(57)【要約】  本発明は、異種遺伝子発現により１つ以上の多価不飽和脂肪酸を生産するためのプロセスであって、エノイルレダクターゼをコードする部分配列ＥＲと、アシルトランスフェラーゼをコードする部分配列ＡＴとを含む多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする異種遺伝子集団を含む生産生物体を提供するステップと、発酵性炭素源の存在下において前記生産生物体を成長させて１つ以上の多価不飽和脂肪酸を生産するするステップとを含み、任意に、前記１つ以上の多価不飽和脂肪酸を回収するステップを含むプロセスに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生産生物体における多価不飽和脂肪酸の生合成経路酵素の異種遺伝子発現により多価不飽和脂肪酸を生産するためのプロセスであり、前記生産生物体は、多価不飽和脂肪酸の合成のための前記生合成経路酵素をコードし、発酵性炭素源の存在下において前記生産生物体を成長させる遺伝子集団を含むように遺伝子操作されており、前記遺伝子集団は、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）をコードするドメインと、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）をコードするドメインとを含む、プロセスであって、
前記遺伝子集団によってコードされた前記アシルトランスフェラーゼは、配列番号３０もしくは３１、配列番号６１もしくは６２、配列番号９５もしくは９６、配列番号１２９もしくは１３０、配列番号１３５もしくは１３６、および／または配列番号１６９もしくは１７０を含む群に含まれる、ドメインＩＶ＊によってコードされたアミノ酸配列、ならびに、配列番号２９、配列番号６０、配列番号９４、配列番号１２８、配列番号１３４、および／または配列番号１６８を含む群に含まれる核酸配列部分によってコードされたアミノ酸配列に対して、少なくとも２２％のアミノ酸配列同一性を有するアシルグリセロールホスファートアシルトランスフェラーゼ（ＡＧＰＡＴ）であることを特徴とするプロセス。
【請求項２】
請求項１に記載のプロセスにおいて、
前記ドメインＩＶ＊は、配列番号１０および／または配列番号４１、配列番号７２、配列番号１０６、および／または配列番号１４６を含む群に含まれるアミノ酸配列に対して少なくとも２８％のアミノ酸配列同一性を有するＰｆａ３遺伝子生産物をコードする核酸配列に含まれることを特徴とするプロセス。
【請求項３】
請求項１または２に記載のプロセスにおいて、前記遺伝子集団は、
ｐｆａ１遺伝子において、５’から３’に、
−配列番号１３、配列番号４４、配列番号７５、配列番号１０９、配列番号１３３、および／または配列番号１４９を含む群のアミノ酸配列に対して少なくとも５９％のアミノ酸配列同一性を有するエノイルレダクターゼをコードするドメインＩを含み、
−ｐｆａ２遺伝子において、５’から３’に、配列番号１６、配列番号４７、配列番号７８、および／または配列番号１１２を含む群のアミノ酸配列に対して少なくとも５７％のアミノ酸配列同一性を有するケトシンターゼおよびマロニル−ＣｏＡ−トランスアシラーゼをコードするドメインＩＩａ、
−配列番号１９、配列番号５０、配列番号８１、配列番号１１５、および／または配列番号１５５を含む群のアミノ酸配列に対して少なくとも２６％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも１つのアシルキャリアタンパク質をコードするドメインＩＩｂ、
−配列番号２２、配列番号５３、配列番号８４、配列番号１１８、および／または配列番号１５８を含む群のアミノ酸配列に対して少なくとも４７％のアミノ酸配列同一性を有するケトレダクターゼおよびデヒドラターゼをコードするドメインＩＩｃを含み、
−ｐｆａ３遺伝子において、５’から３’に、配列番号２５、配列番号５６、配列番号８７、配列番号１２１、および／または配列番号１６１を含む群のアミノ酸配列に対して少なくとも４６％のアミノ酸配列同一性を有するケトシンターゼおよび鎖伸長因子をコードするドメインＩＩＩａ、
−配列番号２８、配列番号５９、配列番号９０、配列番号１２４、および／または配列番号１６４を含む群のアミノ酸配列に対して少なくとも４２％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも１つのデヒドラターゼをコードするドメインＩＩＩｂを含み、および
−前記ドメインＩＶ＊を含むことを特徴とするプロセス。
【請求項４】
請求項３に記載のプロセスにおいて、
前記遺伝子集団は、配列番号９３、配列番号１２７、および／または配列番号１６７を含む群のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）をコードするドメインＩＶを含み、
前記ドメインＩＶは、ドメインＩＩＩａとＩＩＩｂとの間に配置されていることを特徴とするプロセス。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロセスにおいて、
前記遺伝子集団は、配列番号６、配列番号３７、配列番号６８、配列番号１０２、配列番号１３２、および／または配列番号１４２を含む群のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％のアミノ酸配列同一性を有する前記エノイルレダクターゼをコードするｐｆａ１遺伝子を含むことを特徴とするプロセス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロセスにおいて、
前記遺伝子集団は、配列番号８、配列番号３９、配列番号７０、配列番号１０４、および／または配列番号１４４を含む群のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％のアミノ酸配列同一性を有するケトシンターゼ、マロニル−ＣｏＡ−トランスアシラーゼ、アシルキャリアタンパク質、ケトレダクターゼ、およびデヒドラターゼをコードするｐｆａ２遺伝子を含むことを特徴とするプロセス。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロセスにおいて、
前記遺伝子集団は、配列番号１０、配列番号４１、配列番号７２、配列番号１０６、および／または配列番号１４６を含む群のアミノ酸配列に対して少なくとも２８％のアミノ酸配列同一性を有するケトシンターゼ、鎖伸長因子、デヒドラターゼ、および前記アシルグリセロールホスファートアシルトランスフェラーゼ（ＡＧＰＡＴ）をコードするｐｆａ３遺伝子を含むことを特徴とするプロセス。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロセスにおいて、
前記遺伝子集団は、配列番号１、配列番号３２、配列番号６３、配列番号９７、配列番号１３７からなる群のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、および／または配列番号１３１の遺伝子Ｉから配列番号１３４を有するドメインＩＶ＊まで伸長し、配列番号６３によって、配列番号９７によってコードされた前記アミノ酸配列の１つ以上に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＳＭ２３１２２のゲノムＤＮＡに対して、および／または配列番号１３７によってコードされた前記アミノ酸配列に対して少なくとも３０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするプロセス。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロセスにおいて、
前記アミノ酸配列同一性は、少なくとも６０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であることを特徴とするプロセス。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロセスにおいて、
前記発酵性炭素源には脂肪酸が無いことを特徴とするプロセス。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロセスにおいて、
前記多価不飽和脂肪酸は、少なくとも３つのエチレン性不飽和基を含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプロセスにおいて、
前記生産生物体は、ガンマ陰性真正細菌、ガンマ陽性真正細菌、粘液細菌、菌類、およびイーストからなる群より選択されることを特徴とするプロセス。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプロセスにおいて、
１つの多価不飽和脂肪酸は、前記組成に含まれる全ての多価不飽和脂肪酸の総重量に基づいて、少なくとも４０ｗｔ％存在することを特徴とするプロセス。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のプロセスにおいて、
前記多価不飽和脂肪酸は、エイコサペンタン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサン酸（ＤＨＡ）、γ−リノレン酸、および／またはリノレン酸であることを特徴とするプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、好ましくはオメガ−３多価不飽和脂肪酸を、ＰＵＦＡ生合成経路をコードする遺伝子集団の異種発現によって、特定の粘液細菌株を起源として生産するための方法を提供する。これらの固有遺伝子集団は、異種発現による、ＰＵＦＡ、特にオメガ−３ＰＵＦＡの増量した生産のために、クローン化され、広範囲の適切な生物体に組み込まれ得る。
【背景技術】
【０００２】
長鎖多価不飽和脂肪酸は、ω−３（「オメガ−３」）ＰＵＦＡとしても知られるオメガ−３ファミリーの長鎖多価不飽和脂肪酸を含めて、天然の興味深い脂肪酸である。これらは、膜の剛性を減少させる役割を有するリン脂質の重要な構成成分である。エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は、ヒトの脳のリン脂質の主要な構成成分であり、プロスタグランジンおよびレゾルビンの前駆体として機能を果たす。オメガ−３ファミリーの別の重要なＰＵＦＡは、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である。幼児の発達における認識および行動機能の向上は、この化合物の高いレベルと相関すると考えられる。オメガ−３ＰＵＦＡ、特にＤＨＡおよびＥＰＡについて、有益な健康効果は、例えば癌、関節リウマチ、心血管疾患の予防、免疫機能の改善、ならびに目および脳の健康である（Teale, MC (ed.)2006, "Omega-3 fatty acid research", Nova Science Publishers. NewYork, およびその参考文献）。これらの有益な特性により、オメガ−３ＰＵＦＡは、健康および食品サプリメント中の栄養脂質として、および、広範囲の食物における機能性成分として広範に用いられている。オメガ−３ＰＵＦＡは、現在、食物および飲料工業部門の最も大きくそして最も強力に成長している市場の部分の１つを構成し、過去何年にも亘って需要が実質的に増加している。今日では、魚油が最も豊富で広く用いられているオメガ−３脂肪酸の天然の供給源であるが、有名な供給源は、乱獲、ＤＨＡ／ＥＰＡを十分に含む高い等級の油の供給の欠如、および品質の問題（におい、処方の困難など）に苦慮している。藻類および卵菌類を生産生物として含む代替プロセスが確立されているかまたは開発中である（Hinzpeter, Grasas y Aceites (2006) 57:336-342;Ward, Process Biochemistry (2005) 40:3627-3652）。高品質の魚油の供給が漸増的に制限されているので、代替の持続可能な生物学的供給源を見出すことが試みられた。２０年間に亘って種々の群の海藻が探索され、藻類のバイオマスに基づくいくつかの生産物が、この間、市場に参入している。ストラメノパイルの群（「黄色植物門」としても知られていた藻類様真核生物の群）に属するいくつかの卵菌類も、上記の化合物を生産すると時折報告されている（例えば、ワタカビ属およびフハイカビ属のもの；（Aki, J. Ferm. Bioeng.(1998) 86:504-507; Cheng, Biores. Technol. (1999) 67:101-110; Athalye, J. Agric. Food Chem. (2009)57:2739-2744）。他のストラメノパイル（例えば、シゾキトリウム属およびトロウストチトリウム属；例えば米国特許第７０２２５１２号明細書および国際公開第２００７／０６８９９７号に記載）において、および渦鞭毛藻のアンフィディニウムの種（米国特許出願公開第２００６／００９９６９４号明細書）において、ＤＨＡは、細胞の脂肪酸含量の４８％までに相当でき、これは、真核生物において現在までに知られている最高の含量である。しかし、工業規模でのこれらの生物の培養は、開発から数年が経過してもまだ課題を有する。現在までに見出されたオメガ−３ＰＵＦＡのその他の代替の生物学的供給源は、原核生物の真正細菌である［Nichols, Curr. Opin.Biotechnol. (1999)10:240-246; Gentile, J. Appl. Microbiol. (2003) 95: 1124-1133］。しかし、工業的規模でのＰＵＦＡ生産のためのこれらの生物の商業的な活用は、これらの好冷微生物の成長遅滞という特徴、ならびにこ���らの元来の低い収率および生産性により、妨げられている。適切な、商業的な生物体におけるオメガ−３ＰＵＦＡ遺伝子集団の異種発現は、商業規模での所望のオメガ−３−ＰＵＦＡの生産の有効な代替となり、このことは、野生株を用いる生産プロセスの多種多様な利点を有している。オメガ−３−ＰＵＦＡＳは、原核生物の生物体および真核性の生物体の両方においてポリケチド二次代謝産物と同様の方法で生合成され（Metz, Science (2001) 293:290-293による概要を参照）、これにより、抗生剤および抗癌剤の生産を向上および変更するために微生物バイオテクノロジーにおいて確立されているのと同様の方法技術の利用が可能になるということが長い間確立されている。粘液細菌について、二次代謝産物生合成の評価に関するこのような作業は、最近の評論に記載され概説されている（Wenzel, Curr. Opin.Biotechnol. (2005), 16: 594-606; Wenzel, Curr. Opin. Drug Discov. & Develop. (2009), 12 (2): 220-230; Wenzel,Nat. Prod. Rep. (2009), 26 (11): 1385-1407）。
【０００３】
遺伝子集団におけるＰＵＦＡ遺伝子の構成は、遺伝子集団のクローン化と、異種宿主への転移とを可能にする。該異種宿主は、それ自体、原核生物の生物体、または、真核性の生物体であり得る。
【０００４】
オメガ−３ＰＵＦＡの生合成のための合成経路酵素をコードする遺伝子集団は、モリテーラ属（Tanaka, Biotechnol. Lett.(1999) 21 :641-646; Morita, Biochem Soc Trans 28:943-945 (2000)）、フォトバクテリウム属（Allen, Microbiology (2002) 148: 1903-1913）、およびシュワネラ属（Lee, J. Microbiol. Biotechnol.(2009) 19:881-887）の種を含む、様々な海洋細菌から知られている。このような細菌性オメガ−３ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団は、大腸菌に既に転移され、大腸菌において発現された（Lee, Biotechnol. Bioproc.Engin. (2006) 11 :510-515; Orikasa,Biotechnol. Lett. (2006)28: 1841-1847; Orikasa, Biotechnol.Lett. (2007) 29:803-812）。さらに、異種ＥＰＡ生産は、生合成遺伝子集団内のプロモータ配列の置換によって増進された（Lee, Biotechnol. Lett.(2008) 30:2139-2142）。シュワネラｓｐ．からのＥＰＡ遺伝子集団も、シネココックス属のトランスジェニック海洋性藍色細菌において発現され（Takeyama, Microbiology (1997) 143 (Pt8):2725-2731. Orikasa, Biotechnol.Lett. (2007) 29, 803-809）、高性能カタラーゼ遺伝子を含む外来性ＤＮＡ断片およびＥＰＡ生合成遺伝子を共発現する大腸菌細胞においてＥＰＡの増進した異種生産を観察した。ＥＰＡの収率は、全脂肪酸含有量の３％から１２％へ上昇した。Ｊｉａｎｇ（Methods in Enzymology (2009) 459, 80-96）は、多価不飽和脂肪酸シンターゼにおける重要なタンデムアシルキャリアタンパク質ドメインの特性評価について、大腸菌における遺伝子それぞれの異種発現を含むいくつかの他の研究も説明して、これまでの研究をまとめた。これらの例は、このような技術に基づく市販の生産品はこれまでのところもたらされていないにしても、細菌性オメガ−３ＰＵＦＡ遺伝子の異種生産を成し遂げることが実現可能であるということを示した。粘液細菌性オメガ−３ＰＵＦＡ遺伝子集団は、未だかつて同定されておらず、それゆえ、異種発現されていない。粘液細菌性天然生産物の生合成経路は、プチダ菌を含む種々の異種宿主における発現に成功している（Gross, Chem. Biol, (2006) 13: 1253-1264;Wenzel, Chem. Biol. (2005) 12 (3): 349-356）。
【０００５】
