(57)【要約】  酵素プロセスを実施する方法であって、前記プロセスの少なくとも２回目で酵素を再生およびリユースし、前記プロセスの各回は以下の工程：  （ａ）基質が可溶性、一部可溶性、又は不溶性の不均一基質溶液を用意する工程  （ｂ）酵素又は酵素混合物を前記不均一基質溶液に加える工程、及び  （ｃ）前記基質の酵素反応を進行させる工程を含み、各回の工程（ｃ）が完了した後、以下の工程：  （ｄ）前記工程（ｃ）で得られた反応混合物から酵素を分離するために、酵素を吸着する吸着剤と反応混合物とを接触させる工程を含む非充填床吸着プロセスを実施する工程  （ｅ）前記吸着剤に非結合の材料を任意で洗浄する工程、及び  （ｆ）前記吸着剤から酵素を脱着する工程に従って前記工程（ｃ）で得られた混合物から酵素を再生することを特徴とする、酵素プロセスを実施する方法。【選択図】図３
2013530704.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素プロセスを実施する方法であって、前記プロセスの少なくとも２回目で酵素を再生およびリユースし、前記プロセスの各回は以下の工程：
（ａ）基質が可溶性、一部可溶性、または不溶性の不均一基質溶液を用意する工程
（ｂ）酵素又は酵素混合物を前記不均一基質溶液に加える工程、及び
（ｃ）前記基質の酵素反応を進行させる工程
を含み、各回の工程（ｃ）が完了した後、以下の工程：
（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた反応混合物から酵素を分離するために、酵素を吸着する吸着剤と反応混合物とを接触させる工程を含む非充填床吸着プロセスを実施する工程
（ｅ）前記吸着剤に非結合の材料を任意で洗浄する工程、及び
（ｆ）前記吸着剤から酵素を脱着する工程
に従って前記工程（ｃ）で得られた混合物から酵素を再生し、
さらには、前記工程（ｆ）で得られた脱着酵素を、前記プロセスの次の少なくとも１回の工程（ｂ）で用いることを特徴とする、酵素プロセスを実施する方法。
【請求項２】
酵素活性の低下と不活性化を補うために必要に応じて酵素をさらに追加し、前記リサイクルプロセスを２回又はそれ以上繰り返すことを特徴とする、請求項１に記載のリサイクルプロセスの方法。
【請求項３】
前記非充填床吸着プロセスが、膨張床吸着プロセスであることを特徴とする、請求項１に記載のプロセスの方法。
【請求項４】
前記非充填床吸着プロセスが、高密度、低密度もしくは磁性吸着粒子を用いたバッチ吸着プロセス、または膜吸着プロセスであることを特徴とする、請求項１に記載のプロセスの方法。
【請求項５】
前記酵素または酵素混合物をラベリングし、前記吸着剤への結合の特異性および／または強度を高めることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のプロセスの方法。
【請求項６】
前記酵素または酵素混合物のラベリングを遺伝子組み換えによって行うことを特徴とする、請求項４に記載のプロセスの方法。
【請求項７】
前記酵素または酵素混合物のラベリングを酵素の化学修飾によって行うことを特徴とする、請求項４に記載のプロセスの方法。
【請求項８】
前記化学修飾が染料、ＤＮＡオリゴマーまたはＰＮＡやＬＮＡ等のアナログ、炭水化物成分、アセチル化、サクシニル化、アルキル化、還元的アミノ化、ビオチン化、ボロン酸、ＩＤＡ等のキレート基、リガンドが結合したシクロデキストリン、ポリエチレングリコール、またはデキストランを含むことを特徴とする、請求項６に記載のプロセスの方法。
【請求項９】
前記基質がセルロース、セルロース含有材料、でんぷん、でんぷん含有材料、含油材料、または不溶性もしくは一部可溶性の植物性たんぱく質溶液であることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一項に記載のプロセスの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は膨張床吸着（ＥＢＡ）システムによるアフィニティーキャプチャーを用いたバイオリアクターからの酵素のリサイクルに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的に生成されたアルコールには、最も一般的なものにエタノール、それよりやや一般的なものにプロパノールとブタノールがあるが、それらはいずれも（最も単純な手順である）糖またはでんぷんの発酵、あるいは（より複雑な手順の）セルロースの発酵を通じた微生物と酵素の作用で生成される。よく、バイオブタノール（バイオガソリンともいう）はガソリンの代用品になると言われるが、それは（ディーゼルエンジンにおけるバイオディーゼルと同様の方法で）ガソリンエンジンにおいて直接使用することができるためである。
【０００３】
エタノール燃料は世界中で、特にブラジルにおいて、最も一般的なバイオ燃料である。アルコール燃料は麦、トウモロコシ、てん菜、サトウキビや糖蜜由来の糖の発酵、何らかの糖の発酵、あるいはアルコール飲料の製造が可能な（じゃがいもや果物くず等の）でんぷんの発酵により製造される。使用できるエタノール製造方法には（貯蔵でんぷんから糖を放出する）酵素消化法、糖を発酵する方法、蒸留法および乾燥法がある。セルロースから生成可能なエタノールの賦存量はとうもろこしから生産できる量より一桁は多い。とうもろこしからエタノールへの変換とは対照的に、セルロースからエタノールへの変換ルートは温室効果への負担をほとんど伴わないかあるいは全く負担を伴わず、また、明らかにプラスの正味エネルギーバランスを有する。これらが考慮され、セルロースを代謝する微生物は近年注目を集めつつある。
【０００４】
リグノセルロースは（ｉ）ヘミセルロースを伴い、（ｉｉ）ヘミセルロースとの間に限定共有結合を有するリグニンシールに囲まれており、（ｉｉｉ）その大部分は６つの水素結合、４つの分子内結合ならびに２つの分子間結合の形成が可能な結晶構造であり、これは秩序の高い、緊密な構造となるといった理由から、加水分解が難しい。（ｉ）リグニンシールを取り除き、（ｉｉ）ヘミセルロースを可溶化し、（ｉｉｉ）結晶度を低下させ、及び／又は（ｉｖ）細孔容積を増やすことによってセルロースの表面積を増加させることを目的として、前処理が行われる。結晶セルロースを攻撃するセルラーゼシステムの価値は、表面積を増加させる前処理の多くが結晶度も増加させる、という観測にある。これには希硫酸、アルカリ、エチレンジアミンが含まれる。
【０００５】
セルロースから燃料への変換においては、加水分解の段階、特に結晶セルロースの持つ高秩序で不溶性な構造への初期攻撃において、その変換が制限される。これは、この攻撃により発生した生成物が容易に可溶化され、糖に変換されるためである。セルロースから糖へと変換する方法の開発に、これまで多くの取り組みがなされてきた。これらの取り組みのほとんどは生化学、遺伝学、そして前処理方法と酵素的分解のプロセス開発に重点を置いている。
