(57)【要約】  Dll4結合分子、好ましくは、VHHおよびVHのようなDll4結合免疫グロブリン単一可変ドメイン、前記を含む医薬組成物、並びに脈管形成におけるDll4媒介作用と密接に関係する疾患の治療における前記の使用。VEGF-Aとも結合する二重特異性Dll4結合分子。Dll4結合分子をコードする核酸、宿主細胞および前記を調製する方法。
2013506410.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
4つのフレームワーク領域および3つの相補性決定領域、それぞれCDR1、CDR2およびCDR3を有する少なくとも1つの可変ドメインを含むDll4結合分子であって、前記CDR3が、
（a）配列番号：1から166および458、
（b）配列番号：333から353、または、
（c）配列番号：375から395、
に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する、前記Dll4結合分子。
【請求項２】
単離された免疫グロブリン単一可変ドメインであるか、または前記免疫グロブリン単一可変ドメインの1つまたは2つ以上を含むポリペプチドである、請求項1に記載のDll4結合分子であって、前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、4つのフレームワーク領域および3つの相補性決定領域、それぞれCDR1、CDR2およびCDR3から成り、さらに前記CDR3が、
（a）配列番号：1から166および458、
（b）配列番号：333から353、または、
（c）配列番号：375から395
に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する、前記請求項1に記載のDll4結合分子。
【請求項３】
1つまたは2つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインが、
（a）配列番号：1から166に示される第一のグループのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するCDR3、
（b）配列番号：167から332および459に示される第二のグループのアミノ酸配列から選択される配列内に、表5に示すように、部分配列として含まれるアミノ酸配列を有するCDR1およびCDR2、
を含み、ここで配列番号：1から166について、前記第一のグループの配列番号：xが前記第二のグループの配列番号：yとy＝x＋166で一致する、請求項2に記載のDll4結合分子。
【請求項４】
1つまたは2つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインが、
（a）配列番号：333から353に示されるアミノ酸配列の前記第一のグループから選択されるアミノ酸配列を有するCDR3、
（b）配列番号：354から374に示される第二のグループの配列から選択される配列内に、表16-Aに示すように、部分配列として含まれるアミノ酸配列を有するCDR1およびCDR2、
を含み、ここで前記第一のグループの配列番号：xが前記第二のグループの配列番号：yとy＝x＋21で一致する、請求項2に記載のDll4結合分子。
【請求項５】
1つまたは2つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインが、
（a）配列番号：375から395に示される前記第一のグループのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するCDR3、
（b）配列番号：396から416に示される第二のグループの配列から選択される配列内に、表16-Bに示すように、部分配列として含まれるアミノ酸配列を有するCDR1およびCDR2、
を含み、ここで前記第一のグループの配列番号：xが前記第二のグループの配列番号：yとy＝x＋21で一致する、請求項2に記載のDll4結合分子。
【請求項６】
1つまたは2つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHである、請求項2から5のいずれか1項に記載のDll4結合分子。
【請求項７】
1つまたは2つ以上のVHHが、配列番号：167から332および459に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項6に記載のDll4結合分子。
【請求項８】
1つまたは2つ以上のVHHが、配列番号：354から374に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項6に記載のDll4結合分子。
【請求項９】
1つまたは2つ以上のVHHが配列番号：396から416に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項6に記載のDll4結合分子。
【請求項１０】
請求項3に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインの親和性増進によって得られた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１１】
請求項7に記載のVHHの親和性増進によって得られたVHH。
【請求項１２】
配列番号：356および358に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するVHH。
【請求項１３】
請求項12に記載のVHHのヒト化によって得られた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１４】
配列番号：402、407および416に示される配列から選択されるアミノ酸配列を有するVHH。
【請求項１５】
請求項14に記載のVHHのヒト化によって得られた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１６】
請求項3に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインのヒト化によって得られた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１７】
請求項10に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインのヒト化によって得られた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１８】
配列番号：417のアミノ酸残基252−282に一致するEGF-2ドメイン内に全体的にまたは部分的に含まれるDll4のエピトープと結合する、請求項1に記載のDll4結合分子。
【請求項１９】
免疫グロブリン可変ドメインまたは前記ドメインを含むポリペプチドである、請求項18に記載のDll4結合分子。
【請求項２０】
請求項1から19のいずれか1項に記載のDll4結合分子をコードする核酸分子または前記を含むベクター。
【請求項２１】
請求項20に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項２２】
請求項1から19のいずれか1項に記載の少なくとも1つのDll4結合分子を活性成分として含む医薬組成物。
【請求項２３】
脈管形成におけるDll4媒介作用と密接に関係する疾患の治療のための請求項22に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
癌および癌性疾患の治療のための請求項22に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
眼の疾患の治療のための請求項22に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
（a）配列番号：1から166および458、
（b）配列番号：333から353、または、
（c）配列番号：375から395、
に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する配列を含むペプチド。
【請求項２７】
請求項26に記載のペプチドをコードする核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの治療方法の分野、特に癌療法並びにそのような治療方法で有用な薬剤および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
US 2008/0014196に要約したように、脈管形成は多数の疾患（固形腫瘍および転移を含む）に関与している。腫瘍の増殖の場合、脈管形成は、過形成から新形成への移行に、さらに腫瘍の増殖および転移のための栄養提供に必須であるように思われる（Folkman et al., Nature 339 -58, 1989）（前記脈管形成は正常細胞と比較して腫瘍細胞が有利な増殖を獲得することを可能にする）。したがって、抗脈管形成療法は、いくつかの腫瘍タイプにとって重要な治療選択肢となっている。これらの治療方法はVEGF経路の遮断に焦点を当てている（Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov. 2004 May;3(5):391-400）。
Notchシグナル伝達系路は、細胞対細胞情報伝達に重要であり、前記は胚発育時および成熟動物における多数の細胞分化プロセスを制御する遺伝子調節機構に必要である。Notchシグナリングは、多くの癌で（例えばT細胞急性リンパ芽球性白血病および固形腫瘍で）調節障害を示す（Sharma et al. 2007, Cell Cycle 6 (8): 927-30；Shih et al., Cancer Res. 2007 Mar 1;67(5): 1879-82）。
Dll4（またはデルタ様4またはデルタ様リガンド4）はNotchリガンドのデルタファミリーのメンバーである。Dll4の細胞外ドメインは、N-末端ドメイン、デルタ/セルレート/Lag-2（Delta/Serrate/Lag-2）（DSL）ドメインおよび縦列の8つの表皮成長因子（EGF）様リピートを含む。一般的には、EGFドメインは、hDll4のアミノ酸残基218−251（EGF-1；ドメイン1）、252−282（EGF-2；ドメイン2）、284−322（EGF-3；ドメイン3）、324−360（EGF-4；ドメイン4）および362−400（EGF-5；ドメイン5）を、アミノ酸残基約173−217のDSLドメインおよびアミノ酸残基約27−172のN-末端ドメインとともに含むと理解されている（WO 2008/076379）。
【０００３】
Dll4は血管内皮（特に動脈内皮）で高度に選択的な発現を示すことが報告された（Shutter et al. (2000) Genes Develop. 14: 1313-1318）。マウスにおける最近の研究は、DLL4はVEGFによって誘発されること、および脈管の発芽および分枝を抑制する負のフィードバック調節因子であることを示した。この役割と一致して、Dll4の欠落または阻害は過剰な脈管形成をもたらす（Scehnet et al., Blood. 2007 Jun 1; 109(11):4753-60）。この脱抑制性脈管形成は、非生産的脈管構造の形成のために、抗VEGF療法に耐性を示す腫瘍に対してさえ逆説的に腫瘍増殖を低下させる（Thurston et al., Nat Rev Cancer. 2007 May;7(5):327-31；WO 2007/070671；Noguera-Troise et al., Nature. 2006 Dec 21; 444:7122）。さらにまた、VEGFおよびDll4の組合せによる阻害は、複数の腫瘍タイプの異種移植モデルで抗VEGFのみと比較して優れた抗腫瘍活性を提供することが示されている（Noguera-Troise et al., Nature. 2006 Dec 21; 444(7122):1032-7；Ridgway et al., Nature. 2006 Dec 21;444(7122):1083-7）。これらの結果により、Dll4は癌療法のための有望な標的と考えられ、Dll4を標的とする以下のいくつかの生物学的化合物が報告され、(前)臨床開発中である：REGN-421（＝SAR153192；Regeneron, Sanofi-Aventis; WO2008076379）およびOPM-21M18（OncoMed）（Hoey et al., Cell Stem Cell. 2009 Aug 7; 5(2):168-77）、前記は両方とも完全にヒトのDll4抗体である；YW152F（Genentech）、ヒト化Dll4抗体（Ridgway et al., Nature. 2006 Dec 21;444(7122):1083-7）；Dll4Fc（Regeneron, Sanofi-Aventis）、Dll4の細胞外領域およびヒトIgG1のFc領域を含む組換え融合タンパク質（Noguera-Troise et al., Nature. 2006 Dec 21;444:7122）。
【０００４】
しかしながら従来の技術水準のモノクローナル抗体（MAb）および融合タンパク質は、治療的応用の観点からいくつかの欠点を有する。すなわち、分解を防ぐために、それらを凍結温度近傍で保存しなければならない。さらにまた、腸管で急速に消化されるのでそれらは経口投与に適していない。癌治療用MAbのまた別の主要な制限は移送が困難なことであり、その結果、腫瘍内の濃度が低く全細胞を標的とすることができない。
上記観点から、改善されたヒト治療用Dll4結合分子を提供することが本発明の目的であった。
そのようなDll4結合分子（またはDll4アンタゴニスト）は、脈管形成におけるDll4媒介作用と密接に関係する疾患または症状の予防、治療、緩和および／または診断で組成物中の薬理学的に活性な薬剤として有用である。そのような疾患の例は癌および眼の疾患（加齢黄斑変性（AMD）および糖尿病性網膜症（DR）を含む）である。そのような疾患、異常または症状の予防、治療、緩和および／または診断のための方法（そのような薬剤および組成物の使用および／または投与を含む）を提供することも本発明のさらに別の目的であった。
特に、当分野で従来用いられているかおよび／または公知である薬剤、組成物および／または方法と比較して一定の利点を提供する薬理学的に活性な薬剤、組成物および／または方法を提供することが本発明の目的であった。これらの利点には、治療的および／または薬理学的特性の改善、および／または他の有利な特性、例えば、特に上記に記載した通常的な抗Dll4抗体またはそのフラグメントと比較して製造結果についての有利な特性が含まれる。
より具体的には、本発明の目的は、新規なDll4結合分子および／またはそれらを含むポリペプチド、およびとりわけ哺乳動物（特にヒト）のDll4と結合するDll4結合分子を提供することであり、そのような分子またはポリペプチドは本明細書に記載した治療目標および診断目標のために適切である。本発明のさらに別の目的は、Dll4と特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを提供することであった。
【発明の概要】
【０００５】
第一の特徴にしたがえば、Dll4結合分子、好ましくは、VHHおよびVHのようなDll4結合免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
別の特徴では、本発明はDLL4結合分子をコードする核酸および前記を含む宿主細胞に関する。
本発明はさらに製品または組成物に関し、前記製品または組成物は少なくとも1つの本発明のDll4結合分子および場合によってそのような組成物の1つまたは2つ以上のさらに別の成分を収納するかまたは含む。
本発明はさらに、Dll4結合分子、核酸、宿主細胞、本明細書に記載の製品および組成物を調製または創出する方法に関する。
本発明はさらにまた、Dll4結合分子、核酸、宿主細胞、本明細書に記載の製品および組成物の応用および使用、並びに脈管形成におけるDll4媒介作用と密接に関係する疾患および異常の予防および／または治療のための方法に関する。
本発明のこれらおよび他の特徴、実施態様、利点並びの応用は下記の更なる説明から明白となろう。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ヒト、アカゲザルおよびカニクイザルDLL4のアミノ酸配列アラインメント。
【図２】ヒトおよびマウスDLL4欠失変異体（スーパースクリプトではアミノ酸ドメイン境界部）。
【図３−１】hDLL4/hNotch1-Fc相互作用を遮断する精製VHH（ELISA）。
【図３−２】図３−１つづき。
【図３−３】図３−２つづき。
【図４−１】hDLL4/hNotch1-Fc相互作用を遮断する精製VHH（AlphaScreen）。
【図４−２】図４−１つづき。
【図４−３】図４−２つづき。
【図４−４】図４−３つづき。
【図４−５】図４−４つづき。
【図５−１】CHO-hDLL4/hNotch1-FcおよびCHO-mDLL4/hNotch1-Fc相互作用を遮断する精製VHH（FMAT）。
【図５−２】図５−１つづき。
【図５−３】図５−２つづき。
【図５−４】図５−３つづき。
【図５−５】図５−４つづき。
【図５−６】図５−５つづき。
【図５−７】図５−６つづき。
【図５−８】図５−７つづき。
【図５−９】図５−８つづき。。
【図５−１０】図５−９つづき
【図６−１】DLL4媒介Notch1切断を遮断する精製VHH（レポーター）。
【図６−２】図６−１つづき。
【図６−３】図６−２つづき。
【図６−４】図６−３つづき。
【図７−１】精製VHHと組換えヒトおよびマウスDLL4との結合（ELISA）。
【図７−２】図７−１つづき。
【図７−３】図７−２つづき。
【図７−４】図７−３つづき。
【図８−１】精製VHHと組換えヒトDLL1およびヒトjagged-1との結合（ELISA）。
【図８−２】図８−１つづき。
【図８−３】図８−２つづき。
【図９−１】精製VHHとヒト/マウス/カニクイザルDLL4との結合（FACS）。
【図９−２】図９−１つづき。
【図９−３】図９−２つづき。
【図９−４】図９−３つづき。
【図１０−１】hDLL4/hNotch1-Fc相互作用を遮断する親和性増進（affinity matured）VHH（ELISA）。
【図１０−２】図10−１つづき。
【図１１−１】CHO-hDLL4/hNotch1-FcおよびCHO-mDLL4/hNotch1-Fc相互作用を遮断する精製親和性増進VHH（FMAT）。
【図１１−２】図11−１つづき。
【図１１−３】図11−２つづき。
【図１１−４】図11−３つづき。
【図１２−１】精製VHHと組換えヒト/マウスDLL4との結合（ELISA）。
【図１２−２】図12−１つづき。
【図１２−３】図12−２つづき。
【図１２−４】図12−３つづき。
【図１３−１】精製親和性増進VHHと組換えヒトDLL1およびヒトjagged-1との結合（ELISA）。
【図１３−２】図13−１つづき。
【図１３−３】図13−２つづき。
【図１３−４】図13−３つづき。
【図１４−１】精製VHHとヒト/マウス/カニクイザルDLL4との結合（FACS）。
【図１４−２】図14−１つづき。
【図１４−３】図14−２つづき。
【図１４−４】図14−３つづき。
【図１４−５】図14−４つづき。
【図１４−６】図14−５つづき。
【図１５】HUVEC増殖のDll4媒介阻害におけるVHHの作用の評価。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
定義
特段に指示または規定されなければ、用いられる全ての用語は当分野でのそれらの通常の意味を有し、前記通常の意味は当業者には明白であろう。例えば通常の手引書（例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), VoIs. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)；Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990)；およびRoitt et al., "Immunology" (2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York, 1989）の他に本明細書に引用した一般的な背景技術を参照することができる。さらにまた、特段の指示がなければ、特に詳細には記載されていない全ての方法、工程、技術および操作を実施することができ、それらは当業者には明白であるのでそれ自体公知の態様で実施されている。繰り返せば、例えば標準的な手引書、上記で言及した一般的な背景技術および本明細書で引用したさらに別の参考文献を参照できる。
