(57)【要約】  異常なコリン代謝に関連する疾患状態の陽電子放出型断層撮影（ＰＥＴ）又は単一光子放出型コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージング（例えば、前立腺、胸、脳、食道、卵巣、子宮内膜、肺及び前立腺癌−原発性腫瘍、結節性疾患又は転移の腫瘍イメージング）のための新規放射性トレーサー。本発明はまた、新規放射性トレーサーの中間体、前駆体、医薬組成物、作成方法、及び使用方法についても記載する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩＩ）の化合物。
【化１】
2013538234.tif 000038
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は各々独立に水素又は重水素（Ｄ）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、−ＣＨ（Ｒ８）２、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８は独立に水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍは１〜４の整数であり、
Ｃ*は炭素の放射性同位体であり、
Ｘ、Ｙ及びＺは各々独立に水素、重水素（Ｄ）、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択されるハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル基であり、
Ｑは陰イオンである対イオンであるが、式（ＩＩＩ）の化合物が11Ｃ−コリンではないことを条件とする。
【請求項２】
Ｃ*が11Ｃ、13Ｃ、又は14Ｃである、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｃ*が11Ｃであり、Ｘ及びＹが各々水素であり、ＺがＦである、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｃ*が11Ｃであり、Ｘ、Ｙ及びＺが各々水素Ｈであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が各々重水素（Ｄ）であり、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々水素である、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
請求項１記載の化合物及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項６】
請求項２記載の化合物及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項７】
請求項３記載の化合物及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項４記載の化合物及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異常なコリン代謝に関連する疾患状態の陽電子放出型断層撮影（ＰＥＴ）又は単一光子放出型コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージング（例えば、前立腺、乳腺、脳、食道、卵巣、子宮内膜、肺及び前立腺癌−原発性腫瘍、結節性疾患又は転移の腫瘍イメージング）のための新規放射性トレーサーについて記載する。本発明はまた、その新規放射性トレーサーの中間体、前駆体、医薬組成物、作成方法、及び使用方法についても記載する。
【背景技術】
【０００２】
コリンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３２）活性の生合成産物であるホスホコリンは幾つかの癌で上昇し、膜ホスファチジルコリンの前駆体である（Ａｂｏａｇｙｅ，  Ｅ．Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；  ５９：８０−４；  Ｅｘｔｏｎ，  Ｊ．Ｈ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９４；  １２１２：２６−４２；  Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｔ．Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９８９；  １０４：２８３−９１；  ａｎｄ  Ｔｅｅｇａｒｄｅｎ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ    １９９０；  ２６５（１１）：６０４２−７）。コリンキナーゼの過剰発現及び酵素活性の上昇が前立腺、乳腺・胸、肺、卵巣及び結腸癌で報告されており（Ａｏｙａｍａ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ２００４；  ４３（３）：２６６−８１；  Ｇｌｕｎｄｅ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；  ６４（１２）：４２７０−６；  Ｇｌｕｎｄｅ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；  ６５（２３）：  １１０３４−４３；  Ｉｏｒｉｏ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；  ６５（２０）：  ９３６９−７６；  Ｒａｍｉｒｅｚ  ｄｅ  Ｍｏｌｉｎａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００２；  ２９６（３）：  ５８０−３；  ａｎｄ  Ｒａｍｉｒｅｚ  ｄｅ  Ｍｏｌｉｎａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２００７；  ８（１０）：  ８８９−９７）、悪性の形質転換及び進行を伴うホスホコリンレベルの上昇の主たる原因である。癌細胞におけるホスホコリンレベルの上昇はまたホスホリパーゼＣを介した分解の増大にも起因する（Ｇｌｕｎｄｅ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；  ６４（１２）：４２７０−６）。
【０００３】
この表現型、及び低下した尿の排泄のため、［11Ｃ］コリンは前立腺癌の陽電子放出型断層撮影（ＰＥＴ）及びＰＥＴ−コンピューター断層撮影（ＰＥＴ−ＣＴ）イメージング、並びにそれよりは少ないが脳、食道、及び肺癌のイメージングのための重要な放射性トレーサーとなっている（Ｈａｒａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２０００；  ４１：１５０７−１３；  Ｈａｒａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  １９９８；  ３９：９９０−５；  Ｈａｒａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  １９９７；  ３８：８４２−７；  Ｋｏｂｏｒｉ，  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １９９９；  ８６：１６３８−４８；  Ｐｉｅｔｅｒｍａｎ，  Ｒ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２００２；  ４３（２）：１６７−７２；  ａｎｄ  Ｒｅｓｋｅ，  Ｓ．Ｎ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００８；  ３５：１７４１）。特異的なＰＥＴシグナルは、放射性トレーサーの輸送とコリンキナーゼによる［11Ｃ］ホスホコリンへのリン酸化に起因する。
【０００４】
しかしながら、興味深いことは、［11Ｃ］コリン（並びにフルオロ類似体）が主に腎臓及び肝臓組織でコリンオキシダーゼ（下記図１参照）（ＥＣ  １．１．３．１７）により［11Ｃ］ベタインに酸化され、代謝産物が放射性トレーサーの注入後すぐに血漿中で検出可能なことである（Ｒｏｉｖａｉｎｅｎ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０００；  ２７：２５−３２）。このため、後期イメージングプロトコル（ｌａｔｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を使用する場合、親の放射性トレーサー及び異化産物の相対的な寄与の識別が困難になる。
（図１）
2013538234.tif 000002
炭素−１１の短い物理的半減期（２０．４分）を克服するために下記式の［18Ｆ］フルオロメチルコリン（［18Ｆ］ＦＣＨ）が開発され（ＤｅＧｒａｄｏ，  Ｔ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１；  ６１（１）：１１０−７）、この比較的新しい放射性トレーサーを用いた幾つかのＰＥＴ及びＰＥＴ−ＣＴ研究が発表されている（Ｂｅｈｅｓｈｔｉ，  Ｍ．，    ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００８；３５（１０）：１７６６−７４；  Ｃｉｍｉｔａｎ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００６；  ３３（１２）：１３８７−９８；  ｄｅ  Ｊｏｎｇ，  Ｉ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００２；  ２９：１２８３−８；  ａｎｄ  Ｐｒｉｃｅ，  Ｄ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｕｒｏｌ  ２００２；  １６８（１）：２７３−８０）。フッ素−１８のより長い半減期（１０９．８分）は、全身循環における親のトレーサーの充分なクリアランスが起こったときに腫瘍の遅れたイメージングを許容する上で潜在的に有利であると考えられた（ＤｅＧｒａｄｏ，  Ｔ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２００２；  ４３（１）：９２−６）。
【０００５】
【化１】
2013538234.tif 000003
国際公開第２００１／８２８６４号は、１８Ｆ標識コリン類似体、例えば［１８Ｆ］フルオロメチルコリン（［１８Ｆ］−ＦＣＨ）並びに体内でのコリンプロセッシングに影響する新生物及び病態生理学の非侵襲的検出及び局在化のための造影剤（例えば、ＰＥＴ）としてのその用途を記載している（抄録）。国際公開第２００１／８２８６４号はまた、１８Ｆ標識ジ重水素化コリン類似体、例えば［18Ｆ］フルオロメチル−［１−2Ｈ２］コリン（［18Ｆ］ＦＤＣ）（以下、「［18Ｆ］Ｄ２−ＦＣＨ」という。）も記載している。
【０００６】
【化２】
2013538234.tif 000004
様々な条件下でのコリンの酸化、例えば、コリン及び［１，２−2Ｈ４］コリンの相対的酸化安定性が研究されている（Ｂｅｈｅｓｈｔｉ，  Ｍ．，    ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００８；３５（１０）：１７６６−７４；  Ｃｉｍｉｔａｎ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００６；  ３３（１２）：１３８７−９８；  ｄｅ  Ｊｏｎｇ，  Ｉ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００２；  ２９：１２８３−８；  ａｎｄ  Ｐｒｉｃｅ，  Ｄ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｕｒｏｌ  ２００２；  １６８（１）：２７３−８０）。β−二次同位体効果は〜１．０５であるので、一次同位体効果が８〜１０である点で余分な重水素置換の影響は理論上無視できることが判明した（Ｆａｎ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００５，  １２７，  １７９５４−１７９６１）。
【０００７】
［18Ｆ］フルオロメチルコリンは今や腫瘍状態をイメージングするために広くクリニックで使用されている（Ｂｅｈｅｓｈｔｉ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２００８，  ２４９，  ３８９−９０；  Ｂｅｈｅｓｈｔｉ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００８，  ３５，  １７６６−７４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００６／０８２１０８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以下に記載する本発明は、コリン代謝のＰＥＴイメージングに使用することができ、増大した代謝安定性及び好都合な尿の排泄プロフィールを示す新規11Ｃ放射性標識放射性トレーサーを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、次式（ＩＩＩ）の化合物を提供する。
【００１１】
【化３】
2013538234.tif 000005
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は各々独立に水素又は重水素（Ｄ）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、−ＣＨ（Ｒ８）２、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８は独立に水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍは１〜４の整数であり、
Ｃ*は、炭素の放射性同位体であり、
Ｘ、Ｙ及びＺは各々独立に、水素、重水素（Ｄ）、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択されるハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル基であり、
Ｑは陰イオンである対イオンであり、
但し、式（ＩＩＩ）の化合物は11Ｃ−コリンではない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、主要なコリン代謝産物の化学構造及びその経路を示す。
【図２】図２及び図３は、テトラ重水素化コリン前駆体のＮＭＲ分析を示す。図２は、1ＨＮＭＲスペクトルを、図３は、13ＣＮＭＲスペクトルである。いずれのスペクトルもＣＤＣｌ３中で得た。
【図３】図２及び図３は、テトラ重水素化コリン前駆体のＮＭＲ分析を示す。図２は、1ＨＮＭＲスペクトルを、図３は、13ＣＮＭＲスペクトルである。いずれのスペクトルもＣＤＣｌ３中で得た。
【図４】図４は、［18Ｆ］フルオロメチルトシレート（９）及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（Ｄ４−ＦＣＨ）の合成のＨＰＬＣプロフィールであり、（Ａ）１５分後の（９）の合成の放射性ＨＰＬＣプロフィール、（Ｂ）１５分後の（９）の合成のＵＶ（２５４ｎｍ）プロフィール、（Ｃ）１０分後の（９）の合成の放射性ＨＰＬＣプロフィール、（Ｄ）粗製の（９）の放射性ＨＰＬＣプロフィール、（Ｅ）注射用に処方した（９）の放射性ＨＰＬＣプロフィール、（Ｆ）処方後の屈折率プロフィール（陽イオン検出モード）を示す。
【図５ａ】図５ａは、保護されてない前駆体を介する［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（Ｄ４−ＦＣＨ）の生成のための、本発明の完全に組み立てられたカセットの絵である。
【図５ｂ】図５ｂは、ＰＭＢで保護された前駆体を介する［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（Ｄ４−ＦＣＨ）の生成のための、本発明の完全に組み立てられたカセットの絵である。
【図６】図６は、過マンガン酸カリウム酸化研究の代表的な放射性ＨＰＬＣ分析を示す。上図列は、［18Ｆ］フルオロメチルコリン（［18Ｆ］ＦＣＨ）及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ）の対照試料、すなわち時間ゼロ（０分）における反応混合物の抽出物である。下図列は、２０分処理後の抽出物である。左側は［18Ｆ］フルオロメチルコリン（［18Ｆ］ＦＣＨ）、右側は［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ）である。
【図７】図７は、過マンガン酸カリウムの存在下における［18Ｆ］フルオロメチルコリン及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンの化学的酸化電位を示す。
【図８】図８は、コリンオキシダーゼの存在下における［18Ｆ］フルオロメチルコリン及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンの経時的安定性アッセイであり、親の化合物からそれぞれのベタイン類似体への変換を示している。
【図９】図９は、コリンオキシダーゼ研究の代表的な放射性ＨＰＬＣ分析を示す。上図列は、［18Ｆ］フルオロメチルコリン及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンの対照試料、すなわち時間ゼロ（０分）における反応混合物の抽出物である。下図列は４０分処理後の抽出物である。左側は［18Ｆ］フルオロメチルコリン、右側は［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンである。
【図１０】図１０の上図は、マウスにトレーサーを静脈注射した１５分後に得られたマウス血漿試料中における、［18Ｆ］フルオロメチルコリン（ＦＣＨ）から［18Ｆ］ＦＣＨ−ベタインへの、及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（Ｄ４−ＦＣＨ）から［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ−ベタインへの代謝の、放射性ＨＰＬＣによる分析である。下図は、血漿中における、親のトレーサー［18Ｆ］フルオロメチルコリン（ＦＣＨ）及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（Ｄ４−ＦＣＨ）の、代謝産物［18Ｆ］ＦＣＨ−ベタイン（ＦＣＨＢ）及び［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨベタイン（Ｄ４−ＦＣＨＢ）への変換の概要である。
【図１１】図１１は、ＨＣＴ−１１６腫瘍担持マウスにおける［18Ｆ］フルオロメチルコリン（ＦＣＨ）、［18Ｆ］フルオロメチル−［１−2Ｈ２］コリン（Ｄ２−ＦＣＨ）及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（Ｄ４−ＦＣＨ）の生体内分布の経時変化である。挿入図は評価のために選択された時点である。Ａ）［18Ｆ］フルオロメチルコリンの生体内分布、Ｂ）［18Ｆ］フルオロメチル−［１−2Ｈ２］コリンの生体内分布、Ｃ）［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンの生体内分布、Ｄ）チャートＡ〜Ｃの［18Ｆ］フルオロメチルコリン（ＦＣＨ）、［18Ｆ］フルオロメチル−［１−2Ｈ２］コリン（Ｄ２−ＦＣＨ）及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（Ｄ４−ＦＣＨ）の腫瘍取込の経時変化である。約３．７ＭＢｑの［18Ｆ］フルオロメチルコリン（ＦＣＨ）、［18Ｆ］フルオロメチル−［１−2Ｈ２］コリン（Ｄ２−ＦＣＨ）及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（Ｄ４−ＦＣＨ）を覚醒したオスのＣ３Ｈ−Ｈｅｊマウスに注射し、示した時点でイソフルオラン麻酔下に犠牲にした。
【図１２】図１２は、放射性ＨＰＬＣクロマトグラムであり、ｐ．ｉ．（注射後）３０分で正常な白色マウスから取った組織内のコリン放射性トレーサー代謝産物の分布を示す。上図列は放射性トレーサー標準、中央の列は腎臓抽出物、下図列は肝臓抽出物である。左側は［18Ｆ］ＦＣＨ、右側は［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨである。
【図１３】図１３は、放射性ＨＰＬＣクロマトグラムであり、注射後３０分のＨＣＴ１１６腫瘍内のコリン放射性トレーサーの代謝産物分布を示す。上図列は純粋な放射性トレーサー標準、下図列は３０分腫瘍抽出物であり、左側は［18Ｆ］ＦＣＨ、中央は［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ、右側は［11Ｃ］コリンである。
【図１４】図１４は、ＨＣＴ１１６細胞を用いたホスホコリンＨＰＬＣ検証の放射性ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。左側は純粋な［18Ｆ］ＦＣＨ標準、中央はホスファターゼ酵素インキュベーション、右側は対照インキュベーションである。
【図１５】図１５は、選択された時点における［18Ｆ］フルオロメチルコリン類似体［18Ｆ］フルオロメチルコリン、［18Ｆ］フルオロメチル−［１−2Ｈ２］コリン及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンの放射性代謝産物の分布を示す。
【図１６】図１６は、［18Ｆ］ＦＣＨ及び［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨの組織プロフィールを示す。（ａ）ＰＥＴデータから得られた肝臓、腎臓、尿（膀胱）及び筋肉における［18Ｆ］ＦＣＨの取込に対する時間対放射活性曲線、（ｂ）［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨに対する対応するデータ。結果は平均±ＳＥであり、ｎ＝４匹のマウスである。簡明にするために上下のエラーバー（ＳＥ）を使用している（Ｌｅｙｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９：６９：（１９），ｐｐ７７２１−７７２７）。
