(57)【要約】本発明は、特定危険部位のプリオンを除去するための連続回分式反応槽の使用および使用プロセス、ならびに特定危険部位のプリオンタンパク質を分解するための連続回分式反応槽の有効性の測定に関するものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定危険部位のプリオンタンパク質を分解するプロセスであって、
（ａ）馴養嫌気性汚泥の層を含有する連続回分式反応槽（ＳＢＲ）に特定危険部位（ＳＲＭ）を供給するステップと、
（ｂ）前記特定危険部位を前記汚泥と２５℃以下で反応させ、プリオンタンパク質を分解するステップと
を含むプロセス。
【請求項２】
請求項１に記載のプロセスにおいて、前記特定危険部位は動物の屠体を含むプロセス。
【請求項３】
請求項１に記載のプロセスにおいて、前記嫌気性汚泥は豚糞尿または家畜糞尿由来であるプロセス。
【請求項４】
請求項３に記載のプロセスにおいて、前記家畜糞尿は屠畜場汚泥由来であるプロセス。
【請求項５】
請求項１に記載のプロセスにおいて、前記特定危険部位は５℃〜２５℃の温度で前記汚泥と反応するプロセス。
【請求項６】
請求項５に記載のプロセスにおいて、前記特定危険部位は２０℃〜２５℃の温度で前記汚泥と反応するプロセス。
【請求項７】
請求項５に記載のプロセスにおいて、前記特定危険部位は２０℃の温度で前記汚泥と反応するプロセス。
【請求項８】
請求項１に記載のプロセスにおいて、前記ＳＢＲにケラチンを添加するステップをさらに含むプロセス。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスにおいて、前記ケラチンは羽毛または蹄由来のケラチンであるプロセス。
【請求項１０】
請求項９に記載のプロセスにおいて、前記ケラチンはβケラチンまたはαケラチンであるプロセス。
【請求項１１】
請求項９に記載のプロセスにおいて、前記羽毛ケラチンは鶏羽毛由来であるプロセス。
【請求項１２】
請求項９に記載のプロセスにおいて、前記蹄ケラチンは牛蹄由来であるプロセス。
【請求項１３】
請求項１に記載のプロセスにおいて、前記ＳＢＲは嫌気性消化連続回分式反応槽であるプロセス。
【請求項１４】
請求項１に記載のプロセスにおいて、前記ＳＢＲは中温嫌気性消化連続回分式反応槽であるプロセス。
【請求項１５】
特定危険部位のプリオンタンパク質を分解する連続回分式反応槽（ＳＢＲ）の有効性を測定するプロセスであって、
（ａ）馴養嫌気性汚泥の層を含む連続回分式反応槽（ＳＢＲ）に特定危険部位（ＳＲＭ）を供給するステップと、
（ｂ）モデルタンパク質を前記ＳＢＲに添加するステップと、
（ｃ）前記特定危険部位およびモデルタンパク質を５℃〜２５℃の温度で前記汚泥と反応させるステップと
を含むプロセスであって、前記モデルタンパク質の分解は、前記ＳＲＭ内のプリオンタンパク質を分解するＳＢＲの有効性を示すプロセス。
【請求項１６】
請求項１５に記載のプロセスにおいて、前記モデルタンパク質は、過塩素酸可溶性タンパク質、コラーゲン、エラスチンおよびケラチンの内の少なくとも一つであるプロセス。
【請求項１７】
請求項１６に記載のプロセスにおいて、前記ケラチンはβケラチンまたはαケラチンであるプロセス。
【請求項１８】
請求項１６に記載のプロセスにおいて、前記ケラチンは羽毛または蹄由来のケラチンであるプロセス。
【請求項１９】
請求項１８に記載のプロセスにおいて、前記羽毛ケラチンは鶏羽毛由来であるプロセス。
【請求項２０】
請求項１８に記載のプロセスにおいて、前記蹄ケラチンは牛蹄由来であるプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、本発明における最初の出願である。
【０００２】
本発明は、特定危険部位のプリオンを除去するための連続回分式反応槽の使用または使用プロセスに関するものである。
【背景技術】
【０００３】
プリオンは核酸および細胞膜を持たないタンパク質であり、標準的な滅菌法にはほとんど影響を受けない。プリオンは、全く新しい機序で例外なく死に至る一群の神経変性疾患をもたらす、前例のない感染性の病原体である（非特許文献１）。プリオンの不活性化は、プリオン感染動物の処分および動物飼料などの動物由来材料の調製の双方に重大な環境問題および健康問題をもたらしている。屠畜場の汚泥および動物の死（屠体）は、病原体すなわち感染性プリオンタンパク質の重要な源である。
【０００４】
プリオンは動物で自然に見られるタンパク質である。細胞型すなわち正常型のプリオンタンパク質は、健康な成熟動物の脳内において構成的に発現するが、発生中は空間的、時間的に高度に調節される（非特許文献１）。プリオンタンパク質には２つのアイソフォームがある。ＰｒＰＣ（正常型プリオンタンパク質）は細胞構造、Ｎ結合型であり、αヘリックスを多く含む球状の可溶性糖タンパク質であり、シグナル伝達タンパク質として働き（非特許文献２）、哺乳類の脳の正常な発達に重要な役割を担うものである。ＰｒＰＣは健常組織および病変組織の双方において生じる。ＰｒＰＳｃ（異常型プリオンタンパク質）は、βシートを多く含む、線維性の、極めて不溶性のタンパク質であり、哺乳類の中枢神経系疾患の原因物質である。βシートを多く含むということは、ＰｒＰＳｃに耐熱性およびプロテアーゼ耐性がもたらされると考えられている。
【０００５】
異常な病的アイソフォーム（ＰｒＰＳｃ）の存在は、病的な状態の典型である。ＰｒＰＣとＰｒＰＳｃは一次構造が同じであり、二次構造に違いが生じてくる。ＰｒＰＣは３つのαヘリックス（約４０％αへリックス）と１つの短い逆平行βシートとを含んでおり、ＰｒＰＳｃは２つのαヘリックス（約３０％αヘリックス）と４つのβシート（４５％βシート）とを含んでいる（非特許文献１）。これによってＰｒＰＳｃの三次構造の構造変化が誘導され、修飾特性となる。どちらのＰｒＰアイソフォームも核酸を持っていない（非特許文献１）。
【０００６】
実験データは、プリオンが自然環境において長時間生き延びることができることを示している。例えば、ブラウン（Brown）氏およびガイジュセク（Gajdusek）氏は、庭の土壌に埋めたプリオンが、土壌中に僅かに深く溶け出し、３年間生き延びて感染力を保つことができたことを示唆した（非特許文献３）。
【０００７】
最近の実験は、動物への一次感染方法が経口摂取であることを示唆している。プリオンは死んだ動物の残骸や尿、唾液、およびその他の体液を通して環境に堆積されると考えられている。その後プリオンは粘土やその他の鉱物と結合して土壌にとどまる。プリオンの滅菌には、分子が正常タンパク質の異常な折り畳みを引き起こすことができなくなる状態までタンパク質を変性させることが含まれる。しかしながらプリオンは一般に、プロテアーゼ、熱、放射線およびホルマリン処理によってその感染力は弱まるものの、これらの処理に対して極めて耐性がある。有効なプリオン汚染除去は、タンパク質の加水分解またはタンパク質三次構造の還元および／または破壊に依存している。例えば、漂白剤、苛性ソーダまたは強酸性洗剤がある。
【０００８】
伝達性変性脳症（TDE: Transmissible Degenerative Encephalopathies）は、哺乳類の脳内にプリオンが蓄積することにより、一群の致命的神経変性疾患を形成するものである。ＴＤＥでは、感染すると、宿主の正常型プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）が感染型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）に修飾され（非特許文献４）、そして感染した組織、特に中枢神経系に沈着物が形成される点において独特である。ＴＤＥは多くの種類の野生動物、家畜および人間に影響を与え、次の３つの方法で存在し、これらはどれもプリオンタンパク質の修飾を伴うものである：遺伝子の突然変異による遺伝的なもの；未だ定義されていないメカニズムによる、プリオンタンパク質の病的形態への自然転換による散発的なもの；外因性の異常な折り畳み構造のプリオンタンパク質への接触による感染。
【０００９】
牛海綿状脳症（BSE: Bovine Spongiform Encephalopathy）は最も有名なプリオン疾患である。国際貿易委員会（ITC: International Trade Commission）は、ＢＳＥによる貿易制限は、２００４年〜２００７年にかけて家畜産業に１１０億ドルの損害をもたらしたと報告した。
【００１０】
このように、動物性肥料の管理作業は多くの場合に環境へ害をもたらすだけでなく、悪臭を放ち、ハエの繁殖を促し、雑草問題や空気、土壌および水の汚染の誘発に加え、人間および動物の健康に対する潜在的な危険性をも表している。
【００１１】
カナダ食品検査庁によると、カナダで発生した特定危険部位（ＳＲＭ）の推定量は年間１７万トンであるということだった。プリオンで汚染された可能性のあるＳＲＭの安全な処分は困難である、というのもこれらのＴＤＥ原因物質は、微生物に通常適用される、物理的または化学的処置による不活性化に対して比較的耐性があるからである（非特許文献５）。さらに、処理の中にはコストが相当かかるものがある。アルコール、アルデヒドおよび蒸気による急速加熱を含む、プリオンを効率的および／または迅速に固定化する、プリオン不活性化の物理的および化学的方法は、不活性化からプリオンを保護し、そのためプリオンの熱安定性が強化される。よってタンパク質構造を固定化するよりも、それを破壊する処理が、プリオンで汚染された可能性のあるＳＲＭの処理を考える際には必要である。さらに、変性剤、洗剤、強アルカリなどの化学薬品を使用する処理は、農場においてユーザに触れる可能性や、農地への処分問題により、ＳＲＭ内のプリオンの不活性化には不適切である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】（プルシナー（Prusiner）氏、１９９８年、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Aca Sci）、第９５巻：１３３６３−１３３８３頁）
