(57)【要約】本発明は、上皮組織に関連する障害を処置するための組成物および方法を提供する。本発明は、上皮組織に関連する障害の治療的処置または診断を増強する、かつ／または上皮組織をイメージングするための方法を提供し、この方法は、それを必要とする被験体に、ａ）障害を処置するために十分な量の１種またはそれより多い種の治療薬、障害を診断するために十分な量の診断薬、および／または上皮組織をイメージングするために十分な量のイメージング剤と、ｂ）１種またはそれより多い種の治療薬、診断薬、および／またはイメージング剤の有効性を増強するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体またはその機能的等価物とを投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）１つまたはそれより多いＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドシャフトドメイン、またはそれらの機能的等価物と、
ｂ）前記１つまたはそれより多いＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドシャフトドメインに作動可能に連結され、そのＣ末端側に位置するＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドノブドメイン、またはそれらの機能的等価物と、
ｃ）前記１つまたはそれより多いＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドシャフトドメインに作動可能に連結され、そのＮ末端側に位置する１つまたはそれより多い非ＡｄＢ−２／３由来二量体形成ドメインと
を含む組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項２】
ＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド尾部ドメインを含まない、請求項１に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項３】
各シャフトドメインが、Ａｄ３線維ポリペプチドシャフトドメイン、Ａｄ７線維ポリペプチドシャフトドメイン、Ａｄ１１線維ポリペプチドシャフトドメイン、Ａｄ１４線維ポリペプチドシャフトドメイン、Ａｄ１４ａ線維ポリペプチドシャフトドメイン、それらの組み合わせ、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される、請求項１または２に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項４】
前記１つまたはそれより多いシャフトドメインが１〜２２個のシャフトドメインを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項５】
各シャフトドメインが、配列番号１１：
【化１３】
2013538040.tif 000030
によるアミノ酸配列を含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項６】
各シャフトドメインが、配列番号１２：
【化１４】
2013538040.tif 000031
によるアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項７】
各シャフトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項８】
前記ノブドメインが、Ａｄ３線維ポリペプチドノブドメイン、Ａｄ７線維ポリペプチドノブドメイン、Ａｄ１１線維ポリペプチドノブドメイン、Ａｄ１４線維ポリペプチドノブドメイン、Ａｄ１４ａ線維ポリペプチドノブドメイン、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項９】
前記ノブドメインが、配列番号１３：
【化１５】
2013538040.tif 000032
によるアミノ酸配列を含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ノブドメインが、配列番号１４：
【化１６】
2013538040.tif 000033
によるアミノ酸配列を含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項１１】
前記ノブドメインが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項１２】
前記二量体形成ドメインが、ＥＶＳＡＬＥＫ（配列番号２２）および／またはＫＶＳＡＬＫＥ（配列番号２３）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項１３】
ａ）それぞれがＡｄ３シャフトドメイン（配列番号１）を含む１つまたはそれより多いシャフトドメインと、
ｂ）Ａｄ３ノブドメイン（配列番号６）を含むノブドメインと
を含む、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項１４】
結合開口薬−１（ＪＯ−１）（配列番号２０）のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項１５】
単一のＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドシャフトドメインを含有する、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項１６】
多量体形成している、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項１７】
二量体形成している、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項１８】
前記組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドに結合体化した、１種またはそれより多い種の化合物をさらに含む、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項１９】
前記１種またはそれより多い種の化合物が、治療薬、診断薬、およびイメージング剤からなる群より選択される、請求項１８に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項２０】
前記１種またはそれより多い種の化合物が、少なくとも１種の治療薬を含み、前記治療薬が、抗体、免疫複合体、ナノ粒子、化学療法薬、放射性粒子、ウイルス、ワクチン、細胞免疫療法薬、遺伝子療法構築物、核酸治療薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１９に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１から１９までのいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の単離された核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
ａ）ＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物と、
ｂ）薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物。
【請求項２５】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、請求項１６から２０までのいずれか一項に記載の多量体形成している組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドを含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
上皮組織に関連する障害の治療的処置または診断を増強するため、および／または上皮組織をイメージングするための方法であって、それを必要とする被験体に、
ａ）前記障害を処置するために十分な量の１種またはそれより多い種の治療薬、前記障害を診断するために十分な量の診断薬、および／または前記上皮組織をイメージングするために十分な量のイメージング剤と、
ｂ）前記１種またはそれより多い種の治療薬、診断薬、および／またはイメージング剤の有効性を増強するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物と
を投与することを含む、方法。
【請求項２７】
前記上皮組織に関連する障害が、固形腫瘍、過敏性腸症候群、炎症性腸障害、クローン病、潰瘍性大腸炎、便秘、胃食道逆流性疾患、バレット食道、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、肺炎、原発性肺高血圧症、肺塞栓症、肺サルコイドーシス、結核、膵炎、膵管障害、胆管閉塞症、胆嚢炎、総胆管結石症、脳障害、乾癬、皮膚炎、糸球体腎炎、肝炎、糖尿病、甲状腺障害、蜂巣炎、感染症、腎盂腎炎、および胆石からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記上皮組織に関連する障害が固形腫瘍である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記固形腫瘍が、乳房の腫瘍、肺の腫瘍、結腸の腫瘍、直腸の腫瘍、胃の腫瘍、前立腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、子宮の腫瘍、皮膚の腫瘍、内分泌の腫瘍、子宮頸部の腫瘍、腎臓の腫瘍、黒色腫、膵臓の腫瘍、肝臓の腫瘍、脳腫瘍、頭頸部の腫瘍、鼻咽頭の腫瘍、胃の腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、膀胱の腫瘍、および食道の腫瘍からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、Ａｄ３線維多量体、Ａｄ７線維多量体、Ａｄ１１線維多量体、Ａｄ１４線維多量体、Ａｄ１４ａ線維多量体、それらの組み合わせ、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される、請求項２６から２９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、Ａｄ３線維多量体、またはその機能的等価物である、請求項２６から３０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３の１２面体粒子（ＰｔＤｄ）、組換えＡｄＢ−２／３線維多量体、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される、請求項２６から３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体がＡｄ３のＰｔＤｄを含む、請求項２６から３２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、結合開口薬１（ＪＯ−１）（配列番号２０）を含む、請求項２６から３２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
１種またはそれより多い種の化合物が、少なくとも１種の治療薬を含み、前記治療薬が、抗体、免疫複合体、ウイルス、ナノ粒子、化学療法薬、放射性粒子、ワクチン、細胞免疫療法薬、遺伝子療法構築物、核酸治療薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２６から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記治療薬が、化学療法薬またはモノクローナル抗体を含む、請求項２５から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記治療薬が、抗腫瘍モノクローナル抗体を含む、請求項２５から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗腫瘍モノクローナル抗体が、トラスツズマブ、セツキシマブ、ペルツズマブ、アポマブ、コナツムマブ、レクサツムマブ、ベバシズマブ、ベバシズマブ、デノスマブ、ザノリムマブ、リンツズマブ、エドレコロマブ、リツキシマブ、チシリムマブ、トシツモマブ、アレムツズマブ、エプラツズマブ、ミツモマブ、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、オレゴボマブ、ペムブモマブ、ダクリズマブ、パニツムマブ、カツマキソマブ、オファツムマブ、およびイブリツモマブからなる群より選択される抗体を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記上皮組織に関連する障害が、Ｈｅｒ−２陽性腫瘍を含む、請求項２５から３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｈｅｒ−２陽性腫瘍が、乳房の腫瘍、胃の腫瘍、結腸の腫瘍、および卵巣の腫瘍からなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記治療薬が、トラスツズマブを含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記治療薬が、化学療法薬、照射、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３９から４１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、Ａｄ３のＰｔＤｄ、ＪＯ−１、またはその機能的等価物を含む、請求項３９から４２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記被験体が、トラスツズマブ療法に応答しなかった、請求項３９から４３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記上皮組織に関連する障害が、ＥＧＦＲ陽性腫瘍を含む、請求項２６から３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＥＧＦＲ陽性腫瘍が、肺の腫瘍、結腸の腫瘍、乳房の腫瘍、直腸の腫瘍、頭頸部の腫瘍、および膵臓の腫瘍からなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記治療薬が、セツキシマブを含む、請求項４５または４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記治療薬が、ＶＥＧＦ阻害剤を含む、請求項２８から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記治療薬が、化学療法薬、照射、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４５から４８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、Ａｄ３のＰｔＤｄ、ＪＯ−１、またはそれらの機能的等価物を含む、請求項４５から４９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記被験体が、セツキシマブ療法に応答しなかった、請求項４５から５０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が二量体である、請求項２６から５１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、ＪＯ−１、またはその機能的等価物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
上皮組織に関連する障害を処置するための方法であって、前記障害の処置を必要とする被験体に、前記障害を処置するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物を投与することを含む、方法。
【請求項５５】
前記障害が、ＡｄＢ−２／３ウイルス感染症または固形腫瘍である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記障害が、固形腫瘍であり、前記固形腫瘍が、乳房の腫瘍、肺の腫瘍、結腸の腫瘍、直腸の腫瘍、胃の腫瘍、前立腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、子宮の腫瘍、皮膚の腫瘍、内分泌の腫瘍、子宮頸部の腫瘍、腎臓の腫瘍、黒色腫、膵臓の腫瘍、肝臓の腫瘍、脳腫瘍、頭頸部の腫瘍、鼻咽頭の腫瘍、胃の腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、膀胱の腫瘍、および食道の腫瘍からなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、Ａｄ３線維多量体、Ａｄ７線維多量体、Ａｄ１１線維多量体、Ａｄ１４線維多量体、Ａｄ１４ａ線維多量体、それらの組み合わせ、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される、請求項５４から５６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、Ａｄ３線維多量体、およびそれらの機能的等価物である、請求項５４から５７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３の１２面体粒子（ＰｔＤｄ）、組換えＡｄＢ−２／３線維多量体、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される、請求項５４から５８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体がＡｄ３のＰｔＤｄを含む、請求項５４から５９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、結合開口薬１（ＪＯ−１）（配列番号２０）を含む、請求項５４から５９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が二量体である、請求項５４から６１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、ＪＯ−１、またはその機能的等価物を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
上皮組織への化合物の送達を改善するための方法であって、前記上皮組織を、
ａ）前記上皮組織に送達すべき１種またはそれより多い種の化合物、および
ｂ）前記上皮組織への前記１種またはそれより多い種の化合物の送達を増強するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物
と接触させることを含む、方法。
【請求項６５】
前記１種またはそれより多い種の化合物が、診断薬またはイメージング剤を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記上皮組織が固形腫瘍を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記固形腫瘍が、乳房の腫瘍、肺の腫瘍、結腸の腫瘍、直腸の腫瘍、胃の腫瘍、前立腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、子宮の腫瘍、皮膚の腫瘍、内分泌の腫瘍、子宮頸部の腫瘍、腎臓の腫瘍、黒色腫、膵臓の腫瘍、肝臓の腫瘍、脳腫瘍、頭頸部の腫瘍、鼻咽頭の腫瘍、胃の腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、膀胱の腫瘍、および食道の腫瘍からなる群より選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
デスモグレイン２（ＤＳＧ２）を発現している組織への物質の送達を改善するための方法であって、ＤＳＧ２を発現している前記組織を、
ａ）前記組織に送達すべき１種またはそれより多い種の化合物、および
ｂ）前記組織への前記１種またはそれより多い種の化合物の送達を増強するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物
と接触させることを含む、方法。
【請求項６９】
組織における上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘導するための方法であって、上皮組織を、ＥＭＴを誘導するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物と接触させることを含む、方法。
【請求項７０】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、Ａｄ３線維多量体、Ａｄ７線維多量体、Ａｄ１１線維多量体、Ａｄ１４線維多量体、Ａｄ１４ａ線維多量体、それらの組み合わせ、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される、請求項６４から６９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、Ａｄ３線維多量体、またはその機能的等価物である、請求項６４から７０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３の１２面体粒子（ＰｔＤｄ）、組換えＡｄＢ−２／３線維多量体、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される、請求項６４から７１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体がＡｄ３のＰｔＤｄを含む、請求項６４から７２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、結合開口薬１（ＪＯ−１）（配列番号２０）を含む、請求項６４から７３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が二量体である、請求項６４から７４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、ＪＯ−１（配列番号２０）、またはその機能的等価物を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
上皮組織に関連する障害を処置すること、上皮組織への物質の送達を改善すること、ＤＳＧ２を発現している組織への物質の送達を改善すること、組織におけるＥＭＴを誘導すること、および／またはＡｄＢ−２／３感染症を処置することのうちの１つまたはそれより多いための候補化合物を同定するための方法であって、
ａ）ＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物を、１種またはそれより多い種の試験化合物の存在下、ＤＳＧ２への多量体の結合を促進する条件下でＤＳＧ２と接触させるステップと、
ｂ）対照と比較して、ＤＳＧ２との結合についてＡｄＢ−２／３線維多量体と競合する陽性の試験化合物を同定するステップと
を含み、前記陽性の試験化合物が、上皮組織に関連する障害を処置すること、上皮組織への物質の送達を改善すること、ＤＳＧ２を発現している組織への物質の送達を改善すること、組織におけるＥＭＴを誘導すること、および／またはＡｄＢ−２／３感染症を処置することのうちの１つまたはそれより多いための候補化合物である、方法。
【請求項７８】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、Ａｄ３線維多量体、Ａｄ７線維多量体、Ａｄ１１線維多量体、Ａｄ１４線維多量体、Ａｄ１４ａ線維多量体、それらの組み合わせ、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、Ａｄ３線維多量体、またはその機能的等価物である、請求項７７または７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３の１２面体粒子（ＰｔＤｄ）、組換えＡｄＢ−２／３線維多量体、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される、請求項７７から７９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、Ａｄ３のＰｔＤｄを含む、請求項７７から８０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、結合開口薬１（ＪＯ−１）（配列番号２０）を含む、請求項７７から８０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が二量体である、請求項７７から８２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体が、ＪＯ−１、またはその機能的等価物を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記ＡｄＢ−２／３線維多量体がＪＯ−１二量体を含む、請求項２４または２５に記載の医薬組成物。
【請求項８６】
上皮組織に関連する障害を処置するために十分な量の１種またはそれより多い種の治療薬、上皮組織に関連する障害を診断するために十分な量の診断薬、および／または上皮組織をイメージングするために十分な量のイメージング剤をさらに含む、請求項２４、２５または８５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１０年６月１０日に出願された米国仮出願第６１／３５３，６５２号、２０１１年１月５日に出願された米国仮出願第６１／４３０，０９１号、および２０１１年４月１日に出願された米国仮出願第６１／４７０，６６３号の利益を主張する。これらの仮出願の全ては、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
政府の権利についての声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与されたＲ０１  ＣＡ０８０１９２およびＲＯ１  ＨＬＡ０７８８３６の下、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトアデノウイルス（Ａｄ）は、現在５１種の血清型を含有する６種（Ａ〜Ｆ）に分類されている。大部分のＡｄ血清型は、主要な付着受容体としてコクサッキー・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を利用する（非特許文献１）。しかし、Ｂ種のＡｄ血清型の場合は違う。最近、本発明者らは、それらの受容体の使用に基づいたＢ種Ａｄの新しいグループ分けを提案した（非特許文献２）。グループ１（Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３５、Ａｄ５０）は、ほぼＣＤ４６のみを受容体として利用する；グループ２（Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１４）は、共通の未確認の受容体（複数可）を共有し、それは、ＣＤ４６ではなく、仮に受容体Ｘと名付けた；グループ３（Ａｄ１１）は、優先的にＣＤ４６と相互作用するが、ＣＤ４６が遮断されている場合には受容体Ｘも利用する。
【０００４】
Ｂ種Ａｄは、一般的なヒト病原体である。２００５年から、大多数の米国の軍事訓練施設において多様なＢ種血清型の同時出現が観察された。これには、血清型Ａｄ３、Ａｄ７、およびＡｄ１４が含まれた（Ｍｅｔｚｇａｒら、２００７年）。２００７年に、米国およびアジアのいくつかの場所でＡｄ１４の新規の病原性が高い株および毒性が強いと思われる株であるＡｄ１４ａが発見された（Ｌｏｕｉｅら、２００８年；Ｔａｔｅら、２００９年）。本発明者らは最近、Ａｄ１４ａが、それらの受容体の使用に関してＡｄのＢ種グループ２に属することを実証した（Ｗａｎｇら、２００９年）。まとめると、受容体Ｘを利用する血清型（Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１４、Ａｄ１４ａ、およびＡｄ１１）は全て、本明細書ではＡｄＢ−２／３と称される。
【０００５】
ＡｄＢ−２／３は、特に、大部分の固形腫瘍を代表する上皮起源の腫瘍との関連において、遺伝子伝搬ベクターとして極めて重要である（ＹａｍａｍｏｔｏおよびＣｕｒｉｅｌ、２０１０年）。上皮細胞は、いくつかの細胞間結合および頂端−基底極性を維持する。上皮細胞の重要な特徴は、上皮内がん（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｓｅｒｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）において、およびがん細胞株において保存されている（Ｔｕｒｌｅｙら、２００８年）。ＣＡＲおよびＣＤ４６はどちらも、多くの場合、上皮がん細胞の密着結合および接着結合内に閉じ込められており、これらの付着受容体を使用するＡｄは接近することができない（ＣｏｙｎｅおよびＢｅｒｇｅｌｓｏｎ、２００５年；Ｓｔｒａｕｓｓら、２００９年）。対照的に、ＡｄＢ−２／３は、上皮がん細胞に効率的に感染し、これは、部分的に、上皮間葉転換（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）（ＥＭＴ）によく似たプロセスを誘導することによって実現される（Ｓｔｒａｕｓｓら、２００９年）。ＡｄＢ−２／３の別の示差的な特徴は、それらが、複製時にＡｄ線維とペントンベースとからなるウイルス成分の１２面体粒子を産生することができることである（Ｎｏｒｒｂｙら、１９６７年）。ペントン１２面体（ＰｔＤｄ）は、全長のペントンベースタンパク質から組み立てることはできず、残基３７と残基３８の間におけるタンパク質分解による自発的なＮ末端の切断を必要とする（Ｆｕｓｃｈｉｏｔｔｉら、２００６年）。この切断部位はＡｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、およびＡｄ１４において保存されているが、Ａｄ２およびＡｄ５には存在しない。Ａｄ３の場合では、ＰｔＤｄは、感染性ウイルス当たりＰｔＤｄ５．５×１０６個という非常に過剰に形成され（Ｆｅｎｄｅｒら、２００５年）、ＰｔＤｄが、細胞間結合を妨害することによってＡｄ３の感染性を増強し、したがって、ウイルスの伝播に好都合であることが示されている（Ｗａｌｔｅｒｓら、２００２年）。
【０００６】
受容体Ｘを同定するための最初の試みは、１９９５年に遡る。最近、ＣＤ４６、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６などの、受容体Ｘのいくつかの候補が提唱された（Ｆｌｅｉｓｃｈｌｉら、２００７年；Ｓｈｏｒｔら、２００４年；Ｓｈｏｒｔら、２００６年；Ｓｉｒｅｎａら、２００４年）。しかし、これらのタンパク質が、ＡｄＢ−２／３に対する高親和性受容体としての機能を果たし得ることは、これまで誰も検証することができていない（Ｇａｇｇａｒら、２００３年ｂ；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら、２００６年；Ｍａｒｔｔｉｌａら、２００５年；Ｐｅｒｓｓｏｎら、２００８年；Ｓｅｇｅｒｍａｎら、２００３年；非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，  Ｊ．Ｍ．ら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  Ｂ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ２  ａｎｄ  ５．  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７５，  １３２０〜１３２３
【非特許文献２】Ｔｕｖｅ，  Ｓ．ら、Ａ  ｎｅｗ  ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２００６）８０，  １２１０９〜１２１２０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様では、本発明は、上皮組織に関連する障害の治療的処置または診断を増強する、かつ／または上皮組織をイメージングするための方法であって、それを必要とする被験体に、
ａ）障害を処置するために十分な量の１種またはそれより多い種の治療薬、障害を診断するために十分な量の診断薬、および／または上皮組織をイメージングするために十分な量のイメージング剤と、
ｂ）１種またはそれより多い種の治療薬、診断薬、および／またはイメージング剤の有効性を増強するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体またはその機能的等価物と
を投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明の方法は、上皮組織に関連する障害を処置する、かつ／または診断する、かつ／または、上皮組織、例えば、そのような障害が存在すると考えられる上皮組織などをイメージングするために用いることができ、そのような障害としては、これらに限定されないが、固形腫瘍、過敏性腸症候群、炎症性腸障害、クローン病、潰瘍性大腸炎、便秘、胃食道逆流性疾患（ｇａｔｒｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｒｅｆｌｕｘ  ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、肺炎、原発性肺高血圧症、肺塞栓症、肺サルコイドーシス、結核、膵炎、膵管障害、脳障害（すなわち：上皮の血液脳関門を通る薬物の輸送を改善することが有効であり得る任意の脳障害）、胆管閉塞症、胆嚢炎、総胆管結石症、感染症（これらに限定されないが、蜂巣炎、肺炎、および腎盂腎炎を含む）、および胆石が挙げられる。好ましい実施形態では、障害は、これらに限定されないが、乳房の腫瘍、肺の腫瘍、結腸の腫瘍、直腸の腫瘍、胃の腫瘍（ｓｔｏｍａｃｈ  ｔｕｍｏｒ）、前立腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、子宮の腫瘍、子宮頸部の腫瘍（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｔｕｍｏｒ）、腎臓の腫瘍、皮膚の腫瘍、黒色腫、膵臓の腫瘍、肝臓の腫瘍、内分泌の腫瘍、脳腫瘍、頭頸部の腫瘍、鼻咽頭の腫瘍、胃の腫瘍（ｇａｓｔｒｉｃ  ｔｕｍｏｒ）、扁平上皮癌、腺癌、膀胱の腫瘍、および食道の腫瘍を含めた固形腫瘍である。
【００１０】
本発明の任意の実施形態の方法では、例えば、Ａｄ３線維多量体、およびＡｄ７線維多量体、Ａｄ１１線維多量体、Ａｄ１４線維多量体、Ａｄ１４ａ線維多量体、それらの組み合わせ、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択されるＡｄＢ−２／３線維多量体を利用することができる。好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３線維多量体、またはそれらの機能的等価物である。別の実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３の１２面体粒子（ＰｔＤｄ）、組換えＡｄＢ−２／３線維多量体、およびそれらの機能的等価物を含んでよい。好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３のＰｔＤｄまたは結合開口薬（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｐｅｎｅｒ）１（ＪＯ−１）（配列番号２０）を含む。
【００１１】
任意の適切な治療薬、診断薬、またはイメージング剤をこれらの方法において使用することができる。治療薬を使用する実施形態では、そのような治療薬としては、これらに限定されないが、抗体、免疫複合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、ワクチン、放射性粒子／放射線療法（「照射」）、化学療法薬、養子Ｔ細胞療法および樹状細胞療法を含めた細胞免疫療法、ナノ粒子、吸入治療薬、遺伝子療法構築物、および核酸治療薬、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。好ましい実施形態では、治療薬は、化学療法薬または抗腫瘍モノクローナル抗体を含む。本発明の方法において使用することができる例示的な抗腫瘍モノクローナル抗体としては、これらに限定されないが、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｍｉｘｉｍａｂ）、ペルツズマブ（ｐｅｔｕｚｕｍａｂ）、アポマブ（ａｐｏｍａｂ）、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、レクサツムマブ（ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、デノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、ザノリムマブ（ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）、リンツズマブ（ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、エドレコロマブ（ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、チシリムマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）、トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、エプラツズマブ（ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、ゲムツズマブ（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、オゾガマイシン（ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、オレゴボマブ（ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、ペムブモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ダクリズマブ（ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、カツマキソマブ（ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、およびイブリツモマブ（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）が挙げられる。
【００１２】
好ましい一実施形態では、上皮組織に関連する障害は、Ｈｅｒ−２陽性腫瘍を含む。この実施形態の下で処置することができる例示的なＨｅｒ−２陽性腫瘍としては、これらに限定されないが、乳房の腫瘍、胃の腫瘍、結腸の腫瘍、および卵巣の腫瘍が挙げられる。この実施形態では、治療薬が、トラスツズマブを含むことがさらに好ましく；さらに好ましい実施形態では、治療薬が、１種またはそれより多い種の化学療法薬および／または照射をさらに含む。この実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体が、Ａｄ３のＰｔＤｄ、ＪＯ−１（配列番号２０）、またはそれらの機能的等価物を含むことがさらに好ましい。別の好ましい実施形態では、処置される被験体は、トラスツズマブ療法に応答していない。
【００１３】
別の好ましい実施形態では、上皮組織に関連する障害は、ＥＧＦＲ陽性腫瘍を含む。例示的なＥＧＦＲ陽性腫瘍としては、これらに限定されないが、肺の腫瘍、結腸の腫瘍、乳房の腫瘍、直腸の腫瘍、頭頸部の腫瘍、および膵臓の腫瘍が挙げられる。この実施形態では、治療薬が、セツキシマブを含むことが好ましく；さらに好ましい実施形態では、治療薬が、１種またはそれより多い種の化学療法薬および／または照射をさらに含む。この実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体が、Ａｄ３のＰｔＤｄ、ＪＯ−１（配列番号２０）、またはそれらの機能的等価物を含むことがさらに好ましい。別の好ましい実施形態では、処置される被験体は、セツキシマブ療法に応答していない。
【００１４】
別の実施形態では、上皮組織に関連する障害は固形腫瘍を含み、治療薬は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤を含む。
【００１５】
第２の態様では、本発明は、上皮組織に関連する障害を処置するための方法であって、それを必要とする被験体に、障害を処置するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体またはその機能的等価物を投与することを含む方法を提供する。この実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体を単独療法として投与する。一実施形態では、この方法を、ＡｄＢ−２／３ウイルス感染症を処置するために使用する。別の実施形態では、処置される障害は固形腫瘍である。本発明のこの態様を使用して処置することができる例示的な固形腫瘍としては、これらに限定されないが、乳房の腫瘍、肺の腫瘍、結腸の腫瘍、直腸の腫瘍、胃の腫瘍、前立腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、子宮の腫瘍、子宮頸部の腫瘍、腎臓の腫瘍、皮膚がん、黒色腫、膵臓の腫瘍、肝臓の腫瘍、内分泌の腫瘍、脳腫瘍、頭頸部の腫瘍、鼻咽頭の腫瘍、胃の腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、膀胱の腫瘍、および食道の腫瘍が挙げられる。この態様では、使用するための例示的なＡｄＢ−２／３線維多量体としては、これらに限定されないが、Ａｄ３線維多量体、およびＡｄ７線維多量体、Ａｄ１１線維多量体、Ａｄ１４線維多量体、Ａｄ１４ａ線維多量体、それらの組み合わせ、およびそれらの機能的等価物が挙げられる。好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３線維多量体、およびそれらの機能的等価物である。さらに好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３の１２面体粒子（ＰｔＤｄ）、組換えＡｄＢ−２／３線維多量体、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される。種々のさらに好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３のＰｔＤｄまたは結合開口薬１（ＪＯ−１）（配列番号２０）を含む。
【００１６】
第３の態様では、本発明は、
ａ）１つまたはそれより多いＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドシャフトドメイン、またはそれらの機能的等価物と、
ｂ）１つまたはそれより多いＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドシャフトドメインに作動可能に連結され、そのＣ末端側に位置するＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドノブドメイン、またはその機能的等価物と、
ｃ）１つまたはそれより多いＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドシャフトドメインに作動可能に連結され、そのＮ末端側に位置する１つまたはそれより多い非ＡｄＢ−２／３由来二量体形成ドメインと
を含む組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドを提供する。
【００１７】
一実施形態では、組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドは、ＡｄＢ−２／３尾部ドメインを含まない。別の実施形態では、各シャフトドメインは、Ａｄ３シャフトドメイン、Ａｄ７シャフトドメイン、Ａｄ１１シャフトドメイン、Ａｄ１４シャフトドメイン、Ａｄ１４ａシャフトドメイン、それらの組み合わせ、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される。別の実施形態では、１つまたはそれより多いシャフトドメインは、１〜２２個のシャフトドメインを含む。種々の別の実施形態では、各シャフトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１１または配列番号１２によるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。別の実施形態では、ノブドメインは、Ａｄ３ノブドメイン、Ａｄ７ノブドメイン、Ａｄ１１ノブドメイン、Ａｄ１４ノブドメイン、Ａｄ１４ａノブドメイン、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される。種々の別の実施形態では、ノブドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３または配列番号１４によるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。別の実施形態では、二量体形成ドメインは、ＥＶＳＡＬＥＫ（配列番号２２）および／またはＫＶＳＡＬＫＥ（配列番号２３）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、組換えＡｄＢ−２／３ポリペプチドは、（ａ）それぞれがＡｄ３シャフトドメイン（配列番号１）を含む、またはそれからなる１つまたはそれより多いシャフトドメインを含み、（ｂ）ノブドメインがＡｄ３ノブドメイン（配列番号６）を含む、またはそれからなる。
【００１８】
さらに好ましい実施形態では、組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドは、ＪＯ−１（配列番号２０）のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。さらに好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドは、多量体を形成しており、二量体を形成していることが最も好ましい。
【００１９】
他の態様では、本発明は、本発明の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドをコードする単離された核酸；本発明の単離された核酸を含む組換え発現ベクター；本発明の組換え発現ベクターを含む宿主細胞；および本明細書に記載のＡｄＢ−２／３多量体を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、上皮組織への化合物の送達を改善するための方法であって、上皮組織を、（ａ）上皮組織に送達すべき１種またはそれより多い種の化合物；および（ｂ）上皮組織への１種またはそれより多い種の化合物の送達を増強するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物と接触させることを含む方法を提供する。この方法により、これらに限定されないが診断用化合物およびイメージング化合物を含めた、上皮細胞を標的とする任意の化合物の送達を改善することが可能になる。好ましい一実施形態では、上皮組織は固形腫瘍を含む。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、デスモグレイン２（ＤＳＧ２）を発現している組織への化合物の送達を改善するための方法であって、ＤＳＧ２を発現している組織を、（ａ）組織に送達すべき１種またはそれより多い種の化合物；および（ｂ）組織への１種またはそれより多い種の化合物の送達を増強するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物と接触させることを含む方法を提供する。本発明のこの態様の方法は、ＤＳＧ２を発現している組織への、任意の対象の化合物の送達を改善するために用いることができる。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、組織における上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘導する方法であって、上皮組織を、ＥＭＴを誘導するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物と接触させることを含む方法を提供する。
【００２３】
