(57)【要約】単糖の存在下で増殖させたカカオ細胞培養物からカカオプロシアニジンオリゴマーを調製する方法であって、次のとおりにプロシアニジン生産量を増加させることができる方法：第一速度でカカオプロシアニジンオリゴマーを生産させるのに十分な量の細胞を培養する工程と、細胞に、第一速度よりも速い第二速度でのカカオプロシアニジンオリゴマーの生産を誘導するのに十分な量の単糖を細胞に導入する工程。本方法は、更に、細胞からカカオプロシアニジンオリゴマーを抽出する工程を包含してよく、この抽出する工程は、単糖の導入の１日〜２１日後に行うことができる。所望により、単糖は、培養培地の約０．５〜約２０体積％の量で導入することができる。単糖はグルコース、ショ糖、又は果糖などであってよい。単糖は、対数増殖期の後期相の間又は後に導入することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カカオプロシアニジンオリゴマーの調製法であって、
第一速度でカカオプロシアニジンオリゴマーを生産させるのに十分な時間かつ十分な条件下で細胞を培養する工程と、
前記細胞に、前記第一速度よりも速い第二速度での前記カカオプロシアニジンオリゴマーの生産を誘導するのに十分な量の単糖を細胞に導入する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞から前記カカオプロシアニジンオリゴマーを抽出する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単糖がグルコースである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記単糖が、対数増殖期後期の間又は後に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記培養がホルモン無添加培地で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抽出が、前記単糖の導入から１日〜２１日後に行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
安定的な細胞株の維持、過剰発現の誘導、及び細胞凝集の予防のために、前記単糖を、前記培養培地の容量の約０．５％〜約２０％で導入する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
エタノール抽出溶液を用い、前記細胞培養物から前記カカオプロシアニジンオリゴマーを抽出する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記エタノール抽出溶液が水溶液である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記エタノール抽出溶液に有機溶媒が含まれていない、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
酸性抽出液を用い、前記細胞培養物からカカオプロシアニジンオリゴマーを抽出する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記酸性抽出液のｐＨが約３〜約６である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記酸性抽出液が、酢酸、クエン酸、又はアスコルビン酸を含有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抽出物が、キサンチン類を実質的に含まない、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、脱脂工程を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
次の工程：
細胞を回収する工程、
ポリフェノールが豊富に含まれる画分を抽出するにあたって好適な溶媒に細胞バイオマスを懸濁する工程、
溶媒−溶媒抽出及び／又はクロマトグラフィーを用い、プロシアニジンに富む画分を単離する工程、又は
前記プロシアニジン画分を乾燥又は濃縮させる工程、のうち１つ以上の工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
次の工程：
テオブロマ種細胞のカルスを固体培地で増殖させる工程、
テオブロマ・カカオのカルス培養物から急速に増殖する細胞株を選別する工程、又は
前記急速に増殖する細胞株を液体培地に播種して、テオブロマ種細胞の懸濁培養を開始する工程、のうちの１つ以上を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
カカオプロシアニジンオリゴマーの調製法であって、
第一速度でカカオプロシアニジンオリゴマーを生産させるのに十分な時間かつ十分な条件下で細胞を培養する工程と、
ホルモン無添加培地において、前記細胞による、前記第一速度よりも速い第二速度でのカカオプロシアニジンオリゴマーの生産を誘導するのに十分な条件下で、前記細胞を培養する工程と、を含む、方法。
【請求項１９】
前記細胞から前記カカオプロシアニジンオリゴマーを抽出する工程を更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ホルモン無添加培地において、前記細胞による、第二速度よりも速い第三速度でのカカオプロシアニジンオリゴマー生産を誘導するのに十分な量の単糖を前記細胞に導入する工程を更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記単糖がグルコースである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記単糖が、対数増殖期後期の間又は後に導入される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記単糖を、前記培養培地の約０．５％〜約２０％の量で導入する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記抽出する工程を、前記ホルモン無添加培地における培養開始後１日〜２１日の間に行う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
エタノール抽出溶液を用い、前記細胞培養物から前記カカオプロシアニジンオリゴマーを抽出する工程を更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記エタノール抽出溶液が水溶液である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記エタノール抽出溶液に有機溶媒が含まれていない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
酸性抽出液を用い、前記細胞培養物からカカオプロシアニジンオリゴマーを抽出する工程を更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記酸性抽出液のｐＨが約３〜約６である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記酸性抽出液が、酢酸、クエン酸、又はアスコルビン酸を含有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記抽出物が、キサンチン類を実質的に含まない、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、脱脂工程を含まない、請求項１８に記載の方法。
【請求項３３】
次の工程：
細胞を回収する工程、
ポリフェノールが豊富に含まれる画分を抽出するにあたって好適な溶媒に細胞バイオマスを懸濁する工程、
溶媒−溶媒抽出及び／又はクロマトグラフィーを用い、プロシアニジンに富む画分を単離する工程、又は
前記プロシアニジン画分を乾燥又は濃縮させる工程、のうち１つ以上の工程を更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３４】
次の工程：
テオブロマ種細胞のカルスを固体培地で増殖させる工程、
テオブロマ・カカオのカルス培養物から急速に増殖する細胞株を選別する工程、又は
前記急速に増殖する細胞株を液体培地に播種して、テオブロマ種細胞の懸濁培養を開始する工程、のうち１つ以上の工程を更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３５】
カカオプロシアニジンオリゴマーの調製法であって、
ホルモン無添加培地を用い、前記細胞による、第一速度でのカカオプロシアニジンオリゴマー生産を誘導するのに十分な条件下で、前記細胞を培養する工程と、
前記ホルモン無添加培地において、前記細胞による、前記第一速度よりも速い第二速度でのカカオプロシアニジンオリゴマー生産を誘導するのに十分な量の単糖を前記細胞に導入する工程と、を含む、方法。
【請求項３６】
前記細胞から前記カカオプロシアニジンオリゴマーを抽出する工程を更に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記単糖がグルコースである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記単糖が、対数増殖期後期の間又は後に導入される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記単糖を、前記培養培地の約０．５％〜約２０％の量で導入する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記抽出する工程を、前記ホルモン無添加培地における培養開始後１日〜２１日の間に行う、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
エタノール抽出溶液を用い、前記細胞培養物から前記カカオプロシアニジンオリゴマーを抽出する工程を更に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記エタノール抽出溶液が水溶液である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記エタノール抽出溶液に有機溶媒が含まれていない、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
酸性抽出液を用い、前記細胞培養物からカカオプロシアニジンオリゴマーを抽出する工程を更に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記酸性抽出液のｐＨが約３〜約６である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記酸性抽出液が、酢酸、クエン酸、又はアスコルビン酸を含有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記抽出物が、キサンチン類を実質的に含まない、請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
前記方法が、脱脂工程を含まない、請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
次の工程：
細胞を回収する工程、
ポリフェノールが豊富に含まれる画分を抽出するにあたって好適な溶媒に細胞バイオマスを懸濁する工程、
溶媒−溶媒抽出及び／又はクロマトグラフィーを用い、プロシアニジンに富む画分を単離する工程、又は
前記プロシアニジン画分を乾燥又は濃縮させる工程、のうち１つ以上の工程を更に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５０】
次の工程：
テオブロマ種細胞のカルスを固体培地で増殖させる工程、
テオブロマ・カカオのカルス培養物から急速に増殖する細胞株を選別する工程、又は
前記急速に増殖する細胞株を液体培地に播種して、テオブロマ種細胞の懸濁培養を開始する工程、のうちの１つ以上を更に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５１】
カカオプロシアニジンオリゴマーの調製法であって、
カカオプロシアニジンオリゴマーを生産させるのに十分な時間かつ十分な条件下で細胞を培養する工程と、
エタノール抽出溶液により前記細胞から前記カカオプロシアニジンオリゴマーを抽出する工程と、を含む、方法。
【請求項５２】
培養時に、単糖を前記細胞に導入し、前記カカオプロシアニジンオリゴマーの生産量を増加させる工程を更に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記単糖がグルコースである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記単糖が、対数増殖期後期の間又は後に導入される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記懸濁培養がホルモン無添加培地で行われる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記抽出する工程を、培養時の、細胞への単糖の導入後、又はホルモン無添加培地の導入後１日〜２１日の間に行う、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記単糖を、前記培養培地の約０．５％〜約２０％の量で導入する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記エタノール抽出溶液が水溶液である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記エタノール抽出溶液に有機溶媒が含まれていない、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
前記エタノール抽出溶液が酸性である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
前記酸性抽出液のｐＨが約３〜約６である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記酸性抽出液が、酢酸、クエン酸、又はアスコルビン酸を含有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記抽出物が、キサンチン類を実質的に含まない、請求項５１に記載の方法。
【請求項６４】
前記方法が、脱脂工程を含まない、請求項５１に記載の方法。
【請求項６５】
次の工程：
細胞を回収する工程、
ポリフェノールが豊富に含まれる画分を抽出するにあたって好適な溶媒に細胞バイオマスを懸濁する工程、
溶媒−溶媒抽出及び／又はクロマトグラフィーを用い、プロシアニジンに富む画分を単離する工程、又は
前記プロシアニジン画分を乾燥又は濃縮させる工程、のうち１つ以上の工程を更に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６６】
次の工程：
テオブロマ種細胞のカルスを固体培地で増殖させる工程、
テオブロマ・カカオのカルス培養物から急速に増殖する細胞株を選別する工程、又は
前記急速に増殖する細胞株を液体培地に播種して、テオブロマ種細胞の懸濁培養を開始する工程、のうちの１つ以上を更に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６７】
カカオプロシアニジンオリゴマーの調製法であって、
カカオプロシアニジンオリゴマーを生産させるのに十分な時間かつ十分な条件下で細胞を培養する工程と、
酸性抽出液により前記細胞から前記カカオプロシアニジンオリゴマーを抽出する工程と、を含む、方法。
【請求項６８】
培養時に、単糖を前記細胞に導入し、前記カカオプロシアニジンオリゴマーの生産量を増加させる工程を更に含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記単糖がグルコースである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記単糖が、対数増殖期後期の間又は後に導入される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記懸濁培養がホルモン無添加培地で行われる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記抽出する工程を、培養時の、細胞への単糖の導入後、又はホルモン無添加培地の導入後１日〜２１日の間に行う、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
前記単糖を、前記培養培地の約０．５％〜約２０％の量で導入する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
前記エタノール抽出溶液が酸性である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７５】
前記酸性抽出液に有機溶媒が含まれていない、請求項６７に記載の方法。
【請求項７６】
前記酸性抽出液がエタノールを含有する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７７】
前記酸性抽出液のｐＨが約３〜約６である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７８】
前記酸性抽出液が、酢酸、クエン酸、又はアスコルビン酸を含有する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７９】
前記抽出物が、キサンチン類を実質的に含まない、請求項６７に記載の方法。
【請求項８０】
前記方法が、脱脂工程を含まない、請求項６７に記載の方法。
【請求項８１】
次の工程：
細胞を回収する工程、
ポリフェノールが豊富に含まれる画分を抽出するにあたって好適な溶媒に細胞バイオマスを懸濁する工程、
溶媒−溶媒抽出及び／又はクロマトグラフィーを用い、プロシアニジンに富む画分を単離する工程、又は
前記プロシアニジン画分を乾燥又は濃縮させる工程、のうち１つ以上の工程を更に含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項８２】
次の工程：
テオブロマ種細胞のカルスを固体培地で増殖させる工程、
テオブロマ・カカオ培養物から急速に増殖する細胞株を選別する工程、又は
前記急速に増殖する細胞株を液体培地に播種して、テオブロマ種細胞の懸濁培養を開始する工程、のうちの１つ以上を更に含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項８３】
前記カカオ細胞を培養する工程を、増殖期の間、空気飽和の１％〜４００％の溶存酸素濃度下で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項８４】
前記カカオ細胞を培養する工程を、前記単糖を導入する工程後に、空気飽和の１％〜４００％の溶存酸素濃度下で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項８５】
前記単離カカオ細胞株を、カフェイン及びテオブロミンを実質的に不含であるよう選別する、単離カカオ細胞株。
【請求項８６】
前記単離カカオ細胞株が、花構成要素又は花以外の栄養組織のうちの少なくとも１種から誘導されたものである、請求項８５に記載の単離カカオ細胞株。
【請求項８７】
前記花構成要素が、花弁、萼片、仮雄ずい、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８６に記載の単離カカオ細胞株。
【請求項８８】
前記花以外の栄養組織が、節、節間、幼葉、成葉、茎、根、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８６に記載の単離カカオ細胞株。
【請求項８９】
前記単離カカオ細胞株が、２００ｍｇ／Ｌ  ＰＣＶ超のプロシアニジンを生成する、請求項８５に記載の単離カカオ細胞株。
【請求項９０】
前記単離カカオ細胞株が、４００ｍｇ／Ｌ  ＰＣＶ超のプロシアニジンを生成する、請求項８５に記載の単離カカオ細胞株。
【請求項９１】
前記単離カカオ細胞株が、細胞培養物１Ｌあたり１００ｍｇ超のプロシアニジンを生成する、請求項８５に記載の単離カカオ細胞株。
【請求項９２】
前記単離カカオ細胞株が、細胞培養物１Ｌあたり２００ｍｇ超のプロシアニジンを生成する、請求項８５に記載の単離カカオ細胞株。
【請求項９３】
前記単離カカオ細胞株が、細胞培養物１Ｌあたり少なくとも２５０ｍｇ超のプロシアニジンを生成する、請求項８５に記載の単離カカオ細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は植物の細胞培養物由来のプロシアニジンの生産及び抽出方法を提供する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は米国仮出願第６１／３８９，６２９号（２０１０年１０月４日出願）に対する権利を主張し、その全体を引用により本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００３】
ポリフェノールは、植物、果物、及び野菜に広く含まれる物質であり、ヒト及び動物の健康に関し、抗酸化活性、抗変異原性及び抗がん活性などにより生理的に機能することから非常に注目を集めてきた（非特許文献１（Ｓａｌｖｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．３９：１５４９〜１５５２，１９９１）；非特許文献２（Ｂｏｍｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，１３５：１５１〜１５７，１９９９；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０：１７３７〜１７４５，１９９９））。疫学研究により、ポリフェノールの一種であるフラボノイドが、心疾患のリスクを減少させ得ることが示唆されている（非特許文献３（Ｈｅｒｔｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ：３４２：１００７〜１０１１，１９９３））。これに加えて、食物由来のフラバン−３−オール及び／又はプロアントシアニジンが、実験動物において、アテローム性動脈硬化症及び冠動脈心疾患の発生率を低下させることも示されている（非特許文献４（Ｔｉｊｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｏｒｏｓｉｓ，１３５：３７〜４７，１９９７）；非特許文献５（Ｙａｍａｋｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１４２：１３９〜１４９，１９９９））。これらの作用に関与している可能性のある機序としては、例えば、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化阻害が挙げられる（非特許文献６（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８５：２３３７〜２３４４，１９９２））。