これらの生産品は商業的に非常に重要性があるため、トランスジェニック導入植物および菌類において種々の真核性の生物体および原核生物の生物体からのオメガ−３ＰＵＦＡの生合成に包含される遺伝子の異種発現の実現可能性について種々の例がある。Ｄｏｍｅｒｇｕｅ（Plant Physiol. (2003) 131, 1648-1660）およびストラメノパイル藻、フェオダクチラム・トリコルヌツム（Phaeodactylum tricornutum）の脂肪酸生合成遺伝子により例示されるように、実験室において培養することが簡単ではないある種の海洋生物供給源の生合成の解明さえ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）または他のイーストにおけるそれらの異種発現を多くの場合は包含していた。Ｃｉｐａｋ（Free Radic. Biol. & Med. (2006) 40,897 - 906）は、Ｓ．セレビシエにおいてもゴムノキであるパラゴムノキ（Hevea brasiliensis）からデサチュラーゼ遺伝子を発現させた。Ｔｏｎｏｎ（2005, Plant Physiol. 138, 402-408）は、同じ宿主を使用して、珪藻、タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）におけるゲノム採掘から見出されたアシルコエンザイムＡ（アシル−ＣｏＡ）シンセターゼを発現させ特性評価した。Ｈｓｉａｏ（2007, Mar. Biotechnol. 9,154-165）もＳ．セレビシエを、海洋微細藻類であるグロッソマスチキス・クリソプラスタ（Glossomastix chrysoplasta）からのデルタ−６デサチュラーゼの異種発現および機能的特性評価ための宿主として使用した。Ｌｅｅ（2008, Biotechnol. Bioproc.Engin., 13, 524-532）は、イーストであるピキア・パストリス（Pichia pastoris）における異種発現によりストラメノパイル、トラウストチトリウム・オーレウム（Thraustochytrium aureum）からのオメガ−３ＰＵＦＡ生合成における重大な酵素であるデルタ−９エロンガーゼの活性の実証に成功している。Ｌｉ（Biotechnol. Lett., 31, 1011-1017）は、異種宿主としてピキア・パストリスにおいて藻であるフェオダクチラム・トリコルヌツムから脂肪酸デサチュラーゼおよびエロンガーゼをコードする遺伝子のコピー数を増やすことによるアラキドン酸およびエイコサペンタエン酸生産の向上を報告した。しかし、ピキア・パストリスの総脂肪酸含有量のそれぞれ０．１％および０．１％のＰＵＦＡという相対的に低い割合しか得られなかった。後者のイーストは、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ハンセヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）、ならびに他のメチロトローフのおよび／または疎水性のイーストと同様、ＰＵＦＡの生産に理想的と思われる。なぜなら、これらは、十分に確立された工業的過程の生産生物体であるからである（Banlar, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2009) 84,47-865; Silva, J. Food, Agric. & Environment. 2009, 7, 268.273）。また、特に好ましい生産生物体であり、高脂溶性環境において成長可能である疎水性イーストは、非常に多量の脂質を蓄積する可能性があり、基質として広範囲の炭化水素を使用することができる。工業微生物学およびバイオテクノロジーにおけるイースト状菌類の他の応用は、Ｐｏｒｒｏ（2005, Mol. Biotechnol. 31, 245-259）およびＩｄｉｒｉｓ（2010, Appl. Microbiol. Biotechnol.86:403-417）によりまとめられている。
【０００６】
Ｇｒａｈａｍら（Curr. Opin. Biotechnol. (2007) 18 (2),142-147）は、オメガ−３ＰＵＦＡの生合成のためのトランスジェニック導入植物の代謝工学の従来技術をまとめている。彼らは、特に、オメガ−３ＰＵＦＡの含有量が高い油料種子作物の合理的設計における最近の進歩を強調しているが、脂肪種子または他の種子植物を用いることによるＰＵＦＡのための競合生産プロセスの開発をこれまで阻害していた、これまでに観察された先天的な低い収率の原因かもしれないいくつかの要因についても考察している。Ｔａｙｌｏｒ（Plant Biotechnol. J. (2009) 7, 925-938）は、最近、カルダミン・グラエカ（Cardamine graeca）から３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを同定し、クローン化し、結果としてＰＵＦＡ、ネルボン酸の生産率が上昇したアブラナ属脂肪種子におけるその異種発現を報告し、そして、異種宿主におけるネルボン酸の１５倍の増加を報告している。しかし、ネルボン酸は、オメガ−３というよりはむしろオメガ−９のＰＵＦＡであり、ＤＨＡおよびＥＰＡの商業的重要性にまったく達していない。そのうえ、ネルボン酸は、実際にはオレイン酸のエロンゲーションから由来している。
【０００７】
Ｌｅｅら（Biotech. Bioproc. Eng. (2006) 11,510-515）は、大腸菌におけるＥＰＡ生産のためのシュワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）ＭＲ−１からの推定上のポリケチドシンセターゼ遺伝子集団の異種発現を説明している。該遺伝子集団は、所与のヌクレオチド配列を有する、プライマー対を用いる長いＰＣＲにより、且つ、ＢｇｌＩＩおよびＮｄｅＩにより生成された制限断片のサイズで得られる２０．１９５ｋｂのＤＮＡ断片としてのみ同定されている。
【０００８】
Ｏｒｉｋａｓａら（Biotechnol. Lett. (2006) 28,1841-1847）は、モリテーラ・マリーナ（Moritella marina）ＭＰ−１から遺伝子集団の発現による大腸菌におけるＤＨＡの合成を説明している。
【０００９】
Ｓｃｈｎｅｉｋｅｒら（naturebiotechnology (2007) 25, 1281-1289）は、ソランギウム・セルロサム（Sorangium cellulosum）の完全ゲノムのシーケンシングを説明し、単一複合抗生物質の合成に包含されるポリケチドシンセターゼ遺伝子集団を同定している。ミクソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）ゲノムとの比較により、グローバルシンテニーの欠如が明らかになった。
【００１０】
Ｄｉｃｋｓｃｈａｔら（Org. Biomol. Chem. (2005) 3, 2824-2831）は、ＧＣ−ＭＳを用いるスチグマテラ・オーランチアカ（Stigmatella aurantiaca）の脂肪酸プロファイルの解析、および、生合成の合成段階を説明している。
【００１１】
ＰＵＦＡ、特に、３つ、または４つ以上の二重結合を含むＰＵＦＡを生産するための方法であって、前駆体として同じく機能する他の脂肪酸を変更、例えば、エロンゲートするのではなくむしろデノボでＰＵＦＡを生合成する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、ＰＵＦＡを生産するための方法であって、従来技術の方法と比較して利点を有する方法、好ましくは、関連の合成経路酵素を発現する宿主微生物の発酵を用いる生産プロセスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記目的を、請求項に記載の生産プロセスにより、特に、ＰＵＦＡの合成のための合成経路酵素をコードするＤＮＡ配列、異種発現のためにこれらのＤＮＡ配列を包含するように遺伝子操作された微生物、および、ＰＵＦＡの合成のための合成経路酵素をコードするＤＮＡ配列を包含するように遺伝子操作された微生物を、異種遺伝子発現のために培養することにより１つ以上の多価不飽和脂肪酸を生産するためのプロセスを提供することにより達成され、該プロセスは、好ましくは、
（ｉ）多価不飽和脂肪酸の生合成経路をコードする遺伝子集団を含む生産生物体を提供するステップであって、該遺伝子集団は、生産生物体とは異なる供給源生物体から由来しており；エノイルレダクターゼをコードする部分配列ＥＲとアシルトランスフェラーゼをコードする部分配列ＡＴとを包含し、該部分配列ＡＴは、部分配列ＥＲの下流に位置しているステップと、
（ｉｉ）発酵性炭素源の存在下で（ｉ）の生産生物体を成長（培養とも呼ばれる）させて１つ以上の多価不飽和脂肪酸を生産するステップとを含み、
（ｉｉｉ）発酵液および／または生産生物体から、前記１つ以上の多価不飽和脂肪酸を回収、好ましくは複数の多価不飽和脂肪酸に単離するステップを任意に含む。
【００１４】
発明者らは、驚くべきことに、例えば、遺伝子ｐｆａ１、ｐｆａ２、およびｐｆａ３をそれぞれ包含し、それゆえ、対応するタンパク質Ｐｆａ１、Ｐｆａ２、およびＰｆａ３をコードする、ソランギウム・セルロサムおよびエーテロバクター・ファスキクラタス（Aetherobacter fasciculatus）から由来の粘液細菌性ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団を、ＰＵＦＡの生産において有利に使用できる、ということを見出した。生合成遺伝子座の解析は、生合成タンパク質における遺伝子の配列、および、触媒ドメインの構成が、種々の他の生物体からのＰＵＦＡ遺伝子集団の公開された配列とは著しく異なっている、ということを示す。本発明の目的のためには、アミノ酸配列、ペプチド、タンパク質、およびこれらの１つの切片という用語を交換可能に使用することができる。核酸配列によりコードされたアミノ酸配列の機能への言及は、コード化核酸配列への言及を含むことができ、そしてさらに、ドメインの触媒機能への言及は、触媒機能を有するペプチド切片をコードする核酸配列切片への言及としてとらえることができ、この核酸配列切片を、核酸ドメインとも称することができる。ドメインと呼ばれるそれらの配列および切片は、例えばそれらの触媒機能に従って指定される１つ以上の触媒中心または触媒ドメインを含み得る。配列同一性および類似性は、本明細書において説明されるようなClustalWまたはGeneiousアルゴリズムにより決定されるとおりであることが好ましい。遺伝コードの普遍性により、ドメインをコードする核酸配列は、該ドメインのアミノ酸配列により決定され、この場合、該核酸配列は、宿主微生物のコドン利用またはコドン・バイアスを有していることが好ましく、該宿主微生物は、遺伝子操作されて、ＰＵＦＡ合成酵素遺伝子集団をコードする異種遺伝子、例えば、遺伝子集団をコードし、宿主微生物のコドン利用を有する核酸配列を含んでいる。
【００１５】
一般的に好ましくは、遺伝子ｐｆａ１は、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）をコードするヌクレオチド配列を包含するドメインＩを有し、遺伝子ｐｆａ２は、ケトシンターゼドメイン（ＫＳ）をコードし、且つ、マロニル−ＣｏＡ−トランスアシラーゼドメイン（ＭＡＴ）をコードする、ヌクレオチド配列を包含するドメインＩＩａと、少なくとも１つ、好ましくは３つ、４つ、または５つのアシルキャリアタンパク質ドメイン（ＡＣＰ）をコードするヌクレオチド配列を包含するドメインＩＩｂと、ケトレダクターゼドメイン（ＫＲ）をコードし、且つ、デヒドラターゼドメイン（ＤＨ）をコードするヌクレオチド配列を包含するドメインＩＩｃとを有し、遺伝子ｐｆａ３は、ケトシンターゼドメイン（ＫＳ）をコードし、且つ、鎖伸長因子ドメイン（ＣＬＦ）をコードするヌクレオチド配列を包含するドメインＩＩＩａと、１つ、好ましくは２つのデヒドラターゼドメイン（ＤＨ）をコードするヌクレオチド配列を包含するドメインＩＩＩｂと、アシルグリセロールホスファートアシルトランスフェラーゼ（ＡＧＰＡＴ）をコードするヌクレオチド配列を包含するドメインＩＶ＊とを有し、この場合、これらのドメインは、それぞれの遺伝子の５’から３’に配置されていることが好ましい。エーテロバクターの合成遺伝子集団において、領域ＩＩＩａと領域ＩＩＩｂとの間に、アシルトランスフェラーゼをコードしているドメインＩＶが見出されている。したがって、アシルトランスフェラーゼドメイン（ＡＴ）をコードするヌクレオチド配列を包含する任意のドメインＩＶは、遺伝子ｐｆａ３においてドメインＩＩＩａとドメインＩＩＩｂとの間に、特に、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡの生産のために配置されている。遺伝子集団、例えば、好ましくはｐｆａ３に包含されるドメインＩＶ＊によってコードされるアシルグリセロールホスファートアシルトランスフェラーゼ（ＡＧＰＡＴ）は、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）の特定の形態である。
【００１６】
一般的に、ドメインＩは、配列番号１２もしくは１３、配列番号４３もしくは４４、配列番号７４もしくは７５、配列番号１０８もしくは１０９、配列番号１３２もしくは１３３、および／または配列番号１４８もしくは１４９の１つに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし；
ドメインＩＩａは、配列番号１５もしくは１６、配列番号４６もしくは４７、配列番号７７もしくは７８、配列番号１１１もしくは１１２、および／または配列番号１５１もしくは１５２の１つに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし；
ドメインＩＩｂは、配列番号１８もしくは１９、配列番号４９もしくは５０、配列番号８０もしくは８１、配列番号１１４もしくは１１５、および／または配列番号１５４もしくは１５５の１つに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし；
ドメインＩＩｃは、配列番号２１もしくは２２、配列番号５２もしくは５３、配列番号８３もしくは８４、配列番号１１７もしくは１１８、および／または配列番号１５７もしくは１５８の１つに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし；
ドメインＩＩＩａは、配列番号２４もしくは２５、配列番号５５もしくは５６、配列番号８６もしくは８７、配列番号１２０もしくは１２１、および／または配列番号１６０もしくは１６１の１つに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードし；
ドメインＩＩＩｂは、配列番号２７もしくは２８、配列番号５８もしくは５９、配列番号８９もしくは９０、配列番号１２３もしくは１２４、および／または配列番号１６３もしくは１６４の１つに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
【００１７】
任意のドメインＩＶは、配列番号９２もしくは９３、配列番号１２６もしくは１２７、および／または配列番号１６６もしくは１６７の１つに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
【００１８】
遺伝子、領域、および／またはドメインの各々は、本明細書に記載のような各ドメインについてアミノ酸配列の１つ以上に対して少なくとも６０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、そして好ましくは少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、または、本明細書に記載のような各ドメインについて核酸配列によりコードされることが好ましい。
【００１９】
ドメインＩＶ＊は、ドメインＩＶ＊について所定のアミノ酸配列の１つ、例えば、配列番号３０もしくは３１、配列番号６１もしくは６２を含むもしくはこれらからなる群に含まれるドメインＩＶ＊アミノ酸配列に対して、ならびに／または配列番号９５もしくは９６、配列番号１２９もしくは１３０、配列番号１３５もしくは１３６、および／もしくは配列番号１６９もしくは１７０を含むもしくはこれらからなる群に含まれるドメインＩＶ＊アミノ酸配列に対して、少なくとも２．５％、好ましくは少なくとも２２％もしくは２４％、より好ましくは少なくとも５０％、７５％、もしくは少なくとも８４％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％、もしくは少なくとも９７％もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、または、ドメインＩＶ＊をコードする核酸配列切片、例えば、配列番号２９、配列番号６０を含むもしくはこれらからなる群、ならびに／または配列番号９４、配列番号１２８、配列番号１３４、および／もしくは配列番号１６８を含むもしくはこれらからなる群に含まれる核酸配列切片によってコードされることが好ましい。
【００２０】
さらに、このドメインＩＶ＊は、Ｐｆａ３遺伝子生産物をコードする、好ましくは配列番号１０および／もしくは配列番号４１を含むもしくはこれらからなる群、ならびに／または、配列番号７２、配列番号１０６、および／もしくは配列番号１４６を含むもしくはこれらからなる群に含まれるアミノ酸配列の１つに対して、少なくとも３０％、少なくとも３２．５％、または少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、少なくとも４２．５％、少なくとも５４％、より好ましくは少なくとも８４％、９０％または９５％のアミノ酸配列同一性を有するＰｆａ３をコードする核酸配列に含まれていることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】多価不飽和脂肪酸の生合成経路をコードする遺伝子集団の概略比較を示す図である。供給源生物体を左側に示す。省略形（タンパク質コード）は、以下の意味である：ＥＲ＝エノイルレダクターゼ；ＫＳ＝ベータ−ケトアシルシンターゼ；ＭＡＴ＝マロニル−ＣｏＡ−トランスアシラーゼ；ＫＲ＝ケトレダクターゼ；ＤＨ＝デヒドラターゼ；ＣＬＦ＝鎖伸長因子；ＡＴ＝アシルトランスフェラーゼ；ＡＣＰ＝アシルキャリアタンパク質；ＡＧＰＡＴ＝アシルグリセロールホスファートアシルトランスフェラーゼ。
【図２】別の粘液細菌、例えば、ミクソコッカス・キサンタスＤＫ１６２２におけるソランギウム・セルロサムＳｏｃｅ５６からのＰＵＦＡ生合成遺伝子集団の異種発現のための核酸構築物を示す図である。ＰＵＦＡ生合成遺伝子（ｐｆａ１、ｐｆａ２およびｐｆａ３）は、Ｐｔｅｔプロモータの制御下にあり、該構築物は、トランスポゾンにより仲介された遺伝子集団転移を介して宿主染色体へランダムに統合される。トランスポゾン：トランスポザーゼをコードする遺伝子、ＩＲ：逆位反復、ａｍｐＲ：アンピシリン耐性遺伝子、ｂｓｄＲ：ブラストサイジン耐性遺伝子、ｎｅｏＲ：カナマイシン耐性遺伝子、ｔｅｔ調節因子：Ｐｔｅｔプロモータの抑制因子をコードする遺伝子：Ｐｔｅｔ：テトラサイクリン誘導可能プロモータ、ｏｒｉＴ：転移開始点。
【図３】（Ａ）は、Ｓ．セルロサムＳｏｃｅ５６野生型からの細胞脂肪酸抽出物のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）クロマトグラム、（Ｂ）は、図２に示す発現構築物を持つＭ．ｘａｎｔｈｕｓ：：ｐ１５Ａ−ＰＵＦＡからの細胞脂肪酸抽出物のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）クロマトグラム、（Ｃ）は、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓＤＫ１６２２野生型からの細胞脂肪酸抽出物のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）クロマトグラムである。
【図４】別の粘液細菌、例えばミクソコッカス・キサンタスＤＫ１６２２におけるエーテロバクター・ファスキクラタスＤＳＭ２１８３５からのＰＵＦＡ生合成遺伝子集団の異種発現のための核酸構築物を示す図である。ＰＵＦＡ生合成遺伝子（ｐｆａ１、ｐｆａ２およびｐｆａ３）は、Ｐｔｅｔプロモータの制御下にあり、該構築物は、Ｍｘ９のａｔｔＢ部位を介して宿主染色体へ統合されている。ｍｘ９：Ｍｘ９インテグラーゼをコードし、Ｍｘ９ファージ付着部位（ａｔｔＰ）を含む遺伝子、ｚｅｏＲ：ゼオシン耐性遺伝子、ａｍｐＲ：アンピシリン耐性遺伝子、ｐ１５Ａｏｒｉ：ｐ１５Ａ複製開始点、ｎｅｏＲ：カナマイシン耐性遺伝子、Ｐｔｅｔ：テトラサイクリン誘導可能プロモータ。