特段の指示がなければ、“免疫グロブリン”という用語（本明細書で重鎖抗体または通常の4鎖抗体のどちらを指すために用いられていようとも）は、完全なサイズの抗体、その個々の鎖の他にその部分、ドメインまたはフラグメントの全てを含む一般的な用語として用いられる。
【０００８】
特段の指示がなければ、“Dll4結合分子”という用語は、抗Dll4抗体、抗Dll4抗体フラグメント、“抗Dll4抗体様分子”およびこれらのいずれかとの連結物を含む。抗体にはモノクローナル抗体およびキメラ化モノクローナル抗体が含まれるが、ただしこれらに限定されない。“抗体”という用語には、完全な免疫グロブリン、宿主細胞での組換え発現により生成された類似のモノクローナル抗体が、Dll4抗体フラグメントまたは“抗体様分子”（単鎖抗体および線状抗体、いわゆる“SMIP”（“小モジュール免疫医薬（Small Modular Immunopharmaceutical）”）、例えばWO 02/056910に記載されている）を含む）と同様に含まれる。抗Dll4抗体様分子には、本明細書に定義する免疫グロブリン単一可変ドメインが含まれる。抗体様分子の他の例は、免疫グロブリンスーパーファミリー抗体（IgSF）またはCDR移植分子である。
本明細書で用いられる“配列”（例えば“免疫グロブリン配列”、“（単一）可変ドメイン配列”、“VHH配列”または“タンパク質配列”のような用語として用いられる）という用語は、文脈がより限定的な解釈を要求していない場合は、一般的には、対応するアミノ酸配列および前記をコードする核酸配列またはヌクレオチド配列の両方を含むと理解されるべきである。
2つのDll4結合分子配列間の“配列同一性”は、2つの配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。前記は、WO 08/020079の49ページおよび50ページのパラグラフ）に記載されているように計算または決定できる（“配列類似性”は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換を示すアミノ酸のパーセンテージを示す）。
【０００９】
本明細書で用いられる（ポリペプチドまたはタンパク質の）“ドメイン”という用語は、その三次元構造をタンパク質の他の部分とは独立に維持する能力を有する折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般的には、ドメインはタンパク質のそれぞれ別個の機能的特性をもたらし、多くの場合当該タンパク質および／または当該ドメインの残りの部分の機能を損なうことなく、付加し、除去しまたは他のタンパク質に移転させることができる。
本明細書で用いられる“免疫グロブリンドメイン”という用語は、抗体鎖（例えば通常の4鎖抗体または重鎖抗体の鎖）の球形領域、または本質的にそのような球形領域から成るポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、抗体分子に特徴的な免疫グロブリンの折り畳みを保持するという特徴を有する。前記折り畳みは、2つのベータシート内に編成された（場合によって保存ジスルフィド結合によって安定化されている）約7つのアンチパラレルベータ鎖をもつ2層のサンドイッチから成る。
本明細書で用いられる“免疫グロブリン可変ドメイン”という用語は、本質的に4つの“フレームワーク”から成る免疫グロブリンドメインを意味する。前記フレームワークドメインは、当分野および本明細書下記では“フレームワーク領域1”もしくは“FR1”、“フレームワーク領域2”もしくは“FR2”、“フレームワーク領域3”もしくは“FR3”、“フレームワーク領域4”もしくは“FR4”とそれぞれ称され、前記フレームワーク領域は、3つの“相補性決定領域”または“CDR”によって中断され、それらは、当分野および本明細書下記ではそれぞれ“相補性決定領域1”もしくは“CDR1”、“相補性決定領域2”もしくは“CDR2”、“相補性決定領域3”もしくは“CDR3”と称される。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般的構造または配列は以下のように示すことができる：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。抗原結合部位を保持することによって抗原に対する特異性を抗体に付与するのはこの免疫グロブリン可変ドメインである。
【００１０】
本明細書で用いられる“免疫グロブリン単一可変ドメイン”は、更なる別の可変免疫グロブリンドメインと対を形成することなく抗原のエピトープと特異的に結合することができる免疫グロブリン可変ドメインを意味する。本発明のこの意味での免疫グロブリン単一可変ドメインの例は、以下で定義される、免疫グロブリン単一可変ドメインVHおよびVL（VHドメインおよびVLドメイン）並びにラクダ科動物由来の“VHHドメイン”（または単に“VHH”）である。
上記定義の観点から、通常の4鎖抗体（例えば当分野で公知のIgG、IgM、IgA、IgDまたはIgE分子）の抗原結合ドメイン、またはFabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメント（例えばジスルフィド結合連結FvまたはscFvフラグメント）もしくは前記通常的4鎖抗体から誘導されるジアボディ（いずれも当分野では公知である）の抗原結合ドメインは、通常は免疫グロブリン単一可変ドメインとみなされないであろう。なぜならば、抗原の対応するエピトープとの結合は通常一つの（単一の）免疫グロブリンドメインによって生じるのではなく、一対の（会合）免疫グロブリンドメイン（例えば軽鎖および重鎖可変ドメイン）によって、すなわち免疫グロブリンドメインのVH-VL対によって（これらは一緒になって対応する抗原のエピトープと結合する）生じるからである。
【００１１】
“VHHドメイン”（VHH、VHHドメイン、VHH抗体フラグメントおよびVHH抗体としても知られている）は、最初は“重鎖抗体”（すなわち“軽鎖を欠く抗体”）の抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインと記載されていた（Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 1993, 363:446-448）。“VHHドメイン”という用語は、通常の4鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（前記は本明細書では“VHドメイン”と称する）と区別するために、さらに通常の4鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（前記は本明細書では“VLドメイン”と称する）と区別するために選択された。VHまたはVLドメインとは対照的に（前記は通常単一抗原結合ドメインとしてはエピトープと結合することはない）、VHHドメインは、また別の抗原結合ドメインの非存在下でエピトープと特異的に結合することができる。VHHドメインは、ただ1つの免疫グロブリンドメインによって形成された小さい強力で効率的な抗原認識ユニットである。
本発明の関係では、VHHドメイン、VHH、VHHドメイン、VHH抗体フラグメント、VHH抗体、並びに“ナノボディ（Nanobody(商標)）”および“ナノボディ(商標)ドメイン”（“ナノボディ（Nanobody）”とはAblynx N.V.社（Ghent; Belgium）の商品名である）は相互に用いられ、免疫グロブリン単一可変ドメインの典型例（一般構造：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4を有し、第二の免疫グロブリン可変ドメインの存在を必要としないでエピトープと特異的に結合する）であり、いわゆる“ホールマーク残基”（例えばWO 2009/109635、図１で定義される）によりVHとは区別される。
【００１２】
“VHドメイン”および“VLドメイン”（または単に“VH”もしくは“VL”）（4鎖抗体、特にヒト抗体由来）は、それぞれ“単一ドメイン抗体”であり、前記はまた“ドメイン抗体”、“Dab”、“Domain Antibody”および“dAb”（“Domain Antibody”および“dAb”という用語はグラクソスミスクライン（GlaxoSmithKline）グループ会社の商品名として用いられている）としても知られ、例えば以下に記載されている：Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341: 544-546 (1989)；Holt, L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003)；およびWO 2003/002609。
単一ドメイン抗体は、非ラクダ科哺乳動物（特にヒト）の抗体の重鎖または軽鎖の可変ドメインに対応する。一抗原結合ドメインとして（すなわちそれぞれVLまたはVHドメインと対を形成することなく）エピトープと結合するために、そのような抗原結合特性のための特別な選別（例えばヒト一VHまたはVLドメイン配列ライブラリーを用いることによる）が必要である。
単一ドメイン抗体は、VHHのように大まかに約13から約16 kDaの分子量を有し、さらに完全にヒト配列に由来する場合は例えばヒトの治療薬のためのヒト化を必要としない。VHHドメインの場合のように、それらは原核細胞発現系でもまた良好に発現され、全体的な製造コストを大いに削減する。
【００１３】
免疫グロブリン単一可変重鎖ドメインのアミノ酸残基は、Kabatら（"Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91）によって提供されたVHドメインのための一般的ナンバリングにしたがって番号が付与され、Riechmann and Muyldermansの論文（J. Immunol. Methods 231:2538, 1999）の例えば図2に示されているラクダ科動物由来のVHHドメインに適用されているとおりである。このナンバリングにしたがって例示すれば、
−FR1は1−30位のアミノ酸残基を含み、
−CDR1は31−35位のアミノ酸残基を含み、
−FR2は36−49位のアミノ酸残基を含み、
−CDR2は50−65位のアミノ酸残基を含み、
−FR3は66−94位のアミノ酸残基を含み、
−CDR3は95−102位のアミノ酸残基を含み、
−FR4は103−113位のアミノ酸残基を含む。
例えばWO 2006/040153およびWO 2006/122786に詳細に記載されているように、VHHはフレームワーク領域内のアミノ酸の一定の組合せに応じて特異的に3つのグループ、すなわち（a）“GLEW-グループ”（“GLEW様”配列もまた含まれる）；（b）“KERE-グループ”（KQRE配列もまた含まれる）；および（c）“103P,R,S-グループ”に分類することができ、さらに特異的な“ホールマーク残基”を特徴とし得る。
【００１４】
“親和性増進（affinity matured）Dll4結合分子”は1つまたは2つ以上のCDRにおける1つまたは2つ以上の変異を有し、この変異は、対応する親Dll4結合分子と比較してDll4に対する親和性の改善をもたらす。本発明の親和性増進Dll4結合分子は、例えば以下に記載されている当分野で公知の方法によって調製することができる：Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783；またはBarbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 38093813；Shier et al., 1995, Gene 169:147-155；Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004；Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9；およびHawkins et al., 1992, J. MoI. Biol. 226(3): 889 896；KS Johnson and RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996。
本発明のためには、“配列番号：xのアミノ酸配列”には、特段の記載がなければ、関連する配列（例えば完全な免疫グロブリン単一可変ドメイン配列またはCDR配列）に関して以下の配列が含まれる：
a）対応する配列番号：xに示された配列と100%同一であるアミノ酸配列；
b）対応する配列番号：xに示された配列と少なくとも80%アミノ酸同一を有するアミノ酸配列；
c）対応する配列番号：xに示された配列と3つ、2つまたは1つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列。
【００１５】
“エピトープ”および“抗原決定基”（前記は相互に用いることができる）という用語は、抗原結合分子、例えば通常の抗体または本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、およびより具体的には前記分子の抗原結合部位によって認識される巨大分子（例えばポリペプチド）の部分を指す。エピトープは、免疫グロブリンに対する最少結合部位を規定し、したがって免疫グロブリンに対し特異性を伝える。
本明細書で用いられる“二パラトープ性Dll4結合分子”または“二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメイン”という用語は、本明細書で規定される第一の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび第二の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むDll4結合分子を意味し、ここで前記分子はDll4抗原の異なる2つのエピトープと結合することができる。本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、異なる特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインから構成される。エピトープを認識する、抗原結合分子（例えば本発明の抗体またはポリペプチド）の部分はパラトープと呼ばれる。
一定のエピトープ、抗原またはタンパク質（またはその少なくとも1つの部分、フラグメントまたはエピトープ）と“結合”または“特異的に結合する”ことができる、前記に“親和性を有する”、および／または前記に対して“特異性を有する”ポリペプチド（例えば免疫グロブリン、抗体、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはそれらを含むポリペプチド、または一般的に抗原結合分子もしくはそのフラグメント）は、エピトープ、抗原またはタンパク質に“対する”、もしくはエピトープ、抗原またはタンパク質に“向けられた”と称されるか、またはそのようなエピトープ、抗原またはタンパク質に対する“結合分子”である。
【００１６】
一般的には、“特異性”という用語は、個々の抗原結合分子または抗原結合タンパク質（例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン）分子が結合できる種々のタイプの抗原またはエピトープの数を指す。抗原結合分子の特異性はその親和性および／またはアビディティーを基準に決定できる。親和性（抗原と抗原結合タンパク質の解離の平衡定数（KD）によって表される）は、エピトープと抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度の測定値であり、KD値が小さければ小さいほど、エピトープと抗原結合分子間の結合強度は強くなる（或いは、親和性はまた親和性定数（KA）として表すことができる：KAは1/KDである）。当業者には明白なように（例えば本明細書の更なる開示に基づいて）、親和性は対象の特定の抗原に応じてそれ自体公知の態様で決定することができる。アビディティーは、抗原結合分子（例えば免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインまたは前記を含むポリペプチド）と関係抗原間の結合強度の測定値である。アビディティーは、エピトープと抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性および当該抗原結合分子上に存在する関係結合部位の数の両方に関係する。
【００１７】
アミノ酸残基は、標準的な3文字または1文字アミノ酸コード（一般的に公知であり当分野で合意されている）にしたがって表示されるであろう。2つのアミノ酸配列を比較するとき、“アミノ酸の相違”という用語は、第二の配列と比較して参照配列のある位置における表示された数のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を指す。置換の場合にはそのような置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換であろう。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸残基が類似する化学的構造の別のアミノ酸残基により置換されることを意味し、前記は、当該ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性に対してほとんどまたは本質的に影響を与えない。そのような保存的アミノ酸置換は、例えばWO98/49185から当分野で周知であり、この場合、保存的アミノ酸置換は、好ましくは以下のグループ（i）−（v）内のあるアミノ酸が同じグループの別のアミノ酸残基によって代用される置換である：（i）小さな脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ala、Ser、Thr、ProおよびGly；（ii）極性で負に荷電した残基およびそれらの（非荷電）アミド：Asp、Asn、GluおよびGln；（iii）極性で陽性に荷電した残基：His、ArgおよびLys；（iv）大きな脂肪族、非極性残基：Met、Leu、Ile、ValおよびCys；および（v）芳香族残基：Phe、TyrおよびTrp。特に好ましい保存的アミノ酸置換は以下のとおりである：
AlaからGlyにまたはSerに；ArgからLysに；AsnからGlnにまたはHisに；AspからGluに；CysからSerに；GlnからAsnに；GluからAspに；GlyからAlaにまたはProに；HisからAsnにまたはGlnに；IleからLeuにまたはValに；LeuからIleにまたはValに；LysからArgに、GlnにまたはGluに；MetからLeuに、TyrにまたはIleに；PheからMetに、LeuにまたはTyrに；SerからThrに；ThrからSerに；TrpからTyrに；TyrからTroにまたはPheに；ValからIleにまたはLeuに。
【００１８】
核酸またはポリペプチド分子は、例えばその天然の生物学的供給源および／またはそれが入手された反応媒体または培養媒体と比較した場合に、それが前記供給源または媒体中で通常付随している少なくとも１つの他の要素、例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的要素もしくは巨大分子、または少なくとも１つの夾雑物質、不純物もしくはマイナー要素から分離されているときには、“本質的に単離された形態”であるとみなされる。特に核酸またはポリペプチド分子は、それが少なくとも2倍、特に少なくとも10倍、さらに特に少なくとも100倍さらに1000倍以上に精製されているとき、“本質的に単離されている”とみなされる。“本質的に単離された形態”の核酸またはポリペプチドは、適切な技術（例えば適切なクロマトグラフィー技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動）を用いて決定したとき好ましくは本質的に均質である。
【００１９】
