(57)【要約】本明細書に記載されるような治療有効量の界面動電的に改変された水性流体を必要とする対象に投与することを含む、心血管疾患並びに関連する疾患および症状（例えば、心不整脈、血管疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全）を治療するための方法が提供される。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、約１００ナノメートル未満の平均直径を主に有し、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な、帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含む。界面動電的に改変された流体（例えば、界面動電的に改変され、ガス富化された流体および溶液）および治療用組成物のための投与経路または製剤が提供され、それと共に心血管系の手術を含むが限定はされない外科的状況における、界面動電的に改変された水性流体の用途が提供される。さらに、界面動電的に改変された流体の生物活性を測定する方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
心血管疾患または状態の治療用薬剤の調製のための界面動電的に改変された水性流体の使用であって、前記流体が、約１００ナノメートル未満の平均直径を主に有し、心血管疾患もしくは状態またはその少なくとも１つの症状の治療を提供するのに十分な量でイオン水性流体中で安定に形成される、帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含む、使用。
【請求項２】
前記帯電安定化した酸素含有ナノ構造が、流体が生細胞と接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量で、イオン水性流体中で安定に形成される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記帯電安定化した酸素含有ナノ構造が、流体中の主要な帯電安定化したガス含有ナノ構造種である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
帯電安定化した酸素含有ナノ構造として流体中に存在する溶解した酸素分子の割合が、０．０１％超、０．１％超、１％超、５％超；１０％超；１５％超；２０％超；２５％超；３０％超；３５％超；４０％超；４５％超；５０％超；５５％超；６０％超；６５％超；７０％超；７５％超；８０％超；８５％超；９０％超；および９５％超からなる群から選択される割合である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
全溶解酸素が、実質的に帯電安定化した酸素含有ナノ構造中に存在する、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
帯電安定化した酸素含有ナノ構造が、９０ｎｍ；８０ｎｍ；７０ｎｍ；６０ｎｍ；５０ｎｍ；４０ｎｍ；３０ｎｍ；２０ｎｍ；１０ｎｍ；および５ｎｍ未満からなる群から選択される大きさより小さい平均直径を主に有する、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
イオン水溶液が食塩水を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
流体が過酸素化されている、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
流体が溶媒和電子の形態を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
界面動電的に改変された水性流体の改変が、流体力学的に誘起され局在化した界面動電効果への流体の曝露を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
局在化した界面動電効果への曝露が、電圧パルスおよび電流パルスのうちの少なくとも１つへの曝露を含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
流体力学的に誘起された局在化した界面動電効果への流体の曝露が、流体を生成するのに使用される装置の界面動電効果を誘起する構造的特徴への、流体の曝露を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
心血管疾患または状態が、心不整脈、血管疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋炎、アテローム性動脈硬化、および再狭窄からなる群から選択される少なくとも１つの状態または疾患を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
心血管の状態または疾患が、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋炎、およびアテローム性動脈硬化のうちの少なくとも１つのうちの少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
心血管状態または疾患が心筋梗塞およびアテローム性動脈硬化のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記心血管疾患の少なくとも１つの症状が、心不整脈、血管疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋炎、アテローム性動脈硬化、および再狭窄からなる群から選択される少なくとも１つの状態に関する、請求項１に記載の使用。
【請求項１７】
界面動電的に改変された水性流体が、一酸化窒素レベルの局在レベルまたは細胞内レベルを調節する、請求項１に記載の用途。
【請求項１８】
界面動電的に改変された水性流体が、投与部位において、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの局在的な低減を促進する、請求項１に記載の使用。
【請求項１９】
治療が、炎症における相乗的または非相乗的な阻害または低減を目的として、別の抗炎症剤の同時使用または補助的使用をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項２０】
前記他の抗炎症剤が、ステロイドまたは糖質コルチコイドステロイドを含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
糖質コルチコイドステロイドがブデソニドまたはその活性誘導体を含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
治療が、少なくとも１つのさらなる治療薬が患者に投与される併用療法をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのさらなる治療薬が、キニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、リドカイン、フェニトイン、メキシレチン、フレカイニド、プロパフェノン、モリシジン、プロプラノロール、エスモロール、チモロール、メトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、アミオダロン、ソタロール、イブチリド、ドフェチリド、ドロネダロン、Ｅ−４０３１、ベラパミル、ジルチアゼム、アデノシン、ジゴキシン、硫酸マグネシウム、ワルファリン、ヘパリン、抗血小板剤（例えば、アスピリンおよびクロピドグレル）、β遮断薬（例えば、メトプロロールおよびカルベジロール）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、カソキニン（ｃａｓｏｋｉｎｉｎ）およびラクトキニン（ｌａｃｔｏｋｉｎｉｎ））、スタチン（例えば、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチン）、アルドステロン拮抗剤（例えば、エプレレノンおよびスピロノラクトン）、ジギタリス、利尿薬、ジゴキシン、変力物質（例えば、ミルリノン）、血管拡張剤およびω３脂肪酸並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
少なくとも１つのさらなる治療薬がＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗薬である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２５】
ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗薬が、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰ受容体に特異的な中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、並びにＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子または２つ以上の受容体鎖の成分をコードするポリペプチドを含むＴＳＬＰ受容体融合タンパク質からなる群から選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
治療が、膜結合タンパク質の高次構造、リガンド結合活性、または触媒活性の調節を含む、細胞膜の構造または機能のうちの少なくとも１つを調節することを含む、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項２７】
膜結合タンパク質が、受容体、膜貫通受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、インテグリン等からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
膜貫通受容体がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を含む、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）がＧタンパク質αサブユニットと相互作用する、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
Ｇタンパク質αサブユニットがＧαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ、およびＧα１２からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
少なくとも１つのＧタンパク質αサブユニットがＧαｑである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
治療が、全細胞伝導性を調節することを含む、細胞膜伝導性を調節することを含む、請求項２に記載の使用。
【請求項３３】
全細胞伝導性の調節が、全細胞伝導性の少なくとも１つの電位依存性寄与を調節することを含む、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
治療が、カルシウム依存性細胞内伝達経路または系の調節を含む、細胞内シグナル伝達の調節を含む、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節することを含む、請求項２に記載の使用。
【請求項３５】
治療が、ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む細胞内シグナル伝達の調節を含む細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節することを含む、請求項２に記載の使用。
【請求項３６】
治療が、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む、細胞内シグナル伝達の調節を含む、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節することを含む、請求項２に記載の使用。
【請求項３７】
治療が、心血管系における慢性炎症、並びに心血管系における急性炎症からなる群から選択される少なくとも１つの状態または症状に関連する細胞内シグナル伝達の調節を含む、細胞内シグナル伝達を調節することを含む、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項３８】
治療が、細胞ネットワークまたは細胞層への投与を含み、それらの細胞間結合の調節をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３９】
細胞内接合が、密着結合、ギャップ結合、接着帯およびデスモソームからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記細胞ネットワークまたは細胞層が、ＣＮＳ血管における内皮細胞および内皮星状膠細胞の密着結合、血液脳脊髄液の密着結合または関門、肺上皮型結合、気管支上皮型結合、並びに腸上皮型結合からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項３８に記載の使用。
【請求項４１】
界面動電的に改変された水性流体が酸素化されており、流体中の酸素が、大気圧で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５，ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍ酸素の量で存在する、請求項１に記載の使用。
【請求項４２】
界面動電的に改変された流体の帯電安定化した酸素含有ナノ構造中に存在する酸素量が、大気圧で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５，ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍ酸素である、請求項１に記載の使用。
【請求項４３】
界面動電的に改変された水性流体が、溶媒和電子、および界面動電的に修飾または荷電された酸素種の形態のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項４４】
溶媒和電子または界面動電的に修飾もしくは荷電された酸素種の形態が少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
界面動電的に改変され酸素化された水性流体が、分子酸素によって、少なくとも部分的には、安定化した溶媒和電子を含む、請求項４３に記載の使用。
【請求項４６】
細胞内シグナル伝達の調節を提供するのに十分な、細胞膜の構造または機能を変化させる能力が、密閉された気密性容器中で少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月、またはより長い期間持続する、請求項１に記載の使用。
【請求項４７】
膜結合タンパク質がＣＣＲ３を含む、請求項２６に記載の使用。
【請求項４８】
治療が、細胞内のＮＦ−κＢの発現および／または活性の調節を含み；好ましくはＮＦ−κＢの発現および／または活性を低下させる、請求項１に記載の使用。
【請求項４９】
対象が哺乳動物またはヒトである、請求項１に記載の使用。
【請求項５０】
外科手術の少なくとも１つの態様に用いる薬剤または試薬流体の調製のための、界面動電的に改変された水性流体の使用であって、前記流体が、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、外科的に有効な量でイオン水性流体中で安定に形成される帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含む、使用。
【請求項５１】
外科手術が心臓血管手術である、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
外科手術が、心不整脈に関連する外科手術；血管疾患に関連する外科手術；心筋梗塞に関連する外科手術；うっ血性心不全に関連する外科手術；心筋炎に関連する外科手術；アテローム性動脈硬化および再狭窄に関連する外科手術；心肺バイパス（ＣＰＢ）の使用を含む外科手術；血管（例えば、静脈、動脈）保存液の使用を含む外科手術；並びに心筋保護液の使用を含む外科手術からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
界面動電的に改変された流体（例えば、ＲＮＳ６０）の生物活性の簡便なハイスループット測定のための方法であって、
細胞を、約１００ナノメートル未満の平均直径を主に有する帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含む界面動電的に改変された流体と接触させること；
適切なアッセイを用いて、イオンチャネル測定を行うこと；および
イオンチャネル測定値に基づいて、対照流体（例えば、非界面動電的に改変された対照流体）と接触させた細胞のそれと比較して、界面動電的に改変された流体の生物活性レベルまたは値を決定すること、
を含む、方法。
【請求項５４】
イオンチャネル測定が、増強作用、阻害、開閉速度の改変、電位感受性、および作動薬により誘導される活性の調節からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
イオンチャネルが５ＨＴ３ＡおよびＴＲＰＶ１のうちの少なくとも１つである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
セロトニンによって誘導される５ＨＴ３Ａおよびカプサイシンによって誘導されるＴＲＰＶ１のうちの少なくとも１つの測定を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
界面動電的に改変された流体（例えば、ＲＮＳ６０）の生物活性の簡便なハイスループット測定のための方法であって、
約１００ナノメートル未満の平均直径を主に有する帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液に対し、ラマン分光法および蛍光偏光異方性測定のうちの少なくとも１つを行うこと；並びに
少なくとも１つのラマン分光法および蛍光偏光異方性測定を、界面動電的に改変された流体のある量の生物活性と相関させることを含み、界面動電的に改変された流体の生物活性の簡便なハイスループット測定のための方法が提供される、方法。
【請求項５８】
ラマン後方散乱および蛍光偏光異方性のうちの少なくとも１つの測定を含む、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
特定の態様は、一般に、本明細書に記載されるような治療有効量の界面動電的に改変された水性流体を必要とする対象に投与することを含む、心血管疾患およびその関連疾患および症状（例えば、心不整脈、血管疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋炎、アテローム性動脈硬化、および再狭窄のうちの少なくとも１つ）を治療するための方法に関する。ある態様は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、生細胞が流体と接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量でイオン水性流体中で安定に形成される、帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含む、界面動電的に改変された水性流体の使用に関する。さらなる態様は、界面動電的に改変された流体の生物活性を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心血管疾患は、心臓または血管（動脈および静脈）に関わる大きなクラスの疾患である。心血管疾患には、限定はされないが、心不整脈、血管疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋炎、アテローム性動脈硬化、および再狭窄が含まれる。これらの状態の原因、機序、および治療法は類似している。ほとんどの心血管疾患は、炎症、高コレステロール、および肥満症を含む共通の危険因子を共有している。
【０００３】
さらに、食塩水が使用される多くの心血管の外科シナリオが存在し、それにおいては、外科シナリオに伴う有害作用を低減または除去することが望ましいであろう（例えば、心肺バイパス（ＣＰＢ）充填（バイパスポンプ充填液）で、そこでは全身性炎症反応によりＣＰＢの有害作用が引き起こされる；食塩水の使用が有効な、移植完了後に冠血管に流すための静脈保存液（典型的には、パパベリンおよび食塩水）心筋保護液（例えば、カリウムも含有し得る、グルタミン酸および／またはアスパラギン酸含有心筋保護液））。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書に記載されるような治療有効量の界面動電的に改変された水性流体を、必要とする対象に投与することを含む、心血管疾患およびその関連疾患および症状（例えば、心不整脈、血管疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋炎、アテローム性動脈硬化、および再狭窄からなる群から選択される少なくとも１つの状態または疾患）を治療するための方法が提供される。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に（例えば、主に）有し、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な、帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含む。さらに、界面動電的に改変された流体（例えば、界面動電的に改変され、ガス富化された流体および溶液）および治療用組成物の投与経路または製剤が提供され、それと共に、心血管系の手術を含むがそれに限定はされない、外科的な状況においての、界面動電的に改変された水性流体の用途も提供される。
【０００５】
特定の態様は、循環器の疾患または状態を治療するための方法を提供し、該方法は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に（例えば、主に）有する帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含み、循環器の疾患もしくは状態またはその少なくとも１つの症状の治療を提供するのに十分な量でイオン水性流体中で安定に形成される、治療有効量の界面動電的に改変された水性流体を、必要とする対象またはその一部に投与することを含む。ある態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、流体が生細胞と接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量で、イオン水性流体中で安定に形成される。
【０００６】
特定の実施形態では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、流体中の主な帯電安定化したガス含有ナノ構造種である。ある態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造として流体中に存在する溶解酸素分子の割合は、０．０１％超、０．１％超、１％超、５％超；１０％超；１５％超；２０％超；２５％超；３０％超；３５％超；４０％超；４５％超；５０％超；５５％超；６０％超；６５％超；７０％超；７５％超；８０％超；８５％超；９０％超；および９５％超からなる群から選択される割合である。特定の態様では、全溶解酸素は、帯電安定化した酸素含有ナノ構造中に実質的に存在する。セラチンの実施形態では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、９０ｎｍ；８０ｎｍ；７０ｎｍ；６０ｎｍ；５０ｎｍ；４０ｎｍ；３０ｎｍ；２０ｎｍ；１０ｎｍ；および５ｎｍ未満からなる群から選択されるサイズ未満の平均直径を実質的に有する。
【０００７】
好ましい実施形態では、イオン水溶液は食塩水を含む。ある実施形態では、流体は過酸素化されている。
【０００８】
特定の態様では、流体は溶媒和電子の形態を含む
【０００９】
ある態様では、界面動電的に改変された水性流体の改変は、流体力学的に誘起され局在化した界面動電効果への流体の曝露を含む。特定の実施形態では、局在化した界面動電効果への曝露は、電圧パルスおよび電流パルスのうち少なくとも１つへの曝露を含む。特定の実施形態では、流体力学的に誘起され局在化した界面動電効果への流体の曝露は、流体を生成するのに使用される装置の界面動電効果を誘起する構造的特徴への流体の曝露を含む。
【００１０】
ある実施形態では、心血管疾患または状態は、心不整脈、血管疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋炎、アテローム性動脈硬化、および再狭窄からなる群から選択される少なくとも１つの状態または疾患を含む。特定の実施形態では、心血管の状態または疾患は、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋炎、およびアテローム性動脈硬化のうちの少なくとも１つを含む。好ましい態様では、心血管の状態または疾患は、心筋梗塞およびアテローム性動脈硬化のうちの少なくとも１つを含む。
【００１１】
特定の態様では、前記心血管疾患の少なくとも１つの症状は、心不整脈、血管疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋炎、アテローム性動脈硬化、および再狭窄からなる群から選択される少なくとも１つの状態に関連する。
【００１２】
ある態様では、界面動電的に改変された水性流体は、一酸化窒素の局在レベルまたは細胞内レベルを調節する。
【００１３】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの投与部位における局在的な低減を促進する。
【００１４】
特定の態様は、別の抗炎症剤で対象を同時に、または補助的に治療することによる、炎症における相乗的または非相乗的な阻害または低減をさらに含む。ある実施形態では、前記他の抗炎症剤には、ステロイドまたは糖質コルチコイドステロイド（例えば、ブデソニドまたはその活性誘導体を含む）が含まれる。
【００１５】
特定の態様には、少なくとも１つのさらなる治療薬が患者に投与される併用療法がさらに含まれる。ある実施形態では、前記少なくとも１つのさらなる治療薬は、キニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、リドカイン、フェニトイン、メキシレチン、フレカイニド、プロパフェノン、モリシジン、プロプラノロール、エスモロール、チモロール、メトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、アミオダロン、ソタロール、イブチリド、ドフェチリド、ドロネダロン、Ｅ−４０３１、ベラパミル、ジルチアゼム、アデノシン、ジゴキシン、硫酸マグネシウム、ワルファリン、ヘパリン、抗血小板剤（例えば、アスピリンおよびクロピドグレル）、β遮断薬（例えば、メトプロロールおよびカルベジロール）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、カソキニン（ｃａｓｏｋｉｎｉｎ）およびラクトキニン（ｌａｃｔｏｋｉｎｉｎ））、スタチン（例えば、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチン）、アルドステロン拮抗剤（例えば、エプレレノンおよびスピロノラクトン）、ジギタリス、利尿薬、ジゴキシン、変力物質（例えば、ミルリノン）、血管拡張剤およびω３脂肪酸並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１６】
ある実施形態では、前記少なくとも１つのさらなる治療薬は、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲの拮抗薬を含む。特定の態様では、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲの拮抗薬は、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰ受容体に特異的な中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、並びに２つ以上の受容体鎖の成分をコードするＴＳＬＰＲ−免疫グロブリンＦｃ分子またはポリペプチドを含むＴＳＬＰ受容体融合タンパク質からなる群から選択される。
【００１７】
特定の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節は、膜結合タンパク質の高次構造、リガンド結合活性、または触媒活性の調節を含む、細胞膜の構造または機能のうち少なくとも１つを調節することを含む。ある実施形態では、膜結合タンパク質には、受容体、膜貫通受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、インテグリン等からなる群から選択される少なくとも１つが含まれる。特定の態様では、膜貫通受容体にはＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）が含まれる。ある実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）はＧタンパク質のαサブユニットと相互作用する。特定の態様では、Ｇタンパク質のαサブユニットは、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ、およびＧα１２からなる群から選択される少なくとも１つを含む。ある実施形態では、少なくとも１つのＧタンパク質αサブユニットはＧαｑである。
【００１８】
特定の態様では、細胞膜伝導性を調節することには、全細胞伝導性を調節することが含まれる。ある実施形態では、全細胞伝導性を調節することには、全細胞伝導性の少なくとも１つの電位依存性寄与を調節することが含まれる。
【００１９】
ある態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節は、カルシウム依存性細胞内伝達経路または系の調節を含む細胞内シグナル伝達を調節することを含む。ある態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節は、ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む細胞内シグナル伝達を調節することを含む。ある態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節は、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む細胞内シグナル伝達を調節することを含む。ある態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節は、心血管系における慢性炎症、および心血管系における急性炎症からなる群から選択される、少なくとも１つの状態または症状に関連する細胞内シグナル伝達の調節を含む、細胞内シグナル伝達を調節することを含む。
【００２０】
特定の態様では、本方法は、細胞ネットワークまたは細胞層への投与を含み、その中の細胞間結合の調節をさらに含む。ある実施形態では、細胞間結合には、密着結合、ギャップ結合、接着帯およびデスモソームからなる群から選択される少なくとも１つが含まれる。特定の実施形態では、細胞ネットワークまたは細胞層には、ＣＮＳ血管内における内皮細胞および内皮型星状膠細胞の密着結合、血液脳脊髄液の密着結合または関門、肺上皮型結合、気管支上皮型結合、並びに腸上皮型結合からなる群から選択される少なくとも１つが含まれる。
【００２１】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は酸素化されており、流体中の酸素は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素の量で存在する。ある態様では、界面動電的に改変された流体の帯電安定化した酸素含有ナノ構造に存在する酸素の量は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素である。
【００２２】
ある態様では、界面動電的に改変された水性流体は、溶媒和電子、および界面動電的に修飾または荷電された酸素種の形態のうち少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、溶媒和電子または界面動電的に修飾または荷電された酸素種の形態は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。特定の実施形態では、界面動電的に改変され酸素化された水性流体は、分子酸素によって少なくとも部分的に安定化された溶媒和電子を含む。
【００２３】
特定の態様では、細胞内シグナル伝達の調節を提供するのに十分な、細胞膜の構造または機能を変化させる能力は、密閉された気密容器内で、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、またはより長期間持続する。
【００２４】
ある態様では、膜結合タンパク質はＣＣＲ３を含む。
【００２５】
特定の態様では、治療には、細胞内ＮＦ−κＢの発現および／または活性の調節が含まれる。
【００２６】
好ましい態様では、対象は哺乳動物、またはヒトである。
【００２７】
特定の態様は、試薬流体が少なくとも１つの外科手術の態様において用いられ、試薬流体が、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含む外科的に有効量の界面動電的に改変された水性流体を含む、外科手術を、必要とする対象に対し行うことを含む、外科手術を行うための方法を提供する。
【００２８】
特定の態様では、外科手術は、心不整脈に関連する外科手術；血管疾患に関連する外科手術；心筋梗塞に関連する外科手術；うっ血性心不全に関連する外科手術；心筋炎に関連する外科手術；アテローム性動脈硬化および再狭窄に関連する外科手術；心肺バイパス（ＣＰＢ）の使用を含む外科手術；血管（例えば、静脈、動脈）保存液の使用を含む外科手術；並びに心筋保護液の使用を含む外科手術からなる群から選択される少なくとも１つを含む。
【００２９】
さらなる態様は、界面動電的に改変された流体（例えば、ＲＮＳ６０）の生物活性の簡便なハイスループット測定のための方法を提供し、該方法は、細胞を本明細書で定義されるような界面動電的に改変された流体と接触させること；適切なアッセイを用いて、イオンチャネル測定を行うこと；および対照流体と接触させた細胞のイオンチャネル測定と比較した、上記イオンチャネル測定値に基づいて、界面動電的に改変された流体の生物活性レベルまたは値を決定することを含む。ある実施形態では、イオンチャネル測定は、増強作用、阻害、開閉速度の改変、電位感受性、および作動薬誘発性の活性の調節からなる群から選択される少なくとも１つである。特定の態様では、イオンチャネルは、５ＨＴ３ＡおよびＴＲＰＶ１のうちの少なくとも１つである。ある実施形態では、前記方法は、セロトニン誘発性５ＨＴ３Ａおよびカプサイシン誘発性ＴＲＰＶ１のうちの少なくとも１つの測定を含む。
【００３０】