【０００４】
植物のカカオ（アオギリ科、テオブロマ・カカオＬ）の種子にはポリフェノールが豊富に含まれていることが知られている（非特許文献７（Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１６５７〜１６６３，１９９１））。ココア及びチョコレート製品の主原料であるカカオ豆を、発酵させ、焙煎して製造したカカオ液に含まれる一部の抗酸化成分は、フラバン−３−オール及びプロシアニジンオリゴマーとして特性評価されている（非特許文献８（Ｓａｎｂｏｎｇｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４６：４５４〜４５７．１９９８）；非特許文献９（Ａｄａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４７：４１８４〜４１８８．１９９９））。
【０００５】
テオブロマ以外の他の種及び他の属、例えば、ヘラニアもまた、カカオプロシアニジンの供給源として知られている。テオブロマについては２０の別種が報告されているが、通常はそのうちの１２種のみが認容されている。これらのカカオのうち、９種はアマゾン原産であり、遺伝的には主にアマゾン西部に分布するようである（非特許文献１０（Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ，１９９４，Ｉｎ「Ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ  Ｃｒｏｐｓ：１４９２  ｆｒｏｍ  ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（Ｊ．Ｅ．Ｈｅｒｎａｎｄｏ  Ｂｅｒｍｅｊｏ  ａｎｄ  Ｊ．Ｌｅｏｎ，Ｅｄｓ．）Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．２６，ＦＡＯ，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ，ｐ  ２０５〜２０９））。
【０００６】
テオブロマ属は、典型的には、亜熱帯の植物であり、西半球の北緯１８度から南緯１５度の間の熱帯雨林に分布している。ほとんどの種は、コスタリカ及びコロンビア北東の領域に分布する。５節及び２０種が認識されている。テオブロマ・グランディフローラム（Theobroma grandiflorum）はグロッソ・ペタルム（Glossopetalum）節に属し、１１種からなり、テオブロマ・カカオはテオブロマ節の唯一の種である。
【０００７】
テオブロマのうち４種、すなわちテオブロマ・グランディフローラム、テオブロマ・カヌマネンセピレス＆フロエス（Theobroma canumanense Pires &#38; Froes）、テオブロマ・スビンカヌム・マルチウス（Theobroma subincanum Martius）（ブラジルではカプイ（Cupui）、コロンビアではカカウ・デ・モンテ（Cacau de monte））並びにテオブロマ・トリコロール・ハンブ＆ボンプル（Theobroma tricolor Humb. &#38; Bonpl）は、アマゾン西部からメキシコ南部に分布している低木であり、食用果肉の生産株として報告されている。チョコレートもこれらの種の種子から製造される（非特許文献１０（Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ，１９９４，Ｉｎ「Ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ  Ｃｒｏｐｓ：１４９２  ｆｒｏｍ  ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（Ｊ．Ｅ．Ｈｅｒｎａｎｄｏ  Ｂｅｒｍｅｊｏ  ａｎｄ  Ｊ．Ｌｅｏｎ，Ｅｄｓ．）Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．２６，ＦＡＯ，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ，ｐ２０５〜２０９））。テオブロマ及びヘラニアのうちの数種の豆から類似したプロシアニジンが生産されること、及び豆からこれらの化合物を抽出できることが示されている（Ｒｏｍａｎｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，特許文献１（国際公開第９７／３６４９７号））。
【０００８】
カカオ豆に含まれるポリフェノールは、子葉の色素細胞に貯蔵される。ポリフェノール貯蔵細胞とも呼ばれるこれらの色素細胞に含まれるアントシアニンの量に応じて、カカオ豆は白色から深紫になる。これらの細胞では、ポリフェノールは３群に、すなわちカテキン又はフラバン−３−オール（約３７％）、アントシアニン（約４％）、及びプロアントシアニジン（約５８％）に分類できる。主要なカテキンは（−）−エピカテキンであり、総ポリフェノール含量の最大で３５％を構成する。プロシアニジン（一般にプロアントシアニジンと呼ばれる）は主にフラバン−３，４−ジオールであり、主鎖伸長サブユニットのエピカテキンと４→８又は４→６結合した縮合二量体、三量体又はオリゴマーである（Ｒｏｍａｎｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，特許文献１（国際公開第９７／３６４９７号））。
【０００９】
新鮮なカカオ豆を乾燥脱脂させた場合に含まれる可溶性ポリフェノールの総量は１５〜２０％であり（脂質分５４％、湿分６％の風乾させたカカオ豆で約６％相当）、発酵させた豆では約５％である。したがって、豆の加工時に大部分のポリフェノールが失われることが、カカオ豆をポリフェノール資源として用いる際の主な欠点として挙げられる。焙煎及び脱脂などのその他の工程も損失につながる。したがって、カカオ粉末に含まれる総ポリフェノール量は、新鮮な豆で見出される量の１０％未満になる。他には、テオブロマ・カカオ植物の生育範囲が制限されていることも、カカオ豆を使用する際の課題である。カカオは、赤道の北緯約２０°及び南緯約２０°の、温暖で湿気の多い気候でのみ生育する。そのため、加工し、ポリフェノールを抽出することのできる場所まで貯蔵及び輸送している間に、カカオ豆のポリフェノール含量を維持することは困難である。
【００１０】
植物細胞の培養は、これらの課題を克服するにあたって魅力的な代案である。植物細胞の培養は、近年ではフラボノイドの単離に使用されている。プロシアニジンの場合、培養により数種の特定の化合物を単離することができる。例えば、バラ属の培養物からは４→８結合型（−）−エピカテキン−（＋）−カテキン及び没食子酸が単離されている（非特許文献１１（Ｍｕｈｉｔｃｈ  ＆  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７５：５９２〜５９５，１９８４））。クリプトメリア・ジャポニカ（Cryptomeria japonica）の懸濁培養物及びカルスが乾燥重量の２６％程度のプロシアニジンを生産し（非特許文献１２（Ｔｅｒａｍｏｔｏ  ＆  Ｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｂｏｔ．Ｍａｇ．Ｔｏｋｙｏ  ９８：１７１〜１７９，１９８５）；非特許文献１３（Ｉｓｈｉｋｕｒａ  ＆  Ｔｅｒａｍｏｔｏ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４７：４２１〜４２３，１９８３））、シュードツガ・メンシエシ（Pseudotsuga mensiesii）の懸濁培養物が乾燥重量の４０％程度のプロシアニジンを生産する（非特許文献１４（Ｓｔａｆｆｏｒｄ  ＆  Ｃｈｅｎｇ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：１３１〜１３５，１９８０））ことが判明している。ヴィティス・ヴィニフェラ（Vitis vinifera）の細胞の懸濁培養物でプロシアニジンの生産が示されたという報告もある（非特許文献１５（Ｄｅｃｅｎｄｉｔ  ＆  Ｍｅｒｉｌｌｏｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１５：７６２〜７６５，１９９６）；非特許文献１６（Ｗａｆｆｏ−Ｔｅｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．４２：１５９１〜１５９３，１９９６））。
【００１１】
これまでに、いくつかの研究室では、クローン増殖による植物の繁殖を目的として、体細胞胚形成に焦点を置いた、テオブロマ・カカオの組織培養研究が行われている。テオブロマ・カカオの体細胞胚形成に関する最初の報告は１９７７年のＥｓａｎによるものであり（非特許文献１７（Ｐｒｏｃ．５ｔｈ  Ｉｎｔ．Ｃａｃａｏ  Ｒｅｓ．Ｃｏｎｆ．１９７５．Ｉｂａｄａｎ）：非特許文献１８（Ｃａｃａｏ  Ｒｅｓ．Ｉｎｓｔ．Ｎｉｇｅｒｉａ，１９７７：１１６〜１２５，１９７７））、未成熟な接合胚組織外植片を用いる方法を報告している。後に、同様の報告が他者からもされている（非特許文献１９（Ｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．１０４：１４５〜１４８，１９７９）；非特許文献２０（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ  ＆  Ａｇｕｉｌａｒ，Ａｂｓｔｒ．ＶＩＩ  Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇｒ．Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｉｎｔ．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｐ１４０，１９９０））。後の研究では、葉（非特許文献２１（Ｌｉｔｚ，Ｉｎ  Ｄｉｍｉｃｋ，Ｐ．Ｓ．，Ｅｄ．，Ｃａｃａｏ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．Ｔｈｅ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ，ＰＡ，ｐｐ  １１１〜１２０，１９８６））、珠心（非特許文献２２（Ｃｈａｔｅｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｐａｒｉｓ  ３１５：５５〜６２，１９９２）；非特許文献２３（Ｆｉｇｕｅｉｒａ  ＆  Ｊａｎｉｃｋ，Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔ．３３６：２３１〜２３８，１９９３）；非特許文献２４（Ｓｏｎｄｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔ．３３６：２４５〜２４８，１９９３））、並びに花弁及び仮雄ずいなどの花由来の外植片（非特許文献２５（Ｌｏｐｅｚ−Ｂａｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｐａｒｉｓ  ３１６：５７９〜５８４，１９９３）；非特許文献２６（Ａｌｅｍａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔ．４６：１８７〜１９４，１９９６）；非特許文献２７（Ａｌｅｍａｎｎｏ  ＆  Ｍｉｃｈａｕｘ−Ｆｅｒｒｉｅｒｅ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  ３３：１６３〜１７２，１９９７））などの体性組織からの組織培養法の開発に焦点が置かれている。これらの初期の方法は、成功していたものの、すべての遺伝子型に適用可能であったわけではなく、植物が再生する頻度は低かった。多様な遺伝子型を繁殖させ得る、より効果的な方法も開発された（非特許文献２８（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  ３４：２９３〜２９９，１９９８）；非特許文献２９（Ｍａｘｉｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  ３８：２５２〜２５９，２００２））。しかしながら、記載のすべての方法は、組織培養による体細胞胚の製造方法を教示しているものの、細胞懸濁液を生成する方法については教示していなかった。
【００１２】
テオブロマ・カカオの細胞培養法の開発に関する報告の数は限られており、研究の殆どは１９７０年代及び１９８０年代になされたものである（非特許文献３０（Ｈａｌｌ  ＆  Ｃｏｌｌｉｎ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔ．３９：５５５，１９７５）；非特許文献３１（Ｊａｌａｌ  ＆  Ｃｏｌｌｉｎ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．１６：１３７７〜１３８０，１９７７）；非特許文献３２（Ｊａｌａｌ  ＆  Ｃｏｌｌｉｎ，Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．８３：３４３〜３４９，１９７９）；非特許文献３３（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．４７：７６８〜７７３，１９８２）；非特許文献３４（Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔ’ｓ  Ｓｏｃ．１６：１７２０〜１７２４，１９８４））。これらの報告のうち、ほんの僅かなものだけが、テオブロマ・カカオの細胞培養物に含まれるフラボノイドを研究している。例えば、非特許文献３５（Ｊａｌａｌ及びＣｏｌｌｉｎ（１９７９年））は、カルス及び細胞懸濁液に含まれるフラボノイド化合物は類似しており、もとのインタクトな子葉と比べてはるかに変動が少ないことを報告している。いずれの組織培養物も、（−）−エピカテキン、ロイコシアニジン、コーヒー酸及びクマル酸を含有していた。組織培養物からはメチル化プリン、テオブロミン及びカフェインは検出されなかった。しかしながら、非特許文献３６（Ｇｕｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｅｘｐｔ．Ｂｏｔ．４３：７６９〜７７５，１９９２））は、テオブロマ・カカオのカルス及び懸濁培養物が、ｉｎ  ｖｉｖｏの場合の約１０％の濃度で、カフェイン、テオブロミン及びテオフィリンを生産していることを報告している。
【００１３】
先行技術には、近年、優れた生物有効性を有することが示された、プロシアニジンオリゴマーの生成に関する報告はない。非特許文献３７（Ｊａｌａｌ及びＣｏｌｌｉｎ（Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．８３：３４３〜３４９，１９７９））は、テオブロマ・カカオの細胞培養時にロイコシアニジンが検出されたことを報告した。しかしながら、化合物の検出に使用した方法では、ロイコシアニジンの性質又は分子量を特徴づけることは困難であった。更に、テオブロマ又はヘラニア以外の種についての組織培養法は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第９７／３６４９７号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓａｌｖｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．３９：１５４９〜１５５２，１９９１
【非特許文献２】Ｂｏｍｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，１３５：１５１〜１５７，１９９９；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０：１７３７〜１７４５，１９９９
【非特許文献３】Ｈｅｒｔｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ：３４２：１００７〜１０１１，１９９３
【非特許文献４】Ｔｉｊｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｏｒｏｓｉｓ，１３５：３７〜４７，１９９７
【非特許文献５】Ｙａｍａｋｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１４２：１３９〜１４９，１９９９
【非特許文献６】Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８５：２３３７〜２３４４，１９９２
【非特許文献７】Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１６５７〜１６６３，１９９１
【非特許文献８】Ｓａｎｂｏｎｇｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４６：４５４〜４５７．１９９８
【非特許文献９】Ａｄａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４７：４１８４〜４１８８．１９９９
【非特許文献１０】Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ，１９９４，Ｉｎ「Ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ  Ｃｒｏｐｓ：１４９２  ｆｒｏｍ  ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（Ｊ．Ｅ．Ｈｅｒｎａｎｄｏ  Ｂｅｒｍｅｊｏ  ａｎｄ  Ｊ．Ｌｅｏｎ，Ｅｄｓ．）Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．２６，ＦＡＯ，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ，ｐ  ２０５〜２０９
【非特許文献１１】Ｍｕｈｉｔｃｈ  ＆  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７５：５９２〜５９５，１９８４
【非特許文献１２】Ｔｅｒａｍｏｔｏ  ＆  Ｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｂｏｔ．Ｍａｇ．Ｔｏｋｙｏ  ９８：１７１〜１７９，１９８５
【非特許文献１３】Ｉｓｈｉｋｕｒａ  ＆  Ｔｅｒａｍｏｔｏ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４７：４２１〜４２３，１９８３
【非特許文献１４】Ｓｔａｆｆｏｒｄ  ＆  Ｃｈｅｎｇ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：１３１〜１３５，１９８０
【非特許文献１５】Ｄｅｃｅｎｄｉｔ  ＆  Ｍｅｒｉｌｌｏｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１５：７６２〜７６５，１９９６
【非特許文献１６】Ｗａｆｆｏ−Ｔｅｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．４２：１５９１〜１５９３，１９９６
【非特許文献１７】Ｐｒｏｃ．５ｔｈ  Ｉｎｔ．Ｃａｃａｏ  Ｒｅｓ．Ｃｏｎｆ．１９７５．Ｉｂａｄａｎ
【非特許文献１８】Ｃａｃａｏ  Ｒｅｓ．Ｉｎｓｔ．Ｎｉｇｅｒｉａ，１９７７：１１６〜１２５，１９７７
【非特許文献１９】Ｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．１０４：１４５〜１４８，１９７９
【非特許文献２０】Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ  ＆  Ａｇｕｉｌａｒ，Ａｂｓｔｒ．ＶＩＩ  Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇｒ．Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｉｎｔ．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｐ１４０，１９９０
【非特許文献２１】Ｌｉｔｚ，Ｉｎ  Ｄｉｍｉｃｋ，Ｐ．Ｓ．，Ｅｄ．，Ｃａｃａｏ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．Ｔｈｅ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ，ＰＡ，ｐｐ  １１１〜１２０，１９８６
【非特許文献２２】Ｃｈａｔｅｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｐａｒｉｓ  ３１５：５５〜６２，１９９２
【非特許文献２３】Ｆｉｇｕｅｉｒａ  ＆  Ｊａｎｉｃｋ，Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔ．３３６：２３１〜２３８，１９９３
【非特許文献２４】Ｓｏｎｄｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔ．３３６：２４５〜２４８，１９９３
【非特許文献２５】Ｌｏｐｅｚ−Ｂａｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｐａｒｉｓ  ３１６：５７９〜５８４，１９９３