これらの本発明のさらなる態様のそれぞれの好ましい一実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３線維多量体、およびＡｄ７線維多量体、Ａｄ１１線維多量体、Ａｄ１４線維多量体、Ａｄ１４ａ線維多量体、それらの組み合わせ、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される。種々のさらに好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３線維多量体、またはその機能的等価物であり；ＡｄＢ−２／３線維多量体は、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３の１２面体粒子（ＰｔＤｄ）、組換えＡｄＢ−２／３線維多量体、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択され；ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３のＰｔＤｄを含み；ＡｄＢ−２／３線維多量体は、結合開口薬１（ＪＯ−１）（配列番号２０）を含み；ＡｄＢ−２／３線維多量体は二量体である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、上皮組織に関連する障害を処置すること、上皮組織への物質の送達を改善すること、ＤＳＧ２を発現している組織への物質の送達を改善すること、組織におけるＥＭＴを誘導すること、および／またはＡｄＢ−２／３感染症を処置することのうちの１つまたは複数に対する候補化合物を同定するための方法であって、（ａ）ＡｄＢ−２／３線維多量体とＤＳＧ２を、ＤＳＧ２への多量体の結合を促進する条件下、１種またはそれより多い種の試験化合物の存在下で接触させるステップと；（ｂ）対照と比較して、ＡｄＢ−２／３線維多量体がＤＳＧ２と結合することに競合する陽性の試験化合物を同定するステップとを含み、陽性の試験化合物が、上皮組織に関連する障害を処置すること、上皮組織への物質の送達を改善すること、ＤＳＧ２を発現している組織への物質の送達を改善すること、組織におけるＥＭＴを誘導すること、および／またはＡｄＢ−２／３感染症を処置することのうちの１つまたは複数に対する候補化合物である方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、Ａｄ受容体の同定およびＡｄの付着についての競合試験のツールを示す図である。ａ）ＡｄペントンのＮ末端のアミノ酸アラインメントである。アミノ酸３７／３８におけるプロテアーゼ切断部位がオレンジ色で示されている。ｂ）この試験で使用したウイルス粒子および粒子成分の略図である。ＰｔＤｄは、ペントンベースおよび三量体の線維を含有する１２ユニットを保有する。ＢｓＤｄは、ペントンベースのみを含有する。ｃ）３Ｈで標識したＡｄ１４ウイルス、Ａｄ１４ａウイルス、Ａｄ１１ウイルスおよびＡｄ３５ウイルスの、Ａｄ３のＢｓＤｄ、ＰｔＤｄ、または抗ＣＤ４６抗体（ａＣＤ４６）と一緒にプレインキュベートした後のＨｅＬａ細胞への付着の競合。ＰＢＳで処置した細胞における付着を１００％とした。ｎ＝５。特に、ＰｔＤｄがＡｄ３５を部分的に遮断するという所見は、ＨｅＬａ細胞においてＤＳＧ２とＣＤ４６が物理的に近傍にあることに起因し得る。ｄ）Ａｄ３線維ノブとＢｓＤｄの両方と一緒にプレインキュベートした後の、ｃ）の場合と同様のＡｄ３付着試験（ＢｓＤｄ＋Ａｄ３Ｋ）。Ａｄ３Ｋのモル濃度は競合のために使用したＰｔＤｄ内部の線維ノブのモル濃度と同等であった。ｅ）Ａｄ３−ＧＦＰベクターの略図である。ベクターは、野生型Ａｄに基づき、ヌクレオチド２９，８９２〜３０，９４７を欠失させてＣＭＶ−ＧＦＰ−ポリＡ発現カセットに適応させたものである。下のパネルは、野生型Ａｄ３およびＡｄ３−ＧＦＰの、予測される断片を用いた制限酵素分析を示す。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー。ｆおよびｇ）組換えＡｄ３線維ノブに対するポリクローナルウサギ抗体の検証である。ｆ）ウエスタンブロットである。Ａｄノブ（Ａｄ３Ｋ、Ａｄ５Ｋ、１４Ｋ、１４ａＫ、Ａｄ１１Ｋ、Ａｄ３５Ｋ）またはＰｔＤｄを、ＰＡＧ細胞において、試料を変性させて（Ｂ）、および試料を変性させずに（ＵＢ）分離した。フィルターを、抗Ａｄ３Ｋ抗血清および抗ウサギ−ＨＲＰ抗体と一緒にインキュベートした。ｇ）Ａｄの付着の阻害：３Ｈで標識したＡｄ３ウイルス、Ａｄ１４ウイルスおよびＡｄ５ウイルスを、ＰＢＳ（白棒）またはウサギ抗Ａｄ３Ｋ血清（灰色の棒）と一緒に、氷上で１時間インキュベートし、次いで、付着試験のためにＨｅＬａ細胞に加えた。
【図２】図２は、Ａｄ３ビリオンおよびＡｄ３のＰｔＤｄを使用した受容体Ｘの同定を示す図である。ａ）Ａｄ３のＢｓＤｄ、ＰｔＤｄ、またはＡｄ線維ノブと一緒にプレインキュベートした後の、３Ｈで標識したＡｄ３ウイルスおよびＡｄ５ウイルスのＨｅＬａ細胞への付着の競合。ＰＢＳで処置した細胞における付着を１００％とした。ｎ＝５。データは、平均＋／−ＳＥＭとして示されている。Ａｄ３−ＰｔＤｄ対Ａｄ３ノブ、Ｐ＝０．００３３。ｂ）Ａｄ３−ＧＦＰおよびＡｄ３５−ＧＦＰのウイルス感染の競合。ＨｅＬａ細胞を、漸増濃度のＡｄ３線維ノブまたはＰｔＤｄを用いて前処置し、次いで、Ａｄ３−ＧＦＰウイルス（左側のパネル）またはＡｄ３５−ＧＦＰウイルス（右側のパネル）に細胞当たり１００ｐｆｕのＭＯＩで曝露させた。１８時間後にフローサイトメトリーによってＧＦＰの発現を測定した。データは、平均として示されている。標準偏差は全てのデータポイントについて１０％未満であった。ｃ）３Ｈで標識したＡｄ３ウイルスおよびＡｄ３５ウイルスの、ヒト細胞株および非ヒト細胞株への付着。Ｙ７９およびＲａｍｏｓは、それぞれヒト網膜芽細胞腫細胞およびリンパ腫細胞である。ＣＨＯ細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞である。ＭＭＣ細胞およびＴＣ１細胞は、それぞれマウスの乳がん細胞および肺がん細胞である。ＴＣ１−ＣＤ４６細胞は、ヒトＣＤ４６を発現する。細胞当たりの付着したウイルス粒子の平均数が示されている。ｎ＝５。ｄおよびｅ）親和性捕捉およびＭＳ／ＭＳによる受容体Ｘの同定。ＨｅＬａ細胞およびＲａｍｏｓ細胞から膜タンパク質画分を調製した。タンパク質ブロットを、Ａｄ５／３５＋＋ビリオン（ｄ）と、Ａｄ３ビリオンまたはＡｄ３のＰｔＤｄ（ｅ）とハイブリダイズさせた。結合を、Ａｄ３５＋＋ノブ（ｄ）またはＡｄ３ノブ（ｅ）に対するポリクローナル抗体を用いて可視化した（図１ｆおよび図１ｇも参照されたい）。可溶化されたＨｅＬａ細胞膜溶解物も、プロテインＡ／Ｇプラスアガロースと架橋結合したＤＳＧ２  ｍＡｂ  ６Ｄ８を用いて免疫沈降させた。免疫沈降物のウエスタンブロットを、ＤＳＧ２モノクローナル抗体ＡＨ１２．２（抗ＤＳＧ２−ＩＰを参照されたい）を用いて実施した。ｆ）１６０ｋＤａのバンドのＭＳ／ＭＳ分析。上のパネル：ＤＳＧ２の構造。ＥＣ：細胞外ドメイン、ＥＡ：膜近傍細胞外アンカードメイン、ＴＭ：膜貫通ドメイン。下のパネル：ＤＳＧ２のアミノ酸配列。１６０ｋＤａのバンドのＭＳ／ＭＳ分析によって捕捉されたペプチド配列が強調表示されている。ＤＳＧ２の略図（一番上のパネル）中の三角形は、異なるドメインに関して同定されたペプチドの局在を示す。ＭＳ／ＭＳ分析により、高信頼因子（タンパク質の適用範囲２０．８％および個々のペプチドについて２．６〜５．５にわたるＳｅｑｕｅｓｔ相互相関係数スコア）で１４ペプチドのＤＳＧ２が検出された。ｇ〜ｉ）センサーチップ上に固定化した組換えヒトＤＳＧ２を用いたＢｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴試験。１ｍｌ当たりｖｐ５．１０９個のＡｄ２、Ａｄ３およびＡｄ５（ｇ）、異なる濃度のＰｔＤｄ（ｈ）またはＰｔＤｄおよびＡｄ３線維ノブ（ｉ）を、活性化した表面一面に注入し、示されている期間にわ��って反応シグナルを収集した。
【図３】図３は、Ａｄ受容体としてのＤＳＧ２の検証を示すグラフである。「機能の損失」試験。ａ）組換えＤＳＧ２による、３Ｈで標識したＡｄの結合の競合。３Ｈ−Ａｄ３ウイルス、３Ｈ−Ａｄ７ウイルス、３Ｈ−Ａｄ１４ウイルス、３Ｈ−Ａｄ１４ａウイルス、３Ｈ−Ａｄ１１ウイルス、３Ｈ−Ａｄ５ウイルスおよび３Ｈ−Ａｄ３５ウイルスを、６μｇ／ｍｌの組換えヒトＤＳＧ２タンパク質と一緒にプレインキュベートした。ＰＢＳと一緒にインキュベートしたウイルス粒子の付着を１００％とした。Ａｄ１１の付着を分析するために、細胞を、５０μｇ／ｍｌのＡｄ３５Ｋとも一緒に氷上で１時間インキュベートした後にＡｄ１１ウイルスを加えてＣＤ４６を遮断した。ｂ）組換えＤＳＧ１タンパク質、組換えＤＳＧ２タンパク質または組換えＤＳＣ２タンパク質によるＡｄ形質導入の競合。ｃ）ＤＳＧ２特異的抗体による３Ｈ−Ａｄ結合の競合。ｎ＝５。ＰＢＳ対６Ｄ８：Ｐ＝０．０１３；ＰＢＳ対８Ｅ５：Ｐ＝０．００１４。異なるＤＳＧ２ドメインに対するｍＡｂの特異性は以下の通りである（ＤＳＧ２の略図については、図１ｆを参照されたい）：２０Ｇ１（プロペプチド領域）、７Ｈ９（Ｐｒｏ／ＥＣ１）、１３Ｂ１１（ＥＣ１／ＥＣ２）、１０Ｄ２（ＥＣ１／ＥＣ２）、８Ｅ５（ＥＣ３）、６Ｄ８（ＥＣ３／ＥＣ４）。ｄ）およびｅ）ｓｉＲＮＡに媒介されるＤＳＧ２の下方制御の、Ａｄの付着（ｄ）および形質導入（ｅ）に対する効果。平均蛍光強度の値が示されている。ｎ＝５。感染後１８時間の時点では、Ａｄ３５−ＧＦＰおよびＡｄ５／３５−ＧＦＰについてＧＦＰレベルは同程度であり、それにより、第一世代のＡｄ５／３５−ＧＦＰベクターをさらなる試験において使用することができたことに注目されたい。ｆ）Ａｄ３−ＧＦＰを感染させたＢＴ４７４細胞の、感染の７日後の細胞溶解。ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞に、同等の最初の形質導入速度が可能になるように調整したＭＯＩ、すなわち、ＤＳＧ２  ｓｉＲＮＡで処置した細胞および対照ｓｉＲＮＡで処置した細胞に対して、それぞれ細胞当たり１．０ｐｆｕのＭＯＩおよび細胞当たり０．５ｐｆｕのＭＯＩで感染させた。７日後に、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。ウイルス用量が多いにもかかわらず、ＤＳＧ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞で見られた死滅は少なく、これは、Ａｄ３の側方伝播におけるＤＳＧ２の重要性を示している。ｇ）Ａｄ３−ＧＦＰ感染細胞の、感染の７日後の細胞溶解。ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした小気道上皮細胞を、調整したＭＯＩで感染させた。７日後に、細胞の生存率をＷＳＴ−１アッセイによって測定した。ＰＢＳで処置した細胞の生存率を１００％とした。ｎ＝３。Ａｄ３−ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ／対照ｓｉＲＮＡ対Ａｄ３−ＧＦＰ  ＤＳＧ２  ｓｉＲＮＡ：Ｐ＜０．００１。
【図４】図４は、Ａｄ受容体としてのＤＳＧ２の検証を示すグラフである。「機能獲得」試験。ａ）異なるＤＳＧ２レベルを発現するヒト細胞株の形質導入。ヒト骨髄赤芽球細胞（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｉｄ）白血病Ｋ５６２細胞およびバーキットＢ細胞リンパ腫であるＢＪＡＢ細胞およびＲａｍｏｓ細胞を、Ａｄ３−ＧＦＰおよびＡｄ５／３５−ＧＦＰにＭＯＩを上昇させて感染させ、１８時間後にＧＦＰの発現を測定した。Ｎ＝３。標準偏差は全てのデータポイントについて１０％未満であった。ｂ）ＤＳＧ２の異所発現。ヒト組織球性リンパ腫Ｕ９３７細胞を、ＥＦ１αプロモーターの制御下で、ＤＳＧ２  ｃＤＮＡを保有するレンチウイルスベクターに感染させた。フローサイトメトリーにより、レンチウイルスで形質導入された細胞の＞９８％において安定なＤＳＧ２の発現が検出された。ｃ）３Ｈ−Ａｄ３および３Ｈ−Ａｄ３５の、Ｒａｊｉ細胞、Ｕ９３７細胞およびＤＳＧ２を発現しているＵ９３７（Ｕ９３７−ＤＳＧ２）細胞への付着。Ａｄ３５の付着はＣＤ４６によって媒介され、可溶性のＣＤ４６によって遮断することができることに注目されたい（データは示していない）。ｄ）Ｕ９３７細胞およびＵ９３７−ＤＳＧ２細胞にＡｄ３−ＧＦＰおよびＡｄ５／３５−ＧＦＰを形質導入した後のＧＦＰの発現。ｎ＝３。
【図５】図５は、ヒト上皮細胞におけるＤＳＧ２の局在およびＡｄ３との相互作用を示す画像である。ａ）ヒト結腸、包皮および卵巣がんのパラフィン切片に対する、ＤＳＧ２特異的抗体を用いた免疫組織学的試験。陽性染色は褐色で現れる。ｂ）極性ヒト結腸がんＴ８４細胞の、ＤＳＧ２（緑色）および細胞間結合タンパク質クローディン７（赤色）についての共焦点顕微鏡免疫蛍光分析。核は青色である。ＸＹ平面およびＸＺ平面が示されている。ｃ）Ａｄ３とＤＳＧ２の結合。Ｔ８４細胞を、Ｃｙ３で標識したＡｄ３粒子（赤色）と一緒に１５分間インキュベートし、洗浄し、共焦点顕微鏡にかけた。上のＸＺ画像の方が拡大率が高い。少なくとも２つの（緑色の）ＤＳＧ２シグナルが１つの（赤色の）Ｃｙ３−Ａｄ３シグナルに付随していることに注目されたい。ｄ）正常なヒト小気道上皮細胞（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーにおいて成長させていない）の共焦点顕微鏡写真。細胞を、Ｃｙ５で標識したＰｔＤｄと一緒に１５分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳで洗浄した。上のＸＺパネルは、ＤＳＧ２（赤色）とＥ−カドヘリン（緑色）の共局在を示す。下のＸＺパネルは、紫色のＣｙ５−ＰｔＤｄシグナルと緑色のＥ−カドヘリンシグナルの共局在を示す同じ画像である。ＸＹパネルは、紫色の（ＰｔＤｄ）および緑色のＥ−カドヘリンチャネルを示す。薄い矢印は、膜局在ＰｔＤｄを示し、太い矢印は、細胞質内のＤＳＧ２を標識する。ｅ）ヒト子宮頸癌ＨｅＬａ細胞（上のＸＺパネルおよびＸＹパネル）およびＣｙ３−Ａｄ３と一緒に１５分間インキュベートしたＨｅＬａ細胞（下のＸＺパネル）の共焦点顕微鏡免疫蛍光分析。全ての共焦点顕微鏡写真のスケールバーは２０μｍである。
【図６】図６は、上皮細胞においてＡｄ３ビリオンおよびＰｔＤｄによって誘導される上皮間葉転換シグナル伝達を示す図である。ａ〜ｄ）乳がん上皮細胞においてＰｔＤｄによって誘発される表現型の変化。ＢＴ４７４細胞１×１０５個を、５０ｎｇのＰｔＤｄまたはＢｓＤｄと一緒に、示されている時間にわたってインキュベートし、抗体を用いて染色した。スケールバーは、全てのＺＹ共焦点画像（ａ、ｂ）で２０μｍであり、標準の免疫蛍光試験（ｃ、ｄ）では４０μｍである。ｅ）上方制御された遺伝子および下方制御された遺伝子（ＰｔＤｄで処置した細胞対ＰＢＳで処置した細胞）のアレイデータの図表による実証。各ドットが１つの遺伝子を表す。ｆ）ＢＴ４７４細胞を、示されている濃度のＰｔＤｄ特異的抗体、ＢｓＤｄ特異的抗体、ＤＳＧ２特異的抗体（１０Ｄ２、１３Ｂ１１、または６Ｄ８）、または対照抗体（抗ＧＡＰＤＨ）と一緒に６時間インキュベートした後に分析した、ＥＲＫ１／２−ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋのリン酸化のウエスタンブロット分析。経路を阻害するために、細胞を、Ｅｒｋ１／２阻害剤であるＵＯ１２６（５μＭ）またはＰＩ３Ｋ阻害剤であるＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ（２．５μＭ）を用いて一晩処置した後にＰｔＤｄを加えた。特異的な経路の阻害に対する薬物の有効性を以前の試験８において検証した。均等なローディングを実証するためにＧＡＰＤＨを使用する。
【図７】図７は、上皮乳がん細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ）における、Ａｄ３ビリオンまたはＰｔＤｄとＤＳＧ２の相互作用による細胞間結合の開口についての図である。ａ）ＢＴ４７４細胞の単層を通じたＦＩＴＣ−デキストラン拡散。孔サイズが０．４μｍのｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー内で培養したＢＴ４７４細胞を、０．５μｇ／ｍｌのＢｓＤｄ、ＰｔＤｄまたは１ｍｌ当たり２×１０８個のＡｄ粒子を用いて２時間にわたって処置し、次いで、４ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストランを頂端区画に加えた。頂端チャンバーおよび基底チャンバーからの一定分量において傍細胞の流束を評価した。ＢｓＤｄ対ＰｔＤｄ：Ｐ＜０．００１。ｂ）ＰｔＤｄによる３Ｈ−Ａｄ３５の取り込みの容易化。左側のパネル：Ｔ８４細胞の細胞間結合におけるＣＤ４６の閉じ込め。黄色シグナルをもたらすＣＤ４６および細胞間結合タンパク質クローディン７の共局在。右側のパネル：３Ｈ−Ａｄ３５の付着。ＢＴ４７４細胞を、ＰｔＤｄまたはＢｓＤｄ、および３Ｈ−Ａｄ３５と一緒に氷上で２時間インキュベートし、洗浄し、次いで、３７℃で６０分インキュベートした。内部移行しなかったＡｄ粒子をトリプシン消化によって除去し、細胞に伴う放射活性を測定した。ｃ）皮下ｏｖｃ３１６腫瘍を担持するマウスに、５０μｇのＰｔＤｄまたはＢｓＤｄを静脈内注射した８時間後に、１×１０９ｐｆｕのＡｄ５／３５−ｂＧａｌを静脈内注射した。注射した７２時間後に切片をＸ−ｇａｌで染色した。スケールバーは４０μｍである。ｄ）Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性ヒト乳がん細胞株ＢＴ４７４におけるＨｅｒ２／ｎｅｕおよびクローディン７についての共焦点顕微鏡写真。これらの細胞は、単層を形成しない。ＰＢＳで処置した細胞では、大部分のＨｅｒ２／ｎｅｕシグナル（緑色）がクローディン７（赤色）と共局在し、黄色シグナルをもたらすことに注目されたい。ＰｔＤｄで処置すると、クローディン７シグナルは減少するが、一方、細胞表面上に現れるＨｅｒ２／ｎｅｕ染色は増える。ｅ）ＰＢＳまたはＰｔＤｄを用いて処置した２時間後のＢＴ４７４細胞の共焦点顕微鏡写真。ｆ）Ａｄ３およびＰｔＤｄは、ハーセプチンによるＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳がん細胞の死滅を増強する。ＰＢＳで処置した細胞の生存率を１００％とした。ｎ＝５、＊Ｐ＜０．０５。ｇ）Ａｄ３およびＰｔＤｄによるハーセプチン療法の増強は、ＤＳＧ２によって媒介され、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路およびＰＩ３Ｋ経路を必要とする。図２ｄに記載の通り、ＢＴ４７４細胞に、対照ｓｉＲＮＡおよびＤＳＧ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、４８時間後に、ｇ）に記載の通りＡｄ３またはＰｔＤｄおよびハーセプチンで処置した。阻害剤の試験のために、ＢＴ４７４細胞を、示されている作用剤と一緒に一晩インキュベートした。細胞を洗浄し、上記の通りＰｔＤｄ／Ａｄ３およびハーセプチンで処置した。ｎ＝５、ＰＢＳ対Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＵＯ１２６：Ｐ＜０．０５。ｈ）ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるハーセプチン療法のＰｔＤｄに媒介される増強。ＢＴ４７４−Ｍ１細胞を注射した後の異なる日数における個々のマウスの腫瘍体積が示されている。
【図８】図８は、ｍＡｂ療法に対するＰｔＤｄの効果についての図である。ａ）Ａｄ３およびＰｔＤｄは、ハーセプチンによるＨｅｒ２／ｎｅｕ−陰性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞の死滅を増強しない。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌのＢｓＤｄもしくはＰｔＤｄ、またはｕｖにより不活化したＡｄ５またはＡｄ３のウイルス粒子１ｍｌ当たり２×１０８個と一緒に１２時間インキュベートし、その後ハーセプチン（１５ｍｇ／ｍｌ）と一緒に３０分インキュベートした。２時間後に、Ｒｏｃｈｅ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＷＳＴ−１アッセイによって細胞の生存率を測定した。ＰＢＳで処置した細胞の生存率を１００％とした。ｂ）Ａｄ３およびＰｔＤｄにより、アービタックス（抗ＥＧＦＲ）によるＥＧＦＲ陽性の結腸がん細胞の死滅が増強される。ＬｏＶｏ細胞（ＥＧＦＲ陽性）を、０．５ｍｇ／ｍｌのＰｔＤｄと一緒に１２時間インキュベートし、その後、アービタックス（１５ｍｇ／ｍｌ）と一緒に３０分インキュベートした。２時間後に、ＷＳＴ−１アッセイによって細胞の生存率を測定した。ＰＢＳで処置した細胞の生存率を１００％とした。＊Ｐ＜０．０５。ｃ）ＢＴ４７４細胞の接着結合に対するＤＳＧ２  ｓｉＲＮＡの効果。ＰＢＳまたはＤＳＧ２  ｓｉＲＮＡで処置した２日後におけるＢＴ４７４細胞のクローディン７染色が示されている。スケールバーは４０ｍｍである。
【図９】図９は、キメラＡｄ５／３ベクターの形質導入におけるＤＳＧ２の役割を示す図である。Ａ）Ａｄ５／３ベクターの構造。ベクターは、Ａｄ５に基づき、Ｅ１領域およびＥ３領域が欠失している。どちらのベクターも、Ｅ３領域に挿入されたＧＦＰ発現カセットを含有している。Ａｄ５／３Ｌ−ＧＦＰでは、Ａｄ５線維ノブドメインがＡｄ３由来の線維ノブドメインで置き換わっている。Ａｄ５／３Ｓ−ＧＦＰでは、Ａｄ５シャフトドメインおよびＡｄ５ノブドメインを、Ａｄ３由来の対応するドメインと置き換えた。Ａｄ３シャフトドメインは、６個のシャフトモチーフを含有するが、Ａｄ５シャフトドメインは、２２個のシャフトモチーフを含有する。Ｂ）組換えＤＳＧ２タンパク質によるＡｄの付着の遮断。Ｈ３で標識したＡｄを、６ｍｇ／ｍｌの組換えヒトＤＳＧ２タンパク質と一緒に氷上で１時間インキュベートし、次いで、氷上で１時間にわたってＨｅＬａ細胞に加えた。ＤＳＧ２の代わりにＰＢＳと一緒にインキュベートした細胞へのＡｄの付着を１００％とした。ｎ＝３、すなわち、３つの別々のウェル。Ａｄ３−ＧＦＰは、Ａｄ５／３ベクターと同じＧＦＰ発現カセットを含有する、Ａｄ３に由来するベクターである。Ｃ）組換えＤＳＧ２タンパク質によるＡｄの付着の遮断。Ａｄベクターを、漸増濃度のＤＳＧ２タンパク質と一緒に室温で６０分インキュベートした。次いで、ＨｅＬａ細胞を、細胞当たり１００ｐｆｕのＭＯＩで６０分にわたって感染させ、その後ウイルスを除去し、新しい培地を加えた。１８時間後にフローサイトメトリーによってＧＦＰ蛍光を測定した。ｎ＝３。平均値が示されている。標準偏差は全ての試料で１０％未満であった。Ｄ）Ａｄ３のＰｔＤｄによる、Ａｄ感染の競合。ＨｅＬａ細胞を、漸増濃度のＰｔＤｄと一緒に６０分インキュベートし、次いで、Ａｄベクターに細胞当たり１００ｐｆｕのＭＯＩで６０分にわたり感染させ、その後ウイルスを除去し、新しい培地を加えた。１８時間後にＧＦＰ蛍光を測定した。Ｎ＝３。平均値が示されている。標準偏差は全ての試料で１０％未満であった。Ｅ）ＤＳＧ２  ｓｉＲＮＡは、Ａｄ５／３ベクターの感染を遮断する。ＨｅＬａ細胞１×１０５個に合計１マイクログラムのｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクトした４８時間後に、Ｖｅｒｓｅｎｅによって細胞を収集し、細胞１×１０５個を再度播いた。２日目に、細胞を、Ａｄベクターに細胞当たり１００ｐｆｕのＭＯＩで感染させた。１８時間後にＧＦＰ蛍光を測定した。
【図１０】図１０は、Ａｄ３線維ノブの架橋を必要とするＡｄ３の感染の遮断を示す図である。Ａ）Ｎ末端のＨｉｓタグ、６個のシャフトモチーフ（Ｓ６）、およびノブドメイン（Ｋｎ）を含有する組換えＡｄ３線維ノブ（Ｓ６／Ｋｎ）の構造。追加的な線維ノブ変異体は、５個、４個、３個、２個、または１個のシャフトモチーフを含有し、それぞれＳ５／Ｋｎ、Ｓ４／Ｋｎ、Ｓ３／Ｋｎ、Ｓ２／Ｋｎ、およびＳ／Ｋｎと標識した。Ｂ）組換えＡｄ３線維ノブのウエスタンブロット分析。フィルターを、組換えＤＳＧ２と一緒にインキュベートし、その後、マウスモノクローナル抗ＤＳＧ２抗体および抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ結合体と一緒にインキュベートした。５０〜７０ｋＤａの範囲内の三量体型のＡｄ３線維ノブが目に見える。（三量体）Ｓ６／Ｋｎ、Ｓ５／Ｋｎ、Ｓ４／Ｋｎ、Ｓ３／Ｋｎ、Ｓ２／Ｋｎ、およびＳ／Ｋｎの理論分子量は、９３．９ｋＤａ、８９．７ｋＤａ、８４．３ｋＤａ、７９．２ｋＤａ、７４．４ｋＤａ、および６９．３ｋＤａである。Ｓ６／ＫｎおよびＳ２／Ｋｎは、他のノブより多くの線維ノブの多量体（＞７５ｋＤａ）を形成し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて封入体を生成する傾向があった。線維ノブが変性することにより、２５〜３０ｋＤａの単量体がもたらされると思われる（示されていない）。Ｃ）Ａｄ３線維ノブに対する抗体をプローブとして用いたウエスタンブロット。ＤおよびＥ）Ａｄ３−ＧＦＰの形質導入の競合。ＨｅＬａ細胞を、漸増濃度のＰｔＤｄおよび異なるＡｄ３線維ノブと一緒に６０分インキュベートし、次いで、Ａｄ３−ＧＦＰに細胞当たり１００ｐｆｕのＭＯＩで６０分にわたって感染させ、その後ウイルスを除去し、新しい培地を加えた。１８時間後にＧＦＰ蛍光を測定した。ｎ＝３。ＧＦＰ陽性細胞の百分率の平均値（Ｄ）および平均のＧＦＰ蛍光（Ｅ）が示されている。標準偏差は全ての試料で１０％未満であった。明確にするために、Ｓ５／Ｋｎは示していない。Ｆ）Ｈｉｓタグを付けた線維ノブ（Ｓ／Ｋｎ）と抗Ｈｉｓ抗体の架橋。抗Ｈｉｓ  ｍＡｂをＰＢＳまたはＳ／Ｋｎと一緒に１５分インキュベートし、ネイティブなポリアクリルアミドゲルに流した。抗体の分子量は１５０ｋＤａである。Ｓ／Ｋｎの存在下では、それよりも分子量が大きい追加的なバンドが現れ、これは、両方のタンパク質の複合体を反映している。ノブ単独は示されていない。Ｇ）Ａｄ３線維ノブと抗Ｈｉｓ抗体の架橋の、Ａｄ３−ＧＦＰの形質導入の阻害に対する効果。５ｍｇ／ｍｌのＡｄ３線維ノブを、２０ｍｇ／ｍｌのマウス抗Ｈｉｓ  ｍＡｂと一緒に室温で６０分インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞１×１０５個に加えた。６０分インキュベートした後、細胞当たり１００ｐｆｕのＡｄ３ＧＦＰウイルスを加え、Ｄ）に記載の通りＧＦＰを分析した。全てのＡｄ３線維ノブについて「ノブ」と「ノブ＋抗Ｈｉｓ」の間の差異は有意であった（Ｐ＜０．００５）。比較のために、この試験にＡｄ３５線維ノブ（非二量体形成性）も含めた。Ｈ）Ａｄ３５−ＧＦＰの形質導入に対する架橋したＡｄ３線維ノブまたはＡｄ３５線維ノブの効果。Ａｄ３５−ＧＦＰは、ＣＭＶ−ＧＦＰ発現カセットを含有する、Ａｄ３５に由来するベクターである（３３）。Ａｄ３線維ノブおよび���ｄ３５線維ノブは、Ｈｉｓタグ、１つのシャフトモチーフ、および対応するノブを含有するタンパク質である（３１）（Ａｄ３ノブは、Ｓ／Ｋｎと同じである）。Ｇ）に記載の通り実験を実施した。「ノブ」と「ノブ＋抗Ｈｉｓ」の間の差異は有意でなかった。
【図１１】図１１は、Ｅ−コイル／Ｋ−コイルを介したＡｄ３線維ノブの二量体形成についての図である。Ａ）Ｎ末端のＨｉｓタグ、二量体形成ドメイン（Ｅ−コイルまたはＫ−コイル（３７））、可動性のリンカー、２つの線維シャフトモチーフ（５番目および６番目）、およびＡｄ３線維ノブドメインを含有する組換えＡｄ３線維ノブタンパク質の模式的な構造。Ａｄ３−Ｓ２／Ｋｎは、二量体形成ドメインを欠く線維である。Ｂ）Ａｄ３−ＧＦＰの形質導入の競合。ＨｅＬａ細胞を、漸増濃度のＰｔＤｄおよび異なるＡｄ３線維ノブと一緒に６０分インキュベートし、次いで、Ａｄ３−ＧＦＰに細胞当たり１００ｐｆｕのＭＯＩで６０分にわたって感染させ、その後ウイルスを除去し、新しい培地を加えた。１８時間後にＧＦＰ蛍光を測定した。ｎ＝３。ＧＦＰ陽性細胞の百分率の平均値が示されている。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ２／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ２／Ｋｎは、両方の線維ノブの１：１混合物である。ＰｔＤｄ対Ａｄ３−Ｅ／Ｓ２／Ｋｎ：ｐ＝０．０７４；ＰｔＤｄ対Ａｄ３−Ｋ／Ｓ２／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ２／Ｋｎ：Ｐ＝０．０３；Ａｄ３−Ｋ／Ｓ２／Ｋｎ対Ａｄ３−Ｋ／Ｓ２／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ２／Ｋｎ：Ｐ＝０．６２。Ｃ）Ａｄ３線維ノブと抗Ｈｉｓ抗体の架橋。５ｍｇ／ｍｌのＡｄ３線維ノブを、２０ｍｇ／ｍｌのマウス抗Ｈｉｓ  ｍＡｂと一緒に室温で６０分インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞１×１０５個に加えた。６０分インキュベートした後、細胞当たり１００ｐｆｕのＡｄ３−ＧＦＰウイルスを添加し、Ｂ）に記載の通りＧＦＰを分析した。「ノブ」と「ノブ＋抗Ｈｉｓ」の間の差異は、Ａｄ３−Ｅ／Ｓ２／Ｋｎについては有意である（Ｐ＜０．０５）が、他の試料については有意でない。
【図１２】図１２は、シャフトモチーフを１つのみ含有する二量体の線維ノブの分析について示す図である。Ａ）組換えＡｄ３線維ノブタンパク質であるＡｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎおよびＡｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎの模式的な構造。各線維ノブ三量体の理論分子量は約６０ｋＤａである。Ｂ）クーマシーブルー染色したゲル。試料を、トリス／グリシン／０．１％ＳＤＳ緩衝液中４〜１５％勾配のポリアクリルアミドゲルに流した。ＵＢ−煮沸していない試料、Ｂ−煮沸した試料。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で煮沸することにより、三量体タンパク質の構造が攪乱され、約２５ｋＤａの線維ノブ単量体がもたらされることに注目されたい。Ｃ）精製したＡｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎおよびＡｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎと混合したＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎの陰性染色電子顕微鏡写真。左上の画像は、両方の調製物中の線維ノブ二量体を示す。線維ノブ自体は三量体であることに注目されたい。下の画像は、３つ以上の線維ノブを含有する凝集体を示す。右側のパネルは、写真の模式図を示す。Ｄ）組換えＡｄ３線維ノブまたはＰｔＤｄによる、３Ｈ−Ａｄ３の付着の遮断。ＰＢＳと一緒にインキュベートした細胞へのＡｄの付着を１００％とした。Ｎ＝３。Ｅ）組換えＡｄ３線維ノブまたはＰｔＤｄによる、３Ｈ−Ａｄ５の付着の遮断。ＰＢＳと一緒にインキュベートした細胞へのＡｄの付着を１００％とした。Ｎ＝３。ＦおよびＧ）Ａｄ３−ＧＦＰの形質導入の競合。ＨｅＬａ細胞を、漸増濃度の線維ノブまたはＰｔＤｄと一緒に６０分インキュベートし、次いで、Ａｄ３−ＧＦＰを細胞当たり１００ｐｆｕのＭＯＩで６０分にわたって感染させ、その後ウイルスを除去し、新しい培地を加えた。１８時間後にＧＦＰ蛍光を測定した。ｎ＝３。ＧＦＰ陽性細胞の百分率の平均値（Ｆ）および平均のＧＦＰ蛍光（Ｇ）が示されている。標準偏差は全ての試料で１０％未満であった。ＨおよびＩ）ＦおよびＧ）と同じ試験を、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎおよび２つのシャフトモチーフを有する線維ノブであるＡｄ３−Ｋ／Ｓ２／Ｋｎを用いて実施した。
【図１３】図１３は、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／ＫｎのＳＰＲ分析およびＡｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎとＤＳＧ２の相互作用について示す図である。Ａ）ビオチン化した線維ノブを、ストレプトアビジンを連結したセンサーチップに固定化した。示されている濃度（３ｍｇ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌ）でＤＳＧ２を注射した。示されている期間にわたり、自動的にバックグラウンドを差し引きながら反応シグナルを収集した。Ｂ）ＤＳＧ２をセンサーチップ上に固定化し、対照フローセルからバックラウンドを自動的に差し引いた。Ａｄ３線維ノブ（非二量体形成性）、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎおよびＡｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎを１０ｍｇ／ｍｌで、およびＰｔＤｄを３ｍｇ／ｍｌで注入して、全ての反応を約１００ＲＵに正規化する（１２面体は１２個の線維を有すること、およびＳＰＲシグナルはアナライトの分子量に左右されることを考慮に入れる）。Ｃ）Ｂ）に示されているＳＰＲデータの要約および注入を終えた１５０秒後に算出された残りのシグナル。Ｄ）上皮の結腸がんＴ８４細胞上のＤＳＧ２およびＡｄ３粒子の共焦点免疫蛍光分析。側方からの細胞、すなわち、積み重なったＸＺ共焦点像の層が示されている。細胞を、Ｃｙ−３で標識したＡｄ３粒子に１５分曝露させ、洗浄し、固定し、抗ＤＳＧ２抗体（緑色）で染色した。Ａｄ３粒子は赤色で現れる。スケールバーは２０ｍｍである。右側のパネルは、Ａｄ３粒子が群がる２つのＤＳＧ２ユニットを伴う共焦点像の模式図を示す。Ｅ）細胞表面およびそれよりも１ｍｍ深部のＸＹ切片。この画像は、Ａｄ３が、細胞表面上に露出しているＤＳＧ２分子と結合することを示唆している。ＤＳＧ２の大部分が、より深部、すなわち、タイトジャンクションの遠位に局在することに注目されたい。
【図１４】図１４は、上皮の結合の分析について示す図である。ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー内で２０日間培養した極性結腸癌Ｔ８４細胞に対して試験を実施した。Ａ）共焦点免疫蛍光顕微鏡。代表的な積み重なったＸＺ画像が示されている。上のパネル：ＤＳＧ２（緑色）が、クローディン７（赤色）がマーカーとなる側底の結合の頂端部位に現れている。下のパネル：密着結合のマーカーであるＺＯ−１（赤色）がＤＳＧ２（緑色）の頂端側に局在している。クローディン７染色によって外側の膜内に「筋をつける」ＤＳＧ２の下部が隠れており、一方ＺＯ−１染色によってＤＳＧ２シグナルの上部が覆われている。スケールバーは２０ｍｍである。Ｂ）ＤＳＧ２（緑色）およびＺＯ−１（赤色）について染色された、細胞表面および１ｍｍ深部由来のＸＹ切片が示されている。Ｃ）細胞を、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ（５ｍｇ／ｍｌ）で処置し、１２時間後にＤＳＧ２およびＺＯ−１について分析した。Ｄ）Ｔ８４細胞の結合領域の透過型電子顕微鏡。細胞を、ＰＢＳ（左側のパネル）またはＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ（右側のパネル）のいずれかを用いて氷上で１時間処置し、洗浄し、次いで、３７℃で１時間インキュベートした。この時に、高電子密度の色素であるルテニウムレッド（１）を固定液と一緒に加えた。密着結合（デスモソームの上）が閉じている場合、この色素では、頂端膜のみが染色される（黒い線）。密着結合が開いている場合、この色素は細胞間に浸透し、側底膜が染色される。スケールバーは１ｍｍである。拡大率は４０，０００×である。Ｅ）より高い拡大率（１００，０００×）により、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎで処置した後のデスモソームの崩壊が示されている（矢印で示されている）。スケールバーは０．２ｍｍである。
【図１５】図１５は、上皮の結合開口の機能分析について示す図である。Ａ）Ｔ８４細胞を、ポリエステル膜ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート内で、経上皮の抵抗性が一定になるまで、つまり、細胞間密着結合が形成されるまで、２１日間成長させた。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー内で培養した極性Ｔ８４細胞を通じた１４Ｃ−ＰＥＧ−４，０００の拡散が示されている。細胞を、ＰＢＳまたは種々のＤＳＧ２リガンドと一緒に１５分インキュベートし、その後、１４Ｃ−ＰＥＧ−４，０００を内部チャンバーに加えた。他に記載の通り（１）、頂端チャンバーおよび基底チャンバーからの一定分量において傍細胞の流束を評価した。以下のＤＳＧ２の異なる細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するモノクローナル抗体を使用した：１３Ｂ１１−ｍＡｂ（ＥＣＤ１／２に対する）および６Ｄ８−ｍＡｂ（ＥＣＤ３／４に対する）。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎは、二量体形成型である。Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎは二量体を形成することができない。Ｂ）Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳がんＢＴ４７４−Ｍ１細胞のトラスツズマブによる死滅に対するＤＳＧ２リガンドの効果。細胞を、１００％集密で２日間インキュベートした。リガンドを１時間にわたって内部チャンバーに加えた後、ＰＢＳまたはトラスツズマブを加えた。２時間後に細胞の生存率を測定した（材料および方法を参照されたい）。１３Ｂ１１  ｍＡｂおよび６Ｄ８  ｍＡｂに加えて、以下の抗ＤＳＧ２抗体を使用した：７Ｈ９（プロペプチドドメインに対する）、１０Ｄ２（ＥＣＤ２に対する）、８Ｅ５（ＥＣＤ３／４に対する）。希釈緩衝液で処置した細胞の生存率を１００％とした。ｎ＝５、すなわち、５つの別々のウェル。＊：希釈緩衝液と比較してＰ＜０．０５。Ｃ）希釈緩衝液またはＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎで処置したＴ８４細胞におけるＣＡＲの共焦点顕微鏡写真（積み重なったＸＺ層）。Ｔ８４細胞を、ポリエステル膜ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート内で２１日間成長させた。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ（４０ｍｇ／ｍｌ）または希釈緩衝液を６０分にわたり加え、その後、細胞を洗浄し、免疫蛍光分析にかけた。ＣＡＲは緑色に染色される。核は青色である。スケールバーは２０ｍｍである。Ｄ）極性Ｔ８４細胞におけるＣＡＲの共焦点顕微鏡写真。細胞表面および細胞表面の１ｍｍ下の層（右側のパネル）のＸＹ画像を取得した。実験条件はＣ）の場合と同様であった。スケールバーは２０ｍｍである。Ｅ）Ｔ８４細胞へのＡｄの形質導入。Ｔ８４細胞を、ポリエステル膜ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート内で２１日間成長させた。Ａｄ３−ＧＦＰおよびＡｄ５−ＧＦＰを細胞当たり２５０ｐｆｕのＭＯＩで、希釈緩衝液（上のパネル）またはＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ（４０ｍｇ／ｍｌ）と一緒に内部チャンバーに加えた。３時間後にウイルスを除去し、細胞を洗浄した。２０時間インキュベートした後にＧＦＰの発現を分析した。代表的な画像が示されている。数量化するために、３回の独立した実験の独立した１０画像からのＧＦＰ陽性細胞を計数した。スケールバーは２０ｍｍである。Ｆ）Ａｄ５−ＧＦＰ感染細胞のフローサイトメトリー。Ｔ８４細胞を、希釈緩衝液または４０ｍｇ／ｍｌのＤＳＧ２リガンドのいずれかの存在下で、Ｅ）に記載の通りＡｄ５−ＧＦＰに��染させた。ｎ＝３。＊：希釈緩衝液と比較してＰ＜０．０５。
【図１６】図１６は、ＪＯ−１による、上皮の結合の一過性の開口を示す図である。Ａ）Ａｄ３ウイルス粒子の構造。左側のパネル：完全な、感染性のＡｄ３粒子。カプシドタンパク質の線維およびペントンベースがそれぞれ緑色および青色で示されている。三量体の線維ノブが赤色で示されている。中央のパネル：１２個の組換えペントン（線維＋ペントンベース）の自然発生的な組立てによって形成されたＡｄ３ペントン１２面体（ｐｅｎｔｏｎｄｏｄｅｃａｈｅｄｒａ）（ＰｔＤｄ）。右側のパネル：二量体Ａｄ３線維（ＪＯ−１）。Ｂ）Ｎ末端のＨｉｓタグ、二量体形成ドメイン［Ｋ−コイル（Ｚｅｎｇら、２００８年）］、可動性のリンカー、１つの線維シャフトモチーフ、およびホモ三量体のＡｄ３線維ノブドメインを含有するＪＯ−１の模式的な構造。ＪＯ−１をＥ−ｃｏｌｉにおいて産生させ（約１０ｍｇ／ｌの収量で）、Ｎｉ−カラムを用いて精製した。Ｃ）左側のパネル：密着結合、デスモソーム、および接着結合を有する上皮の結合の簡易化した構造。ＤＳＧ２はデスモソームタンパク質である。クローディン７は接着結合タンパク質である。右側のパネル：Ｔ８４細胞の共焦点免疫蛍光顕微鏡写真。代表的な積み重なったＸＺ画像が示されている。細胞を、ＪＯ−１（５μｇ／ｍｌ）を用いて氷上で１時間処置した。ＪＯ−１を除去した後、細胞を３７℃でインキュベートし、０分後、３０分後および６０分後に分析した。上のパネル：ＤＳＧ２（緑色）は、クローディン７（赤色）がマーカーとなる側底の結合の頂端部位に現れる。中央のパネル：ＪＯ−１を加えた後３０分以内に、クローディン７染色が増加し、外側の膜の上部に沿ってＤＳＧ２染色が目に見えるようになる（黄色シグナル）。下のパネル：６０分まで、側方結合は、「０分」時点のものと類似している。スケールバーは４０μｍである。Ｄ）極性結腸がんＴ８４細胞の結合領域の透過型電子顕微鏡写真。細胞を、ＰＢＳ（左側のパネル）またはＪＯ−１（右側のパネル）のいずれかを用いて氷上で１時間処置し、洗浄し、次いで、３７℃で１時間インキュベートした。この時に、高電子密度の色素であるルテニウムレッド（Ａｍｉｅｖａら、２００３年）を固定液と一緒に加えた。密着結合（デスモソームの上、矢印によって示されている）が閉じている場合、この色素では、頂端膜のみが染色される（黒い線）。密着結合が開いている場合、この色素は細胞間に浸透し、側底膜が染色される。スケールバーは１μｍである。拡大率は４０，０００×である。Ｅ）ＪＯ−１または抗ＤＳＧ２抗体（６Ｄ８、ＥＣＤ３／４を対象とする）を加えた後の異なる時点における、Ｔ８４細胞の単層を通じた１４Ｃ−ＰＥＧ−４，０００の拡散。細胞をＤＳＧ２リガンドと一緒に氷上で１時間インキュベートし、洗浄した。次いで、１４Ｃ−ＰＥＧ−４，０００を含有する新鮮な培地を内部チャンバーに加えた。他で記載されている通り（Ａｍｉｅｖａら、２００３年）、頂端チャンバーおよび基底チャンバーからの一定分量において傍細胞の流束を評価した。実験を３回繰り返した。
【図１７】図１７は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍におけるＪＯ−１の作用機構の分析について示す図である。合計４×１０６個のヒト乳がんＨＣＣ１９５４細胞を、ＣＢ１７−ＳＣＩＤ／ベージュマウスの乳房の脂肪パッドに注射した。３０日後、腫瘍の体積が約２００ｍｍ３に達した時、ＪＯ−１（２００μｌのＰＢＳ中２ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。ＪＯ−１を注射した１時間後または１２時間後に腫瘍を採取した。対照マウスには２００μｌのＰＢＳを受けさせ、１時間後に腫瘍を収集した。Ａ）腫瘍におけるＪＯ−１の蓄積の動力学。左側のパネル：抗Ｈｉｓタグ抗体を用いた（ＪＯ−１を可視化するため）腫瘍切片の免疫蛍光分析。代表的な切片が示されている。スケールバーは２０μｍである。右側のパネル：Ａｄ３−線維ノブ特異的抗体を用いた腫瘍組織のウエスタンブロット分析（Ｗａｎｇら、２０１１年ｂ）。ＪＯ−１を示す特異的なバンドに矢印がつけられている。代表的な画像が示されている。実験を３回繰り返した。Ｂ）腫瘍中のＤＳＧ２の分析。左側のパネル：ＤＳＧ２抗体（ＤＳＧ２の細胞外ドメイン３／４に対するｍＡｂである６Ｄ８）を用いた腫瘍切片の免疫蛍光法分析。挿入写真はより高い拡大率を示す。右側のパネル：同じ抗ＤＳＧ２抗体を腫瘍組織のウエスタンブロット分析に使用した。Ｃ）ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞内シグナル伝達。左側のパネル：Ｅ−カドヘリンおよびリン酸化されたＥ−カドヘリン、Ｅｒｋ１／２、リン酸化されたＥｒｋ１／２、クローディン７、およびビメンチンについての腫瘍組織のウエスタンブロット分析。ガンマ−チューブリンに対する抗体を使用して試料のローディングを評価した（「ローディング対照」）。右側のパネル：Ｅ−カドヘリンおよびリン酸化されたＥｒｋ１／２に対する抗体を用いた免疫蛍光法分析。  代表的な画像が示されている。実験を３回繰り返した。
【図１８Ａ】図１８は、ＪＯ−１により、ＨＣＣ１９５４乳がん上皮内腫瘍（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）におけるトラスツズマブの浸透が改善されることを示す図である。腫瘍を担持するマウスに、ＰＢＳまたはＪＯ−１（２ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射し、その１時間後にトラスツズマブを静脈内注射した。トラスツズマブを注射した１時間後または１２時間後に腫瘍を採取した。Ａ）切片を、ヒトＩｇＧ（すなわち、トラスツズマブ）について染色した。陽性染色は緑色で現れる。代表的な切片が示されている。スケールバーは２０μｍである。Ｂ）腫瘍におけるヒトＩｇＧ（トラスツズマブ）についてのウエスタンブロット分析。Ｉｇの重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）が矢印により示されている。膜にブロッティングされた総タンパク質についてのＰｏｎｃｅａｕ  Ｓ染色がローディング対照としての機能を果たす。代表的な画像が示されている。
【図１８Ｂ】図１８は、ＪＯ−１により、ＨＣＣ１９５４乳がん上皮内腫瘍（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）におけるトラスツズマブの浸透が改善されることを示す図である。腫瘍を担持するマウスに、ＰＢＳまたはＪＯ−１（２ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射し、その１時間後にトラスツズマブを静脈内注射した。トラスツズマブを注射した１時間後または１２時間後に腫瘍を採取した。Ａ）切片を、ヒトＩｇＧ（すなわち、トラスツズマブ）について染色した。陽性染色は緑色で現れる。代表的な切片が示されている。スケールバーは２０μｍである。Ｂ）腫瘍におけるヒトＩｇＧ（トラスツズマブ）についてのウエスタンブロット分析。Ｉｇの重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）が矢印により示されている。膜にブロッティングされた総タンパク質についてのＰｏｎｃｅａｕ  Ｓ染色がローディング対照としての機能を果たす。代表的な画像が示されている。
【図１９】図１９は、ＪＯ−１により、標的受容体が上皮の結合内に閉じ込められている細胞のｍＡｂによる死滅が増加することを示す図である。Ａ）極性ＢＴ４７４細胞培養物に対するＨｅｒ２／ｎｅｕ染色（緑色）およびＤＳＧ２染色（赤色）の共焦点顕微鏡写真（ＸＹ画像およびＸＺ画像）。ＰＢＳで処置した細胞が左側のパネルに示されている。真ん中のパネルおよび右側のパネル：細胞を、ＪＯ−１（２０μｇ／ｍｌ）を用いて氷上で１時間処置した。ＪＯ−１を除去した後、細胞を３７℃でインキュベートし、１時間後および１６時間後に分析した。ＸＹ画像は、細胞表面（左側）および細胞表面の２μｍ下の切片を示す。スケールバーは４０μｍである。Ｂ）極性Ａ５４９肺がん細胞に対するＥＧＦＲ（赤色）および密着結合タンパク質であるＥ−カドヘリン（緑色）の共焦点顕微鏡写真。Ｃ）ＪＯ−１により、トラスツズマブによるＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳がん細胞の死滅が増強される。ＢＴ４７４細胞を、ＪＯ−１（５μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳと一緒にインキュベートした。１時間後にトラスツズマブ（１５μｇ／ｍｌ）を加えた。３時間後に、以前に記載の通り（Ｗａｎｇら、２０１０年）ＷＳＴ−１アッセイによって細胞の生存率を測定した。ＰＢＳで処置した細胞の生存率を１００％とした。ｎ＝５、トラスツズマブ対ＪＯ−１＋トラスツズマブについてＰ＜０．０５。代表的な画像が示されている。実験を３回繰り返した。Ｄ）ＪＯ−１により、ＥＧＦＲ陽性Ａ５４９細胞のセツキシマブによる死滅が増強される。ｎ＝５、セツキシマブ対ＪＯ−１＋セツキシマブに対してＰ＜０．０５。
【図２０】図２０は、ＪＯ−１により、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳がんモデルにおけるトラスツズマブ療法が改善されることを示す図である。Ａ）合計４×１０６個のＢＴ４７４−Ｍ１細胞、（ＢＴ４７４の腫瘍形成性サブクローン）を、ＣＢ１７−ＳＣＩＤ／ベージュマウスの乳房の脂肪パッドに注射した。２９日後（腫瘍の体積が約１００ｍｍ３に達した時）、マウスに５０μｇのＪＯ−１（２ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを静脈内注射し、その１０時間後にトラスツズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）＊またはＰＢＳを腹腔内注射した。３６日目に第２の治療サイクルを開始した（矢印によって示されている）。個々の動物において腫瘍の体積の増加が示されている（２９日目に処置前のレベルと比較して）。ｎ＝５。４０日目における腫瘍体積はＪＯ−１＋トラスツズマブで処置したマウスにおいて、トラスツズマブを単独で受けた動物における腫瘍体積よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０１）。＊このトラスツズマブの用量およびその適用経路は、マウスにおいて常套的に用いられている（Ｂｅｙｅｒら、２０１１年）。Ｂ）同様の療法試験を、ＨＣＣ１９５４  Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳がん由来腫瘍を用いて実施した。これらの腫瘍はトラスツズマブ処置に対する抵抗性が高い。合計４×１０６個のＨＣＣ１９５４細胞を、ＣＢ１７−ＳＣＩＤ／ベージュマウスの乳房の脂肪パッドに注射した。１８日後（腫瘍の体積が約１００ｍｍ３に達した時）、マウスに５０μｇのＪＯ−１（２ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを静脈内注射し、その１０時間後にトラスツズマブまたはＰＢＳを腹腔内注射した。ｎ＝５。トラスツズマブ対ＪＯ−１＋トラスツズマブ、Ｐ＜０．００１。Ｃ）ＪＯ−１注射とトラスツズマブ注射の間の種々の時間間隔の治療転帰に対する効果。ＨＣＣ１９５４乳がん腫瘍を担持するマウスに、ＪＯ−１およびトラスツズマブの混合物、ＪＯ−１とその１時間後にトラスツズマブ、およびＪＯ−１とその１０時間後にトラスツズマブを注射した。注射を週１回繰り返した。ｎ＝５、トラスツズマブ対ＪＯ−１＋トラスツズマブ（１０時間）Ｐ＜０．００１；トラスツズマブ対ＪＯ−１＋トラスツズマブ（１時間）Ｐ＜０．００５８；トラスツズマブ対ＪＯ−１＋トラスツズマブ（混合）Ｐ＜０．００７４。ＪＯ−１＋トラスツズマブ（１０時間）対ＪＯ−１＋トラスツズマブ（１時間）Ｐ＜０．１７、有意でない（ｎｓ）；ＪＯ−１＋トラスツズマブ（１０時間）対ＪＯ−１＋トラスツズマブ（混合）Ｐ＜０．４７、ｎｓ。
【図２１】図２１は、ＪＯ−１により、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性胃がんモデルにおけるトラスツズマブ療法が改善されることを示す図である。左側のパネル：Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性ヒト胃がん細胞（ＮＣＩ−Ｎ８７）の免疫蛍光顕微鏡写真。スケールバーは２０μｍである。右側のパネル：皮下のヒト胃がん（ＮＣＩ−Ｎ８７）異種移植腫瘍を担持するマウスのＪＯ−１／トラスツズマブ処置。ｎ＝５、トラスツズマブ対ＪＯ−１＋トラスツズマブ（２９日目および３３日目）：Ｐ＜０．０５  。