【非特許文献２】Mouillet-Richard氏ら、サイエンス、第２８９巻：１９２５−１９２８頁
【非特許文献３】ブラウン(Brown)氏およびガイジュセク（Gajdusek）氏、１９９１年、Ｊ  インフェクト・ディス（J Infect Dis）第１５３巻：１１４５−１１４８頁
【非特許文献４】カルプ（Carp）氏ら、１９８５年、ジェイ・ゲン・ヴァイロル（J Gen Virol）、第６６巻：１３５７−１３６８頁
【非特許文献５】テイラー(Taylor)氏ら、１９９４年、アーク・ヴァイロル(Arch Virol)、第３９巻：３１３−３２６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
よってＳＲＭ内のプリオンを分解する、環境に優しい生物学的処理を開発する必要がある。
【００１４】
従って、低コストで、非常に安定性があり、運転が簡単で、通常の農場作業を妨げない、特定危険部位のプリオンタンパク質を動物から除去するプロセスを提供することは非常に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本開示によれば、特定危険部位のプリオンタンパク質を分解するプロセスを提供する。該プロセスは、馴養嫌気性汚泥の層を含む連続回分式反応槽（ＳＢＲ）に特定危険部位（ＳＲＭ）を供給するステップと、該特定危険部位を汚泥と２５℃以下で反応させてプリオンタンパク質を分解させるステップとを含んでいる。
【００１６】
また、特定危険部位のプリオンタンパク質を分解する連続回分式反応槽（ＳＢＲ）の有効性を測定するプロセスも提供する。該プロセスは、馴養嫌気性汚泥の層を含む連続回分式反応槽（ＳＢＲ）に特定危険部位（ＳＲＭ）を供給するステップと、ＳＢＲにモデルタンパク質を添加するステップと、特定危険部位とモデルタンパク質とを５℃〜２５℃の温度で汚泥と反応させるステップとを含んでおり、該モデルタンパク質の分解は、ＳＲＭ内のプリオンタンパク質を分解させるＳＢＲの有効性を示している。
【００１７】
好適な実施形態において、特定危険部位には動物の屠体も含まれる。
【００１８】
別の実施形態において、嫌気性汚泥は豚糞尿、家畜糞尿および／または屠畜場汚泥由来のものである。
【００１９】
好適な実施形態において、特定危険部位を汚泥と５℃〜２５℃の温度で、好適には２０℃〜２５℃の温度で、より好適には２０℃の温度で反応させる。
【００２０】
別の実施形態において、本明細書に記載する特定危険部位のプリオンタンパク質を分解するプロセスは、ＳＢＲにケラチンを添加するステップも含んでいる。ケラチンは、羽毛ケラチンまたは蹄ケラチン由来のものとすることができ、これらはβケラチンまたはαケラチンに対応する。好適には、羽毛ケラチンは鶏羽毛由来のもので、蹄ケラチンは牛蹄由来のものである。
【００２１】
別の実施形態では、ＳＢＲは嫌気性消化処理の連続回分式反応槽または中温嫌気性消化の連続回分式反応槽である。
【００２２】
別の実施形態では、本明細書に記載するモデルタンパク質は、過塩素酸可溶性タンパク質、コラーゲン、エラスチンおよびケラチンの内の少なくとも一つとすることができる。
【００２３】
「特定危険部位」とは、反芻動物の細胞組織のような、プリオンの濃縮物を含有する可能性のある任意の部位を意味する。このような部位には、脳、頭蓋骨、眼、三叉神経節、脊髄、脊柱、後根神経節、扁桃腺および例えば小腸の回腸遠位部が含まれる。
【００２４】
添付の図面を参照して、以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実験室規模の連続回分式反応槽の概略図である。
【図２Ａ】羽毛ケラチンを供給した反応槽のバッグ内における羽毛ケラチンの減少を示すグラフである。
【図２Ｂ】羽毛ケラチンを供給した反応槽のバッグ内における羽毛ケラチンの減少を示すグラフである。
【図３Ａ】反応槽内で測定したガス生成を示すものであり、より具体的には、羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽３４、３５）および含まない反応槽（反応槽１３、１４）における累積ガス生成を示すものである。
【図３Ｂ】反応槽内で測定したガス生成を示したものであり、より具体的には、羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽３４、３５）および含まない反応槽（反応槽１３、１４）における一日あたりのガス生成を示すものである。
【図４Ａ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽３４、３５）および含まない反応槽（反応槽１３、１４）で測定した累積メタン生成を示すものである。
【図４Ｂ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽３４、３５）および含まない反応槽（反応槽１３、１４）で測定した酢酸濃度を示すものである。
【図４Ｃ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽３４、３５）および含まない反応槽（反応槽１３、１４）で測定したプロピオン酸濃度を示すものである。
【図４Ｄ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽３４、３５）および含まない反応槽（反応槽１３、１４）で測定したプロピオン酸プロファイルを示すものである。
【図５Ａ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽３４、３５）および含まない反応槽（反応槽１３、１４）で測定したイソ酪酸の濃度を示すものである。
【図５Ｂ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽３４、３５）および含まない反応槽（反応槽１３、１４）で測定した可溶性化学的酸素要求量（ＳＣＯＤ）を示すものである。
【図６Ａ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽３４、３５）および含まない反応槽（反応槽１３、１４）で測定したｐＨプロファイルを示すものである。
【図６Ｂ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽３４、３５）および含まない反応槽（反応槽１３、１４）で測定したアルカリ度プロファイルを示すものである。
【図７Ａ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽３４、３５）および含まない反応槽（反応槽１３、１４）で測定した、蒸発残留物（ＴＳ）を示すものである。
【図７Ｂ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽３４、３５）および含まない反応槽（反応槽１３、１４）で測定した、強熱減量（ＶＳ）を示すものである。
【図７Ｃ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽３４、３５）および含まない反応槽（反応槽１３、１４）で測定した、有機性浮遊物質（ＶＳＳ）プロファイルを示すものである。
【図８Ａ】管理反応槽１３および羽毛ケラチンを含む反応槽３４の混合液に存在するケラチン加水分解物（ＫＨＯ）の量を示すものである。
【図８Ｂ】羽毛ケラチンの分解とＫＨＯ数との間の測定相関関係を示すものである。
【図９Ａ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽１５、１６）および含まない反応槽（反応槽１３Ａ、１３Ｂ）で測定した、累積ガス生成を示すものである。
【図９Ｂ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽１５、１６）および含まない反応槽（反応槽１３Ａ、１３Ｂ）で測定した、一日当たりのガス生成を示すものである。
【図１０Ａ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽１５、１６）および含まない反応槽（反応槽１３Ａ、１３Ｂ）で測定した、累積メタン生成を示すものである。
【図１０Ｂ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽１５、１６）および含まない反応槽（反応槽１３Ａ、１３Ｂ）で測定した、酢酸濃度を示すものである。
【図１０Ｃ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽１５、１６）および含まない反応槽（反応槽１３Ａ、１３Ｂ）で測定した、プロピオン酸濃度を示すものである。
