(57)【要約】スクアレンを含む組成物からスクアレンを調製するための改善された方法。当該方法は（ａ）温度Ｔ１で行う精製蒸留の工程；（ｂ）温度Ｔ２で行う変性蒸留の工程を含み、ここで工程（ａ）および工程（ｂ）は、いずれの順序においても実施され得；Ｔ１およびＴ２はスクアレンを沸騰させるために十分であり；Ｔ２＞Ｔ１およびＴ２＞２００℃である。本発明の方法を使用して、薬学的適用のために適当である産物を産生し得る。特に、本発明の方法を使用して、夾雑物、病原体、ウイルス、ヒト毒素、またはタンパク質、特にヒトに対して有害であり得るタンパク質パルブアルブミンを含まない、精製スクアレンを産生し得る。
2013530941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物供給源由来のスクアレンを含む組成物からスクアレンを調製するための方法であって、該方法は、
（ａ）温度Ｔ１で行う精製蒸留の工程；
（ｂ）温度Ｔ２で行う変性蒸留の工程
を含み、ここで、工程（ａ）および工程（ｂ）は、いずれの順序においても実施され得、Ｔ１およびＴ２は、スクアレンを沸騰させるために十分であり、Ｔ２＞Ｔ１およびＴ２≧２００℃である、方法。
【請求項２】
スクアレンを含む組成物からスクアレンを調製するための方法であって、該方法は、
（ａ）温度Ｔ１で行う精製蒸留の工程；
（ｂ）温度Ｔ２で行う変性蒸留の工程
を含み、ここで、工程（ａ）および工程（ｂ）は、いずれの順序においても実施され得、Ｔ１およびＴ２は、スクアレンを沸騰させるために十分であり、Ｔ１＜１４０℃およびＴ２≧２００℃である、方法。
【請求項３】
前記組成物が、１つまたはそれより多いタンパク質を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、パルブアルブミンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記変性蒸留が、０．５ｍｍＨｇから５．０ｍｍＨｇの圧力で行われる、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記精製蒸留が、７０℃から１００℃の温度で行われる、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記精製蒸留が、０．５μｍＨｇから５μｍＨｇの圧力で行われる、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記精製蒸留が、前記変性蒸留の前に行われる、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
スクアレンを含む前記組成物が、けん化に供される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
けん化が、スクアレンを含む前記組成物へのＮａＯＨまたはＫＯＨの添加を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
９９％またはそれを超えるスクアレンを含む組成物の再蒸留のための方法であって、該再蒸留は、温度Ｔ２で行う変性蒸留であり、ここで、Ｔ２≧２００℃である、方法。
【請求項１２】
水中油型エマルジョンの製造のための方法であって、請求項１から１１のいずれか一項に従って調製されたスクアレンを用いてエマルジョンを調製する工程を含む、方法。
【請求項１３】
ワクチン組成物を調製するための方法であって、請求項１２に従ってエマルジョンを調製する工程、および該エマルジョンを抗原と組み合わせる工程を含む、方法。
【請求項１４】
ワクチンキットを調製するための方法であって、請求項１２に従ってエマルジョンを調製する工程、および該エマルジョンを、キット成分として、抗原成分と共にキットにパッケージングする工程を含む、方法。
【請求項１５】
前記キット成分が、別個のバイアル中に存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記バイアルが、ホウケイ酸ガラスから作製されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原が、インフルエンザウイルス抗原である、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記エマルジョンおよび前記抗原の組み合わせが、ワクチン組成物を形成し、該ワクチン組成物が、インフルエンザウイルス１株あたり約１５μｇ、約１０μｇ、約７．５μｇ、約５μｇ、約３．８μｇ、約３．７５μｇ、約１．９μｇ、または約１．５μｇの赤血球凝集素を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記エマルジョンおよび前記抗原の組み合わせが、ワクチン組成物を形成し、該ワクチン組成物が、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノール保存剤を含む、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法に従って調製された、スクアレン。
【請求項２１】
請求項２０に記載のスクアレンを含む、水中油型エマルジョン。
【請求項２２】
請求項２０に記載のスクアレンを含む、ワクチン。
【請求項２３】
アジュバントおよび／またはワクチンにおける請求項２０に記載のスクアレンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮出願第６１／３９５，４４８号（２０１０年５月１２日に出願）の利益を主張し、上記米国仮出願の完全な内容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、薬学的適用のために適当な純度を有するスクアレンの製造の分野内にある。
【背景技術】
【０００３】
サメ肝油は、スクアレン（Ｃ３０Ｈ５０；［（ＣＨ３）２Ｃ［＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）］２＝ＣＨＣＨ２−］２；２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサ−ヘキサエン；ＣＡＳ  ＲＮ  ７６８３−６４−９）と呼ばれる、分岐、不飽和テルペノイドを含む。スクアレンは、ヒトワクチンにおける水中油型エマルジョンでの使用に関して公知である（例えば、インフルエンザワクチンを補助する（ａｄｊｕｖａｎｔ）ために使用されるＭＦ５９エマルジョン）。スクアレンはまた、他の薬学的産物（例えば軟膏、坐剤）および化粧品において使用される。
【０００４】
現在のスクアレンの供給源は主に魚油、特にサメ肝油である。特に、厳格な製造基準（ＮｏｖａｒｔｉｓによるＭＦ５９の産生の間に使用されるもののような）が維持されない場合、サメ肝油から抽出されたスクアレンの使用に関連する問題が存在し得る。例えば、サメは、ヒトにも感染性である病原体、またはヒトに有害である物質を産生する病原体に感染し得、ならびに、ＴＳＥまたはＴＳＥ様のサメ外的病原因子が存在し得る［例えば参考文献１〜３（非特許文献１〜３）］。さらに、サメはｃａｒｃｈａｔｏｘｉｎのようなヒト毒素を含み得る。それに加えて、サメは、ヒトにとってアレルギー性であり得るタンパク質を含み得る。ヒトにとってアレルギー性であるありふれた魚類タンパク質は、サメにおいて見出されるパルブアルブミンである。従って、安価で低品質のスクアレン供給源は、ヒトの薬学的使用のために適当ではない。当然ながら、アジュバントは、不純物に対して望ましくない強力な免疫反応を誘導し得るので、ヒトレシピエントに対する害のリスクは、スクアレンが免疫学的アジュバントの一部である状況において高まり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｏｒｕｃｉｎｓｋａ  ＆  Ｆｒａｓｃａ、  Ｊ  Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  （２００２）  ２５：２８７〜９８．
【非特許文献２】Ｂｅｒｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ  Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  （１９９６）  １９：４２９〜３４．
【非特許文献３】Ｂｒｉｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ｂ  （１９９８）  ４５：４４３〜５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
薬学的使用のために適当なスクアレン、すなわち規制基準を満たし、かつ夾雑物、病原体、ウイルス、ヒト毒素またはヒトに有害であり得るタンパク質を含まない産物を調製するための、さらなる改善された方法を見出すことが有用である。本発明のプロセスは、サメ肝油から得られたスクアレンの精製のために特に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、動物供給源由来のスクアレンを含む組成物からスクアレンを調製する方法を提供し、当該方法は、以下の工程を含む：（ａ）温度Ｔ１で行う精製蒸留（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）；（ｂ）温度Ｔ２で行う変性蒸留（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）。ここで、工程（ａ）および（ｂ）は、いずれの順序でも行うことができる。Ｔ１およびＴ２は、スクアレンを沸騰させるために十分である。Ｔ２＞Ｔ１およびＴ２≧２００℃である。その動物供給源は、典型的にはサメ肝油（またはその抽出物）のような魚類供給源である。すなわち本発明は、サメ肝油またはサメ肝油抽出物からスクアレンを調製する方法を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、（ａ）温度Ｔ１で行う精製蒸留の工程；（ｂ）温度Ｔ２で行う変性蒸留の工程を含む、スクアレンを含む組成物からスクアレンを調製する方法を提供し、ここで工程（ａ）および（ｂ）は、いずれの順序でも行うことができる；Ｔ１およびＴ２は、スクアレンを沸騰させるために十分である。Ｔ１＜１４０℃およびＴ２≧２００℃である。そのスクアレンを含む組成物は、通常サメ肝油またはその抽出物であり得る。