【図１７】図１７は、ＳＫＭＥＬ２８腫瘍異種移植片における［18Ｆ］ＦＣＨ及び［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨの腫瘍プロフィールを示す。（ａ）ＳＫＭＥＬ２８腫瘍担持マウスの典型的な［18Ｆ］ＦＣＨ−ＰＥＴ及び［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ−ＰＥＴ画像。腫瘍の０．５ｍｍ横断面及び膀胱の冠状断面を示す。視覚化のために、３０〜６０分合計した画像データを示す。矢印は腫瘍（Ｔ）、肝臓（Ｌ）及び膀胱（Ｂ）を示す。（ｂ）腫瘍における［18Ｆ］ＦＣＨ及び［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨに対する時間対放射活性曲線の比較。各腫瘍に対して、１９の時間枠の各々における放射活性を測定した。データは平均％ＩＤ／ｖｏｘ６０±ＳＥ（ｎ＝４匹のマウス／群）である。（ｃ）イメージング変数の概要。データは平均±ＳＥであり、ｎ＝４、*Ｐ＝０．０４である。簡明にするために上下のエラーバー（ＳＥ）を使用している。
【図１８】図１８は、マイトジェン細胞外キナーゼ阻害剤であるＰＤ０３２５９０１の、ＨＣＴ１１６腫瘍及び細胞内の［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨの取込に対する効果を示す。（ａ）ビヒクル又は２５ｍｇ／ｋｇのＰＤ０３２５９０１で１０日間毎日処理した後のＨＣＴ１１６腫瘍における規格化された時間対放射活性曲線。データは平均±ＳＥであり、ｎ＝３匹のマウスである。（ｂ）イメージング変数％ＩＤ／ｖｏｘ６０、％ＩＤ／ｖｏｘ６０ｍａｘ、及びＡＵＣの概要。データは平均±ＳＥであり、*Ｐ＝０．０５である。（ｃ）ＨＣＴ１１６細胞を培養中［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨで１ｈｒ処理した後の［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨホスホコリン代謝に対するＰＤ０３２５９０１（１μＭ）の固有の細胞効果。データは平均±ＳＥで、ｎ＝３、*Ｐ＝０．０３である。
【図１９】図１９は、ＨＣＴ１１６腫瘍におけるコリンキナーゼＡの発現を示す。（ａ）腫瘍コリンキナーゼＡ（ＣＨＫＡ）タンパク質発現に対するＰＤ０３２５９０１の効果を示す典型的なウェスタンブロット。ＰＤ０３２５９０１（２５ｍｇ／ｋｇ、毎日１０日間、経口）又はビヒクルを注射したマウスのＨＣＴ１１６腫瘍のＣＨＫＡ発現をウェスタンブロッティングにより分析した。β−アクチンを充填対照(loadｉng control)として使用した。（ｂ）β−アクチンに対する比として表したＣＨＫＡ発現に対する濃度計測定の概要。結果は平均の比±ＳＥであり、ｎ＝３、*Ｐ＝０．０５である。
【図２０】図２０は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける11Ｃ−コリン、11Ｃ−Ｄ４−コリン及び18Ｆ−Ｄ４−コリンの生体内分布の経時変化を示す。約１８．５ＭＢｑの11Ｃで標識したトレーサー又は３．７ＭＢｑの18Ｆを麻酔した動物に静脈内投与した後示した時点で犠牲にした。組織を切除し、秤量し、カウントした。カウントは注射服用量／ｇ湿潤秤量組織に規格化した。平均値（ｎ＝３）及びＳＥＭを示す。
【図２１】図２１は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの肝臓（Ａ）及び腎臓（Ｂ）における11Ｃ−コリン、11Ｃ−Ｄ４−コリン及び18Ｆ−Ｄ４−コリンの代謝プロフィールを示す。放射性標識した代謝産物プロフィールを、親の放射性トレーサーの静脈内注射後２、１５、３０及び６０分に、放射性ＨＰＬＣを用いて評価した。平均値（ｎ＝３）及びＳＥＭを示す。略語Ｂｅｔ−ａｌｄはベタインアルデヒドであり、ｐ−コリンはホスホコリンである。
【図２２】図２２は、ＨＣＴ１１６腫瘍における11Ｃ−コリン、11Ｃ−Ｄ４−コリン及び18Ｆ−Ｄ４−コリンの代謝プロフィールを示す。ＨＣＴ１１６腫瘍異種移植片における放射性標識した代謝産物プロフィールを、親の放射性トレーサーの静脈内注射後１５分及び６０分に、放射性ＨＰＬＣを用いて評価した。平均値（ｎ＝３）及びＳＥＭを示す。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。
【図２３】図２３は、11Ｃ−コリン（○）、11Ｃ−Ｄ４−コリン（▲）及び18Ｆ−Ｄ４−コリン（■）のＰＥＴ画像分析を示す。ＨＣＴ１１６腫瘍取込プロフィールを、６０分動的ＰＥＴイメージング後検査した。Ａは、11Ｃ−コリン、11Ｃ−Ｄ４−コリン及び18Ｆ−Ｄ４−コリンに対するＨＣＴ１１６腫瘍担持マウス（３０〜６０分合計した活性）の代表的な軸方向ＰＥＴ−ＣＴ画像である。ＣＴ画像により示された腫瘍境界のアウトラインを赤色で示す。Ｂは腫瘍時間対放射活性曲線（ＴＡＣ）である。平均±ＳＥＭ（ｎ＝４匹のマウス／群）。
【図２４】図２４は、ＨＣＴ１１６腫瘍における11Ｃ−コリン、11Ｃ−Ｄ４−コリン及び18Ｆ−Ｄ４−コリンの薬物動態を示す。Ａ、血漿代謝産物及び腫瘍内の交換可能な空間内へのそれらの流れを考慮する改変コンパートメントモデリング解析を用いて、腫瘍内の不可逆的保持の尺度Ｋｉを導出した。Ｂ、コリンキナーゼ活性の動態パラメーターｋ３は、既に記載したようなツーサイトコンパートメントモデルを用いて計算した。Ｃ、腫瘍内のベタイン対ホスホコリンの比。代謝産物は、トレーサーの注射後１５及び６０分に放射性ＨＰＬＣにより定量化した。平均値（ｎ＝４）及びＳＥＭを示す。*Ｐ＜０．０５、***Ｐ＜０．００１。略語ｐ−コリンはホスホコリンである。
【図２５】図２５は、異なる組織学的起源の腫瘍における18Ｆ−Ｄ４−コリンの動的取込及び代謝安定性を示す。Ａ、６０分の動的ＰＥＴイメージングから得られた腫瘍時間対放射活性曲線（ＴＡＣ）。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３〜５匹マウス／群）。Ｂ、腫瘍における18Ｆ−Ｄ４−コリンの代謝プロフィール。ＨＣＴ１１６腫瘍異種移植片における放射性標識代謝産物のプロフィールは、ＰＥＴイメージング後放射性ＨＰＬＣを用いて評価した。平均値（ｎ＝３）及びＳＥＭを示す。Ｃ、悪性黒色腫、前立腺腺癌及び結腸癌腫腫瘍におけるコリンキナーゼの発現。腫瘍溶解物（ｎ＝腫瘍細胞株当たり３つの異種移植片）の代表的なウェスタンブロット。アクチンを充填対照として使用した。略語ＣＫαはコリンキナーゼアルファである。
【図２６】図２６は、18Ｆ−Ｄ４−コリンの取込及び保持に対する腫瘍の大きさの影響を示す。トレーサーの取込プロフィールは１００ｍｍ3（●）及び２００ｍｍ3（○）のＰＣ３−Ｍ腫瘍における６０分動的ＰＥＴイメージングの後に検査した。Ａ、平均の崩壊−補正カウントを用いた腫瘍時間対放射活性曲線。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３〜５匹マウス／群）。Ｂ、最大のボクセル崩壊−補正カウントを用いた腫瘍時間対放射活性曲線。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３〜５）。
【図２７】図２７は、放射性クロマトグラムにおける分析物の同定を示す。18Ｆ−Ｄ４−コリンで処理したＨＣＴ１１６細胞溶解物の代表的な放射性クロマトグラム。Ａ、ＨＣＴ１１６細胞中への18Ｆ−Ｄ４−コリンの１ｈ取込後細胞を溶解し、３７℃でビヒクルと共に１ｈインキュベーション。Ｂ、ＨＣＴ１１６細胞中への18Ｆ−Ｄ４−コリンの１ｈ取込後細胞を溶解し、ビヒクルに溶解したアルカリ性ホスファターゼと共に１ｈインキュベーション。標識されたピークは、１が18Ｆ−Ｄ４−コリン、２が18Ｆ−Ｄ４−ホスホコリンである。
【図２８】図２８は、18Ｆ−Ｄ４−コリンのコリンオキシダーゼ処理を示す。Ａ、18Ｆ−Ｄ４−コリンの代表的な放射性クロマトグラム。Ｂ、コリンオキシダーゼによる２０分処理後の18Ｆ−Ｄ４−コリンクロマトグラム。Ｃ、４０分処理後の18Ｆ−Ｄ４−コリンクロマトグラム。標識されたピークは、１が18Ｆ−Ｄ４−ベタインアルデヒド、２が18Ｆ−Ｄ４−ベタイン、３が18Ｆ−Ｄ４−コリンである。
【図２９】図２９は、全腎臓活性とホスホコリンとして保持される％放射活性の相関関係を示す。データはトレーサー注射後２、１５、３０及び６０分における11Ｃ−コリン、11Ｃ−Ｄ４−コリン及び18Ｆ−Ｄ４−コリンの取込値及び代謝から得られた。
【図３０】図３０は、ＨＣＴ１１６腫瘍における11Ｃ−コリン（○）、11Ｃ−Ｄ４−コリン（▲）及び18Ｆ−Ｄ４−コリン（■）のＰＥＴイメージング分析を示す。動的ＰＥＴスキャンの最初の１４分の腫瘍時間対放射活性曲線（ＴＡＣ）はトレーサー動態におけるわずかな変化を示す。平均±ＳＥＭ（ｎ＝４匹のマウス／群）。
【図３１】図３１は、ヒト黒色腫（●）、前立腺（▲）及び結腸（■）癌細胞株における18Ｆ−Ｄ４−コリンのインビトロ（生体外）の取込の経時変化を示す。取込はビヒクルで処理した細胞（中塗りの記号）及びヘミコリニウム−３で処理した細胞（５ｍＭ、中抜きの記号）で測定した。平均値＋ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。挿入図は、３つの細胞株におけるコリンキナーゼ−α発現の代表的なウェスタンブロットである。アクチンを充填対照として使用した。略語ＣＫαはコリンキナーゼアルファである。
【図３２】図３２は、それぞれ１００ｍｍ3及び２００ｍｍ3におけるＰＣ３−Ｍ腫瘍担持マウスの代表的な軸方向のＰＥＴ−ＣＴ画像（３０〜６０分合計した活性）を示す。ＣＴ画像から示される腫瘍境界のアウトラインを赤色で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、次式（Ｉ）の新規放射性標識コリン類似体化合物を提供する。
【００１４】
【化４】
2013538234.tif 000006
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は各々独立に水素又は重水素（Ｄ）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、−ＣＨ（Ｒ８）２、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８は独立に水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍは１〜４の整数であり、
Ｘ及びＹは各々独立に水素、重水素（Ｄ）、又はＦであり、
Ｚは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択されるハロゲン、又は放射性同位体であり、
Ｑは、陰イオンである対イオンである。
【００１５】
但し、前記式（Ｉ）の化合物は、フルオロメチルコリン、フルオロメチル−エチル−コリン、フルオロメチル−プロピル−コリン、フルオロメチル−ブチル−コリン、フルオロメチル−ペンチル−コリン、フルオロメチル−イソプロピル−コリン、フルオロメチル−イソブチル−コリン、フルオロメチル−ｓｅｃ−ブチル−コリン、フルオロメチル−ジエチル−コリン、フルオロメチル−ジエタノール−コリン、フルオロメチル−ベンジル−コリン、フルオロメチル−トリエタノール−コリン、１，１−ジデューテロフルオロメチルコリン、１，１−ジデューテロフルオロメチル−エチル−コリン、１，１−ジデューテロフルオロメチル−プロピル−コリン、又はこれらの［18Ｆ］類似体ではない。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態では、式（Ｉ）において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が各々独立に水素であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、−ＣＨ（Ｒ８）２、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８が独立に水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍが１〜４の整数であり、
Ｘ及びＹが各々独立に水素、重水素（Ｄ）、又はＦであり、
ＺがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択されるハロゲン、又は放射性同位体であり、
Ｑが陰イオンである対イオンである
化合物が提供される。
但し、前記式（Ｉ）の化合物は、フルオロメチルコリン、フルオロメチル−エチル−コリン、フルオロメチル−プロピル−コリン、フルオロメチル−ブチル−コリン、フルオロメチル−ペンチル−コリン、フルオロメチル−イソプロピル−コリン、フルオロメチル−イソブチル−コリン、フルオロメチル−ｓｅｃ−ブチル−コリン、フルオロメチル−ジエチル−コリン、フルオロメチル−ジエタノール−コリン、フルオロメチル−ベンジル−コリン、フルオロメチル−トリエタノール−コリン、又はこれらの［18Ｆ］類似体ではない。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、式（Ｉ）において、
Ｒ１及びＲ２が各々水素であり、
Ｒ３及びＲ４が各々重水素（Ｄ）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、−ＣＨ（Ｒ８）２、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８が独立に水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍが１〜４の整数であり、
Ｘ及びＹが各々独立に水素、重水素（Ｄ）、又はＦであり、
ＺがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択されるハロゲン、又は放射性同位体であり、
Ｑが陰イオンである対イオンである
化合物が提供される。
但し、前記式（Ｉ）の化合物は、１，１−ジデューテロフルオロメチルコリン、１，１−ジデューテロフルオロメチル−エチル−コリン、１，１−ジデューテロフルオロメチル−プロピル−コリン、又はこれらの［18Ｆ］類似体ではない。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、式（Ｉ）において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が各々重水素（Ｄ）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、−ＣＨ（Ｒ８）２、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８が独立に水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍが１〜４の整数であり、
Ｘ及びＹが各々独立に水素、重水素（Ｄ）、又はＦであり、
ＺがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択されるハロゲン又は放射性同位体であり、
Ｑが陰イオンである対イオンである
化合物が提供される。
【００１９】
本発明によると、本明細書に記載する式（Ｉ）の化合物のＺがハロゲンである場合、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択されるハロゲンであることができ、好ましくはＦである。
【００２０】
本発明によると、本明細書に記載する式（Ｉ）の化合物のＺが放射性同位体である場合（以下、、「式（Ｉ）の放射性標識化合物」という）、当技術分野で公知の任意の放射性同位体であることができる。好ましくは、Ｚはイメージング（例えば、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ）に適した放射性同位体である。より好ましくは、ＺはＰＥＴイメージングに適した放射性同位体である。さらにより好ましくは、Ｚは18Ｆ、76Ｂｒ、123Ｉ、124Ｉ、又は125Ｉである。さらにより好ましくは、Ｚは18Ｆである。
【００２１】
本発明によると、本明細書に記載する式（Ｉ）の化合物のＱは陽イオン性のアンモニウム化合物に適した当技術分野で公知の任意の陰イオンである対イオンであることができる。Ｑの適切な例としては、陰イオン、臭素イオン（Ｂｒ-）、塩素イオン（Ｃｌ-）、酢酸イオン（ＣＨ３ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｏ-）、又はトシレート（-ＯＴｏｓ）がある。本発明の好ましい実施形態では、Ｑは臭素イオン（Ｂｒ-）又はトシレート（-ＯＴｏｓ）である。本発明の好ましい実施形態では、Ｑは塩素イオン（Ｃｌ-）又は酢酸イオン（ＣＨ３ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｏ-）である。本発明の好ましい実施形態では、Ｑは塩素イオン（Ｃｌ-）である。
【００２２】
本発明によると、式（Ｉ）の化合物の好ましい実施形態は、次式（Ｉａ）の化合物である。
【００２３】
【化５】
2013538234.tif 000007
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は各々独立に重水素（Ｄ）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々が水素であり、
Ｘ及びＹは各々独立に水素であり、
Ｚは18Ｆであり、
ＱはＣｌ-である。
【００２４】
本発明によると、式（Ｉａ）の好ましい化合物は［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］−コリン（［18Ｆ］−Ｄ４−ＦＣＨ）である。［18Ｆ］−Ｄ４−ＦＣＨは代謝的により安定なフルオロコリン（ＦＣＨ）類似体である。［18Ｆ］−Ｄ４−ＦＣＨは対応する18Ｆ−非重水素化及び／又は18Ｆジ重水素化類似体に対して数多くの利点を提供する。例えば、［18Ｆ］−Ｄ４−ＦＣＨは［18Ｆ］フルオロメチルコリンと比べて増大した化学的及び酵素的酸化安定性を示す。［18Ｆ］−Ｄ４−ＦＣＨは、ジデューテロフルオロコリン、［18Ｆ］フルオロメチル−［１−2Ｈ２］コリンと比べて、先行文献から予想できる以上の、従って予期されない改良されたインビボ（生体内）プロフィールを有する（すなわち、インビボイメージングに対してより良好な有効性を示す）。［18Ｆ］−Ｄ４−ＦＣＨは改良された安定性を示し、従って放射性トレーサーの全身循環からの充分なクリアランスの後の腫瘍の遅れたイメージングがより良好に可能である。［18Ｆ］−Ｄ４−ＦＣＨはまた、基質の増大したアベイラビリティーにより腫瘍イメージングの感度も高める。これらの利点は以下でさらに詳細に述べる。
【００２５】
本発明はさらに、次式（ＩＩ）の前駆体化合物を提供する。
【００２６】
【化６】
2013538234.tif 000008
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は各々独立に水素又は重水素（Ｄ）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、−ＣＨ（Ｒ８）２、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８は独立に水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍは１〜４の整数である。
【００２７】
本発明はさらに、式（ＩＩ）の前駆体化合物の製造方法を提供する。
【００２８】
本発明は、次式（ＩＩＩ）の化合物を提供する。
【００２９】
【化７】
2013538234.tif 000009
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は各々独立に水素又は重水素（Ｄ）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、−ＣＨ（Ｒ８）２、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８は独立に水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍは１〜４の整数であり、
Ｃ*は炭素の放射性同位体であり、
Ｘ、Ｙ及びＺは各々独立に水素、重水素（Ｄ）、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択されるハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル基であり、
Ｑは陰イオンである対イオンである。但し、式（ＩＩＩ）の化合物は11Ｃ−コリンではない。
【００３０】
本発明によると、式（ＩＩＩ）の化合物のＣ*は炭素のいかなる放射性同位体であることもできる。Ｃ*の適切な例としては、限定されることはないが、11Ｃ、13Ｃ、及び14Ｃがある。Ｑは式（Ｉ）の化合物に関して記載した通りである。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、Ｃ*が11Ｃであり、Ｘ及びＹが各々水素であり、ＺがＦである式（ＩＩＩ）の化合物が提供される。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、Ｃ*が11Ｃであり、Ｘ、Ｙ及びＺが各々水素Ｈであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が各々重水素（Ｄ）であり、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々水素である式（ＩＩＩ）の化合物が提供される（11Ｃ−［１，２−2Ｈ４］コリンすなわち「11Ｃ−Ｄ４−コリン」）。
【００３３】
医薬又は放射性医薬組成物
本発明は、本明細書で定義された式（Ｉ）の化合物、例えば式（Ｉａ）の化合物を、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は生体適合性の担体と共に含む医薬又は放射性医薬組成物を提供する。本発明によると、式（Ｉ）又は（Ｉａ）の化合物のＺが放射性同位体である場合、医薬組成物は放射性医薬組成物である。
【００３４】
本発明はさらに、本明細書で定義された式（Ｉ）の化合物、例えば式（Ｉａ）の化合物を、哺乳類への投与に適した薬学的に許容される担体、賦形剤、又は生体適合性担体と共に含む医薬又は放射性医薬組成物を提供する。
【００３５】
本発明は、本明細書で定義された式（ＩＩＩ）の化合物を、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は生体適合性の担体と共に含む医薬又は放射性医薬組成物を提供する。
【００３６】
本発明はさらに、本明細書で定義された式（ＩＩＩ）の化合物を、哺乳類への投与に適した薬学的に許容される担体、賦形剤、又は生体適合性の担体と共に含む医薬又は放射性医薬組成物を提供する。
【００３７】
当業者には理解されるように、薬学的に許容される担体又は賦形剤は、当技術分野で公知のいかなる薬学的に許容される担体又は賦形剤であることもできる。
