(57)【要約】  本開示は、脂肪酸生合成に関与する植物の遺伝子を標的化する改変ジンクフィンガータンパク質に関する。遺伝子発現の変調、遺伝子の不活性化、および標的化遺伝子の変更におけるそういったジンクフィンガータンパク質の使用方法もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類の内因性植物遺伝子の発現を変調する非天然ジンクフィンガータンパク質であって、上記少なくとも１種類の植物遺伝子が脂肪酸生合成に関与し、かつ、それが以下の：β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼ（ＫＡＳ）遺伝子、脂肪酸チオエステラーゼＢ（ＦａｔＢ）遺伝子、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）遺伝子、脂肪酸エロンガーゼ遺伝子、脂肪酸チオエステラーゼ（ＦａｔＡ）遺伝子、色素体Ｇ−３−Ｐデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）遺伝子、グリセロキナーゼ（ＧＫ）遺伝子、ステアロイル−アシル担体タンパク質デサチュラーゼ（Ｓ−ＡＣＰ−ＤＥＳ）遺伝子、およびオレオイル−ＡＣＰヒドロラーゼ遺伝子から成る群から選択される前記非天然ジンクフィンガータンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のジンクフィンガータンパク質と機能ドメインを含む融合タンパク質。
【請求項３】
前記機能ドメインが、転写調節ドメインまたは切断ドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記植物遺伝子がアブラナ属植物の中に含まれている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のジンクフィンガータンパク質または融合タンパク質。
【請求項５】
前記ジンクフィンガータンパク質が、表２または表１０Ａに示す標的部位に結合する、請求項４に記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項６】
前記ジンクフィンガータンパク質が、表１または表１０Ｂの行中に示す認識ヘリックス領域を含む、請求項４に記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の１以上のジンクフィンガータンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
植物細胞内の脂肪酸生合成に関与する１以上の遺伝子の変更方法であって、以下のステップ：
請求項７に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む１以上の発現ベクターを、前記１以上のジンクフィンガータンパク質が発現され、そして該１以上の遺伝子が変更されるような条件下、該植物細胞内に導入する、
を含む前記方法。
【請求項９】
前記変更が、少なくとも１種類の遺伝子の発現を変調することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種類の遺伝子の発現が活性化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１種類の遺伝子の発現が抑制される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドがジンクフィンガーヌクレアーゼをコードし、かつ、少なくとも１種類の遺伝子が切断される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
ドナーベクターが相同組換えにより切断部位に導入されるように、該ドナー核酸を導入するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法によって変更した少なくとも１種類の遺伝子を含む植物細胞。
【請求項１５】
前記細胞が種子内にあり、かつ、該種子の脂肪酸含有量が変更されている、請求項１４に記載の植物細胞。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の少なくとも１つの細胞を含む植物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の植物の種子または子孫。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のジンクフィンガータンパク質または請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を含む植物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の植物の種子または子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
当該出願は、２０１０年１０月２２日に出願された米国特許仮出願第61/279,528号の恩恵を主張し、その開示全体を本明細書中に援用する。
【０００２】
技術分野
本開示は、一般的に、ゲノム工学および植物中でのタンパク質発現の分野に関する。特に本開示は、脂肪酸合成に関与する遺伝子を標的とする改変ＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガータンパク質、ならびに変更された脂肪酸プロフィールを有する植物を作出するための遺伝子発現、遺伝子不活性化および遺伝子修飾を変調する際のこうしたジンクフィンガータンパク質の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
飽和脂肪を多く含む食事は低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を上昇させ、それがひいてはアテローム性動脈硬化症や冠状動脈性心臓病に密接に関連する前提条件である血管へのコレステロールの沈着を引き起こす（Conner et al., Coronary Heart Disease: Prevention, Complications, and Treatment, J.B. Lippincott, Philadelphia, 1984 pp. 43-64）。対照的に、一価不飽和脂肪を多く含む食事は心臓病を減少させることが示された。オレイン酸（ほとんどの食用植物油における唯一の一価不飽和脂肪）は、リノール酸と同じくらい有効にＬＤＬを下げるが、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルには影響を及ぼさない（Mensink et al (1989) New England J. Meet., 321:436-441）。さらに、一価不飽和脂肪を多く含む食物はさらに、収縮期血圧の低下に関係する（Williams et al., (1987) J. Am. Meet, Assoc., 257:3251-3256, 1987）。
【０００４】
食事と健康に対する脂肪酸の影響の観点から、食用および工業用目的に使用される植物の脂肪酸プロフィールを変更する試みがなされた。しかしながら、脂肪酸プロフィールを改善するための植物を変更する慣用的方法は、突然変異誘発（例えば化学的、放射線照射など）および／または育種に依存し、手間がかかり、困難であり、そして選択された遺伝子を特異的に標的化するわけではない。例えば、米国特許第5,861,187号を参照のこと。
【０００５】
最近、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインやジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）などの改変ＤＮＡ結合ドメインは、植物における遺伝子発現を選択的に変調するために、そして遺伝子配列の標的化変更のために有利に使用されてきた（米国特許第7,262,054号、同第7,235,354号、同第7,220,719号、同第7,001,768号、および同第6,534,261号；米国特許公開番号第2008/0182332号および米国特許第12/284,888号を参照のこと）である。ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）は、ジンクフィンガーとして知られている金属安定化ドメインに基づいて、配列特異的な様式で、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質に結合するタンパク質である。例えばMiller et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614；Rhodes et al. (1993) Sci. Amer, 268(2):56-65；およびKlug (1999) J. Mol Biol. 293:215-218を参照のこと。ＺＦＰは一般的に、転写因子中に見出され、これまで１０，０００を超えるジンクフィンガー配列が数千の既知のまたは推定上の転写因子において同定されている。
【０００６】
ＤＮＡ結合ドメインはまた、改変ヌクレアーゼを作り出すための核酸分解酵素ドメインと共に使用され得る。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインが、新規ホーミングエンドヌクレアーゼを作り出すために変更され得る。同様に、ジンクフィンガードメインもまた、修飾（例えば、欠失、突然変異、相同組換え、または外因性配列の挿入）が所望されるゲノムの領域への二本鎖切断の特異的ターゲッティングのためのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を産生するためにヌクレアーゼ切断ドメインとも組み合わされてきた（例えば、米国特許出願第2007/0134796号；同第2005/0064474号；同第2008/0182332号を参照のこと）。改変ＺＦＰは、植物における特定の標的部位での外因性配列の挿入または内因性配列の修飾を大いに促し、慣用的方法より高い効率を有する植物ゲノムの標的化変更を提供する（例えば、米国特許第7,262,054号、同第7,235,354号、同第7,220,719号、同第7,001,768号、および同第6,534,261号を参照のこと）。
【０００７】
それにもかかわらず、選択された脂肪酸を持つ植物および植物製品（例えば植物油）を生み出すために脂肪酸合成に関与する遺伝子の標的化変更のための組成物および方法に対する必要性が依然として存在する。種子油中に低いレベルの個々のおよび総飽和脂肪しか含まない植物変種を生み出すことによって、より少ない飽和脂肪しか含まないオイルが主成分の食品を作り出すことができる。そういった製品は、アテローム性動脈硬化症や冠状動脈性心臓病の発生を減少させることによって公衆衛生に役立つ。
【発明の概要】
【０００８】
概要
本開示は、植物全体または植物細胞の脂肪酸生合成に関与する1もしくは複数の植物遺伝子の発現の変調ならびに標的化変更により、植物全体または植物細胞の脂肪酸組成を変更するための組成物および方法を提供する。植物全体または植物細胞は、いくつかの特定の実施形態において採油植物を含めた、単子葉（単子葉植物）または双子葉（双子葉植物）の植物種からであり得るし、培養細胞、発生の任意の段階での植物中の細胞、ならびに植物全体から取り出された植物細胞（これらの細胞（またはそれらの子孫）は植物に再生される）も包含する。植物細胞は、１若しくは複数のホメオロガス（homeologous）またはパラロガス遺伝子配列を含有し得るし、その任意数またはその全部が、本明細書中に開示されている方法によって修飾のために標的化され得る。
【０００９】
一態様において、植物の脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメイン（例えばジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ））を本明細書中に記載する。いくつかの実施形態において、上記遺伝子はセイヨウアブラナ（Brassica napus）の遺伝子である。いくつかの特定の実施形態において、セイヨウアブラナ遺伝子は、アセチル−ＣＯＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼ（ＫＡＳ、例えばＫＡＳ Ｉ〜ＫＡＳ ＩＶ）、脂肪酸チオエステラーゼＢ（ＦＡＴＢ、例えばＦＡＴＢ１〜ＦＡＴＢ５、または他の色素体チオエステラーゼ）、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）、脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ、例えばＦＡＥ１）、脂肪酸チオエステラーゼＡ（ＦａｔＡ）、脂肪酸デサチュラーゼ（Ｆａｄ２、Ｆａｄ３）、色素体Ｇ−３−Ｐデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）、グリセロキナーゼ（ＧＫ）、ステアロイル−アシル担体タンパク質デサチュラーゼ（Ｓ−ＡＣＰ−ＤＥＳ）、およびオレオイル−ＡＣＰヒドロラーゼ）をコード化する。いくつかの特定の実施形態において、上記遺伝子は、他の採油植物においてこれらの遺伝子のオルソログまたは相同体であり得る。
【００１０】
よりさらなる態様において、本明細書中に記載したいずれかのＤＮＡ結合ドメイン（例えばＺＦＰ）を含む融合タンパク質もまた提供する。特定の実施形態において、融合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質と転写調節ドメイン（例えば、活性化または抑制ドメイン）を含んでなり、ＺＦＰ ＴＦとしても知られている。他の実施形態において、融合タンパク質は、ＺＦＰと、標的遺伝子を持つ着目のゲノム領域を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成するヌクレアーゼドメインを含む。特定の実施形態において、ＺＦＮは、植物脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子（例えば、ＡＣＣａｓｅ、ＫＡＳ Ｉ、ＫＡＳ ＩＩ、ＫＡＳ ＩＩＩ、ＫＡＳ ＩＶ、ＦＡＴＢ１、ＦＡＴＢ２、ＦＡＴＢ３、ＦＡＴＢ４、ＦＡＴＢ５、ＦＡＳ、ＦＡＥ１、ＦａｔＡ、Ｆａｄ２、Ｆａｄ３、ＧＰＤＨ、ＧＫ、またはＳ−ＡＣＰ−ＤＥＳをコードする遺伝子）に特異性を有する改変ジンクフィンガー結合ドメインと切断ドメインを含む１つの融合ポリペプチド、および／または改変ジンクフィンガー結合ドメインと切断半ドメインを含む1もしくは複数の融合ポリペプチドを包含する。特定の実施形態において、ジンクフィンガー結合ドメインは、表２または表１０Ａに示されている標的部位に結合する。特定の実施形態において、ジンクフィンガー結合ドメインは、表１または表１０Ｂに示されている認識ドメイン（例えば単列）を含むジンクフィンガータンパク質から成る群から選択される配列を含む。切断ドメインおよび切断半ドメインは、例えば、様々な制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得られる。１つの実施形態において、切断半ドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ Ｉ）から得られる。
【００１１】
他の態様において、本明細書中に記載した任意のＤＮＡ結合ドメイン（例えばジンクフィンガータンパク質）および／または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを本明細書中で提供する。特定の実施形態において、プロモーターと作動可能に連結された本明細書中に記載した1もしくは複数のＺＦＰをコードするポリヌクレオチドを含むＺＦＰ発現ベクターを本明細書中に記載する。一実施形態において、ＺＦＰのうちの1もしくは複数がＺＦＮである。
【００１２】
ＺＦＰおよびこれらのＺＦＰを含む融合タンパク質は、当該遺伝子のコード領域内、またはその遺伝子内もしくはそれに隣接する非コード配列、例えばリーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどにおいて、あるいはコード領域の上流または下流の非転写領域内で、脂肪酸合成に関与する遺伝子と結合し、および／またはそれを切断し得る。特定の実施形態において、ＺＦＰまたはＺＦＮは、脂肪酸生合成に関与する遺伝子のコード配列または調節配列に結合し、および／またはそれを切断する。
【００１３】
もう１つの態様において、本明細書中に記載した、タンパク質、融合タンパク質またはポリヌクレオチドを1もしくは複数含む組成物を本明細書中に記載する。植物細胞は、１つの独自の遺伝子標的または同じ遺伝子の多数のパラロガスコピーを含有し得る。よって、組成物は、植物細胞中の１若しくは複数の脂肪酸合成に関与する遺伝子を標的にする1もしくは複数のＺＦＰ含有タンパク質（および同じものをコードするポリヌクレオチド）を含み得る。ＺＦＰは、植物細胞中のすべてのパラロガスまたはホメオロガス遺伝子および選択された特定のパラロガスまたはホメオロガス遺伝子、またはその組合せを標的とすることもできる。
【００１４】
もう１つの態様において、本明細書中に記載した、タンパク質またはポリヌクレオチド（例えばＺＦＰ発現ベクター）を1もしくは複数含む植物宿主細胞を本明細書中で提供する。ポリヌクレオチドに関して、植物宿主細胞は、1もしくは複数のＺＦＰ発現ベクターで安定的に形質転換され得るか、または一時的にトランスフェクトされ得るか、あるいはその組合せであり得る。一実施形態において、1もしくは複数のＺＦＰ発現ベクターは、植物宿主細胞中で1もしくは複数のＺＦＮを発現する。もう１つの実施形態において、1もしくは複数のＺＦＰ発現ベクターは、植物宿主細胞中で1もしくは複数のＺＦＰ ＴＦを発現する。
【００１５】
もう１つの態様において、植物細胞中での1もしくは複数の脂肪酸生合成に関与する遺伝子の発現の変調方法であって：（ａ）（単数もしくは複数の）ＺＦＰ ＴＦが発現され、かつ、1もしくは複数の遺伝子の発現が変調されるような条件下で、脂肪酸生合成に関与する1もしくは複数の遺伝子内の標的部位に結合する1もしくは複数のＺＦＰ ＴＦをコードする1もしくは複数の発現ベクターを植物細胞内に導入することを含む方法を、本明細書中に記載する。変調は活性化であっても抑制であってもよい。特定の実施形態において、少なくとも１つの標的部位は、（単数もしくは複数の）ＡＣＣａｓｅ、ＫＡＳ Ｉ、ＫＡＳ ＩＩ、ＫＡＳ ＩＩＩ、ＫＡＳ ＩＶ、ＦＡＴＢ１、ＦＡＴＢ２、ＦＡＴＢ３、ＦＡＴＢ４、ＦＡＴＢ５、ＦＡＳ、ＦＡＥ１、ＦａｔＡ、Ｆａｄ２、Ｆａｄ３、ＧＰＤＨ、ＧＫ、および／またはＳ−ＡＣＰ−ＤＥＳ遺伝子内に存在する。他の実施形態において、脂肪酸生合成に関与する２つ以上の遺伝子が変調される。本明細書中に記載した脂肪酸生合成に関与する遺伝子の発現の変調方法のいずれかにおいて、方法は変更された脂肪酸含量、例えば植物細胞中の飽和脂肪量の低下のある植物細胞をもたらす。いくつかの実施形態において、植物細胞中の変更された脂肪酸含量は、植物種子中の変更された脂肪酸含量、例えば植物種子中の飽和脂肪量の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、植物は、変更された脂肪酸を有する採油植物であり、その採油植物の種子においても一致する（例えば、飽和脂肪の低下）。一部の特定の実施形態において、植物は、変更された脂肪酸を有するセイヨウアブラナ植物であり、そのセイヨウアブラナ植物の種子においても一致する（例えば、飽和脂肪を還元する）。
【００１６】
もう１つの態様において、植物細胞中での脂肪酸生合成に関与する1もしくは複数の遺伝子の切断方法であって：（ａ）（単数もしくは複数の）ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）が発現され、かつ、1もしくは複数の遺伝子が切断されるような条件下で、脂肪酸生合成に関与する1もしくは複数の遺伝子中の標的部位に結合する1もしくは複数のヌクレアーゼ（例えばＺＦＮ）をコードする1もしくは複数の発現ベクターを植物細胞内に導入することを包含する方法を、本明細書中に記載する。特定の実施形態において、少なくとも１つの標的部位が、ＡＣＣａｓｅ、ＫＡＳ Ｉ、ＫＡＳ ＩＩ、ＫＡＳ ＩＩＩ、ＫＡＳ ＩＶ、ＦＡＴＢ１、ＦＡＴＢ２、ＦＡＴＢ３、ＦＡＴＢ４、ＦＡＴＢ５、ＦＡＳ、ＦＡＥ１、ＦａｔＡ、Ｆａｄ２、Ｆａｄ３、ＧＰＤＨ、ＧＫ、および／またはＳ−ＡＣＰ−ＤＥＳをコードする遺伝子中に存在する。他の実施形態において、脂肪酸生合成に関与する２つ以上の遺伝子が切断される。さらに、本明細書中に記載したいずれかの方法において、1もしくは複数の遺伝子の切断がその切断領域のヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換をもたらし得る。
【００１７】
さらにもう１つの態様において、植物細胞のゲノム中への外因性配列の導入方法であって：（ａ）外因性配列（ドナーベクター）と細胞を接触させるステップ；そして（ｂ）細胞中で本明細書中に記載されている1もしくは複数のヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）を発現させるステップ（ここで、上記1もしくは複数のヌクレアーゼが染色体ＤＮＡを切断する）を包含し；したがって、ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同組換えによるゲノム中へのドナーベクターの組入れを刺激する方法を、本明細書中に記載する。特定の実施形態において、1もしくは複数のヌクレアーゼは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインと改変ジンクフィンガー結合ドメインとの間の融合物である。他の実施形態において、ヌクレアーゼには、ホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば変更されたＤＮＡ結合ドメインを持つホーミングエンドヌクレアーゼが含まれる。本明細書中に記載した方法のいずれにおいても、外因性配列はタンパク質産物をコードし得る。
【００１８】
よりさらなる態様において、本明細書中に記載した方法のいずれかによって得られたトランスジェニックまたは非トランスジェニック植物細胞もまた提供する。
【００１９】
もう１つの態様において、本明細書中に記載したように得られたトランスジェニックまたは非トランスジェニック植物細胞を含む植物を、本明細書中で提供する。
【００２０】
もう１つの態様において、本明細書中に記載したように得られたトランスジェニックまたは非トランスジェニック植物細胞を含む植物からの種子を本明細書中で提供する。
【００２１】
もう１つの態様において、本明細書中に記載したように得られたトランスジェニックまたは非トランスジェニック植物細胞を含む植物から採取した種子からの油を本明細書中で提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
図面の簡単な説明
【図１】キャノーラ（B. napus）における脂肪酸生合成経路を示す図解である。これは、John Shanklin, Brookhaven National Laboratory, Upton, NY（Thelen and Ohlrogge, 2002, Metabolic engineering 4:12-21）に従って編集した。
【図２】種々の代表的なＫＡＳ ＩＩ標的化ＺＦＰについてＫＡＳ ＩＩ遺伝子内の標的部位の位置を示す図解である。数は、表ＩＩＩに示された構築物内に含まれるＺＦＰの標的部位を示す。ＺＦＰの設計は表ＩおよびＩＩに示されている。
【図３】ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した場合の、ＫＡＳ ＩＩ活性化ＺＦＰ ＴＦ構築物４６９５で形質転換されたＴ0植物葉におけるＫＡＳ ＩＩのｍＲＮＡ発現を示すグラフである。グラフに示した倍数上方制御を計算するために、２７の対照植物の平均を使用された。３倍を超えるＫＡＳ ＩＩのｍＲＮＡ上方制御が、特定の事象で観察された。
【図４】ｑＲＴ−ＰＣＲによって検出されたＴ1植物葉におけるＫＡＳ ＩＩ−ＺＦＰ ＴＦ／チューブリン発現比を図示するグラフである。３つの事象が対応するヌルと比較された。
【図５】ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した場合の、それぞれ３事象のＺＦＰ ＴＦ含有および隔離ヌルＴ1植物における平均ＫＡＳ ＩＩ／チューブリンｍＲＮＡ発現比を図示するグラフである。２〜３倍のＫＡＳ ＩＩのｍＲＮＡ上方制御がこれらのＴ1植物葉で観察された。
【図６】（Ａ）と（Ｂ）：各事象の中でＺＦＰ ＴＦ陽性および同胞ヌル植物における一貫した有意（ｐ＝＜０．００１）な総Ｃ１６の低下（６Ａ）および総Ｃ１６／総Ｃ１８比（６Ｂ）の低下を図示する、（単数もしくは複数の）標的脂肪酸の一元配置分析についてＪＭＰ統計ソフトウェアで描いたグラフである。総Ｃ１６にはＣ１６：０とＣ１６：１の含有量が含まれ、そして総Ｃ１８にはＣ１８：０、１８：１、１８：２および１８：３の含有量が含まれる。
【図７Ａ】ＡＦ３１８３０７とＡＦ２４４５２０の配列アラインメントを図示する。陰影は完全な相同性の領域を示す。
【図７Ｂ】ＡＦ３１８３０７とＡＦ２４４５２０の配列アラインメントを図示する。陰影は完全な相同性の領域を示す。
【図７Ｃ】ＡＦ３１８３０７とＡＦ２４４５２０の配列アラインメントを図示する。陰影は完全な相同性の領域を示す。
【図７Ｄ】ＡＦ３１８３０７とＡＦ２４４５２０の配列アラインメントを図示する。陰影は完全な相同性の領域を示す。
【図８Ａ】配列番号３、配列番号４、配列番号４６、配列番号３０、ＡＣ１８９４６１、およびＢＨ７２３５０４の配列アラインメントを図示する。β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｃＤＮＡの増幅のための順方向および逆方向プライマー配列（配列番号２８および２９）が対応配列上の破線によって強調される。陰影は完全な相同性の領域を示す。
【図８Ｂ】配列番号３、配列番号４、配列番号４６、配列番号３０、ＡＣ１８９４６１、およびＢＨ７２３５０４の配列アラインメントを図示する。β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｃＤＮＡの増幅のための順方向および逆方向プライマー配列（配列番号２８および２９）が対応配列上の破線によって強調される。陰影は完全な相同性の領域を示す。
【図８Ｃ】配列番号３、配列番号４、配列番号４６、配列番号３０、ＡＣ１８９４６１、およびＢＨ７２３５０４の配列アラインメントを図示する。β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｃＤＮＡの増幅のための順方向および逆方向プライマー配列（配列番号２８および２９）が対応配列上の破線によって強調される。陰影は完全な相同性の領域を示す。
【図８Ｄ】配列番号３、配列番号４、配列番号４６、配列番号３０、ＡＣ１８９４６１、およびＢＨ７２３５０４の配列アラインメントを図示する。β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｃＤＮＡの増幅のための順方向および逆方向プライマー配列（配列番号２８および２９）が対応配列上の破線によって強調される。陰影は完全な相同性の領域を示す。
【図９】構築物ｐＤＡＢ４６９０〜ｐＤＡＢ４６９２で存在する、異なったＺＦＰ ＴＦ設計のトランスジェニック・セイヨウアブラナ・カルス株におけるＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５遺伝子発現を図示する。対照の１７株とそれぞれのＺＦＰ構築物の２５株を分析した。黒色の棒グラフ＝ＦａｔＢ４ ｍＲＮＡ発現；灰色の棒グラフ＝ＦａｔＢ５ｍＲＮＡ発現。
【図１０】ｑＲＴ−ＰＣＲで分析したセイヨウアブラナＴ0トランスジェニック植物葉におけるＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５の発現を表す。３種類の構築物であるＺＦＰ ＴＦ、ｐＤＡＢ４６８９〜ｐＤＡＢ４６９１を含むトランスジェニック植物を試験した。この実験のために分析した独立したＴ0トランスジェニック植物の総数は、ｐＤＡＢ４６８９〜ｐＤＡＢ４６９１およびｐＤＡＢ８２１０に関して、それぞれ４０、６２、４１、および２２であった。Ｎｅｘ７１０対照には１０の植物が含まれた。ＺＦＰ ＴＦ発現アッセイ（実施例８．３）によって測定されたように、３種類のＺＦＰ ＴＦ構築物に関してトランスジェニック事象の９７パーセントがＺＦＰ ＴＦ発現について陽性であった。ＦａｔＢ遺伝子発現を標準化するための基準として天然チューブリンｍＲＮＡ発現を使用したとき、同様の結果を得た。黒色の棒グラフ＝ＦａｔＢ４発現；灰色の棒グラフ＝ＦａｔＢ５発現。
【図１１】Ｔ1植物から分析したときに、ＦａｔＢ遺伝子とチューブリン発現との間の直線関係を示すプロットである。黒色の四角形＝ＦａｔＢ４発現；灰色の菱形＝ＦａｔＢ５発現。
【図１２】ＺＦＰ ＴＦ構築物ｐＤＡＢ４６９１トランスジェニックＴ1植物葉におけるＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲを表す。黒色の四角形＝ＦａｔＢ４発現；灰色の菱形＝ＦａｔＢ５発現。
【図１３】ＪＭＰ統計ソフトウェアを使用した、サンプルによるＣ１８：０含有量の一元配置分析である。
【図１４】ＪＭＰ統計解析ソフトウェアを使用した、サンプルによる総Ｃ１６／Ｃ１８含有量の一元配置分析を表す。
【図１５】ＪＭＰ統計ソフトウェアを用いて表された、４種類のＺＦＰ ＴＦ構築事象を含む成熟種子のＴ1 ＦＡプロフィールの分析を図示する。ＡおよびＢパネルは、それぞれＣ１８：０含有量とＣ１６：０／Ｃ１８：０含有量のサンプル（構築物）による一元配置分析を表す。
【図１６】ＪＭＰ統計ソフトウェアを用いて表された、４種類のＺＦＰ ＴＦ構築事象を含む成熟種子のＴ1 ＦＡプロフィールの分析を図示する。ＡおよびＢパネルは、それぞれＣ１４：０およびＣ１６：１含有量のサンプル（構築物）による一元配置分析を表し、そして構築物ｐＤＡＳ５２２７の識別特性を強調した。４種類のＺＦＰ ＴＦ構築事象を含む成熟種子のＴ1 ＦＡプロフィールの分析を、ＪＭＰ統計ソフトウェアを用いて表す。ＡおよびＢパネルは、それぞれＣ１４：０およびＣ１６：１含有量のサンプル（構築物）による一元配置分析を表し、そして構築物ｐＤＡＳ５２２７の識別特性を強調した。
【図１７】ｐＤＡＳ５２２７ ＺＦＰ ＴＦ構築物で形質転換されたＴ2未熟種子におけるＦａｔＢ５ ｍＲＮＡの下方調節（黒色の棒グラフ）を表す。ＺＦＰ ＴＦ発現は、ＥＲＦ３発現（灰色の棒グラフ）によって表される。２５個のＤＡＦ未熟種子を、事象５２２７−１２の４つのヌル、３つのヘテロ接合（５２２７＿１２ＺＦ−１）および４つのホモ接合（５２２７＿１２ＺＦ−２）Ｔ1植物から分析した。
【図１８】ｐＤＡＳ５２１２ ＺＦＰ ＴＦ構築物で形質転換したＴ2未熟種子のＦａｔＢ５ ｍＲＮＡ下方調節（黒色の棒グラフ）を表す。ＺＦＰ ＴＦ ｍＲＮＡ発現は、ＫＲＡＢ１発現（灰色の棒グラフ）によって表される。２５個のＤＡＦ未熟種子を、事象５２１２−４の５つのヌル、３つのヘテロ接合、および４つのホモ接合植物から分析した。
【図１９】ＺＦＰ ＴＦ事象５２２７−１２のＴ2種子における接合性による総飽和脂肪酸（ｓａｔｓ．）の一元配置分析を表す。Ｔ1ヌル、ヘテロ接合およびホモ接合の親株から得たＴ2種子を、それぞれ５２２７−１２ＺＦヌル、５２２７−１２ＺＦ（１）および５２２７−１２ＺＦ（２）とラベル付けする。
【図２０】ＺＦＰ ＴＦ事象５２１２−４のＴ2種子における接合性による総飽和脂肪酸（ｓａｔｓ．）の一元配置分析を表す。Ｔ1ヌル、ヘテロ接合およびホモ接合の親株から得たＴ2種子を、それぞれ５２１２−４ＺＦヌル、５２１２４ＺＦ（１）および５２１２−４（２）とラベル付けする。
【００２３】
詳細な説明
植物中での脂肪酸合成に関与する1もしくは複数の遺伝子の発現の変調、ならびに標的化切断および変更に有用な組成物および方法を、本明細書中に開示する。そういった遺伝子の調整は、例えば改変ＺＦＰ転写因子を使用するか、または遺伝子調節領域を変更することによって変調できる。遺伝子は、例えば標的化切断と、それに続く染色体内の相同組換えによって、または標的化切断と、それに続く外因性ポリヌクレオチド（遺伝子ヌクレオチド配列と相同性を有する１若しくは複数の領域を含む）とゲノム配列の間の相同組換えによって変更できる。
【００２４】
ゲノム配列には、染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム（例えばミトコンドリア、色素体）、人工染色体、および細胞内に存在する任意のその他のタイプの核酸中に存在するもの、例えば増幅配列、二重微小染色体、ならびに内因性または感染性細菌およびウイルスのゲノムなどが含まれる。ゲノム配列は、正常（すなわち、野生型）または突然変異体であり得る；突然変異配列は、例えば挿入、欠失、転座、再編成および／または点突然変異を含み得る。ゲノム配列は、多数の異なる対立遺伝子のうちの１つも含み得る。
【００２５】
本明細書中に開示した組成物は、改変ジンクフィンガー結合ドメイン、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにＺＦＰおよびＺＦＰコードポリヌクレオチドの組合せからなる1もしくは複数のＺＦＰを含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、1もしくは複数のジンクフィンガー（例えば２、３、４、５、６、７、８、９またはそれより多くのジンクフィンガー）を含み得るし、脂肪酸生合成に関与する、遺伝子に作動的に連結された調節配列を含めて、遺伝子の任意のゲノム配列と結合するように改変され得る。
【００２６】
本明細書中に記載したようなＺＦＰは、遺伝子転写の活性化または抑制により、遺伝子発現を調節するために使用され得る。調節ドメインに連結されるジンクフィンガードメインの融合物を含むＺＦＰは、転写を活性化するかまたは抑制するキメラ転写因子を作製するように構築され得る。ＺＦＰは、ジンクフィンガードメインをヌクレアーゼ切断ドメイン（または切断半ドメイン）と連結して、ジンクフィンガーヌクレアーゼを生じることにより、着目のゲノム領域の標的化切断のためにも使用され得る。よって、遺伝子調節、切断または組換えが所望される着目の標的ゲノム領域を同定することにより、本明細書中に開示される方法に従って、そのゲノム領域中の遺伝子配列を認識するよう改変されたジンクフィンガードメインと連結される1もしくは複数の調節ドメインおよび／または切断ドメイン（または切断半ドメイン）を含む1もしくは複数の融合タンパク質を含むジンクフィンガータンパク質を構築し得る。細胞中の融合タンパク質（単数もしくは複数）を含むそういったＺＦＰの存在は、（単数もしくは複数の）融合タンパク質とその（それら）の（単数もしくは複数の）結合部位との結合、ならびにゲノム領域内またはゲノム領域付近での調節または切断の変更をもたらす。さらに、ゲノム領域が切断され、そのゲノム領域と相同である外因性ポリヌクレオチドも細胞中に存在する場合、相同組換えは、ゲノム領域と外因性ポリヌクレオチドとの間で高率で起こる。
【００２７】
図１に示されているとおり、脂肪酸生合成に関与するいくつかの遺伝子が存在する。よって、本明細書中に記載した組成物は、これだけに限定されるものではないが、（単数もしくは複数の）ＡＣＣａｓｅ、ＫＡＳ Ｉ、ＫＡＳ ＩＩ、ＫＡＳ ＩＩＩ、ＫＡＳ ＩＶ、ＦＡＴＢ１、ＦＡＴＢ２、ＦＡＴＢ３、ＦＡＴＢ４、ＦＡＴＢ５、ＦＡＳ、ＦＡＥ１、ＦａｔＡ、Ｆａｄ２、Ｆａｄ３、ＧＰＤＨ、ＧＫ、またはＳ−ＡＣＰ−ＤＥＳ遺伝子、ならびにこれらの遺伝子のオルソログ、パラログ、およびホメオログを含めた、植物細胞中のこれらの遺伝子の1もしくは複数を標的化し得る。例えば、脂肪酸生合成に関与する１、２、３、４、５またはそれより多くの遺伝子を、本明細書中に開示したタンパク質（例えばＺＦＰ）によって標的化できる。そのため、1もしくは複数のＺＦＰまたは異なる特異性のＺＦＰをコードする発現ベクターを、植物において着目の所望の遺伝子を標的化するために組合せることもできる。
【００２８】
概要
本明細書中に開示される方法の実行、ならびに本明細書中に開示される組成物の調製および使用は、別記しない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および解析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、ならびに当該技術分野の技術内であるような関連分野を用いる。これらの技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001；Ausubel et al.、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego；Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998；METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, “Chromatin” (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999；およびMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, “Chromatin Protocols” (P. B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999を参照のこと。
【００２９】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に用いられ、線状または環状立体配座での、ならびに一本鎖または二本鎖形態での、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語はポリマーの長さに関して限定するよう意図されるべきでない。本用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート主鎖）で修飾されるヌクレオチドを包含し得る。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有する；すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
