(57)【要約】抗原特異的制御性Ｔ細胞、並びに、関連する組成物、方法及びシステムが説明される。抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞の発生方法が提供され、該方法は、抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる前記抗原に特異的な制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、Ｔ細胞又は抗原提示細胞と、両性イオン多糖類とを、接触させることを含む。【選択図】図２１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる当該抗原に特異的な制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、Ｔ細胞と、前記抗原に結合した両性イオン多糖類とを、又は、
ｂ）抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる当該抗原に特異的な制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、抗原提示細胞と、前記抗原に結合した両性イオン多糖類とを、
接触させることを含む、抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞の発生方法。
【請求項２】
前記多糖類がＰＳＡである、請求項１に記載の発生方法。
【請求項３】
前記Ｔ細胞が制御性Ｔ細胞である、請求項１又は２に記載の発生方法。
【請求項４】
前記ｂ）について、前記抗原提示細胞が、前記抗原に結合した前記両性イオン多糖類と接触した後に、前記抗原提示細胞と制御性Ｔ細胞とを接触させることを更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の発生方法。
【請求項５】
前記ｂ）について、前記制御性Ｔ細胞の存在下、前記抗原提示細胞と、前記抗原に結合した前記両性イオン多糖類とを接触させる、請求項１に記載の発生方法。
【請求項６】
同じ小胞上又は小胞内に前記両性イオン多糖類と前記抗原とを含ませることによって、前記両性イオン多糖類が前記抗原に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発生方法。
【請求項７】
前記小胞が、ＯＭＶである、請求項６に記載の発生方法。
【請求項８】
前記両性イオン多糖類が、物理的結合によって前記抗原に結合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の発生方法。
【請求項９】
前記両性イオン多糖類が、直接的又は間接的な共有結合によって、前記抗原に結合する、請求項１に記載の発生方法。
【請求項１０】
前記炎症誘発反応が、細胞介在性炎症反応である、請求項１に記載の発生方法。
【請求項１１】
前記炎症誘発反応が、液性炎症反応である、請求項１に記載の発生方法。
【請求項１２】
前記接触がインビトロで行われる、請求項１に記載の発生方法。
【請求項１３】
前記Ｔ細胞が個々の患者から得られる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の発生方法。
【請求項１４】
前記発生した抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞を、前記個体に注入し返す、請求項１３に記載の発生方法。
【請求項１５】
前記接触がインビボで行われる、請求項１に記載の発生方法。
【請求項１６】
前記接触が、前記抗原に結合した前記両性イオン多糖類の局所又は全身投与によって行われ、個体の内臓において、前記抗原特異的Ｔｒｅｇを発生させる、請求項１５に記載の発生方法。
【請求項１７】
前記抗原が、リウマチ性関節炎、心筋炎症、硬皮症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、自己免疫性肝炎及び重症筋無力症からなる群より選択される疾患に関連する、請求項１に記載の発生方法。
【請求項１８】
個体において、抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞を誘発する時間及び条件で、特異的な抗原に結合した両性イオン多糖類によって前記個体を治療することを含む、前記個体における抗原特異的炎症の抑制方法。
【請求項１９】
前記多糖類がＰＳＡである、請求項１８に記載の抑制方法。
【請求項２０】
同じ小胞上又は小胞内に、前記両性イオン多糖類と前記抗原とを含ませることにより、前記両性イオン多糖類が前記抗原に結合する、請求項１８又は１９に記載の抑制方法。
【請求項２１】
前記両性イオン多糖類が、物理的結合によって前記抗原に結合する、請求項１８に記載の抑制方法。
【請求項２２】
前記両性イオン多糖類が、直接的又は間接的な連結によって前記抗原に結合する、請求項１８に記載の抑制方法。
【請求項２３】
前記抗原が、リウマチ性関節炎、心筋炎症、硬皮症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、自己免疫性肝炎及び重症筋無力症からなる群より選択される疾患に関連する、請求項１８に記載の抑制方法。
【請求項２４】
ａ）抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる当該抗原に特異的な制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、Ｔ細胞と、両性イオン多糖類とを、又は、
ｂ）抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる、当該抗原に特異的な制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、抗原提示細胞と、両性イオン多糖類とを、
接触させることを含む、抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞の発生方法。
【請求項２５】
前記多糖類が、ＰＳＡである、請求項２４に記載の発生方法。
【請求項２６】
前記両性イオン多糖類が、小胞内又は小胞の細胞表面上に存在する、請求項２４又は２５に記載の発生方法。
【請求項２７】
前記小胞がＯＭＶである、請求項２６に記載の発生方法。
【請求項２８】
前記両性イオン多糖類が、抗原に結合している、請求項２４に記載の発生方法。
【請求項２９】
前記接触が、インビトロで行われる、請求項２４に記載の発生方法。
【請求項３０】
前記発生した抗原特異的制御性Ｔ細胞が、患者に注射される、請求項２４に記載の発生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、引用によって全体が本明細書に組み込まれる２０１０年５月２０日出願の米国特許出願第６１／３４６，８３７号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
政府の認可に関する声明
国立衛生研究所により授与された助成金第ＤＫ０７８９３８号に準じて、米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、免疫系、特には、抗体特異的な制御性Ｔ細胞、並びに、関連する組成物、方法及びシステムに関連する。
【背景技術】
【０００４】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、リンパ球として既知である白血球の一群に属し、細胞介在性免疫において中心的な役割を果たす。特には、Ｔヘルパー細胞（サプレッサーＴ細胞又はＴｈ細胞としても既知）は、免疫系の機能を確立及び最大化する、並びに、特に、他の免疫細胞を活性化及び指揮する重要な役割を果たすリンパ球のサブグループ（白血球又はリンパ球の１種）である。
【０００５】
特にＴｒｅｇは、免疫反応に関与する他の細胞の生物活性を抑制する免疫系の一構成要素である。更に特には、Ｔｒｅｇは、免疫抑制性サイトカインであるＴＧＦ−ベータ及びインターロイキン１０を分泌することができ、炎症を制限又は抑制できることが知られている。
【０００６】
Ｔ細胞、特にＴｒｅｇは、抗原特異的免疫反応に関与する。特に抗原特異的Ｔｒｅｇは、抗原のクリアランスのため、抗原特異的炎症性Ｔ細胞によって誘発される免疫反応を調節及び解消する。炎症性及び制御性反応の抗原特異性は、宿主の免疫を低下させることを回避するために最も重要である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本明細書で提供するのは、抗原特異的制御性Ｔ細胞、並びに、関連する組成物、方法及びシステムであり、いくつかの実施形態でこれらは、インビトロ及び／又はインビボにおける抗原特異的炎症誘発細胞介在性及び／又は液性免疫反応を抑制することができる。
【０００８】
第１態様に従うと、抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞の発生方法が説明される。該方法は、抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる抗原特異的制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、Ｔ細胞と、抗原に結合した両性イオン多糖類と、を接触させることを含む。
【０００９】
第２態様に従うと、抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞の発生方法が説明される。該方法は、抗原に対する炎症反応を抑制することのできる抗原特異的制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、Ｔ細胞と、本明細書で説明する組換えバクテロイデスフラジリス（Bacteroides fragilis）と、を接触させることを含む。
【００１０】
第３態様に従うと、抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞の発生方法が説明される。該方法は、抗原を提示する抗原提示細胞を発生させる時間及び条件で、抗原提示細胞と、抗原に結合した両性イオン多糖類と、を接触させることを含む。該方法は、抗原に対する炎症反応を抑制することのできる抗原特異的制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、抗原を提示する抗原提示細胞と、Ｔ細胞と、を接触させることを更に含む。
【００１１】
第４態様に従うと、抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞の発生方法が説明される。該方法は、抗原を提示する抗原提示細胞を発生させる時間及び条件で、抗原提示細胞と、本明細書で説明する組換えバクテロイデスフラジリスとを接触させることを含む。該方法は、抗原を提示する抗原提示細胞と、制御性Ｔ細胞とを接触させ、抗原に対する炎症反応を抑制することのできる抗原特異的制御性Ｔ細胞を発生させることを更に含む。
【００１２】
第５態様に従うと、組換えバクテロイデスフラジリスが説明され、組換えバクテロイデスフラジリスは、多糖類Ａと結合した異種の抗原を発現する。
【００１３】
第６態様に従うと、本明細書で説明される抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞の発生方法によって得ることのできる、抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞が説明される。
【００１４】
第７態様に従うと、抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞の発生システムが説明される。該システムは、抗原を発現する組換えバクテロイデスフラジリス、両性イオン多糖類、Ｔ細胞及び抗原からなる群より選択される少なくとも２つを含む。
【００１５】
第８態様に従うと、個体において抗原特異的炎症を抑制する方法が説明される。該方法は、抗原に特異的な個体において抗原特異的制御性Ｔ細胞を誘発する時間及び条件で、抗原に結合した両性イオン多糖類によって、個体を治療することを含む。
【００１６】
第９態様に従うと、個体において抗原特異的炎症を抑制する方法が説明され、該方法は、抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる抗原特異的制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、多糖類Ａと結合した抗原を発現する組換えバクテロイデスフラジリスによって、個体を治療することを含む。
【００１７】
第１０態様に従うと、個体における抗原特異的炎症誘発Ｔ細胞応答と関連する個体の疾患の治療方法が説明される。該方法は、抗原特異的抗炎症Ｔ細胞によって個体を治療することを含み、該抗原特異的抗炎症性Ｔ細胞は、抗原特異的炎症誘発Ｔ細胞応答の特異的抗原に特異的である。
【００１８】
本明細書で説明されるＴｒｅｇ、並びに、関連する組成物、方法及びシステムは、医学、薬学、獣医学用途、並びに、基礎生物学研究及び種々の用途に関連して使用することができ、抗原特異的Ｔｒｅｇの発生が望ましい本明細書を読むことにより、当業者によって認識することができる。
【００１９】
一実施形態では、抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞の発生方法が提供され、該方法は、ａ）抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる抗原特異的制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、Ｔ細胞と、抗原に結合した両性イオン多糖類とを、又は、ｂ）抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる抗原特異的制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、抗原提示細胞と、抗原に結合した両性イオン多糖類とを、接触させること、を含む。
【００２０】
別の実施形態では、抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞の発生方法が提供され、該方法は、ａ）抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる抗原特異的制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、Ｔ細胞と、両性イオン多糖類とを、又は、ｂ）抗原特異的制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、抗原提示細胞と、両性イオン多糖類とを、接触させること、を含む。
【００２１】
本開示の１以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に示される。他の特徴、目的、利点は、本明細書及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２２】
本明細書に組み込まれ、一部を構成する添付の図面は、発明の詳細な説明及び実施例の項と共に、本発明の１以上の実施形態を説明し、発明の原則及び遂行を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１−１】図１は、ＰＳＡが、抑制性の制御性Ｔ細胞を機能的に拡張したことを示す。図１Ａは、ＴＮＢＳの直腸への注入前にＰＳＡ又はＰＢＳによって１日おきに６日間治療したＢａｌｂ／ｃマウスのＭＬＮにおける、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋の集団内のＦｏｘｐ３＋細胞の割合のフローサイトメトリー（ＦＣ）分析の結果を示す。これらのデータは、３つの独立した実験の代表である。図１Ｂは、図１Ａのように治療されたマウスのＦＣ分析の結果を示し、ＭＮＬ細胞を計上し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の絶対数を決定した（ｘ１０３）。数字は、１つの実験における４匹のマウスの平均を表す。図１Ｃは、ＭＬＮにおけるＦｏｘｐ３の発現を示す。ＲＮＡを、図１Ａのように治療されたマウスのＭＬＮから抽出し、Ｆｏｘｐ３の発現を、全リンパ節中におけるβ−アクチン発現に対して規格化した。図１Ｄは、結腸炎のＰＢＳ又はＰＳＡ治療マウスのＭＬＮから精製し、ＣＦＳＥパルスしたＣＤ４＋ＣＤ２５−によって培養したＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の、インビトロ抑制評価における分析を示す。数字は、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）と制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）との２つの異なる比において少なくとも１つの細胞分割を受けた細胞の割合を示す。これらのデータは、２つの独立した実験の代表である。図１Ｅは、２週間１日置きにＰＳＡを経口的に与えたＣ５７Ｂ１／６マウスのＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞のＦＣ分析を示す。ＭＬＮを抽出し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋区画内のＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞の割合をＦＣによって分析した。各々の記号は、個々のマウスを表す。ｐ値は、両側スチューデンツｔ検定によって決定した。図１Ｆは、ＰＢＳ又はＰＳＡ治療マウスのＭＬＮから精製し、ＣＦＳＥパルスしたＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞、マイトマイシンＣ治療ＣＤ４−細胞及び精製α−ＣＤ３を使用してインキュベートした、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞のインビトロ抑制評価の結果を示す。数字は、Ｔｒｅｇ細胞に対するＴｅｆｆの３つの比率における増殖細胞の割合を示す。
【図１−２】図１Ｇは、実験的結腸炎の間、ＰＳＡが、Ｂ細胞ではなくＴｒｅｇの拡張を誘発することを示す。ＴＮＢＳマウスのＭＬＮを、Ｂ細胞の存在についてＦＡＣＳにより分析した。
【図２】図２は、精製ＰＳＡが「誘発性」のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを活性化することを示す。図２Ａにおいて、Ｃ５７Ｂ１／６Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰマウスを、精製ＰＳＡによって、６日間１日おきに経口的に治療した。ＭＬＮを抽出し、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋又はＣＤ４＋Ｆｏｘ３−Ｔ細胞を、±ＧＴＦ発現に基づく細胞選別により精製した。これらの細胞のタイプからＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲに用いた。これらのデータは、３つの独立した試験の代表である。図２Ｂは、ＴＮＢＳ結腸炎の間、精製ＰＳＡ治療が、Ｆｏｘｐ３の発現を上方調節することを示す。
