(57)【要約】  試料構造の顕微鏡像を取得する装置及び方法が記載される。試料構造（３４）及び参照構造（５０）を撮像する光学系（３０、３８、５４、５６、５８）が、撮像された参照構造に基づいて光学系（３０、３８、５４、５６、５８）に対する試料構造（３４）のドリフトを感知するドリフト感知ユニット（４２、５２）とともに提供される。光学系（３０、３８、５４、５６、５８）は、試料構造（３４）を撮像する第１の鮮鋭平面（４６）と、同時に、参照構造（５０）を撮像する、第１の鮮鋭平面（４６）に対して位置を変更可能な第２の鮮鋭平面（６０）とを備える。
2013533513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料構造（３４）の顕微鏡像を取得する装置（２０、２０’）であって、
前記試料構造（３４）及び参照構造（５０）を撮像する光学系（３０、３８、５４、５６、５８）と、撮像された前記参照構造（５０）に基づいて、前記光学系（３０、３８、５４、５６、５８）に対する前記試料構造（３４）のドリフトを感知するドリフト感知ユニット（４２、５２）と、を有し、
前記光学系（３０、３８、５４、５６、５８）は、前記試料構造（３４）を撮像する第１の鮮鋭平面（４６）と、同時に、前記第１の鮮鋭平面（４６）に対して位置を変更可能な、前記参照構造（５０）を撮像する第２の鮮鋭平面（６０）とを備えて構成される、装置（２０、２０’）。
【請求項２】
前記光学系（３０、３８、５４、５６、５８）は、前記試料構造（３４）を撮像する対物レンズ（３０）と、前記参照構造（５０）を撮像するために前記対物レンズ（３０）と共に動作して、前記第２の鮮鋭平面（６０）の位置を変更するように調整可能な下位光学系（５４、５６、５８）とを備えて構成される、請求項１に記載の装置（２０、２０’）。
【請求項３】
前記下位光学系（５４、５６、５８）は、互いに移動可能な少なくとも２枚のレンズ（５６、５８）を含む、請求項２に記載の装置（２０、２０’）。
【請求項４】
前記下位光学系（５４、５６、５８）は、前記試料構造（３４）の撮像を目的とする主光路から逸れた補助光路に配置される、請求項２又は３に記載の装置（２０、２０’）。
【請求項５】
前記主光路に配置され、前記試料構造（３４）を撮像可能な第１の光検出器（４０）と、前記補助光路に配置され、前記参照構造（５０）を撮像可能な第２の光検出器（５２）とを特徴とする、請求項４に記載の装置（２０、２０’）。
【請求項６】
前記補助光路を前記主光路から逸らし、前記第２の光検出器（５２）に向ける光分離光学要素（３６、３６’）を特徴とする、請求項４又は５に記載の装置（２０、２０’）。
【請求項７】
前記第２の鮮鋭平面（６０）を前記参照構造（５０）上に調整するオートフォーカス装置（４２、６１）を特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の装置（２０、２０’）。
【請求項８】
前記参照構造（５０）は試料ホルダ（４４）のカバースリップ（７０）に具現される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の装置（２０、２０’）。
【請求項９】
前記光学系（３０、３８、５４、５６、５８）及び／又は試料ホルダ（４４）の少なくとも一部分を移動させて、ドリフトを補償するため、前記ドリフト感知ユニット（４２、５２）により生成されるドリフト信号を介して制御を適用可能である位置決め部材（４８）を特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の装置（２０、２０’）。
【請求項１０】
前記対物レンズ（３０）を通して、前記試料構造（３４）を照明し、同時に前記参照構造（５０）を照明する光源（２２）を特徴とする、請求項２〜９のいずれか一項に記載の装置（２０）。
【請求項１１】
前記装置（２０、２０’）が蛍光顕微鏡である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の装置（２０、２０’）。
【請求項１２】
光学系（３０、３８、５４、５６、５８）により試料構造（３４）及び参照構造（５０）を撮像し、撮像された参照構造（５０）に基づいて、前記光学系（３０、３８、５４、５６、５８）に対する前記試料構造（３４）のドリフトを感知する、試料構造（３４）の顕微鏡像を取得する方法であって、
