(57)【要約】  本明細書に示される式（Ｉ）の化合物。血中コレステロールレベルを下げ、癌、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、アルツハイマー病、及び角膜環を治療するための上記化合物の一の使用方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
2013500986.tif 000018
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、またはスルホン酸基であり、
Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ６、およびＲ６’は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、若しくはスルホン酸基であり、またはＲ３およびＲ３’は一緒に若しくはＲ６およびＲ６’は一緒に＝Ｏであり；
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３、およびＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、またはアミノ基であり；
ＡおよびＤは、それぞれ独立して、欠失しているまたはアルキレン基であり；
ＸおよびＹは、それぞれ独立して、アルキル基であり；ならびに
Ｚは、ヒドロキシル基またはアルコキシ基である、
を有する化合物。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ヒドロキシル基、またはアミノ基であり；ならびにＲ１０およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子またはアルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、それぞれ、水素原子であり；ならびにＲ１０およびＲ１３は、それぞれ、メチル基である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３およびＲ６は、それぞれ、ＯＨであり、Ｒ３’およびＲ６’は、それぞれ、Ｈである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
ＸおよびＹは、それぞれ、ハロアルキル基であり、Ｚは、ヒドロキシル基である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
ＸおよびＹは、それぞれ、ＣＦ３であり、Ｚは、ヒドロキシル基である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
ＡおよびＤは、それぞれ、欠失している、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
ＡはＣＨ２であり、Ｄは欠失している、請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
Ａは欠失していて、ＤはＣＨ２である、請求項６に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ３およびＲ３’は一緒に＝Ｏであり、Ｒ６はＯＨであり、およびＲ６’はＨである、請求項３に記載の化合物。
【請求項１１】
ＸおよびＹは、それぞれ、ＣＦ３であり、Ｚはヒドロキシル基である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
ＡおよびＤは、それぞれ、欠失している、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
ＡはＣＨ２であり、Ｄは欠失している、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ａは欠失していて、ＤはＣＨ２である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ６およびＲ６’は一緒に＝Ｏであり、Ｒ３はＯＨであり、およびＲ３’はＨである、請求項３に記載の化合物。
【請求項１６】
ＸおよびＹは、それぞれ、ＣＦ３であり、Ｚはヒドロキシル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
ＡおよびＤは、それぞれ、欠失している、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
有効量の請求項１に記載の化合物を、血中コレステロールレベルを下げる必要のある患者に投与することを有する、血中コレステロールレベルの低減方法。
【請求項１９】
有効量の請求項１に記載の化合物を、アテローム性動脈硬化症を治療する必要のある患者に投与することを有する、アテローム性動脈硬化症の治療方法。
【請求項２０】
有効量の請求項１に記載の化合物を、癌を治療する必要のある患者に投与することを有する、癌の治療方法。
【請求項２１】
有効量の請求項１に記載の化合物を、糖尿病を治療する必要のある患者に投与することを有する、糖尿病の治療方法。
【請求項２２】
有効量の請求項１に記載の化合物を、アルツハイマー病を治療する必要のある患者に投与することを有する、アルツハイマー病の治療方法。
【請求項２３】
有効量の請求項１に記載の化合物を、角膜環を治療する必要のある患者に投与することを有する、角膜環の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００９年７月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／２２９，３８６号の優先権を主張するものである。この先願は、全体を参考で本明細書中に引用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
