(57)【要約】  本発明はヒトの健康に適用されるバイオテクノロジーの分野に関連する。本発明は、真核生物由来のトキシンが、脱水−再水和の過程により得られる、多重脂質層を有するリポソーム中にカプセル化されたワクチンビヒクルを記載し、その脂質組成物が、皮下又は筋肉内投与のために設計された、１：１のモル比のジパルミトイルホスファチジルコリン：コレステロールであるワクチンビヒクルである。これらの組成物は他のアジュバントの使用を必要としない。開示された組成物は、トキシン含有リポソーム中に共カプセル化された１種以上の抗原に対して特異的なＣＴＬ免疫反応の調整を可能にする。本発明のワクチンビヒクルは、誘発された免疫反応だけでなくその免疫調整特性の頑健性及び機能性により、先行技術に開示された他のものよりも利点を示す。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソギンチャク  スチコダクチラ  ヘリアンサス（Ｓｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）から得られるタンパク質及び抗原のリポソームベシクル中への共カプセル化を含む細胞免疫反応を誘発するためのワクチンビヒクル。
【請求項２】
脂質ベシクルがＤＰＰＣ及びＣｈｏを当モル比で含む請求項１記載のワクチンビヒクル。
【請求項３】
イソギンチャク  スチコダクチラ  ヘリアンサス（Ｓｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）由来のタンパク質がＳｔＩＩ、ＳｔＩ及びそれらの変異体を含む群から選ばれる、請求項１記載のワクチンビヒクル。
【請求項４】
Ｓｔトキシンの変異体がＳｔＩＷ１１１Ｃ、ＳｔＩＷ１１１Ｃｉｒｒｅｖ又は熱不活性化ＳｔＩＩを含む群から選ばれる、請求項３記載のワクチンビヒクル。
【請求項５】
抗原が、癌及び細胞内病原体により引き起こされる感染性疾患を含む群から選ばれる病変に関連したタンパク質又はポリペプチドである、請求項１記載のワクチンビヒクル。
【請求項６】
抗原が、癌に関連したタンパク質又はポリペプチドである、請求項５記載のワクチンビヒクル。
【請求項７】
抗原が、ＡＩＤＳに関連したタンパク質又はポリペプチドである、請求項５記載のワクチンビヒクル。
【請求項８】
抗原が、結核に関連したタンパク質又はポリペプチドである、請求項５記載のワクチンビヒクル。
【請求項９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のワクチンビヒクルを含み、免疫性アジュバントを欠くワクチン組成物。
【請求項１０】
癌及び細胞内病原体により引き起こされる感染性疾患を含む群から選ばれる疾病に罹っている患者の免疫反応を増大させるために有用な請求項９記載のワクチン組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトの健康に適用されるバイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明はスチコリシン（ｓｔｉｃｈｏｌｙｓｉｎ）を含み、抗原特異的な免疫細胞反応を増大させ、癌免疫療法及び細胞内病原体により引き起こされる疾病の治療に有用なリポソームに基づく皮下及び筋肉内の両方に使用されるワクチンビヒクルに関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームベシクルの免疫アジュバント能は長年知られている。免疫及びワクチン設計にリポソームを使用することについて存在する合理性は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に抗原性分子を放出し、免疫反応を刺激するリポソームの能力に基づくものである。リポソームの免疫アジュバントとしての最も重要な利点は次のように要約される。
（ｉ）ＡＰＣに大量の抗原をもたらす病原体を真似る能力、
（ｉｉ）抗原と免疫刺激性分子を共カプセル化する能力、
（ｉｉｉ）より高い効率化のためにその物理化学的特性を修飾する柔軟性、及び
（ｉｖ）生体分解性で無毒性であるという事実
（Ｌｅｓｅｒｍａｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，１４（３＆４），１７５-１８９）
【０００３】
ワクチン学の分野での挑戦は、抗原特異的細胞毒性Ｔリンパ球ＣＤ８＋（ＣＴＬ）により仲介される細胞性免疫反応の増大を、細胞内病原体及び腫瘍細胞により誘発される疾病の防止と治療に関連させることである。リポソームベシクルはＣＴＬ応答を増大させるが常に効率的とは限らない。リポソームベシクルに基づいた様々な戦略がこの機能を効率化する意図の下で設計されている。例えば、酸性ｐＨ−感受性リポソーム、カチオン性リポソーム、ＣｐＧ及び細菌由来の孔形成性トキシンのような免疫調整剤の包含などである。様々な刊行物にもかかわらず、これらの戦略の幾つかは効率的な細胞性免疫反応の誘発には限定的な成功を収めただけか、利点のないものであり、そのため実施前にもっと良い設計が必要である。
【０００４】