【非特許文献２６】Ａｌｅｍａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔ．４６：１８７〜１９４，１９９６
【非特許文献２７】Ａｌｅｍａｎｎｏ  ＆  Ｍｉｃｈａｕｘ−Ｆｅｒｒｉｅｒｅ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  ３３：１６３〜１７２，１９９７
【非特許文献２８】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  ３４：２９３〜２９９，１９９８
【非特許文献２９】Ｍａｘｉｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  ３８：２５２〜２５９，２００２
【非特許文献３０】Ｈａｌｌ  ＆  Ｃｏｌｌｉｎ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔ．３９：５５５，１９７５
【非特許文献３１】Ｊａｌａｌ  ＆  Ｃｏｌｌｉｎ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．１６：１３７７〜１３８０，１９７７
【非特許文献３２】Ｊａｌａｌ  ＆  Ｃｏｌｌｉｎ，Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．８３：３４３〜３４９，１９７９
【非特許文献３３】Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．４７：７６８〜７７３，１９８２
【非特許文献３４】Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔ’ｓ  Ｓｏｃ．１６：１７２０〜１７２４，１９８４
【非特許文献３５】Ｊａｌａｌ及びＣｏｌｌｉｎ（１９７９年）
【非特許文献３６】Ｇｕｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｅｘｐｔ．Ｂｏｔ．４３：７６９〜７７５，１９９２）
【非特許文献３７】Ｊａｌａｌ及びＣｏｌｌｉｎ（Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．８３：３４３〜３４９，１９７９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
植物細胞の培養は、これらの課題を克服するにあたって魅力的な代案である。したがって、ポリフェノール、及び特にプロシアニジンを得るために改良された植物細胞培養プロトコル、並びに抽出プロトコルを有することは有利なものであり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本開示は、単離カカオ細胞株、このような単離細胞株から調製した抽出物、並びに液体培地で増殖させるのに適したカカオ細胞株の開発方法に関する。本開示は、細胞培養時にプロシアニジンを高レベルで生産する細胞株の選別方法、並びにこのような細胞培養物からプロシアニジンを抽出して、食品原材料、食品添加物、治療用組成物、又は化粧品組成物を製造する方法にも関する。加えて、プロシアニジンを高レベルで生産するよう選別される、このような単離細胞株は、カフェイン及びテオブロミンを実質的に含まないよう選別することもできる。カフェイン及びテオブロミンは、一般的にカカオ製剤に極めて豊富に含まれる化合物であり、ココアでは主にココアの苦味に関係する。これらの化合物は、主に犬及び他の動物用のカカオ製品の毒性にも関係する。本開示は更に、カカオ細胞の細胞懸濁培養物の増殖用の新規増殖条件及び／又は培養培地（例えば、液体培地）、並びにこのような細胞懸濁液によるプロシアニジン生産を向上させるための液体培地組成物に関係する。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、カフェイン及びテオブロミンを実質的に不含であるように選別した単離カカオ細胞株を包含する。すなわち、単離カカオ細胞株により生産された生成物は、カフェイン及びテオブロミンを実質的に含まない。結果として、単離カカオ細胞株から得た製剤（例えば、可溶化液、抽出物など）は、そのままでカフェイン及びテオブロミンを実質的に不含である。一実施形態では、単離カカオ細胞株は懸濁培養で増殖させるのに適した細胞であり得る。
【００１９】
単離カカオ細胞株は、カカオ植物の本質的にあらゆる部位から誘導できる。例えば、単離カカオ細胞株は、少なくとも１種の花構成要素又は花以外の栄養組織から誘導できる。花構成要素の例としては、限定するものではないが、花弁、萼片、仮雄ずい、及びこれらの組み合わせが挙げられる。花以外の栄養組織の例としては、限定するものではないが、節、節間、幼葉、成葉、茎、根、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２０】
一実施形態では、単離カカオ細胞株は、１００ｍｇ／Ｌ溶液中細胞体積（「ＰＣＶ」）超、２００ｍｇ／Ｌ  ＰＣＶ超、３００ｍｇ／Ｌ  ＰＣＶ超、４００ｍｇ／Ｌ  ＰＣＶ超、又は５００ｍｇ／Ｌ  ＰＣＶ超のプロシアニジンを生成する。一実施形態では、単離カカオ細胞株は、細胞培養物１Ｌあたり１００ｍｇ超、２００ｍｇ超、又は少なくとも２５０ｍｇのプロシアニジンを生成する。
【００２１】
一実施形態では、カカオ細胞培養物からのカカオプロシアニジンオリゴマーの調製を開示する。
【００２２】
一実施形態では、カカオプロシアニジンオリゴマーの調製方法には、（１）第一速度でカカオプロシアニジンオリゴマーを生産させるのに十分な時間かつ十分な条件下で細胞を培養する工程と、（２）細胞に、第一速度よりも速い第二速度でのカカオプロシアニジンオリゴマーの生産を誘導するのに十分な量の単糖を細胞に導入する工程と、が包含される。一態様では、単糖はグルコース、ショ糖、又は果糖などであってよい。単糖は、対数増殖期の後期の間又は後に導入することができる。所望により、単糖は、培養培地の約０．５〜約２０重量％又は体積％の量で導入することができる。単糖は、安定的な細胞株の維持、過剰生産の誘導、及び細胞の凝集予防を目的として、加えることができる。
【００２３】
他の実施形態では、カカオプロシアニジンオリゴマーの調製方法には、（１）第一速度でカカオプロシアニジンオリゴマーを生産させるのに十分な時間かつ十分な条件下で細胞を培養する工程と、（２）ホルモン無添加培地において、第一速度よりも速い第二速度でのカカオプロシアニジンオリゴマーの生産を誘導するのに十分な条件下で、細胞を培養する工程と、が包含される。一実施形態では、本方法は、ホルモン無添加培地で、細胞による、第二速度よりも速い第三速度でのカカオプロシアニジンオリゴマーの生産を誘導するのに十分な量の単糖を細胞に導入する工程を包含し得る。
【００２４】
本明細書に記載の方法の一実施形態に従って、方法には更に、細胞由来のカカオプロシアニジンオリゴマーを抽出する工程を包含させることができる。一実施形態では、細胞抽出物は、キサンチン類を実質的に含まない。キサンチン類としては、限定するものではないが、カフェイン、テオブロミン、及びテオフィリンが挙げられる。
【００２５】
適宜、更に他の実施形態では、カカオプロシアニジンオリゴマーの製造方法は、（１）カカオプロシアニジンオリゴマーを生産させるのに十分な時間かつ十分な条件下で細胞を培養する工程と、（２）抽出溶液を用い、細胞からカカオプロシアニジンオリゴマーを抽出する工程と、を包含する。一実施形態では、抽出溶液はエタノール系溶液であってよい。一態様では、エタノール系抽出溶液は水溶液であってよい。他の態様では、エタノール系抽出溶液は、エタノール以外に任意の有機溶媒を含まない溶液であり得る。一実施形態では、抽出溶液は酸性抽出液であり得る。酸性抽出液のｐＨは、約３〜約６である。酸性抽出液としては、酢酸、クエン酸、又はアスコルビン酸が挙げられる。一実施形態では、方法は、抗酸化剤を含む酸性抽出液を用い実施することができる。一部の例では、同様に、酸性抽出液に含まれる酸は抗酸化剤である。一部の例では、別個の酸及び抗酸化剤を抽出溶液に使用する。
【００２６】
本開示に記載の方法には、更に、単糖の導入後、１日目〜２１日目（例えば、約１日目〜約１０日目）の細胞からカカオプロシアニジンオリゴマーを抽出する工程を包含させることができる。所望により、単糖は、培養培地の約０．５〜約２０重量％又は体積％の量で導入することができる。一態様では、培養物はホルモン無添加培地で培養することができる。
【００２７】
一実施形態では、本方法は、脱脂工程を含まなくてもよい。すなわち、抽出物（プロシアニジン、ポリフェノールなど）は、脱脂工程を行わずとも、培養細胞から製造できる。
【００２８】
一実施形態では、本方法は、次の工程：細胞を回収する工程、ポリフェノールが豊富に含まれる画分を抽出するにあたって好適な溶媒に細胞バイオマスを懸濁する工程、溶媒−溶媒抽出及び／又はクロマトグラフィーを用い、プロシアニジンに富む画分を単離する工程、又はプロシアニジン画分を乾燥又は濃縮させる工程、のうち１つ以上の工程を包含し得る。
【００２９】
一実施形態では、本方法は、次の工程：テオブロマ種細胞のカルスを固体培地で増殖させる工程、テオブロマ・カカオのカルス培養物から急速に増殖する細胞株を選別する工程、並びに急速に増殖する細胞株を液体培地に播種して、テオブロマ種細胞の懸濁培養を開始する工程、のうち１つ以上の工程を包含し得る。
【００３０】
一実施形態では、本方法は、発酵槽又はバイオリアクター容器にて、酸素などの溶存ガスの存在下でカカオ細胞培養物を培養することで、液体培地中で高濃度の溶存酸素に細胞を暴露する工程を包含し得る。増殖期及び誘導段階（例えば、単糖の導入後、又は細胞をホルモン無添加培地に導入した後）時に、スパージャにより、酸素を単独で、あるいは空気と精製気体酸素との混合物として、発酵槽又はバイオリアクターに供給し、高増殖性及び高生産性を支持することができる。細胞に供給する溶存酸素濃度は、細胞の一次代謝又は二次代謝時の要求酸素量に応じて異なってよい。一実施形態では、カカオ細胞を培養する工程は、増殖期の間、空気飽和の１％〜４００％の溶存酸素濃度下で実施する（例えば、約１％〜約２００％）。一実施形態では、カカオ細胞を培養する工程は、誘導段階の間は、空気飽和の１％〜４００％の溶存酸素濃度下で実施する（例えば、約１％〜約２００％）。
【００３１】
これまでの及びその他の目的、特徴及び利点は、添付の図を参照しつつ進行する以降の記載により更に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】急速に増殖する細胞株の写真。
【図２Ａ】プロシアニジン生産及び収率、並びにテオブロマ・カカオ細胞培養物における糖消費を示す、花以外の栄養組織及び花構成要素由来の懸濁培養物の生産収率のグラフ。
【図２Ｂ】プロシアニジン生産及び収率、並びにテオブロマ・カカオ細胞培養物における糖消費を示す、プロシアニジン生産のグラフ。
【図２Ｃ】プロシアニジン生産及び収率、並びにテオブロマ・カカオ細胞培養物における糖消費を示す、プロシアニジン生産性の改善に対する細胞選別効果。
【図２Ｄ】プロシアニジン生産及び収率、並びにテオブロマ・カカオ細胞培養物における糖消費を示す、プロシアニジン生産収率の改善に対する細胞選別効果。
【図２Ｅ】プロシアニジン生産及び収率、並びにテオブロマ・カカオ細胞培養物における糖消費を示す、培地ＸＸＶＩ（表１）におけるテオブロマ・カカオ細胞培養物の糖解析。
【図３】各種播種密度での培養におけるバイオマス密度の典型的な経時変化を示すグラフ。
【図４】栄養組織由来の細胞を選別する工程によりプロシアニジン生産性が経時的に改善されたことを示すグラフ。
【図５Ａ】グルコースを加えインキュベートしたことに応答してプロシアニジン生産性が上昇したことを示すグラフ。
【図５Ｂ】各種濃度のグルコースの添加によりプロシアニジン生産性が上昇したことを示すグラフ。
【図６】細胞株ＭＸ１４４０−３４９６において、追加でグルコースを添加したことによる２度の誘導により、プロシアニジン生産性が増強されたことを示すグラフ。
【図７Ａ】ホルモン無添加培地による２週間にわたる培養後に、培養物１Ｌあたりのプロシアニジン生産性が増加したことを示すグラフ。
【図７Ｂ】２つの処理、すなわちホルモン無添加培地により１週間培養を行い、及び次いで６％グルコースにより細胞に２度目の誘導処理を１週間行う処理による追加効果を示すグラフ。この処理において、誘導は培地をホルモン無添加培地に変えてから７日目に行った。
【図８Ａ】プロシアニジンを測定するためのブタノール−ＨＣｌ加水分解アッセイ。
【図８Ｂ】プロシアニジンを測定するためのブタノール−ＨＣｌ加水分解アッセイ。
【図８Ｃ】プロシアニジンを測定するためのブタノール−ＨＣｌ加水分解アッセイ。  プロシアニジンは、酸加水分解により、２種の単量体、すなわち（−）−エピカテキン及びシアニジンに分解され、ピンク色を呈する。各試料において、ピンク色の濃さにより、異なる細胞株において得られるプロシアニジンの量を表す（図８Ａ）。試料を迅速にスクリーニングするにあたって、この方法を９６ウェルプレート形式に最適化した（図８Ｂ）。シアニジンの吸収波長は５２０ｎｍであり、エピカテキンの吸収波長は２８０ｎｍである（図８Ｃ）。シアニジン吸光度値をもとに計算を行い定量した。
【図９Ａ】テオブロマ・カカオ細胞培養物のプロシアニジン及びアルカロイドについての一連のクロマトグラフであって、各種化合物の標準品を用いるＨＰＬＣ  ＬＣ−ＭＳ解析。
【図９Ｂ】テオブロマ・カカオ細胞培養物のプロシアニジン及びアルカロイドについての一連のクロマトグラフであって、各種化合物の標準品を用いるＨＰＬＣ  ＬＣ−ＭＳ解析。
【図９Ｃ】テオブロマ・カカオ細胞培養物のプロシアニジン及びアルカロイドについての一連のクロマトグラフであって、各種化合物の標準品を用いるＨＰＬＣ  ＬＣ−ＭＳ解析。
【図９Ｄ】テオブロマ・カカオ細胞培養物のプロシアニジン及びアルカロイドについての一連のクロマトグラフであって、テオブロマ・カカオ細胞懸濁液のＨＰＬＣ  ＬＣ−ＭＳ解析。
【図９Ｅ】テオブロマ・カカオ細胞培養物のプロシアニジン及びアルカロイドについての一連のクロマトグラフであって、テオブロマ・カカオ細胞懸濁液のＨＰＬＣ  ＬＣ−ＭＳ解析。
【図９Ｆ】テオブロマ・カカオ細胞培養物のプロシアニジン及びアルカロイドについての一連のクロマトグラフであって、テオブロマ・カカオ細胞懸濁液のＨＰＬＣ  ＬＣ−ＭＳ解析。  これらの解析結果では、エピカテキン及びカテキンのシグナルは検出されたのに対し、カフェイン又はテオブロミンのシグナルは検出されなかった。
【図１０Ａ】２８０ｎｍでの蛍光検出器モードでの、細胞懸濁液抽出物の一連のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフ。
【図１０Ｂ】ＰＤＡ検出器モードでの、細胞懸濁液抽出物の一連のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフ。  表示１〜１２により、プロシアニジンの重合度を示す。それぞれ、１は単量体、２は二量体、３は三量体、４は四量体、５は五量体、６は六量体、７は七量体、８は八量体、９は九量体、１０は十量体、１１は十一量体、１２は十二量体。
【図１１】細胞懸濁液抽出物及び発酵カカオ豆抽出物に含まれるテオブロミン及びカフェイン濃度を比較するクロマトグラム。細胞懸濁液抽出物は、カカオ豆抽出物とは対照的に微量の代謝産物を示す。
【図１２Ａ】各種水性溶媒の全体的なプロシアニジン収率の比較を示すグラフ（一日あたり，ｎ＝３）。
【図１２Ｂ】抽出手順に関し、プロシアニジンオリゴマー（単量体〜十量体）の全体的な抽出速度を比較するグラフ（ｎ＝２）。
【図１２Ｃ】６０％エタノールあるいは７０％アセトンで抽出した場合に抽出物に含まれるプロシアニジンプロファイルを比較するグラフ。
【図１３】各種播種密度の培養物におけるバイオマス密度の典型的な経時変化のグラフ。
【図１４Ａ】酸性及び非酸性抽出溶媒系における、室温下２３時間以内の二量体プロシアニジンの安定性を比較するグラフ。
【図１４Ｂ】酸性及び非酸性抽出溶媒系における、室温下２３時間以内の二量体プロシアニジンの安定性を比較するグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本開示は、単離カカオ細胞株、このような単離細胞株から調製した抽出物、並びに液体培地で増殖させるのに適したカカオ細胞株の開発方法に関する。本開示は、細胞培養時にプロシアニジンを高レベルで生産する細胞株の選別方法、並びにこのような細胞培養物からプロシアニジンを抽出して、食品原材料、食品添加物、治療用組成物、又は化粧品組成物を製造する方法にも関する。加えて、プロシアニジンを高レベルで生産するよう選別される、このような単離細胞株は、カフェイン及びテオブロミンを実質的に含まないよう選別することもできる。カフェイン及びテオブロミンは、一般的にカカオ製剤に極めて豊富に含まれる化合物であり、ココアでは主にココアの苦味に関係する。これらの化合物は、主に犬及び他の動物用のカカオ製品の毒性にも関係する。本開示は更に、カカオ細胞の細胞懸濁培養物の増殖用の新規増殖条件及び／又は培養培地（例えば、液体培地）、並びにこのような細胞懸濁液によるプロシアニジン生産を向上させるための液体培地組成物に関係する。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
ＩＩ．用語
別途記載のない限り、技術用語は従来法に従って使用する。本発明の各種実施形態の総括を容易にする目的で、以降に専門用語に関する説明を提供する：
抗酸化剤は、フリーラジカルにより生じるものなどの、酸化による損傷（酸素によりもたらされる損傷）を減少させる物質である。
【００３６】
カルスは、細胞壁の薄い未分化の植物細胞塊であり、損傷時にあるいは栄養培地での増殖時に発達する。
【００３７】
カテキンは、植物で天然に生じるポリフェノール系化合物である。フラバン−３−オールとも呼ばれる。
【００３８】
カカオは、テオブロマ・カカオ（アオギリ科に所属）から得られる種であり、主に２種の品種、すなわちクリオロ（Criollo）及びフォラステロ（Forestero）により構成され、これらが更にいくつかの亜変種に分類される。トリニタリオ（Trinitario）と呼ばれる第３群は、クリオロ及びフォラステロにまたがる種である。本開示に包含される他の種としては、テオブロマ・グランジホルム（Theobroma grandiflorum）、テオブロマ・オボバツム（Theobroma obovatum）、テオブロマ・スペシオスム（Theobroma speciosum）、テオブロマ・サブインカヌム（Theobroma subincanum）及びテオブロマ・シルベストリス（Theobroma sylvestris）が挙げられる。
【００３９】
フラボノイドは特徴的な芳香族三量体複素環核を含有する任意の化合物群であり、一般的には、グリコシド形態で生じ、しばしば色素として植物に広く含まれる。
【００４０】
ポリフェノールはバイオフラボノイドとしても既知の水溶性の植物色素であり、化学構造に従って分類することのできる４，０００種以上の化学的に特有のフラボノイドを包含する。ポリフェノールモノマーとしては、カテキン、エピカテキン、ロイコシアニジンが挙げられる。ポリフェノールオリゴマーとしては、プロシアニジンが挙げられる。
【００４１】
プロシアニジンは、２〜５０超の単位のカテキン単位が結合してなる高分子化合物である。プロシアニジンは、一般的にプロアントシアニジン又は縮合型タンニンとも呼ばれる。
【００４２】
懸濁培養は、原核細胞又は真核細胞のいずれかを、制御条件下で液体栄養培地で増殖させる手法である。
【００４３】
組織培養は、培養培地中での組織の生存及び増殖維持に関する手法又は方法である。
【００４４】
キサンチン、キサンチン誘導体（３，７−ジヒドロ−プロリン−２，６−ジオン）は、温和な刺激剤として、並びに気管支拡張薬として作用させるために一般的に使用されるアルカロイド群の一員である。メチル化キサンチン誘導体としては、カフェイン、パラキサンチン、テオフィリン、及びテオブロミン（主にチョコレートに見られる）が挙げられる。これらの化合物は、ホスホジエステラーゼを阻害し、アデノシンと拮抗する。
【００４５】
別途記載のない限り、本明細書において使用されるすべての技術的用語及び科学的用語は、本発明の属する分野の当業者に慣例的に理解されるものと同じ意味を有する。不定冠詞「ａ」「ａｎ」及び定冠詞「ｔｈｅ」には、文脈上明記のない限り、複数個の対象を包含する。同様にして、用語「又は（or）」は、文脈上明記のない限り「及び（and）」を包含する。したがって、「Ａ又はＢを含む」は、Ａ又はＢ、あるいはＡ及びＢを包含する。本発明の実施又は試験には、本開示に記載の方法及び材料と同様又は等価の方法及び材料を使用できるものの、好適な方法及び材料を以降に記載する。本明細書において言及される出版物、特許出願、特許、及びその他の参考文献はすべて、その全体が参照により組み込まれるものとする。矛盾する場合、用語の説明を含む本開示を参照する。加えて、材料、方法、及び例は、単に例示的なものであり、限定を意図したものではない。
【００４６】
ＩＩＩ．発明の実施形態
単離カカオ細胞株の開発、このような単離細胞株から調製した抽出物、液体培養により増殖させるのに適したカカオ細胞株の開発法、プロシアニジンを高収率で生産できる細胞培養物の生成方法、並びに培養物からこれらの化合物を効率的に抽出する方法は、有用な化合物の生産性を有意に向上させることができる。プロシアニジンを生産するための細胞培養法を使用することで、プロシアニジンの損失量を減少させるために、カカオ豆の新規加工法を開発するという面倒な仕事を行う必要がなくなる。同様に、細胞培養物を、作物生産を混乱させ得る環境条件に暴露することはない。このような細胞培養物及び細胞培養法を本明細書に記載する。
【００４７】
本明細書では、カフェイン及びテオブロミンを実質的に不含であるよう選別した単離カカオ細胞株を提供する。すなわち、単離カカオ細胞株により生産された生成物は、カフェイン及びテオブロミンを実質的に含まない。結果として、単離カカオ細胞株から得た製剤（例えば、可溶化液、抽出物など）は、そのままでカフェイン及びテオブロミンを実質的に不含である。これは、溶媒抽出を行いカカオ細胞調製物からカフェイン及びテオブロミンを除去する必要のある、一般的なカカオ細胞調製物とは対照的である。一般的に必要とされる溶媒抽出には費用及び時間がかかる。加えて、このような溶媒抽出には、一般的に、強い溶媒（例えば、ヘキサン）が使用され、このような溶媒を用いることで、カカオ細胞抽出物には、毒性の残留物が生じる危険性がある。一実施形態では、単離カカオ細胞株は、懸濁培養で増殖させるのに適したものであり得る。