【００３８】
「生体適合性担体」は、式（Ｉ）、（Ｉａ）、又は（ＩＩＩ）の化合物が懸濁又は溶解することができ、医薬組成物が生理的に容認できる、例えば、毒性又は過度の不快感なしで哺乳類の体内に投与することができるような任意の流体、殊に液体であることができる。生体適合性の担体は、無菌の発熱性物質を含まない注射用の水、生理的食塩水のような水溶液（これは有利なことに最終の注射用産物が等張であるか又は低張でないようにバランスをとり得る）、１種以上の張度調節物質（例えば、血漿陽イオンと生体適合性対イオンの塩）、糖（例えば、グルコース又はショ糖）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）、又はその他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液のような注射可能な担体液体が適切である。生体適合性担体はまたエタノールのような生体適合性の有機溶媒からなり得る。かかる有機溶媒はより親油性の化合物又は製剤を可溶化するのに有用である。好ましくは、生体適合性担体は発熱性物質を含まない注射用水、等張の生理的食塩水又は水性エタノール溶液である。静脈内注射用の生体適合性担体のｐＨは４．０〜１０．５の範囲が適切である。
【００３９】
医薬又は放射性医薬組成物は非経口的に、すなわち注射により投与され得、最も好ましくは水溶液である。かかる組成物は場合により、緩衝剤、薬学的に許容される可溶化剤（例えば、シクロデキストリン又は界面活性剤、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ、Ｔｗｅｅｎ又はリン脂質）、薬学的に許容される安定剤又は抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、ゲンチシン酸又はパラ−アミノ安息香酸）のようなさらに別の成分を含有し得る。式（Ｉ）、（Ｉａ）、又は（ＩＩＩ）の化合物が放射性医薬組成物として提供される場合、前記化合物の製造方法はさらに、放射性医薬組成物を得るのに必要とされる工程、例えば、有機溶媒の除去、生体適合性緩衝剤及び任意の別の成分の添加を含み得る。非経口投与のためには、放射性医薬組成物が無菌で非発熱性であるのを保証するための工程も必要である。かかる工程は当業者に周知である。
【００４０】
本発明の化合物の製造
本発明は、式（Ｉ）の化合物、例えば式（Ｉａ）の化合物を製造する方法を提供する。この方法は、式（ＩＩ）の前駆体化合物を式（ＩＩＩａ）の化合物と反応させて式（Ｉ）の化合物を形成すること（スキームＡ）を含んでいる。
【００４１】
【化８】
2013538234.tif 000010
式中、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物は各々本明細書に記載したものであり、式（ＩＩＩａ）の化合物は次式の通りである。
ＺＸＹＣ−Ｌｇ          （ＩＩＩａ）
式中、Ｘ、Ｙ及びＺは各々式（Ｉ）の化合物に対して本明細書で定義した通りであり、「Ｌｇ」は脱離基である。「Ｌｇ」の適切な例には、限定されることはないが、臭素（Ｂｒ）及びトシレート（ＯＴｏｓ）である。式（ＩＩＩａ）の化合物は本明細書に記載するものを含めて当技術分野で公知のいかなる手段によっても製造することができる。
【００４２】
ＺがＦであり、ＸとＹがいずれもＨであり、ＬｇがＯＴｏｓである式（ＩＩＩａ）の化合物（すなわち、フルオロメチルトシレート）の合成は次のスキーム３に示すように行うことができる。
【００４３】
【化９】
2013538234.tif 000011
上記スキーム３により、次の反応が起こる。
（ａ）メチレンジトシレートの合成
市販のジヨードメタンをＥｍｍｏｎｓとＦｅｒｒｉｓの方法を用いて銀トシレートと反応させてメチレンジトシレートを得ることができる（Ｅｍｍｏｎｓ，Ｗ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｅｔａｔｈｅｔｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓａｌｔｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ．ＩＩ．  Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｋｙｌ  Ｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９５３；７５：２２５）。
（ｂ）非放射性（コールド）フルオロメチルトシレートの合成
フルオロメチルトシレートは、８０℃標準条件下アセトニトリル中のフッ化カリウム／Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ  Ｋ２２２を用いて、工程（ａ）からのメチレンジトシレートの親核置換により製造することができる。
【００４４】
Ｚが放射性同位体である場合、この放射性同位体は当業者に公知のいかなる手段でも導入することができる。例えば、放射性同位体［18Ｆ］−フッ素イオン（18Ｆ-）は通常核反応１８Ｏ（ｐ，ｎ）18Ｆで水溶液として得られ、陽イオン性対イオンの添加及びその後の水の除去によって反応性にされる。適切な陽イオン性対イオンは、18Ｆ-の溶解度を維持するのに充分な無水反応溶媒内の溶解度を保有するべきである。従って、使用されている対イオンとしては、ルビジウム若しくはセシウムのような大きいが軟らかい金属イオン、Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ（商標）のようなクリプタンドと錯体を形成したカリウム、又はテトラアルキルアンモニウム塩がある。好ましい対イオンは、その良好な無水溶媒溶解度及び高まった18Ｆ-反応性の故に、Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ（商標）のようなクリプタンドと錯体を形成したカリウムである。18Ｆはまた、ハロゲン又はトシレート基のような適切な脱離基の親核置換によって導入することもできる。周知の18Ｆ標識技術に関するより詳細な考察は「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」（２００３；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ：Ｍ．Ｊ．Ｗｅｌｃｈ及びＣ．Ｓ．Ｒｅｄｖａｎｌｙ，Ｅｄｓ．）の第６章に見ることができる。例えば、［１８Ｆ］フルオロメチルトシレートは、２〜１０％水を含有するアセトニトリル中で［18Ｆ］−フッ素イオンによるメチレンジトシレートの親核置換によって調製することができる（Ｎｅａｌ，Ｔ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ２００５；４８：５５７−６８参照）。
【００４５】
自動合成
好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物、例えば式（Ｉａ）の化合物を製造する方法は自動化される。例えば、［18Ｆ］−放射性トレーサーは、自動化された放射性合成装置により自動化された様式で都合よく製造し得る。かかるプラットフォーム装置の幾つかの市販の例として、ＴＲＡＣＥＲｌａｂ（商標）（例えば、ＴＲＡＣＥＲｌａｂ（商標）ＭＸ）及びＦＡＳＴｌａｂ（商標）（いずれもＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｔｄ．製）がある。かかる装置は一般に、放射化学を遂行する、使い捨て式であることが多い「カセット」を含み、このカセットは放射性合成を実行するために装置に嵌め込まれる。カセットは通常、流体経路、反応容器、及び試薬バイアルを受容する口、並びに放射性合成後のクリーンアップ工程に使用される固相抽出カートリッジを含んでいる。場合により、本発明の別の実施形態では、自動化された放射性合成装置は高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）に連結することができる。
【００４６】
従って、本発明は、各々本明細書で定義される式（Ｉ）の化合物、例えば式（Ｉａ）の化合物の自動合成のためのカセットを提供し、このカセットは、
（ｉ）本明細書で定義される式（ＩＩ）の前駆体化合物を含有する容器、及び
ステップ（ｉ）の容器の中味を本明細書で定義される式（ＩＩＩａ）の化合物で溶出するための手段
を含んでいる。
本発明のカセットの場合、式（ＩＩ）及び（ＩＩＩａ）の前駆体化合物の適切で好ましい実施形態は各々が本明細書で定義されている。
【００４７】
本発明の一実施形態では、ＦＡＳＴｌａｂ（商標）と適合性であり、各々本明細書に記載した式（Ｉ）の化合物、例えば式（Ｉａ）の化合物を保護されたエタノールアミン前駆体から作成するための、ＨＰＬＣ精製工程を必要としない方法が提供される。
【００４８】
［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（18Ｆ−Ｄ４−ＦＣＨ）の放射性合成は本明細書に記載した方法及び実施例に従って行うことができる。18Ｆ−Ｄ４−ＦＣＨの放射性合成はまた、限定されることはないがＧＥ  ＦＡＳＴｌａｂ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｉｎｃ．から市販されている）を始めとする市販の合成プラットフォームを用いて実行することもできる。
【００４９】
保護された前駆体から［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンを調製するＦＡＳＴｌａｂ（商標）放射性合成プロセスの一例を次のスキーム５に示す。
【００５０】
【化１０】
2013538234.tif 000012
［18Ｆ］フルオロ−［１，２−2Ｈ４］コリン又は［18Ｆ］フルオロコリンの（保護された前駆体からの）自動化は、同じ自動化されたプロセスを含む（それぞれフルオロメチル化  ｏｆ  Ｏ−ＰＭＢ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−［１，２−2Ｈ４］エタノールアミン及びＯ−ＰＭＢ−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミンから調製される）。
【００５１】
本発明の一実施形態によると、［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン又は［18Ｆ］フルオロメチルコリンのＦＡＳＴｌａｂ（商標）合成は次の連続した工程を含む。
（ｉ）［18Ｆ］フッ素イオンのＱＭＡ上へのトラップ、
（ｉｉ）［18Ｆ］フッ素イオンのＱＭＡからの溶出、
（ｉｉｉ）［18Ｆ］ＦＣＨ２ＯＴｓの放射性合成、
（ｉｖ）［18Ｆ］ＦＣＨ２ＯＴｓのＳＰＥクリーンアップ、
（ｖ）反応容器のクリーンアップ、
（ｖｉ）反応容器及びＳＰＥ  ｔ−Ｃ１８  ｐｌｕｓに保持された［18Ｆ］フルオロメチルトシレートの同時乾燥、
（ｖｉｉ）アルキル化反応、
（ｖｉｉｉ）未反応のＯ−ＰＭＢ前駆体の除去、
（ｉｘ）脱保護及び処方。
各工程（ｉ）〜（ｉｘ）は以下により詳細に記載する。
【００５２】
本発明の一実施形態では、上記工程（ｉ）〜（ｉｘ）は本明細書に記載するカセットで行われる。本発明の一実施形態は自動合成プラットフォームで使用される工程（ｉ）〜（ｉｘ）を遂行することができるカセットである。本発明の一実施形態は保護された前駆体からの［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（［18Ｆ］−Ｄ４−ＦＣＨ）又は［18Ｆ］フルオロメチルコリンの放射性合成のためのカセットである。本発明のカセットの一例を図５ｂに示す。
【００５３】
（ｉ）［18Ｆ］フッ素イオンのＱＭＡ上へのトラップ
［18Ｆ］フッ素イオン（通例０．５〜５ｍＬのＨ２１８Ｏ中）をプレコンディショニング済みのＷａｔｅｒｓ  ＱＭＡカートリッジに通す。
【００５４】
（ｉｉ）［18Ｆ］フッ素イオンのＱＭＡからの溶出
表１に記載する溶出液を溶出液バイアルからシリンジ中に抜き取り、Ｗａｔｅｒｓ  ＱＭＡを通して反応容器中に入れる。この手順で、［18Ｆ］フッ素イオンが反応容器中に溶出される。水及びアセトニトリルを、「窒素／真空／加熱／冷却」の適切に設定された乾燥サイクルを用いて除去する。
【００５５】
（ｉｉｉ）［18Ｆ］ＦＣＨ２ＯＴｓの放射性合成
（ｉｉ）のＫ［18Ｆ］フッ化物／Ｋ２２２／Ｋ２ＣＯ３錯体を乾燥したら、Ｋ［18Ｆ］フッ化物／Ｋ２２２／Ｋ２ＣＯ３錯体を含有する反応容器にアセトニトリル及び水を含有する溶液中のＣＨ２（ＯＴｓ）２メチレンジトシレートを加える。得られた反応混合物を加熱し（通例１１０℃に１０分）、その後冷却する（通例７０℃に）。
【００５６】
（ｉｖ）［18Ｆ］ＦＣＨ２ＯＴｓのＳＰＥクリーンアップ
［18Ｆ］ＦＣＨ２ＯＴｓの放射性合成が完了し、反応容器を冷却したら、水を反応容器に加えて反応容器中の有機溶媒含有量を約２５％に低下させる。この希釈溶液を反応容器からｔ−Ｃ１８−ｌｉｇｈｔ及びｔ−Ｃ１８  ｐｌｕｓカートリッジを通して移す。これらのカートリッジをその後１２〜１５ｍＬの２５％アセトニトリル／７５％水溶液で濯ぐ。このプロセスの終了時、
メチレンジトシレートはｔ−Ｃ１８−ｌｉｇｈｔにトラップされたまま残り、
［18Ｆ］ＦＣＨ２ＯＴｓ、トシル−［18Ｆ］フッ化物はｔ−Ｃ１８  ｐｌｕｓにトラップされたまま残る。
【００５７】
（ｖ）反応容器のクリーンアップ
［18Ｆ］フルオロエチルトシレート及びＯ−ＰＭＢ−ＤＭＥＡ前駆体のアルキル化に先立って（エタノールを用いて）反応容器を清浄化した。
【００５８】
（ｖｉ）反応容器及びＳＰＥ  ｔ−Ｃ１８  ｐｌｕｓ上に保持された［18Ｆ］フルオロメチルトシレートの同時乾燥
クリーンアップ（ｖ）が完了したら、反応容器及びＳＰＥ  ｔ−Ｃ１８  ｐｌｕｓ上に保持された［18Ｆ］フルオロメチルトシレートを同時に乾燥した。
【００５９】
（ｖｉｉ）アルキル化反応
工程（ｖｉ）の後、ｔ−Ｃ１８  ｐｌｕｓ上に保持された［18Ｆ］ＦＣＨ２ＯＴを（トシル−［18Ｆ］フッ化物と共に）、アセトニトリル中のＯ−ＰＭＢ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−［１，２−2Ｈ４］エタノールアミン（又はＯ−ＰＭＢ−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン）の混合物を用いて反応容器中に溶出した。
【００６０】
Ｏ−ＰＭＢ前駆体による［18Ｆ］ＦＣＨ２ＯＴｓのアルキル化は、反応容器を加熱する（通例１１０℃で１５分）ことによって行い、［18Ｆ］フルオロ−［１，２−2Ｈ４］コリン（又はＯ−ＰＭＢ−［18Ｆ］フルオロコリン）を得た。
【００６１】
（ｖｉｉｉ）未反応のＯ−ＰＭＢ前駆体の除去
水（３〜４ｍＬ）を反応物に加え、次にこの溶液を前処理したＣＭカートリッジに通した後、エタノール（通例２×５ｍＬ）で洗浄すると（これにより、未反応のＯ−ＰＭＢ−ＤＭＥＡを除去する）、ＣＭカートリッジ上にトラップされた「精製された」［18Ｆ］フルオロ−［１，２−2Ｈ４］コリン（又はＯ−ＰＭＢ−［18Ｆ］フルオロコリン）が残った。
【００６２】
（ｉｘ）脱保護及び処方
塩酸をＣＭカートリッジに通してシリンジに入れた。この結果、Ｏ−ＰＭＢ−［18Ｆ］フルオロコリンの脱保護が生じた（シリンジは、ＨＣｌ溶液中に［18Ｆ］フルオロコリンを含有する）。次いで、このシリンジに酢酸ナトリウムを加えてｐＨ５〜８に緩衝し、酢酸緩衝液中に［18Ｆ］−Ｄ４−コリン（又は［18Ｆ］コリン）を得た。その後、この緩衝溶液を、適切な緩衝剤を含有する生成物バイアルに移す。
【００６３】
表１に、本発明の［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（Ｄ４−ＦＣＨ）（又は［18Ｆ］フルオロメチルコリン）放射性カセットの調製に必要とされる試薬及びその他の成分のリストを示す。
【００６４】
【表１】
2013538234.tif 000013
本発明の一実施形態によると、保護されてない前駆体を介する［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンのＦＡＳＴｌａｂ（商標）合成は下記スキーム６に示す連続した工程を含む。
【００６５】
【化１１】
2013538234.tif 000014
本発明の一実施形態では、上記工程（１）〜（１１）は本明細書に記載するカセットで行われる。本発明の一実施形態は自動合成プラットフォームで使用される工程（１）〜（１１）を遂行することができるカセットである。本発明の一実施形態は保護されてない前駆体からの［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（［18Ｆ］−Ｄ４−ＦＣＨ）の放射性合成のためのカセットである。本発明のカセットの一例を図５ａに示す。
【００６６】
表２に、本発明の保護されてない前駆体放射性カセットによる［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（Ｄ４−ＦＣＨ）（又は［18Ｆ］フルオロメチルコリン）の調製に必要とされる試薬及びその他の成分のリストを提供する。
【００６７】
【表２】
2013538234.tif 000015
イメージング方法
本明細書に記載した本発明の放射性標識化合物は、細胞の輸送体を介して、又は拡散により細胞中に取り込まれる。コリンキナーゼが過剰発現されるか又は活性化される細胞において、本明細書に記載した本発明の放射性標識化合物は、リン酸化され、その細胞内に捕捉される。これは、新生物組織を検出する主要なメカニズムを形成する。
【００６８】
本発明はさらに、各々本明細書に記載された本発明の放射性標識化合物又は本発明の放射性標識化合物を含む医薬組成物を対象（被験体）に投与し、前記対象内の前記本発明の放射性標識化合物を検出する工程を含むイメージング方法を提供する。本発明はさらに、各々本明細書に記載された本発明の放射性標識化合物又は本発明の放射性標識化合物を含む医薬組成物を用いてインビボで新生物組織を検出する方法を提供する。そこで、本発明は、利用可能な治療処置に応答するか又はしない患者を容易に確認するための早期検出及び診断のより良好なツール、並びに改良された予後の計画及び方法を提供する。本発明の化合物の新生物組織を検出する能力の結果として、本発明はさらに、新生物組織に関連する疾患状態の処置に対する治療反応をモニターする方法を提供する。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載されている本発明のイメージング方法に使用される本発明の放射性標識化合物は、式（Ｉ）の放射性標識化合物である。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載されている本発明のイメージング方法に使用される本発明の放射性標識化合物は、式（ＩＩＩ）の放射性標識化合物である。
【００７１】
当業者には理解されるように、イメージングのタイプ（例えば、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ）は、放射性同位体の種類により決定される。例えば、式（Ｉ）の放射性標識化合物が18Ｆを含有する場合、これはＰＥＴイメージングに適している。
【００７２】
そこで、本発明は、以下の工程を含む新生物組織をインビボで検出する方法を提供する。
ｉ）各々本明細書で定義されている本発明の放射性標識化合物又は本発明の放射性標識化合物を含む医薬組成物を対象に投与する。
ｉｉ）前記本発明の放射性標識化合物を前記対象の新生物組織に結合させる。
ｉｉｉ）前記結合した本発明の放射性標識化合物内の前記放射性同位体から放出されるシグナルを検出する。
ｉｖ）前記シグナルの位置及び／又は量を表す画像を生成する。
ｖ）前記対象内の前記新生物組織の分布及び範囲を決定する。
【００７３】
本発明の放射性標識化合物を「投与する」工程は好ましくは非経口的に、最も好ましくは静脈内に行う。静脈内経路は、対象の体内全体に化合物を送達する最も効率的な方法を表す。静脈内投与は、対象に対して、実質的な物理的介在も、実質的な健康上のリスクも示さない。本発明の放射性標識化合物は好ましくは、本明細書で定義される本発明の放射性医薬組成物として投与される。投与工程は、本発明のイメージング方法の完全な定義には必要とされない。すなわち、本発明のイメージング方法は、本発明の放射性標識化合物を予め投与してある対象に対して行われる上記定義の工程（ｉｉ）〜（ｖ）からなるものとして理解することもできる。
【００７４】
投与工程の後、そして検出工程の前に、本発明の放射性標識化合物を新生物組織に結合させる。例えば、対象が完全(ｉntact)な哺乳類である場合、本発明の放射性標識化合物は哺乳類の体内を動力学的に移動し、その様々な組織と接触する。本発明の放射性標識化合物が新生物組織と接触すると、その新生物組織と結合する。
【００７５】
本発明の方法の「検出する」工程は、本発明の放射性標識化合物に含まれる放射性同位体により放出されたシグナルを、前記シグナルに対して感受性の検出器、例えば、ＰＥＴカメラによって検出することを含んでいる。この検出工程は、シグナルデータの収集と理解することもできる。
【００７６】
本発明の方法の「生成する」工程は、収集したシグナルデータに再構成アルゴリズムを適用するコンピューターによって実行されて、データセットが得られる。次にこのデータセットを処理して、放射性同位体により放出されたシグナルの位置及び／又は量を示す画像を生成する。放出されたシグナルは酵素又は新生物組織の量と直接関連しているので、「決定する」工程は生成した画像を評価することによって行うことができる。
【００７７】
本発明の「対象（被験体）」はあらゆるヒト又は動物の対象（被験体）であることができる。好ましくは、本発明の対象は哺乳類である。最も好ましくは、前記対象はインビボの完全な哺乳類の身体である。殊に好ましい実施形態では、本発明の対象はヒトである。
【００７８】
「新生物組織に関連する疾患状態」は新生物組織の存在の結果であるあらゆる疾患状態であることができる。かかる疾患状態の例としては、限定されることはないが、腫瘍、癌（例えば、前立腺、乳腺、肺、卵巣、膵臓、脳及び結腸）がある。本発明の好ましい実施形態では、新生物組織に関連する疾患状態は脳、乳、肺、食道、前立腺、又は膵臓癌である。
【００７９】
当業者には理解されるように、「処理」は新生物組織に関連する疾患状態に依存する。例えば、新生物組織に関連する疾患状態が癌である場合、処理は、限定されることはないが、手術、化学療法及び放射線療法を含むことができる。そこで、本発明の方法は新生物組織に関連する疾患状態に対する処理の有効性をモニターするのに使用することができる。
【００８０】
新生物以外でも、本発明の放射性標識化合物は、肝疾患、脳障害、腎疾患及び正常な細胞の増殖に関連する様々な疾患にも有用であり得る。本発明の放射性標識化合物はまた、炎症のイメージング、関節リウマチ及び膝滑膜炎を含む炎症過程のイメージング、並びに関節硬化症プラークを含む心血管疾患のイメージングにも有用であり得る。