【図３−１】図３は、Ｂ．フラジリスの単独定着が、腸内環境における耐性Ｔ細胞応答を生じさせることを示す。図３Ａは、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示し、当該結果は、無菌動物のＢ．フラジリスによる単独感作が結腸内のＩＬ−１０の総量を増加させることを示す。示したマウスの結腸からＲＮＡを抽出し、ＩＬ−１０をｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。各々の記号は、個々のマウスを示す。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定によって決定した。図３Ｂは、放射線照射され、Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰマウスからの骨髄によって再形成したＣ５７Ｂｌ／６無菌マウスの結果を示す。続いてマウスに、Ｂ．フラジリス株（示した通り）を８〜１０週間定着させた。固有層リンパ球を結腸から精製し、ブレフェルディンＡの存在下、ＰＭＡ／イオノマイシンを用いて再び刺激した。各々の記号は、個々のマウスを示す。これらのデータは、２つの独立した試験の代表である。
【図３−２】図３Ｃは、図３Ｂのように抽出及び処理した細胞のＦＣ分析を示す。個々のマウスの結腸固有層中のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＩＬ１０＋細胞からの割合を、ＦＣによって決定した。
【図３−３】図３Ｄは、制御性Ｔ細胞と結合することが知られている遺伝子の分析を示す。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰ＋Ｔ細胞をＭＬＮから細胞選別によって精製した。ＲＮＡを抽出してｑＲＴ−ＰＣＲに使用して遺伝子を分析した。図３Ｅは、放射線を照射して骨髄によって再形成し、確実に無菌にしたマウスの排泄物試料から抽出したＤＮＡを示す。ユニバーサル１６ｓプライマーにより、無菌マウスが実験を通して無菌のままであったことが示された。
【図４−１】図４は、ＰＳＡの非存在下では、Ｂ．フラジリスの定着に対する腸内耐性が失われることを示す。図４Ａは、示した動物（ｎ＝４／群）の結腸から抽出し、ブレフェルディンＡの存在下、ＰＭＡとイオノマイシンによって５時間再び刺激した固有層リンパ球（ＬＰＬ）のＦＣ分析を示す。細胞を、α−ＣＤ４及びα−ＩＬ−１７Ａにより染色し、ＦＣによって分析した。これらのデータは、４つの独立した試験の代表である。図４Ｂは、ＰＭＡ及びイオノマイシンによって２４時間再刺激した結腸ＬＰＬ中のＩＬ−１７ＡのＥＬＩＳＡを示す。ｑＲＴ−ＰＣＲからのＩＬ−１７Ａ（図４Ｃ）及びＲＯＲγＴ（図４Ｄ）の相対的発現が示される。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰ−を細胞選別し、ＲＮＡを抽出してｑＲＴ−ＰＣＲを行った。図４Ｅは、示したマウスのＭＬＮから精製し、プレート固相化ａ−ＣＤ３のみで（白色のボックス）、又はＴＧＦ−βに加えて（薄いグレーのボックス）、又はＴＧＦ−β及びＩＬ−６（濃いグレーのボックス）を使用してインキュベートしたＣＤ４＋Ｔ細胞のＥＬＩＳＡを示す。細胞を７２時間インキュベートし、ＩＬ−１７ＡをＥＬＩＳＡによって測定した。これらのデータは、３つの独立した試験の代表である。
【図４−２】図４Ｆは、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた動物からの腸細胞のＥＬＩＳＡ分析を示し、該動物は、Ｂ．フラジリスからの分子に特異的な増加したレベルのＩＬ−１７を生ずる。Ｔ細胞欠乏脾細胞を、示した株の加熱死菌を使用して２４時間インキュベートした。使用前にＡＰＣを洗浄して、内面化していない菌を除去した。Ｂ．フラジリス（白色のボックス）又はＢ．フラジリスΔＰＳＡ（グレーのボックス）に単一感作させたマウスの結腸固有層リンパ球を、細菌性パルスＡＰＣを使用して７２時間インキュベートした。これらの培養物から分泌されたＩＬ−１７Ａの量を、ＥＬＩＳＡによって分析した。これらのデータは、３つの独立した実験の代表である。
【図５−１】図５は、バクテロイデスフラジリスが、制御性Ｔ細胞の成長を誘発することを示す。図５Ａ及び５Ｂは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−（ＧＦＰ−）細胞のＦＡＣＳ分析を示す。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−（ＧＦＰ−）細胞は、従来法で定着させた動物から選別されたＦＡＣＳであり、同じ数の細胞をＧＦＲａｇ−／−受容マウスに移入し、該マウスは、無菌のままにするか、或いは、Ｂ．フラジリス又はＢ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた。ＭＬＮをＣＤ４＋ＧＦＰ＋（Ｆｏｘｐ３）Ｔ細胞について分析した。図５Ｂ中の細胞をインビトロで再び刺激し、ａ−ＣＤ４及びａ−ＩＬ−１０を染色した。細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞についてゲーティング（gated）する。**ｐ値＜０．０１。
【図５−２】図５Ｃは、Ｂ．フラジリスを定着させた動物のＭＬＮから単離したＴｒｅｇが、ＰＳＡに依存する様式でＴＧＦ−βを誘発することを示す。
【図６−１】図６は、バクテロイデスフラジリスの定着が、天然Ｔｒｅｇの存在には影響を及ぼさないが、ＰＳＡ炎症反応の非存在下では反応を誘発することを示す。図６Ａ及び図６Ｂは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞のＦＣ分析を示す。示した通りにマウスに定着させ、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の割合をフローサイトメトリーによって決定した。各々の記号は、個々のマウスを表す。スチューデントのｔ検定により決定される通り、任意の群間で有意差はない。図６Ｂ中の各々の記号は、個々の動物を表す。
【図６−２】図６Ｃは、固有層内のＣＤ４＋ＩＬ−１７Ａ＋細胞の割合を示す。固有層中のＣＤ４＋ＩＬ−１７Ａ細胞の割合は、同じ実験の個々のマウスから表される。これらのデータは４つの独立した実験の代表である。
【図７】図７は、ＰＳＡが、ＴＬＲ２依存の様式で抑制活性によってＴｒｅｇを促進することを示す。図７Ａ〜７Ｂは、ＴＬＲ２−／−のマウスのＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の割合を示す。ＴＬＲ２−／−マウスはＰＳＡを与えられた。ＭＬＮを抽出し、ＣＤ４＋Ｆｏｘ３ｐ＋細胞の割合を分析した。各々の記号は、個々のマウスのＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋の割合を表す。ＮＳ，有意でない。図７Ｂは、ＰＳＡを与えたＴＬＲ２−／マウスのＭＬＮから選別したＦＡＣＳであるＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５−のＴ細胞集団のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＩＬ−１０のレベルは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。薄い棒及び濃い棒グラフは、それぞれＰＢＳ又はＰＳＡ治療動物中のＩＬ−１０レベルを示す。結果は、２つの独立した試験の代表である。図７Ｃは、ＲＯＲγＴ発現が、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡに単独感作させたマウスの結腸中で増加することを示す。結腸をホモジェナイズし、ＲＮＡを組織から抽出した。ｑ−ＰＣＲによってＲＯＲγＴの発現レベルを評価した。
【図８−１】図８は、精製ＰＳＡが、誘発性の表現型によって機能的Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを誘発するのに十分であることを示す。図８Ａは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇのインビトロ抑制評価の結果を示す。マウスにＰＢＳ又はＰＳＡを与え、示した動物からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを精製し、滴定して評価に供した。各々の棒グラフは、１回の分裂を表し、統計的有意性ｐ＜０．０５を示す。*は、統計的有意差ｐ＜０．０５を示す。図８Ｂは、ＭＬＮの定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰ動物に、精製ＰＳＡを強制飼養した。ＭＬＮを抽出し、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−（ＧＦＰ−）及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（ＧＦＰ＋）細胞集団を分類し、ＲＮＡを回収した。濃い棒グラフは、ＰＳＡで治療したマウスの転写レベルを表す。薄いバーは、ＰＢＳで処理した動物から得たデータを表す。定量的リアルタイムＰＣＲを行って、各々の試料中のＩＣＯＳ、パーフォリン及びＴｂｅｔのレベルを決定した。
【図８−２】図８Ｃは、ｑ−ＰＣＲによるＴ−ｂｅｔの発現レベルを示す。示したマウスからＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞を精製し、Ｔ−ｂｅｔの発現レベルを分析した。ＭＬＮからの細胞（図８Ｄ）又は示した動物からの脾細胞（図８Ｅ）を、ブレフェルディンＡの存在下、ＰＭＡ及びイノマイシンによって５時間再び刺激した。続いて、示したサイトカインについて細胞を染色した。プロットは、生存ＣＤ４＋細胞についてゲーティング（gated）した。図８Ｆは、内腔ＡＴＰの異常調節は、増加したレベルの結腸ＩＬ−１７が、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ動物中で誘発されるメカニズムではないことを示す。
【図９】図９は、Ｔｈｌ７細胞応答がＰＳＡの非存在下で誘発されることを示す。図９Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＬ−１７Ａを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、示したマウス（図中に示す通り種々の細菌を定着させた）のＭＬＮから精製し、プレート固相化ａ−ＣＤ３のみ（白色ボックス）、又はＴＧＦ−βに加えて（薄いグレーのボックス）、又はＴＧＦ−ｂ及びＩＬ−６（濃いグレーのボックス）を使用してインキュベートした。誤差バーは、３つの試料の標準偏差を表し、３つの独立した試験の代表である。
【図１０−１】図１０は、Ｂ．フラジリスへの適応免疫反応が抗原特異的であることを示す。図１０Ａは、結腸ＬＰＬＳにおけるＥＬＩＳＡによるＩＬ−１７Ａの分泌を示す。結腸ＬＰＬを、Ｂ．フラジリス又はＢ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた動物から単離し、示した細菌種によってパルスしたＡＰＣを使用してインキュベートした。誤差バーは、３つの試料の標準偏差を表す。これらのデータは、３つの独立した試験の代表である。図１０Ｂは、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１０の産生を示す。無菌動物を放射線照射し、Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰ動物からの骨髄によって再形成した。その後、動物を無菌のままにするか、或いは、Ｂ．フラジリス又はＢ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−（ＧＦＰ−）細胞を、これらの動物群からＦＡＣＳによって精製し、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡに単独感作させたＲａｇ−／−受容マウスに移入した。移入の１０日後、細胞をＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１０産生について評価した。これらのデータは、２つの独立した実験の代表である。
【図１０−２】図１０Ｃは、Ｂ．フラジリスに特異的なＩｇＡのＥＬＩＳＡ分析を示す。各々の記号は、個々のマウスを表す。試料は、回収した結腸内容物の重量に規格化した。*ｐ値＜０．０５。図１０Ｄは、Ｂ．フラジリス、Ｂ．テタイオタオミクロン又はＢ．バルガトゥス抗原へのＩｇＡ反応性のＥＬＩＳＡ分析を示す。誤差バーは、３つの試料の標準偏差を表す。図１０Ｅは、ポリアクリルアミドゲル上で分離してＰＶＤＥ膜に移入した、示した細菌からの総細胞抽出物を示す。Ｂ．フラジリス又はＢ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた動物からの抗体配合物を用いてブロットを調べ、ＨＲＰに連結した二次抗マウスＩｇＡによって免疫反応性種を検出した。白色矢印は、野生型Ｂ．フラジリスではなく、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた動物から単離したＩｇＡと反応する抗原バンドを示す。これらのデータは、２つの独立した実験の代表である。
【図１１】図１１は、Ｂ．フラジリスに対する適応免疫反応が抗原特異的であるという更なる証拠を提供する。図１１は、結腸内容物中のＩｇＡの総量のＥＬＩＳＡ結果を図示する。値は、単離した結腸内容物の重量に規格化した。各々の記号は、１匹のマウスの結腸内ＩｇＡを表す。
【図１２−１】図１２は、他の細菌ではなくＢ．フラジリスに対するＰＳＡ介在性耐性を示す。図１２Ａは、Ｂ．フラジリス及びＢ．バルガトゥス反応性のＩｇＡのレベルのＥＬＩＳＡ分析を示す。無菌マウスに、同数のＢ．バルガトゥスと、野生型Ｂ．フラジリス又はＢ．フラジリスΔＰＳＡとを共定着させ、Ｂ．フラジリス及びＢ．バルガトゥス反応性のＩｇＡのレベルをＥＬＩＳＡによって分析した。データは、結腸内容物の重量に対して規格化した細菌特異的なＩｇＡ結合として表される。誤差バーは、個々のマウス（ｎ＝４）の標準偏差である。データは、２つの独立した実験の代表である。図１２Ｂは、Ｂ．フラジリス又はＢ．バルガトゥスに対するＩｇＡの反応性のＦＣ分析を示す。図１２Ｃは、Ｂ．フラジリス特異的ＩｇＡ（左のパネル）又は総ＩｇＡ（右のパネル）を示す。無菌マウスに、野生型Ｂ．フラジリス、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ又はＢ．フラジリスとＢ．フラジリスΔＰＳＡとの双方を共定着させた。**＜０．０１のｐ値。ＮＳ，有意でない。データは、３つの独立した試験の代表である。
【図１２−２】図１２Ｄ及び図１２Ｆは、野生型Ｂ．フラジリス及びＢ．フラジリスΔＰＳＡの共定着後の、Ｂ．フラジリスに対するＩｇＡの反応性のＦＣ分析を示す。図１２Ｅは、滴定曲線（左から右へ、ＩｇＡ希釈は、１：６、１：４及び１：２）を示す。図１２Ｅにおける誤差バーは、群（ｎ＝４）内の標準偏差を表す。データは、３つの独立した試験の代表である。
【図１３】図１３は、複合腸内定着の間の、Ｂ．フラジリスに対するＰＳＡ介在性の抗体特異的な耐性を示す。図１３Ａは、マウスの該定着を示す。野生型Ｂ．フラジリス及びＢ．フラジリスΔＰＳＡに共感作させた動物から排泄物を回収した。野生型Ｂ．フラジリスは、クロラムフェニコール耐性を付与されたプラスミドを保持する。どちらの株もマウスに同程度定着した。図１３Ｂは、試験した各々の細菌株のユニットを形成するコロニーを示す。野生型Ｂ．フラジリス及びＢ．バルガトゥスを共定着させた動物から排泄物を回収し、各々の細菌株のコロニー形成単位をプレーティングによって決定した。図１３Ｃは、ＥＬＩＳＡを使用したＢ．バルガトゥス抗原に対する反応性を示す。溶解性の結腸含有物を、無菌、Ｂ．フラジリス又はＢ．バルガトゥスに単独感作させたマウスから採取し、Ｂ．バルガトゥス抗原に対する反応性について試験した。
【図１４−１】図１４は、共生の間、適応炎症反応の抑制にＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇが必要であることを示す。図１４Ａは、ＤＴ処理によるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの除去を示す動物のＭＬＮのＦＣプロットを示す。図１４Ｂ及び図１４Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７Ａ及びＩＦＮγ産生を示す。Ｒａｇ欠乏又は放射線照射無菌マウスをＦｏｘｐ３−ＤＴＲ動物からの骨髄によって再形成し、Ｂ．フラジリス又はＢ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた。マウスを、ジフテリアトキシン（ＤＴ）及びＬＰによって処理し、ＭＬＮについて、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７Ａ及びＩＦＮγ産生を評価した。数字は、各象限内の細胞の割合を示す。これらのデータは、３つの独立した試験の代表である。
【図１４−２】図１４Ｄは、ＩＬ１７Ａ発現のｑＲＴ−ＰＣＴ分析を示す。示したマウスの結腸ＬＰＬを単離し、プレート固相化α−ＣＤ３及びα−ＣＤ２８によって２４時間、再び刺激した。図１４Ｅは、ＥＬＩＳＡによるＢ．フラジリス特異的な反応性を示す。ＩｇＡを、示した動物の回腸及び結腸から回収し、Ｂ．フラジリス特異的な反応性を、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを用いて決定した。これらのデータは、３つの独立した試験の代表である。
【図１５】図１５は、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇが、Ｂ．フラジリスに対する適応免疫の抑制に必要であるという更なる証拠である。図１５Ａは、Ｂ．フラジリス又はＢ．フラジリスΔＰＳＡに単独感作させたＤＴ処理動物中のＣＤ４＋ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の割合を示す。図１５Ｂに示す通り、ＩｇＡは、Ｔｒｅｇの非存在下では大きく異ならない。腸内容物を、材料と方法に記載される通りに抽出し、ＥＬＩＳＡによって総ＩｇＡを測定した。図１５Ｃにおいて、ＰＳＡ特異的なＩｇＡをＥＬＩＳＡによって測定し、相対単位を結腸内容物の重量に対して規格化した。
【図１６−１】図１６は、バクテロイデスフラジリスからの膜外小胞がＰＳＡを含むことを示す。図１６Ａは、野生型Ｂ．フラジリス及びＢ．フラジリスΔＰＳＡによって産生されたＯＭＶを示し、ＥＤＬ（電子密度層）強化Ｂ．フラジリスの透過型電子顕微鏡法によって検出された。
【図１６−２】図１６Ｂは、野生型及びＰＳＡ変異細菌の全細胞（ＷＣ）及び膜外小胞（ＯＭＶ）抽出物の免疫ブロット分析を示す。
【図１６−３】図１６Ｃは、精製ＯＭＶの免疫金標識を示し、抗ＰＳＡ及び抗ＩｇＧコロイド状金複合体（５ｎｍ）によって染色され、電子顕微鏡法で分析された。
【図１７】ＰＳＡは、Ｔ細胞への直接的なＴＬＲ２シグナル伝達によるＩＬ−１０産生を生じさせる。図１７Ａは、脾臓ｃｄｌｌｃ＋細胞をＷＴ又はＴＬＲ２−／−動物の脾臓で強化し、抗ＣＤ３及びＴＧＦ−βと共に、ＷＴ又はＴＬＲ２−／−動物の脾臓から精製したＣＤ４＋Ｔ細胞と共に、ＰＳＡの存在下又は非存在下、合計５日間共培養した実験の結果を示す。上清を培養物から回収し、ＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによって評価した。培養は、三回行った。*は、０．０５未満のｐ値を示し、***は、０．００５未満のｐ値を示す。これらの結果は、３つの独立した実験の代表である。図１７Ｂ−１７Ｃは、ＩＬ−１０−ＧＦＰ（ＷＴコントロールとしての）又はＴＬＲ２−／−動物の骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、抗ＣＤ３及びＴＧＦ−βによって培養したＩＬ−１０−ＧＦＰ（ＷＴコントロールとしての）又はＴＬＲ２−／−動物の脾臓から精製したＣＤ４＋Ｔ細胞と共に、精製ＰＳＡの非存在下（−）又は存在下、共培養した実験の結果を示す。ＧＦＰ（ＩＬ−１０）を発現するＣＤ４細胞の割合が示される。***は、０．０１未満のｐ値を示す。図１７Ｃは、細胞が図１７Ａと同様に培養された実験の結果を示し、分泌されたＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡによって評価した。*は、０．０５未満のｐ値を示す。ＮＳは、有意ではないことを示す。