【００４８】
単離カカオ細胞株は、カカオ植物の本質的にあらゆる部位から誘導できる。例えば、単離カカオ細胞株は、少なくとも１種の花構成要素又は花以外の栄養組織から誘導できる。花構成要素の例としては、限定するものではないが、花弁、萼片、仮雄ずい、及びこれらの組み合わせが挙げられる。花以外の栄養組織の例としては、限定するものではないが、節、節間、幼葉、成葉、茎、根、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００４９】
一実施形態では、単離カカオ細胞株は、１００ｍｇ／Ｌ溶液中細胞体積（「ＰＣＶ」）超、２００ｍｇ／Ｌ  ＰＣＶ超、３００ｍｇ／Ｌ  ＰＣＶ超、４００ｍｇ／Ｌ  ＰＣＶ超、又は５００ｍｇ／Ｌ  ＰＣＶ超のプロシアニジンを生産する。一実施形態では、単離カカオ細胞株は、細胞培養物１Ｌあたり１００ｍｇ超、２００ｍｇ超、又は少なくとも２５０ｍｇのプロシアニジンを生成する。
【００５０】
本開示では、キサンチン類を実質的に不含であるカカオポリフェノール調製物の調製法を提供し、方法には、カカオポリフェノールを生産させるのに十分な時間かつ十分な条件下で、懸濁培地でテオブロマ又はヘラニア細胞を増殖させる工程と、懸濁培養物からカカオポリフェノールを回収する工程と、を包含する。特定の実施形態では、テオブロマ又はヘラニア細胞を、カカオプロシアニジン（例えば、プロシアニジンオリゴマー）を生産させるのに十分な時間（例えば、１〜３週間）かつ十分な条件下で増殖させ、懸濁培養物からカカオプロシアニジンを回収する。これらの方法例では、カカオポリフェノール（又はプロシアニジン）調製物は、検出可能なカフェイン及び／又はテオブロミンを実質的に（又は場合によっては完全に）含まない。
【００５１】
カカオ細胞の懸濁培養物の生成方法も提供する。これらの方法例には、固体培地でテオブロマ種のつぼみ外植片又はテオブロマ種栄養組織材料からカルスを増殖させる工程と、テオブロマ種のカルス培養物から、急速に増殖する細胞株を選別する工程と、急速に増殖する細胞株を液体培地に播種して懸濁培養を開始する工程と、を包含する。例えば、テオブロマ・カカオのつぼみ外植片は、場合によっては仮雄ずい、萼片、及び花弁の外植片から選択される。他の具体的な非限定例では、テオブロマ種の栄養組織材料は、幼葉又は成葉、茎、増殖点、節、又は節間から選択される。一部の例では、栄養細胞培養物は、プロシアニジン生産能において花細胞培養物よりも好ましいものであり得る。このようなカカオ細胞懸濁培養物は、細胞及び細胞から生産され得る抽出物が、カフェイン及びテオブロミンを実質的に不含であるように選択することができる。
【００５２】
同様に、本開示に含まれる任意の方法を用い製造される、キサンチン類を実質的に不含であるカカオポリフェノール（例えば、プロシアニジン）調製物を提供する。特定の実施形態では、カカオポリフェノール（例えば、プロシアニジン）調製物は、キサンチン類を検出可能な濃度で含まない（この調製物は、キサンチン類を不含である）。特異的な非限定例では、カカオポリフェノール調製物はプロシアニジン（例えば、プロシアニジンオリゴマー）を含み、カフェイン及び／又はテオブロミンを実質的に不含有である。特異的な非限定例では、本開示のカカオポリフェノールは、食品、化粧品、治療用組成物、又は獣医学用組成物に使用することができる。
【００５３】
例えば、カカオポリフェノール調製物は、抽出物の重量又は体積に基づき、テオブロミン含量が２％未満であり、かつカフェイン含量が０．５％未満である場合に、キサンチン類を実質的に不含である（例えば、カフェイン及びテオブロミンを実質的に不含である）と見なすことができる。特異的な非限定例では、カカオポリフェノール調製物は、テオブロミン含量が１．５％未満、１％未満、０．５％未満、又は０％であり、かつ／あるいはカフェイン含量が０．２５％未満、０．２％未満０．１％又は０％である場合にキサンチン類を実質的に不含であると見なすことができる。他の例では、カカオプロシアニジン調製物は、テオブロミン含量が２％未満であり、かつカフェイン含量が０．５％未満である場合にキサンチン類を実質的に不含であると見なすことができる。特異的な非限定例では、カカオポリフェノール調製物は、テオブロミン含量が１．５％未満、１％未満、０．５％未満、又は０％であり、かつ／又はカフェイン含量が０．２５％未満、０．２％未満０．１％又は０％である場合にキサンチン類を実質的に不含であると見なすことができる。最も望ましくは、キサンチン類を実質的に不含であるということは、テオブロミン含量が０％であり、かつカフェイン含量が０％であることを意味する（この調製物はキサンチン類を不含である）。本開示の及び／又は本開示の方法を用い調製された代表的な調製物は、カテキン、エピカテキン、及びプロシアニジンオリゴマーを含むカカオポリフェノールを含有するものと更に企図される。具体例では、オリゴマーには二量体〜十二量体が含まれる。例えば、一部の調製物では、オリゴマーは、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、又はこれらのうちのいずれか２つ以上の混合物を含む。
【００５４】
同様に、カカオポリフェノールがカカオプロシアニジンである調製物も意図する。本開示のカカオポリフェノール調製物は、液体形態、乾燥形態、又は凍結乾燥形態で提供され得る。カカオポリフェノールは、抽出せずに乾燥又は凍結乾燥させた細胞としても提供され得る。
【００５５】
一実施形態では、プロシアニジン生産を増加させるために、懸濁培養物には追加のグルコースを添加することもできる。対数増殖期の終わりに細胞培養物にグルコースを添加することで、プロシアニジン生産を増大させ得ることが判明している。そのため、グルコースは、プロシアニジン生産を増加させる誘導剤として使用することができる。グルコースは他の糖で代用することもできる。グルコースは、培地重量又は体積の約０．５重量％〜約２０重量％、より好ましくは約１％〜約１０％、より好ましくは約２％〜約８％、より好ましくは約３％〜約６％、及び最も好ましくは約５又は６重量％の量で添加できる。所望により、グルコースはその他の単糖、例えばショ糖又は果糖で代用することもできる。グルコース又は他の単糖は、プロシアニジン生産を増加させるために、細胞培養時の任意の時点で添加できる。単糖は播種の１日目〜２１日目に導入でき、プロシアニジン抽出前に１回以上導入できる。一例では、単糖は播種後１日目〜７日目と次に７日目〜２１日目、より好ましくは播種後５日目〜８日目と次に１２日目〜１８日目、より好ましくは約７日目と約１４日目に添加され得る。他の例では、単糖の添加は、対数増殖期後期の前、間、及び／又はそれより後に、好ましくは対数増殖期の後期に又はその後に添加され得る。プロシアニジンは、グルコース添加後１〜２１日目に、より好ましくは７〜１８日目に、又はより好ましくは１０日前後に細胞から抽出できる。
【００５６】
同様に、本開示の任意の方法を用い製造される、実質的にホルモンを不含有のカカオポリフェノール（例えば、プロシアニジン）調製物を提供する。特定の実施形態では、カカオポリフェノール（例えば、プロシアニジン）調製物には、検出可能な濃度のホルモンは含まれない。このようなホルモン無添加組成物の製造に関係する方法は、細胞を、ホルモン無添加の培養培地で１日〜３週間培養する工程を含み得る。驚くべきことに及び予想外にも、ホルモン無添加の培地で増殖させた細胞は抽出するのに十分な量のプロシアニジンを生産した。ホルモン無添加培地の使用は、細胞培養物から抽出されるホルモン濃度を減少させるのに効果的なものであり得る。細胞培養物は、細胞培養物抽出物中のホルモン含量を減少させつつ、プロシアニジンを生産させるために、ホルモン無添加培地を使用した場合にも、許容可能な範囲で生存したことが判明している。驚くべきことに及び予想外にも、ホルモン無添加の培地を使用することで、プロシアニジン生産量が増加することも判明した。したがって、抽出前に、ホルモン無添加の細胞培養を行うことで、ホルモン含量を減少させつつプロシアニジン生産量を増加させることができる。未分化の細胞では、細胞培養培地にホルモンが無添加であることが有効な場合がある。
【００５７】
細胞培養法には、播種時又はその後の何らかの時点で細胞培養培地からホルモンを除去する工程を包含させることができる。ホルモンを除去する工程には、細胞が実質的にホルモンを含まないように、細胞から細胞培養培地を除去し、及び／又はホルモン無添加培地を細胞に導入する工程が含まれる。一態様では、ホルモンは、播種の１〜１４日後に、より好ましくは播種の１〜７日後、又は播種の７〜１４日後に細胞から除去され得る。抽出前の１〜３週間、より好ましくは１〜２週間、最も好ましくは１週間にわたって、ホルモンの非存在下で細胞を培養できる。ホルモン無添加培地の播種前は２５％であり得る。
【００５８】
一実施形態では、プロシアニジン生産用の細胞は、グルコースを添加する前にホルモンの非存在下で培養できる。ホルモン無添加培地を使用した場合、及びグルコースを添加した場合のいずれの場合でも、それぞれプロシアニジン生産の増加が見られる一方で、驚くべきことに及び予期されないことに、グルコースを添加したホルモン無添加培地を用いた場合に、ホルモン無添加培地のみの場合又はグルコースを添加したのみの場合と比べて、プロシアニジン生産が更に増加する。細胞培養における複数の可変要素に修正を加えると、多くの場合、満足のいかない結果が生じることから、プロシアニジン生産量が増加したという結果は驚くべきものであり、予期されないものである。しかしながら、ホルモン無添加培地をグルコース添加と組み合わせた本例では、ホルモン無添加培地単独又はグルコース添加単独を組み合わせた場合に更にプロシアニジン生産量が増加するという実質的な相加効果が得られた。細胞培養物からホルモンを除去し、グルコースを導入し、プロシアニジンを抽出する工程は、これまでに記載のとおりにグルコース導入及びホルモン無添加培地での培養に関する特徴を組み合わせることで実施できる。
【００５９】
更に、最初に細胞をホルモン無添加培地で培養させた後でグルコースを添加するなどして、ホルモン無添加培地での培養と、グルコース存在下での培養を、順番に組み合わせることもできる。培養法には次の工程：１週間かけて細胞からホルモンを除去した後にグルコースを添加し、１〜２１日間置いてからプロシアニジンを抽出する工程、２週間かけて細胞からホルモンを除去した後にグルコースを添加し、１〜２１日間置いてからプロシアニジンを抽出する工程、３週間かけて細胞からホルモンを除去した後にグルコースを添加し、１〜２１日間置いてからプロシアニジンを抽出する工程、１週間以上かけて細胞からホルモンを除去した後に、間を１〜１４日間取って２回以上グルコースを添加し、１〜２１日間置いてからプロシアニジンを抽出する工程、播種後１〜１４日目に細胞からホルモンを除去し、本開示に記載のとおりにグルコースを添加し、次に１〜２１日間置いてからプロシアニジンを抽出する工程、あるいは他の同様の培養法、のうちの１つ以上を包含させることができる。
【００６０】
一実施形態では、プロシアニジンを得るための抽出工程において、抽出溶媒としてエタノールを使用することで、細胞培養物からのプロシアニジン単量体〜十量体の抽出効率を上昇させることができる。すなわち、エタノールを使用できることから、この手法は、環境汚染物質になることが知られているアセトンに比べ、環境に親和的なものであり得る。また、エタノール系抽出剤は再利用及び再使用できる。それに対し、アセトンは再利用することが難しい。
【００６１】
一実施形態では、プロシアニジンを得るための抽出工程は酸の存在下で実施することができ、この酸はアスコルビン酸又はクエン酸などの抗酸化剤であってもよい。酸性抽出液が抗酸化特性を有すると、酸化による分解が抑えられるため、プロシアニジンの抽出性が改善され得る。また、細胞への抽出溶媒の浸透性が上昇し、かつプロシアニジンが遊離することに一部応じ、抽出効率が上昇する。あるいは、酸と、酸とは別の抗酸化剤を使用することもできる。
【００６２】
本開示のいずれかの方法により製造したテオブロマ又はヘラニア細胞懸濁培養物を用い細胞培養を実施し、本開示に記載のとおりにこれらの細胞懸濁培養物を使用してカカオポリフェノール（例えば、プロシアニジン）を製造することができる。
【００６３】
一実施例では、キサンチン類を実質的に不含であるカカオポリフェノール調製物の製造法を提供し、方法は、カカオポリフェノールを生産させるのに十分な時間かつ十分な条件下で、懸濁培地でテオブロマ又はヘラニア細胞を増殖させる工程と、細胞懸濁液からカカオポリフェノールを回収する工程と、を包含し得る。本方法例では、カカオポリフェノール調製物は、検出可能なカフェイン及び／又はテオブロミンを実質的に（又は一部の場合は全く）含まない。他の特異的な実施例では、調製物は、鞘を発酵させて製造したカカオポリフェノール調製物に含まれる濃度の５０％未満のカフェイン及び／又はテオブロミンを含有する。好ましい実施形態では、細胞培養により生成した調製物は、鞘を発酵させて製造したカカオポリフェノール調製物に含まれる濃度の３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、又は５％未満のカフェイン及び／又はテオブロミンを含有する。本開示の方法に関する特定の実施形態では、テオブロマ又はヘラニア細胞を、カカオプロシアニジン（例えば、プロシアニジンオリゴマー）を生産させるのに十分な時間かつ十分な条件下で増殖させ、細胞懸濁液からカカオプロシアニジンを回収する。
【００６４】
本明細書で提供される代表的な方法では、テオブロマ又はヘラニア細胞の懸濁培養物は、固体培地で、テオブロマ又はヘラニアのつぼみ外植片あるいはテオブロマ又はヘラニアの栄養組織材料からカルスを増殖させ、テオブロマ又はヘラニアのカルス培養物の中から急速に増殖する細胞株を選別し、急速に増殖する細胞株を液体培地に播種し懸濁培養を開始することで製造される。
【００６５】
提供する特定の方法によるカカオポリフェノール（プロシアニジンを含む）の製造には、細胞を回収する工程、ポリフェノールが豊富に含まれる画分を抽出するために細胞バイオマスを好適な溶媒（例えば、エタノール抽出剤）に懸濁する工程、プロシアニジンが豊富に含まれる画分を単離する工程（例えば、溶媒−溶媒抽出及び／又はクロマトグラフィーを用いる）、並びに場合により、プロシアニジン画分を乾燥、凍結乾燥又は濃縮する工程、を包含する。場合によっては、細胞を回収する工程には、遠心分離、ろ過又はこれらの組み合わせが含まれる。
【００６６】
更に別の実施例には、カカオ細胞懸濁培養物の製造法が含まれる。この製造例には、テオブロマ又はヘラニアのつぼみ外植片あるいはテオブロマ又はヘラニア植物材料から誘導したカルスを固体培地で増殖させる工程と、テオブロマ又はヘラニアのカルス培養物から急速に増殖する細胞株を選別する工程と、急速に増殖する細胞株を液体培地に播種して、細胞の懸濁培養を開始する工程と、を包含する。例えば、テオブロマ・カカオ又はヘラニアのつぼみ外植片は、場合によっては仮雄ずい、萼片及び花弁由来の外植片から選択される。他の具体的な非限定例では、テオブロマ・カカオ又はヘラニア由来の栄養組織材料は、幼葉又は成葉、茎、増殖点、節、又は節間から選択される。
【００６７】
所望により、カカオ細胞懸濁培養物の製造方法には、更に、細胞懸濁液をフラスコ、任意の好適な培養容器、又はバイオリアクターで増殖させる工程が包含される。例えば、場合によっては、増殖性は、容器又はバイオリアクターに、及びバッチモード、フェドバッチモード又は連続モードに影響を受ける。
【００６８】
本開示のいずれかの方法により製造したテオブロマ又はヘラニア細胞懸濁培養物、並びにこれらの細胞懸濁培養物の使用によるカカオポリフェノール、又はより具体的にはプロシアニジンの製造も本開示に企図される。
【００６９】
本開示により提供される別の実施例としては、カカオポリフェノールの混合物を含み、かつ天然のカフェイン及びテオブロミンを実質的に不含であるカカオポリフェノール調製物も挙げられる。この調製物は、テオブロマ又はヘラニア細胞懸濁培養物から調製される。「天然のカフェイン及びテオブロミンを実質的に不含である」に関して、用語「天然の」は、ＬＨ−２０分子ふるいクロマトグラフィーなどの精製法を用いずともカフェイン及びテオブロミンを比較的含有していないことを指す。そのため、本開示の方法により得られた細胞培養物の初回抽出物は、更に精製を行わずともカフェイン及び／又はテオブロミンを実質的に含まないものであり得る。しかしながら、初回の抽出時に、望ましい濃度を上回るカフェイン及び／又はテオブロミンが含まれていた場合には、更に精製を行ってもよい。
【００７０】
他の実施例としては、ヘキサン又は他の有機溶媒を用いる脱脂工程を行わない、カカオポリフェノールの抽出調製法が挙げられる。エタノールはこれらの意図する有機溶媒としては見なされない。そのため、本開示では、ヘキサンを用いずに製造される（例えば、抽出される）カカオポリフェノール（例えば、プロシアニジン）の調製法が企図される。カカオポリフェノール抽出物は、ヘキサン又はアセトン等の任意の有機溶媒を実質的に又は完全に不含である。
【００７１】
本開示で提供するカカオポリフェノール調製物は、食品組成物、及び／又は治療用組成物、及び／又は獣医学用組成物、及び／又は化粧品組成物に使用できるということも企図する。
【００７２】
ＩＶ．カカオ組織培養
本開示には、テオブロマ又はヘラニア細胞培養物から効率的にプロシアニジンを単離する方法を記載する。具体的には、カカオ豆から抽出されるプロシアニジンと同様のプロシアニジンを所定の方法で単離できる、テオブロマ又はヘラニア細胞懸濁培養物を樹立した。更に、本開示に提供される方法により、これらのプロシアニジンを大量に生産する培養細胞資源が製造された。これらの手法の代表的な利点としては、気候条件が調節されることにより、バイオマス資源が、信頼性のあるかつ持続的な資源になること、単離法が迅速で効率的なものであり、抽出時のプロシアニジンの分解が最小限に抑えられること、細胞培養物から単離したプロシアニジンの組成が、カカオ豆から単離したプロシアニジンの組成と同様であること、並びに／又は細胞培養によるプロシアニジン生産を操作し、最適化させるのに有用な手法であること、が挙げられる。
【００７３】
概して、本開示には、テオブロマ又はヘラニア植物の様々な組織から誘導したカルス培養物が記載される。誘導したカルスを使用して、各種細胞培養培地を用い懸濁培養物を調製する。安定的な細胞懸濁培養物を誘導したら、細胞からプロシアニジンを抽出し、分光光度法によりプロシアニジン含量について解析する一方で、ＨＰＬＣ−ＭＳ法を用い、個々のプロシアニジンを同定する。このような解析をもとに、生産性を更に最適化させるために、所望のプロシアニジン生産能を持つ懸濁培養物を選択する。
【００７４】
カカオ培養物の生成
カカオ培養物の生成法を本節に概説し、かつ例示的なプルトコルを実施例に記載する。簡潔に述べると、既知の修正を加え当業者により改変を行うことはできるものの、任意の各種植物部位、例えば、花弁、萼片、仮雄ずいなどの花形成要素から、あるいは体細胞胚形成に関し記載されるとおり、節、節間、幼葉、成葉などの花以外の栄養組織に由来する外植片からカルス及び懸濁培養物を誘導し、プロシアニジン生産細胞の培養を開始する。培養した細胞の一部を周期的に新鮮な培地に移すことで懸濁培養物を新鮮な懸濁培養培地に維持する。細胞の継代スケジュール及び播種密度は、細胞の増殖性及び培地からの糖消費をもとに決定する。
【００７５】
一実施例は、プロシアニジン含量を変更する方法を提供し、この方法は、プロシアニジンを生産する培養を、このような培養を開始するのに十分な条件下で開始する工程、増殖性の細胞培養物を生成するのに十分な生産培地を調製する工程、続いて、増殖性の細胞培養物をスケールアップして適切な時間をかけてプロシアニジンを単離する工程、を包含する。したがって、培養の開始に又は増殖培養の実施に必要とされる条件を変更することで、このような培養物に含まれるプロシアニジン含量が修正される。植物細胞培養物の微小環境に関わる物理的側面（例えば、光照射）及び／又は化学的側面（例えば、培地組成又は化学的誘導物質）を変更して、修正された所望の含量を得ることもできる。
【００７６】
例えば、懸濁培地に含有させる糖（例えば、ショ糖又はグルコース）濃度は、培養物に含まれるプロシアニジン量を増加させる目的で、誘導の開始時に又は誘導中に増加させることもできる。更に、植物細胞の培養により二次代謝物を製造するにあたって、窒素源（例えば、硝酸アンモニウム）を操作することもできる（Ｎｅｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３１（１２）：４１４３〜４１４９，１９９２を参照されたい）。したがって、テオブロマ又はヘラニア細胞培養物の培地に含まれる窒素源濃度を減少させることで、培養によるプロシアニジン生産量が増加し得る。加えて、特定のアミノ酸（グルタミン、グリシン、及びセリンなど）の注入も、二次代謝産物の生産に有意に影響し得る。そのため、プロシアニジン生産を増加させるために、テオブロマ又はヘラニア懸濁培養液に含まれるこれらのアミノ酸濃度を増加させることもできる。培地にアミノ酸を追加し、このアミノ酸が、テオブロマ又はヘラニアの懸濁培養によるプロシアニジン生産を増加させる程度について試験することもできる。これに加えて、培養培地からホルモンを除去して、テオブロマ又はヘラニアの懸濁培養によるプロシアニジン生産を増加させることもできる。
【００７７】
テオブロマ又はヘラニア細胞培養物のプロシアニジン含量を変更させる目的で光照射条件を変更させることもできる。例えば、光の照射量又は露光時間を増加させるなどして光照射条件に変更を加えることで、プロシアニジン生産量を増加させることができる。光の照射波長を変更させて、プロシアニジン生産量を増加させることもできる。例えば、ＵＶ光は、植物細胞培養物によるアントシアニン生産を誘導することが既知である（Ｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９３：４５〜５７，２００２）。
【００７８】
植物細胞培養物の微小環境を操作するにあたって、当業界で既知の他の変更も本開示の範囲内に含まれ、当業者であれば誰でも実施することができるものと企図される。
【００７９】