【０００９】
本発明はさらに、少なくとも９９％のスクアレンを含む組成物の再蒸留の方法を提供し、当該再蒸留は、温度Ｔ２で行う変性蒸留であり、ここでＴ２≧２００℃である。この再蒸留は、組成物の水分含有量を、例えば≦０．０１％まで減少させ得る。
【００１０】
本発明の方法を使用して、薬学的適用のために適当である産物を産生し得る。特に、本発明の方法を使用して、夾雑物、病原体、ウイルス、ヒト毒素、またはタンパク質、特にヒトに対して有害であり得るタンパク質パルブアルブミンを含まない、精製スクアレンを産生し得る。
【００１１】
本発明はさらに、上記で記載した方法によって調製したスクアレンを用いてエマルジョンを調製することを含む、水中油型エマルジョンの製造方法を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、上記で記載したようにエマルジョンを調製すること、およびそのエマルジョンを抗原と組み合わせることを含む、ワクチン組成物を調製する方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、上記で記載したようにエマルジョンを調製すること、およびそのエマルジョンを、抗原成分と共に、キット成分としてキットにパッケージングすることを含む、ワクチンキットを調製する方法を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、本発明の方法によって調製したスクアレンを提供する。
【００１５】
本発明はさらに、本発明の方法によって調製したスクアレンを含む水中油型エマルジョンを提供する。
【００１６】
本発明はさらに、本発明の方法によって調製したスクアレンを含むワクチンを提供する。
【００１７】
本発明はさらに、ワクチンにおける、本発明の方法によって調製したスクアレンの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】記載無し
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（精製蒸留）
スクアレンを含む組成物を、任意の適当な供給源、例えば黒液石鹸スキミング；トール油石鹸；粗トール油；トール油ピッチ；サトウキビ油；油および脂肪の抽出、脱ガム、および清澄化からの残渣；脂肪酸およびエステルの蒸留残渣；植物油の脱臭蒸留物；オリーブ油；ダイズ油；米ぬか油；サメ肝油；牛脂；コーヒー油；魚油；タラ肝油；コムギ胚芽油；トウモロコシ胚芽油；パーム油；アンディローバ油；およびトマト残渣からの油から得ることができる。特に、スクアレンを含む組成物を、サメ肝油から得ることができる。
【００２０】
精製蒸留は、スクアレンを含む組成物から不純物を除去して、精製組成物を産生する。そのスクアレンを含む組成物は、一般的に液体である。精製蒸留の前に、そのスクアレンを含む組成物は、スクアラミン；アルキルグリセロール；脂肪酸（例えばオメガ−３−脂肪酸）；ビタミンＡおよびＤ；プリスチン（ｐｒｉｓｔｉｎｅ）；トリグリセリド；グリセロールエーテルおよび脂肪アルコールのような不純物を含み得る。
【００２１】
その精製蒸留を、温度Ｔ１で行い、ここでＴ１はスクアレンが沸騰するのに十分であり得、すなわちＴ１はスクアレンの沸点以上であり得る。スクアレンの沸点は、７６０ｍｍＨｇ（すなわち１気圧）で４２９〜４３０℃である。
【００２２】
液体の沸点は、化合物の液相の蒸気圧が、その液体の表面に作用する外圧と同じである温度である。従って、スクアレンの沸点、および従ってＴ１の下限は、そのスクアレンを含む組成物の表面に作用する外圧に依存する。この現象は当該分野において周知であり、そして当業者は、使用する所定の蒸留圧におけるスクアレンの観察される沸点を計算し得る。あるいは、当業者は、望ましいスクアレンの観察される沸点に基づいて、必要な蒸留圧を計算し得る。そのような計算を、ノモグラフを用いて行い得る。
【００２３】
１つの実施態様において、その精製蒸留を、少なくとも７０℃、例えば少なくとも７５℃、または少なくとも８０℃の温度で行い得る。別の実施態様において、その精製蒸留を、１４０℃未満、例えば１３０℃未満、１２０℃未満、１１０℃未満、１００℃未満、９５℃未満、９０℃未満、または８５℃未満の温度で行い得る。
【００２４】
１つの実施態様において、その精製蒸留を、ほぼ真空で行い得る。特に、その精製蒸留を、少なくとも０．５μｍＨｇ、例えば少なくとも０．７５μｍＨｇ、または少なくとも１μｍＨｇの圧力で行い得る。その精製蒸留を、５μｍＨｇ未満、例えば２．５μｍＨｇ未満、または２μｍＨｇ未満の圧力で行い得る。
【００２５】
本発明のさらなる実施態様は、上記で述べた最低および最高温度ならびに最低および最高圧力の組み合わせを含む。
【００２６】
その精製蒸留は、少なくとも９５％のスクアレン、例えば少なくとも９６％のスクアレン、少なくとも９７％のスクアレン、少なくとも９８％のスクアレン、少なくとも９９％のスクアレン、少なくとも９９．５％のスクアレン、少なくとも９９．８％のスクアレン、少なくとも９９．９％のスクアレン、またはさらに１００％のスクアレン含む組成物を生じ得る。
【００２７】
本明細書中で示された全てのパーセンテージは、重量によるパーセンテージであり、そしてガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて測定し得る。ＧＣ技術を、ヘキサン中のスクアレンのサンプルを、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたガスクロマトグラフに注入することによって行い得る。その分析を、３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．５０ｍｍのキャピラリーカラムで行うことができ、それは、２００℃で２分間維持され、そして次いで１分あたり１２℃の勾配で３１０℃まで上昇し、そこで９分間維持される。その注入ポートおよびＦＩＤを、それぞれ３００℃および３２０℃に維持する。スクアレンピークのアイデンティティー（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を、ＧＣ／ＭＳ（質量選択検出器を用いたガスクロマトグラフィー）を用いて確立する。純度を、クロマトグラム中の全てのピークの面積の合計のパーセンテージとしてのスクアレンピークの面積として報告する。
【００２８】
その精製蒸留を、変性蒸留の前に行うことができ、精製組成物を生じる。あるいは、その精製蒸留を、変性蒸留の後に行うことができ、変性、精製組成物を生じる。
【００２９】
（変性蒸留）
サメ、および従ってサメ肝油由来のスクアレンは、ヒトにとってアレルギー性であるタンパク質を含み得る。ヒトにとってアレルギー性であり得るありふれた魚類タンパク質は、パルブアルブミンであり、それはサメにおいて見出される。それに加えて、夾雑物タンパク質または材料が、例えば精製蒸留後に、またはスクアレンの分解産物として、スクアレン組成物に導入され得る。考えられる夾雑物タンパク質または材料は、アセトン、アセトアルデヒド、ホルムアルデヒド、および水を含む。有利なことに、その変性蒸留工程は、タンパク質、特にパルブアルブミンおよび任意の夾雑物タンパク質を、変性および／またはスクアレンを含む組成物から除去し、従って変性組成物を提供する。本発明の方法のさらなる利点は、その変性蒸留が、スクアレンを含む組成物に存在する任意の考えられるウイルスを、不活性化および／または精製組成物から除去することを保証し得ることである。従って変性組成物は、非変性組成物よりヒト使用のために安全である。
【００３０】
理論に拘束されることを望まないが、スクアレンの沸点は、スクアレンを含む組成物の表面に作用する外圧に依存する。しかし、スクアレンを含む組成物中に存在する任意のタンパク質が変性する温度は、一般的に、スクアレンを含む組成物の表面に作用する外圧に依存しない。従って、その変性蒸留を、その蒸留を行う圧力に関係なく、特定の温度で行い得る。特に、その変性蒸留を、温度Ｔ２で行い得、ここでＴ２は、２００℃以上、例えば２０５℃以上、２１０℃以上、２１５℃以上、２２０℃以上、２３０℃以上、２４０℃以上、２５０℃以上、または２６０℃以上であり得る。
【００３１】
その変性蒸留を、５００℃未満、例えば４８０℃未満、４５０℃未満、４２０℃未満、４００℃未満、３５０℃未満、または３００℃未満の温度で行い得る。
【００３２】
その変性蒸留を、ほぼ真空で行い得る。特に、その変性蒸留を、少なくとも０．５ｍｍＨｇ、例えば少なくとも０．６ｍｍＨｇ、少なくとも０．７ｍｍＨｇ、または少なくとも０．８ｍｍＨｇの圧力で行い得る。その変性蒸留を、５ｍｍＨｇ未満、例えば４ｍｍＨｇ未満、３ｍｍＨｇ未満、２ｍｍＨｇ未満、１．５ｍｍＨｇ未満、１ｍｍＨｇ未満、０．９ｍｍＨｇ未満の圧力で行い得る。
【００３３】
本発明のさらなる実施態様は、上記で述べた最低および最高温度ならびに最低および最高圧力の組み合わせを含む。
【００３４】
そのような高温で変性蒸留を行うために、スクアレンを含む組成物を熱い表面に接触させる装置を使用することが有利であり得る。その熱い表面を、上記で定義したような温度Ｔ２に維持し得、そしてその熱い表面の周囲の圧力は、変性蒸留のために上記で定義した圧力であり得る。その熱い表面の周囲の圧力を、スクアレンの観察される沸点がＴ２またはそれ未満であることを保証するように選択し得る。スクアレンを含む組成物がその熱い表面と接触すると、スクアレンを含む組成物の成分（熱い表面の周囲の圧力でその沸点がＴ２より下である）が揮発する。不揮発性の成分、例えばタンパク質は熱い表面に残り、そして変性し、スクアレンから分離し得る。
