(57)【要約】本発明は、Ｏ−ホスホセリンを中間産物として用いたシステインまたはその誘導体の生産方法、およびＯ−ホスホセリンの生産に用いるための組換え微生物に関する。2013543723.tif 000040
2013543723.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）内在的ホスホセリンホスファターゼ（ＳｅｒＢ）の活性が低下している組換え微生物を培養して、Ｏ−ホスホセリン（ＯＰＳ）を生産するステップと、
２）Ｏ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（ＯＰＳＳ）の存在下またはＯＰＳＳを発現する微生物の存在下で、前記ステップ１）のＯＰＳと硫化物とを反応させて、システインまたはその誘導体を生産するステップと
を含む、システインまたはその誘導体の生産方法。
【請求項２】
前記ホスホセリンホスファターゼが配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酵素活性のレベルが、以下からなる群より選択される技術を用いることによって、低下されている、請求項１に記載の方法：
酵素をコードする染色体遺伝子の欠失；内在的遺伝子の活性を低下させるための、染色体遺伝子への変異の導入；内在的酵素の活性を低下させるように変異された遺伝子による、染色体遺伝子の置換；内在的遺伝子の活性を低下させるための、遺伝子の調節領域への変異の導入；およびｍＲＮＡの翻訳を阻害するための、遺伝子の転写物に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入。
【請求項４】
内在的ＳｅｒＢの活性が妨害されている前記組換え微生物が、グリシンまたはセリンを含む培地で培養される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記培地が、０．１〜１０ｇ／Ｌの量のグリシンを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記培地が、０．１〜５ｇ／Ｌの量のセリンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記組換え微生物が、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）またはホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＳｅｒＣ）の活性を強化するようにさらに改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＳｅｒＡが、野生型であるか、またはセリンフィードバック阻害に耐性の変異体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ｉ）前記ＳｅｒＡが、配列番号３〜７に記載のアミノ酸配列からなる群より選択される１つのアミノ酸配列を有し、かつ
ｉｉ）ＳｅｒＣが、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する、
請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換え微生物が、ＰｈｎＣＤＥ［ＰｈｎＣ（ホスホネート輸送のＡＴＰ結合要素、ＥＧ１０７１３）−ＰｈｎＤ（Ｐｎトランスポーターの周辺質結合タンパク質要素、ＥＧ１０７１４）−ｐｈｎＥ（アルキルホスホネートＡＢＣトランスポーターの膜内在性要素、ＥＧ１１２８３）］の活性を低下させるようにさらに改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換え微生物が、アルカリホスファターゼ（ＰｈｏＡ）または酸ホスファターゼ（ＡｐｈＡ）の活性を低下させるようにさらに改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換え微生物が、ヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（ＰｎｔＡＢ）の活性を強化するようにさらに改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換え微生物が、Ｏ−アセチルセリン／システイン排出パーミアーゼ（ＹｆｉＫ）、ホモセリン／ホモセリンラクトン排出タンパク質（ＲｈｔＢ）、およびトレオニン／ホモセリン排出タンパク質（ＲｈｔＣ）からなる群より選択される少なくとも１つの酵素の活性を強化するようにさらに改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
酵素活性のレベルが、以下からなる群より選択される技術を用いることによって、強化されている、請求項７、１２、または１３のいずれか一項に記載の方法：
酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させること；酵素活性を強化するように、遺伝子の調節領域に変異を導入すること；酵素を強化するように変異された遺伝子によって、染色体遺伝子を置換すること；および酵素活性を強化するように、染色体遺伝子に変異を導入すること。
【請求項１５】
前記組換え微生物が、ホスホグリセリン酸ムターゼアイソザイム（ＧｐｍＡ、ＧｐｍＩ、またはＧｐｍＢ）からなる群より選択される少なくとも１つの活性を低下させるようにさらに改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記組換え微生物が、Ｌ−セリンデヒドラターゼＩ（ＳｄａＡ）の活性を低下させるようにさらに改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記組換え微生物が、２−アミノ−３−ケトブチレート補酵素Ａリガーゼ（Ｋｂｌ）または転写因子（ＩｃｌＲ）の活性を低下させるようにさらに改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記組換え微生物が、アセチルＣｏＡシンテターゼ（Ａｃｓ）、酢酸キナーゼ（ＡｃｋＡ）−ホスホトランスアセチラーゼ（Ｐｔａ）、リンゴ酸シンターゼＧ（ＧｌｃＢ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭａｅＢ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｄｈＡ）、グリオキシル酸カルボリガーゼ（Ｇｌｃ）、タルトロン酸セミアルデヒドレダクターゼ２（ＧｌｘＲ）、およびグリセリン酸キナーゼＩＩ（ＧｌｘＫ）からなる群より選択される少なくとも１つの酵素の活性を強化するようにさらに改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
Ｇｌｃ、ＧｌｘＲ、およびＧｌｘＫからなる群より選択される少なくとも１つの酵素の活性が強化されることにより、前記組換え微生物の糖消費および増殖が改善される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組換え微生物が、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の種またはコリネ型（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ）の細菌である、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記ステップ２）の硫化物が、Ｎａ２Ｓ、ＮａＳＨ、（ＮＨ４）２Ｓ、Ｈ２Ｓ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステップ２）の硫化物が、変換反応で用いられるＯＰＳモル濃度の０．１〜３倍のモル濃度で用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップ２）のＯＰＳＳが、アエロピュルム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、およびトリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）からなる群より選択される少なくとも１つの種に由来するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＯＰＳＳが、ステップ２）の変換率が高くなるようにさらに改変されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステップ２）の変換が、０．００１〜２ｍＭのＰＬＰ（ピリドキサール−５−リン酸）、０．００１〜１００ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）、およびそれらの組み合わせから選択される補助因子の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記システインまたはその誘導体を単離および精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
内在的ＳｅｒＢの活性が低下している、組換え微生物。
【請求項２８】
ＳｅｒＣの活性またはセリンフィードバック阻害に耐性であるＳｅｒＡの活性を強化するようにさらに改変されている、請求項２７に記載の組換え微生物。
【請求項２９】
ＰｈｎＣＤＥ、ＰｈｏＡ、およびＡｐｈＡの中より選択される少なくとも１つの活性を低下させるようにさらに改変されている、請求項２７に記載の組換え微生物。
【請求項３０】
受託番号ＫＣＣＭ１１１０３Ｐで寄託された、請求項２７に記載の組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｏ−ホスホセリンを中間産物として用いたシステインまたはその誘導体の生産方法、およびＯ−ホスホセリンの生産に用いるための組換え微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−システインは、すべての生命体の硫黄代謝において重要な役割を果たすアミノ酸である。それは、毛髪のケラチンのようなタンパク質、グルタチオン、ビオチン、メチオニンおよびその他硫黄を含む代謝産物の合成に使用されるだけでなく、コエンザイムＡの前駆物質として使用される。また、システイン生合成は、Ｌ−セリン、Ｌ−グリシン、およびＬ−メチオニンを含む他のアミノ酸の生合成と密接な関係があることが知られている。産業的に、Ｌ−システインおよびその誘導体は、製薬産業（気管支疾患の治療）、化粧品産業（ヘアシャンプー、パーマネントウエーブの組成物）、および食品産業（抗酸化剤、風味増進剤、生地補助剤など）を含む多様な分野で活用されている。
【０００３】
Ｌ−システインは、主に、ヒトの髪の毛または動物の羽毛の酸加水分解工程により得られてきた（非特許文献1）。しかし、髪の毛または羽毛からのシステインの生産は７〜８％程度と低収率しか保障されず、塩酸または硫酸の使用は環境汚染を引き起こす多くの廃棄物を生産する。また、髪の毛または羽毛からの抽出は、使用者に強い嫌悪感を抱かせることがある。このような問題は、環境に優しいＬ−システインの生産工程の開発に対する要求につながった。現在の主な経路は、微生物を用いた発酵に関連している。
【０００４】
Ｌ−システインの微生物を用いた生産の中で代表的なのは、１)微生物を用いたＤ，Ｌ−ＡＴＣの生物学的変換がある（非特許文献2）。しかし、この変換方法は、Ｄ，Ｌ−ＡＴＣ前駆体の低い溶解度のため、産業的な応用に困難があった。２）Ｌ−システインを生産する別の方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いた直接発酵がある（特許文献1、非特許文献3）。微生物内のＬ−システインの過度の蓄積が細胞内毒性を示すことがあり、高い濃度のＬ−システインの生産に限界があった。このような問題を克服するために、Ｌ−システイン排出タンパク質が用いられているが、生産性において顕著な改善はなかった。
【０００５】
微生物および植物のＬ−システインの生合成経路を調べてみると、Ｏ−アセチル−セリン（ＯＡＳ）は、Ｌ−システインの炭素骨格を提供する中間前駆物質として作用する（非特許文献4）。Ｏ−アセチル−セリン酵素（ＯＡＳＳ）は、硫黄ドナーとして硫化水素を用いて、Ｏ−アセチル−セリンからシステインへの変換を触媒する。あるいは、システインの生産における硫黄ドナーとして、ＳＯ４がチオ硫酸塩に還元され得る（非特許文献5）。かくして、システインは、ＯＡＳおよびＯＡＳＳを蓄積する微生物を用いて多様な硫黄ドナーを用いて生産できる（特許文献2）。ＯＡＳによるシステイン生合成経路は、セリンからＯＡＳの変換を触媒するセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）、およびＯＡＳからセリンの変換を触媒するシステインシンターゼ（ＣｙｓＫ）の２つの酵素を用いる。なかでも、セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）は、最終産物システインによるフィードバック阻害に対して感受性がより高い（非特許文献3）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許登録 EP0885962B
【特許文献２】特許登録 US6,579,705
【特許文献３】特許登録 EP0943687B
【特許文献４】大韓民国特許10-0620092B1
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Biotechnology of the Amino Acids Production edited by Ko Aida、pp 217-223、(1986)
【非特許文献２】Ryu OH、Ju JY and Shin CS、Process Biochem.、32： 201-209、(1997)
【非特許文献３】Wada M and Takagi H、Appl．Microbiol.Biochem.、73:48-54、(2006)
【非特許文献４】Kredich NM and Tomkins GM、J. Biol.Chem.、241：4955-4965、(1966)
【非特許文献５】Nakamura T、Kon Y、Iwahashi H and Eguchi Y、J. Bacteriol.、156：656-662、(1983)
【非特許文献６】Agren D、Schnell R and Schneider G、FEBS letters、583：330-336、(2009)
【非特許文献７】Mino K and Ishikawa K、FEBS letters、551：133-138、(2003)
【非特許文献８】Burns KE、Baumgart S、Dorrestein PC、Zhai H、McLafferty FW and Begley TP、J. Am.Chem.Soc.、127：11602-11603、(2005)
【非特許文献９】Westrop GD、 Goodall G、Mottram JC and Coombs GH、J. Biol.Chem.、281：25062-25075、(2006)
【非特許文献１０】Grant GA et al., J. Biol. Chem.、 39:5357-5361、(1999)
【非特許文献１１】Grant GA et al., J. Biol.Chem.、 39:7316-7319、(2000)
【非特許文献１２】Grant GA et al., J. Biol.Chem  276: 17844-17850,(2001)
【非特許文献１３】Peters-Wendisch P et al.、Appl. Microbiol. Biotechol. 、60: 437-441、(2002)
【非特許文献１４】Sauer Up et al.、J Biol Chem.20、279(8):6613-9. Epub (2003)
【非特許文献１５】L Gui et al.、J. Bacteriol.、Vol 178、No. 1、321-324、1996
【非特許文献１６】J Bacteriol. (1995) May、177(10):2878-86
【非特許文献１７】Kim HJ et al.、J. Bacteriol.、186(11)、3453-3460、(2004)
