(57)【要約】  ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡において、試料に含まれる蛍光体を励起して蛍光化し、少なくとも１個の焦点域に焦点される励起光（３）を試料にパルス照射する。更に、励起蛍光体を脱励起し、上記少なくとも１個の焦点域に強度ゼロポイントを備える脱励起光（１２）を試料に連続波照射する。試料内の励起蛍光体が放出する蛍光を、励起光（３）の各パルス後に脱励起光（１３）の照射に重ね合せた後、励起光（３）の連続パルス間の高時間分解能により記録する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料（２）内の蛍光体で標識された構造を撮像するＳＴＥＤ蛍光顕微鏡法であって：  
蛍光体を励起して蛍光化し、少なくとも１個の焦点域に焦点される励起光（３）を前記試料（２）にパルス照射する工程と；
励起蛍光体を脱励起し、前記少なくとも１個の焦点域内に強度ゼロポイントを備える脱励起光（１２）を前記試料（２）に連続波照射する工程と；
前記試料（２）内の励起蛍光体が自然放出する蛍光（９）を、励起光（３）の各パルス後に、前記脱励起光（１２）の照射に重ね合せた後、記録する工程と；
前記照射工程および記録工程を前記励起光（３）の焦点域および前記脱励起光（１２）の強度ゼロポイントの異なる位置で繰返し実行する工程とを備え；
前記記録工程において、励起蛍光体が自然放出する前記蛍光（９）は前記励起光（３）の連続パルス間の時間分解能により記録される、ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡法。
【請求項２】
試料（２）に含まれる蛍光体の変動を前記試料（２）の空間的に制限された所定範囲内で観察するＳＴＥＤ蛍光相関分光法であって：  
蛍光体を励起して蛍光化し、少なくとも１個の焦点域に焦点される励起光（３）を前記試料（２）に連続波パルス照射する工程と；
励起蛍光体を脱励起し、前記少なくとも１個の焦点域内に強度ゼロポイント備える脱励起光（１２）を前記試料（２）に照射する工程と；
前記試料（２）内の励起蛍光体が自然放出する蛍光（９）を、励起光（３）の各パルス後に、前記脱励起光（１２）の照射に重ね合せた後、記録する工程とを備え；
前記記録工程において、励起蛍光体が自然放出する前記蛍光（９）は前記励起光（３）の連続パルス間の時間分解能により記録される、蛍光相関分光顕微鏡法。
【請求項３】
前記記録工程において、励起蛍光体が放出する前記蛍光（９）は、蛍光（９）の自然放出によってのみ減衰する蛍光体の励起状態の寿命より高い時間分解能で記録される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記記録工程において、励起蛍光体が放出する前記蛍光（９）は、少なくとも、蛍光（９）の自然放出および最大照射強度の前記脱励起光（１２）による脱励起により減衰する蛍光体の励起状態の寿命と同程度に高い時間分解能で記録される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記記録工程において、励起蛍光体が放出する前記蛍光（９）は少なくとも毎秒２００の時間分解能で記録される、請求項３又は請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記記録工程において、励起蛍光体が放出する前記蛍光（９）は少なくとも毎秒１００の時間分解能で記録される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記記録工程において、励起光（３）の各パルスの後に放出される前記蛍光（９）に対して少なくとも１個の時間ゲートが設けられる、請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１個のゲートは、前記脱励起光（１２）の強度ゼロポイント外の励起蛍光体の原則的に全てが蛍光を放出した直後に開放される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１個のゲートは、前記励起光（３）の焦点域内の励起蛍光体の原則的に全てが蛍光を放出する前に閉鎖される、請求項７又は請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１個のゲートは励起光（３）の各パルスに対して所定の時間間隔で開放および閉鎖される、請求項７〜９のