(57)【要約】  本発明は、光線力学治療および診断用途、ならびに生物学的、および工業的用途における、ＮＩＲ感作剤として有用な一般式１によって表わされる新規なポルフィリン誘導体および／またはそれらの薬剤として許容できる誘導体を提供するものである。これらのポルフィリン誘導体は、生物学的発色団が吸光しない領域において吸光（４００〜７００ｎｍ）および発光（６００〜７５０ｎｍ）を有し、したがってＮＩＲ ＰＤＴ剤としての用途のための理想的な候補および生物学における薬剤用途用の蛍光センサーである。これらの染料のヒドロキシル基およびグリコール基のような置換基は、それらを両親媒性にし、これにより水性溶媒中のそれらの溶解性、細胞摂取、および細胞局在を向上させる。これらの染料は、暗所で毒性を示さず、腫瘍細胞に対して非常に選択的であり、そして核を急速に染色する。したがって、これらのポルフィリン誘導体は、光線力学的治療および診断、生物学的および工業的用途におけるＮＩＲ ＰＤＴ蛍光センサーとして非常に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１のポルフィリン誘導体、
【化１】
2013518042.tif 000003
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ、
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝Ｚｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ａｕ、
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｉ、Ｍ＝２Ｈ、
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｉ、Ｍ＝Ｚｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ａｕ、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５＝Ｈ、Ｒ３＝（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎ＝３〜７）、Ｍ＝２Ｈ、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５＝Ｈ、Ｒ３＝（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎ＝３〜７）、Ｍ＝Ｚｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ａｕ。
【請求項２】
請求項１に記載の一般式１のポルフィリン誘導体の製造方法であって、
前記方法が、
ａ．置換ベンズアルデヒドをピロールと１：２５ｍｍｏｌの比率で混合し、続いて不活性雰囲気および光防護下、１５〜２０分間、２５〜３０℃の温度で攪拌する工程と、
ｂ．工程（ａ）で得た前記反応混合物の中へトリフルオロ酢酸を一滴ずつ加え、続いて２０〜３０分間再攪拌する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で得た前記混合物を、溶媒を加えることによってクエンチする工程と、
ｄ．工程（ｃ）で得た前記反応混合物からの前記過剰のトリフルオロ酢酸を、水酸化ナトリウム溶液で中和する工程と、
ｅ．工程（ｄ）で得た前記反応混合物から前記有機層を分離し、続いて水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを通して乾燥させて、無水有機層を得る工程と、
ｆ．工程（ｅ）で得た有機層を減圧下で濃縮して、粘性材料を得る工程と、
ｇ．工程（ｆ）で得た前記粘性材料を、酢酸エチルとヘキサンの混合物（２：８）と共にシリカゲルを通してクロマトグラフを行い、置換フェニルジピロメタンを得る工程と、
ｈ．工程（ｇ）で得た置換フェニルジピロメタンを置換ベンズアルデヒドと共に溶媒中に溶解する工程と、
ｉ．工程（ｈ）で得た前記混合物の中にトリフルオロ酢酸をゆっくりと加え、続いて２５〜３０℃の温度で攪拌する工程と、
ｊ．工程（ｉ）で得た前記混合物の中に２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノン（ＤＤＱ）を加え、続いて２５〜３０℃の温度で、１〜３時間攪拌する工程と、
ｋ．工程（ｊ）で得た前記反応混合をアルミナのパッドの上に注ぎ、溶媒で溶出し、続いて加圧下で前記溶媒を除去して黒色固体を得る工程と、
ｌ．工程（ｋ）で得た前記黒色固体を塩化メチレンと共にシリカゲルを通してクロマトグラフを行い、ポルフィリン誘導体を得る工程と
を含む、一般式１のポルフィリン誘導体の製造方法。
【請求項３】
工程（ｃ）、（ｈ）および（ｋ）で用いられる溶媒が、塩化メチレンおよびクロロホルムからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載のポルフィリン誘導体は、光線力学用途、診断用途、生物学的用途、および工業的用途の近赤外蛍光センサーとして有用である。
【請求項５】
請求項１に記載のポルフィリン誘導体は、人間または動物における癌および他の疾病の検出用の光線力学用途におけるＮＩＲ蛍光プローブとして有用である。
【請求項６】
請求項１に記載のポルフィリン誘導体は、可視光照射下のタンパク質ラベリング、核染色のような生物学的用途用の近赤外蛍光プローブとして有用である。
【請求項７】
請求項１に記載のポルフィリン誘導体は、可視光照射下の免疫測定におけるＮＩＲ蛍光ラベルとして有用である。
【請求項８】
請求項１に記載のポルフィリン誘導体は、無害な照射下で有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光線力学治療および診断用途、ならびに生物学的、生物化学的、および工業的用途における、ＰＤＴ剤および近赤外（ＮＩＲ）蛍光プローブとして有用なポルフィリン誘導体に関するものである。より特別には、本発明は、一般式１のポルフィリン誘導体の製造方法、ならびに人間または動物における癌および他の疾病の検出用の光線力学用途におけるＮＩＲ蛍光プローブとしてのそれらの使用にも関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光線力学的療法（ＰＤＴ）は、腫瘍性疾患および非腫瘍性疾患の両方の診断および治療のための急速に発展しているモダリティであり、このモダリティには悪性または良性疾病の治療のための光線感作物質、光および酸素の相互作用を介して仲介される光化学反応の使用が含まれる。ＰＤＴは２段階の治療である。第一工程では、光線感作物質がいくつかの経路（例えば、局所、経口、静脈）のうちの一つによって患者に投与され、標的細胞によって吸収されることができる。第二工程には、標的組織に向けられた特定の波長の光と酸素の存在下での光線感作物質の活性化が含まれる。光線感作物質が過剰増殖組織に選択的に吸収され、光源が損傷性組織上を直接的に標的としているため、ＰＤＴは選択的であることと、隣接する健康な組織への損傷を最小限に抑えることとの両方を達成する。Lane, N. Scientific American 2003, 38, 45; Bonnett, R. Chem. Soc. Rev. 1995, 24, 19; Dougherty, T. J. Photochem. Photobiol. 1987, 45, 879; Kessel, D.; Dougherty, T. J. Phorphyrin Photosensitization; Plenum Publishing Corp. New York, 1983; Bissonette, R.; Bergeron, A.; Liu, Y. d. J Drugs. Dermatol. 