(57)【要約】本発明は、宿主生物におけるPUFAの産生を可能にする、および／または向上させる、多価不飽和脂肪酸（PUFA）シンターゼ系および1つまたは複数のアクセサリータンパク質（例えば、PPTアーゼおよび／またはACoAS）によって遺伝的に改変された組換え宿主生物（例えば、植物）を提供する。本発明はまた、（例えば、PUFAを得るために）そのような生物を作製および使用する方法、ならびにそのような生物から得られる産物（例えば、油および／または種子）にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）少なくとも1つのPUFAを産生する多価不飽和脂肪酸（PUFA）シンターゼ系をコードする核酸配列；および
（ii）ホスホパンテテイニル補因子をPUFAシンターゼ系ACPドメインへと転移させるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）をコードする核酸配列
を含む、遺伝的に改変されたアブラナ属（Brassica）植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項２】
ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）である、請求項1記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項３】
ブラッシカ・ジュンセア（Brassica juncea）である、請求項1記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項４】
PUFAシンターゼ系が、SEQ ID NO：1のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一なアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項５】
PUFAシンターゼ系がSEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項６】
PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO：6の核酸配列に対して少なくとも80％同一な核酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項７】
PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列がSEQ ID NO：6の核酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項８】
PUFAシンターゼ系が、SEQ ID NO：2のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一なアミノ酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項９】
PUFAシンターゼ系がSEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項１０】
PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO：7の核酸配列に対して少なくとも80％同一な核酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項１１】
PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列がSEQ ID NO：7の核酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項１２】
PUFAシンターゼ系が、SEQ ID NO：3のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一なアミノ酸配列を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項１３】
PUFAシンターゼ系がSEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項１４】
PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO：8の核酸配列に対して少なくとも80％同一な核酸配列を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項１５】
PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列がSEQ ID NO：8の核酸配列を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項１６】
PUFAシンターゼ系がSEQ ID NO：1〜3のアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項１７】
PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO：6〜8の核酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項１８】
PPTアーゼが、SEQ ID NO：5に対して少なくとも80％同一なアミノ酸配列を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項１９】
PPTアーゼがSEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項２０】
PPTアーゼをコードする核酸配列が、SEQ ID NO：10の核酸配列に対して少なくとも80％同一である、請求項1〜17のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項２１】
PPTアーゼをコードする核酸配列がSEQ ID NO：10の核酸配列を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項２２】
（i）および（ii）の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれる、請求項1〜21のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項２３】
（i）および（ii）の核酸配列が種子特異的プロモーターと機能的に連結している、請求項1〜22のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項２４】
（i）および（ii）の核酸配列が、PvDlec2、LfKCS3およびFAE 1からなる群より選択されるプロモーターと機能的に連結している、請求項1〜23のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項２５】
（iii）長鎖PUFA遊離脂肪酸（FFA）からアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ（ACoAS）をコードする核酸配列
をさらに含む、請求項1〜24のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項２６】
ACoASが、SEQ ID NO：4に対して少なくとも80％同一なアミノ酸配列を含む、請求項25記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項２７】
ACoASがSEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む、請求項25記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項２８】
ACoASをコードする核酸配列が、SEQ ID NO：9の核酸配列に対して少なくとも80％同一な核酸配列を含む、請求項25記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項２９】
ACoASをコードする核酸配列が、SEQ ID NO：9の核酸配列を含む、請求項25記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項３０】
ACoASをコードする核酸配列が、SEQ ID NO：34の核酸配列を含む、請求項25記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項３１】
（i）、（ii）および（iii）の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれる、請求項25〜30のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項３２】
（i）、（ii）および（iii）の核酸配列が種子特異的プロモーターと機能的に連結している、請求項25〜31のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項３３】
（i）、（ii）および（iii）の核酸配列が、PvDlec2、LfKCS3およびFAE 1からなる群より選択されるプロモーターと機能的に連結している、請求項25〜32のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項３４】
アセチルCoAカルボキシラーゼ（ACCアーゼ）をコードする核酸配列および／または2型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGAT2）をコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜33のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項３５】
SEQ ID NO：6〜10から選択される核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３６】
組換え発現ベクターpDAB7361。
【請求項３７】
組換え発現ベクターpDAB7362。
【請求項３８】
組換え発現ベクターpDAB7363。
【請求項３９】
検出可能な量のDHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））、DPA（C22:5、n-6またはn-3）またはEPA（エイコサペンタエン酸（C20:5、n-3））を含む、請求項1〜34のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項４０】
0.01％〜15％のDHAを含む、請求項1〜34および39のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項４１】
0.05％〜10％のDHAを含む、請求項1〜34、39および40のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項４２】
0.05％〜5％のDHAを含む、請求項1〜34および39〜41のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項４３】
0.01％〜5％のEPAを含む、請求項1〜34および39〜42のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項４４】
0.05％〜5％のEPAを含む、請求項1〜34および39〜43のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項４５】
0.05％〜1％のEPAを含む、請求項1〜34および39〜44のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項４６】
0.01％〜5％のDPAを含む、請求項1〜34および39〜45のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項４７】
0.05％〜5％のDPAを含む、請求項1〜34および39〜46のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項４８】
0.05％〜1％のDPAを含む、請求項1〜34および39〜47のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
【請求項４９】
請求項1〜34および39〜48のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分から得られる、油。
【請求項５０】
請求項1〜34および39〜48のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織または部分から得られる、種子。
【請求項５１】
請求項1〜34および39〜48のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分から得られる、種子油。
【請求項５２】
請求項1〜34および39〜48のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子もしくは部分から得られた油を含むか、または請求項1〜34および39〜48のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織もしくは部分から得られた種子を含む、食品。
【請求項５３】
請求項1〜34および39〜48のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子もしくは部分から得られた油を含むか、または請求項1〜34および39〜48のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織もしくは部分から得られた種子を含む、機能性食品。
【請求項５４】
請求項1〜34および39〜45のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子もしくは部分から得られた油を含むか、または請求項1〜34および39〜48のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織もしくは部分から得られた種子を含む、医薬製品。
【請求項５５】
少なくとも1つのPUFAを含む油を生産するための方法であって、請求項1〜34および39〜45のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子もしくは部分から、または請求項1〜34および39〜48のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織もしくは部分の種子から、油を回収する段階を含む前記方法。
【請求項５６】
少なくとも1つのPUFAを含む油を生産するための方法であって、請求項1〜34および39〜48のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分を成育させる段階を含む前記方法。
【請求項５７】
種子油中に少なくとも1つのPUFAを産生させるための方法であって、請求項1〜34および39〜48のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織または部分の種子から油を回収する段階を含む前記方法。
【請求項５８】
種子油中に少なくとも1つのPUFAを産生させるための方法であって、請求項1〜34および39〜48のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分を成育させる段階を含む前記方法。
【請求項５９】
少なくとも1つのPUFAを含む栄養補助食品または治療用製品を個体に提供するための方法であって、請求項1〜34および39〜48のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分、請求項49記載の油、請求項50記載の種子、請求項51記載の種子油、請求項52記載の食品、請求項53記載の機能性食品、または請求項54記載の医薬製品を個体に提供する段階を含む前記方法。
【請求項６０】
PUFAがDHAである、請求項55〜59のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
PUFAがEPAである、請求項55〜59のいずれか一項記載の方法。
【請求項６２】
請求項1〜34および39〜48のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織または部分を作製するための方法であって、（i）少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を産生する藻類PUFAシンターゼをコードする核酸配列；および（ii）ホスホパンテテイニル補因子を藻類PUFAシンターゼACPドメインへと転移させるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）をコードする核酸配列によって、アブラナ属植物またはアブラナ属植物細胞を形質転換させる段階を含む前記方法。
【請求項６３】
（iii）長鎖PUFA遊離脂肪酸（FFA）からアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ（ACoAS）をコードする核酸配列によって、アブラナ属植物またはアブラナ属植物細胞を形質転換させる段階をさらに含む、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
約0.05％〜5％のDHAを含む、アブラナ属植物の種子由来の油組成物。
【請求項６５】
約0.05％〜5％のDHA
を含み、かつ
（重量で）オレイン酸が70％を上回る脂肪酸プロファイル
を有する、アブラナ属植物の種子由来の油組成物。
【請求項６６】
約0.05％〜5％のDHA
を含み、かつ
（重量で）α-リノレン酸が3.5％未満である脂肪酸プロファイル
を有する、アブラナ属植物の種子由来の油組成物。
【請求項６７】
約0.05％〜5％のDHA
を含み、かつ
（重量で）オレイン酸が70％を上回り、かつα-リノレン酸が3.5％未満である脂肪酸プロファイル
を有する、アブラナ属植物の種子由来の油組成物。
【請求項６８】
請求項1〜34および39〜48のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分を作製するための方法であって、（i）少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を産生するPUFAシンターゼ系をコードする核酸配列；（ii）長鎖PUFA遊離脂肪酸（FFA）からアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ（ACoAS）をコードする核酸配列；および（iii）PUFAシンターゼ系ACPドメインを活性化するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）をコードする核酸配列を含む発現カセットによって、アブラナ属植物またはアブラナ属植物細胞を形質転換させる段階を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は全体として、宿主生物における多価不飽和脂肪酸（PUFA）の産生を可能にする、および／または向上させる、PUFAシンターゼ系および1つまたは複数のアクセサリータンパク質によって遺伝的に改変された組換え宿主生物（例えば、植物）に関する。本発明はまた、（例えば、PUFAを得るために）そのような生物を作製および使用する方法、ならびにそのような生物から得られる産物（例えば、油および種子）にも関する。
【背景技術】
【０００２】
多価不飽和脂肪酸（PUFA）は、栄養学的用途、薬学的用途、産業的用途および他の目的に有用であると考えられている。しかし、天然供給源（例えば、魚油）から、および化学合成からのPUFAの現在の供給は、長期的な商業的需要に対して十分ではない。
【０００３】
植物（例えば、油糧種子作物）に由来する植物油は比較的安価であり、魚油に付随する汚染の問題がない。しかし、商業的に開発された植物および植物油中に見いだされるPUFAは、典型的には、比較的飽和度の高いPUFAや比較的長鎖であるPUFAを含まず、典型的にはリノール酸（Δ9位およびΔ12位に2つの二重結合を有する18個の炭素‐18:2 Δ9,12）およびリノレン酸（18:3 Δ9,12,15）のみを含む。
【０００４】
植物によって内因性に産生される脂肪酸の改変による、植物における、より不飽和度の高い、またはより長鎖のPUFAの産生については記載されている。例えば、脂肪酸エロンガーゼおよび／またはデサチュラーゼをコードするさまざまな個々の遺伝子による植物の遺伝的改変が、より長鎖でより不飽和度の高いエイコサペンタエン酸（EPA）などのPUFAを有意なレベルで含む上に、より短鎖でより不飽和度の低い混合性PUFAも有意なレベルで含む葉または種子の作製をもたらしたことが記載されている（Qi et al., Nature Biotech. 22:739 (2004)（非特許文献1）；国際公開公報第04/071467号（特許文献1）；Abbadi et al., Plant Cell 16:1 (2004) （非特許文献2）；Napier and Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society 64:387-393 (2005) （非特許文献3）；Robert et al., Functional Plant Biology 32:473-479 (2005) （非特許文献4）；米国特許出願公開第2004/0172682号（特許文献2））。
【０００５】
アブラナ属（genus Brassica）には、世界で最も重要な油糧種子作物の1つであり、かつ温帯地域で生育する最も重要な油糧種子作物であるキャノーラが含まれる。キャノーラは、通常育種法を通じてエルカ酸およびグルコシノレート類が取り除かれるかまたは著しく減少したブラッシカ・ナプス（Brassica napus）（ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）とブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）との種間交雑の結果に由来する種）として従来より特徴づけられている。キャノーラ油の大半は、ヒト消費のために生産される植物油の形態にある。また、産業的用途におけるキャノーラ油の使用の市場も拡大しつつある。
【０００６】
個別の種々のキャノーラ種子に由来する食用油および工業用油の品質はその構成要素の脂肪酸によって決まるが、これは脂肪酸不飽和のタイプおよび量が、食事用途および産業的用途の両方にとって意味を持つためである。従来のキャノーラ油は、オレイン酸（C18:1）を約60％、リノール酸（C18:2）を約20％、リノレン酸（18:3）を約10％含む。従来のキャノーラの典型的な多価不飽和リノレン酸のレベルは、油が容易に酸化されるので望ましくなく、酸化の速度は、酸素の存在、光および熱への曝露、ならびに油中に本来備わるかまたは添加された酸化防止物および酸化促進物の存在を含むいくつかの要因によって影響を受ける。酸化は、繰り返しの揚げ調理（誘導酸化）または長期の貯蔵（自己酸化）の結果として異臭および酸敗を引き起こす。酸化はまた、キャノーラ油の潤滑特性および粘性も変化させる。
【０００７】
従来のキャノーラ油に比して低い多価不飽和脂肪酸のレベルを示し、一不飽和オレイン酸のレベルが高い油は、より高い酸化安定度を伴う。個々の脂肪酸の酸化されやすさは、それらの不飽和度に依存する。このため、3つの炭素-炭素二重結合を有するリノレン酸の酸化の速度は、1つの二重結合しか有しないオレイン酸の酸化の速度の25倍であり、2つの二重結合を有するリノール酸の酸化の速度の2倍である。リノール酸およびリノレン酸はまた、それらがヒドロペルオキシドを容易に形成するため、風味および匂いに及ぼす影響も最も大きい。高オレイン酸油（オレイン酸70％以上）は、貯蔵、揚げ調理および精製の際に酸化されにくく、発煙を伴わずにより高温に加熱することができるため、調理用油としてより適している。種子油中のオレイン酸（C18:1）が（重量で）70％を上回り、かつリノレン酸（C18:3）が（重量で）3.5％未満である脂肪酸プロファイルを有する、商業的に販売されているキャノーラ品種の例には、Dow AgroSciences LLC（Indianapolis, IN）によって販売されているNEXERA（商標）品種があり、これらの品種は、レストランおよび飲食物提供サービス業により、揚げ調理（frying）、炒め調理（sauteing）、オーブン調理（baking）、吹き付け（spraying）およびサラダドレッシングを含む数多くの用途に現在用いられている、水素非添加で高オレイン酸、低リノレン酸の油である「ω-9油」を産生する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開公報第04/071467号
【特許文献２】米国特許出願公開第2004/0172682号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Qi et al., Nature Biotech. 22:739 (2004)
【非特許文献２】Abbadi et al., Plant Cell 16:1 (2004)
【非特許文献３】Napier and Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society 64:387-393 (2005)
【非特許文献４】Robert et al., Functional Plant Biology 32:473-479 (2005)
【発明の概要】
【００１０】
発明の簡単な概要
植物、植物種子または植物油の中に、かなりの数量（例えば、商業ベースの数量）の、比較的長鎖の、または比較的飽和度の高いPUFAを効率的かつ効果的に産生させるための比較的安価な方法、ならびに植物、植物種子または植物油中の、そのようなPUFAに富むかなりの数量の脂質（例えば、トリアシルグリセロール（TAG）およびリン脂質（PL））に対しては、当技術分野において需要がある。本明細書に記載されたような、多価不飽和脂肪酸（PUFA）シンターゼおよび1つまたは複数のアクセサリータンパク質によって遺伝的に改変された組換え宿主生物を提供することにより、宿主生物（例えば、植物）におけるPUFA産生をもたらし、かつ向上させるための系は、当技術分野におけるアプローチに代わる意義深い選択肢である。
【００１１】
本発明は、（i）少なくとも1つのPUFAを産生する多価不飽和脂肪酸（PUFA）シンターゼ系（例えば、藻類PUFAシンターゼ系）をコードする核酸配列；および（ii）ホスホパンテテイニル補因子をPUFAシンターゼ系（例えば、藻類PUFAシンターゼ系）ACPドメインへと転移させるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）をコードする核酸配列を含む、遺伝的に改変された植物（例えば、アブラナ属）、その子孫、種子、細胞、組織または部分を対象とする。いくつかの態様において、遺伝的に改変された植物、その子孫、種子、細胞、組織または部分は、経済的に重要なアブラナ属の種（例えば、ブラッシカ・ナプスまたはブラッシカ・ジュンセア（Brassica juncea））由来である。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系は、SEQ ID NO：1のアミノ酸配列に対して少なくとも60％〜99％同一なアミノ酸配列を含むか、またはSEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列は、SEQ ID NO：6の核酸配列に対して少なくとも60％〜99％同一な核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO：6の核酸配列を含む。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系は、SEQ ID NO：2のアミノ酸配列に対して少なくとも60％〜99％同一なアミノ酸配列を含むか、またはSEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列は、SEQ ID NO：7の核酸配列に対して少なくとも60％〜99％同一な核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO：7の核酸配列を含む。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系は、SEQ ID NO：3のアミノ酸配列に対して少なくとも60％〜99％同一なアミノ酸配列を含むか、またはSEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列は、SEQ ID NO：8の核酸配列に対して少なくとも60％〜99％同一な核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO：8の核酸配列を含む。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系は、SEQ ID NO：1、2もしくは3のアミノ酸配列またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列は、SEQ ID NO：6、7もしくは8の核酸配列またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００１２】
いくつかの態様において、PPTアーゼは、SEQ ID NO：5に対して少なくとも60％〜99％同一なアミノ酸配列を含むか、またはSEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、PPTアーゼをコードする核酸配列は、SEQ ID NO：10の核酸配列に対して少なくとも60％〜99％同一であるか、またはSEQ ID NO：10の核酸配列を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、（i）および（ii）の核酸配列は、単一の組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの態様において、（i）および（ii）の核酸配列は、種子特異的プロモーターと機能的に連結している。いくつかの態様において、（i）および（ii）の核酸配列は、PvDlec2、PvPhaseolin、LfKCS3およびFAE 1からなる群より選択されるプロモーターと機能的に連結している。
【００１４】
いくつかの態様において、遺伝的に改変された植物（例えば、キャノーラ油を産生するアブラナ属の種）、その子孫、種子、細胞、組織または部分は、（iii）長鎖PUFA遊離脂肪酸（PFFA）からアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ（ACoAS）をコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの態様において、ACoASは、SEQ ID NO：4に対して少なくとも60％〜99％同一なアミノ酸配列を含むか、またはSEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ACoASは、SEQ ID NO：9の核酸配列に対して少なくとも60％〜99％同一な核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO：9の核酸配列を含む。いくつかの態様において、ACoASをコードする核酸配列は、SEQ ID NO：34の核酸配列を含む。いくつかの態様において、（i）、（ii）および／または（iii）の核酸配列は、単一の組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの態様において、（i）、（ii）および／または（iii）の核酸配列は、種子特異的プロモーターと機能的に連結している。いくつかの態様において、（i）、（ii）および／または（iii）の核酸配列は、PvDlec2、LfKCS3およびFAE 1からなる群より選択されるプロモーターと機能的に連結している。
【００１５】
いくつかの態様において、遺伝的に改変された植物（例えば、アブラナ属）、その子孫、細胞、組織または部分は、アセチルCoAカルボキシラーゼ（ACCアーゼ）をコードする核酸配列、および／または2型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGAT2）をコードする核酸配列をさらに含む。
【００１６】
本発明は、SEQ ID NO：6〜10およびSEQ ID NO：34核酸配列を含む単離された核酸分子、組換え発現ベクターpDAB7361、組換え発現ベクターpDAB7362、組換え発現ベクターpDAB7363、組換え発現ベクターpDAB7365、組換え発現ベクターpDAB7368、組換え発現ベクターpDAB7369、組換え発現ベクターpDAB7370、組換え発現ベクターpDAB100518、組換え発現ベクターpDAB101476、組換え発現ベクターpDAB9166、組換え発現ベクターpDAB9167、組換え発現ベクターpDAB7379、組換え発現ベクターpDAB7380、組換え発現ベクターpDAB9323、組換え発現ベクターpDAB9330、組換え発現ベクターpDAB9337、組換え発現ベクターpDAB9338、組換え発現ベクターpDAB9344、組換え発現ベクターpDAB9396、組換え発現ベクターpDAB101412、組換え発現ベクターpDAB7733、組換え発現ベクターpDAB7734、組換え発現ベクターpDAB101493、組換え発現ベクターpDAB109507、組換え発現ベクターpDAB109508、組換え発現ベクターpDAB109509、組換え発現ベクターpDAB9151、組換え発現ベクターpDAB108207、組換え発現ベクターpDAB108208、組換え発現ベクターpDAB108209、組換え発現ベクターpDAB9159、組換え発現ベクターpDAB9147、組換え発現ベクターpDAB108224、または組換え発現ベクターpDAB108225を対象とする。
【００１７】
いくつかの態様において、遺伝的に改変された植物、その子孫、種子、細胞、組織または部分から得られる種子油は、検出可能な量のDHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））および／またはEPA（エイコサペンタエン酸（C20:5、n-3））を含む。いくつかの態様において、種子油は0.01％〜15％のDHA、0.05％〜10％のDHA、または0.05％〜5％のDHAを含む。いくつかの態様において、種子油は0.01％〜5％のEPA、0.05％〜5％のEPA、または0.05％〜1％のEPAを含む。他の態様において、種子油中に認められる検出可能な量のDHAおよび／またはEPAは、遺伝的に改変された植物の穀粒および／または穀粉中にも認められる。いくつかの態様において、検出可能な量のDHAおよび／またはEPAは、重量で70％またはそれ以上のオレイン酸（C18:1）および／または4％またはそれ未満のリノレン酸（C18:3）で構成される脂肪酸含有率を有するアブラナ属の種の種子油中に認められる。
【００１８】
本発明は、本明細書に記載の遺伝的に改変された植物（例えば、アブラナ属）、その子孫、細胞、組織または部分から得られる油または種子を対象とする。本発明は、本明細書に記載の遺伝的に改変された植物、その子孫、細胞、組織または部分から得られた油を含む食品を対象とする。本発明はまた、本明細書に記載の遺伝的に改変された植物、その子孫、細胞、組織もしくは部分から得られた油を含むか、または本明細書に記載の遺伝的に改変された植物、その子孫、細胞、組織もしくは部分から得られた種子を含む機能性食品も対象とする。本発明は、本明細書に記載の遺伝的に改変された植物、子孫、細胞、組織または部分から得られた油を含む医薬製品を対象とする。
【００１９】
本発明は、少なくとも1つのLC-PUFAを含む油を生産するための方法であって、本明細書に記載の遺伝的に改変された植物（例えば、アブラナ属）、その子孫、細胞、組織もしくは部分から、または本明細書に記載の遺伝的に改変された植物（例えば、アブラナ属）、その子孫、細胞、組織もしくは部分の種子から油を回収する段階を含む方法を対象とする。本発明はまた、少なくとも1つのLC-PUFAを含む油を生産するための方法であって、本明細書に記載の遺伝的に改変された植物（例えば、アブラナ属）、その子孫、細胞、組織または部分を成育させる段階を含む方法も対象とする。本発明はまた、種子油中に少なくとも1つのLC-PUFAを産生させるための方法であって、本明細書に記載の遺伝的に改変された植物（例えば、アブラナ属）、その子孫、細胞、組織または部分の種子から油を回収する段階を含む方法も対象とする。
【００２０】
本発明は、種子油中に少なくとも1つのPUFAを産生させるための方法であって、本明細書に記載の遺伝的に改変された植物（例えば、アブラナ属）、その子孫、細胞、組織または部分を成育させる段階を含む方法を対象とする。本発明はまた、少なくとも1つのPUFAを含む栄養補助食品または治療用製品を個体に提供するための方法であって、本明細書に記載の遺伝的に改変された植物（例えば、アブラナ属）、その子孫、細胞、組織もしくは部分、本明細書に記載の油、本明細書に記載の種子、本明細書に記載の食品、本明細書に記載の機能性食品、または本明細書に記載の医薬製品を個体に提供する段階を含む方法も対象とする。いくつかの態様において、そのような態様に含まれるPUFAは、DHAおよび／またはEPAである。
【００２１】
本発明は、本明細書に記載の遺伝的に改変された植物（例えば、アブラナ属）、その子孫、細胞、組織または部分を作製するための方法であって、（i）少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を産生するPUFAシンターゼ系（例えば、藻類PUFAシンターゼ系）をコードする核酸配列；および（ii）ホスホパンテテイニル補因子をPUFAシンターゼ系（例えば、藻類PUFAシンターゼ系）ACPドメインへと転移させるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）をコードする核酸配列によって植物または植物細胞を形質転換させる段階を含む方法を対象とする。いくつかの態様において、本方法は、（iii）長鎖PUFA遊離脂肪酸（FFA）からアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ（ACoAS）をコードする核酸配列によって植物または植物細胞を形質転換させる段階をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本発明のさまざまな態様は、本発明の一部をなす以下の詳細な説明、図面および添付の配列説明から、より十分に理解することができる。
【図１】PUFA OrfAの9つの反復ドメインのそれぞれをコードする、再設計されたDNA配列のClustal W（Vector NTIにおけるアラインメント）を描写している。
【図２】pDAB7361のプラスミド地図を示している。
【図３】pDAB7362のプラスミド地図を示している。
【図４】pDAB7363のプラスミド地図を示している。
【図５】キャノーラ事象5197[14]-032.002からのT1種子のDHA含有率に関する単一種子分析を示している。
【図６】Orf A、Orf BおよびOrf Cに対して特異的な抗血清によるプローブ検査を行った、キャノーラ事象5197[14]-032.002由来の後期（DAPが30を上回る）の発育中T1種子からの抽出物のSDS-PAGEウエスタンブロットの結果を示している。
【図７Ａ】DHA産生性キャノーラ事象5197[14]-032.002.Sx002から受粉15、20、25、30、35および42日後に収集した発育中T2種子試料の脂質含有率を示している。
【図７Ｂ】ウエスタンブロットによる、DHA産生性キャノーラ事象5197[14]-032.002,Sx002からの抽出物におけるOrfA、OrfBおよびOrfCポリペプチドの存在を示している。
【図８】キャノーラ事象5197[14]-032.002の温室内で成育させたT1植物由来のホモ接合T2植物のLC-PUFA含有率を示している。
【図９】6つのホモ接合系統からの単一T2種子分析によるLC-PUFAの概要を示している。
【図１０】2つのT1系統および非形質転換ω-9 Nexera 710の正逆交雑から結果として生じた親種子およびF1雑種種子のDHA含有率を示している。
【図１１】キャノーラ事象5197[13]-010.001に由来する60件の個々のT1植物のpat遺伝子コピー数を示している。
【図１２】受粉後日数（DAP）として表した6つの時点のそれぞれに関する生の強度値を用いた、ヌル非形質転換ω-9 Nexera 710系統における関心対象の遺伝子の発現プロファイルを示している。
【図１３】DAPとして表した6つの時点のそれぞれに関する標準化された強度値を用いた、ヌル非形質転換ω-9 Nexera 710系統における関心対象の遺伝子の発現プロファイルを示している。
【図１４】DAPとして表した6つの時点のそれぞれに関する生の強度値を用いた、ホモ接合体事象5197[14]-032.002系統における関心対象の遺伝子の発現プロファイルを示している。
【図１５】DAPとして表した6つの時点のそれぞれに関する標準化された強度値を用いた、ホモ接合体事象5197[14]-032.002系統における関心対象の遺伝子の発現プロファイルを示している。
【図１６】薄層クロマトグラフィー（TLC）によって測定した、成熟トランスジェニックキャノーラ種子におけるPUFAシンターゼ活性を示している。
