(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は細胞成長モジュールの組立方法に関する。該組立方法は、細胞成長モジュールにおいて細胞の成長を妨げる細胞毒性物が細胞成長モジュール内に生成されることを抑制しながら、細胞成長モジュールを組み立てる。膜をハウジングに挿入する前に、ガンマ線照射のような電磁照射を用いて該膜の表面を処理する。該細胞成長モジュールは少なくとも膜とハウジングを有する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成高分子膜と合成高分子ハウジングを有する細胞成長モジュールの組立方法であって、
電磁照射によって前記膜を処理して、細胞を前記膜に接着させるために前記膜の表面を修飾する工程と、
前記処理工程の後に、前記膜を前記ハウジングに挿入して、前記細胞成長モジュールを形成する工程と
を備えることを特徴とする細胞成長モジュールの組立方法。
【請求項２】
請求項１記載の細胞成長モジュールの組立方法において、前記膜は中空糸膜であることを特徴とする細胞成長モジュールの組立方法。
【請求項３】
請求項２記載の細胞成長モジュールの組立方法において、前記処理工程を行う前に前記中空糸を束ねる工程をさらに備えることを特徴とする細胞成長モジュールの組立方法。
【請求項４】
請求項２記載の細胞成長モジュールの組立方法において、前記処理工程を行った後に前記中空糸を束ねる工程をさらに備えることを特徴とする細胞成長モジュールの組立方法。
【請求項５】
請求項２記載の細胞成長モジュールの組立方法において、前記挿入工程の後に、前記束の端部をポッティングし、前記ハウジングに対して流体密シールを行う工程をさらに備えることを特徴とする細胞成長モジュールの組立方法。
【請求項６】
請求項１記載の細胞成長モジュールの組立方法において、前記処理工程は、ガンマ線照射処理工程であることを特徴とする細胞成長モジュールの組立方法。
【請求項７】
請求項６記載の細胞成長モジュールの組立方法において、前記ガンマ線照射処理工程は、１２．５ｋＧｙから１７５ｋＧｙの範囲のガンマ線照射線量にて処理を行うことを特徴とする細胞成長モジュールの組立方法。
【請求項８】
請求項１記載の細胞成長モジュールの組立方法において、前記処理工程は、プラズマ処理中に放射される電磁放射による処理工程であることを特徴とする細胞成長モジュールの組立方法。
【請求項９】
請求項８記載の細胞成長モジュールの組立方法において、前記プラズマ処理は、ガスプラズマ処理であることを特徴とする細胞成長モジュールの組立方法。
【請求項１０】
請求項９記載の細胞成長モジュールの組立方法において、前記ガスプラズマ処理は、高周波グロー放電であることを特徴とする細胞成長モジュールの組立方法。
【請求項１１】
請求項１記載の細胞成長モジュールの組立方法において、前記処理工程は、ガンマ線照射とガスプラズマの両方による処理工程であることを特徴とする細胞成長モジュールの組立方法。
【請求項１２】
請求項１記載の細胞成長モジュールの組立方法において、前記膜は、ポリビニルピロリドンと、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン及びポリアリルエーテルスルホンからなる群から選択される高分子とから構成されることを特徴とする細胞成長モジュールの組立方法。
【請求項１３】
請求項１記載の細胞成長モジュールの組立方法において、前記膜は、平板膜であることを特徴とする細胞成長モジュールの組立方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜表面をバイオリアクタに組み付ける前に行う膜表面の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の治療や医学療法における幹細胞の使用に対して注目が集まっている。細胞増殖システムを使用することにより、幹細胞や、幹細胞を含む骨髄細胞のようなその他のタイプの細胞を成長することができる。ドナー細胞から増殖した幹細胞を使用することで、損傷を受けた又は欠陥のある組織を修復又は置換することができ、広範囲な疾病に対する治療が考えられている。
【０００３】
細胞増殖システムの重要な構成部品として、バイオリアクタすなわち細胞成長チャンバは、細胞成長のための最適環境の提供において重要な役割を果たしている。バイオリアクタは、細胞への栄養供給や代謝物除去、さらには細胞成長を促す生理化学的環境の提供を効率的に行う。
【０００４】
現在、多くの種類のバイオリアクタが入手可能である。そのうち、最も一般的なタイプとして、平板型バイオリアクタ及び中空糸型バイオリアクタの２つがある。平板型バイオリアクタでは、細胞を大きな平面上に成長させることができる。一方、中空糸型バイオリアクタでは、細胞を中空糸の内部表面上又は外部表面上のどちらかに成長させることができる。通常、複数の（中空糸）膜が束ねられて、ケーシング又はハウジング内に配置される。
