(57)【要約】本発明は、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。適切には、本発明による抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、１０ｐＭ〜５０ｎＭ、好ましくは１０ｐＭ〜１０ｎＭ、好ましくは２５０ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）でＴＧＦβＲＩＩと結合するものである。配列番号１〜２３の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、ＴＧＦβＲＩＩと結合する単離ポリペプチドも提供される。本発明は、ＴＧＦβシグナル伝達に関連した疾患、適切には、特発性肺繊維症を含む肺繊維症のような組織繊維症、肝硬変および慢性肝炎を含む肝臓繊維症、関節リウマチ、眼障害、あるいは皮膚のケロイドを含む皮膚の繊維症、ならびに腎炎、腎繊維症および腎硬化症を含む腎臓の線維症、ならびに再狭窄のような血管症状を治療するためのポリペプチド、リガンドまたは医薬組成物も提供する。【選択図】図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２】
１０ｐＭ〜５０ｎＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）を有するＴＧＦβＲＩＩと結合する請求項１記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項３】
抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインを含む単離ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１〜２３の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項３記載の単離ポリペプチドであって、ＴＧＦβＲＩＩと結合することを特徴とする、単離ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１〜２３の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２４〜４６の群から選択される少なくとも１つの核酸配列と少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる単離ポリペプチドであって、ＴＧＦβＲＩＩと結合する単離ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１〜２３の群の少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項８】
配列番号１〜２３の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項９】
配列番号１〜２３の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、前記少なくとも１つのアミノ酸配列が２５以下のアミノ酸位置で修飾され、そして配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ１配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を含むことを特徴とする、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１０】
配列番号１〜２３の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、前記少なくとも１つのアミノ酸配列が２５以下のアミノ酸位置で修飾され、そして配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ２配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を含むことを特徴とする、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１１】
配列番号１〜２３の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、前記少なくとも１つのアミノ酸配列が２５以下のアミノ酸位置で修飾され、そして配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ３配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を含むことを特徴とする、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１２】
配列番号１〜２３の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、前記少なくとも１つのアミノ酸配列が２５以下のアミノ酸位置で修飾され、そして配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ１配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を含み、さらに、配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ２配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を含むことを特徴とする、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１３】
配列番号１〜２３の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、前記少なくとも１つのアミノ酸配列が２５以下のアミノ酸位置で修飾され、そして配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ１配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を含み、さらに、配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ３配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を含むことを特徴とする、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１４】
配列番号１〜２３の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、前記少なくとも１つのアミノ酸配列が２５以下のアミノ酸位置で修飾され、そして配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ２配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を含み、さらに、配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ３配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を含むことを特徴とする、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１５】
配列番号１〜２３の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、前記少なくとも１つのアミノ酸配列が２５以下のアミノ酸位置で修飾され、そして配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ１配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を含み、さらに、配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ２配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列、ならびに、配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ３配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を含むことを特徴とする、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１６】
配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ３配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を含む請求項１記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン
【請求項１７】
配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ３配列を含む請求項１記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１８】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む請求項１記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３が配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列と同一であることを特徴とする、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１９】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインの位置６１のＮ、位置６４のＲ、位置１０２のＨ、位置３９のＲ、位置５３のＤまたは位置１０３のＳから選択されるアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む請求項１〜２または７〜１８のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、あるいは請求項３〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ＴＧＦβＲＩＩに対する結合特異性を有し、配列番号１〜２３の群から選択されるアミノ酸配列を含む、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインの結合を抑制するリガンド。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドであって、ヒトＴＧＦβＲＩＩと結合することを特徴とする、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンド。
【請求項２２】
請求項２１に記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドであって、マウスＴＧＦβＲＩＩとも結合することを特徴とする、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンド。
【請求項２３】
請求項１〜２３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドを含む融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンドまたは融合タンパク質であって、ＴＧＦβ活性を中和することを特徴とする、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンド。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンドまたは融合タンパク質であって、ＴＧＦβとＴＧＦβＲＩＩとの結合を抑制することを特徴とする、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンド。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンドまたは融合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項２７】
請求項２６記載の単離核酸分子であって、前記核酸が配列番号２４〜２６の群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一である少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、前記少なくとも１つの核酸がＴＧＦβＲＩＩと特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードすることを特徴とする、単離核酸分子。
【請求項２８】
請求項２４〜２６の群から選択される少なくとも１つの核酸分子を含む請求項２６または２７記載の単離核酸分子。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３０】
請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の核酸またはベクターを含む宿主細胞。
【請求項３１】
請求項１〜２５のいずれかに記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドまたはリガンドを含むポリペプチドの産生方法であって、前記核酸またはベクターの発現に適した条件下で請求項３０記載の宿主細胞を保持し、それにより免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドを含むポリペプチドが産生されることを包含する方法。
【請求項３２】
医薬として用いるための請求項１〜２５のいずれかに記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンド。
【請求項３３】
請求項１〜２５のいずれかに記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドを含む医薬組成物。
【請求項３４】
ＴＧＦβシグナル伝達に関連した疾患の治療用の、請求項３２または３３記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドまたは医薬組成物。
【請求項３５】
ＴＧＦβシグナル伝達に関連した前記疾患が、特発性肺繊維症を含む肺繊維症のような組織繊維症、肝硬変および慢性肝炎を含む肝臓繊維症、関節リウマチ、眼障害、あるいは皮膚のケロイドを含む皮膚の繊維症、ならびに腎炎、腎繊維症および腎硬化症のような腎臓の線維症、ならびに再狭窄のような血管症状の群から選択される請求項３４記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドまたは医薬組成物。
【請求項３６】
前記眼障害が、眼組織の繊維性疾患、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、糖尿病性網膜症、解放角緑内障のような緑内障、閉塞隅角緑内障、先天性および偽性落屑症候群、化学的または温熱的熱傷後の創傷治癒反応のような水晶体の創傷治癒反応、あるいはスティーブン・ジョンソン症候群、白内障手術後合併症、ならびに緑内障濾過手術後瘢痕の群から選択される請求項３５記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドまたは医薬組成物。
【請求項３７】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドまたは医薬組成物であって、肺送達のために処方されることを特徴とする、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドまたは医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドまたは医薬組成物であって、眼送達のために処方されることを特徴とする、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドまたは医薬組成物。
【請求項３９】
肺送達のための医薬の製造における請求項１〜２５のいずれかに記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ単一可変ドメインまたはアンタゴニストまたは融合タンパク質の使用。
【請求項４０】
患者の肺への送達のための医薬の製造における請求項１〜２５のいずれかに記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ単一可変ドメインまたはアンタゴニストまたは融合タンパク質の使用。
【請求項４１】
ヒト患者におけるＴＧＦβにより媒介される症状を治療するかおよび／または予防するための方法であって、請求項１〜２５のいずれかに記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドを含む組成物を前記ヒト患者に投与するステップを包含する方法。
【請求項４２】
請求項３３記載の組成物を含有する肺送達デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
形質転換成長因子β；ＴＧＦβ（ＴＧＦ−β）は、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ；ＴＧＦβＲ（ＴＧＦ−βＲ））との結合を介して細胞へのシグナル伝達を媒介するシグナル伝達分子である。ＴＧＦβシグナル伝達活性は、細胞の分化および成長を調節し、その作用の、すなわち細胞成長プロモーター、成長サプレッサーまたは他の細胞機能の誘発因子としての性質は、細胞型によって決定される（Ｒｏｂｅｒｔｓ,  ｅｔ  ａｌ.,  Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａｓ,  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ,  Ｐａｒｔ  Ｉ,  ｅｄ.  ｂｙ  Ｓｐｏｒｎ,  Ｍ.Ｂ.  ＆  Ｒｏｂｅｒｔｓ,  Ａ.Ｂ.,  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ,  Ｂｅｒｌｉｎ,  １９９０,  ｐ.４１９‐４７２参照）。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦβは広範な種々の細胞型により産生され、そのコグネイト受容体は広範な種々の器官および細胞中で発現される（Ｓｈｉ  ａｎｄ  Ｍａｓｓａｇｕｅ,  Ｃｅｌｌ,  Ｖｏｌｕｍｅ  １１３,  Ｉｓｓｕｅ  ６,  １３  Ｊｕｎｅ  ２００３,  Ｐａｇｅｓ  ６８５‐７００；  Ｂｉｏｌ.  Ｓｉｇｎａｌｓ.,  Ｖｏｌ.  ５,  ｐ.２３２,  １９９６およびＰｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ,  Ｖｏｌ.  ８０  ｏｆ  Ｌｕｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｅｒｉｅｓ,  ｅｄ.  ｂｙ  Ｐｈａｎ,  ｅｔ  ａｌ.,  ｐ.６２７,  Ｄｅｋｋｅｒ,  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ,  １９９５参照）。ＴＧＦβ受容体は、以下の３つの型に分かれることが確認されている：ＴＧＦベータＲＩ（ＴＧＦβＲＩ）（ＴＧＦベータＩ型受容体（Ｆｒａｎｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｃｅｌｌ,  Ｖｏｌ.  ７５,  Ｎｏ.  ４,  ｐ.  ６８１,  １９９３；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｌ１１６９５））；ＴＧＦベータＲＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）（ＴＧＦベータＩＩ型受容体（Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｃｅｌｌ,  Ｖｏｌ.  ６８,  Ｎｏ.  ４,  ｐ.  ７７５,  １９９２；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｍ８５０７９））およびＴＧＦベータＲＩＩＩ（ＴＧＦベータＩＩＩ型受容体（Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｓｉｌｌａｓ,  Ｃｅｌｌ,  Ｖｏｌ.  ６７,  Ｎｏ.  ４,  ｐ.  ７８５,  １９９１；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｌ０７５９４））。ＴＧＦベータおよびＴＧＦベータＲＩＩは、ＴＧＦ−ベータのシグナル伝達に不可欠であることが示されている（Ｌａｉｈｏ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｊ.  Ｂｉｏｌ.  Ｃｈｅｍ.,  Ｖｏｌ.  ２６５,  ｐ.  １８５１８,  １９９０およびＬａｉｈｏ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｊ.  Ｂｉｏｌ.  Ｃｈｅｍ.,  Ｖｏｌ.  ２６６,  ｐ.  ９１０８,  １９９１）が、一方、ＴＧＦベータＲＩＩＩは不可欠であるとは考えられてない。
【０００３】
ＴＧＦベータシグナル伝達は、ＴＧＦベータＲＩおよびＲＩＩの両方とのその結合により媒介される。リガンドが細胞外リガンド結合ドメインと結合する場合、２つの受容体は結び付けられて、ＲＩＩにＲＩをリン酸化させて、Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化によりシグナル伝達カスケードを開始する（Ｓｈｉ  ａｎｄ  Ｍａｓｓａｇｕｅ（上記）参照）。
【０００４】
ＴＧＦベータの３つのアイソフォーム：すなわち、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２およびＴＧＦベータ３が、哺乳動物で同定されている。各アイソフォームは多機能性であり、自己調節フィードバック機序で作用して、発生過程のための生物学的利用能を制御し、組織恒常性を維持する（Ｄｉｊｋｅ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｕｒ,  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ,  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ,  Ｖｏｌ.  ８,  Ｎｏｖ.  ２００７,  ｐ.  ８５７‐８６９で検討されている）。ＴＦＧベータのレベルは、ＴＧＦベータ発現を介した、ならびにプロテオグリカン、すなわち細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との結合を介した調節により制御される。
【０００５】
調節不全ＴＧＦベータシグナル伝達、例えば過剰ＴＧＦベータシグナル伝達および高レベルの生体利用可能ＴＧＦベータは、多数の病態、例えば種々の組織の繊維症、例えば肺繊維症および肝硬変、慢性肝炎、関節リウマチ、眼障害、血管再狭窄、皮膚のケロイド、ならびに腎硬化症と関連する。
【０００６】
したがって、ＴＧＦベータ受容体ＩＩとの結合による、といったような具体的方法で、ＴＧＦベータシグナル伝達を遮断するかまたは中断させる化合物を提供する必要がある。このような化合物が、治療に用いられ得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Roberts, et al., The transforming growth factor-betas, Peptide Growth Factors and Their Receptors, Part I, ed. by Sporn, M.B. & Roberts, A.B., Springer-Verlag, Berlin, 1990, p.419‐472
【非特許文献２】Shi and Massague, Cell, Volume 113, Issue 6, 13 June 2003, Pages 685‐700; Biol. Signals., Vol. 5, p.232, 1996
【非特許文献３】Pulmonary Fibrosis, Vol. 80 of Lung Biology in Health and Disease Series, ed. by Phan, et al., p.627, Dekker, New York, 1995
【非特許文献４】Franzen et al., Cell, Vol. 75, No. 4, p. 681, 1993
【非特許文献５】Herbert et al., Cell, Vol. 68, No. 4, p. 775, 1992
【非特許文献６】Lopez-Casillas, Cell, Vol. 67, No. 4, p. 785, 1991
【非特許文献７】Laiho et al., J. Biol. Chem., Vol. 265, p. 18518, 1990
【非特許文献８】Laiho et al., J. Biol. Chem., Vol. 266, p. 9108, 1991
【非特許文献９】Dijke and Arthur, Nature Reviews, Molecular Cell Biology, Vol. 8, Nov. 2007, p. 857‐869
【発明の概要】
【０００８】
第一の態様において、本発明は、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。適切には、第一の態様による抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、１０ｐＭ〜５０ｎＭ、好ましくは１０ｐＭ〜１０ｎＭ、好ましくは２５０ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）を有するＴＧＦβＲＩＩと結合するものである。一実施形態では、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、高親和性（高力価）でＴＧＦベータＲＩＩを結合し、１０ｐＭ〜５００ｐＭの解離定数を有するものである。別の実施形態では、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、中等度の親和性（低力価）でＴＧＦベータＲＩＩを結合し、５００ｐＭ〜５０ｎＭ、好ましくは５００ｐＭ〜１０ｎＭの解離定数を有するものである。別の態様において、本発明は、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインを含む単離ポリペプチドを提供する。適切には、単離ポリペプチドは、配列番号１〜２３で記述されるアミノ酸配列のいずれかの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、これは、ＴＧＦβＲＩＩと結合する。適切には、単離ポリペプチドは、ヒトＴＧＦベータＲＩＩと結合する。別の実施形態では、単離ポリペプチドは、異なる種、例えばマウス、イヌまたはサル、例えばカニクイザル（ｃｙｎｏ）由来のＴＧＦベータＲＩＩとも結合する。適切には、単離ポリペプチドは、マウスおよびヒトのＴＧＦベータＲＩＩの両方と結合する。ヒトおよび他の種からのＴＧＦベータＲＩＩ間のこのような交差反応性は、同一抗体構築物が動物疾患モデルにおいて、ならびにヒトにおいて用いられるのを可能にする。