前記試料構造（３４）は、前記光学系（３０、３８、５４、５６、５８）の第１の鮮鋭平面（４６）に撮像され、同時に、前記参照構造（５０）が、前記光学系（３０、３８、５４、５６、５８）の第２の鮮鋭平面（６０）上で撮像され、前記第２の鮮鋭平面（６０）は、前記第１の鮮鋭平面（４６）に対して位置を変更可能である、方法。
【請求項１３】
前記試料構造（３４）を含む試料は、前記参照構造（５０）を構成する粒子（４９）を用いて準備される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記参照構造（５０）は、試料ホルダ（４４）の一部分、特にカバースリップ（７０）に具現される、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１及び請求項１２のそれぞれの前提部（プリアンブル部分、所謂おいて書き部分）に係る、試料構造の顕微鏡像を取得する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、個々のマーカー（特に、蛍光分子）の逐次確率的局在化に基づいて、従来の光学顕微鏡の回折に関連する解像限界よりも小さな試料構造を表示可能な光学顕微鏡撮像法が開発された。そのような方法は、例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、非特許文献１、非特許文献２に記載されている。顕微鏡のこの新しい部門は「局在顕微鏡法」とも呼ばれる。該当する方法は、例えば、ＰＡＬＭ、ＦＰＡＬＭ、（Ｆ）ＳＴＯＲＭ、ＰＡＬＭＩＲＡ、又はＧＳＤＩＭの名称でも文献において既知である。
【０００３】
これらの新しい方法には共通して、撮像すべき試料構造は、２つの区別可能な状態、すなわち、「明」状態及び「暗」状態を有するマーカーを用いて準備される、という事実がある。例えば、蛍光染料がマーカーとして使用される場合、明状態は蛍光可能状態であり、暗状態は非蛍光可能状態である。試料構造を、像生成光学系の従来の解像限界よりも小さな分解能で撮像するには、マーカーの小さなサブセットが繰り返し、明状態に準備される。このサブセットを以下、「アクティブサブセット」と呼ぶ。アクティブサブセットは、明状態、ひいては光学顕微鏡法により撮像可能な状態、での隣接マーカーの平均間隔が、撮像光学系の撮像限界よりも大きくなるように選択しなければならない。アクティブサブセットの輝度信号が、空間分解光検出器、例えば、ＣＣＤカメラに撮像される。したがって、像生成光学系の解像限界によってサイズが決まる光点の形態の光の分布が、各マーカーから取得される。
【０００４】
結果として、複数の個々の未処理データ像が取得され、個々の未処理データ像のそれぞれでは、異なるアクティブサブセットが撮像される。像解析プロセスでは、次に、光分布（明状態のマーカーを表す）の中心点が、個々の各未処理データ像で特定される。次に、個々の未処理データ像から識別された光分布の中心点が、全体像データセットの形態の１つの全体図に組み合わせられる。この全体図により生成される高分解能全体図は、マーカーの分布を反映する。したがって、「未処理データ」は以下、中心点位置を特定するために、像解析プロセスをまだ受けていないデータとして理解される。
【０００５】
撮像すべき試料構造を表現する複製のために、十分に多くの信号を検出しなければならない。しかし、特定のアクティブサブセット内のマーカーの数は、明状態で２つのマーカーの間に存在しなければならない最小平均間隔により制限されるため、試料構造を完全に撮像するには、非常に多くの個々の未処理データ像を取得しなければならない。個々の未処理データ像の数は通常、１０，０００〜１００，０００の範囲内にある。
【０００６】
個々の未処理データ像の取得に必要な時間の最短端は、光検出器の最高像取得速度により制限される。これは、全体図に必要な一連の個々の未処理データ像の合計取得時間が比較的長くなることに繋がる。したがって、合計取得時間は、数時間という長い時間になり得る。
【０００７】
この長い合計取得時間にわたり、像生成光学系に対する撮像中の試料の移動が生じ得る。すべての個々の未処理データ像は、高分解能全体像を生成するために、中心点特定後に結合しなければならないため、２つの連続した個々の未処理データ像の取得中に生じる試料と像生成光学系とのいかなる相対移動も、全体像の空間分解能を低下させる。多くの場合、この相対移動は、熱膨張若しくは熱収縮により、機械的応力により、又は機械部品に使用される潤滑剤の一貫性の変化により生じるシステムの系統的な機械的移動（「機械的ドリフト」とも呼ばれる）から生じる。