【図５】（Ａ）は、Ｍ．キサンタスＤＫ１６２２野生型からの細胞脂肪酸抽出物のＧＣ解析を示す図であり、（Ｂ）は、配列番号６３のｐｆａ１、ｐｆａ２およびｐｆａ３を含む遺伝子集団を持つＭ．キサンタス：：ｐＰｆａＡｆ−Ｐｔｅｔ−ｍｘ９．２からの細胞脂肪酸抽出物のＧＣ解析を示す図である。細胞脂質は加水分解され、脂肪酸は誘導体化したので、これらを、ＧＣ−ＭＳによって解析することができる。以下の脂肪酸の誘導体を示す：ヘキサデカン酸（１６：０；１）、イソ−ヘプタジエン酸（イソ−１７：２ω５、１１；２）、ヘプタデセン酸（１７：１ω７；３）、イソ−ヘプタデセン酸（イソ−１７：１ω５；４）、イソ−ヘプタデカン酸（イソ−１７：０；５）、イソ−３−ヒドロキシ−ペンタデカン酸（イソ−３−ＯＨ−１５：０；６）、ヘキサデセン酸（１６：１ω７；７）、ヒドロキシ−ヘキサデカン酸（２−ＯＨ−１６：０、３−ＯＨ−１６：０；８）、ヒドロキシ−ヘプタデカン酸（２−ＯＨ−１７：０、３−ＯＨ−１７：０；９）、エイコサペンタエン酸（２０：５ω３、６、９、１２、１５；１０）、イソ−ペンタデカン酸（イソ−１５：０；１１）、およびドコサヘキサエン酸（２２：６ω３、６、９、１２、１５、１８；１２）。
【図６】エーテロバクター・ファスキクラタスの１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の親和性を示すＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴｎから生成される近隣結合ツリーを示す図である。
【図７】粘液細菌性１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子配列に基づき、且つ、ソランギウム・セルロサムのＥＰＡおよびＤＨＡ生産株の統計学的位置を示す近隣結合ツリーを示す図である。
【００２２】
配列表の簡単な説明
2013529912.tif 000003
【００２３】
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【００２４】
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【００２５】
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【００２６】
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【００２７】
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【００２８】
配列番号１は、１７１７６ｂｐ．を含むソランギウム・セルロサムＳｏｃｅ５６のｐｆａ遺伝子集団全体のＤＮＡ配列である。遺伝子ｐｆａ１は、位置１から位置１６５０に位置し、遺伝子ｐｆａ２は、位置１６７７から位置９３８９に位置し、遺伝子ｐｆａ３は、位置９３８６から位置１７１７６に位置し、ｐｆａ２に重なっている。遺伝子ｐｆａ１、ｐｆａ２、およびｐｆａ３によってそれぞれコードされるタンパク質配列も示されている。配列番号２は、遺伝子ｐｆａ１によってコードされる配列番号１のタンパク質配列であり、配列番号３は、遺伝子ｐｆａ２によってコードされる配列番号１のタンパク質配列であり、配列番号４は、遺伝子ｐｆａ３によってコードされる配列番号１のタンパク質配列である。遺伝子ｐｆａ１は、配列番号６としてコードされたアミノ酸配列を有する配列番号５として別個に示されている。遺伝子ｐｆａ２は、配列番号８としてコードされたアミノ酸配列を有する配列番号７として別個に示されている。遺伝子ｐｆａ３は、配列番号１０としてコードされたアミノ酸配列を有する配列番号９として別個に示されている。
【００２９】
配列番号３２は、１７２２１ｂｐ．を含むソランギウム・セルロサムＳｏｃｅ３７７のＤＮＡ配列であり、遺伝子ｐｆａ１は、位置１から位置１６５０に位置し、遺伝子ｐｆａ２は、位置１６７７から位置９３８０に位置し、遺伝子ｐｆａ３は、位置９３７７から位置１７２２１に位置し、ｐｆａ２に重なっている。遺伝子ｐｆａ１、ｐｆａ２、およびｐｆａ３によってそれぞれコードされるタンパク質配列も示されている。配列番号３３は、遺伝子ｐｆａ１によってコードされる配列番号１のタンパク質配列であり、配列番号３４は、遺伝子ｐｆａ２によってコードされる配列番号１のタンパク質配列であり、配列番号３５は、遺伝子ｐｆａ３によってコードされる配列番号１のタンパク質配列である。遺伝子ｐｆａ１は、配列番号３７としてコードされたアミノ酸配列を有する配列番号３６として別個に示されている。遺伝子ｐｆａ２は、配列番号３９としてコードされたアミノ酸配列を有する配列番号３８として別個に示されている。遺伝子ｐｆａ３は、配列番号４１としてコードされたアミノ酸配列を有する配列番号４０として別個に示されている。
【００３０】
配列番号６３は、エーテロバクター・ファスキクラタスＳＢＳｒ００２（ＤＳＭ２１８３５）を起源とするｐｆａ遺伝子集団（１６２１９ｂｐ）全体のＤＮＡ配列である。遺伝子ｐｆａ１は、位置１から位置１６０８に位置し、遺伝子ｐｆａ２は、位置１６４４から位置８３１２に位置し、遺伝子ｐｆａ３は、位置８３０９から位置１６２１９に位置し、ｐｆａ２に重なっている。遺伝子ｐｆａ１、ｐｆａ２、およびｐｆａ３によってそれぞれコードされるタンパク質配列も示されている。配列番号６４は、遺伝子ｐｆａ１によってコードされる配列番号６３のタンパク質配列であり、配列番号６５は、遺伝子ｐｆａ２によってコードされる配列番号６３のタンパク質配列であり、配列番号６６は、遺伝子ｐｆａ３によってコードされる配列番号６３のタンパク質配列である。遺伝子ｐｆａ１は、配列番号６８としてコードされたアミノ酸配列を有する配列番号６７として別個に示されている。遺伝子ｐｆａ２は、配列番号７０としてコードされたアミノ酸配列を有する配列番号６９として別個に示されている。遺伝子ｐｆａ３は、配列番号７２としてコードされたアミノ酸配列を有する配列番号７１として別個に示されている。
【００３１】
配列番号９７は、エーテロバクターＳＢＳｒ００８を起源とするｐｆａ遺伝子集団（１６２４３ｂｐ）全体のＤＮＡ配列である。遺伝子ｐｆａ１は、位置１から位置１６０８に位置し、遺伝子ｐｆａ２は、位置１６４４から位置８３４２に位置し、遺伝子ｐｆａ３は、位置８３３９から位置１６２４３に位置し、ｐｆａ２に重なっている。遺伝子ｐｆａ１、ｐｆａ２、およびｐｆａ３によってそれぞれコードされるタンパク質配列も示されている。配列番号９８は、遺伝子ｐｆａ１によってコードされる配列番号９７のタンパク質配列であり、配列番号９９は、遺伝子ｐｆａ２によってコードされる配列番号９７のタンパク質配列であり、配列番号１００は、遺伝子ｐｆａ３によってコードされる配列番号９７のタンパク質配列である。遺伝子ｐｆａ１は、配列番号１０２としてコードされたアミノ酸配列を有する配列番号１０１として別個に示されている。遺伝子ｐｆａ２は、配列番号１０４としてコードされたアミノ酸配列を有する配列番号１０３として別個に示されている。遺伝子ｐｆａ３は、配列番号１０６としてコードされたアミノ酸配列を有する配列番号１０５として別個に示されている。
【００３２】
配列番号１３７は、エーテロバクターＳＢＮａ００８を起源とするｐｆａ遺伝子集団（１７１９１ｂｐ）全体のＤＮＡ配列である。遺伝子ｐｆａ１は、位置１から位置１６３２に位置し、遺伝子ｐｆａ２は、位置１６５９から位置８３２７に位置し、遺伝子ｐｆａ３は、位置８３２４から位置１７１９１に位置し、ｐｆａ２に重なっている。遺伝子ｐｆａ１、ｐｆａ２、およびｐｆａ３によってそれぞれコードされるタンパク質配列も示されている。配列番号１３８は、遺伝子ｐｆａ１によってコードされる配列番号１３７のタンパク質配列であり、配列番号１３９は、遺伝子ｐｆａ２によってコードされる配列番号１３７のタンパク質配列であり、配列番号１４０は、遺伝子ｐｆａ３によってコードされる配列番号１３７のタンパク質配列である。遺伝子ｐｆａ１は、配列番号１４２としてコードされたアミノ酸配列を有する配列番号１４１として別個に示されている。遺伝子ｐｆａ２は、配列番号１４４としてコードされたアミノ酸配列を有する配列番号１４３として別個に示されている。遺伝子ｐｆａ３は、配列番号１４６としてコードされたアミノ酸配列を有する配列番号１４５として別個に示されている。
【００３３】
エーテロバクターＳＢＳｒ００３について、ＰＵＦＡ合成集団の以下の領域が与えられている：配列番号１３２としてコードされたタンパク質を有する配列番号１３１として、および、別個に配列番号１３３としての遺伝子Ｉ、配列番号１３５としてコードされたタンパク質を有する配列番号１３４として、および、別個に配列番号１３６としてのドメインＩＶ＊。ＳＢＳｒ００３は、ブダペスト条約の下にＤＳＭ２３１２２（DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH, Inhoffenstr. 7b, 38124 Braunschweig,Germany, on 7 October 2009）として寄託されているので、この細菌のＰＵＦＡ合成遺伝子集団は、本発明の目的のために包含される。この遺伝子集団は、ＳＢＳｒ００３に与えられた暗号配列を含み、好ましくは、その遺伝子ＩからそのドメインＩＶ＊へ伸長する。ＤＳＭ２３１２２のこの遺伝子集団は、以下のようなアミノ酸配列をコードすることが好ましく、以下のようなアミノ酸配列とはすなわち、エーテロバクターのＰＵＦＡ合成遺伝子の１つ以上のアミノ酸配列に対して、特に、配列番号６３（アミノ酸配列配列番号６４および６８、配列番号６５および７０、ならびに配列番号６６および７２を含む）によって、配列番号９７（アミノ酸配列の配列番号９８および１０２、配列番号９９および１０４、ならびに配列番号１００および１０６を含む）によって、ならびに／または、配列番号１３７（アミノ酸配列である配列番号１３８および１４２、配列番号１３９および１４４、ならびに配列番号１４０および１４６を含む）によってコードされたアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、そして好ましくは少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列のことである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明者らは、ソランギウム・セルロサム株５６（Ｓｏｃｅ５６）および株３７７（Ｓｏｃｅ３７７）から、ならびに、エーテロバクター・ファスキクラタスＳＢＳｒ００２ＤＳＭ２１８３５、エーテロバクターｓｐ．ＳＢＳｒ００８、ミニシスティス・ロセアＳＢＮａ００８から、および一部はエーテロバクター・ルフスＳＢＳｒ００３からの粘液細菌性ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団を同定した。これらの供給源生物体の生合成遺伝子座の解析は、生合成タンパク質における遺伝子の配列、および、触媒ドメインの構成が、高相同性ではあるが、種々の生物体からのＰＵＦＡ遺伝子集団の公開された配列とは著しく異なっている、ということを示す（図１参照）。
【００３５】
本発明の第１観点は、異種遺伝子発現によって１つ以上の多価不飽和脂肪酸を生産するためのプロセスに関し、このプロセスは、
（ｉ）多価不飽和脂肪酸の生合成経路をコードする遺伝子集団を含む生産生物体を提供するステップであって、該遺伝子集団は、前記生産生物体とは異なる供給源生物体から由来し；エノイルレダクターゼをコードする部分配列ＥＲと、アシルトランスフェラーゼをコードする部分配列ＡＴをと有し、前記部分配列ＡＴは、前記部分配列ＥＲの下流に位置するステップと、
（ｉｉ）発酵性炭素源の存在下においてステップ（ｉ）の生産生物体を成長させて１つ以上の多価不飽和脂肪酸を生産するステップとを含み、
（ｉｉｉ）前記１つ以上の多価不飽和脂肪酸を回収するステップを任意に含む。
【００３６】
本発明に係るプロセスは、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生産に有用である。「多価不飽和脂肪酸」という用語は、当業者に一般的に知られている通りの意味で本願において使用される。好ましくは、多価不飽和脂肪酸は、１２個から３０個の炭素原子、より好ましくは、１８個から２４個の炭素原子、特に好ましくは２０個または２２個の炭素原子を含むモノカルボン酸である。好ましくは、「多価不飽和脂肪酸」という用語は、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、または少なくとも４つの二重結合を有する１８個以上の炭素原子と、末端カルボキシラート基とからなる長い炭化水素鎖を指す。好ましくは、多価不飽和脂肪酸は、互いにコンジュゲートしていないことが好ましい少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、より一層好ましくは少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つのエチレン性不飽和基（Ｃ＝Ｃ二重結合）を含む。本発明の目的のために、「多価不飽和脂肪酸」という用語は、ヒドロキシ誘導体および／または塩類などの多不飽和カルボキシル酸の誘導体を包含する。当分野において知られているように、脂肪酸は、トリグリセリドおよび／またはリン脂質、ならびに、スフィンゴ脂質を形成するようにエステル化されてもよい。したがって、一実施形態において、本発明は、このようなエステル化された生産物にも関する。さらに、本発明の脂肪酸生産物は、遊離脂肪酸であり得る。遊離脂肪酸は、遊離カルボキシル基を有し、トリアシルグリセリド、リン脂質、またはスフィンゴ脂質を含むなんらかの他の化合物と化学的に結合しておらず、細胞の任意のコンパートメントに遊離して存在し得る。
【００３７】
好ましい一実施形態では、エチレン性不飽和基の少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、より一層好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは全てが、シス−配列［（Ｚ）−配列］を有している。典型的な多価不飽和脂肪酸は、オレイン酸、リノール酸、アルファ−リノレン酸、ガンマ−リノレン酸、ジホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサテトラエン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸（ＥＴＥ）、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、および４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である。好ましい多価不飽和脂肪酸は、（１８：３）、（１８：４）、（１８：５）、（２０：３）、（２０：４）、（２０：５）、（２２：３）、（２２：４）、（２２：５）、および（２２：６）からなる群より選択される。
【００３８】
特に好ましい一実施形態では、多価不飽和脂肪酸は、ω−３−多価不飽和脂肪酸である。好ましい多価不飽和脂肪酸は、（１８：３ω−３）、（１８：４ω−３）、（１８：５ω−３）、（２０：３ω−３）、（２０：４ω−３）、（２０：５ω−３）、（２２：３ω−３）、（２２：４ω−３）、（２２：５ω−３）、および（２２：６ω−３）からなる群より選択される。ω−３−多価不飽和脂肪酸の好ましい例としては、α−リノレン酸（１８：３ＡＬＡ）、エイコサ−シス−５，８，１１，１４，１７−ペンタエン酸（２０：５ω−３ＥＰＡ）、およびドコサ−シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサエン酸（２２：６ω−３ＤＨＡ）が挙げられる。さらに好ましい一実施形態では、オメガ−３不飽和脂肪酸は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、およびこれらの混合物から選択される。これらの化合物は、それぞれＥＰＡについてはチムノドン酸、および、ＤＨＡについてはセルボン酸という慣用名でも知られている。
【００３９】
特に好ましい一実施形態では、１つ以上の多価不飽和脂肪酸は、ヘキサデカジエン酸（１６：２）、ヘキサデセン酸（１６：１）、ヘキサデカン酸（１６：０）、ヘプタデセン酸（１７：１ω７）、イソ−ヘプタジエン酸（イソ−１７：２ω５、１１）、イソ−ヘプタデセン酸（イソ−１７：１ω５）、イソ−ヘプタデカン酸（イソ−１７：０）、イソ−３−ヒドロキシ−ペンタデカン酸（イソ−３−ＯＨ−１５：０）、γ−リノレン酸（１８：３ω６）、リノール酸（１８：２ω６）、オクタデセン酸（１８：１）、オクタデカン酸（１８：０）、２−ヒドロキシ−ヘプタデカン酸（２−ＯＨ−１７：０）、２−ヒドロキシ−ヘプタデセン酸（２−ＯＨ−１７：１）、ヒドロキシ−ヘキサデカン酸（２−ＯＨ−１６：０、３−ＯＨ−１６：０）、イソ−ペンタデカン酸（イソ−１５：０）、およびエイコサジエン酸（２０：２ω６）からなる群より選択される。本発明のプロセスによると、１つ以上の多価不飽和脂肪酸が生産される。したがって、本発明のプロセスは、典型的には、組成物を産出し、この組成物から、前記１つ以上の多価不飽和脂肪酸は、任意のステップ（ｉｉｉ）に記載のようにそれぞれ回収され、単離され得る。
【００４０】
本発明のプロセスは、２つ以上の多価不飽和脂肪酸を含む組成物、例えば、少なくとも２つまたは３つのＰＵＦＡの組成物を産出することが好ましく、この場合、１つの特定の多価不飽和脂肪酸が主要成分である。
【００４１】
好ましい一実施形態では、１つの特定の多価不飽和脂肪酸の含有量は、組成物に含まれる全ての多価不飽和脂肪酸の総重量に対して少なくとも４０ｗｔ％、より好ましくは少なくとも４５ｗｔ％、より一層好ましくは少なくとも５０ｗｔ％、さらにより一層好ましくは少なくとも５５ｗｔ％、さらになおより一層好ましくは少なくとも６０ｗｔ％、最も好ましくは少なくとも６５ｗｔ％、そして特に、少なくとも７０ｗｔ％となる。他の好ましい実施形態では、前記特定の多価不飽和脂肪酸の含有量は、組成物に含まれる全ての多価不飽和脂肪酸の総重量に対して少なくとも７５ｗｔ％、より好ましくは少なくとも８０ｗｔ％、より一層好ましくは少なくとも８２ｗｔ％、さらにより一層好ましくは少なくとも８４ｗｔ％、なお一層好ましくは少なくとも８６ｗｔ％、最も好ましくは少なくとも８８ｗｔ％、そして特に、少なくとも９０ｗｔ％となる。
【００４２】
本発明は、異種遺伝子発現による１つ以上の多価不飽和脂肪酸の生産のためのプロセスに関する。「異種遺伝子発現」という用語は、当業者に知られている。好ましくは、異種遺伝子発現は、宿主生物体（生産生物体）において、異なる生物体（供給源生物体）からの遺伝子を担持するベクターによるその生物体の形質転換の結果として、外来タンパク質が合成されること、と定義される。「遺伝子発現」によって、ｍＲＮＡへの核酸セグメントの転写、および、タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳による機能性ポリペプチドの生産が意味されている。「異種遺伝子発現」によって、一般的には、生産生物体のゲノムには天然では存在していない核酸が、該生産生物体に存在し、該生産生物体においてそれが発現されるような方法で、プロモータおよびターミネーター核酸配列に操作可能に結合している、ということが意味されている。「操作可能に結合」という用語は、遺伝子が単一の核酸断片におけるその発現を調節する配列と会合することを指している。例えば、プロモータは、暗号配列の発現を調節できる場合、その暗号配列と操作可能に結合している。また、この文脈においては、異種遺伝子発現は、天然に存在する核酸と類似の機能性を有する核酸の存在にさらに関連し、該異種核酸生産物の発現は脂肪酸組成物を変化させる。多価不飽和脂肪酸の生合成経路をコードする遺伝子集団の異種発現により、いくつかの遺伝子が異種発現されるということが意味されており、その遺伝子生産物は、生産生物体には天然では存在しない、経路におけるステップを構成する。