【０００９】
一態様では、本発明は、配列番号１〜２３で記述されるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号４（ＤＯＭ２３ｈ−２７１）、８（ＤＯＭ２３ｈ−４３７）または１０（ＤＯＭ２３ｈ−４３９）のいずれかで記述されるようなアミノ酸を含む単離ポリペプチドを提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、配列番号２４〜４６で記述される核酸配列のいずれかの群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも６０％同一であり、そしてＴＧＦベータＲＩＩと結合するヌクレオチド配列によりコードされる単離ポリペプチドを提供する。適切には、単離ポリペプチドはヒトＴＧＦベータＲＩＩと結合する。
【００１１】
別の態様では、配列番号１〜２３で記述されるアミノ酸配列のいずれかの群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。一実施形態では、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号１〜２３で記述されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。適切には、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号４（ＤＯＭ２３ｈ−２７１）、８（ＤＯＭ２３ｈ−４３７）または１０（ＤＯＭ２３ｈ−４３９）のいずれかで記述されるようなアミノ酸を含む。別の実施形態では、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号１〜２３で記述されるアミノ酸配列のいずれかの群から選択されるアミノ酸配列を含む。適切には、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＴＧＦベータＲＩＩ、好ましくはヒトＴＧＦベータＲＩＩを結合する。
【００１２】
別の態様では、２５以下のアミノ酸位置で修飾され、そして配列番号１〜２３のいずれか１つにおけるＣＤＲ１配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を含む、配列番号１〜２３で記述されるアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
【００１３】
さらなる態様では、２５以下のアミノ酸位置で修飾され、そして配列番号１〜２３のいずれか１つにおけるＣＤＲ２配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を含む、配列番号１〜２３で記述されるアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
【００１４】
さらなる態様では、２５以下のアミノ酸位置で修飾され、そして配列番号１〜２３のいずれか１つにおけるＣＤＲ３配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を含む、配列番号１〜２３で記述されるアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
【００１５】
さらなる態様では、２５以下のアミノ酸位置で修飾され、そして配列番号１〜２３のいずれか１つにおけるＣＤＲ１配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を含み、さあに、配列番号１〜２３のいずれか１つにおけるＣＤＲ２配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を含む、配列番号１〜２３で記述されるアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
【００１６】
別の態様では、２５以下のアミノ酸位置で修飾され、そして配列番号１〜２３のいずれか１つにおけるＣＤＲ１配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を含み、さらに、配列番号１〜２３のいずれか１つにおけるＣＤＲ３配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を含む、配列番号１〜２３で記述されるアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
【００１７】
さらに別の態様では、２５以下のアミノ酸位置で修飾され、そして配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ２配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を含み、さらに、配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ３配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を含む、配列番号１〜２３で記述されるアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
【００１８】
別の態様では、２５以下のアミノ酸位置で修飾され、そして配列番号１〜２３のいずれか１つにおけるＣＤＲ１配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を含み、さらに、配列番号１〜２３のいずれか１つにおけるＣＤＲ２配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を含み、ならびに、配列番号１〜２３のいずれか１つにおけるＣＤＲ３配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を含む、配列番号１〜２３で記述されるアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
【００１９】
さらなる態様では、配列番号１〜２３のいずれか１つにおけるＣＤＲ３配列から成る群から選択されるＣＤＲ３配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を含む抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
【００２０】
別の態様では、配列番号１〜２３のいずれか１つにおけるＣＤＲ３配列から成る群から選択されるＣＤＲ３配列を含む抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
【００２１】
さらに別の態様では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３が配列番号１〜２３のいずれか１つにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列と同一である抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
【００２２】
適切には、ＣＤＲ配列は、本明細書中に記載されるカバトの方法を用いて決定される。一実施形態では、各配列のＣＤＲ配列は、図７に記述されるものである。
【００２３】
一実施形態では、以下のアミノ酸：免疫グロブリン単一可変ドメインの位置６１のＮ、位置６４のＲ、位置１０２のＨ、位置３９のＲ、位置５３のＤまたは位置１０３のＳのいずれかを含む本発明の任意の態様に従った抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドが提供される。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドは、これらのアミノ酸の組合せを含む。別の実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドは、６１位置のＮおよび６４位置のＲのアミノ酸を含む。これらの実施形態では、アミノ酸番号付けは、例えば配列番号１〜２３で示される配列により例示されるような免疫グロブリン単一可変ドメインのものである。
【００２４】
別の態様では、ＴＧＦβＲＩＩに対する結合特異性を有し、配列番号１〜２３の群から選択されるアミノ酸配列を含む抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインの結合を抑制するリガンドまたは結合部分が提供される。
【００２５】
本発明のさらなる態様では、本発明の任意の態様に従った免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドを含む融合タンパク質が提供される。
【００２６】
一実施形態では、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンドまたは融合タンパク質は、ＴＧＦベータ活性を中和するものである。適切には、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドは、ＴＧＦベータとＴＧＦベータＲＩＩとの結合を抑制する。別の実施形態では、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドは、ＴＧＦベータＲＩＩを介したＴＧＦベータシグナル伝達活性を抑制する。別の実施形態では、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドは、ＴＧＦベータ活性、特にＴＧＦベータ細胞成長活性を抑止する。適切には、ＴＧＦベータＲＩＩはヒトＴＧＦベータＲＩＩである。
【００２７】
一実施形態では、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンドまたは融合タンパク質は、１０マイクロモル（μＭ）でのＴＧＦベータＲＩＩアゴニスト活性を欠く。
【００２８】
別の態様では、半減期延長部分をさらに含む本発明の任意の態様に従った免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンドまたは融合タンパク質が提供される。適切には、半減期延長部分は、ポリエチレングリコール部分、血清アルブミンまたはその断片、トランスフェリン受容体またはそのトランスフェリン結合部分、あるいは半減期をｉｎ  ｖｉｖｏで増強するポリペプチドのための結合部位を含む抗体または抗体断片である。一実施形態では、半減期延長部分は、血清アルブミンまたは新生児Ｆｃ受容体のための結合部位を含む抗体または抗体断片である。別の実施形態では、半減期延長部分は、ｄＡｂ抗体または抗体断片である。
【００２９】
別の態様では、本発明は、本発明の任意の態様に従った抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンドまたは融合タンパク質を含むポリペプチドをコードする単離または組換え核酸を提供する。
【００３０】
一実施形態では、単離または組換え核酸分子は、配列番号２４〜４６で記述される配列を有する核酸分子のいずれかの群から選択される核酸分子を含む。
【００３１】
一態様では、本発明は、核酸が配列番号２４〜４６で記述される配列を有する核酸分子のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列を含み、そして核酸がＴＧＦベータＲＩＩと特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする単離または組換え核酸を提供する。
【００３２】
別の態様では、本発明による核酸を含むベクターを提供する。
【００３３】
さらなる態様では、本発明による核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明のさらに別の態様では、本発明による抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドまたはリガンドを含むポリペプチドの産生方法であって、前記核酸またはベクターの発現に適した条件下で本発明による宿主細胞を保持し、それにより免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドを含むポリペプチドが産生されることを包含する方法が提供される。任意に、当該方法は、当該ポリペプチドを単離するステップ、ならびに任意に、単離ポリペプチドより改善された親和性（Ｋｄ）；または標準検定におけるＴＧＦベータ中和に関するＥＣ５０を有する変異体、例えば突然変異化変異体を産生するステップをさらに含む。ＴＧＦベータ活性のための適切な検定、例えば細胞センサー検定は、本明細書中に、例えば実施例の節に記載されている。
【００３４】
本発明の一態様では、本発明による抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドは、医薬として用いるためである。したがって、医薬としての使用のための本発明の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドを含む組成物が提供される。
【００３５】
適切には、本発明による抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドまたは組成物は、ＴＧＦベータシグナル伝達に関連した疾患の治療のためである。適切には、疾患は、組織繊維症、例えば肺繊維症、例えば特発性肺繊維症、肝臓繊維症、例えば肝硬変および慢性肝炎、関節リウマチ、眼障害、あるいは皮膚の繊維症、例えば皮膚のケロイド、ならびに腎臓、例えば腎炎、腎繊維症および腎硬化症、あるいは血管症状、例えば再狭窄である。ＴＧＦベータシグナル伝達に関連した他の疾患としては、血管性疾患、例えば高血圧症、子癇前症、Ｉ型遺伝性出血性毛細管拡張症（ＨＨＴ１）、ＨＨＴ２、肺動脈高血圧症、大動脈瘤、マルファン症候群、家族性動脈瘤障害、ロイス・ディーズ症候群、動脈蛇行症候群（ＡＴＳ）が挙げられる。ＴＧＦベータシグナル伝達に関連した他の疾患としては、筋骨格症候群、例えばデュシェンヌ筋ジストロフィーおよび筋繊維症が挙げられる。ＴＧＦベータシグナル伝達に関連するさらなる疾患としては、癌、例えば結腸、胃および膵臓癌、ならびに神経膠腫およびＮＳＣＬＣが挙げられる。さらに本発明は、腫瘍血管新生におけるＴＧＦベータシグナル伝達を調整することにより癌を標的化するための方法を提供する。他の疾患または症状としては、組織瘢痕化に関連したものが挙げられる。他の疾患としては、肺疾患、例えばＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）が挙げられる。一態様では、本発明は、肺送達のための抗ＴＧＦβＲＩＩ単一可変ドメインまたはアンタゴニスト、組成物または融合タンパク質を提供する。一態様では、本発明は、患者の肺への送達のための抗ＴＧＦβＲＩＩ単一可変ドメインまたはアンタゴニストまたは融合タンパク質を提供する。一態様では、本発明は、肺送達のための医薬の製造における抗ＴＧＦβＲＩＩ単一可変ドメインまたはアンタゴニストまたは融合タンパク質の使用を提供する。一態様では、本発明は、患者の肺への送達のための医薬の製造における本発明による抗ＴＧＦβＲＩＩ単一可変ドメインまたはアンタゴニストまたは融合タンパク質の使用を提供する。
【００３６】
一実施形態では、可変ドメインは、それ自体で、あるいはアンタゴニストまたは融合タンパク質の一部である場合、プロテアーゼ、例えばロイコザイムおよび／またはトリプシンに耐性である。
【００３７】
一実施形態では、組成物は肺送達のためである。適切には、組成物は、肺送達のための単量体ｄＡｂを含む。別の実施形態では、組成物は、肺送達のための単量体ｄＡｂからなる。
【００３８】
適切には、組成物は、ヒトにおけるＴＧＦベータにより媒介される症状の治療または予防のためである。
【００３９】
したがって、一実施形態では、特発性肺繊維症を治療するための抗ＴＧＦベータＲＩＩ  ｄＡｂを提供する。適切には、抗ＴＧＦベータＲＩＩ  ｄＡｂは、肺送達のための単量体ｄＡｂとして提供され、好ましくは、ｍｙｃまたは別の精製タグのような任意のタグを欠いている（すなわち、非タグ化）。
【００４０】
一態様では、組成物は医薬組成物であって、製薬上許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含む。
【００４１】
別の態様では、ヒト患者におけるＴＧＦβにより媒介される症状を治療するかおよび／または予防するための方法であって、本発明による抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドを含む組成物を患者に投与するステップを包含する方法が提供される。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、本発明による組成物を含有する肺送達デバイスを提供する。適切には、このようなデバイスは、吸入器または鼻内投与デバイスである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１−１】本発明によるｄＡｂのアミノ酸（配列番号１〜２３）および核酸（配列番号２４〜４６）配列を示す。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−１の続きである。
【図１−４】図１−１の続きである。
【図１−５】図１−１の続きである。
【図１−６】図１−１の続きである。
【図１−７】図１−１の続きである。
【図１−８】図１−１の続きである。
【図１−９】図１−１の続きである。
【図２−１】ＤＯＭ２３ｈネイティブｄＡｂアミノ酸配列のアラインメントを示す。アミノ酸配列は、カバトに従って番号付けされる。ＣＤＲ配列は、太字で示され、下線を付されている。点印は、ＤＯＭ２３ｈ−２５１（配列番号２）との配列同一性を示す。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図２−３】図２−１の続きである。
【図２−４】図２−１の続きである。
【図３−１】ＤＯＭ２３ｈ−２６２（配列番号３）系統アミノ酸配列のアラインメントを示す。アミノ酸配列は、カバトに従って番号付けされる。ＣＤＲ配列は、太字で示され、下線を付されている。点印は、ＤＯＭ２３ｈ−２６２（配列番号３）との配列同一性を示す。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図４−１】ＤＯＭ２３ｈ−２７１系統アミノ酸配列（配列番号４）のアラインメントを示す。アミノ酸配列は、カバトに従って番号付けされる。ＣＤＲ配列は、太字で示され、下線を付されている。点印は、ＤＯＭ２３ｈ−２７１（配列番号４）との配列同一性を示す。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図５−１】ＤＯＭ２３ｈ−４３７系統アミノ酸配列（配列番号８）のアラインメントを示す。アミノ酸配列は、カバトに従って番号付けされる。ＣＤＲ配列は、太字で示され、下線を付されている。点印は、ＤＯＭ２３ｈ−４３７（配列番号８）との配列同一性を示す。
【図５−２】図５−１の続きである。
【図６−１】ＤＯＭ２３ｈ−４３９系統アミノ酸配列（配列番号１０）のアラインメントを示す。アミノ酸配列は、カバトに従って番号付けされる。ＣＤＲ配列は、太字で示され、下線を付されている。点印は、ＤＯＭ２３ｈ−４３９（配列番号１０）との配列同一性を示す。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図７−１】ＣＤＲ配列を詳述する表を示す。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図８】競合ＢＩＡコアを示す。ＤＯＭ２３ｈ−４３７−６（配列番号１９）をｈＴＦＧβ−ＲＩＩ−Ｆｃ結合チップ上に注入し（注入１）、その直後、ＤＯＭ２３ｈ−４３７−６（配列番号１９）とＤＯＭ２３ｈ−２７１−３（配列番号  ）との混合物（Ａ）、またはＤＯＭ２３ｈ−４３７−６（配列番号１９）とＤＯＭ２３ｈ−４３９−６（配列番号２２）（Ｂ）との混合物から成る注入２を注入した。１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．２５の２回の注射（注射３）を用いて、チップを再生した。
【図９】競合ＢＩＡコアを示す。ＤＯＭ２３ｈ−４３７−９（配列番号２１）をｈＴＦＧβ−ＲＩＩ−Ｆｃ結合チップ上に注入し（注入１）、その直後、ＤＯＭ２３ｈ−４３７−９（配列番号２１）とＤＯＭ２３ｈ−２６２−１０（配列番号１３）との混合物（Ｃ）、またはＤＯＭ２３ｈ−４３７−９（配列番号２１）とＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２（配列番号１６）（Ｄ）との混合物から成る注入２を注入した。１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．２５の２回の注射（注射３）を用いて、チップを再生した。
【図１０】競合ＢＩＡコアを示す。ＤＯＭ２３ｈ−４３７−９（配列番号２１）をｈＴＦＧβ−ＲＩＩ−Ｆｃ結合チップ上に注入し（注入１）、その直後、ＤＯＭ２３ｈ−４３７−９（配列番号２１）とＤＯＭ２３ｈ−４３９−８（配列番号２３）との混合物（Ｅ）、から成る注入２を注入した。１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．２５の２回の注射（注射３）を用いて、チップを再生した。
【図１１−１】配列識別子番号（配列番号）およびそれらの対応する識別物を列挙する表を示す。
【図１１−２】図１１−１の続きである。
【図１１−３】図１１−１の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
この明細書中で、実施形態に関して、明快且つ簡潔な明細書を書くように、本発明を記述してきた。実施態様は、本発明を逸脱しない限り、種々に組合されあるいは分離され得ると意図されており、そのように理解されるべきである。
【００４５】
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術および科学用語は全て、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学において）当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。標準技術は、分子的、遺伝的および生化学的方法（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ,  ｅｔ  ａｌ.,  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ,  ２ｄ  ｅｄ.  （１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ,  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ,  Ｎ.Ｙ.およびＡｕｓｕｂｅｌ,  ｅｔ  ａｌ.,  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９９）  ４ｔｈ  Ｅｄ,  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ,  Ｉｎｃ.参照）（これらは参照により本明細書中に組入れられる）、ならびに化学的方法のために用いられる。
【００４６】
免疫グロブリン：  本明細書中で用いる場合、「免疫グロブリン」は、２つのβシートを、そして通常は保存ジスルフィド結合を含有する抗体分子に特徴的な免疫グロブリン襞を保持するポリペプチドの一ファミリーを指す。
【００４７】
ドメイン：  本明細書中で用いる場合、「ドメイン」は、残りのタンパク質とは無関係にその三次構造を保持する折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般的に、ドメインは、タンパク質の別個の機能的特性に寄与し、そして多くの場合、残りのタンパク質および／またはドメインの機能を損失することなく、他のタンパク質に付加され、除去され、または移動され得る。単一抗体可変ドメインまたは免疫グロブリン単一可変ドメインとは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインを意図される。したがってそれは完全抗体可変ドメインおよび修飾可変ドメインを包含し、例えば、この場合、抗体可変ドメインに特徴的でない配列、あるいは切頭化されているか、Ｎ−またはＣ末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに少なくとも一部は全長ドメインの結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片により１つ以上のループが置き換えられている。
【００４８】
免疫グロブリン単一可変ドメイン：  「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という語句は、異なるまたは他のＶ領域またはドメインと関係なく抗原またはエピトープを特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）または結合ドメインを指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変領域または可変ドメインを伴うフォーマット（例えば、ホモまたはへテロ多量体）で存在し得るが、この場合、他の領域またはドメインは単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要でない（すなわち、この場合、免疫グロブリン単一可変ドメインは付加的可変ドメインとは無関係に抗原を結合する）。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、本明細書中で用いる場合の「免疫グロブリン単一可変ドメイン」である。「単一抗体可変ドメイン」または「抗体単一可変ドメイン」は、本明細書中で用いる場合の「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。免疫グロブリン単一可変ドメインは、一実施形態では、ヒト抗体可変ドメインであるが、しかし、他の種、例えば齧歯類（例えばＷＯ００／２９００４（この記載内容は参照により本明細書中に組入れられる）に開示）、テンジクザメおよびラクダ類ＶＨＨ  ｄＡｂからの単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ類ＶＨＨは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコを含めた種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであって、これは、天然で軽鎖を欠く重鎖抗体を産生する。ＶＨＨは、ヒト化され得る。