【００８１】
前駆体化合物
本発明は、次式（ＩＩ）の前駆体化合物を提供する。
【００８２】
【化１２】
2013538234.tif 000016
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は各々独立に水素又は重水素（Ｄ）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、−ＣＨ（Ｒ８）２、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８は独立に水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍは１〜４の整数である。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態では、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が各々独立に水素であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８が水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍが１〜４の整数である、式（ＩＩ）の化合物が提供される。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態では、
Ｒ１及びＲ２が各々水素であり、
Ｒ３及びＲ４が各々重水素（Ｄ）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８が水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍが１〜４の整数である、式（ＩＩ）の化合物が提供される。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態では、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が各々重水素（Ｄ）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８が水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍが１〜４の整数である、式（ＩＩ）の化合物が提供される。
【００８６】
本発明によると、式（ＩＩ）の化合物は次式（ＩＩａ）の化合物である。
【００８７】
【化１３】
2013538234.tif 000017
本発明の一実施形態では、次式（ＩＩｂ）の化合物が提供される。
【００８８】
【化１４】
2013538234.tif 000018
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は各々独立に水素又は重水素（Ｄ）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、−ＣＨ（Ｒ８）２、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８は独立に水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍは１〜４の整数であり、
Ｐｇは、ヒドロキシル保護基である。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態では、Ｐｇがｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、又はジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基である、式（ＩＩｂ）の化合物が提供される。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態では、Ｐｇがｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）基である式（ＩＩｂ）の化合物が提供される。
【００９１】
本発明の一実施形態では、次式（ＩＩｃ）の化合物が提供される。
【００９２】
【化１５】
2013538234.tif 000019
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は各々独立に水素又は重水素（Ｄ）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、−ＣＨ（Ｒ８）２、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８は独立に水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍは１〜４の整数である。
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が各々水素である場合、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々水素ではなく、また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が各々重水素である場合、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は各々水素ではない。
【００９３】
本発明の好ましい実施形態では、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が各々独立に水素であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８が水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍが１〜４の整数であるが、但しＲ５、Ｒ６及びＲ７が各々水素ではない、式（ＩＩｃ）の化合物が提供される。
【００９４】
本発明の好ましい実施形態では、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が各々重水素（Ｄ）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が各々独立に水素、Ｒ８、−（ＣＨ２）ｍＲ８、−（ＣＤ２）ｍＲ８、−（ＣＦ２）ｍＲ８、又は−ＣＤ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８が水素、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＤ３、−ＣＤ２ＯＨ、−ＣＤ２Ｆ、ＣＤ２Ｃｌ、ＣＤ２Ｂｒ、ＣＤ２Ｉ又は−Ｃ６Ｈ５であり、
ｍが１〜４の整数であるが、但しＲ５、Ｒ６及びＲ７が各々水素ではない、式（ＩＩｃ）の化合物が提供される。
【００９５】
本発明の好ましい実施形態では、
Ｒ１及びＲ２が各々水素であり、
Ｒ３及びＲ４が各々重水素（Ｄ）である、式（ＩＩｃ）の化合物が提供される。
【００９６】
式（ＩＩ）の前駆体化合物、例えば式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）及び（ＩＩｃ）の化合物は、本明細書に記載するものを含めて当技術分野で公知の任意の手段により製造することができる。例えば、式（ＩＩａ）の化合物は、下記スキーム１に示されるように、炭酸カリウムの存在下２−ブロモエタノール−１，１，２，２−ｄ４によるＴＨＦ中でのジメチルアミンのアルキル化によって合成することができる。
【００９７】
【化１６】
2013538234.tif 000020
ここで、ｉ＝Ｋ２ＣＯ３、ＴＨＦ、５０℃、１９ｈである。所望のテトラ重水素化生成物は蒸留により精製することができる。デューテリオクロロホルム中の式（ＩＩａ）の化合物の1Ｈ  ＮＭＲスペクトル（図３）は、Ｎ，Ｎ−ジメチル基及びアルコールのヒドロキシルに関連するピークのみを示しており、エチルアルコール鎖のメチレン基の水素に関連するピークは観察されなかった。これと一致して、13Ｃ  ＮＭＲスペクトル（図３）は、Ｎ，Ｎ−ジメチル炭素に関連する大きい一重線を示した。しかし、６０．４ｐｐｍ及び６２．５ｐｐｍのエチルアルコールメチレン炭素のピークは大きさが実質的に低下しており、炭素−水素共有結合の存在に関連するシグナル増大の不在を示唆した。加えて、メチレンピークはいずれも多重線に分裂しており、スピン−スピンカップリングを示している。13Ｃ  ＮＭＲは通例1Ｈデカップリングを伴うので、観察された多重性は炭素−重水素結合の結果であるはずである。上記観察を基にして、所望の生成物の同位体純度は（1Ｈ同位体に対して）2Ｈ同位体が＞９８％であると考えられる。
【００９８】
式（ＩＩ）の前駆体化合物のジ重水素化類似体は、下記スキーム２に示されているように、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンから水素化アルミニウムリチウム還元を介して合成することができる。
【００９９】
【化１７】
2013538234.tif 000021
ここで、ｉ＝ＬｉＡｌＤ４、ＴＨＦ、６５℃、２４ｈである。13Ｃ  ＮＭＲ分析は、（1Ｈ同位体に対して）９５％を超える2Ｈ異性体の同位体純度を達成することができることを示していた。
【０１００】
本発明によると、式（ＩＩ）の化合物、例えば式（ＩＩａ）の化合物のヒドロキシル基をさらに保護基により保護して次式（ＩＩｂ）の化合物を得ることができる。
【０１０１】
【化１８】
2013538234.tif 000022
ここで、Ｐｇは当技術分野で公知の任意のヒドロキシル保護基である。好ましくは、Ｐｇは、酸に対して不安定なヒドロキシル保護基、例えば、”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”第３版、Ａ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，１７−２００頁に記載されているものである。好ましくは、Ｐｇはｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、又はジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基である。より好ましくは、Ｐｇはｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）基である。
【０１０２】
［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（Ｄ４−ＦＣＨ）の検証
同位体置換の結果得られる酸化に対する安定性を、標準として［18Ｆ］フルオロメチルコリンを用いるインビトロの化学及び酵素モデルで評価した。次に、［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンをインビボモデルで評価し、［11Ｃ］コリン、［18Ｆ］フルオロメチルコリン及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１−2Ｈ２］コリンと比較した。
【０１０３】
【化１９】
2013538234.tif 000023
過マンガン酸カリウム酸化研究
最初に、結合強度に対する重水素置換の影響を、過マンガン酸カリウムを用いて［18Ｆ］フルオロメチルコリン及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンの化学的酸化パターンの評価により試験した。下記スキーム６に、室温における［18Ｆ］フルオロメチルコリン及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンの塩基により触媒される過マンガン酸カリウム酸化の詳細を示す。予め選択された時点で試料を取り出し、放射性ＨＰＬＣで分析した。
【０１０４】
【化２０】
2013538234.tif 000024
試薬及び条件：ｉ）ＫＭｎＯ４、Ｎａ２ＣＯ３、Ｈ２Ｏ、ｒｔ。
【０１０５】
結果を図６及び７に要約して示す。放射性ＨＰＬＣクロマトグラム（図６）は、［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンに関して、２０分で、より大きな割合の親の化合物が残っていることを示した。図７のグラフはさらに、重水素化された類似体［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンに対する重要な同位体効果を示しており、過マンガン酸カリウムでの処理の１時間後ほぼ８０％の親化合物がまだ存在するのに対して同じ時点で親の化合物［18Ｆ］フルオロメチルコリンの４０％未満がまだ存在する。
【０１０６】
コリンオキシダーゼモデル
［18Ｆ］フルオロメチルコリン及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンをコリンオキシダーゼモデル（Roivainen, A., et al., European Journal of Nuclear Medicine 2000; 27:25-32）で評価した。図８のグラフ表示は、明らかに、この酵素酸化モデルにおいて、重水素化された化合物が、対応する非重水素化化合物より遥かに安定であることを示している。６０分の時点でのコリン種の放射性ＨＰＬＣ分布によると、［18Ｆ］フルオロメチルコリンに関して、親の放射性トレーサーは１１±８％のレベルで存在し、６０分で対応する親の重水素化された放射性トレーサー［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンは２９±４％存在していた。関連する放射性ＨＰＬＣクロマトグラムを図９に示す。この図は、［18Ｆ］フルオロメチルコリンと比べて［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］−コリンの増大した酸化安定性をさらに例示している。これらの放射性ＨＰＬＣクロマトグラムは「未知」と記した第３のピークを含有しているが、これは中間の酸化生成物ベタインアルデヒドであると推測される。
【０１０７】
インビボ安定性分析
［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］−コリンはインビボで酸化に対してより耐性である。２つの同位体放射性標識コリン化学種［18Ｆ］フルオロメチルコリン及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］−コリン、並びにそれぞれの代謝産物［18Ｆ］フルオロメチルコリン−ベタイン（［18Ｆ］−ＦＣＨ−ベタイン）及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］−コリン−ベタイン（［18Ｆ］−Ｄ４−ＦＣＨ−ベタイン）の酸化の相対的な速度を、放射性トレーサーの静脈内投与後マウス血漿中において高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で評価した。［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］−コリンは、酸化に対して［18Ｆ］フルオロメチルコリンより顕著に安定であることが判明した。図１０に示されているように、［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］−コリンは［18Ｆ］フルオロメチルコリンより著しく安定であった。マウスへの静脈内注射後１５分で［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］−コリンから［18Ｆ］−Ｄ４−ＦＣＨ−ベタインへの〜４０％の変換に対して、［18Ｆ］フルオロメチルコリンから［18Ｆ］−ＦＣＨ−ベタインへの変換は〜８０％であった。インビボ酸化の経時変化を図１０に示す。この図は、［18Ｆ］フルオロメチルコリンに対する［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］−コリンの全体的な改良された安定性を示している。
【０１０８】
生体内分布
経時的生体内分布
経時的生体内分布試験は、［18Ｆ］フルオロメチルコリン、［18Ｆ］フルオロメチル−［１−2Ｈ２］コリン及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンに対して、ＨＣＴ１１６ヒト結腸異種移植片をもつヌードマウスで行った。組織は注射後２、３０及び６０分で集めた。データを図１１Ａ〜Ｃに要約して示す。［18Ｆ］フルオロメチルコリンに対する取込値は、先の研究（ＤｅＧｒａｄｏ，Ｔ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  18Ｆ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｏｌｉｎｅ  ａｓ  ａｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ  Ｔｒａｃｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０００；６１：１１０−７）と基本的に一致した。取込プロフィールの比較により、重水素化された化合物［18Ｆ］フルオロメチル−［１−2Ｈ２］−コリン及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］−コリンに関して、心臓、肺及び肝臓で放射性トレーサーの低下した取込が明らかになった。３つの放射性トレーサーに対する腫瘍取込プロフィールを図１１Ｄに示す。図は、全ての時点で［18Ｆ］フルオロメチルコリンと比べて重水素化された化合物に対する放射性トレーサーの増大した局在化を示している。より遅い時点で［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンの腫瘍取込が著しく増大することが明らかである。
【０１０９】
コリン代謝産物の分布
ＨＰＬＣによる肝臓、腎臓及び腫瘍を含む組織の代謝産物分析も行った。組織内における［18Ｆ］ＦＣＨ及び［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ並びにそれぞれの代謝産物の典型的なＨＰＬＣクロマトグラムを図１２に示す。代謝産物の腫瘍分布を同様に分析した（図１３）。コリン及びその代謝産物はＵＶ発色団を欠いており、放射活性クロマトグラムと同時に非放射性非標識化合物のクロマトグラムの提示を許容する。従って、代謝産物の存在は他の化学的及び生物学的手段で確認した。注目すべきことに、代謝産物の特徴付けには同じクロマトグラフィー条件を使用し、保持時間は同様であった。ホスホコリンピークの同一性は、アルカリ性ホスファターゼで未処理のＨＣＴ１１６腫瘍細胞で形成される推定ホスホコリンのインキュベーションにより生化学的に確認した（図１４）。
【０１１０】
［18Ｆ］ＦＣＨ及び［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨの両方で注射後３０分に高割合の肝臓放射活性がホスホコリンとして存在していた（図１２）。［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨで処理したマウスの肝臓（７．４±２．３％）及び腎臓（８．８±０．２％）試料の両方で未知の代謝産物（おそらくアルデヒド中間体）が観察された。対照的に、この未知の代謝産物は、［18Ｆ］ＦＣＨで処理したマウスの肝臓試料では見られず、腎臓試料では小程度（３．３±０．６％）のみであった。特に、［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨに由来する腎臓放射活性の６０．６±３．７％がホスホコリンであったのに対して、［18Ｆ］ＦＣＨ由来は３１．８±９．８％であった（Ｐ＝０．０３）。逆に、腎臓における［18Ｆ］ＦＣＨ由来の放射活性の殆どが［18Ｆ］ＦＣＨ−ベタインの形態であり、［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨの２０．６±６．２％に対して５３．５±５．３％であった（図１２）。血漿中のベタインのレベルは肝臓及び腎臓のような組織内のレベルを反映するということができよう。腫瘍は肝臓及び腎臓と比べて異なるＨＰＬＣプロフィールを示した。腫瘍試料の分析（［18Ｆ］ＦＣＨ、［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ及び［11Ｃ］コリンの静脈内注射後３０分）から得られた典型的な放射性ＨＰＬＣクロマトグラムを図１２に示す。腫瘍において、放射活性は［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨの場合主としてホスホコリンの形態であった（図１３）。対照的に、［18Ｆ］ＦＣＨは顕著なレベルの［18Ｆ］ＦＣＨ−ベタインを示した。遅れたイメージングの上で、これらの結果は、［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨが、より解釈し易い取込プロフィールを伴うＰＥＴイメージングのための優れた放射性トレーサーであることを示している。
【０１１１】
本発明の複数の局面に存在するあらゆる特徴の適切で好ましい局面は本明細書に記載されている第１の局面における前記特徴に対して定義されている通りである。以下、一連の非限定例により本発明を例証する。
【０１１２】
同位体炭素コリン類似体
本発明は、本明細書に記載されている式（ＩＩＩ）の化合物を提供する。かかる化合物は、本明細書に記載されているように腫瘍イメージングのＰＥＴ造影剤として有用である。特に、本明細書に記載されている式（ＩＩＩ）の化合物は、尿中に排泄されないので、前立腺癌のような骨盤悪性腫瘍のより特異的なイメージングを提供する。
【０１１３】
本発明は、式（ＩＩＩ）の化合物を製造する方法を提供し、この方法は式（ＩＩ）の前駆体化合物と式（ＩＶ）の化合物との反応で式（ＩＩＩ）の化合物を形成することを含んでいる（スキームＡ）。
【０１１４】
【化２１】
2013538234.tif 000025
ここで、式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）の化合物は各々本明細書に記載されている通りであり、式（ＩＶ）の化合物は次式の通りである。
ＺＸＹＣ*−Ｌｇ        （ＩＶ）
式中、Ｃ*、Ｘ、Ｙ及びＺは各々式（ＩＩＩ）の化合物に関して本明細書で定義されている通りであり、「Ｌｇ」は脱離基である。「Ｌｇ」の適切な例としては、限定されることはないが、臭素（Ｂｒ）及びトシレート（ＯＴｏｓ）がある。式（ＩＶ）の化合物は本明細書中に記載されているもの（例えば、実施例５及び７と同様）を含めて当技術分野で公知のあらゆる手段により製造することができる。