酸性ｐＨ又はタンパク分解過程の条件下で膜融合を促進するためにリポソーム膜にウイルス性膜タンパク質を融合させることもまたワクチンビヒクルの開発のためのもう一つの代替策である。ビロソームとして知られるこれらのベシクルは親ウイルスワクチンとして使用されるだけでなく、ビロソームに結合した又はカプセル化されたワクチン抗原のためのビヒクルとして探索されてきた（Ｚｕｒｂｒｉｇｇｅｎ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００３  １４；２１（９−１０）：９２１−４）。ＩＲＩＶ（免疫強化再構成インフルエンザビロソーム）という略語で知られるビロソームはインフルエンザエンブロープウイルス由来のタンパク質と脂質を含み、この戦略の最良の例示であり、Ａ型肝炎に対するワクチンの特許（米国特許５５６５２０３）の基礎をなしている。しかし、このワクチン調製はＡ型肝炎に対する中和抗体反応を増大させるために設計されたものである。
【０００５】
ビロソーム膜中で不活性化され高度に純化されたＡ型肝炎ウイルスの結合は、ＡＰＣ中のビロソーム及びエンドソーム膜の融合過程の結果として、古典的経路ＭＨＣＩＩに由来するペプチドのプロセッシングと提示に有利に働いた（Ｇｌｕｃｋ及びＷａｌｔｉ，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ（Ｂａｓｅｌ），２０００，１０３，１８９−９７）。記載された証拠によれば抗原−ビロソームの物理的会合が免疫アジュバントに重要であることを示唆している（Ｚｕｒｂｒｉｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒ．，ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，２０００，３９（１），３−１８；Ａｍａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５，１７（６），６９５−７０４）。
【０００６】
Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：７１４−７２３，２００４でＳｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、ＩＲＩＶが細胞介在免疫反応を増大させることができることを報告した。特に、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．はインビトロでＣＴＬの誘発にそのアジュバント活性を示した。この能力はウイルスタンパク質に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の反応性の刺激に主として依存した。
【０００７】
しかし、ビロソームのアジュバントとしての使用には低毒性や高免疫原性のような多くの利点があるものの、現在のビロソーム技術の問題点の一つは、ＣＴＬ反応の誘発に必要な、タンパク質のような溶質の効率的なカプセル化の手順がないことである。ビロソームが産生される脂質濃度（およそ１ｍＭの脂質）、及びその直径（約２００ｎｍ）を考慮して、１％未満の水相をビロソーム内にカプセル化する（Ｓｃｈｏｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，３：７６７−７９２，１９９３）。これらの特徴はビロソームが抗原や遺伝子を細胞に放出する効率を有意に減少させる。
【０００８】
この制限を克服し、ＣＤ８＋Ｔ細胞のための免疫原性製剤を製造する一つの戦略（米国特許出願番号２０１０００１５２１４に最近刊行された）は空のビロソームとビヒクル、好ましくはリポソームとの組み合わせに基づいており、これは抗原をカプセル化している。米国特許出願番号２０１０００１５２１４は、これらの粒子とリポソームはそれらの間で物理的相互作用を示さないものの、ビロソームのトランス−アジュバント効果を開示している。
【０００９】
Ｊ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２００８，１８（１），１−１９に刊行されたＬａｎｉｏらによる記事では、ｒｈＥＧＦに対して、脱水−再水和手順（ＤＲＶ）により得られ、飽和ホスファチジルコリン（ＰＣ）（ジパルミトイルホスファチジルコリン、ＤＰＰＣ）とコレステロール（Ｃｈｏ）のモル比１：１からなるリポソームの、非飽和ＰＣとＣｈｏを含むものに比べて、より高いカプセル化保持効率が開示されている。実際、ＤＲＶを得るための手順により、広い範囲の様々な可溶性溶質に対して高いカプセル化／保持効率を持った多重二層ベシクルが得られている。Ｌａｎｉｏらは、これらのベシクルの免疫アジュバント特性がｒｈＥＧＦに対して定量的にも定性的にも優れた抗体反応を増大させることを実証した。
【００１０】
Ｔｏｘｉｃｏｎ，  ２００９，  ５４（８）：１１３５−４７にＡｌｖａｒｅｚらによって刊行された総説では、海洋無脊椎動物、カリブ海イソギンチャク  スチコダクチラ  ヘリアンサス（Ｓｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）により生産され、著者らによりスチコリシン（Ｓｔ）Ｉ及びＩＩ（ＳｔＩ／ＩＩ）と命名された二つのタンパク質に特徴的な構造と機能を要約している。これらのタンパク質は孔形成トキシン（ＰＦＴ）であり、タンパク質ファミリーアクチノポリン（Ａｃｔｉｎｏｐｏｒｉｎｓ）という専らイソギンチャクに見出される真核細胞起源のＰＦＴのユニークなクラスに属する。
【００１１】
このファミリーの他のメンバーと同様に、Ｓｔ類は高い等電点（＞９．５）、約２０ｋＤａの分子質量を持ち、アミノ酸配列中にシステイン残基を欠き、スフィンゴミエリン（ＳＭ）を含む膜を好む塩基性タンパク質である。Ｓｔ類は可溶性の形態で産生されるが、２ｎｍの直径の孔を形成する様々な細胞性の及びモデルの膜システムと容易に会合することができるが、それはおそらく４つのモノマーからのＮ末端のαへリックスの相互作用によるものであろう。会合と孔形成の両方の事象とも膜の物理化学的特性に依存する。