【００３５】
変性蒸留の前に、スクアレンを含む組成物は、８５％から９９．９％のスクアレン、例えば９０％から９９．５％のスクアレン、９５％から９９．５％のスクアレン、または９７％から９９．５％のスクアレンを含み得る。
【００３６】
その変性蒸留は、より高いパーセンテージのスクアレンを有するスクアレン組成物を産生し得る。特に、その変性蒸留は、少なくとも９５％のスクアレン、例えば少なくとも９９％のスクアレン、少なくとも９９．５％のスクアレン、少なくとも９９．９％のスクアレン、またはさらに１００％のスクアレンを含む、変性組成物を生じ得る。
【００３７】
その変性蒸留は、０．５％未満のタンパク質、例えば、０．１％未満のタンパク質、０．０１％未満のタンパク質、または０％のタンパク質を含む、変性組成物を生じ得る。従って、本発明は、０．５％未満のタンパク質、例えば、０．１％未満のタンパク質、０．０１％未満のタンパク質、または０％のタンパク質を含むスクアレンを提供する。
【００３８】
１つの実施態様において、その変性蒸留を、精製蒸留の後に行い、結果として、精製、変性組成物を生じ得る。
【００３９】
Ｔ２は、Ｔ１より高い場合がある。特に、Ｔ２−Ｔ１は１０℃から３００℃、例えば３０℃から２５０℃、５０℃から２００℃、または８０℃から１５０℃であり得る。
【００４０】
（溶媒）
スクアレンを含む組成物中に不純物が導入されることを避けるために（これは、スクアレン組成物をワクチンにおいて使用することを意図する場合に特に重要である）、その精製蒸留および変性蒸留を、溶媒を添加せずに行い得る。
【００４１】
（けん化）
スクアレンを含む組成物を、けん化に供し得る。けん化を、通常、上記で議論した蒸留工程（ａ）および（ｂ）の前に行う。あるいは、けん化を、蒸留工程（ａ）と蒸留工程（ｂ）との間（どちらの順序においても行う）に行い得る。あるいは、通常ではないが、けん化を蒸留工程（ａ）および（ｂ）の後に行い得る。けん化は、スクアレンを含む組成物中に存在するタンパク質を破壊し得る。しかし、けん化は、存在する全てのタンパク質を除去するわけではない。けん化の後にスクアレンを含む組成物中に残る任意の残留タンパク質を、変性蒸留工程によって除去し得る。けん化および変性蒸留の組み合わせは、スクアレンが任意のタンパク質を含まない可能性を改善するので、有用である。
【００４２】
けん化は、アルコールおよびカルボン酸の塩を形成する、塩基性条件下でのエステルの加水分解である。スクアレンを含む組成物のけん化の間、塩基（例えばＮａＯＨまたはＫＯＨ）を組成物に加え、それは脂肪酸エステル（例えばトリグリセリド）を、石鹸に変換し得る。けん化は、けん化産物の沸点と非けん化産物の沸点との間の差異を増加させ、蒸留、例えば精製蒸留および／または変性蒸留による分離をより効率的にし得るので、有用であり得る。あるいは、そのけん化産物を、別の手段、例えば遠心分離によって除去し得る。
【００４３】
けん化による脂肪酸エステルの除去は、スクアレンを含むけん化組成物を生じ得、それはスクアレンを含む非けん化組成物と比較して改善された純度（すなわちより高い％のスクアレン）であり得る。
【００４４】
（スクアレンの特徴付け）
本発明の方法によって産生されたスクアレンは、４ｍｇ／ｍｌ未満、例えば３ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、または１ｍｇ／ｍｌ未満のけん化値を有し得る。この測定値は、スクアレン中に存在するけん化可能な種の量を示す。けん化値を、米国薬局方（ＵＳＰ）＜４０１＞において記載されたように、水酸化ナトリウムの加水分解および中和化当量として決定し得る。ＮａＯＨを用いて得られたけん化値を、ＫＯＨおよびＮａＯＨの分子量の比（１．４０３）をかけることによって、ＫＯＨの値に変換し得る。
【００４５】
本発明の方法によって産生されたスクアレンは、１ｍｇＫＯＨ／ｇ以下、例えば０．８ｍｇＫＯＨ／ｇ以下、０．６ｍｇＫＯＨ／ｇ以下、０．５ｍｇＫＯＨ／ｇ以下、０．４ｍｇＫＯＨ／ｇ以下、０．２ｍｇＫＯＨ／ｇ以下、０．１ｍｇＫＯＨ／ｇ以下、０．０５ｍｇＫＯＨ／ｇ以下、０．０３ｍｇＫＯＨ／ｇ以下、０．０２ｍｇＫＯＨ／ｇ以下、または０．０１ｍｇＫＯＨ／ｇ以下の酸価を有し得る。その酸価を、ＵＳＰ＜４０１＞において記載されたように、スクアレンによって消費される水酸化カリウムの中和化当量として決定し得る。
【００４６】
（水中油型エマルジョン）
スクアレンを含む組成物を、上記で記載したように調製したら、それを下流の産物、例えば薬学的、水中油型エマルジョンアジュバント等の調製のために使用し得る。
【００４７】
汚染を回避するために、スクアレンを蒸留処理後、および下流の産物の調製前に無菌を維持することが好ましい。例えば、下流の産物がエマルジョンである場合、エマルジョンの形成前のスクアレンの汚染を回避するために、蒸留およびエマルジョン装置は閉鎖システムを形成し得る。あるいは、またはそれに加えて、そのスクアレンを、下流の産物の調製前に、不活性雰囲気下、例えば窒素下に維持し得る。
【００４８】
水中油型エマルジョンは、ワクチンの補助で使用するために特に適当であることが見出された。本発明によって調製されたエマルジョンは、水性成分に加えて、スクアレンおよび少なくとも１つの界面活性剤を含む。そのエマルジョンは、さらなる油を含み得る。理想的には、その油および界面活性剤は、生物分解性（代謝性）および生体適合性である。
【００４９】
スクアレンおよびトコフェロールの油の組み合わせを使用し得る。組成物がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、ε、またはζトコフェロールのいずれもを使用し得るが、α−トコフェロールが好ましい。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールをどちらも使用し得る。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。トコフェロールは、いくつかの形態、例えば様々な塩および／または異性体をとり得る。塩は、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩等のような、有機塩を含む。トコフェロールの塩を使用する場合、好ましい塩はコハク酸塩である。スクアレンおよびトコフェロール（例えばＤＬ−α−トコフェロール）を含む油の組み合わせは有用である。
【００５０】
２〜２０％（容積で）の範囲の油含有量が典型的である。
【００５１】
水性成分は、混ぜ物の無い水（例えばｗ．ｆ．ｉ．）であり得、またはさらなる成分、例えば溶質を含み得る。例えば、それは緩衝液を形成する塩、例えばナトリウム塩のようなクエン酸塩またはリン酸塩を含み得る。典型的な緩衝液は、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、またはクエン酸緩衝液を含む。緩衝液を、典型的には５〜２０ｍＭの範囲で含む。
【００５２】
界面活性剤は、好ましくは生物分解性（代謝性）および生体適合性である。界面活性剤を、その「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類し得、ここで１〜１０の範囲のＨＬＢは、一般的にその界面活性剤が水よりも油に可溶であることを意味し、そして１０〜２０の範囲のＨＬＢは、油よりも水に可溶である。エマルジョンは、好ましくは少なくとも１０、例えば少なくとも１５、または好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する、少なくとも１つの界面活性剤を含む。
【００５３】
本発明を、以下のものを含むがこれに限らない界面活性剤と共に使用し得る：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（通常Ｔｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーのような、商品名ＤＯＷＦＡＸＴＭで販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の反復数が変動し得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）は特に重要である；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）のような、ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）；ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル；ならびにソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウラートのような、ソルビタンエステル（通常ＳＰＡＮとして公知である）。エマルジョンに含まれる好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレアート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。
【００５４】
界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物、またはＴｗｅｅｎ８０／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００混合物を、エマルジョン中に含み得る。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Ｔｗｅｅｎ８０）のようなポリオキシエチレンソルビタンエステル、およびｔ−オクチルフェノキシ−ポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）のようなオクトキシノールの組み合わせも適当である。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。有用な混合物は、１０〜２０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ８０、１５．０のＨＬＢ）、および１〜１０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（例えばＳｐａｎ８５、１．８のＨＬＢ）を含み得る。