【実施例】
【０１１５】
試薬と溶媒はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）から購入し、さらに精製することなく使用した。塩化フルオロメチルコリン（参照標準）はＡＢＣＲ  Ｇｍｂｈ  ＆  Ｃｏ．（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。等張の生理的食塩水（０．９％ｗ／ｖ）はＨａｍｅｌｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ、ＵＫ）から購入した。ＮＭＲスペクトルは４００ＭＨｚ（1Ｈ  ＮＭＲ）及び１００ＭＨｚ（13Ｃ  ＮＭＲ）又は６００ＭＨｚ（1Ｈ  ＮＭＲ）及び１５０ＭＨｚ（13Ｃ  ＮＭＲ）で作動するＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＮＭＲ機を用いて得た。精密質量分光分析は陽電子イオン化（ＥＩ）又は化学イオン化（ＣＩ）モードのＷａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ機で行った。蒸留はＢｕｅｃｈｉ  Ｂ−５８５ガラスオーブン（Ｂｕｅｃｈｉ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて行った。
【０１１６】
実施例１．Ｎ，Ｎ−ジメチル−［１，２−2Ｈ４］−エタノールアミン（３）の調製
【０１１７】
【化２２】
2013538234.tif 000026
乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＫ２ＣＯ３（１０．５０ｇ、７６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ジメチルアミン（２．０Ｍ、ＴＨＦ中）（３８ｍＬ、７６ｍｍｏｌ）、次いで２−ブロモエタノール−１，１，２，２−ｄ４（４．９０ｇ、３８ｍｍｏｌ）を加え、この懸濁液をアルゴン下５０℃に加熱した。１９ｈ後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（酢酸エチル／アルミナ／Ｉ２）が（２）の完全な変換を示した。反応混合物を周囲温度に放冷し、ろ過した。次に、減圧下で大部分の溶媒を除去した。蒸留により、所望の生成物（３）を無色液体として得た。沸点７８℃／８８ｍｂａｒ（１．９３ｇ、５５％）。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ  ３．４０（ｓ、１Ｈ、ＯＨ）、２．２４（ｓ、６Ｈ、Ｎ（ＣＨ３）２）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δ  ６２．６（ＮＣＤ２ＣＤ２ＯＨ）、６０．４（ＮＣＤ２ＣＤ２ＯＨ）、４７．７（Ｎ（ＣＨ３）２）。ＨＲＭＳ（ＥＩ）＝９３．１０９３（Ｍ＋）。Ｃ４Ｈ７2Ｈ４ＮＯは９３．１０９２を要する。
【０１１８】
実施例２．Ｎ，Ｎ−ジメチル−［１−2Ｈ２］−エタノールアミン（５）の調製
【０１１９】
【化２３】
2013538234.tif 000027
乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＮ，Ｎ−ジメチルグリシン（０．５２ｇ、５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、重水素化アルミニウムリチウム（０．５３ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）を加え、得られた懸濁液をアルゴン下で還流した。２４ｈ後懸濁液を周囲温度に放冷し、飽和水性Ｎａ２ＳＯ４（１５ｍＬ）上に注ぎ、１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３でｐＨ８に調節した後、エーテル（３×１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。蒸留により、所望の生成物（５）を無色液体として得た。沸点６５℃／２６ｍｂａｒ（０．０６ｇ、１３％）。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ  ２．４３（ｓ、２Ｈ、ＮＣＨ２ＣＤ２）、２．２５（ｓ、６Ｈ、Ｎ（ＣＨ３）２）、１．４３（ｓ、１Ｈ、ＯＨ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１５０ＭＨｚ）δ  ６３．７（ＮＣＨ２ＣＤ２ＯＨ）、５７．８（ＮＣＨ２ＣＤ２ＯＨ）、４５．７（Ｎ（ＣＨ３）２）。
【０１２０】
実施例３．フルオロメチルトシレート（８）の調製
【０１２１】
【化２４】
2013538234.tif 000028
メチレンジトシレート（７）を確立された文献の手順に従って調製した。分析データは報告された値と一致した（Ｅｍｍｏｎｓ、Ｗ．Ｄ．、ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９５３；７５：２２５７、及びＮｅａｌ、Ｔ．Ｒ．、ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ２００５；４８：５５７−６８）。
【０１２２】
乾燥アセトニトリル（１０ｍＬ）中のメチレンジトシレート（７）（０．６７ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ  Ｋ２２２［４，７，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−１，１０−ジアザビシクロ［８．８．８］ヘキサコサン］（１．００ｇ、２．６５ｍｍｏｌ）、次いでフッ化カリウム（０．１６ｇ、２．８３ｍｍｏｌ）を加えた。次に、懸濁液を窒素下で１１０℃に加熱した。１ｈ後ＴＬＣ（７：３ヘキサン／酢酸エチル／シリカ／ＵＶ２５４）が、（７）の完全な変換を示した。反応混合物を酢酸エチル（２５ｍＬ）で希釈し、水（２×１５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥した。クロマトグラフィー（５→１０％酢酸エチル／ヘキサン）により、所望の生成物（８）を無色の油として得た（４０ｍｇ、１１％）。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ  ７．８６（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８Ｈｚ、アリールＣＨ）、７．３９（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８Ｈｚ、アリールＣＨ）、５．７７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝５２Ｈｚ、ＣＨ２Ｆ）、２．４９（ｓ、３Ｈ、トリルＣＨ３）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  １４５．６（アリール）、１３３．８（アリール）、１２９．９（アリール）、１２７．９（アリール）、９８．１（ｄ、Ｊ＝２２９Ｈｚ、ＣＨ２Ｆ）、２１．７（トリルＣＨ３）。ＨＲＭＳ（ＣＩ）＝２２２．０６０４（Ｍ＋ＮＨ４）＋。Ｃ８Ｈ１３ＦＮＯ３Ｓとした計算値２２２．０６００。
【０１２３】
実施例４．Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン（Ｏ−４−メトキシベンジル）エーテル（Ｏ−ＰＭＢ−ＤＭＥＡ）の調製
【０１２４】
【化２５】
2013538234.tif 000029
乾燥したフラスコに、ジメチルエタノールアミン（４．４６ｇ、５０ｍｍｏｌ）と乾燥ＤＭＦ（５０ｍＬ）を加えた。この溶液をアルゴン下で攪拌し、氷浴で冷却した。次に、水素化ナトリウム（２．０ｇ、５０ｍｍｏｌ）を少しずつ１０分間にわたって加えた後、反応混合物を室温まで暖めさせた。３０分後塩化４−メトキシベンジル（３．９２ｇ、２５ｍｍｏｌ）を滴下して１０分間にわたって加え、得られた混合物をアルゴン下で攪拌し続けた。６０ｈ後ＧＣ−ＭＳが反応の完了を示した（塩化４−メトキシベンジルの消失）。反応混合物を１Ｍ水酸化ナトリウム（１００ｍＬ）上に注ぎ、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（３×３０ｍＬ）で抽出した後乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。カラムクロマトグラフィー（０→１０％メタノール／ＤＣＭ；中性シリカ）により、所望の生成物（Ｏ−ＰＭＢ−ＤＭＥＡ）を黄色の油として得た（１．４６ｇ、２８％）。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ  ７．２８（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、アリールＣＨ）、６．８９（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、アリールＣＨ）、４．４９（ｓ、２Ｈ、−ＣＨ２−）、３．８１（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ３）、３．５４（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．８、ＮＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、２．５４（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．８、ＮＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、２．２８（ｓ、６Ｈ、Ｎ（ＣＨ３）２）。ＨＲＭＳ（ＥＳ）＝２１０．１４９７（Ｍ＋Ｈ＋）。Ｃ１２Ｈ２０ＮＯ２は２１０．１４９４を要する。
【０１２５】
実施例４ａ．Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン（Ｏ−４−メトキシベンジル）エーテル（Ｏ−ＰＭＢ−ＤＭＥＡ）の重水素化された類似体の調製
Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン（Ｏ−４−メトキシベンジル）エーテルの二及びテトラ重水素化類似体は適当な二又はテトラ重水素化ジメチルエタノールアミンから実施例４に従って調製することができる。
【０１２６】
実施例５．［18Ｆ］フルオロメチルトシレート（９）の合成の調製
【０１２７】
【化２６】
2013538234.tif 000030
Ｋ２ＣＯ３（０．５ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ、１００ｍＬの水に溶解）、１８−クラウン−６（１０．３ｍｇ、３９ｍｍｏｌ）及びアセトニトリル（５００μＬ）の混合物を含有するＷｈｅａｔｏｎバイアルに、［18Ｆ］フッ素イオン（〜２０ｍＣｉ、１００μＬ水中）を加えた。次に、溶媒を窒素気流下（１００ｍＬ／分）１１０℃で除去した。その後、アセトニトリル（５００μＬ）を加え、乾燥するまで蒸留を続けた。この手順を二回繰り返した。次に、３％の水を含有するアセトニトリル（２５０μＬ）中のメチレンジトシレート（７）（６．４ｍｇ、１８ｍｍｏｌ）の溶液を周囲温度で加えた後、分析用放射性ＨＰＬＣでモニターしながら１０〜１５分１００℃に加熱した。１：１アセトニトリル／水（１．３ｍＬ）の添加により反応を停止させ、半調製用放射性ＨＰＬＣで精製した。［18Ｆ］フルオロメチルトシレート（９）を含有する溶出液の画分を集め、水で最終容積２０ｍＬに希釈した後、Ｓｅｐ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ｌｉｇｈｔカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）（ＤＭＦ（５ｍＬ）と水（１０ｍＬ）でプレコンディショニング）に固定化した。このカートリッジをさらに水（５ｍＬ）で洗浄し、［18Ｆ］フルオロメチルトシレート（９）を保持するカートリッジを窒素気流中で２０分乾燥した。［18Ｆ］（１３）の合成の典型的なＨＰＬＣ反応プロフィールを図４Ａ／４Ｂに示す。
【０１２８】
実施例６．［18Ｆ］フルオロブロモメタンとの反応による［18Ｆ］フルオロメチルコリン誘導体の放射性合成
【０１２９】
【化２７】
2013538234.tif 000031
［18Ｆ］フルオロブロモメタン（Ｂｅｒｇｍａｎら（Ａｐｐｌ  Ｒａｄｉａｔ  Ｉｓｏｔ  ２００１；５４（６）：９２７−３３）に従って調製）を、乾燥アセトニトリル（１ｍＬ）中にアミン前駆体Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン（１５０μＬ）又はＮ，Ｎ−ジメチル−［１，２−2Ｈ４］エタノールアミン（３）（１５０μＬ）を含有し、０℃に予め冷却したＷｈｅａｔｏｎバイアルに加えた。このバイアルを密閉した後１００℃に１０分加熱した。次に、大部分の溶媒を窒素気流下で除去した後、残っている試料を水（１０ｍＬ）中の５％エタノールに再溶解させ、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  ＣＭ  ｌｉｇｈｔカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）（２Ｍ  ＨＣｌ（５ｍＬ）と水（１０ｍＬ）でプレコンディショニング）上に固定化して塩素イオンの陰イオン交換を行った。次にこのカートリッジをエタノール（１０ｍＬ）と水（１０ｍＬ）で洗浄した後、生理的食塩水（０．５〜２．０ｍＬ）を用いて放射性トレーサー（１１ａ）又は（１１ｃ）を溶出させ、無菌フィルター（０．２μｍ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に通した。
【０１３０】
実施例７．［18Ｆ］フルオロメチルメチルトシレートとの反応による［18Ｆ］フルオロメチルコリン、［18Ｆ］フルオロメチル−［１−2Ｈ２］コリン及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリンの放射性合成
【０１３１】
【化２８】
2013538234.tif 000032
乾燥ＤＭＦ（３００μＬ）を用いてＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジから溶出させた［18Ｆ］フルオロメチルトシレート（９）（実施例５に従って調製）を、前駆体Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン（１５０μＬ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−［１，２−2Ｈ４］エタノールアミン（３）（１５０μＬ）（実施例１に従って調製）、又はＮ，Ｎ−ジメチル−［１−2Ｈ２］エタノールアミン（５）（１５０μＬ）（実施例２に従って調製）の１つを含有するＷｈｅａｔｏｎバイアルに加え、攪拌しながら１００℃に加熱した。２０分後水（１０ｍＬ）で反応を停止させ、Ｓｅｐ  Ｐａｋ  ＣＭ  ｌｉｇｈｔカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）（２Ｍ  ＨＣｌ（５ｍＬ）と水（１０ｍＬ）でプレコンディショニング）上に固定化して塩素イオンの陰イオン交換を行った後エタノール（５ｍＬ）と水（１０ｍＬ）で洗浄し、次いで放射性トレーサー［18Ｆ］フルオロメチルコリン（１２ａ）、［18Ｆ］フルオロメチル−［１−2Ｈ２］コリン（１２ｂ）又は［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン［18Ｆ］（１２ｃ）を等張の生理的食塩水（０．５〜１．０ｍＬ）で溶出した。
【０１３２】
実施例８．非放射性フルオロメチルトシレート（１５）の合成
【０１３３】
【化２９】
2013538234.tif 000033
上記スキーム３に従って次の反応を行った。
【０１３４】
（ａ）メチレンジトシレート（１４）の合成
Ｅｍｍｏｎｓ及びＦｅｒｒｉｓの方法を用いて、市販のジヨードメタン（１３）（２．６７ｇ、１０ｍｍｏｌ）を銀トシレート（６．１４ｇ、２２ｍｍｏｌ）と反応させて、メチレンジトシレート（１０）（０．９９ｇ）を２８％の収率で得た（Ｅｍｍｏｎｓ、Ｗ．Ｄ．、ら、」Ｍｅｔａｔｈｅｔｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓａｌｔｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ．ＩＩ．Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｋｙｌ  Ｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９５３；７５：２２５）。
【０１３５】
（ｂ）非放射性フルオロメチルトシレート（１５）の合成
アセトニトリル（１０ｍＬ）中のフッ化カリウム（０．１６ｇ、２．８３ｍｍｏｌ）／Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ  Ｋ２２２（１．０ｇ、２．６５ｍｍｏｌ）を用いて８０℃で実施例３（ａ）のメチレンジトシレート（１０）（０．６７ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）の親核置換によってフルオロメチルトシレート（１１）（０．０４ｇ）を調製し、所望の生成物を１１％の収率で得た。
【０１３６】
実施例９．［18Ｆ］フルオロブロモメタン（１７）の合成
【０１３７】
【化３０】
2013538234.tif 000034
Ｂｅｒｇｍａｎらの方法（Ａｐｐｌ  Ｒａｄｉａｔ  Ｉｓｏｔ  ２００１；５４（６）：９２７−３３）を改変して、市販のジブロモメタン（１６）をアセトニトリル中１１０℃で［18Ｆ］フッ化カリウム／Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ  Ｋ２２２と反応させて所望の［18Ｆ］フルオロブロモメタン（１７）を得、これをガスクロマトグラフィーで精製し、溶出により、アセトニトリル及び関連するコリン前駆体を含有する予め冷却されたバイアル中にトラップする。
【０１３８】
実施例１０．放射化学的な純度の分析
［18Ｆ］フルオロメチルコリン、［18Ｆ］フルオロメチル−［１−2Ｈ２］コリン及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン［18Ｆ］の放射化学的な純度を、市販のフルオロコリン塩化物標準と共に溶出させることによって確認した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３６２Ａ屈折率検出器（ＲＩＤ）及びＢｉｏｓｃａｎ  Ｆｌｏｗｃｏｕｎｔ  ＦＣ−３４００  ＰＩＮダイオード検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズのＨＰＬＣシステムを使用した。クロマトグラフィー分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８逆相カラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）で行い、５ｍＭヘプタンスルホン酸及びアセトニトリル（９０：１０ｖ／ｖ）を含む移動相を１．０ｍＬ／分の流量で送った。
【０１３９】
実施例１１．コリンオキシダーゼを用いた酵素的酸化研究
この方法は、Ｒｏｉｖａｎｎｅｎらの方法（Ｒｏｉｖａｉｎｅｎ、Ａ．、ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０００；２７：２５−３２）を改変した。［18Ｆ］フルオロメチルコリン又は［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン［18Ｆ］（１００μＬ、〜３．７ＭＢｑ）の試料を、水（１．９ｍＬ）を含有するバイアルに加えて原液を得た。コリンオキシダーゼ（０．０５単位／ｕＬ）を含有するリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７）（１０ｕＬ）を原液（１９０ｕＬ）の試料に加え、バイアルを室温に放置し、時々攪拌した。選択された時点（５、２０、４０及び６０分）で試料をＨＰＬＣ移動相（緩衝液Ａ、１．１ｍＬ）で希釈し、ろ過し（０．２２μｍフィルター）、次にその〜１ｍＬを分析のために１ｍＬ試料ループによってＨＰＬＣ上に注入した。クロマトグラフィー分離は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  Ｂｏｎｄａｐａｋ（７．８×３００ｍｍ）カラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）により、緩衝液Ａと緩衝液Ｂの移動相を用いて３ｍＬ／分で行った。この緩衝液Ａはアセトニトリル、エタノール、酢酸、１．０ｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム、水、及び０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム（８００：６８：２：３：１２７：１０［ｖ／ｖ］）を含有し、緩衝液Ｂは同じ構成成分を異なる割合（４００：６８：４４：８８：４００：１０［ｖ／ｖ］）で含有していた。勾配プログラムは１００％緩衝液Ａが６分、０〜１００％緩衝液Ｂが１０分、１００〜０％Ｂが２分、次いで０％Ｂが２分であった。
【０１４０】
実施例１２．生体内分布
ヒト結腸（ＨＣＴ１１６）腫瘍を既に報告されているようにしてオスのＣ３Ｈ−Ｈｅｊマウス（Ｈａｒｌａｎ、Ｂｉｃｅｓｔｅｒ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）で増殖させた（Ｌｅｙｔｏｎ、Ｊ．、ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００５；６５（１０）：４２０２−１０）。キャリパーを用いて腫瘍の寸法を連続的に測定し、腫瘍容積を式：容積＝（π／６）×ａ×ｂ×ｃで計算した。式中、ａ、ｂ、及びｃは腫瘍の３つの直交軸を表す。腫瘍が約１００ｍｍ3になったマウスを使用した。［18Ｆ］フルオロメチルコリン、［18Ｆ］フルオロメチル−［１−2Ｈ２］コリン及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（〜３．７ＭＢｑ）を各々尾静脈から覚醒した非処置の腫瘍担持マウスに注射した。放射性トレーサー注射後所定の時点（２、３０及び６０分）でマウスを終末麻酔下で犠牲にし、血液、血漿、腫瘍、心臓、肺、肝臓、腎臓及び筋肉を得た。組織の放射活性をガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ  ＩＩ  Ａｕｔｏ−Ｇａｍｍａ  ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏ、Ｐａｎｇｂｏｕｒｎｅ、ＵＫ）で測定し、崩壊補正した。データは組織グラム当たりパーセント注射服用量として表した。