【０００６】
バイオ燃料の製造においては低い生産経済性がネックであり、その原因の一つはバイオマスの分解や高分子炭水化物構造の発酵性糖への変換に用いられる酵素（セルラーゼ、キシラナーゼ、リグナーゼ等）の価格にある。一般的に、バイオ燃料の生産量を最大限にするために用いられる酵素の量と、高酵素濃度を利用することに伴うコストのバランスを取ることが必要となる（言い換えれば、多くの酵素を添加することにより生産量を高めることができるが、そのコストは非常に高いものとなる）。
【０００７】
これら酵素（すなわち、セルラーゼ、キシラナーゼ、リグナーゼ等）は高い価値があるが、現在のところ、上記プロセスで使用されたそれらの酵素の再生、リサイクルには至っていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、消化プロセスの最後にリユースできるよう酵素をリサイクルすることが望ましいことを見出した。これは、酵素をリサイクルすることが一般的に酵素の価格を下げるだけではなく、バイオ燃料の生産量を高め、利益性を改善するためである。
【０００９】
消化プロセスにおけるバイオマスの起源は多種多様であり、可溶性、一部可溶性、ならびに不溶性の原材料で構成される。バイオマスの一部のみが二糖類あるいは単糖類へと変換され、可溶性および不溶性材料からなる混合溶液が残る。膜濾過や充填床クロマトグラフィー（packed bed chromatography）等の従来の分離技術においては、大量の不溶性物質を付着や流閉塞を発生させること無く扱うことは不可能であるため、そのような混合物から消化酵素を抽出することは困難である。
【００１０】
更に、酵素の活性や有用性を壊すことなく消化プロセスが終了した後に、残った混合物から酵素を再生するためには、酵素の変性や失活を引き起こさない穏和な条件下で行うことができる抽出方法を選ぶことが必要となる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、酵素プロセスを実施する方法であって、前記プロセスの少なくとも２回目で酵素を再生およびリユースし、前記プロセスの各回は以下の工程：
（ａ）基質が可溶性、一部可溶性、または不溶性の不均一基質溶液を用意する工程
（ｂ）酵素又は酵素混合物を前記不均一基質溶液に加える工程、及び
（ｃ）前記基質の酵素反応を進行させる工程
を含み、各回の工程（ｃ）が完了した後、以下の工程：
（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた反応混合物から酵素を分離するため、酵素を吸着する吸着剤と反応混合物とを接触させる工程を含む非充填床吸着（non-packed-bed adsorption）プロセスを実施する工程
（ｅ）前記吸着剤に非結合の材料を任意で洗浄する工程、及び
（ｆ）前記吸着剤から酵素を脱着する工程
に従って前記工程（ｃ）で得られた混合物から酵素を再生することを特徴とする、酵素プロセスを実施する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明に係るプロセスの模式的な説明を示したものである。
【図２】図２は、膨張床吸着及び膜ろ過を含む酵素リサイクルシステムを模式的に示したものである。
【図３】図３は、発酵時における酵素の再生システムを模式的に示したものである。
【図４】図４は、たんぱく質分離および酵素リサイクルの複合プラントを模式的に示したものである。  ＥＢＡ酵素再生および膜ろ過の統合プロセスは、限外濾過法を水再生ステップに用い、プロセス経済性を向上した場合において実現が可能となる（図２参照）。この場合、粗酵素溶液はバイオエタノールプロセスにおけるどの段階からも得ることができる。このＥＢＡベースの酵素リサイクルプロセスは、具体的にはバイオマス発酵ステージの前処理の後においても用いることができ、ここでは酵母ベースのあるいは細菌ベースの発酵槽と共に酵素の再生が行われ、その結果、酵素リサイクルが同時糖化発酵（ＳＳＦ）プロセスの一部を構成する（図３参照）。  ＥＢＡ吸着を用いた可溶性たんぱく質のバイオマスからの複合精製について、図４に示す。たんぱく質精製後、更に任意の前処理工程が続き、セルロースの消化のためのサンプルを調製し、ＥＢＡベースの酵素リサイクルステップがその後に続く。この複合プロセスにおいては、２つのＥＢＡ吸着工程が用いられている。最初の工程では、その後のプロセスで破壊されるおそれのある商業的価値のある可溶性たんぱく質を分散バイオマスから移動させ、第２の工程では消化酵素を発酵前にリサイクルする。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
前記方法の前記プロセスは、少なくとも２回、例えば３回、５回、１０回と繰り返すことが好ましい。不均一基質溶液中で望ましい酵素の活性レベルを維持するために、２回目以降の繰り返しにおいて用いられるリサイクルされた酵素に、必要に応じて追加の酵素を補うことが好ましい。これは、時間がたつにつれ、反応混合物からの酵素再生が不完全になり、再生された酵素の活性が使用に伴い低下することが予想されるためである。補給する酵素は既に用いられ再生された酵素、あるいは「新しい」、すなわち未使用の酵素であることが好適であると考えられる。
【００１４】
前記方法は、脱着した酵素を吸着剤から工程（ｆ）において水溶液中で得た後、該水溶液に限外ろ過を行い、濃縮酵素溶液および水を得るステップを更に含むことが好適である。これにより、更なる経済的且つ環境的利益が得られる。酵素再生のために用いられた水をリサイクルし、例えば、酵素をさらに吸着剤から脱着するのに用いることができる。
【００１５】
本発明の吸着工程（ｄ）は、工程（ｃ）から得られた混合物に対して行われるその他のプロセスと同時に行われることが好適である。例えば、該プロセスがバイオ燃料を製造するプロセスの一部である場合、吸着工程（ｄ）は工程（ｃ）で製造された糖の発酵が行われている間に行う。
【００１６】
非充填床クロマトグラフィー（non-packed-bed chromatography）は様々な方法が知られており、本発明で用いることが可能である。充填床クロマトグラフィー法は、吸着剤の充填カラムが不均一溶液、すなわち不溶性物質を含む溶液がカラムを通過する際にブロックする傾向を持つため、不適切であると考えられる。しかし、反応混合物のタンクが吸着剤に接触しており、酵素を吸着させ、続いて濾過等で吸着剤をタンクから分離するといった方法であれば、当技術分野で知られているその他の類似方法と同様に好適に用いることができる。しかし、本発明のステップ（ｄ）は膨張床（expanded bed）クロマトグラフィーで行うことが好ましい。膨張床吸着クロマトグラフィー（ＥＢＡ）はアフィニティー分離工程を行って精製されていない原料から特定の物質を得るのに有効な方法である。この点において、ＥＢＡは、価値の高い酵素のバイオマス消化プロセスからの捕捉とリサイクルに適している。ＥＢＡカラムにおいて処理される物質は、消化プロセス完了後、未消化物質と可溶性消化産物を含む不均一溶液であると定義することができ、これは、０．１％体積／体積（v/v）を超える不溶性物質を含む水溶液である。