【００４３】
本発明のプロセスのステップ（ｉ）によると、多価不飽和脂肪酸の生合成経路をコードする遺伝子集団を含む生産生物体が提供される。本明細書では、「多価不飽和脂肪酸の生合成経路をコードする遺伝子集団」は、生産生物体により１つ以上の多価不飽和脂肪酸を合成することのできる生合成経路をコードする任意の遺伝子集団を指す。遺伝子集団の異種発現により、いくつかの遺伝子が異種発現され、その遺伝子生産物は、生産生物体には天然では存在しない、経路におけるステップを構成する。遺伝子集団は、単機能性または多機能性のタンパク質および／または酵素を独立してそれぞれコードしてもよい１つ以上の遺伝子を含んでいてもよい。本明細書では、遺伝子は、一般的に、生体系における遺伝の単位とみなされる。それは、通常は、タンパク質の一種、または、生物体において機能性を有するＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡの伸長である。遺伝子は、制御領域、転写領域、および／または他の機能性配列領域に関連する、遺伝の単位に対応する、ゲノム配列の位置確認可能な領域として定義されることが好ましい。
【００４４】
前記遺伝子集団は、少なくとも２つの遺伝子を含むことが好ましく、少なくとも３つの遺伝子を含むことがより好ましい。前記遺伝子集団は、最多で４つの遺伝子を含むことが好ましく、最多で３つの遺伝子を含むことがより好ましい。特に好ましい一実施形態では、前記遺伝子集団は、正確に３つの遺伝子を含む、すなわち、３つの遺伝子からなり、これらの３つの遺伝子間において遺伝物質を任意に含む。
【００４５】
本発明によると、前記遺伝子集団は、生産生物体とは異なる供給源生物体に由来している。この文脈において、「由来している」は、遺伝子集団が、供給源生物体として天然に生じる生物体（野生型）または遺伝子操作された生物体を起源としていることを好ましくは意味する。この点に関して、「起源としている」は、遺伝子集団が供給源生物体によって生合成されていることを必ずしも意味していないが、ＰＣＲ、および、ホスホアミダイトなどの適切な細胞構築物からのデノボ合成といった生物工学的増幅方法も含むものとする。
【００４６】
遺伝子集団が、供給源生物体として遺伝子操作された生物体を起源とする場合、前記遺伝子操作された生物体のゲノムは、その対応の天然発生生物体（野生型）と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、より一層好ましくは少なくとも９４％、さらにより一層好ましくは少なくとも９６％、さらになおより一層好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９８％、そして特に、少なくとも９９％の相同性を有することが好ましい。本発明の目的のためには、「相同性」の程度は、Zhang Z et al. (2000) J Comput Biol 7:203-214にも記載のｕｒｌであるhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiからのＢＬＡＳＴｎ２．２．２２アルゴリズムを用いる２つの配列の比較に基づくことが好ましい。
【００４７】
本発明に係る遺伝子集団を形成する塩基対（ｂｐ）の数は、５，０００ｂｐから３０，０００ｂｐ、より好ましくは７，０００ｂｐから２８，０００ｂｐ、より一層好ましくは９，０００ｂｐから２６，０００ｂｐ、さらにより一層好ましくは１１，０００ｂｐから２４，０００ｂｐ、最も好ましくは１３，０００ｂｐから２２，００ｂｐ、そして特に、１５，０００ｂｐから２０，０００ｂｐ、または１６，２００ｂｐから１７，３００ｂｐの範囲であることが好ましい。
【００４８】
本発明によると、遺伝子集団は、エノイルレダクターゼをコードする部分配列ＥＲと、アシルトランスフェラーゼをコードする部分配列ＡＴとを含み、該部分配列ＡＴは、部分配列ＥＲの下流に位置している。この点に関し、遺伝子集団の「部分配列」は、遺伝子集団上であって解読枠内に位置するＤＮＡ配列を意味し、この部分配列は、遺伝子集団のＤＮＡ配列全体よりも短い。この点に関し、「下流」は、ＤＮＡ配列の３’末端に比較的近いことを好ましくは意味する。したがって、部分配列ＡＴは、部分配列ＥＲよりも３’末端の近くに位置している。当業者は、どのペプチドまたはタンパク質をエノイルレダクターゼおよびアシルトランスフェラーゼとしてそれぞれ認定することができるか、すなわち、生体触媒活性に関してどの要件を満たす必要があるかを知っている。
【００４９】
一般的に、エノイルレダクターゼは、エノイル基に作用する酵素の一種である。エノイルレダクターゼは、カテゴリーＥＣ１．３（供与体のＣＨ−ＣＨ基に作用するオキシドリダクターゼ）、サブカテゴリーＥＣ１．３．１（受容体としてＮＡＤまたはＮＡＤＰを有する）に好ましくは分類される。
【００５０】
一般的に、アシルトランスフェラーゼは、アシル基に作用するトランスフェラーゼ酵素の一種である。アシルトランスフェラーゼは、カテゴリーＥＣ２．３に分類され、サブカテゴリーＥＣ２．３．１（アミノ−アシル基以外の基を転移するアシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．３．２（アミノアシルトランスフェラーゼ）、およびＥＣ２．３．３（転移時にアシル基をアルキル基にアシル基に転換するアシルトランスフェラーゼ）を含み、これらから、本発明のアシルトランスフェラーゼが選択されることが好ましい。
【００５１】
本発明によると、部分配列ＥＲおよび／または部分配列ＡＴは、別個の独立したタンパク質および酵素をそれぞれコードする必要がない。それよりはむしろ、部分配列ＥＲおよび／または部分配列ＡＴは、さらなる生体触媒活性のうち当該生体触媒活性を含む多機能性タンパク質／酵素のドメインをコードするということが可能である。したがって、本明細書では、「〜をコードする」という表現は、「任意には他の活性または機能性のうち、〜の活性または機能を有するペプチドまたはタンパク質をコードする」と同義である。
【００５２】
遺伝子集団は、第１遺伝子、第２遺伝子、および第３遺伝子を含み、第２遺伝子は、第１遺伝子よりも下流に位置し；第３遺伝子は、第２遺伝子よりも下流に位置していることが好ましい。好ましい一実施形態では、部分配列ＥＲは、第１遺伝子上に位置し、および／または、好ましくはＡＧＰＡＴである部分配列ＡＴは、第３遺伝子上に位置している。
【００５３】
本発明の好ましい一実施形態では、部分配列ＥＲは、さらなる生体触媒活性を示すさらなるドメインを含まない単機能性タンパク質／酵素をコードする。この好ましい実施形態では、部分配列ＥＲは、本明細書では好ましくは「遺伝子ｐｆａ１」とも呼ばれる第１遺伝子上に位置することが好ましい。したがって、生産生物体における遺伝子ｐｆａ１の異種発現は、エノイルレダクターゼ活性を示す好ましくは単機能性のタンパク質／酵素を好ましくは産出する。
【００５４】
本発明の好ましい一実施形態では、部分配列ＡＴは、多機能性タンパク質／酵素のドメインをコードする。なお、この多機能性タンパク質／酵素は、部分配列ＡＴによってコードされたドメインにおいてアシルトランスフェラーゼ活性を示し、さらに、更なる部分配列によってコードされた更なるドメインにおいて更なる生体触媒活性を示すものである。この好ましい実施形態では、部分配列ＡＴは、本明細書では好ましくは「遺伝子ｐｆａ３」とも呼ばれる第３遺伝子上に位置することが好ましい。したがって、生産生物体における遺伝子ｐｆａ３の異種発現は、部分配列ＡＴによってコードされたドメインにおけるアシルトランスフェラーゼ活性と、遺伝子ｐｆａ３上に同じく位置する他の部分配列により同様にコードされた他のドメインにおけるさらなる生体触媒活性とを示す好ましくは多機能性タンパク質／酵素を好ましくは産出する。
【００５５】
部分配列ＥＲによってコードされたエノイルレダクターゼは、配列番号２および／または配列番号６と少なくとも４６％、より好ましくは少なくとも４８％、より一層好ましくは少なくとも５０％、さらにより一層好ましくは少なくとも５２％、さらになおより一層好ましくは少なくとも５４％、最も好ましくは少なくとも５６％、そして特に、少なくとも５８％のタンパク質同一性を有していることが好ましい。
【００５６】
部分配列ＡＧＰＡＴによってコードされたアシルトランスフェラーゼは、配列番号３０および／または配列番号３１と、例えば、本明細書において指定のような、Geneiousソフトウエアおよび整列ツールGeneious Alignmentにより決定されるように、少なくとも２．５％、より好ましくは少なくとも５．０％、より好ましくは少なくとも７．５％、より一層好ましくは少なくとも１０％、さらにより一層好ましくは少なくとも１２．５％、さらになおより一層好ましくは少なくとも１５％、最も好ましくは少なくとも１７．５％、そして特に、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２２％のタンパク質同一性を有していることが好ましい。
【００５７】
部分配列ＥＲによってコードされたエノイルレダクターゼは、配列番号２および／または配列番号６と、少なくとも６６％、より好ましくは少なくとも６７％、より一層好ましくは少なくとも６８％、さらにより一層好ましくは少なくとも６９％、さらになおより一層好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも７１％、特に、少なくとも７２％のタンパク質類似性を有していることが好ましい。
【００５８】
部分配列ＡＧＰＡＴによりコードされたアシルトランスフェラーゼは、配列番号６６、配列番号７２、配列番号３１、配列番号６２、配列番号９６、配列番号１３０、配列番号１３６、および／または配列番号１７０と、本明細書において指定のような、Geneiousソフトウエアおよび整列ツールGeneious Alignmentにより好ましくは決定される、少なくとも２．５％、より好ましくは少なくとも５．０％、より好ましくは少なくとも７．５％、より一層好ましくは少なくとも１０％、さらにより一層好ましくは少なくとも１５％、さらになおより一層好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２２％、最も好ましくは少なくとも２５％、そして特に、少なくとも２７．５％のタンパク質類似性を有していることが好ましい。
【００５９】
部分配列ＥＲは、配列番号６７および／または配列番号６３のｎｔ１−１６０８と、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６２％、より一層好ましくは少なくとも６４％、さらにより一層好ましくは少なくとも６６％、さらになおより一層好ましくは少なくとも６７％、最も好ましくは少なくとも６８％、そして特に、少なくとも６９％のＤＮＡ対同一性を有していることが好ましい。
【００６０】
部分配列ＡＧＰＡＴは、配列番号６３、ｎｔ８３０９−１６２１９、および、配列番号７１および／または配列番号２９、配列番号６０、配列番号９４、配列番号１２８、配列番号１３６および／または配列番号１７０と、本明細書において指定のような、Geneiousソフトウエアと整列ツールClustalWとを用いて好ましくは決定された、少なくとも４６％、より好ましくは少なくとも４８％、より好ましくは少なくとも５０％、より一層好ましくは少なくとも５２％、さらにより一層好ましくは少なくとも５４％、さらになおより一層好ましくは少なくとも５６％、最も好ましくは少なくとも５８％、そして特に、少なくとも６０％のＤＮＡ対同一性を有していることが好ましい。本明細書では、タンパク質同一性はタンパク質配列同一性と同義であり、ＤＮＡ対同一性はＤＮＡ配列対同一性と同義であり、タンパク質類似性はタンパク質配列類似性と同義である。
【００６１】
タンパク質同一性、タンパク質類似性、およびＤＮＡ対同一性（整列）は、一般的に、以下の整列ツール：Geneious Alignment（Drummond AJ, Ashton B, Cheung M, Heled J, Kearse M, Moir R, Stones-Havas S, Thierer T, Wilson A(2009) Geneious Pro v5.4.2, http://www.geneious.com/から入手可能）の１つを用いるGeneiousプログラム（http://www.geneious.com/）によって好ましくは決定される。あるいは、ＤＮＡ対同一性は、ツール、ClustalW2.0.11 Alignment（Thompson, NucleicAcids Res. 1994, 4673-4680）を用いて決定されてもよい。タンパク質配列比較用のパラメータ設定は、好ましくは以下の通りである：ClustalW Alignment：コストマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ、ギャップオープンコスト：１０、ギャップエクステンドコスト：０．１。ＤＮＡ配列比較用のパラメータ設定は、好ましくは以下の通りである：（Ａ）Geneious Alignment：コストマトリックス：５１％類似性（５．０／−３．０）、ギャップオープンペナルティ：１２、ギャップエクステンションペナルティ：３、配列タイプ：遊離端ギャップを有するグローバルアライメント、および（Ｂ）ClustalW2.0.11 Alignment：コストマトリックス：ＩＵＢ、ギャップオープンコスト：１５、ギャップエクステンドコスト：６．６６。
【００６２】
好ましい一実施形態では、本発明の遺伝子集団は、ケトシンターゼ（以下ではケトシンターゼｋｓ１とも呼ばれる）をコードする部分配列ＫＳ、および／または、デヒドラターゼ（以下ではデヒドラターゼｄｈ１とも呼ばれる）をコードする少なくとも１つの部分配列ＤＨをさらに含む。好ましい一実施形態では、本発明の遺伝子集団は、ケトシンターゼ（以下ではケトシンターゼｋｓ１とも呼ばれる）をコードする部分配列ＫＳ、鎖伸長因子をコードする部分配列ＣＬＦ、および／または、デヒドラターゼ（以下ではデヒドラターゼｄｈ１とも呼ばれる）をコードする少なくとも１つの部分配列ＤＨをさらに含む。当業者は、どのペプチドまたはタンパク質をケトシンターゼ、鎖伸長因子、およびデヒドラターゼとしてそれぞれ認定できるか、すなわち、生体触媒活性に関してどの要件を満たす必要があるかを知っている。一般的に、ベータ−ケトアシルシンターゼは、一種のシンターゼ酵素であり、このシンターゼ酵素は、クライゼン縮合の一種である炭素連鎖を合成する。ベータ−ケトアシルシンターゼは、カテゴリーＥＣ２．３．１．４１に分類されることが好ましい。一般的に、鎖伸長因子は、合成される脂肪酸の鎖の長さを制御する。鎖伸長因子は、ポリケチド合成においても重要な役割を果たす（例えばY tang et al, J Am Chem Soc. 2003,125(42), 12708-9を参照）。
【００６３】
一般的に、デヒドラターゼは、水の形態の有機化合物からの酸素および水素の除去（脱水）を特徴付ける酵素の一種である。デヒドラターゼには４つの等級：３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡエステル（共同因子なし）に作用するデヒドラターゼ；２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡエステル（ラジカル反応、［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスタ含有）に作用するデヒドラターゼ；４−ヒドロキシアシル−ＣｏＡエステル（［４Ｆｅ−４Ｓ］およびＦＡＤ含有）に作用するデヒドラターゼ；および［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスタを活性部位として含むデヒドラターゼ（アコニターゼ、フマラーゼ、セリンデヒドラターゼ）があり、これらの中から本発明のデヒドラターゼが選択されることが好ましい。デヒドラターゼは、ＥＣ４．２．１（ヒドロリアーゼ）に分類されることが好ましい。デヒドラターゼの好ましい例は、ヒドロキシ−アシル−デヒドラターゼ、特に、β−ヒドロキシ−アシル−デヒドラターゼである。好ましい一実施形態では、該デヒドラターゼは、クロトノイル−［アシル−キャリア−タンパク質］ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５８）、３−ヒドロキシオクタノイル−［アシル−キャリア−タンパク質］デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５９）、３−ヒドロキシデカノイル−［アシル−キャリア−タンパク質］デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．６０）、３−ヒドロキシパルミトイル−［アシル−キャリア−タンパク質］デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．６１）、長鎖−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．７４）、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１１６）、および４−ヒドロキシブタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２０）からなる群より選択される。
【００６４】
好ましい一実施形態では、部分配列ＫＳ、部分配列ＣＬＦ、少なくとも１つの部分配列ＤＨ、および／または部分配列ＡＴは、同じ遺伝子上に、好ましくは、第３遺伝子（すなわちｐｆａ３）上に位置し、該第３遺伝子は、少なくとも３つのドメイン、より好ましくは少なくとも４つのドメイン、そして特に好ましくは少なくとも５つのドメインを含む多機能性タンパク質をコードすることが好ましい。
【００６５】
好ましい一実施形態では、第３遺伝子は、少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つの異なる機能性を有する多機能性タンパク質をコードし、個々の異なる機能性をコードする部分配列は、アシルトランスフェラーゼをコードする部分配列ＡＴを含み、該部分配列ＡＴは、他の部分配列よりも下流に位置している。
【００６６】
好ましい一実施形態では、遺伝子集団、好ましくは第３遺伝子（すなわちｐｆａ３）は、同一であってもよいし、または異なっていてもよい２つのデヒドラターゼ、すなわちデヒドラターゼｄｈ１およびデヒドラターゼｄｈ２をコードする２つの部分配列を含む。
【００６７】
遺伝子集団は、ケトシンターゼ（以下ではケトシンターゼｋｓ２とも呼ばれる）をコードする部分配列ＫＳ、マロニル−ＣｏＡ−トランスアシラーゼをコードする部分配列ＭＡＴ、アシルキャリアタンパク質（以下ではａｃｐ１と呼ばれる）をコードする少なくとも１つの部分配列ＡＣＰ、ケトレダクターゼをコードする部分配列ＫＲ、および／またはデヒドラターゼ（以下ではデヒドラターゼｄｈ３とも呼ばれる）をコードする部分配列ＤＨをさらに含むことが好ましい。ケトシンターゼｋｓ２は、上記ケトシンターゼｋｓ１と同一であってもよいし、または異なっていてもよい。
【００６８】
デヒドラターゼｄｈ３は、上記デヒドラターゼｄｈ１およびｄｈ２とそれぞれ同一であってもよいし、または異なっていてもよい。
