(57)【要約】  本発明は、ホヤ由来の新規環状デプシペプチドおよびこの環状デプシペプチドを用いて多能性幹細胞を多能性を維持しつつ培養する方法を提供する。
2013530125.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式で表される環状デプシペプチドであって；
【化１】
2013530125.tif 000006
式中、R1およびR2がそれぞれHまたはC1-C6アシル基であり、R3-R11はそれぞれHまたはC1-C6アルキル基である環状デプシペプチド。
【請求項２】
R1およびR2がプロピオニル基であり、R3、R6、R8、R10がメチル基、R4、R5、R7、R9、R11がHである、請求項１に記載の環状デプシペプチド。
【請求項３】
多能性幹細胞を多能性を維持しつつ培養する方法であって、請求項１または２に記載の環状デプシペプシドを含む培地で多能性幹細胞を培養することを含む方法。
【請求項４】
人工多能性幹細胞の樹立効率を改善する方法であって、核初期化物質が導入された体細胞を請求項１または２に記載の環状デプシペプシドを含む培地で培養することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウスボヤ科ホヤ由来の新規環状デプシペプチドおよびこの環状デプシペプチドを用いて多能性幹細胞を多能性を維持しつつ培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞の未分化性維持のためには、フィーダー細胞もしくはLIF（Leukemia Inhibitory Factor、マウス）／FGF（Fibroblast Growth Factor、ヒト）存在下、ウシ胎仔血清を含む未分化維持培地中で培養するのが一般的である。しかしながら多能性幹細胞の医療への利用を考えた場合、異種動物成分の混入を避けるためにも無血清・無フィーダー培養法の開発は欠かせない。同時に、LIF/FGFは高価であるため、その機能を代替しうる低分子化合物の開発が望まれている。2006年にDingらはpluripotinという化合物投与下（1 μM）でマウス胚性幹（ES）細胞の未分化性が維持されることを報告している（非特許文献１）。2008年にSmithらは、3つの低分子阻害剤（3i: PD184352, Su5402, CHIR99021）ないしは2つの低分子阻害剤(PD0325901, CHIR99021)によって、多能性細胞の未分化状態維持に必要なLIFの機能が代替されうることを報告した（非特許文献２）。このとき使用された阻害剤のひとつであるPD0325901は、その後Dingらによって人工多能性幹（iPS）細胞のリプログラム効率を200倍活性化する因子として機能することが示され（非特許文献３）、未分化維持活性化合物はリプログラム過程を研究するための低分子プローブとしても有用であることが明らかになった。また、2010年にDingらは、ROCK（Rho-associated kinase）の低分子阻害剤であるthiazovivin（Tzv）を投与したヒトES細胞では、E-カドヘリンが安定化された結果、細胞自身の生存率が向上することを見出した（非特許文献４）。さらに、DingらはヒトES細胞とマウスES細胞の特性の違いがあることを示した。これは、ヒトESが、未分化性の維持にFGF依存的であることに対して、マウスESではLIF依存的な未分化性の維持であることである。さらに、マウスES細胞ではE-カドヘリンを介するシグナル伝達が未分化維持に関わるのに対して、ヒトES細胞では主にインテグリンを介するシグナル伝達によって未分化性が維持されていることを明らかにした。その結果、Dingらは、マウスES細胞の未分化性を向上させる活性が知られる２種のMAPK阻害剤のPD0325901（MEK阻害剤）とSB203580（p38阻害剤）をLIFとともに加えた培地でヒトES細胞を培養することで、マウスと同様にLIF依存的な未分化維持へと性質を変えたヒトES細胞株の誘導に成功している。以上のように、多能性幹細胞の未分化性維持を標的とするような低分子化合物群は、幹細胞を用いた医療の開発のみならず、細胞の分化・未分化維持機構の解明にとっても極めて有用な知見を与えうるツールとして高い価値を有する。
【０００３】
また、環状デプシペプチドは、環構造を有する、少なくとも２つのα−アミノ酸と少なくとも１つのα−ヒドロキシカルボン酸との配列を含有し、少なくとも１つのペプチド結合と、ヒドロキシカルボン酸から誘導されたエステル結合を介して結合した化合物である。この化合物は、細菌等の天然生物から抽出され、様々な生物活性を有することが報告されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Chen S et al. PNAS 2006, 103,17266-17271
【非特許文献２】Ying QL et al. Nature 2008, 453, 519-523
【非特許文献３】Lin T et al. Nature Methods 2009, 6, 805-808
【非特許文献４】Xu Y et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010, 107, 8129-34
【非特許文献５】Taniguchi et al. Tetrahedron 2003, 59, 4533-4538