【００１７】
工程（ｄ）はバッチ処理として行われることが好適である。工程（ｄ）においては、高密度粒子、低密度粒子または磁性粒子を含む吸着剤か、あるいは、膜吸着プロセスを用いることが好適である。
【００１８】
酵素プロセスに用いられる基質には、セルロースあるいは木や藁といったセルロース含有材料、トウモロコシ、小麦、あるいは藻由来のでんぷんベースの材料、油糧種子、菜種、ひまわり、ヤトロファ、あるいは藻由来の含油材料、あるいは不溶性または一部可溶性の植物性たんぱく質溶液がある。
【００１９】
バイオマスを含む不均一溶液あるいは懸濁液は、有機溶媒あるいはイオン性溶媒を含んでもよい。この場合、消化工程（ｃ）を、これらの条件下でも活性を有する酵素を用いて行う必要がある。同様に、工程（ｄ）において酵素を吸着するために選択する吸着剤は、有機あるいはイオン性溶液においても安定するよう選ぶ必要がある。
【００２０】
本発明のプロセスで用いるのに好適な酵素には、セルラーゼ、キシラナーゼおよびリグナーゼ酵素が含まれる。これらの酵素は、自然発生であるか、所望の特性を得るよう人工的に操作されたものである。
【００２１】
酵素あるいは複数の酵素の混合物は、酵素の吸着剤との結合の特異性及び／又は強度を高めるためにラベリングされているのが好ましい。
【００２２】
本発明で用いられる酵素あるいは複数の酵素は、特定の吸着剤により効果的に捕捉されるよう、遺伝子操作又は化学修飾されていることが好ましい。好適なラベリング方法および化学基としては、以下が挙げられる。
Ｈｉｓ６タグと組み合わせて、固定化金属キレートと、あるいはその他の特定のペプチド配列と相互作用させる方法。この特定のペプチド配列は特異的に認識することが可能であり、あるいはCibacron Blueといった色素等の固定化成分と結合している。
酵素と吸着剤の両方を色素でラベリングし、アルブミン等の架橋分子を用いて固定化する方法。
酵素を色素でラベリングする方法。通常、これはデキストランやポリエチレングリコール等のスペーサー分子の末端に行うことができ、ラベリングされた酵素は、その後、吸着剤に固定化したアルブミンに結合することができる。
特定の配列を酵素に結合する方法。この場合、特定の配列には吸着剤上に固定化した相補配列に結合するＤＮＡオリゴマーやＰＮＡ、ＬＮＡ等のアナログがある。
酵素を炭水化物成分やアセチル化、サクシニル化、アルキル化あるいは還元的アミノ化で修飾する方法。および、
酵素をビオチン、反応性色素あるいはボロン酸、ＩＤＡ等のキレート基、リガンドが結合したシクロデキストリン、ポリエチレングリコールあるいはデキストラン等によりアフィニティーラベリングする方法。
【００２３】
好ましい方法としては、酵素をフルオレセイン等の特定のリガンドでラベリングする方法、および、フルオレセイン特異的抗体等のリガンド特異的抗体を溶出で、その後ｐＨを低下させて抗体／リガンド相互作用をリバースさせて吸収剤上に固定化する方法が挙げられる。植物由来材料等の低コストの抗体源あるいは「植物抗体」を使用するのが有益である。
【００２４】
代替的アプローチとしては、酵素を修飾して、酵素活性を実質的に低減することなく、消化プロセス中に存在する他のたんぱく質とかぶらないようその等電点（pI）を実質的に変更することが挙げられる。その結果、クロマトグラフィー補足ステップに選択されたｐＨ条件下で、修飾酵素は吸着剤と結合し、他のたんぱく質との結合はごくわずかとなる。吸着剤はイオン交換体であることが好ましく、結合した酵素の溶出は、溶出緩衝液のｐＨを変えることで行われることが好ましい。
【００２５】
更なるアプローチとしては、十分に高い親和性で活性部位に結合した酵素に、吸着剤として固定化基質を用い、酵素を消化液から捕捉することが挙げられる。
【００２６】
更なるアプローチとしては、デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ微粒子やマイクロ微粒子等の強磁性、常磁性あるいは超常磁性物質又は、酵素に強く結合することが可能なその他の高分子磁気複合体で酵素をラベリングすることが挙げられる。
【００２７】
その他のアプローチとしては、吸着剤の合成リガンドを用いて、消化液中で酵素と直接結合し、とりわけリガンドと相互作用するよう酵素アミノ酸配列に挿入されたドメインと結合すること、あるいは化学誘導体化によって導入された部分と結合することが挙げられる。結合した酵素は、その後、ｐＨやイオン強度等の条件変更を適切に行うことで、吸着剤から放出することが可能である。
【００２８】
ＥＢＡプロセスにおいて、流速、粒子のサイズ、粒子の密度は全て流動床の膨張に影響を持ち、粒子をカラム内に閉じ込める方法で膨張度を調節することが重要となる。膨張度はＨ／ＨＯと定義することができ、ＨＯは充填床モードにおける床の高さを表し、Ｈは膨張モードにおける床の高さを表す。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態においては、膨張度Ｈ／ＨＯは１．０〜２０の範囲内であり、例えば１．０〜１０（例：１．０〜６）、１．２〜５（例：１．５〜４）、４〜６、３〜５（例：３〜４）、４〜６等の範囲が挙げられる。その他の本発明の好ましい実施形態においては、膨張度Ｈ／ＨＯは少なくとも１．０であり、例えば少なくとも１．５（例：少なくとも２）、少なくとも２．５（例：少なくとも３）、少なくとも３．５、（例：少なくとも４）、少なくとも４．５（例：少なくとも５）、少なくとも５．５（例：少なくとも６）、少なくとも１０（例：少なくとも２０）等が挙げられる。
【００３０】
ＥＢＡ吸着剤粒子の密度は、典型的なＥＢＡカラム内で可能な吸着剤床の最大膨張度（例：最大３〜５のＨ／ＨＯ）と関連して、適用可能な流速にとって非常に重要なことが明らかである。高いプロセス生産性を得るため、ＥＢＡ吸着剤粒子の密度は少なくとも１．３ｇ／ｍＬ（好ましくは少なくとも１．５ｇ／ｍＬであり、更に好ましくは少なくとも１．８ｇ／ｍＬであり、更に好ましくは少なくとも２．０ｇ／ｍＬであり、更に好ましくは少なくとも２．３ｇ／ｍＬである）である必要がある。吸着剤粒子の密度は、完全に溶媒和された（例えば水和した）状態にある吸着剤の密度を表しており、乾燥させた吸着剤の密度とは対照的である。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態においては、吸着剤粒子の平均粒径は最大でも１５０μｍであり、好ましくは最大でも１２０μｍであり、より好ましくは最大でも１００μｍであり、より好ましくは最大でも９０μｍであり、より好ましくは最大でも８０μｍであり、より好ましくは最大でも７０μｍである。通常、吸着剤粒子の平均粒径の範囲は４０〜１５０μｍであり、例えば、４０〜１２０μｍ（例：４０〜１００μｍ）、４０〜７５μｍ（例：４０〜５０μｍ）等が挙げられる。好ましい実施形態を組み合わせ、平均粒径を１２０μｍ以下とした場合、粒子密度は少なくとも１．６ｇ／ｍＬであり、より好ましくは少なくとも１．９ｇ／ｍＬである。
