(57)【要約】本発明は、一般に血管新生及び腫瘍転移の阻害に関する。特に、本発明はＧ−ＣＳＦ抗体等のＧ−ＣＳＦアンタゴニスト、及び抗Ｂｖ８抗体及び抗ＰＫＲ１抗体等のＢｖ８アンタゴニストを用いる腫瘍転移の予防又は処置に関する。
2013500993.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストの有効量を被験体に投与することを含む、腫瘍転移を阻害又は低減させる方法。
【請求項２】
Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストが原発性腫瘍が被験体の前転移性臓器へ拡散することを阻害又は低減させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍転移を低減させることが肺転移の大きさ又は数を低減させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍の転移を阻害又は低減させることが、被験体の前転移性臓器におけるＢｖ８、ＰＫＲ１、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ９の一以上の発現レベルを低減させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍の転移を阻害又は低減させることが、被検体の前転移性臓器におけるＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の発現レベルを減少させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍の転移を阻害又は低減させることが、被検体の前転移性臓器におけるＧ−ＣＳＦ及びＰＫＲ１の発現レベルを低減させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
被検体にＢｖ８アンタゴニストの有効量を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
被検体にＶＥＧＦアンタゴニストの有効量を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
被検体が以前にＶＥＧＦアンタゴニストにより処置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブ又はその断片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
被検体にＧ−ＣＳＦアンタゴニスト又はＢｖ８アンタゴニストの有効量を投与することを含む、前転移性臓器におけるＧ−ＣＳＦ、Ｂｖ８、ＰＫＲ１、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ９の一以上の発現レベルを低減させる方法。
【請求項１３】
ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の発現レベルが前転移性臓器において低減させられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
被検体にＧ−ＣＳＦアンタゴニスト又はＢｖ８アンタゴニストの有効量を投与することを含む、転移性腫瘍細胞又は好中球の前転移性臓器への遊走を阻害する方法。
【請求項１５】
前転移性臓器が肺又は肝臓である、請求項２、４、６、１２又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストが抗Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片である、請求項１、１２又は１４に記載の方法。
【請求項１７】
Ｂｖ８アンタゴニストが抗Ｂｖ８抗体又は抗ＰＫＲ１抗体ないしはその断片である、請求項７、１２又は１４に記載の方法。
【請求項１８】
被験体に化学療法剤の有効量を投与することを更に含む、請求項１、１２又は１４に記載の方法。
【請求項１９】
被験体がヒトである、請求項１、１２又は１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、内容を出典明示によりここに援用する２００９年７月３１日出願の仮出願第６１／２３０５７１号、２０１０年６月２日出願の仮出願第６１／３５０５５８号に対して米国特許法第１１９条第（ｅ）項の下の優先権を主張する米国特許法施行規則１．５３（ｂ）（１）条の下に出願した非仮出願である。
（発明の分野）
本発明は一般的に血管新生及び腫瘍の転移に関連する病気及び疾患の治療に有用である組成物及び方法に関する。特に、本発明は、予防又はＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストを用いる腫瘍転移の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は腫瘍進行及び転移に重要な役割を果たしていることは十分確立されており、抗血管新生は臨床的に有効な抗癌戦略を表わしている(Folkman, Nat Med 1, 27-31 (1995); Ferrara and Kerbel, Nature 438, 967-974 (2005); Carmeliet, Nat Med 9, 653-660 (2003))。
【０００３】
最近数年間にわたり、様々な骨髄（ＢＭ）由来細胞型の腫瘍血管新生に対する寄与は、徹底した研究対象となっている(Coussens and Werb, Nature 420, 860-867 (2002); Rafii et al., Nat Rev Cancer 2:826-35 (2002); De Palma et al., Trends Immunol 28:519?524 (2007); Shojaei et al., Trends Cell Biol 18:372?378 2008))。これらの細胞型の中で、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞はしばしば腫瘍及び腫瘍を有する動物の末梢血（ＰＢ）において増加しており、腫瘍血管新生を促進し(Yang et al., Cancer Cell 6, 409-421 (2004))、免疫機能を抑制し、よって骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の名称がある(Bronte et al., Blood 96:3838-3846(200))。しかしながら、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞における末梢動員、腫瘍ホーミング及び血管新生特性の獲得に関与する開始メカニズムは解明されていない。
【０００４】
ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は、特定の内皮細胞型のマイトジェンとして、造血前駆細胞の増殖因子として(LeCouter et al., Proc Natl Acad Sci USA 100, 2685-2690 (2003); LeCouter et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 16813-16818 (2004))、及び神経修飾物質として(Cheng et al., Nature 417, 405-410 (2002); Matsumoto et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:4140-4145 (2006))以前に特徴づけられた分泌タンパク質であるＢｖ８を含む、複数の血管新生因子を生成する。複数の異種移植片並びにトランスジェニック癌モデル（ＲＩＰ−Ｔａｇ）の分析は、Ｂｖ８が骨髄細胞の末梢動員の増大及び血管新生の局所的刺激により、腫瘍血管新生を促進することを示した(Shojaei et al., Nature 450:825-831 (2007); Shojaei et al., Proc Natl Acad Sci USA 105:2640-2645 (2008))。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が、インビボ及びインビトロ両方でＢｖ８発現の強力なインデューサーとして報告されている(Shojaei et al., Proc Natl Acad Sci USA 106(16):6742-7 (2009))。生理学的に、Ｇ−ＣＳＦは造血幹細胞、前駆細胞、及び成熟細胞、特に好中球の血液循環中への動員に重要な役割を持っている(Rapoport et al.，Blood Rev 6:43?57 (1992); Lieschke et al., Blood 84:1737?1746 (1994))。Ｇ−ＣＳＦはまた、好中球、好酸球及び好塩基球等の顆粒球系の細胞への前駆細胞の分化にも必要である。幾つかの報告にて、Ｇ−ＣＳＦの投与が腫瘍血管新生及び増殖を高めると示唆しているが(Natori et. al., Biochem Biophys Res Commun 297:1058?1061 (2002); Okazaki, T. et al., Int Immunol 18, 1-9 (2006))、腫瘍形成において本因子が関与している証拠は決定的というにはほど遠い。
【０００５】
転移とは、癌細胞が元の腫瘍部位を離れ、血流又はリンパ系を介して体の他の部分に移行する複雑な一連の段階である。転移性腫瘍は癌の後期段階で非常に一般的である。転移は、固形腫瘍による死亡の主要な原因である。残念ながら、現在利用可能な治療の選択肢ではほとんど転移性癌を治癒することができない。
【０００６】
従って、血管新生及び腫瘍転移の進行をどのように効果的に抑制し、阻止し、かつ治療することができるかを見いだして理解する必要がある。本発明は、以下の開示を総括することで明らかになるであろうが、これら及び他の必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、Ｇ−ＣＳＦ及びＢｖ８が、血管新生及び腫瘍転移に関与しているという発見に、少なくとも一部は基づいている。
【０００８】
一態様において、本発明はＧ−ＣＳＦアンタゴニストの有効量を被験体に投与することを含む腫瘍転移を阻害又は減少させる方法を提供する。所定の実施態様において、本方法は被験体にＢｖ８アンタゴニストの有効量を投与することを更に包含する。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストは、被検体の前転移性臓器への原発性腫瘍の拡散を阻害又は低減する。所定の実施態様において、腫瘍転移を減らすことは肺転移の大きさ又は数を減らすことを含む。所定の実施態様において、腫瘍転移を阻害又は減少させることは、次の分子のいずれか又は複数の発現レベルを減少させることを含む：Ｇ−ＣＳＦ、Ｂｖ８、ＰＫＲ１、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ９。所定の実施態様において、腫瘍転移を阻害又は減少させることは、Ｇ−ＣＳＦ及びＰＫＲ１の発現レベルを減少させることを含む。所定の実施態様において、腫瘍の転移を阻害又は減少させることは、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の発現レベルを減少させることを含む。所定の実施態様において、腫瘍転移を阻害又は減少させることは、Ｂｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の発現レベルを低下させることを含む。所定の実施態様において、腫瘍の転移を阻害又は減少させることは、Ｇ−ＣＳＦ、Ｂｖ８、及びＰＫＲ１の発現レベルを減少させることを含む。所定の実施態様において、発現レベルとはｍＲＮＡの発現レベルである。所定の実施態様において、発現レベルとはタンパク質の発現レベルである。所定の実施態様において、これらの分子の一つ以上の発現レベルは、被検体の前転移性臓器において減少する。所定の実施態様において前転移性臓器は肺である。所定の実施態様において前転移性臓器は肝臓である。
【０００９】
所定の実施態様において、本方法は更に被験体にＶＥＧＦアンタゴニストの有効量を投与することを含む。特定の実施態様において、被験体は以前にＶＥＧＦアンタゴニストで治療を受けている。特定の実施態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片である。所定の実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブ又はその断片もしくは変異体である。所定の実施態様において、本方法は被験体に化学療法剤の有効量を投与することを更に含む。
【００１０】
一態様において、本発明はＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストの有効量を被験体に投与することを含む、前転移性臓器においてＧ−ＣＳＦ、Ｂｖ８、ＰＫＲ１、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ９の発現レベルを減少させる方法を提供する。別の態様において、本発明は、被験体にＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストを有効量投与することを含む、前転移性臓器において次の分子、Ｇ−ＣＳＦ、Ｂｖ８、ＰＫＲ１、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ９の一つ以上の発現レベルを減少させる方法を提供する。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストが被験体に対して投与される場合、ＰＫＲ１、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９の発現レベルが被験体の前転移性臓器において減少させられる。所定の実施態様において、Ｂｖ８アンタゴニストが被験体に対して投与される場合、ＰＫＲ１、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９の発現レベルが被験体の前転移性臓器において減少させられる。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストが被験体に対して投与される場合、Ｂｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９の発現レベルが被験体の前転移性臓器において減少させられる。所定の実施態様において、Ｂｖ８アンタゴニストが被験体に対して投与される場合、Ｂｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９の発現レベルが被験体の前転移性臓器において減少させられる。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストが被験体に対して投与される場合、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９の発現レベルが被験体の前転移性臓器において減少させられる。所定の実施態様において、Ｂｖ８アンタゴニストが被験体に対して投与される場合、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９の発現レベルが被験体の前転移性臓器において減少させられる。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストが被験体に投与される場合、Ｇ−ＣＳＦ及びＰＫＲ１の発現レベルが被験体の前転移性臓器において減少させられる。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストが被験体に投与される場合、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＫＲ１及びＭＭＰ−９の発現レベルが被験体の前転移性臓器において減少させられる。
【００１１】
一態様において、本発明は被験体に対してＧ−ＣＳＦアンタゴニスト又はＢｖ８アンタゴニストを有効量投与することを含む、前転移性臓器への転移性腫瘍細胞の遊走を阻害する方法を提供する。その他の態様において、本発明は被験体に対してＧ−ＣＳＦアンタゴニスト又はＢｖ８アンタゴニストを有効量を投与することを含む、前転移性臓器への好中球の遊走を阻害する方法を提供する。所定の実施態様において、本方法はＧ−ＣＳＦアンタゴニストの有効量及びＢｖ８アンタゴニストの有効量を被験体に投与することを含む。
【００１２】
所定の実施態様において、被験体の前転移性臓器は肺、肝臓、脳、骨又はリンパ節である。所定の実施態様において、被験体の前転移性臓器は肺又は肝臓である。所定の実施態様において、被験体の前転移性臓器は肺である。
【００１３】
所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストは抗Ｇ−ＣＳＦ抗体である。所定の実施態様において、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体はモノクローナル抗体である。所定の実施態様において、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体はヒト化抗体である。所定の実施態様において、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体はヒト抗体である。
【００１４】
所定の実施態様において、Ｂｖ８アンタゴニストは抗Ｂｖ８抗体である。所定の実施態様において、Ｂｖ８アンタゴニストは抗ＰＫＲ１抗体である。所定の実施態様において、抗Ｂｖ８抗体又は抗ＰＫＲ１抗体はモノクローナル抗体である。所定の実施態様において、抗Ｂｖ８抗体又は抗ＰＫＲ１抗体はヒト化抗体である。所定の実施態様において、抗Ｂｖ８抗体又は抗ＰＫＲ１抗体はヒト抗体である。
【００１５】
別の態様において、本発明は、被検体由来の試料が参照試料における発現レベルよりも大きいレベルでＢｖ８、ＰＫＲ１及び／又はＧ−ＣＳＦを発現する細胞を含むかどうかを決定することを含む、被験体の腫瘍がＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストによる治療に効果的に応答するかどうかを予測する方法を提供し、前記細胞の検出は被験体が前記Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストによる治療に効果的に応答しうる腫瘍を有することを示す。所定の実施態様において、参照試料における発現レベルよりも高いレベルでＢｖ８、ＰＫＲ１及びＧ−ＣＳＦを発現する細胞の検出は、被験体が前記Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストによる治療に対して効果的に応答しうる腫瘍細胞を有することを示す。所定の実施態様において、Ｂｖ８、ＰＫＲ１及び／又はＧ−ＣＳＦのｍＲＮＡ発現レベルが測定される。所定の実施態様において、Ｂｖ８、ＰＫＲ１及び／又はＧ−ＣＳＦの蛋白質発現レベルが測定される。所定の実施態様において、腫瘍は転移性腫瘍である。
【００１６】
別の態様において、本発明は、被検体由来の試料が参照試料における発現レベルよりも大きいレベルでＢｖ８を発現するＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカウンターパートを含むかを決定することを含む、被験体の腫瘍がＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストによる治療に効果的に応答するかどうかを予測する方法を提供し、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の前記機能的ヒトカウンターパートの検出は、被験体が前記Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストによる治療に効果的に応答する腫瘍を有することを示す。所定の実施態様において、Ｂｖ８のｍＲＮＡ発現レベルが測定される。所定の実施態様において、Ｂｖ８の蛋白質発現レベルが測定される。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒトの未成熟骨髄細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト骨髄由来サプレッサー細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージ、の前駆体である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージである。所定の実施態様において、腫瘍は転移性腫瘍である。
【００１７】
さらに別の態様において本発明は、被験体由来の試料が参照試料と比較して、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカウンターパートの数又は頻度が増加しているかどうかを決定することを含む、被験体の腫瘍がＧ−ＣＳＦのアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストによる治療に効果的に応答するかどうかを予測する方法を提供し、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカンウンターパートの数又は頻度の増加は、被験体が前記Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストによる治療に効果的に応答する腫瘍を有することを示す。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒトの未成熟骨髄細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト骨髄由来のサプレッサー細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージ、の前駆体である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージである。所定の実施態様において、腫瘍は転移性腫瘍である。
【００１８】
一態様において、本発明は（ａ）被験体由来の試料が参照試料における発現レベルを超えるレベルでＢｖ８、ＰＫＲ１及び／又はＧ−ＣＳＦを発現する細胞を含むか否かを決定し、（ｂ）試料が参照試料における発現レベルを超えるレベルでＢｖ８、ＰＫＲ１及び／又はＧ−ＣＳＦを発現する細胞を含む場合、被験体に前記Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストの有効量を投与することを含む、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストにより被験体の腫瘍を治療する方法を提供する。所定の実施態様において、細胞はＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカウンターパートである。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒトの未成熟骨髄細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト骨髄由来のサプレッサー細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージ、の前駆体である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージである。所定の実施態様において、細胞は転移性腫瘍細胞である。所定の実施態様において、細胞は被験体の前転移性臓器由来である。所定の実施態様において、試料が参照試料における発現レベルよりも大きいレベルでＢｖ８、ＰＫＲ１及びＧ−ＣＳＦを発現する細胞を含む場合、前記Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストの有効量が被験体に投与される。
【００１９】
所定の実施態様において、Ｂｖ８、ＰＫＲ１及び／又はＧ−ＣＳＦのｍＲＮＡ発現レベルが測定される。所定の実施態様において、Ｂｖ８、ＰＫＲ１及び／又はＧ−ＣＳＦの蛋白質発現レベルが測定される。
【００２０】
その他の態様において、本発明は、（ａ）被験体由来の試料が参照試料と比較して、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカウンターパートの数又は頻度が増加しているかどうかを決定し、（ｂ）試料が参照試料と比較して、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカウンターパートの数又は頻度が増加している場合、前記Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストの有効量を被験体に投与することを含む、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストによる被験体の腫瘍の治療方法を提供する。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒトの未成熟骨髄細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト骨髄由来サプレッサー細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージ、の前駆体である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージである。所定の実施態様において、腫瘍は転移性腫瘍である。
【００２１】
その他の態様において、本発明は（ａ）担癌被験体に対してＧ−ＣＳＦアンタゴニストの有効量を投与すること、及び（ｂ）治療前の被験体から得られた試料中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカウンターパートの数及び発生頻度と比較して、治療後の被験体から得られた試料中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカウンターパートの数及び発生頻度を決定することにより前記治療の有効性をモニタリングし、治療後に被験体から得られた試料中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカウンターパートの数及び頻度の減少は治療が効果的であることを示すことを含む、腫瘍を治療する方法を提供する。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒトの未成熟骨髄細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト骨髄由来サプレッサー細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージ、の前駆体である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージである。所定の実施態様において、腫瘍は転移性腫瘍である。
【００２２】
その他の態様において、本発明は（ａ）担癌被験体に対してＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストの有効量を投与すること、及び（ｂ）治療前の被験体から得られた試料中のＢｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ９の発現レベルと比較して、治療後の被験体から得られた試料中のＢｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ９の発現レベルを決定することにより前記治療の有効性をモニタリングし、治療後に被験体から得られた試料中のＢｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ９の発現レベルの減少が治療が効果的であることを示すことを含む、腫瘍を治療する方法を提供する。
【００２３】
所定の実施態様において、治療前の被験体から得た試料と比較して治療後の被験体から得た試料中で４つの分子Ｂｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の少なくとも２つの発現レベルが減少する。所定の実施態様において、治療前の被験体から得た試料と比較して治療後の被験体から得た試料中で４つの分子Ｂｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の少なくとも３つの発現レベルが減少する。所定の実施態様において、Ｂｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９のｍＲＮＡ発現レベルが測定される。所定の実施態様において、Ｂｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９の蛋白質発現レベルが測定される。所定の実施態様において、腫瘍は転移性腫瘍である。
【００２４】
所定の実施態様において、Ｂｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９のｍＲＮＡ発現レベルが前転移性肺及び／又は転移性肺において増加する。所定の実施態様において、Ｂｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９のタンパク質発現レベルが前転移性肺及び／又は転移性肺において増加する。所定の実施態様において、Ｂｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９のｍＲＮＡ発現レベルが前転移性組織又は腫瘍組織において増加する。所定の実施態様において、Ｂｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９のタンパク質発現レベルが前転移性組織又は腫瘍組織において増加する。所定の実施態様において、抗Ｂｖ８抗体による治療後にＢｖ８及び／又はＭＭＰ−９のｍＲＮＡ発現レベルが減少する場合、抗Ｂｖ８抗体による治療は効果的である。所定の実施態様において、抗Ｂｖ８抗体による治療は前転移性肺においてＢｖ８及び／又はＭＭＰ−９のｍＲＮＡ発現レベルを減少させる。所定の実施態様において、抗Ｂｖ８抗体による治療後にＢｖ８及び／又はＭＭＰ−９のタンパク質発現レベルが減少する場合、抗Ｂｖ８抗体による治療は効果的である。所定の実施態様において、抗Ｂｖ８抗体による治療は前転移性肺においてＢｖ８及び／又はＭＭＰ−９のタンパク質発現レベルを減少させる。所定の実施態様において、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体による治療はＢｖ８及び／又はＭＭＰ−９のｍＲＮＡ発現レベルが抗Ｇ−ＣＳＦ抗体による治療後に減少する場合、効果的である。所定の実施態様において、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体による治療は前転移性肺及び／又は転移性肺においてＢｖ８及び／又はＭＭＰ−９のｍＲＮＡ発現レベルを減少させる。所定の実施態様において、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体による治療はＢｖ８及び／又はＭＭＰ−９のタンパク質発現レベルが抗Ｇ−ＣＳＦ抗体による治療後に減少する場合、効果的である。所定の実施態様において、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体による治療は前転移性肺及び／又は転移性肺においてＢｖ８及び／又はＭＭＰ−９のタンパク質発現レベルを減少させる。所定の実施態様において、抗ＰＫＲ１抗体による治療はＢｖ８及び／又はＭＭＰ−９のｍＲＮＡ発現レベルが抗ＰＫＲ１抗体による治療後に減少する場合、効果的である。所定の実施態様において、抗ＰＫＲ１抗体による治療は前転移性肺及び／又は転移性肺においてＢｖ８及び／又はＭＭＰ−９のｍＲＮＡ発現レベルを減少させる。所定の実施態様において、抗ＰＫＲ１抗体による治療はＢｖ８及び／又はＭＭＰ−９のタンパク質発現レベルが抗ＰＫＲ１抗体による治療後に減少する場合、効果的である。所定の実施態様において、抗ＰＫＲ１抗体による治療は前転移性肺及び／又は転移性肺においてＢｖ８及び／又はＭＭＰ−９のタンパク質発現レベルを減少させる。
【００２５】
所定の実施態様において腫瘍は転移性腫瘍である。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストによる治療は、転移性腫瘍が体の他の場所の前転移性組織又は前転移性臓器へ転移することを防ぐ。所定の実施態様において、被験体由来の試料は、組織、血漿、血清、又はそれらの任意の組み合わせである。所定の実施態様において、これらの方法で用いられる試料は前転移性臓器又は転移性臓器由来である。所定の実施態様において、前転移性臓器又は転移性臓器は、肺、肝臓、脳、骨、リンパ節又は卵巣である。所定の実施態様において、試料は前転移性組織又は転移性組織に由来する。所定の実施態様において、前転移性組織又は転移性組織は被験体の肺、肝臓、脳、卵巣、リンパ節、骨又は骨髄である。所定の実施態様において、試料は前転移性臓器由来の組織試料である。所定の実施態様において、もし試料が前転移性臓器又は前転移性組織由来である場合、試料は任意の腫瘍細胞を含まない。所定の実施態様において、試料は原発性腫瘍組織である。
【００２６】
所定の実施態様において、遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）又は定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて測定される。所定の実施態様において、ｍＲＮＡ発現レベルはマイクロアレイを用いて測定される。所定の実施態様において、ｍＲＮＡ発現レベルはＩＳＨ（インサイツハイブリダイゼーション）を用いて測定される。所定の実施態様において、遺伝子のタンパク質発現レベルはＩＨＣアッセイを用いて測定される。
【００２７】
その他の態様において、本発明は、被験体に対してＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストの有効量を投与することを含む、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカウンターパートの、骨髄から前転移性臓器又は転移性臓器への動員を防ぐ方法を提供する。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト未成熟骨髄細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞は骨髄由来サプレッサー細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージ、の前駆体である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージである。
【００２８】
一態様において、本発明は、被験体にＧ−ＣＳＦアンタゴニストを有効量投与することを含む、腫瘍が抗がん剤治療に対して再発したか又は難治性である被験体の腫瘍を治療する方法を提供する。所定の実施態様において、抗癌治療はＶＥＧＦアンタゴニストを含む。所定の実施態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片である。所定の実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブ又はその断片ないしは変異体である。
【００２９】
一態様において、本発明は被験体にＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストを有効量投与することを含む、被験体の良性、前癌性又は非転移性癌を治療する方法を提供する。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストの投与は、良性、前癌性又は非転移性癌が浸潤性又は転移性癌になることを防ぐ。所定の実施態様において、良性、前癌性又は非転移性癌はステージ０、ステージＩ、又はステージＩＩの癌である。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストの投与は、良性、前癌性又は非転移性癌がステージＩＩＩ又はステージＩＶの癌へ進行することを防ぐ。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストの投与は腫瘍の大きさを縮小させる。
【００３０】
その他の態様において、本発明は被験体にＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストを有効量投与すること及び癌を切除する手術を実施することを含む、手術可能な癌を持つ被験体を治療する方法を提供する。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストは手術前に被験体に投与される。所定の実施態様において、本方法は癌の再発を防ぐために手術後、被験体に対してＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストを有効量投与する段階を更に含む。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストの投与は微小転移の増殖を防ぐ。
【００３１】
その他の態様において、本発明は被験体に対してＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストを投与することを含む、手術可能な癌を持つ被験体におけるネオアジュバント治療の方法を提供する。
【００３２】
その他の態様において、本発明は被験体に対してＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストを投与し、該投与が被験体における癌の再発を防ぐことを含む、被験体における癌の再発を防ぐ方法を提供する。更に別の態様において、本発明は被験体に対してＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストを投与し、該投与が被験体における癌の再発可能性を低減することを含む、被験体における癌の再発の可能性を低減する方法を提供する。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストの投与は臨床的に検出可能な腫瘍の再発又はその転移の可能性を防ぐか又は低減させる。所定の実施態様において、被験体はＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストの投与に先立ち根治手術を受ける。
【００３３】
その他の態様において、本発明は腫瘍を除去しその後被験体にＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストを投与する段階を含む、被験体における腫瘍の再増殖を防ぐ方法を提供する。更に別の態様において、本発明は腫瘍を除去しその後被験体にＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストを投与する段階を含む、腫瘍を持つ被験体における癌の再発を防ぐ方法を提供する。所定の実施態様において、本方法は腫瘍の除去とＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストの投与の間の期間を更に含み、その期間は外科的切開が完全に癒されるか又は創傷裂開のリスクが低減するのに十分な期間である。
【００３４】
所定の実施態様において、投与されるＧ−ＣＳＦアンタゴニストは抗Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片である。所定の実施態様において、投与されるＢｖ８アンタゴニストは抗Ｂｖ８抗体又はその断片である。所定の実施態様において、投与されるＢｖ８アンタゴニストは抗ＰＫＲ１抗体又はその断片である。
【００３５】
所定の実施態様において、本発明によるアンタゴニスト及び抗体は連続して投与される。所定の実施態様において、本発明によるアンタゴニスト及び抗体は同時に投与される。
【００３６】
一態様において、本発明は被験体に抗Ｇ−ＣＳＦ抗体及び／又は抗Ｂｖ８抗体を有効量投与することを含む、肺転移、肝転移、脳転移、卵巣転移、リンパ節転移及び／又は骨転移を阻害する方法を提供する。その他の態様において、本発明は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体が腫瘍が前転移性肺に転移することを阻害し、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体の有効量が被験体に投与されることを含む肺転移を阻害する方法を提供する。その他の態様において、本発明は被験体に抗Ｂｖ８抗体が有効量投与され、抗Ｂｖ８抗体が腫瘍が前転移性肺に転移することを阻害することを含む、肺転移を阻害する方法を提供する。その他の態様において、本発明は被験体に抗ＰＫＲ１抗体が有効量投与され、抗ＰＫＲ１抗体が腫瘍が前転移性肺に転移することを阻害することを含む、肺転移を阻害する方法を提供する。その他の態様において、本発明は被験体に抗Ｇ−ＣＳＦ抗体の有効量及び抗Ｂｖ８抗体の有効量が投与されることを含む、肺転移を阻害する方法を提供する。その他の態様において、本発明は被験体に抗Ｇ−ＣＳＦ抗体の有効量及び抗ＰＫＲ１抗体の有効量が投与されることを含む、肺転移を阻害する方法を提供する。その他の態様において、本発明は被験体に抗Ｂｖ８抗体の有効量及び抗ＰＫＲ１抗体の有効量が投与されることを含む、肺転移を阻害する方法を提供する。
【００３７】
その他の態様において、本発明は被験体に抗Ｇ−ＣＳＦ抗体の有効量が投与され、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体が腫瘍が前転移性肝臓へ転移することを阻害することを含む、肝転移を阻害する方法を提供する。その他の態様において、本発明は被験体に抗ＰＫＲ１抗体の有効量が投与され、抗ＰＫＲ１抗体が腫瘍が前転移性肝臓へ転移することを阻害することを含む、肝転移を阻害する方法を提供する。
【００３８】
所定の実施態様において、抗体又は抗体断片はキメラ型、ヒト化型又はヒト型であり得る。
【００３９】
所定の実施態様において、本発明の方法は被験体にＶＥＧＦアンタゴニストの有効量を投与することを更に含む。所定の実施態様において、被験体は以前にＶＥＧＦアンタゴニストにより治療された腫瘍を持つ。所定の実施態様において、被験体はＶＥＧＦアンタゴニストから再発したか又はＶＥＧＦアンタゴニストに対して難治性である。所定の実施態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体か又はその断片である。所定の実施態様において、抗VEGF抗体はベバシズマブ又はその断片又は変異体である。所定の実施態様において、本発明の方法は更に被験体に化学療法剤の有効量を投与することを含む。所定の実施態様において、治療される被験体は化学療法及び／又は放射線療法を受け、ここで化学療法は例えば細胞傷害性薬物の投与を含む。所定の実施態様において、追加される治療は標的とする特定の腫瘍の治療のための「標準治療」として知られる治療である。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストは、化学療法及び／又は放射線療法等の異なる抗腫瘍薬及び／又は治療計画による組合わせで投与される。所定の実施態様において、Ｂｖ８アンタゴニストは、化学療法及び／又は放射線療法等の異なる抗腫瘍薬及び／又は治療計画による組合わせで投与される。所定の実施態様において、本発明の方法は追加の血管新生阻害剤、例えば血管新生因子に対する抗体等の投与を更に含む。
【００４０】
所定の実施態様において、被験体は哺乳動物である。所定の実施態様において、被験体はヒトである。所定の実施態様において、被験体は癌と診断されている。所定の実施態様において、癌は大腸癌、肺癌、乳癌、腎細胞癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、黒色腫又は神経膠芽腫である。
【００４１】
上掲に記載の任意の実施態様及びその任意の組合わせは本明細書に記載された本発明による任意の全ての方法に適用する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】Ｂｖ８は転移性腫瘍を有するマウスの前転移性肺において強く上方制御される。Ａ．ＢＡＬＢ／ｃナイーブマウス、非転移性腫瘍６７ＮＲ及び転移性４Ｔ１腫瘍を有するマウス由来の肺における遺伝子発現を比較したマイクロアレイ研究のデザイン及び結果。「転移性」遺伝子発現プロファイルは、「非転移性の」プロファイルから、両方のナイーブから明瞭に分離されている。各プロファイルの列は１匹のマウスを表す。Ｂ．ナイーブ又は６７ＮＲを有するマウスと比較した４Ｔ１腫瘍を有するマウス由来の前転移性肺における上位２４の上方制御及び下方制御された遺伝子の模式図。Ｃ．様々な腫瘍を有するマウスの前転移性肺におけるＢｖ８タンパク質濃度（群あたりｎ＝３）。Ｄ．様々な腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスの前転移性肺におけるＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のＦＡＣＳ解析。グラフは平均±標準誤差を示す。
【図２】Ｇ−ＣＳＦ及びＢｖ８レベルの増加は、転移性表現型と関連する。Ａ．非転移性又は転移性腫瘍細胞の接種２週間後のＳＤＦ１α、ＰｌＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ及びＢｖ８の血漿中濃度。アスタリスク（＊）は、ナイーブ群と比較した場合の有意差を示す。Ｂ．４Ｔ１腫瘍を有し、抗Ｂｖ８抗体、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体、又はそれらの組み合わせにより処置されたマウス由来の肺におけるＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の合計数の分析（群あたりｎ＝１０）。４Ｔ１細胞は、雌ＣＢ６Ｆ１マウスの第４乳腺脂肪パッドに同所性に接種された。抗体による処置は細胞を接種２日後に開始し、実施例１の材料と方法の項において説明した通りに実施した。肺をＰＢＳで灌流し、細胞の接種１週間後（前転移段階）又は５．５週間後（転移段階）に採取した。アスタリスク（＊）は、対応するＩＳＯ群と比較した場合の有意差を示している。Ｃ．４Ｔ１腫瘍を有しパネルＢにあるように処置されたマウスの肺における腫瘍の数。分析は、腫瘍接種の５．５週間後に行った。ＩＳＯ−アイソタイプコントロール抗体（群あたりｎ＝５）。アスタリスク（＊）は、ナイーブ群に比較した場合の有意差を示している。Ｄ．６６ｃ１４腫瘍を有し、コントロール（ＩＳＯ）又は抗Ｂｖ８抗体により処置されたＢａｌｂ−ｃマウスにおいてマイクロＣＴにより解析された肺腫瘍の数（ＩＳＯ群においてｎ＝８、抗Ｂｖ８群においてｎ＝１０）。ＩＳＯ及び抗Ｂｖ８群における転移結節（赤）を示す代表的なマイクロＣＴスキャン肺のレンダリング（群あたり２）がグラフの下に示される。表示データは平均±標準誤差を示す。