【図１０Ｄ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽１５、１６）および含まない反応槽（反応槽１３Ａ、１３Ｂ）で測定した、イソ酪酸濃度を示すものである。
【図１１】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽１５、１６）および含まない反応槽（反応槽１３Ａ、１３Ｂ）で測定した、可溶性化学的酸素要求量（ＳＣＯＤ）を示すものである。
【図１２Ａ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽１５、１６）および含まない反応槽（反応槽１３Ａ、１３Ｂ）で測定した、ｐＨプロファイルを示すものである。
【図１２Ｂ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽１５、１６）および含まない反応槽（反応槽１３Ａ、１３Ｂ）で測定した、アルカリ度プロファイルを示すものである。
【図１３Ａ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽１５、１６）および含まない反応槽（反応槽１３Ａ、１３Ｂ）で測定した、蒸発残留物（ＴＳ）を示すものである。
【図１３Ｂ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽１５、１６）および含まない反応槽（反応槽１３Ａ、１３Ｂ）で測定した、強熱減量（ＶＳ）を示すものである。
【図１３Ｃ】羽毛ケラチンを含む反応槽（反応槽１５、１６）および含まない反応槽（反応槽１３Ａ、１３Ｂ）で測定した、揮発性浮遊物質（ＶＳＳ）を示すものである。
【図１４】ブタ糞尿を植え付けたＰＡＤ内の羽毛ケラチンの微生物分解を示すものである（実験２）。
【図１５】ブタ糞尿を植え付けたＰＡＤ内の蹄ケラチンの微生物分解を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
特定危険部位（ＳＲＭ）のプリオンを除去し、動物相、土壌、地下水および地上水の生物学的汚染を低減するための、低温嫌気性消化連続回分式反応槽（ＰＡＤＳＢＲ）および中温嫌気性消化連続回分式反応槽（ＭＡＤＳＢＲ）技術の利用を提供する。
【００２７】
現在、焼却はヨーロッパにおけるＳＲＭ処理の主要な方法である。実験結果によると、ＳＲＭ内のプリオンは焼却によって生き残る可能性は低いということである（テイラー氏ら、１９９６年、ニューロパソ・アプル・ニューロ（Neuropath Appl Neuro）、第２２巻：２５６−２５８頁）。しかしながらこの処理には費用がかかり、ＳＲＭから派生する任意の価値が排除される。さらに焼却は、プリオン汚染されたＳＲＭの輸送に関連する追加料金および受け入れ難い汚染リスクを伴うため、牛群の地理的分散により、多くの地域において実用的な方法ではない。
【００２８】
プリオンの乾熱に対する極めて優れた耐性は、凍結乾燥試料、すなわちガラスあるいはスチールの表面で乾燥させた試料において見られる。初期の実験において、１３４℃の温度で１時間行う重力置換式オートクレーブによるプリオン除去が示されている。しかしながら多孔質負荷オートクレーブで行った実験によると、矛盾する結果が示された。データによれば、プリオンの熱安定性は、オートクレーブの温度が上昇すると（１３４℃から１３８℃へ）高まったということであった（テイラー氏、１９９９年、ヴェト・マイクロバイオル（Vet Microbiol）、第６７巻、１３−１６頁）。これは、温度の上昇や、プリオンで汚染されたＳＲＭの多孔質負荷オートクレーブへの露出時間の増大があると、信頼ある除染として有効でないことを示している。
【００２９】
イオン化、紫外線照射およびマイクロ波照射は、プリオンにほとんど効果がない（テイラー氏およびディプローズ（Diprose）氏、１９９６年、ニューロパソ・アプル・ニューロ（Neuropath Appl Neuro）第２２巻、２５６−２５８頁）。一般的には、マイクロ波の微生物に対する不活性化効果は、発生した熱によるものであると認められている。
【００３０】
強次亜塩素酸ナトリウム溶液または水酸化ナトリウムの熱溶液は、プリオンを完全に不活性化する唯一の方法であると考えられているが、濃縮ギ酸は組織学的な固定性組織の感染レベルを大幅に下げる。プリオンはオートクレーブまたは水酸化ナトリウム溶液にさらすことによって完全に不活性化されるわけではなく、これら２つの処理を組み合わせることによって、不活性化が達成されるものである。しかしながらＳＲＭに添加される化学物質はＳＲＭの肥料価値に悪影響を与える可能性があるため、プリオンを不活性化する化学処理は、牛屠畜場の汚泥または屠体の農場における大規模な処分戦略にとっては実用的でない。
【００３１】
濃縮ギ酸はタンパク質を可溶化する。照射の場合と同様に、エチレンオキシド、グルタルアルデヒド、ホルマリン、β‐プロピオラクトンまたはアセチルエチレンイミンにさらした後、プリオンにはほとんど効果がない。
【００３２】
プリオンにいくらかの効果がある唯一の洗剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であるが、報告によると、ＳＤＳは汚染流体のみに使用しなければならないということである（テイラー氏ら、１９９９年、ヴェト・マイクロバイオル（Vet Microbiol）、第６７巻：１３−１６頁）。従って、ＳＲＭをＳＤＳまたはその他の洗剤で処理することは実用的ではないように思える。
【００３３】
エタノール、エーテル、アセトン、５％クロロホルム、４％フェノール、一般用フェノール系消毒剤を含む有機溶剤およびヘキサン、ヘプタン、ペルクロロエチレンまたは石油を用いる工業用の溶媒抽出プロセスは、プリオンの感染力を低減させるには効果が弱い。
【００３４】
３％過酸化水素、二酸化塩素、または過酢酸にさらしたスクレイピー病原体は、全く不活性化されなかったか、または僅かに不活性化されただけだった。
【００３５】
これらの既知の処理は全て相当なコストがかかり、不活性化からプリオンを保護することがあるので、プリオンの熱安定性を高め、タンパク質構造を固定するのではなく破壊するため、農場でユーザにさらされる可能性があり、農地への処分の問題もあることから、ＳＲＭ内のプリオンの不活性化には適切でない。
【００３６】
従って、ＳＲＭ内のプリオンを分解する環境に優しい生物学的処理は、本明細書に記載されるように、代替手段を表している。
【００３７】
有機物の嫌気性消化は、有機廃棄物処理およびエネルギー生成に使用されるプロセスである。嫌気性生物反応槽において、有機物は種々の微生物グループの協調作用によって廃水から除去される。有機物の無機化に関与する微生物種の活動は、生物反応槽において有機物の効率的な分解を得るには極めて重要である。嫌気性消化中、有機物は、酢酸、短鎖揮発性脂肪酸（プロピオン酸塩、酪酸、イソ酪酸など）および二酸化水素／二酸化炭素を介して、加水分解性／発酵性酸生成菌、酸酸化細菌およびメタン生成アーキアからなる複合微生物の活動によってメタンに変換される。分解プロセス全体において、異なる機能を持つ微生物の４つの大きなグループが確認されている。第１グループは加水分解微生物および発酵微生物であり、これらは廃棄物にみられる重合体および単量体を最初に攻撃して主に酢酸塩と水素、そしてプロピオン酸塩を生成するが、プロピオン酸、酪酸および多少のアルコールなどの揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）もそれぞれ異なる量で生成する；第２グループは水素生成酢酸生成菌であり、これは、プロピオン酸と酪酸とを酢酸と水素に変換する；メタン生成アーキアの２つのグループ（３および４）は、それぞれ酢酸または水素からメタンを生成する。
【００３８】
牛屠畜場の汚泥または屠体は、熱および電気エネルギーに加工処理可能な高品質のバイオガスに変換することのできる、易生分解性の有機物からなる基質である。屠畜場の廃棄物は嫌気性処理に適しており、多くの固形廃棄物の除去が達成される。重金属中の排水濃度（カドミウム、コバルト、ニッケル、銅、クロム）は検出可能限界以下である。カルシウム、マグネシウム、硫黄およびイオンなどの栄養素は、廃水の生物学的処理に適した濃度である。屠畜場の排水は一般に凝固、凝集されて、色および濁度に関与するコロイド物質および浮遊固体が除去される（Al-Mutairi氏、２００６年、生態毒性および環境安全（Ecotoxicology and Environmental Safety）、第６５巻：７４−８３頁）。石灰、ミョウバン、アルミン酸ナトリウム、塩化第二鉄、および硫化第一鉄などのフロック形成物は、浮遊固体の除去に使用される。
【００３９】
生成される汚泥は、血液、第一胃の内容物、胃の内容物、未消化の食物、尿、遊離した肉、可溶性タンパク質、脂肪、糞便物質などから主に構成されている。汚泥内のこれらの要素の割合は屠畜場によって異なる。Al-Mutairi氏（２００６年、生態毒性および環境安全（Ecotoxicology and Environmental Safety）、第６５巻：７４−８３頁）は、屠畜場排水から固体を凝固、凝集するために使用するミョウバンおよび重合体が、次の生態処理プロセスの微生物叢にとって有毒となる場合があると指摘している。沈殿タンク内の凝固剤の濃度が１００ｍｇ／ｌを超えると、排水は微生物にとって有毒となる。沈殿した汚泥は、沈殿タンクの上清よりも汚染されており、毒性がある。