【００３０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に用いられる。本用語は、1もしくは複数のアミノ酸が対応する天然アミノ酸の化学的類似物または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも当てはまる。
【００３１】
「結合」は、高分子物質間（例えば、タンパク質および核酸間）の配列特異的非共有的相互作用を指す。全体としての結合相互作用が配列特異的である限り、相互作用の構成成分すべてが配列特異的である（例えばＤＮＡ主鎖中のリン酸残基との接触）必要はない。このような相互作用は、一般的に、１０-6Ｍ-1またはそれより低い解離定数（Ｋd）により特徴づけられる。「親和性」は、結合の強度を指す：結合親和性増大は、低Ｋdと相関する。
【００３２】
「結合タンパク質」は、別の分子と非共有的に結合し得るタンパク質である。結合タンパク質は、例えばＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）と結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、それはそれ自体と結合し（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成し）得るし、および／またはそれは異なる単数または複数のタンパク質のうちの1もしくは複数の分子と結合し得る。結合タンパク質は、１つより多くの型の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
【００３３】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、その構造が亜鉛イオンの配位により安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である1もしくは複数のジンクフィンガーにより配列特異的方式でＤＮＡを結合するタンパク質、または大型タンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと短縮して表される。
【００３４】
ジンクフィンガー結合ドメインは、予定ヌクレオチド配列（例えば、脂肪酸生合成に関与する任意の遺伝子の中の標的配列）と結合するよう「改変」され得る。ジンクフィンガータンパク質を改変するための方法の非限定例は、設計および選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は、天然には生じないタンパク質であり、その設計／組成は、主に合理的判定基準に起因する。設計のための合理的判定基準としては、現存するＺＦＰ設計および結合データの情報を保存するデータベース中の情報を処理するための置換規則およびコンピュータアルゴリズムの適用が挙げられる。例えば米国特許第6,140,081号；第6,453,242号；第6,534,261号；および第6,785,613号を参照のこと；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536；およびWO 03/016496；ならびに米国特許第6,746,838号；第6,866,997号；および第7,030,215号も参照のこと。したがって、「改変」ジンクフィンガータンパク質または「非天然」ジンクフィンガータンパク質は、構成成分ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（認識らせん）のうちの1つまたは複数が天然ではなく、予備選択標的部位と結合するよう改変されているものである。
【００３５】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質は、その産生が主に経験的プロセス、例えばファージ表示、相互作用トラップまたはハイブリッド選択に起因する。例えば米国特許第5,789,538号；米国特許第5,925,523号；米国特許第6,007,988号；米国特許第6,013,453号；米国特許第6,200,759号；米国特許第6,733,970号；米国特許RE39,229号；ならびにWO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197およびWO 02/099084を参照のこと。
【００３６】
「配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る；線状、環状または分枝鎖であり得る、そして一本鎖または二本鎖であり得る任意の長さのヌクレオチド配列を指す。「ドナー配列」という用語は、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば２〜２５，０００ヌクレオチド長（またはその間のまたはそれ以上の任意の整数値）、好ましくは約１００〜５，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の整数）、さらに好ましくは約２００〜２，５００ヌクレオチド長を有し得る。
【００３７】
「相同配列」は、第二配列とある程度の配列同一性を共有する第一配列を指し、その配列は第二配列のものと同一である。「相同、非同一配列」は、第二配列とある程度の配列同一性を共有する第一配列を指すが、その配列は第二配列のものと同一ではない。例えば、突然変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、突然変異体遺伝子の配列と相同で且つ非同一である。特定の実施形態において、２つの配列間の相同性の程度は、正常細胞機序を利用することによって、その間の相同組換えを可能にするのに十分である。２つの相同、非同一配列は任意の長さであり、それらの非相同度は単一ヌクレオチドと同じくらい小さい（例えば、標的化相同組換えによるゲノム点突然変異の修正に関して）か、あるいは１０キロ塩基またはそれ以上の大きさ（例えば、染色体中の予定部位での遺伝子の挿入に関して）であり得る。相同非同一配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同一長である必要はない。例えば、２０〜１０，０００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド（すなわちドナーポリヌクレオチド）が用いられ得る。
【００３８】
核酸およびアミノ酸配列同一性を確定するための技法は、当該技術分野で既知である。典型的には、このような技法としては、遺伝子に関するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を確定すること、および／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を確定し、これらの配列を第二のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することが挙げられる。ゲノム配列も、このようにして確定され、比較され得る。概して、同一性は、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド−ヌクレオチドまたはアミノ酸−アミノ酸対応を指す。２またはそれより多い配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性％を確定することにより比較され得る。２つの配列の同一性％は、核酸配列であれ、アミノ酸配列であれ、２つの一列に並んだ配列間の正確な整合数を短い方の配列の長さで割って、１００を掛けた値である。核酸配列に関するおよそのアラインメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)の局所相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAにより開発され、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6): 6745-6763 (1986)により、正規化されたスコアマトリックスを用いることにより、アミノ酸配列に適用され得る。配列の同一性％を確定するためのこのアルゴリズムの例示的手段は、「BestFit」ユーティリティアプリケーションにおいてGenetics Computer Group (Madison, WI)により提供される。この方法に関するデフォルトパラメーターは、Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995)（Genetics Computer Group, Madison, WIから入手可能）に記載されている。本開示の状況で同一性％を確立する好ましい方法は、エジンバラ大学により著作権所有され、John F. Collins and Shane S. Sturrokにより開発され、IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)により配給されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを用いることである。この一続きのパッケージから、デフォルトパラメーターがスコア表に関して用いられる場合（例えば、ギャップ開始ペナルティ １２、ギャップ伸長ペナルティ １、およびギャップ ６）、Smith-Watermanアルゴリズムが用いられ得る。生成されたデータから、「整合」値は配列同一性を反映する。配列間の同一性または類似性の％を算定するためのその他の適切なプログラムは当該技術分野で一般的に知られており、例えば、別のアラインメントプログラムはＢＬＡＳＴであり、デフォルトパラメーターと共に用いられる。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを用いて使用され得る：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０配列；並べ替え＝高スコア順；データベース＝非冗長、GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB＋GenBank CDS翻訳＋スイス・タンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、インターネット上で見出され得る。本明細書中に記載される配列に関して、所望程度の配列同一性の範囲は、約３５％〜１００％、ならびにその間の任意の整数値である。典型的には、配列間の同一性％は、少なくとも３５％〜４０％；４０％〜４５％；４���％〜５０％；５０％〜６０％；６０％〜７０％；７０％〜７５％、好ましくは８０〜８２％、さらに好ましくは８５〜９０％、さらに好ましくは９２％、さらに好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。
【００３９】
代替的には、ポリヌクレオチド間の配列同一性の程度は、相同領域間の安定二重鎖の形成を可能にする条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイズ氏、その後、一本鎖特異的ヌクレアーゼ（単数または複数）で消化し、消化断片のサイズを確定することにより、確定され得る。２つの核酸または２つのポリペプチド配列は、上記の方法を用いて確定されるように、限定長の分子全体で配列が少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、さらに好ましくは８５％〜９０％、さらに好ましくは９２％、さらに好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を示す場合に、互いに実質的に相同である。本明細書中で用いる場合、実質的に相同とは、特定ＤＮＡまたはポリペプチド配列との完全同一性を示す配列も指す。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、その特定の系に関して限定されるように、例えば緊縮条件下で、サザンハイブリダイゼーション実験で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を限定することは、当該技術分野の技術の範囲内である（例えば、Sambrook et al.、上記；Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford；Washington, DC; IRL Press参照）。
【００４０】
２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、以下のように確定され得る。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を及ぼす。部分的に同一の核酸配列は、完全同一配列と標的分子とのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に抑制する。完全同一配列のハイブリダイゼーションの抑制は、当該技術分野でよく知られているハイブリダイゼーション検定（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーション等。Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.参照）を用いて査定され得る。このような検定は、種々の程度の選択性を用いて、例えば低緊縮から高緊縮まで変化する条件を用いて、実行され得る。低緊縮条件が用いられる場合、非特異的結合の非存在は、部分的配列同一性さえ欠く第二プローブ（例えば、標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を用いて査定され得るので、したがって、非特異的結合事象の非存在下では、第二プローブは標的とハイブリダイズしない。
【００４１】
ハイブリダイゼーションベースの検出系を利用する場合、参照核酸配列と相補的である核酸プローブが選択され、次に、適切な条件の選択により、プローブおよび参照配列は互いに選択的にハイブリダイズし、または結合して、二重鎖分子を形成する。中等度の緊縮ハイブリダイゼーション条件下で参照配列と選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、典型的には、選択核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。緊縮ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、選択核酸プローブの配列と約９０〜９５％より高い配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブおよび参照配列が特定程度の配列同一性を有するプローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で知られているように確定され得る（例えば、Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford；Washington, DC; IRL Press参照）。
【００４２】
ハイブリダイゼーションのための条件は、当業者によく知られている。ハイブリダイゼーション緊縮度は、ハイブリダイゼーション条件が、不整合ヌクレオチドを含有するハイブリダイズの形成を退ける程度を指す。ハイブリダイゼーションの緊縮度に影響を及ぼす因子は当業者によく知られており、例としては温度、ｐＨ、イオン強度および有機溶媒、例えばホルムアミドおよびジメチルスルホキシドの濃度が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に知られているように、ハイブリダイゼーション緊縮度は、温度が高いほど、イオン強度が低いほど、そして溶媒濃度が低いほど増大される。
【００４３】
ハイブリダイゼーションのための緊縮条件に関して、例えば以下の因子：配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩およびその他のハイブリダイゼーション溶液構成成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中の遮断剤（例えば、硫酸デキストリンおよびポリエチレングリコール）の存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメーター、ならびに種々の洗浄条件を変えることにより、特定緊縮度を確立するための多数の等価の条件が用いられ得る、ということが当該技術分野でよく知られている。特定組のハイブリダイゼーション条件の選択は、当該技術分野における標準方法に従って選択される（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.参照）。
【００４４】
「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換プロセスを指す。この開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば細胞における二本鎖切断の修復中に起きるこのような交換の特殊形態を指す。このプロセスは、ドナーから標的への遺伝情報の移動をもたらすため、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経たもの）の鋳型修復のための「ドナー」分子を用い、そして「非交差遺伝子変換」または「短い領域の遺伝子変換」として様々に知られている。任意の特定の理論に縛られることなく考えると、このような移動は、切断標的とドナーとの間に生じるヘテロ二重鎖ＤＮＡの不整合修正、および／または標的および／または関連プロセスの一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが用いられる「合成依存性鎖アニーリング」を包含し得る。このような特殊ＨＲは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチド中に組入れられるよう、標的分子の配列の変更を生じる。
【００４５】
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有的主鎖の破損を指す。切断は、種々の方法、例えばホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解（これらに限定されない）により開始され得る。一本鎖切断および二本鎖切断がともに可能であり、二本鎖切断は２つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端の生成を生じ得る。特定の実施形態において、融合ポリペプチドは標的化二本鎖ＤＮＡ切断のために用いられる。
【００４６】
「切断ドメイン」は、ＤＮＡ切断のための触媒的活性を保有する1もしくは複数のポリペプチド配列を含む。切断ドメインは、単一ポリペプチド鎖中に含入され得るし、あるいは切断活性は２つ（またはそれより多く）のポリペプチドの会合に起因し得る。
【００４７】
「切断半ドメイン」は、第二ポリペプチド（同一のまたは異なる）と協力して、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。
【００４８】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、およびタンパク質、例えばヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含む。真核生物細胞クロマチンの大部分はヌクレオソームの形態で存在し、この場合、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４のうちの各々２つを含む八量体と会合される約１５０塩基対のＤＮＡを含み；リンカーＤＮＡ（生物体によって可変性の長さを有する）はヌクレオソームコア間に伸びる。ヒストンＨ１の分子は、一般的に、リンカーＤＮＡと会合される。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、原核生物および真核生物の両方のすべての型の細胞核タンパク質を包含するよう意図される。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームクロマチンの両方を包含する。
【００４９】
「染色体」は、細胞のゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、細胞のゲノムを含む染色体すべての収集物であるその核型により特徴づけられる。細胞のゲノムは、1もしくは複数の染色体を含み得る。
【００５０】
「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部でない核酸を含む他の構造物である。エピソームの例としては、プラスミドおよびある種のウイルスゲノムが挙げられる。
【００５１】
「アクセス可能領域」は、核酸中に存在する標的部位が標的部位を認識する外因性分子により結合され得る細胞クロマチン中の部位である。任意の特定の理論に縛られずに考えると、アクセス可能領域は、ヌクレオソーム構造中に包まれないものである。アクセス可能領域の異なる構造はしばしば、化学的および酵素的プローブ、例えばヌクレアーゼに対するその感受性により検出され得る。
【００５２】
「標的部位」または「標的配列」は、結合分子が結合する核酸の一部を限定する核酸配列であるが、但し、結合のために十分な条件が存在する。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、Ｅｃｏ ＲＩ制限エンドヌクレアーゼのための標的部位である。
【００５３】
「外因性」分子は、細胞中に通常は存在しないが、しかし1もしくは複数の遺伝的、生化学的またはその他の方法により細胞中に導入され得る分子である。「細胞中の通常の存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して確定される。したがって、例えば筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成体筋肉細胞に関しては外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘導される分子は、非熱ショック細胞に関しては外因性分子である。外因性分子は、例えば機能性バージョンの機能不全内因性分子または機能不全バージョンの正常機能内因性分子を含み得る。
【００５４】
内因性分子は、特に、小分子（例えば、組合せ化学工程により生成される）、あるいは高分子、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記分子のうちの1つまたは複数を含む任意の複合体であり得る。核酸はＤＮＡおよびＲＮＡを包含し、一本鎖または二本鎖であり得るし；線状、分枝鎖または環状であり得るし；任意の長さを有し得る。核酸は、二重鎖を形成し得るもの、ならびに三重鎖形成核酸を包含する。例えば米国特許第5,176,996号および第5,422,251号を参照のこと。タンパク質としては、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構築因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼおよびヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
外因性分子は、内因性分子、例えば外因性タンパク質または核酸と同型の分子であり得る。例えば外因性核酸は、感染性ウイルスゲノム、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴ鎖、細胞中に導入されるプラスミドまたはエピソーム、細胞中に通常は存在しない染色体を含み得る。細胞中への外因性分子の導入のための方法は当業者に知られており、例としては、脂質媒介性運搬（すなわち、リポソーム、例えば中性および陽イオン性脂質）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、粒子衝突、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性運搬およびウイルスベクター媒介性運搬が挙げられるが、これらに限定されない。外因性分子は、非植物分子、例えば哺乳類（例えば、ヒトまたはヒト化）抗体であり得る。
【００５６】
それに比して、「内因性」分子は、特定環境条件下の特定発生段階で特定細胞中に普通に存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体またはその他の細胞小器官のゲノム、あるいは天然エピソーム核酸を含み得る。付加的内因性分子としては、タンパク質、例えば転写因子および酵素が挙げられる。
【００５７】
「融合」分子は、２つまたはそれより多くの分子が、好ましくは共有的に連結される分子である。サブユニット分子は、同一化学型の分子であるか、または異なる化学型の分子であり得る。第一の型の融合分子の例としては、融合タンパク質（例えばＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合を含むＺＦＮ）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第二の型の融合分子の例としては、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、ならびに副溝結合物質および核酸間の融合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
細胞中の融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達により生じ得るが、この場合、ポリヌクレオチドは転写され、転写物は翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランス−スプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチド結紮も、細胞中のタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示の別の箇所に示されている。
【００５９】
本開示の目的のための「遺伝子」としては、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記参照）、ならびに遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域（このような調節配列がコードおよび／または転写配列に隣接するか否かにかかわらず）が挙げられる。したがって、遺伝子としては、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界素子、複製開始点、マトリックス結合部位および遺伝子座制御領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
「遺伝子発現」は、遺伝子中に含入される情報の遺伝子産物中への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、構造ＲＮＡまたは任意のその他の型のＲＮＡ）、あるいはｍＲＮＡの翻訳により産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物としては、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集のようなプロセスにより修飾されるＲＮＡ、ならびに例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化により修飾されるタンパク質も挙げられる。
【００６１】
遺伝子発現の「変調(Modulation)」は、遺伝子の活性における変化を指す。発現の変調としては、遺伝子活性化および遺伝子抑制が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
「植物」細胞としては、単子葉（単子葉類）または双子葉（双子葉類）植物の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。単子葉類の非限定例としては、穀類植物、例えばトウモロコシ、コメ、オオムギ、オートムギ、コムギ、モロコシ、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、タマネギ、バナナおよびココナツが挙げられる。双子葉類の非限定例としては、タバコ、トマト、ヒマワリ、ワタ、テンサイ、ジャガイモ、レタス、メロン、ダイズ、キャノーラ（ナタネ）およびアルファルファが挙げられる。植物細胞は、植物の任意の部分から、および／または植物発生の任意の段階からであり得る。そのため、植物細胞は、植物の種子からの細胞であり得る。いくつかの実施形態において、植物または植物細胞は、食用および／または工業使用のための植物油の製造に関与する植物（すなわち、「採油植物」）であるか、またはそれらに由来する。代表的な採油植物には、これだけに限定されるものではないが、アブラナ属（例えば、キャノーラ栽培品種を含めたセイヨウアブラナ（Brassica napus））、トウモロコシ、ダイズ、ハマナ、マスタード、トウゴマの実、ラッカセイ、ゴマ、ワタ、アマニ、ベニバナ、油ヤシ、アサ、ヒマワリ、およびココナッツが含まれる。
【００６３】
「当該（着目）領域」は、細胞クロマチンの任意の領域、例えば外因性分子を結合することが望ましい遺伝子、あるいは遺伝子内のまたは遺伝子に隣接する非コード配列である。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えの目的のためであり得る。当該領域は、染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム（例えばミトコンドリア、葉緑体）または感染性ウイルスゲノム中に存在し得る。当該領域は、遺伝子のコード領域、転写非コード領域、例えばリーダー配列、トレーラー配列またはイントロン内、あるいはコード領域の上流または下流の非転写領域内であり得る。当該領域は、単一ヌクレオチド対と同じくらい小さいか、または２５，０００ヌクレオチド対長まで、あるいは任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。
【００６４】
「作動性連結」および「作動的に連結される」（または「作動可能に連結される」）という用語は、２つまたはそれより多くの構成成分（例えば配列素子）の並置に関して互換的に用いられ、この場合、構成成分は、両方の構成成分が正常に機能し、そして構成成分のうちの少なくとも１つが他の構成成分のうちの少なくとも１つで発揮される機能を媒介し得る実現性を可能にするよう、整列される。例証として、転写調節配列、例えばプロモーターは、転写調節配列が1もしくは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答して、コード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列と作動的に連結される。転写調節配列は、一般的に、コード配列とシスで作動的に連結されるが、しかしそれと直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが連続していなくても、コード配列と作動的に連結される転写調節配列である。
【００６５】
融合ポリペプチドに関して、「作動的に連結される」という用語は、構成成分の各々が、他の構成成分との連結に際して、それがそのように連結されていない場合と同一の機能を実施する、という事実を指す。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが調節ドメインと融合される融合ポリペプチドに関して、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインおよび調節ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位を結合し得るが、一方、調節ドメインが標的部位の近くでＤＮＡの発現を調節し得る場合、作動的連結状態である。
【００６６】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一でないが、依然として全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一の機能を保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応するネイティブ分子より多いか、少ないかまたは同一の数の残基を保有し得るし、および／または1もしくは複数のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含有し得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸とハイブリダイズする能力）を確定するための方法は、当該技術分野でよく知られている。同様に、タンパク質機能を確定するための方法はよく知られている。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えばフィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降検定により確定され得る。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動により検定され得る（上記のAusubel et al.参照）。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば共免疫沈降、２−ハイブリッド検定または相補性（遺伝的および生化学的の両方）により確定され得る。例えば、Fields et al. (1989) Nature 340: 245-246；米国特許第5,585,245号およびＰＣＴ WO 98/44350を参照のこと。
【００６７】
本明細書中で使用されるとき、「飽和脂肪酸」には、これだけに限定されるものではないが、ラウリン酸（Ｃ１２：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）およびステアリン酸（Ｃ１８：０）が含まれる。同様に、「一価不飽和脂肪酸」および「多価不飽和脂肪酸」には、これだけに限定されるものではないが、Ｃ１８脂肪酸、例えば、オレイン酸（Ｃ１８：１）、還元リノレン酸（Ｃ１８：２）および還元リノレン酸（Ｃ１８：３）が含まれる。
【００６８】
標的部位
開示される方法および組成物は、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）および調節ドメインまたは切断（ヌクレアーゼ）ドメイン（または切断半ドメイン）を含む融合タンパク質を包含し、この場合、ＤＮＡ結合ドメイン（ジンクフィンガードメイン）は、脂肪酸合成に関与する遺伝子内の細胞クロマチン中の配列と結合することにより、転写調節ドメインまたは切断ドメイン（または切断半ドメイン）の活性を配列の付近に向けて、それゆえ、標的配列の近くで転写を変調するかまたは切断を誘導する。
【００６９】
この開示の他の箇所に記述されているように、ジンクフィンガードメインは、事実上任意の所望の配列と結合するよう改変され得る。したがって、遺伝子調節、切断または組換えが所望される配列を含有する当該領域を同定後、1もしくは複数のジンクフィンガー結合ドメインは、改変されて、当該領域中の1もしくは複数の配列と結合し得る。
【００７０】
ジンクフィンガードメインによる結合のための、脂肪酸合成に関与する任意の遺伝子（図１を参照のこと）の細胞クロマチン中の着目のゲノム領域内の標的部位の選択は、例えば共有米国特許第6,453,242号（2002年9月17日）（これは、選択配列と結合するようＺＦＰを設計するための方法も開示する）に開示された方法に従って成し遂げられ得る。標的部位の選択のためにヌクレオチド配列の簡易視覚検査も用いられ得るということは、当業者に明らかである。したがって、標的部位選択の任意の手段が、特許請求される方法に用いられ得る。
【００７１】
特定の実施形態において、本明細書中に記載したＺＦＰは、ＡＣＣａｓｅ、ＫＡＳ Ｉ、ＫＡＳ ＩＩ、ＫＡＳ ＩＩＩ、ＫＡＳ ＩＶ、ＦＡＴＢ１、ＦＡＴＢ２、ＦＡＴＢ３、ＦＡＴＢ４、ＦＡＴＢ５、ＦＡＳ、ＦＡＥ１、ＦａｔＡ、Ｆａｄ２、Ｆａｄ３、ＧＰＤＨ、ＧＫ、および／またはＳ−ＡＣＰ−ＤＥＳをコードする遺伝子内の標的部位に結合する。
【００７２】
標的部位は、一般的に、複数の隣接標的サブサイトで構成される。標的サブサイトは、個々のジンクフィンガーにより結合される配列（通常は、隣接四つ組と１つのヌクレオチドにより重複し得るヌクレオチド三つ組またはヌクレオチド四つ組）を指す（例えばWO 02/077227参照）。ジンクフィンガータンパク質が最も多く接触する鎖が標的鎖「第一認識鎖」または「第一接触鎖」と呼ばれる場合、いくつかのジンクフィンガータンパク質は標的鎖中の３塩基三つ組ならびに非標的鎖上の第四の塩基と結合する。標的部位は、一般的に、少なくとも９ヌクレオチドの長さを有し、したがって、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインにより結合される。しかしながら、例えば、４-フィンガー結合ドメインの１２−ヌクレオチド標的部位との、５−フィンガー結合ドメインの１５−ヌクレオチド標的部位との、または６−フィンガー結合ドメインの１８−ヌクレオチド標的部位との結合も可能である。明らかになるように、より大きい結合ドメイン（例えば、７−、８−、９−フィンガーおよびそれ以上）のより長い標的部位との結合も可能である。