【０００８】
上述した問題を図１〜図３を参照して以下に説明する。
【０００９】
図１ａは、３つの同心円環で構成される試料構造２を概略的に示す。以下、撮像すべきこの試料構造２の構造的特徴、特に同心円環の互いの間隔が、光学顕微鏡法撮像の回折限界解像限界を下回るほど小さいと仮定する。
【００１０】
次に、図１ａに示される試料構造２にマーカーが提供され、これらのマーカーを明状態にすると（それにより、光学顕微鏡法により撮像できる）、結果として生成されるのは、光学顕微鏡法撮像の回折限界分解性能により、図１ｂに示される類いの顕微鏡像であり、この像では、マーカーが提供された試料構造２の個々の円環はもはや区別不可能である。図１ｂでは（及び図２及び図３でも）、図１ａに示される試料構造２は破線の円形線で示されて、この状況を示す。図１ｂに示されるように、ここでの結果はぼやけ、したがって、ハッチングで示される空間的に分解されていない光分布４である。
【００１１】
図２ａは、一連の個々の未処理データ像を示し、像のそれぞれでは、マーカーのアクティブサブセットが撮像される。アクティブマーカーは、個々の未処理データ像では、像生成光学系の解像分解によってサイズが決まる広がった光点６として見える。図２ａが示すように、光点６はそれぞれ、光点６のサイズを決めるこの解像限界よりも大きな、互いの平均間隔にある。
【００１２】
図２ｂは、個々の未処理データ像から、上述した像解析プロセスで光点６の中心点位置８が識別される様式を示す。次に、個々の未処理データ像から特定される中心点位置８を結合して、図２ｃに示される全体図にする。したがって、２ｃの全体図は、図１ａに示される試料構造２の高分解能全体像を供給する。
【００１３】
図３ａ及び図３ｂは、撮像中の試料構造２と像生成光学系との、２つの連続した個々の未処理データ像の取得中に生じる相対移動の結果として、全体像の空間分解能の低下がどのように生じ得るかを示す。この例では、単に説明のために、第１の個々の未処理データ像から特定される中心位置は、円１０で示され、第１の個々の未処理データ像の直後の第２の個々の未処理データ像から特定される中心点位置は、正方形１２で示されるものと仮定する。
【００１４】
図３ａは、機械的ドリフトがない理想的な状況を示す。２つの個々の未処理データ像から識別された中心点位置１０及び１２は、図１ａに示される試料構造２を精密に再現する。図３ｂは、機械的ドリフトが、第１の個々の未処理データ像に対して第２の個々の未処理データ像を変位させる場合を示す。第２の個々の未処理データ像から導出される中心点位置１２は、それに対応して、第１の個々の未処理データ像から導出される中心点位置１０からずれる。この結果は、全体像の空間分解能の低下である。
【００１５】
撮像光学系に対する試料構造のドリフトを感知して補償する様々な方法が既知である。例えば、参照マーカー、例えば、金ミクロスフィア又は蛍光ナノ粒子で試料構造に印を付け、試料構造の像の実際の取得の同時に位置を光学的に感知することが提案されている。この文脈の中では、第１の波長領域（すなわち、蛍光顕微鏡の場合、蛍光の波長領域）で試料構造を光学的に感知し、第１の波長領域とは異なる第２の波長領域（例えば、反射性金ミクロスフィアが使用される場合、照明光の波長領域）で参照構造を光学的に感知することが普通である。２つの別個の光検出器又は２つの色チャネルで動作する単一の光検出器をこのために使用することができる。次に、参照構造の取得像のドリフト関連位置変位から、ドリフトを特定することができる。
【００１６】
上述した方法では、参照マーカーが比較的高密度で試料に導入される。これは、参照マーカーが、光学系により光検出器に鮮鋭に撮像すべき試料構造が導入される撮像光学系の鮮鋭平面に十分な数量で存在することを保証する唯一の方法である。高密度で存在し、異物を構成する参照マーカーは、特に生きている細胞構造の光学顕微鏡法撮像の文脈の中で不利な影響を有する。加えて、参照マーカーを導入するために実行しなければならない試料準備は、比較的複雑である。
【００１７】
適したセンサ、例えば、容量性距離測定装置を使用して、機械的ドリフトを感知することも可能である。そのようなセンサは通常、試料が搭載される試料ホルダに取り付けられる。この文脈の中で、試料ホルダと試料との任意の相対移動を相殺することができない場合、センサを介して特定された試料ホルダのドリフトが必ずしも試料構造の実際のドリフトに対応するわけではないことは不利である。加えて、そのようなセンサの使用は、技術的に比較的複雑である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２７６９２ Ａ２号パンフレット