【００６９】
当業者は、どのペプチドまたはタンパク質をマロニル−ＣｏＡ−トランスアシラーゼ、アシルキャリアタンパク質、およびケトレダクターゼとしてそれぞれ認定できるか、すなわち、生体触媒活性に関してどの要件を満たす必要があるかを知っている。
【００７０】
一般的に、マロニル−ＣｏＡ−トランスアシラーゼ（［アシル−キャリア−タンパク質］Ｓ−マロニルトランスフェラーゼとも呼ばれる）は、コエンザイムＡからアシルキャリアタンパク質へのマロニル基の転移を触媒する。マロニル−ＣｏＡ−トランスアシラーゼは、カテゴリーＥＣ２．３．１．３９に分類されることが好ましい。
【００７１】
一般的に、アシルキャリアタンパク質は、小さなポリペプチドであり、該ポリペプチドに、成長炭素／またはアシル鎖が、生合成中にチオエステル結合を介して付着する（TDH Bugg (ed.) in introduction to Enzym and Coenzyme Chemistry, 2.ed, 2004, BlackwellPublishing）。
【００７２】
一般的に、ケトレダクターゼは、ケト基を還元する酵素である。ケトレダクターゼは、カテゴリーＥＣ１．１．１．１８４に分類されることが好ましい。
【００７３】
好ましい一実施形態では、部分配列ＫＳ、部分配列ＭＡＴ、少なくとも１つの部分配列ＡＣＰ、部分配列ＫＲ、および／または部分配列ＤＨは、同じ遺伝子上に、好ましくは第２遺伝子（すなわち、ｐｆａ２）上に位置している。
【００７４】
好ましい一実施形態では、遺伝子集団、好ましくは第２遺伝子（すなわち、ｐｆａ２）は、同一であってもよいし、または異なっていてもよい２つのアシルキャリアタンパク質、すなわち、アシルキャリアタンパク質ａｃｐ１およびアシルキャリアタンパク質ａｃｐ２をコードする少なくとも２つの部分配列ＡＣＰを含む。好ましい一実施形態では、アシルキャリアタンパク質をコードする部分配列ＡＣＰの合計数は、５以下（ａｃｐ１、ａｃｐ２、ａｃｐ３、ａｃｐ４およびａｃｐ５）である。これらの５以下のアシルキャリアタンパク質は、同一であってもよいし、または異なっていてもよい。
【００７５】
特に好ましい一実施形態では、本発明の遺伝子集団は、第１遺伝子（ｐｆａ１）、第２遺伝子（ｐｆａ２）、および第３遺伝子（ｐｆａ３）を含み、該第２遺伝子は、第１遺伝子よりも下流に任意に位置し、該第３遺伝子は、第２遺伝子よりも下流に任意に位置し；また、該遺伝子集団は、エノイルレダクターゼ活性を示すペプチドまたはタンパク質をコードする部分配列ＥＲ、ケトシンターゼ活性（ｋｓ２）を示すペプチドまたはタンパク質をコードする部分配列ＫＳ２、マロニル−ＣｏＡ−トランスアシラーゼ活性を示すペプチドまたはタンパク質をコードする部分配列ＭＡＴ、アシルキャリアタンパク質機能性を示すペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つの部分配列ＡＣＰ、ケトレダクターゼ活性を示すペプチドまたはタンパク質をコードする部分配列ＫＲ、デヒドラターゼ活性（ｄｈ３）を示すペプチドまたはタンパク質をコードする部分配列ＤＨ３、ケトシンターゼ活性（ｋｓ１）を示すペプチドまたはタンパク質をコードする部分配列ＫＳ１、鎖伸長因子機能性を示すペプチドまたはタンパク質をコードする部分配列ＣＬＦ、デヒドラターゼ活性（ｄｈ１およびｄｈ２）を示すペプチドまたはタンパク質をコードする２つの部分配列ＤＨ１およびＤＨ２、およびアシルトランスフェラーゼ活性を示すペプチドまたはタンパク質をコードする部分配列ＡＴを含み、該部分配列ＥＲは、第１遺伝子（ｐｆａ１）上に好ましくは位置し；該部分配列ＫＳ２、ＭＡＴ、ＡＣＰ、ＫＲおよびＤＨ３は、第２遺伝子（すなわちｐｆａ２）上に位置し；該部分配列ＫＳ１、ＣＬＦ、ＤＨ１、ＤＨ２、およびＡＴは、第３遺伝子（すなわちｐｆａ３）上に位置している。
【００７６】
部分配列は、遺伝子集団上において（上流から下流へ、すなわち５’−３’で）以下の順番：ＥＲ、ＫＳ２、ＭＡＴ、ｎＡＣＰ、ＫＲ、ＤＨ３、ＫＳ１、ＣＬＦ、ＤＨ１、ＤＨ２、ＡＴを有していることが好ましい。ただし、ｎは、ＡＣＰの数であり、好ましくは１、２、３、４または５である。
【００７７】
好ましい一実施形態では、本発明の遺伝子集団は、タンパク質Ｐｆａ１をコードする部分配列を含み、このタンパク質Ｐｆａ１は、配列番号２、配列番号６、および／または配列番号３３、配列番号３７（Ｓｏｃｅ）、および／または配列番号６４、配列番号６８（エーテロバクター）、および／または配列番号９８、配列番号１０２（エーテロバクター）、および／または配列番号１３８、配列番号１４２（エーテロバクター）と、本明細書において指定されるような、Geneiousソフトウエアと整列ツールGeneious Alignmentとを用いて好ましくは決定された、少なくとも３０％、少なくとも３２．５％、少なくとも３５％、少なくとも３７．５％、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４２．５％、少なくとも４４％、より一層好ましくは少なくとも４５％、少なくとも４６．５％、さらにより一層好ましくは少なくとも４７．５％、さらになおより一層好ましくは少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１．５％、最も好ましくは少なくとも５２．５％、そして特に、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５６．５％、より一層好ましくは少なくとも５８％、少なくとも５９％、さらにより一層好ましくは少なくとも６０％、さらになおより一層好ましくは少なくとも６２％、最も好ましくは少なくとも６４％、そして特に、少なくとも６６％のタンパク質同一性を有する。このタンパク質Ｐｆａ１は、配列番号５、および／または配列番号３６（Ｓｏｃｅ）、および／または配列番号６７、および／または配列番号１０１、および／または配列番号１４１（エーテロバクター）と、本明細書において指定されるような、Geneiousソフトウエアと整列ツールClustalWとを用いて好ましくは決定された、少なくとも５４％、より好ましくは少なくとも５６％、より一層好ましくは少なくとも５８％、さらにより一層好ましくは少なくとも６０％、さらになおより一層好ましくは少なくとも６２％、最も好ましくは少なくとも６４％、そして特に、少なくとも６６％の配列同一性を有するＤＮＡ配列によってコードされ得る。
【００７８】
好ましい一実施形態では、本発明の遺伝子集団は、タンパク質Ｐｆａ２をコードする部分配列を含み、このタンパク質Ｐｆａ２は、配列番号３、配列番号８、および／または配列番号３４、配列番号３９（Ｓｏｃｅ）、および／または配列番号６５、配列番号７０（エーテロバクター）、および／または配列番号９９、配列番号１０４（エーテロバクター）、および／または配列番号１３９、配列番号１４４（エーテロバクター）と、本明細書において指定されるような、Geneiousソフトウエアと整列ツールGeneious Alignmentとを用いて好ましくは決定された、少なくとも３０％、少なくとも３２．５％、少なくとも３５％、少なくとも３７．５％、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４２．５％、少なくとも４４％、より一層好ましくは少なくとも４５％、少なくとも４６．５％、さらにより一層好ましくは少なくとも４７．５％、さらになおより一層好ましくは少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１．５％最も好ましくは少なくとも５２．５％、そして特に、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５６．５％より一層好ましくは少なくとも５８％、少なくとも５９％、さらにより一層好ましくは少なくとも６０％、さらになおより一層好ましくは少なくとも６２％、最も好ましくは少なくとも６４％、そして特に、少なくとも６６％のタンパク質同一性を有する。このタンパク質Ｐｆａ２は、配列番号７、および／または配列番号３８（Ｓｏｃｅ）、および／または配列番号６９、および／または配列番号１０３、および／または配列番号１４３（エーテロバクター）と、本明細書において指定されるような、Geneiousソフトウエアと整列ツールClustalWとを用いて好ましくは決定された、少なくとも５４％、より好ましくは少なくとも５６％、より一層好ましくは少なくとも５８％、さらにより一層好ましくは少なくとも６０％、さらになおより一層好ましくは少なくとも６２％、最も好ましくは少なくとも６４％、そして特に、少なくとも６６％の配列同一性を有するＤＮＡ配列によってコードされ得る。
【００７９】
好ましい一実施形態では、本発明の遺伝子集団は、タンパク質Ｐｆａ３をコードする部分配列を含み、このタンパク質Ｐｆａ３は、配列番号４、配列番号１０、および／または配列番号３５、配列番号４１（Ｓｏｃｅ）、および／または配列番号６６、配列番号７２（エーテロバクター）、および／または配列番号１００、配列番号１０６（エーテロバクター）、および／または配列番号１４０、配列番号１４６（エーテロバクター）と、本明細書において指定されるような、Geneiousソフトウエアと整列ツールGeneious Alignmentとを用いて好ましくは決定された、少なくとも２８％、少なくとも３１％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３７％、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４３％、少なくとも４６％、より一層好ましくは少なくとも４８％、少なくとも５０％、さらにより一層好ましくは少なくとも５２％、さらになおより一層好ましくは少なくとも５４％または少なくとも５６％、より一層好ましくは少なくとも５８％、少なくとも５９％、さらにより一層好ましくは少なくとも６０％、さらになおより一層好ましくは少なくとも６２％、最も好ましくは少なくとも６４％、そして特に、少なくとも６６％のタンパク質同一性を有する。このタンパク質Ｐｆａ３は、配列番号９、および／または配列番号４０（Ｓｏｃｅ）、および／または配列番号７１、および／または配列番号１０５、および／または配列番号１４５（エーテロバクター）と、本明細書において指定されるような、Geneiousソフトウエアと整列ツールClustalWとを用いて好ましくは決定された、少なくとも４９％、より好ましくは少なくとも５１％、少なくとも５３．５％）、少なくとも５３．５％、より一層好ましくは少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８．５％、さらにより一層好ましくは少なくとも５９％、さらになおより一層好ましくは少なくとも６１％、最も好ましくは少なくとも６３．５％、そして特に、少なくとも６６％の配列同一性を有するＤＮＡ配列によってコードされ得る。
【００８０】
好ましい一実施形態では、本発明の遺伝子集団は、配列番号１と、および／または配列番号３２（Ｓｏｃｅ）と、および／または配列番号６３と、配列番号９７と、および／または配列番号１３７（エーテロバクター）と、本明細書において指定されるように、Geneiousソフトウエアと整列ツールClustalWとを用いて好ましくは決定されるような、少なくとも４９％、より好ましくは少なくとも５１％、より一層好ましくは少なくとも５３％、より好ましくは少なくとも５３．５％、さらにより一層好ましくは少なくとも５５％、より一層好ましくは少なくとも５６％）、さらになおより一層好ましくは少なくとも５７％、さらにより一層好ましくは少なくとも５８．５％、最も好ましくは少なくとも５９％、さらになおより一層好ましくは少なくとも６１％、最も好ましくは少なくとも６３．５％、そして特に、少なくとも６６％のＤＮＡ対同一性を有する部分配列を含む。
【００８１】
上記部分配列のいずれかにより含まれる遺伝子集団のｂｐの数は、遺伝子集団のｂｐの合計数の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より一層好ましくは少なくとも６０％、さらにより一層好ましくは少なくとも６５％、さらになおより一層好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも７５％、そして特に、少なくとも８０％であることが好ましい。
【００８２】
一般的に、本発明のプロセスに好ましくは採用される生産生物体の種類は、特に限定されない。
【００８３】
粘液細菌は、界：バクテリア、門：プロテオバクテリア、綱：デルタプロテオバクテリア、目：ミクソコッカス目に科学的に分類されることが好ましい。
【００８４】
本発明の目的のためには、「粘液細菌」および「粘液細菌株」という用語は、ミクソコッカス目に属する微生物の任意の種または他のメンバーを指すことが好ましい。
【００８５】
用いられる「メンバー」という用語は、エーテロバクターの相同近縁種であると定義される本発明の任意の粘液細菌株について用いられることが好ましい。
【００８６】
本発明の目的のためには、全ての使用される分類学的関係は、Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＤＪら(eds.) Bergey's Manual of SystematicBacteriology, 2nd edn, New York: Springerに従い、特に、本発明の方法は、この基準を参照している。
【００８７】
生産生物体のゲノムは、少なくとも５０．０％、より好ましくは少なくとも５２．５％、より一層好ましくは少なくとも５５．０％、さらにより一層好ましくは少なくとも５７．５％、さらになおより一層好ましくは少なくとも６０．０％、最も好ましくは少なくとも６２．５％、そして特に、少なくとも６５．０％のＧＣ含有量を有していることが好ましい。
【００８８】
生産生物体は、グラム陰性真正細菌、グラム陽性真正細菌、菌類、およびイーストからなる群より選択されることが好ましい。
【００８９】
本発明のプロセスによると、生産は、生産生物体における異種遺伝子発現により行われ、この生産生物体は、該生産生物体とは異なる供給源生物体から由来の遺伝子集団を含んでいる。
【００９０】
この要件を満たすための最低条件は、生産生物体が、供給源生物体として機能する野生型の生物体、すなわち、同定される遺伝子集団の起源である供給源生物体と同一ではないことである。
【００９１】
好ましい一実施形態では、生産生物体および供給源生物体は、微生物である。
【００９２】
分類学的な関連の程度に関する限り、生産生物体および供給源生物体は、好ましくは、異なる種または属；より好ましくは、異なる下族、亜族、または族；より一層好ましくは、異なる下科、亜科、または科；さらにより一層好ましくは、異なる亜目、または目；さらになおより一層好ましくは、異なる亜群、または群；最も好ましくは、異なる亜綱、または綱；そして特に、異なる亜門、門、界、またはドメインに属する。
【００９３】
好ましい一実施形態では、生産生物体は、グラム陰性真正細菌およびグラム陽性真正細菌から好ましくは選択された、原核生物の生物体である。
【００９４】
好ましいグラム陰性真正細菌は、バクテリア、プロテオバクテリア、ガンマプロテオバクテリア（プセウドモナス属、エシェリヒア属、ミクソコッカス属を含む）を含み；特に好ましいのは、プチダ菌（プロテオバクテリア、ガンマプロテオバクテリア）、プセウドモナス目、プセウドモナス科、プセウドモナス、大腸菌（プロテオバクテリア、ガンマプロテオバクテリア）、エンテロバクター目、エンテロバクター科、エシェリヒア属、ミクソコッカス・キサンタス（プロテオバクテリア）、デルタプロテオバクテリア、ミクソコッカス目、シストバクター亜目、ミクソコッカス科、ミクソコッカスである。
【００９５】
好ましいグラム陽性真正細菌は、アクチノバクテリアを含み；特に好ましいのは、コリネバクテリウム属、ロドコッカス属、ストレプトマイセス属、バシラス属のメンバー、コリネバクテリウムグルタミカム（バクテリア）、アクチノバクテリア、アクチノバクテリア亜綱、アクチノマイセス目、コリネバクテリウム亜目、コリネバクテリウム科、コリネバクテリウム、ロドコッカスジョスティイ（バクテリア、アクチノバクテリア、アクチノバクテリア亜綱、アクチノマイセス目、コリネバクテリウム亜目）、ノカルディア科、ロドコッカス、ストレプトマイセスセリカラー（バクテリア、アクチノバクテリア、アクチノバクテリア亜綱、アクチノマイセス目、ストレプトマイセス亜目、ストレプトマイセス科、ストレプトマイセス）である。
【００９６】
他の好ましい実施形態において、生産生物体は、菌類およびイーストから好ましくは選択される真核性の生物体である。
【００９７】
好ましい菌類およびイーストは、ピキア・パストリス（子嚢菌門、サッカロミセス綱、サッカロミセス亜綱（saccharomycetidae）、ピキア科（pichiaceae）、ピキア）、サッカロミセス・セレビシエ（子嚢菌門、サッカロミセス綱、サッカロミセス亜綱）、サッカロミセス科、サッカロミセス属、ハンゼヌラ種の子嚢菌門、サッカロミセス綱、サッカロミセス亜綱）、サッカロミセス科）、トルラスポラ種の子嚢菌門、サッカロミセス綱、サッカロミセス亜綱）、サッカロミセス科）、ヤロウィア・リポリティカ菌類；ディカリア；子嚢菌門；サッカロミセス門；サッカロミセス亜門；サッカロミセス綱；サッカロミセス目；ジポドアスクス科（dipodascaceae）（その無性段階、カンジダリポリチカを含む）を含む。
【００９８】
好ましい一実施形態では、生産生物体は、メチロトローフのまたは疎水性のイースト、すなわち、メタノール上での成長を可能にし、通常は多くの脂肪酸を蓄積してエネルギーも貯える生理機能を有するイーストである。好ましいのは、ハンゼヌラ属、ピチア属、カンジダ属、トルロプシス属、ヤロウイア属および、担子菌イーストであるロドトルラ属である。
【００９９】
典型的には、生産生物体は、ＧＲＡＳステータスを有し、すなわち、一般的には安全と認識されている。
【０１００】
本発明のプロセスによると、遺伝子集団は、供給源生物体から由来している。供給源生物体は、多価不飽和脂肪酸の生合成経路をコードする遺伝子集団を含む任意の生物体であればよく、この遺伝子集団は、エノイルレダクターゼをコードする部分配列ＥＲと、アシルトランスフェラーゼをコードする部分配列ＡＴとを含み、該部分配列ＡＴは、部分配列ＥＲよりも下流に位置している。
【０１０１】
供給源生物体は、粘液細菌から選択されることが好ましい。
【０１０２】
粘液細菌は、ミクソコッカス目、プロテオバクテリアにおけるデルタ亜群における生物体の単系統群として発生したと考えられている。現在のところ、３つの亜目（シストバクター亜目、ナノシスティス亜目、およびソランギウム亜目）が粘液細菌において認識されている［Reichenbach H(2005) Order VIII. Myxococcales Tchan,Pochon and Prevot 1948,398AL. In Brenner DJ, et al. (eds.) Bergey's Manualof Systematic Bacteriology, 2nd edn, vol. 2, part C,pp. 1059-1072, New York: Springer］。これらの亜目は、６つの科、すなわち、シストバクター科、ミクソコッカス科、ナノシスティス科、コフレリア科、ポリアンギウム科、およびフェーズリシスティス科に分割される。
【０１０３】