【図３】Ｇ−ＣＳＦは、前転移「ニッチ」をイニシエート（initiate）し、複数の腫瘍における転移能を増強する。Ａ．ビークル又はヒトｒＧ−ＣＳＦにより処置されたマウスの単離された組織におけるＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のＦＡＣＳ分析（１０μｇ／マウス、５日間）。組織はｒＧ−ＣＳＦ最終投与２４時間後に採取された。マウスは、組織採取前にＰＢＳで灌流された（群あたりｎ＝５）。アスタリスク（＊）はビークル群と比較した場合の有意差を示す。データは生きている細胞中のＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋（又はＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１−）細胞の割合として表される。Ｂ．パネルＡにおけるものと一致する組織におけるＥＬＩＳＡ法により測定されたＢｖ８レベル。値は、総タンパク質含有量に正規化され、対数スケール上にプロットされる。アスタリスク（＊）はビークル群と比較した場合の有意差を示す（群あたりｎ＝５）。Ｃ．ヒトｒＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／マウス、灰色のバー）又はビークル（白色のバー）により５日間前処置されたマウスの肺における腫瘍の数。Ｇ−ＣＳＦ処置の後、マウス（１群あたり５匹）は、腫瘍細胞（マウス１匹あたり１０，０００細胞）を（尾静脈を介して）静脈内注射した。６６ｃ１４及び４Ｔ１細胞がＢａｌｂ／ｃマウスに注入され、一方Ｂ１６Ｆ１０細胞がＣ５７ＢＬ／６マウスに注入された。ｒＧ−ＣＳＦ処置はその他の５日間続いた。肺は細胞接種後３週間で目に見える腫瘍の存在について分析された。アスタリスク（*）は、ビークル及びＧ−ＣＳＦで処置したマウス（群あたりｎ＝５）の間の有意差を示す。Ｄ．Ｂ１６Ｆ１０細胞を注入され、パネルＣにある通りにビークル又はｒＧ−ＣＳＦの何れかにより前処置されたマウス由来の肺の代表的な画像。ｒＧ−ＣＳＦで処置されたマウス由来の肺は腫瘍の数が多い（黒い斑点）。Ｅ．静脈内へ非転移性６７ＮＲ細胞を注射されパネルＣにある通りにヒトｒＧ−ＣＳＦで処置されたＢａｌｂ／ｃマウスにおける肺腫瘍の数。マウスは細胞接種３週間後に目に見える肺腫瘍の存在について分析された。アスタリスク（＊）は有意差を示す。頻度は肺において検出可能な腫瘍を持つマウスの数を表す（群あたりｎ＝５）。Ｆ．マウスｒＧ−ＣＳ（２．５μｇ／マウス）により毎日処置され、続いてコントロール（ＩＳＯ）、抗Ｂｖ８、抗Ｇｒ１又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体により処置され、実施例１の材料及び方法の項に記載の６６ｃ１４細胞を静脈注射されたマウスの肺における腫瘍数。肺は細胞接種３週間後に腫瘍の存在について分析された。表示データは平均±標準誤差である。
【図４】Ｂｖ８は癌細胞遊走の増強を通じてＧ−ＣＳＦ誘導転移を仲介する。Ａ．インビトロ非転移性及び転移性癌細胞によるＰＫＲ１発現及びＰＫＲ２発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。データはＨｐｒｔ１発現（群あたりｎ＝６）に対して正規化された値が示される。アスタリスク（＊）は６７ＮＲ細胞と比較した場合の有意差を示している。Ｂ．ヒトＢｖ８の濃度の増加に応答した非転移性細胞及び転移性細胞の遊走。１％ＦＢＳはポジティブコントロールとして役割を果たした。コラーゲンコートされた８μｍ孔を通って遊走した細胞はアッセイ開始１６時間後カウントされた（群あたりｎ＝５）。アスタリスク（＊）は、無処置群に比べた場合の有意差を示す。Ｃ．ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒグリーンで標識した細胞の静脈内接種（尾静脈）３６時間後に評価した４Ｔ１細胞のインビボ血管外遊走。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスは、５日間連続でマウスｒＧ−ＣＳＦ（２．５μｇ／マウス、毎日）で前処理し、次いでコントロール（ＩＳＯ）抗体、抗Ｂｖ８抗体、抗Ｇｒ１抗体又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体で処置された。「標識なし」はＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒグリーンで標識されていなかった細胞を接種したマウスのグループを表す。画像は代表的な肺切片における４Ｔ１腫瘍細胞（白矢頭で示す）を示している。スケールバー＝５０μｍ。Ｄ．パネルＣによるインビボ血管外遊走アッセイの定量化。平均して、群あたり３匹のマウスが用いられ、１５の画像が（マウス１匹あたりランダムな５切片）分析に含まれた。Ｅ．Ｇ−ＣＳＦの発現に基づいて層別化したＰａｗｉｔａｎ Ｂｒｅａｓｔデータセット由来の乳癌患者の全生存の確率を表すカプラン・マイヤー曲線。曲線はＧ−ＣＳＦの高レベルと生存の低下との間に強い相関を示している。Ｆ．転移におけるＧ−ＣＳＦ及びＢｖ８の役割の模式的モデル。ＬＵ−肺、Ｔ−原発性腫瘍、ＢＭ−骨髄。データは平均±標準誤差である。
【図５】前転移性肺は組織採取時において腫瘍フリーである。腫瘍を有するマウス由来の前転移性肺の追加分析。Ａ．既知の転移部位による、研究で使用した４Ｔ１関連細胞株の模式図。Ｂ．４Ｔ１−Ｌｕｃ−ｚｓＧｒｅｅｎ−Ｈｙｇｒｏ腫瘍を有するマウス由来の肺のハイグロマイシンシグナルの欠如を示す肺又は原発性腫瘍におけるハイグロマイシン遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ発現解析。原発性腫瘍からの正のシグナルに注意。肺は腫瘍細胞接種６日間後に採取した。Ｃ．４Ｔ１−Ｌｕｃ−ｚｓＧ−Ｈｙｇｒｏ腫瘍を有するマウスのＢＬＩイメージング。肺野領域のシグナルの欠如及び原発性腫瘍における正のシグナルに注意。Ｄ．マイクロアレイ分析のために用いた肺組織のＢｖ８ ｑＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｅ．非転移性腫瘍及び転移性腫瘍を有するマウスの前転移性肺におけるＢｖ８発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｆ．ナイーブマウス又は４Ｔ１腫瘍を有するマウス由来の肺組織から単離されたＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋及びＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１−細胞におけるＢｖ８転写レベルのｑＲＴ−ＰＣＲ解析。Ｇ．６７ＮＲ又は４Ｔ１腫瘍を有するマウス由来の前転移性肺におけるＢｖ８ ＩＨＣ染色の例。４Ｔ１腫瘍を有する前転移性肺組織中の暗い染色はＢｖ８陽性細胞を示す。６６ＮＲ又は４Ｔ１細胞を第４乳腺脂肪パッドに同所性に接種し、１週間後に肺が採取され、実施例１の材料と方法の項において説明したようにＢｖ８がＩＨＣにより検出された。スケールバーは５０μｍを示す。Ｈ．Ｂ１６Ｆ１０及びＬＬＣ腫瘍（コントロール群としての役割のマトリゲル注入マウス）並びにＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウス（コントロール群としての役割のＰｙＭＴ−陰性同胞）（群あたりｎ＝５）を有するマウス由来の前転移性肺におけるＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋のＦＡＣＳ分析。Ｉ．ＬＬC（ＥＬＩＳＡにより測定されたＢｖ８タンパク質）腫瘍、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍及びＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ（ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定されたＢｖ８ ＲＮＡ）腫瘍を持つマウス由来の前転移性肺におけるＢｖ８発現レベル。データはナイーブ組織と比較した発現として示される。値は平均±標準誤差である。
【図６】腫瘍を有するマウスにおけるＧ−ＣＳＦ及びＢｖ８発現の追加分析。腫瘍量の追加的な分析。Ａ．実施例１の材料と方法の項において記載された、４８時間インキュベーション後の細胞培養上清中のＧ−ＣＳＦ濃度（群あたりｎ＝３）。アスタリスク（＊）は、ナイーブ群に比べた場合の有意差を示す。Ｂ．４Ｔ１腫瘍を有しＩＳＯコントロール又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体で処置されたマウスの肺及び血漿中のＢｖ８濃度（群あたりｎ＝５）。アスタリスク（＊）は、ナイーブ群に比べた場合の有意差を示す。Ｃ．前転移段階及び転移段階の４Ｔ１腫瘍を有するマウスにおける血漿及び腫瘍のＧ−ＣＳＦ濃度（群あたりｎ＝５）。アスタリスク（＊）は、ナイーブ群に比べた場合の有意差を示す。Ｄ．コントロール（ＩＳＯ）、抗Ｂｖ８抗体、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその両方の抗体で処置したマウスにおける４Ｔ１原発性腫瘍の増殖（群あたりｎ＝１０）。４Ｔ１細胞は雌ＣＢ６Ｆ１マウスの右第４乳腺脂肪パッドに同所性に接種された。抗Ｂｖ８処置群に隣接するアスタリスク（＊）は、ＩＳＯ群に比べた場合の有意差を示す。Ｅ．コントロール（ＩＳＯ）、抗Ｂｖ８抗体、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体及び両方の抗体で処置したマウスにおける６６ｃ１４原発性腫瘍増殖（群あたりｎ＝１０）。６６ｃ１４細胞は雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの右第４乳腺脂肪パッドに同所性に接種された。抗Ｂｖ８処置群に隣接するアスタリスク（＊）は、ＩＳＯ群に比べた場合の有意差を示す。Ｆ．腫瘍接種６週間後に６６ｃ１４腫瘍を有するマウスにおける肺腫瘍の多重度。腫瘍が移植され、パネルＥの通りに治療が行われた（群あたりｎ＝１０）。アスタリスク（＊）は、ＩＳＯ群に比べた場合の有意差を示す。グラフは平均±標準誤差を示す。
【図７】癌細胞を静脈内（尾静脈）注射されたマウスにおけるＧ−ＣＳＦ誘導転移の解析。Ａ．腫瘍細胞接種、及びヒトｒＧ−ＣＳＦ又はビークルによる処置後の肺腫瘤の（ナイーブマウス由来の肺に比べての）増大。データは図３Ｃの群に対応する。アスタリスク（＊）は有意差を示す（群あたりｎ＝５）。Ｂ．６７ＮＲ細胞が注入され、ビークル又はＧ−ＣＳＦで処置されたマウス由来肺のＨ＆Ｅ染色。Ｇ−ＣＳＦ処置群における腫瘍の存在に注意。拡大像のスケールバー＝５０μｍ。Ｔ＝腫瘍領域、Ｌ＝正常肺領域。Ｃ．マウスｒＧ−ＣＳＦ（１μｇ／マウス）又はビークルを毎日（３日間）処置され、実施例１の材料と方法の項において説明した通りコントロール抗体（ＩＳＯ）、抗Ｂｖ８抗体、抗Ｇｒ１抗体又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体で処置されたマウスの肺におけるＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のＦＡＣＳ分析（群あたりｎ＝５）。Ｄ．４Ｔ１細胞接種３週間後のマウスの肺腫瘍の数。マウスはビークル又はヒトｒＧ−ＣＳＦで（毎日）前処置され、コントロール（ＩＳＯ）又は抗Ｂｖ８抗体又は抗Ｇｒ１抗体で処置された。ｒＧ−ＣＳＦ及び抗体の両方による処置は癌細胞接種後更に５日間続けられた。Ｅ．４Ｔ１細胞を接種されたマウスの肺腫瘍の数。肺は３週間後に分析された。動物はまたコントロール（ＩＳＯ）又は抗Ｂｖ８又は抗Ｇｒ１抗体で処置された。Ｆ．３日間連続してｒＧ−ＣＳＦ又はビークルにより毎日処置されたマウスの肺におけるＶＥＧＦＲ１＋細胞のＦＡＣＳ分析。Ｇ．パネルＦの通りにマウスｒＧ−ＣＳＦ又はビークルにより毎日処置されたマウスの肺におけるＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋（及びＧｒ１−）細胞のＦＡＣＳ分析。Ｈ．パネルＦ及びＧの通りにビークル又はマウスｒＧ−ＣＳＦを投与したマウスの全Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋（又はＧｒ１−）細胞中のＶＥＧＦＲ１＋細胞の分布。パネルＦ、Ｇ及びＨにおいて、アスタリスク（＊）は、ビークル群と比較した場合の有意差を、ＮＳは有意でないことを示す（群あたりｎ＝５）。表示された値は平均±標準誤差である。
【図８】Ｇ−ＣＳＦがイニシエートする前転移性微小環境のメカニズム。Ａ．ビークル又はマウスｒＧ−ＣＳＦで前処置され（１μｇ／マウス、３日間毎日）、次いでコントロール（ＩＳＯ）、抗Ｂｖ８抗体、抗Ｇｒ１抗体又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体で処置されたマウス由来の全肺組織におけるＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９のｑＲＴ−ＰＣＲ遺伝子の発現分析。アスタリスク（＊）は、Ｇ−ＣＳＦ＋ＩＳＯ群と比較した場合の有意差を示す（群あたりｎ＝５）。Ｂ．ビークル又はｒＧ−ＣＳＦで前処理されたマウス由来の肺から選別されたＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋（又はＧｒ１−）細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲにより測定されたＢｖ８、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９及びＭＭＰ９遺伝子発現。単一細胞懸濁液が組織から生成され、細胞は特定の抗Ｃｄ１１ｂ抗体及び抗Ｇｒ１抗体で染色され、二重陽性細胞（Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋）、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１−、及び二重陰性細胞（Ｃｄ１１ｂ−Ｇｒ１−）の細胞集団がＦＡＣＳにより分離された。全ＲＮＡが細胞から単離され、遺伝子発現がｑＲＴ−ＰＣＲにより測定された。データはＨｐｒｔ１に対する相対的発現として示された（群あたりｎ＝５）。アスタリスク（*）は、ビークル群と比較した場合の有意差を示す。Ｃ．同所性に接種された４Ｔ１腫瘍を有し、コントロール（ＩＳＯ）、抗Ｂｖ８抗体、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体、又は抗Ｂｖ８抗体と抗Ｇ−ＣＳＦ抗体の両方の組み合わせで処置されたマウス由来の前転移性肺又は転移性肺においてＥＬＩＳＡ法により測定したＭＭＰ−９濃度（群あたりｎ＝５）。ナイーブ−腫瘍が無いマウスの肺。試料は図２Ｂにおける対応する実験に由来する。アスタリスク（＊）は、ＩＳＯ群と比較した場合の有意差を示す。Ｄ．６７ＮＲ及び６６ｃ１４細胞中のＢｖ８による刺激によってＥＲＫ１／２（Ｐ−ＥＲＫ１／２）のリン酸化を示すイムノブロット分析。細胞はＢｖ８（５ｎｇ／ｍｌ）又は１％ＦＢＳで指定された回数刺激された。重複した試料が示される。Ｅ．ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒグリーンで標識した細胞の静脈内接種（尾静脈）３６時間後に評価された、６６ｃ１４細胞のインビボ血管外遊走の定量化。マウスは５日間連続でマウスｒＧ−ＣＳＦ（２．５μｇ／マウス、毎日）で前処置され、その後コントロール（ＩＳＯ）、抗Ｂｖ８抗体、抗Ｇｒ１抗体又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体で処置された。「標識なし」はＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒグリーンで標識されない細胞を接種したマウス群を表す。示された値は平均±標準誤差である。
【図９】癌患者における高いＧ−ＣＳＦ発現は生存低下と関係する。Ａ．Ｇ−ＣＳＦの発現に基づいて層別化したＣｈｉｎ乳房（Ｃｈｉｎ Ｂｒｅａｓｔ）群由来の乳癌患者の全生存の確率を表すカプラン・マイヤー曲線。グラフはＧ−ＣＳＦの高レベル及び生存の低下との間に強い相関を示している。Ｂ．Ｇ−ＣＳＦの発現に基づいて層別化したＢｌａｖｅｒｉ膀胱（Ｂｌａｖｅｒｉ Ｂｌａｄｄｅｒ）群由来の乳癌患者の全生存の確率を表すカプラン・マイヤー曲線。グラフはＧ−ＣＳＦの高レベル及び短い生存との間に強い相関を示している。Ｃ．Ｇ−ＣＳＦの臨床的意義を分析するために本研究で用いたデータセットの概要。
【図１０】前転移性肺は組織採取時点において腫瘍フリーである。腫瘍を有するマウス由来の前転移性肺の追加分析。４Ｔ１腫瘍を有するマウスにおける肺転移の発生時期、肺及び原発性腫瘍におけるハイグロマイシン遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ発現解析は、４Ｔ１−Ｌｕｃ−ｚｓＧｒｅｅｎ−Ｈｙｇｒｏ腫瘍接種の最大２週間後まで肺におけるハイグロマイシンシグナルの欠如を示す。原発腫瘍からの正の信号に注意。肺腫瘍接種後７日ごとに肺が採取され、組織内の癌細胞の存在と相関するハイグロマイシンの存在について分析された。
【図１１】前転移性組織におけるＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のＦＡＣＳ分析。Ｂｖ８及びＧ−ＣＳＦ発現の追加分析。Ａ．腫瘍接種２週間後、４Ｔ１腫瘍を有するマウス由来の前転移性肺内の異なる細胞集団のＦＡＣＳ分析。Ｂ．４８時間インキュベーション後の細胞培養上清中のＧ−ＣＳＦ濃度（群あたりｎ＝３）。アスタリスク（＊）はナイーブ及び非転移性群に比べた場合の有意差を示す。Ｃ．アイソタイプＩｇＧ抗体（ＩＳＯ）、抗Ｂｖ８抗体（２Ｄ３）又は抗ＧＣＳＦ抗体で処置したナイーブ又はＰｙＭＴ腫瘍を有するＦＶＢマウスの末梢血中のＬｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ＋細胞の数（上段パネル）。ナイーブ又はＰｙＭＴ腫瘍を有するＦＶＢマウスの肺、原発腫瘍、及び骨髄中のＬｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ＋細胞のＦＡＣＳ分析（下パネル）。アスタリスク（＊）は、ナイーブ群に比べた場合の有意差を示し、二重アスタリスク（＊＊）はＩＳＯグループと比較した場合の有意差を示す。
【図１２】Ｇ−ＣＳＦ及びＢｖ８レベルの増加は転移性表現型に関連する。Ａ．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｘ１．１腫瘍を有し、抗Ｂｖ８（２Ｄ３）又は抗Ｇ−ＣＳＦで６週間処置したＳＣＩＤ／ｂｇマウスの肺における腫瘍病巣の数（群あたりｎ＝１０）。アスタリスク（＊）は、ＩＳＯ群に比べた場合の有意差を示す。Ｂ．コントロール（ＩＳＯ）、抗Ｂｖ８（２Ｄ３）、又は抗Ｇ−ＣＳＦで処置されたＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｘ１．１原発腫瘍の増殖（群あたりｎ＝１０）。Ｃ．６６ｃ１４腫瘍を有し、指示された抗体で処置されたＢａｌｂ−ｃヌードマウスにおける肺腫瘍の数。アスタリスク（＊）はＩＳＯ群に比べた場合の有意差を示す。表示データは平均±標準誤差である。
【図１３】同所性に接種された腫瘍を有するマウスの肺腫瘍量及び原発性腫瘍増殖の解析。Ａ及びＢ．胎児肝移植によって得られたＢｖ８野生型又はノックアウトＢＭＭＮＣを持つマウスにおける肺転移の数。マウスは、６６ｃ１４腫瘍（パネルＡ）、又は４Ｔ１（パネルＢ）腫瘍（同所性モデル）で接種され、アイソタイプコントロールＩｇＧ（ＩＳＯ）又は抗Ｂｖ８（２Ｂ９＋３Ｆ１）抗体で処置された。アスタリスク（＊）は野生型−ＩＳＯ群と比較した場合の有意差を示す。Ｃ．パネルＡ及びＢに由来するＢｖ８野生型及びノックアウト実験の統計的分析の要約。比較は、線形関数の値が０未満である場合にのみ有意であることに注意。統計的有意性は以下の比較においてのみ達成された：野生型抗Ｂｖ８対野生型ＩＳＯ、ノックアウトＩＳＯ対野生型ＩＳＯ、ノックアウト抗Ｂｖ８対野生型ＩＳＯ及びＩＳＯ対他のすべての群。Ｄ．腫瘍接種７週間後においてＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ腫瘍を有するＦＶＢマウスにおける肺当たりの転移の数。腫瘍は移植され処置が施された（群あたりｎ＝６）。アスタリスク（＊）はＩＳＯグループと比較した場合の有意差を示す。Ｅ．コントロール（ＩＳＯ）、抗Ｂｖ８（２Ｄ３）、又は抗Ｇ−ＣＳＦで処置されたＦＶＢマウスにおけるＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ原発性腫瘍の増殖（群あたりｎ＝１０）。Ｆ．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｘ１．１腫瘍を有するマウスの血漿及び原発性腫瘍におけるマウス及びヒトＧ−ＣＳＦ（ＭＧ−ＣＳＦ及びＨＧ−ＣＳＦ）の発現レベル。アスタリスク（＊）は、ナイーブ群に比べた場合の有意差を示す。表示データは平均±標準誤差である。
【図１４】Ｇ−ＣＳＦは、前転移「ニッチ」をイニシエートし、幾つかの腫瘍の転移能を増強させる。Ａ．ビークル又はマウスｒＧ−ＣＳＦ（２．５μｇ／マウス）で毎日処置され、コントロール（ＩＳＯ）、抗Ｂｖ８（２Ｄ３）、又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体で処置され、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌ１．１細胞を静脈内注射されたマウスの肺の腫瘍の数（群あたりｎ＝５）。Ｂ.ビークル又はマウスｒＧ−ＣＳＦ（２．５μｇ／マウス）で毎日処置され、コントロール（ＩＳＯ）、抗Ｂｖ８（２Ｄ３）、抗Ｌｙ６Ｇ、抗Ｇｒ１抗体又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体で処置され、６６ｃ１４細胞を静脈内注射されたマウスの肺の腫瘍の数。肺は細胞接種3週間後の腫瘍の存在について分析した（群あたりｎ＝１０）。パネルＡ及びＢにおいて、アスタリスク（＊）はビークル−ＩＳＯ群と比較した場合に有意差を示し、一方二重アスタリスク（＊＊）はＧ−ＣＳＦ−ＩＳＯ群と比較して有意差を示す。表示データは平均±標準誤差である。
【図１５】Ｂｖ８は癌細胞遊走の増強を通じてＧ−ＣＳＦ誘導転移を仲介する。Ａ．６７ＮＲ又は６７ＮＲ−ＰＫＲ１細胞を静脈内注射されたＢａｌｂ／ｃマウスにおける肺腫瘍の数。マウスはビークル又はヒトｒＧ−ＣＳＦにより前処置された。マウスは細胞接種３週間後に目に見える肺腫瘍の存在について分析された。アスタリスク（＊）は、ビークル及びＧ−ＣＳＦで処置されたマウスの間の有意差を示す。頻度は肺に検出可能な腫瘍を持つマウスの数を表す（群あたりｎ＝１０）。Ｂ．肺転移（肺）か又は原発性腫瘍（腫瘍）のどちらかから単離されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の遺伝子発現解析。三つの独立した細胞株が各群ごとに分析された（肺に対して：細胞株Ｌ１．１、Ｌ２．１、及びＬ３．１；腫瘍に対して：細胞株Ｔ１．１、Ｔ２．１、及びＴ３．１）。発現は親のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ１細胞株と比較された。アスタリスク（＊）は親細胞株と比較した場合の有意差を示し、二重アスタリスク（＊＊）は腫瘍又は親細胞株と比較した場合の有意差を示す。データは平均±標準誤差である。Ｃ．図１５Ｂの遺伝子発現解析のために使用されるＭＤＡ−ＭＢ−２３１クローンの模式図。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ１はＳＣＩＤ／ｂｇマウスの第４乳腺脂肪パッドの中へ、又は尾静脈から注射した。続いて、樹立された腫瘍（乳癌又は肺内の何れか）から癌細胞を単離しインビトロで増殖させた。各組織から、３つの独立した細胞株（３つの別々の肺からＬ１．１、Ｌ２．１、及びＬ３．１及び３つの独立した原発性腫瘍からＴ１．１、Ｔ２．１、及びＴ３．１）が樹立された。
【図１６】Ｇ−ＣＳＦにイニシエートされた前転移性微小環境のメカニズム。Ａ．ＰＫＲ１を過剰発現する６７ＮＲ細胞におけるＰＫＲ１発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。発現レベルが６６ｃ１４細胞に匹敵することに注意。Ｂ．ｓｈＲＮＡを標的にするＰＫＲ１（ｓｈＰＫＲ１）を発現する６６ｃ１４細胞におけるＰＫＲ１及びＧ−ＣＳＦ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析。Ｇ−ＣＳＦはｓｈＰＫＲ１によって影響されないことに注意。ｓｈ（コントロール）はコントロールとして使用されるスクランブルされたｓｈＲＮＡである。アスタリスク（＊）はｓｈ（コントロール）群と比較した場合の有意差を示す。Ｃ．ビークル又はＧ−ＣＳＦで前処置され、６６ｃ１４又は６６ｃ１４−ｓｈＰＫＲ１細胞が注入されたマウスの肺における腫瘍数。分析は、細胞接種３週間後に行った。アスタリスク（＊）は、６６ｃ１４−野生型ＩＳＯ群と比較した場合の有意差を示し、二重アスタリスク（＊＊）は６６ｃ１４−野生型Ｇ−ＣＳＦ群と比較した場合の有意差を示す（群あたりｎ＝１０）。表示データは平均±標準誤差である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明の詳細な説明
詳細に本発明を記述する前に、本発明が特定の組成物又は生物系に限定されるものではなく、当然のことながら変化しうることは理解されるであろう。また、本明細書において用いられる用語は実施態様のみを記述するためのものであって、限定するためのものでないことも理解されるであろう。特に定義しない限り、本明細書にて使用される技術用語及び科学用語は本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を持つ。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), and March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)は本出願で使用される用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供する。本明細書に引用された特許出願及び出版物を含む全ての参考文献はその全体が参照により援用される。
【００４４】
定義
本仕様書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、いつでも必要に応じて、単数形で使用される用語は複数形も含まれ、かつその逆も含まれる。以下に記載される任意の定義が本明細書に参照により組み入れられた任意の文書と競合する場合には、以下に記載される定義が統制し得る。
【００４５】
用語「顆粒球コロニー刺激因子」、「Ｇ−ＣＳＦ」、「コロニー刺激因子３」及び「ＣＳＦ３」はここに同義的に使用し、完全な全長ポリペプチド及び／又は全長ポリペプチドの活性断片を言う。
【００４６】
「天然配列Ｇ−ＣＳＦ」は、その調製態様にかかわらず、天然由来のＧ−ＣＳＦと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。しかして、天然配列Ｇ−ＣＳＦは、天然に生じるヒトＧ−ＣＳＦ、マウスＧ−ＣＳＦ、又は他の哺乳動物種由来のＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列を有し得る。ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列の天然配列の例は配列番号８、１０、１２及び１４に示される。ヒト及びマウスＧ−ＣＳＦの配列は例えば、Nagata et al. Nature 319, 415-418(1986); Nagata et al. EMBO J. 5, 575-581 (1986)、及びTsuchiya et al. Proc Natl Acad Sci 83(20), 7633-7637 (1986)においても開示されている。そのような天然配列Ｇ−ＣＳＦは天然から単離することができるか又は組換え及び／又は合成手段によって生産することができる。「天然配列Ｇ−ＣＳＦ」なる用語は、Ｇ−ＣＳＦの天然に生じるプレプロ、プロ及び成熟型及び切断型、天然に生じる変異体型、及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に包含する。
【００４７】
「Ｇ−ＣＳＦ変異体」とは、天然配列中の一又は複数のアミノ酸残基の挿入、欠失、修飾及び／又は置換によって、ヒト及びマウスＧ−ＣＳＦにおける天然配列Ｇ−ＣＳＦポリペプチドの配列とは異なるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なＧ−ＣＳＦポリペプチドである。Ｇ−ＣＳＦ変異体は一般には配列番号８、１０、１２及び１４に示されたヒトＧ−ＣＳＦ等の天然配列Ｇ−ＣＳＦと１００％より少ない配列同一性を有する。しかしながら通常は、生物学的に活性なＧ−ＣＳＦ変異体は天然に生じるＧ−ＣＳＦアミノ酸配列と少なくと約７０％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を有するであろう。所定の実施態様において、生物学的に活性なＧ−ＣＳＦ変異体は天然に生じるＧ−ＣＳＦアミノ酸配列に対して、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を、１％の増分において、持つアミノ酸配列を有するであろう。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦ変異体は、天然配列Ｇ−ＣＳＦポリペプチドに対応する生物学的活性を保持する少なくとも５アミノ酸のペプチド断片を含む。Ｇ−ＣＳＦ変異体はまた、１以上のアミノ酸残基が天然Ｇ−ＣＳＦ配列のＮ末端またはＣ末端か又は内部に追加されたＧ−ＣＳＦポリペプチドを含む。Ｇ−ＣＳＦ変異体は、複数のアミノ酸残基が１以上のアミノ酸残基により削除又は置換されたＧ−ＣＳＦポリペプチドを含む。Ｇ−ＣＳＦ変異体はまた、例えば天然のアミノ酸以外の部分と置換することによるか又は非天然アミノ酸を生成するためにアミノ酸残基を修飾することにより共有結合性に修飾され得る。
【００４８】
本明細書中で使用される用語「Ｇ−ＣＳＦ」アンタゴニストは「Ｇ−ＣＳＦ」に結合し、Ｇ−ＣＳＦの生物活性を阻害し又は実質的に低減する分子を意味する。Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストの非限定的な例としては、抗体又はその抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣薬、薬剤及びそれらの代謝産物、転写調節配列及び翻訳調節配列等を含む。アンタゴニストはまた、Ｇ−ＣＳＦの小分子阻害剤、Ｇ−ＣＳＦに対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、及びＧ−ＣＳＦに対するリボザイムを含む。本発明の一実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストは、ヒトＧ−ＣＳＦと結合する抗体、特に抗Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片である。
【００４９】
「Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト抗体」とは、本明細書で定義されるＧ−ＣＳＦアンタゴニストであり、従って、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞動員又はＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のカウンターパートの動員を調節し、Ｂｖ８の発現を調節し、腫瘍の血管新生を促進し及び／又は腫瘍転移を促進する能力を部分的に又は完全に遮断し、阻害し又は中和する抗体を意味する。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒトの未成熟骨髄細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト骨髄由来サプレッサー細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージ、の前駆体である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞は好中球、単球又はマクロファージである。
【００５０】
「Ｂｖ８」、「Ｂｖ８ホモログ」、「プロキネチシン-２(別名「ＰＫ２」、「ＫＡＬ４」及び「ＭＩＴ１」)なる用語は、交換可能に本明細書中で用いられ、完全長ポリペプチド及び／又は完全長ポリペプチドの活性断片である。
【００５１】
「天然配列Ｂｖ８」は、その調製態様にかかわらず、天然由来のＢｖ８と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。従って、天然配列Ｂｖ８は、天然に生じるヒトＢｖ８、マウスＢｖ８、あるいは他の哺乳動物種由来のＢｖ８のアミノ酸配列を有し得る。例えば、完全長天然配列ヒトＢｖ８アミノ酸配列は配列番号２に示される。第二の完全長天然配列ヒトＢｖ８は配列番号４に示される。これらの二つの配列は標準的なヘパリン結合ドメインをコードするエキソンの選択的スプライシングの結果である。従って、アミノ酸配列が配列番号２に示される天然配列のヒトＢｖ８はヘパリン結合ドメインを含み、一方配列番号４に示された天然配列Ｂｖ８は含まない。天然配列マウスＢｖ８アミノ酸配列は配列番号６に示される。ヒト及びマウスＢｖ８配列はまた例えばWechselberger等（FEBS Lett. 462:177-181 (1999)）及びLi等（Mol. Pharm. 59:692-698 (2001)）に開示されている。そのような天然配列Ｂｖ８は天然から単離することができるか又は組換え及び／又は合成手段によって生産することができる。「天然配列Ｂｖ８」なる用語は、Ｂｖ８の天然に生じるプレプロ形、プロ型及び成熟型及び切断型、天然に生じる変異体型（例えば配列番号４に示された選択的スプライシング型等）、及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に包含する。所定の実施態様において、天然配列Ｂｖ８は配列番号２に示されるような完全長天然配列ヒトＢｖ８である。所定の実施態様において、天然配列Ｂｖ８は配列番号４に示された完全長天然配列ヒトＢｖ８である。
【００５２】
「Ｂｖ８変異体」とは、天然配列中の一又は複数のアミノ酸残基の挿入、欠失、修飾及び／又は置換によって、ヒト及びマウスＢｖ８に対して配列番号２、４及び６に示されるもののように、天然配列Ｂｖ８ポリペプチドの配列とは異なるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なＢｖ８ポリペプチドである。Ｂｖ８変異体は一般には配列番号２又は配列番号４のヒトＢｖ８等の、天然配列Ｂｖ８と１００％より少ない配列同一性を有する。しかしながら通常は、生物学的に活性なＢｖ８変異体は天然に生じるＢｖ８アミノ酸配列と少なくと約７０％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を有するであろう。所定の実施態様において、生物学的に活性なＢｖ８変異体は天然に生じるＢｖ８アミノ酸配列に対して、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を、１％の増分において、持つアミノ酸配列を有するであろう。Ｂｖ８変異体は、天然配列Ｂｖ８ポリペプチドに対応する生物学的活性を保持する少なくとも５アミノ酸のペプチド断片を含む。Ｂｖ８変異体はまた、１以上のアミノ酸残基が天然Ｂｖ８配列のＮ末端またはＣ末端か又は内部に追加されたＢｖ８ポリペプチドを含む。Ｂｖ８変異体は、複数のアミノ酸残基が１以上のアミノ酸残基により削除又は置換されたＢｖ８ポリペプチドを含む。Ｂｖ８変異体はまた、例えば天然のアミノ酸以外の部分と置換することによるか又は非天然アミノ酸を生成するためにアミノ酸残基を修飾することにより共有結合性に修飾され得る。Ｂｖ８変異体は、ヘパリン結合ドメインを含み得る。
【００５３】
本明細書中で用いられる「Ｂｖ８アンタゴニスト」なる用語は、天然配列のＢｖ８の能力を部分的又は完全に遮断、阻害又は中和し、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞又はＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のヒトカウンターパートの動員を調節し、腫瘍発達の間の血管形成を促進し、及び／又は腫瘍転移を促進する任意の分子を指す。適切なアンタゴニスト分子は特にアンタゴニスト抗体又はその抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣薬、薬剤及びそれらの代謝産物、転写調節配列及び翻訳調節配列等を含む。アンタゴニストはまた、特異的にＢｖ８に結合し標的であるＢｖ８のアンタゴニスト変異体、Ｂｖ８に対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー及びＢｖ８に対するリボザイムへの結合を隔離する、Ｂｖ８の小分子阻害剤、及び融合タンパク質、レセプター分子及びそれらの誘導体を含む。
【００５４】
特に、Ｂｖ８アンタゴニストは、限定しないが、天然配列Ｂｖ８ポリペプチド又は天然配列Ｂｖ８レセプター（ＰＫＲ１／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ１又はＰＫＲ２／ＥＧ−ＶＥＧＦＲ２）に特異的に結合する抗体及び抗体断片を含む。所定の実施態様において、Ｂｖ８アンタゴニストは、ＰＫＲ１アンタゴニストである。所定の実施態様において、ＰＫＲ１アンタゴニストは抗ＰＫＲ１抗体である。Ｂｖ８ペプチドのアンタゴニストを同定するための方法は、候補アンタゴニスト分子とＢｖ８ペプチドを接触させ、Ｂｖ８がＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞動員又はＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカウンターパートの動員を調節し、腫瘍の血管新生を促進し、及び／又は腫瘍転移を促進するする能力を測定することを含む。
【００５５】
「Ｂｖ８アンタゴニスト抗体」とは、上掲に定めたＢｖ８アンタゴニストである抗体であり、従ってＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動員又はＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカウンターパートの動員を調節し、腫瘍の血管新生を促進し、及び／又は腫瘍転移を促進する能力を部分的又は完全に遮断、阻害又は中和する抗体を意味する。
【００５６】
「Ｂｖ８レセプター」はＢｖ８が結合しＢｖ８の生物学的特性を媒介する分子である。従って「Ｂｖ８レセプター」なる用語はその意味においてＰＫＲ１／ＧＰＲ７３／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター１／ＰＲＯＫＲ１及びＰＫＲ２／ＧＰＲ７３Ｌ１／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター２／ＰＲＯＫＲ２なる範囲を含む(LeCouter et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2685-2690; Lin et al., 2002, J. Biol. Chem., 277:19276-19280; Masuda et al., 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun., 293:396-402)。
【００５７】
ポリペプチドに関して「生物学活性」又は「生物学的に活性な」なる用語は、分子が特異的に結合し、増殖、遊走等の細胞応答を調節する能力を言う。細胞応答はまた、限定されないが、遊走、及び／又は増殖を含み、レセプターを介して媒介されるものを含む。この文脈で「調節」なる用語は、促進及び阻害の両方を含む。
【００５８】
ここでの目的において、Ｂｖ８又はＧ−ＣＳＦとの関連で「活性な」又は「活性」とは、天然又は天然に生じるＢｖ８又はＧ−ＣＳＦの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持する、Ｂｖ８又はＧ−ＣＳＦの形態を言い、ここで「生物学的」活性とは、天然又は天然に生じるＢｖ８又はＧ−ＣＳＦが保有する抗原エピトープに対する抗体産生を誘導する能力以外の、天然又は天然に生じるＢｖ８又はＧ−ＣＳＦにより引き起こされる生物機能（阻害又は刺激の何れか）を指し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然に生じるＢｖ８又はＧ−ＣＳＦが保持する抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘発する能力を言う。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦの生物学的活性は、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞（又はＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカウンターパート）の動員を調節し、Ｂｖ８の発現を調節し、腫瘍の血管新生を促進し、及び／又は腫瘍転移を促進する能力である。所定の実施態様において、Ｂｖ８の生物学的活性はＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞（又はＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカウンターパート）の動員を調節し、腫瘍の血管新生を促進し、及び／又は腫瘍転移を促進する能力である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒトの未成熟骨髄細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト骨髄由来のサプレッサー細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージ、の前駆体である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージである。
【００５９】
「造血幹／始原細胞(前駆細胞)」又は「原始的造血細胞」は、より関係しているか、又は成熟した血液細胞種を形成するように分化することができるものである。「リンパ系の血液細胞系統」は、リンパ球(Ｂ細胞又はＴ細胞)を形成するように分化することができるそれらの造血前駆細胞である。同様に「リンパ球新生」はリンパ球の形成である。「赤血球血液細胞系統」は、赤血球(red blood cells)を形成するように分化することができるそれらの造血前駆細胞であり、「赤血球新生」は赤血球の形成である。
【００６０】
本明細書中の目的において、「骨髄血液細胞系統」なる句は、上記のリンパ系及び赤血球血液細胞系統以外の全ての造血始原細胞を包含し、「骨髄造血」は血液細胞(リンパ球及び赤血球以外)の形成を伴う。
【００６１】
所定の実施態様において、骨髄細胞群は、Ｇｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋（又はＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋）又はＧｒ１＋／Ｍａｃ-１＋である骨髄免疫細胞が豊富であり得る。所定の実施態様において、ヒト骨髄細胞群は、Ｇｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋の機能的ヒトカウンターパート（又はＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の機能的ヒトカウンターパート）である骨髄免疫細胞が豊富であり得る。例えばAlmand, B. et al. J Immunol 166, 678-689 (2001); Young, M. R. & Lathers, D. M. Int J Immunopharmacol 21, 241-252 (1999)を参照。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト未成熟骨髄細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト骨髄由来のサプレッサー細胞である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージ、の前駆体である。所定の実施態様において、ヒトカウンターパート細胞はヒト好中球、単球又はマクロファージである。所定の実施態様において、骨髄免疫細胞は、マクロファージ系統の骨髄細胞に対するマーカー、ＣＤ１１ｂ、顆粒球に対するマーカー、Ｇｒ１を発現する。Ｇｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋は例えばＧｒ１＋に対する抗体による免疫粘着パニングにより選択され得る。
【００６２】
本明細書中で用いられる「Ｇｒ１アンタゴニスト」なる用語は、Ｇｒ１に結合して、Ｇｒ１の生物学的な活性を阻害するか又は実質的に減少させる分子を指す。Ｇｒ１アンタゴニストの非限定的な例は、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣薬、薬剤及びその代謝物、転写調節配列及び翻訳調節配列等を含む。本発明の一実施態様では、Ｇｒ１アンタゴニストは、抗体、特にヒトのＧｒ１を結合する抗Ｇｒ１抗体である。アンタゴニストはまた、Ｇｒ１の小分子阻害剤、Ｇｒ１に対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、及びＧｒ１に対するリボザイムを含む。本発明の一実施態様では、Ｇｒ１アンタゴニストは、ヒトＧｒ１を結合する抗体、特に抗Ｇｒ１抗体及びその断片である。
【００６３】
