(57)【要約】  本発明は、桂枝、牛蒡子、蔓荊子、金銀花、五加皮、ライフクシ、オウギ及び麦芽の抽出物または分画物、及びこれを含有する組成物に関する。また、本発明は、前記組成物の癌治療または予防用度、発毛促進または脱毛防止用度に関する。また、本発明は、前記組成物の製造方法に関する。【選択図】図１
2013533888.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
桂枝(Cinnamomumaromaticum)、牛蒡子(Arctiumlappa)、蔓荊子(Viticisfructus)、金銀花(Lonicerajaponica)、五加皮(Acanthopanax gracilistylis)、ライフクシRaphanussativus)、オウギ(Astragalusmembranaceus)及び麦芽(Hordeum vulgare)の抽出物または分画物。
【請求項２】
第１項による抽出物または分画物を含有することを特徴とする癌治療または予防用組成物。
【請求項３】
第１項による抽出物または分画物を含有することを特徴とする発毛促進または脱毛防止用組成物。
【請求項４】
前記癌は、乳癌、前立腺癌、肺癌、肝癌、膵臟癌、皮膚癌、大腸癌、骨肉腫または脳腫瘍であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記桂枝、牛蒡子、蔓荊子、金銀花、五加皮、ライフクシ、オウギ及び麦芽が、４〜５：２：４〜７：２〜４：２〜３：２〜８：２：４〜７の比率で含有されることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記桂枝の抽出物または分画物には、２−メチル酪酸(2-MethylbutyricAcid)が、含まれることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記牛蒡子の抽出物または分画物には、アルクチゲニン−４−Ｏ−グルコシド、３、５、７、９−テトラリンまたはアラニンが、含まれることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記蔓荊子の抽出物または分画物には、ヴィテクシカルピン(vitexicarpin)またはヘスペリジンが、含まれることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記金銀花の抽出物または分画物には、ルテオリン-7-ラムノグルコシド、サポニン、ピネン、トランス-ゲラニオール、リナロールまたはクロロゲン酸が、含まれることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記五加皮の抽出物または分画物には、コッパーが、含まれることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記ライフクシの抽出物または分画物には、シニグリンが、含まれることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記オウギの抽出物または分画物には、３’-ヒドロキシフォルモノネチン(hydroxyformononetin)、ケンペロールまたは水が、含まれることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記麦芽の抽出物または分画物には、バリンが、含まれることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
a）桂枝(Cinnamomum aromaticum)、牛蒡子(Arctium lappa)、蔓荊子(Viticis fructus)、金銀花(Lonicera japonica)、五加皮(Acanthopanax gracilistylis)、ライフクシ(Raphanus sativus)、オウギ(Astragalus membranaceus)及び麦芽(Hordeum vulgare)を、水と一緒に抽出装置に入れる段階と、
b）前記抽出装置を加熱し、抽出液を取得する段階とを含む抽出液を含む組成物の製造方法。
【請求項１５】
前記ｂ）段階において、使用される水は、逆浸透圧メンブレンフィルター方式の浄水システムによって精製された水であることを特徴とする、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記ａ）段階において、使用される水は、逆浸透圧メンブレンフィルター方式の浄水システムによって精製された水であることを特徴とする、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記ｂ）段階において、取得された抽出液を、１００〜１５０℃の水で濾過する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記精製段階以後に、７０〜１００℃の水で濾過する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記精製段階以後に、４０〜６０℃の水で濾過する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記精製段階以後に、１５〜３０℃の水で濾過する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記精製段階以後に、−１〜１５℃の水で濾過する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記濾過に使用されたフィルターは、空隙の大きさが、１０−６ｍ以下であることを特徴とする、請求項１７〜２１のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、桂枝、牛蒡子、蔓荊子、金銀花、五加皮、ライフクシ、オウギ及び麦芽の抽出物または分画物に関する。