2004, 3, 26-31 ; Jeffes, E.W.; McCullough, J. L.; Weinstein, G. D.; Fergin, P. E.; Nelson, J.S.; Shull, T. F. Arch. Dermatol, 1997, 133, 727-732を参照することができる。この方法には、標的組織によって吸収されることができ、かつ、特定の波長の光による照射の際に、それらの組織にとって有毒である非常に反応性に富む種を発生させる光線感作剤の存在が必要である。光線力学的療法は、光線力学的方法の選択性に起因して、従来の他の多くの治療法に対して利点を有する。腫瘍組織の中の方が通常の組織の中よりも多くの感作性物質が存在し、このことが通常の組織の破壊可能性を低減する。加えて、光ファイバー技術を使用することによって、光を特に標的細胞および組織上に向ける能力が、さらにこの方法の選択性を高めた。さらに、光を照射するまで反応をもたらさない感作性物質の使用は、副作用の可能性を著しく減少させる。Jeffes, E. W.; McCullough, J. L.; Weinstein, G. D.; Kaplan, R.; Glazer, S. D.; Taylor, J. R. J. Am. Acad. Dermatol, 2001, 45, 96-104; Kurwa, H. A.; Yong-Gee, S. A.; Seed, P. T.; Markey, A. C.; Barlow, R. J. J. Am. Acad. Dermatol, 1999, 41, 414-8; Pariser, D. M.; Lowe, N. J.; Stewart, D. M,; Jarratt, M. T.; Lucky, A. W.; Pariser, R. J. J. Am. Acad. Dermatol, 2003, 48, 227-32を参照することができる。
【０００３】
ＰＤＴにおいては、腫瘍細胞のアポトーシスまたは壊死のいずれかを介する破壊（治療）と比べて、腫瘍組織の検出（診断）は同様に重要である。近赤外（ＮＩＲ）染料は、癌検出用の蛍光プローブとして、現在かなりの注目を集めている。Lin, Y.; Weissleder, R.; and Tung, C. H. Bioconjugate Chem. 2002 13, 605-610; Achilefu, S.; Jimenez, H. N.; Dorshow, R. B.; Bugaj, J. E.; Webb, E. G.; Wilhelm, R. R.; Rajagopalan, R.; Johler, J.; Erion, J. L. J. Med. Chem. 2002 45, 2003-2015; Mujumdar, S. R.; Mujumdar, R. B.; Grant, C. M.; Waggoner, A. S. Bioconjugate Chem. 1996, 7, 356-362を参照することができる。組織は比較的ＮＩＲ光を透過するため、近赤外蛍光イメージング（ＮＩＲＦ）およびＰＤＴは、表面下の腫瘍でさえ、検出および治療をそれぞれすることができる。これに関して、本発明は、生物学的用途のためのポルフィリン系の効率的なＮＩＲ吸光蛍光プローブの開発を目的とするものである。ＮＩＲ領域で吸光および発光を示し、かつ、両親媒性を与えて、溶解性および蛍光強度を向上させ、細胞取り込みを加速させるであろうヒドロキシル基およびグリコール基のような置換基を有するポルフィリン系分子を合成した。
【０００４】
診断法において、治療法の場合のように、染料は投与されて、体内に拡散することができる。しかし、腫瘍選択性に加え、診断法においては光線感作剤が生理学的条件下で顕著な蛍光収率を示さなければならない。よって、長波長領域で強い吸光を有し、通常の組織に対して毒性がなく、生理学的なｐＨでバッファーに可溶であり、より高い治療効果を示す、光線感作剤の開発が今も望まれている。生物化学的および生物医学的用途のため、特定の癌細胞を標的とすることができる機能分子の設計もまた非常に重要である。
【０００５】
ポルフィリン分子は、現在研究中の光線感作剤の一つである。ポルフィリンは、リング状のテトラピロールコアを有する大環状分子化合物である。Mahler, H. R.; Cordes, E. H. Biological Chemistry, 2d ed. 1966, 418; Jori, G.; Reddi, E.Int J Biochem, 1993, 25, 1369-75を参照することができる。ポルフィリンそのもの自体は、金属イオンに配位した２価陰イオンの形態で一般に見つかる。テトラピロールコアの特異な性質が、ポルフィリンを多くの生命過程において重要な役割を果たす多くの生物学的システムの中心にしてきた。本質的な生物学的過程にとって非常に重要ないくつかの化合物、例えばクロロフィルやヘム、は、金属イオンとポルフィリン環の配位から派生する。ポルフィリンは、コバルト、銅、鉄、マグネシウム、ニッケル、銀および亜鉛を含む、多種多様の金属イオンと金属キレートを形成することができる。ヘムは、ポルフィリンの鉄キレートであり、クロロフィルとバクテリオクロロフィルはマグネシウムのキレートである。これらのようなポルフィリンは、前駆体のグリシンおよびスクシニルＣｏＡから一般的に合成される。L. Stryer, Biochemistry, 2nd ed. 504-507 (1981)を参照することができる。光線感作剤の親水性または親油性が、標的細胞への光線感作剤の結合に強く影響し、その結果、その細胞毒性に影響することがさらに確立されている。Merchat et al., J. Photochem. Photobiol. B: Biol, 35: 149-157 (1996)を参照することができる。現在知られているポルフィリン系光線感作剤には、第一世代光線感作剤と呼ばれるヘマトポルフィリン誘導体（ＨｐＤ）およびフォトフリンが含まれる。ＨｐＤは、（ａ）少なくとも９つの成分の混合物であること、（ｂ）製造が反応条件に対して非常の敏感であること、および（ｃ）皮膚光線過敏症を引き起こすこと、を含む、重大な欠点に直面している。ポルフィリン系光線感作剤の他の例は、フォスカンとして商業的に知られている、５，１０，１５，２０−テトラキス（メタヒドロキシフェニル）−クロリンである。それらの合成の現行の方法、およびそれらの使用のための既知の手法は、多くの対象とする用途に関して不十分である。高濃度の作用物質および広範な照射期間の要件の必要性から、このことは一部において真実である。これらの要因は、方法を煩わしく、かつ、不便にする。さらに、そのような条件は多くの医学的および／または工業的用途に適していない。したがって、医学的または他の用途のための新規な光線感作剤の必要性が見られる。変異原性でない生命体を不活性化するかまたは殺すための経路を利用する作用物質を提供することは、当業界において向上となるであろう。最後に、当業界において現在知られ、かつ、教示されているものよりも、低濃度、かつ、短期間で効果的に機能することができるそのような光線感作剤を供給することは当業界において追加的な向上となるであろう。
【０００６】