【００１２】
Ｔｏｘｉｃｏｎ，  ２００７，４９：６８−８１に刊行された記事では、Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．はＳＭとＣｈｏの存在がＳｔＩＩによる膜における会合と孔形成への関連性を報告している。膜の相状態はこれらの構造とのＳｔＩＩ会合に影響を与える。雑誌Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１６，２：８５−９３にＭａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．によって報告されているように、このトキシンはＤＰＰＣ及びＳＭの膜に、極めめて低い能力の透過性で可逆的に会合している。
【００１３】
ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，Ｖｏｌ．９  Ｎｏ．１，２３−２８及びＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００４，Ｖｏｌ．２５  Ｎｏ．２，９２−９７にそれぞれＤｉｅｔｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．及びＭｏｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．による総説において要約されているように、抗原特異的なＣＴＬ反応の誘発に対するバクテリア由来の孔形成トキシンの免疫調節特性が、リポソームへのカプセル化を含む様々な戦略を用いて広く報告されているが、海洋真核細胞生物由来の機能的に同等なトキシンについては参照されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
腫瘍疾患の免疫療法における応用の観点から、抗原への特異的な細胞性免疫反応を誘発することができ、バクテリアトキシンを含む組成物よりも攻撃性の少ない新しいワクチン製剤を得ることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
驚くべきことに本発明の著者らは、抗原を孔形成又は溶菌活性を示さないものも含めて記載されたトキシンの変異体のいずれかとともにワクチン製剤リポソーム−Ｓｔ内にカプセル化して皮下に（ｓｃ）又は筋肉内に（ｉｍ）投与すると、ＣＴＬ反応の典型的なエンハンサー、非修飾の抗体レベル、及びリポソーム抗原により誘発された混合Ｔｈ１／Ｔｈ２反応として従来技術と考えられるポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ、ＰＩＣ）を用いた陽性対照群で観察されるよりも、標的細胞の溶菌がずっと高い割合で誘発される。これは、タンパク質抗原に対する細胞性及び体液性の両方の反応を生じるリポソーム−Ｓｔシステムのポテンシャルを示しており、ワクチン化目的のためのこの製剤の使用に関連している。
【００１６】
本発明の目的は、Ｓｔ類として知られるＤＰＰＣとＣｈｏ共カプセル化トキシンとタンパク質抗原のリポソーム調製に基づくワクチンビヒクルである。ＤＰＰＣとＣｈｏのリポソーム製剤ではＳｔ類として知られるトキシンの変異体（例えばＳｔＩＷ１１１Ｃ及びＳｔＩＷ１１１Ｃｉｒｒｅｖ）がタンパク質抗原とともにカプセル化されており、このリポソーム調製も本発明の主題である。
【００１７】
他の局面では、強力な抗原特異的なＣＴＬ反応の誘発のためにｓｃで又はｉｍで投与した抗原とともにトキシンを含むこのワクチンビヒクルに基づくワクチン組成物もまた、本発明の主題である。
【００１８】
本発明の他の目的は、癌及び細胞内病原体により引き起こされる感染性疾患からなる群から選ばれる疾患に罹っている患者の免疫反応の強化のためにｓｃで又はｉｍで投与した抗原とともにトキシンを含むこのワクチンビヒクルに基づく、上記のワクチン組成物の使用である。
【００１９】
他の局面では、本発明の主題はまた、癌及び細胞内病原体により引き起こされる感染性疾患からなる群から選ばれる疾患に罹っている、免疫反応の強化を必要とする患者を治療する方法であって、トキシンＳｔ類又はその変異体を疾患に関連のある抗原とともに含むこのワクチンビヒクルに基づくワクチン組成物をｓｃで又はｉｍで投与することを含む上記方法である。
【００２０】
さらに本発明はまた、抗原を発現する腫瘍細胞による攻撃に対するそのようなワクチン組成物によって提供される保護、腫瘍の割合の低減、及び癌患者の生存率の上昇に関する。それ故、抗原に関連する病気の開始の予防方法もまた本発明の目的である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】様々なワクチン処理をインビボ細胞毒性アッセイで受けた実験動物においてＯＶＡ免疫優勢のペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を有し、ＣＦＳＥで標識された標的細胞の溶菌割合を示すグラフである。各点は一つの動物からのデータに対応し、線は少なくとも２つの独立した実験の平均値に対応する。様々な文字はＤｕｎｎｅｔｔ  Ｔ３テストによる免疫化された群の統計的に有意な差を示す（ｐ＜０．０５）。