また、本発明は、前記抽出物または分画物を含有する組成物に関する。また、本発明は、前記組成物の癌治療または予防用度、発毛促進または発毛防止用度に関する。また、本発明は、前記組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、全世界的に益々増加している深刻な実病の一つである。癌は、非正常細胞の成長及び拡散が調節できない特徴を持ち、身体のすべての器官及び組織に副作用をもたらせ、最後には死まで至ることもある。癌の開始及び進行には、多数の因子が原因となっているため、癌の治療を困難にする要因の一つである。また、子供の癌の発病率が、最近増加している。アメリカで、癌は、２００７年、約１，４４４，０００の新しいケースが診断されている。この統計には、膀胱を除いた任意の部位の非浸透性癌が含まれておれず、基底及び扁平上皮細胞の皮膚癌も含まれていない。
【０００３】
癌の分子状態での診断は、正常細胞より癌細胞にもって高い水準で発現する抗原またはたんぱく質のバイオマーカー分子、或いは新規合成されたバイオマーカー分子に依存する。このようなバイオマーカーは、腫瘍細胞によって直接製造されるか、または癌の存在に反応する身体によって製造できる。患者のサンプルでのバイオマーカーの探知は、癌の診断にとって重要な段階であり、また、癌の初期段階で癌を検診できる能力は、癌患者の生存率を増加させる。現在、癌治療のために利用される様々な類型の抗癌剤があり、これらは多様なカテゴリとして分類される。最も多く使用される抗癌剤のカテゴリ分類及びその例の一つが、下記に記載されている。
【０００４】
癌の分子状態での診断は、
（１）DNA損傷剤：ドキソルビシン(doxorubicin)は、引接ヌクレオチド(nucleotide)に挿入され、RNAとDNAの合成を遮断する作用をするアントラサイクリン（anthracycline）抗生物質である。このような作用を達成するために、ドキソルビシンは、DNAと薬物の間の強い相互作用を形成させ、またDNA合成に必修的な酵素であるトポイソメラーゼIIを抑制する。ドキソルビシンの物質代謝は、脂質膜の過酸化を引起す自由酸素ラジカルを生成し、カルシウムは、心臓組織から排出されるが、これによって心筋毒性を引起す。ドキソルビシンの重要な臨床問題点は、薬物の耐性である。このような副作用にもかかわらず、ドキソルビシンは、広範囲な癌に対して使用される最も幅広く使用されるアントラサイクリンである。
【０００５】
（２）アルキル化剤：シクロホスファミド(cyclophosphamide)は、最も平凡に使用されるアルキル化剤である。シトクロムP-450の作用によって、シクロホスファミドは、ヒドロキシル化中間体に変換され、活性ホスホラミドマスタード(phosphoramide mustard)及びアクロレイン(acrolein)を形成する。ホスホラミドマスタードは、鎖内/鎖間のDNA架橋結合を引起し、これによって広範囲な癌細胞の細胞死滅をもたらす。シクロホスファミドは、発癌性を持っているため、他の癌を進行させる危険性を増加させ、免疫系を抑制する。
【０００６】
（３）微細小管抑制剤(MI)：MIは、微細小管力学の機能を妨害させ、細胞周期の阻止及び細胞自滅を引起す。タキサン類(taxane)(パクＬキセル(paclitaxel)及びドセタキセル(docetaxel))は、微細小管重合製剤であり、ビンカアルカロイド(vinca alkaloid)は、微細小管脱重合製剤である。タキサン類は、乳癌治療に最も使われる活性剤である。パクＬキセルは、β-チューブリン(tubulin)に結合し、微細小管重合及び安定性をもたらし、中期から後期への進行を抑制し、細胞自滅を誘導する。ドセタキセルは、２世代のタキサンであり、パクＬキセルと同じ結合部位を持ち、親和度がもっと高い。ドセタキセルは、細胞毒性が、パクＬキセルより２乃至４倍高いことが立証された。
【０００７】
（４）ビンカアルカロイド：ンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ポドフィロトキシン、及びノコダゾールは、微細小管末端に対して高い親和度を持ちながら結合され、動原体に微細小管が付着されることを妨害する。これは、微細小管接合の抑制をもたらし、微細小管を不安定化させ、細胞自滅を誘導する。これは、タキサン類と結合部位を共有しない。このようなMIは、一般的にドキソルビシン、シクロホスファミド治療に対して、補助治療剤として使用される。
【０００８】
（５）アロマターゼ 抑制剤(AI)：アロマターゼは、アンドロゲンをエストロゲンに転換させ、これによって局部エストロゲン濃度が増加される。これは、乳癌に対して、発癌の役割をする可能性がある。アロマターゼ抑制剤は、アロマターゼを抑制するが、卵巣からエストロゲンを生成することを遮断しなく、閉経期後の女性にだけ作用する。アロマターゼ抑制剤は、心血官系及び骨からエストロゲンの減少を引起す可能性がある。したがって、心臓問題及び骨粗鬆症が、重要な副作用となる。
【０００９】