さらに別の態様は、界面動電的に改変された流体（例えば、ＲＮＳ６０）の生物活性の、簡便なハイスループット測定法を提供し、該方法は、細胞を本明細書で定義されるような界面動電的に改変された流体と接触させること；ラマン分光法および蛍光偏光異方性測定のうちの少なくとも１つを行うこと；並びに対照流体と接触させた細胞の測定値と比較した、少なくとも上記１つの測定値に基づいて、界面動電的に改変された流体の生物活性レベルまたは値を測定することを含む。ある実施形態では、前記方法は、ラマン後方散乱および蛍光偏光異方性のうちの少なくとも１つの測定を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ガス富化流体および脱イオン化対照流体の存在下における分裂促進アッセイのサイトカインプロファイルを示す。
【図２】サイトカインに関する全血試料の評価結果を示す。
【図３】同上。
【図４】同上。
【図５】同上。
【図６】同上。
【図７】同上。
【図８】同上。
【図９】同上。
【図１０】同上。
【図１１】同上。
【図１２】対応するサイトカインの、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）試料評価の結果を示す。
【図１３】同上。
【図１４】同上。
【図１５】同上。
【図１６】同上。
【図１７】同上。
【図１８】同上。
【図１９】同上。
【図２０】同上。
【図２１】同上。
【図２２】本明細書で開示される特定の実施形態の、調節性Ｔ細胞に影響する能力を示すデータを示す。前記試験は、抗原提示細胞を照射すること、並びに抗原およびＴ細胞を導入することを含んだ。
【図２３】同上。
【図２４】同上。
【図２５】同上。
【図２６】同上。
【図２７】同上。
【図２８】同上。
【図２９】同上。
【図３０】ＲＤＣ１６７６−０１（即席の独自開発装置を通して処理し、さらに酸素を付加した無菌食塩水；ガス富化され、界面動伝的に生成された流体（Ｒｅｖ））に曝露されたヒト包皮ケラチノサイトから得られたデータを示す。
【図３１】同上。
【図３２】同上。
【図３３】同上。
【図３４】同上。
【図３５】Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットのオボアルブミン感作モデルにおける、本発明の界面動伝的に生成された流体の気道抗炎症特性を評価するために行われた、本発明の界面動伝的に生成された流体にブデソニドを併用した実験の結果を示す。本発明の界面動伝的に生成された流体は、好酸球数を減少させ、好酸球数を減少させることにおいてブデソニドと強力な相乗作用を示し、エオタキシンの血中レベルを減少させ、本発明の界面動伝的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０）単独による処置、またはブデソニドを組み合わせての処置の結果として、曝露から６時間後に主要な、２つの重要な抗炎症サイトカイン、ＩＬ１０およびインターフェロンγの血中レベルを有意に増強し、ランテスの全身レベルを減少させた。
【図３６】同上。
【図３７】同上。
【図３８】同上。
【図３９】本発明の界面動伝的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）が、気管支上皮細胞におけるＤＥＰによって誘導された細胞表面結合型のＭＭＰ−９レベルを、それぞれおよそ８０％、および７０％だけ阻害したが、生理食塩水（ＮＳ）はわずかな効果しか持たなかったことを示す。
【図４０】Ａ〜Ｂは、白血球の細胞表面受容体であるＣＤ１９３（ＣＣＲ３）の発現レベルを、生理食塩水またはＲＮＳ−６０のいずれかを用いて比較した、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析の結果を示す。Ｘ軸は試料の対数蛍光を表わし、Ｙ軸は試料中に生じる蛍光の現象を表わしている。
【図４１】Ａ〜Ｃは、白血球の細胞表面受容体である、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）（パネルＡ）；ＣＤ１１Ｂ（パネルＢ）；およびＣＤ３（パネルＣ）の発現レベルを、生理食塩水またはＲＮＳ−６０のいずれかを用いて比較した、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析の結果を示す。Ｘ軸は試料の対数蛍光を表わし、Ｙ軸は試料に生じる蛍光の事象を表わしている。
【図４２】Ａ〜Ｃは、ＭＢＰ刺激を受けたＴ細胞におけるＮＦκＢの活性化に対するＲＮＳ６０の効果を試験した、２つのゲル移動度シフト実験（パネルＡおよびＢ）およびルシフェラーゼ活性（レポーター遺伝子）アッセイ（パネルＣ）の結果を示す。
【図４３】Ａ〜Ｄは、心筋梗塞を誘導したときの、トロポニン（パネルＡおよびＢ）およびクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）（パネルＣおよびＤ）の血中レベルの時間経過をグラフ表示したものである。
【図４４】Ａ〜Ｉは、特定の態様による、対照で処置された雄の動物（＃３０３３）で見られた壊死組織の例を示す。
【図４５】ＡおよびＢは、特定の態様による、ラマン後方散乱により測定した、ＲＮＳ６０（４５Ｂ）に対する温度上昇（心臓）の影響を、対照のＰＮＳ６０（４５Ａ）と比較して示しており、それぞれの差異曲線、および２つの酸素ピークを示す。
【図４６】特定の態様による、「ＲＮＳ６０」（「ロットＡ」および「ロットＢ」）、「ＮＳ」（生理食塩水対照）、「ＲＤＷ」（界面動電的に処理した脱イオン水）および「ＤＷ」（脱イオン水）間の蛍光偏光異方性データにおける、小さいが有意な差異を示している。
【図４７】特定の態様によれば、細胞外に散布されたＲＮＳ６０（８９％）は、セロトニン誘導性５ＨＴ３Ａ（イオンチャネル）活性を増強することを示す（対照と比較して、−１０１．８±２４．２％（ｎ＝３）の平均阻害）。
【図４８】特定の態様によれば、ＲＮＳ６０（８４％）は、カプサイシン誘導性ＴＲＰＶ１（イオンチャネル）電流を阻害することを示す（−９０．９±６．７％（ｎ＝３）の平均阻害）。比較は、生理食塩水、１００ｎｍ  カプサイシン、および１００ｎｍ  カプサイシン＋８７％  ＲＮＳ６０間のものである。
【図４９】特定の態様によれば、ＲＮＳ６０散布は心筋細胞における電気的なスパイクを改変することを示している；Ｖ傾斜、−１００ｍＶ→＋４０ｍＶ；ΔＶスパイク、１．６７±．４７ｍＶ；Δｔスパイク、５．９５  １．６７ｍ秒（ｎ＝６）。機序に束縛されるものではないが、スパイクの遅延は、Ｎａｖ１．５との相互作用によるものである可能性がある。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本明細書に記載されるような治療有効量の界面動電的に改変された水性流体を必要とする対象に投与することを含む、心血管疾患およびその関連疾患および症状（例えば、心不整脈、血管疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋炎、アテローム性動脈硬化、および再狭窄からなる群から選択される少なくとも１つの状態または疾患）を治療するための方法が提供される。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、生細胞が流体と接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量で、イオン水性流体中で安定に形成される、帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含む。他の実施形態は、界面動電的に改変された流体（例えば、界面動電的に改変され、ガス富化された流体および溶液）および治療用組成物のための特定の投与経路または製剤を含む。
【００３３】
界面動電的に生成された流体：
本明細書で使用する「界面動電的に生成された流体」とは、本明細書の実施例の目的上、本明細書に詳述される代表的な混合装置により生成される、本出願人の発明による界面動電的に生成された流体を指す（米国公開特許第２００８０２１９００８８号および国際公開第２００８／０５２１４３号も参照のこと。両方とも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書に開示され提示されるデータが示すように、界面動電流体は、先行技術である含酸素化非界面動電流体（例えば、加圧ポット含酸素化流体等）を含む、先行技術である非界面動電流体と比べて、新規かつ根本的に異なる流体を表す。本明細書の様々な態様で開示されるように、界面動電的に生成された流体は、独特かつ新規の物理的および生物学的特性を有する。例えば下記の特性を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含み、この流体により生細胞に接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される。
【００３５】
特定の態様では、界面動電的に生成された流体とは、本明細書に記載される装置機能局在化効果等の、流体力学的に誘起され、局在化した（例えば、全流体体積に関して不均一な）界面動電効果（例えば、電圧／電流パルス）の存在下で生成された流体を指す。特定の態様では、この流体力学的に誘起され局在化した界面動電効果は、本明細書に開示され論じられるように、表面に関連した二重層および／または流動電流効果と組み合わされる。
【００３６】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、その中に溶解されるレポーター溶質（例えば、トレハロース）の１３Ｃ−ＮＭＲの線幅を調節するのに適している。ＮＭＲ線幅効果は、例えば、本明細書の特定の実施例で説明されているように、試験流体中の溶質の「タンブリング」を測定する間接的方法におけるものである。
【００３７】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、−０．１４Ｖ、−０．４７Ｖ、−１．０２Ｖ、および−１．３６Ｖのうちのいずれか１つでの特徴的な矩形波ボルタンメトリーピーク差；−０．９ボルトでのポーラログラフピーク；ならびに−０．１９および−０．３ボルトでのポーラログラフピークの不存在のうちの少なくとも１つによって特徴付けられ、これらは、本明細書の特定の実施例に開示されるように、界面動電的に生成された流体に特有のものである。
【００３８】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、細胞膜伝導性（例えば、本明細書に開示されるパッチクランプ実験において測定される、全細胞伝導性の電位依存性寄与）を改変するのに適している。
【００３９】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は含酸素化され、流体中の酸素は、大気圧において、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの溶解酸素量で存在する。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、大気圧で、またはおおよその周囲酸素レベルで、１５ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満の溶解酸素を有する。
【００４０】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は含酸素化され、流体中の酸素は約８ｐｐｍ〜約１５ｐｐｍの量で存在し、この場合、本明細書では「Ｓｏｌａｓ」とも称する。
【００４１】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、溶媒和電子（例えば、酸素分子により安定化されたもの）、および界面動電的に修飾され、かつ／または帯電した酸素種のうちの少なくとも１つを含み、ある実施形態では、この溶媒和電子および／または界面動電的に修飾もしくは荷電された酸素種は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。
【００４２】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、対照の非界面動電的に改変された流体に対して異なる（例えば、上昇または低下した）誘電率で特徴付けられる。好適な態様では、界面動電的に改変された流体は、対照の非界面動電的に改変された流体に対して異なる、上昇した誘電率で特徴付けられる。誘電率（ε）（ファラド毎メートル）とは、ある物質が電場により極性を与えられ、それにより物質内の総電場を低減する能力の尺度である。したがって、誘電率（ｐｅｒｍｉｔｔｉｖｉｔｙ）は、物質が電場を伝導する（すなわち「許可」（ｐｅｒｍｉｔ）する）能力に関係する。密接に関係する特性の１つであるキャパシタンス（Ｃ）（ファラド；クーロン／ボルト）は、ある物質の両端に電圧をかけた場合に、その物質が電荷を保持する能力を示す尺度である（例えば、２枚の並行した導電板に挟まれた誘電体層が最良モデルである）。キャパシタンスＣのコンデンサの両端に電圧Ｖを印加した場合、コンデンサが保持できる電荷Ｑは印加電圧Ｖに正比例し、キャパシタンスＣが比例定数となる。したがって、Ｑ＝ＣＶすなわちＣ＝Ｑ／Ｖとなる。コンデンサのキャパシタンスは、誘電体層の誘電率εによって異なるだけでなく、コンデンサの面積Ａ、および２枚の導電板間の分離距離ｄによっても異なる。誘電率とキャパシタンスの数学的関係は、Ｃ＝ε（Ａ／ｄ）である。使用する誘電体が真空である場合、キャパシタンスＣｏ＝εｏ（Ａ／ｄ）となる。ここで、εｏは真空の誘電率（８．８５×１０−１２Ｆ／ｍ）である。比誘電率（ｋ）、すなわち物質の相対誘電率は、真空の誘電率εｏに対する物質の誘電率εの比であり、よってｋ＝ε／εｏである（真空の比誘電率は１）。ｋ値の低い誘電体は、誘電率の低い誘電体であり、すなわち極性を有し電荷を保持する能力が低い。これに対して、ｋ値の高い誘電体は、誘電率が高い。ｋ値の高い誘電体は電荷を保持する能力が高いため、コンデンサ用の好適な誘電体である。ｋ値の高い誘電体は、デジタルデータを電荷の形で保存するメモリーセルにも使用される。
【００４３】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、細胞内シグナル伝達の調節を提供するのに十分なだけ細胞膜構造または機能を改変する（例えば、膜結合タンパク質の立体配座、リガンド結合活性、または触媒活性を改変する）のに適しており、特定の態様では、膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体（例えば、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、ＴＳＬＰ受容体、β２アドレナリン受容体、ブラジキニン受容体等）、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、およびインテグリンからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。ある態様では、作用を受けたＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｇタンパク質αサブユニット（例えば、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ、およびＧα１２）と相互作用する。
【００４４】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、細胞内シグナル伝達を調節するのに適しており、この調節は、カルシウム依存性の細胞伝達経路またはシステムの調節（例えば、ホスホリパーゼＣ活性の調節、またはアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節）を含む。
【００４５】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、実施例および本明細書の他の箇所に記載される、種々の生物学的活性（例えば、サイトカイン、受容体、酵素、および他のタンパク質、ならびに細胞内シグナル経路の調節）により特徴付けられる。
【００４６】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、本明細書の実施例に示されるように、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）におけるＤＥＰ誘発された細胞表面結合型ＭＭＰ９のレベルを阻害する。
【００４７】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体の生物学的効果は、ジフテリア毒素により阻害され、このことは、本明細書の実施例に示されるように、β遮断、ＧＰＣＲ遮断、カルシウムチャネル遮断が、界面動電的に改変された水性流体の活性（例えば、制御性Ｔ細胞機能に対する活性）に影響を及ぼすことを示す。
【００４８】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体の物理的および生物学的効果（例えば、細胞内シグナル伝達の調節を提供するのに十分な細胞膜構造または機能の改変能力）は、閉鎖された容器内（例えば、閉鎖された気密性容器内）で、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、またはそれ以上の期間持続する。
【００４９】
したがって、さらなる態様は、このような界面動電的に生成された溶液を提供し、界面動電的に改変された含酸素化水性流体または溶液を生産する方法を提供する。本方法は、相対運動で２つの相隔てる表面の間に流体物質の流れを提供し、それらの間の混合体積を画定することと（ここで、混合体積内また混合体積を通過して流動流体物質が１回移動する際の滞留時間は０．０６秒超または０．１秒超である）、流動流体物質中に少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素を溶解し流体または溶液を界面動電的に改変するのに適した条件下で、混合体積内において酸素（Ｏ２）を流動流体物質に導入することと、を含む。ある態様では、酸素は、１００ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、または４００ミリ秒未満の間に流動流体物質中に注入される。特定の実施形態では、体積に対する表面積の比は、少なくとも１２、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０である。
【００５０】
さらなる態様は、界面動電的に改変された含酸素化水性流体または溶液を生産する方法を提供し、本方法は、２つの相隔てる表面の間に流体物質の流れを提供し、それらの間の混合体積を画定することと、１００ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、または４００ミリ秒未満において、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、もしくは少なくとも６０ｐｐｍの酸素を流動流体物質に注入するのに適した条件下で、混合体積内において酸素を流動流体物質に導入することと、を含む。ある態様では、混合体積内での流動物質の滞留時間は、０．０６秒超または０．１秒超である。特定の実施形態では、体積に対する表面積の比は、少なくとも１２、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０である。
【００５１】
さらなる実施形態は、界面動電的に改変された含酸素化水性流体または溶液を生産する方法を提供し、本方法は、第１の物質と第２の物質を混合することにより出力混合物を作製するための混合装置の使用を含み、この装置は、第１の物質の源から第１の物質を受容するように構成された第１のチャンバと；固定子と；回転軸を有する回転子であって、固定子内部に配設され、その中の回転軸の周囲を回転するように構成され、回転子および固定子のうちの少なくとも１つは、複数のスルーホールを有する、回転子と；回転子と固定子の間に画定される混合チャンバであって、第１のチャンバと流体連通し、そこから第１の物質を受容するように構成され、第２の物質は、回転子および固定子のうちの１つに形成された複数のスルーホールを介して混合チャンバに提供される、混合チャンバと；混合チャンバと流体連通し、そこから産出物質を受容するように構成された、第２のチャンバと；第１のチャンバ内部に格納された第１の内部ポンプであって、第１のチャンバから混合チャンバに第１の物質を送出するように構成される、第１の内部ポンプと、を含む。ある態様では、第１の内部ポンプは、第１の物質が混合チャンバに流入する前に第１の物質に周速度を与えるように構成される。
【００５２】
さらなる実施形態は、界面動電的に改変された含酸素化水性流体または溶液を生産する方法を提供し、本方法は、第１の物質と第２の物質を混合することにより出力混合物を作製するための混合装置の使用を含み、この装置は、固定子と；回転軸を有する回転子であって、固定子内部に配設され、その中の回転軸の周囲を回転するように構成される回転子と；回転子と固定子の間に画定される混合チャンバであって、第１の物質が混合チャンバに入る際に通る第１の開口末端と、産出物質が混合チャンバを出る際に通る第２の開口末端と、を有し、第２の物質が回転子と固定子のうちの少なくとも１つを通って混合チャンバに流入する、混合チャンバと；混合チャンバの第１の開口末端の少なくとも大部分と連通する第１のチャンバと；混合チャンバの第２の開口末端と連通する第２のチャンバと、を含む。
【００５３】
さらなる態様は、上記の方法のいずれかに従って作製された、界面動電的に改変された含酸素化水性流体または溶液を提供する。特定の態様では、投与される本発明の界面動電的に改変された流体は、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、帯電安定化した酸素含有ナノ構造を含む。ある実施形態では、界面動電的に改変された流体は、過酸素化される（例えば、標準食塩水中、それぞれ、２０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの溶解酸素を含む、ＲＮＳ−２０、ＲＮＳ−４０、およびＲＮＳ−６０である）。特定の実施形態では、界面動電的に改変された流体は、過酸素化されない（例えば、１０ｐｐｍ（例えば、標準食塩水中ほぼ周囲レベルの溶解酸素）を含むＲＮＳ−１０またはＳｏｌａｓである）。ある態様では、本発明の界面動電的に改変された流体の塩分、無菌性、ｐＨ等は、流体が界面動電的的に生成されるときに確立され、適切な経路により滅菌流体が投与される。あるいは、流体の塩分、無菌性、ｐＨ等のうちの少なくとも１つは、流体の投与前に、投与経路に生理学的に適合するように、（例えば、滅菌食塩水または適切な希釈剤を用いて）適切に調整される。好ましくは、流体の塩分、無菌性、ｐＨ等のうちの少なくとも１つを調整するために使用される希釈剤および／または食塩溶液および／または緩衝組成物も、界面動電流体であるか、または他の手段によりこれらと適合性を有する。
【００５４】
特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体は、食塩水（例えば、１つまたは複数の溶解塩；例えば、アルカリ金属ベースの塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ等）またはアルカリ土類ベースの塩（例えば、Ｍｇ、Ｃａ）等を含み、任意の好適なアニオン成分を共に含む。特定の態様は、混合塩ベースの界面動電流体（例えば、種々の組み合わせおよび濃度のＮａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ等）を含む。特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体は、標準食塩水（例えば、約０．９％  ＮａＣｌまたは約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）を含む。特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体は、濃度が少なくとも０．０００２Ｍ、少なくとも０．０００３Ｍ、少なくとも０．００１Ｍ、少なくとも０．００５Ｍ、少なくとも０．０１Ｍ、少なくとも０．０１５Ｍ、少なくとも０．１Ｍ、少なくとも０．１５Ｍ、または少なくとも０．２Ｍの食塩水を含む。特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体の伝導率は、少なくとも１０μＳ／ｃｍ、少なくとも４０μＳ／ｃｍ、少なくとも８０μＳ／ｃｍ、少なくとも１００μＳ／ｃｍ、少なくとも１５０μＳ／ｃｍ、少なくとも２００μＳ／ｃｍ、少なくとも３００μＳ／ｃｍ、または少なくとも５００μＳ／ｃｍ、少なくとも１ｍＳ／ｃｍ、少なくとも５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも４０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも８０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１００ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１５０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも２００ｍＳ／ｃｍ、少なくとも３００ｍＳ／ｃｍ、または少なくとも５００ｍＳ／ｃｍである。特定の態様では、本明細書に開示される生物活性塩安定化ナノ構造（例えば、塩で安定化された酸素含有ナノ構造）の形成を可能にするという条件で、任意の塩を使用して、本発明の界面動電的に改変された流体を調製してよい。
【００５５】
特定の態様によれば、帯電安定化したガス含有ナノ構造を含む本発明の流体組成物の生物学的効果は、例えば上記のように、流体のイオン成分を改変することによって、および／または流体のガス成分を改変する事によって、調整（例えば、増加、減少、整調等）され得る。好ましい態様では、本発明の界面動電流体の調製時に酸素を使用する。さらなる態様では、窒素、酸素、アルゴン、二酸化炭素、ネオン、ヘリウム、クリプトン、水素、およびキセノンから選ばれる少なくとも１つの他のガスと酸素の混合物を使用する。
【００５６】
本明細書に開示される教示事項およびアッセイシステム（例えば、細胞ベースのサイトカインアッセイ、パッチクランプアッセイ等）から、当業者であれば、本明細書に開示される生物活性を達成するための適切な塩およびその濃度を容易に選択できるであろう。
【００５７】
表１．代表的なカチオンおよびアニオン
【表１−１】
2013538803.tif 000002
【表１−２】
2013538803.tif 000003
【表２−１】
2013538803.tif 000004
【表２−２】
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【００５８】
表２．代表的なカチオンおよびアニオン
【表３】
2013538803.tif 000006
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
2013538803.tif 000010
【００５９】
本開示は新規のガス富化流体について記載しており、このガス富化流体には、ガス富化イオン水溶液、水性食塩溶液（例えば、標準の水性食塩溶液、および本明細書で論じられ、かつ当技術分野でも認識されると考えられる、生理学的に適合する任意の食塩溶液を含む他の食塩溶液）、細胞培養培地（例えば、最小培地、および他の培養培地）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
心血管疾患および関連疾患
心血管疾患は、心臓または血管（動脈および静脈）に関わる疾患の大きなクラスである。心血管疾患には、限定はされないが、心不整脈、血管疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋炎、アテローム性動脈硬化、および再狭窄が含まれる。これらの状態の原因、機序、および治療法は類似している。ほとんどの心血管疾患は、炎症、高コレステロール、および肥満症を含む共通の危険因子を共有している。Ｃ反応性タンパク質、インターロイキン６（ＩＬ−６）、およびインターロイキン８（ＩＬ−８）を含む炎症性生物マーカーは、心血管疾患に関連があるとされている。さらに、マトリックスメタロプロテアーゼは、心血管疾患に関与することが最近になった分かった。
【００６１】
心不整脈は、心臓に異常な電気的活動がある、大きく異質な状態群のいずれかを表わす用語である。心拍動は、過度に速くまたは過度に遅くなり得、規則的または不規則的であり得る。ある種の不整脈は、心停止および突然死を引き起こし得る生命を危うくするような医学的な緊急事態である。他は、心拍動（動悸）の異常な認識等の症状を引き起こし、単に厄介なだけのものであり得る。これらの動悸は、心房／心室細動、電線の欠陥、および心臓ペースメーカー／除細動器における他の技術的または機械的な問題によって引き起こされることも知られている。さらに他の種類は、いかなる症状にも全く関連がない場合もあるが、患者を生命にかかわる恐れのある脳卒中または塞栓症の素因となる場合もある。心不整脈の治療には、心房細動、心房粗動、心室頻拍、および心室細動等の心臓（心不整脈）の速律動を抑制するのに用いられる、抗不整脈薬と呼ばれる薬剤の一群が含まれる。抗不整脈薬の５つの主要なクラスが存在する。キニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、リドカイン、フェニトイン、メキシレチン、フレカイニド、プロパフェノン、およびモリシジンを含むがこれらに限定はされないクラスＩ薬剤は、ナトリウム（Ｎａ＋）チャネルを妨げる。クラスＩＩ薬剤（例えば、プロプラノロール、エスモロール、チモロール、メトプロロール、アテノロール、およびビソプロロール）は、抗交感神経系薬剤であり、その大部分はβ遮断薬である。クラスＩＩＩ薬剤（例えば、アミオダロン、ソタロール、イブチリド、ドフェチリド、ドロネダロンおよびＥ−４０３１）は、カリウム（Ｋ＋）流出に影響を及ぼす。クラスＩＶ薬剤（例えば、ベラパミルおよびジルチアゼム）は、カルシウムチャネルおよびＡＶ結節に影響を及ぼす。クラスＶ薬剤（例えば、アデノシン、ジゴキシンおよび硫酸マグネシウム）は、他の、または未知の機序によって働く。さらに、不整脈は心臓内で血液凝固を促進し、塞栓および脳卒中のリスクを増加させる場合があるため、抗凝固薬剤（例えば、ワルファリンおよびヘパリン）およびアスピリン等の抗血小板剤が、凝固のリスクを低減させるために頻繁に使用される。
【００６２】
血管疾患は大型および中型の筋性動脈の病理状態であり、内皮細胞の機能不全によって引き起こされる。病原体のような因子を原因として、酸化ＬＤＬ粒子および他の炎症性刺激内皮細胞は活性型になる。これはそれらの特徴に変化をもたらし、内皮細胞はサイトカインおよびケモカインを分泌し始め、そしてそれらの表面上に接着分子を発現し始める。これが次いで白血球（単球およびリンパ球）の動員をもたらし、その白血球は血管壁に浸潤することができる。内皮細胞および動員された白血球によって産生されたサイトカインによる平滑筋細胞層の刺激は、平滑筋細胞の増殖および血管腔への遊走を引き起こす。その過程により血管壁の肥厚がもたらされ、増殖性の平滑筋細胞、マクロファージおよび様々な種類のリンパ球からなるプラークが形成される。このプラークによって血流の閉塞が引き起こされ、それによって標的器官に到達する酸素および栄養の量が減少する。最終段階では、プラークは破綻し、血餅を形成し、その結果、脳卒中を引き起こす場合もある。
【００６３】
心筋梗塞（ＭＩ）または急性心筋梗塞（ＡＭＩ）は、心発作として一般に知られている、心臓部分への血液供給の途切れであり、これにより心筋細胞死が引き起こされる。これは、それに続く、動脈壁内の脂質および白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ）の不安定な集積である、脆弱な動脈硬化巣の破綻に続く冠動脈の閉塞に起因することが最も多い。結果として生じる虚血および酸素不足は、十分な期間治療されないままであると、心筋組織の損傷または死（梗塞）を引き起こし得る。
【００６４】
急性心筋梗塞の古典的な症状には、突然の胸痛（典型的には左腕または頸部の右側に広がる）、息切れ、悪心、嘔吐、動悸、発汗、および不安（切迫した不運の感覚としてしばしば説明される）が含まれる。女性が経験し得る典型的な症状は男性よりも少なく、最も多いのは息切れ、脱力、消化不良感、および疲労である。全心筋梗塞のおよそ４分の１は無症状であり、胸痛または他の症状がない。
【００６５】
診断検査の中では、心電図（ＥＣＧ）、胸部Ｘ線、および種々の血液検査が心筋の損傷を検出するのに利用可能である。最も頻繁に使用されるマーカーは、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）画分およびトロポニンレベルである。急性心筋梗塞の疑いへの緊急治療には、酸素、アスピリン、および舌下へのニトログリセリンが含まれる。
【００６６】
患者は通常、さらなる心筋梗塞、うっ血性心不全または脳血管発作（ＣＶＡ）等の続発性の心血管事象を防止することを目的として、心筋梗塞後にいくつかの長期間にわたる薬物治療を開始する。続発の心血管事象の防止に有用な薬物療法には、限定はされないが、抗血小板剤治療（例えば、アスピリンおよびクロピドグレル）、β遮断薬（例えば、メトプロロールおよびカルベジロール）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、カソキニン（ｃａｓｏｋｉｎｉｎ）およびラクトキニン（ｌａｃｔｏｋｉｎｉｎ））、スタチン（例えば、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチン）、アルドステロン拮抗剤（例えば、エプレレノンおよびスピロノラクトン）およびω３脂肪酸が含まれる。
【００６７】
うっ血性心不全（ＣＨＦ）、または心不全は、心臓が十分な血液を身体の他の器官へポンピングするのを制限される状態である。これは、心筋に血液を供給する動脈の狭窄（例えば、冠動脈疾患）、心筋の正常な動作を妨害する瘢痕組織を有する過去の心筋梗塞、高血圧、過去のリウマチ熱もしくは他の原因による心臓弁膜症、心筋症、先天性心疾患、心内膜炎および／または心筋炎が原因である可能性がある。血液が心臓からゆっくりと流れ出るため、静脈をとおって心臓へ戻る血液が逆流し、組織における鬱血を引き起こし、しばしば、水腫を引き起こす。特に横になっているときに、液体が肺に集まって呼吸を妨げ、息切れを引き起こす場合がある。ＣＨＦの治療には、安静、適切な食事、日常活動の修正および医薬品が含まれ、医薬品には、限定はされないが、β遮断薬（例えば、メトプロロールおよびカルベジロール）、ＡＣＥ阻害剤（例えば、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、カソキニン（ｃａｓｏｋｉｎｉｎ）およびラクトキニン（ｌａｃｔｏｋｉｎｉｎ））、ジギタリス、利尿薬、および血管拡張剤が含まれる。ＡＣＥ阻害剤および血管拡張剤は血管を拡張し、抵抗を減少させる。β遮断薬は、心臓の左下のチャンバ（左心室）がいかに良好にポンピングするかを改善することができる。ジギタリスは心筋のポンプ作用を増加させ；一方、利尿薬は、身体が過剰な塩および水を排除するのを助ける。
【００６８】
心筋炎は心筋の炎症である（虚血心筋）。心発作に似ているが、冠動脈は遮断されない。心筋炎は、ほとんどの場合、パルボウイルスＢ１９等の一般的なウイルス、ライム病ボレノア（ライム病）もしくはクルーズトリパノソーマ等の一般的でない非ウイルス性病原体の感染によるものであるか、または薬剤への過敏性反応として現れる。心筋炎の中心となる特徴は、炎症性浸潤を伴う心臓の感染、そして冠動脈の遮断または他の一般的な非感染性の原因なしでの虚血心筋への損傷である。心筋炎は、心臓組織の壊死を含む場合もあり含まない場合もある。例えば、連鎖球菌Ｍタンパク質およびコクサッキーウイルスＢが、心筋ミオシンに免疫学的に類似したエピトープを有することから、心筋炎は、ある作用物質の感染による自己免疫反応であり得る。その作用物質が身体から取り除かれた後に、免疫系が心筋ミオシンを攻撃する可能性がある。
【００６９】
