(57)【要約】  本発明は、抗ＬＲＰ６抗体及びそれを使用する方法を提供する。本発明の特定の態様では、複数のＷｎｔアイソフォームによりシグナル伝達を阻害する二重特異性抗ＬＲＰ６の抗体を提供する。
2013529060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＲＰ６に結合する単離された抗体であって、第一のＷｎｔアイソフォームによって誘導されるシグナル伝達を阻害し、第二のＷｎｔアイソフォームによって誘導されるシグナル伝達を増強する抗体。
【請求項２】
第一のＷｎｔアイソフォームが、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
第二のＷｎｔアイソフォームが、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、及びＷｎｔ１０ｂからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
第一のＷｎｔアイソフォームが、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択され、第二のＷｎｔアイソフォームが、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、及びＷｎｔ１０ｂからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
第一のＷｎｔアイソフォームが、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
第二のＷｎｔアイソフォームが、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
第一のＷｎｔアイソフォームが、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂからなる群から選択され、第二のＷｎｔアイソフォームが、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
抗体が、ＬＲＰ６のＥ３−Ｅ４領域に結合する、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９】
抗体が、ＬＲＰ６のＥ１−Ｅ２領域に結合する、請求項１又は５から７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された抗体。
【請求項１１】
抗体がＬＲＰ６のＥ１−Ｅ２領域に結合し、かつＬＲＰ６のＥ３−Ｅ４領域に結合する、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体が、Ｗｎｔ１とＷｎｔ３ａの組合わせにより誘導されるＷｎｔシグナル伝達を阻害する、請求項１０又は１１に記載の抗体。
【請求項１３】
抗体が自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する、請求項１０、１１、又は１２に記載の抗体。
【請求項１４】
ＬＲＰ６への結合について、請求項１から１３の何れか一項に記載の抗体と競合する抗体。
【請求項１５】
請求項１から１３の何れか一項に記載の抗体と細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲート。
【請求項１６】
請求項１から１５の何れか一項に記載の抗体と薬学的に許容される担体を含有する薬学的製剤。
【請求項１７】
医薬としての使用のための、請求項１から１４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
癌又は骨格障害の治療に使用される、請求項１から１４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
第一のＷｎｔアイソフォームによって誘導されるシグナル伝達の阻害と、第二のＷｎｔアイソフォームによって誘導されるシグナル伝達の増強に使用される、請求項１から１４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
医薬の製造における、請求項１から１４の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２１】
医薬が、癌又は骨格障害を治療する、請求項２０の使用。
【請求項２２】
医薬が、第一のＷｎｔアイソフォームによって誘導されるシグナル伝達の阻害と、第二のＷｎｔアイソフォームによって誘導されるシグナル伝達の増強に使用される、請求項２０の使用。
【請求項２３】
請求項１から１５の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法。
【請求項２４】
癌が、非小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、及び前立腺癌からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）ＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害する単離された抗体、及び
ｂ）ＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害する単離された抗体
の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法。
【請求項２６】
ａ）ＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａに誘導されるシグナル伝達を阻害する単離された抗体、及び
ｂ）ＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂにより誘導されるシグナル伝達を阻害する単離された抗体
の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法。
【請求項２７】
ａ）ＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａに誘導されるシグナル伝達を阻害する単離された抗体、及び  
ｂ）ＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、及びＷｎｔ１０ｂにより誘導されるシグナル伝達を阻害する単離された抗体
の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法。
【請求項２８】
請求項１から１４の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、骨格障害を有する個体を治療する方法。
【請求項２９】
骨格障害が、骨粗しょう症、変形性関節症、骨折、及び骨病変からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
個体におけるＷｎｔアイソフォームにより誘導されるＷｎｔシグナル伝達を増強する方法において、Ｗｎｔアイソフォームにより誘導されるＷｎｔシグナル伝達を増強するために、請求項１から１４の何れか一項に記載の抗体及びＷｎｔアイソフォームの有効量を個体に投与することを含む方法。
【請求項３１】
抗体が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択されるＶＨを含む抗体、ＬＲＰ６に結合する単離された抗体。
【請求項３２】
抗体が、配列番号１０及び配列番号１２からなる群から選択されるＶＬを含む、ＬＲＰ６に結合する単離された抗体。
【請求項３３】
抗体が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５の重鎖からのＶＨからなる群から選択されるＶＨと、配列番号１０及び配列番号１２の軽鎖からのＶＬからなる群から選択されるＶＬを含む、ＬＲＰ６に結合する単離された抗体。
【請求項３４】
抗体が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含む、ＬＲＰ６に結合する単離された抗体。
【請求項３５】
抗体が、配列番号１０及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＬＲＰ６に結合する単離された抗体。
【請求項３６】
抗体が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１０及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＬＲＰ６に結合する単離された抗体。
【請求項３７】
抗体が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体。
【請求項３８】
抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含む第一のＶＨと、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第二のＶＨを含む、請求項３７に記載の二重特異性抗体。
【請求項３９】
抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む第一のＶＨと、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第二のＶＨを含む、請求項３７に記載の二重特異性抗体。
【請求項４０】
抗体が、配列番号１３のアミノ酸配列を含む第一のＶＨと、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第二のＶＨを含む、請求項３７に記載の二重特異性抗体。
【請求項４１】
抗体が、配列番号１０及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを更に含む、請求項３７から４０の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項４２】
抗体が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含む、ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する二重特異性抗体。
【請求項４３】
抗体が、配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む第一のＶＨと、配列番号１５のアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む第二のＶＨを含む、請求項４２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４４】
抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む第一のＶＨと、配列番号１５のアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む第二のＶＨを含む、請求項４２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４５】
抗体が、配列番号１３のアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む第一のＶＨと、配列番号１５のアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む第二のＶＨを含む、請求項４２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４６】
抗体が、配列番号１０及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを更に含む、請求項４２から４５の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項４７】
ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体であって、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインと、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインとを含む抗体。
【請求項４８】
ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体であって、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号19のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つのＶＨ ＨＶＲ配列の全てを含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つのＶＨ ＨＶＲ配列の全てを含む第二のＶＨドメインを含む抗体。
【請求項４９】
ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体であって、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む抗体。
【請求項５０】
ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体であって、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３ 配列番号２１からの三つのＶＨ ＨＶＲ配列の全てを含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つのＶＨ ＨＶＲ配列の全てを含む第二のＶＨドメインを含む抗体。
【請求項５１】
ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体であって、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３ 配列番号１９から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む抗体。
【請求項５２】
ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体であって、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つのＶＨ ＨＶＲ配列の全てを含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つのＶＨ ＨＶＲ配列の全てを含む第二のＶＨドメインを含む抗体。
【請求項５３】
抗体が、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３  配列番号２７から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を更に含む、請求項４７から５２の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５４】
抗体が、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３  配列番号２７から選択される、三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を更に含む、請求項４７から５２の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５５】
抗体が、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３  配列番号２８から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を更に含む、請求項４７から５２の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５６】
抗体が、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３  配列番号２８から選択される、三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を更に含む、請求項４７から５２の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５７】
ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体であって、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第一のＶＨと、配列番号９、配列番号１１、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨからなる群から選択される第二のＶＨを含む抗体。
【請求項５８】
配列番号１０又は配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含む、請求項５７に記載の二重特異性抗体。
【請求項５９】
配列番号１５のアミノ酸配列を含む第一のＶＨ、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む第二のＶＨ、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項５７に記載の二重特異性抗体。
【請求項６０】
Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害し、かつＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害する、請求項３７から５９の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６１】
抗体が、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、及びＷｎｔ１０ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害する、請求項３７から５９の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６２】
抗体が自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する、請求項３７から５９の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６３】
ＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害し、かつＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂからなる群から選択されたＷｎｔアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害する単離された二重特異性抗体。
【請求項６４】
抗体が、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、及びＷｎｔ１０ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害する、請求項６２に記載の二重特異性抗体。
【請求項６５】
ＬＲＰ６への結合について、請求項３７から６４の何れか一項に記載の二重特異性抗体と競合する抗体。
【請求項６６】
請求項３７から６４の何れか一項に記載の二重特異性抗体と同じ２つのエピトープに結合する抗体。
【請求項６７】
２つのエピトープの一つが、ＬＲＰ６のＲ２８、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｅ７３、Ｌ９５、Ｓ９６、Ｄ９８、Ｅ１１５、Ｒ１４１、及びＮ１８５を含む、請求項６６に記載の抗体。
【請求項６８】
２つのエピトープの一つが、ＬＲＰ６のＲ２８、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｅ７３、Ｌ９５、Ｓ９６、Ｄ９８、Ｅ１１５、Ｒ１４１、Ｎ１８５、Ｒ２９、Ｗ１８８、Ｋ２０２、Ｐ２２５、Ｈ２２６、Ｓ２４３、及びＦ２６６を含む、請求項６７に記載の抗体。
【請求項６９】
請求項１から１４又は３１から６８の何れか一項に記載のＬＲＰ６抗体又は二重特異性抗体をコードする単離された核酸。
【請求項７０】
請求項６９に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項７１】
請求項３１から６８の何れか一項に記載の抗体又は二重特異性抗体と薬学的に許容される担体を含有する薬学的製剤。
【請求項７２】
医薬として使用される、請求項３１から６８の何れか一項に記載の抗体又は二重特異性抗体。
【請求項７３】
癌の治療に使用される、請求項３１から６８の何れか一項に記載の抗体又は二重特異性抗体。
【請求項７４】
医薬の製造における、請求項３１から６８の何れか一項に記載の抗体又は二重特異性抗体の使用。
【請求項７５】
請求項３１から６８の何れか一項に記載の抗体又は二重特異性抗体の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法。
【請求項７６】
癌が、非小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、及び前立腺癌からなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年３月２４日に出願された米国仮出願第６１／３１７１３７号、及び２０１０年１０月２０日に出願された米国仮出願第６１／３９４８３６号の利益を主張し、その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
発明分野
本発明は、抗ＬＲＰ６抗体、及び癌又は骨疾患の治療のために同じものを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
他のほとんどのモルフォゲンと増殖因子のシグナル伝達経路と同様に、Ｗｎｔシグナル伝達は、１９の異なるリガンド、１０のレセプター、及びＬＲＰ５／６、Ｒｏｒ１／２、及びＲｙｋを含む複数のコレセプターを利用して、発達と組織の恒常性の最中に複数回展開される(van Amerongen and Nusse, 2009)。加えて、ＳＦＲＰ１／２／３／４／５及びＷＩＦ１などのＷｎｔか、又はＤＫＫ１／２／４及びＳＯＳＴを含むＬＲＰ５／６のどちらかに結合する異なる分泌アンタゴニストは、リガンドとレセプター間の相互作用を調節する。これらの膜タンパク質及び細胞外タンパク質及びそれらの複数のアイソフォームは、発現及びコンビナトリアルタンパク質相互作用のレベルで分別制御を与える。大半のＷｎｔアイソフォームは、コレセプターのＬＲＰ５／６へ結合することができるように見え、ＬＲＰ５／６結合が、標準の又はβカテニン依存のＷｎｔシグナル伝達を規定する。ＷｎｔシグナルはＬＲＰ５／６とＦＺＤをヘテロ二量体化し、ＬＲＰ５／６細胞内ドメインのリン酸化及びＡｘｉｎ結合を媒介する(Tamai et al., 2000; Semenov et al., 2001; Tamai et al., 2004)。ＤＶＬは、アキシン及びＦＺＤの両方を直接結合することにより複合体にされ、ＤＶＬのオリゴマー化は、ＧＳＫ３を捕捉する膜の細胞質質面でこれらのタンパク質複合体を拡大し、そのリン酸化とβカテニンの不安定化を阻害する(Mi et al., 2006; Bilic et al., 2007; Schwarz-Romond et al., 2007; Cselenyi et al., 2008; Piao et al., 2008; Zeng et al., 2008; Wu et al., 2009)。
【０００４】
かなりの一次配列の相違を示し、哺乳類の標準的Ｗｎｔシグナル伝達を媒介する比類なく多数のリガンドアイソフォームは、相同性の高いコレセプターの対とは対照的である。  ＬＲＰ６及びＬＲＰ５細胞外ドメインは、大部分が、Ｎ末端からＣ末端もかけてＥ１からＥ４と命名された相同性を持つ４つの領域からなり、各々はＹＷＴＤ型βプロペラ及びＥＧＦ様ドメインを含む(Jeon et al., 2001)。ＬＲＰ６及びＬＲＰ５の類似位置での各反復は非常に保存されているが、同じタンパク質内部の異なる反復はかなり相違している。興味深いことに、Bourhis et al. (2010) は、Ｗｎｔ９ｂがインビトロでＥ１−Ｅ２領域内で排他的に結合するが、Ｗｎｔ３ａはＥ３−Ｅ４を含む断片のみに結合することを示し、各反復か又は２つの隣接反復の組み合わせが、Ｗｎｔアイソフォームの異なるサブセットに結合することを示唆している。この配置は、Ｗｎｔタンパク質の多様性に対応し、またおそらくはＬＲＰ５／６アンタゴニストリガンドによるそれらの分別制御を可能にし得る。ノッチレセプター及びＶＥＧＦレセプターにおいて、その細胞外ドメインはそれぞれＥＧＦ様ドメイン及びＩｇドメインの反復を含み、複数のリガンドアイソフォームの結合は１つ又は２つ反復の同一領域へ限局される（別の反復の存在は結合を高めることができるにも関わらず）(Rebay et al., 1991; Davis-Smyth et al., 1996; Cunningham et al., 1997)。
【０００５】
レセプター型チロシンキナーゼにおいて、リガンドで誘導される二量体化は、キナーゼ活性の刺激及びシグナル伝達を開始する。リガンド誘導性のレセプターコレセプターのヘテロ二量体化は標準的なＷｎｔシグナル伝達に必要であるが、ＬＲＰ５／６又はＦＺＤホモ二量体化については明確に定義された役割はない。異なる組み換えＬＲＰ６タンパク質の強制的な二量体化は、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するか又は阻害することができる。
【０００６】
βカテニン依存性Ｗｎｔシグナル伝達は、レセプターＦＺＤ及びコレセプターＬＲＰ５／６の両方へのＷｎｔアイソフォームの結合により開始され、その後、細胞膜面に多量体複合体を構築し、キナーゼのＧＳＫ３をリクルートし不活性化する。Ｗｎｔアイソフォームとレセプターの間の機械的に異なる相互作用が、この過程を調節するかどうか及びいかに調節するかは決定されていない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一態様は、ＬＲＰ６に結合する単離された抗体を提供し、抗体は、第一のＷｎｔアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達を阻害し、第二のＷｎｔアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達を増強する。一実施態様において、第一のＷｎｔアイソフォームは、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択される。一実施態様において、第二のＷｎｔアイソフォームは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、及び１０ｂからなる群から選択される。その他の実施態様において、第一のＷｎｔアイソフォームは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂからなる群から選択され、第二のＷｎｔアイソフォームは、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択される。
【０００８】
本発明の一態様は、ＬＲＰ６のＥ３−Ｅ４領域に結合する抗体を提供する。本発明のその他の態様は、ＬＲＰ６のＥ１−Ｅ２領域に結合する抗体を提供する。さらにその他の態様は、ＬＲＰ６の２つの異なる領域、例えばＬＲＰ６のＥ１−Ｅ２領域及びＥ３−Ｅ４領域に結合する抗体を提供する。一態様において、これらの抗体は、Ｗｎｔ１及びＷｎｔ３ａの組み合わせにより誘導されたＷｎｔシグナル伝達を阻害する。一態様において、これらの抗体は、自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。
【０００９】
本発明の一つの態様は、ＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害する単離された抗体、及びＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害する単離された抗体の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法を提供する。
【００１０】
本発明のその他の態様は、ＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａにより誘導されたシグナル伝達を阻害する単離された抗体、及びＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂにより誘導されたシグナル伝達を阻害する単離された抗体の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法を提供する。
【００１１】
本発明のその他の態様は、ＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａにより誘導されたシグナル伝達を阻害する単離された抗体、及びＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、及びＷｎｔ１０ｂにより誘導されたシグナル伝達を阻害する単離された抗体の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法を提供する。
【００１２】
本発明の一態様は、個体に本明細書に記載される抗ＬＲＰ６抗体の有効量を個体に投与することを含む、骨格障害、例えば、骨粗しょう症、変形性関節症、骨折及び骨病変を有する個体を治療する方法を提供する。
【００１３】
本発明のその他の態様は、Ｗｎｔアイソフォームにより誘導されたＷｎｔシグナル伝達を増強するために、本明細書に記載される抗ＬＲＰ６抗体及びＷｎｔアイソフォームの有効量を個体に投与することを含む、個体においてＷｎｔアイソフォームにより誘導されたＷｎｔシグナル伝達を増強する方法を提供する。
【００１４】
また提供されるのは、二重特異性抗ＬＲＰ６抗体を含む、特異的抗ＬＲＰ６抗体である。一実施態様において、ＬＲＰ６に結合する単離された抗体は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号１０及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一実施態様において、ＬＲＰ６に結合する単離された抗体は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５のアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一実施態様において、ＬＲＰ６に結合する単離された抗体は、配列番号１０及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを更に含む。
【００１５】
一実施態様において、抗体は、ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体であり、該抗体は配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第一のＶＨ、及び配列番号９、配列番号１１、及び配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第二のＶＨを含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号１０及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００１６】
一実施態様において、ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する二重特異性抗体は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを更に含む。一実施態様において、ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する二重特異性抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む第一のＶＨ、及び配列番号９、配列番号１１、及び配列番号１３のアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む第二のＶＨを含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号１０及び配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを更に含む。
【００１７】
一実施態様において、ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む。一実施態様において、ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つのＶＨ ＨＶＲ配列の全てを含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つのＶＨ ＨＶＲ配列の全てを含む第二のＶＨドメインを含む。