【非特許文献１８】Eva Cusa et al.、J. Becteriol.、181(24)、7479-7484、(1999)
【非特許文献１９】Chnag YY et al.、J. Biol. Chem. 268(6):3911-3919、(1993)
【非特許文献２０】van der Rest et al. (1999)
【非特許文献２１】Datsenko KA and Wanner BL、Proc. Natl. Acad. Sci.、97:6640-6645、(2000)
【非特許文献２２】Wanner BL and Metcalf WW. FEMS Microbiol. Lett.、15-133-139、(1992)
【非特許文献２３】Posfai G et al.、Nucleic Acids Res. 27:4409-4415、(1999)
【非特許文献２４】Arakawa H et al.、BMC Biotechnol. 1:7、(2001)
【非特許文献２５】Le Borgne S et al.、Methods Mol Biol.267"135-43、(2004)
【非特許文献２６】Franke I et al.、J. Bacteriology、185:116-166、(2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明によれば、本発明者らは、集中的な研究により、Ｌ−システイン合成するためにＯＡＳ−特異的経路ではなくＯ−ホスホ−Ｌ−セリン（ＯＰＳ）−特異的経路を有するアエロピュルム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、およびトリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）において、Ｏ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ  ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌａｓｅ；ＯＰＳＳ）の存在を見出し（非特許文献7 、非特許文献8、非特許文献9）、さらに、Ｃ末端の５個のアミノ酸残基が除去された場合に、ＯＰＳをシステインに変換するにあたり、追加的な酵素の不在においてさえ硫黄ドナーとしてＮａ２Ｓを用いることができるマイコバクテリウム・ツベルクローシスのＯＰＳＳを見出した（非特許文献6）。本発明において、微生物は、その中にＯＰＳを蓄積するように改変され、インキュベーション後、ＯＰＳＳ酵素の存在下、ＯＰＳをシステインに変換する。このような方法はかつてどこにも記述されたことがない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、システインまたはその誘導体の生産方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、Ｏ−ホスホセリンの生産のための組換え微生物を提供することである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法により、Ｏ−ホスホセリンが組換え微生物によって高収率で生産され、かつ、システインへの変換に用いられる。本方法は、現状においては、より環境に優しく、そして、化学的合成方法よりもシステインの生産においてより高い効率を保障する。システインおよびその誘導体は、動物およびヒトの食品および食品添加物の生産に広く使用可能な本発明の発酵および生物変換によって生産される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】微生物発酵によるＯ−ホスホセリンの蓄積および蓄積されたＯ−ホスホセリンからＬ−システインへの酵素変換を示す概略図である。
【図２】温度によるＯＰＳスルフヒドリラーゼの活性を示すグラフである。
【図３】ＯＰＳスルフヒドリラーゼのｐＨ感受性を示すグラフセットである。
【図４】ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる分析でｐＥＴシステムおよびｐＣＬ−Ｐｃｊ１システムにおけるＭｓｍ−Ｔの発現レベルを示す写真である。
【図５】精製されたＯＰＳ発酵ブロスからシステインへと変換するＯＰＳスルフヒドリラーゼの酵素活性を示すグラフである。
【図６】ＯＰＳ発酵ブロスからシステインへと変換するＯＰＳスルフヒドリラーゼの酵素活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において使用される、用語「システイン変換」とは、基質のＯ−ホスホセリン（ＯＰＳ）から生産物のシステインへの変換をもたらすＯ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（ＯＰＳＳ）の触媒反応をいい、すなわち、ＯＰＳからシステインに変換する触媒反応をいう。
【００１４】
本明細書において使用される、用語「システイン変換率」とは、出発物質のＯＰＳの量に対する生産物であるシステインの量の百分率をいう。最適な反応条件下で、ＯＰＳ１モルはシステイン１モルに変換される。例えば、ＯＰＳ１００モルがシステイン１００モルに変換される場合、システイン変換率は１００％である。
【００１５】
一態様により、本発明は、１）内在的ホスホセリンホスファターゼ（ＳｅｒＢ）の活性を低下させるように改変されている組換え微生物を培養して、Ｏ−ホスホセリン（ＯＰＳ）を生産するステップと、２）Ｏ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（ＯＰＳＳ）の存在下またはＯＰＳＳを発現する微生物の存在下で、前記ステップ１）のＯＰＳと硫化物とを反応させて、システインまたはその誘導体を生産するステップとを含む、システインまたはその誘導体の生産方法を提供する。
【００１６】
本方法において、ステップ１）は、内在的ホスホセリンホスファターゼ（ＳｅｒＢ）の活性が減少した組換え微生物を培養するステップに関するものである。
【００１７】
ＳｅｒＢは、ＯＰＳをＬ−セリンへと加水分解する活性を有するタンパク質である。したがって、内在的ＳｅｒＢの活性が減少した微生物はその中にＯＰＳを蓄積することを特徴とする。ＳｅｒＢは、限定されないが、ＳｅｒＢの活性を示すいかなるアミノ酸配列をも含み得、好ましくは、配列番号１または２のアミノ酸配列を有し得る。しかし、ＳｅｒＢの活性を示す限り、いかなるアミノ酸配列も使用され、配列番号１または２のアミノ酸配列との好ましくは９０％またはそれ以上、より好ましくは９６％またはそれ以上、さらに好ましくは９８％またはそれ以上、および最も好ましくは９９％またはそれ以上の相同性を有する。減少したＳｅｒＢの活性とは、改変前の菌種のＳｅｒＢ活性と比較したＳｅｒＢ活性の減少を意味し、かつＳｅｒＢの破壊を含む。ＳｅｒＢ活性を減少させる多様な方法が当該技術分野でよく知られている。代表例には、染色体上のｓｅｒＢの除去；内在的ｓｅｒＢの活性を減少させるための、染色体上のｓｅｒＢへの変異の導入；内在的ｓｅｒＢの活性を減少させるための、ｓｅｒＢの調節領域への変異の導入；内在的ＳｅｒＢの活性を減少させるように改変した遺伝子による染色体上のＳｅｒＢの置換；およびｍＲＮＡの翻訳を阻害するための、ＳｅｒＢの転写物に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入が含まれるが、ＳｅｒＢの活性を減少させる方法はこれらに限定されない。これらの技術は、本発明において他の酵素の活性を減少させるために適用することができる。
【００１８】
内在的ＳｅｒＢの除去は、組換え微生物へのセリン栄養要求性の導入をもたらすため、培地はグリシンまたはセリンが補充されなければならない。グリシンは、精製されたグリシン、グリシンを含有する酵母抽出物、またはトリプトンの形態で提供できる。グリシンは、０．１〜１０ｇ／Ｌの濃度、好ましくは０．５〜３ｇ／Ｌの濃度で含まれる。セリンの場合には、精製されたセリン、セリンを含有する酵母抽出物、またはトリプトンの形態で提供できる。培養培地において、その濃度は０．１〜５ｇ／Ｌ、および好ましくは０．１〜１ｇ／Ｌの範囲である。
【００１９】
本発明の一実施態様において、グリシンまたはセリンを含む培地で培養する時、内在的ＳｅｒＢの活性が妨害された、変異コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）または大腸菌が、野生型に比べて、より多量のＯＰＳを生産することが分かった（表２、３、６および７参照）。
【００２０】
さらに、本発明の組換え微生物は、強化されたホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）またはホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＳｅｒＣ）活性を有することができる。ＳｅｒＡは、３−ホスホグリセレート（３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）を３−ホスホヒドロキシピルベート（３−ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｕｖａｔｅ）に変換する活性を有するタンパク質である。ＳｅｒＡは、野生型アミノ酸を有していても、またはセリンによるフィードバック阻害に耐性を示す変異アミノ酸配列を有していてもよいが、これに限定されない。好ましくは、ＳｅｒＡは、配列番号３〜７のアミノ酸配列からなる群より選択される１つを有することができる。野生型ＳｅｒＡの活性またはセリンフィードバック阻害に耐性である変異ＳｅｒＡの活性を示す限り、いかなるアミノ酸配列も使用可能であるが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を配列番号３〜７のアミノ酸配列のうちの１つと共有する。「フィードバック阻害に耐性である変異ＳｅｒＡ」とは、セリンまたはグリシンによるフィードバック阻害に関係なく維持されたまたは強化されたＳｅｒＡ活性を示す変異体を意味する。フィードバック耐性変異体は当該技術分野でよく知られている（非特許文献10、非特許文献11、非特許文献12、非特許文献13、特許文献3）。本発明の一実施態様において、フィードバック耐性ｓｅｒＡがさらに導入された場合、破壊されたｓｅｒＢを有するコリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌が、野生型に比べて、より多量のＯＰＳを生産することが分かった（表４および９参照）。
【００２１】
ＳｅｒＣは、３−ホスホヒドロキシピルベートをＯ−ホスホセリンに変換する活性を有するタンパク質である。ＳｅｒＣは、これに限定されないが、ＳｅｒＣ活性を示す配列を含むことができ、そして、好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列を有することができる。しかし、ＳｅｒＣ活性を示す限り、いかなるアミノ酸配列も使用可能であるが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、そして、最も好ましくは９９％以上の相同性を配列番号８のアミノ酸配列と共有する。また、酵素活性を増加させ得るように変異がｓｅｒＣに導入されてもよい。本発明の一実施態様において、ｓｅｒＣがさらに導入された時、破壊されたｓｅｒＢおよびフィードバック耐性ｓｅｒＡを有するコリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌が、野生型に比べて、より多量のＯＰＳを生産することが分かった（表９参照）。
【００２２】
また、Ｏ−ホスホセリンの細胞内取り込みまたは分解を行う本発明の組換え微生物の能力が減少し得る。具体的には、組換え微生物は、ＰｈｎＣ／ＰｈｎＤ／ＰｈｎＥアルキルホスホネートＡＢＣトランスポーター（ＰｈｎＣＤＥオペロン、すなわち、ホスホネート輸送のＡＴＰ結合要素（ＰｈｎＣ；ＥＧ１０７１３）−Ｐｎトランスポーターの周辺質結合タンパク質要素（ＰｈｎＤ；ＥＧ１０７１４）−アルキルホスホネートＡＢＣトランスポーターの膜内在性要素（ＰｈｎＥ；ＥＧ１１２８３））、アルカリホスファターゼ（ＰｈｏＡ）、または酸ホスファターゼ（ＡｐｈＡ）の活性を低下させるように改変され得る。
【００２３】
本発明の一実施態様において、組換え変異体からのさらなるＰｈｎＣＤＥオペロンの欠失は、ＯＰＳ生産の増加をもたらすことが観察された（表１０）。ＰｈｏＡまたはＡｐｈＡ活性がさらに妨害された組換え微生物において、培養培地中のリン酸の濃度が低下する際にＯＰＳ分解が減少し始めた（表１２）。さらに、フィードバック耐性ｓｅｒＡまたはｓｅｒＣの導入がＯＰＳの生産を増加させた（表１４〜１６）。
【００２４】
また、本発明の組換え微生物は、ピリミジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（ＰｎｔＡＢ；ＥＣ１．６．１．１）活性の強化によってさらに特徴付けられ得る。以前に記載されたとおり（非特許文献14）、ＰｎｔＡＢは、細胞内のレドックスバランス（ｒｅｄｏｘ  ｂａｌａｎｃｅ）を調節するＮＡＤＰＨ代謝に関与する。本発明の一実施態様において、ＰｎｔＡＢ活性がｐｎｔＡＢの過剰発現によってさらに強化された組換え微生物は、ＯＰＳ生産を増加させることが分かった（表１７）。
【００２５】
さらに、本発明の組換え微生物は、Ｏ−アセチルセリン／システイン排出パーミアーゼ（ＹｆｉＫ）、ホモセリン／ホモセリンラクトン排出タンパク質（ＲｈｔＢ；ＥＧ１１４６９）、またはトレオニン／ホモセリンラクトン排出タンパク質（ＲｈｔＣ；ＥＧ１１４６８）の強化によって特徴付けられ得る。ＹｆｉＫは、システインおよびＯＡＳを細胞外に排出するための排出輸送体として知られており（非特許文献26）、また、ＲｈｔＢは、トレオニン前駆体であるホモセリン／ホモセリンラクトンの細胞外排出輸送体として働くことが報告された。さらに、ＲｈｔＣは、トレオニンおよびホモセリンの排出輸送体として知られている。ＹｆｉＫ、ＲｈｔＣ、およびＲｈｔＢ活性の強化は、ＯＰＳ蓄積菌株の増殖およびＯＰＳ生産の増加を示した（表１８）。
【００２６】
酵素活性の強化は、関心対象の酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させること；酵素活性を強化するように、遺伝子の調節領域に変異を導入すること；酵素活性を強化するように改変された遺伝子によって、染色体遺伝子を置換すること；および酵素活性を強化するように、染色体遺伝子に変異を導入することを含む、多様な周知の方法を用いて、達成され得るが、これに限定されない。
【００２７】
また、本発明の組換え微生物は、ホスホグリセリン酸ムターゼの減少した活性によってさらに特徴付けられ得る。ホスホグリセリン酸ムターゼは、ＧｐｍＩ、ＧｐｍＡ、およびＧｐｍＢの３つのアイソザイムとして存在し、そして、解糖プロセスにおいて３−ホスホグリセレートから２−ホスホグリセレートへの変換を担う。基質としての３−ホスホグリセレートの使用のために、これらの酵素は、３−ホスホヒドロキシピルベートの合成を触媒するＳｅｒＡと競合関係にある。したがって、各酵素の活性の減少により、ＯＰＳの前駆物質である３−ホスホグリセレートが増加して、増加したレベルのＯＰＳ生産がもたらされることが観察された（表１９）。
【００２８】
本発明の組換え微生物において、Ｌ−セリンデヒドラターゼＩ（ＳｄａＡ；ＥＣ４．３．１．１７）または２−アミノ−３−ケトブチレート補酵素Ａリガーゼ（Ｋｂｌ）もまた減少され得る。そのため、組換え微生物は、低い濃度のグリシンまたはセリンを含む培地で培養された場合でもＯＰＳ生産が維持されるかまたは増加することにより特徴付けられる（表２０）。
【００２９】
また、本発明の組換え微生物は、ＩｃｌＲの減少した活性によってさらに特徴付けられ得る。ＩｃｌＲは、グリオキシル酸バイパスオペロン（ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ  ｂｙｐａｓｓ  ｏｐｅｒｏｎ）であるａｃｅＢＡＫの発現を抑制する機能の転写因子である（非特許文献15）。それが除去された場合に、ＯＰＳの生産が増加することが観察された（表２１）。
【００３０】