心筋炎の症状はばらつきが大きい。心筋炎は、自然に回復するような、症状が全くない軽度の疾患を引き起こし得るか、または胸痛、心不全、もしくは突然死を引き起こし得る。心筋炎の治療には、ジゴキシン、利尿薬、変力物質（例えば、ミルリノン）およびＡＣＥ阻害剤（例えば、カプトプリル、リシノプリル）が含まれ得る。
【００７０】
アテローム性動脈硬化症は、コレステロール等の脂肪質の蓄積（プラークと呼ばれる）の結果として、動脈壁が肥厚する状態である。特に、動脈血管に発症するこの症状は、主にマクロファージ白血球の蓄積による、動脈壁における慢性的な炎症反応であり、機能する高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）によるマクロファージからの脂肪およびコレステロールの適切な除去がなく、低密度リポタンパク質によって促進される。それは一般的に動脈の硬化または毛状物付着（ｆｕｒｒｉｎｇ）とも称される。
【００７１】
以下の用語は類似しているが、綴りおよび意味の両方において別個のものであり、容易に混同される可能性がある：動脈硬化症、細動脈硬化症、およびアテローム性動脈硬化。動脈硬化症は、中型または大型動脈のあらゆる硬化（および弾性の喪失）を述べる一般名であり；細動脈硬化症は、細動脈（小動脈）のあらゆる硬化（および弾性の喪失）であり；アテローム性動脈硬化は、特に粥状斑による動脈の硬化である。アテローム発生性という用語は、アテローム性動脈硬化を引き起こす物質または過程に用いられる。
【００７２】
アテローム性動脈硬化症は、典型的には数十年間無症候性であるが、最終的には２つの大きな問題を生じる。１つは、粥状斑が、動脈拡張により長期に相殺されるが、最終的にはプラーク破綻とその破綻を覆う動脈内腔内の血餅をもたらすことである。血餅は治癒し、通常は収縮するが、動脈の狭窄が残され（局所およびより小さな下流の枝の両方で）、さらに悪いと閉鎖が完了してしまい、それによって、その動脈が供給している組織および器官への血液供給が不十分になる。２つ目は、仮に動脈拡張過程の相殺が過剰である場合、正味の動脈瘤が発生し得ることである。アテローム性動脈硬化は全身に及ぶ過程であるため、これらの現象は脳、心臓、腸、腎臓、脚等への動脈で生じ得る。
【００７３】
アテローム性動脈硬化の治療には、限定はされないが、β遮断薬（例えば、メトプロロールおよびカルベジロール）、ＡＣＥ阻害剤（例えば、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、カソキニン（ｃａｓｏｋｉｎｉｎ）およびラクトキニン（ｌａｃｔｏｋｉｎｉｎ））、スタチン（例えば、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチン）、利尿薬、および栄養補助食品（例えば、葉酸、ナイアシン、ω３脂肪酸、およびビタミンＣ）が含まれる。
【００７４】
再狭窄は、血管の狭小化である狭窄の再発であり、血流の制限をもたらす。再狭窄は通常、狭小化したことがあり、遮断を除去するための治療を受けたことがあり、そしてその後に再狭小化した動脈または他の大血管に関連する。再狭窄は内腔の周径における５０％以上の減少として定義することができ、バルーン血管形成術を受けたことがある患者において高い発症率（２５〜５０％）を有し、過半数の患者が６ヶ月以内にさらなる血管形成術を必要とする。再狭窄治療には、限定はされないが、血管形成術、近接照射療法、および冠動脈内照射が含まれる。
【００７５】
炎症
炎症は心血管疾患に関わることが知られている（例えば、Ｊｉａｌａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖａｒａｊ  Ｓ，  “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  ｔｈｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ａｓ  ａ  ｒｉｓｋ  ｍａｒｋｅｒ．”  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  （２００１）  １１６  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１０８−１５；  Ｚａｉｒｉｓ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ，  “Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｐｌａｑｕｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｕｎｓｔａｂｌｅ  ａｎｇｉｎａ．”  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  （２００２）  １６４（２）：３５５；  Ｌｏｗｅ  ＧＤ，  “Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ．”  Ａｎｎ  Ｐｅｒｉｄｏｎｔｏｌ  （２００１）  ６（１）：１−８；  Ｒｉｆａｉ  ａｎｄ  Ｒｉｄｋｅｒ，  “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．”  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｌｉｐｉｄｏｌ  （２００２）  １３（４）：３８３−９；  Ｂｅｒｍｕｄｅｚ  ａｎｄ  Ｒｉｄｋｅｒ，  “Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｓｔａｔｉｎｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．”  Ｐｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ  （２００２）  ５（１）：４２−６；  Ｂｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｒｉｄｋｅｒ，  “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  ｆｒｏｍ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．”  Ｉｔａｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  （２００１）  ２（１１）：７９６−８００；  Ｐｒａｄｈａｎ  ＡＤ，  ｅｔ  ａｌ，  “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ，  ａｎｄ  ｉｎｃｉｄｅｎｔ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ”．  ＪＡＭＡ  （２００２）  ２８８（８）：９８０−７；  Ｒｉｄｋｅｒ  ＰＭ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  ａｓｐｉｒｉｎ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｍｅｎ．”  ＮＥＪＭ  （１９９７）  ３３６（１４）：９７３−９；  “Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ”  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  （２００９）  ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｃｖｒ／ｃｖｐ２４１を参照されたい）。
【００７６】
炎症は、異物、特に微生物起源の異物による侵入に対する対象の防衛反応として発生し得る。加えて、機械的外傷、毒素、および新生組織形成が炎症反応を誘発する場合がある。白血球の蓄積およびその後の活性化が、大部分の炎症形態の発症原因における主要な事象である。炎症による欠失は、宿主を弱化させ、感染症または創傷を悪化させやすい状態にし得る。長期的炎症反応等の過度の炎症は、糖尿病、心血管疾患（例えば、動脈硬化症、心不整脈、血管疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋炎、アテローム性動脈硬化、および再狭窄）  黄斑変性、白内障、慢性皮膚疾患、再かん流傷害、および癌を含むが、これらに限定されない炎症性疾患、感染性髄膜炎、リウマチ熱等の感染後症候群、全身性エリテマトーデスおよびリウマチ性関節炎等のリウマチ性疾患を引き起こし得る。これらの疾患は、毎年世界中の何百万人もの人々に発症し、死亡率および罹患率の増加を引き起こす。これらの様々な疾病過程における炎症反応に共通性があるため、その調節が、ヒト疾患の予防および治療における主要素となっている。
【００７７】
炎症性サイトカインの過剰産生は、多数の炎症性および自己免疫疾患の発症原因に関連付けられている。ＴＮＦαの分泌は、炎症カスケードの開始において、初期事象であり（Ｂｒｅｎｎａｎ  Ｆ．  Ｍ．，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ，  １９８９，  ２：２４４−７；  Ｈａｗｏｒｔｈ  Ｃ，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９１，  ２１：２５７５−２５７９）、これらの疾患の開始および維持に直接的に寄与する。インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、一酸化窒素（ＮＯ）、ＩＦＮ−γ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびＩＬ−１０を含む他のサイトカインも、何らかの役割を果たす。これらのサイトカインの一部（例えば、ＩＬ−８）は、炎症反応を増加または悪化させ得るが、他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）は、炎症反応を軽減または緩和させ得る。
【００７８】
免疫系の細胞、特にマクロファージは、活性化刺激に反応してこれらのサイトカインの多くを分泌する。サイトカインの標的細胞は、任意の身体区画に局在化し得、長距離機序を介して、または隣接細胞に対して作用し得る。したがって、サイトカインは、局部的に、または全身に渡って炎症を調節し得る。
【００７９】
心血管疾患および炎症の関連
慢性炎症状態は、Ｃ反応性タンパク質の増加から明らかなように、血栓形成、プラーク破綻、および塞栓形成を含む有意な損傷を動脈系にもたらす。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、高感度であるが非特異的な炎症マーカーである。特に高感度アッセイで測定されるＣＲＰ血中レベルの上昇は、ＭＩおよび脳卒中並びに糖尿病発症のリスクを予測することができる。さらに、ＭＩに対するいくつかの薬剤がＣＲＰレベルを低減することが示されている。しかしながら、ＣＲＰがアテローム性動脈硬化または心血管疾患において直接関与しているかどうかは不確定のままである。
【００８０】
Ｃ反応性タンパク質に関する研究は、コレステロールが詰まった血管中プラークは、それらが炎症を発症しない限り、いかなる実際の危険ももたらさない場合があることを示している。炎症はプラークを弱体化させ、それらを破裂に対しより脆弱にするか、または血餅をくびれ切って冠血管を遮断させ得る（Ｊｉａｌａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖａｒａｊ  Ｓ，  “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  ｔｈｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ａｓ  ａ  ｒｉｓｋ  ｍａｒｋｅｒ．”  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００１  Ｄｅｃ；１１６  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１０８−１５；  Ｚａｉｒｉｓ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ，  “Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｐｌａｑｕｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｕｎｓｔａｂｌｅ  ａｎｇｉｎａ．”  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ２００２  Ｏｃｔ；１６４（２）：３５５；  Ｌｏｗｅ  ＧＤ，  “Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ．”  Ａｎｎ  Ｐｅｒｉｄｏｎｔｏｌ  ２００１  Ｄｅｃ；６（１）：１−８；  ａｌｌ  ｏｆ  ｗｈｉｃｈ  ａｒｅ  ｈｅｒｅｉｎ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ｅｎｔｉｒｅｔｙ，  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ｔｅａｃｈｉｎｇｓ  ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）．特に、一連の研究は、２５〜３５百万人のアメリカ人が、正常の範囲内の総コレステロールを有するが、彼らの心血管系内では平均以上の炎症レベルを有していることを示している。この炎症は心疾患リスクに重大な影響を及ぼす（Ｒｉｆａｉ  ａｎｄ  Ｒｉｄｋｅｒ，  “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．”  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｌｉｐｉｄｏｌ  ２００２  Ａｕｇ；１３（４）：３８３−９；  Ｂｅｒｍｕｄｅｚ  ａｎｄ  Ｒｉｄｋｅｒ，  “Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｓｔａｔｉｎｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．”  Ｐｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２００２  Ｗｉｎｔｅｒ；５（１）：４２−６；  Ｂｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｒｉｄｋｅｒ，  “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  ｆｒｏｍ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．”  Ｉｔａｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  ２００１  Ｎｏｖ；２（１１）：７９６−８００；  これらの全ては、その心血管疾患における炎症の関与に関する教示も含めて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。さらに、３９，８７６人の健康な閉経後女性が参加した女性健康調査（Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙ）は、���反応性タンパク質（従って慢性炎症）の心血管疾患への関連を裏付けた（Ｐｒａｄｈａｎ  ＡＤ，  ｅｔ  ａｌ，  “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ，  ａｎｄ  ｉｎｃｉｄｅｎｔ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ”．  ＪＡＭＡ  ２００２  Ａｕｇ  ２８；２８８（８）：９８０−７；これらは、心血管疾患における炎症の役割に関するその教示を含むその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。最も高いＣ反応性タンパク質レベルを有した女性は、最も低いレベルを有した対象と比較して、５倍の心血管疾患発症リスク、および７倍の心発作または脳卒中リスクを有した。興味深いことに、Ｃ反応性タンパク質レベルは、他の関連危険因子を持たないように思えた女性において、これらの現象のリスクを予測した。さらに、２２，０００人の初期に健康な男性におけるＣ反応性タンパク質レベルおよび心疾患リスクを評価した医師健康検査は、炎症および心発作の関連性を裏付けている（Ｒｉｄｋｅｒ  ＰＭ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  ａｓｐｉｒｉｎ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｍｅｎ．”  ＮＥＪＭ  １９９７  Ａｐｒ  ３；３３６（１４）：９７３−９；これらは、心血管疾患における炎症の役割に関するその教示を含むその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００８１】
さらに、ある種の炎症誘発性サイトカインおよびケモカインはアテローム性動脈硬化を含むが限定はされない心血管疾患に関わることが知られている。特に、インターロイキン８は、傷害された血管壁の炎症性微小環境の構築および保存に関わることが示されている（レビューとしては：“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ”  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  （２００９），  ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｃｖｒ／ｃｖｐ２４１；これらは、心血管疾患におけるＩＬ−８の役割に関するその教示を含むその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００８２】
図２並びに図３７ＡおよびＢから分かるように、界面動電的に改変された水性流体は、対照流体と比較して、炎症誘発性サイトカインのＩＬ−６並びに炎症誘発性ケモカインのＩＬ−８およびエオタキシンのレベルを減少させた。従って、ある実施形態によれば、本発明の流体は、炎症誘発性サイトカインおよびケモカインのレベルを減少させることにより、いくつかの心血管疾患の症状および／または状態の多くを軽減し、それによって炎症を制限する。
【００８３】
メタロプロテイナーゼ
メタロプロテイナーゼは、例えばＮ．  Ｍ．  Ｈｏｏｐｅｒ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５４：１−６，  １９９４に記載されているようなファミリーおよびサブファミリーに分類されるプロテイナーゼ（酵素）のスーパーファミリーである。メタロプロテイナーゼの例としては、コラゲナーゼ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１３）、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９）、ストロメライシン（ＭＭＰ３、ＭＭＰ１０、ＭＭＰＩＩ）、マトリリシン（ＭＭＰ７）、メタロエラスターゼ（ＭＭＰ１２）、エナメリシン（ＭＭＰ１９）、ＭＴ−ＭＭＰ（ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７）等のマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）；ＴＮＦ変換酵素（ＡＤＡＭ１０およびＴＡＣＥ）等のセクレターゼおよびシェダーゼを含む、レプロリシンもしくはアダマリシンまたはＭＤＣファミリー；プロコラーゲン処理プロテイナーゼ（ＰＣＰ）等の酵素を含む、アスタシンファミリー；ならびにアグリカナーゼ、エンドセリン変換酵素ファミリー、およびアンジオテンシン変換酵素ファミリー等の他のメタロプロテイナーゼが挙げられる。集合的に、メタロプロテイナーは、コラーゲン、プロテオグリカン、およびフィブロネクチン等の広範囲のマトリクス基質を開裂することが知られている。メタロプロテイナーゼは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等の生物学的に重要な細胞メディエーターの処理または分泌；および低親和性ＩｇＥ受容体ＣＤ２３等の生物学的に重要な膜タンパク質の翻訳後タンパク質分解処理または脱落に関連付けられている（例えば、Ｎ．  Ｍ．  Ｈｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３２１：２６５−２７９，  １９９７を参照のこと）。
【００８４】
したがって、当然のことながら、メタロプロテイナーゼは、組織の再構築（例えば、胚発生、骨形成、月経中の子宮の再構築等）を伴う、多くの生理的疾病プロセスにおいて重要であると考えられる。さらに、１つまたは複数のメタロプロテイナーゼの活性の阻害は、これらの疾病または状態、例えば、関節の炎症（特に、関節リウマチ、変形性関節炎、および痛風）、胃腸管の炎症（特に、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、および胃炎）、皮膚の炎症（特に、乾癬、湿疹、皮膚炎）等の様々な炎症性およびアレルギー性疾患；腫瘍転移または浸潤；変形性関節炎等の細胞外マトリクスの抑制されない分解に関連する疾病；骨吸収疾病（骨粗しょう症およびパジェット病等）；異常血管形成に関連する疾病；糖尿病に関連するコラーゲンの再構築の亢進、歯周病（歯肉炎等）、角膜潰瘍、皮膚の潰瘍、術後疾患（結腸吻合等）、および真皮創傷治癒；中枢および末梢神経系の脱髄疾患（多発性硬化症等）；アルツハイマー病；再狭窄およびアテローム性動脈硬化症等の心臓血管疾患において観察される細胞外マトリクスの再構築；喘息；鼻炎；ならびに慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）において、十分有効であり得る。
【００８５】
ＭＭＰ１２は、マクロファージエラスターゼあるいはメタロエラスターゼとしても知られ、最初はマウスにおいてクローン化され（Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７：  ４６６４，  １９９２）、１９９５年に、同じグループによりヒトでもクローン化された。ＭＭＰ１２は、活性化マクロファージにおいて優先的に発現され、喫煙者からの肺胞マクロファージから（Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２６８：  ２３８２４）、ならびにアテローム性硬化症の病変部における泡沫細胞中で（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １５３：  １０９，  １９９８）、分泌されることが示された。ＣＯＰＤのマウスのモデルは、６ヶ月間、１日当たり２本、週６日タバコの煙でのマウスへの刺激に基づいている。野生型マウスは、この処置の後に肺気腫を発症した。ＭＭＰ１２ノックアウトマウスをこのモデルにおいてテストすると、有意な気腫を発症せず、ＭＭＰ１２がＣＯＰＤ病因の鍵酵素であることを強く示唆した。ＣＯＰＤ（気腫および気管支炎）におけるＭＭＰ１２等のＭＭＰの役割は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎａｇａｗａ，  １９９９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  １（１）：  ２９−３８で考察されている。近年、喫煙はヒト頸動脈プラークにおけるマクロファージ浸潤およびマクロファージ由来ＭＭＰ−１２発現を増加させることが発見された（Ｍａｔｅｔｚｋｙ  Ｓ，  Ｆｉｓｈｂｅｉｎ  Ｍ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０２：（１８），  ３６−３９  Ｓｕｐｐｌ．  Ｓ，  Ｏｃｔ．  ３１，  ２０００）。
【００８６】
ＭＭＰ９−（ゼラチナーゼＢ；９２ｋＤａ−ＩＶ型コラゲナーゼ；９２ｋＤａゼラチナーゼ）は、１９８９年に、初めて精製され、次いでクローン化し配列決定された分泌タンパク質である（Ｓ．  Ｍ．  Ｗｉｌｈｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４  （２９）：  １７２１３−１７２２１，  １９８９；誤植公開、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５  （３６）：  ２２５７０，  １９９０）（このプロテアーゼに関する詳細な情報および参考文献の概説については、Ｔ．  Ｈ．  Ｖｕ  ＆  Ｚ．  Ｗｅｒｂ  （１９９８）  （Ｉｎ：  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏタンパク質ａｓｅｓ，  １９９８，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｗ．  Ｃ．  Ｐａｒｋｓ  ＆  Ｒ．  Ｐ．  Ｍｅｃｈａｍ，  ｐｐ．  １１５−１４８，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．  ＩＳＢＮ  ０−１２−５４５０９０−７）を参照のこと）。ＭＭＰ９の発現は通常、栄養膜、破骨細胞、好中球、およびマクロファージを含む、数個の細胞型に制限される（Ｖｕ  ＆  Ｗｅｒｂ、上記を参照）。しかしながら、発現は、成長因子またはサイトカインへの細胞の曝露を含む、いくつかのメディエーターにより、これらの同一の細胞または他の細胞型において誘起され得る。これらは、炎症反応の開始に関連付けされることの多い同一のメディエーターである。他の分泌ＭＭＰと同様に、ＭＭＰ９は、不活性な酵素前駆体として放出され、続いて切断されて、酵素的に活性な酵素を形成する。インビボでのこの活性化に必要とされるプロテアーゼは知られていない。活性ＭＭＰ９対不活性酵素のバランスは、ＴＩＭＰ−１（メタロプロテイナーゼ−１組織阻害剤）という自然発生タンパク質との相互作用により、インビボでさらに調節される。ＴＩＭＰ−１は、ＭＭＰ９のＣ末端領域に結合し、ＭＭＰ９の触媒ドメインの阻害をもたらす。ＭＭＰ９前駆体の誘導発現のバランス、前駆体から活性ＭＭＰ９への切断、およびＴＩＭＰ−１の存在が組み合わされて、局所部位に存在する触媒活性ＭＭＰ９の量が決定される。タンパク質分解活性ＭＭＰ９は、ゼラチン、エラスチン、ならびに天然ＩＶ型およびＶ型コラーゲを含む基質を攻撃するが、天然Ｉ型コラーゲン、プロテオグリカン、またはラミニンに対する活性はない。様々な生理学的および病理学的プロセスにおけるＭＭＰ９の役割を関係づけるデータが増えている。生理学的役割は、胚着床の初期段階における子宮上皮を通じた胚栄養膜の浸潤；骨の成長および発達における何らかの役割；および血管系から組織への炎症細胞の移動を含む。
【００８７】
酵素免疫測定法を使用して測定されるＭＭＰ９放出は、他の集団と比較して、未治療の喘息患者からの体液およびＡＭ上清中で有意に増強された（Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐ．  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５：５８３−５９１，  １９９７）。また、ＭＭＰ９発現の増加が、特定の他の病的状態において観察され、このことにより、ＣＯＰＤ、関節炎、腫瘍転移、アルツハイマー病、多発性硬化症、および心筋梗塞等の急性の冠動脈疾患をもたらすアテローム性動脈硬化症におけるプラーク破綻等の疾病プロセスに、ＭＭＰ９が関連付けられている（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０７０８７６３７Ａ３号も参照のこと）。
【００８８】
ＭＭＰ阻害剤：
多くのメタロプロテイナーゼ阻害剤が知られている（例えば、Ｂｅｃｋｅｔｔ  Ｒ．  Ｐ．  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍ．，  １９９８，  Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｐａｔｅｎｔｓ，  ８（３）：２５９−２８２；  ａｎｄ  ｂｙ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  １９９９，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９９（９）：２７３５−２７７６によるＭＭＰ阻害剤の概説を参照のこと）。国際公開第０２／０７４７６７号は、ＭＭＰ阻害剤として、特に強力なＭＭＰ１２阻害剤として有用である、ある式のヒダントイン誘導体を開示している。米国特許出願第１１／７２１，５９０号（第２００８００３２９９７号として公開）は、メタロプロテイナーゼの阻害剤であり、ＭＭＰ１２およびＭＭＰ９等のＭＭＰの阻害において特に着目される、ヒダントイン誘導体のさらなるグループを開示している。ＭＭＰ１２、ＭＭＰ９等のＭＭＰを阻害するための新規トリアゾロン誘導体は、米国特許出願第１０／５９３５４３号（第２００７０２１９２１７号として公開）に開示されている。さらなるＭＭＰ１２およびＭＭＰ９阻害剤は、第１１／５０９，４９０号（第２００６０２８７３３８号として公開）に開示されている（第１０／８３１２６５号（第２００４０２５９８９６号として公開）も参照のこと）。
【００８９】
加えて、４−（４−フェノキシフェニルスルホニル）ブタン−１，２−ジチオール（１）および５−（４−フェノキシフェニルスルホニル）ペンタン−１，２−ジチオール（２）という２つの化合物は、選択的に結合して、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を強力に阻害することが示されている（Ｂｅｒｎａｒｄｏ，  ｅｔ．  ａｌ  （２００２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：１１２０１−１１２０７）。この２つの化合物は、ＭＭＰ−２および−９を阻害するために医療の場で有意に使用され、炎症を軽減し得る。加えて、あるテトラサイクリン抗生物質（例えば、ミノサイクリンおよびドキシサイクリン）の抗生濃度より低い濃度での使用は、ＭＭＰ活性を効果的に阻害することが示されている。本発明のある態様は、ＭＭＰの阻害に有用な補助的抗菌レベルと組み合わせて本発明の流体を用いることを含む。
【００９０】
心血管疾患およびマトリックスメタロプロテアーゼの関連性
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、アテローム性動脈硬化、再狭窄、拡張型心筋症、および心筋梗塞を含む多くの心血管疾患の病因に関わることが最近示されている（Ｃｒｅｅｍｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：  ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｈｅａｒ  ｆａｉｌｕｒｅ？”  （２００１）  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  ８９（３）：２０１−１０；  Ｓｉｅｒｅｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  “Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ：  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．”  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．  ９（１３）：１０３３−４０；これらの両方は、心血管疾患におけるＭＭＰの役割に関するそれらの教示を含んで、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。興味深いことに、これらの心血管疾患の実験モデルにおいての合成ＭＭＰ阻害剤の投与は、動脈硬化病変形成、内膜新生、左心室リモデリング、ポンプ機能不全、および梗塞治癒の進行を有意に阻害した（Ｃｒｅｅｍｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１））。さらに、ＭＭＰは、心血管リモデリングをもたらす細胞外マトリックスの分解によって、アテローム性動脈硬化において重要な役割を果たしていることが示されている（Ｉｋｅｄａ  ａｎｄ  Ｓｈｉｍａｄａ，  （２００３）  “Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．”  Ｃｌｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２６（２）：５５−９；これらは、心血管疾患および冠動脈疾患におけるＭＭＰの役割に関するその教示を含んで、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。最近の研究は、動脈硬化病変においてのＭＭＰの発現増強および細胞外マトリックスの分解による血管壁の弱体化へのそれらの寄与を示している。さらに、研究は、ＭＭＰ遺伝子プロモーターにおける遺伝子多型が、冠動脈心疾患への罹患率における個体差に寄与することを示している（Ｗａｔａｎａｂｅ  ａｎｄ  Ｉｋｅｄａ，  （２００４）  “Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．”  Ｃｕｒｒ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ  Ｒｅｐ．  ６（２０：１１２−２０；これらは、心血管疾患およびアテローム性動脈硬化症におけるＭＭＰの役割に関するその教示を含んで、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。従って、ある実施形態によれば、本発明の流体は、ＭＭＰレベルを調節することにより、いくつかの心血管疾患の症状および／または状態の多くを軽減する。
【００９１】
本明細書のある実施形態は、心血管疾患および／または関連する状態もしくは疾患の少なくとも１つの症状を防止または軽減することによる、対象のための治療用組成物および治療方法に関する。
【００９２】
本明細書のさらなる実施形態は、心血管疾患および／または関連する状態に関係している合併症を防止または軽減するための、治療用組成物および治療方法に関する。
【００９３】
治療方法
「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患、障害、もしくは状態、またはこれらの１つまたは複数の症状を正常化、緩和、その進行を阻害、または予防することを指し、かつこれらの意味を含意し、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「治療的に（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ）」とは、本明細書に定義されるように、治療の行為を指す。
【００９４】
「治療有効量」は、疾患、障害、もしくは状態、またはこれらの１つ以上の症状を正常化、緩和、その進行を阻害、または予防する上で十分な、本明細書に提供される本発明を実践する過程において利用される任意の化合物の任意の量である。
【００９５】
本明細書のある実施形態は、黄斑変性症等のある状態または疾患と関連する炎症の少なくとも１つの症状を予防するまたは緩和することによる、対象に対する治療組成物および治療方法に関する。
【００９６】
