(57)【要約】本発明は、ウイルスゲノムの遺伝子間領域（ＩＧＲ）であってワクシニアウイルスゲノムの２つの隣り合った必須オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の間に位置するＩＧＲの中へ、異種核酸配列を組み込むのに有用な、再構築部位を含有する組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、隣り合った必須ＯＲＦは該組換えＭＶＡウイルスの構築に使用された親ＭＶＡウイルス中では隣り合っていないことを特徴とする組換えＭＶＡウイルスに関し、かつ、ワクシニアウイルスのゲノムに異種ＤＮＡを挿入するのに有用な関連核酸構築物に関し、さらに、医薬品またはワクチンとして開示された該ウイルスの使用に関する。
2013507935.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、ＭＶＡウイルスゲノムの２つの隣り合った必須オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の間に異種核酸配列を含み、親ＭＶＡウイルス中の対応する２つの必須ＯＲＦの間に存在する非必須ＯＲＦを欠いていることを特徴とする、組換えＭＶＡウイルス。
【請求項２】
異種核酸配列は、２つの隣り合った必須ＯＲＦの間にある遺伝子間領域（ＩＧＲ）内にある、請求項１に記載の組換えＭＶＡウイルス。
【請求項３】
非必須遺伝子はＭＶＡウイルスのＤｅｌ  ＩＩＩ挿入部位に隣接している、請求項１に記載の組換えＭＶＡウイルス。
【請求項４】
隣り合った必須ＯＲＦのうち少なくとも一方は、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１９と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１に記載の組換えＭＶＡウイルス。
【請求項５】
隣り合った必須ＯＲＦのうち一方は配列番号１１または配列番号１４と少なくとも９０％の同一性を有し、隣り合った必須ＯＲＦのうち他方は配列番号１６または配列番号１９と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１に記載の組換えＭＶＡウイルス。
【請求項６】
隣り合った必須ＯＲＦのうち一方は配列番号１１または配列番号１４を含み、隣り合った必須ＯＲＦのうち他方は配列番号１６または配列番号１９を含む、請求項１に記載の組換えＭＶＡウイルス。
【請求項７】
ＣＤＣ／アカンビス（Ａｃａｍｂｉｓ）による命名法を用いると、隣り合った必須ＯＲＦのうち一方は１６３であり、隣り合った必須ＯＲＦのうち他方は１６７である、請求項１に記載の組換えＭＶＡウイルス。
【請求項８】
異種核酸配列は、転写制御要素に転写制御される少なくとも１つのコード配列を含む、請求項１に記載の組換えＭＶＡウイルス。
【請求項９】
コード配列は１つ以上のタンパク質をコードする、請求項８に記載の組換えＭＶＡウイルス。
【請求項１０】
転写制御要素はポックスウイルスの転写制御要素である、請求項８に記載の組換えＭＶＡウイルス。
【請求項１１】
コード配列はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する、請求項８に記載の組換えＭＶＡウイルス。
【請求項１２】
コード配列はＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする、請求項８に記載の組換えＭＶＡウイルス。
【請求項１３】
コード配列は配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、コードされているタンパク質が、配列番号４によってコードされるタンパク質に対する免疫応答の誘発能を有する、請求項８に記載の組換えＭＶＡウイルス。
【請求項１４】
コード配列は配列番号４を含む、請求項８に記載の組換えＭＶＡウイルス。
【請求項１５】
単離された核酸構築物であって、
（ａ）第１の必須ＭＶＡウイルスＯＲＦ由来の少なくとも２５個連続したヌクレオチドを含む第１の核酸配列と、
（ｂ）第２の必須ＭＶＡウイルスＯＲＦ由来の少なくとも２５個連続したヌクレオチドを含む第２の核酸配列と
を含み、
第１および第２の必須ＭＶＡウイルスＯＲＦはＭＶＡゲノム中で少なくとも１つの非必須ＯＲＦによって隔てられており、第１および第２の核酸配列は、単離された核酸構築物において互いに隣り合っていることを特徴とする、核酸構築物。
【請求項１６】
ａ）第１の核酸配列は、第１の必須ＭＶＡウイルスＯＲＦの少なくとも１００個連続したポリヌクレオチド領域と少なくとも７５％の同一性を有する少なくとも１００個連続したポリヌクレオチド領域を含み、かつ
（ｂ）第２の核酸配列は、第２の必須ＭＶＡウイルスＯＲＦの少なくとも１００個連続したポリヌクレオチド領域と少なくとも７５％の同一性を有する少なくとも１００個連続したポリヌクレオチド領域を含む、
請求項１５に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
ＣＤＣ／アカンビスによる命名法を用いると、第１のＯＲＦはＡＣＡＭ３０００＿ＭＶＡ＿１６３であり、第２のＯＲＦはＡＣＡＭ３０００＿ＭＶＡ＿１６７である、請求項１５に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
第１および第２の核酸配列の隣り合った端部は、（ａ）遺伝子間領域および（ｂ）制限酵素認識部位からなる群から選択された少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第３の核酸配列によって隔てられている、請求項１５に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
第１および第２の核酸配列の隣り合った端部は、異種核酸配列を含む第３の核酸配列によって隔てられていることを特徴とする、請求項１５に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
異種核酸配列は、転写制御要素に転写制御される少なくとも１つのコード配列を含む、請求項１９に記載の核酸構築物。
【請求項２１】
転写制御要素はポックスウイルスの転写制御要素である、請求項２０に記載の核酸構築物。
【請求項２２】
コード配列は１つ以上のタンパク質または低分子干渉ＲＮＡをコードする、請求項２０に記載の核酸構築物。
【請求項２３】
異種核酸配列はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する、請求項２１に記載の核酸構築物。
【請求項２４】
異種核酸配列はＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする、請求項２１に記載の核酸構築物。
【請求項２５】
ｐＬＷ‐７６の配列（配列番号２１）を含む、請求項１５に記載の核酸構築物。
【請求項２６】
安定な組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスを製造する方法であって、
（ａ）請求項１５に記載の核酸構築物で細胞をトランスフェクションする工程と、
（ｂ）トランスフェクションした細胞をＭＶＡウイルスに感染させる工程と、
（ｃ）核酸構築物とＭＶＡウイルスゲノムとの間の相同組換えを可能とするのに適した条件下で感染細胞を培養する工程と、
（ｄ）組換えＭＶＡウイルスを単離する工程と
を含む方法。
【請求項２７】
対象者において免疫応答を誘導する方法であって、請求項８に記載の組換えＭＶＡウイルスを該対象者に投与する工程を含む方法。
【請求項２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質を生産する方法であって、
（ａ）宿主細胞を請求項８に記載の組換えＭＶＡウイルスに感染させる工程と、
（ｂ）感染宿主細胞を適切な条件下で培養する工程と、
（ｃ）宿主細胞による生産物を単離する工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＶＡゲノム中への異種ＤＮＡ配列の安定的組込みに有用な挿入部位に関する。より具体的には、本発明は、必須遺伝子および非必須遺伝子の組み合わせを包含する改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスゲノムの領域を再構築して、異種ＤＮＡが該ゲノム中への安定的な組込み状態を維持するようにする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポックスウイルス・ファミリーを構成するウイルスは、数百種のタンパク質をコードしている大きな二本鎖ＤＮＡゲノムを有する（非特許文献１）。ポックスウイルスは、脊椎動物および昆虫の宿主域を踏まえて、コードポックスウイルス亜科（Chordopoxvirinae）およびエントモポックスウイルス亜科（Entomopoxvirinae）に分けられる。コードポックスウイルス亜科は８つの属すなわち：オルソポックスウイルス属（Orthopoxvirus）、パラポックスウイルス属（Parapoxvirus）、アビポックスウイルス属（Avipoxvirus）、カプリポックスウイルス属（Capripoxvirus）、レポリポックスウイルス属（Leporipoxvirus）、スイポックスウイルス属（Suipoxvirus）、モルシポックスウイルス属（Molluscipoxvirus）、およびヤタポックスウイルス属（Yatapoxvirus）で構成されている。オルソポックスウイルス属の原型株はワクシニアウイルスである。ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）は、無関係な病原体に対する防御免疫応答を引き起こすことが示された最初の組換えウイルスであり（非特許文献２；非特許文献３）、家畜用および野生生物用ワクチン剤のためのベクターとして使用されている（非特許文献４）。しかしながら、ヒトに使用するための組換えＶＡＣＶの開発は安全性の問題により阻まれてきた。この理由から、免疫不全の動物においても模範的な安全プロファイルを備えた極めて弱毒化された天然痘ワクチンである改変ＶＡＣＶアンカラ（ＭＶＡ）に、関心が集まっている（非特許文献５〜非特許文献７）。ＭＶＡのゲノム配列（非特許文献８）は、ほとんどの哺乳動物細胞において増殖することができず、かつ組換えワクチンベクターの優れた候補であることが知られており（非特許文献９ならびに非特許文献１０）、ニワトリ胚線維芽細胞において５７０回を越えて継代され、その間に、親の野生型アンカラ株に対して６つの主な欠失が、宿主域の厳しい制限を伴って発生した（非特許文献１１）。ＭＶＡは宿主域が厳しく制限されており、ほとんどの哺乳動物細胞において、ビリオンのアセンブリ阻止が原因でほとんどまたは全く繁殖しない（非特許文献９）。組換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ）を用いた初期実験から実証されたその能力は、外来タンパク質を確実に発現すること（非特許文献９）、ならびに防御的な体液性免疫および細胞性免疫を誘導することであった（非特許文献１０）。現在、種々様々な病原体の遺伝子を発現するｒＭＶＡ候補ワクチンが、動物およびヒトの試験を受けている（非特許文献１２）。
【０００３】
候補のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ワクチンおよびその他のワクチンを開発している間に、突然変異体ｒＭＶＡが組織培養継代後に外来タンパク質を発現する能力を失うことが観察された（非特許文献１３〜非特許文献１５）。しかしながら、この不安定性は、個々のプラークが単離されて分析されなければ当初は察知されずにいる可能性がある。しかし、集団内において一度確立されると、非発現体は元のｒＭＶＡを圧倒して急速に増殖することができる。上記を考慮することは、ｒＭＶＡの大規模なワクチンシードストックの製造にとって特に重要である。ＭＶＡにおけるクローン化遺伝子の不安定性は驚くべきことである、というのも、ＭＶＡはすでにニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）における数百回の継代を通じてその適応時の遺伝的変化を経ており、現在は完全に安定しているからである。実際、３つの独立したプラーク単離物（受託番号Ｕ９４８４８、ＡＹ６０３３５５、およびＤＱ９８３２３６）について、アントワーヌらにより、同一の１６７，０００ｂｐのゲノム配列が報告されている（非特許文献１６）。遺伝子挿入物の不安定性の原因はこれまで調査されていないが、組換えタンパク質の有害な影響が非発現性突然変異体の選択優位性において役割を果たすように思われる。したがって、パラインフルエンザウイルスおよび麻疹ウイルスの膜貫通型タンパク質の発現レベルを低減すること、ならびにＨＩＶ  Ｅｎｖの細胞質尾部の一部を欠失させることにより、ｒＭＶＡの安定性が改善される（非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。しかしながら、発現の低減は免疫原性も低下させる可能性があり、したがって不適当な場合がある。（非特許文献１７）。
【０００４】
ワクチンとしてのｒＭＶＡの潜在的価値を考慮すれば、この有害な不安定性の問題を理解し、かつ安定な組換えＭＶＡウイルスを構築する方法を開発することが重要である。さらに、安定性の問題についての理解は、他のＤＮＡ発現ベクターに当てはまる洞察を提供することも考えられる。本発明はそのような洞察を提供し、かつ安定な組換えＭＶＡウイルスの構築という問題の解決策を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄ．Ｍ．クナイプ（Knipe）、Ｐ．Ｍ．ハウリー（Howley）、Ｄ．Ｅ．グリフィン（Griffin）、Ｒ．Ａ．ラム（Lamb）、Ｍ．Ａ．マーティン（Martin）、Ｂ．ロイズマン（Roizman）、およびＳ．Ｅ．シュトラウス（Straus）編、「フィールズ・ウイルス学（Fields Virology）」第５版、モス（Moss）、Ｂ．著、「ポックスウイルス科：ウイルスおよびその複製（Poxviridae: The Viruses and Their Replication）」、米国フィラデルフィア州フィラデルフィア、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンズ（Lippincott Williams and Wilkins）、２００７年
【非特許文献２】モス（Moss）、Ｂ．、Ｇ．Ｌ．スミス（Smith）、Ｊ．Ｌ．ゲリア（Geria）、およびＲ．Ｈ．パーセル（Purcell）、「生きている組換えワクシニアウイルスはＢ型肝炎からチンパンジーを防御する（Live recombinant vaccinia virus protects chimpanzees against hepatitis B.）」、ネイチャー誌（Nature）、１９８４年、第３１１巻、ｐ．６７−６９
【非特許文献３】パオレッティ（Paoletti）、Ｅ．、Ｂ．Ｒ．リピンスカス（Lipinskas）、Ｃ．サムソノルフ（Samsonolf）、Ｓ．Ｒ．マーサー（Mercer）、およびＤ．パニカリ（Panicali）、「遺伝子組換えポックスウイルスを使用する生ワクチンの構築；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄを発現するワクシニアウイルス組換え体の生物学的活性（Construction of live vaccines using genetically engineered poxviruses; biological activity of vaccinia virus recombinants expressing the hepatitis B virus surface antigen and the herpes simplex virus glycoprotein D）」、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、１９８４年、第８１巻、ｐ．１９３−１９７
【非特許文献４】モス（Moss）、Ｂ．、「組換え遺伝子の発現、ワクチン接種、および安全性のための遺伝子組換えポックスウイルス（Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression. vaccination, and safety.）」、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、１９９６年、第９３巻、ｐ．１１３４１−１１３４８
【非特許文献５】マイア（Mayr）、Ａ．、Ｖ．ホッホスタイン‐ミンツェル（Hochstein−Mintzel）、およびＨ．スティックル（Stickl）、「弱毒化ワクシニアウイルス株ＭＶＡの継代経歴、特性、および適用性（Passage history, properties, and applicability of the attenuated vaccinia virus strain MVA.）」、インフェクション誌（Infection）、１９７５年、第３巻、ｐ．６−１４（独語）
【非特許文献６】スティックル（Stickl）、Ｈ．、Ｖ．ホッホスタイン‐ミンツェル（Hochstein−Mintzel）、Ａ．マイア（Mayr）、Ｈ．Ｃ．フーバー（Huber）、Ｈ．シェーファー（Schafer）、およびＡ．ホルツナー（Holzner）、「天然痘のＭＶＡワクチン接種：弱毒化された生ワクシニアウイルス株（ＭＶＡ）の臨床試験（MVA vaccination against smallpox: clinical trial of an attenuated live vaccinia virus strain （MVA）.）」、ドイチェ・メディツィニッシェ・ボーヘンシュリフト誌（Dtsch. Med. Wschr.）、１９７４年、第９９巻、ｐ．２３８６−２３９２（独語）
【非特許文献７】スティッテラー（Stittelaar）、Ｋ．Ｊ．、Ｔ．クイケン（Kuiken）、Ｒ．Ｌ．デ・スワルト（de Swart）、Ｇ．ファン・アメロンゲン（van Amerongen）、Ｈ．Ｗ．ウォス（Vos）、Ｈ．Ｇ．ニーステルス（Niesters）、Ｐ．ファン・スハルクウェイク（van Schalkwijk）、Ｔ．ファン・デル・クワスト（van der Kwast）、Ｌ．Ｓ．ワイアット（Wyatt）、Ｂ．モス（Moss）、およびＡ．Ｄ．オスターハウス（Osterhaus）、「免疫抑制マカクにおける改変ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）の安全性（Safety of modified vaccinia virus Ankara （MVA） in immune−suppressed macaques.）」、ワクチン誌（Vaccine）、２００１年、第１９巻、ｐ．３７００−３７０９
【非特許文献８】マイア（Mayr）、Ａ．ら、ツェントラルブラット・フュール・バクテリオロギー（Zentralbl Bakteriol）、１９７８年、第１６７巻、ｐ．３７５−３９０
【非特許文献９】サッター（Sutter）、Ｇ．およびモス（Moss）、Ｂ．、「非複製型ワクシニアベクターは組換え遺伝子を効率的に発現する（Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes.）」、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、１９９２年、第８９巻、ｐ．１０８４７−１０８５１
【非特許文献１０】サッター（Sutter）、Ｇ．、Ｌ．Ｓ．ワイアット（Wyatt）、Ｐ．Ｌ．フォーリー（Foley）、Ｊ．Ｒ．ベニンク（Bennink）、およびＢ．モス（Moss）「宿主域が制限され、かつ高度に弱毒化されたワクシニアウイルスＭＶＡ株に由来する組換えベクターはマウスにおいてインフルエンザウイルスに対する防御免疫を活性化する（A recombinant vector derived from the host range−restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia virus stimulates protective immunity in mice to influenza virus）」、ワクチン誌（Vaccine）、１９９４年、第１２巻、ｐ．１０３２−１０４０
【非特許文献１１】マイヤー（Meyer）、Ｈ．ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ビロロジー誌（J Gen Virol）、１９９１年、第７２巻、ｐ．１０３１−１０３８
【非特許文献１２】ゴメス（Gomez）、Ｃ．Ｅ．、Ｊ．Ｌ．ナジェラ（Najera）、Ｍ．クルーパ（Krupa）、およびＭ．エステバン（Esteban）、「ポックスウイルスベクターＭＶＡおよびＮＹＶＡＣ  感染症およびがんに対するワクチン接種のための遺伝子送達システム（The poxvirus vectors MVA and NYVAC a gene delivery systems for vaccination against infection diseases and cancer）」、カレント・ジーン・セラピー誌（Curr. Gene Ther.）、２００８年、第８巻、ｐ．９７−１２０
【非特許文献１３】スティッテラー（Stittelaar）、Ｋ．Ｊ．、Ｌ．Ｓ．ワイアット（Wyatt）、Ｒ．Ｌ  デ・スワルト（de Swart）、Ｈ．Ｗ．ウォス（Vos）、Ｊ．グローエン（Groen）、Ｇ．ファン・アメロンゲン（van Amerongen）、Ｒ．Ｓ．ファン・ビンネンダイク（van Binnendijk）、Ｓ．ローゼンブラット（Rozenblatt）、Ｂ．モス（Moss）、およびＡ．オスターハウス（Osterhaus）「受動的獲得抗体の存在下における改変ワクシニアウイルスアンカラ系の麻疹ウイルスワクチンを接種されたマカクの防御免疫（Protective immunity in macaques vaccinated with a modified vaccinia virus Ankara−based measles virus vaccine in the presence of passively acquired antibodies）」、ジャーナル・オブ・ビロロジー誌（J. Virol）、２０００年、第７４巻、ｐ．４２３６−４２４３