ミクソコッカス科は、ミクソコッカス属、コラロコッカス属、およびピキシディコッカス属で構成される。関連するシストバクター科では、５つの属（シストバクター属、アルカンジウム属、ヒアランギウム属、メリトタンジウム属、およびスティグマテラ属）が知られている。ナノシスティス亜目のナノシスティス科は、ナノシスティスと２つの海洋の属（エンハイグロミクサおよびプレシオシスティス）とを含む。その関連するコフレリア科は、陸性のコフレリア属および海洋性のヘリアンギウム属で構成される。ポリアンギウム科は、ヤーネラ属、コンドロマイセス属、ポリアンギウム属、ビソボラックス属、およびソランギウム属を含む。今までのところ、後ろの２つだけが、この目のうちでセルロース分解性の属として知られている；ほとんどのその他の分類群は、単離および培養が困難である。最近発見されたフェーズリシスティス属は、最近設立されたフェーズリシスティス科の唯一の属である［Garcia RO et al. (2009) Int J Syst Evol Microbiol59: 1524-1530］。現在のところ、２０の属が承認できており、粘液細菌として妥当に記述されて、全ての既知の土壌および海洋単離株をカバーしている。
【０１０４】
ミクソコッカス目は、以下の例示的な亜目を含み、これらの亜目は、同様に、以下の例示的な科、例示的な属、および、例示的な種を含む。供給源生物体は、以下の種のいずれかから選択されることが好ましい。
【０１０５】
亜目  科  属                      種（好ましい例）
シストバクター亜目
シストバクター科
アルカンジウム属
シストバクター属
ヒアランギウム属
メリトタンジウム属
スティグマテラ属
ミクソコッカス科
アナエロミクソバクター属
コラロコッカス属
ミクソコッカス属
ピクシディオコッカス（Pyxidiococcus）属
ナノシスティス亜目
ハリアンギウム科（コフレリア科）
ハリアンギウム属
ナノシスティス科
ナノシスティス属
プレシオシスティス属
エンハイグロミクサ属          エンハイグロミクサ・サリナ
ソランギウム亜目
フェーズリシスティス科
フェーズリシスティス属
ポリアンギウム科
ポリアンギウム属
ヤーネラ属
コンドロマイセス属
ビソボラックス属              ビソボラックス・クルエンタ
エーテロバクター属            エーテロバクター・ファスキクラタス（ＤＳＭ２１８３５）
エーテロバクター・ルフス（ＤＳＭ２３１２２）
エーテロバクターｓｐ．（ＤＳＭ２３０９８）
ソランギウム属                ソランギウム・セルロサム
生存可能な培養物が実在する代表的な属および種の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列データの比較から推測される系統発生学的関係を、図５に示す。
【０１０６】
好ましい一実施形態では、遺伝子集団は、ミクソコッカス目のソランギウム亜目に属する粘液細菌株から由来している。他の好ましい実施形態では、遺伝子集団は、ミクソコッカス目のポリアンギウム科に属する粘液細菌株から由来している。好ましい一実施形態では、粘液細菌株は、エーテロバクター・ファスキクラタスＤＳＭ２１８３５、エーテロバクター・ルフスＤＳＭ２３１２２、およびエーテロバクターｓｐ．ＤＳＭ２３０９８株から選択される。他の好ましい実施形態では、粘液細菌株は、ソランギウム・セルロサムＳｏｃｅ５６である。
【０１０７】
好ましい一実施形態では、遺伝子集団は、多価不飽和脂肪酸を含む組成物を生産する粘液細菌株から由来し、オメガ−３多価不飽和脂肪酸の含有量は、該組成物の総細胞脂肪酸含有量の少なくとも１０重量％、好ましくは少なくとも１５重量％である。
【０１０８】
供給源生物体の所望の遺伝子集団を一旦同定し、単離したら、それを、生産生物体において発現させることができる。生産生物体においてこのような遺伝子集団を異種発現させるために、それを、標準クローン化技術または標準インビトロ手順、例えばＰＣＲによる融合を用いて、プロモータおよびターミネーター配列と結合させる。「プロモータ」は、遺伝子の発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。対象の遺伝子集団を含む構築物を、標準技術により生産生物体に導入することができる。これらの技術は、形質転換、例えばＳ．セレビシエにおける、酢酸リチウム形質転換、スフェロプラスト、およびｋａｒ１＃１５変種の使用（Georgieva, B. et al,(2002) Meth. Enzymol. 350: 278-89）、プロトプラスト融合、リポフェクション、トランスフェクション、トランスダクション、共役、感染、弾道衝撃（bolistic impact）、電気穿孔法、または、外来性ＤＮＡを生産生物体細胞に導入する任意の他の方法を含む。簡単化するために、このようなやり方で操作された生産生物体を「形質転換された」、「組換型の」または「遺伝子操作された」と呼ぶ。生産生物体に導入される構築物は、発現カセットに加えて、標識遺伝子を含むことが好ましく、これにより、形質転換された細胞を同定することができ、染色体外発現の場合には、細胞がその構築物を失うのも防止する。
【０１０９】
本発明のプロセスのステップ（ｉｉ）は、発酵性炭素源の存在下においてステップ（ｉ）の生産生物体を成長させて、１つ以上の多価不飽和脂肪酸を生産することを含む。
【０１１０】
典型的には、生産生物体を、発酵性炭素源およびタンパク様物質を含む栄養培地において発酵させる。好ましい炭素源は、グルコース、赤砂糖、スクロース、グリセロール、デンプン、コーンスターチ、ラクトース、デキストリン、糖蜜などを含む。好ましい窒素源は、綿実粉、コーンスティープリカー、イースト、乳固形分を含む自己消化醸造イースト、大豆粉、綿実ミール、コーンミール、乳固形分、カゼインの膵液消化物、蒸留固体産物、動物ペプトンリカー、肉および骨の端材などを含む。これらの炭素源と窒素源との組み合わせを有利に用いることができる。微量金属、例えば亜鉛、マグネシウム、マンガン、コバルト、鉄などを発酵培地に加える必要はない。なぜなら、水道水および未精製の成分を培地成分として用いるからである。
【０１１１】
発酵性炭素源には、脂肪酸が無いことが好ましく、発酵性炭素源は、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、メタノールおよび炭素含有アミンからなる群より選択されることが好ましい。
【０１１２】
生産培養のための大規模発酵は、約１８℃を上回り３２℃未満の、好ましくは約２８℃の、生産生物体の良好な成長につながる任意の温度で誘導できる。通常、化合物は、約２〜８日間の発酵、好ましくは４〜５日間の発酵で最適に生産される。
【０１１３】
生産は、振とうフラスコでも、固形培地および撹拌発酵槽でも行うことができる。成長を振とうフラスコまたは大きい容器およびタンクで行う場合、接種する生産生物体は胞子の形態よりも栄養形態で用いることが好ましい。このことにより、ＰＵＦＡ化合物の生産の著しい遅延と、装置の付随する非効率的な利用とが回避される。よって、水性栄養培地に土培養または斜面培養からのアリコートを接種することにより、この培地中に栄養型接種材料を生産することが望ましい。若く活発な栄養型接種材料が確保されたら、これを、他の振とうフラスコまたは生産生物体の発酵に適するその他のデバイスに無菌的に移す。栄養型接種材料を生産する培地は、微生物の適切な成長が得られる限りは、化合物の生産に用いられる培地と同じであってもよいし、または異なっていてもよい。
【０１１４】
一般的に、撹拌容器中の液内好気発酵での細菌株の播種ならびに化合物の発酵および生産が用いられる。生産は、用いられる容器、発酵槽およびスターター手順に依存しない。化合物は、振とうフラスコ培養、または、エアーリフトもしくはＢｉｏｗａｖｅ発酵タンクのようなその他の特別に設計された容器により得ることもできる。大容量発酵のために、栄養型接種材料を用いることが好ましい。栄養型接種材料は、小容量の培養培地に生物体の胞子の形態または凍結乾燥ペレットを接種することにより調製される。次に、栄養型接種材料を発酵容器へ移し、ここで、適切なインキュベーション時間の後に、化合物が最適な収率で生産される。
【０１１５】
液内好気培養プロセスにおいて慣例になっているように、滅菌空気を培養培地に分散させる。生物体の効率的な成長のために、用いられる空気の容量は、約０．２５ｖｖｍ〜約０．５ｖｖｍの範囲である。１０ｌの容器における最適速度は、約２４０ｒｐｍで回転する通常の撹拌翼により撹拌した状態で約０．３ｖｖｍである。発泡が問題になるならば、発酵培地にシリコーンなどの消泡剤を少量（すなわち１ｍｌ／ｌ）加えることが必要である。微好気性生物体について、バイオマス生産を後押しするために曝気をさらに低減することが好ましいことがある。発酵は、通常、バッチ形態で行われるが、よりよい成長および生産収率の増加を達成するために、流加回分発酵を、元来の培養培地中で必要な栄養源が一旦枯渇したら、それを成長している培養物に供給することにより行うことができる。
【０１１６】
所望の生産物は、通常、発酵された細菌株のバイオマスの中に大抵は存在するが、それらが過剰生産された場合、発酵液の培養濾過物にも存在することがある。培養液は、フィルタプレス上でろ過することにより分離できる。
【０１１７】
本発明のプロセスのステップ（ｉｉｉ）は、単に任意的なものであり、ステップ（ｉｉ）において生産された１つ以上の多価不飽和脂肪酸を回収することを含む。
【０１１８】
脂肪酸を回収するための適切な方法は、当業者に知られており、抽出、クロマトグラフィーなどを含む。特に、発酵液からＰＵＦＡ化合物を単離し、精製するために、例えば、クロマトグラフィー吸着法の後に適切な溶媒を用いる溶出、カラムクロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、超臨界流体抽出、およびこれらの方法の組み合わせにより、種々の手順を採用することができる。
【０１１９】
本発明のさらなる観点は、本明細書において説明するようなＰＵＦＡ合成のための生合成経路酵素をコードする遺伝子の異種遺伝子発現により１つ以上の多価不飽和脂肪酸を生産するための方法に関し、この方法は、
（ｉ）多価不飽和脂肪酸の生合成経路をコードする遺伝子集団を含む生産生成物を提供するステップであり、前記遺伝子集団は、生成生物体とは異なる供給源生物体から由来し、第１部分配列および／または第２部分配列を含み、
前記第１部分配列によりコードされるタンパク質は、Ｐｆａ１のアミノ酸配列と、本明細書においてさらに詳細に指定されるように、Geneiousソフトウエアと整列ツールGeneious Alignmentとを用いて好ましくは決定される、少なくとも４６％、より好ましくは少なくとも４８％、より一層好ましくは少なくとも５０％、さらにより一層好ましくは少なくとも５２％、さらになおより一層好ましくは少なくとも５４％、最も好ましくは少なくとも５６％、そして特に、少なくとも５８％のタンパク質同一性を有し；および／または
Ｐｆａ２のアミノ酸配列と、少なくとも２．５％、より好ましくは少なくとも５．０％、より好ましくは少なくとも７．５％、より一層好ましくは少なくとも１０％、さらにより一層好ましくは少なくとも１２．５％、さらになおより一層好ましくは少なくとも１５％、最も好ましくは少なくとも１７．５％、そして特に、少なくとも２０％のタンパク質同一性を有するタンパク質をコードし；および／または
前記第２部分配列によりコードされるタンパク質は、Ｐｆａ３のアミノ酸配列と、本明細書でさらに詳しく指定されるように、Geneiousソフトウエアと整列ツールGeneious Alignmentとを用いて好ましくは決定される、少なくとも２．５％、より好ましくは少なくとも５．０％、より好ましくは少なくとも７．５％、より一層好ましくは少なくとも１０％、さらにより一層好ましくは少なくとも１２．５％、さらになおより一層好ましくは少なくとも１５％、最も好ましくは少なくとも１７．５％、そして特に、少なくとも２０％のタンパク質同一性を有しているステップと、
（ｉｉ）発酵性炭素源の存在下においてステップ（ｉ）の生産生物体を成長させて１つ以上の多価不飽和脂肪酸を生産するステップとを含み、
（ｉｉｉ）前記１つ以上の多価不飽和脂肪酸を回収するステップを任意に含むことが好ましい。
【０１２０】
第１部分配列は、上述のような部分配列ＥＲであり、および／または、第２部分配列は、上述のような部分配列ＡＴであることが好ましい。
【０１２１】
本発明の第１観点（本発明のプロセス）に関係して説明した全ての好ましい実施形態は、本発明の本観点（本発明の方法）も同様に言及するものであり、したがって、これ以下で繰り返さない。
【０１２２】
本発明のさらなる観点は、本発明のプロセスおよび本発明の方法それぞれによって入手可能な少なくとも２つの異なる多価不飽和脂肪酸を含む組成物に関する。
【０１２３】
系統発生学は、粘液細菌の形態学的特徴および生理的特徴に従う。最も重要なことには、細胞脂肪酸含量のＧＣ−ＭＳ解析から推測される脂肪酸プロファイルは、一般的に用いられ、粘液細菌および細菌性生物体の多くのその他の群の分類学的分離について容認できると考えられている。なぜなら、脂肪酸プロファイルは、標準化された方法を用いた場合には少なくとも、一定の特徴であることが見出されているからである。この技術は、１９８９年の初期に最初に用いられた［Tornabenet G(1985)Methods in Microbiology 18, 209-234］。よって、このようなＧＣ−ＭＳ（またはＧＣ）に基づく脂肪酸プロファイルは、細菌の系統発生学および分類学において広く用いられている。
【０１２４】
したがって、異なる個々の競合種、すなわち、ＰＵＦＡを生産することのできる異なる種から由来する遺伝子集団は、異なる組成の生産物、すなわち、異なるＰＵＦＡを含む、および／または、ＰＵＦＡの量が異なる生産物を産出する。したがって、異なるプロセスによって得られる生産物は、互いに区別される個別の特徴を有している。
【０１２５】
本発明のさらなる一観点は、上で定義したような多価不飽和脂肪酸の生合成経路をコードする遺伝子を含む形質転換された生産生物体に関する。
【０１２６】
次に、本発明を、図を参照して例を用いて詳しく説明する。しかしながら、これらの例は、請求の範囲を限定すると解釈されない。
【０１２７】
現在はＳＢＳｒ００２とも呼ばれるエーテロバクター・ファスキクラタスを、ブダペスト条約に従って、ＤＳＭＺ、Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr.7 B, 38124 Braunschweig, Germanyに、２００８年８月２７日に、寄託番号ＤＳＭ２１８３５の下に寄託した。現在はＳＢＳｒ００３とも呼ばれるエーテロバクター・ルフスを、ＤＳＭＺに、寄託番号ＤＳＭ２３１２２の下に寄託し、現在はＳＢＳｒ００８とも呼ばれるエーテロバクターｓｐを、ＤＳＭＺに、寄託番号ＤＳＭ２３０９８の下に、２００９年１１月１２日にＤＳＭＺに寄託した。
【０１２８】
Ａ．ファスキクラタスＤＳＭ２１８３５は、グラム陰性でほっそりした桿形状の栄養細胞の特徴的なスウォーミング、子実体形成、および溶菌活性を示すことにより、粘液細菌の綱、ミクソコッカス目のメンバーとして同定された。この株は、好気性〜条件的好気性で、化学従属栄養性であり、種々の抗生物質に対しての耐性も示す。主要な脂肪酸は、Ｃ２２：６（ドコサヘキサエン酸）、イソ−Ｃ１５：０、アンテ−イソＣ１７：０、およびＣ２０：５（エイコサペンタエン酸）である。ゲノムＤＮＡのＧ＋Ｃ含量は、６８．９ｍｏｌ％である。１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列は、セルロース分解性ビソボラックス・クルエンタと９６％の同一性、ソランギウム・セルロサムと９５％の同一性を示す。このことは、この株がミクソコッカス目のソランギウム亜目に属することを明確に示す。さらに、形態学的成長段階および新規な脂肪酸プロファイルにおける独特性は、ＤＳＭ２１８３５が新規なエーテロバクター属および新規なＡ．ファスキクラタスの種に属するように分類されると提案される新しい分類群に属することを明確に意味する。
【０１２９】
実施例１：ＰＵＦＡの生産のためのコード化のための生合成遺伝子集団のための発現構築物の生成
ａ）ＰＵＦＡ遺伝子のサブクローニングおよび発現構築物の構築：
ＰＵＦＡ遺伝子を、ＰＵＦＡ生産粘液細菌株の染色体から、ゲノムライブラリーを（例えば、コスミド、フォスミド、ＹＡＣ、またはＢＡＣベクターを用いて）生成することにより、または、ＰＣＲ後にＰＣＲ生産物をサブクローニングしてＰＵＦＡ遺伝子またはその断片を増幅することにより、サブクローニングした。あるいは、ＰＵＦＡ遺伝子を、組み換え、例えば、Ｒｅｄ／ＥＴ組み換え技術（Zhang Y, Nat. Genet. 1998, 20: 123-128; Zhang Y, Nat.Biotechnol.2000, 18: 1314-1317）、または、イースト中での組み換え（Kouprina N, , Nature Protocols 2008,3:371-377; Larionov V, P.Natl.Acad.Sci.USA1996, 93:491-496; Wolfgang MC, Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA 2003, 100:8484-8489）に依存した方法を用いてサブクローニングした。他のアプローチでは、ＰＵＦＡ遺伝子の天然のまたは人工のＤＮＡ配列を、デノボで化学的に（例えば、商業的に利用可能な遺伝子合成により）合成した。ｐｆａ１、ｐｆａ２、ｐｆａ３の遺伝子集団全体を含む好ましいプラスミドを図２に示す。遺伝子集団に隣接するＩＲエレメントは、任意であり、遺伝子集団と隣接ＩＲエレメントとを含むプラスミド切片が、同じまたは別の核酸構築物に含まれていてもよいトランスポザーゼをコードする遺伝子と共形質転換するためには好ましい。
【０１３０】
ＰＵＦＡ遺伝子を動かすために、発現構築物を、異種宿主における転移、伝播、および発現の制御を可能にする遺伝因子によって改質した。共役を介した転移のために、転移の開始点（ｏｒｉＴ）を発現構築物に追加する。宿主細胞におけるＰＵＦＡ遺伝子の伝播のために、宿主株において機能性である複製開始点を発現構築物に付加した、または、発現構築物を多様な方法を用いて宿主染色体に統合した。転位によって宿主染色体にＰＵＦＡ遺伝子をランダムに統合するために（Fu J, Nucleic Acids Res. 2008, 36:el 13）、適切な選択マーカーと共に生合成遺伝子集団に、逆位反復エレメント（ＩＲ）を隣接させ、発現構築物は、マリナートランスポゾンｐＭｙｃｏＭａｒからのトランスポザーゼを含む（図２参照）（Rubin EJ, P.Natl.Acad.Sci.USA 1999, 96:1645-1650）。宿主染色体への直接的統合を、相同性組み換えによって、または、専用インテグラーゼにより触媒される、宿主特定のファージ付着部位（例えば、粘液細菌におけるＭｘ８もしくはＭｘ９付着部位（Magrini V. J.Bacteriol. 1999, 181 :4050-4061; JulienB, J.Bacteriol. 2003, 185:6325-6330）、もしくはアクチノミセス類におけるΦＣ３１付着部位（Kieser T:Practical Streptomyces Genetics. Norwich, England: The John Innes Foundation;2000））を介して行った。
【０１３１】
ｂ）ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団の改質：