【０００５】
損傷組織の修復又は置換に用いられる細胞の多くは、接着性細胞である。本発明において、接着性細胞は、維持、成長、分化、貯蔵等を行うべき基質に付着する細胞として定義される。間葉系幹細胞は、接着性細胞である。懸濁細胞と異なり、接着性細胞は、表面に付着した場合のみ、成長及び分裂ができる。
【０００６】
接着性細胞を成長させるために通常使用される膜は、セルロースのような天然材料で作製してもよいし、合成高分子のような人工材料で作製してもよい。膜を合成高分子材料で作製した場合、細胞が該膜に接着可能となるように、細胞をシステムに導入する前に該膜の表面に対して処理を行う必要がある。
【０００７】
膜をコーティングする際に通常使用される天然材料の例としては、フィブロネクチンのようなタンパク質や血漿（ｐｌａｓｍａ）内にあるタンパク質が挙げられる。細胞接着のために放射線を使用して膜表面を化学修飾する手法の例としては、ガンマ線や電子線によるグラフト重合やプラズマ処理が挙げられる。
【０００８】
通常、膜は、中空糸をハウジングに配置した後に、タンパク質や放射線によって処理される。放射線を使用する場合、膜表面を修飾するには高い放射線量が必要なため、バイオリアクタにおけるその他の部分を破壊するといった望ましくない副次的な影響を引き起こす恐れがある。バイオリアクタのハウジングが破壊されると、細胞毒性生成物が細胞成長領域に広がり、中空糸内に浸入し、バイオリアクタ内における細胞成長を妨げる恐れがある。従来では、細胞をバイオリアクタに配置する前に、バイオリアクタを種々の溶液で広範囲にわたって洗浄し、毒性生成物を除去している。これは、タンパク質含有媒体に一晩暴露することと伴わせて、数リットルの電解質溶液を用いて、使用時に行われる。
【０００９】
国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００６８４７号（国際公開第２０１０／０３４４６６号パンフレット）において、接着性細胞の成長のために合成ＰＥＳ／ＰＶＰ／ＰＡ膜を使用することが教示されている。この場合、作製後の該膜に対して、酸素存在下において１２．５ｋＧｙから１７５ｋＧｙの範囲の線量にてベータ線又はガンマ線又は電子線の照射が行われる。この従来発明では、中空糸を、ハウジングに組み入れ、ポッテイングし（ｐｏｔｔｅｄ）、組み立てたバイオリアクタを、使用前に、最終工程としてガンマ線照射する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
実際の使用において、本発明の発明者は、合成膜処理のために行われる上述のガンマ線照射工程が、ハウジングに損傷を与えるということを発見した。ハウジングを照射した場合、細胞に対して細胞毒性となる高分子破壊生成物が生成された。従って、そのようなバイオリアクタを使用する場合、細胞をバイオリアクタに導入する前に、細胞毒性生成物を除去する必要がある。これは、細胞導入の前に、バイオリアクタを複数回洗浄することで行われる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
膜の照射によるバイオリアクタからの細胞毒性生成物の形成が防止されれば、ユーザーが使用前に行うバイオリアクタの汚染物質除去作業に費やす時間及び材料物質を抑えられるであろう。さらには、複数回にわたる洗浄工程や溶液によってもたらされる汚染のリスクが低減されるであろう。本発明は、バイオリアクタを汚染する細胞毒性生成物の防止を行う。
【００１２】
本発明の目的は、細胞成長モジュールの高分子ハウジングへの電磁照射によって引き起こされる細胞毒性生成物の形成を防止しつつ、電磁照射により高分子膜の表面を処理することである。これは、膜を高分子ケーシングに配置する前に電磁照射により膜を処理することによって実現される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、中空糸型バイオリアクタで使用される未組み立て状態の中空糸膜の束の図である。
【図２】図２は、中空糸型バイオリアクタのエンドキャップを含む高分子ハウジングの外観図である。
【図３】図３は、前記中空糸膜を内部に有するハウジングを備えた細胞成長モジュールの断面図である。
【図４】図４は、細胞毒性物を生成することなしに細胞成長モジュールを組み立てる方法を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に係る膜は、種々の形状をもつことができる。中空糸膜が図に示されるが、本発明の方法は、平板膜を含む、あらゆる形状の膜に適用することができる。細胞成長システムにおいて中空糸膜が、細胞成長には好ましいことが示されてきたが、これは、該システムの該膜によって、細胞への栄養供給、排泄物の除去、ガス交換を効率的に行えるからである。また、中空糸においては、膜の体積に対し、細胞の成長する表面積が大きくなる。