“癌”または“癌性”という用語は、典型的には規律的でない細胞増殖／分裂を特徴とする生理学的状態を指すかまたは表す。本発明のDll4結合分子により治療されるべき癌の例には癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病含まれる（ただしこれらに限定されない）。Dll4アンタゴニストによる治療にUS2008/0014196で提唱された そのような癌のより具体的な例には以下が含まれる：扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸の癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜のまたは子宮の癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、肝臓癌、胃癌、メラノーマ、種々のタイプの頭部および頸部の癌。血管形成の調節障害は、本発明の組成物および方法によって治療できる多くの異常をもたらし得る。これらの異常には非新形成性および新形成性症状の両方が含まれる。新形成には上記に記載したものが含まれるが、ただしこれらに限定されない。Dll4アンタゴニストによる治療にUS2008/0014196で提唱された非新形成性異常には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：望ましくないまたは異常な肥大、関節炎、慢性関節リウマチ（RA）、乾癬、乾癬性プラーク、サルコイドーシス、アテローム性硬化症、アテローム硬化症性プラーク、糖尿病性および他の増殖性網膜症（未熟児網膜症を含む）、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑水腫、角膜血管新生、角膜移植血管新生、角膜移植拒絶、網膜／脈絡膜血管新生、眼角の血管新生（ルベオーシス）、眼の血管新生疾患、血管再狭窄、動静脈奇形（AVM）、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺過形成（グレーヴズ病を含む）、角膜および他の組織の移植、慢性炎症、肺の炎症、急性肺損傷／ARDS、敗血症、一次性肺高血圧、悪性肺滲出、大脳浮腫（例えば急性発作／閉鎖性頭部損傷／外傷に付随するもの）、滑膜炎症、RAにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、変形性関節症、難治性腹水、多発性嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、第三間隙形成液疾患（3rd spacing of fluid diseases）（膵炎、仕切り症候群、火傷、腸疾患）、子宮線維症、早産、慢性炎症、例えばIBD（クローン病および潰瘍性大腸炎）、同種異系腎移植拒絶、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくないまたは異常な組織塊増殖（非癌性）、血友病性関節、過形成瘢痕、毛の成長阻害、オシエル-ウェーバー（Osier-Weber）症候群、化膿性肉芽腫性水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管癒着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心膜滲出（例えば心膜炎に付随するもの）および肺滲出。
【００２０】
発明の詳細な説明
第一の特徴では、本発明は、4つのフレームワーク領域および3つの相補性決定領域、それぞれCDR1、CDR2およびCDR3を有する少なくとも1つの可変ドメインを含むDll4結合分子に関し、ここで、前記CDR3は、
（a）配列番号：1から166および458、
（b）配列番号：333から353、または、
（c）配列番号：375から395、
に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
アミノ酸配列a）（配列番号：1から166および458の第一のグループから選択される）は、表5および配列番号：167から332および459に示される第二のグループの配列から選択される対応するアミノ酸配列に部分配列として含まれる。
アミノ酸配列b）（配列番号：333から353の第一のグループから選択される）は、表16-Aおよび配列番号：354から374に示される第二のグループの配列から選択される対応する配列に部分配列として含まれる。
アミノ酸配列c）（配列番号：375から395の第一のグループから選択される）は、表16-Bおよび配列番号：396から416に示される第二のグループの配列から選択される対応する配列に部分配列として含まれる。
第二の特徴では、前記Dll4結合分子は、単離された免疫グロブリン単一可変ドメインまたは前記免疫グロブリン単一可変ドメインの1つもしくは2つ以上を含むポリペプチドであり、ここで、前記免疫グロブリン単一可変ドメインは4つのフレームワーク領域および3つの相補性決定領域、それぞれCDR1、CDR2およびCDR3から成り、さらに前記CDR3は、
（a）配列番号：1から166および458、
（b）配列番号：333から353、または、
（c）配列番号：375から395
に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２１】
さらに別の特徴では、前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、
（a）配列番号：1から166および458に示される第一のグループのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するCDR3、
（b）配列番号：167から332および459に示される第二のグループのアミノ酸配列から選択される配列内に表5に示すように部分配列として含まれるアミノ酸配列を有するCDR1およびCDR2、
を含み、ここで配列番号：1から166について、前記第一のグループの配列番号：xは前記第二のグループの配列番号：yとy＝x＋166で対応する。
さらに別の特徴では、前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、
（a）配列番号：333から353に示される前記第一のグループのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するCDR3、
（b）配列番号：354から374に示される第二のグループのアミノ酸配列から選択される配列内に表16-Aに示すように部分配列として含まれるアミノ酸配列を有するCDR1およびCDR2、
を含み、ここで前記第一のグループの配列番号：xは前記第二のグループの配列番号：yとy＝x＋21で対応する。
さらに別の特徴では、前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、
（a）配列番号：375から395に示される前記第一のグループのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するCDR3、
（b）配列番号：396から416に示される第二のグループのアミノ酸配列から選択される配列内に表16-Bに示すように部分配列として含まれるアミノ酸配列を有するCDR1およびCDR2、
を有し、ここで前記第一のグループの配列番号：xは前記第二のグループの配列番号：yとy＝x＋21で対応する。
【００２２】
好ましい実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインはVHHである。
さらに別の特徴では、VHHは表5および配列番号：167から332および459に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
治療的応用の観点から改善された特性（例えば親和性の強化または免疫原性の低下）を有するDll4結合分子は、例えば親和性増進（例えば合成、任意抽出または天然に存在する免疫グロブリン配列から出発する）、CDR移植、ヒト化、異なる免疫グロブリン配列に由来するフラグメントの結合、オーバーラッププライマーを用いるPCRアッセンブリー、および当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作する類似の技術または前述のいずれかの適切な任意の組み合わせのような技術によって、本発明の個々のDll4結合分子から入手できる。例えば標準的な手引書を更なる説明および実施例と同様に参照することができる。
好ましくは、親和性が高められた本発明のDll4結合分子は、別のDll4結合分子の親和性増進によって入手される（後者は親和性増進分子に関して“親”Dll4結合分子を意味する）。
したがってまた別の好ましい実施態様では、本発明のDll4結合分子は、上記に定義した親免疫グロブリン単一可変ドメインの親和性増進によって得られた免疫グロブリン単一可変ドメインである。
さらに別の好ましい実施態様では、本発明はVHHの親和性増進によって得られた免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
親和性増進のための適切な親Dll4結合分子は、例えば配列番号：167から332および459に示されたアミノ酸配列を有する上記に記載のVHHである。
さらに別の好ましい実施態様では、本発明は、配列番号：197に示されたアミノ酸配列を有するVHHの親和性増進によって得られた免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
さらに別の実施態様では、配列番号：197に示されたアミノ酸配列を有するVHHに由来する前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号：354から374に示されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインから選択される。
好ましい実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは配列番号：358に示されたアミノ酸配列を有するVHHである。
さらにより好ましい実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号：358に示されたアミノ酸配列を有するVHHのヒト化によって得られた。
【００２３】
別の好ましい実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号：356に示されたアミノ酸配列を有するVHHである。
さらにより好ましい実施態様では、本発明は、配列番号：356に示されたアミノ酸配列を有するVHHのヒト化によって得られた免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
さらに別の好ましい実施態様では、本発明は、配列番号：224に示されたアミノ酸配列を有するVHHの親和性増進によって得られた免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
さらに別の実施態様では、配列番号：224に示されたアミノ酸配列を有するVHHに由来する前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号：396から416に示されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインから選択される。
別の好ましい実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号：402に示されたアミノ酸配列を有するVHHである。
さらにより好ましい実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号：402に示されたアミノ酸配列を有するVHHのヒト化によって得られた。
別の好ましい実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号：416に示されたアミノ酸配列を有するVHHである。
さらにより好ましい実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号：416に示されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインのヒト化によって得られた。
別の好ましい実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号：407に示されたアミノ酸配列を有するVHHである。
さらにより好ましい実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号：413に示されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインのヒト化によって得られた。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様にしたがえば、免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えばVHおよびVHH）は固有の構造的特徴および機能的特性を有し、前記特徴および特性は、それら免疫グロブリン単一可変ドメインを機能的な抗原結合分子として治療に使用するためにそれらを極めて有利なものにする。特に（ただしそのことに限定されないが）、VHHドメイン（本質的に軽鎖可変ドメインと対を形成することなく抗原と機能的に結合できるように“設計”されている）は、ただ一つの比較的小さく機能的な抗原結合構造単位として機能を有し得る。
それらの固有の特性により、免疫グロブリン単一可変ドメインは、本明細書で定義したように、VHHまたはVH（またはVL）と同様に、単独でまたはより大きなポリペプチド（例えば二パラトープ性分子）の部分として以下の多数の重要な利点を提供する：
−高親和性および高選択性で抗原と結合するためにただ1つのドメインしか必要とされず、したがって2つの別々のドメインを存在させることも、これら2つのドメインが正しい空間的配置及び構造で存在していることを確認する（すなわちscFVのリンカーの場合のように特別に設計したリンカーの使用によって確認する）必要もない；
−免疫グロブリン単一可変ドメインは単一の核酸分子から発現させることができ、さらに一切の翻訳後改変（例えばグリコシル化）を必要としない；
−免疫グロブリン単一可変ドメインは多価および多重特異性形式へと容易に操作できる（本明細書でさらに考察する）；
−免疫グロブリン単一可変ドメインはそれらの標的に対して高度な特異性および親和性、固有の低毒性を有し、輸液または注射以外の代替経路により投与できる；
−免疫グロブリン単一可変ドメインは、熱、pH、プロテアーゼおよび他の変性物質または変性条件に対して極めて安定であり、したがって冷蔵装置を用いることなく調製、保存または輸送することができる；
−免疫グロブリン単一可変ドメインは、小規模および工業規模の両方で調製が容易であり相対的に安価である。例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび前記を含むポリペプチドは（例えば以下でさらに説明するように）微生物発酵を用いて生産でき、例えば通常の抗体の場合のように哺乳動物発現系を必要としない；
−免疫グロブリン単一可変ドメインは、通常の4鎖抗体およびその抗原結合フラグメントと比較して相対的に小さく（約15kDa、すなわち通常のIgGの十分の一）、したがって組織（固形腫瘍および他の高密度組織を含むがただしこれらに限定されない）への高い貫通性を示し、該当する通常の4鎖抗体およびその抗原結合フラグメントより高い用量で投与できる；
−VHHは特殊ないわゆる“窩結合特性”を有し（4鎖抗体由来VHと比較してとりわけVHHの伸長CDR3ループによるものである）、したがってまた通常の4鎖抗体およびその抗原結合フラグメントが近づくことができない標的およびエピトープにも近づくことができる；
−VHHは、高度に可溶性であり、非常に安定で凝集傾向をもたない（Wardら（Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989）が記載したマウス由来抗原結合ドメインの場合）という特異な利点を有する。
【００２５】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、それらが入手された特定の生物学的供給源または特定の調製方法に限定されない。例えば、VHHの入手は以下の工程を含み得る：
（1）天然に存在する重鎖抗体のVHHドメインを単離する工程；または重鎖抗体もしくはVHHを含むライブラリーをスクリーニングしてそれらからVHHを単離する工程；
（2）天然に存在する配列を有するVHHをコードする核酸分子を発現する工程；
（3）天然に存在する配列を有するVHHを（場合によって親和性増進の後で）“ヒト化する”工程（本明細書に記載するように）、またはそのようなヒト化VHHをコードする核酸を発現させる工程；
（4）ある動物種、特に哺乳動物種（例えばヒト）由来の天然に存在する抗体から免疫グロブリン単一可変重鎖ドメインを（本明細書に記載するように）“ラクダ化する”工程またはそのようなラクダ化ドメインをコードする核酸分子を発現する工程；
（5）VHを“ラクダ化する”工程、またはそのようなラクダ化VHをコードする核酸分子を発現させる工程；
（6）タンパク質、ポリペプチドまたは他のアミノ酸配列を合成または半合成により調製する技術を用いる工程；
（7）核酸合成技術を用いてVHHドメインをコードする核酸分子を調製し、続いてそのようにして得られた核酸を発現させる工程；
（8）重鎖抗体またはVHHを親和性増進、変異導入（例えばランダム変異導入または部位特異的変異導入）および／または任意の他の技術に付し、VHHの親和性および／または特異性を増進させる工程；および／または
（9）上述の工程の組合せまたは選択。
上述の工程を実行するための適切な方法と技術は当分野でよく知られており、当業者には明らかであろう。
【００２６】
具体的な実施態様にしたがえば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは本発明のポリペプチドに存在する免疫グロブリン単一可変ドメインは、天然に存在するVHHドメインのアミノ酸配列と本質的に一致するが、“ヒト化”された（場合によって親和性増進後にヒト化される）アミノ酸配列を有するVHHドメインである（前記ヒト化はすなわち、前記天然に存在するVHH配列のアミノ酸配列中の1つまたは2つ以上のアミノ酸残基を、ヒトの通常の4鎖抗体の可変重鎖ドメイン内の対応する位置に存在する1つまたは2つ以上のアミノ酸残基で置き換えることによる）。前記は、当業者が日常的に用いることができる、当分野で公知の方法を用いて実施することができる。
ヒト化VHHドメインは1つまたは2つ以上の完全にヒトのフレームワーク領域配列を含むことができ、さらに具体的な実施態様では、ヒト生殖細胞系列Vh3配列DP-29、DP-47、DP-51に由来するヒトフレームワーク領域またはその部分を含み得るか、または前記と高度に相同であり得る。したがって、ヒト化プロトコルは、VHH残基のいずれかを生殖細胞系列VH遺伝子、例えばDP-47、DP-29およびDP51の対応するフレームワーク1、2および3（FR1、FR2およびFR3）の残基で単独にてまたは組み合せて置換する工程を含むことができる。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの適切なフレームワーク領域（FR）は、例えばWO2006/004678に示されたものから選択でき、特にいわゆる“KERE”および“GLEW”クラスが含まれる。特に好ましいものは、約44〜47位にアミノ酸配列G-L-E-Wを有する免疫グロブリン単一可変ドメインおよびそれらの各々のヒト化対応物である。
【００２７】
103P、R、S-グループおよび／またはGLEW-グループ（以下で定義する）に属するVHHドメインのための好ましい（ただしそれに限定されない）ヒト化置換は、108L に対して108Qである。免疫グロブリン単一可変ドメインをヒト化する方法は当分野で公知である。
別の実施態様にしたがえば、免疫グロブリン単一可変ドメインは本明細書に定義するVHドメインである。