【００４０】
混合消化のために外部の原料を畜産農家に持ち込む場合、衛生面が重要である。家禽および豚肉処理場からの排水は、生物的汚染物質で汚染されている可能性がある。土地還元前の病原体除去は、家畜生産システムに汚染サイクルの再導入を防止するために重要である。
【００４１】
嫌気性生物処理におけるプリオンの運命はこれまで一度しか報告されたことがない（Kirchmayr氏ら、２００６年、Wat Sci Technol、第５３巻、９１−９８頁）。中温条件において、プリオン力価の低減はみられなかった（Kirchmayr氏ら、２００６年、Wat Sci Technol、第５３巻、９１−９８頁）。
【００４２】
図１は、本開示において使用する実験室規模の連続回分式反応槽（ＳＢＲ）の概略図であり、カナダ特許第２，１３８，０９１に記載されているように、反応槽の構成部品には参照番号を付している。それぞれの参照番号は下記の通りである。
【００４３】
図１に示すＳＢＲにおいて、糞尿を供給システム１４に積載し、供給ライン７を通して生物反応槽１に供給する。糞尿は、嫌気性汚泥２を予め植菌した生物反応槽１の底を通って供給される。生物反応槽１内のバイオガスは、バイオガス再循環ポンプ６を使って、バイオガス再循環ライン５を通してガス空間４に再循環させることができる。
【００４４】
本明細書では、動物の脳の汚染を除去し、プリオンを取り除き、土壌、地下水および地上水の生物汚染リスクを低減させるためのＳＢＲの使用について記載する。
【００４５】
プリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）の感染性アイソフォームで行う実験には、バイオセーフティレベル３の実験室が必要である。構造（アミノ酸の数、グリシン残基の高い割合、高βシート構造の高い含有率、高凝集）および特性（プロテアーゼ耐性、耐熱性、弱溶解性）においてＰｒＰＳｃと類似しているタンパク質を、豚または家畜の糞尿内のプリオンタンパク質に対するＳＢＲの有効性を確認するために選択した（アライ（Arai）氏ら、１９９６年、ジェイ・アプル・ポリム・サイ（J Appl Polym Sci）、第６０巻：１６９−１７９頁；コーギー（Caughey）氏およびレイモンド（Raymond）氏、１９９１年、ジェイ・バイオル・ケム（J Biol Chem）、第２６６巻：１８２１７−１８２２３ページ；パン（Pan）氏ら、１９９３年、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci USA）、第９０巻：１０９６２−１０９６６頁； プルシナー（Prusiner）氏ら、１９８８年、セル（Cell）、第９３巻：３３７−３４８頁；ヴァイスマン（Weissmann）氏、１９９９年、ジェイ・バイオル・ケム(J Biol Chem)、第２７４巻、３−６ページ）。これらの生物反応槽におけるプリオンの運命の再現、実験のために嫌気性消化連続回分式反応槽（ＡＤ−ＳＲＢ）に添加する、このような適切なモデルタンパク質の非制限的な例を下記に開示する。
【００４６】
過塩素酸可溶性タンパク質（ＰＳＰ）（１３７アミノ酸残基を持つ１４．１４９ｋＤａタンパク質）を、ラットの腎臓、脳および肺ならびにラット、豚および鶏の肝臓から分離した（ホイ（Hui）氏ら、２００４年、バイオケム・バイオフィーズ・レス・コミュヌ（Biochem Biophys Res Commun）、第３２１巻：４５−５０頁）。そのタンパク質の二次構造（２αヘリックスおよび６βシート）は、ＰｒＰＳｃ（２αヘリックスおよび４βシート）の二次構造と類似している。ＰＳＰはＰｒＰＳｃの様に熱安定性があり、プロテイナーゼＫに対して耐性がある。これは、ＰＳＰがＡＤ−ＳＢＲによるＰｒＰＳｃの運命の実験に適切なモデルタンパク質であることを示唆している。
【００４７】
コラーゲンは哺乳類において最も豊富なタンパク質であり、全タンパク質の２５％に相当する。コラーゲンは、肌、腱、軟骨、骨および歯の主要な、線維性、不溶性の細胞外タンパク質であり、細胞を結び付ける働きをする。
【００４８】
エラスチンは細胞外マトリックスの線維性架橋タンパク質であり、多くの組織に弾性力を提供し、これによって細胞は何度も伸び、緊張が解けると元の状態に戻ることができる。エラスチンは、血管壁および靭帯、特に草食動物の首に多く見られる。
【００４９】
ケラチンは線維性タンパク質の最も多様性に富んだ種類の中の一つを形成している。種々のタイプのケラチンがあり、各々はタンパク質の複合混合物から成るものである。ケラチンは肌から成長する構造の主要な構成成分である。αケラチンは、哺乳類の髪の毛（羊毛を含む）、角、爪、鉤爪および蹄に見られる。蹄は有蹄動物のつま先であり、厚い角膜（ケラチン）で覆われている。蹄は硬い、または弾性のある足底から成り、厚い爪によって形成された硬い壁がつま先を巻いている。
【００５０】
αケラチンは最も一般的な形態であり、大部分がヘリックス立体配座のポリペプチド鎖から成る。より硬いβケラチンは、爬虫類の爪、鱗および殻、ならびに鳥類の爪、鱗、嘴および羽毛に存在する代替形態である（Zubay氏、１９８８年、バイオケミストリ（Biochemistry）、アメリカ合衆国ニューヨーク州ニューヨーク）：マクミラン出版社（Macmillan Publishing Company））。βケラチンは、積み重ねられ、折り畳まれたβシートから成り、ＰｒＰＳｃ内により多く含まれている。種々の鳥類のβケラチンのアミノ酸配列は、コラーゲンとエラスチンの様に類似性が高く、グリシンを高比率で含んでいる（ハラップ（Harrap）氏およびウッズ（Woods）氏、１９６４年、バイオケム・ジェイ（Biochem J）、第９２巻：１９−２６頁）。グリシンに富む反復は、βケラチンのいくつかに見られるものであり、全てには見られない。βケラチンはＰｒＰタンパク質（２５６〜２６４アミノ酸）よりも短い（９８〜１５５アミノ酸）。
【００５１】
αケラチンは、並んで配置されて螺旋状の繊維を形成する、極端に長いαヘリックスポリペプチド鎖で構成されている。αヘリックスのパッキングは、個々のヘリックスを相互に包み込むことにより最適化および強化される。αケラチンの多くの形態は、隣接するポリペプチド鎖のシステイン残基の間に形成された（共有）ジスルフィド結合を含んでおり、これによって永久の耐熱性架橋が与えられる。ジスルフィド架橋の量によってケラチンの強度および剛性は調節される。羽毛ケラチンの約４分の１から３分の１はβ配座を有しており、このほとんどは分子における中心の疎水性部分に集中している。残りのタンパク質は不規則なマトリックスを形成している。近縁のβケラチンは、羽毛の主な構成物質であり、羽軸の約９０％を構成している。
【００５２】
準工業規模の嫌気性配列ベンチ生物反応槽（ＡＤ−ＳＢＲ）から回収した屠畜場の接種材料をここでは使用した。このＳＢＲ反応槽を２０℃で運転し、一日に約１０００頭の畜牛を処理する商業的な畜牛屠畜場（Colbex, Levinoff,ケベック州）からの新鮮な汚泥を毎週供給した。屠畜場の汚泥を毎週約５０ｋｇ回収し、後の分析のために代表副試料（１Ｌ）を２０℃で保管し、残りを準工業ＳＢＲ反応槽へ供給するために使用した。
【００５３】
この場合も、使用した豚糞尿接種材料を準工業規模の嫌気性配列ベンチ生物反応槽（ＡＤ−ＳＢＲ）から回収した。同様に、これを２０℃に保ち、一年に約４０００頭の豚を処理する商業的な養豚場（1944 ch. Tremblay. Ste-Edwidge, ケベック州）からの新鮮な汚泥を毎週供給した。豚糞尿を毎週約５０ｋｇ回収し、後の分析のために代表副試料（１Ｌ）を２０℃で保管し、残りを準工業ＳＢＲ反応槽へ供給するために使用した。
【００５４】
出発材料としての馴養嫌気性汚泥の使用も記載する。生物反応槽の供給成分に大きな変化があると、細菌性汚泥は新しい基質に適合するための時間を必要とする。供給物の中の新しい基質は汚泥微生物叢を抑制することがある。通常、細菌の性能は時間と共に増大する。嫌気性汚泥は、汚泥が最大の特定メタン生成（供給１グラムあたり１Ｌのメタン）に到達し、この最大性能が時間の経過と共に維持される場合に順応する。
【００５５】
北米では、羽毛は最大の固形廃棄物の内の一つである。羽毛は主にケラチンからできている。ケラチンは不溶性であり、タンパク質分解に対して高い機械的安定性および耐性を示す。羽毛ケラチンは、主に積み重ねられ、折り畳まれたβシートから成るβケラチンであり、よって羽毛ケラチンは、ジスルフィド結合、水素結合および疎水性相互作用による高度な架橋のため、トリプシンおよびペプシンなどの一般的な消化酵素によって不完全に消化される（Papadopoulos氏、１９８６年、アニマル・フィード・サイエンス・アンド・テクノロジー（Animal Feed Science and Technology）、第１４巻：２７９−２９０頁）。同様の構造は感染性タンパク質（ＰｒＰＳｃ）に見られる。従って、羽毛ケラチンは、多数のアミノ酸、高い割合のグリシン残基、高いβシート構造の含有率、高程度の凝集、およびプリオンタンパク質に類似した特性（プロテアーゼ耐性、耐熱性、弱溶解性）を有することから、鶏の羽毛をモデルタンパク質として使用する。
【００５６】
同様に、高い硬ケラチンの含量率、不溶性、ならびにジスルフィド結合、水素結合および疎水性相互作用による高度な架橋による、トリプシン、ペプシンおよびパパインなどの一般的な消化酵素による分解に対する耐性のため、蹄もＰｒＰＳｃのモデルタンパク質として使用する。