【特許文献２】独国特許第１０ ２００６ ０２１ ３１７ Ｂ３号明細書
【特許文献３】国際公開第２００７／１２８４３４ Ａ１号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９／０１３４３４２ Ａ１号明細書
【特許文献５】独国特許出願公開第１０ ２００８ ０２４ ５６８ Ａ１号明細書
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】「Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy（ＳＴＯＲＭ）」Nature Methods ３，７９３−７９６（２００６），M．J．Rust，M．Bates，X．Zhuang
【非特許文献２】「Resolution of Lambda／１０ in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching」Geisler C．et al.，Appl．Phys．A，８８，２２３−２２６（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、撮像光学系に対する試料構造のドリフトの信頼性の高い感知を、技術的複雑性が殆ど伴わずに可能にする試料構造の顕微鏡像を取得する装置及び方法を記載することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、請求項１及び１２のそれぞれの特徴部の特徴構成によりこの目的を達成する。
【００２２】
本発明は、撮像光学的に、互いに物理的に離間され、互いに対してシフト可能な２つの鮮鋭平面又は焦点面を提供し、そのうちの第１の鮮鋭平面又は焦点面は試料構造を撮像するように機能し、第２の鮮鋭度面又は焦点面は参照構造を撮像するように機能する。「平面」という用語は当然、ここでは、厳密に数学的な意味での平面、すなわち、厳密に二次元の幾何学的空間ではなく、むしろ、物体（この場合、試料構造又は参照構造のそれぞれ）が画像平面に鮮鋭に撮像される、通常は光学系の焦点深度により特徴付けられる光学系の物体空間内の領域として理解されたい。
【００２３】
撮像すべき試料構造が、例えば、試料ホルダに取り付けられた合焦駆動装置により運ばれる光学系の第１の鮮鋭平面が固定されると仮定すると、本発明による光学系は、所望に応じて適した参照構造への第２の鮮鋭平面を調整できるようにする。特に、参照構造は、試料構造が配置される第１の鮮鋭平面の物理的な直近に配置する必要がない。これにより、ドリフトを感知するために参照構造として撮像試料構造と固定された空間関係を有する任意の所望の構造を使用することが可能になる。例えば、試料又は試料ホルダにすでに存在する構造を光学顕微鏡法で撮像可能である。参照構造は特に、通常、試料ホルダのキャリアの試料を不動化するために使用されるカバースリップに具現することができる。或いは、参照構造を、キャリア自体に具現、例えば、キャリア自体にインプリントすることができる。
【００２４】
試料の自己蛍光構造も同様に、ドリフト感知に使用することができる。上述したように、明状態及び暗状態を有する局在顕微鏡法で使用されるマーカーは、参照構造を構成することもできる。したがって、例えば、すべてのマーカーを暗状態から明状態にすることにより、参照構造を生成することが可能である。次に、光学系の限られた解像能力により、試料構造の撮像に適さない、それにより生成された構造に基づいてドリフトを特定することができる。
【００２５】
本発明による装置の文脈の中では、光学系の第２の鮮鋭平面が、第１の鮮鋭平面に対して所望のように調整可能なことにより、適した参照構造を見つけ、ドリフトの感知に使用することは常に容易である。これは特に、異物、例えば、金ミクロスフィアを構成する参照マーカーが試料に導入される場合に有利である。光学系の第２の鮮鋭平面を変位させることにより、十分な参照マーカーが存在する試料領域を見つけることが容易である。結果として、試料に導入する必要がある参照マーカーの集中度が低減し、これは特に、生きている細胞構造を撮像する場合に有利である。これは試料準備をさらに簡易化する。
【００２６】
