(57)【要約】  本発明は、特に、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の天然のアンチセンスポリヌクレオチドを標的にすることでサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の発現および／または機能を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の発現に関連する疾患及び障害の治療における、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの識別およびそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボまたはインビトロでの患者細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法であって、前記細胞または組織と長さが５〜３０ヌクレオチドの少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドとを接触させることを含み、その中で、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、配列番号５のヌクレオチド１〜１０２８、または配列番号６のヌクレオチド１〜４２９、または配列番号７のヌクレオチド１〜１５６、または配列番号８のヌクレオチド１〜５９３、または配列番号９の１〜３７３、または配列番号１０のヌクレオチド１〜１７１３、または配列番号１１のヌクレオチド１〜６６０、または配列番号１２のヌクレオチド１〜５８９、または配列番号１３のヌクレオチド１〜４２８、および配列番号１４のヌクレオチド１〜４０４１の中の５〜３０の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの逆相補体に対して少なくとも５０％配列相同性を有し、それによりインビボまたはインビトロでの患者細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法。
【請求項２】
インビボまたはインビトロでの患者細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法であって、前記細胞または組織と長さが５〜３０ヌクレオチドの少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドとを接触させることを含み、その中で、前記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの天然アンチセンスの逆相補体に対して少なくとも５０％配列相同性を有し、それによりインビボまたはインビトロでの患者細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法。
【請求項３】
インビボまたはインビトロでの患者細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法であって、前記細胞または組織と長さが５〜３０ヌクレオチドの少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドとを接触させることを含み、その中で、前記オリゴヌクレオチドが前記サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドへのアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して少なくとも５０％配列相同性を有し、それによりインビボまたはインビトロでの患者細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法。
【請求項４】
インビボまたはインビトロでの患者細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法であって、前記細胞または組織と前記サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの天然のアンチセンスオリゴヌクレオチドの領域を標的とする少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドとを接触させることを含み、それによりインビボまたはインビトロでの患者細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法。
【請求項５】
対照に関するインビボまたはインビトロでの前記サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の機能および／または発現が増大する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドがサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列を標的とする、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドのコ−ド化および／または非コ−ド化核酸配列を含む核酸配列を標的とする、請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドのオ−バ−ラップしたおよび／またはオ−バ−ラップしていない配列を標的とする、請求項４記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾された糖部分、少なくとも１つの修飾されたインタ−ヌクレオシド結合、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド、およびこれらの組み合わせから選択される１以上の修飾を含む、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
前記１以上の修飾が、２′−Ｏ−メトキシエチル修飾された糖部分、２′−メトキシ修飾された糖部分、２′−Ｏ−アルキル修飾された糖部分、二環式糖部分、およびこれらの組み合わせから選択された少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記１以上の修飾が、ホスホロチオエ−ト、２′−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）、２′−フルオロ、アルキルホスホン酸塩、ホスホロジチオエ−ト、アルキルホスホノチオエ−ト、ホスホルアミダ−ト、カ−バメイト、カ−ボネイト、リン酸トリエステル、アセトアミダ−ト、カルボキシメチルエステル、およびこれらの組み合わせから選択された少なくとも１つの修飾されたインタ−ヌクレオシド結合を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記１以上の修飾が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アラビノ−核酸（ＦＡＮＡ）、類似体、誘導体、およびこれらの組み合わせから選択された少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、配列番号１５から９４と示された少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