（６）非ステロイド性ホルモン治療剤：タモキシフェンは、ER-陰性乳癌患者を除いて、骨、子宮及びコレステロール水準でエストロゲン性効果を持っている一方、乳房で正常信号伝達を破壊し、ER α/βに直接結合するとこで、抗エストロゲン性効果を示す選択的なエストロゲン受容体調節剤(SERM)として作用する。子宮に対するプロエストロゲン効果は、タモキシフェンで治療された乳癌患者に対して、子宮癌の進行可能性を増加させる。ラロキシフェンは、次世代のSERMとして、乳房と子宮の両方に対して、抗エストロゲン効果を持っている。従って、子宮内膜の成長が刺激されない。ラロキシフェンは、２００７年にFDAで承認され、危険来暦が高い閉経期後の女性に対して、浸襲性乳癌の危険及び骨粗鬆症を予防する。ラロキシフェンは、骨及び心臓に対して、プロエストロゲン効果を持ち、コレステロールを下げる。
【００１０】
前記記載の治療剤は、すべて癌細胞を死滅させながら、正常細胞も類似に死滅させる共通点も持っている。また、患者の人生の質を落す副作用が存在する。
【００１１】
最近、さらに２つの有望な抗腫瘍剤が開発された。トラスツズマブ(ハーセプチン)は、erbB-2(her2/neu)受容体に結合するように特異的に設計されたモノクローナル抗体である。これは、リガンドと受容体の結合を妨害することによって、細胞外成長信号を抑制する。トラスツズマブは、抗体依存性細胞性細胞毒性を誘導することができる。しかし、トラスツズマブの耐性は、細胞質の信号伝達の水準で発見され、ペルツズマブのような追加的なモノクローナル抗体が、erbB受容体信号を上昇的に遮断するために必要である。有望なもう一つの薬物は、チロシンキナーゼ抑制剤グリベック(イマチニブ メシレート)である。イマチニブは、多数のチロシンキナーゼ酵素の特異的な抑制剤として作用する2-フェニルアミノピリミジン誘導体である。これは、TK 活性部位を占有することで、その機能を発揮し、活性の減少をもたらす。イマチニブは、abl(アベルソン原始腫瘍遺伝子)、c-kit及びPDGF-R(血小板-誘導成長因子の受容体)で、TKドメインに対して特異的である。イマチニブは、bcr-ablのATP結合部位に結合し、蛋白質の酵素活性を競争的に抑制することによって作用する。イマチニブは、bcr-ablに対して選択的であり、また前記記載の他のターゲット(ckit及びPDGF-R)を抑制する。しかし、グリベックを使って治療された患者には、心臓問題、貧血及び他の副作用を発生させた。
【００１２】
従って、細胞を死滅させる数多くの方法を知っているとしても、標的癌細胞を特異的に死滅させる同時に、副作用及び細胞毒性を大幅に減少させる抗癌剤の開発が要求されている。
【００１３】
前記記載した通りに、これまで開発された抗癌剤は、抗癌効果が優れた場合は、毒性があまりにも強すぎて、身体機能が弱い子供、老人や病弱な人または末期癌の患者には、適切ではない問題点を持っている。また、毒性が低い場合には、抗癌効果が低下するか抗癌効果を短い時間内に出せない問題点があった。また、殆どの従来の抗癌剤は、血液毒性、胃腸毒性、神経毒性、皮膚毒性、脱毛、不妊などの副作用を伴う。さらに、従来の抗癌剤は、癌細胞と正常細胞を区分できないため、癌細胞以外の正常細胞までも破壊してしまう。特に、パクＬキセルは、全世界的に多く使用されている抗癌剤の一つであるが、これは、難溶性物質であり、蒸留水に殆ど分散されない。従って、これを注射剤として使用するためには、他の物質を混合して使用しなければならないため、臨床的にこのような物質の過量投与は、心臓毒性と過敏反応を発生させると報告されている。
【００１４】
一方、脱毛症(Baldness)とは、身体の毛、その中にも特に髪の毛が不足な状態を意味する。これは、身体の内分泌系の異常による円形脱毛症と遺伝的な気質によって発現される男性形脱毛症と区分される。毛嚢細胞が完全に破壊され、もう髪の毛が生える可能性がなく、額線が後退し、外形から見て、正常人とはっきり区分が可能な場合には、はげ頭という。男性形脱毛症の場合、現代医学でも特に解決策はない。フィナステライドとミノキシジルは、FDA公認が出たが、脱毛減少の進行を遅くするだけで、根本的な治療剤は、未だに存在しない。５０代以後の男性の脱毛は、外見と社会生活にそこまで深刻な悪影響をもたらすわけではない。しかし、２０、３０代の若い男性または女性の場合、脱毛は憂鬱症まで引起し、求職と結婚及び社会生活に大きな否定的な影響を与える可能性もある。また、脱毛症は、親世代から子世代に引き継かれる遺伝的な性向が強い疾患である。また、毛髪移植手術は、費用が高すぎるため、まだ大衆的に利用されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、従来の抗癌剤の問題を解決するために、癌細胞のように異常増殖された変異細胞だけを除去し、かえって正常細胞を活性化させ、損傷された正常細胞を復旧し、毒性がなく、末期癌の患者のように身体機能が弱くなった人にも適切に適用でき、温和な条件で製造が可能であり、従来の有機溶媒を使用する製造方法に比べて安全で親水性薬物であり、注射剤と経口の両方として利用でき、薬の効果が出るスピードが大変速い薬学組成物を提供することである。
【００１６】
本発明のもう一つの目的は、脱毛症を根本的に治療し、予防できる組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、桂枝、牛蒡子、蔓荊子、金銀花、五加皮、ライフクシ、オウギ及び麦芽の抽出物または分画物、及びこれらを含有する組成物に関する。
【００１８】