【００１８】
一実施態様において、ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む。一実施態様において、ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つのＶＨ ＨＶＲ配列の全てを含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つのＶＨ ＨＶＲ配列の全てを含む第二のＶＨドメインを含む。
【００１９】
一実施態様において、ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３  配列番号１９から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む。一実施態様において、単離された二重特異性抗体はＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合し、該抗体は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つのＶＨ ＨＶＲ配列の全てを含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つのＶＨ ＨＶＲ配列の全てを含む第二のＶＨドメインを含む。
【００２０】
一実施態様において、上記実施態様中の二重特異性は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３ 配列番号２７から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を更に含む。
【００２１】
一実施態様において、上記実施態様中の二重特異性は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３ 配列番号２８から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を更に含む。
【００２２】
一実施態様は、ＬＲＰ６の２つの異なる領域に結合する単離された二重特異性抗体を提供し、該抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第一のＶＨ、及び配列番号９、配列番号１１、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨからなる群から選択される第二のＶＨを含む。一態様において、この抗体は、配列番号１０又は配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む第一のＶＨ、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む第二のＶＨ、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００２３】
一実施態様において、二重特異性抗体は、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害し、かつＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害する。一実施態様において、二重特異性抗体は、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、及びＷｎｔ１０ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を更に阻害する。一実施態様において、二重特異性抗体は自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。
【００２４】
本発明の一態様は、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害し、かつＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及び１０ｂからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害する二重特異性抗体を提供する。一実施態様において、二重特異性抗体は、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、及びＷｎｔ１０ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を更に阻害する。
【００２５】
本発明の一態様は、本明細書に記載の二重特異性抗体を含む抗ＬＲＰ６抗体の何れかと、ＬＲＰ６への結合に対して競合する抗体を提供する。
【００２６】
本発明のその他の態様は、本明細書に記載の二重特異性抗体として、同じ２つのエピトープに結合する抗体を提供する。一実施態様において、２つのエピトープの一つは、ＬＲＰ６のアミノ酸残基のＲ２８、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｅ７３、Ｌ９５、Ｓ９６、Ｄ９８、Ｅ１１５、Ｒ１４１、及びＮ１８５を含む。一実施態様において、２つのエピトープの一つは、ＬＲＰ６のアミノ酸残基のＲ２８、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｅ７３、Ｌ９５、Ｓ９６、Ｄ９８、Ｅ１１５、Ｒ１４１、Ｎ１８５、Ｒ２９、Ｗ１８８、Ｋ２０２、Ｐ２２５、Ｈ２２６、Ｓ２４３、及びＦ２６６を含む。
【００２７】
本発明のその他の態様は、本明細書に記載される抗ＬＲＰ６抗体をコードする単離された核酸を提供する。その他の態様は、そのような核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００２８】
本発明の一態様は、本明細書に記載される抗ＬＲＰ６抗体を含むイムノコンジュゲート、及び細胞傷害性薬物を提供する。その他の態様は、本明細書に記載される抗ＬＲＰ６抗体を含む薬学的製剤、及び薬学的に許容可能な担体を提供する。
【００２９】
本発明の一態様は、医薬として用いる、本明細書に記載される抗ＬＲＰ６抗体を提供する。一態様は、癌又は骨格障害の治療に使用される、本明細書に記載される抗ＬＲＰ６抗体を提供する。一態様は、第一のＷｎｔアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達の阻害、及び第二のＷｎｔアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達の増強に使用される、本明細書に記載される抗ＬＲＰ６抗体を提供する。一態様は、例えば癌又は骨格障害の治療に有用な医薬の製造に使用される、本明細書に記載される抗ＬＲＰ６抗体を提供する。
【００３０】
本発明の一態様は、個体に本明細書に記載される抗ＬＲＰ６抗体の有効量を個体に投与することを含み、例えば非小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌などの癌を有する個体を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】ＬＲＰ６．Ｅ３−Ｅ４タンパク質に対する抗体による、０．１ｍｇ／ｍｌの精製Ｗｎｔ３ａで誘導されたＨＥＫ２９３細胞におけるＷｎｔルシフェラーゼレポーター活性の阻害を示すグラフ。
【図１Ｂ】Ｗｎｔ３ａで刺激されてないか又はＷｎｔ３ａで誘導され、指示されたＬＲＰ６抗体又は精製タンパク質で処置されたＨＥＫ２３９細胞のウエスタンブロット解析。
【図１Ｃ】ＹＷ２１０．０９抗体が、ＨＥＫ２９３細胞中のＷｎｔ３ａ濃度に比例する形でＷｎｔレポーター遺伝子活性を増強することを示すグラフ。
【図２Ａ】ルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトされ、ＬＲＰ６抗体又はＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質で、個別か又は組み合わせて処置された、ＰＡ−１テラトカルシノーマ細胞における自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達の濃度依存性阻害及び増強を示すグラフ。
【図２Ｂ】０．３ｍｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａタンパク質と共に又は無しで処置され、かつ１０ｍｇ／ｍｌのＹＷ２１１．３１抗体、抗ｇＤモノクローナル抗体（陰性コントロール）又はＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質（陽性コントロール）で処置されたＰＡ−１細胞中の、Ｗｎｔ誘導遺伝子ＳＡＸ１及びＧＡＤ１、及びＷｎｔ抑制遺伝子ＬＥＦＴＹ２のｑＰＣＲ発現解析の結果を示すグラフ。データはＷｎｔ３ａを添加しない（ＮＡ）細胞からのサンプルに規格化される。
【図３】細胞株の自己分泌シグナル伝達におけるＬＲＰ６抗体及びＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質の影響を示す概略表。
【図４Ａ】０．２μｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａがある場合とない場合で（ＮＡ）、２５μｇ／ｍｌのＹＷ２１１．３１．５７抗体又はＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質で処置された四つの細胞株中のＡＸＩＮ２ ｍＲＮＡのｑＰＣＲ解析の結果を示すグラフ。
【図４Ｂ】ＮＣＩ−Ｈ２３細胞中のＷｎｔ誘導性遺伝子の発現が、ＹＷ２１１．３１．５７で増強され、ＹＷ２１０．０９抗体（３０μｇ／ｍｌ）により拮抗されることを示すグラフ。ＣＤ４−Ｆｃタンパク質（３０μｇ／ｍｌ）は、陰性コントロールとしての役割を果たす。
【図４Ｃ】Ｍ１４細胞中のＷｎｔ誘導性遺伝子の発現が、ＹＷ２１１．３１．５７で増強され、ＹＷ２１０．０９抗体（３０μｇ／ｍｌ）により拮抗されることを示すグラフ。
【図４Ｄ】Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターを安定に組込まれたＨｓ５７８Ｔ細胞における、Ｗｎｔ３ａで刺激されたシグナル伝達のＹＷ２１１．３１．５７抗体による濃度依存性阻害を示すグラフ。
【図４Ｅ】Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターを安定に組込まれたＨｓ５７８Ｔ細胞における、Ｗｎｔシグナル伝達のＹＷ２１１．３１．５７抗体による濃度依存性増強を示すグラフ。
【図４Ｆ】ＷｎｔルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトされたＥＫＶＸ細胞が、自己分泌シグナル伝達（ＮＡ）の増強、及びＹＷ２１１．３１．５７抗体によるＷｎｔ３ａ誘導性シグナル伝達の拮抗作用を示すことを示すグラフ。
【図４Ｇ】自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達の抗体媒介性増強が５μｇ／ｍｌのＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質により阻害されることを示すグラフ。
【図５】Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターを安定に組込まれたＨＥＫ２９３又はＨｓ５７８Ｔ細胞株のＷｎｔアイソフォームについての発現コンストラクトのトランスフェクションにより誘導されたシグナル伝達における、１０ｍｇ／ｍｌのＬＲＰ６抗体又はＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質の影響の概略表。Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターの発現は細胞数に規格化され、同じ発現コンストラクトをトランスフェクトしたがタンパク質で処理されていない細胞中の量(levels)に対して更に規格化される。
【図６】Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターを安定に組込まれたＨＥＫ２９３細胞株のシグナル伝達における、１０ｍｇ／ｍｌのＬＲＰ６抗体又はＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質の影響の概略表。シグナル伝達は、ＦＺＤアイソフォーム又はＬＲＰ６に融合したＷｎｔアイソフォームからなるキメラタンパク質についての発現コンストラクトのトランスフェクションにより誘導された。Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターの発現は細胞数に規格化され、同じ発現コンストラクトをトランスフェクトしたがタンパク質で処理されていない細胞中のレベル（level）に対して更に規格化される。
【図７】Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターを安定に組込まれた細胞株中のＷｎｔアイソフォームについての発現コンストラクトのトランスフェクションにより誘導されたシグナル伝達における、１０ｍｇ／ｍｌのＬＲＰ６抗体又は抗体の組合わせの影響の概略表。Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターの発現は細胞数に規格化され、同じ発現コンストラクトをトランスフェクトしたがタンパク質で処理されていない細胞中のレベルに対して更に規格化される。
【図８Ａ】ＹＷ２１１．３１．５７及びＹＷ２１０．０９抗体の組合わせが、Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターを安定に組込まれ、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ１の何れか又はＷｎｔ３ａとＷｎｔ１の両方の発現についてトランスフェクトされているＨＥＫ２９３細胞中のシグナル伝達を阻害することを示すグラフ。抗ｇＤ抗体及びＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質は、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害においてそれぞれ陰性及び陽性コントロールとして示される。
【図８Ｂ】ＹＷ２１１．３１．５７抗体及びＹＷ２１０．０９抗体の組合わせが、Ｈｓ５７８Ｔ細胞における自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を増強することを示すグラフ。
【図８Ｃ】ＣＹＷ２１１．３１．５７抗体及びＹＷ２１０．０９抗体の組合わせが、ＥＫＶＸ細胞における自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を増強することを示すグラフ。
【図９Ａ】ストレプトアビジンバイオセンサー上に固定されたビオチン化ＬＲＰ６ Ｅ１−Ｅ４タンパク質によるバイオレイヤーインターフェロメトリーアッセイ（Ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ ａｓｓａｙ）は、ＹＷ２１１．３１．５７抗体がＬＲＰ６に対するＷｎｔ３ａ及びＷｎｔ９ｂの結合を阻害し、ＹＷ２１０．０９抗体がＷｎｔ９ｂ結合のみ阻害することを示している。
【図９Ｂ】ストレプトアビジンバイオセンサー上に固定されたビオチン化ＬＲＰ６ Ｅ１−Ｅ４タンパク質によるバイオレイヤーインターフェロメトリーアッセイ（Ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ ａｓｓａｙ）は、ＹＷ２１１．３１．５７抗体がＬＲＰ６に対するＷｎｔ３ａ及びＷｎｔ９ｂの結合を阻害し、ＹＷ２１０．０９抗体がＷｎｔ９ｂ結合のみ阻害することを示している。
【図９Ｃ】ＬＲＰ６のより小さな非重複断片によるバイオレイヤーインターフェロメトリーアッセイは、Ｗｎｔ３ａがＥ３−Ｅ４領域に結合し、この相互作用がインタクトなＹＷ２１１．３１抗体又はワンアームドＹＷ２１１．３１抗体の何れかによりブロックされることを示す。
【図９Ｄ】ＬＲＰ６のより小さな非重複断片によるバイオレイヤーインターフェロメトリーアッセイは、ＹＷ２１０．０９抗体がＬＲＰ６ Ｅ１−Ｅ２タンパク質に結合し、Ｗｎｔ９ｂとの結合を競合することを示す。
【図９Ｅ】バイオレイヤーインターフェロメトリーアッセイは、ＹＷ２１１．３１．５７抗体及びＹＷ２１０．０９抗体が、任意の順序で逐次に添加される場合、固定化ＬＲＰ６．Ｅ１−Ｅ４タンパク質に一緒に結合することができることを示し、別々のエピトープを確認している。
【図１０Ａ】マウスがＹＷ２１０．０９抗体で処置される場合に、Ｆｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質で観察されたのと同様に、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１同種移植腫瘍の増殖の退縮を示すグラフ。
【図１０Ｂ】インタクトなＹＷ２１１．３１抗体又はワンアームドＹＷ２１１．３１抗体で処置されたがＹＷ２１０．０９抗体では処置されていないマウスにおいて、Ｎｔｅｒａ−２異種移植腫瘍がｑＰＣＲ解析によりＳＰ５ ｍＲＮＡの発現の減少を示すことを示すグラフ。
【図１０Ｃ】培養液中でのマウス頭蓋外植片のＹＷ２１０．０９抗体（ＹＷ２１１．３１．６２抗体でなく）処置は、ＲＡＮＫ−Ｆｃタンパク質による処置に類似して、石灰化した頭頂骨の骨ミネラル濃度（ＢＭＤ）を著しく増大させることを示すグラフ。
【図１１Ａ】大腸菌細胞又はＨＥＫ２９３細胞で生産された二重特異性抗ＬＲＰ６抗体が、０．１μｇ／ｍｌの精製Ｗｎｔ３ａで誘導されたＨＥＫ２９３細胞中において、Ｗｎｔルシフェラーゼレポーター活性を濃度依存的様式で同様に阻害することを示すグラフ。ＩＣ５０の値はそれぞれ、０．０３２μｇ／ｍｌ及び０．０１４μｇ／ｍｌである。
【図１１Ｂ】Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターを安定に組込まれたＰＡ−１細胞とＭ１４細胞、及びレポーターでトランスフェクトされたＣＡＬ−５１細胞中の自己分泌Ｗｉｎｔシグナル伝達における、指定されたコントロールバッファー（ＰＢＳ）、抗体、抗体の組合わせ、又はＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質（各１０μｇ／ｍｌ）による処置の効果が、０．１μｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａによる刺激のある（Ｃ）又は無し（Ｂ）で、指定されたコントロールバッファー（ＰＢＳ）、抗体、抗体の組合わせ、又はＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質（各１０μｇ／ｍｌ）により処置されたことを示すグラフ。
【図１１Ｃ】Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターを安定に組込まれたＰＡ−１細胞とＭ１４細胞、及びレポーターでトランスフェクトされたＣＡＬ−５１細胞において、０．１μｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａにより刺激され、指定されたコントロールバッファー（ＰＢＳ）、抗体、抗体の組合わせ、又はＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質（各１０μｇ／ｍｌ）による処置の効果を示すグラフ。
【図１２】Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターが安定に組込まれたＨＥＫ２９３細胞株又はＨｓ５７８Ｔ細胞株中のＷｎｔアイソフォームについての発現コンストラクトのトランスフェクションにより誘導されたシグナル伝達における、抗体又はＦｚｄ８ＣＲＤタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）の影響の概略表。
【図１３Ａ】Ｗｎｔ３ａトランスフェクションを伴うか又は伴わずに、指定された抗体又はＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質（５μｇ／ｍｌ）で１８時間処置されたＨＥＫ２９３細胞のウエスタン解析。βアクチン又はＧＡＰＤＨタンパク質の量は、それぞれ上と下のゲルにおいてサンプル負荷コントロールとして示される。
【図１３Ｂ】３０ｍｇ／ｋｇのＬＲＰ６二重特異性抗体又はＦｚｄ８ＣＲＤタンパク質で（しかしコントロールの抗ｇＤ抗体でなく）、１６時間処置されたＳＣＩＤーｂｇマウスにおけるＭ１４異種移植腫瘍が、ｑＰＣＲ解析により、ＡＸＩＮ２及びＡＰＣＤＤ１ ｍＲＮＡの発現の減少を示すことを示すグラフ。
【図１４】ＬＲＰ６の溝にある残基とのＣＤＲ Ｈ３相互作用の詳細な表示は、ＮＡＶＫモチーフにより作られた相互作用の重要なネットワークを示している。
【図１５】ＣＤＲ Ｈ１、２、Ｌ１、２及び３により作られた相互作用の詳細。
【図１６】典型的な抗ＬＲＰ６抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）はＫａｂａｔのＣＤＲを示す。
【図１７】典型的な抗ＬＲＰ６抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）はＫａｂａｔのＣＤＲを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク”に由来する”アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
【００３３】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって典型的な実施態様は、以下で説明される。
【００３４】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つものである。
【００３５】
用語「抗ＬＲＰ６抗体」及び「ＬＲＰ６に特異的に結合する抗体」は、抗体がＬＲＰ６を標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように十分な親和性でＬＲＰ６に結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体の無関係な、非ＬＲＰ６タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＬＲＰ６への結合の約１０％未満である。所定の実施態様において、ＬＲＰ６へ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）．所定の実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、異なる種由来のＬＲＰ６間で保存されているＬＲＰ６のエピトープに結合する。
【００３６】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００３７】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００３８】
参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体、逆に競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックするその参照抗体を指す。典型的な競合アッセイは、本明細書で提供される。
【００３９】
用語 「癌」及び「癌性」は、無秩序な細胞成長/細胞増殖を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を記述する。癌の例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含む。そのような癌のより具体的な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌、膵臓癌、神経膠腫を含む、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、白血病、及びその他のリンパ増殖性疾患、及び様々な型の頭頸部癌を包含する。
【００４０】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物を指す。化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド(ＣＹＴＯＸＡＮ(登録商標))；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン(piposulfan)；アジリジン類、例えばベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)；アルトレトアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ-９-テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標）；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）を含む）、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９-アミノカンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えばNicolaou et al., Agnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照）；ＣＤＰ３２３、経口α−４インテグリン阻害剤；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン（ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標）、リポソームドキソルビシンＴＬＣＤ-９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標）、及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(gemcitabine) (GEMZAR(登録商標))、テガフル(tegafur) (UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(capecitabine) (XELODA(登録商標))、エポチロン(epothilone)、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン類(ansamitocins)のようなメイタンシノイド類(maytansinoids)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantron)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリジンＡ(roridin A)及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(ABRAXANETM)、及びドキセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標))；ク��ランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチン（例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））及びカルボプラチン；ビンカ類でチューブリン重合の微小管形成を阻害するもの、例えばビンブラスチン(ＶＥＬＢＡＮ(登録商標)、ビンクリスチン(ＯＮＣＯＶＩＮ(登録商標))、ビンデシン(ＥＬＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))、及びビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボビン(leucovovin)；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド、例えば、ベキサロテン(ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ(登録商標))；ビスホスホネート、例えばクロドロネート(例えばＢＯＮＥＦＯＳ(登録商標)又はＯＳＴＡＣ(登録商標))、エチドロン酸(ＤＩＤＲＯＣＡＬ(登録商標))、ＮＥ-５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ＺＯＭＥＴＡ(登録商標))、アレンドロネート(ＦＯＳＡＭＡＸ(登録商標))、パミドロン酸(ＡＲＥＤＩＡ(登録商標))、チルドロン酸(ＳＫＥＬＩＤ(登録商標))、又はリセドロン酸(ＡＣＴＯＮＥＬ(登録商標))；トロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮増殖因子受容体(ＥＧＦ-Ｒ)；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、及びＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害薬(例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標))；ＢＡＹ４３９００６(ソラフェニブ；Bayer)；ＳＵ-１１２４８(スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ(登録商標)、Pfizer)；ペリフォシン(perifosine)、ＣＯＸ-２阻害剤(例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ)、プロテオゾーム阻害剤(例えばＰＳ３４１)；ボルテゾミブ(ＶＥＬＣＡＤＥ(登録商標))；ＣＣＩ-７７９；チピファルニブ(tipifarnib)(Ｒ１１５７７)；オラフィニブ(orafenib)、ＡＢＴ５１０；ＢＣＬ-２阻害剤、例えばオブリメルセンナトリウム(oblimersen sodium)(GENASENSE(登録商標))；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（以下の定義を参照）；チロシンキナーゼ阻害剤；セリン-スレオニンキナーゼ阻害剤、例えばラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ(登録商標)）；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばロナファーニブ（ＳＣＨ６６３６，ＳＡＲＡＳＡＲＴＭ）；及び上述したものの何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組合せ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロンの併用療法の略称であるＣＨＯＰ；及び５−ＦＵ及びロイコボリンとオキサリプラチン(ELOXATINTM)を組合せた治療法の略称であるＦＯＬＦＯＸが含まれる。
ここで定義された化学療法剤には、癌の増殖を促進しうるホルモンの効果を調節、低減、ブロック、又は阻害するように働く「抗ホルモン剤」又は「内分泌治療剤」が含まれる。それらはそれ自体がホルモンであってもよく、限定するものではないが、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを持つ抗エストロゲン、例えばタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標)）、４-ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ(登録商標)）、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)（ＥＶＩＳＴＡ(登録商標)）、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、及びＳＥＲＭ３などの選択的なエストロゲン受容体調節因子(ＳＥＲＭ)；アゴニスト特性を有さない純粋な抗エストロゲン類、例えばフルベストラント(ＦＡＳＬＯＤＥＸ(登録商標))、及びＥＭ８００(このような薬剤はエストロゲン受容体(ＥＲ)二量体化をブロックし、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲ代謝回転を増加させ、及び／又はＥＲレベルを抑制しうる)；アロマターゼインヒビター、例えば、ホルメスタン及びエキセメスタン(ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標))などのステロイド系アロマターゼインヒビター、及びアナストロゾール(ＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標))、レトロゾール(ＦＥＭＡＲＡ(登録商標))及びアミノグルテチミドなどの非ステロイド性アロマターゼインヒビター、及びボロゾール(ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標))、メゲストロールアセテート(ＭＥＧＡＳＥ(登録商標))、ファドロゾール及び４(５)-イミダゾールを含む他のアロマターゼインヒビター；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えばロイプロリド(ＬＵＰＲＯＮ(登録商標)及びＥＬＩＧＡＲＤ(登録商標))、ゴセレリン、ブセレリン、及びトリプトレリン；性ステロイド、例えばプロゲスチン、例えばメゲストロールアセテート及びメドロキシプロゲステロンアセテート、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びプレマリン、及びアンドロゲン／レチノイド、例えばフルオキシメステロン、全てのトランスレチオニン酸及びフェンレチニド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方制御因子(ＥＲＤ)；抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド；及び上記の何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体；並びに、上記のうちの２以上の組合せを含む。