【００７３】
標的部位が３つのヌクレオチドの倍数である必要はない。例えば、交差鎖相互作用が起きる場合（例えば米国特許第6,453,242号およびWO 02/077227参照）、多フィンガー結合ドメインの個々のジンクフィンガーのうちの1つまたは複数が重複四つ組みサブサイトと結合し得る。その結果、３−フィンガータンパク質は１０−ヌクレオチド配列を結合し得るが、この場合、第１０ヌクレオチドは末端フィンガーにより結合される四つ組の一部であり、４-フィンガータンパク質は１３−ヌクレオチド配列と結合し得るが、この場合、第１３ヌクレオチドは末端フィンガーにより結合される四つ組の一部である、ということである。
【００７４】
多フィンガー結合ドメイン中の個々のジンクフィンガー間のアミノ酸リンカー配列の長さおよび性質も、標的配列との結合に影響を及ぼす。例えば、多フィンガー結合ドメイン中の隣接ジンクフィンガー間のいわゆる「非正準リンカー」、「ロングリンカー」または「構造化リンカー」の存在は、それらのフィンガーに、直接隣接しないサブサイトを結合させ得る。このようなリンカーの非限定例は、例えば米国特許第6,479,626号およびWO 01/53480に記載されている。したがって、ジンクフィンガー結合ドメインに関する標的部位中の1もしくは複数のサブサイトは、１、２、３、４、５またはそれより多くのヌクレオチドにより互いから分離され得る。一例を挙げると、４-フィンガー結合ドメインは、配列中に、２連続３−ヌクレオチドサブサイト、１つの介在ヌクレオチドおよび２連続三つ組サブサイトを含む１３−ヌクレオチド標的部位と結合し得る。異なる数のヌクレオチドにより分離される標的部位と結合するよう人工ヌクレアーゼを連結するための組成物および方法に関しては、米国特許出願61/130,099号も参照のこと。配列（例えば、標的部位）間の距離は、互いに最も近い配列の縁から測定した場合の、２つの配列間に介在するヌクレオチドまたはヌクレオチド対の数を指す。
【００７５】
特定の実施形態において、転写因子機能を有するＺＦＰが意図される。転写因子機能に関しては、簡単な結合とプロモーターに十分に近いということが、一般的に必要とされることのすべてである。プロモーター、配向、ならびにその範囲内での距離に関しての正確な位置決めは、重大事というわけではない。この特徴は、人工転写因子を構築するための標的部位を選択するに際してかなりの柔軟性を可能にする。したがって、ＺＦＰにより認識される標的部位は、任意に調節ドメインに連結されるＺＦＰによる遺伝子発現の活性化または抑制を可能にする標的遺伝子中の任意の適切な部位であり得る。好ましい標的部位としては、転写開始部位に隣接する領域、転写開始部位の下流の領域または上流の領域が挙げられる。さらに、エンハンサー領域に位置する標的部位、レプレッサー部位、ＲＮＡポリメラーゼ休止部位、ならびに特異的調節部位（例えば、ＳＰ−１部位、低酸素状態応答素子、核内受容体認識素子、ｐ５３結合部位）、ｃＤＮＡコード領域におけるまたは発現配列タグ（ＥＳＴ）コード領域における部位。
【００７６】
他の実施形態において、細胞中での、ヌクレアーゼ活性を有するＺＦＰが意図される。ジンクフィンガー結合ドメインおよび切断ドメインを含む融合タンパク質を含む（または各々がジンクフィンガー結合ドメインおよび切断半ドメインを含む２つの融合タンパク質の）ＺＦＮの発現は、標的配列に近接して切断を実行する。特定の実施形態において、切断は、２つのジンクフィンガードメイン／切断半ドメイン融合分子の、別個の標的部位との結合に依っている。２つの標的部位は、反対ＤＮＡ鎖上にあるか、代替的には、両方の標的部位が同一ＤＮＡ鎖上に存在し得る。
【００７７】
ＤＮＡ結合ドメイン
任意のＤＮＡ結合ドメインを本発明の実施に使用できる。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、1もしくは複数のジンクフィンガーのジンクフィンガー結合ドメインを含む（Miller et al. (1985) EMBO J. 4: 1609-1614；Rhodes (1993) Scientific American Feb.:56-65；米国特許第6,453,242号）。典型的には、単一ジンクフィンガードメインは、約３０アミノ酸長である。各ジンクフィンガードメイン（モチーフ）は、２つのβシート（２つの不変システイン残基を含有するβターン中に保持される）およびαらせん（２つの不変ヒスチジン残基を含有する）を含有し、これらは、２つのシステインおよび２つのヒスチジンにより亜鉛原子の配位により特定立体配座で保持される、ということを、構造試験は実証した。
【００７８】
ジンクフィンガーは、正準Ｃ2Ｈ2ジンクフィンガー（すなわち、亜鉛イオンが２つのシステインおよび２つのヒスチジン残基により配位結合されるもの）ならびに非正準ジンクフィンガー、例えばＣ3ＨおよびＣ2ＨＣジンクフィンガー（亜鉛イオンが３つのシステイン残基および１つのヒスチジン残基により配位結合されるもの、例えば米国特許公開番号第2008/0182332号を参照のこと）およびＣ4ジンクフィンガー（亜鉛イオンが４つのシステイン残基により配位結合されるもの）の両方を包含する。WO 02/057293も参照のこと。
【００７９】
ジンクフィンガー結合ドメインは、えり抜きの配列と結合するよう改変され得る。例えば、Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141；Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70: 313-340；Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660；Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 632-637；Choo et al. (2002) Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 411-416を参照のこと。改変（または非天然）ジンクフィンガー結合ドメインは、天然ジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。改変方法としては、合理的設計および種々の型の選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的設計としては、例えば三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用（この場合、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列を結合するジンクフィンガーの1もしくは複数のアミノ酸配列と会合される）が挙げられる。例えば共有米国特許第6,453,242号および第6,534,261号参照。付加的設計方法は、例えば米国特許第6,746,838号；第6,785,613号；第6,866,997号および第7,030,215号に開示されている。
【００８０】
例示的選択方法、例えばファージ表示および２−ハイブリッド系は、米国特許第5,789,538号；第5,925,523号；第6,007,988号；第6,013,453号；第6,410,248号；第6,140,466号；第6,200,759号；および第6,242,568号；ならびにWO 98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197およびGB 2,338,237に開示されている。
【００８１】
ジンクフィンガー結合ドメインに関する結合特異性の増強は、例えば共有米国特許第6,794,136号に記載されている。
【００８２】
個々のジンクフィンガーは３−ヌクレオチド（すなわち三つ組）配列（または一ヌクレオチドにより、隣接ジンクフィンガーの４−ヌクレオチド結合部位と重複し得る４−ヌクレオチド配列）と結合するため、ジンクフィンガー結合ドメインが改変されて結合する配列（例えば、標的配列）の長さは、改変ジンクフィンガー結合ドメイン中のジンクフィンガーの数を確定する。例えば、フィンガーモチーフが重複サブサイトと結合しないＺＦＰに関して、６−ヌクレオチド標的配列は、２−フィンガー結合ドメインにより結合される；９−ヌクレオチド標的配列は、３−フィンガー結合ドメインにより結合される等である。本明細書中で特に言及されるように、標的部位における個々のジンクフィンガーに関する結合部位（すなわち、サブサイト）は連続している必要はないが、しかし、多フィンガー結合ドメイン中のジンクフィンガー間のアミノ酸配列（すなわち、フィンガー間リンカー）の長さおよび性質によって、１つまたはいくつかのヌクレオチドにより分離され得る。
【００８３】
多フィンガージンクフィンガー結合ドメインでは、隣接ジンクフィンガーは約５アミノ酸のアミノ酸リンカー配列（いわゆる「正準」フィンガー間リンカー）により、代替的には、1もしくは複数の非正準リンカーにより、分離され得る（例えば米国特許第6,453,242号および第6,534,261号参照）。３つより多くのフィンガーを含む改変ジンクフィンガー結合ドメインに関して、ジンクフィンガーのうちのいくつかの間のより長い（「非正準」）フィンガー間リンカーの挿入は、それが結合ドメインによる結合の親和性および／または特異性を増大し得る場合、選択され得る（例えば米国特許第6,479,626号およびWO 01/53480参照）。したがって、多フィンガージンクフィンガー結合ドメインは、非正準フィンガー間リンカーの存在および位置に関しても特徴づけられ得る。例えば、３つのフィンガー（２つの正準フィンガー間リンカーにより連結される）、長いリンカーおよび３つの付加的フィンガー（２つの正準フィンガー間リンカーにより連結される）を含む６−フィンガージンクフィンガー結合ドメインは、２×３立体配置で示される。同様に、２つのフィンガー（その間に正準リンカーを有する）、長いリンカーおよび２つの付加的フィンガー（正準リンカーにより連結される）を含む結合ドメインは、２×２立体配置で示される。３つの２−フィンガー単位（その各々において、２つのフィンガーは正準リンカーにより連結される）を含むタンパク質（この場合、各２−フィンガー単位は長いリンカーにより隣接する２つのフィンガーに連結される）は、３×２タンパク質として言及される。
【００８４】
多フィンガー結合ドメイン中の２つの隣接ジンクフィンガー間の長いまたは非正準リンカー−フィンガーリンカーは、しばしば、２つのフィンガーを、標的配列中では密着して連続しないサブサイトと結合させる。したがって、標的部位中のサブサイト間に1もしくは複数のヌクレオチドのギャップが存在し得る；すなわち、標的部位は、ジンクフィンガーにより接触されない1もしくは複数のヌクレオチドを含有し得る。例えば２×２ジンクフィンガー結合ドメインは、１つのヌクレオチドにより分離される２つの６−ヌクレオチド配列と結合し得る；すなわち、それは１３−ヌクレオチド標的部位と結合する。Moore et al. (2001a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1432-1436；Moore et al. (2001b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1437-1441およびWO 01/53480も参照のこと。
【００８５】
前記のように、標的サブサイトは、単一ジンクフィンガーにより結合される３−または４-ヌクレオチド配列である。ある目的のために、２−フィンガー単位は結合モジュールで示される。結合モジュールは、例えば特定の６−ヌクレオチド標的配列を結合する多フィンガータンパク質（一般的には３つのフィンガー）の状況で２つの隣接フィンガーに関して選択することにより得られる。代替的には、モジュールは、個々のジンクフィンガーの集合により構築され得る（WO 98/53057およびWO 01/53480も参照）。
【００８６】
一実施形態において、表１に示されるようなアミノ酸配列を含むジンクフィンガー結合ドメインが本明細書中で記載される。別の実施形態において、本開示は、ジンクフィンガー結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを提供し、この場合、ジンクフィンガー結合ドメインは表１に示されるようなアミノ酸配列を含む。
【００８７】
あるいは、DNA結合ドメインは、ヌクレアーゼから得ることもできる。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が知られている。米国特許第5,420,032号；米国特許第6,833,252号；Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353、ならびにNew England Biolabsカタログを参照のこと。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのDNA結合特異性を、非天然の標的部位に結合するように人工的に改変することができる。例えば、Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; 米国特許公開番号第20070117128号を参照のこと。
【００８８】
他の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、天然のまたは改変（非天然）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。キサントモナス属の植物病原細菌が、作物植物の多くの重大な病気を引き起こすことが知られている。キサントモナスの病原性は、植物細胞内に２５種類を超える様々なエフェクタータンパク質を注入する保存的ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）システムに依存する。中でも、これらの注入されたタンパク質は、植物転写活性化因子をまねて、植物トランスクリプトームを操る転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター（Kay et al (2007) Science 318:648-651を参照のこと）である。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインを含んでいる。最もよく特徴づけされているＴＡＬエフェクターの１つは、キサントモナス・カムペストリス属ベスカトリア（Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria）からのＡｖｒＢｓ３である（Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136およびWO2010079430を参照のこと）。ＴＡＬエフェクターは、それぞれの反復が約３４個のアミノ酸を含む縦列反復の核となるドメインを含んでいるが、それはこれらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の要である。加えて、それらは、核局在化配列と酸性転写活性化ドメインを含んでいる（総説のために、Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272を参照のこと）。加えて、植物病原性菌ラルストニア・ソラナセアルム（Ralstonia solanacearum）において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と称する２つの遺伝子が、Ｒ．ソラナセアルム次亜種１株ＧＭＩ１０００および次亜種４株ＲＳ１０００において、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが分かった（Heuer et al (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384を参照のこと）。これらの遺伝子は、互いにヌクレオチド配列が９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメイン内の１，５７５ｂｐの欠失によって異なる。しかしながら、両遺伝子産物は、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性しかない。
【００８９】
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、縦列反復中に見られる配列に依存する。反復配列には約１０２ｂｐが含まれ、そしてその反復は通常、互いに９１〜１００％相同である（Bonas et al、同書中）。反復の多型性は通常、１２位および１３位に位置し、それらは１２位および１３位における超可変性残基の同一性と、ＴＡＬエフェクターの標的配列中の隣接ヌクレオチドの同一性の間の一対一対応にあると思われる（Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501 and Boch et al (2009) Science 326:1509-1512を参照のこと）。実験的に、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然のコードは、１２位および１３位におけるＨＤ配列は、シトシン（Ｃ）への結合につながり、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、かつ、ＩＮＧがＴに結合するように決定した。これらのＤＮＡ結合反復は、新しい配列と相互作用できる人工転写因子を作製し、そして植物細胞内で非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化するように、反復の新しい組合わと数を用いてタンパク質へと構築された（Boch et al.、同書中）。改変ＴＡＬタンパク質は、酵母レポーターアッセイにおいて活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合（ＴＡＬＥＮ）を得るために、ＦｏｋＩ切断半ドメインに連結された（プラスミド・ベースの標的）。Christian et al.（(2010) Genetics epub 10.1534/genetics.l 10.120717）。
【００９０】
調節ドメイン
本明細書中に記載されるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）は、任意に、遺伝子発現の変調のために調節ドメインと会合され得る。ＺＦＰは、1もしくは複数の調節ドメイン、代替的には２つまたはそれより多くの調節ドメインと、共有的にまたは非共有的に会合され得るし、２つまたはそれより多くのドメインは、同一ドメインの２つのコピー、または２つの異なるドメインである。調節ドメインは、ＺＦＰと共有的に、例えば、融合タンパク質の一部としてアミノ酸リンカーを介して、連結され得る。ＺＦＰは、非共有的二量体化ドメイン、例えばロイシン／ジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメインまたはＦＫ５０６結合タンパク質を介しても、調節ドメインと会合され得る（例えば、O’Shea, Science 254: 539 (1991), Barahmand-Pour et al, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211: 121-128 (1996)；Klemm et al., Annu. Rev. Immunol. 16: 569-592 (1998)；Klemm et al., Annu. Rev. Immunol. 16: 569-592 (1998)；Ho et al., Nature 382: 822-826 (1996)；およびPomeranz et al., Biochem. 37: 965 (1998)参照）。調節ドメインは、任意の適切な位置で、例えばＺＦＰのＣ−またはＮ−末端で、ＺＦＰと会合され得る。
【００９１】
ＺＦＰへの付加のための一般的調節ドメインとしては、例えば転写因子（活性化因子、制御因子、活性化補助因子、制御補助因子）、サイレンサー、核ホルモン受容体、癌遺伝子転写因子（例えばmyc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリー成員等）；ＤＮＡ修復酵素ならびにそれらの会合因子および修飾因子；ＤＮＡ再編成酵素ならびにそれらの会合因子および修飾因子；クロマチン会合タンパク質およびそれらの修飾因子（例えばキナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）；そしてＤＮＡ修飾酵素（例えばメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにそれらの会合因子および修飾因子からのエフェクタードメインが挙げられる。
【００９２】
調節ドメインを得ることが出来る転写因子ポリペプチドとしては、調節および基本転写に関与するものが挙げられる。このようなポリペプチドとしては、転写因子、それらのエフェクタードメイン、活性化補助因子、サイレンサー、核ホルモン受容体が挙げられる（例えば、転写に関与するタンパク質および核酸素子の検討に関しては、Goodrich et al., Cell 84: 825-30 (1996)を参照；転写因子は、概して、Barnes & Adcock, Clin. Exp. Allergy 25 Suppl. 2: 46-9 (1995)およびRoeder, Methods Enzymol. 273: 165-71 (1996)で検討されている）。核ホルモン受容体転写因子は、例えばRosen et al., J Med. Chem. 38: 4855-74 (1995)に記載されている。転写因子のＣ／ＥＢＰファミリーは、Wedel et al., Immunobiology 193: 171-85 (1995)で検討されている。核ホルモン受容体により転写調節を媒介する活性化補助因子および制御補助因子は、例えばMeier, Eur. J Endocrinol. 134(2): 158-9 (1996)；Kaiser et al., Trends Biochem. Sci. 21: 342-5 (1996)；およびUtley et al., Nature 394:498-502 (1998)で検討されている。造血の調節に関与するＧＡＴＡ転写因子は、例えばSimon, Nat. Genet. 11: 9-11 (1995)；Weiss et al., Exp. Hematol. 23: 99-107に記載されている。ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）およびその会合ＴＡＰポリペプチド（ＴＡＦ３０、ＴＡＦ５５、ＴＡＦ８０、ＴＡＦ１０、ＴＡＦＩ５０およびＴＡＦ２５０を包含する）は、Goodrich & Tjian, Curr. Opin. Cell Biol. 6: 403-9 (1994)およびHurley, Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 69-75 (1996)に記載されている。転写因子のＳＴＡＴファミリーは、例えばBarahmand-Pour et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211: 121-8 (1996)で検討されている。疾患に関与する転写因子は、Aso et al., J Clin. Invest. 97: 1561-9 (1996)で検討されている。
【００９３】
一実施形態において、ヒトＫＯＸ−１タンパク質からのＫＲＡＢ抑制ドメインは、転写レプレッサーとして用いられる（Thiesen et al., New Biologist 2: 363-374 (1990)；Margolin et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 4509-4513 (1994)；Pengue et al., Nucl. Acids Res.22: 2908-2914 (1994)；Witzgall et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 4514-4518 (1994)）。別の実施形態において、ＫＡＰ−１（ＫＲＡＢ制御補助因子）は、ＫＲＡＢとともに用いられる（Friedman et al., Genes Dev. 10: 2067-2078 (1996)）、代替的には、ＫＡＰ−１はＺＦＰとだけで、用いられ得る。転写レプレッサーとして作用する他の好ましい転写因子および転写因子ドメインとしては、ＭＡＤ（例えばSommer et al., J. Biol. Chem. 273: 6632-6642 (1998)；Gupta et al., Oncogene 16: 1149-1159 (1998)；Queva et al., Oncogene 16: 967-977 (1998)；Larsson et al., Oncogene 15: 737-748 (1997)；Laherty et al., Cell 89: 349-356 (1997)；およびCultraro et al., Mol Cell. Biol.17: 2353-2359 (19977)参照）；ＦＫＨＲ（横紋筋肉腫遺伝子におけるフォークヘッド；Ginsberg et al., Cancer Res. 15: 3542-3546 (1998)；Epstein et al., Mol. Cell. Biol. 18: 4118-4130 (1998)）；ＥＧＲ−１（初期増殖応答遺伝子産物−１；Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 8298-8303 (1998)；およびLiu et al., Cancer Gene Ther. 5: 3-28 (1998)）；ｅｔｓ２レプレッサー因子レプレッサードメイン（ＥＲＤ；Sgouras et al., EMBO J 14: 4781-4793 (19095)）；ＭＡＤｓｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ；Ayer et al., Mol. Cell. Biol. 16: 5772-5781 (1996)）；ならびにＥＲＦ３（エチレン応答因子−３）両親媒性抑制ドメイン、ＥＡＲ（Ohta, M., et al (2001), Plant Cell 13:1959-1968）が挙げられる。
【００９４】
一実施形態において、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメインは、転写活性因子として用いられる（例えばHagmann et al., J. Virol. 71: 5952-5962 (1997)参照）。活性化ドメインを供給し得る他の好ましい転写因子としては、ＶＰ６４活性化ドメイン（Seipel et al., EMBO J. 11: 4961-4968 (1996)）；核ホルモン受容体（例えばTorchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10: 373-383 (1998)参照）；核因子κＢのｐ６５サブユニット（Bitko & Barik, J. Virol. 72: 5610-5618 (1998)およびDoyle & Hunt, Neuroreport 8: 2937-2942 (1997)）；ＥＧＲ−１（初期増殖応答遺伝子産物−１；Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 8298-8303 (1998)；およびLiu et al., Cancer Gene Ther. 5: 3-28 (1998)）；ならびにトウモロコシ・アントシアニン生合成経路調節タンパク質、Ｃ１（S.A. Goff, et al., (1991), Genetics and Development 5:298-309）が挙げられる。
【００９５】
キナーゼ、ホスファターゼおよび遺伝子調節に関与するポリペプチドを修飾するその他のタンパク質も、ＺＦＰに関する調節ドメインとして有用である。このような修飾因子は、しばしば、例えばホルモンにより媒介される転写のスイッチオンまたはオフに関与する。転写調節に関与するキナーゼは、Davis, Mol. Reprod. Dev. 42: 459-67 (1995)、Jackson et al., Adv. Second Messenger Phosphoprotein Res. 28: 279-86 (1993)およびBoulikas, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 5: 1-77 (1995)で検討されているが、一方、ホスファターゼは、例えばSchonthal and Semin, Cancer Biol. 6: 239-48 (1995)で検討されている。核チロシンキナーゼは、Wang, Trends Biochem. Sci. 19: 373-6 (1994)に記載されている。
【００９６】
記載されたように、有用なドメインは、癌遺伝子（例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリー成員）の遺伝子産物ならびにそれらの会合因子および修飾因子からも得られる。癌遺伝子は、例えばCooper, Oncogenes, 2nd ed., The Jones and Bartlett Series in Biology, Boston, Mass., Jones and Bartlett Publishers, 1995に記載されている。ｅｔｓ転写因子は、Waslylk et al., Eur. J. Biochem. 211: 7-18 (1993)およびCrepieux et al., Crit. Rev. Oncog. 5: 615-38 (1994)で検討されている。ｍｙｃ癌遺伝子は、例えばRyan et al., Biochem. J. 314: 713-21 (1996)で検討されている。ｊｕｎおよびｆｏｓ転写因子は、例えばThe Fos and Jun Families of Transcription Factors, Angel and Herrlich, eds. (1994)に記載されている。ｍａｘ癌遺伝子は、Hurlin et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 59: 109-16で検討されている。ｍｙｂ遺伝子ファミリーは、Kanei-Ishii et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211: 89-98 (1996)で検討されている。ｍｏｓファミリーは、Yew et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 19-25 (1993)で検討されている。
【００９７】
ＺＦＰは、ＤＮＡ修復酵素およびそれらの会合因子および修飾因子から得られる調節ドメインを包含し得る。ＤＮＡ修復系は、例えばVos, Curr. Opin. Cell Biol. 4: 385-95 (1992)；Sancar, Ann. Rev. Genet. 29: 69-105 (1995)；Lehmann, Genet. Eng. 17: 1-19 (1995)；およびWood, Ann. Rev. Biochem. 65: 135-67 (1996)で検討されている。ＤＮＡ再編成酵素ならびにそれらの会合因子および修飾因子も、調節ドメインとして用いられ得る（例えばGangloff et al., Experientia 50: 261-9 (1994)；Sadowski, FASEB J. 7: 760-7 (1993)参照）。
【００９８】
同様に、調節ドメインは、ＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ）ならびにそれらの会合因子および修飾因子に由来し得る。ヘリカーゼは、Matson et al., Bioessays, 16: 13-22 (1994)で検討されており、メチルトランスフェラーゼは、Cheng, Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 4-10 (1995)に記載されている。クロマチン会合タンパク質およびそれらの修飾因子（例えばキナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）、例えばヒストンデアセチラーゼ（Wolffe, Science 272: 371-2 (1996)）も、選ばれたＺＦＰへの付加のためのドメインとして有用である。好ましい一実施形態において、調節ドメインは、転写レプレッサーとして作用するＤＮＡメチルトランスフェラーゼである（例えばVan den Wyngaert et al., FEBS Lett. 426: 283-289 (1998)；Flynn et al., J. Mol. Biol. 279: 101-116 (1998)；Okano et al., Nucleic Acids Res. 26: 2536-2540 (1998)；およびZardo and Caiafa, J. Biol. Chem. 273: 16517-16520 (1998)参照）。別の好ましい実施形態において、エンドヌクレアーゼ、例えばＦｏｋ１は、遺伝子切断により作用する転写レプレッサーとして用いられ得る（例えばWO95/09233；およびPCT/US94/01201参照）。
【００９９】
クロマチンおよびＤＮＡの構造、動きおよび局在化を制御する因子、ならびにそれらの会合因子および修飾因子；微生物（例えば原核生物、真核生物およびウイルス）由来の因子ならびにそれらと会合するかまたはそれらを修飾する因子も、キメラタンパク質を得るために用いられ得る。一実施形態において、リコンビナーゼおよびインテグラーゼが調節ドメインとして用いられる。一実施形態において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは転写活性因子として用いられる（例えばJin and Scotto, Mol. Cell. Biol. 18: 4377-4384 (1998)；Wolffe, Science 272: 371-372 (1996)；Taunton et al., Science 272: 408-411 (1996)；およびHassig et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 3519-3524 (1998)参照）。別の実施形態において、ヒストンデアセチラーゼは転写レプレッサーとして用いられる（例えばJin and Scotto, Mol. Cell. Biol. 18: 4377-4384 (1998)；Syntichaki and Thireos, J. Biol. Chem. 273: 24414-24419 (1998)；Sakaguchi et al., Genes Dev. 12: 2831-2841 (1998)；およびMartinez et al, J. Biol. Chem. 273: 23781-23785 (1998)参照）。
【０１００】
ポリペプチドドメイン間、例えば２つのＺＦＰ間、またはＺＦＰおよび調節ドメイン間のリンカードメインが含まれ得る。このようなリンカーは、典型的には、ポリペプチド配列、例えば約５〜２００アミノ酸間のポリｇｌｙ配列である。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質の一部として合成される可変長アミノ酸亜配列である。例えば米国特許第6,534,261号；Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 5525-5530 (1997)；Pomerantz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9752-9756 (1995)；Kim et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160 (1996)（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）を参照のこと。代替的には、可変長リンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプチドそれ自体をともにモデリングし得るコンピュータプログラムを用いて（Desjarlais and Berg, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 2256-2260 (1993)、Desjarlais and Berg, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 11099-11103 (1994)）、あるいはファージ表示法により、合理的に設計され得る。
【０１０１】
他の実施形態において、化学リンカーを用いて、合成的または組換え的産生ドメイン配列を連結する。このような可変長リンカーは、当業者に既知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alaから入手可能である。これらのリンカーは、任意に、アミド結合、スルフヒドリル結合またはheteroflnctional結合を有する。調節ドメインとのＺＦＰの共有結合のほかに、非共有的方法を用いて、調節ドメインと会合されるＺＦＰを有する分子を産生し得る。
【０１０２】
切断ドメイン