【００４９】
本発明の全ての態様において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、独立して、抗体重鎖および軽鎖単一可変ドメイン、例えばＶＨ、ＶＬおよびＶＨＨから選択される。
【００５０】
本明細書中で用いる場合、「抗体」は、抗体を産生する任意の種に由来するものであれ、組換えＤＮＡ技術により作製されるものであれ；例えば血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、形質転換体、酵母または細菌から単離されたものであれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ、あるいは断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、閉鎖立体配座多重特異性抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、ダイアボディ）を指す。
【００５１】
抗体フォーマット：  一実施形態では、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドは、任意の抗体フォーマットで提供され得る。本明細書中で用いる場合、「抗体フォーマット」は、構造に抗原に対する結合特異性を付与する１つ以上の抗体可変ドメインが組入れられ得る任意の適切なポリペプチド構造を指す。種々の適切な抗体フォーマット、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、前記のいずれかの抗原結合断片（例えば、Ｆｖ断片（例えば一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）、単一抗体可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、ならびに前記のいずれかの修飾化バージョン（例えば、ポリエチレングリコールまたは他の適切なポリマーまたはヒト化ＶＨＨの共有結合により修飾される）が、当該技術分野で既知である。一実施形態では、代替的抗体フォーマットは、本発明による任意の分子のＣＤＲが適切なタンパク質足場または骨格上にグラフトされ得る代替的足場、例えばアフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、アビマー（例えば米国特許出願公開第２００５／００５３９７３号、２００５／００８９９３２号、２００５／０１６４３０１号参照）またはＥＧＦドメインを包含する。さらにリガンドは、本明細書中に記載されるような二価（ヘテロ二価）または多価（ヘテロ多価）であり得る。他の実施形態では、「普遍的フレームワーク」が用いられ得るが、この場合、「普遍的フレームワーク」は、カバト（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”,  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）により定義されるような配列中に保存された抗体の領域に対応する、あるいはＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ,  （１９８７）  Ｊ.  Ｍｏｌ.  Ｂｉｏｌ.  １９６：９１０‐９１７により定義されるようなヒト生殖系列免疫グロブリンレパートリーまたは構造に対応する単一抗体フレームワーク配列を指す。本発明は、超可変領域単独における変異による事実上任意の結合特異性の誘導を可能にすることが判明している単一フレームワークまたはこのようなフレームワークの一組の使用を提供する。
【００５２】
この開示全体を通して記載される本発明の実施形態では、本発明のペプチドまたはリガンドにおける抗ＴＧＦベータＲＩＩ「ｄＡｂ」の使用の代わりに、熟練受け手は、ＴＧＦベータＲＩＩを結合する本発明のｄＡｂのＣＤＲ（例えば、適切なタンパク質足場または骨格例えばアフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメインまたはＥＧＦドメイン上にグラフトされたＣＤＲ）のうちの１つ以上または３つ全てを含むポリペプチドまたはドメインを用い得る、ということが意図される。したがって、全体としての開示は、ｄＡｂの代わりにこのようなどメインを用いてポリペプチドの開示を提供するよう意図されるべきである。この点で、ＷＯ２００８０９６１５８（参照により本明細書中に組入れられる）を参照されたい。
【００５３】
一実施形態では、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは任意の適切な免疫グロブリン可変ドメインであり、そして任意にヒト可変ドメイン、あるいはヒトフレームワーク領域（例えばＤＰ４７またはＤＰＫ９フレームワーク領域）を含むかまたはそれに由来する可変ドメインである。
【００５４】
抗原：  本明細書中で記載する場合、「抗原」は、本発明に従って結合ドメインにより結合される分子である。典型的には、抗原は抗体リガンドにより結合され、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体応答を引き起こし得る。それは、例えばポリペプチド、タンパク質、核酸または他の分子であり得る。
【００５５】
エピトープ：  「エピトープ」は、免疫グロブリンＶＨ／ＶＬ対により慣用的に結合される構造の単位である。エピトープは、抗体のための最小結合部位を限定し、したがって、抗体の特異性の標的を表す。単一ドメイン抗体の場合、エピトープは、単離に際して可変ドメインにより結合される構造の単位を表す。
【００５６】
結合：  典型的には、特異的結合は、５０ナノモル以下、任意に２５０ピコモル以下の解離定数（Ｋｄ）により示される。抗原またはエピトープに対する抗原結合タンパク質の特異的結合は、適切な検定により、例えばスカチャード分析および／または競合結合検定、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫検定、例えばＥＬＩＳＡおよびサンドイッチ競合検定、ならびにその種々の変法により確定され得る。
【００５７】
結合親和性：  結合親和性は、任意に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）およびＢｉａｃｏｒｅ（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ.,  １９９１）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（Ｕｐｐｓａｌａ,  Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて確定される。Ｂｉａｃｏｒｅシステムは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｗｅｌｆｏｒｄ  Ｋ.  １９９１,  Ｏｐｔ．  Ｑｕａｎｔ.  Ｅｌｅｃｔ.  ２３：１；Ｍｏｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｍｙｓｚｋａ,  １９９８,  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２９５：  ２６８）を用いて実時間での生体分子相互作用をモニタリングし、そして、３００ｎｍまで離れた表面の屈折率における変化の結果としてのガラス支持体上の薄い金皮膜の表面での光の共鳴角度の変化を検出し得る表面プラズモン共鳴を用いる。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数および親和定数を生じると好都合である。結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴システム（Ｂｉａｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ.）を用いて、会合および解離速度定数を査定することにより得られる。バイオセンサーチップは、メーカー（Ｂｉａｃｏｒｅ）の使用説明書に従って標的の共有結合のために活性化される。次いで、標的は希釈され、チップ上に注入されて、固定化物質の応答単位でシグナルを得る。共鳴単位（ＲＵ）でのシグナルは固定化物質の質量に比例するため、これは、マトリックス上の一連の固定化標的密度を表す。解離データは、ｋオフ＋／−ｓ．ｄ．（測定値の標準偏差）を得るために一部位モデルに適合される。各解離曲線に関して擬一次速度定数（Ｋｄ）が算定され、タンパク質濃度の一関数としてプロットされて、ｋオン＋／−ｓ．ｅ．（適合度の標準誤差）を得る。ＳＰＲ測定値からｋオフ／ｋオンとして、結合に関する平衡解離定数Ｋｄが算定される。
【００５８】
本発明の別の態様は、ヒトＴＧＦベータＲＩＩと特異的に結合する抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態では、可変ドメインは、約５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭまたはそれ未満、任意に、約９、８、７、６または５ｎＭまたはそれ未満、任意に約４ｎＭまたはそれ未満、約３ｎＭまたはそれ未満、あるいは約２ｎＭまたはそれ未満あるいは約１ｎＭまたはそれ未満、任意に約５００ｐＭまたはそれ未満の解離定数でヒトＴＧＦベータＲＩＩを結合する。適切には、可変ドメインが約５０ｎＭ〜５００ｐＭの範囲の解離定数を有する場合、それは、肺のような当該組織への局所投与に特に適している。この実施形態では、高濃度のこのような「中等度親和性」結合剤が有効治療薬として提供され得る。別の実施形態では、可変ドメインは、約５００ｐＭまたはそれ未満、任意に約４５０ｐＭ、４００ｐＭ、３５０ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたはそれ未満、任意に約４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭまたはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）を有するヒトＴＧＦベータＲＩＩを結合する。適切には、可変ドメインが約５００ｐＭ〜１０ｐＭの範囲の解離定数を有する場合、当該組織のいずれか１つにおける量が有効な治療を提供するのに十分であるよう、それは全身投与のために特に適している。この実施形態では、低濃度のこのような「高親和性」結合剤が有効治療薬として提供され得る。
【００５９】
一実施形態では、本発明の単一可変ドメインは、ヒトＴＧＦベータＲＩＩと、別の種からのＴＧＦベータＲＩＩ、例えばマウスＴＧＦベータＲＩＩとの間の交差反応性を示す。この実施形態では、可変ドメインは、ヒトおよびマウスＴＧＦベータＲＩＩを特異的に結合する。これは、薬剤がヒトにおいて試験される前に薬剤開発が典型的にはマウス系における主要薬剤候補の試験を要するため、特に有用である。ヒトおよびマウス種を結合し得る薬剤の提供により、これらの系における結果を試験することが可能となり、同一薬剤を用いてデータを横並び比較し得る。これは、マウスＴＧＦベータＲＩＩに対して働く薬剤ならびにヒトＴＧＦベータＲＩＩに対して働く別個の薬剤を見つけ出す必要があるという厄介な問題を回避し、そして非同一薬剤を用いてヒトおよびマウスにおける結果を比較する必要性も会費する。疾患モデル、例えばイヌまたはサル、例えばカニクイザルにおいて用いられる他の種間の交差反応性も予測される。
【００６０】
任意に、少なくともマウスＴＧＦベータＲＩＩに関する免疫グロブリン単一可変ドメインの結合親和性ならびにヒトＴＧＦベータＲＩＩに関する結合親和性は、１０、５０または１００のうちのわずか１因子が異なる。
【００６１】
ＣＤＲ：  本明細書中に記載される免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含有する。ＣＤＲ、およびフレームワーク（ＦＲ）領域の場所ならびに番号付けシステムは、カバト等（Ｋａｂａｔ,  Ｅ.Ａ.  ｅｔ  ａｌ.,  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎ  ｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ,  Ｕ.Ｓ.  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ,  Ｕ.Ｓ.  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ  （１９９１））により定義されている。本明細書中に開示されるＶＨ（ＣＤＲＨ１等）およびＶＬ（ＣＤＲＬ１等）（Ｖκ）ｄＡｂのアミノ酸配列は、周知のカバトアミノ酸番号付けシステム、ならびにＣＤＲの定義に基づいて、当業者には容易に明らかになる。配列変異性に基づいた最も一般に用いられる方法であるカバト番号付けシステムによれば、重鎖ＣＤＲ−Ｈ３は種々の長さを有し、挿入は、Ｋまでの文字を用いて残基Ｈ１００およびＨ１０１間で番号付けられる（すなわち、Ｈ１００、Ｈ１００Ａ・・・・・Ｈ１００Ｋ、Ｈ１０１）。ＣＤＲは、代替的には、以下のように、コチアのシステム（構造的ループ領域の場所に基づいて）（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ.,  （１９８９）  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ；  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２,  ｐ８７７‐８８３）を用いて、ＡｂＭ（カバトおよびコチア間の折衷案）によって、あるいはコンタクト法（結晶構造ならびに抗原との接触残基の予測に基づいて）によって確定され得る。ＣＤＲを確定するための適切な方法に関しては、http://www.bioinf.org.uk/abs/参照。
【００６２】
一旦、各残基が番号付けされると、次に、以下のＣＤＲ定義を適用し得る：
2013500030.tif 000002
ＴＧＦベータＲＩＩ：  本明細書中で用いる場合、「ＴＧＦベータＲＩＩ」（形質転換増殖因子ベータＩＩ型受容体；ＴＧＦβＲＩＩ）は、天然または内因性哺乳動物ＴＧＦベータＲＩＩタンパク質を、ならびに天然または内因性の対応する哺乳動物ＴＧＦベータＲＩＩタンパク質（例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質（すなわち、合成有機化学の方法を用いて製造される））のものと同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。したがって、本明細書中で定義されるように、当該用語は、成熟ＴＧＦベータＲＩＩタンパク質、多型性または対立遺伝子突然変異体、およびＴＧＦベータＲＩＩの他のアイソフォーム、ならびに前記のものの修飾または非修飾形態（例えば、脂質化、グリコシル化）を包含する。天然または内因性ＴＧＦベータＲＩＩとしては、野生型タンパク質、例えば成熟ＴＧＦベータＲＩＩ、多型性または対立遺伝子変異体、ならびに哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類）において天然に生じるその他のアイソフォームおよび突然変異体形態が挙げられる。このようなタンパク質は、例えばＴＧＦベータＲＩＩを天然に発現する供給源から回収されるかまたは単離され得る。これらのタンパク質および天然または内因性の対応するＴＧＦベータＲＩＩと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質は、対応する哺乳動物の名称により言及される。例えば、対応する哺乳動物がヒトである場合、タンパク質はヒトＴＧＦベータＲＩＩと呼ばれる。ヒトＴＧＦベータＲＩＩは、例えばＬｉｎ,  ｅｔ  ａｌ.,  Ｃｅｌｌ  １９９２,  Ｖｏｌ.  ６８（４）,  ｐ.７７５‐７８５およびＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ８５０７９により記載されている。
【００６３】
ヒトＴＧＦベータＲＩＩは、約１５９個のアミノ酸の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインならびに細胞質ドメイン（シグナル伝達のためのプロテインキナーゼドメインを含む）を伴う５６７個のアミノ酸からなる膜貫通受容体である。
【００６４】
本明細書中で用いる場合、「ＴＧＦベータＲＩＩ」は、ＴＧＦベータＲＩＩの一部または断片も包含する。一実施形態では、このような一部または断片は、ＴＧＦベータＲＩＩの細胞外ドメインまたはその一部を包含する。
【００６５】
「抗ＴＧＦベータＲＩＩ」とは、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、融合タンパク質等に関しては、ＴＧＦベータＲＩＩを認識し、結合する部分を意味する。一実施形態では、「抗ＴＧＦベータＲＩＩ」は、タンパク質ＴＧＦベータＲＩＩ、適切にはヒトＴＧＦベータＲＩＩを特異的に認識し、および／または特異的に結合する。別の実施形態では、本発明による抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、マウスＴＧＦベータＲＩＩとも結合する（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号  ＮＭ＿０２９５７５；例えばＭａｓｓａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｃｅｌｌ  ６９  （７）,  １０６７‐１０７０  （１９９２）に記載）。
【００６６】
「ＴＧＦベータ」は、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２およびＴＧＦベータ３のようなアイソフォームを包含する。
【００６７】
ＴＧＦベータはＴＧＦベータＲＩＩを結合し、そしてＴＧＦベータＲＩとの複合体中で、シグナル伝達経路を開始する。したがって、ＴＧＦベータ活性、ならびにＴＧＦベータ活性の抑制または中和は、ＴＧＦベータシグナル伝達の出力を測定する任意の検定により決定され得る。ＴＧＦベータシグナル伝達は、例えばＩｔｏｈ,  ｅｔ  ａｌ.,  Ｅｕｒ.  Ｊ.  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０００,  Ｖｏｌ.  ２６７,  ｐ.６９５４；Ｄｅｎｎｌｅｒ,  ｅｔ  ａｌ.,  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ.  ２００２,  ７１（５）,  ｐ.  ７３１−４０で再検討されている。したがって、ＴＧＦベータ活性は、当業者に周知の多数の異なる検定で試験され得る。「抑制」または「中和」は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの存在下では、このような免疫グロブリン単一可変ドメインの非存在下でのＴＧＦベータの活性と比較して、ＴＧＦベータの生物学的活性が全体的または部分的に低減される、ということを意味する。
【００６８】
一実施形態では、ＴＧＦベータ活性の抑制または中和は、ＩＬ−１１放出検定で試験される。この実施形態では、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインの能力は、Ａ５４９細胞のような細胞からのヒトＴＧＦベータ１（ＴＧＦベータ１；ＴＧＦ−β１）刺激性ＩＬ−１１放出を抑制するその能力に関して試験される。ＴＧＦベータ１（ＴＧＦ−β１）は、ＴＧＦベータＲＩＩ（ＴＧＦ−βＲＩＩ）と直接結合して、ＴＧＦベータＲＩ／ＲＩＩ（ＴＧＦ−βＲＩ／ＲＩＩ）複合体のアセンブリーを誘導する。ＴＧＦベータＲＩ（ＴＧＦ−βＲＩ）はリン酸化され、そしてＳｍａｄ４経路を含めたいくつかの経路によりシグナル伝達し得る。Ｓｍａｄ４経路の活性化は、ＩＬ−１１の放出を生じる。ＩＬ−１１は、細胞上清中に分泌され、次いで、比色ＥＬＩＳＡ法により測定される。適切なＩＬ−１１放出検定は、本明細書中に記載されており、例えばヒトＩＬ−１１クアンチキンＥＬＩＳＡ検定キット（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）（ｒｅｆ.  Ｄ１１００）である。
【００６９】
別の実施形態では、ＴＧＦベータ活性は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ルシフェラーゼ検定におけるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中でのＣＡＧＡ−ルシフェラーゼのＴＧＦベータ誘導性発現を抑制する本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインの能力に関する検定で試験される。ＣＡＧＡボックスと呼ばれるＴＧＦベータ応答性配列モチーフの３つのコピーは、ヒトＰＡＩ−１プロモーター中に存在し、Ｓｍａｄ３および４タンパク質を特異的に結合する。ルシフェラーゼレポーター構築物中へのＣＡＧＡボックスの多数のコピーのクローニングは、レポーター系でトランスフェクトされた細胞にＴＧＦベータ応答性を付与する。適切な一検定は、本明細書中に記載されており、［ＣＡＧＡ］１２−ルシフェラーゼレポーター構築物で安定的にトランスフェクトされたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（マウス骨芽細胞）を用いる（Ｄｅｎｎｌｅｒ,  ｅｔ  ａｌ.,  （１９９８）  ＥＭＢＯ  Ｊ.  １７,  ３０９１−３１００）。
【００７０】
他の適切な検定としては、ヒトＳＢＥベータ−ラクタマーゼ細胞検定（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）、細胞センサー検定）が挙げられる。適切な検定の例は、本明細書中に記載されている。
【００７１】
適切には、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンドまたは融合タンパク質は、それ自体、ＴＧＦベータＲＩＩ受容体シグナル伝達を活性化しない。したがって、一実施形態では、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンドまたは融合タンパク質は、１０μＭでアゴニスト活性を欠く。アゴニスト活性は、ＴＧＦベータの非存在下で、本明細書中に記載されるようなＴＧＦベータＲＩＩ検定において当該化合物を試験することにより確定され得る。ＴＧＦベータが存在しない場合、当該化合物のアゴニスト活性は、ＴＧＦベータＲＩＩシグナル伝達を検出することにより検出される。
【００７２】
相同性：  本明細書中に開示される配列と類似のまたは相同の配列（例えば少なくとも約７０％配列同一性）も、本発明の一部である。いくつかの実施形態では、アミノ酸レベルでの配列同一性は、約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であり得る。核酸レベルでは、配列同一性は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であり得る。代替的には、実質的な同一性は、核酸セグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば、非常に高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件）下で、当該鎖の相補体とハイブリダイズする場合に存在する。核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製されたかまたは実質的に純粋な形態で存在し得る。
【００７３】
本明細書中で用いる場合、「低ストリンジェンシー」、「中等度ストリンジェンシー」、「高ストリンジェンシー」または「極高ストリンジェンシー」条件という用語は、核酸のハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記載する。ハイブリダイゼーション反応を実施するための指針は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ,  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ,  Ｎ.Ｙ.  （１９８９）,  ６.３．１‐６．３．６（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に見出され得る。水性および非水性方法は、その参考文献中に記載されており、いずれかが用いられ得る。本明細書中で言及される具体的ハイブリダイゼーション条件を以下に示す：（１）低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：約４５℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中。その後、少なくとも５０℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄（洗浄温度は、低ストリンジェンシー条件に関しては５５℃に増大され得る）；（２）中等度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：約４５℃で、６×ＳＳＣ。その後、６０℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄；（３）高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：約４５℃で、６×ＳＳＣ中。その後、６５℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄；そして任意に、（４）極高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：６５℃で、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ。その後、６５℃で、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回以上洗浄。極高ストリンジェンシー条件（４）は、好ましい条件であり、別記しない限り、用いられるべきものである。
【００７４】