【０１４１】
実施例１３．［18Ｆ］フルオロメチルコリン（［18Ｆ］ＦＣＨ）及び［18Ｆ］フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］コリン（［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ）のインビボ酸化電位
［18Ｆ］ＦＣＨ又は［18Ｆ］（Ｄ４−ＦＣＨ）（８０〜１００  μＣｉ）を尾静脈から麻酔した腫瘍をもたないＣ３Ｈ−Ｈｅｊマウスに注射した。イソフルオラン／Ｏ２／Ｎ２Ｏ麻酔を使用した。注射の２、１５、３０及び６０分後に得た血漿試料を液体窒素でスナップ冷凍し、〜８０℃で貯蔵した。分析のためには、試料を解凍し、４℃に保った。約０．２ｍＬの血漿に氷冷アセトニトリル（１．５ｍＬ）を加えた。次に、この混合物を遠心分離した（３分、１５４９３×ｇ、４℃）。回転蒸発器（Ｈｅｉｄｏｌｏｐｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧＭＢＨ  ＆  Ｃ０、Ｓｃｈｗａｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を浴温４５℃で用いて上清を蒸発乾固させた。残渣を移動相（１．１ｍＬ）に懸濁させ、澄ませ（０．２μｍフィルター）、ＨＰＬＣで分析した。肝臓試料を氷冷アセトニトリル（１．５ｍＬ）中でホモジナイズし、その後血漿試料として処理した。全ての試料を、γ−ＲＡＭ  Ｍｏｄｅｌ３放射性検出器（ＩＮ／ＵＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎｃ．、ＦＬ、ＵＳＡ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステムで分析した。分析は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ＳＣＸカラム（１０μ、２５０×４．６ｍｍ）並びに０．２５Ｍリン酸二水素ナトリウム（ｐＨ４．８）及びアセトニトリル（９０：１０ｖ／ｖ）を含み２ｍｌ／分の流量で流した移動相を用いた、Ｒｏｉｖａｎｎｅｎの方法に基づく（Ｒｏｉｖａｉｎｅｎ、Ａ．、ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０００；２７：２５−３２）。
【０１４２】
実施例１４．コリン代謝産物の分布
３０分に肝臓、腎臓、及び腫瘍試料を得た。全ての試料を液体窒素でスナップ冷凍した。分析のために、試料を解凍し、使用直前まで４℃に保った。〜０．２ｍＬの血漿に氷冷メタノール（１．５ｍＬ）を加えた。次に、この混合物を遠心分離した（３分、１５４９３ｘｇ、４ｊＣ）。回転蒸発器（Ｈｅｉｄｏｌｏｐｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を浴温４０℃で用いて上清を蒸発乾固させた。残渣を移動相（１．１ｍＬ）に懸濁し、澄ませ（０．２Ａｍフィルター）、ＨＰＬＣで分析した。肝臓、腎臓、及び腫瘍試料を、ＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ−２５ホモジナイザーを用いて氷冷メタノール（１．５ｍＬ）中でホモジナイズし、その後血漿試料（上記）として処理した。全ての試料を、γ−ＲＡＭモデル３γ−検出器（ＩＮ／ＵＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＬａｕｒａ  ３ソフトウェア（Ｌａｂｌｏｇｉｃ）を具備したＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で放射性ＨＰＬＣにより分析した。固定相は、Ｗａｔｅｒｓ  μＢｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８逆相カラム（３００×７．８ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）からなっていた。試料は、溶媒Ａ（アセトニトリル／水／エタノール／酢酸／１．０ｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム／０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、８００／１２７／６８／２／３／１０）及び溶媒Ｂ（アセトニトリル／水／エタノール／酢酸／１．０ｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム／０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、４００／４００／６８／４４／８８／１０）からなる移動相を用いて分析した。勾配は０％Ｂが６分、次に０→１００％Ｂが１０分、１００％Ｂが０．５分、１００→０％Ｂが１．５分、その後０％Ｂが２分で、流量３ｍＬ／分で流した。
【０１４３】
実施例１５．ＨＣＴ１１６腫瘍細胞による［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ及び［18Ｆ］ＦＣＨの代謝
ＨＣＴ１１６細胞をＴ１５０フラスコ内において三連で(ｉn trｉplｉcate)７０％コンフルエントになるまで増殖させた後ビヒクル（１％ＤＭＳＯ、増殖培地中）又はビヒクル中１μｍｏｌ／ＬのＰＤ０３２５９０１で２４ｈ処理した。細胞を１．１ＭＢｑの［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ又は［18Ｆ］ＦＣＨで１ｈパルス処理した。細胞を氷冷リン酸塩緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で３時間洗浄し、掻き取って５ｍＬのＰＢＳ中に入れ、５００×ｇで３分遠心分離した後、組織試料に関して上に記載したＨＰＬＣ分析のために２ｍＬの氷冷メタノールに再懸濁させた。５’−ホスフェートがＨＰＬＣクロマトグラムで同定されたピークであるという生化学的な証拠を得るために、培養した細胞を既に記載されている（Ｂａｒｔｈｅｌ、Ｈ．、ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；６３（１３）：３７９１−８）ようにしてアルカリ性ホスファターゼで処理した。簡潔に言うと、ＨＣＴ１１６細胞を１００ｍｍの皿で三連で増殖させ、５．０ＭＢｑ［18Ｆ］ＦＣＨと共に６０分３７℃でインキュベートして推定の［18Ｆ］ＦＣＨ−ホスフェートを形成させた。細胞を５ｍＬの氷冷ＰＢＳで二回洗浄した後、掻き取り、５ｍＬのＰＢＳ中７５０×ｇ（４℃、３分）で遠心分離した。細胞を、５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、及び０．５ｍｍｏｌ／ＬのＺｎＣｌ２を含有する１ｍＬの５ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中でホモジナイズし、１０単位の細菌の（タイプＩＩＩ）アルカリ性ホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）と共に３７℃で振盪水浴中で３０分インキュベートして、［18Ｆ］ＦＣＨ−ホスフェートを脱リン酸化した。氷冷メタノールを加えることにより反応を停止させた。試料を上記血漿と同様に処理し、放射性ＨＰＬＣで分析した。
【０１４４】
対照実験はアルカリ性ホスファターゼなしで行った。
【０１４５】
実施例１６．小動物ＰＥＴイメージング
ＰＥＴイメージング研究
動的［18Ｆ］ＦＣＨ及び［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨイメージングスキャンは、専用の小動物ＰＥＴスキャナーｑｕａｄ−ＨＩＤＡＣ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。この機器の特徴は既に記載されている（Ｂａｒｔｈｅｌ，Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；６３（１３）：３７９１−８）。尾静脈をスキャンするために、ビヒクル又は薬剤で処理したマウスを麻酔（イソフルオラン／Ｏ２／Ｎ２Ｏ）の誘導後カニューレ処置した。動物をサーモスタットで制御された治具（直腸温度が〜３７℃になるように調整）内に入れ、スキャナー内でうつぶせに配置した。［18Ｆ］ＦＣＨ又は［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ（２．９６〜３．７ＭＢｑ）を、尾静脈カニューレを介して注射し、スキャンを開始した。動的スキャンを、既に報告されているように６０分の期間にわたってリストモード形式で得た（Ｌｅｙｔｏｎ，Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００６；６６（１５）：７６２１−９）。得られたデータを画像再構成のために０．５ｍｍシノグラムビン及び１９の時間枠（０．５×０．５×０．５ｍｍボクセル、４×１５、４×６０、及び１１×３００）に区分した。この再構成は二次元のＨａｍｍｉｎｇフィルター（カットオフ０．６）を用いたフィルタ補正逆投影によって行った。画像データセットを、分析ソフトウェア（バージョン６．０、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ）を用いて視覚化した。３０〜６０分の動的データの累積画像を放射性トレーサー取込の視覚化のために使用し、対象領域(regｉon of ｉnterest)を描くのに用いた。対象領域は５つの隣接した腫瘍領域（各々０．５ｍｍの厚さ）に手作業で画定された。これらのスライスの動的データを各組織（肝臓、腎臓、筋肉、尿、及び腫瘍）に対して平均し、１９時点の各々で時間対放射活性曲線を得た。注射された放射活性を表す対応する全身の時間対放射活性曲線を、２００×１６０×１６０の再構成されたボクセルの全てで放射活性を加えることによって得た。腫瘍の放射活性を全身の放射活性に対して規格化し、ボクセル当たりのパーセント注射服用量（％ＩＤ／ｖｏｘ）として表した。６０分における放射性トレーサーの規格化された取込（％ＩＤ／ｖｏｘ６０）をその後の比較に用いた。腫瘍の不均一性及び腫瘍における壊死性の領域の存在を説明するために、腫瘍の５つのスライスの規格化された最大のボクセル強度％ＩＤｖｏｘ６０ｍａｘの平均も比較に用いた。曲線下の面積を０〜６０分の％ＩＤ／ｖｏｘの積分値として計算した。
【０１４６】
実施例１７．マウスにおけるＰＤ０３２５９０１処理の効果
大きさを合わせたＨＣＴ１１６腫瘍担持マウスをランダム化して、ビヒクル（０．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース＋０．２％Ｔｗｅｅｎ８０）又はビヒクル中で調製したマイトジェン細胞外キナーゼ阻害剤ＰＤ０３２５９０１２５ｍｇ／ｋｇ（０．００５ｍＬ／ｇマウス）を経口栄養補給による処理を毎日受けさせた。１０日間の毎日処理の後、最後に服用投与させた１ｈ後に［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ−ＰＥＴスキャンを行った。イメージング後、腫瘍を液体窒素でスナップ冷凍し、コリンキナーゼＡ発現の分析のために−８０℃で貯蔵した。結果を図１８及び１９に示す。
【０１４７】
これは、薬物反応の早期バイオマーカーとしての［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ−ＰＥＴの使用を例証する。癌を標的とする現在開発されている薬剤の殆どは細胞増殖又は生存に関与するキナーゼを対象としている。この実施例は、腫瘍の収縮が有意でない異種移植片モデルにおいて、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１による成長因子受容体−Ｒａｓ−ＭＡＰキナーゼ経路の阻害が、経路の阻害を意味する腫瘍の［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ取込の有意な低下に至ることを示している。図はまた、［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨの取込の阻害が、少なくとも部分的にコリンキナーゼ活性の阻害に起因していたことも示している。
【０１４８】
実施例１８．イメージングのための［18Ｆ］ＦＣＨ及び［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨの比較
図１６に示されているように、［18Ｆ］ＦＣＨ及び［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨはいずれも迅速に組織中に取り込まれ、保持された。組織の放射活性は筋肉＜尿＜腎臓＜肝臓の順に増大した。肝臓においては酸化よりリン酸化が優勢であると仮定して（図１２）、肝臓全体の放射活性レベルには２つの放射性トレーサー間で殆ど差が見られなかった。［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ又は［18Ｆ］ＦＣＨの注射後６０分での肝臓の放射活性レベル％ＩＤ／ｖｏｘ６０は、それぞれ２０．９２±４．２４及び１８．７５±４．２８であった（図１６）。これはまた、［18Ｆ］ＦＣＨ注射によるよりも［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ注射によるベタインのより低いレベルとも調和している（図１２）。このように、肝臓においてＰＥＴ（これは化学的分解を欠く）により測定される２つの放射性トレーサーの薬物動態は同様であった。他方、［18Ｆ］ＦＣＨと比較して［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨに対するより低い腎臓の放射活性レベル（図１６）は、腎臓におけるより低い［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨの酸化電位を反映している。［18Ｆ］ＦＣＨ及び［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨに対する％ＩＤ／ｖｏｘ６０は腎臓においてそれぞれ１５．９７±４．６５及び７．５９±３．９１であった（図１６）。尿の排泄はこれらの放射性トレーサー間で類似していた。膀胱に関して描かれた対象領域（ＲＯＩ）は［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ及び［18Ｆ］ＦＣＨに対してそれぞれ５．２０±１．７１及び６．７０±０．７１の％ＩＤ／ｖｏｘ６０の値を示した。尿の代謝産物は主として代謝されてない放射性トレーサーを含んでいた。筋肉は、あらゆる組織で最も低い放射性トレーサーレベルを示した。
【０１４９】
［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨの比較的高い全身の安定性及び高割合のホスホコリン代謝産物にも関わらず、［18Ｆ］ＦＣＨ群と比べて、［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨを注射したマウスにおいてより高いＰＥＴによる腫瘍放射性トレーサー取込が観察された。図１７は典型的な（０．５ｍｍ）横断ＰＥＴ画像スライスを示し、ヒト黒色腫ＳＫＭＥＬ−２８異種移植片における［18Ｆ］ＦＣＨ及び［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨの蓄積を立証している。このマウスモデルで腫瘍シグナル−バックグランドコントラストは、［18Ｆ］ＦＣＨ画像と比べて［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨのＰＥＴ画像において定性的に優れていた。いずれの放射性トレーサーもＰＥＴにより検出される同様な腫瘍動態プロフィールを有していた（図１７）。この動態は〜１分にピーク放射活性をもつ迅速な腫瘍流入により特徴付けられた（図１７）。次に、腫瘍レベルを〜５分まで平衡化させた後安定期にさせた。［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨの送達と保持はＦＣＨよりも定量的に高かった（図１７）。［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ及び［18Ｆ］ＦＣＨの％ＩＤ／ｖｏｘ６０はそれぞれ７．４３±０．４７及び５．５０±０．４９（Ｐ＝０．０４）であった。腫瘍は細胞の不均一な集団を呈することが多いので、実験的なノイズに対して感受性がおそらくより低い別のイメージング変数を利用した（５つのスライスに対する最大のピクセル％ＩＤ／ｖｏｘ６０の平均（％ＩＤｖｏｘ６０ｍａｘ））。この変数もまた［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨでずっと高い（Ｐ＝０．０５、図１７）。さらに、時間対放射活性曲線（ＡＵＣ）下の腫瘍面積はＦＣＨよりＤ４−ＦＣＨマウスの方が高かった（Ｐ＝０．０２）。組織試料のより詳細な分析のために３０分の時点を選択したが、血漿中の親化合物の割合はより早い時点で［18Ｆ］ＦＣＨよりも［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨの方が一貫して高かった。イメージングに関して、両方の放射性トレーサーの腫瘍による取込は、早い（１５分）及び遅い（６０分）時点で同様であった（補遺表１）。より早い時点が骨盤のイメージングに適当であるかもしれない。
【０１５０】
実施例１９．処置に対するイメージング応答
［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨがインビボ研究に対してより安定なフッ素化されたコリン類似体であることを立証した後、治療法に対する応答を測定するためのこの放射性トレーサーの使用を検討した。これらの研究は、処置の結果が既に特徴付けられている再現性のある腫瘍モデル系、すなわち、１０日間ＰＤ０３２５９０１で毎日処理されたヒト結腸癌腫異種移植片ＨＣＴ１１６で行った（Ｌｅｙｔｏｎ，Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＰＤ０３２５９０１”、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００８；７（９）：３１１２−２１）。薬剤処置は腫瘍停滞に至った（１０日目の腫瘍の大きさの低下は前処理群と比較して１２．２％だけ）が、ビヒクル処置したマウスの腫瘍は３７５％増大した。ＰＤ０３２５９０１で処置したマウスの腫瘍の［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨレベルはビヒクルで処置したものとほぼ同じ時間でピークに達したが、処置された腫瘍における放射性トレーサーの保持は顕著に低下した（図１８）。全てのイメージング変数が薬剤処置の１０日後に減少した（Ｐ＝０．０５、図１８）。これは、腫瘍の大きさの低下に大きな変化が見られない条件下でも処置応答を検出するのに［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨを使用することができるということを示している（Ｌｅｙｔｏｎ，Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｌｕｌａｒ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＰＤ０３２５９０１”、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００８；７（９）：３１１２−２１）。バイオマーカーの変化を理解するために、培養下指数関数的に増殖するＨＣＴ１１６細胞を２４時間ＰＤ０３２５９０１で処置し、［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨの６０分取込をインビトロで測定することによって、Ｄ４−ＦＣＨ−ホスホコリンの形成に対するＰＤ０３２５９０１の固有の細胞効果を検査した。図１８に示されているように、ＰＤ０３２５９０１は、薬剤で処置した細胞において［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨ−ホスホコリンの形成を顕著に阻害し、腫瘍における薬剤の効果が血流力学効果によるというよりコリン代謝に対する細胞効果に起因する可能性が高いことを示している。
【０１５１】
薬剤処置による［18Ｆ］Ｄ４−ＦＣＨの取込を調節する別のメカニズムを理解するために、ＰＥＴスキャン後に切除されたＰＤ０３２５９０１及びビヒクルで処置した腫瘍におけるＣＨＫＡの発現の変化を評価した。ＣＨＫＡタンパク質の発現の有意な低下はＰＤ０３２５９０１による処置の１０日後にインビボで見られ（Ｐ＝０．０３）（図１９）、ＣＨＫＡ発現の低下が薬剤で処置した腫瘍におけるより低いＤ［18Ｆ］４−ＦＣＨの取込に寄与することを示している。また、薬剤により誘導されたＣＨＫＡ発現の低下も、ＰＤ０３２５９０１で処置された指数関数的に増殖する細胞でインビトロで起こった。
【０１５２】
実施例２０．統計
統計解析は、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン４（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて行った。群間の比較はノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験を用いて行った。両側(two-taｉled)Ｐ≦０．０５を有意と考えた。
【０１５３】
実施例２１
材料及び方法
細胞株