先に述べたように、ＤＮＡ結合ドメインはさらに、切断（ヌクレアーゼ）ドメインとも結び付けられ得る。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの機能を保持したままで、それらのＤＮＡ結合の特異性を変えることもできる。加えて、ジンクフィンガータンパク質はさらに、切断ドメインに融合されて、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成することもできる。本明細書中に開示される融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られる。切断ドメインが由来するエンドヌクレアーゼの例としては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA；およびBelfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えばＳ１ヌクレアーゼ；緑豆ヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993も参照）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの1つまたは複数は、切断ドメインおよび切断半ドメインの供給源として用いられ得る。
【０１０３】
同様に、切断半ドメインは、切断活性のために二量体化を要する、上記のような任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。概して、２つの融合タンパク質は、切断半ドメインを含む場合、切断のために必要とされる。代替的には、２つの切断半ドメインを含む単一タンパク質が用いられ得る。２つの切断半ドメインは、同一エンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得るか、あるいは各切断半ドメインは異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。さらに、２つの融合タンパク質とそれらのそれぞれの標的部位との結合が、例えば二量体化することにより切断半ドメインに機能的切断ドメインを形成させる互いに対する空間的配向で切断半ドメインを配置するよう、２つの融合タンパク質に関する標的部位は、好ましくは、互いに関して配置される。したがって、特定の実施形態において、標的部位の近接縁は、５〜８ヌクレオチドにより、または１５〜１８ヌクレオチドにより分離される。しかしながら、任意の整数値のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位間に入る（例えば、２〜５０ヌクレオチドまたはそれ以上）。概して、切断点は、標的部位間にある。
【０１０４】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多数の種において存在し、ＤＮＡと配列特異的に結合し（認識部位で）、結合の部位でまたはその近くでＤＮＡを切断し得る。ある制限酵素（例えばＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えばＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ Ｉは、１つの鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド、ならびに他方の上のその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば米国特許第5,356,802号；第5,436,150号および第5,487,994号；ならびにLi et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4275-4279；Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2764-2768；Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 883-887；Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269: 31,978-31,982を参照のこと。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素および1もしくは複数のジンクフィンガー結合ドメイン（改変され得ることもされ得ないこともある）からの切断ドメイン（または切断半ドメイン）を含む。
【０１０５】
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的ＩＩＳ制限酵素は、Ｆｏｋ Ｉである。この特定酵素は、二量体として活性である（Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575）。したがって、本開示の目的のために、開示される融合タンパク質に用いられるＦｏｋ Ｉ酵素の一部分は、切断半ドメインと考えられる。したがって、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ Ｉ融合物を用いた細胞性配列の標的化二本鎖切断および／または標的化置換のために、各々がＦｏｋ Ｉ切断半ドメインを含む２つの融合タンパク質を用いて、触媒的に活性名切断ドメインを再構成し得る。代替的には、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋ Ｉ切断半ドメインを含有する単一ポリペプチド分子も用いられ得る。ジンクフィンガー−Ｆｏｋ Ｉ融合物を用いた標的化切断および標的化配列変更のためのパラメーターが、この開示中の他の箇所で提供される。
【０１０６】
切断ドメインまたは切断半ドメインは、切断活性を保持する、または多量体化（例えば二量体化）する能力を保持して機能的切断ドメインを形成するタンパク質の任意の部分であり得る。
【０１０７】
ＩＩＳ型制限酵素の例は、国際特許公開番号第ＷＯ０７／０１４２７５号に記載されており、その全体を本明細書中に援用する。付加的制限酵素も分離可能な結合および切断ドメインを含有し、これらは、本開示により意図される。例えば、Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 418-420を参照のこと。
【０１０８】
特定の実施形態において、切断ドメインは、例えば米国特許公開番号第20050064474号；同第20060188987号および同第20080131962号（これらのすべての記載内容を本明細書中に援用する）に記載されたような、ホモ二量体化を最小限にするかまたは阻止する1または複数の改変切断半ドメイン（二量体化ドメイン突然変異体とも呼ばれる）を含む。Ｆｏｋ Ｉの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位のアミノ酸残基はすべて、Ｆｏｋ Ｉ切断半ドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。
【０１０９】
絶対へテロ二量体を形成するＦｏｋ Ｉの例示的改変切断半ドメインには、第一切断半ドメインがＦｏｋ Ｉの４９０位および５３８位におけるアミノ酸残基の突然変異を含み、そして第二切断半ドメインが第４８６および４９９アミノ酸残基における突然変異を含む対を包含する。
【０１１０】
したがって、一実施形態において、４９０位での突然変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；５３８位での突然変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；４８６位での突然変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え；そして４９９位での突然変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。具体的には、一切断半ドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を突然変異化して、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と呼ばれる改変切断半ドメインを作り出し、別の切断半ドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を突然変異化して、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と呼ばれる改変切断半ドメインを作り出すことにより、本明細書中に記載される改変切断半ドメインを調製した。本明細書中に記載される改変切断半ドメインは、異所性切断が最小限にされるかまたは廃止される絶対へテロ二量体突然変異体である。例えば米国特許公開番号第20080131962号の実施例１を参照のこと（この開示をすべての目的のために本明細書中に援用する）。Szczepek et al. (2007) Nat Biotechnol 25:786-793も同様に参照のこと。特定の実施形態において、改変切断半ドメインには、４８６、４９９および４９６位（野生型ＦｏｋＩに対して付番）に突然変異、例えば、４８６位にて野性型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換え、４９９位にて野性型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換え、そして４９６位にて野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える（それぞれ「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）突然変異が含まれる。他の実施形態において、改変切断半ドメインには、４９０、５３８および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して付番）に突然変異、例えば、４９０位にて野性型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換え、５３８位にて野性型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換え、そして５３７位にて野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える（それぞれ「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）突然変異が含まれる。他の実施形態において、改変切断半ドメインは、４９０および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して付番）に突然変異、例えば、４９０位にて野性型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換え、そして５３７位にて野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える（それぞれ「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）突然変異が含まれる。（２０１０年２月８日に出願された米国特許仮出願第61/337,769号を参照のこと）。他の実施形態において、改変切断半ドメインには「Sharkey」および／またはが「Sharkey’」突然変異が含まれる（Guo et al, (2010) J, Mol. Biol. doi:10.1016/j.jmb.2010.04.060を参照のこと）。
【０１１１】
本明細書中に記載した改変切断半ドメインは、任意の好適な方法を使用して、例えば、米国特許公報20050064474および同20080131962に記載の野生型切断半ドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的突然変異誘発によって調製できる。
【０１１２】
もう１つの好ましいＩＩＳ型制限酵素はＢｆｉＩである（Zaremba et al, (2004) J. Mol Biol. 336(l):81-92を参照のこと）。この酵素の切断ドメインは、そのＤＮＡ結合ドメインと切り離され、そしてジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに作動的に連結されてＺＦＮを作り出し得る。
【０１１３】
融合タンパク質
融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に既知である。例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（例えばジンクフィンガードメイン）および調節または切断ドメイン（または切断半ドメイン）を含む融合タンパク質ならびにこのような融合タンパク質をことするポリヌクレオチドの設計および構築のための方法は、共有米国特許第6,453,242号および第6,534,261号、ならびに米国特許出願公告2007/0134796および2005/0064474（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【０１１４】
特定の実施形態において、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが構築される。これらのポリヌクレオチドはベクター中に挿入され、ベクターは細胞中に導入され得る（細胞中にポリヌクレオチドを導入するためのベクターおよび方法に関する付加的開示に関しては、下記を参照のこと）。
【０１１５】
先に述べたとおり、特定の実施形態において、融合タンパク質には、脂肪酸生合成に関与する遺伝子内の標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質および少なくとも１つの転写調節ドメイン、例えば活性化または抑制ドメインが含まれる。
【０１１６】
本明細書中に記載される方法の特定の実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガー結合ドメインならびにＦｏｋ Ｉ制限酵素からの切断半ドメインを含む融合タンパク質を含み、２つのこのような融合タンパク質が細胞中で発現される。細胞中の２つの融合タンパク質の発現は、細胞への２つのタンパク質の送達；細胞への１つのタンパク質およびタンパク質のうちの１つをコードする１つの核酸の送達；各々がタンパク質のうちの１つをコードする２つの核酸の細胞への送達から；あるいは両タンパク質をコードする単一核酸の細胞への送達により、生じ得る。付加的実施形態において、融合タンパク質は、２つの切断半ドメインおよびジンクフィンガー結合ドメインを含む単一ポリペプチドを含む。この場合、単一融合タンパク質は細胞中で発現され、理論に縛られずに考えると、切断半ドメインの分子内二量体の形成の結果としてＤＮＡを切断する。
【０１１７】
特定の実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（例えばＺＦＰ−Ｆｏｋ Ｉ融合体）の構成成分は、ジンクフィンガードメインが融合タンパク質のアミノ末端に最も近く、切断半ドメインがカルボキシ末端に最も近いよう、並べられる。これは、切断ドメイン、例えばＦｏｋ Ｉ酵素由来のものを天然に二量体化するに際しての切断ドメインの相対的配向を反映し、この場合、ＤＮＡ結合ドメインはアミノ末端に最も近く、切断半ドメインはカルボキシ末端に最も近い。これらの実施形態において、機能的ヌクレアーゼを形成するための切断半ドメインの二量体化は、反対ＤＮＡ鎖上の部位への融合タンパク質の結合によりもたらされ、結合部位の５’末端は互いに近位にある。
【０１１８】
付加的実施形態において、融合タンパク質（例えばＺＥＰ−Ｆｏｋ Ｉ融合物）の構成成分は、切断半ドメインが融合タンパク質のアミノ末端に最も近く、ジンクフィンガードメインがカルボキシ末端に最も近いよう、並べられる。これらの実施形態において、機能的ヌクレアーゼを形成するための切断半ドメインの二量体化は、反対ＤＮＡ鎖上の部位への融合タンパク質の結合によりもたらされ、結合部位の３’末端は互いに近位にある。
【０１１９】
さらなる付加的実施形態において、第一融合タンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端に最も近い切断半ドメインならびにカルボキシ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含有し、そして第二融合タンパク質は、ジンクフィンガードメインが融合タンパク質の網の末端に最も近く、切断半ドメインがカルボキシ末端に最も近いように並べられる。これらの実施形態において、両融合タンパク質は同一ＤＮＡ鎖に結合され、第一融合タンパク質の結合部位は、アミノ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含有する大に融合タンパク質の結合部位の５’側に配置されるカルボキシ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含有する。
【０１２０】
開示融合タンパク質の特定の実施形態において、ジンクフィンガードメインおよび切断ドメイン（または切断半ドメイン）間のアミノ酸配列は、「ＺＣリンカー」を示す。ＺＣリンカーは、上記のフィンガー間リンカーとは区別されるべきものである。切断を最適化するＺＣリンカーの獲得についての詳細に関しては、例えば米国特許第20050064474A1号および第20030232410号、ならびに国際特許公報WO05/084190を参照のこと。
【０１２１】
一実施形態において、当該開示は、表１または表１０に示されている認識らせんアミノ酸配列を有するジンクフィンガータンパク質を含むＺＦＮを提供する。別の実施形態において、表１または表１０に示される認識らせんを有するＺＦＰをコードするヌクレオチド配列を含むＺＦＰ発現ベクターが、本明細書中で提供される。
【０１２２】
遺伝子発現の調節
種々の検定を用いて、ＺＦＰが遺伝子発現を変調するか否かを確定し得る。特定ＺＦＰの活性は、例えば、イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学的検定（抗体を用いる））、ハイブリダイゼーション検定（例えばＲＮａｓｅ保護、ノーザン、in situハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドアレイ試験）、比色検定、増幅検定、酵素活性検定、表現型検定等を用いて、例えばタンパク質またはｍＲＮＡレベル、生成物レベル、酵素活性；レポーター遺伝子の転写活性化または抑制を測定することにより、種々のin vitroおよびin vivo検定を用いて査定され得る。
【０１２３】
ＺＦＰは、典型的には、ＥＬＩＳＡ検定を用いて、次に腎臓細胞を用いて、in vitroでの活性に関して先ず試験される。ＺＦＰはしばしば、レポーター遺伝子を伴う一過性発現系を用いて先ず試験され、次に、標的内因性遺伝子の調節が、細胞でおよび植物体全体で、in vivoとex-vivoの両方で、試験される。ＺＦＰは、細胞中で組換え的に発現され、植物中に移植された細胞中で組換え的に発現され、あるいはトランスジェニック植物中で組換え的に発現され得るし、ならびに下記の送達ビヒクルを用いて、植物または細胞にタンパク質として投与され得る。細胞は、固定され、溶液中に存在し、植物中に注入され、あるいはトランスジェニックまたは非トランスジェニック植物中に天然に存在し得る。
【０１２４】
遺伝子発現の変調は、本明細書中に記載されるin vitroまたはin vivo検定のうちの１つを用いて試験される。試料または検定はＺＦＰで処理され、試験化合物を有さない対照試料と比較されて、変調の程度を調べる。内因性遺伝子発現の調節に関して、ＺＦＰは、典型的には、２００ｎＭ以下、さらに好ましくは１００ｎＭ以下、さらに好ましくは５０ｎＭ、最も好ましくは２５ｎＭ以下のＫdを有する。
【０１２５】
ＺＦＰの作用は、上記のパラメーターのいずれかを調べることにより測定され得る。任意の適切な遺伝子発現、表現型または生理学的変化を用いて、ＺＦＰの影響を査定し得る。機能的結果が無傷細胞または植物を用いて確定される場合、植物成長、既知の且つ非特性化遺伝子マーカーに対する転写的変化（例えばノーザンブロットまたはオリゴヌクレオチドアレイ試験）、細胞代謝における変化、例えば細胞の増殖またはｐＨの変化、ならびに細胞内二次メッセンジャー、例えばｃＧＭＰにおける変化のような種々の作用を測定し得る。
【０１２６】
内因性遺伝子発現のＺＦＰ調節に関する好ましい検定は、in vitroで実施され得る。好ましい一in vitro検定フォーマットでは、培養細胞中の内因性遺伝子発現のＺＦＰ調節は、ＥＬＩＳＡ検定を用いてタンパク質産生を検査することにより、測定される。試験試料は、空ベクターで、あるいは別の遺伝子に対して標的化される無関係なＺＦＰで処理された対照細胞と比較される。
【０１２７】
別の実施形態において、内因性遺伝子発現のＺＦＰ調節は、標的遺伝子ｍＲＮＡ発現のレベルを測定することにより、in vitroで確定される。遺伝子発現のレベルは、増幅を用いて、例えばＰＣＲ、ＬＣＲまたはハイブリダイゼーション検定、例えばノーザンハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、ドットブロッティングを用いて測定される。ＲＮａｓｅ保護は、一実施形態で用いられる。タンパク質またはｍＲＮＡのレベルは、本明細書中に記載されるように、直接的にまたは間接的に標識された検出作用物質、例えば蛍光的にまたは放射能的に標識された核酸、放射能的または酵素的に標識された抗体等を用いて検出される。
【０１２８】
代替的には、レポーター遺伝子系は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、ＣＡＴまたはβ−ｇａｌのようなレポーター遺伝子と作動可能に連結される標的遺伝子プロモーターを用いて考案され得る。レポーター構築物は、典型的には、培養細胞中に同時トランスフェクトされる。選ばれたＺＦＰでの処理後、当業者に知られている標準技法に従って、レポーター遺伝子の転写、翻訳または活性の量が測定される。
【０１２９】
トランスジェニックおよび非トランスジェニック植物も、in vivoでの内因性遺伝子発現の調節を検査するための好ましい実施形態として用いられる。トランスジェニック植物は、選ばれたＺＦＰを安定的に発現し得る。代替的には、選ばれたＺＦＰを一時的に発現するか、またはＺＦＰが送達ビヒクル中で投与された植物が、用いられ得る。内因性遺伝子発現の調節は、本明細書中に記載される検定のうちのいずれか１つを用いて試験される。
【０１３０】
標的化切断のための方法
開示される方法および組成物を用いて、細胞クロマチン中の当該領域（例えば脂肪酸の生合成に関与する遺伝子内のまたはそれに隣接するゲノム中の所望のまたは予定の部位）でＤＮＡを切断し得る。このような標的化ＤＮＡ切断に関して、ジンクフィンガー結合ドメインは、予定切断部位でまたはその付近で、標的を結合するよう改変され、改変ジンクフィンガー結合ドメインおよび切断ドメインを含む融合タンパク質は細胞中で発現される。融合タンパク質のジンクフィンガー部分の、標的部位との結合時に、ＤＮＡは、切断ドメインにより標的部位付近で切断される。切断の正確な部位は、ＺＣリンカーの長さに依っている。
【０１３１】
代替的には、各々がジンクフィンガー結合ドメインおよび切断半ドメインを含む２つの融合タンパク質は、細胞中で発現され、機能的切断ドメインが再構成され、ＤＮＡが標的部位に近接して切断されるような方法で並置される標的部位と結合される。一実施形態において、切断は、２つのジンクフィンガー結合ドメインの標的部位間で起きる。ジンクフィンガー結合ドメインの一方または両方が、改変され得る。
【０１３２】
ジンクフィンガー結合ドメイン−切断ドメイン融合ポリペプチドを用いる標的化切断に関して、結合部位は切断部位を包含するか、あるいは結合部位の近縁は、切断部位から１、２、３、４、５、６、１０、２５、５０またはそれより多くのヌクレオチド（あるいは１〜５０の任意の整数値のヌクレオチド）であり得る。結合部位の正確な位置は、切断部位に関しては、特定切断ドメインに、ならびにＺＣリンカーの長さに依っている。各々がジンクフィンガー結合ドメインおよび切断半ドメインを含む２つの融合ポリペプチドが用いられる方法に関して、結合部位は一般的に切断部位をまたぐ。したがって、第一結合部位の近縁は切断部位の一側上の１、２、３、４、５、６、１０、２５またはそれより多いヌクレオチド（または１〜５０の任意の整数値のヌクレオチド）であり得るし、第二結合部位の近縁は切断部位の他側上の１、２、３、４、５、６、１０、２５またはそれより多いヌクレオチド（または１〜５０の任意の整数値のヌクレオチド）であり得る。切断部位をin vitroおよびin vivoでマッピングするための方法は、当業者に知られている。
【０１３３】
したがって、本明細書中に記載される方法は、切断ドメインと融合された改変ジンクフィンガー結合ドメインを用い得る。これらの場合、結合ドメインは、切断が所望される箇所またはその近くで、標的配列と結合するよう改変される。融合タンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドは、植物細胞中に導入される。一旦細胞中に導入されるかまたは細胞中で発現されると、融合タンパク質は標的配列と結合し、標的配列で、またはその近くで切断する。切断の正確な部位は、切断ドメインの性質、ならびに／あるいは結合ドメインと切断ドメインとの間のリンカー配列の存在および／または性質に依っている。各々が切断半ドメインを含む２つの融合タンパク質が用いられる場合、結合部位の近縁間の距離は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５またはそれより多いヌクレオチド（または１〜５０の任意の整数値のヌクレオチド）であり得る。切断の最適レベルは、２つの融合タンパク質の結合部位間の距離（例えばSmith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 3361-3369；Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21: 289-297参照）と、各融合タンパク質中のＺＣリンカーの長さの両方にもより得る。米国特許公報第20050064474A1号、ならびに国際特許公報WO05/084190、WO05/014791およびWO03/080809も参照のこと。
【０１３４】
特定の実施形態において、切断ドメインは、その両方が結合ドメインを含む単一ポリペプチドの一部である２つの切断半ドメイン（第一切断ハンドメインおよび第二切断半ドメイン）を含む。切断半ドメインは、それらがＤＮＡを切断するよう機能する限り、同一アミノ酸配列を有し得るし、あるいは異なるアミノ酸配列を有し得る。
【０１３５】
切断半ドメインは、別個の分子中でも提供され得る。例えば、２つの融合ポリペプチドが細胞中に導入され得るが、この場合、各ポリペプチドは結合ドメインおよび切断半ドメインを含む。切断半ドメインは、それらがＤＮＡを切断するよう機能する限り、同一アミノ酸配列を有し得るし、あるいは異なるアミノ酸配列を有し得る。さらに、結合ドメインは、融合ポリペプチドの結合時に、切断ドメインの再構成を可能にし（例えば、半ドメインの二量体化により）、それにより機能的切断ドメインを形成するために互いに対比して半ドメインを配置して、当該領域中の細胞クロマチンの切断を生じる、互いに対する空間配向で２つの切断半ドメインが存在するような方法で、典型的には配置される標的配列と、結合ドメインは結合する。一般的には、再構成切断ドメインは、２つの標的配列間に置かれる部位で起きる。
【０１３６】
２つの融合タンパク質は同一のまたは反対の極性で当該領域で結合し得るし、それらの結合部位（すなわち、標的部位）は任意数のヌクレオチド、例えば、０〜２００ヌクレオチド、またはその間の任意の整数値のヌクレオチドにより分離され得る。特定の実施形態において、各々がジンクフィンガー結合ドメインおよび切断半ドメインを含む２つの融合タンパク質に関する結合部位は、他の結合部位に最も近い各結合部位の縁から測定して、５〜１８ヌクレオチド離れて、例えば５〜８ヌクレオチド離れて、または１５〜１８ヌクレオチド離れて、または６ヌクレオチド離れて、または１６ヌクレオチド離れて配置され、切断は結合部位間で起こる。
【０１３７】
ＤＮＡが切断される部位は、一般的には、２つの融合タンパク質に関する結合部位間に存在する。ＤＮＡの二本鎖切断はしばしば、２つの一本鎖切断、あるいは１、２、３、４、５、６またはそれより多くのヌクレオチドにより埋め合わされる「ニック」に起因する（例えば、ネイティブＦｏｋ Ｉによる二本鎖ＤＮＡの切断は、４ヌクレオチドにより埋め合わされる一本鎖切断に起因する）。したがって、切断は、必ずしも各ＤＮＡ鎖上の真反対の部位で起きるわけではない。さらに、融合タンパク質の構造ならびに標的部位間の距離は、切断が単一ヌクレオチド対に隣接して起きるか、あるいは切断がいくつかの部位で起きるかに影響を及ぼし得る。しかしながら、多数の用途、例えば標的化組換えおよび標的化突然変異誘発（以下参照）に関して、一連のヌクレオチド内の切断は一般的に十分であり、特定塩基対間の切断は必要とされない。
【０１３８】
上記のように、融合タンパク質（単数または複数）は、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドとして導入され得る。例えば、各々が上記のポリペプチドのうちの１つをコードする配列を含む２つのポリヌクレオチドが細胞中に導入され、そしてポリペプチドが発現され、各々がその標的配列と結合すると、切断が標的配列で、またはその付近で起こる。代替的には、両方の融合ポリペプチドをコードする配列を含む単一ポリヌクレオチドが、細胞中に導入される。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはＤＮＡおよび／またはＲＮＡの修飾形態または類似体であり得る。
【０１３９】
切断特異性を増大するために、本明細書中に記載される方法には付加的組成物も用いられ得る。例えば、単一切断半ドメインは、限定された二本鎖切断活性を示し得る。各々が３−フィンガージンクフィンガードメインおよび切断半ドメインを含有する２つの融合タンパク質が細胞中に導入される方法では、どちらか一方のタンパク質が、約９−ヌクレオチド標的部位を特定する。１８ヌクレオチドの集合体標的配列は哺乳類および植物ゲノムに独特であると思われるが、しかし、ヒトゲノム中に平均して約２３，０００回、任意の所定の９−ヌクレオチド標的部位が生じる。したがって、単一半ドメインの部位特異的結合のため、非特異的切断が起こり得る。したがって、本明細書中に記載される方法は、２つの融合タンパク質と一緒に細胞中で発現されるＦｏｋ Ｉ（またはそれをコードする核酸）のような切断半ドメインのドミナントネガティブ突然変異体の使用を意図する。ドミナントネガティブ突然変異体は、二量体化し得るが、切断することは出来ず、さらに、それが二量体化される半ドメインの切断活性を遮断する。融合タンパク質に対して過剰モルでドミナントネガティブ突然変異体を提供することにより、両融合タンパク質が結合される領域のみが、二量体化および切断が起きるために十分に高い局所的濃度の機能的切断半ドメインを有する。２つの融合タンパク質のうちの１つだけが結合される部位で、その切断半ドメインはドミナントネガティブ突然変異体半ドメインと二量体を形成し、望ましくない非特異的切断は起きない。
【０１４０】
発現ベクター
本明細書中に記載した1もしくは複数のタンパク質（例えばＺＦＰ）をコードする核酸は、複製および／または発現のために原核生物または真核生物細胞中への形質転換のためにベクター中でクローン化され得る。ベクターは、原核生物ベクター、例えばプラスミド、またはシャトルベクター、昆虫ベクター、ウイルスベクター、または真核生物ベクターであり得る。ＺＦＰをコードする核酸は、植物細胞への投与のために、発現ベクター中でもクローン化され得る。
【０１４１】
ＺＦＰを発現するために、ＺＦＰをコードする配列は、典型的には、転写を指図するプロモーターを含有する発現ベクター中でサブクローン化される。適切な細菌および真核生物プロモーターは当該技術分野でよく知られており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual Stockton Press, New York (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al.、上記。ＺＦＰを発現するための細菌発現系は、例えば大腸菌、枯草菌種およびサルモネラにおいて利用可能である（Palva et al., Gene 22: 229-235 (1983)）)に記載されている。このような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳類、植物、酵母および昆虫細胞に関する真核生物発現系は当業者によく知られており、これらも市販されている。
【０１４２】
ＺＦＰコード核酸の発現を指図するために用いられるプロモーターは、特定の用途に依っている。例えば、宿主細胞に適合された強力な構成的プロモーターは、典型的には、ＺＦＰの発現および精製のために用いられる。
【０１４３】
それに対比して、ＺＦＰが植物遺伝子の調節のためにin vivoで投与される場合（下記の「植物細胞への核酸送達」の節を参照）、ＺＦＰの特定の用途によって、構成的または誘導的プロモーターが用いられる。植物プロモーターの非限定例としては、シロイヌナズナユビキチン−３（ｕｂｉ−３）（Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493）；アグロバクテリウム・ツメファシエンス・マンノピンシンターゼ（Δｍａｓ）（Petolino et al.、米国特許第6,730,824号）；および／またはキャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）（Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31: 1129-1139）が挙げられる。実施例も参照のこと。
【０１４４】
プロモーターの他に、発現ベクターは、典型的には、原核生物または真核生物の宿主細胞中での核酸の発現のために必要とされるすべての付加的素子を含有する転写ユニットまたは発現カセットを含有する。したがって、典型的発現カセットは、例えばＺＦＰをコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーター、ならびに転写物の効率的ポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位または翻訳終結のために必要とされるシグナルを含有する。カセットの付加的素子としては、例えばエンハンサー、異種スプライシングシグナル、および／または核局在化シグナル（ＮＬＳ）が挙げられ得る。
【０１４５】
細胞中に遺伝情報を移すために用いられる特定の発現ベクターは、ＺＦＰの意図される用途、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物等における発現に関して選択される（下記の発現ベクター参照）。標準細菌および動物発現ベクターは当該技術分野で知られており，例えば米国特許公報第20050064474A1号、ならびに国際特許公報WO05/084190、WO05/014791およびWO03/080809に詳細に記載されている。
【０１４６】
標準トランスフェクション法は、大量のタンパク質を発現し、これが次に標準技法を用いて精製され得る細菌、哺乳類、酵母または昆虫細胞株を産生するために用いられ得る（例えば、Colley et al., J. Biol. Chem. 264: 17619-17622 (1989)；Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)参照）。真核生物および原核生物細胞の形質転換は、標準技法に従って実施される（例えばMorrison, J. Bact. 132: 349-351 (1977)；Clark-Curtiss and Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347-362 (Wu et al., eds., 1983)参照）。
【０１４７】
このような宿主細胞中に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手法のいずれかが用いられ得る。これらの例としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、原形質体融合、電気穿孔、超音波法（例えば超音波穿孔）、リポソーム、マイクロインジェクション、裸ＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター（エピソームおよび組込みの両方）、ならびにクローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはその他の外来遺伝物質を宿主細胞中に導入するためのその他の周知の方法のいずれかの使用が挙げられる（例えばSambrook et al.、上記、参照）。用いられる特定遺伝子改変手法が選択されるタンパク質を発現し得る宿主細胞中に少なくとも１つの遺伝子を首尾よく導入し得る、ということのみが必要である。
【０１４８】
植物細胞への核酸送達
上記のように、ＤＮＡ構築物は、種々の慣用的技法により所望の植物宿主中（例えばそのゲノム中）に導入され得る。このような技法の検討に関しては、例えばWeissbach and Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, pp.421-463；およびGrierson and Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9を参照のこと。
【０１４９】
