(57)【要約】多能性幹細胞の分化から心筋細胞を生成するための方法および組成物を提供する。例えば、ある態様において、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で、大体積の懸濁培養物中の多能性幹細胞を分化させることを含む方法を記載する。さらなる態様において、様々な幹細胞クローンおよび様々なバッチの培養培地間の変動性を克服する、幹細胞を心筋細胞に分化させるための方法を提供する。一実施形態において、心筋細胞の生成を増大するための方法が提供され、該方法は：ａ）凝集物形成を促進する条件下で懸濁培養物中の選択された細胞クローンからの多能性幹細胞をインキュベートするステップと、ｂ）選択されたバッチの培養培地から調製される心臓分化培地中で該幹細胞を心筋細胞に分化させるステップとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞の生成を増大するための方法であって、該方法は：
ａ）凝集物形成を促進する条件下で懸濁培養物中の選択された細胞クローンからの多能性幹細胞をインキュベートするステップと、
ｂ）選択されたバッチの培養培地から調製される心臓分化培地中で該幹細胞を心筋細胞に分化させるステップと
を含み、該培養培地中の１つまたは複数の分化因子のレベルを、該選択された細胞クローンの心臓分化および採用される培養培地バッチに好適であると決定された量に調整することによって、該分化培地は該培養培地から調製された、方法。
【請求項２】
前記選択された細胞クローンが人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞クローンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択された細胞クローンが接着培養物中の単一の多能性幹細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞増殖を促進する条件下で、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤を含む培地中で前記単一の多能性幹細胞をインキュベートすることを含むプロセスによって、前記選択された細胞クローンが単一の多能性幹細胞に由来する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
約１０６個から約１０１０個の前記多能性幹細胞をステップａ）における前記懸濁培養物中で最初にインキュベートする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
凝集物形成を促進する前記条件が、外部から添加されるＲＯＣＫ阻害剤、ミオシンＩＩ阻害剤、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、または肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ミオシンＩＩ阻害剤がブレビスタチンである、請求項４または６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
心臓分化の前に前記多能性幹細胞から形成された前記凝集物が直径約１０ｎｍから４００μｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞に分化させるための前記懸濁培養物が５ミリリットルから２５リットルまでの体積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記多能性幹細胞および／または該多能性幹細胞から分化した心筋細胞が１つまたは複数の導入遺伝子を含有している、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の導入遺伝子が、心筋細胞特異的なプロモーターの制御下の選択マーカーおよび／またはスクリーニング可能マーカーをコードしている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
分化した前記心筋細胞を富化または精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記心臓分化培地が、５ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌの量の外部から添加された線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記懸濁培養物が約１５ｒｐｍから１００ｒｐｍの速度で回転または振盪される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養培地が、ＴｅＳＲ、ｍＴｅＳＲ、ＲＰＭＩ培地、補充ＤＭＥＭ−Ｆ１２またはその希釈物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養培地中でそのレベルが調整されている前記分化因子が、骨形成タンパク質、アクチビンＡ／ノーダル、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ディックコップホモログ１（ＤＫＫ１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、および／または上皮増殖因子（ＥＧＦ）のシグナル伝達経路のモジュレーターの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記分化因子が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ１０、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤、アクチビンシグナル伝達阻害剤、またはこれらの組合せを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＢＭＰシグナル伝達阻害剤がドルソモルフィンを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アクチビンＡシグナル伝達阻害剤がＳＢ４３１５４２を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも９９％の心筋細胞を含む、約５×１０８から１０１０細胞の単離された細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００９年１０月１９日に出願された米国仮出願第６１／２５２，９１９号（この全内容は、参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。この出願の主題はまた、２０１０年１０月１９日に出願されたＵＳＳＮ第６１／３９４，５８９号（この全体の開示は、放棄することなくその全体が参考として本明細書に具体的に援用される）の主題にも関する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、概ね、幹細胞の発生の分野に関する。より具体的には、本発明は、多能性幹細胞からの心筋細胞の分化の誘導に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
心筋細胞は最終分化していると考えられている。小さな割合の心筋細胞には増殖能力があることがあるが、損傷し、または死滅した心筋細胞を十分に置き換えるにはこれでは十分ではない。心筋細胞の死は、例えば、冠状血管が血栓によって閉塞され、他の冠状血管から周囲の心筋に必要なエネルギー源が供給され得ない場合に起こる。機能的な心筋細胞の喪失は慢性心不全をもたらすことがある。
【０００４】
心筋細胞の増殖能力は、心筋損傷後の心臓を再生するのに十分ではない。様々なステージの虚血性心疾患を有する患者に対する従来の薬理学的治療により、心臓の機能、生存、および生活の質は改善される。しかし、虚血性心疾患は米国および欧州において依然として最も生命を脅かす疾患であり、したがって虚血性心疾患を有する患者に対する臨床成績をさらに改善するのに代替治療が必要である。近年、骨格筋芽細胞、成体心筋幹細胞、骨髄幹細胞、および胚性幹細胞などの移植に対する可能性のある細胞源の数の増大によって刺激されて、細胞置換療法に対する焦点が強化されている。
【０００５】
「正常な」心臓機能を復旧するのに可能性のある経路は、新しい機能的な心筋細胞による、損傷または死滅した心筋細胞の置換である。多能性幹細胞、例えば、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞は、心筋細胞の置換に対して可能性のある細胞の源である。多能性幹細胞の心筋細胞への分化は、自発的に、または誘導時のいずれかに達成され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、多能性幹細胞から心筋細胞系統の細胞を大幅に豊富にした集団を得るパラダイムの開発の途上には数々の障害が立ちはだかっている。霊長類起源の多能性細胞の相対的な脆弱性、これらの培養における困難、培養環境中に存在する様々な因子に対するこれらの繊細な感受性および依存性、ならびに分化方法の低い効率および広い変動性の結果として起こるものもある。したがって、特に大規模に生成するために、多能性幹細胞の心筋細胞への分化の誘導を改善する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、臨床応用における必要性を満たすための、特に大規模かつ高効率の生成のための、多能性幹細胞を心筋に分化させるための方法を提供することによって、当技術分野における主要な欠陥を克服するものである。
【０００８】
多能性幹細胞を分化させるための手順は、特異的な増殖因子の添加によるなど特定の系統の発生を推進するｉｎ  ｖｉｖｏの環境を模倣しようとする培養条件を使用するのが好ましい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させた場合、１）細胞自体からの内因性の発現、２）その中で多能性幹細胞が培養され、および／または引き続き分化させられる血清および／または培地（非限定的な例として、ＴｅＳＲ、ｍＴｅＳＲ、ＲＰＭＩ培地、補充ＤＭＥＭ−Ｆ１２またはその希釈物が含まれる）、ならびに３）外因性の増殖因子の添加を含めた数々の源が増殖因子の環境に寄与する。増殖因子の内因性の発現に関して、本発明者らは、クローン毎の変動性および細胞の一次培養物における違いによる変動性を認めている。さらに、本発明者らは、多能性幹細胞の培養および分化において用いられる培養培地の増殖因子含量におけるバッチ毎の変動性が（ときには劇的に）存在し、培養も分化も細胞系統の分化に対する予測不可能性を導入することを決定している。
【０００９】
多能性幹細胞の分化の手順における前述の変動性を是正するために、本発明者らは、所与の分化培養物中の増殖因子の環境に寄与する全ての源の説明となる技術を開発し、これらの源は最適の分化を達成するために、用いられる各バッチまたは培地のロットに対して、および各々の個々の幹細胞クローンに対して独立に「バランスが取れている」。これは、発生上のシグナル伝達経路を変調するための分化因子の添加によって達成され得る。例として、１）ある経路におけるシグナルの合計を低減するためのアンタゴニストの添加、２）ある経路のシグナルの合計を増大するためのアゴニストの添加、または３）シグナルを最適化するためのアゴニストおよびまたはアンタゴニストの組合せが含まれる。
【００１０】
心筋細胞の生成を増大するために、凝集物形成を促進する条件下で懸濁培養物中の選択された細胞系から多能性幹細胞をインキュベートし、選択されたバッチの培養培地から調製された心臓分化培地中で幹細胞を心筋細胞に分化させることを含む方法を提供する。例えば、培養培地は、ＴｅＳＲ、ｍＴｅＳＲ、またはＲＰＭＩ培地、補充ＤＭＥＭ−Ｆ１２またはその希釈物である。心筋細胞の分化の場合、理論によって拘泥しようとするものではないが、ＴＧＦβシグナル伝達経路が、最適の心臓分化の条件を達成するためにある種の増殖因子の外部からの添加を調整することによって細かく制御され得ることが企図される。特に、ＢＭＰシグナル伝達およびアクチビンシグナル伝達は、用いられる特定のバッチの培地および多能性細胞クローンの（例えば、ｉＰＳ系からの）特定のバッチに最適化され得る２つの例示のＴＧＦβシグナル伝達経路である。２つのシグナル伝達経路間の相対的な活性比は、最適の心筋細胞分化条件にとって重要であり得る。このように、分化因子は、ＢＭＰシグナル伝達および／またはアクチビンシグナル伝達の正のモジュレーターまたは阻害剤を含み得る。例えば、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤はドルソモルフィンを含み、アクチビンシグナル伝達阻害剤はＳＢ４３１５４２を含む。
【００１１】
このように、本発明のいくつかの態様によると、心臓分化培地は、培養培地中の１つまたは複数の分化因子のレベルを、選択された細胞クローンまたは細胞系の心臓分化および使用される培養培地バッチに好適であると決定される量に調整することによって、培養培地から調製される。特定の態様において、選択された細胞クローンは人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞クローンである。本明細書下記（実施例８）に記載するのは、あらゆる所与の培地のバッチおよび使用される多能性細胞クローンに対して添加すべき好適な量の増殖因子を別々に決定するための例示の手順である。特定の培地のバッチおよび細胞クローンに対して調整が決定された後、調整は分化の手順中に組み入れられ、各々のバッチおよびクローンに誂えられた高度に再現性のある分化手順を提供する。
【００１２】
選択された細胞クローンは接着培養物または懸濁培養物中の単一の多能性幹細胞に由来するのが典型的である。例えば、選択された細胞クローンが、例えばＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤を含む培地中で、細胞の増殖を促進する条件下、単一の多能性幹細胞をインキュベートすることを含むプロセスによって、単一の多能性幹細胞に由来するのが好ましい。このようなミオシンＩＩ阻害剤はブレビスタチン（ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ）であってよい。多能性幹細胞の出発数は、少なくとも、もしくは多くても約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０細胞であってよく、またはこれらに由来するあらゆる範囲であってよい。
【００１３】
ある態様において、凝集物形成を促進する条件は、外部から添加されるＲＯＣＫ阻害剤、ミオシンＩＩ阻害剤、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、または肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（ＨＧＦ）を含む。多能性幹細胞から形成される凝集物は、少なくとも、または多くて直径約５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００μｍであってよい。直径は、平均の（ｍｅａｎ）、中央の、または平均の（ａｖｅｒａｇｅ）直径であってよい。懸濁培養物は、少なくとも、または多くて約２ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２００ｍｌ、５００ｍｌ、１リットル、３リットル、５リットル、１０リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットルの体積を有していてよく、またはバイオリアクター中など、これらに由来するあらゆる範囲であってよい。
【００１４】
心臓分化培地は、外部から調整される線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子、または用いられ、もしくはスクリーニングされるあらゆる分化因子も含み得る。このようなＦＧＦ、またはＴＧＦβシグナル伝達モジュレーターなどの他の分化因子は、少なくとも、または多くても約０．１、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１５０、２００ｎｇ／ｍｌの量、またはこれらに由来するあらゆる範囲であってよい。
【００１５】
所望の細胞を選択または富化するために、多能性幹細胞および／または多能性幹細胞から分化した心筋細胞は、１つまたは複数の導入遺伝子を含んでいてよい。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子は、心筋細胞特異的なプロモーターの制御下で選択マーカーおよび／またはスクリーニング可能マーカーをコードしている。方法は分化した心筋細胞を富化する、または精製することをさらに含み得る。
【００１６】
ある態様において、培養培地中でそのレベルを調整された分化因子は、骨形成タンパク質のシグナル伝達経路のモジュレーター、アクチビンＡ／ノーダル、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ディックコップ（ｄｉｃｋｋｏｐｆ）ホモログ１（ＤＫＫ１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（ＩＧＦ）、および／または上皮増殖因子（ＥＧＦ）の１つまたは複数を含む。例えば、分化因子は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ１０、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤、アクチビンシグナル伝達阻害剤、またはこれらの組合せを含み得る。特に、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤はドルソモルフィンを含むことができ、アクチビンＡシグナル伝達阻害剤はＳＢ４３１５４２を含み得る。
【００１７】
ある態様において、分化培地は、心筋細胞の分化用など、１つまたは複数の分化因子の添加の量を調整することによって、選択されたバッチの培養培地から調製することができた。さらなる態様において、分化培地は、やはり心筋細胞の分化用など、１つまたは複数の分化因子の添加のタイミングを調整することによって、選択されたバッチの培養培地から調製することができた。
【００１８】
あらゆる所与の培地バッチおよび使用される多能性細胞クローンに添加しなければならない増殖因子の好適な量および／またはタイミングを別々に決定することを伴う方法も提供する。特定の培地バッチおよび細胞クローンに対して調整が決定された後、調整は分化手順中に組み入れられ、各バッチおよびクローンに誂えた高度に再現性のある分化手順を提供する。
【００１９】
ある態様において、方法は、心筋細胞など、選択された系統に分化させるのに好適な１つまたは複数の分化因子の添加の量を決定することを含み得る。この決定は、試験期間の間に様々な量の分化因子を添加した選択されたバッチからの培養培地中の選択されたクローンからの細胞の分化を試験することを含み得る。例えば、試験期間の間に様々な量の分化因子を加えることができる。試験期間は、分化因子の特定の濃度の試験条件に対して同じであっても、または変化してもよい。例えば、試験期間は、分化前約１、２、３、４、５、６、７日、または分化後１、２、３、４、５日から始まり、分化後６、７、８、９、１０、１１、１２、もしくは１３日目に終了することができる（あらゆる中間の期間も含まれてよい）。同じ濃度の分化因子を、毎日、または２、４、８、１６、２４、４８時間毎、またはあらゆる中間の間隔で変えることができる。
【００２０】
このような様々な量の分化因子は、様々な比率のＢＭＰ／アクチビンシグナル伝達活性での条件を含み得る。これは、ＢＭＰ、アクチビン、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤、および／またはアクチビンシグナル伝達阻害剤の量を変化させることによって実現され得る。例えば、この変動は以下の様々な条件の１つまたは複数を含み得る：様々な濃度のＢＭＰ４単独、様々な濃度のアクチビンＡ単独、様々な濃度のＢＭＰシグナル伝達阻害剤、様々な濃度のアクチビンシグナル伝達阻害剤、ならびに様々な濃度のＢＭＰ４およびアクチビンＡの組合せ。
【００２１】
心筋細胞の好適な分化条件を決定するために、試験は、各条件に対する中胚葉または心筋細胞の分化効率を測定し、最高の分化効率を有する条件を、選択された多能性幹細胞クローンが心筋細胞に分化するのに、および使用される培養培地の選択されたバッチに好適であるとして選択することをさらに含み得る。分化効率の測定は、分化後少なくとも、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日、またはあらゆる中間の時間範囲に、中胚葉マーカーの発現を測定することを含み得る。中胚葉マーカーの非限定的な例には、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲ−ａ、ＣＸＣＲ４、ＣＫＩＴｎｅｇｔｉｖｅ、Ｎ−カドヘリン、および／またはＭＥＳＰ１が含まれる。他の態様において、分化効率の測定は、分化後約、または少なくとも１４日の心筋細胞マーカーの発現を測定することを含む分化効率の測定を含み得る。好適な条件を選択した後、方法は、選択されたバッチの培養培地から調製された分化培地中で幹細胞を心筋細胞に分化させることを含むことができ、分化培地は試験期間の間に選択された条件下、選択されたバッチの培養培地から調製された。
【００２２】
少なくとも、または約９０％（例えば、少なくとも、もしくは約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくはこれらに由来するあらゆる範囲）の心筋細胞を含む、少なくとも、または約１０６、１０７、１０８、５×１０８、１０９、１０１０細胞（もしくはこれらに由来するあらゆる範囲）の単離された細胞集団も提供することができる。
【００２３】
ある一実施形態において、ａ）懸濁培養物が凝集物促進培地を含む、凝集物形成を促進する条件下、懸濁培養物中で多能性幹細胞をインキュベートし、ｂ）次いで、心臓分化に適する懸濁培養物中で幹細胞を心筋細胞に分化させることを含む、心筋細胞の生成を増大するための方法も提供することができる。例えば、心臓分化に適する懸濁培養物の体積は５ミリリットルを超えてよい。凝集物促進培地はＲｈｏ関連（ＲＯＣＫ）阻害剤を含むことができ、ある態様において、ＲＯＣＫ阻害剤はＲＯＣＫ特異的阻害剤であってよい。
【００２４】
「生成の増大」の語は、別段の指摘がなければ、細胞の絶対数における増加を意味してもよく、または非心筋細胞の細胞に比べた心筋細胞のパーセント値における増大を意味してもよく、または両方でもよい。いくつかの実施形態において、方法は、心筋細胞の絶対数における増大に関係することができることが企図される。他の実施形態において、方法は心筋細胞のパーセント値における増大に関係してよい。さらなる実施形態において、心筋細胞の絶対数およびパーセント値両方における増大が存在してよい。
【００２５】
さらなる一態様において、方法は、ｃ）凝集物が形成した後、および／または分化後、複数の懸濁培養物をプールし、ｄ）心筋細胞を富化することをさらに含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、方法は、心筋細胞を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはこれらに由来するあらゆるパーセント値を含む、少なくとも、または約１０７、１０８、１０９、または最高約１０１０細胞（もしくはこれらに由来するあらゆる範囲）の細胞集団をもたらす。
【００２７】
別の一実施形態において、ａ）多能性幹細胞の凝集物を含む多能性幹細胞集団を得、ｂ）幹細胞を心筋細胞に分化させる心臓誘導培地（ＣＩＭとも呼ばれる）を含む懸濁培養物中で多能性幹細胞をインキュベートすることを含む、心筋細胞を調製するための方法が存在する。心臓誘導培地は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）など、幹細胞を心筋細胞に分化させるのに有効な１つまたは複数の心臓誘導剤を含み得る。方法は、心筋細胞の大規模な生成に特に適する。多能性幹細胞の凝集物は懸濁培養物中で形成されてよく、懸濁培養物は、バイオリアクター中など、約０．５ｍｌと約２５リットルの間であってよい。いくつかの実施形態は、標準のペトリ皿または９６ウエルプレートより体積の大きい空間における細胞の増殖を伴い、その結果いくつかの実施形態はこのような容器の使用を除外する。