また、本発明は、前記組成物の癌治療または予防用度に関する。前記癌には、乳癌、前立腺癌、肺癌、肝癌、膵臟癌、皮膚癌、大腸癌、骨肉腫、脳腫瘍などが含まれるが、これに限定されず、本発明による組成物は、すべての種類の癌に効果がある。
【００１９】
また、本発明は、前記組成物の脱毛防止または発毛促進の用度に関する。
【００２０】
また、本発明は、下記の段階を含む抽出物を含有する組成物の製造方法に関する：a）桂枝、牛蒡子、蔓荊子、金銀花、五加皮、ライフクシ、オウギ及び麦芽を不織布で密封し、これを水と一緒に抽出装置内に入れる段階；及びb）前記抽出装置を加熱し、抽出液を収得する段階。
【００２１】
本発明の一実施例によると、前記a)段階で使われる水は逆浸透圧メンブレンフィルター方式の浄水システムによって精製された水である。
【００２２】
本発明の一実施例によると、前記a）段階で密封された不織布は、他の不織布でさらに密封される。
【００２３】
本発明の一実施例によると、前記b）段階での加熱温度は、１００〜１２０℃であり、加熱時間は、４〜５時間である。
【００２４】
本発明の一実施例によると、前記b)段階で収得された抽出液を１００〜１５０℃の水で濾過し、好もしくは前記濾過後に７０〜１００℃の水で追加濾過し、より好もしくは前記濾過後に４０〜６０℃の水で追加濾過し、もっと好ましくは前記濾過後に１５〜３０℃の水に追加濾過し、特に好ましくは前記濾過後に−１〜１５℃の水で追加濾過する。ここで、前記濾過に使用されたフィルターは、空隙の大きさが１０-６m以下であることが好ましい。
【００２５】
本発明による組成物は、非経口(皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、胸膜内、小胞内、または包膜内)、局所、経口、直腸または鼻腔経路で投与できる。本発明による組成物の投与量及び投与間隔は、治療対象である疾患の類型、患者の年齢、患者の体重のように様々な因子によって変わる。
【００２６】
桂枝(Cinnamomum aromaticum)は、一般的に熱を下げ、熱毒を除去することによって、体内の熱を調節し、薬の吸収や効果を促進させるために使用されると知られている。前記桂枝の抽出物または分画物には、2-メチル酪酸(MethylbutyricAcid)が構成成分として含有されている(Dr. Duke's Phytochemical and Ethnobotanical Databases [Online Database]参照)。
【００２７】
牛蒡子(Arctium lappa)は、一般的に神経伝達を円滑にさせ、脾臓を刺激して、その機能を促進し、ホルモンの分泌を促進させると知られている。前記牛蒡子の抽出物または分画物には、アルクチゲニン-4-O-グルコシド、3、5、7、9-テトラリン及びアラニンが構成生物として含有されている(Dr. Duke's Phytochemical and EthnobotanicalDatabases [Online Database]参照)。
【００２８】
蔓荊子(Viticis fructus)は、一般的にリンパ液の生成、リンパ昨日の活性化、心臓機能の向上、血液の浄化に有効であることが知られている。前記蔓荊子の抽出物または分画物には、ヴィテクシカルピン(vitexicarpin)及びヘスペリジンが構成成分として含有されている(“蔓荊子の成分分析”、生薬学会紙 Kor.J.Pharmacogn２５（３）：２１４〜２２０(１９９４)、カンサムシクなど参照)。
【００２９】
金銀花(Lonicera japonica)は、一般的にホルモン調節機能を刺激し、視床下部に影響を与え、運動中枢にも刺激を与えると知られている。前記金銀花の抽出物または分画物には、ルテオリン-7-ラムノグルコシド、サポニン、ピネン、トランス-ゲラニオール、リナロール(linalol)及びクロロゲン酸が構成成分として含有されている(Dr. Duke's Phytochemical and EthnobotanicalDatabases [Online Database]参照)。
【００３０】
五加皮(Acanthopanax gracilistylis)は、一般的に首の炎症や睾丸の質病に利用され、T-ヘルパー細胞を活性化させ、浄化すると知られている。前記五加皮の抽出物または分画物には、コッパー(copper)が構成成分として含有されている(Dr. Duke'sPhytochemical and Ethnobotanical Databases [OnlineDatabase]参照)。
【００３１】
ライフクシ(Raphanus sativus)は、一般的に血管が弱くなった場合に使用され、神経系の外膜を復旧するための増殖細胞に影響を与えると知られている。前記ライフクシの抽出物または分画物には、シニグリンが構成成分として含有されている(Dr. Duke's Phytochemical and EthnobotanicalDatabases [Online Database]参照)。
【００３２】
オウギ(Astragalus membranaceus)は、一般的に胃液の過渡な酸性化を塞げ、胃を楽にし、これによって神経が回復する効果があると知られている。前記オウギの抽出物または分画物には、3'-ヒドロキシフォルモノネチン(hydroxyformononetin)、ケンペロール及び水が構成成分として含有されている(Dr. Duke's Phytochemical and EthnobotanicalDatabases [Online Database]参照)。
【００３３】