【００２２】
【図２Ａ】様々なワクチン処理を受け、ＯＶＡ発現腫瘍細胞の投与を受けた３つの群の実験動物における腫瘍のない動物の割合を示す。
【００２３】
【図２Ｂ】ＯＶＡ発現腫瘍細胞の接種後の３つの上記の群における生存率パラメータを可視化するグラフを示す。様々な文字はＬｏｇ−Ｒａｎｋテストに従った有意の統計的な差を示す（ｐ＜０．０５）。
【００２４】
【図３】還元条件（２−ＭＥの存在下）及び非還元条件下でのＳｔＩ（ＳｔＩＷ１１１Ｃ又はＳｔＩＷ１１１Ｃｉｒｒｅｖ）のダイマー変異体の作用による赤血球懸濁液の濁度の変化を示す。
【００２５】
【図４】野生型ＳｔＩＩ（活性タンパク質）の活性による、又は熱処理により不活性化された赤血球懸濁液の濁度の損失を示す。
【００２６】
【図５】エンドトキシン中和剤（ｐｍｘＢ）の存在下での又は非存在下での活性及び熱不活性化変異体の両方におけるＳｔＩＩへのインビトロでの暴露による樹状細胞（ＤＣ）の分子マーカーの発現の変化を示す。  グラフＡ：  ＣＤ８０の割合  グラフＢ：  ＣＤ８６の割合  グラフＣ：  ＣＤ４０の割合
【００２７】
【図６】インビボ細胞毒性アッセイで様々なワクチン処理を受けた実験動物においてＯＶＡ免疫優勢のペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を有し、ＣＦＳＥで標識された標的細胞の溶菌割合を示す２つのグラフである。各点は一つの動物からのデータに対応し、線は平均値に対応する。様々な文字はＴｕｋｅｙテストによる免疫化された群の統計的に有意な差を示す（ｐ＜０．０５）。グラフＡ：  ＯＶＡ、野生型ＳｔＩＩ又は可逆的に（ＳｔＩＷ１１１Ｃ）又は不可逆的に（ＳｔＩＷ１１１Ｃｉｒｒｅｖ）不活性なＳｔＩのダイマー変異体を共カプセル化するリポソームで免疫化して得られた反応。グラフＢ：  ＯＶＡと熱処理で不活性化したＳｔＩＩを共カプセル化するリポソームで免疫化して得られた反応。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明のワクチンビヒクルはＳｔを抗原とともにカプセル化するＤＰＰＣ：Ｃｈｏの１：１モル比でのＤＲＶリポソームの水性分散系に基づいており、最終的には水と混和性で、無毒性の、刺激性のない他の共溶媒を含むことができ、通常注射可能な薬剤組成物に使用されるようなベシクル、例えば糖、ポリエチレングリコール等の脱安定化を引き起こすことがない。
【００２９】
本発明のリポソーム製剤は脱水−再水和手順により得られ、ＤＰＰＣとＣｈｏの１：１モル比により構成され、抗原をＳｔ変異体又はそれらの可逆的不活性化変異体のいくつかで共カプセル化することにより得られ、該ワクチン組成物は抗原特異的ＣＴＬ免疫反応を促進することができ、腫瘍細胞の投与に対して保護的になることができる。
【００３０】
本発明の一つの態様では、ワクチン組成物は抗原としてタンパク質ＯＶＡを含むが、抗原は、治療的見地から、このタンパク質抗原に対して特異的なＣＴＬ免疫反応を誘発するよう関連した疾病に関連したいかなるタンパク質やポリペプチドであることができる。例えば、抗原は癌に関連したタンパク質又はポリペプチドであってもよく、ＡＩＤＳに関連したタンパク質又はポリペプチドであってもよく、又は結核に関連したタンパク質又はポリペプチドであってもよい。
【００３１】
本明細書に記載されるリポソームは、ＫｉｒｂｙとＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓによりＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８４，２，９７９−９８４で報告された水和−再水和技術により得られ、これらは抗原や免疫調節タンパク質のような不安定な分子の高い効率のカプセル化と保持により特徴付けられるいくつかの脂質二重膜により取り囲まれた内部水相を有するベシクルである。
【００３２】
ＤＰＰＣ：Ｃｈｏの１：１モル比でのクロロホルム溶液を濃縮し、３０分間真空下に保持した。脂質は脱イオン水で、ＤＰＰＣの相転移温度（Ｔｃ）より高い温度（Ｔ＞４５℃）で水和した。得られた多重ラメラベシクル（ＭＬＶ）の懸濁液を、超音波及び休止サイクル又は孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜による押出しにより、ＳＵＶ又はＬＵＶ（それぞれ、小単一ラメラベシクル及び大単一ラメラベシクル）に変換する。得られたベシクルをタンパク質溶液と混合した。脂質：タンパク質の関係を１６〜６４μｍｏｌの脂質：１．８〜７ｎｍｏｌの抗原及び０．５〜２ｎｍｏｌのＳｔとし、２０〜２４時間凍結乾燥した。再水和は脱イオン水で行い３０分間４５℃未満の温度で攪拌した。リポソーム中にカプセル化されていない材料を、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）ｐＨ７．４（ＮａＣｌ  １３６ｍｍｏｌ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４  １．４７ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４  ９．５５ｍｍｏｌ／Ｌ，ＫＣｌ  ２．６８ｍｍｏｌ／Ｌ）で洗浄し、次いで１００００ｇで１５分間遠心分離することにより除去した。このような製剤は、ＰＢＳ中に懸濁させて４℃で１ヶ月の保存後も７０％の保持をしつつ、約５０％に亘るＳｔ類の様々な変異体についてのカプセル化効率に到達した。