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ウスボヤ科ホヤ由来の新規環状デプシペプチドおよびこの環状デプシペプチドを用いて多能性幹細胞を多能性を維持しつつ培養する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明は以下の特徴を有する。
（１）以下の式で表される環状デプシペプチドであって；
【化１】
2013530125.tif 000003
式中、R1およびR2がそれぞれHまたはC1-C6アシル基であり、R3-R11はそれぞれHまたはC1-C6アルキル基である環状デプシペプチド。
（２）R1およびR2がプロピオニル基であり、R3、R6、R8、R10がメチル基、R4、R5、R7、R9、R11がHである、（１）に記載の環状デプシペプチド。
（３）多能性幹細胞を多能性を維持しつつ培養する方法であって、（１）または（２）に記載の環状デプシペプシドを含む培地で多能性幹細胞を培養することを含む方法。
（４）人工多能性幹細胞の樹立効率を改善する方法であって、核初期化物質が導入された体細胞を（１）または（２）に記載の環状デプシペプシドを含む培地で培養することを含む方法。
【０００７】
本発明のウスボヤ科ホヤ由来の単離された新規環状デプシペプチドを用いることにより、多能性幹細胞を多能性を維持しつつ培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、逆相HPLCのデータを示す。保持時間４分における下線のピークがサメウラミドを示す。
【図２】図２（a）および（b）は、それぞれ、サメウラミドの1H NMRスペクトルおよび13C NMRスペクルを示す。
【図３ａ】図３は、サメウラミドの二次元NMRスペクトルの分析結果を示す。図３（a）、（b）および（c）は、それぞれCOSY、HMQCおよびHMBCスペクトルを示す。
【図３ｂ】図３は、サメウラミドの二次元NMRスペクトルの分析結果を示す。図３（a）、（b）および（c）は、それぞれCOSY、HMQCおよびHMBCスペクトルを示す。
【図３ｃ】図３は、サメウラミドの二次元NMRスペクトルの分析結果を示す。図３（a）、（b）および（c）は、それぞれCOSY、HMQCおよびHMBCスペクトルを示す。
【図４】図４は、サメウラミドのESI法による質量分析結果を示す。
【図５】図５は、サメウラミドの赤外吸収スペクトルを示す。
【図６】図６は、サメウラミドの構造式（a）ならびにサメウラミドの平面構造、およびCOSYまたはHMBCの主要な相関（b）を示す。図中、β-HyLeuはβ-hydroxyleucine、N,O-Me2ThrはN,O-dimethylthreonine、N-MeDhaはN-methyldehydroalanine、Alaはalanine、N-MeAlaはN-methylalanine、Plaは3-phenyllactic acidおよびPrはプロピオニル基を示す。
【図７】図７は、サメウラミドのNMR解析結果を示す。ここでResidueに記載の残基は図６aに記載の残基に相当する。
【図８】図８は、サメウラミド（1 nM）を用いて培養したES細胞の各日数での形態を示す位相差像である（写真）。図８(a)および(e)は2日間培養後の位相差像を示す。図８(b)および(f)は7日間培養後（3回継代）の位相差像を示す。図８(c)および(g)は13日間培養（6回継代）の位相差像を示す。図８(d)および(h)は19日間培養（8回継代）の位相差像を示す。(a)から(d)は、対物倍率4倍の像であり、(e)から(h)は、倍率10倍の像である。
【図９】図９は、サメウラミド（1 nM）を用いて培養したES細胞の免疫染色の結果およびフローサイトメトリー分析プロファイルを示す（写真）。図９(a)は、低血清（KSR）培地を用いた結果を示し、図９(b)は、血清培地を用いた結果を示す。図中、左図は、Nanog（緑色）およびDAPI（青色）による染色像を示し、中央図は、Oct3/4（赤色）とDAPI（青色）による染色像を示し、右図は、左図と中央図の重ねた像を示す。図９（c）は、SSEA1（赤色）およびDAPI（青色）による染色像を示す。図中、左図は、低血清（KSR）培地を用いた場合の結果を示し、右図は、血清培地を用いた場合の結果を示す。図９（d）は、フローサイトメトリーによる結果を示す。横軸にSSEA1の発現強度を縦軸に細胞数を示す。図中、左図は、無染色対照の結果を示し、中央図は、低血清（KSR）培地を用いた場合の結果を示し、右図は、血清培地を用いた場合の結果を示す。
【図１０】図１０は、サメウラミド（1 nM）を用いて培養したES細胞から発生したテラトーマのHE染色像を示す（写真）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明を以下に詳細に説明する。
【００１０】
本発明は、ウスボヤ科ホヤ由来の新規環状デプシペプチドおよびこれを用いて多能性幹細胞を多能性を維持しつつ培養する方法に関する。
【００１１】
本発明において、デプシペプチドとは、少なくとも２つのα−アミノ酸と少なくとも１つのα−ヒドロキシカルボン酸との配列を含有し、少なくとも１つのペプチド結合と，ヒドロキシカルボン酸から誘導されたエステル結合を介して結合した化合物である。環状デプシペプチドとは、少なくとも１つの環構造を有するデプシペプチドである。