インビボまたはインビトロでの哺乳動物細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の機能および／または発現を調節する方法であって、前記細胞または組織と長さが５〜３０ヌクレオチドの少なくとも１つの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドに特異的な前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとを接触させること、その中で、前記少なくとも１つのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドが、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの前記アンチセンスおよび／またはセンス核酸分子の少なくとも約５つの連続する核酸の相補的な配列に対して少なくとも５０％配列相同性を有し、および、インビボまたはインビトロでの哺乳動物細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の機能および／または発現を調節すること、を含む方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドのアンチセンスおよび／またはセンス核酸分子と相補的である少なくとも約５つの連続する核酸の配列に対して少なくとも８０％配列相同性を有する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
インビボまたはインビトロでの哺乳動物細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の機能および／または発現を調節する方法であって、前記細胞または組織とサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドのセンスおよび／または天然アンチセンス鎖の非コ−ド化および／またはコ−ド化配列に特異的な長さが５〜３０ヌクレオチドの少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドとを接触させること、その中で、前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号１から１４と示された少なくとも１つの核酸配列に対して少なくとも５０％配列相同性を有し、および、インビボまたはインビトロでの哺乳動物細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の機能および／または発現を調節することを含む、方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの修飾を含む合成の修飾されたオリゴヌクレオチドであって、前記少なくとも１つの修飾が、少なくとも１つの修飾された糖部分；少なくとも１つの修飾されたインタ−ヌクレオチド結合；少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド；およびこれらの組み合わせから選択され、前記オリゴヌクレオチドが、通常の対照と比べて、インビボまたはインビトロでのサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の機能および／または発現に対してハイブリダイズし、かつ、調節するアンチセンス化合物である、オリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの修飾が、ホスホロチオエ−ト、アルキルホスホン酸塩、ホスホロジチオエ−ト、アルキルホスホノチオエ−ト、ホスホルアミダ−ト、カ−バメイト、カ−ボネイト、リン酸トリエステル、アセトアミダ−ト、カルボキシメチルエステル、およびこれらの組み合わせから成る群から選択されたインタ−ヌクレオチド結合を含む、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのホスホロチオエ−トインタ−ヌクレオチド結合を含む、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエ−トインタ−ヌクレオチド結合の骨格を含む、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含み、前記修飾されたヌクレオチドが、ペプチド核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）、類似体、誘導体、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドが、複数の修飾を含み、前記修飾が、ホスホロチオエ−ト、アルキルホスホン酸塩、ホスホロジチオエ−ト、アルキルホスホノチオエ−ト、ホスホルアミダ−ト、カ−バメイト、カ−ボネイト、リン酸トリエステル、アセトアミダ−ト、カルボキシメチルエステル、およびこれらの組み合わせから選択される修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドが、複数の修飾を含み、前記修飾が、ペプチド核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）、類似体、誘導体、およびこれらの組み合わせから選択される修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドが、２′−Ｏ−メトキシエチル修飾された糖部分、２′−メトキシ修飾された糖部分、２′−Ｏ−アルキル修飾された糖部分、二環式糖部分、およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドが、複数の修飾を含み、前記修飾が、２′−Ｏ−メトキシエチル修飾された糖部分、２′−メトキシ修飾された糖部分、２′−Ｏ−アルキル修飾された糖部分、二環式糖部分、およびこれらの組み合わせから選択される修飾された糖部分を含む、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドが、長さが少なくとも約５〜３０ヌクレオチドであり、かつ、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドのアンチセンスおよび／またはセンス鎖に対してハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドが、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドのアンチセンスおよび／またはセンスコ−ド化および／または非コ−ド化核酸配列の少なくとも約５つの連続する核酸の相補的な配列に対して少なくとも約２０％配列相同性を有する、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドが、前記サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドのアンチセンスおよび／またはセンスコ−ド化および／または非コ−ド化核酸配列の少なくとも約５つの連続する核酸の相補的な配列に対して少なくとも約８０％配列相同性を有する、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