【００３２】
平均粒径が９０μｍ未満の場合、密度は少なくとも１．８ｇ／ｍＬである必要があり、より好ましくは少なくとも２．０ｇ／ｍＬである。平均粒径が７５μｍ未満の場合、密度は少なくとも２．０ｇ／ｍＬである必要があり、より好ましくは少なくとも２．３ｇ／ｍＬであり、最も好ましくは少なくとも２．５ｇ／ｍＬである。多くの場合、吸着剤粒子は、高密度無孔質コア材料を一定の比率で含有することで、高い密度を得ることができる。吸着剤粒子の密度は、好ましくは少なくとも４．０ｇ／ｍＬ（例：少なくとも５．０）である。通常、無孔質コア材料の密度の範囲は約４．０〜２５ｇ／ｍｌであり、例えば約４．０〜２０ｇ／ｍｌ（例：約４．０〜１５ｇ／ｍＬ）、１２〜１９ｇ／ｍｌ（例：１４〜１８ｇ／ｍｌ）、約６．０〜１５．０ｇ／ｍＬ（例：約６．０〜１０ｇ／ｍｌ）等が挙げられる。
【００３３】
酵素含有混合物は、少なくとも３ｃｍ／ｍｉｎの線流速で吸着剤カラムに適用することができ、例えば、少なくとも５ｃｍ／分（例：少なくとも８ｃｍ／分）、少なくとも１０ｃｍ／分（例：２０ｃｍ／分）等で塗布することが可能である。通常、流速は５〜５０ｃｍ／分の範囲から選ばれ、例えば、５〜３０ｃｍ／分（例：１０〜３０ｃｍ／分）や２５〜５０ｃｍ／分等の範囲が挙げられる。吸着剤粒子のサイズが小さいため、流速は大きく上げることができる。その結果、消化されたバイオマスおよび酵素の吸着剤カラムへの適用は少なくとも２００ｃｍ／ｈの線流速を伴い、例えば少なくとも３００ｃｍ／ｈ、より好ましくは少なくとも４００ｃｍ／ｈ、あるいは少なくとも５００または６００ｃｍ／ｈや少なくとも９００ｃｍ／ｈの線流速が挙げられる。
【００３４】
本発明の特に好ましい実施形態を組み合わせ、消化されたバイオマス材料を適用する際の線流速を３００ｃｍ／ｈより上とした場合、好ましい平均粒径は１５０μｍより下である。通常、酵素再生プロセスを５００ｃｍ／分超の線流速で行う実施形態において、平均粒径は１２０μｍより下であり、好ましくは９０μｍより下である。あるいは、酵素再生プロセスを６００ｃｍ／ｈ超の線流速で行う実施形態において、通常、平均粒径は好ましくは８５μｍより下であり、より好ましくは７５μｍより下である。
【００３５】
本発明に用いられる吸着剤粒子は、大きな結合能を確保するため、標的分子のみと表面で結合し、その結果比較的低い結合能を有する不浸透性粒子とは対照的に、再生される酵素を少なくとも部分的に通すことが好ましい。吸着剤粒子は多数の異なる構造や組成、形状を有してもよい。従って、吸着剤粒子は、与えられた流速それ自体で作用するのに必要な密度と結合能を有する、化学的に誘導体化された複数の多孔質材料によって構成されていてもよい。
【００３６】
粒子は、ＷＯ１０  ９２／００７９９で開示されているような、多孔質材料によって覆われた少なくとも２つの無孔質コアを有する集合体タイプ、あるいは、多孔質材料によって覆われた１つの無孔質コアを持つ薄膜タイプのいずれかである。
【００３７】
本明細書において、「集合体タイプ」という用語は粒子状材料でできた粒子に関連し、該粒子は、タイプやサイズが異なり、高分子ベースマトリクスによって結合した、コア材料のビーズを含む。一例としては、アガロースの覆い（＝高分子ベースマトリクス）によって結合した２つ以上の高密度粒子からなるコア粒子が挙げられる。
【００３８】
本明細書において「薄膜タイプ」という用語は複合粒子に関連し、各粒子は、多孔質高分子ベースマトリクスの層で覆われた高密度コア材料一種類のみからなリ、例えば、アガロースでコーティングした高密度ステンレスビーズが挙げられる。
【００３９】
従って、「少なくとも１つの高密度無孔質コア」という用語は、１つの高密度無孔質粒子からなる薄膜コアに関連するか、あるいは、１より多い高密度無孔質粒子からなる集合体コアに関連したものである。
【００４０】
上記のように、吸着剤粒子は、高密度無孔質コアとそれを取り巻く多孔質材料を含み、該多孔質材料は外表面にリガンドを有していてもよい。本明細書において、「コア」という用語は、前記無孔質コア粒子、あるいは前記吸着剤粒子の内側に存在するコア粒子に関連したものである。
【００４１】
コア粒子は、多孔質材料内でランダムに分布することができ、吸着剤粒子の中心に位置することを制限されない。通常、無孔質コアは、最大でも吸着剤粒子の全体積の５０％を構成しており、例えば最大でも４０％、好ましくは最大でも３０％である。
【００４２】
好適な無孔質コア材料の例としては無機化合物、金属、重金属、非金属元素、金属酸化物、非金属酸化物、金属塩、金属合金等が挙げられる。これらは、上記密度基準が満たされている限り、用いられることができる。
【００４３】
そのようなコア材料の例としては、以下が挙げられる。金属ケイ酸塩、金属ホウケイ酸塩；二ホウ化チタン、炭化チタン、ホウ化ジルコニウム、炭化ジルコニウム、炭化タングステン、炭化ケイ素、窒化アルミニウム、窒化ケイ素、窒化チタン、酸化イットリウム、粉末シリコン金属、二珪化モリブデン等のセラミック；マグネシウム、アルミニウム、チタニウム、バナジウム、クロム、ジルコニウム、ハフニウム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅および銀酸化物等の金属酸化物および金属硫化物；非金属酸化物；硫酸バリウム等の金属塩；タングステン、ジルコニウム、チタン、ハフニウム、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、インジウム、銅、銀、金、パラジウム、プラチナ、ルテニウム、オスミウム、ロジウムおよびイリジウム等の金属元素、および前記金属元素を用いて形成された合金等の金属元素の合金（例：ステンレス）；グラファイト、カーボンブラックおよびチャコール等の結晶性および非晶質炭素。
【００４４】
好ましい無孔質コア材料としては、炭化タングステン、タングステン、および、ステンレスビーズ等のスチールおよびチタンのビーズが挙げられる。
【００４５】
多孔質材料とは、コアを覆い、また必要に応じて複数（あるいは単数）のコア材料を結びつけるために用いられる高分子ベースマトリクスであり、且つ、吸着リガンドを結合するために用いられる高分子ベースマトリクスである。
【００４６】