【００１５】
図示される実施形態において、細胞成長媒体を中空糸の外側又は毛細管外側空間（ＥＣ空間）に沿って流しながら、細胞を中空糸の内腔又は毛細管内側空間（ＩＣ空間）内で成長させる。しかしながら、本発明の目的においては、本発明の要旨を逸脱しない範囲で、細胞成長媒体をＩＣ空間内にて流しながら、細胞をＥＣ空間にて成長させることもできる。
【００１６】
図１は、バイオリアクタで使用される各中空糸３０を有する高分子中空糸膜１２の束を示す。該中空糸の作製に使用可能な高分子材料の例は、以下に記載される。複数の中空糸はまとめて「膜」と呼ばれる。用語「バイオリアクタ」と用語「細胞成長チャンバ」は、同じ意味で用いられる。
【００１７】
中空糸は、細胞成長チャンバの入口ポート及び出口ポートと流通可能に結合されていれば、任意の数の中空糸を使用してよい。
【００１８】
中空糸は、半透性且つ生体適合性の高分子材料で作製される。半透性膜により、栄養分、排泄物及び溶存ガス（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｇａｓｅｓ）は該膜を通じてＥＣ空間とＩＣ空間との間で移動可能となる。種々の実施形態において、中空糸膜の分子移動特性は、代謝廃棄物を該膜を通じて非細胞側に拡散させて除去しながら、成長因子であるサイトカインのような細胞成長に必要である高価な試薬が中空糸の細胞成長側から損失することを最小限にするように選択される。
【００１９】
中空糸３０は、少なくとも１つの疎水性高分子及び少なくとも１つの親水性高分子とから構成される。好ましい疎水性高分子としては、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、ポリアラミド、ポリアリルエーテルスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリアリルスルホン、ポリカーボネート、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリエーテルイミド及びそれら高分子の共重合体の混合物が挙げられる。好ましい親水性高分子としては、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリグリコールモノエステル、水溶性セルロース誘導体、ポリソルベート及びポリエチレン―ポリプロピレンオキシド共重合体が挙げられる。
【００２０】
種々の形態において、中空糸の外側層は、内側層又は細胞接着側に対してなめらかな或いは低い表面粗さを有する均質開孔構造によって特徴づけられる。孔開口径は、０．５μｍから３μｍであり、中空糸の外側表面における孔数は、１ｍｍ２当たり１０，０００個から１５０，０００個である。この外側層の厚さは、約１μｍから約１０μｍである。中空糸における次の層は、スポンジ構造を有する第２層である。本発明の好ましい実施形態では、第２層の厚さは、約１μｍから約１５μｍである。この第２層は、外側層の支持体として機能する。第２層に隣接する第３層は、指状構造を有する。この第３層は、機械的安定性を提供し、また高い空隙容量であるため、膜を通じた分子の移動に対する膜の抵抗を低くする。使用中、指状の空隙は流体で満たされ、該流体により、低い空隙容量を有するスポンジ構造で満たされた基盤（ｍａｔｒｉｘ）よりも、拡散・伝達において低い抵抗を示す。この第３層の厚さは、２０μｍから６０μｍである。
【００２１】
上述したような膜は、ガンブロ社（Ｇａｍｂｒｏ  Ｄｉａｌｙｓａｔｏｒｅｎ  ＧｍｂＨ  （Ｈｅｃｈｉｎｇｅｎ、  ＤＥ））やメンブラーナ社（Ｍｅｍｂｒａｎａ  ＧｍｂＨ  （Ｗｕｐｐｅｒｔａｌ、  ＤＥ））のような会社から入手可能である。
【００２２】
上述したように、間葉系幹細胞のような接着性細胞を細胞成長チャンバにて増殖させる場合、チャンバ内の高分子糸を表面修飾して細胞成長及び／又は細胞の膜への接着を促進する必要がある。フィブロネクチンやラミニンやコラーゲンのような天然物質を用いて表面修飾は通常行われるが、そのような表面処理の場合、一般には、バイオリアクタを再使用することができない。従って、膜の再使用が可能となり且つ膜の表面修飾が行えるガンマ線照射又はプラズマ処理による表面修飾が望ましい。
【００２３】
