(57)【要約】  葉酸（ｆｏｌｉａｔｅ）またはその類似体、リンカー、免疫グロブリンＧなどの抗体からなる、抗腫瘍コンジュゲート。リンカーは、グルタチオン、システアミンまたはシステイン残基を含んでなり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをさらに含んでなる。コンジュゲートは、葉酸受容体陽性腫瘍細胞を標的とする。コンジュゲートを調製する方法、および抗腫瘍および抗自己免疫疾患における使用もまた提供される。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）、
【化１】
2013543849.tif 000046
（式中、
ＦＯＬＡＴＥは、細胞表面葉酸受容体と結合する、葉酸、またはメトトレキサート、テトラヒドロ葉酸（ｔｈｒｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ）、およびジヒドロ葉酸（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ）をはじめとする葉酸類似体であり、
ＧＳＨは、グルタチオン、または遊離スルフヒドリルと遊離アミノ基の双方を含んでなる化合物、またはシステアミンまたはシステインであり、
ＩｇＧは、免疫グロブリンＧ、またはＩｇＧ重鎖のモノマー、またはＩｇＧの還元に由来するそのＦｃ断片、動物ＩｇＧ、ＡヒトＩｇＧ、または組換えヒト化ＩｇＧであり、
Ｒ１は、
【化２】
2013543849.tif 000047
であり、
Ｒ２は、
【化３】
2013543849.tif 000048
であり、
Ｒ３は、
【化４】
2013543849.tif 000049
である。）のコンジュゲート。
【請求項２】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
式１〜１０、
【化５】
2013543849.tif 000050
2013543849.tif 000051
からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
１）葉酸をＮ−ヒドロキシスクシンイミドと共役させて、活性ＮＨＳ−葉酸を得るステップと；
２）ＮＨＳ−葉酸をＧＳＨと共役させて、アミド結合を通じて葉酸−ＧＳＨを得るステップと；
３）ＩｇＧを活性化して、式ＶＩまたは式ＶＩＩの活性化誘導体、または式ＩＸ、
【化６】
2013543849.tif 000052
2013543849.tif 000053
を有するスルフヒドリル反応性誘導体を生成するステップと、
４）活性産物を葉酸−ＧＳＨと共役させるステップと
を含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンジュゲートを合成する方法。
【請求項５】
前記葉酸が、葉酸、またはメトトレキサート、テトラヒドロ葉酸およびジヒドロ葉酸からなる群から選択される、葉酸類似体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ１の反応条件が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解された葉酸または葉酸類似体が、０．５〜２倍のＮ、Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと２〜５時間反応されて、不溶性副産物が濾過または遠心分離を通じて廃棄され、ＮＨＳ−活性化葉酸（ＮＨＳ−ＦＯＬＡＴＥ）が溶液中にあり、反応方程式が、
【化７】
2013543849.tif 000054
である、請求項４に又は５記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ２において、ＮＳＨ−ＦＯＬＡＴＥが暗所においてアルゴン下で、等モル量の（ｅｑｕａｍｏｌａｒ）ＧＳＨと一晩反応され、
【化８】
2013543849.tif 000055
の構造のＦＯＬＡＴＥ−ＧＳＨが得られる、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩｇＧのＮ末端アミノ基が、
【化９】
2013543849.tif 000056
（式中、ＲａＣＯＲｂは架橋剤であり、その中でＲａは離脱基であり、ＲｂはＧＳＨ中で遊離スルフヒドリルと反応する基を含有する。）の反応に従って活性化され、
前記架橋剤が、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６−［３'（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート）、ＬＣ−ＳＰＤＰ（（スクシンイミジル６−［３'（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−Ａ−［２−ピリジルジチオ］トルエン）、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ（４−スルホスクシンイミジル−６−メチル−Ａ−（２−ピリジルジチオ）トルアミドヘキサノエート）、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＳＭ（ＰＥＧ）ｎ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミド架橋剤、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＬＣ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロレート］）、スルホ−ＥＭＣＳ（［Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）、ＥＭＣＳ（［Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル）、スルホ−ＧＭＢＳ（Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル）、スルホ−ＫＭＵＳ（Ｎ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、スルホ−ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート）、ＡＭＡＳＮ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル）、ＢＭＰＳ（Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル）、またはＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）であり、または遊離−ＳＨ基と反応して、式ＶＩまたはＶＩＩ、
【化１０】
2013543849.tif 000057
（式中、Ｒ１は
【化１１】
2013543849.tif 000058
であり、
Ｒ２は、
【化１２】
2013543849.tif 000059
である。）で示されるような活性化アミノ基があるＩｇＧを生じ得る群である、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ３において、ＩｇＧが還元剤で処理されて、ｈａｌｆ−ＩｇＧまたは重鎖が生成し、それがスルフヒドリルリンカーによって活性化され、前記スルフヒドリルリンカーが、１，８−ビス−マレイミドジエチレングリコール（ＢＭ（ＰＥＧ）２）、ＢＭ（ＰＥＧ）ｎＰＥＧ架橋剤、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビス−マレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、１，４−ジ−［３'−（２'−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ジチオ−ビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、トリス［２−マレイミドエチル］アミン（ＴＭＥＡ）、およびその類似体であり、式ＩＸ、
【化１３】
2013543849.tif 000060
のコンジュゲートを生成する、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＩｇＧが、
【化１４】
2013543849.tif 000061
の反応に従って、２−メルカプトエチルアミンＨＣｌ（２−ＭＥＡ）によりｈａｌｆ−ＩｇＧに活性化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ３において、ＩｇＧが、
【化１５】
2013543849.tif 000062
の反応に従って、１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）によりＩｇＧ重鎖に還元される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ３で、濃度が０．０５〜１ｍｍｏｌ／ＬのＩｇＧ溶液が得られ、それが１０〜３０倍の活性化架橋剤と室温で０．５〜１時間、または４℃で１〜３時間反応されて活性化ＩｇＧが得られる、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記活性化ＩｇＧが、分子ふるいクロマトグラフィーによって比較的高純度に精製される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＩｇＧ溶液が、１０〜３０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＳ−ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５〜９．０）、超純水、ＤＭＳＯまたはＤＭＦから選択される溶媒である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ステップ４で、ＦＯＬＡＴＥ−ＧＳＨが１〜１０倍の活性化ＩｇＧと、室温で２〜５時間または４℃で１５〜２０時間反応されて、式Ｉ〜ＩＩＩのＦＯＬＡＴＥ−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートが得られる、請求項４〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
精製コンジュゲートが、分子ふるいクロマトグラフィーを通じて収集される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ステップ３が、前記ステップ１および２に先だって、またはそれと同時に実施される、請求項４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートの有効量と、薬学的に許容できるキャリアまたは賦形剤とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１９】