【００２８】
本発明のある実施形態において、心筋細胞の大規模な生成を実行することができる。本明細書で用いられる「大規模」は、少なくとも１．０×１０６細胞／ｍｌの濃度を有する少なくとも５００ｍｌの体積の細胞培養物の使用を意味する。体積は、少なくとも、または約５００ｍｌ、６００ｍｌ、７００ｍｌ、８００ｍｌ、１リットル、２リットル、３リットル、５リットル、１０リットル、２０リットル、もしくは最高２５リットルであってよく、またはバイオリアクター中など、これらに由来するあらゆる範囲であってよい。懸濁培養物中の細胞濃度は、少なくとも、または約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０細胞／ｍｌであってよく、またはこれらに由来するあらゆる範囲であってよい。細胞は、これらを凝縮し、および／または細胞培養物の体積を低減するなどによって、生成後に操作されてよい。
【００２９】
ある態様において、心筋細胞を大規模に生成するために、懸濁培養物は、少なくとも、または約１０、１５、２０、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００ｒｐｍ、またはこれらに由来するあらゆる範囲の速度で動かすことができる。運動は、非限定的な例として、撹拌、振盪、または回転を含み得る。
【００３０】
多能性幹細胞は１つまたは複数の導入遺伝子を含むことができ、例えば、方法のあらゆるステップを、トランスジェニック細胞を選択するための条件下で行うことができる。さらなる一態様において、心筋細胞は、ＦＧＦの添加を欠く心臓維持培地中でインキュベートしてもよい。上記に記載したステップｂ）など、本発明のステップは、少なくとも１、２、３、４、５、６日、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５週、もしくは最高１０６日、またはこれらに由来するあらゆる時間の範囲続くことができる。さらなる態様において、方法は、ｃ）凝集物が形成した後、および／または分化後、複数の懸濁培養物をプールし、ｄ）心筋細胞に対して濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（もしくはこれらに由来するあらゆる範囲）の心筋細胞を含む、少なくとも、または約１０７、１０８、１０９、または最高約１０１０細胞（もしくはこれらに由来するあらゆる範囲）の細胞集団をもたらす。
【００３１】
他の実施形態は、ａ）凝集物形成を促進する条件下、ＲＯＣＫ阻害剤およびＦＧＦを含む凝集物促進培地を含む５ミリリットルを超える懸濁培養物中でトランスジェニックｉＰＳ細胞の集団を増殖させ、ｂ）次いで、心筋細胞の分化を促進する条件下、ＦＧＦを含む心臓誘導培地を含む懸濁培養物中でｉＰＳ細胞を心筋細胞に分化させることを含む心筋細胞を調製するための方法に関する。ある態様において、トランスジェニックｉＰＳ細胞の集団は、単一のトランスジェニックｉＰＳ細胞にクローン的に由来してよい。さらなる一態様において、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（もしくはこれらに由来するあらゆる範囲）を含む少なくとも、または約１０７、１０８、１０９、または最高約１０１０細胞（もしくはこれらに由来するあらゆる範囲）の細胞集団の心筋細胞が上記に記載した方法によって生成され、方法は、ｃ）凝集物が形成した後および／または分化した後複数の懸濁培養物をプールし、ｄ）心筋細胞に対して濃縮することをさらに含む。
【００３２】
ある種のさらなる実施形態において、方法は、心筋細胞を生成または調製するための出発材料として多能性幹細胞を伴い、これらは胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹細胞、または体細胞の核移植によって由来する胚性幹細胞であってよい。ある一態様において、多能性幹細胞は、単一の多能性幹細胞にクローン的に由来していてよく、単細胞にクローン的に由来する細胞の実質的な部分を含んでいてよく、または細胞の複数の集団のプールであってよく、この場合、細胞の各集団は単細胞にクローン的に由来する。単細胞から多能性幹細胞を得るための例示の一プロセスは、細胞の増殖を促進する条件下、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で単一の多能性幹細胞をインキュベートすること、例えば、接着培養物条件下でインキュベートすることを含み得る。ステップａ）において凝集物を形成するために懸濁培養物中で多能性幹細胞を増殖させる前に、単一の多能性幹細胞を開始源として、１回、２回、３回、４回、または好ましくは少なくとも５回継代してもよい。別の一態様において、多能性幹細胞は、単細胞を超えて含むｉＰＳ細胞集団に由来してもよい。
【００３３】
なおさらなる態様において、約１０７個から約１０１０個の多能性幹細胞を、凝集物を形成するために、ステップａ）における懸濁培養物中で最初にインキュベートしてもよい。多能性幹細胞の凝集物は、ＲＯＣＫ阻害剤を含む凝集物促進培地と多能性幹細胞をインキュベートすることによって形成されてよく、ＲＯＣＫ阻害剤は、少なくとも、または約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．８、１、１．５、２、２．５、５μＭ、またはこれらに由来するあらゆる範囲を含めた細胞の増殖もしくは生存を促進するのに有効なあらゆる濃度など、約０．０５から約５μＭであってよい。
【００３４】
ある態様において、凝集物促進培地など、培養培地は、例えば、少なくとも、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、１８０、２００ｎｇ／ｍｌ、またはこれらに由来するあらゆる範囲など、約５ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌの濃度の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含み得る。場合により、例えば、少なくとも、または約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、１８０、２００ｎｇ／ｍｌ、またはこれらに由来するあらゆる範囲の濃度の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）も含まれていてよい。
【００３５】
凝集物促進培地は、心筋細胞の濃縮または選択に用いられ得るゼオシンなどの抗生物質をさらに含み得る。分化前に多能性幹細胞によって形成される凝集物は、直径少なくとも、または約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００μｍ（もしくはこれらに由来するあらゆる範囲）であってよく、別の一態様において、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、８０％、９０％、９５％、または９９％（もしくはこれらに由来するあらゆる範囲）の凝集物が、少なくとも、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００細胞、またはこれらに由来するあらゆる範囲を含み得る。ある態様において、実質的な部分（例えば、約５０％、８０％、９０％、９５％、９９％を超えて、もしくはこれらに由来するあらゆる範囲）の凝集物が直径約８０から２００μｍである。分化は、凝集サイズを変えることによって操作され得る空間的な手がかり、および様々な細胞型の間の相互作用によって導かれるので、凝集物のサイズの最適な範囲がほぼ均一であれば、心筋細胞の分化を助けることができる。
【００３６】
心臓分化のステップにおけるように、幹細胞を分化させるための懸濁培養物は、ＦＧＦを有する心臓誘導培地など、心臓分化に適するあらゆる心臓誘導培地を含むことができ、これらは少なくとも、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、１８０、２００ｎｇ／ｍｌ、またはこれらに由来するあらゆる範囲など、約５から約２００ｎｇ／ｍｌの濃度を有することができる。さらなる一態様において、分化のための懸濁培養物、または心臓誘導培地は、ＲＯＣＫ阻害剤の添加を含まなくてよい。
【００３７】
ある一態様において、上記に記載したあらゆる方法のステップａ）またはｂ）におけるこのような懸濁培養物は、少なくとも、または約２ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２００ｍｌ、５００ｍｌ、１リットル、３リットル、５リットル、１０リットル、２０リットル、もしくは最高２５リットルであってよく、またはバイオリアクター中など、これらに由来するあらゆる範囲であってよい。方法の実施形態は、ステップａ）の後など、複数の懸濁培養物をプールすることをさらに含み得る。例えば、凝集した細胞の複数の懸濁培養物を幹細胞の分化の前にプールしてもよく、または心筋細胞など、分化した幹細胞の複数の懸濁培養物をプールしてもよい。
【００３８】
いくつかのさらなる態様において、トランスジェニックｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、選択マーカーをコードする導入遺伝子など、１つまたは複数の導入遺伝子を含むことができ、この導入遺伝子は、例えば、抗生物質耐性、またはスクリーニング可能マーカー（蛍光もしくは発光でもよい）を付与する。凝集物促進培地または心臓誘導培地は、導入遺伝子を発現する細胞の選択を可能にする抗生物質を含み得る。心筋細胞を選択または濃縮するために、導入遺伝子は組織特異的プロモーターの制御下であってよく、この場合組織特異性は心筋細胞に対するものである。
【００３９】
さらに、ある態様において、方法は分化した心筋細胞の濃縮または精製をさらに含み得る。ある一実施形態において、心筋細胞は１つまたは複数の選択可能な、またはスクリーニング可能な導入遺伝子を発現することができ、導入遺伝子は心筋細胞の濃縮または精製に用いられてよい。例えば、導入遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であってよい。心筋細胞の濃縮または単離のために、このような導入遺伝子は、ミオシンプロモーターまたはトロポニンＴプロモーターなど、心筋細胞に特異的であるプロモーターの制御下にあってよい。
【００４０】
さらなる実施形態は、少なくとも９０％（例えば、少なくとも、もしくは約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくはこれらに由来するあらゆる範囲）のトランスジェニック心筋細胞を含む、少なくとも、または約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０細胞（もしくはこれらに由来するあらゆる範囲）の単離された細胞集団を提供する。特定の一例において、細胞集団は、心筋細胞に特異的なプロモーターの下で導入遺伝子を含み得る。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ａ）トランスジェニック人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から細胞集団を得、ｂ）凝集物形成を促進する条件下、ＲＯＣＫ阻害剤およびＦＧＦを有する凝集物形成培地を含む５ミリリットルから２５リットルの少なくとも１つの懸濁培養物中でトランスジェニックｉＰＳ細胞の集団を増殖させ、ｃ）場合により、ｉＰＳ細胞凝集物を含む複数の懸濁培養物をプールし、ｄ）次いで、ＦＧＦを有する心臓誘導培地を含む懸濁培養物中、プールしたｉＰＳ細胞凝集物を心筋細胞に分化させ、ｅ）心筋細胞に対して濃縮することを含む、少なくとも９０％（例えば、少なくとも、または約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくはこれらに由来するあらゆる範囲）を含む、少なくとも、または約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０細胞（もしくはこれらに由来するあらゆる範囲）の細胞集団が存在することができる。
【００４２】
本発明の方法および／または組成物の状況において論じる実施形態は、本明細書に記載するあらゆる他の方法または組成物に関して使用することができる。したがって、１つの方法または組成物に関する実施形態を、本発明の他の方法および組成物にも適用することができる。
【００４３】
核酸に関して本明細書で用いられる、「コードする」または「コードしている」の語は、本発明が当業者によって容易に理解されるように用いられるが、これらの語は、それぞれ「含む」または「含んでいる」と交換可能に用いられてよい。
【００４４】
本明細書の明細書で用いられる「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は１つまたは複数を意味することができる。本明細書の請求項（１つまたは複数）で用いられる通り、「含んでいる」という言葉と組み合わせて用いられる場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は１つ、または１つを超えるものを意味することができる。
【００４５】
特許請求の範囲における「または」の語の使用は、代替物のみを意味するように明確に指摘されなければ、または代替物が相互に排他的でなければ、「および／または」を意味するように用いられるが、本開示は代替物および「および／または」のみを意味する定義を支持するものである。本明細書で用いられる「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は少なくとも２番目またはそれを超えて意味することができる。
【００４６】
本出願を通して「約」の語は、値が装置に固有の誤差変動を含むことを示すために用いられ、方法は値、または試験対象間に存在する変動を決定するのに用いられる。
【００４７】
本発明の他の目的、特徴、および利点は以下の発明を実施するための形態から明らかになるであろう。しかし、この発明を実施するための形態から本発明の精神および範囲内で様々な変更および改変が当業者には明らかになるので、発明を実施するための形態および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、例示のみによって示されることを理解されたい。
【００４８】
以下の図面は本明細書の一部分を形成し、本発明のある態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に表す特定の実施形態の発明を実施するための形態と組み合わせて、これらの図面の１つまたは複数を参照することによってより理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、クエン酸ナトリウム細胞分割／ダブルスタックのスケールアップ実験デザインを示す図である。
【図２】図２Ａ〜ＣはｉＰＳ６．１およびｉＰＳ６．１ＭＲＢに対する倍加時間を示す図である。これらのグラフは、ｉＰＳ６．１およびｉＰＳ６．１ＭＲＢの両方に対する、ディスパーゼ分割したＴ１５０対照細胞およびクエン酸ナトリウム分割したダブルスタック細胞の倍加時間を示す。
【図３】図３は、クエン酸ナトリウムでのダブルスタック分割において維持されたｉＰＳ６．１およびｉＰＳ６．１ＭＲＢ両方のＭＲＢに対して行った核型試験の結果を示す図である。図１Ａ〜Ｂ：ＵＬＡ  Ｔ７５またはＴ２５フラスコのマーキング。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、ダブルスタック（ＤＳ）およびＴ１５０フラスコ中ＩＰＳ６．１細胞から形成された凝集物（１４日目）を示す図である。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、ダブルスタック（ＤＳ）におけるＩＰＳ６．１ＭＲＢ細胞から形成された凝集物（１４日目）を示す図である。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、Ｔ１５０フラスコ中ＩＰＳ６．１ＭＲＢ細胞から形成された凝集物（１４日目）を示す図である。
【図７】図７Ａ〜Ｃは、ＤＳからの、第２ラウンドのｉＰＳ  ＭＲＢ１４日目の凝集物を示す図である。
【図８】図８Ａ〜Ｃは、ディスパーゼおよびクエン酸ナトリウム細胞分割両方での４継代または７継代後のｉＰＳ６．１およびｉＰＳ６．１ＭＲＢ細胞のフローサイトメトリー多能性分析を示す図である。
【図９】図９は、Ｔ１５０フラスコ（対照）およびクエン酸ナトリウムを含むダブルスタックにおける、ディスパーゼで継代したｉＰＳ６．１およびｉＰＳ６．１ＭＲＢ細胞から産生された心筋細胞の細胞データを編集した図である。
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、フラスコ中供給線の印付けを示す図である。
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、フラスコからの培地の吸引を示す図である。
【図１２】図１２は、ＩＰＳ単細胞密度実験デザインを示す図である。
【図１３】図１３Ａ〜Ｂは、凝集物中に組み入れられた開始のｉＰＳ細胞の計数を示す図である。
【図１４】図１４Ａ〜Ｅは、ｃＴＮＴ染色による、分化した心筋細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１５】図１５Ａ〜Ｄは、異なる開始のｉＰＳ細胞密度から分化した心臓細胞の計数を示す図である。
【図１６】図１６Ａ〜Ｃは、回転培養におけるｉＰＳ細胞を示す画像である。
【図１７】図１７Ａ〜Ｄは、細胞凝集物を示す画像である。
【図１８】図１８は、Ｈ１１５２における心筋細胞形成のための単細胞凝集物形成の実験デザイン１を示す図である。
【図１９】図１９は、ディスパーゼと一緒に維持された細胞を用いた心筋細胞の形成のための凝集物形成の実験デザイン２を示す図である。
【図２０】図２０は、Ｈ１１５２における心筋細胞形成のための単細胞凝集物形成の実験デザイン１からの凝集物形成を示す画像である。
【図２１】図２１は、ディスパーゼと一緒に維持された細胞を用いた心筋細胞の形成のための凝集物形成の実験デザイン２からの凝集物形成を示す画像である。
【図２２】図２２は、Ｈ１１５２の試験期間および凝集物の形成の実験１を示す図である。
【図２３】図２３は、Ｈ１１５２の試験期間および凝集物の形成の実験２を示す図である。
【図２４】図２４Ａ〜Ｊは、分化１４日目の凝集物数における差を示す実験１からの画像を示す図である。図２４Ａは、１日のＨ１１５２での３ｅ５細胞／ｍｌの開始の接種を示す図である。図２４Ｂは、２日のＨ１１５２での３ｅ５細胞／ｍｌの開始の接種を示す図である。図２４Ｃは、１日のＨ１１５２での５ｅ５細胞／ｍｌの開始の接種を示す図である。図２４Ｄは、２日のＨ１１５２での５ｅ５細胞／ｍｌの開始の接種を示す図である。図２４Ｅは、１日のＨ１１５２での７ｅ５細胞／ｍｌの開始の接種を示す図である。図２４Ｆは、２日のＨ１１５２での７ｅ５細胞／ｍｌの開始の接種を示す図である。図２４Ｇは、１日のＨ１１５２での１０ｅ５細胞／ｍｌの開始の接種を示す図である。図２４Ｈは、２日のＨ１１５２での１０ｅ５細胞／ｍｌの開始の接種を示す図である。図２４Ｉは、１日のＨ１１５２での１５ｅ５細胞／ｍｌの開始の接種を示す図である。図２４Ｊは、２日のＨ１１５２での１５ｅ５細胞／ｍｌの開始の接種を示す図である。
【図２５】図２５は、４８時間Ｈ１１５２を含む条件下の心臓細胞生成に対するＨ１１５２の利点を示す繰返し結果を示す図である。
【図２６】図２６は、Ｈ１１５２に長時間曝露すると、独立のメカニズムによるものではなく、細胞密度によって純度に影響を及ぼすことを示唆する、実験１からの最終の細胞計数および純度のプロットを示す図である。
【図２７】図２７は、Ｈ１１５２に長時間曝露すると、独立のメカニズムによるものではなく、細胞密度によって純度に影響を及ぼすことを示唆する、実験２からの最終の細胞計数および純度のプロットを示す図である。
【図２８】図２８は、ＩＰＳ６．１細胞に対して１日量のＨ１１５２を投与した、細胞の生存に対する、様々な濃度のＨ１１５２の効果を示す図である。
【図２９】図２９Ａ〜Ｂは、様々な濃度のＨＧＦおよびＦＧＦの存在下のｉＰＳ細胞の心臓誘導を示す図である。ＨＧＦ濃度の関数としての心筋細胞の収量およびｉＰＳ細胞の変換効率。エラーバーは、１つの実験におけるｎ＝３のＴ２５フラスコに対するＳＥＭ（平均値の標準誤差）を表す。
【図３０】図３０Ａ〜Ｂは、様々な濃度のＨＧＦおよびＦＧＦの存在下のｉＰＳ細胞の心臓誘導を示す図である。エラーバーは、１つの実験におけるｎ＝３のＴ２５フラスコに対するＳＥＭを表す。
【図３１Ａ】図３１Ａ〜Ｃは、ＨＧＦ濃度の関数としての、心筋細胞収量（図３１Ａ）、Ｈ９−ＴＧＺ細胞変換効率比（図３１Ｂ）、およびＣＭ純度（図３１Ｃ）を示す図である。各点は、凝集物形成の効率が低いことによる、２日目の複数のＴ２５フラスコからまとめた１本のＴ２５フラスコを表す。
【図３１Ｂ】図３１Ａ〜Ｃは、ＨＧＦ濃度の関数としての、心筋細胞収量（図３１Ａ）、Ｈ９−ＴＧＺ細胞変換効率比（図３１Ｂ）、およびＣＭ純度（図３１Ｃ）を示す図である。各点は、凝集物形成の効率が低いことによる、２日目の複数のＴ２５フラスコからまとめた１本のＴ２５フラスコを表す。
【図３１Ｃ】図３１Ａ〜Ｃは、ＨＧＦ濃度の関数としての、心筋細胞収量（図３１Ａ）、Ｈ９−ＴＧＺ細胞変換効率比（図３１Ｂ）、およびＣＭ純度（図３１Ｃ）を示す図である。各点は、凝集物形成の効率が低いことによる、２日目の複数のＴ２５フラスコからまとめた１本のＴ２５フラスコを表す。
【図３２Ａ】図３２Ａ〜Ｃは、ＨＧＦ濃度の関数としての、心筋細胞収量（図３２Ａ）、Ｈ９−ＴＧＺ細胞変換効率比（図３２Ｂ）、およびＣＭ純度（図３２Ｃ）を示す図である。エラーバーは、１つの実験におけるｎ＝３のＴ２５フラスコに対するＳＥＭを表す。
【図３２Ｂ】図３２Ａ〜Ｃは、ＨＧＦ濃度の関数としての、心筋細胞収量（図３２Ａ）、Ｈ９−ＴＧＺ細胞変換効率比（図３２Ｂ）、およびＣＭ純度（図３２Ｃ）を示す図である。エラーバーは、１つの実験におけるｎ＝３のＴ２５フラスコに対するＳＥＭを表す。
【図３２Ｃ】図３２Ａ〜Ｃは、ＨＧＦ濃度の関数としての、心筋細胞収量（図３２Ａ）、Ｈ９−ＴＧＺ細胞変換効率比（図３２Ｂ）、およびＣＭ純度（図３２Ｃ）を示す図である。エラーバーは、１つの実験におけるｎ＝３のＴ２５フラスコに対するＳＥＭを表す。
【図３３】図３３Ａ〜Ｄは、様々な濃度のＢＭＰ（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ）、ドルソモルフィン（２ｕＭ、０．２ｕＭ）、アクチビンＡ（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＢ−４３１５４２（１０ｕＭ、０．１ｕＭ）、およびアクチビンＡ（６ｎｇ／ｍＬ）とＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）との組合せを利用した増殖因子／阻害剤のスクリーニングの結果を示す図である。図３３Ｃは培養物１５ｍｌに対する実際のデータであり、図３３Ｄは図３３Ｃのデータに基づいて計算した１Ｌスケールアップ（生成用の計画として）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
Ｉ．方法および組成物
様々な異なる方法および組成物を本明細書に記載する。ある実施形態は、心筋細胞を生成するプロセスを改善するいくつかの重要な利点に関するものである。まず第一に、凝集物のサイズを懸濁培養物中で制御できることが発見され、これにより、最適の回転速度、接種濃度、および／または心臓の誘導までの時間などによる心臓の誘導に最適な条件が提供される。いくつかの実施形態において、このような方法は分化細胞の均一性および収量を増大する。第二に、ＲＯＣＫ阻害剤が懸濁培養物と組み合わされて、バイオリアクターなど大体積の培養ベッセルにおける細胞の生存および分化を改善している。いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤のインキュベーションの濃度および／または期間が最適化されている。さらに、本明細書において、あらゆる所与の培地のバッチまたは使用される多能性細胞クローンに対する心臓分化を劇的に改善するのに使用することができる増殖因子の添加における好適な調整を決定するための例示的な技術を提供する。