高分子ベースマトリクスはある種の天然あるいは合成有機ポリマーから探すことができ、通常は以下からえらばれるものである。ｉ）寒天、アルギン酸塩、カラギナン、グァーガム、アラビアゴム、ガティゴム、トラガカントゴム、カラヤゴム、ローカストビーンゴム、キサンタンゴム、アガロース、セルロース、ペクチン、ムチン、デキストラン、でんぷん、ヘパリン、キトサン、ヒドロキシでんぷん、ヒドロキシプロピルでんぷん、カルボキシメチルでんぷん、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびカルボキシメチルセルロース等の天然および合成多糖類及びその他の炭水化物ベースのポリマー。ｉｉ）アクリルポリマー、ポリアミド、ポリイミド、ポリエステル、ポリエーテル、高分子ビニル化合物、ポリアルケン、およびこれらの置換誘導体、ならびに１より多いこれらのポリマー基を含む共重合体、およびこれらの置換誘導体、等の合成有機ポリマーおよびポリマーとなるモノマー。ｉｉｉ）これらの混合物。
【００４７】
好ましい高分子ベースマトリクスの一群としては、アガロース等の多糖類が挙げられる。生産性の観点から、吸着剤が、その体積単位につき、リサイクルされる酵素を大量に結合できることが重要である。その結果、我々は、吸着剤粒子体積の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を構成する高分子相（すなわち、リガンドがあり、吸着が実際に発生する透過性骨格）を有する吸着剤を用いるのが好ましいことを見出した。
【００４８】
本発明の発明者らは、流速が高い場合においても効率的な吸着を実現するためには、吸着剤粒子の平均粒径を最小化するのが好ましいことを見出した。各吸着剤粒子の形状は実質的に球状であることが好ましい。しかし、粒子の全体の形は通常はそれほど重要ではなく、したがって、その他の円形を有していてもよい。例えば、楕円形や液滴形、豆の形等が挙げられる。しかし、ある種の特定の用途（例えば粒子が流動床の準備に用いられる場合）においては、少なくとも粒子の９５％が実質的な球形であることが好ましい。
【００４９】
本発明においては、粒子状材料の調製は、当業者が周知の従来のプロセス（例えば、ＥＰ０５３８３５０Ｂ１あるいはＷＯ９７／１７１３２参照）など、それ自体が周知の各種方法で行うことができる。
【００５０】
例えば、モノマーのブロック重合；モノマーの懸濁重合；ゲル形成材料のブロックゲル化または懸濁ゲル化（例えばアガロース等の加熱冷却）、あるいはゲル化「触媒」の添加（例えば適切な金属イオンのアルギン酸塩またはカラギナンへの添加）；適切な可溶性材料のブロック架橋または懸濁架橋（例えばデキストラン、セルロース、でんぷん、ゼラチンまたはその他の有機ポリマーとエピクロロヒドリン、ジビニルスルホン等との架橋）；シリカ溶液（ブロック溶液、懸濁溶液等）の酸性化によるシリカポリマーの形成；複数の手順を組み合わせたもの（重合とゲル化の組み合わせ等）；スプレー法；および密度調整粒子の流動床コーティング；高分子ベースマトリクス中で懸濁した密度調整粒子のエマルジョンを熱した油溶剤中で冷却する方法；あるいは密度調整粒子と活性物質を適切なモノマー溶液または共重合体溶液の中で懸濁し、重合する方法、等が挙げられる。
【００５１】
本発明における、粒子状材料の調製に一般的に適用可能な、特に好適な実施形態においては、アガロースと水の混合物を熱し（約９５°Ｃまで）、スチールビーズを加え、混合物を熱した油（植物油等）に移し、激しく撹拌して乳化させ（任意で一般的な乳化剤を加えることもできる）、混合物を冷却すすることによって、高分子ベースマトリクスとしてアガロースを含み、コア材料としてスチールビーズを含む粒子状材料を得る。このプロセスは連続的に行うこともできるし、あるいは連続的なプロセス中に乳化重合することによって行うこともできる（ＷＯ２００９０７１５６０参照）。
【００５２】
当業者は、粒子サイズ（各粒子に導入される高分子ベースマトリクスの量、ここではアガロース）はミキサーの速度と冷却プロセスを変えることで調整できることが分かる。通常、粒子の一次生産に続き、ふるい分け及び／あるいは流動層洗浄を行い、粒度分布をさらに決定する。
【００５３】
酵素を高分子アガロース等の多孔質マトリクスに結合する方法は、リサイクルする酵素に親和性を有する低分子量リガンドで化学的に誘導体化することである。リガンドは吸着性媒体の吸着機能を担うか、あるいは、吸着剤粒子の高分子骨格が導入された結合機能それ自体を有する。そのような親和性リガンドは、「Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., Academic Press, Inc., San Diego, 1992」で説明されているような当業者に周知の方法でベースマトリクスに結合してもよい。この目的に用いることが可能なそれ自体が既知のあらゆる種類の共有結合、例えば、リガンドと固相材料の直接化学反応、あるいは、マトリクス骨格をリガンドに結合可能なそれ自体が既知の好適な試剤で、固相材料またはリガンドを先行して活性化することで、リガンドを固相材料に付着させてもよい。
【００５４】
そのような好適な活性化剤の例としては、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、アリルグリシジルエーテル；ブタンジオールジグリシジルエーテル等のビスエポキシド；ジクロロプロパノール、ジビニルスルホン等のハロゲン置換脂肪族化合物；カルボニルジイミダゾール；グルタルジアルデヒド等のアルデヒド；キノン；臭化シアン；メタ過ヨウ素酸ナトリウム等の過ヨウ素酸塩；カルボジイミド；塩化シアヌル等のクロロトリアジン；塩化トシル及び塩化トレシル等のスルホニルクロリド；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−スルホネート；オキサゾロン；マレイミド；ピリジルジスルフィド；及びヒドラジドが挙げられる。これらのうち、単結合とは異なるスペーサー基を生じる活性化剤が好ましく、例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、アリル−グリシジルエーテル；ビスエポキシド；ハロゲン置換脂肪族化合物；ジビニルスルホン；アルデヒド；キノン；臭化シアン；クロロトリアジン；オキサゾロン；マレイミド；ピリジルジスルフィド；及びヒドラジドが挙げられる。
【００５５】
特に興味深い活性化剤は、エピクロロヒドリン、アリルグリシジルエーテルおよびブタンジオールジグリシジルエーテル等のエポキシ化合物であると考えられる。
【００５６】
場合によっては、活性化剤は、酵素の固相マトリクスへの結合に寄与する機能性の一部を担うこともでき、例えば、ジビニルスルホンを活性化剤として使用するケースがある。その他には、官能基とマトリクスの反応の間に、活性化剤をマトリクスから放出するケースがある。これはカルボジイミダゾールおよびカルボジイミドが用いられる場合である．