核受容体上科(super-family)に属する、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）は、コレステロール代謝及び恒常性に関する遺伝子の発現を調節する。２つのＬＸＲアイソフォーム、即ち、ＬＸＲα及びＬＸＲβ、が、同定されている。ＬＸＲα発現は肝臓、腎臓、腸、脂肪組織、マクロファージ、肺、及び脾臓に限定されるが、ＬＸＲβはほとんどすべての組織及び器官で発現する。
【０００３】
ＬＸＲは、脂質の代謝及びＡｐｏＥ遺伝子の発現を調節する。動脈での脂質の蓄積はアテローム性動脈硬化症を引き起こし、角膜での脂質の蓄積は角膜環を引き起こす。例えば、Zech et al., Lipids in Health and Disease 2008, 7: 7を参照。ＡｐｏＥ遺伝子の発現の欠損は、アルツハイマー病等の病気の原因となる。例えば、Artiga et al., Human Molecular Genetics 1998, 7: 1887を参照。ゆえに、ＬＸＲアゴニストを用いることにより、アテローム性動脈硬化症、角膜環、及びアルツハイマー病を治療できる。
【０００４】
ＬＸＲはまた、インスリンの分泌を刺激して、炎症や自己免疫反応を阻害する。Jamroz-Wisniewska et al., Postepy Hig Med Dosw. 2007, 61:760を参照。ゆえに、ＬＸＲアゴニストを用いることにより、糖尿病 （例えば、１型糖尿病）や炎症／自己免疫疾患を治療できる。
【０００５】
さらに、ＬＸＲの活性化により、様々な器官（例えば、脳、肺、血液、前立腺、乳、及び皮膚）の癌の発症に鍵となる役割を果たす、ヘッジホッグシグナル伝達経路が阻害されることが分かった。例えば、Watkin et al., Nature, 2003, 442: 313-317を参照。ゆえに、ＬＸＲアゴニストを用いることにより、癌を治療できる。例えば、Chu et al., Journal of biomedical science, 2007, 14(5): 543-553を参照。
【発明の概要】
【０００６】
発明の要約
本発明は、非常に有効なＬＸＲアゴニストの発見に基づくものである。
【０００７】
本発明の一態様は、下記式（Ｉ）：
【０００８】
【化１】
2013500986.tif 000002
【０００９】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、またはスルホン酸基であり；Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ６、及びＲ６’は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、またはスルホン酸基であり、またはＲ３およびＲ３’は一緒に若しくはＲ６およびＲ６’は一緒に＝Ｏであり；Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３、及びＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、またはアミノ基であり；Ａ及びＤは、それぞれ独立して、欠失しているまたはアルキレン基であり；ＸおよびＹは、それぞれ独立して、アルキル基であり；ならびにＺは、ヒドロキシル基またはアルコキシ基である、の化合物に関する。
【００１０】
式（Ｉ）に関して、前記化合物の一つのサブセットとしては、以下の態様の一以上がある：ＸおよびＹは、それぞれ、ハロアルキル基（例えば、ＣＦ３）である；Ｚは、ヒドロキシル基であり、Ｒ３およびＲ６は、それぞれ、ＯＨであり、及びＲ３’およびＲ６’は、それぞれ、Ｈである；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ヒドロキシル基、またはアミノ基である（例えば、それぞれが水素原子である）；Ｒ１０およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子またはアルキル基である（例えば、それぞれがメチル基である）；ならびにＡおよびＤは、それぞれ、欠失している、ＡはＣＨ２でありかつＤは欠失している、またはＡは欠失していてかつＤはＣＨ２である。
【００１１】
式（Ｉ）に関して、前記化合物の他のサブセットとしては、以下の態様の一以上がある：ＸおよびＹは、それぞれ、ハロアルキル基（例えば、ＣＦ３）である；Ｚは、ヒドロキシル基である；Ｒ３およびＲ３’は一緒に＝Ｏであり、Ｒ６はＯＨであり、およびＲ６’はＨである；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ヒドロキシル基、またはアミノ基である（例えば、それぞれが水素原子である）；Ｒ１０およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子またはアルキル基である（例えば、それぞれがメチル基である）；ならびにＡおよびＤは、それぞれ、欠失している、ＡはＣＨ２でありかつＤは欠失している、またはＡは欠失していてかつＤはＣＨ２である。
【００１２】
式（Ｉ）に関して、前記化合物のさらなるサブセットとしては、以下の態様の一以上がある：ＸおよびＹは、それぞれ、ハロアルキル基（例えば、ＣＦ３）である；Ｚは、ヒドロキシル基である；Ｒ６およびＲ６’は一緒に＝Ｏであり、Ｒ３はＯＨであり、およびＲ３’はＨである；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ヒドロキシル基、またはアミノ基である（例えば、それぞれが水素原子である）；Ｒ１０およびＲ１３は、それぞれ独立して、水素原子またはアルキル基である（例えば、それぞれがメチル基である）；ならびにＡおよびＤは、それぞれ、欠失している、ＡはＣＨ２でありかつＤは欠失している、またはＡは欠失していてかつＤはＣＨ２である。
