(57)【要約】  本発明は、ＳＰＡＲＣ、特に血漿のＳＰＡＲＣ、に対し高い親和性を有する、ＳＰＡＲＣ結合抗体、及び該抗体を、癌を含む状態を治療することに使用する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＰＡＲＣ結合抗体を含む組成物であって、該ＳＰＡＲＣ結合抗体がＩｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、ｈＨＴＩ、又はそれらの組み合わせを含む組成物。
【請求項２】
該ＳＰＡＲＣ結合抗体がｈＨＴＩを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該ＳＰＡＲＣ結合抗体がＩｍｍ１２を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
該ＳＰＡＲＣ結合抗体がＩｍｍ１４を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
更に活性剤を含み、該活性剤が前記ＳＰＡＲＣ結合抗体に結合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
該活性剤が治療剤又は診断剤を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
該治療剤又は診断剤が、チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、生物学的活性剤、生体分子、放射性核種、アドリアマイシン、アンサマイシン抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブシル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトテシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、ｍｅｐｌｈａｌａｎ、メトトレキサート、ラパマイシン（シロリムス）、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド、ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ、抗血管内皮増殖因子化合物（「抗ＶＥＧＦ」）、抗上皮増殖因子レセプター化合物（「抗ＥＧＦＲ」）、５−フルオロウラシル及びその派生物、放射性核種、ポリペプチド毒物、アポトーシス誘導因子、治療増感剤、酵素又はその活性型断片、並びにこれらの組み合わせ、からなる群より選択される治療剤である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
該治療剤又は診断剤が抗体若しくは抗体断片を含む治療剤である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗体又は抗体断片が、ＩｇＧ、若しくはＩｇＡ、若しくはＩｇＤ、若しくはＩｇＥ、若しくはＩｇＭのＦｃ断片である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗体又は抗体断片が、補体活性化、細胞媒介性細胞傷害若しくはオプソニン化、又はマスト細胞活性化、又はその他の免疫反応の、１つ以上を媒介するものである、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
該治療剤又は診断剤が、蛍光色素、放射性物質、ＭＲＩ造影剤、Ｘ線造影剤、超音波造影剤、及びＰＥＴ造影剤からなる群より選択される診断剤である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
リポソーム中に含有されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
アルブミンナノ粒子中に含有されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
該組成物が適切な医薬担体を更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、静脈内を介して、局所的に、注入を介して、吸入を介して、鼻腔内に、直腸内に、又は経口で、患者に投与されるものである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
ＳＰＡＲＣ結合抗体を含む組成物を診断上又は治療上有効量投与することを含み、該ＳＰＡＲＣ結合抗体がＩｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、ｈＨＴＩ、又はこれらの組み合わせを含む、動物における疾患を診断する又は治療する方法。
【請求項１７】
該ＳＰＡＲＣ結合抗体がｈＨＴＩを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該ＳＰＡＲＣ結合抗体がＩｍｍ１２を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
該ＳＰＡＲＣ結合抗体がＩｍｍ１４を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
該組成物が、ＳＰＡＲＣ結合抗体に結合した活性剤がを更に含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
該活性剤が治療剤又は診断剤を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該治療剤又は診断剤が、チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、生物学的活性剤、生体分子、放射性核種、アドリアマイシン、アンサマイシン抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブシル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトテシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、ｍｅｐｌｈａｌａｎ、メトトレキサート、ラパマイシン（シロリムス）、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド、ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ、抗血管内皮増殖因子化合物（「抗ＶＥＧＦ」）、抗上皮増殖因子レセプター化合物（「抗ＥＧＦＲ」）、５−フルオロウラシル及びその派生物、放射性核種、ポリペプチド毒物、アポトーシス誘導因子、治療増感剤、並びに酵素又はその活性型断片、からなる群より選択される治療剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該治療剤又は診断剤が抗体若しくは抗体断片を含む治療剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
該抗体又は抗体断片が、ＩｇＧ、若しくはＩｇＡ、若しくはＩｇＤ、若しくはＩｇＥ、若しくはＩｇＭのＦｃ断片である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体又は抗体断片が、補体活性化、細胞媒介性細胞傷害若しくはオプソニン化、又はマスト細胞活性化、又はその他の免疫反応の、１つ以上を媒介するものである、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
該治療剤又は診断剤が、蛍光色素、放射性物質、ＭＲＩ造影剤、Ｘ線造影剤、超音波造影剤、及びＰＥＴ造影剤からなる群より選択される診断剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
該組成物が適切な医薬担体を更に含む、請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
該組成物の治療有効量が、静脈内を介して、局所的に、注入を介して、吸入を介して、鼻腔内に、直腸内に、又は経口で、患者に投与される、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
治療有効量のアルブミン結合ナノ粒子パクリタキセルを投与することを更に含む、請求項１６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
腫瘍が、口腔腫瘍、咽頭腫瘍、消化器系腫瘍、呼吸器系腫瘍、骨腫瘍、軟骨腫瘍、骨転移、肉腫、皮膚腫瘍、メラノーマ、乳房腫瘍、生殖器系腫瘍、泌尿器系腫瘍、眼窩腫瘍、脳及び中枢神経系腫瘍、神経膠腫、内分泌系腫瘍、甲状腺腫瘍、食道腫瘍、胃腫瘍、小腸腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、肛門腫瘍、肝臓腫瘍、胆嚢腫瘍、膵臓腫瘍、喉頭腫瘍、肺の腫瘍、気管支腫瘍、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、子宮頸部腫瘍、子宮体部腫瘍、卵巣腫瘍、外陰部腫瘍、膣腫瘍、前立腺腫瘍、前立腺癌、精巣腫瘍、陰茎の腫瘍、膀胱腫瘍、腎臓の腫瘍、腎盂の腫瘍、尿管の腫瘍、頭部及び頸部の腫瘍、副甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
該動物がヒトである、請求項１６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
動物における腫瘍を、抗癌剤及びＳＰＡＲＣ結合抗体を用いて治療する方法であって：
（ａ）動物から生物サンプルを単離すること；
（ｂ）該生物サンプルにおけるＳＰＡＲＣタンパク質の発現を検出すること；並びに
（ｃ）該生物サンプルにおけるＳＰＡＲＣタンパク質を定量すること；
を含み、該ＳＰＡＲＣタンパク質が閾値レベルを超えて存在している場合に、治療有効量の抗癌剤及び治療有効量のＳＰＡＲＣ結合抗体を投与するか；又は、該ＳＰＡＲＣタンパク質が該閾値レベルを下回って存在している場合に、治療有効量の抗癌剤を投与し、ＳＰＡＲＣ結合抗体を投与しないことを含む方法。
【請求項３３】
該ＳＰＡＲＣ結合抗体が、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、ｈＨＴＩ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該生物サンプルが体液から単離される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
該体液が、脳脊髄液、血液、血漿、血清、及び尿からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
該動物がヒトである、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
該腫瘍が、口腔腫瘍、咽頭腫瘍、消化器系腫瘍、呼吸器系腫瘍、骨腫瘍、軟骨腫瘍、骨転移、肉腫、皮膚腫瘍、メラノーマ、乳房腫瘍、生殖器系腫瘍、泌尿器系腫瘍、眼窩腫瘍、脳及び中枢神経系腫瘍、神経膠腫、内分泌系腫瘍、甲状腺腫瘍、食道腫瘍、胃腫瘍、小腸腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、肛門腫瘍、肝臓腫瘍、胆嚢腫瘍、膵臓腫瘍、喉頭腫瘍、肺の腫瘍、気管支腫瘍、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、子宮頸部腫瘍、子宮体部腫瘍、卵巣腫瘍、外陰部腫瘍、膣腫瘍、前立腺腫瘍、前立腺癌、精巣腫瘍、陰茎の腫瘍、膀胱腫瘍、腎臓の腫瘍、腎盂の腫瘍、尿管の腫瘍、頭部及び頸部の腫瘍、副甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、からなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
該化学療法剤又は抗癌剤が、ドセタキセル、パクリタキセル、タキサン、白金化合物、葉酸代謝拮抗剤、代謝拮抗剤、抗有糸分裂剤、ＤＮＡ傷害剤、アポトーシス促進剤、分化誘導剤、抗血管新生剤、抗生物質、ホルモン、ペプチド、抗体、及びこれらの組み合わせ、からなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
該動物の治療が、治療有効量の血管新生阻害剤を投与することを更に含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
該血管新生阻害剤が、ベバシズマブ、ｓｕｎｔｉｎｉｂ、ＨＫＰ、ＩＦＮ−ａｌｐｈａ、フマギリン、アンジオスタチン、エンドスタチン、サリドマイド、及びこれらの組み合わせ、からなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
該化学療法剤がタンパク質結合薬剤の粒子を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
該タンパク質結合薬剤粒子のタンパク質成分がアルブミンを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
該化学療法剤がアルブミン結合パクリタキセル粒子を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
ＳＰＡＲＣタンパク質の発現が抗体を用いて検出される、請求項３２〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
ＳＰＡＲＣタンパク質の発現が抗体を用いずに検出される、請求項３２〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
ＳＰＡＲＣタンパク質の発現が、抗体でないＳＰＡＲＣ結合分子を用いて検出される、請求項３２〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
ＳＰＡＲＣタンパク質の発現が、ＳＰＡＲＣ結合分子を使用することなく検出される、請求項３２〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年６月３日に出願された、米国仮出願番号61/351,246の35 U.S.C. §119(e)の下の優先権の利益を主張し、その全体の内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
酸性であり且つシステインに富んだ分泌タンパク質（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ａｃｉｄｉｃ，  Ｒｉｃｈ  ｉｎ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ；ＳＰＡＲＣ）（オステオネクチンとしても知られる）は、２８１個のアミノ酸からなる糖タンパク質である。ＳＰＡＲＣは、陽イオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋）、成長因子（例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質（例えば、コラーゲンＩ−Ｖ及びコラーゲンＩＸ、ビトロネクチン、並びにトロンボスポンジン−１）、内皮細胞、血小板、アルブミン、並びにハイドロキシアパタイトを含む多種多様なリガンドへの親和性を有する。ＳＰＡＲＣの発現は発生段階で制御を受け、主に、正常発生中の又は傷への反応における、再構築を行っている組織において発現する（例えば、Lane et al., FASEB J., 8, 167−173（1994）を参照されたい）。ＳＰＡＲＣタンパク質は発生中の骨や歯において高発現している。
【０００３】
ＳＰＡＲＣはマトリックス細胞タンパク質であり、いくつかの侵襲性の癌で上方制御されているが、大部分の正常組織では発現が見られない（Porter et al., J. Histochem. Cytochem., 43, 791（1995）及び下記参照）。実際に、ＳＰＡＲＣの発現は様々な腫瘍において誘導されている（例えば、膀胱、肝臓、卵巣、腎臓、腸、及び乳房）。例えば膀胱癌において、ＳＰＡＲＣの発現は進行性の癌と関連付けられている。ステージＴ２かそれよりも進行した浸潤性の膀胱癌では、ステージＴ１の膀胱癌（又はより早期の表在性腫瘍）よりもＳＰＡＲＣの高い発現が見られ、より不良な予後となることが示されている（例えば、Yamanaka et al., J. Urology, 166, 2495−2499（2001）を参照されたい）。髄膜腫において、ＳＰＡＲＣの発現は浸潤性腫瘍のみに関連付けられている（例えば、Rempel et al., Clinical Cancer Res., 5, 237−241（1999）を参照されたい）。ＳＰＡＲＣの発現は、上皮内浸潤性乳癌種病変の７４．５％（例えば、Bellahcene et al., Am. J. Pathol., 146, 95−100（1995）を参照されたい）、及び浸潤性の乳管癌の５４．２％（例えば、Kim et al., J. Korean Med. Sci., 13, 652−657（1998）を参照されたい）でも検出される。ＳＰＡＲＣの発現は乳癌における頻繁な微小石灰化とも関連付けられており（例えば、上掲のBellahcene et al.を参照されたい）、このことはＳＰＡＲＣの発現が、乳房転移の骨に対する親和性の原因となり得ることを示唆している。ＳＰＡＲＣはアルブミンと結合することも知られている（例えば、Schnitzer, J. Biol. Chem., 269, 6072（1994）を参照されたい）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、特に、いくつかの癌におけるＳＰＡＲＣの役割といった、疾患におけるＳＰＡＲＣの役割を活用する組成物や方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
一態様において、本発明は、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、ｈＨＴＩ、又はそれらの組み合わせを含むＳＰＡＲＣ結合抗体を包含する組成物を提供する。