異種発現を可能にする、および／または、最適化するために、転写／翻訳に関与する遺伝因子を操作（例えば、プロモータまたはリボソーム結合部位を操作）すること、または、異種宿主のコドン利用を目的としてＰＵＦＡ遺伝子コドンを適応させることにより、ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団を改質した。粘液細菌における異種発現のために、天然のプロモータ構造をＰＴ７Ａ１、Ｐｍ、Ｐｔｅｔ（図２参照）、ｔｎ５−誘導ｎｐｔプロモータ、または他のプロモータ（例えば、天然の二次代謝物経路の発現を誘導するプロモータ）と交換した。ＰＵＦＡ生産プロファイルを最適化するために、生合成遺伝子を改質することにより、粘液細菌性ＰＵＦＡ生合成機構の操作（例えば、触媒的ドメインの変異／挿入／欠失／交換）を行った。
【０１３２】
実施例２：ＰＵＦＡの異種生産のための宿主生物体への遺伝子集団の転移
粘液細菌性ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団の発現構築物を、電気穿孔法、共役、または他の形質転換方法（例えば、プロトプラスト／スフェロブラスト形質転換、または、自然の適格性の使用）によって、異種宿主株へ転移した。形質転換体を、ＰＵＦＡ遺伝子含有構築物の存在（および、正しい統合）について遺伝子型で解析した。粘液細菌性ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団を含む宿主株を、適切な条件下（例えば、Ｍ．キサンタスについては：２〜４日間３０℃でのＣＴＴ媒体）で培養した。ＰＵＦＡ生産を、ＦＡＭＥ方法、例えば、脂肪酸メチルエステル化の解析を用いるガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）によって解析した。
【０１３３】
実施例３：慣例のクローン化方法によるエーテロバクター・ファスキクラタスＤＳＭ２１８３５からのＰＵＦＡ生合成遺伝子集団のための発現構築物の生成
エーテロバクター・ファスキクラタスＤＳＭ２１８３５からのＰＵＦＡ生合成遺伝子集団を、染色体ＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。このため、遺伝子集団を、複数の領域に分割し、適切な制限部位をプライマー配列と共に導入しながら、これらの領域を、個別に増幅した。合計で７つの断片：天然のプロモータ配列を有していない完全な遺伝子ｐｆａ１（１、ＳｗａＩ−ＳｐｅＩ−ｐｆａ１−ＨｐａＩ）、遺伝子ｐｆａ２の５’末端（２、ＨｐａＩ−５’ｐｆａ２−ＨｉｎｄＩＩＩ）、遺伝子ｐｆａ２の中心部（３、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＣＲｐｆａ２−ＮｈｅＩ）、遺伝子ｐｆａ２の３’末端（４、ＮｈｅＩ−３’ｐｆａ２−ＡｓｅＩ）、遺伝子ｐｆａ３の５’末端（５、ＡｓｅＩ−５’ｐｆａ３−ＨｉｎｄＩＩＩ）、遺伝子ｐｆａ３の中心部（６、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＣＲｐｆａ３−ＮｈｅＩ）、および遺伝子ｐｆａ３の３’末端（７、ＮｈｅＩ−３’ｐｆａ３−ＳｓｐＩ−ＰａｃＩ）をＰＣＲによって増幅した。次に、ＰＣＲ生産物を、慣例の制限およびライゲーション方法によって、ハイコピークローニングベクター（例えば、ｐＵＣ１８誘導体）へとサブクローニングした。断片１のサブクローニングは、プラスミドｐＰｆａ１となり、同じベクターへの断片２〜４のサブクローニングは、プラスミドｐＰｆａ２を生成し、同じベクターへの断片５〜７のサブクローニングは、プラスミドｐＰｆａ３をもたらした。次のステップでは、３つのＰＵＦＡ生合成遺伝子（ｐｆａ１、ｐｆａ２、およびｐｆａ３）を、同じプラスミド上にサブクローニングした。このために、遺伝子ｐｆａ２およびｐｆａ３を、構築物ｐＰｆａ１−２−３を生成する遺伝子ｐｆａ１を持つｐＰｆａ１プラスミドへライゲートした。異種宿主（プロモータ配列、調節遺伝子、リボソーム結合部位）におけるｐｆａ遺伝子の発現のために必要な遺伝因子を、断片１から誘導されたＳｗａＩ−ＳｐｅＩ制限部位を介してライゲートした。宿主染色体における転移および複製または統合に必要なカセットを、プラスミドｐＰｆａ１−２−３の独自制限部位を介して導入した。
【０１３４】
実施例４：遺伝子組換技術によるエーテロバクター・ファスキクラタスＤＳＭ２１８３５からのＰＵＦＡ生合成遺伝子集団のための発現構築物の生成
ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団を、組換技術によってＡ．ファスキクラタスＤＳＭ２１８３５からの染色体ＤＮＡから直接サブクローニングした。このため、ゲノムＤＮＡ断片の混合物を示すＰＵＦＡ生合成遺伝子集団の隣接領域に割り込む制限酵素によって、ゲノムＤＮＡを消化した。複製開始点および選択マーカー（例えば、ｐＡＣＹＣ１８４からのｐ１５Ａｏｒｉ−ｃｍＲまたはｐＡＣＹＣ１７７からのｐ１５Ａｏｒｉ−ａｍｐＲ）を含むカセットを、ＰＣＲにより増幅し、ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団を持つゲノムＤＮＡ断片の両端へのホモロジーアームを、プライマー配列と共に導入した。さらに、転移カセットの後のサブクローニングのための独自制限部位（例えば、ＰａｃＩ）を、遺伝子集団の３’末端のホモロジーアームと共に導入した。次に、ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団を持つゲノムＤＮＡ断片を、インビボでの二重相同性組み換えによって、ＰＣＲ生産物へサブクローニングした。組換型構築物を、第２二重相同性組み換えステップによってさらに改質して、ＰＣＲにより増幅され、２つのホモロジーアームにより隣接された耐性遺伝子と、制限部位（例えば、ＳｗａＩおよびＳｐｅＩ）とを、ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団の５’末端において統合させた。次に、得られた構築物を、慣例クローン化方法によりさらに操作して、転移および異種発現に必要なカセットを導入した：異種宿主（プロモータ配列、調節遺伝子、リボソーム結合部位）におけるｐｆａ遺伝子の発現のために必要な遺伝因子を、ＳｗａＩ−ＳｐｅＩ制限部位を介してライゲートし、宿主染色体における転移および複製または統合のために必要なカセットを、独自制限部位を介して、ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団の３’末端において導入した。
【０１３５】
実施例５：宿主生物体へのエーテロバクター・ファスキクラタスＤＳＭ２１８３５からのＰＵＦＡ生合成遺伝子集団の形質転換および異種発現
Ｍ．キサンタスを、ＣＴＴ媒体（１０ｇ／Ｌのカジトン、１０ｍｌ／Ｌのトリス緩衝液、１ｍＬ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６；８６ｍＬ  １Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４＋１３．４ｍＬ  １Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４）、１０ｍＬ／Ｌの０．８Ｍ硫酸マグネシウム）において、３０℃で、０．５のＯＤ６００に達するまで成長させた。１０ｍＬの細菌性培養物を、４℃で１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、細胞ペレットを、氷のように冷たい蒸留水で２回洗浄し、最終的に、４０μＬの氷のように冷たい水の中に再懸濁させた。次に、細胞懸濁液を、氷のように冷たい０．１ｃｍの電気穿孔キュベットにおいて発現構築物による電気穿孔を以下の条件：８ミリ秒〜９ミリ秒のパルス長を達成するための４００Ω、２５μＦ、および６５０Ｖで行った。次に、１ｍＬのＣＴＴ媒体を添加し、細胞を、３０℃で１８時間インキュベートした。５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを２５μＬ含む３ｍＬのＣＴＴ軟寒天（ＣＴＴ媒体と７．５ｇ／Ｌの寒天）を、培養物に添加し、混合物を、ＣＴＴ寒天平板（ＣＴＴ媒体と１５ｇ／Ｌの寒天）の表面上に注いだ。平板を、３０℃で３日間、変異コロニーが現れるまでインキュベートした。次に、形質転換体を、遺伝子型と表現型とで解析した。
【０１３６】
実施例６：ＰＵＦＡの異種生産
ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団を持つＭ．キサンタス変異体を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを補足したＣＴＴ媒体中で、３〜５日間３０℃で成長させた。媒体物を、遠心分離し、ＰＵＦＡを抽出した。細胞脂肪酸を、ＦＡＭＥ方法［Bode HB et al. (2006) J. Bacteriol188:6524-6528; Ring MW et al. (2006), J Biol Chem 281 :36691-36700 (2006)］を用いて抽出した。アリコート（１μＬ）の抽出物を、ＧＣ−ＭＳにより解析した。ＥＰＡおよびＤＨＡを含む細胞脂肪酸の同定：オメガ−３ＰＵＦＡ（ＥＰＡおよびＤＨＡ）を含む細胞脂肪酸を、断片化パターンと持続時間とに基づいて同定した。これらの脂肪酸（ＦＡ）を、３７脂肪酸メチルエステルを含むＦＡＭＥミックス標準品（Sigma-Aldrich社）と比較した。ＤＨＡおよびＥＰＡの存在を、Sigma-Aldrich社の標準品（シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ＤＨＡ、シス−５，８，ｌｌ，１４，１７−ＥＰＡ）を用いて確定した。
【０１３７】
ソランギウム・セルロサムＳｏｃｅ５６からのＰＵＦＡ生合成遺伝子集団の異種発現のための核酸構築物を、真正細菌における、または、他の粘液細菌、例えば、ミクソコッカス・キサンタスＤＫ１６２２における合成遺伝子生産物の異種発現のために使用することができる。
【０１３８】
図３は、図２の核酸構築物からのＳｏｃｅ５６（配列番号１）の遺伝子集団ｐｆａ１、ｐｆａ２、ｐｆａ３を含むＭ．キサンタスによるＰＵＦＡ生産の分析結果を示す。
【０１３９】
異種発現のためのＰｆａ１、Ｐｆａ２、およびＰｆａ３をコードする遺伝子集団を含むように遺伝子操作された生産微生物を用いるＰＵＦＡの生産のためのさらなる実施例として、Ｍ．キサンタスを、エーテロバクターＳＢＳｒ００２（配列番号６３、または代替として、配列番号６７、配列番号６９、および配列番号７１）からクローン化されたｐｆａ１、ｐｆａ２、ｐｆａ３を含む、図４に示すような核酸構築物によって形質転換させた。詳細には、ＤＳＭ２１８３５のゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡ断片の混合物を示すＰＵＦＡ生合成遺伝子集団の隣接領域に割り込むＳｃａＩによって消化した。ｐ１５Ａ複製開始点と、アンピシリン耐性遺伝子（ｐＡＣＹＣ１７７からのｐ１５Ａｏｒｉ−ａｍｐＲ）とを含むカセットを、ＰＣＲによって増幅し、ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団を持つゲノムＤＮＡ断片の両端へのホモロジーアームを、プライマー配列と共に導入した。さらに、転移カセットの後のサブクローニングのための独自ＰａｃＩ制限部位を、遺伝子集団の３’末端のホモロジーアームと共に導入した。次に、ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団を持つゲノムＤＮＡ断片を、インビボでの二重相同性組み換えによりＰＣＲ生産物へとサブクローニングした。組換型構築物を、第２二重相同性組み換えステップによって、さらに改質して、カナマイシン耐性遺伝子、および、ＰＣＲにより増幅され、２つのホモロジーアームにより隣接されるＰｔｅｔプロモータを、ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団の５’末端において統合した。次に、構築物を、慣例のクローン化方法によりさらに操作した：ゼオシン耐性遺伝子と、宿主染色体における統合のための対応するファージ付着部位（ａｔｔＰ）を有するＭｘ９インテグラーゼをコードする遺伝子とを含むｚｅｏＲ−ｍｘ９カセットを、独自Ｐａｄ制限部位を介して、ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団の３’末端において導入した。次に、ＰＵＦＡ発現構築物を、Ｍ．キサンタスＤＫ１６２２に形質転換した。形質転換体を、遺伝子型および表現型で解析した。ＰＵＦＡ生合成遺伝子集団を持つＭ．キサンタス形質転換体を、６０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２０μｇ／ｍＬゼオシンを補足したＣＴＴ媒体中で２〜３日間３０℃で成長させた。培養物を、遠心分離し、ＰＵＦＡを抽出し、エステル化し、ＧＣ−ＭＳによって解析した。
【０１４０】
本発明のプロセスにおける生産生物体を培養することによるＰＵＦＡの生産についての更なる一実施例として、１０Ｌ撹拌バイオリアクター（Biostat E、Braun Melsungen社）を使用して、Ｓｏｃｅ５６のＰＵＦＡ遺伝子集団を持つＭ．キサンタス株と、別個に、エーテロバクター・ファスキクラタスのＰＵＦＡ遺伝子集団を持つＭ．キサンタスとを、本明細書でそれぞれ説明したように、２Ｌ／分の曝気で、１２０ｒｍｐで撹拌して、２８℃で、５〜７日間適切な媒体中で培養した。接種のために、７２時間、振とうフラスコプレカルチャーを使用したメチル化ＰＵＦＡの解析は、各株に対して０．４％〜１．６％のγ−リノレン酸、および、乾燥バイオマスにおけるＡ．ファスキクラタス遺伝子集団を発現するＭ．キサンタスに対して０．６％のＤＨＡを示した。
【０１４１】
実施例７：配列比較
新規の粘液細菌性ＰＵＦＡシンターゼの範囲内の触媒的ドメインを、以下の部分に記載のような様々なバイオインフォマティックツールを用いて注釈した。ただし、ＥＲ＝エノイルレダクターゼ、ＫＳ＝β−ケトアシルシンターゼ、ＭＡＴ＝マロニル／アセチルトランスフェラーゼ、ＡＣＰ＝アシルキャリアタンパク質、ＫＲ＝β−ケトアシルレダクターゼ、ＤＨ＝β−ヒドロキシアシルデヒドラターゼ：
Ｐｆａ１ＥＲドメインは、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８、モリテーラ・マリーナＭＰ−１、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９、およびシゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８の対応する配列との整列により注釈された。
【０１４２】
Ｐｆａ２＿ＫＳ−ＭＡＴ−ＡＣＰｓ−ＫＲは、Jacques RavelのＰＫＳ／ＮＲＰＳ解析ウェブサイト（http://nrps.igs.umaryland.edu/nrps/）により注釈された。
【０１４３】
Ｐｆａ２＿ＤＨは、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８、モリテーラ・マリーナＭＰ−１、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９、およびシゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８の対応する配列との整列により注釈された。
【０１４４】
Ｐｆａ３＿ＫＳ−ＣＬＦ−ＤＨ−ＤＨは、Pfam SequenceSearch（http://pfam.sanger.ac.uk/）により注釈された。
【０１４５】
Ｐｆａ３＿ＡＴは、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８、モリテーラ・マリーナＭＰ−１、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９、およびシゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８の対応する配列と整列させることにより注釈された。BlastP（NationalCancer Institute, USA: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi?PAGE=Proteins）およびPfam SequenceSearch（Version 24.0; The WellcomeTrust Sanger Institute, Cambridge, UK: http://pfam.sanger.ac.uk/）においては、最も顕著な的中は、ＡＴドメインを表しているが、それが他の機能性を果たしているということかもしれない。現在は同定されていない追加のドメインが、本明細書に記載の遺伝子においてコードされてもよい。
【０１４６】
遺伝子集団間の組織的差異に加えて、図１に示すような粘液細菌性遺伝子集団における比較の機能性領域は、タンパク質およびＤＮＡレベルにおいて、図２および図３に示すような既知のＰＵＦＡ生合成遺伝子（表１）に対して予想外に低いレベルの配列同一性を示す。本発明の粘液細菌性ＰＵＦＡ遺伝子間の配列類似性は、全体的に比較的高い（表４参照）。
【０１４７】
表１：ＰＵＦＡ−シンターゼをコードする比較の既知の生合成遺伝子集団
2013529912.tif 000009
【０１４８】
ソランギウム・セルロサムＳｏｃｅ５６のＢＬＡＳＴ受入番号：ＹＰ００１６１１４５７．１
ソランギウム・セルロサム（Sorangium cellulosum）Ｓｏｃｅ５６（＝Ｓｏｃｅ５６）のＰＵＦＡ遺伝子集団からのからの粘液細菌性ドメインＩＶ＊（ＡＧＰＡＴ）、およびエーテロバクター・ファスキクラタス（Aetherobacter fasciculatus）ＤＳＭ２１８３５（＝A. fasciculatus）のＡＧＰＡＴと、比較微生物であるメチリビウム・ペトロレイフィラム（Methylibium petroleiphilum）ＰＭ１（各ボックスの第１行）、クロストリジウム（Clostridium）ｓｐ．７＿２＿４３ＦＡＡ（各ボックスの第２行）、タラロマイセス・スティピタトゥス（Talaromyces stipitatus）ＡＴＣＣ１０５００（各ボックスの第３行）、およびプチダ菌（Pseudomonas putida）ＧＢ−１（各ボックスの第４行）の対応する配列との以下の配列比較は、それぞれ、ＤＮＡおよびタンパク質レベルの双方において重要な配列差異を示す。
【０１４９】
表２：ドメインＩＶ＊と既知のドメインとの配列比較
上側のブロック：Ｓｏｃｅ５６対比較微生物
下側のブロック：A. fasciculatus対比較微生物
2013529912.tif 000010
【０１５０】
既知の生物体の機能的に類似したドメインに対する、ソランギウムおよびエーテロバクターのドメインＩＶ＊の比較的低い同一性および類似性は、本発明において使用される合成遺伝子が事前に知られている遺伝子とは著しく異なることを示す。
【０１５１】
−粘液細菌性ＰＵＦＡ遺伝子ドメインおよびタンパク質ドメインと、比較細菌性ＰＵＦＡ遺伝子／タンパク質との比較−
本発明のＰＵＦＡ遺伝子のドメインと既知の微生物の相同性ドメインとの表３の配列比較は、本発明の遺伝子と既知の遺伝子との間の、ＤＮＡおよびタンパク質レベル双方における重要な配列差異を示す。
【０１５２】
表３：比較遺伝子との配列比較
2013529912.tif 000011
【０１５３】