【００５１】
心筋細胞の細胞集団の生成におけるさらなる進歩も下記に記載する。本開示によって生成される細胞の顕著な均一性および機能的性質により、これらの細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで心臓組織を研究するのに、および心臓疾患の処置における心臓組織再生のための新たな治療モダリティーを開発するのに価値あるものとなる。
【００５２】
ＩＩ．定義
「多能性」は、あらゆる３つの胚葉、すなわち内胚葉（内側の胃の内壁、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、または外胚葉（表皮組織、および神経系）など、１つまたは複数の組織または器官を構成する全ての細胞に分化する可能性を有する幹細胞を意味する。本明細書で用いられる「多能性幹細胞」（またはＰＳＣ）は、全能性細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞の子孫など、あらゆる３つの胚葉に由来する細胞に分化することができる細胞を意味する。
【００５３】
通例ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略記される「人工多能性幹細胞」は、リプログラミング因子を導入もしくは接触させることによって、典型的には成体の体細胞である非多能性細胞、または線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、神経細胞、上皮細胞などの最終分化細胞から人工的に調製される一タイプの多能性幹細胞を意味する。
【００５４】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は初期胚に由来する多能性幹細胞である。
【００５５】
「懸濁培養物」は、細胞、または細胞の凝集物が液体培地中に懸濁されて増加する培養物を意味する。
【００５６】
「ＲＯＣＫ阻害剤」と略記される「Ｒｈｏ関連キナーゼ阻害剤」は、小分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなど、Ｒｈｏ関連キナーゼまたはその細胞中のシグナル伝達経路の機能を阻害または低減するあらゆる物質を意味する。本明細書で用いられる「ＲＯＣＫシグナル伝達経路」は、細胞中のＲｈｏ−ＲＯＣＫ−ミオシンＩＩシグナル伝達経路、その上流のシグナル伝達経路、またはその下流のシグナル伝達経路など、ＲＯＣＫ関連シグナル伝達経路に関与するあらゆるシグナルプロセッサーを含み得る。ＲＯＣＫ阻害剤の例には、それだけには限定されないが、Ｒｈｏ特異的阻害剤、ＲＯＣＫ特異的阻害剤、ＭＲＬＣ（ミオシン制御軽鎖）−特異的阻害剤、またはミオシンＩＩ特異的阻害剤が含まれる。
【００５７】
「凝集物促進性培地」の語は、作用機序に関していかなる制限なしに、幹細胞の凝集物形成を増強するあらゆる培地を意味する。
【００５８】
「心臓誘導培地」または「心臓分化培地」の語は、作用機序に関していかなる制限なしに幹細胞の心筋細胞への分化を増強するあらゆる培地を意味する。
【００５９】
「心臓維持培地」の語は、作用機序に関していかなる制限なしに心筋細胞の維持に適するあらゆる培地を意味する。
【００６０】
「凝集物」、すなわち胚様体の語は、多能性幹細胞が非特異的な様式において分化させられる場合に出現する分化細胞、および部分的分化細胞を含む不均一なクラスターを意味する。
【００６１】
「心筋細胞」は、一般にあらゆる心筋細胞系統の細胞を意味し、別段の特定がなければ、いかなる制限なしに、心筋細胞の個体発生のあらゆる段階の細胞に適用すると理解することができる。例えば、心筋細胞は、心筋細胞前駆細胞および成熟心筋細胞の両方を含み得る。
【００６２】
特定のタンパク質を「コードする」「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、または「フラグメント」は、好適な制御配列の制御下におかれた場合にｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、ポリペプチドなどの遺伝子生成物に転写され、場合により翻訳もされる核酸分子である。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡの形態のいずれかにおいて存在することができる。ＤＮＡの形態において存在する場合、核酸分子は一本鎖（すなわちセンス鎖）でも、または二本鎖でもよい。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子には、それだけには限定されないが、原核生物または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成のＤＮＡ配列が含まれ得る。転写終結配列は、通常、遺伝子配列に対して３’に位置する。
【００６３】
「導入遺伝子」の語は、外来の核酸など、人工または天然の手段によって細胞または生物体中に導入された遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドを意味する。外来の核酸は様々な生物体または細胞からであってよく、または生物体もしくは細胞内に天然に存在する核酸のさらなるコピーの１つまたは複数であってよい。非限定的な例として、外来の核酸は、天然の細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にあり、または他の点で天然に見られるものと異なる核酸配列が側面にある。
【００６４】
「プロモーター」の語は、本明細書において、その通常の意味において、ＤＮＡ制御配列を含むヌクレオチド領域を意味するのに用いられ、この場合、制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する。
【００６５】
ＩＩＩ．多能性幹細胞の源
「多能性幹細胞」の語は、３つの胚層全て、すなわち内胚葉、中胚葉、および外胚葉の細胞を生じることができる細胞を意味する。理論上、多能性幹細胞は身体のあらゆる細胞に分化することができるが、多能性を実験的に決定することは、典型的に、多能性細胞が各胚層のいくつかの細胞型に分化することに基づく。本発明のいくつかの実施形態において、多能性幹細胞は胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚性幹（ＥＳ）細胞である。他の実施形態において、多能性幹細胞は、体細胞をリプログラミングすることによって由来する人工多能性幹細胞である。ある実施形態において、多能性幹細胞は、体細胞の核移植によって由来する胚性幹細胞である。
【００６６】
Ａ．胚性幹細胞
胚性幹（ＥＳ）細胞は胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性細胞である。ＥＳ細胞は、発生中の胚の外側の栄養外胚葉層を除去し、次いで非増殖細胞のフィーダー層上で内部塊細胞を培養することによって単離することができる。好適な条件下で増殖性の未分化ＥＳ細胞のコロニーが生成される。このコロニーを取り去り、個々の細胞に解離し、次いで新鮮なフィーダー層上に再塗抹することができる。再塗抹された細胞を引き続き増殖させ、未分化ＥＳ細胞の新しいコロニーを生成することができる。次いで、この新しいコロニーを取り去り、解離し、再び再塗抹し、増殖させる。未分化のＥＳ細胞を「継代培養」または「継代」するこのプロセスを数回繰り返して、未分化のＥＳ細胞を含む細胞系を生成することができる（米国特許第５，８４３，７８０号、第６，２００，８０６号、第７，０２９，９１３号）。「初代細胞培養物」は、胚盤胞の内部細胞塊などの組織から直接得た細胞の培養物である。「継代培養物」は初代細胞培養物に由来するあらゆる培養物である。
【００６７】
マウスＥＳ細胞を得るための方法は周知である。一方法において、マウス１２９株からの着床前の胚盤胞をマウス抗血清で処理して栄養外胚葉を除き、内部細胞塊を、ウシ胎児血清を含む培地中で化学的に不活性化したマウス胚線維芽細胞のフィーダー細胞層上で培養する。発生する未分化ＥＳ細胞のコロニーを、ウシ胎児血清の存在下、マウス胚線維芽細胞フィーダー層上で継代培養してＥＳ細胞の集団を生成する。いくつかの方法において、血清添加培養培地にサイトカイン白血病抑制因子（ＬＩＦ）を添加することによって、マウスＥＳ細胞をフィーダー層の非存在下で増殖させることができる（Ｓｍｉｔｈ、２０００年）。他の方法において、マウスＥＳ細胞を、骨形成タンパク質およびＬＩＦの存在下、無血清培地中で増殖させることができる（Ｙｉｎｇら、２００３年）。
【００６８】
ヒトＥＳ細胞は先に記載した方法を用いて胚盤胞から得ることができる（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５年；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８年；ＴｈｏｍｓｏｎおよびＭａｒｓｈａｌｌ、１９９８年；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００年）。一方法において、５日目のヒト胚盤胞をウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に曝露し、次いでモルモット補体の１：５希釈に曝露して栄養外胚葉細胞を溶解する。溶解した栄養外胚葉細胞をインタクトな内部細胞塊から除去した後、内部細胞塊を、ガンマ線不活性化したマウス胚線維芽細胞のフィーダー層上、ウシ胎児血清の存在下で培養する。９日から１５日後、内部細胞塊に由来する細胞クランプを、化学的（すなわち、トリプシンに曝露）または機械的に解離し、ウシ胎児血清、およびマウス胚線維芽細胞のフィーダー層を含む新鮮な培地中に再塗抹することができる。さらに増殖させたら、未分化な形態を有するコロニーをマイクロピペットによって選択し、機械的にクランプに解離し、再塗抹する（米国特許第６，８３３，２６９号を参照されたい）。ＥＳ様の形態は、核対細胞質比が明らかに高く、核小体が顕著な密集したコロニーを特徴とする。得られたＥＳ細胞は、簡単なトリプシン処理によって、またはマイクロピペットによる個々のコロニーの選択によって、日常的に継代することができる。いくつかの方法において、ヒトＥＳ細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下、線維芽細胞のフィーダー層上でＥＳ細胞を培養することによって、血清なしで増殖させることができる（Ａｍｉｔら、２０００年）。他の方法において、ヒトＥＳ細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子を含む「条件」培地の存在下、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはラミニンなどのタンパク質マトリックス上で細胞を培養することによって、フィーダー細胞層なしで増殖させることができる（Ｘｕら、２００１年）。培地を、線維芽細胞と同時培養することによって予め馴らしておく。
【００６９】
アカゲザルおよびコモンマーモセットのＥＳ細胞を単離するための方法も公知である（ＴｈｏｍｓｏｎおよびＭａｒｓｈａｌｌ、１９９８年；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５年；ＴｈｏｍｓｏｎおよびＯｄｏｒｉｃｏ、２０００年）。
【００７０】
ＥＳ細胞の別の源は確立されたＥＳ細胞系である。様々なマウス細胞系およびヒトＥＳ細胞系が公知であり、これらの増殖および繁殖のための条件は規定されている。例えば、マウスＣＧＲ８細胞系はマウス１２９系統の胚の内部細胞塊から確立されており、ＣＧＲ８細胞の培養物は、フィーダー層なしでＬＩＦの存在下で増殖させることができる。さらなる一例として、ヒトＥＳ細胞系Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、およびＨ１４はＴｏｍｐｓｏｎらによって確立された。さらに、Ｈ９系統のサブクローンＨ９．１およびＨ９．２が開発されている。例えば、参照によって本明細書に組み入れられる、ＹｕおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ、２００８年に記載されているものなど、当技術分野において公知である実質的にあらゆるＥＳ細胞または幹細胞系が、本発明とともに用いることができることが予想される。
【００７１】
本発明と関連して用いるためのＥＳ細胞の源は、胚盤胞、胚盤胞の内部細胞塊の培養に由来する細胞、または確立された細胞系の培養物から得られた細胞であってよい。このように、本明細書で用いられる通り、「ＥＳ細胞」の語は、胚盤胞の内部細胞塊の細胞、内部細胞塊の培養物から得られたＥＳ細胞、およびＥＳ細胞系の培養物から得られたＥＳ細胞を意味することができる。
【００７２】
多能性細胞は身体のあらゆる細胞に分化することができる。ＥＳ細胞の多能性は様々な方法で決定されている（Ｍａｒｔｉｎ、１９８２年）。一試験において、胚盤胞の内部細胞塊に由来するマウスＥＳ細胞を、別の胚盤胞の孔中に注射する。注射された胚盤胞は偽妊娠メスマウスの子宮中に沈着して、注射されたレシピエントの胚盤胞細胞のキメラである子孫を生成する。別の一試験において、マウスＥＳ細胞を成年マウス中に注射して奇形腫と呼ばれる腫瘍を生成する。このような腫瘍は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉に由来する様々な細胞型を含み得る。ある実施形態において、１つまたは複数の奇形腫由来の細胞を培養し、または神経細胞もしくは神経関係細胞に分化させてもよい。ヒトＥＳ細胞の多能性は、免疫不全マウスにおける奇形腫の形成によっても試験することができる。第三の試験は、ＥＳ細胞をより特殊化した細胞に分化させるように培養条件を変えることである。例えば、マウスＥＳ細胞は、フィーダー層を除去し、培養培地にＬＩＦを添加することによって様々な細胞型に自発的に分化することができる。同様に、ヒトＥＳ細胞は、フィーダー層を除去し、ＥＳ細胞を懸濁液中の非接着性の表面上で増殖させることによって自発的に分化することができる（Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒら、２０００年；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００年；Ｒｏａｃｈら、１９９３年）。このような条件下、ＥＳ細胞は、神経細胞および心筋細胞の特徴を有する細胞を含む胚様体と呼ばれる細胞凝集物を形成することができる。これらの試験全てにおいて、ＥＳ細胞の多能性は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉起源の細胞を産生するこれらの能力によって示される。
【００７３】
ＥＳ細胞は、これらが生成するタンパク質によって特徴付けることができる。例えば、ＥＳ細胞を特徴付けるのに以下のマーカータンパク質が用いられている：ステージ特異的胚性抗原ＳＳＥＡ−１、ステージ特異的胚性抗原ＳＳＥＡ−３、ステージ特異的胚性抗原ＳＳＥＡ−４、腫瘍拒絶抗原−１−６０（ＴＲＡ１−６０）、腫瘍拒絶抗原−１−８１（ＴＲＡ１−８１）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、および転写因子Ｏｃｔ−４。表１に示す通り、マウス、ヒト、および霊長動物の細胞は、これらのマーカーを発現するパターンが異なる。例えば、ＳＳＥＡ−１はマウスＥＳ細胞において発現されるがヒトまたはサルのＥＳ細胞では発現されず、ＴＲＡ１−６０はヒトおよびサルのＥＳ細胞において発現されるがマウスＥＳ細胞では発現されない。
【００７４】
【表１】
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Ｂ．人工多能性幹細胞
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞はＥＳ細胞の特徴を有するが、分化した体細胞のリプログラミングによって得られる細胞である。人工多能性幹細胞は様々な方法によって得られている。一方法において、成体ヒト皮膚線維芽細胞を、レトロウイルスの形質導入を用いて、転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４でトランスフェクトする（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年）。トランスフェクトされた細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を補った培地中、ＳＮＬフィーダー細胞（ＬＩＦを生成するマウス細胞線維芽細胞系）上に塗抹する。およそ２５日後、培養物中にヒトＥＳ細胞コロニーに似たコロニーが現れる。ＥＳ細胞様コロニーを拾い、ｂＦＧＦの存在下、フィーダー細胞上に広げる。
【００７５】
細胞の特徴に基づくと、ＥＳ細胞様コロニーの細胞は人工多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞はヒトＥＳ細胞に形態学的に類似しており、様々なヒトＥＳ細胞マーカーを発現する。また、ヒトＥＳ細胞の分化をもたらすことが公知の条件下で増殖させた場合、人工多能性幹細胞はそれに応じて分化する。例えば、人工多能性幹細胞は、神経細胞の構造を有し、神経細胞のマーカーを有する細胞に分化することができる。ＹｕおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ、２００８年において記載されているものなどを含む、実質的にあらゆるｉＰＳ細胞または細胞系を本発明で用いることができることが予想される。
【００７６】
別の一方法において、ヒト胎児または新生児の線維芽細胞を、レンチウイルスの形質導入を用いて、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８の４つの遺伝子と一緒にトランスフェクトする（Ｙｕら、２００７年）。感染１２〜２０日後、ヒトＥＳ細胞の形態を有するコロニーが見えるようになる。このコロニーを拾い、拡大する。コロニーを構成する人工多能性幹細胞はヒトＥＳ細胞に形態学的に類似しており、様々なヒトＥＳ細胞マーカーを発現し、マウス中に注射後、神経組織、軟骨、および腸上皮を有する奇形腫を形成する。
【００７７】
マウスから人工多能性幹細胞を調製する方法も公知である（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年）。ｉＰＳ細胞の誘導は、Ｓｏｘファミリーからの少なくとも１メンバーおよびＯｃｔファミリーからの少なくとも１メンバーの発現、またはこれらへの曝露を必要とするのが典型的である。ＳｏｘおよびＯｃｔはＥＳ細胞のアイデンティティを特定する転写の階層的制御に重要であると考えられている。例えば、ＳｏｘはＳｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、Ｓｏｘ−１５、またはＳｏｘ−１８であってよく、ＯｃｔはＯｃｔ−４であってよい。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、またはｃ−Ｍｙｃなど、さらなる因子がリプログラミングの効率を増大することがあり、リプログラミング因子の特定のセットは、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、および場合によりＬｉｎ−２８を含むセットであってよく、またはＳｏｘ−２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ、および場合によりｃ−Ｍｙｃを含むセットであってよい。
【００７８】
ＥＳ細胞などのｉＰＳ細胞は、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４  （Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．）、ならびにＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１に対する抗体を用いて、免疫組織化学またはフローサイトメトリーによって同定または確認することができる特徴的な抗原を有する（Ａｎｄｒｅｗｓら、１９８７年）。胚性幹細胞の多能性はおよそ０．５〜１０×１０６細胞を、８〜１２週齢のＳＣＩＤオスマウスの後肢の筋肉中に注射することによって確認することができる。３つの胚葉の各々の少なくとも１つの細胞型を実証する奇形腫が発生する。
【００７９】
本発明のある態様において、ｉＰＳ細胞は、上記に記載した通り、ＫｌｆまたはＮａｎｏｇと組み合わされたＯｃｔ４およびＳｏｘ２などのＯｃｔファミリーメンバーおよびＳｏｘファミリーメンバーを含むリプログラミング因子を用いた、体細胞のリプログラミングから作成される。本発明における体細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉系細胞、肝細胞、胃の細胞、またはβ細胞など、多能性に誘発され得るあらゆる体細胞であってよい。ある態様において、Ｔ細胞もリプログラミング用の体細胞の源として用いることができる（参照によって本明細書に組み入れられる、米国出願第６１／１８４，５４６を参照されたい）。
【００８０】
リプログラミング因子は、組込みベクターまたはエピソームベクターなど（例えば、ＥＢＶエレメントベース系）の１つまたは複数のベクター中に含まれる発現カセットから発現されてよい（参照によって本明細書に組み入れられる、米国出願第６１／０５８，８５８号、Ｙｕら、２００９年を参照されたい）。さらなる一態様において、リプログラミングタンパク質が、タンパク質形質導入によって体細胞中に直接導入され得る（参照によって本明細書に組み入れられる、米国出願第６１／１７２，０７９号を参照されたい）。
【００８１】
Ｃ．体細胞核移植によって由来する胚性幹細胞
多能性幹細胞は体細胞核移植によって調製することができ、体細胞核移植ではドナーの核が紡錘体のない卵母細胞中に移植される。核移植によって生成された幹細胞は、ドナーの核と遺伝学的に同一である。一方法において、アカゲザルの皮膚線維芽細胞からのドナーの線維芽細胞核を、紡錘体のない、成熟した中期ＩＩのアカゲザル卵母細胞の細胞質中に電気融合によって導入する（Ｂｙｒｎｅら、２００７年）。融合した卵母細胞をイオノマイシンに曝露することによって活性化し、次いで胚盤胞段階までインキュベートする。次いで、選択された胚盤胞の内部細胞塊を培養して、胚性幹細胞系を生成する。胚性幹細胞系は正常のＥＳ細胞の形態を示し、様々なＥＳ細胞マーカーを発現し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で複数の細胞型に分化する。本明細書で用いられる「ＥＳ細胞」の語は、受精した核を含む胚に由来する胚性幹細胞を意味する。ＥＳ細胞は核移植によって生成される胚性幹細胞と区別され、これらは「体細胞核移植によって由来する胚性幹細胞」と呼ばれる。
【００８２】
ＩＶ．多能性幹細胞の培養
培養条件に応じて、多能性幹細胞は分化細胞または未分化細胞のコロニーを生成することができる。「分化する」の語は、細胞の発生経路を下る進行を意味する。「分化した」の語は、別の細胞との比較において発生経路を下る細胞の進行を記載する相対的な語である。例えば、多能性細胞は身体のあらゆる細胞を生じることができ、造血細胞など、より分化した細胞はより少数の細胞型しか生じない。
【００８３】
多能性幹細胞の培養物は、集団における幹細胞および幹細胞の誘導体のかなりの比率が未分化細胞の形態学的特徴を示し、これらが胚または成体起源の分化細胞と明らかに区別される場合、「未分化」と記載される。未分化のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は当業者によって認められ、高比率の核／細胞質および顕著な核小体を有する細胞のコロニーにおいて二次元の顕微鏡の視野において出現するのが典型的である。未分化細胞のコロニーは分化している隣接細胞を有することがあることが理解される。
【００８４】
ある態様において、本方法に対する出発細胞は、少なくとも、または約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３細胞、もしくはこれらに由来するあらゆる範囲を含み得る。出発細胞の集団は、少なくとも、または約１０、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８細胞／ｍｌ、またはこれらに由来するあらゆる範囲の播種密度を有することができる。