【図１７】参照ペプチドと、HetI共発現の存在下または非存在下において大腸菌（E. coli）で発現されたOrfA、およびキャノーラ事象5197[14]-032.002で発現されたOrfAのそれぞれとの算出比を示している。
【図１８】アポ（apo）2-9ペプチドと、HetI共発現の存在下または非存在下において大腸菌（E. coli）で発現されたOrfA、およびトランスジェニックキャノーラ事象5197[14]-032.002で発現されたOrfAからの6つの参照ペプチドのそれぞれとの算出比を示している。
【図１９】pDAB7365のプラスミド地図を示している。
【図２０】pDAB7368のプラスミド地図を示している。
【図２１】pDAB7369のプラスミド地図を示している。
【図２２】pDAB7370のプラスミド地図を示している。
【図２３】pDAB100518のプラスミド地図を示している。
【図２４】pDAB101476のプラスミド地図を示している。
【図２５】pDAB101477のプラスミド地図を示している。
【図２６】pDAB9166のプラスミド地図を示している。
【図２７】pDAB9167のプラスミド地図を示している。
【図２８】pDAB7379のプラスミド地図を示している。
【図２９】pDAB7380のプラスミド地図を示している。
【図３０】pDAB9323のプラスミド地図を示している。
【図３１】pDAB9330のプラスミド地図を示している。
【図３２】pDAB9337のプラスミド地図を示している。
【図３３】pDAB9338のプラスミド地図を示している。
【図３４】pDAB9344のプラスミド地図を示している。
【図３５】pDAB9396のプラスミド地図を示している。
【図３６】pDAB101412のプラスミド地図を示している。
【図３７】pDAB7733のプラスミド地図を示している。
【図３８】pDAB7734のプラスミド地図を示している。
【図３９】pDAB101493のプラスミド地図を示している。
【図４０】pDAB109507のプラスミド地図を示している。
【図４１】pDAB109508のプラスミド地図を示している。
【図４２】pDAB109509のプラスミド地図を示している。
【図４３】pDAB9151のプラスミド地図を示している。
【図４４】pDAB108207のプラスミド地図を示している。
【図４５】pDAB108208のプラスミド地図を示している。
【図４６】pDAB108209のプラスミド地図を示している。
【図４７】pDAB9159のプラスミド地図を示している。
【図４８】pDAB9147のプラスミド地図を示している。
【図４９】pDAB108224のプラスミド地図を示している。
【図５０】pDAB108225のプラスミド地図を示している。
【図５１】pDAB101493、pDAB7362、pDAB7369、pDAB101412またはpDAB7380によって形質転換させた個々のトランスジェニックアラビドプシス属事象由来のT2種子のDHA含有率およびLC-PUFA含有率を図示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
「多価不飽和脂肪酸」または「PUFA」という用語は、本明細書で用いる場合、炭素鎖の長さが少なくとも炭素16個、少なくとも炭素18個、少なくとも炭素20個、または炭素22個もしくはそれ以上であって、少なくとも3つもしくはそれ以上の二重結合、4つもしくはそれ以上の二重結合、5つもしくはそれ以上の二重結合、または6つもしくはそれ以上の二重結合を有し、すべての二重結合がシス配置にある脂肪酸のことを指す。
【００２４】
「長鎖多価不飽和脂肪酸」または「LC-PUFA」という用語は、本明細書で用いる場合、炭素鎖の長さが18およびそれ以上、炭素鎖の長さが20およびそれ以上であって、3つもしくはそれ以上の二重結合を含むか、または炭素が22個もしくはそれ以上であって、少なくとも3つもしくはそれ以上の二重結合、4つもしくはそれ以上の二重結合、5つもしくはそれ以上の二重結合、または6つもしくはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸のことを指す。ω-6系列のLC-PUFAには、γ-リノレン酸（C18:3）、ジ-ホモ-γ-リノレン酸（C20:3n-6）、アラキドン酸（C20:4n-6）、アドレン酸（adrenic acid）（ドコサテトラエン酸またはDTAとも呼ばれる）（C22：4n-6）およびドコサペンタエン酸（C22:5n-6）が非限定的に含まれる。ω-3系列のLC-PUFAには、α-リノレン酸（C18:3）、エイコサトリエン酸（C20:3n-3）、エイコサテトラエン酸（C20:4n-3）、エイコサペンタエン酸（C20:5n-3）、ドコサペンタエン酸（C22:5n-3）およびドコサヘキサエン酸（C22:6n-3）が非限定的に含まれる。LC-PUFAにはまた、C28：8（n-3）を非限定的に含む、炭素が22個を上回って、4つまたはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸も含まれる。
【００２５】
「PUFAシンターゼ」または「PUFAシンターゼ系」または「SzPUFA」または「hSzThPUFA」という用語は、本明細書で用いる場合、多価不飽和脂肪酸（PUFA）、特に長鎖PUFA（LC-PUFA）を産生する酵素系、ならびに複合体中のそのような酵素の任意のドメインのことを指す。PUFAシンターゼという用語には、PUFA PKS系、またはPUFAの産生のためのPKS様の系が非限定的に含まれる。
【００２６】
「ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ」または「PPTアーゼ」または「NoHetI」という用語は、本明細書で用いる場合、補因子（例えば、4-ホスホパンテテイン）を、補酵素A（CoA）からPUFAシンターゼ系に存在する1つまたは複数のACPドメインへと転移させることによってPUFAシンターゼ系を活性化する酵素のことを指す。
【００２７】
「アシル-CoAシンテターゼ」または「ACoAS」または「SzACS-2」という用語は、本明細書で用いる場合、長鎖多価不飽和遊離脂肪酸（FFA）からアシル-CoAへの変換を触媒する酵素のことを指す。
【００２８】
「植物」という用語は、本明細書で用いる場合、植物のあらゆる子孫、細胞、組織または部分を非限定的に含む。
【００２９】
「ニュートラシューティカル（nutraceutical）」とは、生理的利益をもたらすか、または疾患に対する防御を与える、植物から単離、精製、濃縮または産生された産物のことを意味し、これには、そのような産物を補充した加工食品も、そのような生理的活性のある構成要素を高いレベルで含むように遺伝的に操作された作物から産生された食品とともに含まれる。
【００３０】
「機能性食品」とは、（a）通常食の一部として消費される従来食品と外観が似ているか、またはそれであることができ、かつ（b）改変されていない食品中に典型的に存在する構成要素の割合の改変に基づき、栄養価が強化されているか、および／または特定の食生活上の利益を有する、食品のことを意味する。
【００３１】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、単数の核酸ならびに複数の核酸、核酸分子またはその断片、変異体もしくは誘導体、または構築物、例えばメッセンジャーRNA（mRNA）もしくはプラスミドDNA（pDNA）を範囲に含むものとする。ポリヌクレオチドまたは核酸には、5'および3'非翻訳配列ならびにコード配列を含む、完全長cDNA配列のヌクレオチド配列、またはその断片が含まれうる。ポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成されてよく、それは修飾されていないRNAもしくはDNA、または修飾されたRNAもしくはDNAでありうる。例えば、ポリヌクレオチドまたは核酸は、一本鎖および二本鎖のDNA、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖のRNA、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖であり、または一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であってもよいDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子で構成されうる。これらの用語はまた、ポリヌクレオチドまたは核酸の化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態も包含する。
【００３２】
ポリヌクレオチド配列または核酸配列は、それがその自然の環境から取り出されている場合に、「単離された」と呼ぶことができる。例えば、ベクター中に含まれている、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードする異種ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明において単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸のさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中にある（部分的もしくは実質的に）精製されたポリヌクレオチドまたは核酸が含まれる。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成により生成されたそのような分子もさらに含まれる。DNAの重合体の形態にある単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、cDNA、ゲノムDNAまたは合成DNAの1つまたは複数のセグメントで構成されてよい。
【００３３】
「遺伝子」という用語は、コード配列の前方（5'非コード配列）および後方（3'非コード配列）にある調節配列を任意で含む、特定のタンパク質として発現されうる核酸またはその断片のことを指す。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「コード領域」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列のことを指す。「適した調節配列」とは、コード配列の上流（5'非コード配列）、内部または下流（3'非コード配列）に位置し、かつ関連するコード配列の転写、RNAプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列のことを指す。調節領域には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造が含まれうる。
【００３５】
本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」およびそれらの断片を範囲に含むものとし、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直鎖状に連結された単量体（アミノ酸）で構成される分子のことを指す。「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸が2個またはそれ以上である任意の1つまたは複数の鎖のことを指し、特定の長さの産物を指すわけでなない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖、またはアミノ酸が2個もしくはそれ以上である1つもしくは複数の鎖を指して用いられる他の任意の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲に含まれ、「ポリペプチド」という用語をこれらの用語のいずれかの代わりに、または互換的に用いることができる。ポリペプチドは天然の生物供給源に由来しても、または組換え技術によって産生されてもよいが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳される必要はない。化学合成によるものを含む任意の様式で、それを作製することができる。
【００３６】
「単離された」ポリペプチド、またはその断片、変異体もしくは誘導体とは、その天然環境にないポリペプチドを意図している。特定のレベルの精製が必要とされるわけではない。例えば、単離されたポリペプチドを、その自然な環境または天然環境から取り出すことができる。宿主細胞において組換えにより産生されたポリペプチドおよびタンパク質は本発明において単離されたとみなされ、任意の適した手法によって分離、分画または部分的もしくは実質的に精製されたネイティブポリペプチドまたは組換えポリペプチドについても同様である。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「ネイティブ」という用語は、もし存在するならばそれ自体の調節配列とともにある、天然に認められるポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの形態のことを指す。
【００３８】
本明細書で用いる場合、「内因性」とは、生物において、または生物のゲノム中で、その天然の位置にある、ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドのネイティブ形態のことを指す。「内因性ポリヌクレオチド」には、生物のゲノム中でその天然の位置にあるネイティブポリヌクレオチドが含まれる。「内因性遺伝子」には、生物のゲノム中でその天然の位置にあるネイティブ遺伝子が含まれる。「内因性ポリペプチド」には、生物においてその天然の位置にあるネイティブポリペプチドが含まれる。
【００３９】
本明細書で用いる場合、「異種」とは、宿主生物において天然には認められないが宿主生物に導入されている、ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドのことを指す。「異種ポリヌクレオチド」には、供給源の生物に、対応するネイティブポリヌクレオチドとは異なる形態で再び導入されたネイティブコード領域またはその部分が含まれる。「異種遺伝子」には、供給源の生物に、対応するネイティブ遺伝子とは異なる形態で再び導入されたネイティブコード領域またはその部分が含まれる。例えば、異種遺伝子には、ネイティブ宿主に再び導入された、非ネイティブ調節領域を含むキメラ遺伝子の一部分であるネイティブコード領域が含まれうる。「異種ポリペプチド」には、供給源の生物に再び導入された、対応するネイティブポリペプチドとは異なるネイティブポリペプチドが含まれる。
【００４０】
本明細書で用いる場合、「改変」という用語は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの活性の低下、実質的な消失、または消失をもたらす、本明細書に開示されたポリヌクレオチドの変化、ならびにポリペプチドの活性の低下、実質的な消失または消失をもたらす、本明細書に開示されたポリペプチドの変化のことを指す。そのような変化は、欠失、突然変異（例えば、自然突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、ミューテーター遺伝子によって引き起こされる突然変異誘発、もしくはトランスポゾン突然変異誘発）、置換、挿入、ダウンレギュレーション、細胞位置の変更、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの状態の変更（例えば、メチル化、リン酸化もしくはユビキチン化）、補因子の除去、アンチセンスRNA／DNAの導入、干渉RNA／DNAの導入、化学修飾、共有結合修飾、UVもしくはX線の照射、相同組換え、有糸分裂組換え、プロモーター置換法、および／またはそれらの組み合わせを非限定的に含む、当技術分野において周知の方法によって作り出すことができる。どのヌクレオチドまたはアミノ酸残基を改変しうるかを判定する上での手引きは、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を、酵母または細菌などの相同なポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と比較して、相同性の高い領域（保存された領域）またはコンセンサス配列の領域に加える改変の数を最大限にすることによって見いだすことができる。
【００４１】
「誘導体」という用語は、本明細書で用いる場合、本発明において開示された配列の改変物のことを指す。そのような改変物の実例は、油糧種子作物種における本明細書に開示されたコード配列の機能を保持する、幾分変化させる、または高める、本明細書に開示されたコード配列の核酸配列に関係する1つまたは複数の塩基の置換、挿入および／または欠失であると考えられる。そのような誘導体は、例えば、配列構造の予測および最適化のためのコンピュータモデル化の手法を用いて、当業者によって容易に決定されうる。「誘導体」という用語には、このため、本発明のLC-PUFAの産生に用いるための開示された機能性を有しうるような、本明細書に開示されたコード配列との実質的な配列相同性を有する核酸配列も含まれる。
【００４２】
本明細書で用いる場合、「変異体」という用語は、例えば突然変異誘発などの組換えDNA手法を用いて作製したアミノ酸の挿入、欠失、突然変異および置換の点で、具体的に挙げた本発明のポリペプチドとは異なるポリペプチドのことを指す。関心対象の活性を無効化することなしに、どのアミノ酸残基を置き換える、付加する、または欠失させることができるかを判定する上での手引きは、特定のポリペプチドの配列を相同ポリペプチドの配列と比較して、相同性の高い領域（保存された領域）に加えるアミノ酸配列変化の数を最小限にすることによって、またはアミノ酸をコンセンサス配列に置き換えることによって見いだすことができる。
【００４３】
または、これらの同一または類似のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド変異体を、遺伝暗号における「冗長性」を利用することによって合成または選択することもできる。さまざまな制限部位を生成させるサイレント変化などのさまざまなコドン置換を、発現用のプラスミドベクターまたはウイルスベクターへのクローニングを最適化するために導入することができる。ポリヌクレオチド配列における突然変異は、そのポリペプチドに、またはポリペプチドの任意の部分の特性を修飾するためにポリペプチドに添加される他のペプチドのドメインに反映されうる。
【００４４】
アミノ酸「置換」は、1つのアミノ酸を類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸によって置き換えること、すなわち保存的アミノ酸置換の結果であってもよく、またはそれらは、1つのアミノ酸を異なる構造および／または化学特性を有するアミノ酸によって置き換えること、すなわち非保存的アミノ酸置換の結果であってもよい。「保存的」アミノ酸置換は、係わる残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性または両親媒性の類似性に基づいて作製することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる；正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる；ならびに負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。または、これらのアミノ酸のいずれかの極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性または両親媒性の違いを選択することによって、「非保存的」アミノ酸置換を作製することもできる。「挿入」または「欠失」は、組換えタンパク質によって構造的または機能的に容認される差異の範囲内にあってよい。許容される差異は、ポリペプチド分子中のアミノ酸の挿入、欠失または置換を組換えDNA手法を用いて系統的に作製し、その結果生じた組換え変異体を活性に関してアッセイすることによって、実験的に求めることができる。
【００４５】
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性RNAの発現を制御することのできるDNA配列のことを指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の3'側に位置する。プロモーターは、その全体がネイティブ遺伝子に由来してもよく、または天然に見いだされるプロモーターに由来する複数の異なるエレメントで構成されてもよく、またはさらには合成DNAセグメントを含んでもよい。当業者であれば、異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞種において、または異なる発生段階で、または異なる環境条件もしくは生理条件に応答して、遺伝子の発現を導きうることを理解するであろう。遺伝子をほとんどの細胞種においてほとんどの時点で発現させるプロモーターは、一般的に「構成性プロモーター」と呼ばれる。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全に明確には定められていないため、異なる長さのDNA断片が同一のプロモーター活性を有しうることも認識されている。
【００４６】
「機能的に連結された」という用語は、一方の機能がもう一方によって影響されるような、1つの核酸断片上の核酸配列の連係のことを指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現を生じさせうる（例えば、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）ならば、そのコード配列と機能的に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンスの向きに、調節配列と機能的に連結させることができる。
【００４７】
「発現」という用語は、本明細書で用いる場合、本発明の核酸断片に由来するセンスRNA（mRNA）またはアンチセンスRNAの転写および安定な蓄積のことを指す。発現が、mRNAのポリペプチドへの翻訳のことを指すこともある。
【００４８】
「過剰発現」という用語は、本明細書で用いる場合、同じまたは関連する遺伝子の内因性発現よりも高度の発現のことを指す。異種遺伝子は、その発現が同等の内因性遺伝子のものよりも高度であるならば、過剰発現されている。
【００４９】
本明細書で用いる場合、「形質転換」という用語は、遺伝的に安定的な遺伝をもたらす、宿主生物への核酸または断片の移入のことを指す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」生物と呼ばれる。
【００５０】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、本明細書で用いる場合、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を多くの場合保有し、通常は環状二本鎖DNA分子の形態にある染色体外因子のことを指す。そのような因子は、いくつかのヌクレオチド配列が、選択した遺伝子産物のためのプロモーター断片およびDNA配列を適切な3'非翻訳配列とともに細胞に導入することのできる独特な構築物として連結されるかまたは組み換えられている、任意の源に由来する、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAの、直鎖状または環状の、自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ配列またはヌクレオチド配列であってよい。
【００５１】
本明細書で用いる場合、「コドン縮重」という用語は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の差異を許容する遺伝暗号の性質のことを指す。当業者であれば、ある決まったアミノ酸を指定するヌクレオチドコドンの使用頻度に関して、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分承知しているであろう。このため、宿主細胞における発現向上のために遺伝子を合成する場合には、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。
【００５２】
「コドンが最適化された（codon-optimized）」という用語は、それがさまざまな宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコード領域を指す場合、遺伝子または核酸分子のコード領域における、そのDNAによってコードされるポリペプチドを変更することなく宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映させるようなコドンの変更のことを指す。そのような最適化には、少なくとも1つ、または複数、またはかなりの数のコドンを、その生物の遺伝子でより高い頻度で用いられる1つまたは複数のコドンによって置き換えることが含まれる。
【００５３】
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列における偏りは、その遺伝子をコードする配列における差異を可能にする。各コドンは3つのヌクレオチドからなり、DNAを含むヌクレオチドは4種の特定の塩基で構成されるため、ヌクレオチドの組み合わせは64通りが考えられ、そのうち61通りがアミノ酸をコードする（残りの3つのコドンは翻訳を終止させるシグナルをコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝暗号」は、本明細書において表1として転載されている。その結果、多くのアミノ酸は複数のコドンによって指定されている。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは4種のトリプレットによってコードされ、セリンおよびアルギニンは6種によってコードされるが、一方、トリプトファンおよびメチオニンは1つのトリプレットのみによってコードされる。この縮重性は、DNA塩基組成物が、DNAによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更することなく広い範囲にわたって異なることを可能にする。
【００５４】
（表１）標準的な遺伝暗号
2013529086.tif 000002
【００５５】
多くの生物は、成長中のペプチド鎖への特定のアミノ酸の挿入のためのコードを行う特定のコドンの使用に関してバイアスを示す。コドン選好性、またはコドンバイアス、すなわち生物間のコドン使用頻度の違いは、遺伝暗号の縮重性によってもたらされ、多くの生物において詳細に記述されている。コドンバイアスは多くの場合、メッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳の効率と相関しており、それ自体は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーRNA（tRNA）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択されるtRNAの優位性は、一般に、ペプチド合成に最も高い頻度で用いられるコドンの反映である。このため、コドン最適化に基づき、遺伝子を、ある所与の生物における最適な遺伝子発現の目的に合ったものにすることができる。
【００５６】
多種多様な動物、植物および微生物の種に関して多数の遺伝子配列を入手しうることから判断して、コドン使用の相対的頻度を計算することが可能である。コドン使用頻度の表は容易に入手可能であり、さまざまな形で適合化することができる。Nakamura et al. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を参照。この表および類似の表を利用することによって、当業者はその頻度を任意の所与のポリペプチド配列に当てはめて、そのポリペプチドをコードするだけでなく、ある所与の種にとって最適なコドンを用いる、コドンが最適化されたコード領域の核酸断片を作製することができる。本発明は、本明細書においてさらに説明するような、本発明のOrfA、OrfB、キメラOrfC、PPTアーゼおよび／または他のアクセサリータンパク質のコドン最適化形態に関する。
【００５７】
「同一性％（percent identity）」という用語は、当技術分野で公知であるように、配列を比較することによって決定される、2つもしくはそれ以上のポリペプチド配列間または2つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係のことである。当技術分野において、「同一性（identity）」は、ポリペプチドまたポリヌクレオチド配列間の配列関連性の度合いのことも指し、これは場合に応じて、そのような配列の連鎖間の合致によって決定される。「同一性」および「類似性」は、1）Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988)；2）Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993)；3）Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994)；4）Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987)；および5）Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991)に開示されたものを非限定的に含む、公知の方法によって容易に計算することができる。
【００５８】
同一性を決定するための方法は、被験配列間で最良の合致が得られるように設計されている。同一性および類似性を決定するための方法は、公開コンピュータプログラムで体系的に整備されている。配列アラインメントおよび同一性％の計算は、例えば、Vector NTI（登録商標）スイート（Invitrogen, Carlsbad, CA）のAlignXプログラム、またはLASERGENEバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイート（DNASTAR Inc., Madison, WI）のMegAlign（商標）プログラムを用いて行うことができる。配列の多重アラインメントは、Clustal V（Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989)；Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8: 189-191 (1992)により開示）と名付けられ、LASERGENEバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイート（DNASTAR Inc.）のMegAlign（商標）プログラムに見られるアラインメント法に対応する「Clustal Vアラインメント法」を含む、いくつかの種類のアルゴリズムを範囲に含む「Clustalアラインメント法」を用いて行われる。多重アラインメントの場合、デフォルト値はGAP PENALTY＝10およびGAP LENGTH PENALTY＝10に対応する。Clustal法を用いるタンパク質配列の同一性％のペアワイズアラインメントおよび計算のためのデフォルトパラメーターは、KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5およびDIAGONALS SAVED＝5である。核酸の場合、これらのパラメーターはKTUPLE＝2、GAP PENALTY＝5、WINDOW＝4およびDIAGONALS SAVED＝4である。Clustal Vプログラムを用いた配列のアラインメントの後に、同じプログラムにおける「配列距離」表を検査することにより、「同一性％」を得ることが可能である。さらに「Clustal Wアラインメント法」も利用可能であり、これは、Clustal W（Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989)；Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8: 189-191(1992)により記載）と名付けられ、LASERGENEバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイート（DNASTAR Inc.）のMegAlign（商標）v6.1プログラムに見られるアラインメント法に対応する。多重アラインメントのためのデフォルトパラメーター（GAP PENALTY＝10、GAP LENGTH PENALTY＝0.2、Delay Divergen Seqs（％）＝30、DNA Transition Weight＝0.5、Protein Weight Matrix＝Gonnet Series、DNA Weight Matrix＝IUB）。Clustal Wプログラムを用いた配列のアラインメントの後に、同じプログラムにおける「配列距離」表を検査することにより、「同一性％」を得ることが可能である。
【００５９】
当業者であれば、ポリペプチドを他の種から同定する上で多くのレベルの配列同一性が有用であり、そのようなポリペプチドが同一または類似の機能または活性を有することを十分に理解しているであろう。同一性％の有用な例には、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％もしくは95％が非限定的に含まれ、または60％から100％までの任意の整数パーセンテージ、例えば60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％などが本発明を説明する上で有用でありうる。適した核酸断片は、上記の相同性を有するだけでなく、典型的には、少なくとも50アミノ酸、少なくとも100アミノ酸、少なくとも150アミノ酸、少なくとも200アミノ酸、および少なくとも250アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００６０】
「配列解析ソフトウエア」という用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の解析のために有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウエアプログラムのことを指す。「配列解析ソフトウエア」は、市販のものでもよく、または独自に開発したものでもよい。典型的な配列解析ソフトウエアには、1.）GCGプログラムスイート（Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI）；2）BLASTP、BLASTN、BLASTX（Altschul et al., J. Mol Biol., 215:403-410 (1990)）；3.）DNASTAR（DNASTAR, Inc. Madison, WI）；4.）Sequencher（Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI）；および5.）Smith-Watermanアルゴリズムを組み入れたFASTAプログラム（W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY）が非限定的に含まれる。本出願の文脈において、配列解析ソフトウエアを解析のために用いる場合には、別に指定しない限り、解析の結果は参照したプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解されるであろう。本明細書で用いる場合、「デフォルト値」は、最初に初期化した時にソフトウエアに最初にロードされた値またはパラメーターの任意のセットを意味するものとする。
【００６１】
本明細書で用いられる標準的な組換えDNA手法および分子クローニング手法は当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2000)；およびSilhavy et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984)；およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987 to present)によって記載されている。
【００６２】
本明細書に開示された組換え宿主の遺伝子操作は、標準的な遺伝学的手法およびスクリーニングにより、遺伝子操作のために適した任意の宿主細胞で行うことができる。いくつかの態様において、本明細書に開示された組換え宿主細胞は、遺伝子操作および組換え遺伝子発現のために有用な任意の生物宿主または微生物宿主であってよい。いくつかの態様において、組換え宿主は、双子葉植物および単子葉植物の両方を含む任意の高等植物、ならびに作物植物およびその油のために用いられる植物を含む消費可能な植物であってよいが、それらには限定されない。すなわち、以下にさらに説明するような任意の植物種および植物細胞を選択することができる。
【００６３】
本発明の油は、アブラナ属の種の種子油中にDHAおよび／またはEPAを産生するキャノーラ栽培品種から得ることができ、ここでこの油は重量で70％もしくはそれ以上のオレイン酸（C18:1）および／または4％もしくはそれ未満のリノレン酸（C18:3）を含む脂肪酸含有率を有する。そのような油は心臓に良く、飲食物提供サービスおよび一般消費者向け包装品の用途での安定性が向上している。そのような油はまた、水素添加の必要性も少なく、食品産業によって使用されるダイズ油、パーム油および他の多くの油に比して栄養上の利点も得られる。当技術分野において公知の酸化防止剤および加工用添加物の添加によって、そのような油の酸化安定度をさらに高めることができる。
【００６４】
また、本発明の油を、料理用でも食事用でもない工程および組成物に用いることもできる。これらの用途のいくつかは、産業用、美容用または医療用でありうる。また、本発明の油を、本発明の油が適合する任意の用途に用いることもできる。一般に、本発明の油は、潤滑剤、潤滑剤添加物、金属加工油、作動液および耐火性作動液などの種々の用途において、鉱油、エステル、脂肪酸または動物性脂肪などに代わって用いることができる。また、本発明の油を、改変油（modified oil）を製造する工程における材料として用いることもできる。本発明の油を改変するための手法の例には、分留、水素添加、油のオレイン酸またはリノレン酸含有率の変更、および当業者に公知の他の改変手法が含まれる。
【００６５】
本発明の油の美容用用途の例には、美容用組成物における皮膚軟化剤として；ワセリン代用物として；石鹸の一部を構成するものとして、または石鹸を製造するための工程における材料として；経口治療溶液の一部を構成するものとして；老化に対する処置用（ageing treatment）組成物の一部を構成するものとして；および、皮膚用または毛髪用のエアロゾルフォーム製剤の一部を構成するものとしての使用が含まれる。
【００６６】
さらに、本発明の油を医療用途に用いることもできる。例えば、本発明の油を感染に対する防護障壁に用いることができ、ω-9脂肪酸を多く含む油を、移植片の存続性を強化するために用いることができる（米国特許第6,210,700号）。
【００６７】
前記のものは、本発明の油が適合する料理用以外の用途の非限定的な例であることが理解されるべきである。先述の通り、本発明の油および改変油は、当業者に公知のすべての用途において、鉱油、エステル、脂肪酸または動物性脂肪などに代わって用いることができる。
【００６８】
PUFAシンターゼ系
真核生物における長鎖PUFA（LC-PUFA）の合成のための「標準的」または「古典的」な経路は中鎖長の飽和または一不飽和脂肪酸の伸長および不飽和化を伴い、それは記載されている。PUFAシンターゼ系を介した長鎖PUFAの合成のための経路も記載されており、これは「標準的」経路とは非常に異なる。具体的には、PUFAシンターゼはマロニル-CoAを炭素源として利用し、中間体を大量に放出することなく、最終的なPUFAを産生する。また、PUFAシンターゼの場合には、酸素を必要としない機構を用いて、合成時に適切なシス二重結合も付加される。いくつかの態様においては、NADPHが合成サイクルにおける還元剤として用いられる。
【００６９】
本発明は、PUFAシンターゼ系を（内因性に、または遺伝子操作によるかのいずれかで）発現するように遺伝的に改変された宿主生物（例えば、植物）に関する。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系を発現するように遺伝的に改変された生物であって、天然に（遺伝子操作を伴わずに内因性に）はそのような系または少なくともその生物において遺伝的に改変されているその特定のPUFAシンターゼもしくはその部分を発現しない生物を、本明細書では、PUFAシンターゼによる生物の改変に関して、またはその生物によって内因性には発現されない別のタンパク質による生物の改変に関して、「異種」宿主生物と呼ぶことができる。本発明の遺伝子操作は、PUFAシンターゼ系を内因性に発現する宿主生物におけるPUFA産生を向上させるために用いることができ、ここで生物は異なるPUFAシンターゼまたはその一部分によるそれ以上の改変は受けていない。
【００７０】