麦芽(Hordeum vulgare)は、一般的に胃の機能を補助し、胃の状態が良好でなく、胃液の分泌が減少した場合に使用されると知られている。前記麦芽の抽出物または分画物には、バリンが構成成分として含有されている(Dr. Duke's Phytochemical and EthnobotanicalDatabases [Online Database]参照)。
【００３４】
本発明による薬学組成物は、人体内に投与した時、神経伝達物質を全体的に活性化させ、脾臓の機能を向上させ、血液を浄化する。すなわち、身体の神経伝達物質とホルモンの分泌を促進し、活性化させ、これによって脾臓の活動が促進され、体熱が下がる。また、本発明による薬学組成物は、人体内のリンパ球の機能を全体的に向上させ、脾臓内のリンパ球と大食細胞を増殖させることによって、リンパと血液が浄化される。癌患者は、全体的に身体機能が低下しているか合併症を有している場合が多いため、毒性が強い従来の抗癌剤を耐えることが困難であるが、本発明による組成物は、毒性がないため、正常細胞を害することなく、むしろ低下された患者の身体機能を向上させ、抗癌治療に有利な身体状態を形成させる効果がある。したがって、本発明による組成物は、末期癌患者にも副作用や薬物によるショックを発生させずに使用できる。
【００３５】
また、本発明による組成物は、人体内に投与する時、癌細胞が一時的に活動を止め、組織の構成が、黒い枠を持つ多角形の形に変化して、細胞が裂けて死滅する。また、本発明による組成物は、骨髄を刺激し、NK及びNKT細胞を生成し、これによってT細胞、B細胞へ分化され、血液が及ぶすべての範囲内の癌細胞を除去する効果が発見された。
【発明の効果】
【００３６】
本発明による組成物は、すべての癌を治療または予防出来る効果を持つ。特に、本発明による組成物は、癌細胞と正常細胞を区分すること出来なかった従来の抗癌剤と違って、癌細胞のように異常増殖した変異細胞だけを除去し、むしろ正常細胞を活性化させ、損傷された正常細胞を復旧する。また、本発明による組成物は、薬の効果が出るスピードが大変早く、癌または合併症によって弱化された身体機能を回復する作用が有るため、末期癌患者に対して有用性が大変高いだけではなく、子供、老人や病弱な人に投与するに適合する。また、本発明による組成物は、体内で潜伏している腫瘍を除去し、血液内の免疫細胞を強化させるため、癌の発病を予防できる。
【００３７】
また、本発明による組成物は、脱毛を防止し、発毛を促進する効果を持ち、毛髪を移植する時に必要な費用を節減でき、頭のはげた患者にも毛髪が出る効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、細胞株HCC 1419に対して、各々第１週(LC50)の間に測定した細胞数と、第２週(回復期)の間に測定した細胞数とを図示したグラフである。ここで、横軸は、培養時間を示し、縦軸は、細胞数の1/20の値を示す図である。
【図２】図２は、細胞株HCC 1419に対して、各々第１週(LC50)の間に測定した細胞数と、第２週(回復期)の間に測定した細胞数とを図示したグラフである。ここで、横軸は、培養時間を示し、縦軸は、細胞数の1/20の値を示す図である。
【図３】図３は、細胞株 HCC 1419に対して、波長500nmで、XTT分析方法を実施し、各々第１週(LC50)の間の生存度と、第２週(回復期)の間の生存度を図示したグラフである。ここで、横軸は、培養時間を示し、縦軸は、生存度(%)の1/100の値を示す図である。
【図４】図４は、細胞株 HCC 1419に対して、波長500nmで、XTT分析方法を実施し、各々第１週(LC50)の間の生存度と、第２週(回復期)の間の生存度を図示したグラフである。ここで、横軸は、培養時間を示し、縦軸は、生存度(%)の1/100の値を示す図である。
【図５】図５は、細胞株 HCC 1419に対して、波長500nmで、XTT分析方法を実施し、各々第1週(LC50)の間の細胞毒性と、第２週(回復期)の間の細胞毒性とを図示したグラフである。ここで、横軸hは、培養時間を示し、縦軸は、細胞毒性(%)の1/100の値を示す図である。
【図６】図６は、細胞株 HCC 1419に対して、波長500nmで、XTT分析方法を実施し、各々第1週(LC50)の間の細胞毒性と、第２週(回復期)の間の細胞毒性とを図示したグラフである。ここで、横軸hは、培養時間を示し、縦軸は、細胞毒性(%)の1/100の値を示す図である。
【図７】図７は、細胞株 HMEに対して、第1週(LC50)の間に測定した細胞数を図示したグラフである。ここで、横軸は、培養時間を示し、縦軸は、細胞数の1/20の値を示す図である。
【図８】図８は、細胞株 BJに対して、第1週(LC50)の間に測定した細胞数を示したグラフである。ここで、横軸は、培養時間を示し、縦軸は、細胞数の1/20の値を示す図である。
【図９】図９は、細胞株 MDA-MB-231に対して、XTT分析結果として細胞生存度を示したグラフである。横軸は、試料を添加してから１２時間後、８４時間後、１０８時間後、１３２時間後を各々示し、縦軸は、(試料処理群のXTT値−ブランクのXTT値)を示す図である。
【図１０】図１０は、細胞株TTU-1に対して、XTT分析結果として細胞生存度を示したグラフである。横軸は、試料を添加してから１２時間後、８４時間後、１０８時間後、１３２時間後を各々示し、縦軸は、(試料処理群のXTT 値−ブランクのXTT値)を示す図である。
【図１１】図１１は、細胞株A549に対して、MTT分析結果として細胞生存度を示したグラフである。横軸は、試料を添加してから２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後を各々示し、縦軸は、試料処理群のMTT値を示す図である。