さらに別の実施態様では、本発明のDll4結合免疫グロブリン単一可変ドメインまたは本発明のポリペプチドに存在するDll4結合免疫グロブリン単一可変ドメインクラスの典型的なものは、“ラクダ化”された天然に存在するVHドメインアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を有する（すなわち、ラクダ化は通常の4鎖抗体の天然に存在する可変重鎖のアミノ酸配列中の1つまたは2つ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のVHHドメイン中の対応する位置に存在する1つまたは2つ以上のアミノ酸残基で置換することによって達成される）。前記はそれ自他公知の態様で実施することができ、当業者には明白であろう。さらにまたWO 94/04678を参照できる。そのようなラクダ化は、VH-VL接触面およびいわゆるラクダ科ホールマーク残基に存在するアミノ酸の位置でもっぱら生じ得る（例えばWO 94/04678もまた参照されたい）。そのような“ヒト化”および“ラクダ化”技術並びにそれらに適合する好ましいフレームワーク領域配列に関する詳細な記述は、さらにまたWO 2006/040153のpp.46およびpp.98並びにWO 2006/122786のp.p107から入手できる。
【００２８】
本発明のDll4結合分子（例えば免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはそれらを含むポリペプチド）は、それらがDll4分子内の1つまたは2つ以上のエピトープと特異的に結合する1つまたは2つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むという点でDll4に対して特異性を有する。
Dll4結合分子とその抗原Dll4との特異的結合は、それ自体公知の任意の適切な態様で決定できる。前記適切な態様には、例えば本明細書に記載したアッセイ、スキャチャード解析および／または競合結合アッセイ、ラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素免疫アッセイ（EIAおよびELISA）およびサンドイッチ競合アッセイ、並びに当分野でそれ自体公知である前記の種々の変型が含まれる。
抗原Dll4に関して、本発明のDll4結合分子（例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン）は種に関して限定されない。したがって、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれらを含むポリペプチドは、ヒトでの治療目標を考える場合には好ましくはヒトDll4と結合する。しかしながら、別の動物種由来のDll4と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれらを含むポリペプチドもまた本発明の範囲内である。1つの種のDll4型と結合する本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、1つまたは2つ以上の他の種由来のDll4と交差反応し得る。例えば、ヒトDll4と結合する本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、1つまたは2つ以上の他の霊長類種由来のDll4、および／または疾患の動物モデル（例えばサル（特にカニクイザルまたはアカゲザル）、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ）、および特に血管形成でDll4媒介作用と密接に関係する疾患および異常の動物モデルで用いられる1つまたは2つ以上の動物種（例えば本明細書に記述する種および動物モデル）由来Dll4との交差反応性を示す。そのような交差反応性を示す本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは研究および／または薬剤開発において有益である。なぜならば、前記交差反応性は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを周知の疾患モデル、例えばサル（特にカニクイザルまたはアカゲザル）またはマウスおよびラットで試験することを可能にするからである。
【００２９】
さらにまた、本発明のDll4結合分子は、それらが向けられたDll4の特定ドメインまたは抗原決定基に限定されることなく、それらによって規定されることもない。好ましくは、治療用Dll4アンタゴニストの開発時に動物モデルとして使用することを意図するヒト以外の種に由来する1つまたは2つ以上のDll4分子との交差反応性の観点から、Dll4結合分子は、ヒトDll4と高度な同一性を有する、対象Dll4の領域内のエピトープを認識する。例示すれば、マウスモデルを使用する観点から、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、EGF-2ドメイン内に全体的にまたは部分的に存在し、ヒトとマウス間で高い同一性を示すエピトープを認識する。
したがって、好ましい実施態様にしたがえば、本発明は、Dll4結合分子（具体的には免疫グロブリン単一可変ドメインまたは前記を含むポリペプチド）に関し、ここで前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号：417のアミノ酸残基252−282に一致するEGF-2ドメイン内に全体的にまたは部分的に含まれるエピトープと結合するグループから選択される。
本発明のポリペプチドが本明細書で定義した二パラトープ分子（前記は本発明の2つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む）である場合は、免疫グロブリン単一可変ドメイン要素の少なくとも1つは上記に定義したEGF-2ドメイン内のエピトープと結合する。
好ましくは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、500nM未満、好ましくは200nM、より好ましくは10nM未満、例えば500pM未満の親和性でDll4と結合する（実施例5.7に記載するように表面プラズモン共鳴解析によって決定）。
好ましくは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、実施例5.1に記載するように競合ELISAアッセイで測定したとき、10-6から10-10モル/リットル以下の範囲、より好ましくは10-8から10-10モル/リットル以下の範囲、さらに好ましくは10-9から10-10モル/リットル以下の範囲のIC50値を有する。
その態様に限定されないが好ましい本発明の実施態様にしたがえば、本発明のDll4結合免疫グロブリン単一可変ドメインまたは前記を含むポリペプチドは、10-5から10-12モル/リットル（M）以下、および好ましくは10-7から10-12モル/リットル（M）以下、およびより好ましくは10-8から10-12モル/リットル（M）以下の解離定数（KD）で、および／または少なくとも107 M-1、好ましくは少なくとも108 M-1、より好ましくは少なくとも109 M-1、例えば少なくとも1012 M-1の結合定数（KA）で、さらに具体的には500nM未満、好ましくは200nM未満、より好ましくは10nM未満、例えば500pM未満のKDでDll4と結合する。Dll4に対する本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインのKDおよびKA値は測定することができる。
【００３０】
さらに別の実施態様では、本発明は、オーバーラップしない別個のエピトープで抗原Dll4と結合する、2つまたは3つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むDll4結合分子に関する。より具体的には、本発明のそのようなポリペプチドは、本質的に（i）Dll4の第一のエピトープと特異的に結合する第一の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび（ii）Dll4の第二のエピトープと特異的に結合する第二の免疫グロブリン単一可変ドメインから成るか、または前記（i）および（ii）を含み、ここで前記Dll4の第一のエピトープとDll4の第二のエピトープは同一エピトープではない。換言すれば、本発明のそのようなポリペプチドは、Dll4に存在する少なくとも2つの異なるエピトープに対する2つまたは3つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むかまたはそれらから成り、ここで前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、それらが同時にDll4と結合できる態様で互いに連結されている。この意味で、本発明のポリペプチドはまた“二価”または“多価”免疫グロブリン構築物と、さらに前記ポリペプチドがDll4に対して少なくとも2つの結合部位を含むという点で特に“多価免疫グロブリン単一可変ドメイン構築物”とみなすことができる。
本発明のそのようなDll4結合分子は（少なくとも）2つの抗Dll4免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、ここで（当該）2つの免疫グロブリン単一可変ドメインはDll4分子内の別個のエピトープに対する。したがって、これら2つの免疫グロブリン単一可変ドメインは別個の抗原特異性、したがって別個のCDRを有するであろう。この理由のために、本発明のそのようなポリペプチドはまた、“二パラトープ性ポリペプチド”もしくは“二パラトープ性一ドメイン抗体構築物”（免疫グロブリン単一可変ドメインが一ドメイン抗体から成るかまたは本質的に前記から成る場合）、または“二パラトープ性VHH構築物”（免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHから成るかまたは本質的に前記から成る場合）とそれぞれ本明細書では称されるであろう（なぜならば、前記2つの免疫グロブリン単一可変ドメインは2つの異なるパラトープを含むからである）。
【００３１】
本発明の特定の実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドが3つ以上の抗Dll4免疫グロブリン単一可変ドメイン（すなわち3つ、4つ、またはそれより多い抗Dll4免疫グロブリン単一可変ドメイン）を含む場合、前記抗Dll4免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも2つはDll4分子内の別個のエピトープに対するものであり、ここでさらに別の任意の免疫グロブリン単一可変ドメインは前記2つの別個のエピトープのいずれか、および／またはDll4分子内に存在するさらに別のエピトープと結合することができる。
本発明にしたがえば、2つまたは3つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは互いに独立してVHまたはVHH、および／または本明細書で定義した任意の他の種類の免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えばVLドメイン）であり得るが、ただしこれらの免疫グロブリン単一可変ドメインが抗原（すなわちDll4）と結合することを条件とする。
好ましい実施態様にしたがえば、第一および第二の免疫グロブリン単一可変ドメインは本質的に本明細書で定義したVH配列またはVHH配列から成る。特に好ましい実施態様にしたがえば、第一および第二の免疫グロブリン単一可変ドメインは本質的にVHHから成る。
本発明のある種の実施態様にしたがえば、本発明のDll4結合分子内に存在する少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメインは、直接（すなわちリンカーを使用することなく）またはリンカーを介して互いに連結され得る。前記リンカーは好ましくはリンカーペプチドであり、さらに、少なくとも2つの別個の免疫グロブリン単一可変ドメインがDLL4の少なくとも2つの異なるエピトープの各々と1つの同じDll4分子内でまたは2つの別個の分子内で結合することを可能にするようにリンカーは選択されるであろう。
【００３２】
リンカーの選択はとりわけエピトープ、特に免疫グロブリン単一可変ドメインが結合するDll4上のエピトープ間の距離に左右され、当業者には本明細書の開示から（場合によってはある程度の日常的な実験を経て）明瞭であろう。そのような実験の出発点として、本発明のそのようなポリペプチドに存在する2つの免疫グロブリン単一可変ドメインのN-末端とC-末端間の距離は、好ましくは少なくとも50オングストローム、より好ましくは55−200オングストロームの範囲、特に65−150オングストロームの範囲（上限は下限ほど重要ではなく、便利であるという理由から、例えば当該タンパク質の発現／生産の観点から選択される）であろうと一般的には考えられよう。
さらにまた、Dll4と結合する2つまたは2つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインはVHまたはVHHであり、それらはそれぞれ第三のVHまたはVHHを介して互いに連結され得る（そのようなDll4結合分子では、2つまたは3つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは前記第三の免疫グロブリン単一可変ドメインと直にまたは適切なリンカーを介して連結され得る）。そのような第三のVHまたはVHHは、例えば半減期の延長を提供するVHまたはVHHであり得る。例えば後者のVHまたはVHHは、（ヒト）血清蛋白質、例えば（ヒト）血清アルブミンまたは（ヒト）トランスフェリンと結合できるVHまたはVHHであり得る。
或いは、Dll4と結合する2つまたは3つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは一続きにして（直にまたは適切なリンカーを介して）連結でき、第三のVHまたはVHH（半減期の延長を提供し得る）は、これら2つまたは3つ以上の前述の免疫グロブリン配列の1つと直にまたはリンカーを介して連結できる。
【００３３】
適切なリンカーは、長さが好ましくは9または10以上のアミノ酸、より好ましくは17以上のアミノ酸、例えば約20−40アミノ酸残基を有するアミノ酸（前記は例示であり、これらに限定されない）を含むことができる。しかしながら、前記上限は重要ではなく、そのようなポリペプチドの生物薬剤製造に関して便利であるという理由から選択される。
リンカー配列は天然に存在する配列でも天然に存在しない配列でもよい。治療目的で用いられる場合は、リンカーは好ましくは本発明のポリペプチドが投与される対象者で非免疫原性である。
リンカー配列のある有用なグループは、WO 96/34103およびWO 94/04678に記載されている重鎖抗体ヒンジ領域から誘導されたリンカーである。
他のリンカーの例はポリ-アラニンリンカー配列、例えばAla-Ala-Alaである。
本発明のポリペプチドがポリマー（例えばポリエチレングリコール、PEG（ポリエチレングリコール）部分）の結合によって改変される場合、リンカー配列は好ましくはアミノ酸残基、例えばシステインまたはリジンを含み、リンカー領域でそのような改変（例えばPEG化）を可能にする。
さらにまた、リンカーはまた例えばWO 04/081026に示されているようにポリ(ポリエチレングリコール)部分であってもよい。
【００３４】
別の実施態様では、本発明のポリペプチドの少なくとも2つのDll4結合免疫グロブリン単一可変ドメインは、別の部分を介して（任意的に1つまたは2つのリンカーを介して）互いに連結される。前記別の部分は、例えば別のポリペプチドであり、好ましいがそれに限定されない実施態様では、上記に記載したようにさらに別の免疫グロブリン単一可変ドメインであり得る。そのような要素は本質的に不活性であってもよいが、生物学的作用、例えばポリペプチドの所望の特性を改善する作用を有していてもよく、また1つもしくは2つ以上のさらに別の所望の特性をポリペプチドに付与してもよい。例えば、前記部分は当該タンパク質またはポリペプチドの半減期を改善するか、および／またはその免疫原性を低下させるか、または他の任意の所望される特性を改善し得るが、ただしこれらに限定されない。
【００３５】
本発明の好ましい実施態様にしたがえば、本発明のDll4結合分子は、それが治療薬剤として使用されるという観点から、患者の血清または他の体液中での本発明のポリペプチドの半減期を延長する要素部分を含む。“半減期”という用語は、（改変された）ポリペプチドの血清濃度がin vivoで例えばポリペプチドの分解および／または天然のメカニズムによる除去のために50%低下するために要する時間と定義される。
より具体的には、そのような半減期延長要素部分は前記ポリペプチドに共有結合で連結するかまたは融合させることができ、例えばFc部分、アルブミン部分、アルブミン部分のフラグメント、アルブミン結合部分（例えば抗アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメイン）、トランスフェリン結合部分（例えば抗トランスフェリン免疫グロブリン単一可変ドメイン）、ポリオキシアルキレン分子（例えばポリエチレングリコール分子）、アルブミン結合ペプチドまたはヒドロキシエチルデンプン（HES）誘導体であり得る（ただしこれらに限定されない）。
別の好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドは、血中で見出される抗原と結合する要素部分を含み、それによって生成ポリペプチドにin vivoでの半減期の増加を付与する。血中で見出される抗原は、例えば血清アルブミン、血清免疫グロブリン、サイロキシン結合タンパク質、フィブリノゲンまたはトランスフェリンである。特に好ましい実施態様にしたがえば、そのような要素部分はアルブミン結合免疫グロブリンであり、特に好ましいものはアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えばアルブミン結合VHHドメイン）である。
ヒトでの使用が意図される場合、そのようなアルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメインは好ましくはヒト血清アルブミンと結合し、さらに前記は好ましくはヒト化されたアルブミン結合VHHドメインであろう。
【００３６】
ヒト血清アルブミンと結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは当分野で公知であり、例えばWO 2006/122786にさらに詳細に記載されている。特に有用なアルブミン結合VHHはALB1およびそのヒト化対応物ALB8（WO 2009/095489）である。しかしながら上記の特許公開公報に記載されている他のアルブミン結合VHHドメインも同様に用いることができる。
本発明のさらに別の実施態様にしたがえば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えばWO01/79271およびWO03/59934に記載されているように血清アルブミン分子と融合できる。例えばWO01/79271に記載されているように、融合タンパク質は通常の組み換え技術によって入手できる。すなわち、血清アルブミンをコードするDNA分子またはそのフラグメントを、Dll4結合分子をコードするDNAに結合させ、得られた構築物を選択した宿主細胞（例えばピキア・パストリス（Pichia pastoris）のような酵母細胞または細菌細胞）での発現に適したプラスミドに挿入し、続いて前記宿主細胞に融合ヌクレオチド配列をトランスフェクトして適切な条件下で増殖させる。
