(57)【要約】  多量体化、例えば三量体化ドメインを有するポリペプチドと、ＩＬ−２３Ｒを結合するポリペプチド配列とを含む、ＩＬ−２３Ｒに結合するポリペプチド。多量体化ドメインはヒトテトラネクチンに由来してもよい。ＩＬ−２３Ｒ結合ポリペプチドはネイティブなＩＬ−２３によるＩＬ−２３Ｒの活性化を阻害し、様々な免疫関連障害及び癌の治療剤として使用することができる。ポリペプチドの選択方法及び多量体複合体の調製方法が記載される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
三量体化ドメインと、ＩＬ−２３ヘテロ二量体受容体を活性化することなくヒトＩＬ−２３Ｒに結合する少なくとも１つのポリペプチド配列と、を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドがヒトＩＬ−１２Ｒβ１又はヒトＩＬ−１２Ｒβ２の少なくとも一方に結合しない、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドがヒトＩＬ−２３Ｒとの結合についてネイティブなヒトＩＬ−２３と競合する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記三量体化ドメインが、２６位、３０位、３３位、３６位、３７位、４０位、３１位、４２位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、及び５１位に最大５個のアミノ酸置換を有するヒトテトラネクチン三量体化ドメイン（配列番号１０８）のポリペプチドを含み、３個の三量体化ドメインが三量体複合体を形成する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記三量体化ドメインがｈＴＲＡＦ３［配列番号  ］、ｈＭＢＰ［配列番号  ］、ｈＳＰＣ３００［配列番号  ］、ｈＮＥＭＯ［配列番号  ］、ｈキュビリン［配列番号  ］、ｈトロンボスポンジン［配列番号  ］、及びヒトＳＰ−Ｄのネック領域［配列番号  ］、ウシＳＰ−Ｄのネック領域［配列番号  ］、ラットＳＰ−Ｄのネック領域［配列番号  ］、ウシコングルチニンのネック領域：［配列番号  ］；ウシコレクチンのネック領域：［配列番号  ］；及びヒトＳＰ−Ｄのネック領域：［配列番号  ］からなる群から選択される三量体化ポリペプチドを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ヒトＩＬ−２３Ｒが配列番号５を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ＩＬ−２３Ｒを結合する少なくとも１つのポリペプチドが前記三量体化ドメインのＮ末端及びＣ末端の一方に連結され、且つＮ末端及びＣ末端の他方に位置する炎症調節剤をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ＩＬ−２３Ｒに結合する少なくとも１つのポリペプチドがＣ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）を含み、前記ＣＴＬＤのループセグメントＡのループ１、２、３若しくは４の１つ又はループセグメントＢがＩＬ−２３を結合するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ＣＴＬＤの前記ポリペプチド配列が配列番号１３３、１３４、１３５、１６７、１３７、１３８、１３９、１４０、及び１４１からなる群から選択される、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ＩＬ−２３を結合するポリペプチドが前記三量体化ドメインのＮ末端及びＣ末端の一方に連結され、且つＮ末端及びＣ末端の他方に位置する炎症調節剤をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
Ｎ末端及びＣ末端の各々に連結した、ＩＬ−２３を結合するポリペプチドを有し、Ｎ末端の前記ポリペプチドがＣ末端の前記ポリペプチドと同じであるか又は異なる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが融合タンパク質である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ＩＬ−２３Ｒを結合するポリペプチドが前記三量体化ドメインのＮ末端及びＣ末端の一方に位置し、且つＮ末端及びＣ末端の他方に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を結合するポリペプチド配列をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドに共有結合した治療剤をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドを３個含む、三量体複合体。
【請求項１６】
前記三量体化ドメインがテトラネクチン三量体化構造要素である、請求項１５に記載の三量体複合体。
【請求項１７】
ＩＬ−２３Ｒを発現する細胞においてＩＬ−２３によるＩＬ−２３Ｒの活性化を阻止する方法であって、前記細胞を請求項１５に記載の三量体複合体と接触させる工程を含む方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の三量体複合体と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の医薬組成物を動物に投与する工程を含む、対象における免疫障害の治療方法。
【請求項２０】
炎症調節剤を同時に又は逐次的に前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
動物における癌の治療方法であって、それを必要とする対象に請求項１８に記載の医薬組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項２２】
化学療法剤又は細胞傷害剤の少なくとも一方を同時に又は逐次的に前記動物に投与する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチドの調製方法であって、
ａ）ＩＬ−２３Ｒを結合する第１のポリペプチドを選択する工程と、
ｂ）前記第１のポリペプチドを多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端の一方と融合する工程と、
を含む方法。
【請求項２４】
ａ）炎症調節剤である第２のポリペプチド配列を選択する工程と、
ｂ）前記第２のポリペプチドを前記多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端の他方と融合する工程と、
をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ａ）の前記ポリペプチドがＩＬ−１２Ｒβ１又はＩＬ−１２Ｒβ２の少なくとも一方に結合しないように選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ＩＬ−２３Ｒを発現する細胞におけるＩＬ−２３Ｒの活性化を阻止するポリペプチド複合体の調製方法であって、請求項２３に従い調製された３つのポリペプチドを三量体化する工程を含む方法。
【請求項２７】
免疫関連障害を仲介するポリペプチドの調製方法であって、
ａ）少なくとも１つのランダム化ループ領域を含むＣＴＬＤを含むポリペプチドのライブラリーを作成する工程と、
ｂ）ＩＬ−２３Ｒを結合するがＩＬ−１２Ｒβ１又はＩＬ−１２Ｒβ２の少なくとも一方に結合しない第１のポリペプチドを前記ライブラリーから選択する工程と、
を含む方法。
【請求項２８】
（ｃ）前記選択されたポリペプチドを多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端に結合させる工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ネイティブなＩＬ−２３Ｒとの結合についてネイティブなヒトＩＬ−２３と競合するポリペプチドであって、ヒトＩＬ−２３Ｒを活性化せず、且つＩＬ−１２Ｒβ１又はＩＬ−１２Ｒβ２の少なくとも一方に結合しない、ポリペプチド。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが、ループセグメントＡのループ１、２、３又は４の１つにおいて又はループセグメントＢにおいてＩＬ−２３Ｒに結合するように修飾されたＣＴＬＤである、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号１３３、１３４、１３５、１６７、１３７、１３８、１３９、１４０、及び１４１からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
請求項１に記載のポリペプチドを含むポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項３２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項３４】
請求項３４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年１０月９日に出願された米国特許出願第１２／５７７，０６７号の一部継続出願、２００９年１０月９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６０２７１号の一部継続出願、及び２０１０年２月１０日に出願された米国特許出願第１２／７０３，７５２号の一部継続出願であり、これらの各々は全体として参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表に関する記載
本願では配列表が電子形式に限り提出され、参照により本明細書に援用される。配列表テキストファイル「10-_____.SequenceListing.txt」は__________に作成したもので、そのサイズは_____バイトである。
【０００３】
本発明は、概して炎症性及び自己免疫性疾患並びに癌の治療に関する。特に、本発明は、ＩＬ−２３Ｒヘテロ二量体受容体のＩＬ−２３Ｒサブユニットに結合し、且つＩＬ−２３とその受容体との相互作用を阻害するポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００４】
ＩＬ−２３は、Ｔｈ１７細胞の発生及び生存に必須のサイトカインである。前臨床モデル及び臨床経験から、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び多発性硬化症を含む多くの自己免疫疾患の病理においてＴｈ１７細胞が重要な役割を果たすという証拠が積み上がっている。ＩＬ−２３Ｒは、Ｔｈ１７細胞上の重要な標的である。ＩＬ−２３ヘテロ二量体受容体は２つのサブユニット：ＩＬ−２３ＲとＩＬ−１２Ｒβ１とから構成され、ＩＬ−２３ＲはＩＬ−２３経路に固有のサブユニットである。ＩＬ−１２Ｒβ１は、ＩＬ−１２受容体、ひいてはＩＬ−１２経路と共用される。同様に、ＩＬ−２３サイトカインは２つのサブユニット：ｐ１９とｐ４０とから構成され、ｐ１９サブユニットはＩＬ−２３に固有であり、ｐ４０はＩＬ−１２と共用される。ＩＬ−２３のヘテロ二量体ＩＬ−２３受容体との結合は、特定のＴ細胞サブセット、ＮＫ細胞、及び骨髄性細胞の活性化を仲介する。
【０００５】
重要なことに、ＩＬ−２３Ｒの遺伝的変異は乾癬及びクローン病に対する感受性と関連付けられており、また強直性脊椎炎、フォークト・小柳・原田病、全身性硬化症、ベーチェット病（ＢＤ）、原発性シェーグレン症候群、グッドパスチャー病に対する感受性にも関与するとされている。また、移植片対宿主病及び慢性潰瘍におけるＩＬ−２３の重要性が示唆されており、ＩＬ−２３は腫瘍発生に関与するとされている。
【０００６】
ＩＬ−２３経路の阻害は自己免疫疾患の前臨床モデルの多くで有効である。しかしながら、ＩＬ−２３経路とＩＬ−１２経路との間でリガンド及び受容体サブユニットが共用されるという性質から、これまでの理解と比べて生物学的複雑性が増しており、ＩＬ−２３阻害をＩＬ−１２阻害と分けることが、効力及び安全性の双方に関して治療上重要な意味を持つものと思われる。いずれか一方の又は双方の阻害は、サイトカインサブユニット又は受容体サブユニットのレベルで行われ得る。
【０００７】
ＩＬ−２３／ＩＬ−１２サイトカインを標的とする抗体は承認済みであるか（例えば、ｐ４０を標的とするウステキヌマブ）、或いは、臨床開発の初期にあるSchering PloughのＩＬ−２３特異的抗ｐ１９抗体の他、臨床開発中（Abbott Laboratories）であるが、より優れた効力及びより良好な安全性プロファイルを有するＩＬ−２３特異的な阻害が、以下の理由から必要とされている：
・ＩＬ−２３ヘテロ二量体受容体の分布は比較的限られており、ＩＬ−２３ヘテロ二量体受容体発現細胞は主に炎症組織／罹患組織に見られる。対照的にＩＬ−２３は全身に認められ、より豊富にある。
・ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットにわたって受容体を標的化することは、関節リウマチ患者の滑膜などの自己免疫性組織において実証されるとおり、サイトカインが細胞結合性である及び／又は豊富にない状況で有利であることが示されている。
・ＩＬ−２３シグナル伝達により感受性であり得る受容体変異体（すなわちシグナル伝達において極めて少しのリガンドしか必要としない低い閾値の変異体）を有する患者では、受容体の標的化がより効率的な阻害となり得る。
【０００８】
また、当初はＩＬ−１２を阻害するために開発された一方、ウステキヌマブの効力がＩＬ−２３阻害を通じて仲介されること、及びＩＬ−１２経路を阻害すると弊害がもたらされ得ることについて以下の観察に基づく前臨床及び臨床の証拠がある：
・ウステキヌマブによる乾癬治験では、ＩＬ−２３特異的サイトカインサブユニットであるｐ１９がプラークにおいてダウンレギュレーションされた（しかし、ＩＬ−１２特異的サイトカインサブユニットであるｐ３５はダウンレギュレーションされなかった）。
・ｐ１９及びｐ４０ノックアウトマウスは実験的自己免疫疾患の誘導に抵抗性を示すが、ＩＬ−１２特異的サブユニットｐ３５のノックアウトでは多くの実験的自己免疫疾患が悪化した。
・ＩＬ−１２及びＩＬ−２３の双方のサイトカインを阻害するとトキソプラズマ・ゴンジイ（Toxoplasma gondii）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、及びＭ．ツベルクローシス（M. tuberculosis）、並びに同様の他の病原体に対する感受性が増加することが示されているため、双方の阻害と比べてＩＬ−２３を選択的に阻害することは、効力が優れている可能性に加え、感染症に対する感受性に関連する安全性の点で有利であると考えられている。
・安全性上の利点はまた、腫瘍原性となる可能性にも関連し得る。前臨床データからは、ＩＬ−１２を阻害すると腫瘍成長が亢進される一方、ＩＬ−２３を阻害すると腫瘍成長が低減され得ることが示唆される。ＩＬ−１２ｐ４０とは対照的に、ＩＬ−２３はヒト腫瘍で過剰発現する。さらに、マウスによる確認試験からは、ＩＬ−２３ノックアウトマウス又は抗ＩＬ−２３処置マウスが腫瘍形成に抵抗性を示す一方、ＩＬ−２３レベルが上昇すると腫瘍形成が増加し得ることが実証される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、当該技術分野では、ＩＬ−２３Ｒを阻害することによってＩＬ−２３ヘテロ二量体受容体を選択的に阻害する分子、それらの分子を含む組成物、そのような分子のスクリーニング方法、並びに多種多様な炎症性及び自己免疫性病態並びに癌の治療的処置におけるそのような分子の使用方法が必要とされている。そのような分子は、アビディティ作用による良好な標的保持性を示すものでなければならず、且つ障害に関連する炎症部位に治療を限局化し、全身性免疫を著しく損なうことのないものでなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様において、本発明は、三量体化ドメインと、ＩＬ−２３ヘテロ二量体受容体を活性化させることなくヒトＩＬ−２３Ｒに結合する少なくとも１つのポリペプチド配列と、を有するポリペプチドに関する。他の態様において、本発明のポリペプチドはヒトＩＬ−１２Ｒβ１又はヒトＩＬ−１２Ｒβ２の少なくとも一方に結合せず、このポリペプチドは、ヒトＩＬ−２３Ｒとの結合についてネイティブな（native）ヒトＩＬ−２３と競合する。三量体化ドメインは、２６位、３０位、３３位、３６位、３７位、４０位、４１位、４２位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、及び５１位に最大５個のアミノ酸の置換を有するヒトテトラネクチン三量体化ドメインのポリペプチド（配列番号１０８）を含み得る。このようなポリペプチドは、三量体複合体を形成することができる。ポリペプチドは三量体化して三量体複合体を形成し得る。
【００１１】
さらに、本発明のポリペプチドは、ＩＬ−２３Ｒに結合し、且つ三量体化ドメインのＮ末端及びＣ末端の一方に連結される少なくとも１つのポリペプチドを含み、また、Ｎ末端及びＣ末端の他方に位置する炎症調節剤も含む。本発明のポリペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端の各々に連結された、ＩＬ−２３を結合するポリペプチドを有してもよく、ここで、Ｎ末端のポリペプチドはＣ末端のポリペプチドと同じであるか又は異なる。ポリペプチドは、該ポリペプチドに共有結合した治療剤を有してもよい。
【００１２】
さらになお、本発明のポリペプチドはＣ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）を含み、ここで、ＣＴＬＤのループセグメントＡのループ１、２、３又は４の１つ又はループセグメントＢはＩＬ−２３を結合するポリペプチド配列を含む。様々な態様において、ＣＴＬＤのポリペプチド配列は、配列番号１３３、１３４、１３５、１６７、１３７、１３８、１３９、１４０、及び１４１からなる群から選択される。
【００１３】
本発明はまた、ＩＬ−２３Ｒを発現する細胞においてＩＬ−２３によりＩＬ−２３Ｒが活性化されることを阻止する方法にも関する。この方法は、細胞を本発明の三量体複合体と接触させる工程を含む。別の態様において、本発明は、三量体複合体と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む医薬組成物を含む。この組成物は免疫障害又は癌の治療のために投与され得る。この組成物はまた、炎症調節剤、化学療法剤、又は細胞傷害剤も含み得る。
【００１４】
さらになお、本発明は、本発明のポリペプチドの調製方法に関する。この方法は、ＩＬ−２３Ｒに結合する第１のポリペプチドを選択する工程と、第１のポリペプチドを多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端の一方と融合する工程とを含む。この方法はまた、炎症調節剤である第２のポリペプチド配列を選択する工程と；第２のポリペプチドを多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端の他方と融合する工程とを含み得る。第１のポリペプチドは、それがＩＬ−１２Ｒβ１又はＩＬ−１２Ｒβ２の少なくとも一方に結合しないように選択され得る。これらのポリペプチドを使用して、ＩＬ−２３Ｒを発現する細胞におけるＩＬ−２３Ｒの活性化を阻止する三量体複合体を調製することができる。
【００１５】
さらになお、本発明は、ネイティブなＩＬ−２３Ｒとの結合についてネイティブなヒトＩＬ−２３と競合するポリペプチドに関し、該ポリペプチドはヒトＩＬ−２３Ｒを活性化せず、且つＩＬ−１２Ｒβ１又はＩＬ−１２Ｒβ２の少なくとも一方に結合しない。該ポリペプチドは、ＩＬ−２３Ｒとの結合のためにループセグメントＡのループ１、２、３又は４の１つにおいて又はループセグメントＢにおいて修飾されているＣＴＬＤであってもよく、配列番号１３３、１３４、１３５、１６７、１３７、１３８、１３９、１４０、及び１４１の１つから選択されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】ヒトＩＬ−２３（配列番号１）、ヒトＩＬ−２３Ｒ（配列番号５）、ヒトＩＬ−１２Ａ（配列番号３）、及びヒトＩＬ−１２Ｂ（配列番号２）のポリペプチド配列を示す。
【図１Ｂ】ヒトＩＬ−１２Ｒβ１（配列番号６）、ヒトＩＬ−１２Ｒβ２（配列番号７）のポリペプチド配列を示す。
【図２Ａ】本発明の例示的ポリペプチドで使用されるテトラネクチン三量体化モジュール変異体の例を示す。
【図２Ｂ】本発明の例示的ポリペプチドで使用されるテトラネクチン三量体化モジュール変異体の例を示す。
【図２Ｃ】本発明の例示的ポリペプチドで使用されるテトラネクチン三量体化モジュール変異体の例を示す。
【図２Ｄ】本発明の例示的ポリペプチドで使用されるテトラネクチン三量体化モジュール変異体の例を示す。
【図３】テトラネクチンタンパク質ファミリーの三量体化構造要素のアミノ酸配列のアラインメントを示す。ヒトテトラネクチン（配列番号９９）；マウステトラネクチン（配列番号１００）（Sorensen et al., Gene, 152: 243-245, 1995）；リーフシャーク軟骨から単離したテトラネクチン相同タンパク質（配列番号１０７）（Neame and Boynton, 1992, 1996）；及びウシ軟骨から単離したテトラネクチン相同タンパク質（配列番号１０６）（Neame and Boynton、データベース受託番号ＰＡＴＣＨＸ：ｕ２２２９８）のエクソン２とエクソン３の最初の３残基とを含む残基Ｖ１７〜Ｋ５２に対応するアミノ酸配列（一文字記号）に下線を引いている。７個のアミノ酸繰り返し配列のａ位及びｄ位における残基を太字で掲載する。テトラネクチンタンパク質ファミリー三量体化構造要素の列記したコンセンサス配列（配列番号１０８）は、領域の他の保存残基に加えて、図に示される７個のアミノ酸繰り返し配列のａ位及びｄ位に存在する残基を含む。「＊」は脂肪族疎水性残基を表す。
【図４】既知の３Ｄ構造の１０個のＣＴＬＤのアミノ酸配列のアラインメントを示す。主な二次構造要素の配列位置を各配列の上に示し、αヘリックス番号Ｎを表す「αＮ」、及びβストランド番号Ｍを表す「βＭ」として連番で符号が付される。ＣＴＬＤの２つの保存されたジスルフィド架橋の形成に関与する４個のシステイン残基が、図中ではそれぞれ「ＣＩ」、「ＣＩＩ」、「ＣＩＩＩ」、及び「ＣＩＶ」として示され、列挙される。２つの保存されたジスルフィド架橋は、それぞれＣＩ〜ＣＩＶ及びＣＩＩ〜ＣＩＩＩである。ヒトテトラネクチン配列における様々なループ１〜４及びＬＳＢ（ループ５）を下線で示す。１０個のＣ型レクチンは、ｈＴＮ：ヒトテトラネクチン（配列番号１０９）、ＭＢＰ：マンノース結合タンパク質（配列番号１１０）；ＳＰ−Ｄ：サーファクタントタンパク質Ｄ（配列番号１１１）；ＬＹ４９Ａ：ＮＫ受容体ＬＹ４９Ａ（配列番号１１２）；Ｈ１−ＡＳＲ：アシアロ糖タンパク質受容体のＨ１サブユニット（配列番号１１３）；ＭＭＲ−４：マクロファージマンノース受容体ドメイン４（配列番号１１４）；ＩＸ−Ａ（配列番号１１５）及びＩＸ−Ｂ（配列番号１１６）：それぞれ凝固因子ＩＸ／Ｘ結合タンパク質ドメインＡ及びＢ；Ｌｉｔ：リソスタチン（lithostatine）（配列番号１１７）；ＴＵ１４：被嚢類Ｃ型レクチン（配列番号１１８）である。ＴＵ１４を除くこれらのＣＴＬＤは全て、ヒトタンパク質由来である。
【図５】ヒト（Swissprot  Ｐ０５４５２）（配列番号１１９）、マウス（Swissprot  Ｐ４３０２５）（配列番号１２０）、ニワトリ（Swissprot  Ｑ９ＤＤＤ４）（配列番号１２１）、ウシ（Swissprot  Ｑ２ＫＩＳ７）（配列番号１２２）、タイセイヨウサケ（Swissprot  Ｂ５ＸＣＶ４）（配列番号１２３）、カエル（Swissprot  Ｑ５Ｉ０Ｒ９）（配列番号１２４）、ゼブラフィッシュ（GenBank  ＸＰ＿７０１３０３）（配列番号１２５）から単離したテトラネクチン、並びにウシ（Swissprot  ｕ２２２９８）（配列番号１２６）及びリーフシャーク（Swissprot  ｐ２６２５８）（配列番号１２７）の軟骨から単離した関連するＣＴＬＤホモログのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図６】ＣＴＬＤにおいてランダム化ループを作成するためのＰＣＲ戦略を示す。
【図７】Ｃａ２＋結合部位を示すクローニング用制限部位を含むように修飾したヒトテトラネクチンＣＴＬＤのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。制限部位には実線で下線を引いている。ループには破線で下線を引いている。カルシウム配位残基は太字・斜体とし、部位１：Ｄ１１６、Ｅ１２０、Ｇ１４７、Ｅ１５０、Ｎ１５１；部位２：Ｑ１４３、Ｄ１４５、Ｅ１５０、Ｄ１６５を含む。ＣＴＬＤドメインは太字のアミノ酸Ａ４５を始端とする（すなわち、ＡＬＱＴＶＣＬ．．．）。ネイティブテトラネクチン（ＴＮＣＴＬＤ）塩基配列に対する変更は小文字で示す。制限部位はサイレント突然変異を用いて作成し、これによりネイティブアミノ酸配列が変化することはなかった。
【図８】ＩＬ−２３Ｒに結合する本発明の複数のポリペプチド配列を示す。配列は、本発明の方法に従い、１以上のループ領域で修飾されているヒトテトラネクチンＣＴＬＤの足場構造を有するポリペプチドのライブラリーからポリペプチドを選択することにより産生した。これらの配列のＣＴＬＤ足場はヒトテトラネクチン（配列番号１１９）のＡ４５を始端とする。ランダム化されているループ領域を示す配列部分に下線を引いている。
【図９】その三量体化ドメインを始端とする成熟形態のヒトテトラネクチン（配列番号１４３［ヌクレオチド配列］及び配列番号１４２［アミノ酸配列］）並びにマウステトラネクチン（配列番号１４４［ヌクレオチド配列］及び配列番号１４５［アミノ酸配列］）のコード領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のアラインメントを示し、既知の二次構造要素も表示する。
【図１０】競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。本発明のポリペプチドの存在下又は非存在下におけるヒトＩＬ−２３のヒトＩＬ−２３Ｒとの結合を評価した。
【図１１】本発明のアトリマー（ATRIMER）（商標）複合体４Ｇ８、ネイティブなヒトＩＬ−２３、及びウステキヌマブの存在下におけるＩＬ−２３誘導ＩＬ−１７産生を比較する実験の結果を示す。
【図１２】本発明のアトリマー（ATRIMER）（商標）複合体１Ａ４及びウステキヌマブの存在下におけるＩＬ−２３誘導ＩＬ−１７産生を比較する実験の結果を示す。
【図１３】本発明のアトリマー（ATRIMER）（商標）複合体４Ｇ８、ネイティブなヒトＩＬ−２３、及びウステキヌマブの存在下におけるＩＬ−１２誘導ＩＦＮγ産生を比較する実験の結果を示す。
【図１４】ＩＬ−２３及び本発明のポリペプチドに応答したＮＫＬ細胞におけるＳｔａｔ−３リン酸化を比較する実験の結果を示す。
【図１５Ａ】本発明のいくつかのアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体に関連する実験結果を示す表である。
【図１５Ｂ】本発明のいくつかのアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体に関連する実験結果を示す表である。
【図１６】ヒトテトラネクチンについての三次元構造（リボン形式）を示し、タンパク質の二次構造の特徴を示す。Ｃａ２＋結合形態の構造が解かれた。
【図１７Ａ】ヒトマンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ラットマンノース結合タンパク質Ｃ（ＭＢＰ−Ｃ）、ヒトサーファクタントタンパク質Ｄ、ラットマンノース結合タンパク質Ａ（ＭＢＰ−Ａ）、及びラットサーファクタントタンパク質Ａを含む、ヒトテトラネクチン（ＨＴＮ）及びいくつかのテトラネクチン相同体についてのＣＴＬＤの三次元オーバーレイ（overlay）構造を示す。ＣＴＬＤオーバーレイ構造は、Swiss PDB Viewer DeepView、バージョン４．０．１、MacIntosh用を用いて、ヒトテトラネクチンの三次元構造を鋳型として使用して生成した。
【図１７Ｂ】図１７Ａに示すヒトテトラネクチン及びテトラネクチン相同体についてのＣＴＬＤＳの対応するアミノ酸配列を示す。図１７Ｂでは、１ＨＵＰ＝ヒトマンノース結合タンパク質、１ＢＶ４Ａ＝ラットマンノース結合タンパク質、２ＧＧＵＡ＝ヒトサーファクタントタンパク質Ｄ、１ＫＸＯＡ＝ラットマンノース結合タンパク質Ａ、１Ｒ１３＝ラットサーファクタントタンパク質Ａ。
【図１８Ａ】ヒト膵炎関連タンパク質、ヒト樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３結合ノンインテグリン２（ＤＣ−ＳＩＧＮＲ）、ラットアグレカン、マウススカベンジャー受容体、及びヒトスカベンジャー受容体を含む、ヒトテトラネクチン（ＨＴＮ）及びいくつかのテトラネクチン相同体についてのＣＴＬＤの三次元オーバーレイ構造を示す。ＣＴＬＤオーバーレイ構造は、Swiss PDB Viewer DeepView、バージョン４．０．１、MacIntosh用を用いて、ヒトテトラネクチンの三次元構造を鋳型として使用して生成した。