この分野における我々の興味は、現在存在しているポルフィリン誘導体の光線力学用途への活用というアイデアに基づくものである。近年、多種多様な非ポルフィリン感作剤がＰＤＴにおける使用のために開発されている。赤色光吸光フェノチアキシニウム染料であるメチレンブルーは、生物学的検定法の染色剤としてすでに広く使われてきており、種々の疾病の臨床診断において用いられることができ、手術における腫瘍マーカーとしても用いらることができる。しかし、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）光線感作剤としてのその使用は、遍在する細胞性酵素によって光線力学的に不活性な無色の形態へと還元されてしまうため、制限されている。ローダミンは重要なレーザー色素であり、赤色光を発するレーザー色素に現在長い間用いられている。ミトコンドリアによるそれらの特有の摂取、および生物化学的蛍光プローブとしてのそれらの既知の使用のために、ローダミン類の分子は悪性腫瘍の治療における感作剤として用いられている。しかし一方で、簡単に入手できる市販の染料であるローダミン１２３は、低い三重量子収率を引き起こすその高蛍光量子収率のために、弱いフォトトキシンである。Yamamoto, H.; Okunaka, T.; Furukawa, K.; Hiyoshi, T.; Konaka, C; Kato, H. Curr. Sci, 1999, 77, 894; Sharman, W. M.; Allen, C. M.; van Lier, J. E.; DrugDiscovery Today, 1999, 4, 507; Milgrom, L.; MacRobert, S; Chem. Britain, 1998, 45; Bonnett, R. Chem.Soc.Rev, 1995, 24, 19. Dolphin, D. Can. J. Chem, 1994, 72, 1005を参照することができる。
【０００７】
ＰＤＴにおける使用のために我々のグループから発展した他の種類の分子は、スクアラインである。スクアラインは、近赤外領域における鋭く強い吸光を有する染料の種類であり、著しい三重量子収率を示す。開発された種々のスクアライン染料の中で、ビス（３，５−ジヨード−２，４，６−トリヒドロキシフェニル）スクアラインが、臨床用途を確かに有する潜在的な光線感作剤であることがインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）およびインビボ試験から分かる。この染料は、効果的なＮＩＲ光線感作剤としてＰＤＴにおける有望な化合物であることが分かる。U.S. Pat. 6,770,787 B2; Ramaiah, D.; Joy, A.; Chandrasekar, N.; Eldho, N.V.; Das, S.; George, M.V; Photochem. Photobio, 1997, 65, 783-790; Ramaiah, D.; Eckert, I.; Arun, K. T.; Weidenfeller, L.; Epe, B. Photochem. Photobiol, 2002, 76, 672-677を参照することができる。
【０００８】
いくつかの非ポルフィリン系光線感作剤が市販されているが、ポルフィリンのような天然起源の染料がＰＤＴにおける第一選択薬であるという事実は、ポルフィリン大員環ベースのより良い光線感作剤の追求を促進してきた。これらのテトラピロール環は、可視から近赤外領域における鋭く強い吸光帯を有する染料の種類を形成する。これらの吸光および光化学的特徴によって多くの生物学的および工業的用途に非常に適するようになるため、これらの光線力学および光化学特性は広く研究されてきた。U.S. Pat. 4. 649. 151 ; R.   Bonnet, R. D. White, U. J. Winfield, M. C. Berenbaum. Biochem. J., 1989, 261, 277-280; D. Kessel. Photochem. Photobiol., 1984, 39, 851-859を参照することができる。
【０００９】
本特許出願で請求項に規定されている一般式１の新規ポルフィリン誘導体は、テトラフェニルポルフィリンの誘導体である。我々による予備調査は、より多くのヒドロキシル基をポルフィリンメソフェニル環に置換することで、現在存在するものと比較して、水性媒体中でのそれらの高められた溶解性と改良されたシステム間の交差効率をもたらすことを示した。水溶性でない他のポルフィリンと比較した場合、本発明において請求項に規定された誘導体は高い水溶性を示す。
【００１０】
さらに、亜鉛のような重金属のポルフィリン大員環上への挿入も、高められたシステム間の交差効率をもたらし、そして高い一重項酸素発生効率をもたらす。これらの染料は、４００〜７００ｎｍの範囲での吸光と、６００〜８００ｎｍの範囲での蛍光発光を示す。これらの染料は、０．１５〜０．２３の範囲内のほぼ良好な蛍光量子収率を有する。また、メソフェニル環上に存在する置換基および挿入された金属の特性によって、これらのポルフィリン誘導体の三重項励起状態（□Ｔ）の量子収率が、０．６０〜０．７５の範囲内であり、一重項酸素発生の量子収率（□（１Ｏ２））が０．４０〜０．７５の範囲内であることが分かる。哺乳類細胞株および菌株を用いたこれらのポルフィリン誘導体の細胞毒性、変異原性、摂取および放出の速度、ならびに細胞局在の研究により、可視光による励起の際にこれらの染料が顕著な細胞毒性を示すことおよびそれらの生物活性のメカニズムが一重項酸素のインビトロ発生に起因し得ることが判明した。
【００１１】
合成されたポルフィリン誘導体の細胞局在の研究は、可視光励起の間に赤色蛍光を有する核の上に細胞が選択的に集まることを示した。よって、これらの誘導体は、核染色用ＮＩＲ蛍光プローブとして使用されることができる。クロリンｅ６のような報告されたポルフィリンとヘマトポルフィリン誘導体のほとんどが細胞膜に主に局在する一方で、核に局在する我々の光線感作剤は、光線力学的な損傷をもたらす点においてはるかに効果的であろう。
【００１２】
本発明のポルフィリン誘導体に関する細胞摂取の研究は、それらがはるかに効果的であることを示した。フォトフリンＲの細胞摂取がたった４時間以内で最大である一方、本発明の新規のポルフィリン誘導体は、図１０として与えられた蛍光顕微鏡画像によって照明されたように、１０分以内で最大細胞摂取を示す。
【００１３】
また、本調査は、ポルフィリン誘導体が血清アルブミンのようなタンパク質への結合親和性を有し、したがってタンパク質ラベリング用ＮＩＲ蛍光プローブとして使用され得ることを示した。
【００１４】
本発明において、新規なポルフィリン誘導体を合成し、ＮＩＲ ＰＤＴ剤および生物学的および生物化学的用途のための蛍光プローブとしてのそれらの潜在力を実証した。
【発明の目的】
【００１５】
本発明の主な目的は、光線力学治療および診断用途、ならびに生物学的、生物化学的、および工業的用途における、ＰＤＴ剤および近赤外（ＮＩＲ）蛍光プローブとして有用なポルフィリン誘導体を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、腫瘍検出用の光線力学診断用途におけるＮＩＲ蛍光プローブとしての使用のための、ポルフィリン誘導体およびまたはそれらの薬剤として許容できる誘導体を提供することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、生物学的、生物化学的および工業的用途用の近赤外蛍光センサーとしての使用のための、ポルフィリン誘導体およびまたはそれらの薬剤として許容できる誘導体を提供することである。
【００１８】
本発明の更に他の目的は、タンパク質ラベリング用ＮＩＲ蛍光プローブとして使用することができるポルフィリン誘導体を提供することである。
【００１９】
本発明の更に他の目的は、核染色用ＮＩＲ蛍光プローブとして使用することができるポルフィリン誘導体を提供することである。
【００２０】
本発明の更に他の目的は、免疫測定におけるＮＩＲ蛍光ラベルとして使用することができる一般式１のポルフィリン誘導体を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本明細書に添付の図面において
【図１】一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）の水中での吸光スペクトルである。
【図２】一般式１のポルフィリン染料（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）の水中での蛍光発光スペクトルである。