さらに、本発明の組換え微生物は、ｉ）アセチルＣｏＡシンテターゼ（Ａｃｓ）、ｉｉ）酢酸キナーゼ（ＡｃｋＡ）−ホスホトランスアセチラーゼ（Ｐｔａ）、ｉｉｉ）リンゴ酸シンターゼＧ（ＧｌｃＢ）、ｉｖ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭａｅＢ）、ｖ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｄｈＡ）、ｖｉ）グリオキシル酸カルボリガーゼ（Ｇｌｃ）、ｖｉｉ）タルトロン酸セミアルデヒドレダクターゼ２（ＧｌｘＲ）、およびｖｉｉｉ）グリセリン酸キナーゼＩＩ（ＧｌｘＫ）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される酵素活性の強化によってさらに特徴付けられ得る。
【００３１】
本発明の具体的な実施態様において、生産されたＮＡＤＨの消費に伴って蓄積されたアセテートを効果的に再使用するための、ｉ）Ａｃｓ（ＥＣ  Ｎｏ．６．２．１．１； 非特許文献16）またはピルビン酸オキシダーゼモノマー（ＰｏｘＢ；ＥＣ１．２．２．２）、またはｉｉ）ＡｃｋＡおよびＰｔａ（ＥＣ２，３，１，８）がさらに強化された場合に、本発明の組換え微生物がＯＰＳの生産を増加させることが分かった（表２２）。グリオキシレートからマレートの合成およびマレートからピルベートへの変換を触媒する機能を果たす、ｉｉｉ）ＧｌｃＢ（ＥＣ  Ｎｏ．２．３．３．９）およびｉｖ）ＭａｅＢ（ＥＣ１．１．１３７）は、ＴＣＡ回路を弱めることがあり、したがって、グルコースの消費およびＯ−ホスホセリンの生産を増加させるために使用される（表２３）。本発明の一実施態様によれば、２−オキソグルタレートおよびＮＡＤＰＨからＳｅｒＣの基質であるグルタメートの合成を触媒するｖ）ＧｄｈＡ；（ＥＣ１．４．１．２）の強化は、微生物においてＯＰＳを生産するための、より高い潜在力を付与する（表１７）。ｖｉ）Ｇｌｃ（ＥＣ４．１．１．４７）、ｖｉｉ）ＧｌｘＲ（ＥＣ１．１．１．６０）、およびｖｉｉｉ）ＧｌｘＫ（ＥＣ２．７．１．３１）のすべては、グリオキシレートを３−ホスホグリセレートに変換することが知られており、すなわち、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼの基質のレベルを増加させるものである（非特許文献17、非特許文献18、非特許文献19）。本発明の組換え微生物は、Ｇｌｃ、ＧｌｘＲおよびＧｌｘＫの活性がさらに強化された場合に、糖消費および増殖が向上した（表２４）。
【００３２】
本発明の組換え微生物は、ＳｅｒＢの活性の減少した、したがって、増加したレベルでＯＰＳを生産する任意の微生物を意味する。このような条件を満たす場合、原核生物であれまたは真核生物であれ、いかなる微生物も本発明の範囲内である。なかでも、代表的なものとしては、腸内細菌またはコリネ型細菌がある。本発明において有用な微生物の例には、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の種、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）の種、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）の種、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）の種、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の種およびブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の種が含まれ、より好ましくはエシェリキア属の種、最も好ましくは大腸菌である。
【００３３】
一実施態様において、ＯＰＳを生産可能な組換え菌株は大腸菌ＣＡ０７−００１２と名付けられ、そして、大韓民国、ソウル、西大門、弘濟１、３６１−２２１所在の、韓国微生物保存センターに２０１１年１０月１２日に受託番号ＫＣＣＭ１１２１２Ｐで寄託された。
【００３４】
さらに、一実施態様において、ＯＰＳを生産可能な組換え菌株は大腸菌ＣＡ０７−００２２／ｐＣＬ−ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−ｓｅｒＣと名付けられ、大韓民国、ソウル、西大門、弘濟１、３６１−２２１所在の、韓国微生物保存センターに２０１０年９月２８日に受託番号ＫＣＣＭ１１１０３Ｐで寄託された。本明細書における、用語「ＣＡ０７−００２２／ｐＣＬ−ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−ｓｅｒＣ」とはＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）／ｐＣＬ−ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−ｓｅｒＣと交換可能に使用される。
【００３５】
菌株は、１Ｌの発酵槽で８０時間培養された後、１９．５ｇ／Ｌの濃度でＯ−ホスホセリンが生産された（実施例３５）。
【００３６】
本明細書において使用される、用語「培養」は、人工的に調節された条件下で微生物の増殖を意味するものである。培養方法は、当該技術分野においてよく知られた適切な培地および培養条件を用いて実施できる。当業者は採用された菌株に対応する培養方法を容易に調節することができる。例えば、それは、回分式（ｂａｔｃｈ  ｔｙｐｅ）、連続式、または流加式（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｔｙｐｅ）で実施できるが、これに限定されない。
【００３７】
さらに、培養培地は炭素源を含む。炭素源の例としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、およびセルロースなどの糖および炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、およびココナッツ油などの油および脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、およびリノール酸などの脂肪酸、グリセロールおよびエタノールなどのアルコール、ならびに酢酸などの有機酸が含まれる。これらの炭素源は、個別にまたは混合物として培養培地に提供され得る。窒素源として、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウロモコシ浸漬液、大豆、および小麦タンパク質などの有機材料、または尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合物が培養培地に含まれ得る。これらの窒素源は、個別にまたは混合物として使用できる。培地は、リン酸二水素カリウム、リン酸カリウム、またはリン源（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ  ｓｏｕｒｃｅ）としての対応するナトリウム塩を含むことができる。培地は、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの金属塩を含むことができる。培養培地はさらに、アミノ酸、ビタミンおよび適切な前駆体を含むことができる。栄養素は、回分式または連続式で培地に添加できる。
【００３８】
水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸などの化合物は、培養する間、培養のｐＨを調整するために、適切な方法で培養培地に添加できる。さらに、培養する間、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤が、泡の形成を抑制するために使用される。さらに、好気性状態で培養培地を維持するために、酸素または酸素含有気体が培養培地に注入できる。嫌気性または微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）状態のために、窒素、水素、または二酸化炭素が通気なしに提供される。培養培地は、一般的に、２７℃〜３７℃の温度、および好ましくは３０℃〜３５℃の温度に維持され得る。培養期間については、関心対象の生産物が所望量で得られるまで維持可能であり、１０〜１００時間の範囲が好ましい。
【００３９】
培養培地から培養するステップの間に生産されたＯＰＳのさらなる収集および回収のために、当該技術分野でよく知られた適切な方法が回分式、連続式または流加式培養である培養の種類に応じて選択できる。
【００４０】
本発明の方法において、Ｏ−ホスホセリンからシステインまたはその誘導体への変換を誘導するために、ステップ２）は、Ｏ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（ＯＰＳＳ）の存在下またはＯＰＳＳを発現する微生物の存在下で、ステップ１）のＯＰＳと硫化物との反応をいう。
【００４１】
硫化物は、ｐＨ、圧力および／または溶解度の差のため、当該技術分野で典型的に使用される固体形態は勿論のこと、液体または気体形態で提供できる。チオール基（ＳＨ）に変換できるものであれば、硫化物（ｓｕｌｆｉｄｅ、Ｓ２−）またはチオスルファト（ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ、Ｓ２Ｏ３２−）などの任意の硫黄化合物も本発明で使用できる。好ましくは、ＯＰＳにチオール基を提供することができる、Ｎａ２Ｓ、ＮａＳＨ、Ｈ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、ＮａＳＨおよびＮａ２Ｓ２Ｏ３が使用できる。反応時に、システインまたはその誘導体１分子を提供するために、１つのチオール基が１つのＯＰＳ分子に提供される。このような酵素変換において、硫化物は、好ましくは、用いられるＯＰＳと比べて、モル濃度で０．１〜３倍、およびより好ましくは１〜２倍添加できる。経済的な面で、チオール基を提供する硫化物およびＯＰＳは、最も好ましくは、モル比率１：１で使用される。本発明の一実施態様において、Ｎａ２Ｓは硫黄源として使用された。Ｎａ２Ｓは、変換反応において使用されたＯＰＳと比べて、モル濃度で１〜３倍多く添加された。好ましくは、効果的にＯＰＳをシステインに変換するために、モル濃度でＯＰＳに比べて２倍多く提供される（表３４）。
【００４２】
本明細書において使用される用語「Ｏ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（ＯＰＳＳ）」とは、ＯＰＳをシステインに変換するために、ＯＰＳ（Ｏ−ホスホセリン）へのチオール基（ＳＨ）の転移を触媒する酵素をいう。酵素は、アエロピュルム・ペルニクス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、およびトリコモナス・バギナリスで初めて見出された（非特許文献7、非特許文献8）。
【００４３】
本明細書において使用される用語「変異体」は、表現型において遺伝的または非遺伝的変化を示す培養物または個体をいう。ＯＰＳＳと共に使用される場合、用語「変異体」は、その活性が野生型と比較して効果的に強化され得るように遺伝的に変化したＯＰＳＳ酵素を意味すると考えられる。
【００４４】
本発明において、ＯＰＳＳ変異体は、ＯＰＳＳをコードする核酸配列の一部分の欠失、置換または付加によって作製できる。本発明の一実施態様によれば、強化された活性を有するＯＰＳＳ酵素は、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のＯＰＳＳ酵素のＣ末端の５個のアミノ酸残基を欠失させることにより作製された。
【００４５】
ＯＰＳＳ変異体は、関心対象の酵素を高収率で得ることができるコドン最適化に基づいた遺伝子合成技術を利用することにより、酵素の発現に広く使用される大腸菌から得ることができる。あるいは、微生物に関する膨大な量の遺伝的情報のバイオインフォマティクスに基づいた有用な酵素資源のスクリーニング方法が、ＯＰＳＳ変異体を得るのに利用され得る。本発明の一実施態様において、システインを合成するために基質としてＯＰＳを利用するＯＰＳＳ酵素は、アミノ酸配列の相同性をスクリーニングすることにより多様な微生物から選択される。この点に関して、当該技術分野で適した培地および培養条件を利用して得られた細胞ペレットを溶解し、続いて、酵素を含む上清を精製してＯＰＳＳ酵素を得た（表２６）。
【００４６】
さらに、高収率発現システムは、ＯＰＳＳ酵素を経済的に得るために開発された。Ｔ７プロモーターを用いるｐＥＴベクターは当該技術分野でよく知られている。しかし、本発明者らは、通常のシステムを用いる代わりに、ＣＪ１システムと名付けられた（特許文献4）酵素発現システムを利用した。本発明の一実施態様において、Ｔ７プロモーターを含むｐＥＴシステムと、ＣＪ１プロモーターを含むＣＪ１システムとの間でＯＰＳＳの発現レベルが同じ条件で比較された。その結果、ＣＪ１システムは、ｐＥＴシステムよりも高いＯＰＳＳの発現レベルを示した。しかも、ＯＰＳＳの過剰発現は、ｐＥＴシステムでは低い温度（１８℃）および長い時間を必要としたが、これに対し、ｐＣＬ−ｐＣＪ１システムでは高い温度（３７℃）および短い時間を必要とした。好ましくは、ｐＣＬ−ｐＣＪ１システムを用いてＯＰＳＳを得る（実施例４６）。
【００４７】
酵素活性の強化は、よく知られた多様な方法を用いて達成できる。例えば、ＯＰＳＳをコードする遺伝子のコピー数を増加させる、強力なプロモーターを用いる、または遺伝的変異を導入することによって実施できる。
【００４８】
ＯＰＳＳの酵素変換の最適化は、当該技術分野でよく知られた様々な方法を用いて達成することができる。例えば、最適化は、最適温度およびｐＨ、基質に対する阻害、基質濃度、温度安定性などのようなＯＰＳＳの特性を完全に理解することを基礎とすることができる。さらに、最適化は、最適なＯＰＳＳ濃度、使用される基質の濃度に関する最適なバランス、酵素変換のためにＳＨを提供する硫黄化合物に対する選好度、特定の緩衝液に対する選好度、イオン生成の影響、および補助因子およびその最適な濃度のような、酵素変換に対する最適な条件によって決定できる。
【００４９】
本発明の一実施態様において、前記言及した方法を利用することにより得られたＯＰＳＳ酵素が特徴付けられ、そして、見出した特性に基づいて、酵素安定性を保障する、ＯＰＳからシステインへの高い変換率を有する経済的に有用な酵素変換プロセスが開発された。酵素変換プロセスにおいて、反応温度は３７℃から８０℃まで設定可能である。具体的には、古細菌（Ａｒｃｈｅａ）に属する、Ａｐｅ−ＯＰＳＳ（配列番号１２）は、３７℃に比べて６０℃で増加した酵素活性を示し、６０℃で最適活性であり、酵素それ自体が高い熱安定性である。その反面、Ｍｓｍ−Ｔ（配列番号１０）は、３７℃で最適活性を示し、そして、６０℃で熱処理すると活性が低下する。ＯＰＳＳ酵素は、ｐＨ範囲６．０〜１０．０で酵素活性を有することが観察された。Ａｐｅ−ＯＰＳＳは、ｐＨ７．４で最適活性を示した。ｐＨ８．０から９．０までにおいて最適活性を示すＭｓｍ−Ｔは、Ａｐｅ−ＯＰＳＳと比較して、より広いｐＨ範囲で安定性を示した（表２８および３１、ならびに図２および図３）。
【００５０】
補助因子として、０．００１〜２ｍＭ  ＰＬＰ（ピリドキサール-5'-リン酸）または０．００１〜１００ｍＭ  ＤＴＴが酵素変換に使用され得る。本発明の一実施態様において、システイン変換率は、２５ｍＭ  ＤＴＴまたは０．２ｍＭ  ＰＬＰの存在下で２．３倍増加した。このように、ＤＴＴまたはＰＬＰでの処理は、ステップ２）のシステイン変換率における向上につながった。補助因子の添加は、増加した生産費用および増加した変換率を考慮して適切なレベルに設定された（表３０）。
【００５１】
ＯＰＳＳに対する反応条件は、使用されるＯＰＳの種類および濃度に応じて異なり得る。本発明の一実施態様において、純粋なＯＰＳ（商業的に入手可能）、ステップ１）で作製された培養物から精製されたＯＰＳ、およびステップ１）のＯＰＳを含む培養物は、最適な変換率を提供するために様々な条件下で用いられた。結果的に、システイン変換率は、ＯＰＳＳの種類および濃度、ならびに反応温度、ならびにＯＰＳの種類および濃度に応じて異なった（図５および図６、ならびに表３５）。
【００５２】
本発明の方法は、さらに、ステップ２）で生産されたシステインを単離および精製することを含み得る。酵素変換後、システインは、当該技術分野でよく知られた方法を用いて培養培地から単離および精製できる。