撮像光学系自体を使用する本発明によるドリフトの光学感知には、既存の分野から既知の外部センサを使用する場合よりも低い技術的複雑性が関連付けられる。試料自体に存在する構造が参照構造として使用される場合、上述した外部センサを使用して可能な信頼性及び精度よりも高い信頼性及び精度で試料構造のドリフトを感知することができる。上述した外部センサを使用する場合、例えば、センサで測定されるドリフトが実際に試料構造のドリフトに対応することが常に保証されるわけではない。これは特に熱膨張が、センサが通常取り付けられる試料ホルダで発生する場合に言えることである。
【００２７】
光学系は、好ましくは、試料構造を撮像する対物レンズと、対物レンズと共に動作して、参照構造を撮像し、第２の鮮鋭平面の位置を変更するように調整可能な下位光学系とを備える。したがって、この実施形態では、対物レンズは、試料構造の撮像及び参照構造の撮像の両方に寄与し、その一方で、下位光学系は参照構造の撮像のみに使用され、第１の鮮鋭平面に対して第２の鮮鋭平面を調整するように機能する。
【００２８】
好ましい改良形態では、下位光学系は互いに対して移動可能な少なくとも２枚のレンズを含む。これらのレンズを互いに対してシフトすることにより、下位光学系及び対物レンズにより構成される光学システムの焦点長、ひいては第２の鮮鋭平面を容易に調整することができる。
【００２９】
或いは、下位光学系を静止、すなわち非シフト可能な光学系として提供し、光軸に沿って移動可能な、参照構造が下位光学系により撮像される光検出器を具現することも可能である。この場合、光検出器の変位、ひいては撮像平面の変位も、下位光学系の鮮鋭領域、すなわち、第２の鮮鋭平面をシフトさせる。
【００３０】
下位光学系は好ましくは、試料構造の撮像を目的とする主光路から逸れた補助光路に配置される。補助光路内への下位光学系の配置により、第２の鮮鋭平面の単純で確実な調整が可能であり、それにより、試料構造の撮像に影響することがない。
【００３１】
さらなる好ましい実施形態は、主光路に配置され、試料構造を撮像可能な第１の光検出器と、補助光路に配置され、参照構造を撮像可能な第２の光検出器とを提供する。２つの光検出器を使用して、例えば、第１の波長領域の光を使用して試料構造を撮像し、第１の波長領域とは異なる第２の波長領域の光を使用して参照構造を撮像することができる。本発明による装置が蛍光顕微鏡法に使用される場合、第１の光検出器は、試料構造から発せられた蛍光を受け取り、その一方で、第２の光検出器は、例えば、参照構造から反射され、試料構造を励起させて蛍光を発する励起光を受け取る。
【００３２】
しかし、同様に、異なる波長領域の光を別個に感知するように設計された１つのみの光検出器を提供することも可能である。これは、試料構造及び参照構造が１つの同じ光路で撮像され、それにより、異なる光路間で生じ得るドリフトの影響をなくすという利点を有する。
【００３３】
主光路及び補助光路が提供される場合、装置は、好ましくは、光分離学要素を備え、光分離光学要素を用いて、補助光路が主光路から逸らされ、第２の光検出器に向けられる。この光分離光学要素は、試料構造が第１の波長領域で撮像され、参照構造が第１の波長領域と異なる第２の波長領域で撮像される場合、例えば、ダイクロイックミラーである。２つの構造が１つの同じ波長領域で撮像される場合、光分離光学要素は、例えば、半透明ミラーである。
【００３４】
特に好ましい実施形態では、オートフォーカス装置が提供されて、参照構造への第２の鮮鋭平面を調整する。この種のオートフォーカス装置は、例えば、試料ホルダに係合する合焦駆動装置により試料深度方向に試料がシフトした場合、光学系が参照構造に合焦された状態を保ち、関心のある試料構造を第１の鮮鋭平面に持って行くことを保証する。したがって、この種のオートフォーカス装置の効果は、例えば、試料ホルダのカバースリップに具現される参照構造に向けて調整される第２の鮮鋭平面が、試料変位時に自動的に追跡されることである。オートフォーカス装置として、例えば、参照構造から反射された照明光を用いて機能する受動装置及び参照構造を照明する別個の光源を備える能動装置の両方を使用することが可能である。
【００３５】
参照構造により感知される光学系に対する試料構造のドリフトを使用して、識別されたドリフトに基づいて、取得された個々の像を事後補正することができる。しかし、試料構造の撮像中にドリフトを補償済みすることも同様に可能である。これは、例えば、ドリフト感知ユニットにより生成されるドリフト信号を介して制御を適用して、光学系及び／又は試料ホルダの少なくとも一部分を移動させて、ドリフトを補償することができる位置決め部材を提供することにより行うことができる。この構成は、制御ループの方式で具現することができ、この構成では、連続した参照／実際の比較が実施され、光学系又は試料ホルダの上記一部分は、その比較に基づいてドリフト信号を参照して駆動される。