本明細書中で用いる「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は、Leung et al. (1989) Science 246:1306, and Houck et al. (1991) Mol. Endocrin, 5:1806に記載された、１６５アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子及び関連する１２１、１８９、及び２０６アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型を指す。「ＶＥＧＦ」なる用語はまた、マウス、ラット又は霊長類等の非ヒト種由来のＶＥＧＦを指す。ときに、特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦに対してｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦに対してｍＶＥＧＦ等の用語で示される。また、「ＶＥＧＦ」なる用語は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８〜１０９、又は１〜１０９を含むポリペプチドの切断型を言及することにも使われる。任意のそのようなＶＥＧＦ型の参照は、本明細書では、例えば、「ＶＥＧＦ(８−１０９)」、「ＶＥＧＦ(１−１０９)」又は「ＶＥＧＦ１６５」として特定され得る。「切断した(切断型の)」天然のＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然のＶＥＧＦ配列に示される数で示す。例えば、切断型の天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７(メチオニン)は、天然のＶＥＧＦ中の位置１７(メチオニン)でもある。切断型の天然ＶＥＧＦは天然のＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲ及びＦｌｔ−１レセプターに対する結合親和性を有する。
【００６４】
「ＶＥＧＦ生物学的活性」には、任意のＶＥＧＦレセプターへの結合又は任意のＶＥＧＦシグナル伝達活性、例えば正常及び異常な血管形成及び脈管形成の調節(Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18: 4-25；Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77: 527-543)、胚性の脈管形成及び血管形成を促進すること(Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439；Ferrara et al. (1996) Nature 380:439-442)、及び雌生殖器系における周期的血管増殖、及び骨の成長及び軟骨形成を調節すること(Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4: 336-340；Gerber et al. (1999) Nature Med. 5: 623-628)が含まれる。血管形成及び脈管形成における血管新生因子であることに加えて、多面発現性増殖因子としてＶＥＧＦは、他の生理的過程、例えば内皮細胞生存、血管透過性及び血管拡張、単球走化性、及びカルシウム流入において複数の生物学的効果を示す(上掲のFerrara and Davis-Smyth (1997)、及びCebe-Suarez et al. Cell. Mol. Life Sci. 63: 601-615 (2006))。更に研究によれば、わずかな非内皮細胞型、例えば網膜色素上皮細胞、膵管細胞及びシュワン細胞に対するＶＥＧＦの分裂促進効果が報告されている。Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394；Oberg-Welsh et al. (1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132；Sondell et al. (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740。
【００６５】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、限定しないが、一又は複数のＶＥＧＦレセプターへの結合を含む、ＶＥＧＦ活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減又は干渉することができる分子を指す。ＶＥＧＦアンタゴニストには、限定しないが、抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合性断片、ＶＥＧＦに特異的に結合することによって一又は複数のレセプターへの結合を隔離するレセプター分子及び誘導体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子阻害剤などの抗ＶＥＧＦレセプター抗体及びＶＥＧＦレセプターアンタゴニストが含まれる。本明細書で用いる「ＶＥＧＦアンタゴニスト」なる用語は、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減又は干渉することができる抗体、抗体断片、他の結合ポリペプチド、ペプチド、非ペプチド性小分子を特に含む。従って、「ＶＥＧＦの活性」なる用語は特にＶＥＧＦによるＶＥＧＦ媒介生物学的活性を含む。
【００６６】
「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性と特異性を有してＶＥＧＦに結合する抗体である。一実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与している疾患又は病気を標的とし干渉する治療剤として使用することができる。抗ＶＥＧＦ抗体は、通常、ＶＥＧＦ−Ｂ又はＶＥＧＦ−Ｃ等の他のＶＥＧＦのホモログ、又はＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦ等の他の成長因子は結合しないであろう。一実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ１０７０９；限定しないが「ベバシズマブ」（ＢＶ）として知られ、「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」又は「ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）」としても知られる抗体を含む組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599を参照）により産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４.６.１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体を含む。ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）は現在市販されている。ベバシズマブは、ヒトＶＥＧＦがそのレセプターへ結合することを遮断するマウス抗体Ａ.４.６.１由来の抗原結合性相補性決定領域、及び変異したヒトのＩｇＧ１フレームワーク領域を含む。フレームワーク領域のほとんどを含め、ベバシズマブのアミノ酸配列のおよそ９３％は、ヒトのＩｇＧ１に由来し、配列のおよそ７％はマウスの抗体Ａ４.６.１に由来する。ベバシズマブは、約１４９０００ダルトンの分子量を有しグリコシル化されている。ベバシズマブ及び他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、２００５年２月２６日に発行の米国特許第６８８４８７９号に更に記載されている。ＰＣＴ出願公開国際公開第２００５／０１２３５９に記載された更なる抗ＶＥＤＦ抗体は、Ｇ６又はＢ２０系列抗体(例えば、Ｇ６-２３、Ｇ６-３１、Ｂ２０-４.１)を含む。更なる抗体については、米国特許第７０６０２６９号、同第６５８２９５９号、同第６７０３０２０号；同第６０５４２９７号；国際公開第９８／４５３３２号；国際公開第９６／３００４６号；国際公開第９４／１０２０２号；欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１；米国特許出願公開第２００６００９３６０号、同第２００５０１８６２０８号、同第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、及び同第２００５０１１２１２６号；及び、Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)を参照のこと。
【００６７】
本明細書において使用される「Ｂ２０系列ポリペプチド」なる用語は、ＶＥＧＦに結合する抗体を含むポリペプチドを意味する。Ｂ２０系列ポリペプチドには、限定しないが、米国特許出願公開第２００６０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７０１４１０６５号及び／又は米国特許出願公開第２００７００２０２６７号に記載されたＢ２０抗体又はＢ２０誘導体抗体の配列に由来する抗体が含まれ、これらの特許出願の内容は出典明示により明示的にここに援用される。一実施態様において、Ｂ２０系列ポリペプチドは、米国特許出願公開第２００６０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７０１４１０６５号及び／又は米国特許出願公開第２００７００２０２６７号に記載されたＢ２０-４．１である。他の実施態様において、Ｂ２０系列ポリペプチドは米国特許出願第１２／３１５２２１に記載されたＢ２０-４.１.１であり、この開示内容の全体は出典明示により明示的にここに援用される。
【００６８】
本明細書において使用される「Ｇ６系列ポリペプチド」は、ＶＥＧＦに結合する抗体を含むポリペプチドを指す。Ｇ６系列ポリペプチドには、限定しないが、米国特許公開第２００６０２８０７４７号、米国特許公開第２００７０１４１０６５号及び／又は米国特許公開第２００７００２０２６７号に記載されたＧ６抗体又はＧ６由来の抗体の配列から由来する抗体が含まれる。米国特許公開第２００６０２８０７４７号、米国特許公開第２００７０１４１０６５号および／または米国特許公開第２００７００２０２６７号に記載されたＧ６系列ポリペプチドには、限定しないが、Ｇ６-８、Ｇ６-２３及びＧ６-３１が含まれる。
【００６９】
「転移」とは、癌がその主要部位から体内の他の場所へ広がることを意味する。癌細胞は原発腫瘍から離脱し、リンパ管及び血管に浸透し、血流を介して循環し、体の他の正常組織中の遠位増殖巣で増殖する（転移する）することが可能である。転移は、局所的又は遠位であり得る。転移は腫瘍細胞が原発腫瘍から離脱し、血流又はリンパ管を通って移動し、遠位部位で停止することを条件とする逐次プロセスである。腫瘍細胞は別の場所で静止した後、血管又はリンパ管の壁を介して再浸透し、増殖を続け、最終的に別の腫瘍が形成される。新しい場所で細胞は血液供給を確立し、増殖し生命を脅かす腫瘤を形成することが可能である。所定の実施態様において、この新規腫瘍は転移性（又は２次）腫瘍と呼ばれる。所定の実施態様において、転移性腫瘍なる用語は、転移することができるがまだ体の他の組織又は臓器に転移していない腫瘍を指す。所定の実施態様において、転移性腫瘍なる用語は、体の他の組織又は臓器に転移した腫瘍を指す。所定の実施態様において、転移性腫瘍は、転移性腫瘍細胞からなる。
【００７０】
「転移性臓器」又は 「転移性組織」は広い意味で使用され、原発性腫瘍由来の癌細胞又は体の別の部分由来の癌細胞が転移した臓器又は組織を指す。転移性臓器及び転移性組織の例としては、限定しないが、肺、肝臓、脳、卵巣、骨、骨髄又はリンパ節が含まれる。
【００７１】
本明細書において使用される、「前転移性臓器」又は 「前転移性組織」とは、原発性腫瘍由来か又は体の別の部位に由来する癌細胞が検出されてない臓器又は組織を指す。所定の実施態様において、本明細書において使用される前転移性臓器又は前転移性組織とは、原発性腫瘍又は体の別の部分由来の癌細胞が器官又は組織への拡散が起きる前の段階における臓器又は組織を指す。前転移性臓器又は前転移性組織の例としては、限定しないが、肺、肝臓、脳、卵巣、骨、骨髄又はリンパ節が含まれる。
【００７２】
「微小転移」とは、原発性腫瘍から体の他の部位に広がった少数の細胞を意味する。微小転移は、スクリーニング又は診断検査で検出されるか又は検出されない場合がある。
【００７３】
「非転移性」とは、良性である癌又は原発部位に止まりリンパ管又は血管系又は原発部位以外の組織に浸透していない癌を意味する。所定の実施態様において、非転移性癌は、ステージ０、Ｉ又はＩＩの癌、時にはステージＩＩＩの癌である任意の癌である。
【００７４】
腫瘍又は癌を「ステージ０」、「ステージＩＩ」、「ステージＩＩＩ」又は「ステージＩＩＶ」と呼ぶことは、当該技術分野で知られた全ステージ分類又はローマ数字病気分類法を用いた腫瘍又は癌の分類を示す。癌の実際のステージは、癌の種類に依存するが、一般的にステージ０の癌はその場での病変であり、ステージＩの癌は小さな局所性腫瘍、ステージＩＩ及びＩＩＩ癌は局所的リンパ節の関与を示す局所進行性腫瘍であり、ステージＩＶの癌は転移性癌を表す。腫瘍の種類に対して特定のステージは、熟練した臨床医に知られている。
【００７５】
「原発性腫瘍」又は「原発性癌」とは、元の癌を意味し、被験体の身体の別の組織、器官、又は場所に位置する転移病巣ではない。所定の実施態様において、原発性腫瘍は原発性腫瘍細胞からなる。
【００７６】
「良性腫瘍」又は「良性癌」とは、元の位置に局在化したままで、遠隔部位に浸潤し、侵入し又は転移する能力を持たない腫瘍を意味する。
【００７７】
本明細書中、「癌の再発」は、治療後の癌の復活を意味し、原発性臓器の癌の復活、並びに癌が原発性臓器以外で復活する遠隔再発を含む。
【００７８】
「腫瘍の休眠」とは、腫瘍細胞が存在するが、腫瘍の進行が臨床的に明らかではない遷延性休止状態を意味する。休眠腫瘍はスクリーニング又は診断検査で検出されるか又は検出されない場合がある。
【００７９】
「腫瘍量」とは、体内における癌細胞の数、腫瘍の大きさ、又は癌の量を意味する。腫瘍量はまた腫瘍量（tumor load）とも言う。
【００８０】
「腫瘍数」とは、腫瘍の数を意味する。
【００８１】
「ＵＲＭＣＮＡ」は腫瘍、前転移性臓器及び／又は転移性の臓器において上方制御される核酸を指す。ＵＲＭＣＮＡは、限定しないが、Ｓｔｆａ３、ＣＡＭＰ、Ｂｖ８、ＴＮＦＳＦ１４、ＭＧＡＭ、Ｎｇｐ、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＬＲＰ１Ｂ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＨＡＯ１、Ｃ１０ｏｒｆ４６、ＣＬＥＣＳＦ９、Ｍｃｐｔ８、ＰＲＴＮ３、Ｓｌｆｎ３及びＭＭＰ−９を含む。所定の実施態様において、ＵＲＭＣＮＡはＢｖ８、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９及びＭＭＰ−９を指す。
【００８２】
「ＵＲＭＣＰ」は腫瘍、前転移性臓器及び／又は転移性の臓器において上方制御されるタンパク質を指す。ＵＲＭＣＰは、限定しないが、Ｓｔｆａ３、ＣＡＭＰ、Ｂｖ８、ＴＮＦＳＦ１４、ＭＧＡＭ、Ｎｇｐ、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＬＲＰ１Ｂ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＨＡＯ１、Ｃ１０ｏｒｆ４６、ＣＬＥＣＳＦ９、Ｍｃｐｔ８、ＰＲＴＮ３、Ｓｌｆｎ３及びＭＭＰ−９を含む。所定の実施態様において、ＵＲＭＣＰはＢｖ８、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９及びＭＭＰ−９を指す。
【００８３】
「ＤＲＭＣＮＡ」は腫瘍、前転移性臓器及び／又は転移性の臓器において下方制御される核酸を指す。ＤＲＭＣＮＡは、限定しないが、ＴＹＭＳ、ＣＲＩＰＴＯ ＣＲ−１、ＭＰＨＯＳＰＨ１、ＣＤＨ６、ＷＷＰ２、ＤＭＣ１、ＢＣＨＥ、ＮＳＬＥ１６４８４、Ｆ９、ＧＤＡＰ１、ＬＯＣ３７５１８８、ＤＮＴＴ、ＰＰＩＬ３、ＫＣＮＤ２、ＺＮＦ５９７、ＩＧＳＦ４Ｄ及びＧＴＦ３Ｃ４を含む。
【００８４】
「ＤＲＭＣＰ」は腫瘍、前転移性臓器及び／又は転移性の臓器において下方制御されるタンパク質を指す。ＤＲＭＣＰは、限定しないが、ＴＹＭＳ、ＣＲＩＰＴＯ ＣＲ−１、ＭＰＨＯＳＰＨ１、ＣＤＨ６、ＷＷＰ２、ＤＭＣ１、ＢＣＨＥ、ＮＳＬＥ１６４８４、Ｆ９、ＧＤＡＰ１、ＬＯＣ３７５１８８、ＤＮＴＴ、ＰＰＩＬ３、ＫＣＮＤ２、ＺＮＦ５９７、ＩＧＳＦ４Ｄ及びＧＴＦ３Ｃ４を含む。
【００８５】
本明細書において使用される「試料」なる用語は、例えば物理学的、生化学的、化学的及び／又は生理学的特徴に基づいて特徴付けられるか又は同定される、細胞実体及び／又は他の分子実体を含有する対象とする被検体から得られるか又は該被検体に由来する組成物を指す。一実施態様では、この定義は血液及び生物起源の他の液体試料、及び生検試料などの組織試料又は組織培養物又はこれら由来の細胞を包含する。細胞試料の供給源は、新鮮な、凍結された及び／又は保存された臓器又は組織試料又は生検又は吸引による固体組織；血液又は血液成分；体液；及び被検体の妊娠期又は発生期の任意の時期の細胞又は血漿であり得る。
【００８６】
他の実施態様において、この定義には、試薬による処理、可溶化又はタンパク質又はポリヌクレオチドなどの特定成分の濃縮、又は切片を作るための半固形又は固形マトリックスへの包埋といった、何れかの方法で調達後操作された生物学的試料が含まれる。所定の実施態様において、組織試料の「切片」は、組織試料の一部又は断片、例えば、組織の薄切り又は組織試料由来の細胞片を意味する。
【００８７】
試料は、限定しないが、原発性又は培養された細胞又は細胞株、細胞上清物、細胞溶解物、血小板、血清、血漿、硝子体体液、リンパ液、関節液、ろ胞液、精液、羊水、乳汁、全血液、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液、腫瘍溶解物および組織培養液、並びに組織抽出物、例としてホモジナイズした組織、腫瘍組織および細胞抽出物を含む。
【００８８】
一実施態様において、試料は臨床試料である。他の実施態様では、試料は診断検査法で使用される。所定の実施態様では、試料は前転移性臓器又は前転移性組織から得られる。所定の実施態様では、試料は原発性又は転移性の腫瘍から得られる。組織生検は、腫瘍組織の代表的な部分を得るためにしばしば用いられる。あるいは、腫瘍細胞は、対象の腫瘍細胞を含むことが既知であるか又はそう思われる組織又は体液の形態で間接的に得ることができる。例えば、肺癌病変の試料は、切除術、気管支鏡検査法、細針吸引、気管支のブラッシングによって、又は痰、胸膜液又は血液から得られてよい。
【００８９】
所定の実施態様において、試料は、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストによる処置の前の被検体又は患者から得られる。所定の実施態様において、試料は、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストによる処置の後の被検体又は患者から得られる。所定の実施態様において、試料はＶＥＧＦアンタゴニスト療法の前の被検体又は患者から得られる。所定の実施態様において、試料はＶＥＧＦアンタゴニスト療法の後の被検体又は患者から得られる。所定の実施態様において、試料は抗ＶＥＧＦ抗体療法の前の被検体又は患者から得られる。所定の実施態様において、試料は抗ＶＥＧＦ抗体療法の後の被検体又は患者から得られる。所定の実施態様において、試料は癌が転移する前に得られる。所定の実施態様において、試料は癌が転移した後に得られる。
【００９０】
本明細書において使用される「参照（reference）試料」は、比較目的のために用いられる任意の試料、標準物質又はレベルを指す。一実施態様において、参照試料は、同一被検体又は患者の身体の健康な及び／又は罹患していない部分から得られる。他の実施態様において、参照試料は、同一被検体又は患者の身体の処置していない組織及び／又は細胞から得られる。
【００９１】
所定の実施態様において、参照試料は、試験試料を得るときとは異なる一又は複数の時点で得る同一被検体又は患者由来の単一試料又は組み合わせた複数の試料である。例えば、参照試料は、同一被検体又は患者から、試験試料を得る時より早い時点に得られる。そうした参照試料は、参照試料が癌の初期診断時に得られ、試験試料が後に癌が転移性になるときに得られる場合に、有用であり得る。
【００９２】
一実施態様において、参照試料は、被検体又は患者でない個体の身体の健康な及び／又は罹患していない部分から得られる。他の実施態様では、参照試料は、被検体又は患者でない個体の身体の処置していない組織及び／又は細胞部分から得られる。
【００９３】
所定の実施態様において、参照試料は、被検体又は患者でない一又は複数の個体から得られる「試料」なる用語の下で定義される、全種類の生物学的試料を含む。所定の実施態様では、参照試料は、被検体又は患者でない癌を有する一又は複数の個体から得られる。
【００９４】
所定の実施態様において、参照試料は、被検体又は患者でない一又は複数の健康な個体からの組み合わせた複数の試料である。ある実施態様では、参照試料は、被検体又は患者でない癌を有する一又は複数の個体からの組み合わせた複数の試料である。所定の実施態様では、参照試料は、被検体又は患者でない一又は複数の個体由来の前転移性臓器又は前転移性組織由来のプールされたＲＮＡ試料である。所定の実施態様では、参照試料は、被検体又は患者でない癌を有する一又は複数の個体からの前転移性臓器又は前転移性組織由来のプールされたＲＮＡ試料である。
【００９５】
第一試料における遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカーの発現レベル／量が、第二試料における遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカーの発現レベル／量よりも大きい場合には、第一試料における遺伝子、タンパク質又はバイオマーカーの発現レベル／量は、第二試料における発現レベル／量に比較して増加している。発現レベル／量は、限定しないが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、タンパク質断片及び／又は遺伝子コピーを含み当該技術分野で知られた任意の適切な判断基準に基づいて決定されることが可能である。発現レベル／量は定性的及び／又は定量的に決定されることが可能である。
【００９６】
所定の実施態様において、第一試料における遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカーの発現レベル／量の増加は、第二試料に比較して、本明細書に記載された標準的方法で検出された各遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカーの発現レベル／量の少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％又は１００％である。所定の実施態様において、第一試料における遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカーの発現レベル／量の増加は、第二試料中の各遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカーの発現レベル／量の少なくとも約１．５Ｘ、１．７５Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、２５Ｘ、５０Ｘ、７５Ｘ、又は１００Ｘである。所定の実施態様において、第一試料は被験体から得られた試料であり第二試料は参照試料である。
【００９７】
所定の実施態様において、「減少」又は「低減」なる用語はここでは、第二試料との比較にて、本明細書に記載された標準的方法で検出された各遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカーの発現レベル／量と比較して少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％である第一試料における遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカーの発現レベル／量の全体的な低減を指す。所定の実施態様において、低減なる用語は、減少が第二試料中の各遺伝子又はバイオマーカーの発現レベル／量の少なくとも約０．９Ｘ、０．８Ｘ、０．７Ｘ、０．６Ｘ、０．５Ｘ、０．４Ｘ、０．３Ｘ、０．２Ｘ、０．１Ｘ、０．０５Ｘ、又は０．０１Ｘである第一試料中の遺伝子又はバイオマーカーの発現レベル／量の減少を指す。所定の実施態様において、第一試料は被験体から得られた試料であり第二試料は参照試料である。
【００９８】
所定の実施態様において、試料はアッセイされたＲＮＡ又はタンパク質の量の違い、及び用いたＲＮＡ又はタンパク質試料の品質のばらつきの両方に対して正規化される。このような正規化は、ＧＡＰＤＨ等のよく知られたハウスキーピング遺伝子を含み、所定の正規化遺伝子の発現を測定し、組み込むことにより達成され得る。あるいは、正規化は、アッセイした遺伝子全て又はその大規模なサブセット（グローバルノーマライゼーション・アプローチ）の平均値又は中央値シグナルに基づく可能性がある。遺伝子に基づいて、患者の腫瘍ｍＲＮＡ又はタンパク質が測定され正規化された量は参照セットにおいて見いだされた量と比較される。患者ごとに検査された腫瘍ごとに各ｍＲＮＡ又はタンパク質の正規化された発現レベルは、参照セットで測定された発現レベルの割合として表現することができる。分析すべき特定の患者の試料で測定された発現レベルは、当該技術分野で周知の方法によって決定することが可能なこの範囲内のどこかのパーセンタイルで落ちつくだろう。
【００９９】
「検出する」又は「検出」なる用語は、標的分子の定性的及び定量的な双方の測定を含むため広い意味で使用される。検出は直接的及び間接的な検出を含み、検出する任意の手段を含む。
【０１００】
本明細書中で交換可能に用いられる「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、変性ヌクレオチド又は塩基及び／又はそれらのアナログ、又は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼによって又は合成反応によってポリマーに組み込まれうる任意の基質であってよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそのアナログといった変性ヌクレオチドを含んでよい。
【０１０１】
本明細書中で用いられる「オリゴヌクレオチド」は一般に、必須ではないが一般におよそ２００ヌクレオチド未満である、短い、一般に一本鎖の、一般に合成のポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は互いに排他的である。ポリヌクレオチドについての先の記載はオリゴヌクレオチドに対して等しく、完全に適用できる。
【０１０２】
所定の実施態様において、ポリヌクレオチドは、様々なストリンジェンシー条件下で遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【０１０３】
ここで定義されるストリンジェントな条件又は高度にストリンジェントな条件は、（１）例えば５０℃の０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムと、洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる；（２）例えば４２℃の５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドに０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムと、ホルムアミド等の変性剤をハイブリダイゼーションに用いる；又は（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストラン溶液を４２℃で用い、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）での４２℃での洗浄と５０％のホルムアミドでの５５℃での洗浄に、５５℃でのＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄が続くものによって同定されうる。
【０１０４】
中程度にストリンジェントな条件は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているようにして同定され、上述のものより低いストリンジェンシーの洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で３７℃での終夜インキュベーションの後、１×ＳＳＣ中で約３７−５０℃でのフィルターの洗浄が続くものである。当業者であれば、プローブ長などの要因に適合させるために必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは分かるであろう。
【０１０５】
「単離された」核酸分子は、同定され、ポリペプチド核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子には、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるポリペプチドを通常発現する細胞に含まれる核酸分子が含まれる。
【０１０６】
「プライマー」は、一般に、標的配列とハイブリダイズすることによって、対象の試料中に存在しうる標的に結合して、その後、標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する、一般に遊離した３'-ＯＨ基を有する短い単鎖のポリヌクレオチドである。
【０１０７】
「ハウスキーピング遺伝子」なる用語は、活性が細胞機能の維持に必須であるタンパク質をコードする一群の遺伝子を指す。これらの遺伝子は一般的に、すべての細胞型において同じように発現される。
【０１０８】
本明細書中で用いられる「バイオマーカー」なる用語は、一般的に、遺伝子、タンパク質、糖質構造又は糖脂質を含む分子を指し、哺乳動物組織又は細胞中ないしは組織又は細胞上での該分子の発現は標準的な方法(又は本明細書中で開示される方法)によって検出されうるものであり、哺乳動物細胞又は組織の、ＶＥＧＦ特異的インヒビター、Ｂｖ８特異的インヒビター、Ｇ−ＣＳＦ特異的インヒビターといった抗血管形成薬などの血管形成の阻害に基づく治療投薬計画への感受性を予測、診断及び／又は予後の予測をするものである。ある実施態様では、このようなバイオマーカーの発現は、参照試料について観察されるものより高いか又は低いことが決定される。このようなバイオマーカーの発現は、Rules Based Medicine, Inc.又はMeso Scale Discoveryから市販されているような高性能多重化イムノアッセイを使用して決定されてよい。また、バイオマーカーの発現は、例えば、ＰＣＲ又はＦＡＣＳアッセイ、免疫組織化学アッセイ又はジーンチップベースのアッセイを用いて決定してよい。
【０１０９】
本明細書で用いる「アレイ」又は「マイクロアレイ」なる用語は、基質上でのハイブリダイズ可能なアレイ成分、好ましくはポリヌクレオチドプローブ(例えばオリゴヌクレオチド)の規則正しい整列を指す。基質は、ガラススライドなどの固体基質、又はニトロセルロースメンブレンなどの半固体基質であってもよい。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は何れかのその並べ換えであってよい。
【０１１０】
本明細書で用いる「標的遺伝子」、「標的バイオマーカー」、「標的配列」、「標的核酸」又は「標的タンパク質」は、その検出が望まれる、対象とするポリヌクレオチド又はタンパク質である。通常、本明細書中で用いる「鋳型」は標的ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドである。場合によって、「標的配列」、「鋳型ＤＮＡ」、「鋳型ポリヌクレオチド」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」及びその変異体は交換可能に用いられる。
【０１１１】
本明細書中で用いる「増幅」は通常、所望の配列の複数のコピーを生産する方法を指す。「複数のコピー」は少なくとも２のコピーを意味する。「コピー」が、鋳型配列に対して相補的な又は同一な完全な配列を必ずしも意味するものではない。例えば、コピーは、ヌクレオチド類似体、例えばデオキシイノシン、意図的配列変化(鋳型に相補的ではないがハイブリダイズすることができる配列を含むプライマーにより導入された配列変化など)、及び／又は増幅中に起こる配列エラーを含みうる。
【０１１２】
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来のポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。よって、天然配列ポリペプチドは、任意の哺乳動物由来の天然に生じるポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。このような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、あるいは組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列」ポリペプチドという用語は特にポリペプチドの天然に生じる切断型又は分泌型(例えば細胞外ドメイン配列)、ポリペプチドの天然に生じる変異体型(例えば、選択的スプライシング型)及び天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。
【０１１３】
「単離された」ポリペプチド又は「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定されて分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、ポリペプチドの診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を含む。ある実施態様では、ポリペプチドは、（１）ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法により定量したポリペプチドの９５重量％を上回るまで、好ましくは９９重量％を上回るまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに十分な程度まで、あるいは（３）クーマシーブルー又は銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一性が得られるまで精製される。ポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内にインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは、少なくとも一の精製工程により調製されるであろう。
【０１１４】
「ポリペプチド鎖」とは、その各々のドメインが他のドメインに、非共有結合的相互作用又はジスルフィド結合とは対照的に、ペプチド結合により連結されているポリペプチドである。
【０１１５】
ポリペプチド「変異体」は、対応する天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、一又は複数のアミノ酸残基（天然に生じるアミノ酸及び／又は非天然的に生じるアミノ酸）が、ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端で付加されているか、又は欠失しているポリペプチドが含まれる。通常、変異体は、天然配列ポリペプチドと少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。また、変異体は、一般的に生物学上活性な天然配列のポリペプチド断片(例えば部分配列、切断配列など)を含む。
【０１１６】
本明細書中で用いる「タンパク質変異体」なる用語は、上記の変異体及び／又は一又は複数のアミノ酸突然変異を天然のタンパク質配列に含むタンパク質を指す。場合によって、一又は複数のアミノ酸突然変異にはアミノ酸置換が含まれる。本発明での使用のためのタンパク質及びその変異体は当分野で公知の様々な方法によって調製されうる。タンパク質のアミノ酸配列変異体はタンパク質ＤＮＡの突然変異によって調製されうる。このような変異体には、タンパク質のアミノ酸配列内の残基の例えば欠失、挿入又は置換が含まれる。欠失、挿入及び置換の何かを組み合わせて、所望の活性を有する最終コンストラクトに達成してもよい。変異体をコードするＤＮＡ中に作製される突然変異は、リーディングフレーム外の配列におくべきでなく、好ましくは二次的ｍＲＮＡ構造を生産しうる相補的な領域を作製しないであろう。欧州特許第７５４４４号Ａ。
【０１１７】
所定の実施態様において、ポリペプチド「変異体」(すなわち本明細書において開示される任意のポリペプチドの変異体)は、対応する天然配列のポリペプチドと少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体は、例えば、ポリペプチドのＮ−及び／又はＣ末端で、一又は複数のアミノ酸(天然に生じるアミノ酸及び／又は天然には生じないアミノ酸)残基が付加又は欠失しているポリペプチドを含む。通常、変異体は、天然配列のポリペプチドと少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。また、変異体は、一般的に生物学的に活性な天然配列のポリペプチド断片(例えば部分配列、切断配列など)をも含む。
【０１１８】
本明細書での「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとして、選択した配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＩＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較プログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって以下に記載のように得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、米国著作権事務所、ワシントンＤ．Ｃ．２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録され、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから好適に入手可能でありる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【０１１９】
ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【０１２０】
本明細書中で用いられる「アンタゴニスト」なる用語は、リガンドの場合には一又は複数のレセプターへの結合、又はレセプターの場合には一又は複数のリガンドへの結合を含む、本発明のタンパク質の活性を中和、遮断(ブロック)、阻害、抑止、低減又は干渉することができる分子を指す。アンタゴニストには、抗体及びその抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。また、アンタゴニストには、本発明のタンパク質の小分子インヒビター、及び融合タンパク質、タンパク質に特異的に結合することによってその標的への結合を隔離するレセプター分子及び誘導体、タンパク質のアンタゴニスト変異体、本発明のタンパク質に対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、及び本発明のタンパク質に対するリボザイムが含まれる。
【０１２１】
「抗体」という用語は最も広義に使用され、モノクローナル抗体(完全長又は無傷のモノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多価抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片(以下を参照)を具体的に包含する。
【０１２２】
特に断らない限りは、本明細書全体を通して「多価抗体」という表現は３又はそれ以上の抗原結合部位を含む抗体を指すために使用される。多価抗体は典型的には３又はそれ以上の抗原結合部位を持つように遺伝子操作されたもので、一般には天然配列ＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。
【０１２３】
「遮断(ブロック)」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減させるものである。特定の遮断抗体ないしアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的に又は完全に阻害する。
【０１２４】
本明細書中で用いる「アゴニスト抗体」は、対象のポリペプチドの機能的な活性の少なくとも一を部分的ないし完全に模倣する抗体である。
【０１２５】
「抗体断片」は、一般には無傷の抗体の抗原結合を含み、よって抗原に結合する能力を保持している無傷の抗体の一部のみを含む。本定義に包含される抗体断片の例には、(i)ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦａｂ断片；(ii)ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基を持つＦａｂ断片であるＦａｂ'断片；(iii)ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ断片；(iv)ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基とＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ'断片；(v)抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを持つＦｖ断片；(vi)ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片(Ward等, Nature 341, 544-546 (1989))；(vii)単離されたＣＤＲ領域；(viii)ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ'断片を含む二価断片であるＦ(ａｂ')２断片；(ix)単鎖抗体分子(例えば単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ)(Bird等, Science 242:423-426 (1988)；及びHuston等, PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988))；(x)同一のポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に結合した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む、２つの抗原結合部位を持つ「ダイアボディー(diabodies)」(例えば、欧州特許公報第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照)；(xi)相補的軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント(ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１)を含む「線形抗体」(Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)；及び米国特許第５６４１８７０号)が含まれる。
【０１２６】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる天然に生じる突然変異等の可能性のある突然変異を除いて、同一である。したがって、「モノクローナル」なる修飾語は、別の抗体の混合ではない抗体の性質を示す。モノクローナル抗体は非常に特異的で、単一抗原に対するものである。ある実施態様では、モノクローナル抗体は、一般に、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を包含しており、この場合の標的に結合するポリペプチドは、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られたものである。例えば、このような選択プロセスは、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールからの、独特のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的に対する親和性を向上させる、標的結合配列をヒト化する、細胞培養液中でのその産生を向上させる、インビボでのその免疫原性を低減する、多特異性抗体を作製する等が可能であること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。一般に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、１の抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、通常他の免疫グロブリンによって汚染されない点で有利である。
【０１２７】
「モノクローナル」との修飾詞は、ほぼ均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作ることができ、それらの技術には例えばハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow等, Antibodies: A loboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Clarkson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、WO1998/24893; WO1996/34096；WO1996/33735；WO1991/10741；Jackobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；及び同第5,661,016号；Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)；Longerg等, Nature, 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)；及びLongerg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)）が含まれる。
【０１２８】
ここに記載のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から由来するか、特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である一方、鎖の残りが、他の種から由来するか、他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片を含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。