例えばＤＮＡ構築物は、電気穿孔ならびに植物細胞原形質体のマイクロインジェクションのような技法を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡ中に直接導入され得るし、あるいはＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ微粒子衝撃のような微粒子銃法を用いて植物組織に直接導入され得る（例えばKlein et al (1987) Nature 327: 70-73参照）。代替的には、ＤＮＡ構築物は、適切なＴ−ＤＮＡフランキング領域と組合されて、慣用的アグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主ベクター中に導入され得る。アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介性形質転換技法、例えばバイナリーベクターの無害化および使用は、科学文献中に十分に記載されている。例えばHorsch et al (1984) Science 233: 496-498およびFraley et al (1983) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 80: 4803を参照のこと。
【０１５０】
さらに、遺伝子移入は、非アグロバクテリウム細菌またはウイルス、例えば根粒菌ＮＧＲ２３４株、アルファルファ根粒菌、ミヤコグサ根粒菌、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルスを用いて達成され得る（例えばChung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1): 1-4参照）。
【０１５１】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主の病原性機能は、バイナリーＴ ＤＮＡベクター（Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12: 8711-8721）または同時培養手法（Horsch et al (1985) Science 227: 1229-1231）を用いて細胞が細菌に感染される場合、植物細胞ＤＮＡ中への構築物および隣接マーカーの挿入を指図する。一般的には、アグロバクテリウム形質転換系は、双子葉植物を改変するために用いられる（Bevan et al (1982) Ann. Rev. Genet 16: 357-384；Rogers et al (1986) Methods Enzymol. 118: 627-641）。アグロバクテリウム形質転換系は、ＤＮＡを単子葉植物および植物細胞に形質転換し、ならびに移入するためにも用いられ得る。米国特許第5,591,616号；Hernalsteen et al (1984) EMBO J 3: 3039-3041；Hooykass-Van Slogteren et al (1984) Nature 311: 763-764；Grimsley et al (1987) Nature 325: 1677-179；Boulton et al (1989) Plant Mol. Biol. 12: 31-40；およびGould et al (1991) Plant Physiol. 95: 426-434を参照のこと。
【０１５２】
代替的遺伝子移入および形質転換方法としては、裸ＤＮＡの、カルシウム−、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−または電気穿孔−媒介性取込みによる原形質体形質転換（Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3: 2717-2722；Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199: 169-177；Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828；およびShimamoto (1989) Nature 338: 274-276参照）、ならびに植物組織の電気穿孔（D’Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505）が挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞形質転換のための付加的方法としては、マイクロインジェクション、シリコンカーバイド媒介性ＤＮＡ取込み（Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9: 415-418）、ならびに微粒子発射衝撃（Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309；およびGordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603-618参照）またはナノ粒子が挙げられる。
【０１５３】
開示される方法および組成物は、植物細胞ゲノム中の予定位置に外因性配列を挿入するために用いられ得る。これは、植物ゲノム中への導入遺伝子の発現が決定的にその取込み部位に依っているために、有用である。したがって、例えば栄養素、抗生物質または治療用分子をコードする遺伝子は、標的化組換えにより、それらの発現に有利な植物ゲノムの領域中に挿入され得る。
【０１５４】
上記の形質転換技法のいずれかにより産生される形質転換植物細胞は、培養されて、形質転換化遺伝子型を、したがって所望の表現型を保有する全植物体を再生し得る。このような再生技法は、組織培養増殖培地中でのある種の植物ホルモンの操作に頼っており、典型的には、所望のヌクレオチド配列と一緒に導入された殺生物剤および／または除草剤マーカーに頼っている。培養原形質体からの植物再生は、Evans, et al., ”Protoplasts Isolation and Culture” in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983；およびBinding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985に記載されている。再生は、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚またはその一部からも得られる。このような再生技法は、一般的に、Klee et al (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486に記載されている。
【０１５５】
植物細胞中に導入される核酸は、本質的に任意の植物に所望の形質を付与するために用いられ得る。広範な種々の植物および植物細胞系は、本開示の核酸構築物ならびに上記の種々の形質転換方法を用いて、本明細書中に記載される所望の生理学的および農学的特徴に関して改変され得る。好ましい実施形態において、改変のための標的植物および植物細胞としては、単子葉および双子葉植物、例えば作物、例えば穀物（例えばコムギ、トウモロコシ、コメ、アワ、オオムギ）、果実作物（例えばトマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えばアルファルファ）、根菜作物（例えばニンジン、ジャガイモ、テンサイ、ヤムイモ）、葉物作物（例えばレタス、ホウレンソウ）；花卉植物（例えばペチュニア、バラ、キク）、球果植物およびマツ類（例えばモミ、トウヒ）；植物集含み用いられる植物（例えば重金属蓄積植物）；油糧作物（例えばヒマワリ、ナタネ、ダイズ）および実験目的のために用いられる植物（例えばシロイヌナズナ）が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、開示される方法および組成物は、広範囲の植物、例えばアスパラガス属、カラスムギ属、ブラシカ属、ミカン属、キトルルス属、トウガラシ属、カボチャ属、ニンジン属、ムカシヨモギ属、ツルマメ属、ワタ属、オオムギ属、アキノノゲシ属、ホソムギ属、トマト属、リンゴ属、マニホット属、タバコ属、オオアラセイトウ属、イネ属、ペルセア属、インゲンマメ属、エンドウ属、ナシ属、サクラ属、ダイコン属、ライムギ属、ナス属、モロコシ属、コムギ属、ブドウ属、ササゲ属およびトウモロコシ属からの植物種（これらに限定されない）に亘る使用を有する。
【０１５６】
発現カセットがトランスジェニック植物中に安定的に組入れられて、作動可能であると確証された後、それは、性的交雑により他の植物中に導入され得る、と当業者は認識する。交雑されるべき種によって、多数の標準育種技法のいずれかが用いられ得る。
【０１５７】
形質転換中のＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によりコードされる形質に関して、改変植物物質を選択し、スクリーニングすることにより、形質転換植物細胞、カルス、組織または植物は同定され、単離され得る。例えば、形質転換遺伝子構築物が耐性を付与する阻害量の抗生物質または除草剤を含有する培地上で改変植物物質を増殖させることにより、選択は実施され得る。さらに、形質転換化植物および植物細胞は、組換え核酸構築物上に存在し得る任意の可視的マーカー遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢまたはＣ１遺伝子）の活性に関してスクリーニングすることによっても同定され得る。このような選択およびスクリーニング方法は、当業者によく知られている。
【０１５８】
挿入遺伝子構築物を含有する植物または植物細胞形質転換体を同定するために、物理学的および生化学的方法も用いられ得る。これらの方法としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：１）組換えＤＮＡ挿入物の構造を検出し、確定するためのサザン分析またはＰＣＲ増幅；２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写物を検出し、検査するためのノーザンブロット、Ｓ１ ＲＮａｓｅ保護、プライマー延長または逆転写酵素−ＰＣＲ増幅；３）酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素的検定（この場合、このような遺伝子産物は遺伝子構築物によりコードされる）；４）タンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット技法、免疫沈降法または酵素結合イムノアッセイ（この場合、遺伝子構築物産物はタンパク質である）。付加的技法、例えばin situハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色も、特定の植物器官および組織中の組換え構築物の存在または発現を検出するために用いられ得る。これらの検定すべてを実行するための方法は、当業者によく知られている。
【０１５９】
本明細書中に開示される方法を用いた遺伝子操作の作用は、例えば、当該組織から単離されるＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）のノーザンブロットにより観察され得る。典型的には、ｍＲＮＡの量が増大した場合、対応する内因性遺伝子は以前より高率で発現されているものである、と推定される。遺伝子および／またはＣＹＰ７４Ｂ活性を測定する他の方法が用いられ得る。用いられる基質、ならびに反応産物または副産物の増大または低減を検出する方法によって、異なる型の酵素検定が用いられ得る。さらに、発現されるＣＹＰ７４Ｂタンパク質のレベルは、免疫化学的に、すなわち当業者によく知られたＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよびその他の抗体ベースの検定により、例えば電気泳動的検出検定により（染色によりまたはウエスタンブロッティングにより）測定され得る。導入遺伝子は、植物のいくつかの組織中で、またはいくつかの発生段階で、選択的に発現され得るし、あるいは導入遺伝子は、実質的にすべての植物組織中で、実質的にその全生活環に沿って、発現され得る。しかしながら、任意の組合せ発現方式も適用可能である。
【０１６０】
本開示は、上記のトランスジェニック植物の種子も包含し、この場合、種子は導入遺伝子または遺伝子構築物を有し、そして所望の変更油プロフィールを有する種子を含む。本開示はさらに、上記のトランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞株または細胞を包含し、この場合、上記の子孫、クローン、細胞株または細胞は、導入遺伝子または遺伝子構築物を有する。
【０１６１】
有効量の投与は、処理されるべき植物細胞との最終的接触にＺＦＰを導入するために普通に用いられる経路のいずれかによる。ＺＦＰは、任意の適切な方法で、好ましくは許容可能な担体とともに投与される。このようなモジュレーターの適切な投与方法は、当業者に利用可能であり、よく知られているが、しかし、特定組成物を投与するために１つより多くの経路が用いられ得るし、特定経路はしばしば、別の経路より即時の且つより効率的な反応を提供し得る。
【０１６２】
担体はさらにまた、一部は投与されている特定組成物により、ならびに組成物を投与するために用いられる特定の方法により、用いられ、確定され得る。したがって、利用可能である組成物の広範な種々の適切な処方物が存在する。
【０１６３】
用途
先に述べたとおり、脂肪酸合成に関与する遺伝子の標的化変更は、所望の脂肪酸プロフィールの植物油を迅速、かつ、効率的に作り出すのに使用できる。
【０１６４】
採油植物、例えばキャノーラなどからの植物油の脂肪酸組成を変更することは、食糧生産に関して、そしてその結果として食事の健康に対して奥深い意味がある。例えば、種子油中の低い飽和脂肪酸レベルを有するキャノーラ属性油糧種子であるアブラナ属変種は、心臓血管健康を促進する食品を作り出すのに使用できる。本明細書中に記載した方法および組成物は、低いパルミチン酸および／またはステアリン酸含有量を有する採油植物を作り出すのに使用でき、そしてそれが、植物油中の飽和脂肪酸のレベルを下げる。同様に、高いレベルのオレイン酸含有量を有する採油植物を作り出すこともまた、植物油中の飽和脂肪酸の量を下げる。
【０１６５】
さらに、本明細書中に記載した方法および組成物は、例えば上述の植物から産生される油中、パルミチン酸含有量を高めるのに使用できる。パルミチン酸含有量が多い油は、マーガリンの形成で特に有用である。
【０１６６】
加えて、本明細書中に記載したような脂肪酸プロフィールの標的化変更は、リノレン酸の低い植物（植物油）を作り出すのに使用できる。低リノレン酸油は、高い安定性を示し；これらの油を使用して作られた食事は、高いリノレン酸濃度を有する植物材料から作られた食事と同じ位の速さで香味や匂いに関して悪くなることはない。
【実施例】
【０１６７】
実施例
以下は、本発明の開示を実行するための特定の実施形態の実施例である。実施例は、例示的目的のためにのみ提供されるものであって、如何なる点でも本発明の開示の範囲を限定するよう意図されない。
【０１６８】
用いられる数（例えば量、温度等）に関する精度を保証するために努力がなされてきたが、しかし多少の実験誤差および偏差は、もちろん、許容されるべきである。
【０１６９】
実施例１：セイヨウアブラナＬにおける標的配列同定
１．１  標的配列同定
本実施例では、セイヨウアブラナＬ（Brassica napus L）（キャノーラ）の天然の酵素であるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ（ＫＡＳ ＩＩ）をコードする内因性ＤＮＡ配列を、同定した。脂肪酸生合成の所望の変更、および付随する種子油プロフィールの変更をもたらすために、改変ジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ ＴＦ）による転写制御を実証するための代表的な標的として、これらの遺伝子を選定した。酵素β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩは、１６：０−ＡＣＰから１８：０−ＡＣＰへの転換と、それに続くオレイン酸の形成を触媒する（Ohlrogge and Browse, 1995, The Plant Cell, 7: 957-970）。β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子の報告されているシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ｆａｂ１突然変異は、酵素活性の６５％の低下と、付随する葉および根のそれぞれ７％と３％のステアリン酸含有量の増加をもたらした（Wu etal,, 1994, Plant Physiology, 106: 143- 150）。キャノーラにおいて形質転換したダイズβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ導入遺伝子を安定的に発現することで、種子パルミチン酸含有量を０．８％低下させ、そして、タバコへの同じ遺伝子の導入は、パルミチン酸含有量を２％低下させた（日本国特許公開番号第501446/1995号）。
【０１７０】
β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩのｃＤＮＡ配列は、シロイヌナズナ（GenBank：AF318307）やセイヨウアブラナ（GenBank：AF244520）を含めた多くの植物から報告された。シロイヌナズナとセイヨウアブラナのｃＤＮＡ配列（それぞれGenBank：ＡＦ３１８３０７とＡＦ２４４５２０）のアラインメントは、ＡＦ２４４５２０配列が不完全であることを示した（図７）。切り詰められたセイヨウアブラナＤＮＡ配列は、５’末端が数百塩基対欠失していた。加えて、セイヨウアブラナは、カブ類（B.rapa）（２ｎ＝２０、ＡＡ）とキャベツ類（B.oleracea）（２ｎ＝１８、ＣＣ）の染色体対の組合せから生じる複二倍体種なので（Morinaga, 1934, Cytologia, 6:62-67; U.N., 1935, Japanese J. Bot., 7:389-452）、この種にいて２つ以上のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子が存在することが予測される。ｃＤＮＡ配列に存在する追加の５’ＵＴＲ配列を同定し、そして得た。これらの５’β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子配列は、本実施例におけるＺＦＰ ＴＦによる転写の上方制御のための標的としての役割を果たした。
【０１７１】
１．２  全ＲＮＡ分離
全ＲＮＡを、QiagenのRNEASY（登録商標）PLANT MINI KIT（Qiagen、Valencia, CA）を使用して、開花の１５日後（ＤＡＦ）のセイヨウアブラナ（キャノーラ）遺伝子型Ｎｅｘ７１０（Crop Certificate99-70492Q8-501）の未熟種子から単離した。総ｍＲＮＡを製造業者の推奨に従ってＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅによって処理して、定量的ＲＴ−ＰＣＲ中に増幅するかもしれないＤＮＡのあらゆる混入を取り除いた。
【０１７２】
１．３  ５’ＲＡＣＥと配列分析
セイヨウアブラナのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｃＤＮＡ（GenBank AF244520）の５’末端に特異的なｃＤＮＡ末端の急速増幅（ＲＡＣＥ）を、製造業者の推奨によってAmbion製のFIRSTCHOICE（登録商標）RLM-RACEキット（Ambion、Austin, TX）を使用して実施した。５’ｃＤＮＡ配列を得るために、合成ＲＮＡアダプターを５’非キャップｍＲＮＡ領域にアニールした。キットにより供給されたプライマー（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＣＴＧＣＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＡＡ−３’）（配列番号１）および部分的なセイヨウアブラナｃＤＮＡ配列（GenBank AF244520）と結合するように改変された二次プライマー（５’−ＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＴＡＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣ−３’）（配列番号２）を断片を増幅するために使用して、未知の上流配列を決定した。５’ＲＡＣＥ増幅では、約５００塩基対の新しいセイヨウアブラナ配列を決定した。β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子の４種類の明らかに異なる５’ｃＤＮＡ配列のコンティグ（配列番号３、配列番号４、配列番号４６、および配列番号３０）を、増幅した配列をアラインメントしたときに同定した（図８）。これらの５’配列は、同じ領域からのカブ類（GenBank：AC189461）およびキャベツ類（GenBank：BH723504）の配列に対して高レベルの相同性を示した。
【０１７３】
ＺＦＰ ＴＦ結合配列を、β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子の５’ｃＤＮＡ配列中で同定した。β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子の上流領域（表２）からの配列は、結合するＺＦＰ ＴＦの標的としての役割を果たした（表１）。プ改変ＺＦＰ ＴＦ設計を含むラスミド構築物：ｐＤＡＢ４６９５、ｐＤＡＢ４６９６、ｐＤＡＢ４６９７、およびｐＤＡＢ４６９８を、次項に記載のとおりセイヨウアブラナを安定して形質転換するために使用した。植物細胞中での発現により改変ＺＦＰ ＴＦが内因性β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ標的に結合し、標的の変更されたｍＲＮＡ発現をもたらすと仮定した。
【０１７４】
実施例２：β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子に特異的なＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインの設計
ジンクフィンガータンパク質を、セイヨウアブラナβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子プロモーター領域、ならびに５’非翻訳領域および翻訳領域内の様々な標的部位に対して設計した。図２を参照のこと。代表的なＺＦＰ設計に関する認識ヘリックスを、以下の表１に示す。ジンクフィンガー設計の標的部位を、以下の表２に示す。
【０１７５】
【表１】
2013507960.tif 000002
【０１７６】
【表２】
2013507960.tif 000003
【０１７７】
β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ設計を、ＣＣＨＣ構造を含む少なくとも１つのフィンガーを持つタンパク質をコードするジンクフィンガー発現ベクター内に組み入れた。米国特許公開番号第2008/0182332号を参照のこと。特に、各タンパク質の最後のフィンガーがＣＣＨＣ構造（アーキテクチャ）を持っていた。
【０１７８】
ジンクフィンガーをコードする配列を、次いでＶＰ１６活性化ドメインおよびｏｐａｑｕｅ−２核局在化シグナルをコードする配列に融合した。
こうしたプロモーターが融合タンパク質の発現を、比較的強い構成的プロモーター、例えばシロイスナズナＵｂｉｑｕｉｔｉｎ１０（ＡｔＵｂｉ１０）プロモーター由来のプロモーターなどによって駆動した。代表的なベクターを、以下の表３に示す。
【０１７９】
実施例３：セイヨウアブラナにおける天然β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子のＺＦＰ ＴＦ媒介上方制御
植物細胞内での設計したジンクフィンガータンパク質の機能性を評価するために、植物生細胞内におけるかかるタンパク質の発現方法を利用した。ジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡを、そのＤＮＡが植物細胞ゲノム内に組み込まれない条件下で植物細胞内に送達する。よって、ＤＮＡ分子は一時的に植物細胞内に維持され、そして遺伝子発現のための鋳型として作用する。あるいは、ジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡは、そのＤＮＡが植物細胞ゲノム内に組み込まれるのを可能にし、そしてそのＤＮＡ分子が植物細胞内に安定に維持され、そして遺伝子発現のための鋳型として機能するようにジンクフィンガータンパク質コード遺伝子のトランスジェネシスを結果としてもたらす条件下で植物細胞内に送達されることもできる。当業者は、植物生細胞内のこれらのタンパク質の機能性を評価するために、ジンクフィンガータンパク質コードＤＮＡの一過性発現またはトランスジェニック発現のいずれかを利用できる。
【０１８０】
３．１  構築物の設計
このプロジェクトのために設計し、そして構築したバイナリープラスミドを、表３中に列挙する。
【０１８１】
【表３】
2013507960.tif 000004
【０１８２】
ｐＤＡＢ４６９５は、１４０２５ｖ３／ＶＰ１６およびｐａｔ遺伝子発現カセットを含むバイナリープラスミドである。この構築物には以下の遺伝子要素が含まれる；ＲＢ７ ＭＡＲ ｖ３（マトリクス結合領域（Thompson et al., 1997, WO9727207））：：ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２（シロイスナズナＵｂｉｑｕｉｔｉｎ−１０プロモーター（Callis, et al., 1990, J. Biol, Chem. 265-12486-12493））：：１４０２５ ｖ３ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合：：Ａｔｕ ＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）オープンリーディングフレーム２３、３’非翻訳領域（Gelvin et al., 1987, EP222493））：：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２（キャッサバ葉脈モザイク病ウイルスプロモーター（Verdaguer et at., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139）：：ｐａｔ ｖ５（フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37））：：ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４（アグロバクテリウム・ツメファシエンス・オープンリーディングフレーム１、３’非翻訳領域（Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822））。そのバイナリーを、ＮｃｏI−ＳａｃＩ制限部位を介してｐＤＡＢ３９１６内に１４０２５ ｖ３ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合を含むＤＮＡ断片をクローニングすることによって構築した。ｐＤＡＢ８２２１とラベルされた得られた構築物は、ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２：：１４０２５ ｖ３ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合：：Ａｔｕ ＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１遺伝子発現カセットを含む。ｐＤＡＢ８２２１を、Ｌ−Ｒ Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Invitrogen、Carlsbad, CA）によってｐＤＡＢ７３０９バイナリー内にクローン化した。この反応でｐＤＡＢ４６９５を作製し、そしてそれを制限酵素消化と配列決定反応によって確認した。
【０１８３】
ｐＤＡＢ４６９６は、１４０３３ｖ３／ＶＰ１６およびｐａｔ遺伝子発現カセットを含むバイナリープラスミドである。この構築物には以下の遺伝子要素が含まれる；ＲＢ７ ＭＡＲ ｖ３：：ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２：：１４０３３ ｖ３ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合：：Ａｔｕ ＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１：：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２：：ｐａｔ ｖ５：：ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４。そのバイナリーを、ＮｃｏI−ＳａｃＩ制限部位を介してｐＤＡＢ３９１６内に１４０３３ｖ３ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合を含むＤＮＡ断片をクローニングすることによって構築した。ｐＤＡＢ８２２２とラベルされた得られた構築物は、ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２：：１４０３３ ｖ３ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合：：Ａｔｕ ＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１遺伝子発現カセットを含む。ｐＤＡＢ８２２２を、L-R Gateway（登録商標）Reaction（Invitrogen、Carlsbad, CA）によってｐＤＡＢ７３０９バイナリー内にクローン化した。この反応でｐＤＡＢ４６９６を作製し、そしてそれを制限酵素消化と配列決定反応によって確認した。
【０１８４】
ｐＤＡＢ４６９７は、１４０３５ｖ３／ＶＰ１６およびｐａｔ遺伝子発現カセットを含むバイナリープラスミドである。この構築物には以下の遺伝子要素が含まれる；ＲＢ７ ＭＡＲ ｖ３：：ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２：：１４０３５ ｖ３ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合：：Ａｔｕ ＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１：：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２ｖ：：ｐａｔ ｖ５：：ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４。そのバイナリーを、ＮｃｏI−ＳａｃＩ制限部位を介してｐＤＡＢ３９１６内に１４０３５ｖ３ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合をに含むＤＮＡ断片をクローニングすることによって構築した。ｐＤＡＢ８２２３とラベルされた得られた構築物は、ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２：：１４０３５ ｖ３ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合：：Ａｔｕ ＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１遺伝子発現カセットを含む。ｐＤＡＢ８２２３を、L-R Gateway（登録商標）Reaction（Invitrogen、Carlsbad, CA）によってｐＤＡＢ７３０９バイナリー内にクローン化した。この反応でｐＤＡＢ４６９７を作製し、そしてそれを制限酵素消化と配列決定反応によって確認した。
【０１８５】
ｐＤＡＢ４６９８は、１４０４７ｖ３／ＶＰ１６およびｐａｔ遺伝子発現カセットを含むバイナリープラスミドである。この構築物には以下の遺伝子要素が含まれる；ＲＢ７ ＭＡＲ ｖ３：：ＡｔＵｂｉ１０プロモーター ｖ２：：１４０４７ ｖ３ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合：：Ａｔｕ ＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１：：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２：：ｐａｔ ｖ５：：ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４。そのバイナリーを、ＮｃｏI−ＳａｃＩ制限部位を介してｐＤＡＢ３９１６内に１４０４７ｖ３ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合を含むＤＮＡ断片をクローニングすることによって構築した。ｐＤＡＢ８２２４とラベルされた得られた構築物は、ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２：：１４０４７ ｖ３ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合：：Ａｔｕ ＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１遺伝子発現カセットを含む。ｐＤＡＢ８２２４を、L-R Gateway（登録商標）Reaction（Invitrogen、Carlsbad, CA）によってｐＤＡＢ７３０９バイナリー内にクローン化した。この反応でｐＤＡＢ４６９８を作製し、そしてそれを制限酵素消化と配列決定反応によって確認した。
【０１８６】
３．２  アグロバクテリウムの形質転換
エレクトロポレーションのためにWeigel D., Glazebrook J. Arabidopsis: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002: pg123-124に記載のプロトコールを使用して、アグロバクテリウム細胞を調製した。アグロバクテリウムの最適な増殖を可能にするわずかな変更を、プロトコールに加えた（すなわち、ＹＥＰ培地をＬＢに置き換えた）。独立に、１．５〜３μｇの各構築物のプラスミドＤＮＡを、５０μｌのＣ５８：：Ｚ７０７ｓアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞に加え、そしてそっと混合した。混合物を、冷たい０．２ｃｍのGENE PULSER（登録商標）キュベット（BioRad、Hercules, CA）に移し、そして氷上に置いた。そのキュベットを、次に冷たいGENE PULSERRラック（BioRad、Hercules, CA）に置き、以下の条件でエレクトロポレーション処理した：静電容量出力２５μＦａｒａｄ、静電容量エクステンダー９６０μＦａｒａｄ、抵抗２００オーム、および電圧２．５ｋＶｏｌｔｓ。エレクトロポレーション直後に、９５０μｌのＳＯＣ培地（Irnvitrogen、Carlsbad, CA）を加え、そして混合物をFalcon2059チューブ（Becton Dickinson and Co.、Franklin Lakes, NJ）または同等物に移した。次いで、形質転換細胞を２８℃にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、５０μｌ、１００μｌ、および２００μｌの細胞を、適宜抗生物質を含む別々のＹＥＰ培地プレート（１リットルの水中、１０グラムの酵母抽出物、１０グラムのペプトン、５グラムのＮａＣｌ、１０グラムのショ糖、および１５グラムの寒天）上で平板培養した。そのプレートを２８℃にて約３６〜４８時間倒立培養した。単一コロニーを取り出し、適宜抗生物質を含む５０ｍｌの液体ＹＥＰ（１リットルの水中、１０グラムの酵母抽出物、１０グラムのペプトン、５グラムのＮａＣｌ、および１０グラムのショ糖）中、２８℃にて約３６時間増殖させた。
【０１８７】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株を、ケトラクトース試験によって確認した。推定上の形質転換コロニーを、ラクトース寒天上に画線接種し、そして２８℃にて４８時間インキュベートした。次いで、プレートをベネディクト溶液に浸した。そのプレートを観察した；ベネディクト溶液を青色から黄化色に変化させる画線接種した単離物を、アグロバクテリウムとして確認した（Bouzar, H., Jones, J., Bishop, A. "Simple Cultural Tests for Identification of Agrobacterium Biovars." Methods in Molecular Biology. Volume 44. Humana Press, 1995: 9-13）。
【０１８８】
ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）低コピー少量調製プロトコール（Qiagen、Valencia, CA）を完了後に、精製したプラスミドＤＮＡを細菌培養物から調製した。ＤＮＡ完全性を制限消化産物によって評価した。予想されたバンドパターンを有するクローンを特定し、そして５００μｌの無菌グリセロール（Sigma Chemical Co.、St. Louis, MO）に５００μｌの細菌培養物を加えることによって、グリセロール・ストックを調製し、そして倒立して混合する。グリセロール・ストックをドライアイス上で凍らせ、そして−８０℃にて保存した。
【０１８９】
３．３  ＺＦＰ ＴＦによるセイヨウアブラナの形質転換