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１個のゲートおよび補助ゲートは交互に開放および閉鎖される、請求項７〜１０のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記記録工程において、励起光（３）の各パルスの後に自然放出される前記蛍光（９）に対して前記少なくとも１個のゲートおよび時間的に連続するゲートが設けられ、前記時間的に連続するゲートは、前記試料に含まれる第２の励起蛍光体より短い寿命を有する第１の励起蛍光体の原則的に全てが蛍光を放出した後にのみ開放される、請求項７〜１１のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記記録工程において、前記蛍光（９）は複数の時間的に連続するチャンネルに記録される、請求項１〜６いずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記励起光（３）のパルス照射工程において、前記励起光（３）の波長は、多光子プロセスを介して蛍光体を励起して蛍光化するよう選択される、請求項１〜１３のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記励起光（３）のパルス照射工程において、前記励起光（３）の波長は波長のスーパーコンティニウムから選択される、請求項１〜１４のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡（１）であって：  
試料（２）に含まれる蛍光体を励起して蛍光化し、少なくとも１個の焦点域に焦点される励起光（３）を前記試料（２）にパルス照射するパルス励起光源（４）と；
励起蛍光体を脱励起し、前記少なくとも１個の焦点域内に強度ゼロポイントを備える脱励起光（１２）を前記試料（２）に照射する連続波脱励起光源（１１）と；
前記試料（２）内の励起蛍光体が自然放出する蛍光（９）を励起光（３）の各パルス後に、前記脱励起光（１２）の照射に重ね合せた後、記録する検出器（１０）と、を備え；
前記検出器は、励起蛍光体が自然放出する前記蛍光（９）を前記励起光源（４）の連続パルス間の時間分解能により記録する、ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡（１）。
【請求項１７】
前記検出器（１０）は、励起蛍光体が放出する前記蛍光（９）を少なくとも毎秒２００の時間分解能で記録する、請求項１６に記載の顕微鏡（１）。
【請求項１８】
前記検出器（１０）は、励起蛍光体が放出する前記蛍光（９）を少なくとも毎秒１００の時間分解能で記録する、請求項１７に記載の顕微鏡（１）。
【請求項１９】
前記検出器（１０）の時間ジッタは毎秒２００以下である、請求項１７に記載の顕微鏡（１）。
【請求項２０】
前記検出器（１０）の時間ジッタは毎秒１００以下である、請求項１８に記載の顕微鏡（１）。
【請求項２１】
前記検出器（１０）は単一光子計数器を含む、請求項１６〜２０のうちいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
【請求項２２】
前記検出器（１０）は少なくとも１個の時間ゲート（１５）を備える、請求項１６〜２１のうちいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
【請求項２３】
前記少なくとも１個の時間ゲート（１５）は励起光源（４）の各パルスにより起動される、請求項２２に記載の顕微鏡（１）。
【請求項２４】
前記少なくとも１個のゲート（１５）は、前記励起光源（４）の各パルスに対する可調な時間間隔で開放および閉鎖される、請求項２３に記載の顕微鏡（１）。
【請求項２５】
前記検出器（１０）は更に補助ゲートを備え、前記少なくとも１個のゲートおよび前記補助ゲートは交互に開放および閉鎖される、請求項２２又は請求項２３のうちいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
【請求項２６】
前記脱励起光源（１１）は連続波レーザダイオードである、請求項１６〜２５のうちいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
【請求項２７】
前記パルス励起光源（４）は、前記検出器（１０）が記録する蛍光の波長の約２倍の長さを有する波長の励起光（３）を放出する、請求項１６〜２６のうちいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