【００８５】
Ａ．ＥＳ細胞の培養
ＥＳ細胞は、血清およびフィーダー層、典型的にはマウス胚線維芽細胞の存在下で細胞を培養することによって未分化状態において維持することができる。幹細胞を未分化状態において維持するための他の方法も公知である。例えば、マウスＥＳ細胞は、フィーダー層なしでＬＩＦの存在下で培養することによって未分化状態において維持することができる。しかし、マウスＥＳ細胞とは異なり、ヒトＥＳ細胞はＬＩＦに応答しない。ヒトＥＳ細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下、線維芽細胞のフィーダー層上でＥＳ細胞を培養することによって（Ａｍｉｔら、２０００年）、またはフィーダー層なしで、および線維芽細胞条件培地プラス塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはラミニンなどのタンパク質マトリックス上で培養することによって未分化状態を維持することができる（Ｘｕら、２００１年、米国特許第６，８３３，２６９号）。
【００８６】
ＥＳ細胞を調製および培養するための方法は、全て参照によって本明細書に組み入れられる、ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８７年）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  （１９９３年）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  （１９９３年）；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９８年）を含めた、細胞生物学、組織培養、および発生学における標準の教科書および概説において見ることができる。組織培養に用いられる標準方法は、概ね、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７年）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  （１９８７年）；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙおよびＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８７年および１９９５年）に記載されている。
【００８７】
Ｂ．ｉＰＳ細胞の培養
体細胞をリプログラミング因子に導入または接触した後、これらの細胞を、多能性および未分化状態を維持するのに十分な培地中で培養してもよい。本発明において生成された人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養は、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許公開第２００７０２３８１７０号、および米国特許公開第２００３０２１１６０３号、および米国特許公開第２００８０１７１３８５号に記載されているように、霊長動物の多能性幹細胞、より詳しくは胚性幹細胞を培養するために開発された様々な培地および技術を用いることができる。当業者には公知である通り、多能性幹細胞の培養および維持のためのさらなる方法を本発明と一緒に用いることができることが理解される。
【００８８】
ある実施形態において、不確定の条件を用いてもよく、例えば、幹細胞を未分化状態に維持するために、多能性細胞を線維芽細胞のフィーダー細胞または線維芽細胞フィーダー細胞に曝露した培地上で培養することができる。あるいは、多能性細胞を、ＴｅＳＲ培地など、規定された、フィーダー非依存性培養系を用いて本質的に未分化状態において培養および維持してもよい（Ｌｕｄｗｉｇら、２００６年ａ；Ｌｕｄｗｉｇら、２００６年ｂ）。フィーダー非依存性培養系および培地を用いて多能性細胞を培養および維持してもよい。これらの取組みにより、ヒト胚性幹細胞は、マウス線維芽細胞の「フィーダー層」を必要とせずに本質的に未分化状態にとどまることができる。本明細書に記載する通り、所望により費用を低減するために、これらの方法に対して様々な改変を行うことができる。
【００８９】
ヒト多能性幹細胞の培養および維持において様々なマトリックス成分を用いることができる。例えば、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、およびビトロネクチンを組み合わせて用いて、その全文が参照によって組み入れられる、Ｌｕｄｗｉｇら（２００６年ａ；２００６年ｂ）に記載されている通り、多能性細胞の増殖用の固体支持体を提供する手段として培養表面をコーティングしてもよい。
【００９０】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）も、ヒト多能性幹細胞の細胞培養および維持のための基質を提供するのに用いることができる。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、マウス腫瘍細胞によって分泌されたゼラチン状のタンパク質混合物であり、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、米国）から市販されている。この混合物は、多くの組織において見られる複雑な細胞外環境に似ており、細胞生物学者によって細胞培養のための基質として用いられている。
【００９１】
Ｃ．ＲＯＣＫ阻害剤およびミオシンＩＩＡＴＰ分解酵素阻害剤
多能性幹細胞、特にヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、細胞の脱離および解離の際にアポトーシスを受けやすく、これらはクローンの単離または拡大、および分化の誘導に重要である。最近、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤など、小クラスの分子が、解離された多能性幹細胞のクローンの効率および生存を増大することが見出されており、これらは、Ｒｈｏ−特異的阻害剤、ＲＯＣＫ−特異的阻害剤、またはミオシンＩＩ−特異的阻害剤など、ＲＯＣＫ関連シグナル伝達経路に対する阻害剤である。本発明のある態様において、ＲＯＣＫ阻害剤を、多能性幹細胞の培養および継代、ならびに／または幹細胞の分化に用いることができる。したがって、ＲＯＣＫ阻害剤は、粘着性培養物または懸濁培養物など、多能性幹細胞が増殖し、解離し、凝集物を形成し、または分化を受けるあらゆる細胞培養培地中に存在することができる。
【００９２】
ＲＯＣＫシグナル伝達経路は、ＲｈｏファミリーＧＴＰ加水分解酵素、ＲＯＣＫ、Ｒｈｏの下流のメジャーエフェクターキナーゼ、ミオシンＩＩ、ＲＯＣＫの下流の優勢なエフェクター（Ｈａｒｂら２００８年）、およびあらゆる中間体、上流または下流のシグナルプロセッサーを含み得る。ＲＯＣＫは、ミオシン制御軽鎖（ＭＲＬＣ）の脱リン酸によってミオシンの機能を負に制御するＲＯＣＫの主要な下流の標的の１つである、ミオシンホスファターゼ標的サブユニット１（ＭＹＰＴ１）をリン酸化および不活性化することがある。
【００９３】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｃ３細胞外酵素および／またはミオシンＩＩ特異的阻害剤などのＲｈｏ特異的阻害剤を、本発明のある態様においてＲＯＣＫ阻害剤として用いることができる。本明細書において別段の記載がなければ、ブレビスタチンなどのミオシンＩＩ阻害剤は、ＲＯＣＫ阻害剤の実験的な使用の代わりとなることができる。
【００９４】
ミオシンＩＩは、筋肉収縮におけるその役割に対して最初に研究されたが、筋肉以外の細胞においても機能する。ミオシンＩＩ（従来のミオシンとしても知られている）は各々がアミノ酸約２０００個の長さである２つの重鎖を含み、これらの重鎖は頭部および尾部のドメインを構成する。これら重鎖の各々はＮ末端頭部ドメインを含み、Ｃ末端尾部はコイルドコイルの形態を呈し、２個の重鎖を一緒に保持している（使者の杖におけるように、２匹のヘビが互いに巻きついているのを想像されたい）。このように、ミオシンＩＩは頭部を２個有する。ミオシンＩＩは４個の軽鎖（頭部１個あたり２個）も含み、これらは頭部と尾部との間の「頸部」領域で重鎖に結合している。これらの軽鎖はしばしば本質的な軽鎖および制御軽鎖と呼ばれる。例示のミオシンＩＩ特異的阻害剤はブレビスタチンまたはその誘導体であってよい。
【００９５】
ＲＯＣＫは、Ｒｈｏ（Ｒｈｏに対してＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、およびＲｈｏＣの３つのイソ型が存在する）に対する標的タンパク質として役立つセリン／スレオニンキナーゼである。これらのキナーゼは、最初、ＲｈｏＡ誘発性ストレス線維および接着斑の形成のメディエーターと特徴付けられた。ＲＯＣＫの２つのイソ型であるＲＯＣＫ１（ｐ１６０ＲＯＣＫ、ＲＯＫβとも呼ばれる）およびＲＯＣＫ２（ＲＯＫα）はＮ末端キナーゼドメイン、その後にＲｈｏ−結合性ドメインを含むコイルドコイルドメイン、およびプレクストリン相同ドメイン（ＰＨ）からなる。ＲＯＣＫは両方とも細胞骨格調節物質であり、ストレス線維の形成、平滑筋の収縮、細胞接着、膜ラッフリング、および細胞の運動性に対するＲｈｏＡの効果を媒介する。ＲＯＣＫは、ミオシンＩＩ、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）、ＭＬＣホスファターゼ（ＭＬＣＰ）、ならびにホスファターゼおよびテンシンのホモログ（ＰＴＥＮ）など、下流の分子を標的化することによってその生物学的活性を発揮することができる。
【００９６】
例示のＲＯＣＫ−特異的阻害剤は、ＲＯＣＫ１を選択的に標的化し（しかし、ＲＯＣＫ２はやはり阻害し）、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βを阻害するＹ−２７６３２である。Ｙ−２７６３２は細胞透過性であり、ＡＴＰと競合することによってＲＯＣＫ１／ＲＯＣＫ２を阻害する（ＩＣ５０＝８００ｎＭ）。その全文において記載するように参照によって本明細書に組み入れられる、Ｉｓｈｉｚａｋｉら（２０００年）。他のＲＯＣＫ阻害剤には、例えば、Ｈ−１１５２、Ｙ−３０１４１、Ｗｆ−５３６、ＨＡ−１０７７、ヒドロキシル−ＨＡ−１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、およびＳＢ−７７２０７７−Ｂが含まれる。その各々がその全文において記載するように参照によって本明細書に組み入れられる、Ｄｏｅら（２００７年）；Ｉｓｈｉｚａｋｉら、上述；Ｎａｋａｊｉｍａら、（２００３年）；およびＳａｓａｋｉら（２００２年）。
【００９７】
ＲＯＣＫ阻害剤の他の非限定的な例には、Ｈ−１１５２、およびＦａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７とも呼ばれる）、Ｙ−３０１４１（米国特許第５，４７８，８３８号に記載される）、およびこれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンスの核酸、核酸を誘発するＲＮＡ干渉（例えば、ｓｉＲＮＡ）、競合ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害抗体、抗体−ＳｃＦＶフラグメント、ドミナントネガティブバリアント、およびこれらの発現ベクターが含まれる。さらに、他の低分子量化合物はＲＯＣＫ阻害剤として公知であるので、これらの化合物またはこれらの誘導体も実施形態において用いることができる（例えば、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許公開第２００５０２０９２６１号、第２００５０１９２３０４号、第２００４００１４７５５号、第２００４０００２５０８号、第２００４０００２５０７号、第２００３０１２５３４４号、および第２００３００８７９１９号、ならびに国際特許公開第２００３／０６２２２７号、第２００３／０５９９１３号、第２００３／０６２２２５号、第２００２／０７６９７６号、および第２００４／０３９７９６号を参照されたい）。本発明において、１つまたは２つまたはそれを超えるＲＯＣＫ阻害剤の組合せも用いることができる。
【００９８】
いくつかの実施形態にしたがって、幹細胞を培地中でＲＯＣＫ阻害剤で処理することができる。それによって、本発明の方法において用いられる培地はすでにＲＯＣＫ阻害剤を含んでいてよく、またはその代わり、本発明の方法は培地にＲＯＣＫ阻害剤を添加するステップを伴うことができる。培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、幹細胞の生存率の改善など所望の効果を達成することができる限り特に制限されない。このようなＲＯＣＫ阻害剤、例えば、Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１０７７、またはＨ−１１５２などは、少なくとも、または約０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、５００から約１０００μＭ、もしくはこれらに由来するあらゆる範囲の効果的な濃度で用いられてよい。これらの量は、ＲＯＣＫ阻害剤の、独立の、または１つもしくは複数のＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせた量を意味することができる。
【００９９】
例えば、Ｙ−２７６３２をＲＯＣＫ阻害剤として用いる場合、これは約０．０１μＭから約１０００μＭ、より具体的には約０．１μＭから約１００μＭ、さらにより具体的には約１．０μＭから約３０μＭ、最も具体的には約２．０μＭから２０μＭ、またはこれらに由来するあらゆる範囲の濃度で用いることができる。Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７をＲＯＣＫ阻害剤として用いる場合、これは前述のＹ−２７６３２の濃度の約２倍で用いることができる。Ｈ−１１５２をＲＯＣＫ阻害剤として用いる場合、これは前述のＹ−２７６３２の濃度の約５０分の１で用いることができる。
【０１００】
ＲＯＣＫ阻害剤で処理するための時間は、幹細胞の生存率の改善などの所望の効果を達成することができる期間である限り特に制限されない。例えば、幹細胞がヒト胚性幹細胞などの多能性幹細胞である場合、処理するための時間は、解離前、少なくとも、または約１０、１５、２０、２５、３０分から数時間（例えば、少なくとも、もしくは約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２４時間、３６時間、４８時間、もしくはこれらに由来するあらゆる範囲）である。解離後、多能性幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤で、所望の効果を達成するのに、例えば、少なくとも、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、２４、４８時間、またはそれを超えて処理することができる。
【０１０１】
ＲＯＣＫ阻害剤で処理する幹細胞（１つまたは複数）の密度は、幹細胞の生存率の改善などの所望の効果を達成することができる密度である限り特に制限されない。これは、例えば、約１．０×１０１から１．０×１０７細胞／ｍｌであり、より具体的には約１．０×１０２から１．０×１０７細胞／ｍｌ、さらにより具体的には約１．０×１０３から１．０×１０７細胞／ｍｌ、最も具体的には約３．０×１０４から２．０×１０６細胞／ｍｌである。
【０１０２】
ある実施形態において、幹細胞をＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養して、低密度（単細胞もしくは小型の凝集物に解離した）での生存性、クローニング効率、または継代効率を改善する。本発明のある実施形態において、幹細胞を、フィーダー細胞、フィーダー細胞抽出物、および／または血清の非存在下で培養する。幹細胞を、継代培養または継代する前に、例えば、継代培養または継代の前少なくとも１時間、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することができる。あるいは、またはさらに、幹細胞を、継代培養または継代の間または後にＲＯＣＫ阻害剤の存在下で維持する。
【０１０３】
ある実施形態において、幹細胞を、多くて、または少なくとも約４、８、１２時間、約２時間、約４時間、または約６日、またはこれらに由来するあらゆる範囲、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下に維持する。他の実施形態において、幹細胞を少なくとも１継代から５継代、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下に維持する。場合により、例えば、約４、８、１２時間後、または約２日後、または約４日後、または約６日後、またはこれらに由来するあらゆる範囲、ＲＯＣＫ阻害剤を、引き続き培養培地から取り除く。他の実施形態において、少なくとも１、２、３、４、５継代、またはそれを超えて、またはこれらに由来するあらゆる範囲の後、ＲＯＣＫ阻害剤を取り除く。
【０１０４】
本発明にしたがってＲＯＣＫ阻害剤で処理する幹細胞は、解離した細胞であってよく、または非解離の細胞であってよい。解離した細胞は、細胞の解離（例えば、後に記載する解離）を促進するように処理された細胞を意味する。解離した細胞には、単細胞、および数細胞（典型的には、約２から５０個、２から２０個、または２から１０個）の小型の細胞クランプ（凝集物）を形成した細胞が含まれる。解離した細胞は、懸濁した（浮遊している）細胞であってよく、または接着細胞であってよい。例えば、ヒトＥＳ細胞などのＥＳ細胞は、解離（および／または解離後の懸濁培養物）などの特定の条件に感受性である。本発明の方法は、幹細胞が、今までに細胞死が生じた条件にさらされた場合に、特定の使用を有する。
【０１０５】
本発明のある態様は、幹細胞を解離するステップをさらに伴うことができる。幹細胞の解離は、あらゆる公知の手順を用いて行うことができる。これらの手順には、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、酵素（例えば、トリプシン、コラゲナーゼ）などでの処理、および機械的な解離（例えば、ピペッティング）などの操作が含まれる。幹細胞（１つまたは複数）を、解離の前および／または後にＲＯＣＫ阻害剤で処理することができる。例えば、幹細胞（１つまたは複数）を解離の後だけに処理してもよい。
Ｄ．幹細胞培養条件
本発明による培養条件は、用いる培地および幹細胞に応じて好適に規定される。本発明による培地は、基本培地として動物細胞を培養するのに用いられる培地を用いて調製することができる。基本培地として、あらゆるＴｅＳＲ、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ  １０６６、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ、ＩＭＤＭ、１９９培地、イーグルＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ  １６４０、およびＦｉｓｃｈｅｒの培地、ならびにこれらのあらゆる組合せを用いることができるが、培地は動物細胞を培養するのに用いることができる限りこれらに特に制限されない。
【０１０６】
本発明による培地は、血清添加培地でも、または無血清培地でもよい。無血清培地は、未加工または未精製の血清を含まない培地を意味し、したがって精製した血液由来の成分または動物組織由来の成分（例えば、増殖因子）を有する培地を含み得る。外来の動物由来成分での汚染を防ぐ局面から、血清は、幹細胞（１つまたは複数）と同じ動物由来であってよい。
【０１０７】
本発明による培地は、あらゆる血清の代替物を含んでいても、または含んでいなくてもよい。血清の代替物には、アルブミン（例えば、脂質に富むアルブミン、アルブミン代替物、例えば、組換えアルブミン、植物デンプン、デキストラン、およびタンパク質加水分解物）、トランスフェリン（または他の鉄トランスポーター）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールギセロール（３’−ｔｈｉｏｌｇｉｙｃｅｒｏｌ）、またはこれらの同等物を好適に含んでいる材料が含まれ得る。血清の代替物は、例えば、国際公開第９８／３０６７９号に開示されている方法によって調製することができる。あるいは、さらなる便宜上、あらゆる市販の材料を用いることができる。市販の材料には、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、脂肪酸濃縮液（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）（Ｇｉｂｃｏ）、およびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）が含まれる。
【０１０８】
本発明の培地は、脂肪酸または脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン（１つまたは複数）、増殖因子、サイトカイン、抗酸化物質、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、および無機塩も含み得る。２−メルカプトエタノールの濃度は、例えば、約０．０５ｍＭから１．０ｍＭ、特に約０．１ｍＭから０．５ｍＭであってよいが、濃度は、幹細胞（１つまたは複数）を培養するのに好適である限り特にこれらに限定されない。
【０１０９】
幹細胞（１つまたは複数）を培養するのに用いられる培養ベッセルには、特にそれだけには限定されないが、その中で幹細胞を培養することができるのであれば、フラスコ、組織培養用フラスコ、シャーレ、ペトリ皿、組織培養用シャーレ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、試験管、トレイ、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養バッグ、およびローラーボトルが含まれてよい。幹細胞は、培養物の必要性に応じて、少なくとも、または約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ、またはこれらに由来するあらゆる範囲の体積の培養物であってよい。ある一実施形態において、培養ベッセルはバイオリアクターであってよく、バイオリアクターは、生物学的に活性な環境を支持するあらゆる装置または系を意味することができる。バイオリアクターは、少なくとも、または約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル、またはこれらに由来するあらゆる範囲の体積を有していてよい。
【０１１０】
培養ベッセルは、細胞接着性でも、または非接着性でもよく、目的に応じて選択される。細胞接着性の培養ベッセルは、ベッセル表面の細胞に対する接着性を改善するために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）など、細胞接着用のあらゆる基質でコーティングされていてよい。細胞接着用の基質は、幹細胞またはフィーダー細胞（使用する場合は）を付着することを意図するあらゆる材料であってよい。細胞接着のための基質には、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、およびフィブロネクチン、ならびにこれらの混合物、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、および溶解した細胞膜調製物が含まれる（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａら、２００５年）。
【０１１１】
他の培養条件を好適に規定することができる。例えば、培養温度は約３０℃から４０℃、例えば、少なくとも、または約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃であってよいが、特にこれらに限定されない。ＣＯ２濃度は約１から１０％、例えば、約２から５％、またはこれらに由来するあらゆる範囲であってよい。酸素分圧は、少なくとも、または約１、５、８、１０、２０％、またはこれらに由来するあらゆる範囲であってよい。
【０１１２】