【非特許文献１４】ワイアット（Wyatt）、Ｌ．Ｓ．、Ｉ．Ｍ．ベリアコフ（Belyakov）、Ｐ．Ｌ．アール（Earl）、Ｊ．Ａ．ベルゾフスキー（Berzofsky）、およびＢ．モス（Moss）、「組換えＭＶＡによって発現されたＨＩＶ  Ｅｎｖの自然発生的切断に起因する、細胞表面発現、免疫原性および遺伝的安定性の増大（Enhanced cell surface expression, immunogenicity and genetic stability resulting from a spontaneous truncation of HIV Env expressed by a recombinant MVA）」ビロロジー誌（Virology）、２００８年、第３７２巻、ｐ．２６０−２７２
【非特許文献１５】ワイアット（Wyatt）、Ｌ．Ｓ．、Ｓ．Ｔ．ショル（Shors）、Ｂ．Ｒ．マーフィー（Murphy）、およびＢ．モス（Moss）、「動物モデルにおけるパラインフルエンザウイルス３感染に対して有効な複製欠損型組換えワクシニアウイルスワクチンの開発（Development of a replication−deficient recombinant vaccinia virus vaccine effective against parainfluenza virus 3 infection in an animal model.）」、ワクチン誌（Vaccine）、１９９６年、第１４巻、ｐ．１４５１−１４５８
【非特許文献１６】アントワーヌ（Antoine）、Ｇ．、Ｆ．シェイフリンガー（Scheiflinger）、Ｆ．ドルナー（Dorner）、およびＦ．Ｇ．フォークナー（Falkner）、訂正記事１０「改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）株の完全なゲノム配列：他のオルソポックスウイルスとの比較（The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara （MVA） strain: comparison with other orthopoxviruses）」、ビロロジー誌（Virology）、２００６年、第３５０巻、ｐ．５０１−５０２、［１９９８年第２４４巻ｐ．３６５の訂正］
【非特許文献１７】ワイアット（Wyatt）、Ｌ．Ｓ．、Ｐ．Ｌ．アール（Earl）、Ｊ．フォークト（Vogt）、Ｌ．Ａ．エラー（Eller）、Ｄ．チャンドラン（Chandran）、Ｊ．リウ（Liu）、Ｈ．Ｌ．ロビンソン（Robinson）、およびＢ．モス（Moss）、「組換え改変ワクシニアウイルスアンカラＨＩＶワクチンの免疫原性とｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現レベルとの関連（Correlation of immunogenicities and in vitro expression levels of recombinant modified vaccinia virus Ankara HIV vaccines）」、ワクチン誌（Vaccine）、２００８年、第２６巻、ｐ．４８６−４９３
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスのゲノムを、該ゲノムの領域を再構築することによってより安定させることができるという発見に関する。特に、本発明者らは、非必須遺伝子を含有するゲノム領域が遺伝学的に不安定であることを発見した。さらに、そのような領域は、非必須ＤＮＡを除去し、これらの領域の必須遺伝子を互いに隣り合わせることによってより安定させることが可能である。必須遺伝子の喪失は増殖上の不都合を有するウイルスを生じるので、そのようなウイルスはウイルス集団から急速に失われて、必須遺伝子および任意の介在ＤＮＡが維持されたウイルスの集団が生じる。
【０００７】
本開示は、組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、ＭＶＡウイルスゲノムの２つの隣り合った必須オープンリーディングフレームの間に異種核酸配列を含むウイルスを提供する。必須ＯＲＦの選択は、該ＯＲＦが、本発明の組換えウイルスを構築するために使用される親ＭＶＡウイルスのゲノム中で隣り合っていないように行われる。すなわち、該必須ＯＲＦは少なくとも１つの非必須ＯＲＦによって隔てられている。しかしながら、組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）子孫ウイルスでは、該必須ＯＲＦは隣り合わせにされている。すなわち、必須ＯＲＦの間には介在する非必須ＯＲＦが存在しない。従って、必須ＯＲＦの間の領域は安定であり、ウイルス集団内で維持される。従って、この領域は、異種核酸配列の挿入のための新規かつ有用な部位を提供する。そのような異種核酸配列は、抗原のような、治療上有用なタンパク質をコードすることができる。
【０００８】
本開示はさらに、本発明の組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスを構築するために使用することができる核酸構築物も提供する。そのような構築物は、親ＭＶＡウイルス由来であって親ウイルスにおいては隣り合っていない必須ＯＲＦを含んでいる。しかしながら、開示される核酸構築物では、これらの必須ＯＲＦは互いに隣り合わせにされている。さらに、必須ＯＲＦの間に遺伝子間領域を含有する構築物が開示され、これらは異種核酸配列の挿入に使用することができる。
【０００９】
最後に、本発明のウイルスを疾患の予防および治療のために使用する方法も開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｐｏｌ遺伝子塩基配列の同一性に基づいたＨＩＶ‐１およびＨＩＶ‐２の系統関係を示す図。ＳＩＶｃｐｚおよびＳＩＶｓｍｍは、それぞれチンパンジーおよびスーティーマンガベイから検出された、ヒトに近い霊長類のレンチウイルスである。
【図２】４つの異なるＳＩＶｃｐｚ単離物を用いた、完全長ｐｏｌ遺伝子塩基配列に基づいたＨＩＶ‐１のグループＭ、ＮおよびＯの系統関係を示す図。バーは遺伝的距離０．１（１０％のヌクレオチド相違）を示し、アステリスクはｅｎｖの配列に基づいてグループＮのＨＩＶ‐１単離物を位置付けている。
【図３】ＨＩＶ‐１単離物の指向性および生物学的特性を示す図。
【図４】ＨＩＶにコードされたタンパク質を示す図。ＨＩＶ遺伝子の位置、一次翻訳産物（場合によってはポリプロテイン）のサイズ、およびプロセシングされた成熟ウイルスタンパク質が示されている。
【図５】成熟ＨＩＶ‐１ビリオンの概略図。
【図６】ＨＩＶ‐１  Ｅｎｖ糖タンパク質を直線的に表す図。矢印は、ｇｐ１６０が切断されてｇｐ１２０およびｇｐ４１となる部位を示す。ｇｐ１２０では、斜線の付されたエリアは可変ドメイン（Ｖ１〜Ｖ５）を表わし、無地のボックスは保存配列（Ｃ１〜Ｃ５）を示している。ｇｐ４１エクトドメインでは、いくつかのドメインが示されている、すなわち：Ｎ末端融合ペプチド、および２つのエクトドメインへリックス（ＮへリックスおよびＣへリックス）である。膜貫通ドメインは黒色のボックスによって表わされている。ｇｐ４１細胞質ドメインでは、Ｔｙｒ‐Ｘ‐Ｘ‐Ｌｅｕ（ＹＸＸＬ）エンドサイトーシス・モチーフ（配列番号１）および２つの予測へリックスドメイン（ヘリックス‐１および‐２）が示されている。アミノ酸番号が示されている。
【図７】ｐＬＷ‐７３核酸構築物（配列番号２および３）を示す図。
【図８】導入用ベクターｐＬＷ‐７３のヌクレオチド配列を示す図（上側の鎖、配列番号２；下側の鎖、配列番号３）。
【図９】ウガンダ人のクレードＤ  Ｅｎｖタンパク質（単離物ＡＯ７４１２）をコードしているヌクレオチド配列を示す図（配列番号４）。
【図１０】ウガンダ人のクレードＤ  ｇａｇｐｏｌタンパク質（単離物ＡＯ３３４９）をコードしているコドン変更されたヌクレオチド配列を示す図（配列番号５）。
【図１１】組換えＭＶＡの生成および挿入遺伝子の安定性の分析について示す図。Ａ）ｅｎｖおよびｇａｇｐｏｌがそれぞれＤｅｌ  ＩＩ部位およびＤｅｌ  ＩＩＩ部位へ挿入されることを示す概略図。Ｂ）免疫染色による安定性の評価。
【図１２】ＭＶＡ／６５Ａ／Ｇ  ｅｎｖにおけるｅｎｖ突然変異の種類および頻度を示す図。
【図１３】Ｉ８Ｒ／Ｇ１Ｌ  ＩＧＲにＥｎｖ、Ｄｅｌ  ＩＩＩにＧａｇＰｏｌが挿入されることを示す図。
【図１４】安定性を増大するためのＡ／Ｇ構築物への改変を示す図。
【図１５】プラーク継代後のＥｎｖの発現について示す図。
【図１６】個々のクローンのＰＣＲおよびウエスタンブロット解析を示す図。
【図１７】二重組換えＭＶＡによるＡ／Ｇ  ｅｎｖの発現を示す図。
【図１８】ウガンダ人のＨＩＶ‐１単離物由来のｅｎｖおよびｇａｇｐｏｌを発現する組換えウイルスを示す図。
【図１９】ＭＶＡ／ＵＧＤ４ａ  −  非染色ｅｎｖプラークの分析について示す図。
【図２０】組換えＭＶＡにおけるＵＧＤ  ｅｎｖ遺伝子の改変を示す図。
【図２１】ＭＶＡ／ＵＧＤ４ｂ  −  非染色ｇａｇプラークの分析について示す図。＊はＧまたはＣ残基が４〜６個連続した箇所の位置である。
【図２２】組換えＭＶＡにおけるＵＧＤ  ｇａｇｐｏｌ遺伝子の改変を示す図。
【図２３】ＵＧＤのｅｎｖおよびｇａｇｐｏｌを発現する安定した組換えＭＶＡの構築を示す図。
【図２４】ＭＶＡ／ＵＧＤ４ｄによって誘発された細胞応答を示す図。
【図２５】ＭＶＡ／ＵＧＤ４ｄによって誘発された抗体応答を示す図。
【図２６】ＭＶＡウイルスゲノムのｄｅｌ  ＩＩＩ部位を再構築する方法の概要を示す図。
【図２７】ｐＬＷ‐７６核酸構築物（配列番号２１および２２）を示す図。
【図２８】ｄｅｌ  ＩＩＩ部位の再構築によるｒＭＶＡのシンシチウム表現型を示す図。
【図２９】様々な組換えＭＶＡウイルスにおける異種核酸の安定性の比較を示す図。
【図３０】様々な組換えＭＶＡウイルスにおけるＵＧＤ  Ｅｎｖタンパク質発現レベルの比較を示す図。
【図３１】導入用ベクターｐＬＷ‐７６のヌクレオチド配列（配列番号２１および２２）を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
微生物の寄託
次の微生物は、ブダペスト条約の条項に従って記載の日時に米国バージニア州マナッサス所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託済みである。
【００１２】
【表１】
2013507935.tif 000003
ＭＶＡ  １９７４／ＮＩＨクローン１は、２００３年３月２７日、米国バージニア州２０１１０‐２２０９、マナッサス、ユニバーシティ・ブールバード１０８０１、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ‐５０９５として寄託された。本寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびその規定（ブダペスト条約）に従って行われた。これは、寄託日時から３０年間にわたり該寄託物の生存培養物の維持を保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項の下でＡＴＣＣより入手可能となり、また、関連する米国特許の発行または任意の米国もしくは外国特許出願の公開のいずれか早い方に際して公衆が該寄託物の培養物の子孫を恒久的かつ無制限に入手可能であることを保証し、かつ米国特許法第１２２条およびこれに関連する長官が定める規則（米国特許法施行規則第１．１４条を含む）に従って権利を与えられることが米国特許商標庁長官によって決定された者が該子孫を入手可能であることを保証する、出願人とＡＴＣＣとの間の合意に従うことになる。寄託された株が入手可能であるということは、任意の政府の権限の下で該政府の特許法に従って与えられた権利に違反して本発明を実行することが許されると解釈されるものではない。
【００１３】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明についてさらに説明する前に、了解されるべきことは、本発明は記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、それ自体が当然多様であってよいことである。さらに当然ながら、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書中で使用される専門用語は特定の実施形態のみについて説明するためのものであって、限定するようには意図されていない。
【００１４】
別途定義のないかぎり、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は本発明の属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、シングルトン（Singleton）Ｐおよびセインズベリー（Sainsbury）Ｄ．、「微生物学および分子生物学の辞典（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology）」第３版、米国ニューヨーク州チチェスター、Ｊ．ワイリー・アンド・サンズ（J. Wiley and Sons）、２００１年、ならびに、Ｄ．Ｍ．クナイプ（Knipe）、Ｐ．Ｍ．ハウリー（Howley）、Ｄ．Ｅ．グリフィン（Griffin）、Ｒ．Ａ．ラム（Lamb）、Ｍ．Ａ．マーティン（Martin）、Ｂ．ロイズマン（Roizman）、およびＳ．Ｅ．シュトラウス（Straus）編、「フィールズ・ウイルス学（Fields Virology）」第５版、米国フィラデルフィア州フィラデルフィア、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンズ（Lippincott Williams and Wilkins）、２００７年）を参照のこと。本発明の実施または試験においては、本明細書に記載のものに類似または等価の任意の方法および材料も使用可能であるが、好適な方法および材料についてここで説明する。本明細書中で言及された出版物はすべて、該出版物が関連して引用された方法または材料のうち少なくともいずれかを開示かつ説明するために、参照により本願に組み込まれる。
【００１５】
本発明によれば、単離されたタンパク質（または核酸分子）とは、その天然の環境から取り出されたタンパク質（または核酸分子）である。単離されたタンパク質（または核酸分子）は、例えば、その天然の供給源から得られてもよいし、組換えＤＮＡ技術を使用して生産されてもよいし、化学的に合成されてもよい。そのため、単離された、とは、タンパク質または核酸分子が精製された状態や程度を反映するものではない。
【００１６】
留意せねばならないのは、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈がそうでないことを明白に規定していないかぎり、複数の指示物を含むことである。さらに留意すべきは、特許請求の範囲はあらゆる任意選択の要素を除外して作成されうることである。そのため、この記述は、請求項の構成要件の記述に関する「専ら（solely）」、「〜のみ（only）」などのような排他的な用語の使用、または「否定的な（negative）」限定の使用について、先行記述としての役割を果たすことが意図されている。
【００１７】
本明細書中で使用されるように、用語「１つの（a）」物または「１つの（an）」物は、１つ以上のその物を指すことが理解されよう。例えば、（１つの（a））核酸分子は１つ以上の核酸分子を指す。そのため、用語「１つの（a）」、「１つの（an）」、「１つ以上の（one or more）」および「少なくとも１つの（at least one）」は互換的に使用可能である。同様に、用語「〜を含む（comprising）」、「〜を含む、〜を備える（including）」および「〜を有する（having）」は互換的に使用可能である。
【００１８】
移行語「〜を含む（comprising）」は、「〜を含む、〜を備える（including）」、「〜を含有する（containing）」、または「〜を特徴とする（characterized by）」と同義であり、包括的すなわちオープンエンドであって、記述されていないさらなる構成要件または方法ステップを除外しない。
【００１９】
移行句「〜からなる（consisting of）」は、請求項において指定されていないあらゆる構成要件、ステップ、または成分を除外するが、通常付随する不純物のような、本発明とは無関係な追加の構成成分またはステップは除外しない。
【００２０】
移行句「本質的に〜からなる（consisting essentially of）」は、請求項の範囲を、指定された材料またはステップ、およびクレームに記載された発明の基礎的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。
【００２１】
本明細書中で議論された出版物は、専ら本願の出願日以前の開示について提供される。本明細書は、本発明が先行発明に基づくそのような出版物に先行することは認められないという了解として解釈されるべきではない。さらに、提示された出版日は実際の出版日とは異なる可能性があり、独立に確認する必要がある場合もある。
【００２２】
当然のことであるが、明確さのために別個の実施形態において記載されている本発明のある種の特徴が、単一の実施形態において組み合わせて提供されることも可能である。反対に、簡潔にするために単一の実施形態を背景として記載されている本発明の様々な特徴が、別々に、または任意の適切な小さな組み合わせ（サブコンビネーション）で提供されてもよい。実施形態の全ての組み合わせが、本発明によって明確に包含され、かつ、ありとあらゆる組み合わせが個々に明示的に開示されているかのように、本明細書中に開示される。さらに、小さな組み合わせも全て、本発明によって明確に包含され、かつ、ありとあらゆる小さな組み合わせが個々に明示的に本明細書中に開示されているかのように、本明細書中に開示される。
【００２３】
全ゲノム塩基配列は、コードポックスウイルスの各々の属のウイルスのうち少なくとも１つについて、および２つのエントモポックスウイルスについて報告されている。ほぼ１００個の遺伝子がすべてのコードポックスウイルスにおいて保存されており、これらの約半分がエントモポックスウイルスにも存在する。上記に基づいて、いくつかの一般化を行うことができる。すなわち、遺伝子は、大部分はオーバーラップしておらず、ゲノムの近いほうの端部に向かってブロック単位で存在する傾向があり、高度に保存されていて必須の複製機能に関係している場合は通常は中央領域に位置し、可変的であり宿主との相互作用に関係している場合は通常は端部領域に位置している。中央の遺伝子の配置構成は、すべてのコードポックスウイルスにおいて著しく類似している。ゲノム全体の塩基配列決定以前に始まり、その後ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株の完全配列について使用された、ワクシニアウイルスの遺伝子またはＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の命名のための慣例は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡフラグメントの文字、次にフラグメント内のＯＲＦ番号（左から右へ）、そして、ＯＲＦの方向に応じてＬまたはＲを使用することからなる。この規則にはＨｉｎｄＩＩＩ  Ｃフラグメントについて例外が作られた。すなわち、ＯＲＦについて、高度に可変的なゲノムの左端から始まるのを避けるため、右から番号付けが行われた。ポリペプチド名は、ＬまたはＲが外される以外は遺伝子名に対応する。ほとんどの後続の完全長ポックスウイルスゲノム配列では、ＯＲＦはゲノムの一端から他端へ連続的に番号付けが行われた。しかしながら、文献上の連続性を提供するために古い文字表示が一般名として保持されてきた。ワクシニアウイルスのウエスタン・リザーブ（ＷＲ）株のＯＲＦ番号は、この株が生化学および遺伝学研究の大多数について使用されてきたため、参考図書において共通して示されている。
【００２４】
本発明の発明者らは、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスのゲノム内に外来ＤＮＡ配列の安定な挿入を行うための新たな部位、ならびに新たな部位を作出する方法を特定した。本発明は、安定な組換えＭＶＡウイルスを構築する方法の特定を目的とした研究から生じた。従来観察されてきたように、ＭＶＡゲノムに挿入された異種ＤＮＡ配列を含有している組換えＭＶＡを得ることが可能である一方、これらの挿入物は多くの場合不安定であった。この不安定性の調査から、ＯＲＦとＯＲＦとの間の場所への、ウイルス増殖に必須でない異種ＤＮＡ配列の挿入は、同じくウイルスによって欠失させられる恐れがある、という結論が生じた。したがって、安定な組換えＭＶＡウイルスを構築するための改良された戦略の必要性が認識された。
【００２５】
本明細書中で使用されるように、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とは、タンパク質のアミノ酸をコードする一続きの連続したヌクレオチドを意味する。そのようなタンパク質はペプチド、ポリペプチドであってよく、単一アミノ酸より大きい任意の長さであってよい。当然のことながら、ＯＲＦは、アミノ酸をコードしない終止コドンも含むことができる。当業者には当然のことであるが、組換え事象により、一部のＯＲＦはその本来のコード能力の一部を失っており、よって機能を持たないタンパク質をコードしている。そのようなＯＲＦはＯＲＦフラグメントと呼ばれることがある。ＯＲＦは、コード領域の外側に位置する調節要素（例えばプロモーター、転写制御要素、エンハンサーなど）を含まない。それに対し、遺伝子は、ＯＲＦ（終止コドンを含む）および該ＯＲＦの転写を調節することができる調節要素を指す。
【００２６】
ＯＲＦは、隣り合っているとされる場合もあれば隣り合っていないとされる場合もある。本明細書中で使用されるように、２つのＯＲＦは、該ＯＲＦが同じ核酸分子中に存在し、かつこれらの最も近接した２つの端部が別のポックスウイルスＯＲＦによって隔てられていない場合は、隣り合っている。隣り合っていないＯＲＦとは、その最も近接した２つの端部が別のポックスウイルスＯＲＦによって隔てられているＯＲＦである。隣り合ったＯＲＦとは、一方のＯＲＦに属する末端コドンと他方のＯＲＦに属する末端コドンとの間に他のヌクレオチド配列がないことを意味する、連続したものであってもよい。末端コドンとは、ＯＲＦの最初のコドンまたは最後のコドン（終止コドンを含む）を意味する。末端コドンの一例は、ＯＲＦによってコードされるタンパク質の最初の５’アミノ酸をコードするコドンである。末端コドンの別の例は、ＯＲＦによってコードされるタンパク質の最後の３’アミノ酸をコードするコドンである。末端コドンのさらに別の例は、ＯＲＦの終止コドンである。