がんまたは自己免疫疾患を治療するための請求項１〜３のいずれか１項に記載の葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートの使用。
【請求項２０】
前記がんが、葉酸受容体の高度発現レベルを有するがん細胞によって特徴付けられる、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記がんが、白血病、または卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、乳癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、および脈絡膜癌、または上衣細胞腫である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記自己免疫疾患が、葉酸受容体の高度発現レベルを有する罹患細胞によって特徴付けられる、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、紅斑性狼瘡、肺線維症またはサルコイドーシスである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２４】
ＦＯＬＡＴＥ−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートが、注射によって投与される、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
ＦＯＬＡＴＥ−ＧＳＨ−ＩｇＧが、注射によって皮膚、筋肉または静脈に投与される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
ヒトにおけるＦＯＬＡＴＥ−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートの有効用量が、０．１〜４ｇ／ｋｇ（体重）である、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
ヒトにおけるＦＯＬＡＴＥ−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートの有効用量が、０．１〜１．０ｇ／ｋｇ（体重）である、請求項２６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬品、特に腫瘍および自己免疫疾患を治療するための葉酸−抗体コンジュゲートの調製および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
葉酸は、１９４１年にＨ．Ｋ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌによって、ホウレンソウの葉から初めて単離された。これは、プテリンと、ｐ−アミノ安息香酸と、分子式がＣ１９Ｈ１９Ｎ７Ｏ６であり、構造式が、
【化１】
2013543849.tif 000002
であるグルタミン酸残基とから構成される、ビタミンＢ群の水溶性ビタミンである。葉酸はヒトにとって必須であり、骨髄中の細胞の成熟を促進する。葉酸欠乏症は、未熟赤血球細胞の増加と白血球細胞の減少をもたらす。最新の研究は、葉酸が、がん細胞の遺伝子発現変化およびアポトーシスの誘発を通じて、がんから保護することもあり得ることを示す。重要なことには、葉酸は葉酸受容体に結合する。葉酸受容体は、αおよびβの２つの膜アイソフォームを有する。以前の報告は、葉酸受容体αが、卵巣癌の９０％で高度に発現され、ならびに乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、結腸癌、肺癌、脈絡膜癌、および上衣細胞腫で高頻度に発現されることを示した。葉酸受容体βは、悪性骨髄性細胞（白血病）中で、および関節リウマチなどの自己免疫疾患に付随する活性化マクロファージ中で、高度に発現された。それとは全く逆に、正常組織中における葉酸受容体の発現は、ほぼ皆無であった。したがって葉酸および葉酸受容体は、特にがんおよび自己免疫疾患を治療するための標的治療薬の開発において、非常に優れた可能性を有する。（Ｈｉｌｇｅｎｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．９４（１０）：２１３５−２１４６；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４（５）：６７５−６９３．；Ｌｅａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ６（１）：４４−５１．；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９１（１−２）：１７−２９．）。
【０００３】
現在のがん治療法
ＷＨＯは、がんが２０１０年には心疾患を追い越して、世界的に最も致命的な疾患になると推定した。がんの罹患率および死亡率は、１９９０年と比較してそれぞれ１９％および１８％増大した。２０２０年には、世界的ながん罹患率は５０％増大するであろう。毎年１５００万の新しい症例が、世界的に報告されるであろう。肺癌は、世界的に最も頻度の高いがんであり、毎年１２０万の新しい症例が発生する。２番目に頻度が高いのは、毎年１００万の新しい症例が発生する乳癌であり、結腸癌（９４万）、胃癌（８７万）、肝臓癌（５６万）、子宮頸癌（４７万）、および食道癌（４１万）がそれに続く。世界的ながんの有病率は増大しており、人命に対する深刻な脅威となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在のがん治療法としては、外科手術、化学療法、放射線療法、および免疫療法が挙げられる。これらの治療は、併用されることが多い。化学療法薬に不可避な副作用のために、新しい薬剤の開発が必要である。最近、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）、およびＲｉｔｕｘａｎ（商標）などのモノクローナル抗体ベースの薬剤が、がん患者によって支持されている。従来の化学療法薬と比較して、これらの薬剤の最大の利点は、高い効果と低い毒性である（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（９）：１１４７−１１５７；Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ６（５）：３４９−３５６．）。
【０００５】
現在の抗体薬剤市場は、年間１２０億米ドルと見積もられるが、それらの開発経費もまた非常に高い。それらにはまた、高い品質管理要件、免疫原性、および非特異的効果などの多くの不都合もある（Ｋｕｕｓ−Ｒｅｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（４）：３６５；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２（７）：１９６１）。
【０００６】
現在の自己免疫疾患治療法
自己免疫疾患は、免疫系が健康な組織を誤って攻撃し、破壊する場合に起きる病状である。臨床的に、自己免疫疾患は、血清γグロブリン、ＩｇＧ含量＞１．５％；罹患臓器中の自己免疫抗体の存在；糸球体中の変性γグロブリンまたは対応する抗原の沈着；病変中の多数のリンパ球および血漿細胞の浸潤によって特徴付けられることが多い。副腎皮質ホルモンの施用によって、一時的または継続的緩和を獲得し得る。
【０００７】
自己免疫疾患としては、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼蒼、関節リウマチ、炎症性腸疾患、および乾癬が挙げられる。多年の研究にもかかわらず、これらの疾患は根治され得ない。
【０００８】
自己免疫疾患のために通常使用される薬剤としては、期初の軽症疾患のためのアミノサリチル酸、インドメタシン、プロピオン酸誘導体、および制酸薬などの非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。作用機序は、ＣＯＸ酵素阻害およびプロスタグランジン生成による、消炎鎮痛効果の達成である。しかしそれらは、関節リウマチの進行を阻止し得ない。これに加えて、代謝経路が重なるために、これらの薬剤間で相互作用が発生することもあり、併用は推奨されない。
【０００９】
金チオリンゴ酸ナトリウムなどの金塩もまた、使用される。ペニシラミン、クロロキン、レバミゾール、免疫抑制剤、および副腎皮質ホルモンをはじめとする、その他の薬剤は、それぞれ独自の欠点がある。
【００１０】
先にも言及されたように、葉酸受容体αは、多種のがん細胞中で高度に発現され、葉酸受容体βは、骨髄性白血病の白血球細胞中、または関節リウマチなどのいくつかの自己免疫疾患の活性化マクロファージ中で高度に発現されるが、葉酸受容体の発現は、正常組織中ではほぼ皆無である。したがって、（葉酸と１２５Ｉ、６７Ｇａ、および１１１Ｉｎのコンジュゲートなどの）放射性標識葉酸コンジュゲートが使用されて、葉酸受容体を高度に発現する腫瘍組織が検出される。また抗がん剤として、葉酸−タンパク質毒素、葉酸−小分子化学療法薬、葉酸−リポソーム（リポソーム含有化学療法薬または遺伝子ベースの薬剤）、および葉酸−免疫療法薬が開発されている。（例えば、Ｈｉｌｇｅｎｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９４（１０）：２１３５−２１４６；Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １３（３）：４３５−４４２；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，２１（５）：９６１−９６８；Ｈａｓｓａｎ，Ｒ．，Ｗ．Ｅｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ７：２０を参照されたい）。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
既存の技術の欠陥の観点から、本発明は、高効能の葉酸−コンジュゲート抗体（葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧ）、その調製方法、そしてがんおよび自己免疫疾患の治療における使用を提供する。
【００１２】