２つの配列間の「相同性」または「配列同一性」または「類似性」（当該用語は、本明細書中で互換的に用いられる）の算定は、以下のように実施される。配列は、最適比較目的のために整列される（例えば、最適アラインメントのために、ギャップが、第一および第二アミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入され得るし、非相同配列は比較目的のためには無視される）。一実施形態では、比較目的のために整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも約３０％、任意に少なくとも約４０％、任意に少なくとも約５０％、任意に少なくとも約６０％、そして任意に少なくとも約７０％、８０％、９０％または１００％である。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが、次に比較される。第一配列中の位置が第二配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められる場合には、分子はその位置で同一である（本明細書中で用いる場合、アミノ酸または核酸「相同性」は、アミノ酸または核酸「同一性」と等価である）。２つの配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一位置の数の一関数であり、ギャップの数ならびに各ギャップの長さを考慮するが、これは、２つの配列の最適アラインメントのために導入される必要がある。
【００７５】
本明細書中で定義されるようなアミノ酸およびヌクレオチド配列のアラインメントおよび相同性、類似性または同一性は、任意に、アルゴリズムＢＬＡＳＴ  ２シーケンスを用いて、デフォルトパラメーターを用いて、調製され、確定される（Ｔａｔｕｓｏｖａ，  Ｔ.  Ａ.  ｅｔ  ａｌ．．,  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ,  １７４：１８７‐１８８  （１９９９））。代替的には、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（バージョン２．０）は配列アラインメントのために用いられ、パラメーターをデフォルト値に設定する。ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘにより用いられる発見的検索アルゴリズムである；これらのプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ,  １９９０,  Ｐｒｏｃ.  Ｎａｔｌ.  Ａｃａｄ.  Ｓｃｉ.  ＵＳＡ  ８７（６）：２２６４−８の統計学的方法を用いた彼等の知見により有意性を有する。
【００７６】
リガンド：  本明細書中で用いる場合、「リガンド」という用語は、ＴＧＦベータＲＩＩに関する結合特異性を有する結合部位を有する少なくとも１つのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質部分を含む化合物を指す。リガンドは、「結合部分」としても言及され得る。
【００７７】
本発明によるリガンドまたは結合部分は、任意に、異なる結合特異性を有する免疫グロブリン可変ドメインを含み、そして標的化合物に関する結合部位を一緒になって形成する可変ドメイン対を含有しない（すなわち、ＴＧＦベータＲＩＩに関する結合部位を一緒になって形成する免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含まない）。任意に、標的に関する結合特異性を有する結合部位を有する各ドメインは、所望の標的（例えばＴＧＦベータＲＩＩ）に関する結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、免疫グロブリン単一重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＨＨ）、免疫グロブリン単一軽鎖可変ドメイン（例えば、ＶＬ））である。
【００７８】
したがって、「リガンド」は、２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを包含し、この場合、各免疫グロブリン単一可変ドメインは異なる標的と結合する。リガンドは、少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド、あるいは適切なフォーマット、例えば抗体フォーマット（例えば、ＩｇＧ様フォーマット、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）あるいは適切なタンパク質足場または骨格、例えばアフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、ＥＧＦドメイン、アビマーで異なる標的を結合する単一可変ドメインのＣＤＲ配列、ならびに本明細書中に記載されるような二重および多重特異性リガンドも包含する。
【００７９】
標的（例えば、ＴＧＦベータＲＩＩ）に関する結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチドドメインは、所望の標的に関する結合部位を含むタンパク質ドメインでもあり得るし、例えばタンパク質ドメインは、アフィボディ、ＳｐＡドメイン、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、アビマーから選択される（例えば米国特許出願公開番号２００５／００５３９７３、２００５／００８９９３２、２００５／０１６４３０１参照）。所望により、「リガンド」は、各々独立して、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質部分あるいは非ペプチド部分（例えば、ポリアルキレングリコール、脂質、炭水化物）であり得る１つ以上の付加的部分をさらに含み得る。例えば、リガンドは、本明細書中に記載されるような半減期延長部分（例えば、ポリアルキレングリコール部分、アルブミン、アルブミン断片またはアルブミン変異体を含む部分、トランスフェリン、トランスフェリン断片またはトランスフェリン変異体を含む部分、アルブミンを結合する部分、新生児Ｆｃ受容体を結合する部分）をさらに含み得る。
【００８０】
競合する：  本明細書中で言及する場合、「競合する」という用語は、一次標的（）とそのコグネイト標的結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）との結合が、上記コグネイト標的に特異的である二次結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）の存在下で抑制される、ということを意味する。例えば、結合は、標的に対するその親和性（アフィニティー）または親和力（アビディティー）が低減されるよう、例えば結合ドメインの物理的遮断により、あるいは結合ドメインの構造または環境の変化により、立体的に抑制され得る。競合ＥＬＩＳＡおよび競合ＢｉａＣｏｒｅ実験を実施して、一次および二次結合ドメイン間の競合を確定する方法の詳細に関しては、ＷＯ２００６０３８０２７を参照。その詳細は、本発明で用いるための明白な開示を提供するために、参照により本明細書中に組入れられる。
【００８１】
ＴＧＦベータシグナル伝達：  適切には、本発明の単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドは、ＴＧＦベータＲＩＩを介したＴＧＦベータシグナル伝達を中和し得る。「中和する」とは、ＴＧＦベータの存在がＴＧＦベータＲＩＩシグナル伝達に及ぼす中立的作用を有するよう、ＴＧＦベータの通常のシグナル伝達作用が遮断される、ということを意味する。中和作用を測定するための適切な方法としては、本明細書中に記載されるようなＴＧＦベータ氏愚案流伝辰に関する検定が挙げられる。一実施形態では、中和は、ＴＧＦベータシグナル伝達検定におけるＴＦＧベータ活性の抑制％として観察される。一実施形態では、単一可変ドメインまたはポリペプチドはＴＧＦベータＲＩＩの細胞外ドメインと結合し、それによりＴＧＦベータとＴＧＦベータＲＩＩの細胞外ドメインとの結合を抑制し／遮断する。適切には、過剰量の生体利用可能ＴＧＦベータが存在する場合、単一可変ドメインまたはポリペプチドは有用であり、そして単一可変ドメインまたはポリペプチドは、ＴＧＦベータとそのコグネイト受容体ＴＧＦベータＲＩＩとの結合を抑制することにより生体利用可能ＴＧＦベータのシグナル伝達活性を抑制するのに役立つ。
【００８２】
本明細書中で用いる場合、「ＴＧＦベータＲＩＩのアンタゴニスト」または「抗ＴＧＦベータＲＩＩアンタゴニスト」等という用語は、ＴＧＦベータＲＩＩを結合し、ＴＧＦベータＲＩＩの一（すなわち、１つ以上の）機能を抑制し得る作用物質（例えば、分子、化合物）を指す。例えば、ＴＧＦベータＲＩＩのアンタゴニストは、ＴＧＦベータとＴＧＦベータＲＩＩとの結合を抑制し、および／またはＴＧＦベータＲＩＩにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得る。したがって、ＴＧＦベータにより媒介される工程および細胞性応答は、ＴＧＦベータＲＩＩのアンタゴニストを用いて抑制され得る。
【００８３】
一実施形態では、ＴＧＦベータＲＩＩを結合するリガンド（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、≦約１０μＭ、≦約１μＭ、≦約１００ｎＭ、≦約５０ｎＭ、≦約１０ｎＭ、≦約５ｎＭ、≦約１ｎＭ、≦約５００ｐＭ、≦約３００ｐＭ、≦約１００ｐＭまたは≦約１０ｐＭである抑制濃度５０（ＩＣ５０）で、ＴＧＦベータとＴＧＦベータＲＩＩ受容体との結合を抑制する。ＩＣ５０は、任意に、in vitroＴＧＦベータ受容体結合検定、または細胞検定、例えば本明細書中に記載される検定を用いて決定される。
【００８４】
リガンド（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、任意に、適切なin vitro検定において、≦約１０μＭ、≦約１μＭ、≦約１００ｎＭ、≦約５０ｎＭ、≦約１０ｎＭ、≦約５ｎＭ、≦約１ｎＭ、≦約５００ｐＭ、≦約３００ｐＭ、≦約１００ｐＭ、≦約１０ｐＭ、≦約１ｐＭ≦約５００ｆＭ、≦約３００ｆＭ、≦約１００ｆＭ、≦約１０ｆＭである中和用量５０（ＮＤ５０）で、ＴＧＦベータＲＩＩ誘導性機能を抑制する、ということも意図される。
【００８５】
「二重特異性リガンド」：  一実施形態では、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドは、一次抗原またはエピトープ結合部位（例えば一次免疫グロブリン単一可変ドメイン）および二次抗原またはエピトープ結合部位（例えば二次免疫グロブリン単一可変ドメイン）を含むリガンドを指す「二重特異性リガンド」の一部であり得るが、この場合、結合部位または可変ドメインは、２つの抗原（例えば異なる抗原または同一抗原の２つのコピー）、あるいは一重特異性免疫グロブリンにより普通は結合されない同一抗原上の２つのエピトープと結合し得る。例えば、２つのエピトープは同一抗原上に存在し得るが、しかし同一エピトープではないかあるいは一重特異性リガンドにより結合されるほど十分に隣接していない。一実施形態では、本発明による二重特異性リガンドは、異なる特異性を有する結合部位または可変ドメインからなり、同一特異性を有する（すなわち、単位結合部位を形成しない）相互相補的可変ドメイン対（すなわち、ＶＨ／ＶＬ対）を含有しない。
【００８６】
一実施形態では、「二重特異性リガンド」は、ＴＧＦベータＲＩＩと、ならびに別の標的分子と結合し得る。例えば、別の標的分子は、本発明の二重特異性リガンドが本発明による抗ＴＧＦベータＲＩＩポリペプチドまたは免疫グロブリン単一可変ドメインを当該組織に対して標的にさせるよう、組織特異性標的分子であり得る。このような組織としては、肺、肝臓等が挙げられる。
【００８７】
本発明のリガンド（例えば、ポリペプチド、ｄＡｂおよびアンタゴニスト）は、二次免疫グロブリン単一可変ドメインと直接的に融合される一次免疫グロブリン単一可変ドメインを含有する融合タンパク質としてフォーマット化され得る。所望により、このようなフォーマットは、半減期延長部分をさらに含み得る。例えばリガンドは、血清アルブミンを結合する免疫グロブリン単一可変ドメインと直接的に融合される二次免疫グロブリン単一可変ドメインと直接的に融合される一次免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得る。
【００８８】
一般的に、標的に関する結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチドドメインの配向、ならびにリガンドがリンカーを含むか否かは、設計選択の問題である。しかしながら、いくつかの配向は、リンカーの有無にかかわらず、他の配向より良好な結合特質を提供し得る。全ての配向（例えば、ｄＡｂ１−リンカー−ｄＡｂ２；ｄＡｂ２−リンカー−ｄＡｂ１）が本発明に包含され、そして所望の結合特質を提供する配向を含有するリガンドはスクリーニングにより容易に同定され得る。
【００８９】
本発明によるポリペプチドおよびｄＡｂ、例えばｄＡｂ一量体、二量体、三量体は、Ｃ２およびＣ３ドメインの一方または両方を含む抗体Ｆｃ領域と、そして任意にヒンジ領域と連結され得る。例えば、単一ヌクレオチド配列としてＦｃ領域と連結されるリガンドをコードするベクターが、このようなポリペプチドを調製するために用いられ得る。
【００９０】
本発明はさらに、前記のｄＡｂ単量体の二量体、三量体および多量体を提供する。
【００９１】
標的：  本明細書中で用いる場合、「標的」という語句は、結合部位を有するポリペプチドドメインが結合し得る生物学的分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物）を指す。標的は、例えば、細胞内標的（例えば、細胞内タンパク質標的）、可溶性標的（例えば、分泌型）、または細胞表面標的（例えば、膜タンパク質、受容体タンパク質）であり得る。一実施形態では、標的はＴＧＦベータＲＩＩである。別の実施形態では、標的はＴＧＦベータＲＩＩ細胞外ドメインである。
【００９２】
相補的：  本明細書中で用いる場合、「相補的」は、２つの免疫グロブリンドメインが、コグネイト対または群を形成する構造のファミリーに属するか、あるいはこのようなファミリーに由来し、この特徴を保持する場合を指す。例えば、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインは相補的である；２つのＶＨドメインは相補的でなく、２つのＶＬドメインは相補的でない。相補的ドメインは、免疫グロブリンスーパーファミリーの他の成員に見出され、例えば、Ｔ細胞受容体のＶαおよびＶβ（またはγおよびδ）ドメインである。人工的なドメイン、例えばそうなるように工学処理されない限りエピトープを結合しないタンパク質足場を基礎にしたドメインは、非相補的である。同様に、（例えば）免疫グロブリンドメインおよびフィブロネクチンドメインを基礎にした２つのドメインは、相補的でない。
【００９３】
「親和性」および「親和力」は、結合相互作用の強度を記述する技術用語である。本発明のリガンドに関しては、親和力は、細胞上の標的（例えば一次標的および二次標的）およびリガンド間の結合の全体的強度を指す。親和力は、個々の標的に関する個々の親和性の合計より大きい。
【００９４】
核酸分子、ベクターおよび宿主細胞：  本発明は、本明細書中に記載されるようなリガンド（単一可変ドメイン、融合タンパク質、ポリペプチド、二重特異性リガンドおよび多重特異性リガンド）をコードする単離および／または組換え核酸分子も提供する。
【００９５】
「単離された」として本明細書中で言及される核酸は、それらの供給源のゲノムＤＮＡまたは細胞性ＲＮＡの核酸から分離されている核酸を指し（例えばそれが、細胞中に、またはライブラリーのような核酸の混合物中に存在する場合）、例としては、本明細書中に記載される方法または他の適切な方法により得られる核酸、例えば本質的に純粋な核酸、化学合成により、生物学的および化学的方法の組合せにより産生される核酸、ならびに単離される組換え核酸が挙げられる（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ,  Ｂ.Ｌ.  ｅｔ  ａｌ.,  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.,  １９（９）： ２４７１−２４７６  （１９９１）；  Ｌｅｗｉｓ,  Ａ.Ｐ.  ａｎｄ  Ｊ.Ｓ.  Ｃｒｏｗｅ,  Ｇｅｎｅ,  １０１：  ２９７‐３０２  （１９９１）参照）。
【００９６】
「組換え体」として本明細書中で言及される核酸は、組換えＤＮＡ技法により産生された核酸、例えば人工組換えの方法に依っている手法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を用いるベクター中へのクローニングにより生成される核酸である。
【００９７】
ある実施形態では、単離および／または組換え核酸は、本明細書中に記載されるような免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドをコードするヌクレオチド配列を含み、この場合、上記リガンドは、本明細書中に開示されるＴＧＦベータＲＩＩを結合するｄＡｂのアミノ酸配列、例えば配列番号１〜２３のいずれかで記述されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ヌクレオチド配列同一性は、選択抗ＴＧＦベータＲＩＩ  ｄＡｂをコードするヌクレオチド配列の全長に亘って確定され得る。
【００９８】
本発明は、本発明の組換え核酸分子を含むベクターも提供する。ある実施形態では、ベクターは、本発明の組換え核酸と操作可能的に連結される１つ以上の発現制御素子または配列を含む発現ベクターである。本発明は、本発明の組換え核酸分子またはベクターを含む組換え宿主細胞も提供する。本発明の組換え宿主細胞を産生するための適切なベクター（例えばプラスミド、ファージミド）、発現制御素子、宿主細胞および方法は当該技術分野で周知であり、例は、本明細書中でさらに記載される。
【００９９】
適切な発現ベクターは、多数の構成成分、例えば複製の起点、選択可能マーカー遺伝子、１つ以上の発現制御素子、例えば転写制御素子（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、および／または１つ以上の翻訳シグナル、シグナル配列またはリーダー配列等を含有し得る。発現制御素子およびシグナル配列は、存在する場合、ベクターまたは他の供給源により提供され得る。例えば、抗体鎖をコードするクローン化核酸の転写および／または翻訳制御配列を用いて、発現を指図し得る。
【０１００】
プロモーターは、所望の宿主細胞中での発現のために提供され得る。プロモーターは、構成性または誘導性であり得る。例えばプロモーターは、それが核酸の転写を指図するよう、抗体、抗体鎖またはその部分をコードする核酸と操作可能的に連結され得る。原核生物（例えば大腸菌に関するｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）および真核生物（例えばサルウイルス４０早期または後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長い末端反復プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター）宿主に関する種々の適切なプロモーターが利用可能である。
【０１０１】
さらに、発現ベクターは、典型的には、ベクターを保有する宿主細胞の選択のための選択可能マーカーを含み、複製可能発現ベクターの場合、複製の起点を含む。抗生物質または薬剤耐性を付与する生成物をコードする遺伝子は、共通選択可能マーカーであり、原核生物（例えば、ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性に関するＴｅｔ遺伝子）および真核生物（例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８またはゲネチシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリンまたはヒグロマイシン耐性遺伝子）細胞に用いられ得る。ジヒドロフォレートレダクターゼマーカー遺伝子は、種々の宿主においてメトトレキサートによる選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）は、しばしば、酵母における選択可能マーカーとして用いられる。ウイルス（例えばバキュロウイルス）またはファージベクター、ならびに宿主のゲノム中に組み込み得るベクター、例えばレトロウイルスベクターの使用も、意図される。哺乳動物細胞および原核生物細胞（大腸菌）、昆虫細胞（ショウジョウバエシュナイダーＳ２細胞、Ｓｆ９）および酵母（ピキア・メタノリカ（Ｐ.  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・パストリス（Ｐ.  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、出芽酵母（Ｓ.  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））中での発現のための適切な発現ベクターは、当該技術分野で周知である。
【０１０２】
適切な宿主細胞は、原核生物細胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌、枯草菌および／またはその他の適切な細菌；真核生物細胞、例えば真菌または酵母細胞（例えば、ピキア・パストリス、アスペルギルス種、出芽酵母、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ））、あるいはその他の下等真核生物細胞、ならびに高等真核生物の細胞、例えば昆虫（例えば、ショウジョウバエシュナイダーＳ２細胞、Ｓｆ９昆虫細胞（ＷＯ  ９４／２６０８７（Ｏ‘Ｃｏｎｎｏｒ）)、哺乳類（例えば、ＣＯＳ細胞、例えばＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６５１）、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−９０９６、ＣＨＯ  ＤＧ４４  （Ｕｒｌａｕｂ,  Ｇ.  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ,  ＬＡ.,  Ｐｒｏｃ.  Ｎａｔｌ.  Ａｃａｄ.  Ｓｃｉ.  ＵＳＡ,  ７７（７）：４２１６‐４２２０  （１９８０）））、２９３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２）、ＣＶ１（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−７０）、ＷＯＰ（Ｄａｉｌｅｙ,  Ｌ.,  ｅｔ  ａｌ.,  Ｊ.  Ｖｉｒｏｌ.,  ５４：７３９‐７４９  （１９８５）、３Ｔ３、２９３Ｔ（Ｐｅａｒ,  Ｗ.  Ｓ.,  ｅｔ  ａｌ.,  Ｐｒｏｃ.  Ｎａｔｌ.  Ａｃａｄ.  Ｓｃｉ.  Ｕ.Ｓ.Ａ.,  ９０：８３９２‐８３９６  （１９９３））  ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０、ＨｕＴ  ７８細胞等、または植物（例えば、タバコ）（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ,  Ｆ.Ｍ.  ｅｔ  ａｌ.,  ｅｄｓ.  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ.  （１９９３）参照）。いくつかの実施形態では、宿主細胞は単離宿主細胞であり、多細胞生物（例えば、植物または動物）の一部ではない。ある実施形態では、宿主細胞は非ヒト宿主細胞である。
【０１０３】
本発明は、本発明のリガンド（例えば、二重特異性リガンド、多重特異性リガンド）の産生方法であって、組換え核酸の発現に適した条件下で本発明の組換え核酸を含む組換え宿主細胞を維持し、それにより、組換え核酸が発現され、リガンドが産生されることを包含する方法も提供する。いくつかの実施形態では、当該方法はさらに、リガンドを単離することを包含する。
【０１０４】
本発明の実施形態に適用可能である開示の詳細に関しては、ＷＯ２００７０８５１５、１６１ページ、２４行目〜１８９ページ、１０行目が参照される。この開示は、本発明の開示の本文中に明白に認められ、本発明の実施形態に関する場合のように、参照により本明細書中に組入れられる。これは、ＷＯ２００７０８５１５、１６１ページ、２４行目〜１８９ページ、１０行目に提示された開示を含み、「免疫グロブリンベースのリガンドの調製」、「ライブラリーベクター系」、「ライブラリー構築」、「単一可変ドメイン組合せ」、「リガンドの特性化」、「リガンドの構造」、「骨格」、「タンパク質足場」、「リガンドを構築するのに用いるための足場」、「基準配列の多様化」および「治療用および診断用組成物ならびに使用」の詳細を、同様に、「操作可能的に連結される」、「ナイーブ」、「防止」、「抑制」、「処置」、「アレルギー性疾患」、「Ｔｈ２により媒介される疾患」、「治療的有効用量」および「有効な」の定義を提供する。
【０１０５】
「半減期」という語句は、例えばリガンドの分解、および／または天然のメカニズムによるリガンドのクリアランスまたは隔離のために、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドの血清濃度がin vivoで５０％低減するのに要する時間を指す。本発明のリガンドは、in vivoで安定化され得るし、それらの半減期は、分解および／またはクリアランスまたは隔離を阻止する分子と結合することにより増大される。典型的には、このような分子は、それ自体がin vivoで長い半減期を有する天然タンパク質である。リガンドの半減期は、その機能的活性が半減期増大分子に特異的でない類似のリガンドより長い期間、in vivoで存続する場合、増大される。したがって、ＨＳＡおよび標的分子に特異的なリガンドは、ＨＳＡに対する特異性が存在しない、すなわち、ＨＳＡを結合しないがしかし別の分子を結合する同一リガンドと比較される。典型的には、半減期は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上増大される。半減期の２×、３×、４×、５×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×またはそれ以上の範囲の増大が可能である。代替的には、またはさらに、半減期の３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×、１５０×の範囲の増大が可能である。
【０１０６】
フォーマット：  半減期増大は、免疫グロブリン、特に抗体、最も特別には小サイズの抗体断片のin vivo適用に有用であり得る。このような断片（Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ）は、一般的に、身体から迅速に掃去される。本発明によるｄＡｂ、ポリペプチドまたはリガンドは、in vivoでの半減期増大を提供し、その結果、リガンドの機能的活性の身体中でのより長い存続時間を提供するよう適合され得る。
【０１０７】