【００４１】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
【００４２】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）、成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など、抗生物質、小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）、及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
【００４３】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化を含む。
【００４４】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
【００４５】
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端へ伸長する。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端のリジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しうるか又は存在し得ない。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００４６】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００４７】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００４８】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。
【００４９】
「ヒト抗体」は、ヒトまたはヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００５０】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
【００５１】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全てまたは実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げている抗体を指す。
【００５２】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲＳを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、略称(abbreviated-)ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照のこと)。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
【００５３】
「イムノコンジュゲート」は、１つ以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害性薬物を含む。
【００５４】
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
【００５５】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上または９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００５６】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００５７】
「抗ＬＲＰ６抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖および軽鎖（又はその断片）をコードする一つ以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【００５８】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び/又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００５９】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【００６０】
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００６１】
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている指示書を指すために使用される。
【００６２】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
【００６３】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
【００６４】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【００６５】
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。 薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【００６６】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＬＲＰ６」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＬＲＰ６を指す。その用語は、細胞内でのプロセシングから生じた「完全長」、未処理ＬＲＰ６並びにＬＲＰ６の任意の形態を含む。その用語はまた、天然に存在するＬＲＰ６の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。典型的なヒトＬＲＰ６のアミノ酸配列は、配列番号２９に示される。ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＩ４３７２６、Strausberg, R. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 : 16899-16903 (2002) (He, X, et al., Development, 131:1663-1677 (2004); Chen, M., et al., J. Biol. Chem., 284:35040-35048 (2009)も参照。
【００６７】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する(treat)」または 「治療している(treating)」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００６８】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する(例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照)。単一のＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために抗原を特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【００６９】
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」として参照される。
【００７０】
ＩＩ．組成物及び方法
本発明は、幾つかのＷｎｔアイソフォームによりシグナル伝達を阻害し、かつ他のアイソフォームによりシグナル伝達を増強する予想外の能力を持つ抗ＬＲＰ６抗体を提供する。実施例に記載されるように、特徴付けられた２つの抗ＬＲＰ６抗体は、大部分のＷｎｔにおいて、一つの抗体は拮抗し、他は増強する相反する活性を更に示す。これらの２つの抗体は、ＬＲＰ６の異なる領域に結合し（異なるＷｎｔアイソフォームに結合するように）、シグナル伝達の阻害がＷｎｔ結合の遮断によって生じる。
【００７１】
本発明の抗LRP6抗体とのそれらの機能的相互作用に基づき、試験された１４のWntアイソフォームを３つのクラスにグループわけすることができる。Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａは、抗ＬＲＰ６抗体ＹＷ２１１．３１により阻害され、かつ抗ＬＲＰ６抗体ＹＷ２１０．０９により増強され；Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、及びＷｎｔ１０Ｂは、抗ＬＲＰ６抗体ＹＷ２１１．３１により増強され、かつ抗ＬＲＰ６抗体ＹＷ２１０．０９により拮抗され；及びＷｎｔ４、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、及びＷｎｔ１０Ａは、抗ＬＲＰ６抗体ＹＷ２１１．３１により増強され、かつ抗ＬＲＰ６抗体ＹＷ２１０．０９により阻害されない（図３Ｃ）。Ｗｎｔ３／３ａサブファミリーは、最も進化的に発散しているが(Choら、2010)、これらの分類は明らかにＷｎｔ遺伝子の提唱された系統に対応していない。異なるクラスのＷｎｔアイソフォームを阻害する抗ＬＲＰ６抗体の組合わせは、Ｗｎｔシグナル伝達に関連した疾患を治療するための有効な治療法を提供するために使用することができる。
【００７２】
ＬＲＰ６の抗体媒介性二量体化は、Ｗｎｔアイソフォームがまた複合体に結合することができ、恐らくはＦＺＤをリクルートするときにのみ、シグナル伝達を増強できる。異なる腫瘍細胞株における内在性自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達は、ＬＲＰ６抗体によって拮抗されるか又は亢進することができる。コレセプター−リガンド相互作用のこの複雑性は、Ｗｎｔアイソフォームによるシグナル伝達の分別制御を可能にすることができ、抗体により、特異的組織又は疾患状態におけるＷｎｔシグナル伝達を差動的に操作するために利用することができる。
【００７３】
幾つかの実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は幾つかの細胞型において、自己分泌、又は内因性のＷｎｔシグナル伝達を阻害し、他の細胞型において自己分泌シグナル伝達を増強することができる。幾つかの実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体はＬＲＰ６の二量体化を媒介し、ＬＲＰ６へ同時に結合するＷｎｔアイソフォームの存在下でシグナル伝達を亢進又は増強する。幾つかの実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体はＷｎｔアンタゴニスト、例えばＤＫＫアイソフォーム及びＳＯＳＴなどの結合を阻害することにより、Ｗｎｔシグナル伝達を増強する。
【００７４】
抗ＬＲＰ６抗体は、Ｗｎｔ誘導性シグナル伝達により、活性化又は阻害されるプロセスを選択的に調節することに使用することができる。そのようなプロセスは、例えば、細胞増殖、細胞運命特定、及び異なる細胞型における幹細胞の自己複製、及び発達過程を含む。抗ＬＲＰ６は、例えば、癌、及び骨又は骨格系の障害、及び疾患血管障害などのＷｎｔ媒介性疾患の治療に有用である。抗ＬＲＰ６抗体を用いて治療することができる癌の例は、小細胞肺癌、非小細胞肺がん、肝細胞癌、消化器癌、膵臓癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎癌（腎細胞癌を含む）、肝臓癌、前立腺癌を含む。抗ＬＲＰ６抗体を用いて治療することができる骨格障害又は骨障害は、骨粗しょう症、変形性関節症、骨折、及び骨病変を含む。抗ＬＲＰ６抗体を用いて治療することができる血管障害は、網膜血管疾患を含む。ノリエ病、骨粗鬆症・偽性神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、未熟児網膜症、コーツ病及びコーツ様反応、及び網膜動脈又は静脈閉塞、及び心筋梗塞や虚血性心疾患などの心筋に関連する疾患を含む。
【００７５】
従って、本発明の一態様は、ＬＲＰ６に結合する抗体を提供し、その抗体は、Ｗｎｔアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達を阻害し、その他のＷｎｔアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達を増強する。一実施態様において、抗体はＷｎｔ３及び／又はＷｎｔ３ａによるシグナル伝達を阻害する。一実施態様において、抗体はＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、及び／又はＷｎｔ１０ｂによるシグナル伝達を増強する。一実施態様において、抗体はＷｎｔ３及び／又はＷｎｔ３ａによるシグナル伝達を阻害し、かつＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、及び／又はＷｎｔ１０ｂによるシグナル伝達を増強する。一実施態様において、抗体はＷｎｔ３及びＷｎｔ３ａによるシグナル伝達を阻害し、かつＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ及びＷｎｔ１０ｂによるシグナル伝達を増強する。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体はＬＲＰ６のＥ３−Ｅ４領域（第一及び第二のベータプロペラ）に結合する。
【００７６】
その他の実施態様において、抗体はＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ及び／又はＷｎｔ１０ｂによるシグナル伝達を阻害する。一実施態様において、抗体はＷｎｔ３及び／又はＷｎｔ３ａによるシグナル伝達を増強する。一実施態様において、抗体はＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ及び／又はＷｎｔ１０ｂによるシグナル伝達を阻害し、かつＷｎｔ３及び／又はＷｎｔ３ａによるシグナル伝達を増強する。一実施態様において、抗体はＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ及び／又はＷｎｔ１０ｂによるシグナル伝達を阻害し、かつＷｎｔ３及びＷｎｔ３ａによるシグナル伝達を増強する。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体はＬＲＰ６のＥ１−Ｅ２領域（第三及び第四のベータプロペラ）に結合する。
【００７７】
本発明のその他の態様は、多重特異性抗ＬＲＰ６抗体を提供する。実施例に示されるように、多重特異性抗体は、幾つかの実施態様において、Ｗｎｔアイソフォームの三つのクラス全てを阻害する利点を有する。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、ＬＲＰ６の二つ以上の異なる領域又はエピトープに結合することができる多重特異性抗体である。一実施態様において、多重特異性抗体は、ＬＲＰ６の二つの異なる領域に特異的に結合することができる二重等異性抗体である。一実施態様において、二重特異性抗体はＬＲＰ６のＥ１−Ｅ２領域に結合し、かつＬＲＰ６のＥ３−Ｅ４領域に結合する。一実施態様において、多重特異性抗体は、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害し、かつＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害する。一実施態様において、多重特異性抗体は、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害し、かつＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害し、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、及びＷｎｔ１０ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を更に阻害する。一実施態様において、多重特異性抗体は、Ｗｎｔ１及びＷｎｔ３ａの組み合わせにより誘導されたＷｎｔシグナル伝達を阻害する。一実施態様において、多重特異性抗体は自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。
【００７８】
所定の実施態様において、多重特異性抗体は、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害し、かつＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害する二重特異性抗体である。所定の実施態様において、多重特異性抗体は、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害し、かつＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害し、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、及びＷｎｔ１０ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を更に阻害する二重特異性抗体である。所定の実施態様において、多重特異性抗体は、Ｗｎｔ１及びＷｎｔ３ａの組み合わせにより誘導されたＷｎｔシグナル伝達を阻害する二重特異性抗体である。一実施態様において、多重特異性抗体は、Ｗｎｔ１及びＷｎｔ３ａの組合わせにより誘導されたシグナル伝達を、二重特異性抗体と同じ特異性を有する単一特異性抗体よりもより効率的に阻害する二重特異性抗体である。
【００７９】
所定の実施態様において、多重特異性抗体は、自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を、二重特異性抗体と同じ特異性を有する単一特異性抗体よりもより効率的に阻害する二重特異性抗体である。
【００８０】
所定の実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体又は多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、Ｗｎｔシグナル伝達を少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又はそれ以上阻害する。Ｗｎｔシグナル伝達の阻害は、当業者に既知で本明細書に記載されるアッセイを使用して決定することができる。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害は、Ｗｎｔレポーターアッセイ、例えば、実施例に記載されたＷｎｔルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して決定することができる。
【００８１】
Ｗｎｔシグナル伝達の阻害はまた、実施例に記載されるように、Ｗｎｔ標的遺伝子、例えばＡＰＣＤＤ１、ＡＸＩＮ２、ＧＡＤ１、ＬＥＦＴＹ２、及びＳＡＸ１の発現をモニタリングすることにより決定することができる。
【００８２】
所定の実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体又は多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、Ｗｎｔ標的遺伝子、例えばＡＰＣＤＤ１、ＡＸＩＮ２、ＧＡＤ１、ＬＥＦＴＹ２、及びＳＡＸ１の発現を、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、又は約９０％阻害する。一実施態様において、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現は、ｑＰＣＲを含むＰＣＲなどの遺伝子発現アッセイを使用して決定することができる。
【００８３】
本発明のその他の態様は、ＬＲＰ６に結合し、本明細書に記載される抗ＬＲＰ６抗体の何れかと結合について競合する抗体を提供する。本発明のその他の態様は、本明細書に記載される抗ＬＲＰ６抗体の何れかと同じＬＲＰ６上のエピトープに結合する抗体を提供する。
【００８４】
Ａ．典型的な抗ＬＲＰ６抗体
本発明の一態様は、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である抗ＬＲＰ６抗体を提供する。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、ファージライブラリーを使用して生成される。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。その他の態様において、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。
【００８５】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、表２のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、表２のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、表２のアミノ酸配列を含む重鎖配列及び軽鎖配列を含む。
【００８６】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖配列、及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖配列をを含む。
【００８７】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖配列、及び配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む。
【００８８】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖配列、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む。
【００８９】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖配列、及び抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む。
【００９０】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、表３のアミノ酸配列からの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、表３のアミノ酸配列からの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、表３のアミノ酸配列からのＶＨ及びＶＬを含む。
【００９１】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１のアミノ酸配列の重鎖からの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号２のアミノ酸配列の軽鎖からの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１のアミノ酸配列の重鎖からのＶＨ、及び配列番号２のアミノ酸配列の軽鎖からのＶＬを含む。
【００９２】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００９３】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号３のアミノ酸配列の重鎖からの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号４のアミノ酸配列の軽鎖からの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号３のアミノ酸配列の重鎖からのＶＨ、及び配列番号４のアミノ酸配列の軽鎖からのＶＬを含む。
【００９４】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００９５】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号５のアミノ酸配列の重鎖からの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号６のアミノ酸配列の軽鎖からの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号５のアミノ酸配列の重鎖からのＶＨ、及び配列番号６のアミノ酸配列の軽鎖からのＶＬを含む。
【００９６】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００９７】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号７のアミノ酸配列の重鎖からの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号８のアミノ酸配列の軽鎖からの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号７のアミノ酸配列の重鎖からのＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列の軽鎖からのＶＬを含む。
【００９８】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００９９】
本発明のその他の態様は、多重特異性抗ＬＲＰ６抗体を提供する。一実施態様において、多重特異性抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号７の少なくとも一つのアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一実施態様において、多重特異性抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号７の少なくとも二つのアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一実施態様において、多重特異性抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号７の少なくとも一つのアミノ酸配列を含む重鎖を含む二重特異性抗体である。一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む第一の重鎖、及び配列番号７のアミノ酸配列を含む第二の重鎖を含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む第一の重鎖、及び配列番号７のアミノ酸配列を含む第二の重鎖を含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む第一の重鎖、及び配列番号７のアミノ酸配列を含む第二の重鎖を含む。
【０１００】
一実施態様において、多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号７の少なくとも一つのアミノ酸配列の重鎖からのＶＨを含む。一実施態様において、多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号７の少なくとも二つのアミノ酸配列の重鎖からのＶＨを含む。一実施態様において、多重特異性抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号７のアミノ酸配列の重鎖からのＶＨを含む二重特異性抗体である。一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号１のアミノ酸配列の重鎖からのＶＨ、及び配列番号７のアミノ酸配列の重鎖からのＶＨを含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号３のアミノ酸配列の重鎖からのＶＨ、及び配列番号７のアミノ酸配列の重鎖からのＶＨを含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号５のアミノ酸配列の重鎖からのＶＨ、及び配列番号７のアミノ酸配列の重鎖からのＶＨを含む。
【０１０１】
一実施態様において、多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３又は配列番号１５の少なくとも一つのアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一実施態様において、多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３又は配列番号１５の少なくとも二つのアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一実施態様において、多重特異性抗体は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３又は配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨを含む二重特異性抗体である。一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む第一のＶＨ、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む第二のＶＨを含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む第一のＶＨ、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む第二のＶＨを含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む第一のＶＨ、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む第二のＶＨを含む。
【０１０２】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）表４のＨＶＲ−Ｈ１アミノ酸配列からのＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）表４のＨＶＲ−Ｈ２アミノ酸配列からのＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）表４のＨＶＲ−Ｈ３アミノ酸配列からのＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）表４のＨＶＲ−Ｌ１アミノ酸配列からのＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）表４のＨＶＲ−Ｌ２アミノ酸配列からのＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）表４のＨＶＲ−Ｌ３アミノ酸配列からのＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＨＶＲ、二つのＨＶＲ、三つのＨＶＲ、四つのＨＶＲ、五つのＨＶＲ、又は六つのＨＶＲを含む。
【０１０３】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２；（ｆ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＨＶＲ、二つのＨＶＲ、三つのＨＶＲ、四つのＨＶＲ、五つのＨＶＲ、又は六つのＨＶＲを含むＶＨを含む。