本発明の第１の目的は、ＧＳＨを通じた、活性化ＩｇＧと葉酸との共役によって特徴付けられる、高効能の葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートを提供することである。ＧＳＨの分子式は、Ｃ１０Ｈ１７Ｎ３Ｏ６Ｓである。このコンジュゲートの構造は、式Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ、
【化２】
2013543849.tif 000003
で示され、式中、ＦＯＬＡＴＥは、葉酸、または構造式、
【化３】
2013543849.tif 000004
のメトトレキサート、テトラヒドロ葉酸、ジヒドロ葉酸などの葉酸誘導体を表し、
ＧＳＨは、分子式Ｃ１０Ｈ１７Ｎ３Ｏ６Ｓのグルタチオン、または構造式、
【化４】
2013543849.tif 000005
のシステアミンやシステインなどの遊離スルフヒドリルおよび遊離アミノ基がある化合物を表す。
【００１３】
ＩｇＧは、動物ＩｇＧ、ヒトＩｇＧ、組換えヒト化ＩｇＧ、ｈａｌｆ−ＩｇＧ、Ｆｃ断片、または還元反応から得られるその重鎖であってもよい。式ＩＩＩでは、ＩｇＧは、活性スルフヒドリルがある上記のＩｇＧを表す。
【００１４】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の４つのＩｇＧのサブタイプのいずれか１つを使用し得る。ＩｇＧは、２−メルカプトエチルアミンＨＣｌなどの弱還元剤によって、ｈａｌｆ−ＩｇＧに還元されてもよく、また１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの強力な還元剤によって、ＩｇＧ重鎖に還元される。
【化５】
2013543849.tif 000006
【００１５】
式Ｉでは、Ｒ１は、表１の基から選択される。
【００１６】
【表１】
2013543849.tif 000007
【００１７】
式ＩＩでは、Ｒ２は、表２の基から選択される。
【００１８】
【表２】
2013543849.tif 000008
【００１９】
式ＩＩＩでは、Ｒ３は、表３の基から選択される。
【００２０】
【表３】
2013543849.tif 000009
【００２１】
ＤＣＣおよびＮＨＳによる活性化後、葉酸はアミド結合を通じてＧＳＨに連結されて葉酸−ＧＳＨが形成する。次に、ＩｇＧのリジン残基のアミノ末端（Ｎ末端）またはεアミノ基が活性化されて、ＩｇＧの活性型が生じる。ＩｇＧはまた、ｈａｌｆ−ＩｇＧまたは重鎖に還元してもよい。これらの２種類のＩｇＧは、どちらも葉酸−ＧＳＨと共役し得る。
【００２２】
第１の方法では、ＩｇＧアミノ基が活性化される。言及される活性化剤は、ＲａＣＯＲｂの構造を有してもよく、式中、Ｒａは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどのアミン反応性官能基の一部としての離脱基であり、その式は、式ＩＶで示される。Ｒｂは、式Ｖで示されるように、ＧＳＨ中の遊離スルフヒドリルに対して反応性の、好ましくはマレイミドである官能基を含有する。
【化６】
2013543849.tif 000010
【００２３】
活性化剤は、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６−［３'（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート）、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−［３'（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α−［２−ピリジルジチオ］トルエン）、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ（４−スルホスクシンイミジル−６−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート））、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＳＭ（ＰＥＧ）ｎＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミド架橋剤、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＬＣ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロレート］）、スルホ−ＥＭＣＳ（［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）、ＥＭＣＳ（［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル）、スルホ−ＧＭＢＳ（Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル）、スルホ−ＫＭＵＳ（Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、スルホ−ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート）、ＡＭＡＳＮ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル）ＢＭＰＳ（Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル）ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）から、または遊離スルフヒドリルと反応し得るその他の基から選択される。
【００２４】
ＩｇＧが、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＭ（ＰＥＧ）ｎＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミド架橋剤、ＳＭＣＣ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＥＭＣＳ、ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、ＭＢＳ、スルホ−ＳＭＰＢ、ＳＭＰＢ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳａｎｄＳＭＰＨと反応した後、生成物は、式ＶＩ、
【化７】
2013543849.tif 000011
（式中、Ｒ１は、表１に列挙される基を表す。）の共通構造を有する。
【００２５】
葉酸−ＧＳＨと式ＶＩの活性化ＩｇＧを反応させた後に、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートが形成される。このコンジュゲートは、式Ｉで示される構造を有する。
【００２６】
ＩｇＧが、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、およびスルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴと反応した後、生成物は式ＶＩＩ、
【化８】
2013543849.tif 000012
（式中、Ｒ２は表２に列挙される群を表す。）の共通構造を有する。
【００２７】
葉酸−ＧＳＨと式ＶＩの活性化ＩｇＧを反応させた後に、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートが形成される。このコンジュゲートは、式ＩＩで示される構造を有する。
【００２８】
上述のＩｇＧが、反応性スルフヒドリルのあるｈａｌｆ−ＩｇＧまたは重鎖である場合、それはまた、１，８−ビス−マレイミドジエチレングリコール（ＢＭ（ＰＥＧ）２）、ＢＭ（ＰＥＧ）ｎＰＥＧ架橋剤、１，４−ビスマレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビス−マレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、１，４−ジ−［３'−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ジチオ−ビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、およびトリス［２−マレイミドエチル］アミン（ＴＭＥＡ）またはそれらの誘導体などのスルフヒドリル−反応性リンカーを通じて活性化され得る。これらの化合物は、式ＶＩＩＩ、
【化９】
2013543849.tif 000013
に示される共通構造を有する。Ｒ３は、表３に列挙される基を表す。
【００２９】
葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧの形成中に、葉酸は、ＤＣＣおよびＮＨＳによる活性化後、アミド結合を通じてＧＳＨと連結する。ｈａｌｆ−ＩｇＧまたは重鎖中の遊離スルフヒドリルは、式ＶＩＩＩの生成物と反応して、式ＩＸ、
【化１０】
2013543849.tif 000014
の構造の化合物を生じる。
【００３０】
この化合物は、葉酸−ＧＳＨと反応して、式ＩＩＩのコンジュゲートを生じる。
【００３１】
理解を助けるために、異なる構造のコンジュゲートの一覧を下に示す。
１．ＳＰＤＰを通じた、葉酸−ＧＳＨとＩｇＧの共役によって生じる、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート
【化１１】
2013543849.tif 000015
これは、次のように簡略化される。
【化１２】
2013543849.tif 000016
２．ＳＭＰＢを通じた、葉酸−ＧＳＨとＩｇＧの共役によって生じる、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート
【化１３】
2013543849.tif 000017
３．ＳＭＣＣを通じた、葉酸−ＧＳＨとＩｇＧの共役によって生じる、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート
【化１４】
2013543849.tif 000018
４．ＢＭＢを通じた、葉酸−ＧＳＨと還元形態ＩｇＧ（弱還元剤）の共役によって生じる、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート
【化１５】
2013543849.tif 000019
５．ＤＴＭＥを通じた、葉酸−ＧＳＨと還元型ＩｇＧ（強力な還元剤）の共役によって生じる、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート
【化１６】
2013543849.tif 000020