【００５７】
ＡＤ−ＳＢＲ内における羽毛ケラチンの分解を、実例を用いて本明細書で説明する（例示的な条件に関しては表１を参照のこと）。バッグ内での羽毛ケラチンの減少が、図２Ａおよび図２Ｂに示すように、反応槽内で見られた。各反応槽の羽毛ケラチンは、ＳＢＲ実験開始時点における３１ｇからほぼ直線的に減少し、１２０日後には５ｇになった。反対に、抗生物質を含む水を供給した反応槽のバッグ内では、羽毛ケラチンの減少は全く見られなかったか、ごく僅かな減少が見られただけだった。羽毛ケラチンの添加は、反応槽内のガス生成に効果を与えた。図３Ａに示す様に、羽毛ケラチンを含むまたは含まない全ての反応槽内におけるガス生成は、最初の１５日間で飛躍的に増加した。１５日後、管理反応槽内のガス生成は、実験が終わるまで徐々に増えていった。一定の期間、ガス生成は見られなかった。しばらくたって、管理反応槽よりも速い速度で反応槽内においてガス生成が再び始まった。平均すると、羽毛ケラチンを含む反応槽のガス生成の方が、羽毛ケラチンを含まない管理反応槽のガス生成よりも１．２倍高かった。羽毛ケラチンの添加は、ガス生成に刺激を与えた。
【００５８】
羽毛ケラチンのガス生成への効果は、一日当たりのガス生成率においても見られた。図３Ｂに示す様に、全ての反応槽内におけるガス生成率は、最初の１３日間において、一日あたり３〜２３Ｌの間で変動した。その後管理反応槽内のガス生成率は徐々に減少し、実験の最終日には一日あたり１Ｌ以下となった。しかしながら、羽毛ケラチンを含む反応槽内のガス生成率は、１３日経過後も一日あたり０〜７．７Ｌの間で変動し、実験の最終日まで同じ傾向が続いた。反応槽内で測定した平均率は、管理反応槽内で測定したものより１．６倍高かった。
【００５９】
羽毛ケラチンの添加のガス生成への効果は、累積メタン生成プロファイル（図４Ａ）でも見ることができる。全反応槽におけるメタン生成は、最初の１５〜２０日間で急激に増えた。その後、管理反応槽におけるメタン生成は、実験が終了するまで徐々に減少した。平均すると、羽毛ケラチンを含む反応槽は、管理反応槽の１．４倍のケラチンを生成した。全ての反応槽の混合液内の酢酸、プロピオン酸およびイソ酪酸を含む揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）の濃度もＳＢＲの運転中に観察した。これらのＶＦＡのプロファイルを図４Ｂ，図４Ｃおよび図４Ｄにそれぞれ示す。最初の１０〜１５日間、３つの有機酸の濃度は著しく高かった。これは、初期汚泥内の発酵性有機基質の存在によるものであっただろう。それらの消費後、各ＶＦＡの濃度は一定の範囲内で変動した。酢酸は２３〜９７ｍｇ／Ｌの間で変動した。最初の６０日間、羽毛ケラチンを含む反応槽と管理反応槽の間で、酢酸濃度の明らかな差は見られなかった。羽毛ケラチンを含む反応槽内の平均酢酸濃度は９３ｍｇ／Ｌおよび９７ｍｇ／Ｌで、それぞれ管理反応槽内の７５ｍｇ／Ｌおよび６８ｍｇ／Ｌよりも高かった。これは、羽毛ケラチンの添加が酢酸の生成を刺激したことを示唆している。
【００６０】
プロピオン酸の濃度も羽毛ケラチンの添加による影響を受けた。図４Ｃに示す様に、プロピオン酸の濃度は初期汚泥において高かった。これは最初の１５日間で徐々に減少した。その後、０〜２６ｍｇ／Ｌの間で変動した（図４Ｄ参照）。酢酸プロファイルにおいて見られる様に、最初の６２日間では、羽毛ケラチンを含む反応槽と管理反応槽との間で、プロピオン酸の生成に大きな違いは見られなかった。７２日後、羽毛ケラチンを含む反応槽で測定したプロピオン酸の濃度は、管理反応槽内の濃度よりもほとんど高かった。羽毛ケラチンの添加はイソ酪酸の濃度に大した影響を与えなかった（図５Ａ参照）。９０日後、羽毛ケラチンを含む反応槽内で測定したイソ酪酸濃度のほとんどの値は、管理反応槽内のものよりも高かった。羽毛ケラチンを含む反応槽内の平均濃度は、管理反応槽内の平均濃度の１．９倍であり、羽毛ケラチンの添加が肯定的な影響を与えたことを示している。
【００６１】
羽毛ケラチンは可溶性ＣＯＤの濃度にも影響を与える。図５Ｂに示す様に、最初の６０日間において、全ての反応槽のＳＣＯＤは同じ傾向で徐々に減少した。その後、管理反応槽内のＳＣＯＤは実験の終了まで減少し続けた。しかしながら羽毛ケラチンを含む反応槽内のＳＣＯＤは、実験の終了まで徐々に増加した。羽毛ケラチンを含む反応槽内の平均ＳＣＯＤ濃度は８７５７ｍｇ／Ｌで、これは管理反応槽で測定されたもの（８１７１ｍｇ／Ｌ）の１．１倍だった。
【００６２】
羽毛ケラチンは、ＳＢＲ反応槽内における混合液のｐＨにも影響を与えた。図６Ａに示す様に、全ての反応槽のｐＨは最初の５０日間で８．０〜８．１から７．８へと減少した。その後、羽毛ケラチンを含む反応槽内で測定した全てのｐＨ値は、管理反応槽内で測定したものよりも０．０５〜０．１０高かった。羽毛ケラチンはアルカリ度に大きく影響した。図６Ｂに示す様に、最初の６０日間で、全ての反応槽のアルカリ度は、ほとんどが２５０００〜２７０００ｍｇ／Ｌの間で変動した。その後、管理反応槽で測定したアルカリ度は、実験が終了するまで同じ傾向を保った。しかしながら、羽毛ケラチンを含む反応槽のアルカリ度は、２８８３９および２８１７１ｍｇ／Ｌまで徐々に増加した。
【００６３】
さらに羽毛ケラチンはＴＳプロファイルにも影響を与えた。図７Ａに示す様に、全ての管理反応槽内のＴＳは最初の８０日間で徐々に減少し、その後一定の範囲内で変動した。一般に、羽毛ケラチンを含む反応槽のＴＳは、管理反応槽の場合よりも速い速度で減少した。羽毛ケラチンを含む反応槽で測定したＴＳ値は、管理反応槽で測定したものよりもほとんどが低かった。平均すると、管理反応槽のＴＳ値は、羽毛ケラチンを含む反応槽よりも１．１倍高かった。ＴＳで見られたものと同様のプロファイルは、ＶＳおよびＶＳＳプロファイルにも見られる。全ての反応槽内のＶＳおよびＶＳＳは、最初の６０〜８０日間で徐々に減少し、その後一定の範囲内で変動した。大きな違いは、羽毛ケラチンを含む反応槽のＶＳおよびＶＳＳは、管理反応槽内のものよりも低いレベルまで減少したということである。羽毛ケラチンを含む反応槽内で測定したＶＳおよびＶＳＳ値は、羽毛ケラチンを含まない反応槽で測定したものよりもほとんどが低かった。
【００６４】
バッグ内の羽毛ケラチンは、豚糞尿を供給したＡＤ−ＳＢＲ内において減少した。観察された減少は、ほとんどが微生物の活動によるものだった、すなわち、ケラチン加水分解微生物がバッグ内でケラチナーゼを排泄し、羽毛ケラチンを加水分解した。豚糞尿を供給したＡＤ−ＳＢＲに添加したケラチンは、ＡＤ−ＳＢＲの性能に否定的な影響を与えなかった。ケラチンはバイオガスの生成を向上させ、ＡＤ−ＳＢＲのバイオマス生成を減少させた。
【００６５】
ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）蛍光外酵素染色法を使って、ケラチン加水分解物（ＫＨＯ）の蛍光標識および可視化を行った。ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬカゼインを先ず、生物反応槽内の羽毛バッグの試料に塗布した。染色を始めて３０分後、棒状の形態型を持つ細菌に蛍光が、弱い蛍光バックグラウンド上に見られた。１８０分間の染色中、その他の形態型は見られなかった。サンプリングおよび顕微鏡検査を１５分毎に行った。しかしながらバックグラウンド蛍光は時間が経つにつれて増えていった。羽毛ケラチンを含む反応槽と含まない反応槽の全ての反応槽からの試料に対して同じ染色を行った。異なるＡＤ−ＳＢＲからの試料（羽毛バッグの流体または混合液）を１００℃で１０分間加熱したところ（ネガティブコントロールとして）、蛍光（バックグラウンド蛍光を含む）は見られず、これは、観察された蛍光が微生物の活動によるものであることを示している。ＡＤ−ＳＢＲ内のＫＨＯを特定して標識化し、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ染色によって染色された可能性のある標識化された加水分解物の消費微生物を標識化しないために、一組の阻害剤（Xia氏ら、２００８年、ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・エコロジー（FEMS Microbiology Ecology）、第６６巻：４６２−４７１頁）を全ての染色培養に添加した。解糖、ＴＣＡサイクルおよび電子伝達鎖を阻害するために、ヨード酢酸、フルオロ酢酸およびアジドをそれぞれ添加した。それぞれの阻害剤は、ＡＤ−ＳＢＲ内で全ての微生物のエネルギー代謝を効果的に阻害する濃度で添加した（Xia氏ら、２００８年、スープラ（supra））。阻害剤の存在下で、前に観察された棒状蛍光は全て継続して見られた。違いは、阻害後にＫＨＯの数が著しく減少したことである。従って、ポジティブに染色された細菌は、これらのＡＤ−ＳＢＲ内で観察された羽毛ケラチンの分解を行うと推定されるＫＨＯである。
【００６６】
ＡＤ−ＳＢＲの混合液内のＫＨＯの相対数は、サンプリング、試料準備、顕微鏡検査、画像取り込みおよび画像分析を含む全てのプロセスを一定に保ちながら測定した。結果を表１に示す。図８Ａに示す様に、管理反応槽内のＫＨＯの数は、０日目の１５０から１１３日目の５６へと徐々に減少した。羽毛ケラチンを含む反応槽内のＫＨＯの数は、最初の２０日間で１４２から１３１へと僅かに減少し、８５日目で１７５へと増加し、１１３日目で１２１へと減少した。