【００２７】
隣り合ったＯＲＦが核酸配列によって隔てられている場合もある。そのような配列は遺伝子間領域（intergenic region）と呼ばれる。本明細書中で使用されるように、遺伝子間領域とは、隣り合ったＯＲＦの最も近接した末端コドンの間の核酸配列であって、ポックスウイルス転写制御要素以外に、ワクシニアウイルスに由来するヌクレオチド配列を含んでいない配列を意味する。ＩＧＲ配列は隣り合ったＯＲＦの終止コドンの外側に位置し、よってこれらの隣り合ったＯＲＦによってコードされるタンパク質のいかなる部分もコードしていない。ＩＧＲ配列はポックスウイルス転写制御要素を含有する場合がある。ＩＧＲは、ポックスウイルス以外の生物に由来する配列を含有する場合もある。好ましくは、ＩＧＲは、ポックスウイルス転写制御要素の一部ではないいかなるポックスウイルス配列も有していない。一実施形態では、ＩＧＲは少なくとも１つの異種核酸配列を含む。そのような配列は、ＩＧＲの中に本来存在するかまたは他の異種核酸配列を挿入する目的でＩＧＲに導入済みの、制限酵素認識部位すなわち制限部位に挿入可能である。
【００２８】
ＯＲＦのヌクレオチド配列はタンパク質をコードするが、２つのＯＲＦの間の遺伝子間領域（ＩＧＲ）にはコード能力はない。したがってＩＧＲは、いかなるウイルスタンパク質の生産にも影響せずに異種ＤＮＡを挿入することができる部位としての役割を果たす可能性がある。しかしながらＩＧＲは、ウイルス遺伝子発現の転写制御に必須であるかまたは関与する、調節要素、結合部位、プロモーター配列またはエンハンサー配列のうち少なくともいずれかを含む場合がある。したがって、ＩＧＲは、ウイルスの生活環の調節管理に関与する可能性がある。それでも本発明者は、ＩＧＲが、ＭＶＡの典型的な特徴および遺伝子発現に影響を及ぼしたり変化させたりせずにＭＶＡゲノムに異種核酸配列を安定的に挿入するために使用可能であることを見出した。この新しい挿入部位は、ＭＶＡのＯＲＦやコード配列が変更されないので、特に有用である。
【００２９】
本発明についてさらに説明する前に、ポックスウイルスゲノムにおける遺伝子の配置について理解することは有用である。ＯＲＦのヌクレオチド配列は、規則的に開始コドンで始まり終止コドンで終わる。２つの隣り合ったＯＲＦの向きに依存して、これらのＯＲＦの間の領域であるＩＧＲは、２つの隣り合ったＯＲＦの２つの終止コドンによって挟まれるか、２つの隣り合ったＯＲＦの２つの開始コドンによって挟まれるか、第１のＯＲＦの終止コドンおよび第２のＯＲＦの開始コドンによって挟まれるか、または、第１のＯＲＦの開始コドンおよび第２のＯＲＦの終止コドンによって挟まれる。
【００３０】
従って、ＩＧＲへの外来ＤＮＡ配列の挿入部位は、第１のＯＲＦの終止コドンの下流すなわち３’側となる場合がある。第２のＯＲＦとも呼ばれる隣りのＯＲＦが第１のＯＲＦと同じ向きを有する場合、第１のＯＲＦの終止コドンの下流のこの挿入部位は、第２のＯＲＦの開始コドンの上流すなわち５’側に位置する。
【００３１】
第２のＯＲＦが第１のＯＲＦに対して逆の向きを有する場合、これは２つの隣り合ったＯＲＦの向きが互いに向かっていることを意味するが、この場合挿入部位は両ＯＲＦの終止コドンの下流に位置する。
【００３２】
第３の別例として、２つの隣り合ったＯＲＦが逆方向に読まれるが該２つの隣り合ったＯＲＦの向きが互いに離れる向きである場合、これは２つのＯＲＦの開始コドンが互いに隣り合っていることを特徴とする配置と同義であるが、この場合外来ＤＮＡは両方の開始コドンに対して上流に挿入される。
【００３３】
ＭＶＡゲノム中のＯＲＦは２つのコード方向で存在する。従って、ｍＲＮＡ合成活動は、左から右すなわち順方向、および、同様に、右から左（逆方向）に生じる。ＯＲＦを、ゲノムの様々なＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断フラグメントにおける向きおよび配置によって同定することは、ポックスウイルス学における慣例であり、ワクシニアウイルスの標準的な分類となっている。命名法については、様々なＨｉｎｄＩＩＩフラグメントはそのサイズの大きい順に対応して降順の大文字により示される。ＯＲＦは各ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント上で左から右に番号付けされ、ＯＲＦの向きは、大文字のＬ（右から左への転写を表わす）またはＲ（左から右への転写を表わす）によって示される。さらに、ＭＶＡゲノム構造についてはごく最近の刊行物があるが、該刊行物は、ゲノムの左端から右端へと単純にＯＲＦを番号付けし、その向きを大文字のＬまたはＲで示す、異なる命名法を使用している（アントワーヌ（Antoine）、Ｇ．ら、ビロロジー誌（Virology）、１９９８年、第２４４巻、ｐ．３６５−３９６）。例として、古い命名法によるＩ８Ｒ  ＯＲＦは、アントワーヌらによる０６９Ｒ  ＯＲＦに相当する。
【００３４】
ＨＩＶ遺伝子を発現する改変ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）の組換え体をワクチン剤候補として作製する努力において、本発明者らは、不安定性の原因の１つは外来遺伝子および隣接するＭＶＡ配列の欠失に起因することを究明した。この問題を克服する試みにおいて、本発明者らは、組換えＭＶＡにおいて生存可能な欠失が生じるのを防止するために、保存された遺伝子の間に外来遺伝子を挿入しようと計画した。そのような欠失を備えたウイルスは生育上有利であり、よってｒＭＶＡウイルス集団において異常増殖することになる。ワクシニアゲノム中の保存された遺伝子（これらの遺伝子はワクシニアウイルスの複製に必要と考えられ、したがって「必須遺伝子」である）の間に外来遺伝子を挿入すれば、必須遺伝子のいかなる欠失もウイルス複製を阻害し、したがって組換えＭＶＡを抑えて異常増殖することはないと思われる。したがって、ｒＭＶＡ集団の安定な発現が維持される。組換え体を作製するために本発明者らが使用してきたＭＶＡの株は、該発明者らによって米国疾病管理予防センター（ＣＤＣ）に提供され、その後アカンビス（Acambis）により塩基配列決定がなされた（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ６０３３５５）。ババリアン・ノルディック（Bavarian Nordic）が同社の国際公開公報第０３／０９７８４５号の基礎としてきたＭＶＡの株は、アントワーヌ（Antoine）、Ｇ．ら、ビロロジー誌（Virology）、１９９８年、第２４４巻、ｐ．３６５−３９６で塩基配列決定がなされたワクシニアウイルス株改変ワクシニア・アンカラ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ９４８４８）である。（所与の遺伝子についての上記２つの配列における遺伝子番号が異なることに注意されたい。）
本発明者らは当初、ポックスウイルス科において保存された遺伝子およびコードポックスウイルス亜科（脊椎動物のポックスウイルス）において保存された遺伝子に着目していた（アプトン（Upton）、Ｃ．ら、ジャーナル・オブ・ビロロジー誌（Journal of Virology）、２００３年、第７７巻、ｐ．７５９０−７６００）。これらの遺伝子は、ワールドワイドウェブのpoxvirus.orgに見出されるポックスウイルス・バイオインフォマティクス・リソース・センター（Poxvirus Bioinformatics Resource Center）に掲載されたコペンハーゲン・ワクシニアウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３５０２７）の命名法でリストされている。これらの遺伝子は、ポックスウイルス科における合計４９個の保存遺伝子と、コードポックスウイルスにおいて保存された４１個の追加の遺伝子とであり、合計９０個の保存遺伝子である。これらの９０個の保存遺伝子から、本発明者らは、保存遺伝子の対の間の遺伝子間部位をリストした。これらの遺伝子対を以下の表１に列挙する。（ババリアン・ノルディックの国際公開公報第０３／０９７８４５号に含まれていない遺伝子には印が付されていることに注意されたい）。
【００３５】
【表２】
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2013507935.tif 000005
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これらの遺伝子の向きは様々であり、あるものは右に、あるものは左に向かって転写される。このことは、遺伝子間部位のうちのいくつかは、挿入ベクターの構築において保存されるべきであろうプロモーターを含有することを意味している。さらに、オーバーラップしている保存遺伝子については、ベクター構築の際に、繰り返し配列を最小限にするために代替コドンを使用して遺伝子が再構築されるべきであろう。
【００３６】
本発明者らは、保存遺伝子の３’終止コドンが互いに近接した、該遺伝子の向きが「終端対終端」である保存遺伝子に注目した。これらの部位で使用される導入ベクターの構築は、終止コドンと終止コドンとの間のこの領域にはプロモーターは存在しないであろうという事実によって容易になる。終止コドンを隔てる遺伝子間ヌクレオチドが存在する場合、挿入ベクターの構築は簡単である。一方の遺伝子の終止コドンが他方の遺伝子の３’末端の内部にある場合、プラスミド導入ベクターの構築の際に、遺伝子は、繰り返し配列を最小限にするために代替コドンを使用して再構築されてもよいし、または、オーバーラップ部分の長さに応じて、オーバーラップしないように隣接部のＰＣＲにおいて単純に調整されてもよい。表２は、「終端対終端」である保存遺伝子の向きの要件を満たす遺伝子間部位を示す。灰色で強調表示された遺伝子間部位にはオーバーラップしている終端がなく、したがって構築が最も簡単である。
【００３７】
【表３】
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このリストから、本発明者らは、終端がオーバーラップしていない６つの遺伝子間部位に注目した。実施例においては、これら６つのうち遺伝子間部位０７１‐０７２（Ｉ８Ｒ‐Ｇ１Ｌ）が、異種遺伝子を挿入する部位として選択された。この遺伝子間部位を使用した組換えＭＶＡウイルスの構築、および得られたウイルスの特徴については、実施例１に、および参照により全体が本願に組み込まれる国際公開公報第２００８／１４２４７９号Ａ２に、記載されている。
【００３８】
上述された保存遺伝子および対応する遺伝子間部位に加えて、本発明者らは異種核酸配列の挿入に有用な他の部位を発見した。例えば、任意の遺伝子であってその欠失（または不活性化）が力価の０．５ｌｏｇ、０．７５ｌｏｇまたは１ｌｏｇ（１０倍）の低減をもたらすことが実験的に実証された遺伝子は、「必須遺伝子」と考えることができるかもしれない。同様に、必須遺伝子とは、該当する遺伝子が欠失または不活性化されなかったウイルスと比較して力価の少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の低減をもたらす任意の遺伝子である。この遺伝子が別の必須遺伝子に隣り合っていれば、２つの遺伝子の間の遺伝子間部位は異種核酸配列の挿入に有用な部位になるであろう。これらのＯＲＦの１つ以上が、間に入っている異種核酸配列とともに欠失しても、ウイルスの増殖は妨げないと思われる一方、これらのＯＲＦを含有しているウイルスと比較して増殖率の低下がもたらされるであろう。したがって、時間とともに、１つ以上の必須ＯＲＦを失ったウイルスは徐々にウイルス集団全体の中でより小さい割合を占めるようになり、十分な時間を経ると、ウイルス集団から完全に消失するであろう。
【００３９】
したがって、本発明の１つの実施形態は、組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、ＭＶＡウイルス由来の２つの隣り合った必須ＯＲＦの間に、または該ＯＲＦに挟まれた、異種核酸配列を含むウイルスである。一実施形態では、隣り合ったＯＲＦは遺伝子間領域（ＩＧＲ）によって隔てられている。既述のように、ＩＧＲは異種核酸配列を含有することができる。したがって、一実施形態は、組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、ＭＶＡウイルス由来の２つの隣り合った必須ＯＲＦの間に、または該ＯＲＦに挟まれた、遺伝子間領域内に異種核酸配列を含むウイルスである。
【００４０】
本明細書中で使用されるように、異種の、または外来の核酸配列とは、自然界において通常は本発明によって使用されるポックスウイルスに関して見出されることのない配列である。本発明のさらなる実施形態によれば、外来の核酸配列は少なくとも１つのコード配列を含む。該コード配列は、転写制御要素に、好ましくはポックスウイルスの転写制御要素に、作動可能に連結される。さらに、ポックスウイルスの転写制御要素と、例えば内部リボソーム導入部位との間の組み合わせも使用可能である。
【００４１】
さらなる実施形態によれば、異種核酸配列は、１個または数個の転写制御要素に連結された２以上のコード配列を含むこともできる。好ましくは、コード配列は１つ以上のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、該タンパク質は抗原であるか、または、抗原エピトープであって特に治療面から見て興味深い遺伝子のものを含む。
【００４２】
本発明による、治療面から見て興味深い遺伝子とは、疾患を引き起こす病原性または感染性の微生物の遺伝子に由来するかまたは相同である遺伝子であってよい。従って、本発明に関しては、そのような治療面から見て興味深い遺伝子は、特異的免疫応答に影響を及ぼす、好ましくは特異的免疫応答を引き起こすために生物体の免疫系に提示され、その結果として、該生物体に、微生物による感染に対するワクチン接種すなわち予防的保護をもたらす。本発明のさらに好ましい実施形態では、治療面から見て興味深い遺伝子は、感染性ウイルス、例えば、限定するものではないが、デング熱ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスもしくはＣ型肝炎ウイルス、またはＨＩＶのようなヒト免疫不全ウイルスの遺伝子から選択される。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態によれば、異種核酸配列はＨＩＶに由来し、かつＨＩＶ  ｅｎｖをコードするものであって、好ましくは該ＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子は隣り合ったＯＲＦの間のＩＧＲに挿入される。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原因子は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と呼ばれる、レンチウイルス属の典型的な特徴を示すレトロウイルスであることが認識されている。ヒトレンチウイルスの系統関係を図１に示す。ＨＩＶ‐２は、ＨＩＶ‐１に対するよりも、野生のスーティーマンガベイから単離されたウイルスであるＳＩＶｓｍｍに対してより近縁な関係にある。現在、ＨＩＶ‐２はヒトへのＳＩＶｓｍｍの人獣共通感染を表わすものと考えられている。捕獲チンパンジー由来の、ＳＩＶｃｐｚと表された一連のレンチウイルス単離物は、ＨＩＶ‐１の遺伝的近縁種である。
【００４４】
最も初期のＨＩＶ‐１単離物の系統解析は欧州／北米およびアフリカ由来の試料に集中し、世界のこれら２つのエリアから別々のウイルス群が同定された。その後、ＨＩＶ‐１の個別の遺伝学的サブタイプまたはクレードが定義されて３つのグループすなわち：Ｍ（メジャー）；Ｏ（アウトライヤー）；およびＮ（ＭでもＯでもない）に分類された（図２）。全世界のウイルス単離物の９５％以上が含まれる、ＨＩＶ‐１のＭグループは、全ウイルスゲノムの配列に基づけば、少なくとも８つの別々のクレード（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＪ）で構成される。ＨＩＶ‐１のグループＯに属するものは、カメルーン、ガボンおよび赤道ギニアで生活する個体から回収され、これらのゲノムは、グループＭのウイルスとはヌクレオチド配列で５０％未満の同一性を共有する。さらに最近発見されたグループＮのＨＩＶ‐１株は、カメルーン人感染者において同定され、標準的な全ウイルスの酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）では血清学的に反応しないが、従来のウエスタンブロット解析では容易に検出可能である。
【００４５】
ＨＩＶ‐１の遺伝的多様性に関する最新の知見は、多様な地理的起源のグループＭのウイルスに関する研究からもたらされている。過去十年間に集められたデータは、個々の感染者に存在するＨＩＶ‐１集団がヌクレオチド配列で６％〜１０％異なる可能性があることを示している。１つのクレード内のＨＩＶ‐１単離物は、ｇａｇコード配列で１５％およびｇｐ１２０コード配列で最大３０％のヌクレオチド距離を示す場合がある。クレード間の遺伝的多様性は、分析される遺伝子に依存して３０％〜４０％の範囲となりうる。
【００４６】
ＨＩＶ‐１のグループＭサブタイプはすべてアフリカにおいて見出すことができる。クレードＡのウイルスは遺伝学的に最も異なっており、流行の初期にはアフリカで最も一般的なＨＩＶ‐１サブタイプであった。１９９０年代半ばから後期の間にＨＩＶ‐１がアフリカ南部へ急速に広がるとともに、クレードＣのウイルスが主要なサブタイプとなり、現在は世界中のＨＩＶ‐１感染の４８％を占めている。クレードＢのウイルスは最も集中的に研究されたＨＩＶ‐１サブタイプであり、欧州および北米において絶えず最も優勢な単離物である。
【００４７】
高い遺伝子組換え率はレトロウイルスの特徴である。遺伝学的に相異なるウイルス株による同時感染は、ＨＩＶ‐１のリスクにさらされた個体において成立しないであろうと当初は考えられていた。しかしながら、１９９５年までに、ＨＩＶ‐１グループＭの世界規模の多様性のうちかなりの割合が、クレード間のウイルス組換え体を含んでいることが明らかになった。現在では、ＨＩＶ‐１組換え体は、多数のＨＩＶ‐１サブタイプが共存し、かつ流行しているＨＩＶ‐１株の１０％超を占める可能性のある、アフリカ、南米および東南アジアのような地理的なエリアで見出されるであろうと認識されている。分子レベルでは、これらの組換えウイルスのゲノムは寄せ集めのモザイクに似て、並置された相異なるＨＩＶ‐１サブタイプのセグメントを備えており、このことはその世代に寄与する多数の交差事象を反映している。ほとんどのＨＩＶ‐１組換え体はアフリカで発生し、大多数は元々クレードＡのウイルスに由来するセグメントを含有している。タイ国では、例えば、優勢な流行している株の組成は、クレードＡのｇａｇ＋ｐｏｌ遺伝子セグメントおよびクレードＥのｅｎｖ遺伝子からなる。タイ国のＨＩＶ‐１株のクレードＥのｅｎｖ遺伝子は、中央アフリカ共和国由来のウイルス単離物中に存在するクレードＥのｅｎｖと近縁関係にあるので、最初の組換え事象はアフリカで生じ、その後子孫ウイルスがタイ国に伝わったと考えられる。興味深いことに、完全長のＨＩＶ‐１サブタイプＥ単離物（すなわちサブタイプＥのｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を備えたもの）は現在まで報告されていない。
【００４８】
αおよびβケモカイン受容体が感受性ＣＤ４＋細胞へのウイルスの融合および侵入の共受容体として機能するという発見は、ＨＩＶ‐１のための改定分類体系をもたらした（図３）。ここで、ＨＩＶ‐１  ｇｐ１２０およびＣＤ４＋共受容体のタンパク質が別々の細胞で発現される融合アッセイにおけるケモカイン受容体の利用に基づいて、単離物をグループ化することができる。図３に示されるように、ＣＸＣＲ４受容体を使用するＨＩＶ‐１単離物（ここではＸ４ウイルスと呼ぶ）は通常はＴ細胞株（ＴＣＬ）指向性のシンシチウム誘導型（ＳＩ）の株である一方、専らＣＣＲ５受容体を利用するもの（Ｒ５ウイルス）は主にマクロファージ（Ｍ）指向性かつ非シンシチウム誘導型（ＮＳＩ）である。患者単離物の大多数を含み、かつ一連の指向性表現型を示す二重指向性Ｒ５／Ｘ４株は、多くの場合ＳＩである。
【００４９】
複製能を有するすべてのレトロウイルスの場合のように、３つのＨＩＶ‐１一次翻訳産物（すべて構造タンパク質をコードしている）は最初にポリプロテイン前駆体として合成され、該前駆体はその後ウイルスまたは細胞のプロテアーゼによってプロセシングされて成熟粒子関連タンパク質となる（図４）。５５ｋｄのＧａｇ前駆体であるＰｒ５５Ｇａｇは、切断されてマトリックス（ＭＡ）、カプシド（ＣＡ）、ヌクレオカプシド（ＮＣ）およびｐ６タンパク質となる。１６０ｋｄのＧａｇ‐ＰｏｌポリプロテインであるＰｒ１６０Ｇａｇ‐Ｐｏｌの自己触媒反応により、プロテアーゼ（ＰＲ）、ヘテロダイマー性逆転写酵素（ＲＴ）、およびインテグラーゼ（ＩＮ）タンパク質が生じるが、細胞性酵素によるタンパク質分解は、グリコシル化１６０ｋｄ  Ｅｎｖ前駆体ｇｐ１６０をｇｐ１２０表面（ＳＵ）およびｇｐ４１膜貫通（ＴＭ）分解産物に変換する。残る６つのＨＩＶ‐１にコードされたタンパク質（Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、およびＮｅｆ）は、スプライシングされたｍＲＮＡの一次翻訳産物である。
【００５０】
Ｇａｇ
ＨＩＶのＧａｇタンパク質は、他のレトロウイルスのＧａｇタンパク質と同様に、非感染性のウイルス様粒子の形成にとって必要かつ十分である。レトロウイルスのＧａｇタンパク質は一般にポリプロテイン前駆体として合成され、ＨＩＶ‐１のＧａｇ前駆体はそのみかけの分子量に基づいてＰｒ５５Ｇａｇと命名された。先に示したように、Ｐｒ５５ＧａｇのｍＲＮＡはスプライシングされない９．２ｋｂ転写物（図４）であり、該転写物は細胞質中での発現にＲｅｖを必要とする。ｐｏｌのＯＲＦが存在すると、ウイルスのプロテアーゼ（ＰＲ）が細胞からの出芽時または出芽直後にＰｒ５５Ｇａｇを切断して、成熟Ｇａｇタンパク質ｐ１７（ＭＡ）、ｐ２４（ＣＡ）、ｐ７（ＮＣ）、およびｐ６を生成する（図４を参照）。ビリオンでは、ＭＡはウイルスエンベロープの脂質二重層のすぐ内側に局在化し、ＣＡは粒子の中心において円錐形のコア構造の外側部分を形成し、ＮＣはウイルスＲＮＡゲノムとのリボ核タンパク質複合体の状態でコアの中に存在する（図５）。
【００５１】