【００１３】
上記した「アルキル基(alkyl)」、その接頭の「アルク(alk)」（例えば、アルコキシ(alkoxy)等における）、および接尾の「−アルキル基(-alkyl)」（例えば、ヒドロキシアルキル基やハロアルキル基等における）ということばはすべて、１価のＣ１−１８の直鎖または分岐鎖の炭化水素基を意味し、必要であれば、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基で置換されてもよく、また、必要であれば、−ＮＨ−、−Ｎ（アルキル）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｏ−ＳＯ２−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ３−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ’−、または−ＮＲ’−ＣＯ−が挿入されてもよい。
【００１４】
「アルキレン基」ということばは、２価のＣ１−１８の直鎖または分岐鎖の炭化水素基（例えば、−ＣＨ２−）を意味する。
【００１５】
本発明のコレステロール化合物の例としては、以下がある：
【００１６】
【化２】
2013500986.tif 000003
【００１７】
上記化合物はまた、妥当である場合には、その塩およびそのプロドラッグを包含する。例えば、このような塩は、本発明の化合物の正電荷を帯びた置換基（例えば、アミノ基）およびアニオンの間に形成されてもよい。適当なアニオンとしては、以下に制限されないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、および酢酸塩がある。同様にして、本発明の化合物の負電荷を帯びた置換基（例えば、カルボキシレート）がカチオンと塩を形成してもよい。適当なカチオンとしては、以下に制限されないが、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、及びテトラメチルアンモニウムイオン等のアンモニウムイオンがある。プロドラッグの例としては、患者に投与されると、上記ステロイド化合物を提供できる、エステルおよび他の製薬上許容できる誘導体がある。
【００１８】
本発明の他の態様は、有効量の本発明の化合物および製薬上許容できる担体を含む薬剤組成物に関する。このような化合物を用いて血中のコレステロールレベルを低下させ、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、アルツハイマー病、角膜環、炎症性疾患、及び癌等のＬＸＲが仲介する病気を治療する方法、ならびにコレステロールレベルを低下させ、これらの病気のいずれかを治療する際に使用される薬剤の製造のためのこのような化合物の使用もまた本発明の範囲に含まれる。
【００１９】
本発明のいくつかの化合物の詳細を下記説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は下記説明からおよび特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明の化合物は、適当な既知のステロイド化合物を出発材料として用いて調製できる。既知のステロイド化合物の例としては、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、及びコラン酸(cholanoic acid)がある。これらは、市販されてもあるいは文献、例えば、Roda et al., F. Lipid Res., 1994, 35: 2268-2279; and Roda et al., Dig. Dis. Sci., 1987, 34: 24S-35Sに記載の方法によって合成されてもよい。これらのステロイド化合物は、既知の方法により本発明の化合物に変換できる。例えば、本発明の特定の化合物を、市販のヒオデオキシコール酸（３α，６α−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸(3α,6α-dihydroxy-5β-cholan-24-oic acid)、Sigma, St. Louis, Mo）から調製してもよい。下記スキーム１に示されるように、保護されたヒオデオキシコール酸をα−セレニル化(α-selenylation)する。得られたセレニル生成物を酸化して、α，β−不飽和エステルを形成した後、これをジ（イソ−ブチリル）アルミナヒドライド(di(iso-butryl)alumina hydride)によって還元して、アルデヒド化合物を形成する。このアルデヒドを、トリメチル（トリフルオロメチル）シランと反応させることによってアルコールに変換する。例えば、米国特許第７，０１２，０６９号を参照。次に、このアルコールにデス−マーチン反応(Dess-Martin reaction)を行って、ケトン化合物を形成する。Dess et al., J. Org. Chem., 1983, 38: 4155を参照。このケトンを再度トリメチル（トリフルオロメチル）シランで処理して、２つのトリフルオロメチル基でα−置換された、アルコールを得る。
【００２１】
【化３】
2013500986.tif 000004
【００２２】
また、上記合成経路で調製されたα，β−不飽和エステルを用いて、本発明の他の化合物を合成してもよい。下記スキーム２参照：
【００２３】
【化４】
2013500986.tif 000005
【００２４】