【図１８Ｂ】図１８Ａに示すヒトテトラネクチン及びテトラネクチン相同体についてのＣＴＬＤＳの対応するアミノ酸配列を示す。図１８Ｂでは、１ＴＤＱＢ＝ラットアグレカン、１ＵＶ０Ａ＝ヒト膵炎関連タンパク質、２ＯＸ８Ａ＝ヒトスカベンジャー受容体、２ＯＸ９Ａ＝マウススカベンジャー受容体、及び１ＳＬ６Ａ＝ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲ）
【発明を実施するための形態】
【００１７】
様々な態様において、本発明は、ＩＬ−２３Ｒを結合し、且つ多量体化ドメインのポリペプチド配列とＩＬ−２３Ｒに結合する１つ又は複数のポリペプチド配列とを含むポリペプチドに関する。一態様において、本発明のポリペプチドはＩＬ−２３Ｒ拮抗薬として機能する。２つ、３つ、又はそれ以上のポリペプチドが多量体化して、ＩＬ−２３Ｒを結合するポリペプチドを含む多量体複合体を形成することができる。代替的実施形態において、ポリペプチドはＩＬ−２３Ｒを結合するが、ＩＬ−１２Ｒβ１又はＩＬ−１２Ｒβ２を結合しない。加えて、本発明は、必要性のある患者にポリペプチド又はポリペプチドの多量体複合体を投与することによる対象における免疫介在性障害、癌、及び他の疾患の治療方法を提供する。
【００１８】
定義
本発明をさらに詳細に定義する前に、数々の用語を定義する。用語についての特定の定義が本明細書に提供されない限り、本開示の全体を通じて使用される用語及び語句は、当該技術分野で一般的に理解されるとおりの意味を有するものと解釈されなければならない。また、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数形の指示対象を含む。
【００１９】
「ＩＬ−２３」は自然免疫及び適応免疫において機能するサイトカインであり、ＩＬ−６スーパーファミリーに属するヘテロ二量体タンパク質複合体を指す。ヘテロ二量体複合体は、活性化樹状細胞及び食細胞並びにケラチノサイトにより分泌される。ＩＬ−２３は、皮膚ランゲルハンス細胞によっても発現される。ＩＬ−Ｂ３０、ｐ１９サブユニット、又は単に「ｐ１９」としても知られるＩＬ−２３Ａは、ｐ４０サブユニットのＩＬ−１２Ｂと会合してＩＬ−２３（ｐｌ９／ｐ４０）を形成する。ＩＬ−２３Ａ（ｐ１９）（配列番号１）及びＩＬ−１２Ｂ（配列番号２）のアミノ酸配列は図１に示す。
【００２０】
ＩＬ−２３は、危険又は傷害に対する自己シグナルと共に幅広い病原体及び病原体産物によりアップレギュレーションされる。ＩＬ−２３は、乾癬皮膚組織、多発性硬化症患者の樹状細胞においてアップレギュレーションされ、さらにＩＬ−２３は腫瘍の発生及び成長の促進に活性を有することが示されている。加えて、ＩＬ−２３は好中球及びマクロファージ浸潤を刺激するのみならず、腫瘍内微小環境における血管新生及び炎症性メディエーターも促進する。ＩＬ−２３は、双方とも細胞障害性免疫応答に必須のサイトカインであるＩＬ−１２及びインターフェロンγのダウンレギュレーションをもたらし得るとともに、抗腫瘍エフェクターリンパ球の流入及び活性を調節する。ＩＬ−２３は、細胞傷害性エフェクター適応応答の目的を抗腫瘍免疫から逸らせ、腫瘍を助長する炎症促進性及び血管新生促進性エフェクター経路に向かわせることが示唆されている。結果的に、ＩＬ−２３は、認識される腫瘍細胞が腫瘍関連炎症を伴いながら留まり続けることを可能にする。この概念は、多量の腫瘍特異的Ｔ細胞の存在下における腫瘍成長を説明し得る。
【００２１】
用語「ＩＬ−２３ヘテロ二量体受容体」は、ＩＬ−２３ＲとＩＬ−１２Ｒβ１とのヘテロ二量体ポリペプチド複合体を指す。この受容体はＩＬ−２３を結合する。ＩＬ−２３Ｒ及びＩＬ−１２Ｒβ１のポリペプチド配列は図１に示す。
【００２２】
用語「ＩＬ−２３Ｒ」は、ＩＬ−１２Ｒβ１と複合体化してＩＬ−２３ヘテロ二量体受容体を形成することができるポリペプチドを指す。ＩＬ−２３ＲはＩＬ−２３Ｒサブユニットとも称される。
【００２３】
用語「ＩＬ−１２Ｒβ１」は、ＩＬ−２３Ｒと複合体化してＩＬ−２３ヘテロ三量体受容体を形成し、及び別個に且つ独立してＩＬ−１２Ｒβ２と複合体化してヘテロ二量体ＩＬ−１２受容体を形成するポリペプチドを指す。ＩＬ−１２Ｒβ１及びＩＬ−１２Ｒβ２のポリペプチド配列は図１に示す。
【００２４】
「阻害薬」及び「拮抗薬」又は「賦活薬」及び「作動薬」は、それぞれ阻害分子又は活性化分子を指す。「阻害薬」は、、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、又は細胞に関連する生物学的機能又は活性を減少させ、阻害し、阻止し、活性化遅延させ、不活性化し、低感受性化させ、又はダウンレギュレーションする化合物である。賦活薬は、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、又は細胞の生物学的機能又は活性を増加させ、活性化し、促進し、活性化亢進させ、高感受性化し、又はアップレギュレーションする化合物である。「作動薬」は、標的と相互作用して標的の活性化の増加を引き起こし、又は促進する化合物である。「拮抗薬」は作動薬の作用に対抗する化合物である。拮抗薬は作動薬の活性を阻止し、低減し、阻害し、又は中和する。拮抗薬はまた、特定される作動薬がない場合であっても、標的、例えば標的受容体の構成的活性を阻止し、阻害し、又は低減し得る。
【００２５】
遺伝子、受容体、リガンド、又は細胞の「調節剤」は、遺伝子、受容体、リガンド、又は細胞の活性を変化させる分子であり、ここではその制御特性において活性が活性化され、阻害され、又は変化し得る。調節剤は単独で作用することもでき、又は補因子、例えば、タンパク質、金属イオン、又は小分子を使用することもできる。
【００２６】
用語「ＩＬ−２３Ｒ拮抗薬」は、単独で、或いはＩＬ−１２Ｒβ１との複合体としてＩＬ−２３Ｒに結合し、様々な機構を通じて受容体シグナル伝達を阻害し又は減弱させる任意の分子を指し、そのような機構には、ＩＬ−２３の結合能の阻害、受容体ヘテロ二量体形成の阻害、又は立体構造変化若しくは受容体内在化を含む細胞内シグナル伝達に影響を及ぼす変化の阻害若しくは誘導が含まれ得る。
【００２７】
用語「結合メンバー」は、本明細書で使用される場合、互いに対して結合特異性を有する一対の分子メンバーを指す。結合対のメンバーは天然に由来しても、又は完全に若しくは部分的に合成で産生されてもよい。分子対の一方のメンバーは、分子対の他方のメンバーの特定の空間的及び極性的構成に結合し、従ってそれと相補的である、表面上のある範囲又は空洞を有する。このように、対のメンバーは互いに対して特異的に結合する特性を有する。
【００２８】
リガンド／受容体、抗体／抗原、又は他の結合対を参照するとき、「特異的に」又は「選択的に」結合するとは、ある結合対のメンバーが結合対のもう一つのメンバーの異種集団中に存在することを決定する結合反応を示す。従って、例えばある特定のリガンドは指示された条件下で特別な受容体に結合し、試料中に存在する他のタンパク質に多量に結合することはない。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「多量体化ドメイン」は、多量体化ドメインを有する他の１つ又は複数のアミノ酸配列と会合して多量体複合体を形成することのできる官能性を含むアミノ酸配列を意味する。本発明の様々な実施形態において、多量体化ドメインは、二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、四量体化ドメイン、五量体化ドメイン等である。これらのドメインは、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の本発明のポリペプチドのポリペプチド複合体を形成する能力を有する。一例において、ポリペプチドは、２つの他の三量体化ドメインと三量体複合体を形成するアミノ酸配列−「三量体化ドメイン」−を含む。三量体化ドメインはアミノ酸配列が同じである他の三量体化ドメインと会合することもでき（ホモ三量体）、又はアミノ酸配列が異なる三量体化ドメインと会合することもできる（ヘテロ三量体）。そのような相互作用は三量体化ドメインの成分間の共有結合により、並びに水素結合力、疎水性力、ファンデルワールス力及び塩橋により生じ得る。
【００３０】
本発明のポリペプチドの三量体化ドメインは、全体として参照により援用される米国特許出願公開第２００７／０１５４９０１号（‘９０１号出願）に記載されるテトラネクチンから誘導されてもよい。成熟ヒトテトラネクチン単鎖ポリペプチド配列が、本明細書に配列番号１４２として提供される。テトラネクチン三量体化ドメインの例としては、配列番号９９のアミノ酸１７〜４９、１７〜５０、１７〜５１及び１７〜５２が含まれ、これらはヒトテトラネクチン遺伝子のエクソン２によりコードされるアミノ酸、及び任意選択により、遺伝子のエクソン３によりコードされる最初の１、２又は３個のアミノ酸に相当する。他の例としては、アミノ酸１〜４９、１〜５０、１〜５１及び１〜５２が含まれ、これはエクソン１及び２の全て、及び任意選択により、遺伝子のエクソン３によりコードされる最初の１、２又は３個のアミノ酸に相当する。或いは、エクソン１によりコードされるアミノ酸配列の一部のみが三量体化ドメインに含まれる。特に、三量体化ドメインのＮ末端は、配列番号９９の残基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、及び１７のいずれかを始端とし得る。詳細な実施形態において、Ｎ末端はＩ１０又はＶ１７であり、Ｃ末端はＱ４７、Ｔ４８、Ｖ４９、Ｃ（Ｓ）５０、Ｌ５１又はＫ５２である（配列番号９９に従う付番）。加えて、図２Ａ〜図２Ｄが、ヒトテトラネクチン三量体化ドメインの多くの可能なトランケーション変異体を提供する。
【００３１】
本発明の一態様において、三量体化ドメインは、配列番号１０８のアミノ酸配列を有するテトラネクチン三量体化構造要素（「ＴＴＳＥ」）であり、配列番号１０８は、全体として参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／００１５４９０１号にさらに詳細に記載されるテトラネクチンファミリー三量体化構造要素のコンセンサス配列である。図３に示されるとおり、ＴＴＳＥは、テトラネクチンタンパク質ファミリーの天然に存在するメンバーの変異体、特に、いかなる程度であれ実質的には悪影響を及ぼすことなくアミノ酸配列においてＴＴＳＥのαヘリックスコイルドコイル三量体形成能が修飾されている変異体を包含する。本発明の様々な態様において、本発明に係る三量体ポリペプチドは、配列番号１０８のコンセンサス配列と少なくとも６６％のアミノ酸配列同一性；例えば配列番号１０８のコンセンサス配列と少なくとも７３％、少なくとも８０％、少なくとも８６％又は少なくとも９２％の配列同一性を（定義された（Ｘでない）残基のみをカウントして）有する三量体化ドメインとしてのＴＴＳＥである。換言すれば、配列番号１０８中の定義されたアミノ酸のうち少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個が置換されていてもよい。
【００３２】
詳細な一実施形態において、配列番号１４２の５０位のシステイン（Ｃ５０）は、有利にはセリン、スレオニン、メチオニン又は任意の他のアミノ酸残基への突然変異を誘発してもよく、それにより不要な多量体化をもたらし得る不要な鎖間ジスルフィド架橋の形成を回避することができる。他の公知の変異体には、アミノ酸残基番号６、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３１、３２、３５、３９、４１、及び４２（配列番号１４２に従う付番）から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基が含まれ、これらがヘリックスを破壊しない任意のアミノ酸残基により置換されてもよい。これらの残基は、３つのネイティブなテトラネクチン単量体ＴＴＳＥの間での三量体複合体を安定化させる分子間相互作用に直接的には関与しないことが示されている。図３に示される一態様において、ＴＴＳＥは、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇ（ＮからＣ）を有する７個のアミノ酸の繰り返しを有し、ここで残基ａ及びｄ（すなわち、２６位、３０位、３３位、３７位、４０位、４４位、４７位、及び５１位）は任意の疎水性アミノ酸であり得る（配列番号９９に従う付番）。
【００３３】
さらなる実施形態において、ＴＴＳＥ三量体化ドメインは、ポリヒスチジン配列及び／又はプロテアーゼ切断部位、例えば血液凝固因子Ｘ又はグランザイムＢを組み込むことにより（参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０１９９２５１号を参照のこと）、及びＣ末端ＫＧ又はＫＧＳ配列を含むことにより、修飾されてもよい。また、精製を促進するため、２位のプロリンをグリシンに置換してもよい。
【００３４】
ＴＴＳＥトランケーション及び変異体の詳細な非限定的例を図２Ａ〜図２Ｄに示す。加えて、公知のヒトテトラネクチンの三量体化ドメインと実質的な相同性（６６％より高い）を有する多くの三量体化ドメインを示す：
【００３５】
【表１】
2013507124.tif 000002
【００３６】
【表２】
2013507124.tif 000003
【００３７】
三量体化することが公知の他のヒトポリペプチドには、以下が含まれる：
【００３８】
【表３】
2013507124.tif 000004
【００３９】
三量体化ドメインの別の例が米国特許第６，１９０，８８６号（全体として参照により本明細書に援用される）に開示され、そこにはコレクチンネック領域を含むポリペプチドが記載されている。次に、コレクチンネック領域アミノ酸配列を含む３個のポリペプチドにより適切な条件下で三量体を作製することができる。多くのコレクチンが特定されており、以下が含まれる：
【００４０】
ヒトＳＰ−Ｄのコレクチンネック領域：
ＶＡＳＬＲＱＱＶＥＡＬＱＧＱＶＱＨＬＱＡＡＦＳＱＹＫＫ［配列番号  ］
【００４１】
ウシＳＰ−Ｄのコレクチンネック領域：
ＶＮＡＬＲＱＲＶＧＩＬＥＧＱＬＱＲＬＱＮＡＦＳＱＹＫＫ［配列番号  ］
【００４２】
ラットＳＰ−Ｄのコレクチンネック領域：
ＳＡＡＬＲＱＱＭＥＡＬＮＧＫＬＱＲＬＥＡＡＦＳＲＹＫＫ［配列番号  ］
【００４３】
ウシコングルチニンのコレクチンネック領域：
ＶＮＡＬＫＱＲＶＴＩＬＤＧＨＬＲＲＦＱＮＡＦＳＱＹＫＫ［配列番号  ］
【００４４】
ウシコレクチンのコレクチンネック領域：
ＶＤＴＬＲＱＲＭＲＮＬＥＧＥＶＱＲＬＱＮＩＶＴＱＹＲＫ［配列番号  ］
【００４５】
ヒトＳＰ−Ｄのネック領域：
ＧＳＰＧＬＫＧＤＫＧＩＰＧＤＫＧＡＫＧＥＳＧＬＰＤＶＡＳＬＲＱＱＶＥＡＬＱＧＱＶＱＨＬＱＡＡＦＳＱＹＫＫＶＥＬＦＰＧＧＩＰＨＲＤ［配列番号  ］
【００４６】
ＭＢＰ三量体化ドメインの他の例が、国際公開第２００９／０３６３４９号として公開されたＰＣＴ出願第ＵＳ０８／７６２６６号に記載されており、その全体は参照により援用される。この三量体化ドメインはさらにオリゴマー化してより高次の多量体複合体を形成することができる。
【００４７】
ここでの文脈において「三量体化ドメイン」は、他の、同様の、又は同一の三量体化ドメインと相互作用することができる。この相互作用は三量体タンパク質又はポリペプチドを生成する種類のものである。そのような相互作用は、三量体化ドメインの成分間の共有結合により、並びに水素結合力、疎水性力、ファンデルワールス力、及び塩橋により生じ得る。三量体化ドメインの三量体化効果はコイルドコイル構造によって生じ、この構造が２つの他の三量体化ドメインのコイルドコイル構造と相互作用することで、比較的高温であっても安定した三重αヘリックスコイルドコイル三量体を形成する。様々な実施形態、例えばテトラネクチン構造要素をベースとする三量体化ドメインにおいて、複合体は少なくとも６０℃、例えばいくつかの実施形態では少なくとも７０℃で安定である。
【００４８】
用語「Ｃ型レクチン様タンパク質」及び「Ｃ型レクチン」は、任意の真核生物種に存在する、又はそのゲノムでコードされる任意のタンパク質を指して使用され、このタンパク質は、１つ以上のＣＴＬＤ、又は炭水化物リガンドを結合するＣＴＬＤのサブグループであるＣＲＤに属する１つ以上のドメインを含む。具体的にその定義には、膜結合型のＣ型レクチン様タンパク質及びＣ型レクチン、機能性膜貫通ドメインを欠く「可溶性」Ｃ型レクチン様タンパク質及びＣ型レクチン、並びにグリコシル化又は任意の他の合成後修飾により１つ又は複数のアミノ酸残基が生体内で変化している変異型Ｃ型レクチン様タンパク質及びＣ型レクチン、さらにはＣ型レクチン様タンパク質及びＣ型レクチンの化学修飾によって得られる任意の産物が含まれる。
【００４９】
ＣＴＬＤは約１２０アミノ酸残基からなり、２個又は３個の鎖内ジスルフィド架橋を含むことが特徴である。種々のタンパク質由来のＣＴＬＤ間のアミノ酸配列レベルにおける類似性は比較的低いが、多くのＣＴＬＤの３Ｄ構造は高度に保存されていることが分かっており、構造的可変（variability）は、多くの場合に最大５つのループにより画定されるいわゆるループ領域に本質的に限られている。いくつかのＣＴＬＤは、カルシウム結合部位を１個又は２個含み、カルシウムと相互作用する側鎖のほとんどはループ領域に位置している。
【００５０】
３Ｄ構造情報が利用可能なＣＴＬＤに基づき、正準のＣＴＬＤは構造上、β１、αｌ、α２、β２、β３、β４、及びβ５の順序で順次現れる７つの主要な二次構造要素（すなわち５つのβストランド及び２つのαヘリックス）によって特徴付けられると推測されている。図４は、１０個の既知のＣ型レクチンのＣＴＬＤのアラインメントを示す。３Ｄ構造が決定されている全てのＣＴＬＤにおいて、βストランドは、一方がβ１及びβ５から構成され、他方がβ２、β３及びβ４から構成される２枚の逆平行βシート状に配置される。さらなるβストランドのβ０は、多くの場合に配列中でβ１に先行し、存在する場合にはβ１、β５シートと一体となるさらなるストランドを形成する。さらに、一つがα１とβ５とをつなぎ（ＣＩ−ＣＩＶ）、一つがβ３と、β４とβ５とを結合するポリペプチドセグメントとを結合する（ＣＩＩ−ＣＩＩＩ）２つのジスルフィド架橋が、これまでに特徴付けられた全てのＣＴＬＤに不変的に見られる。また、図５は、ヒトテトラネクチン並びに８個の他のテトラネクチン又はテトラネクチン様ポリペプチド由来のＣＴＬＤのアラインメントを示す。
【００５１】
ＣＴＬＤの３Ｄ構造においてこれらの保存された二次構造要素は、ここでの文脈でまとめて「ループ領域」と称される、コアから突出する複数のループのコンパクトな足場を形成する。ＣＴＬＤの一次構造では、これらのループは、２つのセグメント、ループセグメントＡであるＬＳＡとループセグメントＢであるＬＳＢとに編成される。ＬＳＡは、β２とβ３とを結合する長いポリペプチドセグメントを示し、多くの場合に規則的な二次構造を欠き、且つ最大４つのループを含む。ＬＳＢは、βストランドのβ３とβ４とを結合するポリペプチドセグメントを示す。ＬＳＡの残基は、β４の単一の残基と共に、テトラネクチンのものを含むいくつかのＣＴＬＤのＣａ２＋結合及びリガンド結合部位を特定することが示されている。例えば、１個又は数個の残基の置換を含む突然変異生成試験では、結合特異性、Ｃａ２＋感受性及び／又は親和性の変化がＣＴＬＤドメインにより適応され得ることが示されている。以下の非限定的な例を含め、多くのＣＬＴＤが公知である：テトラネクチン、リソスタチン（lithostatin）、マウスマクロファージガラクトースレクチン、クッパー細胞受容体、ニワトリニューロカン、パールシン（perlucin）、アシアロ糖タンパク質受容体、軟骨プロテオグリカンコアタンパク質、ＩｇＥ  Ｆｃ受容体、膵炎関連タンパク質、マウスマクロファージ受容体、ナチュラルキラー群、幹細胞成長因子、ＩＸ／Ｘ因子結合タンパク質、マンノース結合タンパク質、ウシコングルチニン、ウシＣＬ４３、コレクチン肝１、サーファクタントタンパク質Ａ、サーファクタントタンパク質Ｄ、ｅ−セレクチン、被嚢類Ｃ型レクチン、ＣＤ９４  ＮＫ受容体ドメイン、ＬＹ４９Ａ  ＮＫ受容体ドメイン、ニワトリ肝レクチン、マスＣ型レクチン、ＨＩＶ  ｇｐ  １２０結合Ｃ型レクチン、及び樹状細胞免疫受容体。全体として参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／０２７５３９３号、及びEssentials of Glycobiology, second edition. Edited by A. Varki, R.D. Cummings, J.D. Esko, HH. Freeze, P. Stanley, C.R. Bertozzi, G.W. Hart, M.E. Etzler. CHS Pressを参照
のこと。
【００５２】
「アトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体」又は「アトリマー（ATRIMER）（商標）複合体」は、同様にＣＬＴＤを含む３つの三量体化ドメインの三量体複合体を指す（Anaphore, Inc., San Diego, California）。
【００５３】
「有効量」は、投与が同時か逐次的かを問わず、問題の疾患又は病態の予防、寛解又は治療に有効な治療剤と任意選択により併せた、本発明のポリペプチドの量を指す。詳細な実施形態において、有効量は、阻害ＩＬ−２３のＩＬ−２３Ｒ発現細胞に対する効果を低下させ、ＩＬ−２３Ｒと相乗的に働くか若しくはＩＬ−２３Ｒ発現細胞と協調して作用する他の免疫細胞に影響を及ぼすＩＬ−２３Ｒ発現細胞上の他の経路に影響を及ぼし、細胞が増殖若しくは生存しようとする傾向を低減し、又は細胞がアポトーシスを受ける傾向を亢進させるか若しくは他の形で（例えば相乗的に）高め、腫瘍容積を低減し、又は癌若しくは免疫関連疾患を有する哺乳動物の生存を長期化させるのに十分な組み合わせでの本発明のポリペプチド及び細胞傷害剤又は免疫阻害剤などの治療剤の量である。
【００５４】
「治療剤」は、細胞傷害剤、化学療法剤、免疫阻害剤、抗炎症剤、免疫賦活剤、及び／又は増殖阻害剤を指す。
【００５５】
用語「免疫阻害剤」及び「炎症調節剤」は、本明細書で補助療法に対して使用されるとき、本明細書で治療される哺乳動物の免疫系を阻害又は遮蔽するように作用する物質を指す。これは、サイトカイン産生を阻害し、自己抗原発現をダウンレギュレーション若しくは阻害し、免疫細胞の慢性炎症部位への遊走を阻害し、又はＭＨＣ抗原を遮蔽する物質を含み得る。そのような薬剤の例には、限定はされないが、２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミジン（米国特許第４，６６５，０７７号を参照）；非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）；アザチオプリン；シクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソーン；グルタルアルデヒド（米国特許第４，１２０，６４９号に記載のとおり、これはＭＨＣ抗原を遮蔽する）；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；糖質コルチコステロイドなどのステロイド、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、及びヒドロコルチゾン；メトトレキサート（経口又は皮下）；ヒドロキシクロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカイン又はサイトカイン受容体拮抗薬、例えば、抗インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、−β、又は−α抗体、抗腫瘍壊死因子α抗体（例えばインフリキシマブ、アダリムマブ又はシムジア（Cimzia）など）、抗ＴＮＦαイムノアドヘシン（エタネルセプト）、抗腫瘍壊死因子β抗体、抗ＴＧＦ−β抗体、抗インターロイキン２抗体及び抗ＩＬ−２受容体抗体；抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６Ｒ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ−１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種抗リンパ球グロブリン；汎Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ−３結合ドメインを含む可溶性ペプチド（１９９０年７月２６日に公開された国際公開第９０／０８１８７号）；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ−β；ストレプトドルナーゼ；宿主由来のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ−６１４４３；デオキシスパガリン；ラパマイシン；Ｔ細胞受容体（Cohen et al. 、米国特許第５，１１４，７２１号）；Ｔ細胞受容体断片（Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991)；国際公開第９０／１１２９４号；Janeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開第９１／０１１３３号）；及びＴ細胞受容体抗体（欧州特許第３４０，１０９号）、例えば、Ｔ１０Ｂ９、タイサブリ（Tysabri）などのインテグリン阻害薬、ＣＣＲ９又はＣＣＲ６拮抗薬、抗ＴＬ１Ａ抗体又はＩＬ−１０又はＩＬ−２７などの免疫応答を阻害することが公知のサイトカインが含まれる。
【００５６】
用語「細胞傷害剤」は、本明細書で使用される場合、細胞の機能を阻害若しくは阻止し、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物又は動物起源の小分子毒素若しくは酵素的に活性な毒素などの毒素、又はそれらの断片を含むことが意図される。
【００５７】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシトキサン（CYTOXAN）（登録商標）シクロスホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）、及びウレドパ（uredopa）などのアジリジン；エチレンイミン及びメチルアメラミン（methylamelamine）、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチローロメラミン（trimethylolomelamine）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチイン（sarcodictyin）；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソウレア（nitrosurea）；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１１及びカリケアマイシンω１１（例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照）などの抗生物質；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラミシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質のエンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン（aclacinom
ysin）、アクチノマイシン、オースラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（ADRIAMYCIN）（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝産物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎薬；フロリン酸（frolinic acid）などの葉酸補充物；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（lonidainine）；メイタンシン及びアンサマイトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）多糖類複合体（JHS Natural Products, Eugene, Oreg.）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ（verracurin A）、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、タキソール（TAXOL）（登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）、アブラキサン（BRAXANE）（商標）クレモフォール不含のアルブミン改変ナノ粒子パクリタキセル製剤（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois）、及びタキソテール（TAXOTERE）（登録商標）ドキセタキセル（doxetaxel）（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル（chloranbucil）；ジェムザール（GEMZAR）（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ナベルビン（NAVELBINE）（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ（xeloda）；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメトルヒルオルニチン（difluorometlhylornithine）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；及び上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。定義にはまた、ボルテゾミブ（ベルケイド（Velcade））などのプロテアソーム阻害薬、ＢＣＬ−２阻害薬、ＩＡＰ拮抗薬（例えば、特定のペプチドなどのＳｍａｃ模倣体／ｘＩＡＰ及びｃＩＡＰ阻害薬、（Ｓ）−Ｎ−｛６−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−１−［５−（４−フルオロ−ベンゾイル）−ピリジン−３−イルメチル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル｝−２−メチルアミノ−プロピオンアミドなどのピリジン化合物、ｘＩＡＰアンチセンス）、ＨＤＡＣ阻害薬（ＨＤＡＣＩ）及びキナーゼ阻害薬（ソラフェニブ）も含まれる。