本発明によるPUFAシンターゼ系は、選択されたサイクルにおけるトランス-シス異性化およびエノイル還元反応を含む、脂肪酸鎖の反復処理および非反復処理の両方を遂行するようにともに作用しうるいくつかの多機能性タンパク質を含みうる（単機能性タンパク質が、特に海洋細菌由来のPUFAシンターゼ系の場合には含まれうる）。これらのタンパク質を、本明細書では、コアPUFAシンターゼ酵素複合体またはコアPUFAシンターゼ系と呼ぶこともある。これらのタンパク質の内部に含まれるドメインおよびモチーフの一般的な機能は当技術分野で個々に公知であり、海洋細菌および真核生物由来のさまざまなPUFAシンターゼ系に関して詳細に記載されている（例えば、米国特許第6,140,486号；米国特許第6,566,583号；Metz et al., Science 293:290-293 (2001)；米国特許出願公開第2002/0194641号；米国特許出願公開第2004/0235127号；米国特許出願公開第2005/0100995号、および国際公開公報第2006/135866号を参照）。これらのドメインは、単一のタンパク質として（例えば、ドメインとタンパク質は同義である）、または上述したように単一のタンパク質の中の2つもしくはそれ以上の（複数の）ドメインの1つとして見いだされる。海洋細菌およびヤブレツボカビ属（Thraustochytrium）のメンバー由来のさまざまなPUFAシンターゼのドメイン構成、ならびにそのようなPUFAシンターゼを含む遺伝子およびタンパク質の構造的および機能的な特徴は記載されている（例えば、米国特許第6,140,486号；米国特許第6,566,583号；Metz et al., Science 293:290-293 (2001)；米国特許出願公開第2002/0194641号；米国特許出願公開第2004/0235127号；米国特許出願公開第2005/0100995号および国際公開公報第2006/135866号を参照）。
【００７１】
PUFAシンターゼ活性を有するポリヌクレオチド、遺伝子およびポリペプチドの数多くの例が当技術分野において公知であり、本明細書に開示された遺伝的に改変された宿主に用いることができる。本発明において有用なPUFAシンターゼのタンパク質またはドメインには、細菌性および非細菌性PUFAシンターゼの両方が含まれうる。非細菌性PUFAシンターゼとは、真核生物のように細菌ではない生物からの、またはそれに由来するPUFAシンターゼのことである。細菌PUFAシンターゼは、例えば、米国特許出願公開第2008/0050505号に記載されている。細菌PUFAシンターゼの機能性ドメインを有する非細菌性PUFAシンターゼの機能性ドメイン、さらには他のPKS系（I型反復またはモジュラー、II型またはIII型）またはFAS系からのPUFAシンターゼの機能性ドメインまたはタンパク質を組み入れた、本発明の遺伝的に改変された植物を作製することができる。
【００７２】
いくつかの態様において、本発明のPUFAシンターゼ系は、典型的には3つまたはそれ以上のタンパク質に含まれる、少なくとも以下の生物活性ドメインを含む：（a）少なくとも1つのエノイル-ACPレダクターゼ（ER）ドメイン；（b）複数のアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン（例えば、少なくとも1つ〜4つの、好ましくは少なくとも5つのACPドメイン、いくつかの態様においては最大で6つ、7つ、8つ、9つ、10個または10個を上回るACPドメイン）；（c）少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（d）少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；（e）少なくとも1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ（KR）ドメイン；（f）少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラターゼ（DH）ドメイン；（g）少なくとも1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；（h）少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン。いくつかの態様において、本発明によるPUFAシンターゼ系はまた、デヒドラターゼ（DH）の保存的活性部位モチーフを含む少なくとも1つの領域も含む。
【００７３】
いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系は、少なくとも以下の生物活性ドメインを含む：（a）少なくとも1つのエノイル-ACPレダクターゼ（ER）ドメイン；（b）少なくとも5つのアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン；（c）少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（d）少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；（e）少なくとも1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ（KR）ドメイン；（f）少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラターゼ（DH）ドメイン；（g）少なくとも1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；および（h）少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン。いくつかの態様において、本発明によるPUFAシンターゼ系はまた、FabA様DHドメインの一部ではない、デヒドラターゼ（DH）の保存的活性部位モチーフを含む、少なくとも1つの領域またはドメインも含む。これらのドメインのそれぞれの構造的および機能的な特徴は、米国特許出願公開第2002/0194641号；米国特許出願公開第2004/0235127号；米国特許出願公開第2005/0100995号；米国特許出願公開第2007/0245431号および国際公開公報第2006/135866号に詳細に記載されている。
【００７４】
シゾキトリウム属（Schizochytrium）コアPUFAシンターゼ系を構成し、例えば米国特許出願公開第2007/0245431号において、これまでに記載されているオープンリーディングフレームは3つある。各オープンリーディングフレームのドメイン構造は以下の通りである。
【００７５】
シゾキトリウム属オープンリーディングフレームA（OrfAまたはPfa1）：OrfAは、2910アミノ酸の配列をコードする、8730ヌクレオチドの配列（終止コドンを含めず）である。OrfAの内部には12個のドメインがある：（a）1つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（b）1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン；（c）9つのアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン；および（d）1つのケトレダクターゼ（KR）ドメイン。シゾキトリウム属の種ATCC 20888株、およびシゾキトリウム属の種N230D株と命名されたATCC 20888株の娘株の両方から、OrfAをコードするゲノムDNAクローン（プラスミド）が単離され、配列が決定されている。
【００７６】
ゲノムクローンpJK1126（シゾキトリウム属ATCC 20888株由来の「OrfA」遺伝子を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、pJK1126 OrfAゲノムクローンと命名）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-7648が割り当てられている。
【００７７】
ゲノムクローンpJK306（シゾキトリウム属の種N230D株由来のOrfA遺伝子の5'部分を含む大腸菌プラスミドの形態では、pJK306 OrfAゲノムクローンと命名（pJK320と2.2kBが重複））は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-7641が割り当てられている。
【００７８】
ゲノムクローンpJK320（シゾキトリウム属の種N230D株由来のOrfA遺伝子の3'部分を含む大腸菌プラスミドの形態では、pJK320 OrfAゲノムクローンと命名（pJK306とは2.2kBが重複））は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-7644が割り当てられている。
【００７９】
シゾキトリウム属オープンリーディングフレームB（OrfBまたはPfa2）；OrfBは、2059アミノ酸の配列をコードする、6177ヌクレオチドの配列（終止コドンを含めず）である。OrfBの内部には4つのドメインがある：（a）1つのケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（b）1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；（c）1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；および（d）1つのエノイルACP-レダクターゼ（ER）ドメイン。シゾキトリウム属の種ATCC 20888株、およびシゾキトリウム属の種N230D株と命名されたATCC 20888株の娘株の両方から、OrfBをコードするゲノムDNAクローン（プラスミド）が単離され、配列が決定されている。
【００８０】
ゲノムクローンpJK1129（シゾキトリウム属ATCC 20888株由来の「OrfB」遺伝子を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、pJK1129 OrfBゲノムクローンと命名）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-7649が割り当てられている。
【００８１】
ゲノムクローンpJK324（シゾキトリウム属の種N230D株由来のOrfB遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドの形態では、pJK324 OrfBゲノムクローンと命名）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-7643が割り当てられている。
【００８２】
シゾキトリウム属オープンリーディングフレームC（OrfCまたはPfa3）：OrfCは、1502アミノ酸の配列をコードする、4506ヌクレオチドの配列（終止コドンを含めず）である。OrfCの内部には3つのドメインがある：（a）2つのFabA様ヒドロキシアシル-ACPデヒドラターゼ（DH）ドメイン；および（b）1つのエノイルACP-レダクターゼ（ER）ドメイン。シゾキトリウム属の種ATCC 20888株、およびシゾキトリウム属の種N230D株と命名されたATCC 20888株の娘株の両方から、OrfCをコードするゲノムDNAクローン（プラスミド）が単離され、配列が決定されている。
【００８３】
ゲノムクローンpJK1131（シゾキトリウム属ATCC 20888株由来の「OrfC」遺伝子を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、pJK1131 OrfCゲノムクローンと命名）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-7650が割り当てられている。
【００８４】
ゲノムクローンpBR002（シゾキトリウム属の種N230D株由来のOrfC遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、pBR002 OrfCゲノムクローンと命名）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2006年6月8日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-7642が割り当てられている。
【００８５】
加えて、ヤブレツボカビ属コアPUFAシンターゼを構成し、これまでに記載されているオープンリーディングフレームも3つある。各オープンリーディングフレームのドメイン構造は以下の通りである。
【００８６】
ヤブレツボカビ属23B株オープンリーディングフレームA（OrfA）：OrfAは、2811アミノ酸の配列をコードする、8433ヌクレオチドの配列（終止コドンを含めず）である。Th. 23B OrfAには以下のドメインが存在する：（a）1つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（b）1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ（MAT）ドメイン；（c）8つのアシルキャリアータンパク質（ACP）ドメイン；および（d）1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ（KR）ドメイン。
【００８７】
ゲノムクローンTh23BOrfA_pBR812.1（ヤブレツボカビ属23B株由来のOrfA遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、Th23BOrfA_pBR812.1ゲノムクローンと命名）は、American Type Culture Collection（ATCC）, University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-8232が割り当てられている。ゲノムクローンTh23BOrfA_pBR811（ヤブレツボカビ属23B株由来のOrfA遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、Th23BOrfA_pBR811ゲノムクローンと命名）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-8231が割り当てられている。
【００８８】
ヤブレツボカビ属23B株オープンリーディングフレームB（OrfB）：OrfBは、1935アミノ酸の配列をコードする、5805ヌクレオチドの配列（終止コドンを含めず）である。Th. 23B OrfBには、以下のドメインが存在する：（a）1つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ（KS）ドメイン；（b）1つの鎖長因子（CLF）ドメイン；（c）1つのアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメイン；および（d）1つのエノイル-ACPレダクターゼ（ER）ドメイン。ゲノムクローンTh23BOrfB_pBR800（ヤブレツボカビ属23B株由来のOrfB遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、Th23BOrfB_pBR800ゲノムクローンと命名）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-8227が割り当てられている。
【００８９】
ヤブレツボカビ属23B株オープンリーディングフレームC（OrfC）：OrfCは、1470アミノ酸の配列をコードする、4410ヌクレオチドの配列（終止コドンを含めず）である。Th. 23B OrfCには、以下のドメインが存在する：（a）2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラターゼ（DH）ドメイン、これらは両方ともFabAタンパク質（トランス-2-デセノイル-ACPの合成、およびこの産物のシス-3-デセノイル-ACPへの可逆的異性化を触媒する酵素）との相同性を有する；および（b）シゾキトリウム属OrfBのERドメインとの高度の相同性を有する、1つのエノイル-ACPレダクターゼ（ER）ドメイン。ゲノムクローンTh23BOrfC_pBR709A（ヤブレツボカビ属23B株由来のOrfC遺伝子配列を含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、Th23BOrfC_pBR709Aゲノムクローンと命名）は、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-8228が割り当てられている。
【００９０】
キメラまたはハイブリッド型のPUFAシンターゼ系：いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系は本明細書に記載されたもののいずれかより選択されるドメインであって、本明細書に記載された最低限の要件を満たす完全なPUFAシンターゼ系を形成するように組み合わせられた（例えば、混合してマッチングさせた）ドメインを含む。いくつかの態様において、本発明の遺伝的に改変された生物を、別のPUFAシンターゼ系の少なくとも1つのドメインまたはその生物活性断片によってさらに改変することもできる。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系のドメインのいずれかを、PUFAシンターゼ系におけるそのドメインの機能を改変または強化するために（例えば、系によって産生されるPUFAのタイプまたはその比を改変するために）、それらの天然の構造から改変することができる。キメラPUFAシンターゼ系を作製するためのそのようなドメインの混合は、本明細書で参照している特許および特許公報に記載されている。
【００９１】
いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系は、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ系由来のOrfCがヤブレツボカビ属23B株由来のOrfCによって置き換えられているシゾキトリウム属PUFAシンターゼ系を含む。いくつかの態様において、ヤブレツボカビ属23B株由来のそのようなキメラOrfCは、シゾキトリウム属のコドン使用頻度に最適化された核酸配列によってコードされる。そのようなキメラOrfCの非限定的な一例として、プラスミドpThOrfC-synPS（シゾキトリウム属または他の異種宿主における発現のためにコドンが最適化された「パーフェクトステッチ（perfect stitch）」合成ヤブレツボカビ属23B株PUFA PKS OrfCを含む大腸菌プラスミドベクターの形態では、pThOrfC-synPSと命名）が、American Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USAに2007年3月1日に寄託され、ATCCアクセッション番号PTA-8229が割り当てられている（米国特許出願公開第2008/0022422号も参照）。
【００９２】
本発明の遺伝的に改変された生物に用いうるPUFAシンターゼ遺伝子およびポリペプチドの他の例には、本明細書にさらに記載する方法によって作製された、コドンが最適化された以下の配列が非限定的に含まれる：SEQ ID NO：1（SzPUFA OrfA v3タンパク質）；SEQ ID NO：2（SzPUFA OrfB v3タンパク質）；SEQ ID NO：3（hSzThPUFA OrfC v3タンパク質）；SEQ ID NO：6（SzPUFA OrfA遺伝子）；SEQ ID NO：7（SzPUFA OrfB v3遺伝子）；およびSEQ ID NO：8（hSzThPUFA OrfC v3遺伝子）、ならびにそのような配列の活性変異体、部分、断片または誘導体、ここでそのような遺伝子はPUFAシンターゼ活性をコードするか、またはそのようなポリペプチドもしくはタンパク質はPUFAシンターゼ活性を有する。本発明は、そのような配列の1つまたは複数を含むかまたはそれらからなる、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。
【００９３】
本発明の遺伝的に改変された生物に用いうるPUFAシンターゼ遺伝子およびポリペプチドの他の例には、本明細書に記載されたPUFAシンターゼまたは配列のいずれか1つに対して60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の配列同一性を有するPUFAシンターゼ遺伝子またはポリペプチドが非限定的に含まれる。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択しうる（例えば、60％〜99％、65％〜95％、70％〜95％、75％〜95％、80％〜95％、85％〜95％または90％〜99％）。本発明の遺伝的に改変された生物に用いうるPUFAシンターゼ遺伝子およびポリペプチドのさらに他の例には、本明細書に記載されたPUFAシンターゼまたは配列のいずれか1つの活性変異体、部分、断片または誘導体が非限定的に含まれ、ここでそのような遺伝子はPUFAシンターゼ活性をコードするか、またはそのようなポリペプチドはPUFAシンターゼ活性を有する。
【００９４】
いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系は藻類PUFAシンターゼであってよい。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系は、SEQ ID NO：1のアミノ酸配列に対して少なくとも60％〜99％同一なアミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列は、SEQ ID NO：6の核酸配列に対して少なくとも60％〜99％同一な核酸配列を含みうる。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列はSEQ ID NO：6の核酸配列を含みうる。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系は、SEQ ID NO：2のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一なアミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系はSEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列は、SEQ ID NO：7の核酸配列に対して少なくとも80％同一な核酸配列を含みうる。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列はSEQ ID NO：7の核酸配列を含みうる。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系は、SEQ ID NO：3のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一なアミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系はSEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列は、SEQ ID NO：8の核酸配列に対して少なくとも80％同一な核酸配列を含みうる。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列はSEQ ID NO：8の核酸配列を含む。
【００９５】
いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系は、SEQ ID NO：1、2もしくは3のアミノ酸配列、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系は、SEQ ID NO：6、7もしくは8の核酸配列、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。
【００９６】
いくつかの態様においては、他のPUFAシンターゼ遺伝子および／またはポリペプチドの配列を、本明細書に開示された、および当技術分野において利用可能な配列を用いて、当業者に周知の文献中およびバイオインフォマティクスデータベース中で同定することができる。例えば、そのような配列は、公知のPUFAシンターゼ遺伝子またはポリペプチドの配列を用いた公開データベースのBLAST検索を通じて同定することができる。そのような方法において、同一性は、GAP PENALTY＝1.0、GAP LENGTH PENALTY＝0.1、およびGonnet 250シリーズのprotein weight matrixというデフォルトパラメーターを用いるClustal Wアラインメント法に基づきうる。
【００９７】
さらに、本明細書に開示された、または当技術分野において公知であるPUFAシンターゼ遺伝子またはポリペプチド配列を用いて、自然界にある他のPUFAシンターゼ相同体を同定することもできる。例えば、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離するために、本明細書に開示されたPUFAシンターゼ核酸断片のそれぞれを用いることができる。配列依存的プロトコールを用いる相同遺伝子の単離は、当技術分野において周知である。配列依存的プロトコールの例には、（1）核酸ハイブリダイゼーションの方法；（2）核酸増幅技術のさまざまな使用によって例示されるような、DNAおよびRNA増幅の方法［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、Mullis et al., 米国特許第4,683,202号；リガーゼ連鎖反応（LCR）、Tabor, S. et al., Proc. Acad. Sci. USA 82: 1074 (1985)；または鎖置換増幅法（SDA）、Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:392 (1992)］；ならびに（3）ライブラリー構築および相補性によるスクリーニングの方法が非限定的に含まれる。
【００９８】
これらの方法はすべて、当業者であれば、標的タンパク質をコードする公知または同定された配列を利用して容易に実施しうる。いくつかの態様において、標的PUFAシンターゼのコード配列の周囲のDNA配列もいくつかの改変手順には有用であり、それは当業者であれば公開データベース中に容易に見いだすことができる。遺伝子突然変異を作り出すための方法は当技術分野において一般的かつ周知であり、突然変異体の作出の実行に適用することができる。
【００９９】
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）は、脂肪酸合成、ポリケチド合成および非リボソーム性ペプチド合成における特徴が十分に明確にされている酵素のファミリーである。特に、PUFAシンターゼ酵素に存在するACPドメインは、補酵素A由来の補因子（4-ホスホパンテテイン）のアシルキャリアータンパク質（ACP）との結合による活性化を必要とする。この補因子の結合はPPTアーゼによって行われる。宿主生物の内因性PPTアーゼがPUFAシンターゼのACPドメインを活性化することができなければ、その機能を遂行しうるPPTアーゼを与えることが必要である。多くのPPTアーゼの配列が公知であり、結晶構造が決定されている上に（例えば、Reuter et al., EMBO J. 18:6823-31 (1999)）、活性にとって重要なアミノ酸残基の突然変異分析も行われている（Mofid et al., Biochemistry 43:4128-36 (2004)）。
【０１００】
本明細書に記載されたOrfA ACPドメインを基質として認識することが以前に実証されている異種PPTアーゼの一例は、ネンジュモ属（Nostoc）の種PCC 7120（以前はアナベナ属（Anabaena）の種PCC 7120と呼ばれた）のHet Iタンパク質である。Het Iは、ネンジュモ属において、その生物の異質細胞に存在する糖-脂質層の構成要素である長鎖ヒドロキシ脂肪酸の合成に関与することが知られている遺伝子クラスター内に存在する（Black and Wolk, J. Bacteriol. 176:2282-2292 (1994)；Campbell et al., Arch. Microbiol. 167:251-258 (1997)）。Het Iは、そのクラスター内に存在するタンパク質Hgl EのACPドメインを活性化する可能性が高い。Hgl Eの2つのACPドメインは、シゾキトリウム属Orf Aおよび他のPUFAシンターゼに見られるACPドメインに対して高度の配列相同性を有する。
【０１０１】
いくつかの態様において、PUFAシンターゼは、少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）ドメインを含むと考えることができ、またはそのようなドメインをPUFAシンターゼ系にとってのアクセサリードメインもしくはアクセサリータンパク質であると考えることもできる。PPTアーゼの構造的および機能的な特徴は、例えば、米国特許出願公開第2002/0194641号；米国特許出願公開第2004/0235127号；および米国特許出願公開第2005/0100995号に記載されている。
【０１０２】
PPTアーゼ活性を有する遺伝子およびポリペプチドの数多くの例が当技術分野において公知であり、それらは、用いる具体的なPUFAシンターゼのACPドメインを活性化することができるならば、本発明の遺伝的に改変された生物に用いうると考えられる。本発明の遺伝的に改変された生物に用いうる遺伝子およびポリペプチドの例には、本明細書においてさらに説明する以下のコドン最適化配列が非限定的に含まれうる：SEQ ID NO：5（NoHetI v3タンパク質）およびSEQ ID NO：10（NoHetI v3遺伝子）。
【０１０３】
本発明の遺伝的に改変された生物に用いうるPPTアーゼ遺伝子およびポリペプチドの他の例には、本明細書に記載されたPPTアーゼまたは配列のいずれか1つに対して60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の配列同一性を有するPPTアーゼ遺伝子またはポリペプチドが非限定的に含まれる。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択しうる（例えば、60％〜99％、65％〜95％、70％〜95％、75％〜95％、80％〜95％、85％〜95％、90％〜99％）。本発明の遺伝的に改変された生物に用いうるPPTアーゼ遺伝子およびポリペプチドのさらに他の例には、本明細書に記載されたPPTアーゼまたは配列のいずれか1つの活性変異体、部分、断片または誘導体が非限定的に含まれ、ここでそのような遺伝子はPPTアーゼ活性をコードするか、またはそのようなポリペプチドはPPTアーゼ活性を有する。
【０１０４】
いくつかの態様において、PPTアーゼは藻類PPTアーゼであってよい。いくつかの態様において、PPTアーゼは、SEQ ID NO：5のアミノ酸配列に対して少なくとも60％〜99％同一なアミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様において、PPTアーゼはSEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様において、藻類PPTアーゼをコードする核酸配列は、SEQ ID NO：10の核酸配列に対して少なくとも60％〜99％同一な核酸配列を含みうる。いくつかの態様において、藻類PPTアーゼをコードする核酸配列はSEQ ID NO：10の核酸配列を含みうる。
【０１０５】
本発明のいくつかの態様においては、異種宿主におけるPPTアーゼの産生および／または蓄積のために、PPTアーゼを提供することができる。
【０１０６】
いくつかの態様において、PPTアーゼをコードする遺伝子および／またはポリペプチドは、別のPPTアーゼ遺伝子および／もしくはポリペプチドの配列を同定するために用いることができ、ならびに／または他の細胞におけるPPTアーゼ相同体を同定するために用いることもできる。PPTアーゼをコードするそのような配列は、例えば、当業者に周知の文献中およびバイオインフォマティクスデータベース中で同定することができる。例えば、バイオインフォマティクスを用いた、別の細胞種におけるPPTアーゼをコードする配列の同定は、PPTアーゼをコードする公知のDNA配列およびポリペプチド配列、例えば本明細書において提供されるもののいずれかなどを用いる公開データベースのBLAST（上記に開示）検索を通じて達成することができる。同一性は、GAP PENALTY＝10、GAP LENGTH PENALTY＝0.1、およびGonnet 250シリーズのprotein weight matrixというデフォルトパラメーターを用いるClustal Wアラインメント法に基づく。
【０１０７】
いくつかの態様において、遺伝的に改変された植物（例えば、アブラナ属）、その子孫、細胞、組織または部分は、（i）および（ii）の核酸配列を単一の組換え発現ベクター中に含む。
【０１０８】
アシル-CoAシンテターゼ
本発明は、長鎖PUFA遊離脂肪酸（FFA）からアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ（ACoAS）タンパク質を提供する。PUFAシンターゼによるPUFAの内因性産生体であるシゾキトリウム属は、そのPUFAシンターゼの脂肪酸産物をアシル-CoAに変換させることのできる1つまたは複数のACoASを有する。このことは、この生物ではそのような画分に高レベルのPUFAが蓄積するという事実によって明らかである。このため、シゾキトリウム属、ならびにPUFAシンターゼを内因性に含む他の生物（例えば、他のヤブレツボカビ科生物）、またはPUFA FFAをアシル-CoAに変換することのできる他の生物（タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）またはクリプテコディニウム・コーニイ（Crypthecodinium cohnii）など）は、異種宿主において発現されるPUFAシンターゼの産物の蓄積を許容または増加させるのに有用な酵素をコードする遺伝子の優れた供給源になりうると考えられる。他のACoAS配列は、米国特許出願公開第2007/0245431号に記載されている。
【０１０９】
ACoAS活性を有する遺伝子およびポリペプチドの数多くの例が当技術分野において公知であり、本発明の遺伝的に改変された生物に用いることができる。本発明の遺伝的に改変された生物に用いうる遺伝子およびポリペプチドの例には、本明細書においてさらに説明する以下のコドン最適化配列が非限定的に含まれうる：SEQ ID NO：4（SzACS-2 v3タンパク質）およびSEQ ID NO：9（hSzThACS-2 v3遺伝子）。
【０１１０】
本発明の遺伝的に改変された生物に用いうるACoAS遺伝子およびポリペプチドの他の例には、本明細書に記載されたACoASまたは配列のいずれか1つに対して60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の配列同一性を有するACoAS遺伝子またはポリペプチドが非限定的に含まれる。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択しうる（例えば、60％〜99％、65％〜95％、70％〜95％、75％〜95％、80％〜95％、85％〜95％、90％〜99％）。本発明の遺伝的に改変された生物に用いうるACoAS遺伝子およびポリペプチドのさらに他の例には、本明細書に記載されたACoAS配列のいずれか1つの活性変異体、断片、部分または誘導体が非限定的に含まれ、ここでそのような遺伝子はACoAS活性をコードするか、またはそのようなポリペプチドはACoAS活性を有する。
【０１１１】
いくつかの態様において、ACoASは藻類ACoASであってよい。いくつかの態様において、ACoASは、SEQ ID NO：4のアミノ酸配列に対して少なくとも60％〜99％同一なアミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様において、ACoASはSEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様において、藻類ACoASをコードする核酸配列は、SEQ ID NO：9の核酸配列に対して少なくとも60％〜99％同一な核酸配列を含みうる。いくつかの態様において、藻類ACoASをコードする核酸配列はSEQ ID NO：9の核酸配列を含みうる。いくつかの態様において、ACoASをコードする核酸配列はSEQ ID NO：34の核酸配列を含む。
【０１１２】
本発明のいくつかの態様においては、異種宿主におけるACoASの産生および／または蓄積のために、ならびに内因性宿主におけるACoASの産生および／または蓄積の向上のために、ACoASを提供することができる。
【０１１３】
いくつかの態様において、ACoASをコードする遺伝子および／またはポリペプチドは、別のACoAS遺伝子および／もしくはポリペプチド配列を同定するために用いることができ、ならびに／または他の細胞におけるACoAS相同体を同定するために用いることもできる。ACoASをコードするそのような配列は、例えば、当業者に周知の文献中およびバイオインフォマティクスデータベース中で同定することができる。例えば、バイオインフォマティクスを用いた、別の細胞種におけるACoASをコードする配列の同定は、ACoASをコードする公知のDNA配列およびポリペプチド配列、例えば本明細書において提供されるもののいずれかなどを用いる公開データベースのBLAST（上記に開示）検索を通じて達成することができる。同一性は、GAP PENALTY＝10、GAP LENGTH PENALTY＝0.1、およびGonnet 250シリーズのprotein weight matrixというデフォルトパラメーターを用いるClustal Wアラインメント法に基づく。
【０１１４】
いくつかの態様において、遺伝的に改変された植物（例えば、アブラナ属）、その子孫、細胞、組織または部分は、単一の組換え発現ベクター中に含まれる（i）、（ii）もしくは（iii）の核酸配列、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。いくつかの態様において、（i）、（ii）もしくは（iii）の核酸配列、またはそれらのいずれかの組み合わせは、1つもしくは複数の種子特異的プロモーターの制御下にある、および／または単一の組換え発現ベクター中に含まれる。
【０１１５】
遺伝的に改変された生物を作製する方法
有意に高い収量の1つまたは複数の所望の多価不飽和脂肪酸を産生させるために、ある生物（例えば、植物）を、PUFAシンターゼがその植物に導入されるように遺伝的に改変することができる。本発明はまた、そのような遺伝的改変の有効性を向上させるかまたは強化するための、特に、PUFAシンターゼの最終産物、例えばPUFAなどの産生および／または蓄積を向上させるかまたは強化するための方法に関する。
【０１１６】
植物を非限定的に含む、遺伝的に改変された生物における遺伝子発現のための方法は、当技術分野において公知である。いくつかの態様においては、発現させようとするPUFAシンターゼ遺伝子のコード領域を、下記のように標的宿主細胞に対してコドン最適化することができる。植物細胞を非限定的に含む組換え宿主細胞における遺伝子の発現は、関心対象のコード領域、および／または転写ターミネーターと機能的に連結されたプロモーターを必要とする可能性がある。遺伝子用のベクターの構築には、種子特異的プロモーター（例えば、PvDlec2、LfKCS3およびFAE 1）を非限定的に含む、いくつかのプロモーターを用いることができる。本発明に用いうるプロモーターの他の非限定的な例には、国際公開公報第1992/18634号に開示されたアシルキャリアータンパク質プロモーター；インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）β-ファゼオリンプロモーター、ならびにSlightomら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1897-1901; 1983）；Sengupta-Gopalanら（Proc. Nat. Acad, Sci. 82:3320-3324; 1985）；van der Geestら（Plant Mol. Biol. 33:553-557; 1997）およびBustosら（EMBO J 10:1469-1479; 1991）に開示された短縮バージョンが含まれる。
【０１１７】
本発明のいくつかの態様において、組換えベクターは、選択した核酸配列を操作するため、およびそのような核酸配列を宿主細胞に導入するためのツールとして用いられる、操作された（すなわち、人工的に作製された）核酸分子である。組換えベクターはこのため、選択した核酸配列のクローニング、シークエンシング、ならびに／または選択した核酸配列を組換え細胞を形成させるために宿主細胞で発現させること、および／もしくは宿主細胞に送達することなどによる別の方法での操作に用いるのに適している。そのようなベクターは典型的には、クローニングまたは送達しようとする核酸配列に隣接することが天然には見いだされない核酸配列である異種核酸配列を含むが、ベクターはまた、本発明の核酸分子に隣接して天然に見いだされるか、または本発明の核酸分子の発現のために有用である調節性核酸配列（例えば、プロモーター、非翻訳領域）も含みうる。ベクターは、RNAまたはDNAのいずれであっても、原核生物性または真核生物性のいずれであってもよく、典型的にはプラスミドである。ベクターは染色体外要素（例えば、プラスミド）として維持されてもよく、またはそれが組換え生物（例えば、微生物または植物）の染色体に組み込まれてもよい。ベクター全体が宿主細胞内のしかるべき位置に留まってもよく、または、ある特定の条件下では、プラスミドDNAが除去されて本発明の核酸分子が残ってもよい。組み込まれた核酸分子は、染色体プロモーターの制御下、ネイティブのプロモーターもしくはプラスミドのプロモーターの制御下、またはいくつかのプロモーターの組み合わせの制御下にあってよい。核酸分子の単一または複数のコピーを染色体に組み込むことができる。本発明の組換えベクターは少なくとも1つの選択マーカーを含みうる。
【０１１８】
いくつかの態様において、本発明の組換え核酸分子に用いられる組換えベクターは発現ベクターである。そのような態様において、産生させようとする産物（例えば、PUFAシンターゼ）をコードする核酸配列は、組換え核酸分子を産生させるための組換えベクターに挿入される。産生させようとするタンパク質をコードする核酸配列は、その核酸配列を、組換え宿主細胞内での核酸配列の転写および翻訳を可能にするベクター中の調節配列と機能的に連結させる様式で、ベクターに挿入される。