【請求項２８】
前記パルス励起光源（４）は、音響光学変調器を用いて前記励起光（３）の波長を選択するための波長のスーパーコンティニウムを出力する、請求項１６〜２６のうちいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
【請求項２９】
前記検出器（１０）は時間的に連続するチャンネルを複数備える、請求項１６〜１８のうちいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
【請求項３０】
前記励起光源（４）からの前記励起光（３）の焦点域および前記脱励起光源（１１）からの前記脱励起光（１２）の強度ゼロポイントを用いて前記試料（２）を走査する走査ステージを更に備える、請求項１６〜２９のうちいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的にはＳＴＥＤ蛍光顕微鏡法およびこの方法を実施するのに適したＳＴＥＤ蛍光顕微鏡に関連する。詳細には、前記ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡法は試料内の蛍光体で標識された構造を撮像するために実施してもよく、又は、試料の空間的に制限された所定範囲内で試料に含まれる蛍光体の変動を観察する蛍光相関分光法（ＦＣＳ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ）として実施してもよい。
【０００２】
蛍光分子は、詳細には蛍光分子又は蛍光量子ドットであってもよい。
【背景技術】
【０００３】
誘導放出抑制（ＳＴＥＤ：Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）蛍光顕微鏡法によれば、試料内の蛍光体で標識された構造を撮像する際、又はＦＣＳ法において観察範囲を回折限界を超えて決定する際に空間分解が可能となる。これは、励起光により蛍光体を励起して蛍光化した後、励起蛍光体を誘導して誘導放出させる脱励起光又はＳＴＥＤ光により励起蛍光体の空間分布を変化させることにより実現される。励起光は回折限界を超える空間次元を有する焦点域のみに焦点されてもよく、又、誘導放出により基底状態に戻り引続き蛍光を発することができるため励起蛍光体が暗黒に保持されず、その周囲で蛍光体が再度完全に脱励起される脱励起光の強度のゼロポイントは更に極小でもよい。例えば、脱励起光の強度分布のゼロポイントは脱励起光の異なる成分の相殺的干渉により決定されてもよく、また、脱励起光の全体強度が高くなることにより、それを超えると蛍光体が完全に脱励起される当該ゼロポイントの境界が幾何学的点の周囲に近接して引かれることとなる。
【０００４】
ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡法においては、通常、励起光は試料にパルス照射される。一般的には、脱励起光も試料にパルス照射され、脱励起光の強度分布のゼロポイントを超えて放出される蛍光を記録する検出器は、脱励起光の各パルスが消失した直後にのみ作動する。
【０００５】
しかしながら、上述したとおり、高空間分解能を得るためには脱励起光は比較的高い強度を有することが求められる。高強度パルスを出力するパルスレーザーはコストが高く、特に、強度分布のゼロポイントにおいても脱励起光の各パルス後に励起蛍光体が残存しないということを避けるために、パルスが非常に短い、すなわち、蛍光の自然放出により励起状態が減衰する蛍光体の励起状態の寿命より短い必要がある場合、コストが高くなる。
【０００６】
特許文献１は、上述した励起光および脱励起光のパルス照射に加えて、コストを抑えるため連続波レーザを励起光源として用いることを開示している。この場合でも、脱励起光の強度分布のゼロポイント外で自然放出蛍光を記録する検出器は、脱励起光の各パルスが試料を通過した直後にのみ作動する。
【０００７】