【００５８】
この定義にはまた、抗エストロゲン薬及び選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）などの、腫瘍に対するホルモン作用を制御又は阻害するよう作用する抗ホルモン剤も含まれ、例えば、タモキシフェン（ノルバデックス（NOLVADEX）（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びフェアストン（FARESTON）−トレミフェン；副腎におけるエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、メゲース（MEGASE）（登録商標）酢酸メゲストロール、アロマシン（AROMASIN）（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタニー（formestanie）、ファドロゾール、リビソール（RIVISOR）（登録商標）ボロゾール、フェマーラ（FEMARA）（登録商標）レトロゾール、及びアリミデックス（ARIMIDEX）（登録商標）アナストロゾール；及びフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特にabherantな細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｌｆ及びＨ−Ｒａｓなどの発現を阻害するもの；ＶＥＧＦ発現阻害薬（例えば、アンギオザイム（ANGIOZYME）（登録商標）リボザイム）及びＨＥＲ２発現阻害薬などのリボザイム；遺伝子治療ワクチン、例えば、アロベクチン（ALLOVECTIN）（登録商標）ワクチン、ロイベクチン（LEUVECTIN）（登録商標）ワクチン、及びバキシド（VAXID）（登録商標）ワクチンなどのワクチン；プロロイキン（PROLEUKIN）（登録商標）ｒＩＬ−２；ルルトテカン（LURTOTECAN）（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害薬；アバレリックス（ABARELIX）（登録商標）ｒｍＲＨ；及び上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
【００５９】
「増殖阻害剤」は、本明細書で使用される場合、インビトロ或いはインビボで細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を指す。従って増殖阻害剤は、Ｓ期においてそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に低減するものである。増殖阻害剤の例には、Ｇ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤など、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の場所で）阻害する薬剤が含まれる。古典的なＭ期阻害薬には、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、並びにトポＩＩ阻害薬、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、及びａｒａ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤は、Ｓ期停止にも及ぶ。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995, pg. 13)に見出すことができる。
【００６０】
さらに、例えばアルギナーゼなどのアルギニン枯渇剤など、細胞ストレスを誘導する薬剤が含まれる。
【００６１】
さらに、リツキシマブ、抗ＢＡＦＦ抗体、又は抗ＡＰＲＩＬ抗体などのＢ細胞に影響を及ぼす抗体、及びキャンパス（Campath）などのＴ細胞枯渇抗体が含まれる。さらに、ＩＬ−２３Ｒ拮抗薬をアスピリン及びＮＦｋＢ経路の阻害薬と組み合わせると有益であり得る。
【００６２】
「相乗活性」、「相乗作用」、「相乗効果」又は「相乗効果量」は、本明細書で使用される場合、ＩＬ−２３Ｒ拮抗薬と治療剤との組み合わせを用いるときに認められる効果が、（１）そのＩＬ−２３Ｒ拮抗薬又は治療剤を単独で（又は個別に）用いるときに達成される効果と比べて大きく、且つ（２）そのＩＬ−２３Ｒ拮抗薬又は治療剤について足し合わせた合計の（相加）効果と比べて大きいことを意味する。そのような相乗作用又は相乗効果は、当業者に公知の様々な手段によって判断することができる。例えば、ＩＬ−２３Ｒ拮抗薬と治療剤との相乗効果は、免疫細胞からのサイトカイン放出の減少、存在する免疫細胞の数若しくは種類、又は癌の場合には、腫瘍細胞数又は腫瘍量の減少を調べるインビトロ又はインビボアッセイフォーマットで観察することができる。
【００６３】
用語「癌」、「癌性」、及び「悪性」は、典型的には不制御の細胞成長によって特徴付けられる哺乳動物の生理学的病態を指し、又は表す。癌の例には、限定はされないが、腺癌を含む癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、及び白血病が含まれる。そのような癌のより詳細な例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、消化管癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵癌、膠芽腫、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝細胞癌腫及び肝細胞癌などの肝癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、骨髄腫（多発性骨髄腫など）、唾液腺癌腫、腎細胞癌腫及びウィルムス腫瘍などの腎癌、基底細胞癌腫、黒色腫、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、及び様々な種類の頭頸部癌が含まれる。
【００６４】
用語「免疫関連疾患」は、哺乳動物の免疫系の成分が哺乳動物における病的状態を引き起こし、仲介し、又は他の形でそれに寄与する疾患又は障害を意味する。また、免疫応答の刺激又は介入が疾患の進行に対して寛解効果を有する疾患も含まれる。この用語の範囲内には、自己免疫疾患、免疫仲介性炎症性疾患が含まれる。一部は免疫細胞又はＴ細胞仲介性の、本発明により治療され得る免疫関連疾患及び炎症性疾患の例には、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性ミオパチー（皮膚筋炎、多発筋炎）、原発性シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫介在性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫介在性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び末梢神経系の脱髄性疾患、例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチー又はギラン・バレー症候群、フォークト・小柳・原田病、グッドパスチャー病、及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、肝胆道疾患、例えば、感染性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝親和性ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎など、炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎：クローン病）、グルテン過敏性腸症、ウィップル病、及び線維性肺疾患など、水疱性皮膚疾患、多形紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹などを含む自己免疫性又は免疫介在性皮膚疾患、免疫性肺疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎など、移植片拒絶反応及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患、免疫介在性又は自己免疫性眼疾患、例えば、ブドウ膜炎、ドライアイ、ベーチェット病（ＢＤ）などが含まれる。
【００６５】
感染症には、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染症）、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、及びＥ型肝炎、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症及び寄生虫感染症が含まれる。
【００６６】
「Ｂ細胞悪性腫瘍」は、Ｂ細胞が関わる悪性腫瘍である。例としては、リンパ球優位型ホジキン病（ＬＰＨＤ）を含むホジキン病；非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；濾胞中心細胞（ＦＣＣ）リンパ腫；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；形質細胞性リンパ球性リンパ腫；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ又はＨＩＶ関連リンパ腫；多発性骨髄腫；中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫；移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（リンパ形質細胞性リンパ腫）；粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫；及び辺縁層リンパ腫／白血病が含まれる。
【００６７】
「非ホジキンリンパ腫」（ＮＨＬ）には、限定はされないが、低悪性度／濾胞性ＮＨＬ、再発性又は不応性ＮＨＬ、フロントライン（front line）低悪性度ＮＨＬ、ステージＩＩＩ／ＩＶ  ＮＨＬ、化学療法耐性ＮＨＬ、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、びまん性大細胞型リンパ腫、アグレッシブＮＨＬ（アグレッシブフロントライン（front-linｅ）ＮＨＬ及びアグレッシブ再発性ＮＨＬを含む）、自家幹細胞移植の後に再発する、又はそれに不応性のＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ等が含まれる。
【００６８】
「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）又は「腫瘍特異的抗原」（ＴＳＡ）は、宿主に免疫応答を生じさせ得る腫瘍細胞中で産生される分子である。腫瘍関連抗原は、発現レベルに差はあるものの腫瘍細胞及び正常細胞の双方に認められるが、腫瘍特異的抗原を発現するのは腫瘍細胞のみである。腫瘍細胞の表面上に提示されるＴＡＡ又はＴＳＡには、限定はされないが、特に、アルファフェトプロテイン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、グリピカン−３、腫瘍関連糖タンパク質−７２（ＴＡＧ−７２）、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＳＨ−１、ＭＡＧＥ−１、−２、−３、−１２、ＲＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−１、−２、ＢＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、β−カテニン、ＣＤＣＰ−１、ＣＤＣ−２７、ＳＡＲＴ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、乳房腫瘍関連抗原ＢＴＡ−１及びＢＴＡ−２、ＲＣＡＳ１（ＳｉＳｏ細胞上で発現する受容体結合癌抗原）、胎盤特異的１（ＰＬＡＣ−１）、シンデカン、ＭＮ（ｇｐ２５０）、イディオタイプが含まれる。腫瘍関連抗原には、血液型抗原、例えば、Ｌｅａ、Ｌｅｂ、ＬｅＸ、ＬｅＹ、Ｈ−２、Ｂ−１、Ｂ−２抗原も含まれる（本明細書の最後にある表１９を参照のこと）。理想的には、本発明の目的上、ＴＡＡ又はＴＳＡ標的は結合時に内在化されない。
【００６９】
「非天然（non-natural)アミノ酸」又は「天然に存在しない（non-naturally occuring)アミノ酸」は、２０種の共通アミノ酸のうちの１つではないアミノ酸、例えば、天然にコードされたアミノ酸（限定はされないが、２０種共通アミノ酸又はピロリジン及びセレノシステインを含む）の修飾（例えば翻訳後修飾）により生じるが、それ自体が翻訳複合体によって成長するポリペプチド鎖に天然で組み込まれることはないアミノ酸を指す。そのような天然に存在しないアミノ酸の例としては、限定はされないが、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニン、及びＯ−ホスホチロシンが含まれる。
【００７０】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸配列及び核酸配列の双方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一の又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の核酸配列を指す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードし得る。
【００７１】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中のあるアミノ酸又は特定の割合のアミノ酸を保存アミノ酸と置換する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個々の置換は、「保存的に修飾された変異体」であることを認識するであろう。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換表が、当該技術分野において公知である。
【００７２】
保存的置換の例は、以下の群のうちの１つにおけるアミノ酸を同じ群の別のアミノ酸に交換することである（Lee, et al.に対して発行された米国特許第５，７６７，０６３号；Kyte and Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132）：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、又はＭｅｔ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；（７）小アミノ酸：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ。
【００７３】
阻害の程度を調べるため、例えば、所与の、例えばタンパク質、遺伝子、細胞、又は生物を含む試料又は検体が賦活薬又は阻害薬の候補で処理され、阻害薬を含まない対照試料と比較される。対照試料、すなわち拮抗薬で処理されない試料には、１００％の相対活性値が割り当てられる。阻害は、対照と比べた活性値が約９０％以下、典型的には８５％以下、より典型的には８０％以下、最も典型的には７５％以下、一般的には７０％以下、より一般的には６５％以下、最も一般的には６０％以下、典型的には５５％以下、通常では５０％以下、より通常では４５％以下、最も通常では４０％以下、好ましくは３５％以下、より好ましくは３０％以下、さらにより好ましくは２５％以下、及び最も好ましくは２５％以下であるときに達成される。活性化は、対照と比べた活性値が約１１０％、一般的には少なくとも１２０％、より一般的には少なくとも１４０％、より一般的には少なくとも１６０％、多くの場合に少なくとも１８０％、より多くの場合に少なくとも２倍、最も多くの場合に少なくとも２．５倍、通常では少なくとも５倍、より通常では少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも４０倍、及び最も好ましくは４０倍超高いときに達成される。
【００７４】
活性化又は阻害のエンドポイントは、以下のとおり観察することができる。例えば、細胞、生理的液体、組織、臓器、及び動物又はヒト対象の活性化、阻害、及び治療に対する反応を、エンドポイントにより観察することができる。エンドポイントは、炎症、発癌能、又は細胞脱顆粒若しくは分泌、例えば、サイトカイン、毒性酸素、若しくはプロテアーゼの放出の指標などの所定の分量又は割合を含み得る。エンドポイントは、例えば、所定分量のイオン流束又は輸送；細胞遊走；細胞接着；細胞増殖；転移の可能性；細胞分化；及び表現型の変化、例えば、炎症、アポトーシス、形質転換、細胞周期、又は転移に関する遺伝子の発現の変化を含み得る（例えば、Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145-158；Hood and Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2:91-100；Timme, et al. (2003) Curr. Drug Targets 4:251-261；Robbins and Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am. 86:1467-1495；Grady and Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128；Bauer, et al. (2001) Glia 36:235-243；Stanimirovic and Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126を参照のこと）。
【００７５】
阻害のエンドポイントは、一般的には対照の７５％以下、好ましくは対照の５０％以下、より好ましくは対照の２５％以下、及び最も好ましくは対照の１０％以下である。一般的には、活性化のエンドポイントは、対照の少なくとも１５０％、好ましくは対照の少なくとも２倍、より好ましくは対照の少なくとも４倍、及び最も好ましくは対照の少なくとも１０倍である。
【００７６】
「標識された」組成物は、分光法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、同位体法、又は化学的方法によって直接的に或いは間接的に検出可能である。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、１２５Ｉ、安定同位体、蛍光色素、高電子密度試薬、基質、エピトープタグ、又は例えば酵素結合免疫測定法で使用される酵素、又はフルオレット（fluorette）が含まれる（例えば、Rozinov and Nolan (1998) Chem. Biol. 5:713-728を参照のこと）。
【００７７】
本発明での使用に好適な非天然アミノ酸の多くは、例えばSigma（USA）又はAldrich（Milwaukee, Wis., USA）から市販されている。市販されていないものは、任意選択により本明細書で提供されるように、又は様々な文献に提供されるように、又は当業者に公知の標準方法を用いて合成される。有機合成技術については、例えば、Fessendon and FessendonによるOrganic Chemistry（1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.）；MarchによるAdvanced Organic Chemistry（Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York）；及びCarey and SundbergによるAdvanced Organic Chemistry（Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York）を参照のこと。非天然アミノ酸の合成について記載しているさらなる文献には、例えば、「In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids」と題される国際公開第２００２／０８５９２３号；Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669；King, F. E. & Kidd, D. A. A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of .gamma.-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc., 3315-3319；Friedman, O. M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752；Craig, J. C. et al. (1988) Absolute Configuration of the En
antiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170；Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5；Koskinen, A. M. P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866；Christie, B. D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 1989: 1859-1866；Barton et al., (1987) Synthesis of Novel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L-and D-a-Amino-Adipic Acids, L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron Lett. 43: 4297-4308；及びSubasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35: 4602-7が含まれる。各々が全体として参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００４/０１９８６３７号及び米国特許出願公開第２００５/０１７０４０４号も参照のこと。
【００７８】
用語「アミノ酸修飾」及び「修飾」は、別のアミノ酸配列、例えばネイティブなアミノ酸配列に対するアミノ酸配列中におけるアミノ酸置換、欠失、若しくは挿入又はその任意の組み合わせを指す。本明細書で置換変異体は、取り除かれたネイティブなＣＴＬＤ配列の少なくとも１個のアミノ酸残基と、その代わりに同じ位置に挿入された異なるアミノ酸とを含む。置換は単一であってもよく、その場合、分子内で１個のアミノ酸のみが置換されており、又は置換は複数であってもよく、その場合、同じ分子内で２個以上のアミノ酸が置換されている。ＣＴＬＤ内の２個以上のアミノ酸置換について具体的に言及するとき、それは各個別のアミノ酸置換がＣＴＬＤ内において任意のアミノ酸位置に現れ得る複数の置換を指す。同様に、ＣＴＬＤ中の２個以上のアミノ酸の挿入又は欠失について具体的に言及するとき、それは各個別のアミノ酸の挿入又は欠失が、連続的及び非連続的なアミノ酸位置を含め、ＣＴＬＤ内の任意のアミノ酸位置で起こり得る複数の挿入又は欠失を指す。
【００７９】
用語「核酸分子コーディング」、「ＤＮＡ配列コーディング」、及び「ＤＮＡコーディング」は、デオキシリボ核酸のストランドに沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序又は配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序により、ポリペプチド鎖に沿ったアミノ酸の順序が決定される。従って、ＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。
【００８０】
ランダム化ポリペプチド配列又は核酸配列を特定する任意の文脈において使用される用語「ランダム化する」、「ランダム化している」及び「ランダム化された」並びに任意の類似の用語は、ポリペプチド又は核酸の配列又はセグメント集合を指し、ここで１つ又は複数の配列位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドは、そのポリペプチド又は核酸集合の種々のメンバー間で異なることができ、従って、そのような配列位置の各々に存在するアミノ酸残基又はヌクレオチドが、全ての可能なアミノ酸残基又はヌクレオチドを含み得るアミノ酸残基又はヌクレオチドの組又はその任意の限られた一部の組に属し得る。これらの用語は、可能なアミノ酸残基又はヌクレオチドの数がその集合の各メンバーの数と同じである集合を指して用いられることが多いが、その集合の各メンバーにおける可能なアミノ酸残基又はヌクレオチドの数が適切な整数範囲内の任意の整数であり得るそのような集合を指すために用いられ得る。
【００８１】
ここで本発明をさらに詳細に見ると、一態様において、本発明は、多量体化ドメインと、ＩＬ−２３Ｒに結合する少なくとも１つのポリペプチド結合メンバーと、を有するポリペプチドに関する。本発明において、結合メンバーは、多量体化ドメインに、例えばＮ末端又はＣ末端で連結されていてもよい。また、特定の実施形態では、単量体の多量体化ドメインのＮ末端及びＣ末端の双方に対してＩＬ−２３Ｒを結合する結合メンバー又は２つの異なる結合メンバーを連結し、それによりＩＬ−２３Ｒの結合能を有する６つの結合メンバーを含む多量体ポリペプチド複合体を提供することが有利であり得る。一般に、本発明のポリペプチドは、非天然ポリペプチド、例えば多量体化ドメインとＩＬ−２３Ｒを結合するポリペプチド配列との融合タンパク質である。非天然ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列をアミノ酸の付加、欠失、又は置換によって変化させた天然ポリペプチドであってもよい。そのようなポリペプチドの例には、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドが含まれ、ここでドメインのループ領域の１つ又は複数は本明細書に記載されるとおり修飾されている。本発明の他の態様において、ＩＬ−２３Ｒに結合するポリペプチドは、受容体に結合するネイティブなポリペプチドの断片又は変異体であり、ここで天然に存在するポリペプチド、変異体又は断片が多量体化ドメインと融合されると、融合タンパク質はもはや天然に存在するポリペプチドではなくなる。従って、本発明は、天然に存在するポリペプチド、その断片、又は変異体が本発明の融合タンパク質の一部であることを排除するものではない。
【００８２】
本態様の実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−２３Ｒに結合し、且つＩＬ−２３経路を介したシグナル伝達を阻止するＩＬ−２３Ｒ拮抗薬である。一実施形態において、ポリペプチドはＩＬ２３−Ｒ（配列番号５）又はその変異体を結合する。本発明のポリペプチドはＩＬ−２３Ｒ上の１つ又は複数の部位に結合し、それがネイティブなＩＬ−２３リガンドの結合を阻止し、それによりＩＬ−２３リガンドによる受容体の活性化を阻止する。また、本発明のポリペプチドは作動活性を有さず、且つＩＬ−２３ヘテロ二量体受容体を活性化しない。
【００８３】
詳細な実施形態において、ポリペプチドはＩＬ−１２Ｒβ１又はＩＬ−１２Ｒβ２に特異的に結合しない。従って、治療組成物中に本発明のポリペプチドを使用すると、特定の療法についてのＩＬ−１２活性の不要な阻害の影響を回避することができる。
【００８４】