【０００６】
その他の態様において、本発明は、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、ｈＨＴＩ、又はそれらの組み合わせを含むＳＰＡＲＣ結合抗体を包含する組成物の、診断上又は治療上有効量を投与することを含む、癌などの疾患を動物において診断する又は治療する方法を提供する。
【０００７】
本発明は、１つ以上の抗癌剤及びＳＰＡＲＣ結合抗体で、動物における腫瘍を治療する方法を更に提供し、それは以下を含む：動物から生物サンプルを単離すること、該生物サンプルにおけるＳＰＡＲＣタンパク質の発現を検出すること、該生物サンプルにおけるＳＰＡＲＣタンパク質を定量すること、該生物サンプルにおけるＳＰＡＲＣタンパク質が閾値レベルを超えて存在した場合に、治療有効量の抗癌剤及び治療有効量の抗ＳＰＡＲＣ抗体を投与すること、又はＳＰＡＲＣタンパク質が閾値レベルを下回って存在した場合に、治療有効量の抗癌剤を投与し、該ＳＰＡＲＣ結合抗体を投与しないこと。ＳＰＡＲＣの発現の定量についての、本発明に従う使用のための適切な生物サンプルとして、例えば、血液、血清、及び血漿が挙げられる。本発明に従う、腫瘍を治療するための適切なＳＰＡＲＣ結合抗体として、例えば、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、ｈＨＴＩ等に基づいた、ヒト化ＳＰＡＲＣ結合抗体が挙げられる。ＳＰＡＲＣ結合抗体の使用のための、生物サンプルにおけるＳＰＡＲＣの閾値レベルは、少なくとも約４．３ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４３ｎｇ／ｍｌ、又は、好ましくは、少なくとも約４３０ｎｇ／ｍｌであり得る。
【０００８】
本発明の全ての方法及び組成物において、ＳＰＡＲＣ結合抗体は、治療上の又は診断上の活性剤へと結合させることができる。本発明及び本発明の方法の適用により提供される組成物の投与に適した動物は、ヒトの患者を含むが、これに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、Ｉｍｍ１からＩｍｍ１２へかけての、Ｆａｂ領域のクローニング及び発現に使用した、ｐＡＳＫ８４の制限酵素マップである。
【図２】図２は、２つのヒトＳＰＡＲＣ結合Ｆａｂクローン、Ｆａｂ６及びＦａｂ１６のアミノ酸配列を提供する（配列番号１５〜１６）。
【図３】図３は、Ｆａｂ１６のクローニング及び発現に使用したｐＢＡＤベクターの制限酵素マップである。
【図４】図４は、ｐＢａｄにおけるＦａｂ１６のアミノ酸配列を提供する（配列番号１７）。
【図５】図５は、Ｆａｂ６（配列番号１５）及びＦａｂ１６（配列番号１６）からの完全ヒト抗体Ｉｍｍ１３及びＩｍｍ１４のクローニング及び発現に使用したｐｃＤＮＡ３００２ＮＥＯベクターの制限酵素マップである。
【図６】図６は、Ｉｍｍ１（配列番号１及び８）、Ｉｍｍ２（配列番号２及び９）、Ｉｍｍ３（配列番号３及び１０）、Ｉｍｍ４（配列番号４及び１１）、Ｉｍｍ６（配列番号５及び１２）、Ｉｍｍ１０（配列番号６及び１３）、並びにＩｍｍ１２（配列番号７及び１４）についての、フレームワーク領域（ＦＷＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を提供する。
【図７】図７は、ヒトＳＰＡＲＣに対するＩｍｍ１からＩｍｍ６及びＩｍｍ８からＩｍｍ１２の上清の、１：１、１：１０、及び１：１００の希釈液、並びにコントロールｍＡｂの、定量的ＥＬＩＳＡの結果を提供する。
【図８】図８は、０．０４μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、及び５μｇ／ｍＬの濃度の、ヒトＳＰＡＲＣに対する精製したＩｍｍ１からＩｍｍ１２の抗体、並びにポジティブコントロール及びネガティブコントロールの、定量的ＥＬＩＳＡの結果を提供する。
【図９】図９は、Ｉｍｍ１、Ｉｍｍ３、Ｉｍｍ４、Ｉｍｍ７、Ｉｍｍ９、及びＩｍｍ１０抗体のＨＴＩ−ＳＰＡＲＣ（血小板ＳＰＡＲＣ）への結合と、Ｉｍｍ１０、Ｉｍｍ１１、Ｉｍｍ１２、及びコントロール抗体のＢｉｏ１−ＳＰＡＲＣへの結合を比較した、定量的ＥＬＩＳＡの結果を提供する。
【図１０】図１０は、様々な濃度での、Ｆａｂ１６のＨＴＩ−ＳＰＡＲＣ（血小板ＳＰＡＲＣ）及びＢｉｏ１−ＳＰＡＲＣへの結合についての、定量的ＥＬＩＳＡの結果を提供する。
【図１１】図１１は、Ｆａｂ１６のヒトＨＴＩ  ＳＰＡＲＣへの結合の、表面プラズモン共鳴を使用して作成したセンサーグラム（sensorgram）である。
【図１２】図１２は、Ｆａｂ１６のヒトＢＩＯ１  ＳＰＡＲＣへの結合の、表面プラズモン共鳴を使用して作成したセンサーグラムである。
【図１３】図１３は、様々な濃度のヒトＳＰＡＲＣに対する、Ｉｍｍ１１、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１３、及びＩｍｍ１４の結合についての、定量的ＥＬＩＳＡの結果を提供する。
【図１４】図１４は、変性ヒトＳＰＡＲＣに対する、一連のＩｍｍ抗体でのウェスタンブロットである。
【図１５】図１５は、ＳＰＡＲＣ結合抗体ｍＨＴＩ（Ｉｍｍ１７と名付けた）、Ｉｍｍ１２、及びＩｍｍ１４、並びにコントロールｍＩｇＧの、ＬＬ／２  ルイス肺癌を有する動物の生存率への効果を示しているプロットである。
【図１６】図１６は、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、及びｍＨＴＩ（Ｉｍｍ１７と名付けた）の、ヒト及びマウスＳＰＡＲＣに対する結合についての、定量的ＥＬＩＳＡの結果を提供する。
【図１７】図１７Ａは、事前の化学療法を受けていた患者（ＰＣ）であるコホート１の、高ＳＰＡＲＣ及び低ＳＰＡＲＣについての、全体の生存率を示しているプロットである。図１７Ｂは、事前の化学療法を受けていない患者（ＮＰＣ）であるコホート２の、高ＳＰＡＲＣ及び低ＳＰＡＲＣについての、全体の生存率を示しているプロットである。
【図１８】図１８は、正常なコントロールと比較した、治療前後での、コホート１（事前の化学療法）及びコホート２（事前の化学療法なし）における、ＳＰＡＲＣレベルを示しているドットプロットである。
【図１９】図１９は、治療後の血漿中のＳＰＡＲＣのパーセント変化を示している、棒グラフである。
【図２０】図２０Ａは、高リスククラスター（クラスター１）及び低リスククラスター（クラスター２）の患者についての、進行なし生存率（ＰＦＳ）を示しているプロットである。図２０Ｂは、高リスククラスター（クラスター１）及び低リスククラスター（クラスター２）の患者についての、全体の生存率（ＯＳ）を示しているプロットである。
【図２１】図２１は、コホート１（事前の化学療法）及びコホート２（事前の化学療法なし）における、高リスク（ＨＲ）クラスター及び低リスク（ＬＲ）クラスターについての、ＳＰＡＲＣのレベルを示しているドットプロットである。
【図２２】図２２Ａは、高リスク（ＨＲ）クラスターにおける全ての患者と比較した、リスクレベル０、１、２の患者についての、進行なし生存率（ＰＦＳ）を示しているプロットである。図２２Ｂは、高リスク（ＨＲ）クラスターにおける全ての患者と比較した、リスクレベル０、１、２の患者についての、全体の生存率（ＯＳ）を示しているプロットである。
【図２３】図２３Ａは、２５ｍｇ／ｋｇの５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）及び０．１ｍｇ、０．１５ｍｇ、又は０．２０ｍｇのＳＰＡＲＣを用いた治療の後の腫瘍体積を、生理食塩水又は５−ＦＵのみにおける腫瘍体積と比較して示しているプロットである。図２３Ｂは、ドセタキセル（１０ｍｇ／ｋｇ）及び０．２ｍｇのＳＰＡＲＣを用いた治療の後の腫瘍体積を、生理食塩水、ドセタキセルのみ、又はＳＰＡＲＣのみにおける腫瘍体積と比較して示しているプロットである。
【図２４−１】図２４Ａは、ｓｕｎｔｉｎｉｂ（ＳＵＴ）（３０ｍｇ／ｋｇ）、ＳＰＡＲＣ（ＢＩＯ１）（０．２ｍｇ）、及びｎａｂ−パクリタキセル（ＡＢＸ）（１５ｍｇ／ｋｇ）を用いた治療の後のＨＴ２９の腫瘍体積を、ネガティブコントロール、ＳＰＡＲＣのみ、ｎａｂ−パクリタキセルのみ、ｎａｂ−パクリタキセル及びｓｕｎｔｉｎｉｂ、並びにｎａｂ−パクリタキセル及びＳＰＡＲＣにおける、ＨＴ２９の腫瘍体積と比較して示しているプロットである。図２４Ｂは、ベバシズマブ（ＡＶＳ）（０．２ｍｇ）、ＳＰＡＲＣ（ＢＩＯ１）（０．２ｍｇ）、及びｎａｂ−パクリタキセル（ＡＢＸ）（１５ｍｇ／ｋｇ）を用いた治療の後のＨＴ２９の腫瘍体積を、ネガティブコントロール、ＳＰＡＲＣのみ、ｎａｂ−パクリタキセルのみ、ｎａｂ−パクリタキセル及びベバシズマブ、並びにｎａｂ−パクリタキセル及びＳＰＡＲＣにおける、ＨＴ２９の腫瘍体積と比較して示しているプロットである。
【図２４−２】図２４Ｃは、ｓｕｎｔｉｎｉｂ（ＳＵＴ）（３０ｍｇ／ｋｇ）、ＳＰＡＲＣ（ＢＩＯ１）（０．２ｍｇ）、及びｎａｂ−パクリタキセル（ＡＢＸ）（１０ｍｇ／ｋｇ）を用いた治療の後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１の腫瘍体積を、ｎａｂ−パクリタキセルのみ、並びにｎａｂ−パクリタキセル及びｓｕｎｔｉｎｉｂにおける、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の腫瘍体積と比較して示しているプロットである。図２４Ｄは、ベバシズマブ（ＡＶＳ）（０．２ｍｇ）、ＳＰＡＲＣ（ＢＩＯ１）（０．２ｍｇ）、及びｎａｂ−パクリタキセル（ＡＢＸ）（１０ｍｇ／ｋｇ）を用いた治療の後のＰＣ３の腫瘍体積を、生理食塩水、ＳＰＡＲＣのみ、ｎａｂ−パクリタキセルのみ、ｎａｂ−パクリタキセル及びベバシズマブ、並びにｎａｂ−パクリタキセル及びＳＰＡＲＣにおける、ＰＣ３の腫瘍体積と比較して示しているプロットである。
【図２５】図２５は、０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬのリコンビナント野生型ヒトＳＰＡＲＣ（ＢＩＯ１）を投与した際のビーズ当りのスプラウト（sprout）を、ネガティブコントロールのＤＰＢＳと比較して、示している棒グラフである。
【図２６】図２６Ａは、０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬのリコンビナント野生型ヒトＳＰＡＲＣ（ＢＩＯ１）による、細管形成を示す。図２６Ｂは、リコンビナント野生型ヒトＳＰＡＲＣ（ＢＩＯ１）の、０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬの濃度での管の長さを、ポジティブコントロールＶＥＦＧ及び未処理の細管の管の長さと比較して示している、ドットプロットである。
【図２７】図２７は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５−Ｌｕｃ＋転移モデルにおいて、ＳＰＡＲＣ（４ｍｇ／ｋｇ）及びｎａｂ−パクリタキセル（１０ｍｇ／ｋｇ）を用いた治療について、生理食塩水、ＳＰＡＲＣのみ、及びｎａｂ−パクリタキセルのみの治療と比較して、タンパク質レベルにより肺転移を示しているドットプロットである。
【図２８】図２８は、ＳＰＡＲＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）及びＩｍｍ１２、ＳＰＡＲＣ及びＩｍｍ１４、ＳＰＡＲＣ及びｍＨＴＩ（Ｉｍｍ１７として特定される）、ｍＩｇＧ（ネガティブコントロール）、抗体なし（ネガティブコントロール）、並びにＳＰＡＲＣ又は抗体非存在を含む、ＬＬ２転移組織サンプルにおける細管形成の写真を提供する。
【図２９】図２９は、ｍＨＴＩ（「ＨＴＩ」と名付けた）、Ｉｍｍ−１２、及びＩｍｍ−１４を含む様々な抗体での腫瘍の局在について、Ｉｍｍ−２及びＩｍｍ−３と比較した、定量的蛍光法の結果を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト及びマウスＳＰＡＲＣの両方に対する特異的な結合、並びに血管新生及び転移を阻害する性能について解析した、特定のＳＰＡＲＣ結合抗体に関する。驚いたことに、上記解析は、スクリーニングＥＬＩＳＡにおいて、３つの抗体が天然の及び変性したヒトＳＰＡＲＣに結合したが、１つの抗体のみが、マウスのＳＰＡＲＣにも結合することを明らかにした。これら３つの抗体、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、及びｍＨＴＩはまた、驚いたことに、抗血管新生（即ち、抗腫瘍）及び抗転移特性を有することを見出した。
【００１１】
定義
【００１２】
本明細書において、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、互換的に使用され、ペプチド結合により結合したアミノ酸残基の鎖から構成される化合物のことをいう。ポリペプチドの「活性部位」は、全長ポリペプチドより短いが、測定可能な生物学的活性及び生物学的検出を保持するペプチドを意味する。
【００１３】
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍」は、良性であろうと悪性（癌性）であろうと、原発部位病変であろうと転移であろうと、いかなる新生物の成長、増殖、又は細胞集団をもいう。
【００１４】
本明細書で使用される場合、用語「癌」は、正常な増殖制御に対する感受性を喪失した細胞の増殖によって引き起こされる、又は特徴付けられる、増殖性疾患のことを言う。同一組織型の癌は通常、同一組織に由来し、それらの生物学的な特徴に基づいて異なるサブタイプに分けることができる。癌の４つの一般的なカテゴリーは、カルシノーマ（上皮組織由来）、肉腫（結合組織又は中胚葉系由来）、白血病（造血組織由来）、及びリンパ腫（リンパ組織由来）である。２００を超える異なるタイプの癌が既知であり、体の全ての臓器及び組織が罹患し得る。癌の定義を限定するものではないが、癌の具体例として、メラノーマ、白血病、星状細胞腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、及び慢性リンパ性白血病が挙げられる。様々な癌に罹患し得る臓器及び組織の例として、膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、前立腺、脳下垂体、副腎、腎臓、胃、食道、直腸、小腸、結腸、肝臓、胆嚢、頭部及び頸部、舌、口、眼部及び眼窩、骨、関節、脳、神経系、皮膚、血液、鼻咽頭組織、肺、咽頭、泌尿器、子宮頸部、膣、外分泌腺、並びに内分泌腺が挙げられる。或いは、癌は多中心性癌又は原発不明癌（ＣＵＰＳ）であり得る。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「適切なＳＰＡＲＣ結合抗体」又は「ＳＰＡＲＣ結合抗体」は、ＳＰＡＲＣに特異的に結合することができる抗体をいう。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「腫瘍標的化抗体」は、腫瘍、癌、新生物等の疾患を標的とする抗体をいう。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「ＳＰＡＲＣ結合抗体」は、１、又は１０、又は１００、又は１０００ｎＭの範囲内、好ましくは１０ｎＭ以下のＫｄを有し、循環しているＳＰＡＲＣに対し親和性を有する抗体をいう。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、哺乳動物において１つ以上の疾患又は状態の症状を軽減する（熟練した医療従事者による評価で何らかの程度にまで）組成物の量をいう。更に、組成物の「治療有効量」は、疾患若しくは状態に関連する又は原因となる、生理学的又は生化学的パラメーターを、部分的に又は完全に正常へ戻す量を意味する。当該技術分野における熟練した臨床医は、例えば、静脈内に、腹腔内に、経口的に、又は吸入を介して投与された場合に、特定の疾患状態又は障害を、治療又は予防するために、組成物の治療有効量を決定することができる。治療上有効であるのに必要とされる組成物の正確な量は、例えば、多くの患者に特異的な留意事項に加え、活性剤の特定の活性、使用した送達用機器、薬剤の物理学的特性、投与の目的等の、多くの因子に依存するであろう。しかし、治療有効量の決定は、本明細書の開示を理解した通常の技術を有する臨床医の技術範囲内である。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「治療」、「療法」、及び「治療法」は、治癒的療法、防止的療法、又は予防的療法をいう。「予防的療法」の例として、標的疾患（例えば、癌又は他の増殖性疾患）又はその関連疾患の可能性を阻止する又は減らすことが挙げられる。治療の必要がある者として、すでに疾患又は状態を有する者、及び予防すべき疾患又は状態を有する傾向にある者が挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「治療」、「療法」、及び「治療法」は、疾患又は関連する状態と闘うことを目的とした、哺乳動物の管理及び看護をもいい、組成物の投与により、症状、副作用、又は疾患や状態の他の合併症を緩和することも含む。癌の治療法は、手術、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、及び免疫療法を含むが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「薬剤」又は「薬」又は「治療剤」は、治療上の特性を有すると思われる、化学物質、化学物質の混合物、生物学的高分子、或いは、細菌、植物、真菌、又は動物（特に哺乳膨物）細胞若しくは組織等の生物材料から作製された抽出物をいう。薬剤又は薬は、実質的に精製又は部分的に精製され得る。本発明に係る「薬剤」は、放射線療法剤又は「化学療法剤」をも含む。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「診断剤」は、ＥＬＩＳＡ等の方法により、血漿の／循環しているＳＰＡＲＣの定量を可能にする薬剤をいう。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「化学療法剤」は、癌疾患、新生物疾患、及び／又は増殖性疾患に対し活性を有する薬剤をいう。