【００５５】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ８０のような）０．０１から２％；オクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００または他のＴｒｉｔｏｎシリーズの洗浄剤のような）０．００１から０．１％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９のような）０．１から２０％である。
【００５６】
ポリソルベート８０界面活性剤を含む、スクアレンを含む水中油型エマルジョンが好ましい。
【００５７】
水中油型エマルジョンを、以下の工程を含む方法を用いて製造し得る：（ｉ）予備的エマルジョン、またはプレエマルジョンとしても公知である、第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンの調製；（ｉｉ）第１の平均油滴サイズよりも小さい、第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するための、第１のエマルジョンのマイクロフルイダイゼーション；および（ｉｉｉ）第２のエマルジョンのろ過。第１のエマルジョンを、ホモジナイゼーションによって調製し得る。
【００５８】
エマルジョン中の油滴は、一般的に直径５μｍ未満であり、そしてサブミクロンの直径さえ有し得、これらの小さいサイズは、マイクロフルイダイザーによって好都合に達成され、安定なエマルジョンを提供する。ろ過滅菌に供し得るので、２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴が好ましい。
【００５９】
本発明によって調製したスクアレンを用いて作製し得る、特定の水中油型エマルジョンアジュバントは、以下のものを含むがこれに限らない。
【００６０】
・スクアレン、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、およびソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ８５）のエマルジョン。容積によるエマルジョンの組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ８５であり得る。重量では、これらの比は４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ８５になる。このアジュバントは、「ＭＦ５９」として公知であり［４〜６］、参考文献７の第１０章、および参考文献８の第１２章でより詳細に記載されている。ＭＦ５９エマルジョンは、クエン酸イオン、例えば１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を有利に含む。
【００６１】
・スクアレン、トコフェロール（理想的にはＤＬ−α−トコフェロール）、およびポリソルベート８０のエマルジョン。これらのエマルジョンは、（重量で）２から１０％のスクアレン、２から１０％のトコフェロール、および０．３から３％のポリソルベート８０、例えば４．３％のスクアレン、４．７％のトコフェロール、および１．９％のポリソルベート８０を有し得る。スクアレン：トコフェロールの重量比は、より安定なエマルジョンを生じ得るので、好ましくは≦１（例えば０．９０）である。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の容積比、または約１１：５の重量比で存在し得る。１つのそのようなエマルジョンを、ポリソルベート８０をＰＢＳ中に溶解して２％の溶液を生じ、次いで９０ｍｌのこの溶液を、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、次いでその混合物をマイクロフルイダイズすることによって産生し得る。できたエマルジョンは、サブミクロン、例えば１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径を有する油滴を有する。そのエマルジョンはまた、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ｄ−ＭＰＬ）も含み得る。別の有用なこの型のエマルジョンは、ヒトの１用量あたり、０．５〜１０ｍｇのスクアレン、０．５〜１１ｍｇのトコフェロール、および０．１〜４ｍｇのポリソルベート８０を含み得る［９］。
【００６２】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）のエマルジョン。そのエマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬも含み得る。そのエマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。
【００６３】
・スクアレン、ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）およびトコフェロール（例えばα−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。そのエマルジョンは、これらの３つの成分を、約７５：１１：１０の質量比で含み得（例えば７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および１００μｇ／ｍｌのα−トコフェロールスクシネート）、そしてこれらの濃度は、抗原からのこれらの成分の任意の寄与も含むものとする。そのエマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬも含み得る。そのエマルジョンはまた、ＱＳ２１のようなサポニンも含み得る。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。
【００６４】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えばソルビタンモノオレアートまたは「Ｓｐａｎ８０」のようなソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルジョン。そのエマルジョンは、好ましくは熱可逆的であり、および／または少なくとも９０％の油滴が（容積で）２００ｎｍ未満のサイズである［１０］。そのエマルジョンはまた、１つまたはそれ以上の：アルジトール；凍結保護剤（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはショ糖のような糖）；および／またはアルキルポリグリコシドを含み得る。そのエマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含み得る［１１］。そのようなエマルジョンを凍結乾燥し得る。
【００６５】
・スクアレン、ポロクサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［１２］。アジュバントワクチンにおけるこれらの成分の最終的な濃度（重量）は、５％のスクアレン、４％のポロクサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％のＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ８５（Ｂｉｓ−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル）である。
【００６６】
上記でパーセンテージで表されたこれらのエマルジョンの組成を、希釈または濃縮によって改変し得（例えば２または３のような整数によって、または２／３または３／４のような分数によって）、ここでその比は同じままである。例えば、２倍濃縮ＭＦ５９は、約１０％のスクアレン、約１％のポリソルベート８０、および約１％のソルビタントリオレアートを有する。濃縮された形態を希釈して（例えば抗原溶液によって）、望ましい最終的な濃度のエマルジョンを生じ得る。
【００６７】
本発明のエマルジョンを、理想的には２℃〜８℃で保管する。それらを凍結するべきではない。それらを、理想的には直接光を避けて維持するべきである。特に、本発明のスクアレンを含むエマルジョンおよびワクチンは、スクアレンの光化学的分解を避けるようにに保護するべきである。本発明のエマルジョンを保管する場合、好ましくは不活性雰囲気下、例えばＮ２またはアルゴン下で保管する。
【００６８】
（ワクチン）
水中油型エマルジョンアジュバントを、（例えば患者に別に投与された抗原にアジュバント効果を提供するために）それ自体で患者に投与することが可能であるが、投与の前にそのアジュバントを抗原と混合して、免疫原性組成物、例えばワクチンを形成することがより通常である。エマルジョンおよび抗原の混合を、使用時にその場で行うことができ、またはワクチン製造中に、充填の前に行うこともできる。本発明の方法を、両方の状況に適用し得る。
【００６９】
従って、本発明の方法は、本発明によって調製したスクアレンを含むエマルジョンを、抗原成分と混合するさらなるプロセスの工程を含み得る。代替として、アジュバントを、抗原成分と共にキット成分として、キットへパッケージングするさらなる工程を含み得る。
【００７０】