【０１０４】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む。一実施態様において、抗体は、配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１０５】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む。一実施態様において、抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１０６】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２；（ｃ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１０７】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１０８】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１０９】
その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２；（ｆ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１１０】
その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１１１】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２；（ｆ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＨＶＲ、二つのＨＶＲ、三つのＨＶＲ、四つのＨＶＲ、五つのＨＶＲ、又は六つのＨＶＲを含む。
【０１１２】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む。一実施態様において、抗体は、配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３、配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１１３】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む。一実施態様において、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号２１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１１４】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１１５】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１１６】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１１７】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１１８】
その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ４；（ｆ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１１９】
その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１２０】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＨＶＲ、二つのＨＶＲ、三つのＨＶＲ、四つのＨＶＲ、五つのＨＶＲ、又は六つのＨＶＲを含む。
【０１２１】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む。一実施態様において、抗体は、配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１２２】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む。一実施態様において、抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１２３】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１２４】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１２５】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１２６】
その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ６；及び（ｆ）配列番号６の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１２７】
その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１２８】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＨＶＲ、二つのＨＶＲ、三つのＨＶＲ、四つのＨＶＲ、五つのＨＶＲ、又は六つのＨＶＲを含む。
【０１２９】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む。一実施態様において、抗体は、配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３、配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１３０】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む。一実施態様において、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１３１】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２；（ｃ）配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１３２】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１３３】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１３４】
その他の実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号８の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１３５】
その他の実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１３６】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号1の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号1の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号1の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、及び（ｄ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｅ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、（ｆ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む。
【０１３７】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、多重特異性抗ＬＲＰ６抗体であり、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む。
【０１３８】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３からの三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメイン、及び（ｄ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｅ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｆ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３からの三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む。
【０１３９】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、多重特異性抗ＬＲＰ６抗体であり、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む。
【０１４０】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、多重特異性抗ＬＲＰ６抗体であり、（ａ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｅ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｆ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む。
【０１４１】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、多重特異性抗ＬＲＰ６抗体であり、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む。
【０１４２】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３からの三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｅ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、（ｆ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３からの三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む。
【０１４３】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、多重特異性抗ＬＲＰ６抗体であり、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む。
【０１４４】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ５、（ｂ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号１の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、及び（ｄ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｅ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、（ｆ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む。
【０１４５】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、多重特異性抗ＬＲＰ６抗体であり、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む。
【０１４６】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、（ａ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号５の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３からの三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ１、（ｅ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ２、（ｆ）配列番号７の重鎖のＨＶＲ−Ｈ３からの三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む。
【０１４７】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、多重特異性抗ＬＲＰ６抗体であり、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第一のＶＨドメインを含み、かつ（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３からの三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む第二のＶＨドメインを含む。
【０１４８】
多重特異性抗ＬＲＰ６抗体の上記実施態様の何れかにおいて、抗体は、（ａ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２；（ｃ）配列番号２又は配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を更に含む。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３を含む。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号４の軽鎖のＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１４９】
多重特異性抗ＬＲＰ６抗体の上記実施態様の何れかにおいて、抗体は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸を含むＨＶＲ−Ｌ２；（ｃ）配列番号２７又は配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を更に含む。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１５０】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体又は多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、アミノ酸配列ＮＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４１）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体又は多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、アミノ酸配列ＮＸ１Ｘ２ＫＮ（配列番号４２）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体又は多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、アミノ酸配列ＮＸ１ＶＫ（配列番号４３）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体又は多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、アミノ酸配列ＮＸ１ＩＫ（配列番号４４）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体又は多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、アミノ酸配列ＮＸ１ＶＫＮ（配列番号４５）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体又は多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、アミノ酸配列ＮＸ１ＩＫＮ（配列番号４６）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。上記実施態様において、Ｘ１はアミノ酸であり、Ｘ２はＩ又はＶであり；又はＸ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、又はＬであり、Ｘ２はＩ又はＶであり；又はＸ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、又はＬであり、Ｘ２はＩであり；又はＸ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、又はＬであり、Ｘ２はＶである。
【０１５１】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体又は多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、アミノ酸配列ＮＡＶＫ（配列番号４７）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体又は多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、アミノ酸配列ＮＡＩＫ（配列番号４８）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体又は多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、アミノ酸配列ＮＡＶＫＮ（配列番号４９）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体又は多重特異性抗ＬＲＰ６抗体は、アミノ酸配列ＮＡＩＫＮ（配列番号５０）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１５２】
上記実施態様の何れかにおいて、抗ＬＲＰ６抗体はヒト化されている。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
【０１５３】
その他の態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号７のアミノ酸配列の重鎖のＶＨに対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。その他の態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３又は配列番号１５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。所定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＬＲＰ６抗体は、ＬＲＰ６へ結合する能力を保持する。所定の実施態様において、総計１から１０のアミノ酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、又は配列番号７のＶＨにおいて、又は配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、又は配列番号１５において、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。
【０１５４】
その他の態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含む。所定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する重鎖配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＬＲＰ６抗体は、ＬＲＰ６へ結合する能力を保持する。所定の実施態様において、総計１から１０のアミノ酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号７において、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。
【０１５５】
所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失が、ＨＶＲの外部の領域（即ちＦＲ内）で生じる。任意で、抗ＬＲＰ６抗体は、翻訳後修飾を含む、配列番号１、配列番号３、配列番号５、又は配列番号７の重鎖及び／又は重鎖のＶＨを含む。
【０１５６】
その他の態様において、抗ＬＲＰ６抗体が提供され、その抗体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８のアミノ酸配列の軽鎖のＶＬに対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。その他の態様において、抗ＬＲＰ６抗体が提供され、その抗体は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。所定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＬＲＰ６抗体は、ＬＲＰ６へ結合する能力を保持する。所定の実施態様において、総計１から１０のアミノ酸が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、又は配列番号８のＶＬにおいて、又は配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６において、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。
【０１５７】
その他の態様において、抗ＬＲＰ６抗体が提供され、その抗体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖を含む。所定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する軽鎖配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＬＲＰ６抗体は、ＬＲＰ６へ結合する能力を保持する。所定の実施態様において、総計１から１０のアミノ酸が、配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８において、置換され、挿入され、及び／又は欠失している。
【０１５８】
所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＬＲＰ６抗体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８の軽鎖及び／又はＶＬ配列を、その配列の翻訳後修飾を含め、包含する。
【０１５９】
その他の態様において、抗ＬＲＰ６抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。
【０１６０】
更なる態様において、本発明は、本明細書に与えられた抗ＬＲＰ６抗体と同一エピトープに結合する抗体を提供する。例えば、所定の実施態様において、配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１０のＶＬ配列、又は配列番号１１のＶＨ配列及び配列番号１２のＶＬ配列、又は配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号１４のＶＬ配列、又は配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含む抗ＬＲＰ６抗体から選択される抗ＬＲＰ６抗体と同一エピトープに結合する抗体が提供される。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、ＬＲＰ６のＥ１−Ｅ２領域のアミノ酸配列からなるエピトープに結合する。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、ＬＲＰ６のＥ３−Ｅ４領域のアミノ酸配列からなるエピトープに結合する。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、ＬＲＰ６のＥ１−Ｅ２領域に存在するアミノ酸配列を含むエピトープに結合し、かつＬＲＰ６のＥ３−Ｅ４領域に存在するアミノ酸配列を含むエピトープに結合する二重特異性抗体である。
【０１６１】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、ＬＲＰ６の残基Ｒ２８、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｅ７３、Ｌ９５、Ｓ９６、Ｄ９８、Ｅ１１５、Ｒ１４１、及びＮ１８５を含む立体構造エピトープに結合する。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、ＬＲＰ６の残基Ｒ２８、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｅ７３、Ｌ９５、Ｓ９６、Ｄ９８、Ｅ１１５、Ｒ１４１、Ｎ１８５，Ｒ２９、Ｗ１８８、Ｋ２０２、Ｐ２２５、Ｈ２２６、Ｓ２４３、及びＦ２６６を含む立体構造エピトープに結合する。
【０１６２】
一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、ＬＲＰ６のＥ１のβプロペラのアミノ酸残基  Ｒ２８、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｅ７３、Ｌ９５、Ｓ９６、Ｄ９８、Ｅ１１５、Ｒ１４１、及びＮ１８５の少なくとも一つ、少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、少なくとも五つ、少なくとも六つ、少なくとも七つ、少なくとも八つ、少なくとも九つ、少なくとも十、少なくとも十一、又は全てと相互作用する。更なる実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体は、ＬＲＰ６残基のＲ２９、Ｗ１８８、Ｋ２０２、Ｐ２２５、Ｈ２２６、Ｓ２４３、及びＦ２６６の少なくとも一つ、少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、少なくとも五つ、少なくとも六つ、少なくとも七つと更に相互作用する。
【０１６３】
更なる態様にて、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様のいずれかに記載の抗ＬＲＰ６抗体は、単独または組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる。
【０１６４】
１．抗体親和性
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）。
【０１６５】
一実施態様において、以下のアッセイにより説明されるように、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の力価測定系の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照)。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(例えば、Prestaら, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。 ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間(例えばおよそ６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭγ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ）にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
【０１６６】
他の実施態様によると、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡＣＯＲＥ Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入する。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（ｓｔｏｐ−ｆｌｏｗ ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズ ＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【０１６７】
２．抗体断片
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ，及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃFv断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), 頁269-315 (1994)を参照;また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０１６８】
ダイアボディは２価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
【０１６９】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。所定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６ Ｂ１号を参照）。
【０１７０】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌やファージ）による生産を含む。
【０１７１】
３．キメラ及びヒト化抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１７２】
所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。所定の実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
【０１７３】
ヒト化抗体およびそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号、及び第７０８７４０９号; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）; Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (「リサーフェシング(resurfacing)」を記述); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述);及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択（guided selection）」アプローチを記述）に記載されている。
【０１７４】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域(例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照); ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域 (例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照); 及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域 (例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及び Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照)を含む。
【０１７５】
４．ヒト抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
【０１７６】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つまたはインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６０７５１８１号及び６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号及び、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、さらに種々のヒト定常領域と組み合わせることにより、例えば、更に改変される可能性がある。
【０１７７】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によって製造することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。(例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 頁51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している)及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (ヒト-ヒトハイブリドーマを記載している)に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【０１７８】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