胚軸切片の調製：セイヨウアブラナ遺伝子型Ｎｅｘ７１０の種子を、１０％の市販の漂白剤で１０分間、表面殺菌処理し、そして滅菌蒸留水で３回すすいだ。種子を無菌のペーパータオルによって乾かし、次いで、ＭＳ基本培地（Murashige and Skoog, Physiol. Plant 15(3): 473-497, 1962）、２０ｇ／Ｌのショ糖、および８ｇ／ＬのＴＣ寒天（PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS）の２分の１の濃度から成る「発芽培地」を含むＰｈｙｔａトレー内に置き、２３℃、および１６時間の明／８時間の暗の光期間を設定した培養体制下で維持した。
【０１９０】
５日目に、苗が無菌かどうかチェックし、そしてＰｈｙｔａトレーを、EDGEGARD（登録商標）層流フード（The Baker Company, Sanford, ME）内に置いて無菌を維持した。無菌の鉗子と剥離鋏を使用して、植物をＰｈｙｔａトレーから外し、そして空中（分裂組織と子葉）部分および根茎を取り外し、そして捨てた。胚軸を、乾燥を予防するのに必要である滅菌蒸留水の入った１００ｘ２５ｍｍのペトリディッシュ内に置いた。胚軸を、１００ｘ２５ｍｍのペトリディッシュの蓋に置き、そして＃１０メスを使用して３ｍｍの断片へと横方向に切った。胚軸切片を、無菌の濾紙を含む７ｇ／ＬのＴＣ Ａｇａｒで固めた、３０ｇ／Ｌショ糖、１ｍｇ／Ｌのキネチンおよび１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＭＳ培地から成る「カルス誘導培地」上に置いた。３日間、プレートを、透明なSTERILITE（登録商標）タブ内に入れ、そして前処理過程と同じ培養体制下で維持した。
【０１９１】
８日目に、断片を、１時間の前処理のために、３０ｇ／Ｌのグルコース、１／２濃度のGamborgビタミン（1968）、２１５．２ｍｇ／ｌのキネチン、および２２１．０４ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを含むLinsmaierおよびSkoog基本培地（1965）から成る「液体培地」２０ｍＬの入った１００ｘ２５の無菌のペトリプレートに移した。その「液中培養培地」を胚軸切片から取り除き、５０Ｋｌｅｔｔにて４０ｍＬのアグロバクテリウム懸濁液（Ｚ７０７中にｐＤＡＢ４６９５、ｐＤＡＢ４６９６、ｐＤＡＢ４６９７またはｐＤＡＢ４６９８を含む）を短時間ボルテックス処理し、そして３０分間の処置のために胚軸切片の入った１００ｘ２５ｍｍのペトリディッシュに注ぎ入れた。３０分後に、アグロバクテリウム懸濁液のすべてを、二重に重ねたピペットを使用して取り除いた。処理した胚軸を、濾紙を加えた「カルス誘導培地」上に戻し、STERILITE（登録商標）タブに返し、黒い蓋で覆い、そして３日間の共培養期間、上述と同じ培養体制下の培養室に戻した。３日後に、胚軸を、１ｍｇ／ＬのHERBIACE（登録商標）を含有する「カルス誘導培地」上に直接置き、透明な蓋のあるタブに戻し、そして上述と同じ培養体制を維持する培養室に返した。１週間後に、胚軸を、さらなるカルス発生のために２週間、３ｍｇ／ＬのHERBIACE（登録商標）における選択を含む「カルス誘導培地」に直接移し、そしてさらなるカルス発生のために２〜８週間、５ｍｇ／ＬのHERBIACEの選択を含む「カルス誘導培地」に移した。十分な量のカルスが利用入手可能になった時点で、それを分子分析にかけた。
【０１９２】
時間の経ったキャノーラカルスからの植物の再生：キャノーラカルス組織を、ｍｇ／ＬのHERBIACE（登録商標）の選択を伴う、３０ｇ／Ｌのショ糖、、３ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン、０．５ｇ／ＬのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリン）エタンスルホン酸）、５ｍｇ／Ｌの硝酸銀、１ｍｇ／Ｌのゼアチン、２５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、３００ｍｇ／Ｌのチメンチン、および７ｇ／ＬのＴＣ Ａｇａｒを含有するＭＳ培地から成る「芽再分化培地」上に置き、プレートを３Ｍのテープで包み、そして２３℃、および１６時間の明／８時間の暗の光期間にセットした培養体制下に置いた。次いで、組織を、５ｍｇ／ＬのHERBIACE（登録商標）の選択を伴った、０．５ｇ／ＬのＭＥＳ、３００ｍｇ／Ｌのチメンチン、２０ｇ／Ｌのショ糖、および７ｇ／ＬのＴＣ Ａｇａｒを含むＭＳ培地、から成る「芽伸長培地」に移した。栄養分体を、５ｍｇ／ＬのHERBIACE（登録商標）の選択を伴った、１０ｇ／Ｌのショ糖、０．５ｍｇ／Ｌのインドール酪酸、３００ｍｇ／Ｌのチメンチン、および８ｇ／ＬのＴＣ Ａｇａｒを含む１／２ＭＳ培地かあら成る「発根培地」に移した。
【０１９３】
試験管内で栄養分体上に根が確立した時点で、それらを、Metro Mix 360の入った５ １／４”ポットに移植した。植物を、透明なソロカップで覆い、そして気候順応化のためにconviron内に置いた。４８〜７２時間後に、カップを取り除いて、空気循環を可能にした。合計すると７日後に、さらなる生育のために、ポットをconvironから温室ベイに移した。植物を、昼間と夜間の気温が２２〜２４℃で、１６：８時間の光期間の下で栽培した。一次開花茎が伸び、そして花蕾を形成し始めたときに、植物全体を自殖バッグで覆い、他殖を予防した。自家受粉から得られた種子を、移植の約４カ月後に収穫した。
【０１９４】
アグロバクテリウムの調製：グリセロール・ストックからのアグロバクテリウムを、処置の４日前に、１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンおよび２５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを加えた、１０ｇ／Ｌのペプトン、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌのショ糖から成り、そして１５ｇ／ＬのＢａｃｔｏ Ａｇａｒで固めた「半固形細菌増殖培地」上に画線接種し、そして２８℃にてインキュベータ（Fisher Scientific Isotemp Incubator）内で２日間培養した。２日後に、アグロバクテリウムの小さいループを、２５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンと１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含む１５０ｍＬの「液体細菌増殖培地」（凝固剤を差し引いて上述のものと同じ）を入れた５００ｍＬの無菌の使い捨てバッフル付きフラスコ内に入れ、２００ｒｐｍにて密閉型振盪機（New Brunswick Scientific Innova 4330 refrigerated incubator shaker）により２８℃にて１６時間、一晩暗所内で培養した。１６時間後に、アグロバクテリウム培養物を、振盪機から取り出さし、そして５０ｍＬの遠心分離管中に分注した（１本には調製用に３５ｍＬ入れ、そして２本には再確認用に５０ｍＬを入れた）。遠心分離管を、遠心分離機（Beckman Model J2-21 centrifuge）内に入れ、そして６，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し、それに続いて赤色フィルターを備えたＫｌｅｔｔ５０の最終密度まで「液体培地」中に再懸濁した。
【０１９５】
実施例４：形質転換カルスサンプルの分析
推定上の形質転換のセイヨウアブラナカルスのサンプルを、β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ内因性遺伝子、チューブリン内因性遺伝子、およびＺＦＰ ＴＦ導入遺伝子のｍＲＮＡ発現の変化に関して分析した。チューブリンｍＲＮＡレベルを内部対照として使用して、、ＺＦＰ ＴＦおよびβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｍＲＮＡの発現を標準化した。ＺＦＰ ＴＦ ｍＲＮＡ発現データを、形質転換したカルス内の少なくとも１つの機能的なＺＦＰ ＴＦ導入遺伝子の存在を確認するために使用した。
【０１９６】
４．１  カルスサンプル調製
Ｎｅｘ７１０胚軸組織の形質転換後に、約４０〜５０個の８週齢のセイヨウアブラナのカルスサンプルを得た。それらを、実施例３．３で記載されているように、個別にＺＦＰ ＴＦ構築物、ｐＤＡＢ４６９５、ｐＤＡＢ４６９６、ｐＤＡＢ４６９７、およびｐＤＡＢ４６９８で形質転換した。対照サンプルをｐａｔ遺伝子発現カセット（ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２：：ｐａｔ ｖ３：：Ａｔｕ ＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ３）を含む対照バイナリー構築物の形質転換によって得た。すべてのサンプルを、それらの収穫までHERBIACE補充細胞培地で栽培した。
【０１９７】
全ＲＮＡを、新鮮なカルス組織からQiagen RNEASY96Kit（Qiagen、Valencia, CA）を使用して調製した。ＲＮＡを、キットの取扱説明書に従ってＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅによって処理して、あらゆるゲノムＤＮＡ混入物を取り除いた。まず最初に、鎖合成を、Superscript（登録商標）III Reverse Transcriptase Enzyme（Invitrogen、Carlsbad, CA）の製造業者の取扱説明書に従ってセットし、そしてランダムなヘキサマーをプライマーとして使用した。合成ｃＤＮＡ鎖を、水で１：１０および１：５０の比率で希釈した（これがＰＣＲ増幅多重標的に十分な鋳型を提供する）。各アリコートを−２０℃にて無期限に保存した。
【０１９８】
４．２  β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｍＲＮＡ発現解析
ｑＲＴ−ＰＣＲ反応ミックスを、以下のとおりβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｃＤＮＡの増幅のために準備した：７．５μＬの２Ｘ ＬＣ４８０マスターバッファー（Roche Diagnostic, Indianapolis, IN）、１０μＭのストックからの０．３μＬの遺伝子特異的順方向プライマー（配列番号２８：５’−ＴＴＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣ−３’；図８のアラインメントにおいて配列番号３の５４４位〜５６３位のヌクレオチド）、１０μＭのストックからの０．３μＬの遺伝子特異的逆方向プライマー（配列番号２９：５’−ＴＴＴＣＣＡＴＡＴＣＣＡＴＣＧＣＡＡＣＡ−３’；図８のアラインメントにおいて配列番号３の５８８位〜６０７位のヌクレオチド）、LIGHTCYCLER（登録商標）480 Probes Masterからの０．１５μＬのＵＰＬプローブ＃２５（Roche Diagnostic, Indianapolis, IN）、１．５μＬの１０％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン−４０（ＰＶＰ−４０）、および３．９μＬの水。ＵＰＬプローブ（Roche Diagnostics, Indianapolis, USA）は固定核酸であり、そのため別の方法で計算するより高いＴｍを持つ。標準および未知のものを扱う前に、全成分を冷凍庫内に戻した。３８４ウェルマイクロプレートを区切り、ラベルを付し、ウェルごとに１３．５μＬのマスターミックスを加えた。密封用ホイルをそっとマイクロプレートに取り付けた。そのプレートをQiagenマイクロプレート遠心分離機により３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。１．５μＬの解凍し、希釈した合成ｃＤＮＡ鎖を加えた。さらに、１．５μＬのプラスミドＤＮＡコピー数標準を、最低濃度から最高濃度までの希釈系列で離れたウェルに加え、これらの標準をβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｃＤＮＡ（全ｍＲＮＡから合成）と比較してコピー数を定量した。一連のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ＤＮＡコピー数標準を、ｐＣＲ２．１プラスミド（Invitrogen、Carlsbad, CA）内に標的増幅産物をクローニングし、そしてコピー数を定量化するための希釈系列を作ることによって作製した。ホイルシールをしっかりプレートに付け、そして先に記載したように遠心分離した。ＰＣＲプログラムを以下のとおり実施した：ｉ．活性化９５℃５分間；ｉｉ．変性４．８°Ｃ／秒にて９５℃１０秒間；ｉｉｉ．アニール／伸長２．５°Ｃ／秒にて６０℃２５秒間；ｉｖ．確保４．８°Ｃ／秒にて７２℃１秒間；ステップｉｉ−ｉｖをあと４０〜５０回繰り返す；５秒間で３８℃に冷やす。ＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲ装置ＬＣ４８０（Roche, Indianapolis, IN）または同等物で増幅した。増幅産物サイズは６４塩基対であった。このＰＣＲアッセイで用いた順方向および逆方向プライマー配列は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子標的のうちの２つ、配列番号３および３０の中の対応配列に完全に一致した（図８）。そのため、このアッセイは、２つのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子標的の定量的な発現を表した。
【０１９９】
４．３  チューブリンｍＲＮＡ発現解析
チューブリン遺伝子（セイヨウアブラナの天然遺伝子（GenBank：AF258790およびGenBank：DU106489）を、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて遺伝子全般でｍＲＮＡ発現シグナルを正確に標準化する参照標準として使用した。β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩｑＲＴ−ＰＣＲアッセイのために合成したｃＤＮＡ（実施例４．１に記載）もまた、以下で記載したようにチューブリンｑＲＴ−ＰＣＲアッセイに使用した。
【０２００】
ｑＲＴ−ＰＣＲを、０．３μＬの遺伝子特異的順方向プライマー（配列番号３１：５’−ＡＣＡＧＣＧＡＴＴＧＣＣＴＡＣＡＡＧＧ−３’）（１０μＭストック）および０．３μＬの遺伝子特異的逆方向プライマー（配列番号３２：５’−ＡＧＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＴＣＡＣＣＡＡＡＧＧ−３’）（１０μＭストック）、１．５μＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ−４０、３．９μＬの水、ならびに７．５μＬの２Ｘ LIGHTCYCLER（登録商標）480 SYBR Green I Master Mix（Roche, Indianapolis, IN）を用いて準備して、ＤＮＡを検出し、そして定量化した。３８４ウェルマイクロプレートを区切り、ラベルを付し、ウェルごとに１３．５μＬのマスターミックスを加えた。密封用ホイルをそっとマイクロプレートに取り付けた。そのプレートをQiagenマイクロプレート遠心分離機により３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。密封用ホイルを外し、そして１．５μＬの解凍し、希釈した合成ｃＤＮＡ鎖を加えた。さらに、１．５μＬのプラスミドＤＮＡコピー数標準を、最低濃度から最高濃度までの希釈系列で離れたウェルに加え、これらの標準をチューブリンｃＤＮＡ（全ｍＲＮＡから合成）と比較してコピー数を定量した。一連のチューブリンＤＮＡコピー数標準を、ｐＣＲ２．１プラスミド（Invitrogen、Carlsbad, CA）内に標的増幅産物をクローニングし、そしてコピー数を定量化するための希釈系列を作ることによって作製した。ホイルシールをしっかりプレートに付け、そして先に記載したように遠心分離した。ＰＣＲプログラムを以下のとおり実施した：ｉ．活性化９５℃１０分間；ｉｉ．変性４．８°Ｃ／秒にて９５℃１０秒間；ｉｉｉ．アニール／伸長２．５°Ｃ／秒にて５５．５℃２０秒間；ｉｖ．確保４．８°Ｃ／秒にて７２℃２０秒間；ステップｉｉ−ｉｖをあと３９回繰り返す；５秒間で３８℃に冷やす。ＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲ装置ＬＣ４８０または同等物で増幅した。３０７塩基対の増幅産物をこの反応で増幅した。この逆方向プライマーは、GenBank配列に基づく７８ｂｐのイントロンに及ぶ。そのため、ゲノムＤＮＡから増幅された単位複製配列は好まれず、ゲノムＤＮＡ混入物は分子量がより大きいので、単位複製配列をアガロースゲル上で泳動することによって、ｃＤＮＡのものと容易に区別できる。
【０２０１】
４．４  ＺＦＰ ＴＦ ｍＲＮＡ発現分析
ＺＦＰ ＴＦ ｍＲＮＡの発現を、β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｍＲＮＡのために元々合成した（実施例４．１で先に記載）ｃＤＮＡサンプルから定量した。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイを、５’のｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ配列および３’のＶＰ１６配列に対するアンカリング・プライマーによってＺＦＰカセットから設計した。ＰＣＲアッセイを、以下のものを使用して準備した：１０μＭのストックからの０．５μＬの順方向プライマー「ＯＰ２＿ＮＬＳ＿Ｆ１」（配列番号３３：５’−ＡＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＡＡＣＡＧ−３’）、１０μＭのストックからの０．５μＬの逆方向プライマー「ＶＰ１６＿Ｒ１」（配列番号３４：５’−ＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＧＴＡ−３’）、５μＭのストックからの０．２５μＬのプローブ「ＶＰ１６＿ＭＧＢ＿１８５」（配列番号４５：５’−ＴＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴ−３’）、１．５μＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ−４０、１．５μＬの１０ｘ HOT START PCRバッファー、１．０μＬの２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１．２μＬのｄＮＴＰ（それぞれ２．５ｍＭ）、０．１５μＬのHot Start Taq Polymerase（Qiagen、Valencia, CA）、および６．９μＬの水。その混合物を、LIGHTCYCLER（登録商標）480（Roche Diagnostics、USA）を使用して増幅した。３８４ウェルマイクロプレートを区切り、ラベルを付し、ウェルごとに１３．５μＬのマスターミックスを加えた。密封用ホイルをそっとマイクロプレートに取り付けた。そのプレートをQiagenマイクロプレート遠心分離機により３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。密封用ホイルを外し、そして１．５μＬの解凍し、希釈した合成ｃＤＮＡ鎖を加えた。ホイルシールをしっかりプレートに付け、そして先に記載したように遠心分離した。ＰＣＲプログラムを以下のとおり実施した：ｉ．活性化９５℃１５分間；ｉｉ．変性４．８°Ｃ／秒にて９５℃２０秒間；ｉｉｉ．アニール／伸長２．５°Ｃ／秒にて６０℃２０秒間；ｉｖ．確保４．８°Ｃ／秒にて７２℃５５秒間；ステップｉｉ−ｉｖをあと４４回繰り返す；５秒間で３８℃に冷やす。ＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲ装置ＬＣ４８０または同等物で増幅した。増幅産物サイズは７７５塩基対であった。ＺＦＰ ＴＦ ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡのコピー数を、先のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩやチューブリンの実施例について記載したように、標的増幅産物をプラスミド内にクローン化した一連の標準を使用し、そしてＰＣＲアッセイのための希釈系列を作製して測定した。
【０２０２】
４．５  カルスサンプルの発現解析
ＺＦＰ ＴＦ ｍＲＮＡ発現を、推定上ＺＦＰ ＴＦで形質転換され、そしてHERBIACE（登録商標）選択培地上で栽培した、８週齢のトランスジェニックカルスサンプルで計測した（実施例３を参照のこと）。
ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイで計測されるＺＦＰ ＴＦの定量的ｍＲＮＡ発現は、構築物を含むＺＦＰ ＴＦだけで形質転換したサンプルでは検出されたが、対照構築物を含むサンプルでは検出されなかった。このデータは、アッセイがＺＦＰ ＴＦ発現に特異的であり、かつ、対照カルスがＺＦＰ ＴＦ導入遺伝子を含んでいないことを示した。
【０２０３】
β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩとチューブリンｍＲＮＡ発現の比をｑＲＴ−ＰＣＲの結果に基づいて計算して、カルスサンプル間の発現の違いを識別した。β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｍＲＮＡの最も高いｍＲＮＡ上方制御を、ｐＤＡＢ４６９５構築物で形質転換したキャノーラカルスのサンプルで観察した（表４）。この２７％の上方制御は、対照サンプルの上方制御を通じて統計的に有意であった（ｐ＝０．０５）。
【０２０４】
【表４】
2013507960.tif 000005
【０２０５】
実施例５：形質転換Ｔ0植物サンプルの分析
５．１  β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ、チューブリン、およびＺＦＰ ＴＦ ｍＲＮＡ発現の分析
ｐＤＡＢ４６９５導入遺伝子構築物を含むＴ0キャノーラを、六葉植物期まで栽培し、そしてβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ内因性遺伝子、チューブリン内因性遺伝子、およびＺＦＰ ＴＦ導入遺伝子のｍＲＮＡ発現について分析した。トランスジェニック植物を、ｐａｔ遺伝子発現カセット（ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２：：ｐａｔ ｖ３：：Ａｔｕ ＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ３）を含むバイナリーの構築物で形質転換した対照サンプルと比較した。標準的なサイズのペーパーパンチャーからの６つの葉パンチを、氷上に各植物からサンプル抽出し、そして総ｍＲＮＡを、製造業者の取扱説明書に従ってQiagen ９６ウェルRNeasy RNA抽出キット（Qiagen、Carlsbad, CA）で抽出した。β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ、チューブリン、およびＺＦＰ ＴＦ ｍＲＮＡ発現解析を、実施例４において先に記載したプロトコールを使用して完了した。
【０２０６】
β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｍＲＮＡの発現は、独立したトランスジェニックＴ0植物の間で異った。３倍を超えるｍＲＮＡ上方制御を、分析した１６事象の中で観察した（図３）。すべての植物が、ＺＦＰ ＴＦ発現に関して陽性であった。加えて、２７の対照植物を、β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｍＲＮＡ発現のベースラインを計算するのに使用した。ベースライン対照からのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｍＲＮＡの平均発現を、個々のＺＦＰ ＴＦ植物事象からのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｍＲＮＡの発現と比較して、発現の増加倍数を計算した（図３）。これらの植物を、Ｔ1種子を得るために熟すまで栽培した。開花前に、すべての植物を、個別に自殖バッグで覆って、植物内の花の自家受粉を容易にした。温室にそれらを移した約４カ月後に、これらの植物のＴ1種子を採取した。
【０２０７】
異なるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｍＲＮＡ発現範囲を表す事象３、６および１２．２（これ以降事象１２とも呼ばれる）を、さらなる研究のために選択した。
【０２０８】
実施例６：形質転換Ｔ1植物サンプルの分析
６．１  Ｔ1種子の脂肪酸分析
単一種子の脂肪酸分析を、１事象あたり２４個の個々のＴ1種子に対して実施して、脂肪酸含有量の変化に対するＺＦＰ ＴＦの効果を研究した（表５）。ＡＯＣＳ法Ｃｅ２−６６（９７）に基づく脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）解析法を利用した、そして表５中のすべて数字が、キャノーラ種子中に存在する総脂肪酸のパーセンテージとして表されている。
【０２０９】
【表５】
2013507960.tif 000006
【０２１０】
サンプル調製のために、個々の単一種子を、１／８インチの鋼球（Small Parts, Miramar, FL）１つが入った９６ウェル抽出プレート上のラベルを付けたクラスターチューブの中に入れた。チューブにキャップをし、そしてその種子を１３００ストローク／分にて３．０分間、GenoGrinder（SPEX CertiPrep Group, Metuchen, NJ）で乾式粉砕した。キャップを外し、そして０．６ｍＬのヘプタンを各ウェルに加えた。ウェルに再びキャップをし、１２００ストローク／分にて２．０分間のさらなる粉砕のために、GenoGrinder内に戻した。次いで、サンプルを取り出し、そして３７００ｒｐｍ、６℃にて１０．０分間遠心分離した。Beckman Coulter MC Robotを使用して、上清を、はめ込みガラスを備えた９６ウェルプレート（MicroLiter, Suwanee, GA）に移した。４０μＬの１％ナトリウム・メトキシドをサンプルに加えた。ナトリウム・メトキシドを、ストックの３０％溶液からメタノール（Fluka/Sigma Aldrich, St. Louis, MO）で希釈した。プレートを、テフロン裏張りマットで蓋をし、そしてＧＣ分析前に４時間、室温にてインキュベートできるようにした。
【０２１１】
サンプルを、J&W Scientific DB-23カラム、１５メートル×０．２５ｍｍのＩＤカラムおよび０．２５μｍの膜厚（J&W Scientific, Folsom, CA）を備えたAgilent 6890 GC-FID（Agilent Technologies、Santa Clara, CA）により脂肪酸含有量について分析した。最初のオーブン温度は２００℃であり、この温度を実行中維持した。入口を、１：１００の分割比および２８０℃の温度に設定した。０．８ｍＬ／分のヘリウムの一定の流量を、最初の２分間維持した。次いで、流量を１．０ｍＬ／分から２．５ｍＬ／分の割合で増やし、１．５分間維持した。検出装置を、一定のキャリアガスを作り出す３００℃、ならびに３０ｍＬ／分のカラム流量、３０ｍＬ／分の燃料水素流量、および４００ｍＬ／分の酸化剤流量にセットした。２μＬの注入体積をすべてのサンプルに使用した。
【０２１２】
個々の脂肪酸メチルエステルピークを、Waters Corp. Empower Softwareを使用したメチルエステル参照標準（GLC#428, Nu-Chek-Prep, Inc., Elysian, MN）の保持時間との比較によって決定した。個々のパーセント面積を、積分クロマトグラフィーピーク面積の合計に基づく参照標準におけるすべての分析物について計算した。ヘプタンブランクもまた注入し、ＧＣにおける任意の混入を特定した。
【０２１３】
Ｔ1種子と、３つの最低Ｃ１６：０レベル（たぶんＺＦＰ ＴＦ陽性植物である）および３つの最高Ｃ１６：０レベル（たぶんＺＦＰ ＴＦヌル植物である）との比較は、Ｃ１６：０含有量の変化がＺＦＰ ＴＦ導入遺伝子の分離に起因し得ることを示唆した（表５）。総Ｃ１８（Ｃ１８：０＋Ｃ１８：１＋Ｃ１８：２＋Ｃ１８：３）における対応する変化もまた、すべての事象で観察された；低いＣ１６：０レベルを有する種子が高い総Ｃ１８レベルを有し、その逆もまた同様であった。これは、形質転換されたＮｅｘ７１０遺伝子型におけるｆａｄ２およびｆａｄ３変異遺伝子（Hu, X., et al., Theor. Appl. Genet. 2006, 113: 497-507）の分離に起因するＣ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２およびＣ１８：３の個々の脂肪酸含有量における変動性にかかわらないものであった。そのため、次のステップを、それぞれの事象のＴ1分離集団におけるＺＦＰ ＴＦ陽性、および同胞ヌル植物を特定するために行なって、同様の遺伝的背景における脂肪酸プロフィールの実際の変化を検出した。
【０２１４】
６．２  Ｔ1植物におけるＺＦＰ ＴＦ存在分析
全３種類のトランスジェニック事象３、６、および１２のＴ1苗１００〜１５０本を、ＺＦＰ ＴＦ陽性、および同胞ヌル植物を特定するためにスクリーニングした（表６）。植物を、少なくとも１つのＺＦＰ ＴＦ導入遺伝子の完全長カセットの存在について試験した。QIAGEN PLANT DNEASY抽出キット（Qiagen、Valencia, CA）を用いて製造業者の推奨に従って、これらの植物の葉から総ゲノムＤＮＡを単離した。プロトコールを、QiagenバッファーＡＰ１に１％の終濃度でＰＶＰ４０を加えることによって変更した。精製したｇＤＮＡを、PICOGREEN（登録商標）ＤＮＡ定量化プロトコール（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）によって定量化した。ＤＮＡサンプルを、最少で１つのＺＦＰ ＴＦ導入遺伝子の完全長コピーの存在について、以下の試薬を含むＰＣＲアッセイによりアッセイした：５μＬの１０Ｘ EX Taqバッファー（Takara Bio Inc., Otsu, Siga, Japan）、５μＬの１０％ポリビニル・ピロリドン−４０、１０μＭのストックからの１．０μＬのｕｂｉ１０順方向プライマー（配列番号３５：５’−ＧＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＣＡＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＧ−３’）、１０μＭのストックからの１．０μＬのＡｔｕＯＲＦ２３逆方向プライマー（配列番号３６：５’−ＣＣＡＴＧＴＴＧＧＣＡＡＡＧＧＣＡＡＣＣ−３’）、４μＬのｄＮＴＰ（それぞれ２．５ｍＭ）、０．２μＬのTaKaRa EX Taq（商標）Hot Start、３１．８μＬの水、および２μＬの１０ｎｇ／μＬの濃度のＤＮＡ。ＰＣＲサイクル条件は、以下のとおりであった：９４℃２分間、１０サイクルのタッチダウンＰＣＲに９８℃１０秒間、６５℃２０秒間、６０℃までサイクルごとに０．５℃温度を下げ、続いて７２℃３：００分間。これに、３５サイクルの９８℃１０秒間、６０℃２０秒間、そして７２℃３：００分間、および７２℃１０分間の最後の伸長が続いた。それぞれの反応物５μｌを１％アガロースゲル上で泳動して、２６６２ｂｐの予想されるサイズのＺＦＰ ＴＦバンドを検出した。
【０２１５】
ｐａｔ遺伝子（ｐＤＡＢ４６９５構築物内で分子的にＺＦＰ ＴＦに連結している）の定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを開発し、そしてｐａｔ陽性およびヌル植物を特定するためにそれを適用して、分子的に連結しているＺＦＰ ＴＦカセットとの遺伝的分離を確認した。
【０２１６】
【表６】
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【０２１７】
ｐａｔのTaqMan RT-PCRアッセイのための反応ミックスは、次のものを含んでいる：３μＬのRoche LIGHTCYCLER（登録商標）Cycler 480 II Probes ２×マスターミックス、０．６μＬの１０％ＰＶＰ−４０、１０μＭストックからの０．２μＬのそれぞれのｐａｔ順方向プライマー（配列番号３７：５’−ＡＣＡＡＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴ−３’）、１０μＭストックからの０．２μＬのｐａｔ逆方向プライマー（配列番号３８：５’−ＣＴＴＴＧＡＴＧＣＣＴＡＴＧＴＧＡＣＡＣＧＴＡＡＡＣＡＧＴ−３’）、５μＭのストックからの０．２μＬのプローブ（配列番号３９：５’−６ＦＡＭ−ＣＣＡＧＣＧＴＡＡＧＣＡＡＴＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＡＣＣ−クエンチャー−３’）、そしてそれを、以下のとおり、ＨＭＧ（GenBank：AF127919）の内部参照標準を以下の試薬を用いて多重化した：１０μＭストックからの０．２μＬのそれぞれのＨＭＧ順方向プライマー（配列番号４０：５’−ＣＣＴＣＴＣＴＡＣＣＡＣＣＧＴＣＴＣＡＣＡＴＧ−３’）、１０μＭストックからの０．２μＬのＨＭＧ逆方向プライマー（配列番号４１：５’−ＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＧＡＣＴＧＴＴＴＣＡ−３’）、５μＭのストックからの０．２μＬのプローブ（配列番号４２：５’−６ＦＡＭ−ＣＧＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＣＣＡＣＣＴＣＡＡＣＣＡ−クエンチャー−３’）、１μＬのＤＮＡおよび０．２μＬの水。ＰＣＲサイクル条件は、以下のとおりであった：１サイクルの９５℃５分間、４０サイクルの９５℃１０秒間、６０℃４０秒間、そして７２℃１秒間。すべてのサンプルを、Roche LIGHTCYCLER（登録商標）480 PCRマシンで１〜４コピーのトランスジェニックゲノムＤＮＡ標準と共に３８４ウェルプレート内で三重反復試験で増幅した。
【０２１８】
各事象の中のＺＦＰ ＴＦ陽性、およびヌル植物の分離比に基づいて、事象３、６、および１２は、セイヨウアブラナゲノム内にそれぞれ約２、１、および２個のＺＦＰ ＴＦ導入遺伝子の挿入を含む（表６、３列目）。このデータは、全３事象におけるｐａｔ遺伝子分離データと一致した。
【０２１９】
６．３  Ｔ1植物におけるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｍＲＮＡの上方制御
表６、３列目に示したすべてのＴ1 ＺＦＰ ＴＦ陽性および同胞ヌル植物を、次いで、内因性β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子、ＺＦＰ ＴＦ導入遺伝子、および内因性チューブリン遺伝子のｍＲＮＡ発現解析にかけた。後者は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩおよびＺＦＰ ＴＦ遺伝子発現を標準化するための参照遺伝子としての役割を果たした。六葉植物期のそれぞれからの６つの葉パンチを氷上にサンプル抽出し、そして全ＲＮＡをQIAGEN RNAEASY（登録商標）キットを使用して抽出した。ｃＤＮＡ鎖の合成および希釈を、実施例４．１に記載のとおり完了した。
【０２２０】
合成ｃＤＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を、すべての３つの遺伝子について完了した。β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩおよびチューブリンｍＲＮＡ発現解析を、それぞれ実施例４．２および実施例４．３にに記載のとおり実施した。ＺＦＰ ＴＦアッセイを変更した。ＰＣＲ反応を、以下のとおり準備した：反応条件は以下のとおりであった：７．５μＬの2X LC480マスターバッファー（Roche Diagnostic、Indianapolis, IN）、０．３μＬの遺伝子特異的順方向プライマー＃１（配列番号４３：５’−ＴＣＧＡＴＣＴＴＧＡＴＡＴＧＴＴＧＧＧＡＧＡ−３’）（１０μＭのストック）、０．３μＬの遺伝子特異的逆方向プライマー＃２（配列番号４４：５’−ＡＧＧＴＧＣＡＧＡＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＧ−３’）（１０μＭのストック）、０．１５μＬのＵＰＬプローブ＃８５、１．５μＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ−４０、および３．９μＬの水。３８４ウェルマイクロプレートを、区切り、そして先に記載したミックス１３．５μＬをウェルごとに加えた。密封用ホイルをプレートに貼り付け、そしてそのプレートを３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。フィルムを取り外し、そして、１．５μＬの解凍し、希釈した第一鎖をウェルごとに加えた。加えて、ｃＤＮＡ標準を、離れた対照ウェルに加えた。ホイルシールを、プレート上に貼り付け、そして遠心分離ステップを繰り返した。ＰＣＲプログラムを以下の条件で実施した；ｉ．活性化；９５℃５分間、ｉｉ．変性９５℃１０秒間（＠４．８°Ｃ／秒間にて）、ｉｉｉ．アニーリング／伸長６０℃２５秒間（＠２．５°Ｃ／秒間にて）、ｉｖ．確保７２℃１秒間（＠４．８°Ｃ／秒間にて）、ｖ．ステップｉｉ−ｉｖをあと３９〜４９回繰り返す、ｖｉ．５秒間で３８℃に冷やす。
【０２２１】