従って、全体として、混合ワクチンを調製する場合に、または混合する準備ができた抗原およびアジュバントを含むキットを調製する場合に、本発明を使用し得る。混合を製造中に行う場合、混合するバルク抗原およびエマルジョンの容積は、典型的には１リットル超、例えば≧５リットル、≧１０リットル、≧２０リットル、≧５０リットル等である。混合を使用時に行う場合、混合する容積は、典型的には１ミリリットル未満、例えば≦０．６ｍｌ、≦０．５ｍｌ、≦０．４ｍｌ、≦０．３ｍｌ、≦０．２ｍｌ等である。両方の場合において、実質的に同じ容積、すなわち実質的に１：１（例えば１．１：１〜１：１．１、好ましくは１．０５：１〜１：１．０５、およびより好ましくは１．０２５：１〜１：１．０２５）のエマルジョンおよび抗原溶液を混合することが通常である。しかし、いくつかの実施態様において、過剰のエマルジョンまたは過剰の抗原を使用し得る［１３］。過剰な量の１つの成分を使用する場合、その過剰さは、一般的に少なくとも１．５：１、例えば≧２：１、≧２．５：１、≧３：１、≧４：１、≧５：１等である。
【００７１】
抗原およびアジュバントがキット内で別個の成分として存在する場合、それらはキット内で物理的にお互いから離れており、そしてこの分離を様々な方法で達成し得る。例えば、その成分は、バイアルのような別個の容器内に存在し得る。２つのバイアルの内容物を、必要な場合に、例えば１つのバイアルの内容物を取り出し、そしてそれらを他方のバイアルに加えることによって、または両方のバイアルの内容物を別々に取り出し、それらを３番目の容器中で混合することによって混合し得る。
【００７２】
別の構成において、キット成分の１つはシリンジ中にあり、そして他方はバイアルのような容器内にある。そのシリンジを、その内容物を混合のためにバイアル内へ入れるために使用し得（例えば針によって）、そして次いでその混合物をシリンジ内へ回収し得る。シリンジの混合した内容物を、次いで典型的には新しい滅菌針によって患者に投与し得る。１つの成分をシリンジ内に詰めることは、患者への投与のために別のシリンジを使用する必要性を排除する。
【００７３】
別の好ましい構成において、２つのキット成分を、同じシリンジ、例えば参考文献１４〜２１等で開示されたもののような、デュアルチャンバーシリンジ内で一緒に、しかし別々に保持する。シリンジを作動させる場合に（例えば患者への投与中）、２つのチャンバーの内容物が混合される。この構成は、使用時の別個の混合工程の必要性を回避する。
【００７４】
様々なキット成分の内容物は、一般的に全て液体形態である。いくつかの構成において、成分（典型的にはエマルジョン成分ではなく抗原成分）は乾燥形態であり（例えば凍結乾燥形態）、他の成分は液体形態である。乾燥成分を再活性化し、そして患者へ投与するための液体組成物をもたらすために、２つの成分を混合し得る。凍結乾燥成分は典型的にはシリンジではなくバイアル内にある。乾燥成分は、ラクトース、ショ糖、またはマンニトールおよびその混合物、例えばラクトース／ショ糖混合物、ショ糖／マンニトール混合物等のような安定剤を含み得る。１つの考えられる構成は、充填済みのシリンジ中の液体エマルジョン成分およびバイアル中の凍結乾燥抗原成分を使用する。
【００７５】
ワクチンが、エマルジョンおよび抗原に加えて成分を含む場合、これらのさらなる成分は、これら２つのキット成分のうちの１つに含まれることがあり、または３番目のキット成分の一部であり得る。
【００７６】
本発明の混合ワクチンのために、または個々のキット成分のために適当な容器は、バイアルおよび使い捨てシリンジを含む。これらの容器は無菌でなければならない。
【００７７】
組成物／成分がバイアル中にある場合、そのバイアルは、好ましくはガラスまたはプラスチック材料でできている。そのバイアルを、好ましくは組成物を加える前に滅菌する。ラテックス感受性の患者に関する問題を回避するために、バイアルを好ましくはラテックスフリーのストッパーで密封し、そして全てのパッケージング材料においてラテックスが存在しないことが好ましい。１つの実施態様において、バイアルはブチルゴムストッパーを有する。そのバイアルは、単一用量のワクチン／成分を含み得、またはそれは、１を超える用量（「複数用量」バイアル）、例えば１０用量を含み得る。１つの実施態様において、バイアルは１０×０．２５ｍｌの用量のエマルジョンを含む。好ましいバイアルは、無色のガラスでできている。
【００７８】
バイアルは、キャップであって、充填済みのシリンジをキャップ内に挿入し得、シリンジの内容物をバイアル内に放出し得（例えばその中の凍結乾燥物質を再構成するために）、そしてバイアルの内容物をシリンジへ戻し得るように適合させた、キャップ（例えばＬｕｅｒ  ｌｏｃｋ）を有し得る。シリンジをバイアルから除去した後、次いで針をつけて、そしてその組成物を患者に投与し得る。そのキャップは、好ましくはシールまたはカバーの内側にあり、そのため、キャップにアクセスし得る前にそのシールまたはカバーを除去しなければならない。
【００７９】
組成物／成分をシリンジ中にパッケージングする場合、そのシリンジは通常それに取り付けられた針を有さないが、組み立ておよび使用のために、別個の針を、シリンジと共に供給し得る。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージ、および５／８インチ２５ゲージ針が典型的である。シリンジを、記録の保持を容易にするために、ロット番号、インフルエンザシーズンおよび内容物の有効期限を印刷し得る剥離ラベルと共に提供し得る。シリンジ中のプランジャーは、好ましくは吸引中にプランジャーが偶発的に取れてしまうことを予防するためのストッパーを有する。そのシリンジは、ラテックスゴムのキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含む。そのシリンジは、一般的に針を取り付ける前には、先端を密封する先端キャップを有し、そしてその先端キャップは好ましくはブチルゴムでできている。そのシリンジおよび針を別々にパッケージングする場合、その針には好ましくはブチルゴムシールドが備え付けられている。
【００８０】
そのエマルジョンを、バイアルまたはシリンジへパッケージングする前に、緩衝液で希釈し得る。典型的な緩衝液は：リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、またはクエン酸緩衝液を含む。希釈は、その相対的な割合を保持しながら、アジュバント成分の濃度を低下させて、例えば「半分の強度の」アジュバントを提供し得る。
【００８１】
例えば小児への送達を容易にするために、容器に半分の用量容積を示す印を付け得る。例えば、０．５ｍｌの用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌの容積を示す印を有し得る。
【００８２】
ガラス容器（例えばシリンジまたはバイアル）を使用する場合、ソーダ石灰ガラスではなく、ホウケイ酸ガラスから作製された容器を使用することが好ましい。
【００８３】
以下のものを含むがこれに限らない様々な抗原を、水中油型エマルジョンと共に使用し得る：ウイルス表面タンパク質のようなウイルス抗原；タンパク質および／または糖類抗原のような細菌抗原；真菌抗原；寄生虫抗原；および腫瘍抗原。本発明は、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、鉤虫、Ｂ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病、ＲＳウイルス、サイトメガロウイルス、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、クラミジア、ＳＡＲＳ、コロナウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルス等に対するワクチンのために特に有用である。例えば：
・インフルエンザウイルス抗原。これらは、生のウイルスまたは不活化ウイルスの形態をとり得る。不活化ウイルスを使用する場合、そのワクチンは、ビリオン全体、分割ビリオン、または精製表面抗原（赤血球凝集素を含む、および通常ノイラミニダーゼも含む）を含み得る。インフルエンザ抗原をまた、ビロソームの形態で提示し得る。その抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、および／またはＨ１６から選択される、任意の赤血球凝集素のサブタイプを有し得る。ワクチンは、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスを含む、１つまたはそれ以上（例えば１、２、３、４、またはそれ以上）のインフルエンザウイルス株由来の抗原を含み得る（例えば一価のＡ／Ｈ５Ｎ１またはＡ／Ｈ１Ｎ１ワクチン、または三価のＡ／ＨＩＮ１＋Ａ／Ｈ３Ｎ２＋Ｂワクチン）。そのインフルエンザウイルスは、再集合体（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）株であり得、そして逆遺伝学的技術によって得ることができた［例えば２２〜２６］。従って、そのウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の、１つまたはそれ以上のＲＮＡセグメントを含み得る（典型的にはＡ／ＰＲ／８／３４から６個のセグメント、ＨＡおよびＮセグメントはワクチン株由来、すなわち６：２再集合体）。抗原の供給源として使用するウイルスを、卵（例えば孵化鶏卵）または細胞培養のいずれかで増殖させ得る。細胞培養を用いる場合、その細胞培養基は、典型的にはＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８等のような、哺乳動物細胞系統である。インフルエンザウイルスを増殖させるために好ましい哺乳動物細胞系統は：Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞［２７〜３０］；アフリカミドリザル腎臓由来のＶｅｒｏ細胞［３１〜３３］；またはヒト胚性網膜芽細胞由来のＰＥＲ．Ｃ６細胞［３４］を含む。ウイルスを哺乳動物細胞系統で増殖させた場合、その組成物は有利なことに卵タンパク質（例えば卵白アルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まず、それによってアレルゲン性を抑制する。典型的には、ワクチンの単位用量を、典型的にはＳＲＩＤによって測定される赤血球凝集素（ＨＡ）含有量に関して標準化する。既存のワクチンは、典型的には１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、特にアジュバントを使用する場合には、より低い用量を使用し得る。１／２（すなわち株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８のような分数の用量も、より高い用量も（例えば３×または９×用量［３７、３８］）使用した［３５、３６］。従って、ワクチンは、インフルエンザ１株あたり０．１〜１５０μｇのＨＡ、好ましくは０．１〜５０μｇ、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ等のＨＡを含み得る。特定の用量は、例えば１株あたり約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５等を含む。