【０１７９】
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性または活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【０１８０】
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが個別ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性なしで免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。 最後に、ナイーブなライブラリはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の未転位Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０を含む。
【０１８１】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体の断片とみなされる。
【０１８２】
６．多重特異性抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。所定の実施態様において、結合特異性の一つはＬＲＰ６に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。所定の実施態様において、二重特異性抗体は、ＬＲＰ６の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたＬＲＰ６を発現する細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１８３】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照)及び「ｋｎｏｂ-ｉｎ-ｈｏｌｅ」技術（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。
【０１８４】
多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照)、２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること(例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照)、二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること(例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照)、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること(例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照)、及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【０１８５】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照）。
【０１８６】
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＮＲＧ並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
【０１８７】
７．抗体変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、またはペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び/又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作成され得る。
【０１８８】
ａ）置換変異体、挿入変異体、及び欠失変異体
所定の実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされた。
【０１８９】
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【０１９０】
アミノ酸は共通の側鎖特性に応じて分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性、親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
【０１９１】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【０１９２】
置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、さらなる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイベースの親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照)、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、またはモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【０１９３】
所定の実施態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で発生する可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個または３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【０１９４】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基またはグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１９５】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０１９６】
ｂ）グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体がグリコシル化される程度を増加または減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成または削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
【０１９７】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は一定の改善された特性を有する抗体変異型を作成するために行われ得る。
【０１９８】
一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、または２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流または下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「フコース非修飾」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。フコース非修飾抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986);米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８ Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２ Ａ１号、Ａｄａｍｓら、特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、アルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞(例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
【０１９９】
抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖とともに更に与えられる。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０２００】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
所定の実施態様において、１つまたは複数のアミノ酸改変が、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【０２０１】
所定の実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイでは、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。
【０２０２】
造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の464頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号 (例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照) 及びHellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 第５８２１３３７号 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照)に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができるＣ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003);及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照)。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定はまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる(例えば、Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照)。
【０２０３】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０２０４】
ＦｃＲへの改善又は減少させた結合を持つ特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／１０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照)。
【０２０５】
所定の実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
【０２０６】
幾つかの実施態様において、改変された（すなわち改善されたか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域において改変がなされ、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明される。
【０２０７】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基の１以上の置換を有するものが含まれる：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７３７１８２６号）。
【０２０８】
Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０２０９】
ｄ）システイン改変抗体変異体
所定の実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン改変抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で起きる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分またはリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。所定の実施態様において、以下の残基のいずれかまたは複数がシステインに置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０２１０】
ｅ）抗体誘導体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手されている追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造において好都合である。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、１つより多い重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのか等を考慮しながら決定することができる。
その他の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体と非タンパク質部分のコンジュゲートが、提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【０２１１】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号で説明したように、組換えの方法および組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＲＰ６抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は〜を含む（例えば、〜で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第ニベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗ＬＲＰ６抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、および必要に応じて、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０２１２】
抗ＬＲＰ６抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニングおよび/または発現のために1つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【０２１３】
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物または真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で製造することができる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照）。発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。
【０２１４】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は、「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
【０２１５】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【０２１６】
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【０２１７】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞系は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), 頁255-268 (2003)を参照。
【０２１８】
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗ＬＲＰ６抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、または特徴づけることができる。
【０２１９】
１．結合アッセイとその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【０２２０】
その他の態様において、競合アッセイが、ＬＲＰ６に結合するための本発明の抗ＬＲＰ６抗体と競合する抗体を同定するために用いることができる。
【０２２１】
所定の実施態様において、このような競合する抗体は、本発明の抗ＬＲＰ６抗体により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
【０２２２】
典型的な競合アッセイにおいて、固定化ＬＲＰ６は、ＬＲＰ６に結合する第一の標識された抗体、及びＬＲＰ６へ結合について第一の抗体と競合する能力について試験された未標識の第二の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化ＬＲＰ６が、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。ＬＲＰ６への第一の抗体の結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化されたＬＲＰ６に結合した標識の量が測定される。もし、固定化ＬＲＰ６に結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体がＬＲＰ６への結合に対して、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies:A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０２２３】
２．活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらの抗ＬＲＰ６抗体を同定するために与えられる。生物学的活性は、例えば、Ｗｎｔアイソフォーム媒介性シグナル伝達の阻害又は増強、変調骨量／含量、細胞増殖の抑制、細胞増殖の増大を含み得る。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
【０２２４】
所定の実施態様において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。生物学的活性を試験するために使用される特異的なアッセイが、実施例に記載される。
【０２２５】
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、１つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗ＬＲＰ６抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０２２６】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であり、そこでは抗体が、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０ ４２５２３５ Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び第５７８０５８８号及び第７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン、カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、第５７１４５８６号、第５７３９１１６号、第５７６７２８５号、第５７７０７０１号、第５７７０７１０号、第５７７３００１号、及び第５８７７２９６号を参照;Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993);及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン (Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002);及び米国特許第６６３０５７９号を参照）；メトトレキサート、ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン、トリコテセン、及びＣＣ１０６５を含む一以上の薬物にコンジュゲートしている。
【０２２７】
その他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。
【０２２８】
その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のためにコンジュゲートを使用する場合は、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再び、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
【０２２９】
抗体と細胞傷害性薬物のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート (SMCC)、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）など、を使って作成され得る。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992);米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。
【０２３０】
本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の(例えばＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを限定されないが明示的に熟考している。
【０２３１】
Ｅ．診断及び検出のための方法および組成物
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗ＬＲＰ６抗体の何れかは、生物学的サンプル中のＬＲＰ６の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。所定の実施態様において、生物学的サンプルは細胞又は組織を含む。
【０２３２】
一実施態様において、診断又は検出の方法に使用される抗ＬＲＰ６抗体が提供される。更なる態様において、生物学的サンプル中のＬＲＰ６の存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様において、本方法は、抗ＬＲＰ６抗体のＬＲＰ６への結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗ＬＲＰ６抗体と生物学的サンプルを接触させること、及び複合体が抗ＬＲＰ６抗体とＬＲＰ６との間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。一実施態様において、例えばＬＲＰ６が患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗ＬＲＰ６抗体が抗ＬＲＰ６抗体による治療にふさわしい被検体を選択するために使用される。
【０２３３】
本発明の抗体を用いて診断され得る典型的な障害は、癌及び骨格系の障害を含む。
【０２３４】
所定の実施態様において、標識された抗ＬＲＰ６抗体が与えられる。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光、発色、高電子密度の化学発光、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応や分子間相互作用を介して間接的に検出されるような酵素やリガンドのような部分が含まれる。このような標識の例には、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ(米国特許第４７３７４５６号)、ルシェフェリン、２,３-ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどを酸化する過酸化水素を利用する酵素とカップリングさせたもの、などが含まれる。
【０２３５】
Ｆ．薬学的処方物
本明細書に記載の抗ＬＲＰ６抗体の薬学的処方物は、所望の程度の純度を有するそのような抗体と任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980))とを、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つまたは複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
【０２３６】
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２３７】
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
活性成分はまた、調製されるマイクロカプセルに、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって、捕捉され得る、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、コロイド薬物送達系で（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンで。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。
【０２３８】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形をしている。
【０２３９】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。
【０２４０】
Ｇ．治療的方法及び組成物
本明細書で提供される抗ＬＲＰ６抗体のいずれかを、治療方法で使用することができる。
一態様では、医薬として使用するための抗ＬＲＰ６抗体が提供される。更なる態様において、Ｗｎｔ媒介性障害、例えば、癌又は骨格障害又は骨障害の治療に使用される抗ＬＲＰ６抗体が提供される。所定の実施態様において、治療の方法に使用される抗ＬＲＰ６抗体が提供される。所定の実施態様において、本発明は、個体に抗ＬＲＰ６抗体の有効量を投与することを含む、癌又は骨格障害又は骨障害を有する個体を治療する方法に使用される抗ＬＲＰ６抗体を提供する。一つのそのような実施態様において、この方法は、例えば後述するように、少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本発明は、第一のＷｎｔアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達の阻害、及び第二のＷｎｔアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達の増強に使用される抗ＬＲＰ６抗体を提供する。所定の実施態様において、本発明は、個体において、第一のＷｎｔアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達を阻害し、及び第二のＷｎｔアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達を増強する方法に使用される抗ＬＲＰ６抗体を提供し、第一のＷｎｔアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達を阻害し、及び第二のＷｎｔアイソフォームによって誘導されたシグナル伝達を増強するために、抗ＬＲＰ６抗体の有効量を個体に投与することを含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
【０２４１】
更なる態様にて、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＬＲＰ６抗体の使用を提供する。一実施態様において、医薬は、癌又は骨格障害又は骨障害などのＷｎｔ媒介性障害の治療用である。更なる実施態様において、医薬は、Ｗｎｔ媒介性障害を有する個体に対して医薬の有効量を投与することを含み、癌又は骨格障害又は骨障害などのＷｎｔ媒介性障害を治療する方法に使用される。一つのそのような実施態様において、この方法は、例えば後述するように、少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０２４２】
更なる態様において、本発明は、Ｗｎｔ媒介性障害、例えば、癌又は骨格障害又は骨障害の治療するための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、Ｗｎｔ媒介性障害などを有する個体に、ＬＲＰ６抗体の有効量を投与することを含む。一つのそのような実施態様において、この方法は、後述するように、少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０２４３】
一実施態様において、Ｗｎｔ媒介性障害は、例えば、非小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、又は前立腺癌などの癌である。その他の実施態様において、Ｗｎｔ媒介性障害は、例えば、骨粗しょう症、変形性関節症、骨折、又は骨病変などの骨格障害又は骨障害である。
【０２４４】
一つの実施態様は、ＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害する抗体、及びＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂからなる群から選択されるＷｎｔアイソフォームにより誘導されたシグナル伝達を阻害する抗体の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法を提供する。その他の実施態様は、ＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａにより誘導されたシグナル伝達を阻害する抗体、及びＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂにより誘導されたシグナル伝達を阻害する抗体の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法を提供する。その他の実施態様は、ＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａにより誘導されたシグナル伝達を阻害する抗体、及びＬＲＰ６に結合し、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、及びＷｎｔ１０ｂにより誘導されたシグナル伝達を阻害する抗体の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法を提供する。
【０２４５】
更なる態様において、本発明は、Ｗｎｔアイソフォームによるシグナル伝達を増強する抗ＬＲＰ６抗体、及びＷｎｔアイソフォームにより誘導されたＷｎｔシグナル伝達を増強するためのＷｎｔアイソフォームの有効量を個体に投与することを含む、個体においてＷｎｔアイソフォームにより誘導されたＷｎｔシグナル伝達を増強するための方法を提供する。
【０２４６】
更なる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される抗ＬＲＰ６抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＬＲＰ６抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体を含む。その他の実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＬＲＰ６抗体のいずれかと、少なくとも１つの更なる治療剤を、例えば後述するように含む。
【０２４７】
本発明の抗体は、治療において、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は少なくとも１つの更なる治療剤と同時投与され得る。所定の実施態様において、更なる治療薬は、化学療法剤である。その他の実施態様において、薬剤は、癌の治療、又は骨格障害又は骨障害の治療に有効である抗体である。上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一または別々の製剤に含まれている）、及び、本発明の抗体の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。本発明の抗体はまた放射線治療と併用して用いることができる。