特許文献２は、多光子プロセス内で蛍光を放出させるために試料内の蛍光体を励起する波長で励起光が試料にパルス照射される、二光子励起ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡法を開示している。脱励起光又はＳＴＥＤ光は連続波として試料に照射され、励起蛍光体が試料内で自然放出する蛍光は、励起光の複数パルスにわたって連続的に記録される。試料内の蛍光体を励起するために用いられる多光子プロセスにより、励起蛍光体の空間分布は脱励起光の強度分布のゼロポイントを大きく超えないと予想される。したがって、脱励起光は連続波レーザで試料に照射され、また、試料が自然放出する蛍光が連続的に記録されるため、コストを大幅に削減することが可能となる。自然放出蛍光を記録する際、励起光、脱励起光および蛍光体からの誘導放出は適切なエッジフィルタ又は狭帯域フィルタにより遮断され、および／又は、励起光および脱励起光を適切に偏光する場合、偏光フィルタにより遮断される。
【０００８】
しかしながら、多光子励起を用いた蛍光顕微鏡法における信号の発生量は小さく、多光子プロセスにおいて蛍光体を励起するのに適切な、適切な出力強度を有するパルス光源はコストが高い。
【０００９】
ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡法の一種でＣＷ−ＳＴＥＤと呼ばれる方法が公開されており、試料にパルス照射される励起光が単純な一光子プロセスにおいて蛍光体を励起して蛍光化する点において、特許文献２に開示されている方法と異なる。
【００１０】
特許文献２およびＣＷ−ＳＴＥＤに開示されている二光子励起方法のいずれにおいても、期待される空間分解能が得られないことが分かっている。実際、蛍光体で標識された既知の構造の画像は、パルス励起光およびパルス脱励起光を用いて、自然放出蛍光を脱励起光の各パルスの後にのみ記録して得られた同一構造の画像と比較すると、若干不明瞭である。
【００１１】
したがって、低コストの連続波レーザを用いながら空間分解能にも優れたＳＴＥＤ蛍光顕微鏡法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５，７３１，５８８Ａ１号明細書
【特許文献２】米国公開公報２０１０／０１７６３０７号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一様態は、試料内の蛍光体で標識された構造を撮像するＳＴＥＤ蛍光顕微鏡法に関する。本様態による方法は：蛍光体を励起して蛍光化し、少なくとも１個の焦点域に焦点される励起光を前記試料にパルス照射する工程と；励起蛍光体を脱励起し、前記少なくとも１個の焦点域内に強度ゼロポイントを備える脱励起光を前記試料に連続波照射する工程と；前記試料内の励起蛍光体が自然放出する蛍光を、励起光の各パルス後に前記脱励起光の照射に重ね合せた後、記録する工程と；前記照射工程および記録工程を前記励起光の焦点域および前記脱励起光の強度ゼロポイントの異なる位置で繰返し実行する工程とを備える。前記記録工程において、励起蛍光体が自然放出する前記蛍光は前記励起光の連続パルス間の時間分解能により記録される。
【００１４】
本発明のその他の様態は、試料に含まれる蛍光体の変動を前記試料の空間的に制限された所定範囲内で観察するＳＴＥＤ蛍光相関分光法に関する。本様態による方法は：蛍光体を励起して蛍光化し、少なくとも１個の焦点域に焦点される励起光を前記試料にパルス照射する工程と；励起蛍光体を脱励起し、前記少なくとも１個の焦点域内に強度ゼロポイント備える脱励起光を前記試料に連続波照射する工程と；前記試料内の励起蛍光体が自然放出する蛍光を、励起光の各パルス後に、前記脱励起光の照射に重ね合せた後、記録する工程とを備える。前記記録工程において、励起蛍光体が自然放出する前記蛍光は前記励起光の連続パルス間の時間分解能により記録される。
【００１５】
本発明の更に他の様態は、ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡であって：試料に含まれる蛍光体を励起して蛍光化し、少なくとも１個の焦点域に焦点される励起光を前記試料にパルス照射するパルス励起光源と；励起蛍光体を脱励起し、前記少なくとも１個の焦点域内に強度ゼロポイントを備える脱励起光を前記試料に照射する連続波脱励起光源と；前記試料内の励起蛍光体が自然放出する蛍光を、励起光の各パルス後に、前記脱励起光の照射に重ね合せた後、記録する検出器（１０）と、を備えるＳＴＥＤ蛍光顕微鏡に関する。前記検出器は、励起蛍光体が自然放出する前記蛍光を前記励起光源の連続パルス間の時間分解能により記録する。
【００１６】
本発明のその他の特徴および利点は、当業者にとって、以下の図面および詳細な説明を検討することにより明確となるであろう。これらその他の特徴および利点は、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に属するものとする。
【００１７】