【図１２】図１２は、細胞株HepG2のMTT分析結果として細胞生存度を示したグラフである。横軸は、試料を添加してから２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後を各々示し、縦軸は、試料処理群のMTT値を示す図である。
【図１３】図１３は、細胞株HCT-15に対して、本発明による抽出物またはPBSで処理してから２４時間後、４８時間後、７２時間後に各々撮影した形状を示す写真である。上の写真２つは、本発明による抽出物で処理した群をH&Eで染色したものであり、下の写真２つは、PBSで処理した群をH&Eで染色したものである。
【図１４】図１４は、細胞株HCT-15に対して、本発明による抽出物またはPBSで処理してから２４時間後、４８時間後、７２時間後に各々撮影した形状を示す写真である。上の写真２つは、本発明による抽出物で処理した群をH&Eで染色したものであり、下の写真２つは、PBSで処理した群をH&Eで染色したものである。
【図１５】図１５は、細胞株HCT-15に対して、本発明による抽出物またはPBSで処理してから２４時間後、４８時間後、７２時間後に各々撮影した形状を示す写真である。上の写真２つは、本発明による抽出物で処理した群をH&Eで染色したものであり、下の写真２つは、PBSで処理した群をH&Eで染色したものである。
【図１６】図１６は、５週齢の雌ヌードマウス(BALB/c nu/nu)に対して、本発明の抽出物を含む組成物を投与してから１４日後に撮影した写真である。
【図１７】図１７は、５週齢の雌ヌードマウス(BALB/c nu/nu)対して、本発明の抽出物を含む組成物を投与してから２１日後に撮影した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明による組成物の効果について、実施例及び図面に基づいて説明する。但し、本発明を実施例及び図面に限定する趣旨はなく、当業者であれば、本発明の範囲内で多様な変更をして本発明を実施することができる。
【００４０】
（実施例１）
桂枝、牛蒡子、蔓荊子、金銀花、五加皮、ライフクシ、オウギ及び麦芽を準備し、これを、秤を利用して含量を称量した。続いて、前記桂枝４g、牛蒡子２g、蔓荊子４g、金銀花２g、五加皮２g、ライフクシ２g、オウギ２g、及び麦芽４gを、潔い不織布の袋に入れ、袋の入口を密封した。前記不織布は、スパンボンド不織布SSを使用した。
【００４１】
続いて、水180Ｌが入っている抽出装置内に前記密封された不織布の袋を固定させる。ここで、水は逆浸透圧メンブレンフィルター方式の浄水システムによって精製された水を使用した。
【００４２】
その後、前記抽出装置を１００〜１１０℃で加熱した。水が沸き始めるまで約１時間が所要され、それから４時間を追加加熱した。その時、発生した水蒸気の一部は、抽出装置の上端部の排出口を通じて外部へ排出させ、水蒸気の一部は冷却機を通じて冷却した後、抽出装置に再注入した。ここで、水蒸気の一部を排出したことは、生薬材料に含まれている任意の有害物質を除去するためである。
【００４３】
４時間の追加加熱が完了した後、収得された抽出液を、空隙の大きさが10-6m以下であるフィルターを使用して１００〜１５０℃の水、７０〜１００℃の水、４０〜６０℃の水、１５〜３０℃の水、-１〜１５℃の水で、連続的に濾過した。
【００４４】
（実施例２）
桂枝４g、牛蒡子２g、蔓荊子４g、金銀花４g、五加皮２g、ライフクシ２g、オウギ２g、及び麦芽４gを使用したことを除いて、実施例１と同一に遂行し、抽出物を収得した。
【００４５】
（実施例３）
抽出装置を１１０〜１２０℃で加熱し、水が沸き始めてから５時間を追加加熱したことを除いて、実施例１と同一に遂行し、抽出物を収得した。
【００４６】
（実施例４）
癌細胞株に属するHCC1419と正常細胞株に属するHME 50 HT及びBJに対して、物質代謝(XTT分析方法)及び細胞死滅(セルカウント)の変化程度を実験した。各々の細胞株に対しては、下記表１に示された培養培地で培養した。
【００４７】
【表１】
2013533888.tif 000003
【００４８】
前記表１において、DMEMはDulbecco's Minimum Essential Mediumの略字である。
【００４９】
正常細胞株に対しては、２０，０００個の細胞の密度で、癌細胞株に対しては、１０，０００−２０，０００個の細胞の密度で、48-ウェルCorning CellBindTMプレートに細胞を播種し、播種から２４乃至４８時間後に、本発明による抽出物を精製水で２０倍希釈し、前記培養細胞に添加し、本発明による組成物が、最初に投与された時間を０hとした。本発明による組成物が、最初に投与された時から３日目に、細胞培養液を交替しながら、本発明による組成物を同一な濃度で培養培地に添加した。
【００５０】
一方、陽性対照群として、タキソールを播種してから２４乃至４８時間後に、2.2e-7Mの濃度で２４時間の間に並行培養細胞に添加させ、陰性対照群として培養培地には、いかなる物質も添加しなかった。
【００５１】
細胞数の測定(cell count)：