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「放射線療法レジメン」又は「放射線療法」は、癌性細胞を殺す放射線の投与のことをいう。放射線は細胞内の様々な分子と相互作用するが、細胞死という結果を招く主要な標的はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。しかしながら、放射線療法はしばしば細胞膜及び核膜並びに他の細胞小器官に対しても傷害をもたらす。ＤＮＡ損傷は通常、糖−リン酸骨格における１本鎖及び２本鎖切断に関連する。更に、細胞機能を破壊し得る、ＤＮＡとタンパク質の架橋が生じる可能性がある。放射線のタイプによって、ＤＮＡ損傷の機序は、相対的な生物学的有効性と共に、様々であり得る。例えば、重粒子（即ち陽子、中性子）はＤＮＡを直接傷害し、より大きな相対的生物学的有効性を有する。それに対し、電磁放射線は主に細胞内の水のイオン化によって生じる、寿命の短いヒドロキシル基のフリーラジカルを介して、間接的なイオン化という結果をもたらす。放射線の臨床応用は、外部からの放射線照射（外部の照射源から）及び密封小線源治療（患者に移植された又は埋め込まれた放射線源の使用）からなる。外部からの放射線照射は、Ｘ線及び／又はガンマ線からなり、一方、密封小線源治療は崩壊してアルファ粒子、又はガンマ線と共にベータ粒子を放射する放射性核を用いる。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「代替療法レジメン」又は「代替療法」は（上述のような第一の化学療法レジメンではない）、例えば、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤（例えばイレッサ（登録商標）（ゲフィチニブ）、タルセバ（登録商標）（エルロチニブ）、アービタックス（登録商標）（セツキシマブ）、イマチニブメシル酸塩（グリベック（登録商標））、プロテアソーム(proteosome)阻害剤（例えば、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標））；ＰＴＫ７８７（ＺＫ２２２５８４）、オーロラキナーゼ阻害剤（例えばＺＭ４４７４３９）等のＶＥＧＦＲ２阻害剤；哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤、ラパマイシン阻害剤（例えば、シロリムス（ラパミューン（登録商標）））；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ティピファニブ（ザーネストラ（登録商標）））；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＢＡＹ１２−９５６６；硫酸多糖テコガラン）；血管新生阻害剤（例えば、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）；ＴＮＰ−４等のフマギリン類似体；カルボキシアミノトリアゾール(carboxyaminotriazole)；ＢＢ−９４及びＢＢ−２５１６；サリドマイド；インターロイキン−１２；リノマイド；ペプチド断片；並びに血管成長因子及び血管成長因子受容体に対する抗体）；血小板由来成長因子受容体阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、マイトジェン活性化キナーゼ阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ阻害剤、ラウス肉腫ウイルス形質転換癌遺伝子（ＳＲＣ）阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、小分子低酸素誘導因子阻害剤、ヘッジホッグ阻害剤、並びにＴＧＦ−βシグナル阻害剤を含み得る。更に、免疫療法薬もまた代替療法レジメンとして考えられるであろう。例えば、前もって作られた抗体を含む血清又はガンマグロブリン；非特異的な免疫刺激アジュバント；能動的で特異的な免疫療法；及び養子免疫療法も含まれる。更に、代替療法は、ポリヌクレオチド（アンチセンス分子を含む）、ポリペプチド、抗体、遺伝子治療ベクター等の、その他の生物を基盤とした化学物質を含み得る。そのような代替療法は、単独若しくは組み合わせで、又は本明細書に記載されている別の治療レジメンとの組み合わせで実施されてもよい。用量及び投与レジメンを含めて、併用療法における代替療法レジメンに用いられる、化学療法剤及びその他の薬剤の使用方法もまた、当該技術分野に精通した者に公知であろう。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍の局在」は、腫瘍を有する動物への注入の際に、ＳＰＡＲＣを発現している腫瘍において、ＳＰＡＲＣ結合抗体が濃縮する度合いを意味する。腫瘍の局在は、抗体を蛍光色素でラベルすること、該蛍光抗体を腫瘍を有する動物へ注入すること、及び腫瘍の蛍光と、任意の肉眼的腫瘍から離れた皮膚の蛍光との比率を決定することを含むが、これに限定されない、いかなる適切な方法によっても測定することができ、前記比率が＞２０、好ましくは＞１０、より好ましくは＞５である場合、局在が存在する。
【００２６】
抗体
【００２７】
本発明はＳＰＡＲＣ結合抗体を提供する。特に、ＳＰＡＲＣ結合抗体は、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、ｍＨＴＩ、ｈＨＴＩ（ｍＨＴＩのヒト化バージョン）、又はそれらの組み合わせであり得る。
【００２８】
更に、本発明は、例えば、ＨＴＩ（血小板）ＳＰＡＲＣ等の血液に見られるＳＰＡＲＣ、及び例えば、Ｂｉｏ１−ＳＰＡＲＣ等の腫瘍部位に見られるＳＰＡＲＣの両方に結合することができる、ＳＰＡＲＣ結合抗体を提供する。抗体結合強度を決定するための様々な方法が当業者に既知である。
【００２９】
ヒトへの使用については、免疫原性及び免疫反応を避けるために、ヒト化ＳＰＡＲＣ結合抗体、又はＦａｂ’、Ｆａｂ、若しくはＦａｂ２等の適切な断片を使用するのが好ましい。ヒト化抗体又はその断片は、例えば、以下の確立された方法の１つを使用して産生することができる：１）ヒト化抗体は、可変ＣＤＲ領域をＳＰＡＲＣに対する抗体のＣＤＲ領域で置換した、ヒトＩｇＧ骨格を使用して構築することができ、このとき重鎖及び軽鎖は、別個のプロモーター下で独立に発現する、又はＩＲＥＳ配列とともに１つのプロモーター下で共発現する；２）ヒト化モノクローナル抗体は、ヒトの免疫系を有するように操作されたマウスを使用して、ＳＰＡＲＣに対して産生させることができる；３）ＳＰＡＲＣに対するヒト化抗体は、ファージミド（Ｍ１３、ラムダ大腸菌ファージ、又は表面提示可能な任意のファージ系）を使用して、産生させることができる。全長抗体を構築するために、可変領域を重鎖及び軽鎖の両方のＣＤＲ上へ移行することができる。ＣＨＯ、２９３、又はヒト骨髄細胞等の哺乳動物細胞における重鎖及び軽鎖の共発現は、全長抗体を提供し得る。同様に、十分に確立された方法を使用して、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、又はＦａｂ２断片、及び一本鎖抗体を作製することが可能である。
【００３０】
本発明は、血漿のＳＰＡＲＣに特有のエピトープを特異的に認識するヒト化抗体を更に提供する。ヒト化抗体は通常、そのＣＤＲの残基が、所望の特異性、親和性、及び性能を有する、マウス、ラット、又はラビット等の非ヒトである種のＣＤＲの残基で置き換えられている、ヒト抗体である。いくつかの例では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられている。例えば、ヒト及びマウスの両方のＳＰＡＲＣへ結合し（特に、循環しているヒトＳＰＡＲＣ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで良好な抗血管新生活性を示し、動物モデルにおいて有望な結果を有する（例えば、異種移植モデル系で転移を減少する）、抗ＳＰＡＲＣ抗体等の、いかなる適切なモノクローナル抗体も、ＣＤＲの供給源として使用することができる。
【００３１】
モノクローナル抗体をヒト化するために、４つの一般的な工程が存在する。（１）出発抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域の、ヌクレオチド配列及び予想されるアミノ酸配列を決定すること、（２）ヒト化抗体をデザインすること、即ち、ヒト化の過程でどの抗体フレームワーク領域を使用するかを決定すること、（３）実際のヒト化の方法論／技術、並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現、の工程である。例えば、米国特許番号4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089；6,180,370;及び6,548,640を参照されたい（これらは参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、抗体が臨床試験及びヒトの治療に使用される場合は、免疫反応を避けるために、定常領域をよりヒト定常領域に類似のものへと操作し得る。例えば、米国特許番号5,997,867及び5,866,692を参照されたい（これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３２】
抗体を、抗原に対する高親和性、及びその他の有利な生物学的特性を保持しながらヒト化することが重要である。この目標を達成するために、ヒト化抗体は、元の配列、並びに元の配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用した、様々な概念的なヒト化産物の解析の過程により作製することができる。三次元イムノグロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者に公知である。選択されたイムノグロブリン配列の候補の、推定三次元立体構造を図示及び表示する、コンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示の調査は、イムノグロブリン配列候補の機能における残基の推定上の役割の解析、即ち、イムノグロブリン候補のその抗原への結合能に影響する残基の解析、を可能にする。このようにして、標的抗原（複数含む）への増加した親和性等の、所望の抗体特性を達成するために、フレームワーク残基を、共通配列及び移入した配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基が、直接及び最も実質的に抗原への結合に関与する。ヒト化抗体は、抗体の１つ以上の特性を改善するために、ヒンジ領域において修飾をも含み得る。
【００３３】
或いは、抗体は、ファージディスプレイ技術により選別し、組換え技術により作製し得る。例えば、米国特許番号5,565,332；5,580,717；5,733,743及び6,265,150を参照されたい（これらは参照により本明細書に組み込まれる）。或いは、ファージディスプレイ技術（McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)）を使用して、免疫されていないドナーの、イムノグロブリン可変（Ｖ）領域遺伝子レパートリーから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト抗体及び抗体断片を産生することができる。
【００３４】
自然の免疫反応において、抗体遺伝子は高い割合で変異を蓄積する（体細胞超突然変異）。導入された変化のいくつかは、より高い親和性をもたらし、高親和性表面イムノグロブリンを提示しているＢ細胞は、その後の抗原曝露の間に優先的に複製及び分化を行う。この自然の過程は、「チェーンシャッフリング（chain shuffling）」として知られる技術を用いることで、模倣することができる。（Marks, et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)）。当該方法において、ファージディスプレイにより得られた「第１次」ヒト抗体の親和性は、重鎖及び軽鎖Ｖ領域遺伝子を、免疫されていないドナーから得た、自然発生したＶ領域遺伝子のバリアント（レパートリー）のレパートリーで、順次置換することによって改善することができる。この技術は、ｐＭ〜ｎＭの範囲で親和性を有する、抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
【００３５】
遺伝子シャッフリング（Gene shuffling）もまた、げっ歯類の抗体から得たヒト抗体であって、最初のげっ歯類の抗体と同様の親和性及び特異性を有する、ヒト抗体を得るために使用することができる。「エピトープインプリンティング」とも称される当該方法により、ファージディスプレイ技術により得られたげっ歯類の抗体の重鎖又は軽鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒトＶ領域遺伝子のレパートリーと置換し、げっ歯類−ヒトキメラを創出する。抗原に対する選別により、機能的な抗原結合部位を保持することができる、ヒト可変領域の単離をもたらす（即ち、エピトープがパートナーの選択を支配する（刷り込む））。残存しているげっ歯類Ｖ領域を置換するために、上記過程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日発行のＰＣＴ公報番号WO 93/06213を参照されたい）。ＣＤＲ移植による従来からのげっ歯類抗体のヒト化と異なり、当該技術は、げっ歯類起源のフレームワーク又はＣＤＲの残留がない、完全ヒト抗体を提供する。上述したのはヒト化抗体に関することであるが、議論した一般的な原理は、例えば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、及びウシ等への使用のための、抗体のカスタマイズへ応用可能であることは明白である。
【００３６】
本発明のＳＰＡＲＣ結合抗体は、抗体全体、及びＳＰＡＲＣ結合部位を保持する抗体の断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆａｂ及びＦａｂ２）を含む。該抗体は、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及びＩｇＹ等の任意のクラスの抗体であり得る。該抗体は、例えば、１つの結合価がＳＰＡＲＣに対するもので、他の結合価が活性剤（ｔＴＦ若しくはリシンＡ、又は本明細書に記載の他の活性剤等）に対するものであるような、二価の、一価の、又はキメラ抗体でもあり得る。ヒト化抗体はＩｇＧに限定されない。特定の疾患標的に適した、異なる抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性や補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ等の全ての他のクラスの抗体を産生することにも、同様の技術を使用することができる。抗体の機能的な断片は、制限的タンパク質分解によって産生し得る。これらの断片は、Ｆａｂ’等の一価のもの又はＦａｂ２等の二価のものであり得る。大腸菌で、単鎖のｓｃｆｖとして、又は二重特異性抗体として、断片を合成することも可能である。
【００３７】
組成物
本発明は、上記のように、ＳＰＡＲＣ結合抗体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、該組成物は、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、ｍＨＴＩ、又はｈＨＴＩ、加えて適切な担体を含む。その他の実施形態において、該組成物は、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、ｍＨＴＩ、又はｈＨＴＩの組み合わせ、加えて適切な担体を含む。好ましい実施形態において、該組成物は、ＳＰＡＲＣ結合抗体及び医薬上許容される担体を含む、医薬上許容される組成物である。
【００３８】
本発明の組成物は、活性剤を更に含み得る。いくつかの実施形態において、該活性剤は、その薬理学的効果を直接発揮することができる、医薬上の活性型治療剤である。その他の実施形態において、該活性剤は診断剤である。好ましい実施形態において、該活性剤は、ＳＰＡＲＣ結合抗体に結合した、又はＳＰＡＲＣ結合抗体と共に投与される、診断上の又は治療上の活性剤である。いくつかの活性剤は、診断剤と治療剤の両方として有用であり、従って、これらの用語は相互排他的ではないことが理解されるであろう。
【００３９】
本発明の組成物を使用し、活性剤のみでの送達よりも、病変部への活性剤の送達を亢進することができ、又は、ＳＰＡＲＣの排除を亢進し、ＳＰＡＲＣの血中レベルの減少をもたらすことができる。好ましい実施形態において、ＳＰＡＲＣの血中レベルにおける減少は、少なくとも約１０％である。より好ましい実施形態において、ＳＰＡＲＣの血中レベルにおける減少は、少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は、最も好ましくは、少なくとも約５０％である。
【００４０】