【００３６】
参照構造の個々の像が、試料構造の個々の各像でも取得され、個々の各像でドリフトが感知される場合、特に厳密なドリフト補正が得られる。しかし、参照構造の像を取得し、より長い所定の時間間隔でのみドリフトを特定することも可能である。これは、像補償が、取得された個々の像に対して事後に実行される場合及び位置決め部材によりドリフト補償が、測定中、すなわち、試料構造の撮像中に達成される場合の両方に当てはまる。前者の場合、個々の像が事後にドリフト補正され、ドリフトが個々の各像ではなく、Ｎ番目の個々の各像でのみについて感知される場合（ｎは１よりも大きな自然数）、それらの間に配置される像のドリフトは補間により特定することができる。
【００３７】
好ましくは、対物レンズを通して試料構造を照明し、同時に参照構造を照明する光源が提供される。この実施形態では、試料構造及び参照構造は、入射光顕微鏡法を使用して照明される。代替の実施形態では、試料構造のみが入射光法を使用して照明されるが、参照構造は透過光法を使用して照明される。この場合、参照構造の照明に別個の光源が提供される。この光源から発せられる照明光の波長は、使用されている参照構造に応じて適宜選択することができる。
【００３８】
本発明による装置は、試料構造の拡大表示を可能にし、撮像精度を増大するためにドリフト感知及びドリフト補償が望まれるすべての機器と有効に使用可能である。「局在顕微鏡法」の用語で先に一緒にグループ化された方法の１つに従って動作する蛍光顕微鏡としての利用が特に好ましい。
【００３９】
本発明について図を参照してさらに詳細に後述する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１ａ】光学顕微鏡法により撮像すべき構造特徴が光学顕微鏡撮像の解像限界よりも小さい例示的な試料構造を概略的に示す。
【図１ｂ】マーカーを用いて準備された図１ａによる試料構造の分解能が制限された光学顕微鏡像を示す概略図である。
【図２ａ】それぞれでマーカーのアクティブサブセットが撮像された一連の個々の未処理データ像を示す。
【図２ｂ】個々の未処理データ像から識別された中心点位置を有する図２ａの像シーケンスに対応するシーケンスを示す。
【図２ｃ】図２ｂに示される中心点位置が結合される高分解能全体像である。
【図３ａ】２つの連続した個々の未処理データ像からの中心点位置が、例示のために結合される、図１ａによる試料構造のドリフトのない全体像である。
【図３ｂ】図３ａにより、２つの連続した個々の未処理データ像の中心点位置が結合される、図１ａによる試料構造のドリフトの影響を受けた全体像である。
【図４】第１の例示的な実施形態として、本発明により具現される蛍光顕微鏡の概略構造を示す。
【図５】光学系の第１の鮮鋭平面にある試料構造及び第２の鮮鋭平面にある参照構造を示す図４の一部分を示す。
【図６】第２の例示的な実施形態としての、本発明により具現される蛍光顕微鏡の概略構造を示す。
【図７】光学系の第１の鮮鋭平面にある試料構造及び第２の鮮鋭平面にある参照構造を示す図６の一部分を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
図４は、本発明による装置の第１の例示的な実施形態を構成する蛍光顕微鏡２０を示す。蛍光顕微鏡２０は、２枚のレンズ２４及び２６から構成されるレンズ系に励起光を発する光源２２を有する。このレンズ系は、光源２２から発せられた励起光を所望のようにコリメートするように機能する。次に、コリメートされた励起光は集束レンズ２８に入射し、集束レンズ２８は励起光を対物レンズ３０の開口に合焦する。励起光はまず、励起光にとって透明な第１のダイクロイックミラー３２を通過する。光源２２から発せられた励起光は対物レンズ３０の開口に合焦されるため、対物レンズ３０からコリメートされた光線束として出射し、したがって、３４と記されるシンボルで図１に示される試料構造の比較的広域の均質照明を生じさせる。
【００４２】
上述したように、例示的な本実施形態では、試料構造３４はマーカー、例えば、蛍光分子を用いて準備される。上述した方法を使用して、これらのマーカーの各部分を明状態にし、それにより、個々の像で撮像されるアクティブサブセットを生成することができる。
【００４３】