【図３】一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝Ｚｎ）の水中での吸光スペクトルである。
【図４】一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝Ｚｎ）の水中での蛍光発光スペクトルである。
【図５】一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）のメタノール中での三重項吸光スペクトルである。レーザー励起波長は５３２ｎｍである。差し込み図は、一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）の、酸素の不在下および存在下における、４４０ｎｍでのメタノール中での過渡減衰プロファイルを示す。
【図６】（ａ）調査された一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）の口腔癌細胞（ＳＣＣ１３１）におけるシトトトキシティ（cytototoxicity）を示すヒストグラムである。図は、ナトリウムランプからの可視光（５０Ｊ／ｃｍ２ ５９０ｎｍ）を用いた照射の有無での、種々の濃度の調査された一般式１のポルフィリン誘導体を用いた４８時間の治療の後の人間の口腔癌細胞（ＳＣＣ１３１）細胞増殖を示す。（ｂ）種々の濃度の一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）での口腔癌細胞（ＳＣＣ１３１）の％成長阻害のプロットである。データは、ナトリウムランプからの可視光（５０Ｊ／ｃｍ２ ５９０ｎｍ）を用いた、種々の濃度の一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）での４８時間の治療後の％成長阻害を示す。
【図７】（ａ）調査された一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）の哺乳類の乳癌細胞（ＭＤＡＭＢ）におけるシトトトキシティを示すヒストグラムである。図は、ナトリウムランプからの可視光（５０Ｊ／ｃｍ２ ５９０ｎｍ）を用いた照射の有無での、種々の濃度の一般式１のポルフィリン誘導体を用いた４８時間の治療の後の哺乳類の乳腔癌細胞（ＭＤＡＭＢ）細胞増殖を示す。（ｂ）種々の濃度の一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）での哺乳類の乳癌細胞（ＭＤＡＭＢ）の％成長阻害のプロットである。データは、ナトリウムランプからの可視光（５０Ｊ／ｃｍ２ ５９０ｎｍ）を用いた、種々の濃度の一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）での４８時間の治療後の％成長阻害を示す。
【図８】一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）を用いた、ＦＡＣＳ分析による口腔癌細胞（ＳＣＣ１３１）における細胞死のメカニズム示すヒストグラムである。細胞数対ＦＩＴＣ染色に対してプロットしたＦＡＣＳヒストグラムにおいて、アポトーシス集団（Ｐ３）は右へのシフトを示す。
【図９】調査された一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）を用いた培養後の、哺乳類の乳癌細胞（ＭＤＡＭＢ２３１）の蛍光顕微鏡画像であり、一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）の短時間内、ここでは１時間以内、の癌細胞による摂取を示す。統合された図が、細胞内部での薬品の存在を裏付ける。
【図１０】一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）を用いた、口腔癌細胞（ＳＣＣ１３１）の５分間隔の異なる時間での蛍光顕微鏡画像であり、一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）の短時間内、ここでは１０分以内、の癌細胞による摂取を示す。
【図１１】（ａ）調査された一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ）を用いた培養後、および（ｂ）ヘキスト（市販の核染料）を用いた培養後の哺乳類の乳癌（ＭＤＡＭＢ２３１）細胞の核染色であり、（ｃ）はａとｂの統合された画像を示す。
【発明の概要】
【００２２】
したがって、本発明は、光線力学治療および診断用途、ならびに生物学的、生物化学的、および工業的用途における、ＰＤＴ剤および近赤外（ＮＩＲ）蛍光プローブとして有用なポルフィリン誘導体に関するものである。
【００２３】
本発明の一態様において、一般式１のポルフィリン誘導体、
【化１】
2013518042.tif 000002
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ、
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝Ｚｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ａｕ、
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｉ、Ｍ＝２Ｈ、
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｉ、Ｍ＝Ｚｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ａｕ、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５＝Ｈ、Ｒ３＝（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎ＝３〜７）、Ｍ＝２Ｈ、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５＝Ｈ、Ｒ３＝（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎ＝３〜７）、Ｍ＝Ｚｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ａｕである。
【００２４】
本発明の他の態様において、一般式１のポルフィリン誘導体の製造方法であって、
前記方法が、
ａ．置換ベンズアルデヒドをピロールと１：２５ｍｍｏｌの比率で混合し、続いて不活性雰囲気および光防護下、１５〜２０分間、２５〜３０℃の温度で攪拌する工程と、
ｂ．工程（ａ）で得た前記反応混合物の中へトリフルオロ酢酸を一滴ずつ加え、続いて２０〜３０分間再攪拌する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で得た前記混合物を、溶媒を加えることによってクエンチする工程と、
ｄ．工程（ｃ）で得た前記反応混合物からの前記過剰のトリフルオロ酢酸を、水酸化ナトリウム溶液で中和する工程と、
ｅ．工程（ｄ）で得た前記反応混合物から前記有機層を分離し、続いて水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを通して乾燥させて、無水有機層を得る工程と、
ｆ．工程（ｅ）で得た有機層を減圧下で濃縮して、粘性材料を得る工程と、
ｇ．工程（ｆ）で得た前記粘性材料を、酢酸エチルとヘキサンの混合物（２：８）と共にシリカゲルを通してクロマトグラフを行い、置換フェニルジピロメタンを得る工程と、
ｈ．工程（ｇ）で得た置換フェニルジピロメタンを置換ベンズアルデヒドと共に溶媒中に溶解する工程と、
ｉ．工程（ｈ）で得た前記混合物の中にトリフルオロ酢酸をゆっくりと加え、続いて２５〜３０℃の温度で攪拌する工程と、