【００８４】
・ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含むヒト免疫不全ウイルス。その抗原は、典型的にはエンベロープ抗原である。
【００８５】
・Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原。この抗原を、好ましくは、組換えＤＮＡ法によって得る（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母における発現後）。天然ウイルスＨＢｓＡｇとは異なり、その組換え酵母発現抗原は、糖鎖付加されていない。それは、リン脂質を含む脂質マトリックスを含む、実質的に球形の粒子の形態（約２０ｎｍの平均直径）であり得る。天然ＨＢｓＡｇ粒子とは異なり、酵母で発現した粒子は、ホスファチジルイノシトールを含み得る。そのＨＢｓＡｇは、サブタイプａｙｗ１、ａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４、ａｙｒ、ａｄｗ２、ａｄｗ４、ａｄｒｑ−およびａｄｒｑ＋のいずれかに由来し得る。
【００８６】
・特にイヌにおいて見られる鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃａｎｉｎｕｍ）。この抗原は、組換えＡｃ−ＭＴＰ−１（アスタシン様メタロプロテアーゼ）および／またはアスパラギン酸ヘモグロビナーゼ（Ａｃ−ＡＰＲ−１）であり得、それを分泌タンパク質としてバキュロウイルス／昆虫細胞システムにおいて発現し得る［３９、４０］。
【００８７】
・単純ヘルペスウイルス抗原（ＨＳＶ）。本発明で使用するための好ましいＨＳＶ抗原は、膜糖タンパク質ｇＤである。ＨＳＶ−２株由来のｇＤを使用することが好ましい（「ｇＤ２」抗原）。その組成物は、Ｃ末端膜アンカー領域が欠失したｇＤの形態、例えばＣ末端にアスパラギンおよびグルタミンを付加した、天然タンパク質のアミノ酸１〜３０６を含む短縮ｇＤを使用し得る［４１］。この形態のタンパク質は、シグナルペプチドを含み、それは切断されて成熟２８３アミノ酸タンパク質を生じる。アンカーの欠失は、そのタンパク質を可溶性形態で調製することを可能にする。
【００８８】
・ヒトパピローマウイルス抗原（ＨＰＶ）。本発明で使用するために好ましいＨＰＶ抗原は、Ｌ１カプシドタンパク質であり、それは集合してウイルス様粒子（ＶＬＰ）として公知の構造を形成し得る。ＶＬＰを、酵母細胞における（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける）または昆虫細胞における（例えばＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのようなＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ細胞における、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞における）Ｌ１の組換え発現によって産生し得る。酵母細胞に関して、プラスミドベクターがＬ１遺伝子を有し得る；昆虫細胞に関して、バキュロウイルスベクターがＬ１遺伝子を有し得る。より好ましくは、その組成物は、ＨＰＶ−１６株およびＨＰＶ−１８株両方に由来するＬ１  ＶＬＰを含む。この二価の組み合わせは、非常に有効であることが示された［４２］。ＨＰＶ−１６株およびＨＰＶ−１８株に加えて、ＨＰＶ−６株およびＨＰＶ−１１株由来のＬ１  ＶＬＰを含むことも可能である。腫瘍形成性ＨＰＶ株の使用も可能である。ワクチンは、ＨＰＶ株あたり２０〜６０μｇ／ｍｌ（例えば約４０μｇ／ｍｌ）のＬ１を含み得る。
【００８９】
・炭疽抗原。炭疽は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓによって引き起こされる。適当なＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原は、Ａ成分（致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ））を含み、それらはどちらも保護抗原（ＰＡ）として公知である共通のＢ成分を有し得る。その抗原を任意で無毒化し得る。さらなる詳細を、参考文献［４３から４５］において見出し得る。
【００９０】
・Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗原。様々なＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原が公知である。適当な抗原は、莢膜糖類（例えば５型および／または８型株由来）およびタンパク質（例えばＩｓｄＢ、Ｈｌａ等）を含む。莢膜糖類抗原は、理想的にはキャリアタンパク質に結合体化する。
【００９１】
・Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原。様々なＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原が公知である。適当な抗原は、莢膜糖類（例えば１つまたはそれ以上の血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および／または２３Ｆ由来）およびタンパク質（例えばニューモリシン、無毒化ニューモリシン、ポリヒスチジン三つ組（ｔｒｉａｄ）タンパク質Ｄ（ＰｈｔＤ）等）を含む。莢膜糖類抗原は、理想的にはキャリアタンパク質に結合体化する。
【００９２】
・がん抗原。様々な腫瘍特異的抗原が公知である。本発明を、肺がん、黒色腫、乳がん、前立腺がん等に対する免疫療法的反応を誘発する抗原と共に使用し得る。
【００９３】
抗原の溶液を、通常、スクアレンを含むエマルジョンと、例えば１：１の容積比で混合する。この混合を、ワクチン製造者が充填の前に実施することができ、または医療従事者が使用時に実施することもできる。
【００９４】
（薬学的組成物）
本発明の方法を用いて作製した組成物は、薬学的に許容可能である。それらは、スクアレンを含むエマルジョンおよび任意の抗原に加えて、成分を含み得る。
【００９５】
その組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールのような保存剤を含み得る。しかし、ワクチンは、実質的に水銀材料を含むべきではなく（すなわち５μｇ／ｍｌ未満）、例えばチオメルサールを含まないことが好ましい［４６、４７］。水銀を含まないワクチンおよび成分がより好ましい。
【００９６】
組成物のｐＨは、一般的に５．０〜８．１、およびより典型的には６．０〜８．０、例えば６．５〜７．５である。従って、本発明のプロセスは、パッケージングの前に、ワクチンのｐＨを調整する工程を含み得る。
【００９７】
その組成物は、好ましくは無菌である。その組成物は、好ましくは非発熱性であり、例えば用量あたり＜１ＥＵ（エンドトキシンユニット、標準尺度）、および好ましくは用量あたり＜０．１ＥＵを含む。その組成物は、好ましくはグルテンを含まない。
【００９８】
その組成物は、単回免疫化のための材料を含み得、または複数回免疫化のための材料を含み得る（すなわち、「複数用量」キット）。複数用量の構成では、保存剤を含むことが好ましい。
【００９９】
ワクチンを、典型的には約０．５ｍｌの投与容積で投与するが、半分の用量（すなわち約０．２５ｍｌ）を小児に投与し得る。
【０１００】
（処置方法、およびワクチンの投与）
本発明は、本発明の方法を用いて調製したキットおよび組成物を提供する。本発明の方法によって調製した組成物は、ヒト患者への投与に適当であり、そして本発明は、そのような組成物を患者へ投与する工程を含む、患者において免疫反応を起こす方法を提供する。
【０１０１】
本発明はまた、薬物として使用するためのこれらのキットおよび組成物を提供する。
【０１０２】
本発明はまた、患者において免疫反応を起こすための薬物の製造における、（ｉ）抗原の水性調製物；および（ｉｉ）本発明によって調製したスクアレンを含む水中油型エマルジョンの使用を提供する。
【０１０３】
これらの方法および使用によって起こされた免疫反応は、一般的に、抗体反応、好ましくは保護的抗体反応を含む。
【０１０４】
その組成物を、様々な方法で投与し得る。最も好ましい免疫化経路は、筋肉内注射（例えば腕または脚への）であるが、他の利用可能な経路は、皮下注射、鼻腔内［４８〜５０］、経口［５１］、皮内［５２、５３］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経真皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［５４］等を含む。