【図１８】ＰＳＡは、Ｔ細胞上のＴＬＲ２によって、ＡＰＣの非存在下、直接的にシグナル伝達することができ、ＴＬＲ１又はＴＬＲ６を必要としない。図１８Ａ−１８Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を野生型（ＷＴ）ＴＬＲ１−／−、ＴＬＲ２−／−、ＴＬＲ６−／−又はＣＤ１４−／−動物から単離した実験の結果を示す。細胞を抗ＣＤ３によって、ＴＧＦ−βの存在下、ＰＳＡと共に（＋）又は無しに（−）刺激した。インビトロの培養を４日間インキュベートし、上清に分泌されたＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによって測定した。*は、統計的有意性ｐ＝＜０．０５を示す。細胞培養物は純度９４％であった。図１８Ｃは、ＢＭＤＣをＷＴ，ＴＬＲ２−／−動物から作製し、ＷＴマウスからの精製ＣＤ４＋Ｔ細胞によってインキュベートした実験の結果を示す。培養物を抗ＣＤ３及びＴＧＦ−βで刺激し、４日間インキュベートした。これら培養物から分泌されたＩＦＮ−γを、ＥＬＩＳＡによって評価した。*は、統計的有意性ｐ≦０．０５を示す。
【図１９】ＰＳＡは、独特のＴＬＲ２リガンドである。図１９Ａは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞上のＰＳＡ、ＰＡＭ３ＣｙｓＫ及びＦＳＬ１によって行われた実験の結果を示す。ＰＡＭ３ＣｙｓＫは、既知のＴＬＲ１／ＴＬＲ２リガンドであるが、ＦＳＬ１は、既知のＴＬＲ２／６リガンドである。非Ｔｒｅｇ細胞の高度に純化された集団（９９％を超える純粋なＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞）からＩＬ−１０を誘発するＰＳＡ能力を評価した。非Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−）は、Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰ動物から選別したＦＡＣであり、ＴＧＦ−β及び示したＴＬＲリガンドＰＳＡ又はＰＡＭ３ＣｙｓＫの存在下、抗ＣＤ３によって刺激した。ＩＬ−１０の分泌をＥＬＩＳＡによって評価した。
【図２０】ＰＳＡは、インビトロでＴｒｅｇ機能を増強させることができる。図２０は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞が、Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰマウスから選別されたＦＡＣＳであり、Ｔｒｅｇの抑制能力を増強させるＰＳＡの能力を測定した実験の結果を示す。精製ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞は、ＣＦＳＥパルスに供され、ＢＭＤＣの存在下、Ｔｒｅｇ細胞によって培養し、ＣＦＳＥの希釈によって抗ＣＤ３細胞増殖を評価した。
【図２１】ＰＳＡは、ＴｒｅｇがＩＬ−１０及びＴＧＦ−Ｂを産生することを直接的に誘発することができる。図２１は、Ｆａｃｓによって選別された野生型又はＴＬＲ２−／−動物のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞をＴＧＦ−βの存在下、抗ＣＤ−３によって刺激し、ＰＳＡ有り及び無しにインキュベートした実験の結果を示す。培養５日後、ＲＮＡを細胞から抽出し、ＩＬ−１０をｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。
【００２４】
発明の詳細な説明
本明細書で提供されるのは、抗原特異的制御性Ｔ細胞の発生方法及びシステムである。
【００２５】
本明細書で使用する「Ｔ細胞」の語は、当業者によって認識可能な種々の細胞タイプが含まれる白血球の１つのタイプを示し、Ｔヘルパー細胞又はＴｈ細胞の種々のサブタイプが含まれることを示す。「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」の語は、サプレッサーＴｈ細胞、即ち、免疫系の活性化を抑制することによって免疫系ホメオスタシスと自己抗原に対する寛容を維持するＴｈ細胞を示す。特には、Ｔ制御性細胞は、機能的には、Ｔヘルパー細胞増殖等の免疫反応を抑制することのできるＣＤ４＋Ｔ細胞タイプとして定義することができる。Ｔｒｅｇの検出及び／又は同定に用いることのできるバイオマーカーは、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ−１０、ＩＬ−３５、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＣＤ２５、ＴＧＦ、パーフォリン、グランザイムＢの任意の組み合わせを含む。一般的には、Ｔｒｅｇは、免疫寛容の維持に極めて重要である。ヒト等の個体におけるＴｒｅｇの主な役割は、免疫反応の終わりに向かってＴ細胞介在性免疫を阻害することと、胸腺における陰性選択のプロセスを回避する自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の２つの主要なクラスについて説明したが、これらには、天然Ｔｒｅｇ細胞と適応型Ｔｒｅｇ細胞が含まれる。天然Ｔｒｅｇは、細胞を産生する宿主又は生命体（即ち、マウス及びヒト等の個体）からの「シグナル」に基づき、発達するＴｒｅｇである。適応型又は誘導性Ｔｒｅｇは、環境からシグナルを受け取る、未処理のＴ細胞に由来する（例えば、Ｔｒｅｇについては腸内細菌）。
【００２６】
「抗原特異的制御性Ｔ細胞」の語は、本明細書で使用する場合、特異的な抗原に対する免疫反応の活性化を抑制することによって、該特異的な抗原への耐性を誘発することのできるＴｒｅｇを示す。特には、抗原特異的なＴｒｅｇは、典型的には、Ｔヘルパー細胞の増殖と抗原特異的炎症とを抑制することのできるＴｒｅｇである。
【００２７】
「抗原」の語は、本明細書で使用する場合、免疫系によって認識される分子を示す。典型的な抗原は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって抗体に特異的に結合する分子と結合することができ、Ｔ−細胞レセプターに提示される任意の分子又は分子断片とが含まれる。「自己」抗原は通常、免疫系によって許容される一方、「非自己」抗原は、免疫系によって侵入者として認識され、攻撃される。抗原特異的Ｔｒｅｇを認識及び／又は検出するのに使用することができるバイオマーカーは、典型的には、ＣＤ２５、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４の表面発現又はＦｏｘｐ３の核発現を含む。かかる「抗原」は、下記段落［００７６］〜［００８８］に見出される種々の条件に関連するものであってよい。
【００２８】
「阻害」、「阻害する」又は「抑制」の語は、本明細書で使用する場合、生体反応又は作用を低下させる活性を示す。従って、特定の生体反応又は作用に干渉することによって、その生体反応又は作用を減少させることができる場合、物質は、前記反応又は作用を「阻害」する。例えば、物質は、生体反応又は作用に関連する別の物質（例えば酵素）の活性を低減又は抑制することによって、例えば、（いくつかの場合には特異的に）前記他の物質に結合することによって、特定の生体反応又は作用を阻害することができる。生体反応又は作用の阻害は、生体反応又は作用に関与する分析物の検出によって検出することができる。「検出する」又は「検出」の語は、本明細書で使用する場合、空間の限られた部分での分析物又は関連するシグナルの実在、存在又は事実の決定を示し、限定するものではないが、これらには、試料、反応混合物、分子複合体及び物質が含まれる。分析物又は関連するシグナルの数量又は量の測定（定量ともいう）に言及する、関連する又は伴う場合には、検出は、「定量的」であり、限定するものではないが、分析物又は関連するシグナルの量又は割合を決定するように設計された任意の分析が挙げられる。定量されていない別の分析物又は関連するシグナルに対する相対的存在量の観点から、分析物又は関連するシグナルの質又種類の特定に言及する、関連する又は伴う場合には、「検出」は「定性的」である。
【００２９】
一実施形態において、「阻害」、「阻害する」又は「抑制」は、当業者によって決定される通り、コントロールに見出された値よりも低い、測定された反応、活性又は物質の任意の値又は量を意味してもよい。例えば、反応がＰＳＡ若しくはＯＭＶ小胞及び／又は抗原を含まない場合のコントロール試料、即ち、コントロール媒質のみを含んだコントロール（即ちＰＢＳコントロール）である。同様に、「増加する」又は「増加」活性若しくは量は、当業者によって決定される通り、コントロールに見出された値よりも大きい、測定された反応、活性又は物質の任意の値若しくは量である。
【００３０】
「炎症反応」、「炎症誘発反応」及び「炎症」の語は、本明細書で使用する場合、有害な刺激、例えば病原菌、損傷細胞又は刺激物等に対する個体の脈管組織の複合的な生物学的応答を示し、サイトカイン及び特には炎症誘発性サイトカイン、即ち、活性化された免疫細胞（例えばミクログリア等）によって主に産生され、炎症反応の増幅に関与するサイトカインの分泌を含む。典型的な炎症誘発性サイトカインとしては、限定するものではないが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１７、ＩＬ２１、ＩＬ２３及びＴＧＦβが挙げられる。典型的な炎症としては、急性炎症及び慢性炎症が挙げられる。「急性炎症」の語は、本明細書で使用する場合、血漿及びリンパ球による組織の浸透によって、炎症の典型的な兆候（腫れ、赤み、疼痛、熱及び機能低下）によって特徴付けられる短期間プロセスを示す。急性炎症は典型的には、有害な刺激が存在する限り生じ、刺激が除去されるか、弱まるか、或いは、瘢痕化（線維症）によって閉じられると、停止する。「慢性炎症」の語は、本明細書で使用する場合、並行活動性炎症、組織破壊と修復の試みとによって特徴付けられる状態を示す。慢性炎症は、先に列挙した急性炎症の典型的な兆候によっては特徴付けられない。その代わり、慢性的に炎症を起こす組織は、単核免疫細胞（単球、マクロファージ、リンパ球及び血漿細胞）の浸透、組織破壊及び治癒の試みによって特徴付けられ、血管形成と線維症とが挙げられる。炎症は、本開示の意味において、個体における炎症と関連する複合的な生物学的応答を形成する事象のいずれかに作用することにより、特に阻害することにより、抑制することができる。
【００３１】
「抗原特異的炎症反応」とは、特定の抗原に特異的な炎症反応を示し、典型的にはＴｈ細胞を含む他の白血球を刺激又は相互作用する、サイトカイン、タンパク質又はペプチドを分泌する抗原特異的炎症性Ｔ細胞又はエフェクターＴｈ細胞の活性化を伴う。典型的な炎症性Ｔ細胞は、Ｔｈ１、Ｔｈ２及びＴｈ／１７を含む。
【００３２】
本願の他の部分で拡張されるように、興味のある任意の抗原が、多糖類（即ちＰＳＡ）と同じ小胞内又は小胞上に位置するか若しくは発現してもよく、次いで小胞を用いてＴ細胞及び／又は抗体提示細胞のいずれかと接触させることにより、抗原特異的炎症反応を阻害することのできる抗原特異的Ｔｒｅｇを発生させる。
【００３３】
別の実施形態において、興味のある任意の抗原が、多糖類（即ちＰＳＡ）に結合するのに対し、多糖類は実際には小胞上に位置してもよく（即ち、細胞表面結合）、次いで小胞を使用して、Ｔ細胞及び／又は抗原提示細胞と接触させ、それによって、抗原特異的炎症反応を阻害することのできる抗原特異的Ｔｒｅｇを発生させる。
【００３４】
更に別の実施形態において、興味のある任意の抗原が、精製した天然又は合成多糖類（即ちＰＳＡ）に結合してもよく（即ち、小胞の中でもその一部でもなく）、その後、結合した多糖類−抗原複合体を使用して、Ｔ細胞及び／又は抗原提示細胞と接触させることによって、抗原特異的炎症反応を阻害することのできる抗原特異的Ｔｒｅｇを発生させる。
【００３５】
一実施形態において、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ又は抗原提示細胞を、個体又は患者から精製し、次いでこれらの患者特異的な細胞を使用して、インビトロにおいて、抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる抗原特異的制御性Ｔ細胞を発生させる条件で、抗原に結合した両性イオン多糖類と一定時間接触させてもよい。
【００３６】
別の実施形態では、段落［００３５］で上述した、得られた患者特異的な抗原特異的制御性Ｔ細胞を、同じ個体／患者に注入し返してもよく、該個体又は患者は、疾患、即ち炎症性疾患に罹患したか又は移植を受けている。
【００３７】
一実施形態において、抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞は、抗原を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を発生させる時間及び条件で、ＡＰＣと、抗原に結合した両性イオン多糖類と、を接触させることにより、及び、抗原に対する抗炎症反応を抑制することのできる抗原特異的制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、抗原を提示するＡＰＣと、制御性Ｔ細胞と、を接触させることにより、発生する。
【００３８】
「接触」及び「インキュベート」の語は、本明細書で使用する場合、２つの項目間の相互的若しくは非相互的な作用又は影響のうちの少なくとも１つが発揮され得るような時間及び条件で提供される、２つの項目間の空間的関係の構築を対象とする作用を示す。特にインキュベーションは、結合した抗原と細胞との間で行われてもよく、抗原と細胞との間の直接的な接触及び／又は相互作用をもたらすか、或いは、細胞の組換えの後、結合した抗原の間接的な作用（例えば、後の、細胞と直接的に相互作用する別の化合物の活性化又は改変）をもたらしてもよい。
【００３９】
インキュベーションが、第１の細胞と第２の細胞との間で行われた後、第１の細胞と抗原とを接触させてもよく、第１の細胞と第２の細胞との間の直接的な接触及び／又は相互作用をもたらすか、或いは、第２の細胞の改変後、第１の細胞の間接的な作用（例えば、サイトカイン又は第２の細胞に直接的に相互作用する他の分子の分泌）をもたらしてもよい。
【００４０】
「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」の語は、本明細書で使用する場合、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）をその表面に有する抗原複合体を提示する細胞を示す。特には、抗原提示細胞には、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、上皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞及び当業者に認識可能な更なる細胞が含まれる。
【００４１】
「両性イオン多糖類」又は「ＺＰ」の語は、本明細書で使用する場合、グリコシド結合によって互いに結合した１以上の単糖類を含み、且つ、正に荷電した部分を少なくとも１つと、負に荷電した部分を少なくとも１つ含んだ合成又は天然ポリマーを示す。両性イオン多糖類としては、限定するものではないが、任意の長さのポリマー、単糖類ポリマー若しくは二糖類ポリマーから、数百又は数千の単糖類を含んだポリマーが挙げられる。いくつかの実施形態において、両性イオン多糖類は、繰り返し単位を含み、各々の繰り返し単位が、２〜１０の単糖類と、正に荷電した部分（例えば、正に荷電した、遊離アミノ部分）と、負に荷電した部分（スルホネート、サルフェート、ホスフェート及びホスホネート等）とを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ＺＰは、５００Ｄａ〜２，０００，０００Ｄａの分子量を有していてもよい。いくつかの実施形態において、ＺＰは、２００〜２５００の分子量を有していてもよい。典型的なＺＰとしては、限定するものではないが、バクテロイデスフラジリスからのＰＳＡ及びＰＳＢ、黄色ブドウ球菌からのＣＰ５／ＣＤ８、並びに、肺炎連鎖球菌からのＳｐｌ／ＣＰｌが挙げられる。両性イオン多糖類は、天然供給源、特には細菌供給源から、例えば精製によって単離されてよい。両性イオン多糖類は、化学的又は生化学的方法、及び、当業者によって認識可能な全ての組み換え微生物技術によって生成されてもよい。従って、それらの方法及び技術は、詳細は本明細書で更には説明されない。
【００４２】
「多糖類Ａ」の表現は、本明細書で使用する場合、バクテロイデスフラジリスのＰＳＡ遺伝子座によって製造される分子、及び、その誘導体を示し、限定するものではないが、繰り返し単位：
【化１】
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［式中、ＡＡＴＧａｌは、アセタミド−アミノ−２，４，６−トリデオキシガラクトースであり、ガラクトピラノシル残基は、Ｏ−４及びＯ−６に渡るピルベート置換基によって修飾されている］から作製されたポリマーが挙げられる。「誘導体」の語は、第１の多糖類（例えばＰＳＡ）を参照して本明細書で使用する場合、第１の多糖類に構造的に関連し、且つ、第１の多糖類の官能性を保持しつつ、第１の多糖類には存在しない特徴を導入する改良によって第１の多糖類から得られる第２の多糖類を示す。従って、ＰＳＡの誘導体多糖類は通常、元の多糖類に存在しない更なる機能に関連するか又は関連しない、繰り返し単位又は１以上の繰り返し単位の単糖類成分の改良によって元の多糖類とは異なっている。しかしながら、ＰＳＡの誘導体多糖類は、１以上の機能的活性を保持し、該活性は、本明細書では、ＰＳＡの抗炎症活性に関連するＰＳＡに関連して記載される。
【００４３】
「結合した（conjugated）」又は「結合（conjugate）」の語は、本明細書中で使用する場合、結合した化合物／物質を抗体提示細胞に接触させる場合に、抗原提示細胞の同じエンドソーム内で化合物及び／又は物質を内部化させる２以上の化合物及び／又は物質間の連結を示す。実施例の項で詳細に説明される結果は、ＰＳＡとＢ．フラジリス特異的な分子との外膜小胞（ＯＭＶ）での共封入、並びに、特に前記分子とＰＳＡとの近接が、Ｔｒｅｇの抗原特異的活性化の決定因子であるという出願人の結論を裏付ける（特には例７〜９、更に特には例９を参照されたい，例９では、Ｂ．フラジリスによって生成したＰＳＡが、内臓に存在する他の抗原に対する抗原特異的応答を抑制することができない）。結果として、出願人は、本明細書の意味において、同じ閉環境内での共封入、又は、抗原とＺＰ（又はＰＳＡ）との間の直接的な連結が、抗原特異的Ｔｒｅｇの活性化を誘発し得ると結論付けた。更には、ＡＰＣに関する知見は、結合した抗原とＺＰとがＡＰＣと接する場合に、連結及び近接が、同じエンドソーム内での封入を許容するという結論を裏付ける。
【００４４】