様々な態様において、本発明の単量体ポリペプチドは少なくとも２つのセグメント：他の多量体化ドメインとの多量体複合体形成能を有する多量体化ドメイン、及びＩＬ−２３Ｒに結合するポリペプチド配列を含む。ＩＬ−２３Ｒに結合する配列は、ドメインのＮ末端で、Ｃ末端で、又はＮ末端及びＣ末端の双方で多量体化ドメインと融合し得る。一実施形態において、Ｎ末端でＩＬ−２３Ｒに結合するポリペプチドは、三量体化ドメインのＣ末端でＩＬ−２３Ｒを結合するポリペプチドとは異なる。
【００８５】
一実施形態において、ＩＬ−２３Ｒを結合する第１のポリペプチドが三量体化ドメインのＮ末端及びＣ末端の一方で融合し、且つ炎症調節剤である第２のポリペプチドが三量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端の他方で融合する。当業者であれば理解し得るとおり、ポリペプチドでない調節剤は三量体化ドメインに共有結合に、或いは非共有結合的に連結させることができる。炎症調節剤に加え、他のポリペプチド及び非ポリペプチド治療剤を三量体化モジュールに連結させることができる。
【００８６】
癌治療のためには、本発明のポリペプチドの標的を腫瘍環境に定め、それにより腫瘍細胞上でのＩＬ−２３の腫瘍促進作用をより有効に阻止することが求められ得る。従って本発明の別の態様は、ドメインの一方の端部（Ｎ末端又はＣ末端のいずれか一方）に、ＩＬ−２３Ｒに結合するポリペプチドを有し、且つ他方の端部（Ｎ末端及びＣ末端の他方）に、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）に結合するポリペプチドを有する多量体化ドメインを含む。ＴＡＡ又はＴＳＡに結合するドメインは、ペプチド、例えばＣＴＬＤ、一本鎖抗体、又は所望の標的と特異的に結合する任意の種類のドメインなどであってもよい。
【００８７】
一つの特定の手法において、細胞死受容体作動薬の活性は、三量体化ドメインの一方の端部のＩＬ−２３Ｒ結合ポリペプチドを通じて仲介される結合活性を有する分子であって、癌の環境中で薬物を炎症部位に駆動し、且つ三量体化ドメインの第２の端部の細胞死受容体特異的なポリペプチドの密集化を可能にする分子を設計することにより亢進させることができる。様々な態様において、ポリペプチドは、ＩＬ−２３Ｒに対するより低い親和性で細胞死受容体を結合する。より具体的には、ＩＬ−２３Ｒに結合するポリペプチドは、ポリペプチドが細胞死受容体を結合するより最小２倍高い、例えば、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、１０、１５、２０、５０及び１００倍高い親和性で結合し得る。
【００８８】
ＩＬ−２３Ｒ結合ポリペプチドとＴＡＡ又はＴＳＡ標的化剤との双方を有する三量体複合体の適応には、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸癌、卵巣癌、腎癌、膵癌、肉腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫、乳癌、前立腺癌、黒色腫、膠芽腫、神経芽細胞腫が含まれる。
【００８９】
別の態様において、ＩＬ−２３受容体に特異的に結合するポリペプチドはＣＴＬＤのループ領域に含まれる。ポリペプチドはＩＬ−２３ポリペプチドの一部分であってもよく、又はここに提供するとおり特定される配列であってもよい。この態様では、配列はＣＬＴＤのループ領域に含まれ、ＣＴＬＤが三量体化ドメインとドメインのＮ末端又はＣ末端で直接的に、或いは適切なリンカーを介して融合する。また、本発明のポリペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端の他方で融合した第２のＣＬＴＤドメインを含むことができ、ここでＣＴＬＤの配列及び／又はそのＩＬ−２３Ｒに対する親和性は同じであっても、又は異なってもよい。この態様の変形例では、ポリペプチドは、三量体化ドメインの末端の一方でＩＬ−２３Ｒに、及び末端の他方でＣＬＴＤに結合するポリペプチドを含む。ポリペプチドの１つ、２つ又は３つは、ＩＬ−２３Ｒに対する最大６つの特異的結合メンバーを含む三量体複合体の一部であり得る。
【００９０】
ＩＬ−２３Ｒを結合するポリペプチド配列は、ネイティブなＩＬ−２３がＩＬ−２３Ｒに対して有する結合親和性とほぼ等しい結合親和性をＩＬ−２３Ｒに対して有し得る。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ネイティブなＩＬ−２３が同じＩＬ−２３Ｒに対して有する結合親和性より高い或いは低いＩＬ−２３Ｒに対する結合親和を有する。
【００９１】
本発明のポリペプチドは、ネイティブなＩＬ−２３（ｐ１９）配列又はランダム配列中に、ＩＬ−２３Ｒに対して選択的な結合親和性を有するが、ＩＬ−１２Ｒβ１又はＩＬ−１２Ｒβ２に対しては有しない１つ又は複数のアミノ酸突然変異を含み得る。例えば、そのような結合メンバーのＩＬ−２３Ｒに対する結合親和性が、ネイティブなＩＬ−２３と比較したときほぼ等しい（変化していない）か、又はより大きく（増加している）、及び結合メンバーのＩＬ−１２Ｒβ１又はＩＬ−１２Ｒβ２に対する結合親和性がネイティブな配列ＩＬ−２３と比較して少ないか、ほぼ除かれている場合、結合メンバーの結合親和性は、本明細書での目的上、ＩＬ−２３Ｒに「選択的」であるとみなされる。別の例において、結合メンバーのＩＬ−２３Ｒに対する親和性は、ＩＬ−２３のその受容体に対する親和性より低いが、結合メンバーがＩＬ−１２Ｒβ１又はＩＬ−１２Ｒβ２に対するその親和性と比べてＩＬ−２３Ｒに対してより高い親和性を有するならば、それはなお受容体選択的である。本発明の好ましいＩＬ−２３Ｒ選択的拮抗薬は、ＩＬ−１２Ｒβ１又はＩＬ−１２Ｒβ２と比較してＩＬ−２３Ｒに対して少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍高い結合親和性を有し、さらにより好ましくは、ＩＬ−１２Ｒβ１又はＩＬ−１２Ｒβ２と比較してＩＬ−２３Ｒに対して少なくとも１００倍高い結合親和性を有し得る。
【００９２】
拮抗薬のそれぞれの結合親和性は、当該技術分野において公知のＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はBIAcoreアッセイにより決定し、ネイティブなＩＬ−２３又はその一部分に対する結合特性と比較することができる。本発明の好ましいＩＬ−２３Ｒ選択的拮抗薬は少なくとも１つの哺乳動物細胞型でＩＬ−１２シグナル伝達を阻害しないものであってよく、そのようなシグナル阻害はＥＬＩＳＡなどの当該技術分野の公知の方法により決定することができる。
【００９３】
ある実施形態では、ＩＬ−２３Ｒ拮抗薬は抗体又は抗体断片を含む。ここでの文脈では、用語「抗体」は、天然であるにしろ、又は部分的若しくは全体的に合成で産生されるにしろ、免疫グロブリンについて記載するために使用される。抗体は多くの方法で修飾され得るが、用語「抗体」は、要求される受容体特異性を備える結合ドメインを有する任意の特異的結合メンバー又は物質を包含するものとして解釈されなければならない。従って、この用語は、天然であるにしろ、又は完全に若しくは部分的に合成であるにしろ、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含め、抗体断片、誘導体、抗体の機能的等価物及び相同体を包含する。従って、別のポリペプチドと融合した、免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子、又は等価物が含まれる。この用語はまた、抗体結合ドメインであるか、又はそれと相同な結合ドメインを有する任意のポリペプチド又はタンパク質、例えば抗体模倣体も包含する。これらは天然の供給源から誘導することができ、又は部分的若しくは完全に合成で産生されてもよい。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプ及びそのアイソタイプのサブクラス；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの、抗原結合ドメインを含む断片；及び二特異性抗体である。
【００９４】
別の態様において本発明は、３つのポリペプチドの多量体複合体であって、ポリペプチドの各々が多量体化ドメインと、ＩＬ−２３Ｒに結合する少なくとも１つのポリペプチドとを含む多量体複合体に関する。ある実施形態では、多量体複合体は、ヒトテトラネクチン三量体化構造要素、又はマンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）三量体化ドメイン、コレクチンネック領域ポリペプチド、及びその他を含む他のヒト三量体化ポリぺプチドと実質的な相同性を有するポリペプチドから選択される多量体化ドメインを有するポリペプチドを含む。多量体複合体は、本発明のポリペプチドの任意のものから構成されることができ、ここで多量体複合体のポリペプチドは、互いに会合して多量体を形成することが可能な多量体化ドメインを含む。従って、いくつかの実施形態において、多量体複合体は、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドから構成されるホモ多量体複合体である。他の実施形態において、多量体複合体は、例えば異なる多量体化ドメイン、及び／又はＩＬ−２３Ｒに結合する異なるポリペプチドなどの、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドから構成されるヘテロ多量体複合体である。加えて、ヘテロ多量体複合体は治療剤及びＩＬ−２３Ｒ拮抗薬を含むことができる。
【００９５】
さらに一態様において、本発明は、ＩＬ−２３Ｒ発現細胞におけるＩＬ−２３Ｒの活性化を阻止するポリペプチドの調製方法に関する。この方法は、（ａ）ＩＬ−２３Ｒを特異的に結合する第１のポリペプチドを選択する工程と；（ｂ）第１のポリペプチドをテトラネクチンＣＴＬＤの１つ又は２つのループ領域にグラフトして第１の結合決定基を形成する工程、又はポリペプチドをテトラネクチン三量体化ドメインと直接融合する工程と、（ｃ）第１のＣＴＬＤをテトラネクチン三量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端の一方と融合する工程とを含む。この方法の詳細な一実施形態において、ＩＬ−２３Ｒを結合するポリペプチドはＩＬ−１２Ｒβ１又はＩＬ−１２Ｒβ２を結合しない。
【００９６】
テトラネクチンＣＴＬＤは、本明細書に記載するランダム化ライブラリーから選択することにより、ＩＬ−２３Ｒに対する結合メンバーを挿入又は特定し得るループ領域を最大５個有する。従って、本発明のポリペプチドがＣＴＬＤを含む場合、ポリペプチドは、ＣＴＬＤを介して三量体化ドメインに結合するＩＬ−２３Ｒに対する結合メンバーを最大５個有し得る。結合メンバーの各々は同じであっても異なってもよい。
【００９７】
本発明のポリペプチドの他の態様において、受容体拮抗薬が三量体化ドメインの一方の末端に結合することができ、１つ又は複数の治療剤が第２の末端に結合してもよい。薬剤は直接結合しても、又は当業者が理解するとおりの適切なリンカーを介して結合してもよい。そのような薬剤は同じ経路で拮抗薬として作用し得るか、免疫障害、癌、及び他の病態に対して異なる経路で作用し得る。ポリペプチドの末端の一方に結合されることに加え、薬剤は、三量体化ドメインの側鎖とのペプチド結合を介して、又はシステイン残基との結合を介して、三量体化ドメインに共有結合的に連結されてもよい。参照により本明細書に援用される米国特許第６，１９０，８８６号に示されるとおり、薬剤をモジュールと共有結合させる他の方法も用いることができる。
【００９８】
ＩＬ−２３Ｒに特異的なポリペプチド配列の同定
一態様において、ＩＬ−２３Ｒに対する特異的結合メンバーはポリペプチドのランダムライブラリーから、受容体に特異的に結合するライブラリーメンバーを選択することによって入手することができる。推定リガンド結合部位を含む表現型を示す数多くの系が公知である。これらには、ファージディスプレイ（例えば繊維状ファージｆｄ［Dunn (1996), Griffiths and Duncan (1998), Marks et al. (1992)］、λファージ［Mikawa et al. (1996)］）、真核生物ウイルス上でのディスプレイ（例えばバキュロウイルス［Ernst et al. (2000)］）、細胞ディスプレイ（例えば細菌細胞［Benhar et al. (2000)］、酵母細胞［Boder and Wittrup (1997)］、及び哺乳動物細胞［Whitehorn et al. (1995)］上でのディスプレイ、リボソーム結合ディスプレイ［Schaffitzel et al. (1999)］、及びプラスミド結合ディスプレイ［Gates et al. (1996)］が含まれる。
【００９９】
また、全体として参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／０２７５３９３号は、ＣＬＴＤライブラリーの作成用ディスプレイ系を完成させるための手順について具体的に記載している。一般的な手順には、（１）選択されるＣＴＬＤの３Ｄ構造が利用可能な場合にそのような情報を参照することによる、ループ領域の位置の同定、又は利用可能でない場合には、既知の配列との配列アラインメントによるβ２、β３及びβ４ストランドの配列位置の同定（これは、同様に上記に開示される、β２及びβ３コンセンサス配列エレメント及びβ４ストランド特徴に対応する配列エレメントを同定することによるさらなる確証によって支持される）；（２）β２、β３及びβ４をコードする配列に近接したエンドヌクレアーゼ制限部位の事前挿入有り又は無しで、選択されるＣＴＬＤをコードする核酸断片のタンパク質ディスプレイベクター系でのサブクローニング；及び（３）選択されるＣＴＬＤのループ領域の一部又は全てをコードする核酸断片の、多数の核酸断片からなる集合のランダムに選択したメンバーによる置換（これは、受け入れるフレームワークをコードする核酸コンテクストに挿入された後、元のループ領域ポリペプチド断片をコードする核酸断片をランダムに選択された核酸断片に置換する）が含まれる。元のループセグメント又はループ領域全体に置き換わる新しいポリペプチドをコードする、クローニングされた核酸断片の各々は、その新しい配列のコンテクストの範囲内で決定されるリーディングフレームにおいて解読され得る。
【０１００】
ネイティブなＩＬ−２３がＩＬ−２３Ｒを結合して活性化させることを阻害するホモ三量体タンパク質として機能する複合体が形成されてもよい。しかしながら、初めにＩＬ−２３Ｒ結合活性を有するペプチドを同定しなければならない。これを達成するため、既知の結合活性を有するペプチド、又はディスプレイライブラリーからスクリーニングによって同定されるさらなる新規ペプチドを使用することができる。限定はされないが、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、及び酵母ディスプレイなど、多くの異なるディスプレイ系が利用可能である。
【０１０１】
新規ペプチドを結合活性で選択するため、ライブラリーを構築し、ＩＬ−２３Ｒへの結合性について、単一の単量体ＣＴＬＤドメインとして、或いはファージの表面に提示される個別のペプチドとして、初期スクリーニングを行うことができる。ＩＬ−２３Ｒ結合活性を有する配列が同定されると、続いてそれらの配列がヒトテトラネクチンの三量体化ドメインにグラフトされ、ＩＬ−２３Ｒの結合能を有する候補タンパク質治療薬が作成され得る。 
【０１０２】
これらのファージディスプレイライブラリー及び三量体化ドメイン構築物の構築では、４つの主要な戦略が用いられ得る。第１の戦略は、ランダムペプチドファージディスプレイライブラリーの構築及び／又は使用であり得る。ランダム直鎖状ペプチド及び／又はジスルフィドで拘束されたループとして構築されるランダムペプチドは、ファージ粒子の表面に個別的に提示され、ファージディスプレイ「パニング（panning）」により所望のＩＬ−２３Ｒとの結合性について選択され得る。ＩＬ−２３Ｒ結合活性を有するペプチドクローンが得られた後、それらのペプチドはヒトテトラネクチンの三量体化ドメインに、又はＣＴＬＤドメインのループ内へのグラフトに続いて三量体化ドメインにグラフトされ、拮抗活性についてスクリーニングされ得る。
【０１０３】
ファージディスプレイライブラリー及び三量体化ドメイン構築物を構築する第２の戦略は、ＣＴＬＤ由来の結合体を得ることを含み得る。ライブラリーは、ファージの表面に提示されるヒトテトラネクチンのＣＴＬＤ足場内の５つの異なるループの１つ又は複数におけるアミノ酸をランダム化することにより構築され得る。ＩＬ−２３Ｒとの結合は、ファージディスプレイパニングにより選択することができる。ＩＬ−２３Ｒ結合活性を示すペプチドループを含むＣＴＬＤクローンが得られた後、次にそれらのＣＴＬＤクローンはヒトテトラネクチンの三量体化ドメインにグラフトされ、拮抗活性についてスクリーニングされ得る。
【０１０４】
ファージディスプレイライブラリー及び三量体化ドメイン構築物を構築する第３の戦略は、ＩＬ−２３Ｒとの結合能を有する既知の配列を選び、それらをヒトテトラネクチンの三量体化ドメインに直接グラフトし、結合活性についてスクリーニングすることを含み得る。
【０１０５】
第４の戦略は、ＩＬ−２３Ｒとの既知の結合能を有するペプチド配列を使用することを含み、初めにそれらの結合性を、ペプチドに隣接するランダム化アミノ酸又は／及びペプチド内のランダム化され選択された内部アミノ酸を含む新規ライブラリーを作成することによって向上させ、続いて結合性の向上についてファージディスプレイにより選択する。親和性が向上した結合体が得られた後、それらのペプチドの結合体をヒトテトラネクチンの三量体化ドメインにグラフトし、拮抗活性についてスクリーニングすることができる。この方法では初期ライブラリーを、第１の戦略（上記）のとおりファージ粒子の表面に提示される遊離ペプチドとしても、又は同様に上記で考察する第２の戦略のとおりＣＴＬＤ足場内の拘束されたループとしても構築することができる。親和性が向上した結合体が得られた後、ヒトテトラネクチンの三量体化ドメインに対するそれらのペプチドのグラフト及び拮抗活性についてのスクリーニングが行われ得る。
【０１０６】
Ｎ末端（Ｖ１７）で最大１６残基が取り除かれるか、或いはＣ末端が変化した型の三量体化ドメインを使用することができる。ＴｒｉｐＶ［配列番号６０］、ＴｒｉｐＴ［配列番号６１］、ＴｒｉｐＱ［配列番号６２］、及びＴｒｉｐＫ［配列番号５９］（図２を参照のこと）と命名されるＣ末端のバリエーションは、三量体化ドメイン上のＣＴＬＤドメインの特有の提示を可能にする。ＴｒｉｐＶ、ＴｒｉｐＴ、ＴｒｉｐＱは、ＣＴＬＤ分子の三量体化モジュールとの直接的な融合物に相当し、構造上のフレキシブルさは一切ないが、ＴｒｉｐＶからＴｒｉｐＴに、及びＴｒｉｐＴからＴｒｉｐＱに移るにつれＣＴＬＤ分子が１／３旋回している。これは、これらのアミノ酸の各々がαヘリックスターンの状態で、一周するのに３．２ａａが必要であるという事実に起因する。第１、第３及び第４の戦略において結合性について選択される遊離ペプチドは、上記の型の三量体化ドメインのいずれにグラフトすることもできる。次に得られる融合物をスクリーニングして、最高の活性をもたらすペプチドの組み合わせ及び配向がどれかを確認することができる。テトラネクチンのＣＴＬＤのループ内に拘束された結合性について選択されるペプチドは、完全長三量体化ドメインにグラフトすることができる。
【０１０７】
より詳細に、４つの戦略を以下に記載する。これらの戦略はファージディスプレイに主眼を置いているが、ポリペプチドを同定する他の同等の方法を用いることができる。
【０１０８】
戦略１
限定はされないが、New England Biolabs Ph.D. Phage display Peptide Library Kitなどのペプチドディスプレイライブラリーキットが市販されており、ＩＬ−２３Ｒ結合活性を有する新型且つ新規のペプチドの選択に使用するために購入することができる。New England Biolabsのキットは３つの形態が利用可能である：Ph.D.-7 Peptide Library Kit、直鎖状ランダムペプチド７個のアミノ酸長を含み、ライブラリーサイズ２．８×１０９個の独立クローン、Ph.D.-C7C Disulfide Constrained Peptide Library Kit、ジスルフィドで拘束されたループとして構築されたペプチドを含み、ランダムペプチド７個のアミノ酸長、及びライブラリーサイズ１．２×１０９個の独立クローン、並びにPh.D.-12 Peptide Library Kit、直鎖状ランダムペプチド１２個のアミノ酸長を含み、ライブラリーサイズ２．８×１０９個の独立クローン。
【０１０９】
或いは同様のライブラリーを、これらのキットと同様のランダムアミノ酸を含むペプチドでデノボ構築することができる。構築には、ＮＮＫ戦略、又はＮＮＳ戦略のいずれかを用いてランダムヌクレオチドが生成され、ここでＮは４つの核酸塩基Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴの等量混合物を表す。ＫはＧ又はＴのいずれかの等量混合物を表し、及びＳはＧ又はＣのいずれかの等量混合物を表す。これらのランダム化位置は、ファージ又はファージミドのいずれかのディスプレイベクター系における遺伝子ＩＩＩタンパク質に対してクローニングされ得る。ＮＮＫ戦略及びＮＮＳ戦略のいずれも２０種の可能なアミノ酸全て及び１つの終止コドンを網羅し、コードされるアミノ酸の頻度に僅かな違いがある。細菌形質転換の効率には限界があるため、ファージディスプレイ用に生成されるライブラリーサイズは上記で始まるオーダーであり、従って最大７つのランダム化アミノ酸位置を含むペプチドを生成することができ、しかしなお理論上の組み合わせ（２０７＝１．２８×１０９）のレパートリー全体を網羅する。ＮＮＫ戦略又はＮＮＳ戦略のいずれを用いても、さらに長いペプチドライブラリーを構築することができるが、しかしながら実際のファージディスプレイライブラリーサイズは、細菌形質転換の要件に起因して、そのような長さに関連して可能性のある理論上の全てのアミノ酸の組み合わせは網羅しないものと思われる。
【０１１０】
従って、より大きい／より長いランダムペプチドが関与するリボソームディスプレイライブラリーが有益であり得る。ジスルフィド拘束（constrained)ライブラリーについては、同様のＮＮＫ又はＮＮＳランダムヌクレオチド戦略が使用される。しかしながらこれらのランダム位置にはシステインアミノ酸残基が隣接し、ジスルフィド架橋の形成が可能である。Ｎ末端システインにはアラニンなどのさらなるアミノ酸が先行することが多い。加えて、限定はされないがいくつかのグリシン残基で構成されるフレキシブルなリンカーが、上記のランダムペプチドライブラリーのいずれかについてペプチドと遺伝子ＩＩＩタンパク質との間のスペーサーとして作用し得る。
【０１１１】
戦略２
図４及び図５に示されるヒトテトラネクチンＣＴＬＤは５つのループを含み（ＬＳＡに４つのループ及び１つのループを含むＬＳＢ）、これらのループは種々のタンパク質標的に対するＣＴＬＤの結合性を付与するよう変化させることができる。ランダムアミノ酸配列をこれらのループの１つ又は複数に置き、所望の結合特性を有するＣＴＬＤドメインを選択し得るライブラリーを作成することができる。ヒトテトラネクチンＣＴＬＤの５つのループのいずれか又は全ての範囲内に拘束されるランダムペプチドを含むこれらのライブラリーの構築は、（限定はされないが）上記で戦略１に記載したとおりのＮＮＫ又はＮＮＳのいずれかを用いて達成することができる。７つのランダムペプチドをＴＮ  ＣＴＬＤのループ１に挿入することができる方法の唯一つの例は以下のとおりである。
【０１１２】
鋳型なしのＰＣＲ反応においてプライマー１Ｘ  ｆｏｒ（配列番号  ）及び１Ｘ  ｒｅｖ２（配列番号  ）を使用してＰＣＲを達成して断片Ａを生成することができ、及び鋳型なしの別個のＰＣＲ反応においてプライマーＢｓｔＸ１ｆｏｒ（配列番号  ）及びＰｓｔＢｓｓＲｅｖＣ（配列番号  ）を使用して断片Ｂを生成することができる。ＰＣＲは高性能ポリメラーゼ又はｔａｑブレンド及び標準的なＰＣＲ熱サイクル条件を用いて実施することができる。次にこれらの２つの重複断片を精製し、外側プライマーＢｇｌｆｏｒｌ２（配列番号５）及びＰｓｔＲｅｖ（配列番号６）と共に合わせて使用して、ＰＣＲにより所望のＤＮＡ断片を精製することができる。制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩ及びＰｓｔＩ、又は他のプライマーを使用する場合には他の適切な制限酵素により消化すると、ＴＮ  ＣＴＬＤのループ又はそのいくらかの部分を含む断片のゲル分離が可能となる。次にこの精製断片を、ｐＰＨＣＰＡＢ（配列番号１５０）又はｐＡＮＡ２７（配列番号１６４）などの同様に消化したファージディスプレイベクターにライゲートすることができる（図６を参照）。
【０１１３】
ランダム化アミノ酸に置き換えることによる他のループの修飾も同様に、上記に示すとおり実施することができる。ループ内の定義されたアミノ酸をランダム化アミノ酸に置き換えることは、任意の具体的なループに限定されるものではなく、また元のループサイズに限定されるものでもない。同様に、ループの全てを置き換える必要はなく、ループのいずれかについて部分的に置き換えることが可能である。ある場合には、ループ内の元のアミノ酸の一部、例えば図７に示されるカルシウム配位アミノ酸の維持が望ましいこともある。そのような場合には、ランダム化アミノ酸による置き換えはカルシウム配位アミノ酸を維持するようにループ内のより少数のアミノ酸について行われ得るか、又は追加的なランダム化アミノ酸が、全体的なループサイズは増加するものの、それらのカルシウム配位アミノ酸はなお維持されるようにループに付加され得る。ループ１と２、又はループ３と４など、ループ領域を組み合わせて一つのより大きい置換ループにすることにより、極めて大きいペプチドを適応させて試験することができる。加えて、テトラネクチンのＣＴＬＤの代わりに他のＣＴＬＤ、例えば限定はされないがＭＢＬ  ＣＴＬＤを使用することができる。これらのＣＴＬＤへのペプチドのグラフトは、上記の記載と同様の方法を用いて行うことができる。
【０１１４】
本発明の様々な例示的態様において、ＩＬ−２３Ｒに結合するポリペプチドは、コンビナトリアルペプチドライブラリー、及びそのライブラリーのポリペプチドをコードする核酸配列のライブラリーを使用して、ＣＴＬＤ骨格に基づき同定することができ、ここでポリペプチドのＣＴＬＤは多くの例示的スキームに従い修飾されており、それらには識別のみを目的としてスキーム（ａ）〜（ｈ）が付されている：
【０１１５】
一態様において、本発明はコンビナトリアルペプチドライブラリー、及びそのライブラリーのポリペプチドをコードする核酸配列のライブラリーを提供し、ここでポリペプチドのＣＴＬＤは多くのスキームに従い修飾されており、それらには識別のみを目的としてスキーム（ａ）〜（ｊ）が付されている。各スキームについては本明細書により詳細に記載されるが、修飾は少なくとも以下のとおりである：
【０１１６】
（ａ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、ループ１における少なくとも１個のアミノ酸の挿入と、ループ１内での少なくとも５個のアミノ酸のランダム置換とを含むアミノ酸修飾；
【０１１７】
（ｂ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、ループ１内での少なくとも５個のアミノ酸のランダム置換と、ループ２内での少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換とを含むアミノ酸修飾；
【０１１８】
（ｃ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、ループ１内での少なくとも７個のアミノ酸のランダム置換と、ループ４における少なくとも１個のアミノ酸挿入とを含むアミノ酸修飾；
【０１１９】
（ｄ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、ループ３における少なくとも１個のアミノ酸挿入と、ループ３内での少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換とを含むアミノ酸修飾；
【０１２０】
（ｅ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、２つのループを組み合わせて単一のループにする修飾を含み、ここで２つの組み合わされるループはループ３及びループ４であるアミノ酸修飾；
【０１２１】
（ｆ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、ループ４における少なくとも１個のアミノ酸挿入と、ループ４内での少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換とを含むアミノ酸修飾；
【０１２２】
（ｇ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）及びループセグメントＢ（ＬＳＢ）における５つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、ループ３における少なくとも５個のアミノ酸残基のランダム置換と、ループ５内での少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換とを含むアミノ酸修飾；
【０１２３】
（ｈ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、ループ３における少なくとも１個のアミノ酸のランダム置換及び少なくとも６個のアミノ酸の挿入を含むアミノ酸修飾；