別の実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドの半減期延長改変（そのような改変はまた当該ポリペプチドの免疫原性を低下させる）は、医薬的に許容できる適切なポリマーの結合を含み、前記ポリマーは、例えば直鎖または分枝鎖ポリ(エチレングリコール)（PEG）またはその誘導体（例えばメトキシポリ(エチレングリコール)またはmPEG）である。一般的には、任意の適切なPEG化型、例えば抗体および抗体フラグメント（一ドメイン抗体およびscFvを含むがただしこれらに限定されない）のために当分野で用いられるPEG化型を用いることができる。例えば以下を参照できる：Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002)；Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456, 2003；Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2, 2003；およびWO 04/060965。ポリペプチドのPEG化のための多様な試薬もまた、例えばネクター・セラピューティクス（Nektar Therapeutics, USA）またはNOFコーポレーション（日本）から市場で入手可能で、例えばSunbright(商標)EAシリーズ、SHシリーズ、MAシリーズ、CAシリーズおよびMEシリーズ、例えばSunbright(商標)ME-100MA、Sunbright(商標)ME-200MAおよびSunbright(商標)ME-400MAである。
【００３７】
好ましくは部位特異的PEG化が、特にシステイン残基を介して用いられる（例えば以下を参照されたい：Yang et al., Protein Engineering 16, 761-770 (2003)。例えばこの目的のためには、本発明のポリペプチドに天然に存在するシステイン残基にPEGを結合させることができる。本発明のポリペプチドを、PEG結合用の1つまたは2つ以上のシステイン残基を適切に導入するために改変するか、またはPEG結合用の1つまたは2つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列を本発明のポリペプチドのN-および／またはC-末端に融合させてもよい。いずれもそれ自体当業者に公知のタンパク質工学技術を用いる。
本発明のポリペプチドのためには、好ましくは5kDaより大きく（例えば10kDaより大きく）200kDa未満（例えば100kDa未満）、例えば20kDaから80kDaの範囲の分子量を有するPEGが用いられる。PEG化に関しては、一般的に本発明はまた、1つまたは2つ以上のアミノ酸の位置でPEG化された任意の二パラトープ性Dll4結合分子を包含することに留意されるべきである。好ましくは、前記PEG化は以下のような態様で実施されてある：（1）in vivoで半減期を延長するか；（2）免疫原性を低下させるか；（3）PEG化についてそれ自体公知のさらに別の1つまたは2つ以上の有利な特性を提供するか；（4）Dll4に対するポリペプチドの親和性に本質的に影響を与えず（例えば、当分野で報告されている適切なアッセイによって決定したとき50%以上、より好ましくは10%以上前記親和性を低下させない）；および／または（4）本発明のDll4結合分子の他の所望の特性のいずれにも影響を及ぼさない。適切なPEGグループおよびそれらを特異的にまたは非特異的に結合させる方法は当業者には明白であろう。そのようなPEG化のための適切なキットおよび試薬は例えばネクター（Nektar, CA, USA）から入手できる。
【００３８】
別の特徴では、本発明は、本発明のDll4結合分子をコードする核酸分子に関する。そのような核酸分子は本明細書ではまた“本発明の核酸”とみなされ、さらにまた本明細書で定義する遺伝的構築物の形態であり得る。本発明の核酸はゲノムDNA、cDNAまたは合成DNA（例えば意図する宿主細胞または宿主生物での発現に特に順応させたコドン使用頻度を有するDNA）であり得る。本発明のある実施態様にしたがえば、本発明の核酸は、上記で定義したように本質的に単離された形態である。
本発明の核酸はまた、ベクター（例えばプラスミド、コスミドまたはYAC）の形態であるか、前記内に存在するか、および／または前記の部分であり得る。ベクターは特に発現ベクター、すなわちin vitroおよび／またはin vivo（すなわち適切な宿主細胞、宿主生物および／または発現系）でDll4結合分子の発現を提供できるベクターであり得る。そのような発現ベクターは一般的に少なくとも1つの本発明の核酸を含み、前記核酸は1つまたは2つ以上の適切な調節エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）に作動できるように連結される。特定の宿主で特定の配列を発現させるという観点におけるそのようなエレメントおよびそれらの選択は当業者にとって通常的な知識である。本発明のDll4結合分子の発現に有用なまたは必要な調節エレメントおよび他のエレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、組込み因子、選別マーカー、リーダー配列、レポーター遺伝子などの具体的な例は、例えばWO2006/040153のpp.131から133に開示されている。
【００３９】
本発明の核酸は、本明細書で提供する本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報に基づいてそれ自体公知の態様で調製または入手するか（例えば自動DNA合成および／または組換えDNA技術によって）、および／または適切な供給源から単離できる。
別の特徴では、本発明は、本発明の1つまたは2つ以上のDll4結合分子を発現するかまたは前記を発現する能力を有するか、および／または本発明の核酸を含む宿主細胞に関する。特に好ましい実施態様にしたがえば、前記宿主細胞は細菌細胞であり、他の有用な細胞は酵母細胞、菌類細胞または哺乳動物細胞である。
適切な細菌細胞には、グラム陰性細菌株（例えば大腸菌（Escherichia coli）、プロテウス（Proteus）およびシュードモナス（Pseudomonas）の株）およびグラム陽性細菌株（例えばバシルス（Bacillus）、ストレプトミセス（Streptomyces）、スタヒロコッカス（Staphylococcus）およびラクトコッカス（Lactococcus）の株）が含まれる。適切な菌類細胞には、トリコデルマ（Trichoderma）、ニューロスポラ（Neurospora）およびアスペルギルス（Aspergillus）の種に由来する細胞が含まれる。適切な酵母細胞には、サッカロミセス（Saccharomyces）（例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae））、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）（例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe））、ピキア（Pichia）（例えばピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびピキア・メタノリカ（ichia methanolica））およびハンセヌラ（Hansenula）の種に由来する細胞が含まれる。
適切な哺乳動物細胞には、例えばCHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞などが含まれる。しかしながら、異種タンパク質の発現に当分野で用いられる両性動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および他の任意の細胞も同様に用いることができる。
【００４０】
本発明はさらに、本発明のDll4結合分子を製造する方法を提供する。そのような方法は一般的には以下の工程を含む：
−Dll4結合分子をコードすることができる核酸を含む宿主細胞を、本発明のDll4結合分子の発現を可能にする条件下で培養する工程；および
−前記宿主細胞によって発現されたポリペプチドを前記培養から回収または単離する工程；および
−本発明のDl44結合分子をさらに精製するか、および／または改変するか、および／または処方化する任意的工程。
工業的スケールでの生産について好ましい宿主生物には大腸菌、ピキア・パストリスおよびS.セレビシアエが含まれ、前記は大規模な発現、生産および発酵に、特に大規模な医薬の発現、生産および発酵に適切である。
具体的な発現系の選択は、部分的には一定の翻訳後改変（より具体的にはグリコシル化）の要求に左右される。グリコシル化が所望または要求される本発明のDll4結合分子の生産には、発現タンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳動物の発現宿主を使用することが必要であろう。これに関して、得られるグリコシル化パターン（すなわち結合される残基の種類、数および位置）は発現に使用される細胞または細胞株に左右されることは当業者には明白であろう。
上記に示した細胞で生産される本発明のDll4結合分子は、細胞内で（例えばサイトゾルで、ペリプラズムで、または封入体で）産生され、続いて前記宿主細胞から単離され、場合によってさらに精製されるか、またはそれらは細胞外に（例えば宿主細胞が培養されている培養液に）産生され、続いて培養液から単離され、場合によってさらに精製される。
【００４１】
ポリペプチドの組換え体の生産に用いられる方法および試薬、例えば個々の適切な発現ベクター、形質転換もしくはトランスフェクションの方法、選別マーカー、タンパク質発現の誘発の方法、培養条件などは当分野で公知である。同様に、本発明のポリペプチドの製造方法で有用なタンパク質の単離および精製技術は当業者には周知である。
さらに別の特徴では、本発明は、配列番号：1から166および458、配列番号：333から353、または配列番号：375から395にそれぞれ示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドおよび前記をコードする核酸分子に関する。
これらのペプチドは本発明のVHH由来のCDR3に対応する。それら（特にそれらをコードする核酸分子）は、CDR移植を実施して免疫グロブリン鎖にCDR3を置換するために、または非免疫グロブリン土台（例えばプロテアーゼ阻害物質、DNA結合タンパク質、チトクロームb562、ヘリックス束タンパク質、ジスルフィド架橋タンパク質、リポカリンまたはアンチカリン）に挿入してそのような土台に標的結合特性を付与するために有用である。CDR移植の方法は当分野では周知であり、例えばヒト化抗体のために広く用いられている（前記は通常ヒト抗体のFvフレームワークへのげっ歯類抗体由来のCDRの移植を含む）。
【００４２】
本発明のCDR3を含む免疫グロブリンまたは非免疫グロブリン土台を得るために、そのような分子をコードするDNAを分子生物学の標準的な方法にしたがって、例えば遺伝子合成によって、オリゴヌクレオチドアニーリングによって、またはPCRフラグメントをオーバーラップさせる方法によって、例えばDaughertyら（Nucleic Acids Research, 1991, Vol. 19, 9, 2471-2476）が記載しているように入手することができる。VHH CDR3を非免疫グロブリン土台に挿入する方法は、Nicaiseら（Protein Science, 2004, 13, 1882-1891）により記載された。
本発明はさらに、本発明の少なくとも１つのDll4結合分子を収納または含む製品または組成物に関し、場合によって前記はさらに、それ自体公知である（すなわち前記組成物の意図される使用に応じて）そのような組成物のさらに別の1つまたは2つ以上の要素を含む。
医薬としての使用のために、本発明のDll4結合分子または前記を含むポリペプチドは、少なくとも1つの本発明のDll4結合分子および少なくとも1つの医薬的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバント、並びに場合によって1つまたは2つ以上のさらに別の医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬調製物または組成物として処方することができる。非限定的に例示すれば、そのような処方物は経口投与に、非経口投与に（例えば静脈内、筋肉内もしくは皮下注射または静脈内輸液による）、局所投与に、吸入、皮膚絆創膏、インプラント、座薬などによる投与に適した形態であり得る。そのような適切な投与形態（投与態様に応じてそれらは固体、半固体または液体であり得る）並びにその調製で使用される方法および担体は当業者には明白であり、本明細書でさらに開示される。
【００４３】
したがって、さらに別の特徴では、本発明は、少なくとも１つのDll4結合分子、特に本発明の1つの免疫グロブリン単一可変ドメインまたは前記を含むポリペプチドおよび少なくとも1つの適切な担体、希釈剤または賦形剤（すなわち医薬としての使用に適切である）並びに場合によって1つまたは2つ以上のさらに別の活性物質を含む医薬組成物に関する。
本発明のDll4結合分子はそれ自体公知の任意の適切な態様で処方および投与することができる。すなわち特に免疫グロブリン単一可変ドメインについては例えば、WO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867およびWO 08/020079並びに標準的な手引書（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington；the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)；またはthe Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007（例えば252-255ページ参照））を参照できる。
例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、通常の抗体および抗体フラグメント（ScFvおよびジアボディを含む）や他の医薬的に活性なタンパク質のためのそれ自体公知の任意の態様で処方および投与することができる。そのような処方物および前記を調製する方法は当業者には明白で、例えば、非経口投与（例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、管内または脊髄内投与）または局所（すなわち経皮または皮内）投与に適した調製物を含む。
【００４４】
非経口投与用調製物は、輸液または注射に適した例えば無菌的な溶液、懸濁液、分散液または乳液であり得る。そのような調製物に適した担体または希釈剤には、例えば滅菌水および医薬的に許容できる水性緩衝剤および溶液（例えば生理学的リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンクス溶液）；水油；グリセロール；グリコール、例えばプロピレングリコールまたは鉱物油、動物油および植物油（例えばピーナツ油、ダイズ油または前記の混合物）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。通常は水溶液または懸濁液が好ましい。
したがって、本発明のDll4結合分子は、医薬的に許容できるビヒクル（例えば不活性希釈剤）または消化吸収性食用担体と一緒にして全身的に、例えば経口的に投与できる。経口治療薬投与のためには、本発明のDll4結合分子は1つまたは2つ以上の賦形剤と一緒にして、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェファースなどの形態で用いることができる。そのような組成物および調製物は少なくとも0.1%の本発明のDll4結合分子を含むべきである。組成物または調製物中のそれらのパーセンテージはもちろん変動可能であり、便利にはあるユニット投薬形の重量の約2から約60%であり得る。そのような治療的に有用な組成物中の本発明のDll4結合分子の量は有効投薬レベルが得られる量である。
錠剤、ピル、カプセルなどはまた、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤および甘味料または香料、例えばWO 08/020079の143-144ページに記載されたものを含むことができる。 ユニット投薬形がカプセルである場合、前記は上記タイプの物質に加えて液状担体（例えば植物油またはポリエチレングリコール）を含むことができる。他の多様な物質もコーティングとして、またはそうでなければ固体のユニット投薬形の物理的形態の改変のために存在し得る。例えば、錠剤、ピルまたはカプセルはゼラチン、ワックス、シェラックまたは砂糖などで被覆できる。シロップまたはエリキシルは、本発明のDll4結合分子、甘味剤としてシュクロースまたはフラクトース、保存料としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、染料および香料（例えばサクランボまたはオレンジ香料）を含むことができる。もちろん、任意のユニット投薬形の調製に用いられるいずれの物質も医薬的に許容でき、さらに使用量において実質的に非毒性であるべきである。さらにまた、本発明のDll4結合分子を徐放性調製物および装置中に取り込むことができる。
【００４５】
経口投与用調製物および処方物はまた、本発明の構築物が胃の環境に耐え腸へと通過することを可能にする腸溶コーティングとともに提供できる。より一般的には、経口用調製物および処方物は胃腸管の所望される任意の部分へのデリバリーのために適切に処方できる。さらにまた、適切な座薬を胃腸管へのデリバリーのために用いることができる。
本発明のDll4結合分子はまた、WO 08/020079の144および145ページにさらに記載されているように輸液または注射により静脈内または腹腔内に投与できる。
本発明のDll4結合分子の局所投与のためには、一般的には皮膚学的に許容できる担体と一緒にした組成物または処方物としてDll4結合分子を皮膚に投与することが所望され、それらはWO 08/020079の145ページにさらに記載されているように固体または液体であり得る。
一般的には、液体組成物（例えばローション）中の本発明のDll4結合分子の濃度は約0.1−25 wt%、好ましくは約0.5−10 wt%であろう。半固体または固体組成物（例えばゲルまたは散剤）中の濃度は約0.1−5 wt%、好ましくは約0.5−2.5 wt%であろう。治療での使用に要求される本発明のDll4結合分子の量は、選択される具体的なDll4結合分子だけでなく、投与経路、治療される症状の性質並びに患者の年齢および症状により変動し、最終的に主治医または医師の裁量であろう。さらにまた、本発明のDll4結合分子の投薬量は、標的の細胞、腫瘍、組織、移植片または器官にしたがって変動する。便利には、所望の用量は1回の投与で提供するか、または適切な間隔で投与される分割投与として、例えば1日のサブ用量で2回、3回、4回または5回以上として提供できる。サブ用量自体をさらに、例えば大雑把に間をあけて何回か別々の投与として、例えば散布器から多数回の吸引として、または眼に複数回点眼することによって分割してもよい。
投与処置スケジュールは長期の毎日の処置を含むことができる。“長期”とは、少なくとも2週間、好ましくは数週間、数カ月または数年の期間を意味する。この投薬範囲における必要な改変は、本明細書の教示により単なる日常的な実験を用いるだけで当業者が決定できる。以下の成書を参照された：Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA。投薬量はまた、何らかの合併症の発生時に個々の医師によって調整され得る。
【００４６】
さらに別の実施態様では、本発明は、本発明のDll4結合分子、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインまたは前記を含むポリペプチドの例えば以下の治療目的のための使用に関する：
−脈管形成におけるDll4媒介作用と密接に関係するか、またはNotchシグナル伝達系路をDll4結合分子により調節することによって予防、治療または緩和できる異常、疾患または症状（特にヒトの）の予防、治療および／または緩和のため；
−そのような治療を必要とする患者の処置方法で（そのような方法は、その必要がある対象者で本発明の少なくとも1つのDll4結合分子（例えば免疫グロブリン単一可変ドメインまたは前記を含む医薬組成物）の医薬的に活性な量を投与する工程を含む）；
−脈管形成におけるDll4媒介作用と密接に関係する異常、疾患または症状の予防、治療および／または緩和のための医薬の調製のため；
−上記の目的のために使用される医薬組成物または医薬中の活性成分として。
具体的な特徴にしたがえば、前記異常、疾患または症状は本明細書で定義した癌または癌性疾患である。
別の特徴にしたがえば、前記疾患は脈管形成におけるDll4媒介作用と密接に関係するか、またはNotchシグナル伝達系路をDll4結合分子により調節することによって治療または緩和できる眼の疾患である。