【００５７】
上記可能性はマトリクスＭとリガンドＬをつなげる任意のスペーサーＳＰ１の存在を定義することに関係している。本明細書においては、スペーサーＳＰ１はマトリクスとリガンドの間に結合を形成する活性化剤の部分であると考えられる。結果、スペーサーＳＰ１は活性化剤とそれに伴うカップリング反応に相当する。時として、例えばカルボジイミドを使用した場合など、活性化剤は活性型マトリクスあるいは活性型リガンドを形成する。カップリング後は、活性化剤はリガンドとマトリクスの間に全く残っておらず、したがって、ＳＰ１は単に単結合である。
【００５８】
その他の場合では、スペーサーＳＰ１は結合特性に影響する官能基、すなわちリガンド、に不可欠な部分であり、スペーサーＳＰ１が機能的に活性な部位や置換基を含むかどうかは非常に重要となる。そのような部位や置換基としては、例えば、チオール、アミン、酸性基、スルホン基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ニトリル基、水素結合や静電結合や反発作用を通しての相互作用等が可能なその他の基、あるいは電荷移動等が可能なその他の基等が挙げられる。
【００５９】
その他の場合、スペーサーＳＰ１は、固相マトリクスの結合特性に重要な役割を果たす芳香環あるいは芳香族複素環を含んでもよい。例えば、キノンあるいはクロロトリアジンを固相マトリクスやリガンドの活性化剤として用いる場合が考えられる。
【００６０】
好ましくは、スペーサーＳＰ１は単結合か、あるいはエピクロロヒドリン、アリルグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル等のビスエポキシド、１，３−ジクロロプロパン−２−オール等のハロゲン置換脂肪族化合物、グルタルジアルデヒド等のアルデヒド、ジビニルスルホン、キノン、臭化シアン、塩化シアヌル等のクロロトリアジン、２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−スルホネート、マレイミド、オキサゾロン、およびヒドラジドから選ばれる活性化剤に由来のビラジカルであることが好ましい。
【００６１】
スペーサーＳＰ１は短鎖脂肪族ビラジカルから選ばれることが好ましい。短鎖脂肪族ビラジカルの例としては、式ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（エピクロロヒドリン由来）、（ＣＨ２）３ＯＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（アリルグリシジルエーテル由来）あるいはＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）４ＯＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ブタンジオールジグリシジルエーテル由来）であらわされる短鎖脂肪族ビラジカル、あるいは単結合が挙げられる。また、リガンドの構造は芳香族構造でも複素環芳香族構造であってもよく、以下のタイプの芳香環あるいは芳香族複素環や芳香族基あるいは複素環芳香族基（ラジカル）に１又はそれ以上の置換基を官能基として任意に有する、非常に様々な異なる構造をカバーすることもできる。２−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、２−メルカプト安息香酸、４−アミノ−２−クロロ安息香酸、２−アミノ−５−クロロ安息香酸、２−アミノ−４−クロロ安息香酸、４−アミノサリチル酸、５−アミノサリチル酸、３，４−ジアミノ安息香酸、３，５−ジアミノ安息香酸、５−アミノイソフタル酸、４−アミノフタル酸等の安息香酸；ヒドロキシ桂皮酸等の桂皮酸；２−メルカプトニコチン酸等のニコチン酸；２−ヒドロキシ−１−ナフトエ酸等のナフトエ酸；２−メルカプトキノリン等のキノリン；５−メルカプト−１−酢酸テトラゾール等の酢酸テトラゾール；２−メルカプト−５−メチル−１，３，４−チアジアゾール等のチアジアゾール；２−アミノ−ベンズイミダゾール、２−メルカプトベンズイミダゾールおよび２−メルカプト−５−ニトロ−ベンズイミダゾール等のベンズイミダゾール；２−アミノベンゾチアゾール、２−アミノ−６−ニトロベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾチアゾールおよび２−メルカプト−６−エトキシベンゾチアゾール等のベンゾチアゾール；２−メルカプトベンゾキサゾール等のベンゾオキサゾール；チオフェノールおよび２−アミノチオフェノール等のチオフェノール；２−（４−アミノフェニルチオ）酢酸；１−アミノ−２−ナフトール−４−スルホン酸等の芳香族あるいは複素環芳香族スルホン酸およびホスホン酸、および２−アミノ−４−ニトロフェノール等のフェノール。
【００６２】
リガンドは更に式−ＳＰ２−ＡＣＩＤで表される置換基を有してもよい。ＳＰ２は任意の第２のスペーサーを意味し、ＡＣＩＤは酸性基を表す。本明細書においては、「酸性基」は約６．０未満のｐＫａ値を有する基を意味し、例えば、カルボン酸基（ＣＯＯＨ）、スルホン酸基（ＳＯ２ＯＨ）、スルフィン酸基（Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、ホスフィン酸基（ＰＨ（Ｏ）（ＯＨ））、ホスホン酸モノエステル基（Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲ））、およびホスホン酸基（Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）等が挙げられる。酸性基のｐＫａ値は１．０から６．０の範囲内であることが好ましい。酸性基はカルボン酸、スルホン酸およびホスホン酸から選ばれることが好ましい。ＳＰ２基はＣ１−１２−アルキル、Ｃ１−６−アルキレンおよびＣ２−６−アルケニレンから選ばれるか、もしくは、ＳＰ２は単結合である。
【００６３】
関連するビラジカルの例としては、メチレン、エチレン、プロピレン、プロペニレン、イソプロピレンおよびシクロヘキシレンが挙げられる。ＳＰ２はメチレン、エチレンまたは単結合であることが好ましい。本明細書では、「Ｃ１−１２−アルキル」は直鎖、分岐鎖あるいは環状の１〜１２個の炭素原子を有するアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、ドデシル、シクロペンチル、シクロヘキシル、デカリニル等が挙げられる。
【００６４】