【００３３】
ＳｔＩとＳｔＩＩトキシンを、Ｌａｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．によりＴｏｘｉｃｏｎ．２００１，３９，１８７−９４に記載された手順によりイソギンチャクＳｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓから単離し、精製した。組み換えスチコリシンＩ（Ｓｔｉｃｈｏｌｙｓｉｎ  Ｉ）（ｒＳｔＩ）及びｒＳｔＩ変異体、ＳｔＩ  Ｗ１１１Ｃを、Ｐａｚｏｓ  ｅｔ  ａｌ．によりＴｏｘｉｃｏｎ，２００６，４８，１０８３−１０９４に、及びＰｅｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．によりＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２０１１，２４，４８５−４９３にそれぞれ記載された手順に従って得た。
【００３４】
本発明のワクチンビヒクルに使用されるＳｔ類の濃度は０．２５〜１μＭの範囲であり、１６〜６４ｍＭの総脂質濃度の範囲でリポソームの懸濁液中１〜３．５μＭの濃度範囲で抗原と共カプセル化されている。
【００３５】
好ましくは、本発明のワクチンビヒクルは０．３〜０．４ｎｍｏｌの量のＳｔ類を含んでおり、２００μＬの体積中総脂質の２０μｍｏｌのリポソーム懸濁液中１〜２ｎｍｏｌの抗原とともに共カプセル化されている。
本発明におけるワクチンに使用される用量範囲はｓｃ又はｉｍで、１〜２ｎｍｏｌ（５０〜１００ｍｇ）の抗原である。
本発明のワクチン組成物の重要な特徴は、記載されたもの以外に免疫学的なアジュバントを欠いているということである。
【００３６】
上に説明したように、リポソームベシクル中にカプセル化されたバクテリアの孔形成性トキシンがＣＴＬ反応を増大させることができることは従来技術から知られていたが、バクテリアのトキシンに基づくワクチン組成物の使用がヒトに悪影響をもたらすことが知られている。しかし、本発明の著者らは予期せぬことに、非バクテリア性のトキシンが同じ免疫刺激剤効果を持っていることを見出した。さらに、本発明の著者らはトキシンの孔形成活性とＣＴＬ反応の刺激剤効果とを切り離すことに成功し、これがこのワクチンビヒクルに対してヒトでの臨床的使用にとって大きな利点をもたらすのである。本発明のワクチンビヒクルにおいて、リポソーム中に抗原とともに分子ＳｔＩＷ１１１Ｃｉｒｒｅｖ又は熱不活性化ＳｔＩＩを共カプセル化したものを用いて得られた結果は、リポソーム−Ｓｔの製剤による抗原特異的ＣＴＬ免疫反応の増大と膜内で孔を形成するこれらのタンパク質の能力との間に絶対的な依存性がないことを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄から単離され、インビトロでＳｔＩＩに暴露されたた樹状細胞（ＤＣ）の成熟の試験では、このタンパク質の能力がその活性変異体にだけではなく熱不活性化変異体においても、ＣＤの活性化を誘発することが示された。これは同様の条件下でＬＰＳ（陽性対照）で見られることと同様である。
【００３７】
膜中に孔を形成するＳｔ類の能力を、Ｔｏｘｉｃｏｎ，２００１，３９，１５４７-１５６０にＭａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．により記載されているように、カルボキシフルオレッセイン（ＣＦ）の入ったＬＵＶの溶血活性アッセイと透過性を試験することにより評価した。ＣＦをカプセル化するＤＰＰＣ：Ｃｈｏ  （１：１）のリポソームベシクルの透過性を分析することにより、卵黄ホスファチジルコリンとＳＭ（１：１）（陽性対照）からなるベシクルで観察されるものと比較して、Ｓｔ類が透過活性を示さないことが示された。
【００３８】
Ｐｅｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．によりＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２０１１，２４，４８５−４９３にちょうど記載されているように、還元剤として２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）の存在下及び非存在下で溶血活性アッセイとＳＤＳ−ＰＡＧＥによりジスルフィド結合により安定化された不活性ダイマーを変異体ＳｔＩＷ１１１Ｃが形成することが証明された。モデル細胞として赤血球中で孔を形成するダイマー構造の不活性は、膜と会合していないことの結果である。
【００３９】
２−ＭＥ  （０．１  ｍｏｌ／Ｌ）とのインキュベーションによりＳｔＩＷ１１１Ｃを還元し、カラムＰＤ−１０でのろ過により還元剤を除去し、そしてただちにＳｔＩＷ１１１Ｃｍｏｎｏｍｅｒをホモ二官能性試薬ビス（マレイミド）ヘキサン（ＢＭＨ）とともに４℃で２時間、ＳｔＩＷ１１１Ｃｍｏｎｏｍｅｒ：ＢＭＨ  １：１〜２：１のモル比でインキュベーションすることに基づくＳｔＩＷ１１１Ｃ（ＳｔＩＷ１１１Ｃｉｒｒｅｖ）の不可逆的ダイマー種を得る手順が確立された。ＳｔＩＷ１１１Ｃｉｒｒｅｖを還元剤の存在下でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＨＲ  １０／３００カラムでゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。不可逆的ダイマーを得たこと及びその純度は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより証明した。不可逆的ダイマーは９４％の純度で得られ、可逆的ダイマーの汚染はわずか６％であった。機能活性の欠如は溶血活性アッセイにより証明した。