薬物動態分析ならびにリガンド半減期の決定のための方法は、当業者には周知である。詳細は、Ｋｅｎｎｅｔｈ,  Ａ  ｅｔ  ａｌ：  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：  Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓに、そしてＰｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ,  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （１９９６）に見出され得る。薬物動態パラメーター、例えばｔアルファおよびｔベータ半減期ならびに曲線下面積（ＡＵＣ）を記載している“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”,  Ｍ  Ｇｉｂａｌｄｉ  ＆  Ｄ  Ｐｅｒｒｏｎ,  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ,  ２ｎｄ Ｒｅｖ.  ｅｘ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８２）も参照される。
【０１０８】
半減期（ｔ1/2アルファおよびｔ1/2ベータ）およびＡＵＣは、時間に対するリガンドの血清濃度の曲線から確定され得る。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ解析パッケージ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ.，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ,  ＣＡ９４０４０,  ＵＳＡから入手可能）が、例えば曲線を形作るために用いられ得る。第一相（アルファ相）では、リガンドは主に、多少の排除を伴って患者における分配を受けつつある。第二相（ベータ相）は、終期であり、この時、リガンドは分配されており、リガンドが患者から掃去されるので、血清濃度は減少しつつある。ｔアルファ半減期は、第一相の半減期であり、ｔベータ半減期は第二相の半減期である。したがって、一実施形態では、本発明は、１５分以上の範囲のｔα半減期を有する本発明によるリガンドまたはリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態では、範囲の下限は、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間または１２時間である。さらに、あるいは代替的には、本発明によるリガンドまたは組成物は、１２時間まで（１２時間を含む）の範囲のｔα半減期を有する。一実施形態では、範囲の上限は、１１、１０、９、８、７、６または５時間である。適切な範囲の一例は、１〜６時間、２〜５時間または３〜４時間である。
【０１０９】
一実施形態では、本発明は、約２．５時間以上の範囲のｔβ半減期を有する本発明によるリガンド（ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニスト）またはリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態では、範囲の下限は、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約１０時間、約１１時間または約１２時間である。さらに、あるいは代替的には、本発明によるリガンドまたは組成物は、２１日まで（２１日を含む）の範囲のｔβ半減期を有する。一実施形態では、範囲の上限は、約１２時間、約２４時間、約２日、約３日、約５日、約１０日、約１５日または約２０日である。一実施形態では、本発明によるリガンドまたは組成物は、約１２〜約６０時間の範囲のｔβ半減期を有する。さらなる実施形態では、それは、約１２〜約４８時間の範囲である。さらなる実施形態では、さらに、それは約１２〜約２６時間の範囲である。
【０１１０】
上記の判定基準のほかに、または代替的には、本発明は、約１ｍｇ・分／ｍｌ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する本発明によるリガンドまたはリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態では、範囲の下限は、約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約１００、約２００または約３００ｍｇ・分／ｍｌである。さらに、または代替的には、本発明によるリガンドまたは組成物は、約６００ｍｇ・分／ｍｌまでの範囲のＡＵＣを有する。一実施形態では、範囲の上限は、約５００、約４００、約３００、約２００、約１５０、約１００、約７５または約５０ｍｇ・分／ｍｌである。一実施形態では、本発明によるリガンドは、以下からなる群から選択される範囲のＡＵＣを有する：約１５〜約１５０ｍｇ・分／ｍｌ、約１５〜約１００ｍｇ・分／ｍｌ、約１５〜約７５ｍｇ・分／ｍｌおよび約１５〜約５０ｍｇ・分／ｍｌ。
【０１１１】
本発明のポリペプチドおよびｄＡｂ、ならびにこれらを含むアンタゴニストは、例えば、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体または少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域の付着により、または抗体ドメインの接合により、より大きな流体力学的サイズを有するようフォーマットされ得る。例えば、ポリペプチド、ｄＡｂおよびアンタゴニストは、抗体のより大きな抗原結合断片として、または抗体としてフォーマットされる（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖとしてフォーマットされる）。
【０１１２】
本明細書中で用いる場合、「流体力学的サイズ」は、水溶液を通した分子の分散に基づいた分子（例えば、タンパク質分子、リガンド）の見掛けのサイズを指す。溶液を通してのタンパク質の分散または移動は、タンパク質の見掛けのサイズを引き出すよう処理され得るが、この場合、そのサイズは、タンパク質粒子の「ストークス半径」または「流体力学的半径」により与えられる。タンパク質の「流体力学的半径」は、同一分子質量を有する２つのタンパク質がタンパク質の全体的立体配座に基づいた異なる流体力学的サイズを有し得るよう、質量および形状（立体配座）の両方によって決まる。
【０１１３】
本発明のリガンド（例えば、ｄＡｂ単量体および多量体）の流体力学的サイズは、当該技術分野で周知である方法を用いて決定され得る。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、リガンドの流体力学的サイズを決定し得る。リガンドの流体力学的サイズを決定するための適切なゲル濾過マトリックス、例えば架橋アガロースマトリックスは周知であり、容易に利用可能である。
【０１１４】
リガンドフォーマットのサイズ（例えば、ｄＡｂ単量体と連結されたＰＥＧ部分のサイズ）は、所望の用途によって変更され得る。例えば、リガンドが循環を離れて末梢組織中に入るよう意図される場合、リガンドの流体力学的サイズを低く維持して、血流からの溢出を助長するのが望ましい。代替的には、より長時間、全身循環中にリガンドが保持されることが所望される場合、リガンドのサイズは、例えばＩｇ用タンパク質としてフォーマットすることにより増大され得る。
【０１１５】
半減期をin vivoで増大する抗原またはエピトープを標的化することによる半減期延長：  リガンドの流体力学的サイズおよびその血清半減期は、本発明のＴＧＦベータＲＩＩ結合ポリペプチド、ｄＡｂまたはリガンドを、本明細書中に記載されるようなin vivoで半減期を増大する抗原またはエピトープを結合する結合ドメイン（例えば、抗体または抗体断片）と接合するかまたは会合することによっても増大され得る。例えば、ＴＧＦベータＲＩＩ結合作用物質（例えば、ポリペプチド）は、抗血清アルブミンまたは抗新生児Ｆｃ受容体抗体または抗体断片、例えば抗ＳＡまたは抗新生児Ｆｃ受容体ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｃと、あるいは抗ＳＡアフィボディまたは抗新生児Ｆｃ受容体アフィボディまたは抗ＳＡアビマー、あるいはＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＳｐＡ、アフィボディ、アビマー、ＧｒｏＥ１およびフィブロネクチン（これらに限定されない）からなる群から選択される（これらの結合ドメインの開示に関しては、ＷＯ２００８０９６１５８参照。このドメインおよびそれらの配列は、参照により本明細書中に組み入れられ、本発明の本文の開示の一部を構成する）。コンジュゲート化すること（コンジュゲート）は、血清アルブミンに結合する結合ドメインのような結合ドメインと（共有的にまたは非共有的に）結合された本発明のポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストを含む組成物を指す。
【０１１６】
典型的には、in vivoで血清半減期を増強するポリペプチドは、in vivoで天然に生じ、そして生物体（例えばヒト）から望ましくない物質を除去する内因性メカニズムによる分解または除去を阻止するポリペプチドである。例えば、in vivoで血清半減期を増強するポリペプチドは、細胞外マトリックスからのタンパク質、血中に見出されるタンパク質、血液脳関門でまたは神経組織中に見出されるタンパク質、腎臓、肝臓、肺、心臓、皮膚または骨に限局されるタンパク質、ストレスタンパク質、疾患特異的タンパク質、またはＦｃ輸送に関与するタンパク質から選択され得る。適切なポリペプチドは、例えばＷＯ２００８／０９６１５８に記載されている。
【０１１７】
このようなアプローチは、当該組織への本発明による単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドの標的化送達のためにも用いられ得る。一実施形態では、本発明による高親和性単一可変ドメインの標的化送達が提供される。
【０１１８】
血清アルブミンを結合するｄＡｂ：  本発明は、一実施形態では、ＴＧＦベータＲＩＩと結合するポリペプチドまたはアンタゴニスト（例えば、抗ＴＧＦベータＲＩＩｄＡｂ（第一ｄＡｂ）を含む二重特異性リガンド）、ならびに血清アルブミン（ＳＡ）を結合する第二ｄＡｂ、第二ｄＡｂ結合ＳＡを提供する。二重特異性リガンドは、ＷＯ０３００２６０９、ＷＯ０４００３０１９、ＷＯ２００８０９６１５８およびＷＯ０４０５８８２１に見出される。
【０１１９】
リガンドおよびアンタゴニストの特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンを結合し、アルブミンとの結合に関して、ＷＯ２００４００３０１９に開示されたｄＡｂ配列のいずれか（この配列およびそれらの核酸相対物は、参照により本明細書中に組入れられて、本発明の本文の開示の一部を構成する）、ＷＯ２００７０８０３９２に開示されたｄＡｂ配列のいずれか（この配列およびそれらの核酸相対物は、参照により本明細書中に組入れられて、本発明の本文の開示の一部を構成する）、ＷＯ２００８０９６１５８に開示されたｄＡｂ配列のいずれか（この配列およびそれらの核酸相対物は、参照により本明細書中に組入れられて、本発明の本文の開示の一部を構成する）からなる群から選択されるｄＡｂと競合する。
【０１２０】
ある実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンを結合し、そしてＷＯ２００４００３０１９、ＷＯ２００７０８０３９２またはＷＯ２００８０９６１５８のいずれかに記載されたｄＡｂのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、ヒト血清アルブミンを結合するｄＡｂは、これらのｄＡｂのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンを結合し、これらのｄＡｂのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
さらなる特定の実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンを結合するＶκｄＡｂである。さらに特定の実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンを結合するＶＨｄＡｂである。
【０１２２】
血清アルブミンを結合する適切なラクダ類ＶＨＨとしては、ＷＯ２００４０４１８６２（Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ.Ｖ.）に、ならびにＷＯ２００７０８０３９２に記載されたものが挙げられる（このＶＨＨ配列およびそれらの核酸相対物は、参照により本明細書中に組み入れられ、そして本発明の本文の開示の一部を構成する）。ある実施形態では、ラクダ類ＶＨＨはヒト血清アルブミンを結合し、ＷＯ２００７０８０３９２に開示された配列、または配列番号５１８〜５３４（これらの配列番号はＷＯ２００７０８０３９２またはＷＯ２００４０４１８６２に列挙されたものに対応する）のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２３】
代替的実施形態では、アンタゴニストまたはリガンドは、ＴＧＦベータＲＩＩ（例えば、ヒトＴＧＦベータＲＩＩ）に特異的な結合部分を含み、この場合、当該部分は、ＷＯ２００８０９６１５８に記載されたような非免疫グロブリン配列を含み、これらの結合部分、それらの産生および選択方法（例えば、多様なライブラリーからの）、ならびにそれらの配列の開示は、本発明の本文の開示の一部として参照により本明細書中に組入れられる。
【０１２４】
半減期延長部分（例えばアルブミン）とのコンジュゲーション：  一実施形態では、ある（１つ以上の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンならびにその断片および類似体）は、本発明のＴＧＦベータＲＩＩ結合ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストとコンジュゲート化されるかまたは会合される。ＴＧＦベータＲＩＩ結合フォーマットに用いるための適切なアルブミン、アルブミン断片またはアルブミン変異体の例は、ＷＯ２００５０７７０４２に記載されている（この開示は、参照により本明細書中に組入れられ、本発明の本文の開示の一部を構成する）。
【０１２５】
ＴＧＦベータＲＩＩ結合フォーマットに用いるための適切なアルブミン、断片および類似体のさらなる例は、ＷＯ０３０７６５６７に記載されている（この開示は、参照により本明細書中に組入れられ、本発明の本文の開示の一部を構成する）。
【０１２６】
ある（１つ以上の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンならびにその断片および類似体）が本発明のＴＧＦベータＲＩＩ結合ポリペプチド、ｄＡｂおよびアンタゴニストをフォーマットするために用いられる場合、それは、任意の適切な方法を用いて、例えば、ＴＧＦベータＲＩＩ結合部分（例えば、抗ＴＧＦベータＲＩＩ  ｄＡｂ）との直接融合により、例えば融合タンパク質をコードする単一ヌクレオチド構築物を用いることにより、コンジュゲート化され得るが、この場合、融合タンパク質は、ＴＧＦベータＲＩＩ結合部分に対してＮまたはＣ末端方向に限局される半減期延長部分を有する単一ポリペプチド鎖としてコードされる。代替的には、コンジュゲート化は、部分間のペプチドリンカー、例えばＷＯ０３０７６５６７またはＷＯ２００４００３０１９に記載されたようなペプチドリンカーを用いることにより達成され得る（これらのリンカー開示は、本発明の開示中に参照により組入れられて、本発明で用いるための例を提供する）。
【０１２７】
ＰＥＧへのコンジュゲート化：  他の実施形態では、半減期延長部分は、ポリエチレングリコール部分である。一実施形態では、アンタゴニストは、ポリエチレングリコール部分（任意に、前記部分は約２０〜５０ｋＤａ、任意に約４０ｋＤａのサイズの線状または分枝鎖ＰＥＧを有する）と連結された本発明の単一可燃ドメインを含む（任意に、それからなる）。ｄＡｂおよび結合部分のペギル化についてのさらなる詳細に関しては、ＷＯ０４０８１０２６が参照される。一実施形態では、アゴニストはＰＥＧと連結されたｄＡｂ単量体からなり、この場合、ｄＡｂ単量体は本発明による単一可変ドメインである。
【０１２８】
別の実施形態では、本発明による単一可変ドメイン、リガンドまたはポリペプチドは、毒素部分または毒素と連結され得る。
【０１２９】
プロテアーゼ耐性：  本発明による単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドは、プロテアーゼ分解に対するそれらの耐性を改善するよう修飾され得る。本明細書中で用いる場合、「プロテアーゼ分解に対して耐性」であるペプチドまたはポリペプチド（例えば、ドメイン抗体（ｄＡｂ））は、プロテアーゼ活性に適した条件下でプロテアーゼとともにインキュベートされる場合、プロテアーゼにより実質的に分解されない。プロテアーゼ活性に適した温度で約１時間、プロテアーゼとともにインキュベーション後にプロテアーゼにより、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１４％以下、約１３％以下、約１２％以下、約１１％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下のタンパク質が分解されるか、またはタンパク質が実質的に分解されない場合、ポリペプチド（例えばｄＡｂ）は実質的に分解されない。例えば３７または５０℃で、任意の適切な方法を用いて、例えば、本明細書中に記載されるようなＳＤＳ−ＰＡＧＥによりまたは機能性検定（例えばリガンド結合）により、タンパク質分解は査定され得る。
【０１３０】
プロテアーゼ耐性増強を示すｄＡｂの生成方法は、例えば、ＷＯ２００８１４９１４３に開示されている。一実施形態では、本発明による単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドは、ロイコザイムおよび／またはトリプシンによる分解に耐性である。本発明のポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびリガンドは、以下のうちの１つ以上に対して耐性であり得る：セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン（例えば、カテプシンＧ）、プロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼ１、プロテイナーゼ２、プロテイナーゼ３）、サーモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ９、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３）、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメラインおよびセパラーゼ。特定の実施形態では、プロテアーゼは、トリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムである。プロテアーゼは、生物学的抽出物、生物学的ホモジネートまたは生物学的調製物によっても提供され得る。一実施形態では、プロテアーゼは、痰、粘液（例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液）、気管支肺胞洗浄液、肺ホモジネート、肺抽出物、膵臓抽出物、胃液、唾液中に見出されるプロテアーゼである。一実施形態では、プロテアーゼは、眼および／または涙液中に見出されるものである。眼中に見出されるこのようなプロテアーゼの例としては、カスパーゼ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ、ジスインテグリン、メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭｓ）およびトロンボスポンジンモチーフを伴うＡＤＡＭ、プロテオソーム、組織プラスミノーゲン活性因子、セクレターゼ、カテプシンＢおよびＤ、シスタチンＣ、セリンプロテアーゼＰＲＳＳ１、ユビキチンプロテオソーム経路（ＵＰＰ）が挙げられる。一実施形態では、プロテアーゼは、非細菌性プロテアーゼである。一実施形態では、プロテアーゼは、動物、例えば哺乳動物、例えばヒトのプロテアーゼである。一実施形態では、プロテアーゼは、消化管プロテアーゼまたは肺組織プロテアーゼ、例えば、ヒトに見出される消化管プロテアーゼまたは肺組織プロテアーゼである。ここに列挙されるこのようなプロテアーゼは、例えば、ライブラリーのレパートリーのプロテアーゼへの曝露を含めて、ＷＯ２００８１４９１４３に記載された方法にも用いられ得る。
【０１３１】
安定性：  本発明の一態様において、本発明のポリペプチド、単一可変ドメイン、ｄＡｂ、リガンド、組成物または処方物は、ブリットン・ロビンソンまたはＰＢＳ緩衝液中で、３７〜５０℃で１４日間（１ｍｇ／ｍｌのポリペプチドまたは可変ドメインの濃度で）インキュベーション後、実質的に安定である。一実施形態では、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％のポリペプチド、アンタゴニストまたは可変ドメイン等は、３７℃でのこのようなインキュベーション後、依然として非凝集性である。一実施形態では、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％のポリペプチドまたは可変ドメインは、３７℃でのこのようなインキュベーション後、依然として単量体である。
【０１３２】
一実施形態では、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％のポリペプチド、アンタゴニストまたは可変ドメインは、５０℃でのこのようなインキュベーション後、依然として非凝集性である。一実施形態では、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％のポリペプチドまたは可変ドメインは、５０℃でのこのようなインキュベーション後、依然として単量体である。一実施形態では、ポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニストの凝集は、このようなインキュベーションのいずれの後にも観察されない。一実施形態では、ポリペプチドまたは可変ドメインのｐＩは、ブリットン・ロビンソン緩衝液中で１ｍｇ／ｍｌのポリペプチドまたは可変ドメインの濃度で、３７℃でインキュベーション後、依然として変化しないかまたは実質的に変化しない。本発明の一態様では、本発明のポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニスト、組成物または処方物は、７〜７．５のｐＨで（例えばｐＨ７またはｐＨ７．５で）、ブリットン・ロビンソン緩衝液またはＰＢＳ緩衝液中で、４℃で７日間、（１００ｍｇ／ｍｌのポリペプチドまたは可変ドメインの濃度で）インキュベーション後、実質的に安定である。一実施形態では、少なくとも９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９または９９．５％のポリペプチド、アンタゴニストまたは可変ドメインは、このようなインキュベーション後、依然として非凝集性である。一実施形態では、少なくとも９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９または９９．５％のポリペプチドまたは可変ドメインは、このようなインキュベーション後、依然として単量体である。一実施形態では、ポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニストの凝集は、このようなインキュベーションのいずれの後にも観察されない。
【０１３３】
本発明の一態様では、本発明のポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニスト、組成物または処方物は、例えばジェット・ネブライザーで、例えばＰａｒｉ  ＬＣ＋カップ中で、例えば室温、２０℃または３７℃で１時間、（４０ｍｇ／ｍｌのポリペプチドまたは可変ドメインの濃度で）噴霧化後、実質的に安定である。一実施形態では、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９または９９．５％のポリペプチド、アンタゴニストまたは可変ドメインは、このような噴霧化後、依然として非凝集性である。一実施形態では、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９または９９．５％のポリペプチドまたは可変ドメインは、このような噴霧化後、依然として単量体である。一実施形態では、ポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニストの凝集は、このような噴霧化のいずれの後にも観察されない。
【０１３４】
単量体形態：  一実施形態では、本発明のｄＡｂは、単量体形態で提供される。適切には、本発明は、（実質的に）純粋な単量体を提供する。一実施形態では、ｄＡｂは、少なくとも９８、９９、９９．５％純粋、または１００％純粋である。ｄＡｂが単量体であるかまたは溶液中でより高次のオリゴマーを形成するか否かを確定するために、それらは、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより分析され得る。ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳ（多角度レーザー光散乱を用いるサイズ排除クロマトグラフィー）は、溶液中の高分子の特性化のための非侵襲性技法である。要するに、（緩衝液ダルベッコのＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍＬの濃度での）タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫ３０００；Ｓ２００）により、それらの流体力学的特性に従って分離される。分離後、光を散乱するタンパク質の傾向は、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器を用いて測定される。タンパク質が検出基を通過する間の散乱光の強度は、角度の一関数として測定される。屈折率（ＲＩ）検出器を用いて確定されるタンパク質濃度と一緒に得られるこの測定値は、適切な方程式を用いるモル質量の算定を可能にする（解析ソフトウェアＡｓｔｒａ  ｖ．５．３．４．１２の整数部分）。
【０１３５】