【０２４８】
本発明の抗体（および任意の追加の治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、および鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内または皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間ポイント上の単一または複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。
【０２４９】
本発明の抗体は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０２５０】
疾患の予防又は治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば抗体の約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、１つ以上の低用量を投与してよい。この治療法の進行は従来の手法及び試験により容易にモニタリングされる。
【０２５１】
上記の製剤または治療方法のいずれかが、抗ＬＲＰ６抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。
【０２５２】
製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベルまたは容器上にあるまたは容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグ 等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；および（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの立場から望まれる他の物質を更に含んでもよい。
【０２５３】
上記の製造品の何れかは、抗ＬＲＰ６抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。
【実施例】
【０２５４】
以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、様々な他の実施態様が実施され得ることが理解される。
実施例１：
実験手順
細胞培養及び細胞アッセイ
細胞株ＥＫＶＸとＭ１４を、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭグルタミンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させ、ＪＨＨ−１細胞は、同じサプリメントによりウィリアムズの培地Ｅで増殖させた。他のすべての細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手し、推奨されているように維持された。
【０２５５】
細胞は、製造業者の推奨に従い、２４ウェルプレートでＦｕＧＥＮＥ ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いてトランスフェクトした。ルシフェラーゼレポーターアッセイでは、発現プラスミドＤＮＡの混合物が、トランスフェクトされた：７．５ｎｇ ＴＯＰｇｌｏｗ（アップステート（Ｕｐｓｔａｔｅ））又はＴＯＰｂｒｉｔｅ(Zhangら、2009)ホタルルシフェラーゼＷｎｔレポーター、０．５ｎｇのｐＲＬ−ＳＶ４０のウミシイタケルシフェラーゼ（プロメガ）、及び１ｎｇのＬＥＦ１。細胞は、トランスフェクションの２４時間後に開始し、１６から２０時間、抗体で処理した。Ｗｎｔ３ａタンパク質（Ｘに従って精製されたか又はＲ＆Ｄシステムズから購入した）が、抗体治療を開始して１時間後に開始し、細胞に添加された。細胞を溶解緩衝液１５０μｌに回収され(DeAlmeidaら、2007)、発光は、デュアルグロ（Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ）ルシフェラーゼ系（プロメガ）及びエンビジョンマルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して溶解液の３０−５０ｕｌについてアッセイした。ホタルルシフェラーゼのレベルは、ウミシイタケルシフェラーゼレベルに対するトランスフェクション効率について規格化され、相対的なルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）は、Ｗｎｔ３ａはで刺激していない細胞のレベルに規格化された。
【０２５６】
ＴＯＰｂｒｉｔｅレポーターが安定に組込まれたＨＥＫ２９３細胞株及びＨｓ５７８Ｔ細胞株が、ハイグロマイシン耐性のために選択された。Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターの発現が、ＨＥＫ２９３細胞においては、安定に組込まれたＳＶ４０駆動型ウミシイタケルシフェラーゼに基づいて、又はＨｓ５７８Ｔ細胞においては、ＭｕｌｔｉＴｏｘ−Ｆｌｕｏｒ細胞生存率アッセイ（プロメガ）に基づいて、細胞数に対して規格化される。
【０２５７】
Ｗｎｔキメラコンストラクトが、ｐＲＫ５発現ベクターの完全長ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、又はＬＲＰ６の上流の完全長Ｗｎｔ１又はＷｎｔ３ａのクローニングにより作成された。２４アミノ酸リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＴ）３がＷｎｔ配列とＦＺＤ配列又はＬＲＰ６配列との間に挿入された(Congら、2004)。
【０２５８】
ワンアーム型ＹＷ２１１．３１抗体変異体が、「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」技術を用いて、切断Ｆｃドメインを持つＹＷ２１１．３１．６２の重鎖及び軽鎖を共発現することにより大腸菌で生成された(Ridgway, J.B.B. et al, Protein Engineering 9:617-621 (1996)。 抗体架橋結合のために、Ｆｃ特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体又はＦ（ａｂ’）２断片（シグマアルドリッチ）が、ワンアーム型ＹＷ２１１．３１抗体とインキュベートされ、１時間後にその混合物が細胞に添加された。
【０２５９】
ウエスタン解析のために、１．２ｘ１０６のＨＥＫ２９３細胞が１０ｃｍのディッシュ上で播種され、３日後に１０μｇ／ｍｌの抗体、又はＸμｇ／ｍｌのＤＫＫ１（Ｒ＆Ｄシステムズ）又はＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃ(DeAlmeidaら、2007)タンパク質で１時間処置され、その後更に１時間０．２ｕｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａを添加した。細胞は冷却ＰＢＳで２回洗浄され、氷上で０．５ｍｌの溶解緩衝液で溶解した。２０μｇのタンパク質が、変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（４−１２％）上で電気泳動により分離され、ニトロセルロース膜へ移され、リン酸化された全ＬＲＰ６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、βカテニン（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、βアクチン及びＧＡＰＤＨに対して抗体により探索された。タンパク質は赤外線標識二次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）及びオデッセイイメージャー（ＬＩ−ＣＯＲ）を用いて可視化した。
【０２６０】
定量的リアルタイムＰＣＲ（定量ＰＣＲ）発現解析のために、ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン）を用いて細胞からＲＮＡが単離され、７９００ＨＴファストリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ）上で、ＴａｑＭａｎ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）により反応が行われた。相対的ＲＮＡレベルは△△Ｃｔ法を用いて計算され、同一試料内で、ヒトＧＡＰＤＨ又はマウスＲｐｌ１９ ＲＮＡレベルに規格化され、更にＷｎｔ３ａ、抗体又は他のタンパク質を添加ていない（ＮＡ）、細胞からのサンプルに規格化された。プライマー及びプローブのセットは、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブ配列のそれぞれについて５’から３’にリストされる。
ＳＰ５：ＡＡＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＡＡＴＡＧＡＡＡ（配列番号３２）、
ＡＡＣＣＧＧＴＣＣＴＡＧＣＧＡＡＡＡ（配列番号３３）、
ＣＣＧＡＧＣＡＣＴＧＴＴＴＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＡ（配列番号３４）；
ＺＮＲＦ３：ＴＧＡＧＡＧＴＧＴＧＡＣＡＴＴＧＴＴＧＧＡＡ（配列番号３５）、
ＧＴＡＡＡＡＴＣＴＧＴＧＴＧＣＡＡＴＴＡＴＣＡＴＧＴ（配列番号３６）、
ＡＡＴＣＡＴＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＡＡＣＡＣＡＡＧＡＣＣＣＴＧＴＡＡＡＴ（配列番号３７）；
マウスＭｍｐ７：ＴＧＡＧＧＡＣＧＣＡＧＧＡＧＴＧＡＡ（配列番号３８）、
ＣＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＴ（配列番号３９）、
ＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＴＧＡ（配列番号４０）．
【０２６１】
ヒトＡＰＣＤＤ１、ＡＸＩＮ２、ＧＡＤ１、ＬＥＦＴＹ２、及びＳＡＸ１のため、及びマウスＲｐｌ１９及びＡｘｉｎ２のためのプライマーとプローブは以前に説明された (DeAlmeida, et al. (2007); Liu et al., (2010))。
【０２６２】
ＧＡＰＤＨプライマー及びプローブはアプライドバイオシステムズから購入した。レポーター遺伝子及びｑＰＣＲ解析のために、全ての図は、三回又は四回の実験反復の平均値と標準偏差を示す。
【０２６３】
ＬＲＰ６抗体のスクリーニング及び親和性成熟
領域Ｅ１−Ｅ２（配列番号２９のアミノ酸Ａ１９ーＲ６４４）及びＥ３−Ｅ４（配列番号２９のアミノ酸Ｖ６２９−Ｇ１２４４）をコードするヒトＬＲＰ６のｃＤＮＡ断片は、ＨＳＶシグナル配列とタンパク質タグとしてヒトＩｇＧのＦｃ領域（配列番号３０（Ｅ１−Ｅ２−ｆｃ）；配列番号３１（Ｅ３−Ｅ４−ｆｃ））を含む哺乳類の発現ベクター中に別個にクローニングされた。ＬＲＰ６．Ｅ１−Ｅ２−Ｆｃタンパク質及びＬＲＰ６．Ｅ３−Ｅ４−Ｆｃタンパク質は、一過性のトランスフェクションによりＣＨＯ細胞で発現させ、プロテインＡ／Ｇアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ＬＲＰ６．Ｅ１−Ｅ２−Ｆｃタンパク質及びＬＲＰ６．Ｅ３−Ｅ４−Ｆｃタンパク質はまた、合成ヒトＦａｂファージディスプレイライブラリーをスクリーニングするために個別に使用された。固定化ＬＲＰ６タンパク質上で選択後に、ファージクローンは単離され、Ｆｃタンパク質ではなく、ＬＲＰ６−Ｆｃ融合タンパク質断片に対する結合についてファージＥＬＩＳＡ法により確認された。その次に、ファージＦａｂクローンが、ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体としての発現のために再編成された。ＬＲＰ６．Ｅ１−Ｅ２−Ｆｃに対する２４の固有の抗体重鎖クローン、及びＬＲＰ６．Ｅ３−Ｅ４−Ｆｃに対する２２のクローンがトランスフェクトされ、一般的なハーセプチン由来ヒトカッパ軽鎖でＨＥＫ２９３細胞中に一過性に発現され、ＩｇＧタンパク質はアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。続く大規模な抗体調製物は、ＣＨＯ細胞で一過性のトランスフェクションにより産生された。
【０２６４】
ＹＷ２１１．３１抗体はＨｉｓタグ付きＬＲＰ６．Ｅ３−Ｅ４タンパク質を用いて親和性成熟された。ＣＤＲループの三つの異なる組合わせ（Ｈ１／Ｌ３、Ｈ２／Ｌ３、及びＨ３／Ｌ３）が、別々のライブラリー中で、ソフトランダム化（ｓｏｆｔ−ｒａｎｄｏｍｉｚｉｎｇ）選択残基によりランダム化のために標的とされた。更に、Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３のＣＤＲの組合わせが、ハードランダム化（ｈａｒｄ ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）のために標的とされた。選択の第一ラウンドにおいて、無作為化されたライブラリ由来のファージが、固定化されたＬＲＰ６．Ｅ３−４−Ｈｉｓタンパク質を用いて選択され、その後５ラウンドの液−相選別が続き、ＬＲＰ６．Ｅ３−４−Ｈｉｓの濃度が３００ｎＭから０．５ｎＭに徐々に減らされ、ＬＲＰ６．Ｅ３−４−Ｆｃタンパク質の１００倍過剰が添加され、より速い解離速度を有する抗体を枯渇させた。１１のファージクローンが精製され、全てが、ファージ競合ＥＬＩＳＡによって決定されるように、ＬＲＰ３．Ｅ３−Ｅ４に対して改善された親和性を示した。これらのクローンの配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ３、及びＣＤＲ−Ｌ３において１から６アミノ酸の変化を示した。精製抗体の解離速度定数を、ＢＩＡｃｏｒｅ機器を用いて表面プラズモン共鳴分析により評価した。
【０２６５】
バイオレイヤーインターフェロメトリーＬＲＰ６タンパク質結合アッセイ
バイオレイヤーインターフェロメトリーを以前に記載のように実施した(Bourhis et al., 2010)。短く言うと、ビオチン標識化、Ｈｉｓタグ付きＬＲＰ６タンパク質は、ＡｖｉＴａｇシステム（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）を使用して、バキュロウイルス感染昆虫細胞から精製した。結合速度は２０μｇ／ｍｌのＬＲＰ６タンパク質がロードされたストレプトアビジン高結合ＦＡバイオセンサーを使用してＯｃｔｅｔ ＲＥＤシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で測定した。担体無しの精製ヒトＷｎｔ３ａ及びマウスＷｎｔ９ｂは、Ｒ＆Ｄシステムズから購入し、精製ＤＫＫ１タンパク質は以前に記載の通りに産生された(Bourhis et al., 2010)。
【０２６６】
腫瘍及び骨の研究
ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１トランスジェニックマウスからの腫瘍をＣ５７ＢＬ／６マウスの乳腺脂肪体中で継代し、機械的及び酵素的に解離させ、マトリゲル及びハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中に再懸濁され、胸腺欠損ＮＣＲヌードマウス（タコニック）の乳腺脂肪体に注入された。腫瘍体積が２５０から８００ｍｍ３に達したら治療が開始された。各治療群において、１０匹のマウスに、３０ｍｇ／ｋｇの抗体又はタンパク質が腹腔内に（ＩＰ）２日ごとに投与された。腫瘍体積は、キャリパー測定を用いて解析した。
【０２６７】
Ｎｔｅｒａ-２異種移植腫瘍の増殖及びインビボ研究が、以前に記載のように行われた(DeAlmeida et al., 2007)。簡単には、ＮＵ／ＮＵ無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に、マウスあたり千万のＮｔｅｒａ−２細胞（ＨＢＳＳ中の５０％のマトリゲル中）が皮下注射され、平均腫瘍体積が５３５−５９５ｍｍ３に達したとときに４つ又は５つのグループに分けられ、１００ｍｇ／ｋｇの抗体又は３０ｍｇ／ｋｇのＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質の単一のＩＰ用量が注射された。腫瘍サンプル及び血液の血清サンプルは、治療後１６時間で採取した。腫瘍はＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒシステム（キアゲン）を用いてホモジナイズし、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（キアゲン）を用いて抽出した。
【０２６８】
頭蓋冠を採取し、Mohammadら、2008により記載のように培養した。簡単に説明すると、頭蓋冠は、２日齢の仔マウスから切り出され、半分にカットし、硬膜、血管、及び頭皮から分離した。頭蓋冠は０．１％ウシ血清アルブミン及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシンの各々を補充したＢＧＪｂ培地で組織培養プレートで１日培養し、その後７日間、１０μｇ／ｍｌの抗体又はタンパク質で処理した。骨は、３７℃で５％ＣＯ２の加湿大気中で培養した。マウス頭蓋冠は、μＣＴ４０（ＳＣＡＮＣＯ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｂａｓｓｅｒｄｏｒｆ，スイス）Ｘ線マイクロＣＴ装置で撮像した。マイクロＣＴデータは以下のパラメーターにより得られた：Ｘ線管のエネルギーレベル＝４５ｋＶ、電流＝１７７μＡ、積分時間＝３００ミリ秒、２０００投影。軸方向の画像が６μｍの等方性分解能で得られた。ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）ファントムが、キャリブレーションのために使用された。マイクロＣＴスキャンは、Ａｎａｌｙｚｅ（ＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ社、レネックサ、カンザス州、米国）で解析した。横断面の最大強度の投影及び３次元表面レンダリングが、各サンプルにおいて作成された。頭頂骨の境界線は、頭頂部セグメント化するためのトレース・ツールを使用して手動で描かれた。この領域内で、サンプルの体積及び平均骨密度（ＢＭＤ）が計算された。領域内の石灰化組織のみの平均ＢＭＤを計算するために、０．３ｇｍ−ＨＡ／ｃｍ３の閾値がその領域に適用された。閾値はまた、石灰化ボクセル数の数を頭頂部の総ボクセルで除することにより、頭頂部の石灰化した体積の割合を計算するために使用された。以下のパラメーターが各サンプルについて解析された：頭頂部の体積、頭頂部の石灰化したボクセルのＢＭＤ、及び石灰化した頭頂部の割合。グループ間の相違は、ダネット検定によりｐ値が０．０５未満の場合、有意であると考えられた。
【０２６９】
マウスを用いた全ての実験は、ジェネンテック機関内動物実験委員会のガイドラインに沿って行われた。
【０２７０】
実施例２：
Ｗｎｔアンタゴニストの単離及びＬＲＰ６モノクローナル抗体の増強
Ｗｎｔシグナル伝達を操作するための治療用分子の候補を開発するために、Ｗｎｔ３ａタンパク質により誘導されたシグナル伝達を阻害又は増強することができる抗体が作成された。組換えＬＲＰ６．Ｅ１−Ｅ２−Ｆｃ（配列番号３０）タンパク質及びＬＲＰ６．Ｅ３−Ｅ４−Ｆｃタンパク質（配列番号３１）が、ヒト合成Ｆａｂファージディスプレイライブラリーをスクリーニングするために使用され、単離されたファージクローンのＬＲＰ６への結合がＥＬＩＳＡにより確認された。ＬＲＰ６．Ｅ１−Ｅ２に対する２４の固有の抗体重鎖クローン及びＬＲＰ６．Ｅ３−Ｅ４に対する２２のクローンが単離され、再編成され、ヒトＩｇＧ１抗体として発現された。０．１ｍｇ／ｍｌの精製Ｗｎｔ３ａで誘導されたＨＥＫ２９３細胞中において、ＬＲＰ６．Ｅ３−Ｅ４抗体のうち六つが、濃度依存的にＷｎｔルシフェラーゼレポーター活性を阻害した（図１Ａ）。これと他のすべてのグラフのエラーバーは、特に断りがない限り、少なくとも３反復サンプルの標準偏差を表す。これらの抗体は、ＹＷ２１１．０３、ＹＷ２１１．０８、ＹＷ２１１．１１、ＹＷ２１１．１２、ＹＷ２１１．３１、及びＹＷ２１１．３３と命名された。ＬＲＰ６．Ｅ１−Ｅ２抗体のいずれも、この阻害を示さなかった。ＬＲＰ６．Ｅ３−Ｅ４ドメインを認識するＹＷ２１１．３１抗体は、約１μｇ／ｍｌ（又は６ｎＭ）のＩＣ５０を持ち、Ｗｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３細胞におけるシグナル伝達の阻害において最も強力であった。ＹＷ２１１．３１抗体は、精製されたＦｚｄ８ＣＲＤタンパク質及びＤＫＫ１タンパク質に類似して、ＬＲＰ６タンパク質のレベルに影響を与えることなく、Ｗｎｔ３ａ誘導性ＬＲＰ６リン酸化及びβカテニンタンパク質の安定化を阻害した（図１Ｂは、Ｗｎｔ３ａで刺激されていないか又は刺激され、指定されたＬＲＰ６抗体又は精製タンパク質（βカテニン及びＧＡＰＤＨタンパク質のレベルはロードしたコントロールのサンプルとして示される）で処置されたＨＥＫ２９３細胞のウエスタン解析を示す。）。ＲＮＡｉ実験は、βカテニンポリクローナル抗体により認識された低分子量のバンドのみがβカテニンタンパク質を表わしていることを示した。ＹＷ２１１．３１抗体はまた、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞中のＷｎｔ３ａ誘導性レポーター活性と、マウスＬ細胞中のβカテニンタンパク質の安定化を部分的に阻害するため、マウスＬＲＰ６機能に拮抗することができる。
【０２７１】
ＹＷ２１１．３１抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により約２ｎＭの結合親和性、及びスキャッチャード分析により約０．６ｎＭの結合親和性を有する。ＹＷ２１１．３１抗体親和性と潜在的な効力を改善するために、クローンは、Ｈｉｓタグ付きＬＲＰ６ Ｅ３−Ｅ４タンパク質、及び選択されたＣＤＲ残基がランダム化の標的とされたＣＤＲコンビナトリアルライブラリーを用いて親和性成熟された。ファージ競合ＥＬＩＳＡにより最も改善された親和性を示す４つのファージクローン、ＹＷ２１１．３１．１１、ＹＷ２１１．３１．１１、３５、ＹＷ２１１．３１．５７、及びＹＷ２１１．３１．６２が再編成され、完全長ヒトＩｇＧとして発現された。４つの親和性成熟ＩｇＧの全ての解離速度定数は減少し、最良の２つの抗体ＹＷ２１１．３１．５７とＹＷ２１１．３１．６２についてそれぞれＫＤが０．２７ｎＭと０．１７ｎＭという改善された親和性をもたらした。ＹＷ２１１．３１．５７及びＹＷ２１１．３１．６２はまた、Ｗｎｔ３ａに刺激されたＨＥＫ２９３細胞におけるシグナル伝達の阻害において、約０．１μｇ／ｍｌ（０．６ｎＭ）のＩＣ５０値を持ち、改善された効力を示している。
【０２７２】
スクリーニングで単離された抗体の何れもが、外因性Ｗｎｔ３ａタンパク質を用いた刺激のない状態で、ＨＥＫ２９３細胞中のシグナル伝達を活性化しなかったが、しかし、５つのＬＲＰ６ Ｅ１−Ｅ２及び２つのＥ３−Ｅ４抗体が、Ｗｎｔ３ａ誘導性シグナル伝達を少なくとも２倍増強した。マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞において、ＹＷ２１０．０９、Ｅ１−Ｅ２抗体はまた、Ｗｎｔ３ａ誘導性シグナル伝達を少なくとも１．５倍増強し、それがまたマウスＬＲＰ６を認識することを示している。ＨＥＫ２９３細胞において、ＹＷ２１０．０９抗体によるＷｎｔ３ａ誘導性シグナル伝達の増強の大きさは、Ｗｎｔ３ａの濃度に比例している（図１Ｃ）。ＹＷ２１０．０９抗体は、ＳＰＲ分析によって測定されるように、５ｎｍのＫＤでヒトＬＲＰ６ Ｅ１−Ｅ２蛋白質と相互作用する。ＥＬＩＳＡ試験は、全てのアンタゴニスト及び増強抗体が、それらの単離に用いたＬＲＰ６タンパク質断片のみに特異的に結合し、何れもＥ１−Ｅ２とＥ３−Ｅ４の両方を認識しないことを示している。ＦＡＣＳ分析は、可溶性ＬＲＰ６ Ｅ１−Ｅ４タンパク質が、ＹＷ２１１．３１．５７及びＹＷ２１０．０９のＨＥＫ２９３細胞への結合を、効率的かつ完全にブロックすることを示しており、これらの抗体が、他の細胞表面タンパク質を認識しないことを示している。
【０２７３】
実施例３：
自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達におけるＬＲＰ６モノクローナル抗体の作用
ＬＲＰ６抗体が、内因性、又は自己分泌のＷｎｔシグナル伝達に拮抗又は増強する能力が、様々な腫瘍細胞株を用いて決定された(Bafico et al., 2004; DeAlmeida et al., 2007; Akiri et al., 2009)。テラトカルシノーマ細胞株のＰＡ−１及びＮＴＥＲＡ−２において、ＹＷ２１１．３１抗体は、外因性Ｗｎｔ３ａで観察されたのと類似した効力で、自己分泌シグナル伝達により誘導されたレポーター活性を阻害する（図２Ａは、ルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトされ、かつ、ＬＲＰ６抗体で（個別に又は組合わせの何れかで）、又はＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質（陽性コントロール）で処置された、ＰＡ−１テトラカルシノーマ細胞における自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達の濃度依存性阻害及び増強を示す。）。
【０２７４】
ＰＡ１細胞において、ＹＷ２１１．３１抗体によるＷｎｔシグナル伝達の阻害はまた、内因性Ｗｎｔ標的遺伝子の発現について観察される（図２Ｂ）。図２Ｂは、０．３ｍｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａタンパク質と共に又は無しで処置され、かつ１０ｍｇ／ｍｌのＹＷ２１１．３１抗体、陰性コントロールとして抗ｇＤモノクローナル抗体、又は陽性コントロールとしてＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質で処置され、更にＷｎｔ３ａを添加していない（ＮＡ）細胞からのサンプルに規格化された、ＰＡ−１細胞中の、Ｗｎｔ誘導遺伝子ＳＡＸ１及びＧＡＤ１、及びＷｎｔ抑制遺伝子ＬＥＦＴＹ２のｑＰＣＲ発現解析の結果を示す。
【０２７５】
抗体は、外因性Ｗｎｔ３ａタンパク質により誘導されたか、又は内因性の自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達により維持されているかの何れかである、ＳＡＸ１、ＧＡＤ１、及びＡＰＣＤＤ１の発現を部分的に阻害する。逆に、Ｗｎｔ３ａタンパク質または自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達の何れかの方法によるＬＥＦＴＹ２発現の抑制は、ＹＷ２１１．３１抗体によって緩和される。ＹＷ２１１．３１とは対照的に、ＹＷ２１０．０９抗体は、レポーター遺伝子アッセイにより、ＰＡ−１及びＮＴＥＲＡ−２細胞株における、Ｗｎｔ３ａ誘導性及び自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達の両方を増強する（図２Ａ）。Ｗ２１１．３１．５７抗体によるＷｎｔシグナル伝達の阻害は、抗体濃度の増加に伴い徐々に増加するが、一方、ＹＷ２１０．０９及び他の抗体による増強は、ＰＡ−１細胞などの幾つかの細胞種において、高い抗体濃度で減少させることができる。このことは、高抗体濃度は一価の相互作用を好み、よってＬＲＰ６分子の架橋を制限するであろう故に、増強のために受容体ＬＲＰ６の二量体化が必要であることを示し得る。ＰＡ−１又はＮＴＥＲＡ−２細胞のＹＷ２１１．３１．５７及びＹＷ２１０．０９抗体の両方の組合わせによる処置は、ＹＷ２１１．３１．５７単独の効果に類似して、Ｗｎｔ３ａ誘導性シグナル伝達及び自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達の両方に拮抗する。
【０２７６】
自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を示す更なる細胞株を同定するために、Ａｘｉｎ２ ｍＲＮＡ又はリン酸化ＬＲＰ５／６の比較的高発現を示す細胞株が、Ｗｎｔルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおけるＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質によるＷｎｔシグナル伝達の阻害について試験された。９つの細胞株が、Ｆｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質により阻害される自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を示し、他のＷｎｔアンタゴニストによるアッセイに基づき、内因性Ｗｎｔシグナル伝達を有すると以前に報告されている、ＮＳＣＬＣ細胞株のＮＣＩ−Ｈ２３及びＮＣＩ−Ｈ２０３０及び軟部組織肉腫細胞ＳＷ８７２及びＨＴ−１０８０を含む (Guo et al., 2008; Akiri et al., 2009; Nguyen et al., 2009)。図３は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（ｐ値＜０．０１）により解析されたデータの概要を示す。増強作用を増大させるために、アッセイは、１ｍｇ／ｍｌのＹＷ２１１．３１．５７抗体又はＹＷ２１０．０９抗体でそれぞれ処置されたＮＣＩ−Ｈ３５８細胞及びＨＴ−１０８０細胞を除き、１０ｍｇ／ｍｌの抗体を用いて行われた。
【０２７７】
Ｗｎｔシグナル伝達は、外因性Ｗｎｔ３ａタンパク質により９つの細胞株全てにおいて更に誘導され、ＹＷ２１１．３１．５７抗体がＷｎｔ３ａに対するこの応答を阻害した（図３、４Ａ、４Ｄ、及び４Ｆ）。驚くべきことに、９つのこれらの細胞株の全てにおいて、ＹＷ２１１．３１．５７抗体は、自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を増強したが、ＹＷ２１０．０９は５つの株において自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を増強し、３つの株において阻害した（図３、４Ａ−４Ｃ、４Ｅ及び４Ｆ）。自己分泌及びＷｎｔ３ａ誘導性シグナル伝達におけるＹＷ２１１．３１．５７抗体のこの相反する活性は、ルシフェラーゼレポーターを用いてだけでなく、試験された６つの細胞株においてＡｘｉｎ２などの内因性Ｗｎｔ標的遺伝子の発現においても観察された（図４Ａ、４Ｂ、及び４Ｃ）。ＥＫＶＸ及び乳癌Ｈｓ５７８Ｔ細胞株において、ＹＷ２１１．３１抗体によるＷｎｔシグナル伝達の増加は、この増加がＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質によりブロックされることを実証することにより、（複数の）自己分泌Ｗｎｔに依存していることが確認された（図４Ｇ）。ＥＫＶＸ及びＨｓ５７８Ｔ細胞における自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達の増強はまた、スクリーニングで同定されたＷｎｔ３ａは誘導性のシグナル伝達の他の５つの抗体アンタゴニストで観察される。
【０２７８】
図４Ａにおいて、ＨＴ−１０８０、ＥＫＶＸ、ＮＣＩ−Ｈ３５８、及びＨｓ５７８ＴにおけるＡＸＩＮ２ ｍＲＮＡのｑＰＣＲ発現解析は、ＹＷ２１１．３１．５７（２５ｍｇ／ｍｌ）抗体は、自己分泌（ＮＡ）Ｗｎｔシグナル伝達を増強し、Ｗｎｔ３ａ（０．２ｍｇ／ｍｌ）により誘導されたシグナル伝達を阻害するが、Ｆｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃ（２５ｍｇ／ｍｌ）は自己分泌（ＮＡ）シグナル伝達とＷｎｔ３ａ誘導性シグナル伝達の両方に拮抗することを示している。図４Ｂ及び４Ｃにおいて、ＮＣＩ−Ｈ２３（Ｂ）細胞及びＭ１４（Ｃ）細胞中のＷｎｔ誘導性遺伝子の発現が、ＹＷ２１１．３１．５７で増強され、ＹＷ２１０．０９抗体（３０μｇ／ｍｌ）により拮抗される。Ｗｎｔ３ａ（０．２ｍｇ／ｍｌ）とＦｚｄ８ＣＲＤ−ＦＣ（３０ｍｇ／ｍｌ）の処置は、自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達のそれぞれ増強および抑制のための陽性コントロールとして示され、ＣＤ４−Ｆｃタンパク質（Ｂ）又は抗ｇＤ抗体（Ｃ）は、陰性コントロール（３０ｍｇ／ｍｌ）として機能する。Ｍ１４細胞（Ｃ）については、ＡＸＩＮ２及びＳＰ５の発現が、Ｗｎｔ３ａタンパク質又はＹＷ２１１．３１．５７抗体によって、ＡＰＣＤＤ１及びＺＮＲＦ３の発現よりも、より強力に増強される。図４Ｄ及び４Ｅは、Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターを安定に組入れたＨｓ５７８Ｔ細胞において、ＹＷ２１１．３１．５７抗体は、濃度依存的に、Ｗｎｔ３ａ刺激性シグナル伝達（Ｄ）の阻害及び自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達（Ｅ）の増強を示しているが、０．１ｍｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａの刺激の有る無し（ＮＡ）に関わらず、Ｆｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質はシグナル伝達を阻害し、ＹＷ２１０．０９抗体はシグナル伝達を増強する。ＲＮＡｉ実験は、Ｈｓ５７８Ｔ細胞内のＷｎｔ３ａ誘発性シグナル伝達の少なくとも４１％がＬＲＰ５発現に依存しており、このシグナル伝達は、ＹＷ２１１．３１．５７抗体でなく、Ｆｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質により阻害されることが予測される。この実験において、ＳＶ４０駆動型ルシフェラーゼは、規格化のためにトランスフェクトされておらず、代わりに、抗体及びタンパク質の処置は、この細胞株の生存率に有意な影響を及ぼさないことが独立して確認された。図４Ｆ及び４Ｇは、ＷｎｔルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトされたＥＫＶＸ細胞はまた、自己分泌シグナル伝達（ＮＡ）の増強、及びＹＷ２１１．３１．５７抗体によるＷｎｔ３ａ誘導性シグナル伝達の拮抗作用を示すことを示すことを示している。自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達の抗体媒介性増強は、５ｍｇ／ｍｌのＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質により阻害される。