【０１１９】
種々の宿主生物および細胞の形質転換のために有用なベクターは一般的であり、文献中に開示されている。典型的には、ベクターは、選択マーカー、および所望の宿主における自律複製または染色体組み込みを可能にする配列を含む。加えて、適したベクターは、転写開始制御領域および転写終結制御領域を保有するプロモーター領域を含むことができ、それらの間にコード領域のDNA断片を挿入して、挿入されたコード領域の発現をもたらすことができる。制御領域が両方とも、形質転換される宿主細胞にとって相同な遺伝子に由来してもよいが、そのような制御領域が産生用宿主として選択した特定の種にとってネイティブでない遺伝子にも由来しうることが理解される必要がある。
【０１２０】
本発明は、異種宿主におけるPUFAの産生および／または蓄積を増加させるために、単独で、または本明細書に記載された任意の1つもしくは複数の戦略（例えば、以下の任意の1つ、2つ、3つまたは4つ：コドン最適化、オルガネラ標的化、マロニル-CoAをめぐるPUFAシンターゼの競合の強化（例えば、FASの阻害による）、および／または1つもしくは複数のアシルトランスフェラーゼもしくは関連酵素の発現）を組み合わせて利用される、本明細書に記載されたPUFAシンターゼを伴い、かつ外因性PPTアーゼを伴う、本明細書において記載および例示されたような1つまたは複数のアシル-CoAシンテターゼの発現を含む。
【０１２１】
本発明のいくつかの態様は、宿主の1つまたは複数のオルガネラに対する、PUFAシンターゼ酵素、PPTアーゼ、および／または1つもしくは複数のアクセサリータンパク質の発現の標的化および／または標的化遺伝子改変に関する。例えば、いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系およびPPTアーゼの発現を植物のプラスチドに標的化することができる。いくつかの態様において、PUFAシンターゼおよびPPTアーゼの発現はサイトゾルに標的化される。いくつかの態様において、PUFAシンターゼおよびPPTアーゼの発現は植物のプラスチドおよびサイトゾルの両方に標的化される。これらの態様の任意のものにおいて、他の標的をプラスチドまたはサイトゾルに向かわせることもできる。
【０１２２】
いくつかの態様においては、DHAおよび／または他のLC-PUFA遊離脂肪酸をアシル-CoAに変換させ、それが続いてアシルトランスフェラーゼによって利用されうるように、アシル-CoAシンテターゼをサイトゾル中で発現させる。
【０１２３】
1つの例示的なプラスチド標的化配列はブラッシカ・ナプスアシル-ACPチオエステラーゼに由来し、これは米国特許出願公開第2007/0245431号に記載されている。種々の他のプラスチド標的化配列が当技術分野において公知であり、異種宿主が植物または植物細胞であって、かつプラスチドに対する標的化が望まれる態様に用いることができる。
【０１２４】
本発明は、異種宿主におけるPUFAの産生および／または蓄積を増加させるために、単独で、または本明細書に記載された任意の1つもしくは複数の戦略（例えば、以下の任意の1つ、2つ、3つまたは4つ：コドン最適化、マロニル-CoAをめぐるPUFAシンターゼの競合の強化（例えば、FASの阻害による）、1つもしくは複数のアシル-CoAシンテターゼの発現、および／または1つもしくは複数のアシルトランスフェラーゼもしくは関連酵素の発現）を組み合わせて利用される、本明細書に記載されたPUFAシンターゼを伴い、かつ外因性PPTアーゼを伴う、オルガネラ標的化（例えば、植物におけるプラスチドまたは葉緑体に対する）の使用を含む。
【０１２５】
プラスチドまたは葉緑体に対する遺伝子産物の標的化は、さまざまなタンパク質のアミノ末端に認められ、輸入の際に切断されて成熟タンパク質を生じるシグナル配列によって制御される（例えば、葉緑体標的化については、Comai et al., J Biol Chem. 263:15104-15109 (1988)などを参照）。これらのシグナル配列を異種遺伝子産物と融合させて、異種産物の葉緑体への輸入を生じさせることができる（van den Broeck et al. Nature 313:358-363 (1985)）。RUBISCOタンパク質、CABタンパク質、EPSPシンターゼ酵素、GS2タンパク質、および葉緑体に局在することが知られている他の多くのタンパク質をコードするcDNAから、適切なシグナル配列をコードするDNAを単離することができる。
【０１２６】
本発明のいくつかの態様において、本発明に用いられるタンパク質の局在は細胞内区画、例えばプラスチドまたは葉緑体に向けられる。タンパク質は、そのアミノ末端に葉緑体移行ペプチド（CTP）を含めることによって、葉緑体に向かわせることができる。同様に、タンパク質は、そのN末端にプラスチド移行ペプチドまたはシグナル伝達ペプチドを含めることによって、プラスチドに向かわせることができる。
【０１２７】
より大きな前駆体タンパク質として合成され、その前駆体を葉緑体輸入機構に向かわせる葉緑体標的化ペプチドをアミノ末端に含む、葉緑体を標的とする天然のタンパク質が当技術分野において周知である。葉緑体標的化ペプチドは一般に、葉緑体オルガネラ内部に位置する特異的エンドプロテアーゼによって切断され、それにより、標的とした成熟型の、好ましくは活性のある酵素が前駆体から葉緑体環境内に放出される。植物細胞の葉緑体またはプラスチドに対して遺伝子または遺伝子産物の標的化を行うために適したペプチドをコードする配列の例には、ペチュニアEPSPS CTP、アラビドプシス（Arabidopsis）EPSPS CTP2およびイントロン、ならびに当業者に公知である他のものが含まれる。そのような標的化配列は、所望の発現されたタンパク質をそれが最も効果的に機能する細胞構造へと移行させるか、または所望の発現されたタンパク質を所望の表現型機能のために必要な細胞プロセスが集中している細胞領域へと移行させる。葉緑体標的化ペプチドの具体的な例は当技術分野において周知であり、これにはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットats1A移行ペプチド、シロイヌナズナのEPSPS移行ペプチド、およびトウモロコシ（Zea maize）のリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット移行ペプチドが含まれる。
【０１２８】
最適化された移行ペプチドの1つは、例えば、van den Broeck et al., Nature, 313:358-363 (1985)によって記載されている。原核生物性および真核細胞性のシグナル配列は、例えば、Michaelis et al., Ann. Rev. Microbiol. 36:425 (1982)によって記載されている。本発明に用いうる移行ペプチドのその他の例には、Von Heijne et al., Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126 (1991)；Mazur et al., Plant Physiol. 85:1110 (1987)；Vorst et al. Gene 65:59 (1988)に記載された葉緑体移行ペプチドが含まれる。Chen & Jagendorf（J Biol. Chem. 268:2363-2367 (1993)）は、異種導入遺伝子の輸入のための葉緑体移行ペプチドの使用を記載している。用いられたこのペプチドは、ニコチアナ・プルムバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）由来のrbcS遺伝子からの移行ペプチドである（Poulsen et al. Mol. Gen. Genet. 205: 193-200 (1986)）。本明細書において異種タンパク質を葉緑体に局在させるのに機能した1つのCTPは、ブラッシカ・ナプスのアシル-ACPチオエステラーゼに由来した。
【０１２９】
遺伝子を葉緑体またはプラスチドに局在させるための代替的な手段には、葉緑体またはプラスチドの形質転換が含まれる。本出願において想定している分子を組み入れるように葉緑体DNAのみが改変された組換え植物を作製することができる。葉緑体において機能するプロモーターは当技術分野において公知である（Hanley-Bowden et al., Trends in Biochemical Sciences 12:67-70 (1987)）。異種DNAが挿入された葉緑体を含む細胞を入手するための方法および組成物は、例えば、Daniellら（米国特許第5,693,507号）およびMaligaら（米国特許第5,451,513号）によって記載されている。
【０１３０】
戦略の組み合わせ
本発明によれば、1つまたは複数の標的PUFAの産生および蓄積のための異種宿主の作製において、宿主におけるPUFAの産生および／または蓄積を向上させるために、本明細書に記載した戦略の任意の1つまたは複数（任意の組み合わせ）を用いることができる。実際に、戦略のさまざまな組み合わせは相加的または相乗的であると考えられ、1つまたは複数のそのような戦略の非存在下と比較して、PUFAの産生および／または蓄積の向上をもたらすことが予想される。実際に、実施例では、宿主生物におけるPUFAの産生のための例示的な戦略を提供している。
【０１３１】
これらの改変の組み合わせ、または本明細書に記載された他の任意の改変もしくは改変の組み合わせを用いたあらゆる植物または植物細胞が、本発明の範囲に含まれる。いくつかの態様において、そのような植物は、宿主によるPUFA（またはPUFAシンターゼの他の生体活性産物）の産生および／または蓄積の向上のための、本明細書に記載されたアクセサリータンパク質（例えば、ACoAS、GPAT、LPAAT、DAGATまたはアセチルCoAカルボキシラーゼ（ACCアーゼ））を発現するように、さらに遺伝的に改変されている。その上、本明細書に記載された任意の改変または改変の組み合わせを用いたあらゆる宿主細胞または生物が本発明の範囲に含まれ、標的PUFAを含む種子および油を含む、そのような細胞または生物に由来するあらゆる産物についても同様である。
【０１３２】
いくつかの態様において、本発明に従って遺伝的に改変しようとする植物（例えば、植物宿主細胞）には、双子葉植物および単子葉植物の両方を含む任意の高等植物、特に作物植物、とりわけその油のために用いられる植物を含む消費可能な植物が非限定的に含まれる。そのような植物には、例えば、以下のものが非限定的に含まれる：キャノーラ、ダイズ、ナタネ、アマニ、トウモロコシ、ベニバナ、ヒマワリおよびタバコ。このように、任意の植物種または植物細胞を選択することができる。諸態様において、本明細書において用いられる植物細胞、およびそれらから育成されるかまたは導き出される植物には、以下のものから得られる細胞が非限定的に含まれる：キャノーラ（ブラッシカ・ナプス(Brassica napus)）；ナタネ（ブラッシカ・ナプス(Brassica napus））；カラシナ（ブラッシカ・ジュンセア(Brassica juncea)）；アビシニアガラシ（ブラッシカ・カリナタ(Brassica carinata)）；カブ（ブラッシカ・ラパ(Brassica rapa)）；キャベツ（ブラッシカ・オレラセア(Brassica oleracea)）；ダイズ（ダイズ(Glycine max)）；アマニ／アマ（アマ(Linum usitatissimum)）；モロコシ（トウモロコシ）（トウモロコシ(Zea mays)）；ベニバナ（ベニバナ(Carthamus tinctorius)）；ヒマワリ（ヒマワリ(Helianthus annuus)）；タバコ（タバコ(Nicotiana tabacum)）；シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ブラジルナッツ（ベソレシア・エクセルサ(Betholettia excelsa)）；トウゴマ（トウゴマ(Ricinus communis)）；ココナッツ（ココヤシ(Cocus nucifera)）；コリアンダー（コエンドロ(Coriandrum sativum)）；ワタ（ゴシッピウム属の種(Gossypium spp.)）；ラッカセイ（ピーナッツ(Arachis hypogaea)）；ホホバ（シモンジア・チネンシス(Simmondsia chinensis)）；ギニアアブラヤシ（アブラヤシ(Elaeis guineeis)）；オリーブ（オリーブ(Olea eurpaea)）；イネ（イネ(Oryza sativa)）；カボチャ（ククルビタ・マキシマ(Cucurbita maxima)）；オオムギ（オオムギ(Hordeum vulgare)）；コムギ（コムギ(Triticum aestivum)）；およびウキクサ（ウキクサ科の種(Lemnaceae sp.)）。いくつかの態様において、1つの植物種における遺伝的バックグラウンドはさまざまであってよい。
【０１３３】
「植物の部分」は、本明細書で用いる場合、種子（成熟種子および未熟種子を含む）、花粉、胚、花、果実、苗条、葉、根、茎、外植片などを非限定的に含む、植物の任意の部分を含む。いくつかの態様において、遺伝的に改変された植物は、所望の結果（例えば、PUFAシンターゼならびに／またはPUFAシンターゼを用いた所望の産物の産生および／もしくは蓄積の増加または改変）が達成されるように、その正常な（すなわち、野生型または天然の）形態から改変された（すなわち、突然変異または変化した）ゲノムを有する。いくつかの態様において、植物の遺伝的改変は、古典的な系統開発および／または分子遺伝学の手法を用いて達成しうる。所望のアミノ酸配列をコードする組換え核酸分子がその植物のゲノム中に組み入れられているトランスジェニック植物を作製するための方法は、当技術分野において公知である。いくつかの態様において、本発明に従って遺伝的に改変するのに好ましい植物は、ヒトを含む動物による消費のために適した植物であることが好ましい。
【０１３４】
特に望ましい形質、例えば病害抵抗性、植物形質転換の容易さ、油の含有率またはプロフィールなどに関して最適化された、これらの植物からの植物系統を、本明細書に従って作製、選択または同定することができる。いくつかの態様において、植物系統は、植物育種を通じて、またはマーカーを利用した育種およびティリング法などを通じて選択することができる。いくつかの態様においては、植物細胞培養物を用いることができ、例えば、通常の農業の慣行を用いて植物細胞を分化した植物に成育させて栽培することはせず、その代わりに液体培地中で成育させて維持する。
【０１３５】
いくつかの態様において、植物は油糧種子植物であってよく、ここで油糧種子、および／または油糧種子中の油は、PUFAシンターゼによって産生されるPUFAを含む。いくつかの態様において、そのような油は、PUFAシンターゼの産物である、検出可能な量の少なくとも1つの標的PUFAまたは主PUFAを含みうる。いくつかの態様において、そのような油は、標的PUFA産物でも主PUFA産物でもなく、野生型植物において内因性FAS系によって天然には産生されない中間産物または副産物を実質的に含まないことが可能である（例えば、野生型植物は、FAS系を介して炭素18個のPUFAといったいくつかのより短鎖または中鎖のPUFAを産生するものの、PUFAシンターゼ系による遺伝的改変の結果として植物において産生される新たなまたは追加的な脂肪酸が存在すると考えられる）。
【０１３６】
遺伝的に改変された植物の作製に関して、植物の遺伝子工学のための方法は当技術分野において周知である。例えば、双子葉植物および単子葉植物のための生物的および物理的な形質転換プロトコールを含む、植物形質転換のための数多くの方法が開発されている（例えば、Goto-Fumiyuki et al,. Nature Biotech 17:282-286 (1999)；Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J, E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)）。加えて、植物細胞または組織の形質転換および植物の再生のためのベクターおよびインビトロ培養方法を、例えば、Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)で得ることもできる。
【０１３７】
本発明は、SEQ ID NO：6〜10から選択される核酸配列を含む単離された核酸分子、ならびに本明細書に記載されたそのような配列の改変または突然変異を含む単離された核酸分子に関する。本発明は、SEQ ID NO：1〜5から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、ならびに本明細書に記載されたそのような配列の改変または突然変異を含む単離されたポリペプチドに関する。
【０１３８】
本発明は、組換え発現ベクターpDAB7361を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB7362を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB7363を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB7365を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB7368を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB7369を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB7370を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB00518を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB101476を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB9166を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB9167を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB7379を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB7380を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB9323を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB9330を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB9337を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB9338を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB9344を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB9396を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB101412を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB7733を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB7734を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB101493を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB109507を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB109508を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB109509を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB9151を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB108207を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB108208を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB108209を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB9159を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB9147を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB108224を含む。本発明は組換え発現ベクターpDAB108225を含む。
【０１３９】
本明細書で用いる場合、「トランスフェクション」という用語は、外因性核酸分子（例えば、組換え核酸分子）を細胞に挿入しうる任意の方法を指して用いられる。「形質転換」という用語は、そのような用語が藻類、細菌および酵母などの微生物細胞への、または植物細胞への核酸分子の導入を指して用いられる場合、「トランスフェクション」という用語と互換的に用いうる。微生物系および植物系では、「形質転換」という用語は、微生物または植物による外因性核酸の獲得に起因する遺伝性変化を記載するために用いられ、「トランスフェクション」という用語と本質的に同義である。いくつかの態様において、トランスフェクション手法には、形質転換、微粒子射入、拡散、能動輸送、槽内超音波処理（bath sonication）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、感染およびプロトプラスト融合が非限定的に含まれる。
【０１４０】
発現ベクターを植物に導入するために幅広く利用されている方法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の天然の形質転換系に基づく。Horsch et al., Science 227:1229 (1985)。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびアグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換させるのに有用なことが公知である植物病原性土壌細菌である。A.ツメファシエンスおよびA.リゾゲネスのそれぞれTiプラスミドおよびRiプラスミドは、植物の遺伝的形質転換の原因となる遺伝子を保有する。Kado, C.I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991)。アグロバクテリウムベクター系およびアグロバクテリウムを介した遺伝子導入の方法に関する記載を、例えば、Gruber et al., 前記、Miki et al., 前記、Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)；米国特許第4,940,838号および第5,464,763号から得ることもできる。
【０１４１】
植物形質転換の別の公知の方法には、DNAが微小発射体（microprojectile）の表面にある状態で運搬される、微小発射体を介した形質転換が含まれる。この方法では、発現ベクターを、植物細胞壁および膜を貫通するのに十分な速度まで微小発射体を加速する遺伝子銃装置を用いて植物組織に導入する。Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J. C, Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J. C, Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)。
【０１４２】
植物へのDNAの物理的送達のための別の方法は、標的細胞の超音波処理である。Zhang et al., Bio/Technology 9:996 (1991)。また、リポソームまたはスフェロプラスト融合も、発現ベクターを植物に導入するために用いられている。Deshayes et al., EMBO J, 4:2731 (1985), Christou et al, Proc Natl. Acad Sci. USA 84:3962 (1987)。CaCl2沈降、ポリビニルアルコールまたはポリ-L-オルニチンを用いたプロトプラストへのDNAの直接的な取り込みも報告されている。Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985)およびDraper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982)。プロトプラストならびに全細胞および組織のエレクトロポレーションも記載されている。Donn et al., Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p.53 (1990)；D'Halluin et al, Plant Cell 4: 1495-1505 (1992)およびSpencer et al, Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994)。さらに、炭化ケイ素ウィスカー（Kaepler et al., 1990, Plant Cell Reports）、および植物形質転換において、例えば花浸漬法（Clough and Bent, Plant J. 16:735-743 (1998)）を用いることもできる。厳密な植物形質転換の方法は、選択した植物種および形質転換のために選択した植物細胞のタイプ（例えば、胚軸および子葉（cotelydon）といった実生由来の細胞または胚組織）に応じて幾分異なると考えられる。
【０１４３】
植物細胞への遺伝子構築物の導入の後に、植物細胞を成育させて、苗条および根などの分化組織の出現に続いて、成熟植物を生じさせることができる。いくつかの態様においては、多数の植物を生じさせることができる。植物を再生させるための方法は当業者に一般に公知であると考えられ、例えば、以下に記載がある：Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers and in: Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press)。
【０１４４】
いくつかの態様において、遺伝的に改変された植物は、発酵培地中で培養するか、または土壌などの適した媒質中で成育させることができる。いくつかの態様において、高等植物に適した増殖培地には、土壌、砂、根の成長を補助する他の任意の粒状培地（例えば、バーミキュライト、パーライトなど）または水耕栽培、ならびに適当な光、水および高等植物の成長を最適化する栄養補給剤を非限定的に含む、植物のための任意の増殖培地が含まれる。
【０１４５】
組換えDNA技術の使用が、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、それらの核酸分子が転写される効率、その結果として生じる転写物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率を操作することによって、トランスフェクトされた核酸分子の発現の制御を改善しうることは、当業者には理解されるであろう。さらに、ネイティブプロモーターと比較して発現レベルを向上させるために、プロモーター配列を遺伝的に操作することも考えられる。核酸分子の発現を制御するために有用な組換え手法には、1つまたは複数の宿主細胞染色体への核酸分子の組み込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または改変、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン-ダルガノ配列）の置換または改変、宿主細胞のコドン使用頻度に対応させるための核酸分子の改変、および転写物を不安定化する配列の除去が非限定的に含まれる。
【０１４６】
いくつかの態様において、植物には、薬剤、香味剤、ニュートラシューティカル剤、機能性食品成分もしくは美容用活性物質として用いられる化合物を産生することが公知である植物、またはこれらの化合物／作用物質を産生するように遺伝的に操作された植物が含まれうる。
【０１４７】
本発明のこれらの態様はすべて、本明細書に記載された遺伝的に改変された生物ならびにそのような生物を作製および使用する方法の任意のものに関する議論に対して適用される。
【０１４８】
遺伝的に改変された生物からの産物
いくつかの態様において、本発明の遺伝的に改変された生物は、EPA（C20:5、n-3）、DHA（C22:6、n-3）、DPA（C22:5、n-6またはn-3）、ARA（C20:4、n-6）、GLA（C18:3、n-6）、ALA（C18:3、n-3）および／またはSDA（C18:4、n-3））を非限定的に含む、1つまたは複数の多価不飽和脂肪酸を産生し、さらにいくつかの態様において、EPA（C20:5、n-3）、DHA（C22:6、n-3）、DPA（C22:5、n-6またはn-3）もしくはDTA（C22:4、n-6）、またはそれらの任意の組み合わせを非限定的に含む、1つまたは複数の比較的長鎖のPUFAを産生する。いくつかの態様において、本発明の遺伝的に改変された植物は、EPA（C20:5、n-3）、DHA（C22:6、n-3）および／もしくはDPA（C22:5、n-6またはn-3）、またはそれらの任意の組み合わせを非限定的に含む、1つまたは複数の多価不飽和脂肪酸を産生する。
【０１４９】
いくつかの態様において、遺伝的に改変された生物は、本明細書に記載されたように、PUFAシンターゼ系およびPPTアーゼを組換えにより発現するように遺伝的に改変された植物である。いくつかの態様において、そのような植物は、宿主によるPUFA（またはPUFAシンターゼの他の生体活性産物）の産生および／または蓄積の向上のための、本明細書に記載されたアクセサリータンパク質（例えば、ACoAS、GPAT、LPAAT、DAGATまたはACCアーゼ）を発現するように、さらに遺伝的に改変されている。
【０１５０】
本発明のいくつかの態様は、所望の鎖長および所望の数の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸、ひいては、これらのPUFAを含む、本明細書に記載の遺伝的に改変された植物から得られる（例えば、そのような植物の油または種子から得られる）油糧種子および油の産生を含む。本発明によって産生しうるPUFAの例には、DHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））、ARA（エイコサテトラエン酸またはアラキドン酸（C20:4、n-6））、DPA（ドコサペンタエン酸（C22:5、n-6またはn-3））およびEPA（エイコサペンタエン酸（C20:5、n-3））、ならびにそれらの任意の組み合わせが非限定的に含まれる。本発明は、PUFAをPUFAシンターゼ系の使用を通じての、本発明者らによる遺伝的に改変された植物の開発により、1つまたは複数の所望の（標的または主）PUFAに富む商業的に価値のある脂質の産生を可能にする。
【０１５１】
いくつかの態様において、特定の生物に由来する所定のPUFAシンターゼ系は特定のPUFAを産生し、その結果、特定の生物由来のPUFAシンターゼ系の選択は、指定の標的PUFAまたは主PUFAの産生をもたらすと考えられる。いくつかの態様において、PUFAの比は、特定のPUFAシンターゼ系の選択、およびそれが発現される具体的な条件に対してその系がどのように応答するかに応じて異なりうる。例えば、ヤブレツボカビ属23B（ATCC番号20892）由来のPUFAシンターゼ系も、標的PUFAまたは主PUFAとしてのDHAおよびDPAn-6の産生をもたらすと考えられる；しかし、ヤブレツボカビ属23Bの場合には、DHAとDPAn-6との比は約10：1であり（約8：1〜約40：1の範囲にわたりうる）、一方、シゾキトリウム属ではこの比は典型的には約2.5：1である。いくつかの態様において、異なるPUFAシンターゼからのタンパク質およびドメインを混合することによって所与のPUFAシンターゼを改変することもでき、または標的PUFA産物および／もしくは比を変化させるために所与のPUFAシンターゼのドメインもしくはタンパク質を改変することもできる。
【０１５２】
いくつかの態様において、PUFAを産生する酵素系の「中間産物」または「副産物」に対する言及は、系の標的PUFAまたは主PUFAの産生の結果として酵素系によって産生されるが、主PUFAまたは標的PUFAではない任意の産物、特に脂肪酸産物のことを指す。いくつかの態様において、中間産物および副産物には、野生型植物によって、または指定された遺伝的改変のためのレシピエントとして用いられる親植物によって天然に産生されるが、野生型植物によって、または指定された遺伝的改変のためのレシピエントとして用いられる親植物によって産生されるレベルと比較して、遺伝的改変の結果としてより上回るレベルで産生されることからここでは中間産物または副産物として分類される、標的でない脂肪酸が含まれうる。いくつかの態様において、1つの酵素系の主PUFAまたは標的PUFAは、主産物または標的産物が異なるPUFAである異なる酵素系の中間体でありうる。例えば、EPAを産生するための標準的経路を用いる場合には、GLA、DGLAおよびSDAなどの脂肪酸が中間産物として有意な量で産生される（例えば、米国特許出願公開2004/0172682号）。同様に、米国特許出願公開2004/0172682号によっても例証されているように、DHAを産生するための標準的経路を用いる場合には、上述した脂肪鎖に加えて、ETAおよびEPA（上記の第1の例における標的PUFAであることに注目）が有意な量で産生され、総脂肪酸産物に占める比率として標的PUFAそれ自体よりも有意に多い量で存在しうる。
【０１５３】
いくつかの態様においては、有意に高い収量の1つまたは複数の所望の多価不飽和脂肪酸を産生させるために、植物を、該植物にPUFAシンターゼ系が導入されるように遺伝的に改変することができる。植物はPUFAシンターゼ系を内因性に含まないことが公知であり、このため、本発明は、類いまれな脂肪酸産生能力を有する植物を作製するための機会となる。本発明は、EPA、DHA、DPA（n3またはn6）、ARA、GLA、SDA、およびそれらの任意の組み合わせを含む他のものを非限定的に含む、同じ植物において1つまたは複数のPUFAを産生するように遺伝的に操作された植物を提供する。本発明は、さまざまな比および形態にある、種々の「人工的に設計された油（designer oil）」の任意のものを作り出す能力を提供する。いくつかの態様において、本明細書に記載された特定の海洋生物由来のPUFAシンターゼの使用は、PUFA産生の範囲を拡張し、大半の作物植物を成育させるために用いられる温度範囲内でそのようなPUFAを首尾よく産生させるための機会も提供する。
【０１５４】
いくつかの態様において、PUFAを合成するための系の中間産物もしくは副産物を「実質的に含まない」、または実質的な量で存在する中間産物もしくは副産物を有しないとは、PUFAを産生するための酵素系の導入または存在の結果として、遺伝的に改変された植物（および／または植物の部分および／または種子油画分）において産生された、任意の中間産物または副産物の脂肪酸（標的でないPUFA）（すなわち、野生型植物または指定された遺伝的改変のためのレシピエントとして用いられる親植物によっては産生されない）が、植物によって産生される総脂肪酸の約10重量％未満、より好ましくは植物によって産生される総脂肪酸の約9重量％未満、より好ましくは約8重量％未満、より好ましくは約7重量％未満、より好ましくは約6重量％未満、より好ましくは約5重量％未満、より好ましくは約4重量％未満、より好ましくは約3重量％未満、より好ましくは約2重量％未満、より好ましくは約1重量％未満、より好ましくは植物によって産生される総脂肪酸の約0.5重量％未満で存在することを意味する。
【０１５５】
いくつかの態様において、本発明の遺伝的に改変された植物、または本発明の遺伝的に改変された植物から得られる油もしくは種子は、検出可能な量のDHA（ドコサヘキサエン酸（C22:6、n-3））またはEPA（エイコサペンタエン酸（C20:5、n-3））を含む。いくつかの態様において、本発明の遺伝的に改変された植物、または本発明の遺伝的に改変された植物から得られる油もしくは種子は、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、1 1％、1 1.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％または15％のDHAを含む。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択することができ、例えば、0.01〜15％、0.05〜10％および1〜5％のDHAであってよい。
【０１５６】
いくつかの態様において、本発明の遺伝的に改変された植物、または本発明の遺伝的に改変された植物から得られる油もしくは種子は、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％または10％のEPAを含む。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択することができ、例えば、0.01〜10％、0.05〜5％および0.1〜5％のEPAであってよい。
【０１５７】
いくつかの態様において、PUFAシンターゼ系の標的産物がDHA、DPA（n-6もしくはn-3）またはEPAなどの長鎖PUFAである場合、そのようなPUFAシンターゼ系によって遺伝的に改変された植物の総脂質中に実質的な量では存在しない中間産物および副産物には、以下が非限定的に含まれうる：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）；ステアリドン酸（STAまたはSDA；18:4、n-3）；ジホモ-γ-リノレン酸（DGLAまたはHGLA；20:3、n-6）、アラキドン酸（ARA、C20:4、n-6）；エイコサトリエン酸（ETA；20:3、n-9）およびさまざまな他の中間産物または副産物、例えば20:0；20:1（Δ5）；20:1（Δ11）；20:2（Δ8,11）；20:2（Δ11,14）；20:3（Δ5,11,14）；20:3（Δ11,14,17）；ミード酸（20:3；Δ5,8,11）；または20:4（Δ5,1,14,17）。
【０１５８】
本発明による植物の遺伝的改変は、植物による1つまたは複数のPUFAの産生をもたらしうる。いくつかの態様において、その植物によって産生されるPUFAプロフィールおよびPUFAの比は、PUFAシンターゼの由来となった生物によって産生されるPUFAプロフィールおよびPUFAの比と必ずしも同じである必要はない。
【０１５９】
いくつかの態様において、本発明の遺伝的に改変された植物は、PUFAシンターゼの活性を通じてPUFAを産生するように操作しうる。いくつかの態様において、PUFAは、植物から化合物を抽出する精製工程を通じて回収することができる。いくつかの態様において、PUFAは植物を採取することによって回収することができる。いくつかの態様において、PUFAは植物から（例えば、油糧種子から）または植物の種子から油を採取することによって回収することができる。いくつかの態様において、植物はその自然の状態で消費されてもよく、または消費可能な産物へさらに加工処理されてもよい。
【０１６０】
いくつかの態様において、本発明の遺伝的に改変された植物は、1つまたは複数の多価不飽和脂肪酸を産生することができる。いくつかの態様において、本植物は、少なくとも1つのPUFA（標的PUFA）を産生することができ（例えば、油糧種子植物であればその成熟種子中に、または油糧種子植物の種子の油の中に）、ここで植物またはPUFAが蓄積する植物の部分（例えば、植物が油糧種子植物であれば成熟種子、または油糧種子植物の種子の油）における総脂肪酸プロフィールは、検出可能な量のこの1つまたは複数のPUFAを含む。いくつかの態様において、標的PUFAは少なくとも炭素が20個のPUFAであって、少なくとも3つの二重結合を有し、より好ましくは少なくとも4つの二重結合、さらにより好ましくは少なくとも5つの二重結合を有する。いくつかの態様において、標的PUFAはその植物によって天然には産生されないPUFAでありうる。いくつかの態様において、植物における、またはPUFAが蓄積する（植物の種子油を含む）植物の部分における総脂肪酸プロフィールは、標的PUFAを総脂肪酸の少なくとも0.1重量％含み、少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（標的PUFA）を、重量で、植物によって産生される総脂肪酸の少なくとも0.2％、少なくとも0.3％、少なくとも0.4％、少なくとも0.5％、少なくとも1％、少なくとも1.5％、少なくとも2％、少なくとも2.5％、少なくとも3％、少なくとも3.5％、少なくとも4％、少なくとも4.5％、少なくとも5％、少なくとも5.5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、75％超、または標的PUFAを0.1％から75％まで、もしくは75％超（最大100％または100％）までの0.1％刻みの任意のパーセンテージで含む。
【０１６１】
本明細書において一般に用いる場合、PUFA産生のパーセンテージ量に対する言及は、別に指定のない限り、生物（植物）によって産生される総脂肪酸に対する重量比である。いくつかの態様において、植物によって産生される総脂肪酸は、脂肪酸メチルエステル（FAME）調製物のガスクロマトグラフィー（GC）分析によって決定される重量パーセントとして提示されるが、総脂肪酸の決定はこの方法には限定されない。