【図２２Ａ】図２２は、ＪＯ−１により、肺がん異種移植モデルにおけるセツキシマブ療法が改善されることを示す図である。Ａ）免疫不全のＣＢ１７−ＳＣＩＤ／ベージュマウスに、Ａ５４９細胞１×１０６個を皮下注射した。１１日目にＪＯ−１を静脈内注射（２ｍｇ／ｋｇ）または腹腔内注射（４ｍｇ／ｋｇ）し、その１０時間後にセツキシマブまたはＰＢＳを腹腔内注射した。１つの群には、１ｍｇ／ｋｇのＪＯ−１を静脈内注射し、１ｍｇ／ｋｇのＪＯ−１を腫瘍内注射した。ｎ＝５、セツキシマブ対ＪＯ−１、ｉ．ｖ．＋ｉ．ｔ．＋セツキシマブ、Ｐ＜０．００１；セツキシマブ対ＪＯ−１、ｉ．ｖ．＋セツキシマブＰ＜０．００１；セツキシマブ対ＪＯ−１、ｉ．ｐ．＋セツキシマブ、Ｐ＜０．００１。ＪＯ−１注射の異なる経路間の差異は有意ではなかった。Ｂ）免疫不全のＣＢ１７−ＳＣＩＤ／ベージュマウスに、Ａ５４９細胞１×１０６個を皮下注射した。１１日後（腫瘍の体積が約１００ｍｍ３に達した時）、マウスに２ｍｇ／ｋｇのＰｔＤｄを静脈内注射し、その１０時間後にセツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを腹腔内注射した。１５日目に第２の治療サイクルを開始した（矢印によって示されている）。ｎ＝５。セツキシマブ対ＰｔＤｄ＋セツキシマブ、Ｐ＜０．００１。Ｃ）転移性肺がんモデル。ＣＢ１７−ＳＣＩＤ／ベージュマウスに、Ａ５４９細胞１×１０６個を静脈内注射した。１０日後に、マウスに２ｍｇ／ｋｇのＪＯ−１またはＰＢＳを静脈内注射し、その１０時間後にセツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを腹腔内注射した。この処置を３８日目まで３日ごとに繰り返した。ｎ＝１０。左側のパネル：墨汁で染色した個々のマウス由来の肺。健康な組織は黒色で現れる。腫瘍組織は白色に染色される。右側のパネル：Ｈ＆Ｅで染色した肺の代表的な切片。
【図２２Ｂ】図２２は、ＪＯ−１により、肺がん異種移植モデルにおけるセツキシマブ療法が改善されることを示す図である。Ａ）免疫不全のＣＢ１７−ＳＣＩＤ／ベージュマウスに、Ａ５４９細胞１×１０６個を皮下注射した。１１日目にＪＯ−１を静脈内注射（２ｍｇ／ｋｇ）または腹腔内注射（４ｍｇ／ｋｇ）し、その１０時間後にセツキシマブまたはＰＢＳを腹腔内注射した。１つの群には、１ｍｇ／ｋｇのＪＯ−１を静脈内注射し、１ｍｇ／ｋｇのＪＯ−１を腫瘍内注射した。ｎ＝５、セツキシマブ対ＪＯ−１、ｉ．ｖ．＋ｉ．ｔ．＋セツキシマブ、Ｐ＜０．００１；セツキシマブ対ＪＯ−１、ｉ．ｖ．＋セツキシマブＰ＜０．００１；セツキシマブ対ＪＯ−１、ｉ．ｐ．＋セツキシマブ、Ｐ＜０．００１。ＪＯ−１注射の異なる経路間の差異は有意ではなかった。Ｂ）免疫不全のＣＢ１７−ＳＣＩＤ／ベージュマウスに、Ａ５４９細胞１×１０６個を皮下注射した。１１日後（腫瘍の体積が約１００ｍｍ３に達した時）、マウスに２ｍｇ／ｋｇのＰｔＤｄを静脈内注射し、その１０時間後にセツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを腹腔内注射した。１５日目に第２の治療サイクルを開始した（矢印によって示されている）。ｎ＝５。セツキシマブ対ＰｔＤｄ＋セツキシマブ、Ｐ＜０．００１。Ｃ）転移性肺がんモデル。ＣＢ１７−ＳＣＩＤ／ベージュマウスに、Ａ５４９細胞１×１０６個を静脈内注射した。１０日後に、マウスに２ｍｇ／ｋｇのＪＯ−１またはＰＢＳを静脈内注射し、その１０時間後にセツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを腹腔内注射した。この処置を３８日目まで３日ごとに繰り返した。ｎ＝１０。左側のパネル：墨汁で染色した個々のマウス由来の肺。健康な組織は黒色で現れる。腫瘍組織は白色に染色される。右側のパネル：Ｈ＆Ｅで染色した肺の代表的な切片。
【図２２Ｃ】図２２は、ＪＯ−１により、肺がん異種移植モデルにおけるセツキシマブ療法が改善されることを示す図である。Ａ）免疫不全のＣＢ１７−ＳＣＩＤ／ベージュマウスに、Ａ５４９細胞１×１０６個を皮下注射した。１１日目にＪＯ−１を静脈内注射（２ｍｇ／ｋｇ）または腹腔内注射（４ｍｇ／ｋｇ）し、その１０時間後にセツキシマブまたはＰＢＳを腹腔内注射した。１つの群には、１ｍｇ／ｋｇのＪＯ−１を静脈内注射し、１ｍｇ／ｋｇのＪＯ−１を腫瘍内注射した。ｎ＝５、セツキシマブ対ＪＯ−１、ｉ．ｖ．＋ｉ．ｔ．＋セツキシマブ、Ｐ＜０．００１；セツキシマブ対ＪＯ−１、ｉ．ｖ．＋セツキシマブＰ＜０．００１；セツキシマブ対ＪＯ−１、ｉ．ｐ．＋セツキシマブ、Ｐ＜０．００１。ＪＯ−１注射の異なる経路間の差異は有意ではなかった。Ｂ）免疫不全のＣＢ１７−ＳＣＩＤ／ベージュマウスに、Ａ５４９細胞１×１０６個を皮下注射した。１１日後（腫瘍の体積が約１００ｍｍ３に達した時）、マウスに２ｍｇ／ｋｇのＰｔＤｄを静脈内注射し、その１０時間後にセツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを腹腔内注射した。１５日目に第２の治療サイクルを開始した（矢印によって示されている）。ｎ＝５。セツキシマブ対ＰｔＤｄ＋セツキシマブ、Ｐ＜０．００１。Ｃ）転移性肺がんモデル。ＣＢ１７−ＳＣＩＤ／ベージュマウスに、Ａ５４９細胞１×１０６個を静脈内注射した。１０日後に、マウスに２ｍｇ／ｋｇのＪＯ−１またはＰＢＳを静脈内注射し、その１０時間後にセツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを腹腔内注射した。この処置を３８日目まで３日ごとに繰り返した。ｎ＝１０。左側のパネル：墨汁で染色した個々のマウス由来の肺。健康な組織は黒色で現れる。腫瘍組織は白色に染色される。右側のパネル：Ｈ＆Ｅで染色した肺の代表的な切片。
【図２３】図２３は、ＨＣＣ１８５４乳がんモデルにおけるＪＯ−１とレラキシンの併用療法について示す図である。Ａ）実験の模式図。偽形質導入したＬｉｎ−造血幹細胞またはＬＶ−ＥＦ１ａ／Ｒｌｘを形質導入したＬｉｎ−造血幹細胞のいずれかを受けさせたマウスに致死的に放射線を照射した。６週間後にＨＳＣが生着した後、マウスの乳房の脂肪パッドにＨＣＣ１９５４細胞４×１０６個を注射した。７日後に、レラキシンの発現をドキシサイクリンによって活性化した。マウスを、ＰＢＳ、ＰＢＳ／トラスツズマブまたはＪＯ−１／トラスツズマブで週１回処置し、腫瘍体積を測定した。Ｂ）個々のマウスの腫瘍体積。ｎ＝５。トラスツズマブ対ＪＯ−１＋トラスツズマブ、Ｐ＜０．００１：Ｒｌｘ  ＪＯ−１＋トラスツズマブ対Ｒｌｘトラスツズマブ、Ｐ＜０．００１；Ｒｌｘ  ＰＢＳ対ＰＢＳ、Ｐ＜０．００１。
【図２４】図２４は、Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４、およびＡｄ１４ａの線維ポリペプチドアラインメントおよびそれらのドメイン構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
引用されている参考文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本出願の範囲内では、別段の指定のない限り、利用される技法は、いくつかの周知の参考文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、Ｄ．  Ｇｏｅｄｄｅｌ編、１９９１年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．  Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ編、（１９９０年）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版（Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．  １９８７年、Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１０９〜１２８頁、Ｅ．Ｊ．  Ｍｕｒｒａｙ編、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、およびＡｍｂｉｏｎ  １９９８年  Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）などのいずれかにおいて見ることができる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、単数形である「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を包含する。「および（ａｎｄ）」は、本明細書で使用される場合、明示的に別段の規定がない限り「または（ｏｒ）」と互換的に使用される。
【００２８】
本明細書で使用される場合、アミノ酸残基は以下の通り省略される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「Ａｄ」という略語は、アデノウイルスを指し、一般には、その後にアデノウイルスの血清型を示す数が続く。例えば、「Ａｄ３」とは、アデノウイルス血清型３を指す。
【００３０】
本発明の任意の態様の実施形態は全て、文脈により明確に別段の規定がなされない限り組み合わせて用いることができる。
【００３１】
第１の態様では、本発明は、上皮組織に関連する障害の治療的処置、診断、またはイメージングを増強するための方法であって、それを必要とする被験体に、（ａ）障害を処置するために十分な量の１種またはそれより多い種の治療薬、障害を診断するために十分な量の診断薬、および／または上皮組織をイメージングするために十分な量のイメージング剤；および（ｂ）１種またはそれより多い種の治療薬、診断、および／またはイメージング剤の有効性を増強するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物を投与することを含む方法を提供する。
【００３２】
本発明のこの態様の方法を用いて、治療薬、診断薬、および／またはイメージング剤の、それらの標的への接近および上皮組織への散在を改善することにより、上皮組織に関連する障害の治療的処置、診断、またはイメージングを増強することができる。いかなる機構にも縛られるものではないが、出願人らは、これは、相補的な機構を通じて生じると考える：したがって標的受容体が側底から頂端の細胞表面に移動することにより、受容体を標的とする治療薬、診断薬、および／またはイメージング剤、例えば、モノクローナル抗体などの標的となる上皮組織への接近が向上すること、および細胞間結合の破壊を通じて治療薬の浸透が向上することが可能になる。本明細書において詳細に開示されている通り、出願人らは、デスモグレイン（ｄｅｓｍｏｇｅｌｉｎ）−２（ＤＳＧ２）がＡｄＢ−２／３に対する主要な高親和性受容体であることを発見した。ＤＳＧ２は、カドヘリンタンパク質ファミリーに属するカルシウム結合性膜貫通糖タンパク質である。上皮細胞では、ＤＳＧ２は細胞間接着構造の構成成分である。その細胞質尾部は、細胞接着および細胞間結合／細胞形態の調節因子と直接接触している一連のタンパク質と相互作用する。ＤＳＧ２は、胃がん、扁平上皮癌、黒色腫、転移性前立腺がん、および膀胱がんを含めた一連の上皮の悪性疾患において過剰発現されることが示されている。
【００３３】
特定の作用機構に縛られるものではないが、出願人らは、ＡｄＢ−２／３線維多量体がＤＳＧ２と結合することは、ＤＳＧ２に媒介される一過性の細胞間結合の開口を誘発するために役立ち、ＤＳＧ２に媒介される一過性の細胞間結合の開口は、そうでなければ少なくともいくらかの程度で細胞間結合内に閉じ込められている上皮細胞内の標的と結合する治療薬、診断薬、イメージング剤、または任意の他の対象の化合物の接近を改善するために役立つと考える。そのような活性の詳細な例は本明細書において提供される。
【００３４】
ＤＳＧ２は上皮細胞において広範に発現されるので、本発明の方法は、対象の標的への接近が限定され得る細胞間結合を含む上皮組織に任意の治療薬、診断薬、イメージング剤、または他の化合物を送達するための広範な適用を有する。本明細書で使用される場合、「上皮組織に関連する障害」とは、上皮細胞／上皮組織に投与される／接近する治療薬、診断薬、またはイメージング剤により、治療の有効性、診断の有効性、および／またはイメージングの有効性のいずれの改善であろうと患者に臨床的利益がもたらされる任意の障害である。そのような障害としては、これらに限定されないが、固形腫瘍（すなわち：上皮細胞結合を有する任意の腫瘍）、胃腸障害（これらに限定されないが、過敏性腸症候群、炎症性腸障害、クローン病、潰瘍性大腸炎、便秘、胃食道逆流性疾患、バレット食道などを含む）、皮膚疾患（これらに限定されないが、乾癬および皮膚炎を含む）、肺障害（これらに限定されないが、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、肺炎を含む）、膵管障害、脳障害（すなわち：血液脳関門を通る薬物の輸送を改善することが有効であり得る任意の脳障害）、原発性肺高血圧症、肺塞栓症、肺サルコイドーシス、結核など）、腎障害（これに限定されないが、糸球体腎炎を含む）、肝疾患（これに限定されないが、肝炎を含む）、内分泌障害（これらに限定されないが、糖尿病および甲状腺障害を含む）、膵管障害（これらに限定されないが、膵炎を含む）、および胆管障害（これらに限定されないが、胆管閉塞症、胆嚢炎、総胆管結石症、胆石などを含む）および上皮組織の感染症（これらに限定されないが、蜂巣炎、肺炎、肝炎、および腎盂腎炎を含む）が挙げられる。好ましい一実施形態では、上皮組織に関連する障害は、これらに限定されないが、乳房の腫瘍、肺の腫瘍、結腸の腫瘍、直腸の腫瘍、皮膚の腫瘍、内分泌の腫瘍、胃の腫瘍、前立腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、子宮の腫瘍、子宮頸部の腫瘍、腎臓の腫瘍、黒色腫、膵臓の腫瘍、肝臓の腫瘍、脳腫瘍、頭頸部の腫瘍、鼻咽頭の腫瘍、胃の腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、膀胱の腫瘍、および食道の腫瘍を含めた固形腫瘍を含む。当業者には理解される通り、そのような腫瘍は、原発腫瘍、局所浸潤性腫瘍、ならびに転移した腫瘍を包含する。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「有効性の増強」とは、治療薬、診断薬、および／またはイメージング剤を単独で使用すると見られるものに対する治療の有効性、診断の有効性、および／またはイメージングの有効性の任意の増大を意味する。例えば、治療効果の測定は、処置されている障害に応じて変動するが、主治医によりすぐに同定される。例えば、そのような効力の増大としては、これらに限定されないが、治療薬を単独で用いた処置と比較して、
（ａ）障害の重症度が軽減すること；
（ｂ）処置されている障害（複数可）に特徴的な症状の発生が限定または予防されること；
（ｃ）処置されている障害（複数可）に特徴的な症状の悪化が阻害されること；
（ｄ）以前障害（複数可）を有していた患者における障害（複数可）の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）が限定または予防されること；および
（ｅ）以前、障害（複数可）の症候があった患者における症状の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）が限定または予防されることのうちの１つまたは複数が増大することが挙げられる。１つの非限定的な例では、固形腫瘍の治療により、腫瘍受容体が上皮細胞の基底外側から出て来ることを誘導して、接近の改善および腫瘍の死滅を可能にする能力がもたらされる。
【００３６】
がんに関して、腫瘍の反応を定義するための標準および反応を測定する標準の方法がある。これらとしては、腫瘍サイズの変化をモニタリングによって決定する腫瘍の反応または疾患の血清マーカーが挙げられる。部分奏効とは、腫瘍が５０％超縮小することであり、一方、完全奏効は、腫瘍が完全に消失することと定義される。腫瘍を測定するために用いられる方法は、医師には周知であり、それらとしては、理学的検査、放射線学的検査、例えば、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、ＰＥＴスキャン、Ｘ線など、ならびに血清マーカー、例えば、前立腺がんをモニターするために使用される前立腺特異的抗原などが挙げられる。癌治療の治療有効性の他の測定としては、無進行期間、無増悪生存および全生存の測定が挙げられる。
【００３７】
診断有効性の改善としては、これらに限定されないが、診断検査の特異度および／または感度の増大を含めた、診断薬単独での投与と比較した有効性の任意の改善が挙げられる。イメージングの有効性の改善としては、これらに限定されないが、特異度、感度、再現性、コントラスト増強、疾患のより小さな部位の検出、腫瘍、膿瘍などの疾患のサイズおよび形状などの疾患のより正確な描写を含めた、イメージング剤単独での投与と比較した有効性の任意の改善が挙げられる。
【００３８】
種々の実施形態では、有効性の増大は、患者集団全体にわたって治療薬、診断薬、および／またはイメージング剤を単独で用いた有効性と比較して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、またはそれ以上の利益である。
【００３９】
本発明の方法を用いて任意の適切な被験体、好ましくはヒト被験体を処置することができる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「ＡｄＢ−２／３」とは、ウイルスが結合するための上皮細胞受容体としてＤＳＧ２を使用する任意のアデノウイルス血清型である。現在まで、Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４、およびＡｄ１４ａの血清型が同定されている。他のＡｄ血清型が同定されるので、当業者は、本明細書に開示されているＤＳＧ２結合アッセイに基づいて、ＡｂＤ−２／３ファミリーに属するものを容易に同定することができる。例えば、固定化した組換えＤＳＧ２を含有するセンサーを使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験を用いて、ＤＳＧ２競合試験と組み合わせて、新規のＡｄ血清型がＤＳＧ２と結合するかどうかを決定することができる。機能の損失および獲得についての分析などの別の例示的な試験は、実施例１に詳しく記載されている。
【００４１】
アデノウイルスビリオンは、カプシドの１２個の頂点のそれぞれの基部に位置する線維を特徴とする２０面体である。ビリオン上の線維は、３つの個々の線維ポリペプチドからなるホモ三量体の構造である。アデノウイルス線維ポリペプチドのそれぞれは、Ｎ末端尾部からなる非対称な構造であり、カプシドのペントンベースタンパク質と相互作用し、また、タンパク質を細胞核へ輸送するために必要なシグナル；いくつもの１５残基の繰り返し単位を含有するシャフト；および受容体の結合に対する決定因子を含有するＣ末端ノブドメインを含有する（Ｊ．Ｓ．  ＨｏｎｇおよびＪ．Ａ．  Ｅｎｇｌｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０巻：７０７１〜７０７８頁（１９９６年））。全てのアデノウイルスは、それらの受容体に線維の末端上のノブ構造を通じて付着する。
【００４２】
したがって、本明細書で使用される場合、ＡｄＢ−２／３「線維ポリペプチド」という用語は、ＡｄＢ−２／３によって発現される、Ｎ末端尾部ドメイン、シャフトドメイン、およびＣ末端ノブドメインを含む全長の線維ポリペプチドを指す（例えば、配列番号１５〜１９、配列番号１５はＡｄ３線維ポリペプチドであり、配列番号１６はＡｄ７線維ポリペプチドであり、配列番号１７はＡｄ１１ポリペプチドであり、配列番号１８はＡｄ１４線維ポリペプチドであり、配列番号１９はＡｄ１４（ａ）線維ポリペプチドである）。線維ポリペプチドは、自然にホモ三量体に組み立てられ、それは「線維」と称され、カプシドの１２個の頂点のそれぞれの基部においてアデノウイルスビリオンの外側に位置する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ＡｄＢ−２／３線維多量体」とは、ＡｄＢ−２／３線維の多量体（二量体、三量体など）、またはその機能的等価物を含む任意の構築物である。当業者には理解される通り、ＡｄＢ−２／３線維は、ホモ三量体のノブを含む。ＡｄＢ−２／３線維多量体は、ホモ三量体のＡｄＢ−２／３線維の多量体、例えば、二量体などである。下記の実施例において詳細に開示されている通り、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、そうでなければ細胞間結合内に閉じ込められている標的への治療薬の接近を改善するために役立つ、ＤＳＧ２に媒介される一過性の細胞間結合の開口を誘発するＤＳＧ２との結合のために必要である。
【００４４】
一実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３線維多量体、Ａｄ７線維多量体、Ａｄ１１線維多量体、Ａｄ１４線維多量体、Ａｄ１４ａ線維多量体、それらの組み合わせ、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される。好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３線維多量体である。
【００４５】
１種またはそれより多い種のＡｄＢ−２／３線維多量体（またはそれらのキメラ／機能的等価物）を含む例示的な構築物としては、これらに限定されないが、ＡｄＢ−２／３ビリオン（例えば、「死滅した」ビリオン、例えば、ＵＶ処理されたビリオンなど）、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３の１２面体粒子（ＰｔＤｄ）（ＡｄＢ−２／３の複製時にそれらにより産生されるウイルス成分の１２面体粒子）、組換えＡｄＢ−２／３線維多量体（これらに限定されないが、下記の実施形態のいずれか、または複数の実施形態の組み合わせにおいて開示されているものを含めた）、およびそれらの機能的等価物が挙げられる。好ましい実施形態では、１種またはそれより多い種のＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３のＰｔＤｄなどのＡｄＢ−２／３のＰｔＤｄを含む、またはそれからなる。別の好ましい実施形態では、１種またはそれより多い種のＡｄＢ−２／３線維多量体は、下記の本発明の組成物の実施形態のいずれか、または複数の実施形態の組み合わせを含む、またはそれからなる。さらに好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、本明細書においてＪＯ−１（結合開口薬−１）と称される、ポリペプチド（配列番号２０）、またはそれらの機能的等価物を含む、またはそれからなる。下記の実施例に示されている通り、ＪＯ−１（実施例において自己二量体形成性Ａｄ３線維誘導体と記載されている）は、単鎖の組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドドメインの多量体であり、ポリペプチドは、ホモ三量体化することができるノブドメインを含む。したがって、ＪＯ−１は、本発明によるＡｄＢ−２／３線維多量体である。
【００４６】
多量のＡｄＢ−２／３ビリオンおよびカプシドを調製するための方法は当技術分野で周知であり、同様に、ＰｔＤｄを大規模生産するための方法も当技術分野で周知である。同様に、二量体形成ドメインを組換えポリペプチドに組み入れることによってＡｄＢ−２／３線維多量体（例えば、ＪＯ−１など）を組換作製するための方法は、本明細書における教義に基づいて、十分に当業者のレベルの範囲内である。
【００４７】
したがって、本発明の方法は、ＤＳＧ２と結合し、ＤＳＧ２に媒介される一過性の細胞間結合の開口を誘発することができる任意のＡｄＢ−２／３線維多量体を用いて行うことができる。したがって、本明細書に開示されているＡｄＢ−２／３線維多量体に対する天然に存在しない修飾（異なるＡｄ血清型線維タンパク質およびそのドメインなどの欠失、付加、置換、キメラ）は、ＡｄＢ−２／３線維多量体の「等価物」であり、ＤＳＧ２と結合する働きをし、また、多量体形成し、ＤＳＧ２に媒介される細胞間結合の開口を誘発することができる限りは本発明の範囲内である。ＤＳＧ２との結合についての試験およびＤＳＧ２に媒介される細胞間結合の開口についての評価に関する本明細書における教義に基づいて、そのようなＡｄＢ−２／３線維多量体の機能的等価物を同定することは十分に当業者のレベルの範囲内である。１つの非限定的な例では、標識した化合物（例えば、ＦＩＴＣ−デキストランなど）の、候補ＡｄＢ−２／３線維多量体の存在下における集密的な分極上皮細胞を通る流束を評価するためのアッセイが、下記の実施例１および２において実証されている。別の非限定的な例では、候補ＡｄＢ−２／３線維多量体の存在下での、上皮細胞結合に起因して通常は利用できないタンパク質（例えば、ＣＤ４６、クローディン７、およびＺＯ−１など）への接近を評価するためのアッセイは、下記の実施例１および２において実証されている。別のそのようなアッセイも本明細書において開示されている。
【００４８】
ＡｄＢ−２／３線維の多量体形成は、当業者に周知の方法に従って決定することができる。例えば、組換えＡｄＢ−２／３線維構築物の多量体形成は、ショ糖勾配での沈降、トリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性、およびポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動移動度を含めた判断基準によって評価することができる（ＨｏｎｇおよびＥｎｇｌｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０巻：７０７１〜７０７８頁（１９９６年））。電気泳動移動度に関しては、線維多量体は、非常に安定な複合体であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に試料を煮沸しない場合、多量体の分子量と一致する分子量で流れる。しかし、煮沸すると、多量体の構造は破壊され、その後、タンパク質は、タンパク質単量体と一致するサイズで流れる。上皮組織を標的とすることができる任意の治療薬、診断薬、イメージング剤、または他の化合物およびその上皮組織への送達は、本発明の方法において用いることができる一過性の細胞間結合の開口によって改善することができる。一実施形態では、治療薬は、抗体、免疫複合体、ナノ粒子、核酸治療薬、およびそれらの組み合わせ、化学療法薬、ワクチン、放射性粒子／放射線療法（「照射」）、養子Ｔ細胞療法および樹状細胞療法を含めた細胞免疫療法（例：投与されたＴ細胞の腫瘍内への浸透）、吸入治療薬、遺伝子療法構築物（これらに限定されないが、遺伝子療法ベクターとしてのＡｄＢ−２／３ウイルス、およびＡｄ５に基づく遺伝子療法ベクターとの同時投与を含む）、他の核酸治療薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００４９】
種々の実施形態では、治療薬は、アルキル化剤、血管新生阻害剤、抗体、代謝拮抗薬、抗有糸分裂薬、抗増殖薬、オーロラキナーゼ阻害剤、アポトーシスプロモーター（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗおよびＢｆｌ−１）阻害剤、細胞死受容体経路の活性化因子、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＢｉＴＥ（Ｂｉ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ）抗体、生物学的応答修飾因子、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、増殖因子阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）−９０阻害剤、脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ホルモン療法、免疫薬（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ）、アポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ）、インターカレーティング抗生物質、キナーゼ阻害剤、ラパマイシン阻害剤の哺乳動物標的、マイクロＲＮＡのマイトジェン活性化細胞外シグナル調節キナーゼ阻害剤、多価の結合性タンパク質、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ポリＡＤＰ（アデノシン二リン酸）−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、プラチナ化学療法薬、ポロ様キナーゼ（Ｐｌｋ）阻害剤、プロテアソーム阻害剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、レチノイド／デルトイド（ｄｅｌｔｏｉｄ）植物アルカロイド、低分子阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、トポイソメラーゼ阻害剤などからなる群より選択される。
【００５０】
これらの種々のクラスの中に入る例示的な治療薬としては、これらに限定されないが、ドセタキセル、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、パクリタキセルアルブミン結合粒子（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、ドキソルビシンＨＣＬリポソーム（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））、ＢｉＴＥ抗体、例えば、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ  ＭＴ２０１）、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ  ＭＴ１０３）など、ｓｉＲＮＡに基づく治療薬、アルトレタミン、ＡＭＤ−４７３、ＡＰ−５２８０、アパジコン、ベンダムスチン、ブロスタリシン、ブスルファン、カルボコン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、クロラムブシル、ＣＬＯＲＥＴＡＺＩＮＥ（登録商標）（ラロムスチン（ｌａｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ＶＮＰ４０１０１Ｍ）、シクロホスファミド、ダカルバジン、デシタビン、５’−アザシチジン、エストラムスチン、フォテムスチン、グルホスファミド、イホスファミド、ＫＷ−２１７０、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、マホスファミド、メルファラン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ニムスチン、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、ラニムスチン、テモゾロミド、チオテパ、ＴＲＥＡＮＤＡ（登録商標）（ベンダムスチン）、トレオスルファン、ロホスファミド（ｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）などを含めたアルキル化剤；内皮特異的受容体チロシンキナーゼ（Ｔｉｅ−２）阻害剤、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、インスリン増殖因子−２受容体（ＩＧＦＲ−２）阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）阻害剤、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）阻害剤、トロンボスポンジン類似体、血管内皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤などを含めた血管新生阻害剤；ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）（ペメトレキセド二ナトリウム、ＬＹ２３１５１４、ＭＴＡ）、５−アザシチジン、ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）（カペシタビン）、カルモフール、ＬＥＵＳＴＡＴ（登録商標）（クラドリビン）、クロファラビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、シトシンアラビノシド、デシタビン、デフェロキサミン、ドキシフルリジン、エフロルニチン、ＥＩＣＡＲ（５−エチニル−１−β−Ｄ−リボフラノシルイミダゾール−４−カルボキサミド）、エノシタビン、エチニルシチジン（ｅｔｈｎｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）、フルダラビン、５−フルオロウラシル単独、または５−フルオロウラシルとロイコボリンの組み合わせ、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）、ヒドロキシウレア、ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標）（メルファラン）、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、メトトレキサート、メトトレキサート類似体（例えば、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）およびプララトレキサート（ｐｒａｌａｔｒａｘａｔｅ）など）、ミコフェノール酸、ネララビン、ノラトレキシド、オクホスファート、ペリトレキソール（ｐｅｌｉｔｒｅｘｏｌ）、ペントスタチン、ラルチトレキセド、リバビリン、トリアピン（ｔｒｉａｐｉｎｅ）、トリメトレキサート、Ｓ−１、チアゾフリン、テガフール、ＴＳ−１、ビダラビンなどを含めた代謝拮抗薬；ＡＴ−１０１（（−）ゴシポール）、ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標）（Ｇ３１３９またはオブリメルセン（Ｂｃｌ−２−ターゲティングアンチセンスオリゴヌクレオチド））、ＩＰＩ−１９４、ＩＰＩ−５６５、Ｎ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミド）（ＡＢＴ−７３７）、Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル−）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド（ＡＢＴ−２６３）、ＧＸ−０７０（オバトクラックス）などを含めたＢｃｌ−２タンパク質阻害剤；ＤＡＳＡＴＩＮＩＢ（登録商標）（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（イマチニブ）などを含めたＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害剤；ＡＺＤ−５４３８、ＢＭＩ−１０４０、ＢＭＳ−０３２、ＢＭＳ−３８７、ＣＶＴ−２５８４、フラボピリドール（ｆｌａｖｏｐｙｒｉｄｏｌ）、ＧＰＣ−２８６１９９、ＭＣＳ−５Ａ、ＰＤ０３３２９９１、ＰＨＡ−６９０５０９、セリシクリブ（ｓｅｌｉｃｉｃｌｉｂ）（ＣＹＣ−２０２、Ｒ−ロスコビチン）、ＺＫ−３０４７０９などを含めたＣＤＫ阻害剤；ＡＢＸ−ＥＧＦ、抗ＥＧＦＲ免疫リポソーム（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）、ＥＧＦ−ワクチン、ＥＭＤ−７２００、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、ＨＲ３、ＩｇＡ抗体、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）（ゲフィチニブ）、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブまたはＯＳＩ−７７４）、ＴＰ−３８、ＥＧＦＲ融合タンパク質、ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）（ラパチニブ）などを含めたＥＧＦＲ阻害剤；ＣＰ−７２４−７１４、ＣＩ−１０３３（カネルチニブ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）（ラパチニブ）、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標）（２Ｃ４、ペルツズマブ）、ＴＡＫ−１６５、ＧＷ−５７２０１６（イオナファルニブ（ｉｏｎａｆａｒｎｉｂ））、ＧＷ−２８２９７４、ＥＫＢ−５６９、ＰＩ−１６６、ｄＨＥＲ２（ＨＥＲ２ワクチン）、ＡＰＣ−８０２４（ＨＥＲ−２ワクチン）、抗ＨＥＲ／２ｎｅｕ二重特異性抗体、Ｂ７．ｈｅｒ２ＩｇＧ３、ＡＳ  ＨＥＲ２三機能性二重特異性抗体、ｍＡｂ  ＡＲ−２０９、ｍＡｂ  ２Ｂ−１などを含めたＥｒｂＢ２受容体阻害剤；ロミデプシン、ＬＡＱ−８２４、ＭＳ−２７５、トラポキシン、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド（ＳＡＨＡ）、ＴＳＡ、バルプロ酸などを含めたヒストン脱アセチル化酵素阻害剤；１７−ＡＡＧ−ｎａｂ、１７−ＡＡＧ、ＣＮＦ−１０１、ＣＮＦ−１０１０、ＣＮＦ−２０２４、１７−ＤＭＡＧ、ゲルダナマイシン、ＩＰＩ−５０４、ＫＯＳ−９５３、ＭＹＣＯＧＲＡＢ（登録商標）（ＨＳＰ−９０に対するヒト組換え抗体）、ＮＣＳ−６８３６６４、ＰＵ２４ＦＣ１、ＰＵ−３、ラディシコール、ＳＮＸ−２１１２、ＳＴＡ−９０９０  ＶＥＲ４９００９などを含めたＨＳＰ−９０阻害剤；ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ受容体または細胞死受容体（例えば、ＤＲ４およびＤＲ５）を標的とする抗体または他の作用剤、例えば、アポマブ（ａｐｏｍａｂ）、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ＥＴＲ２−ＳＴ０１、ＧＤＣ０１４５、（レクサツムマブ）、ＨＧＳ−１０２９、ＬＢＹ−１３５、ＰＲＯ−１７６２およびトラスツズマブなどを含めた細胞死受容体経路の活性化因子；シスプラチン、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）（オキサリプラチン）エプタプラチン（ｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、ロバプラチン、ネダプラチン、ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標）（カルボプラチン）、サトラプラチン、ピコプラチン（ｐｉｃｏｐｌａｔｉｎ）などを含めたプラチナ化学療法薬；ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＡＢＴ−８６９、ＡＥＥ−７８８、アキシチニブ（ＡＧ−１３７３６）、ＡＺＤ−２１７１、ＣＰ−５４７、６３２、ＩＭ−８６２、ＭＡＣＵＧＥＮ（ペガプタニブ（ｐｅｇａｐｔａｍｉｂ）、ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）（ソラフェニブ、ＢＡＹ４３−９００６）、パゾパニブ（ＧＷ−７８６０３４）、バタラニブ（ＰＴＫ−７８７、ＺＫ−２２２５８４）、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ、ＳＵ−１１２４８）、ＶＥＧＦトラップ、ＺＡＣＴＩＭＡＴｈｉ（バンデタニブ、ＺＤ−６４７４）などを含めたＶＥＧＦＲ阻害剤；樹状細胞療法（シプロイセルＴ、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標））；アクラルビシン、９−アミノカンプトテシン、アモナファイド、アムサクリン、ベカテカリン（ｂｅｃａｔｅｃａｒｉｎ）、ベロテカン、ＢＮ−８０９１５、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）（塩酸イリノテカン）、カンプトテシン、デクスラゾキサン（ｄｅｘｒａｚｏｘｉｎｅ）、ジフロモテカン（ｄｉｆｌｏｍｏｔｅｃａｎ）、エドテカリン、ＥＬＬＥＮＣＥ（登録商標）またはＰＨＡＲＭＯＲＵＢＩＣＩＮ（登録商標）（エピルビシン）、エトポシド、エクサテカン（ｅｘａｔｅｃａｎ）、アブラキサン、イリノテカン（ｉｒｅｎｏｔｅｃａｎ）、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ジャイマテカン、ラルトテカン、ミトキサントロン、オラテシン（ｏｒａｔｈｅｃｉｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｂｕｃｉｎ）、ピキサントロン、ルビテカン（ｒｕｂｉｔｅｃａｎ）、ソブゾキサン、ＳＮ−３８、タフルポシド（ｔａｆｌｕｐｏｓｉｄｅ）、トポテカンなどを含めたトポイソメラーゼ阻害剤；ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＣＤ４０特異的抗体、ｃｈＴＮＴ−１／Ｂ、デノスマブ、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、ＨＵＭＡＸ−ＣＤ４（登録商標）（ザノリムマブ（ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ））、ＩＧＦ  Ｉ  Ｒ特異的抗体、リンツズマブ（ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標）（エドレコロマブ）、ＲＥＮＣＡＲＥＸ（登録商標）（ＷＸ  Ｇ２５０）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）、チシリムマブ、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｉｍａｂ）などを含めた抗体；ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール）、ＡＲＯＭＡ���ＩＮ（登録商標）（エキセメスタン）、アルゾキシフェン、ＣＡＳＯＤＥＸ（登録商標）（ビカルタミド）、ＣＥＴＲＯＴＩＤＥ（登録商標）（セトロレリクス）、デガレリクス、デスロレリン、ＤＥＳＯＰＡＮ（登録商標）（トリロスタン）、デキサメタゾン、ＤＲＯＧＥＮＩＬ（登録商標）（フルタミド）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）（ラロキシフェン）、ＡＦＥＭＡ（登録商標）（ファドロゾール）、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（トレミフェン）、ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）（フルベストラント）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール）、ホルメスタン、グルココルチコイド、ＨＥＣＴＯＲＯＬ（登録商標）（ドキセルカルシフェロール）、ＲＥＮＡＧＥＬ（登録商標）（セベラマー炭酸塩）、ラソフォキシフェン、酢酸リュープロリド、ＭＥＧＡＣＥ（登録商標）（メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｅｒｏｌ）、ＭＩＦＥＰＲＥＸ（登録商標）（ミフェプリストン）、ＮＩＬＡＮＤＲＯＮ（登録商標）（ニルタミド）、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）（クエン酸タモキシフェン）、ＰＬＥＮＡＸＩＳ（登録商標）（アバレリクス）、プレドニゾン、ＰＲＯＰＥＣＩＡ（登録商標）（フィナステリド）、トリロスタン（ｒｉｌｏｓｔａｎｅ）、ＳＵＰＲＥＦＡＣＴ（登録商標）（ブセレリン）、ＴＲＥＬＳＴＡＲ（登録商標）（黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ））、ＶＡＮＴＡＳ（登録商標）（ヒストレリンインプラント（Ｈｉｓｔｒｅｌｉｎ  ｉｍｐｌａｎｔ））、ＶＥＴＯＲＹＬ（登録商標）（トリロスタンまたはモドラスタン（ｍｏｄｒａｓｔａｎｅ））、ＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標）（フォスレリン（ｆｏｓｒｅｌｉｎ）、ゴセレリン）などを含めたホルモン療法薬；インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ−１ａ、ＡＣＴＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（インターフェロンガンマ−１ｂ）またはインターフェロンガンマ−ｎ１を含めた免疫薬、それらの組み合わせなどが挙げられる。他の作用剤としては、ＡＬＦＡＦＥＲＯＮＥ（登録商標）（ＩＦＮ−アルファ）、ＢＡＭ−００２（酸化型グルタチオン）、ＢＥＲＯＭＵＮ（登録商標）（タソネルミン）、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）（トシツモマブ）、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）（アレムツズマブ）、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性リンパ球抗原４）、デカルバジン、デニロ
イキン（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ）、エプラツズマブ、ＧＲＡＮＯＣＹＴＥ（登録商標）（レノグラスチム）、レンチナン、白血球アルファインターフェロン、イミキモド、ＭＤＸ−０１０（抗ＣＴＬＡ−４）、黒色腫ワクチン、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モルグラモスチム、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（ゲムツズマブ、オゾガマイシン）、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）（フィルグラスチム）、ＯｎｃｏＶＡＣ−ＣＬ、ＯＶＡＲＥＸ（登録商標）（オレゴボマブ）、ペムブモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）（Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１）、ＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標）（シプロイセルＴ）、サルグラモスチム（ｓａｒｇａｒａｍｏｓｔｉｍ）、シゾフィラン、テセロイキン、ＴＨＥＲＡＣＹＳ（登録商標）（カルメット−ゲラン桿菌）、ウベニメクス、ＶＩＲＵＬＩＺＩＮ（登録商標）（免疫療法薬、Ｌｏｒｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｚ−１００（丸山ワクチン（ＳＳＭ））、ＷＦ−１０（テトラクロロデカオキシド（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｅｃａｏｘｉｄｅ）（ＴＣＤＯ））、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）（アルデスロイキン）、ＺＡＤＡＸＩＮ（登録商標）（チマルファシン）、ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）（ダクリズマブ）、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（９０Ｙ−イブリツモマブチウキセタン）など；オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）；クレスチン、レンチナン、シゾフィラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）、ピシバニールＰＦ−３５１２６７６（ＣｐＧ−８９５４）、ウベニメクスなどを含めた生物学的反応修飾剤；シタラビン（ａｒａ  ＣまたはアラビノシドＣ）、シトシンアラビノシド、ドキシフルリジン、ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標）（フルダラビン）、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、フロクスウリジン、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）、ＴＯＭＵＤＥＸ（登録商標）（ラルチトレキセド（ｒａｔｉｔｒｅｘｅｄ））、ＴＲＯＸＡＴＹＬ（登録商標）（トリアセチルウリジントロキサシタビン）などを含めたピリミジン類似体；ＬＡＮＶＩＳ（登録商標）（チオグアニン）およびＰＵＲＩ−ＮＥＴＨＯＬ（登録商標）（メルカプトプリン）を含めたプリン類似体；バタブリン（ｂａｔａｂｕｌｉｎ）、エポチロンＤ（ＫＯＳ−８６２）、Ｎ−（２−（（４−ヒドロキシフェニル）アミノ）ピリジン−３−イル）−４−メトキシベンゼンスルホンアミド、イキサベピロン（ＢＭＳ２４７５５０）、パクリタキセル、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル）、ＰＮＵ１００９４０（１０９８８１）、パツピロン（ｐａｔｕｐｉｌｏｎｅ）、ＸＲＰ−９８８１（ラロタキセル）、ビンフルニン、ＺＫ−ＥＰＯ（合成エポチロン）などを含めた抗有糸分裂薬；および他の化学療法剤、例えば、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（ＡＢＩ−００７）、ＡＢＴ−１００（ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＡＤＶＥＸＩＮ（登録商標）（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ワクチン）、ＡＬＴＯＣＯＲ（登録商標）またはＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）（ロバスタチン）、ＡＭＰＬＩＧＥ（登録商標）（ポリＩ：ポリＣ１２Ｕ、合成ＲＮＡ）、ＡＰＴＯＳＹＮ（登録商標）（エクシスリンド）、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）（パミドロン酸）、アルグラビン、Ｌ−アスパラギナ��ゼ、アタメスタン（１−メチル−３，１７−ジオン−アンドロスタ−１，４−ジエン）、ＡＶＡＧＥ（登録商標）（タザロテン）、ＡＶＥ−８０６２（コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅａｓｔａｔｉｎ）誘導体）ＢＥＣ２（ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ））、カケクチンまたはカケキシン（ｃａｃｈｅｘｉｎ）（腫瘍壊死因子）、カンバキシン（ｃａｎｖａｘｉｎ）（ワクチン）、ＣＥＡＶＡＣ（登録商標）（がんワクチン）、ＣＥＬＥＵＫ（登録商標）（セルモロイキン）、ＣＥＰＬＥＮＥ（登録商標）（ヒスタミン二塩酸塩）、ＣＥＲＶＡＲＩＸ（登録商標）（ヒトパピローマウイルスワクチン）、ＣＨＯＰ（登録商標）（Ｃ：ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）（シクロホスファミド）；Ｈ：ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（ヒドロキシドキソルビシン）；Ｏ：ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；Ｐ：プレドニゾン）、ＣＹＰＡＴ（登録商標）（酢酸シプロテロン）、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎ）Ａ４Ｐ、ＤＡＢ（３８９）ＥＧＦ（Ｈｉｓ−Ａｌａリンカーを介してヒト上皮増殖因子と融合したジフテリア毒素の触媒ドメインおよび転座ドメイン（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ））またはＴｒａｎｓＭＩＤ−１０７Ｒ（登録商標）（ジフテリア毒素）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）、エニルウラシル、ＥＶＩＺＯＮ（商標）（乳酸スクアラミン）、ＤＩＭＥＲＩＣＩＮＥ（登録商標）（Ｔ４Ｎ５リポソームローション剤）、ディスコデルモリド、ＤＸ−８９５１ｆ（メシル酸エキサテカン）、エンザスタウリン、ＥＰＯ９０６（エポチロン（ｅｐｉｔｈｉｌｏｎｅ）Ｂ）、ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）（四価のヒトパピローマウイルス（型６、１１、１６、１８）組換えワクチン）、ＧＡＳＴＲＩＭＭＵＮＥ（登録商標）、ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標）、ＧＭＫ（ガングリオシド結合体化ワクチン）、ＧＶＡＸ（登録商標）（前立腺がんワクチン）、ハロフジノン、ヒストレリン（ｈｉｓｔｅｒｅｌｉｎ）、ヒドロキシカルバミド、イバンドロン酸（ｉｂａｎｄｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＩＧＮ−１０１、ＩＬ−１３−ＰＥ３８、ＩＬ−１３−ＰＥ３８ＱＱＲ（シントレデキン・ベスドトクス（ｃｉｎｔｒｅｄｅｋｉｎ  ｂｅｓｕｄｏｔｏｘ））、ＩＬ−１３−シュードモナス外毒素、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ガンマ、ＪＵＮＯＶＡＮ（登録商標）またはＭＥＰＡＣＴ（登録商標）（ミファムルチド）、ロナファルニブ、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸、ミルテホシン（ヘキサデシルホスホコリン）、ＮＥＯＶＡＳＴＡＴ（登録商標）（ＡＥ−９４１）、ＮＥＵＴＲＥＸＩＮ（登録商標）（グルクロン酸トリメトレキサート）、ＮＩＰＥＮＴ（登録商標）（ペントスタチン）、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）（リボヌクレアーゼ酵素）、ＯＮＣＯＰＨＡＧＥ（登録商標）（黒色腫ワクチン治療薬）、ＯＮＣＯＶＡＸ（登録商標）（ＩＬ−２ワクチン）、ＯＲＡＴＨＥＣＩＮ（登録商標）（ルビテカン（ｒｕｂｉｔｅｃａｎ）、ＯＳＩＤＥＭ（登録商標）（抗体ベースの細胞薬（ｃｅｌｌ  ｄｒｕｇ））、ＯＶＡＲＥＸ（登録商標）ＭＡｂ（マウスモノクローナル抗体）、パクリタキセル、ＰＡＮＤＩＭＥＸ（登録商標）（２０（Ｓ）プロトパナキサジオール（ａＰＰＤ）および２０（Ｓ）プロトパナキサトリオール（ａＰＰＴ）を含む、チョウセンニンジン由来のアグリコンサポニン）、パニツムマブ、ＰＡＮＶＡＣ（登録商標）−ＶＦ（治験がんワクチン）、ペグアスパラガーゼ、ＰＥＧインターフェロンＡ、フェノクソディオール、プロカルバジン、レビマスタト、ＲＥＭＯＶＡＢ（登録商標）（カツマキソマブ）、ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）（レナリドマイド）、ＲＳＲ１３（エファプロキシラル）、ＳＯＭＡＴＵＬＩＮＥ（登録商標）ＬＡ（ランレオチド）、ＳＯＲＩＡＴＡＮＥ（登録商標）（アシトレチン）、スタウロスポリン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｅｓ）、タラボスタット（ＰＴ１００）、ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標）（ベキサロテン）、ＴＡＸＯＰＲＥＸＩＮ（登録商標）（ＤＨＡ−パクリタキセル）、ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）（カンホスファミド（ｃａｎｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ＴＬＫ２８６）、テミリフェン（ｔｅｍｉｌｉｆｅｎｅ）、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）（テモゾロミド）、テスミリフェン（ｔｅｓｍｉｌｉｆｅｎｅ）、サリドマイド、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）（ＳＴｎ−ＫＬＨ）、チミタク（２−アミノ−３，４−ジヒドロ−６−メチル−４−オキソ−５−（４−ピリジルチオ）キナゾリンジヒドロクロリド）、ＴＮＦＥＲＡＤＥ（登録商標）（アデノベクター：腫瘍壊死因子−アルファの遺伝子を含有するＤＮＡ担体）、ＴＲＡＣＬＥＥＲ（登録商標）またはＺＡＶＥＳＣＡ（登録商標）（ボセンタン）、トレチノイン（Ｒｅｔｉｎ−Ａ）、テトランドリン、ＴＲＩＳＥＮＯＸ（登録商標）（三酸化ヒ素）、ＶＩＲＵＬＩＺＩＮ（登録商標）、ウクライン（より大きなクサノオウ植物体由来のアルカロイドの誘導体）、ビタキシン（抗アルファｖベータ３抗体）、ＸＣＹＴＲＩＮ（登録商標）（モテキサフィンガドリニウム）、ＸＩＮＬＡＹ（登録商標）（アトラセンタン）、ＸＹＯＴＡＸ（登録商標）（パクリタキセルポリグルメクス）、ＹＯＮＤＥＬＩＳ（登録商標）（トラベクテジン）、ＺＤ−６１２６、ＺＩＮＥＣＡＲＤ（登録商標）（デクスラゾキサン）、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）（ゾレドロン酸）、クリゾチニブ、ゾルビシンなどが挙げられる。