【０１２４】
（ｉ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、（１）ループ３における少なくとも６個のアミノ酸のランダム置換と、（２）ループ３における少なくとも６個のアミノ酸のランダム置換及び少なくとも１個のアミノ酸挿入との混合体を含むアミノ酸修飾；及び
【０１２５】
（ｊ）ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つに、又はループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるループ５に、少なくとも４個以上のアミノ酸の挿入を含むアミノ酸修飾。
【０１２６】
スキーム（ａ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ここでランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのＬＳＡにおける４つのループのうちの少なくとも１つ又はＬＳＢにおけるループにおけるアミノ酸修飾であって、ループ１における少なくとも１個のアミノ酸挿入と、ループ１内での少なくとも５個のアミノ酸のランダム置換とを含むアミノ酸修飾を含む。
【０１２７】
コンビナトリアルライブラリーのこの態様の特定の実施形態において、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来であるとき、ＣＴＬＤはまたアルギニン−１３０のランダム置換も有する。ヒトテトラネクチンのＣＴＬＤ以外のＣＴＬＤについて、このペプチドはＣ末端方向でループ２のＣ末端ペプチドに直ちに隣接して位置する。例えばマウステトラネクチンでは、このペプチドはＧｌｙ−１３０である。コンビナトリアルライブラリーのこの態様の特定の実施形態において、ＣＴＬＤがヒト又はマウステトラネクチン由来であるとき、ＣＴＬＤはループ４におけるリジン−１４８のアラニンへの置換を含む。
【０１２８】
特定の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ａ）の修飾ＣＴＬＤを有するとき、アミノ酸修飾は、ループ１における２個のアミノ酸挿入と、ループ１内での少なくとも５個のアミノ酸のランダム置換とを含む。他の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ａ）の修飾ＣＴＬＤを有し、且つＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来であるとき、アミノ酸修飾は、ループ１における少なくとも１個のアミノ酸挿入と、ループ１内での少なくとも５個のアミノ酸のランダム置換とを含み、且つアルギニン１３０のランダム置換を含む。具体的な一実施形態において、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ａ）の修飾ＣＴＬＤを有し、且つＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来であるとき、アミノ酸修飾は、ループ１における２個のアミノ酸挿入と、ループ１内での５個のアミノ酸のランダム置換と、アルギニン１３０のランダム置換とを含む。具体的な一実施形態において、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ａ）の修飾ＣＴＬＤを有し、且つＣＴＬＤがマウステトラネクチン由来であるとき、アミノ酸修飾は、ループ１における２個のアミノ酸挿入と、ループ１内での５個のアミノ酸のランダム置換と、ロイシン１３０のランダム置換とを含む。スキーム（ａ）の任意の実施形態において、アミノ酸修飾はリジン−１４８のアラニンへの置換をさらに含み得る。従って、コンビナトリアルライブラリーのこの態様の具体的な一実施形態において、ＣＴＬＤは、ループ１における２個のアミノ酸挿入と、ループ１内での少なくとも５個のアミノ酸のランダム置換と、アルギニン−１３０又はＣ末端方向でループ２の外側にそれに隣接して位置する他のアミノ酸のランダム置換と、ループ４におけるリジン−１４８のアラニンへの置換とを含む。
【０１２９】
スキーム（ｂ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ここでランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのＬＳＡにおける４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、ループ１内での少なくとも５個のアミノ酸のランダム置換と、ループ２内での少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換とを含むアミノ酸修飾を含む。
【０１３０】
スキーム（ｂ）のコンビナトリアルライブラリーのこの態様の特定の実施形態において、ＣＴＬＤがテトラネクチン由来であるとき、アミノ酸修飾は、ループ１内での少なくとも５個のアミノ酸のランダム置換と、ループ２内での少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換と、アルギニン−１３０、又はＣ末端方向でループ２の外側にそれに隣接して位置する他のアミノ酸のランダム置換とを含む。特定の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｂ）の修飾ＣＴＬＤを有し、且つＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来であるとき、アミノ酸修飾は、ループ１における少なくとも５個のアミノ酸のランダム置換と、ループ２における少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換とを含み、及びアルギニン１３０のランダム置換を含む。一実施形態において、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｂ）の修飾ＣＴＬＤを有し、且つＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来であるとき、アミノ酸修飾は、ループ１における５個のアミノ酸のランダム置換と、ループ２における３個のアミノ酸のランダム置換と、アルギニン１３０のランダム置換とを含む。特定の他の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｂ）の修飾ＣＴＬＤを有し、且つＣＴＬＤがマウステトラネクチン由来であるとき、アミノ酸修飾は、ループ１における少なくとも５個のアミノ酸のランダム置換と、ループ２における少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換とを含み、及びロイシン１３０のランダム置換を含む。一実施形態において、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｂ）の修飾ＣＴＬＤを有し、且つＣＴＬＤがマウステトラネクチン由来であるとき、アミノ酸修飾は、ループ１における５個のアミノ酸のランダム置換と、ループ２における３個のアミノ酸のランダム置換と、ロイシン１３０のランダム置換とを含む。スキーム（ｂ）の任意の実施形態において、アミノ酸修飾はリジン−１４８のアラニンへの置換をさらに含み得る。従って、具体的な一実施形態において、アミノ酸修飾は、ループ１内での少なくとも５個のアミノ酸のランダム置換と、ループ２内での少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換と、アルギニン−１３０又はＣ末端方向でループ２の外側にそれに隣接して位置する他のアミノ酸のランダム置換と、ループ４におけるリジン−１４８のアラニンへの置換とを含む。
【０１３１】
スキーム（ｃ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ここでランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、ループ１内での少なくとも７個のアミノ酸のランダム置換と、ループ４における少なくとも１個のアミノ酸挿入とを含むアミノ酸修飾を含む。
【０１３２】
コンビナトリアルライブラリーのこの態様の特定の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーのポリペプチドメンバーは、ループ４内での少なくとも２個のアミノ酸のランダム置換をさらに含む。この態様の特定の他の実施形態において、アミノ酸修飾はループ４における３個のアミノ酸挿入を含み、任意選択により、少なくとも２個のアミノ酸のランダム置換をさらに含む。一実施形態において、アミノ酸修飾は、ループ１内での少なくとも７個のアミノ酸のランダム置換と、ループ４における少なくとも３個のアミノ酸挿入と、ループ４内での少なくとも２個のアミノ酸のランダム置換とを含む。具体的な一実施形態において、アミノ酸修飾は、ループ１内での７個のアミノ酸のランダム置換と、ループ４における３個のアミノ酸挿入と、ループ４内での２個のアミノ酸のランダム置換とを含む。
【０１３３】
スキーム（ｄ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ここでランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、ループ３における少なくとも１個のアミノ酸挿入及びループ３内での少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換を含むアミノ酸修飾を含む。
【０１３４】
特定の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｄ）の修飾ＣＴＬＤを有するとき、アミノ酸修飾はループ４における少なくとも１個のアミノ酸挿入をさらに含むことができ、ループ４内での少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換をさらに含むことができる。スキーム（ｄ）について記載される任意の実施形態において、アミノ酸修飾はループ３に３個のアミノ酸挿入を含み得る。スキーム（ｄ）について記載される任意の実施形態において、アミノ酸修飾はループ４に３個のアミノ酸挿入を含み得る。従って、特定の実施形態において、アミノ酸修飾は、ループ３内での少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換と、ループ４内での少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換と、ループ３における少なくとも１個のアミノ酸挿入と、ループ４における少なくとも１個のアミノ酸挿入とを含む。特定の実施形態において、アミノ酸修飾は、ループ３内での少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換と、ループ４内での少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換と、ループ３における少なくとも３個のアミノ酸挿入と、ループ４における少なくとも３個のアミノ酸挿入とを含む。具体的な一実施形態において、アミノ酸修飾は、ループ３内での３個のアミノ酸のランダム置換と、ループ４内での３個のアミノ酸のランダム置換と、ループ３における３個のアミノ酸挿入と、ループ４における３個のアミノ酸挿入とを含む。記載される任意の実施形態において、ＣＴＬＤがテトラネクチンであるとき、アミノ酸修飾は、ループ４におけるリジン−１４８のアラニンへのランダム置換をさらに含むことができる。
【０１３５】
スキーム（ｅ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ここでランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、２つのループを組み合わせて単一のループとする修飾を含むアミノ酸修飾を含み、ここで２つの組み合わされるループはループ３及びループ４である。特定の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーのメンバーがスキーム（ｅ）の修飾ＣＴＬＤを有するとき、アミノ酸修飾は、ループ３内での少なくとも６個のアミノ酸のランダム置換と、ループ４内での少なくとも４個のアミノ酸のランダム置換とを含む。具体的な一実施形態において、アミノ酸修飾は、ループ３内での６個のアミノ酸のランダム置換と、ループ４内での４個のアミノ酸のランダム置換とを含む。スキーム（ｅ）の任意の実施形態において、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来であるとき、アミノ酸修飾はプロリン−１４４のランダム置換をさらに含み得る。具体的な一実施形態において、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来であるとき、アミノ酸修飾は、ループ３内での６個のアミノ酸のランダム置換と、ループ４内での４個のアミノ酸のランダム置換と、プロリン１４４のランダム置換とを含み、それにより例えばＮＷＥＸＸＸＸＸＸＸ  ＸＧＧＸＸＸＮ（配列番号  ）（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、及び配列番号  のアミノ酸配列は単一のループ領域を形成する）を含む、ループ３とループ４とが組み合わされたアミノ酸配列がもたらされる。従って、具体的な一実施形態においてコンビナトリアルライブラリーのポリペプチドメンバーは配列ＮＷＥＸＸＸＸＸＸＸ  ＸＧＧＸＸＸＮ（配列番号  ）を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、且つ配列番号  のアミノ酸配列は、組み合わされて修飾されたループ３及びループ４からの単一のループを形成する。
【０１３６】
スキーム（ｆ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ここでランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、ループ４における少なくとも１個のアミノ酸挿入と、ループ４内での少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換とを含むアミノ酸修飾を含む。特定の実施形態において、アミノ酸修飾はループ４に４つのアミノ酸挿入を含む。一実施形態において、アミノ酸修飾は、ループ４に少なくとも４個のアミノ酸挿入と、ループ４内での少なくとも３個のアミノ酸のランダム置換とを含む。具体的な一実施形態において、アミノ酸置換は、ループ４における４つのアミノ酸挿入と、ループ４内での３個のアミノ酸のランダム置換とを含む。
【０１３７】
スキーム（ｇ）に関して、コンビナトリアルライブラリーのポリペプチドメンバーは修飾されたループ３と修飾されたループ５とを含み、ここで修飾されたループ３は５個のアミノ酸残基のランダム化を含み、及び修飾されたループ５は３個のアミノ酸残基のランダム化を含む。一実施形態において、コンビナトリアルライブラリーのポリペプチドメンバーは修飾されたループ３と、修飾されたループ５と、修飾されたループ４とを含み、ここでループ４に対する修飾はプラスミノーゲン結合を無効にする。例えば、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｇ）の修飾ＣＴＬＤを有し、且つＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来であるとき、アミノ酸修飾は、ＣＴＬＤのプラスミノーゲン結合親和性を調節する１つ又は複数のアミノ酸修飾、例えばリジン１４８のアラニンへの置換をループ４にさらに含むことができる。従って、特定の実施形態において、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来であるとき、アミノ酸修飾は、ループ３における少なくとも５個のアミノ酸残基のランダム置換と、ループ５における少なくとも３個のアミノ酸残基のランダム置換と、ループ４におけるリジン１４８のアラニンへの置換とを含む。具体的な一実施形態において、アミノ酸修飾は、ループ３における５個のアミノ酸残基のランダム置換と、ループ５における３個のアミノ酸残基のランダム置換とを含み、及び別の具体的な実施形態では、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来であるとき、アミノ酸修飾はループ４にリジン１４８のアラニンへの置換をさらに含む。
【０１３８】
スキーム（ｈ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ここでランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、少なくとも１個のアミノ酸のランダム置換と、少なくとも６個のアミノ酸挿入とを含むアミノ酸修飾を含む。特定の実施形態において、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来であるとき、アミノ酸修飾は、ＣＴＬＤのプラスミノーゲン結合親和性を調節する１つ又は複数のアミノ酸修飾、例えばリジン１４８のアラニンへの置換をループ４にさらに含むことができる。特定の実施形態において、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来であるとき、コンビナトリアルライブラリーのメンバーは、ループ３における少なくとも１個のアミノ酸のランダム置換及び少なくとも６個のアミノ酸の挿入と、ループ４におけるリジン１４８のアラニンへの置換とを有する。具体的な一実施形態において、アミノ酸修飾は、ループ３に１個のアミノ酸のランダム置換と６個のアミノ酸の挿入とを含む。具体的な一実施形態において、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来であるとき、コンビナトリアルライブラリーのメンバーは、ループ３における１個のアミノ酸のランダム置換及び６個のアミノ酸の挿入と、ループ４におけるリジン１４８のアラニンへの置換とを有する。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来であるとき、置換の一つはイソロイシン１４０の置換である。
【０１３９】
スキーム（ｉ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ここでランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、ループ３における６個のアミノ酸のランダム置換と、ループ３における６個のアミノ酸のランダム置換及び１つのアミノ酸挿入との混合体を含むアミノ酸修飾を含む。一実施形態において、この混合体はループ３に６個のアミノ酸のランダム置換と２個のアミノ酸挿入とをさらに含む。従って一実施形態において、アミノ酸修飾は、ループ３における６個のアミノ酸のランダム置換と、ループ３における６個のアミノ酸のランダム置換及び１つのアミノ酸挿入と、ループ３における６個のアミノ酸のランダム置換及び２個のアミノ酸挿入との混合体を含む。スキーム（ｉ）の任意の実施形態において、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来であるとき、アミノ酸修飾はループ４にリジン１４８のアラニンへの置換をさらに含む。
【０１４０】
スキーム（ｉ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ここでランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾であって、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つに、又はループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるループ５に、少なくとも４個のアミノ酸以上の挿入を含むアミノ酸修飾を含む。
【０１４１】
コンビナトリアルライブラリーがループ４領域に対して１つ又は複数のアミノ酸修飾を（単独で、又はＣＴＬＤの他の領域に対する修飾との組み合わせで）含む実施形態では、ある修飾が、ＣＴＬＤの金属イオン結合親和性を維持、調節、又は無効化するように設計される。そのような修飾はＣＴＬＤのプラスミノーゲン結合活性に影響を及ぼす（例えば、Nielbo, et al., Biochemistry, 2004, 43 (27), pp 8636-8643；又はGraversen 1998を参照のこと）。
【０１４２】
ライブラリーのポリペプチドメンバーは、１つ又は複数のアミノ酸修飾（例えば、挿入、置換、伸長、又はランダム化による）を、ＣＴＬＤの４つのＬＳＡループ及びＬＳＢループ（ループ５）の任意の組み合わせに含むことができる。従って、本明細書に記載される様々な実施形態のいずれにおいても、ランダム化ＣＴＬＤはＬＳＢループ領域のループ（ループ５）に１つ又は複数のアミノ酸修飾を、単独で、或いはＬＳＡループ領域（ループ１〜４）の任意の１つ、２つ、３つ、又は４つのループにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾との組み合わせで含み得る。一態様において、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ここでランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループのうちの少なくとも１つにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾と、ループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるループ（ループ５）における１つ又は複数のアミノ酸修飾とを含み、ここで１つ又は複数のアミノ酸修飾はＬＳＢアミノ酸残基のランダム化を含む。
【０１４３】
本明細書に記載される様々な実施形態によれば、組み合わせライブラリーのポリペプチドメンバーは、ＣＴＬＤのループ領域（ＬＳＡ及びＬＳＢ）における任意の２つ、３つ、４つ、又は５つのループにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾（例えば、２つのループに対する、３つのループに対する、４つのループに対する、又は５つのループ全てに対するランダムアミノ酸修飾の任意のランダムな組み合わせ）を有し得る。組み合わせライブラリーのポリペプチドメンバーは、ループ領域（ＬＳＡ及びＬＳＢ）の外側にあるＣＴＬＤの領域、例えばαヘリックス又はβストランドに対するさらなるアミノ酸修飾をさらに含むことができる（例えば、図１を参照のこと）。
【０１４４】
本発明のさらなる実施形態において、ＣＴＬＤループ領域は、以下の非限定的な実施例に詳述される例示的な構築物を越えて伸長することができる。
【０１４５】
一態様において、本発明はまた、上述の態様及び実施形態のいずれか一つに係るコンビナトリアルポリペプチドライブラリーのポリペプチドをコードする核酸分子のライブラリーも提供する。この態様の一実施形態において、本発明は、ライブラリーのポリペプチドをコードする核酸配列のライブラリーを提供し、ここでポリペプチドのＣＴＬＤは、スキーム（ａ）〜（ｊ）により修飾されている。
【０１４６】
以下の実施例にさらに詳しく記載するとおり、例えば、図８に示されるとおりの配列番号１３３〜１４１を含め、好ましい結合特性を有する多くのポリペプチドが修飾スキーム（ａ）〜（ｈ）の１つ又は複数により特定されている。
【０１４７】
戦略３
別の戦略では、ＩＬ−２３Ｒに結合する既知のポリペプチドを、直鎖状遊離ペプチドとして、又はシステインを用いてジスルフィドで拘束されたループとして、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかの端部の三量体化ドメインに直接クローニングすることができる。ＩＬ−２３Ｒの結合能を有する一本鎖抗体又はドメイン抗体はまた、三量体化ドメインのいずれの端部にもクローニングすることができる。加えて、公知の結合特性を有するペプチドを、ＴＮ  ＣＴＬＤのループ領域のいずれか一つに直接クローニングすることができる。ジスルフィドで拘束されたループとして、又は抗体の相補性決定領域として選択されるペプチドは、ヒトテトラネクチンのＣＴＬＤのループ領域への再配置に非常に適し得る。次に、これらの構築物の全てについて、単量体としての結合性、並びに三量体化ドメインと融合したときの三量体としての結合活性及び阻害活性を試験することができる。
【０１４８】
戦略４：
場合によっては、結合活性を有するペプチドを直接クローニングするだけでは十分でないこともあり、さらなる最適化及び選択が必要となり得る。例として、ＩＬ−２３Ｒとの公知の結合性を有するペプチド、例えば、限定はされないが上記に言及したものは、ヒトテトラネクチンのＣＴＬＤにグラフトすることができる。結合について最適なこれらのペプチドの提示を選択するため、隣接するアミノ酸の１つ又は複数をランダム化し、続いて結合についてファージディスプレイ選択を行うことができる。さらに、単独では限られた、又は弱い結合性を示すペプチドもまた、別のさらなるループのランダム化を含むＣＴＬＤライブラリーのループの１つにグラフトすることができ、ここでも続いて結合性及び／又は特異性の増加についてファージディスプレイによる選択が行われる。加えて、特異的に相互作用／結合するアミノ酸が公知である場合に結晶構造により同定されるペプチドについて、非結合性のアミノ酸のランダム化を探り、続いて結合性及び受容体特異性の増加についてファージディスプレイにより選択することができる。結合に関与すると特定されるＩＬ−２３リガンドの領域もまた、種にわたって調べることができる。保存アミノ酸を維持することができる一方、ランダム化及び種で保存されない位置の選択を試験することができる。
【０１４９】
治療方法
本発明の別の態様は、ＩＬ−２３Ｒを発現する細胞におけるＩＬ−２３Ｒの活性化を阻止する方法に関する。この方法は、三量体化ドメインと、ＩＬ−２３Ｒに特異的に結合する少なくとも１つのポリペプチドとを含む本発明のＩＬ−２３Ｒ結合ポリペプチドに細胞を接触させる工程を含む。この態様の一実施形態において、この方法は、細胞を本発明の三量体複合体と接触させる工程を含む。ＩＬ−２３Ｒ結合ポリペプチドはＩＬ−２３Ｒ（又はヘテロ二量体受容体）の拮抗薬であってもよく、又は上記に記載したとおり、ＩＬ−２３Ｒに結合することにより、三量体化ドメインと会合した治療剤の腫瘍への、炎症部位への、又はＩＬ−２３Ｒの提示が望ましい他の位置への局所送達を可能にしてもよい。
【０１５０】
別の態様において、本発明は、三量体化ドメインと、ＩＬ−２３Ｒに特異的に結合する少なくとも１つのポリペプチドとを有するポリペプチドを含むＩＬ−２３Ｒ拮抗薬の治療有効量を対象に投与することによる、免疫障害又は腫瘍を有する対象の治療方法に関する。この態様の一実施形態において、この方法は、本発明の三量体複合体を対象に投与することを含む。
【０１５１】
本発明の別の態様は併用療法に関する。ＩＬ−２３Ｒ拮抗薬と治療剤とを含む製剤もまた、本発明により提供される。そのような製剤は保存並びに治療投与に特に好適であるものと考えられる。製剤は公知の技術によって調製することができる。例えば、製剤はゲルろ過カラム上での緩衝液交換により調製されてもよい。
【０１５２】
本明細書に記載されるＩＬ−２３Ｒ拮抗薬及び治療剤は、様々な治療適用で用いられ得る。それらの適用の中には、様々な癌の治療方法がある。ＩＬ−２３Ｒ拮抗薬及び治療剤は、ボーラス注入としての、若しくはある期間にわたる持続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、又は吸入経路などの公知の方法に従い投与することができる。任意選択により、投与は様々な市販の装置を使用したミニポンプ注入によって実施されてもよい。
【０１５３】
ＩＬ−２３Ｒ拮抗薬の投与に有効な投薬量及びスケジュールは実験的に決定することができ、そのような決定を下すことは当該分野の技術範囲内である。単回又は複数回投薬量が用いられてもよい。ここでは、単独で使用する拮抗薬の有効な投薬量又は量は、１日約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重又はそれ以上の範囲であり得ると考えられる。投薬量の種間スケーリングは、例えばMordenti et al., Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991)に開示されるとおりの当該技術分野において公知の方法で実施することができる。
【０１５４】
ＩＬ−２３Ｒ拮抗薬の生体内投与が用いられるとき、通常の投薬量は、投与経路に応じて１日約１０ｎｇ／ｋｇ〜最大１００ｍｇ／ｋｇ哺乳動物体重又はそれ以上、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／Ｋｇ／日まで異なり得る。特定の投薬量及び送達方法に関する指針は、文献に提供されている［例えば、米国特許第４，６５７，７６０号；同第５，２０６，３４４号；又は同第５，２２５，２１２号を参照のこと］。当業者は、異なる製剤が異なる治療化合物及び異なる障害に対して有効であり得ること、例えばある臓器又は組織を標的とする投与が、別の臓器又は組織に対する送達と異なる方法での送達を必然的に伴い得ることを理解するであろう。当業者は、投与しなければならないＩＬ−２３Ｒ拮抗薬の投薬量が、例えば、ＩＬ−２３Ｒ拮抗薬の投与を受け得る哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に投与される他の薬物又は療法に応じて異なり得ることを理解するであろう。