６．ＥＭＣＳを通じた、葉酸−ＧＳＨと還元型ＩｇＧ（弱い還元剤）の共役によって生じる、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート
【化１７】
2013543849.tif 000021
７．ＬＣ−ＳＰＤＰを通じた、葉酸−ＧＳＨと還元型ＩｇＧ（強力な還元剤））の共役によって生じる、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート
【化１８】
2013543849.tif 000022
８．スルホ−ＧＭＢＳを通じた、葉酸−ＧＳＨとＩｇＧ１との共役によって生じる、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート
【化１９】
2013543849.tif 000023
９．スルホ−ＫＭＵＳを通じた、葉酸−ＧＳＨとＩｇＧ１の共役によって生じる、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート
【化２０】
2013543849.tif 000024
および
１０．スルホ−ＫＭＵＳを通じた、メトトレキサート−ＧＳＨとＩｇＧ１の共役によって生じる、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート
2013543849.tif 000025
式中、式１〜９のＦＯＬＡＴＥは葉酸であり、式１０中ではメトトレキサートである。
【００３２】
本発明で提供される葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートは、葉酸受容体の発現がより高い、標的細胞の受容体を特異的に認識して結合する。これらの結合は、ＩｇＧによって媒介される、エフェクター細胞または補体系の活性化を通じて、細胞毒性効果を誘発し、ＩＬ−２など生物反応修飾物質の機能を高める。葉酸受容体発現がより低い正常細胞は、影響を受けない。したがって、本発明は、従来の薬剤が、体内で正常細胞を損傷する問題を回避する。
【００３３】
本発明者らは、がんおよび自己免疫疾患の治療において、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートを使用し得ることを認識し、コンジュゲートが良好な治療効果を有することを実験的に示した。さらに、コンジュゲート中にはいかなる外来性タンパク質配列もないので、生体内における抗体中和反応がない。その一方で、ＩｇＧはコンジュゲートの効果を向上させ得る。化合物は、細胞内部に移行する必要なしに、細胞表面に結合して下流反応を活性化することで、効果がある。さらなる研究は、コンジュゲートのＧＳＨ構成要素が、葉酸リガンドの遊離カルボキシル含量と親水性の増大をもたらし、葉酸とＩｇＧの間隔を広げて、葉酸受容体の標的化と治療効果に顕著な改善をもたらすことを示した。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、
１．葉酸をＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、ＮＨＳ−葉酸を形成するステップと；
２．アミド結合を通じて、ＮＨＳ−葉酸をＧＳＨと反応させて、葉酸−ＧＳＨを形成するステップと；
３．ＩｇＧをそのアミノ基において活性化して、それぞれ式ＶＩ〜ＶＩＩまたは式ＩＸ、
【化２１】
2013543849.tif 000026
（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は上で定義される。）の構造を有する、スルフヒドリル反応型を形成するステップと
を含んでなる、この安定コンジュゲートを合成する方法を提供する。
【００３５】
これらのステップに伴うパラメータと条件は、さらに次のように説明される。
１．葉酸をＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、ＮＨＳ−葉酸を形成する。Ｆｏｌａｔｅは、葉酸、またはメトトレキサート、テトラヒドロ葉酸、ジヒドロ葉酸などの葉酸誘導体を表し、葉酸が好ましい選択である。
【００３６】
好ましくは、葉酸または葉酸誘導体はＤＭＳＯに溶解されて、Ｎ、Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと２〜５時間反応される。不溶性副産物は、遠心分離または濾過を通じて廃棄される。可溶性構成物は、活性化ＮＨＳ−葉酸を含有する。葉酸を例として、下に反応方程式を示す。
【化２２】
2013543849.tif 000027
【００３７】
２．葉酸−ＧＳＨは、ＮＨＳ−葉酸とＧＳＨの反応後に生成され、それはアミド結合を通じて連結する。好ましくは、ＮＨＳ−葉酸は、アルゴン下において暗所で等量のＧＳＨと一晩反応される。最終生成物は、式、
【化２３】
2013543849.tif 000028
の構造を有する。
【００３８】
３．活性化ＩｇＧの調製ＩｇＧアミノ基は、アミド結合を通じて活性化されてもよく、あるいはＩｇＧはｈａｌｆ−ＩｇＧまたは重鎖に還元されてもよい。
ｉ．ＩｇＧアミノ基の活性化
【化２４】
2013543849.tif 000029
式中、ＩｇＧ−ＮＨ２は、ＩｇＧのアミノ基を表す。ＩｇＧは、ヒトＩｇＧ、マウスＩｇＧ、組換えＩｇＧ、これらのＩｇＧのＦｃ断片、および還元を通じたｈａｌｆ−ＩｇＧまたは重鎖から選択される。本発明では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の４種類のＩｇＧの内のいずれか１つである。ＲａＣＯＲｂは、離脱基Ｒａを持つＩｇＧ活性化剤である。式ＩＶのスクシンイミドが好ましい。Ｒｂは、ＧＳＨの遊離スルフヒドリルとの反応に関与する基である。式Ｖのマレイミドが好ましい。
【化２５】
2013543849.tif 000030
【００３９】
活性化剤が、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＭ（ＰＥＧ）ｎＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミド架橋剤、ＳＭＣＣ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＥＭＣＳ、ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、ＭＢＳ、スルホ−ＳＭＰＢ、ＳＭＰＢ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、およびＳＭＰＨである場合、生成化合物は、ＩｇＧとの反応後に、式ＶＩ、
【化２６】
2013543849.tif 000031
（式中、Ｒ１は上で定義される。）の共通構造を有する。
【００４０】
活性化剤が、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、およびスルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴであれば、生成化合物は、ＩｇＧとの反応後に、式ＶＩＩ、
【化２７】
2013543849.tif 000032
（式中、Ｒ２は、表２に示される基を表す。）の共通構造を有する。
【００４１】
好ましくは、ＩｇＧは、０．０５〜１ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で適切な溶媒に溶解される。この溶液を１０〜３０倍の上述の活性化剤と、室温で０．５〜１時間、または４℃で１〜３時間反応させる。この活性化ＩｇＧは、ＰＤ−１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの分子ふるいカラムを通して、精製される。適切な溶媒は、１０〜３０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＳ−ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５〜９．０）、超純水、ＤＭＳＯまたはＤＭＦであり得る。１０〜３０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＳ−ＥＤＴＡが、好ましい選択である。
【００４２】
ｉｉ．ＩｇＧの還元
還元剤での治処理後、重鎖中の、または重鎖と軽鎖間の、ジスルフィド結合が分離されて、活性スルフヒドリルが曝露される。
【００４３】
ＩｇＧは、２−メルカプトエチルアミン・ＨＣｌ（２−ＭＥＡ）などの弱い還元剤によって、ｈａｌｆ−ＩｇＧに還元される。１ｍｌの２〜２０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ−ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液（２０〜１００ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０〜８．０）を、６ｍｇの２−ＭＥＡまたはその他の弱い還元剤と共に、３７℃で１〜３時間、均質に混合する（ＩｇＧ溶液の体積が１ｍｌ未満の場合は、６ｍｇの２−ＭＥＡをＰＢＳ−ＥＤＴＡ中に溶解し、１０００〜４００：１の比率でＩｇＧ溶液と迅速に混合し得る）。室温に冷却後、ＰＤ−１０などの脱塩カラムを通して、反応混合物を精製する。反応方程式は、次のとおりである。
【化２８】
2013543849.tif 000033
【００４４】
ＩｇＧは、１、４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの強力な還元剤によって、重鎖に還元される。ＤＴＴを０．１〜２０Ｍｍの最終濃度で、溶液（ｐＨ６．５〜９．０）に溶解させる。ＤＴＴ溶液をＩｇＧ溶液と室温で１〜４時間反応させ、混合物を即座に脱塩カラムに装入してＩｇＧ重鎖を得る。反応方程式は、次のとおりである。
【化２９】
2013543849.tif 000034
【００４５】
ＩｇＧはまた、共通構造が、式ＶＩＩＩ（式中、Ｒ３は表３に列挙される基を表す。）である、１，８−ビス−マレイミドジエチレングリコール（ＢＭ（ＰＥＧ）２）、ＢＭ（ＰＥＧ）ｎＰＥＧ架橋剤、１，４−ビスマレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビス−マレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、１，４−ジ−［３'−（２'−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ジチオ−ビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、トリス［２−マレイミドエチル］アミン（ＴＭＥＡ）、およびそれらの類似体などのスルフヒドリル反応性リンカーによって活性化され得る。以下のコンジュゲートが生じる。
【化３０】