従って、本明細書の意味において、結合は、物理的連結を含み、直接的又は間接的連結、並びに、特には、共有結合的連結、及び／又は、結合化合物／物質間の他の化学的結合による連結が挙げられる。本明細書の意味において、結合には、同じ／一般的／共有の小胞又は他の閉じられた空間内への結合化合物／物質の封入によって確立される連結、並びに、空間の限定された部分における結合した項目の近接を許容する、２以上の化合物／物質の濃度の増加によって生じた他の相互作用若しくは関係（空間的関係等）も含まれる。
【００４５】
一実施形態において、両性イオン多糖類は、実施例の項に例示される通り、ＰＳＡ及び／又はＰＳＢであってよい。一実施形態において、ＰＳＡ又は他のＺＰは、抗原との物理的連結（例えば、ＰＳＡが発現する同じ細胞区画内における抗原の封入等）によって抗原に結合してもよい（例えば、単独感作した動物においてＰＳＡを発現する、実施例７〜９のＢ．フラジリスを参照のこと）。ＺＰと抗原との同様の近接を確実にする更なる連結は、同様の結果を提供すると予測され、本明細書中に含まれることが意図され、例えば第３化合物によってＺＰが抗原に連結する場合、抗原に対する直接的又は間接的な共有結合的連結を含む。
【００４６】
一実施形態において、抗原とのＺＰの結合は、水性環境を包囲する脂肪膜によって形成される小胞内にＺＰ及び抗原を封入することによって行うことができる。特には、小胞は、水性環境内にＺＰと抗原とを含み、膜に結合していてもよい。特には、一実施形態において、小胞は、例１２に記載されるＢ．フラジリス外膜小胞（ＯＭＶ）によって形成されてもよい。
【００４７】
一実施形態において、ＰＳＡ又は他のＺＰは、非自己抗原、例えば、天然Ｔｒｅｇ応答を活性化しないものへと結合してもよく、病原体由来の抗体（例えば、病原性細菌若しくはウイルス）又は自己免疫疾患に関与する既知の抗原（即ちＭＯＧペプチド）を含んでもよい。一実施形態において、ＰＳＡ又は他のＺＰが、自己免疫疾患に関与する自己抗原と結合してもよい。かかる自己免疫疾患としては、限定するものではないが、リウマチ性関節炎、心筋炎症、硬皮症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、自己免疫性肝炎及び重症筋無力症が挙げられる。
【００４８】
いくつかの実施形態において、抗原に結合したＺＰ、並びに、特にはＰＳＡ及び／又はＰＳＢの有効量は、２５グラムのマウスにつき２５μｇ〜１００μｇである。実施例の項に説明する結果は、５μｇ／２５グラムマウスの用量が言及される。１０μｇ／マウス未満、２００μｇ／マウスを超える範囲は、本明細書の意味においてＴｒｅｇ活性化を提供することも期待される。
【００４９】
別の実施形態において、ＺＰ、抗原、ＺＰ−抗原複合体、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、抗原提示細胞、及び／又は小胞、並びにこれらの任意の組み合わせの有効量は、当業者によって決定され、コントロールと比較して、例えばＺＰの非存在下での反応と比較して、炎症誘発免疫反応を妨げるか、阻害するか、或いは低減させる。かかるコントロールは、当業者によって設計することができる。
【００５０】
一実施形態において、結合ＰＳＡ−抗原とＡＰＣとの接触は、Ｔｒｅｇの非存在下で行われ、続いて、得られた抗原を提示するＡＰＣとＴｒｅｇとを接触させてもよい。一実施形態において、結合ＰＳＡ−抗原とＡＰＣとの接触は、Ｔｒｅｇの存在下行われ、抗原提示細胞をＴｒｅｇに送達してもよい。これらの実施形態において、結合は、特には抗原とＺＰとを小胞又は同様の閉空間に封入することによって行われてもよい。一実施形態において、抗体特異的な抗炎症性の制御性Ｔ細胞を、抗原に対する炎症誘発反応を阻害することのできる抗原特異的制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、Ｔ細胞と、抗原に結合した両性イオン多糖類と、を接触させることによって発生させる。
【００５１】
一実施形態において、接触は、抗原に結合したＺＰと、Ｔ細胞、特にはＴｒｅｇと、を直接的にインキュベートし、寛容原生の免疫反応を活性化することにより行ってもよい。これらの実施形態のうちの一部において、結合は、物理的連結、特には共有結合的な直接的又は間接的なＺＰと抗原との連結によって行われてもよい。実施例の項、特に例１３〜１９に説明するＰＳＡを直接的に接触ささせることによって行われるＴｒｅｇ活性化が参照される。
【００５２】
抗原に結合したＺＰと、抗原提示細胞及び／又はＴ細胞との典型的な接触は、１種類以上の細胞を含んだ試料全体を、適当な条件下インビトロで、抗原を含んだ溶液中に入れることを含み、該条件は、特異的細胞及び特異的抗原に依存し、且つ、本明細書を読むことにより当業者に認識可能である。更には、抗原に結合したＺＰと、抗原提示細胞及び／又はＴ細胞との典型的な接触を、適当な条件下、精製した細胞の細胞培養液にＺＰ結合抗原を導入することによってインビトロで、及び、個体をＺＰ結合抗原で処理することによってインビボで、行われてもよい。
【００５３】
ＺＰ結合抗原とＡＰＣとをインビトロで接触させる更なる例は、例８及び９並びに１７で説明され、ここでは、抗原提示細胞を精製し、抗原結合多糖類によってインキュベートし、続いてＴリンパ球によってインキュベートし、Ｔｒｅｇ応答を生じさせる。他の方法では、個体にＺＰ結合抗原を導入して、インビボでＴｒｅｇを発生させてもよい。特には、個体は、抗原特異的抗炎症制御性Ｔ細胞を、抗原特異的な個体中で誘発する時間及び条件で、抗原に結合した両性イオン多糖類によって処理してもよい。
【００５４】
一実施形態において、続いてＴｒｅｇ細胞を、個体から精製してもよい。典型的な抗原特異的Ｔｒｅｇは、例３及び図５Ａに示される。更なる例は、図２Ａによって提供され、図２Ａは、ＰＳＡ処理に応答して誘発され、且つ、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、パーフォリン、ＴＧＦ−Ｂ及びグランザイムＢの発現を含むＴｒｅｇの表現型を示す。
【００５５】
一実施形態において、Ｔ細胞と両性イオン多糖類とは、抗原に対する炎症誘発反応を阻害することのできる抗原特異的制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で抗原に結合する。
【００５６】
発生したＴｒｅｇの検出は、適当な標識と、本明細書を読むことにより当業者が特定可能な適当な関連技術を用いて行うことができる。
【００５７】
「標識」及び「標識された分子」の語は、検出可能な分子を参照して複合体又は分子の成分として本明細書で使用する場合、限定するものではないが、放射性同位体、蛍光色素分子、化学発光染料、発色団、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、染料、金属イオン、ナノ粒子、金属ゾル、リガンド（例えばビオチン、アビジン、ストレプタビジン又はヘプタン等）等が含まれる。「蛍光色素分子」の語は、検出可能な画像において、蛍光を呈することのできる物質又はその一部をいう。結果として、「シグナル」又は「標識シグナル」の表現は、本明細書で使用する場合、標識から放出され、標識の検出を可能にするシグナルを意味し、限定するものではないが、放射能、蛍光、化学発光、酵素反応の結果の化合物の生成等が挙げられる。
【００５８】
バイオマーカー発現の典型的な検出方法は、当業者に既知の方法によって行われ、該方法としては、限定するものではないが、ＥＬＩＳＡ、Ｑ−ＰＣＲ、及び、ＦＡＣｓによって検出される細胞内サイトカイン染色が挙げられる。いくつかの実施形態において、バイオマーカーの発現は、バイオマーカー特異的抗体又はそれに結合した分子（蛍光色素分子で標識した）を使用して行われる細胞培養で読み出した情報に基づき、蛍光によって検出されてもよく、蛍光色素分子としては、非包括的に、小分子染料、タンパク質発色団、量子ドット及び金ナノ粒子が挙げられる。一実施形態において、バイオマーカーの発現は、バイオマーカープロモータのインビボ（例えば動物細胞中での）又はインビトロでの（細胞培養液中での）転写制御下、標識の発現を検出することによって見いだされてもよい。それらの実施形態の一部において、バイオマーカーは、特にＩＬ−１０又はＦｏｘｐ３であってよい。更なる方法は、ＧＦＰと呼ばれる蛍光色素分子の使用を含んでもよい。ＧＦＰ又は緑色蛍光タンパク質は、フローサイトメータによって検出することができる。ＧＦＰは、ＩＬ−１０又はＦｏｘｐ３の発現を促進するプロモータの制御下に設置される。ＧＦＰによるこれらの遺伝子のいずれかの誘発を用いて、発生したＴｒｅｇを検出してもよい（例えば、例２及び３を参照のこと）。
【００５９】
一実施形態において、結合は、組換えＢ．フラジリスに、所定の抗原を発現させて行ってもよい。続いて、精製した結合多糖類を、樹状細胞等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってインキュベートした後、Ｔ制御性細胞によってインキュベートして、抗原特異的寛容反応を生じさせるであろう。
【００６０】
本明細書で説明する方法及びシステムによって阻害することのできる、特定抗原の実体（細菌を含む）に対する炎症反応は、例７〜９並びに図４、９及び１０に示す通り、炎症性ＴＨ１７細胞又は液性反応（例えばＩｇＡ産生）の誘発を含む。
【００６１】
特に、本明細書で説明する典型的な抗原特異的炎症誘発反応は、ＴＨ１７細胞（例えば図４に示すもの）の誘発を含む。ＰＳＡ又は他のＺＰによって抑制することのできる他の炎症性メディエータとしては、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１が挙げられる。Ｔエフェクター細胞の増殖は、抗原特異的Ｔｒｅｇによって抑制されてもよい。
【００６２】
一実施形態において、接触は、抗原に対する炎症誘発反応を抑制することのできる抗原特異的制御性Ｔ細胞を発生させる時間及び条件で、抗原を発現する組み換えバクテロイドフラジリスによって行われてもよい。
【００６３】
特に、組み換えＢ．フラジリスが使用される実施形態において、細菌は、ＰＳＡに結合する抗原を発現するよう組み換えられるであろう。次いで、この細菌を被験者に経口的に送達してもよい。その後、細菌を腸に定着させ、ＰＳＡと抗原との両方を結腸免疫系に送達してもよく、それによって、かかる特異的抗原に対してＴｒｅｇが発生するであろう。
【００６４】
組み換えＢ．フラジリスが生ずる実施形態において、結合は、ＰＳＡと同じ細胞区画で抗原を発現させることによって達成されてもよい。よって、精製ＰＳＡに対して結合した抗原は、それらが共に送達されることを確実にする。更に、Ｂ．フラジリスの組換え株の表面における抗原の発現は、抗原をＰＳＡと同じ位置に置く（細菌表面、特には外膜上に）。
【００６５】
一実施形態において、組換えバクテロイデスフラジリスは、異種抗体を発現する、組み換えられたバクテロイデスフラジリスである。上述の通り、抗原は、ＰＳＡと同じ位置に発現できるように、細菌表面に発現するよう組み換えられるであろう。Ｂ．フラジリスは、Ｂ．フラジリス遺伝子の発現を促進するプロモータの制御の下、抗原配列を設置することにより、外因性抗原を発現するよう組み換えられてもよい。特には、Ｂ．フラジリス（例えば、タンパク質Ａ又は当業者に認識可能な他の化合物）の外膜上に発現されることが既知であるか又は認識される遺伝子である。例えば、ｐＦＤ３４０と称される、Ｂ．フラジリスのために十分に特徴付けられたクローニングベクターが、係る異種抗体発現に使用されてもよい。
【００６６】
一実施形態において、本明細書に記載する、抗原に結合した両性イオン多糖類、抗原を発現する組換えＢ．フラジリス及び／又は抗原特異的Ｔｒｅｇが、個体における炎症に関与する疾患を治療又は予防する方法において投与されてもよい。該方法は、個体に、治療上有効量のＰＳＡを投与することを含む。
【００６７】
「治療上有効量」の語は、個体において、炎症誘発反応の低減、阻害又は予防をもたらす量である。これを達成するＺＰ又はＰＳＡの量は、当業者によって決定されてもよい。
【００６８】
「個体」の語は、本明細書で使用する場合、炎症が生じ得る１つの生物有機体であり、動物に限定するものではなく、特には高等動物、特には哺乳類等の脊椎動物、特にはヒトが挙げられる。
【００６９】
「疾患」の語は、本明細書で使用する場合、全体又は１以上の部分としての個体の体の身体状況を示す。本明細書で説明する疾患としては、限定するものではないが、障害及び疾患が挙げられ、「障害」の語は、体又はその部分のいずれかの通常の機能に関連する生きた個体の状態を示し、「疾患」の語は、体又はその部分のいずれかの通常の機能を損なった生きた個体の状態を示し、典型的には、兆候又は症状を区別することによって明らかになる。典型的な疾患としては、限定するものではないが、損傷、障害（精神的及び肉体的障害を含む）、症候群、感染、個体の逸脱行動、並びに、個体又はその一部の体の構造及び機能の非定型の変形が挙げられる。疾患には、個体が、移植組織／器官又は移植片を有する又は受けようとしている状況も含み得る。かかる疾患又は障害としては、限定するものではないが、リウマチ性関節炎、心筋炎、硬皮症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、自己免疫性肝炎及び重症筋無力症が挙げられてもよい。
【００７０】
「関連する」の表現は、２つの項目を参照して本明細書で使用する場合、第１の項目の存在が、第２の項目の存在に付随するような２つの項目間の関係を示し、限定するものではないが因果関係及び兆候／症候−疾患関係が挙げられる。
【００７１】
炎症に関連する疾患としては、限定するものではないが、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ぜんそく、皮膚炎、関節炎、重症筋無力症、グレーブス病、硬化症、乾癬が挙げられる。
【００７２】
「治療」の語は、本明細書で使用する場合、疾患の医療的ケアの一部であるか、或いは、状態を医療的又は外科的に治療する任意の活動を示す。
【００７３】
「予防」の語は、本明細書で使用する場合、個体において、死亡又は病的状態の負担を疾患から低減する、任意の活動を示す。これは、一次、二次及び三次予防レベルで行われ、ａ）一次予防は、疾患の発達を回避する；ｂ）二次予防活動は、初期の疾患治療を目的とし、それによって、疾患の進行及び症候の発生を予防する介入の機会を増加させる；ｃ）三次予防は、機能を回復させ、疾患関連合併症を低減させることによって、既に確立された疾患の負の影響を低減する。
【００７４】
特には、一実施形態において、ＰＳＡ又はＺＰは、所定の抗原に結合した後、個体に（例えば経口的に又は全身的に）投与され、抗原特異的免疫反応を生じさせてもよい。この方法は、精製した多糖類及び精製した抗原のみを必要とし、必ずしもインビトロでのＴｒｅｇの発生を必要としないが、代わりに個体において、これらのＴｒｅｇを誘発するであろう。
【００７５】
別の実施形態において、Ｂ．フラジリスは、説明した通り組み換えられて、ＰＳＡに結合した抗原を発現し、その後、患者に投与されてもよい。Ｂ．フラジリスは、患者に定着し、ＰＳＡ及び抗原の持続的供給源を提供することができる。Ｂ．フラジリスが、患者に定着できない場合、所定の抗原を発現するＢ．フラジリスを、精製ＰＳＡ又は他のＺＰの投与時間に匹敵することが予測される一定期間に亘って経口的に投与することができる。別の実施形態では、治療上有効量のＺＰ結合抗原は、上記範囲内にある標的組織において一定濃度のＺＰ−結合抗原を可能にする用量を含む。
【００７６】
一実施形態において、疾患は、移植片拒絶であってよく、組換えＴｒｅｇがドナー抗原に対する細胞応答を特異的に抑制する方法は、移植片受容の成功率を増加させることが期待される。
【００７７】
一実施形態において、疾患は、リウマチ性関節炎であってよい。マウスモデルにおけるＴｒｅｇの欠乏は、疾患の重症度を増大させる一方、Ｔｒｅｇの移送は疾患を改善し、Ｔｒｅｇは、リウマチ性関節炎の予防又は治療に治療的役割を果たしてもよいことを示す。この疾患は、関節で見出される抗原を標的としているので、Ｔｒｅｇは、タンパク質と接続させるよう設計されてもよい。リウマチ性関節炎に関連するかかる抗原としては、限定するものではないが、コラーゲン、ヒト軟骨細胞グリコプロテイン３９、プロテオグリカン、熱ショックタンパク質、シトルリン化フラグリン、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、ｐ２０５及びＢｉＰが挙げられる。
【００７８】
一実施形態において、疾患は、心筋症であってよい。この疾患は、心臓の筋肉の炎症を特徴とする。これは、感染から、胸痛、心不全及び最終的には死につながる可能性のある毒性物質又は免疫学的病因への曝露をもたらす可能性がある。Ｔｒｅｇ欠乏細胞を受容したマウスは、ヒトにおける巨細胞性心筋炎に似た重症の心筋炎を発達させ、Ｔｒｅｇは、この種の炎症を予防する重要な要因である可能性があることを示すことを立証した。心臓及び／又は心筋抗原に対する炎症反応を抑制するよう設計されたＴｒｅｇは、この疾患を治療するための適当な治療であることが期待される。
【００７９】
一実施形態において、疾患は、硬皮症であってよい。この自己免疫疾患は、慢性的な炎症性疾患であり、皮膚又は他の器官の硬化を特徴とする。現在の治療法には、メトトレキサート等の一般的な免疫抑制剤の使用を含む。皮膚の抗原に特異的なＴｒｅｇの設計は、適当な治療であると考えられる。硬化症に関連するかかる抗原としては、限定するものではないが、中心体又は中心体自己抗原、例えばＣＥＮＰ−Ｃ、Ｕｆｄ２、ＳＳＳＣＡ１、ＰＭ−Ｓｃｌ及びＢ２３等が挙げられる。
【００８０】
一実施形態において、疾患は、Ｉ型糖尿病であってよい。膵臓ベータ細胞内での炎症を制御するＴｒｅｇの役割を裏付ける多数の証拠があるため、Ｔｒｅｇ治療に適切であると予測されている。Ｉ型糖尿病に関連するかかる抗原としては、限定するものではないが、インスリン、プロインスリン、クロモグラニン及びＧＡＤ６５が挙げられる。
【００８１】
一実施形態において、疾患は、多発性硬化症であってよい。この疾患における標的抗原は、本開示に従って十分に特徴付けられ、抗原特異的Ｔｒｅｇである。多発性硬化症に関連するかかる抗原としては、限定するものではないが、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオソーム、Ｂ−クリスタリン、ミエリンデンドロサイト糖タンパク質、プロテオリピドタンパク質、トランスケトラーゼ、エノラーゼ及びアレスチンが挙げられる。
【００８２】
一実施形態において、疾患は、クローン病又は潰瘍性大腸炎であってよい。我々のこれまでのデータは既に、ＰＳＡが、結腸内において炎症を抑制することができることを立証しており、また、現在のデータは、結腸からの保護の間、ＰＳＡがＴｒｅｇを誘発することによって、ＰＳＡを、腸炎治療のための見込みのある候補にすることを示唆する。
【００８３】
一実施形態において、疾患は、シェーグレン症候群等の自己免疫疾患であってよく、対応する標的抗原は、限定するものではないが、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオソーム、Ｂ−クリスタリン、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、プロテオリピドタンパク質、トランスケトラーゼ、エノラーゼ及びアレスチンであってよい。
【００８４】
一実施形態において、疾患は、ＳＬＥ（紅斑性狼瘡）等の自己免疫疾患であってよく、対応する標的抗原としては、限定するものではないが、二重鎖ＤＮＡ、Ｕ−１核内低分子リボ核タンパク質複合体であってよい。
【００８５】
一実施形態において、疾患は、橋本甲状腺炎等の自己免疫疾患であってよく、対応する標的抗原は、限定するものではないが、ヒドロペルオキシターゼ（ＴＰＯ）、サイログロブリン（Ｔｇ）及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体であってよい。
【００８６】