活性剤は、化学療法剤又は抗癌剤等の、いかなる適切な治療剤又は診断剤でもあり得る。適切な診断剤として、蛍光色素、放射性物質、ＭＲＩ造影剤、Ｘ線造影剤、超音波造影剤、及びＰＥＴ造影剤が挙げられる。本発明に基づいた使用のための、適切な化学療法剤又は他の抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（ゲニステイン）、生物学的活性剤（ＴＮＦ、ｔＴＦ）、放射性核種（１３１Ｉ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、２１１Ａｔ、３２Ｐ、及びその他の既知の治療用放射性核種）、アドリアマイシン、アンサマイシン抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブシル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトテシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、ｍｅｐｌｈａｌａｎ、メトトレキサート、ラパマイシン（シロリムス）及び派生物、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド、及びｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍを含むが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明に基づいた使用のための、他の適切な化学療法剤は、代謝拮抗剤（例えば、アスパラギナーゼ）、抗有糸分裂剤（例えば、ビンカアルカロイド）、ＤＮＡ傷害剤（例えば、シスプラチン）、アポトーシス促進剤（プログラム細胞死又はアポトーシスを誘導する薬剤）（例えば、ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎ）、分化誘導剤（例えば、レチノイド）、抗生物質（例えば、ブレオマイシン）、及びホルモン（例えば、タモキシフェン、ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｂｅｓｔｒｏｌ）を含むが、これらに限定されない。更に、本発明に基づいた使用のための、適切な化学療法剤は、ＩＦＮ−ａｌｐｈａ、フマギリン、アンジオスタチン、エンドスタチン、サリドマイド等の、抗血管新生剤（血管新生阻害剤）を含む。Carmeliet and Jain (2000)によってリストされたものを含む、多くのその他の抗血管新生剤が同定されており、当該技術分野において公知である。抗血管新生剤は、天然に生じた又は人工的なものであり得る。いくつかの実施形態において、化学療法剤は抗血管新生合成ペプチドである。例えば、アポトーシス促進小分子合成ペプチドの抗血管新生活性は、２つの機能性領域を含み、１つは腫瘍の微小血管におけるＣＤ１３レセプター（アミノペプチダーゼＮ）を標的とし、もう一方は、内在化後にミトコンドリア膜を破壊することが、以前に報告されている。Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １９９９，  ５（９）：１０３２−８。その他の実施形態において、抗血管新生剤は、第２世代２量体ペプチド、ＣＮＧＲＣ−ＧＧ−ｄ（ＫＬＡＫＬＡＫ）２であり、ＨＫＰ（Ｈｕｎｔｅｒ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）と称され、改善した抗腫瘍活性を有することが見出された。特定の実施形態において、当業者はベバシズマブが本発明に従って使用され得ることも理解するであろうが、抗血管新生剤は抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブ等）以外である。
【００４２】
好ましい化学療法剤として、ドセタキセル、パクリタキセル、及びそれらの組み合わせが挙げられる。「それらの組み合わせ」は、１つより多くの薬（例えば、ドセタキセルとパクリタキセル）を含む剤形の投与、並びにドセタキセル及びパクリタキセルの連続的ではあるが時間的に異なる投与（例えば、１サイクルにおいてドセタキセルを使用し、次にパクリタキセルを使用する等）の両方のことをいう。特に好ましい化学療法剤は、タンパク質結合剤の粒子を含むものであって、該タンパク質結合剤の粒子を構成するタンパク質がアルブミンを含み、５０％を超える化学療法剤がナノ粒子形態であることを含む、タンパク質結合剤の粒子を包含するが、これに限定されない。最も好ましくは、化学療法剤は、例えばＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）等の、アルブミン結合パクリタキセルの粒子を含む。ｎａｂ−パクリタキセルと称される、そのようなアルブミン結合パクリタキセル製剤を、本発明に従って使用することができ、投与するパクリタキセルの用量は、約３０ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２で、約３週間の投与サイクルで（即ち、約３週間ごとに、パクリタキセル用量の投与）使用され得る。更に、投与するパクリタキセル用量は、約５０ｍｇ／ｍ２〜約８００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約８０ｍｇ／ｍ２〜約７００ｍｇ／ｍ２、及び最も好ましくは２５０ｍｇ／ｍ２〜約３００ｍｇ／ｍ２を、約３週間の投与サイクルで行うことが望ましい。
【００４３】
その他の治療剤は、生物学的に活性型であるポリペプチド、抗体及びその断片、レクチン、並びに毒素（リシンＡ等）、又は放射性核種も含むが、これらに限定されない。本発明に従う活性剤として使用するための、適切な抗体は、結合型（共役型）又は非結合型（非共役型）抗体、モノクローナル又はポリクローナル抗体、ヒト化又は非ヒト化抗体、及びＦａｂ′、Ｆａｂ、又はＦａｂ２断片、単鎖抗体等を含むが、これらに限定されない。予期される抗体又は抗体断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭのＦｃ断片であり得る。様々な好ましい実施形態において、活性剤は、抗体自体のＦｃ断片、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、二重特異性抗体等である。より好ましい実施形態において、抗体又は抗体断片は、補体活性化、細胞媒介性細胞傷害、オプソニン化、マスト細胞活性化、及び／又はその他の免疫反応を媒介する。
【００４４】
更に、医薬上の活性剤はｓｉＲＮＡであり得る。好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、例えば、ｃ−Ｓｉｓ及び他の成長因子、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、その他のレセプター型チロシンキナーゼ、Ｓｒｃファミリー遺伝子、Ｓｙｋ−ＺＡＰ−７０ファミリー遺伝子、ＢＴＫファミリー遺伝子、その他の細胞質型チロシンキナーゼ、Ｒａｆキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、その他の細胞質型セリン／スレオニンキナーゼ、Ｒａｓタンパク質及び他の制御性ＧＴＰａｓｅ等の腫瘍に関連した遺伝子の発現を阻害する。
【００４５】
ＳＰＡＲＣ結合抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合することもできる。ＰＥＧへの結合は、循環するタンパク質の半減期を増加し、タンパク質の免疫原性及び抗原性を減少し、並びに生物活性を改善し得る。例えば、メトキシ−ＰＥＧをＳＰＡＲＣ結合抗体の利用可能なアミノ基又は他の反応性部位（ヒスチジン又はシステイン等）と反応させることを含むが、これに限定されない、いかなる適切な結合法も使用され得る。更に、リコンビナントＤＮＡアプローチを使用し、ＰＥＧ−反応基を有するアミノ酸を本発明のＳＰＡＲＣ結合抗体へ付加することができる。ＳＰＡＲＣ結合抗体と反応させる前に、例えば、リンカー基をＰＥＧへ付加する等の処理をすることができる。更に、例えば、ＰＥＧ分子がＳＰＡＲＣ結合抗体の特定の部位へ付加され、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて遊離するようなＳＰＡＲＣ結合抗体のＰＥＧ化等、遊離可能な及び複合型ＰＥＧ化戦略を本発明に従って使用することができる。そのようなＰＥＧ結合法は当該分野において既知である（Greenwald et al., Adv. Drug Delivery Rev. 55:217-250 (2003)等を参照されたい）。
【００４６】
予期されるＳＰＡＲＣ結合抗体及びその複合体は、天然の形態又は塩の形態で組成物中へ調合され得る。医薬上許容される塩は、例えば、塩酸若しくはリン酸等の無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸とともに形成される、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）を含む。遊離カルボキシル基とともに形成される塩もまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化第二鉄等の無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基に由来し得る。
【００４７】
本発明の組成物は、通常、製剤中で医薬上許容される担体等の担体とともに提供される。通常、担体は液体であるが、固体、又は液体と固体成分の組み合わせでもあり得る。担体は、望ましくは、生理学的に許容可能な（例えば、医薬上又は薬理学上許容可能な）担体（例えば、賦形剤又は希釈剤）である。適切な医薬上の賦形剤は、安定化剤、抗酸化剤、浸透圧調節剤、緩衝剤、及びｐＨ調節剤を含む。適切な添加剤は、生理学的に生体適合性である緩衝剤、キレート若しくはカルシウムキレート複合体の添加、又は、任意で、カルシウム塩若しくはナトリウム塩の添加を含む。医薬組成物は、液体の形態で又は凍結乾燥形態で梱包され得る。好ましい生理学的に許容される担体の媒体は、水、緩衝水、生理食塩水、０．４％塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。生理学的に許容される担体は周知であり、容易に利用できる。担体の選択は、少なくとも部分的には、標的となる組織及び／又は細胞の部位、並びに組成物を投与するのに使用される特定の方法により決定されるであろう。
【００４８】
上記組成物は、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、局所的、経皮的、皮下、経粘膜的（例えば、肺内を含む）、鼻腔内、直腸内、腟内、又は経口を含む経路による投与のために調合し得る。該組成物は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、保存剤、及びｐＨ調節剤等の追加の成分も含み得る。
【００４９】
注入投与可能な適切な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を対象レシピエントの血液と等張にする溶質、を含み得る、水性及び非水性の、等張で無菌の注入溶液、並びに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、リオプロテクタント（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、及び保存剤を含み得る、水性及び非水性の、無菌の懸濁液を包含する。該製剤は、単回用量又は複数回用量で、アンプル及びバイアル等の密封した容器で提供することができ、注入による使用直前に、例えば、水等の無菌の液体担体の添加のみを必要とする、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）状態で保存することができる。即時調製の注入溶液及び懸濁液を、無菌の粉末、顆粒、又は錠剤から調製し得る。
【００５０】
活性化合物を必要量、適切な溶媒中に、必要に応じて上記成分の１つ又は組み合わせと共に組み入れ、その後フィルターで滅菌することで、無菌の注入可能な溶液を調製することができる。好ましくは、注入用の溶液はエンドトキシンフリーである。一般的に、分散液は、基礎分散媒及び上記の必要な他の成分を含む、無菌の媒体へ活性化合物を取り込むことにより調製される。無菌の注入可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合、好ましい調製法は、先にフィルター滅菌した溶液から、活性成分と任意の付加的な所望の成分の粉末を産生する、バキューム乾燥及び凍結乾燥である。全ての場合において、製剤は無菌でなければならず、容易に注入できる程度に流動的でなければならない。該製剤は製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の混入に対し保護されなければならない。遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩としての、活性化合物の溶液は、ヒドロキシセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）等の界面活性剤と適切に混合された水中に調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐ保存剤を含む。
【００５１】
好ましい実施形態において、活性成分は、コロイド性ドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョン（ｍａｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）において、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ）マイクロカプセル）、調製されるマイクロカプセル内に封入することができる。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)において開示されている。具体的には、ＳＰＡＲＣ結合抗体を含むリポソームを、Rezler et al., J. Am. Chem. Soc. 129(16): 4961-72 (2007)；Samad et al., Curr. Drug Deliv. 4(4): 297-305 (2007)；並びに米国特許番号4,485,045及び4,544,545に記載されているような方法により調製することができる。亢進した循環時間を有するリポソームは、米国特許番号5,013,556に開示されている。
【００５２】
特に有用なリポソームは、例えば、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた、逆相蒸発法により産生し得る。所望の直径を有するリポソームを産生するために、リポソームを既定のポアサイズのフィルターに通す。本発明のポリペプチドは、Werle et al., Int. J. Pharm. 370(1-2): 26-32 (2009)に記載のように、リポソームへ結合することができる。
【００５３】
その他の実施形態において、天然のウイルス若しくはウイルス様粒子、デンドリマー、ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｙ、ポリマー担体、常磁性粒子、強磁性粒子、ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ、ｆｉｌｏｍｉｃｅｌｌｅ、ミセル、又はリポタンパク質を使用して、組成物を送達し得る。
【００５４】
気道への投与は、全身性の投与、又は気管及び／若しくは肺等への局所的投与のいずれかを提供し得る。そのような投与は、エアロゾル、溶液、気管支鏡等の機器を使用して、吸入を介して又は物理的な塗布を介して行い得る。吸入のために、本明細書に記載の組成物は、吸入器、噴霧器、ポンプ、加圧パック、又は粉末のエアロゾル、非エアロゾルスプレー、若しくは液体の非エアロゾルスプレーを送達するその他の有用な方法で、有用に送達される。加圧パックは、液化ガス又は圧縮ガス等の適切な推進剤を含み得る。液化ガスとして、例えば、フッ化塩化炭化水素、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロカーボン（hydrochlorocarbon）、炭化水素、ヒドロカーボンエーテル（hydrocarbon ether）が挙げられる。圧縮ガスとして、例えば、窒素、亜酸化窒素、及び二酸化炭素が挙げられる。特に、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又はその他の適切なガスの使用が予期される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、制御された量を送達するためのバルブを提供することにより決定できる。乾燥粉末組成物の投与において、粉末混合物は、ラクトース又はデンプン等の適切な粉末ベースを含み得る。粉末組成物は、例えば、カプセル、薬包、ブリスター包装といった、吸入具又は吸入器を利用して粉末を投与可能である、単位投与形態であり得る。
【００５５】
全身性の投与も経粘膜又は経皮の方法であり得る。経粘膜又は経皮投与については、浸透に対する障壁への適切な浸透剤を、製剤中で使用する。該浸透剤は当該技術分野で公知であり、例として、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸派生物が挙げられる。経粘膜投与は、スプレー式点鼻薬、吸入エアロゾル、直腸坐薬若しくは膣坐薬、洗口剤、即溶解性錠剤、又はトローチ剤の使用を介して成し得る。経皮投与については、活性化合物は、当該技術分野において公知であるように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、泡状、又はクリームへと調合される。
【００５６】
上記医薬組成物はドラッグデリバリーシステムを使用して送達することができる。該デリバリーシステムは、ヒアルロン酸溶液又はコラーゲン断片の懸濁液を含む。薬剤はマイクロカプセル中に調合することができ、ポリ乳酸、エチルヒドロキシセルロース（ｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリカプロラクトン、ポリカプロラクトンジオール、ポリリジン、ポリグリコール酸、ポリマレイン酸、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド］等の、適切な重合体物質を用いて放出を制御するよう設計され得る。ドラッグデリバリーシステムを使用した特定の製剤は、液体懸濁液、軟膏、包帯との複合物、コラーゲン保護剤等の形態であり得る。
【００５７】
上記組成物は、特に組成物の安定性及び／又はその最終用途を亢進するために、いかなる他の適切な成分も更に含み得る。従って、本発明の組成物について、多種多様な適切な製剤が存在する。
【００５８】
例えば、米国特許番号5,672,659及び5,595,760に記載されているような、組成物の持続した放出も、本明細書に記載の組成物に使用され得る。即時の又は持続した組成物の放出の使用は、治療される状態の性質に依存する。該状態が急性の又は超急性の障害からなる場合、長期の組成物放出よりも、即時の放出形態での治療が好ましいであろう。或いは、特定の予防的治療又は長期治療については、持続した組成物の放出が適切であり得る。