【００５３】
当業者はシステインからシステイン誘導体を周知の方法を用いて化学的に合成することができる。システインは、ＮＡＣ（Ｎ−アセチルシステイン）を提供するためにアセチル化剤と、およびＳＣＭＣ（Ｓ−カルボキシメチルシステイン）を提供するために基本条件下でハロ酢酸（ｈａｌｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と、容易に反応することができる。これらシステイン変異体は、咳、気管支炎、気管支喘息、および咽喉炎を治療する医薬材料として使用される。
【００５４】
本発明において、微生物の発酵を通じて得られたＯＰＳブロスは、システイン合成のための基質として使用される。微生物の発酵によって得られたＯＰＳブロスは、商業的に入手可能な純粋ＯＰＳに比べて、ＯＰＳブロスが追加的に精製することなく使用できる点および変換に必要な補助因子ＰＬＰが発酵培養物から得られうる点で経済的な利点を有する。
【００５５】
本発明の一実施態様において、変換プロセスは、５０ｍＭのＯＰＳブロス、または６０ｍＭの精製されたＯＰＳブロス、１００ｍＭ  Ｎａ２Ｓまたは１２０ｍＭ  Ｎａ２Ｓ、および０．２ｍＭ  ＰＬＰの反応条件下で５０μｇ／ｍｌのＭｓｍ−Ｔが使用された場合に、８０％もの高いシステイン変換率を保障するように開発された。高活性の酵素を用いた酵素的変換が、容易に最適化およびスケールアップできることは当業者にとって自明である。
【００５６】
さらに他の態様として、本発明は、ＯＰＳの生産のためのＳｅｒＢの活性が減少した組換え微生物を提供する。一実施態様において、組換え微生物は、セリンフィードバック耐性ｓｅｒＡまたはｓｅｒＣの強化、またはＰｈｎＣ／ＰｈｎＤ／ＰｈｎＥアルキルホスホネートＡＢＣトランスポーター（ｐｈｎＣＤＥオペロン）、アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ）および酸ホスファターゼ（ａｐｈＡ）の中から選択される少なくとも１つの欠失を示す。好ましくは、ＯＰＳの生産のための組換え微生物は、受託番号ＫＣＣＭ１１１０３ＰまたはＫＣＣＭ１１２１２Ｐで寄託された微生物である。より好ましくは、ＯＰＳの生産のための組換え微生物は、受託番号ＫＣＣＭ１１１０３Ｐで寄託された微生物である。
【００５７】
発明の形態
本発明のさらなる理解は、例示的に説明する下記の実施例を通じて得ることができるが、本発明を限定するものと理解されてはならない。
【００５８】
＜Ｏ−ホスホセリンを生産するコリネバクテリウムの作製およびこれを用いたＯ−ホスホセリンの生産＞
【実施例１】
【００５９】
ホスホセリンホスファターゼ（ｓｅｒＢ）欠損コリネバクテリウム菌株の作製
コリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２は、Ｏ−ホスホセリンからＬ−セリンの合成を触媒する、ホスホセリンホスファターゼをコードするｓｅｒＢ遺伝子（配列番号１３、ＥＣ３．１．３．３）を欠失させることにより改変した。このために、ｓｅｒＢの不活性化のための断片が構築された。これに関連し、プライマーは、本発明の組換え菌株１３０３２−ΔｓｅｒＢの作製のために設計された。第一に、コリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２のｓｅｒＢ配列はＮＩＨ  ＧｅｎＢａｎｋのデータに基づいて得られ、そして、プライマー配列番号２２〜２７はｓｅｒＢ配列を基本として合成された。部位特異的遺伝子破壊（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）のために、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて複製されないｐＤＣベクターが使用された。ｓｅｒＢのオープンリーディングフレームが内部的に破壊されたｐＤＣ−ΔｓｅｒＢプラスミドが構築され、そして、コリネバクテリウム・グルタミカム変異菌株において部位特異的ｓｅｒＢ遺伝子欠失の生成のために採用された。ｐＤＣ−ΔｓｅｒＢの内部的遺伝子欠失は鋳型として提供されるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡで、配列番号２２および２３、そして、配列番号２４および２５のプライマー対を用いて交差ＰＣＲ、そして、ＰＣＲ産物の、ｐＤＣベクターへの導入によって生成された。得られた組換えプラスミドにより、電気穿孔法で野生型コリネバクテリウム・グルタミカムを形質転換した（非特許文献20）。プラスミドは、１次組換え（交差）によって染色体に導入され、染色体から本来のｓｅｒＢを切り取るための２次組換え（交差）がこれに続いた。
【００６０】
２次組換えの完了後に、ｓｅｒＢの欠失変異を含むコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換体は、遺伝子特異的プライマー配列番号２６および２７の対を用いた診断ＰＣＲによって分析された。組換え菌株は、ＣＢ０１−００４７と名付けられた。
【実施例２】
【００６１】
ホスホセリンホスファターゼ欠損コリネバクテリウム菌株におけるＯ−ホスホセリン生産能アッセイ
コリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２からｓｅｒＢの欠失でもたらされた、Ｏ−ホスホセリンが蓄積されると予想されていた変異菌株ＣＢ０１−００４７は、ＢＨＩＳプレートに塗抹され、そして、３０℃の培養器で一晩培養された。その後に、ＢＨＩＳプレート上に現れたコロニーは、表１に示した２５ｍＬの力価培地に白金耳を用いて接種され、そして、その後に、３０℃で４８時間、２００ｒｐｍで振とうしながら培養された。結果は下記の表２にまとめられている。
【００６２】
（表１）
2013543723.tif 000003
【００６３】
（表２）
2013543723.tif 000004
【００６４】
ＣＢ０１−００４７菌株は、力価培地で非常に遅く増殖することが観察された。このような増殖遅延は、Ｌ−グリシン補充物の添加にもかかわらず向上しなかった。しかし、増殖はＬ−セリンの存在下で増加したものの、野生型に比べて、Ｏ−ホスホセリンの生産においては若干の増加だけが観察された。結果は下記の表３にまとめられている。
【００６５】
（表３）
2013543723.tif 000005
【実施例３】
【００６６】
コリネバクテリウム由来の変異ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ＊）遺伝子の構築
３−ホスホグリセレートから３−ホスホヒドロキシピルベートの合成を触媒する酵素である、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼのそれぞれの変異をコードするコリネバクテリウム・グルタミカム由来の遺伝子ｓｅｒＡ＊（Ｅ２３５Ｋ）（配列番号１４）およびｓｅｒＡ＊（１９７Δ）（配列番号１５）が構築された。変異はセリンに対してフィードバック耐性（ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ、ＦＢＲ）であることが報告された（非特許文献13、特許文献3）。ｓｅｒＡ＊（Ｅ２３５Ｋ）は、ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡにおける配列番号２８〜３１のプライマーを用いたソーイングＰＣＲ（ｓｅｗｉｎｇ  ＰＣＲ）によって得られたのに対し、ｓｅｒＡ＊（１９７Δ）は、配列番号２８〜３２のプライマー対を用いたＰＣＲによって構築された。こうして得られたＰＣＲ産物は、Ｔｂｌｕｎｔ−ｓｅｒＡ＊（Ｅ２３５Ｋ）およびＴｂｌｕｎｔ−ｓｅｒＡ＊（１９７Δ）と呼ばれる組換えベクターを構築するために、それぞれのＴベクターに挿入された。その後、２つのベクターは、２つの断片ｓｅｒＡ＊（Ｅ２３５Ｋ）およびｓｅｒＡ＊（１９７Δ）を提供するために、制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで処理された。これら断片は、それぞれ同じ制限酵素で消化したｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ＧＦＰ−ターミネーターベクターに挿入された。結果的に、２つの組換えベクターｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｓｅｒＡ＊（Ｅ２３５Ｋ）、およびｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｓｅｒＡ＊（１９７Δ）が得られた。
【実施例４】
【００６７】
ｓｅｒＡ＊を過剰発現するコリネバクテリウム菌株の作製およびＯ−ホスホセリン生産能アッセイ
実施例３で構築された２つのコリネバクテリウム由来のＦＢＲ−ｓｅｒＡ＊プラスミドは、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＢ０１−００４７に導入された。Ｏ−ホスホセリン生産能を評価するために、形質転換体はＢＨＩＳプレートに塗抹され、３０℃で一晩培養された。その後に、ＢＨＩＳプレート上に現れたコロニーは、２ｇ／Ｌ  Ｌ−セリンをさらに含む、表１に示した２５ｍＬの力価培地に白金耳を用いて接種され、そして、その後に、３０℃で４８時間、２００ｒｐｍで振とうしながら培養された。結果は下記の表４にまとめられている。
【００６８】
（表４）
2013543723.tif 000006
【００６９】
コリネバクテリウム由来のＦＢＲ−ｓｅｒＡ＊で形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカム菌株において、表４に示したように、０．１から０．３ｇ／Ｌまでの濃度でＯ−ホスホセリンの蓄積が観察された。
【００７０】
＜Ｏ−ホスホセリン生産大腸菌の作製およびこれを用いたＯ−ホスホセリンの生産＞
【実施例５】
【００７１】
低下したホスホセリンホスファターゼ（ＳｅｒＢ）活性を有する大腸菌菌株の作製
大腸菌は、Ｏ−ホスホセリンからのＬ−セリンの合成を触媒するホスホセリンホスファターゼをコードするｓｅｒＢ遺伝子（配列番号１６）を欠失させることにより改変した。欠失変異体大腸菌Ｋ１２はワンステップの不活性化方法（非特許文献21）により作製し、抗生物質耐性マーカー遺伝子を除去した。ｓｅｒＢ欠失菌株を作製するために、まず、配列番号３３と配列番号３４のプライマー対とｐＫＤ３プラスミド（非特許文献21; GenBank No. AY048742）を用いてＰＣＲ反応を行い、その結果取得したＰＣＲ産物をｐＫＤ４６（非特許文献21; GenBank No. AY048746）を含む大腸菌Ｋ１２のコンピテント細胞にエレクトロポレーションで導入した。その後、クロラムフェニコール耐性を示す菌株を対象にＰＣＲ反応を行い、ｓｅｒＢの欠失を確認し、ｐＣＰ２０（非特許文献21）で形質転換して抗生物質耐性マーカーを除去した。得られた変異菌株は、ＣＡ０７−００１２と名付けた。
【００７２】
また、ホスホセリンホスファターゼ活性を低下させるようにｓｅｒＢの開始コドンを改変した。クローニングは次のような方法で実施した。開始コドンがＡＴＧで始まる野生型ＳｅｒＢ遺伝子は、大腸菌Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって取得し、開始コドンがＣＴＧで始まる変異ｓｅｒＢは、ソーイングＰＣＲによって取得した。野生型ｓｅｒＢ増幅のＰＣＲは配列番号３５および３６のプライマー対を用い、変異ｓｅｒＢ増幅のＰＣＲは配列番号３７〜３８のプライマー対を用いた。ＰＣＲ産物はＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｐｃｃＢＡＣ１（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトにクローニングし、ｐｃｃＢＡＣ１−Ｐｓｅｌｆ−ＡＴＧ−ｓｅｒＢ、ｐｃｃＢＡＣ１−Ｐｓｅｌｆ−ＣＴＧ−ｓｅｒＢをそれぞれ構築した。野生型および変異型ｓｅｒＢベクターをＣＡ０７−００１２に導入し、ホスホセリンホスファターゼ活性を比較した。
【実施例６】
【００７３】
低下したＳｅｒＢ活性を有する大腸菌菌株のＯ−ホスホセリン生産能アッセイ
Ｏ−ホスホセリンが蓄積されると予想されるホスホセリンホスファターゼ欠損変異菌株をＬＢプレートに塗抹した後、３３℃の培養器で一晩培養した。ＬＢプレート上に現れたコロニーを、表５に示す２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍで振とうしながら培養器で４８時間培養した。その結果を下記の表６にまとめている。
【００７４】
（表５）
2013543723.tif 000007
【００７５】
（表６）
2013543723.tif 000008
【００７６】
また、Ｏ−ホスホセリンの生産能および菌株の増殖を向上させるために、ＣＡ０７−００１２を表５の力価培地に１ｇ／Ｌ  Ｌ−グリシンを添加して４８時間培養した。その結果を下記の表７にまとめている。
【００７７】
（表７）
2013543723.tif 000009
【００７８】
表７に示されたように、培地にＬ−グリシンを添加した場合、菌株の増殖率およびＯ−ホスホセリンの生産能が増加した。
【実施例７】
【００７９】
大腸菌由来の変異ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ＊）遺伝子を保有するベクターの構築
３−ホスホグリセレートから３−ホスホヒドロキシピルベートへの合成を触媒する酵素である３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ各変異体をコードする大腸菌由来の遺伝子であるｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）（配列番号１８）、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｇ３３７Ｖ）（配列番号１９）、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｒ３３８Ｇ）（配列番号２０）を作製した。変異体は、セリンに対してフィードバック耐性（ＦＢＲ）であることが報告された（非特許文献11、非特許文献12）。大腸菌の染色体への変異遺伝子の導入は、ソーイングＰＣＲを用いて行った。下記プライマーを用いて、変異が含まれたＤＮＡ断片を作製した。
【００８０】
配列番号３９および４１のプライマーはＳｅｒＡ＊遺伝子に共通に用いた。ｓｅｒＡ遺伝子に変異を導入するために、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）は配列番号４２、４３のプライマー対を、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｇ３３７Ｖ）は配列番号４４、４５のプライマー対を、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｒ３３８Ｇ）は配列番号４６、４７のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。この時用いたプライマーは、ＮＩＨ  ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＫ１２  Ｗ３１１０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ００３４７１）および周辺塩基配列に関する情報に基づいて合成した。
【実施例８】
【００８１】
大腸菌由来のｓｅｒＡ、ｓｅｒＡ＊、および３−ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ｓｅｒＣ）遺伝子のクローニング