試料構造３４から発せられた蛍光は対物レンズ３０を通り、ダイクロイックミラー３２に入射する。ダイクロイックミラー３２は、試料構造３４から発せられた光を反射し、そうして反射光を第２のダイクロイックミラー３６に向けるように具現される。ダイクロイックミラー３６は、蛍光を透過させ、それにより、蛍光を光検出器４０、例えば、ＣＣＤカメラに集束するレンズ３８に蛍光を入射させるように具現される。したがって、試料構造３４の個々の像が光検出器４０に生成される。光検出器４０は、受け取った蛍光を電気信号に変換し、その電気信号を計算／制御ユニット４２に出力し、計算／制御ユニット４２においてその信号はさらに処理される。
【００４４】
試料構造３４は、試料ホルダ４４に搭載される試料（図４及び図５にさらに示さない）の一部分である。図５に示されるように、光学顕微鏡法撮像中、試料構造３４は、以下、「第１の鮮鋭平面」と呼ぶ対物レンズ３０の鮮鋭平面４６に配置される。試料構造３４を第１の鮮鋭平面４６に運ぶことができるように、試料ホルダ４４は、両矢印で図４に示されるように垂直に移動可能である。この目的のために、計算／制御ユニット４２により制御が適用される、試料ホルダ４４に結合された合焦駆動装置４８が提供される。
【００４５】
図５から明らかなように、試料は試料構造３４のみならず、参照マーカー４９も含み、参照マーカー４９は、一連の個々の像の取得中に、撮像光学系、特に対物レンズ３０と試料構造３４との間で生じるドリフトを光学的に感知できるようにする。これらの参照マーカー４９の一部分は、参照構造５０として使用される。蛍光顕微鏡２０は、このために、上述した光学構成要素に加えて（特に、対物レンズ３０に加えて）さらに詳細に後述する下位光学系を備える。
【００４６】
この下位光学系は、試料構造３４から、試料構造３４から発せられる蛍光の第１の光検出器４０まで繋がる光路により画定される主光路からダイクロイックミラー３６により逸らされた補助光路に配置される。補助光路は、第２の光検出器５２、例えば、ＣＣＤカメラに向けられる。第２のダイクロイックミラー３６と第２の光検出器５２との間には、上述した下位光学系が配置され、下位光学系は、静止レンズ５４と、互いに対して変位可能であり、それ自体が可変焦点距離のレンズ系を構成する２枚のレンズ５６及び５８とで構成される。
【００４７】
例示的な本実施形態では、試料に導入されるか、又は試料内に存在する任意の場合、自己蛍光粒子又は構造が、参照マーカー４９として使用される。重要なのは、これらの参照マーカー４９を、試料構造３４が撮像される第１の鮮鋭平面４６に配置する必要がないことである。その代わり、レンズ５４〜５８により構成される下位光学系が対物レンズ３０と共に動作して、レンズ５６及び５８をシフトすることにより所望のように（図５では上下に）シフト可能な第２の鮮鋭平面６０を画定する。これにより、試料内の第２の鮮鋭平面６０を、光学顕微鏡法で撮像可能な参照構造５０として使用可能な十分な参照マーカー４９が存在する領域に変位させることが可能である。
【００４８】
第２の鮮鋭平面６０に配置される参照マーカー４９により構成される参照構造５０は、対物レンズ３０並びにレンズ５４〜５８により第２の光検出器５２に撮像される。したがって、参照構造５０の個々の像は、第２の光検出器５２上に生成され、電気信号に変換される。次に、これらの電気信号は、評価のために計算／制御ユニット４２に運ばれる。計算／制御ユニット４２において、個々の参照構造像の位置変化が感知され、ドリフト補償値がそこから特定され、前記値は、例示的な本実施形態において、個々の一連の試料構造像に対する測定後のドリフト補償を実行するために使用される。
【００４９】
第２の鮮鋭平面６０を調整するために互いに対して移動する下位光学系のレンズ５４及び５６は、この例示的な実施形態では、試料ホルダ４４が合焦駆動装置４８により移動した場合に第２の鮮鋭平面６０を自動的に追跡するオートフォーカス装置に結合される。オートフォーカス装置は、計算／制御ユニット４２及び駆動装置６１から構成され、駆動装置６１は、制御が計算／制御ユニット４２により適用され、第２の鮮鋭平面６０を追跡するためにレンズ５４及び５６を移動させる。
【００５０】
本明細書に記載される例示的な実施形態では、参照マーカー４９の一部分から構成される参照構造５０は、自己蛍光参照構造５０から発せられる自己蛍光に基づいて生成される。それに従って、第１のダイクロイックミラー３２は、一方では、レーザ光源２２から発せられた励起光を透過し、他方では、試料構造３４から発せられた蛍光及び参照構造から発せられた自己蛍光を反射するように具現される。第２のダイクロイックミラー３６は、試料構造３４から発せられた蛍光を透過し、参照構造から発せられた自己蛍光を反射するように具現される。