これに加え、カカオ細胞は本開示に記載のとおりに培養することができる。例えば、培養物には、プロシアニジン抽出前の何らかの時点でグルコースを投与することができる。グルコースをショ糖、又は果糖などの他の糖で置き換えることもできる。グルコースは、播種時、播種後１〜７日目、播種後７〜１４日目、播種後１４〜２１日目に、又はこれらの時点を組み合わせて細胞培養物に導入できる。他の例では、培養物はプロシアニジンの抽出前にホルモン無添加培地で増殖させることができる。培養時には、播種時、播種後１〜７日目、播種後７〜１４日目、播種後１４〜２１日目、又はこれらの時点を組み合わせて細胞にホルモン無添加培地を導入できる。
【００８０】
培養物からのカカオ細胞の回収
テオブロマ又はヘラニア細胞のプロシアニジン生産バッチを本開示に記載のとおりに増殖させ、細胞を回収してプロシアニジンを抽出する。細胞懸濁物の回収は幾通りかの方法で実施することができ、そのうちの幾つかを本開示に記載する。
【００８１】
細胞培養が定常期に達し、所望のプロシアニジン生産量に達したならば、培養物は容器内でコンパクトに細胞集団として沈殿させ、大部分の固体細胞バイオマスを残して培地をデカントすることができる。次に細胞バイオマスを洗浄して、残留している培地を洗い流し、同様にデカントした。あるいは、細胞懸濁液を遠心分離してもよく、上清（培地）を廃棄し、続いてその後に細胞集団を洗浄し、再度遠心分離して液体を廃棄する。第３番目の選択肢は、細胞の懸濁培養物をろ過して培地を除去するというものである。数ミリリットルの細胞培養から、数千リットルの製造規模の範囲の体積の培地に対し、これらの方法のいずれかのものを使用することができる。
【００８２】
抽出法
回収した細胞集団を破砕し、挽き又はすりつぶして細胞集団を懸濁し、細胞を破壊して、抽出溶媒と試料との接触面積を増加させ、抽出した部分が確実に全サンプルを表すようにする。
【００８３】
プロシアニジンは不安定な化合物である。したがって、抽出前に細胞バイオマスを保存する必要がある場合、好ましくは凍結保存すべきであり、例えば、液体窒素により凍結させる。
【００８４】
テオブロマ又はヘラニアの細胞培養物から総ポリフェノールを抽出する手法は、いくつかの大きな違いを除き、カカオ豆から総ポリフェノールを抽出するのに使用される手法と同様のものである。カカオ豆の場合、豆をすりつぶした後に、すりつぶしたフレーク（粗挽きココア豆）の脱脂工程を開始する。この工程でポリフェノールが減少する。細胞培養物は、豆と比べて脂肪含量が少ないことから、この脱脂工程は必要とされない。この工程を行わなければ、細胞培養物の抽出過程でのポリフェノールの減少が抑えられる。
【００８５】
更に、脱脂にはヘキサンなどの溶媒が必要とされ、この溶媒は最終的な抽出物に微量で持ち越されてしまうことが判明している。これにより、カカオ豆から製造される抽出物には望ましくない臭気が生じ、また溶媒は食品成分などの特定の用途で毒性を生じる恐れがあり、あるいは望ましくないものである恐れがある。本開示には、溶媒（ヘキサンなど）を使用せずに細胞培養物バイオマスを抽出する方法が記載され、抽出物には溶媒の汚染はなく、すなわち得られる抽出物には望ましくない臭気も生じない。
【００８６】
代表的な方法では、ポリフェノールはすりつぶし、懸濁した細胞から、７０〜８０％メタノール水溶液又は７０％アセトン水溶液又はこれらの組み合わせにより抽出される。これまでに水及びエタノールも使用されてきたものの、これらの溶媒を使用した場合、プロシアニジンオリゴマーはほんの一部しか抽出されず、高分子量のポリマーは全く抽出されない（Ｇｒａｙｅｒ，Ｉｎ  Ｊ．Ｂ．Ｈａｒｂｏｒｎｅ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ（Ｖｏｌ．１），ｐｐ  ２８３〜３２３，１９８９．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｌｅｅ  ＆  Ｗｉｄｍｅｒ，Ｉｎ  Ｌ．Ｍ．Ｌ．Ｎｏｌｌｅｔ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｖｏｌ．１），ｐｐ  ８２１〜８９４，１９９６，Ｂａｓｅｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）。
【００８７】
一実施形態では、抽出溶媒はエタノールを含有し得る。このエタノールは、重量又は体積に基づき、エタノールを約２５％〜約１００％、より好ましくは約５０％超、より好ましくは７５％超、及び更により好ましくは９０％超で含有する水溶液であってよい。具体的なエタノール濃度例としては、５０％、６０％、７０％、及び８０％濃度が挙げられ、図１２は６０％エタノールが優れていることを示す。この実施形態では、エタノール抽出溶媒は、他のアルコール類又はケトン類を含まない。
【００８８】
一実施形態では、抽出溶媒には、水及び／又はエタノールと共に、その他のアルコール類又はケトン類を例えば有機溶媒水溶液などのようにして含有させることができる。その他のアルコール類又はケトン類の例としては、イソプロピルアルコール、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸エチルが挙げられ、あるいはこれらを組み合わせて使用してもよい。有機溶媒水溶液には、水を約２５％〜約９９％、より好ましくは約３０％〜約９０％、又は更により好ましくは５０％超含有させることができる。
【００８９】
一実施形態では、細胞集団の量に応じ、様々な量の抽出溶媒を加工済みの又は未加工の細胞と組み合わせる。抽出溶媒の量は、細胞集団の質量又は体積の５０％以上、より好ましくは約７５％以上、更により好ましくは約１００％以上、更により好ましくは２００％超であり得る。言うまでもなく、より多量の抽出溶媒を使用できる。
【００９０】
一実施形態では、抽出溶媒には抗酸化剤などの酸を含有させることができる。酸の例としては、酢酸、クエン酸、又はアスコルビン酸が挙げられる。酸は、抽出組成物の体積の、又は抽出溶媒の体積の約０．０５％〜１０％、より好ましくは約０．７５％〜約５％、又は最も好ましくは約０．１％〜約１％又は約２％であってよい。
【００９１】
抽出による微小成分の除去後には、各種プロシアニジンは希釈濃度で抽出物に含有され得る。濃縮は低温（４０℃未満）でかつ減圧下で実施し、プロシアニジンの分解を最小限に抑える（Ｌｅｅ  ＆  Ｗｉｄｍｅｒ．Ｉｎ  Ｌ．Ｍ．Ｌ．Ｎｏｌｌｅｔ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｖｏｌ．１），ｐｐ  ８２１〜８９４，１９９６，Ｂａｓｅｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）。
【００９２】
この段階でテオブロマ又はヘラニア細胞培養物から得られるポリフェノール抽出物は比較的不純物が存在せず、即座に解析することができる。本開示の方法の利点の１つとしては、まず始めに、テオブロマ又はヘラニアポリフェノール細胞培養物から得られる抽出物には、豆由来のポリフェノール抽出物と比較して、検出され得る濃度の不純物（例えば、カフェイン及びテオブロミン）は含有されていないということである。しかしながら、カフェイン及びテオブロミンなどの微量の不純物を除去するために、更に精製することが有用である場合もある。抽出物を精製することで、これらの微量不純物でさえも除去することができる。このような精製工程としては、不混和性溶媒による液液分配、並びにＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０、ポリアミド、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−２によるカラムクロマトグラフィー、分取ＨＰＬＣ、及び市販の使い捨てカートリッジを使用する固相抽出（ＳＰＥ）が挙げられる（Ｇｒａｙｅｒ，Ｉｎ  Ｊ．Ｂ．Ｈａｒｂｏｒｎｅ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ（Ｖｏｌ．１），ｐｐ  ２８３〜３２３，１９８９．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｍａｒｋｈａｍ  ＆  Ｂｌｏｏｒ，Ｉｎ  Ｃ．Ａ．Ｒｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｌ．Ｐａｃｋｅｒ，Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ｐｐ  １〜３３，１９９８，Ｂａｓｅｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）。ほとんどのフラボノイド類は、クロロホルム又は塩化メチレンなどの溶媒に対する溶解性が低いことから、テオブロミン及びカフェインの除去は、通常、これらの溶媒を用いる抽出により実施できる。
【００９３】
解析手順
テオブロマ又はヘラニア細胞培養物から得られるプロシアニジンの検出及び同定に使用される解析手順は、豆由来の抽出物に用いられる手順と同様のものである。カカオプロシアニジンの同定は、主に、各種クロマトグラフィー法によりオリゴマーを分離し、次いで構造評価に関し独立した手法を用い実施されてきた。Ｑｕｅｓｎｅｌ（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７：１５８３〜１５９２，１９６８）、並びにＪａｌａｌ及びＣｏｌｌｉｎ（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．１６：１３７７〜１３８０，１９７７）は、それぞれペーパークロマトグラフィー及びＴＬＣ法を用いカカオに含まれるプロシアニジンを同定した。しかしながら、これらの刊行物は、カカオにプロシアニジンが含まれていることは認識しているものの、プロシアニジンの立体特異的な構造については解明していなかった。Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１６５７〜１６６３，１９９１）が、カラムクロマトグラフィー、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、及び陰イオンＦＡＢ／ＭＳを用い、カカオに含まれるプロシアニジンについて厳密な調査を行ったところ、プロシアニジンは七量体までのオリゴマー形態で存在することが確認された。更に、ＮＭＲによりプロシアニジンの四量体構造が確認され、これは主に（−）−エピカテキンからなることも判明した。カカオプロシアニジンが八量体までのオリゴマーであるという根拠はＣｌａｐｐｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．により報告されており、（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，１６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｇｒｏｕｐｅ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ，Ｌｉｓｂｏｎ，Ｐｏｒｔｕｇａｌ；Ｇｒｏｕｐｅ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ：Ｎｏｒｂｏｎｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ，Ｖｏｌ  ＩＩ，ｐｐ  １１２〜１１５，１９９２）、Ｃｌａｐｐｅｒｔｏｎらは、カラムクロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、及び陽イオンＬＳＩＭＳを組み合わせてプロシアニジンオリゴマーを特性評価している。この研究は、陽イオンＬＳＩＭＳの有用性と、より大きいプロシアニジンオリゴマーを同定する手段としてナトリウム付加物を使用する方法と、を実証している。残念なことに、これらの手法はすべて煩雑なものであり、構造に関する情報を得るにあたり長い時間をかけて準備する必要があり、ハイスループットな解析及び細胞培養試料の大量スクリーニングにそのまま用いることもできない。また、これらの手法は少量の試料には好適ではない。
【００９４】
本開示に際し、出願者らは、テオブロマ又はヘラニア細胞培養物からプロシアニジンをハイスループットで微小スケールで抽出する手法、逆相ＨＰＬＣによりプロシアニジンモノマー及びオリゴマーを迅速に分離する手法、並びに質量分析（ＭＳ）により分子特性に応じプロシアニジンオリゴマーを同時に同定する手法を開発した。
【００９５】
テオブロマ又はヘラニア細胞の大規模培養法の最適化
植物細胞の大規模培養は、商業的加工法の開発に重要な技術である。植物細胞の大規模培養は、微生物発酵で使用されているものと同様の大型槽で実施できる。これらの槽では、大規模工程での細胞増殖特性及び生産特性に基づき、生体分子のもつ要素を決定し、大規模のバイオプロセスに際し、プロシアニジンの生産性を上昇させる可変要素を最適化することにより生産性を増強できる。生体分子のもつ要素としては、培地成分、誘導物、及び生合成経路における前駆体が挙げられる。より小さなスケールで最適化が観察された条件に関し、ラージスケールでも再現性が認められるようスケールアップすることを目標とするものであるため、生体分子のもつ要素条件は、大規模培養前にフラスコ規模で試験すべきである。しかしながら、大規模なバイオリアクターでの培養条件は、フラスコスケールでテオブロマ又はヘラニア細胞懸濁物を培養する場合とは異なる場合もある。培養のマクロ動態は、懸濁細胞に作用する環境条件に対し輸送制限により生じる変化により影響を受ける。例えば、増殖動態のパラメータはスケールとは独立したものである一方で、気体及び溶存栄養素及び代謝産物の輸送はスケールに依存するものであることから、容器中の細胞培養物の全体的な増殖性はスケールに依存する（Ｄｉｃｏｓｍｏ  ＆  Ｍｉｓａｗａ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｐｐ１１〜４４，１９９６．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ）。したがって、カカオプロシアニジン生産の際にバイオリアクター工程をスケールアップするにあたって、数多くの基礎実験を実施して、増殖速度、生成物生産速度、栄養素の取り込み速度及び呼吸速度に関する必須データを生成する。
【００９６】
一般的には、細胞濃度及び特異的な生産能を増加させることで植物細胞培養物の生産性を上げることができる。最大細胞濃度は、栄養分の補給、基質あたりのバイオマス収率、及び水分含量によって異なる。基本的なデータに基づき、その他の環境的な因子を１つずつ変更させることで、あるいは複数の因子を同時に変更することで、バイオマスを増量させることができる。バイオプロセスに関する、通気速度、懸濁培養物のレオロジー特性などの可変要素は、成分の輸送及びバイオリアクター内の混合に影響し、更には細胞増殖だけでなく植物の二次代謝産物の生産にも影響する。したがって、大抵の場合、ほとんどのポリフェノールは、非増殖期に関連付けられる化合物であることから、二段階培養を検討することもできる。一段階培養では、培養は、理想的には単一の増殖速度に制限され、推定上単一の発生段階に制限されることから、非増殖期に関連付けられる化合物の生産に何段階かの発生段階が必須である場合には、この培養操作は適さない。増殖段階及び生産段階に関係する通気速度、撹拌速度、その他の混合に伴う変数、及び更には培地組成を、別々に最適化する。しかしながら、すべての条件を最適に保持したまま工程をスケールアップすることは不可能である。どの可変要素が最も重要なものなのか検討し、選択を行うべきである。
【００９７】
同様に、二次代謝産物の生合成及び細胞増殖の増強には、炭素及び窒素源の相対量が重要な役割を果たすため、炭素及び窒素源を添加することで増殖性及び生産性に生じる効果を、炭素及び窒素消費量に関係する基本的な技術データをもとに試験する（Ｂａｓａｒｉａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：３７０〜３７４，１９９０）。次に、酸素及び二酸化炭素の供給について試験することができる。酸素に加え、二酸化炭素も、植物細胞培養物において細胞の増殖性及び二次代謝産物の生産性を改善することが報告されている（Ｔｈａｎｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，５０：７５２〜７５４，２００６；Ｔａｔｅ  ＆  Ｐａｙｎｅ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１０：２２〜２５，１９９１）。植物細胞の酸素要求量は、細胞増殖段階では比較的少ないものの、代謝産物の合成段階では有意に増加し得る。これらの気体濃度は、テオブロマ又はヘラニア細胞をリアクターで培養するにあたって、利用が最適化されるよう制御する。大規模発酵では、研究室規模で導入することができる量と同量の気体（空気、酸素など）を導入することは不可能である。したがって、成分輸送係数の定数は、バイオリアクターでの工程中の表面気体速度定数を満たすよう維持すべきである。
【００９８】
酸素は炭素源の代謝において重要な役割を果たすものであり、増殖速度又は微生物の生成物の生産動態に応じ、異なる速度でスパージャによりバイオリアクターの増殖及び誘導培地に導入することができる（Ｓｈｕｌｅｒ  ＆  Ｋａｒｇｉ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｂａｓｉｃ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２．Ｕｐｐｅｒ  Ｓａｄｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ，ＮＪ，ＵＳＡ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，Ｉｎｃ．）。タキサン生産を目的として、バイオリアクターを用い、高濃度溶存酸素下で植物細胞を培養する例が、これまでに実証されている（例えば、米国特許第７，２６４，９５１号を参照されたい）。７．５Ｌ及び３０Ｌのリアクター（機械的に撹拌）、並びに１０Ｌ及び２０Ｌのエアリフト型バイオリアクターなど、様々な種類及び大きさのバイオリアクターを用い、高濃度溶存酸素がカカオ細胞培養物の増殖性及び生産性に与える影響を調査した。本発明者らは、大規模培養でのカカオ細胞の増殖及びポリフェノールの生産性増加には、高濃度の溶存酸素に用いる気体レジメンが必要とされることを見出した。バイオリアクターに供給する空気及び精製酸素のブレンドにおいて、取り込み気体レジメンに含まれる酸素は、培養物の増殖又は誘導段階時にカカオ細胞懸濁物に必要とされる濃度に応じ、１％〜１００％の範囲の最適な濃度であってよい。増殖段階及び誘導段階でカカオ細胞培養培地に含まれる溶存酸素濃度は、１％空気飽和〜４００％空気飽和の範囲であってよい。増殖段階で、スパージャを介し、空気／酸素混合物としてバイオリアクターに供給する酸素は、混合気体の１％〜１００％の範囲の濃度を占める。誘導段階で、空気／酸素混合物としてバイオリアクターに供給する酸素は、混合気体の１％〜１００％の範囲の濃度を占め、好ましくは２５％〜１００％の範囲の濃度を占める。
【００９９】
代謝産物の生産及び分泌を刺激する誘導剤を使用することは、工程にまつわる重要な戦略である。高濃度の生成物を得るのに、例えば、体積比生産を行うのに必要とされる生産時間を減少させることは、非常に有用である。更に、誘導により新規化合物が生産される場合もある（Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｐ３３３〜３５１，１９９５，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）。処理すべき時期、投与に最良の物質、細胞を暴露すべき期間、及び細胞を回収すべき時期を最適化するため、いくつかの生物的／非生物的候補による誘導を、大規模反応器を用いる培養で試験し、最適化した。各誘導剤は、生合成経路において異なる種類の酵素を誘導し得ることから、誘導物による処理を複数回行うことにより生産性を増加させる相乗効果についても試験した。
【０１００】
リアクターの操作方法は、増殖、生産及び関係性に関する細胞動態によって異なる。これまでに示したとおり、本研究における目的化合物は非増殖期に関連付けられるものであり、すなわち、二段階培養工程を検討すべきであることを意味する。したがって、フェドバッチ培養は、バイオマスを増殖させるのに必要とされる時間よりも、生産時間の方が大幅に長い場合に特に魅力的な選択肢であり、この場合、同じバイオリアクターの容積で続けてより長時間の工程を行うことが可能となり、結果としてバイオマスの処理に必要とされるバイオリアクターの数が少なくなる。
【０１０１】
Ｖ．プロシアニジンの使用及び投与
本開示の方法により生成されるプロシアニジンを、治療、食事、又は化粧用途で対象者に投与することもできる。対象者は、ヒト又は哺乳動物、例えば猿、馬、牛、豚、犬、猫、マウス又はラットであり得る。
【０１０２】
治療用途に関し、プロシアニジンを使用して、アテローム性動脈硬化症、循環器疾患、がん、血圧調節及び／又は高血圧などのいくつかの疾患又は疾病を治療又は予防することができる。例えば、予防目的で、腫瘍を発症する危険性のある対象者、腫瘍に罹患している対象者、又はこれまでに腫瘍を治療したことのある対象者にプロシアニジンを投与することができる。腫瘍の治療としては、限定するものではないが、腫瘍の外科的除去、化学療法又は放射線療法が挙げられる。他の実施形態では、本開示の方法により生成したプロシアニジンを、少なくとも１種の追加の剤と組み合わせて、腫瘍の治療前、腫瘍の治療と同時に、又は腫瘍の治療後に対象者に投与する。この追加の剤は、本開示に記載される、腫瘍の成長を阻害又は抑制するその他の剤であってもよい。あるいは、追加の剤は、患者のもつ腫瘍の成長を阻害する能力を改善する剤又は腫瘍の治療過程で生じる感染症に対する患者の抵抗を補佐する剤（抗菌剤など）であり得る。例えば、追加の剤は、サイトカインなどの免疫系を刺激する剤であってよい。
【０１０３】
本開示の方法により生成したプロシアニジンを、任意の種類の腫瘍を発症する危険のある患者に、あるいは任意の種類の腫瘍に罹患している患者に投与することができる。この腫瘍は良性腫瘍であっても又は悪性腫瘍であってもよい。腫瘍としては、細胞腫、肉腫、白血病、リンパ腫、又は神経系の腫瘍が挙げられる。幾つかの具体的な非限定例では、腫瘍としては、乳腺腫瘍、肝臓腫瘍、膵臓腫瘍、胃腸腫瘍、結腸腫瘍、子宮腫瘍、卵巣腫瘍、子宮頸部腫瘍、精巣腫瘍、前立腺腫瘍、脳腫瘍、皮膚腫瘍、黒色腫、網膜腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、骨腫瘍、骨肉腫、鼻咽頭腫瘍、甲状腺腫瘍、白血病、又はリンパ腫が挙げられる。概して、本開示の方法により生成したプロシアニジンは、腫瘍の成長を予防又は阻害するのに十分な量を対象者に投与する。