2013543849.tif 000035
【００４６】
４．葉酸−ＧＳＨはＩｇＧと共役されて、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートを生じる。
【００４７】
上述したように、活性化ＩｇＧは葉酸−ＧＳＨと共役されて、式ＩおよびＩＩの構造の葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートを形成する。スルフヒドリル反応性リンカーによって活性化されたｈａｌｆ−ＩｇＧまたは重鎖は、葉酸−ＧＳＨと共役されて、式ＩＩＩの構造の葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートを形成する。
【００４８】
好ましい実施形態では、葉酸−ＧＳＨは、１〜１０倍の活性化ＩｇＧと室温で２〜５時間、または４℃で１５〜２０時間反応される。生成物は、分子ふるいクロマトグラフィーによって精製され収集される。
【００４９】
ステップ３は、ステップ１および２と同時に、またはそれに先だって実施し得る。
【００５０】
別の実施形態では、本発明は、有効量の葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートと、薬学的に許容できるキャリアまたは賦形剤とを含んでなる、医薬組成物を提供する。適切な投与形態は、凍結乾燥粉末または注射液であってもよい。下の表は、本発明の組成物の具体例を列挙する。
【００５１】
【表４】
2013543849.tif 000036
【００５２】
本発明はまた、抗腫瘍薬の調製における、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートの使用も提供する。
【００５３】
上述したように、がんまたは自己免疫疾患のある患者では、本明細書で提供される葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートは、がん細胞上、または活性化マクロファージ上の葉酸受容体と特異的に結合する。この結合は、ＩｇＧを通じて、抗体または補体系を活性化させ、および／またはＩＬ−２などの生物反応修飾物質の機能を高める。がん細胞は、結果として生じる細胞毒性によって死滅する。しかし葉酸受容体発現がより低い、正常細胞に対する影響は皆無である。機序解析に基づいて、がん細胞が高レベルの葉酸受容体を発現しさえすれば、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧは適切な投与量で効果的である。本発明の組成物による治療に適するがんタイプとしては、白血病、子宮頸癌、子宮頸癌、乳癌、子宮内膜癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、脈絡膜癌、および上衣細胞腫が挙げられる。コンジュゲートは、ｉ．ｖ．、ｉ．ｍ．またはｓ．ｃ．注射などの注射を通じて、送達し得る。ヒトにおける適切な投与量範囲は１ｍｇ〜４ｇ／ｋｇであり、５ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇが好ましい。
【００５４】
本発明は、自己免疫疾患を治療する薬剤調製における、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートの使用をさらに提供する。
【００５５】
複雑な病理学的特徴、再発、および治癒の困難さのために、自己免疫疾患は、患者を非常に苦しめる。病理過程において多数の免疫細胞が活性化され、サイトカインが放出される。そしてマクロファージが、疾患の進行において重要な役割を果たす。本明細書で提供される葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートは、活性化マクロファージ中の葉酸受容体と選択的に結合する。これに加えて、葉酸受容体標的化と協調して作用する、以下の機構がある。第一に、コンジュゲートは、マクロファージ上のＩｇＧ  Ｆｃ受容体と競合的に結合して、食作用と炎症性因子分泌を低下させる。第二に、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧは、マクロファージの抗原提示を効果的に阻害し、それによってＴリンパ球活性化、炎症性因子分泌、および細胞毒性Ｔ−細胞の致死効果を阻害する。最後に、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧは、マクロファージ上のＦｃ受容体をブロックし、それによって、自己抗体（例えば抗血小板抗体）と既に結合した自己組織の食作用を妨げる。
【００５６】
本発明で言及される自己免疫疾患は、自己組織を損傷し得る、自己抗原に対する免疫応答によって引き起こされる疾患である。したがって疾患が、高レベルの葉酸受容体発現によって特徴付けられさえすれば、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧは適切な投与量で効果的である。これらの自己免疫疾患としては、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、紅斑性狼瘡、肺線維症、およびサルコイドーシスが挙げられる。コンジュゲートは、静脈、筋肉を通じた注射、または皮下注射を通じて送達され得る。処方される用量は、１ｍｇ〜４ｇ／ｋｇ体重の範囲であり、５ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇが好ましい。
【００５７】
以下の実施例によって、更に詳しい説明を提供する。動物実験では、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧのＩｇＧは、マウスに由来するものであったことに留意されたい。これによってマウスにおける、Ｆｃ受容体ミスマッチと、ヒト化ＩｇＧの免疫原性を回避する。将来、コンジュゲートがヒトに適用される場合は、ヒトＩｇＧが使用される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧを生成する反応の概略図である。ＤＣＣおよびＮＨＳによる活性化後、アミド結合を通じて葉酸をＧＳＨと反応させて、葉酸−ＧＳＨを形成する。同時に、ＩｇＧ中のアミノ基をそれぞれＭＢＳまたはＳＰＤＰによって活性化する。これらの２種類の活性化ＩｇＧを葉酸−ＧＳＨと共役させて、異なる葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートを生成する。
【実施例】
【００５９】
材料：ＢＭＢ、ＤＣＣ、ＤＴＴ、ＤＴＭＥ、ＥＭＣＳ、ＦＩＴＣ、葉酸、ＧＳＨ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、２−ＭＥＡ、メトトレキサート、ＮＨＳ、ＳＭＣＣＳＭＰＢＳＰＤＰ、スルホ−ＧＭＢＳ、およびスルホ−ＫＭＵＳは、Ｓｉｇｍａから購入される。組換えＩｇＧは、Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得られる。Ｆｃ部分は、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから得られる。ヒトＩｇＧ１は、ＡＸＸＯＲＡから得られる。
【００６０】
ウシ胎仔血清およびＭＥＭ培地は、Ｈｙｃｌｏｎｅによって提供される。
【００６１】
ＭＣＦ−７乳癌細胞系は、武漢大学の中国典型培養物保蔵中心から得られる。
【００６２】
実施例１
葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートは、葉酸、ＧＳＨ、およびＩｇＧを含んでなる。ＩｇＧは組換えＩｇＧである。
【００６３】
０．１ｍｍｏｌの葉酸、０．１ｍｍｏｌのＤＣＣ、および０．１ｍｍｏｌのＮＨＳの混合物をＤＭＳＯ中に室温で２時間保ち、遠心分離がそれに続く。葉酸−ＧＳＨを得るために、０．１ｍｍｏｌのＧＳＨを上清に添加して、アルゴン環境下、暗所で一晩反応させる。ＩｇＧを１０倍のＳＰＤＰ（２０ｍＭ原液から）と、室温で０．５時間混合する。混合物を分子ふるいカラムＰＤ−１０に装入して、活性化ＩｇＧを得る。葉酸−ＧＳＨを０．１当量の活性化ＩｇＧと、室温で１５時間反応させる。分子ふるいカラムを通して、生成物葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧを収集する。
【００６４】
実施例２
ＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ部分である。
【００６５】
３０ミクロモルの葉酸、４０ミクロモルのＤＣＣ、および３０ミクロモルのＮＨＳの混合物をＤＭＳＯ中で室温で５時間保ち、遠心分離がそれに続く。葉酸−ＧＳＨを得るために、３０ｍｍｏｌのＧＳＨを上清に添加して、アルゴン環境下、暗所で一晩反応させる。ＩｇＧを３０倍のＳＭＰＢ（２０ｍＭ原液から）と、室温で１時間混合する。反応物を分子ふるいカラムＰＤ−１０に装入して、活性化ＩｇＧを得る。葉酸−ＧＳＨを重量で２０倍の活性化ＩｇＧと、４℃で２０時間反応させる。次に、分子ふるいカラムＰＤ−１０を通して、生成物、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧを収集する。
【００６６】
実施例３
ＩｇＧはヒトＩｇＧ１である。
【００６７】
１０ミクロモルの葉酸、２０ミクロモルのＤＣＣ、および１０ミクロモルのＮＨＳの混合物をＤＭＳＯ中で室温で３時間保ち、遠心分離がそれに続く。葉酸−ＧＳＨを得るために、１０ｍｍｏｌのＧＳＨを上清に添加して、アルゴン環境下、暗所で一晩反応させる。ＩｇＧを２０倍のＳＭＣＣ（２０ｍＭ原液から）と、室温で１時間混合する。反応物を分子ふるいカラムＰＤ−１０に装入して、活性化ＩｇＧを得る。葉酸−ＧＳＨを重量で１０倍の活性化ＩｇＧと、室温で２０時間反応させる。次に、分子ふるいＰＤ−１０を通して、生成物葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧを収集する。
【００６８】
実施例４
ＩｇＧはヒトＩｇＧ１である。
【００６９】
２〜２０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧを含有する１ｍｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液（２０〜１００ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０〜８．０）に、６ｍｇの２−ＭＥＡを３７℃で１時間溶解する。
【００７０】