ｓｅｒＡ（配列番号１７、ＥＣ１．１．１．９５）、ｓｅｒＣ（配列番号２１、ＥＣ２．６．１．５２）、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｇ３３７Ｖ）、およびｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｒ３３８Ｇ）のクローニングは次のように実施した。ｓｅｒＡおよびｓｅｒＣは、大腸菌Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡにおけるＰＣＲによって取得し、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｇ３３７Ｖ）、およびｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｒ３３８Ｇ）は実施例７のＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲによって取得した。ｓｅｒＡに対してはＰＣＲプライマーは配列番号４８および４９であり、ｓｅｒＣに対しては配列番号５０および５１であった。ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩで処理した後、ｐＣＬ１９２０ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ  ＡＢ２３６９３０）に大腸菌のｒｍｆプロモーターが挿入されている組換えｐＣＬ−Ｐｒｍｆベクターへとクローニングし、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＣ、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｇ３３７Ｖ）、およびｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｒ３３８Ｖ）との名称の組換えベクターをそれぞれ作製した。
【００８２】
また、ｓｅｒＡ、３種のｓｅｒＡ変異体のうちの１つ、および／またはｓｅｒＣがオペロンを形成しているプラスミドである、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣ、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣ、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｇ３３７Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣ、およびｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｒ３３８Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣを構築した。それぞれのプラスミドは、配列番号５１および配列番号５２のプライマーを用いて（ＲＢＳ）ｓｅｒＣ断片を取得した後、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｇ３３７Ｖ）、およびｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｒ３３８Ｖ）ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトにクローニングして作製した。
【実施例９】
【００８３】
大腸菌由来のｓｅｒＡ、ｓｅｒＡ＊、およびｓｅｒＣ強化菌株の作製およびＯ−ホスホセリン生産能アッセイ
実施例８で構築された８種のプラスミドでそれぞれＣＡ０７−００１２を形質転換し、得られた組換え菌種をＯ−ホスホセリン生産能についてアッセイした。それぞれの菌株をＬＢプレートに塗抹した後、３３℃の培養器で一晩培養した。ＬＢプレートに現れたコロニーを、表８の２５ｍＬの力価培地に接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍで振とうしながら培養器で４８時間培養した。結果を下記の表９にまとめている。
【００８４】
（表８）
2013543723.tif 000010
【００８５】
（表９）
2013543723.tif 000011
【００８６】
表９のデータから明らかなように、大腸菌ＣＡ０７−００１２菌株をｓｅｒＡで形質転換した場合、Ｏ−ホスホセリンの生産性が増加した。各３種のｓｅｒＡ＊変異体のいずれかが導入された場合、Ｏ−ホスホセリンの生産能はより増加した。また、ｓｅｒＡまたは３種のｓｅｒＡ＊変異体のうちの１つとｓｅｒＣとが同時に活性化された菌株の場合、Ｏ−ホスホセリンの生産能は、ｓｅｒＡまたはｓｅｒＡ＊単独が活性化された場合に比べてより高かった。変異体ｓｅｒＡ＊およびｓｅｒＣが同時に活性化された菌株では、最も高いＯ−ホスホセリンの生産能が検出された。
【実施例１０】
【００８７】
ＰｈｎＣ／ＰｈｎＤ／ＰｈｎＥアルキルホスホネートＡＢＣトランスポーター（ｐｈｎＣＤＥオペロン）欠損大腸菌菌株の作製
【００８８】
大腸菌において、ＰｈｎＣ／ＰｈｎＤ／ＰｈｎＥアルキルホスホネートＡＢＣトランスポーターは、Ｏ−ホスホセリンを細胞質内に移動させることが知られている（非特許文献22）。ＰｈｎＣ／ＰｈｎＤ／ＰｈｎＥアルキルホスホネートＡＢＣトランスポータータンパク質をコードするｐｈｎＣＤＥオペロンを、ｓｅｒＢが欠失した菌株から欠失させ、ＣＡ０７−００１６菌株を作製した。ｐｈｎＣＤＥの欠失のために、配列番号５３と配列番号５４のプライマー対を用いた。欠失方法は実施例５に記述したのと同様である。
【００８９】
さらに、実施例８で構築されたｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣをＣＡ０７−００１６菌株に導入した。
【実施例１１】
【００９０】
ｐｈｎＣＤＥオペロン欠損大腸菌菌株のＯＰＳ生産能アッセイ
実施例１０で作製されたＣＡ０７−００１６菌株およびＣＡ０７−００１６／ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣ菌株のＯ−ホスホセリン生産能を評価した。それぞれの菌株をＬＢプレートまたはＬＢ（スペクチノマイシン）プレートに塗抹した後、３３℃の培養器で一晩培養した。ＬＢプレートまたはＬＢ（スペクチノマイシン）プレートに現れたコロニーを、表８の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍで振とうしながら培養器で４８時間培養した。結果を下記の表１０にまとめている。
【００９１】
（表１０）
2013543723.tif 000012
【００９２】
表１０に示したように、ｐｈｎＣＤＥオペロンが欠失した菌株の場合、ＯＰＳの生産性がわずかに増加した。
【実施例１２】
【００９３】
アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ）、酸ホスファターゼ（ａｐｈＡ）欠損大腸菌菌株の作製
ホスホセリンホスファターゼが欠損した菌株において、アルカリホスファターゼをコードするｐｈｏＡ遺伝子および酸ホスファターゼをコードするａｐｈＡをさらに欠損させた。ｐｈｏＡ遺伝子を欠失させるためのＤＮＡ断片は、配列番号５５および配列番号５６のプライマー対を用いてｐｋＤ３プラスミドにおいてＰＣＲを行うことにより取得し、ａｐｈＡ遺伝子を欠失させるためのＤＮＡ断片は、配列番号５７および配列番号５８のプライマー対を用いて前記と同様の方法で取得した。各欠失菌株を作製するための方法は実施例５に記述したのと同様である。ｐｈｏＡとａｐｈＡが両方とも欠失した菌株は、ｐＫＤ４６で再度形質転換したｐｈｏＡ欠失菌株のコンピテント細胞に、ａｐｈＡを欠失させるためのＤＮＡ断片をエレクトロポレーションで導入することにより作成した。したがって、クロラムフェニコール耐性を示す細胞株を対象にＰＣＲ反応を行い、ａｐｈＡの欠失を確認し、ｐＣＰ２０で形質転換して抗生物質耐性マーカーを除去した。得られた変異菌株およびその遺伝子型を下記の表１１にまとめている。
【００９４】
（表１１）
2013543723.tif 000013
【００９５】
実施例８で構築されたｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣを、実施例１０と同様の方法で各欠失菌株に導入した。
【実施例１３】
【００９６】
アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ）、酸ホスファターゼ（ａｐｈＡ）欠損大腸菌菌株のＯ−ホスホセリン分解能アッセイ
実施例１２で作製された菌株を用いてＯＰＳ生産能およびＯＰＳ分解不能度をアッセイした。それぞれの菌株をＬＢプレートまたはＬＢ（スペクチノマイシン）プレートに塗抹した後、３３℃の培養器で一晩培養した。ＬＢプレートまたはＬＢ（スペクチノマイシン）プレートに現れたコロニーを、表８の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍで振とうしながら培養器で７２時間培養した。結果を下記の表１２にまとめている。ＯＰＳ分解不能度は、リン酸イオン分析により決定されるリン酸イオンレベルの変化によって評価した。
【００９７】
（表１２）
2013543723.tif 000014
【００９８】
表１２に示されたように、ａｐｈＡ欠失菌株は、異常な増殖現象を示したが、ｐｈｏＡが欠失した菌株またはｐｈｏＡおよびａｐｈＡの両方が欠失した菌株は、Ｏ−ホスホセリンの生産能がやや増加し、Ｏ−ホスホセリンの分解能が減少した。一方、ｐｈｏＡもａｐｈＡも欠失していない菌株では、７２時間で、蓄積したＯ−ホスホセリンを、ＰＯ４レベルの増加を伴って分解した。
【実施例１４】
【００９９】
ｐｈｎＣＤＥオペロン、ｐｈｏＡ、およびａｐｈＡ欠損菌株の作製
ｓｅｒＢ欠損菌株（ＣＡ０７−００１２）は、ｐｈｎＣ／ｐｈｎＤ／ｐｈｎＥアルキルホスホネートＡＢＣトランスポーターをコードするｐｈｎＣＤＥ、アルカリホスファターゼをコードするｐｈｏＡ、および酸ホスファターゼをコードするａｐｈＡをさらに欠失させるように改変した。作製された菌株を下記の表１３に提示する。実施例５に記述したワンステップの不活性化方法を利用して欠失変異体を作製した。
【０１００】
（表１３）
2013543723.tif 000015
【０１０１】
実施例８で構築されたｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣを、実施例１０と同様の方法でそれぞれの欠損菌株に導入した。
【実施例１５】
【０１０２】
ｐｈｎＣＤＥオペロン、ｐｈｏＡ、およびａｐｈＡ欠損大腸菌菌株のＯ−ホスホセリン生産能アッセイ
実施例１４で作製された菌株を用いてＯＰＳ生産能をアッセイした。それぞれの菌株をＬＢプレートまたはＬＢ（スペクチノマイシン）プレートに塗抹した後、３３℃の培養器で一晩培養した。ＬＢプレートまたはＬＢ（スペクチノマイシン）プレートに現れたコロニーを、表８の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍで振とうしながら培養器で７２時間培養した。結果を下記の表１４にまとめている。
【０１０３】
（表１４）
2013543723.tif 000016
【０１０４】
ＣＡ０７−００２０およびＣＡ０７−００２２は、ＣＡ０７−００１２と比較して、ＯＰＳ生産能が増加し、Ｏ−ホスホセリン分解能が減少したことが見出された。この特性は、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣにより追加的に形質転換した菌株でも検出された。
【実施例１６】
【０１０５】
ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ置換（ｓｅｒＡ＊）を有する、ｐｈｎＣＤＥオペロン、ｐｈｏＡ、およびａｐｈＡ遺伝子欠損大腸菌変異体の作製
ＣＡ０７−００２２において、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするｓｅｒＡを、セリンに対してフィードバック耐性であることが報告されたｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｇ３３７Ｖ）、またはｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｒ３３８Ｇ）で染色体上で下記のように置換した。
【０１０６】
ｓｅｒＡ遺伝子に各変異を導入するために、次のようにベクターを構築した。実施例７で作製されたｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｇ３３７Ｖ）、およびｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｒ３３８Ｇ）において配列番号４０および配列番号４１のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで処理した後、ｐＳＧ７６ＣベクターのＳａｃＩ、ＢａｍＨＩサイトにクローニングした。得られた組換えベクターで大腸菌ＢＷを形質転換した後、ＬＢプレートに塗抹した。プレートに現れたコロニーを塩基配列分析に供し、変異が導入された形質転換体を選択した。そこから、通常のプラスミドミニプレップ法を利用してプラスミドを取得した。得られたプラスミドは、導入された変異に応じてｐＳＧ７６Ｃ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）、ｐＳＧ７６Ｃ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｇ３３７Ｖ）およびｐＳＧ７６Ｃ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｒ３３８Ｇ）と名付けた。
【０１０７】
各大腸菌変異体は、文献に提示された方法（非特許文献23）によって作製し、抗生物質耐性マーカー遺伝子を除去した。特に、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）変異体を作製するために、ｐＳＧ７６Ｃ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）をＣＡ０７−００２２のコンピテント細胞にエレクトロポレーションで導入した。その後、クロラムフェニコール耐性を示す菌株を対象にＰＣＲ反応を行い、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）導入を確認した。菌種はｐＳＴ７６−ＡＳｃｅＰ（非特許文献23）で形質転換して抗生物質耐性マーカー遺伝子を除去した。得られた菌株は、ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）と名付けた。ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）菌株は、ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｇ３３７Ｖ）およびｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｒ３３８Ｇ）を得るためにｐＳＧ７６Ｃ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｇ３３７Ｖ）およびｐＳＧ７６Ｃ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｒ３３８Ｇ）で前記と同様の方法で形質転換し、それぞれＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｇ３３７Ｖ）およびＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｒ３３８Ｇ）と名付けた。
【実施例１７】
【０１０８】
ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ置換（ｓｅｒＡ＊）を有する、ｐｈｎＣＤＥオペロン、ａｐｈＡ、およびａｐｈＡ遺伝子欠損大腸菌変異体のＯ−ホスホセリン生産能アッセイ
実施例１６で作製された菌株をＯ−ホスホセリン生産能についてアッセイした。それぞれの菌株をＬＢプレートまたはＬＢ（スペクチノマイシン）プレートに塗抹した後、３３℃の培養器で一晩培養した。ＬＢプレートまたはＬＢ（スペクチノマイシン）プレートに現れたコロニーを、表８の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍで振とうしながら培養器で４８時間培養した。結果を下記の表１５にまとめている。
【０１０９】
（表１５）
2013543723.tif 000017