【０２７９】
実施例４：
異なるＷｎｔアイソフォームにおけるＬＲＰ６抗体の相反する活性
ＹＷ２１１．３１抗体は、全ての細胞株において外因性Ｗｎｔ３ａタンパク質によって誘導されたシグナル伝達を阻害するが、細胞株に依存した方法で自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を阻害又は増強することができ、自己分泌シグナルを駆動する特定のＷｎｔのアイソフォームが抗体の活性を特定することを示唆している。従って、Ｗｎｔ３ａ及び他のＷｎｔアイソフォームの外因性発現により誘導されたシグナル伝達における抗体の活性を測定した。ＨＥＫ２９３細胞又はＨｓ５７８Ｔ細胞の何れかにおいてＷｎｔ３ａのトランスフェクションによって誘発されるＷｎｔシグナル伝達は、Ｗｎｔ３ａタンパク質処置により誘導されたシグナル伝達の阻害と同様の効力で、ＹＷ２１１．３１．５７抗体によって阻害される。驚くべきことに、両細胞株においてＷｎｔ１発現により誘導されたシグナル伝達は、ＹＷ２１１．３１．５７抗体によって増強された。Ｗｎｔ１シグナル伝達及びＷｎｔ３ａシグナル伝達の両方が、期待されるようにう、Ｆｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質によって阻害される。Ｗｎｔ１シグナル伝達の増強もまた、スクリーニングで同定される他のＷｎｔ３ａアンタゴニスト抗体で観察された。ＹＷ２１０．０９抗体はまた、Ｗｎｔ３ａ誘導性シグナル伝達及びＷｎｔ１誘導性シグナル伝達に対して対立する活性を示し、それはＹＷ２１１．３１．５７の活性、即ち、Ｗｎｔ３ａシグナル伝達の増強およびＷｎｔ１シグナル伝達の阻害の相反であった。Ｗｎｔ標的遺伝子のＡｘｉｎ２及びＭｍｐ７の低下した発現により観察されるように、ＹＷ２１０．０９抗体はまた、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１マウス腫瘍から培養で増殖させた腫瘍細胞におけるＷｎｔ１シグナル伝達を、Ｆｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質の処置と同程度に、阻害する。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１細胞では、Ｗｎｔ１シグナル伝達がすでにこれらの細胞内で最大であるため、ＹＷ２１１．３１．５７抗体は、Ｗｎｔ１シグナル伝達を増強することができなかった。
【０２８０】
ＹＷ２１１．３１．５７抗体及びＹＷ２１０．０９抗体が、Ｗｎｔ３ａとＷｎｔ１によって開始されたＷｎｔシグナル伝達において相反活性を有することが実証されており、この分析はまた、ＨＥＫ２９３細胞においてルシフェラーゼレポーター２倍以上誘導する１９のＷｎｔ遺伝子のうち更なる１１のＷｎｔ遺伝子において行われた。図５は、データの概要、１０μｇ／ｍｌの抗体、１０μｇ／ｍｌのＦｚｄ８ＣＲＤを用いて行われたアッセイの要約を与える。Ｗｎｔ３ａとＷｎｔ３の活性のみＹＷ２１１．３１．５７抗体によって阻害され、両方がＹＷ２１０．０９によって増強される。Ｗｎｔ１に加え、７つのＷｎｔのアイソフォームがＹＷ２１１．３１．５７によって増強され、ＹＷ２１０．０９によって阻害される。Ｗｎｔアイソフォームの第三のクラス（Ｗｎｔ７ａ、７ｂ、及び１０ａ）が、どの抗体でも阻害されなず、少なくともＹＷ２１１．３１．５７により増強されるシグナル伝達活性を示す。異なるＷｎｔアイソフォームでトランスフェクトされたＨｓ５７８Ｔ細胞では、抗体は、これらの同一活性の大半を示す。特に、ＹＷ２１１．３１．５７はＷｎｔ３とＷｎｔ３ａを阻害し、ルシフェラーゼレポーターを少なくとも２倍誘導する１１の他のＷｎｔアイソフォームの全てを増強する。ＹＷ２１０．０９はまた、Ｈｓ５７８Ｔ細胞内のＷｎｔ３とＷｎｔ３ａを増強し、並びに、ＨＥＫ２９３細胞で拮抗され、かつＨｓ５７８Ｔ細胞で試験することができる７つのＷｎｔアイソフォームのうち５つを阻害するこのクラスの他の２つのＷｎｔアイソフォームである、Ｗｎｔ８ａ及びＷｎｔ９ｂは、Ｈｓ５７８Ｔ細胞でＹＷ２１０．０９抗体により影響されない。ＲＮＡｉ実験は、ＨＥＫ２９３細胞でなくＨｓ５７８Ｔ細胞においてＷｎｔ３ａシグナル伝達が、ＬＲＰ６及びＬＲＰ５の両方により形質導入されるため、Ｗｎｔ８ａ及びＷｎｔ９ｂは主にＨｓ５７８Ｔ細胞におけるＬＲＰ５を介してシグナル伝達することがある。ＨＥＫ２９３細胞におけるように、第三のクラスにおけるＷｎｔアイソフォームは、Ｈｓ５８７Ｔ細胞中でどちらの抗体によっても阻害されず、我々はこのクラスに、ＨＥＫ２９３細胞でシグナル伝達を誘導しなかったＷｎｔ４を追加することができる。ＹＷ２１０．０９抗体が、ＨＥＫ２９３細胞でなくＨｓ５７８Ｔにおいて、そのシグナル伝達を増強するという点で、このクラスのＷｎｔ７ｂの活性のみが異なる振る舞いをする。ＹＷ２１１．３１．５７抗体とＹＷ２１０．０９抗体のＷｎｔアイソフォーム特異的活性とは対照的に、Ｆｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＷｎｔ６とＷｎｔ９ｂを除いて、全てのＷｎｔの活性を強力に阻害することができる。Ｈｓ５７８Ｔ細胞では、自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達は、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７ａ、及びＷｎｔ７ｂの発現により誘導されてシグナル伝達されるように、ＹＷ２１１．３１．５７抗体とＹＷ２１０．０９抗体の両方によって増強される。したがって、これらの３つのＷｎｔアイソフォームは、Ｈｓ５７８Ｔ細胞における自己分泌シグナル伝達を駆動するものの候補である。
【０２８１】
Ｗｎｔ７ｂに対する複数のｓｉＲＮＡは（他のＷｎｔのアイソフォームでなく）、Ｈｓ５７８Ｔ細胞で自己分泌シグナル伝達を阻害し、特定のＷｎｔタンパク質媒介性シグナル伝達を同定する。ＰＡ−１細胞における自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達がＹＷ２１１．３１．５７抗体によって阻害され、ＹＷ２１０．０９によって増強されるため、Ｗｎｔ３又はＷｎｔ３ａは、おそらくこれらの細胞において内因性シグナル伝達を活性化する。実際、Ｗｎｔ３ａでなくＷｎｔ３に対するｓｉＲＮＡは、ＰＡ−１細胞において自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。ＮＣＩ−Ｈ２３ ＮＳＣＬＣ細胞及びＭ１４メラノーマ細胞において、ＹＷ２１１．３１抗体による自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達の増強とＹＷ２１０．０９による拮抗作用は、ＮＣＩ−Ｈ２３細胞において内因性シグナル伝達を抑制するＷｎｔ２ ＲＮＡｉ、及びＭ１４細胞における内因性Ｗｎｔ１発現と一致している。複数のｓｉＲＮＡを用いて、我々は、ＮＣＩ−Ｈ２３細胞におけるＷｎｔ２の発現及びＭ１４細胞におけるＷｎｔ１の発現が自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達に必要であることを確認している。
【０２８２】
Ｗｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３細胞内でシグナル伝達に拮抗する、実施例２のスクリーニングから単離された全ての抗体はまた、試験した他の全ての細胞株でＷｎｔ３ａ刺激を阻害し、またテトラカルシノーマ細胞株において自己分泌シグナル伝達を阻害するため、これらの抗体は、試験された他の９つの細胞株において自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を増強することを予期されなかった。更に、ＹＷ２１０．０９抗体は、試験した全ての細胞株においてＷｎｔ３ａシグナル伝達を増強し、かつ７つの細胞株において自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を増強するが、３つの他の株では内因性シグナル伝達を阻害する。これらの研究は、（同じ細胞株で発現された）異なるＷｎｔアイソフォームがＬＲＰ６抗体の活性を決定し、そのＷｎｔ３ａアンタゴニスト及び増強抗体はまた、他のＷｎｔタンパク質の大半において相反作用を持っていることを示している。これらの研究は、異なるＷｎｔアイソフォームを同一細胞株へ導入することがＬＲＰ６抗体の活性を決定し、そのＷｎｔ３ａアンタゴニスト及び増強抗体はまた、他のＷｎｔタンパク質の大半において相反作用を持っていることを示している。２つのＬＲＰ６抗体とのそれらの機能的相互作用に基づき、試験された１４のＷｎｔアイソフォームを３つのクラスにグループ分けすることができる。Ｗｎｔ３及びＷｎｔ３ａはＹＷ２１１．３１により阻害され、ＹＷ２１０．０９により増強され；Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、及びＷｎｔ１０ｂはＹＷ２１１．３１により増強され、ＹＷ２１０．０９により拮抗され；及びＷｎｔ４、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、及びＷｎｔ１０ａはＹＷ２１１．３１により増強され、ＹＷ２１０．０９により阻害されない（図５）。Ｗｎｔ３／３ａサブファミリーは、最も進化的に発散しているが（Choら、2010）、これらの分類は明らかにＷｎｔ遺伝子の提唱された系統に対応していない。
【０２８３】
実施例５：
Ｗｎｔアイソフォームは、ＬＲＰ６抗体の異なる活性を特定する
異なるＷｎｔのアイソフォームが様々な細胞株において内因性に発現された異なるＦＺＤアイソフォームに優先的に結合することができ、我々のＬＲＰ６抗体の特異的活性の恐らくは主要因である可能性がある。この可能性を検討するために、異なるＷｎｔ−ＦＺＤの対を共有結合で連結するキメラタンパク質が、特定のＷｎｔアイソフォーム又はＦＺＤアイソフォームがＬＲＰ６抗体の活性を決定するかどうかを試験するために構築された。ＦＺＤ４又はＦＺＤ５どちらに融合したＷｎｔ３ａ又はＷｎｔ１は、内因性Ｗｎｔ発現の推定的欠損下で、ＨＥＫ２９３細胞においてＷｎｔシグナル伝達を活性化するが、ＦＺＤ４又はＦＺＤ５の過剰発現は、Ｗｎｔシグナル伝達を誘導しない。ＹＷ２１１．３１．５７抗体はＦＺＤ４又はＦＺＤ５のどちらかに融合したＷｎｔ３ａのシグナル伝達活性を阻害し、ＦＺＤ４又はＦＺＤ５どちらかに融合したＷｎｔ１の活性を増強する（図６は、データの概要、１０μｇ／ｍｌの抗体、１０μｇ／ｍｌのＦｚｄ８ＣＲＤを用いて行われたアッセイの要約を与える）。ＹＷ２１０．０９抗体は、両方を阻害するＷｎｔ１キメラに対する相反する活性を示す。従って、抗体の活性は、ＦＺＤアイソフォームとではなくＷｎｔアイソフォームと相関している。Ｆｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質は、４つのＷｎｔ−ＦＺＤキメラのいずれかにより誘導されたシグナル伝達に影響を与えず、ＷｎｔｓのＦＺＤ−結合部位の独立して機能するキメラと一致している。
【０２８４】
Ｗｎｔ１又はＷｎｔ３ａをＬＲＰ６に融合するキメラの発現は、ＬＲＰ６の過剰発現よりはるかに強力にＷｎｔシグナル伝達を誘導する。ＹＷ２１１．３１．５７抗体及びＹＷ２１０．０９抗体は、この誘導を阻害することはできず、抗体の阻害機能が、ＬＲＰ６へのＷｎｔ結合をブロックすることに依存しているという仮説と一致している（図６）。
【０２８５】
この研究では、ＦＺＤでなくＷｎｔアイソフォームが、抗体の活性を決定することを確認する。ＦＺＤでなく、ＬＲＰ６とのＷｎｔアイソフォームのキメラタンパク質融合物は、ＬＲＰ６抗体による阻害に対して非感受性であり、拮抗作用はリガンド−コレセプターの相互作用を遮断することによって媒介される可能性があることを示唆している。これは、ＬＲＰ６のＥ３−Ｅ４領域内で両方とも競合的に結合するＷｎｔ３ａ及びＹＷ２１０．０９抗体について、及びＥ１−Ｅ２領域内で結合を競合するＷｎｔ９ｂ及びＹＷ２１１．３１抗体についてのインビトロでの結合実験によって確認されている。２つのＬＲＰ６抗体のエピトープの各々は、一方はＥ１−Ｅ２ドメイン内部に、一方はＥ３−Ｅ４ドメイン内部に、異なるクラスのＷｎｔアイソフォームについての結合部位を定義する。少なくとも第三のＷｎｔ結合部位が、抗体又はそれらの組み合わせのいずれかによっても阻害されないアイソフォームについて予測されており、４つの反復ドメインのそれぞれが、Ｗｎｔアイソフォームの異なるサブセットを結合するように見える。このモジュール構造化は、Ｗｎｔ結合アンタゴニスト、及びコレセプター結合アンタゴニスト、例えば、それぞれＳＦＲＰタンパク質アイソフォーム及びＤＫＫタンパク質アイソフォームによる分別制御に対応するために、異なるＷｎｔ及びそれらの結合部位の構造的多様性を可能にし得る。
【０２８６】
実施例６：
Ｗｎｔシグナル伝達の抗体媒介性増強はＬＲＰ６二量体化を含む
ＹＷ２１１．３１抗体による自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達の増強は、恐らくはＬＲＰ６の二量体化を通じて、結合活性作用を必要とする。ＹＷ２１１．３１の一価Ｆａｂ断片及び組換えワンアーム型ＹＷ２１１．３１抗体は、ＥＫＶＸ細胞及びＨｓ５７８Ｔ細胞において、これらの細胞株中でＷｎｔ３ａ誘導性シグナル伝達を阻害する濃度で、自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達の増強を示さない。対照的に、ＹＷ２１１．３１ Ｆａｂ断片及びワンアーム型ｍＡｂは、ＰＡ−１テトラカルシノーマ細胞株中で自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達及びＷｎｔ３ａ誘導シグナル伝達の両方を、インタクトなＩｇＧ抗体と同様の効力で、阻害する。ワンアーム型ＹＷ２１１．３１抗体の架橋が全ＩｇＧ分子のＷｎｔ増強機能を回復させるするかどうかを試験するために、ＹＷ２１１．３１．５７抗体によって増強される自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達及びＷｎｔ２誘導性シグナル伝達を示すＨＴ−１０８０軟部組織肉腫細胞株、並びにＦｃ架橋により亢進されるＡｐｏｍａｂ抗体誘導性アポトーシスを使用した(Adamsら、2008)。ワンアーム型ＹＷ２１１．３１抗体は、自己分泌Ｗｎｔシグナル又はＷｎｔ２トランスフェクションによって誘導されたシグナル伝達に影響を与えない。Ａｐｏｍａｂ媒介性アポトーシスを増強する抗Ｆｃ抗体との架橋結合条件の下では、ワンアーム型抗体の架橋が、ＹＷ２１１．３１．５７全抗体で観察される自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達及びＷｎｔ２シグナル伝達の両方の増強を部分的に再構築することが決定された。
【０２８７】
ワンアーム型抗体形式とＦａｂ抗体形式は、架橋しない限り、Ｗｎｔシグナル伝達を向上させないため、抗体媒介性Ｗｎｔ増強はコレセプター二量体化を必要とする。また、本明細書に示される細胞ベースのデータ及び生化学的データは、架橋されたＬＲＰ６へのＷｎｔの結合はまた、シグナル伝達の増強のために必要であり、恐らくは複合体中へのＦＺＤのＷｎｔ媒介性補充の要求を反映していることを示している。過剰発現されたＬＲＰ６のごく一部は、細胞表面でホモ二量体として同定することができ、二量体化は細胞外ドメインを必要とするが、しかしながら、これが、ＬＲＰ６の過剰発現により誘導されたＷｎｔ非依存性−β−カテニンシグナル伝達に寄与するかどうかは明確ではない(Liuら、2003)。ＬＲＰ６の細胞外ドメインの欠失はまた、Ｗｎｔに依存しない方式でシグナル伝達を活性化し、別の方法によるこの組換えタンパク質の強制的細胞外２量体化は、この活性を亢進するか又は阻害するかの何れかが可能である(Liuら、2003; Congら、2004)。Ｗｎｔは、原形質膜でのＬＲＰ６の凝集及びリン酸化を誘導し、両方とも細胞内ＤＶＬタンパク質のホモオリゴマー化機能を必要とする(Bilicら、2007)。これらの大きな凝集体もＡｘｉｎとＧＳＫ３を含み、β−カテニンの分解を阻害する可能性がある。
【０２８８】
実施例７：
Ｗｎｔアンタゴニストの結合を阻害することによるＷｎｔシグナル伝達の抗体媒介性増強
ＤＫＫ１アイソフォーム及びＳＯＳＴなどの細胞外ＬＲＰ６アンタゴニストの活性を阻害することもＷｎｔシグナル伝達を増強することができる(Niidaら、2004)。外因性ＤＫＫ１タンパク質はＨＥＫ２９３細胞においてＷｎｔ１誘導性シグナル伝達を阻害し、ＹＷ２１１．３１．５７抗体は、この拮抗作用をブロックすることができ、ＤＫＫ１タンパク質の存在下で十分に高い濃度にて、シグナル伝達を増強することさえできる（図４Ｇ）。これに対して、ＹＷ２１１．３１ワンアーム型抗体は、これらの同じ濃度でＷｎｔ１シグナル伝達のＤＫＫ１拮抗作用を非常に弱く阻害する。ＹＷ２１１．３１．５７の完全抗体は、試験された全てのＤＫＫ１濃度でＤＫＫ１活性に効果的に拮抗するが、ワンアーム型抗体は低いＤＫＫ１濃度でさえも、最小限度か、あるいはまったく影響がない。ワンアーム型ＹＷ２１１．３１抗体でなく完全抗体で観察された外因性ＤＫＫ１活性の強力な拮抗作用は、完全抗体に固有のＷｎｔ−増強活性に寄与するかもしれない。あるいは、ＤＫＫ１タンパク質は、このアッセイにおいてＷｎｔ１誘導性シグナル伝達を完全には阻害することができなかったので、インタクトなＹＷ２１１．３１抗体は、ＬＲＰ６の二量体化を介して、残存するシグナル伝達を単に増強することも可能である。
【０２８９】
ＬＲＰ６とのＤＫＫ１の相互作用の抗体阻害は、必ずしもＷｎｔシグナル増強活性を付与せず、ＤＫＫ１拮抗作用はＬＲＰ６二量体化を要求しているように見えるため、ＤＫＫ１活性の阻害は、コレセプターに結合したＷｎｔによる、残存するシグナル伝達の増強によって主に媒介される可能性が高い。
【０２９０】
実施例８：
Ｗｎｔシグナル伝達拮抗作用はＬＲＰ６抗体の組み合わせにおいて優勢である。
上記のアッセイはＬＲＰ６のＥ１−Ｅ２領域内でＷｎｔ３ａとＷｎｔ３が結合し、ＹＷ２１１．３１．５７抗体による結合が抑制されることを示している。Ｗｎｔ１クラスにおけるＷｎｔアイソフォームは、Ｅ３−Ｅ４領域に結合すると予測されており、この結合はＹＷ２１０．０９抗体によってブロックされる。何れの理論に縛られることなく、Ｗｎｔシグナル伝達の増強は、Ｗｎｔアイソフォーム及び抗体の両方が同じＬＲＰ６の分子を結合することができる場合に生じる可能性があり、恐らくは抗体によるＷｎｔとＬＲＰ６の二量体化によりＦＺＤのリクルートメントを必要とする。このモデルは、両方の抗体の組み合わせがＷｎｔシグナルアイソフォームのどちらかのクラスによって誘発されるシグナル伝達を阻害するであろうと予測しており、その理由は、ＬＲＰ６二量化は恐らく依然として生じるであろうが、Ｗｎｔ結合が、１つまたは他の抗体によってブロックされるであろうゆえである。予測されるように、ＨＥＫ２９３細胞をＹＷ２１１．３１．５７抗体及びＹＷ２１０．０９抗体と同時に処置することは、Ｗｎｔ３ａ又はＷｎｔ１の何れかの発現により開始されたシグナル伝達を阻害する（図７及び８Ａ）。図８Ａに示されたアッセイは、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ１の何れか又はＷｎｔ３ａとＷｎｔ１の両方の発現コンストラクトでトランスフェクトされているＷｎｔルシフェラーゼレポーターを安定に組込まれたＨＥＫ２９３細胞中で実施された。全ての抗体とタンパク質は、１０μｇ／ｍｌでそれぞれ使用した。この分析は、Ｗｎｔ１クラスの他の３つのＷｎｔアイソフォームに拡張され、ＹＷ２１１．３１．５７抗体とＹＷ２１０．０９抗体の組合わせが、ＹＷ２１０．０９単独と同程度に、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害することが見出された（図７）。Ｗｎｔ３ａとＷｎｔ１の両方が同時に発現される場合、どちらの抗体も、Ｗｎｔシグナル伝達に拮抗しないが、両方の抗体の組み合わせではシグナル伝達を阻害する（図８Ａ）。この結果の一つの可能な説明は、各抗体がただ一つのＷｎｔアイソフォームの結合を阻害し、両方の抗体が同時にＬＲＰ６の分子に結合し、Ｗｎｔ結合部位の両方をブロックすることができるということである。
【０２９１】
ＹＷ２１１．３１．５７又はＹＷ２１０．０９抗体により拮抗されない第三のクラスの４つのＷｎｔアイソフォームは、何れの抗体によってもブロックされないＬＲＰ６上の部位に結合する可能性があるか、あるいは、抗体により定められたＷｎｔ結合部位の何れかに結合する能力を有し得る。これらのＷｎｔアイソフォームの各々において、両方の抗体の組合わせはまた、それらのシグナル伝達を阻害するのでなく、むしろ増強するか、もしくはそれらの活性に影響を与えず、これらのＷｎｔアイソフォームが、ＹＷ２１１．３１．５７エピトープ及びＹＷ２１０．０９エピトープとは異なる部位に結合することができることを示唆している。
【０２９２】
外因性Ｗｎｔアイソフォームにより誘導されたＹＷ２１１．３１．５７及びＹＷ２１０．０９抗体の組合わせの観察された活性はまた、内因性、自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達にまで及ぶ。ＹＷ２１１．３１．５７抗体が自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を阻害し、かつＹＷ２１０．０９抗体がそれを増強する、テトラカルシノーマ細胞株ＰＡ−１及びＮｔｅｒａ−２において、抗体の組合わせはシグナル伝達を阻害する（図２Ａ）。両方の抗体が自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を増強する、Ｈｓ５７８Ｔ細胞及びＥＫＶＸ細胞においては、抗体の組合わせはまた増強する（図８Ｂ及び８Ｃ）。
【０２９３】
実施例９：
ＬＲＰ６抗体は複数の部位へのＷｎｔの結合を差動的に阻害する。
ＬＲＰ６抗体の相反する活性は、ＹＷ２１１．３１．５７及びＹＷ２１０．０９は、ＬＲＰ６上の異なるＷｎｔアイソフォーム結合部位と相互作用し、かつＷｎｔ結合は、アンタゴニスト抗体により拮抗されるが増強抗体により許容されることを示していた。精製された固定化ＬＲＰ６細胞外ドメインタンパク質に対する精製されたＷｎｔタンパク質を測定するバイオレイヤーインターフェロメトリーアッセイは（実施例１を参照）、Ｗｎｔ３ａは、ＹＷ２１１．３１．５７抗体に対するエピトープが存在するＬＲＰ６のＥ３−Ｅ４領域へ結合し、Ｗｎｔ９ｂ（抗体相互作用についてＷｎｔ１と同一クラスにある）は、ＹＷ２１０．０９抗体もまた結合するＥ１−Ｅ２領域のみに結合することを示した(Bourhisら、(2010)。ＹＷ２１０．０９でなく、ＹＷ２１１．３１．５７抗体は、ＬＲＰ６．Ｅ１−Ｅ４タンパク質断片へのＷｎｔ３ａの結合を阻害する（図９Ａ）。逆に、ＹＷ２１１．３１．５７でなくＹＷ２１０．０９は、Ｗｎｔ９ｂのＬＲＰ６．Ｅ１−Ｅ４への結合を阻害する（図９Ｂ）。これらのアッセイにおいて、ＬＲＰ６タンパク質への抗体結合は平衡に到達され、干渉縞におけるその後の波長シフトが、Ｗｎｔタンパク質結合の会合段階と解離段階において示される。
【０２９４】
Ｗｎｔ結合の抗体媒介性阻害はまた、より小さなＷｎｔ結合断片である、Ｗｎｔ３ａに対するＥ３−Ｅ４及びＷｎｔ９ｂに対するＥ１−Ｅ２を用いて検出することができる（図９Ｃ及び９Ｄ）。ワンアーム型ＹＷ２１１．３１抗体はまた、Ｅ３−Ｅ４断片へのＷｎｔ３ａ結合を阻害することができる。また、ＹＷ２１１．３１．５７及びＹＷ２１０．０９は、競合することなく、いずれの順序で追加されても、ＬＲＰ６．Ｅ３−Ｅ４タンパク質へ逐次的に結合することができる。Ｗｎｔ３ａとＹＷ２１１．３１．５７抗体のみの間の結合、及びＷｎｔ９ｂとＹＷ２１０．０９のみの間の結合に関する競合は、特異的Ｗｎｔアイソフォームによるシグナル伝達に対する各抗体の阻害活性と相関する。
【０２９５】
以前に、バイオレイヤーインターフェロメトリーアッセイは、精製されたＤＫＫ１タンパク質がＬＲＰ６のＥ３−Ｅ４断片とＥ１−Ｅ２断片の両方に結合することができ、この結合が、これらのそれぞれのタンパク質領域へのＷｎｔ３ａとＷｎｔ９ｂの結合を阻害することができることを示した。このアッセイは、ＹＷ２１１．３１．５７抗体及びＹＷ２１０．０９抗体は、各々ＬＲＰ６．Ｅ１−Ｅ４タンパク質へのＤＫＫ１結合を阻害することができることを示すのに用いられた。ＹＷ２１１．３１．５７抗体はまた、ＬＲＰ６．Ｅ３−Ｅ４タンパク質へのＤＫＫ１結合を阻害し、ＹＷ２１０．０９抗体はＬＲＰ６．Ｅ１−Ｅ２断片へのＤｋｋ１の結合をブロックする。ワンアーム型ＹＷ２１１．３１抗体は、細胞においてＷｎｔシグナル伝達を増強することが出来ず、又はＷｎｔシグナル伝達における外因性ＤＫＫ１活性に有意に拮抗できないにも関わらず、この阻害活性を完全に保持する。この結果は、ＤＫＫ１拮抗作用は、Ｗｎｔシグナル伝達の抗体媒介性増強へ恐らくは有意には寄与しないことを示している。
【０２９６】
実施例１０：
ＬＲＰ６抗体はＷｎｔ駆動型腫瘍及び骨形成において活性である。
ＬＲＰ６抗体の抗腫瘍治療効果の探索を開始するため、Ｗｎｔリガンド駆動型腫瘍の２つのモデルが扱われた。Ｗｎｔ１発現に依存するＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１トランスジェニック乳腺腫瘍同種移植片と未知のＷｎｔアイソフォームの自己分泌Ｗｎｔシグナルによって駆動されるＮｔｅｒａ−２ヒトテトラカルシノーマ異種移植片(DeAlmeidaら、2007)。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１トランスジェニックマウスの乳腺腫瘍から単離された細胞が、無胸腺ヌードマウスに腫瘍を確立するために使用され、それらは２日ごとに抗体が投与された。迅速かつ持続的な腫瘍の退縮がＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質に類似してＹＷ２１０．０９抗体で観察された（図１０Ａ）。ＹＷ２１１．３１．５７抗体は、コントロールバッファー（ＰＢＳ）又は抗ｇＤ抗体処置と比較して、これらの条件下で腫瘍の増殖を変えなかった。マウスは抗体又はタンパク質の３０ｍｇ／ｋｇを２日ごとに投与された（矢印）（図１０Ａ）。これらの結果は、組織培養で扱われたＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍細胞のＷｎｔ標的遺伝子の発現における上記の抗体の作用と一致している。
【０２９７】
Ｎｔｅｒａ−２テラトカルシノーマ細胞はまた、抗体又はＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質のいずれかで処理した無胸腺ヌードマウス中に異種移植腫瘍を確立するために使用された。抗体のＹＷ２１１．３１．５７、ワンアーム型ＹＷ２１１．３１、又はＹＷ２１１．３１．５７とＹＷ２１０．０９との組合わせで処置された腫瘍から抽出されたＲＮＡは、Ｗｎｔ標的遺伝子のＳＰ５の発現を、バッファー注射コントロールマウス由来の腫瘍の４１−５７％のレベルへ減少させたが、一方、Ｆｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質処置はＳＰ５発現を８．０％へ減少させた。ＳＰ５のｍＲＮＡレベルは同一腫瘍内のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルに対して規格化され、更に、ＰＢＳ処置腫瘍に対して規格化された。ＹＷ２１０．０９を除く全ての処置は、ＰＢＳコントロールに比し、ＡＮＯＶＡによりｐ値＜０．００５を示している（図１０Ｂ）。Ａｘｉｎ２発現はＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃによりわずか５６．２％へと減少し、Ａｘｉｎ２発現の有意な変化は抗体処置の何れにおいても検出されなかった。ＹＷ２１０．０９抗体処置はＳＰ５又はＡｘｉｎ２のどちらの発現にも有意な影響を与えなかった。ＨＥＫ２９３細胞におけるＷｎｔ３ａ誘導性シグナル伝達の阻害又は増強についての血清サンプルアッセイでは、注射された抗体及びタンパク質は、１６時間の曝露を通じて、少なくとも若干の活性をインビボで保持することを確認している。
【０２９８】
Ｗｎｔシグナル伝達の活性化又は増強は、骨芽細胞の分化と機能を亢進することにより、及び間接的に破骨細胞の分化を阻害することにより、骨質量を増加させることができるため(Glass et al., 2005)、器官培養中のマウス頭蓋冠の骨におけるＬＲＰ６抗体の活性が試験された。顕微頭蓋外植片は、抗体又はＲＡＮＫ−Ｆｃで培養され、次いで頭頂骨量及び密度をマイクロコンピュータ断層撮影で分析した。コントロールサンプルのヒストグラム分析を用いて、Ｘ線減衰範囲は石灰化（骨）組織及び非石灰化（軟骨）組織について定められた。ＹＷ２１０．０９抗体による処置は石灰頭頂骨の平均骨密度（ＢＭＤ）を７．４％だけ有意に増加させ、破骨細胞の分化を阻害するＲＡＮＫーＦｃ処置で観察された６．８％の増加に類似している（図１０Ｃ；Hsuら、1999）。ＹＷ２１１．３１．６２抗体による処置は、石灰頭頂部のＢＭＤを有意には変えなかった。全ての処置は７日間で１０μｇ／ｍｌの抗体又はタンパク質であった。図１０Ｃにおいて、データポイントは、各投与群の４匹のマウスからの８つの頭蓋冠半分を表しており、平均と平均値の標準誤差は、それぞれ、水平線と垂直線として表示される。ダネット検定により、ＹＷ２１０．０９処置とＲＡＮＫ−Ｆｃ処置のみ、それぞれｐ値が０．０１未満、及び０．０５未満であり（ｔ検定により両方とも０．０５未満）、未処置のサンプルとは有意に異っている。
【０２９９】
全頭頂骨領域（石灰化及び非石灰化）の体積、及びこの領域の石灰化骨の割合は、抗体処置又はＲＡＮＫ−Ｆｃ処置によって有意には変化せず、ＹＷ２１０．０９抗体が細胞増殖において肉眼的変化無しに、石灰化を亢進し得ることを示唆している。
【０３００】
実施例１１：
ＬＲＰ６二重特異性抗体はＰａｎ−Ｗｎｔ阻害剤として働く。
Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ技術 (Atwellら、1997)がＹＷ２１１．３１．６２とＹＷ２１０．０９の重鎖ヘテロダイマーによる２重特異性ＩｇＧハイブリッドを構築するために用いられた。ＬＲＰ６二重特異性抗体は、大腸菌又はＨＥＫ２９３細胞の何れかで産生され、ＨＥＫ２９３細胞中（図１１Ａ）、及び腫瘍細胞株のＰＡ−１、Ｍ１４及びＣＡＬー５１（図１１Ｃ）で、Ｗｎｔ３ａ誘導性（０．１μｇ／ｍｌ）シグナル伝達を拮抗した。特記すべきは、二重特異性抗体は、ＹＷ２１１．３１と少なくとも同じくらい強く阻害し、ＹＷ２１０．０９のＷｎｔ３ａ増強活性を保持しない。二重特異性抗体は、ＰＡ−１細胞中のＹＷ２１１．３１抗体、及びＭ１４細胞におけるＹＷ２１０．０９の阻害活性を保持し、試験したすべての３の腫瘍細胞株で自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する（図１１Ｂ）。興味深いことに、ＣＡＬ−５１乳癌細胞において、ＹＷ２１１．３１が自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達を増強させ、ＹＷ２１０．０９が自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達に影響を及ぼさないにも関わらず、二重特異性抗体は、シグナル伝達を阻害する。この新規なアンタゴニスト活性はＹＷ２１１．３１抗体とＹＷ２１０．０９抗体の組み合わせでは観察されない。上記アッセイにおいて、Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターを安定に組込んだＰＡ−１細胞とＭ１４細胞、及びレポーターでトランスフェクトされたＣＡＬ−５１細胞は、指定されたコントロールバッファー（ＰＢＳ）、抗体、抗体組合わせ、又はＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質（各々１０μｇ／ｍｌ）で、０．１μｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａによる刺激の有る（１１Ｃ）又は無し（１１Ｂ）で処置された。
【０３０１】