ｊ．工程（ｉ）で得た前記混合物の中に２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノン（ＤＤＱ）を加え、続いて２５〜３０℃の温度で、１〜３時間攪拌する工程と、
ｋ．工程（ｊ）で得た前記反応混合をアルミナのパッドの上に注ぎ、溶媒で溶出し、続いて加圧下で前記溶媒を除去して黒色固体を得る工程と、
ｌ．工程（ｋ）で得た前記黒色固体を塩化メチレンと共にシリカゲルを通してクロマトグラフを行い、ポルフィリン誘導体を得る工程と
を含む、一般式１のポルフィリン誘導体の製造方法。
【００２５】
本発明の更に他の態様において、工程（ｃ）、（ｈ）および（ｋ）で用いられる溶媒が、塩化メチレンおよびクロロホルムからなる群から選択される。
【００２６】
本発明の更に他の態様において、ポルフィリン誘導体は、光線力学用途、診断用途、生物学的用途、および工業的用途の近赤外蛍光センサーとして有用である。
【００２７】
本発明の更に他の態様において、ポルフィリン誘導体は、人間または動物における癌および他の疾病の検出用の光線力学用途におけるＮＩＲ蛍光プローブとして有用である。
【００２８】
本発明の更に他の態様において、ポルフィリン誘導体は、可視光照射下のタンパク質ラベリング、核染色のような生物学的用途用の近赤外蛍光プローブとして有用である。
【００２９】
本発明の更に他の態様において、ポルフィリン誘導体は、可視光照射下の免疫測定におけるＮＩＲ蛍光ラベルとして有用である。
【００３０】
本発明の更に他の態様において、ポルフィリン誘導体は、無害な照射下で有用である。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明において、一般式１のポルフィリン誘導体が合成された。グリコール部分を用いた修飾は、これらの染料へ両親媒性を与え、そして細胞透過性を高め、特異性をもたらすと期待されている。例１〜４は一般式１の化合物の典型的な合成を示し、例５〜７は哺乳類の癌細胞を用いた光線力学的療法用の一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝ＯＨ、Ｍ＝２Ｈ）のインビトロ（in vitro）評価を示す。
【００３２】
以下の例は説明の目的で与えられるものであり、したがって、本研究の範囲を制限するように解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３３】
例１
一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝ＯＨ、Ｍ＝２Ｈ）の調製。２，４，６−トリメトキシベンスアルデヒド（５．１ｍｍｏｌ）を蒸溜したピロール（１２７ｍｍｏｌ）に加え、アルゴン雰囲気および光防護下で１５分間攪拌した。トリフルオロ酢酸（０．５ｍｍｏｌ）を一滴ずつ反応混合物に加え、再度２０分間攪拌した）。塩化メチレン（２５ｍＬ）を加えて反応をクエンチし、過剰のトリフルオロ酢酸を水酸化ナトリウム溶液で中和した。有機層を分離し、蒸留水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを通して乾燥させて、減圧下で濃縮した。得られた粘性材料をシリカゲルに通してクロマトグラフを行った。カラムを酢酸エチルとヘキサンの混合物（２：８）で溶出することで、２，４，６−トリメトキシフェニルジピロメタンを７５％得た。mp 120-122℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3, 30 ℃, TMS): δ = 3.72(s, 6H, -OCH3), 3.79 (s, 3 H, -OCH3), 5.55 (s, 1H, -CH), 5.88-5.89 (d, 2H, J= 8.00 Hz, Ar-ピロール-H), 6.07-6.09 (d, 2H, J = 8.5 Hz, Ar-ピロール-H), 6.11-6.6.23 (d, 2H, J= 8.5 Hz, Ar-ピロール-H), 6.61-6.62 (d, 2H, J= 7.0 Hz, Ar-H), 8.46 (s, 2H, ピロール-NH); 13C NMR (125 MHz, CDCl3, 30 ℃, TMS): δ = 30.95, 32,32, 37.32, 55.37, 56.40, 92.47, 105.70, 106.73, 107.72, 108.54, 112.22, 116.05, 117.32, 131.13, 133.38, 158.88, 160.08; IR (Neat): vmax 3375, 1593, 1463, 1413, 1313, 1219, 945 cm-1 ; FAB-MS: m/z = 312.56 (calcd 312.36 for C18H20N2O3)。
【００３４】
２，４，６−トリメトキシフェニルジピロメタン（３．２ｍｍｏｌ）および２，４，６−トリメトキシベンスアルデヒド（３．２ｍｍｏｌ）を１Ｌの丸底フラスコ中で乾燥塩化メチレン（５００ｍＬ）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（１．３ｍｍｏｌ）を１５分にわたってゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下で、２時間、３０℃で撹拌した。２時間後、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノン（ＤＤＱ）（４．８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を３０℃で２時間撹拌した。完全な反応混合物をアルミナのパッド（５０ｍｍの最大直径ｘ１５０ｍｍの長さ）の上に注ぎ、塩化メチレン（１Ｌ）で溶出した。溶媒を減圧下で除去し、黒色固体を得、これをシリカゲルに通してクロマトグラフを行った。カラムを塩化メチレンで溶出することによって、２５％の５，１０，１５，２０−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ポルフィリンを得た。mp >300 ℃; 1H NMR (500 MHz, CD2Cl2, 30 ℃, TMS): δ 3.48(s, 24H, -OCH3), 4.20 (s, 12H, -OCH3), 6.52 (s, 8H, - Ar-H), 8.64 (s, 8H, Ar-H, ピロール); IR (Neat): vmax 2949, 2794, 1660, 1600, 1573, 1556, 1462, 1411 , 1334 cm-1; 元素分析 calcd (%) for C36H52N2O10: C, 68.98; H, 5,58; N, 5.75; found: C, 67.44; H, 5.88; N, 5.23; MALDI-TOF-MS: m/z = 975.22(calcd 974.37 for C56H54N4O12)。
【００３５】
三臭化ホウ素（７．４ｍｍｏｌ）を乾燥蒸溜塩化メチレン（１０ｍＬ）に加え、その混合物を−７８℃に冷却した。装置に塩化カルシウム乾燥管を取り付けた。５，１０，１５，２０−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ポルフィリン（０．３ｍｍｏｌ）を、最小量の乾燥塩化メチレン（１０ｍｌ）に溶解し、滴下漏斗に入れ、２０分間にわたってゆっくりと加えた。混合物を、−７８℃で２時間、その後２５℃で１２時間攪拌した。氷浴で０℃に冷却した後、過剰量のメタノールを加えて、余分な三臭化ホウ素をソルボライズ（ｓｏｌｖｏｌｙｓｅ）し、ポルフィリン−三臭化ホウ素錯体を分解した。トリエチルアミンを加えて反応混合物を中和し、減圧下で濃縮することで非晶質の紫色固体を得、これをメタノールとクロロホルムのの混合物から再結晶化して一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝ＯＨ、Ｍ＝２Ｈ）を７０％得た。mp > 300 ℃; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 30 ℃, TMS): δ = 6.268 (s, 8H, - Ar-H), 8.746 (s, 8H, - Ar-H, ピロール), 9.016 (d, 8H, -Ar-OH), 9.388 (s, 4H, -Ar-OH); 13C NMR (125 MHz, CD3OD, 30 ℃, TMS): δ = 93.94, 94.18, 98.60, 103.92, 108.58, 113.22, 115.23, 131.05, 132.19, 132.84, 139.15, 146.76, 158.63, 159.06; IR (Neat): vmax 3280, 2948, 1614, 1584, 1469, 1348, 1047 cm-1; MALDI-TOF-MS: m/z = 808.97 (calcd 806.72 for C44H30N4O12)。