上記したように、α，β−不飽和エステルを酸化することにより、α，β−エポキシドエステルが得られ、これを酸性条件で脱カルボキシル化し、アルデヒドに変換する。このアルデヒドにウィッティヒ反応(Wittig reaction)を行って、α，β−不飽和エステルを得るが、これは出発材料に比べてメチレン部分をさらに含む。このα，β−不飽和エステルを、スキーム１で使用したのと同様の方法によって本発明の化合物（上記）に変換する。
【００２５】
下記スキーム３は、本発明の化合物への他の合成経路を示すものである。簡単にいうと、ヒオデオキシコール酸を開裂酸化によりアルケン化合物に変換し、これを、グラブス触媒(Grubb’s catalyst)の存在下でオレフィンメタセシス反応により他のアルケン化合物と反応させる。
【００２６】
【化５】
2013500986.tif 000006
【００２７】
上記方法を修飾して、本発明の他のコレステロール化合物を調製してもよい。例えば、化合物１の３−または６−ヒドロキシル基を部分的に酸化して、化合物２及び３を得るが、これらはそれぞれ３−または６−位にオキソ基を有する。また、上記方法は、本発明のコレステロール化合物を最終的に合成できるように、適当な保護基を付加または除去する工程を有していてもよい。加えて、合成段階を別の並び(sequence)または順番(order)で行って、所望の化合物を得てもよい。適当なコレステロール化合物を合成する際に使用できる合成化学変換及び保護基方法（保護及び脱保護）は当該分野において既知であり、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994);ならびにL. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)および次版に記載される方法がある。
【００２８】
本発明の化合物は、ＬＸＲアゴニストであり、アテローム性動脈硬化症、糖尿病（例えば、１型糖尿病）、アルツハイマー病、角膜環、炎症性／自己免疫疾患、及び癌等の、ＬＸＲが仲介する病気を治療するのに使用できる。ゆえに、本発明は、有効量の上記コレステロール化合物のいずれかを患者に投与することによるＬＸＲが仲介する病気の治療方法に関する。「治療する(treating)」または「治療(treatment)」ということばは、治療効果を得る、例えば、ＬＸＲが仲介する病気、上記病気の症状、または上記病気になりやすい素因を治療する(cure)、和らげる(relieve)、変える(alter)、影響を与える(affect)、改善する(ameliorate)、または予防する(prevent)ことを目的として、ＬＸＲが仲介する病気を患っている、このような病気の症状を有している、またはこのような病気になりやすい素因を持っている、患者に、活性のある化合物を投与することを意味する。「有効量」とは、処置される患者に治療効果を与えるのに必要な化合物の量を意味する。（１ｍ２体表面積当たりのｍｇ基準での）動物及びヒトに関する投与量の相互関係は、Freireich et al., Cancer Chemother. Rep. 1966, 50, 219に記載される。有効量は、当業者には認識されるように、投与経路、賦形剤の使用、及び他の治療のための処置との任意的な併用によって、異なる。
【００２９】
「癌」ということばは、特定の細胞が制御不能な成長、浸潤、および／または転移を行う病気を意味する。癌の例としては、以下に制限されないが、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、脳腫瘍、肺癌、及び白血病が挙げられる。
【００３０】
本発明の方法によって治療できる炎症性疾患としては、以下に制限されないが、喘息、アテローム性動脈硬化症、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、虚血性心疾患、心筋症、糸球体腎炎、腎炎症候群、Ｃ型肝炎感染症、及び呼吸器合胞体ウイルス感染症（肺）が挙げられる。
【００３１】
本発明の方法によって治療できる自己免疫疾患としては、以下に制限されないが、アレルギー性脳症(allergic encephalopathy)、慢性閉塞性肺疾患、乾癬、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症が挙げられる。
【００３２】
本発明の方法を実施するにあたっては、１以上のコレステロール化合物を含む組成物を、非経口で、経口で、経鼻的に、直腸内に、局所的に、または口腔に投与できる。本明細書中で使用される「非経口」ということばは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、または頭蓋内注射、さらには適当な輸注技術を意味する。
【００３３】
滅菌注射用製剤は、非毒性の非経口で許容できる希釈剤または溶剤における溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオールにおける溶液であってもよい。使用できる許容できるベヒクルや溶剤の中には、マンニトール、水、リンガー溶液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、固定油が、溶剤または懸濁媒体として従来使用される（例えば、合成モノまたはジグリセリド）。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体等の、脂肪酸が、注射剤の調製に使用でき、特にポリオキシエチレン化された型の、オリーブ油またはヒマシ油等の、天然の製薬上許容できる油もまた同様にして使用できる。また、これらの油溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤若しくは分散剤、カルボキシメチルセルロースまたは同様の分散剤を含んでもよい。ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）もしくはスパン（Ｓｐａｎ）等の、他の一般的に使用される界面活性剤または製薬上許容できる固体、液体、または他の投与形態の製造に一般的に使用される他の同様の乳化剤若しくはバイオアベイラビリティ促進剤もまた、配合目的で使用されうる。