本発明の方法を、例えば、幹細胞の接着培養に用いることができる。この場合、細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することができる。フィーダー細胞を本発明の方法において用いる場合、胎児線維芽細胞などの間質細胞をフィーダー細胞として用いることができる（例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９４年）；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３年）；Ｍａｒｔｉｎ（１９８１年）；Ｅｖａｎｓら（１９８１年）；Ｊａｉｎｃｈｉｌｌら、（１９６９年）；Ｎａｋａｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９６年）；Ｋｏｄａｍａら（１９８２年）；ならびに国際公開第０１／０８８１００号および第２００５／０８０５５４号を参照されたい）。
【０１１３】
本発明の方法を、担体上の懸濁培養（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、２００７年）またはゲル／生体高分子のカプセル化（米国特許第２００７０１１６６８０号）を含む、幹細胞の懸濁培養にも用いることができる。幹細胞の懸濁培養の語は、幹細胞を、培地における培養ベッセルまたはフィーダー細胞（用いる場合）に関して非接着性の条件下で培養することを意味する。幹細胞の懸濁培養は、幹細胞の解離培養、および幹細胞の凝集物懸濁培養を含む。幹細胞の解離培養の語は懸濁した幹細胞を培養することを意味し、幹細胞の解離培養には、単細胞の幹細胞の解離培養、または複数の幹細胞（例えば、細胞およそ２から４００個）からなる小型細胞の凝集物の解離培養が含まれる。前述の解離培養を継続する場合、培養した、解離した細胞は幹細胞のより大きな凝集物を形成し、その後凝集物懸濁培養を行うことができる。凝集物懸濁培養には、胚様体の培養方法（Ｋｅｌｌｅｒら、１９９５年を参照されたい）およびＳＦＥＢ法（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００５年）；国際公開第２００５／１２３９０２号が含まれる。本発明の方法は、懸濁培養における幹細胞の生存率および／または分化効率を著しく改善することができる。
【０１１４】
Ｅ．単細胞継代
多能性幹細胞の培養のいくつかの実施形態において、培養容器がいっぱいになった後、コロニーを、解離に適するあらゆる方法によって、凝集した細胞、またはさらに単細胞に分割し、次いで、細胞を継代用に新しい培養容器中に配置する。細胞の継代または分割は、長期間、細胞の生存状態を保ち、培養条件下で増殖するのを可能にする技術である。細胞は通常、約７０％〜１００％のコンフルエントであるときに継代される。
【０１１５】
多能性幹細胞の単細胞解離およびその後の単細胞継代は本発明の方法において用いることができ、細胞の拡大、細胞の選別、および分化に対して規定される接種の促進、ならびに培養手順およびクローン拡大の自動化の付与など、いくつかの利点がある。例えば、単細胞にクローン的に由来する子孫細胞は、遺伝構造において均一であってよく、および／または細胞周期が同調していてよく、これらは標的化された分化を増大し得る。単細胞継代に対する例示の方法は、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許出願第２００８０１７１３８５号に記載される通りであってよい。
【０１１６】
ある実施形態において、多能性幹細胞を、個々の単細胞、または個々の単細胞と細胞２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくはそれを超えて含む小型の細胞クラスターとの組合せに解離することができる。解離は、機械的な力によって、または細胞解離剤、例えばクエン酸ナトリウム、もしくは酵素（例えば、トリプシン、トリプシン−ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬｅ  Ｓｅｌｅｃｔなど）によって実現することができる。
【０１１７】
多能性幹細胞の供給源および拡大の必要性に基づき、解離した細胞を、個々に、または小型のクラスターにおいて、少なくとも、または約１：２、１：４、１：５、１：６、１：８、１：１０、１：２０、１：４０、１：５０、１：１００、１：１５０、１：２００、またはこれらに由来するあらゆる範囲などの分割比で、新しい培養容器に移すことができる。懸濁細胞系の分割比は、培養細胞懸濁液の体積に基づいて行うことができる。継代の間隔は、少なくとも、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日毎、またはこれらに由来するあらゆる範囲であってよい。例えば、異なる酵素的な継代プロトコールに対する達成可能な分割比は、３〜７日毎１：２、４〜７日毎１：３、およびおよそ７日毎１：５から１：１０、７日毎１：５０から１：１００であってよい。高い分割比を用いる場合、継代の間隔は少なくとも１２〜１４日、または過剰な自発的な分化または細胞死による細胞の喪失のないあらゆる期間に延長することができる。
【０１１８】
ある態様において、単細胞継代は、上記に記載したＲＯＣＫ阻害剤など、クローニング効率および細胞の生存を増大するのに有効な小型分子の存在下であってよい。このようなＲＯＣＫ阻害剤、例えば、Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１０７７、Ｈ−１１５２、またはブレビスタチンは、少なくとも、または約０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０から約１００μＭ、またはこれらに由来するあらゆる範囲など、有効な濃度で用いることができる。
【０１１９】
Ｖ．心臓分化のための方法
多能性幹細胞の分化は、接着したコロニーにおいて、または細胞凝集物形成（例えば、低接着の環境中）によってなど、様々なやり方で誘導されてよく、この場合、これら凝集物は胚様体（ＥＢ）と呼ばれる。ＥＢ内の分子の、および細胞の形態学的なシグナルおよびイベントは、発生中の胚におけるこのような細胞の天然の個体発生の多くの局面を模倣する。しかし、現在、制御された環境中で大量の心臓細胞を生成するのに満足な方法は残存しない。本発明のある態様は、非静的な懸濁培養物を用いて、凝集物のサイズおよび分化収量を制御し、商業規模で心筋細胞を生成する方法を開示するものである。
【０１２０】
Ａ．凝集物形成
胚様体（ＥＢ）は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞に由来する細胞の凝集物であり、何年もの間マウス胚性幹細胞で研究がなされていた。ｉｎ  ｖｉｖｏの分化に固有のいくつかの手がかりを繰り返すために、本発明のある態様は中間のステップとして３次元の凝集物（すなわち、胚様体）を用いることができる。凝集すると分化が開始し、細胞は限られた程度に胚の発生を繰り返し始める。これらは栄養外胚葉組織（胎盤を含んでいる）を形成することはできないが、生物体に存在する実質的に全ての他の型の細胞が発生することができる。本発明は、凝集物形成後の心臓分化をさらに促進することがある。
【０１２１】
細胞の凝集は、懸滴、非組織培養物で処理したプレート上の塗抹、またはスピナーフラスコ上によって押し付けられてよく、いずれの方法も細胞が表面に接着して典型的なコロニー増殖を形成するのを防ぐ。上記に記載した通り、ＲＯＣＫ阻害剤を、多能性幹細胞を培養するための凝集物形成の前に、間に、または後に用いることができる。
【０１２２】
多能性幹細胞を、細胞培養の技術分野において公知のあらゆる方法を用いて凝集物促進培地中に接種してもよい。例えば、多能性幹細胞を単一のコロニーとして、またはクローンの群として凝集物促進培地中に接種してもよく、多能性幹細胞をまた本質的に個々の細胞として接種してもよい。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞を、当技術分野において公知の機械的方法または酵素的方法を用いて本質的に個々の細胞に解離する。非限定的な例として、多能性幹細胞を、細胞と培養表面との間、および細胞と細胞自体との間の連結を破壊するタンパク質分解酵素に曝露してもよい。凝集物形成および分化のために多能性幹細胞を個別化するのに用いることができる酵素には、それだけには限定されないが、ＴｒｙｐＩＥなどの様々な商業用製剤におけるトリプシン、またはＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）などの酵素の混合物が含まれてよい。
【０１２３】
ある実施形態において、多能性細胞を、培養物表面上の培養物形成用の培養培地に、本質的に個々の（もしくは分散した）細胞として添加または接種することができる。その中に細胞を接種する培養培地は、ＴｅＳＲ培地またはｍＴｅＳＲ培地、およびＲＯＣＫ阻害剤などの生存因子を含み得る。例えば、分散された多能性細胞を、約１０４細胞／ｍｌから約１０１０細胞／ｍｌの密度で培養培地中に接種する。より具体的に、多能性細胞を、約１０５細胞／ｍｌから約１０７細胞／ｍｌの、または約０．５×１０６細胞／ｍｌから約３×１０６細胞／ｍｌの密度で接種する。これらの実施形態において、培養物表面は、当技術分野における標準の無菌的細胞培養方法に適合性の本質的にあらゆる材料、例えば、非接着性の表面からなっていてよい。培養物表面は、本明細書に記載するマトリックス成分をさらに含み得る。ある実施形態において、マトリックス成分を培養物表面に適用した後、表面を細胞および培地と接触させてもよい。
【０１２４】
Ｂ．心筋細胞の分化
心筋細胞系統の細胞は、所望の表現型を有する細胞を富化する特殊な増殖環境中で培養する、または分化させることによって（所望の細胞の増殖（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）によって、または他の細胞型の阻害もしくは死滅いずれかによって）非分化の幹細胞から得ることができる。
【０１２５】
ある態様において、ｉＰＳ細胞は、開示した方法を組み入れる細胞懸濁液中、心臓細胞に分化させることができる。分化は、上記に記載した通り、例えば、多能性幹細胞培養物の増殖によって、またはＥＢを形成させる低接着の性質を有する基質を有する培養ベッセル中の懸濁液中で多能性幹細胞を培養することによって、胚様体または凝集物を形成することによって開始することができる。多能性幹細胞は、短時間のコラゲナーゼ消化によって収集し、クラスターに解離し、非接着性の細胞培養プレートに塗抹することができる（参照によって組み入れられる、ＷＯ  ０１／５１６１６；米国特許第６，６０２，７１１号）。場合により、ＥＢは、アルギネートまたは他の適切な栄養透過性マトリックス中にカプセル化して生成することができ、これはＥＢの直径の均一性、および生成される細胞の粘度を改善する助けとなり得る（参照によって組み入れられる、ＷＯ  ０３／００４６２６、Ｚａｎｄｓｔｒａら）。プロセスがＥＢ形成を伴っても、または伴わなくても、血清または血清同等物を含む培地を使用すると、心筋細胞系統の収縮性の細胞の増殖巣を促進する（例えば、ウシ胎児血清約２０％、またはＲＰＭＩなどの適切な増殖培地中Ｂ２７もしくはＮ２などの血清添加剤）。心臓の分化のさらなる例示的な方法は、胚様体（ＥＢ）法（参照によって組み入れられる、Ｚｈａｎｇら、２００９年）、ＯＰ９間質細胞法（参照によって組み入れられる、Ｎａｒａｚａｋｉら、２００８年）、または増殖因子／化学法（全てその全文が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許公開第２００８００３８８２０号、第２００８０２２６５５８号、第２００８０２５４００３号、および第２００９００４７７３９号を参照されたい）を含み得る。
【０１２６】
心筋細胞の表現型を促進するために、細胞を、心筋細胞型の細胞の増殖または生存を増強し、または他の細胞型の増殖を阻害する因子および因子の組合せと一緒に培養することができる。効果は、細胞自体に対する直接的な効果によるものでも、または次に心筋細胞の形成を増強する別の細胞型に対する効果によるものでもよい。例えば、胚盤葉下層または胚盤葉上層の同等の細胞の形成を誘発し、またはこれらの細胞にこれら自体の心臓促進性エレメントの生成をもたらす因子は、全て心臓作用性因子または心筋細胞の分化のための分化因子の範疇内に入る。
【０１２７】
例えば、心臓の分化のための誘導培地には、それだけには限定されないが、心臓前方の外植片、心臓前中胚葉条件培地、ＨＧＦなどの中胚葉分泌性増殖因子が含まれてよい。
【０１２８】
本発明のある態様において、分化因子を添加するタイミングおよび量を、幹細胞の心筋細胞への分化の好適な条件を求めてスクリーニングしてもよい。特定の一態様において、分化因子は、細胞の発生に関与する増殖因子であってよい。分化因子には、それだけには限定されないが、骨形成タンパク質のシグナル伝達経路の１つまたは複数のモジュレーター、アクチビンＡ／ノーダル、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ディックコップホモログ１（ＤＫＫ１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、および／または上皮増殖因子（ＥＧＦ）が含まれてよい。
【０１２９】
それだけには限定されないが、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン、ヘパラン硫酸（ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、レチノイン酸、上皮増殖因子ファミリー（ＥＧＦ）のメンバー、線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）のメンバー（ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、および／またはＦＧＦ１０を含む）、血小板由来増殖因子ファミリー（ＰＤＧＦ）のメンバー、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／増殖および分化因子（ＧＤＦ）因子ファミリーのアンタゴニスト（それだけには限定されないが、ノギン、フォリスタチン、コーディン、グレムリン、ケルベロス（ｃｅｒｂｅｒｕｓ）／ＤＡＮファミリータンパク質、ベントロピン（ｖｅｎｔｒｏｐｉｎ）、および無羊膜、またはこれらの変異体もしくは機能的フラグメントを含む）を含む、さらなる因子を細胞の分化の環境における最適の濃度またはタイミングに対してスクリーニングすることができることが企図される。ＴＧＦ／ＢＭＰ／ＧＤＦアンタゴニストは、ＴＧＦ／ＢＭＰ／ＧＤＦ受容体−Ｆｃキメラの形態において添加してもよい。スクリーニングすることができる他の因子には、Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーによってシグナル伝達を活性化または不活性化することができる分子（それだけには限定されないが、デルタ様およびジャグド（ｊａｇｇｅｄ）ファミリーのタンパク質、ならびにノッチプロセシングもしくは切断の阻害物質、またはこれらの変異体もしくは機能的フラグメントが含まれる）が含まれる。他の増殖因子には、インスリン様成長因子ファミリー（ＩＧＥ）のメンバー、インスリン、ウイングレス関連（ｗｉｎｇｌｅｓｓ  ｒｅｌａｔｅｄ）（ＷＮＴ）因子ファミリー、およびヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）因子ファミリー、またはこれらの変異体、もしくは機能的フラグメントが含まれてよい。さらなる因子をスクリーニングし、または添加して、中胚葉幹／前駆体、内胚葉幹／前駆体、中胚葉幹／前駆体、または最終的な内胚葉幹／前駆体の増殖および生存、ならびにこれら前駆体の誘導体の生存および分化を促進してもよい。
【０１３０】
多能性幹細胞の中胚葉層の細胞への分化を誘発し、または心筋細胞系統の細胞へのさらなる分化を促進すると考えられている分化因子には、以下の非限定的な例が含まれる：
トランスフォーミング増殖因子ベータ関連リガンド（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、および以下に説明するＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーによって例示される）。リガンドはＴＧＦ−β受容体に結合し、Ｉ型およびＩＩ型セリンキナーゼを活性化し、Ｓｍａｄエフェクターのリン酸化を引き起こす。
【０１３１】
アクチビンＡおよびアクチビンＢなどのモルフォゲン（ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）。
【０１３２】
インスリン様成長因子（例えば、ＩＧＦＩおよびＩＧＦＩＩ）。
【０１３３】
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４によって例示されるＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）。
【０１３４】
線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、およびＦＧＦ−８によって例示される）、サイトゾルのキナーゼｒａｆ−１およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を活性化する他のリガンド、および上皮増殖因子（ＥＧＦ）などの他のマイトジェン。
【０１３５】
ＤＮＡのメチル化に影響を及ぼし、心筋細胞関連遺伝子の発現を変更するヌクレオチド類似体（例えば、５−アザ−デオキシ−シチジン）。
【０１３６】
下垂体ホルモンオキシトシン、または一酸化窒素（ＮＯ）。
【０１３７】
同じ受容体に対するアゴニスト活性を有する特異的な抗体または合成化合物。
【０１３８】
向心臓薬の効果的な組合せの例示には、モルフォゲン様アクチビンＡおよび複数の増殖因子、例えば、初期拘束段階の間にＴＧＦ−βおよびＩＧＦファミリーに含まれるもの、場合によりさらなるカルディオトロピン（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｉｎ）で補われるもの、例えば、１つまたは複数の線維芽細胞増殖因子、骨形態形成タンパク質、および血小板由来成長因子の使用が含まれる。
【０１３９】
理論によって拘泥しようとするものではないが、ある態様において、心筋細胞の分化などに最適な特異的な系統の分化条件を達成するために、ＴＧＦβシグナル伝達経路はある種の増殖因子の外部からの添加のタイミングおよびレベルを調整することによってきめ細かく制御することができることが企図される。ある態様において、分化因子の添加は、選択された幹細胞クローンと選択された培養培地との組合せに対するＴＧＦβシグナル伝達経路活性の活性における、特に、ＢＭＰシグナル伝達とアクチビンシグナル伝達との間の相対的な活性比など、異なるＴＧＦβシグナル伝達経路の相対的な活性における、変動性を説明する助けとなり得る。
【０１４０】
トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）シグナル伝達経路は、成体生物および発生中の胚の両方において、細胞の増殖、細胞の分化、アポトーシス、細胞のホメオスタシス、および他の細胞機能を含めた多くの細胞のプロセスに関与する。ＴＧＦβシグナル伝達経路が制御する細胞のプロセスは広範囲であるにもかかわらず、そのプロセスは比較的単純である。ＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドはＩＩ型受容体に結合し、ＩＩ型受容体はＩ型受容体をリクルートし、リン酸化する。次いで、Ｉ型受容体は、今度は、ｃｏＳＭＡＤ  ＳＭＡＤ４に結合することができる受容体制御型ＳＭＡＤ（Ｒ−ＳＭＡＤ）をリン酸化する。Ｒ−ＳＭＡＤ／ｃｏＳＭＡＤ複合体は核に蓄積し、核においてこれらは転写因子として働き、標的の遺伝子発現の制御に参加する。
【０１４１】
幹細胞は、後生動物の身体の多数の胚および成体細胞型を産生する上で、自己複製能および多能性を表す（Ｒｏｓｓｉら、２００８年による再考）。ＴＧＦβおよびＦＧＦなどの増殖因子は、幹細胞の自己複製および分化を制御する。ＦＧＦ２は、培養物中のマウスおよびヒトの胚性幹細胞（ＥＳＣ）の自己複製を支持する最も広く用いられている増殖因子であり、ＴＧＦβ／アクチビンのリガンドおよび受容体を誘発し、一方でＢＭＰ様の活性を抑制する（Ｇｒｅｂｅｒら、２００７年；Ｏｇａｗａら、２００７年）。さらに、ＴＧＦβ／ノーダルＩ型受容体ファミリーの薬理学的阻害剤は、ヒトおよびマウスＥＳＣの自己複製を抑制する（Ｏｇａｗａら、２００７年）。概して、ＴＧＦβは多能性前駆細胞の分化を阻害し、ＢＭＰはこれらの分化を誘発する（ＷａｔａｂｅおよびＭｉｙａｚｏｎｏ、２００９年）。
【０１４２】
ＥＳＣの自己複製を促進するために、ＴＧＦβ／ノーダルのシグナル伝達はＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３を活性化し、これらは、重大な幹細胞転写因子の１つであるＮａｎｏｇを直接誘発する（Ｘｕ，  Ｒ．  Ｈ．ら、２００８年）。ＴＧＦβおよびＦＧＦのシグナル伝達は、Ｓｍａｄ複合体のＮａｎｏｇプロモーターに対する結合を増強することによって相乗する。興味深いことに、ＮＡＮＯＧは、ＥＳＣにおいてＴＧＦβ（自己複製因子）とＢＭＰ（分化因子）との間の拮抗作用に対する分子リンクを提供する。ＮａｎｏｇはＳＭＡＤ１に結合し、その転写活性を阻害し、初期の中胚葉の分化および発生後期の組織特異的分化を促進するＢＭＰシグナル伝達の可能性を制限する（Ｓｕｚｕｋｉら、２００６年）。この例は、これらの経路の転写およびシグナル伝達因子を求めたゲノム全体にわたるスクリーニングの結果として、ＥＳＣの自己複製および分化のさらなる制御因子に拡張する可能性がある（Ｃｈｅｎら、２００８年）。
【０１４３】
リガンドのＴＧＦベータスーパーファミリーには、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖および分化因子（ＧＤＦ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、アクチビン、ノーダル、およびＴＧＦβが含まれる。シグナル伝達は、ＴＧＦベータスーパーファミリーリガンドのＴＧＦベータＩＩ型受容体に対する結合で始まる。ＩＩ型受容体はセリン／スレオニン受容体キナーゼであり、これはＩ型受容体のリン酸化を触媒する。各クラスのリガンドは特異的なＩＩ型受容体に結合する。哺乳動物において、７つの公知のＩ型受容体、５つのＩＩ型受容体が存在する。
【０１４４】
アクチビンには、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢの３種が存在する。アクチビンは胚発生および骨形成に関与する。これらはまた、下垂体ホルモン、性腺ホルモン、および視床下部ホルモン、ならびにインスリンを含む、多くのホルモンを制御する。これらは神経細胞生存因子でもある。
【０１４５】
ＢＭＰは骨形成タンパク質受容体２型（ＢＭＰＲ２）に結合する。これらは、骨形成、細胞分化、前側／後側の軸の特定化、増殖、およびホメオスタシスを含めた多数の細胞機能に関与する。
【０１４６】
ＴＧＦベータファミリーには、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３が含まれる。ＢＭＰＳ同様、ＴＧＦベータは肺発生および細胞分化に関与するが、これらはアポトーシスおよび他の機能にも関与する。これらはＴＧＦ−ベータ受容体２型（ＴＧＦＢＲ２）に結合する。
【０１４７】
ノーダルはアクチビンＡ受容体、ＩＩＢ型ＡＣＶＲ２Ｂに結合する。これは、次いで、アクチビンＡ受容体ＩＢ型（ＡＣＶＲ１Ｂ）、またはアクチビンＡ受容体ＩＣ型（ＡＣＶＲ１Ｃ）のいずれかと受容体複合体を形成することができる。
【０１４８】
ＴＧＦベータシグナル伝達経路（表２４）は、広範囲の細胞のプロセスに関与し、引き続き非常に厳重に制御される。経路が正および負の両方で変調される様々なメカニズムが存在する。リガンドおよびＲ−ＳＭＡＤに対してアゴニストが存在し、囮受容体が存在し、Ｒ−ＳＭＡＤおよび受容体はユビキチン化されている。
【０１４９】
【表２−１】
2013507936.tif 000003
ある実施形態において、本発明の組成物および方法は、好適または最適な分化の条件を決定するための、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、またはＴＧＦ−βファミリーメンバー、またはこれらの変異体もしくは機能的フラグメントの活性の調節を含む。