【０１１０】
ｓｅｒＡが、セリンに対してフィードバック耐性である遺伝子に変更された菌株は、増殖速度のいくらかの減少を示したが、Ｏ−ホスホセリン生産能の増加を示した。
【実施例１８】
【０１１１】
ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ置換（ｓｅｒＡ＊）を有し、３−ホスホセリンアミノトランスフェラーゼが強化された、ｐｈｎＣＤＥオペロン、ｐｈｏＡ、およびａｐｈＡ欠損大腸菌菌株の作製およびＯ−ホスホセリン生産能アッセイ
実施例１６で作製された菌株であるＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）、ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｇ３３７Ｖ）、ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ、Ｒ３３８Ｇ）に、実施例８で作製されたｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＣプラスミドをそれぞれ導入した。得られた変異体は、実施例９と同様の方法でＯ−ホスホセリン生産能を評価した。結果を下記の表１６にまとめている。
【０１１２】
（表１６）
2013543723.tif 000018
【０１１３】
表１６に示されたように、ｓｅｒＣが活性化された菌株でＯ−ホスホセリンの生産能が向上したことが分かる。また、この現象は、ｓｅｒＡが、セリンに対してフィードバック耐性である遺伝子に変更された菌株において、さらに明らかであった。
【実施例１９】
【０１１４】
ピリミジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（ＰｎｔＡＢ）強化菌株の作製およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｄｈＡ）含有ベクターの構築
ピリミジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードするｐｎｔＡＢが上方制御された菌株を作製するために、ｐｎｔＡＢプロモーターを、変異体ｌｏｘＰシステム（非特許文献24）を用いてｔｒｃプロモーターに交換した。ここでは、配列番号５９と配列番号６０のプライマー対とｐｍｌｏｘ−ｔｒｃ（ｒｅｆ）プラスミドとを用いてＰＣＲ反応を行い、その結果得られたＰＣＲ産物を、ｐＫＤ４６を含むＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）のコンピテント細胞にエレクトロポレーションで導入した。その後、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を対象にＰＣＲ反応を行い、プロモーターの置換を確認した後、ｐＪＷ１６８（非特許文献25）で形質転換して抗生物質耐性マーカー遺伝子を除去した。得られた菌株は、ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）Ｐ（ｔｒｃ）−ｐｎｔＡＢと名付けた。このＰＣＲに用いたプライマーは、ＮＩＨ  ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＫ１２  Ｗ３１１０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ００２２２３、ＡＰ００２２２４）および周辺塩基配列に関する情報に基づいて設計した。
【０１１５】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードするｇｄｈＡ遺伝子は、配列番号６１と配列番号６２のプライマー対を用いてＰＣＲ法によって増幅した。配列番号６１および配列番号６２のプライマーは、制限酵素サイトＨｉｎｄＩＩＩを有している。これらのプライマーは、ＮＩＨ  ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＫ１２  Ｗ３１１０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ００２３８０）および周辺塩基配列に関する情報に基づいて設計した。
【０１１６】
ＰＣＲ法は、９４℃で３分間変性後、９４℃３０秒変性、５６℃３０秒アニーリング、７２℃２分伸長を２５回繰り返した後、７２℃で７分間伸長反応を行った。その結果、１７１４ｂｐ長のポリヌクレオチドを得た。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩで処理した後、ｐＣＣ１ＢＡＣのＨｉｎｄＩＩＩサイトにクローニングし、これを大腸菌ＤＨ５αに導入した後、ＬＢプレートに塗抹した。得られたコロニーの塩基配列分析によって変異のないｇｄｈＡが導入されたコロニーを選択した後、通常のプラスミドミニプレップ法を用いてプラスミドを単離し、ｐＣＣ１ＢＡＣ−Ｐ（ネイティブ）−ｇｄｈＡと名付けた。
【実施例２０】
【０１１７】
ＯＰＳ生産菌株へのｐｎｔＡＢおよびｇｄｈＡの導入およびＯＰＳ生産能アッセイ
ｐｎｔＡＢおよびｇｄｈＡが上方制御されたＯＰＳ生産菌株を作製するために、下記表のように、ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）菌株またはＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）Ｐ（ｔｒｃ）−ｐｎｔＡＢ菌株を、ｐＣＬ−Ｐ（ｔｒｃ）−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−ｓｅｒＣおよびｐＣＣ１ＢＡＣ−Ｐ（ネイティブ）−ｇｄｈＡを個々にまたは組み合わせによって形質転換した。各形質転換体を３３℃の培養器でＬＢプレートで一晩培養した。コロニーを、表８の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍで振とうしながら培養器で４８時間培養した。
【０１１８】
（表１７）
2013543723.tif 000019
【０１１９】
表１７に示されたように、ｐｎｔＡＢが上方制御された場合、菌株は、Ｏ−ホスホセリンの生産能が向上した。ｐｎｔＡＢとｇｄｈＡの両方が上方制御された場合、対照群に比べてＯ−ホスホセリンの生産能がさらに増加した。したがって、ｐｎｔＡＢおよびｇｄｈＡは、ＯＰＳの生産に重要な役割を果たすことが分かる。
【実施例２１】
【０１２０】
大腸菌Ｏ−アセチルセリン／システイン排出タンパク質（ｙｄｅＤ）、Ｏ−アセチルセリン／システイン排出パーミアーゼ（ｙｆｉＫ）、ホモセリン／ホモセリンラクトン排出タンパク質（ｒｈｔＢ）、トレオニン／ホモセリン排出タンパク質（ｒｈｔＣ）、亜ヒ酸／アンチモナイトトランスポーター（ａｓｒＢ）、およびロイシン／イソロイシン／バリン輸送サブユニット（ｌｉｖＨＭ）をコードする遺伝子を保有するベクターの構築
生成されたＯ−ホスホセリンが細胞外に放出されるためには、適切な排出因子が必要であるが、文献に報告されていない。そこで、本発明者らは、既に報告された多様なトランスポーター遺伝子の中から、Ｏ−アセチルセリン／システイン排出タンパク質をコードするｙｄｅＤ、Ｏ−アセチルセリン／システイン排出パーミアーゼをコードするｙｆｉＫ（非特許文献26）、ホモセリン／ホモセリンラクトン排出タンパク質をコードするｒｈｔＢ、トレオニン／ホモセリン排出タンパク質をコードするＲｈｔＣ、亜ヒ酸／アンチモナイトトランスポーターをコードするａｓｒＢ、ロイシン／イソロイシン／バリン輸送サブユニットをコードするｌｉｖＨＭの６種の遺伝子を選択し、クローニングして、評価した。
【０１２１】
それぞれの遺伝子は、大腸菌Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより得た。ｙｄｅＤには配列番号６３および配列番号６４、ｙｆｉＫには配列番号６５および配列番号６６、ｒｈｔＢには配列番号６７および配列番号６８、ｒｈｔＣには配列番号６９および配列番号７０、ａｓｒＢには配列番号７１および配列番号７２、ｌｉｖＨＭには配列番号７３および配列番号７４のプライマー対を用いた。各ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理した後、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ＧＦＰのＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトにクローニングして組換えベクターを得、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｙｄｅＤ、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｙｆｉＫ、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｒｈｔＢ、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｒｈｔＣ、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ａｒｓＢ、およびｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｌｉｖＨＭと名付けた。
【実施例２２】
【０１２２】
大腸菌ＹｄｅＤ、ＹｆｉＫ、ＲｈｔＢ、ＲｈｔＣ、ＡｓｒＢ、ｌｉｖＨＭコード遺伝子を保有するベクターの、Ｏ−ホスホセリン生産菌株への導入およびＯ−ホスホセリン生産能アッセイ
実施例２１で構築された６種のプラスミドで、ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）菌株を形質転換し、実施例９と同様の方法でＯ−ホスホセリンの生産能を評価した。結果を下記の表１８に提示する。
【０１２３】
（表１８）
2013543723.tif 000020
【０１２４】
表１８に示されたとおり、ｙｄｅＤ、ｍｄｔＧ、またはｌｉｖＨＭで形質転換された菌株は、増殖速度の低下およびＯＰＳ生産能の低下を示したが、ｙｆｉＫ、ｒｈｔＢ、またはｒｈｔＣ遺伝子で形質転換された菌株は、増殖速度およびＯＰＳ生成能が増加した（表１８）。
【実施例２３】
【０１２５】
ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｇｐｍＩ、ｇｐｍＡ、およびｇｐｍＢ）欠損菌株の作製
ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）から、ホスホグリセリン酸ムターゼをコードする遺伝子であるｇｐｍＩ、ｇｐｍＡ、およびｇｐｍＢを単独または組み合わせで欠失させ、それぞれ、ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）ΔｇｐｍＩ、ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）ΔｇｐｍＡ、ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）ΔｇｐｍＢ、ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）ΔｇｐｍＩΔｇｐｍＡ、ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）ΔｇｐｍＡΔｇｐｍＢ、およびＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）ΔｇｐｍＩΔｇｐｍＡΔｇｐｍＢ菌株を作製した。ｇｐｍＡ欠失菌株およびｇｐｍＢ欠失菌株の作製方法は実施例５に記述したとおりであり、ｇｐｍＡには配列番号７５および配列番号７６のプライマー対を、ｇｐｍＢには配列番号８１および配列番号８２のプライマー対を用いた。ｇｐｍＩ欠失菌株の作製方法は、実施例１６に記述したように、ｐＳＧ７６Ｃベクターを用いて 終止コドンを含むｇｐｍＩ変異を導入する方法を利用した。終止コドンを含むｇｐｍＩ変異体は、Ｋ１２  Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号７７〜８１のプライマーを用いてｓｅｗｉｎｇ  ＰＣＲにより増幅し、ｐＳＧ７６のＳａｃＩ／ＢａｍＨＩサイトにクローニングした。
【実施例２４】
【０１２６】
ｇｐｍＩ、ｇｐｍＡ、およびｇｐｍＢ欠損菌株のＯＰＳ生産能アッセイ
実施例２３で作製された菌株を、実施例９で記述したのと同様の方法でＯＰＳの生産能を評価した。結果を下記の表１９にまとめている。
【０１２７】
（表１９）
2013543723.tif 000021
【０１２８】
表１９に示されたとおり、ｇｐｍＩ、ｇｐｍＡ、およびｇｐｍＢのそれぞれを欠失させて他を欠失させなかった場合、母株と比較して変異菌株の糖消費は低下するが、ＯＰＳ生産能は増加した。特に、ｇｐｍＡとｇｐｍＢの両方を欠失させた菌株は、ｇｐｍＡまたはｇｐｍＢのいずれかを欠失させた菌株と比べて、糖消費はほぼ同等であったが、ＯＰＳ生産能が増加した。したがって、ｇｐｍＩ、ｇｐｍＡ、およびｇｐｍＢの欠失は、ＯＰＳの前駆物質である３−ホスホグリセレートの量を増加させ、したがってＯＰＳ生産を増加させることが分かった。
【実施例２５】
【０１２９】
２−アミノ−３−ケトブチレートＣｏＡリガーゼ（ｋｂｌ）、Ｌ−セリンデアミナーゼＩ（ｓｄａＡ）欠損菌株の作製
ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）から、２−アミノ−３−ケトブチレートＣｏＡリガーゼをコードするｋｂｌ遺伝子、およびＬ−セリンデアミナーゼＩをコードするｓｄａＡ遺伝子を欠失させ、それぞれ、ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）Δｋｂｌ、およびＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）ΔｓｄａＡ菌株を得た。ｋｂｌ欠失菌株およびｓｄａＡ欠失菌株の作製方法は実施例５に記述したとおりであり、ｋｂｌには配列番号８３と配列番号８４のプライマー対を、ｓｄａＡには配列番号８５と配列番号８６のプライマー対を用いた。
【実施例２６】
【０１３０】
グリシン濃度よる、ｋｂｌ／ｓｄａＡ欠損菌株のＯＤおよび糖消費アッセイ
実施例２５で作製された菌株を、グリシンを０〜２．５ｇ／Ｌの量で使用した以外は実施例９の表８に記述されたのと同じ培地条件で培養した場合の、ＯＤ、糖消費、およびＯ−ホスホセリン生産能について評価した。
【０１３１】
（表２０）
2013543723.tif 000022
【０１３２】
表２０に示されたように、３種の菌株はいずれも培地内のグリシンレベルを増加させた場合にＯＤおよび糖消費速度が増加した。特に、ｓｄａＡ欠失菌株は、１ｇ／Ｌのグリシン濃度でＯＤおよび糖消費速度の顕著な増加を示した。また、ｋｂｌ欠失菌株のＯＰＳ生産能は、２．５ｇ／Ｌのグリシンの存在下、大きく向上した。
【実施例２７】
【０１３３】
ｉｃｌＲ欠損菌株の作製
ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）から、転写因子のｉｃｌＲを欠失させ、ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）ΔｉｃｌＲ菌株を作製した。欠失変異菌株は、実施例５の方法と同様に、ワンステップの不活性化方法によって作製し、抗生物質耐性マーカー遺伝子を除去した。ｉｃｌＲ欠失菌株の作製には、配列番号８７と配列番号８８のプライマー対を用いた。
【実施例２８】
【０１３４】
ｉｃｌＲ欠損菌株のＯＰＳ生産能アッセイ
実施例２７で作製された菌株を、実施例９で記述したのと同様の方法でＯＰＳの生産能を評価した。
【０１３５】
（表２１）
2013543723.tif 000023
【０１３６】
表２１のデータから明らかなように、ｉｃｌＲ欠失菌株のＯＰＳ生産能が増加したことが分かった。
【実施例２９】
【０１３７】
大腸菌アセチルＣｏＡシンテターゼ（ａｃｓ）、ピルビン酸オキシダーゼモノマー（ｐｏｘＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、およびリン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）を保有するベクターの構築