炎症と関連する多くの状態または疾患は、ステロイド、メトトレキサート、免疫抑制剤（シクロホスファミド、シクロスポリン、アザチオプリン、およびレフルノミド等を含む）、非ステロイド系抗炎症剤（例えば、アスピリン、アセトアミノフェンおよびＣＯＸ−２阻害剤）、金剤、ならびに抗マラリア治療剤を用いて治療されている。これらの薬剤は種々の欠点を有し、副作用には、注射部位反応、発疹、上気道感染、自己免疫疾患および感染に対する感受性の増加等が含まれる。加えて、より簡便で適合性の高い経口経路または局所皮膚経路とは異なり、多くの抗炎症性調合薬は、静脈内（ＩＶ）投与または皮下（ＳＣ）投与を必要とする。したがって、炎症に関連する状態および疾患に対する新規の薬剤および治療方法の開発の必要性が未だに存在する。
【００９７】
併用療法．
特定の実施形態は、少なくとも１つの他の薬剤、例えば、限定はされないが、キニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、リドカイン、フェニトイン、メキシレチン、フレカイニド、プロパフェノン、モリシジン、プロプラノロール、エスモロール、チモロール、メトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、アミオダロン、ソタロール、イブチリド、ドフェチリド、ドロネダロン、Ｅ−４０３１、ベラパミル、ジルチアゼム、アデノシン、ジゴキシン、硫酸マグネシウム、ワルファリン、ヘパリン、抗血小板剤（例えば、アスピリンおよびクロピドグレル）、β遮断薬（例えば、メトプロロールおよびカルベジロール）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、カソキニン（ｃａｓｏｋｉｎｉｎ）およびラクトキニン（ｌａｃｔｏｋｉｎｉｎ））、スタチン（例えば、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチン）、アルドステロン拮抗剤（例えば、エプレレノンおよびスピロノラクトン）、ジギタリス、利尿薬、ジゴキシン、変力物質（例えば、ミルリノン）、血管拡張剤およびω３脂肪酸と組み合わせて、本発明の界面動電流体を用いる併用療法を含む。
【００９８】
界面動電的に生成されたガス富化流体および溶液の抗炎症活性：
本発明のある態様によれば、本明細書に開示されるガス富化流体および／または溶液は、抗炎症の特性および効果を有し、炎症に関連する疾患または障害に罹患している対象の治療のための抗炎症剤として使用できる。図１は、健常な献血者から得た刺激されたリンパ球のサイトカインプロファイルの実験結果を示す。図１に見られるように、本発明の酸素富化流体（水）は、特定のサイトカイン、特に、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＬ−１βの下方制御に影響を及ぼした。
【００９９】
炎症性サイトカインの産生増加は、多数の炎症性および自己免疫疾患の発症原因に関連付けられている。ＴＮＦαの分泌は、炎症カスケードの開始における主な事象の１つであり（Ｂｒｅｎｎａｎ  Ｆ．  Ｍ．，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ，  １９８９，  ２：２４４−７；  Ｈａｗｏｒｔｈ  Ｃ，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９１，  ２１：２５７５−２５７９）、炎症性および自己免疫疾患の開始および維持に直接的に寄与する。インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、一酸化窒素、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦを含む、他の炎症促進性サイトカインも、ある役割を果たし、他方、ＩＬ−１０等の抗炎症性サイトカインは、疾患を軽減し得る。免疫系の細胞、特にマクロファージは、活性化刺激に反応してこれらのサイトカインの多くを分泌する。
【０１００】
様々な細胞型が炎症過程に関与する。単球、マクロファージ、および他の免疫細胞によるＴＮＦαの過剰産生は、多数の疾患の発症における主要素である。特にマクロファージおよびＴ細胞は、免疫応答の開始および維持において中心的役割を果たす。マクロファージは、病理的刺激または免疫原性刺激により活性化されると、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、一酸化窒素（ＮＯ）、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦその他を含む多数のサイトカインを放出することにより応答する。Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＮＦ−γ、および他の炎症性サイトカインを放出する。これらのサイトカインは他の免疫細胞を活性化し、サイトカインの一部は、独立した細胞毒としての役割も果たすこともできる。マクロファージおよびＴ細胞に由来する炎症性メディエーターの過剰放出は、特に、正常細胞および周辺組織の損傷をもたらす。
【０１０１】
炎症促進性サイトカインは、ＨＩＶ−ＡＩＤＳ、ならびにサイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、およびヘルペス科ウイルスを含む他のウイルス感染と関連付けられている。ＴＮＦαは、ヒトサイトメガロウイルスの主要な前初期エンハンサー／プロモーターの基礎活性を増強し、前単球細胞において潜在性ＨＣＭＶ感染の再活性化で何らかの役割を果たし得る（Ｐｒｏｓｃｈ  Ｓ．，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９５，  ２０８：１９７−２０６）。
【０１０２】
また、多くの炎症性サイトカインは、敗血症または内毒素性ショックに罹患した患者の死亡原因となる。例えば、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βは、敗血症、敗血症性ショック、および内毒素性ショックにおいて、既知の中心的な役割を有する。これらのサイトカインの濃度増大は、ホスホリパーゼＡ２（Ｇｒｏｎｉｃｈ  Ｊ．，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９４，  ９３：１２２４−１２３３）およびＮＯシンターゼに対する遺伝子発現の誘導とともに、発熱、低血圧、およびショック（Ｓｍｉｔｈ  Ｊ．  Ｗ．  ｅｔ．  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １９９２，  １０：１１４１−１１５２；  Ｃｈａｐｍａｎ  Ｐ．  Ｂ．，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １９８７，  ５：１９４２−１９５１）と関連する。
【０１０３】
平滑筋細胞からのＮＯの誘導は、敗血症性ショック時に、平均動脈圧および全身血管抵抗の低下を媒介するが、このことはＮＯの基本的な役割を示唆している。したがって、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１β、およびＮＯに対する下方制御効果を標的とする療法は、黄斑変性症（ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）を含む、炎症性の疾患または障害の治療に有益となり得る。
【０１０４】
ＩＬ−１およびＴＮＦαは、動物モデルの様々な急性および慢性反応において、中心的な役割を果たす。加えて、ＩＬ−１１、ＩＦＮα、およびＩＦＮβは、炎症性反応を上方制御する場合もある。反対に、いくつかのサイトカインは、炎症反応の下方制御に関与する（すなわち、特にＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３）。実施例２および３に記述されているように、本発明のガス富化流体と接触した細胞は、Ｔ３抗原との対照培地と比べて、Ｔ３抗原によるＩＦＮ−γレベルの増加を示し、一方、Ｔ３抗原との対照培地と比べて、Ｔ３抗原による本発明のガス富化培地のＩＬ−８は低かった。加えて、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αのレベルは、ＰＨＡとの対照培地と比べて、ＰＨＡによる本発明のガス富化培地の方が低く、一方、ＩＬ−１βレベルは、ＰＨＡとの対照培地と比べて、ＰＨＡによる本発明のガス富化流体培地の方が低かった。本発明のガス富化培地単独では、ＩＦＮ−γレベルは対照培地よりも高かった。これらの結果は、抗炎症微小環境と一致する。
【０１０５】
ＮＯは、炎症反応のメディエーターおよびレギュレーターとして認識されている。ＮＯは、病原体に対する細胞毒性作用を有するが、対象自身の組織に悪影響を及ぼすこともある（Ｋｏｒｈｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ４（４）：  ４７１−９，  ２００５）。ＮＯは、可溶性グアニル酸シクラーゼと反応して環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）を形成し、ＮＯの多くの効果を媒介する。ＮＯはまた、分子酸素およびスーパーオキシドアニオンと相互作用して、様々な細胞機能を修飾できる活性酸素種を産生し得る。ＮＯのこれらの間接的な効果は、炎症において重要な役割を持ち、ＮＯは、誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）により大量に産生され、活性酸素種は、活性化した炎症細胞により合成される。
【０１０６】
ケラチン生成細胞、線維芽細胞、内皮細胞のほか、おそらく他の細胞もＮＯを産生し得る。ＮＯの血管作用のいくつかは、血管拡張、血管内皮への血小板粘着の阻害、血管内皮への白血球粘着の阻害、およびスーパーオキシドの除去を含む（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｖ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐ．  ｖ．  １０６  （５）：  １１３９−１１４３）。
【０１０７】
さらに、ＮＯ合成酵素の阻害は、創傷収縮を遅延し、コラーゲン組織を改変し、新表皮の厚さ（ｎｅｏｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）を改変することが示されている（Ａｍａｄｅｕ  ａｎｄ  Ｃｏｓｔａ，  Ｊ．  Ｃｕｔａｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ３３：  ４６５−４７３，  ２００６）。創傷におけるマスト細胞移動および血管形成も、ＮＯの阻害により影響を受ける（同上）。特定の機構理論に拘束されるものではないが、ある実施形態では、本発明のガス富化流体は、局在性および／もしくは細胞内ＮＯの産生または分解を調節し得、このことは、本明細書に開示する実施例部分において例示する多様な創傷治癒効果と一致する。調節経路が可変であるために、本発明のガス富化流体は、ある実施形態ではＮＯの産生を増加させ、かつ／またはＮＯの分解を遅延させ得る一方で、他の実施形態では、ＮＯ産生を減少させ、かつ／またはＮＯの分解を加速させ得る。
【０１０８】
マスト細胞移動の場合は、酸素富化溶液に対する初期および後期の移動の差異も生じた。このことは、ＮＯ合成の阻害に関する当技術分野の公知の事項と一致する（Ａｍａｄｅｕ  ａｎｄ  Ｃｏｓｔａ，  Ｊ．  Ｃｕｔａｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ３３：  ４６５−４７３，  ２００６）。
【０１０９】
炎症プロセスの最初の２段階では、異物が破壊されるか（例えば、異物が生命体である場合）、その周辺の組織が弛緩する（例えば、異物が破片である場合）かのいずれかである。治癒段階では、炎症が鎮静し始め、個体の血管および脈管パターンが再び正常になり、創傷の修復が開始する。修復プロセスにおける３つの主要事象は、（１）線維芽細胞を増殖することによる新結合組織の形成、（２）上皮の再生、および（３）新しい毛細血管の増生である。
【０１１０】
炎症が鎮静する前でさえ、通常は休眠状態で存在する線維芽細胞が、周囲の正常組織から損傷領域への移動を開始する。線維芽細胞は、アメーバ様運動でフィブリンの鎖に沿って移動し、自身を治癒領域全体に分布させる。いったん損傷組織中の位置に固定されると、線維芽細胞はコラーゲンを合成し始め、このタンパク質を分泌し、このタンパク質自身を繊維として配列する。この繊維は、その長軸で応力が最も高い方向に自身を配向させる。コラーゲンの束が成長して堅固になるにつれ、線維芽細胞は次第に変性し、この束に密接に付着して、損傷領域が瘢痕組織に変形する。
【０１１１】
瘢痕組織の形成と同時に、創傷の端の無傷の上皮細胞が増殖し始め、１枚のシートとして損傷領域の中心に向かって動き始める。炎症が鎮静するにつれ、血液の直接供給の必要性が生じ、創傷部位に血管形成が発生する。
【０１１２】
炎症は、多数の細胞型が関与する複雑なプロセスである。例えば、マスト細胞は、初期段階の血管拡張の引き金となるメディエーターを放出し、これに内皮細胞の分離および内皮下層中のコラーゲン繊維の露出が伴う。血管内に形成される細胞間隙の線維が血小板を捕捉し、これらの細胞からのメディエーターの放出の引き金となる。
【０１１３】
血小板に加えて、露出したコラーゲン繊維もまた、拡張した血管壁の孔を通って濾過される血漿のタンパク質と相互作用する。この相互作用は、血液凝固カスケードを誘発する要因である血管拡張の増加、血管の浸透性および走化性の増加を含む。
【０１１４】
加えて、補体カスケードは、いくつかの刺激により活性化され得る。いくつかの刺激とは、損傷した血管、損傷細胞により放出されるタンパク質分解酵素、任意の関与細菌の膜成分、および抗原−抗体複合体である。活性化した補体成分の一部は、走化因子として作用し、白血球が炎症領域へと流入する原因となる一方、他の補体成分は、食作用を促進し、細胞溶解に関与する。
【０１１５】
特定の実施形態では、本発明のガス富化流体または溶液はまた、炎症の少なくとも１つの態様に関与する少なくとも１つのサイトカインを調節し得、これらのサイトカインには、ＭＡＦ（マクロファージ活性化因子）、ＭＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）、ＭＣＦ（マクロファージ走化因子）、ＬＭＩＦ（白血球遊走阻止因子）、ＨＲＦ（ヒスタミン放出因子）、ＴＦ（伝達因子）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５等）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ζ、ＩＦＮ−δ等）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージＣＳＦ）、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージＣＳＦ）、重複ＣＳＦ（ＩＬ−３）、線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、ＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β等）、ＮＡＰ−２（好中球活性化タンパク質２）、ＰＦ−４（血小板因子４）、トロンボグロブリン、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β−＋（マクロファージ炎症性タンパク質）、ランテス（血小板やＴ細胞由来の好酸球走化性物質）、ＨＳＰ（熱ショックタンパク質）、ＧＲＰ（グルコース調節タンパク質）、ユビキチン等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
したがって、ある実施形態では、ガス富化流体および／または治療組成物は、抗炎症分子またはサイトカインの産生および／もしくは分泌を増加させ、並びに／または抗炎症分子もしくはサイトカインの分解を減少させ、それにより、炎症（例えば、黄斑変性症）の少なくとも１つの症状を緩和または予防する。他の実施形態では、本発明のガス富化流体および／または治療組成物は、抗炎症分子もしくはサイトカインの産生および／もしくは分泌を減少させ、並びに／または抗炎症分子もしくはサイトカインの分解を増加させ、それにより、炎症および／または炎症性神経変性の少なくとも１つの症状を緩和または予防する。
【０１１７】
代表的な関連の分子間相互作用：
従来より、量子的特性は１０−１０メートル未満の素粒子に属すると考えられ、一方、日常生活の巨視的世界は、ニュートンの運動の法則に従って挙動するという点で古典的であると称される。
【０１１８】
近年、分子は、希釈と共に大きさが増加するクラスターを形成すると説明されている。これらのクラスターは、直径が数マイクロメートルあり、希釈すると非線形的にサイズが増大すると報告されている。直径１００ナノメートルの量子コヒーレント領域が純水中に発生すると仮定され、コヒーレント領域における水分子の集団振動が、最終的に電磁場変動に位相固定され得る。これにより、水中での安定振動を提供し、水の集合構造を変化させる水中の溶解物質に特異的な、持続性のコヒーレント振動の励起という形で、「記憶」の一形態を提供し、このことが今度は、発生する特異的コヒーレント振動を決定し得る。これらの振動が磁場相連結により安定化しても、希釈時の水は、依然として「種（ｓｅｅｄ）」のコヒーレント振動を保持し得る。分子のクラスターのサイズが増大すると、それに応じてその電磁的痕跡が増幅され、水の保持するコヒーレント振動が増強される。
【０１１９】
溶解分子のクラスターサイズの変化、および水の詳細な微視的構造にもかかわらず、コヒーレント振動の特異性は、なおも存在し得る。水の特性の変化を検討するための１つのモデルは、結晶化が関係する考慮事項に基づく。
【０１２０】
ナノスケールケージを形成する簡易プロトン化水クラスターが、本出願人の以前の特許出願である国際公開第２００９／０５５７２９号に示されている。プロトン化水クラスターは、一般に、Ｈ＋（Ｈ２０）ｎの形態をとる。いくつかのプロトン化水クラスターは、電離層等に自然発生する。特定の理論に拘束されるものではないが、特定の態様によれば、他のタイプの水クラスターまたは構造（クラスター、ナノケージ等）が可能であり、こうした構造には、本発明の産出物質に与えられる酸素および安定化した電子を含む構造が含まれる。酸素原子は、得られた構造に取り込まれ得る。半結合ナノケージの化学反応は、酸素および／または安定化した電子を、長期間、溶解したままにすることが可能である。医薬化合物等の他の原子または分子は、徐放目的のためにケージ形成され得る。溶液物質および溶解化合物の特異的化学反応は、これらの物質の相互作用により異なる。
【０１２１】
以前の実験により、混合装置により処理された流体が、クラスター構造関連の流体分析と一致する様々な構造特性を示すことが実証されている。例えば、国際公開第２００９／０５５７２９号を参照のこと。
【０１２２】
帯電安定化したナノ構造（例えば、帯電安定化した酸素含有ナノ構造）：
本出願人の国際公開第２００９／０５５７２９号の「二重層効果」、「滞留時間」、「注入速度」、「気泡サイズ測定」において以前に説明されているように、界面動電混合装置は、第１の物質および第２の物質の、複合動的乱気流を伴う、独特で非線形の流体動力学的相互作用を、わずか数ミリ秒で生成し、新規の界面動電効果を提供する効果的に膨大な表面積（装置の面積および１００ｎｍ未満の例外的に小さい気泡の面積を含む）と接触する複合混合を提供する。加えて、絶縁回転子および固定子機能を含む特別に設計された混合装置を用いて、機能局在界面動電効果（電圧／電流）が実証された。
【０１２３】
当技術分野においてよく認識されているように、電荷再分配および／または溶媒和電子は、水溶液中で、極めて不安定であることが知られている。特定の態様によれば、本出願人の界面動電効果（例えば、特定の態様では溶媒和電子を含む、電荷再分配）は、産出物質（例えば、食塩溶液、イオン溶液）内で、驚くほど安定化される。実際には、本明細書に記載されるように、本発明の界面動電流体（例えば、ＲＮＳ−６０またはＳｏｌａｓ）の特性および生物活性の安定性は、数ヶ月間、気密性容器内で維持することができる。このことは、本発明の溶液の特性および活性の精製および／または維持および／または媒介の支援に、溶解ガス（例えば、酸素）が関与していることを示す。重要なことは、電荷再分配および／または溶媒和電子は、流体により生細胞（例えば、哺乳類細胞）と接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量で、本発明の界面動電イオン水性流体中に安定的に構成されることである（例えば、本明細書にも開示されている、国際公開第２００９／０５５７２９号の細胞パッチクランプの実施例２３を参照）。
【０１２４】
本発明の界面動電流体（例えば、界面動電食塩溶液）の安定性および生物学的適合性を説明するために、本明細書の「分子間相互作用」に記載されるように、本出願人は、水分子と水中に溶解された物質（例えば、酸素）の分子との間の相互作用が、水の全体構造を変化させ、ナノスケールケージクラスター（本発明の産出物質に与えられる、酸素および／または安定化した電子を含むナノ構造を含む）を提供することを提案した。機構に拘束されるものではないが、特定の態様のナノ構造の構成は、ナノ構造が、溶解ガス（例えば、酸素）を（少なくとも形成および／または安定性および／または生物活性のために）含み；細胞膜またはその関連の構成要素と接触する際に、界面動電流体（例えば、ＲＮＳ−６０またはＳｏｌａｓ食塩流体）が、電荷および／または電荷効果を調節する（例えば、授与または受容する）のを可能にし；かつ、特定の態様では、生物学的に関連した形態において、溶媒和電子の安定化を提供する（例えば、運ぶ、持つ、捕獲する）ような構成である。
【０１２５】
特定の態様によれば、本開示により支持されるように、イオンまたは食塩（例えば、標準食塩水、ＮａＣｌ）溶液において、本発明のナノ構造は、帯電安定化した水和殻内に少なくとも１つの溶解ガス分子（例えば、酸素）を含み得る、帯電安定化したナノ構造（例えば、平均直径１００ｎｍ未満）を含む。さらなる態様によれば、帯電安定化した水和殻は、上記の少なくとも１つの溶解ガス分子（例えば、酸素）を持つケージまたは空隙を含み得る。さらなる態様によれば、好適な帯電安定化した水和殻の供給によって、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、溶媒和電子（例えば、安定化した溶媒和電子）をさらに含み得る。
【０１２６】
機構または特定の理論に拘束されるものではないが、本優先日の後、周囲（大気）気体と平衡状態にある水性液体中のイオンにより安定化された帯電安定化微小気泡が、提案されている（Ｂｕｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，  １０４：４８６−４９８，  ２００７；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本発明の特定の態様によれば、本出願人の新規の界面動電流体は、帯電安定化した酸素含有ナノ構造の新規の生物学的活性形態を含み、そして、このような構造の新規の配列、クラスター、または会合をさらに含み得る。
【０１２７】
帯電安定化した微小気泡モデルによれば、水構造の短距離分子秩序は、ガス分子の存在により破壊され（例えば、非吸着イオンと初期に複合した溶解ガス分子は、短距離秩序の欠陥をもたらす）、イオン性溶滴の濃縮を提供する。この欠陥は、水分子の第１および第２の配位圏に取り囲まれ、これらの配位圏において、それぞれ、６および１２の空孔を占める吸着イオン（例えば、電気二重層を形成するためのＮａ＋イオンの「スクリーニングシェル（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｈｅｌｌ）」の捕捉）および非吸着イオン（例えば、第２の配位圏を占めるＣｌ−イオン）に交互に充填される。不飽和イオン溶液（例えば、不飽和食塩溶液）において、この水和した「細胞核」は、第１および第２の配位圏が、それぞれ、６つの吸着イオンおよび５つの非吸着イオンにより充填されるまで、安定した状態を保ち、次いで、ガス分子を含有する内部空隙を生成するクーロン爆発を受け、吸着イオン（例えば、Ｎａ＋イオン）は、得られる空隙の表面に吸着され、一方、非吸着イオン（またはその一部分）は、溶液に拡散する（Ｂｕｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、上記を参照）。このモデルにおいては、ナノ構造における空隙は、その表面に吸着されたイオン（例えば、Ｎａ＋イオン）間でのクーロン反発により、崩壊が阻止される。空隙含有のナノ構造の安定性は、空隙／気泡表面への同様の電荷を有する溶解イオンの選択的吸着、および溶解ガスと気泡内部のガスとの間の拡散平衡によるものであると仮定され、負の静電圧（得られる電気二重層により与えられる外部からの静電圧）は、界面張力に対して安定補償を提供し、気泡内部のガス圧力は、周囲圧力により均衡を保つ。このモデルによれば、このような微小気泡の形成は、イオン成分を必要とし、ある態様では、衝突が媒介する粒子間会合が、より大きな秩序クラスター（配列）の形成を提供し得る（同上）。
【０１２８】
帯電安定化した微小気泡モデルは、粒子がガス状微小気泡であり得ることを示唆するが、周囲大気と平衡状態にあるイオン溶液中にこのような構造が自然形成されることのみ企図しており、酸素がこのような構造を形成できるかどうかに関しては、特徴付けされておらず、かつ未特定のままであり、同様に、溶媒和電子がこのような構造により会合および／または安定化され得るかどうかに関しても、未特定のままである。
【０１２９】
特定の態様によれば、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造を含む本発明の界面動電流体は、新規であり、微小気泡モデルによる、仮定の非界面動電的かつ大気中の、帯電安定化した微小気泡構造とは基本的に異なる。重要なことは、対照の食塩溶液は本明細書に開示される生物学的特性を持たないが、他方、本出願人の帯電安定化したナノ構造は、帯電安定化した酸素含有ナノ構造の新規かつ生物学的に活性な形態を提供するという事実があり、この事実から少なくとも部分的に派生するこの結論が不可避であることである。
【０１３０】
本発明の特定の態様によれば、本出願人の新規の界面動電装置および方法は、大気と平衡状態にあるイオン流体、または非界面動電的に生成された任意の流体中で自然に発生し得るか発生し得ない任意の量を超える、かなりの量の帯電安定化したナノ構造を含む、界面動電的に改変された新規の流体を提供する。特定の態様では、帯電安定化したナノ構造は、帯電安定化した酸素含有ナノ構造を含む。さらなる態様では、帯電安定化したナノ構造はすべて、もしくは実質的にすべて、帯電安定化した酸素含有ナノ構造であり、または、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、界面動電流体において主要な帯電安定化したガス含有のナノ構造種である。
【０１３１】
なおさらなる態様によれば、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、溶媒和電子を含むか内部に持つことができ、それにより、新規の安定化した溶媒和電子担体を提供する。特定の態様では、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、新規のタイプのエレクトライド（または逆エレクトライド）を提供する。このエレクトライドは、単一の有機配位カチオンを有する従来の溶質エレクトライドとは対照的に、空隙または酸素原子を含有する空隙の周辺に安定的に配列された複数のカチオンを有し、配列されたナトリウムイオンは、有機分子によってではなく、水の水和殻によって配位される。特定の態様によれば、溶媒和電子は、水分子の水和殻により収容され得る。または好ましくは、すべてのカチオンに渡って分布するナノ構造の空隙内に収容され得る。ある態様では、本発明のナノ構造は、配列した複数のナトリウムカチオンに渡って溶媒和電子の分布／安定化を提供するだけでなく、空隙中にケージを形成した酸素分子（複数可）と溶媒和電子との会合または部分的会合を提供することにより（すなわち、溶媒和電子はナトリウム原子の配列および少なくとも１つの酸素原子に渡って分布する）、溶液中の新規の「スーパーエレクトライド」を提供する。したがって、特定の態様によれば、本発明の界面動電流体と関連して本発明で開示される「溶媒和電子」は、水分子による直接の水和を含む従来のモデルでは溶媒和されない場合がある。あるいは、乾燥したエレクトライド塩と限定的に同様に、本発明の界面動電流体中の溶媒和電子は、帯電安定化した複数のナノ構造に渡って分布して、水溶液中の高次の配列を安定化させるために「格子接着剤（ｌａｔｔｉｃｅ  ｇｌｕｅ）」を提供し得る。
【０１３２】
特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、細胞膜もしくはその成分、またはタンパク質等と相互作用して、生物学的活性を媒介することができる。特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または溶媒和電子を持つ帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、細胞膜もしくはその成分、またはタンパク質等と相互作用して、生物学的活性を媒介することができる。
【０１３３】
特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、電荷および／もしくは帯電効果供与体（送達）として、かつ／または電荷および／もしくは帯電効果受容体として、細胞膜もしくはその成分、またはタンパク質等と相互作用して、生物学的活性を媒介することができる。特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または溶媒和電子を持つ帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、電荷および／もしくは帯電効果供与体として、かつ／または電荷および／もしくは帯電効果受容体として、細胞膜と相互作用して、生物学的活性を媒介することができる。
【０１３４】
特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、本発明の界面動電流体の観察された安定性および生物学的特性と一致し、かつこれらを説明し、さらに、イオン水溶液（例えば、食塩溶液、ＮａＣｌ等）中の安定化した溶媒和電子を提供する、新規のエレクトライド（または逆エレクトライド）を提供する。
【０１３５】
特定の態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、帯電安定化した酸素含有ナノ気泡を実質的に含み、またはその形態をとり、またはこれを発生させることができる。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有クラスターは、帯電安定化した酸素含有ナノ構造の相対的に大きな配列の形成、および／または帯電安定化した酸素含有ナノ気泡もしくはその配列の形成を提供する。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、疎水性表面と接触する際、疎水性ナノ気泡の形成を提供することができる。
【０１３６】
特定の態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、少なくとも１つの酸素分子を実質的に含む。ある態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、またはそれ以上の酸素分子を実質的に含む。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、約２０ｎｍ×１．５ｎｍのナノ気泡（例えば、疎水性ナノ気泡）を含むか発生させ、約１２個の酸素分子（例えば、酸素分子の大きさ（約０．３ｎｍ×０．４ｎｍ）、理想気体の状態方程式ｎ＝ＰＶ／ＲＴに基づく。ここで、Ｐ＝１ａｔｍ、Ｒ＝０．０８２  ０５７  ｌ．ａｔｍ／ｍｏｌ．Ｋ；Ｔ＝２９５Ｋ；Ｖ＝ｐｒ２ｈ＝４．７×１０−２２Ｌ、ここで、ｒ＝１０×１０−９ｍ、ｈ＝１．５×１０−９ｍ、およびｎ＝１．９５×１０−２２モル）を含む。
【０１３７】
ある態様では、イオン水性流体中の帯電安定化構造を有する、このようなナノ構造またはその配列にある流体中に存在する、酸素分子の割合は、０．１％超、１％超、２％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超超、６５％、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、および９５％超からなる群より選ばれる割合である。好ましくは、この割合は、約５％超、約１０％超、約１５％超、または約２０％超である。イオン水性流体中の帯電安定化構造を有する、帯電安定化した酸素含有ナノ構造またはその配列の実質的な大きさは、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、１０ｎｍ未満、５ｎｍ未満、４ｎｍ未満、３ｎｍ未満、２ｎｍ未満、および１ｎｍ未満からなる群より選ばれる大きさである。好ましくは、この大きさは、約５０ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満である。
【０１３８】
ある態様では、本発明の界面動電流体は、溶媒和電子を含む。さらなる態様では、本発明の界面動電流体は、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造、および／またはその配列を含み、これらは、１つまたは複数の溶媒和電子、および独特な電荷分布（極性、対称、非対称の電荷分布）のうちの少なくとも１つを含む。ある態様では、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造、および／またはその配列は、常磁性を有する。
【０１３９】
対照的に、本発明の界面動電流体と比較して、対照の加圧ポット含酸素化流体（非界面動電流体）等は、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節が可能な、このような界面動電的に生成され帯電安定化し生物学的に活性なナノ構造および／または生物学的に活性な帯電安定化した酸素含有ナノ構造、および／またはその配列を含まない。
【０１４０】
ガス富化流体を生成するシステム
本出願人の特許出願国際公開第２００９／０５５７２９号に以前開示されたシステムおよび方法は、最小の受動的損失を伴う高濃度で、ガス（例えば、酸素）を安定的に富化させることが可能である。このシステムおよび方法を効果的に使用して、多種多様のガスを高い割合で、多種多様の流体中に富化することができる。単なる例として、一般的には室温で溶解酸素の約２〜３ｐｐｍ（百万分率）のレベルを有する脱イオン水が、開示されたシステムおよび／または方法を用いて、少なくとも約５ｐｐｍ、少なくとも約１０ｐｐｍ、少なくとも約１５ｐｐｍ、少なくとも約２０ｐｐｍ、少なくとも約２５ｐｐｍ、少なくとも約３０ｐｐｍ、少なくとも約３５ｐｐｍ、少なくとも約４０ｐｐｍ、少なくとも約４５ｐｐｍ、少なくとも約５０ｐｐｍ、少なくとも約５５ｐｐｍ、少なくとも約６０ｐｐｍ、少なくとも約６５ｐｐｍ、少なくとも約７０ｐｐｍ、少なくとも約７５ｐｐｍ、少なくとも約８０ｐｐｍ、少なくとも約８５ｐｐｍ、少なくとも約９０ｐｐｍ、少なくとも約９５ｐｐｍ、少なくとも約１００ｐｐｍ、またはいずれかの値以上もしくはそれらの間の範囲の溶解酸素のレベルを達成することができる。特定の代表的な実施形態によれば、約３０〜６０ｐｐｍの溶解酸素レベルで酸素富化水が生成され得る。
【０１４１】
表３は、酸素富化食塩溶液（表３）で処置された治癒創傷、および本発明のガス富化酸素富化食塩溶液のサンプルにおいて得られた様々な分圧測定を示す。
【０１４２】
【表８】
2013538803.tif 000011
【０１４３】
投与経路および形態