【０１５０】
本明細書で用いられる、「ＴＧＦ−βファミリーのメンバー」などの語は、ＴＧＦ−βファミリーの公知のメンバーとの相同性によって、またはＴＧＦ−βファミリーの公知のメンバーとの機能における類似性によってのいずれかで、ＴＧＦ−βファミリーに属すると当業者によって一般的に特徴付けられる増殖因子を意味する。本発明の特定の実施形態において、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーが存在する場合、ＴＧＦ−βファミリーメンバーのこれらの変異体または機能的フラグメントはＳＭＡＤ２または３を活性化する。ある実施形態において、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）、および骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）からなる群から選択される。一実施形態において、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーはアクチビンＡである。
【０１５１】
ノーダルが存在する場合、これはおよそ０．１ｎｇ／ｍｌからおよそ２０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくはおよそ１ｎｇ／ｍｌからおよそ１０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくはおよそ１０ｎｇ／ｍｌからおよそ７５０ｎｇ／ｍｌ、またはより好ましくはおよそ２５ｎｇ／ｍｌからおよそ５００ｎｇ／ｍｌの濃度で変化してよい。アクチビンＡが用いられる場合は、およそ０．０１ｎｇ／ｍｌからおよそ１０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくはおよそ０．１ｎｇ／ｍｌからおよそ１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくはおよそ０．１ｎｇ／ｍｌからおよそ２５ｎｇ／ｍｌの濃度、または最も好ましくはおよそ６ｎｇ／ｍｌからおよそ２０ｎｇ／ｍｌの濃度で変化してよいことが企図される。ＴＧＦ−βが存在する場合は、およそ０．０１ｎｇ／ｍｌからおよそ１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくはおよそ０．１ｎｇ／ｍｌからおよそ５０ｎｇ／ｍｌ、またはより好ましくはおよそ０．１ｎｇ／ｍｌからおよそ２０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在してよいことが企図される。
【０１５２】
ある実施形態において、組成物および方法は、アクチビン／ノーダルシグナル伝達の阻害剤または不活性化剤を含む。本明細書で用いられる「アクチビン／ノーダルシグナル伝達の阻害剤または不活性化剤」は、１つまたは複数のアクチビン／ノーダルタンパク質の活性、またはあらゆるこれらの上流もしくは下流のシグナル伝達組成物に、その可能なシグナル伝達経路のいずれかによって拮抗する薬剤を意味する。非限定的な例としてＳＢ−４３１５４２が含まれる。
【０１５３】
ある実施形態において、組成物および方法は、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤または不活性化剤を含む。本明細書で用いられる「ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤または不活性化剤」は、１つまたは複数のＢＭＰタンパク質の活性、またはあらゆるこれらの上流もしくは下流のシグナル伝達組成物に、その可能なシグナル伝達経路のいずれかによって拮抗する薬剤を意味する。ＢＭＰシグナル伝達を不活性化するのに用いられる化合物（１つまたは複数）は、当技術分野では公知のあらゆる化合物であってよく、または後で発見されるものであってよい。ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例には、ドルソモルフィン、ＧＤＦ−３、ドミナントネガティブ、切断したＢＭＰ受容体、可溶性ＢＭＰ受容体、ＢＭＰ受容体−Ｆｃキメラ、ノギン、フォリスタチン、コーディン、グレムリン、ケルベロス／ＤＡＮファミリータンパク質、ベントロピン、高用量アクチビン、および無羊膜が含まれる。
【０１５４】
本発明を練り上げる間に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの分化の最終段階からインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）および関連の分子などの省略されていた因子が、心臓遺伝子発現のレベルを実際に増大することが見出された。無関係の研究において、ＩＧＦＩＩは線維芽細胞においてＧＳＫ３βのレベルを低減することが見出されている（Ｓｃａｌｉａら、２００１年）。ＩＧＦＩＩは、したがって、培養培地中に存在し、または細胞によって分泌されるＷｎｔタンパク質の効果を増強することができる。Ｗｎｔタンパク質は通常、細胞質の分子であるβ−カテニンを安定化し、核の移動を引き起こし、β−カテニンは転写因子ＴＣＦの一部分を含んでいる。これは、複数の遺伝子の転写活性を変更する。Ｗｎｔの非存在下、β−カテニンはキナーゼＧＳＫ３βによってリン酸化され、ＧＳＫ３βはβ−カテニンを不安定化し、β−カテニンを細胞質中に維持もする。
【０１５５】
ＩＧＦＩＩなどのＷｎｔ活性化物質は明らかに心筋細胞の分化を制限するので、本発明のある態様は、多能性幹細胞の心筋細胞の分化の程度または割合を増大するために、Ｗｎｔアンタゴニストと培養することを含み得る。Ｗｎｔシグナル伝達は、ＤＫＫ−１またはＣｒｅｓｃｅｎｔ（Ｗｎｔに結合し、不活性化する分泌型タンパク質）のいずれかをコードする合成ｍＲＮＡの注入によって（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２００１年）、またはＤＫＫ−１をコードするレトロウイルスに感染させることによって（Ｍａｒｖｉｎら、２００１年）阻害され得る。あるいは、Ｗｎｔ経路は、キナーゼＧＳＫ３βの活性を増大することによって、例えば、細胞をＩＬ−６またはグルココルチコイドなどの因子と培養することによって阻害され得る。
【０１５６】
ある実施形態において、多能性幹細胞、細胞凝集物、または分化した幹細胞を培養するのにＦＧＦまたはＦＧＦとＨＧＦとの組合せが用いられ、これらは幹細胞の心臓誘導を促進し得る。例えば、ＦＧＦを、少なくとも、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、１８０、２００、２５０ｎｇ／ｍｌ、またはこれらに由来するあらゆる範囲の濃度で添加することができる。場合により、例えば、少なくとも、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、１８０、２００、２５０ｎｇ／ｍｌ、またはこれらに由来するあらゆる範囲の濃度の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）も含まれていてよい。
【０１５７】
Ｃ．非静置培養
ある態様において、非静置培養を多能性幹細胞の心臓誘導に用いることができる。大規模のＥＢおよび心筋細胞を引き続き生成するのに懸濁培養を用いることができるが、静置培養は形成するＥＢのサイズおよび形状に対する制御がほとんどなく、このことは、ＥＢから分化する心筋細胞の収量および質に直接影響を及ぼす。非静置培養は、例えば、振盪、回転、もしくは撹拌のプラットフォーム、または培養ベッセル、特に大体積の回転式バイオリアクターを用いることによって、制御された運動速度に維持された細胞とのあらゆる培養物であってよい。かき混ぜは栄養分および細胞老廃物の循環を改善することがあり、より均一な環境を提供することによって細胞凝集物を制御するのにも用いられ得る。例えば、回転速度を、少なくとも、または多くて約２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００ｒｐｍ、またはこれらに由来するあらゆる範囲に設定することができる。多能性幹細胞、細胞凝集物、分化した幹細胞、またはこれらに由来する心筋細胞のための非静置培養におけるインキュベーション期間は、少なくとも、または約４時間、８時間、１６時間、または１、２、３、４、５、６日、または１、２、３、４、５、６、７週、またはこれらに由来するあらゆる範囲であってよい。
【０１５８】
ＶＩ．心筋細胞系統の細胞のキャラクタリゼーション
本発明の技術にしたがって得た細胞を、数々の表現型の判定基準にしたがってキャラクタリゼーションすることができる。多能性幹細胞系に由来する心筋細胞および前駆細胞は、他の源からの心筋細胞の形態学的特徴を有することが多い。これらは、紡錘体、円形、三角形、または多角形の形状であってよく、これらは免疫染色によって検出できるサルコメアの構造に特徴的な横紋を示すことがある。これらは、平らな細胞のシート、または基質に付着したままの、もしくは懸濁液中に浮遊する凝集物であってよく、電子顕微鏡によって検査すると典型的な筋節および心房顆粒を示す。
【０１５９】
多能性幹細胞由来の心筋細胞およびそれらの前駆体は、以下の心筋細胞特異的マーカーの少なくとも１つを有するのが典型的である：
横紋筋の収縮を制御するためのカルシウム感受性分子スイッチを提供するトロポニン複合体のサブユニットである心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）。
【０１６０】
心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）。
【０１６１】
発生中の心臓において持続する、マウス胚初期発生中に心臓中胚葉において発現される心臓転写因子であるＮｋｘ２．５。
【０１６２】
細胞は、以下のマーカーの少なくとも１つ（およびしばしば少なくとも３、５、またはそれを超えて）を発現するのが典型的でもある：
発生中の心臓および胎児心筋細胞において発現されるが、成体において下方制御されるホルモンである心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）。これは心臓細胞において高度に特異的に発現されるが、骨格筋細胞では発現されないので、心筋細胞に対する良好なマーカーであると考えられている。
【０１６３】
ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、特に心臓特異的であるβ鎖、
タイチン、トロポミオシン、アルファ−筋節アクチン、およびデスミン、
心臓中胚葉において高度に発現されるが発生中の心臓において持続する転写因子である、ＧＡＴＡ−４。これは多くの心臓遺伝子を制御し、心発生において役割を果たす
心臓中胚葉において発現され、発生中の心臓において持続する転写因子である、ＭＥＦ−２Ａ、ＭＥＦ−２Ｂ、ＭＥＦ−２Ｃ、ＭＥＦ−２Ｄ、
心臓細胞間の接着を媒介する、Ｎ−カドヘリン、
心筋細胞間にギャップ結合を形成する、コネキシン４３、
β１−アドレナリン受容体（β１−ＡＲ）、
心筋梗塞後に血清中で上昇する、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）およびミオグロビン、
α−心臓アクチン、初期増殖応答−Ｉ、およびサイクリンＤ２。
【０１６４】
組織特異的マーカーは、細胞表面マーカーに対するフローイムノサイトメトリーまたはアフィニティー吸着、細胞内または細胞表面マーカーに対する免疫細胞化学（例えば、固定された細胞もしくは組織切片の）、細胞抽出物のウエスタンブロット分析、および細胞抽出物または培地中に分泌された生成物のための酵素結合免疫吸着検定法など、あらゆる適切な免疫学的技術を用いて検出することができる。ｃＴｎＩおよびｃＴｎＴなどの心臓マーカーを他のイソ型から区別する抗体は、ＳｉｇｍａおよびＳｐｅｃｔｒａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓなどの供給業者から市販されている。場合により細胞の固定後に、および場合により標識した二次抗体を用いて、著しく検出可能な量の抗体が標準の免疫細胞化学またはフローサイトメトリーアッセイにおいて抗原に結合する場合は、細胞による抗原の発現は、抗体検出性であると言われる。
【０１６５】
組織特異的遺伝子生成物の発現は、ノーザンブロット分析、ドットブロットハイブリダイゼーション分析によってｍＲＮＡレベルで、または、公的に入手できる配列データ（ＧｅｎＢａｎｋ）を用いた標準の増幅方法における配列特異的プライマーを用いた逆転写酵素開始（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｉｎｉｔｉａｔｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出することもできる。タンパク質またはｍＲＮＡレベルで検出される組織特異的マーカーの発現は、レベルが、少なくとも、または約２、３、４、５、６、７、８、または９倍、より詳しくは１０、２０、３０、４０、または５０倍を超えて、未分化の多能性幹細胞または他の非関連の細胞型などの対照の細胞を上回る場合に陽性とみなされる。
【０１６６】
マーカーが所望の表現型の細胞の表面上で同定された後、これらを免疫選択法に用いて、イムノパニングまたは抗体媒介性蛍光活性化細胞選別などの技術によってその集団をさらに富化することができる。
【０１６７】
好適な環境下、多能性幹細胞由来の心筋細胞は、しばしば自発的な周期的な収縮活性を示す。これは、これらの細胞を好適なＣａ２＋濃度および電解質のバランスで適切な組織培養環境中で培養する場合、細胞は、細胞の軸の１つにわたって収縮し、次いで培養培地にいかなる追加の成分を添加しなくても収縮から開放されることが観察され得る。収縮は周期的であり、これは通常のバッファー中、１分あたり約６回と２００回との間の収縮の頻度、しばしば１分あたり約２０回と約９０回との間の収縮の頻度で、収縮が規則的または不規則的に繰り返すことを意味する。個々の細胞は、それ自体自発的な周期的な収縮活性を示すことがあり、または組織、細胞凝集物、または培養された細胞塊において周囲の細胞と協調した自発的な周期的な収縮活性を示すことがある。
【０１６８】
細胞の収縮活性は、収縮の性質および頻度に対する培養条件の影響にしたがって特徴付けることができる。利用可能なＣａ２＋濃度を低減し、または他の点でＣａ２＋の膜貫通型の輸送を妨害する化合物は、しばしば収縮活性に影響を及ぼす。例えば、Ｌ型カルシウムチャネルブロッカーのジルチアゼムは、用量依存的に収縮活性を阻害する。一方、イソプレナリンおよびフェニレフリンなどのアドレナリン受容体アゴニストは、正の変時効果を有する。細胞の機能的性質のさらなるキャラクタリゼーションは、Ｎａ＋、Ｋ＋、およびＣａ２＋に対するチャネルを特徴付けることを伴うことができる。心筋細胞様作用の電位に対するパッチクランプ分析によって、電気生理学を研究することができる。Ｉｇｅｌｍｕｎｄら、１９９９年；Ｗｏｂｕｓら、１９９５年；およびＤｏｅｖｅｎｄａｎｓら、２０００年を参照されたい。
【０１６９】
機能的属性によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞およびその前駆体を特徴付ける様式が提供されるが、本開示において言及されるいくつかの使用には必要ではないことがある。例えば、機能的、または電気生理学的性質全てではないが、上記に列挙したマーカーのいくつかを保有する細胞を豊富にした細胞集団の混合は、損傷された心臓組織に移植し、心臓機能を補足するのに必要とされる機能的性質をｉｎ  ｖｉｖｏで獲得するのが可能である場合、治療的にかなり有益であり得る。
【０１７０】
確立された多能性幹細胞系に由来する場合、本発明の細胞集団および単離細胞は、これらが由来する系と同じゲノムを有すると特徴付けることができる。これは、染色体ＤＮＡが多能性幹細胞と心臓細胞との間で９０％を超えて同一であることを意味し、これは心臓細胞が未分化の系から正常の有糸分裂の経過によって得られる場合に推論され得る。心筋細胞の系統の細胞が親細胞集団に由来するという特徴は、いくつかの点において重要である。特に、未分化細胞の集団は、例えば、患者を組織適合性型の心臓同種移植に予め寛容化することができる集団など、さらなるバッチの心臓細胞、または治療において有用であり得る別の細胞型のいずれかである、共有ゲノムを有するさらなる細胞を生成するのに用いることができる（ＵＳ  ２００２／００８６００５；ＷＯ  ０３／０５０２５１）。
【０１７１】
ＶＩＩ．分化細胞の遺伝子改変
本発明の細胞は、分化の前または後のいずれかに細胞を遺伝子操作することによって、１つまたは複数の遺伝子改変を含むようになされてよい（ＵＳ  ２００２／０１６８７６６）。人為的操作のあらゆる適切な手段によってポリヌクレオチドが細胞中に移動される場合に、または細胞がポリヌクレオチドを受け継いだ最初に改変された細胞の子孫である場合、細胞は「遺伝子改変された」または「トランスジェニック」であると言われる。例えば、細胞は、制限された発生上の系統の細胞または最終分化した細胞に進行する前または後のいずれかに、テロメラーゼ逆転写酵素を発現するように細胞を遺伝子改変することによって、その複製の可能性を増大するように処理加工されてよい（ＵＳ  ２００３／００２２３６７）。
【０１７２】
本発明の細胞は、組織の再生に関与するその能力を増強するために、または投与部位に治療用遺伝子を送達するために、遺伝子改変されてもよい。ベクターは、分化細胞の型において汎特異的または特異的に活性のいずれかであるプロモーターに作動可能に連結している、所望の遺伝子に対する公知のコード配列を用いてデザインされる。特に興味深いのは、ＦＧＦ、心房性ナトリウム利尿因子などの向心臓因子、クリプト（ｃｒｉｐｔｏ）、ならびに心臓転写制御因子（例えば、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、およびＭＥＦ２−Ｃ）など、様々なタイプの１つまたは複数の増殖因子を発現するように遺伝子改変された細胞である。投与部位でこれらの因子が生成されると、機能的な表現型の採用を促進し、投与された細胞の有益な効果を増強し、または処置部位周囲の宿主細胞の増殖もしくは活性を増大することができる。
【０１７３】
本発明のある実施形態において、本発明の核酸構築物を含む細胞は、選択マーカーまたはスクリーニング可能マーカーなど、発現ベクター中のマーカーを含むことによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで同定され得る。このようなマーカーは、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にする細胞への同定可能な変化を付与し、または心臓特異的なプロモーター（例えば、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、横紋筋ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、Ｎ−カドヘリン、β１−アドレナリン受容体、ＡＮＦ、転写因子のＭＥＦ−２ファミリー、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ミオグロビン、または心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）のプロモーター）を用いることによって分化した心臓細胞を富化する、もしくは同定するのを助ける。
【０１７４】
一般的に、選択マーカーは、選択を可能にする性質を付与するものである。正の選択マーカーは、マーカーの存在によりその選択が可能になるものであり、負の選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を妨げるものである。正の選択マーカーの一例は薬物耐性マーカーである。
【０１７５】
通常、薬物選択マーカーが含まれると形質転換体のクローニングおよび同定における助けとなり、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択マーカーである。条件の実行に基づいて形質転換体の判別を可能にする表現型を付与するマーカーの他に、その基盤が比色分析であるＧＦＰなどのスクリーニング可能マーカーを含めた他のタイプのマーカーも企図される。あるいは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのスクリーニング可能酵素も利用することができる。当業者であれば、おそらくＦＡＣＳ分析と併用する免疫学的マーカーを使用する方法も知っている。用いるマーカーは、遺伝子生成物をコードする核酸と同時に発現することができるのであれば重要でないと考えられている。選択マーカーおよびスクリーニング可能マーカーのさらなる例は当業者には周知である。
【０１７６】
ＶＩＩＩ．心筋細胞およびその前駆体の使用
本発明のある態様は、心筋細胞系統の多数の細胞を生成する方法を提供する。これらの細胞集団は、数々の重要な調査、開発、および商業上の目的に用いることができる。
【０１７７】
Ａ．薬物スクリーニング
本発明の心筋細胞は、このような細胞およびその様々な子孫の特徴に影響を及ぼす因子（例えば、溶媒、小分子薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド）または環境条件（例えば、培養条件もしくは操作）を求めて商業的にスクリーニングするのに用いることができる。
【０１７８】
いくつかの適用において、多能性幹細胞（非分化または分化）は、後期心筋細胞前駆体、もしくは最終分化細胞への成熟を促進する因子をスクリーニングするために、または長期間培養物中のこのような細胞の増殖および維持を促進するために用いられる。例えば、候補の成熟因子または増殖因子を異なるウエル中の細胞に添加し、次いでさらなる培養物および細胞の使用に対する望ましい評価基準にしたがって、結果として生じるあらゆる表現型の変化を決定することによって、候補の成熟因子または増殖因子を試験する。
【０１７９】
本発明の他のスクリーニングの応用は、医薬化合物の、心筋組織の維持または修復に対する効果の試験に関する。スクリーニングは、化合物が細胞に対して薬理学的効果を有するようにデザインされているという理由から、または他で効果を有するようにデザインされる化合物がこの組織型の細胞に対して意図されない副作用を有し得るという理由から、のいずれかで行われてよい。スクリーニングは、本発明のあらゆる前駆細胞または最終分化細胞を用いて行うことができる。
【０１８０】
読者は、一般に、標準的な教科書であるＩｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、および米国特許第５，０３０，０１５号を参照されたい。候補の医薬化合物の活性の評価は、本発明の分化細胞を、単独で、または他の薬物との併用いずれかの候補の化合物と組み合わせることを一般的に伴う。研究者は、形態学、マーカーの表現型、または化合物に起因する細胞の機能的活性（非処理の細胞、または不活性な化合物で処理した細胞と比べて）におけるあらゆる変化を決定し、次いで化合物の効果を観察される変化と相関させる。
【０１８１】
細胞の生存能、生存、形態学、ならびにある種のマーカーおよび受容体の発現に対する効果によって、まず第一に細胞毒性を決定することができる。薬物の染色体ＤＮＡに対する効果は、ＤＮＡ合成または修復を測定することによって決定することができる。特に細胞周期における予定外の時間の、または細胞の複製に必要とされるレベルを超えた［３Ｈ］−チミジンもしくはＢｒｄＵの組入れは、薬物効果と一致する。不必要な効果には、中期延展体によって決定される異常な割合の姉妹染色分体交換も含み得る。読者は、さらなる詳細にＶｉｃｋｅｒｓ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、３７５〜４１０頁）を参照されたい。
【０１８２】
細胞機能の効果は、細胞培養物またはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかにおいて、マーカーの発現、受容体の結合、収縮活性、または電気生理学など、心筋細胞の表現型または活性を観察するためのあらゆる標準のアッセイを用いて評価することができる。薬剤候補を、これらが収縮の程度または頻度を増大するかまたは低減するかなど、薬剤候補の収縮活性に対する効果を試験することもできる。効果が観察される場合、化合物の濃度を滴定して半数有効量を決定することができる（ＥＤ５０）。
【０１８３】
Ｂ．動物試験