【００４７】
治療される癌性疾患に応じて、本発明のDll4結合分子はそれ自体でまたは1つもしくは2つ以上の追加の治療薬剤と一緒に用いることができる。前記追加の薬剤は、特にDNA損傷薬剤のような化学療法剤、または血管形成、シグナルトランスダクション経路もしくは癌細胞の有糸分裂のチェックポイントを阻害する治療的に活性な化合物から選択される。
前記追加の治療薬剤は、同時に（場合によって同じ医薬調製物の成分として）、またはDll4結合分子の投与の前もしくは後で投与できる。
ある種の実施態様では、前記追加の治療薬剤は、EGFR、VEGFR、HER2-neu、Her3、AuroraA、AuroraB、PLKおよびPI3キナーゼ、FGFR、PDGFR、Raf、KSP、PDK1、PTK2、IGFRまたはIRの阻害剤グループから選択される1つまたは2つ以上の阻害剤であり得るが、ただしこれらに限定されない。
追加の治療薬剤のさらに別の例は、CDK、Akt、src/bcr abl、cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90の阻害剤、ヘッジホッグアンタゴニスト、JAK/STAT、Mek、mTor、NFkappaB、、プロテアソーム、Rhoの阻害剤、wntシグナリングの阻害剤、またはユビキチン化経路の阻害剤またはNotchシグナル伝達系路の別の阻害剤である。
Aurora阻害剤の例は、PHA-739358、AZD-1152、AT 9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、MLN-8045、PF-3814735であるが、ただしこれらに限定されない。
PLK阻害剤の例はGSK-461364である。
raf阻害剤の例は、BAY-73-4506（VEGFR阻害剤でもある）、PLX 4032、RAF265（さらにまたVEGFR阻害剤である）、sorafenib（さらにまたVEGFR阻害剤である）およびXL 281である。
KSP阻害剤の例は、ispinesib、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK 246053A、GSK-923295、MK-0731およびSB-743921である。
srcおよび／またはbcr-abl阻害剤の例は、ダサチニブ（dasatinib）、AZD-0530、ボスチニブ（bosutinib）、XL 228（IGF-1R阻害剤でもある）、ニロチニブ（nilotinib）（PDGFRおよびcKit阻害剤でもある）、イマチニブ（imatinib）（cKit阻害剤でもある）およびNS-187である。
【００４８】
PDK1阻害剤の例はBX-517である。
Rho阻害剤の例はBA-210である。
PI3キナーゼ阻害剤の例は、PX-866、BEZ-235（mTor阻害剤でもある）、XL 418（Akt阻害剤でもある）、XL-147およびXL 765（mTor阻害剤でもある）である。
cMetまたはHGFの阻害剤は、XL-184（VEGFR、cKit、Flt3の阻害剤でもある）、PF-2341066、MK-2461、XL-880（VEGFRの阻害剤でもある）、MGCD-265（VEGFR、Ron、Tie2の阻害剤でもある）、SU-11274、PHA-665752、AMG-102およびAV-299である。
c-Myc阻害剤の例はCX-3543である。
Flt3阻害剤の例は、AC-220（cKitおよびPDGFRの阻害剤でもある）、KW 2449、レスタウアーチニブ（lestaurtinib）（VEGFR、PDGFR、PKCの阻害剤でもある）、TG-101348（JAK2の阻害剤でもある）、XL-999（cKit、FGFR、PDGFRおよびVEGFRの阻害剤でもある）、スニチニブ（sunitinib）（PDGFR、VEGFRおよびcKitの阻害剤でもある）、タンズチニブ（tandutinib）（PDGFRおよびcKitの阻害剤でもある）である。
HSP90阻害剤の例は、タネスピマイシン（tanespimycin）、アルベスピマイシン（alvespimycin）、IPI-504およびCNF 2024である。
JAK/STAT阻害剤の例は、CYT-997（チューブリンとも相互作用する）、TG 101348（Flt3の阻害剤でもある）およびXL-019である。
Mek阻害剤の例は、ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330およびXL 518である。
mTor阻害剤の例は、テムシロリムス（temsirolimus）、AP-23573（VEGF阻害剤としても作用する）、エヴェロリムス（everolimus）（さらにまたVEGF阻害剤である）、XL-765（PI3キナーゼ阻害剤でもある）、およびBEZ-235（PI3キナーゼ阻害剤でもある）である。
Akt阻害剤の例は、ペリフォシン（perifosine）、GSK-690693、RX-0201およびトリシリビン（triciribine）である。
【００４９】
cKit阻害剤の例は、AB-1010、OSI-930（VEGFR阻害剤としても作用する）、AC-220（Flt3およびPDGFR阻害剤でもある）、タンズチニブ（Flt3およびPDGFRの阻害剤でもある）、アクシチニブ（axitinib）（VEGFRおよびPDGFRの阻害剤でもある）、XL-999（Flt3、PDGFR、VEGFR、FGFRの阻害剤でもある）、スニチニブ（Flt3、PDGFR、VEGFRの阻害剤でもある）、およびXL-820（VEGFRおよびPDGFR阻害剤としても作用する）、イマチニブ（bcr-abl 阻害剤としても作用する）、ニロチニブ（bcr-ablおよびPDGFRの阻害剤でもある）である。
ヘッジホッグアンタゴニストの例はIPI-609およびCUR-61414である。
CDK阻害剤の例は、セリシクリブ（seliciclib）、AT-7519、P-276、ZK-CDK（VEGFR2およびPDGFRも阻害する）、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509およびAG 024322である。
プロテアソームの阻害剤の例は、ボルテゾミブ（bortezomib）、カルフィロゾニブ（carfilzomib）およびNPI-0052（NFkappaBの阻害剤でもある）である。
NFκB経路の阻害剤はNPI-0052である。
ユビキチン化経路の阻害剤の例はHBX-41108である。
好ましい実施態様では、追加の治療薬剤は抗血管形成剤である。
抗血管形成剤の例は、FGFR、PDGFRおよびVEGFRの阻害剤または対応するリガンド（例えばペガプタニブ（pegaptanib）のようなVEGF阻害剤または抗VEGF抗体ベヴァシズマブ（bevacizumab））、およびサリドマイド（例えば以下から選択される（ただしこれらに限定されない）：ベヴァシズマブ、モテサニブ（motesanib）、CDP-791、SU-14813、テラチニブ（telatinib）、KRN-951、ZK-CDK（CDK阻害剤でもある）、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KDR、IMC-18F1、IMiD（免疫調節薬）、サリドマイド誘導体CC-4047、レナリドミド（lenalidomide）、ENMD 0995、IMC-D11、Ki 23057、ブリヴァニブ（brivanib）、セジラニブ（cediranib）、XL999（cKitおよびFlt3の阻害剤でもある）、1B3、CP 868596、IMC 3G3、R-1530（Flt3の阻害剤でもある）、スニチニブ（cKitおよびFlt3の阻害剤でもある）、アクシチニブ（cKitの阻害剤でもある）、レスタウアーチニブ（Flt3およびPKCの阻害剤でもある）、ヴァタラニブ（vatalanib）、タンズチニブ（Flt3およびcKitの阻害剤でもある）、パゾパニブ（pazopanib）、GW 786034、PF-337210、IMC-1121B、AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR 258、ソラフェニブトシレート（sorafenib tosylate）（Raf阻害剤でもある）、RAF-265（Raf阻害剤でもある）、ヴァンデタニブ（vandetanib）、CP-547632、OSI-930、AEE-788（EGFRおよびHer2の阻害剤でもある）、BAY-57-9352（Rafの阻害剤でもある）、BAY-73-4506（Rafの阻害剤でもある）、XL 880（cMetの阻害剤でもある）、XL647（EGFRおよびEphB4の阻害剤でもある）、XL 820（cKitの阻害剤でもある）、およびニロチニブ（nilotinib）（cKitおよびbrc-ablの阻害剤でもある））である。
【００５０】
追加の治療薬剤はまたEGFR阻害剤から選択できる。前記は小分子EGFR阻害剤であるかまたは抗EGFR抗体である。抗EGFR抗体の例は、セツキシマブ（cetuximab）、パニツムマブ（panitumumab）、マツズマブ（matuzuma）であるが、ただしこれらに限定されない。小分子EGFR阻害剤の例はゲフィチニブ（gefitinib）である。EGFR調節物質の別の例はEGF融合毒素である。
本発明のDll4結合分子との組合せで有用なEGFRおよびHer2阻害剤はとりわけ、ラパチニブ（lapatinib）、ゲフィチニブ、エルロチニブ（erlotinib）、セツキシマブ、トラスツズマブ（trastuzumab）、ニモツズマブ（nimotuzumab）、ザルツムマブ（zalutumumab）、ヴァンデタニブ（vandetanib）（VEGFRの阻害剤でもある）、ペルツズマブ（pertuzumab）、XL-647、HKI-272、BMS-599626 ARRY-334543、AV 412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788（VEGFRの阻害剤でもある）、ARRY-333786、IMC-11F8、Zemabである。
治療において本発明のDll4結合分子と有利に組み合わせることができる他の薬剤は、トリツムマブ（tositumumab）およびイブリツモマブチウキセタン（ibritumomab tiuxetan）（2つの放射能標識抗CD20抗体）、アレムツズマブ（alemtuzumab）（抗-CD52抗体）、デノスマブ（denosumab）（破骨細胞分化因子リガンド阻害剤）、ガリクシマブ（galiximab）（CD80アンタゴニスト）、オファツムマブ（ofatumumab）（CD20阻害剤）、ザノリムマブ（zanolimumab）（CD4アンタゴニスト）、SGN40（CD40リガンドレセプター調節物質）、リツキシマブ（rituximab）（CD20阻害物質）またはマパツムマブ（mapatumumab）（TRAIL-1レセプターアゴニスト）である。
【００５１】
本発明のDll4結合分子と一緒に用いることができる他の化学療法剤は以下から選択される（ただしこれらに限定されない）：ホルモン、ホルモンアナローグおよび抗ホルモン（例えば、タモキシフェン（tamoxifen）、トレミフェン（toremifene）、ラロキシフェン（raloxifene）、フルヴェストラント（fulvestrant）、メゲストロールアセテート（megestrol acetate）、フルタミド（flutamide）、ニルタミド（nilutamide）、ビカルタミド（bicalutamide）、クリプロテロンアセテート（cyproterone acetate）、フィナステロイド（finasteride）、ブセレリンアセテート（buserelin acetate）、フルドロコーチゾン（fludrocortisone）、フルオキシメステロン（fluoxymesterone）、メドロキシプロジェステロン（medroxyprogesterone）オクトレオチド（octreotide）、アルゾキシフェロン（arzoxifene）、パシレオチド（pasireotide）、ヴァプレオチド（vapreotide））、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール（anastrozole）、レトロゾール（letrozole）、リアロゾール（liarozole）、エキセメスタン（exemestane）、アタメスタン（atamestane）、フォルメスタン（formestane））、LHRHアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、ゴセレリンアセテート（goserelin acetate）、ロイプロリド（leuprolide）、アバレリクス（abarelix）、セトロレリクス（cetrorelix）、デスロレリン（deslorelin）、ヒストレリン（histrelin）、トリプトロレリン（triptorelin））、抗代謝薬（例えば、アンチフォレート、例えばメトトレキセート、ペメトレキシド（pemetrexed）、ピリミジンアナローグ、例えば5フルオロウラシル、カペシタビン（capecitabine）、デシタビン（decitabine）、ネララビン（nelarabine）およびゲムシタビン、プリンおよびアデノシンアナローグ、例えばメルカプトプリンチオグアニン、クラブリジン（cladribine）およびペントシタチン（pentostatin）、シタラビン（cytarabine）、フルダラビン（fludarabine））；抗腫瘍性抗生物質（例えば、アントラサイクリン、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンおよびイダルビシン、、マイトマイシンC、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、ピキサントロン、ストレプトゾシン）；白金誘導体（例えばシスプラチン、オキザリプラチン、カルボプラチン、ロバプラチン、サトラプラチン）；アルキル化剤（例えばエストラムスチン（estramustine）、メクロレタミン（meclorethamine）、メルファラン（melphalan）、クロラムブシル（chlorambucil）、ブスプラン（busulphan）、ダカルバジン、シクロホスファミド、イフォスファミド（ifosfamide）、ヒドロキシウレア、テモゾロミド（temozolomide）、ニトロソウレア、例えばカルムスチンおよびロムスチン、チオテペア（thiotepa）；抗有糸分裂剤（例えば、ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンフラニンおよびビンクリスチン；およびタキサン、例えばパクリタキセル、ドセタキセルおよびそれらの処方物、ラロタキセル；シモタキセル、およびエポシオレン、例えばイクサベピロン（ixabepilone）、パツピロン（patupilone）、 ZK-EPO）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エピポドフィロトキシン（epipodophyllotoxin）、例えばエトポシド（etoposide）およびエトポフォス（etopophos）、テニポシド（teniposide）、アムサクリン（amsacrine）、トポテカン（topotecan）、イリノテカン）、��よび雑多な化学療法剤（例えば、アミフォスチン（amifostine）、アナグレリド（anagrelide）、インターフェロンアルファ、プロカルバジン、ミトタン（mitotane）、およびポルフィマー（porfimer）、ベキサロテン（bexarotene）、セロコキシブ（celecoxib）。
【００５２】
本発明のDll4結合分子またはそれら含むポリペプチド、および前記を含む組成物の有効性は、任意の適切なin vitroアッセイ、細胞系アッセイ、in vivoアッセイおよび／またはそれ自体公知の動物モデルまたは前記の組合せを対象となる具体的な疾患または異常に応じて用いながら試験することができる。適切なアッセイおよび動物モデルは当業者には明白で、例えば本明細書で評し下記実施例で用いるアッセイ、例えば増殖アッセイが含まれる。
本発明の実験で得られたデータによって、本発明のDll4結合分子は従来技術のDll4結合分子の特性よりも優れた特性を有することが確認された。前記データは、例えば図10のELISAデータ（親和性増進VHHは、hDLL4/hNotch1-Fc相互作用を完全な態様で遮断することを示す）とともに、hDLL4/hNotch1-Fc競合ELISAでの親和性増進VHHのIC50値（nM）、および組換えヒトDLL4およびマウスDLL4に対する精製親和性増進VHHの親和性KD（nM）から得ることができる。このことは、本発明のDll4結合分子は、血管形成におけるDll4媒介作用と密接な関係を有する疾患および異常で治療有効性を有する有望な候補物であることを示している。
本発明の別の実施態様にしたがえば、以下の工程によって疾患を診断する方法が提供される：
a）上記で定義した本発明のDll4結合分子とサンプルを接触させる工程；
b）前記Dll4結合分子と前記サンプルとの結合を検出する工程；および
c）工程b）で検出された結合を標準物と比較し、前記サンプルに対する結合の相違によって、血管形成におけるDll4媒介作用と密接な関係を有する疾患または異常が診断される。
【００５３】
前記使用および他の使用のために、例えば特異的結合対（例えばビオチン-(ストレプト)アビジン結合対）の一部分である官能基を導入することによって本発明のDll4結合分子をさらに改変することは有用であり得る。そのような官能基を用いて、本発明のDll4結合分子を別のタンパク質、ポリペプチドまたは化合物（前記は結合対のもう一方と結合、すなわち結合対形成を介して結合する）に連結することができる。例えば、本発明のDll4結合分子をビオチンに連結し、さらにアビジンまたはストレプトアビジンと連結した別のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体と結合させることができる。例えば、そのような連結を実施した本発明のDll4結合分子をレポーターとして例えば診断系で用いることができる（そのような診断系では検出可能なシグナル生成物質はアビジンまたはストレプトアビジンに連結されている）。
【００５４】
材料と方法
a）ヒト、マウスおよびカニクイザルDll4を過剰発現するCHOおよびHEK293細胞株の作製
ヒト（配列番号：417；NM_019074.2）およびマウスDll4（NM_019454.3）をコードするcDNAを、ヒト成人正常心臓組織cDNAライブラリー（BioChain, Hayward, CA, USA）およびマウス心臓組織cDNAライブラリー（C57/Bl6株から単離）から、対応する配列の5’ および3’ UTRで設計したオリゴヌクレオチド（表1参照；配列番号：421から426）を用いてそれぞれ増幅する。アンプリコンを哺乳動物発現ベクターpCDNA3.1(+)-neo（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）でクローニングする。
表1：Dll4遺伝子完全長オルトローグの増幅に用いたオリゴヌクレオチド配列
【表１】
2013506410.tif 000003
【００５５】
カニクイザルDll4 cDNAは、カニクイザル心臓組織cDNAライブラリー（BioChain, Hayward, CA, USA）から、近縁種アカゲザルのDll4コード配列の5’および3’UTRに対して設計したプライマーを用いて増幅される（マカカ・ムラタ（Macaca mulatta）Dll4、配列番号：418；XM_001099250.1）（表1参照）。最終的アンプリコンを哺乳動物発現ベクターpCDNA3.1(+)-neo（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）でクローニングする。カニクイザルDll4のアミノ酸配列はアカゲザルと100%同一であり、ヒトと99%同一であることが示された（図1；ヒト配列との相違は太字下線付きで示されている）。