特定の代表的な実施形態では、本発明のガス富化流体は、炎症の少なくとも１つの症状を予防または緩和するように、単独で、または別の治療剤と組み合わせて、治療組成物として機能し得る。本発明の治療組成物は、それを必要とする対象に投与可能な組成物を含む。ある実施形態では、治療組成物製剤は、担体、アジュバント、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味料、香料、および結合剤からなる群より選ばれる、少なくとも１つの添加剤も含み得る。
【０１４４】
本明細書で使用される「薬剤的に許容可能な担体」および「担体」とは、概して、非毒性で不活性の固体、半固体、もしくは液体の充填剤、希釈剤、封入物質、または任意の種類の製剤補助物質を指す。薬剤的に許容可能な担体としての機能を果たし得る物質のいくつかの非限定的な例として、ラクトース、グルコース、およびスクロース等の糖類；コーンスターチおよびポテトスターチ等のデンプン；セルロース、およびその誘導体である、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース等；トラガカント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬用ワックス等の賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油等の油類；プロピレングリコール等のグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝溶液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム等の他の非毒性の適合性滑沢剤があり、さらに、調剤者の判断に従って、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味料、香料、保存料、および抗酸化剤も組成物中に存在し得る。特定の態様では、このような担体および賦形剤は、本発明のガス富化流体または溶液であり得る。
【０１４５】
例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、または希釈剤等の、本明細書に記載されている薬剤的に許容可能な担体は、当業者には公知である。一般に、薬剤的に許容可能な担体は、治療剤に対して化学的に不活性であり、使用条件下では有害な副作用も毒性もない。薬剤的に許容可能な担体は、ポリマーおよびポリマーマトリクス、ナノ粒子、微小気泡等を含み得る。
【０１４６】
本発明の治療用ガス富化流体に加えて、治療組成物はさらに、不活性希釈剤、例えば追加の非ガス富化水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含み得る。当業者であれば認識するように、特定の治療組成物の新規の改善された製剤、新規のガス富化治療流体、および新規のガス富化治療流体を送達する新規の方法は、１つまたは複数の不活性希釈剤を、組成が同一、類似、または異なるガス富化流体に置き換えることにより取得し得る。例えば、酸素を水または脱イオン水中に混合してガス富化流体を生成し、この流体を従来の水に置き換えるか補完することにより、ガス富化流体が得られる。
【０１４７】
ある実施形態では、本発明のガス富化流体は、１つまたは複数の治療剤と組み合わせてよく、かつ／または単独で使用してよい。特定の実施形態では、ガス富化流体を取り込むことは、脱イオン水、食塩溶液等の当技術分野で公知の１つまたは複数の溶液を、１つまたは複数のガス富化流体に置き換えることを含み、それにより、対象に送達する改善された治療組成物を提供することができる。
【０１４８】
ある実施形態が提供する治療組成物は、本発明のガス富化流体、医薬組成物もしくは他の治療剤またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは溶媒、および少なくとも１つの医薬担体もしくは希釈剤を含む。これらの医薬組成物は、前述の疾患または状態の予防および治療ならびに上記のような治療法において、使用され得る。好ましくは、担体は、薬剤的に許容可能であり、かつ、組成物中の他の成分に適合する（すなわち、有害な影響を与えない）ものでなければならない。担体は、固体または液体でよく、好ましくは、単位用量製剤として、例えば、活性成分の０．０５〜９５重量％を含有し得る錠剤として製剤化される。
【０１４９】
可能な投与経路としては、経口、舌下、口腔、非経口（例えば、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、大槽内、膀胱内、髄腔内、または静脈内）、直腸、局所（経皮、膣内、眼球内、耳内、鼻腔内、植込み可能装置または物質の吸入、注射、または挿入を含む）が含まれる。
【０１５０】
投与経路
特定の対象に対する最適な投与手段は、治療する疾患もしくは状態の性質および重症度、または使用する治療法の性質、ならびに治療組成物もしくは追加の治療剤の性質によって異なる。ある実施形態では、経口投与または局所投与が好ましい。
【０１５１】
経口投与に好適な製剤は、それぞれ既定量の活性化合物を含有する錠剤、カプセル、カシェ剤、シロップ、エリキシル剤、チューインガム、「ロリポップ」（棒付きキャンディ）剤、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、トローチ剤、またはゲルコーティングされたアンプルのような個別単位；粉末または顆粒；水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液；または水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤として、提供し得る。
【０１５２】
経口投与に好適なさらなる製剤は、様々な定量加圧エアロゾル、噴霧器、ネブライザー、または吸入器を用いて発生し得る微粒子粉末またはミスト剤を含むように提供され得る。特に、治療剤の粉末または他の化合物は、本発明のガス富化流体中に溶解または懸濁され得る。
【０１５３】
舌下または口腔投与等による経粘膜的方法に好適な製剤は、活性化合物および通常は風味付けされるベース、例えば、砂糖およびアカシアまたはトラガカントを含むトローチ剤、パッチ剤、錠剤等、ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースアカシア等の不活性ベース中に活性化合物を含むパステル剤を含む。
【０１５４】
非経口投与に好適な製剤は、一般に、既定濃度の活性ガス富化流体を含有し、かつ場合によっては別の治療剤を含有する滅菌水溶液を含み、この水溶液は、好ましくは、対象とするレシピエントの血液と等張である。非経口投与に好適なさらなる製剤は、界面活性剤、シクロデキストリン等の生理的に好適な共溶媒および／または錯化剤を含有する製剤を含む。水中油型乳剤も、ガス富化流体の非経口投与用の製剤に好適であり得る。このような溶液は、好ましくは静脈内投与されるが、皮下注射または筋肉内注射により投与されてもよい。
【０１５５】
尿道、直腸、または膣内投与に好適な製剤は、ゲル剤、クリーム剤、ローション剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、乳剤、溶解可能な固形物質、潅水等を含む。こうした製剤は、好ましくは、座薬ベースを形成する１つまたは複数の固体担体（例えばカカオバター）中に活性成分を含む単位用量座薬として提供される。あるいは、本発明のガス富化流体を用いた結腸洗浄は、結腸または直腸投与用に製剤化され得る。
【０１５６】
局所、眼球内、耳内、または鼻内投与に好適な製剤は、軟膏、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、ペースト剤、ゲル剤（ヒドロゲル等）、スプレー剤、分散性粉末および顆粒、乳剤、流動噴射剤を用いたスプレー剤またはエアロゾル（例えば、リポソームスプレー剤、点鼻剤、鼻腔用スプレー剤等）、ならびに油を含む。このような製剤に好適な担体は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびこれらの組み合わせを含む。経鼻または鼻腔内送達は、定量のこれらの製剤または他の製剤を含み得る。同様に、耳内または眼球内は、点滴剤、軟膏、刺激流体等を含み得る。
【０１５７】
本発明の製剤は、いかなる好適な方法でも調製してよく、一般的には、ガス富化流体を、任意で、液体もしくは微粉化した固体担体、またはその双方を有する活性化合物とともに、必要とされる比率で均一かつ緊密に混合し、次いで、必要に応じて、得られた混合物を所望の形状に付形することにより調製する。
【０１５８】
例えば、錠剤は、粉末または顆粒状の活性成分、および１つまたは複数の任意の成分、例えば、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤または界面活性分散剤を含む均質混合物を圧縮するか、または粉末活性成分および本発明のガス富化流体の均質混合物を成形することにより、調製し得る。
【０１５９】
吸入による投与に好適な製剤は、多様な定量加圧エアロゾル、噴霧器、ネブライザー、または吸入器を用いて発生し得る微粒子粉末またはミスト剤を含む。特に、治療剤の粉末または他の化合物は、本発明のガス富化流体中に溶解または懸濁され得る。
【０１６０】
口からの肺投与に関しては、気管支樹への送達を確実にするために、粉末または溶滴の粒度は、一般に、０．５〜１０μＭ、好ましくは１〜５μＭである。鼻投与に関しては、鼻腔内の保持を確実にするために、１０〜５００μＭの粒度が好ましい。
【０１６１】
定量吸入器は、一般に液化噴射剤中の治療剤の懸濁液または溶液製剤を含有する、加圧エアロゾルディスペンサーである。ある実施形態では、本明細書に開示されるように、本発明のガス富化流体を、標準液化噴射剤に加えて、またはその代わりに、使用され得る。これらの装置は、使用時に、定量（一般に１０〜１５０μＬ）を送達するように適合させた弁を経て製剤を放出して、治療剤およびガス富化流体を含有する微粒子噴霧を生成する。好適な噴射剤には、特定のクロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、およびこれらの混合物が含まれる。
【０１６２】
製剤は、１つまたは複数の共溶媒、例えば、エタノール界面活性剤、例えば、オレイン酸または三オレイン酸ソルビタン、酸化防止剤、および好適な風味剤をさらに含有してよい。ネブライザーは、細いベンチュリ穴を通る圧縮ガス（一般に空気または酸素）の加速によるか、あるいは超音波撹拌のいずれかにより、活性成分の溶液または懸濁液を治療エアロゾルミストに変換する市販の装置である。ネブライザーで用いるのに好適な製剤は、製剤の最大４０％ｗ／ｗ、好ましくは２０％ｗ／ｗ未満をなす、ガス富化流体中の別の治療剤からなる。加えて、蒸留水、滅菌水、または希釈水性アルコール溶液等の他の担体を利用でき、こうした担体は、好ましくは、例えば塩化ナトリウム等の塩の添加により、体液と等張にされる。任意の添加剤として、特に製剤が滅菌調製されていない場合は防腐剤を含み、メチルヒドロキシ−ベンゾエート、酸化防止剤、香味剤、揮発油、緩衝剤、および界面活性剤を含み得る。
【０１６３】
吸入による投与に好適な製剤は、吸入器により送達されるか、または鼻からの吸入により鼻腔に取り込まれ得る微粉砕散剤を含む。吸入器内において、一般にゼラチン製またはプラスチック製のカプセルまたはカートリッジに散剤を入れ、原位置で穴開けまたは開放して、吸入時に装置から引き出される空気または手動ポンプにより散剤を送達する。吸入器で使用する散剤は、活性成分だけからなるか、または活性成分、好適な粉末希釈剤（例えばラクトース）、および任意の界面活性剤を含む粉末ブレンドからなる。活性成分は、一般に、製剤の０．１〜１００ｗ／ｗをなす。
【０１６４】
上記で具体的に言及されている成分に加えて、本発明の製剤は、問題となっている製剤のタイプを考慮して、当業者に公知の他の薬剤を含んでよい。例えば、経口投与に好適な製剤は、香味料を含んでよく、経鼻投与に好適な製剤は、香料を含んでよい。
【０１６５】
本発明の治療組成物は、個別の治療剤として、あるいは、複数の治療剤を組み合わせて、医薬品と併せて使用可能な従来の任意の方法で投与することができる。
【０１６６】
当然のことながら、投与量は、特定の薬剤の薬力学的特性、ならびに投与の様式および経路；レシピエントの年齢、健康状態、および体重；症状の性質および程度；同時治療の種類；治療頻度；ならびに所望の効果、といった既知の要因により異なる。活性成分の１日の投与量は、体重１キログラム（ｋｇ）あたり約０．００１〜１０００ミリグラム（ｍｇ）であり、好ましくは、０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量であると予想できる。ある態様によれば、活性成分の１日の投与量は、０．００１リットル〜１０リットルであり、好ましくは約０．０１リットル〜１リットルであり得る。
【０１６７】
剤形（投与に好適な組成物）は、単位あたり約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を包含する。これらの医薬組成物では、活性成分は、通常、組成物の総重量に基づき約０．５〜９５重量％の量で存在し得る。
【０１６８】
軟膏、ペースト剤、フォーム剤、咬合剤（閉塞）、クリーム剤、およびゲル剤も、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、シリコン、ベントナイト、シリカ酸、およびタルク、またはこれらの混合物のような賦形剤を含有することができる。散剤およびスプレー剤も、ラクトース、タルク、シリカ酸、水酸化アルミニウム、およびケイ酸カルシウム、またはこれらの物質の混合物のような賦形剤を含有することができる。ナノ結晶抗菌性金属の溶液を、エアロゾル医薬品の製造で日常的に使用されている公知の手段のいずれかにより、エアロゾルまたはスプレー剤に変換することができる。概して、このような方法は、通常は不活性担体ガスを用いて溶液の容器を加圧すること、または加圧手段を提供することと、小さな穴に加圧ガスを通すことを含む。スプレー剤はさらに、窒素、二酸化炭素、および他の不活性ガス等の常用の噴射剤を含有することができる。加えて、対象に治療化合物を投与するために必要な任意の経路において、本発明のガス富化治療組成物または流体とともに、マイクロスフェアまたはナノ粒子を使用してよい。
【０１６９】
注射用製剤は、アンプルおよびバイアル等の密閉した単位用量容器または多用量容器中に存在することができ、使用直前に滅菌液体賦形剤またはガス富化流体の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管できる。即時注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。注射可能な組成物用の効果的な医薬担体の必要条件は、当業者には公知である。例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｊ．  Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐａ．，  Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，  Ｅｄｓ．，  ２３８−２５０  （１９８２）  ａｎｄ  ＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，  Ｔｏｉｓｓｅｌ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  ６２２−６３０  （１９８６）を参照のこと。
【０１７０】
局所投与に好適な製剤としては、本発明のガス富化流体を含み、かつ任意で追加の治療剤および香味剤（通常、スクロースおよびアカシア）またはトラガカントを含むトローチ剤；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性ベース中にガス富化流体を含み、かつ任意で追加の治療剤を含む香錠；好適な液体担体中にガス富化流体を含み、かつ任意で追加の治療剤を含む口腔洗薬または含嗽液；ならびにクリーム剤、乳剤、ゲル剤等が挙げられる。
【０１７１】
加えて、直腸投与に好適な製剤は、乳化ベースまたは水溶性ベースなどの様々なベースと混合することにより座薬として提示できる。膣内投与に適した製剤は、活性成分に加えて、当技術分野で適切なものとして知られる担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、フォーム剤、またはスプレー剤として提示できる。
【０１７２】
好適な医薬担体は、当分野における標準の参考テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。
【０１７３】
本発明の文脈において、対象、特に動物、特にヒトへの投与量は、妥当な時間枠の間、当該動物における治療反応に影響するのに十分な量であるべきである。当業者であれば、投与量は、動物の状態、動物の体重、および治療対象の状態を含む様々な要因によって異なることを認識するであろう。好適な用量は、対象において、所望の反応に影響を及ぼすことが知られている濃度の治療組成物をもたらす用量である。
【０１７４】
用量のサイズも、投与の経路、タイミング、および頻度、ならびに治療組成物の投与および所望の生理的効果に伴って発生し得る副作用の存在、性質、および程度によって決まる。
【０１７５】
化合物の組み合わせの投与については、（１）化合物の組み合わせを共製剤にして同時に投与するか、または（２）交互に、すなわち個別の医薬製剤を連続的に、逐次的に、並行して、または同時に送達することにより投与し得ることが認識されるであろう。交互の治療では、第２、および任意の第３の活性成分の投与の遅延が、活性成分の組み合わせの相乗的な治療効果の利益を損失しないようにするべきである。（１）または（２）のいずれかの投与方法によるある実施形態によれば、理想的には、最も有効な結果を達成するように、化合物の組み合わせを投与するべきである。（１）または（２）のいずれかの投与方法によるある実施形態では、理想的には、活性成分のそれぞれのピーク血漿濃度を達成するように、化合物の組み合わせを投与するべきである。組み合わせ共製剤の投与による１日に１回１錠のレジメンは、黄斑変性症に罹患している一部の患者に対して実施可能であり得る。組み合わせの活性成分の効果的なピーク血漿濃度は、約０．００１〜１００μＭの範囲にある。最適なピーク血漿濃度は、特定の患者に処方される製剤および投与レジメンにより達成され得る。本発明の流体および少なくとも１つのさらなる治療薬は、抗血管新生（抗ＶＥＧＦ療法）、単純栄養補助食品、およびスタチンからなる群から選択され、、またはこれらのいずれかの生理学的に機能的な誘導体は、同時に与えられるか逐次的に与えられるかによらず、個々に、複数で、またはこれらの任意の組み合わせで投与され得ることも理解されるであろう。一般に、交互の治療（２）の際は、各化合物の有効投与量が順次に投与され、共製剤治療（１）では、２つ以上の化合物の有効投与量が一緒に投与される。
【０１７６】
本発明による組み合わせは、単位剤形の医薬製剤として簡便に提示され得る。簡便な単位投与製剤は、それぞれ、１ｍｇ〜１ｇの任意の量（例えば１０ｍｇ〜３００ｍｇであるが、これに限定されない）の活性成分を含む。本発明の流体と、キニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、リドカイン、フェニトイン、メキシレチン、フレカイニド、プロパフェノン、モリシジン、プロプラノロール、エスモロール、チモロール、メトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、アミオダロン、ソタロール、イブチリド、ドフェチリド、ドロネダロン、Ｅ−４０３１、ベラパミル、ジルチアゼム、アデノシン、ジゴキシン、硫酸マグネシウム、ワルファリン、ヘパリン、抗血小板剤（例えば、アスピリンおよびクロピドグレル）、β遮断薬（例えば、メトプロロールおよびカルベジロール）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、カソキニン（ｃａｓｏｋｉｎｉｎ）およびラクトキニン（ｌａｃｔｏｋｉｎｉｎ））、スタチン（例えば、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチン）、アルドステロン拮抗剤（例えば、エプレレノンおよびスピロノラクトン）、ジギタリス、利尿薬、ジゴキシン、変力物質（例えば、ミルリノン）、血管拡張剤およびω３脂肪酸（併用療法））とを組み合わせた相乗効果は、幅広い比率で、例えば、１：５０〜５０：１（本発明の流体：さらなる処置）で実現され得る。一実施形態では、この比は、約１：１０〜１０：１の範囲であり得る。別の実施形態では、丸剤、錠剤、カプレット、またはカプセル剤等の共製剤の組み合わせ剤形における、本発明の流体の、キニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、リドカイン、フェニトイン、メキシレチン、フレカイニド、プロパフェノン、モリシジン、プロプラノロール、エスモロール、チモロール、メトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、アミオダロン、ソタロール、イブチリド、ドフェチリド、ドロネダロン、Ｅ−４０３１、ベラパミル、ジルチアゼム、アデノシン、ジゴキシン、硫酸マグネシウム、ワルファリン、ヘパリン、抗血小板剤（例えば、アスピリンおよびクロピドグレル）、β遮断薬（例えば、メトプロロールおよびカルベジロール）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、カソキニン（ｃａｓｏｋｉｎｉｎ）およびラクトキニン（ｌａｃｔｏｋｉｎｉｎ））、スタチン（例えば、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチン）、アルドステロン拮抗剤（例えば、エプレレノンおよびスピロノラクトン）、ジギタリス、利尿薬、ジゴキシン、変力物質（例えば、ミルリノン）、血管拡張剤およびω３脂肪酸（併用療法））に対する重量／重量比は、約１である。すなわち���本発明の流体と、キニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、リドカイン、フェニトイン、メキシレチン、フレカイニド、プロパフェノン、モリシジン、プロプラノロール、エスモロール、チモロール、メトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、アミオダロン、ソタロール、イブチリド、ドフェチリド、ドロネダロン、Ｅ−４０３１、ベラパミル、ジルチアゼム、アデノシン、ジゴキシン、硫酸マグネシウム、ワルファリン、ヘパリン、抗血小板剤（例えば、アスピリンおよびクロピドグレル）、β遮断薬（例えば、メトプロロールおよびカルベジロール）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、カソキニン（ｃａｓｏｋｉｎｉｎ）およびラクトキニン（ｌａｃｔｏｋｉｎｉｎ））、スタチン（例えば、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチン）、アルドステロン拮抗剤（例えば、エプレレノンおよびスピロノラクトン）、ジギタリス、利尿薬、ジゴキシン、変力物質（例えば、ミルリノン）、血管拡張剤およびω３脂肪酸はほぼ等量となる。他の代表的な共製剤では、本発明の流体と、キニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、リドカイン、フェニトイン、メキシレチン、フレカイニド、プロパフェノン、モリシジン、プロプラノロール、エスモロール、チモロール、メトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、アミオダロン、ソタロール、イブチリド、ドフェチリド、ドロネダロン、Ｅ−４０３１、ベラパミル、ジルチアゼム、アデノシン、ジゴキシン、硫酸マグネシウム、ワルファリン、ヘパリン、抗血小板剤（例えば、アスピリンおよびクロピドグレル）、β遮断薬（例えば、メトプロロールおよびカルベジロール）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、カソキニン（ｃａｓｏｋｉｎｉｎ）およびラクトキニン（ｌａｃｔｏｋｉｎｉｎ））、スタチン（例えば、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチン）、アルドステロン拮抗剤（例えば、エプレレノンおよびスピロノラクトン）、ジギタリス、利尿薬、ジゴキシン、変力物質（例えば、ミルリノン）、血管拡張剤およびω３脂肪酸の量は、これより多いかまたは少ない。一実施形態では、各化合物は、単独で使用された場合に抗炎症活性を示す量の組み合わせで利用される。本発明の範囲内において、他の比および量の化合物の上記組み合わせが企図されている。
【０１７７】
単位剤形は、本発明の流体と、キニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、リドカイン、フェニトイン、メキシレチン、フレカイニド、プロパフェノン、モリシジン、プロプラノロール、エスモロール、チモロール、メトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、アミオダロン、ソタロール、イブチリド、ドフェチリド、ドロネダロン、Ｅ−４０３１、ベラパミル、ジルチアゼム、アデノシン、ジゴキシン、硫酸マグネシウム、ワルファリン、ヘパリン、抗血小板剤（例えば、アスピリンおよびクロピドグレル）、β遮断薬（例えば、メトプロロールおよびカルベジロール）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、カソキニン（ｃａｓｏｋｉｎｉｎ）およびラクトキニン（ｌａｃｔｏｋｉｎｉｎ））、スタチン（例えば、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチン）、アルドステロン拮抗剤（例えば、エプレレノンおよびスピロノラクトン）、ジギタリス、利尿薬、ジゴキシン、変力物質（例えば、ミルリノン）、血管拡張剤およびω３脂肪酸、またはこれらのいずれかの生理学的に機能的な誘導体、ならびに薬剤的に許容可能な担体をさらに含む得る。
【０１７８】
当業者であれば、治療に使用するのに必要な本発明の組み合わせにおける活性成分の量は、治療対象の状態の性質、患者の年齢および状態を含む種々の要因によって異なり、最終的には、主治医または医療関係者の裁量によって決まることを認識するであろう。考慮すべき要因としては、投与経路および製剤の性質、動物の体重、年齢、および全身状態、ならびに治療する疾患の性質および重症度が挙げられる。
【０１７９】
同時投与または逐次投与用の単位剤形の任意の２つの活性成分と、第３の活性成分とを組み合わせることも可能である。３部分からなる組み合わせを、同時または逐次的に投与してよい。逐次投与する場合、この組み合わせは、２つまたは３つの投与物で投与され得る。ある実施形態によれば、本発明の流体ならびにキニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、リドカイン、フェニトイン、メキシレチン、フレカイニド、プロパフェノン、モリシジン、プロプラノロール、エスモロール、チモロール、メトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、アミオダロン、ソタロール、イブチリド、ドフェチリド、ドロネダロン、Ｅ−４０３１、ベラパミル、ジルチアゼム、アデノシン、ジゴキシン、硫酸マグネシウム、ワルファリン、ヘパリン、抗血小板剤（例えば、アスピリンおよびクロピドグレル）、β遮断薬（例えば、メトプロロールおよびカルベジロール）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、カソキニン（ｃａｓｏｋｉｎｉｎ）およびラクトキニン（ｌａｃｔｏｋｉｎｉｎ））、スタチン（例えば、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチン）、アルドステロン拮抗剤（例えば、エプレレノンおよびスピロノラクトン）、ジギタリス、利尿薬、ジゴキシン、変力物質（例えば、ミルリノン）、血管拡張剤およびω３脂肪酸の３部分からなる組み合わせを、任意の順序で投与してよい。
【０１８０】
以下の実施例は、単なる例示を意図しており、何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１８１】
実施例１
（微小気泡サイズ）
本実施例は、出願人の米国特許出願公開シリアル番号第１１／９７８，１３７号の実施例２に基づいており、該米国特許出願公開は、気泡サイズに関するその教示について、参照により本明細書に組み込まれる。実験は、ガス微小気泡サイズの限界を決定するために、本発明の散布器を用いることにより、ガス富化流体を用いて行った。微小気泡サイズの限界は、０．２２および０．１ミクロンフィルターを通してガス富化流体を通過させることによって立証された。これらの試験を行う際、ある体積の流体を本発明の散布器に通過させ、ガス富化流体を発生させた。６０ミリリットルの本流体を６０ｍｌ注射器中に流し入れた。続いて、注射器内の流体の溶解酸素レベルをウィンクラー滴定で測定した。注射器内の流体を、０．２２ミクロンのミリポア社製Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＰ５０フィルターを通して、５０ｍｌビーカー中に注いだ。続いて、５０ｍｌビーカー中の物質の溶解酸素の割合を測定した。以下の表４に示される結果を得るために、実験を３回行った。
【０１８２】
【表９】
2013538803.tif 000012
【０１８３】
表に見られるように、注射器内で測定された溶解酸素レベルおよび５０ｍｌビーカー内で測定された溶解酸素レベルは、散布物質を０．２２ミクロンフィルターを通過させることによって有意な変化は生じなかったが、このことは、流体中の溶解ガスの微小気泡が０．２２ミクロンより大きくないことを意味している。
【０１８４】
第二の試験を行い、そこで、１回分の食塩水を本発明の散布器で富化し、出力溶液の試料をフィルター処理していない状態で収集した。フィルター処理していない試料の溶解酸素レベルは４４．７ｐｐｍであった。０．１ミクロンフィルターを用いて本発明の散布器からの酸素富化溶液を濾過し、２つのさらなる試料を収集した。第一の試料について、溶解酸素レベルは４３．４ｐｐｍであった。第二の試料について、溶解酸素レベルは４１．４ｐｐｍであった。最後に、フィルターを除去し、最終試料をフィルター処理していない溶液から収集した。この場合、最終試料は４５．４ｐｐｍの溶解酸素レベルを有していた。これらの結果は、ミリポア社製０．２２ミクロンフィルターを使用した結果と一致した。
【０１８５】
従って、食塩水内のガス気泡または微小気泡の大部分は、およそ０．１ミクロン未満のサイズである。この結果はＡＦＭ測定、およびレーザー分光学研究の両方によって実証されている。
【０１８６】
実施例２
（サイトカインプロファイルを決定した）
本実施例は、出願人の米国特許出願公開シリアル番号第１２／４３５，３５６号の実施例５に基づいており、該米国特許出願公開は、界面動電流体に対するサイトカインプロフィール応答に関するその教示について、参照により本明細書に組み込まれる。混合リンパ球を１人の健康な献血者から得た。軟膜試料を標準的な手順に従って洗浄し、血小板を除去した。リンパ球を、２×１０６／プレートの濃度で、本発明のガス富化流体または蒸留水（対照）のいずれかで希釈したＲＰＭＩ培地（＋５０ｍｍ  ＨＥＰＥＳ）に播種した。細胞を、１マイクログラム／ｍＬ  Ｔ３抗原、または１マイクログラム／ｍＬ  フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）レクチン（汎Ｔ細胞活性化因子）で刺激し、あるいは刺激しなかった（陰性対照）。２４時間インキュベーションした後、細胞の生存率を調べ、上清を抽出し凍結した。
【０１８７】
上清を解凍し、遠心し、サイトカイン発現について、ＸＭＡＰ（登録商標）（ルミネックス社）ビーズＬＩＴＥプロトコルおよびプラットフォームを用いて試験した。
【０１８８】
２００万個の細胞を、本発明の酸素富化流体（水）（ウェル１、３、および５）または蒸留水（２、４および６）のいずれかを含む完全ＲＰＭＩ＋５０ｍｍ  Ｈｅｐｅｓ（水で１０×ＲＰＭＩを１×に希釈）中で、２４ウェルプレートの６ウェル中に播種した。細胞を、１μｇ／ｍｌ  Ｔ３抗原（ウェル１および２）またはＰＨＡ（ウェル３および４）で刺激した。対照ウェル５および６は刺激しなかった。２４時間後、細胞の生存率を調べ、上清を収集し凍結した。次に、上清を解凍し、８，０００ｇで回転してペレットにした。上澄みの上清を、ＬＵＭＩＮＥＸ  ＢＥＡＤ  ＬＩＴＥ（商標）プロトコルおよびプラットフォームを用いて、列挙したサイトカインについてアッセイした。数値データを表５に表わし、対応する棒グラフを図１に示す。注目すべきことに、ＩＦＮ−γレベルは、Ｔ３抗原での対照培地においてよりも、Ｔ３抗原による本発明のガス富化培地においてより高かったが、一方で、ＩＬ−８は、Ｔ３抗原での対照培地においてよりも、Ｔ３抗原による本発明のガス富化培地においてより低かった。さらに、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αレベルは、ＰＨＡでの対照培地においてよりも、ＰＨＡによる本発明のガス富化培地においてより低かったが、一方、ＩＬ−１βレベルは、ＰＨＡでの対照培地と比較した場合、ＰＨＡによる本発明のガス富化流体においてより低かった。本発明のガス富化培地単独において、ＩＦＮ−γレベルは、対照培地においてよりも、より高かった。
【０１８９】
【表１０】
2013538803.tif 000013
【０１９０】
実施例３
（サイトカイン発現）
本実施例は、出願人の米国特許出願公開シリアル番号第１２／４３５，３５６号の実施例６に基づいており、該米国特許出願公開は、界面動電流体に対するサイトカインプロフィール応答に関するその教示について、参照により本明細書に組み込まれる。特定の態様では、ヒト混合リンパ球を本発明の界面動電流体中、あるいは対照流体内で、Ｔ３抗原もしくはＰＨＡによって刺激し、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、エオタキシン、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦｂ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、レプチン、ＴＮＦ−β、ＴＦＧ−β、およびＮＧＦにおける変化を評価した。図１から分かるように、試験された炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＧＭ−ＣＳＦ）、ケモカイン（ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、およびエオタキシン）、炎症性酵素（ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、およびＭＭＰ−９）、アレルゲン応答（ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ２３、Ｂ７−１、およびＢ７−２）、並びにＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−５）は、対照流体と比べ試験流体において減少した。対照的に、試験された抗炎症サイトカイン（例えば、ＩＬ１Ｒ−α、ＴＩＭＰ）は、対照流体と比べ試験流体において増加した。
【０１９１】
出願人は、これらのデータをさらに詳しく説明するために、アレルギー性過敏症反応の評価を目的として、オボアルブミン感作を含む当該技術分野において認められているモデル系を使用した。試験したエンドポイントは、前記反応の具体的な細胞学的且つ細胞成分、並びにタンパク質およびＬＤＨの血清学的測定値であった。エオタキシン、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、およびＶＣＡＭの分析を含む、サイトカイン分析を行った。