一実施形態において、疾患は、グレーブス病等の自己免疫疾患であってよく、対応する標的抗原は、限定するものではないが、チロトロピン受容体であってよい。
【００８７】
一実施形態において、疾患は、自己免疫性肝炎等の自己免疫疾患であってよく、対応する標的抗原は、限定するものではないが、核膜の２１０−ｋＤ糖タンパク質（Ｇｐ２１０）、ヌクレオポリンｐ６２、サイクリンＡ、ラミンＢレセプター、前骨髄球性白血病関連タンパク質ＰＭＬ、ＳＰ１００及びＣＹＰ２Ｄ６であってよい。
【００８８】
一実施形態において、疾患は、重症筋無力症等の自己免疫疾患であってよく、対応する標的抗原は、限定するものではないが、ニコチン性アセチルコリン受容体であってもよい。
【００８９】
ＺＰ、バクテロイデスフラジリス及び／又は抗原特異的Ｔｒｅｇが投与されてもよく、精製した結合多糖類を、全身的に（腹腔内若しくは静脈内に）送達するか、又は、経口的に投与してもよい。Ｂ．フラジリスが経口的に送達されてもよい。特に、投与は、ＺＰ及び抗原が、互いに結合した標的組織に送達されることを確実にする方法及び処方によって行われる。従って、いくつかの実施形態において、経口投与は、胃腸内の酸を中和させる処方を必要とする（例えば、適当なカプセル処方によって）。
【００９０】
一実施形態において、場合によっては、本明細書で説明する抗原を発現する組換えバクテロイデスフラジリス、両性イオン多糖類及び抗原を、本明細書で説明する方法において使用するのに適当な他の試薬と共にシステムに提供してもよい。
【００９１】
システムは、部品を含んだキットの形態で提供されてもよい。部品を含んだキットにおいて、バクテロイデスフラジリス、両性イオン多糖類、抗原及び他の試薬が、１以上の組成に含まれてもよく、各々のバクテロイデスフラジリス、両性イオン多糖類、抗原及び試薬は、適当なビヒクル（vehicle）と共に組成中に含まれてもよい。
【００９２】
更なる成分としては、抗炎症性若しくは炎症性バイオマーカー又はその発現に関連する分子に特異的な標識、標識分子、特には標識捕捉剤、マイクロ微小流体チップ、参照基準、並びに、本明細書を読むことにより当業者が認識可能な更なる成分が挙げられてよい。
【００９３】
「捕捉剤」の語は、本明細書で使用する場合、標的に特異的に結合することのできる化合物を示す。「特異的」、「特異的に」又は「特異性」の表現は、第１の分子の第２の分子への結合を参照して本明細書で使用する場合、第１の分子と第２の分子との間での認識、接触及び安定な錯体の形成であって、第１及び第２の分子の各々と存在し得る別の分子との間での認識、接触及び安定な錯体の形成は、相当少ないか全くないことを言う。典型的な特異的結合は、抗体−抗原相互作用、細胞受容体−リガンド相互作用、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション、触媒基質相互作用等である。「安定な複合体」は、より大きい安定性が一般的には好ましいが、検出可能であり、且つ、任意のレベルの安定性を要求しない複合体を意味する。いくつかの実施形態において、キットは、標識したポリヌクレオチド又は標識した抗体を含んでいてもよい。
【００９４】
キットの成分は、本明細書に説明する方法を行うために、適当な説明書と他の必要な試薬と共に提供されてもよい。キットは通常、別々の容器に組成物を含んでいるであろう。評価を行うための説明書、例えば、紙又は電子補助物に記載の又は音声の説明書（例えば、テープ又はＣＤ−ＲＯＭ等）は通常、キットに含まれるであろう。キットは、使用される特定の方法に応じて、他の包装された試薬及び材料（即ち洗浄緩衝液等）を含んでいてもよい。
【００９５】
「化合物」の語は、本明細書で使用する場合、１以上の化学成分から成る任意の化学物質を示し、種々の物質、分子又は成分を含み、限定するものではないが、例えば、生体分子及び特には薬剤が挙げられる。「生体分子」の語は、本明細書で使用する場合、生物活性に関連する物質化合物又は成分を意味し、限定するものではないが、糖、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、有機分子、ハプテン、エピトープ、生物細胞、生物細胞の一部、ビタミン、ホルモン等が挙げられる。「薬剤」の語は、本明細書で使用する場合、生物の体内に吸収される場合に、通常の身体機能を変化させる物質を示す。特には、本明細書の意味では、薬剤には、疾患の治療、治癒、予防又は診断に使用されるか、或いは、肉体的又は精神的健康を増進させるのに使用される化学物質が含まれる。
【００９６】
本明細書の意味において、「粘膜」の語は、大部分が内胚葉起源の裏層を示し、これは、吸収及び分泌に関与する上皮を被覆する。個体において、粘膜は、外側の環境及び内臓器官に曝露される様々な体腔の内側を覆う。粘膜は、皮膚と連続する様々な場所、例えば鼻孔、口、唇、瞼、耳、生殖器部及び肛門に位置する。
【００９７】
本明細書の意味において、「小胞」の語は、脂質を形成する膜と、水性環境に集まった更なる分子とによって形成される超分子複合体である。特には、本明細書で説明する小胞において、膜形成脂質は、本明細書でサイトゾルとも示される内部の水性環境を包囲する脂質膜に配置される。
【００９８】
本明細書で使用される「膜形成脂質」又は「両親媒性脂質」の語は、水性環境において、極性脂質として既知の両親媒性の１又は２つの対向する層からなる脂質層構造中に集まる、親水性及び疎水性の両方を有する脂質を示す。各々の極性脂質は、親水性部分、即ち極性基（例えば誘導化ホスフェート又は単糖類基）と、疎水性部分（即ち、長い炭化水素鎖）とを有する。典型的な極性脂質としては、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、エーテル脂質、ステロール及びアルキルホスホコリンが挙げられる。両親媒性脂質としては限定するものではないが、膜脂質、即ち、生体膜の構成要素である両親媒性脂質が挙げられ、例えば、ジミリソイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジオレイルホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又はジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）のようなリン脂質である。一実施形態において、小胞の膜は、プラズマ膜（外側の環境から細胞の内部を分離し、水性環境を包囲する生体膜）を模倣する脂質二重層、特にはＢ．フラジリスの外膜によって形成される。
【００９９】
本明細書で説明する小胞はまた、小胞膜に結合するか又は小胞の水性環境に含まれるリポ多糖類（ＬＰＳ）を含む。本明細書で使用される「リポ多糖類」の語は、共有結合により結合した脂質と多糖類とからなる大分子を示し、グラム陰性細菌の外膜に見出され、エンドトキシンとして作用し、動物において強い免疫反応を生じさせる。特には、本明細書で説明する小胞は、当業者によって認識可能なＢ．フラジリスの１以上のＬＰＳを含む。
【０１００】
特に、本明細書で説明する小胞は、小胞の膜に結合するか又は小胞の水性環境に存在するペプチドグリカンを含んでいてもよい。「ペプチドグリカン」の語は、本明細書で使用する場合、糖類及びアミノ酸からなるポリマーを示し、該ポリマーは、細菌（真正細菌であり、古細菌ではない）のプラズマ膜の外側に網目状の層を形成し、細胞壁を形成する。特には、本明細書で説明する小胞は、当業者によって認識されるＢ．フラジリスの１以上のペプチドグリカンを含む。
【０１０１】
一実施形態において、両性イオン多糖類（即ちＰＳＡ）又はＰＳＡ自体を含む小胞は、治療の必要のある個体又は患者に投与される「化合物」又は「組成物」の一部をいう。例えば、炎症又は炎症性障害を有する患者に投与される。
【０１０２】
小胞中に存在し得る更なる化合物は、膜タンパク質、膜脂質炭水化物及び核酸、特には、Ｂ．フラジリスの膜タンパク質、膜脂質炭水化物及び核酸を含む。
【０１０３】
本明細書の意味において、典型的な小胞は、物質を保存又は輸送することのできる小膜包囲嚢を含む。小胞は、膜形成脂質の性質によって自然に形成することができ、細菌の膜から調製されてもよい。ほとんどの小胞は、それらが膜及び／又は水性環境に含む材料に応じて特殊な機能を有する。
【０１０４】
一実施形態において、本明細書で説明する小胞は、細菌の膜の一部によって形成される。一実施形態において、小胞は、細菌の外膜小胞（ＯＭＶ）によって形成される。
【０１０５】
組成物が個体に投与されるいくつかの実施形態において、該組成物は、医薬組成物であり、各々がＰＳＡを含んだ小胞を１以上含んでいてもよい。特定の実施形態では、医薬組成物は、各々が、ＰＳＡと１以上の別の化合物と、及び／又は、薬学的に許容可能な若しくは適当な担体／ビヒクルとを含んだ小胞を１以上含んでもよい。
【０１０６】
別の実施形態において、上記医薬組成物は、ＰＳＡと１以上の別の化合物と、及び／又は、薬学的に許容可能な若しくは適当な担体／ビヒクルとを含んだ小胞を１以上含み、この組成物を与えた炎症性疾患又は炎症を有する個体／患者は改善を示す。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、本明細書で説明する小胞は、賦形剤又は希釈剤とともに医薬組成物中に含まれてもよい。特には、いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書で説明する小胞を、１以上の相溶性且つ薬学的に許容可能なビヒクル、及び特には、薬学的に許容可能な希釈剤又は添加剤と組み合わせて含む。
【０１０８】
「賦形剤」の語は、本明細書で使用する場合、薬剤の活性成分のための、薬学的に許容可能な又は適当な担体として使用される不活性な物質を示す。本明細書に開示される医薬組成物のための適当な賦形剤には、個体の身体の能力を増強させ、本明細書で記載する小胞を吸収する任意の物質が含まれる。適当な賦形剤には、本明細書で説明する小胞によって処方の嵩を大きくし、使い勝手が良く且つ精密な投薬量とするのに使用することができる任意の物質も含まれる。賦形剤は、単回投与量での使用に加え、本明細書で説明する小胞を取り扱うのに役立つ製造方法において使用されてもよい。投与経路及び剤形に応じて、種々の賦形剤が使用されてもよい。典型的な賦形剤としては、限定するものではないが、接着防止剤、結合剤、コーティング崩壊剤、充填剤、調味剤（甘味料等）、及び、着色剤、流動促進剤、潤滑剤、防腐剤、吸収剤が挙げられる。
【０１０９】
薬学的に許容可能な又は適当な担体は、限定するものではないが、有機若しくは無機の固体又は液体賦形剤であり、選択された投与方法、例えば経口投与又は注射の方法に適当であり、慣習的な医薬品の形態で投与されてよい。かかる医薬品としては、錠剤、顆粒、粉末、カプセル等の固体、及び、溶液、エマルション、懸濁液等の液体が挙げられる。前記担体としては、デンプン、ラクトース、グルコース、スクロース、デキストリン、セルロース、パラフィン、脂肪酸グリセリド、水、アルコール、アラビアゴム等が挙げられる。必要な場合には、助剤、安定化剤、乳化剤、潤滑剤、結合剤、ｐＨ調節剤、等張剤及び他の慣習的な添加剤が添加されてもよい。
【０１１０】
薬学的に許容可能な又は適当な担体には、障害された内臓の状況に有益であることが既知である他の化合物（例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ、セレニウム又は亜鉛等の酸化防止剤）又は食品成分が含まれていてもよい。食品組成物は、限定するものではないが、ミルク、ヨーグルト、凝乳、チーズ、発酵乳、乳系発酵産物、アイスクリーム、発酵穀物系産物、乳系粉末、特殊調製粉乳、錠剤、液体細菌懸濁液、乾燥経口サプリメント又は湿潤経口サプリメントであってよい。
【０１１１】
「希釈剤」の語は、本明細書で使用する場合、組成物の活性成分を希釈又は担持するために供給される、希釈する物質を意味する。適切な希釈剤としては、医薬品の粘度を減少させることのできる任意の物質が挙げられる。
【０１１２】
特定の実施形態では、組成物、化合物、特に医薬組成物は、腸内投与のために処方されてもよく、限定するものではないが、例えば、ｉ）口から（経口的に）錠剤、カプセル又は液滴として、ｉｉ）経胃栄養チューブ、経十二指腸チューブ又は胃瘻造設、経腸栄養法によって、及び、ｉｉｉ）坐薬として直腸からのものが挙げられる。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、本明細書で説明される、ＰＳＡを含むビヒクルは、個体の状態を治療又は予防する方法に使用されてもよい。
【０１１４】
方法は、個体に、有効量の組成物又は医薬組成物を投与することを含む。「個体」の語は、本明細書で使用する場合、炎症を生じ得る１つの生物有機体を含み、限定するものではないが、動物、特には高等動物、特には哺乳類等の脊椎動物及び特にはヒトが挙げられる。
【０１１５】
組成物の適当な担体剤又は助剤の特定のための更なる詳細、並びに、キットの一般的製造及び包装は、本明細書を読むことによって当業者によって特定され得る。
【実施例】
【０１１６】
本明細書で説明する方法及びシステム並びに関連する組成物が、以下の例において更に説明され、例は説明を目的として提供され、限定することを意図するものではない。
【０１１７】
特に、以下の例は、Ｂ．フラジリスに特異的な、抗原特異的Ｔ制御性細胞の発生に関する。特にここで説明されるのは、Ｂ．フラジリス自体に対して宿主によって引き起こされる免疫反応を特異的に阻害することのできるＰＳＡ及び／又はＢ．フラジリスによって発生するＴｒｅｇである。当業者は、Ｂ．フラジリスに結合したＰＳＡ又はＰＳＡを発現するＢ．フラジリスについて本明細書で例示する方法及びシステムの、別の抗原（他の細菌又は病原体若しくはそれに結合した分子を含む）に結合した両性イオン多糖類への適用性について、本明細書の教示を考慮して理解するであろう。更に、当業者は、所定の抗原が疾患を誘発し、抗原に特異的なＴｒｅｇを組み換えて免疫を抑制することができる炎症介在性疾患の治療又は予防のための抗原の投与への本明細書で例示する方法及びシステムの適用性を理解するであろう。
【０１１８】
以下の物質及び方法は、本明細書で例示する方法及びシステムの全てに使用された。
【０１１９】
マウス及び細菌
生後８〜１０週間のＳＰＦ（特定病原体未感染の）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、タコニックファーム社から購入した。タコニック社から購入した生後８〜１０週間のＳＰＦＢａｌｂ／ｃマウスを、結腸炎ＴＮＢＳモデルに使用した。Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドのＦｏｘｐ３−ＧＦＰは、タラル・シャティラ（Talal Chatila）（カリフォルニア大学ロサンジェルス校）からの厚意による寄贈であった。Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰマウスは、ヘリコバクター種を持たなかった。ＴＬＲ２−／−マウスは、ジャクソン社から購入した。無菌のＣ５７Ｂｌ／６及びＲａｇ−／−マウスを、カリフォルニア工科大学のプラスチックトレクスラーアイソレータ（plastic Trexler isolators）で飼育し、加圧滅菌処理した食物及び水を与え、毎週、ＰＣＲ及び微生物プレート法でスクリーンをかけ、確実に無菌にした。無菌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰ又はＦｏｘｐ３−ＤＴＲの骨髄キメラを得るために、Ｃ５７Ｂｌ／６又はＲａｇ−／−無菌マウスに、致死的な放射線を照射し、Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰドナーの骨髄によって、後眼窩注射又は眼窩内注射することによって再形成した。マウスは即座に、新たな加圧滅菌したケージに置かれ、２ヶ月の再形成期間に亘って抗生物質（１００ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び１０ｍｇ／ｌのエリスロマイシン）を含んだ水を与えられた。マウスには、エリスロマイシン及びゲンタマイシンに耐性である、Ｂ．フラジリスＮＣＴＣ９３４３の株を経口的な強制飼養によって定着させた。移入実験のため、細胞の移入前に２４時間、無菌Ｒａｇ−／−マウスに亜致死的に放射線照射した。ジフテリアトキシン実験のため、マウスに５０μｇ／ｋｇのジフテリアトキシンを腹腔内に（ｉ．ｐ．）連続２日、その後３日置きに投与した。治療の１０〜１４日後の間にマウスを屠殺した。マウスは全てＬｂＤｉｅｔ５０００１０の食事を与えられ、カリフォルニア工科大学のＩＡＣＵＣガイドラインの下、世話された。
【０１２０】
インビトロ抑制評価
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋又はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞を、Ｔｒｅｇの供給源として使用した。ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を、１ｍｌの５ｍＭＣＦＳＥストックによって３７℃で１０分間パルスに供した。ＣＦＳＥ標識細胞をＰＢＳで２度洗浄し、すぐに使用した。１ｘ１０５マイトマイシンＣ（シグマ社）処理したＣＤ４欠損脾細胞を、ＣＦＳＥパルス化ＣＤ４＋ＣＤ２５−（又はＦｏｘｐ３−）応答細胞と混合した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の示した希釈物を丸底の９６穴プレート中に滴定し、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３を添加した。培養物を３〜４日間インキュベートした後、フリーサイトメトリーによって分析した。
【０１２１】
定量的リアルタイムポリメラーゼ鎖反応
トライゾル（インビトロゲン社）を使用して、ＲＮＡを、徴候を示した細胞から回収した。ｃＤＮＡは、製造業者の指示書（バイオ−ラッド社）により、ｉＳＣＲＩＰＴｃＤＮＡｓｙｎインビトロ論文キットを用いて作製した。ｑＲＴ−ＰＣＲ反応を、製造業者の指示書（バイオラッド社）によってＩＱ ＳＹＢＲグリーンスーパーミックスを使用して行った。反応はバイオ−ラッドＩＱ５ ｑ−ＰＣＲ機で行った。プライマーは、以下の通りである。
ICOS: F 5'-TAC TTC TGC AGC CTG TCC AT3'(配列番号１) & R 5'- CAG CAG AGC TGG GAT TCA TA-3' (配列番号２); FOXP3:F 5'-GCA ATA GTT CCT TCC CAG AGT TCT-3' (配列番号３) & R 5'-GGA TGG CCC ATC GGA TAA G-3' (配列番号４); IL-10: F-5' CTG GAC AAC ATA CTG CTA ACC G-3' (配列番号５) & R 5'-GGG CAT CAC TTC TAC CAG GTA A-3'(配列番号６); EBI3:F 5'- AGC AGC AGC CTC CTA GCC T-3'(配列番号７) & R 5'-ACG CCT TCC GGA GGG TC-3'(配列番号８); GITR: F-5' TGC CCA GCT ATA CCC TTG GT-3'(配列番号９) & R5' CCG CTC TCA TAC ACC CAC TTC-3'(配列番号１０); CD25: F 5'- AAC CATAGT ACC CAG TTG TCG G-3' (配列番号１１) & R 5' -TCC TAA GCA ACG CAT ATA GAC CA3'(配列番号１２); L32: F 5'-AAG CGA AAC TGG CGG AAA C-3'(配列番号１３) & R 5 'TAA CCG ATG TTG GGC ATC AG-3'(配列番号１４).