各時点で、トリプシン-EDTAを使用して細胞を採取した。各々のウェルで総細胞数を、Beckman-Coulter Z1 ParticleCharacterization Unitを使用して測定した場合、本明細書に添付された図のグラフにおいて、縦軸は、細胞数の1/20の値として表示した。細胞株に対して各々２個の48-ウェルプレートを使用し、ウェル内で生存細胞の細胞数を0h、12h、24h、48h、4d及び7dで測定した。第１のプレートにおいて、細胞を０h及び３dで本発明による組成物で処理し、培地を交換し、タキソールは２４時間処理した。これによって第1週のLC-50曲線を得た。第２のプレートにおいて、第１週(LC-50)7dは、第２週(回復期)0hと同一である。回復期 0hで、LC-50 7dの残余物に対して、培地を非処理培地に交換した。非処理群は、第１週末期に過剰生産されるため、回復期で測定しなかった。これによって、第２週の回復曲線を得た。
【００５２】
（１）HCC1419
細胞株 HCC 1419は、原発性乳管上皮癌細胞株である。この細胞は、低分化型であり、Her2-neu過剰発現、p53を発現しない。HCC1419は、上皮細胞の特定マーカーである上皮糖たんぱく質２(EGP2:epithelialglycoprotein 2)とシトケラチン19を表現するが、エストロゲンレセプター及びプロゲステロンレセプターを表現しない。
【００５３】
XTT 細胞生存度分析(XTT Cell Viability Assay)は、抗癌剤または他の薬学化合物の生存度/細胞毒性に対する分析方法と知られている。正常細胞株に対しては、１０，０００個の細胞の密度で、癌細胞株に対しては５，０００個の細胞の密度で、96-ウェル組織培養プレートに細胞を播種した。培養期間の間に形成されたホルマザン(formazan)塩を、ELISAリーダーを利用して定量した。最適な波長として500nmを使用使用し、0h、12h、24h、48h、4d及び7dで、各々測定した。これによって定量された値は、ソフトウェアSoftMax Pro 4.8を利用して獲得した。
【００５４】
XTT分析による細胞毒性(cytotoxicity)測定に関して、製造社の指示に従う式を利用して、実験群及び対照群の各々に対して下記のように細胞生存度を計算した。(ブランクは、培地のみに対して、XTTで測定した値を示す)：
[処理群(本発明による組成物またはタキソール)−ブランク]/非処理群ｘ100%
細胞毒性は、製造社の支持に従って下記のように細胞毒性を計算した：
[非処理群の吸収値−(処理群(本発明による組成物またはタキソール)−ブランク)]/非処理群×100%
前記記載された実験方法を、実験群、対照群、非処理群のすべてに対して同じく遂行し、測定した。
【００５５】
細胞株HCC1419に対して、第1週(LC50)の間に測定した細胞数を図１に図示し、第２週(回復期)の間に測定した細胞数を図２に図示した。ここで、横軸は、培養時間を示し、縦軸は、細胞数の1/20の値を示す。
【００５６】
また、波長500nmで、XTT分析方法を実施し、第１週(LC50)の間の生存度を図３に図示し、第２週(回復期)の間の生存度を図４に図示した。ここで、横軸は、培養時間を示し、縦軸は、生存度(%)の1/100の値を示す。
【００５７】
また、波長500nmで、XTT分析方法を実施し、第1週(LC50)の間の細胞毒性を図５に図示し、第２週(回復期)の間の細胞毒性を図６に図示した。ここで、横軸は、培養時間を示し、縦軸は、細胞毒性(%)の1/100の値を示す。
【００５８】
（２）HME 50 HT−正常上皮細胞
人体の乳房上皮細胞であるHMEは、隣接正常組織から由来した細胞株である。
【００５９】
本発明による抽出物を含有する組成物で処置した群には、いかなる細胞毒性も観察できなかった。むしろ、正常上皮細胞であるHME 50 HT 細胞は、良く成長し、回復期には細胞があふれる程成長し、大変健康的でストレスも受けなかった。
【００６０】
細胞株HMEに対して、第１週(LC50)の間に測定した細胞数を、図７に図示した。ここで、横軸は、培養時間を示し、縦軸は、細胞数の1/20の値を示す。
【００６１】
（３）BJ−正常纖維芽細胞
細胞株BJは、新生兒の正常表皮から由来したものであり、老化する前まで最大７２回の細胞分化が可能であるが、テロメラーゼを発現しない。
【００６２】
本発明による抽出物を含有する組成物で処置した群には、細胞毒性が表れなく、細胞は大変健康で、ストレスも受けなく、強化された細胞成長が観察された。
【００６３】
細胞株 BJに対して、第１週(LC50)の間に測定した細胞数を図８に図示した。ここで、横軸は、培養時間を示し、縦軸は、細胞数の1/20の値を示す。
【００６４】
（実施例５）
実施例１乃至３で取得した抽出物を含む組成物で、癌細胞を処理した場合に、時間による変化をXTT分析、MTT分析及び/または写真撮影で比較し、癌細胞に対する細胞毒性を確認した。
【００６５】
１．実験対象及び分析方法(表２)
【００６６】
【表２】
2013533888.tif 000004
【００６７】
２．実験方法
（１）XTT分析
乳癌細胞株に該当するMDA-MB-231とTTU-1癌細胞株を準備し、培養用試験管(96-well flat-bottomedmicroplate)の各ウェルに、5×103個ずつ分けて入れ、CO2細胞培養機で培養した。MDA-MB-231 細胞株に対しては、DMEM＋10%ウシ胎児血清を培養培地として使用し、TTU-1細胞株に対しては、DMEM＋10%ウシ胎児血清を培養培地として使用した。培養２４時間後、各ウェルに実施例１乃至３で取得した抽出物を添加し、その後、これを細胞培養機で培養した。試料添加12時間後、XTT溶液を入れて２時間をさらに培養し、マイクロプレートスペクトロフォトメーター(Microplate spectrophotometer)を使用して450nmでの吸光度を測定した。