治療的使用：  本発明は、ＴＧＦベータシグナル伝達に関連した疾患を処置し、抑制し、または防止するための方法を提供する。一実施形態では、このような疾患は、調節不全性ＴＧＦベータシグナル伝達により、ＴＧＦベータの過剰発現により、または高レベルの生体利用可能ＴＧＦベータにより引き起こされうるし、あるいはそれが一因であり得る。ＴＧＦベータシグナル伝達に関連する疾患としては、種々の組織の繊維症、例えば肺繊維症、例えば特発性肺繊維症（ＩＰＦ）に関連した疾患、およびその他の間質性肺疾患、例えば急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肝臓の繊維症、例えば肝硬変および慢性肝炎、関節リウマチ、眼障害、血管症状、例えば再狭窄、皮膚の繊維症、例えば皮膚のケロイドおよび創傷治癒後の瘢痕、ならびに腎臓、例えば腎炎、腎繊維症および腎硬化症、あるいは血管症状、例えば再狭窄が挙げられる。ＴＧＦベータシグナル伝達に関連した他の疾患としては、血管性疾患、例えば高血圧症、子癇前症、Ｉ型遺伝性出血性毛細管拡張症（ＨＨＴ１）、ＨＨＴ２、肺動脈高血圧症、大動脈瘤、マルファン症候群、家族性動脈瘤障害、ロイス・ディーズ症候群、動脈蛇行症候群（ＡＴＳ）が挙げられる。ＴＧＦベータシグナル伝達に関連した他の疾患としては、筋骨格症候群、例えばデュシェンヌ筋ジストロフィーおよび筋繊維症が挙げられる。ＴＧＦベータシグナル伝達に関連するさらなる疾患としては、癌、例えば結腸、胃および膵臓癌、ならびに神経膠腫およびＮＳＣＬＣが挙げられる。さらに本発明は、腫瘍血管新生におけるＴＧＦベータシグナル伝達を調整することにより、あるいは癌支質の処置により、癌を標的化するための方法を提供する。他の疾患または症状としては、組織瘢痕化に関連したものが挙げられる。他の疾患としては、肺疾患、例えばＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、肝臓疾患、例えば肝不全（例えば、ウイルス性肝炎、アルコール、肥満性、自己免疫性、代謝性、閉塞性）、腎臓疾患、例えば腎不全（例えば、糖尿病、高血圧）、肥大性心筋症、移植片拒絶（肺／肝臓／腎臓）、ならびに肥厚性およびケロイド瘢痕が挙げられる。
【０１３６】
「繊維症」は、組織の過剰増殖、瘢痕および／または硬化を引き起こす細胞外マトリックス構成成分、例えばコラーゲンの過剰沈着の結果である。
【０１３７】
肺繊維症におけるＴＧＦベータの役割が観察されている（Ｗｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２００８,  ２１４,  ｐ.１９９‐２１０；Ｓｉｍｅ  ｅｔ  ａｌ.  Ｊ.  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９７,  Ｖｏｌ.１００,  ｐ.  ７６８‐７７６）。Ｔｈ２サイトカインの産生増大およびＴｈ１サイトカインの産生低減へのシフトは、未知の肺損傷の結果として観察される。ＴＧＦベータの過剰発現は、血管新生、繊維芽細胞活性化、ＥＣＭの沈着および繊維形成を刺激する。動物モデル（例えば、ＴＧＦベータ過剰発現、ＳＭＡＤ３  ＫＯ、ＴＧＦベータＲシグナル伝達の抑制）は、ＴＧＦベータが肺繊維症の発症の重要な媒介因子である、ということを示している。
【０１３８】
「特発性肺繊維症（ＩＰＦ）」は、原因不明の肺間質の繊維性組織の異常および過剰沈着を生じる慢性および進行性疾患である。米国での年間発症率は、１００，０００人に約１０〜２０症例である。有病率は年齢に伴って明確に増大し、通常は５０〜７０歳で発症して、７５歳以上では１７５症例／１００，０００人に達する。５年生存率は２０％で、平均生存率は２．８年である。症候としては、乾いた咳および進行性息切れ、異常胸部ｘ線またはＨＲＣＴならびに肺容積低減が挙げられる。一般的処置としては、コルチコステロイド（プレドニソン）、免疫抑制剤（シクロホスファミド）または移植が挙げられるが、しかし、一般に利用可能な両方は何れも効能が立証されていない。一実施形態では、本発明の単一可変ドメインまたはポリペプチドは、ＩＰＦのための治療を提供する。
【０１３９】
適切には、特発性肺繊維症（ＩＰＦ）のための上首尾の処置は、肺繊維芽細胞増殖の減少、肺繊維芽細胞アポトーシスの増大、過剰細胞外マトリックス合成および沈着の低減、細胞外マトリックス破壊およびリモデリングの増大のうちのいずれかを示し、あるいは進行中の組織損傷に対する何らかの保護ならびに正常組織病理学の回復を示す。
【０１４０】
適切には、上首尾の処置は疾患進行を遅らせる。
【０１４１】
ＩＰＦに関する処置の効力は、ブレオマイシン誘導性肺繊維症モデルで実証され得る。一実施形態では、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、その効力がマウスモデルで試験され得るよう、マウスＴＧＦベータＲＩＩと交差反応する。
【０１４２】
ＴＧＦベータは、眼組織における細胞行動の調整における重要な細胞シグナル伝達分子である。ＴＧＦベータの過剰活性化は、創傷治癒関連性であり、視力および眼組織恒常性の減損を引き起こし得る眼組織における繊維性疾患の病因に関与する（例えばＳａｉｋａ,  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  （２００６）,  ８６,  １０６−１１５により再検討されている）。
【０１４３】
したがって、一実施形態では、ＴＧＦベータシグナル伝達に関連した疾患としては、眼障害、例えば眼組織の繊維性疾患が挙げられる。眼の繊維性疾患は、角膜、結膜、水晶体または網膜に生じ得る。眼障害としては、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜剥離後の障害および網膜繊維症、糖尿病性網膜症、緑内障、例えば解放角緑内障、閉塞隅角緑内障、先天性および偽性落屑症候群、水晶体の創傷治癒反応、例えば化学的または温熱的熱傷後の治癒反応、あるいはスティーブン・ジョンソン症候群、ならびに白内障手術後合併症が挙げられる。ＴＧＦベータは、白内障発症においてもある役割を有する（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ.  Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ；  ８３  １２３８‐１２４５,  ２００６）。多数の眼障害は、術後繊維症の結果として起こる。さらに、ＴＧＦベータ２（形質転換増殖因子β２）の過剰活性は、緑内障濾過手術後の眼の中および周囲に瘢痕を生じると考えられる。ＴＧＦベータ２は、眼組織、例えば角膜、網膜、結膜および小柱網の病理学的瘢痕に関与する優勢なアイソフォームである。小柱網の瘢痕または繊維症は、正常水性流出経路の閉塞を生じて、眼内圧上昇および緑内障発症の危険をもたらし得る。ＴＧＦベータ２は、緑内障の前臨床モデルにおける病理学的作用物質であることが示されている。ＴＧＦベータ２レベルは、緑内障患者において高められて、ＴＧＦベータ−２によるｈｕＴＭ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ処置が、ＥＣＭ調整タンパク質（ＭＭＰ−２、ＰＡＩ−１）の表現型変化および上方調節をもたらす（Ｌｕｔｊｅｎ−Ｄｒｅｃｏｌ  （２００５）,  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ,  Ｖｏｌ.  ８１,  Ｉｓｓｕｅ  １,  ｐａｇｅｓ  １‐４；Ｌｉｔｏｎ  （２００５）,  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｖｏｌ.  ３３７,  ｉｓｓｕｅ  ４,  ｐ.１２２９‐１２３６；Ｆｕｃｈｓｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）,  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ,  Ｖｏｌ.  ７７,  ｉｓｓｕｅ  ６,  ｐ.  ７５７‐７６５；Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  （ＡＲＶＯ）  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｏｓｔｅｒ  ♯１６３１  ２００９）。さらに、眼におけるＴＧＦベータの過剰発現は、マウスにおける緑内障様病態を生じ（ＡＲＶＯ    ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｏｓｔｅｒ  ♯５１０８  ２００９）、そしてＡＡＶを用いたＴＧＦベータ２の送達は緑内障のラットモデルにおいて網膜神経節細胞損失を抑制することが示されている（ＡＲＶＯ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｏｓｔｅｒ    ♯５５１０  ２００９）。さらに近年、培養ヒト視神経乳頭星状細胞における酸化的ストレス誘導は、ＴＧＦベータ２分泌を増大することが示されている（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｉｎｖｅｓｔ.  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ.  Ｖｉｓ.  Ｓｃｉ.  ５０：  １７０７‐１７１７）。これは全て、ＴＧＦベータ２レベルの低減が、緑内障で観察される特徴的視神経乳頭変化を最小限にし得る、ということを示している。しかしながら、ＴＧＦベータは、免疫抑制的役割を有することも知られており、したがって、いくつかの態様では保護的であり、そこで、完全削減というよりむしろＴＧＦベータ２のレベル上昇の低減が、緑内障のような慢性眼症状の処置において選択され得る。したがって、本発明によるｄＡｂおよび組成物等を用いて処置され得る疾患は、緑内障濾過手術後瘢痕を包含する。
【０１４４】
したがって、一態様では、ＴＧＦベータシグナル伝達、特に調節不全性ＴＧＦベータシグナル伝達に関連した疾患を処置し、抑制し、または防止するための方法であって、それを必要とする哺乳動物に、治療的有効用量または量の本発明のポリペプチド、融合タンパク質、単一可変ドメイン、アンタゴニストまたは組成物を投与することを包含する方法が提供される。
【０１４５】
別の態様では、本発明は、医薬として用いるための本発明による免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンドまたは融合タンパク質を提供する。適切な医薬は、本明細書中に記載されるようにフォーマットされた本発明による免疫グロブリン単一可変ドメイン等を含み得る。
【０１４６】
適切には、医薬は薬学的組成物である。本発明のさらなる態様では、本発明によるポリペプチド、単一可変ドメイン、リガンド、組成物またはアンタゴニスト、ならびに生理学的にまたは製薬上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物（例えば、薬学的組成物）が提供される。一実施形態では、組成物は送達のためのビヒクルを含む。特定の実施形態では、ポリペプチド、融合タンパク質、単一可変ドメイン、アンタゴニストまたは組成物が、肺送達を介して、例えば吸入により（例えば気管支内、鼻内または経口吸入、鼻内（滴下による））、あるいは全身送達により（例えば、非経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、皮下、膣または直腸投与）、投与される。別の実施形態では、本発明によるポリペプチド、単一可変ドメイン、リガンドまたは融合タンパク質または組成物は、例えば局所投与により、点眼薬、特にポリマー系、ゲルまたは埋込物として、あるいは例えば硝子体液中への眼内注射により、眼に投与される。送達は、眼の特定の領域、例えば眼の表面、または涙管または涙腺を、あるいは眼の前または後房（硝子体液）を標的とする。それは、免疫グロブリン単一可変ドメイン、組成物等が、眼振盪増強剤、例えばカプリン酸ナトリウムとともに、または粘性増強剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）とともに眼に送達される場合、有用である。
【０１４７】
さらに、本発明は、本発明によるポリペプチド、単一可変ドメイン、組成物、リガンドまたはアンタゴニストを用いる疾患の治療方法を提供する。一実施形態では、疾患は、組織繊維症、例えば肺繊維症、例えば特発性肺繊維症である。別の実施形態では、疾患は眼障害である。
【０１４８】
本発明の一態様では、ヒトにおけるＴＧＦベータシグナル伝達に関連した疾患あんたは症状の治療および／または予防のためのポリペプチド、単一可変ドメイン、リガンド、組成物またはアンタゴニストが提供される。別の実施形態では、ヒトにおけるＴＧＦベータシグナル伝達に関連した疾患または症状の治療または予防のための医薬の製造におけるポリペプチド、単一可変ドメイン、組成物またはアンタゴニストの使用が提供される。別の態様では、ヒト患者におけるＴＧＦベータシグナル伝達に関連した疾患または症状を処置しおよび／または防止するための方法であって、ポリペプチド、単一可変ドメイン、組成物またはアンタゴニストを患者に投与することを包含する方法が提供される。本発明は、治療的有効量の本発明のリガンド（例えば、アンタゴニストまたは単一可変ドメイン）をそれを必要とする被験者に投与することを包含する治療方法にも関する。
【０１４９】
他の実施形態では、本発明は、特発性肺繊維症を処置するための方法であって、それを必要とする被験者に治療的有効量の本発明のリガンド（例えば、アンタゴニストまたは単一可変ドメイン）を投与することを包含する方法に関する。
【０１５０】
本発明は、本発明の組成物（例えば薬学的組成物）を含む薬剤送達デバイスにも関する。いくつかの実施形態では、薬剤送達デバイスは、複数の治療的有効用量のリガンドを含む。
【０１５１】
他の実施形態では、薬剤送達デバイスは、非経口送達デバイス、静脈内送達デバイス、筋肉内送達デバイス、腹腔内送達デバイス、経皮送達デバイス、肺送達デバイス、動脈内送達デバイス、くも膜下腔内送達デバイス、関節内送達デバイス、皮下送達デバイス、鼻内送達デバイス、眼送達デバイス、膣送達デバイス、直腸送達デバイス、注射器、経皮送達デバイス、カプセル、錠剤、噴霧器、吸入器、アトマイザー、エーロゾル化器、ミスト発生器、乾燥粉末吸入器、計量用量スプレー、計量用量ミスト発生器、計量用量アトマイザーおよびカテーテルからなる群から選択される。
【０１５２】
適切には、本発明は、本発明によるポリペプチド、単一可変ドメイン、組成物またはアンタゴニストを含有する肺送達デバイスを提供する。デバイスは、吸入器または鼻内投与デバイスであり得る。適切には、肺送達デバイスは、治療的有効用量の本発明によるリガンド等の送達を可能にする。
【０１５３】
別の実施形態では、本発明は、本発明によるポリペプチド、単一可変ドメイン、組成物またはアンタゴニストを含有する眼送達デバイスを提供する。適切には、眼送達デバイスは、治療的有効用量の本発明によるリガンド等の送達を可能にする。
【０１５４】
本明細書中で用いる場合、「用量」という用語は、全て１回で（単位用量）、あるいは限定時間間隔に亘って２回以上の投与で、被験者に投与されるリガンドの量を指す。例えば、用量は、１日（２４時間）（１日用量）、２日、１週間、２週間、３週間、あるいは１ヶ月以上（例えば、単一投与により、または２回以上の投与により）の経過中、被験者に投与されるリガンド（例えば、ＴＧＦベータＲＩＩを結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンド）の量を指し得る。用量投与間の間隔は、任意の所望量の時間であり得る。
【０１５５】
一実施形態では、本発明の単一可変ドメインは、任意に非フォーマット化される（例えば、ペギル化または半減期延長化されない）かまたはＰＥＧと連結されるｄＡｂ単量体として、任意に肺症状（例えば、特発性肺繊維症）を処置および／または防止するための、任意に吸入により（例えば、肺送達）患者に送達するための、乾燥粉末処方物として、提供される。
【０１５６】
本発明のリガンドは、いくつかの利点を提供する。例えば、本明細書中に記載されるように、リガンドは、所望のin vivo血清半減期を有するよう作り上げられ得る。ドメイン抗体は、慣用的抗体よりはるかに小さく、慣用的抗体より良好な組織振盪を達成するために投与され得る。したがって、ｄＡｂおよびｄＡｂを含むリガンドは、ＴＧＦベータシグナル伝達により媒介される疾患のような疾患を処置するために投与される場合、慣用的抗体を上回る利点を提供する。特に、特発性肺繊維症を処置するための本発明のｄＡｂの肺送達は、ＴＧＦベータシグナル伝達の阻害剤の特異的局所送達を可能にする。有益には、ＴＧＦベータＲＩＩと特異的に結合し、それを抑制する非フォーマット化ｄＡｂ単量体は、肺送達を介して肺中に吸収されるのに十分に小さい。
【０１５７】
ＷＯ２００７０８５８１５の実施例は、参照により本明細書中に組入れられて、本発明のリガンドに等しく適用され得る関連検定、フォマッティングおよび実験の詳細を提供する。
【０１５８】
（実施例）
以下の実施例において、例証目的だけのために、本発明をさらに記載する。
【０１５９】
実施例１．  ＴＧＦベータＲＩＩを結合するｄＡｂの選択
ナイーブ選択：  ４Ｇに関するＧＡＳ１リーダー配列（ＷＯ２００５０９３０７４参照）から発現される、ならびに付加的に６Ｇに関する加熱／冷却前選択を伴う（ＷＯ０４１０１７９０参照）、抗体単一可変ドメインを呈示するファージライブラリーである４Ｇおよび６Ｇナイーブファージライブラリーを用いた。組換えヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ,  Ａｂｉｎｇｄｏｎ,  ＵＫ,  ｃａｔ  ｎｏ.  ３４１‐ＢＲ）に対するＶＨおよびＶＫライブラリー（４Ｇ  Ｈ１１−１９および６Ｇ  ＶＨ２−４（ＶＨ  ｄＡｂｓ）および４Ｇ  κ１、４Ｇ  κ２および６Ｇ  κ（Ｖκ  ｄＡｂｓ）として同定される）のプールをパニングすることにより、ＤＯＭ２３ｈリードを単離した。マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０中のヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と融合されたヒトＴＧＦ−β受容体ＩＩ型の１５９アミノ酸残基細胞外ドメイン（Ｌｉｎ,  ｅｔ  ａｌ.,  １９９２,  Ｃｅｌｌ  ６８：７７５‐７８５）をコードするＤＮＡ配列の発現により、このキメラタンパク質を作製した。
【０１６０】
初回パニングのために４℃で一晩、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０μｇ／ｍｌ抗原で管を被覆することにより、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）イムノチューブ（Ｎｕｎｃ,  Ｄｅｎｍａｒｋ）上に組換えヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃキメラタンパク質を固定した。イムノチューブをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の２％Ｍａｒｖｅｌｌ粉乳（ＭＰＢＳ）で管を縁まで充填することによりファージの非特異的結合を防止するよう遮断して、室温で少なくとも１時間、インキュベートした。ファージライブラリーを、６群にプールした：４Ｇ  κ１およびκ２、６Ｇ  κ、４Ｇ  Ｈ１１−１３、４Ｇ  Ｈ１４−１６、４Ｇ  Ｈ１７−１９および６Ｇ  ＶＨ２−４。１×１０１１ファージ／ライブラリーをプールした。室温で１時間、４ｍｌの２％ＭＰＢＳ中でファージをインキュベートした。遮断イムノチューブを、ＰＢＳで３回洗浄した。遮断ファージプールをイムノチューブに移して、室温で少なくとも１時間回転しながらインキュベートした。０．１％トゥイーン−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で１０回イムノチューブを洗浄した後、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌトリプシン  ０．５ｍｌで結合ファージを溶離した。
【０１６１】
１０μｇ／ｍｌヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃで被覆したイムノチューブを用いて、２回目のパニングを実施した。投入ファージを上記のように１×１０１０ファージ／プールでプールして、０．５ｍｌの２％ＭＰＢＳ中で遮断し、５０μｇ／ｍｌの対照Ｆｃ断片を付加した。ファージを、室温で１時間、遮断した。３．５ｍｌのＭＰＢＳをファージに付加し、これを次に遮断イムノチューブに移して、室温で少なくとも１時間インキュベートした。イムノチューブをＰＢＳＴで２０回洗浄した後、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌトリプシン  ０．５ｍｌで結合ファージを溶離した。
【０１６２】
１μｇ／ｍｌヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃで被覆したイムノチューブを用いて、３回目のパニングを実施した。投入ファージを上記のようにプールしたが、但し、６Ｇ  κおよび４Ｇ  κ１およびκ２投入ファージを一緒にプールした。ファージを４ｍｌの２％ＭＰＢＳ中で、１００μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片（ヒト骨髄腫血漿ＩｇＧ由来のネイティブＩｇＧ  Ｆｃ断片、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ,  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ,  ＵＳ、カタログ番号４０１１０４）を付加し、少なくとも１時間、遮断した。イムノチューブをＰＢＳＴで２０回洗浄した後、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌトリプシン  ０．５ｍｌで結合ファージを溶離した。２回目および３回目産出物をｆｄ−ファージベクターｐＤＯＭ４からｐＤＯＭ１０中にクローン化した。ベクターｐＤＯＭ４は、遺伝子ＩＩＩシグナルペプチド配列が酵母糖脂質固定表面タンパク質（ＧＡＳ）シグナルペプチドと置き替えられるｆｄファージベクターの誘導体である。それはまた、リーダー配列と遺伝子ＩＩＩとの間にｃ−ｍｙｃタグを含有し、これが、遺伝子ＩＩＩをフレーム中に戻す。このリーダー配列は、ファージ呈示ベクター中だけでなく、他の原核生物発現ベクター中でも良好に機能し、普遍的に用いられ得る。ｐＤＯＭ１０は、ｄＡｂの可溶性発現のために設計されたプラスミドベクターである。それはｐＵＣ１１９ベクターに基づいており、ＬａｃＺプロモーターの制御下での発現を伴う。上清中でのｄＡｂの発現を、Ｎ末端でのｄＡｂ遺伝子と普遍的ＧＡＳリーダーシグナルペプチド（ＷＯ２００５０９３０７４）との融合により確証した。さらに、ＦＬＡＧ−タグを、ｄＡｂのＣ末端に付した。メーカーの使用説明書（カタログ番号２７１０４、Ｑｉａｇｅｎ）に従って、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（商標）キットを用いて、選択ｄＡｂ呈示ｆｄ−ファージに感染した細胞からｐＤＯＭ４  ＤＮＡを単離することにより、ｄＡｂ遺伝子のサブクローニングを実施した。ビオチニル化オリゴヌクレオチドＤＯＭ５７（５’−ＴＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＣＧ−３’（配列番号４７）およびＤＯＭ６（５’−ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣ−３’（配列番号４８）を用いて、ＰＣＲによりＤＮＡを増幅し、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化されたｐＤＯＭ１０と結紮した。結紮産物を、大腸菌ＨＢ２１５１中で電気穿孔により形質転換して、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補足したＴＹＥ（トリプトン酵母抽出物）プレート（ＴＹＥ−ｃａｒｂ）上でプレート化した。個々のクローンを摘み取り、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補足した０．２ｍｌ／ウェル一晩発現自己誘導培地（高レベルタンパク質発現系、Ｎｏｖａｇｅｎ）中で、３７℃で一晩、２５０ｒｐｍで９６ウェルプレート中で発現させた。次に、これらのプレートを、１８００ｇで１０分間、遠心分離した。
【０１６３】
ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃを結合したｄＡｂクローンを、ＥＬＩＳＡにより同定した。９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）免疫プレート（Ｎｕｎｃ,  Ｄｅｎｍａｒｋ）を、４℃で一晩、ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃで被覆した。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、室温で１時間、ＰＢＳ中の１％トゥイーン（１％ＴＰＢＳ）で遮断した。遮断を除去し、１％ＴＰＢＳおよびｄＡｂ上清の１：１混合物を、室温で１時間、付加した。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、検出抗体（モノクローナル抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−ペルオキシダーゼ抗体、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ,  ＵＫ）を付加して、室温で１時間インキュベートした。比色基質（ＳｕｒｅＢｌｕｅ  １−成分ＴＭＢ  マイクロウェル・ペルオキシダーゼ溶液、  ＫＰＬ,  Ｍａｒｙｌａｎｄ,  ＵＳＡ）を用いてプレートを展開し、光学密度（ＯＤ）を４５０ｎＭで測定した。ＯＤ４５０は、結合検出抗体の量に比例する。
【０１６４】
上記のように実施した二次確認ＥＬＩＳＡで、陽性結合剤を再試験した。ＥＬＩＳＡで同定されたヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃ結合ｄＡｂを、一晩発現自己誘導培地（ＯｎＥｘ、Ｎｏｖａｇｅｎ）中で、３０℃で４８〜７２時間、または３７℃で２４時間、発現させた。培養を遠心分離し（４，６００ｒｐｍ、３０分間）、上清を、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ-プロテインＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ,  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ,  ＵＫ。結合容量：５ｍｇのｄＡｂ／ビーズ１ｍｌ)とともに、４℃で一晩または室温で２時間、インキュベートした。次に、ビーズをＵｎｉｆｉｌｔｅｒ  ９６ウェルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ,  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ,  ＵＫ）中に入れて、２×ＰＢＳ（４００μｌ／ウェル）で洗浄し、その後、室温で２分間、１０００ｒｐｍで遠心分離した。２×ＰＢＳを用いて洗浄手順をもう１度繰り返し、その後、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ,  ＵＫ）で最終洗浄した。０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０（２１０μｌ／ウェル）（Ｓｉｇｍａ,  ＵＫ）を付加することにより結合ｄＡｂを溶離し、その後、遠心分離した。通過画分を、Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレートの真下に置いた９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）中に収集した。溶離ｄＡｂを中和するために、９６ウェル丸底プレートのウェルは４０μｌの１Ｍトリス、ｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ,  ＵＫ）を含入した。溶離手順を、もう１度反復した。代替的には、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ-プロテインＡビーズをクロマトグラフィーカラム中に入れて、２×ＰＢＳで洗浄し、その後、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ,  ＵＫ）で洗浄した。結合ｄＡｂを０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０で溶離し、１Ｍトリス、ｐＨ８．０で中和した。ｄＡｂの２８０ｎｍでのＯＤを測定し、ｄＡｂのアミノ酸組成から算定した減衰係数を用いて、タンパク質濃度を確定した。