【０１９２】
簡潔には、雄Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットに、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）（２００ｍｇ／ｍＬ）含有溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）中の０．５ｍＬのオボアルブミン（ＯＶＡ）グレードＶ（Ａ５５０３−１Ｇ、シグマ社）を、１日目、２日目、および３日目に１回ずつ腹腔内注射した。試験は、２×２要因配置無作為化の処置（４群）であった。免疫反応を起こさせるための２週間の待機期間の後、ラットを１週間、ＲＤＣ１６７６−００（レバレシオ社（Ｒｅｖａｌｅｓｉｏ）専売装置を通して処理された無菌食塩水）、またはＲＤＣ１６７６−０１（レバレシオ社専売装置を通して処理し、さらなる酸素を付加した無菌食塩水）のいずれかで曝露または処理した。１日１回の１週間の処置の終了時に、２つの群を半分に分けて、各群の５０％のラットに吸入による食塩水またはＯＶＡ曝露のいずれかを与えた。
【０１９３】
具体的には、最初のシリアル化（ｓｅｒｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）から１４日後、１２匹のラットを、７日間連続で毎日３０分間、吸入により、ＲＤＣ１６７６−００に曝露した。系を通る空気の流量は１０リットル／分に設定した。計１２匹のラットを、噴霧物質が入り、エアロネブの１２個のサブチャンバに均等に分配される単一ポートを有するパイチャンバ中に整列させた。
【０１９４】
最初の感作から１５日後、１２匹のラットを、７日間連続で毎日３０分間、超音波噴霧により、ＲＤＣ１６７６−０１に曝露した。同じ噴霧器およびチャンバを用いて、気流も１０リットル／分に設定した。ＲＤＣ１６７６−００を最初に噴霧し、ＲＤＣ１６７６−０１を噴霧する前にエアロネブチャンバを完全に乾燥させた。
【０１９５】
最後の噴霧処置からおよそ２時間後、ＲＤＣ１６７６−００群の６匹のラットを、Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ（モデル１Ａ−１Ｂ）を用いて気管内注入により送達されるＯＶＡ（食塩水中で１％）に再曝露した。ＲＤＣ１６７６−００群のその他の６匹のラットは、対照群として、気管内注入によって送達される食塩水に曝露した。次の日、ＲＤＣ１６７６−０１群で前記手順を繰り返した。
【０１９６】
再曝露から２４時間後、各群の全てのラットを、ペントバルビタールナトリウムを過剰投与することにより安楽死させた。全血液試料を下大静脈から採取し、２つの異なる血液採取管、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  ＴｕｂｅおよびＱｉａｇｅｎ  ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  Ｔｕｂｅに入れた。肺器官を処理して、ＲＴ−ＰＣＲ用に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液および肺組織を得て、このモデルにおいて肺の炎症に関わることが知られているサイトカイン発現のマーカーの変化を評価した。肺の右側の４葉の完全性を保つために、片側洗浄技術を使用した。左「大」葉を洗浄し、一方、４枚の右葉は、結紮し、直ちにＴＲＩ−ｚｏｌ（商標）中に入れ、ホモジナイズし、さらなる処理のために実験室に送達した。
【０１９７】
ＢＡＬ分析．
肺洗浄液を収集し、６００〜８００ｇ、４℃で１０分間遠心し、細胞をペレットにした。上清を新しい管に移し、−８０℃で凍結した。気管支肺胞洗浄液（「ＢＡＬ」）を２つのアリコートに分割した。第一のアリコートを遠心沈殿させ、上清を砕いたドライアイス上で急速凍結させ、−８０℃に入れ、さらなる処理のために実験室に輸送した。存在するタンパク質およびＬＤＨの量は、それぞれ、血清タンパク質（該タンパク質は、この実験でのように曝露時に膜を通過して漏れる血清成分である）および細胞死のレベルを表わす。独自の試験側（ｔｅｓｔ  ｓｉｄｅ）は、対照よりもわずかに少ないタンパク質を示した。
【０１９８】
気管支肺胞洗浄液の第二のアリコートを、総タンパク質およびＬＤＨ含有量について評価し、さらに細胞診に供した。処置群は、全細胞が、食塩水対照群よりも多いことを示した。さらに、対照群と比べ、処置群において好酸球の増加があった。対照側と比べ処置群において、わずかに異なる多形核細胞も存在した。
【０１９９】
血液分析．
全血を、１．２〜２．０ｍＬの血液を管に移し、少なくとも３０分間凝血させることにより、分析した。残りの血液試料（およそ３．５〜５．０ｍＬ）は、ＴＲＩ−ｚｏｌ（商標）またはＰＡＸｇｅｎｅ（商標）を用いてＲＮＡ抽出用に保存した。次に、凝血させた血液試料を、１２００ｇ、室温で１０分間遠心した。血清（上清）を取って２本の新しい管に入れ、該血清は−８０℃に保存した。
【０２００】
Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＢ−１２６、モレキュラーリサーチセンター社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｉｎｃ．））を使用するＲＮＡ抽出について、０．２ｍＬの全血または血漿を、０．２ｍＬの全血または血漿あたり２０μＬの５Ｎ  酢酸を補充した０．７５ｍＬのＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＢＤに加えた。管を振盪し、−８０℃で保存した。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）を用いて、室温でおよそ２時間、管をインキュベートした。次に、管を横向きに置いて−２０℃のフリーザーに２４時間保存し、その後長期貯蔵のために−８０℃に移した。
【０２０１】
Ｌｕｍｉｎｅｘ分析．
Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームにより、ミクロビーズ分析を、抗体が関連する結合反応の基質として利用したが、これは、光度単位で読み出し、定量化された標準で比較することができる。各血液試料は、２つの試料として同時に検査した。測定ユニットは光度単位であり、群を、独自開発の流体を有する、ＯＶＡ曝露対照、ＯＶＡ曝露処置、および食塩水曝露処置に分けた。
【０２０２】
Ａｇｉｌａｎｔ遺伝子アレイデータ作成のために、肺組織を摘出し、ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＲ１１８、モレキュラーリサーチセンター社）中に浸した。簡潔に説明すると、およそ１ｍＬのＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔを、各管の中の５０〜１００ｍｇの組織に加えた。試料を、ｇｌａｓｓ−Ｔｅｆｌｏｎ（商標）またはＰｏｌｙｔｒｏｎ（商標）ホモジナイザーを用いて、ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ中で、ホモジナイズした。試料を−８０℃で保存した。
【０２０３】
血液試料：
図２〜１１は、全血試料の評価の結果を示す。
例となる図２は、血液試料データ用の基本的な光度データ表示書式を示している。測定されたサイトカイン（この場合はＫＣ）の名称（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す文字は、各データ図の右上にある。データは、データ点（上のグラフ）および個々の試料の棒グラフ（下のグラフ）の両方として表わす。いずれの場合も、グラフは、左から右へ、４つの群に分割している。最初の２群（それぞれＲＤＣ１６７６−００  ＯＶＡおよびＲＤＣ１６７６−０１  ＯＶＡ）は、吸入によりＯＶＡを再曝露されたものであり、一方、最後の２群（それぞれＲＤＣ１６７６−００  ＯＶＡおよびＲＤＣ１６７６−０１  ＯＶＡ）は、食塩水対照のみを再曝露されたものであった。繰り返しになるが、接尾語００は食塩水処置を表わし、接尾語０１は本発明の界面動電流体処置群を表わす。
【０２０４】
各血液試料を２つの試料に分割し、その試料を同時に測定した。測定単位は光度の単位であり、群は、左から右に向かって：ＯＶＡ曝露された対照；ＯＶＡ曝露された本発明の界面動電流体処置；続いて食塩水曝露された食塩水処置；および食塩水曝露された本発明の界面動電流体処置である。検討を促すために、ＲＤＣ１６７６−０１群の両方は灰色の斜線背景で強調し、一方、対照食塩水処置群は斜線なしの背景を持つ。
【０２０５】
一般に、左の２群を比較すると、ＲＤＣ１６７６−０１群のデータの分布はやや大きく、ＲＤＣ１６７６−０１群の特定のサイトカインレベルは、全体として、対照処置群の試料未満であり；２群間の数値差は典型的には約３０％である。一般に、右端の２群を比較すると、ＲＤＣ１６７６−０１群は、ＲＤＣ１６７６−００群と比較して、若干高い数値を有する。
【０２０６】
図３は、特定の例示的な態様による、血液試料データにおけるＲＡＮＴＥＳ（ＩＬ−８スーパーファミリー）の分析を示す。左端の２群（ＯＶＡ曝露群）の光度単位は、概して、ＲＤＣ１６７６−０１処置群における値が、２群間で３０〜３５％の差異を再度示している上のグラフ部分のドットプロットに示されるように、ＲＤＣ１６７６−００対照群未満であったことを示しており、一方、食塩水のみを曝露した群では、サイトカインのレベル値はおおよそ同じか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において恐らく若干増加していた。
【０２０７】
図４は、特定の例示的態様による、血液試料データにおけるＭＣＰ−１の分析を示す。左端の２群（ＯＶＡ曝露群）の光度単位は、概して、ＲＤＣ１６７６−０１処置群における値が、上のグラフ部分のドットプロットに示されるように、ＲＤＣ１６７６−００対照群未満であったことを示しており、一方、食塩水のみを曝露した群では、サイトカインのレベル値はおおよそ同じか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において恐らく若干増加していた。
【０２０８】
図５は、特定の例示的態様による、血液試料データにおけるＴＮＦαの分析を示す。左端の２群（ＯＶＡ曝露群）の光度単位は、概して、ＲＤＣ１６７６−０１処置群における値が、上のグラフ部分のドットプロットに示されるように、ＲＤＣ１６７６−００対照群未満であったことを示しており、一方、食塩水のみを曝露した群では、サイトカインのレベル値はおおよそ同じか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において恐らく若干増加していた。
【０２０９】
図６は、特定の例示的態様による、血液試料データにおけるＭＩＰ−１αの分析を示す。左端の２群（ＯＶＡ曝露群）の光度単位は、概して、ＲＤＣ１６７６−０１処置群における一般的な値が、上のグラフ部分のドットプロットに示されるように、ＲＤＣ１６７６−００対照群未満であったことを示しており、一方、食塩水のみを曝露した群では、サイトカインのレベル値はおおよそ同じか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において恐らく若干増加していた。
【０２１０】
図７は、特定の例示的態様による、血液試料データにおけるＩＬ−１αの分析を示す。左端の２群（ＯＶＡ曝露群）の光度単位は、概して、ＲＤＣ１６７６−０１処置群における値が、上のグラフ部分のドットプロットに示されるように、ＲＤＣ１６７６−００対照群未満であったことを示しており、一方、食塩水のみを曝露した群では、サイトカインのレベル値はおおよそ同じか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において恐らく若干増加していた。
【０２１１】
図８は、特定の例示的態様による、血液試料データにおけるＶｃａｍの分析を示す。左端の２群（ＯＶＡ曝露群）の光度単位は、概して、ＲＤＣ１６７６−０１処置群における値が、上のグラフ部分のドットプロットに示されるように、ＲＤＣ１６７６−００対照群未満であったことを示しており、一方、食塩水のみを曝露した群では、サイトカインのレベル値はおおよそ同じか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において恐らく若干増加していた。
【０２１２】
図９は、特定の例示的態様による、血液試料データにおけるＩＬ−１βの分析を示す。左端の２群（ＯＶＡ曝露群）の光度単位は、概して、ＲＤＣ１６７６−０１処置群における値が、上のグラフ部分のドットプロットに示されるように、ＲＤＣ１６７６−００対照群未満であったことを示しており、一方、食塩水のみを曝露した群では、サイトカインのレベル値はおおよそ同じか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において恐らく若干増加していた。
【０２１３】
図１０および１１は、特定の例示的態様による、血液試料データにおけるそれぞれエオタキシンおよびＭＣＰ−３の分析を示す。それぞれの場合において、左端の２群（ＯＶＡ曝露群）の光度単位は、概して、ＲＤＣ１６７６−０１処置群における値が、上のグラフ部分のドットプロットに示されるように、ＲＤＣ１６７６−００対照群未満であったことを示しており、一方、食塩水のみを曝露した群では、サイトカインのレベル値はおおよそ同じか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において恐らく若干増加していた。
【０２１４】
気管支肺胞試料：
図１２〜２１は、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）試料の評価の対応する結果を示す。
【０２１５】
図１２は、特定の例示的態様による、ＢＡＬデータにおけるＫＣの分析を示す。この場合、反応レベルは、サンプリング変動と相まって、ＲＤＣ１６７６−０１処置群とＲＤＣ１６７６−００処置群の差異に関しては決定的でなかった。つまり、ＫＣは２群間で比較的小さな差異を示したが、光度単位は非常に小さかった。
【０２１６】
同様に、図１３は、特定の例示的態様による、ＢＡＬデータにおけるＲＡＮＴＥＳの結果を示しており、ＲＤＣ１６７６−０１群において顕著な変動性が示され、他よりも著しく高く、結果を歪めている１つの読取り値が含まれている。
【０２１７】
同様に、図１４は、特定の例示的態様による、ＢＡＬデータにおけるＴＮＦαの分析を示しており、ＲＤＣ１６７６−０１処置群とＲＤＣ１６７６−００処置群の差異の点で、比較的小さな有意性しか示していない。
【０２１８】
図１５は、特定の例示的態様による、ＢＡＬデータにおけるＭＣＰ−１の分析を示しており、ＲＤＣ１６７６−０１処置群とＲＤＣ１６７６−００処置群の差異の点で、比較的小さな有意性しか示していない。
【０２１９】
図１６〜２１は、特定の例示的態様による、ＢＡＬデータにおけるＭＩＰ１−Ａ、ＩＬ−１α、Ｖｃａｍ、ＩＬ−１β、ＭＣＰ−３、およびエオタキシンの分析をそれぞれ示しており、ＲＤＣ１６７６−０１処置群とＲＤＣ１６７６−００処置群の差異の点で、比較的小さな有意性しか示していない。
【０２２０】
要約すると、この、既知の感作に対する炎症反応の標準的アッセイは、少なくとも血液試料において、顕著な臨床的且つ血清学的な影響を生じた。さらに、かなりの数の対照動物が生理学的なストレスを受けて処理中に死亡しかけたが、ＲＤＣ１６７６−０１処置群はいずれも、そのような臨床的なストレス効果を示さなかった。これは、その後、ＯＶＡ曝露群におけるＲＤＣ１６７６−０１処置群とＲＤＣ１６７６−０１処置群の間で、およそ３０％の差異で、サイトカインの血中濃度に反映された。対照的に、ＯＶＡ非曝露群におけるＲＤＣ１６７６−０１処置群とＲＤＣ１６７６−０１処置群の間のサイトカイン、細胞および血清学的プロファイルには小さく非常にわずかな変化しかなく、このことは、恐らく、流体それ自体の最小ベースライン変化を表わしているに過ぎない。
【０２２１】
実施例４
（本発明の界面動伝的に生成された流体での初代気管支上皮細胞（ＢＥＣ）の処置は、気道炎症経路の２つの重要なタンパク質、ＭＭＰ９およびＴＳＬＰの発現および／または活性の低減をもたらした）
【０２２２】
要約．
本実施例は、出願人の米国特許出願公開シリアル番号第１２／４３５，３５６号の実施例９に基づいており、該米国特許出願公開は、界面動電流体による炎症反応の調節に関するその教示について、参照により本明細書に組み込まれる。出願人は以前、Ｂ２受容体に結合しているブラジキニンが濃度依存性であり、結合親和性が、生理食塩水と比較して、本開示の界面動伝的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ；ガス富化され、界面動伝的に生成された流体）中で増加したことを示した。さらに、ディーゼル排出微粒子状物質（ＰＭ、標準的な商業的供給源）で刺激された制御性Ｔ細胞と関連して実施例７に示されるように、データは、対照流体中のＰＭ（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）と比較して、ＰＭおよびＲｅｖの存在下で、制御性Ｔ細胞の増殖が減少したことを示し（図２２）、このことは、本発明の界面動伝的に生成された流体Ｒｅｖが、例えば、アッセイにおいて相対的に減少した増殖によって示されるように、調節性Ｔ細胞の機能を向上させたことを示す。さらに、本発明の流体への曝露は、食塩水および培地対照（ＰＭなし）と比較して、ＩＬ−１０の産生の維持またはわずかな減少をもたらす。同様に、粒状物質（ＰＭ）で刺激された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のアレルギー性喘息（ＡＡ）プロフィールの関連では、データは、本開示の流体（「ＰＭ＋Ｒｅｖ」）への曝露が、食塩水および培地対照と同様、有意に低いトリプターゼレベルをもたらすことが示された。さらに、実施例７および図２２〜２９に示されるジフテリア毒素（ＤＴ３９０、切断型ジフテリア毒素分子；標準的な市販品濃度の１：５０希釈）の効果は、β遮断、ＧＰＣＲ遮断およびＣａチャネル遮断が、ＴｒｅｇおよびＰＢＭＣの機能に対する界面動伝的に生成された流体の活性に影響することを示す。さらに、出願人の以前のデータは、さらなる態様によれば、本発明の流体に曝露すると、密着結合関連タンパク質が肺組織において上方制御されたことを示す。データは、それぞれ、接合部接着分子である、ＪＡＭ２およびＪＡＭ３、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ４およびＧＪＡ５（接合部アドヘリン（ａｄｈｅｒｉｎ））、ＯＣＬＮ（オクルディン）、クローディン（例えば、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ５、ＣＬＤＮ７、ＣＬＤＮ８、ＣＬＤＮ９、ＣＬＤＮ１０）、ＴＪＰ１（密着結合タンパク質１）の発現上昇を示す。さらに、本発明の界面動伝的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０）は、気管支上皮細胞（ＢＥＣ；例えば、Ｃａｌｕ−３）において、全細胞伝導性（例えば、過分極状態下）の調節に影響し、さらなる態様によれば、全細胞伝導性の調節はイオンチャネルの調節を反映している。
【０２２３】
本実施例では、出願人は、追加の実験を行い、気道炎症経路の２つの重要なタンパク質の産生の効果を測定することによって、これらの発見を拡張した。具体的には、ＭＭＰ９およびＴＳＬＰを、初代気管支上皮細胞（ＢＥＣ）においてアッセイした。
【０２２４】
材料および方法：
市販の初代ヒト気管支上皮細胞（ＢＥＣ）（プロモセル社（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）、ドイツから得たＨＢＥｐＣ−ｃ）を、これらの試験に用いた。約８０％コンフルエントに達するまで、およそ５０，０００個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェルに播種した。その後細胞を、ディーゼル排出微粒子状物質（ＤＥＰまたはＰＭ）と共に、１：１０希釈（１ｍｌの気道上皮増殖培地中に１００μｌ）の生理食塩水、対照流体Ｓｏｌａｓまたは試験流体Ｒｅｖｅｒａ６０で６時間処理し、その後、ＦＡＣＳ分析に上げられた。ＭＭＰ９およびＴＳＬＰ受容体抗体の両方を、ＢＤバイオサイエンス社から入手し、製造業者の仕様書に従って使用した。
【０２２５】
結果：
出願人は、試験物質Ｒｅｖｅｒａ６０が、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）において、ＤＥＰ誘導性ＴＳＬＰ受容体発現をおよそ９０％だけ低減させることを示す。ＳｏｌａｓはＴＳＬＰ受容体発現において５５％の低減をもたらしたが、一方、生理食塩水は、ＴＳＬＰ受容体発現において、同様の低減レベルを生むことができなかった（およそ２０％の低減）。ＴＳＬＰ受容体発現の低減における本発明の溶液の効果は、ＴＳＬＰが、アレルギー性喘息の病理において中心的役割を果たしており、局所抗体を介したＴＳＬＰ受容体機能の遮断が、アレルギー疾患を軽減したことが最近の知見により示されていることを考慮すると、意味のある発見である（Ｌｉｕ，  ＹＪ，    Ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ：  Ｍａｓｔｅｒ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：２６９−２７３，  ２００６；  Ａｌ−Ｓｈａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＴＳＬＰ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ａｓｔｈｍａ  ｍｏｄｅｌ，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０２：８２９−８３９，  ２００５；  ａｎｄ  Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｏｃａｌ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ＴＳＬＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｌｅｖｉａｔｅｄ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ａｉｒｗａｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００８，  Ａｕｇ  ２９．  （Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ））。
【０２２６】
同様に図３９は、ＤＥＰを介したＭＭＰ９の増加に対するＲｅｖｅｒａ６０、Ｓｏｌａｓおよび生理食塩水の効果を示す。具体的には、Ｒｅｖｅｒａ６０は、気管支上皮細胞において、ＤＥＰを介した細胞表面結合型ＭＭＰ９のレベルをおよそ８０％だけ阻害し、Ｓｏｌａｓはおよそ７０％の阻害効果を有していたが、一方で、生理食塩水（ＮＳ）は、約２０％低減というわずかな効果しか持たなかった。ＭＭＰ−９は、喘息における気道炎症および気管支リモデリングに関わる主要なプロテアーゼの１つである。近年、ＭＭＰ−９のレベルは、健全な対照対象と比較して、安定喘息患者において有意に増加し、急性喘息患者ではさらに高いことが示されている。ＭＭＰ−９は、気道炎症細胞の浸潤および気道過敏性の誘起において重要な役割を果たし、ＭＭＰ−９が、喘息を誘起し維持する上で重要な役割を有し得ることを示している（Ｖｉｇｎｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｐｕｔｕｍ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９／ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｒａｔｉｏ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｉｒｆｌｏｗ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ，  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １５８：１９４５−１９５０，  １９９８；  Ｈｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｈａｌｅｄ  ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｓｕｂｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ，  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０４：３５６−３６３，  １９９９；  Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ  ａｓｔｈｍａ，  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １７２：５５９−５６５，２００５；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｏｌｕｅｎｅ  ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｓｔｈｍａ  ｃａｎ  ｂｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０８：１０２１−１０２６，  ２００１；  ａｎｄ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ＩＣＡＭ−１  ａｎｄ  ＶＣＡＭ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｏｌｕｅｎｅ  ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｓｔｈｍａ，  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１１１：１２７８−１２８４）。
【０２２７】
従って、さらなる態様によれば、本発明の界面動伝的に生成された流体は、ＴＳＬＰ受容体発現を調節（例えば、低減）するための、並びに／またはＭＭＰ−９の発現および／もしくは活性を阻害するための実質的な治療的有用性を有し、例えば、炎症および喘息の治療が挙げられる。
【０２２８】
実施例５
（本発明の界面動伝的に生成された流体が、当該技術分野において承認されているアレルギー性喘息の動物モデルにおいて、ブデソニドとの相乗的な抗炎症効果を有することが示された）
【０２２９】
本実施例は、出願人の米国特許出願公開シリアル番号第１２／４３５，３５６号の実施例１０に基づいており、該米国特許出願公開は、喘息モデルとの関連で、界面動電流体による炎症反応の調節に関するその教示について、参照により本明細書に組み込まれる。本実施例は、Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットのオボアルブミン感作モデルにおいて、本発明の界面動伝的に生成された流体（例えば、ＲＤＣ−１６７６−０３）の抗気道炎症特性を評価するために行われた実験について記述している。Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットは、気道機能に対する試験物質の効果を決定するための、当該技術分野において認められているモデルであり、この系統は、例えばアレルギー性喘息のモデルとして、広く用いられている。このモデルにおいてオボアルブミン感作によって誘導された気道病変および生化学的変化は、ヒトで観察されるそれらに類似している（Ｅｌｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  ８８：９５１−６０，  １９９１；  Ｓｉｒｏｉｓ  ＆  Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ，  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２６：９−１５，  ２００１）。吸入経路を選択し、試験物質または対照溶液への肺暴露を最大にした。オボアルブミン感作動物は、オボアルブミン曝露前に、ブデソニド単独で、または試験物質のＲＤＣ１６７６−０３との併用で、７日間処置した。曝露の６時間および２４時間後に、全血球算定（ｔｏｔａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏｕｎｔ）並びにいくつかの炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのレベル並びに種々の呼吸パラメーターを測定し、種々の炎症パラメーターに対する、試験物質投与のあらゆる有益な作用を推定した。
【０２３０】
材料および方法：
Ｂｎ／Ｃｒｌ系統のＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットはチャールスリバー社（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｋｉｎｇｓｔｏｎ）から入手し、実験開始時におよそ２７５±５０ｇの重量であった。全ての動物試験は、ＰＣＳ−ＭＴＬ施設内動物管理使用委員会（ＰＣＳ−ＭＴＬ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を得て行った。試験中、動物の使用および管理は、米国学術研究会議並びにカナダ動物管理会議（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）の指針に従って行った。
【０２３１】
感作．
実験１日目に、動物（各処置群に１４匹の動物）を、新しく調製した、０．９％塩化ナトリウム１ｍｌあたり２ｍｇ  オボアルブミン／１００ｍｇ  水酸化アルミニウムの溶液の、１ｍｌ腹腔内注射を投与することにより感作し、その後３日目に注射を繰り返した。
【０２３２】
処置．
最初の感作から１５日後、動物を、対照（生理食塩水）または試験溶液（界面動伝的に生成された流体  ＲＤＣ１６７６−００、ＲＤＣ１６７６−０２およびＲＤＣ−１６７６−０３）への噴霧曝露に、１日１回、１５分間、７日間連続で曝し、投与は単独、またはブデソニドとの併用であった。動物は、およそ２０Ｌの全身チャンバ（ｗｈｏｌｅ  ｂｏｄｙ  ｃｈａｍｂｅｒ）中で投薬し、試験環境は、バクスコ社（Ｂｕｘｃｏ）製バイアス流れポンプから空気を供給されるエアロネブ超音波噴霧器を用いて、チャンバの空気吸入口に生成された。送気量は１０リットル／分に設定した。
【０２３３】
オボアルブミン曝露．
２１日目、試験溶液処置から２時間後に、全ての動物を、１％オボアルブミン噴霧溶液に１５分間曝露した（全身チャンバ内、２Ｌ／分の送気量）。
【０２３４】
試料採取
オボアルブミン曝露から６時間および２４時間の時点で、全血球数（ｔｏｔａｌ    ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ）および差分血球数（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ）用、並びに種々の炎症誘導性および抗炎症性サイトカインのレベル測定用に、血液試料を採取した。さらに、オボアルブミン曝露の直後並びに６時間後および２４時間後に、エンハンスドポーズ（Ｐｅｎｈ）および一回呼吸量を、バクスコ・エレクトロニクス社（Ｂｕｘｃｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）製ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ  ＸＡ系を用いて、１０分間測定した。
【０２３５】
結果：
好酸球数：予想された通り、そして図３５に示されるように、ブデソニド（「ＮＳ＋ブデソニド  ７５０μｇ／Ｋｇ」；高密度斜交平行線棒グラフ）での処置は、生理食塩水「ＮＳ」単独対照（白抜き棒グラフ）での処置と比較して、曝露動物における総好酸球数を減少させた。さらに、本発明の流体「ＲＤＣ１６７６−０３」単独（低密度並行斜線棒グラフ）での処置は好酸球数を有意に減少させなかったが、それにもかかわらず、本発明の流体は、好酸球数を減少させることにおいて、ブデソニドとの実質的相乗作用を示した（「ＲＤＣ１６７６−０３＋ブデソニド  ７５０μｇ／Ｋｇ」、濃暗の（ｓｏｌｉｄ  ｄａｒｋ）棒グラフ）同様に図３６では、好酸球率（％）はまた、類似の傾向を示した。ＲＤＣ１６７６−０３（低密度並行斜線棒グラフ（ｇｒａｐｈ  ｂａｒ））またはブデソニド  ７５０μｇ／ｋｇ（高密度斜交平行線棒グラフ）単独が曝露動物における好酸球率（％）カウントに有意な効果を持たなかった一方で、その２つの併用は好酸球率（％）を有意に減少させた（濃暗の（ｓｏｌｉｄ  ｄａｒｋ）棒グラフ）。
【０２３６】
従って、図３５および図３６は、本発明の特定の態様によれば、本発明の界面動伝的に生成された流体（例えば、ＲＤＣ１６７６−０３）が、当該技術分野において認められているヒトアレルギー性喘息のラットモデルにおいて、ブデソニドとの併用で実質的な相乗的有用性を有し、好酸球数（「好酸球率（％）」および総数）を有意に減少させることが、実証されたことを示す。
【０２３７】
呼吸パラメーター：
出願人は、オボアルブミン曝露の直後、６時間および２４時間後に測定されるＰｅｎｈおよび一回呼吸量に対する、試験流体の観察効果を実証する。Ｐｅｎｈはピーク吸気流量、ピーク呼気流量および呼息時間から得られる派生値であり、ｐｅｎｈ値の低下は、肺機能の好ましい予後を反映している。
【０２３８】
Ｐｅｎｈ＝（ピーク呼気流量／ピーク吸気流量）×（呼息時間／６５％の呼息体積を呼息する時間−１）
【０２３９】
単独または本試験流体のいずれかとの併用でのブデソニド処置（両方とも５００および７５０μｇ／ｋｇ）は、曝露直後ではＰｅｎｈ値に有意に影響しなかった。しかしながら、曝露から６時間後、ＲＤＣ１６７６−０３単独またはブデソニド５００または７５０μｇ／ｋｇとの併用で処置された動物は、Ｐｅｎｈ値において有意な低下を示した。この低下の程度は曝露後２４時間までに消失したが、ブデソニドとＲＤＣ流体との相乗効果の傾向はこの時点でなお観察された。
【０２４０】
一回呼吸量は、呼気終末状態からの吸気時に肺に吸い込まれる空気の体積であり、これは安静呼吸中の呼息時に、受動的に肺から排気されるものである。ブデソニド単独で処置された動物は、曝露直後、一回呼吸量に何の変化も示さなかった。しかし、ＲＤＣ１６７６−０３単独は、この初期の時点においてでさえ、一回呼吸量に対する有意な刺激作用を有していた。またここでも、ブデソニドを併用したＲＤＣ１６７６−０３（両方とも、５００および７５０μｇ／ｋｇ）は、この時点で、一回呼吸量測定値に対しさらにより顕著な効果を有していた。曝露から６時間後、ＲＤＣ１６７６−０３単独は、一回呼吸量における有意な増加を引き起こすのに十分であり、治療レジメンへのブデソニドの単独または併用での追加は、一回呼吸量に対し何の相加的効果も持たなかった。しかし、これらの初期の時点で観察されたいずれの効果も、２４時間の時点までに消失した。
【０２４１】
まとめると、これらのデータは、一回呼吸量における増加および曝露から６時間後のＰｅｎｈ値における減少から明らかなように、単独の、またはブデソニドと併用したＲＤＣ１６７６−０３が、気道炎症に有意な軽減を与えたことを示す。
【０２４２】
サイトカイン分析：
上記で論じた生理的パラメーターに見られる作用機序を分析するために、生理学的測定の直後、曝露から６時間および２４時間後の血液試料中の、いくつかの炎症誘導性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインを測定した。
【０２４３】