本発明は、以下の図面を参照することにより、より良い理解が可能となる。本発明の原理を明確に図示することを優先して、図面内の構成部材の縮尺は必ずしも適切ではない。図面において、類似の参照番号は複数の図面の対応する部材に対して付与されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、新規なＳＴＥＤ蛍光顕微鏡の実施の形態の基本設計を示す。
【図２】図２は、励起光の経時変化、脱励起光の経時変化、２個のゲート０および１の開放時間、および診断試料が脱励起光の強度ゼロポイント（灰色の線）および当該ゼロポイント周囲（黒色の線）で自然放出した蛍光の強度を示す。
【図３】図３は、図１の顕微鏡による試料内の同一構造の画像３例を示す。画像（ａ）は、脱励起光を用いない単純な共焦点モードによるものである。画像（ｂ）は、図２のゲート１に記録される蛍光強度によるものである。画像（ｃ）は、ＣＷ−ＳＴＥＤモードに相当する、図２のゲート０およびゲート１に記録される蛍光強度の和によるものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
試料内の蛍光体で標識された構造を撮像する新規なＳＴＥＤ蛍光顕微鏡法、および試料の空間的に制限された所定範囲内で試料に含まれる蛍光体の変動を観察する新規なＳＴＥＤ−ＦＣＳ法のいずれにおいても、励起蛍光体が放出する蛍光は、励起光の連続パルス間に高い時間分解能で記録される。すなわち、数十ＭＨｚという励起光パルスの典型的な繰り返し率においてでも、時間分解能はこの繰り返し率の逆数より大幅に高くある必要がある。本発明によれば、自然放出蛍光は、励起光パルス間の一時点ではなく、励起光の各パルスとともに開始される各周期において所定の時間間隔で記録される。これにより、自然放出蛍光の、試料の脱励起光の強度分布のゼロポイントを囲む領域外の部分を破棄、又は記録しないことが可能となる。本発明の発明者は、蛍光の脱励起光の強度分布のゼロポイント外で放出される部分と正に同一の光学的特性を有する自然放出蛍光の部分が、ＣＷ−ＳＴＥＤ画像が不明瞭に見える理由であると発見した。
【００２０】
新規の本方法においては、脱励起光の強度分布のゼロポイント以外の領域外で自然放出される蛍光を破棄しても、自然放出蛍光を記録する際の高い時間分解能により、脱励起光の強度分布のゼロポイント外で自然放出される蛍光の記録を開始することが可能となり、したがって、ゼロポイント外で励起される蛍光体が脱励起光により脱励起された直後に、任意の自然放出蛍光の光子を最大数記録することが可能となる。自然放出蛍光の全記録を通して脱励起光は連続波として照射されるため、色エッジ又は帯域フィルタにより自然放出蛍光と分離され、および／又は脱励起光が適切に偏光される場合、偏光フィルタにより分離される。これらの手段はまた、誘導放出により蛍光体が放出する光を記録対象の自然放出蛍光から分離する。また、自然放出蛍光を記録する際の高時間分解能により、励起光の最終パルスとの時間間隔が大きくなり、対応して脱励起光の強度分布のゼロポイント内に残存する励起蛍光体の数が減少するのに伴って、信号対雑音比が減少し始めるとすぐに記録を終了することが可能となる。
【００２１】
ＳＴＥＤ−ＦＣＳ法においては、記録される自然放出蛍光がゼロポイント外の物質からの寄与を含まないため、空間的に制限される観察範囲は脱励起光の強度分布のゼロポイントまで狭められる。
【００２２】
新規の本方法において、励起蛍光体が放出する蛍光を記録する時の時間分解能は、励起状態が蛍光の自然放出のみにより減衰する場合、蛍光体の励起状態の寿命より原則的に常に高い必要がある。
【００２３】
好ましくは、蛍光の自然放出および最大照射強度の脱励起光により誘導される誘導放出の両方により励起状態が減衰する場合、時間分解能は少なくとも蛍光体の励起状態の寿命と同じ高さである。この寿命はまた、脱励起光の強度分布のゼロポイント外で蛍光体が自然放出する蛍光は記録せずに、試料が自然放出する蛍光を励起光の各パルス後に記録開始してもよい時間間隔を決定する。新規の本方法の実施に必要な絶対時間分解能は、求められる寿命の絶対値による。通常、時間分解能は少なくとも毎秒２００である。好ましくは、時間分解能は少なくとも毎秒１００である。
【００２４】