【００４０】
熱処理によるＳｔＩＩ不可逆的不活性化はＭａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．によるＴｏｘｉｃｏｎ，２００１，３９，１５４７-１５６０に記載の手順に従って行い、膜中で孔を形成する能力の全体的な欠損を溶血活性アッセイによりチェックした。
【００４１】
インビボでの抗原特異的細胞毒性免疫反応及び予防的シーンでの抗腫瘍免疫性を増大させる能力に関連したリポソーム−Ｓｔ系における様々な分子種Ｓｔ類の免疫調整剤特性は、マウス株Ｃ５７ＢＬ／６の実験モデルにおいて、抗原ＯＶＡ及び腫瘍細胞系Ｅ．Ｇ７、ＯＶＡ  ｐＡｃ−ｎｅｏ−ＯＶＡの相補的ＤＮＡでトランスフェクトされ（Ｍｏｏｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，  １９８８，  ５４：  ７７７−８５）、“Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ”  （ＡＴＣＣ，  ＶＡ）から得られるネズミＥＬ−４胸腺腫のサブクローンを用いて測定することができる（Ｋｕｓｍａｒｔｓｅｖ  ｙ  Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．，  ２００３，  ７４：  １８６−９６）。
【００４２】
本発明の著者らはまた、抗原を含むワクチンビヒクルリポソーム−Ｓｔでの予防的接種がＳｔＩＩを含まないリポソームにより生じるよりも高い抗腫瘍保護を誘発することを見出した。
【００４３】
これらの結果は、抗原タンパク質を用いると他のアジュバントの必要性なく、リポソーム−Ｓｔ系が機能的に強固で保護的な抗腫瘍反応を誘発するのに有効であることを実証している。そして、この製剤を組み合わせ療法で用いればその抗腫瘍効果をさらに増大させるかもしれない。
【００４４】
以下の実施例では、本発明の目的であるインビボでの抗原特異的細胞毒性反応及びワクチン組成物の予防的シーンにおける抗腫瘍免疫性を誘発する免疫効果を、Ｓｔ類を含まない他の非リポソーム的製剤に関して証明する比較実験的詳細が含まれている。
【実施例】
【００４５】
実施例１
タンパク質抗原として野生型ＳｔＩ又はＳｔＩＩ及びＯＶＡを用いるワクチンビヒクルの細胞毒性とＣＴＬ反応の評価
リポソームに基づいたワクチンビヒクルを先述のように調製した。ＤＰＰＣとＣｈｏ（モル比１：１）からなるＤＲＶベシクルにおいて、モデル抗原としてのＯＶＡとＳｔ類（ＳｔＩ又はＳｔＩＩ）をリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中、モル比で１０μｍｏｌの総脂質：１．１ｎｍｏｌのＯＶＡ、及び０．３ｎｍｏｌのＳｔと共カプセル化した。この手順に従い、二つのワクチン組成物を得た。
ワクチン組成物Ａ：  ６．６ｎｍｏｌ（５０μｇ）のＯＶＡをカプセル化するＤＰＰＣ：Ｃｈｏ（６０μｍｏｌの総脂質）のＤＲＶリポソーム
ワクチン組成物Ｂ：  ６．６ｎｍｏｌ（５０μｇ）のＯＶＡと１．８８ｎｍｏｌのＳｔＩ又はＳｔＩＩを共カプセル化するＤＰＰＣ：Ｃｈｏ（６０μｍｏｌの総脂質）のＤＲＶリポソーム
１５匹のＣ５７ＢＬ／６メスのマウス（体重１８−２０ｇ）を選び、各々３匹のマウスの５つの実験グループに分けた。
【００４６】
グループ１（陰性対照）をｓｃ経路で０、１２、１３及び１４日目に０．２ｍＬリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で接種した。
グループ２（陽性対照）  を１２日目に２２．２ｎｍｏｌ（１ｍｇ）のＯＶＡとともに、及び１００μｇのポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ＰＩＣ）、ＴＬＲ３合成リガンド及びＣＴＬ反応の古典的誘発剤（Ｈａｍｉｌｔｏｎ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５，１７４：１１５９−６３）とともに混合してｓｃ経路で接種し、１３日及び１４日目にマウスは再び１００μｇのＰＩＣを摂取した。
グループ３はｓｃ経路で０及び１２日目に０．２ｍＬワクチン組成物Ａ（１．１ｎｍｏｌ又は５０μｇのＯＶＡに等価）で接種した。
グループ４は皮下経路で０及び１２日目に０．２ｍＬワクチン組成物Ｂ（１．１ｎｍｏｌ又は５０μｇのＯＶＡ及び０．３ｎｍｏｌ又は６．２５μｇのＳｔＩに等価）で接種した。
グループ５はｓｃ経路で０及び１２日目に０．２ｍＬワクチン組成物Ｂ（１．１ｎｍｏｌ又は５０μｇのＯＶＡ及び０．３ｎｍｏｌ又は６．２５μｇのＳｔＩＩに等価）で接種した。
【００４７】
実験の２０日目に、Ｃ５７ＢＬ／６非免疫化マウス由来の脾臓細胞を二つの濃度のカルボキシ−フルオレッセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（それぞれ０．３３及び５μｍｏｌ／Ｌ）でインキュベートした。最も高い蛍光強度で標識した細胞も、Ｃ５７ＢＬ／６  マウス株に対してＭＨＣＩハプロタイプの関連で１  μｍｏｌ／ＬのＯＶＡ（２５７−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−２６４）免疫優勢ペプチドとインキュベートした。その後、標識した細胞の両集団を１：１に混合し、実験グループ１〜５を尾の静脈により、０．２ｍＬの合計体積中３０ｘ１０６細胞の混合物で接種した。１６時間後にマウスを犠牲にし、標的細胞の溶菌（％）を免疫部位に近い鼠径リンパ節においてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により決定した。