図３７Ａおよび図３７Ｂは、Ｒｅｖ６０（またはＲＤＣ１６７６−０３）単独が、曝露から６時間および２４時間後両方のエオタキシンの血中レベルを有意に低下させたことを明確に示す。ブデソニド  ７５０μｇ／ｋｇもまた、これら両方の時点で血中エオタキシンレベルを低減させが、一方で、ブデソニドの２５０μｇ／ｋｇのみが、後の時点で注目に顕著な効果を有した。しかし、試験溶液Ｒｅｖ６０単独は、両方の時点での両方の濃度のブデソニドより、有意により強力な効果（血中エオタキシンレベル低減において）を示した。エオタキシンは、喘息を引き起こした肺およびアレルギー反応中の他の組織（例えば、クローン病の腸）に蓄積し、そこに好酸球を誘引することが知られている、小分子Ｃ−Ｃケモカインである。エオタキシンはＧタンパク質共役型受容体ＣＣＲ３に結合する。ＣＣＲ３はＴｈ２リンパ球、好塩基球およびマスト細胞等のいくつかの細胞型によって発現されるが、Ｔｈ２リンパ球によるこの受容体の発現は、これらの細胞が好酸球動員を調節しているため、特に重要である。いくつかの研究が、喘息を引き起こした肺におけるエオタキシンおよびＣＣＲ３産生の増加を示しており、並びにこれらの分子と気道の応答性亢進の関連を確立している（“Ｅｏｔａｘｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｓｔｈｍａｔｉｃ  ｌｕｎｇ，”  Ｄｏｌｏｒｅｓ  Ｍ  Ｃｏｎｒｏｙ  ａｎｄ  Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｊ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００１，  ２：１５０−１５６で総括された）。これらの研究が好酸球数に関する図３５および図３６の結果に完全に一致していることに注目することは、特に重要である。
【０２４４】
まとめると、これらの結果は、単独またはブデソニドと併用してのＲＤＣ１６７６−０３処置が、オボアルブミン曝露の２４時間後に、血中の好酸球の総数および％を有意に減少させることができることを強く示している。このことは、曝露から早くも６時間後に観察される、血中エオタキシンレベルの有意な低下と相関している。
【０２４５】
２つの主要な、重要な抗炎症性サイトカイン、ＩＬ１０およびインターフェロンγの血中レベルも、単独またはブデソニドと併用してのＲｅｖ６０処置の結果として、曝露から６時間後に有意に増強される。図３７Ｃおよび図３７Ｄは、それぞれ、インターフェロンγおよびＩＬ１０に対するそのような効果を示す。Ｒｅｖ６０単独またはブデソニド  ２５０μｇ／ｋｇと併用してのＲｅｖ６０が、曝露から６時間までに、曝露動物におけるＩＬ１０の血中レベルを有意に増加させたことは、これらの図から明らかである。同様に、単独またはブデソニドの２５０または７５０μｇ／ｋｇと併用してのＲｅｖ６０は、曝露から６時間後に、ＩＦＮγの血中レベルを有意に増加させた。これらの抗炎症性サイトカインにおける増加は、曝露から６時間後に見られる生理的呼吸パラメーターに見られる有益な作用を、少なくとも部分的には、上手く説明することができる。これらのサイトカインに対する効果は、曝露から２４時間後にはもはや観察されなかった（データ未記載）。
【０２４６】
ランテスまたはＣＣＬ５は循環Ｔ細胞によって発現されるサイトカインであり、Ｔ細胞、好酸球および好塩基球に対し走化性であり、炎症性部位への白血球の動員において積極的な役割を果たしている。ランテスはまた、好酸球を活性化させて、例えば、好酸球陽イオン性タンパク質を放出させる。ランテスは好酸球の密度を変化させて、好酸球を低密度にするが、これが、全身性の細胞活性化状態を表わすと考えられている。ランテスは、好酸球に特異的な酸化的代謝の強力な活性化因子でもある。
【０２４７】
図３８に示すように、ランテスの全身レベルは、単独またはブデソニドの２５０または７５０μｇ／ｋｇと併用してのＲｅｖ６０で処置された動物において、曝露から６時間後に有意に低減されたが、曝露後２４時間後では有意に低減されなかった。またしても、このデータ一組に記述されるブデソニド  ７５０μｇ／ｋｇおよびＲｅｖ６０の明らかな相乗効果が存在している。ＫＣまたはＩＬ８、ＭＣＰ３、ＩＬ１ｂ、ＧＣＳＦ、ＴＧＦｂおよびＮＧＦ等のいくつかの他の炎症誘発性サイトカインに、同様の減少傾向が観察され、単独またはブデソニドと併用してのＲｅｖ６０で処置された動物において、曝露から６時間または２４時間後に観察された。
【０２４８】
実施例６
（本発明の治療流体は、一酸化窒素レベルを調節することに対し、実質的な有用性を有する。）
【０２４９】
本実施例は、出願人の米国特許出願公開シリアル番号第１２／４３５，３５６号の実施例１２に基づいており、該米国特許出願公開は、界面動電流体による一酸化窒素レベルの調節に関するその教示について、参照により本明細書に組み込まれる。特定の態様によれば、本発明の散布器加工された治療流体は、一酸化窒素レベルおよび／または関連する酵素を調節することに対し、実質的な有用性を有する。図３０〜３４は、ＲＤＣ１６７６−０１（即席の独自開発装置を通して処理し、さらに酸素を付加した無菌食塩水；ガス富化され、界面動伝的に生成された流体（Ｒｅｖ））に曝露されたヒト包皮ケラチノサイトから得られたデータを示しており、ＮＯＳ１およびＮＯＳ３、並びにＮｏｓｔｒｉｎ、ＮＯＳ３の発現上昇を示す。対照的に、ラット肺組織（「サイトカイン発現」という表題の上記実施例の組織）から得られたデータは、Ｒｅｖを用いての、ＮＯＳ２およびＮＯＳ３、Ｎｏｓｔｒｉｎ並びにＮＯＳ１ＡＰの下方制御を示す（図３３および３４）。
【０２５０】
実施例７
（調節性Ｔ細胞アッセイを用いて、Ｔ細胞増殖の調節、並びに調節性Ｔ細胞アッセイにおけるサイトカイン（Ｉｌ−１０）および他のタンパク質（例えば、ＧＩＴＲ、グランザイムＡ、ＸＣＬ１、ｐＳｔａｔ５、およびＦｏｘｐ３））の生成、並びに、例えばＰＢＭＣにおけるトリプターゼの生成における、本発明の界面動電的に生成された流体の効果を示した）
【０２５１】
本実施例は、出願人の米国特許出願公開シリアル番号第１２／４３５，３５６号の実施例８に基づいており、該米国特許出願公開は、界面動電流体による炎症の調節に関するその教示について、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で開示される特定の実施形態のＴ細胞調節能を、抗原提示細胞を照射し、抗原およびＴ細胞を導入することによって試験した。通常、これらの刺激されたＴ細胞は増殖する。しかし、調節性Ｔ細胞の導入の結果、通常のＴ細胞増殖は抑制される。
【０２５２】
方法：
簡潔に説明すると、分離に用いるＦＩＴＣと複合体化した抗ＣＤ２５（ＡＣＴ−１）抗体は、ダコ・サイトメーション社（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、イリノイ州シカゴ）から購入した。使用したその他の抗体は以下である：ＣＤ３（可溶条件に対しＨＩＴ３ａ）、ＧＩＴＲ（ＰＥと複合体化）、ＣＤ４（Ｃｙ−５およびＦＩＴＣと複合体化）、ＣＤ２５（ＡＰＣと複合体化）、ＣＤ２８（ＣＤ２８．２クローン）、ＣＤ１２７−ＡＰＣ、グランザイムＡ（ＰＥと複合体化）、ＦｏｘＰ３（バイオレジェンド社（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））、マウスＩｇＧ１（アイソタイプ対照）、およびＸＣＬ１抗体。全ての抗体は、製造業者の取扱説明書に従って使用した。
【０２５３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｒｏｓｅｔｔｅキット（ステムセル・テクノロジー社（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて、末梢全血から単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ１２７−ＡＰＣ抗体、抗ＣＤ２５−ＰＥ抗体および抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体とともにインキュベートした。細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ／ｎＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５応答性Ｔ細胞に、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａを用いるフローサイトメトリーで分離した。
【０２５４】
抑制アッセイを、丸底９６ウェルマイクロタイタープレート中で行った。３．７５×１０３個のＣＤ４＋ＣＤ２５陰性応答性Ｔ細胞、３．７５×１０３個の自己調節性Ｔ細胞、３．７５×１０４個の同種照射ＣＤ３枯渇ＰＢＭＣを、記載の通りに加えた。全ウェルに、抗ＣＤ３（５．０μｇ／ｍｌのクローンＨＩＴ３ａ）を追加した。Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃で７日間培養した。インキュベーション終了の１６時間前に、１．０ｍＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウェルに加えた。プレートをトムテック（Ｔｏｍｔｅｃ）社製セルハーベスターを用いて収集し、３Ｈ−チミジン取り込みを、パーキンエルマー社製シンチレーションカウンターを用いて測定した。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＳｔｅｍＳｅｐヒトＣＤ３＋Ｔ細胞枯渇（ステムセル・テクノロジー社（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、次いで４０Ｇｙの照射を用いてＴ細胞を枯渇させた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から成った。
【０２５５】
調節性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の条件で刺激し、その後Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ赤色生存率色素（インビトロジェン社）、並びに表面マーカーのＣＤ４、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７で染色した。細胞をＬｙｚｅ／Ｆｉｘ  ＰｈｏｓＦｌｏｗ（商標）緩衝液中に固定し、変性Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（登録商標）で透過処理した。その後、細胞を、それぞれの特定の選択された分子に対する抗体で染色した。
【０２５６】
統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて行った。２群間の比較を、両側の独立スチューデントのｔ試験を用いて行った。３群間の比較を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。０．０５未満のＰ値を有意であると見なした（両側）。２群間の相関は、Ｓｐｅａｒｍａｎ係数を介して、ｒ値が０．７超または−０．７未満である場合に、統計学的に有意であると決定した（両側）。
【０２５７】
結果：
図２２に示されるように、細胞をディーゼル排出微粒子状物質（ＰＭ、ＥＰＡより入手）で刺激することによって、調節性Ｔ細胞の増殖を試験した。図２２のｘ軸は、活性型自己ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（キラー細胞）を黒一色の（ｓｏｌｉｄ  ｂｌａｃｋ）棒グラフとして、そして調節性Ｔ細胞単独を灰色の棒グラフ（アネルギーの確認のために示される）で示しており、それらは、白色の棒グラフに示されるように１：１の比で混合された。ｙ軸は、３Ｈ−チミジンの取り込みによって測定された増殖を示す。ｘ軸に沿って左から右に示される通り、「ＰＭ」はディーゼル排気由来の微粒子状物質を指し、「ＰＭ＋Ｒｅｖ」は本開示のＰＭ＋ガス富化され、界面動伝的に生成された流体（Ｒｅｖ）を指し、「Ｓｏｌｉｓ」は本開示の界面動伝的に生成された流体および周囲の雰囲気以上にはガス富化されていない装置のみ（ＰＭ添加なし）を指し、「Ｒｅｖ」は上記で定義したようにＲｅｖ単独（ＰＭ添加なし）を指し、「培地」は細胞増殖培地単独の対照（ＰＭなし；Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）を指し、「食塩水対照（Ｓａｌｉｎｅ  Ｃｏｎ）」は食塩水の対照（なしＰＭ；Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）を指し、「Ｖ」はベラパミルを指し、「Ｐ」はプロパノロール（ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）を指し、「ＤＴ」は１：５０のＤＴ３９０である。
【０２５８】
図２３に示すように、ＰＭ（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）で刺激された細胞は、分泌型ＩＬ−１０における減少を引き起こしたが、一方で、本開示の流体の存在下でＰＭに曝露された細胞（「ＰＭ＋Ｒｅｖ」）は、食塩水および培地対照（ＰＭなし）と比較して、維持された、またはわずかだけ減少されたＩＬ−１０産生をもたらした。さらに、図２３では、ジフテリア毒素（ＤＴ３９０、切断型ジフテリア毒素分子；標準的な市販品濃度の１：５０希釈）を本発明の流体試料中に滴定し、Ｒｅｖを介したＩＬ−１０の増加の作用を遮断した。Ｒｅｖ単独での処置が食塩水および培地対照と比較して、より高いＩＬ−１０レベルをもたらしたことに注目されたい。
【０２５９】
同じように、図２４〜２８に示される、それぞれＧＩＴＲ、グランザイムＡ、ＸＣＬ１、ｐＳｔａｔ５、およびＦｏｘｐ３を用いての同様の結果が得られた。図では、「ＮＳＣ」は「Ｓｏｌｉｓ」（ＰＭなし）と同一である。
【０２６０】
図２９は、トリプターゼを評価している末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のアレルギー性喘息（ＡＡ）特性から得られたＡＡ  ＰＢＭＣデータを示す。粒状物質（ＰＭ）で刺激された細胞が高いトリプターゼレベルを示し、一方で、本開示の流体（「ＰＭ＋Ｒｅｖ」）存在下でＰＭで処置された細胞は、食塩水および培地対照のそれらと同様の有意に低下したトリプターゼレベルをもたらしたことから、ＡＡ  ＰＢＭＣデータは上記の制御性Ｔ細胞データと一貫していた。制御性Ｔ細胞で得られたデータと一貫して、ＤＴ３９０への曝露は、Ｒｅｖを介したトリプターゼレベルに対する効果を遮断し、これが、単独（Ｒｅｖなし、Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）で見られたような、細胞における上昇したトリプターゼレベルをもたらした。Ｒｅｖ単独での処置が、食塩水および培地対照と比較して、低いトリプターゼレベルをもたらしたことに注目されたい。
【０２６１】
要約すると、対照流体（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）中のＰＭと比較して、ＰＭおよびＲｅｖの存在下で、増殖の減少を示す図２２のデータは、アッセイにおいて相対的に減少した増殖に示されるように、本発明の界面動電的に生成された流体Ｒｅｖが調節Ｔ細胞の機能を向上させたことを示す。さらに、本実施例の証拠、および図２２〜２９は、β遮断、ＧＰＣＲ遮断およびＣａチャネル遮断が、調節性Ｔ細胞の機能に対するＲｅｖｅｒａの活性に影響することを示す。
【０２６２】
実施例８
（ＲＮＳ−６０は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析によって、細胞表面受容体：ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）；ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）；ＣＤ１１Ｂ；およびＣＤ３の発現に対して、顕著な効果を有することが示された）
【０２６３】
要約
出願人は蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を用いて、本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）または生理食塩水対照流体のいずれかと共にインキュベートした白血球上の細胞表面受容体、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）；ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）；ＣＤ１１Ｂ；およびＣＤ３の発現レベルを比較した。
【０２６４】
方法：
フィコール‐ハイパーク分離されたＰＢＭＣ（アフェレーシス−全細胞）を、ＲＮＳ６０または生理食塩水（ＮＳ）の３０％溶液中でおよそ１時間プレインキュベートし；
ＰＢＭＣを、２μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｌで２４または４０時間活性化させた；
細胞を収集および洗浄し、ブロッキング／染色緩衝液中で、染色および固定し；
細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【０２６５】
結果：
ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）に関しては、該受容体は、生理食塩水対照中での受容体の発現レベルと比較した場合、ＲＮＳ−６０存在下で実質的に下方制御される。この下方制御は、ＭＡＰＫ  ｐ３８のリン酸化に影響し（データ未記載）、それが次にエオタキシンを下方制御し（例えば、実施例３および図１０を参照されたい）、それが次にＩＬ５を下方制御し（データ未記載）、さらに好酸球数を変化させ（例えば、実施例３参照）、それが、例えば、気管支収縮応答を変化させる因子の１つとなる。
【０２６６】
オボアルブミン曝露モデルの関連で上記実施例３で論じたように、そして図１０に示されるように、ＲＮＳ−６０は、生理食塩水の効果と比較した場合、ＯＶＡ曝露群において血清エオタキシンレベルを減少させた。従って、特定の態様によれば、ＲＮＳ−６０は、リガンドであるエオタキシンおよびその受容体であるＣＣＲ３の両方を減少させる可能性を有する。
【０２６７】
ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）に関しては、図４１Ａに示されるように、生理食塩水における該受容体の発現レベルと比較した場合に、該受容体はＲＮＳ−６０存在下で下方制御される。
【０２６８】
ＣＤ１１Ｂに関しては、図４１Ｂに示されるように、生理食塩水中での該受容体の発現レベルと比較した場合、該受容体はＲＮＳ−６０存在下で下方制御される。
【０２６９】
ＣＤ３に関しては、図４１Ｃに示されるように、生理食塩水中での該受容体の発現レベルと比較した場合、該受容体はＲＮＳ−６０存在下で下方制御される。
【０２７０】
実施例９
（ＲＮＳ６０は、ＭＢＰ刺激を受けたＴ細胞においてＮＦκＢの活性化を減弱したが、生理食塩水（ＮＳ）は減弱しなかった）
【０２７１】
要約：
インスリン受容体シグナル経路の阻害が、炎症反応およびストレス応答がインスリン抵抗性を媒介する中心的な機序であることが次第に明らかになってきた（例えば、Ｗｅｌｌｅｎ  ＆  Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌによる概説、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，  １１５：１１１１−１１１９，  ２００５を参照）。
【０２７２】
代謝経路および免疫経路の重なり．
いくつかのセリン／トレオニンキナーゼは、炎症性刺激またはストレス性刺激によって活性化され、ＪＮＫ、ＮＦ−κＢキナーゼの阻害剤（ＩＫＫ）、およびＰＫＣ−θを含むインスリンシグナル伝達の阻害に寄与する（Ｚｉｃｋ，Ｙ．  ２００３．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｂｅｓ．  Ｒｅｌａｔ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｏｒｄ．  ２７（Ｓｕｐｐｌ．  ３）：Ｓ５６−Ｓ６０）。また、肥満症におけるこれらのキナーゼの活性化は、代謝経路および免疫経路の重なりを強調する。これらは、自然免疫反応において、ＬＰＳ、ペプチドグリカン、二本鎖ＲＮＡ、および他の微生物の生成物に応答して、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達によって活性化される同一のキナーゼ、特にＩＫＫおよびＪＮＫである。（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，  Ｒ．  ２００１．    Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １：１３５−１４５）．そのため、恐らく、ＴＬＲシグナル経路の成分は強力な代謝活性も示すであろう。
【０２７３】
ＰＫＣおよびＩＫＫは細胞内脂質代謝産物によって活性化される。
インスリン作用の相殺において、特に脂質代謝産物への応答で、大きな役割を果たしている２つの他の炎症性キナーゼは、ＩＫＫおよびＰＫＣ−θである。脂質注入によって、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および脂肪酸アシルＣｏＡ等の細胞内の脂肪酸代謝産物のレベルの上昇がもたされることが示されている。この上昇は、ＰＫＣ−θの活性化およびＩＲＳ−１のＳｅｒ３０７のリン酸化増加と相関している（Ｙｕ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｂｙ  ｗｈｉｃｈ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−１  （ＩＲＳ−１）−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ．    Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：５０２３０−５０２３６）。ＰＫＣ−θは、別のセリン／トレオニンキナーゼ、ＩＫＫβ、またはＪＮＫの活性化によってインスリン作用を損ない得る（Ｐｅｒｓｅｇｈｉｎ，  Ｇ．，  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｓｈｕｌｍａｎ，  Ｇ．Ｉ．  ２００３．    Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｌｉｎｋｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．    Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｂｅｓ．  Ｒｅｌａｔ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｏｒｄ．  ２７（Ｓｕｐｐｌ．  ３）：Ｓ６−Ｓ１１）。他のＰＫＣアイソフォームも、脂質によって活性化されることが報告されており、また、インスリンのシグナル伝達の阻害に関与し得る（Ｓｃｈｍｉｔｚ−Ｐｅｉｆｆｅｒ，  Ｃ．  ２００２．    Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９６７：１４６−１５７）。
【０２７４】
ＩＫＫβはＮＦ−κＢを活性化することによって、インスリンのシグナル伝達に強い影響を与え得る。
ＩＫＫβは、少なくとも２つの経路を通して、インスリンのシグナル伝達に強い影響を与え得る。第一に、ＩＫＫβは、セリン残基でＩＲＳ−１を直接リン酸化し得る（Ｙｉｎ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｇａｙｎｏｒ，  Ｒ．Ｂ．  １９９８．    Ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ  ａｓｐｉｒｉｎ  ａｎｄ  ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＩκＢ  ｋｉｎａｓｅ−β．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３９６：７７−８０，  Ｇａｏ，  Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．    Ｓｅｒｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  １  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｋａｐｐａ  Ｂ  ｋｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：４８１１５−４８１２１）。
【０２７５】
第二に、ＩＫＫβは、ＮＦ−κＢ（ＩκＢ）の阻害剤をリン酸化することによって、他の標的の中で、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を含む複数の炎症性メディエーターの産生を刺激する転写因子ＮＦ−κＢを活性化し得る（Ｓｈｏｅｌｓｏｎ，  Ｓ．Ｅ．，  Ｌｅｅ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｙｕａｎ，  Ｍ．  ２００３．    Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＩＫＫβ／ＩκＢ／ＮＦ−κＢ  ａｘｉｓ  ｉｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ−  ａｎｄ  ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．    Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｂｅｓ．  Ｒｅｌａｔ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｏｒｄ．  ２７（Ｓｕｐｐｌ．  ３）：Ｓ４９−Ｓ５２）。ＩＫＫβがヘテロ接合性のマウスは、脂質注入、高脂肪食、または遺伝的肥満によって、インスリン抵抗性から部分的に保護される（Ｙｕａｎ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．    Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ−  ａｎｄ  ｄｉｅｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｓａｌｉｃｙｌａｔｅｓ  ｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＫＫβ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２９３：１６７３−１６７７；  Ｋｉｍ，  Ｊ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０８：４３７−４４６；  ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ２００１１１５５９）。
【０２７６】
さらに、高用量アスピリン処置によるヒト糖尿病におけるＩＫＫβの阻害も、インスリンのシグナル伝達を向上させるが、この用量で、他のキナーゼも影響を受けるかどうかは明らかではない（Ｈｕｎｄａｌ，  Ｒ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｂｙ  ｗｈｉｃｈ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ａｓｐｉｒｉｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０９：１３２１−１３２６．  ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ２００２１４９５５）。最近の研究は、個々の組織または細胞型におけるインスリン抵抗性の発達のためのＩＫＫの重要性を引き出し始めている。肝臓および骨髄性細胞におけるＩＫＫの活性化は、肥満症により誘導されるインスリン抵抗性に寄与しているように見えるが、この経路は筋肉においてはそれほど重要ではない可能性がある（Ｃａｉ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．  Ｌｏｃａｌ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｈｅｐａｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＫＫβ  ａｎｄ  ＮＦ−κＢ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １１：１８３−１９０；  Ａｒｋａｎ，  Ｍ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．  ＩＫＫβ  ｌｉｎｋｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｂｅｓｉｔｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １１：１９１−１９８；  ａｎｄ  Ｒｏｈｌ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４．    Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩκＢ  ｋｉｎａｓｅ  ２  ｆａｉｌｓ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｏｂｅｓｉｔｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１３：４７４−４８１；  ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ２００４１８７１２）。
【０２７７】
方法．
図４２Ａおよび４２Ｂに示される実験用に、ＭＢＰ−免疫化マウスから単離されたＴ細胞を、ＭＢＰで再刺激し、２４時間後、細胞に異なる濃度のＲＮＳ６０およびＮＳを与えた。処置から２時間後、核抽出物におけるＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を、電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）によってモニターした。
【０２７８】
図４２Ｃに示される実験用に、ＭＢＰ−免疫化マウスから単離したＴ細胞に、ＮＦ−κＢ依存性受容体のコンストラクトであるＰＢＩＩＸ−Ｌｕｃを形質移入し、続いて、ＭＢＰで再刺激した。ＭＢＰ刺激から２４時間後、細胞を異なる濃度のＲＮＳ６０およびＮＳで２時間処理し、続いて、ルシフェラーゼアッセイキット（プロメガ社）による、全細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性のアッセイに供した。他の場合では、また、ＭＢＰ刺激を受けたＴ細胞を、３０ｎＭ  ＰＭＡで１時間刺激した。これらの場合では、ＰＭＡは、ＲＮＳ６０およびＮＳでの前処理の１時間後に加えた。結果は、３つの別々の実験の平均値＋標準偏差である。
【０２７９】
結果．
図４２Ａ〜Ｃは、ＲＮＳ６０がＭＢＰ刺激を受けたＴ細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を減弱したが、生理食塩水（ＮＳ）は減弱しなかったことを示す。具体的には、図４２Ａおよび４２Ｂは、ＲＮＳ６０（図４２Ａおよび４２Ｂの中央の３本のレーンを参照）が、ＭＢＰ刺激を受けたＴ細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を、用量反応性の様式で減弱したが、ＮＳ（図４２Ａおよび４２Ｂの一番右側のレーンを参照）は減弱しなかったことを示す。
【０２８０】
同様に、図４２Ｃの棒グラフは、ＲＮＳ６０（図４２Ａおよび４２Ｂの２本目、３本目および４本目のバーを参照）が、ＭＢＰ刺激されたＴ細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を減弱し、それ故、形質移入されたＮＦ−κＢ依存性レポーターコンストラクト（ＰＢＩＩＸ−Ｌｕｃ）からの、全細胞抽出物でのルシフェラーゼ活性も用量反応性の様式で減弱したが、ＮＳ（図４２Ａおよび４２Ｂの５本目のバーを参照）は減弱しなかったことを示す。
【０２８１】
従って、特定の態様によれば、開示される界面動電的に生成された流体は、炎症並びに炎症を介した状態および疾患、例えば、限定はされないが、糖尿病および関連する代謝障害、インスリン抵抗性、神経変性疾患（例えば、Ｍ．Ｓ．、パーキンソン病、アルツハイマー病等）、喘息、嚢胞性線維症、血管／冠状動脈疾患、網膜および／または黄斑変性、消化器障害（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病等）の治療に対し、実質的な有用性を有する。
【０２８２】
実施例１０
（ＲＮＳ６０は、雌および雄ブタにおいて心筋梗塞から２４時間以内に蓄積されるトロポニンの産生を制限したが、ビヒクル対照は制限しなかった）
【０２８３】
要約：
血中のトロポニンレベルは、心筋損傷の、非常に感受性が強く且つ特異的な指標である。血中で見られるのは通常低レベルであるが、心筋梗塞を患った患者は、損傷した心筋の領域を有するために、血中の心筋トロポニンレベルが上昇しているであろう。従って、上昇したトロポニン血中レベルは、心筋がある種の傷害を患ったことを示すだろう。
【０２８４】
方法．
ＲＮＳ６０が心筋梗塞（ＭＩ）後の生存および生理的パラメーターに正の効果を有することを確認するために、４５〜５０ｋｇの体重を有する飼育ブタのバルーン誘発性心筋虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）モデルを用いて試験を行った。このモデルでは、血管形成用カテーテルを総頸動脈から外科的に挿入し、左前下行（ＬＡＤ）枝の真ん中でバルーンを膨張させることにより心筋虚血を引き起こす。虚血を４０分間誘導し、その後、バルーンの空気を抜き、動脈の再灌流を引き起こした。処置は、ＬＡＤの再灌流から５分後に単回冠動脈内注入（３ｍＬ）を介して、続いて４時間毎に７日間、静脈内注射（１００ｍＬ／用量）によって、投与した。処置群は、生理食塩水またはＲＮＳ６０のいずれかを投与されている雄または雌の群を含む（計４群、表６）。
【０２８５】
【表１１】
2013538803.tif 000014
【０２８６】
具体的には、図４３Ａおよび図４３Ｂに示される実験用に、８匹の雌ブタ（パネルＡ）および８匹の雄ブタ（パネルＢ）を、ＲＮＳ６０またはビヒクル単独のいずれかで処置し、心筋梗塞の状態にさせた。心筋梗塞を誘導する前に、各ブタにＲＮＳ６０またはビヒクル単独のいずれかを注射した。各動物において、血管形成用バルーンを膨張させて（例えば、４０分間）、心筋梗塞（ＭＩ）を誘導した。冠血管の完全閉塞を確認しバルーンの位置を修正するために、バルーン膨張後およびバルーン収縮前に血管写を行った。バルーン収縮後、続いて血管写を行って、先に閉塞した動脈の血流の回復を確認した。バルーン膨張から２０分後、ブタを、ＲＮＳ６０または生理食塩水のいずれかの１ｍｌ／分の冠動脈内注入で処置した。ＭＩを導入する前に血液試料を各動物から採取し、トロポニンのベースラインレベルを確定した。ＭＩ導入の直後、６時間後、１２時間後、および２４時間後の時点でさらなる血液試料を採取し、トロポニンレベルについてアッセイした。グラフ上の各ポイントは８匹の動物のトロポニン平均血中レベルを表わしている。具体的には、心電図（ＥＣＧ）、体重、および心拍数を評価し、生化学的心臓マーカー分析用に血液を、−１日目、０日目（再灌流およびＩＣ投与の間、並びに６時間後および１２時間後）、１日目、および７日目に採取した。試験終了時に、心臓をホルマリンで潅流し、摘出し、壊死領域（左心室）で１ｃｍ切片に切って、巨視的に評価して梗塞サイズを肉眼的に決定した。さらなる組織学的分析のために、各切片からの前壁を３つの試料に分割した。各試料をパラフィン包埋し、５μｍ切片をＨ＆Ｅで染色した。