Ｃ１−１２−アルキルは、１又はそれ以上の、好ましくは１〜３の、以下から選ばれる基で置換されてもよい。カルボキシ；カルボキシエステル等の保護カルボキシ（例：Ｃ１−６−アルコキシカルボニル）；アミノカルボニル；モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノカルボニル；アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル；モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル；アミノ；モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ；Ｃ１−６−アルキルカルボニルアミノ；ヒドロキシ；アシルオキシ等の保護ヒドロキシ（例：Ｃ１−６−アルカノイルオキシ）；スルホノ；Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ；ニトロ；フェニル；フェニル−Ｃ１−６−アルキル；ハロゲン；ニトリロ；およびメルカプト。
【００６５】
置換Ｃ１−１２アルキル基の例としては、カルボキシ−Ｃ１−１２−アルキル（例：カルボキシメチルおよびカルボキシエチル）、エステル化されたカルボキシ−Ｃ１−６−アルキル等の保護カルボキシ−Ｃ１−１２−アルキル（例：メトキシカルボニルメチル、エトキシカルボニルメチル、およびメトキシカルボニルエチル等のＣ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ１−１２−アルキル）、アミノカルボニル−Ｃ１−１２−アルキル（例：アミノカルボニルエチル、アミノカルボニルエチルおよびアミノカルボニルプロピル）、Ｃ１−６−アルキルアミノカルボニル−Ｃ１−１２−アルキル（例：メチルアミノカルボニルメチルおよびエチルアミノカルボニルメチル）、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル−Ｃ１−１２−アルキル（例：アミノメチルアミノカルボニルメチルおよびアミノエチルアミノカルボニルメチル）、モノ−またはジ（Ｃ１−１２−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキルアミノカルボニル−Ｃ１−１２−アルキル（例：ジメチルアミノメチルアミノカルボニルメチルおよびジメチルアミノエチルアミノカルボニルメチル）、モノ−またはジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−１２−アルキル（例：ジ−メチルアミノメチルおよびジメチルアミノエチル）、ヒドロキシ−Ｃ１−１２−アルキル（例：ヒドロキシメチルおよびヒドロキシエチル）、アシルオキシ−Ｃ１−１２−アルキル等の保護ヒドロキシ−Ｃ１−１２−アルキル（例：アセチルオキシエチル、アセチルオキシプロピル、アセチルオキシブチル、アセチルオキシペンチル、プロピオニルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、およびヘキサノイルオキシメチル等のＣ１−６−アルカノイルオキシ−Ｃ１−１２−アルキル）。
【００６６】
本明細書において、「Ｃ２−１２−アルケニル」は、直鎖、分岐鎖あるいは環状でもよく、二重結合は鎖あるいは環内のどこにあってもよい２〜１２個の炭素原子を有するモノ−、ジ−あるいはポリ不飽和アルキル基を意味し、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、ヘキセニル、デセニル、１，３−ヘプタジエニル、シクロヘキセニル等が挙げられる。置換基のうちのいくつかはシス構造およびトランス構造の両方で存在する。本発明はシス型およびトランス型の両方を含む。
【００６７】
本明細書において、「Ｃ２−１２−アルキニル」は、２〜１２個の炭素原子を有し、１又はそれ以上の三重結合が導入された直鎖、分岐鎖アルキル基を意味し、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、２−ブチニル、１，６−ヘプタジイニル等が挙げられる。リガンド構造は特定の理論にとらわれるべきではないが、１又はそれ以上のヘテロ原子と芳香族あるいは複素環芳香族部分の特別な電子配置は、複素環芳香族システム中あるいは置換基としてその上に配置することができ、酵素の特定の結合に関与するものと予測される。
【実施例】
【００６８】
免疫吸着を介した固定化された抗フルオレセイン抗体への、酵素のフルオレセイン−アフィニティーラベリング及びリサイクル
【００６９】
＜ヒツジ−抗フルオレセイン抗体の準備＞
精製したウシ血清アルブミン（Sigma社製、カタログ番号：Ａ４５０３）を、製品の説明書に記載のガイドラインに従い、フルオレセインイソチオシアネート（Sigma社製、カタログ番号：Ｆ４２７４）でラベリングし、２８０ｎｍと４９５ｎｍで複合体吸光度をそれぞれ測定し判明した約１のフルオレセイン／たんぱく質比を有するフルオレセイン−ＢＳＡ複合体を得る。
【００７０】
その後、「Antibodies Volume IA practical approach, Chapter 2, pp1978, D Catty, IRL Press Ltd, 1988」に記載のガイドラインに従い、このフルオレセイン−ＢＳＡ複合体をヒツジの免疫付与に用いる。数ヶ月間にわたり免疫付与を繰り返した後、ヒツジの血から高い力価の抗フルオレセインヒツジ血清を生成する。
【００７１】
＜高密度ビーズのジビニルスルホン活性化＞
アガロースおよび炭化タングステンを含む高密度ビーズを、基本的にＷＯ２００９０７１５６０Ａ１の記載に従い調製し、４％のアガロースを含み、約２．６ｇ／ｍｌの密度と約１５０ミクロンの平均粒子サイズを有する規則性の高いビーズを得る。
【００７２】
高密度アガロースビーズと水が１：１の懸濁液約１４００ｍｌを、焼結したガラス漏斗の上で脱塩水を使って洗浄し、１分間の吸引脱水を行った。７００ｍｌの濡れた（しかし脱水済みの）アガロースビーズをｐＨ１１．５の０．５Ｍリン酸カリウム緩衝剤４５０ｍｌと混合する。３５ｍｌのジビニルスルホン（Sigma-Aldrich社製、カタログ番号：Ｖ３７００）を加え、得られた懸濁液を室温で２時間パドル撹拌する。その後、マトリクスを焼結したガラス漏斗に移し、まず２０リットルの水で、続いて３０％エタノールと水の混合液５リットルで、最後に５リットルの水で洗浄する。得られた活性マトリクスは吸引脱水されたビーズ１ｍｌあたり約２０μｍｏｌの活性ビニル基を含有する。
【００７３】
＜抗フルオレセイン抗体の固定化＞