ヒトDll4、マウスDll4またはカニクイザルDll4を過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を樹立するために、親CHO細胞にpCDNA3.1(+)-neo-hDll4、pcDNA3.1(+)-neo-mDll4またはpcDNA3.1(+)-neo-cDll4をそれぞれエレクトロポレートする。ヒトDll4およびマウスDll4を過剰発現するヒト胎児腎（HEK293）細胞を、それぞれpCDNA3.1(+)-neo-hDll4またはmDll4プラスミドのFugene（Roche）を用い脂質媒介トランスフェクションによってHEK293親細胞株で作製する。全ての条件について、トランスフェクタントは1mg/mLのゲネチシン（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を添加することにより選別される。
【００５６】
b）モノクローナル抗Dll4 IgG Fabフラグメントの作製
US 2008/0014196（Genentech）で、ヒト/マウス交差反応性Dll4 mAbが記載されてあり、前記を用いてRiddwayら（2006）は、多数の異種移植モデルで腫瘍増殖におけるVEGF mAbおよびDll4 mAbの累積的作用を示した。この抗Dll4 mAbおよびその対応するFabを精製し、前記抗体（フラグメント）の生化学/細胞アッセイおよび異種移植モデルにおける特性およびファージ選別中の溶出について評価する。Dll4 mAbの公表された可変重鎖および軽鎖配列をhIgG2akフレームワークにクローニングし、さらにHEK293細胞で一過性に発現させ、上清からタンパク質Aクロマトグラフィーを用いて精製する。精製Dll4 mAbはELISAおよびFACSでヒトDll4およびマウスDll4との結合を示し（CHO-mDll4およびCHO-hDll4細胞を使用）、両増殖因子オルトローグに対して親和性はBiacoreでナノモル以下である。対応するDll4 Fabフラグメントは、バックトランスレーションによる遺伝子アッセンブリーおよびLetoの遺伝子最適化ソフト（www.entechelon.com）を用いる大腸菌発現のためのコドン最適化により構築される。可変軽鎖（VL）、可変重鎖（VH）、定常軽鎖（CL）および重鎖の定常ドメイン1（CH1）のアッセンブリーのためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、アッセンブリーPCRを実施する。VL+CLおよびVH+CH1をコードするcDNAセグメントをpUC119由来のベクター（LacZプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子、マルチクローニング部位およびハイブリッドgIII-pelBリーダー配列を含む）で、それぞれ制限部位SfiIおよびAscI並びに制限部位KpnIおよびNotIを用いクローニングする。Fabコード配列に関してインフレームで、発現ベクターはC-末端HAおよびHis6-タグをコードする。FabフラグメントはHis6-タグ付きタンパク質として大腸菌で発現され、続いて金属固定アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）およびサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により培養液から精製される。可変重鎖および可変軽鎖の対応するアミノ酸配列（それぞれUS 2008/0014196の配列番号：1および配列番号：2）；完全な重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は配列番号：419および420に示されている。
【００５７】
c）エピトープマッピングのためのDll4変異体の作製
抗Dll4 VHHによって認識されるエピトープを含むDll4の細胞外ドメイン（ECD）中の領域を同定すために、Dll4 ECDの進行的欠失変異体を作製する。ポリHis-タグを融合させたDll4 ECDの欠失フラグメントのネストシリーズをコードするポリヌクレオチドの上流にCMVプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターpSecTag2/Hygro（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を、標準的な組換えDNA技術を用いて作製する（図2参照；アミノ酸ドメインの境界は上付添字として記載）。これらの組換えタンパク質をフリースタイル293発現系（Freestyle 293 Expression System, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用い一過性にトランスフェクトしたHEK239細胞で発現させ、この系から条件付け培養液を収集してIMACにより精製する。EGF2様ドメインを欠くDll4変異体のみが、上記に記載したヒト化ヒト/マウス交差反応性抗Dll4 mAbとの結合障害を示した（前記抗体は捕捉性抗ヒトIgG被覆Biacoreセンサーチップにより固定）。このIgGはこのDll4ドメインに特異的な結合エピトープを有することが判明している（特許出願Genentech, US 2008/0014196A1）。
【００５８】
d）Dll4レポーターアッセイプラスミドの作製
レポーターアッセイは、Notch1のγ-セクレターゼ媒介切断およびDll4刺激時のNotch1細胞内ドメインの核内移転に基づいて開発される（本質的に以下に記載されている：Struhl and Adachi, Cell. 1998 May 15, 93(4):649-60）。Gal4/VP16コード配列をNICD-コード配列に挿入する。強力なハイブリッド転写アクチベーターGAL4-VP16（前記は単純ヘルペスウイルス転写アクチベータードメインVP16と融合させた酵母GAL4のDNA結合フラグメントから成る）を、Notch1のトランスメンブレンドメインのカルボキシ末端側に挿入する。γ-セクレターゼによるこの構築物の切断はGal4/VP16 NICD融合タンパク質の遊離をもたらし、前記は核に移転し、そこで同時にトランスフェクトされたルシフェラーゼレポータープラスミドと結合してこれを活性化するであろう（前記は強力なGAL4-UASプロモーター配列を含む（Struhl, G. and Adachi, A., Cell, vol. 93, 649-660, 1998））。ヒトNotch1-Gal4/VP16発現カセットをpcDNA3.1(+)-neo（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）でクローニングする。pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro]ベクター（Promega, Madison, WI, USA）をルシフェラーゼレポータープラスミドとして用いる。
【実施例１】
【００５９】
種々の種に由来するDll4による免疫はラマで液性免疫応答を誘発する
1.1 免疫
獣医学部（University Ghent, Belgium）倫理委員会の承認後、4頭のラマ（No. 208, 209, 230, 231と称する）に組換えヒトDll4（R&D Systems, Minneapolis, MN, US）を6回の筋肉内注射（1週間間隔で100または50μg/用量）により免疫する。Dll4抗原はStimune（Cedi Diagnostics BV, Lelystad, The Netherlands）で処方される。さらに別の3頭のラマ（No. 127b, 260, 261と称する）を、標準的なプロトコルにしたがい、ヒトDll4およびマウスDll4過剰発現CHO細胞（上記のように樹立）を4回交互に皮下注射して免疫する。細胞はD-PBSに再懸濁し、注射前に氷上で維持する。さらにまた、別の3頭のラマ（No. 282, 283, 284と称する）を、標準的なプロトコルにしたがい、組換えヒトDll4およびマウスDll4（R&D Systems, Minneapolis, MN, US）を4回交互に筋肉内注射（2週間間隔で100または50μg/用量）して免疫する。ヒトDll4による0日目の第1回の注射はフロイントの完全アジュバント（Difco, Detroit, MI, USA）で処方し、一方その後のヒトおよびマウスDll4による注射はフロイントの不完全アジュバント（Difco, Detroit, MI, USA）で処方される。
1.2 ラマで誘発された免疫応答の評価
ヒトDll4に対する免疫応答の動物での誘発をELISAにより評価するために、ラマ208、209、230および231から0日目（免疫前）、21日目および43日目（末梢血リンパ球（PBL）収集時）に、ラマ127b、260および261から0日目および51日目に、さらにラマ282、283および284から0日目、28日目および50日目に血清を収集する。簡略には、2μg/mLの組換えヒトDll4またはマウスDll4（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を4℃で一晩96ウェルのMaxiSorpプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）に固定する。ウェルをカゼイン溶液（1%）でブロックする。血清希釈物を添加した後、特異的に結合する免疫グロブリンを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合ヤギ抗ラマ免疫グロブリン（Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA）およびそれに続く基質TMB（3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン）（Pierce, Rockford, IL, USA）の存在下での酵素反応を用いて検出する（前記酵素反応はDll4に対する有意な抗体依存免疫反応が誘発されることを示す）。特異的に結合する免疫グロブリンは、通常のラマIgG1抗体または重鎖のみのラマIgG2もしくはIgG3抗体を特異的に認識する抗体により検出できるので、抗体応答は、通常の抗体および重鎖のみの抗体発現B細胞レパートリーの両方によって生じる（表2-A）。マウスDll4を注射された全てのラマで、抗体応答は、通常抗体および重鎖のみの抗体発現B細胞によってマウスDll4に対して特異的に生じる。さらにまた、ヒトおよびマウスDll4過剰発現HEK293細胞でのFACS解析により、細胞免疫動物の血清力価を確認する（表2-B）。各ラマのDll4血清力価応答は表2に示されている。
【００６０】
表2：Dll4に対する抗体媒介特異的血清応答
A)  ELISA（組換えタンパク質固相被覆）
【表２−１】
2013506410.tif 000004
ND：測定されず
【００６１】
B）FACS（HEK293細胞で天然に発現されるタンパク質）
【表２−２】
2013506410.tif 000005
ND：測定されず
【実施例２】
【００６２】
重鎖のみの抗体フラグメントレパートリーのクローニングおよびファージの調製
最後の免疫原注射に続いて、重鎖抗体を産生するB細胞の供給源として免疫組織を免疫ラマから収集する。典型的には、2つの150mL血液サンプル（最後の抗原注射から4日後および8日後に収集）、1つのリンパ節生検材料（最後の抗原注射から4日後に収集）を各動物につき収集する。前記血液サンプルから、Ficoll-Hypaque（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA）を製造業者の指示に従って用いて末梢血単核球（PBMC）を調製する。PBMCおよびリンパ節生検材料から全RNAを抽出し、RT-PCRのための出発材料として用い、WO 05/044858に記載されているようにVHHコードDNAセグメントを増幅する。各免疫ラマについて、当該動物の全収集免疫組織から単離した全RNAをプールすることによってライブラリーを構築する。略記すれば、VHHライブラリーのファージディスプレーを促進するように設計したベクターで、PCR増幅VHHレパートリーを特定の制限部位を介してクローニングする。前記ベクターはpUC119由来であり、LacZプロモーター、M13ファージgIIIタンパク質コード配列、アンピシリンまたはカルベニシリン耐性遺伝子、マルチクローニング部位およびハイブリッドgIII-pelBリーダー配列を含んでいる（pAX050）。VHHコード配列に関してインフレームで、前記ベクターはC末端c-mycタグおよびHis6タグをコードする。標準的プロトコルにしたがってファージを調製し、ろ過滅菌後4℃で更なる使用のために保存する。
【実施例３】
【００６３】
Dll4特異的VHHのファージディスプレーによる選別
全てのラマから入手しファージライブラリーとしてクローニングしたVHHレパートリーを、多数の選別条件を適用しながら種々の選別手段で用いる。可変事項には以下が含まれる：i）Dll4タンパク質フォーマット（ヒトDll4（Met1-Pro524）およびマウスDll4（Met1-Pro525）のC末端Hisタグ付加組換え発現細胞外ドメイン（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）、またはDll4過剰発現CHOまたはHEK293細胞上に存在する完全長ヒトDll4およびマウスDll4）、ii）抗原提示方法（Dll4で直接被覆したプレートまたはビオチンタグを介してDll4で被覆したニュートラビジン（Neutravidin）プレート；液相：溶液中でのインキュベーション後にニュートラビジン被覆プレート上で捕捉）、iii）抗原濃度、iv）種々の溶出方法（トリプシンによる非特異的方法または同族レセプターNotch1/Fcキメラまたは抗Dll4 IgG/Fabによる特異的方法）。全ての選別をMaxisorp 96-ウェルプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）で実施する。
選別は以下のように実施する：固相および液相選別様式のためのDll4抗原調製物を多数の濃度で上記のように提示する。2時間ファージライブラリーとインキュベートし、続いて十分に洗浄した後、結合ファージをトリプシン（1mg/mL）で30分間溶出させる。ファージ溶出にトリプシンを用いる場合、0.8mMのプロテアーゼ阻害剤ABSFを適用してプロテアーゼ活性を直ちに中和する。コントロールとして抗原使用／不使用選別を並行して実施する。バックグラウンド（無抗原コントロール）を超える濃縮を示すファージアウトプットを大腸菌感染に用いる。感染大腸菌は、次の選別ラウンド用ファージの調製に用いるか、または個々のVHHクローンの解析のために寒天プレート（LB+amp+グルコース2%）にプレートする。選別アウトプットを特異的結合物についてスクリーニングするために、単一コロニーを寒天プレートから採取し、1mLの96-深ウェルプレートで増殖させる。グルコースの非存在下でIPTG（最終濃度0.1−1mM）を添加することによって、LacZ制御VHH発現を誘発する。標準的プロトコルにしたがってペリプラズム抽出物（約80μLの体積）を調製する。
【実施例４】
【００６４】
Dll4-Notch1アルファスクリーンおよびFMAT競合アッセイにおけるペリプラズム抽出物のスクリーニング
ヒトDll4/ヒトNotch1アルファスクリーン（AlphaScreen）アッセイでペリプラズム抽出物をスクリーニングし、発現されたVHHの遮断能力を評価する。ビオチン（Sigma, St Louis, MO, USA）およびビオチンアミドヘキサン酸3-スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルのナトリウム塩（Sigma, St Louis, MO, USA）を用いてヒトDll4をビオチン化する。Notch1/Fcキメラ（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を抗Fc VHH（製造業者（Perkin Elmer, Waltham, MA, US）の指示に従いアクセプタービーズと連結されている）を用いて捕捉する。VHHの中和能力を評価するために、ペリプラズム抽出物の希釈系列をビオチン化ヒトDll4とプレインキュベートする。この混合物に、アクセプタービーズおよびストレプトアビジンドナービーズを添加し、さらに1時間室温でインキュベートする。励起波長680nmおよび発光波長520nmを用いエンビジョンマルチラベルプレートリーダー（Envision Multilabel Plate reader, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA）でプレートを読み取り蛍光を測定する。蛍光シグナルの減少は、ビオチン化ヒトDll4とヒトNotch1/Fcレセプターとの結合がペリプラズマ抽出物中の発現VHHによって遮断されたことを示す。
また別には、CHO-hDll4およびCHO-mDll4細胞をヒトNotch1/Fc FMAT（蛍光測定微小体積アッセイ技術（Fluorometric Microvolume Assay Technology））競合アッセイで用いる。組換えヒトNotch1/Fcキメラ（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）をランダムにAlexa-647（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）で標識する。略記すれば、5μLのペリプラズム材料を100pMまたは175pMの標識ヒトNotch1/Fcにそれぞれ7,500のCHO-hDll4またはCHOmDll4過剰発現細胞とともに添加し、2時間インキュベートした後で読み取りを実施する。無競合のベースラインを設定するために、ヒトNotch1/Fc〜Alexa647を有する細胞の少なくとも30組が含まれ、このベースラインから阻害パーセンテージを算出する。全ての計算はFL1_全シグナルを基準にする（前記はウェル当たりの蛍光の平均ｘウェル当たりのカウント数を含む）。このスクリーニングから阻害性VHHを選別し配列を決定する。配列の解析によって、異なる40のB細胞系列に属する167の固有のVHHが明らかになった。各B細胞系列について見出された変種の総数は表3に示されている。ペリプラズムのスクリーニングデータの概観は表4に示されている。入手した全ての固有VHHの配列は、配列リスト（配列番号：167−322および459）および表5（CDRおよびフレームワーク領域が指示されている）に示されている。
【００６５】
表3：DLL4特異的VHH B細胞系列の同定に使用される選別パラメーター
【表３】
2013506410.tif 000006
2013506410.tif 000007
2013506410.tif 000008
2013506410.tif 000009
【００６６】
表4：発現された抗DLL4 VHHを含むペリプラズム抽出物のスクリーニング
【表４】
2013506410.tif 000010
2013506410.tif 000011
(a)B細胞系列内で複数の固有変種が確認された場合、系列メンバーのオフレートの範囲（最大−最少）またはオフレートは括弧内に斜字体で提供されている。
(b)不均質ヒット：急速および緩徐なオフレートが測定される。
表5
【００６７】
【表５−１】
2013506410.tif 000012
【００６８】
【表５−２】
2013506410.tif 000013
【００６９】
【表５−３】
2013506410.tif 000014
【００７０】
【表５−４】
2013506410.tif 000015
【００７１】
【表５−５】
2013506410.tif 000016
【００７２】
【表５−６】
2013506410.tif 000017
【００７３】
【表５−７】
2013506410.tif 000018
【００７４】
【表５−８】
2013506410.tif 000019
【００７５】
【表５−９】
2013506410.tif 000020
【００７６】
【表５−１０】
2013506410.tif 000021
【００７７】
【表５−１１】
2013506410.tif 000022
【００７８】
【表５−１２】
2013506410.tif 000023
【実施例５】
【００７９】
精製VHHの性状決定
実施例4で述べたスクリーニングから選別した阻害性抗Dll4 VHHをさらに精製し、性状を決定する。選別したVHHを大腸菌TG1でc-myc、His6タグ付加タンパク質として発現させる。発現は1mMのIPTGの添加により誘発し、37℃で4時間持続させる。細胞培養の遠心後、ペレットの凍結溶解によりペリプラズム抽出物を調製する。これらの抽出物を出発材料として用い、VHHをIMACおよびサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により精製し、SDS-PAGEで判定したとき純度95%が得られる。