【０１０５】
本発明によって調製したワクチンを、小児および成人の両方を処置するために使用し得る。その患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。その患者は、高齢者（例えば≧５０歳、好ましくは≧６５歳）、若年者（例えば≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍隊および軍人、妊娠中の女性、慢性的な病気、免疫不全患者、および海外旅行者であり得る。しかし、そのワクチンはこれらのグループだけに適当であるのではなく、より一般的に個体群の中で使用し得る。
【０１０６】
本発明のワクチンを、他のワクチンと実質的に同時に（例えば同じ診察中または医療専門家への訪問中に）患者へ投与し得る。
【０１０７】
（一般）
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を含み、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなり得、またはさらに何か、例えばＸ＋Ｙを含み（ｉｎｃｌｕｄｅ）得る。
【０１０８】
数値ｘに関して、「約」という用語は、任意であり、そして例えばｘ±１０％を意味する。
【０１０９】
「実質的に」という用語は、「完全に」を排除しない。例えばＹを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まない場合もある。必要な場合には、「実質的に」という用語を、本発明の定義から省略し得る。
【０１１０】
明確に述べなければ、２つまたはそれ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、いかなる特定の混合の順序も必要としない。したがって、成分を任意の順序で混合し得る。３つの成分が存在する場合、２つの成分をお互いに組み合わせることができ、そして次いでその組み合わせを３番目の成分と組み合わせることができる、等。
【０１１１】
本方法の様々な工程を、同じかまたは異なるときに、同じかまたは異なる地理的位置、例えば国において、同じかまたは異なる人々または実体が行い得る。
【実施例】
【０１１２】
（発明を実施するための様式）
（実施例１）
図１は、本発明の方法の精製蒸留工程および／または変性蒸留工程のために使用し得る蒸留装置の概略図を示す。図１に関連して記載したプロセスを、スクアレンを含む組成物にいかなる溶媒も添加せずに行い得る。図１に示す実施態様において、スクアレンを含む組成物を、供給容器（ｆｅｅｄ  ｖｅｓｓｅｌ）（１）に入れ、窒素を加えた。注入ライン（３）の１つの端は、ポリプロピレンのプレフィルターを有し、そして供給容器内にあり、一方注入ラインのもう１つの端は、ステンレススチールの針（１９−ｇａ．）を有し、それを蒸留装置（５）の上部に挿入する。その蒸留装置は、中央に突き出した円柱状の「ホットフィンガー」（９）を有するチューブのような形のチャンバー（７）を含む。２１２℃の沸点を有する安息香酸エチルを、そのフィンガーの下で加熱して、そのホットフィンガーの壁に熱を供給する。本実施態様において安息香酸エチルを使用するが、ホットフィンガーの温度を上げるために、より高い沸点を有する溶媒を使用し得ることが明らかである。蒸留の間、その蒸留装置を排気し得る。スクアレンを含む組成物が、例えば蒸留装置内の低圧の使用によって、ステンレススチール針を通って蒸留装置に引き込まれ、そしてホットフィンガーの加熱した壁へ滴下し得る（１１）。スクアレンを含む組成物を加熱すると、蒸留装置内の圧力において沸点が２１２℃より低い成分は揮発する。図１のシステムを用いてスクアレンを揮発させるために、蒸留装置内の圧力を、スクアレンの沸点を２１２℃以下に下げるように選択するべきである（例えば約１．５ｍｍＨｇまたはそれ以下）。揮発した成分は、チャンバー（７）の外壁で凝縮し、それは周囲の空気によって冷却され、そして壁をつたって収集フラスコ（１３）に入り、それも減圧下であり得る。不揮発性の成分、例えばタンパク質は、ホットフィンガーの壁に残り、そして残渣フラスコ（１５）に流れ落ちる。非常に揮発性の成分は、減圧ラインを通って出て、スクアレン凝縮物中のそのレベルを低下させ得る。
【０１１３】
既に精製蒸留に供したスクアレンを、この装置を用いて蒸留した。供給源に関わらず、最終的なスクアレンは、通常≧９９．９％の純度、＜０．０３ｍｇＫＯＨ／ｇの酸価、および＜２ｍｇ／ｇのけん化価を有していた。変性蒸留は、スクアレンの水分含有量を、例えば０．０２２％から０．０１０％、０．００６％から０．００５％、または０．０１０％から０．００６％に低下させた。
【０１１４】
（実施例２−けん化値の測定）
けん化値は、１．０ｇの物質に含まれる、遊離の酸を中和し、そしてエステルをけん化するために必要な水酸化カリウムのｍｇ数である。
【０１１５】
手順（ＵＳＰ＜４０１＞）：１．５ｇから２ｇの物質を、２５０ｍＬのフラスコ（フラスコの重さを引いておく（ｔａｒｅｄ））に入れ、正確に秤量し、そしてそれを２５．０ｍＬの０．５Ｎアルコール性水酸化カリウムに加える。フラスコを適当なコンデンサー下で、蒸気浴で加熱して、３０分間還流を維持し、頻繁に内容物を回転させる。次いで１ｍＬのフェノールフタレインＴＳを加え、そして０．５Ｎの塩酸ＶＳで過剰な水酸化カリウムを滴定する。同じ条件下でブランクの決定を実施する。実際の試験およびブランク試験で消費された０．５Ｎ塩酸の、容積（ｍＬにおける）の間の差に、５６．１および０．５Ｎ塩酸ＶＳの正確な規定度をかけ、そして取った試料の重量ｇで割ったものが、けん化値である。
【０１１６】
スクアレンの供給源に依存して、＜１．４ｍｇ／ｇのけん化値を得ることができる。
【０１１７】
（実施例３−酸価の測定）
脂肪および固定油の酸性度を、１０．０ｇの物質中の遊離の酸を中和するために必要な、０．１ＮのアルカリのｍＬ数として表し得る。酸価は、１．０ｇの物質中の遊離の酸を中和するために必要なアルカリのｍｇ数である。
【０１１８】
手順（ＵＳＰ＜４０１＞）：約１０．０ｇの物質を、正確に秤量し、フラスコに入れた等量のアルコールおよびエーテルの混合物（０．１Ｎの水酸化ナトリウムでフェノールフタレインに対して中和した）５０ｍＬ中に溶解する。試験試料が冷たい溶媒に溶解しない場合、フラスコを適当なコンデンサーに連結し、頻繁に振とうしながら、試料が溶解するまでゆっくりと加熱する。１ｍＬのフェノールフタレインＴＳを加え、そして３０秒間振とうした後、溶液がわずかにピンク色のままになるまで、０．１Ｎの水酸化ナトリウムＶＳで滴定する。どちらかの酸価を計算する。滴定に必要な０．１ＮのアルカリＶＳの容積が２ｍＬ未満であるなら、より希釈した滴定剤を使用し得、またはサンプルサイズを適宜調整し得る。その結果を、滴定剤の容積に関して、または等量の０．１Ｎの水酸化ナトリウムに関して表し得る。
【０１１９】
スクアレンの供給源に依存して、０．０３ｍｇＫＯＨ／ｇの酸価を得ることができる。
【０１２０】
（実施例４−スパイク試験）
多くのスパイク試験を行って、変性蒸留の効果を示した。
【０１２１】
変性蒸留によって除去された不純物のレベルを決定するために、スクアレン組成物に、特定の量の夾雑物（例えば水）およびスクアレンの考えられる分解産物（例えばホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、およびアセトン）を加えた（ｓｐｉｋｅ）。加えた溶液に、本発明による変性蒸留を行い、そして加えた種に関して分析した。
【０１２２】
４ｋｇのスクアレン組成物に、例えば０．３ｍＬ（０．２ｇ）のアセトアルデヒド（＞９９．５％純度）、０．３ｍＬ（０．２ｇ）のアセトン（＞９９．９％純度）、０．５５ｍＬの３７ｗｔ％水性溶液のホルムアルデヒド（０．２ｇ）および３．６５ｇの水を、実施例１で記載した変性蒸留の前に加えた。蒸留物を、３つの画分に収集し、そして加えた開始材料と共に、加えた種に関して分析した。結果を下記の表１に示す。
【０１２３】
【表１】
2013530941.tif 000003
【０１２４】
表１の結果は、アセトン、アセトアルデヒドおよびホルムアルデヒド濃度が全て、変性蒸留後に減少したことを示す。
【０１２５】
本発明は、単なる例によって説明され、そして本発明の範囲および精神の範囲内に留まりながら修飾を行い得ることが理解される。
【０１２６】
【数１】
2013530941.tif 000004
【０１２７】
【数２】
2013530941.tif 000005
【図１】
2013530941.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成25年1月9日(2013.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中油型エマルジョンアジュバントの製造のための方法であって、該方法は、
（ｉ）（ａ）温度Ｔ１で行う精製蒸留の工程、および（ｂ）温度Ｔ２で行う変性蒸留の工程を含むプロセスによって、動物供給源由来のスクアレンを含む組成物からスクアレンを調製する工程であって、ここで、工程（ａ）および工程（ｂ）は、いずれの順序においても実施され得、Ｔ１およびＴ２は、スクアレンを沸騰させるために十分であり、Ｔ２＞Ｔ１およびＴ２≧２００℃である、工程
（ｉｉ）工程（ｉ）において調製された該スクアレンを用いてエマルジョンを調製する工程
を含む、方法。
【請求項２】
水中油型エマルジョンアジュバントの製造のための方法であって、該方法は、
（ｉ）（ａ）温度Ｔ１で行う精製蒸留の工程、および（ｂ）温度Ｔ２で行う変性蒸留の工程を含むプロセスによって、スクアレンを含む組成物からスクアレンを調製する工程であって、ここで、工程（ａ）および工程（ｂ）は、いずれの順序においても実施され得、Ｔ１およびＴ２は、スクアレンを沸騰させるために十分であり、Ｔ１＜１４０℃およびＴ２≧２００℃である、工程
（ｉｉ）工程（ｉ）において調製された該スクアレンを用いてエマルジョンを調製する工程