【０１６２】
いくつかの態様において、本発明の植物（および／または植物の部分もしくは種子油画分）における総脂肪酸は、以下の任意の1つまたは複数から選択される脂肪酸を、重量で、その植物によって産生される総脂肪酸の10％未満、9％未満、8％未満、7％未満、6％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満含みうる：γ-リノレン酸（GLA；18:3、n-6）；ステアリドン酸（STAまたはSDA；18:4、n-3）；ジホモ-γ-リノレン酸（DGLAまたはHGLA；20:3、n-6）、アラキドン酸（ARA、C20:4、n-6）；エイコサトリエン酸（ETA；20:3、n-9）および他のさまざまな脂肪酸、例えば20:0；20:1（Δ5）；20:1（Δ1 1）；20:2（Δ8,11）；20:2（Δ11,14）；20:3（Δ5,11,14）：20:3（Δ11,14,17）；ミード酸（20:3；Δ5,8,11）；または20:4（Δ5,1,14,17）など。
【０１６３】
本発明は、本明細書に記載された植物によって産生される任意の種子、ならびに本明細書に記載された植物または種子によって産生される任意の油を含む。本発明はまた、本明細書に記載された植物、種子または油を用いて産生される任意の産物も含む。
【０１６４】
本発明の遺伝的に改変された生物に関連する用途および産物
本発明は、上記に詳述した本発明の遺伝的に改変された生物（例えば、植物）を成育させること、または培養することによって、PUFAを産生するための方法を含む。いくつかの態様において、そのような方法は、例えば、本明細書において前述した通りに、および本発明に従って、遺伝的改変を有する植物を、土壌などの適した環境で成育させる段階を含む。
【０１６５】
本発明は、本発明の遺伝的に改変された生物から、または本発明の遺伝的に改変された生物の種子から油を回収する段階を含む、少なくとも1つのPUFAを含む油を生産するための方法を含む。本発明は、本発明の遺伝的に改変された植物を成育させる段階を含む、少なくとも1つのPUFAを含む油を生産するための方法を含む。本発明は、本発明の遺伝的に改変された植物の種子から油を回収する段階を含む、種子油中に少なくとも1つのPUFAを産生させるための方法を含む。本発明は、本発明の遺伝的に改変された植物を成育させる段階を含む、種子油中に少なくとも1つのPUFAを産生させるための方法を含む。
【０１６６】
本発明は、少なくとも1つのPUFAを含む栄養補助食品または治療用を個体に提供するための方法であって、個体に対して、本発明の遺伝的に改変された植物、本発明の種子、本発明の油、本発明の種子、本発明の食品、または本発明の医薬製品を提供する段階を含む方法を提供する。本発明はまた、本発明の遺伝的に改変された植物を作製するための方法であって、（i）少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸（PUFA）を産生する藻類PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列；および（ii）ホスホパンテテイニル補因子を藻類PUFAシンターゼ系のACPドメインへと転移させるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）をコードする核酸配列によって、植物または植物細胞を形質転換させる段階を含む方法も含む。いくつかの態様において、本方法は、（iii）長鎖PUFA遊離脂肪酸（FFA）からアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ（ACoAS）をコードする核酸配列によって、植物または植物細胞を形質転換させる段階をさらに含む。
【０１６７】
いくつかの態様において、そのような方法のPUFAはDHAまたはEPAである。
【０１６８】
本発明はさらに、本明細書に記載された任意の生物またはその部分（例えば、植物、植物の部分（例えば、油糧種子）、またはそれらの調製物もしくは画分）、ならびに本明細書に記載された生物によって産生される任意の油を含む。本発明はまた、本明細書に記載された生物、その部分または油を用いて産生される任意の産物も含む。
【０１６９】
本発明は、少なくとも1つの脂肪酸を含む産物を改変するための方法であって、産物に対して、生物、その部分、または本発明に従って本明細書に記載したように遺伝的に改変された生物（例えば、本明細書に記載したように遺伝的に改変された植物）によって産生された油を添加する段階を含む方法に関する。この方法によって産生された、または任意の生物、その部分、もしくは本明細書に記載された生物からの油を一般に含むあらゆる産物も、本発明の範囲に含まれる。
【０１７０】
いくつかの態様において、産物は、食品、栄養補助食品、医薬製剤、ヒト化動物乳、乳幼児用調合乳、ニュートラシューティカルおよび機能性食品からなる群より選択される。適した医薬製剤には、抗炎症製剤、化学療法薬、活性添加剤、骨粗鬆症治療薬、抗鬱薬、抗痙攣薬、抗ヘリコバクター・ピロリ（Helicobactor pylori）薬、神経変性疾患の治療薬、変性肝疾患の治療薬、抗生物質、およびコレステロール低下製剤が非限定的に含まれる。いくつかの態様において、産物は、慢性炎症、急性炎症、胃腸障害、癌、悪液質、心臓再狭窄、神経変性疾患、肝臓の変性疾患、血中脂質疾患、骨粗鬆症、骨関節炎、自己免疫疾患、子癇前症、早産、加齢性黄斑症、肺疾患およびペルオキシソーム病からなる群より選択される病状を治療するために用いられる。
【０１７１】
いくつかの態様において、産物は、食品または機能性食品である。適した食品には、上質なベーカリー製品、パンおよびロールパン、朝食用シリアル、加工および非加工チーズ、調味料（ケチャップ、マヨネーズなど）、乳製品（ミルク、ヨーグルト）、プリンおよびゼラチンデザート、炭酸飲料、茶、粉末飲料ミックス、加工魚製品、果物飲料、チューインガム、固形型菓子類、冷凍乳製品、加工肉製品、ナッツおよびナッツのスプレッド、パスタ、加工家禽肉製品、肉汁およびソース、ポテトチップスおよび他のチップスまたはクリスプ、チョコレートおよび他の菓子類、スープおよびスープミックス、大豆製品（例えば、ミルク、飲料、クリーム、粉状ミルク）、植物油をベースとするスプレッド、ならびに野菜飲料が非限定的に含まれる。
【０１７２】
本発明のいくつかの態様において、産物は、動物用の飼料組成物もしくは食事組成物、または飼料組成物もしくは食事組成物に対する添加物である。動物という用語には、ヒトを含むすべての生物が含まれる。動物の非限定的な例には、非反芻動物（例えば、ブタ、家禽または魚類）および反芻動物（例えば、ウシ、ヒツジおよびウマが含まれる。飼料または飼料組成物という用語は、動物による摂取に適するかまたはそれ向けの、任意の化合物、調製、混合物または組成物を意味する。
【０１７３】
いくつかの態様において、遺伝的に改変された植物、種子または油（例えば、キャノーラ）では、従来の油に比して低下したレベルの多価不飽和脂肪酸および上昇したレベルの一不飽和オレイン酸を含む。そのような植物、種子または油は、例えば、より高い酸化安定度を示しうる。いくつかの態様において、遺伝的に改変された植物、種子または油は、高オレイン酸油バックグラウンド（例えば、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％のオレイン酸）を含む。そのような植物、種子または油は、例えば、貯蔵、揚げ調理および／もしくは精製の際に酸化されにくく、かつ／または発煙を伴わずにより高温に加熱することができることから、調理用油としてより適している。いくつかの態様において、遺伝的に改変された植物、種子または油は、本明細書に記載されたような量のDHA、および高オレイン酸油バックグラウンド（例えば、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％および99％、ならびにそれらの任意の範囲を含む、70％を上回るかまたはそれと等しい量のオレイン酸）を含む。いくつかの態様において、遺伝的に改変された植物、種子または油は、本明細書に記載されたような量のDHA、および低リノレン酸バックグラウンド（例えば、9.5％、9％、8.5％、8％、7.5％、7％、6.5％、6％、5.5％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％、0.05％、0.02％または0.01％、およびそれらの任意の範囲を含む、10％未満であるかまたはそれと等しい量のリノレン酸）を含む。いくつかの態様において、遺伝的に改変された植物、種子または油は、本明細書に記載されたような量のDHA、高オレイン酸油バックグラウンド（例えば、例えば、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％および99％、ならびにそれらの任意の範囲を含む、70％を上回るかまたはそれと等しい量のオレイン酸）および低リノレン酸バックグラウンド（例えば、9.5％、9％、8.5％、8％、7.5％、7％、6.5％、6％、5.5％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％、0.05％、0.02％または0.01％、およびそれらの任意の範囲を含む、10％未満であるかまたはそれと等しい量のリノレン酸）を含む。いくつかの態様において、そのような遺伝的に改変された植物、種子または油（例えば、キャノーラ）は、本明細書に記載された産物に組み入れることができる。
【０１７４】
本発明のその他の目的、利点および新規な特徴は、それらの以下の例の考察によって当業者には明らかになると考えられるが、それらは限定を意図したものではない。
【実施例】
【０１７５】
実施例1
PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIのコドン最適化
シゾキトリウム属の種ATCC_20888株由来のPUFA OrfA（GenBank ID：AF378327、GI：158518688）、シゾキトリウム属の種ATCC_20888株由来のPUFA OrfB（GenBank ID：AF378328、GI：158518690）、シゾキトリウム属の種ATCC_20888株およびヤブレツボカビ属由来のキメラPUFA OrfC（米国特許出願公開第2008/0022422号）（「キメラOrfC」または「ハイブリッドOrfC」）、シゾキトリウム属の種ATCC_20888株由来のアシル-CoAシンテターゼ（米国特許出願公開第2007/0245431号）、およびネンジュモ属の種PCC 7120株由来の4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetI（GenBank ID：P37695、GI：20141367）コード領域をコードするDNA配列の解析により、最適な植物発現にとって有害な恐れのある最適でないコドン組成を含む、いくつかの配列モチーフの存在が明らかになった。PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIタンパク質をコードする遺伝子のデザインを最適化することで、より「植物のような（plant-like）」性質を持ち、かつ、最適でないコドン組成のために配列改変によって翻訳が妨げられることもmRNA不安定性が生じることもないDNA配列を作製した。
【０１７６】
遺伝暗号の冗長性／縮重性（例えば、いくつかのアミノ酸は複数のコドンによって指定される）によって付与される柔軟性（plasticity）が原因で、複数の異なる生物または生物クラスにおけるゲノムの進化の結果、同義コドンの使用頻度の違いがもたらされた。この「コドンバイアス」は、タンパク質コード領域の平均塩基組成に反映される。例えば、G＋C含量が比較的少ないゲノムを有する生物は同義コドンの3番目の位置にAまたはTを有するコドンをより多く利用し、一方、より多くのG＋C含量を有するものは、3番目の位置にGまたはCを有するコドンをより多く利用する。さらに、mRNA内部の「マイナー」コドンの存在は、特にそのマイナーコドンに対応する負荷tRNAの相対的存在量が少ない場合には、そのmRNAの絶対的翻訳速度を低下させる可能性があると考えられている。この推論から敷衍されることは、個々のマイナーコドンによる翻訳速度の低下は、複数のマイナーコドンについて少なくとも相加的であると考えられるということである。このため、マイナーコドンの含量が比較的高いmRNAはそれに応じて翻訳速度が低いと考えられる。この翻訳速度は、コードされるタンパク質のレベルがそれに応じて低いことに反映されると考えられる。
【０１７７】
PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIタンパク質をコードする遺伝子を、キャノーラ（またはイネ、タバコ、トウモロコシ、ワタもしくはダイズといった他の植物）における発現のために操作する上で、キャノーラに関するコドン使用頻度に、公開データベースによってアクセスした（表2）。
【０１７８】
（表２）ブラッシカ・ナプス（キャノーラ）遺伝子（列CおよびG）のコード領域における同義コドンの提示。植物に最適化された合成遺伝子デザインに関する、均衡化されたバイアスありコドン提示セットの値は列DおよびHにある。
2013529086.tif 000003
*DNU＝使用せず
【０１７９】
アミノ酸に関する残りのコドン選択の分布を均衡化するために、各コドンについて、以下の式を用いて加重平均表示の算出を行った（表2）：
C1の加重平均％＝1／（％C1＋％C2＋％C3＋その他（etc.））×％C1×100
ここで式中、C1は、問われるコドンであり、％C2、％C3、その他（etc.）は、表2のキャノーラに関する残りの同義コドンの％値の平均を表す（該当コドンに関する平均％値は列CおよびGから得られる）。
【０１８０】
各コドンに関する加重平均％値は表2の列DおよびHに提示されている。
【０１８１】
植物発現のためのコード領域の設計に際して、その植物によって選好される主（「第一選択」）コドンを決定し、複数の選択肢が存在する場合には好ましいコドンの第2、第3、第4などの選択肢も決定した。続いて、PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIと本質的に同じアミノ酸配列をコードするが、（PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIをコードする）元のDNA配列とは、アミノ酸配列内の各位置でアミノ酸を特定する植物（1番目に好ましい、2番目に好ましい、3番目に好ましい、または4番目に好ましいなど）コドンの置換がある点で異なる、新たなDNA配列を設計した。
【０１８２】
続いて、これらの新しい配列を、配列中の改変によって作り出された制限酵素部位に関して分析した。続いて、コドンを第1、第2、第3または第4の選択肢である好ましいコドンで置き換えることにより、同定された部位を改変した。続いて配列をさらに分析して、TAまたはGCダブレットの頻度が低くなるように改変した。
【０１８３】
これらの配列の分析により、新たなDNA配列が、PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIタンパク質のアミノ酸配列を本質的にはコードするが、キャノーラ遺伝子に見いだされる高頻度に用いられるコドンの均衡化されたコドン分布を用いて、キャノーラにおける最適発現のためにそれぞれ設計されていることが明らかになった。特に、新たなDNA配列は、PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIをコードする元のDNA配列とは、タンパク質アミノ酸配列内の各位置で適切なアミノ酸を特定する植物（1番目に好ましい、2番目に好ましい、3番目に好ましい、または4番目に好ましい）コドンの置換がある点で異なっていた。
【０１８４】
植物に最適化されたDNA配列の設計は、表2の列DおよびHから構築したキャノーラコドンバイアス表を用いる、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4およびSEQ ID NO：5のタンパク質配列の逆翻訳によって開始した。アシル-CoAシンテターゼのタンパク質配列（SEQ ID NO：4）を元の配列から変更した；ここでは2番目のアミノ酸アラニンをタンパク質から除去した。この初期配列を、続いて、制限酵素認識部位を除去または付加するため、非常に安定な鎖内二次構造を除去するため、および植物における操作される遺伝子のクローニング操作または発現にとって有害な恐れのある他の配列を除去するために、代償性コドン変化（全加重平均コドン表示を保ちながら）によって改変した。続いて、DNA配列を、改変によって作り出された可能性のある制限酵素認識部位に関して再び分析した。特定された部位を、該当コドンを第1、第2、第3または第4選択肢の好ましいコドンによって置き換えることによって、さらに改変した。関心対象の遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼす可能性のある、配列中の他の部位には、エクソン：イントロン接合部（5'または3'）、ポリA付加シグナル、またはRNAポリメラーゼ終結シグナルが含まれる。改変された配列をさらに分析して、TAまたはCGダブレットの頻度を低くするため、およびTGまたはCTダブレットの頻度を高めるためにさらに改変した。これらのダブレットに加えて、約6個を上回る連続した［G＋C］または［A＋T］残基を有する配列ブロックも、配列の転写または翻訳に影響を及ぼす恐れがある。このため、これらの配列ブロックも、第1または第2選択肢などのコドンを、選択肢となる他の好ましいコドンによって置き換えることによって改変した。稀にしか用いられないコドンは遺伝子デザインの中にあまり大きな程度では含めず、コドン組成物それ自体とは異なる設計基準に順応させる必要のある場合（例えば、制限酵素認識部位の付加または欠失）にのみ用いる。
【０１８５】
PUFAシンターゼOrfAによってコードされるタンパク質は、サイズが17〜29アミノ酸の範囲にわたる「プロリン-アラニン」反復ドメインを10個含む。プロリン-アラニン反復配列の間には、87アミノ酸を構成する、より長い反復配列ドメインが9個散在する。これらの反復配列のアミノ酸配列は4つの位置にしか違いがなく、変異位置のそれぞれにおいてアミノ酸の選択肢は2つしかない。Clustal Wコンピュータプログラムを用いた9個の反復配列のアミノ酸配列の解析により、100％の相同性値および95.4％の同一性値が得られた。DNAレベルでは、9個の反復配列をコードする配列は100％相同かつ89.7％同一であり、各反復配列をコードする261塩基中、違いがあるのは27の位置のみであった（この27種の変化のうち23種は、同じアミノ酸に対する同義コドンが互換的である「サイレント」差異である）。
【０１８６】
標準的な遺伝子設計プロセスは、コドンバイアスのあるこのサイズの複数反復配列である新しいDNA配列の開発には容易に順応させることができないが、これは、非常に関連性の高いDNA配列が生じるのを避けるために、個々の反復配列（他の8個の反復配列における位置と同じ位置に作製されたコドン選択肢を有する）においてすべてのコドン選択肢のバランスを継続的にとり続けなければならないためである。87残基の反復配列のそれぞれにとって、同じアミノ酸配列をコードする4.5×1043種を上回る想定しうるDNA配列が存在した（配列中の各アミノ酸に対する同義コドンの数の積として計算）。このように、同一のコードを行うDNA配列を作製するために利用しうる計算空間は極めて大きかった。以下のプロトコールは、各個々の反復配列に対して（インシリコで）複数の配列デザインを作製し、その後にすべての配列バージョンの一括での比較を行うことで、それらの反復配列をコードする非常に多様性のある配列に相当するセットを同定するために用いられる方法を記載している：
段階1：各反復アミノ酸ドメインをコードするネイティブDNA配列を別個の配列として抽出する。
段階2：個々の反復DNA配列を、別個の配列として、遺伝子設計用プログラム（例えば、OPTGENE（商標）、Ocimum Biosolutions, Hyderabad, India）に取り込む。段階3〜5は各配列に対して別々に行う。
段階3：DNA配列を標準的な遺伝暗号を用いて翻訳する。
段階4：翻訳されたタンパク質配列を、標準的な遺伝暗号および適切なコドンバイアス表を用いて逆翻訳する。この例では、530個のブラッシカ・ナプスタンパク質コード領域からコンパイルしたバイアスありのコドン表を用い、生成された各配列に「nap」（「napus」に因んで）にバージョン番号を付したコード名をつけた。つまり、反復配列1（Repeat 1）に対する、逆翻訳された第1のコドンバイアスあり配列は「rpt1 nap1.」と命名した。この実例では、このプロセスを10回行って、反復配列1（Repeat 1）のタンパク質配列をコードする10種のDNA配列バージョンが生成された。
段階5：10種の配列バージョンを、対応する数のテキストファイルに書き出す。
段階6：他の反復配列ドメインのそれぞれに対して段階3〜5を繰り返す。この実例では、合計90種の「nap」配列バージョンが生成された（各反復要素毎に10種ずつ）。
段階7：90個の配列ファイルをClustal WプログラムMega 3.1（Megasoftwareにてアクセス）に取り込み、90種の配列すべてを入力として用いて複数の配列アラインメントを行う。これらの配列はタンパク質コード領域のセグメントであるため、アラインメントはギャップを許容せずに行う。Clustal Wアラインメントの後に、近隣結合樹を組み立てて画像化し、タンパク質の中の9個の反復ドメインのそれぞれについて、10個のコドン最適化配列のうち1つを視認の上で選び出す。選択される各配列バージョンは、樹のうち最も深く分岐した区域から選ばれる。
段階8：それぞれの特定の反復配列について、各反復ドメインに関して選ばれた配列を、タンパク質全体をコードするコドン最適化DNA配列の適正な位置に組み入れる。
段階9：望まれないモチーフ、制限酵素認識部位などが存在しないことを確実なものとするために、別々に設計した多様性をもつ反復エレメントを含む、コドン最適化配列全体の最終的解析を行う。
【０１８７】
新たに設計した、キャノーラに最適化されたPUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIのDNA配列は、それぞれSEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9およびSEQ ID NO：10に列挙されている。これらのコドン最適化配列は、本明細書の全体を通してバージョン3（v3）として特定される。バージョン2（v2）と表記された配列は、元のコドン最適化配列を説明している。
【０１８８】
結果として生じたDNA配列は、より高度のコドン多様性、望ましい塩基組成を有し、要所要所に配置された制限酵素認識部位を含み、しかも、その遺伝子の転写または産物mRNAの翻訳に干渉する可能性のある配列を持たない。表3、表4、表5、表6および表7は、元の遺伝子に見いだされるPUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIタンパク質に関するコード領域のコドン組成、ならびに表2の列DおよびHから算出した、植物に最適化されたバージョンのコドン組成、および植物に最適化された配列の推奨コドン組成の比較を提示している。
【０１８９】
（表３）PUFA OrfAのコドン組成
2013529086.tif 000004
【０１９０】
（表４）PUFA OrfBのコドン組成
2013529086.tif 000005
【０１９１】
（表５）PUFAキメラOrfCのコドン組成
2013529086.tif 000006
【０１９２】
（表６）アシル-CoAシンテターゼのコドン組成
2013529086.tif 000007
【０１９３】
（表７）ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIのコドン組成
2013529086.tif 000008
【０１９４】
コード領域配列のコドン最適化が完了した後に、最適化されたコード領域配列に対して、追加のヌクレオチド配列を付加した。クローニングの容易化のための制限部位、Kozak配列および追加の終止コドンを、植物に最適化されたコード配列に付加した。加えて、シロイヌナズナのリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小型鎖1A（GenBank ID：NM_202369.2）由来の葉緑体標的化配列を含む、第2の一連のPUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIコード配列を設計した。この配列SEQ ID NO：11を、PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfCおよびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIの前述のコード配列に付加した。SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8およびSEQ ID NO：10から最初のメチオニンを除去して、葉緑体標的化配列に置き換えた。葉緑体標的化配列を含む配列は、本明細書の全体を通してバージョン4（v4）として特定される。
【０１９５】
第2の葉緑体移行ペプチドを、PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIのコード配列に付加した。これらのコード配列は、アシル-ACP-チオエステラーゼ由来の葉緑体標的化配列（GenBank ID：X73849.1）を含むように設計した。この配列SEQ ID NO：38を、PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfCおよびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIの前述のコード配列に付加した。SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9およびSEQ ID NO：10から最初のメチオニンを除去して、葉緑体標的化配列によって置き換えた。本明細書の全体を通して、葉緑体標的化配列を含む配列はバージョン5（v5）として特定される。
【０１９６】
植物に最適化されたDNA配列をひとたび書類上またはインシリコで設計したならば、設計した配列と配列の点で正確に対応する実際のDNA分子を研究室で合成することができる。そのような合成DNA分子は、それらが天然またはネイティブの供給源に由来する場合と全く同じようにクローニングしたり他の様式で操作したりすることができる。上記の追加の配列を含む、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9およびSEQ ID NO：10を含むDNA断片の合成は、販売供給元（Geneart Ag, Regensburg, Germany）によって行われた。続いて、実施例2、3および4に記載したように、この合成DNAを発現ベクター中にクローニングして、アグロバクテリウムおよびキャノーラへの形質転換導入を行った。
【０１９７】
PUFAシンターゼOrfAコード配列のコドン最適化を伴うこの方法を用いたところ、その結果、反復配列の不安定性が避けられる程度に十分に多様性が付与された（diverged）プロリン-アラニン反復配列の選択がもたらされた。これらの配列は、近隣結合樹の最も深い分岐から選ばれた（すなわち、この配列セットの中で互いに最も隔たった関係にある）。Smith-Wassermanグローバルアラインメントを、対でのすべての比較について行ったところ、相同性の範囲は74〜81％であり、予想中央値（probable median）は76〜77％であった（表8）。
【０１９８】
（表８）PUFA OrfAの反復配列の選択したコドン最適化配列のSmith-Wassserman相同性
2013529086.tif 000009
【０１９９】
9個の反復ドメインについて選ばれた9個の新たに設計されたコード領域のClustal Wアラインメント（ベクターNTI, Invitrogen, Carlsbad, CA）を図1に示している。全体として、100％相同で89.7％同一であった元の配列と比較して、配列は93.1％相同であり、61.7％同一である。10回を上回る配列繰り返しを用い、これらの配列からの選択のために（配列を視認によって選ぶ代わりに）コンピュータプログラムまたは数学アルゴリズムを使用することにより、より大きな配列多様性を達成することができた。しかしながら、例示された配列は高度に多様であり、ポリヌクレオチド断片を含む安定なヌクレオチドが生成された。
【０２００】
実施例2
pDAB7361、pDAB7362、pDAB7363のプラスミド構築物、およびその他の構築物
pDAB7361の構築
pDAB7361プラスミド（図2；SEQ ID NO：35）を、マルチサイトGateway組換えL-R反応（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて構築した。pDAB7361は、3つのPUFAシンターゼ植物転写単位（PTU）、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および以下の通りの1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、短縮型のインゲンマメフィトヘマグルチニン-L遺伝子プロモーター（PvDlec2プロモーターv2；GenBankアクセッション番号X06336）、シロイヌナズナAT2S3遺伝子5'非翻訳領域（2S 5'UTR；GenBankアクセッション番号NM_118850）、シゾキトリウム属の種の多価不飽和脂肪酸シンターゼオープンリーディングフレームA（Sz PUFA OrfA v2）およびシロイヌナズナ2Sアルブミン遺伝子3'非翻訳領域ターミネーターv1（At2S SSPターミネーターv1；GenBankアクセッション番号M22035）を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、シゾキトリウム属の種の多価不飽和脂肪酸シンターゼオープンリーディングフレームB（SzPUFA OrfB v3）およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、シゾキトリウム属およびヤブレツボカビ属の種の多価不飽和脂肪酸シンターゼオープンリーディングフレームC（hSzThPUFA OrfC v3）ならびにAt2S SSPターミネーターv1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、シゾキトリウム属の種のアシル-CoAシンテターゼ（SzACS-2 v3）およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、ネンジュモ属の種の4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetI（NoHetI v3）およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
【０２０１】
プラスミドpDAB7355、pDAB7335、pDAB7336、pDAB7339およびpDAB7333を組み換えて、pDAB7361を形成させた。具体的には、上記の5つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：キャッサバベインモザイクウイルスプロモーター（CsVMVプロモーターv2；Verdaguer et al., Plant Molecular Biology 31: 1129-1139; 1996）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（PAT v5；Wohlleben et al., Gene 70:25-37; 1988）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスORF1 3'非翻訳領域（AtuORF1 3'UTR v4；Huang et al., J, Bacteriol. 172:1814-1822; 1990）も、Overdrive（Toro et al., PNAS 85(22): 8558-8562; 1988）およびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB；Gardner et al, Science 231:725-727; 1986および国際公開公報第2001/025459 A1号）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０２０２】
pDAB7362の構築
pDAB7362プラスミド（図3；SEQ ID NO：36）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7362は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU配列、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzACS-2 v3遺伝子およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
【０２０３】
プラスミドpDAB7334、pDAB7335、pDAB7336、pDAB7339およびpDAB7333を組み換えて、pDAB7362を形成させた。具体的には、上記の5つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０２０４】
pDAB7363の構築
pDAB7363（図4；SEQ ID NO：37）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7363は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTUおよび1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU配列を含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzACS-2 v3遺伝子およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。加えて、PTUはすべて、表記「v4」によって示されるシロイヌナズナリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小型鎖1A葉緑体標的化配列も含んだ。
【０２０５】
プラスミドpDAB7340、pDAB7341、pDAB7342、pDAB7344およびpDAB7333を組み換えて、pDAB7363を形成させた。具体的には、上記の5つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域の内部に頭-尾の向きに配置した。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０２０６】
pDAB7365の構築
pDAB7365は、SzPUFA OrfA v2、SzPUFA OrfB v2、hSzThPUFA OrfC v2、SzACS-2 v2およびNoHetI v2のネイティブでありコドンが最適化されていないバージョンを含むように構築したバイナリープラスミドである。pDAB7365プラスミド（図19；SEQ ID NO：39）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7365は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfC v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzACS-2 v2遺伝子およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
【０２０７】
プラスミドpDAB7355、pDAB7356、pDAB7357、pDAB7360およびpDAB7333を組み換えて、pDAB7365を形成させた。具体的には、上記の5つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域の内部に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v2、SzPUFA OrfB v2、SzPUFA OrfC v2、SzACS-2 v2、NoHetI v2。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、6つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０２０８】
pDAB7368の構築
pDAB7368は、SzPUFA OrfA v2、SzPUFA OrfB v2、hSzThPUFA OrfC v2およびNoHetI v2のネイティブでありコドンが最適化されていないバージョンを含むように構築したバイナリープラスミドである。この構築物はSzACS-2コード配列を含まない。pDAB7368プラスミド（図20；SEQ ID NO：40）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7368は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfC v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
【０２０９】
プラスミドpDAB7355、pDAB7356、pDAB7357、pDAB7359およびpDAB7333を組み換えて、pDAB7368を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域の内部に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v2、SzPUFA OrfB v2、SzPUFA OrfC v2、NoHetI v2。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０２１０】
pDAB7369の構築
pDAB7369は、SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3およびNoHetI v3の再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。この構築物はSzACS-2コード配列PTUを含まない。pDAB7369プラスミド（図21；SEQ ID NO：41）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7369は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
【０２１１】
プラスミドpDAB7334、pDAB7335、pDAB7336、pDAB7338およびpDAB7333を組み換えて、pDAB7369を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域の内部に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０２１２】
pPAB7370の構築
pDAB7370は、コード配列のアミノ末端に融合させたリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小型鎖1A（SSU-TP v1と表記）を含む、SzPUFA OrfA v4、SzPUFA OrfB v4、hSzThPUFA OrfC v4およびNoHetI v4の再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。この構築物はSzACS-2コード配列PTUを含まない。pDAB7370プラスミド（図22；SEQ ID NO：42）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7370は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
【０２１３】
プラスミドpDAB7340、pDAB7341、pDAB7342、pDAB7343およびpDAB7333を組み換えて、pDAB7370を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域の内部に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v4、SzPUFA OrfB v4、hSzThPUFA OrfC v4、NoHetI v4。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3 'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０２１４】
pDAB100518の構築
pDAB100518は、コード配列のアミノ末端に融合させたアシル-ACP-チオエステラーゼ由来の葉緑体移行ペプチド（チオエステラーゼ移行ペプチドと表記）を含む、SzPUFA OrfA v5、SzPUFA OrfB v5、hSzThPUFA OrfC v5およびNoHetI v5の再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。加えて、このプラスミドは、葉緑体移行ペプチドを保有しないSzACS-2 v3コード配列PTUも含む。pDAB100518プラスミド（図23；SEQ ID NO：43）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB100518は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v5およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v5およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v5およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzACS-2 v3遺伝子およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v5およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