【００３４】
経口投与用の組成物は、カプセル、錠剤、エマルジョンならびに水性懸濁液、分散液および溶液などの経口投与が許容できる投与形態であってもよい。錠剤の場合には、一般的に使用される担体としては、ラクトース及びコーンスターチがある。ステアリン酸マグネシウム等の滑剤もまた一般的に添加される。カプセル形態での経口投与では、使用できる希釈剤としては、ラクトースや乾燥コーンスターチがある。水性懸濁液またはエマルジョンを経口投与する場合には、活性成分を乳化剤または懸濁化剤と組み合わせた油相中に懸濁または溶解することができる。必要であれば、特定の甘味剤、風味剤、または着色剤を添加してもよい。
【００３５】
鼻エアロゾルまたは吸入用組成物を、製剤処方の分野で既知の技術に従って調製してもよい。例えば、このような組成物を、ベンジルアルコールまたは他の適当な防腐剤、バイオアベイラビリティを促進するための吸収促進剤、フッ化炭素、および／または当該分野において既知の他の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、生理食塩水における溶液として調製してもよい。
【００３６】
また、１以上の活性のあるコレステロール化合物を含む組成物を、直腸投与用の坐剤の形態で投与してもよい。
【００３７】
薬剤組成物における担体は、組成物の活性成分と適合し（好ましくは、活性成分を安定化でき）、処置される患者に有害でないという意味で「許容でき」なければならない。１以上の可溶化剤を、活性のある化合物のデリバリーのための製薬賦形剤として使用してもよい。他の担体の例としては、コロイド酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＃  １０が挙げられる。
【００３８】
上記コレステロール化合物は、インビトロでのアッセイ（下記実施例２参照）によってＬＸＲアゴニストとして作用する場合の有効性について予めスクリーニングした後、動物モデル、例えば、ＬＸＲが仲介する病気を有するマウスを用いてインビボでのアッセイ（下記実施例３及び４参照）によって確認してもよい。他の方法もまた、当業者には明らかであろう。ＬＸＲが仲介する病気の治療に有用である投与量は、このインビボでのアッセイの結果に基づいて決定されうる。
【００３９】
下記特定の実施例は、単に詳細に説明するものであり、何であれ、残りの開示部分を制限するものではないと、解されるべきである。さらなる努力なしで、当業者は、本明細書の記載に基づいて、十分本発明を利用できると、考えられる。本明細書に挙げられるすべての公報は、全体を参考で本明細書中に引用される。
【００４０】
実施例１：化学合成
（Ａ）ヒオデオキシコール酸のメチル化物の調製
【００４１】
【化６】
2013500986.tif 000007
【００４２】
１．０Ｌのメタノールにおける出発材料（１６２ｇ、０．４１ｍｏｌｅ）の溶液に、１０ｍｌの濃Ｈ２ＳＯ４を添加した。この混合物を室温で４時間撹拌した。ＴＬＣから、反応の終了が示された。次に、この反応溶液を飽和ＮａＨＣＯ３で中和し、蒸発させて溶剤を除去した。残った残渣を酢酸エチルで希釈し、水及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶剤を濃縮して、１６８ｇ（１００％）の未精製のメチルエステルを得、これを次工程に直接使用した。
【００４３】
（Ｂ）ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロライド(tert-butyldimethylsilyl chloride)によるヒドロキシル基の保護
【００４４】
【化７】
2013500986.tif 000008
【００４５】
１．０ＬのＤＭＦにおける上記反応から得られた未精製のメチルエステル（１６５ｇ、０．４０ｍｏｌｅ）の溶液に、トリエチルアミン（１７０ｍＬ、１．２ｍｏｌｅ）、ＤＭＡＰ（４．９５ｇ、３％ｗ／ｗ）、及びＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（１２１ｇ、０．８０ｍｏｌｅ）を添加した。この反応混合物を４０℃で一晩撹拌した。ＴＬＣから、反応の終了が示された。ほとんどのＤＭＦを留去した後、残渣を２．０Ｌの酢酸エチルに溶解した後、３回水洗した（１．５Ｌ、１．０Ｌ、５００ｍｌ）。水層を合わせて、１．０Ｌの酢酸エチルで抽出した。抽出層を２回水洗した（３００ｍｌ、１００ｍｌ）。有機層を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させることによって、２５３ｇの未精製産物を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、２２１ｇ（８７％）の精製ＴＢＤＭＳ保護産物を得た。
【００４６】
（Ｃ）α−セレン化物の調製
【００４７】
【化８】
2013500986.tif 000009
【００４８】