【００５１】
別の好ましい実施形態では、治療薬は、デスモグレイン−２と結合する化合物、好ましくは、ＤＳＧ２と結合し、密着結合を開口させる化合物を含む。
【００５２】
他の実施形態では、治療薬は、放射性粒子／放射線療法を含む。これらに限定されないが、コバルト−６０、ヨウ素１３１、イリジウム−１９２、ストロンチウム８９、サマリウム１５３、レニウム１８６および鉛２１２を含めた、主治医により適切だとみなされる任意の適切な放射性の療法または粒子を用いることができる。
【００５３】
好ましい実施形態では、治療薬は、抗腫瘍治療薬であり、本明細書に記載の化学療法薬または抗腫瘍モノクローナル抗体を含む。さらに好ましい実施形態では、抗腫瘍治療薬は、トラスツズマブ、セツミキシマブ、ペルツズマブ、アポマブ、コナツムマブ、レクサツムマブ、ベバシズマブ、ベバシズマブ、デノスマブ、ザノリムマブ、リンツズマブ、エドレコロマブ、リツキシマブ、チシリムマブ、トシツモマブ、アレムツズマブ、エプラツズマブ、ミツモマブ、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、オレゴボマブ、ペムツモマブ、ダクリズマブ、パニツムマブ、カツマキソマブ、オファツムマブ、およびイブリツモマブからなる群より選択される抗体を含む。有用な抗腫瘍ｍＡｂおよびそれらの特定の使用の非限定的な例が表１に列挙されており、また、参照により本明細書に組み込まれるＣａｍｐｏｌｉ、Ｍ．ら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２３巻（１＆２号）：１〜１９頁（２００９年）においてさらに記載されている。
【００５４】
【表１】
2013538040.tif 000002
【００５５】
モノクローナル抗体治療薬は、これらに限定されないが、マウスまたは他の供給源から生成した標準モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、完全ヒト抗体、キメラモノクローナル、およびその断片を含めた任意の種類のモノクローナル抗体であってよい。「ヒト化モノクローナル抗体」とは、マウスモノクローナル抗体などの非ヒトモノクローナル抗体に由来するモノクローナル抗体を指す。あるいは、ヒト化モノクローナル抗体は、親の非ヒトモノクローナル抗体の抗原結合性を保持する、または実質的に保持するが、親のモノクローナル抗体と比較してヒトに投与される場合の免疫原性が減弱しているキメラ抗体に由来してよい。例えば、キメラモノクローナル抗体は、ヒト抗体断片とマウス抗体断片、一般にヒト定常領域とマウス可変領域とを含んでよい。ヒト化モノクローナル抗体は、これらに限定されないが、（１）非ヒトモノクローナル抗体由来の相補性決定領域をヒトフレームワーク領域および定常領域にグラフティングすること（「ヒト化」）、および（２）非ヒトモノクローナル抗体の可変ドメインを移植するが、表面残基を交換することによってそれらをヒト様表面で「覆い隠す」こと（「ベニアリング」）を含めた、当技術分野で公知の種々の方法を用いて調製することができる。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年）；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＯｉ、Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４巻：６５〜９２頁（１９８８年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９巻：１５３４〜１５３６頁（１９８８年）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２８巻：４８９〜４９８頁（１９９１年）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１巻（３号）：１６９〜２１７頁（１９９４年）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ、Ｃ．  Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ４巻（７号）：７７３〜８３頁（１９９１年）において開示されている。モノクローナル抗体は、従来の技法を使用して断片化し、その断片を、全抗体についてと同じ方法で有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、抗体をペプシンで処理することによってＦ（ａｂ’）２断片を生成することができる。生じたＦ（ａｂ’）２断片を、ジスルフィド架橋が減るように処理してＦａｂ’断片を作製することができる。Ｆａｂ断片は、ＩｇＧ抗体をパパインで処理することによって得ることができ；Ｆ（ａｂ’）断片はＩｇＧ抗体をペプシンによって消化して得ることができる。Ｆ（ａｂ’）断片は、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合を介して結合させることによっても作製することができる。Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる抗体断片である。Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片をジチオスレイトールなどの還元剤で処理することによって得ることができる。抗体断片ペプチドは、そのようなペプチドをコードする核酸を組換え細胞において発現させることによっても生成することができる（例えば、���ｖａｎｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  １８４巻：１２３〜３８頁（１９９５年）を参照されたい）。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片の一部をコードするキメラ遺伝子は、そのような切断された抗体断片分子をもたらすために、Ｈ鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列、その後に翻訳終止コドンを含んでよい。モノクローナル抗体断片の非限定的な例としては、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインから本質的になる一価の断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインから本質的になるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一の腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインから本質的になるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインから本質的になるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１巻：５４４〜５４６頁）；および（ｖｉ）１種またはそれより多い種の単離されたＣＤＲまたは機能的なパラトープが挙げられる。
【００５６】
本発明の実施形態のいずれか、または複数の実施形態の組み合わせと組み合わせることができる好ましい一実施形態では、障害はＨｅｒ−２陽性腫瘍を含み、方法は、単独で、または化学療法薬、照射、またはそれらの組み合わせと組み合わせて、ＡｄＢ−２／３線維多量体を適切なモノクローナル抗体療法薬と同時投与することを含む。さらに好ましい実施形態では、モノクローナル抗体はトラスツズマブである。これらの実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに好ましい実施形態では、Ｈｅｒ−２陽性腫瘍は、乳房の腫瘍、胃の腫瘍、結腸の腫瘍、および卵巣の腫瘍からなる群より選択される。最も好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３のＰｔＤｄ、ＪＯ−１多量体（配列番号２０）、またはそれらの機能的等価物を含む。下記の実施例に示されている通り、ＡｄＢ−２／３線維多量体をトラスツズマブと同時投与することにより、乳房の腫瘍モデルにおいてトラスツズマブのＨｅｒ−２受容体への接近が改善され、それにより、トラスツズマブの治療有効性が著しく改善される。さらに好ましい実施形態では、方法を、腫瘍の寛解の欠乏によって、腫瘍の再発（ｒｅｌａｐｓｅ）によって、またはトラスツズマブに対する抵抗性の発生によってなど、トラスツズマブに対する応答が十分でない患者に対して行う。これらの実施形態の方法は、治療有効性を得るために必要なトラスツズマブの投与量を減少させることを補助するためにも使用することができ、したがって、副作用（例えば、トラスツズマブに関連する心毒性など）を限定する機能を果たし得る。
【００５７】
本発明の実施形態のいずれか、または複数の実施形態の組み合わせと組み合わせることができる別の好ましい実施形態では、障害は、ＥＧＦＲ陽性腫瘍を含み、方法は、単独で、または化学療法薬、照射、またはそれらの組み合わせと組み合わせて、ＡｄＢ−２／３線維多量体を適切なモノクローナル抗体療法薬と同時投与することを含む。さらに好ましい実施形態では、モノクローナル抗体はセツキシマブである。これらの実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらに好ましい実施形態では、ＥＧＦＲ陽性腫瘍は、肺の腫瘍、結腸の腫瘍、乳房の腫瘍、直腸の腫瘍、頭頸部の腫瘍、および膵臓の腫瘍からなる群より選択される。最も好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３のＰｔＤｄ、ＪＯ−１多量体（配列番号２０）、またはそれらの機能的等価物を含む。下記の実施例に示されている通り、ＡｄＢ−２／３線維多量体をセツキシマブと同時投与することにより、肺の腫瘍モデルにおいてセツキシマブのＥＧＦＲ受容体への接近が改善され、それにより、セツキシマブの治療有効性が著しく改善される。さらに好ましい実施形態では、方法を、腫瘍の寛解の欠乏によって、腫瘍の再発（ｒｅｌａｐｓｅ）によって、またはセツキシマブに対する抵抗性の発生によってなど、セツキシマブに対する応答が十分でない患者に対して行う。これらの実施形態の方法は、治療有効性を得るために必要なセツキシマブの投与量を減少させることを補助するためにも使用することができ、したがって、副作用（例えば、セツキシマブ療法中に起こることも多いざ瘡様発疹など）を限定する機能を果たし得る。
【００５８】
本発明の実施形態のいずれか、または複数の実施形態の組み合わせと組み合わせることができる好ましい一実施形態では、障害は上皮腫瘍を含み、方法は、単独で、または他の化学療法薬、照射、またはそれらの組み合わせと組み合わせて、ＡｄＢ−２／３線維多量体を血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤とを同時投与することを含む。これに限定されないが、ベバシズマブを含めた任意の適切なＶＥＧＦ阻害剤を使用することができる。
【００５９】
本明細書の実施形態のいずれか、または複数の実施形態の組み合わせと組み合わせることができる別の実施形態では、固形腫瘍に関する方法は、腫瘍間質タンパク質を分解することができる化合物を投与することをさらに含む。下記の実施例に示されている通り、そのような手法（腫瘍間質タンパク質を分解するための化合物とＪＯ−１多量体（配列番号２０）およびトラスツズマブとの組み合わせ）により、乳がんモデルにおいて腫瘍が完全に根絶する。これらに限定されないが、レラキシン、コラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ、ＭＭＰ（メタロプロテイナーゼ）−１、およびＭＭＰ８を含めた、腫瘍間質タンパク質を分解するための任意の適切な化合物を使用することができる。そのような化合物の送達は、遺伝子療法、ＡｄＢ−２／３線維多量体および治療薬とは別に投与すること、またはＡｄＢ−２／３線維または治療薬との結合体として投与することを含めた任意の適切な機構によるものであってよい。
【００６０】
本明細書の実施形態のいずれか、または複数の実施形態の組み合わせと組み合わせることができる別の実施形態では、方法は、ＡｄＢ−２／３多量体を他の結合開口薬と組み合わせて投与することをさらに含む。本明細書で使用される場合、「結合開口薬」は、細胞間結合を一過性に開口させることができる化合物である。任意の適切な結合開口薬を使用することができる。１つの非限定的な実施形態では、結合開口薬は、腸の上皮の結合を可逆的に変化させ、巨大分子が粘膜関門を通って通過することを可能にする能力を保有する、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）により産生される毒素であるＺｏｎａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ毒素（Ｚｏｔ）を含む（Ｆａｓａｎｏら（１９９１年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８８巻：５２４２〜５２４６頁）］。Ｚｏｔ由来のヘキサペプチド（ＡＴ−１００１）が開発されてきた）。別の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓエンテロトキシンにより、密着結合からクローディン３およびクローディン４を除去して、細菌の浸潤を容易にする（Ｓｏｎｏｄａ  Ｎら（１９９９年）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４７巻：１９５〜２０４頁］。別の実施形態では、ヒトＡｄ、ＨＰＶ、ＨＴＬＶ−１にコードされる腫瘍性タンパク質により、結合タンパク質ＺＯ−１を誤った場所に局在化させることによって上皮の結合を一過性に開口させることができる（Ｌａｔｏｒｒｅ  ＩＪら（２００５年）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１８巻：４２８３〜４２９３頁）。他の実施形態では、いくつかのヒトウイルスが、密着結合または他の細胞結合分子に関与して上皮細胞への侵入を実現する。これらのウイルスとしては、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｅｖａｎｓ  ＭＪら（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ  ４４６巻：８０１〜８０５頁）、レオウイルス（Ｂａｒｔｏｎ  ＥＳら（２００１年）Ｃｅｌｌ  １０４巻：４４１〜４５１頁）、および単純ヘルペスウイルス（Ｇｅｒａｇｈｔｙ  ＲＪら（１９９８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０巻：１６１８〜１６２０頁）がある。
【００６１】
別の実施形態では、治療薬は吸入治療薬である。任意の適切な吸入治療薬を本発明の方法において使用することができる。種々の非限定的な実施形態では、吸入治療薬は、コルチコステロイド、気管支拡張薬、ベータアゴニスト、抗コリン作用薬、アルブテロール（ＰＲＯＶＥＮＴＩＬ（登録商標）；ＶＥＮＯＬＩＮ（登録商標）；ＡＣＣＵＮＥＢ（登録商標）；ＰＲＯＡＩＲ（登録商標））、レバルブテロール（ｌｅｖａｌｂｕｔｅｒｏｌ）（ＸＯＰＥＮＥＸ（登録商標））、ピルブテロール（ｐｉｒｂｕｔｒｏｌ）（ＭＡＸＡＩＲ（登録商標））、臭化イプラトロピウム（ＡＴＲＯＶＥＮＴ（登録商標））、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド（ＡＥＲＯＢＩＤ（登録商標））、フルチカゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルチカゾン（コルチコステロイド）およびサルメテロール（ＡＤＶＡＩＲ（登録商標））、ホルモテロール（ｆｏｒｍｏｔｏｒｏｌ）（長時間作用性、ベータ−アゴニスト気管支拡張薬）およびブデソニド（コルチコステロイド）（ＳＹＭＩＣＯＲＴ（登録商標））、アルブテロール（ベータアゴニスト）およびイプラトロピウム（ＣＯＭＢＩＶＥＮＴ（登録商標）；抗コリン作用薬）（ブデソニド（ＰＵＬＭＩＣＯＲＴ  ＲＥＳＰＵＬＥＳ（登録商標））、およびチオトロピウム（ｔｉｏｐｒｏｐｉｕｍ）（ＳＰＩＲＩＶＡ（登録商標）；抗コリン作用性気管支拡張薬）からなる群より選択される。
【００６２】
別の実施形態では、化合物は、診断薬またはイメージング剤を含む。本発明の方法には、任意の診断薬、イメージング剤、または他の化合物を、対象の標的への接近が限定され得る細胞間結合を含む上皮組織に送達するための広範な適用がある。種々の非限定的な実施形態では、イメージング剤は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生じさせることができる任意の化学化合物を含んでよい。多くのそのようなイメージング剤は、当業者に公知である。本開示の方法および組成物において使用するために適したイメージング剤の例は放射性同位元素、蛍光分子、磁気粒子（ナノ粒子を含む）、金属粒子（ナノ粒子を含む）、リン光分子、酵素、抗体、リガンド、およびそれらの組み合わせであり、一方診断薬は、そのようなイメージング剤と結合した、特定の上皮の障害に対する診断マーカーである化合物を含んでよい。イメージング剤によって生成されるシグナルを検出し、測定するための方法も当業者に公知である。例えば、放射性同位元素はシンチレーション測定または直接的な可視化によって検出することができ；蛍光分子は蛍光分光光度計を用いて検出することができ；リン光分子は分光光度計を用いて検出すること、またはカメラを用いて直接可視化することができ；酵素は酵素によって触媒される反応の生成物を検出または可視化することによって検出することができ；抗体は抗体とカップリングさせた二次的な検出用標識を検出することによって検出することができる。好ましい一実施形態では、イメージング剤および／または診断薬は、直接腫瘍と結合することによって、またはイメージング剤または診断薬を腫瘍と結合することができる化合物とカップリングさせることによってのいずれであっても、腫瘍を検出するために使用することができるものである。
【００６３】
一実施例では、イメージング剤は、蛍光イメージング剤を含んでよく、一方診断薬は、蛍光イメージング剤と結合した、特定の上皮の障害に対する診断マーカーである化合物を含んでよい。蛍光イメージング剤は、検出可能な蛍光シグナルを有する任意の化学的部分である。このイメージング剤は、単独で、または他のイメージング剤と組み合わせて使用することができる。本明細書に開示されている組成物および方法において使用することができる適切な蛍光剤の例としては、これらに限定されないが、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、フルオレスカミン、ＯＰＡ、ＮＤＡ、インドシアニングリーン色素、シアニン色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７）、４−アセタミド−４’−イソチオシアン酸スチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン、アクリジンイソチオシアネート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニルナフタルイミド（ｐｈｅｎｙｌｉｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ）−３，５ジスルホネート、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ＢＯＤＩＰＹ、ブリリアントイエロー、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（Ｃｏｕｍａｒａｎ１５１）、シアノシン、４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド）、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリンジエチレントリアミンペンタアセテート、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート、臭化エチジウム、エチジウム、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセインイソチオシアネート、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローザニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリトリン、ｏ−フタルジアルデヒド、ピレン、ピレン酪酸、スクシンイミジル１−ピレン酪酸、リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ［Ｒ］ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、５，６−テトラメチルローダミン、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロゾール酸、クマリン−６などが、それらの組み合わせを含め、挙げられる。これらの蛍光イメージング部分は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯｒｅｇおよびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏを含めた種々の商業的な供給源から入手することができる、または当業者が合成することができる。
【００６４】
別の例では、イメージング剤は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）作用剤を含んでよく、一方、診断薬は、ＭＲＩ作用剤と結合した、特定の上皮の障害に対する診断マーカーである化合物を含んでよい。ＭＲＩ作用剤は、検出可能な磁気共鳴シグナルを有する、または別の作用剤の磁気共鳴シグナルに影響を及ぼし得る（例えば、増加またはシフト）任意の化学的部分である。この種類のイメージング剤は、単独で、または他のイメージング剤と組み合わせて使用することができる。さらに別の例では、ガドリニウムベースのＭＲＩ作用剤が、イメージング剤としての機能を果たし得る。開示されているイメージング剤に組み入れることができる適切なＭＲＩ作用剤の例は、パラ−アミノ−ベンジルジエチレントリアミン五酢酸（ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＴＰＡ、化合物７）、結合体化可能な形態のジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）であり、ガドリニウムに強力と結合することが公知であり、磁気共鳴造影剤としての臨床使用について認可されている。本明細書に開示されているデンドリマー基質などの大きな巨大分子にＭＲＩ作用剤を組み入れることにより、大きなＴ１弛緩（高い対比）および単一分子における作用剤の多数のコピーが可能になり得、それによりシグナルが増加し得る。ＭＲＩイメージング剤と、例えば、蛍光イメージング剤とを組み合わせることにより、生じた作用剤を、ＭＲＩを介してリアルタイムで検出、画像化、および追跡することができる。他のイメージング剤としては、１８Ｆ、または６４Ｃｕもしくは６８Ｇａのキレート化剤を組み入れることによって調製することができるＰＥＴ作用剤が挙げられる。また、放射性核種を添加することを用いて、ＳＰＥＣＴイメージングまたは放射線量の送達を容易にすることができ、一方診断薬は、ＰＥＴ作用剤と結合した、特定の上皮の障害に対する診断マーカーである化合物を含んでよい。
【００６５】
いくつかの実施形態では、診断薬は、これらに限定されないが、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）作用剤、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）作用剤、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）作用剤、核磁気イメージング剤（ＮＭＩ）、蛍光透視法作用剤および超音波造影剤を含めた診断的なイメージング作用剤である。そのような診断薬としては、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉなどを含めたヨウ素（Ｉ）、バリウム（Ｂａ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、９９Ｔｃを含めたテクネチウム（Ｔｃ）、３１Ｐを含めたリン（Ｐ）、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、タリウム（Ｔｌ）、５１Ｃｒを含めたクロム（Ｃｒ）、１４Ｃを含めた炭素（Ｃ）などの元素の放射性同位元素、蛍光標識した化合物、またはそれらの複合体、キレート、付加物および結合体が挙げられる。これらに限定されないが、炭素１１、窒素１３、酸素１５、フッ素１８、１１Ｃ−メトミデート、および、これらに限定されないが、フルデオキシグルコース（フッ素１８で標識したグルコース類似体を含めたそのグルコース類似体を含めた任意の適切なＰＥＴ作用剤を使用することができる。
【００６６】
他の実施形態では、診断薬は、細胞において発現されるとすぐに検出可能なタンパク質をコードするマーカー遺伝子（これらに限定されないが、ベータガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなどを含む）および標識した核酸プローブ（例えば、放射標識したプローブまたは蛍光標識したプローブ）である。いくつかの実施形態では、診断作用剤と本明細書において提供されるＡｄＢ−２／３多量体との共有結合性結合体化は種々の結合体化プロセスに従って実現される。他の実施形態では、診断薬は、提供されるＡｄＢ−２／３多量体と非共有結合的に結びついている。
【００６７】
別の態様では、本発明は、上皮組織への物質の送達を改善するための方法であって、上皮組織を、（ａ）上皮組織に送達すべき１種またはそれより多い種の化合物；および（ｂ）上皮組織への１種またはそれより多い種の化合物の送達を増強するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物と接触させることを含む方法を提供する。この態様では、化合物は、上に詳細に記載されているものなどの任意の適切な化合物であってよい。好ましい実施形態では、１種またはそれより多い種の化合物は、イメージング剤を含む。さらに好ましい実施形態では、上皮組織は、本出願に開示されている任意のものを含めた固形腫瘍を含む。種々の非限定的な実施形態では、固形腫瘍は、乳房の腫瘍、肺の腫瘍、結腸の腫瘍、直腸の腫瘍、胃の腫瘍、前立腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、子宮の腫瘍、皮膚の腫瘍、内分泌の腫瘍、子宮頸部の腫瘍、腎臓の腫瘍、黒色腫、膵臓の腫瘍、肝臓の腫瘍、脳腫瘍、頭頸部の腫瘍、鼻咽頭の腫瘍、胃の腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、膀胱の腫瘍、および食道の腫瘍からなる群より選択される。
【００６８】
さらに別の態様では、本発明は、デスモグレイン２（ＤＳＧ２）を発現している細胞または組織への物質の送達を改善するための方法であって、ＤＳＧ２を発現している細胞または組織を、（ａ）細胞または組織に送達すべき１種またはそれより多い種の化合物；および（ｂ）組織への１種またはそれより多い種の化合物の送達を増強するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物と接触させることを含む方法を提供する。ＤＳＧ２を発現している例示的な組織の種類としては、これらに限定されないが、上皮細胞／組織（例えば、本明細書に開示されているものなど）、ヒト血小板および顆粒球が挙げられる。下記の実施例に示されている通り、ＤＳＧ２は、非極性細胞において受容体としても作用する。したがって、これらの方法は、上皮細胞および組織における適用だけでなく、例えば、ＡｄＢ−２／３の病態発生および遺伝子療法のためにＡｄＢ−２／３ベクターを血管内の適用に関連することを見いだす。
【００６９】
さらに別の態様では、本発明は、組織における上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘導するための方法であって、上皮組織を、ＥＭＴを誘導するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物と接触させることを含む方法を提供する。ＥＭＴは、上皮細胞が細胞間結合などの特性を失い、間葉細胞の性質を獲得する細胞の分化転換プログラムである。ＥＭＴは、間葉系のマーカーの発現の増加、細胞外マトリックス化合物の発現の増加、上皮のマーカーの発現の減少、転写因子の位置の変更、およびキナーゼの活性化、および細胞間結合の解離を特徴とする。
【００７０】
これらのさらなる態様のそれぞれでは、本明細書に記載の化合物およびＡｄＢ−２／３線維多量体の任意の実施形態を用いることができる。１つの非限定的な実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３線維多量体、Ａｄ７線維多量体、Ａｄ１１線維多量体、Ａｄ１４線維多量体、Ａｄ１４ａ線維多量体、それらの組み合わせ、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される。別の実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３線維多量体、またはその機能的等価物である。別の実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３の１２面体粒子（ＰｔＤｄ）、組換えＡｄＢ−２／３線維多量体、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される。種々の好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３のＰｔＤｄまたは結合開口薬１（ＪＯ−１）（配列番号２０）多量体（例えば、二量体など）、またはその機能的等価物を含む。これらの実施形態のそれぞれと組み合わせることができるさらに好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は二量体である。
【００７１】
特定の作用機構に縛られるものではないが、これらのさらなる態様のそれぞれは、細胞間結合を攪乱する機能を果たすＡｄＢ−２／３線維多量体を活用すると考えられている。本発明の方法の全ての態様および実施形態では、治療薬、診断薬、および／またはイメージング剤は、ＡｄＢ−２／３多量体と一緒に投与することができる、または、一緒に投与することができる。一実施形態では、治療薬とＡｄＢ−２／３多量体は、任意の適切な共有結合または非共有結合によって付着する。１つの非限定的な実施形態では、固形腫瘍細胞を死滅させるために、ＡｂＢ−２／３多量体を毒素または他の薬物に付着することができる。
【００７２】
ＡｄＢ−２／３線維多量体および／または治療薬は、局所的な投与形式または全身投与形式のどちらが処置されている状態に最適であるかに応じて、主治医により適切だとみなされる任意の形で投与することができる。本明細書で使用される場合、「全身送達」および「全身投与」という用語は、これらに限定されないが、送達作用剤を、単一または多数の意図された治療の作用部位に有効に分散させる筋肉内（ＩＭ）投与経路、皮下投与経路、静脈内（ＩＶ）投与経路、動脈内投与経路、吸入による投与経路、舌下投与経路、頬側投与経路、局部投与経路、経皮投与経路、経鼻投与経路、直腸投与経路、膣投与経路、および他の投与経路を含めた経口経路および非経口経路を包含するものとする。本組成物を全身送達するための好ましい経路としては、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、および吸入による経路が挙げられる。好ましい一実施形態では、例えば、播種性腫瘍を処置するために（およびモノクローナル抗体を送達するために）、静脈内投与を使用する。別の実施形態では、例えば、胃腸（ＧＩ）上皮の障害を処置するために経口送達が好ましい場合がある。別の実施形態では、肺に送達するため、例えば、肺上皮の障害に対してなど経鼻送達またはエアロゾル送達が好ましい場合がある。
【００７３】
ポリペプチドを酵素による分解から保護するために、ＡｄＢ−２／３線維多量体を脂質またはリポソームなどの別の分子と併せて導入することができる。例えば、特定のタンパク質を体内での酵素による加水分解から保護し、したがって、半減期を延長するために、ポリマー、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の共有結合による付着が用いられている。
【００７４】
ＡｄＢ−２／３線維多量体および／または治療薬は、所望のレベルの治療効果を維持するように決定された間隔で定期的に全身投与することができる。例えば、静脈内注射による投与は、１日１回、１週間に１回、２〜４週間ごと、またはそれよりも頻度が少ない間隔であってよい。投薬レジメンは、医師が、作用剤の組み合わせの作用に影響を及ぼす可能性があるさまざまな因子を考慮することによって決定する。これらの因子としては、処置されている状態の進行の程度、患者の年齢、性別および体重、ならびに他の臨床的因子が挙げられる。ＡｄＢ−２／３線維多量体および／または治療薬の投与量は、投与されている多量体および／または治療薬、ならびに任意の薬物送達ビヒクル（例えば、持続的放出送達ビヒクル）の存在および本質に応じて変動する。さらに、投与の頻度および送達される作用剤（複数可）の薬物動態学的挙動が変動するように投与量を調整することができる。ＡｄＢ−２／３線維多量体の投与量の範囲は、一般に０．０１ｍｇ／ｋｇから２５０ｍｇ／ｋｇの間にわたり、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの間にわたり、より好ましくは、０．１０ｍｇ／ｋｇから０．５ｍｇ／ｋｇの間にわたる。認可された治療薬の投与量は、医者が容易に同定することができる。治療薬は、がんなどの上皮組織への浸透を増強させることにより用量を減らして投与することも可能であり得る。
【００７５】
ＡｄＢ−２／３線維多量体は、被験体に、治療薬を投与する前、それと同時に、またはその後に投与することができる。好ましい実施形態では、治療薬およびＡｄＢ−２／３線維多量体を同時に投与する。ＡｄＢ−２／３線維多量体に対して治療薬を投与するタイミングは、最大の治療効果を実現するために変動し得る。治療薬は、それを、ＡｄＢ−２／３線維多量体とＤＳＧ２が結合することによって引き起こされる一過性の細胞間結合の開口と確実に接触する時に投与することが好ましい。例えば、治療薬は、ＡｄＢ−２／３線維多量体の各投与の前に、それと同時に、その後に投与することができる。他の好ましい実施形態では、治療薬は、ＡｄＢ−２／３線維多量体を投与した後、例えば、ＡｄＢ−２／３線維多量体を投与した最大５分後、１０分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、３０時間後、３６時間後、４０時間後、４２時間後、４８時間後、５４時間後、６０時間後、６６時間後、７２時間後、７８時間後、８４時間後、９０時間後、または、さらには最大９６時間後に投与することができる。
【００７６】
別の態様では、本発明は、上皮組織に関連する障害を処置するための方法であって、それを必要とする被験体に、障害を処置するために十分な量のＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物を投与することを含む方法を提供する。この実施形態では、他の治療薬は送達されない。非限定的な実施形態では、ＡｄＢ−２／３ウイルス感染症、固形腫瘍、またはＡｄＢ−２／３ベースの遺伝子送達ベクターを用いて処置することができる障害からなる群より選択される障害を処置するために単独療法を使用する。例えば、固形腫瘍の治療では、方法は、浸透などによる免疫系細胞の障害部位への接近（例えば、既存のナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞または樹状細胞の腫瘍内への浸透など）を改善することを含む。該方法は、免疫系細胞の、標的上皮細胞への接近を改善することが有益であり得る上記の任意の上皮細胞に関連する障害を処置するためにも使用することができる。好ましい一実施形態では、障害は、固形腫瘍であり、該方法は、免疫系による腫瘍の攻撃を改善することを含む。該方法は、上記の任意の固形腫瘍と一緒に使用することができる。文脈により明確に別段の規定がなされない限り、本発明の第１の態様の全ての実施形態および複数の実施形態の組み合わせをこの第２の態様においても同様に使用することができる。
【００７７】
したがって、この第２の態様の種々の実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３線維多量体、Ａｄ７線維多量体、Ａｄ１１線維多量体、Ａｄ１４線維多量体、およびＡｄ１４ａ線維多量体からなる群より選択される。同様に、本発明のこの態様において使用するための１種またはそれより多い種のＡｄＢ−２／３線維多量体（またはそれらのキメラ／機能的等価物）を含む例示的な構築物としては、これらに限定されないが、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３の１２面体粒子（ＰｔＤｄ）（ＡｄＢ−２／３の複製時にそれらにより産生されるウイルス成分の１２面体粒子）、組換えＡｄＢ−２／３線維多量体（これに限定されないが、ＪＯ−１多量体、例えば、ＪＯ−１二量体などの、下記の実施形態のいずれか、または複数の実施形態の組み合わせにおいて開示されているものを含む）、およびそれらの機能的等価物が挙げられる。好ましい実施形態では、１種またはそれより多い種のＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３のＰｔＤｄなどのＡｄＢ−２／３のＰｔＤｄを含む、またはそれからなる。別の好ましい実施形態では、１種またはそれより多い種のＡｄＢ−２／３線維多量体は、ＪＯ−１二量体などの、下記の本発明の組成物の実施形態のいずれか、または複数の実施形態の組み合わせを含む、またはそれからなる。さらに、本発明のこの態様の方法は、ＤＳＧ２と結合し、ＤＳＧ２に媒介される一過性の細胞間結合の開口を誘発することができる任意のＡｄＢ−２／３線維多量体を用いて行うことができる。したがって、本明細書に開示されているＡｄＢ−２／３線維多量体に対する天然に生じない修飾（異なるＡｄ血清型線維タンパク質およびそのドメインなどの欠失、付加、置換、キメラ）は、それらが、ＤＳＧ２と結合し、ＤＳＧ２に媒介される細胞間結合の開口を誘発する働きをする限りは本発明の範囲内である。ＤＳＧ２との結合についての試験およびＤＳＧ２に媒介される細胞間結合の開口についての評価に関する本明細書における教義に基づいて、そのようなＡｄＢ−２／３線維多量体の機能的等価物を同定することは、十分に当業者のレベルの範囲内である。
【００７８】
別の態様では、本発明は、（ａ）１つまたはそれより多いＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドシャフトドメイン、またはそれらの機能的等価物と、（ｂ）１つまたはそれより多いＡｄＢ−２／３線維タンパク質シャフトドメインに作動可能に連結され、そのＣ末端側に位置するＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドノブドメイン、またはその機能的等価物と；（ｃ）１つまたはそれより多いＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドシャフトドメインに作動可能に連結され、そのＮ末端側に位置する１つまたはそれより多い非ＡｄＢ−２／３由来二量体形成ドメインとを含む組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドを提供する。
【００７９】
好ましい実施形態では、組換えポリペプチドはＡｄ線維ポリペプチド由来の尾部ドメインを含まない。下で詳細に開示されている通り、出願人らは、線維ポリペプチドの多量体形成およびＤＳＧ２とＡｄＢ−２／３タンパク質のシャフトドメインおよびノブドメインの結合のために必要な部位を突き止めた。したがって、本発明のこの態様のポリペプチドは、例えば、上記の本発明の種々の方法において使用するためのＡｄＢ−２／３線維多量体を形成するために使用することができる。この態様では、組換えポリペプチドは、任意のＡｄＢ−２／３ウイルス由来のシャフトドメインおよびノブドメイン、または、ＤＳＧ２に対する結合親和性を保持または改善し、二量体形成ドメインを介して多量体（例えば、二量体など）を形成することができる、そのようなシャフトドメインおよびノブドメインに対する任意の突然変異体（置換体、付加体、欠失体、キメラなど）（機能的等価物）を含んでよい。そのような突然変異体を生成することは、十分に当業者のレベルの範囲内であり、また、そのような突然変異体をＤＳＧ２との結合について試験すること、および結果として生じる、本発明の組換えポリペプチドにおいて使用するための適合性も、本明細書における教義に基づいて当業者のレベルの範囲内である。例えば、固定化した組換えＤＳＧ２を含有するセンサーを使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験を用いて、ＤＳＧ２競合試験と組み合わせて、評価されている組換えポリペプチドがＤＳＧ２と結合するかどうかを決定することができる。１つの非限定的な実施形態では、ポリペプチドは、当業者に周知の技法を用いてそのアミノ酸配列を変化させることにより、その免疫原性が低下するように修飾することまたは突然変異させることができる。機能の損失および獲得についての分析などの別の例示的な試験は、実施例１に詳しく記載されている。
【００８０】
本出願全体を通して使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、その最も広範な意味で使用され、サブユニットアミノ酸の配列を指す。本発明のポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸（ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＬ−アミノ酸に特異的なプロテアーゼに対して抵抗性である）、またはＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の組み合わせを含んでよい。本明細書に記載のポリペプチドは、化学的に合成すること、または組み換えによって発現させることができる。ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期の増加を促進するために、例えば、ペグ化、ＨＥＳ化（ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ）、ＰＡＳ化（ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化によってなど、他の化合物と連結させることができる、または、Ｆｃ融合物としてもしくは脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）変異体で作製することができる。そのような連結は、当業者には理解される通り、共有結合性または非共有結合性であってよい。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、ドメインが、それらの意図された目的のための単位として機能するように形づくられる、要素の配置を指す。この用語は、ドメインがポリペプチドのすぐ隣にあることを必要とせず、ドメイン間にスペーサー／リンカー配列が存在してよく、その長さは、かなり変動してよい。１つの非限定的な実施形態では、組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドの任意の２つのドメイン間のスペーサーの長さは、約０アミノ酸から約２０アミノ酸の間であってよい。種々の他の非限定的な実施形態では、スペーサーの長さは、
【００８２】
【化１】
2013538040.tif 000003
【００８３】
の長さであってよい。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「組換えポリペプチド」とは、天然に生じないタンパク質産物を意味し、組換えポリペプチドのドメインは、１種またはそれより多い種の他のタンパク質または人工的に誘導された配列に由来する。例えば、各ドメインは、異なる天然に存在するタンパク質配列に由来してよい（例えば：あるＡｄＢ−２／３血清型由来のシャフト配列；異なるＡｄＢ−２／３血清型由来のノブドメイン；など）。組換えポリペプチドは、これらに限定されないが、標準のＤＮＡ操作技法および組換えポリペプチドのサブユニット部分を介した化学的な組立てを含めた種々の機構によって構築することができる。化学的な組立てにより、分子遺伝的な形態としての等価形態または等価な機能を伴う代替物がもたらされ得る。好ましい実施形態では、標準の組換えＤＮＡ技法によって組換えポリペプチドを作製する。本発明の組換えポリペプチドをそのように組換えにより作製し単離するための技法は、本明細書における教示に基づいて、十分に当業者のレベルの範囲内である。
【００８５】