ＨＣＴ１１６（ＬＧＣ標準、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，ＵＫ）及びＰＣ３−Ｍ細胞（Ｄｒ  Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｃａｌｅｙ，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅａｓｔａｓｉｓ  Ｔｅａｍ，Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫからの寄付）を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ．ｍＬ・1のペニシリン及び１００μｇ．ｍＬ・1のストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｒｅｆｒｅｗｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で増殖させた。Ａ３７５細胞（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｅｙａｌ  Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｂｅａｔｓｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫからの寄付）を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ．ｍＬ・1のペニシリン及び１００μｇ．ｍＬ・1のストレプトマイシンを補充した高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｒｅｆｒｅｗｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で増殖させた。全ての細胞は５％ＣＯ２を含有する湿った雰囲気中で３７℃に維持した。
【０１５４】
ウェスタンブロット
ウェスタンブロッティングは標準技術を使用して実施した。細胞を採取し、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）で溶解した。ラビット抗−ヒトコリンキナーゼアルファポリクローナル抗体Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ、１：５００）を用いて膜を探査した。ラビット抗−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ、１：５０００）を充填対照(loadｉng control)として用い、ペルオキシダーゼ結合ロバ抗−ラビットＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ、１：２５００）を二次抗体として用いた。タンパク質は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ  Ｇｉｌｅｓ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）を用いて視覚化した。ブロットをスキャンし（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧＳ−８００  Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、シグナルの定量化はスキャン解析ソフトウェア（Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いるデンシトメトリーによって行った。
【０１５５】
腫瘍コリンキナーゼ発現の分析のために、〜１００ｍｍ3の腫瘍を切除し、１．４ｍｍセラミックビーズを含有するＰｒｅｃｅｌｌｙｓ  ２４溶解キット２ｍＬチューブ（Ｂｅｒｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｎｔｉｇｎｙ−ｌｅ−Ｂｒｅｔｏｎｎｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）に入れ、液体窒素でスナップ冷凍した。ホモジナイゼーションのために、１ｍＬのＲＩＰＡ緩衝液を溶解キットチューブに加え、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ  ２４ホモジナイザー（６５００ＲＰＭ、２×１７、間隔２０ｓ）でホモジナイズした。細胞破片を遠心分離により除去した後、上記のようにウェスタンブロッティングした。
【０１５６】
インビトロでの18Ｆ−Ｄ４−コリン取込
分析の前の晩細胞（５×１０５）を６−ウェルプレートに蒔いた。実験の日、４０μＣｉの18Ｆ−Ｄ４−コリンを含有する新鮮な増殖培地を個々のウェルに加えた。５％ＣＯ２の湿った大気中で６０分３７℃でインキュベーションした後に細胞の取込を測定した。続いてプレートを氷上に載せ、３時間氷冷ＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ、１ｍＬ、１０分）で溶解した。細胞溶解物を計数管に移し、ガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ  ＩＩ  Ａｕｔｏ−Ｇａｍｍａカウンター，Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏ，Ｐａｎｇｂｏｕｒｎｅ，ＵＫ）で崩壊補正した放射活性を測定した。試料をスナップ冷凍し、放射性崩壊後ＢＣＡ９６−ウェルプレートアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いるタンパク質の測定に使用した。データはタンパク質１ｍｇ当たりの合計放射活性のパーセントとして表した。ヘミコリニウム−３処置（５ｍＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のためには、放射活性の添加３０分前及び取込の経時変化の時間の間細胞を化合物と共にインキュベートした。
【０１５７】
インビボ腫瘍モデル
全ての動物実験は、ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  （Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）  Ａｃｔ  １９８６に従って認可された研究者により、かつ癌研究における動物の幸福及び使用に関する新版のガイダンス内で行った（Ｗｏｒｋｍａｎ  Ｐ．Ａｂｏａｇｙｅ  ＥＯ，Ｂａｌｋｗｉｌｌ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｗｅｌｆａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｂｒ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１０；１０２：１５５５−１５７７）。オスのＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（６〜８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用した。腫瘍細胞（２×１０6）をマウスの背部に皮下注射し、異種移植片が〜１００ｍｍ3に達したときの動物を使用した。キャリパーを用いて腫瘍寸法を連続的に測定し、腫瘍容積を式：容積＝（π／６）×ａ×ｂ×ｃにより計算した。式中、ａ、ｂ、及びｃは腫瘍の３つの直交軸を表す。
【０１５８】
インビボトレーサー代謝
Ｓｍｉｔｈ  Ｇ，Ｚｈａｏ  Ｙ，Ｌｅｙｔｏｎ  Ｊ他（Ｒａｄｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ［（１８）Ｆ］フルオロ−［１，２−（２）Ｈ（４）］コリン．Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２０１１；３８：３９−５１）の方法を改変した方法を使用して、血漿及び組織に由来する放射性標識代謝産物を定量化した。簡潔に言うと、終末麻酔下の腫瘍担持マウスに放射性トレーサー11Ｃ−コリン、11Ｃ−Ｄ４−コリン（〜１８．５ＭＢｑ）又は18Ｆ−Ｄ４−コリン（〜３．７ＭＢｑ）のいずれかをボーラス静脈内注射により投与し、放射性トレーサー注射の２、１５、３０又は６０分後心臓穿刺を介した瀉血によって犠牲にした。自動化された放射性合成の方法論としては実施例２２を参照されたい。腫瘍、腎臓及び肝臓の試料を直ちに液体窒素でスナップ冷凍した。ヘパリン添加血液の試料を迅速に遠心分離して（１４０００ｇ、５分、４℃）血漿を得た。その後血漿試料を液体窒素でスナップ冷凍し、分析に先立ってドライアイス上に保った。
【０１５９】
分析のために、試料を解凍し、使用直前まで４℃に保った。氷冷した血漿（２００μｌ）に氷冷したメタノール（１．５ｍＬ）を加え、得られた懸濁液を遠心分離した（１４０００ｇ、４℃、３分）。次に、上清をデカントし、回転蒸発器（浴温４０℃）で蒸発乾固した後、ＨＰＬＣ移動相（溶媒Ａ：アセトニトリル／水／エタノール／酢酸／１．０Ｍ酢酸アンモニウム／０．１Ｍリン酸ナトリウム［８００／１２７／６８／２／３／１０］、１．１ｍＬ）に再懸濁した。試料を親水性のシリンジフィルター（０．２μｍフィルター、Ｍｉｌｌｅｘ  ＰＴＦＥフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）に通してろ過した後、試料（〜１ｍＬ）を１ｍＬ試料ループにより分析用のＨＰＬＣに注入した。Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ−２５ホモジナイザー（ＩＫＡ  Ｗｅｒｋｅ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ＫＧ，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて氷冷メタノール（１．５ｍＬ）中で組織をホモジナイズした後血漿試料のように処理した。
【０１６０】
Ｌｅｙｔｏｎ  Ｊ，Ｓｍｉｔｈ  Ｇ，Ｚｈａｏ  Ｙ他の方法（［１８Ｆ］ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ−［１，２−２Ｈ４］−ｃｈｏｌｉｎｅ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒａｄｉｏｔｒａｃｅｒ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｃｈｏｌｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９；６９：７７２１−７７２８）を用い、上記のように構成されたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、試料を分析した。μＢｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８  ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ；７．８×３０００ｍｍ）、固定相、並びに３ｍＬ／分の流量で送られる溶媒Ａ（上記）及び溶媒Ｂ（アセトニトリル／水／エタノール／酢酸／１．０Ｍ酢酸アンモニウム／０．１Ｍリン酸ナトリウム（４００／４００／６８／４４／８８／１０））からなる移動相を分析物の分離に使用した。勾配は０％Ｂが５分、０％〜１００％Ｂが１０分、１００％Ｂが０．５分、１００％〜０％Ｂが２分、０％Ｂが２．５分にセットした。
【０１６１】
ＰＥＴイメージング研究
腫瘍担持マウスにおいて18Ｆ研究には〜３．７ＭＢｑ、又は11Ｃでは〜１８．５ＭＢｑのボーラス静脈内注射の後、専用の小動物ＰＥＴスキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｉｎｖｅｏｎ  ＰＥＴモジュール、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）で、動的11Ｃ−コリン、11Ｃ−Ｄ４−コリン及び18Ｆ−Ｄ４−コリンイメージングスキャンを実施した。動的スキャンはリストモード形式で６０分にわたって得られた。次いで、得られたデータを、０．５ｍｍシノグラムビン及び画像再構成のための１９の時間枠（４×１５、４×６０、及び１１×３００）に区分した。この画像再構成はフィルタ補正逆投影により行った。入力関数分析のためには、データを画像再構成のための２５の時間枠（８×５、１×２０、４×４０、１×８０、及び１１×３００）に区分した。Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｉｎｖｅｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｗｏｒｋｐｌａｃｅソフトウェアを腫瘍における放射性トレーサー取込の視覚化に使用した。動的データの３０〜６０分の累積画像を用いて三次元（３Ｄ）対象領域（ＲＯＩ）を画定した。動脈の入力関数を評価するために、２〜５分の累積画像を用いて、単一のボクセル３Ｄ  ＲＯＩを心臓腔の中心に手作業で描いた。心筋とのＲＯＩのオーバーラップを最小にするように注意した。カウント密度を各時点での全てのＲＯＩに対して平均して時間対放射活性曲線（ＴＡＣ）を得た。腫瘍ＴＡＣをＶＤＣ−３０４服用量較正器（Ｖｅｅｎｓｔｒａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｊｏｕｒｅ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で測定された注射服用量に対して規格化し、組織１ｍＬ当たりのパーセント注射服用量として表した。０〜６０分の％ＩＤ／ｍＬの積分として計算されるＴＡＣ下の面積、及び、６０分での放射性トレーサーの規格化された取込（％ＩＤ／ｍＬ６０）も比較のために使用した。
【０１６２】
生体内分布研究
11Ｃ−コリン、11Ｃ−Ｄ４−コリン（〜１８．５ＭＢｑ）及び18Ｆ−Ｄ４−コリン（〜３．７ＭＢｑ）を麻酔をかけたＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの尾静脈に各々注射した。マウスを麻酔下に維持し、放射性トレーサーの注射の２、１５、３０又は６０分後心臓穿刺による瀉血で犠牲にして血液、血漿、心臓、肺、肝臓、腎臓及び筋肉を得た。組織の放射活性をガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ  ＩＩ  Ａｕｔｏ−Ｇａｍｍａ  ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏ，Ｐａｎｇｂｏｕｒｎｅ，ＵＫ）で測定し、崩壊補正した。データは組織の１グラム当たりのパーセント注射服用量として表した。
【０１６３】
統計
データは、他に示さない限り、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。２つのデータセット間の比較の有意性はＳｔｕｄｅｎｔのｔ試験を用いて決定した。ＡＮＯＶＡを多様性解析に使用した（Ｐｒｉｓｍ  ｖ５．０ウィンドウズ(登録商標）用ソフトウェア、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）。Ｐ≦０．０５の場合に群間の差を有意と考えた。
【０１６４】
結果
重水素化は腎臓の放射性トレーサーの取込を高めることになる
腫瘍をもたないオスのヌードマウスにおいて11Ｃ−コリン、11Ｃ−Ｄ４−コリン及び18Ｆ−Ｄ４−コリントレーサーを用いて経時的生体内分布を調べた。図２０は、２、１５、３０及び６０分の組織内分布を示す。これら３つのトレーサーの６０分にわたる組織の取込には最小の差しかなかった。取込の値は18Ｆ−コリン及び18Ｆ−Ｄ４−コリンについて既に発表されているデータと基本的に一致していた（ＤｅＧｒａｄｏ  ＴＲ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ＳＷ，Ｗａｎｇ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  （１８）Ｆ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｃｈｏｌｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ａｓ  ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ  ＰＥＴ  ｔｒａｃｅｒｓ．Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．２００１；４２：ｓ１８０５−１８１４；Ｓｍｉｔｈ  Ｇ，Ｚｈａｏ  Ｙ，Ｌｅｙｔｏｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｒａｄｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ［（１８）Ｆ］ｆｌｕｏｒｏ−［１，２−（２）Ｈ（４）］ｃｈｏｌｉｎｅ．Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２０１１；３８：３９−５１））。全てのトレーサーで、注射後２分のような早期に明らかなように、血液から迅速に摘出され、大部分の放射活性は腎臓内に保持されていた。11Ｃ−コリンの重水素化により、６０分にわたり腎臓の保持が有意に１．８倍増大し（Ｐ＜０．０５、図２０Ａ）、18Ｆ−Ｄ４−コリンではこの時点で11Ｃ−コリンと比べて腎臓保持の３．３倍増大が観察された（Ｐ＜０．０１）。11Ｃ−Ｄ４−コリン及び18Ｆ−Ｄ４−コリンで、種類の同じトレーサー11Ｃ−コリンと比べて尿への排泄が増大する傾向があったが、この増大は統計的な有意には至らなかった。
【０１６５】
11Ｃ−コリンの重水素化ではインビボで酸化に対する中程度の耐性が生じる
組織及び血漿におけるトレーサーの代謝を放射性ＨＰＬＣで調べた（図２１）。
【０１６６】
ピークは、同一性を決定するための酵素的な（アルカリ性ホスファターゼ及びコリンオキシダーゼ）方法（それぞれ図２７及び２８）を用いて、コリン、ベタイン、ベタインアルデヒド及びホスホコリンと特定された（Ｌｅｙｔｏｎ  Ｊ．Ｓｍｉｔｈ  Ｇ，Ｚｈａｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．［１８Ｆ］ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ−［１，２−２Ｈ４］−ｃｈｏｌｉｎｅ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒａｄｉｏｔｒａｃｅｒ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｃｈｏｌｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９；６９：７７２１−７７２８）。
【０１６７】
肝臓において、11Ｃ−コリン及び11Ｃ−Ｄ４−コリンはいずれも迅速にベタインに酸化され（図２１Ａ）、11Ｃ−コリン放射活性の４９．２±７．７％が２分までに既にベタインに酸化された。11Ｃ−コリンの重水素化により、肝臓において注射の２分後に酸化に対する重大な保護が得られ、ベタインとして２４．５±２．１％の放射活性があるが（ベタインレベルで５１．２％の低下、Ｐ＝０．０３７）、この保護は１５分までに失われた。特に、高い割合の肝臓放射活性（〜８０％）が18Ｆ−Ｄ４−コリンで１５分までホスホコリンとして存在していた。これは、２つの炭素−１１トレーサーと比べたときのずっと低下した肝臓特異的な酸化（６０分におけるベタインとしての１５．０±３．６％の放射活性、Ｐ＝０．００２）に対応していた。
【０１６８】
肝臓とは対照的に、腎臓においては、11Ｃ−コリンの重水素化により、６０分の時間全体にわたって酸化に対する保護が得られた（図２１Ｂ）。11Ｃ−Ｄ４−コリンでは、11Ｃ−コリンと比較したとき６０分にわたってベタインレベルが２０〜４０％低下しており（Ｐ＜０．０５）、これに対応して、ホスホコリンが比例して増大した（Ｐ＜０．０５）。18Ｆ−Ｄ４−コリンは、腎臓において、いずれの炭素−１１標識コリントレーサーよりも酸化に対して耐性であった。３種全てのトレーサーを比較すると放射性標識ホスホコリンと腎臓保持の間にはある相関関係があった（Ｒ２＝０．５０４、図２９）。血漿においては、11Ｃ−コリン及び11Ｃ−Ｄ４−コリンの両方に対するベタインの一時的なレベルは殆ど同じであった。全体の放射活性レベルは全ての放射性トレーサーで低かったことに留意されたい。２分では11Ｃ−コリン及び11Ｃ−Ｄ４−コリンに対してそれぞれ１２．１±２．６％及び８．８±３．８％の放射活性がベタインの形態であり、１５分で７８．６±４．４％及び７９．５±２．９％に上昇した。ベタインレベルは18Ｆ−Ｄ４−コリンで顕著に低下し、１５分では４３．７±１２．４％の活性がベタインとして存在していた。18Ｆ−Ｄ４−コリンでは、残りの時間にわたって血漿ベタインのさらなる上昇は観察されなかった。
【０１６９】
フッ素化は腫瘍においてコリンの酸化に対して保護する
11Ｃ−コリン、11Ｃ−Ｄ４−コリン及び18Ｆ−Ｄ４−コリンの代謝をＨＣＴ１１６腫瘍で測定した（図２２）。全てのトレーサーで、腫瘍においてコリン酸化は腎臓及び肝臓におけるレベルと比べて大きく減少した。１５分で、11Ｃ−Ｄ４−コリン及び18Ｆ−Ｄ４−コリンはいずれも、11Ｃ−コリンよりずっと大きいホスホコリンに対応する放射活性を有していた。11Ｃ−コリンの３０．５±４．０％と比較して11Ｃ−Ｄ４−コリン及び18Ｆ−Ｄ４−コリンはそれぞれ４３．８±１．５％及び４５．１±３．２％であった（それぞれＰ＝０．０３５及びＰ＝０．０４６）。６０分まで、大部分の放射活性は３種全てのトレーサーでホスホコリンであり、ホスホコリンレベルは11Ｃ−コリン＜11Ｃ−Ｄ４−コリン＜18Ｆ−Ｄ４−コリンの順で増大した。６０分における11Ｃ−コリン及び11Ｃ−Ｄ４−コリンの腫瘍代謝プロフィールには差がなかったが、低下したコリン酸化が18Ｆ−Ｄ４−コリンで観察された。18Ｆ−Ｄ４−コリンでは１４．０±３．０％のベタイン放射活性に対して、11Ｃ−コリンでは２８．１±２．９％であった（Ｐ＝０．０２６）。
【０１７０】
コリントレーサーはＰＥＴによる腫瘍のイメージングに対して同様な感度を有する
18Ｆ−Ｄ４−コリンの高い全身の安定性にも関わらず、ＰＥＴによるマウスにおける腫瘍放射性トレーサー取込は11Ｃ−コリン又は11Ｃ−Ｄ４−コリンの場合以下だった（図２３）。図２３Ａは、典型的な（０．５ｍｍ）横断ＰＥＴ画像スライスであり、３種の全てのトレーサーのＨＣＴ１１６腫瘍における蓄積を示している。３種の全てのトレーサーで腫瘍の取込は不均一であったが、腫瘍のシグナル−バックグランドレベルは同じであった。これは、６０分での規格化された取込値及び時間対放射活性曲線（データは示してない）下の腫瘍面積の値によって確認された。ＰＥＴデータは全体の放射活性を表すことに留意されたい。11Ｃ−コリン又は11Ｃ−Ｄ４−コリンの場合、この放射活性のかなりの割合がベタインである（図２２）。
【０１７１】
腫瘍トレーサー動態