【００３６】
例２
一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝ＯＨ、Ｍ＝Ｚｎ）の調製。メタノールとクロロホルム（１：２）の混合物２５ｍＬ中に一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝ＯＨ、Ｍ＝２Ｈ）（０．６２ｍｍｏｌ）を含む溶液を、酢酸亜鉛（３．１ｍｍｏｌ）と共に６時間還流した。溶媒を減圧下で蒸溜して取り除き、得られた残留物を複数部の蒸留水で洗浄し、過剰な酢酸亜鉛を除去した。得られた未精製の材料を、メタノールとクロロホルムの混合物から再結晶化し、一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝ＯＨ、Ｍ＝Ｚｎ）を８５％得た、mp >300℃; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 30 ℃, TMS): δ = 6.24 (s, 8H, Ar-H), 8.69 (s, 8H, -OH), 8.74 (s, 8H, Ar-ピロール-H), 9.26 (s, 4H, -OH); 13C NMR (125 MHz, CD3OD, 30 ℃, TMS): δ = 93.94, 94.18, 98.60, 103.92, 108.58, 113.22, 115.23, 131.05, 132.19, 132.84, 139.15, 146.76, 158.63, 159.06; IR (Neat): vmax 3281, 1614, 1469, 1151, 1047 cm-1; MALDI-TOF-MS: m/z = 865.76 (calcd 65.85 for C44H28N4012Zn)。
【００３７】
例３
一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｈ、Ｒ３＝（ＯＣＨ２ＣＨ２）３ＯＨ、Ｍ＝２Ｈ）の調製。４−（トリエチレングリコール）ベンズアルデヒド（３．９ｍｍｏｌ）を蒸溜したピロール（９８．３ｍｍｏｌ）に加え、アルゴン雰囲気および光防護下で１５分間攪拌した。トリフルオロ酢酸（０．３９ｍｍｏｌ）を反応混合物に一滴ずつ加え、再度２０分間攪拌した。塩化メチレン（２０ｍＬ）を加えて反応をクエンチし、過剰のトリフルオロ酢酸を水酸化ナトリウム溶液で中和した。有機層を分離し、蒸留水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを通して乾燥させて、減圧下で濃縮した。得られた粘性材料をシリカゲルに通してクロマトグラフを行った。カラムを酢酸エチルとヘキサンの混合物（１：１）で溶出することで、４−（トリエチレングリコール）フェニルジピロメタンを８０％得た。mp 100-102 ℃; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, 30 ℃, TMS): δ = 3.47 (t, 2H, -CH2), 3.66 (t, 2H, -OCH2), 4.07 (m, 6H, -OCH2), 4.20 (t, 2H, -OCH2), 5.45 (s, 1H, -CH), 5.89 (d, 2H, J= 8.00 Hz, Ar-ピロール-H), 6.09 (d, 2H, J = 8.5 Hz, Ar-ピロール-H), 6.6.23 (d, 2H, J= 8.5 Hz, Ar-ピロール-H), 7.02 (d, 2H, J= 8.6 Hz, Ar-H), 7.81 (d, 2H, J= 8.6 Hz, Ar-H), 8.51 (s, 2H, ピロール-NH); 13C NMR (125 MHz, CDCl3, 30 ℃, TMS): δ = 43.7, 61.3, 69.3, 70.0, 70.2, 107.3, 108.3, 114.0, 118.3, 129.0, 130.1, 155.9; IR (Neat): vmax 3442, 3415, 2877, 1600, 1584, 1257, 651 cm-1; FAB-MS: m/z = 370.36 (calcd 370.44 for C21H26N2O4)。
【００３８】
４−（トリエチレングリコール）フェニルジピロメタン（２．７ｍｍｏｌ）および４−（トリエチレングリコール）ベンズアルデヒド（２．７ｍｍｏｌ）を、１Ｌの丸底フラスコ中で乾燥塩化メチレン（４５０ｍｌ）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（１．１ｍｍｏｌ）を６０秒にわたってゆっくりと加えた。反応混合物を３０℃で撹拌した。１時間後、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノン（ＤＤＱ）（４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を３０℃でさらに１時間撹拌した。完全な反応混合物をアルミナのパッド（５０ｍｍの最大直径ｘ１５０ｍｍの長さ）の上に注ぎ、塩化メチレン（１Ｌ）で溶出し、次いでメタノールとクロロホルムの混合物（１：１）で溶出した。溶媒を減圧下で除去し、黒色固体を得、これをシリカゲルに通してクロマトグラフを行った。カラムをメタノールとクロロホルムの混合物（１：１９）で溶出することによって、５，１０，１５，２０−（４−（トリエチレングリコール）フェニル）ポルフィリンを２８％得た。mp >300 ℃; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, 30 ℃, TMS): δ = -2.76(s, 2H, ピロール-NH), 3.71- 3.90 (m, 24H, -CH2), 4.08 (t, 8H, -CH2), 4.32 (t, 8H, -CH2), 4.45 (t, 8H, -OCH2), 7.31 (d, 8H, J= 8.5, -ArH), 8.12 (d, 8H, J= 8.4, -ArH); l3C NMR (125 MHz, CDCl3, 30 ℃, TMS): δ = 61.84, 67.67, 70.32, 70.46, 112.86, 114.97, 119.70, 126.23, 126.85, 131.42, 134.92, 135.56, 158.53; IR (Neat): vmax 3311, 2875, 1604, 1506, 1350, 1246, 966 cm-1; MALDI-TOF-MS: m/z = 1207.7 (calcd 1207.36 for C68H78N4O16)。
【００３９】
例４