【００１２】
本発明において好ましい環状デプシペプチドは、式（１）（式中、R1およびR2がそれぞれHまたはC1-C6アシル基であり、R3-R11はそれぞれHまたはC1-C6アルキル基である）で表される。
【化２】
2013530125.tif 000004
【００１３】
ここで、C1-C6アシル基は、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基等が挙げられる。C1-C6アルキル基は、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。より好ましい環状デプシペプチドは、サメウラミドと命名された式（２）で表された化合物である。
【化３】
2013530125.tif 000005
【００１４】
本発明において、前記式（１）で示される環状デプシペプチドは立体異性体、又はラセミ体を含む。
【００１５】
本発明の環状デプシペプチドは、ウスボヤ科のホヤより抽出することができる。例えば、
ホヤを室温にてメタノール中に浸漬し、得られたメタノール抽出液から分離することができる。分離手段としては、通常の方法を用いることができ、例えば、溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマト法、ゲルろ過法、透析法、沈殿法等を単独でまたは適宜組み合わせて抽出精製することができる。例えば、メタノール抽出液から、水-クロロホルム混合溶媒中の水層より抽出することができる。該環状デプシペプチドをさらに精製するには、オクタデシルシリル（ODS）シリカゲルを用いたクロマトグラフィーが例示される。この時、溶媒として、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトニトリルおよびクロロホルム等の有機溶媒もしくはこれらの有機溶媒と水との混合溶媒を用いてもよい。本発明において、さらに精製するために、ODSシリカゲル以外の逆相HPLC等を用いることもできる。この時、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトニトリルおよびクロロホルム等の有機溶媒と水の混合比率を変化させて、目的の化合物の保持時間を調節することができる。以上のような方法により、あるいはこれらを適宜組み合わせることにより、高純度の該環状デプシペプチドを得られる。
【００１６】
上述のように得られた環状デプシペプチドは、多能性幹細胞の維持培養に用いることができる。
【００１７】
本発明において、多能性幹細胞とは、外胚葉、中胚葉および内胚葉の３胚葉すべての細胞に分化可能である能力（多能性）を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、限定されないが、例えば胚性幹(ES)細胞[M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156, J.A. Thomson et al. (1999), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165]、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞[（Tada M et al. Curr Biol. 11:1553-8, 2001; Cowan CA et al. Science. 2005 Aug
26;309(5739):1369-73）]、精子幹細胞[(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)]、胚性生殖細胞[(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)]、人工多能性幹(iPS)細胞[（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007) Science, 318: 1917-1920; M. Nakagawa et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 101-106; 国際公開WO 2007/069666）]などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞、およびiPS細胞である。
【００１８】
本発明の方法において、多能性幹細胞は多能性を維持した状態で培養される。本発明の方法において、多能性幹細胞が多能性を維持していることは、特に限定されないが、アルカリホスファターゼ、Oct3/4またはNanogなどに例示される遺伝子マーカーの発現、コロニーの形成もしくはテラトーマの形成後の3胚葉組織への分化などを指標として確認することができる。
【００１９】