【００６７】
【表１】
2013529969.tif 000003
【００６８】
ＫＨＯ数の増加およびそれに伴うＫＨＯの活動が羽毛バッグ内で増大するに従い、混合液の中に相当数の可溶ケラチンが放出された。その後、混合液内のＫＨＯは成長を始め、繁殖し、３ヶ月目の終わりには大量（１０１）となり、その後減少した。しかし４ヶ月目の終わりにおいては引き続き高い数（８１）のままだった。というのも、バッグをＳＢＲから一旦取り出す際には新しい羽毛バッグが設置されたため、可溶性ケラチンまたはその加水分解物が混合液内に放出され続けたためである。反応槽の羽毛ケラチンバッグ内のＫＨＯの相対数も数えた。ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬカゼイン染色のために羽毛バッグ内でＫＨＯを効果的に集菌するために、８００ｇ、１０００ｇ、１５００ｇ、２０００ｇ、２５００ｇまたは３０００ｇにおける遠心分離後に得られた細菌細胞の数を測定した。得られた細菌をＤＡＰＩで染色し、その数を顕微鏡で測定した。結果を表１に示す。羽毛バッグ内のＫＨＯ数と羽毛ケラチンの分解との間の肯定的な相関関係を観察した（図８Ｂ参照）。バッグ内で見られた羽毛ケラチンの分解は視覚化されたＫＨＯの活動によるものであって、その他の生理科学的な反応ではないことが確認された。最も多いＫＨＯ数（１０１細胞）は３ヶ月目（８５日目）に見られ、これは羽毛ケラチンの最大分解率（表１：反応槽３４の７１％、反応槽３５の７３％）に対応する。ＫＨＯの最大数および最大分解率のどちらも３ヶ月目に達成された。ＫＨＯ数の僅かな減少は１１３日目に見られた。全ての結果により、加水分解率は、豚糞尿が供給されたＡＤ−ＳＢＲ内の羽毛ケラチンの分解を制限するステップであることがわかった。これらの証拠により、羽毛ケラチンの分解は、豚糞尿が供給されたＡＤ−ＳＢＲ内の化学的および物理的活動よりもむしろＫＨＯによって分泌された外酵素によるものであることが確認された。
【００６９】
ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬカゼイン染色は、商業的な養豚場および畜牛屠畜場からの最初の汚泥試料に対しても行った。結果を表２に示す。
【００７０】
【表２】
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【００７１】
ポジティブシグナルは見られなかった。ＡＤ−ＳＢＲ内で観察されたＫＨＯは存在しなかった。ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ酵素染色も、その他のＡＤ−ＳＢＲと同じ条件で、羽毛バッグを蒸留水で培養した嫌気性バケット内に存在する潜在的なＫＨＯを検出するために使用した。バッグ内にも混合液にもＫＨＯは存在しなかった（表２）。
【００７２】
ＡＤ−ＳＢＲ内の羽毛ケラチンの分解は微生物の活動によるものである。羽毛ケラチンを加水分解することのできる微生物（ケラチン加水分解微生物：ＫＨＯ）は、ＳＢＲ反応槽への供給に使用される豚糞尿内に存在する。羽毛ケラチンを含むバッグを豚糞尿を供給した反応槽に設置すると、ＫＨＯは液体と共にバッグに浸透して羽毛粒子に付着する。その後、ＫＨＯは細胞外ケラチナーゼを排泄し、水晶羽毛ケラチンを可溶ケラチン、オリゴペプチドおよびアミノ酸に加水分解する。アミノ酸および／またはオリゴペプチドができると、ＫＨＯは成長し、その数および活動がアミノ酸とオリゴペプチドの蓄積が始まる一定のレベルに達するまで繁殖する。内部のアミノ酸、オリゴペプチドおよび可溶性ケラチンまでも化学勾配によってバッグの外に出され、そこでそれらは、加水分解菌、発酵菌、メタン生成菌および硫酸塩還元菌を含む微生物によって使われる。このプロセスは少なくとも３０〜４０日かかる。従ってこの期間中、羽毛ケラチンを含む反応槽と羽毛ケラチンを含まない管理反応槽との間に、ガス生成、ガス生成率、メタン生成、ＶＦＡ，ｐＨ，アルカリ度、ＴＳ，ＶＳ，ＶＳＳに大きな違いはなかった。
【００７３】
余分なアミノ酸およびオリゴペプチドが得られると、混合液中の微生物はそれらを窒素源として使用して成長する、および／または微生物は活動を増やす。反応槽内の加水分解および発酵活動が向上し、従って、羽毛ケラチンを含む反応槽において、より高いＶＦＡ（主に酢酸）濃度が検出される。高いＶＦＡレベルはメタン細菌の活動をさらに刺激する。メタン細菌は生成されたＶＦＡのほとんどをメタンと二酸化炭素に変換する。その結果、上述の様に、管理反応槽よりも羽毛ケラチンを含む反応槽により多くのガスおよびメタンが生成され、混合液内の炭素源のかなりの部分がガスに移動されるため、低ＴＳ，ＶＳおよびＶＳＳ値となる。羽毛ケラチンを含む反応槽ではより多くの二酸化炭素が生成されるので、より高いアルカリ度レベルが、羽毛ケラチンを含まない管理反応槽よりもこれらの反応槽で検出される。
【００７４】
羽毛ケラチンの添加はガスの生成に影響を与えた。図９Ａに示す様に、羽毛ケラチンを含む反応槽内の累積ガス生成は、最初の４０日間（４０日目に約１００）で急激に増加し、一方で管理反応槽においては、ガス生成は徐々に増加して４０日目で３２Ｌになった。平均すると、羽毛ケラチンを含む反応槽内の累積ガス生成は管理反応槽内で生成されたものの６．７倍だった。
【００７５】
ガス生成に対する羽毛ケラチンの影響は、一日当たりのガス生成率にも見ることができた。図９Ｂに示す様に、全ての反応槽のガス生成率は、最初の６０日間において一日あたり０〜１２Ｌ内で変動した。その後、管理反応槽内のガス生成は徐々に下がり、一日あたり１Ｌ以下となった。しかしながら羽毛ケラチンを含む反応槽内のガス生成率は、最初の６０日後も一日あたり０〜２．５Ｌ内で引き続き変動し、実験が終了するまで同じ傾向が続いた。羽毛ケラチンを含む反応槽内で測定した平均率は、管理反応槽内で観察されたものの３．１倍だった。
【００７６】
羽毛ケラチンの添加のガス生成に対する影響は、累積メタン生成プロファイル（図１０Ａ）においても見られる。羽毛ケラチンを含む反応槽におけるメタン生成は、管理反応槽よりもかなり速い速度で増加した。羽毛ケラチンを含む反応槽における平均累積メタン生成は、管理反応槽における生成の３．４倍だった。図１０Ｂに示す様に、羽毛ケラチンを含む槽と含まない槽の全ての反応槽で測定した酢酸濃度は、実験期間中全体において１８〜７０ｍｇ／Ｌの間で変動した。ただし最初の１５日間は、羽毛ケラチンを含む反応槽においてかなり高い酢酸濃度が検出された。同様に、羽毛ケラチンを含む反応槽と管理反応槽との間に、プロピオン酸濃度（図１０Ｃ）およびイソ酪酸濃度（図１０Ｄ）の大きな差は見られなかった。プロピオン酸の濃度は０〜１９ｍｇ／Ｌの間で変化し、イソ酪酸の濃度は０〜１６ｍｇ／Ｌの間で変化した。従って、添加した羽毛ケラチンはＶＦＡの生成に大きな影響を与えなかった。
【００７７】
羽毛ケラチンの添加は可溶性ＣＯＤに大きな影響を与えなかった。図１１に示す様に、全ての反応槽においてＳＣＯＤは１９１２〜２１８５ｍｇ／Ｌの間で変動する前の、最初の３０日間において同じ傾向で減少した。
【００７８】
同様に、羽毛ケラチンの添加は混合液のｐＨ（図１２Ａ）には大きな影響を与えなかった。しかしながら、羽毛ケラチンの添加は、少なくとも僅かにアルカリ度に影響を与えた。羽毛ケラチンを含む反応槽（図１２Ｂ）で測定されたＣａＣｏ３は、管理反応槽で測定されたものより僅かに高かった。羽毛ケラチンを含む反応槽内のＣａＣｏ３濃度の平均は１５５７８ｍｇ／Ｌで、管理反応槽内で観察された１３６０６ｍｇ／Ｌよりも高かった。
【００７９】
羽毛ケラチンを含む反応槽内のＴＳプロファイルも羽毛ケラチンを含まない管理反応槽内のものとは異なっていた。図１３Ａに示す様に、２つの管理反応槽内のＴＳは、０日目から２０日目にかけて徐々に減少し、その後１．７〜３．１％の間で変動した。しかしながら、羽毛ケラチンを含む反応槽内のＴＳは減少せず、２．８〜７．９％の間で変動した。平均すると、羽毛ケラチンを含む反応槽内のＴＳ値は３．７％で、これは管理反応槽で測定された２．３％の１．６倍だった。観察されたＶＳ（図１３Ｂ）およびＶＳＳ（図１３Ｃ）プロファイルは、ＴＳプロファイルと類似していた。羽毛ケラチンを含む反応槽で測定されたＶＳ値およびＶＳＳ値は、管理反応槽で測定されたものより全て高く、平均すると１．６（ＶＳ）倍および１．７（ＶＳＳ）倍高かった。
【００８０】
豚糞尿を植え付け、羽毛バッグ（羽毛ＰＡＤ）を加えたＰＡＤ内における羽毛ケラチンの分解を、１５０日後に９９％の効果レベルで測定した（表５、図１４参照）。ケラチナーゼは、ケラチンの存在下で誘導することのできる誘導酵素であることが開示された。従って、適切な濃縮プロセスはＰＡＤにおけるケラチン分解の効率を高める。
【００８１】
豚糞尿を植え付け、蹄バッグを加えたＰＡＤにおける牛蹄ケラチン分解も開示された。個々の全てのナイロンバッグにおいて、１１３日後、８６％の蹄ケラチンが分解された（表６、図１５参照）。
【００８２】
従って、少なくとも豚糞尿および屠畜場汚泥の供給されたＡＤ−ＳＢＲにおいて、羽毛ケラチンおよび牛蹄は加水分解、および分解されたことが実証された。羽毛ケラチンの添加はＡＤ−ＳＢＲの運転を向上させ、バイオガス生成を向上させた。羽毛ケラチンおよび／または牛蹄およびプリオンは構造が類似しているため、汚染された屠体内のプリオンは、このようにＡＤ−ＳＢＲ内で処理することができる。最も重要な点は、プリオンの酵素による分解は、動物の肉を餌として使用するための再生を補助することである。