【００５９】
更に、上記組成物は、さらなる治療上の又は生物学的な活性剤を含み得る。例えば、特定の適応症の治療に有用な治療上の因子が存在し得る。イブプロフェン又はステロイド等の炎症を制御する因子が、医薬組成物のｉｎ  ｖｉｖｏ投与及び生理学的困難性に関連した、腫れや炎症を減少させるために、該組成物の一部であり得る。
【００６０】
本発明により提供される組成物は、例えば、約０．５ｍＬ〜約４ｍＬの水性又は有機液体であって、ＳＰＡＲＣ結合抗体と共役した活性剤を有し、活性剤の濃度が約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬであることを含み得る。該活性剤は、いかなる適切な及び治療上有効な濃度でも存在し得る（例えば、ベバシズマブは約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で）。
【００６１】
方法
本発明は、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、ｍＨＴＩ、ｈＨＴＩ、又はそれらの組み合わせを含む、ＳＰＡＲＣ結合抗体を包含する組成物の、診断上又は治療上有効量を投与することによる、動物における疾患を診断する又は治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、ｍＨＴＩ、ｈＨＴＩ、又はそれらの組み合わせの有効量を投与することによる、動物における疾患を診断するための方法を提供する。その他の実施形態において、本発明は、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、ｍＨＴＩ、ｈＨＴＩ、又はそれらの組み合わせの有効量を投与することによる、動物における疾患を治療するための方法を提供する。上記の任意の組成物が、本発明の方法において使用され得る。
【００６２】
本発明の方法に基づいて、治療上有効量の組成物を、活性剤のみでの送達よりも、病変部への活性剤の送達を亢進するために、又は、排除を亢進することでＳＰＡＲＣの血中レベルの減少をもたらすために、哺乳動物に対して投与し得る。好ましい実施形態において、ＳＰＡＲＣの血中レベルにおける減少は、少なくとも約１０％である。より好ましい実施形態において、ＳＰＡＲＣの血中レベルにおける減少は、少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は、最も好ましくは、少なくとも約５０％である。
【００６３】
本発明は、動物における疾患又は状態を診断する方法も提供し、それは以下を含む：（ａ）Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、ｍＨＴＩ、ｈＨＴＩ、又はそれらの組み合わせを含むＳＰＡＲＣ結合抗体の診断上有効量を動物に投与すること；（ｂ）動物の特定の部位又は組織に存在するＳＰＡＲＣ結合抗体の量を検出すること；並びに（ｃ）特定の部位又は組織において、存在するＳＰＡＲＣ結合抗体の量が、正常レベルのＳＰＡＲＣを有意に超えて存在していることを示した場合に、前記疾患又は状態が存在すると診断すること。
【００６４】
同様に、本発明は、１つ以上の抗癌剤及びＳＰＡＲＣ結合抗体で、動物における腫瘍を治療する方法を更に提供し、それは以下を含む：動物から生物サンプルを単離すること、該生物サンプルにおけるＳＰＡＲＣタンパク質の発現を検出すること、該生物サンプルにおけるＳＰＡＲＣタンパク質を定量すること、該生物サンプルにおけるＳＰＡＲＣタンパク質が閾値レベルを超えて存在した場合に、治療有効量の抗癌剤及び治療有効量の抗ＳＰＡＲＣ抗体を投与すること、又はＳＰＡＲＣタンパク質が閾値レベルを下回って存在した場合に、治療有効量の抗癌剤を投与し、ＳＰＡＲＣ結合抗体を投与しないこと。
【００６５】
サンプル中に存在するＳＰＡＲＣタンパク質のレベルは、通常、抗ＳＰＡＲＣ抗体を使用して検出する。しかしながら、いくつかの実施形態において、ＳＰＡＲＣタンパク質の発現は、抗体の一部のみを使用して、抗体ではないＳＰＡＲＣ結合分子を使用して、又は、抗体若しくはＳＰＡＲＣ結合分子を必要としない、ＳＰＡＲＣ発現を検出するいくつかの他の方法を使用して、決定し得る。
【００６６】
上記方法は、ＳＰＡＲＣの過剰発現により特徴付けられる、いかなる状態においても使用し得る。本発明が有用である典型的な疾患は、軟組織、結合組織、骨、固形臓器、血管等を含む、任意の体の組織における、増殖、組織再構築、過形成、過剰創傷治癒の異常な状態を含む。本発明の方法及び組成物を使用して、治療可能な又は診断される疾患の例として、癌、糖尿病性又はその他の網膜症、炎症、関節炎、血管、若しくは人工血管移植片、若しくは血管内装置における再狭窄等が挙げられる。
【００６７】
本発明の方法の範囲内のその他の疾患は、癌、再狭窄、若しくは他の増殖性疾患、線維症、骨粗鬆症、又は過剰創傷治癒を含むが、これらに限定されない。具体的には、そのような適切な疾患は以下を含むが、これに限定されない：（ａ）癌は、例えば、上皮内癌、非定型過形成、カルシノーマ、肉腫、癌肉腫、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、血液腫瘍、乳癌、脳癌、結腸癌、膀胱癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭部及び頸部の癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、白血病、リンパ腫、口腔癌、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌であり得、（ｂ）再狭窄は、例えば、冠動脈再狭窄、大脳動脈再狭窄、頸動脈再狭窄、腎動脈再狭窄、大腿動脈再狭窄、末梢動脈再狭窄、又はこれらの組み合わせであり得、（ｃ）その他の増殖性疾患は、例えば、過形成、子宮内膜症、肥厚性瘢痕及びケロイド、増殖性糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、増殖性、肺高血圧症、関節リウマチ、動静脈奇形、動脈硬化プラーク、冠動脈疾患、遅延性創傷治癒、血友病性関節、偽関節骨折、Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ症候群、乾癬、化膿性肉芽腫、強皮症、ｔｒａｃｏｍａ、月経過多、血管接着、及び乳頭腫であり得、並びに（ｄ）線維症疾患は、例えば、肝線維症、肺線維症、及び後腹膜線維症であり得る。
【００６８】
上記動物は、治療又は診断を必要とする、いかなる患者又は対象でもあり得る。好ましい実施形態において、該動物は哺乳動物である。特に好ましい実施形態において、該動物はヒトである。その他の実施形態において、該動物は、マウス、ラット、ラビット、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、又は非ヒト霊長類であり得る。
【００６９】
本発明は、例えば、適切なＳＰＡＲＣ結合抗体等の、ＳＰＡＲＣに対する中和抗体を使用して、ＳＰＡＲＣの活性を阻害する方法も提供する。中和抗体は、ＳＰＡＲＣとそのｉｎ  ｖｉｖｏでのエフェクターとの相互作用を遮断する性能を有し、例えばそれは、ＳＰＡＲＣと細胞表面構成成分との相互作用であるか、又はアルブミン、成長因子、及びＣａ２＋等のＳＰＡＲＣの天然のリガンドへのＳＰＡＲＣの結合である。本発明は、化学療法剤を哺乳動物における腫瘍へ送達する方法を提供する。該方法は、ヒト又はその他の動物へ、治療有効量の医薬組成物を投与することを含み、該医薬組成物は、適切なＳＰＡＲＣ結合抗体及び医薬上許容される担体へ共役した、化学療法剤を含む。本発明のその他の実施形態と関連して本明細書に記載された、化学療法剤、動物、及びそれらの構成成分の記述は、化学療法剤を腫瘍へ送達する前記方法の同じ態様へ適用することもできる。
【００７０】
本発明に基づいて治療することが可能であり、化学療法への反応が予測又は決定可能な、検出される腫瘍のタイプは、一般にヒトやその他の哺乳動物に見られるものである。該腫瘍は、実験動物等における接種の結果でもあり得る。多くのタイプ及び形態の腫瘍が、ヒト及びその他の動物の状態において見られ、いかなる特定の腫瘍タイプ又は種類に対しても、本発明の方法の適用を制限することは意図しない。周知なように、腫瘍は、制御されない及び進行性の細胞分裂がもたらす、異常な組織塊を含み、一般に、「新生物」としても知られている。本発明の方法は、例えばヒトにおける、腫瘍細胞及び付随のストローマ細胞、固形腫瘍及び軟組織肉腫等の軟組織に関する腫瘍、に対して有用である。
【００７１】
腫瘍又は癌は、口腔及び咽頭、消化器系、呼吸器系、骨及び関節（例えば、骨転移）、軟組織、皮膚（例えば、メラノーマ）、乳房、生殖器系、泌尿器系、眼及び眼窩、脳及び中枢神経系（例えば、神経膠腫）、又は内分泌系（例えば、甲状腺）に位置する可能性があり、必ずしも原発性腫瘍又は癌に限定されない。口腔に関連する組織として、舌及び口の組織が挙げられるが、これに限定されない。癌は、例えば、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、及び膵臓を含む消化器系の組織において生じ得る。呼吸器系の癌は、喉頭、肺、及び気管支で発症する可能性があり、例えば、小細胞及び非小細胞肺癌を含む。腫瘍は、雄性及び雌性生殖器系を構成する、子宮頸部、子宮体部、卵巣外陰部、腟、前立腺、精巣、及び陰茎、並びに、泌尿器系に含まれる、膀胱、腎臓、腎盂、及び尿管において生じ得る。腫瘍又は癌は、頭部及び／又は頸部に位置し得る（例えば、咽頭癌及び副甲状腺癌）。腫瘍又は癌は、造血系又はリンパ系においても位置する可能性があり、例えば、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、又は白血病（例えば、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病等）を含む。好ましくは、腫瘍は、膀胱、肝臓、卵巣、腎臓、腸、脳、又は乳房に位置するものである。
【００７２】
その他の実施形態において、本発明は、ＳＰＡＲＣ結合抗体を用いて、ＳＰＡＲＣの過剰発現で特徴付けられる疾患部へ、医薬活性剤を送達する方法を提供する。該疾患は、体組織における、増殖、組織再構築、過形成、及び過剰創傷治癒の異常な状態を含む（例えば、軟組織、結合組織、骨、固形臓器、血管等）。適切なＳＰＡＲＣ抗体と共役した治療剤を含む医薬組成物を投与することにより、治療可能な又は診断可能な疾患の例として、癌、糖尿病性又はその他の網膜症、炎症、関節炎や、血管、人工血管移植片、若しくは血管内装置における再狭窄等が挙げられる。本発明のその他の実施形態と関連して本明細書に記載された、化学療法剤、腫瘍、動物、及びそれらの構成成分の記述は、医薬活性剤を送達する前記方法の同じ態様へ適用することもできる。
【００７３】
その他の実施形態において、本発明の方法は、リポソーム又はアルブミンが、適切な疾患を標的とするＳＰＡＲＣ結合抗体と共役する、リポソーム結合型又はアルブミン結合型化学療法剤を含む、医薬組成物の治療有効量を哺乳動物へ投与することを包含する。該化学療法剤は、いかなる適切な方法を使用しても、ＳＰＡＲＣ結合抗体へと共役し得る。好ましくは、該化学療法剤は、例えばジスルフィド結合を含む、共有結合を介して化合物へ化学的に共役している。
【００７４】
上述したもの等の、１以上の化学療法剤の１通り以上の用量もまた、本発明の方法に従い投与することができる。本発明の方法で使用される化学療法剤の種類及び数は、特定の腫瘍タイプについての標準的な化学療法レジメンに依存するであろう。換言すれば、特定の癌は単一の化学療法剤を用いて日常的に治療され得るが、別の癌は化学療法剤の組み合わせを用いて日常的に治療され得る。適切な治療剤、化学療法剤、放射性核種等を、抗体若しくはその断片へ共役する又は結合する方法は、当該技術分野において周知である。以下の例は、本発明を更に説明するが、当然のことながら、いかなる点においても本発明の範囲を限定すると解釈すべきでない。
【００７５】
本発明に基づく方法として、例えば、動物が、手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、免疫療法、ホルモン療法、及びレーザー療法からなる群より選択される、１以上の癌療法も受けている、併用療法が挙げられる。用語「併用投与」及び「併用療法」は、対象に２以上の治療活性剤を投与することをいう。前記の剤は、単一の医薬組成物に含有し、同時に投与することができ、又は、前記の剤は、別々の製剤に含有し、連続的に対象へ投与することができる。２つの剤が、対象において同時に検出される限り、該２つの剤は併用投与されたといえる。
【００７６】
本発明において予期される併用療法は、抗体投与、ワクチン投与、細胞傷害性薬剤の投与、天然のアミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチドアナログ、及び生物反応修飾因子を含むが、これらに限定されない。２以上の組み合わされた化合物を共に、又は連続的に使用し得る。化学療法剤の例として、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然物、ホルモン及び拮抗剤、並びに種々の剤が挙げられる。アルキル化剤の例として、メクロレタミン、シクロフォスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリジン）、及びクロラムブシル等のナイトロジェンマスタード；ヘキサメチルメラミン及びチオテパ等のエチレンイミン及びメチルメラミン；ブスルファン等のアルキルスルホン酸；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、及びストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）等のニトロソウレア；リン酸エストラムスチン等のＤＮＡ合成拮抗剤；及びダカルバジン（ＤＴＩＣ、ジメチル−トリアゼノイミダゾールカルボキサミド）並びにテモゾロミド等のトリアジンが挙げられる。代謝拮抗剤の例として、メトトレキサート（アメトプテリン）等の葉酸類似体；フルオロウラシン（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｎ）（５−フルオロウラシル、５−ＦＵ、５ＦＵ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン、ＦＵｄＲ）、シタラビン（シトシンアラビノシド）、及びゲムシタビン等のピリミジン類似体；メルカプトプリン（６−ｎｉｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ、６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン、ＴＧ）及びペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン、デオキシコホルマイシン）、クラドリビン及びフルダラビン等のプリン類似体；並びにアムサクリン等のトポイソメラーゼ阻害剤が挙げられる。天然物の例として、ビンブラスチン（ＶＬＢ）及びビンクリスチン等のビンカアルカロイド；パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））及びドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））等のタキサン；エトポシド及びテニポシド等のエピポドフィロトキシン；トポテカン及びイリノテカン等のカンプトテシン；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン（マイトマイシンＣ）、イダルビシン、エピルビシン等の抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼ等の酵素；並びにインターフェロンα及びインターロイキン２等の生物学的応答調節物質が挙げられる。ホルモン及び拮抗剤の例として、ブセレリン等の黄体ホルモン放出ホルモン作用物質；プレドニゾン及び関連製剤等の副腎皮質ステロイド；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロール等のプロゲスチン；ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等のエストロゲン及び関連製剤；タモキシフェン及びアナストロゾール等のエストロゲン拮抗剤；プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン等のアンドロゲン及び関連製剤；フルタミド及びビカルタミド等のアンドロゲン拮抗剤；並びにリュープロリド等の性腺刺激ホルモン放出ホルモン類似体が挙げられる。種々の剤の例として、サリドマイド；シスプラチン（ｃ���ｓ−ＤＤＰ）、オキサリプラチン及びカルボプラチン等の白金配位錯体；ミトキサントロン等のアントラセンジオン；ヒドロキシウレア等の置換尿素；プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）等のメチルヒドラジン誘導体；ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミド等の副腎皮質抑制剤；ベキサロテン等のＲＸＲ作用物質；並びにイマチニブ等のチロシンキナーゼ阻害剤が挙げられる。
【００７７】
本発明の方法において特徴付けられる組成物は、単回又は複数回投与し得る。抗体の投与が注入による場合、該注入は単回の持続的投与であり得、又は複数回注入により送達し得る。薬剤の注入は、組織の異常な標的遺伝子発現がある部位に、又はその近辺に直接行うことができる。薬剤の複数回注入は、組織の該部位に、又はその近辺に行うことができる。
【００７８】
用量のレベルは、１投与当り約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）のオーダーが、疾患の治療に有用である。用量に関して、抗体は、体重１ｋｇ当り約７５ｍｇ未満の単位用量で、又は体重１ｋｇ当り約７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、若しくは０．０００５ｍｇ未満で、及び体重１ｋｇ当り２００ｎｍｏｌ未満の抗体、又は体重１ｋｇ当り１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎｍｏｌ未満の抗体を投与することができる。該単位用量は、例えば、注入（例えば、静脈内若しくは筋肉内、髄腔内、又は臓器に直接）、吸入、又は局所投与によって、投与することができる。