自然放出蛍光の記録に高時間分解能を利用する効果的で低コストな方法として、励起光の各パルス後に放出される蛍光に対して時間ゲートを設ける。この時間ゲートは自然放出蛍光を記録する検出器に設けてもよく、その場合、検出器は時間ゲートの最中のみ検知動作する。もしくは、このゲートは検出器により記録される蛍光全体から特定の蛍光を分離するために用いてもよい。これを目的として、検出器自体とは別に時間ゲートを設けてもよい。しかしながら、蛍光の記録に用いられる各装置は求められる高時間分解能を有していなければならない。したがって、個別に設けられるゲートも高時間分解能を有する検出器、すなわち、時間ジッタのほとんどない検出器を必要とする。適切なものとして、時間ジッタが毎秒１００以下の好適な単一光子計数検出器が市販されている。
【００２５】
脱励起光の強度分布のゼロポイント外で自然放出される蛍光を分離するため、好ましくは、強度ゼロポイント外の励起蛍光体の原則的に全部が自然に又は脱励起光による脱励起により蛍光を放出した後、少なくとも１個のゲートが開放される。
【００２６】
最後に残存する励起蛍光体が蛍光を放出するのを待っていると信号対雑音比が減少するにすぎないので、好ましくは、前記少なくとも１個のゲートは励起光の焦点域内の励起蛍光体の原則的に全部が蛍光を放出する前に閉鎖される。
【００２７】
なお特に前段落に関して、「励起光の焦点域内の励起蛍光体の原則的に全部が蛍光を放出する前に」等の規定は統計的見地から解釈されるものとする。励起光の特定のパルス後において脱励起光の強度ゼロポイントに励起蛍光体が一切存在しない場合もあれば、ゼロポイントにおける励起蛍光体の数が非常に少ない場合もあり、これら蛍光体の全てがすぐに蛍光を放出する場合もある。
【００２８】
新規の本方法において、好ましくは、前記少なくとも１個のゲートは励起光の各パルスに対して所定の時間間隔で開放および閉鎖される。すなわち、前記ゲートの開放および閉鎖は励起光の各パルスにより起動させてもよい。
【００２９】
新規の本方法において、脱励起光は連続波として照射されるため、前記少なくとも１個のゲートは脱励起光の照射中に開放のみならず閉鎖される。例えば連続波レーザダイオード等の連続波固体レーザを用いて脱励起光を照射することにより、新規の本方法を実施する際、かなりのコスト削減が可能となる。
【００３０】
本発明を実施するために用いられる各ゲートは、好ましくは、その時に用いられている蛍光体および測定条件に完全に合わせることができる等、開放時間および閉鎖時間に関して調整可能であると理解されるものとする。更に、前記ゲートの可調性を利用して、非常に低い光強度で非常に高い空間分解能を呈する非常に狭いゲート、および非常に高い光強度で低い空間分解能を呈する広いゲートの間での微調整が可能である。
【００３１】
特に効果的で省コストな新規の本方法の一実施の形態は、交互に開放および閉鎖する２個の補完的時間ゲートを有する。当該補完的ゲートは非常に高い周波数で正確に起動される市販の装置を備える。
【００３２】
また、高時間分解能で自然放出蛍光を記録することを利用して、例えば励起光の各パルス後に自然放出される蛍光に対して第１のゲートおよび時間的に連続する第２のゲートを設け、前記時間的に連続するゲートは、試料に含まれる第２の励起蛍光体より寿命の短い第１の励起蛍光体の原則的に全部が蛍光を放出した後にのみ開放される、２色又は複数色ＳＴＥＤ法として新規の本方法を実行してもよい。その結果、前記第２の励起蛍光体により自然放出される蛍光のみが前記第２の時間ゲートに記録される。脱励起光の強度分布のゼロポイントにおける前記第２の蛍光体の濃度は、前記第２のゲートの最中に記録される蛍光の強度に基づいて決定してもよい。この濃度を考慮して、ゼロポイントにおける前記第１の蛍光体の濃度について、前記第１のゲートの最中に記録される蛍光強度を診断してもよい。
【００３３】
新規の本方法において、ゲートを設ける代わりに、複数の時間的に連続するチャンネルに蛍光を記録してもよい。そして、どのチャンネルに記録される蛍光強度又は総数を診断するかは後に選択してもよい。ゲートを設けても、所定の時間的に連続するチャンネルを選択しても診断に基本的な違いはない。しかしながら、高時間分解能のゲートを設ける方が、複数の時間的に連続するチャンネルに同じ時間分解能で蛍光を記録するより低コストの可能性がある。
【００３４】
新規の本ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡において、前記検出器は励起蛍光体により自然放出される蛍光を励起光源の連続パルス間に高時間分解能で記録する。好ましくは、前記検出器は特定の自然放出蛍光を分離する時間ゲートを備える。なお、自然放出蛍光を記録する際の適当な時間分解能は、前記検出器自体、および励起光源からの励起光の各パルス後に所定の時間間隔で自然放出蛍光のみを記録するために前記検出器に設けられる所定の装置により決定されることは自明である。