上記ＴＢＤＭＳ保護産物（１７２ｇ、０．２７ｍｏｌｅ）を８７０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解した。４８ｍＬのＨＭＰＡ（０．２７ｍｏｌｅ）を添加した。この反応混合物を、アセトン／ドライアイス浴中で−７２℃に冷却した。ＬＤＡ（ヘキサン中で１．５Ｍ、３６５ｍＬ、０．５５ｍｏｌｅ）をこの溶液に滴下した。この混合物を−７２℃で１時間さらに撹拌した後、１時間かけてＴＨＦ（無水、２３０ｍＬ）におけるＰｈＳｅＣｌ（７８ｇ、０．４ｍｏｌｅ）を添加した。この反応混合物を室温にまで加温し、一晩放置した。反応が終了したら、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（２００ｍｌ）でクエンチした。有機相を除去して、１００ｍｌ×３で水洗した。水相を酢酸エチル（２００ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせたものをＮａ２ＳＯ４で乾燥した後、真空中で濃縮して、油状の残渣を得、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン、１：１００〜１：３０）によって精製した。生成物は、黄色の固体として得られた（１３０．５ｇ、収率：６１％）。
【００４９】
（Ｄ）セレノキシド酸化
【００５０】
【化９】
2013500986.tif 000010
【００５１】
このα−フェニルセレニル化合物（１２０ｇ、０．１５ｍｏｌｅ）を、ジクロロメタン（８００ｍＬ）に溶解した。２４ｍＬのピリジン（０．３０ｍｏｌｅ）を添加した後、１２０ｍＬの水における過酸化水素（３５ｗ／ｗ％水溶液、３６ｇ、０．３７ｍｏｌｅ）を、室温で上記溶液にゆっくり添加した。得られた混合液を３０〜３５℃で１時間撹拌した。反応が終了したら、反応溶液を飽和ＮａＨＣＯ３（１４０ｍＬ）でクエンチした。水相をジクロロメタンで２回抽出した（２００ｍｌ、１００ｍｌ）。有機相を合わせたものを水洗し（２００ｍｌ×２）、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン、１：１００〜１：３０）で精製した。生成物は、淡黄色の固体として得られた（８８ｇ、収率  ９３％）。
【００５２】
（Ｅ）メチルエステルのＤＩＢＡＬ還元
【００５３】
【化１０】
2013500986.tif 000011
【００５４】
７０ｇのメチルエステル（０．１１ｍｏｌｅ）を１５０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解した。この混合液をアセトン／ドライアイス浴で−７８℃まで冷却した後、２９３ｍＬの１．５Ｍ  ＤＩＢＡＬ／トルエン溶液を滴下した。得られた混合液を−７８℃で１時間撹拌した後、さらに２時間かけて室温まで加温した。５００ｍＬの５Ｍ  塩化アンモニウム溶液をゆっくり添加して、反応物をクエンチした。有機層を分離して、２回水洗し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、５４ｇ（８１％）の未精製のアルコール産物を得、これを次のステップの反応に直接使用した。
【００５５】
（Ｆ）アルコールからアルデヒドへの酸化
【００５６】
【化１１】
2013500986.tif 000012
【００５７】
５４ｇのアルコールを、窒素雰囲気中で１ＬのドライＣＨ２Ｃｌ２に添加した。この混合物を−５０℃に冷却した後、ＤＭＳＯ（５２ｍｌ）を滴下した。次に、塩化オキサリル（３１ｍＬ）を加えた。この反応混合物を−５０℃で０．５時間撹拌した後、トリエチルアミン（１２７ｍＬ）を添加し、得られた混合物を０〜２５℃で１時間撹拌した。飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（２Ｌ）を添加して、反応物をクエンチした。さらに１５分間撹拌した後、より多量のＣＨ２Ｃｌ２を添加して、生成物を抽出した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３、さらにブラインで洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。次に、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー精製し、アルデヒド産物３９ｇ（７２％）を得た。
【００５８】
（Ｇ）アルデヒドのトリフルオロメチルトリメチルシランとの反応
【００５９】
【化１２】
2013500986.tif 000013
【００６０】
窒素雰囲気下で、３３．２ｇ（５５ｍｍｏｌｅ）のアルデヒドを３９０ｍＬのＴＨＦに溶解した。２００ｍｇのＣｓＦを添加して、１０分間撹拌した後、９．３９ｇ（６６ｍｍｏｌｅ）のＣＦ３Ｓｉ（ＣＨ３）３を滴下した。得られた混合物を一晩撹拌した後、溶剤を減圧下で除去した。残渣を酢酸エチル（３００ｍＬ）に溶解し、５％  ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。残渣を短カラムクロマトグラフィー(short column chromatography)で精製し、２６ｇ（７０％）のトリフルオロメチル産物を得た。
【００６１】
（Ｈ）トリフルオロメチル−アルコールのトリフルオロ−ケトンへの酸化
【００６２】
【化１３】
2013500986.tif 000014
【００６３】
窒素雰囲気下で、１６．６７ｇ（３９．３ｍｍｏｌｅ）のＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬を、３００ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２におけるトリフルオロメチル化合物２４ｇ（３５．７ｍｍｏｌｅ）の溶液に添加した。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。５００ｍＬのエチルエーテルを加えて、多くの固体を沈殿させた。この固体を濾過し、エチルエーテルで洗浄した。有機相を合わせたものを飽和ＮａＨＣＯ３、次にブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空中で濃縮して、残渣を得、これをカラムクロマトグラフィーで精製して、２１．１ｇ（８０％）のトリフルオロメチル−ケトン産物を得た。
【００６４】