本発明のある態様は、代謝機能における先天性異常、疾患状態の効果、または著しい外傷の結果など、あらゆる認知される必要性に対する心筋の組織維持または修復を増強するための、心筋細胞および心筋細胞の前駆体の使用も提供する。
【０１８４】
細胞組成物の治療的投与に対する適合性を決定するために、細胞を、適切な動物モデルにおいて最初に試験することができる。一レベルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞が生存し、その表現型を維持する能力に対して細胞を評価する。細胞組成物を免疫不全の動物（例えば、ヌードマウス、または化学的にもしくは照射によって免疫不全にされた動物）に投与する。再増殖の期間の後、組織を収集し、多能性幹細胞由来の細胞が依然として存在するか否かについて評価する。
【０１８５】
これは、予め標識し（例えば、ＢｒｄＵもしくは［３Ｈ］チミジンで）、または引き続き構成的細胞マーカーを検出することによって（例えば、ヒト特異的抗体を使用して）検出できる標識（例えば、緑色蛍光タンパク質もしくはβ−ガラクトシダーゼ）を発現する細胞を投与することによって行うことができる。投与した細胞の存在および表現型は、免疫組織学的に、もしくはヒト特異的抗体を用いてＥＬＩＳＡによって、または公開されている配列データにしたがってヒトポリヌクレオチドに特異的である増幅をもたらすプライマーおよびハイブリダイゼーション条件を用いてＲＴ−ＰＣＲ分析によって評価することができる。
【０１８６】
適合性は、多能性幹細胞に由来する心筋細胞の細胞集団での処置の結果として起こる心臓の回復の程度を評価することによっても決定することができる。このような試験には数々の動物モデルが利用できる。例えば、前側左心室壁の表面に接触させて、予め冷却したアルミニウム棒を配置することによって、心臓を低温傷害してもよい（Ｍｕｒｒｙら、１９９６年；Ｒｅｉｎｅｃｋｅら、１９９９年；米国特許第６，０９９，８３２号；Ｒｅｉｎｅｃｋｅら、２００４年）。より大型の動物では、左心室前壁上に液体Ｎ２中冷却した３０〜５０ｍｍ銅製ディスクプローブを約２０分間配置することによって低温傷害を生じさせることができる（Ｃｈｉｕら、１９９５年）。左冠状動脈主幹部に結紮することによって、梗塞を誘発することができる（Ｌｉら、１９９７年）。傷害した部位を、本発明の細胞調製物で処置し、心臓組織を、傷害領域における細胞の存在に対して組織学的に試験する。左心室拡張終期圧、発生圧、圧力上昇率、および圧減衰率などのパラメーターを決定することによって、心臓機能をモニタリングすることができる。
【０１８７】
Ｃ．ヒトにおける治療使用
十分な試験の後、本発明の分化細胞は、このような処置を必要とするヒト患者または他の対象における組織の再構成または再生に用いることができる。細胞が意図する組織部位に移植または遊走し、機能的に欠損した領域を再構成または再生できるやり方で細胞を投与する。心臓機能を再構成することができる細胞を、心腔、心膜、または心筋の内部の所望の位置に直接投与するように適応される特殊な装置が利用可能である。
【０１８８】
望ましい場合には、多能性幹細胞由来の心筋細胞の同種移植片を受ける患者を、移植される細胞の免疫拒絶を低減するように処置することができる。企図される方法には、シクロスポリンＡなどの伝統的な免疫抑制薬の投与（Ｄｕｎｎら、Ｄｒｕｇｓ、６１巻、１９５７頁、２００１年）、または多能性幹細胞由来の細胞の適合する集団を用いた免疫寛容の誘発（ＷＯ  ０２／４４３４３；米国特許第６，２８０，７１８号；ＷＯ  ０３／０５０２５１）が含まれる。別の取組みは、例えば、アロプリノールでの処置など、対象中に移植したときに細胞によって生成される尿酸の量を低減するように心筋細胞の細胞集団を適応させることである。あるいは、または合わせて、アロプリノール、または尿酸オキシダーゼなどの尿酸を代謝する酵素を投与することによって、患者を準備する（ＰＣＴ／ＵＳ０４／４２９１７）。
【０１８９】
本発明による再生医療を受けるのに適する患者には、冠動脈性心疾患、心筋症、心内膜炎、先天性心臓血管欠損、およびうっ血性心不全など、様々な種類の急性および慢性の心臓状態を有する患者が含まれる。処置の有効性は、臨床的に認められている判定基準、例えば、瘢痕組織または瘢痕組織の血管再生によって占められる面積における低減、および狭心症の頻度および重症度における低減；または発生圧、収縮期圧、拡張末期圧、患者の移動性、および生活の質に置ける改善によってモニタリングすることができる。
【０１９０】
本発明の心筋細胞は、ヒトに投与するのに十分に無菌の条件下で調製される等張の賦形剤を含む、医薬組成物の形態で供給することができる。ある態様において、細胞を、プロテアーゼを用いて、または単細胞もしくは小型のクラスターの懸濁液にする穏やかな機械的操作によって分散するのが望ましいことがある。移植時の細胞死の危険性を低減するために、細胞を、投与の約２４時間前に熱ショックによって処理し、または約０．５Ｕ／ｍＬのエリスロポエチンで培養してもよい。
【０１９１】
医薬製剤における一般的原則に、読者は、Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、１９９６年；およびＨｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２０００年を参照されたい。細胞の受け手および組成物のあらゆる付随するエレメントの選択が、投与に用いられる経路および装置にしたがって適応される。組成物はまた、心筋細胞の移植または機能的な移動を促進する１つまたは複数の他の成分を含み、または伴うこともできる。適切な成分には、心筋細胞の接着を支持もしくは促進するマトリックスタンパク質、または相補的な細胞型、特に内皮細胞が含まれる。
【０１９２】
本発明は、製造、流通、または使用の間のあらゆる時間に存在する１セットまたは組合せの細胞を含む試薬系も含む。細胞のセットは、本開示に記載される２つまたはそれを超える細胞集団のあらゆる組合せを含み、例を挙げると、それだけには限定されないが、しばしば同じゲノムを共有する、非分化の多能性幹細胞または他の分化細胞型と組み合わされた、１タイプの分化細胞（心筋細胞、心筋細胞前駆体など）である。セットにおける各細胞型は一緒に、または同じ設備において別々の容器に、または異なる場所で、同時に、または異なる時間に、取引関係を共有する同じ実体または異なる実体の制御下で包装されてよい。
【０１９３】
本発明の医薬組成物は、場合により、心筋の疾患状態または異常を改善するための心筋細胞の細胞機能の再構成など、所望の目的で、書面の指示と一緒に適切な容器中に包装することができる。
【実施例】
【０１９４】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。当業者であれば、後に続く実施例において開示する技術は、本発明の実践において十分に機能することが本発明者らによって発明された技術を表し、したがってそれを実践するための好ましい様式を構成するとみなされ得ることを理解されたい。しかし、当業者であれば、本開示に鑑みて、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、また本発明の精神および範囲から逸脱せずに同様のまたは類似の結果を依然として得ることができることを理解されたい。
【０１９５】
（実施例１）
自動化のための単細胞分割
ｉＰＳ細胞を、６ウエルプレート中ＴｅＳＲ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）中Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上に維持した。培地を吸引した後、０．０５％トリプシン１ｍｌ／ウエルを加え、細胞を３７℃で７分間インキュベートした。等体積のＡ１培地（１μＭ  Ｈ−１１５２（またはＨＡ−１００）（ＥＭＤ）、０．５ｍｇ／ｍｌダイズトリプシン阻害物質を含むＴｅＳＲ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を細胞に加えた。次いで、細胞を、Ａ１倍地を含むＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）をコーティングしたベッセル中に接種し、２４時間毎にＴｅＳＲ培地を供給した。
【０１９６】
（実施例２）
クエン酸ナトリウムでの単細胞のヒトｉＰＳ細胞の継代
解離したｉＰＳ細胞を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＤ−ＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝食塩水）ですすぎ、培地を吸引した。次いで、細胞を好適な量（すなわち、６ウエルプレートの１ウエルに対して１ｍＬ、Ｔ−１５０フラスコに対して１５ｍＬなど）の１５ｍＭクエン酸ナトリウム、１６５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．３、ＯＳＭ３４０と、室温で６〜１５分間インキュベートした。インキュベーション後、クエン酸ナトリウム水溶液を、依然としてゆるく接着している細胞と一緒に吸引した。細胞を１μＭ  Ｈ１１５２を有する好適な量のＴｅＳＲ中に再懸濁し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）表面のベッセルに分配した。
【０１９７】
Ｔ１５０フラスコからＣｏｒｎｉｎｇ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔａｃｋｓまでの出発材料の生成をスケールアップするために、およびクエン酸ナトリウムで単細胞／小型クランプとしてｉＰＳ細胞が継代される能力を評価するために、ｉＰＳ６．１およびｉＰＳ６．１ＭＲＢを単細胞または小型細胞クランプとして１５ｍＭクエン酸ナトリウムでダブルスタック中に継代し、Ｔ１５０対照フラスコをディスパーゼで分割して維持した（実験デザインは図１を参照されたい）。ダブルスタックのクエン酸ナトリウム条件は約３０時間の良好な典型的な倍加時間を有した（図２Ａ〜Ｃ）。４継代および７継代に、細胞を、心発生、多能性パネル、および核型で評価した。細胞をクエン酸ナトリウムで４回分割し、正常の核型を維持した（図３）。凝集物の画像、および心筋細胞に対するｃＴｎＴ染色を、分割後１４日目に分析した（図４Ａ〜Ｄ、図５Ａ〜Ｃ、図６Ａ〜Ｂ、図７Ａ〜Ｃ）。クエン酸ナトリウムおよびディスパーゼで継代した後のｉＰＳ細胞の多能性のプロファイルを、５つの多能性マーカーを用いてフローサイトメトリーによって比較した（図８Ａ〜Ｃ）。ｉＰＳ細胞を、クエン酸ナトリウム法で少なくとも４回継代するのは安全と思われる。
【０１９８】
これらのｉＰＳ細胞をクエン酸ナトリウムで継代した後、心発生も分析し、データを図９にまとめた。図は、Ｔ１５０フラスコ（対照）中ディスパーゼで正常に継代したｉＰＳ６．１およびｉＰＳ６．１ＭＲＢ細胞、ならびにクエン酸ナトリウムでダブルスタック中で継代した細胞から産生される心筋細胞を示す。最後の３つの「スピナー」試料は、様々なダブルスタック収集物から残されたダブルスタックｉＰＳ６．１ＭＲＢ細胞に由来する。クエン酸ナトリウムでのダブルスタック中で継代した細胞での１Ｌスピナーにおいて、平均収量１１０ｅ６細胞／Ｌが得られた。
【０１９９】
上記に記載した実験およびデータは、ｉＰＳ６．１およびｉＰＳ６．１ＭＲＢなどのｉＰＳ細胞を分割する手段としてのクエン酸ナトリウムの使用を支持するものである。この分割方法をダブルスタックフラスコと組み合わせることにより、大量の出発材料が、より簡単で効率的に生成できるようになる。クエン酸ナトリウム分割細胞ははるかにより均等に広がり、細胞は、ディスパーゼで分割した細胞よりもさらに単層に増殖させることができる。これにより、本発明者らは、各フラスコに対して表面積およびＴｅＳＲ利用／細胞の両方を最大化できるようになる。クエン酸ナトリウムは、ディスパーゼを用いた場合に細胞を掻き取るために細胞の上部に接近する必要性の問題も解決する。本発明者らは、クエン酸ナトリウムで少なくとも４回ｉＰＳ細胞を安全に継代することができ（ディスパーゼで維持される細胞から）、正常の核型、心発生の可能性、および多能性を維持する細胞を依然として有することができると思われる。
【０２００】
（実施例３）
１Ｌスピナーフラスコ中の懸濁凝集物によるｉＰＳ細胞の心筋細胞への誘導
以下の実験において、ヒト多能性幹細胞を、１Ｌスピナーフラスコ中懸濁凝集物によりＴｅＳＲ培地中Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上で維持し、心筋細胞に拡大した。
【０２０１】
ｉＰＳ−ＭＲＢ細胞を、通常継代される準備ができるときまでに、ＴｅＳＲ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）中でＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）上に維持した。本実施例を通してｉＰＳ細胞をＴ−１５０フラスコ中で増殖させたが、他の培養の様式において出発細胞用に秤量することができる。Ｔ−１５０フラスコ５本のｉＰＳ細胞を収集し、培地を吸引し、細胞を室温の組換えトリプシン様酵素であるＴｒｙｐＬｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１２ｍＬと３７℃で７分間インキュベートした。次いで、細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）とともに１２ｍｌ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ）を含む５０ｍｌコニカルチューブ５本に移した（各Ｔ−１５０フラスコに対しチューブ１本）。次いで、細胞を１２００ｒｐｍで５分間ペレットにし、上清を吸引した。ペレットを凝集物促進培地１０ｍＬ（２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１μＭ  Ｈ１１５２を含み、５０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＨＧＦありまたはなしのＴｅＳＲ培地）中に再懸濁した。再懸濁したペレットを、必要であれば、１本の２５０ｍｌコニカルチューブ中に合わせた（後の希釈を可能にする体積）。細胞を、ＣＥＤＥＸ  ＨｉＲＥＳ細胞計数器を用いて計数し、次いで１．０×１０６細胞／ｍＬに希釈した。希釈した細胞ストックの各５００ｍＬを、１Ｌスピナーフラスコ１本中に分配し（後で希釈するためにスピナーフラスコ中室内に放置）、フラスコを速度５０ＲＰＭのマグネチックスターラーのプラットフォーム上に配置した（気体を移動させるために２回めいっぱいまわして両方のサイドキャップを緩めた）。
【０２０２】
翌日（１日目）、細胞を含むフラスコを細胞培養フード中にセットし、懸濁した凝集物を３０分間フラスコの底部に沈降させた。使用済みの培地を、２ｍＬ吸引ピペットを用いて吸引し、およそ１００ｍＬをフラスコ中に残した（設定後、細胞のフィルムが底部上に形成した場合は、フラスコを各方向、前後に振盪しこれらを破壊した後、培地を加える）。凝集物移行培地（５０％ＴｅＳＲ培地、４５％ＤＭＥＭ含有ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、５％ＥＳ用ＦＣＳ、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１μＭ  Ｈ１１５２、および５０ｎｇ／ｍｌＨＧＦありまたはなし）をパイプライン機械を用いてフラスコに加えてオリジナルの体積とした。フラスコを、７％ＣＯ２インキュベーター内部の撹拌プラットフォーム上に戻し、撹拌器を５０±１ＲＰＭで作動開始させた（気体を移動させるために２回めいっぱいまわして両方のサイドキャップを緩めた）。
【０２０３】
２日目、細胞を含むフラスコを細胞培養フード中にセットし、懸濁した凝集物を１５分間フラスコの底部に沈降させた。使用済みの培地を吸引し、およそ１００ｍＬをフラスコ中に残した。凝集懸濁液をフラスコ中穏やかに混合し、心臓誘導培地（９０％ＴｅＳＲ培地、１０％ＥＳ用ＦＣＳ、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍｌヒト組換えｂＦＧＦ、および５０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＨＧＦありまたはなし）をパイプライン機械を用いて各フラスコに加えて１Ｌ（２×希釈）とした。フラスコを、７％ＣＯ２インキュベーター内部の撹拌プラットフォーム上に戻し、撹拌器を５０±１ＲＰＭで作動開始させた（気体を移動させるために２回めいっぱいまわして両方のサイドキャップを緩めた）。
【０２０４】
３日目、細胞を含むフラスコを細胞培養フード中にセットし、懸濁した凝集物を１５分間フラスコの底部に沈降させた。使用済みの培地を吸引し、およそ１００ｍＬをフラスコ中に残した。スピナーフラスコを前後に振盪して大型のクランプを壊した。心臓誘導培地を各フラスコに戻して加えて、３〜７日目に対するオリジナル体積に戻し、８、１０、１２日目の代わりに心臓維持培地を交換した。毎回の培地の交換の後に、フラスコを７％ＣＯ２インキュベーター内部の撹拌プラットフォームに戻し、撹拌器を５０±１ＲＰＭで作動開始させた（気体を移動させるために２回めいっぱいまわして両方のサイドキャップを緩めた）。
【０２０５】
１４日目に収集時のフラスコ１本あたり全細胞を計数し、収集時のｃＴＮＴまたはＲＦＰ純度により、細胞培養物を分析した。凝集物の計数を２日目および最終段階にも行い、凝集物の写真を撮影した。
【０２０６】
（実施例４）
Ｔフラスコ中懸濁凝集物によるｉＰＳ細胞の心筋細胞への誘導
ｉＰＳ細胞またはｈＥＳ細胞（ｉＰＳ６．１細胞、ｉＰＳ６．１−ＭＲＢ細胞、もしくはＨ９−ＴＧＺ細胞のいずれか）を、通常継代される準備ができるときまでに、ＴｅＳＲ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）中Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上に維持した。出発細胞をＴ−１５０フラスコ中で増殖させたが、他の培養の様式において秤量することができた。
【０２０７】
凝集物の形成に対して、最初の日（０日目）、超低接着（ＵＬＡ）のＴ７５またはＴ２５フラスコを、供給線をマーキングすることによって準備した。供給線マーキング用の型板を、低接着フラスコの上部側面上の浮き上がった縁に対して配置し（図１０Ａ）、フラスコ上にマジック（アルコール耐性）インキで線を引いた（図１０Ｂ）。次いで、フラスコにラベル付けした。
【０２０８】
一度に最高５本のＴ１５０フラスコの細胞を収集し、細胞を試験し、６０〜８０％のコンフルエントであることが検証された。培地を吸引し、室温のＴｒｙｐＬＥ１２ｍＬを加えて３７℃で７分間インキュベートした。一方、５０ｍＬコニカルチューブ１本を、１０％ＦＣＳを有する１２ｍＬ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２を加えることによって各Ｔ１５０用に準備した。７分のインキュベーション後、フラスコを軽く叩いて残りの細胞を追い出し、準備した５０ｍＬチューブ中に細胞をピペッティングした。次いで、細胞を、遠心分離器を用いて１２００ｒｐｍ５分間でペレットにし、細胞ペレットを乱さずに上清を吸引した。細胞ペレットを、実施例３に記載した通り、１０ｍＬ凝集形成培地中に再懸濁した。
【０２０９】
複数の細胞のチューブを、必要であれば、１本の２５０ｍＬコニカルチューブ中に合わせた（後の希釈を可能にする体積）。細胞を、ＳＯＰ  ＥＱ−１５にしたがってＣＥＤＥＸ  ＨｉＲＥＳ細胞計数器を用いて計数し、次いで１．０×１０６細胞／ｍＬに希釈した。１５ｍＬの希釈した細胞ストック各々を、各ＵＬＡ  Ｔ７５（またはＵＬＡ  Ｔ２５  １本あたり５ｍＬ）フラスコ中に分配した。
【０２１０】
フラスコ／プレートを７％ＣＯ２インキュベーター内部のロッカーのプラットフォーム上に配置して２４±４時間インキュベートした。ロッカーが十分にバランスが取れていることを確認されたい。ロッカーを、Ｔ７５フラスコに対して７．５±２ＲＰＭ、またはＴ２５フラスコに対して１５±１ＲＰＭで作動する撹拌器で開始させた。ロッカーのＲＰＭを測定するために、時計またはタイマーを用いて時間を記録し、６０秒における完全なサイクルの数を計数した。ＲＰＭの読みが指定の範囲内になるまで回転器の速度を調整し再測定した。フラスコを加え、または取り除くときは常に、再測定および再調節を適宜行った。
【０２１１】
翌日（１日目）、細胞を凝集物移行培地に供給し、図１１Ａに示す通り、フラスコを４５°の角度で短い縁上に傾けることによって細胞を供給し、１０分間、懸濁した凝集物をフラスコの底部の隅に沈降させた。パスツールピペットをフラスコに引いた供給線まで下ろして使用済みの培地を吸引した（図１１Ｂ）。損傷した表面に凝集物がくっつくことがあるので、ピペットでフラスコの低接着表面を引っ掻かないように注意を払わなければならない。フラスコを真っ逆さまにし、１５ｍＬ／Ｔ７５（または５ｍＬ／Ｔ２５）フラスコを凝集移行培地に穏やかに加えた。
【０２１２】
フラスコ／プレートを７％ＣＯ２インキュベーター内部のロッカーのプラットフォーム上に配置して２４±４時間インキュベートした。ロッカーを、Ｔ７５フラスコに対して７．５±２ＲＰＭ、またはＴ２５フラスコに対して１５±１ＲＰＭで作動する撹拌器で開始させた。回転速度を上記に記載した通りに調整した。
【０２１３】
２日目、細胞を希釈し、Ｔ２５またはＴ７５フラスコに分配した。最初に、さらなるＵＬＡ  Ｔ２５またはＴ７５フラスコを、上記に記載した通り供給線をマークし、ラベル付けすることによって準備した。図１１Ａに示す通り、フラスコを４５°の角度で短い縁上に傾けることによって細胞を供給し、１０分間、懸濁した凝集物をフラスコの底部の隅に沈降させた。パスツールピペットをフラスコ上に引いた供給線に下ろして使用済みの培地を吸引した（図１１Ｂ）。フラスコを真っ逆さまにし、１５ｍＬ／Ｔ７５（または５ｍＬ／Ｔ２５）フラスコに好適な体積の心臓誘導培地を穏やかに加えた（Ｔ７５フラスコに対して３０ｍｌ、またはＴ２５フラスコに対して１０ｍｌ）。細胞の大型のクランプが形成した場合、再懸濁した凝集物を、２００ｕｍ滅菌メッシュフィルターを通して５０ｍＬコニカルチューブ中にろ過した後処理加工してもよい。
【０２１４】
次いで、細胞を好適なサイズのフラスコに分配した。Ｔ２５フラスコに接種する場合、完全に再懸濁した凝集物５ｍＬをＴ２５フラスコ各６本に移した。目標は、２５０万個の細胞から形成された凝集物を各Ｔ２５中に接種することである（すなわち、１ｍＬあたり５０万細胞）。細胞の生存または凝集物の個数に対して修正してはならない。Ｔ７５フラスコに接種する場合、完全に再懸濁した凝集物１５ｍＬをＴ７５フラスコ各２本に移した。目標は、細胞７５０万個から形成された凝集物を各Ｔ７５中に接種することである（すなわち、１ｍＬあたり５０万細胞）。細胞の生存または凝集物の個数に対して修正してはならない。
【０２１５】
フラスコ／プレートを７％ＣＯ２インキュベーター内部のロッカープラットフォーム上に配置して２４±４時間インキュベートした。ロッカーを、Ｔ７５フラスコに対して７．５±２ＲＰＭ、またはＴ２５フラスコに対して１５±１ＲＰＭで作動する撹拌器で開始させた。回転速度を上記に記載した通りに調整した。
【０２１６】
３〜１３日目、図１１Ａに示す通り、フラスコを４５°の角度で短い縁上に傾けることによって細胞を準備し、１０分間、懸濁した凝集物をフラスコの底部の隅に沈降させた。パスツールピペットをフラスコ上に引いた供給線まで下ろして使用済みの培地を吸引した（図１１Ｂ）。
【０２１７】
フラスコを真っ逆さまにし、以下に記載する培地を穏やかに加えた（Ｔ２５フラスコ１本あたり培地５ｍＬ、またはＴ７５フラスコ１本あたり培地１５ｍＬ）：３、４、５、６、７日目：心臓誘導培地；８、１０、１２日目：心臓維持培地。
【０２１８】
フラスコ／プレートを７％ＣＯ２インキュベーター内部のロッカーのプラットフォーム上に配置して２４±４時間インキュベートした。ロッカーを、Ｔ７５フラスコに対して７．５±２ＲＰＭ、またはＴ２５フラスコに対して１５±１ＲＰＭで作動する撹拌器で開始した。回転速度を上記に記載した通りに調整した。
【０２１９】
細胞の培養を終了し、１４日目に分析し、収集時のフラスコ１本あたりの全細胞数、ｃＴＮＴ純度（またはＧＦＰ純度）を収集時に分析した。凝集物を、２日目および収集時に計数し、画像化した。
【０２２０】
（実施例５）
凝集物の形成