【０２８７】
結果．
以下の結果を得た。
【０２８８】
生存．
全ての雌ブタは、試験の期間、生存した。生理食塩水対照群およびＲＮＳ６０処置群からの各１匹の動物は、ＥＣＧ分析に基づき虚血誘導に失敗したことが明白であったため、結果から除外した。雄の中で、４匹中２匹の生理食塩水処置動物が、手術後の飼育期間の３日目に死亡した。対照的に、ＲＮＳ６０処置した雄は全て、試験において生存した。
【０２８９】
梗塞サイズ．
肉眼的組織像に基づくと、生存動物の梗塞サイズは、全体的に見て、心室壁の約２％〜約１０％に影響を及ぼした。３匹中２匹の対照群の雌が、肉眼で見える梗塞を示した。対照的に、３匹中２匹のＲＮＳ６０で処置された雌は、筋損傷の兆候を何も見せなかった。生理食塩水を注射された雄の１匹およびＲＮＳ６０で処置された雄の１匹のみが、肉眼的な組織学的分析で目に見える梗塞を発生した。梗塞に関する顕微鏡的変化が、対照処置した全ての雌およびＲＮＳ６０処置したすべての雌、並びに対照処置した雄の４匹中３匹の心臓に見られた（表７）。これらの変化には壊死、線維症、ミネラル化、出血、および単核細胞浸潤が含まれた（例を図４４Ａ〜Ｉに示す）。対照的に、ＲＮＳ６０で処置された雄のいずれも、このレベルの心筋障害の兆候を全く示さなかった（表７）。
【０２９０】
【表１２】
2013538803.tif 000015
【０２９１】
ＥＣＧ変化．
虚血期間中、試験に組み込まれた全ての動物において、ＥＣＧはＳＴ上昇を示した。虚血期間（ＩＣ薬物投与中）直後に、対照群の全ての雌ブタが、Ｔ上昇、二相性Ｔ波、および反転した（ｆｌｉｐｐｅｄ）Ｔ波を含むＴ波異常を示した。対照的に、ＲＮＳ６０処置した雌の３匹中２匹にはＴ波変化がなく、これは即時処置が有益であることを示している。雄群では、対照群およびＲＮＳ６０群の両群における４匹中３匹の動物が、Ｔ波変化を示した。外科手術後１週間目、対照処置した雄の２匹は死亡し、残りの対照動物はＴ波に変化を示し続けた。対照的に、ＲＮＳ６０処置した雄の２匹は、通常のＥＣＧ透写図を示した。
【０２９２】
心筋トロポニン．
ＲＮＳ６０処置は、雄および雌ブタの両方におけるＩ／Ｒにより誘導された循環トロポニンレベルの増加を低減させ（図４３ＡおよびＢ）；その効果は雌よりも雄においてより強かった。ＭＩ後３日目に死亡した２匹の雄動物は、全ての雄の中で最も高いトロポニンレベルを示した。図４３ＡおよびＢは、ＲＮＳ６０は、トロポニン産生を、ビヒクル単独処置動物と比べておよそ２倍〜２０倍まで有意に制限したが、ビヒクル単独は有意に制限しなかったことを示す。具体的には、図４３Ａ（雌）およびＢ（雄）は、ＲＮＳ６０（図４３ＡおよびＢの四角を有するラインを参照）が、ビヒクル単独と比較して、ＭＩ誘導に応答して、図４３Ａの雌動物については２倍〜３倍まで、図４３Ａの雄については５倍〜２０倍まで、トロポニンの血中レベルを低減させたことを示す（図４３ＡおよびＢのひし形を有するラインを参照）。
【０２９３】
従って、特定の態様によれば、ＲＮＳ６０の投与は、雄の動物の間で死亡率を低下させ、ＭＩ後のＥＣＧ変化に対し規範的な傾向を発揮した。心筋組織の生存および生理学的な心機能の保護に対するＲＮ６０処置の明確な利点を、心筋トロポニンの低減した血中濃度および心筋障害の組織学的兆候の不在によって確認した。この試験の発見は、ＲＮＳ６０投与の抗炎症および組織保護効果を示す一貫した傾向を示している。
【０２９４】
図４４Ａ〜Ｉは、特定の態様による、対照処置した雄動物（＃３０３３）で見られた壊死組織の一例を示す。Ａ．右側に壊死組織を、そして左側に生存組織に示す低倍率。四角で囲んだ領域を、示されたように、Ｃ、Ｆ、およびＧで、より高倍率で示す。Ｂ．Ａに示されるものと同じ顕微鏡写真で、生存領域と壊死領域間の境界面に黒線を引いたもの。Ｃ．Ａの最も大きな四角の中倍率。生存領域（Ｖ）および壊死領域（Ｎ）は、好塩基球の外見（＊）を有する組織によって隔てられている。Ｄ．Ｃの中央領域の高倍率。顆粒状物質の大部分はミネラル化している。ミネラル化した心筋細胞の中心（ｆｏｃｕｓ）を丸で囲い；混じり合ったもの（ｉｎｔｅｒｍｉｘｅｄ）は単核炎症細胞である（矢印）。Ｅ．多巣性単核細胞浸潤（矢印）を有する、生存領域（Ｖ）と壊死（Ｎ）領域間の境界面の高倍率。Ｆ．壊死領域（Ａで四角で囲まれた）を覆っている心外膜のさらなる高倍率は、軽度の多巣性単核細胞浸潤（矢印）を示す。Ｇ．Ａの底部の四角で囲まれた組織のさらなる高倍率。多巣性ミネラル化を壊死性心筋細胞内の顆粒状好塩基性物質として見ることができる。重度にミネラル化された領域を丸で囲む。Ｈ．壊死性虚血心筋の高倍率。心筋細胞の核は濃縮した核である（小さく暗い好塩基球性の）。細胞質は凝結しているように見え、特徴的な好酸球性の色相を有している。Ｉ．生存虚血心筋の高倍率。Ｈと比較して、核および細胞質の外見における違いに注目されたい。
【０２９５】
実施例１１
（ＲＮＳ６０は、雌ブタにおいて、心筋梗塞後２４時間以内に蓄積したクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）のレベルを減弱したが、ビヒクル対照は減弱しなかった）
【０２９６】
要約．
血中のクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）レベルは、心筋への損傷の、非常に感受性が高く特異的な指標である。通常は血中で低レベルであるが、心筋梗塞に罹患したことがある患者は損傷した心筋の領域を有することから、血中において上昇した心筋ＣＰＫレベルを有するだろう。
【０２９７】
方法．
本実施例の方法、および図４３Ｃおよび４３Ｄに示されるような方法は、実施例１０で論じられた。血液試料をＭＩ誘導前に各動物から採取し、ＣＰＫのベースラインレベルを確定した。さらなる血液試料を、ＭＩ誘導の直後、６時間後、１２時間後、および２４時間後の時点で採取し、ＣＰＫレベルについてアッセイした。グラフ上の各ポイントは、８匹の動物のＣＰＫ平均血中レベルを表わしている。
【０２９８】
結果．
図４３Ｃ（雌ブタ）は、ＲＮＳ６０（図４３Ｃの四角を有するラインを参照）が、ビヒクル単体処置（図４３Ｄのひし形を有するラインを参照）動物よりも３〜４倍まで、ＣＰＫの産生を有意に制限したが、ビヒクル単体は有意に制限しなかったことを示す。
【０２９９】
従って、特定の態様によれば、結果は、ＲＮＳ６０で処置された動物が低レベルのＣＰＫを産生したことを示しており、このことは、心筋が、ＲＮＳ６０で処置された場合に、ビヒクル単体と比較して、損傷のレベルが低減したことを示す。
【０３００】
実施例１２
（開示される界面動電的に改変された水性流体（例えば、ＲＮＳ６０、ＲＩＳ６０）は、心臓血管手術を含む外科手術の状況における従来の食塩水の補助物および／または代替物を提供する）
【０３０１】
要約．
さらなる態様によれば、開示される界面動電的に改変された水性流体（例えば、ＲＮＳ６０、ＲＩＳ６０）は、心臓血管手術を含むがこれに限定されない外科手術の状況で使用される従来の溶液（例えば、食塩水ベースの溶液および流体）を増強または代替することで、予後を改善し、種々の外科手術に付随する有害作用を低減することができる。
【０３０２】
食塩水が使用される多くの心血管の外科シナリオが存在するが、それにおいては、外科シナリオに付随する有害作用を低減または除去することが望ましいであろう。
【０３０３】
例えば、全身性炎症反応が有害作用を引き起こす、心肺バイパス（ＣＰＢ）を必要とする外科手術では、開示される界面動電的に改変された水性流体（例えば、ＲＮＳ６０、ＲＩＳ６０）を含む、または該水性流体から成る充填液（バイパスポンプ充填液）を用いて、ＣＰＢに付随する有害作用を低減または除去することができる。さらなる態様によれば、開示される界面動電的に改変された水性流体（例えば、ＲＮＳ６０、ＲＩＳ６０）を用いて、ＣＰＢの有害な認知神経科学的作用を低減することができる。
【０３０４】
同様に、静脈保存液（典型的にはパパベリンおよび食塩水）との関連で、開示される界面動電的に改変された水性流体（例えば、ＲＮＳ６０、ＲＩＳ６０）を用いて、予後を一層良くすることができる。
【０３０５】
さらに、開示される界面動電的に改変された水性流体（例えば、ＲＮＳ６０、ＲＩＳ６０）を心筋保護液（例えば、カリウムも含有し得るグルタミン酸および／またはアスパラギン酸含有心筋保護液）として用いて、移植完了後に冠血管に流すことができる。
【０３０６】
従って、さらなる態様によれば、開示される界面動電的に改変された水性流体（例えば、ＲＮＳ６０、ＲＩＳ６０）は、外科手術（例えば、心臓血管手術）で従来的に用いられる溶液（例えば、食塩水ベースの溶液および流体）を増強または代替するために、外科手術（例えば、心臓血管手術）のいかなる場所においても用いることができ、それによって、予後を改善し、種々の外科手術に付随する有害作用を低減することができる。
【０３０７】
代表的な心血管系の外科手術には、大動脈縮窄修復、ブラロック‐タウシグ短絡作製（ｃｒｅａｔｉｏｎ）、動脈管開存の閉鎖、合併症虚血性心疾患（例えば、冠状動脈バイパス移植）の合併症治療、先天性心疾患の矯正、心内膜炎を含む様々な原因によって引き起こされる心臓弁膜症の治療、冠動脈疾患の治療、心臓弁膜症の治療、心臓の腫瘍の治療、胸部大動脈瘤修復、弁手術、大動脈手術、不整脈（心房細動）手術、心不全および移植手術、低侵襲心臓手術、ビデオ補助およびロボット補助心臓手術、心臓弁処置、レーザー冠血行再建術、胸大動脈（ｔｈｏｒａｃｉｃ  ａｏｒｔｉｃ  ａｏｒｔａ）処置、血管形成術（例えば、経皮的血管形成術（ＰＴＡ））、血管造影、頸動脈内膜剥離術、大動脈瘤修復、ルーン弁形成術、脳動脈瘤修復、電気的除細動、大動脈弁置換術、頸動脈内膜剥離術、動静脈瘻、心臓カテーテル、大動脈弁置換術、心膜穿刺、僧帽弁修復、僧帽弁置換術、気管内挿管、末梢血管バイパス手術、冠動脈ステント挿入、高感度外部カウンターパルセイション、血管内ステント手術、門脈バイパス、心肺移植、植え込み型除細動器、末梢動脈内膜切除、静脈血栓症予防、および心筋切除が含まれる。
【０３０８】
特定の態様は、必要とする対象に外科手術を行うことを含み、試薬流体が少なくとも１つの外科手術の態様で用いられ、該試薬流体が、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含む、外科的に有効量の界面動電的に改変された水性流体を含む、外科手術を行うための方法を提供する。
【０３０９】
特定の態様では、外科手術は、心不整脈に関連する外科手術；血管疾患に関連する外科手術；心筋梗塞に関連する外科手術；うっ血性心不全に関連する外科手術；心筋炎に関連する外科手術；アテローム性動脈硬化および再狭窄に関連する外科手術；心肺バイパス（ＣＰＢ）の使用を含む外科手術；血管（例えば、静脈、動脈）保存液の使用を含む外科手術；並びに心筋保護液の使用を含む外科手術からなる群から選択される少なくとも１つを含む。
【０３１０】
実施例１３
（本発明の界面動電的に生成された流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）を散布したＣａｌｕ−３細胞に対し行ったパッチクランプ分析によって、（ｉ）ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓへの曝露が全細胞伝導性の増加をもたらしたこと、（ｉｉ）ＲＮＳ−６０への細胞の曝露が、１５分間のインキュベーション時間で明らかな、非線形伝導性の増加を生じさせたこと、並びに（ｉｉｉ）ＲＮＳ−６０への細胞の曝露が、カルシウム伝導性チャネルに対してＲＮＳ−６０食塩水の効果を生じさせたことが明らかになった）
【０３１１】
要約．
本実施例は、出願人の米国特許出願公開シリアル番号第１２／４３５，３５６号の実施例１７に基づいており、該米国特許出願公開は、界面動電流体による膜電気伝導度の調節に関するその教示について、参照により本明細書に組み込まれる。本実施例では、パッチクランプ試験を行って、本明細書に記載されるような、全細胞電流を調節するための有用性を含む、本発明の界面動電的に生成された食塩水流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の有用性をさらに確認した。２組の実験を行った。
【０３１２】
１組目の実験のデータの概要は、Ｓｏｌａｓ食塩水を用いて得られた全細胞伝導性（電流対電位の関係）は、インキュベーション時間（１５分、２時間）、および全電位プロトコルの両方に対して、高度に比例することを示す。しかしながら、Ｓｏｌａｓと共により長くインキュベーション（２時間）することが、全細胞伝導性を増加させたことは明らかであった。ＲＮＳ−６０への細胞の曝露は、非線形伝導性における増加を生じさせ、これは、１５分間のインキュベーション時間でのみ明らかであった。ＲＮＳ−６０のこの非線形電流に対する効果は消失し、代わりに２時間のインキュベーション時間で線形となった。全ての電位プロトコルで存在するが、非線形全細胞伝導性の寄与は、上述のように、電位感受性があった。
【０３１３】
２組目の実験のデータの概要は、非線形電流に対してＲＮＳ−６０食塩水の効果が存在することを示しており、これは外液中の高カルシウムにおいて明らかにされた。非線形全細胞伝導性の寄与は、電位感受性ではあるが、両方の電位プロトコルに存在し、カルシウム伝導性チャネルに対するＲＮＳ−６０食塩水の効果を示す。
【０３１４】
１組目の実験（伝導性の増加；および非線形電位により調節される伝導性の活性化）
１組目の実験の方法
一般的なパッチクランプ法については、ＷＯ２００９／０５５７２９の細胞パッチクランプの実施例２３を参照されたい。以下の１組目の実験では、０ｍＶ保持電位、−１２０ｍＶ、または−６０ｍＶのいずれかからステッピングするプロトコルで、基底条件下でＣａｌｕ−３細胞を用い、パッチクランプ試験を行って、全細胞電流を調節するための、本発明の界面動電的に生成された食塩水流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の有用性をさらに確認した。
【０３１５】
それぞれの場合における全細胞伝導性を、１５分間または２時間インキュベートした細胞から得られた電流対電位の関係から得た。この試験では、群は、ＳｏｌａｓまたはＲＮＳ−６０食塩水のいずれかについて、所与の時間で得られた。
【０３１６】
結果：
結果は、２つの時点（１５分および２時間）、異なる電位プロトコル（Ａ、０ｍＶからのステッピング；Ｂ、−６０ｍＶからのステッピング；およびＣ、−１２０ｍＶからのステッピング）での、上皮細胞膜の極性およびイオンチャネル活性に対する界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の効果を評価した一連のパッチクランプ法実験を示した。結果は、ＲＮＳ−６０が、全細胞伝導性に対して、Ｓｏｌａｓよりも大きな影響を有することを示した。その実験では、３つの電位プロトコルにおいて、並びに１５分および２時間インキュベーションの両方の時点で、同様の結果が見られた。
【０３１７】
さらなる結果は、３つの電位プロトコル（「デルタ電流」）（Ａ、０ｍＶからのステッピング；Ｂ、６０ｍＶからのステッピング；およびＣ、−１２０ｍＶからのステッピング）、並びに２つの時点（１５分および２時間）での、ＲＮＳ−６０電流データからのＳｏｌａｓ電流データの減算を示した。これらのデータは、ＲＮＳ−６０を用いての１５分の時点で、２時間の時点では存在しない非線形電位依存性成分が存在することを示した。
【０３１８】
前の実験でのように、「生理」食塩水でのデータは、基準として用いられる、非常に一貫した、時間依存的な伝導性を与えた。本結果は、群をＳｏｌａｓまたはＲＮＳ−６０食塩水のいずれかに適合させることによって得られ、基礎条件（ｃＡＭＰなし、他のいかなる刺激もなし）下でのＲＮＳ−６０食塩水へのＣａｌｕ−３細胞の曝露が、より短いインキュベーション時間での電位調節性の伝導性の活性化と合致した、時間依存的な効果を生じさせたことを示した。この現象は、２時間のインキュベーション時点ではそれほど明らかではなかった。本明細書のいずれかの箇所に記載されるように、ｃＡＭＰ「反応混液」での刺激によって伝導性が増加した場合に、線形成分はより明らかである。それにもかかわらず、２時間のインキュベーション時間は、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ食塩水の両方に対して、より高度な線形伝導性を示し、この場合、ＲＮＳ−６０食塩水は、Ｓｏｌａｓ単独と比べたとき、全細胞伝導性が倍になった。この証拠は、全細胞伝導性に対する少なくとも２つの寄与、すなわち非線形電位調節性伝導性、および線形伝導性の活性化が、ＲＮＳ−６０食塩水によって影響されることを示しており、これは、より長いインキュベーション時間でより明らかである。
【０３１９】
２組目の実験（カルシウム伝導性チャネルに対する効果）
２組目の実験の方法：
以下の２組目の実験では、基礎条件下でＣａｌｕ−３細胞を用いて０ｍＶまたは−１２０ｍＶのいずれかの保持電位からステッピングするプロトコルを用いて、さらに追加のパッチクランプ試験を行い、全細胞電流を調節するために、本発明の界面動電的に生成された食塩水流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の有用性をさらに確認した。
【０３２０】
それぞれの場合における全細胞伝導性を、いずれかの食塩水を用いて１５分間インキュベートした細胞から得られた電流対電位関係から得た。全細胞伝導性に対しカルシウム伝導性チャネルの寄与が存在するか否か、およびこの全細胞伝導性の一部がＲＮＳ−６０食塩水を用いたインキュベーションによって影響されるか否かを決定するため、細胞を、インキュベーション期間後に生理食塩水中でパッチした（高ＮａＣｌの外液を伴うが、内液は高ＫＣｌを含有する）。次いで、外部食塩水を、ＮａＣｌをＣｓＣｌに置き換えた溶液と置き換え、主な外部陽イオンを置き換えることによって伝導性に変化があるどうかを測定した。その後これらの条件下で、同じ細胞を、カルシウム流入ステップがより明らかになるように、漸増濃度のカルシウムに曝露した。
【０３２１】
結果：
概して、異なる電位プロトコル（０ｍＶからのステッピング、または−１２０ｍＶからのステッピング）で、異なる外部塩類溶液を用いて、上皮細胞膜の極性およびイオンチャネル活性に対する界面動電的に生成された流体（例えば、ＳｏｌａｓおよびＲＮＳ−６０）の効果を評価した、一連のパッチクランプ法実験の結果は、全細胞伝導性が増加したことを示した。これらの実験では、１５分の１つの時点が用いられた。Ｓｏｌａｓの場合、１）外液としてＮａＣｌの代わりにＣｓＣｌを用いることが、対照と比較した場合、線形挙動で全細胞伝導性が増加させたこと；並びに２）２０ｍＭ  ＣａＣｌ２および４０ｍＭ  ＣａＣｌ２のＣａＣｌ２が共に、非線形様式で全細胞伝導性を増加させたことを、結果は示した。ＲＮＳ−６０の場合、１）外液としてＮａＣｌの代わりにＣｓＣｌを用いることが、対照と比較した場合、全細胞伝導性に対する影響をほとんど持たなかったこと；および２）４０ｍＭのＣａＣｌ２が、非線形の様式で全細胞伝導性を増加させたことを、結果は示す。
【０３２２】
さらなる結果は、ＳｏｌａｓおよびＲＮＳ−６０について、２つの電位プロトコル（０ｍＶからのステッピング；および−１２０ｍＶからのステッピング）での、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２および４０ｍＭ  ＣａＣｌ２電流データからのＣｓＣｌデータの減算にを示した。ＳｏｌａｓおよびＲＮＳ−６０溶液の両方が、カルシウムにより誘発される非線形全細胞伝導性を活性化したことを、結果は示す。効果はＲＮＳ−６０を用いた場合により大きく（用量反応性を示す）、ＲＮＳ−６０を用いた場合のみ、より高いカルシウム濃度では増加された。さらに、より高いカルシウム濃度における非線形カルシウム依存性伝導性は、前記電位プロトコルによっても増加した。
【０３２３】
この２組目の実験のデータは、Ｃａｌｕ−３細胞において得られる全細胞伝導性データに対する、ＲＮＳ−６０食塩水およびＳｏｌａｓ食塩水の効果をさらに示す。いずれかの食塩水を用いての１５分間のインキュベーションが、全細胞伝導性に対する明確な効果を生み、それが、ＲＮＳ−６０を用いて、外部カルシウムを増加させる場合に、最も明白であるということであり、さらには、ＲＮＳ−６０食塩水が、全細胞伝導性のカルシウム依存性非線形成分を増加させるということをデータは示した。
【０３２４】
蓄積された証拠により、Ｒｅｖａｌｅｓｉｏ食塩水によるイオンチャネルの活性化が示唆されており、それが、基底細胞伝導性に対し異なる寄与を与えている。
【０３２５】
出願人の他のデータ（例えば、出願人の他の実施例のデータ）と総合すると、本発明の特定の態様は、膜構造、膜電位もしくは膜伝導性、膜タンパク質もしくは受容体、イオンチャネル、脂質成分、または細胞によって交換可能な細胞内成分（例えば、カルシウム依存性細胞内シグナル伝達系等のシグナル経路）のうち少なくとも１つの調節を含む細胞内シグナル伝達を調節するための組成物および方法を提供し、該方法には、膜上構造（例えば、膜および／もしくは膜タンパク質、受容体または他の膜成分）例えば、限定はされないが、ＧＰＣＲおよび／またはｇ−タンパク質における電気化学的および／または立体構造的な変化を与えるための、本発明の界面動電的に生成された溶液の使用が含まれる。さらなる態様によれば、これらの効果は遺伝子発現を調節し、例えば個々の伝達成分の半減期等に依存して、持続し得る。
【０３２６】
実施例１４
（本発明の界面動電流体の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）測定によって、対照の「圧力ポット」（ＰＮＳ−６０）流体中に存在するものよりもかなり小さい疎水性表面微小気泡の存在および／または形成が示された）
【０３２７】
要約．
本実施例は、出願人の米国特許出願公開シリアル番号第１２／４３５，３５６号の実施例１８に基づいており、該米国特許出願公開は、微小気泡に関するその教示について、参照により本明細書に組み込まれる。出願人は、本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）中の疎水性微小気泡を特徴付けるのに原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）測定法を用いた。
【０３２８】
材料および方法
ＡＦＭ研究．
当該技術分野において認められているＮａｎｏｔｅｃｈ  Ｕｓｅｒ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＮＴＵＦ）にて、ＡＦＭ研究を行った。ＡＦＭ研究のために、非常に小さく、高感度の針を疎水性表面上に配置した水滴の中に入れた。次に、針で水／表面の境界面上を、約１５分間で１ｍｍ２のような速度で走査した。針は表面の形状におけるあらゆる不完全さを記録し、小さな気泡の存在を記録するのに十分なほど高感度である。
【０３２９】
水滴が配置されたシリコン基板を、トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロオクチル）シラン）を用いて準備し、得られた疎水性表面は、水をおよそ９５度の接触角を有する球状にさせる。この被膜は、部分的には、それが特に耐久性があるという理由で、多くのＡＦＭ研究で用いられている。
【０３３０】
溶液調製．
２つの試験溶液、ＲＮＳ−６０およびＰＮＳ−６０を試験した。ＲＮＳ−６０は６０ｐｐｍの酸素を含む本発明の界面動電流体であり、一方、ＰＮＳ−６０は、従来の加圧酸素ヘッド（すなわち、圧力ポット酸素化流体）への曝露によって調製された、６０ｐｐｍの酸素を含む非界面動電的な対照流体である。最初に、各試験溶液を小容量の中性のリン酸緩衝溶液（ｐＨ７）の添加によって緩衝し、およそ６０〜７０μＬの各緩衝試験溶液（およそ２２℃）を先に作製したシリカ板上に配置した。
【０３３１】
結果：
ＲＮＳ−６０の液滴は、ＡＦＭ下で、１ｍｍ２の領域中に、幅約２０ｎｍ、高さ約１．５ｎｍ以下の大きさを有する約２０個の疎水性微小気泡の分布を示した。対照的に、ＰＮＳ−６０の液滴は、ＡＦＭ下で、１ｍｍ２の領域中に、幅約６０ｎｍ、高さ約５ｎｍの大きさを有する約５個の疎水性微小気泡を示した。従って、ＰＮＳ−６０の液滴は、ＲＮＳ６０の液滴と比較して、ずっと少なく、ずっと大きな疎水性微小気泡しか有さなかった。
【０３３２】
従って、特定の態様によれば、ＲＮＳ−６０試験溶液およびＰＮＳ−６０試験溶液間では、疎水性表面の微小気泡の大きさおよび分布にかなりの差異が存在し、そこでは、微小気泡は、ＡＦＭ測定中、試験流体に最初から存在する、および／または該試験流体内に形成される。
【０３３３】
本明細書の他の部分でも述べているように、本発明の特定の態様によれば、本発明の界面動電的に改変された流体は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、生細胞が流体と接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量で、イオン水性流体中で安定に形成される、帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含む。
【０３３４】
しかしながら、出願人は、ＡＦＭ実験で観察されたもののような疎水性の気泡（疎水性表面上に形成）は、本明細書で開示される、本発明の生物活性のある帯電安定化したナノ構造とは根本的に異なる可能性があることを指摘する。従って、特定の態様によれば、本実施例のＡＦＭ実験は、サイズおよび分布疎水性気泡形成に基づき、本発明の界面動電流体（例えば、ＲＮＳ−６０）が非界面動電的な対照流体と根本的に異なることを裏付けるが、疎水性気泡は、本明細書の他の部分に詳細に記載される本発明の帯電安定化した酸素含有ナノ構造と異なる、および／または該ナノ構造から生じる可能性がある。いずれにしても、本発明の界面動電流体と比較して、対照の圧力ポット酸素化流体は、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節が可能な、帯電安定化した酸素含有ナノ構造を含まない。
【０３３５】
実施例１５
（界面動電流体（例えば、ＲＮＳ−６０）と対照の「圧力ポット」（ＰＮＳ−６０）流体を区別するために、ラマン分光法を用いた）
【０３３６】
図４５ＡおよびＢは、特定の態様による、ラマン後方散乱で測定された、ＲＮＳ６０（４５Ｂ）に対する温度上昇（心臓）の効果を、対照のＰＮＳ６０（４５Ａ）と比較して示しており、それぞれの異なる曲線、および２つの酸素ピークを示す。
【０３３７】
特定の態様によれば、ラマン分光法は、界面動電的に改変された流体（例えば、ＲＮＳ６０）の特徴付けに対し、実質的な有用性を有する。さらなる態様によれば、そのようなラマン分光法データ／測定値は、界面動電的に改変された流体（例えば、ＲＮＳ６０）の生物活性と相関している。
【０３３８】
実施例１６
（界面動電流体（例えば、ＲＮＳ−６０）を対照流体と区別するために、蛍光偏光異方性を用いた）
【０３３９】
図４６は、特定の態様による、「ＲＮＳ６０」（「ロットＡ」および「ロットＢ」）、「ＮＳ」（生理食塩水対照）、「ＲＤＷ」（界面動電的に処理した脱イオン水）および「ＤＷ」（脱イオン水）間の蛍光偏光異方性データにおける小さいが有意な差異を示す。
【０３４０】
特定の態様によれば、蛍光偏光異方性は、界面動電的に改変された流体（例えば、ＲＮＳ６０）の特徴付けに対し、実質的な有用性を有する。さらなる態様によれば、そのような蛍光偏光異方性データ／測定値は、界面動電的に改変された流体（例えば、ＲＮＳ６０）の生物活性と相関している。
【０３４１】
実施例１７
（界面動電流体（例えば、ＲＮＳ６０）が、イオンチャネル活性、または電気的スパイクの調節から明らかなように、生体膜と相互作用することが示された）
【０３４２】
図４７は、特定の態様によれば、細胞外に散布したＲＮＳ６０（８９％）が、セロトニン誘発性５ＨＴ３Ａ（イオンチャネル）活性を増強することを示す（対照と比較して−１０１．８±２４．２％（ｎ＝３）の平均阻害）。
【０３４３】
特定の態様によれば、セロトニン誘発性５ＨＴ３Ａ（イオンチャネル）活性に対する効果の測定は、界面動電的に改変された流体（例えば、ＲＮＳ６０）の特徴付けに対し、実質的な有用性を有する。さらなる態様によれば、セロトニン誘発性５ＨＴ３Ａ（イオンチャネル）活性に対する効果のそのような測定は、界面動電的に改変された流体（例えば、ＲＮＳ６０）の生物活性と相関している。
【０３４４】
図４８は、特定の態様によれば、ＲＮＳ６０（８４％）が、カプサイシン誘発性ＴＲＰＶ１（イオンチャネル）電流を阻害することを示す（−９０．９±６．７％（ｎ＝３）の平均阻害）。比較は、生理食塩水、１００ｎｍ  カプサイシン、および１００ｎｍ  カプサイシン＋８７％  ＲＮＳ６０間で行う。示されるデータは、ＴＲＰＶ１を過剰発現している組換えＣＨＯ細胞についてのものである。
【０３４５】
特定の態様によれば、カプサイシン誘発性ＴＲＰＶ１（イオンチャネル）電流に対する効果の測定は、界面動電的に改変された流体（例えば、ＲＮＳ６０）の特徴付けに対し、実質的な有用性を有する。さらなる態様によれば、カプサイシン誘発性ＴＲＰＶ１（イオンチャネル）電流のそのような測定は、界面動電的に改変された流体（例えば、ＲＮＳ６０）の生物活性と相関している。
【０３４６】
特定の態様によれば、イオンチャネル活性の調節は、ＲＮＳ６０の生体膜との相互作用を反映する。さらなる態様によれば、例えば、作動薬誘発性の活性の調節を含む、イオンチャネル測定（例えば、相乗作用、阻害、開閉速度の改変、電位感受性等）は、界面動電的に改変された流体（例えば、ＲＮＳ６０）の生物活性を測定する簡便でハイスループットな方法において実質的な有用性を有する。
【０３４７】
図４９は、特定の態様によれば、ＲＮＳ６０散布が、心筋細胞における電気的スパイク（Ｎａ＋電流スパイク）を変化させたことを示す；Ｖ勾配、−１００ｍＶ→＋４０ｍＶ；ΔＶスパイク、１．６７±  ．４７ｍＶ；Δｔスパイク、５．９５  １．６７ミリ秒（ｎ＝６）。
【０３４８】
特定の態様によれば、心筋細胞における電気的スパイク（例えば、（Ｎａ＋電流スパイク））の測定は、界面動電的に改変された流体（例えば、ＲＮＳ６０）の特徴付けに対し、実質的な有用性を有する。さらなる態様によれば、心筋細胞における電気的スパイクのそのような測定は、界面動電的に改変された流体（例えば、ＲＮＳ６０）の生物活性と相関している。機序に束縛されるものではないが、スパイクの遅延は、Ｎａｖ１．５との相互作用によるものである可能性がある。
【０３４９】
参照による組み込み
本願において言及されている、および／または出願データシートに列挙されている、上記全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【０３５０】
本明細書の図面および詳細な説明は、限定的ではなく、例示的なものであると見なされるべきであり、本発明を、開示された特定の形態および実施例に限定することを意図しないことは理解されるべきである。それとは逆に、本発明には、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、以下の特許請求の範囲により規定されるように、当業者には明らかな、さらなる変形、変更、再構成、置換、代替、設計上の選択、および実施形態の全てが含まれる。従って、以下の特許請求の範囲は、そのようなさらなる変形、変更、再構成、置換、代替、設計上の選択、および実施形態の全てを包含すると解釈されることが意図されている。
【０３５１】
前述の実施形態は、異なる他の構成要素に含有された、またはそれに関わる、異なる構成要素を表す。そのような示された構造は単に例示的なものであり、実際には、同一の機能性を達成する多くの他の構造が実施可能であることを理解されたい。概念的な意味において、同一の機能性を達成するためのいかなる構成要素の配置も、所望の機能が達成されるように、効率的に「関連させ」られる。故に、特定の機能を達成するために組み合された本明細書のいかなる２つの構成要素も、構造または中間構成要素に関わりなく、所望の機能が達成されるように、互いに「関連させ」られているものと見なすことができる。同様に、そのように関連させられたいかなる２つの構成要素も、所望の機能を達成するために、互いに「機能的に連結されている」、または「機能的に共役している」と見なすことができる。
【０３５２】
本発明の特定の実施形態について示し、そして記載してきたが、当業者であれば、本明細書の教示に基づいて、本発明およびそのより広範な態様から逸脱することなく変更および変形を行うことができ、従って、添付の特許請求の範囲が、それらの範囲内に、全てのそのような変更および変形を、本発明の真の精神および範囲に属するものとして包含するものであることを理解できるであろう。さらに、本発明が添付の特許請求の範囲によってのみ定義されるものであることは理解されるべきである。一般に、本明細書、および特に、添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本体部分）に使用される用語は、一般的に、「開いている（ｏｐｅｎ）」用語（例えば、「〜を含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「〜を含んでいるが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈されるものとし、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも〜を有する（ｈａｖｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ）」と解釈されるものとし、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は、「〜を含むが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ｂｕｔ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈されるものとする等）として、意図されるものであることは、当業者には理解されよう。特定の数の導入される特許請求の範囲の詳述が意図される場合、そのような意図は、特許請求の範囲中に明確に引用され、そのような詳述がない場合には、そのような意図は存在しないことは、当業者には更に理解されよう。例えば、理解の援助として、以下の添付の特許請求の範囲は、特許請求の範囲の詳述を導入するために、前置きの表現である「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」および「１つまた複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」の使用を含有し得る。しかしながら、そのような表現の使用は、同一の特許請求の範囲が前置きの表現「１つもしくは複数の」または「少なくとも１つの」、および「ａ」または「ａｎ」等の不定冠詞を含むときでさえも（例えば、「ａ」および／または「ａｎ」は「少なくとも１つの」または「１つもしくは複数の」を意味すると通常は解釈されるべきである）、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による特許請求の範囲の詳述の導入が、このような導入された特許請求の範囲の詳述を含むあらゆる特定の特許請求の範囲を、ただ１つのそのような詳述を含む発明に限定することを意味すると解釈するべきではなく；同じことが特許請求の範囲の詳述の導入に使用される定冠詞の使用にも当てはまる。加えて、特定の数の導入された特許請求の範囲の詳述が明確に引用される場合であっても、そのような詳述は、少なくとも引用された数（例えば、他の修飾語句なしの「２つの詳述」の単なる詳述は、少なくとも２つの詳述、または２つ以上の詳述を通常は意味する）を意味すると通常は解釈されるべきことは、当業者には認識されよう。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【国際調査報告】
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