【０２１５】
プラスミドpDAB100517、pDAB100514、pDAB100511、pDAB100515およびpDAB7333を組み換えて、pDAB100518を形成させた。具体的には、上記の5つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域の内部に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v5、SzPUFA OrfB v5、hSzThPUFA OrfC v5、SzACS-2 v3、NoHetI v5。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3 'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この6つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、6つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０２１６】
pDAB101476の構築
pDAB101476は、SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3およびNoHetI v3の再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。SzACS-2 v2遺伝子配列は、ネイティブでありコドンが最適化されていないバージョンである。pDAB101476プラスミド（図24；SEQ ID NO：44）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB101476は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzACS-2 v2遺伝子およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
【０２１７】
プラスミドpDAB7334、pDAB7335、pDAB7336、pDAB101471およびpDAB7333を組み換えて、pDAB101476を形成させた。具体的には、上記の5つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域の内部に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzACS-2 v2、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3 'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この6つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、6つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０２１８】
pDAB101477の構築
pDAB101477は、SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3およびNoHetI v3の再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。pDAB101477プラスミド（図25；SEQ ID NO：45）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB101477は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzACS-2 v4 geneおよびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
【０２１９】
プラスミドpDAB7334、pDAB7335、pDAB7336、pDAB101472およびpDAB7333を組み換えて、pDAB101477を形成させた。具体的には、上記の5つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域の内部に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzACS-2 v4、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この6つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、6つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０２２０】
実施例3
プラスミドpDAB7361、pDAB7362、pDAB7363用のアグロバクテリウム系統の作製
pDAB7361、pDAB7362およびpDAB7363プラスミドを、標準的なエレクトロポレーション手法を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに形質転換導入した。具体的には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス系統Z707S（Hepburn et al. J. Gen. Microbiol. 757:2961-2969 (1985)）に対して、pDAB7361、pDAB7362またはpDAB7363プラスミドによるエレクトロポレーションを行った。プラスミドを含んでいたアグロバクテリウムの形質転換コロニーを選択して、制限酵素消化を用いて確認した。pDAB7361、pDAB7362またはpDAB7363を含むアグロバクテリウム系統を、グリセロールストックとして-80℃で保存した。
【０２２１】
実施例4
キャノーラのアグロバクテリウムを介した形質転換
アグロバクテリウムの調製
pDAB7361、pDAB7362またはpDAB7363のいずれかを含むアグロバクテリウム系統のグリセロールストックのループを用いて、ストレプトマイシン（100mg／ml）およびスペクチノマイシン（50mg／ml）を含むYEP（バクトペプトン20.0gm／Lおよび酵母抽出物10.0gm／L）プレートへの画線を行い、28℃で2日間インキュベートした。続いて、2日間の画線培養プレートのループを、滅菌500mLバッフルフラスコに入れた、ストレプトマイシン（100mg／ml）およびスペクチノマイシン（50mg／ml）入りの150mLの変法YEP液体培地に接種して、28℃で200rpmにて振盪した。培養物をM培地（LS塩、3％グルコース、調製B5ビタミン、1μMカイネチン、1μM 2,4-D、pH 5.8）中に再懸濁させて、キャノーラ胚軸の形質転換の前に適切な密度（50 Klett単位）に希釈した。
【０２２２】
キャノーラの形質転換
種子発芽：キャノーラ種子（Nexera 710品種）を、10％クロラックス（Clorox）中で10分間かけて表面滅菌して、滅菌蒸留水で3回すすぎ洗いした（このプロセスの間は、種子を鋼製水切り容器に収容しておく）。種子を、Phytatrayに収容した1/2 MSキャノーラ培地（1／2 MS、2％スクロース、0.8％寒天）上に、Phytatray 1枚につき種子25個ずつ発芽のために植え付け、25℃、光周期が明16時間-暗8時間の成育用レジメンに設定したPercivalチャンバーに入れて、5日間かけて発芽させた。
【０２２３】
前処理：第5日に、およそ3mmの胚軸セグメントを無菌的に切り出して、根および苗条の区域を廃棄した（切り出しプロセスの間は、胚軸を10mlの滅菌milliQ水の中に置くことによってそれらの乾燥を防止した）。胚軸セグメントを、カルス誘導培地MSK1D1（MS、1mg／lカイネチン、1mg／l 2,4-D、3％スクロース、0.7％ Phytagar）上の滅菌濾紙の上に横向きに置き、22〜23℃（光周期は明16時間-暗8時間）の成育用レジメンに設定したPercivalチャンバーにおいて3日間の前処理を行った。
【０２２４】
アグロバクテリウムとの共培養：アグロバクテリウム処理の前日に、適切な抗生物質を含むYEP培地のフラスコへの接種を行った。胚軸セグメントが乾燥するのを防止するために、胚軸セグメントを、濾紙から10ml液体M培地を含む空の100×25mmペトリ皿に移した。この段階では、セグメントをすくい取って移行させるのにスパーテルを用いた。液体M培地をピペットで除去し、40mlのアグロバクテリウム浮遊液をペトリ皿に添加した（500のセグメントを40mlアグロバクテリウム溶液に）。胚軸がアグロバクテリウム溶液中に浸漬されたままになるように、セグメントをペトリ皿の周期的回旋下で30分間処理した。処理期間の最後に、アグロバクテリウム溶液をピペット操作により廃液ビーカーに入れ、オートクレーブ処理して廃棄した（アグロバクテリウムの過剰増殖を防止するためにアグロバクテリウム溶液は完全に除去した）。処理した胚軸を、ピンセットを用いて、MSK1D1を濾紙とともに含む元のプレートに戻した（セグメントが確実に乾燥しないように注意を払った）。胚軸セグメントを対照セグメントとともに、（アルミホイルでプレートを覆うことによって）光強度を落としたPercivalチャンバーに戻して、処理した胚軸をアグロバクテリウムと3日間共培養した。
【０２２５】
選択培地上でのカルス誘導：3日間の共培養後に、胚軸セグメントを、カルス誘導培地MSK1D1H1（MS、1mg／lカイネチン、1mg／l 2,4-D、0.5gm／l MES、5mg／l AgNO3、300mg／lチメンチン、200mg／lカルベニシリン、1mg／l Herbiace、3％スクロース、0,7％ Phytagar）上に、ピンセットを用いて個別に移した。胚軸セグメントを培地上に固定はしたものの、培地中に包埋することはしなかった。
【０２２６】
選択および苗条の再生：カルス誘導培地上に7日間置いた後、カルス形成中の胚軸セグメントを、選択用MSB3Z1H1を有する苗条再生培地1（Shoot Regeneration Medium 1）（MS、3mg／l BAP、1mg／lゼアチン、0.5gm／l MES、5mg／l AgNO3、300mg／lチメンチン、200mg／lカルベニシリン、1mg／l Herbiace、3％スクロース、0.7％ Phytagar）に移した。14日後に、苗条を有する胚軸を、選択用MSB3Z1H3を増加させた再生培地2（MS、3mg／l BAP、1mg／lゼアチン、0.5gm／l MES、5mg／l AgNO3、300mg／lチメンチン、200mg／lカルベニシリン、3mg／l HERBIACE、3％スクロース、0.7％ Phytagar）に移した。
【０２２７】
苗条の伸長：14日後に、苗条を有するセグメントを、苗条伸長培地MSMESH5（MS、300mg／lチメンチン、5mg／l Herbiace、2％スクロース、0.7％ TC Agar）に移した。既に伸長している苗条を単離して、MSMESH5に移した。14日後に、1回目のラウンドでは伸長しなかった残りの苗条をMSMESH5の上に置き、同じ組成の新鮮な選択培地に移した。この段階で、残りの胚軸セグメントをすべて廃棄した。
【０２２８】
MSB3Z1H3培地上で2週間後に伸長した苗条を単離して、MSMESH5培地に移した。1回目のラウンドでMSMESH5上で伸長しなかった残りの苗条を単離して、同じ組成の新鮮な選択培地に移した。この段階で、残りの胚軸セグメントをすべて廃棄した。
【０２２９】
根の誘導：14日後に、苗条を、根の誘導のためにMSMEST培地（MS、0.5g／l MES、300mg／lチメンチン、2％スクロース、0.7％ TC Agarに移した。1回目の移行でMSMEST培地上で根を付けなかった苗条は、根の付いた植物が得られるまで、MSMEST培地上での2回目または3回目のサイクルのために移行させた。MSMEST培地上での1回目の移行において伸長することも根付くこともなかった苗条は、根の付いた植物が得られるまで、MSMEST培地上での2回目または3回目のサイクルのために移行させた。
【０２３０】
PCR分析：苗条をMSMESH5培地上で少なくとも14日間培養した後に、PCR用の試料を単離した。緑色の苗条からの葉組織を、PCRによって、PAT選択マーカー遺伝子の存在に関して検討した。黄化した苗条はすべて廃棄し、PATアッセイには供しなかった。PCR反応に関して陽性であった試料を残し、苗条をMSMEST培地上にそのままにして、根の伸長および発育を行わせた。PCRアッセイによって陰性であった苗条は廃棄した。
【０２３１】
MSMESH5またはMSMEST上で根を付け、かつPCR陽性であった植物を、土壌中への移植に差し向けた。硬化後に、T0キャノーラ植物を導入遺伝子PTUカセットのすべてを含む事象に関してさらに分析し、続いて植物を温室に移し、成熟するまで成育させて、追加分析のために種子を収穫した。
【０２３２】
実施例5
トランスジェニックキャノーラにおけるコピー数分析およびコード領域の検出
実施例4から選択されたT0植物を、導入遺伝子PTU発現カセットのそれぞれを含む植物を同定するためにさらに分析した。Invaderアッセイおよび加水分解プローブアッセイを行って、形質転換されたT0植物と推定されるものの試料をまずスクリーニングして、PAT発現カセットを含む事象を同定した。その後に、PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIの遺伝子発現カセットのPCR分析を完了し、植物を形質転換させるために用いたバイナリーベクター由来の各遺伝子発現カセットPTUを含む植物をさらに同定した。PTUのすべてを含む事象を、T1植物に進めるために選択した。
【０２３３】
組織試料を96ウェル収集プレートに収集して、2日間凍結乾燥させた。組織離解はKleco組織微粉砕機およびタングステンビーズ（Kleco, Visalia, CA）を用いて行った。組織離解の後に、DNeasy 96 Plantキット（Qiagen, Germantown, MD）を製造元の提案するプロトコールに従って用いるハイスループット形態でゲノムDNAを単離した。
【０２３４】
gDNAをQuant-IT Pico Green DNAアッセイキット（Molecular Probe, Invitrogen, Carlsbad, CA）によって定量した。定量したgDNAを、Biorobot3000自動液体処理装置（Qiagen, Germantown, MD）を用いて、Invader（登録商標）アッセイ用に10ng／μlに、または加水分解プローブアッセイ用に2ng／μlに調整した。
【０２３５】
個別仕様のINVADER（登録商標）アッセイが、キャノーラ内部のpat分析のために、Third Wave Technologies（Madison, WI）によって開発された。gDNA試料（10ng／μlのgDNAが7.5μl）を、96ウェルプレート形態で、95℃での10分間のインキュベーションによってまず変性させ、続いて環境温度まで冷却した。次に、7.5μlのmaster mix（patおよびHMG内部参照遺伝子用のプローブmixが3μl（Weng, 2005) Weng H. et al., (2005). J. AOAC Int. 88(2):577-84.、3.5μlのCleavase XI FRET mix、ならびに1μlのクリベース（Cleavase）XI酵素／MgCl2溶液）を各ウェルに添加して、試料の上から鉱油の層を重ねた。プレートを密封し、BioRad Tetradサーモサイクラーの中で、63℃で1時間インキュベートした。プレートを環境温度まで冷却し、その後に蛍光プレートリーダーで読み取った。プレートのすべてに、1コピー、2コピーおよび4コピーの標準物質、さらには野生型対照試料、ならびに試料を全く含まないブランクウェルを含めた。
【０２３６】
読み取り値はFAM（λ 485〜528nm）およびRED（λ 560〜620nm）チャンネルの両方に関して収集し、これらから、試料の生シグナルをテンプレート無しの生シグナルによって除算することにより、各チャンネルに関するゼロ値（すなわち、バックグラウンド）に対する倍数を各試料について求めた。このデータから標準曲線を構築し、最良適合を線形回帰分析によって求めた。この適合から同定されたパラメーターを用いて、各試料に関して見かけ上のpatコピー数を推定した。
【０２３７】
TAQMAN（登録商標）アッセイに類似した加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子コピー数の決定は、LIGHTCYCLER（登録商標）480システム（Roche Applied Science, Indianapolis, IN）を用いるリアルタイムPCRによって行った。アッセイは、LIGHTCYCLER（登録商標）Probe Designソフトウエア2.0を用いて、patおよび内部参照遺伝子HMGに対して設計した。増幅のために、LIGHTCYCLER（登録商標）480 Probes Master mix（Roche Applied Science, Indianapolis, IN）をを、0.4μMの各プライマーおよび0.2μMの各プローブ（表8）を含む容量10μLのマルチプレックス反応液中に1×最終濃度で調製した。蛍光取得を行う60℃で35秒間の延長を伴う2段階増幅反応を行った。試料はすべて3件ずつ測定し、平均Cycle閾値（Ct）の値を各試料の分析のために用いた。
【０２３８】
リアルタイムPCRデータの分析は、相対quantモジュールを用い、ΔΔCt法に基づくLIGHTCYCLER（登録商標）ソフトウエア、リリース1.5を用いて行った。このために、単一コピー較正物質および公知の2コピー検定物質（check）からのgDNAの試料を、各測定に含めた（上記のInvaderアッセイに用いたものと同じ）。
【０２３９】
T0植物事象に含まれる他の遺伝子発現カセットの存在は、個々のPCR反応によって検出した。これらの5種のPTUのコード領域に対して特異的なプライマー対（表9）を、検出のために用いた。
【０２４０】
（表９）patおよび内部参照（HMG）の加水分解プローブアッセイのためのプライマーおよびプローブの情報
2013529086.tif 000010
【０２４１】
PUFAシンターゼOrfA PCR反応は、遺伝子配列のオープンリーディングフレームを増幅するために2つの別々のPCR反応および異なる条件（例えば、PCRプライマーおよびサイクル条件）を必要とした。PCR反応はすべて、表10に記載した条件を用いて、EX-TAQ PCRキット（TaKaRa Biotechnology Inc. Otsu, Shiga, Japan）を製造元の指示に従って用いて35サイクルを行うことによって完了した。TAEアガロースゲル電気泳動によってPCR産物を分解して同定した。完全長PTUの存在を示すと考えられるPCR産物に関して予想されるゲル断片サイズは、表10中の「予想されるサイズ」の列に記載されている。
【０２４２】
（表１０）PCRプライマーおよび条件
2013529086.tif 000011
2013529086.tif 000012
【０２４３】
Invader実験および加水分解プローブ実験から、合計197件のキャノーラ事象がpat陽性と同定された。これらの事象のうち15件は、植物の形質転換のために用いたバイナリー内部に含まれた5種の遺伝子発現カセット（PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetI）のすべてに関してPCRアンプリコンを産生した。表11は、ドコサヘキサエン酸（DHA）の産生に関してさらに分析した15件の事象を提示している。これらのT0キャノーラ植物を成熟するまで温室内で成育させ、その後に自家受精させた。成熟T1種子を収穫して、GC-FAME分析を介してDHAに関して分析した。
【０２４４】
（表１１）トランスジェニックキャノーラ植物におけるドコサヘキサエン酸（DHA）産生遺伝子のPCR検出
2013529086.tif 000013
【０２４５】
実施例6
トランスジェニックキャノーラ種子脂質におけるDHAの検出
キャノーラ種子試料（個々の種子またはバルク試料のいずれか）を、鋼製ボールミルを用いて、トリヘプタデカノイン（Nu-Chek prep）をトリアシルグリセロール内部標準物質として含むヘプタン中でホモジネート化した。ホモジネート化の前に、新たに調製した0.25Mナトリウムメトキシド（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）のメタノール溶液を添加した。抽出は一定の振盪下にて40℃で実施した。回収は、メチル化された代用C17脂肪酸の回収によって検証した。FAME（脂肪酸メチルエステル）の抽出を3回繰り返して、ヘプタン層をプールした後に分析を行った。反応の完了は、第4の抽出／誘導体化における内因性FAMEの存在を確かめることによって検証した。その結果生じたFAMEを、SGE製のキャピラリーカラムBPX 70（15m×0.25mm×0.25μM）を用いるGC-FIDによって分析した。各FAMEを保持時間によって同定し、適切な長鎖多価不飽和脂肪酸（Nu-Chek Prep, Elysian MN）の添加とともに、Matreya LLC（Pleasant Gap, PA）製のナタネ油参照mixを較正標準物質として注入することによって定量した。
【０２４６】
7件の事象からの種子に対応するFAME抽出物が、T1種子のGC-FAME分析後に、DHAおよびDPA（n-6）に対応するピークを含むことが見いだされた（以下の表12に表形式でまとめられている）。表12は、DHAを含有する種子の数がさまざまであり（キャノーラゲノム中に挿入された導入遺伝子セットのさまざまなコピーの分離から予想された通り）、個々の種子において観察されたDHAの最大含有率も同様であった。
【０２４７】
（表１２）PUFAシンターゼ遺伝子であるSzACS-2遺伝子およびHetI遺伝子を含む7件のトランスジェニックキャノーラ事象からのT1種子のLC-PUFA含有率
2013529086.tif 000014
a．T1バルクからの、検出可能なDHAを含んでいた種子の数／分析した種子の総数。
b．DHA陽性種子すべての平均DHA含有率（総脂質に占める％）。
c．DHA陽性種子すべての平均PUFA含有率（総脂質に占める％）。
d．DHAn-3／総LC-PUFA（DHA＋DPAn-6）の平均％比。
e．単一の種子で観察された最大DHA含有率。
【０２４８】
さらなる事象からの発育中の種子を分析したところ、DHAを含むことが見いだされたが、成熟植物からはさらなる分析のためには不十分なT1種子しか生じなかった。長鎖多価不飽和脂肪酸（LC-PUFA）ピークの実体を質量分析によって確認した上で、基準標準物質（Nu-Chek Prep, Elysian MN）と比較した。
【０２４９】
1件の事象（事象5197[14]-032.002）からのT1種子のDHA含有率に関する単一種子分析を図5に示している。個々の種子は最大1％のDHA（総FAMEに占める％として）を含んでいた。DHAレベルは3つのクラスに分離され（0、およそ0.4％およびおよそ0.9％のDHA）、このことはDHA産生性遺伝子を含む個々の遺伝子座の分離を反映するように見えた。
【０２５０】
これらのデータは、pDAB7361、pDAB7362およびpDAB7363によって形質転換された植物においてDHAが産生されたことを示している。pDAB7362プラスミドは、インゲンマメフィトヘマグルチニン-L遺伝子プロモーターによって作動する、5種の遺伝子すべて（PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIをコードする）の植物に最適化されたバージョンを含む。pDAB7361では、PUFAシンターゼOrfAのネイティブ遺伝子配列（SzOrfA v2）が植物に最適化されたバージョン（SzOrfA v3）を置き換えている。pDAB7363もpDAB7362に類似しているが、ただし、PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfCおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIのN末端に、これらのポリペプチドのプラスチドに対する標的化のためにシロイヌナズナリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小型鎖1A葉緑体移行ペプチドが付加されていることを例外とする。
【０２５１】
実施例7
キャノーラ種子におけるPUFAシンターゼタンパク質の検出
PUFAシンターゼポリペプチドを、成熟トランスジェニック種子試料においてウエスタンブロットによって検出した。種子を、ステンレス鋼製ビーズ2個を用いてKleco Bead Beater（Garcia Machine, Visalia, CA）中で乾燥種子を破砕することによって分析のために調製した。抽出緩衝液を添加して（50mM Tris、10mM EDTA、2％ SDS）、試料チューブを30分間穏やかに揺り動かした。試料を3000rcfで30分間遠心した。上清を収集して、分析のために用いた。種子抽出物中の総可溶性タンパク質の量をLowryアッセイ（BioRad, Hercules, CA）によって決定した。試料を1.55mg／mlの総可溶性タンパク質に標準化した上で、40mM DTTを有するLDS試料緩衝液（Invitrogen, Carlsbad, CA）中に、1レーン当たり20μgの総可溶性タンパク質という標準化ロードとなるように調製した。試料を3〜8％ Tris酢酸ゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA）中で電気泳動して、ニトロセルロース膜に転写させた。ブロットをブロッキング緩衝液中でブロックし、異なるPUFAシンターゼOrfA、OrfBおよびOrfCポリペプチドに対する抗体によるプローブ検査を行った。シゾキトリウム属PUFAシンターゼサブユニットA（SzPUFS-A）のA2領域を対象とするウサギ抗A2-A、およびシゾキトリウム属PUFAシンターゼサブユニットB（SzPUFS-B）のB3領域を対象とするウサギ抗B3-Aを用いた。領域B3はエノイルレダクターゼ（ER）領域である。また、サブユニットCにはER領域もあり、そのため、この抗血清はウエスタンブロット上でサブユニットBおよびCの両方を認識すると考えられる。抗ウサギ蛍光標識二次抗体（ヤギ抗ウサギAF 633（Invitrogen, Carlsbad, CA））を検出用に用いた。ブロットをTyphoon Trio Plus fluorescent imager（GE Healthcare, New Brunswick NJ）上で描出した。
【０２５２】
事象5197[14]-032.002からの後期（30 DAPを上回る）の発育中T1種子からの抽出物のSDS-PAGEウエスタンブロットからは、Orf A、Orf BおよびOrf Cに対して特異的な抗血清によるプローブ検査を行ったところ、適切なサイズのバンドが示された（図6）。これらのバンドはまた、クーマシーブルーによる直接染色によっても見ることができた。Orf A、Orf BおよびOrf Cはまた、DHA産生事象5197[13]-010.001、5197[21]-052.001、5197[21]-053.001および5217[6]-065.002からの種子試料中でも検出されている。
【０２５３】
DHA産生性キャノーラ事象5197[14]-032.002から受粉後日数（DAP）15、20、25、30、35および42日に収集した発育中T2種子試料のセットを、脂質含有率（図7A）に関して、ならびにウエスタンブロットによってOrfA、OrfBおよびOrfCポリペプチドの存在（図7B）に関して分析した。
【０２５４】
3種のポリペプチドすべての発現が受粉後30日および受粉後35日の発育中の種子で検出され、かつ、受粉後42日および成熟種子では顕著に検出された（図7Aおよび7B）。
【０２５５】
実施例8
T2キャノーラ種子におけるDHA、DPAおよびEPAのレベル
事象5197[14]-032.002からのT1種子を温室内に植え、4〜5葉の段階にある96件の植物からDNA分析のために葉試料を採取して、各T1分離個体植物における導入遺伝子のコピー数を決定した。これを上記のプロトコールを用いるpat遺伝子の加水分解プローブアッセイによって行ったところ、ホモ接合植物21件、ヘテロ接合植物45件およびヌル植物30件という3つの別個のクラスの分離個体が同定された。ホモ接合植物のすべておよびヌル植物31件を温室内で成熟するまで成育させて、種子を収穫した。ホモ接合植物およびヌル植物からの植物当たりのT2種子の平均収量は、それぞれ7.36gmおよび8.61gmであった。
【０２５６】
事象5197[14]-032.002の温室内で成育させたT1植物からのT2種子の長鎖多価不飽和脂肪酸（LC-PUFA）含有率を、前述の通りに、種子8〜12個のバルク抽出物でGC-FAME分析によって決定した。対照として、21件のヌル分離個体植物も成熟するまで成育させた。ホモ接合植物のLC-PUFA含有率は図8に示されている。ヌル分離個体のいずれからの種子中にもLC-PUFAは全く検出されなかった。トランスジェニック系統のうち20個はバルク種子分析において0.28％〜0.90％のDHAを産生し、1つの系統はLC-PUFAを全く産生することができなかった。DHAを含有する種子は、0.09〜0.34％のDPA（n-6）も含んでいた。総PUFA（DHA＋DPA）におけるDHAの平均比率は77％であった。
【０２５７】
0.7％を上回るDHAを産生した4つの系統からの種子の脂肪酸組成が、4つのヌル分離個体系統からのそれと比較して、表13に示されている。
【０２５８】
（表１３）事象5197[14]-032.002からの4つのトランスジェニック系統および4つのヌル分離個体からのバルクT2種子の脂肪酸組成
2013529086.tif 000015
【０２５９】
これらのホモ接合T1植物のうち6つの系統（4、35、63、96、50および106）からの48個のT2種子の単一種子分析を行った。GC-FAMEプロファイルの詳細な分析により、DHAおよびDPAを含有する種子には、もう1つのピークが一貫して存在することが示された。基準標準物質（NU-Chek）との比較により、これはC20:5（n-3）EPAと同定された。その保持時間は基準EPA（C20:5（n-3））のそれと一致し、PolarisQを介してGC-MSによって決定された名目上（nomimal）の分子質量も同一であった。
【０２６０】
この6つの系統からの単一T2種子分析のLC-PUFAに関する概要は図9に示されている。DHA含有率が最大で1.6％に上る個々の種子が見いだされた。加えて、EPA含有率が最大で0.27％に上る植物も同定された。
【０２６１】
2つのT1系統と非形質転換Nexera710との間で正逆交雑を行わせた。その結果生じた親種子およびF1雑種種子をDHA含有率に関して分析した（図10）。図10中で、菱形はX軸上に記載された各カテゴリーの平均ANOVAを表している。縦のバーはそのカテゴリーに関する平均を表しており、菱形の最端間の距離は95％信頼区間である。F1種子におけるDHA蓄積の平均レベル（0.29％および0.28％）は、トランスジェニック親種子に蓄積しているものの半分である（0.51％および0.47％）。表現型と接合レベルとの定量的相関をこの結果から導き出すことができる。
【０２６２】
まとめると、これらのデータは、5種の導入遺伝子によって付与されるDHAの特徴が遺伝性であり、第2世代へと維持されることを示している。
【０２６３】
実施例9
キャノーラ事象-10 T2種子におけるDHA産生
キャノーラ事象5197[13]-010.001（図11に示されているようにpat遺伝子の2つのコピーを含む）からの60個のT1種子を温室内に植えた。pat遺伝子の加水分解プローブアッセイにより、pat遺伝子の0〜4個のコピーに対応する5つの別個のクラスの分離個体が同定された。
【０２６４】
トランスジェニックインサートに対応する2つの遺伝子座は、サザンブロット分析によって区別することができた（遺伝子座AおよびBと命名）。2つのpatコピーを含む植物すべてからのDNAを、それらの遺伝子型（遺伝子座Aもしくは遺伝子座Bに関してホモ接合であるか、または両方の遺伝子に関してヘミ接合であるか）を決定するために、サザンブロットによって分析した。対照として、4つの単一コピー植物および2つのヌル対照植物も分析した。T1植物のすべてを温室内で成熟するまで成育させた。種子を収穫して、バルク種子分析においてLC-PUFA含有率に関して分析した（表14）。
【０２６５】
（表１４）事象5197[13]-010.001からのT1分離個体からのT2種子のLC-PUFA含有率（平均をTukey-Kramer HSD検定によって比較した。同じ文字によって結び付けられていないレベルは有意に異なる。）
2013529086.tif 000016
【０２６６】
これらのデータは、事象5197[13]-010.001の遺伝子座Aでホモ接合である植物はLC-PUFAの産生を導くが、一方、遺伝子座Bのホモ接合体はそうでないことを示している。その上、4コピーの二重ホモ接合体は3コピーの植物と同じく極めて低いレベルのDHAしか産生しなかったことからみて、遺伝子座BはLC-PUFA産生を妨げる。同様に、ヘミ接合の単一コピー遺伝子座A植物は0.47％のLC-PUFAを産生したが、一方、ヘミ接合単一コピー遺伝子座Bは極めて低いレベルのLC-PUFA（0.02％）しか産生しなかった。
【０２６７】
遺伝子座Aでホモ接合（かつ遺伝子座Bに関してヌル）である事象5197[13]-010.001の事象に由来する植物からのバルクT2種子のGC-FAME分析によって決定された完全脂肪組成は、表15に示されている。
【０２６８】
（表１５）遺伝子座Aでホモ接合である事象5197[13]-010.001からのT2種子の脂肪酸組成
2013529086.tif 000017
【０２６９】
実施例10
キャノーラにおけるDHAの圃場産生
最も高いレベルのDHAを含んでいた5197[14]-032.002の10件のホモ接合系統からのT2種子をプールして、60gmの種子が取れた。10件のヌル分離個体系統からも種子をプールして、陰性対照として用いるための47gmの種子が得られた。これらの種子を2009年5月にNorth Dakotaの2つの場所に植え、それぞれの場所に、導入遺伝子を含む種子を8つの小区画（plot）、ヌル分離個体種子を6つの小区画、および商業的対照（Nexera 845CL）を2つの小区画とした。開花中は、トランスジェニック植物の小区画のすべておよびヌル分離個体の小区画のうち4つを隔離ケージで覆った。残りの2つのヌル小区画およびNexera 845CL小区画は覆わないままにした。小区画の刈り取りおよび収穫を通常の慣行に従って9月に行った。場所1では、トランスジェニック植物からは小区画平均で0.95kgの種子が得られ、ヌル植物からは0.99kgが得られた。場所2では、小区画平均はトランスジェニック植物からは0.64kgであり、ヌル植物からは0.73kgであった。圃場で成育させた種子におけるLC-PUFAのレベルを決定するために、各小区画からの種子のGC-FAME脂質分析を行った（表16）。
【０２７０】
（表１６）圃場で成育させた5197[14]-032.002のT2植物からの10個の種子のバルク分析によるT3種子のDHA含有率
2013529086.tif 000018
【０２７１】
表16からの結果は、各小区画からの3つの試料の分析を表している。小区画1〜11からの種子は、場所1の他の小区画（平均で18：1が76.7％、18:3が2.9％）と比較して、18：1のレベルがより低く（65.5％）、18:3のレベルがより高く（7.6％）、このため、従来のキャノーラの広範な混入を受けたと判断された。この小区画は以後の分析から除外した。場所1からのトランスジェニック植物からのT3種子の10個の種子のバルク分析による平均DHA含有率は0.19％であり、場所2からは0.26％であった。最も高いDHA含有率は0.38％（そのEPAは0.03％）であった。n-3 LC-PUFA／総PUFAの平均％比は73％であった。
【０２７２】
圃場試験に用いた各T2系統の試料を、温室内でも成育させた。T3温室種子の10個の種子のバルク分析による平均DHA含有率は0.22％であり、個々の植物は最大で0.8％のDHAを有した。これは、圃場で産生されたDHAの量と相関する。
【０２７３】
これらのデータは、対象PUFAシンターゼ遺伝子スイートが圃場条件下でDHAの産生を導くことを示している。
【０２７４】
実施例11
マイクロアレイ技術を用いたDHA遺伝子発現分析
トランスジェニックホモ接合事象5197[14]-032.002系統および非形質転換ヌル植物から、受粉後日数（DAP）15、20、25、30、35および42日に、発育中のキャノーラ種子を収集した。単色の全体的遺伝子発現プロファイリングデザインを用いて、ホモ接合形質転換系統に新たに導入された遺伝子のそれぞれの発現レベルを、種子発育中の定められた時点のそれぞれに関して、非形質転換ヌル系統とは相対的に決定した。個々の60merオリゴアレイ（Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA）の3つの同一な技術的複製物に対して、各試料から増幅されたCy3標識cRNAをハイブリダイズさせた。受注設計された（eArray, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA）60merの網羅的トランスクリプトームワイドのキャノーラオリゴヌクレオチドアレイを用いて、前述のハイブリダイゼーションを実施した。このアレイは、公開データソースから得られた37,000個を上回る異なるキャノーラ転写物を含む（Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA）。各転写物の発現レベルを効率的に測定するために、アレイ中に存在するオリゴ体が、予想される標的配列と効率的にハイブリダイズするように、各標的に対して一意的かつ特異的であるように設計した。複数の転写物と二重鎖を形成するオリゴ体はアレイから除去した。各オリゴ体はまた、マイクロアレイ処理の全体を通じての最適な成績のために必要とされる化学的および物理的特性も満たす。加えて、新たに導入された遺伝子、ならびに他のいくつかの関心対象の遺伝子に相当する特異的かつ一意的なオリゴ体も、受注設計されたキャノーラオリゴアレイ中に表示されている。60merオリゴ体は、製造元によるSure-Print技術を用いてインサイチューで合成した。
【０２７５】
RNAの単離および精製
事象5197[14]-032.002およびヌル植物対照からの発育中の種子の試料を凍結し、RNA単離および精製のための出発材料として用いるためにプールした。プールした試料当たり合計500mgの種子組織を液体窒素とともに乳鉢および乳棒を用いて粉砕し、およそ50mgの粉砕組織を、RNA抽出用RNeasy Kit（Qiagen, Valencia, CA）からの抽出緩衝液RLT 450μL中に再懸濁させた。組織を破壊するために試料を短時間ボルテックス処理して、その後に抽出プロトコールを続けた。RNA抽出用RNeasy Kit（Qiagen, Valencia, CA）による指示に従って、全RNAを精製した。続いて、精製された全RNAをNanoQuant（TECAN, Research Triangle Park, NC）分光光度計を用いて定量し、標準的な1％アガロースゲル電気泳動によって描出した。
【０２７６】
標識化のためには、各試料から精製された合計1.0μgの全RNAを逆転写させ、増幅した上で、Agilent（Santa Clara, CA）One-colorマイクロアレイに基づく遺伝子発現QuickAmp標識プロトコールに従って、Cy3-CTPで標識した。各キャノーラアレイは1300個を上回る内部スパイクイン（spike-in）対照を含むため、One-color RNA spike-inキット（Agilent, Santa Clara, CA）も製造元の指示に従って標識した。試料をMMLV逆転写酵素を用いて逆転写させて、T7 RNAポリメラーゼを用いて増幅した。増幅後にcRNAをQiagenのRNeasyミニスピンカラムを用いて精製し、NanoQuant分光光度計（TECAN, Research Triangle Park, NC）を用いて定量した。Cy3に関する比活性は以下の指揮によって決定した：（Cy3の濃度／（cRNAの濃度）*1000＝cRNA 1μg当たりのCy3のpmol数。ハイブリダイゼーション用の試料は1.65μgに標準化し、cRNA 1μg当たりのCy3の比活性が9.0pmolを上回るようにした。
【０２７７】
ハイブリダイゼーション、スキャニングおよび特徴抽出
オリゴ遺伝子発現アレイを、Agilent Technologies（Santa Clara, CA）遺伝子発現ハイブリダイゼーションキットおよび洗浄緩衝液キットを用いてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、完全に自動化されたTECAN HS4800 PRO（TECAN, Research Triangle Park, NC）ハイブリダイゼーション用ステーションにて実施した。ハイブリダイゼーション混合物を65℃で注入し、スライドのプレハイブリダイゼーション段階を65℃で30秒間行った後に、撹拌しながら17時間にわたってインキュベートした。続いて、Agilent GE Wash #1を用いてスライドを37℃で1分間洗浄し、その後にAgilent GE Wash #2を用いて2回目の洗浄を30℃で1分間行って、窒素ガスを用いる最終的な乾燥段階を30℃で2分30秒間行った。シグナル強度に対する環境オキシダントの影響を最小限に抑えるために、スライドを直ちにスキャンした。