一実施形態では、各シャフトドメインは、Ａｄ３シャフトドメイン、Ａｄ７シャフトドメイン、Ａｄ１１シャフトドメイン、Ａｄ１４シャフトドメイン、Ａｄ１４ａシャフトドメイン、それらの組み合わせ、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される。ＤＳＧ２と結合し、それにより一過性の細胞間結合の開口をもたらすために必要である線維ノブ二量体形成のためにはシャフトドメインが必要である。したがって、これらのＡｄウイルス血清型のシャフトドメインの機能的等価物は、以下に提供される実施例に基づいて当業者が容易に決定することができる。例えば、固定化した組換えＤＳＧ２を含有するセンサーを使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験を用いて、ＤＳＧ２競合試験と組み合わせて、評価されている組換えポリペプチドがＤＳＧ２と結合するかどうかを決定することができる。機能の損失および獲得についての分析などの別の例示的な試験は、実施例１に詳しく記載されている。
【００８６】
組換えポリペプチドは、１個から２２個の間のＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドシャフトドメインを含んでよい。したがって、種々の実施形態では、ポリペプチドは、
【００８７】
【化２】
2013538040.tif 000004
【００８８】
を含む。単一の組換えポリペプチドにおいて、２個以上のＡｄＢ−２／３線維タンパク質シャフトドメインが存在する場合、各シャフトドメインは同一であってよい、またはシャフトドメインの１つまたはそれより多いコピーは異なってよい。好ましい実施形態では、組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドは単一のシャフトドメインを有する。
【００８９】
別の実施形態では、組換えポリペプチド内の１つまたはそれより多い（または全ての）シャフトドメインは、配列番号１１：
【００９０】
【化３】
2013538040.tif 000005
【００９１】
によるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。この配列および本明細書において示されている他の可変性配列では、可変性の残基は括弧内に示されており、「−」は、その残基が存在しない場合があることを示す。
【００９２】
別の実施形態では、組換えポリペプチド内の１つまたはそれより多い（または全ての）シャフトドメインは、配列番号１２：
【００９３】
【化４】
2013538040.tif 000006
【００９４】
によるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
【００９５】
さらに別の実施形態では、組換えポリペプチド内の１つまたはそれより多い（または全ての）シャフトドメインは、配列番号１（Ａｄ３）、配列番号２（Ａｄ７）、配列番号３（Ａｄ１１）、配列番号４（Ａｄ１４）、および配列番号５（Ａｄ１４（ａ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。ＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドのアラインメントおよびそれらのドメイン構造については図２４を参照されたい。一実施形態では、組換えポリペプチド内のノブドメインは、Ａｄ３ノブドメイン、Ａｄ７ノブドメイン、Ａｄ１１ノブドメイン、Ａｄ１４ノブドメイン、Ａｄ１４ａノブドメイン、およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される。ＤＳＧ２と結合するためにはノブドメインが必要である。したがって、これらのＡｄウイルス血清型のノブドメインの機能的等価物は、ＤＳＧ２との結合を評価するためのさまざまなアッセイの本明細書における教義に基づいて当業者が容易に決定することができる。例えば、固定化した組換えＤＳＧ２を含有するセンサーを使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験を用いて、ＤＳＧ２競合試験と組み合わせて、評価されている組換えポリペプチドがＤＳＧ２と結合するかどうかを決定することができる。機能の損失および獲得についての分析などの別の例示的な試験は、実施例１に詳しく記載されている。
【００９６】
別の実施形態では、ノブドメインは、配列番号１３：
【００９７】
【化５】
2013538040.tif 000007
【００９８】
によるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
【００９９】
別の実施形態では、ノブドメインは、配列番号１４：
【０１００】
【化６】
2013538040.tif 000008
【０１０１】
によるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる
さらに別の実施形態では、ノブドメインは、配列番号６（Ａｄ３）、配列番号７（Ａｄ７）、配列番号８（Ａｄ１１）、配列番号９（Ａｄ１４）、および配列番号１０（Ａｄ１４ａ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。ＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドのアラインメントおよびそれらのドメイン構造については図２４を参照されたい。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「二量体形成ドメイン」とは、それを含有する組換えポリペプチド内の、二量体形成を促進するペプチド配列である。本発明の組換えポリペプチドには、それにより組換えポリペプチドの二量体形成、したがって、ＤＳＧ２との結合が可能になる限りは、任意の適切な非ＡｄＢ−２／３由来二量体形成ドメインを使用することができる。二量体形成ドメインは非ＡｄＢ−２／３由来である、すなわち、ＡｄＢ−２／３線維ポリペプチド内に天然に存在するドメインではない。
【０１０３】
当業者に公知であり、本発明において使用するために適した多数の二量体形成ドメインの非限定的な例としては、これらに限定されないが、少なくとも１つのへリックスを含有するペプチドへリックス、またはへリックス、コイルおよび別のへリックスなどによって形成される構造、コイルドコイル構造、例えば、多くの細胞表面シグナル伝達受容体内の二量体形成ドメイン、抗体のＦｃ領域またはヒンジ領域、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質のＮ末端ドメイン、ＦＫ５０６結合性タンパク質、ＬｅｘＡタンパク質のＣ末端ドメイン、核受容体、ＦｋｐＡのＮ末端ドメイン、Ａ．ｍａｘｉｍａ由来のオレンジ色のカルテノイドタンパク質、インフルエンザ由来のＭ１マトリックスタンパク質、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉフクロースアルドラーゼなどが挙げられる。例えば、Ｏ’Ｓｈｅａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２５４巻：５３９頁（１９９１年）、Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒら、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２１１巻：１２１〜１２８頁（１９９６年）；Ｋｌｅｍｍら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６巻：５６９〜５９２頁（１９９８年）；Ｋｌｅｍｍら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６巻：５６９〜５９２頁（１９９８年）；Ｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ．  ３８２巻：８２２〜８２６頁（１９９６年）；およびＰｏｍｅｒａｎｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３７巻：９６５頁（１９９８年））を参照されたい。さらなる例としては、ウシパピローマウイルスＥ２タンパク質内の残基３２５〜４１０（Ｄｏｓｔａｔｎｉ、Ｎ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ７巻（１９８８年）３８０７〜３８１６頁；Ｈａｕｇｅｎ、Ｔ．ら  ＥＭＢＯ  Ｊ  ７巻（１９８８年）４２４５〜４２５３頁；ＭｃＢｒｉｄｅ、Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ７巻（１９８８年）５３３〜５３９頁；ＭｃＢｒｉｄｅ、Ａ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６巻（１９８９年）５１０〜５１４頁）、１型脱ヨード酵素（Ｄ１）：ＤＦＬＶＩＹＩＥＥＡＨＡＳＤＧＷ（配列番号２４）またはＡＤＦＬ−−ＹＩ−ＥＡＨ−ＤＧＷ（配列番号２５）；ＨＩＶ−１カプシドタンパク質：ＱＧＰＫＥＰＦＲＤＹＶＤＲＦＹＫＴＬＲＡ（配列番号２６）；酵母ＧＣＮ４のロイシンジッパー二量体形成モチーフ：ＨＭＫＱＬ  Ｄ  ＶＥＥＬ  Ｓ  ＮＹＨＬ  Ｎ  ＶＡＲＬ  Ｋ  ＶＧＥＲ（配列番号２７）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ転写性抗ターミネータータンパク質内のロイシンジッパー；およびＢｇｌＧ：ＧＶＴＱＬＭＲＥＭＬＱＬＩＫＦＱＦＳＬＮＹＱＥＥＳＬＳＹＱＲＬＶＴ（配列番号２８）が挙げられる。好ましい実施形態では、二量体形成ドメインは、ＥＶＳＡＬＥＫ（配列番号２２）および／またはＫＶＳＡＬＫＥ（配列番号２３）の１つまたはそれより多いコピーを含む。
【０１０４】
本発明の組換えポリペプチド内の、二量体形成ドメインとしての機能を果たし得る適切なペプチド配列、およびその突然変異体を同定することは、下記の実施例２において開示されているものなどの本明細書における教義に基づいて、十分に当業者のレベルの範囲内である。例えば、組換えＡｄＢ−２／３線維ポリペプチドの二量体形成は、ショ糖勾配での沈降、トリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性、およびポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動移動度を含めた判断基準によって評価することができる（ＨｏｎｇおよびＥｎｇｌｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０巻：７０７１〜７０７８頁（１９９６年））。
【０１０５】
組換えポリペプチドは、１つまたはそれより多い非ＡｄＢ−２／３由来二量体形成ドメインを含んでよい。したがって、種々の実施形態では、組換えポリペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の非ＡｄＢ−２／３由来二量体形成ドメインを含む。ポリペプチド内に多数のドメインが存在する場合、二量体形成ドメインのそれぞれは同じであることが好ましい。
【０１０６】
好ましい実施形態では、スペーサーペプチドは、二量体形成ドメインと１つまたはそれより多いシャフトドメインの間に位置する。さらに好ましい実施形態では、スペーサーペプチドは、構造が柔軟なペプチドである。実質的にあらゆる、構造が柔軟なペプチドを使用することができる。例として、可動性のペプチドは、アミノ酸残基の繰り返し、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒなど、または任意の他の適切なアミノ酸残基の繰り返しを含んでよい。別の実施形態では、抗体のヒンジ領域を使用することができる。スペーサーは、組換えポリペプチドの二量体を形成する能力が維持され、組換えポリペプチドとＤＳＧ２の結合が維持される任意の適切な長さであってよい。
【０１０７】
好ましい一実施形態では、組換えＡｄＢ−２／３ポリペプチドは、
（ａ）それぞれがＡｄ３シャフトドメイン（配列番号１）を含む、またはそれからなる１つまたはそれより多いシャフトドメインと
（ｂ）Ａｄ３ノブドメイン（配列番号６）を含む、またはそれからなるノブドメインとを含む。
【０１０８】
この好ましい実施形態は、本明細書に記載の実施形態のいずれかまたは複数の実施形態の組み合わせと一緒に用いることができる。例えば、これらに限定されないが、ＥＶＳＡＬＥＫ（配列番号２２）および／またはＫＶＳＡＬＫＥ（配列番号２３）の１つまたはそれより多いコピーを含めた任意の適切な二量体形成ドメインを使用することができる。同様に、二量体形成ドメインとシャフトドメインの間および／またはシャフトドメインとノブドメインの間の任意の適切なスペーサーペプチドを使用することができる。最も好ましい実施形態では、組換えＡｄＢ−２／３ポリペプチドは、ＪＯ−１（配列番号２０）、またはその多量体（例えば、二量体など）を含む、またはそれからなる。
【０１０９】
組換えポリペプチドは、別のドメイン、例えば、ポリペプチドを単離するためのドメインおよび／または検出ドメインなどを含んでよい。例えば、実施例および配列番号２１のＨｉｓタグを有するＪＯ−１を参照されたい）。例えば、組換えポリペプチドを作製した後にポリペプチドの精製／単離を容易にするために、単離ドメインを付加することができる。これらに限定されないが、ＨＩＳ、ＣＢＰ、ＣＹＤ（共有結合性だが解離可能なＮｏｒｐＤペプチド）、Ｓｔｒｅｐ  ＩＩ、ＦＬＡＧ、ＨＰＣ（プロテインＣの重鎖）ペプチドタグ、ＧＳＴ親和性タグおよびＭＢＰ親和性タグを含めた任意の適切な単離ドメインを使用することができる。本明細書で使用される場合、「検出ドメイン」とは、検出することができる１つまたはそれより多いアミノ酸配列を意味する。これらに限定されないが、本質的に蛍光性のタンパク質（例えば、非生物発光性Ａｎｔｈｏｚｏａ種由来の緑色蛍光タンパク質および蛍光タンパク質）、補因子要求性蛍光タンパク質または発光タンパク質（例えば、フィコビリタンパク質またはルシフェラーゼ）、および特異的抗体に認識され得るエピトープ、またはこれらに限定されないが、蛍光性または発光性に標識した、色素、酵素補因子および遺伝子工学で操作された結合性分子を含めた他の特異的な天然または非天然の結合性プローブを含めた任意の適切な検出ドメインを使用することができる。
【０１１０】
別の実施形態では、組換えポリペプチドは、多量体の形態、例えば、二量体、三量体などである。好ましい実施形態では、ＪＯ−１（配列番号２０）多量体は、ＪＯ−１ホモ三量体のそれぞれの二量体形成ドメインを通じた二量体形成によって形成されたＪＯ−１二量体を含む（すなわち：ＪＯ−１ポリペプチドは、ノブドメインの三量体形成によるホモ三量体である）。多量体の形態（例えば、二量体など）では、組換えポリペプチドは、ＡｄＢ−２／３線維多量体を含み、上記の本発明の種々の方法において使用することができる。当業者には理解される通り、そのような多量体は、本発明の同一の組換えポリペプチドの多量体を含んでよい、または、本発明の異なる組換えポリペプチドの多量体を含んでよい。一実施形態では、多量体の一部を形成している組換えポリペプチドのそれぞれにおいて二量体形成ドメインは同じである。別の実施形態では、多量体の一部を形成している組換えポリペプチドのそれぞれにおいて二量体形成ドメインは異なる。別の実施形態では、多量体の一部を形成している組換えポリペプチドのそれぞれにおいてシャフトドメインおよび／またはノブドメインは同じである。別の実施形態では、多量体の一部を形成している組換えポリペプチドのそれぞれにおいてシャフトドメインおよび／またはノブドメインは異なる。
【０１１１】
ＡｄＢ−２／３線維の多量体形成は、当業者に周知の方法に従って決定することができる。例えば、組換えＡｄＢ−２／３線維構築物の多量体形成は、ショ糖勾配での沈降、トリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性、およびポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動移動度を含めた判断基準によって評価することができる（ＨｏｎｇおよびＥｎｇｌｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０巻：７０７１〜７０７８頁（１９９６年））。電気泳動移動度に関しては、線維多量体は、非常に安定な複合体であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に試料を煮沸しない場合、多量体の分子量と一致する分子量で流れる。しかし、煮沸すると、多量体の構造は破壊され、その後、タンパク質は、タンパク質単量体と一致するサイズで流れる。
【０１１２】
組換えポリペプチド、またはその多量体型は、溶液中で、または凍結させて保管することができる。
【０１１３】
別の実施形態では、本発明の組換えポリペプチドを、上皮組織に関連する障害に対する１種またはそれより多い種の治療薬と組み合わせる（例えば、それと結合体化するなど）。そのような結合体は、例えば、本発明の治療方法において使用することができる。本発明のポリペプチドと対象の治療薬を結合体化するための方法、例えば、共有結合または化学的架橋によるものなどは、当業者に周知である。それらに限定されないが、上に開示されているもの、ならびにレラキシンなどの腫瘍間質分解性化合物を含めた任意の適切な治療薬を使用して、本発明のこの実施形態による結合体を形成することができる。好ましい実施形態では、治療薬は、抗腫瘍治療薬であり、本明細書に記載の化学療法薬または抗腫瘍モノクローナル抗体を含む。さらに好ましい実施形態では、抗腫瘍治療薬は、トラスツズマブ、セツキシマブ、ペルツズマブ、アポマブ、コナツムマブ、レクサツムマブ、ベバシズマブ、ベバシズマブ、デノスマブ、ザノリムマブ、リンツズマブ、エドレコロマブ、リツキシマブ、チシリムマブ、トシツモマブ、アレムツズマブ、エプラツズマブ、ミツモマブ、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、オレゴボマブ、ペムブモマブ、ダクリズマブ、パニツムマブ、カツマキソマブ、オファツムマブ、およびイブリツモマブからなる群より選択される抗体を含む。
【０１１４】
別の態様では、本発明は、本発明の任意の実施形態のポリペプチドをコードする核酸を提供する。核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含んでよく、また、標準の分子生物学的技法を用いて本明細書における教義に基づいて調製および単離することができる。核酸は、これらに限定されないが、ポリＡ配列、修飾されたコザック配列、ならびにエピトープタグ、輸出シグナル、および分泌シグナルをコードする配列、核局在化シグナル、ならびに原形質膜局在化シグナルを含めた、コードされるタンパク質の発現および／または精製を促進するために有用な追加的なドメインを含んでよい。
【０１１５】
別の態様では、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された本発明の任意の態様の核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。「組換え発現ベクター」は、核酸のコード領域または遺伝子を、遺伝子産物の発現に影響を及ぼすことができる任意のプロモーターと作動可能に連結させるベクターを含む。哺乳動物系において開示されている核酸の発現を駆動するために使用するプロモーター配列は、構成的なもの（これらに限定されないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦを含めた種々のプロモーターのいずれかによって駆動される）または誘導性のもの（これらに限定されないが、テトラサイクリン反応性プロモーター、エクジソン反応性プロモーター、ステロイド反応性プロモーターを含めたいくつもの誘導性プロモーターのいずれかによって駆動される）であってよい。原核細胞のトランスフェクトにおいて使用するための発現ベクターの構築も当技術分野で周知であり、したがって、標準の技法によって実現することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１０９〜１２８頁、Ｅ．Ｊ．  Ｍｕｒｒａｙ編、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、およびＡｍｂｉｏｎ  １９９８年  Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を参照されたい。発現ベクターは、宿主生物体において、エピソームとしてか、または宿主染色体ＤＮＡに組み込まれることによって複製可能でなければならず、また、これらに限定されないが、抗生物質抵抗性遺伝子などの選択マーカーを含めた、所与の使用に適しているとみなされる任意の他の構成要素を含んでよい。
【０１１６】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に開示されている組換え発現ベクターを含む宿主細胞、およびその後代を提供し、宿主細胞は原核生物であっても真核生物であってもよい。細胞は、一過性または安定にトランスフェクトすることができる。そのような、原核細胞および真核細胞への発現ベクターのトランスフェクションは、これらに限定されないが、標準の細菌の形質転換、リン酸カルシウム共沈澱、電気穿孔、またはリポソーム媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、ポリカチオン媒介性トランスフェクション、またはウイルス媒介性トランスフェクションを含めた、当技術分野で公知の任意の技法によって実現することができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版（Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．  １９８７年、Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照されたい）。発現ベクターをトランスフェクトした培養細胞を利用して多量のポリペプチドを作製する技法は当技術分野で周知である。
【０１１７】
別の態様では、本発明は、
（ａ）ＡｄＢ−２／３線維多量体、またはその機能的等価物と、
（ｂ）薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物を提供する。
【０１１８】
ＡｄＢ−２／３線維多量体は、本発明の態様、実施形態のいずれか、または複数の実施形態の組み合わせにより本明細書に記載されている多量体のいずれであってもよい。種々の好ましい実施形態では、ＡｓＢ−２／３線維多量体は、本発明のＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３のＰｔＤｄ、または組換えＡｄＢ−２／３線維多量体、またはそれらの機能的等価物を含む。種々の他の好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３線維多量体、Ａｄ７線維多量体、Ａｄ１１線維多量体、Ａｄ１４線維多量体、Ａｄ１４ａ線維多量体、およびそれらの組み合わせまたはキメラからなる群より選択される。好ましい実施形態では、１種またはそれより多い種のＡｄＢ−２／３線維多量体は、ＡｄＢ−２／３のＰｔＤｄ（例えば、Ａｄ３のＰｔＤｄなど）を含む、またはそれからなる。別の好ましい実施形態では、１種またはそれより多い種のＡｄＢ−２／３線維多量体は、本明細書に記載の本発明の実施形態のいずれか、または複数の実施形態の組み合わせの組成物、例えば、ＪＯ−１（配列番号２０）二量体などを含む、またはそれからなる。
【０１１９】
医薬組成物は、これらに限定されないが、上に開示されているものを含めた、上皮組織に関連する障害を処置するための１種またはそれより多い種の治療薬をさらに含んでよい。好ましい実施形態では、治療薬は、抗腫瘍治療薬であり、本明細書に記載の化学療法薬または抗腫瘍モノクローナル抗体を含む。さらに好ましい実施形態では、抗腫瘍治療薬は、トラスツズマブ、セツキシマブ、ペルツズマブ、アポマブ、コナツムマブ、レクサツムマブ、ベバシズマブ、ベバシズマブ、デノスマブ、ザノリムマブ、リンツズマブ、エドレコロマブ、リツキシマブ、チシリムマブ、トシツモマブ、アレムツズマブ、エプラツズマブ、ミツモマブ、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、オレゴボマブ、ペムブモマブ、ダクリズマブ、パニツムマブ、カツマキソマブ、オファツムマブ、およびイブリツモマブからなる群より選択される抗体を含む。
【０１２０】
薬学的に許容される担体は、無毒性であり、生体適合性であり、多量体（およびそれと組み合わせた任意の他の治療剤）の生物活性に有害な影響を及ぼさないように選択される。例示的な、ペプチドに対する薬学的に許容される担体は、Ｙａｍａｄａの米国特許第５，２１１，６５７号に記載されている。組成物は、経口投与、非経口投与、または外科的投与が可能になる、固体の形態、半固体の形態、ゲルの形態、液体の形態または気体の形態の調製物、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液、坐剤、吸入剤、および注射剤などに製剤化することができる。注射、注入、または洗浄および局部送達によって非経口的に送達するための適切な担体としては、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、規定のリンゲル液または乳酸リンゲル液、ブドウ糖溶液、ハンクス液、またはプロパンジオールが挙げられる。さらに、滅菌した不揮発性油を、溶媒または懸濁媒として使用することができる。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含めた任意の生体適合性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製において使用される。担体および作用剤は、液剤、懸濁剤、重合性ゲルまたは非重合性ゲル、ペースト剤または膏薬として配合することができる。担体は、作用剤（複数可）の送達を持続させる（すなわち、延長する、遅延させる、または調節する）ため、または治療剤（複数可）の送達、取り込み、安定性、または薬物動態を増強するための送達ビヒクルも含んでよい。そのような送達ビヒクルとしては、非限定的な例として、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、またはタンパク質で構成されるナノ粒子、リポソーム、炭水化物、合成の有機化合物、無機化合物、ポリマーヒドロゲルまたはコポリマーヒドロゲル、およびポリマーミセルを挙げることができる。適切なヒドロゲル送達系およびミセル送達系としては、国際特許公開第ＷＯ２００４／００９６６４Ａ２号に開示されているＰＥＯ：ＰＨＢ：ＰＥＯコポリマーおよびコポリマー／シクロデキストリン複合体、および米国特許出願公開第２００２／００１９３６９Ａ１号に開示されているＰＥＯおよびＰＥＯ／シクロデキストリン複合体が挙げられる。そのようなヒドロゲルは、意図された作用部位に、または皮下または筋肉内に局所的に注射して、持続的放出デポ剤を形成することができる。
【０１２１】
くも膜下腔内（ＩＴ）または脳室内（ＩＣＶ）に送達するために、適切に滅菌された送達系（例えば、液体；ゲル、懸濁液など）を使用して組成物を投与することができる。非ペプチド作用剤を経口投与するためには、組成物を不活性な増量剤または希釈剤、例えば、スクロース、コーンスターチ、またはセルロースなどに担持させることができる。
【０１２２】
本発明の組成物は、生体適合性賦形剤、例えば、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤、希釈剤、緩衝液、浸透エンハンサー、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）、結合剤、増粘剤、調味料（経口投与用）なども含んでよい。例示的な製剤は、注射可能な投与量の、水、油、生理食塩水、グリセロール、またはエタノールなどの滅菌された液体であってよい医薬担体を伴う生理的に許容される希釈剤中の多量体の溶液または懸濁剤として非経口的に投与することができる。さらに、補助的な物質、例えば、湿潤剤または乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、界面活性物質、ｐＨ緩衝物質などが修飾されたポリペプチドを含む組成物に存在してよい。医薬組成物の追加的な構成成分としては、石油（例えば、動物起源、植物起源、または合成起源のものなど）、例えば、大豆油および鉱油が挙げられる。一般に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが注射用溶液に好ましい液体担体である。
【０１２３】
医薬組成物は、多量体および他の治療薬（存在する場合）の持続性放出またはパルス放出が可能になるように製剤化することができるデポ剤注射剤または埋め込み調製物の形態で投与することもできる。
【０１２４】
医薬組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、（ａ）分散保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）；（ｂ）界面活性物質；（ｃ）充填剤；（ｄ）張度調整剤；（ｅ）安定剤；（ｆ）保存料および／または（ｇ）緩衝液を含んでよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の緩衝液は、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である。医薬組成物は、分散保護剤、例えば、スクロース、ソルビトールまたはトレハロースも含んでよい。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、保存料、例えば、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、および種々のそれらの混合物を含む。他の実施形態では、医薬組成物は、グリシンのような充填剤を含む。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、界面活性物質、例えば、ポリソルベート−２０、ポリソルベート−４０、ポリソルベート−６０、ポリソルベート−６５、ポリソルベート−８０、ポリソルベート−８５、ポロキサマー−１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミタート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレエート（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｔｒｉｏｌｅａｓｔｅ）、またはそれらの組み合わせを含む。医薬組成物は、張度調整剤、例えば、製剤に、ヒト血液との実質的な等張性（ｉｓｏｔｏｎｉｃ）または等浸透圧性（ｉｓｏｏｓｍｏｔｉｃ）を与える化合物も含んでよい。例示的な張度調整剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、ブドウ糖、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニンおよびアルギニン塩酸塩が挙げられる。他の実施形態では、医薬組成物は、安定剤、例えば、対象のタンパク質と組み合わせると、凍結乾燥した形態または液体の形態における対象のタンパク質の化学的な不安定性および／または物理的な不安定性を実質的に予防するまたは低下させる分子をさらに含む。例示的な安定剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、およびアルギニン塩酸塩が挙げられる。
【０１２５】
医薬組成物は、任意の適切な様式に包装することができる。一実施形態では、医薬組成物を、ＡｄＢ−２／３線維多量体の容器（例えば、バイアルなど）を含有するキットとして包装する。好ましい実施形態では、キットは、同じ容器または別の容器（例えば、バイアルなど）内に、ＡｄＢ−２／３線維多量体と一緒に、被験体に投与しようとする治療薬、診断薬、またはイメージング剤をさらに含む。任意の適切なＡｄＢ−２／３線維多量体をキットに使用することができる；最も好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、ＪＯ−１の多量体（例えば、二量体など）である。
【０１２６】
別の態様では、本発明は、（ａ）１種またはそれより多い種の組換えポリペプチド／ＡｄＢ−２／３線維多量体、単離された核酸、組換え発現ベクター、および／または本発明の宿主細胞；および（ｂ）その／それらの、上皮組織に関連する障害を処置することにおける使用についての説明書を含むキットを提供する。キットは、本発明の方法において使用するための治療薬をさらに含んでよい。
【０１２７】
別の態様では、本発明は、上皮組織に関連する障害を処置すること、上皮組織への物質の送達を改善すること、ＤＳＧ２を発現している組織への物質の送達を改善すること、組織におけるＥＭＴを誘導すること、および／またはＡｄＢ−２／３感染症を処置することのうちの１つまたはそれより多いための候補化合物を同定するための方法であって、（ａ）ＡｄＢ−２／３線維多量体とＤＳＧ２を、１種またはそれより多い種の試験化合物の存在下、ＤＳＧ２への多量体の結合を促進する条件下で接触させるステップと；（ｂ）対照と比較して、ＤＳＧ２との結合についてＡｄＢ−２／３線維多量体と競合する陽性の試験化合物を同定するステップとを含み、陽性の試験化合物が、上皮組織に関連する障害を処置すること、上皮組織への物質の送達を改善すること、ＤＳＧ２を発現している組織への物質の送達を改善すること、組織におけるＥＭＴを誘導すること、および／またはＡｄＢ−２／３感染症を処置することのうちの１つまたはそれより多いための候補化合物である方法を提供する。
【０１２８】
ＤＳＧ２との結合についてＡｄＢ−２／３線維多量体と競合する陽性の試験化合物は、それらがＤＳＧ２と相互作用することによる、細胞内の結合の一過性の開口のための候補化合物である。化合物の、それらがＤＳＧ２と相互作用することによって細胞内の結合を一過性に開口させる能力を検証するための経過観察アッセイは、これらに限定されないが、続く実施例に開示されている試験を含めた任意の適切な方法によって行うことができる。そのように、上皮組織に関連する障害を処置すること、上皮組織への物質の送達を改善すること、ＤＳＧ２を発現している組織への物質の送達を改善すること、または組織におけるＥＭＴを誘導することについて同定された化合物は、本発明の方法のいずれにおいてもＡｄＢ−２／３多量体の代替物として使用することができる。さらに、ＡｄＢ−２／３は、気道感染症（いくらか重篤な）および咽頭結膜熱を引き起こす重要なヒト病原体を示す。したがって、ＡｄＢ−２／３感染症を処置することができる化合物が有用であると思われる。本明細書に開示されている通り、ＤＳＧ２はＡｄＢ−２／３により主要な高親和性受容体として使用され、したがって、ＡｄＢ−２／３とＤＳＧ２の結合を減らすことができる化合物は、ＡｄＢ−２／３感染症の発症を処置または限定するための候補化合物である。
【０１２９】
この態様では、ＡｄＢ−２／３多量体は、実施形態のいずれかまたは複数の実施形態の組み合わせに開示されているＡｄＢ−２／３多量体のいずれであってもよい。したがって、種々の非限定的な実施形態では、ＡｄＢ−２／３多量体は、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３の１２面体粒子（ＰｔＤｄ）（ＡｄＢ−２／３の複製時にそれらにより産生されるウイルス成分の１２面体粒子）、組換えＡｄＢ−２／３線維多量体（これらに限定されないが、下記の実施形態のいずれか、または複数の実施形態の組み合わせにおいて開示されているものを含めた）、およびそれらの機能的等価物であってよい。好ましい実施形態では、１種またはそれより多い種のＡｄＢ−２／３線維多量体は、Ａｄ３のＰｔＤｄなどのＡｄＢ−２／３のＰｔＤｄを含む、またはそれからなる。別の好ましい実施形態では、１種またはそれより多い種のＡｄＢ−２／３線維多量体は、下記の本発明の組成物の実施形態のいずれか、または複数の実施形態の組み合わせを含む、またはそれからなる。さらに好ましい実施形態では、ＡｄＢ−２／３線維多量体は、ＪＯ−１（配列番号２０）二量体、またはそれらの機能的等価物を含む、またはそれからなる。
【０１３０】
これに限定されないが、試験化合物の非存在下におけるＡｄＢ−２／３多量体とＤＳＧ２の結合を含めた任意の適切な対照を使用することができる。
【０１３１】
一実施形態では、ＤＳＧは、組換えＤＳＧ２を含む。別の実施形態では、方法は、細胞表面上にＤＳＧ２（内因的にまたは組換えによって）を発現している細胞を使用する。
【０１３２】
１つの非限定的な実施形態では、固定化した組換えＤＳＧ２を含有するセンサーを使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験を用いて、ＤＳＧ２競合試験と組み合わせて、ＤＳＧ２と結合するＡｄＢ−２／３線維多量体である候補化合物を同定することができる。機能の損失および獲得についての分析などの別の例示的な試験は、実施例１に詳しく記載されている。
【０１３３】
別の実施形態では、同定は、実施例１に開示されているものなどの、試験化合物の、結合を減少させる能力が、ＤＳＧ２を発現している上皮細胞に機能的なＡｄＢ−２／３ビリオンを形質導入する能力の減少として検出される形質導入試験を含む。
【０１３４】
別の実施形態では、ＤＳＧ２を発現している細胞抽出物を電気泳動によって分離し、ウエスタンブロット分析し、標識したＡｄＢ−２／３線維多量体を使用して、試験化合物の存在下でウエスタンブロットを探索する。別の実施形態では、Ｗａｎｇら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００７年）８１巻：１２７８５〜１２７９２頁；およびＷａｎｇら（２００８年）８２巻：１０５６７〜１０５７９年に記載のものなどのドットブロットアッセイを使用することができる。
【０１３５】
ＡｄＢ−２／３感染症を処置するための候補化合物を同定するための技法のさらなる例が、続く実施例において提供される。
【０１３６】
試験化合物がポリペプチド配列を含む場合、そのようなポリペプチドは、化学的に合成すること、または組み換えによって発現させることができる。組換え発現は、上に開示されている通り当技術分野における標準の方法を用いて実現することができる。そのような発現ベクターは、細菌発現ベクターまたはウイルス発現ベクターを含んでよく、そのような宿主細胞は、原核生物または真核生物であってよい。固相、液相、またはペプチド縮合技法の周知の技法、またはそれらの任意の組み合わせを用いて調製した合成ポリペプチドは、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含んでよい。ペプチド合成のために使用するアミノ酸は、標準の脱保護、中和、カップリングおよび洗浄のプロトコールを用いた標準のＢｏｃ（Ｎα−アミノ保護されたＮα−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂、または標準の塩基に不安定なＮα−アミノ保護された９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であってよい。Ｆｍｏｃ  Ｎα−アミノ保護されたアミノ酸およびＢｏｃ  Ｎα−アミノ保護されたアミノ酸はどちらも、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、または当業者によく知られている他の化学薬品会社から入手することができる。さらに、他のＮα−保護基を用いて合成することができるポリペプチドは当業者によく知られている。固相ペプチド合成は、当業者によく知られている技法によって実現することができ、例えば自動合成機を使用することによって提供することができる。
【０１３７】
試験化合物が抗体を含む場合、そのような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよい。抗体は、ヒト化形態、完全ヒト形態、またはマウス形態の抗体であってよい。そのような抗体は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８８年）に記載のものなどの周知の方法によって作出することができる。
【０１３８】
試験化合物が核酸配列を含む場合、そのような核酸は、同様に、化学的に合成すること、または組み換えによって発現させることができる。組換え発現技法は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、上記を参照されたい）。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、一本鎖または二本鎖であってよい。同様に、そのような核酸は、当技術分野における標準の技法を用いて、手動の反応または自動化された反応により化学的または酵素的に合成することができる。化学的にまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素的合成により合成された場合、核酸は、細胞に導入する前に精製することができる。例えば、核酸は、溶媒または樹脂、沈澱、電気泳動、クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせを用いて抽出することによって混合物から精製することができる。あるいは、核酸は、試料を加工することによる損失を回避するために、精製することなく、または最小限に精製して使用することができる。
【０１３９】
試験化合物がポリペプチド、抗体、または核酸以外の化合物を含む場合、そのような化合物は、有機化学合成を行うための当技術分野の種々の方法の任意の変形によって作出することができる。
【実施例】
【０１４０】
（実施例１）
デスモグレイン２は、アデノウイルス血清型３、７、１１、および１４に対する受容体である
要約
アデノウイルス（Ａｄ）血清型Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、およびＡｄ１４によって使用される主要な高親和性受容体としてデスモグレイン２（ＤＳＧ２）を同定した。これらの血清型は、気道感染症を引き起こす重要なヒト病原体を示す。上皮細胞において、アデノウイルスがＤＳＧ２と結合することにより、上皮間葉転換によく似た事象が誘発され、一過性の細胞間結合の開口がもたらされる。これにより、細胞間結合内に閉じ込められている受容体、例えば、ＣＤ４６およびＨｅｒ２／ｎｅｕへの接近が改善される。組換えＡｄ３のＰｔＤｄを用いた試験によって示されている通り、完全なビリオンに加えて、ウイルスの複製時にウイルスのペントンおよび線維によって過剰に形成される１２面体粒子（ＰｔＤｄ）により、ＤＳＧ２に媒介される細胞間結合の開口が誘発され得る。本発明者らの発見は、アデノウイルスの生物学的性質および病原性を明らかにし、また、がん療法のために意味を有する。
【０１４１】
諸言
ヒトアデノウイルス（Ａｄ）は、現在５５血清型を含有する６種（Ａ〜Ｆ）に分類されている。Ａｄ血清型の大部分は、主要な付着受容体としてコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を利用する１。しかしこれは、Ｂ種のＡｄ血清型の場合は違う。最近、本発明者らはそれらの受容体の使用に基づいたＢ種Ａｄの新しいグループ分けを提案した２。グループ１（Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３５、Ａｄ５０）は、ほぼＣＤ４６のみを受容体として利用する；グループ２（Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１４）は、ＣＤ４６ではない、仮に受容体Ｘと名付けた一般的な、未確認の受容体（複数可）を共有する；グループ３（Ａｄ１１）は、ＣＤ４６と優先的に相互作用するが、ＣＤ４６が遮断されている場合には受容体Ｘも利用する。
【０１４２】
Ｂ種Ａｄは、一般的なヒト病原体である。２００５年から、血清型Ａｄ３、Ａｄ７、およびＡｄ１４を含めた多様なＢ種血清型の同時出現が観察された。２００７年に、米国およびアジアのいくつかの場所で、Ａｄ１４の新規の病原性が高く毒性が強いと思われる株であるＡｄ１４ａが発見された３〜４。本発明者らは最近、Ａｄ１４ａが、それらの受容体の使用に関してＡｄのＢ種グループ２に属することを実証した５。まとめると、受容体Ｘを利用する血清型（Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１４、Ａｄ１４ａ、およびＡｄ１１）は全て、ＡｄＢ−２／３と称する。
【０１４３】
ＡｄＢ−２／３は、特に上皮起源の腫瘍に関して、遺伝子移入ベクターとしての潜在性を有する６。上皮細胞は、いくつかの細胞間結合（密着結合、接着結合、ギャップ結合、およびデスモソーム）を維持し、その特徴は、多くの場合、上皮内がんにおいて、およびがん細胞株において保存されている７。ＣＡＲとＣＤ４６はどちらも上皮がん細胞の細胞間結合内に閉じ込められており、これらの付着受容体を使用するＡｄと接近できない８〜９。対照的に、ＡｄＢ−２／３は、上皮がん細胞に効率的に感染し、これは、部分的に、上皮細胞が細胞間結合などの特性を失い、間葉細胞の性質を獲得する細胞の分化転換プログラムである１０上皮間葉転換（ＥＭＴ）によく似たプロセスを誘導することによって実現される８。ＡｄＢ−２／３の別の示差的な特徴は、それらが、複製時にＡｄ線維とペントンベースとからなるウイルス成分の１２面体粒子を産生することができることである１１。ペントン１２面体（ＰｔＤｄ）は、全長のペントンベースタンパク質から組み立てることができないが、残基３７と残基３８の間におけるタンパク質分解による自然発生的なＮ末端の切断を必要とする１２。この切断部位はＡｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、およびＡｄ１４において保存されているが、Ａｄ２およびＡｄ５には存在しない（図１ａ）。Ａｄ３の場合では、ＰｔＤｄは、非常に過剰に形成され（感染性ウイルス当たりＰｔＤｄ５．５×１０６個）、ＰｔＤｄがウイルスの脱出および伝播の一因となるという仮説が立てられている１３。
【０１４４】
受容体Ｘを同定するための最初の試みは、１９９５年に遡る。これらの最初の試験により、Ａｄ３と、約１３０ｋＤａのＨｅＬａ細胞タンパク質との相互作用が示されている１４。最近、ＣＤ４６、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６などに対する受容体Ｘのいくつかの候補が提唱された１５〜１８。しかし、本発明者らおよび他者は、これらのタンパク質がＡｄＢ−２／３に対する高親和性受容体としての機能を果たし得ることをこれまでに検証することができていない２，１９〜２３。
【０１４５】
本試験では、Ａｄ３ビリオンおよび組換えＡｄ３のＰｔＤｄを受容体Ｘについてのプローブとして使用し、ＡｄＢ−２／３血清型に対する高親和性受容体としてデスモグレイン２（ＤＳＧ２）を同定した。ＤＳＧ２は、カドヘリンタンパク質ファミリーに属するカルシウム結合性膜貫通糖タンパク質である。上皮細胞において、ＤＳＧ２は、細胞間接着構造の構成成分である２４。その細胞質尾部は、細胞接着および細胞間結合／細胞形態の調節因子と直接接触している一連のタンパク質と相互作用する２５。ＤＳＧ２は、胃がん２６、扁平上皮癌２７、黒色腫２８、転移性前立腺がん２９、および膀胱がん３０を含めた一連の上皮の悪性疾患において過剰発現されることが示されている。
【０１４６】
結果
ＤＳＧ２は、ＡｄＢ−２／３ウイルスに対する受容体である。本発明者らの以前の試験により、Ａｄ３が、高密度細胞受容体にナノモルの親和性で結合することが示された２。Ａｄ３の結合は、トリプシンに対して感受性であり、ＥＤＴＡによって遮断することができた、つまり、結合には二価カチオンが必要であった。まず、細胞との高親和性結合を媒介するＡｄ３カプシドタンパク質を同定し、後にそれを用いて高親和性受容体Ｘを検索した。特に、Ａｄ５とＣＡＲの高親和性結合およびＡｄ３５とＣＤ４６の結合は、それぞれ、対応する線維ノブによって媒介される３１。しかし、本発明者らの以前の試験により、単一の組換えの三量体Ａｄ３ノブでは、非常に高い濃度を使用した場合でさえ、Ａｄ３ウイルスの結合を完全に遮断することができないことが明らかになり、これは、他のまたは追加的なカプシド部分がＡｄ３の結合に関与していることを示している３２。したがって、本発明者らは、Ａｄ３の結合と競合させるためにＡｄ３ペントンベース（ＢｓＤｄ）またはＡｄ３ペントンベースと線維（ＰｔＤｄ）で構成される組換えＡｄ３  １２面体を利用した（図１ｂ）３３。ＰｔＤｄはＡｄ３の細胞への付着を遮断するが、ＢｓＤｄはそれを遮断しないことが示された（図２ａ）。ＰｔＤｄはまた、ＣＤ４６も遮断されている場合、他のＡｄＢ−２／３、例えば、Ａｄ１４、Ａｄ１４ａ、ならびにＡｄ１１の結合も遮断したが、Ａｄ５の結合は阻害せず、Ａｄ３５の結合は部分的にのみ遮断した（図２ａ、図１ｃ）。細胞をＰｔＤｄと一緒にプレインキュベートすることにより、ＢｓＤｄと混合したＡｄ３ノブよりもＡｄ３の結合が阻害された（図１ｄ）。形質導入試験では、ＰｔＤｄは、Ａｄ３ベクター（Ａｄ３−ＧＦＰ）を効率的に遮断したが、Ａｄ３５ベクター（Ａｄ３５−ＧＦＰ（受容体としてＣＤ４６を使用する）の形質導入は遮断せず（図２ｂ）、ＰｔＤｄのＡｄ３と競合する能力も確認された。Ａｄ３−ＧＦＰ（図１ｅ）およびＡｄ３５−ＧＦＰ３４は、Ｅ３領域にＣＭＶ−ＧＦＰ発現カセットを挿入した、野生型Ａｄ３ベースのベクターおよび野生型Ａｄ３５ベースのベクターである。
【０１４７】
受容体Ｘを同定するために最適な細胞株を選択するために、いくつかのヒト細胞株および動物細胞株へのＡｄ３ウイルスの結合を比較した（図２ｃ）。Ａｄ３はげっ歯類細胞には結合せず、これは、これらの細胞において受容体Ｘが発現されていなかった、またはＡｄ３に接近できなかったことを示している。最初に試験したヒト細胞株１０株（ＨｅＬａ、Ｋ５６２、ＳＫＯＶ３、２９３、ＨＴ２９、ＳＫＨｅｐ１、Ｓａｏｓ、Ｙ７９、Ｒａｍｏｓ）のうち、Ａｄ３の結合は、Ｒａｍｏｓ（ヒトバーキットリンパ腫）細胞においてのみ見られなかった。
【０１４８】
Ａｄ受容体候補を同定するために、ＨｅＬａ細胞膜タンパク質を可溶化し、ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ブロッティングした。ブロットをウイルス粒子とハイブリダイズさせ、ウイルス線維ノブ特異的抗体を用いて結合を可視化した。特異的なゲルバンドを切り取り、タンデムな質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。まず、このアッセイによって公知のＡｄ受容体であるＣＤ４６を検出することができるかどうかを試験した。フィルターを、ＣＤ４６−ターゲティングＡｄ５／３５＋＋ビリオンと一緒にインキュベートし３５、ＣＤ４６と一致する単一のバンドが見いだされた（図２ｄ）。フィルターをＡｄ３ビリオンと一緒にインキュベートすることにより、１６０ｋＤａの分子量および９０ｋＤａの分子量の２つのバンドが明らかになった（図２ｅ）。これらの２つのバンドに加えて、Ａｄ３のＰｔＤｄは、１３０ｋＤａの範囲内のＨｅＬａタンパク質とも反応した。Ｒａｍｏｓ細胞、すなわち、Ａｄ３と結合しない細胞では、１６０ｋＤａのバンドおよび９０ｋＤａのバンドはどちらも存在しなかった。ＨｅＬａ細胞およびＲａｍｏｓ細胞の両方で約１３０ｋＤａのＰｔＤｄ結合バンドが現れ、これは、それがＡｄ３ウイルス受容体ではないことを示している。１６０ｋＤａのバンドのＭＳ／ＭＳ分析により、ヒトデスモグレイン２（ＤＳＧ２）と一致する１４ペプチドが同定された（図２ｆ）。ＨｅＬａ膜タンパク質のＩＰ／ウエスタン分析により、１６０ｋＤａのバンドおよび９０ｋＤａのバンドがどちらも、ＤＳＧ２特異的抗体によって認識されたことが実証された（図２ｅ、右側のパネル）。これは、１６０ｋＤａのバンドが完全なサイズのＤＳＧ２を表すこと、および９０ｋＤａのバンドが、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および膜近傍細胞外アンカードメインを欠くＤＳＧ２変異体であることを示す以前のウエスタンブロット試験と一致する３６〜３７。