室温に冷却した生成物をＰＤ−１０などの脱塩カラムに装入して、ｈａｌｆ−ＩｇＧ（還元ＩｇＧ）を得る。１０ミクロモルの葉酸、２０ミクロモルのＤＣＣ、および１０ミクロモルのＮＨＳの混合物をＤＭＳＯ中で室温で３時間保ち、遠心分離がそれに続く。葉酸−ＧＳＨを得るために、１０ｍｍｏｌのＧＳＨを上清に添加して、アルゴン環境下、暗所で一晩反応させる。ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中で、スルフヒドリル架橋剤ＢＭＢをＤＭＦに溶解し、１倍の還元ＩｇＧと室温で２時間反応させる。次に、脱塩カラムＰＤ−１０を通して、生成物、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧを収集する。
【００７１】
実施例５
ＩｇＧはヒトＩｇＧ１である。
【００７２】
ＤＴＴを５ｍＭでＰＢＳ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）に溶解する。ＩｇＧ溶液とＤＴＴの混合物を室温に２時間保つ。
【００７３】
生成物を即座にＰＤ−１０などの脱塩カラムに装入して、ＩｇＧ重鎖を得る。
【００７４】
１０ミクロモルの葉酸、２０ミクロモルのＤＣＣ、および１０ミクロモルのＮＨＳの混合物をＤＭＳＯ中で室温で３時間保ち、遠心分離がそれに続く。葉酸−ＧＳＨを得るために、１０ｍｍｏｌのＧＳＨを上清に添加して、アルゴン環境下、暗所で一晩反応させる。ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中で、スルフヒドリル架橋剤ＤＴＭＥをＤＭＦに溶解し、１倍の還元ＩｇＧと室温で２時間反応させる。次に、得られた生成物を葉酸−ＧＳＨと反応させる。次に脱塩カラムＰＤ−１０を通して、生成物、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧを収集する。
【００７５】
実施例６
ＩｇＧはヒトＩｇＧ１である。
【００７６】
２〜２０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧを含有する１ｍｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液（２０〜１００ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１〜１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０〜８．０）に、６ｍｇの２−ＭＥＡを３７℃で１時間溶解する。
【００７７】
室温に冷却した生成物をＰＤ−１０などの脱塩カラムに装入して、ｈａｌｆ−ＩｇＧを得る。
【００７８】
１０ミクロモルの葉酸、２０ミクロモルのＤＣＣ、および１０ミクロモルのＮＨＳの混合物をＤＭＳＯ中で室温で３時間保ち、遠心分離がそれに続く。葉酸−ＧＳＨを得るために、１０ｍｍｏｌのＧＳＨを上清に添加して、アルゴン環境下、暗所で一晩反応させる。室温で、ＬＣ−ＳＰＤＰ（２０ｍＭ原液）を使用して、ＩｇＧを１時間還元する。次に、葉酸−ＧＳＨを重量で１０倍の還元ＩｇＧに室温で２０時間添加する。分子ふるいカラムＰＤ−１０を通して、生成物、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧを収集する。
【００７９】
実施例７
ＩｇＧはヒトＩｇＧ１である。
【００８０】
ＤＴＴを５ｍＭでＰＢＳ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）に溶解する。ＩｇＧ溶液とＤＴＴの混合物を室温に２時間保つ。生成物をＰＤ−１０などの脱塩カラムに装入して、ＩｇＧ重鎖を得る。
【００８１】
１０ミクロモルの葉酸、２０ミクロモルのＤＣＣ、および１０ミクロモルのＮＨＳの混合物をＤＭＳＯ中で室温で３時間保ち、遠心分離がそれに続く。葉酸−ＧＳＨを得るために、１０ｍｍｏｌのＧＳＨを上清に添加して、アルゴン環境下、暗所で一晩反応させる。ＩｇＧ重鎖を２０倍のＬＣ−ＳＰＤＰ（２０ｍＭ原液）と室温で１時間反応させ、ＰＤ−１０カラムでで分離する。次に、葉酸−ＧＳＨを重量で１０倍の活性化ＩｇＧと、室温で２０時間反応させる。ＰＤ−１０カラムを通して、生成物、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧを収集する。
【００８２】
実施例８
ＩｇＧはヒトＩｇＧ１である。
【００８３】
１０ミクロモルの葉酸、２０ミクロモルのＤＣＣ、および１０ミクロモルのＮＨＳの混合物をＤＭＳＯ中で室温で３時間保ち、遠心分離がそれに続く。葉酸−ＧＳＨを得るために、１０ｍｍｏｌのＧＳＨを上清に添加して、アルゴン環境下、暗所で一晩反応させる。ＩｇＧを２０倍のスルホ−ＧＭＢＳ（２０ｍＭ原液から）によって室温で１時間活性化し、ＰＤ−１０カラムで分離する。次に、葉酸−ＧＳＨを重量で１０倍の活性化ＩｇＧと、室温で２０時間反応させる。ＰＤ−１０カラムを通して、生成物、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧを収集する。
【００８４】
実施例９
ＩｇＧはヒトＩｇＧ１である。
【００８５】
１０ミクロモルの葉酸、２０ミクロモルのＤＣＣ、および１０ミクロモルのＮＨＳの混合物をＤＭＳＯ中で室温で３時間保ち、遠心分離がそれに続く。葉酸−ＧＳＨを得るために、１０ｍｍｏｌのＧＳＨを上清に添加して、アルゴン環境下、暗所で一晩反応させる。ＩｇＧを２０倍のスルホ−ＫＭＵＳ（２０ｍＭ原液から）によって室温で１時間活性化し、ＰＤ−１０カラムで分離する。次に、葉酸−ＧＳＨを重量で１０倍の活性化ＩｇＧと、室温で２０時間反応させる。ＰＤ−１０カラムを通して、生成物、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧを収集する。
【００８６】
実施例１０
葉酸類似体−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートは、メトトレキサート、ＧＳＨ、およびＩｇＧを含んでなる。メトトレキサートの分子式は、Ｃ２０Ｈ２２Ｎ８Ｏ５である。ＩｇＧは、ヒトＩｇＧ１である。
【００８７】
１０ミクロモルのメトトレキサート、２０ミクロモルのＤＣＣ、および１０ミクロモルのＮＨＳの混合物をＤＭＳＯ中で室温で３時間保ち、遠心分離がそれに続く。メトトレキサート−ＧＳＨを得るために、１０ｍｍｏｌのＧＳＨを上清に添加して、アルゴン環境下、暗所で一晩反応させる。ＩｇＧを２０倍のスルホ−ＳＭＣＣ（２０ｍＭ原液から）と室温で１時間反応させ、ＰＤ−１０カラムで分離する。メトトレキサート−ＧＳＨを１０倍の活性化ＩｇＧと室温で２０時間反応させる。ＰＤ−１０カラムを通して、生成物葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧを収集する。
【００８８】
実施例１１
２つの方法によって調製された葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧの安定性の比較
【００８９】
実験材料
１．実施形態３に従って、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲートを調製する。ウシ胎仔血清およびＭＥＭ培地は、Ｈｙｃｌｏｎｅによって提供される。
２．ＭＣＦ−７乳癌細胞系は、武漢大学の中国典型培養物保蔵中心から得られる。
【００９０】
方法：
葉酸−ＩｇＧコンジュゲートの調製：３０ミクロモルの葉酸、４０ミクロモルのＤＣＣ、および３０ミクロモルのＮＨＳの混合物をＤＭＳＯ中で室温で３時間保ち、遠心分離がそれに続いた。上清を重量で２０倍の組換えＩｇＧと室温で５時間反応させた。分子ふるいＰＤ−１０を通して、生成物を精製し収集した。
【００９１】
葉酸−ＩｇＧおよび葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧをそれぞれ５倍のＦＩＴＣと共に、室温で２時間インキュベートした。ＦＩＧ−ＦＩＴＣおよびＦＧＩＧ−ＦＩＴＣと称されるＦＩＴＣ標識コンジュゲートをＰＤ−１０カラムに装入して収集した。これらの半分を４℃で３ヶ月間、暗所に保った。細胞蛍光強度は、次のように検出した。
【００９２】
対数増殖期にあるＭＣＦ−７細胞（葉酸受容体による安定形質移入）を１０％ウシ胎仔血清を含有するＭＥＭに再懸濁した。９６ウェル培養プレート（５×１０４／ｍｌ）内において、２００μｌ／ウェルで単細胞懸濁液を培養した。細胞をいくつかの群に分けた。陰性対照、ＦＩＧ−ＦＩＴＣ、ＦＧＩＧ−ＦＩＴＣ、ＦＩＧ−ＦＩＴＣ−３、ＦＧＩＧ−ＦＩＴＣ−３（ＦＩＧおよびＧＩＧは、４℃で３ヶ月間、暗所に保った）、および葉酸干渉群（葉酸＋ＦＩＧ−ＦＩＴＣ、葉酸＋ＦＧＩＧ−ＦＩＴＣ）。各群は、３連であった。２０μｌのＦＩＧまたはＦＧＩＧ−ＦＩＴＣを各ウェルに添加した。葉酸干渉群では、葉酸−ＰＢＳをウェルに入れた（葉酸最終濃度は２０μｍｏｌ／Ｌ）。５％ＣＯ２、３７℃で３時間の培養後、サンプルを２００μｌＰＢＳで３回洗浄した。パンクレアチンによる消化後、倒立蛍光顕微鏡下で細胞を観察した。細胞に吸収される蛍光はまた、細胞溶解と、１０００ｒｐｍで２０ｂ分間の遠心分離後に、蛍光光度計によって検出され得た。
【００９３】
結果：
ＦＩＴＣ標識葉酸−ＩｇＧおよび葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧは、葉酸受容体と効率的に結合し得て、腫瘍細胞を緑色にした。しかし葉酸の干渉は、蛍光強度を顕著に低下させた。これは、腫瘍細胞と葉酸−ＩｇＧまたは葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧとの結合特異性を示唆する。その一方で、葉酸−ＩｇＧと比較して、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧは、細胞の取り込みを効果的に改善した（約４５．２％）。これに加えて、結合実験は、コンジュゲートを４℃で３ヶ月保った後の有意差もまた示した。表４では、葉酸−ＩｇＧ基の蛍光強度は、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧ群よりも低く、葉酸−ＩｇＧ群の取り込みは、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧ群のわずか６９．８％であった。これらの結果は、改善された調製方法が、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧの標的化と安定性を強化することを示唆する。
【００９４】
【表５】
2013543849.tif 000037
＊＊ＦＩＧ−ＦＩＴＣ群のオンライン結果と比較してＰ＜０．０１；▲▲４℃で３ヶ月間保ったＦＩＧ−ＦＩＴＣ群と比較してＰ＜０．０１。
【００９５】
実施例１２
乳癌治療のための葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧの使用