Ｏ−ホスホセリン生産菌株においてアセテートの生成および再利用を増加させるために、アセチルＣｏＡシンテターゼをコードするａｃｓ、ピルビン酸オキシダーゼモノマーをコードするｐｏｘＢ、酢酸キナーゼをコードするａｃｋＡ、およびリン酸アセチルトランスフェラーゼをコードするｐｔｓをそれぞれ保有する発現プラスミドを構築した。
【０１３８】
それぞれの遺伝子は、大腸菌Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを鋳型としてｐｆｕ  ＰＣＲを行うことにより取得した。ａｃｓには配列番号８９および配列番号９０、ｐｏｘＢには配列番号９１および配列番号９２、ａｃｋＡおよびｐｔａには配列番号９３および配列番号９４のプライマー対を用いた。得られた各ＰＣＲ産物はＨｉｎｄＩＩＩで処理した後、ｐＣＬ１９２０に大腸菌ｒｍｆプロモーターを挿入して構築したｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ＧＦＰベクターのＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトにクローニングし、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ａｃｓ、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｐｏｘＢ、およびｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ａｃｋＡ−ｐｔａを得た。その後、これらのプラスミドをＥｃｏＲＩで処理し、Ｐｒｍｆ−ａｃｓ、Ｐｒｍｆ−ｐｏｘＢ、およびＰｒｍｆ−ａｃｋＡ−ｐｔａのＤＮＡ挿入断片を取得した後、ｐＣＣ１ＢＡＣ（ＥｃｏＲＩ）（ＣｏｐｙＣｏｎｔｒｏｌＴＭ  ｐｃｃ１ＢＡＣＴＭ  Ｖｅｃｔｏｒ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ．Ｃａｔ．Ｎｏｓ．ＣＢＡＣ３１１）に導入し、それぞれ、ｐＣＣ１ＢＡＣ−Ｐｒｍｆ−ａｃｓ、ｐＣＣ１ＢＡＣ−Ｐｒｍｆ−ｐｏｘＢ、およびｐＣＣ１ＢＡＣ−Ｐｒｍｆ−ａｃｋＡ−ｐｔａを構築した。
【実施例３０】
【０１３９】
大腸菌ａｃｓ、ｐｏｘＢ、ａｃｋＡ、ｐｔａ強化ＯＰＳ生産菌株の作製およびＯＰＳ生産能アッセイ
実施例２９で作製された３種のベクターでＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）菌株を形質転換し、実施例９と同様の方法でＯＰＳ生産能をアッセイした。
【０１４０】
（表２２）
2013543723.tif 000024
【０１４１】
表２２に示されたように、ｐｏｘＢで形質転換された菌株の増殖速度は減少したが、ａｃｓまたはａｃｋＡ−ｐｔａが導入された菌株は増殖速度およびＯＰＳ生産能が増加した。
【実施例３１】
【０１４２】
大腸菌リンゴ酸シンターゼＡ（ａｃｅＢ）、イソクエン酸リアーゼモノマー（ａｃｅＡ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋＡ）、リンゴ酸シンターゼＧ（ｇｌｃＢ）、およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｅＢ）を保有するベクターの構築
リンゴ酸シンターゼＡをコードするａｃｅＢ遺伝子、およびイソクエン酸リアーゼモノマーをコードするａｃｅＡ遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするｐｃｋＡ遺伝子、リンゴ酸シンターゼＧをコードするｇｌｃＢ遺伝子、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするｍａｅＢ遺伝子をそれぞれ大腸菌で発現できるプラスミドを構築した。
【０１４３】
それぞれの遺伝子は、大腸菌Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを鋳型としてｐｆｕ  ＰＣＲを行うことにより取得した。ａｃｅＢＡには配列番号９５および配列番号９６、ｐｃｋＡには配列番号９７および配列番号９８、ｇｌｃＢには配列番号９９および配列番号１００、ｍａｅＢには配列番号１０１および配列番号１０２のプライマー対を用いた。得られた各ＰＣＲ産物はＨｉｎｄＩＩＩで処理した後、ｐＣＬ１９２０に大腸菌ｒｍｆプロモーターを挿入して構築したｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ＧＦＰベクターのＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトにクローニングし、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ａｃｅＢＡ、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｐｃｋＡ、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｇｌｃＢ、およびｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｍａｅＢを得た。
【実施例３２】
【０１４４】
大腸菌ａｃｅＢ、ａｃｅＡ、ｐｃｋＡ、ｇｌｃＢ、およびｍａｅＢ強化ＯＰＳ生産菌株の作製およびＯ−ホスホセリン生産能アッセイ
実施例３１で作製された４種のプラスミドでＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）菌株を形質転換し、実施例９と同様の方法でＯ−ホスホセリン生産能をアッセイした。
【０１４５】
（表２３）
2013543723.tif 000025
【０１４６】
表２３に示されたように、ａｃｅＢＡで形質転換された菌株の場合、糖消費速度およびＯＰＳ生産能はやや減少し、ｐｃｋＡで形質転換された菌株の場合、増殖速度が顕著に低下した。ｇｌｃＢまたはｍａｅＢが導入された菌株の場合、ＯＰＳの生産能は増加した。
【実施例３３】
【０１４７】
グリオキシル酸カルボリガーゼ（ｇｌｃ）、タルトロン酸セミアルデヒドレダクターゼ２（ｇｌｘＲ）、およびグリセリン酸キナーゼＩＩ（ｇｌｘＫ）を保有するベクターの構築
グリオキシレートから３−ホスホグリセレートへの変換に関与する、グリオキシル酸カルボリガーゼをコードするｇｃｌ、タルトロン酸セミアルデヒドレダクターゼ２をコードするｇｌｘＲ、およびグリセリン酸キナーゼＩＩをコードするｇｌｘＫを下記のようにクローニングした。大腸菌Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｇｃｌには配列番号１０３および１０４のプライマー対を、ｇｌｘＲ−ｇｌｘＫには配列番号１０５〜１０８のプライマー対を用いてＰＣＲによって取得した。各ＰＣＲ産物はＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、ｐＣＬ１９２０に大腸菌ｒｍｆプロモーターを挿入して構築したｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ＧＦＰベクターのＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトにクローニングし、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｇｃｌ、ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｇｌｘＲ−ｇｌｘＫ、およびｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｇｌｘＲ−ｇｌｘＫ−Ｐｒｍｆ−ｇｃｌの組換えベクターを得た。
【実施例３４】
【０１４８】
ｇｌｃ、ｇｌｘＲ、ｇｌｘＫを保有するベクターの、Ｏ−ホスホセリン生産菌株への導入およびＯ−ホスホセリン生産能アッセイ
実施例３３で構築された３種のプラスミドをＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）に導入し、実施例９と同様の方法でＯ−ホスホセリンの生産能を評価した。その結果を下記の表２４にまとめている。
【０１４９】
（表２４）
2013543723.tif 000026
【０１５０】
表２４に示されたように、ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）菌株自体と比較して、ｇｃｌ、ｇｌｘＲ−ｇｌｘＫ、およびｇｌｘＲ−ｇｌｘＫ−ｇｃｌでそれぞれ形質転換された菌株は、最終Ｏ−ホスホセリン生産能が減少したが、増殖速度および糖消費速度が増加した。特に、ｇｌｘＲ−ｇｌｘＫが導入された菌株は増殖速度および糖消費速度が最も大きく増加した。
【実施例３５】
【０１５１】
Ｏ−ホスホセリン生産菌株の発酵槽での評価
ＣＡ０７−００２２ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）／ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−ｓｅｒＣ菌株を、５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含むＭＭＹＥ寒天プレート（２ｇ／Ｌのグルコース、２ｍＭの硫酸マグネシウム、０．１ｍＭの塩化カルシウム、６ｇ／Ｌのピロリン酸ナトリウム、０．５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、３ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、１８ｇ／Ｌの寒天）上で３３℃、２４時間培養した。得られたコロニーを各寒天プレートの領域の１／１０から掻き取り、バッフル（ｂａｆｆｌｅ）フラスコ中、５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含む種培養培地（１０ｇ／Ｌのグルコース、０．５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、３ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、１．５ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、１２．８ｇ／Ｌのピロリン酸ナトリウム、１ｇ／Ｌのグリシン）に接種して、３０℃で６時間２００ｒｐｍで振とうしながら培養した。得られた種培養培地は、３００ｍｌの本培養培地で満たされた１Ｌの発酵槽に対して、本培養培地の容積の１６％に対応する量で接種し、培養を３３℃でｐＨ７．０で行った。本培養培地の組成は下記の表２５に示した。
【０１５２】
（表２５）
2013543723.tif 000027
【０１５３】
培養中、培養培地にアンモニア水を添加してｐＨ７．０に調整した。培養培地中のグルコースが枯渇したら、５２０ｇ／Ｌのグルコース水溶液を添加して流加式発酵を行った。８０時間の発酵後、ＨＰＬＣで測定した結果、１９．５ｇ／ＬのＯ−ホスホセリンが生産された。
【０１５４】
＜Ｏ−ホスホセリン（ＯＰＳ）スルフヒドリラーゼ（ＯＰＳＳ）の開発および特徴付け＞
【実施例３６】
【０１５５】
ＯＰＳスルフヒドリラーゼ（ＯＰＳＳ）の開発
アエロピュルム・ペルニクス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、およびトリコモナス・バギナリスでは、システイン合成の基質として、大腸菌におけるＯ−アセチルセリン（ＯＡＳ）とは異なりＯ−ホスホ−Ｌ−セリン（ＯＰＳ）を用いる酵素であるＯ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（ＯＰＳＳ）を有すると報告されている（非特許文献7、非特許文献8、非特許文献9）。前記文献の報告に基づき、本発明者らは、ＯＰＳをシステインへと変換する計２種のＯＰＳスルフヒドリラーゼをアエロピュルム・ペルニクスおよびマイコバクテリウム・ツベルクローシスＨ３７Ｒｖから得た。前記２種の酵素のうち、マイコバクテリウム・ツベルクローシスＨ３７Ｒｖ由来のＯＰＳＳ酵素をアミノ酸相同性検索に用いた。その結果、マイコバクテリウム・スメグマチスＭＣ２  １５５株、ロドコッカス・ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ）ＲＨＡ１、およびノカルジア・ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ）ＩＦＭ１０１５２由来の３種のＯＰＳＳ酵素を確保した。
【０１５６】
それぞれの菌株からＯＰＳＳを取得するために、通常、酵素発現のために用いられるｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクターシステムを構築した。５種の異なるＯＰＳスルフヒドリラーゼ遺伝子のクローニングに用いた各鋳型およびプライマー、ならびに得られた組換えプラスミドは下記の表２６にまとめている。表２６に示した鋳型およびプライマーの適切な組み合わせを用いてＰＣＲ手法によってそれぞれのＯＰＳＳ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物と、ｐＥＴ２８ａベクターとを、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化（３７℃、３時間反応）した。各遺伝子断片を、消化したｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。各ＯＰＳＳ遺伝子を保有する発現ベクターの構築は、塩基のシーケンシングにより確認した。酵素発現ベクターを大腸菌（ＤＥ３）に導入し、５種のＯＰＳＳ酵素を発現できる菌株を作製した。酵素名は下記の表２６に示している。
【０１５７】
（表２６）
2013543723.tif 000028
【０１５８】
酵素の発現は、ｐＥＴシステム製造者の指示書（Ｎｏｖａｇｅｎ）に従って行った。平板ＬＢ培地からの各菌株の単一コロニーを、５ｍＬのＬＢブロスに接種し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間培養した。この培養物を、新たな２５ｍＬのＬＢブロス（２５０ｍＬ容量のフラスコ）に移し、ＯＤ６００が０．５〜０．６となるまで（２〜３時間）同じ培養条件で培養し、その直後に１ｍＭ  ＩＰＴＧを培地に添加して、１２０ｒｐｍで振とうしながら１８℃で１８時間培養して酵素の発現を誘導した。酵素は、Ｈｉｓ  Ｓｐｉｎｔｒａｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてＨｉｓ−ｔａｇについてＮｉ−ＮＴＡカラムで精製した。１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析したところ、単離された５種のＯＰＳＳ酵素のうち、１種（Ｒｊｏ−ＯＰＳＳ）が封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）で、４種が可溶性の形態で見出された。
【実施例３７】
【０１５９】
ＯＰＳスルフヒドリラーゼ（ＯＰＳＳ）のシステイン合成活性アッセイ
Ｏ−ホスホセリン（ＯＰＳ）からシステインへの合成を触媒する能力について、４種の微生物菌種から得たＯＰＳスルフヒドリラーゼをアッセイした。アッセイ条件および方法（ｃｙｓＭ酵素アッセイ）については、以前の文献の報告（非特許文献7、非特許文献8、非特許文献9）を参照した。用いた基質の量はｍＬ単位で表す。酵素活性のアッセイ条件は下記の表２７にまとめている。
【０１６０】
（表２７）
2013543723.tif 000029
【０１６１】
酵素以外の反応液を３７℃で５分間インキュベートし、その後、その反応液に精製ＯＰＳスルフヒドリラーゼ５０ｍｇを添加した。３７℃でインキュベートする間、所定の時間で酵素反応液１００ｍＬを取り出し、３３．２％ＴＣＡ  １００ｍｌと混合して反応を停止させた。酵素反応液中のシステイン濃度は、Ｇａｉｔｏｎｄｅ法で吸光度（ＯＤ５６０）を測定して定量した。下記表２８では、４種の異なるＯＰＳスルフヒドリラーゼのシステイン合成活性をまとめている。ＯＰＳＳ酵素のシステイン変換力価を、反応時間でのシステイン変換率として表す。