【０１４９】
固定化した組換えヒトＤＳＧ２を含有するセンサーを用いたＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験により、Ａｄ３ビリオンはＤＳＧ２と相互作用するが、Ａｄ２ビリオンまたはＡｄ５ビリオンはＤＳＧ２と相互作用しないことが実証された（図２ｇ）。組換えＰｔＤｄはＤＳＧ２と結合したが、ＢｓＤｄ粒子はＤＳＧ２と結合しなかった（図２ｈ）。ＰｔＤｄ−ＤＳＧ２相互作用のＫＤ（平衡解離定数）は２．５ｎＭであった。固定化したＤＳＧ２とＰｔＤｄの結合は、可溶性のＤＳＧ２がそれと競合したという事実によって実証された通り特異的であった（データは示していない）。結合動力学のＳＰＲ分析により、Ａｄ３線維ノブがＤＳＧ２からより早く解離することも示され、これは、線維シャフト内に追加的なＤＳＧ２結合部位（複数可）が存在すること、および／またはＤＳＧ２と高親和性で結合するために線維多量体形成が必要であることを示している（図２ｉ、図１ｄも参照されたい）。
【０１５０】
ＤＳＧ２をＡｄＢ−２／３の結合／感染についての重大な受容体として検証するために、細胞株に対して機能の損失および獲得試験を実施した。組換えＤＳＧ２タンパク質は、Ａｄ３ならびに他のＡｄＢ２／３  Ａｄ、すなわち、Ａｄ７、Ａｄ１４、Ａｄ１４ａ、およびＡｄ１１とＨｅＬａ細胞の結合を遮断したが、Ａｄ５およびＡｄ３５の結合は遮断しなかった（図３ａ）。Ａｄ３−ＧＦＰの感染は、ＤＳＧ２タンパク質によって効率的に阻害されたが、カドヘリンスーパーファミリーの他の構造的に関連するメンバー（デスモグレイン１−ＤＳＧ１およびデスモコリン１−ＤＳＣ１）によっては阻害されなかった３８（図３ｂ）。この試験により、ＤＳＧ２タンパク質は、ＣＤ４６−ターゲティングベクター（Ａｄ３５−ＧＦＰ）による形質導入に影響を及ぼさなかったことも示された。細胞外ドメイン３および４に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いるとＡｄ３の付着の有意な阻害が観察された（図３ｃ）（ＤＳＧ２の概略図については、図２ｆを参照されたい）。ＤＳＧ２特異的ｓｉＲＮＡのプールをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトすることにより、表面のＤＳＧ２レベルが約７分の１に下方制御された（データは示していない）。Ａｄ３の付着は、ＤＳＧ２−ｓｉＲＮＡで処置したＨｅＬａ細胞では、対照ｓｉＲＮＡで処置した細胞と比較して３分の１であった（Ｐ＜０．００１）（図３ｄ）。Ａｄ３−ＧＦＰに感染した後のＧＦＰの発現レベルは、ＤＳＧ２−ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞では、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞の１３．９分の１であった（図３ｅ）。ＤＳＧ２特異的ｓｉＲＮＡは、ＣＡＲ−ターゲティングベクターＡｄ５−ＧＦＰを用いた形質導入に影響を及ぼさなかった。しかし、ＤＳＧ２−ｓｉＲＮＡをトランスフェクトすることにより、結合およびＣＤ４６特異的ベクターＡｄ３５−ＧＦＰおよびＡｄ５／３５−ＧＦＰの形質導入も減少した。ＤＳＧ２−ｓｉＲＮＡによりＨｅＬａ細胞におけるＣＤ４６レベルは低下しなかった。この時点では、この現象を説明することができない。しかし、これはＨｅＬａ細胞に特異的であると思われる。ＤＳＧ２−ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした２９３細胞または乳がんＢＴ４７４細胞ではＡｄ３５−ＧＦＰまたはＡｄ５／３５−ＧＦＰの形質導入の低下は検出されなかった（データは示していない）。
【０１５１】
ｓｉＲＮＡに媒介されるＤＳＧ２の下方制御によっても、１００％集密において細胞当たり１ｐｆｕのＭＯＩでＡｄ３−ＧＦＰを感染させた細胞におけるウイルス細胞溶解および拡散が減少した。感染多重度（ＭＯＩ）を調整して用いて（感染の１６時間後に匹敵するＧＦＰの発現の百分率が実現されるように）、ある期間にわたってウイルス細胞溶解を追跡し、感染の７日後に、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞において、ＤＳＧ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞よりも大規模な溶解性プラークが見いだされた。これは、組織培養ウェルに付着したままである生存細胞、すなわちウイルス感染による細胞変性の影響を生じなかった細胞のクリスタルバイオレット染色に反映される（図３ｆ）。細胞の生存率の定量的分析により、ｓｉＲＮＡによってＤＳＧ２が下方制御されている細胞において、対照ｓｉＲＮＡで処置した細胞と比較して有意に少ない細胞死が示された（図３ｇ）。
【０１５２】
機能獲得試験のために、ＤＳＧ２の発現レベルが異なる一連の細胞株を選択し、Ａｄ３−ＧＦＰの形質導入を測定した（図４ａ）。ＤＳＧ２の発現を欠く全ての細胞株（リンパ腫Ｒａｍｏｓ細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｍｉｎｏ細胞、およびＨＨ細胞）は、Ａｄ３−ＧＦＰが形質導入されにくかったが、ＣＤ４６ターゲティングＡｄ５／３５−ＧＦＰベクターにより形質導入することができた（これらの細胞ではＣＤ４６も発現しているため３９）。他方では、ＤＳＧ２陽性Ｋ５６２細胞にはＡｄ３−ＧＦＰを効率的に形質導入することができた。ＢＪＡＢ細胞の約７０％がＤＳＧ２陽性であり、対応して、ＧＦＰ陽性細胞の百分率は約５０％でプラトーに達した。Ａｄ３の感染におけるＤＳＧ２の決定的な役割を決定的に証明するために、レンチウイルスベクター遺伝子移入により、Ａｄ３−ＧＦＰが形質導入されにくい組織球性リンパ腫細胞株Ｕ９３７においてＤＳＧ２を異所発現させた（図４ｂ）。Ｕ９３７−ＤＳＧ２細胞におけるＤＳＧ２の異所発現により、効率的なＡｄ３の付着および形質導入が付与されたが、一方これらの細胞におけるＡｄ３５の付着およびＡｄ５／３５−ＧＦＰの形質導入は影響を受けなかった（図４ｃおよび４ｄ）。
【０１５３】
ヒト細胞におけるＤＳＧ２の局在：予測通り、正常な上皮組織（包皮および結腸）および上皮がん（乳がんおよび卵巣がん）の細胞膜においてＤＳＧ２が見いだされた（図５ａ）。極性結腸がんＴ８４およびＣａＣｏ−２細胞の共焦点免疫蛍光顕微鏡検査により、ＤＳＧ２と細胞間結合タンパク質であるクローディン７の共局在が実証された（図５ｂ）。積み重なったＸＺ画像切片において（図５ｂ）（または細胞層の異なる深さで取得したＸＹ切片（データは示していない）、ＤＳＧ２は細胞間結合の先端に現れる。ＤＳＧ２は、上皮細胞において接着結合タンパク質であるＥ−カドヘリンとも共局在した（）。Ｃｙ３で標識したＡｄ３を極性細胞に加えた１５分後、ウイルス粒子は結合に局在するＤＳＧ２に伴って検出可能であった（図５ｃ）。Ｃｙ５−ＰｔＤｄ、ＤＳＧ２、およびＥ−カドヘリンの三重の標識によって示されている通り、ＰｔＤｄと一緒に１５分インキュベートした正常な小気道上皮細胞で同様の結果が得られた（図５ｄ、上のパネル）。ＰｔＤｄシグナルは細胞膜上（図５ｄ、下のパネル、薄い矢印）および細胞質内（太い矢印）にあり、内部移行した粒子を反映する可能性が最も高い。
【０１５４】
分極上皮細胞株と対照的に、ＨｅＬａ細胞などの非極性細胞では、細胞間結合（すなわち、膜に局在するクローディン７およびＥ−カドヘリンシグナル）は存在しなかった。ＤＳＧ２およびＡｄ３が細胞表面に分散して見いだされた（図５ｅ）。
【０１５５】
ＨｅＬａ細胞のＡｄ３の感染についての本発明者らの試験（図２および３）は、ＤＳＧ２が非極性細胞においても受容体として作用することを示している。この場合、ヒト血小板および顆粒球においてＤＳＧ２およびＡｄ３の結合／形質導入が検出されたことに注目すべきである（データは示していない）。これらの発見はＡｄ３の病原性および遺伝子療法のためのＡｄ３ベクターの血管内適用と関連するが、本発明者らは、この試験では、分極上皮細胞におけるＡｄ３−ＤＳＧ２相互作用の影響を分析することに焦点を合わせた。
【０１５６】
Ａｄ３とＤＳＧ２の相互作用によりＥＭＴが誘発される。最近、本発明者らは、ＡｄＢ−２／３と上皮の卵巣がん細胞の相互作用により、ＥＭＴが誘発されることを見いだした。ＥＭＴは、間葉系のマーカーの発現の増加、細胞外マトリックス化合物の発現の増加、上皮のマーカーの発現の減少、転写因子の位置の変更、およびキナーゼの活性化を特徴とする７。本発明では、Ａｄ３とＤＳＧ２の相互作用によりＥＭＴ様事象が誘発されることを証明することを試みた。ウイルス遺伝子の発現による細胞形態に対する潜在的な副作用を回避するために、試験では紫外線（ＵＶ）により不活化したＡｄ粒子および組換えＡｄ３のＰｔＤｄを利用した。全体的に、どちらの種類の粒子を用いた結果も同様であった。上皮がん細胞をＰｔＤｄ（図６）またはＵＶにより不活化したＡｄ３（示されていない）と一緒にインキュベートすることにより、膜／結合に局在するクローディン７（図６ａ）またはＥ−カドヘリンシグナル（図６ｂ）の減少に反映される通り、結合のリモデリングが引き起こされた。さらに、ＰｔＤｄで処置した後、間葉系のマーカーであるビメンチンおよびリポカリン２のより強力な免疫蛍光法シグナルが見いだされた（図６ｃおよびｄ）。ＰｔＤｄとＤＳＧ２の相互作用によって誘発される細胞内シグナル伝達経路を同定するために、ｍＲＮＡ発現プロファイルを試験した。極性ＢＴ４７４細胞を、ＰＢＳ、ＢｓＤｄ、またはＰｔＤｄと一緒に１２時間インキュベートした後、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトＳＴ遺伝子アレイを用いてｍＲＮＡを分析した。ＰｔＤｄで処置することにより、ＰＢＳで処置した細胞と比較して４３０の遺伝子が＞１．５倍に上方制御され、３５２の遺伝子が＞１．５分の１に下方制御されることが見いだされた（図６ｅ）。遺伝子の変更の一覧を、Ｐａｔｈｗａｙ−Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア４０によってさらに加工した。このコンピュータによる計算により、ＰｔＤｄが、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ  ａｋａ  ＥＲＫ）、Ｗｎｔ、接着結合、限局性の接着、およびアクチン細胞骨格シグナル伝達経路の調節を含めたＥＭＴに関与するいくつものシグナル伝達経路の顕著な活性化を媒介したことが示唆された。
【０１５７】
リン酸化特異的抗体を使用したウエスタンブロット分析により、ＰｔＤｄは、ＰＩ３ＫおよびＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２、すなわち、ＥＭＴに関与する重要なキナーゼの活性化を誘発するが、ＢｓＤｄはそれを誘発しないことが示された（図６ｆ）。これらの経路の活性化は、ＤＳＧ２特異的ｍＡｂ（６Ｄ８、およびそれよりも劣った程度で、１０Ｄ２、および１３Ｂ１１）によっても誘発されたが、ＣＤ４６を対象とするｍＡｂでは誘発されなかった。ＤＳＧ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２およびＰＩ３Ｋのリン酸化が減少したが、対照ｓｉＲＮＡで処置した細胞ではそれが減少しなかったので、経路のＰｔＤｄによる活性化はＤＳＧ２によって媒介される。最後に、細胞を、ＥＲＫ１／２阻害剤であるＵＯ１２６（上のパネル）またはＰＩ３Ｋ阻害剤であるＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ（下のパネル）を用いて前処置した場合には、ＰｔＤｄに誘発されるキナーゼのリン酸化は存在しなかった。総合すると、本発明者らのデータにより、上皮細胞においてＡｄ３またはＡｄ３ＰｔＤｄがＤＳＧ２と結合することによりＥＭＴが誘発されることが示唆されている。
【０１５８】
Ａｄ３およびＰｔＤｄにより、細胞間結合内に閉じ込められている受容体への接近が増大する。Ａｄ３ビリオンに誘発されるＥＭＴまたはＡｄ３のＰｔＤｄに誘発されるＥＭＴにより、細胞間結合の開口ももたらされるかどうかを試験するために、上皮細胞の単層における関門の性質について試験した。まず、４ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストランの、ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー内で培養した集密的な極性ＢＴ４７４細胞を通る流束を測定した（図７ａ）。ＰｔＤｄインキュベーションにより、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と比較して透過係数が有意に増加するがＢｓＤｄインキュベーションによっては増加しないことが見いだされた。次いで、Ａｄ３に誘発されるＥＭＴまたはＰｔＤｄに誘発されるＥＭＴおよび一過性の結合の開口により、通常は上皮細胞結合が原因で接近できないタンパク質への接近が増大するかどうかを試験した。そのような結合に局在する受容体の例は、Ａｄ３５およびＡｄ５／３５に対する高親和性受容体であるＣＤ４６である８。多数のＣＤ４６分子がＢＴ４７４細胞の結合に局在することが確認された（図７ｂ、左側のパネル）。ＰｔＤｄで前処置することにより、ＢｓＤｄ処置と比較して３Ｈ−Ａｄ３５のＢＴ４７４細胞への付着が有意に増加した（図７ｂ、右側のパネル）。皮下の上皮腫瘍においてｉｎ  ｖｉｖｏで、ＣＤ４６−ターゲティングＡｄベクターの形質導入に対するＰｔＤｄの効果の増強も実証された（図７ｃ）。Ａｄ５／３５−ｂＧａｌを適用する８時間前にＰｔＤｄを静脈内注射することにより、ウイルスの形質導入が増加した。Ａｄを注射した３日後に腫瘍溶解物において測定されたベータガラクトシダーゼ活性は、偽注射したマウス、ＢｓＤｄを同時注射したマウス、およびＰｔＤｄを同時注射したマウスについて、それぞれタンパク質１μｇ当たり２．３（＋／−０．２）×１０５ｒｌｕ、２．７（＋／−０．６）×１０５ｒｌｕ、および３８（＋／−３．５）×１０５ｒｌｕであった。
【０１５９】
乳がん細胞培養物における一連の別の実験では、広く使用されているモノクローナル抗体であるハーセプチン（トラスツズマブ）に対する受容体であるＨｅｒ２／ｎｅｕが、細胞間結合タンパク質であるクローディン７と共染色されることが見いだされた（図７ｄ）。これは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ分子の全てがハーセプチンと接近できるわけではないことを示唆している。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳がん細胞株ＢＴ４７４をＰｔＤｄと一緒にインキュベートすることにより、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞表面への再局在が誘発された（図７ｅ）。この知見を強化するために、Ａｄ３またはＡｄ３ＰｔＤｄにより、ハーセプチンによるＢＴ４７４細胞死が改善されるかどうかを試験した。以前の試験と一致して４１、ハーセプチンにより、ＢＴ４７４細胞のおよそ２５％の死が引き起こされた（図７ｆ）。ＢＴ４７４細胞を、ＵＶにより不活化したＡｄ３粒子またはＰｔＤｄと一緒にプレインキュベートすることにより、ハーセプチン細胞傷害性が２倍超増加した。ＵＶにより不活化したＡｄ５粒子またはＢｓＤｄと一緒にインキュベートすることはハーセプチンによる死滅に影響を及ぼさなかった。さらに、ハーセプチンおよびＰｔＤｄ／ハーセプチンは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陰性乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対して細胞傷害性効果を有さなかった（図８ａ）。ＢＴ４７４細胞のハーセプチンによる死滅に対するＰｔＤｄおよびＡｄ３の効果の増強は、ＢＴ４７４細胞においてＤＳＧ２  ｓｉＲＮＡによりＤＳＧ２が下方制御されることによってこの効果が消失したので、ＤＳＧ２によって媒介された（図７ｇ）。ＥＭＴに関与する重要な経路を阻害することが、ハーセプチン細胞傷害性に対するＰｔＤｄの効果の増強に影響を及ぼすかどうかも試験した。これらの試験により、ＷｏｒｔｍａｎｎｉｎによってＰＩ３Ｋを阻害すること、ならびにＵＯ１２６によってＭＡＰＫ／ＥＲＫを阻害することにより、ハーセプチン療法のＰｔＤｄによる増強が打ち消されることが示された（図７ｇ）。重要なことに、ハーセプチン処置の前にＢＴ４７４−Ｍ１−腫瘍を担持するマウスにＰｔＤｄ（２ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射することにより、ハーセプチン注射を単独で用いた場合には実現することができなかった転帰である腫瘍の排除がもたらされた（図７ｈ）。ＰｔＤｄで前処置すると、ＥＧＦＲ特異的ｍＡｂであるアービタックス（セツキシマブ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いたＥＧＦＲ陽性結腸がんＬｏＶｏ細胞の死滅が増加するので、この抗体の治療効果を発展させることも可能である（図８ｂ）。
【０１６０】
考察
この試験では、２つの主要な発見：ｉ）ＤＳＧ２は、一般的な病原体であり、重要な生物医学的ツールである一連のヒトアデノウイルスの感染のために重大な受容体であること、ｉｉ）ＡｄとＤＳＧ２の相互作用により細胞間結合が開口し、したがって、その中に閉じ込められている受容体への接近が増大することについて説明する。
【０１６１】
ＤＳＧ２は、Ａｄの付着受容体である。完全なＡｄ３粒子またはＰｔＤｄを受容体プローブとして使用することは、Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、およびＡｄ１４に対する付着受容体としてＤＳＧ２を同定することにおいて役に立った。Ａｄ３線維ノブドメインをベイトとして用いた以前の試みでは、意味のある受容体候補はもたらされなかった３２。図２に示されている本発明者らの競合試験および表面プラズモン共鳴試験により、Ａｄ３内のＤＳＧ２相互作用ドメイン（複数可）は線維により、ウイルス粒子に存在する空間的配置でのみ形成されることが示されている。これにより、これまで、線維ノブと細胞受容体、すなわち、ＣＡＲまたはＣＤ４６の高親和性相互作用にのみ関連すると考えられていたＡｄの付着機構に関する本発明者らの理解が明確に広がる。
【０１６２】
ウイルス伝播におけるＡｄ３とＤＳＧ２の相互作用およびＰｔＤｄとＤＳＧ２の相互作用の役割。Ａｄ５の複製時、線維が過剰に産生されることにより、ＣＡＲ二量体形成（結合を維持するために重要である）が干渉されることによってか、または細胞間結合の再編成をもたらす細胞内シグナル伝達が誘発されることによって、上皮の結合が破壊される４２〜４３。どちらの機構も、Ａｄ３ビリオン／ＤＳＧ２に媒介される細胞間結合の開口およびＡｄ３のＰｔＤｄ／ＤＳＧ２に媒介される細胞間結合の開口にも関与し得る。本発明者らは、上皮細胞においてＡｄ３とＤＳＧ２の結合およびＰｔＤｄとＤＳＧ２の結合によって誘発される細胞内シグナル伝達についての実験的な裏付けを有する。免疫蛍光法、ＰＩ３Ｋ／ＭＡＰＫリン酸化、ｍＲＮＡ発現アレイ、および代謝経路の阻害のデータにより、上皮細胞においてＡｄ３およびＰｔＤｄによりＥＭＴが誘発され、それにより一過性の細胞間結合の開口がもたらされることが示唆されている。Ａｄ３粒子または組換えＰｔＤｄとＤＳＧ２の相互作用によって媒介される細胞間結合の開口は、細胞浸透性および細胞間結合内に閉じ込められている受容体（ＣＤ４６およびＨｅｒ２／ｎｅｕ）への接近が増大することによってさらに裏付けられる。これに沿って、最近の試験により、ＤＳＧ２の細胞外ドメインに対する抗体により、ＣａＣｏ−２細胞の単層における細胞間結合の開口がもたらされることが示された４４。
【０１６３】
Ａｄ３ビリオンに誘発されるＥＭＴおよびＰｔＤｄに誘発されるＥＭＴ、すなわち、細胞間結合の解離は、重要な生物学的役割を有すると思われる。特に、ウイルス感染の間にＰｔＤｄが大量に過剰産生されること、およびＰｔＤｄとＤＳＧ２の相互作用により、上皮細胞における側方へのウイルスの拡散、および潜在的に、Ａｄの上皮下の細胞層および血流への浸透が容易になることが推測される。
【０１６４】
Ａｄ病原性に対する意味。ＤＳＧ２が、さらなるウイルスの拡散を容易にする付着受容体であるという本発明者らの発見により、気道上皮のＡｄ３の感染機構が明らかになる。さらに、Ａｄ３が血小板および顆粒球上でＤＳＧ２と結合するという知見は、このウイルスが一度血流に侵入すれば全身に拡散することについて潜在的な意味を有する。マウスＤＳＧ２はヒトＤＳＧ２と７６％の相同性を共有するが４５、本発明者らのデータでは、マウス細胞はＡｄ３−ＧＦＰに感染しにくいことが示されており、これは、マウスＤＳＧ２がＡｄ３受容体として機能することができないことを示している。ＡｄＢ−２／３血清型の病原性を試験するために、ＤＳＧ２をヒトと同様のパターンおよびレベルで発現させる適切な内在性の調節エレメントの制御下でヒトＤＳＧ２を発現するトランスジェニックマウスが重要なツールになるであろう。
【０１６５】
がん療法に対する意味。ＤＳＧ２は、上皮腫瘍のマーカーとして提唱された４６。がん細胞の上皮の表現型および物理的関門を形成する能力は、薬物、抗体、腫瘍退縮ウイルス、または免疫細胞の腫瘍部位への接近を制限する機構を示し、したがって、そのような治療モダリティの有効性を減らす４７。本発明では、３つの例（Ａｄ５／３５ベクター、ハーセプチン、およびアービタックス）において、ＤＳＧ２と相互作用するＡｄ３構成成分を使用することによって、癌療法におけるこの重要な問題に対処することができ得ることを実証した。
【０１６６】
結論として、本発明者らは、一連の一般的なヒトＡｄに対する高親和性受容体の発見について報告する。本発明者らの試験は、上皮組織に接近するために、Ａｄが細胞のプロセスをどのように誘導するかを理解することに寄与する。本発明者らの発見は、がん療法を改善するために意味がある。
【０１６７】
方法
タンパク質および抗体。Ａｄ３線維、Ａｄ５線維、およびＡｄ３５線維のノブドメインを、他で記載されている通りＥ．ｃｏｌｉにおいて産生させた４８。組換えＡｄ３ペントン１２面体（ＰｔＤｄ）および基部の１２面体（ＢｓＤｄ）を、以前に記載されている通り昆虫細胞において産生させ、精製した３３。精製された組換えＡｄ３およびＡｄ３５Ｋ＋＋ノブに対するポリクローナルウサギ抗体は、ＰｉｃｋＣｅｌｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｂ．Ｖ．（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって作製された。ＤＳＧ２特異的モノクローナル抗体である２０Ｇ１、７Ｈ９、１３Ｂ１１、１０Ｄ２および８Ｅ５４９を、ハイブリドーマ培養物の上清から精製した。
【０１６８】
細胞株。ＳＩに記載の通り細胞を培養した。ＢＴ４７４は、上皮細胞の特徴を有するＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳がん細胞株である。細胞の極性化を実現するために、１．４×１０５個のＢＴ４７４細胞、Ｔ８４細胞およびＣａＣｏ−２細胞を、コラーゲンでコーティングした６．５ｍｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌインサート（孔サイズ０．４μｍ）（Ｃｏｓｔａｒ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｒｓ）中で、経上皮抵抗性が安定するまで１０日間にわたって培養した。
【０１６９】
アデノウイルス。野生型のＡｄ３（ＧＢ株）、Ａｄ７ｐ（Ｇｏｍｅｎ染色）、Ａｄ１１ｐ（Ｓｌｏｂｉｔｓｋｉ株）、Ａｄ１４（ＤｅＷｉｔ株）、およびＡｄ３５（Ｈｏｌｄｅｎ株）を、ＡＴＣＣから得た。Ａｄ１４ａはＡｄ１４の新規のゲノム変異体である５。Ａｄの繁殖、メチル−３Ｈチミジンによる標識、精製および力価決定を他で記載されている通り実施した２。Ａｄ５／３５−ＧＦＰおよびＡｄ５−ＧＦＰは、Ａｄ３５線維およびＡｄ５線維とＣＭＶ−ＧＦＰ発現カセットとを含有するＡｄ５ベクターである５０。Ａｄ３−ＧＦＰおよびＡｄ３５−ＧＦＰは、Ｅ３領域にＣＭＶ−ＧＦＰ発現カセットを挿入した、野生型Ａｄ３ベースのベクターおよび野生型Ａｄ３５ベースのベクターである。Ａｄ３−ＧＦＰの構築については、ＳＩに記載されている。Ａｄ３５−ＧＦＰについては以前に記載されている３４。形質導入試験のために、細胞を、示されているＭＯＩで１時間にわたってＡｄベクターに曝露させ、洗浄し、１８時間後にフローサイトメトリーによってＧＦＰの発現を測定した。
【０１７０】
膜タンパク質の調製。ＨｅＬａ細胞膜タンパク質を以前に記載されている通り調製した５１。簡単に述べると、ＨｅＬａ細胞ペレットを氷冷の均質化緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＫＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５％のグリセロール、０．２５Ｍのスクロース、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＰＭＳＦ）に再懸濁させた。溶解物を、３ｍｌのシリンジおよび２１Ｇのニードルを用いて破壊した後、４００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を２倍体積のＰＢＳで希釈し、Ｂｅｃｋｍａｎ超遠心機において３５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。膜タンパク質ペレットを可溶化緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＫＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５％のグリセロール、０．２５Ｍのスクロース、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＰＭＳＦ、０．５％のＢｒｉｊ９６Ｖ（Ｆｌｕｋａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に再懸濁させた。デスモソームタンパク質は、極めて不溶性であるのでＢｒｉｊ９６Ｖを界面活性剤として使用することが役立った。
【０１７１】
Ａｄ３およびＰｔＤｄを用いたウエスタンブロット。質量分析についての技術的な詳細は、他で記載されている５１。ＤＳＧ２を可溶性の粗製の膜タンパク質調製物から免疫沈降させるために、ＤＳＧ２特異的ｍＡｂ  ６Ｄ８、およびＰｉｅｒｃｅ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用した。ＨｅＬａ細胞由来の粗製の膜タンパク質を、０．５％の界面活性剤Ｂｒｉｊ９６Ｖを用いて可溶化し、対照樹脂と一緒に４℃で３時間プレインキュベートして、非特異的な結合を減少させ、次いで、プロテインＡ／Ｇアガロースと架橋結合したＤＳＧ２抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。結合したタンパク質を製造者の説明書に従って溶出させた。
【０１７２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。ＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器で取得を行った。全ての実験において、２ｍＭのＣａＣｌ２を補充したＨＢＳ−Ｎ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を毎分５μｌの流速でランニング緩衝液として使用した。ＤＳＧ２（Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．２中に０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、ＥＤＣ−ＮＨＳで活性化したフローセルに１０分間注入してＣＭ４センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ）への固定化を行った。対照フローセルを、ＥＤＣ−ＮＨＳによって活性化し、エタノールアミンによって不活化した。異なる濃度のＰｔＤｄ、ＢｓＤｄ、Ａｄ３線維ノブを５分間注入し、その後３分を解離時間とし、シグナルをエタノールアミンで非活性化したＥＤＣ−ＮＨＳフローセルのバックラウンドから自動的に差し引いた。アデノウイルス結合実験のために、野生型Ａｄ２、Ａｄ３およびＡｄ５を１ｍｌ当たり５．１０９ｖｐで注入し、同様のプロトコールを使用した。
【０１７３】
ｓｉＲＮＡ試験。ＤＳＧ２特異的ｓｉＲＮＡのセットはＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって合成された。標的配列は、ＣＡＡＵＡＵＡＣＣＵＧＵＡＧＵＡＧＡＡ（配列番号２９）、ＧＡＧＡＧＧＡＵＣＵＧＵＣＣＡＡＧＡＡ（配列番号３０）、ＣＣＵＵＡＧＡＧＣＵＡＣＧＣＡＵＵＡＡ（配列番号３１）およびＣＣＡＧＵＧＵＵＣＵＡＣＣＵＡＡＡＵＡ（配列番号３２）であった。対照ｓｉＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡから購入した。ＨｙｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｓｉＲＮＡトランスフェクションを実施した。
【０１７４】
ＤＳＧ２を発現しているＵ９３７細胞。Ｃａｐｉｔａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）からのＤＳＧ２  ｃＤＮＡ（受託番号ＢＣ０９９６５７）をＥＦ１αプロモーターの対照下でレンチウイルスベクターｐＲＲＬ−ＳＩＮ５２にクローニングした。以前に記載されている通りＶＳＶＧ−偽型レンチウイルスベクターを作製し、力価を決定した５３。
【０１７５】
動物試験：動物を必要とする全ての実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎにより定められた施設のガイドラインに従って行った。マウスを特定の病原体を含まない施設内に収容した。マトリゲル中のがん細胞（１：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）をＣＢ１７  ＳＣＩＤ−ベージュマウスの乳房の脂肪パッドに注射することによって乳がん異種移植を確立した。ハーセプチンを１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内に注射した。ＰｔＤｄを２ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に与えた。腫瘍体積を以前に記載されている通り測定した５４。
【０１７６】
実施例１の参考文献：
【０１７７】
【数１】
2013538040.tif 000009
【０１７８】
【数２】
2013538040.tif 000010
【０１７９】
【数３】
2013538040.tif 000011
【０１８０】
【数４】
2013538040.tif 000012
【０１８１】
【数５】
2013538040.tif 000013
【０１８２】
（実施例２）
ウイルスがデスモグレイン２と効率的に結合するためおよびその後の上皮の結合の開口のためには、アデノウイルス血清型３線維ノブドメインの多量体形成が必要である。
【０１８３】
要約
実施例１では、ヒト集団において広範に分布している血清型であるＡｄ３を含めたＢ種アデノウイルス（Ａｄ）の一群に対する主要な受容体として、デスモグレイン２（ＤＳＧ２）を同定した。本実施例では、Ａｄ３とＤＳＧ２の相互作用の構造的な詳細を説明することを試みた。ＣＡＲと相互作用するＡｄ血清型およびＣＤ４６と相互作用するＡｄ血清型について、細胞への付着は、過剰な組換え線維ノブタンパク質によって完全に遮断することができ、一方、可溶性のＡｄ３線維ノブでは、Ａｄ３の感染は非効率的にしか遮断されない。Ａｄ３内のＤＳＧ２相互作用ドメイン（複数可）はウイルス粒子に存在する空間的配置になければならないいくつかの線維ノブドメインによって形成されることが見いだされた。この発見に基づいて、Ａｄ３線維ノブを含有する小さな組換え自己二量体形成性タンパク質を生成した（Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ）。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎはＤＳＧ２と高親和性で結合し、Ａｄ３の感染を遮断した。共焦点免疫蛍光法および透過型電子顕微鏡分析により、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎは、ＤＳＧ２と結合することにより上皮細胞における一過性の細胞間結合の開口を誘発することが実証された。上皮細胞をＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎで前処置することにより、上皮の結合に局在している、またはそれにより遮蔽されている受容体、例えば、ＣＡＲまたはＨｅｒ２／ｎｅｕへの接近が増大した。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎで処置することにより、密着結合からＣＡＲが解放され、したがって、血清型Ａｄ５ベースのベクターによる上皮細胞への形質導入が増加する。さらに、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳がん細胞をＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎで前処置することにより、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ターゲティングモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン）によるがん細胞の死滅が増加した。この試験により、Ａｄが、それらの受容体に対する高い結合活性および上皮組織への感染をどのように実現するかに関する本発明者らの理解が広がる。小さな組換えタンパク質Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎは、上皮がんの療法および正常な上皮組織への遺伝子／薬物送達に対する実用的な意味を有する。
【０１８４】
諸言
突出線維は、主要な付着受容体との親和性の高い結合を媒介するＡｄカプシド内の部分である。Ａｄカプシドはそれぞれ、ペントンベースに連結した１２個の線維を有する。線維はそれぞれ、ペントンベースの内部に繋ぎ止められている尾部ドメインと、β−シート（異なる血清型において６から２３までにわたる反復の数を有する）を形成する最大１４アミノ酸の反復からなるシャフトドメインと、Ｃ末端のホモ三量体ノブドメインとからなる。ＣＡＲと相互作用するＡｄおよびＣＤ４６と相互作用するＡｄに関して、ノブドメインは、受容体と高親和性で結合し、可溶性の線維ノブは感染を完全に遮断する。
【０１８５】
この試験では、Ａｄ３とＤＳＧ２の相互作用の構造的な詳細を説明することを試みた。本発明者らは、ＤＳＧ２と高親和性で結合するためにはＡｄ３線維ノブの多量体（三量体）が必要であることを報告する。これは、ＣＡＲと相互作用するＡｄ血清型およびＣＤ４６と相互作用するＡｄ血清型の、感染を実現するための戦略とは明確に異なる。このＡｄ３−ＤＳＧ２相互作用の特異的な方式は、それにより上皮の結合の開口が可能になるので、Ａｄ３にとって機能的に重大である。
【０１８６】
材料および方法
タンパク質および抗体。組換えヒトＤＳＧ２タンパク質はＬｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。組換えＡｄ３線維は、他で記載されている通り、Ｎ末端の６−Ｈｉｓタグを使用し、ｐＱＥ３０発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて産生させ、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースクロマトグラフィーによって精製した（３４）。組換えＡｄ３ペントン１２面体（ＰｔＤｄ）は、以前に記載されている通り昆虫細胞において産生させ、精製した（８）。
【０１８７】
免疫蛍光法試験のために以下の抗体を使用した：ポリクローナルヤギ抗ＤＳＧ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、マウスｍＡｂ抗ＤＳＧ２（クローン６Ｄ８）（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｎｔｏｎ、ＭＡ）、ウサギ抗クローディン７（ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ＦＩＴＣと結合体化したヤギ抗アデノウイルス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、モノクローナル抗６ｘＨｉｓ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＭＣＡ１３９６）、ウサギ抗ＺＯ−１抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）。精製された組換えＡｄ３ノブに対するポリクローナルウサギ抗体は、ＰｉｃｋＣｅｌｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｂ．Ｖ．（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって作製された。モノクローナル抗ＤＳＧ２抗体である２０Ｇ１、７Ｈ９、１３Ｂ１１、１０Ｄ２および８Ｅ５（１２）は、ハイブリドーマ培養物の上清から精製した。
【０１８８】
組換えＡｄ３線維ノブ。組換えＡｄ３線維ノブであるＳ／Ｋｎ、Ｓ２／Ｋｎ、Ｓ３／Ｋｎ、Ｓ４／Ｋｎ、Ｓ５／Ｋｎ、およびＳ６／Ｋｎを、Ａｄ３ゲノムＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲによって生成した。次いで、ＰＣＲ産物を、ＢｃｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片またはＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＱＥ３０にクローニングした。以下のプライマーを使用した：
【０１８９】
【化７】
2013538040.tif 000014
【０１９０】
Ａｄ３線維ノブを含有するＫ−コイルまたはＥ−コイルを生成するために、以下のオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ＢａｍＨＩ断片としてｐＱＥ３０にクローニングした。
【０１９１】
【化８】
2013538040.tif 000015
【０１９２】
Ａｄ３−Ｅ／Ｓ２／ＫｎおよびＡｄ３−Ｋ／Ｓ２／Ｋｎを生成するために、以下のプライマーを使用した：
【０１９３】
【化９】
2013538040.tif 000016
【０１９４】
次いで、ＰＣＲ産物を、ｐＱＥ３０−ＫｃｏｉｌおよびｐＱＥ３０−ＥｃｏｉｌのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。
Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／ＫｎおよびＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎを生成するために、以下のプライマーを使用した：
【０１９５】
【化１０】
2013538040.tif 000017
【０１９６】
次いで、ＰＣＲ産物を、ｐＱＥ３０−ＫｃｏｉｌおよびｐＱＥ３０−ＥｃｏｉｌのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。
【０１９７】
細胞株。２９３（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）、ＨｅＬａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＴＣ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン（Ｇｌｕ）、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ＢＴ４７４−Ｍ１細胞（１６）を、１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ／ＳｔｒｅｐおよびＬ−グルタミンを伴うＤＭＥＭ／Ｆ：１２中で培養した。結腸がんＴ８４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４８））を、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地とＤＭＥＭの１：１混合物、１０％のＦＢＳ、ＧｌｕおよびＰ／Ｓ中で培養した。細胞の極性化を実現するために、Ｔ８４細胞１．４×１０５個を６．５ｍｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌインサート（孔サイズ０．４μｍ）（Ｃｏｓｔａｒ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｒｓ）内で、経上皮抵抗性が安定するまで２１日以上培養した。
【０１９８】
アデノウイルス。Ａｄの繁殖、メチル−３Ｈチミジンによる標識、精製および力価決定を他で記載されている通り実施した（３１）。Ａｄ５／３５−ＧＦＰおよびＡｄ５−ＧＦＰは、Ａｄ３５線維およびＡｄ５線維とＣＭＶ−ＧＦＰ発現カセットとを含有するＡｄ５ベクターである（２４）。Ａｄ３−ＧＦＰは、Ｅ３領域にＣＭＶ−ＧＦＰ発現カセットを挿入した野生型Ａｄ３ベースのベクターである（３３）。Ａｄ５／３Ｌ−ＧＦＰおよびＡｄ５／３Ｓ−ＧＦＰは、Ｅ１／Ｅ３が欠失したＡｄ５ベースのベクターであり、同じＣＭＶ−ＧＦＰ発現カセットがＥ３領域に挿入されている。キメラＡｄベクターの構築は、以前に記載されているプロトコールに従った（２３）。キメラ線維遺伝子を構築するために使用したプライマー配列は以下の通りである：Ａｄ５／３Ｌ−ＧＦＰ用
【０１９９】
【化１１】
2013538040.tif 000018
【０２００】
ＳｐｅＩ制限部位またはＸｈｏＩ制限部位を、それぞれＡｄ５／３Ｌ−ＧＦＰまたはＡｄ５／３Ｓ−ＧＦＰについての線維終止コドンの後ろに導入した。全長のＥ１／Ｅ３を欠失したベクターゲノムを生成するために、対応する、キメラ線維遺伝子およびＧＦＰ発現カセットを含有するシャトルプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＪ１５８３において相同組換えによってｐＡｄＨＭ４に挿入した。生じたプラスミドｐＡｄ５／３Ｌ−ＧＦＰおよびｐＡｄ５／３Ｓ−ＧＦＰを制限分析および配列決定によって分析した。対応するウイルスを作製するために、以前に記載されている通り、ｐＡｄ５／３Ｌ−ＧＦＰおよびｐＡｄ５／３Ｓ−ＧＦＰをＰａｃＩで消化してウイルスのゲノムを放出させ、２９３細胞にトランスフェクトした。組換えウイルスを２９３細胞において繁殖させ、標準の方法によって精製した。
【０２０１】
２６０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ２６０）を測定することによって分光光度法でＡｄ粒子（ウイルス粒子、ＶＰ）濃度を決定し、他で記載されている通り、２９３細胞を使用してプラーク力価決定（プラーク形成単位、ｐｆｕ）を実施した（２４）。全てのウイルス調製物についてＶＰとｐｆｕの比は２０：１であった。
【０２０２】
付着および形質導入アッセイ。Ｖｅｒｓｅｎｅと一緒にインキュベートすることによって接着性細胞を培養皿から引き離し、ＰＢＳで洗浄した。チューブ当たり合計１．８×１０５個の細胞を、３Ｈで標識したＡｄを細胞当たり８，０００ＶＰの感染多重度（ＭＯＩ）で含有する氷冷の接着緩衝液１００μｌに再懸濁させた。４℃で１時間インキュベートした後、細胞をペレットにし、氷冷の洗浄緩衝液（ＰＢＳ、１％ＦＢＳ）０．５ｍｌで２回洗浄した。最後の洗浄後、上清を除去し、シンチレーション計数器を用いて細胞に伴う放射活性を決定した。細胞当たりの結合したウイルス粒子（ＶＰ）の数を、ビリオンに特異的な放射活性および細胞の数を用いることによって算出した。競合試験のために、競合剤（ＰｔＤｄ、線維ノブ、抗体）４．５μｇを接着緩衝液中、４℃で６０分にわたり付着させ、細胞をＰＢＳで２回洗浄することによって結合していない競合剤を除去した後、細胞を、３Ｈで標識したＡｄを含有する付着緩衝液に再懸濁させた。形質導入試験のために、細胞を、示されているＭＯＩで１時間にわたってＡｄベクターに曝露させ、洗浄し、１８時間後に、細胞２０，０００個におけるＧＦＰの発現をフローサイトメトリーによって測定した。
【０２０３】
Ａｄ５感染試験。ＨｅＬａの形質導入試験の全てにおいて、形質導入の線形範囲内に入るように以前に最適化されている条件（ＭＯＩ、ウイルス濃度、曝露時間）を用いた（３３）。
【０２０４】
ウエスタンブロット：Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮプレキャストゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、４〜１５％勾配のポリアクリルアミドを用いて使用した。図２Ｂに示されている試験のために、合計０．５μｇのタンパク質を２×ローディング緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２００ｍＭのＤＴＴ、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、０．２％のブロモフェノールブルー）と混合した。試料を、５分間煮沸（Ｂ）するか、または煮沸せずに（ＵＢ）ローディングするかした。以下のランニング緩衝液を使用した：２５ｍＭのトリス、０．１９２Ｍのグリシン、０．１％のＳＤＳ、ｐＨ８．３。以前に記載されている通り、電気泳動した後、タンパク質をニトロセルロースに転写し、抗ＤＳＧ２抗体または抗Ａｄ３ノブ抗体と一緒にインキュベートした（３３）。
【０２０５】
ネイティブなポリアクリルアミドゲル電気泳動：図２Ｆに示されている試験のために、合計０．４μｇのタンパク質を２×試料緩衝液（６２．５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４０％のグリセロール、０．０１％のブロモフェノールブルー）中に混合し、煮沸せず、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．３、０．１９２Ｍのグリシン中に流した。
【０２０６】
浸透性アッセイ。合計５×１０５個のＴ８４細胞を、１２ｍｍのｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート（ＰＥＴ膜、孔サイズ０．４μｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に播種し、経上皮抵抗性が安定するまで＞２０日間培養した。培地を２〜３日ごとに交換した。細胞を接着培地（ＤＭＥＭ、１％ＦＢＳ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）中のＤＳＧ２リガンド（２０μｇ／ｍｌ）に室温で１５分間曝露させた。次いで、ＤＭＥＭ／Ｋ１２培地で希釈した１ｍＣｉの［１４Ｃ］ポリエチレングリコール−４０００（ＰＥＧ−４０００）；（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｃｏｖｉｎａ  ＣＡ）を内部チャンバーに加えた。１５分の時点および３０分の時点で内部チャンバーおよび外側のチャンバーから培地の一定分量を採取し、シンチレーション計数器によって測定した。浸透性を他で記載されている通り算出した（３６）。
【０２０７】
トラスツズマブ細胞毒性アッセイ。ウェル当たり５×１０４個のＢＴ４７４−Ｍ１細胞を、９６ウェルプレートに３連で播種し、集密になるまで成長させた。Ａｄ３線維ノブまたはモノクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）を内部チャンバーに加えた。１時間後、トラスツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）（１５μｇ／ｍｌ）を加え、２時間後にＷＳＴ−１アッセイ（Ｒｏｃｈｅ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）によって細胞の生存率を測定した。３回の独立した試験を実施した。
【０２０８】
免疫蛍光分析。８つのチャンバーガラススライド（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）において細胞を培養し、氷冷のＰＢＳで２回洗浄し、次いで、メタノール／アセトン（１：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用いて４℃で１５分間、または４％のパラホルムアルデヒドを用いて４℃で３０分間、固定した。固定した後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５００μｌのＰＢＳ／２％の粉乳を用いて室温で２０分間遮断した。抗体染色を、１００μｌのＰＢＳ中、３７℃で９０分間または４℃で一晩実施した。必要であれば、ＰＢＳを用いて室温で４５分にわたって３回洗浄した後に、適切な宿主を対象とする二次抗体を適用した。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＤＡＰＩを伴うＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を用いてガラススライドをマウントした。Ｌｅｉｃａ  ＤＦＣ３００ＦＸデジタルカメラを用いて写真を取得した。Ｚｅｉｓｓ  ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡で、４０×油浸レンズ（ｏｉｌ  ｌｅｎｓ）または１００×油浸レンズおよびＺｅｉｓｓ５１０ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を使用して共焦点像を取得した。
【０２０９】