実験材料
１．それぞれ実施形態１および１１に従って、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート（ＦＧＩＧ）および葉酸−ＩｇＧ（ＦＩＧ）コンジュゲートを調製する。ＩｇＧは、ＳｉｇｍａからのマウスＩｇＧである。
２．動物：体重１８〜２２ｇの５０匹の健康な成熟メスヌードマウスは、南京大学モデル動物研究所によって提供される。
【００９６】
動物のグループ分けおよび処置
体重によって、マウスを無作為に、正常対照群、モデル群、エピルビシン陽性対照群、ＦＩＧ  ５ｍｇ／ｋｇ群および４０ｍｇ／ｋｇ群、ＦＧＩＧ  ５ｍｇ／ｋｇ群および４０ｍｇ／ｋｇ群に分けた。実験開始前の７日間に、マウスに葉酸の入っていない飼料を与えた。０日目から、モデル群、エピルビシン陽性対照群、ＦＩＧ  ５ｍｇ／ｋｇ群または４０ｍｇ／ｋｇ群、およびＦＧＩＧ  ５ｍｇ／ｋｇ群または４０ｍｇ／ｋｇ群に、それぞれ葉酸受容体形質移入ＭＣＦ−７細胞（１×１０６）を皮下注射した。５日目から、ＦＩＧ  ５ｍｇ／ｋｇ群およびＦＩＧ  ４０ｍｇ／ｋｇ群には、ＦＩＧ（それぞれ５ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。
【００９７】
ＦＧＩＧ  ５ｍｇ／ｋｇ群およびＦＧＩＧ  ４０ｍｇ／ｋｇ群には、ＦＧＩＧ（それぞれ５ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。エピルビシン陽性対照群には、エピルビシン（２００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。正常対照群およびモデル群には、等量の生理食塩水を腹腔内注射した。注射は、４日ごとに１回実施した。注射の１５日後、マウスを絶食させた。処置の翌日、腫瘍体積をノギスで測定し、平均生存期間もまた計算した。
【００９８】
体積：次式を使用して、固形腫瘍体積を計算した。Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ×Ｈ
【００９９】
結果
１．ＤＢＡ／２マウスにおけるＭＣＦ−７細胞増殖のＦＧＩＧによる阻害
表２に示されるように、５ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇのＦＧＩＧの注射は、ＤＢＡ／２マウスにおけるＭＣＦ−７増殖を効果的に阻害した。１６日後、これらの２群中の固形腫瘍の体積は、５０．８％および６３．３％低下してＦＩＧ群よりも小さく、ＭＣＦ−７増殖に対する葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧによる阻害が、葉酸−ＩｇＧを上回ることが示唆された。
２．ＦＧＩＧは、ＤＢＡ／２マウスの平均生存期間を増大させた。
５ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇのＦＧＩＧの注射は、マウスの平均生存期間を２．０または３．０倍増大させたが、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧ群と葉酸−ＩｇＧ群の間に有意差はなかった。
【０１００】
【表６】
2013543849.tif 000038
＊＊正常対照群と比較してＰ＜０．０１；▲▲モデル群と比較してＰ＜０．０１。
【０１０１】
実施例１３
抗がん剤としてのＦＯＬＡＴＥ−ＧＳＨ−ＩｇＧの生体外試験
抗がん剤としてＦＯＬＡＴＥ−ＧＳＨ−ＩｇＧを選択した。ＭＴＴ比色分析アッセイを使用して、ヒト白血病細胞Ｋ５６２、子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ、乳癌細胞ＭＣＦ−７、結腸癌細胞Ｃａｃｏ−２、および肝臓癌細胞ＨｅｐＧ２に対する増殖阻害効果を試験した。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）もまた測定した。
【０１０２】
実験材料
１．薬剤および試薬：それぞれ実施形態１および１１に従って、ＦＯＬＡＴＥ−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート（ＦＧＩＧ）およびＦＯＬＡＴＥ−ＩｇＧ（ＦＩＧ）コンジュゲートを調製する。
２．ヒト白血病細胞系Ｋ５６２、子宮頸癌細胞系Ｈｅｌａ、乳癌細胞系ＭＣＦ−７、結腸癌細胞系Ｃａｃｏ−２、および肝臓癌細胞系統ＨｅｐＧ２は、武漢大学菌株保存機関から得られる。
【０１０３】
がん細胞阻害（ＣＩ）：ＣＩ＝（ＯＤ対照群−ＯＤ試験群）／ＯＤ対照群＊１００％
【０１０４】
阻害濃度５０（ＩＣ５０）：がん細胞増殖率を異なる濃度の同一サンプルでプロットして、用量応答曲線を得てＩＣ５０を計算した。
【０１０５】
結果
ＦＯＬＡＴＥ−ＧＳＨ−ＩｇＧは、恐らくはＦＯＬＡＴＥ−ＧＳＨ−ＩｇＧ結合によって誘発されるがん細胞アポトーシスのために、Ｋ５６２、Ｈｅｌａ、ＭＣＦ−７、Ｃａｃｏ−２、およびＨｅｐＧ２細胞の増殖を用量依存性に顕著に阻害した。ＦＯＬＡＴＥ−ＧＳＨ−ＩｇＧは、ＦＯＬＡＴＥ−ＩｇＧよりも細胞毒性が高かった。
【０１０６】
【表７】
2013543849.tif 000039
【０１０７】
実施例１４
炎症性腸疾患治療のための葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧ
動物モデルを使用して、炎症性腸疾患治療のための葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧの効果および機構を研究した。
【０１０８】
実験材料
１．それぞれ実施形態１および１１に従って、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート（ＦＧＩＧ）および葉酸−ＩｇＧ（ＦＩＧ）コンジュゲートを調製する。ＩｇＧは、ＳｉｇｍａからのマウスＩｇＧである。メサラジンＳＲ顆粒（Ｍｅｓａｌａｚｉｎｅ  ＳＲ  Ｇｒａｎｕｌｅｓ）は、Ｅｔｈｙｐｈａｒｍ（Ｆｒａｎｃｅ）から得られる。ＭＰＯ検出キットは、南京建成生物工程研究所から得られる。
２．動物：体重１８〜２２ｇの５０匹の健康な成熟オス昆明マウスは、南京大学モデル動物研究所によって提供される。
【０１０９】
動物のグループ分けおよび処置
マウスを無作為に、対照群、モデル群、メサラジン陽性対照群、ＦＩＧ  ５ｍｇ／ｋｇ群および４０ｍｇ／ｋｇ群、ＦＧＩＧ  ５ｍｇ／ｋｇ群および４０ｍｇ／ｋｇ群に分けた。その内、ＦＩＧ  ５ｍｇ／ｋｇ群およびＦＩＧ  ４０ｍｇ／ｋｇ群には、ＦＩＧ（それぞれ５ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。ＦＧＩＧ  ５ｍｇ／ｋｇ群およびＦＧＩＧ  ４０ｍｇ／ｋｇ群には、ＦＧＩＧ（それぞれ５ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。メサラジン陽性対照群には、６００ｍｇ／ｋｇのメサラジンを経口投与した。対照群およびモデル群には、等量の生理食塩水を腹腔内注射した。注射は、毎日１回実施した。
【０１１０】
酢酸刺激を使用して、結腸炎を誘発した。マウスを９日目および１０日目の空腹時に、エーテル吸入によって麻酔した。注射前に、肛門内に約１．５ｃｍ挿入した、０．１ｍｌの６％酢酸を含有するポリエチレンパイプで、腸管を清浄にした。
【０１１１】
試験基準
１．結腸粘膜損傷指数（ｃｏｌｏｎ  ｍｕｃｏｓａ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎｄｅｘ；ＣＭＤＩ）：結腸全体を摘出し、腸間膜に沿ってはさみで切開した。表７に従って、癒着、潰瘍、および鬱血を裸眼観察で点数化した。
２．ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）：組織を秤量し、トリス緩衝液内で均質化した（１：１９、重量／体積）。均質化と、凍結および解凍の反復後、組織を５％ホモジネートにした。キット製造会社の使用説明書に従ってＭＰＯ検出を実施し、Ｌｏｗｒｙ法を使用してタンパク質レベルを検出した。
【０１１２】
【表８】
2013543849.tif 000040
結腸係数は、上の２スコアの合計である。
【０１１３】
結果
表８は、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧが、炎症性腸疾患のあるマウスにおいて、結腸炎症を顕著に緩和したことを示す。５ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇの葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧ注射後、結腸係数は、それぞれ４２．０％および６４．８％低下した。炎症スコアの低下は、１．４４および４．９３倍であった。ＭＰＯ活性低下は、５８．３％および７１．３％であった。これらの結果は、葉酸−ＩｇＧよりも優れていた。低用量または高用量の葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧは、酢酸によって誘発される結腸損傷からマウスを明らかに保護する。マウス結腸評点レベルは、それぞれ３．４および１．４であった。モデル群では、重篤な癒着と２つ以上の潰瘍があった。マウス結腸評点レベルは、８．３であった。なおも軽度の発赤と癒着があった。ＦＩＧ群では、軽度の炎症がなおも存在したが、明白な潰瘍および癒着はなく、結腸評点レベルは１．９であった。
【０１１４】
【表９】
2013543849.tif 000041
＊＊標準対照群と比較してＰ＜０．０１；▲▲モデル群と比較してＰ＜０．０１。
【０１１５】
実施例１５
関節リウマチ治療のための葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧの使用
関節リウマチ動物モデルを通じて、関節リウマチの治療における葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧの効果および機構を試験した。
【０１１６】
実験材料
１．それぞれ実施形態１および１１に従って、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート（ＦＧＩＧ）および葉酸−ＩｇＧ（ＦＩＧ）コンジュゲートを調製する。ラットＩｇＧおよび完全フロイントアジュバントは、Ｓｉｇｍａから得られる。ジクロフェナクナトリウム腸溶コーティング錠剤は、北京諾華製薬有限公司から得られる。ＲＦ検出キットは、南京建成生物工程研究所から得られる。
２．動物：オスおよびメスの双方の体重１５０〜２００ｇの５０匹の健康な成熟ウィスター系ラットは、武漢大学実験動物センターによって提供される。
【０１１７】
方法
動物のグループ分けおよび処置