【０１５５】
本方法ではさらに追加的な療法が用いられ得ることが企図される。１つ又は複数の他の療法には、限定はされないが、放射線療法の投与、サイトカイン、増殖阻害剤、化学療法剤、細胞傷害剤、チロシンキナーゼ阻害薬、ｒａｓファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬、血管新生阻害薬、及びサイクリン依存性キナーゼ阻害薬又は当該技術分野において公知のＩＬ−２３Ｒ拮抗薬による死滅に対する癌細胞の感受性を亢進する任意の他の薬剤が含まれ得る。
【０１５６】
化学療法剤の調製及び投薬スケジュールは、製造者の指示に従い、又は熟練した従事者によって実験的に決定されるとおり用いられ得る。そのような化学療法の調製及び投薬スケジュールはまた、Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992)にも記載されている。化学療法剤は、Ａｐｏ２Ｌ変異体の投与の前であっても、若しくはその後であってもよく、又はそれと同時に投与されてもよい。
【０１５７】
本発明のポリペプチドと治療剤（及び１つ又は複数の他の療法）とは同時的に（一斉に）、又は逐次的に投与され得る。詳細な実施形態では、本発明の非ネイティブなポリペプチド又はその多量体（例えば、三量体）複合体と治療剤とは、同時投与される。別の実施形態では、ポリペプチド又は三量体複合体は治療剤の投与前に投与される。別の実施形態では、治療剤はポリペプチド又は三量体複合体より前に投与される。投与後、インビトロで処置された細胞を分析することができる。生体内治療があった場合、治療された哺乳動物が当業者に周知の様々な方法でモニタされ得る。例えば、腫瘍組織を病理学的に調べて細胞死についてアッセイすることができ、又は免疫系応答について血清を分析することができる。
【０１５８】
医薬組成物
さらに別の態様において、本発明は、治療有効量の本発明のポリペプチドを薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と共に含む医薬組成物に関する。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」又は「薬学的に許容可能な賦形剤」は、生理学的に適合するあらゆる溶剤、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど並びにそれらの組み合わせの１つ又は複数が含まれる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、多価アルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。湿潤物質又は少量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝剤などの、抗体又は抗体部分の有効期間又は有効性を亢進する薬学的に許容可能な物質も含み得る。任意選択により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を含めることができる。賦形剤に加え、医薬組成物は以下、血清アルブミンなどの担体タンパク質、緩衝剤、結合体、甘味剤及び他の香味剤；着色剤及びポリエチレングリコールの１つ又は複数を含むことができる。
【０１５９】
組成物は、例えば、液体、半固形及び固形剤形を含め、液体溶液（例えば注射用及び注入用溶液）、分散剤又は懸濁剤、錠剤、丸薬、散剤、リポソーム及び坐薬など、様々な形態であってよい。好ましい形態は、目的とする投与経路及び治療上の適用に依存し得る。ある実施形態では、組成物は注射用又は注入用溶液の形態、例えば、抗体によるヒトの受動免疫法に用いられるものと同様の組成物である。ある実施形態では投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。ある実施形態では、ポリペプチド（又は三量体複合体）は静脈内注入又は注射により投与される。別の実施形態では、ポリペプチド又は三量体複合体は筋肉内又は皮下注射により投与される。
【０１６０】
医薬組成物に好適な他の投与経路としては、限定はされないが、直腸、経皮、膣内、経粘膜又は腸管内投与が挙げられる。
【０１６１】
治療組成物は典型的には無菌で、且つ製造及び保存条件下で安定である。組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散体、リポソーム、又は高薬物濃度に好適な他の規則構造として製剤化され得る。無菌注射用溶液は、上記に挙げる成分の１つ又は組み合わせと共に所要量の活性化合物（すなわちポリペプチド又は三量体複合体）を適切な溶媒中に組み込み、続いてろ過滅菌することにより調製することができる。概して、分散体は、活性化合物を、基剤の分散媒と上記に挙げる成分からの必要な他の成分とを含む無菌媒体に組み込むことにより調製される。無菌注射用溶液の調製用無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥することであり、これにより、事前に滅菌ろ過されたその溶液からの任意の追加的な所望の成分が活性成分に加えられた粉末がもたらされる。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散体の場合には必要な粒度の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含めることによりもたらすことができる。
【０１６２】
ＩＬ−２３Ｒ拮抗薬と本明細書に記載される障害の治療に有用な治療剤とを含むキットなどの製品は、少なくとも容器及びラベルを含む。好適な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器上の、又は容器と関連付けられたラベルは、その製剤が選択される病態の治療に使用されることを指示する。製品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液などの薬学的に許容可能な緩衝液を含む容器をさらに含み得る。製品はさらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、及び使用説明書を含む添付文書を含め、商業上の観点及び使用者の観点で望ましい他の材料を含み得る。製品はまた、上記に記載したとおりの別の活性薬剤を含む容器も含み得る。
【０１６３】
典型的には、適切な量の薬学的に許容可能な塩を製剤中に使用して、製剤が等張性にされる。薬学的に許容可能な担体の例には、生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液が含まれる。製剤のｐＨは、好ましくは約６〜約９、より好ましくは約７〜約７．５である。当業者には、例えば投与経路並びにＩＬ−２３Ｒ拮抗薬及び治療剤の濃度に応じて、特定の担体がより好ましいものであり得ることは明らかであろう。
【０１６４】
治療組成物は、適切な程度の純度を有する所望の分子を、任意選択の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)）と混合することにより、凍結乾燥製剤、水溶液又は水性懸濁液の形態で調製することができる。許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、好ましくは用いられる投薬量及び濃度で被投与者に対して非毒性であり、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンなどの単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はツイーン（TWEEN）（商標）、プルロニックス（PLURONICS）（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１６５】
そのような担体のさらなる例には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、グリシンなどの緩衝物質、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、及びセルロースベースの物質などが含まれる。局所形態用又はゲルベースの形態用の担体には、カルボキシメチルセルロースナトリウム又はメチルセルロースなどの多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びウッドワックスアルコールが含まれる。あらゆる投与向けに、従来のデポー形態が好適に使用される。そのような形態には、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻用スプレー、舌下錠、及び徐放性製剤が含まれる。
【０１６６】
生体内投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又はその後に無菌ろ過膜でろ過することにより容易に達成される。製剤は、全身投与される場合、凍結乾燥形態で、又は溶液中に保存され得る。凍結乾燥形態の場合、製剤は典型的には、使用時に適切な希釈剤で再構成するための他の成分と組み合わせて製剤化される。液体製剤の例は、皮下注射用に単回用量バイアルに充填された無菌で澄明な無色の防腐処理されない溶液である。
【０１６７】
治療製剤は、概して無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で穿通可能な栓を有する静脈内注射液用バッグ又はバイアルに入れられる。製剤は、好ましくは、反復静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射若しくは注入として、又は鼻腔内若しくは肺内送達（肺内送達については、例えば欧州特許第２５７，９５６号を参照のこと）に好適なエアロゾル製剤として投与される。
【０１６８】
本明細書に開示される分子はまた、徐放性製剤の形態で投与することもできる。徐放性製剤の好適な例には、タンパク質を含む固形疎水性ポリマーの半透性基材が含まれ、この基材は造形品の形態、例えばフィルム、又はマイクロカプセルである。徐放性基材の例には、ポリエステル、Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)により記載されるとおりのハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミメートとの共重合体（Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Langer et al.、上記）、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばリュープロンデポ（Lupron Depot）（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）、並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が含まれる。
【０１６９】
ポリペプチドの産生
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドをコードするベクターで形質転換された宿主を、ポリペプチドが発現する条件下で培養することにより、任意の好適な標準的タンパク質発現系において発現させることができる。好ましくは、発現系は、そこから所望のタンパク質を容易に単離し得る系である。一般に、高いタンパク質収率を達成することができ、且つ精製及び再折り畳み戦略が効率的であることから、原核生物発現系を利用可能である。従って、適切な発現系（ベクター及び細胞型を含む）の選択は、当業者の知識の範囲内である。同様に、本発明のポリペプチドの一次アミノ酸配列が選択されると、当業者は、選択した宿主におけるコドンバイアス（codon bias）、宿主における分泌シグナル配列の必要性、シグナル配列内におけるプロテイナーゼ切断部位の導入などの要素を考慮して、所望のアミノ酸配列をコードし得る適切な組換えＤＮＡ構築物を容易に設計することができる。
【０１７０】
一実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、ＩＬ−２３Ｒを特異的に結合するポリペプチドと三量体化ドメインとをコードする。ある実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、ＩＬ−２３Ｒを特異的に結合する第１のポリペプチドと三量体化ドメインとをコードする。特定の実施形態において、ＩＬ−２３Ｒを特異的に結合するポリペプチドと三量体化ドメインとは、単一の連続ポリヌクレオチド配列でコードされる（遺伝子融合）。他の実施形態では、ＩＬ−２３Ｒを特異的に結合するポリペプチドと三量体化ドメインとは、非連続的なポリヌクレオチド配列によりコードされる。従って、いくつかの実施形態では、ＩＬ−２３Ｒを特異的に結合する少なくとも１つのポリペプチドと三量体化ドメインとは別個のポリペプチドとして発現、単離、及び精製され、及び共に融合されることで本発明のポリペプチドが形成される。
【０１７１】
これらの組換えＤＮＡ構築物は、選択した宿主に適切な数多くの発現ベクターのいずれかにインフレームで挿入され得る。特定の実施形態において、発現ベクターは、組換えポリペプチド構築物の発現を調節する強力なプロモーターを含む。組換え発現戦略を用いて本発明のポリペプチドを生成する場合、得られるポリペプチドは当該技術分野において公知の好適な標準的手順を用いて単離及び精製することができ、任意選択により例えば凍結乾燥などのさらなる処理に供されてもよい。
【０１７２】
組換えＤＮＡ分子、タンパク質、及びポリペプチドの産生、並びに組織培養及び細胞形質転換には、標準的な技法が用いられ得る。例えば、Sambrook, et al.（下記）又はCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994)を参照のこと。精製技法は典型的には、製造者の仕様に従い、又はSambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)に記載されるものなどの従来の手順を用いて当該技術分野で一般に達成されるとおりに、又は本明細書に記載されるとおりに実施される。特に定義が提供されない限り、実験室手順との関連において利用される命名法、並びに本明細書に記載される分子生物学、生化学、分析化学、及び医薬／製剤化学に関連する技法は、当該技術分野において公知の一般に用いられているものである。生化学的合成、生化学的分析、医薬品の調製、製剤化、及び送達、並びに患者の治療には、標準的な技法を用いることができる。
【０１７３】
任意選択によりフレキシブルな分子リンカーを特異的結合メンバーと三量体化ドメインとの間に置き、それらを共有結合的につなぎ合わせてもよいことは理解されるであろう。特定の実施形態において、リンカーは約１〜２０アミノ酸残基のポリペプチド配列である。リンカーは、１０アミノ酸未満、最も好ましくは、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸であり得る。特定の場合には、９、８、７又は６個のアミノ酸が好適であることもあり得る。有用な実施形態において、リンカーは本質的に非免疫原性であり、タンパク質分解切断を起こし難く、他の残基（例えばシステイン残基）と相互作用することが知られるアミノ酸残基を含まない。
【０１７４】
下記の説明はまた、ポリペプチドの、及び１つ又は複数の化学基に共有結合された（以下「コンジュゲートされた」）三量体複合体の産生方法にも関する。そのようなコンジュゲートにおける使用に好適な化学基は、好ましくは著しい毒性又は免疫原性を有しない。化学基は、任意選択により、保存に好適な条件下で保存及び使用することのできるコンジュゲートを産生するように選択される。ポリペプチドとコンジュゲートし得る様々な例示的化学基が当該技術分野において公知であり、例えば、炭水化物、例えば糖タンパク質類に天然に存在する炭水化物、ポリグルタメート、及び非タンパク質ポリマー、例えばポリオールなどが含まれる（例えば、米国特許第６，２４５，９０１号を参照のこと）。
【０１７５】
例えばポリオールは、上記の国際公開第９３／００１０９号に開示されるとおり、リジン残基を含む１つ又は複数のアミノ酸残基で本発明のポリペプチドとコンジュゲートすることができる。用いられるポリオールは任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであってよく、直鎖又は分枝鎖を有し得る。好適なポリオールには、１つ又は複数のヒドロキシル位で、１〜４個の炭素を有するアルキル基などの化学基により置換されたものが含まれる。典型的には、ポリオールはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリ（アルキレングリコール）であり、従って、説明を簡単にするため、本考察の以降では、用いられるポリオールがＰＥＧである例示的実施形態に関し、及びポリオールをポリペプチドとコンジュゲートする方法を「ペグ化」と称する。しかしながら当業者は、本明細書にＰＥＧについて記載されるコンジュゲーション技法を用いて他のポリオール、例えば、ポリ（プロピレングリコール）及びポリエチレン−ポリプロピレングリコール共重合体を用い得ることを認識する。
【０１７６】
Ａｐｏ−２Ｌのペグ化に用いられるＰＥＧの平均分子量は様々であることができ、典型的には約５００〜約３０，０００ダルトン（Ｄ）の範囲であり得る。好ましくは、ＰＥＧの平均分子量は約１，０００〜約２５，０００Ｄ、より好ましくは約１，０００〜約５，０００Ｄである。一実施形態では、ペグ化は約１，０００Ｄの平均分子量を有するＰＥＧで実施される。任意選択により、ＰＥＧホモポリマーは非置換型であり、しかしながら一方の端部でアルキル基により置換されてもよい。好ましくは、アルキル基はＣ１〜Ｃ４アルキル基、最も好ましくはメチル基である。ＰＥＧ製剤は市販されており、典型的には、本発明での使用に好適なＰＥＧ製剤は、平均分子量に基づき販売される不均一製剤である。例えば、市販のＰＥＧ（５０００）製剤は、典型的には、通常±５００Ｄの、分子量に僅かなばらつきがある分子を含有する。本発明のポリペプチドはさらに、小分子化合物（例えば、化学療法薬）とのコンジュゲーション；シグナル分子（例えば、フルオロフォア）とのコンジュゲーション；特異的結合対の分子（例えばビオチン／ストレプトアビジン、抗体／抗原）とのコンジュゲーション；又はグリコシル化、ペグ化、若しくは安定化ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）とのさらなる融合による安定化など、当該技術分野において公知の技法を用いて修飾することができる。
【０１７７】
タンパク質をペグ化する様々な方法が当該技術分野において公知である。ＰＥＧとコンジュゲートされたタンパク質を産生する具体的な方法には、米国特許第４，１７９，３３７号、同第４，９３５，４６５号及び同第５，８４９，５３５号に記載される方法が含まれる。典型的にはタンパク質は、主として反応条件、ポリマーの分子量等に応じて、タンパク質のアミノ酸残基の１つ又は複数を介してポリマーの末端反応基と共有結合する。反応基を有するポリマーは、本明細書では活性化ポリマーと称される。反応基は、遊離アミノ基又はタンパク質上の他の反応基と選択的に反応する。ＰＥＧポリマーは、アミノ基又はタンパク質上の他の反応基と、ランダムにも、或いは部位特異的な形式でも結合し得る。しかしながら、最適な結果を得るために選択される反応基の種類及び量、並びにそのために用いられるポリマーの種類が、反応基をタンパク質上の特に高活性の基と多く反応させ過ぎることを回避するために用いられる特定のタンパク質又はタンパク質変異体に依存し得ることは理解されるであろう。これを完全に回避することは不可能であり得るため、タンパク質濃度に応じて、タンパク質１モル当たり約０．１〜１０００モル、好ましくは２〜２００モルの活性化ポリマーを用いることが推奨される。タンパク質１モル当たりの活性化ポリマーの最終的な量は、最適活性を維持すると同時に、可能であれば、タンパク質の循環半減期を最適化するよう均衡がとられたものである。
【０１７８】
用語「ポリオール」は、本明細書で使用される場合、広義に多価アルコール化合物を指す。ポリオールは、例えば任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであってよく、直鎖又は分枝鎖を有し得る。好ましいポリオールには、１つ又は複数のヒドロキシル位で、１〜４個の炭素を有するアルキル基などの化学基により置換されたものが含まれる。典型的には、ポリオールは、ポリ（アルキレングリコール）、好ましくはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。しかしながら当業者は、本明細書にＰＥＧについて記載されるコンジュゲーション技法を用いて、他のポリオール、例えば、ポリプロピレングリコール）及びポリエチレン−ポリプロピレングリコール共重合体を用い得ることを認識する。本発明のポリオールには、当該技術分野において公知のもの、及び市販の供給元からなど、公的に利用可能なものが含まれる。
【０１７９】
さらに、血清アルブミン結合ペプチド、ＩｇＧ結合ペプチド、又はＦｃＲｎに結合するペプチドを含め、他の半減期を延長させる分子を三量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端に結合することができる。
【０１８０】
節の見出しは、本明細書ではあくまでも編成目的で用いられるに過ぎず、いかなる形であれ記載される発明主題を限定するものと解釈されるべきではないことに留意しなければならない。本明細書に引用される文献は全て、あらゆる目的から全体として参照により援用される。
【０１８１】
以下の実施例は単に本発明の特定の実施形態を例示するに過ぎず、本発明を限定するものとして解釈されるべきではなく、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【実施例】
【０１８２】
以下の実施例で論じるベクター（ｐＡＮＡ）は、これまでに記述されたベクターから誘導される［米国特許出願公開第２００７／０２７５３９３号を参照のこと］。特定のベクター配列は配列表に提供され、当業者は本明細書に提供される説明を所与としてベクターを誘導することが可能であろう。ｐＰｈＣＰＡＢファージディスプレイベクター（配列番号１５０）はｇＩＩＩシグナルペプチドコード領域を有し、これはＡＬＱＴ（等）をコードするｈＴＮ配列とリンカーによって融合している。ＣＴＬＤ領域のＣ末端の端部は、リンカーを介して残りのｇＩＩＩコード領域と融合される。ＣＴＬＤ領域の範囲内にヌクレオチド突然変異を生成し、この突然変異はコード配列を改変しないが、改変されたループ領域を含むＰＣＲ断片のクローニングに好適な制限部位を生じさせた。それらの制限部位の間でループ領域の一部分を取り除き、それにより全てのライブラリーファージが組換え体のみを発現することができ、野生型テトラネクチンは発現できないようにした。マウスＴＮ  ＣＴＬＤファージディスプレイベクターも同様に設計される。これらのベクターの別の実施形態はｐＡＮＡ２７（配列番号１６４）であり、ここでは遺伝子ＩＩＩ  Ｃ末端領域が切り詰められており、ｈＴＮコード配列の末端の抑制性終止コドンがグルタミンをコードするように改変されている。マウスベクターｐＡＮＡ２８（配列番号１６５）も同様に構築した。
【０１８３】
実施例１
ライブラリー構築：ループ１の突然変異及び伸長
ヒトテトラネクチンのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、並びにループ１、２、３、４、及び５（ＬＳＢ）の位置を図９に示す。ヒトテトラネクチンＣ型レクチン結合ドメインの１−２伸長ライブラリー（「ヒト１−２Ｘ」）について、表２に示される配列をコードするようにループ１のコード配列を修飾し、ここでは５個のアミノ酸ＡＡＥＧＴ（配列番号  ）を、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号  ）によりコードされる７個のランダムアミノ酸で置換した；Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴを表す；ＫはＧ又はＴを表す。ループ２の直後のアミノ酸アルギニンも、コード鎖におけるヌクレオチドＮＮＫを使用して完全にランダム化した。アルギニンはループ１のアミノ酸に接触し、ループ１のランダム化により実現可能な立体配置の制約となり得るため、このアミノ酸をランダム化した。加えて、ループ４のリジンに依存することが示されているプラスミノーゲン結合（Graversen et al., 1998）を無効にするため、リジン１４８（Ｋ）ではなくアラニン（Ａ）をコードするようにループ４のコード配列を改変した。
【０１８４】
【表４】
2013507124.tif 000005
【０１８５】
以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いてヒトループ１伸長ライブラリーを生成した（プライマー配列は表３に示す）。プライマー１Ｘｆｏｒ（配列番号  ）及び１Ｘｒｅｖ（配列番号  ）を混合してＰＣＲにより伸長し、及びプライマーＢｓｔＸ１ｆｏｒ（配列番号  ）及びＰｓｔＢｓｓＲｅｖＣ（配列番号  ）を混合してＰＣＲにより伸長した。得られた断片をゲルから精製し、混合して、外側プライマーＢｇｌｆｏｒ１２（配列番号  ）及びＰｓｔＲｅｖ（配列番号  ）の存在下でＰＣＲにより伸長した。得られた断片をゲル精製し、Ｂｇｌ  ＩＩ及びＰｓｔ  Ｉで切断し、ファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。ファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢはｐＣＡＮＴＡＢ（Pharmacia）から誘導し、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩタンパク質と融合したヒトテトラネクチンＣＴＬＤの一部分を含んだ。ＣＴＬＤ領域は、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ制限酵素部位の隣接ループ１〜４を含むように修飾し、及び１〜４領域は終止コドンを含むように改変し、それによりインフレームの挿入断片をライゲートすることなしにベクターから機能遺伝子ＩＩＩタンパク質が産生され得ないようにした。ｐＡＮＡ２７は、ＢａｍＨＩ〜ＣｌａＩ領域を配列番号１６４（ｐＡＮＡ２７）のＢａｍＨＩ〜ＣｌａＩ配列に置換することによりｐＰｈＣＰＡＢから誘導した。これによりアンバー抑制性終止コドンがグルタミンコドンに置き換えられ、遺伝子ＩＩＩのアミノ末端領域が切り取られた。
【０１８６】
ライゲートした材料をエレクトロコンピテントなＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（E. coli）（Stratagene）に形質転換し、４〜８リットルの細胞を一晩成長させ、ＤＮＡを単離してパニング用のマスターライブラリーＤＮＡストックを生成した。１．５×１０８のライブラリーサイズが得られ、調べたクローンは標的領域において多様な配列を示した。
【０１８７】
【表５】
2013507124.tif 000006
【０１８８】
【表６】
2013507124.tif 000007
【０１８９】
実施例２
ライブラリー構築：ループ１及び２の突然変異
ヒトテトラネクチンＣ型レクチン結合ドメインのループ１−２ライブラリー（「ヒト１−２」）について、表２に示される配列をコードするようにループ１のコード配列を修飾し、ここでは５個のアミノ酸ＡＡＥＧＴ（配列番号；ヒト）を、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（（配列番号  ）；ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを表し；ＫはＧ又はＴを表す）によりコードされる５個のランダムアミノ酸に置き換えた。ループ２（隣接するアルギニンを含む）では、ヒトにおける４個のアミノ酸ＴＧＡＲを、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号  ）によりコードされる４個のランダムアミノ酸に置き換えた。加えて、ループ４のリジンに依存することが示されているプラスミノーゲン結合（Graversen et al., 1998）を無効にするため、ループ４のコード配列を、ループにおいてリジン（Ｋ）ではなくアラニン（Ａ）をコードするように改変した。
【０１９０】
以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いてヒト１−２ライブラリーを生成した（プライマー配列は表３に示す）。プライマー１−２  ｆｏｒ（配列番号  ）及び１−２  ｒｅｖ（配列番号  ）を混合してＰＣＲにより伸長した。得られた断片をゲルから精製し、混合し、外側プライマーＢｇｌｆｏｒ１２（配列番号  ）及びＰｓｔＲｅｖｌ２（配列番号  ）の存在下でＰＣＲにより伸長した。上記に記載したとおり、得られた断片をゲル精製し、Ｂｇｌ  ＩＩ及びＰｓｔ  Ｉで切断し、同様に消化したファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。４．８６×１０８のライブラリーサイズが得られ、調べたクローンは標的領域において多様な配列を示した。