【０１２９】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域からの残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種の高頻度可変領域からの残基(ドナー抗体)によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲｓがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部をまた含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。また例として、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；及び米国特許第 6,982,321号及び同第7,087,409号を参照。また、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照のこと。抗原刺激に応答して抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによってヒト抗体を調製することができる(例として、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関する米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照)。また、例えば、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成したヒト抗体に関するLi等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照のこと。
【０１３０】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、当該分野で知られている様々な技術を使用することによって生産することが可能である。一実施態様では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、ここでファージライブラリーがヒト抗体を発現する(Vaughan等, Nature Biotechnology 14:309-314 (1996):Sheets等, PNAS, (USA)95:6157-6162(1998)；Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。また、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウス中に導入することにより産生することができる。暴露時に、遺伝子再構成、アセンブリ及び抗体レパートリーを含む、あらゆる点でヒトに見られるものと密接に類似しているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチ法は、例えば米国特許第５５４５８０７号；第５５４５８０６号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５６６１０１６号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison等, Nature 368: 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して抗体を生産するヒトＢリンパ球の不死化によって調製されてもよい(そのようなＢリンパ球は、個体から回収されてもよいし、インビトロで免疫化されていてもよい)。例えば、Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)；Boerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)；及び米国特許第５７５０３７３号を参照のこと。
【０１３１】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性への抗体の関与を示す。
【０１３２】
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。例えば、高頻度可変領域は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示す、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。例として、Xu等 (2000) Immunity 13:37-45；Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)のJohnson and Wu (2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。Hamers-Casterman等 (1993) Nature 363:446-448；Sheriff等 (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736。
【０１３３】
多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに含まれる。カバット（Kabat）相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＨＶＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらＨＶＲのそれぞれからの残基を以下に示す。
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【０１３４】
ＨＶＲは、次のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、Kabat等, 上掲に従って番号を付した。
【０１３５】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義する高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１３６】
「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、上掲のKabat 等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
【０１３７】
本明細書及び特許請求の範囲すべてにわたって、一般的に、可変ドメインの残基を指す場合にはカバット番号付けシステムを用いる(およそ、軽鎖の残基１−１０７と重鎖の残基１−１１３)(例として、Kabat 等, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。一般的に、イムノグロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合には、「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」を用いる(ＥＵインデックスはKabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において報告されており、出典明記によって本明細書中に特別に組み込まれる)。本明細書中で特に述べない限り、抗体の可変ドメイン内の残基の数の参照は、カバット番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する。本明細書中で特に述べない限り、抗体の定常ドメイン内の残基の数の参照は、ＥＵ番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する(例として、米国特許仮出願第６０／６４０３２３号、ＥＵ番号付けについての図を参照)。
【０１３８】
イムノグロブリンの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体(イムノグロブリン)は異なるクラスが割り当てられる。イムノグロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１(非Ａ及びＡアロタイプを含む)、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。イムノグロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、一般に、例えばAbbas等 Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)に記載されている。抗体は、抗体と一又は複数の他のタンパク質ないしペプチドとの共有的ないしは非共有的結合によって形成される大きな融合分子の一部であってもよい。
【０１３９】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
【０１４０】
「Ｆｃ領域」なる用語は、インタクト抗体のパパイン消化によって生成されうる免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は天然配列Ｆｃ領域又は変異形Ｆｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はおよそＣｙｓ２２６の位置又はおよそＰｒｏ２３０からの位置のアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの２つの定常ドメインを含み、場合によってＣＨ４ドメインを含む。
【０１４１】
特に明記しない限り、本明細書中の免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、出典明記によって本明細書中に特別に援用される上掲のKabat等のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号を指す。
【０１４２】
本明細書中の「Ｆｃ領域鎖」は、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖の１つを意味する。
【０１４３】
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」(「Ｃｇ２」ドメインとも呼ばれる)は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで延びている。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと親密な対にならないという点で独特である。代わりに、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然IgG分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。炭水化物はドメイン−ドメイン対の代替物を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化を助けることができると推測される。BurtonによるMolec. Immunol. 22:161-206 (1985)を参照のこと。ここで、ＣＨ２ドメインは天然配列のＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインとすることができる。
【０１４４】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣ末端からＣＨ２ドメインまでの範囲(つまり、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸から約４４７位のアミノ酸)を含む。ここでは、ＣＨ３領域は、天然配列のＣＨ３ドメインか、又は変異体ＣＨ３ドメイン(例えば、その一鎖に「protroberance」が導入され、それに対応して他の鎖に「空洞」が導入されたＣＨ３ドメイン：出典明記によって特別に本明細書中に援用される米国特許第５８２１３３３号参照)とすることができる。このような変異体ＣＨ３ドメインを使用して本明細書に開示する多重特異性(例えば二重特異性)抗体をつくることができる。
【０１４５】
「ヒンジ領域」は、通常、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６又は約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０まで延びていると定義される(Burton, Molec. Immunol.22:161-206, 1985)。他のＩｇＧイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置に内部重鎖Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を配置することによりIgG1と整列させることができる。本明細書のヒンジ領域は、天然配列のヒンジ領域か、又は変異体ヒンジ領域とすることができる。変異体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、通常、１つのポリペプチド鎖につき少なくとも１つのシステイン残基を保持しており、よって２つの変異体ヒンジ領域のポリペプチド鎖は２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成することができる。本発明の好ましいヒンジ領域は、天然配列のヒトヒンジ領域、例えば天然配列のヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【０１４６】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つの「作動体機能」を有する。例示的「作動体機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)、食作用、細胞表面レセプター(例えばＢ細胞レセプター； ＢＣＲ)の下方制御などが含まれる。そのような作動体機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、そのような抗体の作動体機能を評価するための当技術分野で既知の様々なアッセイを使用して評価される。
【０１４７】
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を包含する。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡ-アロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域；並びに、これらの自然に生じる変異体が含まれる。
【０１４８】
「インタクトな」抗体は、抗原-結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそれらのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、インタクトな抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
【０１４９】
「親抗体」又は「野生型」抗体は、本明細書中で開示する抗体変異体と比較して一又は複数のアミノ酸配列の変更が無いアミノ酸配列を含む抗体である。ゆえに、一般に親抗体は、本明細書中で開示する抗体変異体の対応する高頻度可変領域のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる少なくとも一の高頻度可変領域を有する。親抗体は、天然の配列(すなわち、天然に生じる)抗体(天然に生じる対立変異体を含む)、又は天然に生じる配列の既存のアミノ酸配列修飾(例えば挿入、欠失及び／又は他の変更)を有してもよい。開示内容全体を通して、「野生型」、「ＷＴ」、「ｗｔ」、及び「親」ないしは「親の」抗体は交換可能に用いられる。
【０１５０】
ここで用いる「抗体変異体」又は「変異抗体」は、親抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する抗体を指す。好ましくは、抗体変異体は、天然に見られないアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインを含む。このような変異体は、必然的に親抗体と１００％未満の配列同一性又は類似性がある。好適な実施態様では、抗体変異体は、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と、およそ７５％から１００％未満、より好ましくはおよそ８０％から１００％未満、より好ましくはおよそ８５％から１００％未満、より好ましくはおよそ９０％から１００％未満、最も好ましくはおよそ９５％から１００％未満のアミノ酸配列同一性又は類似性があるアミノ酸配列を有するであろう。抗体変異体は一般に、一又は複数の高頻度可変領域内又は該領域に隣接して一又は複数のアミノ酸変更を有するものである。
【０１５１】
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を包含するものである。ある実施態様では、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親のポリペプチドのＦＣ領域におよそ１からおよそ１０のアミノ酸置換、好ましくはおよそ１からおよそ５のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、典型的には、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と、例えば少なくともおよそ８０％の同一性を有するか、又は少なくともおよそ９０％の配列同一性を、又は少なくともおよそ９５％の配列又はそれ以上の同一性を有するものであろう。
【０１５２】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【０１５３】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
【０１５４】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。ある実施態様では、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が一般的に好まれる。エフェクター細胞はその天然源、例えば本明細書中に記載の血液又はＰＢＭＣから単離してもよい。
【０１５５】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。いくつかの実施態様では、ＦｃＲは天然ヒトＦｃＲである。いくつかの実施態様では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ)を含んでいる(例としてDaeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲsに関しては、 例えばRavetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)；Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。
【０１５６】
また、「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))と、免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie and Ward, Immunol. Today 18: 592-8 (1997)；Ghetie等, Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton等, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)；国際公開第2004/92219号 (Hinton等)を参照)。
【０１５７】
インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又は変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。国際公開公報２０００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。例としてShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
【０１５８】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体(変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチド)は、米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開第１９９９／５１６４２号に記述される。また例としてIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。
【０１５９】
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。一実施態様では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【０１６０】
ここでの「可動(フレキシブル)リンカー」とはペプチド結合によって結合した２又はそれ以上のアミノ酸残基を含むペプチドを意味し、それによって結合された(例えば２つのＦｄ領域のような)２つのポリペプチドに対してより大なる回転自由度を提供する。そのような回転自由度により、可動リンカーによって結合された２又はそれ以上の抗原結合部位がそれぞれより効率的に標的抗原(一又は複数)に接近できるようになる。適切な可動リンカーペプチド配列の例には、gly-ser、gly-ser-gly-ser(配列番号：１８)、ala-ser、及びgly-gly-gly-ser(配列番号：１９)が含まれる。
【０１６１】
「二量体化ドメイン」は少なくとも２つのアミノ酸残基(一般にはシステイン残基)又は少なくとも２つのペプチド又はポリペプチド(これは同じか異なったアミノ酸配列を持ちうる)の結合(association)によって形成される。ペプチド又はポリペプチドは共有的及び／又は非共有的結合(一又は複数)によって互いに相互作用しうる。ここでの二量体化ドメインの例には、Ｆｃ領域；ヒンジ領域；ＣＨ３ドメイン；ＣＨ４ドメイン；ＣＨ１-ＣＬ対；出典明示によりここに取り込まれる米国特許第５８２１３３３号に記載されたような、遺伝子操作された「ノブ(knob)」及び／又は「隆起(protruberance)」を持つ「インターフェース」；ロイシンジッパー(例えば、ｊｕｎ／ｆｏｓロイシンジッパー、Kostelney等, J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)を参照；又は酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパー)；イソロイシンジッパー；レセプター二量体対(例えばインターロイキン-８レセプター(ＩＬ-８Ｒ)；及びインテグリンヘテロ二量体、例えばＬＦＡ-１及びＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ)、又はその二量体化領域(一又は複数)；二量体リガンドポリペプチド(例えば、神経成長因子(ＮＧＦ)、ニューロトロフィン-３(ＮＴ-３)、インターロイキン-８(ＩＬ-８)、血管内皮細胞成長因子(ＶＥＧＦ)、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＰＤＧＦメンバー、及び脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)；Arakawa等, J. Biol. Chem. 269(45): 27833-27839 (1994)及びRadziejewski等 Biochem. 32(48): 1350 (1993)を参照)、又はその二量体化領域(一又は複数)；ジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基対；ペプチド又はポリペプチドの間にジスルフィド結合が形成可能なようにそれぞれが少なくとも一つのシステイン残基(例えば約１、２又は３から約１０のシステイン残基)を有するペプチド又はポリペプチドの対(以下、「合成ヒンジ」)；及び抗体可変ドメインが含まれる。ここでの最も好適な二量体化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域である。
【０１６２】
抗体の「機能的抗原結合部位」は標的抗原に結合可能なものである。抗原結合部位の抗原結合親和性は、抗原結合部位が由来する親抗体と必ずしも同じほどは強くはないが、抗原に結合する能力は、抗原に結合する抗体を評価するために知られている既知の様々な方法の何れか一つを使用して測定できるものでなければならない。更に、ここの多価抗体の抗原結合部位の各々の抗原結合親和性は定量的に同じである必要はない。ここの多量体抗体に対して、機能的抗原結合部位の数は超遠心分離分析法を使用して評価することができる。この分析法によれば、多量体抗体に対する標的抗原の異なった比を組み合わせ、複合体の平均分子量を、機能的結合部位の異なった数を仮定して算定する。これらの理論値を、機能的結合部位の数を評価するために得られた実際の実権値と比較する。
【０１６３】
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体は同じ抗原に結合する他の抗体とは区別されるその抗体の生物学的特性の一又は複数を保有するものである。
【０１６４】
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載のものなどの常套的な交差遮断(cross-blocking)アッセイを行ってもよい。
【０１６５】
「エピトープ」という用語は、タンパク質抗原上の（モノクローナル又はポリクローナル）抗体との結合部位を指すために使用される。
【０１６６】
ここで使用される場合、「治療」とは、有益な又は所望される臨床結果を得るためのアプローチである。この発明の目的において、有益な又は所望される臨床結果には、限定されるものではないが、検出可能か検出不可能かにかかわらず、症状の緩和、疾病範囲の減少、疾病の安定した（つまり、悪くならない）状態、病気進行の遅延又は減速、疾病状態の回復又は緩和、及び沈静化（部分的又は全体的にかかわらず）が含まれる。「治療」はまた治療を受けない場合に予測される生存に比較した延命を意味し得る。「治療」は、疾患の病状の進行又は変化を防止する意図で実施される介入である。従って、「治療」は、治療的処置及び予防的又は防止的手段の両方を意味する。治療が必要な者には、既に疾患を有する者並びに疾患が防止されるべき者が含まれる。すなわち、治療は、細胞変性又は損傷の病理状態、例えば腫瘍転移、腫瘍細胞遊走、及び／又はＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動員と関連する疾患又は症状の病理状態を直接的に防止し、遅延させ又は減少させうる。
【０１６７】
「有効量」又は「治療的有効量」という用語は、被験体の疾病又は疾患の治療のために有効な薬剤の量を言う。所定の実施態様において、有効量とは有益な又は所望の治療（予防を含む）結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、一回以上の投与で投与する可能性がある。所定の実施態様において、有効量は、所望の治療又は予防結果を達成するために、必要な期間、必要な用量での有効量を意味する。本発明の物質／分子の「治療的有効量」は、個体に所望する反応を引き出すために、個体の病状、年齢、性別、体重、及び物質／分子の能力等の要因に応じて変わり得る。治療的有効量とは、物質／分子の任意の毒性又は有害な影響を、治療的に有益な効果が上回る量を含む。癌の場合は、有効量の薬剤により、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害し(すなわち、ある程度遅らせ、典型的には止める)；腫瘍の転移を阻害し(すなわち、ある程度遅らせ、典型的には止める)；腫瘍の増殖をある程度阻害し；耐性腫瘍の治療を可能にする；及び／又は疾患に関連する一又は複数の症状をある程度和らげることが可能である。薬剤は現存の癌細胞の増殖を妨げ及び／又は殺すことが可能であるという点で、細胞増殖抑制性及び／又は細胞傷害性であり得る。
【０１６８】
「予防的有効量」は、所望する予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を意味する。必ずではないが、典型的には、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に被検体に使用されるため予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
【０１６９】
前癌性、良性、初期又は後期の腫瘍の場合、血管形成インヒビターの治療上の有効量は、癌細胞の数を減少させ；原発性腫瘍サイズを縮小させ；周辺臓器への癌細胞浸潤の阻害し(すなわち、ある程度遅らせ及び好ましくは停止させ)；腫瘍転移の阻害(すなわち、ある程度遅らせ及び好ましくは停止させ)；ある程度の腫瘍増殖又は腫瘍進行を阻害し又は遅延させ；及び／又は癌が関与する一又は複数の症状をある程度軽減し得る。薬剤は現存の癌細胞の増殖を妨げ及び／又は殺すことが可能であるという点で、細胞増殖抑制性及び／又は細胞傷害性であり得る。
【０１７０】
「個体」、「被検体」又は「患者」は脊椎動物である。所定の実施態様において、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、これに限定されないが、家畜(ウシなど)、スポーツ用動物、愛玩動物(ネコ、イヌ及びウマなど)、霊長類、マウス及びラットが含まれる。所定の実施態様において、哺乳動物はヒトである。
【０１７１】
「維持療法」とは、疾患再発又は進行の可能性を低減するために施される治療的投薬計画を意味する。維持療法は、被検体の寿命まで延長された時間を含む任意の長さの時間に提供されてもよい。維持療法は、最初の療法の後又は、最初ないしは更なる療法と併せて提供されてもよい。維持療法のために使用する用量は変化してもよく、他の種の療法に使用する用量と比較して、減少した用量を包含しうる。
【０１７２】
「ネオアジュバント療法」又は「術前療法」は本明細書において手術前に与えられる治療を指す。ネオアジュバント療法の目標は、別の外科手術後に全身療法が続く標準的な順序に従った場合には増殖するであろう微小転移を根絶する可能性のある緊急の全身治療を提供することである。ネオアジュバント療法はまた腫瘍の大きさを縮小することに役立ち、それによって初期には切除できなかった腫瘍を完全に切除し又臓器及びその機能の一部を保存することを可能にする。更に、ネオアジュバント療法は、その後の治療の選択肢を導くであろう、薬効のインビボ評価を可能とする。
【０１７３】
「アジュバント療法」は本明細書において、病気の再発のリスクを軽減するために残存病変の証拠が検出され得ない、手術後に与えられる治療を指す。アジュバント療法の目標は癌の再発を防ぐこと、従って癌関連死の可能性を減らすことである。
【０１７４】
本明細書において、「治療の標準」の化学療法は日常的に特定の癌を治療するために使用される化学療法剤を指す。
【０１７５】
「根治手術」とは腫瘍及びその周辺の組織並びに任意の関与するリンパ節を完全に除去することを指す。
【０１７６】
「手術可能」癌とは、一次臓器に限局し、手術に適している癌である。
【０１７７】
本明細書中の「腫瘍」とは、悪性か良性かにかかわらず、全ての腫瘍性細胞成長及び増殖及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を指す。「癌」、「癌性」「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語は、本明細書に参照されるように互いに排他的なものでない。
【０１７８】
腫瘍は固形腫瘍又は非固形腫瘍又は軟部腫瘍である場合がある。軟部腫瘍の例として、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ球性 白血病、又は有毛細胞白血病）、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、又はホジキン病）を含む。固形腫瘍は血液以外の体の組織の任意の癌、骨髄又はリンパ系を含む。固形腫瘍は更に、上皮細胞由来のものと、非上皮細胞由来のものに分けることができる。固形腫瘍の例は、大腸、乳房、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、消化管、肛門、胆嚢、唇、鼻咽頭、皮膚、子宮、男性生殖器、泌尿器、膀胱、及び皮膚の癌を含む。非上皮由来の固形腫瘍は肉腫、脳腫瘍、骨腫瘍を含む。
【０１７９】
「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に調節不可能な細胞成長に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は表す。癌の例には、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍が含まれるが、これに限定されるものではない。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌(例えば上皮性扁平細胞癌)、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)を含む)、腹膜癌、肝細胞癌、胃(gastric)又は腹部(stomach)癌(消化器癌及び胃腸癌を含む)、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、肝癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney)又は腎(renal)癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門部の癌腫、陰茎癌腫、メラノーマ、表在性伸展メラノーマ、黒色癌前駆症メラノーマ、末端性黒子性黒色腫、結節性メラノーマ、多発性骨髄腫
及びＢ細胞リンパ腫(低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；小リンパ球(ＳＬ)ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小非分割細胞ＮＨＬ；バルキー疾患ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びワルデンストロームのマクログロブリン病を含む)；慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)；急性リンパ芽球白血病(ＡＬＬ)；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患(ＰＴＬＤ)、並びに、母斑症と関係する異常な血管性増殖、浮腫(脳腫瘍と関係するものなど)、メイグス症候群、脳、並びに頭頸部癌および関連する転移が含まれる。ある実施態様では、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体、抗Ｂｖ８抗体、抗ＰＫＲ１抗体又はそれらの任意の組合せによる治療に影響を受けやすい癌には、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、膠芽細胞種、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、腎臓細胞癌、前立腺癌、黒色腫、肝癌、膵癌、柔組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭頸部癌、卵巣癌、及び多発性骨髄腫が含まれる。いくつかの実施態様では、癌は、小細胞肺癌、膠芽細胞種、神経芽細胞腫、メラノーマ、乳癌、胃癌、結腸直腸癌(ＣＲＣ)および肝細胞癌からなる群から選択される。さらに、いくつかの実施態様では、癌は、それらの癌の転移型を含む、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、前立腺癌、神経膠芽腫および乳癌からなる群から選択される。
【０１８０】
癌なる用語は、限定しないが、前癌増殖、良性腫瘍、悪性腫瘍及び休眠腫瘍を含む増殖性疾患の集合を包含する。良性腫瘍は発生部位に局在したままで、浸潤、侵攻又は遠隔部位に転移する能力を持たない。悪性腫瘍は侵入しその周囲の他の組織に損傷を与える。それらはまた発生場所から離れる能力を獲得することが可能であり、通常は血流を介して又はリンパ節が存在するリンパ系を通じて体の他の部分に広がる（転移する）。休止状態の腫瘍とは、腫瘍細胞は存在するが、腫瘍の進行が臨床的に明らかではないでない静止腫瘍である。原発性腫瘍は、それらが発生した組織の種類によって分類され、転移性腫瘍は、癌細胞が由来する組織の種類によって分類される。時間の経過とともに、悪性腫瘍の細胞はより異常になり正常細胞のようには見えない。癌細胞の外観のこの変化は、腫瘍悪性度と呼ばれ、癌細胞が高分化型、中分化型、低分化型、又は未分化型であると説明される。高分化型細胞は非常に正常な外観でありそれらが由来する正常細胞に似ている。未分化型細胞は、細胞の起源を決定することがもはや可能ではないほど異常になった細胞である。
【０１８１】
上皮癌は、一般的に良性腫瘍から浸潤前段階（例えば、上皮内癌）、基底膜を貫通し上皮下間質に侵入する悪性の癌へと進化する。
【０１８２】
「形成異常」は、組織、臓器又は細胞の任意の異常な成長ないしは発達を意味する。所定の実施態様において、形成異常は高いグレードであるか、前癌性である。
【０１８３】
「耐性腫瘍」又は「ＶＥＧＦ非依存性腫瘍」なる用語は、少なくともＶＥＧＦアンタゴニストを含む癌治療に対して癌治療の間を通して十分に反応しない、又は反応がない、ないしは反応の減少を示す癌、癌細胞又は腫瘍を指す。ある実施態様では、耐性腫瘍は、抗ＶＥＧＦ抗体療法に抵抗性がある腫瘍である。所定の実施態様において、耐性腫瘍は抗ＶＥＧＦ抗体に抵抗する腫瘍である。一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブである。所定の実施態様において、耐性腫瘍は、少なくともＶＥＧＦアンタゴニストを含む癌治療法に反応しそうにない腫瘍である。所定の実施態様において、耐性腫瘍は少なくともＶＥＧＦアンタゴニストを含む癌の治療に対して、本質的に非応答又は耐性のある腫瘍である。所定の実施態様において、耐性腫瘍は、少なくともVEGFアンタゴニストを含む癌治療に対する最初の強い応答の後、進行癌の治療にもかかわらず、腫瘍の増殖を再開始する腫瘍である。
【０１８４】
「不応性(難治性)」とは、治療に対する疾患又は症状の抵抗性又は非応答性を指す(例えば、腫瘍性プラズマ細胞の数が治療が施された場合でも増加する)。所定の実施態様において、「不応性」なる用語は、限定しないが、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗血管新生薬及び化学療法治療を含む前処置の何れかに対する抵抗性又は非応答性を指す。所定の実施態様において、「不応性」なる用語は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗血管新生薬及び／又は化学療法治療を含む前処置の何れかに対する疾患又は症状の本質的非応答性を言う。所定の実施態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体である。
【０１８５】
「再発性」なる用語は、以前の罹患状態への患者の病気の逆戻り、特に明らかな回復又は部分的な回復後の症状の復活を指す。所定の実施態様において、再発状態は、限定しないが、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗血管新生薬及び化学療法治療を含む前処置以前に病気への逆戻り又は逆戻りの過程を指す。所定の実施態様において、再発状態は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗血管新生薬及び／又は化学療法治療を含む癌治療に対する最初の強い応答の後に病気への逆戻り又は逆戻りの過程を指す。所定の実施態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体である。
【０１８６】
「抗癌療法」又は「癌治療」なる用語は、癌を治療する際に有用な療法を指す。抗癌治療薬の例には、限定するものではないが、例えば、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害剤、放射線療法に用いる薬剤、抗血管形成剤、アポトーシス剤、抗チューブリン薬剤、および癌を治療するための他の薬剤、例として、抗ＨＥＲ-２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)アンタゴニスト(例えばチロシンキナーゼインヒビター)、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲインヒビター(例えばエルロチニブ(ＴａｒｃｅｖａＴＭ)、血小板由来増殖因子インヒビター(例えばＧｌｅｅｖｅｃＴＭ(メシル酸イマチニブ))、ＣＯＸ-２インヒビター(例えばセレコキシブ)、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ又はＶＥＧＦレセプター(一又は複数)、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２の一又は複数に結合するアンタゴニスト(例えば中和抗体)、および他の生理活性かつ有機化学的薬剤などが含まれる。また、その組合せが本発明に包含される。
【０１８７】
「抗新生物性組成物」なる用語は、少なくとも一の活性な治療剤、例えば「抗癌剤」を含む癌の治療に有用な組成物を指す。治療剤(抗癌剤)の例には、限定するものではないが、例えば化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害性剤、放射線療法において使用する薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、毒素、及び癌を治療するための他の薬剤、例えば抗ＶＥＧＦ中和抗体、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＨＥＲ-２、抗ＣＤ２０、上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)アンタゴニスト(例えば、チロシンキナーゼインヒビター)、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲインヒビター、エルロチニブ、ＣＯＸ-２インヒビター(例えば、セレコキシブ)、インターフェロン、サイトカイン、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又はＶＥＧＦレセプターの一又は複数に結合するアンタゴニスト(例えば、中和抗体)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)及び／又は幹細胞因子(ＳＣＦ)に対するレセプターチロシンキナーゼのインヒビター(例えば、メシル酸イマチニブ(Ｇｌｅｅｖｅｃ(登録商標) Novartis))、ＴＲＡＩＬ/Ａｐｏ２、及び他のバイオ活性がある有機化学的薬剤などが含まれる。それらの組合せも本発明に包含される。
【０１８８】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学治療薬、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素を含むように意図されている。
【０１８９】
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロ及び／又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期で細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール(登録商標)、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【０１９０】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標)；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、CPT-11(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９−アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣＩリポソーム注射剤(DOXIL(登録商標))及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)、ペメトレキセド（pemetrexed (ALIMTA（登録商標））、ゲムシタビン(gemcitabine) (GEMZAR(登録商標)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(gemcitabine) (GEMZAR(登録商標))、テガフル(tegafur) (UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(capecitabine) (XELODA(登録商標))、エポチロン(epothilone)、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド類、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、パクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(ABRAXANE（登録商標))、及びドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビ��クリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び５-ＦＵ及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン(ELOXATINTM)を組み合わせた治療法の略称であるFOLFOXが含まれる。
【０１９１】