【０１０４】
他の実施形態では、アテローム性動脈硬化症、循環器疾患、又は高血圧を発症する危険のある患者に対し、予防目的でプロシアニジンを投与することができる。あるいは、患者に対し、アテローム性動脈硬化症、循環器疾患、又は高血圧などの状態を治療する目的でプロシアニジンを投与することができる。組成物は、抗悪性腫瘍薬、抗酸化剤、あるいはアテローム性動脈硬化症、循環器疾患、血圧調節及び／又は高血圧に関連する症状又は状態を緩和する剤などの、他の剤と同時投与又は連続投与することができる。
【０１０５】
加えて、本開示の方法により生成したプロシアニジンは、食用組成物に使用できる。液体形態で経口投与する場合、この液体は水系、乳系、茶系、果汁系、又はこれらの何らかの組み合わせの液体であってよい。体内投与用固体及び液体製剤には、更に増粘剤又は甘味剤を含有させることができる。
【０１０６】
本開示の方法により生成されるプロシアニジンを、化粧用組成物に使用して、対象者の皮膚のきめ又は外観を改善することもできる。皮膚の外観、肌触り及び潤いは、プロシアニジン組成物を外用又は内用することで、又はこれらの方法を組み合わせて投与することで改善できる。許容可能な担体は、組成物を配合する際に、溶媒、担体、希釈剤又は分散剤として作用し得るものであり、皮膚表面に適切な希釈濃度で成分を均一に適用させ得るものである。許容可能な担体は、皮膚への組成物の浸透を促進するものであってもよい。
【０１０７】
本開示の方法により生成したプロシアニジンを含有する組成物は、製薬組成物、食品、及び飲料組成物などの広範な最終製品に有用であり、医薬分野の当業者に周知の一般的な手法により調製できる。活性剤を含有する製薬組成物は、選択された具体的な投与方法に応じ、適切な固体又は液体担体を用い配合できる。本開示に有用な、製薬上許容可能な担体及び賦形剤は一般的なものである。例えば、非経口製剤は、通常、注射可能な液体、すなわち、水、生理食塩水、他の平衡塩類溶液、Ｄ型グルコース水溶液、又はグリセロール水溶液などの製薬学的に及び生理学的に許容可能な液体賦形剤を含む。含有させることができる賦形剤としては、例えば、その他のタンパク質、例えばヒト血清アルブミン又は血漿分画製剤が挙げられる。投与するプロシアニジン組成物には、必要に応じて、例えば、湿潤剤又は乳化剤、保存料、及びｐＨ緩衝剤（例えば、酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレート）などの微量の非毒性補助成分を含有させることもできる。
【０１０８】
注射液だけでなく、外用製剤及び経口製剤を使用することもできる。経口製剤は、液体（例えば、シロップ、飲料、溶液又は懸濁液）、又は固体（例えば、散剤、丸剤、錠剤、又はカプセル剤）であってもよい。固形組成物に関し、一般的な非毒性固体担体としては、製薬等級のマンニトール、ラクトース、でんぷん又はステアリン酸マグネシウムが挙げられる。外用製剤としては、点眼薬、軟膏剤、クリーム、及び噴霧剤などが挙げられる。好ましくは、局所投与に好適な本発明の配合物は、組成物の成分用の溶媒、担体、希釈剤又は分散剤と混合し、適切な希釈濃度で皮膚表面に成分を均一に適用させることができる。許容可能な担体は、皮膚への組成物の浸透も促進し得る。
【０１０９】
プロシアニジン組成物の投与形態は、選択された投与方法に応じ決定される。このような投与形態を実際に製造する方法は既知であり、当業者にとって明白であろう。
【０１１０】
本開示の方法により生成したプロシアニジン組成物は、ヒト又は哺乳動物に投与することができ、局所、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内、髄腔内及び皮下投与などの様々な方法においてヒト又は哺乳動物の細胞に対し効果的なものである。具体的な投与様式及び投与レジメンは、当業者により、具体的な症状（例えば、患者、疾患、関与している疾患の状態、及び治療が予防的なものであるか否か）を考慮に入れて選択され得る。治療には、数日から数ヶ月、又は更には数年にわたって、化合物を１日一回又は１日複数回投与することを包含し得る。
【０１１１】
年齢、性別、体重、及び個々の対象者の状態、並びに投与経路などの因子を考慮に入れ、薬学業界、栄養学業界、又は獣医学業界で周知の手法により、このような組成物を、投与する必要のある対象者に投与量で投与することができる。
【０１１２】
治療、食品、化粧品及び獣医学的用途を目的とした、組成物の調製、投与量及び投与法は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，５５４，６４５号、同第５，８５３，７２８号、同第６，１９４，０２０号、同第６，３１２，７５３号、同第６，９９８，４１７号、同第７，１２２，５７４号、同第７，３１４，６３４号、同第７，３２０，７９７号、及び米国特許出願公開番号２００７／０１４８１０７号を参照されたい。これらの各々は参照により本案件に組み込まれる）。
【０１１３】
特定の具体的な態様及び／又は実施形態を例示する目的で、以降に実施例を提供する。これらの例は、記載の特定の態様又は実施形態に本発明を制限するためのものであると見なすべきでない。
【実施例】
【０１１４】
実施例１．花構成要素からのテオブロマ・カカオのカルス誘導及び増殖
オーキシン（２ｍｇ／Ｌ  ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ））、サイトカイニン（０．００５ｍｇ／Ｌ  チジアズロン（ＴＤＺ））及び他の栄養補助剤（２５０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−グルタミン，１００ｍｇ／Ｌ  ミオイノシトール）を増量した、完全強度のドライバー・クニユキ・クルミ（ＤＫＷ）培地を用い、炭素源としては［Ｄ＋］−グルコースを用い、制御条件下でコンパクトカルスの凝集物を誘導した（表１中培地Ｉ）。培地は、ｐＨ  ５．８に調整後、オートクレーブ滅菌した。数多くの栽培植物から、テオブロマ・カカオのつぼみ試料を採取した。培養物の汚染を予防するため、材料は培養培地に入れる前に表面を滅菌した。試料をまず１％（ｗ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウムに２０分漬け、５分毎に穏やかに撹拌した。滅菌条件下で材料をデカントし、滅菌脱イオン水で３回洗浄し、各洗浄時にも穏やかに撹拌した。最後の洗浄水をデカントし、花蕾のみを滅菌ペトリ皿に移した。滅菌したメスにより、花長の基部から１／３の位置で花蕾を切断した。切断端に生じた開口部から、仮雄ずい、萼片及び花弁基部外植片を取り外した。
【０１１５】
取り外した材料を固体カルス誘導培地に定植した。各プレートの表面全体に、約５０の外植片を分配した。パラフィルムによりペトリ皿を密閉し、２５℃の暗所で１４日間維持した。実質的なカルス形成は１０日後に観察された。カルス誘導培地への花構成要素の定植から１４日以内に、外植片からカルスを分離して、カルス増殖培地に、すなわちに表１に掲載の培地Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩに定植した。４週間経過後に、急速に増殖する細胞をカルス表面から単離し、新鮮な培地で継代培養した。継代培養の際には、白〜淡黄色を示し急速に増殖する細胞株を選別した（図１）。
【０１１６】
実施例２．栄養組織からのテオブロマ・カカオのカルスの誘導及び増殖
オーキシン（２ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡ及び４ｍｇ／Ｌ  ＩＢＡ）、サイトカイニン（０．００５ｍｇ／Ｌ  ＴＤＺ）、及びＬ−グルタミン（２５０ｍｇ／Ｌ）と、炭素源としてグルコース（２０ｇ／Ｌ）とを添加した、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地（培地ＸＸＶＩＩ，表１）でカルスを樹立した。培地は、ｐＨ  ５．８に調整後、オートクレーブ滅菌した。温室で育てた数多くの植物から、テオブロマ・カカオ植物試料（幼葉及び成葉、節及び節間）を採取した。培養物の汚染を予防するため、材料は培養培地に入れる前に表面を滅菌した。試料をまず７０％エタノールに１分漬け、続いて２５％漂白剤に１０分漬け、５分毎に穏やかに撹拌した。滅菌条件下で材料をデカントし、滅菌脱イオン水で３回洗浄し、各洗浄時にも穏やかに撹拌した。葉を５ｍｍ角に切断し、節及び節間を１〜２ｍｍに輪切りにし、固体培地を入れたプレートに外植した。プレートを２５℃の暗所に維持した。汚染の徴候について毎日観察し、汚染が観察された試料は廃棄した。カルス形成は４週後に観察された。６週後にカルスを外植片から分離し、上記のとおりのかつ培地ＸＸＶＩＩ（表１）に示されるとおりのカルス増殖培地に定植した。しかしながら、定植開始後、カルスは非常に迅速に増殖し、樹立した。新しく生成された細胞をカルス表面から単離し、新鮮な培地で２週間継代培養した。継代培養の際には、淡黄色〜淡褐色を示し急速に増殖する細胞株を選別した。
【０１１７】
培地ＸＸＶＩＩに高濃度のオーキシンを含有させた場合に、細胞の増殖が遅延し、その後、非常に褐色の濃いカルスが形成され、細胞がストレスを受けたことが示されたため、カカオカルスの誘導後に低濃度オーキシンがカルスの維持に及ぼす影響について試験する必要があった。カカオカルスを維持する能力、並びに維持培地が以降の細胞懸濁物の生成に及ぼす影響について各種培地を試験した。２０ｇ／Ｌグルコース及び７ｇ／Ｌ寒天を含有するＭＳ培地に、６ｍｇ／Ｌオーキシン（２ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡ及び４ｍｇ／Ｌ  ＩＢＡ）、２Ｘ  ＭＳビタミン及び２５０ｍｇ／Ｌグルタミンを添加して、培地ＸＸＶＩＩを調製した。維持に際し、培地中のオーキシンを４ｍｇ／Ｌ（２ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡ及び２ｍｇ／Ｌ  ＩＢＡ、表１の培地ＸＸＶＩＩＩ）及び２ｍｇ／Ｌオーキシン（ＩＢＡ）に減少させた（表１の培地ＸＸＩＸ）。
【０１１８】
オーキシンを４ｍｇ／Ｌに減少させた場合、カルスの色は暗褐色から淡褐色〜黄色に改善された。カルスの細胞増殖は活発な水準に戻った。培地ＸＸＶＩＩで健康的に継代させたカルスから誘導した培養物同様の容易さで、細胞懸濁培養物を誘導した。
【０１１９】
２ｍｇ／Ｌオーキシンを加えた培地では、カルスの色は変化し、細胞増殖は活発な水準に戻った。しかしながら、これらのカルスを同様の培地に継代したところ、培地ＸＸＶＩＩＩでカルスを培養させた場合と比較してカルスの細胞増殖は低下した。
【０１２０】
オーキシンを２ｍｇ／Ｌに低下させた後、過剰なＭＳビタミン（表１、培地ＸＸＸ）と、グルタミン（表１、培地ＸＸＸＩ）とを除去した事による影響が、増殖において記録された。これらの２種の培地から誘導したカルスの増殖特性は、培地ＸＸＩＸで誘導したカルスに見られる増殖特性と差はなかった。しかしながら、培地に過剰にビタミンを含有させることは、プロシアニジンの生産の観点で有利であったことが判明した。カカオ植物のカルスを維持するにあたって、長期にわたってカルスを維持し、かつ細胞懸濁液の容易な調製及びプロシアニジン生産の維持を可能にする最良の培地は、培地ＸＸＶＩＩＩであった。
【０１２１】
実施例３．テオブロマ・グランディフローラム及びテオブロマ・オボバツムのカルス誘導及び増殖
テオブロマ・カカオに関し実施例１及び２に記載される方法を用い、テオブロマ・グランディフローラム及びテオブロマ・オボバツムのカルス培養物を誘導した。
【０１２２】
実施例４．懸濁培養の開始
実施例１に記載のとおりに、花構成要素由来の外植片から誘導した新鮮な白色カルスを、異なる２０種類の液体培地（培地ＩＶ〜ＸＸＩＩＩ；表１）を２５ｍＬ含有させた１２５ｍＬ三角フラスコに定植し、細胞懸濁培養物を調製した。フラスコにはシリコン発泡キャップで栓をし、温度を２４±１℃で安定的に維持した完全な暗所にて、５４日にわたって１２０ｒｐｍで旋回振盪させて撹拌した。継代は、週ごとにあるいは隔週で必要に応じて行った。粒状の細胞又は微細懸濁物のいずれかを形成した培養物を保持し、懸濁培養物を形成しなかった培養物は廃棄した。細胞増殖の１４日目に、新鮮な培地２５ｍＬを含む新しい１２５ｍＬフラスコに１０％（ｖ／ｖ）の細胞を移し、その後２週おきに継代培養した。培地ＶＩＩＩは、細胞の懸濁培養開始時の細胞増殖に関し最良の性能を示した（１４日目で４５％  ＰＣＶ）。
【０１２３】
花以外の（栄養）組織（節、節間、幼葉、成葉）懸濁液を生成するために、実施例２で生成したカルスを、外植片に関し記載したのと同様の方法で液体培地に移した。一般的な維持培地ＶＩＩＩとは塩の種類が異なり（ＤＫＷ塩ではなくＭＳ塩。ＭＳ塩はアンモニウム及び窒素源を高濃度で含有し、硫酸は低濃度で含有している）、２，４−Ｄの代わりにオーキシンとして２ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡ及び４ｍｇ／Ｌ  ＩＢＡを含有し、かつＭＳビタミンは２倍強度で含有している培地ＸＸＩＶを使用した（表１）。この培地は、栄養組織のカルス誘導を開始した固体培地と同様の培地ＸＸＶＩＩＩであるが、ゲル化剤の寒天は不含である。培地ＶＩＩＩでカルス誘導を開始した場合には、すべての糖供給源を消費するまでに、通常２〜３週間を要するのに対し、培地ＸＸＩＶでは、懸濁培養物はより迅速に調製され、カルスは７日目には培地中のすべての糖を消費した。これらの花以外の組織懸濁液のもつプロシアニジン生産性も、花形成要素から生成した懸濁液の持つ生産性よりも高かった（培養１Ｌあたりの総プロシアニジン産量は１．１ｇ）（図２Ａ〜２Ｂ）。
【０１２４】
実施例５．花形成要素から誘導した細胞懸濁培養物の細胞増殖、細胞選別及び培地の最適化
本例は、懸濁液の細胞増殖を向上させるために使用した方法を記載する。細胞培養物の生産性は、細胞の増殖速度並びに細胞増殖停止時の密度に応じ上昇する。最適な播種密度を決定するために、細胞密度１０、１５及び２０％（ｖ／ｖ）でテオブロマ・カカオ細胞の懸濁培養を開始し、１４日間増殖させた。図３は播種密度に応じたバイオマス密度の典型的な時間経過を示す。細胞密度１０％で培養を開始した場合、増殖が著しく遅くなり、最大密度には１４日以内に達しなかった。培地ＶＩＩＩで細胞密度１５％及び２０％で培養を開始した場合、１３日以内に密度は倍になり、最大平均細胞密度は１４日以内に４０〜４３％に達した。しかしながら、細胞選別工程後１４日目に、一部の培養物の溶液中細胞体積（ＰＣＶ）は、５０〜６０％超を示した。
【０１２５】
培地ＶＩＩＩがＰｈｙｔａｇｅｌを含有していないことを除き、培地ＶＩＩＩ及び培地Ｉは同一の組成である。これらの培地はいずれもＤＫＷ塩及びビタミンがもとになっており、数種類の原液を用い調製され、バッチ間で培地組成を変化させることができる。したがって、予混合したＤＫＷ塩基性塩（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＬＬＣ、カタログ番号Ｄ１９０）を用い培地ＸＸＸＩＩを調製し、細胞懸濁液の増殖を培地ＶＩＩＩ及びＸＸＸＩＩで比較した。どちらの培地においても、細胞の増殖に有意な差はなかった。したがって、花構成要素から誘導した懸濁培養物の維持には培地ＸＸＸＩＩを所定のとおりに使用した。
【０１２６】
培養開始後７日目毎にバイオマスの増加、糖消費、及びプロシアニジン生産性を測定した。所望の細胞を選別する工程において、これらのデータは非常に重要である。ＰＣＶ及び糖消費量測定に基づき、増殖性の良好な細胞を優先的に選別し、次にプロシアニジン収率に基づき、増殖の良好な細胞株から生産性の良好な細胞株を選別した。より多量のバイオマス及びプロシアニジンにより産生性が上昇した。細胞選別工程前のプロシアニジンの平均的な生産性は、培養１Ｌあたりプロシアニジン５２ｍｇというものであり、１年に及ぶ細胞選別工程後、この生産性は最大で培養１Ｌあたりプロシアニジン２５１ｍｇにまで向上し、最も高レベルのものでは、培養１Ｌあたりプロシアニジン１．６ｍｇに達した。その上、最高収率は、５．０ｇ／Ｌ  ＰＣＶにまで増加した。
【０１２７】
Ｂ５主要塩及びＭＳ微量塩を用い、通常の維持培地すなわち培地ＶＩＩＩと比較して、培地中のアンモニウムイオン濃度を減少させて、培地ＸＸＶを調製した。２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ及び０．００５ｍｇ／Ｌ  ＴＤＺの代わりに、糖供給源には６０ｇ／Ｌショ糖を用い、ホルモンには０．１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ及び０．２ｍｇ／Ｌカイネチンを用いた。２週間の工程の終了後、培地ＸＸＶで試験した懸濁液では増殖は見られなかったものの、懸濁液中のプロシアニジンの蓄積量は対照培地ＶＩＩＩの４倍を超えていた（培地ＶＩＩＩでは２２ｍｇ／Ｌであったのに対し、培地ＸＸＶでは９５ｍｇ／Ｌであった）。これは、この培地に含まれる硝酸／アンモニウムイオン比が高かったことに加え、オーキシンの代わりに過剰量のサイトカイニンを使用したことに起因する可能性がある。
【０１２８】
ＭＳ塩、３０ｇ／Ｌショ糖、及び１．５ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄを用い、培地ＸＸＶＩを調製した。この培地に移した懸濁培養物では、１３日目に、対照培地ＶＩＩＩと比べプロシアニジンが４倍蓄積していた（プロシアニジンの蓄積量は、培地ＶＩＩＩでは２２ｍｇ／Ｌであったのに対し、培地ＸＸＶＩでは８７ｍｇ／Ｌであった。）。２種の培地間で、細胞増殖は比較的同様であったものの（培地ＶＩＩＩでは６１％〜２２％  ＰＣＶであったのに対し、培地ＸＸＶＩでは６０％〜２５％  ＰＣＶであった）、糖消費量は異なっていたことから、細胞は糖供給源としてはグルコースを好むことが示された。
【０１２９】
テオブロマ・グランディフローラム及びテオブロマ・オボバツムを用い、同様の試験を実施する。細胞培養物の生産性は、細胞の増殖速度、並びに細胞増殖停止時の密度に応じ上昇する。最適播種密度を決定するため、テオブロマ・グランディフローラム及びテオブロマ・オボバツム細胞の懸濁培養を、細胞密度１０、１５及び２０％（ｖ／ｖ）で開始し、１４日間増殖させた。
【０１３０】
概して、高密度で培養を開始した培養物では増殖期はより短く、あるいはより早期に最大細胞密度に達した。細胞密度１０％で培養を開始した場合、増殖が著しく遅れ、最大密度には１４日以内に達しない。培地で細胞密度１５％及び２０％で培養を開始した場合、１３日以内に密度は倍になり、最大平均細胞密度は１４日以内に４０〜４３％に達した。この増殖速度は、これまでにイチイ属などのその他の植物細胞懸濁培養物について報告されているものよりも遅い。しかしながら、カカオ細胞培養物の細胞増殖は、以降の実施例６に記載のとおりに、増殖培地を更に最適化し、かつ厳密に細胞選別することで向上させることができる。
【０１３１】
実施例６．栄養組織由来の細胞懸濁培養物の細胞増殖、細胞選別及び培地の最適化
培養開始後７日毎にバイオマスの増加、糖消費、及びプロシアニジン生産性を測定した。所望の細胞を選別する工程において、これらのデータは非常に重要である。ＰＣＶ及び糖消費量測定に基づき、増殖性の良好な細胞を優先的に選別し、次にプロシアニジン収率に基づき、増殖の良好な細胞株から生産性の良好な細胞株を選別した。バイオマスがより多量であり、かつプロシアニジン生産量がより多量であると、バッチサイクルにおいて生産性が向上し得る。新しく生成した細胞懸濁培養物は、通常、細胞の不均一な混合物である。細胞が不均一であることで、不均一な細胞増殖性、及び大規模懸濁培養時の所望の代謝物の不安定な生産様式が生じる。大規模生産に適する均一な細胞培養物は、これらの不均一な細胞混合物を継代し、所望の特性を持つ培養物を選別することによって誘導できる。ポリフェノール及び細胞増殖を検出し、この工程を補助するために、選別及び迅速なスクリーニングを行った。実施例８に記載のブタノール−ＨＣｌ加水分解法を使用して、ポリフェノールの蓄積を監視し、バイオマスの測定には溶液中細胞体積（ＰＣＶ（％）＝細胞体積×１００／総培地体積）を使用した。細胞代謝の指標として、屈折率（Ｂｒｉｘ％）から糖消費速度を求めた。
【０１３２】
実施例２及び４に記載のとおりに、栄養組織（節）から誘導したカルスを用い懸濁培養物を調製した。増殖性の良好な細胞株（ＭＸ１４４０−３４９６）を選別し、基本培地の種類（ＤＫＷ塩対ＭＳ培地）、並びにホルモンの種類及び量（表１の培地ＸＸＸＩＩ、ＸＸＸＩＩＩ及びＸＸＸＩＶ）を変化させた３種の異なる培地で増殖させた。７日目に、培地ＸＸＸＩＩ及びＸＸＸＩＶの溶液中細胞体積（ＰＣＶ）はちょうど３３．７±４．７％及び２５．７±４．０％であり、培地ＸＸＸＩＩＩ（４７．６±６．６％）で増殖させた場合よりも増殖が遅かった。細胞増殖速度は、細胞培養工程の体積比生産を最大化させるにあたって非常に重要である。培地ＸＸＸＩＩＩは、培養を行った培地の屈折率（ＲＩ）をもとに測定した糖消費速度も優れていた。対数増殖期の後期に、ＭＸ１４４０−３４９６細胞株のグルコース消費速度が遅くなったことから、培地ＸＸＸＩＩＩに含まれる初期グルコース濃度（２％）は３％に調整した。したがって、ＭＸ１４４０−３４９６細胞株から更に細胞を選別するにあたって、培地ＸＸＸＶを維持培地として選択した。
【０１３３】
細胞が凝集して巨大になっていると、すなわち塊をなしていると培養性能が低下することから、体積比生産を向上させ、かつ凝集した細胞を排除するために、各継代時に、増殖が良好で、細かく分かれている細胞を、すなわち塊であったり、凝集塊の形成などしていない細胞を優先的に選別した。その結果、選別した細胞は、主に黄色の細かく分かれている細胞形態を有し、この細かく分かれている細胞の懸濁培養により得られた均一な懸濁培養物の増殖性と生産性は良好であった。当初、ＭＸ１４４０−３４９６細胞株は、倍加に１５日以上かかっていたが、細胞の選別後には倍加時間は１０日に減少した。プロシアニジンの総生産レベルは、当初の細胞選別前には０．５ｇ／Ｌ  ＰＣＶであったが、細胞選別後には２０．４倍（１０．２ｇ／Ｌ  ＰＣＶ）に上昇した（図４）。
【０１３４】
実施例７．カカオカルス培養物及び懸濁培養物からのポリフェノールの抽出