【００３５】
上述したように、前記検出器は、各光子の到達時間を時間ジッタほとんどなしで求める単一光子計数器および個別のゲートを備えていてもよい。前記個別のゲートは、電子的に又はソフトウエア内に設けてもよい。このような実施例は両方とも当業者に周知である。
【００３６】
新規の本ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡は、励起光源の焦点域および脱励起光源の強度ゼロポイントを用いて試料を走査する走査ステージを備えていてもよい。前記走査ステージは試料を移動してもよく、又は好ましくは、励起光源の焦点域、脱励起光源の強度ゼロポイント、および前記検出器の検出域を同時に移動する光学素子を用いてもよい。前記走査ステージは、ＦＣＳ法における新規の本ＳＴＥＤ顕微鏡の使用に必ずしも必須ではない。
【００３７】
新規の本ＳＴＥＤ顕微鏡の更なる詳細は、本発明の新規な本方法を説明した際に既に説明済みである。
【００３８】
新規の本方法および新規の本ＳＴＥＤ顕微鏡はいずれも、励起光および脱励起光を照射するため、および自然放出蛍光を、励起光の複数の個別焦点域内で脱励起光の強度分布の複数の個別ゼロポイントに対して同時に記録するため用いてもよいことは自明である。既知のＳＴＥＤ顕微鏡のその他の好ましい実施の形態を本発明に設けてもよい。そのような実施の形態は、空間分解能をｚ方向に高めるための励起光の波長での蛍光体の二光子又は多光子励起、および音響光学変調器により波長のスーパーコンティニウムの任意の波長により励起光を選択して、例えば、様々な蛍光体の吸収スペクトルに適合させるものを含む。このスーパーコンティニウムは通常、レーザからの高エネルギパルスを適切な光導波路又は光ファイバに導入することにより得られる。
【実施例】
【００３９】
図面をさらに詳細に参照して、図１は、本発明によるＳＴＥＤ蛍光顕微鏡１を示す。前記顕微鏡１はＦＣＳ法に用いてもよい。しかしながら本実施の形態は試料２内の蛍光体で標識された特定の構造を撮像するものであり、ｘ方向、ｙ方向およびｚ方向を指す矢印で示す走査ステージを備える。試料２内の蛍光体は励起光源４によりパルス放出される励起光３により励起されて蛍光化される。前記励起光３は、ダイクロイックミラー５を介して、前記励起光３を前記試料２内の焦点域に焦点する対物部６へ向けて反射される。前記ダイクロイックミラー５と前記対物部６との間において、前記励起光３は更なるダイクロイックミラー７およびその他の光学素子８を通過する。前記対物部６により前記試料２内で焦点される前記励起光３の焦点域は、回折限界により制限される最小寸法を有する。すなわち、試料内の励起蛍光体が自然放出する、検出器１０により記録される蛍光９は、光学的に標準の空間分解能で試料の所定の点に割当てられてもよい。その結果、前記焦点された励起光３を用いて前記試料２を走査することにより得られる前記試料２内の特定の構造の画像は、回折限界により範囲が決められる空間分解能を有するのみとなる。回折限界を克服するため、前記ＳＴＥＤ顕微鏡１は、ＳＴＥＤ光又は脱励起光１２を連続波として出力する更なる光源１１を備える。位相マスク１３を用いて、前記対物部６により焦点される前記脱励起光１２の強度分布が前記試料２内の前記励起光３の焦点域内でゼロポイントを有するよう、前記脱励起光１２の波面を変形させる。このゼロポイント外のいずれの地点においても、前記脱励起光１２は前記励起光３により励起される蛍光体を誘導放出させる。誘導された光は、前記自然放出蛍光９の波長とは異なり、前記検出器１０の前に配置されるフィルタ１４により遮断してもよい、前記脱励起光１２と同一の波長を有する。前記試料２が反射する前記励起光３および前記脱励起光１２の一部も前記フィルタ１４により前記検出器１０から遮断する。その結果、前記検出器１０は前記試料２外で自然放出される蛍光のみを記録する。ここで、目指す、前記検出器１０の信号の前記脱励起光１２の強度分布のゼロポイントへの高空間分解能での割り当ては、前記検出器が高時間分解能で自然放出蛍光を検出し、前記励起光源４からの励起光３の各パルスが起動する時間ゲート１５を用いて前記検出器１０からの信号を収集カード（Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ｃａｒｄ）１６の２個のゲート０および１内に別々に収集することにより、可能となる。