ＨＩＶのＰｒ５５Ｇａｇ前駆体はその翻訳に続いてオリゴマー化して原形質膜に向かい、原形質膜ではＥＭで視認可能な十分なサイズおよび密度の粒子がアセンブリされる。Ｐｒ５５Ｇａｇによるウイルス様粒子の形成は、Ｇａｇ前駆体に沿った多重ドメインの間で生じる重要なＧａｇ‐Ｇａｇ相互作用を伴う、自己アセンブリのプロセスである。ウイルス様粒子のアセンブリには、ゲノムＲＮＡ（ただし核酸の存在は不可欠のようである）、ｐｏｌにコードされた酵素、またはＥｎｖ糖タンパク質の関与を必要としないが、感染性ビリオンの産生には、ウイルスＲＮＡゲノムのカプシド形成ならびにＥｎｖ糖タンパク質およびＧａｇ‐Ｐｏｌポリプロテイン前駆体Ｐｒ１６０Ｇａｇ‐Ｐｏｌの取り込みを必要とする。
【００５２】
Ｐｏｌ
ｇａｇの下流にはＨＩＶゲノムの最も高度に保存された領域であるｐｏｌ遺伝子が存在し、３つの酵素すなわちＰＲ、ＲＴ、およびＩＮをコードしている（図４を参照）。ＲＴおよびＩＮはそれぞれ、ウイルスＲＮＡゲノムの二本鎖ＤＮＡコピーへの逆転写、およびウイルスＤＮＡの宿主細胞染色体内への組込みに必要である。ＰＲは成熟した感染性ビリオンの産生を調節することにより生活環後期において重大な役割を果たす。ｐｏｌ遺伝子産物は、Ｐｒ１６０Ｇａｇ‐Ｐｏｌと呼ばれる１６０ｋｄのＧａｇ‐Ｐｏｌ融合タンパク質の酵素的切断によって得られる。この融合タンパク質は、Ｐｒ５５Ｇａｇ翻訳時のリボソームのフレームシフトによって生じる（図４を参照）。他の多くのレトロウイルスにも利用されている、Ｇａｇ‐Ｐｏｌ発現のフレームシフト機構は、ｐｏｌから生じるタンパク質が低レベル（Ｇａｇのおよそ５％〜１０％）で発現されることを確実にする。Ｐｒ５５Ｇａｇと同様に、Ｐｒ１６０Ｇａｇ‐ＰｏｌのＮ末端はミリスチル化されて原形質膜を対象として方向づけられる。
【００５３】
プロテアーゼ
鳥類のレトロウイルスを用いて実施された初期のパルス追跡研究は、レトロウイルスのＧａｇタンパク質が当初はポリプロテイン前駆体として合成され、切断されてより小さな産物を生成することを明白に示した。その後の研究から、プロセシング機能は細胞性酵素ではなくウイルス性酵素により提供されること、ＧａｇおよびＧａｇ‐Ｐｏｌ前駆体のタンパク質分解がウイルスの感染性にとって不可欠であることが実証された。レトロウイルスのＰＲの配列分析は、ＰＲがペプシンおよびレニンのような細胞の「アスパラギン酸」プロテアーゼとの関連を有することを示した。これらの細胞性酵素と同様に、レトロウイルスのＰＲは、標的タンパク質中のペプチド結合の加水分解を触媒する水分子を配位するために活性部位の２つの並んだＡｓｐ残基を使用する。偽ダイマーとして機能する（活性部位を生成するために同一分子内の２つの折り畳み部分を使用する）細胞性アスパラギン酸プロテアーゼとは異なり、レトロウイルスのＰＲは真のダイマーとして機能する。ＨＩＶ‐１  ＰＲのＸ線結晶学的データは、２つのモノマーが、各モノマーのＮ末端およびＣ末端両方に由来する４本の逆平行βシートによって部分的に結びついていることを示している。基質結合部位は２つのモノマーの間に形成された裂溝内にある。細胞のホモログと同様に、ＨＩＶ  ＰＲダイマーは、結合部位の上に張り出して裂溝内の基質を安定させる柔軟な「フラップ」を含有し、活性部位のＡｓｐ残基はダイマーの中心にある。興味深いことに、活性部位残基を囲む何らかの限定的なアミノ酸ホモロジーが観察されるが、レトロウイルスのＰＲの一次配列は非常に多様であり、それでもその構造は非常に類似している。
【００５４】
逆転写酵素（Reverse Transcriptase）
定義によれば、レトロウイルスは感染過程の初期段階においてその一本鎖ＲＮＡゲノムを二本鎖ＤＮＡに変換する能力を有している。この反応を、その関連するＲＮａｓｅＨ活性とともに触媒する酵素がＲＴである。レトロウイルスのＲＴは３つの酵素活性すなわち（ａ）ＲＮＡ依存性のＤＮＡ合成（マイナス鎖ＤＮＡ合成のため）、（ｂ）ＲＮａｓｅＨ活性（ＤＮＡ‐ＲＮＡハイブリッド中間体に存在するｔＲＮＡプライマーおよびゲノムＲＮＡの分解のため）、ならびに（ｃ）ＤＮＡ依存性のＤＮＡ合成（第２鎖またはプラス鎖ＤＮＡ合成のため）を有する。
【００５５】
成熟したＨＩＶ‐１  ＲＴホロ酵素は６６ｋｄサブユニットおよび５１ｋｄサブユニットのヘテロダイマーである。５１ｋｄサブユニット（ｐ５１）は、６６ｋｄ（ｐ６６）サブユニットから、ＰＲによるｐ６６のＣ末端１５ｋｄ  ＲＮａｓｅＨドメインのタンパク質分解による除去によって生じる（図４を参照）。ＨＩＶ‐１  ＲＴの結晶構造は、ｐ６６サブユニットおよびｐ５１サブユニットの配向が大きく異なっている極めて非対称的なフォールディングを示している。ｐ６６サブユニットは右手として視覚化することが可能であり、手のひらの内部にポリメラーゼ活性部位を、かつ手のひら、指、および親指のサブドメインによって形成された鋳型結合性の深い裂溝を備えている。ポリメラーゼドメインは接続サブドメインによってＲＮａｓｅＨに連結される。手のひらに位置する活性部位は、近接した３つの重要なＡｓｐ残基（１１０、１８５および１８６）と、２つの配位されたＭｇ２＋イオンとを含有している。これらのＡｓｐ残基の突然変異はＲＴの重合活性を消失させる。３つの活性部位Ａｓｐ残基の配向は、他のＤＮＡポリメラーゼ（例えば大腸菌のＤＮＡ  ｐｏｌＩのクレノウ・フラグメント）で観察されるものと同様である。ｐ５１サブユニットは剛性のようであり、重合用の裂溝を形成せず、このサブユニットのＡｓｐ１１０、１８５および１８６は分子内部に埋まっている。プライマー‐鋳型二重鎖のおよそ１８塩基対が、核酸結合性の裂溝内にあり、ポリメラーゼ活性部位からＲＮａｓｅＨドメインへと伸びている。
【００５６】
ＲＴ‐プライマー‐鋳型‐ｄＮＴＰ構造物では、プライマーの３’末端にジデオキシヌクレオチドが存在することにより、新たに入って来るｄＮＴＰに対して反応開始する直前に捕捉された触媒複合体の視覚化が可能となる。先に得られた構造物との比較から、新たなｄＮＴＰに対するプライマーの３’‐ＯＨの求核攻撃に先立って鋳型およびｄＮＴＰを捕捉するために、指サブドメインが閉じるモデルが示唆される。成長している鎖に新たなｄＮＴＰが付加された後は、指サブドメインがより大きく開いた形態をとることにより、ピロリン酸を放出し、かつＲＴが次のｄＮＴＰに結合するのを可能にすることが提唱されている。ＨＩＶ‐１  ＲＮａｓｅＨの構造もＸ線結晶構造解析によって決定されており、このドメインは大腸菌のＲＮａｓｅＨに類似の球状のフォールディングを示す。
【００５７】
インテグラーゼ
レトロウイルスの複製の卓越した特徴は、逆転写に続いて宿主細胞の染色体内にウイルスゲノムのＤＮＡコピーが挿入されることである。この組込まれたウイルスＤＮＡ（プロウイルス）は、ウイルスＲＮＡ合成のための鋳型としての役割を果たし、感染細胞が生存している間は宿主細胞ゲノムの一部として維持される。組込み能力が不完全なレトロウイルス突然変異体は一般に増殖性感染を確立できない。
【００５８】
ウイルスＤＮＡの組込みは、ＨＩＶ‐１  Ｇａｇ‐ＰｏｌポリプロテインのＣ末端部分がＰＲにより切断されて生成される３２ｋｄタンパク質であるインテグラーゼ（図４を参照）によって触媒される。
【００５９】
レトロウイルスのＩＮタンパク質は、構造的かつ機能的に異なる３つのドメインすなわち、Ｎ末端のジンクフィンガー含有ドメイン、コアドメイン、および比較的非保存的なＣ末端ドメイン、から構成されている。その溶解度が低いことから、２８８アミノ酸のＨＩＶ‐１  ＩＮタンパク質全体を結晶化することは未だ可能ではない。しかしながら、３つのドメインすべての構造がＸ線結晶構造解析またはＮＭＲ法によって独立に解明されている。トリ肉腫ウイルスのＩＮのコアドメインの結晶構造も決定済みである。Ｎ末端ドメイン（残基１〜５５）の構造はＮＭＲ分光法によって解明されたが、該ドメインはアミノ酸Ｈｉｓ‐１２、Ｈｉｓ‐１６、Ｃｙｓ‐４０、およびＣｙｓ‐４３によって配位された亜鉛を備えた４つのヘリックスから構成されている。このＮ末端ドメインの構造は、いわゆるヘリックス・ターン・ヘリックス・モチーフを含むヘリックス系ＤＮＡ結合タンパク質を連想させるが、ＨＩＶ‐１構造においては、このモチーフはダイマー形成に寄与している。当初は、難溶性であることがコアドメインの構造を解明する努力の妨げとなった。しかしながら、ＩＮの残基１８５におけるＰｈｅからＬｙｓへの変更がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの触媒活性を妨げることなく溶解度を大幅に高めることが観察された時、結晶構造解析の試みは成功した。ＨＩＶ‐１  ＩＮのコアドメイン（ＩＮ残基５０〜２１２）の各モノマーは、ヘリックスに挟まれた５本ストランドのβシートから構成されており、この構造は、ＲＮａｓｅＨおよびバクテリオファージＭｕＡトランスポサーゼを含む他のポリヌクレオチジルトランスフェラーゼに非常に類似している。高度に保存された３つの残基が、他のポリヌクレオチジルトランスフェラーゼの類似の位置に見出されており、ＨＩＶ‐１  ＩＮではこれらはＡｓｐ６４、Ａｓｐ１１６およびＧｌｕ１５２、いわゆるＤ，Ｄ‐３５‐Ｅモチーフである。これらの位置における突然変異はｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏいずれにおいてもＨＩＶ  ＩＮの機能を妨げる。トリ肉腫ウイルスおよびＨＩＶ‐１のいずれのコアドメインの結晶構造においても上記の３つのアミノ酸が近接していることは、これらの残基が、組込みプロセスの中心にあるポリヌクレオチド転移反応の触媒作用において中心的な役割を果たすという仮説を支持している。Ｃ末端ドメインの構造はＮＭＲ法によって解明済みであるが、該ドメインはＳｒｃホモロジー３（ＳＨ３）ドメインを連想させる５本ストランドのβバレルのフォールディングトポロジーをとる。最近になって、コアドメインおよびＣ末端ドメインの両方を包含しているＳＩＶおよびラウス肉腫ウイルスのＩＮタンパク質フラグメントのＸ線構造が解明された。
【００６０】
Ｅｎｖ
ＨＩＶ  Ｅｎｖ糖タンパク質はウイルスの生活環において主要な役割を果たす。該タンパク質は、ＣＤ４受容体および共受容体と相互作用する決定基を含有し、またウイルスエンベロープの脂質二重層と宿主細胞原形質膜との間の融合反応を触媒する。さらに、ＨＩＶ  Ｅｎｖ糖タンパク質は、診断薬およびワクチンのいずれの開発の観点からも重要な免疫応答を誘発するエピトープを含有している。
【００６１】
ＨＩＶ  Ｅｎｖ糖タンパク質は、単独にスプライシングされた４．３ｋｂのＶｐｕ／Ｅｎｖバイシストロン性ｍＲＮＡから合成され（図４を参照）、翻訳は粗面小胞体（ＥＲ）に結合したリボソームで行われる。１６０ｋｄポリプロテイン前駆体（ｇｐ１６０）は、成熟したＴＭ  Ｅｎｖ糖タンパク質ｇｐ４１となるように予定されているドメインの疎水性の輸送停止シグナルによって細胞膜につなぎ留められる、内在性膜タンパク質である（図６）。ｇｐ１６０は翻訳時にグリコシル化され、ジスルフィド結合を形成し、ＥＲにおいてオリゴマー化する。主なオリゴマー型はトライマーのようであるが、ダイマーおよびテトラマーも観察される。ｇｐ１６０はゴルジ体に輸送され、ゴルジ体では、他のレトロウイルスのエンベロープ前駆体タンパク質と同様に、細胞性酵素によりタンパク質分解によって切断されて、成熟したＳＵ糖タンパク質ｇｐ１２０およびＴＭ糖タンパク質ｇｐ４１となる（図６を参照）。高度に保存されたＬｙｓ／Ａｒｇ‐Ｘ‐Ｌｙｓ／Ａｒｇ‐Ａｒｇモチーフ直後のレトロウイルスＥｎｖ前駆体の切断に関与する細胞性酵素は、フーリンまたはフーリン様プロテアーゼであるが、その他の酵素がｇｐ１６０のプロセシングを触媒する場合もある。ｇｐ１６０の切断はＥｎｖ誘導型の融合活性およびウイルス感染性に必要である。ｇｐ１６０の切断に続いて、ｇｐ１２０およびｇｐ４１は、ゴルジ体から細胞表面へのＥｎｖ複合体の輸送に重要な非共有結合性会合を形成する。ｇｐ１２０‐ｇｐ４１相互作用は非常に弱く、相当量のｇｐ１２０が、Ｅｎｖを発現している細胞の表面から流される。
【００６２】
ＨＩＶ  Ｅｎｖ糖タンパク質複合体、特にＳＵ（ｇｐ１２０）ドメイン）は、非常に強くグリコシル化されており、ｇｐ１６０の分子量のおよそ半分はオリゴ糖側鎖で構成されている。ＥＲ内のＥｎｖ合成部位から原形質膜までのＥｎｖの輸送中に、側鎖の多くが複合糖類の付加によって修飾される。多数のオリゴ糖側鎖は、宿主の免疫認識からｇｐ１２０の大部分を遮る糖の雲として想像できるようなものを形成する。図６に示されるように、ｇｐ１２０は、散在する保存された（Ｃ１〜Ｃ５）ドメインおよび可変（Ｖ１〜Ｖ５）ドメインを含有している。様々な単離物のｇｐ１２０に存在するシステイン残基は高度に保存されており、大きなループの中の最初の４つの可変領域を連結するジスルフィド結合を形成する。
【００６３】
ウイルスのＥｎｖ糖タンパク質の主要な機能は、ウイルスエンベロープの脂質二重層と宿主細胞の細胞膜との間の膜融合反応を促進することである。この膜融合事象はウイルスのコアが宿主細胞の細胞質内に入り込むのを可能にする。ｇｐ１２０およびｇｐ４１の両方の多くの領域が、Ｅｎｖを介した膜融合に直接または間接的に関与するとされてきた。オルトミクソウイルスのＨＡ２ヘマグルチニンタンパク質およびパラミクソウイルスのＦタンパク質に関する研究から、これらのタンパク質のＮ末端の高疎水性ドメインは、融合ペプチドと呼ばれ、膜融合に重大な役割を果たすことが示された。突然変異解析は、ＨＩＶ‐１、ＨＩＶ‐２およびＳＩＶのＴＭ糖タンパク質のＮ末端に相似ドメインがあることを実証した（図６を参照）。ｇｐ４１のこの領域内の非疎水性置換はシンシチウム形成を大幅に低減または阻害し、その結果非感染性の子孫ビリオンを生じた。
【００６４】
ｇｐ４１融合ペプチドのＣ末端側は、膜融合において中心的な役割を果たす２つの両親媒性へリックスドメインである（図６を参照）。Ｌｅｕジッパー様の７アミノ酸繰り返しモチーフを含有するＮ末端へリックス（Ｎ‐へリックスと呼ばれる）における突然変異は、感染性および膜融合活性を低下させ、これらの配列に由来するペプチドは培養物中で強力な抗ウイルス活性を示す。ＨＩＶ‐１およびＳＩＶのｇｐ４１のエクトドメインの構造、特に２つのへリックスモチーフは、近年の構造分析の中心となってきた。へリックスドメインを含有する融合タンパク質、Ｎ‐ヘリックスおよびＣ‐ヘリックスに由来するペプチドの混合物、または、ＳＩＶ構造の場合には残基２７〜１４９の完全なｇｐ４１エクトドメイン配列、のいずれかについて、Ｘ線結晶構造解析またはＮＭＲ分光法により構造が決定された。これらの研究からは、基本的に同様のトライマー構造であって２つのヘリックスドメインが逆平行方式でパッキングされて６ヘリックス束を生成している構造が得られた。Ｎ‐へリックスは該ヘリックス束の中心にコイルドコイルを形成するとともに、Ｃ‐へリックスは外側の疎水性の溝の中にパッキングされる。
【００６５】
膜融合をもたらすステップでは、ＣＤ４の結合がＥｎｖの立体配座変化を引き起こし、該変化が共受容体の結合を促進する。ｇｐ１２０／ＣＤ４／共受容体三重複合体の形成に続いて、ｇｐ４１は、融合ペプチドが標的の脂質二重層内に挿入されるのを可能にする仮説上の立体配座をとる。ｇｐ４１の６ヘリックス束（ｇｐ４１のＮ‐ヘリックスとＣ‐ヘリックスとの間の逆平行相互作用を伴っている）の形成はウイルスおよび細胞の膜を結び付け、膜融合が生じる。
【００６６】
さらに、本発明による治療面から見て興味深い遺伝子は、増殖性疾患、がんまたは代謝疾患に対して治療効果を有する疾患関連遺伝子も含む。例えば、がんに関する治療面から見て興味深い遺伝子とは、特異的な抗がん性免疫反応を誘導する能力を有するがん抗原であることが考えられる。
【００６７】
本発明のさらなる実施形態によれば、異種核酸配列は少なくとも１つのマーカー遺伝子または選択遺伝子を含む。
選択遺伝子は、細胞に対して特定の耐性を形質導入することにより、ある種の淘汰法が可能となる。当業者は、ポックスウイルスの系において使用可能な様々な選択遺伝子に精通している。その中には、例えばネオマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴ）またはホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）がある。
【００６８】
マーカー遺伝子は、形質導入細胞において発色反応を引き起こし、該反応は形質導入細胞を同定するために使用することができる。当業者は、ポックスウイルスの系において使用可能な様々なマーカー遺伝子に精通している。その中には、例えばβ‐ガラクトシダーゼ（β‐ｇａｌ）、β‐グルコシダーゼ（β‐ｇｌｕ）、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、または青色蛍光タンパク質をコードする遺伝子がある。
【００６９】
本発明のさらに別の実施形態によれば、異種核酸配列は、ポックスウイルスの転写制御要素および／または異種核酸配列中のコード配列を、隣り合うＯＲＦの終止コドンおよび／または開始コドンから隔てる、スペーシング配列を含む。隣り合うＯＲＦの終止／開始コドンと異種核酸配列中の挿入コード配列との間のこのスペーサー配列は、挿入された異種核酸配列を、したがって得られる任意の組換えウイルスを、安定化するという長所を有する。スペーサー配列のサイズは、該配列がそれ自体のコード機能または制御機能を持たない限り、様々であってよい。
【００７０】
さらなる実施形態によれば、ポックスウイルスの転写制御要素および／または異種核酸配列中のコード配列を隣り合うＯＲＦの終止コドンから隔てるスペーサー配列は、少なくとも１ヌクレオチドの長さである。
【００７１】
本発明の別の実施形態によれば、ポックスウイルスの転写制御要素および／または異種核酸配列中のコード配列を隣り合うＯＲＦの開始コドンから隔てるスペーシング配列は、少なくとも３０ヌクレオチドである。特に、典型的なワクシニアウイルスのプロモーター要素が開始コドンの上流に確認される場合、異種核酸配列の挿入は、該プロモーター要素を隣り合うＯＲＦの開始コドンから隔てることができない可能性がある。典型的なワクシニアプロモーター要素は、例えば後期プロモーターについては配列「ＴＡＡＡＴ」（デービソン（Davison）およびモス（Moss）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー誌（J. Mol. Biol.）、１９８９年、第２１０巻、ｐ．７７１−７８４）および早期プロモーターについてはＡ／Ｔリッチドメインを精査することにより同定可能である。約３０ヌクレオチドのスペーシング配列は、ＯＲＦの開始コドンの上流に位置するポックスウイルスのプロモーターが影響を受けないことを確実にする、好ましい距離である。加えて、さらに好ましい実施形態によれば、挿入された異種核酸配列と隣り合うＯＲＦの開始コドンとの間の距離は約５０ヌクレオチド、より好ましくは１００ヌクレオチドである。
【００７２】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、スペーシング配列は、隣りのＯＲＦの転写を制御することができる追加のポックスウイルス転写制御要素を含む。
ここまで、本開示は親ＭＶＡウイルス中で隣り合っているＯＲＦを使用した組換えＭＶＡウイルスに注目してきた。しかしながら、本発明はさらに、組換えウイルス、およびそのようなウイルスを作製する方法であって、異種核酸配列が隣り合った必須ＯＲＦ技術の間に挿入され、挿入に使用されるＯＲｆは親ＭＶＡウイルス中で隣り合っていないものも含む。すなわち、ウイルスは、組換えＭＶＡウイルスにおいて隣り合っているＯＲＦが親ＭＶＡウイルス中では１つ以上のポックスウイルスＯＲＦ（介在ＯＲＦ）によって隔てられているように、構築可能である。本明細書中で使用されるように、親ＭＶＡウイルスとは、子孫の組換えウイルスが構築される元のウイルスである。親ＭＶＡウイルスの一例は、ＭＶＡ  １９７４／ＮＩＨクローン１である。親ウイルスを使用して、本明細書中に開示された技術を使用して組換えウイルスを構築し、構築プロセスの間に介在ＯＲＦが除去可能であるようにすることができる。ポックスウイルス分野の当業者には当然のことであるが、注意深く選択されたポックスウイルスＯＲＦを含む核酸分子を使用することにより、それら２つのＯＲＦの間のウイルスゲノムの一部を、相同組換えのプロセスを通じて欠失させることが可能である。例えば、非必須ＯＲＦを含有している１キロベースのゲノム領域によって２つの必須ＯＲＦが隔てられていることを前提として、その２つの必須ＯＲＦが、例えばプラスミド内で隣り合うようにクローニングされた核酸構築物を作製可能である。該核酸構築物がポックスウイルス感染細胞（例えば親ＭＶＡウイルス感染細胞）に導入されると、必須ＯＲＦは親ウイルスのウイルスゲノム中の対応するＯＲＦとの組換えを行うことになる。当業者には理解されるさらなる組換え事象を通して、１キロベースの領域はウイルスゲノムから切除され、その結果２つの必須ＯＲＦが隣り合うようになる。したがって、本発明の１つの実施形態は、ＭＶＡウイルスゲノム由来の２つの隣り合った必須ＯＲＦの間に位置する異種核酸配列を含む組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、親ＭＶＡウイルス中の対応する必須ＯＲＦの間に存在する非必須ＯＲＦを欠くことを特徴とする組換えＭＶＡウイルスである。したがって、異種核酸配列は、親ＭＶＡウイルス中においては隣り合っていない必須ＯＲＦによって挟まれている。必須ＯＲＦは、非必須ＯＲＦによって隔てられた、ＭＶＡゲノム中に存在する必須ＯＲＦ対から選択される。一実施形態では、必須ＯＲＦは、Ａ５０Ｒ（ＭＶＡ１６３）、Ｂ１Ｒ（ＭＶＡ１６７）、Ｆ１０（ＭＶＡ‐０３９）、Ｆ１２（ＭＶＡ０４２）、Ｆ１３Ｌ（ＭＶＡ０４３）、Ｆ１５Ｌ（ＭＶＡ０４５）、Ｆ１７Ｌ（ＭＶＡ０４７）、Ｅ４Ｌ（ＭＶＡ０５１）、Ｅ６Ｌ（ＭＶＡ０５３）、Ｅ８Ｌ（ＭＶＡ０５５）、Ｅ１０Ｌ（ＭＶＡ０５７）、Ｉ１Ｌ（ＭＶＡ０６２）、Ｉ３Ｌ（ＭＶＡ０６４）、Ｉ５Ｌ（ＭＶＡ０６６）、Ｊ１Ｒ（ＭＶＡ０８５）、Ｊ３Ｒ（ＭＶＡ０８７）、Ｄ７Ｌ（ＭＶＡ１０４）、Ｄ９Ｌ（ＭＶＡ１０６）、Ａ２４Ｒ（ＭＶＡ１３５）、およびＡ２８Ｒ（ＭＶＡ１３９）からなる群から選択される。一実施形態では、２つの必須ＯＲＦは、Ａ５０Ｒ‐Ｂ１Ｒ（ＭＶＡ１６３‐ＭＶＡ１６７）���Ｆ１０‐Ｆ１２（ＭＶＡ０３９‐ＭＶＡ０４２）、Ｆ１３Ｌ‐Ｆ１５Ｌ（ＭＶＡ０４３‐ＭＶＡ０４５）、Ｆ１５Ｌ‐Ｆ１７Ｌ（ＭＶＡ０４５‐ＭＶＡ０４７）、Ｅ４Ｌ‐Ｅ６Ｌ（ＭＶＡ０５１‐ＭＶＡ０５３）、Ｅ６Ｌ‐Ｅ８Ｌ（ＭＶＡ０５３‐ＭＶＡ０５５）、Ｅ１０Ｌ‐Ｉ１Ｌ（ＭＶＡ０５７‐ＭＶＡ０６２）、Ｉ３Ｌ‐Ｉ５Ｌ（ＭＶＡ０６４‐ＭＶＡ０６６）、Ｊ１Ｒ‐Ｊ３Ｒ（ＭＶＡ０８５‐ＭＶＡ０８７）、Ｄ７Ｌ‐Ｄ９Ｌ（ＭＶＡ１０４‐ＭＶＡ１０６）、およびＡ２４Ｒ‐Ａ２８Ｒ（ＭＶＡ１３５‐ＭＶＡ１３９）からなる群の中の必須ＯＲＦ対から選択される。一実施形態では、必須ＯＲＦはＡ５０Ｒ（ＭＶＡ１６３）およびＢ１Ｒ（ＭＶＡ１６７）から選択される。一実施形態では、一方の必須ＯＲＦはＡ５０Ｒ（ＭＶＡ１６３）であり、他方の必須ＯＲＦはＢ１Ｒ（ＭＶＡ１６７）である。