【００７９】
当業者は、本発明の抗体を対象者へ投与するための、適切な投与レジメンを容易に決定することも可能である。例えば、ＳＰＡＲＣ発現部位へ、又はその近辺に、単回の注入又は沈着として、ＳＰＡＲＣ結合抗体組成物を対象へ１回投与することが可能である。本発明の組成物は、毎日、週２回、週１回、２週に１回、月２回、月１回、２月に１回、又は臨床医の裁量で投与することができる。いくつかの実施形態において、該組成物は対象に１日１回又は２回、約３〜約２８日間、より好ましくは、約７〜約１０日間投与される。更なる実施形態において、単位用量が１日１回よりも少ない頻度で、例えば、２、４、８、又は３０日ごとよりも少ない頻度で投与される。その他の実施形態において、単位用量はある頻度では投与されない（例えば、定期的な頻度ではない）。
【００８０】
投与レジメンが複数回投与を含む場合、対象に投与されるＳＰＡＲＣ結合抗体組成物の有効量は、投与レジメン全体に渡って投与される抗体の総量を含み得ると理解される。投与している特定のＳＰＡＲＣ結合抗体組成物、投与の時間、投与の経路、製剤の性質、排出率、治療する特定の疾患、疾患の重症度、オリゴヌクレオチド剤の薬物動力学、並びに患者の年齢、性別、体重、及び全体的な健康状態を含む、様々な因子も多少ならず考慮して、正確な個別の投与量を調節し得ることは、当業者に理解されるであろう。必要な投与量レベルの広範なバリエーションは、投与の様々な経路の異なる効率を考慮して、予期されるべきである。
【００８１】
特定の状況下で望ましい又は適切であるとみなされた場合、有効量を単用量で、又は２回以上の用量で投与することができる。繰り返しの又は頻繁な注入を促すことが望ましい場合、例えば、ポンプ、半透性のステント（例えば、静脈内、腹腔内、嚢内、又は関節内）、又はリザーバー等の、送達装置の移植が望ましくあり得る。成功裏の治療の後、患者に維持治療を受けさせて、疾患状態の再発を防ぐことが望ましくあり得る。抗体組成物の濃度は、疾患を治療する又は予防するのに効果的であるための十分量、又はヒトにおいて生理学的状態を制御するのに十分な量である。投与する抗体の濃度又は量は、薬剤に対して決定したパラメーター、及び投与方法に依存するであろう。
【００８２】
疾患又は障害の重症度、先の治療、全体的な健康状態及び／又は対象の年齢、並びに罹患している他の疾患を含む（がこれらに限定されない）、特定の因子が、対象を効果的に治療するのに求められる投与量へ影響し得る。治療に使用される抗体の有効量は、特定の治療の経過に渡って増加又は減少し得ることも理解されるであろう。投与量の変化は、診断の分析結果からもたらされ、明らかになる可能性がある。例えば、抗体組成物を投与した後、対象者をモニターすることができる。モニタリングの情報に基づいて、抗体組成物の追加量を投与することができる。当業者は、最適投与量、投与の方法論、及び反復する割合を容易に決定することができる。
【実施例】
【００８３】
実施例１
本実施例は、ヒトＳＰＡＲＣに結合することのできる、一連の抗体の調製を明示する。
【００８４】
マウス系統、ＲＢＦ／ＤｎＪ、を使用して、マウス由来の１２の抗ヒトＳＰＡＲＣ抗体が、従来のハイブリドーマアプローチで市販品として産生された。
【００８５】
ｐＡＳＫ８４発現ベクター（図１）を使用し、Ｉｍｍ１からＩｍｍ１２と名付けられた、結果物である抗体の、Ｆａｂ領域を発現した。Ｆａｂ領域をペリプラズムに標的化してそこで回収した後、プロテインＡセファロースカラム上の活性クロマトグラフィーを介して精製した。アイデンティティ（identity）をウェスタンブロットで検証し、ＳＰＡＲＣ結合活性をＥＬＩＳＡで検証した。
【００８６】
Ｉｍｍ１３及びＩｍｍ１４は、ヒトファージディスプレイライブラリーを使用して産生された、完全ヒト抗ヒトＳＰＡＲＣ抗体である。ＳＰＡＲＣを市販のヒトＦａｂファージディスプレイライブラリー、ＨｕＦａｂＬ（登録商標）（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｓｈｉｒｌｅｙ，  ＮＹ）に対してパニングした。２つの目的のＦａｂ配列を同定した：図２に示されている、Ｆａｂ６（配列番号１５）及びＦａｂ１６（配列番号１６）。これら２つのＦａｂ分子について、ＳＰＡＲＣ結合活性をＥＬＩＳＡにより検証した。
【００８７】
これらＦａｂ領域をｐＢＡＤベクター（図３）へクローニングし、細菌内で発現し精製した。ｐＢＡＤベクターにより発現したＦａｂタンパク質を、溶解した細菌のペリプラズムの画分より単離した（図４に配列を提供する）。ペリプラズム画分から得られたＦａｂ領域のアイデンティティを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検証した。Ｆａｂタンパク質は、プロテインＡセファロースカラム上の活性クロマトグラフィーを介して精製し、均一物とした。
【００８８】
完全ヒトのＳＰＡＲＣ結合抗体を創製するために、Ｆａｂ６及びＦａｂ１６の遺伝子をクローニングし、ｐｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を介して発現した（図５）。結果物である抗体を精製し、そのアイデンティティをゲル電気泳動及びＮ末端解析により検証した。Ｆａｂ６から創製した完全ヒト抗体をＩｍｍ１３と指名し、Ｆａｂ１６から創製した完全ヒト抗体をＩｍｍ１４と指名した。
【００８９】
前述の方法に従って上記抗体を産生した後、市販のマウスアイソタイプ試験キット（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ，  Ｒａｌｅｉｇｈ，  ＮＣ）を使用して、Ｉｍｍ１からＩｍｍ１４の抗体のアイソタイプに基づいて特徴を明らかにした。その結果を表１に示す。
【００９０】
【表１】
2013530165.tif 000003
【００９１】
Ｉｍｍ１２を含む選択した一連のＩｍｍ抗体についての、可変相補性決定領域の配列を、図６に示す。Ｉｍｍ１からＩｍｍ１４の表１のクローンは、ＡＴＣＣ等の適切な保管機関へ預けられるであろう。
【００９２】
実施例２
本実施例は、一連のＩｍｍ抗体のＳＰＡＲＣ結合の特徴を明らかにするために、ＥＬＩＳＡアッセイの使用を示す。
【００９３】
Ｉｍｍ１からＩｍｍ１２（マウス由来抗ヒトＳＰＡＲＣ抗体）のリコンビナントヒトＳＰＡＲＣ（Ｂｉｏ１−ＳＰＡＲＣ）への結合能を、精製の様々な段階で行った、複数のＥＬＩＳＡ解析により明らかにした。図７は、精製前の抗体上清の段階希釈（１：１、１：１０、及び１：１００）において行った、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。本アッセイにおいて、Ｉｍｍ４、Ｉｍｍ６、Ｉｍｍ９、Ｉｍｍ１０、及びＩｍｍ１２は最も強いＢｉｏ１−ＳＰＡＲＣ結合を示し、Ｉｍｍ１２が全体で最も強い結合を示した。精製した抗体を用いて、０．０４μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、及び５μｇ／ｍＬの濃度で、別のＥＬＩＳＡアッセイを行った（図８）。精製した抗体の結合は、大抵の場合、未精製の上清よりも改善した。本アッセイにおいて、Ｉｍｍ４、Ｉｍｍ９、Ｉｍｍ１１及びＩｍｍ１２が最も強いＢｉｏ１−ＳＰＡＲＣ結合を示した。更にＥＬＩＳＡを行い、マウス由来の一連のＩｍｍ抗体の、２つの異なる種類のＳＰＡＲＣに対する結合を比較した：Ｂｉｏ１−ＳＰＡＲＣ、及びヒト血小板ＳＰＡＲＣ（ＨＴＩ−ＳＰＡＲＣ）（図９）。本アッセイにおいて、Ｉｍｍ４及びＩｍｍ９の双方は、ＨＴＩ−ＳＰＡＲＣよりもＢｉｏ１−ＳＰＡＲＣへ有意に結合することを見出した。Ｉｍｍ１１及びＩｍｍ１２は、両種のヒトＳＰＡＲＣに同等によく結合する。
【００９４】
ＥＬＩＳＡアッセイは、完全ヒト型ＳＰＡＲＣ結合抗体、Ｉｍｍ１３及びＩｍｍ１４のＳＰＡＲＣ結合の特徴を明らかにするためにも使用した。例えば、タンパク質ＥＬＩＳＡアッセイ（図１０）によれば、Ｆａｂ１６（Ｉｍｍ１４のＦａｂ領域）はＨＴＩ−ＳＰＡＲＣと１１ｎＭのＫＤで結合し、Ｂｉｏ１−  ＳＰＡＲＣと７ｎＭのＫＤで結合する。Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（登録商標）（ＧＥ／Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で行った、表面プラズモン共鳴結合アッセイにより、センサーチップ上に固定された両種のＳＰＡＲＣに対する、Ｆａｂ１６の結合を試験した（図１１及び１２）。本アッセイにより、ＨＴＩ  ＳＰＡＲＣに対するＫＤ値が７６．２ｎＭであり、Ｂｉｏ１−ＳＰＡＲＣに対するＫＤ値が１３２ｎＭであるという結果が得られた。
【００９５】
また、選択したマウス由来の抗ヒトＳＰＡＲＣ抗体、Ｉｍｍ１１及びＩｍｍ１２のＳＰＡＲＣ結合能と、完全ヒト型Ｉｍｍ１３及びＩｍｍ１４の結合能を直接比較するために、ＥＬＩＳＡを行い、その結果を図１３に示す。該結果は、Ｉｍｍ１３はＳＰＡＲＣに対して、マウス由来の両抗体よりも高い親和性を有し、一方、Ｉｍｍ１４はより低い親和性を有することを示している。
【００９６】
本実施例は、特定の一連のＩｍｍ抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合アッセイにおいて、リコンビナントヒトＳＰＡＲＣ及びヒト血小板ＳＰＡＲＣの両方に結合することを明示している。
【００９７】
実施例３
本実施例は、一連のＩｍｍ抗体が結合するエピトープの解析を示す。
【００９８】
ウェスタンブロッティングを使用し、一連のＩｍｍ抗体が直鎖の又は立体構造のエピトープへ結合するかを決定した。本解析において、ＳＰＡＲＣタンパク質を、ＳＤＳ存在下のポリアクリルアミドゲルで泳動した。従って、ゲル上のＳＰＡＲＣタンパク質は変性形態であった。一連のＩｍｍ抗体を一次抗体として使用し、その後、ゴート抗マウスＩｇＧでプローブした。ＢＳＡをネガティブコントロールとして使用した。図１４に示されている、アッセイの結果は、Ｉｍｍ１１及びＩｍｍ１２はＳＰＡＲＣへ結合するが、一方で、Ｉｍｍ１からＩｍｍ１１は変性したＳＰＡＲＣへ結合しないことを示す。続いての試験において、Ｉｍｍ１４及びｍＨＴＩが、変性したＳＰＡＲＣへ結合することも見出した（データは示していない）。
【００９９】
これらの結果は、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、及びｍＨＴＩが、直鎖状又は第一次のエピトープに基づいてＳＰＡＲＣに結合することができることを示している。
【０１００】
実施例４
本実施例では、ＬＬ／２ルイス肺癌に曝露されたヌードマウスの生存率に対する、特定の抗体の効果を調べるための、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの結果を議論する。
【０１０１】
Ｃ５７ＢＬのオスマウス（およそ６週齢）を計量し、その後、静脈内に約１ｘ１０６細胞（約０．１ｍＬ）のＬＬ／２（ルイス肺癌）を２５ゲージの針を用いて注入した。１群当り、最低１０匹の動物を使用した。全ての群の各動物は、週２回を４週間、２００μｇ／マウスの試験抗体又はマウスＩｇＧを受けた。これらの試験用物品／抗体は、腹腔内注入を介して腹膜腔へ２５〜２７ゲージの針を用いて投与した。最初の投与は、腫瘍細胞注入後３０分以内に行った。
【０１０２】
腫瘍細胞注入の前に動物を計量し、週２回、投与前に計量した。生死／病的状態について、全ての動物を１日２回調べた。実験の終了時に、マウスを殺し、原発性腫瘍及び肺を摘出し、固定し、包埋した。安楽死した動物及び死後硬直前の死亡しているいかなる動物についても、剖検を行った。全ての動物から血漿及び肺を回収し、終了時点で計量した。肺に１０％中性緩衝ホルマリンを注入し、その後該溶液に浸した。組織は、追加の肉眼による及び病理組織学的な解析のために保存した。
【０１０３】
動物にｍＨＴＩ、Ｉｍｍ１２、又はＩｍｍ１４のいずれかを投与した。ネガティブコントロール群にはｍＩｇＧを投与した。該抗体はＰＢＳ中に調合し、２００μｇ／マウスの用量で、週２回、４週間投与した。その後、動物の生存率を２０日間に渡り記録した。
【０１０４】
ｍＨＴＩで治療した動物は、Ｉｍｍ１２又はＩｍｍ１４で治療した動物よりも、様々な時点で、より高いパーセンテージで生存した。図１５に示されるように、ｍＨＴＩのみが、マウスにおける肺転移を阻害するのに有効であった（マウスコントロールＩｇＧに対してｐ＝０．０２；ｌｏｇランク統計量）。予期したように、マウスＳＰＡＲＣは認識しないがヒトＳＰＡＲＣは認識する、Ｉｍｍ１２及びＩｍｍ１４は、肺のＬＬ／２転移を阻害しなかった。図１６に示されるように、Ｉｍｍ１２及びＩｍｍ１４は、ヒトＳＰＡＲＣに特異的に結合するが、マウスＳＰＡＲＣには結合せず、一方で、ｍＨＴＩはマウス及びヒトＳＰＡＲＣの両方に結合することができる。
【０１０５】
これらの結果は、ｍＨＴＩによるマウスＳＰＡＲＣの特異的な阻害は、マウスにおける同系ＬＬ／２細胞のコロニー形成及び／又は増殖の阻害をもたらし、ｍＨＴＩ、又はそのヒト化バージョンが、癌治療において有用であり得ることを示している。
【０１０６】
実施例５
本実施例は、切除不能なステージＩＶの悪性メラノーマを有する患者において、カルボプラチン及びｎａｂ−パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）、ＡＢＩ−００７とも称される）の組み合わせの、抗腫瘍活性及び安全特性を評価するための、２つの並行したフェーズＩＩ臨床試験（コホート）からなる研究について述べる。
【０１０７】
コホート１は、以前に化学療法で治療した患者からなり、コホート２は、新たに診断された及び化学療法を受けていない患者からなる。
【０１０８】
本明細書に記載のデータは、Ｎｏｒｔｈ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｇｒｏｕｐ（ＮＣＣＴＧ）を通じて行われた、複数機関による共同グループ研究による。本研究は、全ての参加機関の機関内審査委員会により認証された。書面のインフォームドコンセントを全ての参加者から得た。適格な患者は、年齢１８歳以上で、切除不能な組織学的に確認されたステージＩＶメラノーマを有する者とした。更なる適格基準は、固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ）によって定義される測定可能な疾患、米国東海岸がん臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）のがんの状態を表す指標（ＰＳ）が０〜２であること、平均余命が３ヶ月以上、適正な血液性機能及び肝臓機能、最後の化学療法治療（コホート１のみ）、放射線治療、又は免疫療法から４週以上の経過を含んだ。除外基準は以下を含んだ：白金又はタキサンを用いた任意の過去の治療（コホート１及び２）、転移疾患に対する任意の過去の化学療法（コホート２）、活動性感染症、ニューヨーク心臓協会によるクラスＩＩＩ又はＩＶ、グレード２以上の末梢神経障害；過去５年間におけるその他の悪性腫瘍（非メラノーマ性（ｎｏｎ−ｍｅｌａｎｏｍａｔｏｕｓ）皮膚癌、又は子宮頸部の上皮内癌を除く）、又は脳への未治療の転移性メラノーマ若しくは研究開始３ヶ月以内の脳転移の進行を含む。妊娠中又は授乳中の女性は登録しなかった。
【０１０９】
適格な患者（両コホート）を、２８日サイクルの１、８、及び１５日目に、３０分かけた静脈内注入で１００ｍｇ／ｍ２のｎａｂ−パクリタキセルを用いて処置し、その後、３０分間かけて標的ＡＵＣが２（Ｃｏｃｋｒｏｆｔ  ａｎｄ  Ｇａｕｌｔ等式及び実体重を用いたＣａｌｖｅｒｔ公式による）のカルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）を用いて処理することを最大８サイクル行う。患者が過剰毒性又は進行性の疾患を進展させなかった場合、８サイクルを越えた治療は、治療を行っている臨床医の裁量とした。登録から１４日以内に、患者は、全体的な健康診断、ＥＣＯＧ  ＰＳの評価、全体的な血液細胞の計数（ＣＢＣ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を含む包括的な代謝性検査、及び通常のＣＴ又はＭＲＩ又はスパイラルＣＴによる腫瘍の評価を受けた。各治療サイクルの前に、患者は、健康診断、毒性評価、血液性群及び化学群のための採血を受けた。腫瘍の状態は、ＲＥＣＩＳＴ基準を使用して進行となるまで、８週間ごとに評価した。各治療サイクルの１日目に、絶対好中球数（ＡＮＣ）が１，５００／ｍｍ３未満であり、血小板数（ＰＬＴ）が１００，０００／ｍｍ３であり、患者がグレード２以上のＡＳＴ神経障害を進展し、又はその他のグレード３以上の非血液性毒性を進展した場合、治療は保留とした。患者がこれらの毒性から回復した場合、両薬剤を２０％用量減少させて、治療を再開した。各治療サイクルの８又は１５日目に、以下の場合治療を除外した：ＡＮＣが１，０００／ｍｍ３未満である、又はＰＬＴが１００，０００／ｍｍ３である、又は患者がグレード２以上の神経障害を進展し、又はグレード３以上の非血液性毒性を進展した場合。毒性が４週以内に許容可能なレベルにまで回復しなかった場合、及び／又は、患者が毒性に起因して、３分の１の投与量減少を必要とした場合、研究治療を終了した。全ての患者は、治療を行っている臨床医の裁量で、制吐剤、抗生物質、血液／血小板輸血、エリスロポエチン及びコロニー刺激因子を含む、標準的なサポート療法を受けた。
【０１１０】
２００６年１１月１５日から２００７年７月３１日の間に、３５名の患者をコホート１とし、４１名の患者をコホート２とした（表２）。コホート１（ＰＴ）において、１名の患者が、同意書にサインした後であって、治療開始前に、参加をキャンセルした。そのため、コホート１研究で、研究治療を開始したのは３４名の患者で構成される（男性６７．６％）。登録者の年齢の中央値は６０歳であった（年齢は２８〜８４歳の範囲であった）。コホート２（ＣＮ）において、２名の患者が、同意書にサインした後であって、治療開始前に、参加をキャンセルした。そのため、コホート２研究で、研究治療を開始したのは３９名の患者で構成される（男性５９．０％）。登録者の年齢の中央値は５９歳であった（年齢は２３〜９１歳の範囲であった）。