【０１６２】
（表２８）
2013543723.tif 000030
【０１６３】
以前に報告（非特許文献7、非特許文献9）されたアエロピュルム・ペルニクスおよびマイコバクテリウム・ツベルクローシスＨ３７Ｒｖに由来するＯＰＳスルフヒドリラーゼが、ＯＰＳを基質として用いてシステインを合成する活性を有していることを確認した。Ｍｔｂ−ＯＰＳＳ酵素によるアミノ酸相同性検索によって得た新規マイコバクテリウム・スメグマチスＭＣ２  １５５株由来のＯＰＳスルフヒドリラーゼのシステイン合成活性を初めて見出した。表２８のデータから分かるように、Ａｐｅ−ＯＰＳＳは、１時間でＯＰＳからシステインへの変換率が１００％近くに達した。以前に報告されたマイコバクテリウム・ツベルクローシスＨ３７Ｒｖ由来のＯＰＳＳに基づいて酵素スクリーニング手法を通じて新たに選択されたＭｓｍ−ＯＰＳＳ酵素の最終変換率は４３．７％であり、Ｍｔｂ−ＯＰＳＳと比べて４．３倍高かった。一方、相同性検索によって得られた新規ノカルジア・ファルシニカＩＦＭ  １０１５２由来のＯＰＳスルフヒドリラーゼは、Ｏ−ホスホセリンをシステインに変換する活性は不十分であった。
【実施例３８】
【０１６４】
Ｃ末端の５個のアミノ酸残基が切断されたＭｔｂ−ＯＰＳＳおよびＭｓｍ−ＯＰＳＳをコードするＭｔｂ−ＴおよびＭｓｍ−Ｔの作製
マイコバクテリウム・ツベルクローシスＨ３７Ｒｖ由来のＯＰＳＳ（Ｍｔｂ−ＯＰＳＳ）は追加的な酵素であるｍｅｃ＋およびｃｙｓＯの助けによりＯＰＳからシステインへの変換を触媒するが、Ｃ末端の５個のアミノ酸が除去された場合、このような追加的な酵素の非存在下でさえ、Ｓ２−を有する硫黄源を用いてＯＰＳをシステインに変換させることができると報告されている（非特許文献6）。前記文献の報告に基づいて、硫黄源としてＳ２−の存在下、ＯＰＳを迅速に変換することができるＭｔｂ−Ｔ（配列番号１１）を得た。また、Ｍｔｂ−ＯＰＳＳとアミノ酸相同性を示すＭｓｍ−ＯＰＳＳ（配列番号９）から、Ｍｓｍ−Ｔをさらに得た。２種の酵素変異体を保有する発現ベクターを構築した。ここでは、マイコバクテリウム・ツベルクローシスＨ３７Ｒｖおよびマイコバクテリウム・スメグマチスのゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、および配列番号１２２のプライマー対の存在下、ｐｆｕ  ＰＣＲを行った。得られたＯＰＳＳ遺伝子断片はＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、同じ制限酵素で消化されたｐＥＴ２８ａベクターにクローニングして、組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ−Ｍｔｂ−ＴおよびｐＥＴ２８ａ−Ｍｓｍ−Ｔをそれぞれ構築した。この組換え発現ベクターを、大腸菌（ＤＥ３）に導入した。２種の変異ＯＰＳＳ酵素の発現は、１４％ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって確認した。この２種の変異ＯＰＳＳ酵素の発現および精製は、前記実施例３６と同様の条件で行った。その結果、Ｍｔｂ−Ｔ（配列番号１１）およびＭｓｍ−Ｔ（配列番号１０）を得た。
【実施例３９】
【０１６５】
Ｍｔｂ−ＴおよびＭｓｍ−Ｔのシステイン変換活性アッセイ
Ｃ末端の５個のアミノ酸残基が欠失しているマイコバクテリウム・ツベルクローシスＨ３７Ｒｖ由来ＯＰＳＳ変異体が、補助的な酵素の非存在下でさえ、Ｓ２−基を含有する硫黄源に対する増加した親和性を示すという報告（非特許文献6）に基づいて、Ｍｔｂ−ＴおよびＭｓｍ−Ｔを得た。これらは、最終システイン変換率を測定して酵素活性を評価した。酵素活性は、実施例３７と同じ条件および方法でアッセイした。生成されたシステインはＧａｉｔｏｎｄｅ法で定量した。
【０１６６】
（表２９）
2013543723.tif 000031
【０１６７】
表２９に示したように、マイコバクテリウム・スメグマチスＭＣ２  １５５株由来ＯＰＳＳのＣ末端の５個のアミノ酸残基が欠失しているＭｓｍ−Ｔは、１時間で１００％の率で基質からシステインへの変換が可能であった。
【０１６８】
Ｏ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（ＯＰＳＳ）は、そのアミノ酸配列が改変された場合、より効率的にＬ−システインの整合性を触媒することができる。
【実施例４０】
【０１６９】
ＯＰＳスルフヒドリラーゼ活性のための補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）の要求性
ＯＰＳＳのシステイン変換に対する補助因子の影響を調べるために、ＰＬＰ（ピリドキサール−５'−リン酸）およびＤＴＴ（ジチオスレイトール）の存在下または非存在下においてＭｓｍ−Ｔのシステイン変換率を測定した。ここでは、５０ｍＭ  ＯＰＳブロスおよび１００ｍＭ  Ｎａ２Ｓを基質として２５ｍＭ  ＤＴＴまたは０．２ｍＭ  ＰＬＰの存在下で、３７℃で３０分間反応させた。生成されたシステインはＧａｉｔｏｎｄｅ法で定量した。表３０から分かるように、ＰＬＰとＤＴＴの両方が存在しない場合と比べて、ＰＬＰとＤＴＴの両方が存在する場合は、システイン変換率が２．３倍高かった。つまり、ＰＬＰとＤＴＴの両方が、変換に対して正の影響を有することが観察された。
【０１７０】
（表３０）
2013543723.tif 000032
【実施例４１】
【０１７１】
ＯＰＳスルフヒドリラーゼ活性に対する温度の影響
Ａｐｅ−ＯＰＳＳおよびＭｓｍ−Ｔの、温度によるシステイン変換率を調べた。３７℃および６０℃での酵素活性を、反応２、５、１０、３０、および６０分後に測定した。反応は１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＯＰＳ、１０ｍＭ  Ｎａ２Ｓ、０．２ｍＭ  ＰＬＰ、および５０μｇ／ｍｌ  ＣｙｓＭの条件で行った。生成されたシステインの量はＧａｉｔｏｎｄｅ法で決定した。緩衝液のこの条件では、図２から分かるように、Ａｐｅ−ＯＰＳＳが３７℃で最も速い初期反応速度を示しただけでなく、６０℃でＭｓｍ−Ｔよりも高い反応性を示した。
【実施例４２】
【０１７２】
ＯＰＳスルフヒドリラーゼの熱安定性
Ａｐｅ−ＯＰＳＳおよびＭｓｍ−Ｔの熱安定性を分析した。酵素をそれぞれＯＰＳブロスで２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、３７℃および６０℃で１０、３０、６０、１２０、および２４０分間熱処理した。その後、５ｍＭ  ＯＰＳ、１０ｍＭ  Ｎａ２Ｓ、０．２ｍＭ  ＰＬＰ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）の条件で３７℃で３０分間反応させた。この反応では、１０μｇ／ｍｌ  Ａｐｅ−ＯＰＳＳおよび５０μｇ／ｍｌ  Ｍｓｍ−Ｔを用いた。生成されたシステインの量はＧａｉｔｏｎｄｅ法で測定した。Ａｐｅ−ＯＰＳＳは、６０℃で４時間熱処理したにもかかわらず、そのインタクトな活性を維持していることが観察されたが、Ｍｓｍ−Ｔは、３７℃では活性を維持したものの、６０℃で３０分間の熱処理では、５０％活性が減少した。この結果を下記の表３１に示す。
【０１７３】
（表３１）
2013543723.tif 000033
【０１７４】
また、ＯＰＳブロス中の実際の濃度である５０μｇ／ｍＬでＭｓｍ−Ｔを使用した場合の、３７℃で維持される酵素活性について調べた。Ｎａ２Ｓの非存在下、５０μｇ／ｍＬのＭｓｍ−Ｔを、５０ｍＭのＯＰＳブロスおよび０．２ｍＭ  ＰＬＰとともに３７℃で０．５、１、２、４、および６時間処理した。その後、Ｎａ２Ｓを添加して酵素反応を誘導した。３０分間の反応後、Ｍｓｍ−Ｔの活性を測定した。生成されたシステインの量はＧａｉｔｏｎｄｅ法で決定した。その結果、Ｍｓｍ−Ｔの活性は、ＯＰＳブロス中３７℃で２時間の反応後、５０％を下回るまで減少した（表３２）。
【０１７５】
（表３２）
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【実施例４３】
【０１７６】
ＯＰＳスルフヒドリラーゼに対するｐＨの影響
Ａｐｅ−ＯＰＳＳおよびＭｓｍ−Ｔの、ｐＨによるシステイン変換率を調べた。１００ｍＭ  バッファーにおいて、それぞれ５０μｇ／ｍＬの濃度を有するＡｐｅ−ＯＰＳＳおよびＭｓｍ−Ｔを、３７℃で１０分間反応に供した。ここでは、ｐＨ６．４／７．０／７．４／８．０のリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０／７．４／８．０／８．５／８．８のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．０／８．５／９．０／１０．０の炭酸ナトリウムバッファーを使用した。生成されたシステインの定量はＧａｉｔｏｎｄｅ法で行った。図３に示されたように、Ｍｓｍ−Ｔは、バッファーに関係なくｐＨ８．０〜９．０の間で最も高い活性を示した。Ａｐｅ−ＯＰＳＳの場合、最も高い活性はリン酸カリウム（ｐＨ７．４）で検出され、バッファーごとに最適なｐＨは異なっていた。
【実施例４４】
【０１７７】
ＯＰＳスルフヒドリラーゼ活性に対するイオンの影響
ＯＰＳＳ酵素活性に対するイオンの影響を下記のように調べた。５ｍＭ  ＯＰＳ、１０ｍＭ  Ｎａ２Ｓ、０．２ｍＭ  ＰＬＰ、および１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含む反応混合液において、酵素を、（ＮＨ４）２ＳＯ４［１、３、５、１０、２０ｇ／Ｌ］、ＫＨ２ＰＯ４［０．５、１、２、４、８ｇ／Ｌ］、またはＮＨ４Ｃｌ［０．２、０．５、１、２ｇ／Ｌ］の存在下、３７℃で３０分間の反応に供した。Ａｐｅ−ＯＰＳＳおよびＭｓｍ−Ｔはそれぞれ、１０μｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬの濃度で使用した。生成されたシステインの量はＧａｉｔｏｎｄｅ法で決定した。
【０１７８】
反応混合液に（ＮＨ４）２ＳＯ４またはＫＨ２ＰＯ４を添加した場合、システイン変換率に変化はなかった。一方、下記表３３から明らかなように、ＮＨ４Ｃｌ濃度が増加するにつれて、システイン変換率が減少した。特に、２ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌが添加された場合、最大酵素活性が７０％超減少した。つまり、ＮＨ４Ｃｌは、ＯＰＳスルフヒドリラーゼの変換活性に対して負の影響を有することが観察された。
【０１７９】
（表３３）
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【実施例４５】
【０１８０】
ＯＰＳスルフヒドリラーゼのシステイン合成活性に対する硫黄源の影響
各酵素のシステイン合成活性に対する硫黄源の影響を調べるために実験を行った。各酵素（５０μｇ／ｍＬ  Ａｐｅ−ＯＰＳＳ、５０μｇ／ｍＬ  Ｍｓｍ−Ｔ）を、５ｍＭ  ＯＰＳ、０．２ｍＭ  ＰＬＰ、および１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む反応混合液中、１０ｍＭ  Ｎａ２Ｓ、ＮａＳＨ、またはＮａ２Ｓ２Ｏ３の存在下、３７℃で１時間の反応に供した。生成されたシステインの量はＧａｉｔｏｎｄｅ法で測定した。Ａｐｅ−ＯＰＳＳは、硫黄源としてＮａ２Ｓ２Ｏ３を選び、Ｍｓｍ−ＴはＮａ２Ｓを選ぶことが観察された。結果を下記の表３４にまとめている。
【０１８１】
（表３４）
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【実施例４６】
【０１８２】
ＯＰＳスルフヒドリラーゼを保有する発現ベクター（ｐＣＬ−Ｐｃｊ１システム）の構築および大腸菌における発現
ｐＥＴ２８ａ−Ｍｓｍ−Ｔベクターを鋳型とし、配列番号１２３および１２４のプライマーを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｐＣＬ−Ｐ（ＣＪ１）にクローニングして、組換えベクターｐＣＬ−Ｐ（ＣＪ１）−Ｍｓｍ−Ｔを構築した。ｐＥＴシステムとｐＣＬ−Ｐｃｊ１システムとでＭｓｍ−Ｔの発現レベルの差を調べるために、酵素発現のための菌株を作製した。ｐＥＴシステムはＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に導入し、ｐＣＬ−Ｐｃｊ１システムはＫ１２Ｇ菌株を用いた。酵素発現のために、ＬＢプレートから得た単一コロニーを、５ｍＬのＬＢブロスに接種し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間培養した。この培養物を、カナマイシンまたはスペクチノマイシンと０．２％グルコースとを含む新たな２５ｍＬのＬＢブロス（２５０ｍＬ容量のフラスコ）に移し、ＯＤ６００が０．５〜０．６となるまで培養した。その後直ちに、１ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加して酵素の発現を誘導した。２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で培養する間、様々な培養時間（８、１６、２４時間）で酵素の発現レベルを測定した。２つのシステムでの酵素発現レベルは、１４％ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析した（図４）。
【実施例４７】
【０１８３】
精製ＯＰＳ発酵ブロスを用いた、ＯＰＳスルフヒドリラーゼによるシステイン合成
Ｍｓｍ−ＴおよびＡｐｅ−ＯＰＳＳの、精製ＯＰＳからのシステイン変換率を調べた。ＯＰＳ発酵ブロスから精製した６０ｍＭのＯＰＳを、１２０ｍＭ  Ｎａ２Ｓとともに、７５μｇ／ｍＬの各酵素および０．２ｍＭのＰＬＰの存在下、３７℃または７０℃で３０、６０、９０、および１２０分間反応させた。Ｍｓｍ−Ｔは３７℃でのみ、Ａｐｅ−ＯＰＳＳは３７℃と７０℃の両方で反応を行った。生成されたシステインの量はＧａｉｔｏｎｄｅ法で測定した。図５から明らかなように、精製ＯＰＳ発酵ブロスは、システインへの酵素変換の基質として十分に役に立った。特に、精製ＯＰＳ発酵ブロスを使用した際、７０℃でさえ、Ａｐｅ−ＯＰＳＳの変換率は増加した。
【実施例４８】
【０１８４】
ＯＰＳ発酵ブロスを用いた、ＯＰＳスルフヒドリラーゼによるシステイン合成
ＯＰＳ発酵ブロスを基質として用いた場合の、酵素の濃度によるＭｓｍ−ＴおよびＡｐｅ−ＯＰＳＳのシステイン変換率を測定した。５０ｍＭのＯＰＳ発酵ブロスを、１００ｍＭ  Ｎａ２Ｓおよび０．２ｍＭ  ＰＬＰの存在下、５μｇ／ｍＬまたは５０μｇ／ｍＬの各Ｍｓｍ−ＴおよびＡｐｅ−ＯＰＳＳとともに３７℃で反応させた。生成されたシステインの量はＧａｉｔｏｎｄｅ法で測定した。図６から明らかなように、５０μｇ／ｍＬのＭｓｍ−Ｔにおいて最も高い変換率が検出された。加えて、ＯＰＳ発酵ブロスを基質として使用した際、Ｍｓｍ−Ｔの活性はＡｐｅ−ＯＰＳＳの活性よりも高かった。
【実施例４９】
【０１８５】
ＯＰＳ濃度によるシステイン変換率
Ｍｓｍ−Ｔの変換率に対するＯＰＳ濃度の影響を調べるために、それぞれＯＰＳ発酵ブロスに所定量の精製ＯＰＳを添加して変換反応を誘導した。酵素は５０μｇの量で使用した。反応液中のシステインの量はＧａｉｔｏｎｄｅ法で測定した。Ｍｓｍ−Ｔは、ＯＰＳの濃度が約３０ｇ／Ｌの時に１００％もの高い変換率を示した。
【０１８６】
ＯＰＳの濃度が５０ｇ／Ｌを超えると、変換速度と変換率の両方が減少することが分かった。この結果から、ＯＰＳ発酵ブロスを基質として用いる場合、ＯＰＳと酵素の間には最適な濃度比があることが分かる。
【０１８７】
（表３５）システイン変換率（Ｍｓｍ−Ｔ  ５０ｕｇ）
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【０１８８】
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【０１８９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2013543723.tif 000046
【配列表】
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【国際調査報告】
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