（Ｉ）トリフルオロメチル−ケトンのトリフルオロメチルトリメチルシランとの反応
【００６５】
【化１４】
2013500986.tif 000015
【００６６】
窒素雰囲気下で、２０ｇ（２９．８ｍｍｏｌｅ）のトリフルオロケトンを２５０ｍＬのＴＨＦに溶解した。１５０ｍｇのＣｓＦを添加して、１０分間撹拌した後、５．０９ｇ（３５．８ ｍｍｏｌｅ）のＣＦ３Ｓｉ（ＣＨ３）３を滴下した。得られた混合物を一晩撹拌した後、溶剤を減圧下で除去した。残渣を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解し、５％  ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を短カラムクロマトグラフィー(short column chromatography)で精製し、１５．９ｇ（７２％）のジ−トリフルオロメチル産物を得た。
【００６７】
（Ｊ）ＴＢＤＭＳ保護基の除去による化合物１の生成(Removal of the TBDMS Protecting Group to Compound 1)
【００６８】
【化１５】
2013500986.tif 000016
【００６９】
１５．９ｇ（２１．５ｍｍｏｌｅ）のジ−トリフルオロメチル化合物を、１００ｍＬのエタノールに溶解した。１ｍＬの濃ＨＣｌを添加した。この混合物を室温で２時間撹拌した。１ｍＬの１２Ｎ  ＮａＯＨを添加し、混合物を濃縮して、大部分のエタノールを除去した。１００ｍＬの酢酸エチル及び３０ｍＬの水を添加した。有機層を分離し、水洗し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、残渣を得た後、これをカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物をさらにエーテルで結晶化した。９．７ｇ（８８％）の精製化合物１が得られ、生成物の構造をＮＭＲ分析によって確認した。
【００７０】
（Ｋ）カルボン酸の酸化的切断(oxidative Cleavage)
【００７１】
【化１６】
2013500986.tif 000017
【００７２】
２．５Ｌのドライベンゼンにおける出発材料（５００ｇ）の溶液に、３０ｇの酢酸銅(cuprous acetate)及び３２ｍＬのドライピリジンを添加した。この反応混合物を７５℃にまで加温した。９２０ｇの酢酸鉛（ＶＩ）をゆっくり添加した。得られた混合物を一晩還流した。濾過し、固体をベンゼンで洗浄した後、大部分のベンゼンを減圧下で蒸発させた。残渣を２回カラムクロマトグラフィーで精製して、３５．４ｇの精製生成物を得た。
【００７３】
実施例２：レポーター遺伝子アッセイ
化合物１のＬＸＲアゴニストとしての作用能を、Graham et al., Virology, 1973, 52:456に記載される方法に従ってルシフェラーゼを用いたレポーター遺伝子アッセイ(luciferase-based reporter gene assay)を用いて試験した。アッセイは下記のとおりである：
４８ウェルプレートのウェルに、１０％チャコール処理ウシ胎児血清(charcoal-stripped fetal bovine serum)を含むダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s modified Eagle’s media)（ＤＭＥＭ＋１０％  ＣＳ−ＦＢＳ）０．２５ｍＬ中で５０，０００個のヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）細胞を播種した。ＨＥＫ２９３細胞に、リン酸カルシウム共沈法(calcium phosphate co-precipitation method)(Graham et al., Virology, 1973, 52:456)を用いて様々なプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。各ウェルに、６０ｎｇのホタルルシフェラーゼを用いたレポータープラスミド(firefly luciferase-based reporter plasmid)、６０ｎｇのヒトＬＸＲαまたはＬＸＲβ  ｃＤＮＡを含むｐＳＧ５、０．６ｎｇのウミシイタケルシフェラーゼノーマリゼーションプラスミド(sea pansy luciferase normalization plasmid)ｐｈＲＬ−ＴＫ(Promega)、及び２２０ｎｇのｐＢＳ／ＳＫ＋ＩＩを含むトランスフェクションミックス（１．３６ｍＬ  トランスフェクション成分及び１１．５ｍＬ  ＤＭＥＭ＋１０％  ＣＳ−ＦＢＳ）０．２５ｍＬを添加した。ホタルルシフェラーゼを用いたレポータープラスミドは、ＬＸＲ  ＤＲ−４レスポンスエレメント(response element)の４コピーから構成され、各コピーは、ｃ−ｆｏｓの最小プロモーター（−５６〜＋１０９）の上流の配列：ＡＧＧＴＣＡＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡがホタルルシフェラーゼ遺伝子(Promega, Madison, WI)を含むプラスミドｐＧＬ３−ＢａｓｉｃのＳｍａ  Ｉ部位に挿入されてなる。５時間後、このトランスフェクションミックスを除き、様々な濃度の試験化合物を含むＤＭＥＭ＋１０％  ＣＳ−ＦＢＳで置換した。４８時間後、培地を除いて、細胞を、０．１  ｍＬのpassive lysis buffer(Promega)を用いて溶解した。溶解物におけるホタル及びウミシイタケルシシフェラーゼ活性を、デュアルシフェラーゼアッセイ(dual luciferase assay)(Promega)及びモノライトルミノメーター(Monolight luminometer)を用いて測定した。ホタルルシフェラーゼ活性を各サンプルにおいてウミシイタケルシフェラーゼ活性に正規化した。ホタルルシフェラーゼレポータープラスミドの活性化倍率(fold activation)を、試験化合物の存在及び不存在下での正規化された相対発光量(relative light units)から算出した。