ＺＦＰ ＴＦ ｍＲＮＡ発現は、ＺＦＰ ＴＦ陽性サンプルの事象３で最も低く、事象６で最も高かった（図４）。ヌル植物は、ＺＦＰ ＴＦ ｍＲＮＡを発現せず、ＺＦＰ ＴＦアッセイがＺＦＰ ＴＦ導入遺伝子の存在に特異的であったことを示した。ＺＦＰ ＴＦの標的であるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子のｍＲＮＡレベルは、すべての事象のＺＦＰ ＴＦ陽性植物において上方制御された（図５）。β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｍＲＮＡ発現の３〜４倍の増加は、各事象内でのＺＦＰ ＴＦ陽性と対応する同胞ヌル植物の対比較によって観察した。
すなわち、β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｍＲＮＡレベルの上方制御は、各事象内でのＺＦＰ ＴＦ ｍＲＮＡ発現レベルの増大に対して関連があった、すなわち、事象６で最も低く、事象３で最も高い（図４）。
【０２２２】
６．４  Ｔ1植物の葉の脂肪酸分析
Ｔ1葉サンプルの第２セットを、実施例６．３に記載のｍＲＮＡ分析サンプルの採取と同時に脂肪酸分析のために採取した。しかしながら、サンプルのサブセットだけを、表６の４列目に示されている成熟まで進められた植物のみに関して脂肪酸について分析した。葉材料の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）分析を以下のとおり完了した。１０〜１００ｍｇの葉材料を、氷上に採取し、次いで凍結乾燥し、その後、無水メタノール中、４０℃にて２０分間の０．２５Ｍのナトリウム・メトキシドを用いたメチル基転移反応を行なった。メチル基転移反応後に、脂肪酸を、代替標準としてヘプタデカノインを含むヘプタン溶液で３回抽出した。単離したヘキサン画分を脱水し、そして既知の量のヘプタンで再懸濁した。得られた脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を、ＳＧＥ製のＢＰＸ７０キャピラリーカラム（１５ｍｘ０．２５ｍｍｘ０．２５μｍ）のを使用してＧＣ−ＦＩＤによって分析した。各ＦＡＭＥを、それらの保持時間によって特定し、そしてキャリブレーション標準としてMatreya LLC製のナタネ油基準ミックスの注入によって定量化した。反応の完全性を、４番目の抽出／導出中の内因性ＦＡＭＥの存在をチェックすることによって確かめた。
【０２２３】
全３事象が、各事象内でのＺＦＰ ＴＦ陽性植物と対応する同胞ヌル植物の対比較において総Ｃ１６：０含有量の低下および総Ｃ１８含有量の付随する増加を示した（表７）。例えば、事象１２のＺＦＰ ＴＦ陽性植物は、それ自体の同胞ヌルと比較して、６．３％のＣ１６：０含有量の低下および１．４４％の総Ｃ１８含有量の増大を実証した。
【０２２４】
【表７】
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【０２２５】
実施例７：ＺＦＰ ＴＦトランスジェニックＴ2種子の分析
各事象内で最も高いβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ ｍＲＮＡ発現を実証したＺＦＰ ＴＦ陽性植物と同胞ヌル植物のサブセットを、Ｔ2種子を得るために成熟まで進展させた（表６、４列目）。例外は事象３であり、低い発現範囲を有するいくつかのＺＦＰ ＴＦ陽性植物もまた進展させた。これらは、ｐＤＡＢ４６９５導入遺伝子の他の分離挿入を表す可能性があった。それぞれのＴ1植物を、メッシュバッグで覆って、所定の植物の中での自家受粉を容易にした。種子を収穫し、そして脂肪酸レベルをアッセイした。
【０２２６】
Ｔ2脂肪酸分析を、実施例６．１のＴ1種子分析について記載したように１植物あたり２４個の種子のプールに対して実施した。結果は、それらの対応する同胞ヌル植物との対比較により、全３事象のＺＦＰ ＴＦ陽性植物の中のＣ１６：０含有量の低下を示した（表８Ａおよび８Ｂ）。Ｃ１６：０含有量のこの低下は、事象１２、３および６に関して、それぞれ１２．６％、１１．２％および２２．３％であった。一貫した低下もまた、Ｃ１６：１含有量で観察された。Ｃ１６：０とＣ１６：１含有量の低下に対応して、総Ｃ１８（Ｃ１８：０＋Ｃ１８：１＋Ｃ１８：２＋Ｃ１８：３）含有量の付随する増大が、対応する同胞ヌル植物との対比較によりＺＦＰ ＴＦ陽性植物において観察された。ＺＦＰ ＴＦ陽性植物と対応する同胞ヌル植物との３つの対比較すべてが、ＪＭＰ統計ソフトウェアを用いた分析により総Ｃ１６（Ｃ１６：０＋Ｃ１６：１）含有量、および総Ｃ１６／総Ｃ１８含有量の増加に関して統計的に有意（ｐ＝０．００１）であった（図６ＡおよびＢ）。３つの事象は同胞ヌル植物観察に基づいてそれらのＣ１６：０含有量において可変であったが（表８Ａおよび８Ｂ）、ＺＦＰ ＴＦは、ほぼ同じ水準；２．９３〜３．０５の間、までＣ１６：０含有量を低下させる際に効果があった。事象３および１２のＺＦＰ ＴＦ陽性植物のすべての種を蒔いたのに対して（表８および９）、事象６のＺＦＰ ＴＦ含有植物１つだけの種を蒔いた。事象６のこの特定の植物は、Ｔ1葉脂肪酸データに基づくとＣ１６：０含有量が最も高かった。表８Ａおよび８Ｂは、ｐＤＡＢ４６９５のＺＦＰ ＴＦ陽性植物および対応する同胞ヌル植物の３つのセイヨウアブラナ・トランスジェニック事象のＴ2脂肪酸プロフィールの比較を示す。このデータは、ＦＡＭＥ分析を用いて得られ、そして６．１項に記載される。Ｃ１２：０〜Ｃ２４：１脂肪酸を分析し、そして主なものをこれらの表中に示す。すべての数字は、セイヨウアブラナ種子における総脂肪酸のパーセンテージを表した。
【０２２７】
【表８】
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【０２２８】
【表９】
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【０２２９】
表９は、表８Ａおよび８Ｂに示した個々の脂肪酸に基づく総脂肪酸プロフィールを示す。
【０２３０】
【表１０】
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【０２３１】
すべての長鎖脂肪酸（総Ｃ１８、総Ｃ２０、総Ｃ２２、および総Ｃ２４）を組合せることで、同胞ヌルと比較して、０．４％〜１．２％の増加が異なる事象のＺＦＰ ＴＦ陽性植物で観察された。より長い鎖脂肪酸の中で、Ｃ２０：１の２５％の増加が、事象６に関するＺＦＰ ＴＦ陽性植物において著しかった。総飽和脂肪酸含有量の低下もまた、すべての事象のＺＦＰ ＴＦ含有植物で観察された。それは、事象１２の６％の低下〜事象６の３１％の低下の範囲に及んだ。
【０２３２】
要約すれば、Ｔ0およびＴ1植物におけるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子のＺＦＰ ＴＦ媒介性転写上方制御、ならびにＴ2種子における総Ｃ１６の低下および総Ｃ１８脂肪酸含有量の増加が、例示された。これらのデータは、種子油プロフィールに予測される変化をもたらし、それが子孫の作出を越えて相続可能である、脂肪酸生合成経路の中の特定の遺伝子を標的化および変更する新規ＺＦＰ ＴＦ技術のうまい適用を実証している。
【０２３３】
実施例８−１５：ＦａｔＢの上方調節／下方調節
色素体は、高等植物のデノボ脂肪酸生合成の主要な部位である（Ohlrogge etal, 1979, ProcNatlAcad Sci USA 76:1194-8; Thelen and Ohlrogge, 2002, Metabolic Engineering 4:12-21）。色素体内で利用されなかった脂肪酸は、アシル−アシル担体タンパク質（アシル−ＡＣＰ）の加水分解によってアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＦＡＴ）の特異的活性を通して細胞質にエクスポートされて、遊離脂肪酸を放出する。植物には２つのクラスのＦＡＴ酵素、ＦＡＴＡおよびＦＡＴＢが存在する。ＦＡＴＡクラスは、体外において１８：１−ＡＣＰを好むが、ＦＡＴＢクラスは飽和アシル−ＡＣＰ基質、例えば１６：０−ＡＣＰおよびＣ１８：０−ＡＣＰなどを好み、その他の異種基質特異性も示す（Doermann et al, 1995, Arch. Biochem, Biophys. 316:612-618; Voelker et al. 1997, Plant Physiology 114: 669-677; Salas and Ohlrogge, 2002, Archives of Biochemistry and Biophysics, 403:25-34）。ＦＡＴＡと同様に、ＦＡＴＢもまたすべての植物組織中に存在すると見なされるが、発育中の種子で主に発現される（Jha et al., 2006, Plant Physiology and Biochemistry 44:645-655）。
【０２３４】
アラビドプシス（Arabidopsis）核ゲノムは、２つのＦａｔＡ遺伝子と１つのＦａｔＢ遺伝子をコードする。ＦａｔＢ活性の不活性化は、グリセロリピド中の飽和脂肪酸含有量を劇的に低下させる。例えば、Ｔ‐ＤＮＡの挿入によって作製したＦａｔＢ突然変異体において、パルミタート（１６：０）およびステアラート（１８：０）含有量は、組織によってそれぞれ４２〜５６％および３０〜５０％低下した（Bonaventure et aL, The Plant Cell, 2003 15:1020-1033）。植物の成長速度は、この突然変異体で大いに影響を受け、野生型と比較して、４週間にて５０％少ない生体重量をもたらした。この知見は、ＦａｔＢが植物体内において飽和脂肪酸の運命を決定する重要な因子として機能するという意見を支持している。
【０２３５】
主要な油料種子作物であるセイヨウアブラナは、モデル種アラビドプシスの近縁種である複二倍体種であるが、アラビドプシスのサイズに比べて約８倍大きなゲノムサイズを有している。その結果、アラビドプシスの１つに比べて、６つのＦａｔＢ遺伝子がこの種で報告された（WO2009/007091）。この複雑さが、それらの操作のために個々のＦａｔＢ遺伝子の機能を理解することを難しくしている。逆に、多数の遺伝子の存在が、完全にそれをノックアウトする代わりに、所望の脂肪酸目標に向かって複数の遺伝子発現を操作することをより簡単にしている。ジンクフィンガー転写因子は、本質的にあらゆるＤＮＡ配列に結合し、そして標的とした遺伝子の遺伝子機能を変調することが知られている（Van Eenennaam et al, Metab. Eng. 20046:101-108; Sanchez etal, 2006, Plant Biotechnology Journal 4:103-114）。結果として、このツールを、セイヨウアブラナにおけるそれらの機能を理解するためにＦａｔＢ遺伝子に適用できる。この知識は、飽和脂肪酸が低い所望の「より健康な」キャノーラ種子油に向けて、１〜複数のＦａｔＢ遺伝子の発現を操作する助けとなるであろう。
【０２３６】
以下の実施例８〜１５は、種子における脂肪酸プロフィールの変化をもたらす、セイヨウアブラナ（Brassica napus L.）におけるＦａｔＢ遺伝子の転写の上方制御を実証している。
【０２３７】
実施例８：セイヨウアブラナにおけるＦａｔＢ遺伝子のための標的配列の同定
８．１標的配列の同定
変法ゲノムウォーキング・プロトコールを、セイヨウアブラナ変種Ｎｅｘ７１０のＦａｔＢ遺伝子のためのプロモーター配列を発見し、そして特徴づけするために利用した。これらのヌクレオチド配列を、ＺＦＰ ＴＦの設計そして製造のために単離および同定し、それがＦａｔＢ遺伝子の遺伝子発現を変更するために使用できた。Clontech Genome Walking Kit（Palo Alto, CA）を使用して、９つのゲノムウォーキングライブラリーを構築した。これらのライブラリーを、〜１ｋｂのＦａｔＢ遺伝子の転写開始部位の配列上流を得るために使用した。入れ子状態のＦａｔＢ遺伝子特異的プライマーの順方向の対を、公のデータベースからの入手可能なＦａｔＢ ＥＳＴ配列に基づいて設計し、そして合成した。入れ子状態のプライマーの逆方向の対を、アダプター配列にハイブリダイズするように設計し、そして合成した。複数のＰＣＲ断片を、９つのライブラリーから増幅した。得られたＰＣＲ断片を、ＴＯＰＯベクター（Invitrogen， Carlsbad, CA, USA）内にクローン化し、そして配列決定して、ＦａｔＢプロモーター配列を同定した。２つの異なるＦａｔＢ遺伝子、ＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５を、このアプローチに基づいて同定した。これらのＦａｔＢ遺伝子のコード配列は高度に保存されているが、その配列は、５’ＵＴＲおよびプロモーター領域で枝分かれしていることが観察された。
【０２３８】
進展させたセイヨウアブラナ種子におけるＦａｔＢ発現、ならびに定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５遺伝子の定量化は、その遺伝子がセイヨウアブラナ種子で高度に発現されていることを示唆した。実施例１で先に記載したように、全ＲＮＡを、単離し、定量化し、そして転写開始点をマッピングした。これらの２つの遺伝子のプロモーター配列を、転写による発現変更のためのＺＦＰ ＴＦを設計するのに利用した。
【０２３９】
実施例９：ＦａｔＢ遺伝子に特異的なＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインの設計
ジンクフィンガータンパク質を、ＦａｔＢ遺伝子中の様々な標的部位に対して設計した。代表的なＺＦＰ設計のための標的部位と認識ヘリックスを、以下の表１０Ａおよび１０Ｂに示す。
【０２４０】
【表１１】
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【０２４１】
【表１２】
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【０２４２】
実施例１０：セイヨウアブラナにおける天然ＦａｔＢ遺伝子のＺＦＰ ＴＦ媒介性上方制御
セイヨウアブラナ細胞内でのＦａｔＢのＺＦＰ ＴＦ媒介性上方制御を例示するために、ＺＦＰ ＴＦ遺伝子の４つの設計を含む構築物を構築し（表１０および１１）、これらの遺伝子をアグロバクテリウム介在形質転換によってセイヨウアブラナ細胞内に安定的に送達した。
【０２４３】
１０．１  構築物の設計
設計および構築したＺＦＰ ＴＦバイナリープラスミドを、以下の表１１で列挙する。ＺＦＰ ＴＦの遺伝子の発現を、比較的強力な構成的プロモーター、例えばキャッサバ葉脈モザイク病ウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーターなどに由来するプロモーターによって駆動した。アグロバクテリウム介在植物形質転換を実施例３．２に記載のとおり実施して、セイヨウアブラナゲノム内へのＺＦＰ ＴＦを安定的に組み込んだ。
【０２４４】
【表１３】
2013507960.tif 000014
【０２４５】
ｐＤＡＢ４６８９は、ｏｐａｑｕｅ−２（ｏｐ−２）核局在化配列またはＮＬＳ／１３６８５７／ＶＰ１６およびｐａｔ遺伝子発現カセットを含むバイナリープラスミドである。この構築物には以下の遺伝子要素が含まれる；ＲＢ７ ＭＡＲ ｖ３、（マトリックス結合領域（Thompson et al., 1997, WO9727207）：：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２（キャッサバ葉脈モザイク病ウイルスプロモーター（Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31: 1129-1139）：：ｏｐａｑｕｅ−２ＮＬＳ（Van Eenennaam et al., 2004, Metabolic Engineering 6:101-108; Holmes-Davis et al., 2005, Plant Molecular Biology 57:411-423）／１３６８５ジンクフィンガー／ＶＰ１６（Jamieson et al., Biochem, Biophy. Res. Commun. 2006, 348:873-879）融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１（アグロバクテリウム・ツメファシエンス・オープンリーディングフレーム２３、３’非翻訳領域（Gelvin et al., 1987, EP222493））：：ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２（シロイスナズナＵｂｉｑｕｉｔｉｎ−１０プロモーター（Callis, etal, 1990,7. Biol Chem. 265-12486-12493））：：ｐａｔ ｖ５（フォスフィノスリシン・アセチルトランスフェラーゼ（Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37））：：ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４（アグロバクテリウム・ツメファシエンス・オープンリーディングフレーム１、３’非翻訳領域（Huang et al, J. Bacteriol. 172:1814-1822））。そのバイナリーを、ＮｃｏI−ＳａｃＩ制限部位を介してｐＤＡＢ３９１２内にｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３６８５ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合を含むＤＮＡ断片をクローニングすることによって構築した。ｐＤＡＢ８２１５とラベルされた得られた構築物は、ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２：：ｏｐａｑｕｅ−２ＮＬＳ／１３６８５ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１遺伝子発現カセットを含む。ｐＤＡＢ８２１５を、L-R Gateway Reaction（Invitrogen、Carlsbad, CA）によってｐＤＡＢ４６６８バイナリー内にクローン化した。この反応でｐＤＡＢ４６８９を作製し、そしてそれを制限酵素消化と配列決定反応によって確認した。
【０２４６】
ｐＤＡＢ４６９０は、ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７１４／ＶＰ１６およびｐａｔ遺伝子発現カセットを含むバイナリープラスミドである。この構築物には以下の遺伝子要素が含まれる；ＲＢ７ ＭＡＲ ｖ３：：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２：：ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７１４ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１：：ＡｔＵｂｉ１０プロモーター ｖ２：：ｐａｔ ｖ５：：ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４。そのバイナリーを、ＮｃｏI−ＳａｃＩ制限部位を介してｐＤＡＢ３９１２内にｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７１４ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合を含むＤＮＡ断片をクローニングすることによって構築した。ｐＤＡＢ８２１６とラベルされた得られた構築物は、ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２：：ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７１４ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１遺伝子発現カセットを含む。ｐＤＡＢ８２１６を、L-R Gateway Reaction（Invitrogen、Carlsbad, CA）によってｐＤＡＢ４６６８バイナリー内にクローン化した。この反応でｐＤＡＢ４６９０を作製し、そしてそれを制限酵素消化と配列決定反応によって確認した。
【０２４７】
ｐＤＡＢ４６９１は、ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２／ＶＰ１６およびｐａｔ遺伝子発現カセットを含むバイナリープラスミドである。この構築物には以下の遺伝子要素が含まれる；ＲＢ７ ＭＡＲ ｖ３：：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２：：ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１：：ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２：：ｐａｔ ｖ５（フォスフィノスリシン・アセチルトランスフェラーゼ）：：ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４。そのバイナリーを、ＮｃｏI−ＳａｃＩ制限部位を介してｐＤＡＢ８２１７内にｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合を含むＤＮＡ断片をクローニングすることによって構築した。ｐＤＡＢ３９１２とラベルされた得られた構築物は、ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２：：ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１遺伝子発現カセットを含む。ｐＤＡＢ８２１７を、L-R Gateway Reaction（Invitrogen、Carlsbad, CA）によってｐＤＡＢ４６６８バイナリー内にクローン化した。この反応でｐＤＡＢ４６９１を作製し、そしてそれを制限酵素消化と配列決定反応によって確認した。
【０２４８】
ｐＤＡＢ４６９２は、ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７４３／ＶＰ１６およびｐａｔ遺伝子発現カセットを含むバイナリープラスミドである。この構築物には以下の遺伝子要素が含まれる；ＲＢ７ ＭＡＲ ｖ３（マトリックス結合領域）：：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２：：ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７４３ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１：：ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２（シロイスナズナＵｂｉｑｕｉｔｉｎ−１０プロモーター）：：ｐａｔ ｖ５：：ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４。そのバイナリーを、ＮｃｏI−ＳａｃＩ制限部位を介してｐＤＡＢ３９１２内にｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７４３ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合を含むＤＮＡ断片をクローニングすることによって構築した。ｐＤＡＢ８２１８とラベルされた得られた構築物は、ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２：：ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７４３ジンクフィンガー／ＶＰ１６融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１遺伝子発現カセットを含む。ｐＤＡＢ８２１８を、L-R Gateway Reaction（Invitrogen、Carlsbad, CA）によってｐＤＡＢ４６６８バイナリー内にクローン化した。この反応でｐＤＡＢ４６９２を作製し、そしてそれを制限酵素消化と配列決定反応によって確認した。
【０２４９】
実施例１１：形質転換カルスサンプルの分析
実施例３．２に記載のアグロバクテリウム介在植物形質転換によって、トランスジェニック・セイヨウアブラナ・カルス株を、４つのＺＦＰ ＴＦ構築物、ｐＤＡＢ４６８９〜ｐＤＡＢ４６９２、および対照構築物、ｐＤＡＢ８２１０での形質転換によって作り出した。対照構築物（ｐＤＡＢ８２１０）は、ｐａｔ遺伝子発現カセット（ＡｔＵｂｉ１０プロモーター／ｐａｔ／ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ）を含み、そして標的ＺＦＮカセット（ＣｓＶＭＶプロモーター／ＺＦＮ／ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ）を含まなかった。全ＲＮＡを抽出し、そして実施例４、１に記載のとおり、ｃＤＮＡをすべての株から合成した。先に記載したプロトコールに対する唯一の変更が、ランダムヘキサマーの代わりにｃＤＮＡ反応をプライミングするためにオリゴｄＴプライマーを使用し、そして製造者の仕様書に従ってｃＤＮＡ反応の対応する変更を加えたことである。
【０２５０】
１１．１  ＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５ ｍＲＮＡ発現の分析
１１．１．１  セイヨウアブラナに関するＦａｔＢ４の定量的なリアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ
ＰＣＲミックスを、ＦａｔＢ４のｃＤＮＡ増幅のために以下のとおり準備した：１．５μＬの１０Ｘ Hot Start PCR Buffer（Qiagen、Valencia, USA）、１．２μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＬの２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１５μＬのQiagen Hot Start Taq（５Ｕ／μＬ）、１０μＭのストックからの０．５μＬのｚｚ１４３ＦＷプライマー（配列番号５３：ＣＴＴＴＧＡＡＣＧＣＴＴＡＴＣＴＴＣＣＴＣ）（１０μＭのストック）、１０μＭのストックからの０．５μＬのＦＡＴＢ５＿Ｒ４ ＲＥＶプライマー（配列番号５４：ＴＴＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＡＧ）、０．２５μＬのTaqMan MGBプローブ（Life Technologies, Carlsbad, California）、５μＭのストックからのＦａｔＢ４＿ＭＧＢ＿プローブ＿４（配列番号５５：ＦＡＭＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＣＣ）、１．５μＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ−４０、および１反応あたり１３．５μＬまでのＨ2Ｏ。３８４ウェルマイクロプレートの適当な（単数もしくは複数の）象限を区切り、そして１ウェルあたり１３．５μＬのマスターミックスで満たした。密封用ホイルをそっとプレートに貼り付けた。そのプレートをQiagenマイクロプレート遠心分離機で３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。次に、１．５μＬの解凍し、希釈した第一鎖ｃＤＮＡを適当なウェルに加え、続いて対照ウェル内に最も低いＤＮＡ濃度から最も高いＤＮＡ濃度へと、１．５μＬのプラスミドｃＤＮＡ標準を加えた。最後に、密封用ホイルをしっかりプレートに付け、遠心分離した。ＰＣＲプログラムを、LIGHTCYCLER（登録商標）480 Real-Time PCR System（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA）により、以下のプログラムを使用して実施した：１）活性化９５℃１５分間；２）変性９５℃２０〜３０秒間（４．８°Ｃ／秒間にて）；３）アニーリング６０℃２０〜３０秒間（２．５°Ｃ／秒間にて）；４）確保７２℃４５〜６０秒間（４．８°Ｃ／秒間にて）；ステップ２）−４）をあと３９〜４９回繰り返す；５）５秒間で３８℃まで冷やして反応を止める。
【０２５１】
ＦａｔＢ４増幅産物はサイズが６７８ｂｐであった。この配列は、ゲノム配列に基づき７９ｂｐのイントロンに及ぶ。加えて、逆方向プライマーを、イントロンに及び、それによりＦａｔＢ４ ｃＤＮＡのみの特異的増幅を助けるように設計し、その結果、ゲノムＤＮＡの増幅を排除した。
【０２５２】
１１．１．２  セイヨウアブラナに関するＦａｔＢ５ ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ
ＰＣＲミックスを、ＦａｔＢ５のｃＤＮＡ増幅のために以下のとおり準備した：１．５μＬの１０ＸHot Start PCR Buffer（Qiagen、Valencia, USA）、１．２μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＬの２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１５μＬのQiagen Hot Start Taq（５Ｕ／μｌ）、１０μＭのストックからの０、５μＬのｚｚ１４５ＦＷプライマー（配列番号５６：ＣＴＴＴＧＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣ）、１０μＭストックからの０．５μＬのＦＡＴＢ５＿Ｒ４ ＲＥＶプライマー（配列番号５７：ＴＴＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＡＧ）、０．２５μＬのTaqMan MGBプローブ（Life technologies, Carlsbad, California）、５μＭストックのＦａｔＢ５＿ＭＧＢ＿プローブ１（配列番号５８：ＦＡＭ−ＡＡＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＣＣＡ）、１．５μＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ−４０）、および１反応あたり１３．５μＬまでのＨ2Ｏ。残りのアッセイおよびＰＣＲサイクルの明細は、実施例１１．１．１のＦａｔＢ４ ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイについて記載したとおりであった。
【０２５３】
生じた増幅産物は、サイズが６７８ｂｐであった。このｃＤＮＡ配列は、ゲノム配列に基づくと７６ｂｐのイントロンに及んだ。加えて、逆方向プライマーを、イントロンに及び、それによりＦａｔＢ５ ｃＤＮＡのみの特異的増幅を助けるように設計し、その結果、ゲノムＤＮＡの増幅を排除した。
【０２５４】
１１．２  チューブリンｍＲＮＡ発現の解析
このアッセイを、実施例４．３に記載のとおり完了した。
【０２５５】
１１．３  ＺＦＰ ＴＦ ｍＲＮＡ発現の解析
Ｔ0カルスサンプルＺＦＰ ＴＦ ｍＲＮＡ解析を、実施例４．４に従って完了した。このアッセイにおける増幅産物サイズは、それぞれの設計におけるＺＦＰサイズに依存して１ＫＢ未満であった。Ｔ0植物ＺＦＰ ＴＦ発現の定量化を、以下のとおりＶＰ１６活性化のドメイン・ベースのアッセイを用いて実施した。ＶＰ１６ ｑＲＴ−ＰＣＲミックスを、ＺＦＰ ＴＦのｃＤＮＡ増幅のために以下のとおり準備した：７．５μＬのLIGHTCYCLER（登録商標）480 Probes Master 2X Buffer（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA）、１０μＭストックからの０．３μＬのＶＰ１６＿ＵＰＬ＿Ｆ１プライマー（配列番号５９：ＴＣＧＡＴＣＴＴＧＡＴＡＴＧＴＴＧＧＧＡＧＡ）、１０μＭストックからの０．３μＬのＶＰ１６＿ＵＰＬ＿Ｒ１（配列番号６０：ＡＧＧＴＧＣＡＧＡＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＧ）、０．１５μＬのＵＰＬプローブ＃８５（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA）、１．５μＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ−４０、および１３．６５μＬｍでのＨ2Ｏ。３８４ウェルマイクロプレートの適当な（単数もしくは複数の）象限を区切り、１ウェルあたり１３．５μＬのマスターミックスで満たした。そして、密封用ホイルをそっとプレートに貼り付けた。プレートを、Qiagenマイクロプレート遠心分離機で３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。解凍し、希釈した第一鎖ｃＤＮＡを１．５μＬで加え、続いて対照ウェル内に低濃度から高濃度までの１．５μＬのプラスミドｃＤＮＡ標準を加えた。密封用ホイルを、しっかりプレートに付け、そして遠心分離した。ＰＣＲプログラムを、LIGHTCYCLER（登録商標）480 Real-Time PCR System（Roche Diagnostics、Indianapolis、IN、USA）により、以下の条件を使用して実施した：１）活性化９５℃５分間；２）変性９５℃１０秒間（４．８°Ｃ／秒間にて）；３）アニーリング／伸長６０℃２５秒間（２．５°Ｃ／秒間にて）；４）確保７２℃１秒間（４．８°Ｃ／秒間にて）；５）ステップ２−４をあと３９〜４９回繰り返す。最後に反応物を５秒間で３８℃に冷やして、反応を止めた。
【０２５６】
ＶＰ１６増幅産物サイズは６８ｂｐであり、この断片サイズはＰＣＲ増幅で生じると予想したＶＰ１６断片に一致した。
【０２５７】
１１．４  カルスサンプルの発現解析
HERBIACE（登録商標）選択により増殖するトランスジェニック・カルス株を、ＦａｔＢ４、ＦａｔＢ５、チューブリン、およびＺＦＰ ＴＦ発現レベルについてｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。チューブリン遺伝子は、ＦａｔＢ４、ＦａｔＢ５、およびＺＦＰ ＴＦ ｍＲＮＡレベルの発現を標準化する参照遺伝子としての役割を果たす。ＦａｔＢ４／チューブリンおよびＦａｔＢ５／チューブリン比を計算して、ｍＲＮＡ発現を標準化した。結果は、構成設計ｐＤＡＢ４６９１に関して統計的に有意なＦａｔＢ４ ｍＲＮＡおよびＦａｔＢ５ ｍＲＮＡ上方制御を示した（ｐ＝０．００５；図９）。ｐＤＡＢ４６９２カルス株は、ＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５ ｍＲＮＡにおける上方制御傾向を示したが、その傾向は統計的に有意でなかった。ｐＤＡＢ４６８９カルス株もまた別々の実験で分析し、上方制御傾向を示したが、統計的に有意でなかった（データ未掲載）。対照細胞株はＺＦＰ ＴＦ特異的増幅産物を増幅せず、ＺＦＰ ＴＦアッセイがＺＦＰ ＴＦ発現株だけに特異的であったことを確認した。
【０２５８】
実施例１２：トランスジェニックＴ0植物サンプルの発現解析
１２．１  ｑＲＴ−ＰＣＲの内部対照として使用するためのセイヨウアブラナ・アクチンのアッセイ
全ＲＮＡを抽出し、そしてｃＤＮＡを実施例１１に記載のとおり、すべての株から合成した。ＰＣＲミックスを、アクチンのｃＤＮＡ増幅のために以下のとおり準備した（Bo Yang et al., 2007, Plant Science 173:156-171；アクチン遺伝子GenBank受入番号AF111812）：７．５μＬのLIGHTCYCLER（登録商標）480 Probes Master 2X Buffer、１０μＭストックからの０．３μＬのＢＮ＿アクチン＿Ｆプライマー（配列番号６１：ＡＣＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡＡＧ）、１０μＬストックからの０．３μＬのＢＮ＿アクチン＿Ｒ（配列番号６２：ＧＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＴＡ）、１．５μＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ−４０、および１３．５μＬに適量のＨ2Ｏ。３８４ウェルマイクロプレートの適当な（単数もしくは複数の）象限を区切り、１ウェルあたり１３．５μＬのマスターミックスで満たした。そして、密封用ホイルはそっとプレートに貼り付けた。プレートをQiagenマイクロプレート遠心分離機で３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。解凍し、希釈した第一鎖ｃＤＮＡを１．５μＬ加え、続いて対照ウェル内に低濃度から高濃度までの１．５μＬのｃＤＮＡ標準を加えた。密封用ホイルをしっかりプレートに付け、そして遠心分離した。ＰＣＲプログラムを、LIGHTCYCLER（登録商標）480 Real-Time PCR System（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA）により、以下の条件を使用して実施した：１）活性化９５℃１０分間；２）変性９５℃１０秒間（４．８°Ｃ／秒間にて）；３）アニーリング／伸長６０℃２０秒間（２．５°Ｃ／秒間にて）；４）確保７２℃２０秒間（４．８°Ｃ／秒間にて）；５）ステップ２−４をあと３９〜４９回繰り返す。最後に反応物を５秒間で３８℃に冷やして、反応を止めた。生じる増幅産物はサイズが８０ｂｐであった。
【０２５９】
１２．２  ＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５ ｍＲＮＡ発現分析