【０２７８】
アレイは、SureScan高分解能技術（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）とともにAgilent G2565CAマイクロアレイスキャナーを用いてスキャンした。各アレイのスキャニングのためのプロトコールは、色素チャンネル、スキャン領域および分解脳、TIFFファイルのダイナミックレンジ、PMTゲインおよび最終画像結果に関するパラメーターを定めている。ひとたびアレイをスキャンすれば、その後にグリッド合わせの設置および最適化、スポットの発見、外れ値のフラグ表示、バックグラウンドバイアス、誤差および比の演算、ならびに品質管理尺度の計算のために定められたパラメーターを用いて特徴抽出（FE）プロトコールを行う。スキャニングおよび特徴抽出プロトコールが完了した後に、Cy3画像を含むTIFFファイルが、品質管理尺度の報告、および生データのすべてを含む最終ファイル（TXT）とともに作成される。画像ファイル（TIFF）は、スライドの全般的品質、正しい位置（四隅）および強度にあるspike-in対照の存在を検討するため、ならびにハイブリダイゼーション、洗浄、スキャニングおよび特徴抽出の過程が成功したことを確認するために用いた。FE品質管理（QC）報告は変動係数の値を与え、それはAgilent Technologies （Santa Clara, CA）によって提供および設計された陽性および陰性（原核生物遺伝子および人工的配列）spike-in対照に基づくデータの分散を測定することを可能にした。この報告はまた、データの分布、データの均一性、バックグラウンド、再現性、感度および全般的品質に関する情報も提供した。生データのすべてを含むTXTファイルは、さらなる分析のためにGeneSpring（Agilent, Santa Clara, CA）にアップロードした。
【０２７９】
データの標準化および統計分析
スキャニングおよび特徴抽出の後に、生データファイルをGeneSpring GXバージョン10.0.2（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）にアップロードした上で、各アレイのデータファイルを試料として定め、適切なパラメーター値を割り当てるプロジェクトを創設した。同じパラメーター値を有する試料は複製物として処理した。試料が実験条件にどのようにグループ化されたかを特定するための解釈を設け、これを用いてデータの描出および分析を行った。以前に定められたspike-in対照、パラメーターおよび解釈に基づく試料に対する品質管理を、分析を開始する前にデータの品質を保証するために行い、GeneSpringによる品質管理尺度の報告を作成した。
【０２８０】
系統的な非生物学的な違いを最小限に抑え、アレイを相互比較のために標準化するために、全体的パーセンタイルシフト標準化法を用いてデータを標準化した。このアルゴリズムは、シグナル強度を底数2の対数に変換し、それらを少ない順に並べ、第75パーセンタイルのランクを演算し、この値を対数変換されたシグナル強度のそれぞれから差し引いて、標準化された強度値を生成した。試験中のすべての単一試料中に存在するとフラグ指定された要素を選択して、わずか（Marginal）または欠如（Absent）とフラグ指定された要素を除去することによって、データのフィルタリングを行った。フィルタリングおよび標準化がなされた要素のリストを、DAPおよび遺伝子型をパラメーターとして定めるp＜0.05の補正されたp値カットオフを用いて、両側ANOVA法を用いる統計分析の入力として用いた。新たに導入された遺伝子のそれぞれの発現プロファイルを決定した。
【０２８１】
結果
全RNAならびに標識および増幅されたcRNAの濃度に関して得られた値は最適であった。また、一貫性および信頼性のある結果のために必要な、増幅後の濃度、Cy3による標識の効率および比活性に関する値も優れていた。各個々のアレイに関してスキャニング後に特徴抽出プロトコールによって提供された品質管理（QC）報告からは、陽性および陰性spike-in対照に基づいてデータの分散を測定するために用いた変動係数の値が提供された。これらの報告から得られた値はすべて、データ分布、均一性、バックグラウンドおよび感度の最適な品質を示した。この試験中に用いた試料に関するGeneSpring（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）品質管理尺度の報告により、得られたデータの再現性および信頼性の評価の助けとなる有意な統計値が与えられた。技術的に複製されたアレイの群（試料当たり3つ）に関して報告された値は範囲内にあり、得られたデータに信頼性があることが示された（データは示さず）。
【０２８２】
ホモ接合体系統（表17）（「DAP」は受粉後日数を表す）およびヌル（表18）系統に関して種子発育中に定められた6つの時点のそれぞれに関して報告された生の値は、バックグラウンド減算および乗法的トレンド除去を必要に応じて含む、特徴抽出（FE）処理段階のすべてを完了した後に残るシグナル強度値を表している。これに対して、ホモ接合体系統（表19）およびヌル系統（表20）に関して標準化された値は、技術的変化を考慮に入れ、系統的な非生物学的な違いを最小限に抑え、しかもアレイを相互比較のために標準化する、全体的パーセンタイルシフト標準化法を用いて処理した。
【０２８３】
（表１７）ホモ接合事象5197[14]-032.002における新たに導入された遺伝子のそれぞれに関する発現の生の強度値
2013529086.tif 000019
【０２８４】
（表１８）ヌル非形質転換ω-9 Nexera 710系統における新たに導入された遺伝子のそれぞれに関する発現の生の強度値
2013529086.tif 000020
【０２８５】
（表１９）ホモ接合事象5197[14]-032.002における新たに導入された遺伝子のそれぞれに関する発現の標準化された強度値
2013529086.tif 000021
【０２８６】
（表２０）ヌル非形質転換ω-9 Nexera 710系統における新たに導入された遺伝子のそれぞれに関する発現の標準化された強度値
2013529086.tif 000022
【０２８７】
ヌル系統に関して種子発育中のすべての時点で得られた生の値（図12）および標準化された値（図13）の略図は、これらの遺伝子がω-9 Nexera 710非形質転換系統には存在せず、そのため有意な発現は検出されなかったことを裏づけている。図14（生）および図15（標準化）に示されているような事象5197[14]-032.002では、種子発育が進行するにつれてすべての遺伝子の転写物蓄積が増加するという一般的な傾向を観察することができる。転写物蓄積の最初の有意な増加は15〜30 DAPの間に起こり、DAP 42で最大レベルに達する。図14に示されている生の曲線は、試験中の遺伝子のそれぞれに関して得られた相対的ハイブリダイゼーション強度値の描出を提示しており、一方、図15に概要が示された標準化曲線は、系統的な非生物的差異が最小限に抑えられ、アレイ間での標準化された比較を行った遺伝子発現プロファイルの一般的な傾向を表している。
【０２８８】
実施例12
代替的なプロモーターを用いた藻類PUFAシンターゼ遺伝子スイートの発現
PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIのタンパク質をコードする遺伝子を発現させるためのさらなる転写調節エレメントの使用により、キャノーラ内部のDHA含有率をさらに高めることができる。発育のより早期に、またはより長期間にわたって発現する転写調節エレメントの同定および使用は、種子発育のより早期の段階（例えば、15〜25 DAP）で異種遺伝子の転写を促進することにより、キャノーラ種子内部のDHAのレベルを増加させることができ、それ故にDHA産生時間を延長させることができる。そのような転写調節領域の例には、LfKCS3プロモーター（米国特許第7,253,337号）およびFAE 1プロモーター（米国特許第6,784,342号）およびACPプロモーター（国際公開公報第1992/18634号）が非限定的に含まれる。これらのプロモーターは、以下のプラスミド；pDAB7361、pDAB7362およびpDAB7363において前述されている、PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetI発現カセットの発現を作動させるために、単独で、または組み合わせて用いられる。プラスミド内部の転写調節領域を置き換えるための方法は当技術分野において周知である。そのため、PvDlec2プロモーターv2を含むポリヌクレオチド断片を、pDAB7361、pDAB7362またはpDAB7363（またはpDAB7361、pDAB7362もしくはpDAB7363を構成するために用いた前出のプラスミド）から除去して、LfKCS3またはFAE 1プロモーター領域のいずれかによって置き換えた。新たに構築されたプラスミドは、キャノーラ植物を安定に形質転換させるために用いられる。トランスジェニックキャノーラ植物を単離して、分子的特徴を明らかにする。その結果生じたLC-PUFA蓄積を決定し、0.01％〜15％のDHAまたは0.01％〜10％のEPAを産生するキャノーラ植物を同定する。
【０２８９】
pDAB9166の構築
pDAB9166プラスミド（図26；SEQ ID NO：46）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB9166は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、LfKCS3プロモーターv1、SzPUFA OrfA v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、LfKCS3プロモーターv1、SzPUFA OrfB v3およびAtuOrf23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、LfKCS3プロモーターv1、hSzThPUFA OrfC v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、LfKCS3プロモーターv1、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
【０２９０】
プラスミドpDAB9161、pDAB9162、pDAB9163、pDAB101484およびpDAB7333を組み換えて、pDAB9166を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3 'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０２９１】
pDAB9167の構築
pDAB9167プラスミド（図27；SEQ ID NO：47）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB9167は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、LfKCS3プロモーターv1、SzPUrA OrfA v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、BoACPプロモーターv1、BoACP 5'UTR v1、SzPUFA OrfB v3およびAtuOrf23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、LfKCS3プロモーターv1、hSzThPUFA OrfC v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、BoACPプロモーターv1、BoACP 5'UTR v1、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
【０２９２】
プラスミドpDAB9161、pDAB9165、pDAB9163、pDAB101485およびpDAB7333を組み換えて、pDAB9167を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０２９３】
pDAB7379の構築
pDAB7379は、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfCおよびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。SzACS-2遺伝子配列はこの構築物には含まれない。pDAB7379プラスミド（図28；SEQ ID NO：48）は、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。
【０２９４】
pDAB7379は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAtuORF23 3 'UTR v1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
【０２９５】
プラスミドpDAB7371、pDAB7372、pDAB7373、pDAB7374およびpDAB7333を組み換えて、pDAB7379を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０２９６】
pDAB7380の構築
pDAB7380は、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfCおよびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。SzACS-2遺伝子配列はこの構築物には含まれない。この構築物に用いられているファゼオリンプロモーターのバージョンは、本質的にはBustos et al, 1989 (The Plant Cell, Vol. 1; 839-853)に記載された通りに改変されており、ここでプロモーターの5'部分は短縮しており、ファゼオリン5'非翻訳領域は無傷のままであった。pDAB7380プラスミド（図29；SEQ ID NO：49）は、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。
【０２９７】
pDAB7380は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv5、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
【０２９８】
プラスミドpDAB7375、pDAB7376、pDAB7377、pDAB7378およびpDAB7333を組み換えて、pDAB7380を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０２９９】
pDAB9323の構築
pDAB9323は、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC、SzACS-2およびNoHetIのネイティブでありコドンが最適化されていないバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。pDAB9323プラスミド（図30；SEQ ID NO：50）は、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。
【０３００】
pDAB9323は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v2、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v2、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfC v2、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzACS-2 v2遺伝子、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、NoHetI v2、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。
【０３０１】
プラスミドpDAB9307、pDAB9311、pDAB9315、pDAB9322およびpDAB7333を組み換えて、pDAB9323を形成させた。具体的には、上記の5つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v2、SzPUFA OrfB v2、SzPUFA OrfC v2、NoHetI v2。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この6つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、6つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３０２】
pPAB9330の構築
pDAB9330は、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC、SzACS-2およびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。pDAB9330プラスミド（図31；SEQ ID NO：51）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB9330は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。第2のPUFAシンターゼPTU は、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3'UTRおよびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzACS-2 v3遺伝子、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。
【０３０３】
プラスミドpDAB9324、pDAB9325、pDAB9326、pDAB9329およびpDAB7333を組み換えて、pDAB9330を形成させた。具体的には、上記の5つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzACS-2 v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この6つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、6つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３０４】
pDAB9337の構築
pDAB9337は、その発現がファゼオリンプロモーターによって作動する、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfCおよびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。pDAB9337プラスミド（図32；SEQ ID NO：52）は、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。
【０３０５】
pDAB9337は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。
【０３０６】
プラスミドpDAB9324、pDAB9325、pDAB9326、pDAB9328およびpDAB7333を組み換えて、pDAB9337を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3 'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３０７】
pDAB9338の構築
pDAB9338は、SzPUFA OrfA、SzPUFA QrfB、hSzThPUFA OrfCおよびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。SzPUFA OrfAの発現を作動させるにはファゼオリンプロモーターを用い、他の導入遺伝子を作動させるにはPvDlec2プロモーターを用いる。pDAB9338プラスミド（図33；SEQ ID NO：53）は、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。
【０３０８】
pDAB9338は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
【０３０９】
プラスミドpDAB9324、pDAB7335、pDAB7336、pDAB7338およびpDAB7333を組み換えて、pDAB9338を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3 'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３１０】
pDAB9344の構築
pDAB9344は、そのすべてが、コード配列のアミノ末端に融合させたリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小型鎖1A（SSU-TP v1と表記）を含む、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfCおよびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。ファゼオリンプロモーターがSzPUFA OrfAの発現を作動させるために用いられ、PvDlec2プロモーターが他の導入遺伝子を作動させるために用いられる。
【０３１１】
pDAB9344プラスミド（図34；SEQ ID NO：54）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB9344は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v4、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。第2のPUFAシンターゼPTU は、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v4、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v4、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、NoHetI v4、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。
【０３１２】
プラスミドpDAB9343、pDAB9342、pDAB9340、pDAB9331およびpDAB7333を組み換えて、pDAB9344を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v4、SzPUFA OrfB v4、hSzThPUFA OrfC v4、NoHetI v4。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3 'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この6つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３１３】
pDAB9396の構築
pDAB9396は、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC、SzACS-2およびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。ファゼオリンプロモーターがSzPUFA OrfAおよびSzPUFA OrfBの発現を作動させるために用いられる。PvDlec2プロモーターは、他の導入遺伝子；hSzThPUFA OrfC、SzACS-2およびNoHetIを作動させるために用いられる。
【０３１４】
pDAB9396プラスミド（図35；SEQ ID NO：55）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB9396は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。第2のPUFAシンターゼPTU は、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzACS-2 v3遺伝子、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
【０３１５】
プラスミドpDAB9324、pDAB7335、pDAB7336、pDAB7339およびpDAB7333を組み換えて、pDAB9338を形成させた。具体的には、上記の5つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzACS-2 v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3 'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、6つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３１６】
pDAB101412の構築
pDAB101412は、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC、SzACS-2およびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。この構築物に用いられているファゼオリンプロモーターのバージョンは、本質的にはBustos et al, 1989 (The Plant Cell, Vol. 1; 839-853)に記載された通りに改変されており、ここでプロモーターの5'部分は短縮しており、ファゼオリン5'非翻訳領域は無傷のままであった。短縮型のファゼオリンプロモーター配列は本出願の全体を通して、バージョン4（v4）、バージョン5（v5）およびバージョン6（v6）として特定される。pDAB101412プラスミド（図36；SEQ ID NO：56）は、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。
【０３１７】
pDAB101412は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、2S 5'UTR、SzACS-2 v3遺伝子およびAtuORF23 5'UTR v1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv5、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
【０３１８】
プラスミドpDAB7375、pDAB7376、pDAB7377、pDAB7398およびpDAB7333を組み換えて、pDAB101412を形成させた。具体的には、上記の5つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzACS-2 v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、OverdriveおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、6つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３１９】
種子発育の早期に発現するプロモーターによるキャノーラ形質転換
これらのプラスミドは、上記のプロトコールを用いてキャノーラ植物を安定に形質転換させるために用いられる。トランスジェニックキャノーラ植物を単離して、分子的特徴を明らかにする。代替的な構築物の使用により、より多くの量のDHAおよびLC-PUFAを含有するキャノーラ植物がもたらされる。その結果生じたLC-PUFA蓄積を決定し、0.01％〜15％のDHAまたは0.01％〜15％のLC-PUFAを産生するキャノーラ植物を同定する。
【０３２０】
実施例13
キャノーラ内部でのDGAT2またはACCアーゼと藻類PUFAシンターゼ遺伝子スイートとの共発現
アセチルCoAカルボキシラーゼ（ACCアーゼ）または2型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGAT2）をコードして発現するキメラDNA分子の形質転換により、キャノーラ植物内部での油含有率をさらに改変する。これらの遺伝子を、ACCアーゼもしくはDGAT2の発現カセットを含むキャノーラ植物をPUFAシンターゼ遺伝子を含むキャノーラ植物と交配させること；またはACCアーゼもしくはDGAT2の遺伝子およびPUFAシンターゼ遺伝子を含む遺伝子スタックによってキャノーラ植物を形質転換させることのいずれかによって、上記の藻類PUFAシンターゼ遺伝子とともに共発現させる。ACCアーゼまたはDGAT2のコード配列の発現のために必要な調節エレメントは、上記のものを含みうる。当技術分野において公知であるその他の調節エレメント発現配列を用いることもできる。ACCアーゼおよびDGAT2の発現カセットを、上記の形質転換プロトコールを用いて、キャノーラに形質転換導入する。形質転換は、ACCアーゼまたはDGAT2の発現カセットが、PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIの発現カセットと組み合わされた分子スタックとして起こってもよく；または、選択マーカーと連結された独立したACCアーゼまたはDGAT2の発現カセットとして起こり、続いてその後に、PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIの発現カセットを含むキャノーラ植物と交雑させてもよい。陽性形質転換体を単離して、分子的特徴を明らかにする。非形質転換対照キャノーラ植物と比較して、蓄積濃度の増加した植物、植物種子または植物油におけるLC-PUFAを含むキャノーラ植物を同定する。そのような増加は、1.2倍から20倍までの増加の範囲にわたりうる。
【０３２１】
細胞質におけるACCアーゼの過剰発現は、より高レベルのマロニル-CoAを産生させることができる。上昇したレベルの細胞質マロニル-CoAを含むキャノーラ植物または種子は、藻類PUFAシンターゼ遺伝子が存在して発現される場合には、その後に、より高いレベルの長鎖多価不飽和脂肪酸（LC-PUFA）を産生することができる。キャノーラ植物内部で発現されるDGAT2遺伝子は、有意な量のドコサヘキサエン酸（DHA）およびエイコサペンタエン酸（EPA）をトリアシルグリセロールに選好的に組み入れることができる。LC-PUFAに対する基質選好性を有するDGAT2遺伝子（例えば、国際公開公報第2009/085169号を参照）は、トリアシルグリセロール（TAG）へのこれらの脂肪酸の組み入れを増加させることができる。そのようなDGAT遺伝子は、TAGへのLC-PUFA、特にDHAの組み入れを導くため、ならびに植物および他の生物におけるTAGの産生を増加させるために有用である。
【０３２２】
実施例14
植物内部でのより高いレベルのアシル-CoAシンテターゼ発現のためのネイティブアシル-CoAシンテターゼ遺伝子配列の使用
余分なオープンリーディングフレームを除去するようにネイティブ遺伝子配列を改変することによって、シゾキトリウム属の種由来のアシル-CoAシンテターゼ遺伝子の代替的なバージョンを作り出した。このバージョンは「SzACS-2 v4」と表記し、SEQ ID NO：34としてリスト化した。その配列は、サービス提供元であるDNA 2.0（Menlo Park, CA）によって合成された。そのコード配列を、これらの実施例に記載した、プロモーターおよび3'非翻訳領域を含む植物発現カセットに組み入れた。その結果生じた発現カセットを用いて、「SzACS-2 v3」、SEQ ID NO：9と上述したアシル-CoAシンテターゼ発現カセットを置き換え、それをPUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfCおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIの発現カセットと組み合わせて、pDAB7361、pDAB7362およびpDAB7363を構築した。「SzACS-2 v4」発現カセットを含むこれらの新しいプラスミドに、一意的な識別標識を与えた。新たに構築されたプラスミドは、キャノーラ植物を安定に形質転換させるために用いることができる。トランスジェニックキャノーラ植物を単離して、分子的特徴を明らかにする。遺伝子の代替的なバージョンである「SzACS-2 v4」は、より多くの量のDHAおよびLC-PUFAを含有するキャノーラ植物をもたらすことができる。その結果生じたLC-PUFA蓄積を決定し、0.01％〜15％のDHAまたは0.01％〜10％のEPAを産生するキャノーラ植物を同定する。
【０３２３】
実施例15
成熟トランスジェニックキャノーラ種子におけるPUFAシンターゼ活性
PUFAシンターゼ活性が、アグロバクテリウムベクターpDAB 7361を利用して作製された植物（事象5197[14]-032）からの成熟T1トランスジェニックキャノーラ種子からの抽出物において検出された。種子を水で3〜4時間浸漬させ、その後に種皮を除去し、抽出緩衝液（200mMリン酸 pH 7.0、1mM EDTA、1mM DTT、50mM NaCl、5％グリセロール、1％ PVPP、0.52μg／mLアンチパイン、0.58μg／mLロイペプチン、0.83μg／mLペプスタチンA、12μg／mLのTLCK、12μg／mLのTPCK、および6μg／mLダイズトリプシンインヒビター）中にてドライアイス上で粉砕して、微量遠心分離を4℃で10分間行った。脂肪体を除去し、その結果生じたペレットをイオン強度のより高い緩衝液とともにインキュベートして、その後に再び遠心分離を行った。脂肪体および脂質層を試料から除去し、水性上清を、50mMリン酸 pH 7.2、1mM DTT、10％グリセロールおよび1mM EDTAによって前もって平衡化したZeba脱塩カラムに通した。非形質転換Nexera 710種子を陰性対照として並行して処理した。両方の種子セットからの試料を、Metz et al., Plant Physiol. Biochem. 47:6 (2009)に記載されたHIP抽出およびTLC法を用いてアッセイした（図16）。アッセイ条件は、2mM NADH、NADH再生系（グルコース＋グルコースデヒドロゲナーゼ）、連続振盪および最終的なマロニル-CoA濃度100μM（0.064μCi／アッセイ100μL当たり）を含めるように改変した。その結果生じた上清のアッセイを容量によって標準化したところ、FFA形成を60分後に検出することができた。これはNexera 710対照では観察されず、このことはFFA形成がPUFAシンターゼを介したDHA形成によることを示している。
【０３２４】
実施例16
キャノーラにおいて産生されたOrfAの、共発現されたHetIによるパンテテイニル化
OrfAは9個のアシルキャリアータンパク質ドメインを含み、機能的であるためにはそれぞれがホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（PPTアーゼ）によるホスホパンテテイン基での誘導体化を必要とする。トランスジェニックキャノーラ種子における、PPTアーゼHetIによるOrfAのパンテテイニル化の度合いを、さまざまなOrfA試料からのパンテテイニル化部位を含むトリプシンペプチドのナノ液体クロマトグラフィー-質量分析（ナノLC-MS）評価によって評価した。
【０３２５】
組換えホロ（holo）およびアポ（apo）OrfAポリペプチド標準物質を、HetIとの共発現またはHetIを伴わない発現によって大腸菌において産生させた。HetIの非存在下におけるOrfAの発現は非機能的タンパク質を生じさせるが、これは大腸菌由来の内因性PPTアーゼがホスホパンテテイン基を付加することができないためである（Hauvermale et al., Lipids 41 :739-747; 2006）。対照的に、HetIによる発現は、高度のパンテテイニル化を有するOrfAタンパク質を生じさせる。大腸菌で発現されたOrfAを抽出するために、0.5Lの組換え細胞培養物からの凍結細胞を、20mLの抽出緩衝液：20mM Tris pH 7.0、1mg／mLリゾチーム、1mM EDTA、1mM PMSF、1mM DTT、0.52μg／mLアンチパイン、0.58μg／mLロイペプチン、0.83μg／mLペプスタチンA、12μg／mLのTLCK、12μg／mLのTPCK、6μg／mLダイズトリプシンインヒビター、中に再懸濁させた。溶解後に、抽出物をDNアーゼおよび4mM MgCl2で処理し、遠心分離によって清澄化した上で、上清を-80℃で凍結させた。
【０３２６】
事象5197[14]-032.002の水で戻した成熟キャノーラ種子から、キャノーラにより産生されたPUFAシンターゼのインビトロアッセイに関して前述した抽出方法を用いて、種子により産生されたOrfAを単離した。大腸菌標準およびキャノーラ試料の両方からのOrfAタンパク質を酵素消化し、Agilent ChipCubeナノクロマトグラフィー注入口をAgilent QTOF質量分析計（model 6530）によるMS分析とともに用いるナノLC-MSによって分析した。QTOFは、自動MS2分析を実行して、クロマトグラフィーの間にペプチド配列データを生成するようにプログラム化した。この方法の本質的な特徴は、質量分析計がフルスキャンMSスキャンを実行し、その後に最も存在量の多い3つのイオンの自動MS2を行ってMS2配列スペクトルを生成するようにプログラム化されていることである。イオンは2回の出現後にMS2から排除させ、排除期間は30秒間とした。ナノスプレー中は、QTOFの内部較正のための参照イオンが生成されるように内部参照を連続注入した（m／z 299.29446および1221.99064で）。これらのイオンの擬似的MS2スキャンを防止する目的で、較正ストックの排出物（carry-over）から一般に見いだされるイオンを排除イオンと定義した。MSスキャンはm／z 295〜2400の範囲にわたって行った。MS2スキャンはm／z 59〜3000の範囲にわたって行った。自動MS2は、電荷状態に対して以下の順に選好性が得られるように行った：+2＞+3＞（＞+3）＞不明＞+1。
【０３２７】
タンデム質量スペクトルをMascot Distiller（Matrix Science, London UK；バージョン2.3.2）によって抽出した。電荷状態のデコンボルーションおよび脱同位体化（deisotoping）は行わなかった。MS／MSスペクトルはすべて、Mascot（Matrix Science, London, UK；バージョン2.2.06）およびX! Tandem（www.thegpm.org；バージョン2007.01.01.1）を用いて分析した。MascotおよびX! Tandemはいずれも、トリプシン消化の特異性を仮定して、OrfAタンパク質の完全長配列を含むタンパク質配列データベースを検索するように設定した。MascotおよびX! Tandemを、断片イオン質量許容誤差（mass tolerance）を0.30Da、親イオン許容誤差10.0ppmとして検索した。メチオニンの酸化およびセリンのホスホパンテテインが、MascotおよびX! Tandemにおける可変修飾と特定された。
【０３２８】
Scaffold（バージョンScaffold_2_05_02、Proteome Software Inc., Portland, OR）を、MS／MSに基づくペプチドおよびタンパク質の同定を検証するために用いた。ペプチドの同定は、Peptide Prophetアルゴリズム（Keller et al., Anal. Chem. 74:5383-92 (2002)）による特定で、95.0％を上回る確率でそれらが立証されたならば受け入れた。タンパク質の同定は、99.0％を上回る確率でそれらが立証され、かつ少なくとも2つの同定されたペプチドを含んでいたならば受け入れた。タンパク質の確率は、Protein Prophetアルゴリズム（Nesvizhskii, Anal Chem. 75:4646-58 (2003)）によって特定した。類似のペプチドを含み、MS／MS分析のみに基づいて鑑別することができなかったタンパク質は、最節約原理を満足するようにグループにまとめた。データベース検索により、アポ型のパンテテイニル化部位1
2013529086.tif 000023
およびパンテテイニル化部位2-9
2013529086.tif 000024
に対応するトリプチックペプチドが同定された。パンテテイニル化されたペプチドの直接的な証拠は観察されなかった。
【０３２９】
キャノーラから単離されたOrfAにおける部位2-9でのパンテテイニル化の度合いを推定するために、アポ2-9ペプチドの量を、Orf A分子の他の領域から同定された6種の異なる参照ペプチドに対して相対的に測定した（表21）。
【０３３０】
（表２１）OrfA消化物におけるアポ2-9ペプチドの相対量を算出するために用いたペプチド。「開始」は、完全長タンパク質における表記のペプチドの開始位置のことを指す。アポ2-9ペプチドの開始位置は、タンパク質配列中でのそのペプチドの最初の出現のことを指す。略号「z」は電荷を示し、略号m/zは質量電荷比を示している。
2013529086.tif 000025
【０３３１】