またこの定義に含まれるものには、癌の増殖を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(ＳＥＲＭ)を含み、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)(EVISTA(登録商標))、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(FARESTON(登録商標))；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤(ERD)；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)アゴニスト、例えば酢酸リュープロリド(LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標))、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール(MEGASE(登録商標))、エキセメスタン(AROMASIN(登録商標))、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ボロゾール(RIVISOR(登録商標))、レトロゾール(FEMARA(登録商標))、及びアナストロゾール(ＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標))である。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート(例えばBONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、エチドロン酸(DIDROCAL(登録商標))、NE-58095、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロネート(FOSAMAX(登録商標))、パミドロン酸(AREDIA(登録商標))、チルドロン酸(SKELID(登録商標))、又はリセドロン酸(ACTONEL(登録商標))、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)；THERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤(例えばLURTOTECAN(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばABARELIX(登録商標))；ラパチニブ(lapatinib ditosylate)(GW572016としても知られるＥｒｂＢ-２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤)；セレコシブ(celecoxib)などのＣＯＸ-２阻害剤(CELEBREX(登録商標)；４-(５-(４-メチルフェニル)-３-(トリフルオロメチル)-１Ｈ-ピラゾル-１-イル)ベンゼンスルホンアミド；及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【０１９２】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)のような糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(例えばＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＶＥＧＦ-Ｅ)；胎盤由来の増殖因子(ＰｌＧＦ)；血小板由来成長因子(ＰＤＧＦ、例えばＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ)；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子、例えばＮＧＦ-α；血小板増殖因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、−γ；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばマクロファージ-ＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)；及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-１β、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、ＩＬ-１３、ＩＬ-１４、ＩＬ-１５、ＩＬ-１６、ＩＬ-１７、ＩＬ-１８、ＩＬ-１９、ＩＬ-２０、ＩＬ-３０のインターロイキン(ＩＬ)；セクレトグロビン／ウテログロビン；オンコスタチンＭ(ＯＳＭ)；ＴＮＦ-α又はＴＮＦ-βなどの腫瘍壊死因子；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合は、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【０１９３】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
【０１９４】
「血管新生因子又は薬剤」は、血管の発達を刺激する、例えば、血管新生、血管内皮細胞増殖、血管及び／又は脈管形成の安定性などを促進する増殖因子である。例えば、血管新生因子には、限定するものではないが、例えば、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦファミリのメンバー、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリ、線維芽細胞増殖因子ファミリ(ＦＧＦ)、ＴＩＥリガンド(アンギオポイエチン)、エフリン、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４などが含まれる。また、創傷治癒を促す因子、例として、成長ホルモン、インスリン様成長因子-Ｉ(ＩＧＦ-Ｉ)、ＶＩＧＦ、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、ＣＴＧＦ、及びそのファミリのメンバー、及びＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βが含まれる。例としてKlagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini等, Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、血管新生因子を列挙する表１)；及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)を参照。
【０１９５】
「抗血管新生剤」又は「血管新生インヒビター」は、小分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はこれらのコンジュゲートないし融合タンパク質を指し、直接又は間接的に、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害するものである。例えば、抗血管新生剤は、上記に定義するように、血管新生剤に対する抗体又は他のアンタゴニスト、例えばＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターシグナル伝達を遮断する小分子(例えばＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、ＳＵＴＥＮＴ／ＳＵ１１２４８(リンゴ酸スニチニブ)、ＡＭＧ７０６、ソラフェニブ(NEXAVAR(登録商標))、アキシチニブ及びパゾパニブ)である。また抗血管新生剤には、天然の血管新生インヒビター、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。例としてKlagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)(例えば、悪性メラノーマの抗血管新生療法を列挙する表３)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini等, Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、抗血管新生因子を列挙する表２)；及び、Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)(例えば、臨床試験で用いられる抗血管新生剤を挙げる表１)を参照。
【０１９６】
本明細書中で用いる「免疫抑制剤」なる用語は、本明細書において治療される哺乳動物の免疫系を抑制するか又は隠すために作用する物質を指す。これには、サイトカイン産生を抑制する物質、自己抗原発現を下方制御は又は抑制する物質、又は、ＭＨＣ抗原をマスキングする物質が含まれる。このような薬剤の例には、２-アミノ-６-アリル-５-置換ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号を参照)；非ステロイド性抗炎症薬(ＮＳＡＩＤ)；ガンシクロビル、タクロリムス、糖質コルチコイド、例として、コルチゾール又はアルドステロン、抗炎症剤、例として、シクロオキシゲナーゼインヒビター、５-リポキシゲナーゼインヒビター又はロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；プリンアンタゴニスト、例として、アザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル(ＭＭＦ)；アルキル化剤、例として、シクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタールアルデヒド(ＭＨＣ抗原をマスキングするもの、米国特許第４１２０６４９号に記載)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；ステロイド、例として、副腎皮質ステロイド又は糖質副腎皮質ステロイド又は糖質コルチコイド類似体、例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾロン及びデキサメサゾン；ジヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター、例えばメトトレキセート(経口又は皮下)；ヒドロキシクロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカインないしはサイトカインレセプター抗体、例えば抗インターフェロン-α、-β又は-γ抗体、抗腫瘍壊死因子-α抗体(インフリキシマブ又はアダリムマブ)、抗ＴＮＦ-αイムノアドヘシン(エタネルセプト)、抗腫瘍壊死因子-β抗体、抗インターロイキン２抗体及び抗ＩＬ-２レセプター抗体；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性の抗リンパ球グロブリン；パン-Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(１９９０年７月２６日に発行の国際公開第１９９０／０８１８７号)；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ；宿主のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター(Cohen等、米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプター断片(Offner等, Science, 251: 430-432 (1991)；国際公開第１９９０／１１２９４号；Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開第１９９１／０１１３３号)；及び、Ｔ細胞レセプター抗体(欧州特許第３４０１０９号)、例えばＴ１０Ｂ９が含まれる。
【０１９７】
「非ステロイド系抗炎症薬」又は「ＮＳＡＩＤ」の例は、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、これらの塩類及び誘導体などが含まれる。
【０１９８】
疾患の「病理状態」には、患者の健康を損なうあらゆる現象が含まれる。癌の場合には、これに限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化等々が含まれる。
【０１９９】
一又は複数の更なる治療薬「と組み合わせて(と併用して)」の投与は、同時（一時）及び任意の順序での連続投与を含む。
【０２００】
「同時に」なる用語は、投与の時間の少なくとも一部がオーバーラップしている、２つ以上の治療薬の投与を指すために本明細書中で用いられる。従って、同時投与には、一又は複数の薬剤の投与が一又は複数の他の薬剤の投与をやめた後に続く場合の投薬計画が包含される。
【０２０１】
「慢性」投与とは、初期の治療効果(活性)を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を指す。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処置である。
【０２０２】
ここで用いられる「担体」には、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤が含まれ、用いられる用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例には、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭが含まれる。
【０２０３】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小胞体であり、哺乳動物への薬物（Ｂｖ８ポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質構造に類似する二層形成体として配される。
【０２０４】
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つものと定義される。
【０２０５】
「アミノ酸変更」は、既定のアミノ酸配列のアミノ酸配列内の変化を指す。例示的な変更には、挿入、置換及び欠失が含まれる。「アミノ酸置換」とは、既定のアミノ酸配列内の既存のアミノ酸残基の他の異なるアミノ酸残基への置換を指す。
【０２０６】
「置換」アミノ酸残基は、アミノ酸配列内の他のアミノ酸残基を置き換える、又は置換するアミノ酸残基を指す。置換残基は天然に生じるアミノ酸残基でも天然に生じないアミノ酸残基であってもよい。
【０２０７】
「アミノ酸挿入」とは、既定のアミノ酸配列の中に一又は複数のアミノ酸を取り込ませることを指す。アミノ酸挿入は、ペプチド結合によって結合された２以上のアミノ酸残基を含むペプチドが既定のアミノ酸配列内に導入される場合に「ペプチド挿入」を含みうる。アミノ酸挿入がペプチドの挿入を伴う場合、挿入されたペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を有するようにランダム突然変異誘発によって生成されてもよい。「高頻度可変領域に隣接する」アミノ酸変更とは、高頻度可変領域のＮ末端及び／又はＣ末端での一又は複数のアミノ酸残基の導入ないしは置換を指し、この挿入ないしは置換アミノ酸残基(一又は複数)の少なくとも一により、対象の高頻度可変領域のＮ末端又はＣ末端のアミノ酸残基とペプチド結合が形成される。
【０２０８】
「天然に生じるアミノ酸残基」は遺伝コードによってコードされるものであり、一般に、アラニン(Ａｌａ)；アルギニン(Ａｒｇ)；アスパラギン(Ａｓｎ)；アスパラギン酸(Ａｓｐ)；システイン(Ｃｙｓ)；グルタミン(Ｇｌｎ)；グルタミン酸(Ｇｌｕ)；グリシン(Ｇｌｙ)；ヒスチジン(Ｈｉｓ)；イソロイシン(Ｉｌｅ)：ロイシン(Ｌｅｕ)；リジン(Ｌｙｓ)；メチオニン(Ｍｅｔ)；フェニルアラニン(Ｐｈｅ)；プロリン(Ｐｒｏ)；セリン(Ｓｅｒ)；スレオニン(Ｔｈｒ)；トリプトファン(Ｔｒｐ)；チロシン(Ｔｙｒ)；及び、バリン(Ｖａｌ)からなる群から選択されうる。
【０２０９】
「非天然に生じる(天然に生じない)アミノ酸残基」は、上記に挙げる天然に生じるアミノ酸残基以外の、ポリペプチド鎖内の隣接したアミノ酸残基(一又は複数)を共有結合することができるアミノ酸残基を指す。非天然に生じるアミノ酸残基の例には、例えば、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及び、例えば、Ellman等 Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)に記載のものなどの他のアミノ酸残基アナログが含まれる。非天然のアミノ酸残基を産生するためには、Noren 等 Science 244:182 (1989)および上掲のEllman 等の方法を利用することができる。要するに、これらの方法はインビトロにおけるＲＮＡの転写及び翻訳に先立って非天然に生じるアミノ酸残基にてサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化することを伴う。
【０２１０】
本明細書中で用いる、「高い親和性」を有する抗体とは、ナノモル(ｎＭ)の範囲かそれより良好なＫＤ又は解離定数を有する抗体である。「ナノモル範囲かそれより良好な」ＫＤは、ＸｎＭで表してもよく、このＸはおよそ１０未満の数である。
【０２１１】
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総和の強さを意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、会合定数（Ｋａ）の逆数である解離定数(Ｋｄ)として表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般的に抗原にゆっくり結合し及び／又は容易に解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は一般的に抗原に素早く結合し及び／又は長く結合したままとなる傾向がある。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に具体的な例示的実施態様を記載する。
【０２１２】
所定の実施態様において、本発明の「ＫＤ」、「Ｋｄ」、「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)-２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)-３０００（ビアコア、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）を用いた表面プラズモン共鳴アッセイを用い、固定化抗原ＣＭ５チップにより、〜１０反応単位（ＲＵ）にて２５℃で測定される。簡単に言うと、供給者の指示に従い、デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ビアコア）が、Ｎ-エチル-Ｎ’-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)により活性化される。抗原は、結合タンパク質の約１０反応単位（ＲＵ）を達成するため、５μｌ／分の流量で注入する前に、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）へ希釈る。抗原の注射後、１Ｍエタノールアミンが未反応基をブロックするために注入される。反応速度の測定のため、全長抗体等のポリペプチドの希釈系列が、２５℃にて約２５μＬ／ｍｉｎの流量で０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０ＴＭ界面活性剤（ＰＢＳＴ）のＰＢＳ中に注入される。会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）は単純な一対一のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、同時に会合及び解離のセンサーグラムを当てはめることによって計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率として計算される。Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照。もしオン率（on-rate）が上記の表面プラズモン共鳴アッセイによって１０６Ｍ-1 ｓ-1 を越える場合には、オン率は、攪拌キュベットを備えたストップフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計で測定される抗原濃度の増大のもと、ｐＨ７．２のＰＢＳの中２５℃にて、２０ｎＭの抗−抗原抗体の蛍光発光強度の増加又は減少を測定する蛍光クエンチング技術を用いて決定することができる。
【０２１３】
「繊維状ファージ」なる用語は、その表面上に異種性のポリペプチドをディスプレイすることが可能なウイルス粒子を指し、ｆ1、ｆｄ、Ｐｆ1およびＭ13が挙げられるが、これらに限定されるものではない。繊維状ファージは、テトラサイクリン(例えば「ｆｄ ｔｅｔ」)などの選択可能なマーカーを含みうる。様々な繊維状ファージディスプレイシステムは当業者に周知である(例えば、Zacher et al. Gene 9: 127-140 (1980)（Smith et al. Science 228: 1315-1317 (1985)；及びParmley and Smith Gene 73: 305-318 (1988)を参照)。
【０２１４】
「パニング」なる用語は、標的に対して高親和性および特異性を有する、抗体などの化合物保持するファージの同定および単離におけるスクリーニング工程の複数のラウンドを指すために用いる。
【０２１５】
「短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)」なる用語は、遺伝子発現を干渉する小さい二本鎖ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡが相同遺伝子を沈黙(サイレンシング)させる工程であるＲＮＡ干渉の中間生成物である。ｓｉＲＮＡは典型的に、二本鎖を形成するおよそ１５−２５長のヌクレオチドの２つの一本鎖ＲＮＡからなり、一本鎖オーバーハングを含みうる。酵素複合体、例えばポリメラーゼによる二本鎖ＲＮＡのプロセシングにより、二本鎖ＲＮＡの切断が生じ、ｓｉＲＮＡが生成される。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖はＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)サイレンシング複合体に用いられ、ｍＲＮＡ切断が導かれ、これによってｍＲＮＡ分解が促される。例えば哺乳動物細胞において特定の遺伝子をｓｉＲＮＡを用いて沈黙させるために、塩基対領域を、無関係なｍＲＮＡに偶然に相補性を持たないように選択する。例えばFire et al., Nature 391:806-811 (1998)およびMcManus et al., Nat. Rev. Genet. 3(10): 737-47 (2002)にあるように、ＲＮＡｉサイレンシング複合体は、当分野において同定されている。
【０２１６】
「干渉ＲＮＡ(ＲＮＡｉ)」なる用語は、特定のｍＲＮＡの触媒的分解をもたらす二本鎖ＲＮＡを指すために本明細書において用い、したがって特定の遺伝子の発現を阻害／低減するために用いられうる。
【０２１７】
本明細書中で用いる「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」なる表現は相互に交換可能に用いられ、かかる標記は子孫を含む。よって、「形質転換体」や「形質転換細胞」のような用語には、初代対象細胞と何世代移行したかを問わずそれから由来した培養物とを含む。全ての子孫が、意図的な突然変異あるいは意図せざる突然変異のため、正確に同一のＤＮＡ内容であるわけではないことも理解される。「子孫」なる用語は、最初に形質転換された細胞又は細胞株に続くすべての世代のいずれか及びすべての子孫を指す。最初に形質転換された細胞に対してスクリーニングされたものと同じ機能あるいは生物的活性を有する突然変異子孫も含まれる。区別しての標記を意図している場合は、文脈から明らかなはずである。
【０２１８】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される同一性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにすることになり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology(Wiley Interscience Publishers, 1995)を参照のこと。
【０２１９】
ここで定義される「高度なストリンジェンシー条件」は、(１)洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；(２)ハイブリダイゼーション中に変性剤を用いる、４２℃で、５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム；又は(３)４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ６．８)、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ(５０μｇ／ｍｌ)、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストラン溶液を用いて、４２℃の０．２×ＳＳＣ(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)中と５５℃の５０％ホルムアミドにて洗浄し、ついで５５℃で、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を行うものによって同定される。
【０２２０】
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて３７℃で終夜インキュベーションし、次いで１×ＳＳＣ中にて約３７−５０℃でフィルターを洗浄することを含む。当業者であれば、プローブ長などの因子に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは理解されるであろう。
【０２２１】
Ｂ．詳細な説明
本発明は、Ｇ−ＣＳＦ及びＢｖ８が、腫瘍の転移につながる細胞及び分子の事象において重要な役割を果たしているという認識に少なくとも部分的に基づく。
【０２２２】
２００７年３月２８日に出願された同時係属出願シリアル番号１１／６９２、６８１は、本明細書に参照により明示的に組み込まれた全開示であり、造血骨髄由来細胞の補充と抗ＶＥＧＦ治療に対する腫瘍の抵抗性の発達との間の相関関係を説明している。２００８年９月１９日に出願された同時係属ＰＣＴ公開番号国際公開第２００９／０３９３３７号は抗ＶＥＧＦ治療に対する腫瘍の抵抗性につながる細胞及び分子の事象におけるＢｖ８の役割について説明している。
【０２２３】
転移は、固形腫瘍による死亡の主要な原因である。転移するためには、腫瘍細胞は分解し、細胞外マトリックスに侵入し、血管内侵入し、血液又はリンパ管を介して運搬され、二次部位で血管外遊出し、最終的に二次腫瘍を樹立する必要がある(Nguyen, D. X. & Massague, J. Nat Rev Genet 8, 341-352 (2007))。更に、多くの証拠が腫瘍はいわゆる「前転移ニッチ」を作成する転移性腫瘍細胞の到達前に遠隔微小環境を修飾することが可能であることを示唆している(Psaila, B. & Lyden, D. Nat Rev Cancer 9, 285-293 (2009))。遠隔組織に影響を与える腫瘍のこの能力は、癌細胞が二次腫瘍の増殖を開始し、「種と土壌」仮説を支持することができる特定の臓器を標的とすることを可能にする(Paget, S. Cancer Metastasis Rev. 8(2),98-101 (1989))。骨髄由来細胞（ＢＭＤＣ）がニッチが集まる主要な細胞型であると考えられている(Kaplan, R. N. et al. Nature 438, 820-827 (2005); Hiratsuka, S. et al. Nat Cell Biol 8, 1369-1375 (2006))。
【０２２４】
いくつかの分子が関与しているが(Kaplan, R. N. et al. Nature 438, 820-827 (2005); Hiratsuka, S. et al. Nat Cell Biol 8, 1369-1375 (2006); Yamamoto, M. et al. Cancer Res 68, 9754-9762 (2008); Kim, S. et al. Nature 457, 102-106 (2009); Erler, J. T. et al. Cancer Cell 15, 35-44 (2009)、腫瘍がニッチをイニシエートするメカニズム及び転移におけるニッチの正確な役割は完全には理解されていない。
【０２２５】
臓器固有の前転移部位のプライミングは、転移の間の重要なステップであるが、前転移ニッチのイニシエーションのメカニズムは完全には理解されていない。本明細書で提供されるデータによれば、転移する能力を有する腫瘍は骨髄からＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞を動員し、腫瘍細胞の到達前に遠隔臓器でその後続のホーミングを促進する分泌顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を分泌することを示している。Ｇ−ＣＳＦ発現は調べた腫瘍の転移能と相関していた。更に本明細書に提示されたデータは、Ｇ−ＣＳＦに動員されたＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は局所的に血管新生Ｂｖ８蛋白質を生産することを示している。抗Ｇ−ＣＳＦ又は抗Ｂｖ８抗体による処置が有意に肺転移を減少させる。データはまた、Ｂｖ８の新規な役割、腫瘍細胞の遊走を刺激する能力、２つのＢｖ８受容体（ＰＫＲ−１／ＧＰＲ７３）のいずれかの発現に関連した効果を同定した。最後に、本明細書で提供されるデータは、組換えＧ−ＣＳＦはニッチをイニシエートし、臓器特異的転移部位においてＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数を増加させるのに十分であることを示している。このことはいくつかの腫瘍の転移能の強化をもたらした。従って、本明細書で提供されたデータはＧ−ＣＳＦが転移の鍵となる調節因子であることを示唆している。
【０２２６】
Ｃ．腫瘍血管形成及び腫瘍転移のインヒビターとして作用する抗Ｇ−ＣＳＦ抗体、抗Ｂｖ８抗体及び抗ＰＫＲ１抗体の作製
本発明の結合および活性のアッセイによって同定される抗体は、組換えＤＮＡ技術の技術を含む公知の方法によって製造されうる。
【０２２７】
ｉ）抗原調製
場合によって他の分子にコンジュゲートした可溶性抗原ないしはその断片は、抗体を生成するための免疫原として用いられうる。レセプターなどの膜貫通分子のために、その断片(例えばレセプターの細胞外ドメイン)が免疫原として用いられうる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫源として用いてもよい。このような細胞は、天然の供与源(例えば癌細胞株)から得られてもよいし、膜貫通分子を発現するように組換え体技術によって形質転換されている細胞であってもよい。抗体を調製するために有用な他の抗原及びその形態は当分野の技術者に明らかであろう。
【０２２８】
ｉｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関連する抗原とアジュバントを複数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生されることが好ましい。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲへ、関連する抗原をコンジュゲートさせるために有用である。
【０２２９】
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物を、同じ抗原であるが異なるタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なる架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートにより追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【０２３０】
ｉｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
【０２３１】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【０２３２】
好適な骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０２３３】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくはハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【０２３４】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性な抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、インビボで増殖させることができる。
【０２３５】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーのような常套的なイムノグロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。
【０２３６】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好適な供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外ではイムノグロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体の組み換え産生を以下に詳細に記載する。
【０２３７】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。
【０２３８】
Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【０２３９】
また、ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(ＣＨ及びＣＬ)のコード配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾することができる。
【０２４０】
典型的には、前記の非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０２４１】
ｉｖ）ヒト及びヒト化抗体
ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０２４２】
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【０２４３】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好適な方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０２４４】
あるいは、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosal等 Nature 355:258 (1992)を参照されたい。また、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリからも得られる(Hoogenboom等, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等 Nature Biotech 14:309 (1996))。抗体ファージディスプレイライブラリからのヒト抗体の生成は以下に更に記載する。
【０２４５】
ｖ）抗体断片
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。以下の実施例に記載のような他の実施態様では、Ｆ(ａｂ')２は、Ｆ(ａｂ')２分子のアセンブリを促すように、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号を参照のこと。
【０２４６】
ｖｉ）多重特異性抗体
多重特異性抗体は、通常異なる抗原に由来する少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する。このような分子は通常２つの異なるエピトープを結合するだけであるが(すなわち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ)、本明細書中で用いられる場合には三重特異性抗体などの更なる特異性を有する抗体がこの表現に包含される。ＢｓＡｂの例には、Ｂｖ８に対する一アームと、ＶＥＧＦ又はＥＧ−ＶＥＧＦに対する他のアームとを有するものが含まれる。
【０２４７】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が抗体の最適な収率をもたらす態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな(フレキシビリティ)が与えられる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０２４８】
この手法の所定の実施態様において、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０２４９】
国際公開第９６／２７０１１号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体の定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０２５０】
二重特異性抗体には、交差結合又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの一抗体はアビジンにカップリングし、他方の抗体はビオチンにカップリングしていてもよい。例えば、このような抗体は、望ましくない細胞へ免疫系細胞を標的化するため(米国特許第４６７６９８０号)、そしてＨＩＶ感染の治療のため(国際公開９１／００３６０、国際公開９２／２００３７３)に提唱されている。ヘテロコンジュゲート抗体は従来のいずれかの交差結合法を用いて作製されてもよい。好適な交差結合剤は当分野で周知であり、多くの交差結合技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【０２５１】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０２５２】
Ｆａｂ'-ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収することもできるし、化学的に結合して二重特異性抗体を形成させることもできる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。
【０２５３】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０２５４】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【０２５５】
ｖｉｉ）エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、抗体の有効性を向上させることは望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性(ＡＤＣＣ)を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes,B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０２５６】
ｖｉｉｉ）抗体−サルベージレセプター結合エピトープ融合
本発明のある実施態様では、例えば腫瘍浸透性を増大させるためにインタクト抗体よりも抗体断片を使用することが望ましい。この場合、その血清半減期を増大させるために抗体断片を改変することが望ましい。これは、例えば、抗体断片にサルベージレセプター結合エピトープを組み込むことにより(例えば、抗体断片中の適当な領域の突然変異により、あるいはついで抗体断片の何れかの末端又は中央に、例えばＤＮＡ又はペプチド合成により融合されるペプチドタグ内にエピトープを組み込むことにより)、達成しうる。
【０２５７】
サルベージレセプター結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の一又は複数の任意のアミノ酸残基が抗体断片の類似位置に転移している領域を構成する。更により好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の３以上の残基が転移する。またより好ましくは、エピトープはＦｃ領域の(例えばＩｇＧの)ＣＨ２ドメインから得られ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、又はＶＨ領域、又はそのような領域の一より多くに転移する。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから得られ、抗体断片のＣＬ領域又はＶＬ領域、又はその両方に転移する。
【０２５８】
ｉｘ）抗体の他の共有的修飾
抗体の共有的修飾は本発明の範囲内にある。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又は化学的切断によりなされうる。抗体の共有的修飾の他のタイプは、選択される側鎖又はＮないしＣ末端の残基と反応できる有機誘導体化剤と抗体の標的とするアミノ酸領域を反応させることにより分子中に導入される。共有的修飾は米国特許第５５３４６１５号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される。抗体の共有結合的修飾の好適なタイプは、ポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
【０２５９】
また、本発明は、化学療法薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞障害性剤、あるいは放射性同位体(即ち、放射性コンジュゲート)とコンジュゲートしている本明細書中に記載の抗体を含むイムノコンジュゲートに関する。例には、限定するものではないがＢｉ２１２、Ｉ１３１、Ｉｎ１３１、Ｙ９０、及びＲｅ１８６が含まれる。
【０２６０】
このようなイムノコンジュゲートの生成に有用な化学療法薬は上記した。例えば、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)など(本明細書中の「化学療法薬」の定義も参照のこと)が本発明の抗体ないしその断片にコンジュゲートされうる。
【０２６１】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体ないしその断片を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、限定するものではないがＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、Ｉｎ１１１及びＬｕの放射性同位体などが含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、ＭＲＩとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
【０２６２】
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等 Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57(1978))は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、例として「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０２６３】
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
【０２６４】
抗体と細胞障害性剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害性剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
【０２６５】
別法として、抗ＶＥＧＦ及び／又は本発明の抗体の抗たんぱく質と細胞障害性剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
【０２６６】
ある実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害性剤(例えばラジオヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。ある実施態様では、イムノコンジュゲートは抗体と核酸溶解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼ)との間で形成される。
【０２６７】
本発明は、一又は複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートしている本発明の抗体を提供する。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されている。
【０２６８】
本発明の抗体は、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子にコンジュゲートすることができる。１分子の毒素／抗体は、ネイキッド抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。一実施態様では、メイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
【０２６９】
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０２７０】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。典型的なカップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するためのＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
【０２７１】
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０２７２】