【００７３】
先に議論されたように、細胞培養物中での大規模な継代の結果、ＭＶＡウイルスゲノムは、Ｄｅｌ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩと呼ばれる６つの主な欠失を含有している。歴史的には、およそ３１，０００ヌクレオチドの欠失であるＤｅｌ  ＩＩＩ周辺の領域が異種核酸配列の挿入に使用されてきた。したがって、本発明の１つの実施形態では、組換えＭＶＡウイルスの構築の際に欠失させられる非必須ＯＲＦは、野生型ＭＶＡウイルス中でＤｅｌ  ＩＩＩ領域に隣接している。
【００７４】
説明してきたように、組換えＭＶＡウイルスは、２つの隣り合った必須ＯＲＦの間に、ＩＧＲおよび／または異種核酸配列のような追加の配列を含有することができる。そのような配列は本明細書中に記載されている。したがって、本発明の１つの実施形態は、ＭＶＡウイルスゲノム由来の２つの隣り合った必須ＯＲＦの間に位置する異種核酸配列を含む組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、親ＭＶＡウイルス中の対応する必須ＯＲＦの間に存在する非必須ＯＲＦを欠くこと、および異種核酸配列がＩＧＲに挿入されていることを特徴とする組換えＭＶＡウイルスである。本開示において別記されているように、異種核酸配列は、転写制御要素に制御されるコード配列を含有することができる。
【００７５】
本発明者らは特定の必須ＯＲＦおよびその配列について開示してきたが、本発明は、開示されたＯＲＦの一部またはバリアントを使用する組換えＭＶＡウイルスおよび該組換えＭＶＡウイルスを作製する方法も含む。例えば、本発明はＯＲＦ  Ａ５０Ｒおよびその一部（配列番号１１および配列番号１４）、ならびにＯＲＦ  Ｂ１Ｒおよびその一部（配列番号１６および配列番号１９）を開示しているが、本発明は、これらの配列のバリアントを含む組換えＭＶＡウイルスを、そのバリアントＯＲＦが対応する野生型ＯＲＦによってコードされるタンパク質とほぼ同じ機能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、含む。２つのタンパク質は、それぞれのタンパク質を含むＭＶＡウイルスが、同じ細胞株を使用して増殖させたとき互いに対して約１０％、約２０％、約３０％または約４０％以内の力価を生じる場合に、ほぼ同じ機能を有すると見なされる。したがって、本発明の１つの実施形態は、２つの隣り合うＯＲＦの間に位置する異種核酸配列を含む組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、該隣り合うＯＲＦはＭＶＡ由来の必須ＯＲＦと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。一実施形態では、隣り合うＯＲＦは、Ａ５０Ｒ（ＭＶＡ１６３）、Ｂ１Ｒ（ＭＶＡ１６７）、Ｆ１０（ＭＶＡ‐０３９）、Ｆ１２（ＭＶＡ０４２）、Ｆ１３Ｌ（ＭＶＡ０４３）、Ｆ１５Ｌ（ＭＶＡ０４５）、Ｆ１７Ｌ（ＭＶＡ０４７）、Ｅ４Ｌ（ＭＶＡ０５１）、Ｅ６Ｌ（ＭＶＡ０５３）、Ｅ８Ｌ（ＭＶＡ０５５）、Ｅ１０Ｌ（ＭＶＡ０５７）、Ｉ１Ｌ（ＭＶＡ０６２）、Ｉ３Ｌ（ＭＶＡ０６４）、Ｉ５Ｌ（ＭＶＡ０６６）、Ｊ１Ｒ（ＭＶＡ０８５）、Ｊ３Ｒ（ＭＶＡ０８７）、Ｄ７Ｌ（ＭＶＡ１０４）、Ｄ９Ｌ（ＭＶＡ１０６）、Ａ２４Ｒ（ＭＶＡ１３５）、およびＡ２８Ｒ（ＭＶＡ１３９）からなる群から選択された必須ＯＲＦに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、２つの隣り合うＯＲｆは同じ必須ＯＲＦに由来するものではない。一実施形態では、２つの隣り合うＯＲＦは、Ａ５０Ｒ‐Ｂ１Ｒ（ＭＶＡ１６３‐ＭＶＡ１６７）、Ｆ１０‐Ｆ１２（ＭＶＡ０３９‐ＭＶＡ０４２）、Ｆ１３Ｌ‐Ｆ１５Ｌ（ＭＶＡ０４３‐ＭＶＡ０４５）、Ｆ１５Ｌ‐Ｆ１７Ｌ（ＭＶＡ０４５‐ＭＶＡ０４７）、Ｅ４Ｌ‐Ｅ６Ｌ（ＭＶＡ０５１‐ＭＶＡ０５３）、Ｅ６Ｌ‐Ｅ８Ｌ（ＭＶＡ０５３‐ＭＶＡ０５５）、Ｅ１０Ｌ‐Ｉ１Ｌ（ＭＶＡ０５７‐ＭＶＡ０６２）、Ｉ３Ｌ‐Ｉ５Ｌ（ＭＶＡ０６４‐ＭＶＡ０６６）、Ｊ１Ｒ‐Ｊ３Ｒ（ＭＶＡ０８５‐ＭＶＡ０８７）、Ｄ７Ｌ‐Ｄ９Ｌ（ＭＶＡ１０４‐ＭＶＡ１０６）、およびＡ２４Ｒ‐Ａ２８Ｒ（ＭＶＡ１３５‐ＭＶＡ１３９）からなる群の必須ＯＲＦ対と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、一方の隣り合うＯＲＦは配列番号Ａ５０Ｒ（ＭＶＡ１６３）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性の��クレオチド配列を含み、他方の隣り合うＯＲＦは、第２の必須ＯＲＦと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、一方の隣り合うＯＲＦは配列番号Ｂ１Ｒと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性のヌクレオチド配列を含む。
【００７６】
本発明はさらに、本発明の組換えウイルスを生産するのに有用な核酸構築物も開示する。本明細書中で使用されるように、核酸構築物は、ＭＶＡウイルス由来の少なくとも１つの必須ＯＲＦの少なくとも一部を含む組換え核酸分子である。該核酸構築物は、環境内、例えば限定するものではないが生物体内、組織内、または細胞培養物中の細胞への、有用な核酸配列の輸送を可能にする。本開示の核酸構築物はヒトの介在によって生産される。該核酸構築物は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのバリアントであってよい。核酸分子は、直鎖ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、ウイルスベクター、またはその他のベクターであってよい。一実施形態では、核酸分子はＤＮＡプラスミドであってよい。一実施形態では、核酸分子は、ウイルス成分、プラスミド成分、転写制御要素、ならびに核酸分子の送達および発現を可能にする当業者に周知の任意のその他の有用な要素を含むＤＮＡプラスミドであってよい。組換え核酸分子の一般的な構築のための方法は良く知られている。例えば、サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: a Laboratory Manual）」第３版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、２００１年、およびオースベル（Ausubel）ら編、「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）、１９９４年を参照されたい。
【００７７】
本発明の１つの実施形態は、単離された核酸構築物であって、（ａ）改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスゲノム由来の第１の必須ＯＲＦに由来するかまたは該ＯＲＦに相同な第１の核酸配列と、（ｂ）ＭＶＡウイルスゲノム由来の第２の必須ＯＲＦに由来するかまたは該ＯＲＦに相同な第２の核酸配列とを含み、第１および第２の必須ＭＶＡウイルスＯＲＦは、ＭＶＡウイルスゲノム中では少なくとも１つの非必須ＯＲＦによって隔てられていることと、第１および第２の核酸配列は単離された核酸構築物中では互いに隣り合っていることと、第１および第２の核酸配列は、それぞれ第１および第２の必須ＭＶＡ  ＯＲＦ由来の少なくとも２５個連続したヌクレオチドを含むことと、を特徴とする。そのような核酸構築物は、相同組換えのプロセスを通じて組換えＭＶＡウイルスを構築するのに有用である。このプロセスを使用して、本発明の単離された核酸構築物は、親ＭＶＡウイルスにおいては隣り合っていない（すなわち他の非必須ＭＶＡ  ＯＲＦによって隔てられている）ＯＲＦが、子孫である組換えＭＶＡウイルスにおいては隣り合わせにされる組換えＭＶＡウイルスを構築するために使用可能である。これは、例えば、親ＭＶＡウイルス由来の隣り合っていないＯＲＦをプラスミドのような核酸分子中へクローニングし、かつその間にある非必須ＯＲＦのクローニングは伴わないことにより、行うことができる。こうして、隣り合っていないＯＲＦは核酸構築物中で隣り合わせにされる。説明してきたように、ＭＶＡウイルスゲノムの中にそのような核酸構築物を組み換えることにより、間に存在する親ＭＶＡウイルス由来の非必須ＯＲＦの欠失がもたらされ、その結果として、もとは隣り合っていないＯＲＦが隣り合っている子孫組換えＭＶＡウイルスが生じることになる。したがって、好ましい実施形態では、第１および第２の核酸配列は、親ＭＶＡウイルスにおいては隣り合っていない第１および第２の必須ＭＶＡ  ＯＲＦにそれぞれ由来するかまたは該ＯＲＦと相同である。すなわち、第１および第２の必須ＯＲＦは、親ＭＶＡウイルスゲノム中では少なくとも１つの非必須ＯＲＦによって隔てられている。
【００７８】
本明細書中で使用されるように、「〜に由来する」という語句は、その核酸配列が得られた起源の核酸（すなわちＯＲＦ）を指す。したがって、この点では、核酸配列は起源となるＯＲＦの全部または一部と同一であってよい。しかしながら、核酸配列は起源となるＯＲＦとは配列が異なっていてもよい。したがって、ＭＶＡ  ＯＲＦに由来する核酸配列は、得られた核酸配列において元のＯＲＦの機能が維持される限り、ＭＶＡ  ＯＲＦの全部（または一部）と配列が同一であっても同一でなくてもよい。例えば、当分野では当然のことであるが、ポックスウイルスの近縁種の核酸分子は、そのような分子の配列が同一でなくても、組換えを起こすことができる。したがって、本発明の１つの実施形態では、第１および第２の核酸配列は、該核酸配列の由来する元の必須ＭＶＡ  ＯＲＦとの十分な配列同一性を有し、第１または第２の核酸配列を含む核酸分子と、そのような配列の由来する元の必須ＭＶＡ  ＯＲＦを含む核酸分子との間の相同組換えを可能にする。一実施形態では、第１および第２の核酸配列は、該核酸配列の由来する元の必須ＭＶＡ  ＯＲＦの少なくとも一部に対して、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％同一である。一実施形態では、核酸配列は、該核酸配列の由来する元の必須ＭＶＡ  ＯＲＦの少なくとも一部と同一である。
【００７９】
同様に当分野では当然のことであるが、小さなポリヌクレオチド分子でも相同組換えの過程に関与することができる。従って、本発明の核酸構築物中に存在する核酸配列は、該核酸構築物がＭＶＡウイルスゲノム中への組換えを生じうるために必須ＭＶＡ  ＯＲＦの全配列を含む必要はない。実際、長さ２０塩基相応の小さなポックスウイルスゲノムのフラグメントが、ウイルスゲノム中のそれぞれの配列との相同組換えに関与することが可能であることが示されている。したがって、本発明の１つの実施形態では、第１および第２の核酸配列は、必須ＭＶＡ  ＯＲＦからの２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、または３００ヌクレオチドを含むことができる。本発明の１つの実施形態は、単離された核酸構築物であって、（ａ）第１の必須ＭＶＡ  ＯＲＦからの少なくとも２５個連続したヌクレオチドを含む第１の核酸配列と、（ｂ）第２の必須ＭＶＡ  ＯＲＦからの少なくとも２５個連続したヌクレオチドを含む第２の核酸配列とを含み、第１および第２の必須ＭＶＡウイルスＯＲＦは、ＭＶＡウイルスゲノム中では少なくとも１つの非必須ＯＲＦによって隔てられていること、ならびに第１および第２の核酸配列は単離された核酸構築物中では互いに隣り合っていることを特徴とする。一実施形態では、第１の核酸配列は、Ａ５０Ｒ（ＭＶＡ１６３）、Ｂ１Ｒ（ＭＶＡ１６７）、Ｆ１０（ＭＶＡ‐０３９）、Ｆ１２（ＭＶＡ０４２）、Ｆ１３Ｌ（ＭＶＡ０４３）、Ｆ１５Ｌ（ＭＶＡ０４５）、Ｆ１７Ｌ（ＭＶＡ０４７）、Ｅ４Ｌ（ＭＶＡ０５１）、Ｅ６Ｌ（ＭＶＡ０５３）、Ｅ８Ｌ（ＭＶＡ０５５）、Ｅ１０Ｌ（ＭＶＡ０５７）、Ｉ１Ｌ（ＭＶＡ０６２）、Ｉ３Ｌ（ＭＶＡ０６４）、Ｉ５Ｌ（ＭＶＡ０６６）、Ｊ１Ｒ（ＭＶＡ０８５）、Ｊ３Ｒ（ＭＶＡ０８７）、Ｄ７Ｌ（ＭＶＡ１０４）、Ｄ９Ｌ（ＭＶＡ１０６）、Ａ２４Ｒ（ＭＶＡ１３５）、およびＡ２８Ｒ（ＭＶＡ１３９）からなる群から選択された必須ＯＲＦからの２５個連続したヌクレオチドを含む。一実施形態では、第２の核酸配列は、Ａ５０Ｒ（ＭＶＡ１６３）、Ｂ１Ｒ（ＭＶＡ１６７）、Ｆ１０（ＭＶＡ‐０３９）、Ｆ１２（ＭＶＡ０４２）、Ｆ１３Ｌ（ＭＶＡ０４３）、Ｆ１５Ｌ（ＭＶＡ０４５）、Ｆ１７Ｌ（ＭＶＡ０４７）、Ｅ４Ｌ（ＭＶＡ０５１）、Ｅ６Ｌ（ＭＶＡ０５３）、Ｅ８Ｌ（ＭＶＡ０５５）、Ｅ１０Ｌ（ＭＶＡ０５７）、Ｉ１Ｌ（ＭＶＡ０６２）、Ｉ３Ｌ（ＭＶＡ０６４）、Ｉ５Ｌ（ＭＶＡ０６６）、Ｊ１Ｒ（ＭＶＡ０８５）、Ｊ３Ｒ（ＭＶＡ０８７）、Ｄ７Ｌ（ＭＶＡ１０４）、Ｄ９Ｌ（ＭＶＡ１０６）、Ａ２４Ｒ（ＭＶＡ１３５）、およびＡ２８Ｒ（ＭＶＡ１３９）からなる群から選択された必須ＯＲＦからの２５個連続したヌクレオチドを含む。一実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号１１または配列番号１４からの少なくとも２５個連続したヌクレオチドを含み、第２の核酸配列は、配列番号１６または配列番号１９からの少なくとも２５個連続したヌクレオチドを含む。
【００８０】
本発明の核酸構築物は、ＭＶＡウイルスのゲノムに異種核酸配列を送達するために使用される。したがって、一実施形態、本発明の核酸構築物は、第１および第２の核酸配列の間に異種核酸分子を含む。典型的な異種核酸配列は本開示において別記されている。本明細書中に開示されたいずれの異種核酸配列も本発明の核酸構築物に含めるのに適している。
【００８１】
本発明の核酸構築物は親ＭＶＡウイルスのゲノムと組換えを行うことができるので、ウイルスゲノムに異種核酸配列を挿入するために使用可能である。したがって、本発明の１つの実施形態では、本発明の核酸コントラスト（nucleic acid contrast）は、第１および第２の核酸配列の間に遺伝子間領域を含有している。遺伝子間領域は、転写制御要素、制限部位および非ワクシニアのオープンリーディングフレームのようなものを含むことができる。したがって、遺伝子間領域は転写制御要素に制御される遺伝子を含む異種核酸配列を挿入するために使用可能である。核酸構築物がＭＶＡウイルスゲノムとの組換えを行うと、異種核酸配列は、ＭＶＡウイルスゲノム中の、核酸構築物中において該核酸配列を挟んでいる２つの隣り合った必須ＯＲＦに対応する必須ＯＲＦの間に、挿入されることになる。得られるＭＶＡウイルスは、ＭＶＡウイルスゲノム中に安定的に組み込まれた異種核酸配列を含有している組換えＭＶＡウイルスとなる。
【００８２】
一実施形態では、本発明の核酸構築物は、ウイルスゲノムの２つの隣り合ったＯＲＦの間に位置するＩＧＲ配列の完全長フラグメントまたは部分フラグメントを含む。好ましくは、核酸構築物は、前記ＩＧＲに由来する配列中に挿入された少なくとも１つのクローニング部位であって、対象とする異種ＤＮＡ配列を挿入するための、および好ましくは前記異種ＤＮＡ配列に作動可能に連結されたポックスウイルス転写制御要素を挿入するための、クローニング部位を含む。任意選択で、核酸構築物はレポーター遺伝子カセットおよび／または選択遺伝子カセットを含む。核酸構築物は、好ましくは、ＩＧＲ配列の前記完全長フラグメントまたは部分フラグメントに隣接している２つの隣り合ったＯＲＦの配列も含む。
【００８３】
ヌクレオチド配列を含まないいくつかのＩＧＲが同定されている。これらの場合、プラスミドベクターは、ＩＧＲに隣接している配列のＤＮＡ配列（すなわち２つの隣り合ったＯＲＦのＤＮＡ配列）を含む。好ましくは、異種ＤＮＡ配列の挿入用のクローニング部位がＩＧＲに挿入される。ＩＧＲに隣接している配列のＤＮＡは、ＭＶＡゲノムの対応するＩＧＲ中へ外来ＤＮＡ配列を挿入するために使用される。そのようなプラスミドベクターは、異種ＤＮＡ配列と、任意選択でレポーター遺伝子カセットおよび／または選択遺伝子カセットとを挿入するためのクローニング部位を含むＩＧＲ配列の完全長フラグメントまたは部分フラグメントをさらに含むことができる。
【００８４】
本発明の一実施形態は、安定な組換え改変ワクシニアアンカラウイルスを作製する方法である。そのような方法は、本明細書中に開示された核酸構築物を使用する。したがって該方法は、第１に、ＭＶＡウイルスゲノムの２つの隣り合った必須オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の間にあるかまたは該ＯＲＦに挟まれた異種核酸配列を含む核酸構築物を得る工程を含み、該ＭＶＡウイルスは、親のＭＶＡウイルス中の対応する２つの必須ＯＲＦの間に存在する非必須ＯＲＦまたはＯＲＦフラグメントを欠いている。例えば、適切な核酸構築物を得るために、必須ＭＶＡ  ＯＲＦの核酸配列が単離されてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（Stratagene））のような標準的なクローニングベクターにクローニングされ、該核酸配列がＭＶＡゲノムに挿入されるべき異種ＤＮＡに隣接するようにされてもよい。その後、この構築物は、当業者に周知の方法（例えばトランスフェクション）を使用して細胞に導入可能である。該核酸構築物を含有している細胞はその後ＭＶＡウイルスに感染させられ、核酸構築物とＭＶＡウイルスゲノムとの間の相同組換えを可能にするのに適した条件下で培養される。その後適切な時期に細胞が採取され、組換えＭＶＡウイルスが単離される。得られたウイルスは安定な組換えＭＶＡウイルスとなる。そのようなウイルスは誘導体ウイルスと呼ばれる場合もある。当然ながら、核酸構築物を細胞に導入するステップおよび該細胞を感染せしめるステップの順序は逆にされてもよいし、これら２つのステップが同時に行われてもよい。
【００８５】
核酸構築物中の異種核酸配列をＭＶＡゲノムに導入する一般的な方法および組換えＭＶＡを得る方法は当業者にはよく知られており、さらに、Ｊ．サムブルック（Sambrook）、Ｅ．Ｆ．フリッシュ（Fritsch）およびＴ．マニアティス（Maniatis）、「分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: a Laboratory Manual）」第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年、ならびに「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（John Wiley and Sons Inc.）、１９９８年、第１６章第ＩＶ節「ワクシニアウイルスベクターを使用する哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現（Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vectors）」、から導き出すことが可能である。
【００８６】
本発明によるＤＮＡ配列は、本発明によるＭＶＡまたはその誘導体、および本発明によるＭＶＡに感染した細胞または個体を、同定または単離するために使用可能である。該ＤＮＡ配列は、例えば、ＰＣＲプライマー、ハイブリダイゼーションプローブを生成するために使用され、またはアレイ技術において使用される。
【００８７】
本発明による誘導体ウイルスなどの用語は、親ウイルスと同じ特長を示すがそのゲノムの１つ以上の部分において違いを示す子孫ウイルスを指す。用語「ＭＶＡの誘導体」は、ＭＶＡと同じ機能持性を有するウイルスについて述べている。例えば、ＭＶＡ  １９７４／ＮＩＨクローン１の誘導体は、ＭＶＡ  １９７４／ＮＩＨクローン１の特長を有する。ＭＶＡ  １９７４／ＮＩＨクローン１またはその誘導体のこれらの持性のうちの１つは、その弱毒化および宿主域の厳格な制限である。
【００８８】
本発明による組換えＭＶＡは医薬品またはワクチンとして有用である。したがって、本発明の一実施形態は、本発明の組換えＭＶＡウイルスを使用して個体を疾患から防御する方法である。
【００８９】
本発明の組換えＭＶＡウイルスは標的細胞内への外来コード配列の導入に使用することも可能であり、前記配列は標的細胞のゲノムに対して同種であっても異種であってもよい。標的細胞内への外来コード配列の導入は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗原または抗原エピトープを生産するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われてもよい。この方法は、本発明の組換えＭＶＡを用いた宿主細胞の感染、適切な条件下での感染宿主細胞の培養、ならびに、前記宿主細胞によって生産されるポリペプチド、ペプチド、タンパク質、抗原、エピトープおよび／またはウイルスの単離および／または濃縮を含む。
【００９０】
さらに、細胞内に１つ以上の同種配列または１つ以上の異種配列を導入するための方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの治療法に適用可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの治療法については、本発明による組換えＭＶＡに前もって（ｅｘ  ｖｉｖｏで）感染させられた単離細胞が、免疫応答に影響を及ぼすため、好ましくは免疫応答を引き起こすために、生きている動物の身体に投与される。ｉｎ  ｖｉｖｏの治療法については、本発明による組換えポックスウイルスは、免疫応答に影響を及ぼすため、好ましくは免疫応答を引き起こすために、生きている動物の身体に直接投与される。この場合、接種部位の周囲の細胞、またウイルスが輸送されるのに介在した場所の、例えば血流の細胞も、ｉｎ  ｖｉｖｏで本発明の組換えＭＶＡに直接感染する。感染後、これらの細胞は、外来コード配列によってコードされている治療遺伝子のタンパク質、ペプチドまたは抗原エピトープを合成し、続いて、それらまたはその一部を細胞表面上に提示する。免疫系の特殊化した細胞は、そのような異種のタンパク質、ペプチドまたはエピトープの提示を認識し、特異的免疫応答を開始する。
【００９１】
ＭＶＡは増殖が高度に制限されており、従って高度に弱毒化されているので、ヒトを含む様々な哺乳動物（免疫力が低下した動物またはヒトを含む）の治療に有用である。本発明はさらに、ヒトを含む生きている動物の身体において免疫応答を引き起こすための医薬組成物およびワクチンを提供する。
【００９２】