【０１９１】
実施例３
ライブラリー構築：ループ１及び４の突然変異及び伸長
ヒトＣ型レクチン結合ドメインのループ１−４ライブラリー（「ヒト１−４」）について、表２に示される配列をコードするようにループ１のコード配列を修飾し、ここではヒトについての７個のアミノ酸ＤＭＡＡＥＧＴ（配列番号  ）を、ヌクレオチドＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ（配列番号  ）（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを表し；ＳはＧ又はＣを表す）によりコードされる７個のランダムアミノ酸で置換した。加えて、ループ４のコード配列を、表１に示される配列をコードするように修飾及び伸長し、ここではヒトについてのループ４の２個のアミノ酸ＫＴを、ヒトのヌクレオチドＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ（配列番号  ）によりコードされる５個のランダムアミノ酸に置き換えた。
【０１９２】
以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いてヒト１−４ライブラリーを生成した（プライマー配列は表３に示す）。プライマーＢｇｌＢｓｓｆｏｒ（配列番号  ）及びＢｓｓＢｇｌｒｅｖ（配列番号  ）を混合してＰＣＲにより伸長し、プライマーＢｓｓＰｓｔｆｏｒ（配列番号  ）及びＰｓｔＢｓｓＲｅｖ（配列番号  ）を混合してＰＣＲにより伸長した。得られた断片をゲルから精製し、混合し、外側プライマーＢｇｌｆｏｒ（配列番号  ）及びＰｓｔＲｅｖ（配列番号  ）の存在下でＰＣＲにより伸長した。上記に記載したとおり、得られた断片をゲル精製し、Ｂｇｌ  ＩＩ及びＰｓｔ  Ｉ制限酵素で切断し、同様に消化したファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。２×１０９のライブラリーサイズが得られ、パニング前に調べた１２個のクローンは標的領域において多様な配列を示した。
【０１９３】
実施例４
ライブラリー構築：ループ３及び４の突然変異及び伸長
ヒトＣ型レクチン結合ドメインのループ３−４伸長ライブラリー（「ヒト３−４Ｘ」）について、表２に示される配列をコードするようにループ３のコード配列を修飾し、ここではヒトテトラネクチンの３個のアミノ酸ＥＩＴを、コード鎖におけるヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号  ）（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを表し；ＫはＧ又はＴを表す）によりコードされる６個のランダムアミノ酸に置き換えた。加えて、ループ４において、ヒトにおける３個のアミノ酸ＫＴＥを、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号  ）によりコードされる６個のランダムアミノ酸に置き換えた。
【０１９４】
以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いてヒト３−４伸長ライブラリーを生成した（プライマー配列は表３に示す）。プライマーＨ  Ｌｏｏｐ  １−２−Ｆ（配列番号  ）及びＨ  Ｌｏｏｐ  ３−４  Ｅｘｔ−Ｒ（配列番号  ）を混合してＰＣＲにより伸長し、及びプライマーＨ  Ｌｏｏｐ  ３−４  Ｅｘｔ−Ｆ（配列番号  及びＨ  Ｌｏｏｐ  ５−Ｒ（配列番号  ）を混合してＰＣＲにより伸長した。得られた断片をゲルから精製し、混合し、さらなるＨ  Ｌｏｏｐ  １−２−Ｆ（配列番号  ）及びＨ  Ｌｏｏｐ  ５−Ｒ（配列番号  ）の存在下でＰＣＲにより伸長した。上記に記載したとおり、得られた断片をゲル精製し、Ｂｇｌ  ＩＩ及びＰｓｔ  Ｉ制限酵素で切断し、同様に消化したファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。７．９×１０８のライブラリーサイズが得られ、調べたクローンは標的領域において多様な配列を示した。
【０１９５】
実施例５
ライブラリー構築：ループ３及び４の突然変異並びにループ間のＰＲＯ
ヒトテトラネクチンＣ型レクチン結合ドメインのループ３−４  ｃｏｍｂｏライブラリー（「ヒト３−４  ｃｏｍｂｏ」）について、表２に示される配列をコードするようにループ３及び４のコード配列及びこれらの２つのループ間のプロリンを改変し、ここではヒト配列ＴＥＩＴＡＱＰＤＧＧＫＴＥ（配列番号  ）を１３個のアミノ酸の配列ＸＸＸＸＸＸＸＸＧＧＸＸＸ（配列番号  ）に置き換え、ここでＸは、配列ＮＮＫ（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを表し；ＫはＧ又はＴを表す）によりコードされるランダムアミノ酸を表す。
【０１９６】
以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いてヒト３−４  ｃｏｍｂｏライブラリーを生成した（プライマー配列は表３に示す）。プライマーＨ  Ｌｏｏｐ  １−２−Ｆ（配列番号  ）及びＨ  Ｌｏｏｐ  ３−４  Ｃｏｍｂｏ−Ｒ（配列番号  ）を混合してＰＣＲにより伸長し、得られた断片をゲルから精製して混合し、さらなるＨ  Ｌｏｏｐ  １−２−Ｆ（配列番号  ）及びＨ  Ｌｏｏｐ  ５−Ｒ（配列番号  ）の存在下でＰＣＲにより伸長した。上記に記載したとおり、得られた断片をゲル精製し、Ｂｇｌ  ＩＩ及びＰｓｔ  Ｉ制限酵素で切断し、同様に消化したファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。４．９５×１０９のライブラリーサイズが得られ、調べたクローンは標的領域において多様な配列を示した。
【０１９７】
実施例６
ライブラリー構築：ループ４の突然変異及び伸長
ヒトテトラネクチンＣ型レクチン結合ドメインのループ４伸長ライブラリー（「ヒト４」）について、表２に示される配列をコードするようにループ４のコード配列を修飾し、ここではヒトテトラネクチンの３個のアミノ酸ＫＴＥを、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（（配列番号  ）；ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを表し；ＫはＧ又はＴを表す）によりコードされる７個のランダムアミノ酸に置き換えた。
【０１９８】
以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いてヒト４伸長ライブラリーを生成した（プライマー配列は表３に示す）。プライマーＨ  Ｌｏｏｐ  １−２−Ｆ（配列番号  ）及びＨ  Ｌｏｏｐ  ３−Ｒ（配列番号  ）を混合してＰＣＲにより伸長し、及びプライマーＨ  Ｌｏｏｐ  ４  Ｅｘｔ−Ｆ（配列番号  ）及びＨ  Ｌｏｏｐ  ５−Ｒ（配列番号  ）を混合してＰＣＲにより伸長した。得られた断片をゲルから精製し、混合し、さらなるＨ  Ｌｏｏｐ  １−２−Ｆ（配列番号  ）及びＨ  Ｌｏｏｐ  ５−Ｒ（配列番号  ）の存在下でＰＣＲにより伸長した。上記に記載したとおり、得られた断片をゲル精製し、Ｂｇｌ  ＩＩ及びＰｓｔ  Ｉ制限酵素で切断し、同様に消化したファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。２．７×１０９のライブラリーサイズが得られ、調べたクローンは標的領域において多様な配列を示した。
【０１９９】
実施例７
ライブラリー構築：ループ３の伸長を伴う、及び伴わない突然変異
ヒトテトラネクチンＣ型レクチン結合ドメインのループ３改変ライブラリーについて、表２に示される配列をコードするようにループ３のコード配列を修飾し、ここではヒトの６個のアミノ酸ＥＴＥＩＴＡ（配列番号  ）を、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号  ）、ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号  ）、及びＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号  ）によりコードされる６個、７個、又は８個のランダムアミノ酸に置き換えた；ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを表し；及びＫはＧ又はＴを表す。加えて、ループ４において、ヒトにおける３個のアミノ酸ＫＴＥを、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号  ）によりコードされる６個のランダムアミノ酸に置き換えた。加えて、ループ４のリジンに依存することが示されているプラスミノーゲン結合（Graversen et al., 1998）を無効にするため、ループ４のコード配列を、ループにおいてリジン（Ｋ）ではなくアラニン（Ａ）をコードするように改変した。
【０２００】
以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いてヒトループ３改変ライブラリーを生成した。プライマーＨＬｏｏｐ３Ｆ６、ＨＬｏｏｐ３Ｆ７、及びＨＬｏｏｐ３Ｆ８（それぞれ配列番号  ）を、個々にＨＬｏｏｐ４Ｒ（配列番号  ）と混合してＰＣＲにより伸長した。得られた断片をゲルから精製し、混合し、オリゴＨ  Ｌｏｏｐ  １−２Ｆ（配列番号  ）、ＨｕＢｇｌｆｏｒ（配列番号  ）及びＰｓｔＲｅｖ（配列番号  ）の存在下でＰＣＲにより伸長した。上記のとおり、得られた断片をゲル精製し、ＢｇｌＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で消化し、同様に消化したファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。ライブラリーの生成後、３つのライブラリーをパニング用にプールした。
【０２０１】
ループ３の代替的なループ伸長
以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いてヒトループ３ループライブラリーを生成する。プライマーＬｏｏｐ３ＡＦ２（配列番号  ）及びＬｏｏｐ３ＡＲ２（配列番号  ）を混合し、ＰＣＲにより伸長し、プライマーＬｏｏｐ３ＢＦ（配列番号  ）及びＬｏｏｐ３ＢＲ（配列番号  ）を混合してＰＣＲにより伸長する。得られた断片をゲル精製し、混合し、プライマーＢｇｌ  ｆｏｒ（配列番号  ）及びＬｏｏｐ３ＯＲ（配列番号  ）の存在下でＰＣＲに供する。上記のとおり、生成物をＢｇｌ  ＩＩ及びＰｓｔ  Ｉ制限酵素で消化し、精製した断片を、同様に消化したファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングする。加えて、ループ４のリジンに依存することが示されているプラスミノーゲン結合（Graversen et al., 1998）を無効にするため、ループ４のコード配列を、ループにおいてリジン（Ｋ）ではなくアラニン（Ａ）をコードするように改変した。
【０２０２】
実施例８
ループ３及び５の突然変異
ヒトＣ型レクチン結合ドメインのループ３及び５改変ライブラリーについて、表２に示される配列をコードするようにループ３及び５のコード配列を修飾し、ここではヒトの５個のアミノ酸ＴＥＩＴＡを、ヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ（配列番号  ）によりコードされる５個のアミノ酸に置き換え、ヒトの３個のアミノ酸ＡＡＮをヌクレオチドＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫによりコードされる３個のアミノ酸に置き換えた。加えて、ループ４のリジンに依存することが示されているプラスミノーゲン結合（Graversen et al., 1998）を無効にするため、ループ４のコード配列を、ループにおいてリジン（Ｋ）ではなくアラニン（Ａ）をコードするように改変した。
【０２０３】
以下の方法でオーバーラップＰＣＲを用いてヒトループ３及び５改変ライブラリーを生成した。プライマーｈ３−５ＡＦ（配列番号  ）及びｈ３−５ＡＲ（配列番号  ）を混合してＰＣＲにより伸長し、プライマーｈ３−５ＢＦ（配列番号  ）及びｈ３−５  ＢＲ（配列番号  ）を混合してＰＣＲにより伸長した。得られた断片をゲルから精製し、混合し、ｈ３−５ ＯＦ（配列番号  ）及びＰｓｔＲｅｖ（配列番号  ）の存在下でＰＣＲにより伸長した。上記のとおり、得られた断片をゲル精製し、Ｂｇｌ  Ｉ及びＰｓｔ  Ｉ制限酵素で消化し、同様に消化したファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。
【０２０４】
実施例９
ヒトライブラリー１〜４のパニング及びスクリーニング
ヒトライブラリー１〜４から生成されたファージを組換えヒトＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃキメラ（R&D Systems）に対してパニングした。ＥＬＩＳＡプレートアッセイを使用した３ラウンド、４ラウンド、及び／又は５ラウンドのパニング後のこれらの結合パネルのスクリーニングから、いずれの場合にも受容体特異的結合体が特定された。
【０２０５】
パニング用のファージを生成するため、マスターライブラリーＤＮＡを電気穿孔により細菌株ＴＧ１（Stratagene）に形質転換した。ＳＯＣ（カタボライト抑制された超最適ブロス）培地中３７℃で振盪しながら細胞を１時間回復させてから、スーパーブロス（super broth）（ＳＢ）を２０％グルコース及び２０μｇ／ｍＬカルベニシリンの最終濃度となるよう添加することにより容量を１０倍に増加させた。３７℃で１時間振盪した後、カルベニシリン濃度を５０μｇ／ｍＬまでさらに１時間増加させて、その後２％グルコースを含む４００ｍＬのＳＢ及び５０μｇ／ｍＬカルベニシリンをヘルパーファージＭ１３Ｋ０７と共に、最終濃度が５×１０９ｐｆｕ／ｍＬとなるよう添加した。インキュベーションを３７℃で３０分間振盪なしに継続し、次に１００〜１５０ｒｐｍで振盪しながらさらに３０分間振盪した。細胞を４℃で２０分間、３２００ｇで遠心し、次に５０μｇ／ｍＬカルベニシリンと５０μｇ／ｍＬカナマイシンとを含む５００ｍＬのＳＢ培地中に再懸濁した。細胞を１５０ｒｐｍで振盪しながら室温（ＲＴ）で一晩成長させた。細菌細胞を４℃で２０分間、１５，０００ｇで遠心することによりペレット化してファージを単離した。上清を４分の１容量（通常、２５０ｍＬの上清／ボトル＋６２．５ｍＬのＰＥＧ溶液）の２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌと共に氷上で３０分間インキュベートした。ファージを４℃で２０分間、１５，０００ｇで遠心することによりペレット化する。ファージペレットを、０．１％ナトリウムアジド（ＢＳＡ／ＰＢＳ／アジド）及び完全ミニＥＤＴＡ不含（mini-EDTA-free）プロテアーゼ阻害薬（Roche）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に再懸濁し、製造者の指示に従い調製した。或いはファージは、０．０５％煮沸カゼイン、０．０２５％ツイーン２０（Tween-20）、及びプロテアーゼ阻害薬を含有する緩衝液Ｄに再懸濁した。Whatman Puradiscの２５ｍｍ直径、０．２μｍ孔径フィルタを使用して材料をろ過滅菌した。
【０２０６】
ヒトライブラリー１〜４から生成されたファージを組換えヒトＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃキメラ（R&D Systemsカタログ番号１６８６−ＭＲ）でパニングした。プレート又はビーズのいずれかのフォーマットを使用してライブラリーパニングを実施した。プレートフォーマットについては、９６ウェルImmulon HB2  ＥＬＩＳＡプレートの６〜８ウェルをダルベッコＰＢＳ中２５０〜１０００ｎｇ／ウェルの担体不含ヒトＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃでコーティングした。材料をプレート上で一晩インキュベートし、その後ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、固定用緩衝液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／アジド、又は０．０５％煮沸カゼイン及び１％ツイーン−２０（Tween-20）を含有する緩衝液Ｃのいずれか）を添加し、次にウェルを３７℃で少なくとも１時間インキュベートした。さらなるウェルもまた、後に固定用緩衝液に結合するファージを吸収するため、同時に固定用緩衝液で処理した。
【０２０７】
ファージ調製物の３つの希釈物を使用した：未希釈、固定用緩衝液＋プロテアーゼ阻害薬中１：１０、及び１：１００。いくつかのパニングラウンドにおいて、最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるよう希釈物の各々に組換えヒトＩｇＧ１  Ｆｃを添加した。「固定のみ（Block Only）」（固定するための予備吸収）のウェルから固定用緩衝液を除去し、種々のファージ混合物を３７℃でさらに１時間、それらのウェルでインキュベートした。各ファージ混合物のアリコート（５０μＬ）を洗浄及び固定した標的ウェルに移し、３７℃で２時間インキュベートさせた。最初のパニングラウンドについては、結合したファージを１×ＰＢＳ／０．０５％ツイーン（Tween）又は緩衝液Ｄのいずれかで１回洗浄し、グリシン緩衝液、ｐＨ２．２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ含有を使用して溶出させた。２Ｍトリス塩基（ｐＨ１１．５）で中和した後、溶出したファージを２〜４ミリリットルのＴＧ１（Stratagene）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratagene）、ＥＲ２７３８（Lucigen又はNEB）、又はＳＳ３２０（Lucigen）細胞と共に、６００ｎｍ（ＯＤ６００）で計測される光学濃度を約０．９として酵母エキス−トリプトン（ＹＴ）培地において室温で１５分間インキュベートした。この感染から上記のプロトコルを用いてファージを調製し、但し約２０％（容量）だけ規模を縮小した。溶出ファージから調製されたファージをさらなるパニングラウンドに供した。各ラウンドで、寒天上に適切な抗生物質を播くことにより入力及び出力ファージの力価を測定し、後のＥＬＩＳＡによる結合体についてのスクリーニングにこれらのプレートからのコロニーを使用した。
【０２０８】
さらなるパニングラウンドを上記に記載したとおり実施したが、但し２回目のパニングラウンドでは洗浄を５回まで増やし、続くラウンドでは洗浄を１０回まで増やした。３〜６ラウンドのパニングを実施した。最終パニングラウンドについては、感染後もファージは産生されなかった；むしろ、感染細菌を一晩成長させて、ＤＮＡからマキシプレップ（maxiprep）（Qiagenキット）を調製した。各ラウンドから入力ファージのグリセロールストック（１５％）を凍結保存（−８０℃）した。
【０２０９】
ビーズパニングフォーマットについては、ヒトＩＬ−２３Ｒをビオチン化し、スルホ−ＮＨＳマイクロビオチン化キット（Thermo-Scientific）を製造者の指示に従い使用して精製した。マスターライブラリーからのパニング用にファージを上記のプロトコルのとおり生成し、但しファージペレットは、０．５％煮沸カゼイン、０．０２５％ツイーン２０（Tween 20）をＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害薬（Roche）が添加されたＰＢＳ中に含有するカゼイン緩衝液中に再懸濁した。磁石を使用して、ストレプトアビジン磁気ビーズ（各５０μＬ又は０．５ｍｇのMyone T1 Dynabeads（Invitrogen）の管２本）を０．５％煮沸カゼイン、１％ツイーン２０（Tween 20）で数回洗浄して防腐剤を除去した。ファージプレップ（phage prep）の１５０μＬのアリコートをビーズの１本の管と共に３７℃で３０分間予備インキュベートしてストレプトアビジン結合体を除去した。次にファージプレップ（phage prep）をビーズから除去し、１μｇのビオチン化ＩＬ−２３Ｒを１００μｇ／ｍＬで１０μＬのヒトＦｃと共に添加し、回転させながら３７℃で２時間インキュベートした。次にこの材料を、洗浄したビーズの残りの管に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。磁気スタンドを使用してビーズをＰＢＳ／０．０５％ツイーン（Tween）で５回洗浄した。ファージを上記に記載したとおりグリシン、ｐＨ２．０で溶出させ、中和し、細菌の感染に使用した。続くパニングラウンドでは、ビーズに結合したファージを１０回洗浄してから溶出させた。入力及び出力ファージの力価を上記に記載のとおり測定した。
【０２１０】
ＥＬＩＳＡスクリーニングのため、後のパニングラウンドからのコロニーを、２％グルコース及び抗生物質を含むＹＴ培地で一晩成長させ、次に各々のアリコートを使用して新規培養を開始し、それらを０．５の０Ｄ６００まで成長させた。ヘルパーファージを５×１０９ｐｆｕ／ｍＬとなるよう添加し、３７℃で３０分間感染させ、続いて３７℃で撹拌しながら成長させた。細菌を遠心し、カルベニシリン及びカナマイシンを含むＹＴ培地に再懸濁し、ファージ産生のため一晩成長させた。次に細菌をペレット化し、培地を除去して５分の１容量（１：５乳混合物：上清）の６×ＰＢＳ、１８％乳と混合した。７５〜１００ｎｇ／ウェルの組換えヒトＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃを含む５０〜１００μＬのＰＢＳと共に４℃で一晩インキュベートすることによりＥＬＩＳＡプレートを調製した。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（R&D Systems）でコーティングした二つ目のプレートを対照として使用した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、１×ＰＢＳ中の３％乳により３７℃で１時間固定し、１００ｕＬ／ウェルの乳処理したファージ混合物の各々と共に１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０（Tween 20）で１回、及びＰＢＳで２回洗浄し、ＨＲＰ共役抗Ｍ１３抗体（GE Healthcare）と共に１時間インキュベートし、各々ＰＢＳ／ツイーン（Tween）及びＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ基質（VWR）と共にインキュベートした。硫酸を添加して呈色反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取って陽性の結合体を同定した。
【０２１１】
ヒトＩＬ−２３Ｒに対する結合体は、３ラウンド目及び４ラウンド目のパニングから同定された。ヒトＩＬ−２３Ｒ／ＦｃキメラとのファージディスプレイＣＴＬＤ結合体からのループ１及び４のランダム化領域の配列の例を表４に示す。これらのデータを検討すると、結合体の３１／３６について、モチーフがループ４のランダム化領域に顕著に認められたことが示唆される：２番目及び５番目のアミノ酸は常にグリシンであり、４番目のアミノ酸は常に環状アミノ酸のトリプトファン又はフェニルアラニンの一方であり、１番目のアミノ酸は疎水性で、通常は環状アミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンであり、及び３番目のアミノ酸は疎水性で、通常はバリンであった。ループ１領域はコンセンサスが少なかったが、グリシン及びセリンが主に１位及び２位に現れ、バリンが多くの場合に７位にあった。別の５つの結合体はこのコンセンサスを有しないように思われたが、それらのうちの２つはおそらく、ループ４領域においてＭＦＧＭＧ（配列番号  ）又はＬＦＧＲＧ（配列番号  ）での別の小さい群をなした。多くの結合体は各々、複数のクローンにより表された。
【０２１２】
【表７】
2013507124.tif 000008
【０２１３】
【表８】
2013507124.tif 000009
【０２１４】
ＥＬＩＳＡアッセイでは、これらの結合体がヒトＩｇＧ１  Ｆｃ又は組換えマウスＩＬ−２３Ｒのいずれとも交差反応しなかったことが示された。ＥＬＩＳＡ及びBiacore結合アッセイでは、候補クローン００１−６９．４Ｇ８及びその他からの精製した単量体ＣＴＬＤ又は完全長三量体がヒトＩＬ−２３Ｒとの結合性についてＩＬ−２３と競合したことが示された。競合候補はナノモル親和性を有することが特定されている。
【０２１５】
実施例１０
ヒトＩＬ−２３Ｒに対する結合体の親和性成熟
ヒトＩＬ−２３Ｒのループ４領域は関連するモチーフであると思われるため、既にパニングにより得られたループ４領域の多様性を保存するが、元の未改変ライブラリー由来のあらゆる可能性のあるループ１領域を用いてそれらを再分類するシャッフリング手法を開発した。この目的から、ヒトＩＬ−２３Ｒのラウンド４パニングからのＤＮＡを、ループ１領域とループ４領域との間で切断するＥｃｏＲＩ及びＢｓｓＨＩＩ制限酵素で消化し、ループ４領域を含む約１．４ ｋｂの断片を単離した。それとは別に、元のヒト１−４ライブラリーＤＮＡを同じ酵素で消化し、ループ１領域を含む約３．５ｋｂの断片を単離した。これらの断片を共にライゲートし、上記に記載したとおり新規ｈ１−４シャッフルライブラリーを生成した。ライブラリーは、各パニングラウンドにおいてビオチン化組換えヒトＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃの量を２００ｎｇから（２０ｎｇへと、２ｎｇへと）０．１ｎｇへと約１０分の１に減らしたことを除いては、ビーズプロトコル（上記）を用いてパニングした。コロニーからのファージ上清を上記に記載したとおりＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、結合体を同定して配列決定した。親和性成熟結合体のループ１及び４配列を表５に示す（配列番号  ）。
【０２１６】
【表９】
2013507124.tif 000010
【０２１７】
別の親和性成熟ライブラリーを生成し、ここでは初期パニングラウンド４で得られたループ１領域の多様性が維持され、限られた選定のループ４選択肢が利用され、ループ３が６位でランダム化された。これは、プライマーＢｇｌｆｏｒ（配列番号  ）及びＨ１−３−４Ｒ（配列番号  ）と共に、ヒトループ１−４ライブラリーの元のパニングラウンド４からのＤＮＡを鋳型として使用してループ１領域を増幅するプライマーを生成することにより達成した。このプライマーは以下のループ３及び４についてのアミノ酸配列をコードする：ＲＩＡＹＫＮＷＥＸＸＸＸＸＱＰＸＧＧ（Ｆ／Ｌ）Ｇ（Ｆ／Ｙ／Ｖ／Ｄ）（Ｆ／Ｗ／Ｌ／Ｃ）ＧＥＮＣＡＶＬＳ（配列番号  ）。
【０２１８】
この配列はループ４の一次的な代替配列、並びにＣＴＬＤのループ３領域の改変を組み込む。これと同様だがループ４領域配列に対してより特異的な他のプライマーも生成し、ループ３領域においてランダム化された別のライブラリーの作成に使用した。対象となる領域の残りは、プライマーＰｓｔＬｏｏｐ４ｒｅｖ（配列番号  ）及びＰｓｔ  Ｒｅｖ（配列番号  ）を使用したオーバーラップＰＣＲにより生成した。
【０２１９】
これらのライブラリーから得られる親和性成熟ＩＬ−２３Ｒ結合配列を表６に提供する。得られた結合体の一部は、より好ましいループ４又はループ１配列を他のものと交換することにより改変してさらなる親和性成熟結合体を得たとともに、表６にはそれらの結合体が含まれる。
【０２２０】
【表１０】
2013507124.tif 000011
【０２２１】
表７は、Ｈ１−３−４Ｒ（配列番号  ）と同様だが、以下のループ修飾の選択肢をもたらすコード配列を有するプライマーで作製された一部のさらなるクローンを示す。
【０２２２】
【表１１】
2013507124.tif 000012
【０２２３】
ループ４を５個のアミノ酸配列に限定することにより別の親和性成熟ライブラリーを生成し：ＦＧＶＦＧ（配列番号  ）、ＷＧＶＦＧ、ＦＧＹＦＧ、ＷＧＹＦＧ、及びＷＧＶＷＧ（それぞれ配列番号  ）、一方でＩＬ−２３Ｒ結合体におけるループ１の始端に見られるＧｌｙＳｅｒは維持し、且つＮＮＫ戦略を用いて、ループ１における続く５個のアミノ酸は様々とした。プライマーＧＳＸＸ（配列番号  ）及び０９０８２７  ＢｓｓＢｇｌｒｅｖ（配列番号  ）を混合してＰＣＲを用いて伸長し、プライマーＦＧＶＦＧｆｏｒ、ＦＧＹＦＧｆｏｒ、ＷＧＶＦＧｆｏｒ、ＷＧＹＦＧｆｏｒ、及びＷＧＶＷＧｆｏｒ（配列番号＿〜＿）を個々にプライマーＰｓｔ  Ｌｏｏｐ  ４  ｒｅｖ（配列番号  ）と混合し、ＰＣＲを用いて伸長した。得られた断片をゲル精製して混合し、プライマーＢｇｌ  ｆｏｒ（配列番号  ）及びＰｓｔ  ｒｅｖ（配列番号  ）の存在下でＰＣＲにより伸長した。得られた断片をＢｇｌ  ＩＩ及びＰｓｔ  Ｉで消化し、ファージディスプレイ用のベクターｐＡＮＡ２７に挿入した。連続標的希釈を伴うビーズパニングを用いてライブラリーから親和性成熟候補を選択した。このライブラリーから得られた候補の配列を表８に提供する。