ｐＤＡＢ４６８９〜ｐＤＡＢ４６９１で形質転換したセイヨウアブラナ植物を、ＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５の高いｍＲＮＡ発現についてアッセイした。加えて、２つのタイプの対照を使用した。Ｎｅｘ７１０植物から成る非トランスジェニック対照は陰性対照としての役割を果たす。ｐＤＡＢ８２１０で形質転換した第２のトランスジェニック対照のセイヨウアブラナＮｅｘ７１０植物もまた分析した。ｐＤＡＢ８２１０構築物設計は２つの遺伝子発現カセットから成っていた。ｐａｔ遺伝子発現カセット（ＡｔＵｂｉ１０プロモーター：：ｐａｔ遺伝子：：ＡｔｕＯＲＦ１３’ＵＴＲ）と非標的ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子発現カセット（ＡｔＵｂｉ１０プロモーター：：ＺＦＮ遺伝子：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ）。ｐＤＡＢ８２１０により発現したＺＦＮは、セイヨウアブラナＮｅｘ７１０植物のゲノムに結合および切断するとは考えられないので、これらの植物の表現型を変更するはずがない。
【０２６０】
HERBIACE（登録商標）選択において増殖する推定上のトランスジェニック・カルスを、植物へと再生した（実施例３．３）。葉サンプルを、ｍＲＮＡ発現解析のために温室内で栽培している六葉期のセイヨウアブラナ植物から採取した。各植物から６つの葉パンチを単離し、ＲＮＡ抽出まで氷上に置いた。全ＲＮＡを、Qiagen RNEASYキットを使用して抽出した。ｃＤＮＡ合成と、続く希釈を、実施例１１に記載のとおり完了した。ｑＲＴ−ＰＣＲによるＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５の発現解析プロトコールは、先に記載されている。ＺＦＰ ＴＦ発現解析を、アッセイに追加／削減した。アクチン参照遺伝子のｑＲＴＰＣＲアッセイは、先に記載されている。
【０２６１】
ＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５遺伝子に関するＴ0葉発現は、構築物の間で異なる（図１０）。最も高いＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５ ｍＲＮＡ上方制御は、Ｎｅｘ７１０非トランスジェニックおよびｐＤＡＢ８２１０トランスジェニック対照と比較して全般的に２．０〜２．５倍増のｍＲＮＡ発現がもたらされたｐＤＡＢ４６９１トランスジェニック植物事象において観察された。両遺伝子の発現は、対照と比較して統計的に有意であった（ｐ＝０．０５以下）。そのため、構築物のさらなる特徴づけを、ｐＤＡＢ４６９１を用いて続けた。
【０２６２】
実施例１３：トランスジェニックＴ1植物の分析
１３．１  Ｔ1種子の脂肪酸分析
事象ｐＤＡＢ４６９１−００３−０４９．１（「事象４９」）の「低」油糧種子と「高」油糧種子の間にＣ１８：０含有量の有意差が観察された（表１２）。「低」カテゴリーの種子のＣ１８：０含有量は、Ｎｅｘ７１０（「非トランスジェニック」対照）およびｐＤＡＢ８２１０（トランスジェニック対照）株のものと同様であった。「高」種子におけるＣ１８：０含有量は、ＦａｔＢ遺伝子の上方制御をもたらしたＺＦＰ ＴＦ発現と相関した。Ｃ２０：０、Ｃ２２：０およびＣ２４：０のいくつかの増加もまた、Ｃ１８：０のより長鎖の脂肪酸への流れに基づいて観察された。個々の種子のＣ１６：０含有量は、「低」または「高」カテゴリーのいずれかの中で変化するとは考えにくかった。この結果は、ｐＤＡＢ４６９１ＺＦＰ ＴＦが、Ｃ１６：０−ＡＣＰからＣ１６：０への反応よりむしろＣ１８：０−ＡＣＰからＣ１８：０への酵素反応に特異的な（単数もしくは複数の）ＦａｔＢ遺伝子に結合し、そして上方制御するという事実を示唆している（実施例１、図１を参照のこと）
【０２６３】
【表１４】
2013507960.tif 000015
【０２６４】
１３．２  Ｔ1植物におけるＺＦＰ ＴＦ存在の分析
事象４９の１００個のＴ1種子を温室内に蒔いた。９７本の植物が苗へと発芽した。ＺＦＰ ＴＦのコピー数を、二〜四葉期から分離した植物材料について、実施例６．２に記載したｐａｔ ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して概算した。事象４９には、複数の挿入（〜３つの挿入）および０〜７個のｐａｔ遺伝子、したがって、ＺＦＰ ＴＦが含まれ、コピーがＴ1集団に分離された。たった１つのヌル植物をＴ1集団から同定した。
【０２６５】
１３．３  Ｔ1植物におけるＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５ ｍＲＮＡの上方制御
天然ＦａｔＢ遺伝子の発現解析を、分離Ｔ1集団の９７の植物すべてに対して実施した。同時に植え付けた非トランスジェニックＮｅｘ７１０植物を、対照として研究に組み入れた。１植物あたりの６枚の葉パンチを、採取し、そしてＲＮＡ抽出が完了できるまで氷上に置いた。全ＲＮＡを、QIAGEN RNEASYキットを使用して抽出した。ｃＤＮＡ合成とその後の希釈を、実施例１１に記載のとおり完了した。ＦａｔＢ４、ＦａｔＢ５、チューブリンおよびＶＰ１６（ＺＦＰ ＴＦ）の発現解析を、先に記載したように実施した。
【０２６６】
ＦａｔＢ４／ＦａｔＢ５およびチューブリンの比の統計解析は、チューブリン発現が有意な線形傾向を示し（図１１）、ＦａｔＢ４／ＦｄｔＢ５の増加が内因性対照であるチューブリンの増加と１：１相関がなかったことを示した。そのため、比をこの分析に使用せず、そしてチューブリンを、ＦａｔＢ４／ＦａｔＢ５発現のモデルにおける共変数として含んだ。チューブリンとＶＰ１６（ＺＦＰ ＴＦ）の間のあらゆる共直線性を取り除くために、モデル方程式に関する結合行列を直交させた。
【０２６７】
以下のモデルを、現在の研究のすべてのデータセットに当てはめた：式中、ステータスiは、ｙijkのトランスジェニック・ステータス（トランスジェニックまたはヌル／対照）であり；
【数１】
2013507960.tif 000016
トランスジェニック*ＶＰ１６は、形質転換株内で入れ子にされたＶＰ１６に対する線形回帰法であり；そしてｅijkはランダムな残差である。各サンプルあたり３回の繰返し測定が存在することを考えれば、関連残差構造を使用した：
【数２】
2013507960.tif 000017
式中、Ｉnは、サンプル数と等しいランクを有する単位行列であり、そしてφは頻回測定の残差間の相関である。
【０２６８】
事象４９に関する分析の結果は、高度に有意な右上がり斜線を示すＶＰ１６に対してＦａｔＢ４発現の入れ子型回帰を有するＦａｔＢ４の有意な上方制御を検出した（図１２、表１３）。ＦａｔＢ５に関しては、入れ子型回帰が上方制御に関して右上がり斜線を示し、その斜線が統計的に有意であった。上方制御事象に関して、形質転換および対照植物が同じ株に由来しておらず、それで、株と形質転換効果の何らかの混同があり得ることに留意すべきである。
【０２６９】
【表１５】
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【０２７０】
事象４９のＴ1植物を、ＦａｔＢ４／チューブリンと当時のＦａｔＢ５／チューブリン発現比に基づいて選別し、そして温室内のＴ2世代に進展させるために最も高い発現している植物を見つけ出した。最高に発現している８つのＦａｔＢ４植物を、成熟への進展のために選択した。これらの植物のうちの６つもまた、ＦａｔＢ５を最も高度に発現していた。最も高度な発現性の植物のＺＦＰ ＴＦコピー数は、２〜４コピーで変化するが、Ｔ1子孫全体で分離されたコピー数は、０〜７コピーであった。対照植物に関して、事象４９および１０Ｎｅｘ７１０対照植物の１つのヌル植物もまた、Ｔ2種子採取のための成熟まで進展させた。
【０２７１】
１３．４  Ｔ2種子の脂肪酸分析
脂肪酸（ＦＡ）分析を、実施例６．１に記載したとおり、すべての植物の２４個の種子バルクに対して実施した。対照ＦＡプロフィールの計算のために、１つのヌル植物のＦＡプロフィールを１０のＮｅｘ７１０対照植物と組合せた。平均して、Ｎｅｘ７１０のものと比較した事象４９に関してＣ１８：０含有量の１２％の増加を観察した（表１４Ａおよび１４Ｂ）。この増加は、ｐ＝０．０５にて統計的に有意であった（図１３）。長鎖ＦＡ、例えばＣ２０：０、Ｃ２２：０およびＣ２４：０などもまたある程度の増加に示し、そして５％の総飽和ＦＡ含有量の増加につながった。ＦａｔＢ酵素がＣ１８：０ ＡＣＰのＣ１８：０遊離ＦＡへの転換を触媒するので、ＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５転写上方制御の結果、より多くのＣ１８：０が蓄積する（図１）。ｐＤＡＢ４６９１（実施例６、表１および２）は、ＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５遺伝子の両方に特異的であり、そしてそれがＦＡプロフィールの著しい変化をもたらした（表１４Ａおよび１４Ｂ）。
【０２７２】
【表１６】
2013507960.tif 000019
【０２７３】
【表１７】
2013507960.tif 000020
【０２７４】
総Ｃ１６含有量の有意ではない変化を、天然ＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５遺伝子上方制御を用いて観察した。Ｃ１６：０−ＡＣＰからＣ１６：０への触媒作用は、他のＦａｔＢ遺伝子で起こるが、ｐＤＡＢ４６９１ＺＦＰ ＴＦ設計を使用した上方制御について例示した標的であるＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５で起こるというわけではなさそうである（図１）。
【０２７５】
個々の種子のＣ１６：０含有量は、Ｔ1種子の「低」および「高」カテゴリーを変えるように見えなかったが（表１２）、より詳しく述べると、ｐＤＡＢ４６９１ＺＦＰ ＴＦ設計は、Ｃ１６：０−ＡＣＰのＣ１６：０への反応よりむしろ、Ｃ１８：０−ＡＣＰのＣ１８：０への酵素反応のための（単数もしくは複数の）ＦａｔＢ遺伝子により特異的に結合するという事実を示唆している（図１）。
【０２７６】
天然ＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５遺伝子上方制御と比較した場合に、ＺＦＰ ＴＦによって引き起こされた天然β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子の上方制御が、ＦＡプロフィールにおける異なる変化を引き起こしたことに注意すべきである（実施例１〜６）。例えば、β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩ遺伝子上方制御は、ヌル分離個体と比較した場合に、Ｃ１６：０およびＣ１６：１含有量の統計的に有意な低下および付随する総Ｃ１８含有量の増加を引き起こした（実施例６、図６、表５および８）。比較上、ＺＦＰ ＴＦ媒介性ＦａｔＢ遺伝子上方制御はＣ１８：０含有量の統計的に有意な増加を引き起こしたにもかかわらず、Ｃ１６：０含有量には見掛け上の変化がない（図１４）。また一方、ＺＦＰ ＴＦ媒介性β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼＩＩおよびＦａｔＢ遺伝子上方制御を介したＦＡプロフィールにおけるこれらの変化が、ＦＡ生合成経路のように、同時に起こる（図１）。
【０２７７】
実施例１４：植物の形質転換のためのＺＦＰ ＴＦ構築物の設計
４つの構築物を、セイヨウアブラナにおけるＦａｔＢ遺伝子の転写下方制御のために構築した（表１５）。最良のＦａｔＢ上方制御ＺＦＰ設計（１３７２２および１３７１４）を、ＦａｔＢ下方制御のデモンストレーションのために用いた（実施例９〜１３）。これらのＺＦＰ設計を、ＫＲＡＢ１（Hanna-Rose and Hansen, 1996, Trends in Genetics, 12:229-234）またはＮｔＥＲＦ３（Ohta et al., The Plant Cell, 2001,13:1959-1968）のいずれかから成るｏｐａｑｕｅ−２核局在化シグナルおよび抑制ドメインに融合し、機能的なＺＦＰ ＴＦを構築した。ＺＦＰ ＴＦのすべてが種子特異的プロモーター下で発現された；シロイスナズナ脂質輸送タンパク質２プロモーター（ＡｔＬＴＰ１７０プロモーター）（Genbank ID：NC_003076）またはインゲンマメ（Phaseolus vulgaris）β−ファゼオリンプロモーター（ＰｖＰｈａｓプロモーター）（米国特許番号第5,591,605号）のいずれかを使用した。
【０２７８】
【表１８】
2013507960.tif 000021
【０２７９】
ｐＤＡＳ５２０３は、ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２／ＫＲＡＢ１およびｐａｔ遺伝子発現カセットを含むバイナリープラスミドである。この構築物には以下の遺伝子要素が含まれる；ＡｔＬＴＰプロモーター１７０：：ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２ジンクフィンガー／ＫＲＡＢ１融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１：：ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２：：ｐａｔ ｖ５：：ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４。そのバイナリーを、ゲートウェイドナーベクター内にｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２ジンクフィンガー／ＫＲＡＢ１融合を含むＤＮＡ断片をクローニングすることによって構築した。得られた構築物は、ＡｔＬＴＰプロモーター１７０：：ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２ジンクフィンガー／ＫＲＡＢ１融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１遺伝子発現カセットを含む。この構築物を、L-R Gateway Reaction（Invitrogen、Carlsbad, CA）によってバイナリー内にクローン化した。この反応でｐＤＡＳ５２０３を作製し、そしてそれを制限酵素消化と配列決定反応によって確認した。
【０２８０】
ｐＤＡＳ５２０４は、ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７１４／ＫＲＡＢ１およびｐａｔ遺伝子発現カセットを含むバイナリープラスミドである。この構築物には以下の遺伝子要素が含まれる；ＡｔＬＴＰプロモーター１７０：：ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７１４ジンクフィンガー／ＫＲＡＢ１融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１：：ＡｔＵｂｉ１０プロモーター ｖ２：：ｐａｔ ｖ５：：ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４。そのバイナリーを、ゲートウェイドナーベクター内にｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７１４ジンクフィンガー／ＫＲＡＢ１融合を含むＤＮＡ断片をクローニングすることによって構築した。得られた構築物は、ＡｔＬＴＰプロモーター１７０：：ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７１４ジンクフィンガー／ＫＲＡＢ１融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１遺伝子発現カセットを含む。この構築物を、L-R Gateway Reaction（Invitrogen、Carlsbad, CA）によってバイナリー内にクローン化した。この反応でｐＤＡＳ５２０４を作製し、そしてそれを制限酵素消化と配列決定反応によって確認した。
【０２８１】
ｐＤＡＳ５２１２は、ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２／ＫＲＡＢ１およびｐａｔ遺伝子発現カセットを含むバイナリープラスミドである。この構築物には以下の遺伝子要素が含まれる；ＰｖＰｈａｓプロモーター：：ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２ジンクフィンガー／ＫＲＡＢ１融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１：：ＡｔＵｂｉ１０プロモーター ｖ２：：ｐａｔ ｖ５：：ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４。そのバイナリーを、ゲートウェイドナーベクター内にｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２ジンクフィンガー／ＫＲＡＢ１融合を含むＤＮＡ断片をクローニングすることによって構築した。得られた構築物は、ＰｖＰｈａｓプロモーター：：ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２ジンクフィンガー／ＫＲＡＢ１融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１遺伝子発現カセットを含む。この構築物を、L-R Gateway Reaction（Invitrogen、Carlsbad, CA）によってバイナリー内にクローン化した。この反応でｐＤＡＳ５２１２を作製し、そしてそれを制限酵素消化と配列決定反応によって確認した。
【０２８２】
ｐＤＡＳ５２２７は、ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２／ＮｔＥＲＦ３およびｐａｔ遺伝子発現カセットを含むバイナリープラスミドである。この構築物には以下の遺伝子要素が含まれる；ＲＢ７ ＭＡＲ ｖ３：：ＡｔＬＴＰプロモーター１７０：：ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２ジンクフィンガー／ＮｔＥＲＦ３融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１：：ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２：：ｐａｔ ｖ５：：ＡｔｕＯＲＦ１３’ＵＴＲｖ４。そのバイナリーを、ゲートウェイドナーベクター内にｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２ジンクフィンガー／ＮｔＥＲＦ３融合を含むＤＮＡ断片をクローニングすることによって構築した。得られた構築物は、ＡｔＬＴＰプロモーター１７０：：ｏｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳ／１３７２２ジンクフィンガー／ＮｔＥＲＦ３融合：：ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１遺伝子発現カセットを含む。この構築物を、L-R Gateway Reaction（Invitrogen、Carlsbad, CA）によってバイナリー内にクローン化した。この反応でｐＤＡＳ５２２７を作製し、そしてそれを制限酵素消化と配列決定反応によって確認した。
【０２８３】
上記構築物を、胚軸外植片のアグロバクテリウム介在形質転換によってセイヨウアブラナ変種Ｎｅｘ７１０に安定的に形質転換した（実施例３．２〜３．３）。温室で栽培したＴ0植物を自家受粉させ、そして移植から４カ月後にＴ1種子を採取した。
【０２８４】
実施例１５：４つのＺＦＰ ＴＦ構築物に関するＴ1種子トランスジェニックの分析
Ｔ1種子を、構築物ｐＤＡＳ５２０３、ｐＤＡＳ５２０４、ｐＤＡＳ５２１２、ｐＤＡＳ５２２７のそれぞれのトランスジェニック事象（株）８、２０、３７、および１５から得た。５つのＮｅｘ７１０植物種子を対照として使用した。ＦＡ分析を、Ｔ1トランスジェニック事象それぞれの２４個の個別の種子に対して実施例６．１で先に記載したように実施して、ＦＡプロフィールを変更するのに最も効果的であるＺＦＰ ＴＦ構築物をまず特定した。
【０２８５】
１５．１  Ｔ1種子の脂肪酸（ＦＡ）分析
構築物ｐＤＡＳ５２０３、ｐＤＡＳ５２１２、およびｐＤＡＳ５２２７は、対照であるＮｅｘ７１０との比較で、最低の総飽和ＦＡプロフィールを有するトランスジェニック事象を生じた（表１６）。２つの構築事象、ｐＤＡＳ５２０３とｐＤＡＳ５２１２、およびＮｅｘ７１０対照の間のそれぞれの対での違いは有意であった（ｐ＝＜０．００５）。ｐＤＡＳ５２２７の対での違いは強い傾向を示した（ｐ＝０．０６）。ｐＤＡＳ５２０３からの事象の１つは、Ｎｅｘ７１０対照における平均６．３８％と比較して、５．３％（未掲載）の最も低い総飽和ＦＡ含有量を含んでいた。これは総飽和ＦＡの１７％の低下である。
【０２８６】
【表１９】
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【０２８７】
【表２０】
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【０２８８】
事象ｐＤＡＳ５２０３、ｐＤＡＳ５２１２、およびｐＤＡＳ５２２７の特有のＦＡプロフィールは、Ｎｅｘ７１０と比較して、Ｃ１８：０の２１〜２５％の低下をもたらした（図１５ａ）。これらの相違のすべてが、ｐ＝０．００１にてまたはそれ以下で統計的に有意であった（表１６）。他の長鎖ＦＡ、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０およびＣ２４：０もまた、濃度の低下を示した。しかしながら、Ｃ１６：０含有量の変化は観察されず、３つの構築物トランスジェニック事象すべてにおいてＣ１６：０／Ｃ１８：０含有量の有意な増加をもたらした（図１６５Ｂ）。
【０２８９】
ｐＤＡＳ５２２７トランスジェニック種子のＦＡプロフィールは、ｐＤＡＳ５２０３やｐＤＡＳ５２１２と比較して、明らかな違いを示した。ｐＤＡＳ５２２７種子において、Ｎｅｘ７１０と比較して、Ｃ１４：０の２３％の低下（ｐ＝０．００２）とＣ１６：１含有量の１９％の増加（ｐ＝０．０１）を観察した（図１６ＡおよびＢ、表１６）。ｐＤＡＳ５２２７ＺＦＰ ＴＦ設計は、ＫＲＡＢ１ドメインの代わりにＺＦＰに融合したＥＲＦ３下方調節ドメインの存在を除いて、ｐＤＡＳ５２０３およびｐＤＡＳ５２１２のそれと同一である（表１５）。
【０２９０】
ｐＤＡＳ５２０４に存在する異なるＺＦＰ設計、１３７１４は、１３７２２設計と比較して、Ｃ１８：０低下において効果不十分であった（表１６）。ＦａｔＢ４およびＦａｔＢ５遺伝子の両方に結合する１３７２２設計と異なって、１３７１４設計はＦａｔＢ５の遺伝子だけに結合する（実施例９、表１０Ｂ）。
【０２９１】
１５．２  ｍＲＮＡ解析のための植物の識別
それぞれ構築物ｐＤＡＳ５２１２およびｐＤＡＳ５２２７での形質転換によって生じた２つのトランスジェニック事象、５２１２［１］−００４および５２２７［４］−０１２を、ＦａｔＢ５転写下方調節分析のために選択した。５０〜１００個のＴ1種子を温室に植え付け、そして植物を栽培した。４つの葉パンチを、二〜三葉期の植物から採取した。この植物材料を、ｐａｔ ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して、ＺＦＰ ＴＦコピー数について分析した（実施例６．２）。次に、ランダムＺＦＰヌル植物およびＺＦＰ陽性植物を、Ｔ2種子を採取するための成熟までの進展のために選択した（表１７）。ＦａｔＢ ｍＲＮＡ分析のために、同じ植物からの未熟なさやを、開花後（ＤＡＦ）２５日で採取した。両方の事象を単一コピーとして分離した。これらの事象を、５２１２−４および５２２７−１２とラベルした。
【０２９２】
【表２１】
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【０２９３】
１５．３  ＲＮＡ抽出とｑＲＴ−ＰＣＲ分析法の開発
ＲＮＡを、Qiagen（Valencia、CA）から入手した植物RNAEASY（登録商標）キットを用いて未成熟なアブラナ属種子から単離した。種子を、ＲＬＴバッファー（Qiagen）／β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）およびステンレス・ビーズを入れたクラスターチューブに入れた。サンプルをクラスターチューブラックに立て、そしてビーズミル（Kleco、Visalia, CA）により１分あたり５００ストロークにて５分間均質化した。チューブラックを１８０°回転させ、そしてさらに５分間均質化した。次に、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにサンプルを移し、２０，０００×ｇにて５分間遠心分離し、そして上清を新しいチューブに移した。ＲＮＡを、製造業者のプロトコール（Qiagen；Valencia、CA）によって記述のとおりに単離した。ＲＮＡを、５０μＬのＲＮａｓｅ不含水でカラムから溶出し、そしてＲＮＡサンプルを、Thermo Scientific（Wilmington, DE）によってNanoDrop8000を用いて定量化した。
【０２９４】
１０〜２０マイクログラムのＲＮＡを、１．５ｍｌのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅ不含チューブ内でＴＵＲＢＯ ＤＮＡ不含（カタログ番号AM1907；Applied Biosystems、Foster City, CA）ＤＮａｓｅで処理して、ゲノムＤＮＡを取り除いた。それぞれのＲＮＡサンプルについて、ＲＮＡ、１Ｘ ＤＮａｓｅバッファー、および２単位のＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅを含む５０マイクロリットルの反応物を調製した。反応物を、３７℃にて３０分間インキュベートした。５マイクロリットル（５μｌ）のＤＮａｓｅ不活性化試薬を各チューブに加え、そして混合した。サンプルを、室温にて３分間インキュベートし、再び混合し、そして室温にてさらに２分間インキュベートした。サンプルを、２０，０００×ｇにて５分間遠心分離した。４０マイクロリットル（４０μｌ）の上清を取り出すと同時に、ＤＮａｓｅ不活性化スラリーを残しておいた。ｃＤＮＡ合成に等量のＲＮＡが使用できるように、それぞれのＤＮａｓｅ処理サンプルをNanodropで定量化した。
【０２９５】
相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、cDNA High Capacityキット（Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用することで、それぞれのＲＮＡサンプルについて調製した。簡単に言えば、１．５μｇのＲＮＡを、１Ｘ逆転写バッファー、１ＸｄＮＴＰ、１Ｘランダムオリゴマー、および１２５単位のMultiscribe逆転写酵素を含む５０マイクロリットルの反応物の中で鋳型として使用した。さらに、無ＲＴ対照反応を、Multiscribe逆転写酵素なしで上述と同じ条件下で１．５μｇのＤＮａｓｅ処理ＲＮＡをそれぞれ使用して調製をした。すべてのサンプルを２５℃にて１０分、３７℃にて２時間、８５℃にて５分間、そして４℃にて一晩インキュベートした。
【０２９６】
プライマーおよびプローブを、ＦＡＴＢ、ＫＡＳ ＩＩ、ＥＲＦ３、ＫＲＡＢ１、およびチューブリンについて、Applied Biosystems（Foster City, CA）製のPrimer Express 3ソフトウェアを用いて設計した。プライマーを、Integrated DNA Technologies（Coralville, IA）によって合成した。以下のものは、プライマーの配列である：
配列番号６３：ＦＡＴＢ５ ｆｗｄ−５’ＴＣＧＣＴＧＣＣＡＴＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴ３’；
配列番号６４：ＦＡＴＢ５ ｒｅｖ−５’ＣＧＣＣＴＧＧＧＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡ３’；
配列番号６５：ＫＲＡＢ１ ｆｗｄ−５’ＡＡＧＧＡＴＧＴＧＴＴＣＧＴＧＧＡＴＴＴＣＡ３’；
配列番号６６：ＫＲＡＢ１ ｒｅｖ−５’ＣＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＧＴＧＣＡＧＴＡＴＣＡＡＧ３’；
配列番号６７：ＥＲＦ３ ｆｗｄ−５’ＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＴＴＧＴＴＡ３’；
配列番号６８：ＥＲＦ３ ｒｅｖ−５’ＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＴＴＡＣＡＴＧ３’；
配列番号６９：ＴＵＢＵＬＩＮ ｆｗｄ−５’ＧＡＡＧＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＣＧＡＴＴＧＣ３’；
配列番号７０：ＴＵＢＵＬＩＮ ｒｅｖ−５’ＧＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡＡＣＧＡＡＴＧ３’。
プローブを、Applied Biosystems（Foster City, CA）によって６ＦＡＭ／ＭＧＢ合成した：
配列番号７１：ＦＡＴＢ５プローブ６ＦＡＭ ＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＧＣＣＡ；
配列番号７２：ＫＲＡＢ１プローブ６ＦＡＭ ＴＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴ；
配列番号７３：ＥＲＦ３プローブ６ＦＡＭ ＣＡＧＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＴ；および
配列番号７４：ＴＵＢＵＬＩＮプローブ６ＦＡＭ ＴＡＣＡＡＧＧＴＴＴＣＣＡＡＧＴＴＴ。
【０２９７】
ＦａｔＢ、ＥＲＦ３、ＫＲＡＢ１、およびチューブリンの遺伝子発現を、Applied Biosystem 7900HT（Foster City, CA）を用いたリアルタイムＰＣＲによって評価した。検量線を、異なる群内のいくつかのｃＤＮＡサンプルのアリコートを使用して調製して、アッセイのダイナミックレンジと有効性を確立した。初期希釈のその後の１：５および１：４希釈系列を作った。それぞれのｃＤＮＡのサンプルを、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５で１：５０に希釈した。ＰＣＲ反応物を、１Ｘ遺伝子発現マスターミックス（Applied Biosystems; Foster City, CA）、０．８μｍの順方向および逆方向プライマー、０．２μＭの遺伝子特異的６ＦＡＭ／ＭＧＢプローブ、および４マイクロリットルの希釈したｃＤＮＡを含む２０マイクロリットルの体積で調製した。すべての反応を、ＳＤＳバージョン２．４ソフトウェアを用いてApplied Biosystem 7900HTにより、以下の条件下で実行した：ステップ１）５０℃２分間；ステップ２）９５℃１０分間；ステップ３）９５℃１５秒間；そしてステップ４）６０℃１分間。ステップ３と４をさらに３９サイクル繰り返した。チューブリン遺伝子発現を各プレートに対して評価したのに対して、ＦａｔＢ、ＥＲＦ３、およびＫＲＡＢ１は別々に実施した。すべての反応を三重反復試験で行なった。
【０２９８】
検量線を、回帰および勾配、そして必要に応じて調整した閾値について評価した。非ＲＴサンプル（逆転写酵素以外のすべてのｃＤＮＡ反応成分と共にＲＮＡを含んだ逆転写酵素不含対照）は対応するサンプルと比較して、５〜７のＣｔ相違を確保した。分析のために、データをExcelにインポートした。ＦａｔＢ、ＥＲＦ３、およびＫＲＡＢ１の平均数量値を、チューブリンの数量平均に対して標準化し、そしてＦａｔＢとチューブリンの発現比として報告した。
【０２９９】
１５．４  未熟種子における種子特有なＦａｔＢ５ ｍＲＮＡ下方調節の分析
結果は、開花後（ＤＡＦ）２５日の未熟種子におけるＦａｔＢ ｍＲＮＡ下方調節がＴ1植物の接合性の状況に依存していたことを示した。例えば、見かけのＦａｔＢ５ ｍＲＮＡ下方調節が、５２２７−１２未熟種子のヘテロ接合植物（１コピー）で観察されなかった（図１７）。しかしながら、ＺＦＰ ＴＦ発現がホモ接合植物（２コピー）において２倍まで増加したとき、ＦａｔＢ５ ｍＲＮＡ発現の２１％の低下を観察した（ｐ＝０．０２５）。同様の結果を、異なる構築物、ｐＤＡＳ５２１２の別の事象、５２１２−４で得た。この事象では、同じように、見かけのＦａｔＢ５下方調節はヘテロ接合植物では観察されなかった（図１８）。しかしながら、ＺＦＰ ＴＦ発現が増加したとき、ＦａｔＢ５転写産物の１５％の低下をホモ接合植物で観察した。
【０３００】
両事象のヌル、ヘテロ接合、およびホモ接合植物を、成熟まで進展させ、そしてＦＡプロフィールをそれぞれの植物の２４個の種子プールの中で測定した。ＺＦＰ ＴＦを含む系統からヌル系統を分離するこの過程は、ＺＦＰ ＴＦの存在をより密に反映したＦＡプロフィールの相違を許容する。
【０３０１】
１５．４  Ｔ２成熟種子におけるＦＡプロフィールの分析
Ｔ2成熟種子ＦＡプロフィールは、事象５２２７−１２に関するＴ1親株のＺＦＰ ＴＦ接合性によって異なる（表１８Ａおよび１８Ｂ）。ヘテロ接合Ｔ1植物は２５ＤＡＦ未熟種子において見かけのＦａｔＢ ｍＲＮＡ下方調節を示さなかったが、それらの種子のＦＡプロフィールは、Ｃ１８：０含有量における８％の低下を示した。Ｃ１６：０含有量の有意な低下は観察されなかった。加えて、Ｃ１８：１（オレイン酸）および続く下流のＦＡのわずかな増加が観察され、総飽和ＦＡの全体で５．５％の低下をもたらした（表１８Ａおよび１８Ｂ、図１９）。５２２７−１２Ｔｔ植物がＺＦＰ ＴＦに関してホモ接合であったとき、ＦａｔＢ ｍＲＮＡは有意に下方制御された。これらのＴ2種子のＦＡプロフィールは異なっていた。Ｃ１６：１含有量の１１％の増加が観察され、総飽和ＦＡの２．７％の低下をもたらした（表１８Ａおよび１８Ｂ）。しかしながら、ヘテロ接合植物と比較して、Ｃ１８：０のさらなる低下は観察されなかった。これらの変化は、Ｔ1成熟種子ＦＡプロフィールに一致した（実施例１５．１）。
【０３０２】
【表２２】
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【０３０３】
【表２３】
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【０３０４】
事象５２１２−４のＴ1成熟種子ＦＡプロフィールで同様の結果を得た。ヘテロ接合植物種子において、Ｃ１８：０含有量の５．５％の低下が観察され、３．２％の総飽和ＦＡの低下をもたらした（表１８、図２０）。Ｃ１８：１のわずかな増加も観察された；その一方で、残りのＦＡの濃度はわずかな低下を示した。ホモ接合植物は、ＦａｔＢ ｍＲＮＡの有意な下方制御にもかかわらず、ヘミ接合植物のものと比較して、Ｃ１８：０含有量においてより多くの低下を示さなかった。
【０３０５】
要約すれば、ＺＦＰ ＴＦの種子特異的発現によるＦａｔＢ５遺伝子の転写下方調節を、これらの実施例で実証した。ＺＦＰ ＴＦは、Ｔ2ホモ接合種子における標的ＦａｔＢ５遺伝子の転写下方調節をもたらすのに有効であった。しかしながら、Ｔ2ホモ接合種子におけるＣ１８：０の低下は、Ｔ2分離種子の低下よりも多くはなかった。これらの結果は、ＦａｔＢ遺伝子が植物の増殖と発生に必須であるので、ホモ接合ＺＦＰ ＴＦコピーがＦＡプロフィールを調節するフィードバック機構を引き起こし得ることを示唆している（Bonaventure et al., The Plant Cell, 2003 15:1020-1033）。未熟種子においてＺＦＰ ＴＦによって媒介されたＦａｔＢ ｍＲＮＡ下方調節が、逆にＣ１８：０含有量の変化のためのＦａｔＢ上方制御のそれに関連することは、注目に値する。
【０３０６】
これらの実施例は、天然ＦａｔＢ遺伝子に対するＺＦＰ ＴＦ標的化効果が特異的にＦａｔＢ ｍＲＮＡ数量を変化させ、それによってセイヨウアブラナにおける特異的、かつ、遺伝可能なＦＡプロフィールの変化をもたらすことを示している。
【０３０７】
【表２４】
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【０３０８】
【表２５】
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【０３０９】
本明細書中で言及される特許、特許出願および出版物はすべて、これらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。
【０３１０】
理解をたやすくするために例証および実施例により多少詳細に開示を提供してきたが、本発明の本質または範囲を逸脱しない限り、種々の変更および修正が成され得ることは当業者には明らかである。したがって、前記の説明および実施例は、本発明を限定するものではない。
【図１】
2013507960.tif 000029
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2013507960.tif 000033
【図６】
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【図７Ａ】
2013507960.tif 000035
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
2013507960.tif 000037
【図７Ｄ】
2013507960.tif 000038
【図８Ａ】
2013507960.tif 000039
【図８Ｂ】
2013507960.tif 000040
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
2013507960.tif 000042
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
2013507960000001.app
【国際調査報告】
2013507960.tif 000055
2013507960.tif 000056
2013507960.tif 000057