医薬組成物は一般に、１つ以上の、医薬として許容可能であるかまたは認可されている担体、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤および／または安定化剤を含むことができる。そのような補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝物質、または同様のものであってよい。適切な担体は、典型的には大型で徐々に代謝される分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸重合体、アミノ酸共重合体、脂質凝集体（lipid aggregate）などである。
【００９３】
ワクチンの調製については、本発明の組換えポックスウイルスは生理学的に許容可能な形態に変換される。これは、天然痘に対するワクチン接種に使用されたポックスウイルス・ワクチン剤の調製における経験（スティックル（Stickl）、Ｈ．ら、ドイチェ・メディツィニッシェ・ボーヘンシュリフト誌（Dtsch Med Wochenschr.）、１９７４年、第９９巻、ｐ．２３８６−２３９２）に基づいて行うことができる。例えば、精製されたウイルスは、約１０ｍＭ  トリス、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中で５×１０Ｅ８  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価に製剤化されて−８０℃に保存される。ワクチン注射剤の調製については、例えば、１０Ｅ２−１０Ｅ８のウイルス粒子が、アンプル（好ましくはガラス製アンプル）中で２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下にて１００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で凍結乾燥される。別例として、ワクチン注射剤は、製剤中のウイルスの段階的な凍結乾燥によって製造されてもよい。この製剤は、追加の添加剤、例えばマンニトール、デキストラン、糖質、グリシン、ラクトースもしくはポリビニルピロリドン、または他の助剤、例えば酸化防止剤もしくは不活性ガス、安定化剤もしくはｉｎ  ｖｉｖｏ投与に適した組換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）を含有することができる。その後、ガラス製アンプルは密閉され、４℃〜室温で数か月間保存可能である。しかしながら、必要がない限りは、アンプルは−２０℃未満の温度で保存されることが好ましい。
【００９４】
ワクチン接種または治療については、凍結乾燥品は０．１〜０．５ｍｌの水性溶液、好ましくは生理食塩水またはトリス緩衝液に溶解されて、全身投与または局所投与、すなわち非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、スタンプ式（by scarification）投与、または当業者に周知の任意の他の投与経路によって、投与されうる。投与方式、用量および投与回数は、周知のやり方で当業者によって最適化可能である。しかしながら、最も一般的には、患者は最初のワクチン接種注射の約１か月〜６週間後に、２回目の注射でワクチン接種される。
【００９５】
本発明の一実施形態は、抗原に対する免疫応答を生成する方法である。そのような応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答または抗体応答であってよい。特に、本発明は、初回免疫組成物の投与によって誘発された免疫応答が追加免疫組成物の投与によって増強（ブースト）される「プライム・アンド・ブースト」免疫化法に関する。本発明は、有効な追加免疫が、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを使用して、組換えＭＶＡ自体を含む様々な異なる種類の初回免疫組成物のうち任意のものを用いた初回免疫の後で達成されうる、という先の実験証明に基づいている。
【００９６】
数多くの病原体に対する免疫応答の主要な防御成分は、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）としても知られているＣＤ８＋型のＴリンパ球によって仲介される。ＣＤ８＋細胞の重要な機能はγインターフェロン（ＩＦＮ）の分泌であり、これはＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の尺度を提供する。免疫応答の別の成分は、病原体のタンパク質に対する抗体である。
【００９７】
本発明は、先の実験が示すように、様々な異なる初回免疫組成物のうち任意のものを使用して抗原に対して初回免疫されたＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強するため、さらには抗体反応を誘発するための、有効な手段であることが見出されたＭＶＡを使用する。
【００９８】
特に、先の実験研究は、本発明の先行物の使用により、ＨＩＶ抗原を発現する組換えＭＶＡウイルスが、ＤＮＡワクチンによって初回免疫されたＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強し、さらには抗体応答を誘発することが可能となることを実証している。該ＭＶＡは、免疫化後にＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することが見出される場合がある。組換えＭＶＡは、組換えＭＶＡの１回以上の接種により増強される免疫応答を初回免疫することが示される可能性もある。
【００９９】
プラスミドＤＮＡで免疫化され、ＭＶＡで追加免疫された非ヒト霊長類は、生ウイルスを用いた粘膜内抗原投与に対して有効に防御された（アマラ（Amara）ら、サイエンス誌（Science）、２００１年、第２９２巻、ｐ．６９−７４）。好都合なことに、本発明者らは、初回免疫および追加免疫の両方に皮内免疫、筋肉内免疫または粘膜免疫を用いるワクチン接種法を使用することができ、これは、例えばヒトにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導し、さらに抗体応答を誘発するのに適した一般的な免疫化法を構成すると考える。
【０１００】
本発明の種々の態様および実施形態は、ＨＩＶ抗原をコードする核酸の事前投与によって初回免疫された該抗原へのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強し、さらに抗体応答を誘発するために、該抗原をコードするＭＶＡベクターを使用する。
【０１０１】
本発明の一般的な態様は、ＨＩＶ抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強し、さらに抗体応答を誘発するためのＭＶＡベクターの使用を提供する。
本発明の１つの態様は、個体においてＨＩＶ抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強し、さらに抗体応答を誘発する方法を提供し、該方法は、該抗原をコードする核酸を含むＭＶＡベクターであって、該核酸が該核酸からの発現により個体において抗原を生産するための調節配列に作動可能に連結されているＭＶＡベクターを、個体の体内に提供し、これによって事前に該個体において初回免疫された抗原へのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答が増強されることを含む。
【０１０２】
ＨＩＶ抗原に対する免疫応答は、プラスミドＤＮＡを用いた免疫化によって、または感染性物質による感染によって初回免疫されうる。
本発明のさらなる態様は、個体においてＨＩＶ抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘導し、さらには抗体応答を誘発する方法を提供し、該方法は、該個体に、抗原をコードする核酸を含む初回免疫組成物を投与する工程と、その後、該抗原をコードする核酸を含むＭＶＡベクターであって、該核酸が該核酸からの発現により個体において抗原を生産するための調節配列に作動可能に連結されているＭＶＡベクターを含む追加免疫組成物を投与する工程とを含む。
【０１０３】
さらなる態様は、開示されているように、ＨＩＶ抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強し、さらには抗体応答を誘発するために哺乳動物に投与するための医薬品の製造における、ＭＶＡベクターの使用を提供する。そのような医薬品は一般に、抗原をコードする核酸を含む初回免疫組成物の事前投与に続いて投与するためのものである。
【０１０４】
初回免疫組成物は、抗原をコードするＤＮＡであって、そのようなＤＮＡが好ましくは哺乳動物細胞内で複製することができない環状プラスミドの形態であるものを含むことができる。いかなる選択可能なマーカーも、臨床的に使用される抗生物質に対して耐性であるべきではなく、したがって、例えばカナマイシン耐性がアンピシリン耐性よりも好ましい。抗原の発現は、哺乳動物細胞において活性を有するプロモーター、例えばサイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ  ＩＥ）プロモーターによって、駆動されるべきである。
【０１０５】
本発明の様々な態様の特定の実施形態では、初回免疫組成物の投与に続いて、追加免疫組成物、または第１および第２の追加免疫組成物であって同一であるかまたは互いに異なる第１および第２の追加免疫組成物を用いて、追加免疫が行われる。さらに別の追加免疫組成物が、本発明から逸脱することなく使用される場合もある。一実施形態では、三重免疫化法は、ＤＮＡ、次いで第１の追加免疫組成物としてアデノウイルス、次いで第２の追加免疫組成物としてＭＶＡ、次いで任意選択でさらなる（第３の）追加免疫組成物またはその後の同一もしくは異なるベクターのうち一方もしくは他方もしくは両方の追加免疫投与を使用する。別の選択肢は、ＤＮＡ、次いでＭＶＡ、次いでアデノウイルス、次いで任意選択でその後の同一もしくは異なるベクターのうち一方もしくは他方もしくは両方の追加免疫投与である。
【０１０６】
それぞれの初回免疫組成物および追加免疫組成物においてコードされる抗原は（いかに多くの追加免疫組成物が使用されても）同一である必要はないが、少なくとも１つのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを共有するべきである。抗原は完全抗原に相当してもよいし、そのフラグメントに相当してもよい。より効率的に、抗原中の不要なタンパク質配列および１つまたは複数のベクター中のコード配列を切り取って、ペプチドエピトープまたは人為的なエピトープ連続物が使用されてもよい。１つ以上の追加のエピトープ、例えば、Ｔヘルパー細胞によって認識されるエピトープ、特に様々なＨＬＡ型の個体において認識されるエピトープが含まれてもよい。
【０１０７】
組換えＭＶＡウイルスによってコードされる本発明のＨＩＶ抗原には、少なくとも１つのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープとしてＨＩＶのＥｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、またはＮｅｆアミノ酸配列のアミノ酸配列によって誘発される免疫原活性を有するポリペプチドが挙げられる。このアミノ酸配列は、実質的に、既知のＨＩＶ  ＥｎｖもしくはＰｏｌの少なくとも１つの１０〜９００アミノ酸フラグメントおよび／または共通配列；または、既知のＨＩＶ  Ｇａｇの少なくとも１つの１０〜４５０アミノ酸フラグメントおよび／または共通配列；または、既知のＨＩＶ  Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、もしくはＮｅｆの少なくとも１つの１０〜１００アミノ酸フラグメントおよび／または共通配列に相当する。
【０１０８】
完全長Ｅｎｖ前駆体配列が本発明での使用に関して提示されているが、Ｅｎｖは任意選択で部分配列を欠失している。例えば、ｇｐ１２０表面型切断産物およびｇｐ４１膜貫通型切断産物の領域を欠失していてもよい。
【０１０９】
完全長Ｇａｇ前駆体配列が本発明での使用に関して提示されているが、Ｇａｇは任意選択で部分配列を欠失している。例えば、マトリックスタンパク質（ｐ１７）の領域、カプシドタンパク質（ｐ２４）の領域、ヌクレオカプシドタンパク質（ｐ７）の領域、およびｐ６（ＧａｇポリプロテインのＣ末端ペプチド）の領域を欠失していてもよい。
【０１１０】
完全長Ｐｏｌ前駆体配列が本発明での使用に関して提示されているが、Ｐｏｌは任意選択で部分配列を欠失している。例えば、プロテアーゼタンパク質（ｐ１０）の領域、逆転写酵素タンパク質（ｐ６６／ｐ５１）の領域、およびインテグラーゼタンパク質（ｐ３２）の領域を欠失していてもよい。
【０１１１】
そのようなＨＩＶ  Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌは、既知のＥｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の全体的な同一性、例えば５０〜９９％の同一性、またはその中の任意の範囲もしくは値の同一性を有する一方で、ＨＩＶの少なくとも１つの株に対する免疫原性応答を誘発することができる。
【０１１２】
同一性（％）は、例えば、ウィスコンシン大学遺伝学コンピュータ・グループ（University of Wisconsin Genetics Computer Group）（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン６．０を使用して配列情報を比較することにより、測定することができる。該ＧＡＰプログラムは、ニードルマン（Needleman）およびブンシュ（Wunsch）のアライメント方法（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー誌（J Mol Biol）、１９７０年、第４８巻、ｐ．４４３）を、スミス（Smith）およびウォーターマン（Waterman）によって修正されたようにして（アドバンシズ・イン・アプライド・マスマティックス誌（Adv Appl Math）、１９８１年、第２巻、ｐ．４８２）、利用する。簡潔に述べると、ＧＡＰプログラムは、同一性を、アライメントされた同一のシンボル（すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を２つの配列のうち短いほうのシンボルの総数で除算したもの、として定義する。ＧＡＰプログラム用の好ましい初期設定パラメータには、（１）ユニタリ比較行列（同一について１および非同一について０の値を含む）ならびにグリブスコフ（Gribskov）およびバージェス（Burgess）（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ誌（Nucl Acids Res）、１９８６年、第１４巻、ｐ．６７４５）の重み付き比較行列、シュワルツ（Schwartz）およびデイホフ（Dayhoff）（編、「タンパク質の配列および構造の図解集（Atlas of Protein Sequence and Structure）」、米国ワシントンＤ．Ｃ．所在のナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファウンデーション（National Biomedical Research Foundation）、１９７９年、ｐｐ．３５３−３５８）の記述によるもの；（２）各ギャップについて３．０のペナルティ、および各ギャップの各シンボルについてさらに０．１０のペナルティ；ならびに（３）エンドギャップについてはペナルティなし、が含まれる。
【０１１３】
好ましい実施形態では、本発明のＥｎｖは少なくとも１つのＨＩＶエンベロープタンパク質の１つのバリアント型である。好ましくは、Ｅｎｖはｇｐ１２０と、ｇｐ４１の膜貫通部およびエクトドメインとで構成され、ｇｐ４１の細胞質ドメインの一部または全部を欠いている。
【０１１４】
既知のＨＩＶ配列は、民間およびＧＥＮＢＡＮＫのような公的なＨＩＶ配列データベースから、または公開された編集物として、例えばマイヤーズ（Myers）ら編、「ヒト・レトロウイルスおよびＡＩＤＳ、核酸およびアミノ酸配列の編集および分析（Human Retroviruses and AIDS, A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences）」、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、米国ニューメキシコ州ロスアラモス、セオレティカル・バイオロジー・アンド・バイオフィジックス（Theoretical Biology and Biophysics）、１９９３年、もしくはワールドワイドウェブのｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／において、容易に入手可能である。
【０１１５】
本発明の組換えＭＶＡウイルスで使用される核酸によってコードされる、新たなＨＩＶ  Ｅｎｖ、ＧａｇまたはＰｏｌを得るためのＨＩＶ  Ｅｎｖ、ＧａｇまたはＰｏｌの置換または挿入には、少なくとも１つのアミノ酸残基（例えば１〜２５個のアミノ酸）の置換または挿入が挙げられる。別例として、少なくとも１つのアミノ酸（例えば１〜２５個のアミノ酸）をＨＩＶ  Ｅｎｖ、ＧａｇまたはＰｏｌの配列から欠失させてもよい。好ましくは、そのような置換、挿入または欠失は、安全上の特性、発現レベル、免疫原性、およびＭＶＡの高い複製速度との両立性に基づいて特定される。
【０１１６】
本発明のＨＩＶ  Ｅｎｖ、ＧａｇまたはＰｏｌにおけるアミノ酸配列の変異は、例えば、ＤＮＡ中の突然変異によって作製することができる。そのようなＨＩＶ  Ｅｎｖ、ＧａｇまたはＰｏｌは、例えば、アミノ酸配列中の様々なアミノ酸残基をコードするヌクレオチドの欠失、挿入または置換を含んでいる。言うまでもなく、ＨＩＶ  Ｅｎｖ、ＧａｇまたはＰｏｌをコードする核酸において作製されることになる突然変異は、配列をリーディングフレームから外してはならず、第２のｍＲＮＡ構造物を生じる可能性のある補足的なドメインを作らないことが好ましいであろう。
【０１１７】
本発明のＨＩＶ  Ｅｎｖ、ＧａｇまたはＰｏｌをコードする核酸は、本明細書中に示された教示および手引きに基づいて、ＨＩＶのＥｎｖ、ＧａｇまたはＰｏｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ中のヌクレオチドの増幅または部位特異的変異誘発、およびその後の、ＨＩＶ  Ｅｎｖ、ＧａｇまたはＰｏｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを生産するための該コードＤＮＡの合成または逆転写によって調製されることも可能である。
【０１１８】
本発明のＨＩＶ  Ｅｎｖ、ＧａｇまたはＰｏｌを発現する組換えＭＶＡウイルスには、本明細書中に示された教示および手引きに基づいて、当業者であれば過度の実験作業を伴うことなく日常作業で得ることができる置換ヌクレオチドとして、ＨＩＶ  Ｅｎｖ、ＧａｇまたはＰｏｌをコードする配列の有限な集合が含まれる。タンパク質の化学的性質および構造の詳細な説明については、シュルツ（Schulz）、Ｇ．Ｅ．ら、「タンパク質構造の原理（Principles of Protein Structure）」、米国ニューヨーク州ニューヨーク、シュプリンガー・フェアラーク（Springer−Verlag）、１９７８年、およびクライトン（Creighton）Ｔ．Ｅ．、「タンパク質：構造および分子特性（Proteins: Structure and Molecular Properties）」、米国カリフォルニア州サンフランシスコ、Ｗ．Ｈ．フリーマン社（W. H. Freeman and Co.）、１９８３年を参照されたい。コドン選択のような、ヌクレオチド配列置換の表示については、オースベル（Ausubel）ら編、「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、米国ニューヨーク州ニューヨーク、グリーン・パブリシング・アソシエーツ（Greene Publishing Assoc.）、１９９４年、§§Ａ．１．１〜Ａ．１．２４、およびサムブルック（Sambrook）、Ｊ．ら、「分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: a Laboratory Manual）」第２版、米国ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年、付録ＣおよびＤ、を参照されたい。
【０１１９】
したがって、当業者は、本明細書中に示された教示および手引きがあれば、置換バリアント、欠失バリアントまたは挿入バリアントを含む代替ＨＩＶ  Ｅｎｖ、Ｇａｇ、またはＰｏｌを得るためには、ＨＩＶのｅｎｖ、ｇａｇ、またはｐｏｌのＤＮＡまたはＲＮＡの他の部位の他のアミノ酸残基をどのようにして置換するかが分かるであろう。
【０１２０】
ＭＶＡベクター内では、コードされた抗原を発現するための調節配列はプロモーターを含むことになる。「プロモーター」とは、ヌクレオチドの配列であって、該配列から、下流に（すなわち二本鎖ＤＮＡのセンス鎖上の３’方向に）作動可能に連結されたＤＮＡの転写が開始されうるところの配列を意味する。「作動可能に連結され」とは、転写がプロモーターから開始されるように適切に配置かつ配向されて、同じ核酸分子の一部として連結されることを意味する。プロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡは、プロモーターの「転写開始調節下」にある。ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、マーカー遺伝子およびその他の配列を含む他の調節配列が、当業者の知識および慣行に従って適正に含められてもよい。例えば、Ｄ．Ｍ．クナイプ（Knipe）、Ｐ．Ｍ．ハウリー（Howley）編、「フィールズ・ウイルス学（Fields Virology）」の、モス（Moss）、Ｂ．著「ポックスウイルス科：ウイルスおよびその複製（Poxviridae: The Viruses and Their Replication）」、フィラデルフィア所在のリッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンズ（Lippincott Williams and Wilkins）、２００１年、ｐ．２８４９〜２８８３、を参照されたい。例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発、塩基配列決定、細胞内へのＤＮＡの導入および遺伝子発現における核酸の取扱、ならびにタンパク質の分析のための数多くの既知の技法およびプロトコールは、オースベル（Ausubel）ら編、「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）、１９９８年に詳細に記載されている。