【００８３】
本開示は、その範囲の制限よりもむしろ実施形態の説明のために与えられる下記の例を参照することによって、より簡単に理解することができよう。
【００８４】
実施例１：羽毛の前処理とキャラクタリゼーション
むしり取ったばかりの白い鶏の羽毛を、一週間に９０万羽の鶏を処理する屠畜場（rue Principale, Saint-Anselme, ケベック州）から回収し、できるだけ早急に実験室に移した。これらの鶏の羽毛を清潔な通常の綿バッグに等分（２Ｋｇ）し、洗濯機で洗浄した（デリケート洗い）。続いて羽毛試料を一定の重さになるまで、Ｕｎｉｔｈｅｒｎ（商標）ドライヤー（Construction, CQLTD,イギリス）を使って４５℃で乾かした。これらを切断し、４ｍｍのふるいを通してミルですり潰した。その後羽毛試料を孔サイズが５０μの無窒素ポリエステルの飼料バッグ（アンコム・テクノロジー社（ANKOM Technology）、2052 O'Neil Road Macedon, NY14502,アメリカ合衆国）に等分し（各約３３ｇ）、プラスチックのひも状の包装紙で密封し、同じ条件で再度洗濯機を用いて洗浄し、できるだけ多くの埃を取り除いた。最後に洗浄したバッグを重さが一定になるまで４５℃の温度で再度乾かした。その後羽毛バッグを棒鋼に取り付け、生物反応槽に設置する準備をした。
【００８５】
すり潰した羽毛試料は、下記の方法で、物理的および化学的に特徴付けを行った。全化学酸化要求量（ＴＣＯＤ）、灰含有量および有機物含有量を、標準方法（ＡＰＨＡ、１９９２年: Greenberg, A.E.氏、Clesceri, L.S.氏、Eaton, A.D.氏（編集者）水および廃水の標準検査方法(Standard Method for the Examination of water and wastewater)：米国公衆衛生協会(American Public Health Association)、ワシントンＤＣ）に従って決定した。ケルダール窒素（ＴＫＮ）量およびアンモニア性窒素量を、マクロケルダール法により、Ｔｅｃａｔｏｒ１０３０  Ｋｊｅｌｔｅｃオートアナライザー（テカトール社（Tecator AB）、Hoganas、スウェーデン）を使って決定した。タンパク質濃度は、ＴＫＮとアンモニア‐Ｎとの差に６．２５を掛けて計算した（AOAC、１９８４年：Williams, S氏、Baker, D氏（編集者）、公認分析化学者協会の公定分析法（Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists、バージニア州アーリントン）。脂肪含有量は、Schrooyen氏らによる（２０００年、農芸食品化学誌（Journal of Agricultural and Food Chemistry）、第４８巻：４３２６−４３３４頁）によって決定した。鶏の羽毛試料（３０ｇ）はソックスレー（Soxhlet）抽出器で、石油エーテルを使って１２時間抽出し（沸騰範囲４０〜６０℃）、抽出した脂肪を測定した（Schrooyen氏ら、２０００年、スープラ（supra））。
【００８６】
アミノ酸濃度は、Calder氏らによる同位体希釈法によって決定した（１９９９年、質量分析法速報誌（Rapid Communications in Mass Spectrometry）、第１３巻：２０８０−２０８３頁）。生の羽毛試料を６ｍｏｌ／Ｌのフェノール塩酸５０ｍｌで、１１０℃において２４時間加水分解し、加水分解物を濾過した。その後、２ｇの加水分解物を３ｇの超純水で希釈した。この溶液のうちの１ｇを標識化されたアミノ酸（３Ｃおよび１５Ｎアミノ酸アイソトープ規格、ＣＤＮアイソトープ、Pointe-Claire, カナダケベック州；ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ社（Cambridge Isotope Laboratories Inc.）、アメリカ合衆国マサチューセッツ州アンドーバー）の混合液（２００ｍｇ）と組み合わせ、これを内部標準とした。脱タンパクプラズマおよび加水分解物の試料をｐｏｌｙ−ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム（樹脂１００−２００メッシュＨ，BIO RAD、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を通して溶出し、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−Ｎメチルトリフルオロアセドアミド（ＭＴＢＳＴＦＡ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich）、カナダオンタリオ州）で、１：１の比率で誘導体化した。処理された試料における［２−１５Ｎ］リジンおよびアミノ酸の測定を、ガスクロマトフラフィー質量分析計（GC-MS、型番CG6890-MS5973、ヒューレットパッカード社（Hewlett Packard Co.）、ウィルミントン（Wilmington）、アメリカ合衆国デラウェア州）を用いて行った。
【００８７】
実施例２：ＳＢＲの取り付け
８つの４２Ｌプレキシガラス製ＳＢＲを使用した。図１はこれらの消化槽の概略図である。積載した場合、ＳＢＲは固体、液体およびガス相からなる。個々の部品をＳＢＲの各相上に取り付けて試料をとった。各サイクルの最初の始動汚泥量は３５Ｌだった。全てのＳＢＦを２５℃の温度に保った室内で運転した。豚糞尿および屠畜場汚泥の汚泥負荷はどちらも１．５ｇＣＯＤ／Ｌ−ｄだった。羽毛ケラチンの負荷率は、ＡＤ−ＳＢＲにおけるシリンダの限られたスペースと羽毛の全酸素要求量（ＴＣＯＤ）濃度に応じて決定した。全てのＳＢＲにおける羽毛ケラチン（バッグまたは混合液に添加）の負荷率は同じに保った（０．２１ｇＣＯＤ／Ｌ−ｄ）。ＳＢＲに汚泥を積載するために、１６０Ｌの豚糞尿または屠畜場汚泥を準工業規模の反応槽から取り出し、２００Ｌの容器に移した。汚泥を等分する間、ペイントミキサーを使って固形物を浮遊させ続けた。汚泥の等分には５Ｌの容器を使用した。最後に３５Ｌの汚泥を８つのＳＢＲの各々に移した（その内の４つには豚糞尿を、その他の４つには屠畜場汚泥をそれぞれ供給）。生理化学的分析のためのサンプリングを行う際、試料を取り出す前にバイオガスを５〜１０分循環させて反応槽を混ぜた。
【００８８】
全てのＳＢＲ実験およびその条件を表３に示す。２つのＳＢＲ実験を行った。実験１では、４つのＳＢＲ反応槽を使用し、豚糞尿を供給したＡＤ−ＳＢＲ内の鶏の羽毛の分解を調べた。実験２では、別の４つのＳＢＲ反応槽を使って、屠畜場汚泥を供給したＡＤ−ＳＢＲ内の鶏の羽毛の分解を調べた。鶏の羽毛を２つの方法で加えた。表３に示す様に、実験１では羽毛試料をバッグの中に入れたままにし、実験２では屠畜場汚泥と直接混合した。羽毛バッグは密封されたバケット（各６バッグ）内において、ネガティブコントロールとして２５℃の温度で、蒸留水を使って培養した。
【００８９】
【表３】
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【００９０】
実施例３：生理化学的および微生物学的キャラクタリゼーション
ＡＤ−ＳＢＲに関して測定した全ての生理化学的要因およびそれらのサンプリング頻度を表４に示す。
【００９１】
【表４】
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【００９２】
標準法（ＡＰＨＡ、１９９２年、スープラ（supra））に従い、ｐＨ、アルカリ度、蒸発残留物（ＴＳ）、強熱減量（ＶＳ）および有機性浮遊物質（ＶＳＳ）を決定した。ｐＨ値はｐＨ計を使って測定した。アルカリ度を滴定によってｐＨ４．３８にした。ＴＳ含有量は、１０ｍｌの副試料を１０５℃で２４時間乾かすことによって決定した。乾かした固形物はＶＳ測定のため、５５０℃で３時間焼却した。同様に、遠心分離したスラリーを使用し、５５０℃で３時間焼却することによってＶＳＳを決定した。可溶性化学的酸素要求量（ＳＣＯＤ）は、遠心分離したスラリーの上清を分析することによって決定した。全化学的酸素要求量（ＴＣＯＤ）および可溶性化学的酸素要求量（ＳＣＯＤ）は、密閉還流比色法（ＡＰＨＡ、１９９２年、スープラ（supra））を使って決定した。羽毛バッグを毎月取り出して重量を測定した。羽毛バッグを取り出す際に、同じ重量の新しい羽毛バッグをＳＢＲに設置した。ウェットチップガスメーター（wet tip gas meter）を使って一日当たりのバイオガス生成を観察し、その成分（メタン、二酸化炭素、水素、硫化物および窒素）をHach Carle 400 AGCガスクロマトグラフ（ハック社（Hach）、コロラド州ラブランド（Love-land））を使って毎週分析を行った。カラムと熱伝導検出器を８０℃で運転した。全窒素（ＴＫＮ）およびアンモニア‐Ｎは、マクロケルダール法（ＡＰＨＡ、１９９２年、スープラ（supra））により、Ｔｅｃａｔｏｒ１０３０  Ｋｊｅｌｔｅｃオートアナライザー（テカトール社（Tecator AB）、Hoganas、スウェーデン）を使って決定した。酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、カプロン酸を含む揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）を、高分解能メガボアカラム（megabore column）を備えたオートシステム（商標）ガスクロマトグラフィ（パーキン・エルマー社（Perkin- Elmer Corporation）; アメリカ合衆国コネティカット州０６８５９ノーウォーク（Norwalk））をフレームイオン化検出器に接続して分析した（Masse氏ら、２０００年、バイオリソース・テクノロジー（Bioresource Technology）、第７５巻：２０５−２１１頁；Masse氏ら、２００８年、バイオリソーステクノロジー、第９９巻：７３０７−７３１１頁）。