本例は、実施例１〜４で調製したカカオ培養物のカルス及び細胞懸濁液からポリフェノールを抽出するにあたり開発した手法を記載する。本例に記載の実験は、具体的にはテオブロマ・カカオの培養に使用した。０．１％  Ｈ２ＳＯ４を加えた１．５ｍＬ  ５０％（ｖ／ｖ）エタノールを用い、新鮮重がおよそ０．２５±０．０４ｇのカルスからポリフェノールを抽出し、並びに０．１％  Ｈ２ＳＯ４を加えた１．５ｍＬ  ８０％（ｖ／ｖ）メタノールを用い、乾燥重量がおよそ０．１±０．００３ｇの懸濁細胞（培養上清は不含）からポリフェノールを抽出した。細胞を微量遠心チューブに入れ（２．０ｍＬ）、ビーズミルホモジナイザーにより１分均質化した。均質液を３５００ｒｐｍで２０分間、遠心分離し、上清のみを他のチューブに移した。
【０１３５】
大量の懸濁培養物を選別する必要がある場合、次のとおりの、堅調でハイスループットな手法、すなわち、解析を行う各細胞培養物のフラスコから、１ｍＬを９６ウェルディープウェルプレートに分取する手法を使用することができる。９６ウェルディープウェルプレートに移す前に、試料の溶液中細胞体積（ＰＣＶ）も記録した。卓上遠心機を用い、プレートを６０００ｒｐｍで４分遠心分離して、各ウェル中の細胞をペレット化した。プラスチック製輸送ピペットを用い、各ウェルから上清を除去し、廃棄した。次に、各ウェルに０．５ｍＬの抽出溶媒（８０：２０メタノール：水）、及びタングステンカーバイドビーズを加え、プレートを混合ミルに設置して、細胞を１５Ｈｚで２分粉砕した。次にプレートを遠心機に移し、６０００ｒｐｍで４分間遠心分離して細胞残渣をペレット化した。
【０１３６】
実施例８．培養におけるポリフェノール生産の予備解析
プロシアニジン解析を実施するにあたり用いた手法は、Ｓｗａｉｎ及びＨｉｌｌｉｓの方法（Ｊ．ＳＣＩ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．１０：６３，１９５９）並びにＰｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５（１）：２２３，１９８６）に非常に似せて設計した。ブタノール−ＨＣｌ抽出アッセイを用い、テオブロマ・カカオ懸濁細胞の抽出物に含まれるポリフェノールを測定した。メタノール水溶液抽出物０．１ｍＬ及びブタノール−ＨＣｌ試薬（９５：５ｖ／ｖ）１．０ｍＬを組み合わせ、Ｑｉａｇｅｎディープウェルブロック（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いこの溶液を７５℃で６０分加熱し、ポリフェノールを（−）−エピカテキン及びシアニジンのモノマーに加水分解した。桃色の呈色から、加水分解した試料中に含まれるシアニジンの存在を観察した。２８０及び５２０ｎｍで吸光度を測定し、Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）から購入したプロシアニジンＢ２を様々な濃度で用い作成した検量線から生成されたシアニジン量をもとに、プロシアニジン含量を算出した。定色される桃色が鮮やかである程、懸濁培養物に含まれるプロシアニジン濃度は高くなる（図５Ａ）。この測定法によると、複数の懸濁培養物に関し、プロシアニジン含量は２５０ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの範囲であった。
【０１３７】
実施例９．細胞選別及び花形成要素由来の細胞懸濁液用の培地の最適化工程
培養開始後７日毎にバイオマスの増加、糖消費、及びプロシアニジン生産性を測定した。所望の細胞を選別する工程において、これらのデータは非常に重要である。ＰＣＶ及び糖消費量測定に基づき、増殖性の良好な細胞を優先的に選別し、次にプロシアニジン収率に基づき、増殖の良好な細胞株から生産性の良好な細胞株を選別した。バイオマスがより多量であり、かつプロシアニジン生産量がより多量であると、バッチサイクルにおいて生産性が向上し得る。細胞選別工程前のプロシアニジンの平均的な生産性は、培養１Ｌあたりプロシアニジン５２ｍｇというものであり、１年に及ぶ細胞選別工程後、この生産性は最大で培養１Ｌあたりプロシアニジン２５１ｍｇ／Ｌにまで向上し、最も高レベルのものでは、培養１Ｌあたりプロシアニジン１６００ｍｇに達した（図２Ｃ）。同様に、ＰＣＶによる最高生産収率は、５０００ｍｇ／Ｌ超に増加した（図２Ｄ）。
【０１３８】
Ｂ５主要塩及びＭＳ微量塩を用い、通常の維持培地すなわち培地ＶＩＩＩと比較して、培地中のアンモニウムイオン濃度を減少させて、培地ＸＸＶを調製した。２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ及び０．００５ｍｇ／Ｌ  ＴＤＺの代わりに、糖供給源には６０ｇ／Ｌショ糖を用い、ホルモンには０．１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ及び０．２ｍｇ／Ｌカイネチンを用いた。２週間の工程の終了後、培地ＸＸＶで試験した懸濁液では増殖は見られなかったものの、懸濁液中のプロシアニジンの蓄積量は対照培地ＶＩＩＩの４倍を超えていた（培地ＶＩＩＩでは２２ｍｇ／Ｌであったのに対し、培地ＸＸＶでは９５ｍｇ／Ｌであった）。これは、この培地に含まれる硝酸／アンモニウムイオン比が高かったことに加え、オーキシンの代わりに過剰量のサイトカイニンを使用したことに起因する可能性がある。
【０１３９】
ＭＳ塩、３０ｇ／Ｌショ糖、及び１．５ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄを用い、培地ＸＸＶＩを調製した。この培地に移した懸濁培養物では、１３日目に、対照培地ＶＩＩＩと比べプロシアニジンが４倍蓄積していた（プロシアニジンの蓄積量は、培地ＶＩＩＩでは２２ｍｇ／Ｌであったのに対し、培地ＸＸＶＩでは８７ｍｇ／Ｌであった。）。２種の培地間で、細胞増殖は比較的同様であったものの（培地ＶＩＩＩでは６１％〜２２％  ＰＣＶであったのに対し、培地ＸＸＶＩでは６０％〜２５％  ＰＣＶであった）、糖消費量は異なっていたことから、細胞は糖供給源としてはグルコースを好むことが示された（図２Ｅ）。
【０１４０】
実施例１０．生産性向上のためのグルコース添加
本例は、追加のグルコースを添加することで、カカオ懸濁培養物のプロシアニジン生産性を向上させるプロトコルの開発を記載する。
【０１４１】
培地を増殖培地から生産培地に変えて、植物の二次代謝産物の生産を誘導させた。生産培地を最適化させるにあたり、糖供給源又は窒素源のいずれかを重要な因子として検討することができる。花から及び植物組織から誘導した懸濁培養物のプロシアニジン生産性を向上させる目的で、対数増殖期の終わりに、追加の糖としてグルコースを用いた。
【０１４２】
グルコース添加により、花構成要素から誘導した懸濁細胞株（ＭＸ１２４１−５８）のプロシアニジン生産性は有意に向上した。実施例５に記載のとおり、通常の培養条件下で、培地ＸＸＸＩＩを用い、培養物を通常どおりに７日間維持した。７日目に、グルコースを添加する前にＭＸ１２４１−５８細胞培養物から試料を回収したところ、ＰＣＶ及びＲＩの平均値は４９．５±３．５％及び０．２であった。平均プロシアニジン生産レベルは、１８９．５±１７．７ｍｇ／Ｌ  ＰＣＶであった。７日目に、５０％グルコース原液５ｍＬを懸濁培養液に加え、ＲＩを３％超に調整した。以降、培地中グルコース濃度が０．５％を下回った時点で同様にグルコースを添加し、ＲＩを調整する工程を繰り返した。グルコースの添加後、およそ１０秒間フラスコ内の培養物を手動で激しく振盪して、懸濁培養物内に濃縮グルコース溶液を分散させ、再度ＲＩ値を測定した。ＲＩの平均値は３であった。異なる培養日数で（７、１１、１６及び２１日）グルコースを３〜４回添加し、新鮮な培地を１回加えたところ（２５日）、プロシアニジン生産レベルは、最大で初期値の２４倍超の４．４ｇ／Ｌ  ＰＣＶにまで増加し、ＰＣＶは４９．５±３．５％〜６９．０±１．４％に増加した。
【０１４３】
同様の処理を細胞株ＭＸ１４４０−３４９６（実施例６に記載）に行い、生産レベルを向上させた。この実験は、グルコース添加に対する細胞株の応答性を試験するために設計した。実施例６に記載のとおりに、ＭＸ１４４０−４４９６細胞株を培地ＸＸＸＩＩＩで維持した。６日目に、ＭＸ１４４０−３４９６細胞株の入った６つのフラスコを無作為に選択し、それぞれがフラスコを３つずつ含む２組に分けた。３つのフラスコからなる１組は５０％グルコース原液で処理し、他の３つのフラスコは未処理のままにした。６日目に、グルコースを添加する前に６つのフラスコを測定したところ、平均してＰＣＶは４５％、ＲＩは０．３±０．１、及びプロシアニジン生産のＰＣＶは２．４１±０．１９ｇ／Ｌであった。５０％グルコース原液５ｍＬを処理群の３つのフラスコに添加した。グルコース添加後に、処理群のフラスコの平均ＲＩは６．０±１．１に増加し、平均ＰＣＶは３９．７±０．６％に増加した。
【０１４４】
グルコース添加後１、３、４、５及び６日目に、すべてのフラスコからサンプルを回収し、ＰＣＶ、ＲＩ及びプロシアニジン生産を測定した。未処理のフラスコではＲＩに有意な変化は生じず、ＰＣＶについては４５％から５３±３．６％へと僅かに増加した。処理の６日後、生産性は２．８３±１．１７ｇ／Ｌ  ＰＣＶにとどまっていた。対照的に、処理群のフラスコでは、６日目にＰＣＶは５３±２．７％に順調に増加していた。ＲＩは一日あたり有意に０．６〜０．８単位低下し、０日目には６±１．１だったＲＩが、６日目には２．０±１．３になっていた。その一方で、生産性も、グルコース添加前の２．４２±１．９３ｇ／Ｌ  ＰＣＶから、グルコース添加後５日目の１２．９３±２．２４ｇ／Ｌ  ＰＣＶへと増加していた。グルコース処理により、プロシアニジン生産性は向上していた。図５Ａに示すとおりのこれらの生産特性により、細胞培養工程が、プロシアニジンの生産に関し有意に改良されたことが示される。
【０１４５】
同様に、３％、５％及び６％のグルコース添加により、ＭＸ１４４０−３４９６細胞株のプロシアニジン生産において改良がなされた。この実験は、グルコース添加に対する細胞株の応答性を試験するために設計した。実施例６に記載のとおりに、ＭＸ１４４０−４４９６細胞株を培地ＸＸＸＶで維持した。４日目に、ＭＸ１４４０−３４９６細胞株の入った１２のフラスコを無作為に選択し、それぞれがフラスコを３つずつ含む４組に分けた。３組は異なるグルコース濃度（培養培地の体積の３％、５％、及び６％）で処理し、第４組は未処理のままとした。各フラスコのグルコース濃度は屈折計を用い測定し、ＲＩがそれぞれ３、５及び６であるか確認した。
【０１４６】
４日目に、グルコースを添加する前に６つのフラスコのすべてを測定したところ、平均してＰＣＶは４５％、ＲＩは０．７±０．１及びプロシアニジン生産のＰＣＶは１３．５±１．０ｇ／Ｌであった。グルコース添加後３、６、８、及び９日目に、すべてのフラスコからサンプルを回収し、ＰＣＶ、ＲＩ及びプロシアニジン生産を測定した。未処理のフラスコではＲＩに有意な変化は生じず、ＰＣＶは僅かに増加した。処理の９日後、生産性は１２．８±３．１ｇ／Ｌ  ＰＣＶにとどまっていた。対照的に、処理群のフラスコのＲＩは著しい低下を示し、一日あたり０．７単位低下し、９日目には０．０７±１．３になっていた。その一方で、生産性も着実に上昇し、特に６％グルコース処理群では、グルコース添加前の１３．５±１．０ｇ／Ｌ  ＰＣＶから、グルコース添加後９日目の４０．６±４．１２ｇ／Ｌ  ＰＣＶへと増加していた。グルコース処理を行ったことでプロシアニジンの生産が増加したこと、並びにこれらの生産特性により、図５Ｂに示すとおり、細胞培養工程においてプロシアニジン生産性が著しく改善されたことが示される。
【０１４７】
別の方法としては、誘導を繰り返して行なってもプロシアニジンの生産性は向上した。７日目及び１３日目に培養培地にグルコースを加え、培地のＲＩを６％Ｂｒｉｘに上昇させた。細胞の懸濁培養物に誘導を繰り返し行なったところ、プロシアニジン化合物が着実に生産された。最初の誘導前、プロシアニジン生産は３．２±０．１ｇ／Ｌ  ＰＣＶであったが、１３日目には１２．６±１．３ｇ／Ｌ  ＰＣＶ、並びに２０日目には２９．５±２．８ｇ／Ｌ  ＰＣＶに向上していた。図６に示すとおり、グルコースを繰り返し添加することで、カカオ細胞懸濁培養物によるプロシアニジンの生産を向上するための単純で効果的なアプローチが得られた。図中、矢印はグルコースの添加を示す。
【０１４８】
各継代時に、細胞を反復的に選別し、増殖性及び生産性が良好な細胞を回収したところ、初期グルコース濃度が３％の培地ＸＸＸＶにおいて、４〜５日目から限度が生じ始めた。非常に深刻なストレスが細胞に生じ、細胞は、懸濁培養物中でより凝集するようになっていた。典型的には、凝集は生産系を大規模にスケールアップするにあたって傷害となり得る。したがって、糖の制限から何らかのストレスが生じることのないよう、初期グルコース濃度を３％から４％に上昇させた（培地ＸＸＸＶＩＩ）。４％グルコース濃度により、細胞株は、フラスコによる懸濁培養並びにバイオリアクターによる培養において、凝集せずにより安定して維持された。
【０１４９】
実施例１１．ホルモン無添加培地での細胞の培養並びにこれらの細胞の誘導
本実施例には、ホルモン無添加の培地での２週間にわたる細胞の増殖並びにプロシアニジンの生産を記載する。実施例２及び４に記載の方法により製造した細胞を、培地ＸＸＸＶＩで２週間にわたって培養した（表１）。この培地は、基本培地である培地ＸＸＸＶに添加されているホルモンを含有していない培地である（表１）。初期播種量は２５％に設定した。細胞をホルモン無添加培地で７日間増殖させた後、更にホルモン無添加培地に継代し、７日間増殖させた。新鮮な培地に移してから６日目に増殖及び生産データを記録した。細胞の増殖度は、４５〜５０％から３５〜４０％へと１０〜１５％低下していた。しかしながら、ＰＣＶ  １Ｌ当たりの生産性は対象細胞の２．５〜３倍に増加していた。総体積比生産は、対照細胞の約２〜２．５倍であった。これにより、図７Ａに示すとおり、培養液からホルモンを除去した後にも生産性は維持されることが示される。これは、生産の最終週にホルモンを除去した場合の工程で著しく、制御の観点から非常に有効である。
【０１５０】
細胞をホルモン無添加培地で増殖させ、グルコースによる誘導を行った場合に相乗効果が生じるかについて試験した。細胞をホルモン無添加培地ＴＣ３０１５で１週間増殖させた。培養の７日目に、対照群及び処理群の細胞のＲＩは、もとの３．０から０〜０．６に変化していた。この時点で、細胞には６％グルコースで誘導を行い、更に７日間増殖させた。誘導の０日目及び７日目に試料を回収した。ホルモンの除去及びグルコースによる誘導には相加効果が見られた。対照細胞にグルコースによる誘導のみを行った場合、ＰＣＶ１Ｌあたりの生産性は約２．５倍に上昇したのに対し、ホルモン無添加培地において増殖させ、誘導（例えば、グルコースによる）を行った細胞では、約４倍に上昇した。ホルモンを添加しない場合に、生産性がおよそ２倍に上昇し、かつこれらの細胞に誘導処理を行った後に更に２倍に上昇したことから、これらの２つの処理を組み合わせて行うことで相加効果が得られることは明らかであった（図７Ｂ）。
【０１５１】
実施例１２．新鮮なカカオ細胞又は凍結乾燥細胞粉砕物からのポリフェノールの小規模抽出
培地を除いたカカオ細胞（０．５ｍＬ）又はカカオ細胞粉砕物（５０ｍｇ）を、２．０ｍＬマイクロチューブ又は９６ウェルブロック（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）の１．２ｍＬチューブに採取した。適量の酸性（０〜２％クエン酸、酢酸又はアスコルビン酸）抽出溶媒（３０〜８０％アセトン、エタノール、メタノール）水溶液を各カカオ細胞に加え、次に、超音波処理機又はビーズミルに配置してプロシアニジンを抽出した。試料を６０００ｒｐｍ（ＲＣＦ  ５９９６）で４分間遠心分離した。解析前に、上清を０．４５ｕｍ膜フィルタでろ過し、同様の抽出溶媒水溶液で１０倍希釈してもよい（必要に応じて）。更なる解析に備え、残りの抽出物を−２０℃の冷凍庫で保管した。図１２は、各種溶媒系から得られた結果を例示する。
【０１５２】
実施例１３．テオブロマ・カカオのカルス及び細胞懸濁液から得たポリフェノールの解析。
プロシアニジン解析を実施するにあたり用いた手法は、Ｓｗａｉｎ及びＨｉｌｌｉｓの方法（Ｊ．ＳＣＩ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．１０：６３，１９５９）並びにＰｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５（１）：２２３，１９８６）に似せて設計した。ブタノール−ＨＣｌ加水分解解析を用い、テオブロマ・カカオ細胞抽出物中のプロシアニジンを測定した。エタノール、メタノール又はアセトン水溶液０．１ｍＬ及びブタノール−塩酸試薬（９５：５ｖ／ｖ）１．０ｍＬを組み合わせ、Ｑｉａｇｅｎディープウェルブロック（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用い、この溶液を７５℃で６０分加熱し、プロシアニジンを（−）−エピカテキン及びシアニジンのモノマーに加水分解した。赤色の呈色から、加水分解した試料中に含まれるシアニジンの存在を観察した。分光光度法により、２８０及び５２０ｎｍで吸光度を測定し、Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）から購入したプロシアニジンＢ２を様々な濃度で用い作成した検量線から生成されたシアニジン量をもとに、プロシアニジン含量を算出した。赤色が濃くなるほど、カルス又は懸濁培養物に含まれるプロシアニジン濃度が高いことを意味した（図８Ａ〜８Ｃ）。
【０１５３】
ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ製オートサンプラーの消耗品ＰＡＬ（Ｌｅａｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｒｂｏｒｏ、ＮＣ、ＵＳＡ）、６００Ｓコントローラを備えたＷａｔｅｒｓ  ６２６型ポンプ、並びにＷａｔｅｒｓ  ２９９６光ダイオード−アレイ検出器（ＰＤＡ）を取り付けたＷａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステムを用い、テオブロマ・カカオ細胞抽出物に対しＬＣ解析を実施し、１９０〜７８０ｎｍをスキャンした。０．３ｍＬ／分の一定流量で、水−０．１％ギ酸（溶媒Ａ）及びアセトニトリル−０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）を用い、勾配溶出を実施した。溶媒Ｂを次の比で用い直線勾配を適用した（時間（分）、％Ｂ）：（０、７）、（５、１５）、（２０、７５）、（２５、１００）、（３５、１００）、（３５．１、７）、（４５、７）。カラムは、Ｕｌｔｒａ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｃ１８カラム（１００×２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．，３．５μｍ）（Ｒｅｓｔｅｋ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ．ＵＳＡ）を使用した。プロシアニジンモノマーの（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン、及びプロシアニジンオリゴマー（二量体から六量体）を２８０ｎｍで監視した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｑｕａｔｔｒｏマイクロトリプル四重極型質量検出器（Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を使用し、ＭＳデータを得、ＭａｓｓＬｙｎｘ（商標）ソフトウェアで解析した。ｍ／ｚ  １５０〜１８００でスキャンを行い、フルスキャンデータを取得した。カテキン、エピカテキンの標準品をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、希釈し、代謝産物を検出及び定量するための検量線を作成した（図９Ａ〜９Ｃ）。
【０１５４】
フォリン−シオカルトーアッセイを用い、細胞抽出物の総ポリフェノール含量を測定した（ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ．ｕｃｄａｖｉｓ．ｅｄｕ／ｐｈｅｎｏｌ／ｆｏｌｉｎｍｉｃｒｏ  ｗｅｂｓｉｔｅ；並びにＳｌｉｎｋａｒｄ，Ｋ．；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｖ．Ｌ．Ｔｏｔａｌ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｍａｎｕａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｉｔｉｃｕｌｔｕｒｅ  １９７７，２８：４９〜５５）。抽出物を２０μＬ計り取り、水１．５８ｍＬ及びフォリン−シオカルトー試薬１００μＬに加え、実施例９に記載のとおりの細胞培養物の抽出物を、総ポリフェノール含量について解析した。次に３００μＬ炭酸ナトリウム溶液を添加し、反応を停止させた。細胞抽出物中の総ポリフェノール濃度を測定するために用いたものと同様のアッセイ法を用い、得られた溶液を７６５ｎｍで測定し、没食子酸溶液の各種希釈用液から作成した検量線と比較した。
【０１５５】
Ｗａｔｅｒｓ  ２７９５分離モジュール、Ｗａｔｅｒｓ  ９９６  ＰＤＡ検出器及びＷａｔｅｒｓ  ４７４蛍光検出器からなる順相ＨＰＬＣ系により、プロシアニジンの定量的な解析を実施した。極性プロトン性モノマー及び／又はオリゴマーの分離及び単離に関し改良された手法である、Ｋｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．出典の手法により、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｄｉｏｌ（２５０×４．６ｍｍ  ＩＤ，粒径５μ）を用い、カカオ細胞抽出物に含まれるプロシアニジンの特性評価及び分離条件を得た。（米国特許第００７５０２０号）。移動相は、溶媒（Ａ）、アセトニトリル：酢酸（９８：２、ｖ／ｖ）並びに溶媒（Ｂ）、メタノール：水：酢酸（９５：３：２、ｖ／ｖ／ｖ）の二相からなる。３０℃にて、流速０．８ｍＬ／分で次のように直線勾配を用い溶出を実施した：０〜３５分、１００〜６０％Ａ；３５〜４０分、６０％  Ａ；４０〜４５分、６０〜１００％Ａ。プロシアニジンオリゴマーの分離を、蛍光検出（励起波長２７６ｎｍ、放出波長３１６ｎｍ）、ＵＶ検出２８０ｎｍ（図１０Ａ）（Ｌａｚａｒｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４７（１９９９），３６９３）並びにＰＤＡ（図１０Ｂ）により監視した。