【０１１１】
コホート１については、投与サイクルの中央値は４サイクルであった（合計：１３５サイクル、範囲：１〜１０）。２１名の患者（６１．８％）は、８又は１５日目の治療を除外した、又は少なくとも１用量の減少を行った。これは主に、重篤な好中球減少症、疲労、及び神経障害に起因した。研究中断の主要な理由は疾患の進行であった（２７名の患者）。
【０１１２】
コホート２については、投与サイクルの中央値は４サイクルであった（合計：１９３サイクル、範囲：１〜２５）。２５名の患者は、８又は１５日目の治療を除外した、又は少なくとも１用量の減少を行い、多くは重篤な好中球減少症及び神経障害がその原因であった。研究中断の第一の理由は疾患の進行であった（２７名の患者）。
【０１１３】
血漿ＳＰＡＲＣの予後の有用性を、患者を「高」及び「低」ＳＰＡＲＣ群へ層別化することにより評価した。血漿ＳＰＡＲＣの中央値は４３１ｎｇ／ｍｌであったため、高ＳＰＡＲＣ群は４３１ｎｇ／ｍｌを超える血漿ＳＰＡＲＣを有する患者と定義した。患者集団の内訳を表２に示す。１つの例外を除き、当該結果は、「高ＳＰＡＲＣ」患者は対応する「低ＳＰＡＲＣ」患者よりも、悪い進行なし生存率（ＰＦＳ）及び全体の生存率（ＯＳ）を有する傾向があることを示している（過去の化学療法群におけるＯＳのみが、統計上有意（ｐ＝０．０１）であったが）。
【０１１４】
【表２】
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【０１１５】
２つのコホート間で全体の反応率は有意に異なったが（２５．６％ｖｓ８．８％）、進行なし生存率又は全体の生存率における違いはなかった（図１７Ａ−Ｂ）。全体的に、治療は中程度に良好な耐性であり、主要な毒性は、吐気、嘔吐、末梢神経障害、及び血球減少症（好中球減少症、血小板減少症、白血球減少症）であった。
【０１１６】
これらの結果は、低い循環性ＳＰＡＲＣレベルは、改善した全体の生存率と関連していたことを示している。更に、ｎａｂ−パクリタキセルとカルボプラチンの組み合わせは、以前に治療を受けた又は化学療法を受けたことのない、転移性メラノーマを有する患者にとっての、適した治療選択肢である。
【０１１７】
実施例６
本実施例は、転移性メラノーマ患者及び健康な個人からのサンプルにおける、血漿ＳＰＡＲＣの濃度の評価を記述する。
【０１１８】
ＥＬＩＳＡプレートを、５０ｍＭの炭酸緩衝液中の、２．５μｇ／ｍｌのＳＰＡＲＣ結合ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて、４℃で一晩コートした。プレートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で４回洗浄し、カゼインブロッキング／希釈緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，ＩＬ）を用いて、室温（ＲＴ）で２時間ブロックした。ＳＰＡＲＣの検量線を作成するために、既知の濃度のヒト血小板ＳＰＡＲＣタンパク質（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｅｓｓｅｘ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＶＴ）を、ＳＰＡＲＣネガティブであり１０％のプールした正常ヒトヘパリン血漿（ＰＮＨＰ）を含む、ブロッキング／希釈緩衝液で希釈した。試験をする前に、患者のサンプルをブロッキング／希釈緩衝液で１／１０に希釈した。ブロッキング溶液を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、標準及び希釈した血漿サンプルを、１００μｌ／ｗｅｌｌで二連でＥＬＩＳＡプレートにプレーティングし、室温（ＲＴ）で２時間インキュベートし、その後ＰＢＳＴで更に３回洗浄した。結合したＳＰＡＲＣの検出のために、ブロッキング／希釈緩衝液中の０．５μｇ／ｍｌビオチン化抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）１００uｌを加え、ＲＴで１時間インキュベートし、その後、３回のＰＢＳＴによる洗浄を行った。引き続き、１：２００００で希釈したストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を１００uｌ／ｗｅｌｌで加え、ＲＴで１時間インキュベートした。３回のＰＢＳＴでの洗浄の後、ＨＲＰの基質ＴＭＢ（ＫＰＬ＃５２−００−０３）１００uｌを各ウェルに加え、６５０ｎｍでＯＤを測定した。ＯＤ０．６から０．８での測定のために、反応を２Ｎの硫酸で停止した。ウェルの光学密度はＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ；  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で、４５０ｎｍで３０分以内に読み取った。
【０１１９】
図１８に示されているように、健康な個人からの計２０サンプルの結果と、６５の癌患者の血漿サンプルの結果を比較した。ＥＬＩＳＡの結果の解析により、両群のＳＰＡＲＣ濃度に統計上有意な違いがあることが明らかになった。健康な個人におけるＳＰＡＲＣレベルは、中央値の濃度が１９２ｎｇ／ｍｌと定められ、それに対し、癌患者サンプルの血漿ＳＰＡＲＣの中央値の濃度は３９０ｎｇ／ｍｌであると測定された（ｐ値０．０００２）（図１８）。更に、治療後に、大部分の患者の血漿ＳＰＡＲＣの有意な低下があった（図１９）。
【０１２０】
これらの結果は、転移性メラノーマ患者における増加したＳＰＡＲＣの発現を明示し、腫瘍量と正の相関があり得ることを示す。
【０１２１】
実施例７
本実施例は、ＳＰＡＲＣ微小環境シグニチャー（ＳＭＳ）の調製を示す。
【０１２２】
ＳＰＡＲＣに対する一連の抗体を、それらの結合特性について、様々な正常及び腫瘍組織において評価した。腫瘍細胞、血管、線維芽細胞、ストローマ、炎症細胞、及び隣接する正常組織におけるＳＰＡＲＣの発現レベルを含む、腫瘍の様々な成分における、免疫染色により決定されるＳＰＡＲＣの発現パターンを決定した。２つの抗体がＳＰＡＲＣに対し異なる親和性を有すると同定され、追跡研究に使用された。具体的には、染色のパターンは、モノクローナル抗体（「抗体Ｍ」）（ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、カタログ番号ＭＡＢ９４１、ロット番号ＥＣＨ０４５０１１、トリスベース希釈液で１：１００に希釈）、及びポリクローナル抗体（「抗体Ｐ」）（ＳＰＡＲＣポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）カタログ番号ＡＦ９４１、ロット番号ＥＷＮ０４、トリスベース希釈液で１：５０に希釈）を使用して決定した。
【０１２３】
腫瘍の組織切片は、標準的な免疫染色プロトコールを使用して、スライド上に調製し、染色した。簡単に述べると、ホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍ブロックからの、組織主要部（ブロック当りの最も代表的な領域から２つの主要部）を、各２．０ｍｍの計測用主要部の組織マイクロアレイを作成するために配置し（Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，  ＭＤ）、ポジティブチャージのスライド上に置いた。その後、標本スライドを６０℃のオーブンに１時間おいて、冷却、脱パラフィンを行い、キシレン及び段階的なエタノール溶液から水への移動を介して再水和した。全てのスライドは、自動染色機器を使用して染色した（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ，  Ｄａｋｏ，  Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）。
【０１２４】
全てのスライドは、水中３％過酸化水素溶液において５分間クエンチし、内在性ペルオキシダーゼを阻止する。緩衝液での洗浄の後、スライドを、抗体Ｍ又はネガティブコントロール試薬と共に３０分間インキュベートした。マウスホースラディッシュペルオキシダーゼポリマーキット（Ｍｏｕｓｅ  ＭＡＣＨ  ３  ＨＲＰ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｋｉｔ，Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，  Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＣＡ）を、試薬当り２０分間インキュベートした。もう一度緩衝液で洗浄した後、ＤＡＢ色素原（Ｄａｋｏ，  Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を１０分間適用した。スライドを対比染色するために、ヘマトキシリンを使用した。ＨＲＰ検出キットの代わりに、アビジン−ビオチン検出キット（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，  Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＣＡ）を使用し、試薬当り１５分間のインキュベートを行ったが、抗体Ｐを用いた標本の免疫染色についても同じプロトコールを使用した。
【０１２５】
一連の腫瘍におけるＳＰＡＲＣ発現の詳細な病理学的評価は、委員会によって認定された病理学者により行われた。免疫組織化学により決定したＳＰＡＲＣ発現のレベルを、様々な腫瘍の構成要素についてスコア化した。スコアを０〜３の尺度でＳＰＡＲＣ発現のレベルに対し割り当て、３が最もポジティブスコアであり、これらは、当該分野で一般的に行われ、当業者に周知である。
【０１２６】
上記ポリクローナル抗体は、線維芽細胞においてＳＰＡＲＣの優先的な染色を示し、一方、モノクローナル抗体は、腫瘍細胞においてＳＰＡＲＣを好ましく染色した。
【０１２７】
ロジスティック回帰及び比例ハザードを使用し、進行なし生存率（「ＰＦＳ」）、及び全体の生存率（「ＯＳ」）のＳＰＡＲＣパターンに対する反応の間の相関を決定した。
【０１２８】
腫瘍セットの１つは、切除不能なステージＩＶメラノーマを有する患者における、カルボプラチン及びｎａｂ−パクリタキセル（ＡＢＩ−００７）のフェーズＩＩ試験であった。具体的には、ｎａｂ−パクリタキセル（１００ｍｇ／ｍ２）及びカルボプラチン（ＡＵＣ２）は、２８日サイクルの１、８、及び１５日目に投与した。腫瘍生検のＳＭＳを使用し、患者を、高リスク（クラスター１）及び低リスク（クラスター２）の２つのクラスターへグループ分けした。表３及び図２０Ａ−Ｂに示されるように、高リスク及び低リスクのＳＰＡＲＣシグニチャーは、進行なし生存率及び全体の生存率と相関した。
【０１２９】
【表３】
2013530165.tif 000005
【０１３０】
これらの結果は、ＳＰＡＲＣ微小環境シグニチャーのみで、進行なし生存率及び全体の生存率に関して、低リスクと高リスクを区別することができることを示している。
【０１３１】
実施例８
本実施例は、ＳＰＡＲＣ微小環境シグニチャーと血漿ＳＰＡＲＣレベルの間の相関関係の解析を記述する。
【０１３２】
上記実施例５及び７にあるように、血漿ＳＰＡＲＣレベル及びＳＭＳを解析し、その結果を組み合わせ、患者の転帰との相関を決定した。
【０１３３】
図２１に示されるように、血漿ＳＰＡＲＣのベースラインは、ＳＭＳ高リスク群とＳＭＳ低リスク群との間で同様であった。血漿ＳＰＡＲＣのベースライン、及びＳＭＳ高リスク対低リスクに基づいて、患者の有するリスクレベルを０、１、又は２にコード化した。リスクレベル０は、低ベースラインの血漿ＳＰＡＲＣ、及びＳＭＳ低リスクを有するとして特定される。リスクレベル１は、高ベースラインの血漿ＳＰＡＲＣ、又はＳＭＳ高リスクとして特定される。リスクレベル２は、高ベースラインの血漿ＳＰＡＲＣ、及びＳＭＳ高リスクとして特定される。全体の生存率及び進行なし生存率のデータを、表４に示す。
【０１３４】
【表４】
2013530165.tif 000006
【０１３５】
図２２Ａ−Ｂに示されるように、リスクレベルが増加するとともに、進行なし生存率及び全体の生存率が悪くなる、全般的な傾向があった（リスク２の群の患者の進行なし生存率については、結果に有意な違いはなかったが）。
【０１３６】
これらの結果は、高い血漿ＳＰＡＲＣ及び高リスクＳＭＳを有する患者は、有意に悪い全体の生存率を有することを示している。
【０１３７】
実施例９
本実施例は、ＳＰＡＲＣが特定の化学療法の効果を無効にすることを示す、腫瘍の異種移植アッセイを記述する。
【０１３８】
５〜６週齢の間で、およそ２０ｇ重量の、メス及びオスの胸腺欠損ＮＣｒ−ｎｕマウスを、Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）より購入した。ヒト癌細胞（ＨＴ２９（結腸）、ＰＣ３（前立腺）、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳房））を細胞培養で増殖し、メス（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＨＴ２９に対して）又はオス（ＰＣ３前立腺腫瘍に対して）のヌードマウスの、脇腹当り１００万細胞で皮下に移植し、治療開始前に、およそ６０〜１００ｍｍ３に成長させた。治療は、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、アルブミン結合パクリタキセル（ｎａｂ−パクリタキセル）、ｎａｂ−パクリタキセルとsuntinibリンゴ酸塩（ｓｕｎｔｉｎｉｂ  ｍａｌａｔｅ）（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））、又はｎａｂ−パクリタキセルとベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、と外から投与したＳＰＡＲＣを有する又は有さない、を含んだ。各異種移植についてのコントロール動物にはＰＢＳを投与した。最も長い（長さ）及び最も短い（幅）腫瘍の直径（ミリメーター）、並びに腫瘍の深度を、週２回計測した。腫瘍体積は以下の式で計算した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝幅ｘ長さｘ深度。腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を、コントロール動物の安楽死の時点でのコントロール群と比較した、腫瘍体積の減少のパーセンテージとして定義した。腫瘍の倍加時間を、腫瘍体積が２倍になるのに必要な時間と定義した。動物の体重は週２回測量した。統計解析は、Ｐｒｉｓｍプログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して行った。分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計を使用し、腫瘍成長曲線を比較した。
【０１３９】
ＳＰＡＲＣ投与の影響を、５−フルオロウラシルを用いた治療について評価した。ＨＴ２９結腸癌異種移植モデルにおいて、５−ＦＵは、体重を減少させることなく、腫瘍の成長を抑制するのに効果的であった（ＴＧＩ  ８９．８％、Ｐ＜０．０００１ｖｓ生理食塩水）。図２３Ａに示されるように、ＳＰＡＲＣの投与は５−ＦＵの抗腫瘍活性の用量依存的な阻害を起こし、５０．８％、４７．４％、及び１０．４％のＴＧＩ（それぞれ４、６、及び８ｍｇ／ｋｇ用量レベル）をもたらした（Ｐ＝０．００３ｖｓ５−ＦＵ群、ウイルコクソンの順位和検定）。ＳＰＡＲＣのみでは、中程度の抗腫瘍活性を有していた（３５．４％；ＮＳ）。同様の結果がドセタキセルについても得られた（図２３Ｂ）。
【０１４０】
ＳＰＡＲＣ投与の影響は、同じＨＴ２９異種移植モデルにおいて、４日ごと３サイクルの、１５ｍｇ／ｋｇ  ｎａｂ−パクリタキセルとの組み合わせについても評価した。抗血管新生剤ｓｕｎｔｉｎｉｂ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））との併用は、ｎａｂ−パクリタキセルを有意に亢進した（ＴＧＩ＞１００％ｖｓ．９４．８％、Ｐ＝０．０１５  ｖｓ  ｎａｂ−パクリタキセル単独療法、ウイルコクソンの順位和検定）。対照的に、ＳＰＡＲＣの投与はｎａｂ−パクリタキセルの抗腫瘍活性を有意に減少した（ＴＧＩ  ８４．８％ｖｓ．９４．８％、Ｐ＝０．００７  ｖｓ．  ｎａｂ−パクリタキセル単独療法、ウイルコクソンの順位和検定）。更に重要なことに、外からのＳＰＡＲＣは、ｎａｂ−パクリタキセルとｓｕｎｔｉｎｉｂの相乗効果を大幅に無効にした（ＴＧＩ  ５２．３％ｖｓ．＞１００％（５１日目の後）、Ｐ＝０．００６  ｖｓ．  ｎａｂ−パクリタキセルとｓｕｎｔｉｎｉｂ併用群、ウイルコクソンの順位和検定）（図２４Ａ）。ｎａｂ−パクリタキセルとsuntinib及び／又はＳＰＡＲＣを用いた治療は、明らかな体重の喪失がなく、良好な耐性であった。同様に、ベバシズマブのみで有意なＴＧＩ（７５％、Ｐ＜０．００１）を誘導した。しかしながら、本実験において、ｎａｂ−パクリタキセルの抗腫瘍活性は、ベバシズマブによって亢進したが、ＳＰＡＲＣを用いた治療はｎａｂ−パクリタキセル／ベバシズマブの併用に対し最小の負の影響のみをもたらした（図２４Ｂ）。ｎａｂ−パクリタキセルとベバシズマブ及び／又はＳＰＡＲＣを用いた治療は、明らかな体重の喪失がなく、良好な耐性であった。
【０１４１】
これらの知見は、MDA-MB-231乳癌異種移植（図２４Ｃ）、及びＰＣ３前立腺癌異種移植（図２４Ｄ）においても、更に確認した。これらのアッセイにおいて、ｎａｂ−パクリタキセル及びｓｕｎｔｉｎｉｂ、又はｎａｂ−パクリタキセル及びベバシズマブの併用で観察された抗腫瘍効果は、ＳＰＡＲＣの投与により有意に阻害された（Ｐ＜０．００１、図２４Ｃ及び２４Ｄ）。これらの実験において、ｎａｂ−パクリタキセルを準最適に、１０ｍｇ／ｋｇで、毎日、５サイクル投与した。
【０１４２】
これらのデータは、外来のＳＰＡＲＣが腫瘍の成長を促進し、ｎａｂ−パクリタキセル、ドセタキセル、及び５−フルオロウラシル等の化学療法の治療有益性を無効にすることを示している。
【０１４３】
実施例１０