多能性幹細胞の培養においては、基本培地へ本発明の環状デプシペプチドを添加した培地を用いて行うことができる。基礎培地としては、例えばDoulbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM)培地、Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)培地、Ham’s F12培地、およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、さらに血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。好ましくは無血清である。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBS（ウシ胎仔血清）の血清代替物)、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、ならびに、脂質、アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有
しうる。
【００２０】
該環状デプシペプチドの濃度は、多能性が維持される限り特に限定されないが、0.05nM以上、0.1nM以上、0.5 nM以上、0.6nM以上、0.7 nM以上、0.8 nM以上、0.9 nM以上、または1.0 nM以上であり、100μM以下、50μM以下、40μM以下、30μM以下、20μM以下または10μM以下であればよい。好ましくは1.0 nMから10μMである。より好ましくは、1.0 nMである。
【００２１】
さらに本発明では、上述のように得られた環状デプシペプチドを用いて、iPS細胞の樹立効率を改善することができる。
【００２２】
iPS 細胞は、ある特定の核初期化物質を、DNA、RNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる。このとき核初期化物質と共に培地へ該環状ポリデプシペプチドを加えることによって、iPS細胞の作製効率を上げることができる。該環状ポリデプシペプチドは、初期化物質と同時に添加されてもよく、初期化物質を細胞へ導入した後に添加されてもよい。なお、初期化物質が導入された体細胞をiPS細胞が樹立されるまで環状ポリデプシペプチドを含む培地で培養し続けてもよいし、初期化物質が導入された体細胞を一定期間環状ポリデプシペプチドを含む培地で培養した後、環状ポリデプシペプチドを含まない培地で培養を継続し、iPS細胞を樹立してもよい。iPS細胞の作製効率は、同じ細胞数で環状ポリデプシペプチドを用いる以外の条件を同じにした場合に、作製されるiPS細胞数もしくはそのコロニー数から算出することができる。
【００２３】
ここで、核初期化物質は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Oct3/4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b, Nanog, EsrrbまたはEsrrgが例示される。これらの初期化物質は、iPS細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも１つ、２つもしくは３つ含む組み合わせであり、好ましくは４つを含む組み合わせである。
【００２４】
上記の各核初期化物質のマウスおよびヒトcDNAのヌクレオチド配列並びに該cDNAにコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI（National Center for Biotechnology Information: www.ncbi.nlm.nih.gov/）のaccession numbersとして示される。L-Myc、Lin28、Lin28b、EsrrbおよびEsrrgのマウスおよびヒトのcDNA配列およびアミノ酸配列情報については、それぞれ下記のNCBI accession numbersとして示される。当業者は、当該cDNA配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の核初期化物質を調製することができる。
【００２５】
遺伝子名    マウスアクセション番号  ヒトアクセション番号
L-Myc       NM_008506               NM_001033081
Lin28       NM_145833               NM_024674
Lin28b      NM_001031772            NM_001004317
Esrrb       NM_011934               NM_004452
Esrrg       NM_011935               NM_001438
【００２６】
これらの核初期化物質は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよいし、あるいは、DNAの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によっ
て体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-62, 2009）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができる。使用されるプロモーターとしては、例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など)、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、核初期化物質をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する核初期化物質をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にloxP配列を有してもよい。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる（Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009)、Woltjen et