【００４０】
図２は、前記励起光３、前記脱励起光１２、前記ゲート０および１、および試料内の蛍光体からの蛍光強度の経時変化を示す。この蛍光強度は、脱励起光の強度分布のゼロポイント（灰色の線：ＩＳＴＥＤ＝０）およびゼロポイントの周囲について示されており、脱励起光の強度が、誘導放出により非常に短時間で励起蛍光体が完全に脱励起される飽和強度Ｉｓの５倍を超える。脱励起光の強度分布のゼロポイントにおける蛍光強度の経時変化は、蛍光の自然放出によってのみ減衰する蛍光体の励起状態の寿命により決まる。ゼロポイント周囲において、蛍光強度の経時変化は、脱励起光による誘導放出の結果大幅に短縮される寿命により決まる。
【００４１】
図１の前記検出器１０により記録される蛍光強度は、脱励起光の強度分布のゼロポイントとその周囲外、両方からの自然放出蛍光を含む。しかしながら、ゲート１、ゼロポイント周囲の蛍光体の励起状態が減衰した後にのみ開放し、前の励起光パルスにより励起された蛍光体が原則的に全て蛍光を放出すると閉鎖するよう設けることにより、ゲート１で記録される蛍光は完全に脱励起光の強度分布のゼロポイント外となるため、当該ゼロポイントに割当てられてもよい。ゲート０はゲート１を補完するものである。ゲート０はゲート１が開放すると閉鎖し、ゲート１が閉鎖すると開放する。ゲート０に記録される蛍光強度は、脱励起光の強度分布のゼロポイント外およびその周囲外の蛍光を両方含む。したがって、ゲート０に記録される自然放出蛍光の絶対強度は、ゲート１に記録される強度より大幅に高くなる。更に、ゲート０においても、前記脱励起光１２は脱励起光の強度分布のゼロポイント外の蛍光体による寄与を大幅に減少させる。したがって、ゲート０に収集される蛍光強度のみを診断する場合でも、前記脱励起光１２により空間分解能が回折限界を超えて向上する。
【００４２】
図３は、本発明により得られる空間分解能（ｂ）を、共焦点蛍光顕微鏡法（ａ）およびＣＷ−ＳＴＥＤ顕微鏡法（ｃ）において得られる空間分解能と比較するものである。図３の画像は全て、蛍光体で標識された試料内の同一構造を示す。最も明度が高い画像（ａ）は、脱励起光によって蛍光強度が低下しない共焦点モードで得られたものである。結果、画像（ａ）は最も低い空間分解能を呈する。ＣＷ−ＳＴＥＤモードにおいて、図２のゲート０および１に記録された強度を付加することにより得られた画像（ｃ）では、明度の低下とひきかえに空間分解能が向上している。しかしながら、構造はまだ不明瞭である。本発明によって、すなわち、図２のゲート１に収集される自然放出蛍光のみに基づいて得られた画像（ｂ）では、明度が更に低下して空間分解能が更に向上している。しかしながら、信号対雑音比は高いままであり、対象の構造が周囲に対してコントラスト高く画像化されている。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によれば、連続波脱励起光の強度を原則的に低下させることが可能である。適当な自然放出蛍光のみを記録する前記ゲート１を設けることにより、当該ゲートで記録される信号は全て、試料内の脱励起光の強度分布ゼロポイントの目標位置に直接割当てることが可能となる。光強度が低ければ、試料に、特にそれが生体試料であれば、与える損傷効果が低い。したがって、本発明によれば、非常に高強度の光を照射することにより損傷させることなく生体試料を診断することも可能となる。本発明は詳細には、励起光の焦点域に約２０ｍＷ光パワーという低強度の脱励起光を照射することにより実施してもよい。
【００４４】
本発明の精神および原理から実質的に逸脱しない限り、本発明の好ましい実施の形態に様々な変更および修正を加えてもよい。そのような変更および修正は全て、以下の特許請求の範囲により定義する本発明の範囲に属するものとする。
【符号の説明】
【００４５】
１    顕微鏡  
２    試料  
３    励起光  
４    励起光源  
５    ダイクロイックミラー  
６    対物部  
７    ダイクロイックミラー  
８    光学素子  
９    自然放出蛍光  
１０    検出器  
１１    脱励起光源  
１２    脱励起光  
１３    位相マスク  
１４    フィルタ  
１５    時間ゲート  
１６    収集カード
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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