一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｈ、Ｒ３＝（ＯＣＨ２ＣＨ２）３ＯＨ、Ｍ＝Ｚｎ）の調製。乾燥クロロホルム（２０ｍＬ）中に一般式１のポルフィリン誘導体（０．４１ｍｍｏｌ）を含む溶液を、酢酸亜鉛（２．１ｍｍｏｌ）と共に５時間還流した。溶媒を減圧下で蒸溜して取り除き、得られた残留物を複数部の蒸留水で洗浄し、過剰な酢酸亜鉛を除去した。得られた未精製の材料を、メタノールとクロロホルムの混合物から再結晶化し、一般式１のポルフィリン誘導体（式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｈ、Ｒ３＝（ＯＣＨ２ＣＨ２）３ＯＨ、Ｍ＝Ｚｎ）を９２％得た、mp >300 ℃; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, 30℃, TMS): 3.71- 3.90 (m, 24H, -CH2), 4.08 (t, 8H, -CH2), 4.32 (t, 8H, -CH2), 4.45 (t, 8H, -OCH2), 7.28- 7.31 (d, 8H, J= 8.5, -ArH), 8.12 (d, 8H, J= 8.4, -ArH); 13C NMR (125 MHz, CDCl3, 30 ℃, TMS): δ = 61.84, 67.67, 70.32, 70.46, 112.86, 114.97, 119.70, 126.23, 126.85, 131.42, 134.92, 135.56, 158.53; IR (Neat): vmax 3416, 2875, 1604, 1506, 1350, 1246, 681 cm-1 ; MALDI-TOF-MS: m/z = 1266.33 (calcd 1265.48 for C68H76N4O12Zn)。
【００４０】
例５
細胞増殖の測定による細胞毒性の決定。
臭化３，（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）試験は細胞増殖（細胞成長）を測定するための標準的な比色分析である。この試験を、一般式１のポルフィリン誘導体の細胞毒性を決定するために使用した。ヒト頸部口腔癌細胞（ＳＣＣ１３１細胞）（５ｘ１０３細胞／ウェル）を２つの９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加えた。１つは暗所での細胞毒性で、もう１つは明所での細胞毒性を、１５０μＬのＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）と１０％の血清とを２４時間培養した。そして、３．１２５〜２５μＭの一般式１のポルフィリン誘導体を、試験用に血清希釈液（ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝食塩水）を用いて希釈した原料１００ｍＭ）に加え、対照用に０．０２５％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に加えて、３時間培養し、片方のプレートにナトリウムランプ（７０Ｗで１５分間）を用いて照射し、一方でもう片方のプレートは暗所で保持した。光照射後、ＤＰＢＳを吸引し、１０％の血清を有する１５０μＬのＤＭＥＭをそれぞれのウェルに加え、４８時間培養した。４８時間の培養後、プレートを培養器から取り出して１０□ＬのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ原料）をプレートのそれぞれのウェルに加えた。４時間後、形成したホルマザン結晶を取り除かないように気を付けて慎重に上澄みを取り除き、１００□Ｌのイソプロピルアルコールをそれぞれのウェルに加えた。プレートをアルミニウム箔で覆い、結晶が溶解するまで攪拌機の上に保持した。５７０ｎｍでの吸光度を読み取った。
成長阻害率は以下のように計算した。
％成長阻害＝（対照−試験）／対照）×１００
【００４１】
図６Ａは、７０Ｗナトリウムランプ（５９０ｎｍ）での照射有りおよび無しでの、口腔癌細胞（ＳＣＣ１３１）における、一般式１のポルフィリン誘導体の種々の処理濃度（３．１２５、６．２５、１２．５＆２５μＭ）についての４８時間後の細胞増殖を示す。棒グラフから、照射無しでは、著しい成長阻害がないことが明らかである。
【００４２】
図６Ｂは、口腔癌細胞（ＳＣＣ１３１）における、一般式１のポルフィリン誘導体の種々の処理濃度（３．１２５、６．２５、１２．５＆２５μＭ）についての４８時間後の％成長阻害を示す。この一般式１のポルフィリン誘導体から、４μＭのＩＣ５０値を示した。
【００４３】
図７Ａは、７０Ｗナトリウムランプ（５９０ｎｍ）での照射有りおよび無しでの、乳癌細胞（ＭＤＡ  ＭＢ２３１）における、一般式１のポルフィリンの種々の処理濃度（３．１２５、６．２５、１２．５＆２５μＭ）についての４８時間後の細胞増殖を示す。棒グラフから、照射無しでは、著しい成長阻害がないことが明らかである。
【００４４】
図７Ｂは、乳癌細胞（ＭＤＡ  ＭＢ２３１）における、一般式１のポルフィリンの種々の処理濃度（３．１２５、６．２５、１２．５＆２５μＭ）についての４８時間後の％成長阻害を示す。このグラフから、一般式１のポルフィリン誘導体は、７μＭのＩＣ５０値を示した。
【００４５】
例６
サイトメトリーによるアポトーシス試験の決定。
ＦＩＴＣのようなフルオロチョーム（fluorochome）に接合したアネキシンＶを、アポトーシスの早い段階における簡易な細胞のフローサイトメトリー同定に使用した。３つの６０ｍｍプレートを選び、ＳＣＣ１３１（プレート当り２ｘ１０５の細胞）を２ｍＬのＤＭＥＭ媒体と共に播種し、２４時間培養した。１つのプレートを明対照（薬品無し）用として、１つのプレートを暗対照（光無し、薬品有り）として選び、残りの１つを試験用（薬品＋光）に選んだ。そして、２５μＭの濃度（ＤＰＢＳを用いて希釈した原料１００ｍＭ）の一般式１のポルフィリン誘導体を２つのプレートに加え、３つめには．０２５％のＤＭＳＯを加え、３時間培養し、その後ナトリウムランプ（７０Ｗ、５９０ｎｍ）を使って２つのプレート（明対照＆試験）に１５分間光照射した。光照射後、ＤＰＢＳを吸引し、１０％の血清を有する１５０μｌのＤＭＥＭ媒体をそれぞれの３５ｍｍプレートに加え、４８時間培養した。４８時間後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、１ＸＰＢＳを使ってペレットを洗浄し、２００μｌの結合バッファーをペレットに加えた。濾過して、サイトメトリ管に流した。３μＬのアネクシンＶ−ＦＩＴＣを加え、ボルテックスし、暗所で１５分間培養した。細胞懸濁液を２００μＬの結合バッファーを使って希釈した。この懸濁液をＦＡＣＳ分析に付した。
【００４６】
図８は、アネクシンＶ  ＦＩＴＣ蛍光（対数）対細胞カウント（直線）のヒストグラムを示し、ここで、Ｐ２は染料を吸収しない細胞（健康な通常の細胞）に与えられる基礎蛍光を表わす。Ｐ３はアネクシンＶ  ＦＩＴＣと結合することで蛍光を発している細胞（アポトーシスを起こした細胞）を表わす。ＭＤＡ  ＭＢ２３１−対照細胞（明所＆暗所）において、ほとんどの細胞は、アポトーシスを起こしていない通常の細胞を示すＰ２集団で観測された。一般式１のポルフィリンでのＰＤＴの後、アポトーシスを意味する、Ｐ２からＰ３集団へのピークシフトが観測された。
【００４７】
例７
蛍光顕微鏡検査法を用いた薬品摂取調査。
哺乳類の乳癌細胞ＭＤＡＭＢ２３１（プレート当り２ｘ１０５の細胞）を２ｍｌのＤＭＥＭ媒体と共に播種し、２４時間培養した。そして、調査された一般式１のポルフィリン誘導体（ＤＰＢＳを用いて希釈した原料１００ｍＭ）を１ｍＭ加え、１時間培養した。細胞による薬品摂取の進展を、次いで、５分の時間間隔で、緑色フィルターを用いて蛍光顕微鏡を通して観察した。
【００４８】
図９Ａは、ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞の位相差画像を示す。４Ｂは、一般式１のポルフィリン誘導体で染色されたＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞の蛍光像を示す。９．Ｃは、細胞内への薬品の摂取を意味する、画像Ａ＆Ｂの完全な統合を示す。