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子とコンジュゲートした本発明の抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０２７３】
（ｘ）合成抗体ファージライブラリからの抗体の産生
所定の実施態様において、本発明は特有のファージディスプレイアプローチ法を使用して新規な抗体を産生し選択する方法を提供する。該アプローチ法は、単一フレームワーク鋳型に基づく合成抗体ファージライブラリの産生、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化した可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、抗原を標的とする高親和性を持つ候補抗体の選択、及び選択された抗体の単離を含む。
【０２７４】
ファージディスプレイ法の詳細は例えば２００３年１２月１１日公開の国際公開第０３／１０２１５７号に見出すことができ、この開示内容の全体は出典明記によって特別に本明細書中に援用される。
【０２７５】
一態様では、本発明において使用される抗体ライブラリは抗体可変ドメインの少なくとも一のＣＤＲにおいて溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置を変異させることによってつくることができる。ＣＤＲの幾らか又は全てをここに提供した方法を使用して変異させることができる。ある実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成することにより、多様な抗体ライブラリをつくることが好ましい。
【０２７６】
例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置に変異を有する抗体可変ドメインのライブラリをつくることができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３に変異を有する他のライブラリをつくることができる。これらのライブラリは所望の親和性の結合体をつくるために互いに関連させて使用することもできる。例えば、標的抗原への結合についての重鎖ライブラリの一又は複数回の選択後に、軽鎖ライブラリを結合体の親和性を増加させるために更なる選択回数に対して重鎖結合体の集団中に置き換えることができる。
【０２７７】
好ましくは、ライブラリは重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域における変異アミノ酸での元のアミノ酸の置換によりつくられる。得られたライブラリは複数の抗体配列を含み得、ここで配列多様性は主として重鎖配列のＣＤＲＨ３領域にある。
【０２７８】
一態様では、ライブラリはヒト化抗体４Ｄ５配列、又はヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列の態様でつくり出す。好ましくは、ライブラリはＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸で重鎖の少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられ、ここでＤＶＫコドンセットはこれらの位置の各一に対して変異アミノ酸セットをコードするために使用される。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの一例は配列(ＤＶＫ)７を含む。ある実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)６(ＮＮＫ)を含む。他の実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)５(ＮＮＫ)を含む。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの他の例は配列(ＮＮＫ)６を含む。好適なオリゴヌクレオチド配列の他の例はここに記載された基準に従って当業者によって決定することができる。
【０２７９】
他の実施態様では、異なったＣＤＲＨ３設計を使用して高親和性結合体を単離し様々なエピトープに対して結合体を単離する。このライブラリにおいて産生されたＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１から１３アミノ酸であるが、これとは異なった長さも産生することができる。Ｈ３多様性はＮＮＫ、ＤＶＫ及びＮＶＫコドンセットを使用し、並びにＮ及び／又はＣ末端での多様性をより制限して、拡張することができる。
【０２８０】
多様性をＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２においてまた生じさせることができる。ＣＤＲ-Ｈ１及びＨ２多様性の設計は、過去の設計よりも天然の多様性により密に適合する多様性に焦点を当てる変更をした上で、上述の天然抗体レパートリーを模倣するターゲティング方策に従う。
【０２８１】
ＣＤＲＨ３での多様性に対しては、複数のライブラリを、異なった長さのＨ３と別個に構築し、ついで、標的抗原に対する結合体を選択するために組み合わせる。複数のライブラリをプールし、過去に記載され以下に記載されたような固体支持体選別及び溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方策を用いることができる。例えば、一つの変異は固体に結合した標的での選別を含み、融合ポリペプチド上に存在しうるタグ(例えば抗ｇＤタグ)の選別が続く。別法として、ライブラリは固体表面に結合した標的で先ず選別することができ、溶出した結合体がついで標的抗原の濃度を減少させた溶液相結合を使用して選別される。異なった選別法を併用することにより高度に発現した配列のみの選択の最小化がもたらされ、多くの異なった高親和性クローンの選択をもたらす。
【０２８２】
標的抗原に対する高親和性結合体はライブラリから単離することができる。Ｈ１／Ｈ２領域における多様性の制限は約１０４から１０５倍縮重を減少させ、より多くのＨ３多様性を許容することによりより多くの高親和性結合体をもたらす。ＣＤＲＨ３において異なったタイプの多様性を持つライブラリを利用することにより(例えばＤＶＫ又はＮＶＴを利用して)標的抗原の異なったエピトープに結合しうる結合体の単離をもたらす。
【０２８３】
上述のプールされたライブラリから単離された結合体において、軽鎖において制限された多様性を提供することによって親和性を更に改善することができることが発見された。軽鎖多様性はこの実施態様では以下のように生成される。ＣＤＲＬ１においては：アミノ酸位置２８がＲＤＴによってコードされる；アミノ酸位置２９がＲＫＴによってコードされる；アミノ酸位置３０がＲＶＷによってコードされる；アミノ酸位置３１がＡＮＷによってコードされる；アミノ酸位置３２がＴＨＴによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置３３がＣＴＧによってコードされる；ＣＤＲＬ２においては：アミノ酸位置５０がＫＢＧによってコードされる；アミノ酸位置５３がＡＶＣによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置５５がＧＭＡによってコードされる；ＣＤＲＬ３においては：アミノ酸位置９１がＴＭＴ又はＳＲＴ又はその両方によってコードされる；アミノ酸位置９２がＤＭＣによってコードされる；アミノ酸位置９３がＲＶＴによってコードされる；アミノ酸位置９４がＮＨＴによってコードされる；アミノ酸位置９６がＴＷＴ又はＹＫＧ又は両方によってコードされる。
【０２８４】
他の実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域に多様性を持つライブラリ又はライブラリ群が作製される。この実施態様では、ＣＤＲＨ３における多様性は様々な長さのＨ３領域を用い、主にコドンセットＸＹＺ及びＮＮＫ又はＮＮＳを用いてつくり出される。ライブラリは個々のオリゴヌクレオチドを使用して形成しプールすることができ、又はオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリのサブセットを形成することができる。この実施態様のライブラリは固体に結合した標的に対して選別することができる。多重選別から単離されたクローンをＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異性及び親和性についてスクリーニングすることができる。特異性については、クローンを所望の標的抗原並びに他の非標的抗原に対してスクリーニングすることができる。標的ＮＲＰ１抗原に対する結合体をついで溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイ又はスポット競合アッセイでの親和性についてスクリーニングすることができる。高親和性結合体は上に記載したようにして調製されたＸＹＺコドンセットを使用してライブラリから単離することができる。これらの結合体は抗体又は抗原結合断片として細胞培養物中に高収量で直ぐに産生されうる。
【０２８５】
ある実施態様では、ＣＤＲＨ３領域の長さに大なる多様性を持つライブラリを作成することが望まれる場合がある。例えば、約７から１９アミノ酸の範囲のＣＤＲＨ３領域を持つライブラリを作成することが望ましい場合がある。
【０２８６】
これらの実施態様のライブラリから単離された高親和性結合体は細菌及び真核生物細胞培養で高収量で直ぐに産生される。ベクターはｇＤタグ、ウイルスコートタンパク質成分配列のような配列を直ぐに除去し、及び／又は定常領域配列に加えて完全長抗体又は抗原結合断片を高収量で生産するように設計することができる。
【０２８７】
ＣＤＲＨ３での変異を持つライブラリを、例えばＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２のような他のＣＤＲの変異型を含むライブラリと組み合わせることができる。よって、例えば、一実施態様では、ＣＤＲＨ３ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置２８、２９、３０、３１、及び／又は３２に変異アミノ酸を持つヒト化４Ｄ５抗体配列の形態において作りだしたＣＤＲＬ３ライブラリと組み合わせられる。他の実施態様では、ＣＤＲＨ３に対する変異のライブラリは変異ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリと組み合わせることができる。一実施態様では、ＣＤＲＨ１ライブラリは位置２８、３０、３１、３２及び３３に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５配列を用いてつくり出される。ＣＤＲＨ２ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いてつくり出すことができる。
【０２８８】
（ｘｉ）抗体変異体
ファージライブラリから生成される新規の抗体は、さらに修飾して、親抗体よりも改善した物理学的、化学的及び／又は生物学的特性を有する抗体変異体を生成することができる。使用するアッセイが生物学的活性アッセイである場合、抗体変異体は、選択したアッセイにおいて、該アッセイにおける親抗体の生物学的活性よりも少なくともおよそ１０倍良好な、好ましくは少なくともおよそ２０倍良好な、より好ましくは少なくともおよそ５０倍良好な、時には少なくともおよそ１００倍又は２００倍良好な生物学的活性を有する。所定の実施態様において、抗Ｂｖ８抗体変異体又は抗Ｇ−ＣＳＦ変異体は、親抗体の結合親和性より、少なくともおよそ１０倍強力な、好ましくは少なくともおよそ２０倍強力な、より好ましくは少なくともおよそ５０倍強力な、時には少なくともおよそ１００倍又は２００倍強力な、Ｂｖ８又はＧ−ＣＳＦそれぞれに対する結合親和性を有することが好ましい。
【０２８９】
抗体変異体を産生するためには、親抗体の高頻度可変領域の一又は複数中に一又は複数のアミノ酸修飾(例えば置換)が導入される。別法として、又は加えて、フレームワーク領域残基の一又は複数の修飾(例えば置換)を親抗体に導入することができ、これらにより第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗体変異体の結合親和性が改善される。修飾するためのフレームワーク領域残基の例には、抗原に非共有的に結合するもの(Amit等, Science 233:747-753 (1986))；ＣＤＲと相互作用し／そのコンホメーションに影響を及ぼすもの(Chothia等 J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；及び／又はＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの(欧州特許第２３９４００号Ｂ１)が含まれる。ある実施態様では、そのようなフレームワーク領域残基の一又は複数の修飾により第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗原の結合親和性が向上する。例えば、約１から約５のフレームワーク残基を本発明のこの実施態様において修飾することができる。しばしば、これは、高頻度可変領域が何ら改変されていない場合でさえ、前臨床試験に使用するのに適した抗体変異体を生じるのに十分でありうる。しかしながら、通常は、抗体は更なる高頻度可変領域の改変を含む。
【０２９０】
改変される高頻度可変領域残基は、特に親抗体の出発結合親和性が、無作為に生産された抗体変異体を直ぐにスクリーニングすることができるものである場合には、無作為に変化させることができる。
【０２９１】
そのような抗体変異体を産生するための一つの有用な方法は、「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」(Cunningham及びWells Science 244:1081-1085 (1989))と呼ばれる。ここで、高頻度可変領域残基の一又は複数が、第二の哺乳動物種由来の抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼすためにアラニン又はポリアラニンによって置換される。ついで置換に対する機能的感受性を示す高頻度可変領域残基は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の置換を導入することにより洗練される。従って、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異の種類自体は予め決める必要はない。このようにして産生されるａｌａ変異体をここに記載したその生物活性についてスクリーニングされる。
【０２９２】
通常は、「好ましい置換」の項目名で以下に示されているもののような保存的置換で始める。そのような置換が生物活性(例えば結合親和性)の変化を生じるならば、次の表において「例示的置換」と命名され、又はアミノ酸クラスを参照して以下に更に記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされる。
【０２９３】
好適な置換：
2013500993.tif 000004
【０２９４】
抗体の生物学的性質の更により実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋コンホメーション、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持して、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile；
(２)中性の親水性：cys, ser, thr；
(３)酸性：asp, glu；
(４)塩基性：his, lys, arg；
(５)鎖配向に影響する残基：gly, pro；及び
(６)芳香族：trp, tyr, phe。
【０２９５】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とする。
【０２９６】
他の実施態様では、修飾のために選択された部位がファージディスプレイを使用して亜親和性成熟される(上を参照)。
【０２９７】
アミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、親抗体の先に調製された変異体又は非変異体型のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発を含む。変異体を作製するための好ましい方法は部位特異的突然変異誘発(例えばKunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)を参照)である。
【０２９８】
ある実施態様では、抗体変異体は単一の高頻度可変領域残基が置換されたものである。他の実施態様では、親抗体の高頻度可変領域残基の２又はそれ以上が置換され、例えば約２から約１０の高頻度可変領域置換である。
【０２９９】
通常、改善された生物学的性質を有する抗体変異体は親抗体の重鎖又は軽鎖の何れかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に対する同一性又は類似性は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入し最大の配列同一性パーセントを達成した後に親抗体残基と同一(つまり同じ残基)又は類似(つまり共通の側鎖特性に基づく同じグループのアミノ酸残基、上を参照)である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。可変ドメインの外側の抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸展、欠失、又は挿入は何れも配列同一性又は類似性に影響を及ぼすものとはみなされない。
【０３００】
抗体変異体の産生後に、親抗体に対するその分子の生物活性が決定される。上に述べたように、これは抗体の結合親和性及び／又は他の生物活性を決定することを含みうる。本発明の好適な実施態様では、抗体変異体のパネルを調製し、抗原ないしその断片に対する結合親和性についてスクリーニングする。この最初のスクリーニングから選択される抗体変異体の一又は複数は場合によっては一又は複数の更なる生物活性アッセイにかけて、結合親和性が向上した抗体変異体が例えば前臨床研究に確かに有用であることが確認される。
【０３０１】
このように選択された抗体変異体は、しばしば抗体の意図される用途に応じて更なる修飾を受けることができる。そのような修飾は以下に詳細を記載したもののようなアミノ酸配列の更なる改変、異種ポリペプチドに対する融合及び／又は共有的修飾を含む。アミノ酸配列改変については例示的な修飾を上に詳細に説明した。例えば、抗体変異体の正しいコンホメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基はまた一般にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防止することができる。逆に、システイン結合を抗体に加えてその安定性をかいぜんすることができる(特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合)。他のタイプのアミノ酸変異体は改変されたグリコシル化パターンを有する。これは抗体に見出される一又は複数の糖鎖部分を欠失させ、及び／又は抗体中に存在していない一又は複数のグリコシル化部位を加えることによって達成することができる。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とはアスパラギン残基の側鎖への糖鎖部分の付着を意味する。トリペプチド配列アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である)がアスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的付着に対する認識配列である。よって、ポリペプチドにおいてこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると潜在的なグリコシル化部位をつくる。Ｏ結合グリコシル化はヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン(但し５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた使用できる)への糖Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つの付着を意味する。抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが上述のトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位に対する)の一又は複数を含むようにアミノ酸配列を改変することにより簡便に達成される。改変はまた元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によって行うこともできる(Ｏ結合グリコシル化部位の場合)。
【０３０２】
抗体がＦｃ領域を含有する場合、それに接着する炭水化物を変更してもよい。例えば、抗体のＦｃ領域に接着するフコースを欠損する成熟炭水化物構造の抗体は、米国公開特許第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)に記載される。米国公開特許第２００４／００９３６２１号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)も参照のこと。抗体のＦｃ領域に接着した炭水化物内のＮ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)を二分する抗体は、国際公報第０３／０１１８７８号、Jean-Mairet 等、及び米国特許第６６０２６８４号、Umana 等に参照されている。抗体のＦｃ領域に接着するオリゴサッカライド内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公報第９７／３００８７号、Patel 等に報告される。また、抗体のＦｃ領域に接着する変更された炭水化物を有する抗体については、国際公報第９８／５８９６４号(Raju, S.)及び国際公報第９９／２２７６４号(Raju, S.)も参照のこと。また、修飾されたグリコシル化を有する抗原結合分子については、米国公開特許第２００５／０１２３５４６号(Umana 等)を参照。
【０３０３】
本明細書中の好適なグリコシル化変異体はＦｃ領域を含有し、Ｆｃ領域に接着される炭水化物構造はフコースを欠いている。このような変異形は改善されたＡＤＣＣ機能を有する。場合によって、Ｆｃ領域は、更にＡＤＣＣを改善する一つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の位置２９８、３３３及び／又は３３４の置換(Ｅｕ残基番号付け)を更に含む。「脱フコース化」又は「フコース欠失」抗体に関する文献の例には以下のものを含む：米国公開番号２００３／０１５７１０８；国際公報２０００／６１７３９；国際公報２００１／２９２４６；米国公開番号２００３／０１１５６１４；米国公開番号２００２／０１６４３２８；米国公開番号２００４／００９３６２１；米国公開番号２００４／０１３２１４０；米国公開番号２００４／０１１０７０４；米国公開番号２００４／０１１０２８２；米国公開番号２００４／０１０９８６５；国際公報２００３／０８５１１９；国際公報２００３／０８４５７０；国際公報２００５／０３５５８６；国際公報２００５／０３５７７８；；国際公報２００５／０５３７４２；Okazaki 等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；及びYamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)。脱フコース化抗体を産生する細胞株の例として、タンパク質フコース化欠失Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞 (Ripka 等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国公開番号２００３／０１５７１０８, Presta, L；及び国際公報２００４／０５６３１２, Adams 等, 特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例としてα-１,６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８,-ノックアウトＣＨＯ細胞 (Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004))などがある。
【０３０４】
（ｘｉｉ）抗体の組換え製造
抗体の組換え製造のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、従来の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である(例えば米国特許第５５３４６１５号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される)。
【０３０５】
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【０３０６】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【０３０７】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【０３０８】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)；ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
【０３０９】
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【０３１０】
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ-アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ-アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ-アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０３１１】
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された細胞の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０３１２】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
【０３１３】
Ｄ．Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及びＢｖ８アンタゴニストの使用
本発明のＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及びＢｖ８アンタゴニストは、血管新生、腫瘍転移、腫瘍細胞の遊走の阻害及び叉はＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞又はＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカウンターパートの動員の調節のために、単独又は他の治療薬との組み合わせで使用することができる。
【０３１４】
本発明の治療方法の主な標的は、転移性腫瘍及び前転移性臓器や前転移性組織に転移することができる腫瘍である。本発明の治療方法はまた、Ｇ−ＣＳＦを分泌する腫瘍を標的とし、骨髄からＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞又はＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的ヒトカウンターパートを動員し、それにより前転移ニッチをイニシエートする。ヒトのカウンターパート細胞の例としては、ヒト未成熟骨髄細胞、ヒト骨髄抑制細胞、ヒト好中球、単球及びマクロファージの前駆体、及びヒト好中球、単球又はマクロファージを含む。本発明の治療方法はまた、Ｇ−ＣＳＦ、Ｂｖ８、ＰＫＲ１、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８、及び／又はＳ１００Ａ９の発現が増加した腫瘍を標的とする。
【０３１５】
本発明の方法により治療されるべき疾患及び障害の例としては、本明細書にて「癌」及び「癌性」なる用語のもとに記載されている腫瘍性疾患を含む。所定の実施態様において、本発明の方法により治療されるべき疾患は転移性腫瘍又は転移性の癌である。
【０３１６】
本発明の治療方法はまた、良性、前癌性又は非転移性癌の治療のために提供され、その治療は良性、前癌性又は非転移性癌が転移性癌になることを防ぐ。
【０３１７】
本発明は更に、患者の転移性腫瘍が、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストによる治療に効果的に応答するかどうかを予測するための方法を提供する。このような方法の例としては、患者から得られた試料がＢｖ８、ＰＫＲ１及び／又はＧ−ＣＳＦを発現する細胞を含むか否かを決定することを含む。所定の実施態様において、発現はｍＲＮＡの発現である。所定の実施態様において、遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルがｑＲＴ−ＰＣＲ又はｑＰＣＲを用いて測定される。その他の実施態様において、ｍＲＮＡ発現レベルはマイコロアレイを用いて測定される。その他の実施態様において、ｍＲＮＡ発現レベルは、ＩＳＨ（インサイツハイブリダイゼーション）を用いて測定される。所定の実施態様において、遺伝子のタンパク質発現レベルは、ＩＨＣアッセイを用いて測定される。所定の実施態様において、治療は、良性、前癌性又は非転移性癌が転移性癌になるのを防ぐ。所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストによる治療は、転移性癌が体の他の前転移性組織又は臓器に転移するのを妨げる。
【０３１８】
所定の実施態様において、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストおよび／またはＢｖ８アンタゴニストによる治療の有効性は、前転移性臓器又は前転移性組織においてＧ−ＣＳＦ、Ｂｖ８、ＰＫＲ１、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ９の発現レベルを決定することによりモニターすることができる。所定の実施態様において、Ｂｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８、及び／又はＳ１００Ａ９のｍＲＮＡ発現レベル及び／又はタンパク質発現レベルは、前転移性肺及び／又は転移性肺において上方制御される。所定の実施態様において、Ｂｖ８及び／又はＭＭＰ−９のｍＲＮＡの発現レベル及び／又は蛋白質発現レベルが、抗Ｂｖ８抗体による治療後に減少している場合、抗Ｂｖ８抗体による治療は有効である。所定の実施態様において、抗Ｂｖ８抗体による治療は、前転移性肺におけるＢｖ８及び／又はＭＭＰ−９のｍＲＮＡの発現レベル及び／又は蛋白質を減少させる。所定の実施態様において、Ｂｖ８及び／又はＭＭＰ−９のｍＲＮＡの発現レベル及び／又は蛋白質発現レベルが、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体による治療後に減少している場合、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体による治療は有効である。所定の実施態様において、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体による治療は、前転移性肺及び／又は転移性の肺におけるＢｖ８及び／又はＭＭＰ−９のｍＲＮＡの発現レベル及び／又は蛋白質発現レベルを減少させる。
【０３１９】
本発明は、本発明のＧ−ＣＳＦアンタゴニスト又はＢｖ８アンタゴニストが他の療法と組み合わせて投与される併用療法を提供する。組合せ治療は具体的に、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせた、本明細書中のＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び叉はＢｖ８アンタゴニストの投与を含む。さらに、または、あるいは、本明細書中のＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び叉はＢｖ８アンタゴニストは、様々な腫瘍性疾患を治療するために、一又は複数の更なる薬剤、例えば抗癌剤又は治療法、抗血管形成剤、又は抗血管形成治療法と組み合わせて投与されてもよい。
【０３２０】
本発明のＧ−ＣＳＦアンタゴニスト又はＢｖ８アンタゴニストは、同じ組成物で又は別の組成物として、目的のために有効である他の薬剤と連続して、又は組み合わせて投与されうる。
【０３２１】
アンタゴニストおよび／または薬剤の投与は、例えば単一の組成物として、または、同じか異なる投与ルートを使用した２以上の異なる組成物として、同時に行われてもよい。あるいは、又は、さらに、投与はいずれの順序で連続して行われてよい。ある実施態様では、２以上の組成物の投与の間に分から日、週、月の間隔が存在してもよい。例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストが第一に投与され、その後、本発明の異なるアンタゴニスト又は薬剤が投与されてよい。しかしながら、本発明の異なるアンタゴニスト又は薬剤の同時投与又は投与が第一に考慮される。
【０３２２】
投与される治療薬の有効量は医師又は獣医の裁量である。治療される症状を最大限管理するために用量投与及び調整がなされる。用量は、さらに、使用される治療薬の種類及び治療される特定の患者などの因子に依存するであろう。ＶＥＧＦアンタゴニストの好適な用量は現在用いられているものであり、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び本発明の異なるアンタゴニストの組合せ作用(相乗作用)のために低くてもよい。ある実施態様では、阻害薬の組合せは単一の阻害薬の有効性を増強する。「増強」なる用語は、その一般的又は認可された用量での治療薬の有効性の改善を指す。本明細書中の「製薬的組成物」と題した項目も参照のこと。
【０３２３】
癌との関連の抗血管新生療法は、腫瘍増殖を支える栄養分の供給に必要な腫瘍血管の発達を阻害することを目的とした癌治療方略である。血管新生が原発性腫瘍増殖と転移の療法に伴うので、本発明によって提供される抗血管新生療法は、原発部位での腫瘍の新生物性増殖の阻害と二次部位での腫瘍の転移の予防が可能であり、ゆえに他の療法によって腫瘍の攻撃がなされる。本発明の一実施態様では、抗癌剤又は膠癌療法は抗血管新生剤である。他の実施態様では、抗癌剤は化学療法剤である。
【０３２４】
多くの抗血管新生剤が同定されており、当分野で公知であり、本明細書中に挙げるもの、例えば定義の項目に挙げるもの、例えばCarmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000)；Ferrara等, Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004)；及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)に挙げるものなどがある。また、米国特許公開第２００３００５５００６号を参照。ある実施態様では、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ中和抗体(又は断片)及び／又は他のＶＥＧＦアンタゴニストないしはＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、例として、限定するものではないが、例えば、可溶性ＶＥＧＦレセプター(例えば、ＶＥＧＦＲ-１、ＶＥＧＦＲ-２、ＶＥＧＦＲ-３、ニューロピリン(例えば、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２))断片、ＶＥＧＦないしはＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の低分子量インヒビター、ＶＥＧＦのアンチセンス方略、ＶＥＧＦないしはＶＥＧＦレセプターに対するリボザイム、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体、及びこれらのいずれかの組み合わせと組み合わせて用いられる。あるいは又はさらに、２つ以上の血管新生インヒビターは、場合によってＶＥＧＦアンタゴニスト及びＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストに加えて患者に同時に投与されてもよい。ある実施態様では、一又は複数の更なる治療薬、例えば抗癌剤は、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト、Ｂｖ８アンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は抗血管新生剤と組み合わせて投与されてもよい。
【０３２５】
本発明のある態様では、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト又はＢｖ８アンタゴニストによる併用腫瘍療法に有用な他の治療剤には、他の癌療法(例えば、外科的治療、放射線処置(例えば、放射活性物質の照射又は投与を伴う)、化学療法、本明細書中に挙げる抗癌剤及び当分野で公知の抗癌剤、又はこれらの組み合わせ)が含まれる。あるいは又はさらに、本明細書中に開示した同じ又は２以上の異なる抗原を結合する２以上の抗体が患者に同時に投与されてもよい。また、患者に一又は複数のサイトカインを投与することが有益であることもある。
【０３２６】
ある態様では、本発明は、有効量のＶＥＧＦのアンタゴニスト及びＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニスト及び一又は複数の化学療法剤を、癌に罹りやすい患者又は癌と診断された患者に投与することによって、転移を阻害する方法を提供する。様々な化学療法剤が本発明の併用治療方法で用いられてもよい。考慮する化学療法剤の例示的及び非限定的リストを本明細書中の「定義」の項目に示す。
【０３２７】
当業者によって理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、一般的に、化学療法剤が単独ないしは他の化学療法剤と組み合わせて投与される臨床治療に既に用いられる用量の程度であろう。用量の変更はおそらく治療する症状に応じて行うであろう。治療を行う医師は、個々の被検体ごとに適当な用量を決定することが可能であろう。
【０３２８】
本発明は、前の癌治療から再発又はそれに対して難治性である患者を治療するための方法および組成物を提供する。また、本発明は、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を治療するための方法及び組成物を提供する。再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖は、一又は複数の現在利用可能な治療法(例えば、癌治療、例として化学療法、放射線療法、外科治療、ホルモン療法及び／又は生物学的療法／免疫療法、抗ＶＥＧＦ抗体療法、特に特定の癌のための標準的な治療投薬計画)を施されている患者ないしはこれらによって治療された患者が臨床的に治療に不十分であるか、又は患者がこのような治療からもはやいかなる有用な効果を得ておらず更なる有効な治療を求める場合の症状を表すために用いられる。所定の実施態様において、この表現も「非応答性／再発性の」患者の症状を指すものであり、例えば、副作用に苦しむ治療に応答する患者、耐性を生じる患者、治療に応答しない患者、治療に満足に応答しない患者などを表す。様々な実施態様では、癌は、癌細胞の数が有意に低減しなかった、又は増加した、又は腫瘍の大きさが有意に減少しなかった、又は大きくなった、又は癌細胞のサイズないしは数に何らかの減少が生じなかった、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖である。癌細胞が再発性腫瘍増殖であるか再発性癌細胞増殖であるかの決定は、文脈上で「再発」又は「難治性」又は「非応答性」の当分野で容認される意味、並びに本明細書中の定義に与えられた定義を用いて、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当分野で公知の任意の方法によってインビトロないしはインビボでなされうる。
【０３２９】
更に、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト又はＢｖ８アンタゴニストは、ホルモン、放射線及び化学療法剤と併用して投与することができ、これによりこれらの薬剤の一以上にがん細胞を再感作させ、転移性癌を含む癌を治療又は管理するためにその後投与することができるようにし（又は続けて投与され）、転移を防ぐ。
【０３３０】
本発明はまたＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストによる治療に効果的に応答する患者を特定するための有用なバイオマーカーの同定に一部は基づく。これらのバイオマーカーはまた、そうした治療の有効性を予測し及び監視するのに非常に有用である。例えば、癌患者は組織又は細胞試料を得るために生検を施される可能性があり、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＫＲ１、又はＵＲＭＣＮＡ又はＤＲＭＣＮＡとして記載される一以上の遺伝子の発現が、参照試料と比較して増加させられるか又は減少させられるかどうかを判断するために、試料は様々なインビトロアッセイによって検査することができる。標的マーカーを含む試料は、当該技術分野で周知の方法によって得られ、それは目的とする癌の特定の型及び部位に適したものである。組織生検はしばしば癌組織の代表的な小片を採取するために用いられる。比較は、試料及び参照試料について行うことができ、同時に又は時間的に異なる時点で測定され得る。従って、開示された方法及びアッセイは癌患者を治療するための適切な又は効果的な治療法を評価する上で有用なデータや情報を得るための簡便で効率的、かつ費用対効果の高い可能性のある手段を提供する。
【０３３１】
本発明の方法において、哺乳動物の組織又は細胞試料が入手され、一以上のバイオマーカーの発現について検討される。試料における様々なバイオマーカーの発現は、複数の方法により分析することができ、その多くは当技術分野で知られており、当業者により理解され、限定しないが、免疫組織化学的及び／又はウェスタンブロット解析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）など、定量的な血液ベースのアッセイ（例えば血清ＥＬＩＳＡのような）（例えば、タンパク質発現のレベルを調べるために）、生化学的酵素活性のアッセイ、インサイツハイブリダイゼーション、ｍＲＮＡのノーザン分析及び／又はＰＣＲ解析、並びに遺伝子及び／又は組織アレイ解析により行うことができる様々なアッセイのいずれかを含む。遺伝子及び遺伝子産物の状態を評価するための典型的なプロトコールが例えば、 Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, ユニット２（ノーザンブロット）、４（サザンブロット）、１５（イムノブロット）及び１８（ＰＣＲ分析）に見いだされる。Ｒｕｌｅｓ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ又はＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）から入手可能な多重イムノアッセイを使用しても良い。
【０３３２】
本発明の方法は、組織又は細胞試料中におけるＵＲＭＣＮＡ又はＤＲＭＮＡとして記載されている一以上の標的遺伝子のｍＲＮＡの存在及び／又は発現を調べるプロトコールを含む。標的遺伝子はまたＧ−ＣＳＦ及びＰＫＲ１も含む。細胞内のｍＲＮＡの評価のための方法は良く知られており、例えば、相補的ＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ＵＲＭＣＮＡ、ＤＲＭＣＮＡ、Ｇ−ＣＳＦ又はＰＫＲ１として記載された一以上の遺伝子に対して特異的な標識リボプローブを用いたインサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット及び関連技術）、及び様々な核酸増幅アッセイ（例えば、ＵＲＭＣＮＡ、ＤＲＭＣＮＡ、Ｇ−ＣＳＦ又はＰＫＲ１として記載された一以上の遺伝子に対して特異的な相補的プライマー、及び他の増幅型検出方法、例えば分枝鎖ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡ等を用いたＲＴ−ＰＣＲ）を含む。
【０３３３】
哺乳動物由来の組織又は細胞試料は、ノーザン、ドットブロット又はＰＣＲ分析を用いてｍＲＮＡに対して簡便にアッセイすることができる。例えば、定量的−ＰＣＲアッセイ等のＲＴ−ＰＣＲアッセイは、当技術分野において周知である。本発明による例示的実施態様において、生物学的試料中の標的ｍＲＮＡを検出するための方法は、少なくとも１つのプライマーを用いて逆転写によって試料からｃＤＮＡを生成し；そのようにして生成したｃＤＮＡを、そこに標的ｃＤＮＡを増幅するためにセンス及びアンチセンスプライマーとして標的ポリヌクレオチドを用いて増幅し；増幅した標的ｃＤＮＡの存在を検出することを含む。さらに、このような方法は生物学的試料中の標的ｍＲＮＡのレベルを決定することを可能とする一以上のステップを含めることができる（例えば、同時にアクチンファミリーメンバー等の「ハウスキーピング」遺伝子の比較コントロールｍＲＮＡ配列のレベルを調べることにより）。必要に応じて、標的ｃＤＮＡを増幅した配列を決定することができる。所定の実施態様において、本発明の方法は、マイクロアレイ技術により組織又は細胞試料中の標的ｍＲＮＡ等のｍＲＮＡを調べ又は検出するプロトコールを含む。
【０３３４】
本発明のいくつかの実施態様では、試料中の標的タンパク質の発現が免疫組織化学及び染色プロトコールを用いて調べられる。組織切片の免疫組織化学的染色は、試料中のタンパク質の存在を評価する又は検出する信頼性の高い方法であることが示されている。免疫組織化学（「ＩＨＣ」）技術は、探索するための抗体を利用し、一般的に発色又は蛍光法によりインサイツで細胞の抗原を視覚化する。
【０３３５】