【０１２１】
本発明の態様および実施形態で使用されるプロモーターは、ポックスウイルスの発現系に適合しうるものであって、天然の配列、改変された配列および合成配列が含まれうる。
初回免疫組成物および追加免疫組成物のうち一方または両方は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）またはこれをコードする核酸のようなアジュバントを含んでもよい。
【０１２２】
追加免疫組成物の投与は、一般に初回免疫組成物の投与の約１〜６か月後、好ましくは約１〜３か月後である。
好ましくは、初回免疫組成物、追加免疫組成物、または初回免疫組成物および追加免疫組成物両方の投与は、皮内免疫、筋肉内免疫または粘膜免疫である。
【０１２３】
ＭＶＡワクチン剤の投与は、ウイルスの懸濁液を注入するために注射針を使用することにより達成されてもよい。代替例は、ウイルス懸濁液を投与するための無針注射デバイス（例えばＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）無針注射器を使用）、または、冷蔵を必要としない個別調製された単回投与量の製造をもたらす、再懸濁されたワクチン含有凍結乾燥粉末を使用することである。これは、アフリカの農村地域において必要とされるワクチンについては大きな利点となるであろう。
【０１２４】
ＭＶＡはヒトの免疫化において優れた安全上の実績を備えたウイルスである。組換えウイルスの生成を簡単に行うことが可能であり、大量に再現性よく製造することができる。したがって、組換えＭＶＡウイルスの皮内、筋肉内、または粘膜投与は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答によって制御可能なＡＩＤＳに対するヒトの予防的または治療的ワクチン接種に非常に適している。
【０１２５】
個体は、該抗原の送達および該抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の生成が有益であるか、または治療上有益な効果を有するようなＡＩＤＳに罹患している個体であってよい。
【０１２６】
恐らくは、投与は、感染または症状発現の前にＨＩＶまたはＡＩＤＳに対する免疫応答を生成するための予防的な目的を有することになる。
本発明に従って投与される成分は医薬組成物として製剤化されうる。これらの組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤または当業者に良く知られた他の材料を含むことができる。そのような材料は無毒でなければならず、かつ有効成分の有効性を妨げてはならない。担体またはその他の材料の厳密な性質は、投与経路、例えば静脈内経路、皮内または皮下経路、経鼻、筋肉内経路、腹腔内経路に応じて変化しうる。
【０１２７】
言及したように、投与は好ましくは皮内投与、筋肉内投与、または粘膜投与である。
生理食塩水、デキストロースもしくはその他糖類の溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールが含まれてもよい。
【０１２８】
静脈内、皮内、皮下、筋肉内、もしくは粘膜への注射、または罹患部位での注射については、有効成分は、発熱性物質を含まず適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容可能な水性溶液の形態となろう。当業者は、例えば、生食注射液、リンガー液、乳酸加リンガー液のような等張の媒体を使用して、適切な溶液を調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定化剤、緩衝剤、酸化防止剤および／またはその他の添加剤が含まれていてもよい。
【０１２９】
徐放製剤が使用されてもよい。
ＭＶＡ粒子の生産および任意選択のそのような粒子の組成物中への製剤化に続いて、該粒子は、個体、特にヒトまたはその他の霊長類に投与されうる。投与は、別の哺乳動物、例えばマウス、ラットもしくはハムスターのようなげっ歯動物、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、ロバ、イヌまたはネコに対するものであってもよい。
【０１３０】
投与は、「予防的に有効な量」または「治療上有効な量」（場合に応じて予防は治療と考えることもできるが）であることが好ましく、これは個体に対する有益性を示すのに十分ということである。投与される実際の量、ならびに投与の速さおよび時間的投与条件は、治療対象者の性質および重症度に応じて変わることになろう。治療の処方、例えば投与量の決定などは、一般臨床医およびその他の医師、または獣医学的状況では獣医師の担当事項であり、典型的には、治療される病気、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、および当業者に周知の他の要因を考慮する。上述の技法およびプロトコールの例は、オソル（Osol）、Ａ．編、「レミングトンの製薬科学（Remington’s Pharmaceutical Sciences）」、第１６版、１９８０年、に見出すことができる。
【０１３１】
１つの好ましい投与法では、ＤＮＡが注射１回あたり投与量３００μｇ〜３ｍｇで投与された後、ＭＶＡが注射１回あたり投与量１０６〜１０９個の感染性ウイルス粒子として投与される。
【０１３２】
組成物は単独で投与されてもよいし、他の治療と組み合わされて、治療すべき状態に応じて同時に、または順次、投与されてもよい。
ヒト以外の哺乳動物への送達は必ずしも治療目的である必要はなく、実験的状況で、例えば、対象とする抗原に対する免疫応答、例えばＨＩＶまたはＡＩＤＳからの防御のメカニズムの研究に使用するためであってもよい。
【０１３３】
実施例
以下の実施例は、実施形態を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが発明と見なすものの範囲を限定するようには意図されておらず、また下記の実験が全てであるかまたはその実験しか実施されないということを示すように意図されたものでもない。使用される数値（例えば量、温度など）に関する精度を保証する努力がなされてはいるが、何らかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別途記載の無いかぎり、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度である。標準的な略語が使用される。
【０１３４】
実施例１
以下の実施例は、シャトルプラスミド、組換えＭＶＡ／ＨＩＶ１臨床用ワクチン構築物、ならびに、外来遺伝子のコドン変更および２つのワクシニアウイルス必須遺伝子の間への外来遺伝子の挿入による、組換えＭＶＡにおいて完全な外来遺伝子挿入物を維持するメカニズムを実証する。本開示は以下のメカニズムを提示する、すなわち：
・  ＭＶＡの複製にとって必須の２つのワクシニアウイルス遺伝子の間に完全な外来遺伝子を挿入することにより該外来遺伝子を維持するメカニズム。外来遺伝子の欠失はその組換えＭＶＡに生育上の著しい優位性をもたらす可能性があり、継代が繰り返された際に完全な外来遺伝子を含有するＭＶＡと競合する場合がある。しかしながら、外来遺伝子のほとんどの欠失は、隣接するワクシニアウイルスＤＮＡのある程度の部分の喪失も含んでいる。そのワクシニアウイルスＤＮＡが必須であれば、欠失を備えたウイルスは複製せず、完全な外来遺伝子を含有しているＭＶＡと競合しないことになる。この方法論は、臨床試験で使用するためなど大規模に増幅させる必要のある組換えワクシニアウイルスの生産に有用であろう。また、
・  組換えウイルスを繰り返し継代した後に容易に突然変異を生じる特異的「ホットスポット」を変質させることにより、外来遺伝子挿入物を安定させるメカニズム。この方法論は、臨床試験で使用するためなど大規模に増幅させる必要のある組換えウイルスの生産に有用である。
【０１３５】
そして、
・  ２つの必須ワクシニアウイルス遺伝子の間に外来遺伝子を挿入するために使用されるシャトルプラスミドｐＬＷ‐７３、および
・  上記２つのメカニズムの使用を具体化する材料である、組換えＭＶＡ／ＨＩＶ‐１臨床用ワクチン構築物ＭＶＡ／ＵＧＤ４ｄ
について説明する。
【０１３６】
安定な組換えＭＶＡウイルスの生成
様々な地理的位置からのＨＩＶ‐１単離物由来のｅｎｖおよびｇａｇｐｏｌ遺伝子を発現する改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）組換え体が構築された。外来遺伝子は、ＭＶＡの２つの部位、欠失ＩＩ（Deletion II）および欠失ＩＩＩ（Deletion III）に挿入された。組織培養物中で組換えＭＶＡを繰り返し継代した後の上記遺伝子の安定性は変化しやすいことが判明した。本発明者らは、この不安定性が、外来遺伝子全体および一部の隣接ＤＮＡの欠失に起因するか、または外来遺伝子を発現しないため生育上有利である子孫ビリオンの増殖をもたらす特異的点突然変異に起因するかのいずれかであることを実証した。ここで本発明者らは、完全な外来遺伝子組換えＭＶＡを保持する２つの新規な方法について述べる。第１に、本発明者らは、ゲノムの保存された中央領域の２つの必須ワクシニアウイルス遺伝子の間に外来遺伝子を挿入させる導入ベクターを構築した。この遺伝子挿入部位の使用は、必須ワクシニアウイルスＤＮＡを含んだ大きな欠失部を含有するバリアントの増殖を防止する。加えて、このプラスミドは、組換えウイルスへのさらなる遺伝子の挿入に使用することができる。第２に、点突然変異を備えた単離物の分析から、翻訳中に早期終了を引き起こす単一塩基の挿入または欠失の傾向を備えたある種の「ホットスポット」が明らかとなった。本発明者らは、これらの部位におけるサイレント突然変異の生成が、挿入遺伝子の安定性をもたらすことを示した。
【０１３７】
Ｉ．新規な導入ベクターの構築および適用
新規な導入ベクターｐＬＷ‐７３の構築
１．  ＭＶＡゲノムの中央領域Ｋ７Ｒ‐Ａ２４Ｒについて、１）ポックスウイルス科またはコードポックスウイルス亜科において保存された遺伝子対、および２）遺伝子の３’末端どうしが近接するように逆方向を向いた遺伝子であって、その結果としてワクシニアプロモーターを妨害しないであろう挿入部位を提供する遺伝子、に関する検査が行われた。新しい挿入部位として選択された部位は、２つの必須遺伝子Ｉ８ＲおよびＧ１Ｌの間であった。
【０１３８】
２．  新しいベクターの左側隣接部は次の方法で構築された：プラスミドＬＡＳ‐１が、ｄｅｌ  ＩＩＩ  ＭＶＡ隣接部、ＧＦＰ、およびＭＶＡ隣接部のダイレクトリピートを取り出すために、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断された。この挿入物はＡｓｃＩおよびＳａｃＩで切断されて、ＧＦＰフラグメントが単離された。Ｉ８Ｒ遺伝子末端の５３１塩基対（ＴＡＡ終止コドンを含む）が、ＰＣＲ産物の末端にＥｃｏＲＩおよびＡｓｃＩ制限部位を備えるようにＰＣＲ増幅された。（ＴＡＡ終止コドンを含むＩ８Ｒ遺伝子末端からの）２２９塩基対のダイレクトリピートのＰＣＲ増幅が、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩ制限部位を含有するオリゴヌクレオチドを用いて行なわれた。全４片のＤＮＡすなわち、１）ＥｃｏＲＩ末端およびＸｈｏＩ末端を備えたベクター骨格、２）ＥｃｏＲＩ末端およびＡｓｃＩ末端を備えたＩ８Ｒ末端を含有する新しい左側隣接部、３）ＡｃｓＩ末端およびＳａｃＩ末端を備えたＧＦＰ、ならびに４）ＳａｃＩ末端およびＸｈｏＩ末端を備えたＩ８Ｒ隣接部のダイレクトリピート、が合わせてライゲーションされてプラスミドｐＬＷ‐７２が作製された。
【０１３９】
３．  右側隣接部は以下のように作製された：ｐＬＷ‐７２が制限酵素ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断され、該プラスミド中のＭＶＡのｄｅｌ  ＩＩＩ隣接部が放出された。Ｇ１Ｌ遺伝子末端の７０２塩基対が、両端にＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を備えるようにＰＣＲ増幅され、ｐＬＷ‐７２ベクター中にライゲーションされてｐＬＷ‐７３が作製された（図７）。ｐＬＷ‐７３の配列を図８に示す。
【０１４０】
４．  ｐＬＷ‐７３の顕著な特色は次のとおりである：１）ベクターは、ＭＶＡゲノム中の必須遺伝子の間に外来遺伝子を挿入するために設計された。左側隣接部はＩ８Ｒ遺伝子の終端部からなり、右側隣接部はＧ１Ｌ遺伝子の終端部からなる。２）組換えウイルスの簡単な初期選択のためにＧＦＰ遺伝子が含まれている。３）ＧＦＰはＩ８Ｒ遺伝子のダイレクトリピートに隣接しており、組換えウイルスが繰り返し継代されるとＧＦＰが失われることになるためＧＦＰの一時的発現が可能となっている。国際公開公報第２００４／０８７２０１号を参照すると、特色２および３は、ＭＶＡ／ＨＩＶ組換え体ｐＬＡＳ‐１およびｐＬＡＳ‐２を作製するために使用された初期プラスミドにも含まれていた。
【０１４１】
ｐＬＷ‐７３の適用
１．  ＨＩＶ‐１のクレードＢのＡＤＡ単離物由来のｅｎｖ遺伝子がｐＬＷ‐７３にクローニングされ、組換えＭＶＡウイルスが作製された。ＤＮＡ塩基配列決定により、ｅｎｖ遺伝子の位置および完全性が確認された。
【０１４２】
２．  ＭＶＡの欠失ＩＩ（Deletion II）部位にウガンダのクレードＤ（単離物ＡＯ７４１２）のｅｎｖ遺伝子を発現する組換えＭＶＡウイルス（図９）は、不安定であること、すなわち、培養物中の連続継代が繰り返された後に遺伝子が大部分のウイルス子孫から欠失することが判明した。その後、同じ遺伝子がｐＬＷ‐７３にクローニングされ、組換えＭＶＡウイルスが作製されて特徴解析された。ｅｎｖ遺伝子挿入物は培養物中で連続継代が繰り返された（８×）後も安定していた、すなわち、挿入遺伝子または隣接するＭＶＡ領域の欠失は見出されなかった。加えて、遺伝子がこの部位に挿入された時は他の突然変異が発生しなかった。
【０１４３】
ＩＩ．「ホットスポット」の点突然変異
点突然変異の分析
ＭＶＡの欠失ＩＩＩ（Deletion III）部位にウガンダのクレードＤ（単離物ＡＯ３３４９）ｇａｇｐｏｌ遺伝子を発現する組換えＭＶＡウイルスは、不安定であることが判明した。主な遺伝子変化は、ＧまたはＣ残基が４〜６個連続した箇所における単一の点突然変異の生成であった（表３）。加えて、同様の点突然変異は、ケニアのクレードＡのＨＩＶ‐１単離物およびタンザニアのクレードＣの単離物由来のｇａｇｐｏｌ遺伝子を発現する同様の組換えウイルスからの非染色プラークに見出された。
【０１４４】
ホットスポットの突然変異誘発および組換えウイルス中の安定性の分析
部位特異的突然変異誘発を使用して、ウガンダのＨＩＶ‐１単離物由来のｇａｇ遺伝子の６つのそのような領域にサイレント突然変異を作製した。この変異遺伝子ＵＧＤ４ｄ  ｇａｇｐｏｌ  ｏｒｆ（図１０）はｐＬＡＳ‐１にクローニングされ、不安定なウイルスの構築で行われたようにしてＭＶＡの同じ欠失ＩＩＩ（Deletion III）部位へ組み込まれた。培養物中で連続継代を繰り返した（８×）後、発現のないプラークは見出されなかった。継代８代目のウイルスストックのＤＮＡ塩基配列決定から、ｇａｇｐｏｌ遺伝子の完全性が維持されていることが確認された。
【０１４５】
ＩＩＩ．  二重組換え体の構築
ＭＶＡ／ＵＧＤ４ｄウイルス
ＭＶＡ／ＵＧＤ４ｄウイルス、すなわちウガンダのサブタイプＤ  ＡＯ７４１２のエンベロープおよびＡＯ３３４９のｇａｇｐｏｌを発現する組換えウイルスは、次の方法で構築された：エンベロープおよびｇａｇｐｏｌの遺伝子は、それぞれシャトルプラスミドｐＬＷ‐７３およびｐＬＡＳ‐１を利用した相同組換えによってＭＶＡ  １９７４／ＮＩＨクローン１に挿入された。ＭＶＡ／ＵＧＤ４ｄは、ニワトリ胚線維芽細胞における６回のプラーク精製によって単離され、その後増幅されて特徴解析された。
【０１４６】
概要
１．  ＭＶＡゲノムの保存された中央領域の２つの必須遺伝子Ｉ８ＲおよびＧ１Ｌの間への外来遺伝子の組み込みを行うプラスミド導入ベクターが構築された。この部位の使用により、挿入遺伝子／ＭＶＡ隣接部の欠失を有する変異ウイルスの選択が阻止されることが示された。
【０１４７】
２．ＧおよびＣ残基が連続した極めて変異しやすい箇所は部位特異的突然変異誘発によって変更され、コード配列中のサイレント突然変異が生成された。この変化は、遺伝子がＭＶＡの欠失ＩＩＩ（Deletion III）に挿入された場合に該遺伝子を安定させることが示された。
【０１４８】
３．  上記の２つの方法を利用して、ウガンダのクレードＤのｅｎｖおよびｇａｇｐｏｌの両方を安定して発現するＵＧＤ４ｄ二重ＭＶＡ組換え体が構築された。
実施例２
様々な単離物からのＨＩＶ‐１  ｅｎｖ遺伝子およびｇａｇｐｏｌ遺伝子を発現する組換えＭＶＡが作製された。組織培養物中で継代が繰り返された後の挿入遺伝子の安定性は変化しやすいことが判明した。ここで本発明者らは、（１）不安定性は、自然突然変異または挿入遺伝子の欠失と、発現のない突然変異の選択との組合せを表わすことを実証し、（２）不安定性を低減する新規な方法について述べる。
【０１４９】
概観
多数の異なる単離物からのｅｎｖおよびｇａｇｐｏｌを発現する組換えＭＶＡが構築された。各ウイルスは、臨床試験用ウイルスの製造に必要な大規模増幅を模倣するためにニワトリ胚線維芽細胞において繰り返し継代された。挿入物の安定性は、個々のプラークのｅｎｖおよびｇａｇを免疫染色することによってモニタリングされた。いくつかの組換えウイルスについては、ｅｎｖおよび／またはｇａｇの発現がウイルス集団のかなりの割合において急速に失われることが見出された。発現喪失のメカニズムを同定するために、個々のプラークが単離され、突然変異の性質が特徴解析された。いくつかの事例では、単一ヌクレオチドの付加または欠失によって突然変異する傾向を備えた特定のＤＮＡ塩基配列が同定された。そのような突然変異の生成は、予測される翻訳産物を変化させることなくコドンを変更することにより、回避することができた。他の事例では、発現の喪失は、隣接している非必須ＭＶＡ遺伝子の中まで及ぶことの多い大規模な欠失によって引き起こされた。これが生じるのを防止するために、２つの必須ＭＶＡ遺伝子の間に外来遺伝子を挿入させることを目指した新しいシャトルプラスミドが構築された。この部位への組込みは外来ＤＮＡの欠失を低減した。しかしながら、ある事例では、高レベルのＨＩＶ  ｅｎｖ発現に関連した毒性が非常に強いため、希少な突然変異体を選択してもなお不安定な集団が得られた。この場合、ｅｎｖの膜貫通ドメインを短縮化して初めて安定した組換えＭＶＡの構築が可能となった。
【０１５０】
組換えＭＶＡの生成および挿入遺伝子の安定性の分析
Ｅｎｖ遺伝子およびｇａｇｐｏｌ遺伝子はＭＶＡシャトルベクターにクローニングされた。発現および機能は一時的発現アッセイによって分析された。ｇａｇｐｏｌはＭＶＡ  １９７４／ＮＩＨクローン１に組み込まれた。組換えＭＶＡは６〜８回プラーク精製され、その後ウイルスの増幅が行われた。Ｅｎｖは該ＭＶＡ／ｇａｇｐｏｌ単離物に組み込まれ、二重組換えＭＶＡ（図１１Ａ）は６〜８回プラーク精製され、増幅された。挿入物の安定性を評価するために、ウイルスは、大規模製造を模倣するために〜１ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）を使用してＣＥＦ細胞中で連続的に継代された。安定性は、モノクローナル抗体で免疫染色することにより測定された、ｅｎｖまたはｇａｇを発現する細胞の割合（％）の測定により評価された（図１１Ｂ）。
【０１５１】
組換えＭＶＡの安定性
様々な地理的位置からのＨＩＶ‐１単離物由来の遺伝子を発現する組換えＭＶＡが構築された。ｅｎｖ遺伝子およびｇａｇｐｏｌ遺伝子は、それぞれＭＶＡの欠失ＩＩおよびＩＩＩに挿入され、いずれも改変Ｈ５プロモーターの制御下におかれた。７つの組換えＭＶＡのｅｎｖ遺伝子およびｇａｇｐｏｌ遺伝子の安定性が表４に示されている。様々な程度の不安定性がこの７つのウイルスにおいて観察された。ＭＶＡ／６５Ａ／Ｇでは、ｅｎｖの発現は急速に失われて、継代６代目までにはわずか２５％のビリオンしかｅｎｖを発現しなかった。ＭＶＡ／ＵＧＤ４ａでは、ｅｎｖおよびｇａｇｐｏｌ両方の発現は連続的なウイルス継代とともに徐々に失われた。第Ｉ相試験用の大量のウイルスの製造には少なくとも６〜７回の継代が必要なので、これら２つのウイルスは不適当であると考えられた。
【０１５２】
ＭＶＡ／６５Ａ／Ｇの発現の分析
図１２を参照すると、ＭＶＡ／６５Ａ／ＧのＰ３およびＰ５から１３個のプラークが無作為に採取され、Ｔ‐２４  ｍＡｂ（結合部位をａに示す）を用いた免疫染色、ウエスタンブロッティング、ＰＣＲ、および配列決定により分析された。５種類のプラークが見出され、各種類について得られたこれらのプラークの数は図１２の右側に示されている。プラークａ、ｂおよびｃは染色されたが、ｂおよびｃは、塩基置換（終止コドンを生じるもの）（ｂ）、ならびに、ｅｎｖ遺伝子の端部およびＭＶＡ隣接部の一部の欠失（ｃ）に起因する短縮型であった。染色されないプラークｄおよびｅは、Ｇが５個連続した箇所へのＧの付加を原因とするフレームシフト（ｄ）、ならびに、ｅｎｖ遺伝子全体およびＭＶＡ隣接部の一部の大規模な欠失（ｅ）から生じていた。したがって、塩基対付加、置換、および欠失はすべてＭＶＡ／６５Ａ／Ｇのｅｎｖ遺伝子の不安定な発現に寄与していた。このＡ／Ｇ  ｅｎｖは検討した中で最も不安定な例であり、安定性を増強しうる改変を研究するために採取された。
【０１５３】
安定性を増大させるためのＡ／Ｇ構築物の改変
１．  点突然変異を防止するために、ＧおよびＣが４個および５個連続した箇所をサイレント突然変異によって除去することにより合成エンベロープが作製された。
【０１５４】
２．  ベクターＩ８／Ｇ１すなわちｐＬＷ‐７３は、遺伝子およびＭＶＡ隣接部の欠失が生存可能とならないように、必須遺伝子Ｉ８ＲおよびＧ１Ｌの間の挿入部位を用いて構築された。ＭＶＡのＩ８Ｒ遺伝子の端部（５００ｂｐ）およびＧ１Ｌ遺伝子の端部（７５０ｂｐ）がＰＣＲによって増幅され、外来遺伝子の発現を制御するワクシニアウイルス初期／後期ｍＨ５プロモーターを含有するベクターに挿入された。このＩ８／Ｇ１ベクターは、相同組換えによってＭＶＡに外来遺伝子を挿入するために使用された（図１３）。挿入遺伝子および該挿入遺伝子に隣接しているＭＶＡの欠失は、必須遺伝子の部分が欠失することになるので生存可能とはならなくなる。したがって、これらの突然変異を備えたウイルスは、正常な生育上の利点を備えた集団において異常増殖することができなくなる。