【００４９】
図１０は、一般式１のポルフィリン誘導体を有する、５分間の時間間隔で撮った蛍光像を示す。この写真から、一般式１のポルフィリン誘導体の摂取が、細胞内への薬品添加から１０分以内に起こっていることが明白である。このことは、薬品の有効性を予測する、上記一般式１のポルフィリン誘導体の細胞内への素早い摂取を示唆する。
【００５０】
例８
薬品局在化調査（核染色）。
哺乳類の乳癌細胞ＭＤＡＭＢ２３１（プレート当り２ｘ１０５の細胞）を２ｍＬのＤＭＥＭ媒体と共に播種し、２４時間培養した。そして、調査された一般式１のポルフィリン誘導体（ＤＰＢＳを用いて希釈した原料１００ｍＭ）を１ｍＭ加え、１時間培養した。次いで、ヘキスト染料を基準として加え、ＵＶと緑色フィルターを用いて蛍光顕微鏡を通して局在化を観察した。
【００５１】
図１１Ａは、ＭＤＡ  ＭＢＢ２３１細胞を一般式１のポルフィリン誘導体で染色することによって得た蛍光像を示す。図１１Ｂは、ＭＤＡ  ＭＢＢ２３１細胞を標準的な核染色剤であるヘキストで染色することによって得た蛍光像を示す。図１１Ｃは、一般式１のポルフィリン誘導体の核局在化特性を裏付ける完全な統合を示す。
【００５２】
（利点）
本発明のために使用されるポルフィリン染料は、ＮＩＲ  ＰＤＴ剤の十分な特性を有し、光線力学治療および診断用途、ならびに生物学的、生物化学的、および工業的用途における蛍光プローブとして使用されることができる。これらのシステムの主な利点としては、以下の点が挙げられる：
１．式１で表わされるポルフィリン誘導体は、新規かつ純粋な単一物質である。
２．それらの合成手順は非常に経済的である。
３．式１で表わされるポルフィリン誘導体は、可視から近赤外領域（４００〜７００ｎｍ）における吸光を有する。
４．式１で表わされるポルフィリン誘導体は、近赤外領域（６２０〜７４０ｎｍ）における蛍光放射を有する。
５．式１で表わされるポルフィリン誘導体は、水性媒体中、０．１〜０．２の範囲の放射量子収率を有する。
６．式１で表わされるポルフィリン誘導体は、水性媒体中、０．５〜０．７の範囲の三重量子収率を有する。
７．それらは、液体の殺菌などのような光線力学用途に用いられることができる。
８．ポルフィリン系染料は、タンパク質ラベリング用のＮＩＲ蛍光プローブとして用いられることができる。
９．ポルフィリン系染料は、核染色用のＮＩＲ蛍光プローブとして用いられることができる。
１０．一般式１のポルフィリン誘導体は、免疫測定におけるＮＩＲ蛍光ラベルとして用いられることができる。
１１．それらは、生理的条件下で、生物学的に重要な金属イオンの検出に用いられることができる。
１２．これらの新規な染料は、生物学的および工業的用途において、近赤外蛍光センサーとして用いられることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年9月21日(2012.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１のポルフィリン誘導体、
【化１】
2013518042.tif 000015
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝２Ｈ、
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｈ、Ｍ＝Ｚｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ａｕ、
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｉ、Ｍ＝２Ｈ、
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ２、Ｒ４＝Ｉ、Ｍ＝Ｚｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ａｕ、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５＝Ｈ、Ｒ３＝（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎ＝３〜７）、Ｍ＝２Ｈ、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５＝Ｈ、Ｒ３＝（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎ＝３〜７）、Ｍ＝Ｚｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ａｕ。
【請求項２】
請求項１に記載の一般式１のポルフィリン誘導体の製造方法であって、
前記方法が、
ａ．２，４，６−トリメトキシまたは４−（トリエチレングリコール）で置換されたベンズアルデヒドをピロールと１：２５ｍｍｏｌの比率で混合し、続いて不活性雰囲気および光防護下、１５〜２０分間、２５〜３０℃の温度で攪拌する工程と、
ｂ．工程（ａ）で得た前記反応混合物の中へトリフルオロ酢酸を一滴ずつ加え、続いて２０〜３０分間再攪拌する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で得た前記混合物を、溶媒を加えることによってクエンチする工程と、
ｄ．工程（ｃ）で得た前記反応混合物からの前記過剰のトリフルオロ酢酸を、水酸化ナトリウム溶液で中和する工程と、
ｅ．工程（ｄ）で得た前記反応混合物から前記有機層を分離し、続いて水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを通して乾燥させて、無水有機層を得る工程と、
ｆ．工程（ｅ）で得た有機層を減圧下で濃縮して、粘性材料を得る工程と、
ｇ．工程（ｆ）で得た前記粘性材料を、酢酸エチルとヘキサンの混合物（２：８）と共にシリカゲルを通してクロマトグラフを行い、２，４，６−トリメトキシまたは４−（トリエチレングリコール）で置換されたフェニルジピロメタンを得る工程と、
ｈ．工程（ｇ）で得た２，４，６−トリメトキシまたは４−（トリエチレングリコール）で置換されたフェニルジピロメタンを２，４，６−トリメトキシまたは４−（トリエチレングリコール）で置換されたベンズアルデヒドと共に溶媒中に溶解する工程と、
ｉ．工程（ｈ）で得た前記混合物の中にトリフルオロ酢酸をゆっくりと加え、続いて２５〜３０℃の温度で攪拌する工程と、
ｊ．工程（ｉ）で得た前記混合物の中に２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノン（ＤＤＱ）を加え、続いて２５〜３０℃の温度で、１〜３時間攪拌する工程と、
ｋ．工程（ｊ）で得た前記反応混合をアルミナのパッドの上に注ぎ、溶媒で溶出し、続いて加圧下で前記溶媒を除去して黒色固体を得る工程と、
ｌ．工程（ｋ）で得た前記黒色固体を塩化メチレンと共にシリカゲルを通してクロマトグラフを行い、ポルフィリン誘導体を得る工程と
を含む、一般式１のポルフィリン誘導体の製造方法。
【請求項３】
工程（ｃ）、（ｈ）および（ｋ）で用いられる溶媒が、塩化メチレンおよびクロロホルムからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
癌および他の疾病の検出のような光線力学治療用途用の近赤外染料としての、請求項１に記載のポルフィリン誘導体の使用。
【請求項５】
可視光照射下の診断、タンパク質ラベリング、および核染色のような生物学的用途用の近赤外蛍光プローブとしての、請求項１に記載のポルフィリン誘導体の使用。
【請求項６】
可視光照射下の免疫測定における近赤外蛍光ラベルとしての、請求項１に記載のポルフィリン誘導体の使用。
【国際調査報告】
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