を含む、方法。
【請求項３】
Ｔ１＜１４０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｉ）において調製された前記スクアレンが、蒸留処理の後、および工程（ｉｉ）における前記エマルジョンの調製の前に、無菌で維持される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉ）において使用される前記組成物が、１つまたはそれより多いタンパク質を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が、パルブアルブミンを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記変性蒸留が、０．５ｍｍＨｇ（６６．７Ｐａ）から５．０ｍｍＨｇ（６６６．６Ｐａ）の圧力で行われる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記精製蒸留が、７０℃から１００℃の温度で行われる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記精製蒸留が、０．５μｍＨｇ（６６．７ｍＰａ）から５μｍＨｇ（６６６．６ｍＰａ）の圧力で行われる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記精製蒸留が、前記変性蒸留の前に行われる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉ）において使用される前記組成物が、けん化に供される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
けん化が、スクアレンを含む前記組成物へのＮａＯＨまたはＫＯＨの添加を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ワクチン組成物を調製するための方法であって、請求項１から１２のいずれか一項に従ってエマルジョンを調製する工程、および該エマルジョンを抗原と組み合わせる工程を含む、方法。
【請求項１４】
ワクチンキットを調製するための方法であって、請求項１から１２のいずれか一項に従ってエマルジョンを調製する工程、および該エマルジョンを、キット成分として、抗原成分と共にキットにパッケージングする工程を含む、方法。
【請求項１５】
前記キット成分が、別個のバイアル中に存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記バイアルが、ホウケイ酸ガラスから作製されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原が、インフルエンザウイルス抗原である、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記エマルジョンおよび前記抗原の組み合わせが、ワクチン組成物を形成し、該ワクチン組成物が、インフルエンザウイルス１株あたり１５μｇ、１０μｇ、７．５μｇ、５μｇ、３．８μｇ、３．７５μｇ、１．９μｇ、または１．５μｇの赤血球凝集素を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記エマルジョンおよび前記抗原の組み合わせが、ワクチン組成物を形成し、該ワクチン組成物が、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノール保存剤を含む、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法によって得られた、水中油型エマルジョン。
【請求項２１】
水中油型エマルジョンアジュバントの製造のための方法であって、該方法は、スクアレンを用いてエマルジョンを調製する工程を含み、ここで、該スクアレンは、
（ｉ）（ａ）温度Ｔ１で行う精製蒸留の工程、および（ｂ）温度Ｔ２で行う変性蒸留の工程を含むプロセスであって、ここで、工程（ａ）および工程（ｂ）は、いずれの順序においても実施され得、Ｔ１およびＴ２は、スクアレンを沸騰させるために十分であり、Ｔ２＞Ｔ１およびＴ２≧２００℃である、プロセス、または、
（ｉｉ）（ａ）温度Ｔ１で行う精製蒸留の工程、および（ｂ）温度Ｔ２で行う変性蒸留の工程を含むプロセスであって、ここで、工程（ａ）および工程（ｂ）は、いずれの順序においても実施され得、Ｔ１およびＴ２は、スクアレンを沸騰させるために十分であり、Ｔ１＜１４０℃およびＴ２≧２００℃である、プロセス
のいずれかによって、動物供給源から調製されたものである、方法。
【請求項２２】
９９％またはそれを超えるスクアレンを含む組成物の再蒸留のための方法であって、該再蒸留は、温度Ｔ２で行う変性蒸留であり、ここで、Ｔ２≧２００℃である、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明はさらに、ワクチンにおける、本発明の方法によって調製したスクアレンの使用を提供する。
したがって本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）  動物供給源由来のスクアレンを含む組成物からスクアレンを調製するための方法であって、該方法は、
（ａ）温度Ｔ１で行う精製蒸留の工程；
（ｂ）温度Ｔ２で行う変性蒸留の工程
を含み、ここで、工程（ａ）および工程（ｂ）は、いずれの順序においても実施され得、Ｔ１およびＴ２は、スクアレンを沸騰させるために十分であり、Ｔ２＞Ｔ１およびＴ２≧２００℃である、方法。
（項目２）  スクアレンを含む組成物からスクアレンを調製するための方法であって、該方法は、
（ａ）温度Ｔ１で行う精製蒸留の工程；
（ｂ）温度Ｔ２で行う変性蒸留の工程
を含み、ここで、工程（ａ）および工程（ｂ）は、いずれの順序においても実施され得、Ｔ１およびＴ２は、スクアレンを沸騰させるために十分であり、Ｔ１＜１４０℃およびＴ２≧２００℃である、方法。
（項目３）  上記組成物が、１つまたはそれより多いタンパク質を含む、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）  上記組成物が、パルブアルブミンを含む、項目３に記載の方法。
（項目５）  上記変性蒸留が、０．５ｍｍＨｇから５．０ｍｍＨｇの圧力で行われる、前述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）  上記精製蒸留が、７０℃から１００℃の温度で行われる、前述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）  上記精製蒸留が、０．５μｍＨｇから５μｍＨｇの圧力で行われる、前述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）  上記精製蒸留が、上記変性蒸留の前に行われる、前述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）  スクアレンを含む上記組成物が、けん化に供される、前述の項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）  けん化が、スクアレンを含む上記組成物へのＮａＯＨまたはＫＯＨの添加を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）  ９９％またはそれを超えるスクアレンを含む組成物の再蒸留のための方法であって、該再蒸留は、温度Ｔ２で行う変性蒸留であり、ここで、Ｔ２≧２００℃である、方法。
（項目１２）  水中油型エマルジョンの製造のための方法であって、項目１から１１のいずれか一項に従って調製されたスクアレンを用いてエマルジョンを調製する工程を含む、方法。
（項目１３）  ワクチン組成物を調製するための方法であって、項目１２に従ってエマルジョンを調製する工程、および該エマルジョンを抗原と組み合わせる工程を含む、方法。
（項目１４）  ワクチンキットを調製するための方法であって、項目１２に従ってエマルジョンを調製する工程、および該エマルジョンを、キット成分として、抗原成分と共にキットにパッケージングする工程を含む、方法。
（項目１５）  上記キット成分が、別個のバイアル中に存在する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）  上記バイアルが、ホウケイ酸ガラスから作製されている、項目１５に記載の方法。
（項目１７）  上記抗原が、インフルエンザウイルス抗原である、項目１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）  上記エマルジョンおよび上記抗原の組み合わせが、ワクチン組成物を形成し、該ワクチン組成物が、インフルエンザウイルス１株あたり約１５μｇ、約１０μｇ、約７．５μｇ、約５μｇ、約３．８μｇ、約３．７５μｇ、約１．９μｇ、または約１．５μｇの赤血球凝集素を含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）  上記エマルジョンおよび上記抗原の組み合わせが、ワクチン組成物を形成し、該ワクチン組成物が、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノール保存剤を含む、項目１７または項目１８に記載の方法。
（項目２０）  項目１から１１のいずれか一項に記載の方法に従って調製された、スクアレン。
（項目２１）  項目２０に記載のスクアレンを含む、水中油型エマルジョン。
（項目２２）  項目２０に記載のスクアレンを含む、ワクチン。
（項目２３）  アジュバントおよび／またはワクチンにおける項目２０に記載のスクアレンの使用。
【国際調査報告】
2013530941.tif 000007
2013530941.tif 000008
2013530941.tif 000009