【０１５６】
この解析手法は、新鮮なカカオ細胞又は凍結乾燥細胞に含まれる１０種の異なるプロシアニジンをそれぞれ定量することを目的とする。定量することのできるプロシアニジンは単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体及び十量体である。
【０１５７】
実施例２の内部標準を用いるＨＰＬＣを実施し、新鮮なカカオ細胞、凍結乾燥したカカオ細胞、並びにカカオ細胞抽出物そのれぞれから調製した試料に含まれるプロシアニジンを定量した。研究室内標準原液を用い、プロシアニジンオリゴマーの較正曲線を作成する。研究室内精製標準化合物を用い、２０、４０、８０、及び１００ｕｇ／ｍＬに連続希釈し、標準を一揃い調製した。これらの標準的な較正曲線をもとに、１０種の標的化合物（単量体〜十量体）を定量する。
【０１５８】
実施例１４．−テオブロミン及びカフェインの解析
脱脂したテオブロマ・カカオ種子に含まれる、主要なアルカノイドであるテオブロミン及びカフェインの濃度を、ＬＣ／ＭＳ解析方法を用い測定した所、それぞれ乾燥重量で２５．２ｍｇ／ｇ及び４．６ｍｇ／ｇであった。対照的に、テオブロマ・カカオ懸濁細胞ではカフェイン（図９Ｃ及び９Ｆ）又はテオブロミン（図９Ｂ及び９Ｅ）は検出不能であり、なおかつカテキン及びエピカテキンを種子と匹敵する濃度で生産していた（図９Ａ及び９Ｄ）。テオブロミン及びカフェインの標準品をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、希釈し、これらの代謝産物を検出及び定量するための較正曲線を作成した。これらの結果から、植物細胞培養物が、ほんの僅かな量の不要な化合物とともに、対象化合物を高濃度で生産することが示される。
【０１５９】
Ｗａｔｅｒｓ  ９９６  ＰＤＡ検出器（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）からなるＷａｔｅｒｓ  ２７９５分離モジュールでカフェイン及びテオブロミンの定量を行うこともできる。Ｋｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００６，５４，１５７１）に出典の方法を、ＵＶ  ２８０ｎｍを用い、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｄｉｏｌ（２５０×４．６ｍｍ  ＩＤ，粒径５μ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で実施し、カカオ細胞抽出物中のカフェイン及びテオブロミンを分離した。移動相は、溶媒（Ａ）、アセトニトリル：酢酸（９８：２、ｖ／ｖ）及び溶媒（Ｂ）、メタノール：水：酢酸（９５：３：２、ｖ／ｖ／ｖ）の二相からなる。３０℃にて、流速０．８ｍＬ／分で次のように直線勾配を用い溶出を実施した：０〜３５分、１００〜６０％  Ａ；３５〜４０分、６０％  Ａ；４０〜４５分、６０〜１００％Ａ。カフェイン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及びテオブロミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をそれぞれ、１、１０、２０、５０、１００、２００、及び５００ｕｇ／ｍＬに連続希釈し、標準原液を調製した。上記カカオ細胞懸濁液に関する実施例及び未発酵カカオ豆に関する実施例に記載のとおりに、試料を２本ずつ調製した。０．４５ｕｍ膜フィルタによりろ過した後、すべての試料をＨＰＬＣモジュールに注入した。表３は、試料中に含まれるカフェイン及びテオブロミンの定量値を示す。カフェイン及びテオブロミンを定量したところ、カカオ細胞抽出物ではそれぞれ０．２７〜０．４９ｕｇ／ｍｇ及び０．３２〜０．７３ｕｇ／ｍｇであり、未発酵カカオ豆抽出物ではそれぞれ１４．１ｕｇ／ｍｇ及び４９．３ｕｇ／ｍｇであった。データ解析に基づくと、カカオ細胞は、未発酵のカカオ豆抽出物と比べ、カフェイン及びテオブロミンを実質的に不含である（図１１）。したがって、カフェイン及びテオブロミンがそれぞれ約０．５ｕｇ／ｍｇ未満及び０．７５ｕｇ／ｍｇ未満である場合、抽出組成物は、キサンチン類を実質的に不含であるとみなすことができる。
【０１６０】
実施例１５．カカオ懸濁培養のスケールアップ
植物細胞培養物を使用する際、目的生成物を安定的に得るということが共通して問題になる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２０（６）１６６６，２００４）。したがって、首尾よく植物細胞を大規模培養するには、安定的に生産性を維持することが重要になる。カカオ細胞の懸濁培養を、１２５ｍＬフラスコから５００ｍＬフラスコにスケールアップするための方法を首尾よく導入したところ、スケールアップ条件下でのカカオ細胞の増殖及び増殖が非常に一貫して安定的なものになった。選別した細胞株の平均的なＰＣＶは、７日目には、初期ＰＣＶレベルの２０％の約２．５倍超となる４５〜５５％になった。すべて暗所条件下にて、旋回シェーカーを用い、１２５ｍＬ及び５００ｍＬ三角フラスコに関しては１１０ｒｐｍ、２８００ｍＬフェルンバッハフラスコに関しては５０ｒｐｍで、大規模フラスコ培養物を維持培地の培地ＶＩＩＩで増殖させた。培養の７日毎に、培地中のバイオマス濃度、糖濃度、並びにプロシアニジン生産性を測定した。
【０１６１】
２．７Ｌのカカオ細胞を６．５Ｌバイオリアクター（作業体積＝５．０Ｌ）に播種し、空気流量０．２ｖｖｍ（１分あたりの培養物容量あたりの気体用量）で、１００ｒｐｍの撹拌速度かつ２３℃の容器温度にて７日間培養した。バイオマスは非常にゆっくりと増加し、対数増殖期は４日間続いた。栄養素の利用効率を制限する可能性があり、また細胞を均一に混合することは困難であったことから、大量播種は細胞にとって課題であった。理想的な初期播種量（開始播種体積）は２５〜４０％  ＰＣＶでなくてはならない。溶存酸素（ＤＯ）濃度及び及びＣＯ２などの溶存代謝ガスに関係するガス交換も、バイオマス濃度及び比産生性に影響を与える重要な要因である（Ｄｉｃｏｓｍｏ  ＆  Ｍｉｓａｗａ，「Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」，１９９６，ｐｐ４４）。フラスコ培養では、溶存酸素量及び気体代謝を調節することは不可能であるが、リアクター培養ではこれらを調節することができる。本実施例では、ＤＯレベルは徐々に低下したことから、細胞代謝の良好な指標となった。
【０１６２】
実施例１６．細胞懸濁液培養物からの大規模分離
１Ｌのカカオ細胞懸濁物から回収したバイオマスを新鮮な細胞として用い、あるいはＬａｂｃｏｎｃｏ凍結乾燥機により凍結乾燥させて、７５．０ｇの乾燥カカオ細胞を得てこれを用いた。振盪器を使用し、０．１％〜２％のアスコルビン酸、酢酸、クエン酸水溶液１Ｌ、又は抽出溶媒水溶液１Ｌ（０．１％〜２％のアスコルビン酸、酢酸、クエン酸を含有させた３０、４０、５０、６０、７０、８０％のアセトン、３０、４０、５０、６０、７０  ８０％のメタノール、又は３０、４０、５０、６０、７０、８０％のエタノール水溶液）のいずれかを用い、新鮮な細胞又はカカオ細胞乾燥粉末を０〜８０℃で１時間、２度抽出した。抽出溶液を、ブフナー漏斗を用いてろ過するか、又は遠心分離した。ろ液又は上清を組み合わせ、次に４０℃にて減圧させて、回転蒸発器により最終容量の３００ｍＬにまで蒸発させた。濃縮させた水性残渣を、Ｌａｂｏｃｏｎｃｏ凍結乾燥機を用いて−２０℃で凍結させ、乾燥させて鮮黄色の粗抽出物を得た。実施例１０に記載のＨＰＬＣ定量法により測定したところ、乾燥カカオ細胞から得られた粗プロシアニジンの生成量は、重量の１０〜１５％であった。
【０１６３】
１０Ｌのカカオ細胞懸濁培養物から、凍結乾燥バイオマスを回収し、このバイオマスを８０％メタノールと体積比１：１で混合し、室温で１時間撹拌する。ブフナー漏斗を用い、ろ紙を介し、減圧下でこの混合物をろ過する。抽出を少なくとも３回繰り返す。各メタノール抽出物を回収し、プールし、減圧下で４０℃にて濃縮し、メタノール抽出物の体積をもとの３０％にまで減少させた。液液抽出のため、メタノール抽出物の濃縮物にジクロロメタンを加え、ジクロロメタン層抽出物を回収し、プールし、減圧下で室温にて２５％比にまで濃縮した。乾燥させた抽出物をメタノールに溶解させ、蒸留水に滴下し、０℃にて２日間置き、沈殿を得た。
【０１６４】
乾燥細胞から得た、予精製プロシアニジンの実際の収率は、純度５０〜６０％で１０〜２０％であった。不純物を効果的に除去するため、Ｃ１８カラム及びシリカカラムを用い、Ｗａｔｅｒｓ分取ＬＣ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）により更に精製を行った。分取ＬＣ精製工程後、純度は９９％以上に上昇した。標的化合物のプロシアニジンを高純度で得るために、更に結晶化工程を採用することができる。
【０１６５】
実施例１７．テオブロマ・カカオ細胞培養物及びカカオ豆から製造したポリフェノール及びプロシアニジンの比較
懸濁培養物からの粗プロアントシアニジンの抽出
１Ｌのテオブロマ・カカオ細胞懸濁培養物から回収したバイオマスを、Ｌａｂｃｏｎｃｏ凍結乾燥機を用い凍結乾燥させ、１４．０ｇの乾燥カカオ細胞を得た。乾燥粉末を、２５０ｍＬのアセトン水溶液（７０％  ｖ／ｖ）により３０分抽出した。この水溶液を３５００ｒｐｍで１５分遠心分離し、上清を除去した。同様の方法で、固体残渣を２回抽出した。２回の抽出から得られた上清を共に合わせ、次に、減圧下で、４０℃にて、回転蒸発器により蒸発させた。濃縮させた水性残渣を、Ｌａｂｏｃｏｎｃｏ凍結乾燥機を用いて−２０℃で凍結させ、乾燥させて鮮黄色の粘調な粗抽出物を得た。乾燥細胞から得た粗プロシアニジンの重量収率を、実施例８に記載の酸ブタノール加水分解法により測定した所、１０〜１５％の範囲であった。
【０１６６】
未発酵の生カカオ豆からの粗プロアントシアニジンの抽出
未発酵の生カカオ豆をＲａｗ  Ｈａｒｍｏｎｙ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）から得た。５ｇの乾燥未発酵豆粉砕物又は未発酵カカオ豆の脱脂粉砕物から粗プロシアニジンを抽出した。抽出は、各抽出工程で、５０ｍＬアセトン水溶液（７０％  ｖ／ｖ）を使用したことを除き、上記の懸濁細胞培養物に用いた方法と同様に行い、３回繰り返した。この組み合わせた抽出物を３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清をデカントし、次に減圧下４０℃にて蒸発させて溶媒を除去した。濃縮させた水性残渣を、Ｌａｂｏｃｏｎｃｏ凍結乾燥機を用いて−２０℃で凍結させ、乾燥させて赤紫色の粗抽出物を得た。粗プロシアニジンの収率を、実施例８に記載の酸ブタノール加水分解法により測定した所、１０〜１３％の範囲であった。
【０１６７】
プロシアニジンの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）解析
Ｗａｔｅｒｓ  ２７９５分離モジュール、Ｗａｔｅｒｓ  ９９６  ＰＤＡ検出器及びＷａｔｅｒｓ  ４７４蛍光検出器からなる順相ＨＰＬＣ系により、プロシアニジンのＨＰＬＣ解析を実施した。極性プロトン性モノマー及び／又はオリゴマーに関し改良された手法である、Ｋｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．出典（米国特許出願公開番号第２００７０７５０２０号）の手法により、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｄｉｏｌカラム（２５０×４．６ｍｍ  ＩＤ，粒径５μ）を用い、テオブロマ・カカオ細胞抽出物及び生カカオ豆抽出物に含まれるプロシアニジンの特性評価及び分離条件を得た。移動相は、溶媒（Ａ）、アセトニトリル：酢酸（９８：２、ｖ／ｖ）並びに溶媒（Ｂ）、メタノール：水：酢酸（９５：３：２、ｖ／ｖ／ｖ）の二相からなる。３０℃にて、流速０．８ｍＬ／分で次のように直線勾配を用い溶出を実施した：０〜３５分、１００〜６０％  Ａ；３５〜４０分、６０％  Ａ；４０〜４５分、６０〜１００％  Ａ。プロシアニジンオリゴマーの分離を、蛍光検出（励起波長２７６ｎｍ、放出波長３１６ｎｍ）、ＵＶ検出２８０ｎｍにより監視した（Ｌａｚａｒｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４７：３６９３，１９９９）。
【０１６８】
図８は、蛍光検出器による、未発酵カカオ豆抽出物（図８Ａ）及びテオブロマ・カカオ細胞懸濁物抽出物（図８Ｂ）のクロマトグラムを示す。Ｋｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌ．Ｎｏ．２００７０７５０２０）に記載されるクロマトグラフィーによる分離と一致し、未発酵カカオ豆抽出物は最大で十二量体（重合度が１２）から構成されている。本例から、テオブロマ・カカオの細胞培養物由来のプロシアニジン抽出物も、豆について報告されているものと同様のプロフィールを有することが確認される。図９は、未発酵カカオ豆抽出物（図９Ａ）及びテオブロマ・カカオ細胞培養物抽出物の（図９Ｂ）ＵＶ吸光度のクロマトグラムを示す。この検出モードにより、カフェイン及びテオブロミンを検出することができ、本実験結果から、豆抽出物はこれらの２種の化合物を抽出物中に含有していたのに対し、細胞培養物抽出物ではこれらの化合物は検出されなかったことが実証される。
【０１６９】
したがって、本実施例は、テオブロマ・カカオ細胞培養物は、カカオ豆と同様プロシアニジンを製造することができ、なおかつ望ましくない化合物のカフェイン及びテオブロミンは生産しないことを示す。更に、本明細書に記載の細胞培養物抽出手順は、カカオ豆の脱脂に必要とされるヘキサンなどの溶媒を使用する必要がない。したがって、テオブロマ・カカオ細胞培養物から誘導したプロシアニジン抽出物には、ヘキサンなどの毒性溶媒は残留していない。
【０１７０】
実施例１８．カカオ細胞懸濁培養物から得たプロシアニジン抽出物の抗酸化活性
本実施例は、上記実施例に記載の方法を用いカカオ細胞培養物から抽出したプロシアニジンがもつ、抗酸化活性の試験方法を記載する。
【０１７１】
文献中に示される根拠により、カカオプロシアニジンのもつ健康増進特性と、これらの化合物の持つ抗酸化特性との間に関係性があることが示唆されている。一般的には、これらの抗酸化物質は、ある種の腫瘍成長及び循環器疾患におけるＬＤＬ酸化に関与する特定の酸化的プロセス及びフリーラジカル的プロセスに作用するものと考えられている。したがって、プロシアニジンが抗酸化特性をもつか測定することは、がん及び心疾患などのヒト疾患の予防におけるこれらの化合物の効果を判定し、これらの化合物が健康増進特性を有する組成物に使用可能であると決定するにあたり理にかなうものである。同様にして、抗酸化物質は、シワが少なく若々しい肌を保つ助けとなると考えられているため、カカオプロシアニジンは化粧品組成物に使用できる。
【０１７２】
カカオプロシアニジンなどのポリフェノール系化合物の抗酸化性能は、当該技術分野で既知の様々な手法により測定される。最も一般的な方法は、酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）による方法である（Ｃａｏ  Ｇ，Ａｌｅｓｓｉｏ  Ｈ，Ｃｕｔｌｅｒ  Ｒ（１９９３）「Ｏｘｙｇｅｎ−ｒａｄｉｃａｌ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ」Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １４（３）：３０３〜１１）。このアッセイは、アゾ系重合開始剤などのラジカル生成源と混合させた後で、蛍光分子（β−フィコエリトリン又はフルオレセインのいずれか）の酸化分解を測定する。アゾ系重合開始剤は、加熱することでフリーラジカルのペルオキシを生成すると考えられており、このラジカルにより蛍光分子に損傷が生じると、蛍光が消失する。また、抗酸化物質は、蛍光分子を酸化による変性から保護し得る。保護される程度は、蛍光光度計を用い定量される。現在では、蛍光プローブとしてはフルオレセインが最も使用頻度が高い。保護能を自動的に測定し、算出する装置は市販されている（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。
【０１７３】
酸化的変性過程が進行するにつれ蛍光強度は減少し、その強度は典型的にはアゾ系重合開始剤（ラジカル性製剤は不含有）の添加から３５分後に記録される。蛍光の遅延として測定されるフルオレセインの変性（又は分解）は、抗酸化物質を存在させることで目立たなくなる。遅延曲線（蛍光強度対時間）を記録し、２つの遅延曲線（抗酸化剤を添加する場合又は添加しない場合）間の面積を算出する。続いて、抗酸化物質により介在された保護の程度を、標準物質として抗酸化剤トロロックス（ビタミンＥ誘導体）を用い定量する。異なる濃度のトロロックスを使用して検量線を作成し、試験試料をこの検量線と比較する。試験試料（食品）に関し得られた結果を、「トロロックス相当」又はＴＥをする。
【０１７４】
実施例１９．有機溶媒を用いた場合のカカオ細胞に含まれるプロシアニジンの抽出効率
本実施例では、各種水性溶媒からのプロシアニジンの抽出効率を試験した。各種濃度の水性溶媒を使用した（酢酸の含有させた、ｐＨ範囲が約３．０〜６．０の、３０、４０、５０、６０、７０、８０％のアセトン、３０、４０、５０、６０、７０、８０％のメタノール、又は３０、４０、５０、６０、７０、８０％のエタノール）。抽出物を解析し、異なる条件下での抽出効率を比較した。抽出物を、実施例９に記載のとおりカカオ細胞粉砕物から調製した。溶媒によるプロシアニジンオリゴマーの抽出には、カカオ細胞粉砕物を５０ｍｇ又は１ｇ使用し、それぞれ３重に試験した。抽出物中に含まれる各プロシアニジン量（単量体〜十量体）を、実施例１４に記載のとおりのＨＰＬＣ解析法により測定した。この結果から、８０％  ＥｔＯＨ溶媒は、他の溶媒による抽出系と比べ非効率的であった。５０、６０、７０％  ＥｔＯＨ及び７０％アセトンは、すべてのプロシアニジンオリゴマーに関し最も効率的であった。本試験で得られた結果により、６０％  ＥｔＯＨが、すべてのプロシアニジンオリゴマーに関し最も有効な抽出溶媒であることが実証される（図１２Ａ）。６０％  ＥｔＯＨは、７０％アセトン（図１２Ｂ、図１２Ｃ）で抽出した場合よりも、プロシアニジン全般（単量体〜十量体）を選択的に抽出した。脱脂カカオ固体からプロシアニジンオリゴマーを抽出する際には酸性の７０％アセトンが最も効果的であると報告されていた、カカオ細胞由来の抽出物とは対照的である（米国特許第６６２７２３２号）。
【０１７５】
実施例２０．酸性条件及び中性条件下でのプロシアニジン二量体の安定性試験
プロシアニジンの安定性に関しては、酸性の７０％アセトンが最も効果的な溶媒であるとして報告されている（Ｒｏｈｒ，Ｇ．Ｅ．；Ｍｅｉｅｒ，Ｂ．；Ｓｔｉｃｈｅｒ，Ｏ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ．Ｉｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｖｏｌｕｍｅ  ２１．Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ）．Ａｔｔｕ−ｕｒ−Ｒａｈｍａｎ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，２０００；ｐｐ４９７〜５７０）。プロシアニジン二量体の安定性を、酸性及び中性の７０％アセトン溶媒を用い試験した。精製プロシアニジン二量体を用い５ｕｇ／ｍＬで試料を調製し、室温で０時間〜２３時間維持した。励起波長２７５ｎｍかつ放出波長３１６ｎｍで蛍光検出器を用い、二量体プロシアニジンを検出した。使用したクロマトグラフィー条件は、上記のものと同一である。図１４Ａ〜１４Ｂは、２３時間後、中性の７０％アセトンにおいてプロシアニジン二量体（図１４Ａ）が著しく分解されていたことを示す。しかしながら、酸性の７０％アセトンにおいては、二量体プロシアニジン（図１４Ｂ）は非常に安定なままであった。
【０１７６】
実施例２１．カカオ細胞懸濁液をスケールアップする際の通気条件
溶存気体は、植物細胞培養時の一次及び二次代謝産物の生産に重要な役割を果たす。この実施例では、取り込み気体混合物に気体酸素を添加して、バイオリアクターで増殖させたカカオ細胞においてポリフェノール生産を増大させることで、通気戦略の有効性を実証した。機械的に撹拌を行なっている７．５Ｌのバイオリアクターに、０．８７５Ｌカカオ細胞を播種し（作業体積＝３．５Ｌ）、０．１ｖｖｍ（毎分あたりの培養体積あたりの気体体積）の気体（空気のみ）流量、１００ＲＰＭの撹拌速度、２６℃容器温度にて７日間培養を行い、続いて、誘導剤としてグルコースを用い１０日間培養した。並行して、培養培地に酸素を添加した気体レジメンを用いたことを除き上記のとおりに処理を行ったバイオリアクターでは、空気のみで処理したバイオリアクターで増殖させた細胞と比較して溶液中細胞体積あたりの最終ポリフェノール濃度が３．１倍に増加した。最終的なプロシアニジン生産量は、空気のみで処理した場合にはＰＣＶあたり９．４グラムであり、酸素添加処理を行った場合にはＰＣＶあたり２９．２グラムであった。
【０１７７】
【表２】
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【０１７８】
【表３】
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【０１７９】
【表４】
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【０１８０】
【表５】
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【０１８１】
【表６】
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【０１８２】
【表７】
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【０１８３】
【表８】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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