上側のブロック：シュワネラ（各ボックスの第１行）、モリテーラ・マリーナ（各ボックスの第２行）、フォトバクテリウム・プロファンダム（各ボックスの第３行）のＰＵＦＡ遺伝子と比較したＳｏｃｅ５６
下側のブロック：シュワネラ（各ボックスの第１行）、モリテーラ・マリーナ（各ボックスの第２行）、フォトバクテリウム・プロファンダム（各ボックスの第３行）のＰＵＦＡ遺伝子と比較したＡ．ファスキクラタス
†本明細書に記載のように整列はGeneiousプログラムによって行われた。
【０１５４】
††整列された領域の定義：
一般的に、Ｓｏｃｅおよびエーテロバクター（ＳＢＳｒ００２）からの遺伝子集団のドメインは、配列表の簡単な説明において記載の通りである。
【０１５５】
ドメインＩ（ＤＮＡ配列比較）：Ｓｏｃｅ５６からのｐｆａ１およびＡ．ファスキクラタス（ＳＢＳｒ００２）からのｐｆａ１の完全な遺伝子配列を、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８（受入番号Ｕ７３９３５．１／３０７３０−３２３６１ｎｔ）からのｐｆａＤ（＝ｏｒｆ８）、モリテーラ・マリーナＭＰ−１（受入番号ＡＢ０２５３４２．２／２７１１９−２８７３５ｎｔ）からのｏｒｆ１１、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９（受入番号ＡＦ４０９１００．１／２３１６６−２４８００ｎｔ）からのｐｆａＤの完全な遺伝子配列に対して整列させた。
【０１５６】
ドメインＩ（タンパク質配列比較）：Ｓｏｃｅ５６からのＰｆａ１またはＡ．ファスキクラタスからのＰｆａ１の完全なタンパク質配列を、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８（受入番号ＡＡＢ８１１２６．１／１−５４３ａａ）からのＰｆａＤ（＝ｏｒｆ８）、モリテーラ・マリーナＭＰ−１（受入番号ＢＡＡ８９３８５．１／１−５３８ａａ）からのＯｒｆ１１、および、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９（受入番号ＡＡＬ０１０６３．１／１−５４４ａａ）からのＰｆａＤの完全なタンパク質配列に対して整列させた。
【０１５７】
ドメインＩｌａ（ＤＮＡ配列比較）：Ｓｏｃｅ５６からの遺伝子ｐｆａ２およびＡ．ファスキクラタスからの遺伝子ｐｆａ２を、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８（受入番号Ｕ７３９３５．１）からの遺伝子ｐｆａＡ（＝ｏｒｆ５）、モリテーラ・マリーナＭＰ−１（受入番号ＡＢ０２５３４２．２）からの遺伝子ｏｒｆ８、および、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９（受入番号ＡＦ４０９１００．１）からの遺伝子ｐｆａＡに対して整列させた。
【０１５８】
ドメインＩｌａ（タンパク質配列比較）：Ｓｏｃｅ５６からのタンパク質Ｐｆａ２およびＡ．ファスキクラタスからのタンパク質Ｐｆａ２を、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８（受入番号ＡＡＢ８１１２３．１）からのタンパク質ＰｆａＡ（＝ｏｒｆ５）、モリテーラ・マリーナＭＰ−１（受入番号ＢＡＡ８９３８２．２）からのタンパク質Ｏｒｆ８のＮ末端、および、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９（受入番号ＡＡＬ０１０６０．１）からのタンパク質ＰｆａＡのＮ末端に対して整列させた。
【０１５９】
ドメインＩＩｂ（ＤＮＡ配列比較）：Ｓｏｃｅ５６からの遺伝子ｐｆａ２をシュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８（受入番号Ｕ７３９３５．１）からの遺伝子ｐｆａＡ（＝ｏｒｆ５）の中心部、モリテーラ・マリーナＭＰ−１（受入番号ＡＢ０２５３４２．２）からの遺伝子ｏｒｆ８、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９（受入番号ＡＦ４０９１００．１）からの遺伝子ｐｆａＡに対して整列させた。
【０１６０】
ドメインＩＩｂ（タンパク質配列比較）：Ｓｏｃｅ５６からのタンパク質Ｐｆａ２を、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８（受入番号ＡＡＢ８１１２３．１／１２４４−１７４７ａａ）からのタンパク質ＰｆａＡ（＝ｏｒｆ５）の中心部、モリテーラ・マリーナＭＰ−１（受入番号ＢＡＡ８９３８２．２／１２５１−１７３４ａａ）からのタンパク質Ｏｒｆ８の中心部、および、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９（受入番号ＡＡＬ０１０６０．１／１２２７−１７００ａａ）からのタンパク質ＰｆａＡの中心部に対して整列させた。
【０１６１】
ドメインＩＩｃ（ＤＮＡ配列比較）：Ｓｏｃｅ５６からの遺伝子ｐｆａ２およびＡ．ファスキクラタスからの遺伝子ｐｆａ２を、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８（受入番号Ｕ７３９３５．１／１９１４７−２２１７６ｎｔ）、遺伝子ｐｆａＡ（＝ｏｒｆ５）の３’末端、モリテーラ・マリーナＭＰ−１（受入番号ＡＢ０２５３４２．２／１５２１３−１７９６９ｎｔ）からの遺伝子ｏｒｆ８の３’末端、および、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９（受入番号ＡＦ４０９１００．１／１２５５４−１５１７５ｎｔ）からの遺伝子ｐｆａＡの３’末端に対して整列させた。
【０１６２】
ドメインＩＩｃ（タンパク質配列比較）：Ｓｏからのタンパク質Ｐｆａ２およびＡ．ファスキクラタスからのタンパク質Ｐｆａ２を、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８（受入番号ＡＡＢ８１１２３．１／１７４８−２７５６ａａ）からのタンパク質ＰｆａＡ（＝ｏｒｆ５）のＣ−末端、モリテーラ・マリーナＭＰ−１（受入番号ＢＡＡ８９３８２．２／１７３５−２６５２ａａ）からのタンパク質Ｏｒｆ８のＣ−末端、および、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９（受入番号ＡＡＬ０１０６０．１／１７０１−２５７３ａａ）からのタンパク質ＰｆａＡのＣ−末端に対して整列させた。
【０１６３】
ドメインＩＩＩａ（ＤＮＡ配列比較）：Ｓｏｃｅ５６からの遺伝子ｐｆａ３およびＡ．ファスキクラタスからの遺伝子ｐｆａ３の５’末端を、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８（受入番号Ｕ７３９３５．１／２４５１８−２７８６８ｎｔ）からの遺伝子ｐｆａＣ（＝ｏｒｆ７）の５’末端、モリテーラ・マリーナＭＰ−１（受入番号ＡＢ０２５３４２．２／２０８４７−２４０４４ｎｔ）からの遺伝子ｏｒｆ１０の５’末端、および、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９（受入番号ＡＦ４０９１００．１／１７２７１−２０５２８ｎｔ）からの遺伝子ｐｆａＣの５’末端に対して整列させた。
【０１６４】
ドメインＩＩＩａ（タンパク質配列比較）：Ｓｏｃｅ５６からのタンパク質Ｐｆａ３およびＡ．ファスキクラタスからのタンパク質Ｐｆａ３を、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８（受入番号ＡＡＢ８１１２５．１／１−１１１７ａａ）からのタンパク質ＰｆａＣ（＝ｏｒｆ７）のＮ−末端、モリテーラ・マリーナＭＰ−１（受入番号ＢＡＡ８９３８４．１／１−１０６６ａａ）からのタンパク質Ｏｒｆ１０のＮ−末端、および、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９（受入番号ＡＡＬ０１０６２．１／１−１０８６ａａ）からのタンパク質ＰｆａＣのＮ−末端に対して整列させた。
【０１６５】
ドメインＩＩＩｂ（ＤＮＡ配列比較）：Ｓｏｃｅ５６からの遺伝子ｐｆａ３およびＡ．ファスキクラタスからの遺伝子ｐｆａ３を、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８（受入番号Ｕ７３９３５．１／２７８６９−３０５３２ｎｔ）からの遺伝子ｐｆａＣ（＝ｏｒｆ７）の３’末端、モリテーラ・マリーナＭＰ−１（受入番号ＡＢ０２５３４２．２／２４０４５−２６８８２ｎｔ）からの遺伝子ｏｒｆ１０の３’末端、および、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９（受入番号ＡＦ４０９１００．１／２０５２９−２３１４７ｎｔ）からの遺伝子ｐｆａＣの３’末端に対して整列させた。
【０１６６】
ドメインＩＩＩｂ（タンパク質配列比較）：Ｓｏｃｅ５６からのタンパク質Ｐｆａ３およびＡ．ファスキクラタスからのタンパク質Ｐｆａ３を、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８（受入番号ＡＡＢ８１１２５．１／１１１８−２００４ａａ）からのタンパク質ＰｆａＣ（＝ｏｒｆ７）のＣ−末端、モリテーラ・マリーナＭＰ−１（受入番号ＢＡＡ８９３８４．１／１０６７−２０１１ａａ）からのタンパク質Ｏｒｆ１０のＣ−末端、および、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９（受入番号ＡＡＬ０１０６２．１／１０８７−１９５８ａａ）からのタンパク質ＰｆａＣのＣ−末端に対して整列させた。
【０１６７】
ドメインＩＶ＊（ＤＮＡ配列比較）：Ｓｏｃｅ５６からのｐｆａ３およびＡ．ファスキクラタスからの遺伝子ｐｆａ３の３’末端を、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８（受入番号Ｕ７３９３５．１／２２１７６−２４５１８ｎｔ）からのｐｆａＢ（＝ｏｒｆ６）、モリテーラ・マリーナＭＰ−１（受入番号ＡＢ０２５３４２．２／１８１２６−２０７２３ｎｔ）からのｏｒｆ９、および、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９（受入番号ＡＦ４０９１００．１／１５１７５−１７２７４ｎｔ）からのｐｆａＢの完全な遺伝子配列に対して整列させた。
【０１６８】
ドメインＩＶ＊（タンパク質配列比較）：Ｓｏｃｅ５６からのタンパク質Ｐｆａ３およびＡ．ファスキクラタスからのタンパク質Ｐｆａ３を、シュワネラｓｐ．ＳＣＲＣ−２７３８（受入番号ＡＡＢ８１１２４．１／１−７８０ａａ）からのＰｆａＢ（＝ｏｒｆ６）、モリテーラ・マリーナＭＰ−１（受入番号ＢＡＡ８９３８３．１／１−８６５ａａ）からのＯｒｆ９、および、フォトバクテリウム・プロファンダムＳＳ９（受入番号ＡＡＬ０１０６１．１／１−６９９ａａ）からのＰｆａＢの完全なタンパク質配列に対して整列させた。
【０１６９】
図１は、上記で定義した領域Ｉ、Ｉｌａ、ｌｉｂ、ｌｉｅ、Ｉｌｉａ、ＩＶ、該当する場合は領域ＩｌｌｂおよびＩＶ＊を示す。
【０１７０】
同様に、Ｓｏｃｅ５６およびエーテロバクターからのＰＵＦＡ遺伝子のドメインとシゾキトリウムからのＰＵＦＡ遺伝子のドメインとの比較は、ＰＵＦＡ合成の既知の遺伝子に対する本発明の遺伝子の非常に低い配列相同性を示す。
【０１７１】
表４：シゾキトリウムｓｐ．からのＰＵＦＡ遺伝子／タンパク質に対する粘液細菌性ＰＵＦＡ遺伝子／タンパク質の配列比較
上側のブロック：Ｓｏｃｅ５６対シゾキトリウムｓｐ．
下側のブロック：Ａ．ファスキクラタス対シゾキトリウムｓｐ．＊
2013529912.tif 000012
【０１７２】
††整列されたドメインの定義：Ｓｏｃｅ５６およびエーテロバクター（ＳＢＳｒ００２）からの集団遺伝子のドメインは、配列表の簡単な悦名において記載の通りである。
【０１７３】
シゾキトリウムの比較ドメインは：
ドメインＩａ（ＤＮＡ配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＦ３７８３２８．２／４５００−６１８０ｎｔ）からの遺伝子ｏｒｆＢ（＝サブユニットＢ）の３’末端。
【０１７４】
ドメインＩａ（タンパク質配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＡＫ７２８８０．２／１５００−２０５９ａａ）からのタンパク質ＯｒｆＢ（＝サブユニットＢ）のＣ−末端。
【０１７５】
ドメインＩｂ（ＤＮＡ配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＦ３７８３２９．２／２８４８−４５０９ｎｔ）からの遺伝子ｏｒｆＣ（＝サブユニットＣ）の３’末端。
【０１７６】
ドメインＩｂ（タンパク質配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＡＫ７２８８１．２／９５０−１５０２ａａ）からのタンパク質ＯｒｆＣ（＝サブユニットＣ）のＣ−末端。
【０１７７】
ドメインＩＩａ（ＤＮＡ配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＦ３７８３２７．２／１−３６９９ｎｔ）からの遺伝子ｏｒｆＡ（＝サブユニットＡ）の５’末端。
【０１７８】
ドメインＩＩａ（タンパク質配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＡＫ７２８７９．２／１−１２３３ａａ）からのタンパク質ＯｒｆＡ（＝サブユニットＡ）のＮ−末端部分。
【０１７９】
ドメインＩＩｂ（ＤＮＡ配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＦ３７８３２７．２／３７００−６１９８ｎｔ）からの遺伝子ｏｒｆＡ（＝サブユニットＡ）。
【０１８０】
ドメインＩＩｂ（タンパク質配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＡＫ７２８７９．２／１２３４−２０６６ａａ）からのタンパク質ＯｒｆＡ（＝サブユニットＡ）。
【０１８１】
ドメインＩＩｃ（ＤＮＡ配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＦ３７８３２７．２／６１９９−８７３３ｎｔ）からの遺伝子ｏｒｆＡ（＝サブユニットＡ）の３’末端。
【０１８２】
ドメインＩＩｃ（タンパク質配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＡＫ７２８７９．２／２０６７−２９１０ａａ）からのタンパク質ＯｒｆＡ（＝サブユニットＡ）のＣ−末端部分。
【０１８３】
ドメインＩＩＩａ（ＤＮＡ配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＦ３７８３２８．２／１−３１５０ｎｔ）からの遺伝子ｏｒｆＢ（＝サブユニットＢ）の５’末端。
【０１８４】
ドメインＩＩＩａ（タンパク質配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＡＫ７２８８０．２／１−１０５０ａａ）からのタンパク質ＯｒｆＢ（＝サブユニットＢ）のＮ−末端部分。
【０１８５】
ドメインＩＩＩｂ（ＤＮＡ配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＦ３７８３２９．２／１−２８４７ｎｔ）からの遺伝子ｏｒｆＣ（＝サブユニットＣ）の５’末端。
【０１８６】
ドメインＩＩＩｂ（タンパク質配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＡＫ７２８８１．２／１−９４９ａａ）からのタンパク質ＯｒｆＣ（＝サブユニットＣ）のＮ−末端部分。
【０１８７】
ドメインＩＶ（ＤＮＡ配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＦ３７８３２８．２／３１５１−４４９７ｎｔ）からの遺伝子ｏｒｆＢ（＝サブユニットＢ）の中央領域を、ソランギウムのドメインＩＶ＊、ならびにエーテロバクターのドメインＩＶおよびＩＶ＊とそれぞれ比較した。
【０１８８】
ドメインＩＶ（タンパク質配列比較）：シゾキトリウムｓｐ．ＡＴＣＣ＿２０８８８（受入番号ＡＡＫ７２８８０．２／１０５１−１４９９ａａ）からのタンパク質ＯｒｆＢ（＝サブユニットＢ）の中央領域を、ソランギウムのドメインＩＶ＊、ならびにエーテロバクターのドメインＩＶおよびＩＶ＊とそれぞれ比較した。
【０１８９】
ＤＮＡおよびタンパク質レベルのＰＵＦＡ遺伝子間の配列比較は、本発明のドメイン、遺伝子、および遺伝子集団間で、特に、ソランギウムのドメイン、遺伝子、および遺伝子集団の群の範囲内、ならびに、エーテロバクターのドメイン、遺伝子、および遺伝子集団の群の範囲内それぞれにおいて、顕著な配列相同性を示す。
【０１９０】
以下の表５は、エーテロバクターＳＢＳｒ００２およびＳＢＳｒ００８（上側のブロック）のドメイン、エーテロバクターＳＢＳｒ００２およびＳＢＳｒ００３（中央のブロック）のドメイン、ならびにエーテロバクターＳＢＳｒ００８およびＳＢＳｒ００３（下側のブロック）のドメインについての配列比較の結果を示す。
【０１９１】
以下の表６は、ソランギウム、Ｓｏｃｅ５６およびＳｏｃｅ３７７のドメインについての配列比較の結果を示す。
【０１９２】
これらの比較において使用されるドメインは、配列表に記載のものである。
【０１９３】
表５：エーテロバクターの粘液細菌性ＰＵＦＡ遺伝子／タンパク質の比較
2013529912.tif 000013
【０１９４】
表６：ソランギウムの粘液細菌性ＰＵＦＡ遺伝子／タンパク質の比較
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【０１９５】
これらの解析は、ソランギウムの遺伝子の群について、および、エーテロバクターの遺伝子の群について、ソランギウムとエーテロバクターとの間において、特に、ドメインＩＶ＊に関して見出された著しい程度の配列同一性との組み合わせで、ＰＵＦＡ遺伝子集団ドメインの顕著な程度の同一性をそれぞれ示す。
【０１９６】
さらに、ソランギウムおよびエーテロバクターのＰＵＦＡ合成遺伝子集団のドメインは、以下の表７に示すような高いタンパク質同一性および類似性を有し、これは、例えば、既知の生物体の関連領域およびドメイン、例えば、表３に示すようなシュワネラ、モリテーラ・マリーナ、およびフォトバクテリウム・プロファンダムの機能的に類似したドメイン、および、表４に示すようなシゾキトリウムに対するソランギウムおよびエーテロバクターのそれぞれのタンパク質同一性および類似性よりも著しく高い。
【０１９７】
表７：ソランギウムおよびエーテロバクターの粘液細菌性ＰＵＦＡ遺伝子／タンパク質の比較
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【０１９８】
したがって、本発明のＰＵＦＡ合成経路酵素は、ＡＧＰＡＴ活性を有するドメインとアミノ酸配列とを含み、アミノ酸配列は、本明細書に記載のようなソランギウムおよび／またはエーテロバクターのドメインＩＶ＊の少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも２２％、好ましくは少なくとも２４％、より好ましくは少なくとも２９％または３１％、最も好ましくは少なくとも５０％、８５％、９０％または少なくとも９５％の同一性があるものとする。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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