【００６８】
そのような方法で、試料添加３．５日、４．５日、５．５日後に、各々XTT溶液の処理によって吸光度を測定した。
【００６９】
また、MDA-MB-231とTTU-1癌細胞株を、Annexin-V/PIで染色し、写真撮影を実施して細胞の形の変化を観察した。
【００７０】
（２）MTT分析
肺癌細胞株に該当するA549と肝癌細胞株に該当するHepG2に対して、前記XTT分析での方法のようにMTT分析を実施した。但し、XTT溶液に代わって、MTT溶液を処理し、A549に対しては、L-グルタミン(300mg/L)、25mMHEPES及び25mM NaHCO3が含まれたRPMI1640 90%と熱不活性化されたウシ胎児血清(FBS)10%を含む培地を使用し、HepG2に対しては最小必修培地、25mMのHEPES及び25mMのNaHCO3 90%と熱不活性化されたウシ胎児血清(FBS)10%を含む培地を使用した。１日、２日、３日、４日後に、各々MTT値を測定した。
【００７１】
（３）フラスコで培養した癌細胞の処理
大腸癌細胞株に該当するHCT-15を準備して丸いフラスコに分けて入れ、培養培地はL-グルタミン(300mg/L)、25mMのHEPES及び25mMのNaHCO3が含まれたRPMI1640 90%と熱不活性化されたウシ胎児血清(FBS)10%を含む培地を使用した。
【００７２】
細胞が、十分に培養された後に実施例１乃至３で取得した抽出物で処理した。前記処理後、８時間、２４時間、４８時間、７２時間で、H&Eに染色して写真撮影を実施し、細胞の形の変化を観察した。
【００７３】
３．処理方法(表３)
【００７４】
【表３】
2013533888.tif 000005
【００７５】
４．実験結果
下記で、本発明の抽出物に対する値は、実施例１乃至３で取得した抽出物の値の平均値を示す。
【００７６】
MDA-MB-231に対して取得した(試料処理群のXTT値-ブランクのXTT値)を、下記表４及び図９のグラフで示した。
【００７７】
【表４】
2013533888.tif 000006
【００７８】
TTU-1に対して取得された値(資料処理群のXTT値-ブランクのXTT値)を、下記表５及び図１０のグラフで示した。
【００７９】
【表５】
2013533888.tif 000007
【００８０】
A549に対して取得された試料処理群のMTT値を、下記表６及び図１１のグラフで示した。
【００８１】
【表６】
2013533888.tif 000008
【００８２】
HepG2に対して取得された試料処理群のMTT値を、下記表７及び図１２のグラフで示した。
【００８３】
【表７】
2013533888.tif 000009
【００８４】
図９乃至１２において、実験群では、時間経過に従い値が０に近づくが、PBS処理対照群では、値が増加し、タキソール処理対照群もその値が再び増加することが確認できる。したがって、実験群では、癌細胞の生存度が殆ど無いことが立証される。
【００８５】
また、HCT-15に対して、本発明による抽出物またはPBSで処理し、２４時間後、４８時間後、７２時間後に、撮影した写真を各々図１３乃至１５に図示した。これによって、実験群の癌細胞は、核が破裂され細胞全体が暗く染色されている反面、対照群の癌細胞は、核と細胞質が良く発達していることが確認できる。
【００８６】
（実施例６）
−ヌードマウスの発毛−
ヌードマウスは、アルビノ系統のハツカネズミ群に属するものとして、ヌード形質の遺伝子系が、nu/nu ホモである固体は、毛嚢の奥の角質化以上に毛がない状態で生まれ、生後３〜１４週がすぎると死ぬと知られている。
【００８７】
本実験では、５週齢の雌ヌードマウス(BALB/cnu/nu)５匹に各々実施例１乃至３で取得した抽出物を、２週の間に１日２回0.001ml/g(抽出物の嵩/ネズミの体重)の濃度で経口投与した。その結果、驚いたことに、遺伝子異常で毛がないヌードマウスの５匹すべてが、時間が経過するに伴って、毛が生成されることが確認できた。
【００８８】
２番ヌードマウスに本発明による抽出物を含む組成物を投与してから１４日後の写真を、図１６に、４番ヌードマウスに本発明による抽出物を含む組成物を投与してから２１日後の写真を、図１７に図示した。
【図１】
2013533888.tif 000010
【図２】
2013533888.tif 000011
【図３】
2013533888.tif 000012
【図４】
2013533888.tif 000013
【図５】
2013533888.tif 000014
【図６】
2013533888.tif 000015
【図７】
2013533888.tif 000016
【図８】
2013533888.tif 000017
【図９】
2013533888.tif 000018
【図１０】
2013533888.tif 000019
【図１１】
2013533888.tif 000020
【図１２】
2013533888.tif 000021
【図１３】
2013533888.tif 000022
【図１４】
2013533888.tif 000023
【図１５】
2013533888.tif 000024
【図１６】
2013533888.tif 000025
【図１７】
2013533888.tif 000026
【国際調査報告】
2013533888.tif 000027
2013533888.tif 000028
2013533888.tif 000029
2013533888.tif 000030