al., Nature,458: 766-770 (2009) 、WO 2010/012077）。さらに、ベクターには、染色体への組み込みがなくとも複製されて、エピソーマルに存在するように、リンパ指向性ヘルペスウイルス、BKウイルスおよびウシパピローマウイルスの起点とその複製に係る配列を含んでいてもよい。例えば、EBNA-1およびoriPもしくはLarge TおよびSV40ori配列を含むことが挙げられる（WO 2009/115295、WO 2009/157201およびWO 2009/149233）。また、複数の核初期化物質を同時に導入するために、ポリシストロニックに発現させる発現ベクターを用いてもよい。ポリシストロニックに発現させるためには、遺伝子をコードする配列の間は、IRESまたは口蹄病ウイルス（FMDV）2Aコード領域により結合されていてもよい（Science, 322:949-953, 2008およびWO 2009/0920422009/152529）。
【００２７】
iPS細胞樹立のための基本培地としては、例えば(1) 10〜15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12またはDME培地（これらの培地にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）、(2) bFGFまたはSCFを含有するES細胞培養用培地、例えばマウスES細胞培養用培地(例えばTX-WES培地、トロンボＸ社)または霊長類ES細胞培養用基本培地（例えば霊長類（ヒト＆サル）ES細胞用培地、リプロセル、京都、日本）などが含まれる。
【００２８】
培養法の例としては、たとえば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEMまたはDMEM/F12培地上で体細胞と核初期化物質 (DNAまたはタンパク質) を接触させ約4〜7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞 (たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)
上にまきなおし、体細胞と核初期化物質の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培地で培養し、該接触から約30〜約45日またはそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。また、iPS細胞の誘導効率を高めるために、5-10％と低い酸素濃度の条件下で培養してもよい。
【００２９】
あるいは、その代替培養法として、フィーダー細胞 (たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等) 上で10％FBS含有DMEM培地（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25〜約30日またはそれ以上ののちにES細胞様コロニーを生じさせることができる。
【００３０】
上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培地と培地交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103〜約5×106細胞の範囲である。
【００３１】
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は、対応する薬剤を含む培地（選択培地）で培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。
【００３２】
本明細書中で使用する「体細胞」は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞 (組織前駆細胞) 等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞 (体性幹細胞も含む) であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
【００３３】
本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。
【実施例】
【００３４】
本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されないものとする。
【００３５】
実験方法
＜細胞培養＞