【０２２４】
【表１２】
2013507124.tif 000013
【０２２５】
【表１３】
2013507124.tif 000014
【０２２６】
アラニンスキャニング、すなわち当業者に公知の遺伝子部位特異的突然変異生成による特定のアミノ酸のアミノ酸アラニンによる置換により、ループのアミノ酸配列及び周囲の配列のさらなる変化を生じさせた。表９は候補０５６−５３．Ｈ４Ｅ配列に作製したアラニン置換について記載する。そのような置換は、示される残基に限られるものでなく、任意の候補骨格に作製することができる。表１０は、これらの置換の多くが親和性及び／又はタンパク質産生に有益であったことを示す。
【０２２７】
【表１４】
2013507124.tif 000015
【０２２８】
【表１５】
2013507124.tif 000016
【０２２９】
実施例１１
ヒトＩＬ−２３Ｒに対するＣＴＬＤ及びアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体結合体のサブクローニング及び産生
ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ（又はＭｆｅＩ）制限酵素による制限消化によってループ領域をコードするＤＮＡ断片を得て、ＢｇＩＩＩ及びＰｓｔＩで予め消化した細菌ＣＴＬＤ発現ベクターｐＡＮＡ１、ｐＡＮＡ３、又はｐＡＮＡｌ２にライゲートした。ｐＡＮＡ１（配列番号１５１）は、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグヒト単量体ＣＴＬＤを発現するように設計されたＴ７ベースの発現ベクターである。ｐｅｌＢシグナルペプチドがタンパク質をペリプラズム又は成長培地に誘導する。ｐＡＮＡ３（配列番号１５３）は、Ｃ末端ＨＡ−Ｈｉｓタグ版のｐＡＮＡ１である。ｐＡＮＡ１２（配列番号１６２）は、Ｃ末端ＨＡ−ＳｔｒｅｐＩＩタグ版のｐＡＮＡ１である。三量体タンパク質を発現させるため、ループ領域をアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体発現ベクターｐＡＮＡ４又はｐＡＮＡ１０にサブクローニングして、大腸菌（E. coli）において分泌アトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体を産生することができる。ｐＡＮＡ４（配列番号１５４）は、Ｃ末端Ｈｉｓ／Ｍｙｃタグ完全長ヒトＴＮを含むｐＢＡＤベースの発現ベクターであり、タンパク質をペリプラズム又は成長培地に誘導するｏｍｐＡシグナルペプチドを有する。ｐＡＮＡ１０（配列番号１６０）はＣ末端ＨＡ−ＳｔｒｅｐＩＩタグ版のｐＡＮＡ４である。
【０２３０】
発現構築物を大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。Ｓｔａｒ（ｐＡＮＡ１、ｐＡＮＡ３及びｐＡＮＡ１２用；単量体ＣＴＬＤの産生）又はＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＡＮＡ４及びｐＡＮＡ１０用；アトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体産生）を、適切な抗生物質を含むＬＢ／寒天プレートに播いた。新鮮なプレート上の単一コロニーを、１Ｌの１％グルコース及びカナマイシンを含むＳＢ培地（ｐＡＮＡ１及びｐＡＮＡ１２ベクター用）又はアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（二重に濃縮した酵母トリプトン）（ｐＡＮＡ４及びｐＡＮＡ１０ベクター用）のいずれかに接種した。培養物を振盪機において２００ｒｐｍで、０．５のＯＤ６００となるまで３７℃でインキュベートし、次に室温に冷却した。ｐＡＮＡ１及びｐＡＮＡ１２についてはＩＰＴＧを添加して最終濃度を０．０５ｍＭとし、一方、ｐＡＮＡ４及びｐＡＮＡ１０についてはアラビノースを添加して最終濃度を０．００２〜０．０２％とした。１２０〜１５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションを室温で一晩実施し、その後遠心により細菌を回収した。浸透圧ショック又は弱い音波処理によりペリプラズムタンパク質を抽出した。
【０２３１】
Ｎｉ＋−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて６×Ｈｉｓタグタンパク質を精製した。簡潔に言えば、ペリプラズムタンパク質をＨｉｓ結合緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）中に再構成し、Ｈｉｓ結合緩衝液で予め平衡化したＮｉ＋−ＮＴＡカラムに負荷した。カラムをｌ０倍容量の結合緩衝液で洗浄した。結合したタンパク質を、溶出緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）で溶出させた。精製したタンパク質を１×ＰＢＳ緩衝液に透析し、陰イオン交換により細菌内毒素を除去した。
【０２３２】
strepIIタグ単量体ＣＴＬＤ及びアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体を、ストレプタクチン（Strep-Tactin）アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。簡潔に言えば、ペリプラズムタンパク質を１×ＰＢＳ緩衝液に再構成し、１×ＰＢＳ緩衝液で予め平衡化したストレプタクチン（Strep-Tactin）カラムに負荷した。カラムを１０倍容量のＰＢＳ緩衝液で洗浄した。溶出緩衝液（２．５ｍＭのデスチオビオチンを含む１×ＰＢＳ）でタンパク質を溶出させた。精製したタンパク質を１×ＰＢＳ緩衝液に透析し、陰イオン交換により細菌内毒素を除去した。
【０２３３】
一部の細胞アッセイについては、アトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体を哺乳動物細胞により産生した。ループ領域をコードするＤＮＡ断片を哺乳動物発現ベクターｐＡＮＡ２又はｐＡＮＡ１１にサブクローニングし、ＨＥＫ２９３一過性発現系においてアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体を産生した。ｐＡＮＡ２（配列番号１５２）は、Ｃ末端Ｈｉｓタグを含む修飾ｐＣＥＰ４ベクターである。ｐＡＮＡ１１（配列番号１６１）は、Ｃ末端ＨＡ−ＳｔｒｅｐＩＩタグ版のｐＡＮＡ２である。ＢｇｌＩＩ及びＭｆｅＩでの二重消化によりループ領域をコードするＤＮＡ断片を得て、ＢｇｌＩＩ及びＭｆｅＩで予め消化した発現ベクターｐＡＮＡ２及びｐＡＮＡ１１にライゲートした。HiSpeed Plasmid Maxi Kit（Qiagene）を使用して発現プラスミドを細菌から精製した。Qiagen SuperFect試薬を製造者のプロトコルに従い使用して、ＨＥＫ２９３接着細胞の一過性トランスフェクションを実施した。トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２９３イソプロ（293 Isopro）無血清培地（Irvine Scientific）に交換した。２日後、０．５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中グルコースを培地に添加して最終濃度を１％とした。トランスフェクションの４〜７日後、精製のため組織培養上清を回収した。Invitrogenの２９３フェクチン（293Fectin）により製造者のプロトコルに従いＨＥＫ  ２９３Ｆ懸濁細胞の一過性トランスフェクションを実施した。翌日、１倍容量の新鮮培地を培養物に添加した。トランスフェクションの４〜７日後、精製のため組織培養上清を回収した。
【０２３４】
大腸菌（E. coli）産生アトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体についての記載のとおり、哺乳動物の組織培養上清からのＨｉｓ又はＳｔｒｅｐ  ＩＩタグアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体の精製を実施した。
【０２３５】
実施例１２
ＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡによる結合体の特性決定
実施例９に記載のとおり実施したＥＬＩＳＡアッセイから、ファージディスプレイした結合体のいずれも、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃとも、又は組換えマウスＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃ（R&D Systems）とも交差反応しなかったことが実証された。
【０２３６】
陽性ヒトＩＬ−２３Ｒ（ＩＬ−２３Ｒ）結合体から上記に記載したとおり生成した単量体ＣＴＬＤ又はアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体を使用して競合ＥＬＩＳＡアッセイを実施し、ヒトＩＬ−２３のヒトＩＬ−２３Ｒとの結合を阻害した。概して以下のとおりアッセイを実施した。Immulon HB2プレートの個々のウェルを、１００ｎｇの抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（R&D MAB  １１０クローン９７９２４）を含む１００μＬのＰＢＳと共に４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０（Tween 20）で５回洗浄し、５０ｎｇの組換えヒトＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃを含む各１００μＬのＰＢＳと共に室温で１．５時間ウェルをインキュベートした。プレートを前述のとおり洗浄し、ＰＢＳ中１５０μＬの３％ウシ血清アルブミン（Sigma）により室温で１時間固定し、その後プレートを記載のとおり洗浄し、競合物（アトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体またはＣＴＬＤ）を伴い、又は伴わずＩＬ−２３を含む各１００μＬのＰＢＳと共にウェルを室温で１〜２時間インキュベートした。ＩＬ−２３含有溶液を以下のとおり調製した。ヒトＩＬ−２３（eBioscience）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した。競合物を１μｇ／ｍＬの最終濃度でインキュベートした。インキュベーション後、プレートを記載のとおり洗浄し、１：５０００希釈のストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（Pierceカタログ番号２１１３０）を含む各１００μＬのＰＢＳと共にウェルを室温で４０分間インキュベートした。洗浄後、各１００μＬのＴＭＢ（BioFX Labカタログ番号ＴＭＢＨ−１０００−０）と共に室温で最大３０分間ウェルをインキュベートした。等量の０．２Ｍ硫酸で反応を停止させた。
【０２３７】
初期パニングからのアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体を使用した競合アッセイ（ＩＬ−２３／ＩＬ−２３Ｒ相互作用の阻害）の結果の例を図１０に提供する。ＩＬ−２３Ｒとの結合についてのＩＬ−２３による競合アッセイでは、親和性成熟パニング手順からのクローン５９−３Ｂ５、６１−ｐ４Ｇ３、７８−２Ｅ６及び０５６−５３．Ｈ４Ｅ由来のＣＴＬＤを有するアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体を使用した。
【０２３８】
競合ＥＬＩＳＡではより広範に多くのアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体を試験し、ＩＣ５０値を決定した。表１１に示されるとおり、アトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体はナノモル以下のＩＣ５０もの低さを示した。
【０２３９】
【表１６】
2013507124.tif 000017
【０２４０】
アトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体０５６−５３．Ｈ４Ｅを比較用の標準として選択し、親和性成熟アトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体によるさらなる競合アッセイを実施した。表１２は、アッセイ間での競合結果をより良く比較するため、試験したアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体のＩＣ５０の、同じアッセイで実施した０５６−５３．Ｈ４ＥのＩＣ５０との比を提供する。
【０２４１】
【表１７】
2013507124.tif 000018
【０２４２】
実施例１３
BiacoreによるヒトＩＬ−２３Ｒ結合体の親和性の特性決定
元のライブラリーパニング及び親和性成熟ライブラリーパニングの双方からの単量体結合体及び三量体結合体の見かけの親和性を表１３、表１４及び表１５に提供する。Biacore 3000バイオセンサー（GE Healthcare）を使用してヒトＩＬ−２３Ｒ及び受容体結合体の相互作用を評価した。抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（GE Healthcare）のＣＭ５チップ（GE Healthcare）に対する固定化を、標準的なアミンカップリング化学を用いて実施し、この修飾表面を使用して組換えヒトＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質（R&D Systems）を捕捉した。全ての分析に、２００ＲＵ未満の低密度受容体表面を使用した。アトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体希釈物（１〜５００ｎＭ）を３０ｇｌ／分でＩＬ−２３Ｒ表面に注入し、Biaevaluationソフトウェア（バージョン３．１、GE Healthcare）を使用してセンサーグラムデータから速度定数を求めた。データ収集は会合について３分間、解離について５分間であった。３Ｍ塩化マグネシウムの３０秒パルスにより抗ヒトＩｇＧ表面を再生した。全てのセンサーグラムは、活性化し、且つ固定したフローセル並びに緩衝液注入に対して二重参照した。
【０２４３】
【表１８】
2013507124.tif 000019
【０２４４】
【表１９】
2013507124.tif 000020
【０２４５】
【表２０】
2013507124.tif 000021
【０２４６】
【表２１】
2013507124.tif 000022
【０２４７】
実施例１４
ＩＬ−２３Ｒに結合するアトリマー（ATRIMER）（商標）複合体はＩＬ−１２Ｒβ１又はＩＬ−１２Ｒβ２を認識しない。
Biacore 3000バイオセンサー（GE Healthcare）を使用してヒトＩＬ−１２Ｒβ１／Ｆｃ又はＩＬ−１２Ｒβ２／ＦｃのＩＬ−２３Ｒ結合アトリマー（ATRIMER）（商標）複合体と相互作用を評価した。標準的なアミンカップリング化学を使用して抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（GE Healthcare）のＣＭ５チップ（GE Healthcare）に対する固定化を実施し、この修飾表面を使用して組換えヒトＩＬ−１２Ｒβ１／Ｆｃ又はＩＬ−１２Ｒβ２／Ｆｃ融合タンパク質（R&D Systems）を捕捉した。全ての分析に、２００ＲＵ未満の低密度受容体表面を使用した。アトリマー（ATRIMER）（商標）複合体希釈物（１００ｎＭ）を３０μｌ／分でＩＬ−１２Ｒ表面に注入した。データ収集は会合について３分間、及び解離について５分間であった。３Ｍ塩化マグネシウムの３０秒パルスにより抗ヒトＩｇＧ表面を再生した。全てのセンサーグラムは抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体表面並びに緩衝液注入に対して二重参照した。表１６に示されるとおり、アトリマー（ATRIMER）（商標）複合体はヒトＩＬ−１２Ｒβ１／Ｆｃ又はＩＬ−１２Ｒβ２／Ｆｃに対するいかなる計測可能な結合も示さなかった。
【０２４８】
【表２２】
2013507124.tif 000023
【０２４９】
実施例１５
Biacoreを使用したＩＬ−２３Ｒ結合体の存在下でのＩＬ−２３Ｒに結合するヒトＩＬ−２３の競合アッセイ
ＩＬ−２３Ｒ結合アトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体をＣＭ５チップ（GE Healthcare）にアミンカップリングし、次にＩＬ−２３Ｒ（ＩＬ−２３Ｒ）をチップ表面に注入した。結合の安定化後、ヒトＩＬ−２３（eBioscience）のＩＬ−２３Ｒと相互作用する能力を観察した。ＩＬ−２３ＲとＩＬ−２３との間の又はＩＬ−２３Ｒとアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体との間の複合体を室温で３０分間予備的に形成することにより。さらなる競合アッセイを行った。次に複合体を、アミンがカップリングしたアトリマー（ATRIMER）（商標）複合体を有する表面に注入した。アトリマー（Atrimer）Ａ５Ｆについての表１７に示すとおり、ＩＬ−２３Ｒアトリマー（Atrimer）の残りの結合を決定し、競合物が存在しないときの結合に対する百分率として表した（ＩＬ−２３又は異なるアトリマー（Atrimer））。
【０２５０】
【表２３】
2013507124.tif 000024
【０２５１】
実施例１６
細胞ベースアッセイにおける選択したアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体の試験活性
１０％ＦＢＳ／Advanced RPMI培地（Invitrogen）中ＩＬ−２３Ｒアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体又はウステキヌマブの存在下、ヒト組換えＩＬ−２３（１ｎｇ／ｍＬ、eBioscience）及びＰＨＡ（１μｇ／ｍＬ、Sigma）により１×１０６細胞／ｍＬで健常ドナー（AllCells）からのヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を刺激した。培養下４日後、細胞上清を回収し、IL-17 Quantikineキット（R&D Systems）を使用してＥＬＩＳＡによりアッセイした。並行培養において、ＰＢＭＣをヒト組換えＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍＬ、R&D Systems）でＩＬ−２３Ｒアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体又はウステキヌマブの存在下に４日間処理した。ＩＦＮγ及びＩＬ−１７について細胞上清をLuminex（Procarta, Panomics）によりアッセイし、Bioplexシステム（BioRad）で分析した。全ての処理は三回繰り返して実施し、GraphPad Prismソフトウェアを使用して平均値及び標準誤差をプロットした。図１１、図１２、及び図１３に示されるとおり、ＩＬ−２３アトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体はＩＬ−２３誘導ＩＬ−１７産生を阻害したが、ＩＬ−１２誘導ＩＦＮγ産生は阻害しなかった。予想どおり、ウステキヌマブはＩＬ−２３及びＩＬ−１２の双方の応答を阻害した。
【０２５２】
表１８は、ＰＢＭＣアッセイにおいて試験した親和性成熟アトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体の結果を示す。アトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体について、ＩＬ−２３誘導ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｆ、及びＩＬ−２２産生を阻害するアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体の能力を指示のとおり計測した。ウステキヌマブについてのＩＣ５０と比較したアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体のＩＣ５０を分子とする比として結果を示す。一部のアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体については、２回以上のアッセイの結果を示す。
【０２５３】
【表２４】
2013507124.tif 000025
【０２５４】
実施例１７
ＮＫＬ作動薬アッセイ
ＩＬ−２３Ｒアトリマー（ATRIMER）（商標）ポリペプチド複合体のＩＬ−２３Ｒに対する作動薬活性の欠如を示すため、選択されたＩＬ−２３Ｒアトリマー（ATRIMER）（商標）複合体がヘテロ二量体ＩＬ−２３受容体を発現するナチュラルキラー細胞系ＮＫＬに結合したときのＳＴＡＴ−３リン酸化を測定した。１５０μｇ／ｍＬの濃度のアトリマー（ATRIMER）（商標）複合体又は陽性対照としての５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２３を９６−ウェルプレートにおいて１４０，０００ＮＫＬ細胞／ウェルとして３７℃でインキュベートした。１０分後、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心し、ＰＢＳで２回洗浄した。次に細胞を、Cell Signaling Technology（PATH SCAN（登録商標）Phospho Stat3サンドイッチＥＬＩＳＡキット、カタログ番号７３００、Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA）から入手したＳｔａｔ３リン酸化キットに提供されるプロトコルに従い溶解させ、処理した。Molecular DevicesのＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４５０ｎＭでの吸光度によりＳｔａｔ−３リン酸化を計測した。複合体０５６−５３．Ｈ４Ｅ及びＨ４ＥＰ１Ｅ９を例示する図１４に示されるとおり、アトリマー（ATRIMER）（商標）複合体によるＩＬ−２３Ｒ受容体の活性化は観察されれなかったが、一方、ＩＬ−２３は予想どおりＳＴＡＴ−３リン酸化をもたらした。図１５Ａ及び図１５Ｂに要約するとおり、１０１−５１−１Ａ４、１０１−５１−１Ａ７、１０５−０８−１Ａ８、１０１−５４−４Ｂ６、Ｈ４Ｅ  Ｅ１３７Ａ、１０１−１１３−６Ｃ１０８及び１０１−５４−４Ｂ１０などの試験した他の全てのアトリマーについて同様の結果が観察された。
【０２５５】
上記の例は、これらのライブラリーで生成し得る変異の範囲を限定するものではない。他のライブラリーを作成することができ、そこでは様々な数のランダムな、又はより標的化されたアミノ酸を使用して既存のアミノ酸が置き換えられ、異なる組み合わせのループを利用することができる。加えて、他の突然変異及び突然変異の生成方法、例えばランダムＰＣＲ突然変異生成などを利用して、パニングに供し得る多様なライブラリーを提供することができる。
【０２５６】
【表２５】
2013507124.tif 000026
【０２５７】
【表２６】
2013507124.tif 000027
【０２５８】
【表２７】
2013507124.tif 000028
【０２５９】
【表２８】
2013507124.tif 000029
【０２６０】
【表２９】
2013507124.tif 000030
【０２６１】
【表３０】
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【０２６２】
【表３１】
2013507124.tif 000032
【０２６３】
本明細書には、本発明の様々な具体的実施形態が記載されるが、本発明はそれらの正確な実施形態に限定されるものではなく、そこには本発明の範囲及び精神から逸脱することなく様々な変更又は改良が当業者によって影響を受け得ることが理解されるべきである。
【０２６４】
上記に提供する例は単に例示であり、本発明のあらゆる可能な実施形態、適用又は改良の網羅的な列挙であることは意図しない。従って、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本発明の記載される方法及びシステムの様々な改良及び変形が当業者には明らかであろう。本発明は具体的な実施形態との関連において記載したが、特許請求される本発明がそのような具体的な実施形態に過度に限定されてはならないことは理解されるべきである。実際には、分子生物学、免疫学、化学、生化学又は関連分野の当業者には明らかである本発明を実施するための記載される態様の様々な改良は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０２６５】
本発明は本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬等に限定されないことが理解され、それらは当業者であれば認識するとおり異なり得る。また、本明細書で使用される用語法は特定の実施形態を記載することのみを目的として用いられ、本発明の範囲の限定を意図するものではないことも理解されなければならない。
【０２６６】
本発明の実施形態並びにその様々な特徴及び有利な詳細は、非限定的な実施形態を参照してさらに詳細に説明され、及び／又は添付の図面に図示され、及び以下の記載に詳述される。図面に図示される特徴は、必ずしも一定の尺度で描かれているとは限らず、及び本明細書で明示的に述べられていない場合であっても、当業者であれば認識するとおり一実施形態の特徴が他の実施形態と共に用いられ得ることに留意しなければならない。
【０２６７】
本明細書に記載される任意の数値は、任意の低い値と任意の高い値との間に少なくとも２単位の分離があるならば、低い方の値から高い方の値まで１単位ずつの増分であらゆる値を含む。例として、成分の濃度又はプロセス変数の値、例えば、サイズ、角度の大きさ、圧力、時間などが、例えば、１〜９０、具体的には２０〜８０、より具体的には３０〜７０であると記載される場合、それは、本明細書において１５〜８５、２２〜６８、４３〜５１、３０〜３２等の値が明示的に列挙されているものと意図される。１未満の値については、必要に応じて１単位が０．０００１、０．００１、０．０１又は０．１であるものと見なされる。これらは具体的に意図されることの例に過ぎず、列挙される低い方の値と高い方の値との間の数値のあらゆる可能な組み合わせが、同様にして本願に明示的に示されたものと見なされる。
【０２６８】
本明細書に引用される全ての参考文献及び刊行物の開示は、各々が参照により個別に援用されたのと同じ程度まで全体として参照により明示的に援用される。
【０２６９】
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【図１Ａ】
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【図２Ａ】
2013507124.tif 000035
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
2013507124.tif 000039
【図４】
2013507124.tif 000040
【図５】
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【図６】
2013507124.tif 000042
【図７】
2013507124.tif 000043
【図８】
2013507124.tif 000044
【図９】
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【図１０】
2013507124.tif 000046
【図１１】
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【図１２】
2013507124.tif 000048
【図１３】
2013507124.tif 000049
【図１４】
2013507124.tif 000050
【図１５Ａ】
2013507124.tif 000051
【図１５Ｂ】
2013507124.tif 000052
【図１６】
2013507124.tif 000053
【図１７Ａ】
2013507124.tif 000054
【図１７Ｂ】
2013507124.tif 000055
【図１８Ａ】
2013507124.tif 000056
【図１８Ｂ】
2013507124.tif 000057
【配列表】
2013507124000001.app
【国際調査報告】
2013507124.tif 000058
2013507124.tif 000059
2013507124.tif 000060
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2013507124.tif 000062