【０１２２】
実験的結腸炎
生後８週間のＢａｌｂ／ｃマウスをタコニック社から購入した。５０μｇのＰＳＡで動物を、ＴＮＢＳの投与前の６日間、１日置きに、事前処理した。５０％エタノール中の０．７５〜１．５％のＴＮＢＳ（シグマ社）を、３．５Ｆｒシリコーンカテーテル（インステックソロモン社）を使用して直腸から染みこませた。ＴＮＢＳ投与後５日間、剖検まで毎日マウスの体重を量った。
【０１２３】
固有層リンパ球抽出
結腸は、腸間膜及び残った脂肪を注意深く洗浄し、長手方向に切り裂かれた後、大きな断片（１〜１．５ｃｍ）に切り分けられた。断片を５０ｍｌのコニカルビーカーに入れ、良く冷えたＰＢＳ（インビトロゲン社）によって十分にゆすいだ。洗浄した腸断片を、１５ｍｌの上皮細胞解離溶液（５ｍＭＥＤＴＡ及び１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含んだ、Ｃａ＋及びＭｇ＋を含まないＨＢＳＳ）中に３７℃で１５分間、穏やかな攪拌（１００ｒｐｍ）下に設置した。この工程をもう一度繰り返した。次いで断片を、カミソリの刃で細かく切り刻み、その後、消化溶液（５％ＦＢＳ、３ユニット／ｍｌのディスパーゼ、０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＤ及び０．５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡａｓｅＩ（全てワーシントンバイオケミカル社から）を含んだＨＢＳＳ）中に設置し、３７℃でゆっくりとした回転によって２０分間消化し、十分にボルテックスに供した。上清を４０μｍ細胞ろ過器によってろ過して回収した。消化を更に２回繰り返し、ＬＰＬを８ｍｌの４０％パーコールに再懸濁し、これを８０％パーコール（ＧＥヘルスケア社）５ｍｌの上に重ねた。遠心分離の後、ＬＰＬを４０及び８０％勾配の界面から回収し、洗浄し、説明される通りに使用した。
【０１２４】
細胞内での細胞染色
Ｆｏｘｐ３の細胞内での細胞染色については、０．５〜１ｘ１０６の細胞をまず表面染色した後、１００ｍｌの固定及び浸透緩衝液（イーバイオサイエンス社）中で浸透させ、固定した。ＩＬ−１０及びＩＦＮγ細胞内サイトカイン染色には、固有層リンパ球を抽出し、７５０ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンと５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（カルバイオケム社）によって、０．５μｌのゴルジプラグ（ＢＤバイオサイエンス社）の存在下、３７℃で４〜５時間、再活性化した。続いて細胞を、表面染色し、２％のパラホルムアルデヒドによって固定した。１ｘ１０６の細胞に、１００μｌの固定及び浸透緩衝液（イーバイオサイエンス社）を一晩浸透させた。細胞を０．３μｇの抗ＩＬ−１７Ａ又はＩＬ−１０で、４℃で２０分間染色した。抗体は全て、エーバイオサイエンス社から購入した。
【０１２５】
細菌性抗原の調製
細菌培養物を集菌し、ＰＢＳで十分に洗浄し、超音波処理に供した。崩壊した培養物を１０，０００Ｘｇで２０分間回転させ、上清を回収した。タンパク質濃度の決定のためにブラッドフォードを使用した。使用するまで上清を−２０℃で保存した。
【０１２６】
細菌のＦＡＣＳ
スラックらのプロトコールを使用して、ＩｇＡの細菌への結合を直接的に測定した（スラックら、２００９年）。要するに、１ｍｌの細菌培養物を緩衝液（ＰＢＳ  １％ＢＳＡ，０．０５％アジ化ナトリウム）で洗浄した。溶解性の結腸内容物を緩衝液中、１：１０に希釈し、更に希釈した（１：２、１：４、１：６）。２５μｌの抗体溶液と２５μｌの細菌懸濁液とを混合し、４℃で１時間インキュベートした。染色前に、モノクローナルＰＥ−ａｍｏｕｓｅＩｇＡ（１：２５０；エビオサイエンス社）によって細菌を３０分間４℃で洗浄した。細菌を洗浄し、ＰＦＡ中に固定し、対数モードでＦＳＣ及びＳＳＣのパラメータを使用してフローサイトメトリーにより分析した。
【０１２７】
ＩｇＡ免疫ブロット
細菌培養物１ｍｌをペレット化して十分に洗浄し、ＰＢＳ１ｍｌ中に懸濁し、超音波処理に供した。細菌性の溶菌液を２０分間、１０，０００ｘｇで回転させ、上清をブラッドフォードに供した。等量の溶菌液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に走らせ、ＰＶＤＦ膜へと移動した。膜を、５％のミルクによって室温で一晩塞いだ。等量の溶解性結腸内容物（ブラッドフォードによって測定された通り）を使用して、これらの膜を一晩、４℃でプローブした。膜を十分に洗浄した後、ビオチン結合抗マウスＩｇＡ及びストレプトアビジン−ＨＲＰによってプローブした。
【０１２８】
結腸ＩｇＡの回収及びＥＬＩＳＡ
小腸又は結腸を、長手方向に開き、腸内容物（排泄物及び粘液を含む）を、プロテイナーゼインヒビターの混合物を含んだ５００μＬのＰＳＢ（ロシュ社）中に回収した。試料の重量を測定し、８０００ｘｇで、４℃で１０分回転させた。上清を回収し、使用するまで−２０℃で保存した。細菌特異的なＩｇＡＥＬＩＳＡについては、９６穴プレートを、Ｂ．フラジリス、Ｂ．テタイオタオミクロン又はＢ．バルガトゥスから回収した、ＰＢＳ（１００μＬ／穴）中の２μｇ／ｍｌの溶菌液で、４℃で一晩、被覆した。プレートを、アッセイ希釈液（エーバイオサイエンス社）で１時間、室温で塞いだ。１０μＬの結腸内容物を１００μＬのアッセイ希釈液に希釈し、連続的に更に１／１０４倍まで逐次希釈した。試料を４℃で一晩放置した。ビオチンに結合した抗マウスＩｇＡを室温で１時間、１／１０００の希釈で使用し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（サザンバイオテック社）を室温で１時間、１／１０００の希釈で使用した。
【０１２９】
統計学
データセット間での差を、マン−ホイットニーＵ試験又はスチューデントｔ検定によって、マイクロソフトエクセル又はプリズム５．０を使用して分析した。
【０１３０】
例１．
ＰＳＡは、炎症の存在又は非存在下でＴｒｅｇの成長及び拡大を誘発し、誘発されたＴｒｅｇは、インビトロ及びインビボで機能的に抑制的である
有名なヒト共生生物であるバクテロイデスフラジリスは、カプセル状多糖類、ＰＳＡの産生によって、腸炎及び実験的結腸炎を予防する（２７）。実験的腸炎からの保護の間、ＰＳＡのＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇに対する影響を決定するため、腸炎を誘発し、精製ＰＳＡによって経口的に治療した動物の免疫細胞を分析した。著しく体重を失った治療動物は、結腸の著しい肥大、リンパ球の進入及び上皮過形成を示したので、ＴＮＢＳ治療によってＴ細胞介在性の結腸免疫反応が得られた（データなし、引用文献（２７））。既に報告されているように、疾患は、ＰＳＡを与えたＴＮＢＳ治療動物中では明らかではなかった。
【０１３１】
ビヒクル処理（ＰＢＳ）及びＰＢＳ処理ＴＮＢＳ動物（ＴＮＢＳ＋ＰＢＳ）は、腸管膜リンパ節（ＭＬＮ）内で同様のＴｒｅｇ細胞割合を有していた（図１Ａ）。ＰＳＡの抗炎症性と一致して、ＰＳＡを与えたマウスは、ＭＬＮのＣＤ４＋ＣＤ２５＋区画内でＦｏｘｐ３＋細胞の割合を、再生可能な方法で１０％増加させた（図１Ａ）。
【０１３２】
更には、ＭＬＮ中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の絶対数は、ＰＢＳ又はビヒクル治療動物と比較した場合、ＰＳＡ治療動物中で著しく高かった（図１Ｂ）。ＭＬＮ中のＢ細胞の割合は、ＰＢＳ及びＰＳＡを与えたマウス間では相違は無かったため、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ集団のＰＳＡ拡大は特異的であった（図１Ｇ）。ＰＳＡ治療マウス中のＦｏｘｐ３＋細胞の割合の増加に一致して、総ＭＬＮ中のＦｏｘｐ３＋転写産物の発現が増加した（図１Ｃ）。Ｆｏｘｐ３発現が、結腸からのＰＳＡ介在性の保護の間、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞において１細胞ごとの基準で、増加したことも見出され（図２Ｂ）、このことは、ＰＳＡが、比例的且つ細胞固有のＦｏｘｐ３発現を上方調節することを立証した。動物のＰＳＡ治療が、未知のＣＤ４＋Ｔ細胞の小集団を拡大することも以前に報告されており（７）、現在の結果は、この集団がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の可能性があることを示唆する。
【０１３３】
Ｔｒｅｇ細胞の主要な機能の１つは、炎症性Ｔエフェクター細胞の活性化及び増殖を抑制することである。Ｔｒｅｇ細胞の機能的能力は、蛍光色素分子であるＣＦＳＥ（この染料の希釈は、細胞分割の期間と比例する）によってパルスされた未処理ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞による、インビトロでの増殖の抑制を測定することによって評価することができる。実験的結腸炎からのＰＳＡ介在性保護の間のＴｒｅｇの抑制能力は、ビヒクルのＭＬＮ（ＰＢＳのみでＴＮＢＳなし）及びＰＢＳ−若しくはＰＳＡ治療結腸炎マウスから精製した、様々な量のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を添加することによって決定された。予想された通り、Ｔｒｅｇの非存在下、９０％を超えるエフェクター細胞が増殖し（データなし）、これは、ビヒクル又はＰＢＳ治療結腸炎マウスからのＴｒｅｇが培養物に添加されたときに部分的に抑制された（図１Ｄ）。しかしながら、とりわけ、ＰＳＡを与えたマウス（ＴＮＢＳ＋ＰＳＡ）のＭＬＮから単離したＴｒｅｇは、未治療動物の細胞と比較して、著しく高いレベルまでＴ細胞増殖を抑制し（Ｔｅｆｆ：Ｔｒｅｇ比１：２で４３．５％増殖細胞対６３．５％）、このことは、ＰＳＡによって結腸炎から保護した動物のＴｒｅｇが、機能的に抑制活性を有することを立証する。
【０１３４】
腸炎応答の間に著しい変化（抗原特異的Ｔ及びＢリンパ球の拡大、自己免疫細胞の活性化、及び、炎症性サイトカインの多量の分泌が含まれる）が生ずる。これらの事象は、サイトカイン環境と、免疫経路の数多くの配列に影響を及ぼす能力との複合をもたらす。しかしながら、定常状態の間、これらのサイトカインの多くは発現されず、細胞及び分子的な腸内環境は、免疫の間に見られるのとは大きく異なっている。
【０１３５】
ホメオスタシスの間（共生定着の間等）にＰＳＡがＴｒｅｇを拡大させるかを決定するために、マウスにＰＳＡを与え、定常状態の間のＭＬＮ内のＴｒｅｇのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋集団をモニターした。ＰＳＡ治療しマウスは一貫して、ＭＬＮ中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋小集団内で増加した割合のＦｏｘｐ３＋細胞を有していた（図１Ｅ）。更にはホメオスタシスの間、ＰＳＡ治療動物から単離したＴｒｅｇは、コントロール動物と比較して、エフェクターＴ細胞応答を抑制する非常に高い能力を示した（Ｔｅｆｆ：Ｔｒｅｇ比１：２で２８．５％の増殖細胞対４３．０％）（図１Ｆ）。
【０１３６】
本願の例で説明される知見は、腸炎の存在下又は非存在下で、ＰＳＡが機能的Ｔｒｅｇを誘発することを示す。
【０１３７】
例２．ＰＳＡは、ＭＨＣＴＣＲ認識によって機能抑制的Ｔｒｅｇの成長を誘発することができる
微生物叢は、免疫系の発達及び機能に大きな影響を有する（マクファーソン及びハリス、２００４年）。無菌動物へのバクテロイデスフラジリスの定着は、免疫細菌共生関係の研究のモデルシステムを示す（マスマニアンら、２００５年）。最近の研究は、腸のホメオスタシスの維持の間にＴｒｅｇ産生ＩＬ１０にとって重要な役割を有することを示したので（ルトソブら、２００８年）、Ｂ．フラジリスの定着が、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの成長及びサイトカイン産生にどのように影響を与えるかを理解することが必要である。
【０１３８】
無菌のＣ５７Ｂ１／６マウスを、野生型Ｂ．フラジリス又はＰＳＡ欠損株（Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ）に単独定着させた（図４，６）。最近の研究（アタラシら、２００８年；イヴァノヴら、２００８年）と一致して、結腸内のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの割合は群間で有意な差はなく（図６）、このことは、微生物叢が、腸内では天然のＴｒｅｇ細胞に影響を及ぼさなかったことを示唆する。
【０１３９】
興味深いことに、微生物叢の非存在下では、ＩＬ−１０転写物の産生はなく、更には、Ｂ．フラジリスの定着は、結腸内においてＰＳＡ依存的様式でＩＬ−１０産生を修復する（図３Ａ）。Ｂ．フラジリスの無菌動物への単独定着によって、ＩＬ−１０産生ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの割合が著しく増加する（図３）。Ｂ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた動物からのＴｒｅｇは、無菌マウスと同様のＩＬ−１０レベルを有するので、Ｂ．フラジリスによるＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞からのＩＬ−１０の誘発は、ＰＳＡに依存する。Ｂ．フラジリスの定着は、ほぼ例外なくＦｏｘｐ３＋（及びＦｏｘｐ３−）Ｔ細胞からのＩＬ−１０産生を指揮する（図２Ａ，３Ｄ）。従来法で定着させた動物と比べると、無菌マウスは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇにより産生された、より低い発現レベルのＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３及びＴＧＦ−β２を示す（図２Ａ及び図５Ｃ）。Ｂ．フラジリスの単独感作は、これらの抗炎症性遺伝子の発現、即ち、完全にＰＳＡ依存性である表現型を著しく回復させる。ＣＤ２５等の天然のＴｒｅｇマーカーは変化しない。従って、ＰＳＡは、内臓内のＦｏｘｐ３＋ＩＬ−１０＋Ｔｒｅｇの成長を、動物への通常の定着の間に誘発する。
【０１４０】
ＰＳＡは、新たにＴｒｅｇ変換を指揮することができるか否かを調べるため、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞をＦｏｘｐ３−ＧＦＰ動物から精製し（リンら、２００７年）、無菌Ｒａｇ−／−リンパ球減少マウスに適合移植した。動物の群を、無菌のまま残すか或いは野生型又はＢ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた。図５Ａは、Ｔｒｅｇ変換が無菌マウスでは起こらなかったのに対し、野生型Ｂ．フラジリスによる定着が、著しいレベルのＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを誘発したことを示す。Ｂ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた動物が無菌動物に匹敵する数のＴｒｅｇ細胞を含んでいたので、ＰＳＡは、Ｔｒｅｇ変換に必要である（図５Ａ）。更には、Ｂ．フラジリス定着動物中のＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１０発現を獲得した（図５Ｂ）。
【０１４１】
総合すると、結腸内のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＩＬ−１０＋Ｔｒｅｇの系統的分化は、内臓細菌を必要とし、このことは、ＰＳＡが、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの成長を調節する腸内微生物叢の第１細菌分子であることを明らかにした。
【０１４２】
例３．ＰＳＡにより誘発されたＴｒｅｇは、特徴的且つＰＳＡ特異的な抗炎症性遺伝子発現プロファイルを示す
Ｔｒｅｇは、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β及びＩＬ−３５の分泌によって炎症反応を強く抑制する（コリソンら、２００７年；メイナードら、２００７年）。更には、接触依存性のメカニズムには、パーフォリン及びグランザイムの分泌（ゴンデックら、２００５年）、並びに、抗炎症性表面レセプター（ＧＩＴＲ及びＣＴＬＡ−４等）の発現（ヴィグナリら、２００８年）によるエフェクターＴ細胞の細胞溶解が含まれる。
【０１４３】
Ｔｒｅｇの多くの小集団がＦｏｘｐ３＋集団内に存在するため、ＰＳＡがＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの機能的能力にどのように影響を及ぼすかを理解するべく、ＰＳＡ治療に応答したＴｒｅｇ関連遺伝子の発現を分析した。Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰマウス（緑色蛍光タンパク質がＦｏｘｐ３＋タンパク質を示す）をＰＳＡによって（又はＰＳＢコントロールによって）経口的に治療し、ＭＬＮからのＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋又はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞の両方について、遺伝子発現分析を行った。予測したとおり、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β２を含んだＴｒｅｇ関連遺伝子は、Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞と比較して、Ｆｏｘｐ３＋を著しく増加させた（ＰＢＳ試料；図２Ａ）。ＰＳＡは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇから８倍を超える増加したレベルのＩＬ−１０を著しく誘発したが、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞には実質的には何ら影響を及ぼさなかった。
【０１４４】
従って、ＰＳＡは、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞中でＴＧＦ−β２の著しい誘発を引き起こした。ＰＳＡ治療は、グランザイムＢ、パーフォリン及びＣＣＲ６の転写も著しく増加させ、ケモカインレセプターは、Ｔｒｅｇ細胞の移動に関与していることが示された（図２Ａ）（ヤマザキら、２００８年）。ＰＳＡは、ＴＧＦ−β１の発現のように、Ｔｒｅｇ由来のサイトカイン全てに全体的に影響を及ぼすわけではなく、Ｅｂｉ３は変化せず、このことは、区別可能なＴｒｅｇプロファイルへの特異性を立証する。更には、ＰＳＡ治療に応答する、「天然の」Ｔｒｅｇ結合表面分子ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＣＤ２５及びＩＣＯＳの産生は、Ｆｏｘｐ３＋細胞内では変化しない（図２Ａ）。総合すると、これらのデータは、ＰＳＡが、「誘発性」のＦｏｘｐ３＋ｉＴｒｅｇを活性化し、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞内での、ＰＳＡ特異的な遺伝子発現プログラムを明らかにすることを示唆する。
【０１４５】
別の実験では、Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰマウスを、ＰＳＡ（又はＰＢＳコントロール）によって強制飼養し、ＲＮＡを、ＭＬＮのＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−非Ｔｒｅｇ又はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞から抽出し、その後ＦＡＣＳ精製に供した。予測されるように、Ｆｏｘｐ３−及びＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞の小集団での遺伝子発現は、著しく異なっており、Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞中のＩＬ−１０、ＴＧＦ−β１、ＣＤ２５、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ及びＣＴＬＡ−４のより高い基礎レベル値を含んでいた（図２Ａ）。腸炎からのＰＳＡ介在性保護には、未知のＣＤ４＋Ｔ細胞集団によるＩＬ−１０産生が必要とされることがこれまでに報告されている（２７）。非常に興味深いことには、ＰＳＡは、ＰＢＳ治療細胞中で発現したものと比較して、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋からの８倍を超える増加したレベルのＩＬ−１０を誘発する（図２Ａ）。ＰＳＡは、非Ｔｒｅｇ細胞中でＴＧＦ−β２発現をわずかに上方調節するが、Ｔｒｅｇ細胞中で７倍を超えるＴＧＦ−β２の誘発を引き起こす。ＰＳＡ治療もまた、Ｆｏｘｐ３＋ＴｒｅｇからのグランザイムＢ及びパーフォリンの転写を著しく増加する。ＰＳＡは、Ｔｒｅｇ由来のサイトカインに、Ｅｂｉ３の発現のように全体的には影響を及ぼさず、ＴＧＦ−β１は変化せず、このことは、ＰＳＡ誘発性Ｔｒｅｇプロファイルの特異性を立証することは重要である。更には、ＰＳＡ治療に応答した、「天然の」Ｔｒｅｇ結合表面レセプターであるＣＤ２５、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ及びＣＴＬＡ−４の産生は、Ｆｏｘｐ３＋細胞内では変化しない（図２Ａ）。
【０１４６】