本実施例において、ＳＰＡＲＣの血管新生動態を２つのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより研究した。
【０１４４】
初めに、Ｎａｋａｔｓｕらにより記述されたように（Methods Enzymol. 443:65-82 (2008)）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用して作製した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生モデル系において、ＳＰＡＲＣのスプラウト形成に対する影響を研究した。１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充したＭ１９９培地で育てた、継代数の少ないＨＵＶＥＣを、ビーディング（ｂｅａｄｉｎｇ）の２日前にＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）へと切り換えた。Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３マイクロキャリアビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を水和し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。コーティングのために、１ｘ１０６  ＨＵＶＥＣ細胞を、２５００の水和した無菌のビーズとともに、ＥＧＭ−２培地中で４時間、３７℃でインキュベートした。次に、コートしたビーズを、０．１５ｕｎｉｔｓ／ｍＬアプロチニンを有するＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍＬフィブリノーゲンに５００ビーズ／ｍＬで包埋した。次に、０．６２５ｕｎｉｔｓ／ｍＬトロンビンを加え、その混合液を０．５ｍＬ、２４ウェルプレートの各ウェルへ添加した。該溶液を、ＲＴで５分間と、その後３７℃で１５分間凝固させた。凝固後、ＥＧＭ−２培地中の２０，０００の肺線維芽細胞を各ウェルに播種した。ＰＢＳ中の１、１０、若しくは１００μｇ／ｍＬいずれかのＢｉｏＩ  ＳＰＡＲＣタンパク質、又はタンパク質なしのＰＢＳを成長培地へ加え、培養を５日間、スプラウト形成を光学顕微鏡で評価するまで維持した。形成した管の数／ビーズ、及び培養内のスプラウティングしているＨＵＶＥＣ細胞の形態を、ｉｍａｇｅ  ｐｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を使用して決定した。
【０１４５】
本アッセイの結果は、ＳＰＡＲＣによる処理が、用量依存的にスプラウト形成を誘導することを示している（図２５）。１μｇ／ｍＬで、播種したＨＵＶＥＣ／ビーズの５０％未満がスプラウトを発生した。１０又は１００μｇ／ｍＬ  ＳＰＡＲＣの添加は、それぞれ平均０．９又は１．９スプラウト／ビーズをもたらし（図２６Ｂ）、それに対し、ＳＰＡＲＣ無しの培養における平均スプラウト数は、約０．５スプラウト／ビーズを下回ったままであった。
【０１４６】
次に、ＳＰＡＲＣの管形成への影響を、ＴＣＳ  ｃｅｌｌｗｏｒｋｓ  ｈｕｍａｎ  Ａｎｇｉｏｋｉｔ  ｍｏｄｅｌ  ｋｉｔ（ＴＣＳ−ＺＨＡ−１０００，ＴＣＳ  Ｃｅｌｌ  Ｗｏｒｋｓ  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）を使用して調べた。本アッセイにおいて、内皮細胞は初めに、培養マトリックス内に小さな島を形成する。それらは、続いて増殖を開始し、その後、移動フェーズに入り、移動の間それらはマトリックスを通過し、糸状管構造を形成する。これらは徐々に接続し（９〜１１日までに）、毛細血管床によく似た吻合管のネットワークを形成する。
【０１４７】
初期ステージの共培養を含む、２４ウェルの前もって播種した、内皮細胞の組織培養プレート（２〜３日）を、製造者の推奨（ＴＣＳ  Ｃｅｌｌ  Ｗｏｒｋｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）に従って使用した。該培養を３７℃／５％ＣＯ２で１１日間インキュベートした。該培養の培地は、添加試験及びコントロール化合物を用いて、最初の処理後４、７、及び９日目に交換し、その後、１１日目に７０％エタノールで固定した。固定した培養は、続いて以下のように染色した：ラビット抗ＣＤ３１一次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡブロッキング緩衝液中で、２μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。その後、０．５ｍＬの希釈した抗ＣＤ３１抗体を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。該培養をＰＢＳで３回洗浄し、その後、ＡＰ結合型二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ及び水でよく洗浄した。形成した細管の可視化のために、ウェル当り０．５ｍＬの１ステップＮＩＢ／ＢＣＩＰ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、染色が完了するまでインキュベートした。その後、反応を水で停止した。
【０１４８】
その後、形成した細管の数及び長さを光学顕微鏡により評価した。細管の発達の比較は、ＡｎｇｉｏＫｉｔを使用して産生した画像の解析のために専用に開発された、「ＡｎｇｉｏＳｙｓ」イメージ解析システムを使用して実施した（ＴＣＳ  Ｃｅｌｌ  Ｗｏｒｋｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）。解析ソフトウェアにより取得した、染色された細管を、その幅において、単一ピクセルにまで減少した。それ故、特定の視野におけるピクセルの総数は、細管の長さを表す。このデータから、平均の細管長、標準偏差、及び変動係数を計算することができる。総血管数、総細管面積、分岐点の数も同様に決定することができる。
【０１４９】
図２６に示されるように、この系において、ＳＰＡＲＣは二相性の血管新生活性を示した。これらの結果は、低濃度のＳＰＡＲＣ（１及び１０μｇ／ｍＬ）、特に１０μｇ／ｍＬの濃度で、血管新生を刺激することができ、一方、高濃度のＳＰＡＲＣ（１００μｇ／ｍＬ）は血管新生を有意に阻害することを示す。
【０１５０】
これら２つのアッセイの結果は、少なくとも特定の濃度において、循環するＳＰＡＲＣの活性は血管新生を刺激することを示している。
【０１５１】
実施例１１
本実施例は、ＭＤＡ−４３５転移モデルにおける、外来性のＳＰＡＲＣ及びｎａｂ−パクリタキセルの、腫瘍進行に対する効果を説明する。
【０１５２】
５〜６週齢の間で、およそ２０ｇ重量の、メス及びオスの胸腺欠損ＮＣｒ−ｎｕマウスを、Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）より購入した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５−Ｌｕｃ＋を、乳房脂肪体（ＭＦＰ）に５０％マトリゲル中４ｘ１０６細胞で、同所に移植し、治療前に１８０ｍｍ３の平均腫瘍体積に到達させた。治療は以下であった：２サイクルの１０ｍｇ／ｋｇ  ｎａｂ−パクリタキセル、４ｍｇ／ｋｇ  ＳＰＡＲＣ、及びベバシズマブを隔週で。適切な時間間隔で、以下の臓器を転移の定量のために回収した：近位のリンパ節、対側リンパ節、肺、肝臓、及び脳を回収した。使用した統計検定は、ｔ−検定及びＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を含んだ。
【０１５３】
マウスは週２〜３回モニターし、腫瘍の成長を記録した。腫瘍体積が１８０ｍｍ３に達した場合、マウスを選別し、最初のサイクルの治療を投与した。最初と２回目のサイクルの間に７日間の安静日を与えた。ベバシズマブ及びＳＰＡＲＣは、安静期間の間、継続的に投与した。本研究を通じて体重は定期的に測量し、治療の毒性効果を評価した。Ｎｎａｂ−パクリタキセルは、最小の体重喪失を起こし、薬剤を中止するとすぐに回復した（データは示されていない）。
【０１５４】
以下の投与スケジュールに従った：コントロール（群１）；１０ｍｇ／ｋｇ  ｎａｂ−パクリタキセルを毎日、３〜５サイクル（群２）；４ｍｇ／ｋｇ  可溶性ＳＰＡＲＣ（Ｂｉｏ１）を静脈内に隔週で（群３）；並びに１０ｍｇ／ｋｇ  ｎａｂ−パクリタキセルを毎日、２〜５サイクル、及び４ｍｇ／ｋｇＳＰＡＲＣを隔週で（群４）行った。
【０１５５】
コントロールの腫瘍は安定した腫瘍の成長を有し、体積の平均増加量は４３．７５±５．６５ｍｍ３／ｄａｙであり、最終的な体積は５６日目において１８７０．６ｍｍ３であった。ＳＰＡＲＣ治療群は、同様の成長率である２３．１６±４．３８ｍｍ３／ｄａｙを示し、平均体積は６３日目に１７６５ｍｍ３を示した。ｎａｂ−パクリタキセルのみの群は、１８日間の腫瘍の退縮を有し、再成長が起きる前に腫瘍体積の７６％の減少をもたらした。９匹の内５匹のマウスが明白な腫瘍を有していた；しかしながら、全てのマウスにおいて、２２．９８±０．８９ｍｍ３／ｄａｙの成長率であり、最終的な平均体積は７３９ｍｍ３に成長した。腫瘍の再成長は、ｎａｂ−パクリタキセル治療の休止後６日で起きた。退縮は２９日間続き、再成長は６．１０±１．１６ｍｍ３／ｄａｙで起き、最終体積は１３６ｍｍ３であった。ｎａｂ−パクリタキセル＋ＳＰＡＲＣ群は、ｎａｂ−パクリタキセル群と同様の挙動を示した。２例の完全な退縮が起きたが、治療開始後２１日で、再成長が２１．０５±２．５７ｍｍ３／ｄａｙの率で起き、最終体積が６５３ｍｍ３となった（表４）。
【０１５６】
【表５】
2013530165.tif 000007
【０１５７】
総転移量も計算し、タンパク質ｍｇ当りに標準化したＲＬＵで表される、組織抽出物において測定した、ルシフェラーゼ活性として示している。全ての対側リンパ節は、全ての群でネガティブであった。近位のリンパ節、肝臓、及び脳において、少数の転移の発生が起きた。該近位のリンパは、コントロール群の１２匹の動物の内２匹で、転移を示した。肝臓転移は、コントロール及びＳＰＡＲＣ群の両方において、幾分高頻度で起きた（各群で３匹のマウスで起きた）。脳転移を有する１匹のマウスも存在した。
【０１５８】
転移の大部分は肺で起きた。コントロール群では１２匹中１１匹のマウスがポジティブであり、平均ＲＬＵ／総タンパク質ｍｇは３３８４０±９１７６（Ｎ＝１２）であった。ＳＰＡＲＣは転移に対しわずかな効果を有し、９匹中９匹のポジティブマウス、平均ＲＬＵ／総タンパク質ｍｇが３１６３０±１０８２０（Ｎ＝９）であった。ｎａｂ−パクリタキセルのみでは、肺転移に対しいくらか効果を有し、９匹中４匹のみのポジティブマウスで、及びＲＬＵ／総タンパク質ｍｇが４７２２＋２６８４（Ｎ＝９）で、ｐ＝０．０１５（対コントロール）（スチューデントｔ検定）であった。ｎａｂ−パクリタキセルとＳＰＡＲＣを共投与したものでは、発生は１０匹中９匹のポジティブマウスに増加し、及びＲＬＵ／総タンパク質ｍｇが１３６９０±３５７９（Ｎ＝１０）であり、ｐ＝ｎｓ（対コントロール）（スチューデントｔ検定）であった。これらのデータは、循環するＳＰＡＲＣがｎａｂ−パクリタキセルの抗転移活性を無効にすることを示している。
【０１５９】
循環する血小板及びマクロファージは高レベルのＳＰＡＲＣを発現し、血漿のＳＰＡＲＣの供給源であり得るので（Sangaletti S. et al., Cancer Res. 68: 9050-9059 (2008); Sangaletti S. et al., J. Exp. Med. 198: 1475-1485(2003)）、これらの結果は、特定の状況下で、実験的に（即ち、外来性の投与されたＳＰＡＲＣによって）又は循環するＳＰＡＲＣの内因性の過剰発現（即ち、腫瘍、白血球、血小板、及びマクロファージ等の、患者におけるＳＰＡＲＣを発現する臓器によって）のいずれかにより上昇したＳＰＡＲＣが、化学療法が存在する場合において、転移のリスクを増加することを示す。
【０１６０】
実施例１２
本実施例は、管形成アッセイを使用した、モノクローナルＳＰＡＲＣ結合抗体、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、及びｍＨＴＩの、ＳＰＡＲＣの血管新生性挙動に対する効果の決定について記述する。
【０１６１】
本アッセイは、上記実施例１０に記述されるように、ＴＣＳ  Ｃｅｌｌｗｏｒｋｓ  ｈｕｍａｎ  ＡｎｇｉｏＫｉｔ  ｍｏｄｅｌ  ｋｉｔ（ＴＣＳ−ＺＨＡ−１０００，ＴＣＳ  Ｃｅｌｌ  Ｗｏｒｋｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）を使用して行った。培地は１０μｇ／ｍＬのリコンビナントヒトＳＰＡＲＣタンパク質を含むものであった。また、該培地は、上記の調製したマウスＳＰＡＲＣ結合モノクローナル抗体（Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、ｍＨＴＩ）の１つ、又はコントロール（マウスＩｇＧ）を３００μｇ／ｍＬで含むものであった。
【０１６２】
ＳＰＡＲＣの管形成への影響及びＳＰＡＲＣ結合モノクローナル抗体によるその機能の阻害を調べるために、形成した管の数及びその長さを光学顕微鏡により評価した。
【０１６３】
本アッセイの結果は図２８に示す。培養培地におけるＳＰＡＲＣの存在は、多数の長い管の形成をもたらした。これらの結果は、本モデル系におけるＳＰＡＲＣの血管新生促進効果を確認した。しかしながら、前記３つの抗ＳＰＡＲＣ抗体のどの抗体の添加でも、この効果の阻害をもたらした。Ｉｍｍ１２又はＩｍｍ１４モノクローナル抗体のいずれかの存在下において、非常に短い管のごくわずかな形成のみが観察された。ｍＨＴＩの培養培地への添加は、管形成のほぼ完全な阻害をもたらす。
【０１６４】
これらの結果は、ＳＰＡＲＣ結合抗体、Ｉｍｍ１２、Ｉｍｍ１４、及びｍＨＴＩは、ＳＰＡＲＣの血管新生刺激効果を打ち消すことが可能であることを示している。
【０１６５】
実施例１３
本実施例は、ｍＨＴＩ、Ｉｍｍ１２、及びＩｍｍ１４が、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて、腫瘍部位に局在しないことを示す。
【０１６６】
結腸由来ＨＴ２９の皮下の異種移植により移植を受けたヌードマウスを、Ａｌｅｘａ  ６８０蛍光色素で標識した一連のＩｍｍ抗体を用いて、２００uｇ／マウスの用量で治療した。標識したＩｍｍ抗体を生理食塩水中で調合し、静脈内に１日目に投与した。３６日に渡ってこれらのマウスにおける、蛍光シグナルを追跡した。
【０１６７】
図２９に示される、本研究の結果は、ｍＨＴＩ（「ＨＴＩ」と表示する）、Ｉｍｍ１２、及びＩｍｍ１４は、本モデルにおいては腫瘍部位に局在せず、一方、Ｉｍｍ２は良く局在することを示す。
【０１６８】
本明細書に引用される、刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参照は、それぞれの参照が個別に具体的に示され、参照により組み込まれ、及びその全体が本明細書中に記載されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
本発明を記述することに関して（特に以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中で指示がない場合又は明らかに文脈と矛盾する場合を除き、単数及び複数の両方を対象とすると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に指示の無い場合は、制約のない用語として解釈されるべきである（即ち、「を含むが、これに限定されるものではない」ということを意味する）。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中に特記のない限り、この範囲内に入る各個別の値を個々に言及する、簡単な方法としての役割を単に意図したものであり、各個別の値はそれが個々に本明細書に列挙されたかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に特記のない限り、又はさもなくば文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書中に提供される任意の全ての例、又は例示的語句（例えば、「等（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をより明確に説明することを単に意図するにすぎず、別途特許請求されない限り、本発明の範囲を限定しない。本明細書中のいかなる語句も、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須なものとして示していると解釈されるべきではない。
【０１７０】
本発明を実施するための本発明者らが知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されている。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、前述の記載を読めば、当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてこのようなバリエーションを使用することを予期し、また本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたもの以外の方法で、本発明が実施されることを意図する。従って、本発明は、適用法により許容されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された対象の全ての改変物及び均等物を含む。更に、上記要素の全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組み合わせが、本明細書中に特記のない限り、又はさもなくば文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明により包含される。
【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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