ラットを無作為に、正常対照群、モデル群、ジクロフェナクナトリウム陽性対照群、ＦＩＧ  ２ｍｇ／ｋｇ群および８ｍｇ／ｋｇ群、ＦＧＩＧ  ２ｍｇ／ｋｇ群および８ｍｇ／ｋｇ群に分けた。その内、ＦＩＧ  ２ｍｇ／ｋｇ群およびＦＩＧ  ８ｍｇ／ｋｇ群には、ＦＩＧ（それぞれ２ｍｇ／ｋｇおよび８ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。ＦＧＩＧ  ２ｍｇ／ｋｇ群およびＦＧＩＧ  ８ｍｇ／ｋｇ群には、ＦＧＩＧ（それぞれ２ｍｇ／ｋｇおよび８ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。ジクロフェナクナトリウム陽性対照群には、１０ｍｇ／ｋｇのジクロフェナクナトリウムを経口投与した。正常対照群およびモデル群には、等量の生理食塩水を腹腔内注射した。注射は、毎日１回実施した。０日目の右足体積体積測定後、０．１ｍｌの完全フロイントアジュバントを右足関節に皮下注射した。２１日目に、右足体積を最後の注射後に測定した。血液サンプル採取後、エーテル吸入によりラットを殺処分した。血液サンプルを遠心分離して、リウマチ因子（ＲＦ）検出のために血清を得た。
【０１１８】
試験基準
１．関節損傷指数スコア：表９．
２．リウマチ因子ＲＦ：ＲＦ検出キットと共に１００μｌの血清を使用した。
【０１１９】
【表１０】
2013543849.tif 000042
【０１２０】
結果
表１０では、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧは、関節リウマチがあるラットの足指発赤を顕著に緩和し得た。２ｍｇ／ｋｇおよび８ｍｇ／ｋｇの葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧの注射後、指または足指体積差は、それぞれ７０．９％および７８．８％低下した。関節損傷スコアレベルは、１．５８および５．２０倍低下した。リウマチ因子の含有量は、それぞれ１９．１％および２５．８％低下した。これらの結果は、葉酸−ＩｇＧよりも優れていた。８ｍｇ／ｋｇの葉酸−ＩｇＧ群と比較して、８ｍｇ／ｋｇの葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧ群のラットの関節損傷スコアレベルおよび足指体積差は、５４．５％および３６．９％低下した。これらは、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧの腹腔内注射が、関節リウマチからラットを効果的に保護することを示す。
【０１２１】
【表１１】
2013543849.tif 000043
正常対照群と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；モデル群と比較して▲Ｐ＜０．０５、▲▲Ｐ＜０．０１。
【０１２２】
実施例１６
紅斑性狼瘡を治療するための葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧの使用
実験材料：
１．薬剤および試薬：それぞれ実施形態１および１１に従って、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート（ＦＧＩＧ）および葉酸−ＩｇＧ（ＦＩＧ）コンジュゲートを調製する。マウスＩｇＧおよび完全フロイントアジュバントは、Ｓｉｇｍａから得られる。ＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧは、衛生部北京生物製品研究所から得られる。ＩＬ−１およびＲＦ検出キットは、南京建成生物工程研究所から得られる。
２．動物：体重１８〜２２ｇの５０匹の健康な成熟メス昆明マウスは、武漢大学実験動物センターによって提供される。生産ライセンス：ＳＣＸＫ（湖北省）２００３−２００４。マウス飼料は、武漢大学実験動物センターから購入される。
【０１２３】
方法
動物のグループ分けおよび処置
マウスを無作為に、正常対照群、モデル群、ライコウトウ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）陽性対照群、ＦＩＧ  １ｍｇ／ｋｇ群および１０ｍｇ／ｋｇ群、ＦＧＩＧ  １ｍｇ／ｋｇ群および１０ｍｇ／ｋｇ群に分けた。ＦＩＧ  １ｍｇ／ｋｇ群およびＦＩＧ  １０ｍｇ／ｋｇ群には、ＦＩＧ（それぞれ１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。ＦＧＩＧ  １ｍｇ／ｋｇ群およびＦＧＩＧ  １０ｍｇ／ｋｇ群には、ＦＧＩＧ（それぞれ１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。ライコウトウ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）陽性対照群に、１０ｍｇ／ｋｇのライコウトウ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）を経口を投与した。正常対照群およびモデル群には、等量の生理食塩水を腹腔内注射した。注射は、毎日１回実施した。
【０１２４】
カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）（３×１０１２ＣＦＵ／Ｌ）のホルムアルデヒド懸濁液を完全フロイントアジュバントと等量混合した。完全に乳化した後、５０μｌの懸濁液を中足に注射した。３週間後、１０μｌの懸濁液を静脈内注射によって再度注射した。感作の２８日後に、血清中のヒストンの自己抗体を検出した。
【０１２５】
試験基準
ヒストンの自己抗体：１：１００希釈の血清を被覆９６ウェルプレートに入れた。サンプルを３７℃で２時間インキュベートした。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１００）を添加して、３７℃で２時間インキュベートした。基質を添加して、３７℃で２０分間インキュベートした。２ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４によって反応を停止した。４９０ｎｍにおける吸光度スコアを記録し、これを酵素指数（ＥＩ）と共に示した。
【０１２６】
結果
表１１では、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧは、紅斑性狼瘡があるマウスのヒストン自己抗体の産生を顕著に低減し得た。１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧ注射後、自己抗体の産生は、それぞれ３８．７％および４７．１％低下した。高用量群は、陽性対照群と比較して顕著な効果を有した。１０ｍｇ／ｋｇ群では、ヒストン自己抗体産生は、葉酸−ＩｇＧよりも１２．５％低下した。これらは、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧが、葉酸−ＩｇＧに優って、ヒストン自己抗体の産生を効率的に低下させることを示す。
【０１２７】
【表１２】
2013543849.tif 000044
正常対照群と比較して＊＊Ｐ＜０．０１；モデル群と比較して▲Ｐ＜０．０５、▲▲Ｐ＜０．０１。
【０１２８】
実施例１７
乾癬の治療のための葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧ
動物モデルを通じて、乾癬の治療における葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧの効果および機構を試験した。
【０１２９】
実験材料
１．薬剤および試薬：それぞれ実施形態１および１１に従って、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧコンジュゲート（ＦＧＩＧ）および葉酸−ＩｇＧ（ＦＩＧ）コンジュゲートを調製する。マウスＩｇＧはＳｉｇｍａから得られる。トリアムシノロンアセトニドクリームは、天津藥業公司から得られる。
２．動物：オスおよびメス同数の体重１８〜２２ｇの４０匹の健康な成熟昆明マウスは、武漢大学実験動物センターによって提供される。生産ライセンス：ＳＣＸＫ（湖北省）２００３−２００４。マウス飼料は、武漢大学実験動物センターから購入される。
【０１３０】
方法
動物のグループ分けおよび処置
マウスを無作為に、正常対照群、モデル群、トリアムシノロンアセトニドクリーム陽性対照群、ＦＩＧ  １ｍｇ／ｋｇ群および１０ｍｇ／ｋｇ群、ＦＧＩＧ  １ｍｇ／ｋｇ群および１０ｍｇ／ｋｇ群に分けた。その内、ＦＩＧ  １ｍｇ／ｋｇ群およびＦＩＧ  １０ｍｇ／ｋｇ群には、ＦＩＧ（それぞれ１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。ＦＧＩＧ  １ｍｇ／ｋｇ群およびＦＧＩＧ  １０ｍｇ／ｋｇ群には、ＦＧＩＧ（それぞれ１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。トリアムシノロンアセトニドクリーム陽性対照群には、０．０５ｇのトリアムシノロンアセトニドクリームを尾の付け根に塗布した。正常対照群およびモデル群には、等量の生理食塩水を腹腔内注射した。注射は、毎日１回実施した。１５日間の継続的投与の後、マウスを殺処分した。尾の付け根から１．８ｃｍ離れた尾の皮膚の一片を採取して、ホルムアルデヒド溶液（１００ｍｌ／Ｌ）で固定した。パラフィン包埋とＨＥ染色後、マウスの尾表皮の鱗片を光学的顕微鏡下で観察した。
【０１３１】
試験基準
顆粒層があるマウス尾表皮の鱗片数：２つの毛嚢の間が顆粒層で覆われた鱗片は、顆粒層のある鱗片に分類される。異なる群間で、１００個の鱗片あたりの顆粒層のある鱗片数を測定して比較する。
【０１３２】
結果
表１２では、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧは、顆粒層のある鱗片の産生を顕著に増大させ得る。１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧの注射後には、顆粒層のある鱗片数は、それぞれ１．６４および２．２１倍増大した。表１２  乾癬があるマウスの尾表皮中の顆粒層のある鱗片に対する、葉酸−ＧＳＨ−ＩｇＧの効果（Ｘ±ＳＤ、ｎ＝１０）
【０１３３】
【表１３】
2013543849.tif 000045
＊＊正常対照群と比較してＰ＜０．０１。
【図１】
2013543849.tif 000063
【国際調査報告】
2013543849.tif 000064
2013543849.tif 000065
2013543849.tif 000066
2013543849.tif 000067
2013543849.tif 000068
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