【００５１】
しかし、この実施形態は単なる例として理解されたい。例えば、励起光自体を使用して参照構造５０を撮像することも可能である。この場合、例えば、試料に導入される反射性金ミクロスフィアを参照マーカー５０として使用することができる。
【００５２】
この実施形態は、一方では、レーザ光源２２から発せられた励起光の強度が一般に比較的高い（少なくとも、試料構造３４から発せられる蛍光の強度に関連して）状況を利用する。他方では、実際に、第１のダイクロイックミラー３２で厳密に１００％の透過率を達成することは略不可能である。その代わり、試料から対物レンズ３０に後方散乱した励起光のごく一部分が常に第１のダイクロイックミラー３２で反射する。第２のダイクロイックミラー３６が、蛍光を透過し、励起光を反射するように具現される場合、第１のダイクロイックミラー３２により不可避的に反射された励起光のその部分を使用して、参照構造５０を撮像することができる。
【００５３】
図６及び図７は、本発明による装置の第２の例示的な実施形態を示す。
【００５４】
第１の例示的な実施形態では、参照構造５０は入射光法を使用して照明されるが、図６及び図７による第２の例示的な実施形態では、透過光照明が提供される。第１の例示的な実施形態の構成要素と同一の第２の例示的な実施形態の構成要素は、図６及び図７において、第１の例示的な実施形態で利用される参照文字を用いて記される。それらの構成要素については以下、再び説明しない。
【００５５】
第１の例示的な実施形態による蛍光顕微鏡２０と比較して、第２の例示的な実施形態による蛍光顕微鏡２０’は、光源６２並びに２枚のレンズ６４及び６６から構成されるレンズ系をさらに有する。このレンズ系は、光源６２から発せられた照明光をコリメートし、対物レンズ３０から離れるほうに面する側から試料に向ける。したがって、試料（この例では、透明）は図６では下から光を透過させ、それにより、参照構造５０が、通常の透過光法、例えば位相コントラスト法に従って第２の光検出器５２に撮像される。
【００５６】
光源６２から発せられた照明光の波長は、撮像すべき参照構造５０のタイプに応じて適宜選択することができる。例えば、第２の光検出器５２に透過光で撮像される金ミクロスフィアを参照マーカー４９として使用することができる。２つのダイクロイックミラー３２’及び３６’は、光源６２から発せられる照明光の選択された波長に従って、すなわち、それぞれが光源６２の照明光を反射するように変更される。
【００５７】
上述した例示的な実施形態は、単に本発明を説明する役割を果たし、本発明はこれらの例示的な実施形態に限定されない。
【００５８】
したがって、撮像すべき参照構造は、試料ホルダ４４の一部分である、図５及び図７に示されるカバースリップ７０に具現することができる。この場合、第２の鮮鋭平面６０はカバースリップ７０に向けられる。この場合も同様に、オートフォーカス装置は、第２の鮮鋭平面６０が、カバースリップ７０上に位置決めされた状態を保つように追跡されることを保証することができる。
【００５９】
上述した例示的な実施形態は、ドリフト補償が、生成された個々の試料構造像に対して事後に実行されず、その代わり、測定中に、蛍光顕微鏡２０又は２０’の構成要素、好ましくは、試料ホルダ４４が感知されたドリフトに応じてシフトするように変更することもできる。これは、例えば、合焦駆動装置４８に適切な制御を適用することにより行うことができる。
【符号の説明】
【００６０】
２０、２０’  蛍光顕微鏡
２２  レーザ光源
２４、２６  レンズ
２８  集束レンズ
３０  対物レンズ
３２、３２’  第１のダイクロイックミラー
３４  試料構造
３６、３６’  第２のダイクロイックミラー
３８  レンズ
４０  第１の光検出器
４２  計算／制御ユニット
４４  試料ホルダ
４６  第１の鮮鋭平面
４８  位置決め部材
４９  参照マーカー
５０  参照構造
５２  第２の光検出器
５４、５６、５８  レンズ
６０  第２の鮮鋭平面
６１  駆動装置
６２  光源
６４、６６  レンズ
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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