中空糸処理に使用されるガンマ線放射線量は、１２．５ｋＧｙから１７５ｋＧｙの範囲である。線量は、膜の表面修飾が行われる程度に高く、且つ膜自身が崩壊しない程度に低くするべきである。ガンマ線照射はＣｏ−６０線源を用いて行うことができる。膜をガンマ線照射する際、膜は湿っていても乾燥していてもよい。すなわち、完全に水の無い状態から完全に水に浸っている状態までのいずれの状態でもよい。望ましい線量を当てるために必要な照射時間は放射線源強度のような因子によって変化するが、２５キログレイ線量で６時間から７時間の照射及び７５キログレイ線量で１７時間から２０時間の照射が必要となるであろう。水で飽和した膜に対しては、より高い放射線量が必要となるであろう。膜のガンマ線照射は、変更していないそのままの空気中にて、又は酸素を増やした空気中にて行うことができる。照射後、膜表面は、さらなる処理を必要とせずに、細胞の直接接着及び細胞成長に使用できる状態となる。
【００２４】
プラズマ処理、特にガスプラズマ処理もまた膜表面修飾に用いてもよい。高周波グロー放電は、ガスプラズマ処理の一例である。このタイプのガスプラズマ処理を始める場合、まず、膜を真空チャンバに配置して、ガスを低圧で加える。該ガスを高周波誘導放電又は高周波容量放電させることによって、電磁場又はガスプラズマを発生させる。該ガスは、電磁場からエネルギーを吸収してイオン化し、高エネルギー粒子を生成して、膜の表面修飾に使用される。ガスプラズマ中のエネルギー粒子は、イオン、電子、ラジカル及び短波紫外光領域における光子を含み、プラズマから膜表面へと移動するエネルギーを与える。適当なガスとしては、ヘリウム、アルゴン、酸素のような無機ガス、アセチレンやピリジンのような有機ガス、或いは無機ガスと有機ガスとの混合ガス等が挙げられる。一般には、１０ワットから３０００ワットの範囲の電力レベルが許容可能であり、周波数は１ｋＨｚから１００ＭＨｚの範囲が可能であり、暴露時間は５秒から１２時間、ガス圧は０．００１Ｔｏｒｒから１００Ｔｏｒｒの範囲が可能である。
【００２５】
放射線とガスプラズマを組み合わせてもよい。
【００２６】
図２は、処理済みの中空糸膜１２の束が挿入されるハウジング又はケーシング１４を示す。ハウジング１４は、エンドキャップ１６、１８、入口ポート２０、２４、出口ポート２２、２６、スリーブ１５を有する。
【００２７】
細胞成長チャンバハウジング１４は、円筒形状として示されているが、当技術分野で既知の如何なる形状であってもよい。細胞成長チャンバハウジング１４は、ポリ塩化ビニルやポリカーボネートのような当技術分野で既知の任意のタイプの生体適合性高分子材料で作製することができる。スリーブ１５及びエンドキャップ１６、１８、ポート２４、２６のような種々の部品も、通常は生体適合性高分子材料で作製される。
【００２８】
図３は、組み立て済みの細胞成長モジュール１０の断面図である。細胞成長モジュール１０は、ハウジング１４と中空糸膜１２の束を備える。中空糸膜１２は、細胞成長モジュール１０のハウジング１４の内部に配置される。
【００２９】
細胞成長モジュール１０の組み立てにおいて、中空糸３０は束ねられ、接続材料（「ポッティング（ｐｏｔｔｉｎｇ）」又は「ポッティング材料」とも呼ぶ）によって細胞成長チャンバの端部に固着される。ポッティングは、媒体及び細胞の入口ポートから中空糸内への流れを妨げず且つ当該媒体及び細胞が中空糸内のみに流れ込むのであれば、いかなる生体適合性材料であってもよい。ポッティング材料の例としては、限定はされないが、ポリウレタンが挙げられる。種々の実施形態において、中空糸及びポッティングは、流体が中空糸の内腔に対して流入・流出可能となるように、各端部において、中空糸の中心軸に対して垂直に切断されてもよい。エンドキャップ１６、１８は細胞成長チャンバの各端部に配置される。
【００３０】
図４は、ハウジング１４の電磁放射への暴露による細胞毒性物の生成が起こらないような細胞成長モジュール１０の組立方法を示す。まず、中空糸がガンマ線照射及び／又はプラズマ処理によって処理される（５０）。次に、処理された中空糸膜１２がハウジングへ挿入・ポッティングされる（５２）。最後に、エンドキャップ１６、１８がスリーブ１５の各端部に配置され、密閉が行われる（５４）。なお、中空糸は、ハウジングに挿入するために束ねられる前或いは後のいずれに処理してもよい。
【００３１】
中空糸膜１２の表面に対してさらに処理する必要はない。従って、高分子ハウジング又はケーシング１４は電磁照射にさらされず、細胞成長の妨げとなる細胞毒性生成物の形成が回避される。
【符号の説明】
【００３２】
１０…細胞成長モジュール                １２…中空糸膜
１４…ハウジング                        １５…スリーブ
１６、１８…エンドキャップ              ２０、２４…入口ポート
２２、２６…出口ポート                  ３０…中空糸
【図１】
2013507143.tif 000003
【図２】
2013507143.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2013507143.tif 000008
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