【０１６５】
Ａ５４９ＩＬ−１１放出検定で測定した場合の効力に関して、ならびにＳＥＣ−ＭＡＬＬＳおよびＤＳＣ（下記）により査定した場合の生物物理学的特質に関して、ｄＡｂを試験した。ＤＯＭ２３ｈ−３３（配列番号１）、ＤＯＭ２３ｈ−２５１（配列番号２）、ＤＯＭ２３ｈ−２６２（配列番号３）、ＤＯＭ２３ｈ−２７１（配列番号４）、ＤＯＭ２３ｈ−３４８（配列番号５）、ＤＯＭ２３ｈ−４３５（配列番号６）、ＤＯＭ２３ｈ−４３６（配列番号７）、ＤＯＭ２３ｈ−４３７（配列番号８）、ＤＯＭ２３ｈ−４３８（配列番号９）、ＤＯＭ２３ｈ−４３９（配列番号１０）およびＤＯＭ２３ｈ−４４０（配列番号１１）ライブラリーを、エラープローン親和性成熟に関して選択した。
【０１６６】
実施例２．  エラープローン親和性成熟
ＤＯＭ２３ｈ−３３（配列番号１）、ＤＯＭ２３ｈ−２５１（配列番号２）、ＤＯＭ２３ｈ−２６２（配列番号３）、ＤＯＭ２３ｈ−２７１（配列番号４）、ＤＯＭ２３ｈ−３４８（配列番号５）、ＤＯＭ２３ｈ−４３５（配列番号６）、ＤＯＭ２３ｈ−４３６（配列番号７）、ＤＯＭ２３ｈ−４３７（配列番号８）、ＤＯＭ２３ｈ−４３８（配列番号９）、ＤＯＭ２３ｈ−４３９（配列番号１０）およびＤＯＭ２３ｈ−４４０（配列番号１１）のエラープローン突然変異誘発を実施して、これらのｄＡｂの親和性を改良した。
【０１６７】
ファージライブラリー構築：  ＤＯＭ２３ｈ−３３（配列番号１）、ＤＯＭ２３ｈ−２５１（配列番号２）、ＤＯＭ２３ｈ−２６２（配列番号３）、ＤＯＭ２３ｈ−２７１（配列番号４）、ＤＯＭ２３ｈ−３４８（配列番号５）、ＤＯＭ２３ｈ−４３５（配列番号６）、ＤＯＭ２３ｈ−４３６（配列番号７）、ＤＯＭ２３ｈ−４３７（配列番号８）、ＤＯＭ２３ｈ−４３８（配列番号９）、ＤＯＭ２３ｈ−４３９（配列番号１０）およびＤＯＭ２３ｈ−４４０（配列番号１１）のエラープローンライブラリーを、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ＩＩ無作為突然変異誘発キット(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００５５０)を用いて作製した。メーカーの使用説明書に従って、標的ｄＡｂ遺伝子を、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドＤＯＭ００８（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ−３’（配列番号４９））およびＤＯＭ００９（５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号５０））を用いて、ＰＣＲにより増幅し、その後、オリゴヌクレオチドＤＯＭ１７２（５’  ＴＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＣＧ−３’（配列番号５１））およびＤＯＭ１７３（５’−ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣ−３’（配列番号５２））、ならびにＭｕｔａｚｙｍｅ（商標）ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、希釈ＰＣＲ産物を再増幅した。このＰＣＲ産物を、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼならびにオリゴヌクレオチドＤＯＭ１７２およびＤＯＭ１７３を用いてさらに増幅して、ＤＮＡ産物収量を増大した。ＰＣＲ産物を、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。非消化産物および消化末端を、ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ,  ＵＫ）を用いて消化産物から除去した。消化産物を、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化したｐＤＯＭ４ファージベクター中に結紮し、大腸菌ＴＢ１細胞を形質転換するために用いた。形質転換細胞を、１５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを補足した２×ＴＹ寒天上でプレート化して、ライブラリーサイズ＞１×１０７の形質転換体を得た。
【０１６８】
エラープローン選択：  ＤＯＭ２３ｈ−３３、ＤＯＭ２３ｈ−２５１、ＤＯＭ２３ｈ−２６２、ＤＯＭ２３ｈ−２７１およびＤＯＭ２３ｈ−３４８ライブラリーを、それぞれ１００、５、０．５および０．１ｎＭビオチニル化ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃに対して用いて、４回の選択を実施した。ＤＯＭ２３ｈ−４３５、ＤＯＭ２３ｈ−４３６、ＤＯＭ２３ｈ−４３７、ＤＯＭ２３ｈ−４３８、ＤＯＭ２３ｈ−４３９およびＤＯＭ２３ｈ−４４０エラープローンライブラリーをそれぞれ１００、１０、１および０．１ｎＭビオチニル化ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃに対して用いて、４回の選択を実施した。５倍モル過剰量のＥＺ−Ｌｉｎｋ  スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン試薬（Ｐｉｅｒｃｅ,  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ,  ＵＳＡ）（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ,  ｅｔ  ａｌ.,  ２００２,  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ.  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ,  Ｅｄ.  Ｏ‘Ｂｒｉｅｎ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎ,  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて、ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃをビオチニル化した。上記と同様に、３回目および４回目の選択産出物を、ｐＤＯＭ１０ベクター中でサブクローニングした。ここのクローンを摘み取り、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補足した０．５ｍｌ／ウェル一晩発現自己誘導培地中で、３７℃で２４時間、湿度９０％で、８５０ｒｐｍで９６ウェルプレート中で発現させた。次に、プレートを、１８００ｇで１０分間、遠心分離した。上清を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で1/5または1/2希釈して、ビオチニル化ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃとの結合に関してＢｉａｃｏｒｅ（商標）上でスクリーニングした（メーカーの推奨に従って、１０００Ｒｕビオチニル化ｈＲＩＩ−Ｆｃで被覆したＳＡチップ) (Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ(登録商標))。試料を、５０μｌ／分の流量で、Ｂｉａｃｏｒｅ上を走行させた。親クローンと比較して大きい数の共鳴単位（ＲＵ）で、または改善されたオフ速度で結合したクローンを、５０ｍｌの一晩発現自己誘導培地中で、３０℃で４８〜７２時間発現させて、４，６００ｒｐｍで３０分間、遠心分離した。上清を、Streamline-プロテインＡビーズとともに、４℃で一晩、インキュベートした。次に、ビーズを滴下カラム中に入れて、５カラム容積の２×ＰＢＳで洗浄し、その後、一床容積の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄し、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０中で溶離し、１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。ｄＡｂの２８０ｎｍでのＯＤを測定し、ｄＡｂのアミノ酸組成から算定した減衰係数を用いて、タンパク質濃度を確定した。
【０１６９】
実施例３．  ｄＡｂ配列中へのＫ６１Ｎ  Ｄ６４Ｒ突然変異の導入
効力を改善するための試みで、ＤＯＭ２３ｈ−２７１、４３７および４３９に属するｄＡｂ中に、Ｄ６１ＮおよびＫ６４Ｒ二重突然変異を導入した。これらの突然変異を含有するｄＡｂを、ＤＯＭ２３ｈ−２６２エラープローンファージライブラリーを用いて実施した選択から単離し、Ａ５４９ＩＬ−１１放出検定で測定した場合に、ＤＯＭ２３ｈ−２６２（配列番号３）より強力であることが判明した。Ａ５４９ＩＬ−１１放出検定で確定した場合、ＤＯＭ２３ｈ−２６２−６（配列番号１２）中のＤ６１Ｎ（ならびにＹ１０２Ｈ）の存在は、ＤＯＭ２３ｈ−２６２（配列番号３）に比してｄＡｂ効力を５４倍改善し、ＤＯＭ２３ｈ−２６２−１０（配列番号１３）中のＤ６１ＮおよびＫ６４Ｒ（ならびにＱ３９Ｒ、Ｅ５３ＤおよびＷ１０３Ｓ）の存在は、ＤＯＭ２３ｈ−２６２（配列番号３）に比して効力を５４０倍改善した（表１）。
【０１７０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、重複伸長により、ＤＯＭ２３ｈ−２７１、ＤＯＭ２３ｈ−４３７およびＤＯＭ２３ｈ−４３９に属するｄＡｂ中に突然変異を導入した（Ｈｏ,  ｅｔ  ａｌ.,  Ｇｅｎｅ  １９８９  ７７（１））：相補的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、重複または相補的末端を有する２つのＤＮＡ断片を生成する。これらの断片をその後のアセンブリーＰＣＲで組合せるが、この場合、重複末端をアニーリングして、各鎖の３’重複を相補鎖の３’伸長のためのプライマーとして役立たせて、その結果生じる融合産物をさらにＰＣＲにより増幅する。ヌクレオチド配列における特異的変更は、重複オリゴヌクレオチドプライマー中にヌクレオチド変化を組入れることにより導入し得る。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチド対ＤＯＭ００８（ｄＡｂ遺伝子の５’側  開始）およびＣＤ１３１（５’−ＧＡＡＣＣＧＧＣＣＣＣＴＣＡＣＧＧＡＧＴＴＴＧＣＧＴＡＧＴＡ−３’（配列番号５３））またはＤＯＭ００９（ｄＡｂ遺伝子の３’側末端）ならびにＣＤ１３０（５’−ＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣ−３’（配列番号５４））（突然変異化ヌクレオチド残基に下線を付す）を用いる２つの別個のＰＣＲにより、標的ｄＡｂ遺伝子断片を増幅した。プライマーを付加することなく、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてアセンブリーＰＣＲで、２つのＰＣＲ断片を再結合した。次に、フランキングプライマーＤＯＭ００８およびＤＯＭ００９をＰＣＲ反応に付加することにより、融合産物を増幅した。ＰＣＲ産物をＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化して、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化したｐＤＯＭ１０または１３発現ベクター中に結紮して、大腸菌ＨＢ２１５１細胞を形質転換するために用いた。ｐＤＯＭ１３発現ベクターはｐＤＯＭ１０と同一のヌクレオチド配列を有するが、但し、ＦＬＡＧエピトープヌクレオチド配列は２つの停止コドン（５’−ＴＡＡ  ＴＡＡ−３’）に置き換えられて、Ｃ末端ＦＬＡＧタグを有さない可溶性ｄＡｂの発現を生じる。Ｄ６１ＮおよびＫ６４Ｒヌクレオチド突然変異を、ＤＯＭ２３ｈ−２７１−３（配列番号１４）、ＤＯＭ２３ｈ−２７１−７（配列番号１５）およびＤＯＭ２３ｈ−４３７−６（配列番号１９）中に導入して、それぞれ、ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２（配列番号１６）、ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３（配列番号１７）およびＤＯＭ２３ｈ−４３７−９（配列番号２１）を作製した。ＤＯＭ２３ｈ−４３７−４（配列番号１８）およびＤＯＭ２３ｈ  ４３９−６（配列番号２２）を、既にＫ６４Ｒ突然変異を含有するエラープローン選択産出物から単離した。Ｄ６１Ｎ突然変異をこれら２つのｄＡｂ中に導入して、それぞれＤＯＭ２３ｈ−４３７−８（配列番号２０）およびＤＭ２３ｈ−４３９−８（配列番号２３）を作製した。
【０１７１】
実施例４．  ＴＧＦ−βＲＩＩ抑制に関する検定
Ａ５４９ＩＬ−１１放出細胞検定およびＳＢＥ−ｂｌａ  ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞センサー検定で、ｄＡｂを試験した。
【０１７２】
Ａ５４９ＩＬ−１１放出検定：  Ａ５４９インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）放出検定は、Ａ５４９細胞からのヒトＴＧＦ−β１刺激性ＩＬ−１１放出を抑制するｄＡｂの能力を測定する。ＴＧＦ−β１はＴＧＦ−βＲＩＩと直接結合して、ＴＧＦ−βＲＩ／ＩＩ複合体のアセンブリーを誘導する。ＴＧＦ−βＲＩは、リン酸化され、Ｓｍａｄ４経路を含めたいくつかの経路を介してシグナルを伝達し得る。Ｓｍａｄ４経路の活性化は、ＩＬ−１１の放出を生じる。ＩＬ−１１は、細胞上清中に分泌され、次いで、比色ＥＬＩＳＡにより測定される。
【０１７３】
Ｓｍａｄ４経路を介したＴＧＦ−β１シグナル伝達を遮断するそれらの能力に関して、可溶性ｄＡｂを試験した。要するに、検定培地（ＤＭＥＭ  高グルコース培地（Ｇｉｂｃｏ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ,  Ｐａｉｓｌｅｙ,  ＵＫ）、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＰＡＡ、Ａｕｓｔｒｉａ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ,  ＵＫ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＡＡ,  Ａｕｓｔｒｉａ））中の１×１０５Ａ５４９細胞／ウェルを、組織培養９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に付加し、その後、ｄＡｂおよびＴＧＦ−β１（最終濃度３ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ,  Ａｂｉｎｇｄｏｎ,  ＵＫ）を付加して、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、インキュベートした。ｄＡｂをＰＢＳ中で透析した後、検定した。メーカーの使用説明書に従って、ヒトＩＬ‐１１  Ｄｕｏｓｅｔ（商標）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ,  Ａｂｉｎｇｄｏｎ,  ＵＫ）を用いて、上清中に放出されるＩＬ−１１の濃度を測定する。
【０１７４】
結果を、表１に要約する。
【０１７５】
ＳＢＥ−ｂｌａ  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞センサー検定：  シグナル伝達分子のＳｍａｄファミリーの成員は、細胞表面から核にＴＧＦ−βシグナルを伝達する細胞内経路の構成成分である。ＴＧＦ−β１はＴＧＦ−β１と直接結合して、ＴＧＦ−βＲＩ／ＩＩ複合体のアセンブリーを誘導する。次に、ＴＧＦ−βＲＩによりＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３はリン酸化されて、その後、ｃｏ−ｓｍａｄファミリー成員Ｓｍａｄ４とヘテロマ複合体を形成する。これらの複合体は核に転位されて、そこで、それらはＤＮＡを結合し、遺伝子転写を調節する。
【０１７６】
細胞センサーＳＢＥ−ｂｌａ  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,  ＵＫ）中に安定的に組み込まれたＳｍａｄ結合素子（ＳＢＥ）の制御下のベータ−ラクタマーゼレポーター遺伝子を含有する。細胞はＴＧＦ−β１に応答性であり、Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達経路のアゴニスト／アンタゴニストを検出するために用いられ得る。
【０１７７】
メーカーの推奨プロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,  ＵＫ）に従って、この経路を介したＴＧＦ−β１シグナル伝達を遮断するそれらの能力に関して、可溶性ｄＡｂを試験した。ｄＡｂをＰＢＳ中で透析した後、検定した。
【０１７８】
結果を、表１に要約する。
【表１】
2013500030.tif 000003
【０１７９】
個々のＡ５４９ＩＬ−１１放出検定を二重反復実験で実施して、単一用量−応答曲線およびＩＣ５０値を検定毎に（ｎ＝１）確定した。検定は１〜６回実施した。平均ＩＣ５０値（ｎ＝１〜６）±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を、表１に要約する。個々のＳＢＥ−ｂｌａ  ＨＥＫ２９３細胞センサー検定を二重反復実験で実施して、２つの用量−応答曲線および２つのＩＣ５０値は検定毎に確定した。二重反復実験ＩＣ５０値の平均を算定して、単一ＩＣ５０値／検定（ｎ＝１）を得た。検定は１〜３回実施した（ｎ＝１〜３）。ＩＣ５０値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）の平均を算定し、表１に要約する。
【０１８０】
Ａ５４９ホスホ−ＳｍａｄＭＳＤ検定：  この検定は、ヒト肺胞基底上皮細胞株であるＡ５４９細胞におけるＳｍａｄ３のＴＧＦ−β１刺激性リン酸化を抑制するｄＡｂの能力を測定する。ＴＧＦ−β１はＴＧＦ−βＲＩＩと直接結合して、ＴＧＦ−βＲＩ／ＩＩ複合体のアセンブリーを誘導する。ＴＧＦ−βＲＩはリン酸化され、ついで、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３がリン酸化されるようになる。
【０１８１】
リン酸化Ｓｍａｄ２／３のレベルは、抗Ｓｍａｄ２／３捕捉抗体およびルテニル化抗Ｓｍａｄ３検出抗体を用いて、細胞溶解物中で測定され得るし、電気化学発光検定により測定され得る。
【０１８２】
この経路を介したＴＧＦ−β１シグナル伝達を遮断するそれらの能力に関して、可溶性ｄＡｂを試験した。要するに、増殖培地（１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を有するＤＭＥＭ  Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,  ＵＫ）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,  ＵＫ）および１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,  ＵＫ）を補足）中の２×１０４Ａ５４９細胞／ウェルを、黒色透明底組織培養３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ,  ＵＫ）に付加し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、インキュベートした。ｄＡｂの緩衝液をトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ８．０（ＴＢＳ）（Ｓｉｇｍａ,  ＵＫ）に交換した後、検定した。次に、ｄＡｂを増殖培地中に希釈し、細胞に付加して、３７℃（５％ＣＯ２）で１時間、インキュベートした。この後、ＴＧＦ−β１（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を補足したＤＭＥＭ  培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,  ＵＫ）中に希釈）を付加し、３７℃で３０分間インキュベートした。用いたＴＧＦ−β１の濃度は、Ａ５４９細胞増殖のＴＧＦ−β１刺激に関するＥＣ８０値（８０％最大応答を生じる濃度）と等しかった。典型的に用いたＴＧＦ−β１の濃度は、２．２ｎｇ／ｍｌであった。ホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ,  Ｐｏｏｌｅ,  ＵＫ）およびプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補足した溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,  ＭＡ,  Ｕ.Ｓ.Ａ）中で、４℃で２０分間、細胞を溶解した。細胞溶解物を、３８４ウェル高結合ＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ,  ＭＤ,  Ｕ.Ｓ.Ａ）に移して、室温で３時間インキュベートした。ＭＳＤプレートは、６０μｇ／ｍｌビオチニル化Ｓｍａｄ２／３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ,  Ｏｘｆｏｒｄ,  ＵＫ）を予め点在させ、５％Ｍａｒｖｅｌ乾燥粉乳および０．１％トゥイーン２０（Ｓｉｇｍａ,  ＵＫ）を含有するＴＢＳ（ＭＴＴＢＳ）で、４℃で一晩、遮断され、０．１％トゥイーン２０を含有するＴＢＳ（ＴＴＢＳ）で１回洗浄されていた。細胞溶解物を除去し、プレートをＴＴＢＳで３回洗浄し、その後、ルテニル化抗ホスホＳｍａｄ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＭＡ,  ＵＳＡ）を付加した。メーカーの使用説明書に従って、抗ホスホＳｍａｄ３抗体をＭＳＤ  ＴＡＧ−ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ（ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン）（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ,  ＭＤ,  ＵＳＡ）で標識した。プレートを、室温で１８時間インキュベートした。プレートをＴＴＢＳで１回洗浄し、界面活性剤（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ,  ＭＤ,  ＵＳＡ）を補足したＲｅａｄ緩衝液Ｔ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ,  ＭＤ,  ＵＳＡ）を付加した。ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ,  ＭＤ,  ＵＳＡ）を用いて、プレートを読取った。他の関連細胞株、例えば一次肺繊維芽細胞を用いて、この検定を実施することが可能である。
【０１８３】
ＤＯＭ２３ｈ  ｄＡｂから得た検定データの結果を、表２に要約する。
【０１８４】
ＲＡＷ２６４．７ホスホ−Ｓｍａｄ検定：  この検定は、マウスマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＳｍａｄ３のＴＧＦ−β１刺激性リン酸化を抑制するｄＡｂの能力を測定する。ＴＧＦ−β１はＴＧＦ−βＲＩＩと直接結合して、ＴＧＦ−βＲＩ／ＩＩ複合体のアセンブリーを誘導する。ＴＧＦ−βＲＩはリン酸化され、ついで、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３がリン酸化されるようになる。リン酸化Ｓｍａｄ２／３のレベルは、抗Ｓｍａｄ２／３捕捉抗体およびルテニル化抗Ｓｍａｄ３検出抗体を用いて、細胞溶解物中で測定され得るし、電気化学発光検定により測定され得る。
【０１８５】
この経路を介したＴＧＦ−β１シグナル伝達を遮断するそれらの能力に関して、可溶性ｄＡｂを試験した。要するに、増殖培地（１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,  ＵＫ）および０．０１％プルロニック酸（Ｓｉｇｍａ,  ＵＫ）を有する高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,  ＵＫ）中の３．４５×１０５ＲＡＷ２６４．７細胞／ウェルを、組織培養９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）に付加し、３７℃、５％ＣＯ２で２日間、インキュベートした。ｄＡｂの緩衝液をＴＢＳに交換した後、検定した。その後、ｄＡｂを増殖培地中に希釈し、細胞に付加して、３７℃（５％ＣＯ２）で１時間、インキュベートし、この後、ＴＧＦ−β１（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,  ＵＫ）を補足したＤＭＥＭ  培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,  ＵＫ）中に希釈）を付加し、３７℃で３０分間インキュベートした。用いたＴＧＦ−β１の濃度は、ＲＡＷ２６４．７細胞増殖のＴＧＦ−β１刺激のＥＣ８０値（８０％最大応答を生じる濃度）と等しかった。典型的に用いたＴＧＦ−β１の濃度は、１．１ｎｇ／ｍｌであった。ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を補足した溶解緩衝液中で、４℃で２０分間、細胞を溶解した。細胞溶解物を、３８４ウェル高結合ＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ,  ＭＤ,  Ｕ.Ｓ.Ａ）に移して、室温で３時間インキュベートした。ＭＳＤプレートは、６０μｇ／ｍｌビオチニル化Ｓｍａｄ２／３を予め点在させ、ＭＴＴＢＳで、４℃で一晩、遮断され、ＴＴＢＳで１回洗浄されていた。細胞溶解物を除去し、プレートをＴＴＢＳで３回洗浄し、ルテニル化抗ホスホＳｍａｄ３抗体をプレートに付加し、室温で１８時間インキュベートした。メーカーの使用説明書に従って、抗ホスホＳｍａｄ３抗体をＭＳＤ  ＴＡＧ−ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ（ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン）（Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ,  ＭＤ,  ＵＳＡ）で標識した。プレートをＴＴＢＳで２回洗浄し、界面活性剤を補足したＲｅａｄ緩衝液Ｔを付加した。ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  ｉｍａｇｅｒ  ６０００を用いて、プレートを読取った。