電子顕微鏡。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー内の極性細胞を、半強度カルノフスキー固定液（２％のパラホルムアルデヒド、２．５％のグルタルアルデヒド、０．２Ｍのカコジル酸緩衝液）を用いて室温で１時間にわたって固定した。内部チャンバー内の固定液は、０．２％のルテニウムレッドを含有した。ルテニウムレッド（塩化ルテニウム（ＩＩＩ）酸化物、アンモニア処理されている）は、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＭＡ）から購入した。１％のＯｓＯ４−リン酸緩衝液を用いた後固定を行った。次いで、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーから膜を切り取り、Ｍｅｄｃａｓｔ（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）中に包埋した。超薄切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。加工した格子をＪＥＯＬ  ＪＥＭ１２００ＥＸＩＩ透過形電子顕微鏡を用いて評価した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＳＩＳ  ＭｏｒａｄａデジタルＣＣＤカメラを用いて画像を獲得し、画像を加工するためにｉＴＥＭソフトウェアを使用した。
【０２１０】
ｓｉＲＮＡ試験。ＤＳＧ２特異的ｓｉＲＮＡのセットは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって合成された。標的配列は、ＣＡＡＵＡＵＡＣＣＵＧＵＡＧＵＡＧＡＡ（配列番号２９）、ＧＡＧＡＧＧＡＵＣＵＧＵＣＣＡＡＧＡＡ（配列番号３０）、ＣＣＵＵＡＧＡＧＣＵＡＣＧＣＡＵＵＡＡ（配列番号３１）およびＣＣＡＧＵＧＵＵＣＵＡＣＣＵＡＡＡＵＡ（配列番号３２）であった。対照ｓｉＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡから購入した。ＨｙｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｓｉＲＮＡトランスフェクションを実施した。合計１×１０５個のＨｅＬａに、１ｕｇのＤＳＧ２  ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした４８時間後、上記の通りｖｅｒｓｅｎｅを用いて細胞を収集し、３Ｈ−Ａｄ３ウイルスまたは３Ｈ−Ａｄ３５ウイルスの付着を分析した。ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした４８時間後、細胞を、Ａｄベクターを５０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで用いて感染させ、１８時間後にＧＦＰの発現を分析した。
【０２１１】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ機器で取得を行った。全ての実験において、２ｍＭのＣａＣｌ２を補充したＨＢＳ−Ｎ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）をランニング緩衝液として、毎分５μｌの流速で使用した。ＤＳＧ２（Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．２中に０．１μｇ／ｍｌに希釈し、ＥＤＣ−ＮＨＳで活性化したフローセルに１０分間注入してＣＭ４センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ）への固定化を行った。対照フローセルを、エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）によって活性化し、エタノールアミンによって不活化した。異なる濃度のＡｄ３線維ノブまたはＰｔＤｄを５分間の会合、その後３分の解離時間で注入し、シグナルをエタノールアミンにより非活性化したＥＤＣ−ＮＨＳフローセルのバックラウンドから自動的に差し引いた。
【０２１２】
ビオチン化したリガンドを用いた実験のために、ＣＭ４センサーチップの２つのフローセルを上記の通り活性化し、次いで、ストレプトアビジン（酢酸緩衝液中０．１μｇ／ｍｌ、ｐＨ４．１）を５分間にわたって注入することによってコーティングした。次いで、ビオチン化したリガンドをこれらの２つのフローセルのうちの一方のランニング緩衝液中に０．１μｇ／ｍｌで５分間にわたって注入し、他方は、実行中のバックグラウンド除去のために使用した。次いで、これらのフローセル上のランニング緩衝液中に異なる濃度の可溶性のＤＳＧ２を注入し、バックラウンドを自動的に差し引いた。
【０２１３】
陰性染色電子顕微鏡法。組換え線維ノブタンパク質を陰性染色ＥＭによって可視化して、それらの組立ての状態を評価した。標準の雲母／炭素調製物を、タンパク質を０．１ｍｇ／ｍｌで用いて使用した。１％（ｗ／ｖ）ケイタングステン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を使用して試料を染色し、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１２電子顕微鏡において１００ｋＶで可視化した。
【０２１４】
統計分析：結果は全て、平均＋／−ＳＤとして表されている。適用可能な場合にはウィルコクソンの符号順位検定を適用した。ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
【０２１５】
結果
Ａｄ３線維を含有するキメラＡｄ５ベクターは受容体としてＤＳＧ２を使用する。本発明者らの予備試験により、Ａｄ３内のＤＳＧ２相互作用ドメイン（複数可）はウイルス粒子に存在する空間的配置にある線維または線維／ペントンのみ、すなわち、Ａｄ３ビリオンまたはＰｔＤｄによって形成されることが示された。ＤＳＧ２との結合におけるＡｄ３ペントン（ＰｔＤｄに存在する）の潜在的な役割を評価するために、Ａｄ３線維を含有するが、他のカプシドタンパク質（ペントンを含む）は全てＡｄ５に由来するＡｄベクター（Ａｄ５／３Ｓ−ＧＦＰ）を生成した。Ａｄ３線維シャフトが、Ａｄ３−ＤＳＧ２相互作用において極めて重要な役割を有する、例えばＤＳＧ２が追加的な結合部位を含有するかどうかを評価するために、Ａｄ３シャフトをＡｄ５シャフトで置換したキメラＡｄ５／３ベクターも生成した（Ａｄ５／３Ｌ−ＧＦＰ）（図９Ａ）。特に、Ａｄ３線維シャフトは６個のシャフト反復モチーフを含有するが、一方Ａｄ５シャフトはそれよりも長く、２２個のシャフトモチーフを含有する。比較のために、Ａｄ５／３ベクター（３３）と同じＧＦＰ発現カセットを含有するＡｄ３ベクター（Ａｄ３−ＧＦＰ）を使用した。Ａｄ５／３Ｓ−ＧＦＰベクターおよびＡｄ５／３Ｌ−ＧＦＰベクターが、感染するためにＤＳＧ２を使用するかどうかを分析した。３Ｈで標識したＡｄベクターのＨｅＬａ細胞への付着は、組換えＤＳＧ２タンパク質により、Ａｄ３−ＧＦＰ、Ａｄ５／３Ｓ−ＧＦＰ、およびＡｄ３／５Ｌ−ＧＦＰに対してと同じ程度で遮断された（図９Ｂ）。予測通り、ＨｅＬａ細胞を感染させた１８時間後にＧＦＰ強度に基づいて測定したところ、この３種のベクター全ての形質導入も組換えＤＳＧ２によって遮断された（図９Ｃ）。Ａｄビリオン内のＤＳＧ２相互作用ドメインに対する競合剤として使用したＰｔＤｄにより、Ａｄ３−ＧＦＰ、Ａｄ５／３Ｓ−ＧＦＰ、およびＡｄ３／５Ｌ−ＧＦＰの形質導入が同様のレベルで遮断された（図９Ｄ）。Ａｄ３ベクターおよびＡｄ５／３ベクターの感染におけるＤＳＧ２の極めて重要な役割を証明するために、ＨｅＬａ細胞にＤＳＧ２  ｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした４８時間後のＤＳＧ２の平均蛍光強度は、ＤＳＧ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞および対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞について、それぞれ２２．１および１９５であり、これは、ＤＳＧ２の発現がＤＳＧ２  ｓｉＲＮＡにより効率的に阻害されることを示している。ＤＳＧ２  ｍＲＮＡをノックダウンすることにより、Ａｄ３−ＧＦＰ、Ａｄ５／３Ｓ−ＧＦＰ、およびＡｄ３／５Ｌ−ＧＦＰの形質導入が有意に減少した（Ｐ＜０．００１）（図９Ｅ）。興味深いことに、ＤＳＧ２をノックダウンすることにより、Ａｄ５／３Ｌ−ＧＦＰの形質導入が、Ａｄ３線維を含有するベクター（Ａｄ３−ＧＦＰおよびＡｄ５／３Ｓ−ＧＦＰ）の形質導入よりも低い程度（Ｐ＜０．０１）で減少した。Ａｄ５／３Ｌ−ＧＦＰは、ＤＳＧ２以外の受容体を使用し得ることが推測される。総合すると、これらの試験では、：ｉ）Ａｄ５／３ベクターが受容体としてＤＳＧ２を使用す���ことを示す。これは、Ａｄ５／３ベクターは患者に使用されているので（１４、３５）臨床試験に対して意味を有する、およびｉｉ）Ａｄ３のＤＳＧ２相互作用ドメインは、線維内に位置する。Ａｄペントン（ＰｔＤｄまたはＡｄ５ビリオンおよびＡｄ３ビリオン内にある）は、ただ単に、Ａｄ３線維ノブとＤＳＧ２の相互作用のための空間的配置を補正するための足場をもたらすだけだと思われる。
【０２１６】
ＤＳＧ２と効率的に結合するには、Ａｄ３線維ノブの架橋が必要である。本発明者らは、次いで、Ａｄ３線維に着目した。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、線維ノブを含有し、Ａｄ３シャフトの反復の数が増加した（１〜６の反復）一連の組換えＡｄ３線維ノブタンパク質を産生させた（図１０Ａ）。ＤＳＧ２または抗Ａｄ３線維ノブ抗体を用いたウエスタンブロット分析により、全ての組換え線維ノブが三量体を形成したことが示された（図１０Ｂ、Ｃ）。以前に観察された通り（３３）、Ａｄ３線維ノブ＋１つのシャフトドメイン（Ｓ／Ｋｎ）はウエスタンブロット分析においてＤＳＧ２と結合せず、これは、Ａｄ３ノブコンフォメーションに対するシャフトモチーフの立体的な影響の可能性を示している。６個のシャフトモチーフを含有するタンパク質（Ｓ６／Ｋｎ）は、凝集体を形成する傾向があり、したがって、さらなる試験では使用しなかった。競合試験において使用した場合、全ての組換え線維ノブタンパク質により、Ａｄ３−ＧＦＰの形質導入がＰｔＤｄよりも有意に低く阻害された（図１０Ｄ、Ｅ）。次いで、Ａｄ３線維ノブの二量体形成により、ＤＳＧ２との結合が増加するかどうかを試験することを試みた。全ての組換え線維ノブはＮ末端のＨｉｓタグ（タンパク質を精製するために使用する）を含有したので、Ａｄ３線維ノブと、Ｈｉｓタグに対する抗体を混合してそれらの架橋を実現した。ネイティブなポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動により抗Ｈｉｓタグ抗体と線維ノブとの間の複合体の形成が実証された（図１０Ｆ）。抗Ｈｉｓ抗体と架橋結合した線維ノブを競合剤として使用した場合、Ａｄ３−ＧＦＰの形質導入の有意な阻害（対照ＩｇＧと混合した線維ノブと比較して）が観察され（図１０Ｇ）、これは、ＤＳＧ２と結合するためにはＡｄ３線維ノブの二量体が必要であることを示唆している。これは、Ａｄ３５線維ノブと抗Ｈｉｓ抗体の架橋は、ＣＤ４６と相互作用するベクターであるＡｄ３５−ＧＦＰによる感染には影響を及ぼさなかったので、Ａｄ３に独特の新しいＡｄ結合戦略であると思われた（図１０Ｈ）。
【０２１７】
Ａｄ３線維ノブ二量体はＡｄ３の感染を遮断する。抗体と架橋することにより、含有するシャフトモチーフが野生型Ａｄ３線維ノブよりも少ないＡｄ３線維ノブの遮断効果が増強された。Ａｄ３線維ノブを結合開口薬として治療に適用する可能性のために、さらなる試験の焦点を、最小数のシャフトモチーフを有する線維ノブ変異体、すなわち、Ｓ２／Ｋｎを評価することによって分子のサイズを縮小することに合わせた。線維ノブの架橋によりＤＳＧ２との結合が増加したという所見に基づいて、二量体形成ドメインを組み入れることによってＳ２／Ｋｎの二量体を生成した。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生される間の自然発生的な線維ノブ二量体形成および潜在的な封入体の形成を回避するために、高親和性で互いと相互作用するＥ−コイルペプチドとＫ−コイルペプチドとからなるヘテロ二量体系を利用した（１７）。それぞれＥＶＳＡＬＥＫ（配列番号２２）（Ｋ−コイル）の５つの反復およびＫＶＳＡＬＫＥ（配列番号２３）（Ｅ−コイル）の５つの反復を含有する２つの線維ノブ変異体、後ろに２つのシャフトモチーフが続くＧ／Ｓリッチ柔軟性ドメインおよびホモ三量体の線維ノブドメインを生成した（図１１Ａ）。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ２／ＫｎおよびＡｄ３−Ｅ／Ｓ２／Ｋｎを別々にＥ．ｃｏｌｉにおいて産生させ、親和性クロマトグラフィーによって精製した。二量体形成させるために、精製されたタンパク質の両方を１：１の濃度比で混合した。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ２／ＫｎとＡｄ３−Ｅ／Ｓ２／Ｋｎの混合物により、ＰｔＤｄと同様の効率でＡｄ３の感染が遮断された（図１１Ｂ）。興味深いことに、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ２／Ｋｎ単独では両方のペプチドの混合物と同じ競合強度があるが、一方Ａｄ３−Ｅ／Ｓ２／Ｋｎ単独では、感染は非効率的にしか遮断されなかった。これは、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ２／Ｋｎはホモ二量体化することができるが、Ａｄ３−Ｅ／Ｓ２／Ｋｎはホモ二量体化することができないことを示唆している。この裏付けにおいて、抗Ｈｉｓ抗体とさらに架橋することにより、Ａｄ３−Ｅ／Ｓ２／Ｋｎの遮断効果が増大するが（Ｐ＜０．０５）、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ２／Ｋｎの遮断効果は増大しないことが見いだされた（図１１Ｃ）。
【０２１８】
最小の二量体Ａｄ３線維ノブタンパク質とＤＳＧ２の結合。次いで、Ｋ−コイル二量体形成ドメインまたはＥ−コイル二量体形成ドメイン、ただ１つのシャフトモチーフ、およびホモ三量体のＡｄ３線維ノブを含有する最小のＡｄ３線維ノブ二量体（Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎおよびＡｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎ）を作製することを試みた（図１２Ａ）。そのようなタンパク質はサイズがより小さいので、血管からの放出、組織への浸透において潜在的な治療上の利点を有し、理論的に、含有する免疫原性エピトープも少ない。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎおよびＡｄ３−Ｅ／Ｓ／ＫｎをＥ．ｃｏｌｉにおいて産生させ、親和性クロマトグラフィーによって精製した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析により、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎおよびＡｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎの大部分が三量体（約６５〜７０ｋＤａ）として存在していたことが示された（図１２Ｂ）。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ単独、およびＡｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎとの組み合わせを陰性染色電子顕微鏡検査によって分析して、それらの組立ての状態を評価した（図１２Ｃ）。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎおよびＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎの両方について線維ノブの二量体およびその凝集体が見いだされたが、より大きな凝集体は、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ調製物のほうが少なかった。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎとＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎのどちらによっても、Ａｄ３のＨｅＬａ細胞への付着がＰｔＤｄに匹敵するレベルで遮断された（図１２Ｄ）。ＨｅＬａ細胞をＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎと一緒にプレインキュベートすることおよびＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎと一緒にプレインキュベートすることは、Ａｄ５の付着に影響を及ぼさなかった（図１２Ｅ）。予測通り、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎおよびＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎによっても、Ａｄ３の感染が効率的に阻害された（図１２Ｆ、Ｇ）。線維ノブと２つのシャフトモチーフおよび１つのシャフトモチーフを並べた比較では、それらのＡｄ３の感染を遮断する能力に有意差は示されなかった（図１２Ｈ、Ｉ）。
【０２１９】
二量体Ａｄ３線維ノブとＤＳＧ２の結合のＳＰＲ分析。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎおよびＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎの、ＤＳＧ２との相互作用をより詳細に試験するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験を実施した。最初に、結合実験を設計し、ＤＳＧ２分子を、固定化した線維ノブと結合させた（図１３Ａ）。固定化するために、線維ノブをビオチン化し、ストレプトアビジンを介してセンサーチップに連結させた。動力学分析により、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎおよびＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／ＫｎはどちらもＤＳＧ２を同様に認識し、注入の終わりの時点の解離は少なかったことが示された。明確に、可溶性のＤＳＧ２と線維の結合は、細胞表面とウイルスの間の生理的相互作用を不十分にしか模倣しない。したがって、受容体であるＤＳＧ２をセンサーチップ表面に固定化し、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎおよびＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎ、および比較のためにＰｔＤｄおよび（単量体の）Ａｄ３線維ノブを同様のＳＰＲ反応を生じる濃度で注入した（図１３Ｂ）。これらの試験の転帰は線維ノブの数価に依存するはずであり、数価は、Ａｄ３線維ノブ（単量体）については三量体、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎおよびＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎについては２×三量体、ＰｔＤｄについては１２×三量体である。これは、ＰｔＤｄ内の全ての線維が同時にＤＳＧ２と相互作用し得るわけではないという事実により、さらに複雑になる。線維ノブ二量体の会合は同様であったが（図１３Ｃ「会合終了時の結合」）、解離挙動には明白な差異があった。Ａｄ３線維ノブ（非二量体形成性、以前に記載されている（３３））（「Ａｄ３ノブ」）は、他の３種のリガンドよりも速く解離した。ＰｔＤｄおよびＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎについては、解離はほとんど見られなかった。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎの解離は、Ａｄ３線維ノブの解離とＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎの解離の間であった。複雑ではあるが、これらのデータは、二量体のＡｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎおよびＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎが、Ａｄ３線維ノブよりもゆっくりとＤＳＧ２から解離することを明確に示している。これは、結合活性機構、つまり、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／ＫｎおよびＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／ＫｎがいくつかのＤＳＧ２分子と結合すること；全体的な低解離速度および高度に安定な付着の実現を可能にする機構によって説明することができる。特に、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎ内の全ての二量体がＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎによって形成される可能性があるが、それは解離速度の差異により反証される。これを詳細に証明するために、さらなる試験が必要である。
【０２２０】
Ａｄ３といくつかのＤＳＧ２分子の相互作用は、上皮細胞の免疫蛍光分析によって裏付けられる（図１３ＤおよびＥ）。Ｃｙ３で標識したＡｄ３ビリオンを使用したこれらの試験により、１つのビリオンがその周りのいくつかのＤＳＧ２タンパク質を群がらせることが示唆される。後で概説している通り、本発明者らは、この特異的な受容体が群がることは、細胞内シグナル伝達および上皮の結合の開口を誘発することに関して機能的な重要性を有するという仮説を立てている。特に、実施例１において、ＰｔＤｄとＤＳＧ２が結合することにより、上皮細胞において上皮間葉転換（ＥＭＴ）が誘発され、それにより一過性の細胞間結合の開口がもたらされることが示された。
【０２２１】
多量体のＤＳＧ２リガンド（Ａｄ３ビリオン、ＰｔＤｄ、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ）により上皮の結合の開口が誘発される。上皮細胞は、いくつかの細胞間結合（密着結合、接着結合、ギャップ結合、およびデスモソーム）を維持し、その特徴は、多くの場合、上皮内がんおよびがん細胞株において保存されている（２９）。図１４Ａは、極性結腸がんＴ８４細胞の共焦点免疫蛍光顕微鏡画像を示す。側方からの細胞、すなわち、積み重なったＸＺ層の細胞が示されている。細胞間結合は、接着結合タンパク質であるクローディン７およびデスモソームタンパク質であるＤＳＧ２がマーカーとなる長い垂直方向の筋として目に見える。ＤＳＧ２（緑色）はクローディン７シグナルの頂端に局在する。密着結合タンパク質であるＺＯ−１は、ＤＳＧ２のさらに頂端に見いだすことができる（下のパネル）。後者は、ＸＹ画像においても可視化され、頂端の細胞表面のＺＯ−１がマーカーとなる密着結合の「金網」ネットワークを示し、一方、１μｍ深部の切片は、ＤＳＧ２染色を示す（図１４Ｂ）。重要なことに、Ｔ８４細胞をＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎに曝露させることにより、上皮の結合の部分的な溶解が誘発され、これは、無処置の細胞と比較して（図１４Ａ、下のパネル）ＤＳＧ２およびＺＯ−１に対する染色が減少する（図１４Ｃ）ことに反映される。
【０２２２】
Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎによる上皮の結合の開口を、電子顕微鏡（ＥＭ）試験によってさらに確認した。無処置の上皮細胞のＥＭ画像は、頂端に適用された色素であるルテニウムレッドが側底の空間には入れないことによって判定されるインタクトな密着結合およびデスモソーム結合を示す（図１４Ｄ、左側のパネル）。この色素は、細胞膜表面に沿った高電子密度の線として現れる。上皮細胞をＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎと一緒にインキュベートすることにより、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎを加えてから１時間以内にルテニウムレッドが側方への空間に深く漏出する（図１４Ｄ、右側のパネル）。図１４Ｅでは、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎで処置した細胞においてデスモソームの部分的な分解（矢印によって示されている）がはっきり目に見える。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎに加えて、Ａｄ３ビリオン、ＰｔＤｄ、およびＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎ＋Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎを用いた共焦点免疫蛍光法およびＥＭ試験において上皮の結合の開口が観察された（データは示していない）。細胞をＡｄ３線維ノブ（非二量体形成性）またはＡｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎ、すなわち、多量体形成することができないＤＳＧ２リガンドに曝露させることは上皮の結合に影響を及ぼさなかった（データは示していない）。これらの試験は、上皮の結合の開口にはＡｄ３線維ノブの二量体または多量体が必要であることを示している。
【０２２３】
ルテニウムレッドを用いた漏出試験に加えて、３つの機能アッセイを用いてＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎによる上皮の結合の開口を実証した：ｉ）１４Ｃ−ＰＥＧ−４０００貫流（ｔｒａｎｓｆｌｕｘ）試験によって示されている通り、分極上皮細胞をＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎに曝露させることにより、３０分以内に経上皮の浸透性が増加した（図１５Ａ）。重要なことに、非二量体形成性Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎ線維ノブまたはＤＳＧ２の細胞外ドメインの種々の領域に対するｍＡｂと一緒にインキュベートした後の浸透性は、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎと一緒にインキュベートした後の浸透性よりも＞５分の１低かった。ｉｉ）以前の試験により、極性乳がんＢＴ４７４−Ｍ１細胞において、ハーセプチン／トラスツズマブの標的であるＨｅｒ２／ｎｅｕが上皮の結合内に閉じ込められていること、およびＢＴ４７４−Ｍ１細胞をＡｄ３のＰｔＤｄと一緒にインキュベートすることにより、Ｈｅｒ２／ｎｅｕへの接近が増大し、トラスツズマブによるがん細胞の死滅が増加することが示された（３３）。本発明では、このアッセイを用いて、追加的なＤＳＧ２リガンドのトラスツズマブの細胞傷害性に対する効果を試験した（図１５Ｂ）。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎにより、トラスツズマブによるＢＴ４７４−Ｍ１細胞の死滅が有意に増加したことが見いだされた。対照的に、二量体を形成することができないＤＳＧ２リガンド、すなわち、Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎおよび一連の抗ＤＳＧ２抗体は、トラスツズマブによる死滅に対して有意な効果を有さなかった。特に、細胞外ドメイン３／４に対する抗ＤＳＧ２抗体の１つ（ｍＡｂ  ６Ｄ８）が腫瘍細胞の増殖を刺激すると思われた。ｉｉｉ）Ａｄ５に対する受容体であるＣＡＲは極性Ｔ８４上皮細胞の密着結合内に局在する（３）。これは、Ｔ８４細胞の共焦点免疫蛍光顕微鏡によって示されている（図１５Ｃ、上のパネルおよび図１５Ｄ、上のパネル）。これらの細胞をＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎと一緒にインキュベートすることにより、ＣＡＲ染色が著しく増加し、今では側膜に沿って（図１５Ｃ、下のパネル）および細胞表面に（図１５Ｄ、下のパネル）現れている。これは、密着結合が分解し、Ｔ８４細胞の頂端側に適用されたＣＡＲが抗ＣＡＲ抗体へより接近しやすくなった結果であると推測された。密着結合の破壊およびＣＡＲの接近しやすさについての別の潜在的なアッセイは、ＣＡＲ−ターゲティングＡｄベクターを形質導入することである。極性Ｔ８４細胞（頂端側）にＡｄ５−ＧＦＰを細胞当たり２５０ｐｆｕのＭＯＩで感染させることにより、細胞の８（＋／−２）％が形質導入された（感染の２０時間後に計数されたＧＦＰ陽性細胞に基づく）（図１５Ｅ）。Ａｄ５−ＧＦＰをＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎの存在下で感染させることにより、３８（＋／−９）％のＧＦＰ−陽性細胞がもたらされた。希釈緩衝液またはＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎの存在下では、それぞれ、Ｔ８４細胞の１７（＋／−６）％または６８（＋／−１７）％にＡｄ３−ＧＦＰが形質導入された。後者は、以前の試験と一致し、Ａｄ３が、Ａｄ５よりも効率的に分極上皮細胞に感染することを示している（２８）。これは、そのＤＳＧ２と結合し、結合開口を誘発する能力に起因する可能性が最も高い。Ａｄ３−Ｋ���Ｓ／Ｋｎにより、Ａｄ３−ＧＦＰの形質導入が増加した。比較的小さなＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎタンパク質およびその高濃度が、Ａｄ３ビリオンよりも多くのＤＳＧ２受容体に最初に到達し、したがって、密着結合の開口を増強することが推測される。図１５Ｅに示されている全ての設定において、単層の周辺にある細胞（すなわち、密着結合せずに内部チャンバーの壁と接触している細胞）の大部分がＧＦＰ陽性であった。したがって、ｔｒａｎｓｗｅｌｌの中央の領域にあるＧＦＰ陽性細胞を計数した。後者は、希釈緩衝液またはＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎの存在下でＡｄ５−ＧＦＰを感染させた後のＧＦＰの発現のフローサイトメトリー分析を解釈する際に考慮しなければならない（図１５Ｆ）。バックラウンドのＧＦＰ蛍光レベルは比較的高かったが、Ａｄ５−ＧＦＰを感染させた後のＧＦＰの発現レベルは、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎが存在することによっては有意に上昇したが、Ａｄ３−Ｅ／Ｓ／Ｋｎまたは抗ＤＳＧ２  ｍＡｂが存在することによっては有意に上昇しなかった。全体的に、本発明者らの機能的試験により、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎにより上皮の結合の開口が誘発され得るが、多量体形成することができないリガンドは結合に影響を及ぼさないことが示された。
【０２２４】
考察
この試験では、２つの発見：ｉ）高親和性かつ安定なＤＳＧ２との結合を実現するためにはＡｄ３線維ノブの多量体形成が必要であること、およびｉｉ）多量体型のＡｄ３−線維ノブ／ＤＳＧ２相互作用により、上皮の結合の開口が誘発されることについて説明する。
【０２２５】
ＣＡＲと相互作用するＡｄ５、ＤＳＧ２と相互作用するＡｄ３、およびＣＤ４６と相互作用するＡｄ３５による感染を含めたＡｄ感染の大部分は、気道上皮を標的とする（２２）。Ａｄが感染するためには、ウイルスと標的細胞の接触を維持するため、およびより重要なことに、ウイルスが上皮の関門を破壊し、標的細胞に進入し、標的組織内に拡散することを可能にするその後の事象を誘発するために、受容体に対する低解離速度の高い結合活性を実現することが極めて重要であると思われる。ＣＡＲ結合性ＡｄおよびＣＤ４６結合性Ａｄについては、高い結合活性の結合は、三量体の線維ノブと３つの受容体ユニットの間の相互作用によって実現される。さらに、Ａｄ１１とＣＤ４６の相互作用について示されている通り、最初のＡｄと受容体の結合により、受容体のコンフォメーションの変化が誘発されて、結合が安定化し得るが（２１）；Ａｄ１１以外のＡｄが後者の機構を使用することはまだ示されていない。ＣＡＲと相互作用するＡｄおよびＣＤ４６と相互作用するＡｄに関して、付着には線維ノブおよび受容体が関与し、これは過剰な可溶性の線維ノブによって完全に遮断することができる。これは、ＤＳＧ２結合性Ａｄ３の場合は違う。Ａｄ３の結合および感染を完全に阻害するには、物理的な連結、および、大概は、少なくとも２つの線維ノブの特異的な空間的配置が必要であることが示された。これは、Ａｄビリオン、Ａｄ３のＰｔＤｄまたは二量体のＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎを用いて実現される。これらのリガンドは、一方では、高い結合活性をもたらし、他方では、上皮の結合の開口に機能的に関連する、いくつかのＤＳＧ２分子への同時の結合を実現すると思われる。Ａｄ３−ＤＳＧ２相互作用に関する本発明者らの発見をさらに裏付けるために、本発明者らは現在、結晶構造試験および突然変異誘発試験を行っている。
【０２２６】
感染を開始するために、多くの病原体が結合の完全性を破壊するための機構を進化させてきた。Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ株は、腸の上皮の結合を可逆的に変化させ、巨大分子が粘膜関門を通って通過することを可能にすることができるＺｏｎａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ毒素（Ｚｏｔ）を産生する（６）。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓエンテロトキシンにより、密着結合からクローディン３およびクローディン４が除去され、細菌の浸潤が容易になる（２５）。さらに、ヒトＡｄ、ＨＰＶ、ＨＴＬＶ−１にコードされる腫瘍性タンパク質により、結合タンパク質であるＺＯ−１を誤った場所に局在化させることによって上皮の結合を一過性に開口させることができる（１５）。ウイルスが使用する後者の機構は、側方へのウイルスの拡散において役割を果たすと思われる。しかし、効率的な初感染のためには、ウイルスの付着が上皮の結合の開口を誘発することと連携しなければならない。
【０２２７】
免疫蛍光法、ＰＩ３Ｋ／ＭＡＰＫリン酸化、ｍＲＮＡ発現アレイ、および代謝経路阻害手法を用いた実施例１において、Ａｄ３ビリオンおよびＡｄ３のＰｔＤｄがＤＳＧ２と結合することにより、上皮細胞において上皮間葉転換が誘発され、それにより一過性の細胞間結合の開口がもたらされることを報告した。Ａｄ３粒子または組換えＰｔＤｄとＤＳＧ２の相互作用によって媒介される細胞間結合の開口は、上皮細胞の浸透性および細胞間結合内に閉じ込められている受容体（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）への接近が増大したことによってさらに裏付けられた。本試験では、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎによっても結合の開口が誘発されることを示す形態学的なデータ（共焦点免疫蛍光法、ＥＭ）および機能的なデータ（浸透性、トラスツズマブによる死滅、Ａｄ５の感染）を提供する。重要なことに、多量体形成し、ＤＳＧ２を群がらせることができない他のＤＳＧ２リガンド、例えば、単量体のＡｄ３−Ｅ／Ｓ／ＫｎまたはＤＳＧ２の異なる領域に対するモノクローナル抗体などは、結合を効率的に開口することができなかった。しかし、Ａｄ３が、ＤＳＧ２／デスモソームの頂端側に位置する密着結合をどのように通過することができるのかは疑問のままである。Ａｄ−ＤＳＧ２に媒介される結合開口は数分以内に起こり、それにより、結合の内部に閉じ込められているＤＳＧ２が感染部位に存在するウイルス粒子に曝露されるので、効率的な感染は正のフィードフォワード機構を通じて起こることが推測される。
【０２２８】
Ａｄ３の感染機構の考察では、Ａｄ３の複製時に、ＰｔＤｄが、感染性ウイルス当たりＰｔＤｄ５．５×１０６個と、非常に過剰に形成されることにも注目すべきである（７）。これは、ＰｔＤｄの形成が、Ａｄ３にとって機能的に重要である、すなわち、Ａｄ３の拡散または持続にとって有利であることを示唆している。同様の機構が、上皮細胞へのＡｄ５の感染において起こると思われる。Ａｄ５の複製時に線維が過剰に産生されることにより、ＣＡＲ二量体形成が干渉されることによってか、または細胞内シグナル伝達が誘発され、それにより細胞間結合の再編成がもたらされることによって、上皮の結合が破壊される（４、３２）。最近、（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に基づいて）ＣＤ４６は極性呼吸上皮細胞の頂端に露出しており、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける初感染のＡｄ受容体としてより機能しやすいことが示された（９）。これは、ＣＤ４６の発現パターンがＡｄの形質導入と相関しなかったヒトＣＤ４６トランスジェニックマウスにおいては確認することができなかった（１９）。さらに、極性上皮がん培養物において、細胞間結合内に閉じ込められていて、細胞表面に適用されたＡｄ３５と接近できないＣＤ４６が見いだされた（３３）。この時点では、本発明者らは、ＣＤ４６結合性Ａｄがどのように上皮性関門を破壊するかという疑問の答えは得られていないままであると考える。
【０２２９】
細胞間結合は、抗がん治療薬の接近および腫瘍内への散在に対する物理的な障害を意味するので、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎにより結合の開口が誘発されるという知見には実用的な意味がある（２６−２７）。上皮の結合開口薬は、上皮の結合内に閉じ込められている腫瘍に関連する抗原（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕまたはＥＧＦＲ１）に対するモノクローナル抗体を用いたがん療法と関連すると思われる（３３）。結合開口薬により、養子Ｔ細胞療法（５）またはリポソーム化学療法薬を用いた治療（１０）の有効性も改善される可能性がある。最後に、Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎにより、Ａｄ５ベースの遺伝子療法ベクターによる正常な組織または悪性の組織への形質導入の有効性が増大する可能性がある。Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎのバイオテクノロジーへの適用性は、その産生および精製の容易さによって、およびそれが自然発生的にホモ二量体を形成するという事実によってさらに強まる。
【０２３０】
結論として、本発明者らの試験により、上皮細胞へのＡｄ３の感染の機構が明らかになる。小さな組換えタンパク質であるＡｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎにより、上皮の結合の開口が誘発されるという所見はがん療法および上皮組織への薬物送達に関して意味を有する。
【０２３１】
実施例２の参考文献
【０２３２】
【数６】
2013538040.tif 000019
【０２３３】
【数７】
2013538040.tif 000020
【０２３４】
【数８】
2013538040.tif 000021
【０２３５】
【数９】
2013538040.tif 000022
【０２３６】
（実施例３）
組換え上皮の結合開口薬により、がんのモノクローナル抗体療法が改善される
要約
がん治療のためのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の治療有効性は、上皮腫瘍細胞を互いにしっかりと連結している細胞間結合によって限定される。本発明者らは、上皮の結合タンパク質であるデスモグレイン２（ＤＳＧ２）と結合する小さな組換えアデノウイルス血清型３由来タンパク質である結合開口薬１（ＪＯ−１）を生成した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性ヒトがん細胞株およびＥＧＦＲ陽性ヒトがん細胞株に由来する腫瘍を有するマウスモデルにおいて、静脈内注射後１時間以内に、ＪＯ−１により細胞間結合におけるＤＳＧ２二量体の切断が媒介されること、ならびに密着結合タンパク質であるＥ−カドヘリンのレベルの低下を導く細胞内シグナル伝達経路の活性化を実証する。ＪＯ−１に誘発される上皮の結合の変化により、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ｍＡｂであるトラスツズマブ（ハーセプチン）の腫瘍内への浸透の向上、ならびに部分的に結合内に閉じ込められている、その標的受容体であるＨｅｒ２／ｎｅｕへの接近の改善が可能になった。これは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性の乳がん細胞、胃がん細胞、および卵巣がん細胞を用いた異種移植モデルにおけるトラスツズマブのより優れた治療効果に直接転換される。さらに、ＪＯ−１とＥＧＦＲターゲティングｍＡｂであるセツキシマブ（アービタックス）の組み合わせにより、転移性ＥＧＦＲ陽性肺がんのモデルにおける治療転帰が有意に改善された。ＪＯ−１／トラスツズマブ処置と腫瘍間質タンパク質の一過性の分解を可能にする追加的な手法の組み合わせにより、腫瘍が完全に根絶する。癌治療に対するその臨床的な関連性に加えて、この試験では、上皮細胞へのアデノウイルス血清型３の感染の機構も明らかになる。
【０２３７】
諸言
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、新規の腫瘍治療薬の１つのクラスとして現れた。現在までに、がんを治療するための治療用ｍＡｂは２１種販売されており、数百種超が現在臨床開発中である。販売されているｍＡｂの中にトラスツズマブ（ハーセプチン）およびセツキシマブ（アービタックス）がある。トラスツズマブは、ヒト上皮増殖因子受容体２（Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ−２）を標的とする。セツキシマブに対する受容体は、ヒト上皮増殖因子受容体１（Ｈｅｒ１／ＥｒｂＢ−１）である。どちらの受容体も、チロシンキナーゼ受容体ファミリーに属し、細胞の生存および増殖を促進するいくつかの経路を通じてシグナル伝達を開始する（Ｈａｒａｒｉら、２００７年）。トラスツズマブは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳がん患者において第一選択療法として使用され、転移性Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性胃がんについても認可されている。現在ＦＤＡに認可されているセツキシマブに対する適応症としては、結腸直腸がん、頭頸部癌、肺がん、および膵癌が挙げられる（Ｗｈｅｅｌｅｒら、２０１０年）。初期の乳がんまたは結腸がんの患者の大部分は、トラスツズマブ療法およびセツキシマブ療法に対して、測定可能な腫瘍の応答がある。しかし、進行疾患または再発疾患の患者では、これらのｍＡｂに対する応答率はたったの８％〜１０％である（ＡｄａｍｓおよびＷｅｉｎｅｒ、２００５年）。
【０２３８】
トラスツズマブおよびセツキシマブの作用機構は、抗体依存性細胞毒性または補体依存性細胞毒性の活性化、および腫瘍細胞が生存するために必要なチロシンキナーゼ受容体シグナル伝達への干渉を含む（Ｗｈｅｅｌｅｒら、２０１０年）。これらの機構の間の統一的な態様は、腫瘍細胞の増殖阻害がｍＡｂとそれらの対応する受容体の結合に左右されることである。したがって、受容体への接近および結合を、血管から悪性細胞への腫瘍内輸送を物理的に阻害することによってか、または受容体を遮蔽することによって妨げる分子は、トラスツズマブおよびセツキシマブの活性を遮断することが予測される（Ｌｅｓｎｉａｋら、２００９年）。これらの分子としては、コラーゲンまたはラミニンなどの腫瘍間質タンパク質が挙げられる（Ｌｉら、２００４年）。最近の試験において、本発明者らは、これらの間質タンパク質が一過性に分解されることにより、トラスツズマブ療法が有意に改善されたことを実証した（Ｂｅｙｅｒら、２０１１年）。
【０２３９】
腫瘍間質タンパク質によって形成される障害に加えて、がん細胞の上皮の表現型によっても、がん療法に対する物理的関門が創出される（ＳｔｒａｕｓｓおよびＬｉｅｂｅｒ、２００９年；Ｓｔｒａｕｓｓら、２００９年）。いくつかの試験により、上皮のタンパク質の発現または上方制御が、乳がんのトラスツズマブ療法（Ｆｅｓｓｌｅｒら、２００９年）および結腸直腸がんのセツキシマブ療法（Ｏｌｉｖｅｒａｓ−Ｆｅｒｒａｒｏｓら、２０１１年）に対する抵抗性の増加と相関したことが実証された。上皮細胞は、いくつかの細胞間結合（密着結合、接着結合、ギャップ結合、およびデスモソーム）を維持し、その特徴は、多くの場合、上皮内がんおよびがん細胞株において保存されている（Ｔｕｒｌｅｙら、２００８年）。上皮の結合は、２つの隣接する細胞に由来するカドヘリン分子からなる接着性二量体で構成される（Ｋｏｅｓｅｒら、２００３年）。デスモグレイン１、２、および３（ＤＳＧ１〜３）およびデスモコリン１、２、および３（ＤＳＣ１〜３）は、カドヘリンのサブクラスである。ＤＳＣ２およびＤＳＧ２は広範に発現され、上皮細胞の基底層のデスモソームにおいて共に見いだされる。デスモソームのカドヘリンの細胞質尾部は、原形質膜と細胞骨格を、プラコグロビン、デスモプラキン、およびプラコフィリンを含むタンパク質の複合体を通じて連結する。デスモグレイン２（ＤＳＧ２）は、乳がん（Ｗａｎｇら、２０１１年ｂ）（付録図１）、卵巣がん（Ｗａｎｇら、２０１１年ｂ）（付録図１）、肺がん（Ｗａｎｇら、２０１１年ｂ）、胃がん（Ｂｉｅｄｅｒｍａｎｎら、２００５年）、扁平上皮癌（Ｈａｒａｄａら、１９９６年）、黒色腫（Ｓｃｈｍｉｔｔら、２００７年）、転移性前立腺がん（Ｔｒｏｊａｎら、２００５年）、および膀胱がん（Ａｂｂｏｄら、２００９年）を含めた一連の上皮の悪性疾患において過剰発現される。
【０２４０】
実施例１において、ヒトアデノウイルス（Ａｄ）の一群（Ａｄ血清型３、７、１１、および１４）は、細胞に感染するための主要な付着受容体としてＤＳＧ２を使用することが実証された。重要なことに、上皮細胞においてＡｄ３がＤＳＧ２と結合することにより、シグナル伝達経路の活性化が誘発され、それにより、一過性の上皮の結合の開口がもたらされる。結合の開口は、経上皮の浸透性が増大すること、および密着結合内に閉じ込められているタンパク質、例えば、コクサッキー・アデノウイルス受容体またはｚｏｎｕｌａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ−１タンパク質が露出することにより反映された。上皮の結合の開口は、組換えウイルス成分の粒子、例えば、ペントンベースと連結した１２個のＡｄ３線維からなるペントン１２面体（ＰｔＤｄ）などによっても実現された（Ｆｕｓｃｈｉｏｔｔｉら、２００６年；Ｎｏｒｒｂｙら、１９６７年）。その後、本発明者らは２つの線維ノブドメインによって形成される最小のＡｄ３由来のＤＳＧ２リガンドを生成した。このタンパク質は、分子量がおよそ５０ｋＤａであり、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生され、また容易に精製することができる。一連の機能的試験において、本発明者らは、このタンパク質により、結合の開口が効率的に誘発されることを実証した。したがって、以下の試験では、このタンパク質を結合開口薬−１（ＪＯ−１）と称する。
【０２４１】
この試験では、ＪＯ−１に媒介される結合の開口のｉｎ  ｖｉｖｏ機構を部分的に説明した。異種移植腫瘍においてＨｅｒ２／ｎｅｕおよびＥＧＦＲが細胞間結合内に閉じ込められていることが示された。ＪＯ−１処置により、腫瘍におけるｍＡｂの浸透が有意に増加し、また、一連の異種移植腫瘍モデルにおけるトラスツズマブ療法およびセツキシマブ療法の有効性が有意に増大した。
【０２４２】
結果
ＪＯ−１により、上皮の結合の開口が誘発される。上記の実施例において、Ａｄ３粒子または組換えＡｄ３ペントン１２面体（ＰｔＤｄ）（図１６Ａ）がＤＳＧ２と結合し、一過性の上皮の結合の開口を誘発し、それが今度は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性のＢＴ４７４乳がん細胞のトラスツズマブによる死滅を増加させることが示された。大きなサイズのＡｄ３またはＰｔＤｄ粒子は、それらの血管からの放出および組織への浸透に影響を及ぼし得るので、本発明者らは、上皮の結合開口薬として機能的に活性なより小さなＡｄ３由来のＤＳＧ２リガンドを生成した。ＤＳＧ２との高親和性結合およびその後の結合開口には、Ａｄ３線維二量体が必要であることが見いだされた。この所見に基づいて、結合開口薬１（ＪＯ−１）と称する小さな自己二量体形成性Ａｄ３線維誘導体を設計した（図１６Ａ、Ｂ）。ＪＯ−１の分子量は約５０ｋＤａであり、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生させた後、親和性クロマトグラフィーにより精製する。
【０２４３】
極性結腸がんＴ８４細胞においてＪＯ−１の機能活性を試験した。これにより、クローディン７およびＤＳＧ２についての共焦点顕微鏡検査によって示されている通り、細胞をＪＯ−１と一緒にインキュベートすることにより、上皮の結合のリモデリングが誘発されることが実証された（図１６Ｃ）。デスモソームタンパク質であるＤＳＧ２は、クローディン７がマーカーとなる接着結合とオーバーラップしている。ＪＯ−１がＤＳＧ２と結合してから３０分以内に、クローディン７の染色が増加し、これは、大概は、クローディン７に対する抗体（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ培養物の内部チャンバー、すなわち、分極上皮細胞の頂端側に適用される）がより接近しやすいことの結果である。デスモソーム結合および接着結合に対して頂端に局在する密着結合の開口が電子顕微鏡により例示されている（図１６Ｄ）。無処置の上皮細胞の顕微鏡検査により、頂端に適用された色素であるルテニウムレッドが側底の空間には入れないことによって判定されるインタクトな密着結合が示されている。上皮細胞をＪＯ−１と一緒に１時間インキュベートすることにより、密着結合が分解され、ルテニウムレッドが側底の空間に漏出する（図１６Ｄ、右側のパネル）。分極上皮細胞をＪＯ−１に曝露させることによっても、分子量が４０００Ｄａである１４Ｃ−ＰＥＧ−４０００の貫流によって示されている通り、経上皮の浸透性が増大した（図１６Ｅ）。重要なことに、ＤＳＧ２の細胞外ドメインの種々の領域に対するモノクローナル抗体によっては経上皮の浸透性は有意に増大しなかった。結合の開口を誘発するためには、いくつかのＤＳＧ２分子のライゲーションが必要であることが推測される。顕微鏡検査および浸透性試験により、ＪＯ−１により数分以内に結合の開口が誘発されることが示された。ＪＯ−１パルス処置を解除した６０分後に、結合構造および浸透性は正常な形態に回復したという事実によって例示されるように、ＪＯ−１の効果は一過性である。ＪＯ−１を細胞上に放置した場合、最初にＪＯ−１を加えた２４時間後に、依然として形態学的な上皮の結合の変化を見ることができた（データは示していない）。