参照ペプチドに対する大腸菌由来タンパク質（HetIを伴わない）におけるアポ2-9ペプチドの内部比をパンテテイニル化が皆無である推定値と見なし、一方、HetIとともに発現させた大腸菌由来タンパク質における内部比を高度のパンテテイニル化の推定値と見なした。これらの内部比は、参照ペプチドのモル存在量（molar abundance）がOrfAタンパク質の供給源にかかわらず同等であることを仮定している（図17）。6種の参照ペプチドのそれぞれに対するアポ2-9ペプチドの比を算出し、平均を求めた（6種の参照ペプチドについて3つの比を算出した）。加えて、参照ペプチドが3つのOrfA試料間で有意には違いがないこと（図17）、および存在するアポ2-9ペプチドの相対量を算出するのに適することを実証するために、6種の参照ペプチド相互の3つの比（ref1／ref2、ref3／ref4およびref5／ref6）も算出した。
【０３３２】
参照ペプチドの算出比とは対照的に、参照ペプチドのそれぞれに対するアポ2-9の比からは、OrfA／HetIおよびキャノーラ試料の両方において、HetIを伴わないOrfA標準物質と比較して、アポ2-9ペプチドのレベルが劇的に低いことが示された（図18）。これらの結果の最も簡単な説明は、アポ2-9ペプチド上のパンテテイニル化部位がホスホパンテテイニル基によって実質的に占有されており、そのため、アポ2-9ペプチドのモル存在量を有意に減少させるというものである。このことは、キャノーラで発現されたPPTアーゼであるHetIが、トランスジェニックキャノーラ種子におけるOrfAの活性化を機能的に行いうること、およびキャノーラで発現されたOrfA ACPユニットが機能的な能力を有することを示している。
【０３３３】
実施例17
その他の構築物
調節エレメントの重複を減らすためのプロモーター多様性の導入
遺伝子サイレンシングは、トランスジェニックキャノーラ事象の子孫世代で観察されている現象である。いくつかの総説論文が、転写性遺伝子サイレンシング（TGS）および転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）について考察しており、これにはWaterhouse et al., 2001 (Nature 411:834-842), Vaucheret and Fagard, 2001 (Trends in Genetics 17(1):29-35、およびOkamoto and Hirochika, 2001 (Trends in Plant Sci. 6 (1 1):527-534）などがある。植物において、遺伝子サイレンシングはトランスジェニックポリヌクレオチド配列の重複（縦列反復導入遺伝子配列、逆方向反復導入遺伝子配列、もしくは染色体への複数挿入）によって、または標的遺伝子配列に対して相同な配列が感染性植物ウイルスもしくはアグロバクテリウム・ツメファシエンスのT-DNAによって保有されている場合に、誘発させることができる。
【０３３４】
さらに、導入遺伝子ポリヌクレオチド配列の重複が、構築物不安定性の誘因として作用する可能性もある。高レベルの配列類似性を有する複数の導入遺伝子配列は、互いに折り重なることが可能である。相同組換えを介して再配列が起こる可能性があり、この際にDNAの介在配列が切り出される。その結果、反復導入遺伝子ポリヌクレオチド配列の間に位置するDNAの断片が切り出される。
【０３３５】
プラスミドベクターを設計する上での1つの戦略は、各導入遺伝子の高レベル発現を維持させる複数の一意的な種子特異的プロモーターを組み入れることによって、構築物にプロモーター多様性を導入することである。プラスミドベクターへのプロモーター配列多様性を導入することで、遺伝子サイレンシングを減らし、プラスミド安定性を向上させることができる。複数の種子特異的プロモーターには、PvDlec2、ファゼオリンおよびナピンが含まれる（米国特許第5,608,152号）。これらのプロモーターは、組織特異性、発現レベル、発現の持続時間などといったプロモーター活性の点で比較的同等である。
【０３３６】
pDAB7733の構築
pDAB7733バイナリープラスミド（図37；SEQ ID NO：57）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7733は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、BnaNapinCプロモーターv1、BnaNapinC 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびBnaNapinC 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv5、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuOrf23 3'UTR v1を含む。
【０３３７】
プラスミドpDAB7375、pDAB7731、pDAB7336、pDAB7378およびpDAB7333を組み換えて、pDAB7733を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである；SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、オーバードライブ（Overdrive）およびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３３８】
pDAB7734の構築
pDAB7734バイナリープラスミド（図38；SEQ ID NO：58）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7734は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、BnaNapinCプロモーターv1、BnaNapinC 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびBnaNapinC 3'UTR v1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
【０３３９】
プラスミドpDAB7334、pDAB7376、pDAB7732、pDAB7338およびpDAB7333を組み換えて、pDAB7734を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３４０】
pDAB101493の構築
pDAB101493バイナリープラスミド（図39；SEQ ID NO：59）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB101493は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv5、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuOrf23 3'UTR v1を含む。
【０３４１】
プラスミドpDAB7334、pDAB7376、pDAB7336、pDAB7378およびpDAB7333を組み換えて、pDAB101493を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３４２】
pDAB109507の構築
pDAB109507プラスミド（図40；SEQ ID NO：60）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB109507は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびPvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、BnaNapinCプロモーターv1、BnaNapinC 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびBnaNapinC 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、BoACPプロモーター／5'UTR v1、NoHetI v3およびAtuOrf23 3'UTR v1を含む。
【０３４３】
プラスミドpDAB9324、pDAB7731、pDAB7336、pDAB101485およびpDAB7333を組み換えて、pDAB109507を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３４４】
pDAB109508の構築
pDAB109508プラスミド（図41；SEQ ID NO：61）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB109508は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびPvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、BnaNapinCプロモーターv1、BnaNapinC 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびBnaNapinC 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
【０３４５】
プラスミドpDAB9324、pDAB7731、pDAB7336、pDAB7338およびpDAB7333を組み換えて、pDAB109508を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３４６】
pDAB109509の構築
pDAB109509プラスミド（図42；SEQ ID NO：62）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB109509は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、BoACPプロモーター／5'UTR v1、NoHetI v3およびAtuOrf23 3'UTR v1を含む。
【０３４７】
プラスミドpDAB7334、pDAB7335、pDAB7336、pDAB101485およびpDAB7333を組み換えて、pDAB109509を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３４８】
長い遺伝子配列の断片化を減らすためのバイナリー構築物PTUの順序の再配列
PTUカセットの順序によって、単離されたトランスジェニック事象における断片化および再配列を減少させうるか否かを検証するために、SzPUFA OrfA PTUをバイナリー構築物の3'末端に配置した。SzPUFA OrfAは、9つの縦列アシルキャリアータンパク質反復配列を含む大きなオープンリーディングフレーム（およそ8,700b.p.）である。最初の一連の完成した構築物では、SzPUFA OrfA PTUが、T0植物染色体にまず組み込まれるように配置した。その後、SzPUFA OrfA PTUを残りのPUFA合成関連遺伝子PTUの後に置いたが、これはそれらの分子サイズが減少したためである。SzPUFA OrfAコード領域の分子的分析により、いくつかのトランスジェニックキャノーラ事象およびシロイヌナズナ事象が断片化した挿入を含んでいることが示された。PUFAシンターゼPTUの順序を以下の構成に変更した代替的な構築物を記載している；hSzThPUFA OrfC PTU、SzPUFA OrfB PTU、NoHetI PTU、SzPUFA OrfA PTUおよびPAT PTU。バイナリー構築物上のSzPUFA OrfA PTUの位置の変更を、単離されたトランスジェニック事象における断片化および再配列を減少させるために完了させる。
【０３４９】
pDAB9151の構築
pDAB9151プラスミド（図43；SEQ ID NO：63）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB9151は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。最終的な PUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
【０３５０】
プラスミドpDAB9148、pDAB7335、pDAB9149、pDAB9150およびpDAB7333を組み換えて、pDAB9151を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：hSzThPUFA OrfC v3、SzPUFA OrfB v3、NoHetI v3、SzPUFA OrfA v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3 'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３５１】
構築物多様性を導入するためのバイナリー構築物PTUの転写方向の変更
代替的な構築物のデザインには、PUFAシンターゼPTUの順序および遺伝子発現カセットの転写方向を変更することが含まれる。最初の一連の完成した構築物では、各遺伝子発現カセットを同じ向き（「頭-尾の向き（head to tail）」、この際には、1つの遺伝子発現カセットのプロモーターが第2の遺伝子発現カセットの3'UTRに隣接して設置される）に配置した。以下の構築物は、遺伝子発現カセットが異なる方向に配置されて、代替的なプロモーターを利用する戦略を記載している。これらの実施例では、遺伝子発現カセットは第2の遺伝子発現カセットに対してイントランスに設置され、その結果、両方の遺伝子発現カセットのプロモーターは互いに隣接するように操作される。この構成は「頭-頭」構成と記述される。他の構成も実施例に記載されており、この際には、1つの遺伝子発現カセットが第2の遺伝子発現カセットに対してイントランスに設置され、その結果、両方の遺伝子発現カセットの3'UTRが互いに隣接するように操作される。この構成は「尾-尾」構成と記述される。そのようなデザインで考えられる読み過ごしを軽減するために、二方向性Orf 23／24ターミネーターをこれらの2つのPTUの間に配置した。これらの構成は、導入遺伝子の発現を増大させて、それにより、より高い濃度および含有率のLC-PUFAおよびDHA脂肪酸をもたらすと提唱されている。
【０３５２】
pDAB108207の構築
pDAB108207プラスミド（図44；SEQ ID NO：64）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108207は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv6、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3、At2S SSPターミネーターv1およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv6、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3'UTRおよびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
【０３５３】
プラスミドpDAB7334、pDAB101489、pDAB108205、pDAB108206およびpDAB7333を組み換えて、pDAB108207を形成させた。具体的には、SzPUFA OrfA v3およびNoHetI v3を尾-尾の向きに配置する；NoHetI v3およびhSzThPUFA OrfC v3は頭-頭の向きに配置する；hSzThPUFA OrfC v3およびSzPUFA OrfBは、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に尾-尾の向きに配置する。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、NoHetI v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzPUFA OrfB v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３５４】
pDAB108208の構築
pDAB108208プラスミド（図45；SEQ ID NO：65）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108208は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv5、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3'UTR、PvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
【０３５５】
プラスミドpDAB108200、pDAB101490、pDAB108201、pDAB108202およびpDAB7333を組み換えて、pDAB108208を形成させた。具体的には、SzPUFA OrfA v3およびNoHetI v3は頭-頭の向きに配置する；NoHetI v3およびhSzThPUFA OrfC v3は尾-尾の向きに配置する；hSzThPUFA OrfC v3およびSzPUFA OrfBは、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-頭の向きに配置する。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、NoHetI v3、hSzThPUFA OrfC v3 SzPUFA OrfB v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３５６】
pDAB108209の構築
pDAB108209プラスミド（図46；SEQ ID NO：66）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108209は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv5、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3'UTRおよびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）およびランダムなDNAスペーサーを含む。
【０３５７】
プラスミドpDAB108200、pDAB108204、pDAB108201、pDAB108202およびpDAB7333を組み換えて、pDAB108209を形成させた。具体的には、SzPUFA OrfA v3およびNoHetI v3は頭-頭の向きに配置する；NoHetI v3およびhSzThPUFA OrfC v3は尾-尾の向きに配置する；hSzThPUFA OrfC v3およびSzPUFA OrfBは、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-頭の向きに配置する。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、NoHetI v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzPUFA OrfB v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３５８】
転写干渉を最小限に抑えるための3'UTRの倍加およびスペーサーDNAの包含
転写干渉は、複数の遺伝子が連続して積み重なり、それにより、下流遺伝子の発現低下がもたらされる場合に起こりうる。この現象は、3'UTRおよびターミネーターから次のプロモーター-転写ユニットへの転写読み過ごしに起因する。転写干渉を最小限に抑えるための2つの戦略からなる代替的な構築物デザインが記載されている。第1の戦略は、次の遺伝子発現カセットへの読み過ごしを制限するために、個々のDHA遺伝子発現カセットの間に積み重ねられた2つのターミネーター／3 'UTRを用いることを採用する。第2の戦略は、遺伝子発現カセットの間に約1000塩基対のスペーサーDNAを挿入し、それにより、転写干渉を最小限に抑える。
【０３５９】
pDAB108207の構築
pDAB108207プラスミド（図44；SEQ ID NO：64）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108207は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3'UTR、PvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3、At2S SSPターミネーターv1およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv6、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）を含む。
【０３６０】
プラスミドpDAB7334、pDAB101489、pDAB108205、pDAB108206およびpDAB7333を組み換えて、pDAB108207を形成させた。具体的には、SzPUFA OrfA v3およびNoHetI v3を尾-尾の向きに配置して、AtuORF23 3'UTRを2つのPTUの間に配置する；NoHetI v3およびhSzThPUFA OrfC v3は頭-頭の向きに配置する；hSzThPUFA OrfC v3およびSzPUFA OrfBは、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置して、AtuORF23 3'UTRを2つのPTUの間に配置する。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、NoHetI v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzPUFA OrfB v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３６１】
pDAB108208の構築
pDAB108208プラスミド（図45；SEQ ID NO：65）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108208は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv5、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3'UTR、PvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
【０３６２】
プラスミドpDAB108200、pDAB101490、pDAB108201、pDAB108202およびpDAB7333を組み換えて、pDAB108208を形成させた。具体的には、SzPUFA OrfA v3およびNoHetI v3を頭-頭の向きに配置する；NoHetI v3およびhSzThPUFA OrfC v3を尾-尾の向きに配置して、AtuORF23 3'UTRを2つのPTUの間に配置する；hSzThPUFA OrfC v3およびSzPUFA OrfBは、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-頭の向きに配置する。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、NoHetI v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzPUFA OrfB v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３６３】
pDAB108209の構築
pDAB108209プラスミド（図46；SEQ ID NO：66）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108209は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv5、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3'UTR、PvPhas 3'MAR v2（プラスミド地図上で注釈付けされていない）およびランダムなDNAスペーサーを含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
【０３６４】
プラスミドpDAB108200、pDAB108204、pDAB108201、pDAB108202およびpDAB7333を組み換えて、pDAB108209を形成させた。具体的には、SzPUFA OrfA v3およびNoHetI v3を頭-頭の向きに配置する；NoHetI v3およびhSzThPUFA OrfC v3を尾-尾の向きに配置して、1000塩基対のスペーサーを2つのPTUの間に配置する；hSzThPUFA OrfC v3およびSzPUFA OrfBは、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-頭の向きに配置する。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、NoHetI v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzPUFA OrfB v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3 'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３６５】
転写読み過ごしを制限するための代替的な3'UTR-ターミネーターの使用
独占権のある3'UTR-ターミネーターの数が限られているため、転写を終結させるには、アグロバクテリウムORF 23 3'UTR-ターミネーターが主として用いられる。シロイヌナズナにおける転写読み過ごしを終結させるには、ZmLipase 3'UTR-ターミネーターがより有効であることが最近示された。そのため、構築物の1つのバージョンでは、ZmLipase 3'UTR-ターミネーターをPvDlec2プロモーターと組み合わせて利用して、この3'UTRが上流遺伝子の転写読み過ごしを減らし、それにより、転写干渉を低下させることができるか否かを検証する。
【０３６６】
pDAB9159の構築
pDAB9159プラスミド（図47；SEQ ID NO：67）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB9159は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびZmLip 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびZmLip 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびZmLip 3'UTR v1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびZmLip 3'UTR v1を含む。
【０３６７】
プラスミドpDAB9152、pDAB9153、pDAB9154、pDAB9155およびpDAB7333を組み換えて、pDAB9159を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3 'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３６８】
pDAB9147の構築
pDAB9147プラスミド（図48；SEQ ID NO：68）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB9147は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3、At2S SSPターミネーターv1およびZmLip 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
【０３６９】
プラスミドpDAB9146、pDAB7335、pDAB7336、pDAB7338およびpDAB7333を組み換えて、pDAB9147を形成させた。具体的には、上記の4つのPTUを、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-尾の向きに配置した。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3 'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、5つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３７０】
2つの別個のT-DNA上にあるDHA遺伝子の送達
代替的な構築物デザインは、1つのT-DNA上にあるPUFAシンターゼ遺伝子のサブセットを含む第1のベクター、および第2のT-DNA上にある残りのPUFAシンターゼ遺伝子を含む第2のバイナリーベクターという2つの別個のバイナリーベクターを構築することからなる。これらのバイナリーベクターを個別に用いて、有性交雑させる植物を形質転換させて、それにより、PUFAシンターゼ遺伝子発現構築物のすべてを含む子孫を生じさせる。トランスジェニック植物を作製するための代替的な方法は、両方のバイナリーベクターをキャノーラ組織に共形質転換導入させて、両方のT-ストランドを含む単一の植物を選択またはスクリーニングすることである。
【０３７１】
pDAB108224の構築
pDAB108224プラスミド（図49；SEQ ID NO：69）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108224は、1つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
【０３７２】
プラスミドpDAB108216、pDAB108221およびpDAB7333を組み換えて、pDAB108224を形成させた。具体的には、SzPUFA OrfA v3およびNoHetI v3を、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-頭の向きに配置する。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfA v3、NoHetI v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3 'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、3つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３７３】
pDAB108225の構築
pDAB108225プラスミド（図50；SEQ ID NO：70）を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108225は、2つのPUFAシンターゼPTUおよび1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、SzPUFA OrfB v3およびAtu ORF23 3'UTR v1を含む。
【０３７４】
プラスミドpDAB108217、pDAB108222およびpDAB7333を組み換えて、pDAB108225を形成させた。具体的には、SzPUFA OrfB v3およびhSzThPUFA OrfC v3を、植物形質転換用バイナリーpDAB7333のT-ストランドDNAボーダー領域内に頭-頭の向きに配置する。遺伝子の順序は以下の通りである：SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3。pDAB7333はまた、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTU：CsVMVプロモーターv2、PAT v5、AtuORF1 3 'UTR v4も、オーバードライブおよびT-ストランド（T-stand）ボーダー配列（T-DNAボーダーAおよびT-DNAボーダーB）などの他の調節エレメントのほかに含む。この5つのPTUを含む組換えプラスミドを続いて単離して、制限酵素消化およびDNAシークエンシングにより、3つのPTUの組み入れに関して検討した。
【０３７５】
代替的なデザインを含む構築物によるキャノーラの形質転換
これらのプラスミドを、上記のプロトコールを用いて、キャノーラ植物を安定に形質転換させるために用いる。トランスジェニックキャノーラ植物を単離して、分子的特徴を明らかにする。代替的な構築物の使用により、より多くの量のDHAおよびLC-PUFAを含有するキャノーラ植物がもたらされる。その結果生じたLC-PUFA蓄積を決定し、0.01％〜15％のDHAまたは0.01％〜15％のLC-PUFAを産生するキャノーラ植物を同定する。
【０３７６】
実施例18
シロイヌナズナの形質転換ならびにその後のLC-PUFAおよびDHAの産生のために用いられる代替的な構築物デザイン
シロイヌナズナ植物を、pDAB101493、pDAB7362、pDAB7369、pDAB101412またはpDAB7380バイナリーベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス系統によって形質転換させた。形質転換のためには、Clough and Bent（1998）によって記載された花芽浸漬形質転換プロトコールを用いた。Clough and Bent, "Floral dip: a simplified method for agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thalia," Plant J., 16:735-743, 1998。形質転換されたアラビドプシス植物が得られ、導入遺伝子の存在に関する分子的確認を完了した。トランスジェニックアラビドプシス事象からのT1植物を、温室内で成熟するまで成育させた。これらの植物を自家受精させて、その結果生じたT2種子を成熟時に収穫した。T2アラビドプシス種子におけるLC-PUFAおよびDHA含有率を決定するために、個々の種子をFAME GC-FIDを介して分析した。前記の実施例に記載した通りに、組織をFAME GC-FID方法を介して分析した。アラビドプシス植物のT1植物からの個々のT2種子は、0.00％〜0.95％のDHAおよび0.00％〜1.50％の総LC-PUFAを含んでいた。個々のT1植物からの各T2種子のLC-PUFAおよびDHAの含有率は図51に示されている。
【０３７７】
実施例19
PUFAシンターゼ遺伝子セットによる「非高オレイン酸（non-high oleic）」キャノーラ品種（DH12075）の形質転換
ブラッシカ・ナプス品種DH12075を、プラスミドpDAB7362を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いる、本質的には実施例4に記載した通りの胚軸形質転換法によって形質転換させた。Nexera 710の遺伝的バックグラウンドとは異なり、DH 12075は「高オレイン酸」品種ではない。pat遺伝子の存在に関して陽性であったT0 DH12075植物を回収し、5種のDHA遺伝子セットのすべて（PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetI）の存在に関して、実施例5に記載した分子的分析方法によって分析した。事象001-2009-006DH（事象006）が、5種のDHA遺伝子すべてを含むT0植物として同定された。それを成育チャンバー内で成熟するまで成育させて、T1種子を収穫した。実施例6に記載した方法による事象006の個々のT1種子の分析により、分析した48個の種子のうち31個は、0.19％〜0.86％のDHAのレベルでDHAを含むことが示された。113個のT1種子を植えて、成育チャンバー内で成育させ、実施例4に記載した方法によって葉組織試料を分析して、個々の植物の接合状態を判定した。23件の植物はqPCR分析によってPAT遺伝子に関してホモ接合であると判定され、さらに5種のDHA遺伝子の共分離も示されたが、このことは単一の遺伝子座の存在を示している。patおよびOrfAプローブを用いた事象006 T1植物組織のサザン分析により、OrfA遺伝子のもう1つのコピーが存在することが示された。ホモ接合植物を成熟するまで成育させて、種子を収穫した。これらの植物のそれぞれからのバルクT2種子試料のFAME分析により、23件のホモ接合T2植物のうち17個はLC-PUFAを産生し、DHAは0.17〜0.72％であったことが示された。5件のT2種子試料はEPAを0.08％〜0.16％で含み、LC-PUFA産生性イベントの総LC-PUFA（DHA＋EPA＋DPA[n-6]）は0.33％〜1.35％であった。表22aは、事象006の2つのDHA含有性バルクT2試料の完全脂肪酸プロファイルを示している。ホモ接合T1系統のうち8件からの48個の個々のT2種子の単一種子分析を行い、これらの種子の平均DHA含有率を表23に示している。最大1.31％のDHA含有率を有する個々のT2種子が検出された。表22bは、4個のDHA含有性T2種子の完全脂肪酸プロファイルを示している。これらのデータは、オレイン酸含有率が72％未満である遺伝的バックグラウンドを有するキャノーラにおいて、PUFAシンターゼ遺伝子セットによる形質転換を介してDHAが産生されうることを示している。
【０３７８】
（表２２）DH12075遺伝的バックグラウンドにおける事象006からのT2種子の完全FAMEプロファイル
2013529086.tif 000026
【０３７９】
（表２３）DH12075遺伝的バックグラウンドにおける8件のホモ接合事象006 T1キャノーラ植物からのT2種子の平均DHA含有率（植物当たり48個の種子を分析した）
2013529086.tif 000027
【０３８０】
本発明の前記の説明は、例証および説明を目的として提示されている。その上、この説明は、本発明を本明細書に開示された形式に限定することを意図するものではない。
【０３８１】
本明細書に記載されたさまざまな局面、態様および選択肢はすべて、任意およびすべてのバリエーションで組み合わせることができる。
【０３８２】
本明細書において言及された刊行物、特許および特許出願はすべて、それぞれの個々の刊行物、特許および特許出願が参照により組み入れられることが特定的かつ個別的に指示される場合と同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
2013529086.tif 000028
【図２】
2013529086.tif 000029
【図３】
2013529086.tif 000030
【図４】
2013529086.tif 000031
【図５】
2013529086.tif 000032
【図６】
2013529086.tif 000033
【図７Ａ】
2013529086.tif 000034
【図７Ｂ】
2013529086.tif 000035
【図８】
2013529086.tif 000036
【図９】
2013529086.tif 000037
【図１０】
2013529086.tif 000038
【図１１】
2013529086.tif 000039
【図１２】
2013529086.tif 000040
【図１３】
2013529086.tif 000041
【図１４】
2013529086.tif 000042
【図１５】
2013529086.tif 000043
【図１６】
2013529086.tif 000044
【図１７】
2013529086.tif 000045
【図１８】
2013529086.tif 000046
【図１９】
2013529086.tif 000047
【図２０】
2013529086.tif 000048
【図２１】
2013529086.tif 000049
【図２２】
2013529086.tif 000050
【図２３】
2013529086.tif 000051
【図２４】
2013529086.tif 000052
【図２５】
2013529086.tif 000053
【図２６】
2013529086.tif 000054
【図２７】
2013529086.tif 000055
【図２８】
2013529086.tif 000056
【図２９】
2013529086.tif 000057
【図３０】
2013529086.tif 000058
【図３１】
2013529086.tif 000059
【図３２】
2013529086.tif 000060
【図３３】
2013529086.tif 000061
【図３４】
2013529086.tif 000062
【図３５】
2013529086.tif 000063
【図３６】
2013529086.tif 000064
【図３７】
2013529086.tif 000065
【図３８】
2013529086.tif 000066
【図３９】
2013529086.tif 000067
【図４０】
2013529086.tif 000068
【図４１】
2013529086.tif 000069
【図４２】
2013529086.tif 000070
【図４３】
2013529086.tif 000071
【図４４】
2013529086.tif 000072
【図４５】
2013529086.tif 000073
【図４６】
2013529086.tif 000074
【図４７】
2013529086.tif 000075
【図４８】
2013529086.tif 000076
【図４９】
2013529086.tif 000077
【図５０】
2013529086.tif 000078
【図５１】
2013529086.tif 000079
【配列表】
2013529086000001.app
【国際調査報告】
2013529086.tif 000080
2013529086.tif 000081
2013529086.tif 000082