マウスES細胞（CCE）は、ゼラチンコートしたディッシュまたは96穴マイクロプレートにて、1000 U/mLのLIFを含むES細胞維持用血清培地｛knockoutDMEM（2 mM L-グルタミン、100μM 非必須アミノ酸、100 μM 2-メルカプトエタノール、5000 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシンを含む）とウシ胎仔血清（FBS）を85:15の割合で混合したもの｝を用いることで、未分化状態を維持したまま培養を行った。
【００３６】
低血清培地として、GMEM、1% 非必須アミノ酸、1% ピルビン酸、100μM 2-メルカプトエ
タノール、50 U/mL ペニシリン、50 mg/mLストレプトマイシン、1% FBS、15% Knock out serum replacement (KSRTM)を混合したものを用いた。
【００３７】
＜コロニー維持活性試験＞
96穴プレートに0.1% ゼラチン溶液を50μL/ well分注し、20分間放置してディッシュをゼラチンコートする。ゼラチン溶液を除去後、LIFを含まないES細胞維持培地を200μL添加し、ES細胞（400個/well）を播種する。ここに各サンプルを添加して、4日間インキュベート（37 ℃、5% CO2）したのちに顕微鏡下にて形態変化を観察し、コロニー維持活性を検討した。
【００３８】
＜免疫染色ならびにフローサイトメトリー＞
免疫染色ではOct3/4、NanogおよびSSEA1を、フローサイトメトリーではSSEA1の発現を検討した。
【００３９】
免疫染色は4% PFAで固定した後、0.5%triton-X含有PBSで浸透化処理を行い、１次抗体にanti-mouse Oct3/4抗体、anti-human Nanog抗体を用い、２次抗体でanti-mouse IgG-Alexa
546, anti-rabbit IgG-Alexa 488抗体を用いて染色を行った。Phycoerythrin conjugated anti-SSEA1抗体を用いた場合、2次抗体は用いなかった。全てDAPIと共染色を行った。
【００４０】
フローサイトメトリーは0.5mM EDTAにて細胞を培養皿より回収し、Phycoerythrin-conjugated anti-SSEA1抗体を用いて染色し、FACSAria IIを用いて、発現を評価した。
【００４１】
実施例１：サメウラミドの単離
宮城県石巻市鮫浦湾で採集したウスボヤ（Didemnidae）科の群体ボヤ（27 g）を室温にて3時間以上メタノール（100 mL×2）に浸漬させ抽出し、濃縮後、水（100 mL）とクロロホルム（50 mL×2）で二層分配を行った。得られた水層をODSカラムクロマトグラフィー｛φ1.2×15 cm；50% MeOH、70% MeOH、70% MeCN、85% MeCN、100% MeOH、CHCl3/MeOH/Water (ratio, 6:4:1）｝により分画し、得られた画分についてES細胞のコロニー維持活性試験により活性を調べた。強いコロニー維持活性を示した70% MeCNおよび85% MeCN画分をまとめて、逆相HPLC（カラム；Cosmosil 5C18 AR-II、φ1.0×25 cm、2.0 mL/min；50-100%
MeCN）により精製し（図１）、サメウラミドと命名した新規化合物2.3 mgを単離した。
【００４２】
実施例２：サメウラミドの構造決定
サメウラミドは白いアモルファス粉末で、旋光度は [α]D -75.9 (c 0.02, MeOH) を示した。各種NMRデータ（図２および図３）およびHRESI-MS（図４）から、サメウラミドの分子式はC50H77N7O15と決定した｛[M+Na]+、m/z 1038.5454（C50H77N7NaO15、calc 1038.5375）｝。赤外吸光測定（図５）により、-OH基および-NH基（3349 cm-1）、エステル（1749 cm-1）、およびアミド（1642 cm-1）の存在が示唆された。
【００４３】
1H NMRスペクトル（図２a）では、δH8.5-6.5に５つの交換可能なシグナルが観察され、13C NMR（図２b）ではδC 176-164にかけて10個のエステルもしくはアミドと思われるカルボニル炭素が認められたことから、サメウラミドはペプチドであることが示唆された。一方、δH 5.5-3.5付近にアミノ酸のα-プロトンと思われる複数のシグナルが観察されたが、このうちδH 5.25、5.09、3.57についてはそれぞれが結合する炭素のシグナル（δC 78.1、78.6、79.0）が低磁場シフトしていたことから、これらはオキシメチンであることが確認された。COSY（図３a）、HMQC（図３b）およびHMBC（図３c）スペクトルの解析の結果、これらはそれぞれ、β-ヒドロキシロイシン（β-HyLeu）-1、-2、-3のβ-位のメチンシグナルであるとアサインされた。なお、β-HyLeu-1のα-位（δH 5.14）とβ-位（δH 5.09）のプロトンについては、近接したケミカルシフトのため明瞭なCOSY相関が確認できず、この間の結合を証明するHMBC相関も観察されなかったが、それぞれの1Hシグナルが互