【００４８】
図１はＯＶＡ及びＳｔ類を共カプセル化するリポソームでマウスを免疫化することによりインビボで生じた細胞毒性を示す。Ｓｔ類（ＳｔＩ又はＳｔＩＩ）を共カプセル化するリポソームで免疫化された動物は、ＯＶＡに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞毒性リンパ球反応（ＣＴＬ）を、陽性対照群よりも統計的に高く示した。さらに、ＯＶＡのみを含むリポソームは、このアッセイの古典的な陽性対照（ＰＩＣ）と統計的に同様のＣＴＬ反応を誘発した。
【００４９】
実施例２
ＯＶＡタンパク質モデルにおけるワクチンビヒクルの抗腫瘍保護の誘発
抗腫瘍保護を誘発するリポソームベースのワクチンの能力を研究した。この目的を達成するために、体重１８〜２０ｇの６０匹のＣ５７ＢＬ／６のメスのマウスを選び、各々２０匹のマウスの３つのアッセイグループに分けた。
【００５０】
グループ１（陰性対照）をｉｍ経路で０及び１２日目に０．２ｍＬリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で接種した。
グループ２は０及び１２日目に実施例１に記載の０．２ｍＬワクチン組成物Ａ（１．１ｎｍｏｌ又は５０μｇのＯＶＡに等価）で接種した。
グループ３はｉｍ経路で０及び１２日目に実施例１に記載の０．２ｍＬワクチン組成物Ｂ（１．１ｎｍｏｌ又は５０μｇのＯＶＡ及び０．３ｎｍｏｌ又は６．２５μｇのＳｔＩＩに等価）で接種した。
【００５１】
グループ１〜３のすべてに１９日目に腫瘍系Ｅ．Ｇ７からの３ｘ１０５個の細胞を皮下経路で投与した（０．２ｍＬ）。
動物を０日目から個別に分け、以下のパラメータを週に３回測定した。腫瘍体積、進行時間、及び生存率。
得られた結果を以下に記載する。
【００５２】
進行時間
進行時間は各動物が腫瘍を接種した瞬間から腫瘍が現れるまでに経過した時間を特徴付けるパラメータである。実験の終結時に腫瘍を示さなかったマウスに関しては、進行時間は６０日とみなした。進行時間が延長するという効果は、癌に対するワクチンにとって高度に望ましいパラメータであるということである。図２Ａに見られるように、グループ３の動物は実施例１に記載された、本発明の対象でもあるワクチン組成物製剤Ｂでワクチン接種されており、最も顕著な結果を示した。
【００５３】
生存率
このパラメータは免疫化された動物がＯＶＡ発現腫瘍細胞（Ｅ．Ｇ７）を投与されて生きている時間を増大させるワクチンの能力を評価する。このパラメータは日数で測定され、非処理の動物の生存率と比較されるので相対的な性質を有している。グループ間の生存率結果に見られる差の統計的な有意性を証明するためにＬｏｇ−Ｒａｎｋテストを用いた。
【００５４】
図２Ｂは、実施例１に記載され、本発明の対象でもあるワクチン組成物Ｂを接種したグループ３の動物が腫瘍接種後もより長く生存するものであることを明確に示している。
【００５５】
実施例３
Ｓｔ類変異体の溶血活性
赤血球膜内の孔形成は細胞溶菌を引き起こすコロイド浸透圧ショックを起こす。いわゆるポーリンの孔形成能の後にはその溶血活性（ＨＡ）が続き、これは細胞溶菌による赤血球懸濁液のみかけの吸光度（λ＝６００ｎｍ）の損失を測定することにより実験的に決定することができる。アッセイでは、還元条件下（２−ＭＥ  ０．１ｍｏｌ／ｌ）と非還元条件下で、アッセイ中比較的高いタンパク質濃度（０．１５μｍｏｌ／ｌ）で、ＳｔＩＷ１１１Ｃ不可逆的不活性ダイマーのＨＡ（ＳｔＩＷ１１１Ｃｉｒｒｅｖ）を可逆的ダイマーＳｔＩＷ１１１ＣのＨＡと比較した。Ｔｏｘｉｃｏｎ，２００９，５４（８）：１１３５−４７でＡｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．により報告されたＳｔＩ／ＳｔＩＩのＨＡと比較する。図３に示された溶血の時間的進行は、ＳｔＩＷ１１１Ｃｉｒｒｅｖ  が非還元条件下では不活性であったことを示している。還元条件下では、ＳｔＩＷ１１１Ｃｉｒｒｅｖは完全に還元された又は非還元下のいずれかのＳｔＩＷ１１１Ｃより低い活性を示した。
【００５６】
実施例４
不活性化したＳｔＩＩの孔形成能の評価
２時間８０℃で加熱することにより不可逆的に不活性化したＳｔＩＩによる膜に孔を形成する能力の損失は溶血活性試験を用いて登録した。図４は活性タンパク質と比較した、熱的に不活性化したＳｔＩＩについての溶血活性の欠落を示す。
【００５７】
実施例５
ＤＣ成熟化についてのワクチンビヒクルの効果
ＳｔＩＩにより誘発されたＤＣの成熟化を、５％ＣＯ２チェンバー中で３７℃で２４時間、２０μｇのポリミキシンＢ（ｐｍｘＢ、ＬＰＳの脂質Ａ分画への結合によるエンドトキシンの生物学的活性の中和剤）の存在下又は非存在下で、活性ＳｔＩＩ（０．１ｎｍｏｌ又は２μｇ）又は熱処理により不活性化されたもの（４μｇ）に暴露されたＣ５７ＢＬ／６マウスの骨髄から得られた細胞中で評価した。
【００５８】