ｉＰＳ細胞をディスパーゼで処理し、次いでＴｒｙｐＬｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートして細胞を解離した。解離したｉＰＳ細胞を分割し、１：６希釈によって継代した。ＴｒｙｐＬｅ（商標）の分割および継代を１回繰り返した。０．５×１０６、１×１０６、２×１０６、および３×１０６細胞／ｍｌの４つの密度のｉＰＳ細胞を凝集物形成用に接種した（図１２）。異なる開始の密度のこれらｉＰＳ細胞の凝集物形成および心臓誘導手順を、実施例４に記載したのと本質的に同じに行った。ステップ収率（すなわち凝集物中に組み入れられる細胞のパーセント値）、凝集物のサイズ、心臓細胞の収率を測定し、図１３〜１７において検出する。異なる回転速度での凝集物の形成も以下の表２において比較した。
【０２２１】
【表２−２】
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単細胞分割技術と組み合わせた、ＲＯＣＫ阻害剤およびトリプシンを用いてＨ１およびｉＰＳ細胞から凝集物を形成する本発明者らによる以前の実験は、単細胞を用いて懸濁培養物中に拍動性の心筋細胞を形成することが可能であるという原理の証明を示した。この情報により、ｉＰＳ細胞を用いた高スループットおよび高段階収量（すなわち凝集物中に組み入れられる細胞のパーセント値）での凝集物形成方法を開発する目標を有する実験の指定がもたらされた。以下の実験の目的は、ＲＯＣＫ阻害剤であるＨ１１５２が、ＴｒｙｐＬＥで個別化されたｉＰＳ細胞を自己凝集させ、心臓分化培地中で心筋細胞を形成させることを示すことである。
【０２２２】
以下の源から重大な試薬を得た：ＤＭＥＭおよびＧｌｕｔａｍａｘはＧｉｂｃｏ（＃１０５６７）から；ウシ胎児血清はＣｈｅｍｉｃｏｎ（＃ＥＳ−００９Ｂ）から；ヒト組換えＨＧＦ（ｈｒＨＧＦ）およびヒト組換え塩基性ＦＧＦはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（それぞれ２３４−ＦＳＥおよび２９４−ＨＧＮ）から得た。ゲンタマイシンはＧｉｂｃｏ（＃１５７５０）から得た。Ｈ１１５２はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（＃５５５５０）から得た。
【０２２３】
本実施例に記載する第１の実験（実験１、図１８を参照されたい）は、心筋細胞の分化に対する単細胞凝集物の形成の可能性を示すものであった。第２の実験（実験２、図１９を参照されたい）は、ディスパーゼで維持した細胞を用いた単細胞凝集物の可能性を示していた。心筋細胞の分化の条件を、実験１および２に対してそれぞれ表３〜４および表５〜６に要約する。
【０２２４】
【表３】
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【０２２５】
【表４】
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【０２２６】
【表５】
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【０２２７】
【表６】
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実験１および２からの細胞形態学および凝集物の写真を、それぞれ図２０〜２１に示す。１日後、凝集物形成培地において、ｉＰＳ細胞の凝集は明らかに見ることができ、これらの凝集物はサイズにおいてより均一である傾向があり、次いで凝集物はディスパーゼ法を用いて形成した。図２０〜２１に表すデータは、異なる接種密度にわたる、および単細胞として維持される細胞とディスパーゼで維持される細胞との間の一貫した凝集物の形成を示す。
【０２２８】
細胞を両方の実験に対してやはり計数し（表７〜８）、細胞計数は、分化プロセスの終了時１５日目にフラスコ１本あたりの細胞数を表していた。
【０２２９】
【表７】
2013507936.tif 000009
【０２３０】
【表８】
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心筋細胞の分化もトロポニンＴ染色を用いて分析した（表９〜１０）。トロポニンＴの結果は、分化プロセス終了時の１５日目のフラスコ１本あたりの心筋細胞数を表していた。
【０２３１】
【表９】
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【０２３２】
【表１０】
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本実施例において示す実験は、心筋細胞の分化における単細胞凝集物の形成の可能性を実証するものであった。単細胞を用いることは、細胞接種密度のさらなる最適化を可能にする分化システムに入れる細胞数の容易な定量化、および分化プロセスにわたるいっそうの制御を可能にする。実験からのデータは、心筋細胞の収量が、ディスパーゼ法からのデータと等しく、またはそれを超えることを示している。Ｈ１１５２およびＴｒｙｐＬＥの使用により、凝集物を形成する拡張可能な高スループット方法を可能にする。
【０２３３】
（実施例６）
Ｈ１１５２持続時間および凝集物形成
化合物Ｈ１１５２は、個別化した多能性細胞が自己凝集するのを可能にすることが示されていた。本実施例の目的は、化合物での１日または２日処置の、心筋細胞の発生に対する効果を見ることであった。Ｈ１１５２での開始の試験は、培地中に化合物を含んでいた：ＴｅＳＲ培地で１日目に１μＭおよび凝集物移行培地中の化合物で２日目に０．５μＭ。１日間１μＭだけＨ１１５２化合物を含んでいた新方法を採用した後、開始の細胞の生存での効率の喪失があると思われ、拡大されたＨ１１５２が心発生に負の影響を及ぼさずに細胞の生存を増大するか否かの、この試験における決定をもたらした。図２２〜２３に示す通り２つの実験をデザインした。心筋細胞の分化条件および実験のパラメーターを、実験１および２に対してそれぞれ表１１〜１２および表１３〜１４に要約した。重要な試薬および材料は、先の実施例に記載した通りに入手した。
【０２３４】
心筋細胞の分化における１４日後の実験１からの最終結果（表１５）。Ｈ１１５２曝露の持続期間を４８時間に延ばすと、各細胞密度の条件におけるｃＴｎＴ収量を増大した。心筋細胞の分化における１４日後の実験２からの最終結果（表１６）。Ｈ１１５２曝露の持続期間を４８時間に延ばすと、３ｅ５および５ｅ５細胞／ｍＬで最初に接種した培養物におけるｃＴｎＴ収量を増大した。実験に対する凝集物の形成および心臓の分化の結果を図２４Ａ〜Ｊおよび図２５〜２７に表した。
【０２３５】
１μＭのＨ１１５２で２日処理すると、各実験における細胞の生存に著しい増大があった。１日処理と２日処理との間にｃＴｎＴ陽性細胞の純度における違いがあり、これは細胞の生存、したがって細胞密度に相関する。本発明者らは、拡大したＨ１１５２処理での純度における低減は、細胞密度全体の増大によるが、Ｈ１１５２の心筋細胞に対する直接効果の可能性も依然としてあることに思いをめぐらしていた。化合物の２日処理による細胞生存における増大はｃＴｎＴ純度における低減よりも著しく、大収量のｃＴｎＴ陽性細胞のより大きな収量をもたらす。
【０２３６】
様々な濃度のＨ１１５２の効果も、１日用量のＨ１１５２のＩＰＳ６．１細胞に対する細胞生存に対して試験した（図２８）。このデータは、１μＭの濃度は凝集物形成に最適の濃度であったことを示唆していた。
【０２３７】
【表１１】
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【０２３８】
【表１２】
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【０２３９】
【表１３】
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【０２４０】
【表１４】
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【０２４１】
【表１５】
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【０２４２】
【表１６】
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（実施例７）
心筋細胞の生成におけるＨＧＦ添加の効果の試験
もともとＨＧＦは、調査から開発までのオリジナルの平板法の移行の前の「誘導因子」として培地中に含まれており、平板から懸濁凝集物に発展したプロトコールとして維持された。平板法において、以前の試験はＨＧＦが有益であったことを示していた。経費削減およびプロセスの単純化によって動機づけられて、本発明者らは現在の懸濁凝集物法におけるＨＧＦの必要性を再考した。本実施例は、結果的に誘導培地中のＨＧＦの任意の役割となる一連の実験を要約するものである。これには、ＨＧＦは測定可能な影響なしに取り除くことができるという結果をもたらした、両方の増殖因子の滴定実験が含まれ、これは大規模な定量の測定によって確認された。
【０２４３】
実施例４に記載したのと本質的に同じに、様々な開始の密度のこれらｉＰＳ細胞の凝集物形成および心臓誘発手順を行ったが、異なる濃度のヒトＨＧＦ（ｈＨＧＦ）およびＦＧＦを凝集形成培地、凝集物移行培地、および心臓誘導培地に適用した点が異なった。実験デザインを表１７〜１８に要約した。
【０２４４】
【表１７】
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【０２４５】
【表１８】
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本実験は、ＦＧＦがＣＭの分化プロセスに必要とされて上首尾であることを明らかに示していた。ＦＧＦなしの条件には、生存する凝集物が実質的になく、測定できる心筋細胞がなかった（図２９Ａ〜Ｂ）。一方、ＦＧＦありの条件は全て、ＨＧＦ濃度に無関係に心筋細胞を産生した（図２９Ａ〜Ｂ）。試験したＨＧＦ濃度の範囲にわたって、心筋細胞の収量またはｉＰＳ：ＣＭ比において一貫した傾向は存在しなかった。
【０２４６】
第１の実験の結果に基づき（図２９Ａ〜Ｂを参照されたい）、第２のｉＰＳ６．１の増殖因子の滴定は、ＦＧＦおよびＨＧＦ両方に対してより低い用量範囲に着目していた（図３０Ａ〜Ｂ）。非常に明らかな用量反応がＦＧＦに対して観察され、非常に少量のＦＧＦは凝集物の低い生存をもたらし、高用量は生存を有したが心発生を欠いていた。第１の実験とは異なり、特に最善の性能のＦＧＦ濃度の条件においてＨＧＦ濃度においてここに微妙な傾向が観察され、この場合ＨＧＦ濃度が高いほど生産性が増大した。しかし、どんなことがあってもＨＧＦを省略すると条件の失敗をもたらした（条件はＨＧＦの存在下では他の点では成功であった）ことに留意するのが重要である。
【０２４７】
第２のｉＰＳ増殖因子の滴定と一致して、ＦＧＦ０ｎｇ／ｍＬおよび２５ｎｇ／ｍＬ、ならびにＨＧＦ０ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬの２×２マトリックスを試験するために、ｉＰＳ６．１細胞で簡単な実験（表１９）を設定した。その時点のｉＰＳ６．１細胞に対する現在の最良の実施に基づいてＦＧＦおよびＨＧＦの陽性濃度が選択され、これら陽性濃度は平板および懸濁液両方のプロセスにおいてＨ１細胞の心臓誘導に用いられる条件と同じであった。この実験により、プロセスに対するＦＧＦの必要性を示す先の試験が確認された。しかし、本実験において、ＨＧＦをＦＧＦと一緒に含むことにより、ＦＧＦ単独での全体の培養効率対条件は低減した。
【０２４８】
【表１９】
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ｉＰＳ６．１の最適化が進行している間、別々の一連の実験を行ってＨ９−ＴＧＺ細胞に対する増殖因子の濃度を最適化した。開始の実験は、より高レベルのＦＧＦがＨ９−ＴＧＺ細胞の効果的な心臓誘導に必要とされることを示していた。したがって、試験したＦＧＦの範囲は、最近のｉＰＳ６．１実験におけるよりも高かった。この実験は、最適の心筋細胞の生成は、Ｈ９−ＴＧＺ細胞を有するＦＧＦ１００〜１５０ｎｇ／ｍＬを必要とすることを確認するものであった（図３１Ａ〜Ｃ）。様々なＨＧＦ濃度にわたるプロセス効率における傾向は観察されなかった。
【０２４９】
上記に記載した凝集物形成での論点により、Ｈ９−ＴＧＺ増殖因子滴定実験を繰り返した。この繰返しにおいて、実験上の細胞の生存および拡大は過度に密な培養物をもたらし、最終のＣＭ純度を低減する可能性があった。しかし、培養の性能が全体的に劣るのにもかかわらず、ＦＧＦ低レベルでの性能における、通常の、および予想される低減は依然として識別可能であることに留意するのが重要である（図３２Ａ〜Ｃ）。試験したＨＧＦ濃度の範囲にわたって培養性能に観察できる傾向は存在せず、繰り返すと十分なＦＧＦを有する「ＨＧＦなし」の条件はどれも心筋細胞を生成できなかった。
【０２５０】
これらの実験にわたるメタ分析を行って、本発明者らは誘導培地中にＨＧＦを含めるあらゆる測定可能な利点を検出できるか否かを評価した。この分析は、５０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦありおよびなしの対の条件に対して利用可能な実験全てを再調査したものである。対照の脚（ｌｅｇ）（ＨＧＦを有する）が１％を超えて心筋細胞を生成できなかった条件は除外した。これにより、１４対の条件（実験内では１１を３回行った）が残った。この分析を助けるために、原料費モデルのプロセスを用いて、各条件下の心筋細胞１００万個あたりの費用を見積もった。このモデルは、その時点（２００９年６月１日頃）で利用できる最新の原料費用およびプロセス情報を用いた。この分析を表２０および２１に要約する。データは、平均して、本発明者らの心筋細胞生成プロセスにおいて測定できるＨＧＦの正または負の効果（すなわち、実験上のノイズを超える効果）は存在しないことを示唆している。
【０２５１】
【表２０】
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【０２５２】
【表２１】
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定量の測定を３回行って、ＨＧＦを除去しても測定できる効果がないことを、大規模に、かつｉＰＳ６．１−ＭＲＢ細胞で確認した。これらの測定からの結果を表２２に要約する。これらの測定において、測定＃１だけが正常の測定とみなされ、細胞および心筋細胞全体の収率は測定２および３において変則的に低かった。測定１において、収量は、同じ独立のＨＧＦ条件と実質上同じであった。測定２および３において、依然として低いがより高い収率が、ＨＧＦを有する培養物で、ＨＧＦを有さないものに比べて得られた。これより、本発明者らは、「正常の」測定において、ＨＧＦ添加は効果がないが、最適以下の培養物においてＨＧＦは培養の結果を改善することがあると結論付けた。
【０２５３】
【表２２】
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要約すると、大規模なマトリックス実験においてｉＰＳ６．１およびＨ９−ＴＧＺ細胞を用いて、本発明者らは心筋細胞培養物の生産性に対するＨＧＦの効果を測定することができなかった。大規模なｉＰＳ６．１−ＭＲＢ細胞での定量の測定において、本発明者らは、ＨＧＦは成果の劣る培養物を部分的に救済することがあるが、正常な、より高い収量の培養物における収量、純度、または効率に影響を及ぼさなかった証拠をいくつか認めた。これらの結果に基づくと、ＨＧＦは心臓誘導培地に対する製剤に必要ではない可能性がある。
【０２５４】
（実施例８）
多能性幹細胞の異なる系からの、および異なる幹細胞維持培地における培養後の心筋細胞の分化の最適化のための手順
異なる多能性幹細胞系を分化させる場合、高度の変動性が記録されている。これは、様々な組織（例えば、心筋細胞、血液、肝細胞、または神経細胞）を形成するＰＳＣの「性向」として、当技術分野において認められている。しかし、系間のこの性向は、各細胞系に対して同じ分化手順を用いて記録されている。ＰＳＣの異なる系統への分化は、発生段階によって、最終的に所望の表現型へ細胞を導くｉｎ  ｖｉｔｒｏの条件を必要とする。典型的な分化の手順は、特異的な増殖因子の添加によるなど、特定の系統の発生を駆動するｉｎ  ｖｉｖｏの環境を模倣しようとする培養条件を通常含んでいる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させる場合、１）細胞自体からの内因性の発現、２）多能性幹細胞を培養し、および／または引き続き分化させる血清または培地、ならびに３）外因性の増殖因子の添加、を含めた数々の源が増殖因子の環境に寄与する。増殖因子の内因性の発現に関して、これはクローン毎の変異性から、および細胞の初代培養における違いから生じることがある。所与の分化培養物中の増殖因子の環境に寄与する源は全て、最適の分化を実現するために、説明され、バランスが取れていなければならない。これは、１）ある種の経路における全体のシグナルを低減するためのアンタゴニストの添加、２）ある種の経路の全体のシグナルを増大するためのアゴニストの添加、または３）シグナルを最適化するためのアゴニストおよびまたはアンタゴニストの組合せを必要とすることがある。
【０２５５】
本実施例は、ＢＭＰおよびアクチビン／ノーダルを含めた突出したシグナル伝達経路を操作することによって、様々な初代培養条件下で増殖させた複数のＰＳＣ系またはクローンの心筋細胞系統への分化の可能性を最大にするための手順を記載するものである。この手順は、１）数々の条件下、各細胞系の心発生の可能性をスクリーニングし、その後２）個々のＰＳＣ系に対する分化のプロトコールをカスタマイズすることを含む。
【０２５６】
先の実施例に記載した製造手順は以下の通りであり、下記に詳述する通りに変更される。
【０２５７】
凝集物形成の間のあらゆる時点、好ましくは分化３日目に、典型的な分化培養培地（先の製造手順において概要した）に、ａ）さらなる増殖因子なし、ｂ）様々な濃度のＢＭＰ４単独。例えば、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、ｃ）様々な濃度のアクチビン単独。例えば、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、ｄ）様々の濃度のドルソモルフィン、ｅ）様々な濃度のＳＢ−４３１５４２、ｆ）様々な組合せのＢＭＰ４およびアクチビンを含む、様々な組合せの増殖因子アゴニストおよびアンタゴニストを加えた。
【０２５８】
先の段落に略述した様々な条件を用いて、分化７日まで、培地を毎日交換した。
【０２５９】
分化７日後、先の実施例に記載した標準の製造手順を続けた。
【０２６０】
分化６、７、および８日目、各条件から少量の試料を収集して、心臓中胚葉に一致するマーカーの発現に対して、フローサイトメトリーによってモニタリングした（表２３）。この情報を用いて、心臓系統に細胞を分化させる最適の培養条件を予想した。典型的に、３０％ＫＤＲ＋／ＰＤＧＦＲ−ａ＋集団が、心臓中胚葉の上首尾の誘導に一致する。
【０２６１】
アッセイのエンドポイント時、典型的には分化１４日に、培養物を収集し、心筋細胞のパーセント値に対して、心筋細胞の発生に一致するタンパク質の発現に基づいて分析した（表２３）。さらに、細胞計数値の合計を決定した。
【０２６２】
例えば、図３３Ａ〜Ｄは、様々な濃度のＢＭＰ（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ）、ドルソモルフィン（２ｕＭ、０．２ｕＭ）、アクチビンＡ（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＢ−４３１５４２（１０ｕＭ、０．１ｕＭ）、およびアクチビンＡ（６ｎｇ／ｍＬ）とＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）との組合せを利用した増殖因子／阻害剤のスクリーニングの結果を詳述したものである（分化３日目から７日目に様々な濃度の化合物を加えた）。凝集物形成後１４日目の細胞の分析（図３３Ｃおよび３３Ｄ）は、アクチビンＡとＢＭＰ４との組合せを含む処理において、トロポニンＴ（ＣＴＮＴ）陽性細胞がより高濃度であったことを示している。ＣＴＮＴの存在を、抗−ＣＴＮＴ抗体を用いてフローサイトメトリーによって決定した。このようなものとして、本実験の結果は、心筋細胞への分化のための幹細胞クローンｉＰＳ６．１ＭＲＢに最適化した培養条件は、アクチビンＡ（６ｎｇ／ｍＬ）とＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）との組合せであることを明らかにしている。
【０２６３】
分化、および場合により心筋細胞の合計収量における、６、７、８、９、１０日、および／またはより早い、もしくは遅い時間点からのマーカー分析（例えば、フローサイトメトリーを用いた）に基づき、最高の収量および／または純度（または所望の分化細胞型に最適の細胞培養物の増殖および／もしくは分化の別の尺度、例えば、細胞特異的な酵素もしくは受容体もしくは所望の細胞型に特異的な電気生理学的機能）を有する培養物が同定され、したがって利用される多能性幹細胞クローンの最適な分化をもたらす対応する培養条件は公知である。次いで、これらの培養条件を、製造手順の間に日常的に利用し、それによって同じ細胞系もしくはクローンからの多能性幹細胞を、同じ培養培地の組成と組み合わせることができ、または収量を増大するためのさらなる操作を調査することができる。
【０２６４】
【表２３】
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略語および定義
ＰＳＣ＝多能性幹細胞−胚性および人工多能性幹細胞。
ＢＭＰ４＝骨形成タンパク質−４；発生上のモルフォゲン。
アクチビン＝アクチビンＡ（アクチビンおよびノーダルシグナル伝達はこの状況において交換可能に用いることができる）。発生上のモルフォゲン。
ＳＢ−４３１５４２＝ＴＧＦβ／アクチビン／ノーダルシグナル伝達経路の小分子阻害剤。
Ｄｏｒ＝ドルソモルフィン。ＢＭＰ経路の小分子阻害剤。化合物Ｃとしても知られている。
ＫＤＲ＝ＶＥＧＦＲ−２としても知られている、キナーゼインサートドメイン受容体
ＰＤＧＦＲ−ａ＝血小板由来増殖因子受容体−アルファ  。
【０２６５】
本明細書に開示し、特許請求する方法は全て、本開示に鑑みて過度の実験なしに作製し、実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、当業者であれば、変形が、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱せずに本明細書に記載する方法、および方法のステップまたは一続きのステップに適用することができるのは明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的両方に関連するある種の薬剤は、本明細書に記載する薬剤に置き換えることができ、同じまたは同様の結果が達成されることは明らかであろう。このような同様の置換および改変は全て、当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲によって規定される通り、本発明の精神、範囲、および概念の範囲内にあるとみなされる。
【０２６６】
参照
以下の参照は、本明細書に記載するものに対する補足の、例示の手続き上または他の詳細を提供する範囲まで、本明細書に参照によって特に組み入れられる。
【０２６７】
【化１】
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【０２６８】
【化２】
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【０２６９】
【化３】
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【０２７０】
【化４】
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【図３】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ−２４Ｊ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３】
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【国際調査報告】
2013507936.tif 000072
2013507936.tif 000073