【００９３】
実施例４：豚糞尿汚泥を植菌した低温嫌気性消化連続回分式反応槽（ＰＡＤ）における鶏羽毛ケラチン（βケラチン）の生分解
むしり取ったばかりの白い鶏の羽毛を屠畜場（rue Principale, Saint-Anselme ケベック州）から回収し、４時間以内に実験室に移した。これらの鶏の羽毛を清潔な綿バッグに等分（各２Ｋｇ）し、水道水を使って洗濯機（フリジデアー（Frigidaire）社、アメリカジョージア州マーチネス（Martinez））で洗浄した（デリケート洗い）。続いて羽毛試料を一定の重さになるまで、Ｕｎｉｔｈｅｒｎ（商標）ドライヤーを使って４５℃で乾かした（約８週間）。これらの試料は４ｍｍのふるいを通してミル（トーマス・ウィリー・ラボラトリー・ミル（Thomas-Wiley Laboratory Mill））ですり潰し、その後羽毛試料を孔サイズが５０μｍの無窒素ポリエステルの飼料バッグ（アンコム・テクノロジー社（ANKOM Technology）、2052 O'Neil Road Macedon, NY14502,アメリカ合衆国）に等分（各約３３ｇ）して分けた。これらのバッグはプラスチックのひも状の包装紙で密封し、再度同じ条件下において洗濯機で洗浄し、できるだけ多くの埃を取り除いた。最後に洗浄した羽毛バッグを重さが一定するまで４５℃で乾かした。必要な時に、１２の乾いた羽毛バッグ（各々３１ｇの粉末状の羽毛を含有）を棒鋼に取り付け、ＰＡＤに挿入した。
【００９４】
この実験では３つの４２Ｌのプレキシガラス製ＰＡＤを使用した。ＰＡＤの内の２つには、豚糞尿に適応する嫌気性汚泥を植菌した。容量の１００％に相当するＰＡＤの接種材料は、カナダ農務・農産食品省の酪農・豚研究開発センター（Agriculture and Agri-Food Canada's Dairy and Swine Research and Development Centre）（カナダケベック州レノックスビレ（Lennoxville））に設置された７ｍ３の準工業嫌気性生物反応槽から直接来たもので、２５℃で２年間豚の糞尿処理が行われたものである。１２の羽毛バッグ（始動負荷４ｇ／ｇ ＶＳ汚泥）をそれらの内の一つに加え、羽毛バッグを加えなかったものをネガティブコントロールとして使用した。３つめのＰＡＤには抗生物質（最終濃度１００Ｍｇ／ｍＬでアンピシリン）を含有する脱イオン水を充填し、１２ケの羽毛バッグを加えて、羽毛バッグからの羽毛の生理化学的損失を決定した。各ＰＡＤの接種材料および脱イオン水の量は３５Ｌだった。全てのＰＡＤは２５℃の温度に保った室内で運転した。実験１において、３つの羽毛バッグを各ＰＡＤから３０日毎に取り出し、脱イオン水で洗浄し、４５℃で４８時間乾かして重さを量った。実験２は実験１が３ヶ月目のプロセスの時に開始し、１２の新しい羽毛バッグを生物反応槽に加え、実験１と同じ実験手順で、実験２の重量の減少も記録した。
【００９５】
【表５】
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【００９６】
豚糞尿を植え付け、羽毛バッグを加えたＰＡＤ（羽毛ＰＡＤ）における羽毛ケラチンの分解を記録した。実験１では、１１３日後、羽毛ケラチンの８６％（実験の開始時は３１±０．３ｇで、終了時は５±１．６ｇ）が分解された。反対に、抗生物質を含む水を含有するＰＡＤにおける羽毛ケラチンの分解は僅かだった（３％以下）（データは省略する）。実験２では、１５０日後、羽毛ケラチンの９９％（実験の開始時は３１±０．１ｇで、終了時は０．１４±０．０８ｇ）が分解された（表５、図１４）。実験２の羽毛分解率は実験１の分解率よりも高く、実験１では、ケラチン分解微生物（ＫＤＯ）が順調に増えたことを示している。この実験でわかった全ての結果は、ケラチナーゼがケラチンの存在下で誘導することのできる誘導酵素であることを実証するものである。従って、適切な増殖プロセスはＰＡＤでケラチンの分解を効率的に行うためには好適である。
【００９７】
実施例５：低温嫌気性消化連続回分式反応槽（ＰＡＤ）における牛の生分解
牛蹄の準備
牛蹄（αケラチン）を、一日に約１０００頭の牛を処理する地方の屠畜場（Colbex, Levinoff,ケベック州）から回収し、４時間以内に実験室に移した。これらの牛の蹄を脱イオン水で洗浄し、一定の重さになるまで、Ｕｎｉｔｈｅｒｎ（商標）ドライヤーを使って４５℃で乾かした（約１週間）。次にこれらの牛蹄をドリルを使って手作業により直径３〜５ｃｍ片に切断し、２ｍｍのふるいを通してミル（トーマス・ウィリー・ラボラトリー・ミル（Thomas-Wiley Laboratory Mill））ですり潰した。得られた試料をブレンダー（バイタミックス（Vita-Mix）５２００、バイタミックス社（Vitamix Corporation））でさらに潰し、孔のサイズが５００μｍのふるいにかけた。その後、２７ｇの均一化された牛蹄を、孔サイズが５０μの無窒素ポリエステルの飼料バッグ（アンコム・テクノロジー社（ANKOM Technology）、2052 O'Neil Road Macedon, NY14502,アメリカ合衆国）に等分し、プラスチックのひも状の包装紙で密封し、洗濯機（フリジデアー（Frigidaire）社、アメリカジョージア州マーチネス（Martinez））においてデリケート洗いで洗浄し、できるだけ多くの埃を取り除いた。洗浄した蹄バッグを一定した重さが得られるまで４５℃で再び乾かした。最後に蹄バッグ（各約２７ｇ）を棒鋼に取り付け、生物反応槽に設置した。
【００９８】
ＰＡＤの取り付け 
この実験では３つの４２Ｌプレキシガラス製ＰＡＤを使用した。２つのＰＡＤに豚糞尿に適応する嫌気性汚泥を植菌した。容量の１００％に相当するＰＡＤの接種材料は、カナダ農務・農産食品省の酪農・豚研究開発センターに設置された７ｍ３の準工業嫌気性生物反応槽から直接来たもので、これは２５℃で２年間豚の糞尿処理が行われたものである。その内の一つに１２の牛蹄バッグを加え、牛蹄バッグを加えなかったその他のものをネガティブコントロールとして使用した。３つめのＰＡＤには抗生物質（最終濃度１００ｐｇ／ｍＬでアンピシリン）を含有する脱イオン水を充填し、１２ケの牛蹄バッグを加えて、蹄バッグからの牛蹄の生理化学的損失を決定した。各ＰＡＤの接種材料の量は３５Ｌだった。全てのＰＡＤを２５℃の温度に保った室内で運転した。３０日毎に３つの蹄バッグを各ＰＡＤから取り出し、脱イオン水で洗浄し、４５℃で４８時間乾かし、重量を測定した。重量の減少を記録した。
【００９９】
豚糞尿を植え付け、牛蹄バッグを加えたＰＡＤ内の牛蹄のケラチン分解を記録した。全ての個々のナイロンバッグにおいて、１１３日後、牛蹄ケラチンの８６％（実験の開始時は２７．６±０．１ｇで、終了時は３．９±０．２ｇ）が分解された（表６、図１５）。これとは対照的に、抗生物質を含む水を含有するＰＡＤにおいては、蹄ケラチンの分解は僅かだった（１０％以下）。
【０１００】
【表６】
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【０１０１】
本発明を特定の実施形態と関連させて説明してきたが、さらなる変更が可能であることを理解されたい。また本願は、一般に本発明の原理に従い、そして本発明が関連する技術範囲における既知かつ慣行の範囲内であり、先に定める基本的特徴に適用され、そして添付の特許請求の範囲に従うような、本開示からの逸脱を含む、本発明のいかなる変形、使用あるいは改作も包含することを意図している。
【符号の説明】
【０１０２】
１    生物反応槽
２    汚泥床域
３    盛土域
４    ガス空間
５    バイオガス再循環ライン
６    バイオガス再循環ポンプ
７    供給ライン
８    排出ポート
９    汚泥サンプリングポート
１０  混合液または浮遊物サンプリングポート
１１  ガス出口
１２  ガスメータ
１３  熱電対
１４  供給システム
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2013529969.tif 000013
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2013529969.tif 000023
【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2013529969.tif 000030
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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