標的タンパク質に対して設定された診断マーカーは、ＵＲＭＣＰ又はＤＲＭＣＰの下に記載されている分子の１つ、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９以上、１０以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、又は全体のセットを含めることができる。分子はタンパク質をコードする核酸又は改変された発現及び／又は活性を有するタンパク質であり、次の中から選択される：Ｃ−ＣＳＦ、Ｂｖ８、ＰＫＲ１、Ｓｔｆａ３、ＣＡＭＰ、ＴＮＦＳＦ１４、ＭＧＡＭ、Ｎｇｐ、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＬＲＰ１Ｂ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＨＡＯ１、Ｃ１０ｏｒｆ４６、ＣＬＥＣＳＦ９、Ｍｃｐｔ８、ＰＲＴＮ３、Ｓｌｆｎ３、ＭＭＰ−９、ＴＹＭＳ、ＣＲＩＰＴＯ  ＣＲ−１、ＭＰＨＯＳＰＨ１、ＣＤＨ６、ＷＷＰ２、ＤＭＣ１、ＢＣＨＥ、ＮＳＬＥ１６４８４、Ｆ９、ＧＤＡＰ１、ＬＯＣ３７５１８８、ＤＮＴＴ、ＰＰＩＬ３、ＫＣＮＤ２、ＺＮＦ５９７、ＩＧＳＦ４Ｄ及びＧＴＦ３Ｃ４。所定の実施態様において、標的タンパク質の一以上を検出する一以上の抗体が提供される。
【０３３６】
Ｅ．薬学的組成物及び投与
単独又は他の治療薬と組み合わせた本発明のＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及びＢｖ８アンタゴニスト、例えば抗Ｇ−ＣＳＦ抗体、抗Ｂｖ８抗体は、ヒト患者に、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路、及び／又は皮下投与などにより投与される。
【０３３７】
ある実施態様では、本発明の治療はＧ−ＣＳＦアンタゴニスト又はＢｖ８アンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は化学療法剤との併用投与を伴う。一実施態様では、付加的な抗癌剤、例えば、一又は複数の異なる抗血管新生剤、一又は複数の化学療法剤などが存在する。また、本発明は、複数のインヒビター、例えば同じ抗原に対する複数の抗体又は本発明の異なるタンパク質に対する複数の抗体の投与を考慮する。一実施態様では、異なる化学療法剤の混合物が、本明細書中のＢｖ８アンタゴニストと投与される。併用投与は、別々の製剤又は単一の製薬的製剤による同時投与、及び／又はいずれかの順序での連続投与が含まれる。例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト又はＢｖ８アンタゴニストの投与の前、後、交互に行われるか、又はこれらと同時になされうる。一実施態様では、両方(又はすべて)の活性剤が同時にその生物学的活性を及ぼす一定時間がある。
【０３３８】
疾患の予防又は治療のために、本発明の薬剤の好適な用量は、上記に定義した治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及びインヒビターへの応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。インヒビターは一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。併用療法投与計画では、本発明の組成物は治療的有効量又は治療的相乗作用量で投与される。本明細書中で用いられるように、治療的有効量は、本発明の組成物の投与及び／又はＶＥＧＦアンタゴニスト及び一又は複数の他の治療剤の同時投与により標的とする疾患又は症状が減少又は阻害される量である。薬剤の組み合わせの投与効果は付加的であってもよい。一実施態様では、投与の結果は相乗効果である。治療的相乗作用量は、特定の疾患に関係する状態又は症状を相乗作用的に又は有意に減少ないし除去するために必要な、ＶＥＧＦアンタゴニストと一又は複数の他の治療剤、例えばＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニスト及び場合によっては化学療法剤及び／又は抗癌剤の量である。
【０３３９】
疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ)のＧ−ＣＳＦアンタゴニスト、Ｂｖ８アンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、化学療法剤、及び／又は抗癌剤が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。しかしながら他の用量処方が有用であるかもしれない。典型的には、臨床医は、必要とされる生物学的な効果が生じる用量(一又は複数)が達成されるまで本発明の分子(一又は複数)を投与するであろう。本発明の治療の経過は従来の技術及びアッセイにより用意にモニターされる。
【０３４０】
例えば、血管新生インヒビター、例えばアバスチン(登録商標)(ジェネンテック、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州)などの抗ＶＥＧＦ抗体の調製及び投与計画は製造者の指示に従って用いられても、当業者によって経験的に決定されてもよい。他の例では、このような化学療法剤の調製及び投与計画は製造者の指示に従って用いられても、当業者によって経験的に決定されてもよい。化学療法の調製及び投与計画はChemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載される。
【０３４１】
本発明の治療の有効性は、腫瘍性疾患を診断する際に共通に用いられる様々なエンドポイントによって決定することができる。例えば、癌治療は、限定するものではないが、腫瘍再発、腫瘍重量ないしサイズの収縮、進行時間、生存期間、進行がない生存、全体の応答速度、応答の継続期間、生活の質、タンパク質の発現及び／又は活性などで評価されてもよい。本明細書に記載の抗血管新生剤は腫瘍の血管をターゲットとするのであって、新生物細胞自体をターゲットとする必要はないので、抗癌剤の特定のクラスを示し、それゆえに薬剤に対する臨床応答の特定の測定と定義を必要としうる。例えば、二次元分析において５０％より大きい腫瘍の収縮は応答を示す標準のカットオフである。しかし、本発明のインヒビターは原発性腫瘍を収縮することなく転移の拡がりを阻害するか、又は単に腫瘍抑制(tumouristatic)効果を及ぼしうる。したがって、例えば血管新生の血漿又は尿路マーカーの測定及び放射線画像法による応答の測定などの、治療の有効性を決定する手法が用いられうる。
【０３４２】
本発明の他の実施態様では、上記の疾病の治療又は診断に有用な材料を具備する製造品が提供される。該製造品は容器、ラベル及びパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。一実施態様では、容器は、症状を治療するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる）。組成物中の少なくとも一つの活性剤はＧ−ＣＳＦアンタゴニスト又はＢｖ８アンタゴニストである。所定の実施態様において、活性剤は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体である。所定の実施態様において、活性剤はＢｖ８アンタゴニストである。容器に添付又は付属するラベルは、組成物が選択した症状の治療に使用されることを示す。所定の実施態様において、容器にはＧ−ＣＳＦアンタゴニスト及び／又はＢｖ８アンタゴニストによる治療に効果的に応答する転移性腫瘍を検出するための診断薬であるマーカーセットが入る。所定の実施態様において、組成物の少なくとも一の薬剤はＧ−ＣＳＦ、ＰＫＲ１、ＵＲＭＣＮＡ、ＵＲＭＣＰ、ＤＲＭＣＮＡ及び／又はＤＲＭＣＰを検出するためのマーカーである。さらに製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の容器を更に具備してもよい。
【０３４３】
本発明の更なる詳細は以下の非限定的な実施例によって例示される。
【実施例】
【０３４４】
実施例１
材料と方法
細胞株。マウス乳腺腫瘍細胞株６７ＮＲ、１６８ＦＡＲＮ、４ＴＯ７、及び６６ｃ１４（Dexter, DL et al Cancer Res 38, 3174 (1978); Aslakson, CJ and Miller, FR Cancer Res 52, 1399 (1992)）はＦ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，デロロイト, ミシガン州)から提供された。４Ｔ１乳癌、ルイス肺癌（ＬＬＣ）、及びＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマはＡＴＣＣから購入した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ１（安定ルシフェラーゼを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）はＸｅｎｏｇｅｎ（アラメダ、カリフォルニア州）から提供された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｘ１．１は、高度に腫瘍原性な細胞株を生成するために以前にマウスで継代されたＧＦＰ発現細胞である。それらはＧＦＰ発現ベクター及びピューロマイシンにより親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞へトランスフェクトすることで生成された。続いて、ＧＦＰ陽性細胞は、（マトリゲル中）ＳＣＩＤ／ｂｇマウスに皮下注射した。目視できる腫瘍を採取し、腫瘍原性細胞を単離し増殖させた。全ての乳癌細胞株はＤＭＥＭ（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）で増殖されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＬＬＣ及びＢ１６Ｆ１０細胞を除いて、ＩＭＤＭ中で培養された。ＩＭＤＭ及びＤＭＥＭの両方に１０％ＦＢＳ（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）が補充された。すべての細胞は５％ＣＯ２で８０％湿度インキュベーター中で３７℃で維持された。
【０３４５】
マウス。マウス乳癌ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスは、オンタリオ州のマクマスター大学から得られた。雌Ｂａｌｂ／ｃ、Ｂａｌｂ／ｃヌード、ＣＢ６Ｆ１（雌Ｂａｌｂ／ｃと雄Ｃ５７ＢＬ／６との間の交雑種）は、チャールズリバー研究所（ホリスター、カリフォルニア州）から得た。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ジャクソン研究所（サクラメント、カリフォルニア州）から入手した。動物の維持管理及び実験プロトコルは連邦規制に従って行われ、動物実験及び利用委員会により承認された。
【０３４６】
腫瘍モデル。６７ＮＲ、１６８ＦＡＲＮ、４ＴＯ７、６６ｃ１４、及び４Ｔ１細胞をＰＢＳ１０μｌあたり２００,０００個の細胞の濃度で雌Ｂａｌｂ／ｃ又はＣＢ６Ｆ１の右第四乳腺脂肪パッドに同所性に注入した。前述のように抗Ｂｖ８処置を行った（Shojaei, F. et al. Nature 450, 825-831 (2007)）。簡潔に言うと、抗Ｂｖ８処置は、腹腔内投与経路による腫瘍細胞接種２日後に開始した（各２Ｂ９及び３Ｆ１モノクローナル抗体を５ｍｇ／ｋｇ）。抗ブタクサモノクローナル抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）がコントロールとして働いた。抗体は、週２回担癌マウスに投与された。中和抗マウスＧ−ＣＳＦモノクローナル抗体（ＭＡＢ４１４）及びそれと一致するアイソタイプのＩｇＧコントロール（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）が一日おきにマウス当たり２５μｇの用量で投与された。腫瘍体積が、楕円体体積の公式（０．５×Ｌ×Ｗ２、ここにＬは長さでＷは幅である）を使用して、一日おきに計算された。
【０３４７】
Ｂ１６Ｆ１０及びＬＬＣ細胞はマトリゲル（成長因子を低減；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、サンノゼ、カリフォルニア州）１ｍｌ当たり濃度１×１０８個の細胞で再懸濁し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背側面に皮下注入した（１００μｌ）。Ｂ１６Ｆ１０又はＬＬＣの担癌マウス由来の組織は、腫瘍接種１５日間後にＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の含量及びＢｖ８の発現について分析され、その時点では癌細胞は肺組織で検出されなかった。
【０３４８】
雌ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウス由来の組織は、血漿及び肺組織におけるＧ−ＣＳＦ及びＢｖ８の発現について、生後８週（目に見える肺転移は検出されなかった）及び生後１２州（転移結節がはっきり見えていた）で分析された。ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴが負の同胞（遺伝子型により評価された導入遺伝子を欠いていた同腹子）がコントロール動物として使用され、ナイーブと呼ばれる。抗Ｂｖ８及び抗Ｇ−ＣＳＦ研究のために、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ細胞が１２週齢の雌の原発性腫瘍から単離された。全ての単離された細胞（腫瘍及び間質）は数えられ、ＰＢＳ：マトリゲル（１：１混合）（成長因子を低減、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、サンノゼ、カリフォルニア州）の１ｍｌあたり２×１０７細胞の濃度で再懸濁され、ＦＶＢマウスの第４乳腺脂肪パッド中に（５０μｌ）注入された。単離された細胞はまた、ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ中で培養された。抗Ｂｖ８（２Ｄ３モノクローナル抗体を１０ｍｇ／ｋｇ）又は抗マウスＧ−ＣＳＦ（抗Ｇ−ＣＳＦ、２．５ｍｇ／ｋｇ、Ｒ＆Ｄシステムズ（ミネアポリス、ミネソタ州）由来のＭＡＢ４１４）による処置は、腹腔内投与経路によって腫瘍接種２日間後に開始された。研究終了時に、肺はＰＢＳで灌流されホルマリン中に固定された。その後、７μｍの厚さの切片がＨ＆Ｅ染色され、肺に存在する腫瘍が数えられた。平均で、各肺当たり３つの切片（２５０μｍで区切られた）が分析された。
【０３４９】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｘ１．１細胞はＰＢＳ：マトリゲル（１：１混合）（成長因子を低減、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、サンノゼ、カリフォルニア州）の１ｍｌあたり４×１０７細胞の濃度で再懸濁され、ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの第４乳腺脂肪パッド中に（５０μｌ）注入された。抗Ｂｖ８（２Ｄ３モノクローナル抗体を１０ｍｇ／ｋｇ）又は抗ヒトＧ−ＣＳＦ（抗ｈＧ−ＣＳＦ、２．５ｍｇ／ｋｇ、Ｒ＆Ｄシステムズ（ミネアポリス、ミネソタ州）由来のＭＡＢ４１４）による処置は、腹腔内投与経路によって腫瘍接種２日間後に開始された。マッチングするアイソタイプＩｇＧコントロールがコントロールとして働いた。抗体は腫瘍を有するマウスに週三回投与された。研究終了時に、肺はＰＢＳで灌流され、パラホルムアルデヒド中で１６時間固定された。続いて、肺を３０％スクロース／ＰＢＳ溶液に移した。転移巣の数は、蛍光顕微鏡下に全肺を配置し、組織（肺血管系に閉じ込められた単一の癌細胞のカウントを避けるために２つ以上の細胞からなる）内のＧＦＰ−陽性細胞巣を数えることによって生成された。
【０３５０】
あるいは、雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに組換えＧ−ＣＳＦの注射を含む研究のために、免疫中和及び免疫組織化学に適した抗体である（ジェネンテック、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）、ハムスター抗マウスＢｖ８モノクローナル抗体２Ｄ３（Shojaei, F. et al. Proc Natl Acad Sci U S A (2009)）が週２回１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与された。
【０３５１】
Ｂｖ８欠損マウスの生成。腫瘍モデルにおける内因性Ｂｖ８の有無の影響を評価するために、我々はＢｖ８欠損胎児肝細胞の移植によって、骨髄由来単核細胞（ＢＭＭＮＣ）にＢｖ８を欠いたマウスを生成した。Ｂｖ８欠損マウスを生成するために、マウス遺伝子Ｂｖ８を含むＢＡＣクローンｍＶＲＰＡ ＢＡＣ１３３ Ｎ１２（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、及び３つのｌｏｘＰ部位を持つターゲティングベクターＴＮＬＯＸ１−３が、ノックアウト及びＢｖ８の条件付きノックアウト欠失対立遺伝子を持つマウスを生成するために設計された標的コンストラクトを構築するために用いられた。エクソン２で正しく標的にされるＰＧＫ−Ｎｅｏカセットを持つＥＳクローンはサザンブロッティングによってスクリーニングされ、Ｃｒｅリコンビナーゼの電気穿孔を受け、Ｂｖ８ノックアウトのためＰＧＫ−Ｎｅｏ選択カセット及びエクソン２の両方を切除した。６つのＢｖ８ノックアウトクローンがＣ５７ＢＬ／６マウス由来の胚盤胞に注入された。生殖細胞を介して破壊的な突然変異が伝播されたキメラをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させた。マウスは同系交配の１２９ＳｖＥｖバックグランドに保持され、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドに戻し交配された。
【０３５２】
致死量の放射線を照射された宿主中への胎仔肝移植及び腫瘍接種。胎仔肝（ＦＬ）細胞は、Ｅ１３．５−１４．５の日にＢｖ８野生型又はノックアウトマウスの胚から単離した。妊娠中のマウスは、妊娠の１３．５から１４．５の日に安楽死させ、ＦＬ細胞は顕微解剖顕微鏡の中で分離され、直ちに冷たい平らなダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含むペトリ皿に入れられた。単一の細胞懸濁液は、ＦＬを激しくピペッティングし、４０ミクロンのセルストレーナー（ＢＤファルコン、カリフォルニア州）の中を細胞を通すことにより生成された。ＦＬ細胞は、次いでＡＣＫ溶解緩衝液を用いて赤血球溶解（Ｃａｍｂｒｅｘ社、マサチューセッツ州）に供され、平らなダルベッコ変法イーグル培地中に保存され、その後致死的照射マウスへの移植に使用された。
【０３５３】
移植する前に、ＣＢ６Ｆ１マウスは、セシウム−照射装置中で致死的に１０８０ラドで照射され、宿主中の内因性ＢＭＭＮＣを除去し、続いてＰＢＳ１００μｌ中の全胎児肝細胞４×１０５の静脈内注射を行った。
【０３５４】
ＦＬ移植４週間後、４Ｔ１又は６６ｃ１４細胞は前述のようにＣＢ６Ｆ１マウスの第４乳腺脂肪パッドに接種された。アイソタイプコントロール又は抗Ｂｖ８抗体（２Ｂ９及び３Ｆ１）による処置が記載した通り行われた(Shojaei, F. et al. Nature 450, 825-831 (2007))。肺はマイクロＣＴによるか又は肺表面の目に見える腫瘍を数えるかの何れかにより、転移の存在について分析された。
【０３５５】
Ｌｕｃ−ｚｓＧｒｅｅｎ−Ｈｙｇｒｏ細胞株の生成。融合タンパク質ルシフェラーゼｚｓＧｒｅｅｎ（ホタルルシフェラーゼ及びｚｓＧｒｅｅｎ間の機能的融合）をコードするｐＭＳＣＶベクターは、ｚｓＧｒｅｅｎのｃＤＮＡを持つフレーム内のルシフェラーゼｃＤＮＡをｐＭＳＣＶ−ｚｓＧｒｅｅｎベクター中へ挿入することによって生成された。ハイグロマイシン耐性遺伝子は、ｐＭＳＣＶベクターによりエンコードされる。
【０３５６】
安定してルシフェラーゼｚｓＧｒｅｅｎ融合を発現する６７ＮＲ細胞及び４Ｔ１細胞を生成するために、細胞は、製造者のプロトコール（ロッシュ、インディアナポリス、インディアナ州）に従い、ＦｕＧＥＮＥトランスフェクション試薬を用いてｐＭＳＣＶ−Ｌｕｃ−ｚｓＧｒｅｅｎ−Ｈｙｇｒｏベクターでトランスフェクトした。ハイグロマイシン耐性細胞は２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン存在下でトランスフェクトした細胞を１０日間培養することにより選択された。ルシフェラーゼｚｓＧｒｅｅｎ陽性細胞は、それらのｚｓＧｒｅｅｎ発現に基づいてフローサイトメトリーで選別され、更にデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（プロメガ、サンルイスオビスポ、カリフォルニア州）でルシフェラーゼ活性を測定することにより、ルシフェラーゼを発現することが検証された。ｚｓＧｒｅｅｎ及びルシフェラーゼの両方を発現する細胞は、更にハイグロマイシン（１００μｇ／ｍｌ）存在下で増殖させて続く実験に使用した。
【０３５７】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のインビボ選択。肺において強化された転移の可能性を示すＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を生成するために、ＰＢＳ中の５×１０５のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ１細胞がＳＣＩＤ／ｂｇマウスの尾静脈から注射された。６週間後（生物発光イメージングが肺で増殖する腫瘍の存在を示した場合）、３匹のマウスから肺が採取され、腫瘍細胞は分析され培養液中で増殖された。３つの独立した細胞株（３匹の異なるマウスから取得された）が生成され、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌ１．１、−Ｌ２．１及び−Ｌ３．１と名付けられた。原発腫瘍部位で腫瘍原性である細胞を得るために、１×１０６のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ１細胞が、ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの第４乳腺脂肪パッドの中へマトリゲル中で接種された。原発性腫瘍が採取され、細胞が分析され培養液中で増殖された。３つの独立した細胞株（３匹の異なるマウスから取得された）が生成され、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｔ１．１、−Ｔ２．１及び−Ｔ３．１と名付けられた。遺伝子発現分析のために、新しく樹立された細胞株は５００，０００細胞／ウエル（６穴プレート中）の密度で播種され、ＲＮＡが４８時間後に採取され、その後のｑＲＴ−ＰＣＲ発現分析のために使用された。
【０３５８】
６６ｃ１４−ｓｈＰＫＲ１及び６７ＮＲ−ＰＫＲ１細胞の生成。ＰＫＲ１の発現量が減少した６６ｃ１４細胞を生成するために、６６ｃ１４細胞はマウスＰＫＲ１（ｓｈＰＫＲ１、オープンバイオシステムズ、ハンツヴィル、アラバマ州）を標的とするｓｈＲＮＡベクターでトランスフェクトされ、安定的にｓｈＰＫＲ１を発現するクローンがピューロマイシン（５μｇ／ｍｌ）の存在下での細胞培養を介して単離された。コントロールとして、６６ｃ１４細胞を非標的ｓｈＲＮＡ（ｓｈ（コントロール））を発現するベクターによりトランスフェクトした。ＰＫＲ１を過剰発現する６７ＮＲ細胞を生成するために、６７ＮＲ細胞を、ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）耐性遺伝子を運搬するベクターと一緒にＣＭＶ−ＰＫＲ１カセットを含有するベクタ−によりコトランスフェクトした。安定的にＰＫＲ１を発現する細胞がゼオシン（２００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で選択された。その後、細胞をビークル又はＧ−ＣＳＦで前処理したＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈から静脈注射した。３週間後、肺が単離され、目視可能な腫瘍の存在について確かめられた。肺における腫瘍の信憑性は、Ｈ＆Ｅ染色により確認した。
【０３５９】
ＲＮＡ試料調製及び定量的逆転写酵素−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析。ＤＮＡフリー全ＲＮＡが、製造業者のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙキット（キアゲン、ドイツ）により、ＰＢＳを灌流した肺から調製された。一段階定量逆転写−ＰＣＲは、５０μＬの総容量にて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ プラチナワンステップｑＲＴ−ＰＣＲキット（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）、又はＴａｑＭａｎ ワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックス（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）、及び１００ｎｇの全ＲＮＡとともに行った。以下のＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイプライマー及びプローブミックスを使用した：Ｂｖ８（アッセイ番号：Ｍｍ００４５００８０_ｍ１），ＭＭＰ９（アッセイ番号：Ｍｍ００４４２９９１_ｍ１），Ｓ１００Ａ８（アッセイ番号：Ｍｍ００４９６６９６_ｇ１），Ｓ１００Ａ９（アッセイ番号：Ｍｍ００６５６９２５_ｍ１），Ｇ−ＣＳＦ（アッセイ番号：Ｈｓ９９９９９０８３_ｍ１），Ｍ−ＣＳＦ（アッセイ番号：Ｈｓ９９９９９０８４_ｍ１），ＧＭ−ＣＳＦ（アッセイ番号：Ｈｓ００９２９８７３_ｍ１）ＶＥＧＦ−Ａ（アッセイ番号：Ｈｓ００９０００５４_ｍ１），ＰｌＧＦ（アッセイ番号：Ｈｓ０１１１９２６２_ｍ１），ＳＤＦ１α（アッセイ番号：Ｈｓ００１７１０２２_ｍ１），Ｃｘｃｌ１（アッセイ番号：Ｈｓ００２３６９３７_ｍ１），ＭＭＰ１（アッセイ番号：Ｈｓ００８９９６５８_ｍ１），ＰＫＲ１（アッセイ番号：Ｍｍ００５１７５４６_ｍ１及びＨｓ０３０４４８７７_ｍ１），ＰＫＲ２（アッセイ番号：Ｍｍ００７６９５７１_ｍ１及びＨｓ０３０４６０７７_ｍ１），Ｈｐｒｔ１（アッセイ番号：Ｍｍ００４４６９６８_ｍ１及びＨｓ９９９９９９０９_ｍ１），ＧＡＰＤＨ（アッセイ番号：Ｍｍ９９９９９９１５_ｇ１及びＨｓ９９９９９９０５_ｍ１）．ハイグロマイシン発現はカスタムメイドのプライマー及びＴａｑＭａｎプローブを用いて検出した（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）：フォワードプライマー：ＣＣＧＣＡＡＧＧＡＡＴＣＧＧＴＣＡＡＴ（配列番号：１５）；リバースプライマー：ＧＡＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＧＣＡＴＡＴＧ（配列番号：１６）；ＴａｑＭａｎプローブ：６ＦＡＭ−ＣＡＣＴＡＣＡＴＧＧＣＧＴＧＡＴＴ−ＭＧＢＮＦＱ（配列番号：１７）（分子溝結合非蛍光クエンチャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ-Ｇｒｏｏｖｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｎｏｎ-ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）。
【０３６０】
反応は以下の条件でアプライドバイオシステムズ７５００リアルタイムＰＣＲシステムを用いて行った：逆転写ステップ（４８℃で１５分）に続いて、９５℃での変性ステップ、及び９５℃で１５秒を４０サイクル、及び６０℃で１分が続いた。各サンプルにおける遺伝子発現のレベルはＧＡＰＤＨ又は内在性コントロールとしてＨＰＲＴ１ ｍＲＮＡを用いた相対定量法で測定した。
【０３６１】
マイクロアレイ試料調製及び分析。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＰＢＳ（ナイーブ）、非転移性６７ＮＲ細胞（マウスあたりＰＢＳ中２００,０００細胞）、又は転移性４Ｔ１細胞（マウスあたりＰＢＳ中２００,０００細胞）が注射された。５匹のマウスが、各条件ごとに使用された。腫瘍細胞接種から６日後（又は腫瘍が約５０ｍｍ３に達したとき）、マウスは安楽死させられ、肺は肺の血管から完全に血液を除去するためにＰＢＳで灌流した。洗浄肺葉は、ＲＮＡを安定化させるためにＲＮＡｌａｔｅｒ（キアゲン、ドイツ）に浸漬された。ＲＮＡの調製の項で説明した通りに全ＲＮＡを単離し、続くマイクロアレイ解析に使用した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のマイクロアレイ（マウス４３０−Ｖ２）を組織試料の発現プロファイルを解析するために使用した。データの質が非常に不良であるのが原因で、４Ｔ１群から１つのサンプルが除外された。生データは、Choe, et al. Genome Biol 6, R16 (2005)による推奨事項を実行するプログラムを用いて処理した。
【０３６２】
ＭＧ−ＣＳＦのクローニング及び発現。マウスＧ−ＣＳＦの一過性発現コンストラクトを生成するために、Ｃ末端に６ｘＨｉｓタグを持ち、コンセンサスＫｏｚａｋ配列及びｍＧ−ＣＳＦのコーディング領域を含むＰＣＲ断片を、ＩＭＡＧＥマウスｃＤＮＡクローン＃４０１２９６８２（ＯＰＥＮ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）から増幅し、ｐＲＫベクターのＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩ部位に挿入した。得られたコンストラクトは、その後一過性にＣＨＯ細胞をトランスフェクトするために使用された。上清を回収し、組換えｍＧ−ＣＳＦタンパク質がＮｉ−ＮＴＡカラム続いてサイズ排除カラムを用いて精製された。
【０３６３】
インビボＧ−ＣＳＦ及び抗Ｇ−ＣＳＦ研究。遠隔臓器での骨髄細胞の動員及びホーミングにおけるＧ−ＣＳＦの効果を分析するために、８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス又はＢａｌｂ／ｃヌードマウスは、組換えヒトＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ、アムジェン、サウザンドオークス、カリフォルニア州）又は組換えマウスＧ−ＣＳＦを５日間連続して毎日１０μｇ皮下注射した。Ｇ−ＣＳＦストックは、滅菌ＰＢＳ（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）により望ましい濃度に希釈した。コントロール動物はビークルとしてＰＢＳが投与された。研究の最後に（最後のＧ−ＣＳＦ注射の２４時間後）、マウスはＰＢＳで灌流され、組織（肺、骨髄、全血、脾臓、肝臓、及び腎臓）が分析用に採取された。フローサイトメトリーの項で説明した通りに、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞又はＬｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ＋細胞を分析した。説明した通りに組織内のＢｖ８のレベルはＥＬＩＳＡにより測定された。
【０３６４】
Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のＧ−ＣＳＦ誘導動員におけるＢｖ８の役割を決定するために、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスは、抗Ｂｖ８ ２Ｄ３抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）、続いてその処置の６時間後にマウスＧ−ＣＳＦ（ジェネンテック、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）の投与を毎日（５日間）受けた。抗ｇｐ１２０抗体（ジェネンテック、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）がアイソタイプコントロールとして使用された。幾つかの実験において、マウスはラット抗Ｇｒ１抗体（マウス１匹あたり５０μｇ、クローンＲＢ６−８Ｃ５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）又は抗Ｌｙ６Ｇ抗体（マウス１匹あたり５０μｇ、クローン１Ａ８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州）で処置された。陽性コントロールとして、抗Ｂｖ８抗体と同じ間隔で与えられる、ラット抗マウスＧ−ＣＳＦモノクローナル抗体（マウス１匹あたり５０μｇ、ＭＡＢ４１４、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）を使用し、続いてマウスＧ−ＣＳＦを使用した。
【０３６５】
転移におけるＧ−ＣＳＦの役割を決定するために、Ｂａｌｂ／ｃ、Ｂａｌｂ／ｃヌード、Ｃ５７ＢＬ／６又はＳＣＩＤ／ｂｇマウスは、上述の通りにヒト又はマウスのＧ−ＣＳＦ（マウス１匹あたり１０μｇ）で前処置された。この後、ＰＢＳ１００μｌ中の１０，０００個の細胞（６６ｃ１４、４Ｔ１、６７ＮＲ、Ｂ１６Ｆ１０又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌ１．１）を尾静脈注射した。Ｇ−ＣＳＦ投与は、癌細胞注入後の別の５日間続けた。マウスは、癌細胞の注入３週間後に（６７ＮＲ腫瘍に対しては４週間後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌ１．１腫瘍に対しては５週間後に）、肺腫瘍の存在について分析された。肺をＰＢＳで灌流し、ホルマリンで固定し、目に見える腫瘍を数えた。肺の腫瘍の信憑性は、Ｈ＆Ｅ染色により確認した。
【０３６６】
Ｇ−ＣＳＦ誘導転移におけるＢｖ８、Ｇｒ１＋又はＬｙ６Ｇ＋細胞の役割を決定するために、マウスを、ビークル又はマウスＧ−ＣＳＦ（マウス１匹あたり２．５μｇ）で前処置し、更に上記の通り、抗Ｂｖ８、抗Ｇｒ１、抗Ｌｙ６Ｇ又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体で５日間処置した。抗ＶＥＧＦ抗体（Ｇ６．３１、ジェネンテック、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）５ｍｇ／ｋｇが一日おきに与えられた。抗体処置は腫瘍細胞の接種後に終了させた。
【０３６７】
遊走アッセイ。細胞はトリプシン処理され、ＦＢＳフリーＩＭＤＭで洗浄され、１００，０００細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。細胞懸濁液の３００μＬは、アッセイをセットアップする前の１時間、コラーゲンＩ型（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州）で被覆されたＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ２４マルチウェルインサートシステムプレート（８．０μｍ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の上部ウエルにロードされた。下のウエルはヒトＢｖ８（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、ロッキーヒル、ニュージャージー州）を指示濃度含む１ｍｌのＩＭＤＭが満たされた。１％ＦＣＳのＩＭＤＭは、陽性コントロールとして働いた。プレートは１６時間インキュベートされた。膜を介して移行する細胞は、カルセインＡＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州）で蛍光標識された。標識された細胞の画像が取得され（ツァイス顕微鏡システム）、細胞はＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いてカウントされた。
【０３６８】
腫瘍細胞由来の条件培地の収集。６７ＮＲ、１６８ＦＡＲＮ、４ＴＯ７及び６６Ｃ１４、及び４Ｔ１が分離されたＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｘ１．１の細胞が細胞株の項で記載の通り増殖された。９０％コンフルエンスに達した後、培地は無血清ＩＭＤＭに変更された。条件培地は２日間のインキュベーション後に収集され、細胞生存率及び総細胞数がＶｉ−ＣｅｌｌＸＲ（ベックマン・コールター、フラートン、カリフォルニア州）を用いて測定された。収集された培地はＥＬＩＳＡの項で説明される通りにサイトカインの存在について分析された。全てのデータは総細胞数に対して正規化された。
【０３６９】
インビボ血管外遊走アッセイ。６６ｃ１４又は４Ｔ１細胞を９０％コンフルエンスに達するまで増殖させ、製造業者のプロトコルに従って３０分間１０μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）で標識した。標識後、細胞はトリプシン処理され、ＰＢＳで洗浄され、カウントされ、ＰＢＳ１００μｌの１００,０００個の標識した細胞が、Ｇ−ＣＳＦの項に記載の通り、抗Ｂｖ８（２Ｂ９＋３Ｆ１）、抗Ｇｒ１、抗Ｇ−ＣＳＦ、又はアイソタイプコントロール（ＩＳＯ）抗体の存在下でマウスＧ−ＣＳＦ（マウス１匹あたり２．５μｇ、５日間毎日）で前処置されたＢａｌｂ／ｃヌードマウスの尾静脈から静脈注射された。陰性コントロールとして、標識されていない６６ｃ１４細胞又は４Ｔ１細胞がＧ−ＣＳＦ及びアイソタイプコントロール抗体（ＩＳＯ）で前処置されたマウスに注入された。Ｇ−ＣＳＦ及び抗体による処置は細胞接種後の別の日に続けられた。マウスは、細胞を接種した３６時間後に安楽死させ、肺はＰＢＳで灌流され、採取され、パラホルムアルデヒド中で固定された。固定肺はＯ．Ｃ．Ｔ．化合物（ティッシュテック、トーランス、カリフォルニア州）に埋め込まれ、凍結され、５μｍの切片が生成された。切片はＤＡＰＩで対比染色され、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄマウントメディア（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）で封入された。画像が取得され、蛍光標識された細胞が手作業でカウントされた。平均して群あたり３匹のマウスを使用され、１５枚の画像が（マウス１匹あたり５つのランダムな切片）分析に含まれた。最終的な値は、視野あたりの細胞数の平均値として示された。
【０３７０】
組織学的分析（Ｈ＆Ｅ）。ホルマリン固定組織が脱水され、パラフィン中に包埋された。５μｍの厚さの切片は脱脂され、再水和され、標準プロトコルに従ってヘマトキシリン及びエオシンで染色された。
【０３７１】
Ｂｖ８免疫組織化学（ＩＨＣ）。前述の通りにＢｖ８ ＩＨＣを行った (Shojaei, F. et al. Proc Natl Acad Sci U S A (2009))。簡単に言えば、６７ＮＲ腫瘍又は４Ｔ１腫瘍を有するＰＢＳで灌流したマウス由来の前転移性肺を採取し、中性緩衝ホルマリン中に固定した。５μｍ厚のパラフィン包埋切片は脱脂され再水和された。圧力なべの中でユニバーサルなｄｅｃｌｏａｋｅｒ緩衝液（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ，コンコルド、カリフォルニア州）を用いた抗原回復後、切片はペルオキシダーゼブロッキング試薬（ダコ、グロストラップ、デンマーク）で５分間ブロックの後、タンパク質ブロック溶液（ダコ、グロストラップ、デンマーク）で３０分間ブロックされた。切片は、次に、ハムスター抗ｍＢｖ８モノクローナル抗体２Ｄ３（ジェネンテック、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）、又はハムスターＩｇＧ１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、サンノゼ、カリフォルニア州）を室温で１時間、１０μｇ／ｍＬでインキュベートした。次に、切片を室温で30分間、ビオチン化ヤギ抗ハムスター抗体（ジャクソンイムノリサーチ社、ウエストグローブ、ペンシルバニア州）で染色し、続いてベクタステインＡＢＣエリート試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）とインキュベートした。切片は、次に、望まれる強度が生じるまで、ペルオキシダーゼ基質溶液（金属増強ＤＡＢ；ピアスケミカル、ロックフォード、イリノイ州）とともにインキュベートした。最後に切片はヘマトキシリンで軽く対比染色され、脱水され、封入された。
【０３７２】
ＥＬＩＳＡ。血漿はＥＤＴＡ処理管を用いて採取した。マウスはＰＢＳで灌流され、肺、脾臓、腫瘍、腎臓、骨髄組織の小片が採取され、液体窒素中で直ちに凍結された。組織は、続いて、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解され、総タンパク質含有量が、製造業者のプロトコル（ピアース）によるブラッドフォード法により測定され。説明したように、血漿及び組織溶解物中のＢｖ８タンパク質のレベルはＥＬＩＳＡにより測定された(Shojaei, F. et al. Nature 450, 825-831 (2007); Shojaei, F. et al. Proc Natl Acad Sci U S A (2009))。Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＤＦ１α、ＰｌＧＦ、ＶＥＧＦ及びＭＭＰ９のレベルは、種特異的ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステム、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いて測定された。全ての値は、総タンパク質含有量に正規化された。
【０３７３】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）。マウスはＰＢＳで灌流された。肺、脾臓、腫瘍、腎臓及び骨髄組織が収集され、小片に細かく刻まれ、単一細胞懸濁液を生成するためにろ過された。いくつかの実験において、腫瘍及び肺の組織片はコラゲナーゼ及びディスパーゼ（ロシュ）のブレンドにより酵素的に消化され、続いて１６ゲージ針の滴定を用いて機械的に解離された。赤血球はＡＣＫ溶解緩衝液（ロンザ、バーゼル、スイス）を用いて溶解した。細胞は、非特異的抗体結合を防止するため、以下のフルオロフォア標識抗体で染色する前に、ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州）とインキュベートされた：抗ｃｄ４５（３０−Ｆ１１）、抗ｃｄ１１ｂ（Ｍ１／７０）、抗Ｆ４／８０（ＢＭ８）、抗ｃｄ１１ｃ（Ｎ４１８）、抗ｃｄ１１７（２Ｂ８）（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴから）、抗Ｌｙ６Ｇ（１Ａ８）、抗Ｌｙ６Ｃ（ＡＬ−２１）、抗Ｇｒ１（ＲＢ６−８Ｃ５）、抗ＳｉｇｌｅｃＦ（Ｅ５０−２４４０）（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州から）、及び抗Ｆｌｔ−１（１４１５２２）（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）。ヨウ化プロピジウム（シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）が、生存細胞と死細胞を区別するために使用された。データは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ又はＢＤ ＬＳＲ ＩＩの機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ツリースター、アッシュランド、オレゴン州）又はＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａプログラムを用いて分析した。
【０３７４】
Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の選別。肺が調製され、「フローサイトメトリー」の項で説明の通り、Ｃｄ１１ｂ−ＡＰＣ及びＧｒ１−ＦＩＴＣ抗体により染色された。望みの細胞は、ＦＡＣＳ機器で選別され、その純度を確認し、ＲＮＡ単離の項で説明した通り直ちにＲＮＡが単離された。平均的に選別された個体群の純度は９９％であった。
【０３７５】
Ｐ−ＥＲＫイムノブロッティング。細胞を１０％ＦＣＳ／ＩＭＤＭの１００μｌあたり１０，０００の密度で播種した。２４時間後、培地は無血清ＩＭＤＭに変更され、細胞を２４時間飢餓にさせた。細胞を５、１０、１５及び２０分間、ヒトＢｖ８を５ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、ロッキーヒル、ニュージャージー州）で刺激し、直ちに溶解し、トリス−グリシンＳＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）で煮沸した。溶解物の等量がＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけられ、リン酸化又は全ｐ４４／ｐ４２ ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１及びＥＲＫ２）に対して特定の抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダンヴァーズ、マサチューセッツ州）でイムノブロットされた。
【０３７６】
マイクロＣＴ分析。肺の準備、イメージング及び分析は以前に詳細が記載されている(Caunt, M. et al. Cancer Cell 13, 331-342 (2008))。簡潔に言えば、マウスを５％イソフルラン麻酔で麻酔した。心臓及び肺が露出され、左心房及び右心房が除かれた。鈍い２４ゲージの針が右心室に挿入され、１０ｍｌのＰＢＳを肺血管から血液を除去するために灌流した。肺は解剖され、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で膨張させた。肺を、２４時間、１０％ＮＢＦに浸漬し、次いでＰＢＳで希釈したヨウ素系Ｘ線ＣＴ造影剤、Ｉｓｏｖｕｅ３７０（Ｂｒａｃｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、プリンストン、ニュージャージー州）の２０％溶液中に２４時間浸漬した。肺はその後、過剰の造影剤を除去するために大豆油（シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）の２０ｍｌにより気管を介して灌流した。イメージングのためのバックグラウンド・メディアを与えするために、肺は大豆油中で撮像された。