ＨＥＫ２９３細胞中の１３のＷｎｔアイソフォームのトランスフェクションにより誘導されたシグナル伝達に関して試験すると、二重特異性抗体は、ＹＷ２１１．３１又はＹＷ２１０．０９の何れかによりブロックされる全てのＷｎｔを強力に阻害する（図１２）。図１２に要約されたアッセイは、Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターが安定に組込まれたＨＥＫ２９３細胞株又はＨｓ５７８Ｔ細胞株中のＷｎｔアイソフォームについての発現コンストラクトのトランスフェクションにより誘導されたシグナル伝達において、抗体又はタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）の影響を決定した。レポーター活性は細胞数に対して規格化され、更に、同一の発現コンストラクトでトランスフェクトされたが抗体又はタンパク質で処置されていない細胞におけるレベルに対して規格化された。抗ｇＤがコントロールとして使用された。倍率変化の値は、それらがコントロールの抗ｇＤ抗体処置で観察されら範囲外にある場合に、関連性があると考えられた：ＨＥＫ２９３細胞中では阻害について０，８０未満で増強について１．３０以上、Ｈｓ５７８Ｔ細胞中では阻害について０，６５未満で増強について１．３０以上。
【０３０２】
ＹＷ２１１．３１抗体とＹＷ２１０．０９抗体の組合わせに類似し、かつ何れの抗体単独と異なり、二重特異性抗体はＷｎｔ１及びＷｎｔ３ａの組合わせにより誘導されたシグナル伝達をブロックする（図１２）。予期せぬことに、二重特異性抗体はまた、ホモダイマー抗体単独又は組合わせによって阻害されない３つのＷｎｔによりシグナル伝達を減少させる。二重特異性抗体のこうしたアンタゴニスト活性はまた、Ｗｎｔ７ａ誘導性シグナル伝達における作用の欠如の可能性を除いて、Ｈｓ５７８Ｔ細胞においても観察される。
【０３０３】
βカテニンタンパク質のＷｎｔ３ａ誘導性安定化を阻害する二重特異性抗体の能力が調べられた。Ｗｎｔ３ａトランスフェクションの有る又は無しでのＨＥＫ２９３細胞が、ＹＷ２１１．３１，ＹＷ２１０．０９又は二重特異性抗体により、又はコントロールのＦｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質又は抗ｇＤにより、濃度５μｇ／ｍｌで１８時間、処置され、ウエスタンブロット解析により、βカテニンタンパク質レベルとリン酸化ＬＲＰ５／６のレベルが決定された。図１３ＡＨＥＫ２９３細胞において、二重特異性抗体はβカテニンタンパク質のＷｎｔ３ａ誘導性安定化を阻害し、ＹＷ２１１．３１に似ており、βカテニンレベルを増加するＹＷ２１０．０９と異なる（図１３Ａ）。二重特異性抗体及びＹＷ２１１．３１抗体の両方が（しかしＹＷ２１０．０９ではなく）、リン酸化ＬＲＰ５／６の高分子量種のＷｎｔ３ａによる誘導をブロックする。驚くべきことに、ＹＷ２１１．３１及びＹＷ２１０．０９は、全ＬＲＰ６タンパク質の定常状態のレベルに影響しないが、二重特異性抗体はＷｎｔ３ａ誘導の有る無しにおいて、ＬＲＰ６を増加する。二重特異性抗体はＷｎｔの欠損下でＨＥＫ２９３細胞のＷｎｔレポーター活性に影響を与えないものの、Ｗｎｔ刺激の欠損下において、この安定化されたＬＲＰ６はＳｅｒ１４９０のリン酸化をわずかに増加させ得る。
【０３０４】
二重特異性抗体のＷｎｔシグナル伝達をインビボで阻害する能力もまた決定された。Ｍ１４メラノーマ異種移植腫瘍を有するＳＣＩＤ−ｂｇマウスに３０ｍｇ／ｍｌのＬＲＰ６二重特異性抗体、Ｆｚｄ８ＣＲＤタンパク質（陽性コントロール）、又は抗ｇＤ抗体（陰性コントロール）が注射された。処置の１６時間後に、ＲＮＡが抽出され、Ｗｎｔ標的遺伝子に発現についてｑＰＣＲにより調べられた。ｍＲＮＡレベルは同一腫瘍内のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルに対して規格化され、更に、抗ｇＤ処置マウスに対して規格化された。全二重特異性抗体処置及びＦｚｄ８ＣＲＤ処置は、抗ｇＤコントロールに比して、ＡＮＯＶＡにより、ｐ値が０．００１未満を示している。図１３Ｂに示すように、ＬＲＰ６二重特異性抗体は、異種移植腫瘍として増殖させたＭ１４メラノーマ細胞においてＷｎｔシグナル伝達を阻害した。抗体で処置した腫瘍から抽出されたＲＮＡは、Ｗｎｔ標的遺伝子のＡＸＩＮ２及びＡＰＣＤＤ１の発現を、コントロールの抗ｇＤ抗体で処置した腫瘍におけるレベルのそれぞれ４６−５７％及び３５−３８％へ減少させたことを示している。これらの発現の減少はＦｚｄ８ＣＲＤタンパク質の注射で観察されたものと似ており、二重特異性抗体がインビボにおいて安定で活性であることを示している。
【０３０５】
実施例１２：
ＬＲＰ６ Ｅ１−ＹＷ２１０．０９ Ｆａｂ複合体の構造
ＹＷ２１０．０９ Ｆａｂとの複合体のＬＲＰ６の第一のβプロペラ−とＥＧＦドメイン（Ｅ１とも呼ぶ）の結晶構造は、分子置換法により決定され、１．９ÅでＲとＲｆｒｅｅがそれぞれ０．１７５及び０．２２０に精密化された。結晶学的非対照単位は１つのＬＲＰ６のＥ１ドメインと１つのＹＷ２１０．０９Ｆａｂからなる。解釈可能な電子密度は、Ｅ１ドメインの残基のＡｌａ２０からＬｙｓ３２４，Ｆａｂ軽鎖及び重鎖のそれぞれ、残基Ａｓｐ１からＧｌｕ２１３、Ｇｌｕ１からＬｙｓ２１４を、Ｆａｂ重鎖残基のＳｅｒ１２７からＴｈｒ１３１を除いて、トレース可能であった（全体を通じてＫａｂａｔの番号付けが用いられる）。
【０３０６】
ＬＲＰ６ Ｅ１ドメインはβプロペラモジュール及び上皮増殖因子（ＥＧＦ）様モジュールを含むモジュラー構造で構築されている。βプロペラは、Ｎ末端が中央のチャンネルに面し、放射状に配置された４鎖の逆平行βシートにより形成された６つのブレード、及び各ブレードの二番目の鎖に位置するＹＷＴＤモチーフからなる。ＬＲＰ６ Ｅ１のβプロペラの構造は、配列同一性がわずか３６％にも関わらず、ＬＤＬｒのそれに非常に似ており、２４５のＣα原子を重ねると、ｒｍｓｄが０．８３Åである。保存された残基の大半は、βプロペラ構造の完全性に必須であるβシートを形成するＹＷＴＤのコアモチーフの周りに集中しているが、表面残基は非常に多様であり、これらのレセプターの機能的多様性に寄与している。ＬＲＰ６は、プロペラの一番目と６番目のブレードをロックダウンし、その機械的強度を維持するために、そのＥＧＦ様ドメインを用いる。ＥＧＦ様モジュールはβプロペラからＣ末端外に１０残基のリンカーを介して延び、βプロペラの底面上で折れ畳み、第三と第四のブレードの間の表面に結合する。ＥＧＦとβプロペラの間の相互作用は、大きな埋もれた表面積の全体が１２２６Å２、及び形状相補性が０．７４で示されるように、広範囲である。ＥＧＦモジュールの第一のβストランドにある３つの残基、Ｌｅｕ２９６、Ｌｅｕ２９８及びＭｅｔ２９９は、βプロペラの相補的なキャビティに詰まる疎水性コアを構成し、幾つかの直接的又は水を介した極性相互作用により囲まれている。これらの特徴はまたＬＤＬＲ構造において観察される(Jeon, H.ら、2001); Rudenko, G.ら、2002)。
【０３０７】
ＹＷ２１０．０９ Ｆａｂは、タンパク質ータンパク質相互作用への関与がしばしば見いだされているβプロペラの中央の頂点の領域を認識する (Springer, T. A., 1998)。パラトープはＣＤＲの５つの残基からなり、３つの重鎖ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及び２つの軽鎖ＣＤＲ（Ｌ１とＬ３）を含む。βプロペラへの抗体結合は、形状相補性スコアが０．７６で総面積１６９１Å２を埋めた。β−プロペラの上面の酸性のパッチは、総面積の約３分の１を占めているが、ＹＷ２１０エピトープとほとんど重ならない。これに対して、重鎖及び軽鎖は別々の領域を認識する。重鎖ＣＤＲにより形成された直接の接触は、ＣＤＲのＨ３だけで埋もれ、５０％以上の割合を占める面積の８０％を占める。このセグメントは１７残基からなり、そのうち、残基Ｈｉｓ９８からＬｙｓ１００ｃはβプロペラと直接接触する。重要なことには、抗体のＡｓｎ１００がＬＲＰ６のＡｓｎ１８５と水素結合の対をなし、「ハンドシェイク（ｈａｎｄ ｓｈａｋｅ）」の相互作用を形成している（図１６）。更に、Ｖａｌ１９９ｂとＬｙｓ１００ｃの主鎖の異常なコンフォーメーションは、後部でカルボキシル基をLRP6のＡｒｇ２８と相互作用するように配置し、正面で２つのＮＨ基が２つの水分子（Ｗａｔ１とＷａｔ２）を介して酸性パッチと相互作用するように配置している（図１４）。Ｌｙｓ１００ｃ側鎖はまた、ＬＲＰ６のＶａｌ７０とＳｅｒ９６主鎖のカルボニルと水素結合により酸性パッチを中和している。ＬＲＰ６のＡｒｇ１４１は中央で支えられており、架橋する水のＷａｔ２、ＬＲＰ６のＡｓｎ１８５、及びYW210.09のＡｌａ１００ａと相互作用している。Ａｒｇ１４１は２本の水素結合ネットワークを一緒に一体化するように見える。更に、Ｖａｌ１００ｂ側鎖は、βプロペラの中央チャネルの疎水性キャビティーにドッキングしている。従って、ＹＷ２１０．０９ Ｈ３配列のＮＡＶＫは、ＬＲＰ６のβプロペラＥ１と異常な結合様式を呈している。他のＣＤＲは、βプロペラの上部でパラメーター内の（in the parameters）残基と相互作用する。ＬＲＰ６へのＨ３結合に関与している他の残基は、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｅ７３、Ｌ９５、Ｓ９６、Ｄ９８、及びＥ１１５を含む。Ｈ１とＨ２は、第５及び第６のブレードに触れるが、Ｌ１とＬ３は、第６、第１、及び２番目のブレードに触れる（図１５）。ＬＲＰ６へのＹＷ２１０．０９の結合に関与している更なるＬＲＰ６残基は、Ｒ２９、Ｗ１８８、Ｋ２０２、Ｐ２２５、Ｈ２２６、Ｓ２４３、及びＦ２６６を含む。結晶のパッキングによる相互作用は、ＹＷ２１０．０９がＬＲＰ６のエピトープに接触する領域には直接含まれておらず、結晶構造は、溶液中でいかに２つの分子が相互作用するかを反映しているであろう。異なるＣＤＲのＨ３ ＮＡＶＫＮ（配列番号４９）モチーフとＬＲＰ６ Ｅ１βプロペラとの間の相互作用は、ラミニンとナイドジェンの間の既報の相互作用に非常に似ている(Takagi, J.ら、2003)。両方の場合において、上記のＡｓｎハンドシェイク、及び、両方のプロペラにおいてＰｈｅのシャッターにより閉じられるβプロペラの中央のチャンネルの上部で形成される疎水性キャビティに入る分岐した疎水性残基を介して、有意な接触がなされる。ヒトＤｋｋ１は、そ���Ｉｌｅ４２を除いて、ＹＷ２１０．０９のＣＤＲ Ｈ３ループに見いだされたモチーフと同じであるモチーフ（アミノ酸４０から４４：ＮＡＩＩＮ（配列番号５０））を提示する。このモチーフはＤｋｋ３を除いて、種とファミリーメンバーの間で厳密に保存されており、Ｄｋｋの生物学におけるこのモチーフの特異的機能を指している。保存されたモチーフは、以前は考慮されていなかった領域である、Ｄｋｋ１のＮ末端上に見いだされ(Brott, B. K.,及びSokol, S. Y., 2002) 、乱れた構造をとっていると予想されている。更に、この特定のモチーフはまた、ＬＲＰ５／６との相互作用を介してＷｎｔシグナル伝達を制御する他の２つのタンパク質、即ち、スクレロスチン (Semenov, M.ら、2005) 及びワイズ(Itasaki, N.ら、2003)に保存されている。これらの２つのタンパク質はシステインノットタンパク質の同じスーパーファミリーに属し(McDonald, N. Q.,及びHendrickson, W. A., 1993)、それらのループ番号２に同定されたモチーフを提示し、この保存されたフォールドの「かかと」ともいう (Lintern, K. B., et al., 2009; Veverka, V., et al, 2009)。
【０３０８】
実施例１３：
典型的な抗ＬＲＰ６抗体  
所定の抗ＬＲＰ６抗体のアミノ酸配列が配列リストに提供される。表２−４は、配列の記述を与える。特異的抗ＬＲＰ６抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインのアミノ酸配列のアラインメントは図１６及び図１７に与えられる。
2013529060.tif 000004
2013529060.tif 000005
2013529060.tif 000006
【０３０９】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。
【０３１０】
参考文献
Adams C, Totpal K, Lawrence D, Marsters S, Pitti R, Yee S, Ross S, Deforge L, Koeppen H, Sagolla M, Compaan D, Lowman H, Hymowitz S, Ashkenazi A.  Structural and functional analysis of the interaction between the agonistic monoclonal antibody Apomab and the proapoptotic receptor DR5.  Cell Death Differ. 2008 Apr;15(4):751-61. Epub 2008 Jan 25.
Akiri G, Cherian MM, Vijayakumar S, Liu G, Bafico A, Aaronson SA.  Wnt pathway aberrations including autocrine Wnt activation occur at high frequency in human non-small-cell lung carcinoma.  Oncogene. 2009 May 28;28(21):2163-72. Epub 2009 Apr 20.
Bafico A, Liu G, Goldin L, Harris V, Aaronson SA.  An autocrine mechanism for constitutive Wnt pathway activation in human cancer cells.  Cancer Cell. 2004 Nov;6(5):497-506.
Bilic J, Huang YL, Davidson G, Zimmermann T, Cruciat CM, Bienz M, Niehrs C.  Wnt induces LRP6 signalosomes and promotes dishevelled-dependent LRP6 phosphorylation.  Science. 2007 Jun 15;316(5831):1619-22.
Binnerts ME, Tomasevic N, Bright JM, Leung J, Ahn VE, Kim KA, Zhan X, Liu S, Yonkovich S, Williams J, Zhou M, Gros D, Dixon M, Korver W, Weis WI, Abo A.  The first propeller domain of LRP6 regulates sensitivity to DKK1.  Mol Biol Cell. 2009 Aug;20(15):3552-60. Epub 2009 May 28.
Bourhis E, Tam C, Franke Y, Bazan JF, Ernst J, Hwang J, Costa M, Cochran AG, Hannoush RN.  Reconstitution of a Frizzled8-Wnt3a-LRP6 Signaling Complex Reveals Multiple Wnt and Dkk1 Binding Sites on LRP6.  J Biol Chem. 2010 Mar 19;285(12):9172-9. Epub 2010 Jan 21.
Brott, B. K., and Sokol, S. Y. (2002) Mol Cell Biol 22, 6100-6110.
Cho SJ, Valles Y, Giani VC Jr, Seaver EC, Weisblat DA.  Evolutionary dynamics of the Wnt gene family: a lophotrochozoan perspective.  Mol Biol Evol. 2010 Feb 22. [Epub ahead of print]
Cong F, Schweizer L, Varmus H.  Wnt signals across the plasma membrane to activate the beta-catenin pathway by forming oligomers containing its receptors, Frizzled and LRP.  Development. 2004 Oct;131(20):5103-15.
Cselenyi CS, Jernigan KK, Tahinci E, Thorne CA, Lee LA, Lee E.  LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of beta-catenin.  Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jun 10;105(23):8032-7. Epub 2008 May 28.
Cunningham SA, Stephan CC, Arrate MP, Ayer KG, Brock TA.  Identification of the extracellular domains of Flt-1 that mediate ligand interactions.  Biochem Biophys Res Commun. 1997 Feb 24;231(3):596-9.
Davis-Smyth T, Chen H, Park J, Presta LG, Ferrara N.  The second immunoglobulin-like domain of the VEGF tyrosine kinase receptor Flt-1 determines ligand binding and may initiate a signal transduction cascade.  EMBO J. 1996 Sep 16;15(18):4919-27.
DeAlmeida VI, Miao L, Ernst JA, Koeppen H, Polakis P, Rubinfeld B.  The soluble wnt receptor Frizzled8CRD-hFc inhibits the growth of teratocarcinomas in vivo.  Cancer Res. 2007 Jun 1;67(11):5371-9.
Glass DA 2nd, Bialek P, Ahn JD, Starbuck M, Patel MS, Clevers H, Taketo MM, Long F, McMahon AP, Lang RA, Karsenty G.  Canonical Wnt signaling in differentiated osteoblasts controls osteoclast differentiation.  Dev Cell. 2005 May;8(5):751-64.
Guo Y, Xie J, Rubin E, Tang YX, Lin F, Zi X, Hoang BH.  Frzb, a secreted Wnt antagonist, decreases growth and invasiveness of fibrosarcoma cells associated with inhibition of Met signaling.  Cancer Res. 2008 May 1;68(9):3350-60.
Hsu H, Lacey DL, Dunstan CR, Solovyev I, Colombero A, Timms E, Tan HL, Elliott G, Kelley MJ, Sarosi I, Wang L, Xia XZ, Elliott R, Chiu L, Black T, Scully S, Capparelli C, Morony S, Shimamoto G, Bass MB, Boyle WJ.  Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand.  Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Mar 30;96(7):3540-5.
Itasaki, N., Jones, C. M., Mercurio, S., Rowe, A., Domingos, P. M., Smith, J. C., and Krumlauf, R. (2003) Development 130, 4295-4305
Jeon H, Meng W, Takagi J, Eck MJ, Springer TA, Blacklow SC.  Implications for familial hypercholesterolemia from the structure of the LDL receptor YWTD-EGF domain pair.  Nat Struct Biol. 2001 Jun;8(6):499-504.
Lintern, K. B., Guidato, S., Rowe, A., Saldanha, J. W., and Itasaki, N. (2009) J Biol Chem 284, 23159-23168.
Liu G, Bafico A, Harris VK, Aaronson SA.  A novel mechanism for Wnt activation of canonical signaling through the LRP6 receptor.  Mol Cell Biol.(2003) 16:5825-35.
Liu BY, Soloviev I, Chang P, Lee J, Huang X, et al. (2010) Stromal cell-derived factor-1/CXCL12 contributes to MMTV-Wnt1 tumor growth involving Gr1+CD11b+ cells. PLoS One (2010) 5 (1):1-13; e8611.
McDonald, N. Q., and Hendrickson, W. A. (1993) Cell 73, 421-424.
Mi K, Dolan PJ, Johnson GV. The low density lipoprotein receptor-related protein 6 interacts with glycogen synthase kinase 3 and attenuates activity.  J Biol Chem. 2006 Feb 24;281(8):4787-94. Epub 2005 Dec 19.
Mohammad KS, Chirgwin JM, Guise TA. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures.  Methods Mol Biol. 2008;455:37-50.
Niida A, Hiroko T, Kasai M, Furukawa Y, Nakamura Y, Suzuki Y, Sugano S, Akiyama T.  DKK1, a negative regulator of Wnt signaling, is a target of the beta-catenin/TCF pathway.  Oncogene. 2004 Nov 4;23(52):8520-6.
Nguyen DX, Chiang AC, Zhang XH, Kim JY, Kris MG, Ladanyi M, Gerald WL, Massague J.  WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis.  Cell. 2009 Jul 10;138(1):51-62. Epub 2009 Jul 2.
Piao S, Lee SH, Kim H, Yum S, Stamos JL, Xu Y, Lee SJ, Lee J, Oh S, Han JK, Park BJ, Weis WI, Ha NC.  Direct inhibition of GSK3beta by the phosphorylated cytoplasmic domain of LRP6 in Wnt/beta-catenin signaling.  PLoS One. 2008;3(12):e4046. Epub 2008 Dec 24.
Quarto N, Wan DC, Kwan MD, Panetta NJ, Li S, Longaker MT.  Origin Matters: Differences in Embryonic Tissue Origin and Wnt Signaling Determine the Osteogenic Potential and Healing Capacity of Frontal and Parietal Calvarial Bones.  J Bone Miner Res. 2009 Nov 23. [Epub ahead of print]
Rebay I, Fleming RJ, Fehon RG, Cherbas L, Cherbas P, Artavanis-Tsakonas S.  Specific EGF repeats of Notch mediate interactions with Delta and Serrate: implications for Notch as a multifunctional receptor.  Cell. 1991 Nov 15;67(4):687-99.
Rudenko, G., Henry, L., Henderson, K., Ichtchenko, K., Brown, M. S., Goldstein, J. L., and Deisenhofer, J. (2002) Science 298, 2353-2358
Schwarz-Romond T, Metcalfe C, Bienz M. Dynamic recruitment of axin by Dishevelled protein assemblies.  J Cell Sci. 2007 Jul 15;120(Pt 14):2402-12.
Semenov MV, Tamai K, Brott BK, Kuhl M, Sokol S, He X. Head inducer Dickkopf-1 is a ligand for Wnt coreceptor LRP6.  Curr Biol. 2001 Jun 26;11(12):951-61.
Semenov, M., Tamai, K., and He, X. (2005) J Biol Chem 280, 26770-26775.
Springer, T. A. (1998) J Mol Biol 283, 837-862.
Takagi, J., Yang, Y., Liu, J. H., Wang, J. H., and Springer, T. A. (2003) Nature 424, 969-974.
Tamai K, Semenov M, Kato Y, Spokony R, Liu C, Katsuyama Y, Hess F, Saint-Jeannet JP, He X.  LDL-receptor-related proteins in Wnt signal transduction.  Nature. 2000 Sep 28;407(6803):530-5.
Tamai K, Zeng X, Liu C, Zhang X, Harada Y, Chang Z, He X. A mechanism for Wnt coreceptor activation.  Mol Cell. 2004 Jan 16;13(1):149-56.
van Amerongen R, Nusse R. Towards an integrated view of Wnt signaling in development.  Development. 2009 Oct;136(19):3205-14. Veverka, V., Henry, A. J., Slocombe, P. M., Ventom, A., Mulloy, B., Muskett, F. W., Muzylak, M., Greenslade, K., Moore, A., Zhang, L., Gong, J., Qian, X., Paszty, C., Taylor, R. J., Robinson, M. K., and Carr, M. D. (2009) J Biol Chem 284, 10890-10900.
Veverka, V., Henry, A. J., Slocombe, P. M., Ventom, A., Mulloy, B., Muskett, F. W., Muzylak, M., Greenslade, K., Moore, A., Zhang, L., Gong, J., Qian, X., Paszty, C., Taylor, R. J., Robinson, M. K., and Carr, M. D. (2009) J Biol Chem 284, 10890-10900
Wu G, Huang H, Garcia Abreu J, He X. Inhibition of GSK3 phosphorylation of beta-catenin via phosphorylated PPPSPXS motifs of Wnt coreceptor LRP6.  PLoS One. 2009;4(3):e4926. Epub 2009 Mar 18.
Yasui N, Mihara E, Nampo M, Tamura-Kawakami K, Unno H, Matsumoto K, Takagi J.  Detection of endogenous LRP6 expressed on human cells by monoclonal antibodies specific for the native conformation.  J Immunol Methods. (2010) Jan 31;352(1-2):153-60. Epub 2009 Nov 26.
Ye, X., et al, The Norrin/Frz4 signaling pathway in retinal vascular development and disease.  (2010) Trends Mol Med. 16, 417-425.
Zhang Y, Appleton BA, Wiesmann C, Lau T, Costa M, Hannoush RN, Sidhu SS.  Inhibition of Wnt signaling by Dishevelled PDZ peptides.  Nat Chem Biol. 2009 Apr;5(4):217-9. Epub 2009 Mar 1.
Zeng X, Huang H, Tamai K, Zhang X, Harada Y, Yokota C, Almeida K, Wang J, Doble B, Woodgett J, Wynshaw-Boris A, Hsieh JC, He X. Initiation of Wnt signaling: control of Wnt coreceptor Lrp6 phosphorylation/activation via frizzled, dishevelled and axin functions.  Development. 2008 Jan;135(2):367-75. Epub 2007 Dec 12.
Zhou H, Mak W, Kalak R, Street J, Fong-Yee C, Zheng Y, Dunstan CR, Seibel MJ.  Glucocorticoid-dependent Wnt signaling by mature osteoblasts is a key regulator of cranial skeletal development in mice.  Development. 2009 Feb;136(3):427-36.
Zoltewicz JS, Ashique AM, Choe Y, Lee G, Taylor S, Phamluong K, Solloway M, Peterson AS.  Wnt signaling is regulated by endoplasmic reticulum retention.  PLoS One. 2009 Jul 10;4(7):e6191.
【図１Ａ】
2013529060.tif 000007
【図１Ｃ】
2013529060.tif 000008
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2013529060.tif 000013
【図４Ｃ】
2013529060.tif 000014
【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
2013529060.tif 000016
【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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