腫瘍における全体のトレーサー保持には差がなかったにもかかわらず、トレーサー取込の動態プロフィールは３種のコリントレーサーで変化しており、ＰＥＴにより検出された（図２３Ｂ）。３種のトレーサーの動態は、最初の５分間での迅速な腫瘍流入と、それに続く腫瘍保持の安定化によって特徴付けられた。イメージングの最初の１４分間の18Ｆ−Ｄ４−コリンの初期送達は、11Ｃ−コリン及び11Ｃ−Ｄ４−コリンのいずれよりも高かった（最初の１４分間の拡大されたＴＡＣを図３０に示す）。活性のゆっくりした洗い出しが18Ｆ−Ｄ４−コリン及び11Ｃ−Ｄ４−コリンの両方で３０〜６０分に観察され、対照的に緩やかな蓄積が11Ｃ−コリンで検出された。腫瘍における放射活性の不可逆的捕捉に対するパラメーター、Ｋｉ及びｋ３を、心臓腔からの代謝産物補正ＴＡＣを入力関数として使用して二組織不可逆モデルから計算した（図２４Ａ及びＢ）。代謝産物の組織ＴＡＣに対する寄与を説明するダブルインプット（ＤＩ）モデルを、補充データに記載する動態解析に使用した。重水素化及び非重水素化11Ｃ−コリンの間でフラックス定数の測定値に有意な差はなかった。しかし、フッ化メチルの添加により、すなわち18Ｆ−Ｄ４−コリンを11Ｃ−Ｄ４−コリンと比較すると、Ｋｉ及びｋ３がそれぞれ４９．２％（ｎ＝３、Ｐ＝０．０２２）及び７５．２％（ｎ＝３、Ｐ＝０．００５）減少した。Ｋ１’値は３種の全てのトレーサーで同様であった。すなわち、11Ｃ−コリン、11Ｃ−Ｄ４−コリン及び18Ｆ−Ｄ４−コリンでそれぞれ０．１０６±０．０２６、０．１１４±０．０１９、０．１４２±０．０２７であった。細胞内のベタイン形成（細胞外空間におけるベタインの存在だけではない）が予想より高い不可逆的取込を導いた可能性がある。11Ｃ−コリンでは18Ｆ−Ｄ４−コリンと比較してベタイン：ホスホコリンの比が１５分及び６０分でそれぞれ３８８％及び２３０％（Ｐ＝０．０４５及び０．０３６）有意に増大した（図５Ｃ）。
【０１７２】
18Ｆ−Ｄ４−コリンは前立腺腺癌及び悪性黒色腫のＰＥＴイメージングに対して良好な感度を示す
18Ｆ−Ｄ４−コリンがインビボ研究にとってより安定なコリン類似体であり、結腸腺癌のイメージングに対して良好な感度を有することを確認したので、悪性黒色腫Ａ３７５及び前立腺腺癌ＰＣ３−Ｍを含めてヒト癌の他のモデルでの癌検出に対するその適切性を評価することが望まれた。18Ｆ−Ｄ４−コリンのインビトロ取込は、ほぼ同じレベルのコリンキナーゼ発現（図３１挿入図）に関連して、３つの細胞株で３０分にわたって同様であった（図３１）。コリン輸送及びコリンキナーゼ阻害剤、ヘミコリニウム−３による細胞の処理の結果、３種の全ての細胞株で細胞内のトレーサー放射活性が＞９０％減少したので、放射活性の保持はコリンキナーゼ依存性であることが示された。これらの癌モデルにおける18Ｆ−Ｄ４−コリンの同様な細胞内捕捉はインビボでのそれらの取込になり（図２５Ａ））、フラックス定数測定値及びＰＥＴイメージング変数に対する同様な値を示す（補充表１）。18Ｆ−Ｄ４−コリンの腫瘍保持はＡ３７５＜ＨＣＴ１１６＜ＰＣ３−Ｍの順に増大する傾向があり、これらの株におけるコリンキナーゼの発現により反映されていた（図２５Ｃ）。注射後１５分又は６０分における３つの細胞癌モデルで腫瘍代謝産物プロフィールに識別可能な差はなかった（図２５Ｂ）。
【０１７３】
腫瘍の大きさは18Ｆ−Ｄ４−コリンの取込と保持に影響するが、腫瘍の薬物動態には影響しない
ＰＥＴイメージングのために、腫瘍を１００ｍｍ3に増殖させた後イメージングした。しかし、腫瘍の大きさが２００ｍｍ3に達していたときは、ＰＣ３−Ｍ異種移植片を移植した動物の１つの小さいコホートをイメージングした（典型的な横断ＰＥＴ画像は図３２参照）。これらの腫瘍は、より小さいＰＣ３−Ｍ腫瘍と比較したときの腫瘍の放射活性の実質的な減少に対応して（図２６）、腫瘍の縁の周りで18Ｆ−Ｄ４−コリン取込の別個のパターンを示した。ＨＣＴ１１６腫瘍と同様に、両方のＰＣ３−Ｍコホートでトレーサー注入後５分以内に最大の腫瘍特異的放射活性が達成され、その後安定期があった。６０分における放射性トレーサー保持の大きさはより小さい腫瘍で実質的により高かった。すなわち、規格化された取込値は１．９７±０．０７％ＩＤ／ｍＬであったのに対して、より大きい腫瘍では０．８２±０．１２％ＩＤ／ｍＬ（２．４倍増大、Ｐ＝０．０００２、ｎ＝３〜５）であった。腫瘍ＲＯＩからの最大のボクセル放射活性値をとった腫瘍取込の分析の結果、６０分におけるトレーサー取込の差はより小さくなった。すなわち、〜１００ｍｍ3の腫瘍では％ＩＤ／ｍＬｍａｘが４．７５±０．３８と測定されたのに対して、〜２００ｍｍ3の腫瘍では３．３４±０．０８％ＩＤ／ｍＬｍａｘが測定された（１．４倍の増大、Ｐ＝０．０１９、ｎ＝３〜５）。興味深いことに、放射活性の不可逆的捕捉を測定する動態パラメーター、Ｋｉ及びｋ３には、両方の腫瘍コホートで有意な変化はなかった。
【０１７４】
腎臓の保持は６０分にわたって11Ｃ−コリン＜11Ｃ−Ｄ４−コリン＜18Ｆ−Ｄ４−コリンの順に増大し（図２０）、全体の腎臓放射活性はホスホコリンとして保持される％放射活性に比例することが示された（図２９、Ｒ２＝０．５０４）。11Ｃ−コリンの重水素化によるコリン酸化に対する保護は組織特異的であることが示され、11Ｃ−コリンと比較してベタイン放射活性の減少が肝臓において注入後たった２分で測定された（図２１）。
【０１７５】
18Ｆ−Ｄ４−コリンの場合のコリン酸化に対する全身の保護にも関わらず、コリン酸化の速度の低下は移植されたＨＣＴ１１６腫瘍においてずっとわずかであった（図２２）。11Ｃ−Ｄ４−コリン及び18Ｆ−Ｄ４−コリンを注射したとき、放射性標識ホスホコリンのレベルは注入後１５分で11Ｃ−コリンに対してそれぞれ４３．６％及び４７．９％高かった。６０分では３種のトレーサー間でホスホコリンレベルに差はなかったが、18Ｆ−Ｄ４−コリンでベタイン特異的な放射活性が有意に低下した。このホスホコリン特異的な活性の平衡化は、親のトレーサーレベルが６０分までに最小に低下し、コリンキナーゼ活性に対して利用可能な基質レベルを厳しく制限するという飽和効果によって説明することができる。３種の全てのトレーサーを有する腫瘍において全時間にわたり肝臓及び腎臓と比べてより低いベタインレベルが観察されたが、ベタインのコリン酸化に対するより低い能力又は増大した洗い出しの結果であると思われる。
【０１７６】
３種のコリン放射性トレーサーのＰＥＴによる比較により、他の器官で観察された大きい変化に関わらず、全体的な腫瘍放射性トレーサーの取込、従って感度に有意な差がないことが示された（図２３）。しかしながら、初期の腫瘍動態（代謝がより低い時点）はトレーサー間で変化し、18Ｆ−Ｄ４−コリンは〜５分にわたる迅速な送達とその後の腫瘍からの活性のゆっくりした洗い出しにより特徴付けられた。これは、11Ｃ−コリンのよりゆっくりした取込であるが連続的な腫瘍保持に匹敵していた。６０分において、腫瘍内の18Ｆ−Ｄ４−コリンで、11Ｃ−コリン及び11Ｃ−Ｄ４−コリンと比べてそれぞれ．７倍及び４．０倍高い代謝されなかった親のトレーサーが見られた（図２２）。しかしながら、重水素化は全体の腫瘍放射活性レベルを変化させず、使用したモデリングアプローチはいろいろな細胞内の化学種を区別しなかった。全てのトレーサーが細胞内でホスホコリンに変換されたが、11Ｃ−コリン及び11Ｃ−Ｄ４−コリンの細胞内保持に対する、18Ｆ−Ｄ４−コリンと比較してより高い速度定数（Ｋｉ及びｋ３、図２４Ａ及びＢ）は、ＨＣＴ１１６腫瘍内における非フッ素化されたトレーサーのベタインへの迅速な変換によって説明され、18Ｆ−Ｄ４−コリンに対するより大きな特異性を示している。18Ｆ−Ｄ４−コリンと比較して、腫瘍のベタイン−ホスホコリン代謝産物比は11Ｃ−コリン及び11Ｃ−Ｄ４−コリンに対してそれぞれ３８８％（Ｐ＝０．０４５）及び２５９％（Ｐ＝０．０６１、有意ではない）増大した（図２４Ｃ）。
【０１７７】
実施例２２
全般
材料は購入したままでさらに精製することなく使用した。１，２−2Ｈ４−ジメチルエタノールアミン（ＤＭＥＡ）はＴａｒｇｅｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｌｔｄ（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）による注文合成であった。灌注用水はＢａｘｔｅｒ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）製であり、ソーダ石灰はＶＷＲ（Ｌｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から購入した。注射用の０．９％塩化ナトリウムはＨａｍｅｌｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ（Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ、ＵＫ）製であり、ＮａＣｌの０．０４５％溶液はこのストックと灌注用水から調製した。水素化アルミニウムリチウム（０．１Ｍ、ＴＨＦ中）及びヨウ化水素酸（５７％）はＡＢＸ（Ｒａｄｅｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製であった。メチレンジトシレートはＨｕａｙｉ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）から得た。その他の化学品は全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．Ｌｔｄ（Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）製であった。ｉＰｈａｓｅ  11Ｃ−ＰＲＯでの11Ｃ−メチル化のための、ｉＰｈａｓｅ使い捨て式合成キットはｉＰｈａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手した。ＧＥ  ＦＡＳＴｌａｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ．Ｇｉｌｅｓ、ＵＫ）での18Ｆ−フルオロメチル化のための部分的に組み立てたＧＥ  ＦＡＳＴｌａｂカセットは、ＦＡＳＴｌａｂウォーターバッグ、Ｎ２フィルター、プレコンディショニングしたＱＭＡカートリッジ及び反応容器を含有していた。Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ａｃｃｅｌｌ  ＣＭ  ｌｉｇｈｔ、ｔＣ１８  ｌｉｇｈｔ及びｔＣ１８  ＰｌｕｓカートリッジはＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａ．、ＵＳＡ）から入手した。
【０１７８】
11Ｃ−コリン及び11Ｃ−［１，２−2Ｈ４］−コリンの合成
11Ｃ−ヨウ化メチルは標準の湿式化学法を用いて調製した。簡潔に言うと、11Ｃ−二酸化炭素を注文の付属低温トラップを介してｉＰｈａｓｅプラットフォームに移し、水素化アルミニウムリチウム（０．１Ｍ、ＴＨＦ中）（２００ｕＬ）を用いてＲＴで１分かけて11Ｃ−メタンに還元した。次に、濃縮ヨウ化水素酸（２００μＬ）を反応容器に加え、混合物を１４０℃に１分間加熱した。次いで、11Ｃ−ヨウ化メチルを、ソーダ石灰及び五酸化リン乾燥剤を含有する短いカラムを介して、前駆体のジメチルエタノールアミン又は１，２−2Ｈ４−ジメチルエタノールアミン（２０μｌ）を含有する２ｍＬステンレス鋼ループ中に蒸留した。メチル化反応は室温で２．５分間進行させた。次に、粗製の生成物を、５ｍＬ／分の流量でエタノール（２０ｍＬ）を用いてＣＭカートリッジ上にフラッシュした。このＣＭカートリッジは、０．０４５％塩化ナトリウム（５ｍＬ）、次に水（５ｍＬ）でプレコンディショニングしておいた。次いで、ＣＭカートリッジを水性アンモニア（０．０８％、１５ｍＬ）、次に水（１０ｍＬ）で洗浄した。その後コリン生成物を、塩化ナトリウム溶液（０．０４５％、１０ｍＬ）を用いてカートリッジから溶出した。
【０１７９】
18Ｆ−フルオロメチル−［１，２−2Ｈ４］−コリンの合成
システムは、アセトニトリル（１．０ｍＬ）中水：Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ  Ｋ２２２溶液中の１：４Ｋ２ＣＯ３溶液、水（１０．０ｍＬ）中１８０ｍｇのＫ２ＣＯ３及びアセトニトリル（１０．０ｍＬ）中１２０ｍｇのＫｒｙｐｔｏｆｉｘ  Ｋ２２２を含む溶出液バイアル、アセトニトリル（２％水、１．２５ｍＬ）中メチレンジトシレート（４．２〜４．４ｍｇ）、無水アセトニトリル（１．４ｍＬ）中前駆体１，２−2Ｈ４−ジメチルエタノールアミン（１５０μｌ）で構成した。
【０１８０】
システムに載せＷａｔｅｒｓ  ＱＭＡ  ｌｉｇｈｔカートリッジ上に固定化したフッ素−１８を、炭酸塩とｋｒｙｐｔｏｆｉｘの１ｍＬ混合物で反応容器中に溶出した。Ｋ［18Ｆ］Ｆ／Ｋ２２２／Ｋ２ＣＯ３乾燥サイクルが完了した後、アセトニトリル（２％水、１．２５ｍＬ）中のメチレンジトシレートを反応容器に加え、１１０℃に１０分間加熱した。水（３ｍＬ）で反応を停止させ、得られた混合物をｔ−Ｃ１８  ｌｉｇｈｔ及びｔ−Ｃ１８  ｐｌｕｓカートリッジ（各々２ｍＬのアセトニトリルと水でプレコンディショニングした）の両方に通し、次に水中１５％のアセトニトリルをカートリッジに通した。清浄化サイクルの完了後、メチレンジトシレートはｔ−Ｃ１８  ｌｉｇｈｔカートリッジ上に捕捉され、18Ｆ−フルオロメチルトシレートは（18Ｆ−フッ化トシルと共に）ｔ−Ｃ１８  ｐｌｕｓ上に保持されており、他の反応物質は浪費された。この放射性合成の第１段階の後、エタノール→真空→窒素の洗浄サイクルを使用して反応容器を清浄化した。次に、反応容器及び18Ｆ−フルオロメチルトシレートが固定化されたｔ−Ｃ１８  ｐｌｕｓカートリッジを窒素気流下で同時に乾燥した。次いで、18Ｆ−フルオロメチルトシレートを１．４ｍＬのアセトニトリル中１５０μｌの１，２−2Ｈ４−ジメチルエタノールアミンでｔ−Ｃ１８  ｐｌｕｓカートリッジから反応容器中に溶出した。その後反応容器を１１０℃に１５分間加熱した後冷却し、反応容器の中味をＣＭカートリッジ（２ｍＬの水で調節した）上水で洗浄した。バルクエタノールバイアルからエタノールを抜き取りＣＭカートリッジに通すことにより、カートリッジを洗浄した。この洗浄サイクルを一回繰り返した後０．０８％アンモニア溶液（４．５ｍＬ）で洗浄した。次に、ＣＭカートリッジをエタノール、次いで水による最終洗浄に付した。生成物の18Ｆ−フルオロ−［１，２−2Ｈ２］コリンを０．０９％塩化ナトリウム溶液（４．５ｍＬ）でＣＭカートリッジから洗い出して、最終処方生成物として塩化ナトリウム緩衝液中に18Ｆ−フルオロ−［１，２−2Ｈ２］コリンを得た。
【０１８１】
化学的／放射化学的純度の評価
11Ｃ−コリン、11Ｃ−［１，２−2Ｈ４］−コリン及び18Ｆ−フルオロ−［１，２−2Ｈ２］コリンの化学的／放射化学的純度を、付属のＭｅｔｒｏｓｅｐ  Ｃ４陽イオンカラム（２５０×４．０ｍｍ）を有するＭｅｔｒｏｈｍイオンクロマトグラフィーシステム（Ｒｕｎｃｏｒｎ、ＵＫ）で分析した。移動相は１．５ｍＬ／分でアイソクラチックモードで流れる３ｍＭ硝酸：アセトニトリル（７５：２５ｖ／ｖ）であった。全ての放射性トレーサーは処方後＞９５％の放射化学的純度であった。
【０１８２】
ＨＣＴ１１６腫瘍における動態分析
11Ｃ−コリンに対して既に確立されているように、二組織不可逆的コンパートメントモデルを使用してＴＡＣを適合（フィット）させた（Ｋｅｎｎｙ  ＬＭ，Ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒ  ＫＢ，Ｈｉｎｚ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ［11Ｃ］ｃｈｏｌｉｎｅ−ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ａｕｇ  １５  ２０１０；１６（１６）：４２３６−４２４５、及びＳｕｔｉｎｅｎ  Ｅ，Ｎｕｒｍｉ  Ｍ，Ｒｏｉｖａｉｎｅｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ［（１１）Ｃ］ｃｈｏｌｉｎｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ＰＥＴ  ｓｔｕｄｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｍａｒ  ２００４；３１（３）：３１７−３２４）。全血液ＴＡＣ（ｗｂＴＡＣ（ｔ））の評価は上で説明したようにＰＥＴ画像自体から得られた。ｗｂＴＡＣは１つのボクセルのみから得られたので比較的ノイズが多かった。従って、ピークからの３乗の合計に当て嵌め、このフィットさせた関数を入力関数として動態モデリングに使用した（代謝産物補正後、後述参照）。親の画分値ｐｆは血漿代謝産物解析から計算され、２、１５、３０及び６０分において、それぞれ18Ｆ−Ｄ４−コリンで［０．９６、０．５５、０．４７、０．２６］、11Ｃ−コリンで［０．９２、０．２５、０．２０、０．１２］、11Ｃ−Ｄ４−コリンで［０．９１、０．１８、０．０８、０．０３］であった。ｐｆ値をｐｆ（ｔ＝０）＝１の制限の下で２乗の合計に当て嵌めて関数ｐｆ（ｔ）を得た。次に、親の全血液ＴＡＣ、ｗｂＴＡＣＰＡＲ（ｔ）を、ｗｂＴＡＣ（ｔ）とｐｆ（ｔ）を乗じることにより計算し、入力関数として用いてパラメーターＫ１（ｍＬ／ｃｍ3／分）、ｋ２（１／分）、ｋ３（１／分）及びＶｂ（単位なし）を評価した。定常状態における正味の不可逆的取込速度定数Ｋｉ（ｍＬ／ｃｍ3／分）を評価されたミクロパラメーターからＫ１ｋ３／（ｋ２＋ｋ３）として計算した。ｗｂＴＡＣＰＡＲ（ｔ）をこのモデルの唯一の入力関数として用いて得られる当て嵌めの品質は悪いので、また18Ｆ−Ｄ４−コリン、11Ｃ−コリン及び11Ｃ−Ｄ４−コリンはマウスにおいてインビボで迅速に代謝されるので、組織ＴＡＣに対する代謝産物の寄与を説明するダブルインプット（ＤＩ）モデルも考察した（Ｈｕａｎｇ  ＳＣ，Ｙｕ  ＤＣ，Ｂａｒｒｉｏｌ  ＪＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｌ−６−［１８Ｆ］ｆｌｕｏｒｏ−ｄｏｐａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．Ｎｏｖ  １９９１；１１（６）：８９８−９１３）。ＤＩモデルでは、ｗｂＴＡＣ（ｔ）ｘ［１−ｐｆ（ｔ）］として計算された代謝産物の全血液ＴＡＣ、ｗｂＴＡＣＭＥＴ（ｔ）をｗｂＴＡＣＰＡＲ（ｔ）と共に入力関数として使用した。親のトレーサーは二組織不可逆モデルでモデル化し、一方
ａ  単一の一組織可逆モデルを使用して代謝産物動態を記載し、こうして親について評価されたパラメーターに加えて代謝産物の流入及び流出Ｋ１’及びｋ２’を計算した。標準のＷｅｉｇｈｔｅｄ  Ｎｏｎ−Ｌｉｎｅａｒ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅｓ（ＷＮＬＬＳ）を評価手順として用いた。ＷＮＬＬＳは次式のＷｅｉｇｈｔｅｄ  Ｒｅｓｉｄｕａｌ  Ｓｕｍ  ｏｆ  Ｓｑｕａｒｅｓ（ＷＲＳＳ）関数を最小にする。
【０１８３】
【数１】
2013538234.tif 000035
ここで、Ｃ（ｔｉ）及びｔｉはそれぞれＰＥＴ画像から計算される崩壊補正された濃度及びｉ番目の枠の中央の時間を示し、ｎは枠の数を表す。式１で重量ｗｉは次式で設定した。
【０１８４】
【数２】
2013538234.tif 000036
ここで、Δｉ及びλはｉ番目の枠の持続時間及び18Ｆ（18Ｆ−Ｄ４−コリンの場合）又は11Ｃ（11Ｃ−コリン及び11Ｃ−Ｄ４−コリンの場合）の半減期を表す（Ｔｏｍａｓｉ  Ｇ，Ｂｅｒｔｏｌｄｏ  Ａ，Ｂｉｓｈｕ  Ｓ，Ｕｎｔｅｒｍａｎ  Ａ，Ｓｍｉｔｈ  ＣＢ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＫＣ．Ｖｏｘｅｌ−ｂａｓｅｄ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌ−［１−（１１）Ｃ］ｃｈｏｌｉｎｅ  ＰＥＴ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｇｉｏｎ−ｏｆ−ｉｎｔｅｒｅｓｔ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．Ｊｕｌ  ２００９；２９（７）：１３１７−１３３１）。ＷＮＬＬＳ評価はＭａｔｌａｂ関数ｌｓｑｎｏｎｌｉｎで実行し、パラメーターは正に限定したが、上限は設けなかった。
【０１８５】
補充の表１．腫瘍における動的18Ｆ−Ｄ４−コリンＰＥＴからの動態パラメーター
６０分における崩壊補正した取込値（ＮＵＶ６０）及び曲線（ＡＵＣ）下の面積は腫瘍ＴＡＣからとった。フラックス定数測定値Ｋ１’、Ｋｉ及びｋ３は、腫瘍ＴＡＣ及び誘導入力関数を、18Ｆ−Ｄ４−コリンの放射活性血漿代謝産物について補正してトレーサー送達及び保持の二組織不可逆モデルに当て嵌めることによって得た。平均値（ｎ＝３）±ＳＥＭを示す。
【０１８６】
【表３】
2013538234.tif 000037
上で論じた及び／又は引用した全ての特許、雑誌の論文、刊行物その他の文献は援用により本明細書の一部をなす。
【図１】
2013538234.tif 000039
【図２】
2013538234.tif 000040
【図３】
2013538234.tif 000041
【図４】
2013538234.tif 000042
【図５ａ】
2013538234.tif 000043
【図５ｂ】
2013538234.tif 000044
【図６】
2013538234.tif 000045
【図７】
2013538234.tif 000046
【図８】
2013538234.tif 000047
【図９】
2013538234.tif 000048
【図１０】
2013538234.tif 000049
【図１１】
2013538234.tif 000050
【図１２】
2013538234.tif 000051
【図１３】
2013538234.tif 000052
【図１４】
2013538234.tif 000053
【図１５】
2013538234.tif 000054
【図１６】
2013538234.tif 000055
【図１７】
2013538234.tif 000056
【図１８】
2013538234.tif 000057
【図１９】
2013538234.tif 000058
【図２０】
2013538234.tif 000059
【図２１】
2013538234.tif 000060
【図２２】
2013538234.tif 000061
【図２３】
2013538234.tif 000062
【図２４】
2013538234.tif 000063
【図２５】
2013538234.tif 000064
【図２６】
2013538234.tif 000065
【図２７】
2013538234.tif 000066
【図２８】
2013538234.tif 000067
【図２９】
2013538234.tif 000068
【図３０】
2013538234.tif 000069
【図３１】
2013538234.tif 000070
【図３２】
2013538234.tif 000071
【国際調査報告】
2013538234.tif 000072
2013538234.tif 000073
2013538234.tif 000074
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