【０３７７】
マウスの肺は、μＣＴ４０（ＳＣＡＮＣＯ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂａｓｓｅｒｄｏｒｆ、スイス）Ｘ線マイクロコンピューター断層撮影（マイクロＣＴ）システムにより生体外で画像化された。マイクロＣＴ画像は、４５ｋＶ、１７７μＡの電流のエネルギーレベルにて、積分時間４５０ミリ秒でＸ線管を操作することにより生成された。軸方向の画像は、２０μｍの等方性分解能で得られた。肺腫瘍の推定値（数及び体積）は訓練を受けた読み手による検査工程を含む半自動画像解析アルゴリズムによって得られた。潜在的な腫瘍塊は、一連の画像処理工程により抽出された(Caunt, M. et al. Cancer Cell 13, 331-342 (2008))。画像解析ソフトウェアはＣ＋＋でコーディングされ、アナライズ（ＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ社（株）、Ｌｅｎｅｘａ、カンザス州、アメリカ）画像解析ソフトウェアライブラリが採用された。抽出されたオブジェクトは、次いでアナライズ３Ｄ可視化ソフトウェアにより訓練された読み手により評価された。個々のオブジェクトは、オブジェクトの外観及び肺内における位置に基づいて、可能な腫瘍として受け入れられるか又は拒絶された。腫瘍の数、個々の腫瘍体積及び総腫瘍体積がそれぞれの肺において決定された。
【０３７８】
生物発光イメージング（ＢＬＩ）。マウスは、２００ｍｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）の２００μＬが腹腔内に注射され、撮像中にノーズコーンを介しイソフルラン（ヘンリーシャイン、スパークス、ネバダ州）を用いて麻酔され、体温は加温パッドを使用して維持された。生物発光画像は遮光イメージングチャンバー（スタンフォードフォトニクス、パロアルト、カリフォルニア州）に固定された冷却強化電荷結合素子カメラを用いて得られた。画像取得時間は典型的には５分未満であった。画像は生物発光データ画像と共に参照画像を共記載することにより処理された。
【０３７９】
公知のマイクロアレイデータセットの分析。Ｂｌａｖｅｒｉ膀胱癌データセット(Blaveri, E. et al. Clin Cancer Res 11, 7012-7022 (2005)) はhttp://waldman.ucsf.edu/bladder/blaveri.cgh/からダウンロードされた。Ｃｈｉｎ乳癌データセット(Chin, K. et al. Cancer Cell 10, 529-541 (2006))はｃａＡｒｒａｙ (http://caarray.nci.nih.gov/)からダウンロードされ、Ｐａｗｉｔａｎ乳癌のデータ(Pawitan, Y. et al. Breast Cancer Res 7, R953-964 (2005)) は遺伝子発現情報データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/GSE1456)からダウンロードされた。二つの方法が生存分析で採用された：１）生存転帰とともに、連続的変数としてＧ−ＣＳＦ遺伝子発現の関連性の意義を評価するためのＣｏｘ比例ハザードモデル、２）各データセット内では、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子発現の最適な閾値は、ログランク検定を用いた一連のＧ−ＣＳＦ遺伝子発現の変位値カットオフを試験することにより選択された。カプラン-マイヤー生存曲線は、特定された最適なカットオフ値に基づいて２つのサブグループに対してプロットされ、その後Ｃｏｘモデルが２つのグループ間のハザード比を推定するために使用された。
【０３８０】
統計分析。特に断りのない限り、スチューデントｔ-検定は、統計分析の全てに使用され、ｐ値≦０．０５が有意であると見なされた。グラフは平均±標準誤差を示す。全ての実験は少なくとも二回繰り返され、代表的なデータが表示されている。胎児の肝臓移植実験における腫瘍研究の分析では、ポアソンの誤差及び分布の一般化線形モデルがデータにフィットされた。
【０３８１】
結果及び議論
転移は、固形腫瘍による死亡の主要な原因である。転移するためには、腫瘍細胞は分解し、細胞外マトリックスを侵し、血管内に侵入し、血液又はリンパ管を介して搬送され、二次部位で浸出し、最終的に二次腫瘍を確立する必要がある(Nguyen, D. X. & Massague, J. Nat Rev Genet 8, 341-352 (2007))。更に山のような証拠が、腫瘍が転移性腫瘍細胞の到達前に遠方の微小環境を変更し、いわゆる 「前転移ニッチ」を作成することができることを示唆している。離れた組織に影響を与える腫瘍のこの能力は、癌細胞が二次腫瘍の増殖を開始することができる特定の臓器を標的とすることを可能にし、「種と土壌」仮説を支持する(Paget, S. Cancer Metastasis Rev. 8(2),98-101 (1989))。骨髄由来細胞（ＢＭＤＣ）はニッチを密集させる主要な細胞型であると考えられている(Kaplan, R. N. et al. Nature 438, 820-827 (2005); Hiratsuka, S. et al. Nat Cell Biol 8, 1369-1375 (2006))。
【０３８２】
いくつかの分子が関与しているが(Kaplan, R. N. et al. Nature 438, 820-827 (2005); Hiratsuka, S. et al. Nat Cell Biol 8, 1369-1375 (2006); Yamamoto, M. et al. Cancer Res 68, 9754-9762 (2008); Kim, S. et al. Nature 457, 102-106 (2009); Erler, J. T. et al. Cancer Cell 15, 35-44 (2009)、腫瘍がニッチをイニシエートしするメカニズム及び転移におけるニッチの正確な役割は完全には理解されてない。遠隔部位で原発腫瘍により引き起こされる変化を特徴づけるために、我々は、いかなる腫瘍も無いマウス（ナイーブ）、対、前転移段階における非転移性（６７ＮＲ）乳癌又は転移性（４Ｔ１）乳癌を有するマウスに由来する全肺組織のｃＤＮＡマイクロアレイ解析を行った（図１Ａ）。モデルとして、我々は、非転移性細胞（６７ＮＲ、１６８ＦＡＲＮ）から転移のすべてのステップを完了することが可能な細胞（４ＴＯ７、６６ｃ１４及び４Ｔ１）に至る表現型スペクトルを提供する、マウス乳癌の４Ｔ１関連株(Dexter, D. L. et al. Cancer Res 38, 3174-3181 (1978); Aslakson, C. J. & Miller, F. R. Cancer Res 52, 1399-1405 (1992))を使用した（図５Ａ）。最近これらの細胞の分析は、転移を制御する新規遺伝子の同定を可能にした(Yang, J. et al. Cell 117, 927-939 (2004))。我々が検討した組織が本当に前転移性であるかを確認するために、ルシフェラーゼｚｓＧｒｅｅｎ及びハイグロマイシンを発現する４Ｔ１細胞（４Ｔ１−Ｌｕｃ・ｚｓＧ−Ｈｙｇ細胞）が第四乳腺脂肪パッドに同所接種され、肺を６日後に採取した。この時点で我々は、ハイグロマイシンを検出するｑＲＴ−ＰＣＲにより評価される通り、肺内にていかなる４Ｔ１−Ｌｕｃ−ｚｓＧ−Ｈｙｇ癌細胞をも検出できなかった（図５Ｂ及び図１０）。更に、生物発光イメージングはこの段階で肺内にルシフェラーゼ陽性４Ｔ１細胞を検出しなかった（図５Ｃ）。従って、我々の遺伝子発現解析で検出されたどのシグナルも癌細胞によるものではなかった。
【０３８３】
これらの研究で、肺に任意の検出可能な癌細胞が無い腫瘍増殖期間は、前転移段階(pre-metastatic phase)と呼ばれ、一方、肺に単一の癌細胞又は腫瘍でさえも我々が検出することができた段階は、転移段階(metastatic phase)と呼ぶことにする。
【０３８４】
我々の分析は、ナイーブマウス又は非転移性６７ＮＲ腫瘍を有するマウス由来の肺に比較して、４Ｔ１腫瘍を有するマウス由来の肺において２倍以上特異的に上方制御された２６０遺伝子及び下方制御された２７４遺伝子を同定した（図１Ａ）。上方制御された遺伝子の上位の一つである遺伝子であるＢｖ８に我々は焦点を当てた（図１Ｂ）。Ｂｖ８は、以前に血管新生促進因子(LeCouter, J. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 2685-2690 (2003))として、造血前駆細胞の増殖因子(LeCouter, J. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 16813-16818 (2004))として、及び神経調節物質(Cheng, M. Y. et al. Nature 417, 405-410 (2002); Matsumoto, S. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 4140-4145 (2006))としても特徴づけられた分泌タンパク質である。また、Ｂｖ８は、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄細胞によって発現され、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍の増殖を仲介することが最近示された(Shojaei, F. et al. Nature 450, 825-831 (2007))。肺組織中のＢｖ８発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析は、マイクロアレイの結果を確認した（図５Ｄ）。また、初めて我々は、前転移性肺における高いＢｖ８発現と調査した腫瘍の転移能との間に強い相関が認められることを発見した（図１Ｃ及び図５Ｅ）。Ｂｖ８はＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄細胞によって高度に発現され(Shojaei, F. et al. Nature 450, 825-831 (2007))、従って我々は、転移性腫瘍が骨髄由来のＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動員及びその後の肺へのホーミングによって肺の微小環境を修飾することができるという仮説を立てた。この仮説をテストするために、我々は前転移段階で肺組織に浸潤するＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度を測定した（図１Ｄ）。我々は、転移性腫瘍の４ＴＯ７、６６ｃ１４及び４Ｔ１を有するマウスではこれらの細胞数の増加を観察したが、非転移性腫瘍の６７ＮＲ及び１６８ＦＡＲＮを有するマウス由来の肺はＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の増加（図１Ｄ）を示さなかった（図１Ｄ）。更に、４Ｔ１腫瘍を有するマウスの肺から分離されたＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は強くＢｖ８を発現した（図５Ｆ）。しかし、我々は、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１−細胞においてほんのわずかのＢｖ８転写レベルを検出することができ、腫瘍なしのマウスから単離したＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞においては本質的に転写産物は無く、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞において原発性腫瘍はＢｖ８を上方制御する因子を分泌することを示唆している（図５Ｆ）。更に、我々は抗Ｂｖ８抗体を用いて肺組織を染色し、転移することができる腫瘍を有するマウスから単離した肺においてのみＢｖ８陽性細胞を検出することができた（図５Ｇ）。我々はまた、Ｂ１６Ｆ１０、ＬＬＣ、及び乳癌の遺伝的モデルのＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ等の更なる転移性腫瘍を有するマウスの前転移性肺においてＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度の増加を検出した（図５Ｈ）。同様に、我々は、これらのマウスの肺においてＢｖ８の発現増加を検出した（図５Ｉ）。従って、Ｂｖ８を発現するＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は前転移性微小環境の主要成分であるように見える。更にそのような微小環境の組成物を定義するために、我々はＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞を特徴づけ、前転移性肺における追加の細胞型を同定するためにＦＡＣＳ解析を行った（図１１Ａ）。そうした分析は、Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋顆粒球の特異的蓄積、及び４��１腫瘍を有するマウスの前転移性肺におけるＬｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ単球の適度な蓄積を明らかにした（図１１Ａ）。我々は、原発腫瘍に反応してマクロファージ（Ｆ４／８０＋細胞）、好酸球（ＳｉｇｌｅｃＦ＋細胞）又は樹状細胞の頻度において有意な変化を観察しなかった（例えば、図１１Ａを参照）。また、ナイーブ又は担癌マウスの肺にいかなる肥満細胞も検出しなかった。更に、頻度はＬｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ＋細胞よりもはるかに低かったものの、我々は前述したＶＥＧＦＲ１＋ＣＤ１１７＋造血前駆細胞の存在を検出した(Kaplan, RN et al., Nature 438, 820 (2005))（ＨＰＣにおいて２．７％対Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ＋細胞において２７％）（図１１Ａ）。我々は、転移性腫瘍が顆粒球（Ｃｄ４５＋Ｃｄ１１ｂ＋集団中のＬｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋細胞として定義される）の特異的蓄積及び単球（Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ細胞）の適度な蓄積を誘発すると結論した（図１１Ａ）。
【０３８５】
腫瘍細胞から分泌されるどのサイトカインがニッチをイニシエートすることに関与し得るかを決定するために、我々はいくつかの候補の血漿中濃度、即ち、ナイーブ又は担癌マウスにおける、血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)-Ａ、胎盤成長因子(ＰｌＧＦ)、ストローマ細胞由来因子(ＳＤＦ)１α、マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ(ＧＭ)-ＣＳＦ、顆粒球(Ｇ)-ＣＳＦ及びＢｖ８を測定した（図２Ａ）。驚くべきことに、Ｇ−ＣＳＦ及びＢｖ８血漿レベルのみが腫瘍の転移能力と相関していた。同様の相関関係が転移段階で見いだされた。我々はＧ−ＣＳＦが、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ腫瘍を有するマウスの血漿中においてもまた強く発現されることを見いだした。興味深いことに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を有するマウスにおいて、我々は隆起型腫瘍、及びヒト及びマウスのＧ−ＣＳＦの両方の血漿中濃度を検出し、腫瘍が浸潤された宿主細胞はまた、Ｇ−ＣＳＦの重要な源であることを示唆している（図１３Ｆ）。Ｇ−ＣＳＦは顆粒球の主要な調節因子であり、種々の細胞型によって生成され(Metcalf, D. Nature 339, 27-30 (1989))、骨髄由来の好中球の動員に重要な役割を果たし(Christopher, M. J. & Link, D. C. Curr Opin Hematol 14, 3-8 (2007))、最近では抗ＶＥＧＦ療法に対して不応性の腫瘍を媒介することが示された(Shojaei, F. et al. 106(16), 6742-6747 Proc Natl Acad Sci U S A (2009))。前転移ニッチの形成など、起源の腫瘍から離れたプロセスの潜在的な調節因子としてのＧ−ＣＳＦの別の魅力的な特徴は、その内分泌作用機序である(Metcalf, D. Nature 339, 27-30 (1989))。我々は、Ｇ−ＣＳＦがインビトロ及びインビボの両方で転移性腫瘍細胞により、しかし非転移性腫瘍細胞によってではなく、放出されることがわかった（図６Ａ及び図１１Ｂ）。また、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体による４Ｔ１担癌マウスの処置は、肺へのＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動員およびホーミングを防ぎ（図２Ｂ）、また、肺及び血漿中のＢｖ８レベルを減少させた（図６Ｂ）。これらのデータは、Ｇ−ＣＳＦは、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞において濃縮された前転移性微小環境をイニシエートため、転移性腫瘍により分泌される主要なサイトカインであることを示唆している。抗Ｂｖ８抗体による処置は、転移段階（腫瘍細胞接種５．５週間後）の間、少しも有意な影響を持っていなかったが、４Ｔ１腫瘍を有するマウスの前転移性肺へのＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動員を減少させた（図２Ｂ）。さらに、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体を用いたＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ担癌マウスの処置は、末梢血中へのＬｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ＋細胞の動員及び肺へのこれらの細胞のホーミングを阻止した（図１１Ｃ）。腫瘍増殖の後期段階における抗Ｂｖ８処置に対する反応の欠如は、原発腫瘍によって放出されるＧ−ＣＳＦの量が非常に多いことが原因であるかも知れない（図６Ｃ）。
【０３８６】
転移性腫瘍の進行におけるＧ−ＣＳＦ及びＢｖ８の意義に対処するために、我々はＢａｌｂ／ｃ又はＣＢ６Ｆ１マウスの第４乳腺脂肪パッドに６６ｃ１４腫瘍細胞又は４Ｔ１腫瘍細胞を同所性に接種し、それらを抗Ｂｖ８、抗Ｇ−ＣＳＦ又は両方の（組合わせ）抗体で処置した。処置は腫瘍細胞の接種２日後に開始され、転移性肺結節の数は、腫瘍細胞接種６週間後（６６ｃ１４モデルにおいて）又は５．５週間後（４Ｔ１モデルにおいて）に評価された。我々はこれらの腫瘍モデルにおける原発腫瘍の増殖に有意な変化を検出できなかったが（図６Ｄ及び６Ｅ）、抗Ｂｖ８又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体のどちらかで処置したマウスにおいて肺腫瘍の数に著しい減少を観察した。４Ｔ１腫瘍を有するマウスにおいて、対応するアイソタイプコントロール抗体群に比べた場合、抗Ｂｖ８抗体は目に見える腫瘍の数を５０％、抗Ｇ−ＣＳＦは６５％、及びその併用は７５％減少させた（図２Ｃ）。６６ｃ１４腫瘍を有するマウスにおいて、抗Ｂｖ８抗体処置は肺腫瘍数を３０％、及び抗Ｇ−ＣＳＦは４３％減少させた（図６Ｆ）。抗Ｂｖ８抗体で処置された６６ｃ１４又は４Ｔ１腫瘍を有するマウス由来の肺において、マイクロＣＴ解析がミクロ腫瘍及びマクロ腫瘍両方の詳細数を定量化するために用いられた場合に同様の結果が得られた（図２Ｄ）。重要なことは、４Ｔ１又は６６ｃ１４同所性腫瘍の転移は、ＢＭＭＮＣにおいてＢｖ８を欠損したマウスに腫瘍が接種された場合に、抗Ｂｖ８処置に匹敵するレベルにまで減少したことである（図１３Ａ、１３Ｂ、及び１３Ｃ）。続いて、我々は他の乳癌モデル、即ちヒトのＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１２Ａ）及びマウスＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ（図１３Ｄ）における抗Ｂｖ８抗体及び抗Ｇ−ＣＳＦ抗体の有効性を分析した。両方のモデルにおいて、抗Ｂｖ８抗体又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体の処置は、肺転移の減少をもたらした（図１２Ｂ及び１３Ｅ）。
【０３８７】
転移の発生におけるＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の役割を直接評価するために、同所性６６ｃ１４腫瘍を有するマウスが、抗Ｇｒ１抗体（単球及び好中球の両方が枯渇したクローンＲＢ６−８Ｃ５）又は抗Ｌｙ６Ｇ抗体（特に好中球が枯渇したクローン１Ａ８）で処置された(Daley, JM et al., J Leukoc Biol 83, 64 (2008))（図１２Ｃ）。各抗体による処置は、抗Ｂｖ８抗体又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体に匹敵する程度に肺転移数を著しく減少させた。しかしながら、抗Ｇｒ１抗体は、抗Ｌｙ６Ｇ処置に比べてわずかに顕著な転移の阻害をもたらし、Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ＋好中球は検証されたモデルにおいて転移に大きく関与しているが、単球もまたこのプロセスに貢献する可能性があることを示している。
【０３８８】
我々はＧ−ＣＳＦが積極的に転移を調節するという仮説を直接検証することを求めた。まず、Ｇ−ＣＳＦ投与が前転移ニッチをイニシエートするのに十分であるかどうか求めた。我々は、組換えＧ−ＣＳＦ（ｒＧ−ＣＳＦ）を５日間連続で毎日処置されたマウスにおいて、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度を分析した（図３Ａ）。我々はＢＭ、末梢血及び脾臓においてこれらの細胞の顕著な増加を検出し、ｒＧ−ＣＳＦの送達はＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動員を誘導した。注目すべきことに、我々は肺のＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度の大幅な増加を検出し（図３Ａ）、この後Ｂｖ８の発現増加が続いた（図３Ｂ）。更に、検証された腫瘍の転移の標的となる別の臓器である肝臓において、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度の増大、及びＢｖ８の発現の増強を観察した。我々は、腎臓等、通常転移の標的とされていない組織においてはＢｖ８発現の増大を検出しなかった（図３Ｂ）。これらの影響が強化された転移能をもたらすかどうかを決定するために、マウスは、尾静脈を介して腫瘍細胞の注射前と後の５日間連続してｒＧ−ＣＳＦで処置された。これは、我々に、血管外遊走、生存及び遠隔臓器での腫瘍の増殖等の転移の最終段階におけるＧ−ＣＳＦの潜在的な役割、及びＧ−ＣＳＦがイニシエートした前転移ニッチに焦点を当てる機会を与えた。我々は、非転移性腫瘍細胞株６７ＮＲ、又は複数の侵襲性細胞株、６６ｃ１４、４Ｔ１、及びＢ１６Ｆ１０をマウスに注入した。ｒＧ−ＣＳＦを処置されたマウスは肺腫瘍の数の有意な増加を示した（図３Ｃ及び３Ｄ）。その後、目に見える腫瘍の数に対応し、肺腫瘤の有意な増大が続いた（図７Ａ）。注目すべきことに、非転移性細胞株６７ＮＲは、マウスが一度Ｇ−ＣＳＦで前処置されると、肺に転移性挙動を示した（図３Ｅ）。Ｇ−ＣＳＦにより前処置されたマウスにおける腫瘍の信憑性は、更にＨ＆Ｅ染色切片の組織学的分析により確認された（図７Ｂ）。
【０３８９】
Ｇ−ＣＳＦによって誘導される前転移ニッチにおけるＢｖ８の役割を定義するために、マウスはｒＧ−ＣＳＦ及び抗Ｂｖ８抗体で処置された。抗Ｂｖ８抗体処置は大幅に肺の中のＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞数の増加を低減させた（図７Ｃ）。更に抗Ｇｒ１抗体は、完全にＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞におけるＧ−ＣＳＦの効果を消滅させた。同様に、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体による処置は完全にＧ−ＣＳＦの効果を阻止した（図７Ｃ）。続いて、更にＧ−ＣＳＦ駆動転移におけるＢｖ８の役割を調べるために、我々は抗Ｂｖ８抗体の存在下又は非存在下においてＧ−ＣＳＦにより前処置したマウスに尾静脈を介して６６ｃ１４又は４Ｔ１細胞を注入した。抗Ｂｖ８抗体処置はＧ−ＣＳＦによって誘導される６６ｃ１４（図３Ｆ）、４Ｔ１（図７Ｄ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１４Ａ）肺転移を有意に減少させた。抗Ｇｒ１抗体又は抗Ｌｙ６Ｇ抗体による処置もまた顕著にＧ−ＣＳＦの効果を阻害し（図１４Ｂ、図３Ｆ及び図７Ｄ）、好中球がＧ−ＣＳＦによって誘導される前転移性プライミング及び転移に主に関与していることを示している。我々はまた、抗ＶＥＧＦ抗体がＧ−ＣＳＦ誘導転移を防ぐことができるかどうかを検証した。抗Ｂｖ８処置とは対照的に、抗ＶＥＧＦ療法はＧ−ＣＳＦの効果を抑制せず（図７Ｅ）、Ｇ−ＣＳＦが促進する肺転移は、ＶＥＧＦ依存性であることを示唆している。最近他の抗血管新生療法が使用されたとき報告されたように、我々は抗ＶＥＧＦ抗体の存在下での転移性腫瘍量の増加を検出しなかったことは注目に値する(Paez-Ribes, M. et al. Cancer Cell 15, 220-231 (2009); Ebos, J. M. et al. Cancer Cell 15, 232-239 (2009))。
【０３９０】
ＶＥＧＦ受容体(ＶＥＧＦＲ)-１は、以前に前転移ニッチ内の造血細胞により発現されることが報告されたため(Kaplan, R. N. et al. Nature 438, 820-827 (2005))、我々は更に、ＶＥＧＦ受容体(ＶＥＧＦＲ)-１の発現に関して、Ｇ−ＣＳＦに応答して肺にホーミングする骨髄細胞の集団を特徴づけた。ｒＧ−ＣＳＦの注射後、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度の増加（図７Ｇ）と一致した、肺におけるＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋ＶＥＧＦＲ１＋細胞の頻度の有意な増加を我々は検出した（図７Ｆ）。より詳細な分析で、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の約４４％％がＶＥＧＦＲ１＋であることを明らかにした（図７Ｈ）。しかし、この値はｒＧ−ＣＳＦ投与により有意な影響は受けなかった（図７Ｈ）。従って、我々の結果は、Ｇ−ＣＳＦによって誘導される前転移ニッチにおけるＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１+ 細胞は、ニッチをイニシエートすると以前報告された細胞の特徴を部分的に共有することを示している(Kaplan, R. N. et al. Nature 438, 820-827 (2005))。
【０３９１】
マイクロアレイ解析では、Ｂｖ８に加えて、前転移性肺が、例えばＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８(Hiratsuka, S. et al. Cancer Cell 2, 289-300 (2002); Acuff, H. B. et al. Cancer Res 66, 259-266 (2006))及びＳ１００Ａ９(Hiratsuka, S. et al. Nat Cell Biol 8, 1369-1375 (2006)) のような、転移を促進することが以前に示されている数多くの要因に富んでいることが明らかになった（図１Ｂ）。ＭＭＰ−９は肺の環境において腫瘍細胞の浸潤(Hiratsuka, S. et al. Cancer Cell 2, 289-300 (2002)) 及び生存 (Acuff, H. B. et al. Cancer Res 66, 259-266 (2006))を促進することが示されているが、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９は、肺の中に骨髄及び腫瘍細胞の補充を仲介することが示されている(Hiratsuka, S. et al. Nat Cell Biol 8, 1369-1375(2006))。Ｇ−ＣＳＦ／Ｂｖ８軸はそれらの分子の調節を介して、少なくとも部分的に、その転移促進効果を遂行する可能性があるかどうかを調べるために、我々は、ｒＧ−ＣＳＦを処置されたマウスの肺におけるそれらの発現レベルを測定した。我々は３つの分子全てが有意に上方制御されることを見いだした（図８Ａ）。抗Ｂｖ８抗体処置は有意にＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９のＧ−ＣＳＦ誘導発現を減少させた（図８Ａ）。これは、抗Ｂｖ８で処置したマウスの肺におけるＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の減少頻度と相関していた（図７Ｃ）。再び、同所接種腫瘍の実験と同様に、抗Ｂｖ８抗体の効果はマウスがｒＧ−ＣＳＦを低用量処置された場合にのみ検出されたが（図７Ｃ）、ｒＧ−ＣＳＦの最大用量が注入された場合には検出されなかった。Ｇ−ＣＳＦに曝された肺から選別されたＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は、Ｂｖ８とともに、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の有意な量を発現した（図８Ｂ）。同様の結果が同所性に４Ｔ１細胞が接種され、抗Ｂｖ８又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体で処置されたマウスで得られた（図２Ｃ）。ＭＭＰ−９の発現は前転移性肺における抗Ｂｖ８抗体処置により有意に減少したが（図８Ｃ）、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体による処置もまた転移性肺においてＭＭＰ−９の発現を減少させた（図８Ｃ）。ＭＭＰ−９発現の減少は肺におけるＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度の減少と相関していた（図２Ｂ）。従って、我々のデータは前転移性微小環境の発生においてＧ−ＣＳＦをＢｖ８、ＭＭＰ−９、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａの上流に位置付けている。
【０３９２】
抗Ｂｖ８抗体処置は肺転移の発生におけるＧ−ＣＳＦの効果を効率的に防いだ（図３Ｆ及び図７Ｄ）。しかしながら、同じ処置は、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の、前転移性肺へのＧ−ＣＳＦ誘導動員及びホーミングを部分的にのみ阻害した（図Ｃ）。この知見は、Ｂｖ８が転移を促進するメカニズムは、肺組織へのＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動員を調節することによって部分的にしか説明されないことを示唆している。Ｂｖ８が追加のメカニズムにより転移を調節するかどうかを究明するために、我々はＢｖ８が腫瘍細胞に直接影響を及ぼす可能性があるかどうかを求めた。我々は、非転移性及び転移性腫瘍細胞の両方でＢｖ８受容体（ＰＫＲ−１／ＧＰＲ７３及びＰＫＲ−２／ＧＰＲ７３Ｌ１）の発現レベルを測定した。非転移性細胞株（６７ＮＲ及び１６８ＦＡＲＮ）はＰＫＲ−１に関して非常に低いか又は検出不可能なレベルを示したのに対し、我々は、転移性腫瘍細胞株（４ＴＯ７、６６ｃ１４、４Ｔ１、並びにＢ１６Ｆ１０及びＬＬＣ）においてＰＫＲ−１の有意な発現を検出することができた（図４Ａ）。我々は、ＬＬＣを除いて、検証された細胞株のいずれにおいてもＰＫＲ−２を検出できなかった（図４Ａ）。ＰＫＲ−１が機能性であるかどうかを決定するために、我々はＢｖ８で腫瘍細胞を刺激し、次いでリン酸化ＥＲＫ１／２のレベルを測定した（図８Ｄ）。我々は、転移性細胞株においてのみＢｖ８に応答した有意なＥＲＫ１／２活性化を検出することができ、これらの細胞においてＢｖ８シグナル伝達が実際に機能していることを示唆している（図８Ｄ）。Ｂｖ８は骨髄細胞の遊走を促進することが示されている(Chin, K. et al. Cancer Cell 10, 529-541 (2006))。従って、我々はＢｖ８もまた転移性腫瘍細胞の遊走を促進しうる可能性を検討した。実際、我々はＢｖ８の増加する濃度に応答した遊走の増加を検出した（図４Ｂ）。対照的に、非転移性細胞株はＢｖ８に応答した遊走の増大を一切示さなかった。従って、前転移ニッチへのＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動員およびホーミングを調節することに加えて、Ｂｖ８は、腫瘍細胞に対して直接的な影響を介して転移を調節する可能性がある。最後に、Ｇ−ＣＳＦによって誘導される前転移ニッチがインビボでの腫瘍細胞の遊走を促進することを確認するため、我々は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（注入された細胞のインビボ追跡を容易にするため）で蛍光標識した４Ｔ１又は６６ｃ１４細胞を、Ｂｖ８、抗Ｇｒ１又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体の存在下又は非存在下において、Ｇ−ＣＳＦで前処置したＢａｌｂ／ｃヌードマウスに注入した。我々は３６時間後に、血管外遊出して肺組織を播種することが可能な腫瘍細胞の数を評価した。我々は、マウスコントロールと比較してＧ−ＣＳＦで前処置したマウスの肺における腫瘍細胞数の有意な増加を検出した（図４Ｃ及び４Ｄ、及び図８Ｅ）。この効果は抗Ｂｖ８抗体の投与により著しく減少した。同様の結果は、マウスが抗Ｇｒ１抗体又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体で処置された場合に得られた（図４Ｃ及び４Ｄ、及び図８Ｅ）。
【０３９３】
６７ＮＲ細胞はＧ−ＣＳＦで前処置したマウスの尾静脈から注射された場合に転移特性を示し（図３Ｅ）、これはＧ−ＣＳＦで刺激された肺におけるＭＭＰ９及び他の転移促進分子の発現の実質的な増加に起因する可能性が高い。我々は、６７ＮＲ細胞の転移がＰＫＲ−１の過剰発現によって増強される可能性があると推測した。実際に、６６ｃ１４細胞に匹敵するレベルでの６７ＮＲ細胞におけるＰＫＲ−１の過剰発現は（図１６Ａ）、Ｇ−ＣＳＦで前処置したマウスにおいて６７ＮＲ転移の著しい増大をもたらした（図１５Ａ）。逆に、コントロールｓｈＲＮＡを発現する細胞と比較した場合、ＰＫＲ−１欠損６６ｃ１４細胞（図１６Ｂ）はＧ−ＣＳＦ誘導転移の数を著しく減少させた（図１６Ｃ）。従って、Ｂｖ８はインビボで腫瘍細胞に対する化学誘引物質として作用し、前転移性肺中へそれらの血管外遊出を促進することが可能である。
【０３９４】
Ｇ−ＣＳＦ又はＰＫＲ−１の発現が肺にコロニーを形成する腫瘍細胞において高いレベルで維持されているかどうかを決定するために、原発腫瘍に宿るか又は肺に転移を生成する能力があるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するインビボクローン選択を行った（図１５Ｃ）。類似した方法は、肺 (Minn, AJ et al,, Nature 436, 518 (2005))及び他の臓器(Bos, PD et al,, Nature 459, 1005 (2009); Lu, X et al,, Genes Dev 23, 1882 (2009))に対して乳癌の転移を仲介する遺伝子セットを特定するために以前使用されている。遺伝子発現プロファイリングにより、肺から単離されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、原発腫瘍から単離された細胞又は親細胞と比較した場合に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−９及び以前に同定されたＣｘｃｌ１及びＭＭＰ−１とともに、Ｇ−ＣＳＦ及びＰＫＲ−１の両方について非常に高いレベルを発現することが明らかにされた（図１５Ｂ）。重要なことに、ＰＫＲ−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＤＦ１α、ＶＥＧＦ−Ａ又はＰｌＧＦの発現の増加は検出されず、転移するために、癌細胞が選択的にＧ−ＣＳＦ及びＰＫＲ−１を含む遺伝子の狭いグループの発現を増加させることを示唆している。
【０３９５】
我々は、原発腫瘍におけるＧ−ＣＳＦの発現と疾患の転帰との間の潜在的な関連を特定するために公的に利用可能なデータベースを調べた。我々は、マイクロアレイデータの３つのセットを分析した：２つは乳癌患者由来のもの（Ｐａｗｉｔａｎ乳癌及びチン乳癌データセット(Pawitan, Y. et al. Breast Cancer Res 7, R953-964 (2005); Chin, K. et al. Cancer Cell 10, 529-541 (2006)及び一つは膀胱癌患者由来である（Ｂｌａｖｅｒｉ膀胱癌データセット(Blaveri, E. et al. Clin Cancer Res 11, 7012-7022 (2005))。我々は、乳癌患者の生存とＧ−ＣＳＦの高発現との間に強い負の相関を同定した（図４Ｅ及び図９Ａ）。我々は、膀胱癌患者で同様の相関関係を同定した（図９Ｂ）。詳細な統計分析は、図９Ｃに示される。
【０３９６】
多くの研究において、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞及び他の骨髄細胞型はマウスモデルにおける腫瘍の増殖を促進することが示されている(Yang, L. et al. Cancer Cell 6, 409-421 (2004); Shojaei, F. et al. Nat Biotechnol 25, 911-920 (2007); De Palma, M. et al. Trends Immunol 28, 519-524 (2007); Murdoch, C. et al. Nat Rev Cancer 8, 618-631 (2008))。重要なことは。そのヒトカウンターパートも同様に癌患者で過剰生産されていることが判明している(Almand, B. et al. J Immunol 166, 678-689 (2001); Young, M. R. & Lathers, D. M. Int J Immunopharmacol 21, 241-252 (1999))。最近では、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞がＭＭＰ及びＴＧＦ−β１の増産を通じて原発腫瘍部位に浸潤や転移を促進することが示されている(Yang, L. et al. Cancer Cell 13, 23-35 (2008))。
【０３９７】
本明細書中、データは転移におけるＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の役割は原発腫瘍に限定されないことを示唆しており、我々は、これらの細胞が血管外遊走、二次腫瘍の生存及び増殖等の転移の最終段階をサポートする微小環境を創るために前転移性肺に濃縮されていることを初めて示した（図４Ｆ）。腫瘍が分泌したＧ−ＣＳＦは、ＢＭ由来のＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞を動員し、またＢｖ８発現も誘発する。今度はＢｖ８がＢＭ由来のＣｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞に対する化学誘引物質として作用し、腫瘍細胞の到達前に肺にそれらのホーミングを促進する。一度肺の中に入ると、Ｃｄ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞はＢｖ８、ＭＭＰ−９及びＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の起源としての役割を果たす。これらの分子は、肺へのＢＭＤＣの浸潤又は更なる動員を促進することにより、転移を促進することができる(Hiratsuka, S. et al. Cancer Cell 2, 289-300 (2002); Acuff, H. B. et al. Cancer Res 66, 259-266 (2006); Yang, L. et al. Cancer Cell 6, 409-421 (2004))。我々はまた、Ｇ−ＣＳＦで前処置されたマウスの肝臓におけるＢｖ８の発現増加を検出し、Ｇ−ＣＳＦ及びＢｖ８の転移促進効果が肺に限らず他の臓器にもまた存在している可能性があることを示唆している。
【０３９８】
開示を通して引用された全ての参照は、本明細書においてその全体が参考により明示的に援用される。
【０３９９】
本発明は特定の実施態様であると考えられているものを参照して説明されているが、本発明はこのような実施態様に限定されないことが理解されるべきである。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれる様々な変形及び均等物をカバーするものである。
【０４００】
特許請求の範囲を含む本願の全体を通して、「含む（comprising）」なる用語は、更なる記載されていない要素又は方法工程を排除しない包括的でオープンエンドな移行句として使用される。
【図１Ｂ】
2013500993.tif 000005
【図１Ｃ】
2013500993.tif 000006
【図１Ｄ】
2013500993.tif 000007
【図２Ａ】
2013500993.tif 000008
【図２Ｂ】
2013500993.tif 000009
【図２Ｃ】
2013500993.tif 000010
【図３Ａ】
2013500993.tif 000011
【図３Ｂ】
2013500993.tif 000012
【図３Ｃ】
2013500993.tif 000013
【図３Ｅ】
2013500993.tif 000014
【図３Ｆ】
2013500993.tif 000015
【図４Ａ】
2013500993.tif 000016
【図４Ｂ】
2013500993.tif 000017
【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
2013500993.tif 000019
【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
2013500993.tif 000021
【図５Ｂ】
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【図５Ｄ】
2013500993.tif 000023
【図５Ｅ】
2013500993.tif 000024
【図５Ｆ】
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【図５Ｈ】
2013500993.tif 000026
【図５Ｉ】
2013500993.tif 000027
【図６Ａ】
2013500993.tif 000028
【図６Ｂ】
2013500993.tif 000029
【図６Ｃ】
2013500993.tif 000030
【図６Ｄ】
2013500993.tif 000031
【図６Ｅ】
2013500993.tif 000032
【図６Ｆ】
2013500993.tif 000033
【図７Ａ】
2013500993.tif 000034
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2013500993.tif 000036
【図７Ｅ】
2013500993.tif 000037
【図７Ｆ】
2013500993.tif 000038
【図７Ｇ】
2013500993.tif 000039
【図７Ｈ】
2013500993.tif 000040
【図８Ａ】
2013500993.tif 000041
【図８Ｂ】
2013500993.tif 000042
【図８Ｃ】
2013500993.tif 000043
【図８Ｅ】
2013500993.tif 000044
【図９Ａ】
2013500993.tif 000045
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
2013500993.tif 000048
【図１１Ａ】
2013500993.tif 000049
【図１１Ｂ】
2013500993.tif 000050
【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
2013500993.tif 000052
【図１２Ｂ】
2013500993.tif 000053
【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2013500993.tif 000056
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
2013500993.tif 000058
【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
2013500993.tif 000063
【図１５Ｂ】
2013500993.tif 000064
【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１Ａ】
2013500993.tif 000069
【図２Ｄ】
2013500993.tif 000070
【図３Ｄ】
2013500993.tif 000071
【図４Ｃ】
2013500993.tif 000072
【図５Ｃ】
2013500993.tif 000073
【図５Ｇ】
2013500993.tif 000074
【図７Ｂ】
2013500993.tif 000075
【図８Ｄ】
2013500993.tif 000076
【配列表】
2013500993000001.app
【国際調査報告】
2013500993.tif 000077
2013500993.tif 000078
2013500993.tif 000079
2013500993.tif 000080