【０１８６】
ＤＯＭ２３ｈ  ｄＡｂから得た検定データの結果を、表２に要約する。
【表２】
2013500030.tif 000004
【０１８７】
個々のＡ５４９ホスホ−Ｓｍａｄ  ＭＳＤ検定を、一重項、二重反復実験または三重反復実験で実施して、１、２または３つの用量−応答曲線ならびにＩＣ５０値を、それぞれ、検定毎に（ｎ＝１、２または３）確定した。ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２（配列番号１６）を、７つの検定で、二重反復実験で４回、三重反復実験で３回、試験した（ｎ＝１７）。ＤＯＭ２３ｈ−４３７−９（配列番号２１）を、３つの検定で、二重反復実験で１回、三重反復実験で２回、試験した（ｎ＝８）。ＤＯＭ２３ｈ−４３９−８（配列番号２３）を、３つの検定で、三重反復実験で２回、および一重項で１回試験した（ｎ＝７）。ＩＣ５０値±標準誤差（Ｓ．Ｅ）の平均を算定し、表２に要約する。
【０１８８】
個々のＲＡＷ２６４．７ホスホ−Ｓｍａｄ検定を、一重項、二重反復実験または三重反復実験で実施して、１、２または３つの用量−応答曲線ならびにＩＣ５０値を、それぞれ、検定毎に（ｎ＝１、２または３）確定した。ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２（配列番号１６）を、７つの検定で、一重項で１回、二重反復実験で６回、三重反復実験で２回、試験した（ｎ＝１９）。得られたＩＣ５０値の範囲を、表２に要約する。ＤＯＭ２３ｈ−４３７−９（配列番号２１）およびＤＯＭ２３ｈ−４３９−８（配列番号２３）をともに、二重反復実験で５回試験した（ｎ＝１０）。
【０１８９】
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ルシフェラーゼ検定：  ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ルシフェラーゼ検定は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中でのＣＡＧＡ−ルシフェラーゼのＴＧＦβ誘導性発現を抑制するｄＡｂの能力を測定する。ＣＡＧＡボックスと呼ばれるＴＧＦβ応答性配列モチーフの３つのコピーが、ヒトＰＡＩ−１プロモーター中に存在し、Ｓｍａｄ３および４タンパク質を特異的に結合する。ルシフェラーゼレポーター構築物中へのＣＡＧＡボックスの多数のコピーのクローニングは、レポーター系でトランスフェクトされた細胞にＴＧＦβ応答性を付与する。この検定は、［ＣＡＧＡ］１２−ルシフェラーゼレポーター構築物で安定的にトランスフェクトされたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（マウス骨芽細胞）を用いる（Ｄｅｎｎｌｅｒ,  ｅｔ  ａｌ.,  （１９９８）  ＥＭＢＯ  Ｊ.  １７,  ３０９１−３１００）。
【０１９０】
Ｓｍａｄ３／４経路を介したＴＧＦ−β１シグナル伝達を遮断するそれらの能力に関して、可溶性ｄＡｂを試験した。要するに、検定培地（ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ,  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ,  Ｐａｉｓｌｅｙ,  ＵＫ）、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中の２×１０４ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞／ウェルを、組織培養９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に付加し、その後、ｄＡｂおよびＴＧＦ−β１（最終濃度１ｎｇ／ｍｌ）を付加して、３７℃、５％ＣＯ２で６時間、インキュベートした。ｄＡｂをＰＢＳ中で透析した後、検定した。Ｂｒｉｇｈｔｇｌｏｗルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ,  ＵＫ）をウェルに付加し、室温で２分間インキュベートして、細胞を溶解させ、その結果生じた発光をルミノメーターで測定した。
【０１９１】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２（配列番号１６）、ＤＯＭ２３ｈ−４３７−９（配列番号２１）およびＤＯＭ２３ｈ−４３９−８（配列番号２３）を、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ルシフェラーゼ検定で試験した。結果を、表３に示す。
【表３】
2013500030.tif 000005
【０１９２】
個々のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ルシフェラーゼ検定を二重反復実験で実施して、ＩＣ５０値を確定した。検定を２〜４回実施した（ｎ＝２〜４）。ＩＣ５０値の範囲を表３に要約する。ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２（配列番号１６）に関して得られた結果は、試験したｄＡｂバッチ番号により変化した。したがって、ＩＣ５０値の範囲および平均ＩＣ５０値±標準偏差（Ｓ．Ｄ）を、各バッチ番号に関して算定し、表３に要約する。
【０１９３】
実施例５．  ＤＳＣ（示差走査熱量測定）
示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて、ｄＡｂの熱安定性を測定した。ＰＢＳ緩衝液中１ｍｇ／ｍｌで、ｄＡｂを試験した。タンパク質を、ＰＢＳ緩衝液中で一晩透析した。ＰＢＳ緩衝液を、全試料に関する参照として用いた。１８０℃／時の加熱率で、毛細管セル微量熱量計ＶＰ−ＤＳＣ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ,  ＭＡ,  ＵＳＡ）を用いて、ＤＳＣを実施した。典型的走査は、参照緩衝液およびタンパク質試料の両方に関して、２５〜９０℃からであった。各参照緩衝液および試料対の後に、毛細管セルを、水中の１％Ｄｅｃｏｎ（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ノ溶液で、その後、ＰＢＳで清浄化した。その結果生じたデータトレースを、Ｏｒｉｇｉｎ  ７  Ｍｉｃｒｏｃａｌソフトウェアを用いて解析した。参照緩衝液から得たＤＳＣトレースを、試料トレースから差し引いた。試料の正確なモル濃度をデータ解析ルーチンに入れて、融解温度（Ｔｍ）、エンタルピー（ΔＨ）およびファント・ホッフエンタルピー（ΔＨｖ）値に関する値を得た。１および２遷移事象（またはピーク）の両方を伴う非２状態モデルにデータを適合させた。
【０１９４】
表４に要約した最良適合モデルからの見掛けの融解温度（ａｐｐ  Ｔｍ）を用いて、両モデルに関してａｐｐ  Ｔｍを得た。ｄＡｂの融解温度（Ｔｍ）は、４８．３℃〜６２．９℃の範囲であった。ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２（配列番号１６）およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３（配列番号１７）中に存在する付加的Ｄ６１ＮおよびＫ６４Ｒ突然変異は、それぞれＤＯＭ２３ｈ−２７１−３（配列番号１４）およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−７に比してタンパク質の熱安定性を減少させる；ＤＯＭ２３ｈ−２７１−３（配列番号１４）およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２（配列番号１６）対に関する４℃、ならびにＤＯＭ２３ｈ−２７１−７（配列番号１５）およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３（配列番号１７）対に関する２℃の差。ＤＯＭ４３７−９中に存在する付加的Ｄ６１ＮおよびＫ６４Ｒ突然変異も、これらの突然変異がない同一配列（ＤＯＭ２３ｈ−４３７−６（配列番号１９））に比して熱安定性を低減する（少なくとも４℃）。ＤＯＭ２３ｈ−４３９−７を作製するためにＤＯＭ２３ｈ−４３９にＤ６１ＮおよびＫ６４Ｒ突然変異を付加すると、約２℃の熱安定性低減を生じる。同様に、Ｋ６４Ｒ突然変異を含有するｄＡｂであるＤＯＭ２３ｈ−４３９−６（配列番号２２）にＤ６１Ｎ突然変異を付加すると、約２℃の熱安定性の低減が生じる。これらのデータ（表４に記述）は、Ｄ６１Ｎ  Ｋ６４Ｒ突然変異がＤＯＭ２３ｈ  ｄＡｂの熱安定性に負の作用を及ぼす、ということを示唆する。
【表４】
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【０１９５】
実施例６：  ｄＡｂ発現：
ＤＯＭ２３ｈ−２７１、４３７および４３９系列に属するｄＡｂを、前記と同様に発現させた。ＤＯＭ２３ｈ−２７１（配列番号４）は良好に発現し、発現レベルは７２ｍｇ／ｌであった（表５）。ＤＯＭ２３ｈ−２７１−３（配列番号１４）およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−７（配列番号１５）（これらは、エラープローン突然変異選択産出物から単離した）も良好に発現し、発現レベルは親ＤＯＭ２３ｈ−２７１  ｄＡｂに匹敵した（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−３（配列番号１４）に関しては６３ｍｇ／ｌおよびＤＯＭ２３ｈ−２７１（配列番号４に関しては７１ｍｇ／ｌ）（表５））。ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２（配列番号１６）を作製するためのＤＯＭ２３ｈ−２７１−３（配列番号１４）中へのＤ６１ＮおよびＫ６４Ｒ突然変異の導入は、発現レベルの７倍低減を生じた（表５）。ＤＯＭ２３ｈ−２７１−７中に同一突然変異を導入して、ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３（配列番号１７）を作製すると、ｄＡｂ発現レベルは２．５倍の低減を生じた（表５）。
【０１９６】
ＤＯＭ２３ｈ−４３７系列からのｄＡｂ中へのＤ６１ＮおよびＫ６４Ｒ突然変異の導入は、上記と同様の作用を示した。ＤＯＭ２３ｈ−４３７（配列番号８）、ＤＯＭ２３ｈ−４３７−４（配列番号１８）およびＤＯＭ２３ｈ−４３７−６（配列番号１９）は全て、良好に発現し、発現レベルはそれぞれ、８９、６６および９８ｍｇ／ｌであった（表５）。しかしながら、これらのｄＡｂ中にＤ６１ＮおよびＫ６４Ｒを導入すると、発現レベルは１．７〜２．５倍の低減を示した。ＤＯＭ２３ｈ−４３９（配列番号１０）およびＤＯＭ２３ｈ−４３９−８（配列番号２３）中へのＤ６１ＮおよびＫ６４Ｒ突然変異の導入は同様の作用を示し、これらのｄＡｂの発現レベルは、それぞれ１．８および４．６倍の低減を生じた（表５）。
【表５】
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【０１９７】
ＨＢ２１５１細胞中で形質転換されたｐＤＯＭ１０またはｐＤＯＭ１３発現ベクターにおけるｄＡｂを、一晩発現自己誘導培地中で、３０℃で４８〜７２時間発現させた。Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ-プロテインＡビーズを培養上清に付加して、可溶性ＶＨ  ｄＡｂを結合した。ビーズを２×ＰＢＳで洗浄し、結合ｄＡｂを０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．０で溶離し、１Ｍトリス、ｐＨ８．０で中和した。ｄＡｂの２８０ｎｍでのＯＤを測定し、ｄＡｂのアミノ酸組成から算定した減衰係数を用いて、タンパク質濃度を確定した。
【０１９８】
実施例７：競合ＢＩＡｃｏｒｅ：
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、ＤＯＭ２３ｈ−２７１、４３７および４３９系列からのｄＡｂが、ｈＴＧＦβ−ＲＩＩ上の同一のまたは異なる結合部位に関して互いに競合するか否かを調べるために、実験を実施した。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００計器（ＢＩＡｃｏｒｅ,  ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ,  Ｓｗｅｄｅｎ）で、ＳＰＲ実験を実施した。メーカーの使用説明書に従って、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４（ＢＩＡｃｏｒｅ,  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ,  Ｓｗｅｄｅｎ）中５０ｕｇ／ｍｌのｈＴＧＦｂ−ＲＩＩ／Ｆｃ抗原をＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ,  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ,  Ｓｗｅｄｅｎ）と結合させた。約５５００ＲＵの抗原を結合させた。ブランク・フローセルを、参照として用いた。精製ｄＡｂをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＢＩＡｃｏｒｅ,  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ,  Ｓｗｅｄｅｎ）中に希釈して、コ・インジェクトコマンドを用いて、３０μｌ／分の流量で、抗原被覆およびブランク・フローセル上に流した。コ・インジェクトコマンドは、最初の試料の直後に第二の試料の注入を可能にする。一次注入は単一ｄＡｂからなり、二次注入は第一ｄＡｂおよび第二ｄＡｂの混合物で構成された。ｄＡｂはすべて、最大容量で抗原表面を結合するのに十分高い濃度で用いられた。第一ｄＡｂによる抗原表面の最大結合容量２つのｄＡｂの混合物の注入により超過し得る場合、第二ｄＡｂは抗原上の異なる結合部位またはエピトープに関して競合すると思われる。二次注入後にさらなる結合がかんさつされない場合には、２つのｄＡｂは同一抗原結合部位に関して競合すると思われる。最も強力なまたは最高親和性のｄＡｂが最初に注入油される場合には、結果は解釈するのが容易である。ＣＭ５センサーチップの表面は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．２５を用いたコ・インジェクト（２回の１０μｌ注入）サイクル後に、５分間の待ち期間をおいて、再生された。
【０１９９】
ＤＯＭ２３ｈ−４３７−６（配列番号１９）、ＤＯＭ２３ｈ−２７１−３（配列番号１４）およびＤＯＭ２３ｈ−４３９−６（配列番号２２）を、個別に、ならびに互いに組合せて、同時注入することにより、競合ＢＩＡｃｏｒｅ実験を実施した。エラープローン突然変異ライブラリーを用いた選択後に、これらのクローンを単離した。それらはＤ６１Ｎ  Ｋ６４Ｒ二重突然変異を含有しないが、しかし、ＤＯＭ２３ｈ−４３９−６（配列番号２２）はＫ６４Ｒ単一突然変異を含有する。ＤＯＭ２３ｈ−４３７−６（配列番号１９）は、３つのｄＡｂのうち最も強力であり、このようなものとして、最初に、１００ｎＭで注入され、その後、ＤＯＭ２３ｈ−４３７−６（配列番号１９）（１００ｎＭ）およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−３（配列番号１４）（５００ｎＭ）の混合物（図８Ａ）またはＤＯＭ２３ｈ−４３７−６（配列番号１９）（１００ｎＭ）とＤＯＭ２３ｈ−４３９−６（配列番号２２）（５００ｎＭ）の混合物（図８Ｂ）が注入された。より大きなＲＵのｄＡｂは二次注入中に結合したが、これは、ＤＯＭ２３ｈ−２７１−３（配列番号１４）およびＤＯＭ２３ｈ−４３９−６（配列番号２２）に比して、ＤＯＭ２３ｈ−４３７−６（配列番号１９）が異なる抗原結合部位に関して競合することを示唆する。
【０２００】
ＤＯＭ２３ｈ−４３７−９（配列番号２１）を、ＤＯＭ２３ｈ−２６２−１０（配列番号１３）、ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２（配列番号１６）およびＤＯＭ２３ｈ−４３９−８（配列番号２３）と組合せて同時注入することにより、競合ＢＩＡｃｏｒｅ実験を実施した。これらのクローンはすべて、Ｄ６１Ｎ  Ｋ６４Ｒ突然変異を含有した。ＤＯＭ２３ｈ−２６２−１０（配列番号１３）はエラープローンライブラリー選択産出物から直接単離されたが、一方、ＤＯＭ２３ｈ−４３７−９（配列番号  ）、ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２（配列番号  ）およびＤＯＭ２３ｈ−４３９−８（配列番号  ）は、それぞれ、ＤＯＭ２３ｈ−４３７−６（配列番号１９）、ＤＯＭ２３ｈ−２７１−３（配列番号１４）およびＤＯＭ２３ｈ−４３９−６（配列番号２２）中への部位特異的突然変異誘発により、Ｄ６１Ｎ  Ｋ６４Ｒを導入することにより作製された。ＤＯＭ２３ｈ−４３７−９（配列番号２１）は４つのｄＡｂのうち最も強力であり、このようなものとして、最初に注入され、次いで、他の３つのｄＡｂのうちの１つと組合せて注入される。ｄＡｂはすべて、１００ｎＭで試験した。二次注入中に結合されたｄＡｂのさらなるＲＵはなかったが、これは、全４つのｄＡｂが同一結合部位に関して競合し、一方、Ｄ６１Ｎ  Ｋ６４Ｒ二重突然変異がｄＡｂヌクレオチド配列中に存在しない場合、３つの系列は同一抗原結合部位に関して競合しない、ということを示唆する。データを、図９および１０に要約する。
【０２０１】
ＮＲ突然変異の要約：  要するに、Ａ５４９ＩＬ−１１放出検定ならびにＳＢＥ−ｂｌａ  Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞センサー検定で測定した場合、ＤＯＭ２３ｈ−２７１、ＤＯＭ２３ｈ−４３７およびＤＯＭ２３ｈ−４３９系列へのＤ６１ＮおよびＫ６４Ｒ突然変異の付加は、ｄＡｂがｈＴＧＦβ−ＲＩＩにより媒介されるシグナル伝達を中和する効力を改善する（表１）。さらに、Ｄ６１ＮおよびＫ６４Ｒ突然変異を含有するＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２（配列番号１６）は、それが、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ルシフェラーゼ検定およびＲＡＷ２６４．７ホスホ−Ｓｍａｄ検定におけるｍＴＧＦβ−ＲＩＩにより媒介されるシグナル伝達を中和する能力をディスプレイするため、ｍＴＧＦβＲＩＩと交差反応する。ＤＯＭ２３ｈ−４３７−９（配列番号２１）は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ルシフェラーゼ検定においてｍＴＧＦβ−ＲＩＩにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得たが、しかしＲＡＷ２６４．７ホスホ−Ｓｍａｄ検定においては抑制できなかった。しかしながら、ＤＳＣにより確定下場合、Ｄ６１Ｎ  Ｋ６４Ｒ突然変異の存在は、熱安定性の低減を生じる（表４）。発現レベルの低減も観察された（表５）。
【０２０２】
実施例８  −  ブレオマイシン誘導性肺繊維症のマウスモデル
ブレオマイシン（ＢＬＭ）誘導性炎症および繊維症は、特発性肺繊維症に関する実験モデルの典型である。当該方法は、以前に記載されている（Ａｎｏｎ,  ｅｔ  ａｌ.,  ＡｍＪ  Ｒｅｓｐｉｒ.  Ｃｒｉｔ.  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ.  ２００５  ｖｏｌ.  １７１,  ｐ  １２７９‐１２８５；  Ｐｉｇｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｉｎｔ.  Ｊ.  Ｅｘｐ.  Ｐａｔｈ.  １９９７,  ｖｏｌ.  ７８,ｐ.    ４３−４８；  Ｇａｓｓｅ,  ｅｔ  ａｌ.,  Ｊ.  Ｃｌｉｎ.  Ｉｎｖｅｓｔ.,  （２００７）  ｖｏｌ  １１７,  ｐ  ３７８６‐３７９９）。
【０２０３】
ＢＬＭは、酸化的ストレス、ＤＮＡ損傷、ならびに肺胞マクロファージおよび上皮細胞のアポトーシスを誘導して、ケモカインおよび前炎症性サイトカイン分泌、炎症細胞再動員、リモデリングおよび肺繊維症を引き起こす。
【０２０４】
ブレオマイシンで処置したマウスに、ＴＧＦβ−ＲＩＩを結合するｄＡｂを鼻内用量投与して、肺の炎症および繊維症に及ぼすそれらの作用を確定する。
【０２０５】
本発明の実施形態を参照しながら本発明を具体的に示し、記載してきたが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱しない限り、形態および詳細の種々の変更が成され得る、と当業者には理解されるであろう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年3月28日(2012.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０ｐＭ〜５０ｎＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）を有するＴＧＦβＲＩＩと結合する配列番号１〜２３の群の少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２】
配列番号１〜２３の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項３】
前記少なくとも１つのアミノ酸配列が２５以下のアミノ酸位置で修飾され、そして配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ１配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ１配列を含み、および／または、配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ２配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ２配列を含み、および／または、配列番号１〜２３の群から選択されるＣＤＲ３配列と少なくとも５０％同一であるＣＤＲ３配列を含む請求項１記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインを含む単離ポリペプチドであって、ＴＧＲβＲＩＩと結合することを特徴とする単離ポリペプチド。
【請求項５】
免疫グロブリン単一可変ドメインの位置６１のＮ、位置６４のＲ、位置１０２のＨ、位置３９のＲ、位置５３のＤまたは位置１０３のＳの群から選択されるアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む請求項１〜３のいずれかに記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、あるいは請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＴＧＦβＲＩＩに対する結合特異性を有し、配列番号１〜２３の群から選択されるアミノ酸配列を含む、抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインの結合を抑制するリガンド。
【請求項７】
ヒトＴＧＦβＲＩＩと結合し、場合によりマウスＴＧＦβＲＩＩと結合してもよい、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドを含む融合タンパク質。
【請求項９】
前記抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドがＴＧＦβ活性を中和する請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドまたは融合タンパク質。
【請求項１０】
ＴＧＦβとＴＧＦβＲＩＩとの結合を抑制する請求項１〜９のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンドまたは融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンドまたは融合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項１２】
請求項１１記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１１または１２記載の核酸またはベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドまたはリガンドを含むポリペプチドの産生方法であって、前記核酸またはベクターの発現に適した条件下で請求項１３記載の宿主細胞を保持し、それにより免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドを含むポリペプチドが産生されることを包含する方法。
【請求項１５】
ＴＧＦβシグナル伝達に関連した疾患の治療に用いるための請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドであって、場合によりＴＧＦβシグナル伝達に関連した前記疾患が、特発性肺繊維症を含む肺繊維症などの組織繊維症、肝硬変および慢性肝炎のような肝臓繊維症、関節リウマチ、眼障害、あるいは皮膚のケロイドのような皮膚の繊維症、ならびに腎炎、腎繊維症および腎硬化症のような腎臓の線維症、ならびに再狭窄のような血管症状の群から選択されてもよい、前記抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンド。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドを含む医薬組成物。
【請求項１７】
ヒト患者におけるＴＧＦβにより媒介される症状の治療および／または予防方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはリガンドを含む組成物を前記ヒト患者に投与するステップを包含する方法。
【国際調査報告】
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