【００７４】
結果から、化合物１は非常に有効なＬＸＲアゴニストであることが示された。
【００７５】
実施例３：コレステロールレベルの減少
Ｃ５７ＢＬ／６バックグランドにおける８週齢のオスＬＤＬＲ−／−マウス（Jackson Laboratoryから得た）に、８週間、粥腫発生用の餌(atherogenic diet)(TD94059, Harlan TEKLAD, Madison, WI)を与えた。同時期、このマウスに、Gao et al., Int J Pharm 1998, 161:75-86に記載される方法によって調製したマイクロエマルジョン中で３〜５ｍｇ／ｋｇの投与量で強制飼養によって毎日化合物１を投与した。コントロール群（ベヒクル）には、化合物１を含まないマイクロエマルジョンを投与した。８週間後、マウスを４時間絶食させ、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔をかけた。血液サンプルを各マウスの眼窩静脈叢(retro-orbital plexus)から集めた。２００μｌの血漿を、タンデムＳｕｐｅｒｏｓｅ６ファストプロテイン液体クロマトグラフィーカラム(tandem Superose 6 fast protein liquid chromatography column)(Reardon et al., 2001)で分画した。偶数のファストプロテイン液体クロマトグラフィー画分における及び血漿サンプルにおけるコレステロール及びトリグリセリドを、市販のキット(Stanbio Laboratory, Boerne, TX)を用いて測定した。
【００７６】
サンプルの分析から、化合物１で処置したマウスでは、血中のコレステロール及びトリグリセリドレベルが顕著に減少したことが分かった。また、３ｍｇ／ｋｇの投与量では、化合物１は、ＶＬＤＬコレステロール及びトリグリセリドレベルは減少させたが、ＨＤＬコレステロールレベルは減少させず、５ｍｇ／ｋｇの投与量では、ＶＬＤＬ及びＬＤＬコレステロールならびにトリグリセリドレベルは減少させたが、ＨＤＬコレステロールレベルは減少させないことが示された。
【００７７】
次に、これらのマウスをＰＢＳで次にパラホルムアルデヒドで経心臓的に灌流した。心臓及び上部血管系(upper vasculature)を除いて、Reardon et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001, 21:1011-1016に記載されるのと同様にして、組織学用に調製した。
【００７８】
腕頭動脈中の病変部を、１００μｍずつで分け、大動脈弓との腕頭動脈の分岐から１５０〜４５０μｍ抹消側に位置する、４つのデジタル処理で捕捉されたオイルレッドＯ−染色された(digitally captured oil red O-stained)１０μｍの切片を用いて定量した。上行胸部大動脈中の病変部を、１００μｍずつで分け、大動脈弓の小弯の先端の１００〜３００μｍ下に位置する３つの切片から評価した。大動脈洞の病変部を、１００μｍずつで分け、冠状動脈が見える部位で始まる３つの切片から評価した。OpenLabソフトウェア  バージョン３．１．５を定量に使用した。
【００７９】
腕頭動脈及び上行胸部大動脈では、動脈硬化性プラークの大きさが、５ｍｇ／ｋｇ／日の化合物１で処置したマウスでは顕著に減少した。大動脈基部では、平均アテローム性動脈硬化症の面積が、３ｍｇ／ｋｇ／日の化合物１で処置したマウス及び５ｍｇ／ｋｇ／日の化合物１で処置したマウス双方で顕著に減少した。
【００８０】
実施例４：１型糖尿病の予防および治療
本実験は、１型糖尿病を処置する際の、化合物１及び他のステロイド化合物、即ち、３α，６α，２４−トリヒドロキシ−２４，２４−ジ（トリフルオロメチル）−５β−コラン[3α,6α,24-trihydroxy-24,24-di(trifluoromethyl)-5β-cholane]の有効性を比較するために行った。
【００８１】
６週齢のメスの非肥満糖尿病マウスを３群に分けた（各群１０〜１２匹のマウス）。２つの群は、それぞれ、１０及び２０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物１で８週間処置した。３番目の群はまた、１０ｍｇ／ｋｇ／日の３α，６α，２４−トリヒドロキシ−２４，２４−ジ（トリフルオロメチル）−５β−コランで８週間処置した。血漿中のグルコールレベルを、１２週〜３４週の間、毎週観察した。
【００８２】
他の実施形態
本明細書中に開示されるすべての特徴は、いずれの組み合わせで組み合わせてもよい。本明細書中に開示される各特徴は、同じ、等価の、または同様の目的を果たす別の特徴で置換されてもよい。ゆえに、特記しない限り、開示される各特徴は、包括的な一連の等価のまたは同様の特徴の一例でしかない。
【００８３】
上記説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認でき、本発明の概念および範囲から逸脱することなく、本発明を様々に変更したり修飾したりして、様々な用法や疾患に適用できる。例えば、上記共役体に構造が類似した共役体をまた、作製し、上記活性についてスクリーニングし、本発明を実施するのに使用することができる。ゆえに、他の実施形態もまた、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【国際調査報告】
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