陽性対照として、ＬＰＳ（２μｇ）を用い、陰性対照はＲＰＭＩ培地プラス３０ｐｍｘＢであった。マウス骨髄から抽出した細胞を６穴プレートを用いて１穴当たりＲＰＭＩ上６０００００ＤＣ前駆体の数で培養した。１０％のウシ胎仔血清（ＢＦＳ）、４００μＬのＧＭＣＳＦ及びＲＰＭＩを添加し１穴当たり３ｍＬとした。
【００５９】
図５は、インビトロでのこれらの細胞の活性及び熱不活性化ＳｔＩＩ変異体の両方への曝露の結果としてＤＣ活性化を指し示す分子マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ４０）の増加（％）を示す。結果は陽性対照で得られた結果に相当する。
【００６０】
実施例６
抗原タンパク質としてＳｔ変異体及びＯＶＡを用いるワクチンビヒクルの細胞毒性とＣＴＬ反応の評価
可逆的（ＳｔＩＷ１１１Ｃ）又は不可逆的（ＳｔＩＷ１１１Ｃｉｒｒｅｖ）低孔形成活性のＳｔＩダイマー変異体と熱的不活性化ＳｔＩＩ変異体を、１０μｍｏｌの総脂質：１．１ｎｍｏｌのＯＶＡ、０．３ｎｍｏｌのＳｔＩＷ１１１Ｃ、ＳｔＩＷ１１１Ｃｉｒｒｅｖ、又は熱不活性化ＳｔＩＩの比で、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中、ＤＰＰＣ：Ｃｈｏ（１：１）のリポソームにＯＶＡとともに共カプセル化し、これらのワクチン製剤のインビボでのＯＶＡ特異的細胞毒性活性を誘発する能力を評価した。これらのアッセイでは、実施例１に記載したように本質的に同じワクチン組成物を用いた。組成物Ｂの場合には、様々なＳｔの変異体を用いた。
【００６１】
ワクチン組成物Ａ：  ６．６ｎｍｏｌのＯＶＡをカプセル化するＤＰＰＣ：Ｃｈｏ（６０  μｍｏｌの総脂質）のＤＲＶリポソーム
ワクチン組成物Ｂ：  ６．６ｎｍｏｌのＯＶＡと１．８７５ｎｍｏｌのＳｔ（ＳｔＩＷ１１１Ｃ，ＳｔＩＷ１１１Ｃｉｒｒｅｖ又は野生型ＳｔＩＩ又は熱不活性化ＳｔＩＩ）を共カプセル化するＤＰＰＣ：Ｃｈｏ（６０μｍｏｌの総脂質）のＤＲＶリポソーム
【００６２】
第１のアッセイでは、１２匹のメスのＣ５７ＢＬ／６マウス（体重１８−２０ｇ）を選び、各々３匹のマウスの４つの実験グループに分けた。
グループ１（陰性対照）を皮下経路で０及び１２日目に０．２ｍＬのＰＢＳで接種した。
グループ２（陽性対照）は０及び１２日目に０．２ｍＬのワクチン組成物Ｂ（１．１ｎｍｏｌ又は５０μｇのＯＶＡ及び０．３ｎｍｏｌ又は６．２５μｇの野生型ＳｔＩＩに等価）で接種した。
グループ３は皮下経路で０及び１２日目に０．２ｍＬのワクチン組成物Ｂ（１．１ｎｍｏｌ又は５０μｇのＯＶＡ及び０．３ｎｍｏｌ又は６．２５μｇのＳｔＩＷ１１１Ｃに等価）で接種した。
グループ４は皮下経路で０及び１２日目に０．２ｍＬのワクチン組成物Ｂ（１．１ｎｍｏｌ又は５０μｇのＯＶＡ及び０．３ｎｍｏｌ又は６．２５μｇのＳｔＩＷ１１１Ｃｉｒｒｅｖに等価）で接種した。
【００６３】
図６Ａは、低孔形成活性のＳｔ変異体を含むリポソーム（ＬＰ／ＯＶＡ＋ＳｔＩＷ１１１Ｃ又はＬＰ／ＯＶＡ＋ＳｔＩＷ１１１Ｃｉｒｒｅｖ）で免疫化された動物が、リポソームにＯＶＡとともに共カプセル化されたとき（ＬＰ／ＯＶＡ＋ＳｔＩＩ）、ＳｔＩＩとともに得られるのと統計的に同様の細胞毒性反応を示す。
【００６４】
他のアッセイでは、９匹のメスのＣ５７ＢＬ／６マウス（体重１８−２０ｇ）を選び、各々３匹のマウスの３つのグループに分けた。
【００６５】
グループ１（陰性対照）は皮下経路で０及び１２日目に０．２ｍＬのリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で接種した。
グループ２は０及び１２日目に０．２ｍＬのワクチン組成物Ａ（１．１ｎｍｏｌ又は５０μｇのＯＶＡに等価）で接種した。
グループ３は皮下経路で０及び１２日目に０．２ｍＬワクチン組成物Ｂ（１．１ｎｍｏｌ又は５０μｇのＯＶＡ及び０．３ｎｍｏｌ又は６．２５μｇの不活性化ＳｔＩＩに等価）で接種した。
【００６６】
図６Ｂは、ＯＶＡと完全に熱不活性化したＳｔＩＩ変異体を共カプセル化するリポソームによる免疫化が、抗原のみを含むリポソームにより誘発されたものよりも有意に高く、野生型のＳｔＩ／ＳｔＩＩを含むリポソーム製剤で観察されたのと同様の、ＯＶＡ特異的な細胞毒性活性を発揮した。
【００６７】
実験結果は、抗原をスチコリシン変異体とともに共カプセル化する本発明の対象であるリポソームワクチンが、孔形成能を示さないものと一緒であっても、強力で強固で機能的な抗原特異的ＣＴＬ反応を誘発し、これはインビボＣＴＬアッセイで使用した古典的陽性対照（ＰＩＣ）により引き出されるものよりもずっと大きかったことを示した。予防的シナリオでのリポソーム−Ｓｔ製剤は腫瘍移植の時間的進行を有意に増大させ、ＰＢＳのみを摂取したものと比較して評価したグループでは生存率を有意に増大させた。要するに、リポソーム−Ｓｔでのワクチン化は、抗原のみを含むリポソームベシクルで観察されたものよりも良好な結果を示した。
【図１】
2013530190.tif 000002
【図２Ａ】
2013530190.tif 000003
【図２Ｂ】
2013530190.tif 000004
【図３】
2013530190.tif 000005
【図４】
2013530190.tif 000006
【図５】
2013530190.tif 000007
【図６】
2013530190.tif 000008
【国際調査報告】
2013530190.tif 000009
2013530190.tif 000010
2013530190.tif 000011
2013530190.tif 000012