【０１５５】
３．  Ａ／Ｇ  ｇｐ１４０エンベロープは、ｇｐ４１の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を欠失させることにより変異させられ、分泌タンパク質を生じた。
安定性を増大させるための試験的改変
図１４に示されるように、ｅｎｖの改変および／または新しいベクターの使用により７つの単一組換えウイルスが作製された。改変がエンベロープの安定的発現を増強したかどうかを判定するために、各ウイルスの５つのプラークが単離されてＣＥＦ中で独立に継代された。継代されたプラークは、ｍＡｂ  Ｔ‐４３（結合部位はｅｎｖの１０１〜１２５ａａにマッピングされた）を用いた免疫染色、ウエスタンブロッティング、ＰＣＲ、および配列決定により分析された。
【０１５６】
プラーク継代後のＥｎｖ発現
図１５を参照すると、上記に列挙された７つの組換え体それぞれの５つの独立に継代されたプラーク単離物が、継代１、３、５および７代目において、ｍＡｂ  Ｔ‐４３（ｇｐ１２０の１０１〜１２５ａ．ａ．の間に結合する）を用いた免疫染色によって特徴解析された。７種のウイルスのうち４つ（図１５のａ、ｂ、ｃ、ｅ）は、５つの継代プラークそれぞれにおいて不安定なタンパク質発現を有し、（図１５ｆ）の２つのプラーク継代物も不安定なｅｎｖ発現を有していた。これらは、ＭＶＡゲノムのｄｅｌ  ＩＩ（図１５ｃ）および必須遺伝子部位（図１５ｆ）の両方に合成ｅｎｖを備えたウイルスを含んでいた。短縮された分泌型ｇｐ１４０としてのエンベロープを含有している組換えウイルスだけが、エンベロープを安定に発現し続けた（図１５のｄおよびｇ）。
【０１５７】
ウエスタンブロッティング、ＰＣＲおよび配列分析
選択されたプラーク継代物からクローンを採取し、ウエスタンブロッティング、ＰＣＲおよび配列分析によってタンパク質発現を分析した（図１６）。ウエスタンブロット解析については、クレードＡのエンベロープの先頭部および終端部にそれぞれ結合するＴ‐２４およびＴ‐３２が、部分的エンベロープのみが作製されたか完全長エンベロープが作製されたかを測定するために使用された。ｃと印付けされた対照ウイルスが各ブロットの右側にある。ＭＶＡの欠失ＩＩにおいて作製された３つのウイルス（図１６ａ、ｂおよびｃ）については、図１６ｃ（すなわちｇｐ１４０クローン）にのみ、全クローンがウエスタン分析で検出可能なタンパク質を発現していた。このタンパク質（Ｔ‐３２によって計測）は短縮されていなかった。エンベロープがベクターＩ８／Ｇ１によって必須遺伝子部位へ挿入されると（図１６ｄ、ｅおよびｆ）、この場合も、ｇｐ１４０エンベロープだけがすべてのクローンにおいて発現されており、短縮されていなかった。Ｉ８／Ｇ１ベクターの使用はｅｎｖ配列の突然変異生成を防止しなかったが、ｄｅｌ  ＩＩに挿入されたエンベロープで見られていた欠失は防止した。（Ｉ８／Ｇ１ベクター由来の試験されたすべてのクローンの陽性ＰＣＲ産物、対してｄｅｌ  ＩＩベクターを使用して試験されたクローンの陰性ＰＣＲ産物に注目されたい。）
クレードＡ／Ｇ二重組換え体におけるＥｎｖの発現
１つのｅｎｖ分析を用いた先の結果に基づいて、ｇｐ１４０または合成ｇｐ１６０遺伝子とともにｇａｇｐｏｌを発現する二重組換え体が作製され、ｅｎｖ発現の安定性について試験された（図１７）。先述のようにして各々から５つのプラークが単離され、ｅｎｖ発現の安定性を分析するために７回継代された。継代７代目で、継代されたプラークはＴ‐４３およびＴ‐３２  ｍＡｂｓ（それぞれｇｐ１２０およびｇｐ４１に結合する）両方を用いて免疫染色された。Ｔ‐４３  ｍＡｂでは、合成エンベロープを発現する組換え体の５つのクローンのうちの１つが染色されないプラークのみで構成されていた。続いてこれらのプラークのＴ‐３２染色は、別のプラークが短縮されたエンベロープを発現することを示した。ｇｐ１４０エンベロープを含有する二重組換え体からの継代プラークは全て、Ｔ‐４３およびＴ‐３２両方の免疫染色により、安定しているように見えた。力価も他の二重組換え体を用いるより２ｌｏｇ高かった。したがって、安定してエンベロープを発現するクレードＡ／Ｇ二重組換え体は、ｇｐ１４０エンベロープを用いた場合にのみ作製可能であった。
【０１５８】
ウガンダのＨＩＶ‐１単離物由来のｅｎｖおよびｇａｇｐｏｌを発現する組換えウイルス
ウガンダの単離物ＡＯ７４１２およびＡＯ３３４９由来のＨＩＶ‐１  ｅｎｖおよびｇａｇｐｏｌ遺伝子を発現する組換えＭＶＡウイルスは、図１８に示されるようにして構築された。各々４〜６個の独立な単離物が連続的に継代され、両遺伝子が単独で発現されても組み合わせで発現されても不安定であることが分かった（表５）。対照的に、膜結合型ｇｐ１６０の代わりとしてｇｐ１４０の発現は、連続継代後のｅｎｖ遺伝子の安定性をもたらした（図１８および表５）。
【０１５９】
ＭＶＡ／ＵＧＤ４ａ  −  非染色ｅｎｖプラークの分析
不安定性のメカニズムを究明するために、２４個の個々の非染色プラーク（Ｍａｂ  Ｔ‐４３を使用）がＭＶＡ／ＵＧＤ４ａの継代６代目から単離され、増幅され、特徴解析された。２つの小さな欠失（１．２ｋｂおよび０．３ｋｂ）がＰＣＲ増幅およびＤＮＡ塩基配列決定によって同定された（図１９）。他の単離物はすべて、隣接するＭＶＡにまで及ぶ非常に大きな欠失を含んでいた。これらの欠失に関するおよその切断点は、ｅｎｖ遺伝子または隣接するＭＶＡ領域の内側からプライマー対を使用して同定された。
【０１６０】
組換えＭＶＡにおけるＵＧＤ  ｅｎｖ遺伝子の改変
ＵＧＤ  ｅｎｖ遺伝子の不安定性の問題を改善するために、新しいベクターＩ８／Ｇ１を使用して、ＡＯ７４１２  ｅｎｖ遺伝子をＭＶＡに挿入した。このベクターＩ８／Ｇ１は、２つの必須ワクシニアウイルス遺伝子Ｉ８およびＧ１の間に外来遺伝子を組み込み、かつ改変Ｈ５プロモーターを使用する（図２０）。独立した４つのプラークが連続的に継代され、継代５代目でＭａｂ  Ｔ‐４３およびＴ‐３２を用いて免疫染色することによりｅｎｖ発現について分析された。すべての単離物において、遺伝子は安定していた（表６）。
【０１６１】
ＭＶＡ／ＵＧＤ４ｂ  −  非染色ｇａｇプラークの分析
ｇａｇ遺伝子の不安定性のメカニズムを究明するために、８個の個々の非染色プラーク（Ｍａｂ  １８３‐Ｈ１２‐５Ｃ（ＮＩＡＩＤ  ＡＩＤＳリポジトリ）を使用）がＭＶＡ／ＵＧＤ４ｂの継代６代目から採取され、増幅され、ｇａｇｐｏｌ挿入物が配列決定された（表７）。７個の単離物には、５６４〜５６９位における単一のＧ残基の挿入または欠失が見出された。１つの単離物では、５３０〜５３４位の配列ＣＣＣＣからＣ残基が欠失していた。更に、ＭＶＡ／ＫＥＡおよびＭＶＡ／ＴＺＣの多数回継代ストック由来の非染色プラークから、同様の突然変異ホットスポット、すなわち５６４〜５６９位が明らかとなった。ＵＧＤ  ＡＯ７４１２  ｇａｇｐｏｌ遺伝子の完全配列の調査から、２２箇所の４個以上連続したＧまたはＣ残基が実証された（図２１）。
【０１６２】
組換えＭＶＡにおけるＵＧＤ  ｇａｇｐｏｌ遺伝子の改変
ｇａｇｐｏｌ遺伝子の不安定性のメカニズムが主として４〜６個の連続したＧまたはＣ残基内の単一ヌクレオチドの挿入または欠失であったので、この遺伝子の安定性を改善する戦略は、そのような部位でサイレント突然変異を生成させることであった。したがって、ｐ１７およびｐ２４  ｇａｇの６部位における部位特異的突然変異誘発（表３）が使用された。結果として得られた、ＭＶＡの同じ場所すなわち欠失ＩＩＩ（Deletion III）に挿入されたコドン変更された（ｃ．ａ．）遺伝子は、連続継代しても安定であることが証明された（図２２および表８）。
【０１６３】
ＵＧＤ  ｅｎｖおよびｇａｇｐｏｌを発現する安定な組換えＭＶＡの構築
ＭＶＡのＩ８／Ｇ１座においてＵＧＤ  ｅｎｖ遺伝子、および欠失ＩＩＩ（Deletion III）においてコドン変更されたｇａｇｐｏｌ遺伝子を発現する組換えウイルスが構築された（図２３）。連続継代では、いずれの遺伝子の不安定性も示されなかった。更に、タンパク質発現のレベルおよびＤＮＡ塩基配列は継代を経ても不変であった（表９）。
【０１６４】
結論
ｅｎｖ挿入物およびｇａｇｐｏｌ挿入物の不安定性は、点突然変異および欠失の生成ならびに非発現性ＭＶＡ突然変異が生育上優位であることに起因する。不安定性は一般に、コドン変更、またはＭＶＡゲノムの必須領域への挿入のうち少なくともいずれか一方によって低減することが可能である（ＭＶＡ／ＵＧＤ４ｄ）。しかし、１つの事例ではｅｎｖを変更しなければならなかった（ＭＶＡ／６５Ａ／Ｇ）。
【０１６５】
実施例３
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＭＶＡ／ＵＧＤ４ｄの免疫原性
マウス１０匹の群が、それぞれ感染単位１０６または１０７のＭＶＡ／ＵＧＤ４ｄを用いて腹腔内経路により免疫化された。マウス５匹の群が、それぞれ親のＭＶＡ‐１９７４を用いて同様に免疫化された。マウスは第０週および第３週で免疫化処置され、第０週、第３週および第５週で採血された。第５週で脾臓が採取された。
【０１６６】
細胞の応答は細胞内のサイトカイン染色によって新鮮な脾細胞で計測された。脾細胞は、下記すなわち：１）免疫優勢であるｇａｇペプチド（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ（配列番号６））、２）ｅｎｖペプチド（ＤＴＥＶＨＮＶＷＡＴＨＡＣＶＰ（配列番号７）およびＱＱＱＳＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨ（配列番号８））、３）ｐｏｌペプチド（ＥＬＲＱＨＬＬＲＷＧＬＴＴ（配列番号９）およびＨＧＶＹＹＤＰＳＫＤＬＩＡＥ（配列番号１０）の単一アミノ酸バリアントを備えた８つのペプチド）、ならびに４）ＭＶＡを用いて別々に刺激された。
【０１６７】
細胞は、ＣＤ４およびＣＤ８の表面発現について染色され、次いでＩＦＮ‐γおよびＩＬ２またはＴＮＦのいずれかの細胞内発現について染色された。図２４に示されるように、ＭＶＡ／ＵＧＤ４ｄはｇａｇペプチド、ｐｏｌペプチドおよびＭＶＡに対してＣＤ８／ＩＦＮ‐γ応答を誘発した。ｇａｇペプチドの応答は、ＩＦＮ‐γと、ＩＬ２またはＴＮＦのいずれかとの両方を発現する多機能性であった。さらに、ＣＤ４／ＩＦＮ‐γ応答がｅｎｖペプチドの集合物に対して誘発された。
【０１６８】
体液性応答はＥＬＩＳＡによって計測された（図２５）。ＵＧＤ  ｅｎｖに対する強い応答が１回の免疫化処置の３週間後に実証され、第２の免疫化処置によって増強された。加えて、強いワクシニアウイルス応答が１回および２回の免疫化処置の後で誘発された。
【０１６９】
【表４】
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【０１７０】
【表５】
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【０１７１】
【表６】
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【０１７２】
【表７】
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【０１７３】
【表８】
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【０１７４】
【表９】
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【０１７５】
【表１０】
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実施例４
この実施例は、安定な組換えＭＶＡウイルスを生成するためのさらなる挿入部位の使用について実証する。ＭＶＡウイルスゲノムのＤｅｌ  ＩＩＩ領域はいくつかの非必須遺伝子および遺伝子フラグメントを含有しており、よって歴史的に異種核酸配列を挿入するために使用されてきた。したがって、ＭＶＡのｄｅｌ  ＩＩＩ挿入部位周辺の隣接領域が、フラグメント化遺伝子または非必須遺伝子の存在について分析された。いくつかの細胞においてＶＡＣＶの複製に重要であることが知られている遺伝子、すなわちＡ５０Ｒ  ＤＮＡリガーゼおよびＢ１Ｒキナーゼは、ｄｅｌ  ＩＩＩ挿入部位からそれぞれ約１ｋｂｐおよび１．８ｋｂｐに位置していた。本発明者らは、Ｄｅｌ  ＩＩＩ挿入部位に隣接する非必須遺伝子を除去すれば、より安定な挿入部位にすることができるであろうと推論した。この目的に向けて、Ａ５０Ｒ  ＤＮＡリガーゼＯＲＦの３’末端部分（左）、ならびにＢ１Ｒ  ＯＲＦの５’末端、およびプロモーター（右）を含む隣接配列を備えた核酸構築物（例えばシャトルベクター）が以下のように構築された。これにより、相同組換えが生じた時に上記２つの重要な遺伝子の間の非必須遺伝子の領域が有効に除去されるであろう。
【０１７６】
Ａ．  Ａ５０Ｒ／Ｂ１Ｒシャトルベクターの調製：
ＭＶＡゲノム中のｄｅｌ  ＩＩＩ挿入部位周辺の隣接領域（ｂｐ数１４３５５２、アカンビス（Acambis）３０００  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＹ６０３３５５））の分析から、いくつかの細胞においてＶＡＣＶの複製に重要であることが知られている少なくとも２つの遺伝子が明らかとなった。具体的には、Ａ５０Ｒ  ＤＮＡリガーゼ（ＯＲＦ１６３；ＡＣＡＭ３０００＿ＭＶＡ＿１６３；配列番号１１）およびＢ１Ｒキナーゼ（ＯＲＦ１６７；ＡＣＡＭ３０００＿ＭＶＡ＿１６７；配列番号１６）が、ｄｅｌ  ＩＩＩ挿入部位からそれぞれ約１ｋｂｐおよび１．８ｋｂｐに位置していた。したがって、ＯＲＦ１６３とＯＲＦ１６７との間にある非必須遺伝子またはフラグメント化遺伝子が除去の標的とされた。具体的には、ＯＲＦ１６４（Ａ５１Ｒ‐Ａ５５のフラグメント）、ＯＲＦ１６５（Ａ５６Ｒプロモーターの一部を欠いている）、ＯＲＦ１６６、およびフラグメント化したＡ５７Ｒが除去の標的となった。これらの非必須遺伝子およびフラグメント化遺伝子の除去を行うために、核酸構築物（すなわちシャトルベクター）が、ＭＶＡゲノムのＯＲＦ１６３とＯＲＦ１６７との間に相同組換えによって組換えを生じ、その結果として介在配列を除去することができるように設計された。そのような組換えを達成すると、核酸構築物は、ＡＣＡＭ３０００＿ＭＶＡ＿１６３由来の１つの核酸配列（左側の隣接配列）と、ＡＣＡＭ３０００＿ＭＶＡ＿１６７由来の１つの核酸配列（右側の隣接配列）とを含むことになる。これらの配列は該核酸構築物中で隣り合うことになり、これは、該配列がいかなるポックスウイルスＯＲＦによっても隔てられていないことを意味する。より具体的には、左側隣接部はＡ５０ＲリガーゼＯＲＦのＣ末端を含有することになり、右側隣接部はプロモーター領域およびＢ１Ｒ  ＯＲＦのＮ末端を含有することになる。ベクターの設計は図２６に示されている。
【０１７７】
シャトルベクターを構築するために、隣接部はそれぞれ別々に作出された。再構築Ｄｅｌ  ＩＩＩベクターの左側隣接部は最初に以下のようにして構築された。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子およびダイレクトリピートと共に左側隣接部全体（Ｉ８Ｒ遺伝子の一部を含有する隣接部１）を切り出すために、プラスミドＬＷ‐７３（図７）がＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化された。その後、ＧＦＰを含有するフラグメントが制限酵素ＡｃｓＩおよびＳａｃＩで消化されてＧＦＰ遺伝子が取り出された。
【０１７８】
ＯＲＦ１６３のＣ末端部分を含んでいる左側隣接部を作出するために、プライマーＬＷ４７０（配列番号２３）およびＬＷ４７１（配列番号２４）を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によってＭＶＡゲノムからＤＮＡフラグメントが増幅された。ＰＣＲ増幅は標準的な条件を使用して実施された。次に、ＯＲＦ１６３の末端のダイレクトリピートが、プライマーＬＷ‐４７２（配列番号２５）およびＬＷ‐４７３（配列番号２６）を使用してＭＶＡゲノムから増幅された。最後に、ＥｃｏＲＩ部位およびＸｈｏＩ部位を備えたベクター骨格、ＡｃｓＩ部位およびＳａｃＩ部位を備えたＧＦＰ遺伝子、ＥｃｏＲＩ部位およびＡｓｃＩ部位を含有するＯＲＦ１６３フラグメント（左側隣接部）、ならびにＳａｃＩ部位およびＸｈｏＩ部位を含有するＯＲＦ１６３のＣ末端領域由来のダイレクトリピートが合わせてライゲーションされて、中間プラスミド＃２７４３が形成された。
【０１７９】
ＯＲＦ１６７のＮ末端部分（そのプロモーター領域を含む）を含有している右側隣接部を作出するために、中間プラスミド＃２７４３は制限酵素ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されて右側隣接部が放出された。次に、プライマーＬＷ‐４７４（配列番号２７）およびＬＷ‐４７５（配列番号２８）を使用してＭＶＡゲノムからＤＮＡフラグメントがＰＣＲ増幅された。このフラグメントは制限酵素ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化され、該消化フラグメントは同様に消化されたシャトルベクター骨格にライゲーションされてＬＷ‐６７６核酸構築物が作られた。（図２７）
ｐＬＷ‐７６の顕著な特色は次のとおりである：
１）  該ベクターは、ＭＶＡゲノム中のＡ５０Ｒ  ＤＮＡリガーゼ遺伝子（ＯＲＦ１６３）の端部と、プロモーターおよびＢ１Ｒキナーゼ遺伝子（ＯＲＦ１６７）のＮ末端部分との間に外来遺伝子を挿入するために設計されている。左側隣接部はＡ５０Ｒリガーゼ遺伝子の端部からなり、右側隣接部はプロモーターおよびＢ１Ｒキナーゼの先頭部からなる。
【０１８０】
２）  組換えウイルスの簡単な初期選択のためにＧＦＰ遺伝子が含まれている。
３）  ＧＦＰはＡ５０Ｒリガーゼ遺伝子のダイレクトリピートに隣接していることにより、組換えウイルスの継代が繰り返されるとＧＦＰが失われるのでＧＦＰの一時的発現を可能にする。特色２および３は、ＭＶＡ／ＨＩＶ組換え体を作製するために使用された初期のプラスミドｐＬＡＳ‐１およびｐＬＡＳ‐２にも含まれていた。
【０１８１】
その後、ウガンダのクレードＤのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（単離物ＡＯ７４１２）由来のｅｎｖ遺伝子が新しいｐＬＷ‐７６構築物にクローニングされた。このｅｎｖを含有する核酸構築物はその後細胞にトランスフェクションされ、該細胞をＭＶＡウイルスに感染させることでＨＩＶ  ＥＮＶタンパク質を発現する組換えＭＶＡウイルスｒＭＶＡ／ＵＧＤｅｎｖ（ｄｅｌＩＩＩｒｓｔ）が生成された。次いでこのウイルスが特徴解析された。
【０１８２】
ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）において生育させると、ｒＭＶＡ／ＵＧＤｅｎｖ（ｄｅｌＩＩＩｒｓｔ）による感染がシンシチウム型の細胞質効果（ＣＰＥ）をもたらすことが観察された。これは、再構築されたｄｅｌ  ＩＩＩ部位で生じた組換えの際の非必須Ａ５６ヘマグルチニン遺伝子の欠失に起因していた。正常なｒＭＶＡはフレイ（flay）フォーカス（図２８Ａ）を有していたが、ｒＭＶＡ／ＵＧＤｅｎｖ（ｄｅｌＩＩｒｔ）に感染すると、シンシチウム形成を示すフォーカスを示し、凝縮されたシンシチウムへと進行した。（図２８Ｂ）。
【０１８３】
その後、ｒＭＶＡ／ＵＧＤｅｎｖ（ｄｅｌＩＩＩｒｓｔ）は、挿入された異種核酸配列の安定性に関して特徴解析された。これは、ＣＥＦ細胞中でウイルスを繰り返し継代すること、および、各世代について、発現されたＨＩＶ  ＥＮＶタンパク質の存在を試験することにより行われた。ＥＮＶタンパク質の検出は、ＨＩＶエンベロープタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いてウイルスのプラークをスクリーニングすることにより行われた。ｒＭＶＡ／ＵＧＤｅｎｖ（ｄｅｌＩＩＩｒｓｔ）の安定性は、ｄｅｌ  ＩＩ領域にｅｎｖ遺伝子を含有しているウイルス、およびｅｎｖ遺伝子が中央の保存領域へ挿入されたウイルスと比較された。この比較の結果は図２９に示されている。発現されているＥＮＶタンパク質のレベルも、ＨＩＶ  ＥＮＶタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用してウエスタンブロット法により計測された。
【０１８４】
図２９は、ＭＶＡ／ＵＧＤｅｎｖ（ｄｅｌ  ＩＩ）が、ｅｎｖ内部に生じ、かつ隣接するＭＶＡに及んでいる欠失が原因で、明らかに不安定であったことを示している。ＵＧＤ  ｅｎｖが、ＭＶＡ／ＵＧＤｅｎｖ（Ｉ８／Ｇ１）のように２つのＶＡＣＶ必須遺伝子の間に置かれると、生存可能な欠失が防止された。最後に、ＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子のｒＭＶＡ／ＵＧＤｅｎｖ（ｄｅｌ  ＩＩＩｒｓｔ）への組み入れは、少なくとも１１回の継代を通じて安定であることが観察された。
【０１８５】
図３０は、１１種のウイルス構築物が同様の量のＥＮＶタンパク質を発現したことを示している。
したがって、これらの研究の結果は、ＭＶＡウイルスゲノムのｄｅｌ  ＩＩＩ領域が、非必須遺伝子を除去してｄｅｌ  ＩＩＩ部位を再構築することにより、より安定となったことを示唆している。
【０１８６】
本発明は明瞭さおよび理解を目的としてある程度詳細に説明されているが、当業者であれば、本発明の真の範囲から逸脱することなく形態および詳細の様々な変更を行なうことができることを認識するであろう。上記に引用されたすべての図面、表および付録、ならびに特許、出願および公開は、参照により本願に組込まれる。
【図８】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図９】
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【図１０】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３１−４】
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【図３１−５】
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【図３１−６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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