５００ｍｌのジビニルスルホン活性化された高密度のアガロースビーズを１５００ｍｌの上記に従って調製したヒツジ−抗フルオレセイン血清と混合する。この懸濁液に１１０ｇのポリエチレングリコールをパドル撹拌器でやさしく撹拌しながら加える。１Ｍの水酸化ナトリウムを徐々に加え、懸濁液のｐＨをｐＨ９．０に調整する．この懸濁液を室温で１８時間撹拌し、この間に、ここでビニルスルホン基との反応を介して、ヒツジ血清中の免疫グロブリン（抗体）を高密度ビーズに選択的に共有結合で固定化する。カップリング後、焼結したガラスフィルターの上で、最初に５Ｌの０．５Ｍ塩化ナトリウム、次に５Ｌの０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ１１．０）、その次に５Ｌの０．５Ｍ塩化ナトリウムと０．１Ｍのリン酸カリウムの混合液（ｐＨ７．０）でビーズを洗浄する。
【００７４】
＜セルラーゼのフルオレセインのラベリング＞
酸性セルラーゼである５０ｍｌのCelluclast１．５Ｌ（Sigma社製、カタログ番号：Ｃ２７３０）を、分子量５０００ダルトンカットオフ中空ファイバーモジュールであるポリスルホン限外ろ過膜（ＧＥヘルスケア社製）を用いて１００ｍｌの水で透析ろ過を５回行った。この作業で、フルオレセインイソチオシアネートとの後続反応を妨げるおそれのある全ての低分子量物質を取り除く。
【００７５】
透析濾過の後、酵素の調製液において最終たんぱく質濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調整し（タンパク質濃度の測定にBioRad Laboratories社（カリフォルニア州リッチモンド）製のクマシーブルー試薬を用い、ウシ血清アルブミンを標準たんぱく質として用いる）、ｐＨをｐＨ８．５に調整する。この直後、酵素溶液１ｍｌあたり１００マイクロリットルに相当する量のフルオレセインイソチオシアネートの溶液（ジメチルスルホキシド中２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、得られた溶液を室温で４時間反応させる。反応に続き、ｐＨを１Ｍリン酸の残りでｐＨ７．０に調整し、未反応のフルオレセインイソチオシアネートを上記の透析濾過で酵素溶液から取り除くが、水の代わりに２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）を透析ろ過の緩衝剤として用いる。
【００７６】
＜基質の調製と酵素消化処理＞
乾燥したトウモロコシの茎葉を挽いて微粉末にし、１．４ｗｔ％の硫酸を使用し１６５℃と１０７ｐｓｉで８分間前処理を行う。割合はトウモロコシ茎葉１部に対して硫酸３部である。その後、焼結したグラスフィルターの上で不溶性物質を２０部の脱塩水で洗い、吸引して余分な水分を除く。乾物含量は約２５％である。
【００７７】
前処理したトウモロコシ茎葉が５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中１０％重量／体積（w/v）となるよう懸濁液を調製し、SOFTANOL90（商品名、INEOS Oxide社製（ベルギー、ズワイドレヒト））を加えて最終濃度を１％体積／体積（v/v）とする。
【００７８】
フルオレセインでラベリングされたCelluclast（商品名）１．５Ｌを加えて酵素濃度を前処理したトウモロコシ茎葉１０ｍｇ／ｇとし、２４時間やさしく撹拌しながら懸濁消化反応混合物をセ氏５０度まで加熱する。続いて、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド分析（Lever M., 1973, Colorimetric and fluorometric carbohydrate determination with p-hydroxybenzoic acid hydrazide, Biochemical Medicine 7: 274-281）を用い、還元糖を形成する。
【００７９】
酵素処理に続き、不均一反応混合物を１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整し、以下に説明する膨張床吸着（expanded bed adsorption）を用いて懸濁液から酵素を捉えてリサイクルする。
【００８０】
＜膨張床吸着および新しい基質バッチへの溶出を用いた酵素リサイクル＞
リサイクル処理は膨張床吸着カラム（FastLine（登録商標）２０、内径（i.d.）＝２ｃｍ、UpFront Chromatography A/S社製（デンマーク、コペンハーゲン））で行う。
【００８１】
Fastline２０カラムに対する一般的な指示に従い、最初に、上記調製した抗フルオレセイン吸着剤（１５７ｍｌ）５０ｃｍをカラムに詰め、使用前に蠕動ポンプによる上向線流速１０ｃｍ／分で２５℃の５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）で洗浄して平衡化する。
【００８２】
その次に、酵素処理したｐＨ７．０のトウモロコシ茎葉を前記膨張床カラムを通して１０ｃｍ／分の線流速で送り出し、それにより、固定化抗フルオレセインヒツジ抗体を介して、フルオレセインでラベリングされたセルラーゼ酵素を選択的に吸着剤に結合する。処理を施している膨張床カラムから定期的に回収した、遠心分離したサンプル（１００００ｒｐｍ、５分間）について、フルオレセインの吸収極大である４９５ｎｍでの吸光度を測定する。これにより、カラムを通過する非結合のフルオレセインでラベリングされたたんぱく質の量を推定する。カラムに酵素処理したトウモロコシ茎葉を装填する。これは、処理サンプルの４９５ｎｍにおける吸光度が、膨張床カラム装填前の、遠心分離と酵素処理を施したトウモロコシ茎葉懸濁液の吸光度の約２０％になるまで続ける。
【００８３】
続いて、基本的に全ての結合したフルオレセインでラベリングされたたんぱく質が放出されるまで膨張床カラムを０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ３．０）で洗浄することで、結合したフルオレセインでラベリングされたセルラーゼを放出し、前処理と脱水を施したトウモロコシ茎葉の新しいバッチへとリサイクルする。これに続き、最終乾物調整と最終ｐＨ調整を行い、トウモロコシ茎葉の乾物を１０％、ｐＨを５．０にして、新しい消化プロセスを始める。前の消化・リサイクルプロセス全体における酵素活性のロスは、追加の新たな結合したフルオレセインでラベリングされた酵素を添加し、バランスを取る。
【００８４】
図１は実施例１に記載されたリサイクル原理を示している。
【図１】
2013530704.tif 000003
【図２】
2013530704.tif 000004
【図３】
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【図４】
2013530704.tif 000006
【国際調査報告】
2013530704.tif 000007
2013530704.tif 000008
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