総合すると、これらのデータは、ＰＳＡが、サイトカイン及び細胞溶解性のメカニズムによって炎症を抑制する、「誘発性」のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを活性化し、このことはＴｒｅｇ細胞内でのＰＳＡ特異的な遺伝子発現プログラムを明らかにすることを示唆する。
【０１４７】
例４．ＰＳＡによって誘発されたＴｒｅｇは、ＩＬ１０産生及び／又はＴｈ１プロファイルの活性化によってＴ細胞耐性を活発に生じさせる
Ｔｒｅｇを拡大させるのにＰＳＡのみで十分であるかを決定するべく、従来法で定着させたマウスにＰＳＡを与え、ＭＬＮ内でのＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの割合をモニターした。ＰＳＡによって経口的に治療したマウスは、ＭＬＮ内でＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の増加した割合を示す（図１Ａ）。Ｔｒｅｇ細胞の主要な機能のうちの１つは、炎症性Ｔエフェクター細胞の活性化及び増殖を抑制することである。Ｔｒｅｇ機能は、ＭＬＮから精製したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞と、未処理ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞とを様々な割合で添加することによって決定した。ＰＳＡ治療動物から単離したＴｒｅｇは、ＰＢＳ治療コントロール動物と比較してインビトロでＴ細胞応答を抑制する、相当高い能力を示す（例えば、１：２のＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆ比で、２８．５％の増殖細胞対４３．０％）ことが見出された（図１Ｆ）。これらの知見は、従来法で定着させた動物において、ＰＳＡが、増強した抑制能力を有する機能性Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを誘発することを立証する。
【０１４８】
出願人は、これまでに、無菌動物にＰＳＡ産生細菌を定着させることによって、脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞内でＴｈ１サイトカインインターフェロン−ｇ（ＩＦＮγ）を増加させることを報告した（マスマニアンら、２００５年）。特に、出願人はこれまでに、ＰＳＡによって誘発されたＴｒｅｇが、Ｔｈ１／Ｔｈ２応答を指揮する能力を有することを示した（マスマニアンら、２００５年参照）。Ｔｈ１応答は一般的には、転写因子Ｔ−ｂｅｔによって調節することができると考えられているが、近年の報告は、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの小集団は、Ｔ−ｂｅｔを発現するが、ＩＦＮγ発現を欠くことを明らかにした（コホら、２００９年）。
【０１４９】
野生型Ｂ．フラジリスを定着させた動物のＭＬＮ内のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞は、ＰＳＡ依存様式でＴ−ｂｅｔを発現することが見出された（図８Ｂ）。興味深いことに、これらの細胞は、ＩＦＮγを産生しない（図８Ｄ）。しかしながら、同じ動物の脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＰＳＡ依存様式で非ＴｒｅｇからＩＦＮγを発現する（図８）。脾臓Ｔ細胞は、ＭＬＮとは異なり、ＩＬ−１０を産生しない。
【０１５０】
これらの結果は、防御反応を生じさせるＰＳＡ誘発性Ｔｒｅｇの能力における区画差を明らかにする。特には、ＰＳＡ誘発性Ｔｒｅｇが脾臓においてＴｈ１プロファイルを誘発することができるが、内臓での対応するＴｒｅｇは、ＩＬ−１０産生によって耐性を促進することができる。更には、内臓内でＦｏｘ３＋ＩＬ１０＋Ｔｒｅｇ細胞の成長を促進するＰＳＡの能力は、更に、ＰＳＡが粘膜耐性を活発に生じさせるという考えを裏付ける。
【０１５１】
例５．マウスへのＢ．フラジリスの単独感作は、Ｂ．フラジリス特異的なＰＳＡ依存性Ｔｒｅｇ応答を生じさせる
無菌マウスは、数々の発育上及び機能的欠陥を有し、このことは、微生物叢が、腸内免疫応答に大きな影響を及ぼすことを示唆する（４）。無菌マウスの単独感作は、個々の細菌種の生理学的寄与を分析し、細菌変異体の比較定着によって分子機能を割り当てる、理想のモデルシステムを提供する。Ｂ．フラジリスの定着がＴｒｅｇ細胞の成長にどのように影響を及ぼすかを更に理解するべく、無菌のＣ５７Ｂｌ／６マウスを、（全ての造血細胞を欠損させるべく）致死的に放射線照射し、それらを、Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰ動物の骨髄によって再形成した。続いてマウスを、無菌のままにするか、或いは、野生型Ｂ．フラジリス又はＰＳＡ欠損した株（Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ）を単独感作させた。
【０１５２】
マウスを毎週ＰＣＲによってモニターし、それらの微生物学的状態を確実にした（図３Ｅ）。最近の報告（２１，２３）と一致して、ＭＬＮ又は結腸内に存在するＴｒｅｇ（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）細胞の割合は、群間で大きな差はなく（データなし）、このことは、微生物叢が、腸内の天然Ｔｒｅｇ細胞の存在の必要条件ではないことを示唆する。しかしながら、腸内のＦｏｘｐ３＋ＴｒｅｇのＩＬ−１０産生は、微生物叢の非存在下では欠損しており、更にはＢ．フラジリスの定着は、ＰＳＡ依存様式で結腸内でのＩＬ−１０産生を回復させる（図３Ａ）。無菌動物へのＢ．フラジリスの単独感作によって、結腸内のＩＬ−１０産生Ｔｒｅｇの割合の２．５倍を超える増加をもたらす（図３Ｂ及び３Ｃ）。Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ定着動物内で分析したＴｒｅｇは、無菌マウスと同様のＩＬ−１０レベルを有するので、Ｆｏｘｐ３＋細胞からのＢ．フラジリスによるＩＬ−１０の誘発は、ほぼ完全にＰＳＡに依存している。最近の研究は、Ｆｏｘｐ３＋ＴｒｅｇからのＩＬ−１０産生が、粘膜表面におけるホメオスタシスを維持するのには非常に重要であることを示している（３１）。従って、Ｂ．フラジリスによる共生定着は、腸の区画内の機能的なＩＬ−１０−産生Ｔｒｅｇの成長を指揮する。
【０１５３】
Ｔｒｅｇの遺伝子発現プロファイルに対する微生物定着の影響を調査するべく、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞を従来法によって定着させた無菌のＢ．フラジリス又はＢ．フラジリスΔＰＳＡ単独感作マウスのＭＬＮから精製した。無菌マウスは、従来法で定着させたマウスと比較した場合、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ集団内でのＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３及びＴＧＦ−β２発現の欠損を示した（図３Ｄ）。Ｂ．フラジリスの単独感作は、完全に、これらの遺伝子３の全ての発現を回復させた。Ｂ．フラジリスΔＰＳＡの動物への単独感作は、これらの抑制遺伝子の発現を向上させないので、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３及びＴＧＦ−β２の誘発は、Ｂ．フラジリスによるＰＳＡ産生に完全に依存している。ＣＤ２５は、恒常性細菌定着によって影響されないので、遺伝子発現の変化は、誘発性Ｔｒｅｇマーカーに特異的である。従って、共生細菌による定着が、Ｔｒｅｇ関連遺伝子のプログラミングに著しい影響を与え、このことは、Ｂ．フラジリスが、宿主の共生の間に寛容原性腸内免疫環境を誘発することを実証する。
【０１５４】
例６．Ｔｒｅｇに対するＰＳＡ活性は、トール様レセプター２シグナル伝達を必要とする
多くの微生物生産物は、トール様レセプター（ＴＬＲ）等のパターン認識レセプターによって感知される。ＴＬＲシグナル伝達は、歴史的に見て、炎症を誘発すると考えられていたが、一連の研究は、ＴＬＲシグナル伝達が、抗炎症反応も促進することができることを示す（ファンマレンら、２００８年に概説される）。ＰＳＡは、近年、ＴＬＲ２シグナル伝達によって、自然免疫細胞からのサイトカインの産生と連動していることを示したが（ワンら、２００６）、Ｔｒｅｇ成長におけるＴＬＲ２の役割は未知のままである。ＰＳＡがＴｒｅｇ生物学と連動しているメカニズムを理解するべく、ＴＬＲ２欠損動物を、ＰＳＡを用いて経口的に治療し、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞成長について分析した。野生型動物に見られるＴｒｅｇ拡大とは対照的に（図７Ａ）、ＰＳＡによって治療したＴＬＲ２−／−マウスにおけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の割合に差が観察されなかった（図７）。更には、ＰＳＡに応答したＴｒｅｇによるＩｌ−１０の誘発は、ＴＬＲ２発現の非存在下では失われる（図７Ｂ）。当該知見は、ＴＬＲ２ノックアウトマウスがＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を欠損しているという報告と完全に一致している（リウら、２００６年；ストミュラーら、２００６年）。自然免疫シグナル伝達がＴｒｅｇの系統的分化にどのように寄与するかを完全に理解するには、更なる研究が必要であるが、ＰＳＡ介在性のＴｒｅｇの成長は、ＴＬＲ２依存的なメカニズムである。
【０１５５】
例７．ＰＳＡの非存在下、Ｂ．フラジリスは、Ｂ．フラジリス特異的な炎症性免疫応答を誘発する
ほとんど全ての細菌は、パターン認識レセプターのための微生物リガンド（例えば、ＬＰＳ（エンドドキシン）、ペプチドグリカン、非メチル化ＣｐＧ等）を共有し、このことは、分子メカニズムが、粘膜免疫系に、共生細菌と病原性細菌とを区別させなければならないことを示唆する。この区別のための現行の理論は、免疫系と微生物叢（免疫学的無視）との空間分離、及び、自然免疫抑制を含む（フーパー、２００９年）。微生物の感染を制御すべく、免疫系は、炎症誘発Ｔｈ１７細胞の機能を生じさせる。宿主組織への付随的な損傷を予防するため、Ｔｒｅｇは、Ｔｈｌ７免疫を制御し、Ｔｒｅｇの機能は、無害の非自己及び自己抗原の双方への免疫反応の抑制のに必要である。更には、共生及び病原性細菌は、パターン認識レセプターのための多くの微生物リガンドを共有し、このことは、分子メカニズムが、免疫系に有益細菌と有害細菌とを区別させなければならないことを示唆する。
【０１５６】
哺乳類の腸の一生の定着の間、Ｂ．フラジリス（及び考えられる他の共生生物）は、宿主における有害な炎症を予防すべく、‘自己’として許容されなければならないと結論付けられた。従って、ＰＳＡは、Ｔｈ１７応答を抑制することによって、Ｂ．フラジリス抗原に対する免疫耐性を許容するように発達してきた可能性があるという仮説が立てられた。既刊文献（２１，２３）とも一致して、無菌動物は、従来法によって定着させた動物と比較した場合、結腸内に実質的にＴｈ１７細胞を持たない（図４Ａ及び図６Ｃ）（図９Ａ）。Ｂ．フラジリス単独感作動物は、結腸内でＴｈ１７細胞を著しく生じさせないが、ＰＳＡの非存在は、実質的に増加した腸内Ｔｈ１７細胞応答をもたらす。Ｂ．フラジリスΔＰＳＡに単独感作させた動物から単離した結腸固有層リンパ球は、増加したＩＬ−１７Ａの分泌（図４Ａ）（図９）及び増加したＲＯＲｙｔの転写、Ｔｈ−１７特異的な系統的分化因子（図４Ｄ）（図７Ｃ）を有する。更には、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ定着動物のＭＬＮから精製したＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞は、ＩＬ−１７Ａ及びＲＯＲγｔのレベルを増加させた（図４Ｃ及び図４Ｄ）。
【０１５７】
増加したＴｈ１７細胞を有する動物では結腸炎の徴候は観察されなかった。Ｔｈ１７細胞の分化は、ＴＧＦ−β及びＩＬ−６の存在下でのＴ細胞レセプターの刺激に応答して生ずる。特異的に定着させた動物からのＴ細胞応答の大きさを決定すべく、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＭＬＮから精製し、ＩＬ−１７Ａを産生する細胞の能力を、インビトロでのＴｈ１７スキューイングアッセイ中に評価した。Ｂ．フラジリスに単独感作させた動物の細胞は、ＴＧＦ−β及びＩＬ−６の存在下においてさえ、無菌動物と同等のレベルのＩＬ−１７Ａ産生を有する。とりわけ、ＰＳＡを欠損したＢ．フラジリス（Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ）を定着させた動物のＣＤ４＋Ｔ細胞は、野生型を定着させた動物から回収した細胞と比較して、著しく増加したレベルのＩＬ−１７Ａ産生を示す（図４Ｅ）。
【０１５８】
これらのデータは、Ｂ．フラジリスに単独感作した動物から単離したＴ細胞が、Ｔｈ１７分化に対して本質的に耐性があることを示す。ＡＴＰは、近年、腸内の微生物叢がＴｈ１７細胞の成長を腸内で開始させることができるメカニズムとして実証された（２３）。増加したレベルの内腔ＡＴＰが、従来法によって定着された動物に一貫して見出されるが、無菌及びＢ．フラジリスにより単独感作した動物は、ＰＳＡの非存在によっては変化しない著しく低いレベルのＡＴＰを有し、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ動物に見られる増加したＩＬ−７の原因としてのＡＴＰ異常調節の役割を排除する（図８Ｆ）。これらのデータは、ヒトミクロビオームの共生細菌が実際に、病原体と同様の腸内免疫応答を誘発し得ることを明らかにする。しかしながら、ＰＳＡ専用の産生によって、Ｂ．フラジリスに対する免疫誘発Ｔｈ１７の成長は、活発に抑制され、このことは、（免疫学的無視ではなく）ＰＳＡ介在性耐性が、Ｂ．フラジリスに対するＴｈ１７応答を防ぐモデルを裏付ける。
【０１５９】
データは、Ｂ．フラジリスが、宿主の免疫系によって単に無視されるのではなく、むしろ、専用のＰＳＡ産生によって寛容原性の腸内環境を活発に誘発することを実証する。ＰＳＡの非存在下の結果起こる宿主の免疫応答は、非特異的な免疫細胞プライミングを表すか又はＢ.フラジリスを対象とするものではないかと考えられている。この考えを検証するべく、腸細胞による炎症誘発免疫応答を、自家又は異種の共生細菌によって惹起された、Ｂ．フラジリス又はＢ．フラジリスΔＰＳＡ単独感作動物から測定した。単離した結腸固有層細胞を、加熱死共生細菌の様々な株によってパルスした抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって活性化し、これらの培養のＩＬ−１７産生を分析した。最小のＩＬ−１７誘発を、抗原の非存在下（細菌なし）検出した（図４Ｆ）。更には、バクテロイデステタイオタミクロン又はバクテロイデスバルガトゥスによるＡＰＣのインキュベーションによって提供される抗原の添加は、Ｂ．フラジリス又はＢ．フラジリスΔＰＳＡ単独感作動物から単離した細胞によって、基礎レベル値のＩＬ−１７のみを誘発した。
【０１６０】
珍しいことに、Ｂ．フラジリス単独感作動物の結腸の固有細胞が、Ｂ．フラジリス由来の抗原に応答してほとんどＩＬ−１７を誘発しなかったのに対して、Ｂ．フラジリスＰＳＡを定着させた後、Ｂ．フラジリス（他の密接に関係するバクテロイデス種ではなく）により刺激したマウスから単離した細胞は、著しい量のＩＬ−１７を誘発した。更には、Ｂ．フラジリスＰＳＡ定着動物からの細胞によるＩＬ−１７産生は、野生型Ｂ．フラジリスによってＡＰＣをパルスした場合に、より低く、このことは、これまでに報告されていた通り（２７）、ＰＳＡが、インビトロでの抗炎症性を有することを示す。Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ細胞による増強したＩＬ−１７産生は、ＭＬＮでも観察される（図４Ｅ）。従って、当該知見は、ＰＳＡの非存在下、宿主が、とりわけＢ．フラジリスに対する炎症反応を増加させることを明らかにし、このことは、この共生細菌がＰＳＡを進化させ、宿主−細菌の共生の間にそれ自体に対する炎症を抑制することを示唆する。
【０１６１】
例８．Ｂ．フラジリスに対するＴｈ１７細胞応答は、抗原特異的である
ＰＳＡの非存在の結果として生ずる宿主炎症反応は、非特異的Ｔ細胞活性化を表すか又はＢ．フラジリスの抗原を対象とするのではないかと考えられている。これらの２つの可能性のあるメカニズムを区別するべく、Ｔ細胞によるＩＬ−１７産生を、Ｂ．フラジリス又はＢ．フラジリスΔＰＳＡ定着動物から種々の共生細菌の抗原まで測定した。抗原提示細胞（ＡＰＣ）を細菌抽出物でパルスし、Ｂ．フラジリス又はＢ．フラジリスΔＰＳＡ定着動物から採取した固有層リンパ球によって共培養した。更なる刺激を加えず、抗原特異的応答を正確に測定する。最小のＩＬ−１７誘発を、細菌非存在下で検出した（図９Ａ）。
【０１６２】
バクテロイデステタイオタミクロン又はバクテロイデスバルガトゥス抗原によってパルスしたＡＰＣは、Ｂ．フラジリス及びＢ．フラジリスΔＰＳＡ単独感作動物両方の細胞によって基礎レベル値のＩＬ−１７のみを生じさせた。更には、両方のグループの同等のＩＬ−産生によって、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ定着マウスの細胞は、非Ｂ．フラジリス抗原への反応性が低いことが示される。驚くべきことに、野生型Ｂ．フラジリス単独感作動物の細胞は、無視できる程度の応答を誘発するが、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた後、Ｂ．フラジリスをパルスしたＡＰＣ（他の密接に関連したバクテロイデス種ではない）によって共培養したマウスは、著しい量のＩＬ−１７を誘発した。これまでの研究と一致して、ＡＰＣが野生型Ｂ．フラジリスによってパルスされる場合、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡと比較して応答はより低く、このことは、ＰＳＡが、インビトロ細胞培養の間、抗炎症性活性を有することを示す（マスマニアンら、２００８年）。Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ動物からの増強したＩＬ−１７産生は、同様にＭＬＮからの細胞中でも観察される（図９Ａ）。これらの知見は、宿主が、Ｂ．フラジリス抗原への炎症性ＩＬ−１７応答を、ＰＳＡの非存在下で選択的に開始することを明らかにする。
【０１６３】
データは、Ｂ．フラジリス抗原に対するＴｈ１７細胞の応答が、ＰＳＡの非存在下で発展することを示唆する。インビボでこの考えを試験するべく、無菌マウスを、Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰ動物からの骨髄によって再形成し、無菌のままとするか、或いは、Ｂ．フラジリス又はＢ．フラジリスΔＰＳＡにより単独感作させた。このアプローチは、ＰＳＡの存在下又は非存在下、Ｔｈ１７細胞の誘発を生じさせる。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−エフェクターＴ細胞を、３つの定着した群から精製し、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡを単独定着させたＲａｇ欠損動物へと移動した。Ｔｈ１７細胞応答を、Ｂ．フラジリス抗原に対するＴ細胞反応性の指標として分析した。Ｂ．フラジリスに単独感作させた動物由来のエフェクターＴ細胞は、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた動物へと移動した場合に、Ｔｈ１７の最小の発現を有し（図５Ａ）、このことは、Ｂ．フラジリス抗原への無視できる程度の反応性を示す。しかしながら、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡを定着させたドナーからの細胞を受容したマウスは、Ｂ．フラジリス抗原への再曝露によってＴｈ１７細胞の割合に著しい増加をもたらした。これらのデータは、Ｂ．フラジリス抗原に対するインビボでのＴｈ１７細胞成長は、ＰＳＡによって妨げられることを示す。
【０１６４】
例９．ＰＳＡは、Ｂ．フラジリスに対する抗原特異的ＩｇＡ応答を抑制する
粘膜免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）は、定着の間に内臓細菌に対して産生されるので（スラックら、２００９年）、ＰＳＡもまた抗Ｂ．フラジリス抗原産生の発達を妨げているのではないかと考えられている。Ｂ．フラジリス特異的なＩｇＡのレベルは、Ｂ．フラジリス、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ又は密接に関連した種であるＢ．テタイオタオミクロン及びＢ．バルガトゥスに単独感作させた動物において測定した。無菌、Ｂ．テタイオタミクロン又はＢ．バルガトゥスを単独定着させた動物から単離した結腸の抗原が、Ｂ．フラジリス抗原に対して反応性を持たないので、腸内の抗体反応は、非常に特異的である（図４Ｆ）。更には、Ｂ．フラジリスを単独感作させた動物の腸内ＩｇＡは、Ｂ．テタイオタミクロン又はＢ．バルガトゥスからの抗原とは反応しなかった（図１１Ｄ）。増加したＴ細胞応答の知見と一致して、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた動物は、ＰＳＡを発現するＢ．フラジリスとは反対に、Ｂ．フラジリス特異的なＩｇＡの増加したレベルを示す（図１１Ｃ）。
【０１６５】
Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ定着動物中で宿主によって認識される性質及び抗原を決定するため、細菌抽出物を、ポリアクリルアミドゲル上で分離させ、Ｂ．フラジリス又はＢ．フラジリスΔＰＳＡ単独感作動物からのＩｇＡによって調べた。Ｂ．フラジリス定着動物から単離したＩｇＡは、Ｂ．テタイオタオミクロン又は大腸菌からの抗原に対しては反応性が観察されないので、種特異的である（図４Ｆ）。Ｂ．フラジリス抽出物が、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ単独感作動物から単離したＩｇＡによって検査される場合、野生型定着マウスと比較して、より多い数且つより高い強度の抗原性の種が検出された（図１０Ｃ）。更には、総ＩｇＡのレベルは、Ｂ．フラジリス又はＢ．フラジリスΔＰＳＡ定着動物の間で大きな差がなく（図１２）、このことは、Ｂ．フラジリス抗原のみに対する特異的な反応性の特異的な増加を実証する。総合すると、これらのデータは、宿主−細菌共生の間に、Ｂ．フラジリスがＰＳＡを発達させて、抗原特異的適応免疫を抑制すること、及び、ＰＳＡによって誘発されるＴｒｅｇ活性化は、Ｂ．フラジリスに特異的であることを実証する。
【０１６６】
例１０．ＰＳＡは、他の共生細菌ではなくＢ．フラジリスに対するＩｇＡ応答を阻害し、抗原特異的粘膜耐性を活発に生じさせる
単独感作試験は、免疫応答の抗原特異性を決定するのに有益である。該知見は、ＰＳＡが、Ｂ．フラジリスに対する適応免疫を抑制することを示すが、それらは、１）ＰＳＡが、特異的にＢ．フラジリス抗原への耐性を誘発し、２）ＰＳＡが、他の細菌の抗原に対して耐性のある免疫環境を誘発すると解釈することができる。これらの２つの可能性を区別するべく、動物にＢ．フラジリス及びＢ．バルガトゥスを共定着させ、同じ微生物叢に存在する両方の微生物に対するＩｇＡ応答を測定した。Ｂ．フラジリス及びＢ．バルガトゥスは、同等のレベルで動物に定着する（図１２）。Ｂ．フラジリス抗原に対する抗体レベルは、共定着の間にＰＳＡによって再度抑制されたが、ＰＳＡの存在又は非存在が、Ｂ．バルガトゥスに対するＩｇＡ反応性には効果がなかった（図１３）。無菌又はＢ．フラジリス単独感作動物から単離した溶解性の結腸内容物は、Ｂ．バルガトゥス由来の抗原と反応しないので、抗体応答は特異的である（図１３）。定量的フローサイトメトリーに基づく評価を使用して、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた動物が、Ｂ．フラジリス表面抗原に対して著しく多いＩｇＡを発生させることが確定された（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。表面抗原の位相変化のために低いレベルの結合が起こる可能性がある（リウら、２００８年）。Ｂ．バルガトゥス抗原に対する結合における差異は、野生型又はフラジリスΔＰＳＡの共定着の間には観察されず（図１２Ｂ，１２Ｃ及び１３）、このことは、ＰＳＡが、同じ微生物叢に存在する他の共生細菌の抗原に対する耐性を促進することができないことを実証する。これらの結果は、ＰＳＡが、恒常的定着の間に、内臓の一般的な寛容原性免疫環境を誘発しないことを立証する。
【０１６７】
Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇは、優勢寛容によって抑制を行う。ＰＳＡがＢ．フラジリス抗原への耐性を介在するＴｒｅｇを誘発する場合、次に野生型細菌が、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡの抗原への反応を妨げるＴｒｅｇを誘発するべきである。珍しいことに、動物が野生型及びＢ．フラジリスΔＰＳＡを同じ数保持している場合（図１１）、Ｂ．フラジリス抗原に対するＩｇＡ反応性の増加は観察されず（図１２）、このことは、ＰＳＡ産生細菌が、ＰＳＡを欠いたＢ．フラジリス細胞への反応を妨げることを示す。共定着の間のＢ．フラジリス特異的なＩｇＡのレベルは、野生型を単独定着させた動物のものと同等であり、総ＩｇＡレベルが変化しないので、特異的である（図１１）。更には、Ｂ．フラジリス抗原のＩｇＡ認識は、定量的ＦＣ評価を使用した共定着の間には増加しない（図１２Ｅ）。この証拠に基づいて、Ｂ．フラジリスによって発現したＰＳＡは、その抗原に対する優勢な耐性を媒介するが、同じ微生物叢に見出されるＢ．バルガトゥス抗原に対しては媒介しないことが結論付けられた。まとめると、当該研究は、ＰＳＡが抗原特異的粘膜耐性を活発に生じさせることを確認した。
【０１６８】
例１１．Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇは、Ｂ．フラジリスに対する適応免疫の抑制に必要である
Ｆｏｃｐ３＋Ｔｒｅｇが適応免疫反応のＰＳＡ介在性の抑制のためのメカニズムを提供することを立証すべく、Ｂ．フラジリスを定着させた後、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ４＋Ｔ細胞の特異性を除去して、Ｔｈ１７及びＩｇＡの応答を試験した。Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲマウスは、Ｆｏｘｐ３プロモータの制御下、ジフテリアトキシンレセプター（ＤＴＲ）を発現する。ジフテリアトキシン（ＤＴ）によるマウスの治療は、Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の除去をもたらし、インビボでのＴｒｅｇの機能分析を可能にする（キムら、２００７年）。これまでの知見（図１４における）と一致して、Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲによって再形成した、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた無菌動物は、野生型のＢ．フラジリスを定着させた動物と比較した場合、増加したＴｈ１７細胞を、結腸（ＬＰ）及びＭＬＮの両方に保持する（図１４Ａ及び１４Ｂ；左のパネル、−ＤＴ）。
【０１６９】
同じ組織に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞を産生するＩＦＮｇに対する効果が無かったため、この相違は、Ｔｈ１７特異的である（図１４Ｃ）。最も重要なことであるが、Ｂ．フラジリス単独感作動物におけるＴｒｅｇの除去は、結腸固有層及びＭＬＮ中でのＴｈ１７細胞を著しく増加させるが、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ動物中のＴｈ１７応答は増強しない（図１４Ｂ；右のパネル、＋ＤＴ）。ＤＴ治療の後、両方の群のマウスにおけるＩＦＮｇ産生は、ＭＬＮで増加し（図１４Ｂ）、また、Ｔｈ１７応答への特異性を示す。Ｔｈ１７細胞のレベルは、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡ定着マウスで実際に減少した。この異常な表現型については説明できないが、ＣＤ４＋ＩＬ−１７＋細胞の割合は、その後ＤＴ投与を行ったこの群だけで増加するので、結果は、野生型細菌についてＴｈ１７の特異的増加を明確に示す（図１４Ａ）。ジフテリアトキシン（＋ＤＴ）によるマウスの治療は、動物中のＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞のほぼ完全な除去を裏付ける（図１４Ａ）。従って、結腸ＬＰにおけるＩＬ−１７Ａ転写物の発現は、ＤＴ治療した動物中で著しく増加する（図１４Ｄ）。これらのデータは、ＰＳＡが、共生的定着の間にＢ．フラジリスに対するＴｈ１７応答を活発に抑制する、機能的Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを誘発することを明らかにする。
【０１７０】
最終的には、Ｔｒｅｇの存在下又は非存在下でのＢ．フラジリス特異的な抗原産生を決定した。Ｂ．フラジリス単独感作動物は、回腸及び結腸の両方でＢ．フラジリス特異的抗体を産生する（図１５）。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ除去によって、Ｂ．フラジリス特異的ＩｇＡは、小腸及び大腸の全体に亘って著しく増加し、結腸中で最も高い（１０倍を超える）増加を有する（図１５）。腸全体に亘ってＰＳＡ特異的及び総ＩｇＡ抗体産生の両方がＴｒｅｇの非存在によって影響されないので、これは、抗原特異的反応性における定量的増加を反映する（図１５）。まとめると、Ｂ．フラジリスが、内臓においてＴｒｅｇ細胞を誘発する免疫調節分子を産生することが示され、抗原特異的適応免反応を抑制する。これらの知見は、哺乳類が、どのように宿主−細菌片利共生の間、共生細菌分子を許容するかについて、新規な細胞機構及び分子機構を明らかにする。
【０１７１】
例１２：免疫調節カプセル状多糖類ＰＳＡは、Ｂ．フラジリスのＯＭＶに積極的に仕分けされる
ＥＤＬ強化Ｂ．フラジリスの極薄の部分は、材料と方法で記載される通りに調製され、透過型電子顕微鏡法によって撮像される。
【０１７２】
図１６に説明される結果は、ＯＭＶが細菌によって豊富に産生され、細菌のエンベロープからの発芽を確認できたことを説明する（図１７Ａ、より大きな拡大図）。出願人のこれまでの研究は、ＰＳＡの除去が、Ｂ．フラジリスの免疫調節能力を無効にすることを示している（マスマニアン、リウ、チアナボス及びカスパー（２００５年），共生細菌の免疫調節分子が、宿主の免疫系の成熟を指揮する（An Immunomodulatory Molecule of Symbiotic Bacteria Directs Maturation of the Host Immune System）、Cell 122: 1 第107-118頁.) （マスマニアン、ラウンド及びカスパー（２００８年），細菌共生因子が、腸の免疫疾患を予防する（A microbial symbiosis factor prevents intestinal inflammatory disease.）， Nature. 453 (7195) 第620-625頁）。ＰＳＡ変異株の電子顕微鏡写真は、ＯＭＶ合成の欠損を説明せず、生成したＯＭＶの大きさ、形状及び存在量は、野生型細菌と区別がつかない（図１７Ａ）。特には、図１７Ａで説明する結果は、小胞が、細菌の表面から活発に発芽していることを明らかにする。
【０１７３】
ＰＳＡが、Ｂ．フラジリスのＯＭＶと結合しているか否かを決定するべく、野生型及びΔＰＳＡ細菌から精製した小胞を、材料と方法の項で説明する通り、免疫ブロット分析に供した。
【０１７４】
図１６Ｂに説明する結果は、野生型からの小胞が、Ｂ．フラジリスＰＳＡからのＯＭＶとは異なり、ＰＳＡに対して免疫反応を示したことを示す。Ｂ．フラジリスは、ＰＳＡ−ＰＳＨと名付けられる細菌細胞の表面を被覆する少なくとも８つの別々のカプセル状の多糖類を産生する。小胞の調製においてＰＳＢもまた検出されるが、ＰＳＧは、存在せず、このことは、ＯＭＶと共にパッケージされる特定の多糖類への選択性を実証する（図１７Ｂ）。従って、図１７Ｂの結果は、ＰＳＡ及びＰＳＢが、小胞に結合しており、一方ＰＳＧのみが細胞表面に見出されることを示す。カプセル状多糖類の欠失変異体は、各々の抗血清の特異性を裏付ける。
【０１７５】
免疫ブロット分析の結果は、材料と方法の項に記載される通りに行われる免疫金標識の試験によって確認された。図１７Ｃに説明する精製した小胞の免疫金標識の結果は、ＰＳＡが、ＯＭＶと物理的に結合すること、及び、野生型Ｂ．フラジリス株のＯＭＶの大部分がＰＳＡについて陽性に染色する（データなし）ことを確認する。ＰＳＡの非存在が、ＯＭＶの分子組成を変化させないことを立証するべく、質量分析計によってプロテオーム解析を行い、野生型又はＰＳＡ変異体細菌の小胞間でタンパク質組成に主要な定性的又は定量的差異がないことを明らかにした（データなし）。
【０１７６】
ＰＳＡは、繰り返しサブユニットの異種ポリマーである。細胞抽出物全体からクロマトグラフィーによって回収したＰＳＡのサイズ分離は、材料と方法で示した細胞全体及び精製ＯＭＶのカプセル状多糖類の調製の抗ＰＳＡによって免疫ブロット分析と同様に行われた。
【０１７７】
図１６Ｄに説明される関連結果は、驚くべきことに、低分子量種のみがＯＭＶと結合することを示し、ＰＳＡの小胞中へのパッケージングの特異性を説明する。特には、図１６Ｄの結果は、細菌細胞のエンベロープに結合したままである高分子量（Ｈ−ＰＳＡ）種とは異なり、低分子量ＰＳＡ（ＬＰＳＡ）のみが、小胞にパッケージされることを示す。
【０１７８】
総合すると、上記結果は、免疫調節カプセル状多糖類ＰＳＡが、積極的にＢ．フラジリスのＯＭＶへと仕分けされることを明らかにする。
【０１７９】
例１３：ＰＳＡは、Ｔ細胞上の直接的なＴＬＲ２シグナル伝達によってＩＬ−１０産生を生じさせる
ＰＳＡは、図１７Ａ〜１７Ｄに説明する一連の実験において脾臓から精製したＣＤ４＋Ｔ細胞とともに培養した脾臓細胞又は樹状細胞由来の骨髄（ＢＭＤＣ）と接触させた。結果は、ＰＳＡがＴ細胞上のＴＬＲ２シグナル伝達によってＩＬ−１０産生を生じさせ得るという結論を裏付ける。
【０１８０】
例１４：ＰＳＡは、ＡＰＣの非存在下、ＴＬＲ２によってＴ細胞へ直接的にシグナルを伝達することができ、これはＴＬＲ１又はＴＬＲ６を必要としない
図１８Ａ及び１８Ｂに説明する実験セットにおいて、野生型（ＷＴ）ＴＬＲ１−／−、ＴＬＲ２−／−、ＴＬＲ６−／−又はＣＤ１４−／−動物から単離したＴ細胞とＰＳＡとを接触させた。結果は、ＰＳＡが、（ＡＰＣの非存在下）Ｔ細胞を直接刺激し、ＩＬ−１０を誘発し得ることを示す。ＰＳＡによるＩＬ−１０の誘発は、ＴＬＲ２を必要とするが、ＴＬＲ１もＴＬＲ６も必要としない。ＴＬＲ２は、ホモ二量体としては作用せず、ＴＬＲ１及びＴＬＲ６とヘテロ二量化することが知られているため、このことは、ＰＳＡがＴＬＲ２によってＩＬ−１０を誘発するように特異的に作用していることを示す。
【０１８１】
ＰＳＡを、図１８に説明する実験セットにおいて、ＷＴ、ＴＬＲ−／−、ＴＬＲ２−／−、ＴＬＲ６−／−及びＣＤ１４−／−動物のＢＭＤＣ、並びに、ＷＴマウスの精製ＣＤ４＋細胞とも接触させた。結果は、実験条件下、ＩＬ−１０産生を生じさせる精製ＰＳＡの能力が、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２又はＴＬＲ６による樹状細胞上のシグナル伝達に依存しないことを示す。しかしながら、これらの結果に従うと、ＩＦＮ−γ産生は、樹状細胞上のＴＬＲ１及びＴＬＲ２両方のシグナル伝達を必要とする。
【０１８２】
例１５：ＰＳＡは、独特なＴＬＲ２リガンドである
ＰＳＡ、ＴＬＲ１／ＴＬＲ２リガンドＰＡＭ３ＣｙｓＫ及びＴＬＲ２／６リガンドＦＳＬ１を、図１９に説明する実験セットにおいてＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−細胞と接触させた。結果は、ＰＳＡが、非Ｔｒｅｇ細胞を直接刺激してＩＬ−１０を産生し得ることを示す。ＰＡＭ３ＣｙｓＫのような他のＴＬＲ２リガンドは、この同じ集団の非Ｔｒｅｇ細胞からＩＬ−１０産生を誘発しないので、非常に独特である。更には、他のＴＬＲ２リガンドが、Ｔ細胞によってＩＦＮ−γ産生を実際に抑制し、Ｔ細胞を活性化するＰＳＡの独特の能力を更に示す。
【０１８３】
ＴＬＲ２リガンド、ＰＳＡ、ＰＡＭ３ＣｙｓＫ又はＦＳＬ１は、図２０で説明する実験セットでＣＤ４＋Ｔ細胞と接触させた。ＰＳＡは、他の既知のＴＬＲ２リガンドと比較して、ＡＰＣの非存在下、Ｔ細胞からより多くのＩＬ−１０産生を生じさせることを示す。
【０１８４】
図２０に説明する実験セットにおいて、ＰＳＡを、ＷＴ又はＴＬＲ２−／−動物のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞と接触させた。結果は、ＰＳＡによる、非Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ−１０の誘発が、Ｔ細胞上のＴＬＲ２シグナル伝達に依存することを示す。
【０１８５】
例１６：ＰＳＡは、Ｔｒｅｇを直接的に誘発し、ＩＬ−１０を生産させ、インビトロ培養でのＴｒｅｇの生存を増強することができる
図２１に説明する実験セットにおいて、ＣＤ４＋Ｆｏｘ３Ｔ細胞を、ＴＧＦ−βの存在下、抗ＣＤ−３によって刺激し、ＰＳＡ有り及び無しでインキュベートした。結果は、ＰＳＡが直接的に、ＴｒｅｇにＩＬ−１０の遺伝子発現を誘発させることができることを示す。
【０１８６】
ＣＤ４＋Ｆｏｘ３＋Ｔ細胞を、ＢＭＣＤによってインキュベートし、培養物を、図２１で説明する実験セットで抗ＣＤ３及びＴＧＦ−βにより刺激した。結果は、ＰＳＡが、Ｔ制御性細胞をインビトロで発現するＦｏｘｐ３の生存又は増殖を増強させ得ることを示す。
【０１８７】
例１３〜１６で説明する結果は、１）ＰＳＡが、Ｔ細胞中のＴＬＲ２に作用し、ＩＦＮｙγではなくＩＬ−１０を誘発する、２）ＰＳＡが、ＩＬ−１０産生にＴ細胞上でＴＬＲ１又はＴＬＲ６を必要としない、３）ＰＳＡが、Ｔ細胞に直接的に作用し、ＩＬ−１０を誘発することができ（ＡＰＣは必要ない）、ＰＳＡは他のＴＬＲ２リガンドとは異なる様式で作用するようである（２及び３は、トールリガンドとして、ＰＳＡの独特の性質を際立たせるのに重要である）、４）ＩＬ−１０をＴ細胞上で直接的に誘発するＰＳＡの能力は、ＴＬＲ２に依存する、５）１つの実験が、ＰＳＡがインビトロで高いレベルで変換され得る（％及び絶対数の両方で）、６）ＰＳＡは、精製ＴｒｅｇからもＩＬ−１０を誘発することができ、ｃｄ４ｆｏｘｐ３の多い集団を維持／拡大するようである、という結論を裏付ける。
【０１８８】
バクテロイデスフラジリスは、宿主の免疫を調節し、それ自体の抗原に対する炎症反応を抑制することのできる細菌分子を産生することによって、宿主耐性をもたらす。Ｂ．フラジリスの多糖類Ａ（ＰＳＡ）は、機能的に抑制性のＦｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞において、特異的な遺伝子発現プロファイルを誘発し、寛容原性の免疫環境の確立を調整する。最も注目すべきは、Ｂ．フラジリスΔＰＳＡを定着させた動物から回収した宿主細胞は、Ｂ．フラジリスに対してより反応性が高いが、他の（密接に関連した）共生細菌に対してはそうではないことである。これらのデータは、宿主免疫系が、Ｂ．フラジリスの存在を無視するわけではなく、むしろＰＳＡがこれらの炎症反応を活発に抑制していることを実証する。共生細菌は、免疫学的に無視されず、炎症の誘発は、在外微生物（共生的及び病原性の双方）に対するデフォルトの応答であると考えられる。病原体によって採用される毒性因子とよく似ているが、共生細菌は、共生因子を発達させ、免疫系をプログラミングし、内臓定着の間に抗原特異的応答を阻害することにより、宿主免疫を制御すると考えられる。ＰＳＡが実験的結腸炎から動物を保護するので、病原体とは反対に、Ｂ．フラジリスによる定着は実際に、宿主の健康に有益な結果をもたらす（２６）。従って、Ｂ．フラジリスは、それ自体の耐性を積極的に誘発するだけでなく、生存のために定着する適所の完全性も保存する。
【０１８９】
先に示した例は、Ｔｒｅｇの実施形態の製造及び使用方法に関する完全な開示及び説明、並びに、本開示のシステム及び方法を当業者に提供するために示され、発明者らが開示とみなす範囲を制限することを意図しない。開示を実施するために先に説明した様式の変更は、当業者に明らかであり、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本明細書で述べた特許及び公開公報の全ては、本開示が属する分野の当業者の技術水準を示す。本開示において言及される全ての参考文献は、各々の参考文献の全体が引用によって個別に組み込まれているのと同じレベルで、引用によって組み込まれる。
【０１９０】
背景技術、要約、詳細な説明及び実施例において言及される各々の文献（特許、特許出願、学術論文、摘要、実習手引書、書籍又は他の開示を含む）の全体的開示は、引用により本明細書に組み込まれる。更には、本明細書に添付して提出される配列表のハードコピー及びコンピュータ可読の対応する形態はどちらも、その全体を引用によって本明細書に組み込まれる。
【０１９１】
本開示は、特定の組成物又は生物系に限定されるものではなく、当然のことながら変化するものと理解される。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的とすると解釈され、限定するこことを意図しない。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１（ａ）」，「１（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」には、内容が明確に反対の意味を指示しない限り、複数の指示対象が含まれる。「複数」の語には、内容が明確に反対の意味を指示しない限り、２以上の指示対象が含まれる。特に示さない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する分野の一当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
【０１９２】
本明細書で説明されるのと同様又は同等の任意の方法及び材料を、具体的な実施例の試験の実施に使用することができるが、適当な材料及び方法が本明細書で記載される。
【０１９３】
本開示に関する多数の実施形態が説明される。それにもかかわらず、本開示の精神及び範囲を逸脱することなく種々の変更が行われてもよいことが理解される。従って、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０１９４】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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