5.1 ELISAによるDll4遮断VHHの評価
VHHの遮断能力をヒトDll4-ヒトNotch1/Fc遮断ELISAで評価する。略記すれば、1μg/mLのヒトNotch1/Fcキメラ（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）で96ウェルのMaxiSorpプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）を被覆する。15nMの固定濃度のビオチン化ヒトDll4を一連のVHH希釈物と1時間プレインキュベートし、その後この混合物を被覆Notch1レセプターとともにさらに1時間インキュベートする。ビオチン化ヒトDll4の残留結合をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）連結エキストラビジン（Sigma, St. Louis, MO, USA）を用いて検出する（図3）。ヒトDll4は上記に記載したようにビオチン化する。ヒトDll4-ヒトNotch1/Fc相互作用を遮断するVHHのIC50値は表6に示されている。
表6：hDLL4/hNotch1-Fc競合ELISAでのVHHのIC50（nM）
【００８０】
【表６】
2013506410.tif 000024
5.2 アルファスクリーンによるDll4遮断VHHの評価
略記すれば、1nMのビオチン化ヒトDll4をストレプトアビジン被覆ドナービーズ（20μg/mL）上で捕捉し、一方0.4nMのレセプターヒトNotch1（Fc融合タンパク質として）を抗ヒトFc VHH被覆アクセプタービーズ（20μg/mL）上で捕捉する。両方の装荷ビーズを一連の希釈の競合VHHとともにインキュベートする（図4）。ヒトDll4-ヒトNotch1/Fc相互作用を遮断するVHHのIC50値は表7に示されている。
表7：hDLL4/hNotch1競合アルファスクリーンでのVHHのIC50（nM）
【表７】
2013506410.tif 000025
(a) 部分的阻害
【００８１】
5.3 CHO細胞で発現されたヒトまたはマウスDll4とヒトNotch1/Fcとの結合の抗Dll4 VHHによる阻害
VHHの遮断能力を、実施例4で概略したようにヒトおよびマウスDll4-ヒトNotch1/Fc競合FMATアッセイで評価する（図5）。CHO細胞発現ヒトまたはマウスDll4とヒトNotch1/Fcとの相互作用を遮断するVHHのIC50値は表8に示されている。
表8：CHO細胞で発現されたヒトまたはマウスDLL4とヒトNotch1/Fcとの相互作用を遮断する精製VHHの（平均）IC50値（nM）
【表８】
2013506410.tif 000026
【００８２】
5.4 レポーターアッセイによるDll4遮断VHHの評価
選別したVHHの能力を評価するために、Dll4による刺激によるNotch1のγ-セクレターゼ媒介切断およびNotch1の細胞内ドメイン（NICD）の遊離に基づくレポーターアッセイをセットする。pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro]レポータープラスミドとともにNotch1-GAL4/VP16構築物でHEK細胞を同時トランスフェクトして、融合タンパク質の一過性発現を得る。これらの一過性にトランスフェクトした細胞をHEK293-hDll4安定細胞株とともに同時培養することによって24時間刺激する。トランスフェクションから48時間後に読み取りを実施する。同時培養の開始前にVHHを1時間HEK293-hDll4細胞とプレインキュベートし、さらに同時培養中にもVHHを加える（図6）。Notch1のDll4媒介切断およびその後のNICDのレセプター細胞の核への移転を遮断するVHHのIC50値は表9に示されている。
【００８３】
表9：DLL4/Notch1レポーターアッセイでの精製VHH（平均）IC50値（nM）
【表９】
2013506410.tif 000027
【００８４】
5.5 エピトープビンニング
例えばベンチマーク抗体が結合するときにVHHが同時にDll4に結合できるか否かを決定するために、エピトープビンニング実験を実施する（Biacore T100装置を用いた表面プラズモン共鳴（SPR）による）。抗Dll4 FabフラグメントをCM5センサーチップの参照および活動フローセルに不可逆的に固定する。各サンプル（サイクル）に対して、ヒトDll4を活動および参照フローセルに注入し、抗Dll4 Fabによって可逆的に捕捉する。追加されたVHHの結合を固定された表面への注入によって評価する。全てのVHHおよび抗Dll4 Fabは、表面接触時間120秒、流速10μL/分、100nMで注入される。表面は10mMグリシン（pH1.5）を用いて再生する。処理曲線はBiacore T100評価ソフトにより評価する。表10-Aは解析したVHHおよびコントロールの連続的注入／再生経路を示す。VHH DLLBII56A09（配列番号：300）、DLLBII96C03（配列番号：326）、DLLBII101G08（配列番号：197）およびDLLBII115A05（配列番号：224）は、Dll4 Fabによって捕捉されたヒトDll4とは更なる結合を示さない。Dll4 Fabの注入もまたヒトDll4との更なる結合をもたらさず、全てのエピトープが飽和していることを示す。したがって、これらのVHHは、ヒトDll4と結合するDll4 Fabとオーバーラップするエピトープを認識すると結論することができる。ヒト専用VHH DLLBII6B11（配列番号：174）およびDLLBII104G01（配列番号：215）は、Dll4 Fab捕捉ヒトDll4と更なる結合を示し、ヒトDll4二特異的なこれらのVHHは、ヒト/マウス交差反応性VHHとは異なるエピトープを認識することを示唆する。
【００８５】
表10-A：抗DLL4 VHHのエピトープビンニング−DLL4 Fabによる同時結合
【表１０−Ａ】
2013506410.tif 000028
【００８６】
5.6 Dll4欠失変異体によるエピトープマッピング
これらのDll4変異体とVHHとの結合をBiacoreで評価する。略記すれば、VHH DLLBII101G08（配列番号：197）およびDLLBII115A5（配列番号：224）でCM4センサーチップを被覆し、200nMの各欠失変異体をチップに注入する。結合を定量的に判定する。ヒトおよびマウスDll4変異体hDll4.1およびmDll4.8（それぞれEGF様2ドメインを欠く）に対するDLLBII56A09（配列番号：300）、DLLBII101G 08（配列番号：197）およびDLLBII115A05（配列番号：224）の結合は観察されない。hDll4/Dll4 IgG競合ELISAを用いた間接的証拠によれば前記の観察は既に指摘されていた。略記すれば、1μg/mLの Dll4 IgGで96ウェルのMaxiSorpプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）を被覆する。6nMの固定濃度のビオチン化ヒトDll4をVHHの一連の希釈と1時間プレインキュベートし、その後、前記混合物を前記被覆IgG上でさらに1時間インキュベートする。ビオチン化ヒトDll4の残留結合をセイヨウワサビペルオキシダーゼ連結エキストラビジン（Sigma, St. Louis, MO, USA）を用いて検出する（データは示されていない）。ヒトDll4は上記に記載したようにビオチン化する。モノクローナル抗Dll4 IgG（Genentech, US 2008/0014196A1）はDll4のEGF様2ドメイン内のエピトープと結合することは、特許文献から公知である。
【００８７】
表10-B：抗DLL4 VHHのエピトープマッピング−DLL4欠失変異体との結合
【表１０−Ｂ】
2013506410.tif 000029
【００８８】
5.7 Dll4-VHH相互作用の親和性の決定
Dll4-VHH相互作用の親和性を決定するための動力学的解析をBiacore T100装置により表面プラズモン共鳴（SPR）によって実施する。組換えヒトDll4をEDCおよびNHSを用いてアミノ酸カップリングによってCM5チップに固定するか、またはビオチン化ヒトDll4をSAチップ（ストレプトアビジン表面）で捕捉する。精製VHHまたはFabフラグメントを種々の濃度（10から300nM）で2分間注入し、流速45μL/分で20分間解離させる。サンプル注入の間、10mMグリシン（pH1.5）および100mMのHClにより表面を再生させる。HBS-N（Hepes緩衝液、pH7.4）を作動緩衝液として用いる。可能な場合には、結合曲線に1：1相互作用モデル（Langmuir結合）を適合させることによってデータを評価する。得られた結合および解離速度定数（ka）および（kd）から親和性定数KDを計算する。抗Dll4 VHHの親和性は表11に示されている。
【００８９】
表11：組換えヒトDLL4に対する精製VHHの親和性KD（nM）
【表１１】
2013506410.tif 000030
（a）1：1適合を生じない不均質な結合曲線
【００９０】
5.8 オルトローグ（mDll4、cDll4）およびファミリーメンバー（hJagged-1,hDLL1）への結合
マウスDll4への交差反応性を決定するために、結合ELISAを実施する。略記すれば、組換えマウスDll4（R&D Systems, Minneapolis, MS, USA）で1μg/mL、4℃で96ウェルMaxiSorpプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）を一晩被覆する。ウェルをカゼイン溶液（PBSで1%）ブロックする。連続希釈物としてVHHを適用し、マウス抗myc（Roche）および抗マウスAP連結物（Sigma, St Louis, MO, USA）を用いて結合を検出する（図7）。参照として、ヒトDll4との結合を測定する。EC50値は表12に要約されている。
表12：組換えヒトDLL4およびマウスDLL4結合ELISAでのVHHのEC50（nM）値
【表１２】
2013506410.tif 000031
【００９１】
VHHのカニクイザル交差反応性を決定するために、FACS結合実験を実施する。カニクイザルDll4発現HEK293細胞（一過性または安定的トランスフェクション）をVHHの結合実験の力価測定に用いる。氷上で30分インキュベートした後、全てのサンプルを洗浄し、検出は抗c-myc〜Alexa647（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）を用いて実施する。ヒトおよびマウスDll4過剰発現HEK293細胞を参照として用いる。平均MCF値をFACSアレイで決定し、EC50値の計算に用いる（図9）。
同種リガンドヒトDLL1およびヒトJagged-1との結合が存在しないことは固相結合アッセイ（ELISA）で判定する。略記すれば、ヒトDLL1（Alexis, San Diego, CA, USA）およびヒトJagged-1（Alexis, San Diego, CA, USA）で1μg/mL、4℃で96ウェルのMaxiSorpプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）を一晩被覆する。ウェルをカゼイン溶液（PBSで1%）でブロックする。連続希釈物としてVHHを適用し、マウス抗myc（Roche）および抗マウスAP連結物（Sigma, St Louis, MO, USA）を用いて結合を検出する。全ての抗Dll4 VHHは、これらの同種リガンドに対して交差反応性でないと考えられる（図8）。
【００９２】
5.9 Dll4媒介HUVEC増殖の阻止におけるVHHの評価
選別したVHHの能力をRidgwayらが記載した増殖アッセイの改変型で評価する（Ridgway et al., Nature. 2006 Dec 21;444(7122):1083-7）。略記すれば、96ウェルの組織培養プレートを被覆緩衝液（PBS、0.1%BSA）中の精製Dll4-His（RnD Systems；C末端Hisタグ付加ヒトDll4、アミノ酸27-524、0.75ml/ウェル、10 ng/ml）を用いて被覆する。ウェルをPBSで洗浄した後、4000 HUVE細胞/ウェルを4つ組で播種する。4日目に細胞増殖を［3H］-チミジンの取り込みによって測定する。図15に示した結果は、DLL4 VHHのDLLBII101G08、DLLBII104G01、DLLBII115A05、DLLBII56A09およびDLL4 Fabは、HUVEC増殖におけるDLL4依存作用を用量依存態様で阻害することを明示している。IC50値は表13に要約されている。試験したVHHは、DLL4依存作用の完全な阻害を10μMで達成する。
表13：DLL4増殖アッセイで得られたIC50値
【表１３】
2013506410.tif 000032
【実施例６】
【００９３】
選別したVHHの親和性増進
VHH DLLBII101G08およびDLLBII115A05を2サイクルの親和性増進に付す。
最初のサイクルでは、アミノ酸置換が、変異性PCR方法を用いてフレームワーク（FW）および相補性決定領域（CDR）の両方にランダムに導入される。変異導入は、2ラウンドのPCR系アプローチ（Stratagene（La Jolla, CA, USA）から入手されるGenemorph II ランダム変異導入キット）で実施される。前記アプローチでは、1ngのDLLBII101G08またはDLLBII115A05 cDNA鋳型が用いられ、続いて2回目の変異性PCRが0.1ng の1回目の生成物を用いて実施される。精製工程の後で、PCR生成物をVHHライブラリーのファージディスプレーを促進するように設計したベクターに固有の制限部位を介して挿入する。ビオチン化組換えヒトDLL4（biot-rhDLL4）の濃度下降およびトリプシン溶出を用いて溶液中での連続選別ラウンドを実施する。コールドのrhDLL4（biot-rhDLL4よりも少なくとも100ｘ過剰）を用いた第3ラウンドの親和性駆動選別もまた実施する。ネズミDLL4についての選別は、交差反応性（の保存）をスクリーニングレベルで評価するので組み入れない。個々の変異体は、pUC119由来の発現ベクター（pAX50）を用いて組換えタンパク質として生成される（前記ベクターはLacZプロモーター、アンピシリン耐性遺伝子、マルチクローニング部位およびompAリーダー配列を含む）。大腸菌TG1細胞を前記発現ベクターライブラリーで形質転換し、寒天プレート（LB＋Amp＋2%グルコース）にプレートする。寒天プレートから単一コロニーを採取し、1mL 96深ウェルプレートで増殖させる。VHH発現をIPTG（1mM）の添加により誘発する。標準的方法にしたがってペリプラズム抽出物（体積約80μL）を調製し、ProteOn（BioRad, Hercules, CA, USA）オフレートアッセイで組換えヒトおよびマウスDll4との結合についてスクリーニングする。略記すれば、GLC ProteOnセンサーチップの“リガンドチャネル”L2およびL4を組み換えヒトDll4で被覆し（L1/L3は参照チャネル）、一方、“リガンドチャネル”L3およびL6はマウスDll4で被覆する。親和性増進クローンのペリプラズム抽出物を1/10に希釈し、“分析物チャネル”A1−A6に注入する。プレートに存在する野生型クローンの平均オフレートを計算し、オフレート改善の計算の参照として供する。
2回目サイクルでは、1回目サイクルで認定した感受性を有する位置を同時ランダム化することによってコンビナトリアルライブラリーを作製する。このために、完全長DLLBII101G8またはDLLBII115A05 cDNAを、前記同時ランダム化位置において縮退オリゴヌクレオチド（NNS）を用いるオーバーラップPCRによって合成し、さらにレスキューPCRを実施する。コンビナトリアルライブラリーの作製のために用いたプライマーのリストは表14および配列番号：427から457で見出すことができる。上記（実施例2）に記載したように特異的制限部位を用いて、前記ランダム化VHH遺伝子をファージディスプレーベクター（pAX50）に挿入する。個々のVHHクローンのペリプラズム抽出物の調製は以前に記載したように実施する。
【００９４】
表14：オリゴヌクレオチド親和性増進ライブラリー
【表１４】
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【００９５】
ProteOnオフレートアッセイでの組換えヒトDll4との結合についてのスクリーニングによって、38倍まで（DLLBII101G08）および11倍まで（DLLBII115A05）オフレートが改善されたクローンが同定された（表15）。
【００９６】
表15：DLLBII101G08およびDLLBII115A05親和性増進クローンのオフレートスクリーニング
【表１５】
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【００９７】
最上位DLLBII101G08変種およびDLLBII115A05変種をC末端c-mycタグおよび(His)6タグと共にインフレームで発現ベクターpAX100にクローニングする。組換えマウスDll4におけるオフレートもまた改善されている。大腸菌でVHHをHis6タグ付きタンパク質として生成し、IMACおよびSECで精製する。配列は表16-A（LLBII101G08）および16-B（DLLBII11A05）にそれぞれ提示されている。
【００９８】
【表１６−Ａ】
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【００９９】
【表１６−Ｂ】
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【実施例７】
【０１００】
精製した親和性増進VHHの性状決定
親和性増進VHH DLLBII101G08およびDLLBII115A05変種を上記（実施例6）に記載したように発現させ精製する。rhDLL1/rhJAG1結合ELISAおよびhDll4/mDll4/ cynoDll4 FACS（実施例5.8；表20；図12および13）、rhDll4-rhNotch1競合ELISA （実施例5.1；表17；図10）、競合rhNotch1-CHO-hDll4 FMAT（実施例5.3；表18；図11）でVHHの性状を決定する。
性状決定のデータは表21に要約されている。全般的に、親和性増進VHHは親和性および効力に置いて明瞭な改善を示し、一方、それらとmDll4およびcynoDll4との結合は維持され、hDLL1またはhJAG1との結合は観察されない。
【０１０１】
表17：hDLL4/hNotch1-Fc競合ELISAでの親和性増進VHHのIC50値（nM）
【表１７】
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【０１０２】
表18：ヒトNotch1/FcとCHO細胞発現ヒトまたはマウスDLL4との相互作用を阻止する精製親和性増進VHHのIC50値（nM）
【表１８】
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【０１０３】
表19：組換えヒトDLL4およびマウスDLL4に対する精製親和性増進VHHの親和性KD（nM）
【表１９】
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【０１０４】
表20：CHO-hDLL4、CHO-mDLL4およびCHO-cDLL4との結合（FACS）に対する親和性増進VHHのEC50値（nM）
【表２０】
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【０１０５】
表21：DLLBII101G08およびDLLBII115A05由来の親和性増進VHHの特徴
【表２１】
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【０１０６】
nb：結合無し
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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