【０２４４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＪＯ−１により、細胞内シグナル伝達が誘発され、上皮腫瘍内へのｍＡｂの浸透が増大する。乳がん異種移植モデルを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける上皮の結合に対するＪＯ−１の効果を試験した。ヒト乳がんＨＣＣ１９５４細胞を、ＣＢ１７−ＳＣＩＤ／ベージュマウスの乳房の脂肪パッドに注射した。生じた腫瘍は、ヒトにおける乳がんの組織構造と似ていた（Ｌｉら、２００４年）、すなわち、腫瘍は血管化し、上皮の結合でくっついた上皮細胞の巣を含有し、細胞外マトリックスで囲まれていた）。腫瘍の体積が約２００ｍｍ３に達した時、ＪＯ−１を静脈内注射した。ＪＯ−１は、早ければ注射した１時間後に、免疫蛍光顕微鏡により、腫瘍内で検出することができた。注射した１２時間後に免疫蛍光が増大したことよって示される通り、ＪＯ−１は腫瘍内に蓄積した（図１７Ａ、左側の３つのパネル）。これは、腫瘍溶解物のウエスタンブロット分析によっても確認された（図１７Ａ、右側のパネル）。ＰＢＳで処置した動物における、免疫蛍光顕微鏡検査による腫瘍切片についてのＤＳＧ２の分析により、膜局在シグナルが示された（図１７Ｂ、左側のパネル）。ＪＯ−１を注射した１時間後には、ＤＳＧ２分子は、主に腫瘍細胞の細胞質において見いだされた（２番目のパネル）。１２時間までに、ＤＳＧ２の膜局在化が部分的に回復すると思われた（３番目のパネル）。ＤＳＧ２の細胞外ドメインに対する抗ＤＳＧ２抗体を使用したウエスタンブロット分析により、１時間の時点で、おそらくタンパク質分解性の切断によって産生されるＤＳＧ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のより小さな断片が明らかになった（図１７Ｂ、右側のパネル）。総合すると、これらのデータにより、ＪＯ−１により、ＤＳＧ２  ＥＣＤ内部の切断およびＤＳＧ２の内部移行が誘発されることが示唆されている。これにより、２つの隣接する上皮腫瘍細胞間のＤＳＧ２二量体が破壊され、側方結合のリモデリングの一因となることが推測される。ＪＯ−１で処置した動物の組織学的検査では、胃腸管または気道の正常な上皮組織に毒性の副作用または変化は観察されなかった。
【０２４５】
上記の実施例において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において、Ａｄ３が上皮細胞のＤＳＧ２と結合することにより、上皮間葉転換（ＥＭＴ）に関与する経路を含めた細胞内シグナル伝達が誘発されることが見いだされた。ＥＭＴは胚発生に関与する再プログラミング過程であるが、腫瘍における転移にも関与する。ＥＭＴを特徴付ける特徴としては、上皮のマーカーの発現の減少、転写因子の位置の変更、およびＥｒｋ１／２（ＭＡＰＫ）の活性化が挙げられる（Ｔｕｒｌｅｙら、２００８年）。異種移植腫瘍を用いた本発明者らの試験では、ＪＯ−１を静脈内注射した１２時間後に腫瘍内に見られたリン酸化されていない形態およびリン酸化された形態のＥ−カドヘリンは少なかった（図１７Ｃ、左側のパネル）。Ｅ−カドヘリンの変化に先立って、リン酸化されたＥｒｋ１／２が増大した（図１７Ｃ、ｐＥｒｋ１／２ＰＢＳとＪＯ−１を比較（１時間））。ＥＲＫ１／２が活性化されることにより、ＥＭＴ時のＥ−カドヘリンの発現およびリン酸化が減少することはよく確立されている（Ａｎｄａｒａｗｅｗａら、２００７年；Ｌａｒｓｅｎら、２００３年；Ｔｕｒｌｅｙら、２００８年）。ＪＯ−１を注射すると、Ｅ−カドヘリンが減少し、また、リン酸化されたＥｒｋ１／２のシグナルが増加することも、免疫蛍光顕微鏡によって確認された（図１７Ｃ、右側のパネル）。全体的に、これらの試験は、ＨＣＣ１９５４腫瘍において、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＪＯ−１によりＥｒｋ１／２経路の活性化が誘発されることを示している。これに基づいて、本発明者らは、ＪＯ−１がＤＳＧ２と結合することによる上皮の結合の開口には、少なくとも２つの機構：ｉ）ＤＳＧ２  ＥＣＤの切断、およびその後の内部移行を伴うＤＳＧ２二量体の破壊；ならびにｉｉ）Ｅｒｋ１／２の活性化によるＥＭＴ様事象の誘導が関与するという仮説を立てている。
【０２４６】
次に、腫瘍におけるＪＯ−１に誘発される上皮の結合の開口により、異種移植腫瘍へのモノクローナル抗体の浸透が増大するかどうかを試験した。この試験のためにヒト化ＩｇＧ１  ｍＡｂであるトラスツズマブを最初に利用した。以前の試験の場合と同様に、トラスツズマブを１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内に注射した。ヒトＩｇＧに特異的な抗体を用いて腫瘍内のトラスツズマブを可視化した。腫瘍切片の分析およびウエスタンブロット分析において、トラスツズマブは、注射した１時間後に検出可能であり、注射した１２時間後にはより高レベルで検出可能であった（図１８）。トラスツズマブを投与する１時間前にＪＯ−１を静脈内注射することにより、腫瘍内のトラスツズマブの量が目に見えて増加し、これは、血管から放出したこと、腫瘍内への浸透が向上したこと、および／または腫瘍内の半減期が長くなったことのいずれかを示している。
【０２４７】
ｍＡｂ標的は上皮の結合内に閉じ込められている。乳がん異種移植切片および培養した乳がん細胞において、Ｈｅｒ２／ｎｅｕと接着結合タンパク質であるクローディン７の共染色が見いだされた（図１９Ａ）。乳がんＢＴ４７４細胞の共焦点顕微鏡写真により、Ｈｅｒ２／ｎｅｕが側方結合内に閉じ込められていることが確認された。これは、以前の試験と一致し、Ｈｅｒ２／ｎｅｕが、密着結合が破壊された際にのみ頂端の表面から接近可能になる側底のタンパク質であることを実証している（Ｖｅｒｍｅｅｒら、２００３年）。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳がん細胞株ＢＴ４７４（図１９）またはＨＣＣ１９５４（示されていない）をＪＯ−１と一緒にインキュベートすることにより、１時間以内に上皮の側方結合の組成が変化した。この結果として、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ染色が、細胞表面では染まり方がより強くなったが、細胞表面より遠位の領域ではあせた。これは、ＪＯ−１に媒介される結合の開口により、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの側膜から細胞表面への移行が誘発されたことを示唆している。側方結合に対するＪＯ−１の効果は一過性であり、細胞の形態は、ＪＯ−１パルス処置した１６時間後までに対照細胞の形態に戻った。上皮の結合内に閉じ込められていることはまた、ＥＧＦＲと密着結合タンパク質であるＥ−カドヘリンの共染色によって示唆されるように、ＥＧＦＲ１（セツキシマブ／アービタックスの標的）などの他のがん療法の標的に関しても問題であると思われる（図１９Ｂ）。セツキシマブを用いた本発明者らの試験では、結腸がん細胞株は大部分がセツキシマブに対する抵抗性を付与するＫ−ｒａｓの突然変異を有するので（Ｋａｒａｍｏｕｚｉｓら、２００７年）、肺がんモデル（Ａ５４９細胞）に焦点を合わせている。Ｈｅｒ２／ｎｅｕに関して観察されたことと同様に、Ａ５４９細胞をＪＯ−１と一緒にインキュベートすることにより、ＥＧＦＲが細胞表面に移行した。
【０２４８】
ｍＡｂ受容体が閉じ込められている状態から解放されることは、トラスツズマブおよびセツキシマブによるがん細胞の死滅が増強されることによって裏付けられる。トラスツズマブによるＢＴ４７４乳がんのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける死滅およびセツキシマブによるＡ５４９肺がん細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける死滅は、それぞれ非効率的であった（図１９ＣおよびＤ）。これらの細胞をＪＯ−１で前処置することにより、どちらの抗体もｉｎ  ｖｉｔｒｏでの対応する細胞株における細胞傷害性が有意に増大する。
【０２４９】
全体的に、これらの試験は、ＪＯ−１により、結合の開口が媒介され、それにより、ｍＡｂの腫瘍内への浸透を向上させること、ならびに、そうでなければ結合内に閉じ込められているそれらの標的受容体への接近を改善することが可能になることを示す。これに基づいて、ＪＯ−１で前処置することにより、異種移植モデルにおけるｍＡｂの治療効果が改善され得るかどうかを調査するために一連のｉｎ  ｖｉｖｏ試験を実施した。
【０２５０】
ＪＯ−１により、ｉｎ  ｖｉｖｏでトラスツズマブ療法が改善される。まず、トラスツズマブ療法のＪＯ−１による潜在的な増強を、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性ＢＴ４７４−Ｍ１細胞に基づく同所性乳がんモデルにおいて試験した。ＪＯ−１を単独で注射することは、腫瘍の増殖に対して有意な効果がなかった（図２０Ａ）。ＢＴ４７４−Ｍ１腫瘍は、トラスツズマブに最初に良好に応答したが、ＪＯ−１を前注射することにより、トラスツズマブの治療効果が有意に増強された（図２０Ａ）。これらの発見は、このモデルにおいてＰｔＤｄを用いた本発明者らの試験と一致する。処置したマウスを長期、すなわち、１３６日間にわたって追跡すると、ＪＯ−１での前処置の増強効果がより明白になる。トラスツズマブ単独療法を受けた動物の６０％が、およそ１００日目に再発（ｒｅｌａｐｓｅ）し、ＪＯ−１＋トラスツズマブで処置した動物はいずれも腫瘍の再増殖を示さなかった（データは示していない）。
【０２５１】
第２の乳がんモデルはＨＣＣ１９５４細胞を伴う。これらの細胞に由来する腫瘍は、トラスツズマブに対する抵抗性がより高い（図２０Ｂ）。ＢＴ４７４−Ｍ１モデルにおいて見られるように、ＪＯ−１で前処置することにより、トラスツズマブ療法が有意に改善され、腫瘍の増殖が失速した。ＪＯ−１の増強効果は、ＰｔＤｄの増強効果に匹敵した（データは示していない）。ＰｔＤｄを用いた本発明者らの試験に基づいて、ＪＯ−１注射とトラスツズマブ注射の間に１０時間の時間間隔を選択した。このレジメンは、腫瘍におけるＪＯ−１の蓄積の動力学およびＥ−カドヘリン減少の動力学によって裏付けられる（図１７ＡおよびＣを参照されたい）。他方では、結合の開口、すなわち、ＤＳＧ２の切断またはＥｒｋ１／２が活性化されることに関連づけられると思われる事象は、ＪＯ−１を注射してから１時間以内にすでに起こる。したがって、ＪＯ−１／トラスツズマブを同時に注射すること、およびＪＯ−１を適用した１時間後にトラスツズマブを注射することが、治療転帰にどのように影響を及ぼすかを調査した（図２０Ｃ）。この試験では、最初に用いた治療手法（ＪＯ−１の１０時間後にトラスツズマブ）と比較して有意差は見いだされなかった。これは、腫瘍におけるタンパク質の蓄積が相対的に遅いことに起因することが推測される。
【０２５２】
トラスツズマブに対する併用治療薬としてのＪＯ−１の臨床的な関連性をさらに強化するために、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性胃がん（ＮＣＩ−Ｎ８７）モデルにおいて有効性試験を実施した（図２１）。乳がんモデルと同様に、ＮＣＩ−Ｎ８７培養物および異種移植腫瘍においてＨｅｒ２／ｎｅｕとクローディン７の共染色が見いだされ、これは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕが上皮の結合に閉じ込められていることを示唆している。胃がん異種移植モデルを確立するために、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を皮下注射した。腫瘍を担持するマウスをＪＯ−１で前処置することにより、腫瘍の増殖が遅延したことに反映された通り、トラスツズマブ療法が有意に改善された。
【０２５３】
ＪＯ−１により、ｉｎ  ｖｉｖｏでセツキシマブ療法が改善される。Ａ５４９肺がん細胞に由来する皮下腫瘍を有する異種移植モデルを最初に利用した。以前確立されたＡ５４９腫瘍を有するマウスをセツキシマブで処置することでは、ＰＢＳ処置と比較して腫瘍の増殖の有意な遅延はもたらされなかった。ＪＯ−１を静脈内注射または腹腔内注射した１２時間後にセツキシマブを注射した。どちらの処置手法でも有意な治療効果があり、腫瘍体積が減少した（図２２Ａ）。ＪＯ−１の静脈内注射と結合開口薬の腫瘍内適用の追加的な組み合わせで治療効果がさらには増大することはなかった。乳がんモデルにおいて見られるように、ＪＯ−１処置単独では、有意な抗腫瘍効果は発揮されなかった。ＪＯ−１で前処置することにより、セツキシマブ療法がＰｔＤｄで見られるのと同程度に増強された（図２２Ｂ）。
【０２５４】
次に、同所性肺がんモデルにおいて併用療法を試験した。このモデルを確立するために、Ａ５４９細胞を静脈内注射した。このモデルでは、マウスは腫瘍細胞を移植してから３７日以内に罹患し、腫瘍は肺に優勢に局在した（図２２Ｃ、「ＰＢＳ」群）。マウスの処置は、１０日目、すなわち、対照群の動物が試験のエンドポイントに到達する２７日前に開始した。全ての動物を４０日目に屠殺した。対照群、ＪＯ−１群、ならびにセツキシマブで処置した動物では肺転移がはっきり目に見えたが、ＪＯ−１＋セツキシマブで処置した動物の肺の８０％で、肉眼検査時には腫瘍がなかった。肺切片の顕微鏡検査により、ＰＢＳ処置した動物では、腫瘍細胞はほぼ完全に正常な肺組織にとって代わり、細気管支も満たしたことが示された（図２２Ｃ、右側のパネル）。細気管支への浸潤は、セツキシマブを注射した動物において有意性が低かった。重要なことに、セツキシマブで処置した動物はかなりの浸潤性腫瘍の増殖を有したが、大多数のＪＯ−１＋セツキシマブを注射した動物は微小転移のみを示した。
【０２５５】
腫瘍間質タンパク質分解と結合の開口の組み合わせ。本発明者らは最近、がん患者由来の腫瘍切片および異種移植片の免疫組織化学的試験において、細胞外マトリックスタンパク質が、悪性の乳がんおよび結腸がん細胞の巣をしっかりと包囲する腫瘍間質を形成していることを示した（Ｌｉら、２００９年）。ペプチドホルモンであるレラキシンが腫瘍内で発現することによる腫瘍間質タンパク質の一過性の分解により、トラスツズマブ療法が有意に増強された（Ｂｅｙｅｒら、２０１１年）。本発明では、追加的な一過性の腫瘍間質タンパク質分解により、トラスツズマブ療法に対するＪＯ−１の効果がさらに増大するかどうかを試験するために、ＨＣＣ１９５４モデルを利用した（図２３Ａ）。レラキシン遺伝子を腫瘍に送達するために、造血幹細胞（ＨＳＣ）に基づいた手法（Ｌｉら、２００９年）を用いた。この手法では、腫瘍細胞が、骨髄から骨髄系前駆細胞を活発に動員し、それらを、そこでそれらが腫瘍関マクロファージ（ＴＡＭ）に分化する腫瘍間質に動員するいくつものケモカインを分泌するという知見を利用する。ＴＡＭは、腫瘍の増殖、血管新生、免疫エスケープおよび間質発生を誘発／支持する因子を産生するので、腫瘍が生存するために重要である。この手法は、骨髄由来ＨＳＣに、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性転写カセットの制御下で、導入遺伝子を発現しているレンチウイルスベクターをｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入すること、およびこれらの細胞を、骨髄に植え付け、腫瘍に向かう遺伝子改変された細胞の長期供給源をもたらす骨髄調整（ｍｙｅｌｏ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）レシピエントに移植することを伴う。この試験（図２３Ｂ）により、レラキシンの発現単独で、有意に腫瘍の増殖が遅延し、トラスツズマブ療法が増大したことが示された。レラキシンの発現とＪＯ−１処置の組み合わせにより、腫瘍の増殖が停止した。処置終了時に、レラキシン＋トラスツズマブ療法またはＪＯ−１＋トラスツズマブ療法のいずれかを受けた群とは対照的に、腫瘍は再成長しなかった。観察期間の最後にＪＯ−１／レラキシン／トラスツズマブ群に残留していた腫瘤の組織学的分析では結合組織のみが示された。対照的に、他の群から外植された腫瘍は腫瘍細胞を含有し、それは腫瘍をプロテアーゼによって消化した際にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができた。特に、三重の組み合わせ（ＪＯ−１／レラキシン／トラスツズマブ）処置を受けたマウスにおいて有害な副作用は観察されなかった。
【０２５６】
本発明者らのデータにより、腫瘍における物理的な障害がトラスツズマブ療法に対する抵抗性の媒介に関与することが強調される。
【０２５７】
ＪＯ−１に対する抗体の存在下での、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイに対する効果。Ａｄ３は、広範に分布した病原体である。そのため、ＪＯ−１は、潜在的に免疫原性であり得、繰り返し投与した後にその治療的活性に干渉し得るウイルスタンパク質である。試験した乳がん患者由来の血清試料３０のうち１０が、中和性Ａｄ３抗体について陽性であった（データは示していない）。これは、ヒトにおける（１０歳まで）中和性抗Ａｄ３抗体の血清分布率は約４０％であるという報告と一致する（Ｓａｋａｍｏｔｏら、１９９５年）。しかし、本発明者らは、抗Ａｄ３抗体陽性ヒト血清がＪＯ−１と反応しないことを示した（データは示していない）。中和性抗体の大部分はＡｄのヘキソンを対象とするので、これは驚くべきことではない（Ｓｕｍｉｄａら、２００５年）。抗ＪＯ−１陽性血清を得るために、マウスに、ＪＯ−１を用いてワクチン接種した（データは示していない）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験では、抗ＪＯ−１抗体による、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性ＢＴ４７４細胞のトラスツズマブによる死滅に対するＪＯ−１の増強効果への干渉は見いだされなかった（データは示していない）。これに沿って、健康なボランティアまたは乳がん患者由来のプールしたヒト血清も、ＪＯ−１の機能に干渉しなかった。
【０２５８】
考察
新規の併用治療薬としてのＪＯ−１。多くの領域におけるそれらの成功にもかかわらず、ｍＡｂの治療有効性は限られており、少数の患者のみが単独療法としてのこれらの作用剤に応答している。トラスツズマブおよびセツキシマブを含めた多くの抗がんｍＡｂの作用は、腫瘍細胞上の対応する標的受容体に結合することを必要とする。標的受容体が遮蔽されることまたはｍＡｂの腫瘍内の散在が妨げられることは、がん細胞の潜在的な遮蔽およびエスケープ機構である（Ｌｅｓｎｉａｋら、２００９年）。コラーゲンまたはラミニンなどの腫瘍間質タンパク質によって形成される関門に加えて、上皮がんの上皮の表現型によっても、ｍＡｂ療法に対する障害が創出される。最近の試験では、ムチン１などの上皮の特徴の発現が、トラスツズマブ抵抗性と相関することが報告された（Ｆｅｓｓｌｅｒら、２００９年）。さらに、Ｅ−カドヘリンが上方制御されることが、結腸直腸がんのセツキシマブ療法に対する抵抗性の一因となる（Ｏｌｉｖｅｒａｓ−Ｆｅｒｒａｒｏｓら、２０１１年）。
【０２５９】
腫瘍の浸潤および転移はＥＭＴを伴うことが長年にわたり公知であるが、最近の試験により、このプロセスは、間葉上皮転換（ＭＥＴ）によって逆転させることができることが示された（ＴｈｉｅｒｙおよびＳｌｅｅｍａｎ、２００６年）。上皮の結合を含めた上皮の特徴を回復させることは、同様に腫瘍を抗がん治療から遮蔽する腫瘍の防御機構を示すと思われる（Ｂｒｅｎｎａｎら、２０１０年；Ｓｔｒａｕｓｓら、２００９年；ＴｈｉｅｒｙおよびＳｌｅｅｍａｎ、２００６年）。この状況において、主要な卵巣がん細胞に対する試験において、化学療法抵抗性の獲得および推定上のがん幹細胞の形成は、ＭＥＴによく似た過程を伴うことが見いだされた（Ｓｔｒａｕｓｓら、２０１１年）。
【０２６０】
本発明者らは、上皮の結合の一過性の溶解を可能にする手法により、トラスツズマブおよびセツキシマブなどのｍＡｂの治療有効性が改善され得るという仮説を立てた。基本的なアデノウイルス学的（ａｄｅｎｏｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ）試験の状況において、小さな組換えタンパク質ＪＯ−１を設計した。ＪＯ−１がＤＳＧ２と結合することにより、一過性の密着結合の開口がもたらされた。これにより、ヒト上皮腫瘍細胞を伴う一連の異種移植モデルにおいて、腫瘍におけるトラスツズマブの浸透が増大し、ｍＡｂ標的受容体へより接近しやすくなり、それが今度は、ｍＡｂ療法を容易にした。潜在的に、ＪＯ−１とトラスツズマブおよびＪＯ−１とセツキシマブの組み合わせにより、これらのｍＡｂの有効用量を減らし、それにより、重大な副作用、すなわち、トラスツズマブに関連する心毒性およびセツキシマブ療法中に起こることも多いざ瘡様発疹を軽減することが可能になり得る。
【０２６１】
ＪＯ−１は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて高収率で産生させることができるので、開発するのに魅力的な治療薬である。特に、ＤＳＧ２を群がらせることができないＤＳＧ２リガンド、例えば、ＤＳＧ２に対するモノクローナル抗体などは、この試験において使用する腫瘍モデルにおける結合の開口において非効率的である。本発明者らの知るところでは、ＤＳＧ２と結合し、腫瘍をｍＡｂに対して感作することができる他の開発中の療法はない。一連の病原体は、結合の完全性を破壊するための機構を進化させてきた。例えば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ株は、腸の上皮の結合を可逆的に変化させ、巨大分子が粘膜関門を通って通過することを可能にすることができるＺｏｎａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ毒素（Ｚｏｔ）を産生する（Ｆａｓａｎｏら、１９９１年）。Ｚｏｔ由来のヘキサペプチド（ＡＴ−１００１）が開発されてきたが、セリアック病の患者における臨床試験は、最近、安全性の懸念および有効性の欠如により中止された。
【０２６２】
作用機構。本発明者らのデータにより、ＪＯ−１により、上皮腫瘍において、２つの潜在的に関連する機構：細胞間結合におけるＤＳＧ２二量体の破壊および／またはＥ−カドヘリンおよび潜在的に他の結合タンパク質を減少させる細胞内シグナル伝達を通じて、結合の開口が誘発されることが示唆されている。カドヘリンは隣接する細胞間で二量体を形成するので、いくつもの病原体は、カドヘリンの細胞外ドメイン内の切断を誘発するための機構を進化させてきた。胃腸管を介して血流に浸潤することができる生物体であるＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓは、Ｅ−カドヘリンと結合し、Ｅ−カドヘリンの細胞内ドメインと細胞外ドメインの両方の切断を誘発し、それにより、近接する上皮細胞間のホモタイプの相互作用を不安定にする（ＦｒａｎｋおよびＨｏｓｔｅｔｔｅｒ、２００７年）。さらに、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓエンテロトキシンおよびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパインがＥ−カドヘリンの分解に関連づけられている（Ｋａｔｚら、２０００年；Ｗｕら、１９９８年）。これらの試験ではどちらも、Ｅ−カドヘリンの切断の原因が、特異的な細菌のプロテアーゼであるとされた。本発明者らのデータにより、Ａｄ３が同様の機構を使用して気道内の上皮性関門を突破することが示唆されている。本発明者らは現在、ＤＳＧ２切断の機構について試験している。進行中の試験では、ＪＯ−１の結合により、ＤＳＧ２内部のコンフォメーションの変化が誘発されることを決定することを試みている。最近考察されている通り、ＤＳＧ２二量体の溶解により、今度は、頂端により多く局在している密着結合が不安定になり得る（Ｋｏｅｓｅｒら、２００３年）。
【０２６３】
上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に基づいて、Ａｄ３がＤＳＧ２と結合することにより、Ｅｒｋ１／２およびＥＭＴに関与する他の経路の活性化が誘発される。この試験により、静脈内にＪＯ−１を注射してから１時間以内に腫瘍におけるＥｒｋ１／２が活性化されることが示されている。本発明者らの所見は、カドヘリンが、受容体チロシンキナーゼを伴う双方向的なシグナル伝達に関わって細胞間結合を調節することを示す以前の報告と一致する（Ｋｌｅｓｓｎｅｒら、２００９年）。本発明者らは現在、上皮の結合の維持におけるＤＳＧ２の役割をよりよく説明するために、種々のＤＳＧ２ノックアウトモデルおよび切断／突然変異ＤＳＧ２変異体を生成している。
【０２６４】
正常な上皮組織に対する副作用。ヒトおよび非ヒト霊長類において、ＤＳＧ２は胃腸管および気道で発現される（Ｌｉら、２０１１年）。ＤＳＧ２のマウスオルソログはＡｄ３またはＪＯ−１によって認識されないので（Ｗａｎｇら、２０１１年ｂ）、正常なマウスにおける安全性試験は比較的不十分である。したがって、ヒトＤＳＧ２遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスを生成した。これらの動物におけるヒトＤＳＧ２の発現パターンおよびレベルは、ヒトにおいて見いだされるものと同様であった。さらに、トランスジェニックマウス上皮細胞においてＪＯ−１がヒトＤＳＧ２と結合することにより、ヒト細胞において観察されたデータと同様の程度に結合の開口が誘発されることが示された。ＤＳＧ２−トランスジェニックマウスを用いた予備試験では、静脈内にＪＯ−１を注射すること（２ｍｇ／ｋｇ）による重大な副作用は見いだされなかった（Ｌｉら、２０１１年）。正常な上皮細胞内のＤＳＧ２は、静脈内に適用されたＪＯ−１とすぐには接近可能ではないことが推測される。他方では、腫瘍に関連する血管の漏出および厳密な細胞の極性化の欠如が増すことにより、上皮腫瘍のＪＯ−１に対する反応性がより高くなる可能性がある。ＪＯ−１リガンドを静脈内注射した後の毒性がないことは、Ａｄ３線維を含有するアデノウイルスを用いた試験によっても強調される。これらのウイルスは、ＤＳＧ２と結合し、ＪＯ−１と同じ様に結合に作用する。Ａｄ５／３腫瘍退縮ベクターまたはＡｄ３腫瘍退縮ベクターのヒトへの静脈内注射は安全であることが見いだされた（Ｈｅｍｍｉｎｋｉら、２０１０年；Ｋｏｓｋｉら、２０１０年）。本発明者らは現在、安全な治療薬としてのＪＯ−１の可能性を検証するために、非ヒト霊長類およびＤＳＧ２−トランスジェニックマウスにおいて詳細な毒性試験を行っている。
【０２６５】
ＪＯ−１免疫原性。ＪＯ−１は、ウイルスタンパク質であるので、特に、繰り返し注射した後にはヒトにおいて適応性の免疫応答が発生する可能性がある。しかしこれは、臨床的な問題ではないと思われる。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性転移性乳がんの第一選択治療は、化学療法薬（ドキソルビシン、シクロホスファミド、パクリタキセル、またはドセタキセル）と組み合わせたトラスツズマブである。また、非小細胞肺がん患者においては、セツキシマブを化学療法薬（ビノレルビン＋シスプラチン）と組み合わせて使用する。免疫抑制性の化学療法により、ＪＯ−１に対する免疫応答予防される可能性がある。さらに、この予想は、腫瘍退縮性のアデノウイルスベクターを用いた試験によって裏付けられる。これらの試験では、免疫抑制により、繰り返しベクターを適用することが可能になる（Ｔｈｏｍａｓら、２００８年）。他方では、免疫適格性のがん患者においてＪＯ−１を使用することができれば、有益だと思われる。例えば、ＪＯ−１は、理論的に、既存の抗腫瘍Ｔ細胞または移植された抗腫瘍Ｔ細胞の接近および腫瘍内への浸透を増大させることにより、免疫賦活性の単独療法としての機能を果たし得る。腫瘍に特異的なＴ細胞は、無処置の乳がん患者において、疾患の後期においてさえ頻繁に見いだされ、これらの細胞をマウスに移すと、異種移植された自己の腫瘍を拒絶することが示されている（Ｂｅｃｋｈｏｖｅら、２００４年；Ｄｉｓｉｓら、１９９４年；Ｄｉｓｉｓら、２０００年；Ｆｅｕｅｒｅｒら、２００１年；Ｔｏｓｏら、１９９６年）。したがって、本発明者らは、ＪＯ−１免疫原性のより詳細な調査を開始した。ヒトのおよそ３分の１がＡｄ３に対する中和性抗体を有するという事実にもかかわらず、本発明者らの試験により、これらの抗体はＪＯ−１と相互作用しないことが示された（付録図５）。さらに、マウスにワクチン接種することにより生成された抗ＪＯ−１抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、トラスツズマブによる死滅に対するＪＯ−１の増強効果に影響を及ぼさなかった。これは、ＪＯ−１−ＤＳＧ２相互作用の親和性が高いことに起因する可能性が最も高い（Ｗａｎｇら、２０１１年ａ）。本発明者らは現在、抗ＪＯ−１免疫応答が、その有効性にどのように影響を及ぼすかを調査するために、ｈｕ−ＤＳＧ２−トランスジェニックマウスにおいて同系の腫瘍を確立している。
【０２６６】
腫瘍の浸潤および転移の増強に対する潜在的な危険性。他の試験（Ｗａｎｇら、２０１１年ｂ）、（Ｂｉｅｄｅｒｍａｎｎら、２００５年）、（Ｈａｒａｄａら、１９９６年）、（Ｓｃｈｍｉｔｔら、２００７年）、（Ｔｒｏｊａｎら、２００５年）、（Ａｂｂｏｄら、２００９年）と一致して、本発明者らは、悪性の組織におけるＤＳＧ２の発現が周囲の正常な上皮組織よりも高いことを見いだした。さらに、子宮頚部扁平上皮がん（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）における最近の試験により、他の全てのデスモソームタンパク質とは対照的に、ＤＳＧ２は浸潤がんにおいて上方制御されることが実証された（Ｋｕｒｚｅｎら、２００３年）。しかし、浸潤性の膵臓癌または胃がんにおいてＤＳＧ２の量が減少していることが報告されている試験もある（Ｒａｍａｎｉら、２００８年；Ｙａｓｈｉｒｏら、２００６年）。後者、ならびにＪＯ−１によりＥＭＴ様シグナル伝達が誘発されるという所見は、ＪＯ−１により転移が容易になるかどうかという疑問を生じる可能性がある。特に、この試験において使用する全てのモデルでは、ＪＯ−１単独で処置した動物において腫瘍の増殖への刺激または肉眼で見える／顕微鏡レベルの転移の徴候は見られなかった。腫瘍の浸潤および転移には、一過性を超えるＥＭＴ経路の活性化が必要である。上皮がんからの脱離および腫瘍細胞の遊走は、腫瘍間質の変化および上皮細胞の間葉細胞への表現型の再プログラミングをもたらす悪性細胞と腫瘍微小環境の間の長期のクロストーク後にのみ可能である（Ｇｕａｒｉｎｏ、２００７年）。
【０２６７】
要約すると、上皮の結合開口薬であるＪＯ−１は、がんのｍＡｂ療法を有効性と安全性の両方に関して、すなわち、治療用ｍＡｂの用量の低減を可能にすることによって改善する可能性を有する。この試験により、上皮細胞でのＡｄ３の感染の機構も明らかになる。
【０２６８】
材料および方法
タンパク質および抗体。ＪＯ−１（Ａｄ３−Ｋ／Ｓ／Ｋｎとしても公知）の生成については、以前に記載されている（Ｗａｎｇら、２０１１年ａ）。ＪＯ−１は、他で記載されている通り、ｐＱＥ３０発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて産生させ、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースクロマトグラフィーによって精製した（Ｗａｎｇら、２００７年）。組換えＡｄ３ペントン１２面体（ＰｔＤｄ）タンパク質複合体は、他で記載されている通り、昆虫細胞において産生させ、精製した（Ｆｅｎｄｅｒら、１９９７年）。
【０２６９】
免疫蛍光試験またはウエスタンブロットのために以下の抗体を使用した：ポリクローナルヤギ抗ＤＳＧ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、マウスｍＡｂ抗ＤＳＧ２（クローン６Ｄ８）（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｎｔｏｎ、ＭＡ）、ウサギ抗クローディン７（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ウサギ抗ＥＧＦＲ（Ａｂｃａｍ）、マウス抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（Ａｂｃａｍ）、マウス抗Ｅ−カドヘリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ホスホ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫに対するマウスｍＡｂ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウス抗Ｅｒｋ１／２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウス抗ホスホ−Ｅ−カドヘリン（ｐＳ８３８／８４０）（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、マウス抗６−Ｈｉｓ（Ｑｉａｇｅｎ）。
【０２７０】
細胞株。ＢＴ４７４−Ｍ１細胞は、１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを伴うＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。ＨＣＣ１９５４乳がん、Ａ５４９肺がんおよびＮＣＩ−Ｎ８７？？？？細胞は、１０％のＦＢＳおよび１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを伴うＲＭＰＩ中で培養した。ＳＫＯＶ３−ｉｐ１細胞はＭＥＢＭ培地中で培養した。結腸がんＴ８４細胞は、１０％のＦＢＳ、ＧｌｕおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを加えたＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地とＤＭＥＭの１：１混合物中で培養した。細胞の極性化を実現するために、１．４×１０５Ｔ８４細胞をコラーゲンでコーティングした６．５ｍｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌインサート（孔サイズ０．４μｍ）（Ｃｏｓｔａｒ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｒｓ）中で、経上皮抵抗性が安定するまで１４〜２０日の期間にわたり培養した（Ｗａｎｇら、２０１１年ｂ）。
【０２７１】
免疫蛍光分析。細胞をチャンバーガラススライド（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）内で培養し、氷冷のＰＢＳで２回洗浄し、次いで、メタノール／アセトン（１：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用いて４℃で１５分間にわたって、または４％のパラホルムアルデヒドを用いて４℃で３０分間わたって固定した。固定後に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後、２％の粉乳（ＢｉｏＲａｄ）を含有するＰＢＳを用いて室温で２０分間にわたって遮断した。抗体をＰＢＳ中に希釈し（クローディン７  １：１００、ＤＳＧ２  １：１００、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  １：５０、ＥＧＦＲ  １：５０、Ｅ−カドヘリン１：１００、ヒトＩｇＧ  １：４００、ホスホ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ  １：４００、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ  １：５００）、細胞を室温で９０分間にわたって、または４℃で一晩染色した。必要な場合には、ＰＢＳを用いて室温で３０分間にわたって３回洗浄した後に、適切に指向させた二次抗体を適用した。ＤＡＰＩを伴うＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を用いてガラススライドをマウントした。写真をＬｅｉｃａ  ＤＦＣ３００ＦＸデジタルカメラを使用して得た。Ｚｅｉｓｓ  ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡で、４０×油浸レンズまたは１００×油浸レンズおよびＺｅｉｓｓ５１０ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を使用して共焦点像を取得した。
【０２７２】
組織。ヒト乳がんのパラフィン切片を脱パラフィンし、再水和させた。Ｖｅｃｔｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｐＨ  ６．０（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて抗原の回収（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を実施した。マウス抗ＤＧＳ２抗体（３Ｇ１３２）（Ａｂｃａｍ）を１：１０に希釈した。Ｐｏｌｉｎｋ−２  ＨＲＰ  Ｂｒｏａｄ  Ｋｉｔ（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．  Ｍｕｋｉｌｔｅｏ、ＷＡ）および基質としてＤＡＢを使用して免疫組織学的検査を実施した。
【０２７３】
ウエスタンブロット。異種移植腫瘍組織を解剖し、手動でホモジナイズし（組織破壊器）、タンパク質溶解緩衝液［２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＥＧＴＡ、１０％のグリシン、１％のトリトンＸ１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手）、およびプロテアーゼ／ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ）阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  ａｎｄ  ＰｈｏｓＳＴＯＰ、Ｒｏｃｈｅ）］中、氷上で３０分インキュベートした。集密になった培養細胞を氷冷のＰＢＳで２回洗浄し、次いで、タンパク質溶解緩衝液中、氷上で３０分溶解させた。試料をペレットにし（１０分、４℃、１５，０００ＲＰＭ、タンパク質を含有する上清を−８０℃で保管した。ウエスタンブロット手順のために合計８０μｇの総タンパク質を使用した。タンパク質試料を煮沸し（９５℃で５分）、１０％のビス−トリスゲルおよびＭＯＰＳ緩衝液（Ｎｏｖｅｘ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離し、次いで、供給者（ｉＢｌｏｔ，ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってニトロセルロース膜に転写した。膜を０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ、Ｓｉｇｍａ）および５％の粉乳を含有するＰＢＳ中でブロックした。一次抗体および二次抗体についてのインキュベーション時間は、それぞれ４℃で１６時間および室温で１時間であった。抗体をＰＢＳ−Ｔおよび５％の粉乳中に希釈した［ヒトＩｇＧ  １：１０００、ＤＳＧ２  １：５００、Ａｄ３−Ｋ  血清  １：２０００、ｐ−Ｅ−カドヘリン  １：２０００、Ｅ−カドヘリン  １：１０００、クローディン７  １：５００、ビメンチン  １：２０００、ホスホ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）１：２０００、Ｅｒｋ１／２  １：２０００］。抗体をインキュベートしている間に膜をＰＢＳ−Ｔ中で５回洗浄し、ＥＣＬプラス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）またはＯｄｙｓｓｅｙシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて薄膜を展開した。
【０２７４】
ＤＳＧ２  ｍＲＮＡ  ＰＣＲ：乳がんにおけるＤＳＧ２の発現レベルを評価するために、１μｇの全ＲＮＡについて、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して逆転写を実施した。ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現を参照として使用した。７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてＳｅｎｓｉＭｉｘ  ＳＹＢＲ  Ｋｉｔ（Ｑｕａｎｔａｃｅ）を使用して定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を３連で実行した。以下のプライマーを使用した：
【０２７５】
【化１２】
2013538040.tif 000023
【０２７６】
ｑＰＣＲを以下の条件下で実施した：最初の９５℃で１０分の酵素活性化ステップの後、それぞれ９５℃で１５秒および６０℃で１分間からなる増幅サイクルを４０サイクル行った。最後に、最終的な伸長ステップを６０℃で２分実施した。
【０２７７】
浸透性アッセイ。合計５×１０５個のＴ８４細胞を１２ｍｍのｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート［ＰＥＴ膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）、孔サイズ０．４μｍ］に播種し、経上皮抵抗性が安定するまで１４〜２０日間培養した。２〜３日ごとに培地を交換した。細胞を、接着培地（ＤＭＥＭ、１％のＦＢＳ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）中でＤＳＧ２リガンド（２０μｇ／ｍｌ）に室温で１５分間にわたって曝露させた。その後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で希釈した１ｍＣｉの［１４Ｃ］ポリエチレングリコール−４０００（ＰＥＧ−４０００）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｃｏｖｉｎａ  ＣＡ）を内部チャンバーに加えた。１５分の時点および３０分の時点で内部チャンバーおよび外側のチャンバーから培地の一定分量を採取し、シンチレーション計数器によって測定した。浸透性を他で記載されている通り算出した（Ｙａｎｇら、２００４年）。
【０２７８】
トラスツズマブおよびセツキシマブ細胞毒性アッセイ。
【０２７９】
ＢＴ４７４細胞またはＡ５４９細胞を、３連で、９６ウェルプレートにウェル当たり細胞５×１０４個の密度で播き、集密になるまで成長させた。ＪＯ−１（５００ｎｇ／ｍｌ）を培地に加えた。１２時間後に、トラスツズマブまたはセツキシマブ（１５μｇ／ｍｌ）を加え、その２時間後にＷＳＴ−１アッセイ（Ｒｏｃｈｅ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）によって細胞の生存率を測定した。３回の独立した試験を実施した。
【０２８０】
電子顕微鏡法。ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー内の極性細胞を、半強度カルノフスキー固定液（２％のパラホルムアルデヒド、２．５％のグルタルアルデヒド、および０．２Ｍのカコジル酸緩衝液）を用いて、室温で１時間にわたって固定した。内部チャンバー内の固定液は、０．２％のルテニウムレッドを含有した。ルテニウムレッド［塩化ルテニウム（ＩＩＩ）酸化物、アンモニア処理した］は、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＭＡ）から購入した。１％のＯｓＯ４−リン酸緩衝液を用いて後固定を行った。ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーから膜を切り取り、Ｍｅｄｃａｓｔ（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）に包埋した。超薄切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。加工した格子をＪＥＯＬ  ＪＥＭ１２００ＥＸＩＩ透過形電子顕微鏡を用いて評価した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＳＩＳ  ＭｏｒａｄａデジタルＣＣＤカメラを用いて画像を獲得し、画像を加工するためにｉＴＥＭソフトウェアを使用した。
【０２８１】
動物試験：動物を必要とする全ての実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎにより定められた施設のガイドラインに従って行った。マウスを特定の病原体を含まない施設内に収容した。がん細胞４×１０６個をＣＢ１７  ＳＣＩＤ−ベージュマウスの乳房の脂肪パッドに注射することによって乳がん異種移植片を確立した。トラスツズマブを１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内に注射した（ｉ．ｐ．）。ＰｔＤｄまたはＪＯ−１を２ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に与えた（ｉ．ｖ．）。腫瘍体積を以前に記載されている通り測定した（Ｔｕｖｅら、２００７年）。腫瘍体積が１，０００ｍｍ３に到達するか、または潰瘍化したらマウスを屠殺した。４×１０６個のＡ５４９をＣＢ１７  ＳＣＩＤベージュマウスの右側腹部に皮下注射（ｓ．ｃ．）することによって肺がん異種移植片を確立した。１２日目にＪＯ−１をｉ．ｖ．注射した１０時間後にセツキシマブを１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．で注射し、これを３日後に繰り返した。播種性肺の腫瘍モデルについては、８週齢の雄のＣＢ１７  ＳＣＩＤ−ベージュマウスに、１日目にＡ５４９細胞２×１０６個を静脈内注射した。ＪＯ−１（２ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ）およびセツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）を用いた処置を１０日目に開始し、３日ごとに繰り返した。動物を、体重減少および呼吸困難の徴候についてモニターした。非処置群の最初のマウスが瀕死の状態になったら動物を屠殺した。墨汁（ＰＢＳ中１５％）を気管内に注射した後、肺を取り出した。正常な組織が黒いのに対して転移は非染色（白色）として現れた。抗ＪＯ−１抗体を産生させるために、他で記載されている通りマウスにフロイントアジュバントと混合したＪＯ−１を皮下注射した（Ｌｉら、２００９年）。
【０２８２】
ＨＳＣベースのレラキシンの発現：プロトコールは、他で記載されている（Ｂｅｙｅｒら、２０１１年）。簡単に述べると、移植レシピエントは、６〜１０週齢の雌のＣＢ１７  ＳＣＩＤ−ベージュマウスであり、レンチウイルスベクターで形質導入された、５−ＦＵ−処置したマウス由来の骨髄細胞６×１０５個を尾静脈注射する直前に３５０ｃＧｙを用いて亜致死的に放射線を照射した。細胞がレシピエントの骨髄に生着したことを確認した後、合計４×１０６個のＨＣＣ１９５４を乳房の脂肪パッドに注射した。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の制御下で、レラキシンを発現しているレンチウイルスベクターについては、以前に記載されている（Ｂｅｙｅｒら、２０１１年）。
【０２８３】
中和性抗体アッセイ：患者に化学療法を行う前にがん患者由来の血清試料を取得した。簡単に述べると、２９３細胞を、９６ウェルプレートにウェル当たり細胞４×１０４個で播種し、３７℃でインキュベートした。次の日に、血清試料を５６℃で３０分間にわたって熱失活させ、２％のＦＣＳを含有するＭＥＭ中に１：２から１：１，２０４まで段階的に希釈した。１０μｌのＭＥＭ中の野生型Ａｄ５または野生型Ａｄ１１の細胞当たり合計２０のプラーク形成単位（ＰＦＵ）を各血清希釈液１００μｌと一緒に３７℃で１時間インキュベートした。前日に播いた細胞から培地を除去し、ウイルスを含有する血清５５μｌを２９３増殖培地４５μｌと一緒に細胞に加えた。感染後３日目および６日目に、さらに１００μｌの２９３増殖培地を細胞に加えた。感染後８日目に、細胞を、細胞変性の効果（ＣＰＥ）の存在について分析し、１：２以上の希釈度においてＣＰＥが見られなかった場合、血清試料を中和性抗体の存在について正にスコア化した。
【０２８４】
統計分析：
結果は全て、平均＋／−ＳＤとして表されている。多数の試験に対して、適用可能な場合ステューデントのｔ検定または二元配置ＡＮＯＶＡを適用した。ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
【０２８５】
実施例３の参考文献
【０２８６】
【数１０】
2013538040.tif 000024
【０２８７】
【数１１】
2013538040.tif 000025
【０２８８】
【数１２】
2013538040.tif 000026
【０２８９】
【数１３】
2013538040.tif 000027
【０２９０】
【数１４】
2013538040.tif 000028
【０２９１】
【数１５】
2013538040.tif 000029
【図１】
2013538040.tif 000034
【図２】
2013538040.tif 000035
【図３】
2013538040.tif 000036
【図４】
2013538040.tif 000037
【図５】
2013538040.tif 000038
【図６】
2013538040.tif 000039
【図７】
2013538040.tif 000040
【図８】
2013538040.tif 000041
【図９】
2013538040.tif 000042
【図１０】
2013538040.tif 000043
【図１１】
2013538040.tif 000044
【図１２】
2013538040.tif 000045
【図１３】
2013538040.tif 000046
【図１４】
2013538040.tif 000047
【図１５】
2013538040.tif 000048
【図１６】
2013538040.tif 000049
【図１７】
2013538040.tif 000050
【図１８Ａ】
2013538040.tif 000051
【図１８Ｂ】
2013538040.tif 000052
【図１９】
2013538040.tif 000053
【図２０】
2013538040.tif 000054
【図２１】
2013538040.tif 000055
【図２２Ａ】
2013538040.tif 000056
【図２２Ｂ】
2013538040.tif 000057
【図２２Ｃ】
2013538040.tif 000058
【図２３】
2013538040.tif 000059
【図２４】
2013538040.tif 000060
【配列表】
2013538040000001.app
【国際調査報告】
2013538040.tif 000061
2013538040.tif 000062