いにJ = 1.9 Hzでカップリングしていることから、互いに結合していることがわかった。また、それぞれのβ-位の1Hケミカルシフト値から、β-HyLeu-1および-2ではβ-位の酸素原子はエステル結合し（δH 5.09および5.25）、β-HyLeu-3では水酸基（δH 3.57）になっていると考えられた。このことはCOSYスペクトルにおいて、β-HyLeu-3ではヒドロキシプロトン（δH 6.91）とβ-位のメチンプロトン（δH 3.57）の間に相関が認められたことからも確認された。N,O-ジメチルトレオニン（N,O-Me2Thr）のN-、O-メチル基はそれぞれ、N-メチルからα炭素、O-メチルからβ炭素へのHMBC相関が認められたことから確認された。サメウラミドのNMRスペクトルには2つのアラニン様のスピン系が認められたが、一つはアラニン（Ala）でもう1つはN-メチルプロトン（δH 2.82）からアラニン様のスピン系（CH-CH3）のα炭素へのHMBC相関が観測されたことから、N-メチルアラニン（N-MeAla）であると確認された。また、δH 5.26および5.17の互いに小さな結合定数（J = 2.2 Hz）を示しているプロトンはδC 107.5の炭素に結合していることから、エキソメチレンプロトン由来であることがわかった。これらのプロトンからδC 146.7および164.7の炭素シグナルにHMBC相関が認められることと、N-メチルプロトン（δH 3.20、δC37.0）からδC
146.7のシグナルにもHMBC相関が認められることから、この残基はN-メチルデヒドロアラニン（N-MeDha）であることが明らかになった。
【００４４】
これらのアミノ酸残基以外にも、フェニルアラニン様のスピン系が観察されていたが、α炭素の化学シフト（δC 72.23）からオキシ酸であるフェニル乳酸（Pla）であることが明らかになった。また、2つのプロピオン酸ユニットが、それぞれβ-HyLeu-1および-3のアミノ基に結合していることが明らかになった。
【００４５】
以上、COSY、HMQC、HMBCを含む2次元NMRスペクトルの解析から、サメウラミドには7つのアミノ酸：β-hydroxyleucine-1 （β-HyLeu-1）、β-hydroxyleucine-2（β-HyLeu-2）、β-hydroxyleucine-3（β-HyLeu-3）、N,O-dimethylthreonine（N,O-Me2Thr）、N-methyldehydroalanine（N-MeDha）、alanine（Ala）、N-methylalanine（N-MeAla）、1つのオキシ酸（3-phenyllactic acid：Pla）および2つのプロピオニル基からなる環状デプシペプチドである事が分かった（図６aおよび図７）。
【００４６】
これらの各残基間の配列はHMBC相関の詳細な解析により明らかになった。NHもしくはNMeのプロトンから隣のカルボニル基の炭素へのHMBC相関は、N-MeAlaからAla、AlaからN-MeDha、N-MeDhaからPla、β-HyLeu-3からPr-2、N,O-Me2Thrからβ-HyLeu-2、β-HyLeu-2からN-MeAla、β-HyLeu-1からPr-1があり、β-HyLeu-2、-3のエステル結合はβプロトンから隣の部位のカルボニル基の炭素へのHMBC相関から、β-HyLeu-3からN,O-Me2Thr、β-HyLeu-2からβ-HyLeu-1へと繋がっていることが分かった。Plaとβ-HyLeu-3の相関は確認できなかったが、ヒドロキシ基のNMRスペクトルが1つしかないことや分子量を考慮すると、ここでエステル結合していると考えられる。以上より、サメウラミドの平面構造は図６bのように示された。
【００４７】
実施例３：サメウラミドによるコロニー維持活性ならびに未分化マーカーの発現について得られたサメウラミド（1 nM）をLIFの代わりに添加した培地中でES細胞を培養し、２日ごとに継代すると、7日目にはコロニー数が減少し、13日目には極小さいコロニーが観察されるかもしくは全くコロニーは観察されなくなる。しかし、サメウラミドの投与下で、同様に継代しつつ培養を継続すると、19日目頃から再び同程度の大きさのコロニーが確認され、その後はサメウラミド（1 nM）を加えたLIFを含まないES細胞未分化維持培地中でコロニーの維持が可能であることが確認された（図８）。
【００４８】
さらに、未分化マーカーの発現を確認したところ、血清および低血清のいずれの培地においてもNanog、Oct3/4、およびSSEA1の発現が認められた（図９）。この結果より、サメウラミドをLIFの代わりとして添加することでES細胞の未分化状態を維持したまま培養する
ことが可能であることが確認された。
【００４９】
実施例４：テラトーマ形成と３胚葉への分化の確認
マウスES細胞（CCE）をサメウラミドの存在下（1 nM）で培養し、約3ヵ月間維持した。得られた細胞をヌードマウス皮下に移植した。4週間後にマウスからテラトーマを回収、パラフィン切片の作製、HE染色を行った。すると、未分化な部分は少なく、分化した細胞が観察された。外胚葉（神経上皮、角化上皮）、中胚葉（骨格筋、心筋）、内胚葉（粘液産生性上皮）への組織学的な分化を認めたことから（図１０）、サメウラミド存在下で培養したマウスES細胞は多分化能を有していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明により、新規環状デプシペプチドを用いて多能性幹細胞を多能性を維持しつつ培養することが可能になる。このように培養された多能性幹細胞は再生医療の分野で使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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