通常の対照と比べて、前記オリゴヌクレオチドが、インビボまたはインビトロでの少なくとも１つのサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの発現および／または機能に対してハイブリダイズし、かつ、調整する、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１５から９４と示された配列を含む、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
１以上のサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドに特異的な１以上のオリゴヌクレオチドをふくむ化合物であって、前記ポリヌクレオチドが、アンチセンス配列、相補的な配列、対立遺伝子、相同体、アイソフォ−ム、変種、誘導体、変異体、断片、またはこれらの組み合わせを含む、組成物。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１５から９４と示されたヌクレオチド配列の１つと比較してオリゴヌクレオチドが少なくとも約４０％配列相同性を有する、請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１５から９４と示されたヌクレオチド配列を含む、請求項３０記載の組成物。
【請求項３３】
配列番号１５から９４と示された前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上の修飾または置換を含む、請求項３２記載の組成物。
【請求項３４】
前記１つ以上の修飾が、ホスホロチオエ−ト、メチルホスホネ−ト、ペプチド核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）分子、およびこれらの組み合せから選択される、請求項３３記載の組成物。
【請求項３５】
少なくとも１つのサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１つのこれらのコ−ド化された産物に関連する疾患の予防または治療する方法であり、前記少なくとも１つのサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの天然のアンチセンス配列と結合し、かつ、前記少なくとも１つのサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの発現を調整する少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効治療量を患者に投与することを含み、それにより前記少なくとも１つのサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１つのこれらのコ−ド化された産物に関連する疾患を予防するまたは治療する、方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つのサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドに関連する疾患が、癌（例えば、乳癌、大腸癌、ＣＣＬ、ＣＭＬ、前立腺癌）、神経変性疾患または障害（例えば、アルツハイマ−病（ＡＤ）、ハンチントン病、パ−キンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、およびポリグルタミンの凝集による障害）、骨格筋疾患（例えば、デュシャンヌ型筋ジストロフィ−症、骨格筋萎縮、ベッカ−型筋ジストロフィ−、または筋硬直性ジストロフィ−）、代謝疾患または障害（例えば、インスリン抵抗性、糖尿病、２型糖尿病、肥満、グルコ−ス耐性障害、メタボリックシンドロ−ム、大人の糖尿病、糖尿病性腎症、高血糖、糖尿病性腎症、高コレステロ−ル血症、脂質代謝異常、高脂血症および加齢性代謝疾患など）、インシュリン値の調節障害に関連する疾患または障害、神経障害（例えば、感覚神経障害、自律神経障害、運動神経障害、網膜症）、ケトン原性条件に関連する疾患または障害、エネルギ−恒常性障害に関連する疾患または障害、アセチルＣｏＡ合成酵素２活性に関連する疾患または障害、代謝恒常性に関連する疾患または障害、脂質代謝性疾患または障害、熱産生障害に関連する疾患または障害、ミトコンドリア機能障害に関連する疾患または障害、神経障害（例えば、感覚神経障害、自律神経障害、運動神経障害、網膜症）、肝臓疾患（例えば、アルコ−ル依存症または肝炎、脂肪肝による）、加齢性黄斑変性症、骨疾患（例えば、骨粗鬆症）、血液疾患（例えば、白血病）、肝臓疾患（例えば、アルコ−ル依存症または肝炎による）、肥満、骨吸収、加齢性黄斑変性症、ＡＩＤＳ関連の認知症、ＡＬＳ、ベル麻痺、動脈硬化症、心臓疾患（例えば、不整脈、慢性うっ血性心不全、虚血性脳卒中、冠動脈疾患および心筋症）、慢性の変形性疾患（例えば、心筋疾患）、慢性腎不全、２型糖尿病、潰瘍、白内障、老眼、糸球体腎炎、ギラン−バレ−症候群、出血性の脳卒中、関節リュウマチ、炎症性腸疾患、ＳＬＥ、クロ−ン病、骨関節炎、骨粗鬆症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺炎、皮膚老化症、尿失禁、ミトコンドリア機能障害に関連する疾患または障害（例えば、ミトコンドリアミオパシ−、脳障害、レ−バ−病、リ−脳症、ピアソン病、乳酸アシド−シス、ミトコンドリア脳症、乳酸アシド−シスおよび、脳卒中様症状（ＭＥＬＡＳ）など）および、神経細胞死に関連する疾患または障害、退行性変化症候群、加齢、テロメア機能障害に関連する疾患または障害、クロマチン制御障害に関連する疾患または障害、早期細胞老化に関連する疾患または障害、ＳＩＲＴ６媒介のＤＮＡ修復障害に関連する疾患または障害、および望ましくない細胞損失を特徴とする状態、から選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つのサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１つのこれらのコ−ド化された産物に関連する皮膚状態を予防するまたは治療する方法であって、前記少なくとも１つのサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの天然のアンチセンス配列と結合し、かつ、前記少なくとも１つのサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの発現を調節する少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効治療量を、ある皮膚状態を有する、またはある皮膚状態が発現するリスクの患者に投与することを含み、それにより前記少なくとも１つのサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１つのこれらのコ−ド化された産物に関連する前記疾患皮膚状態を予防するまたは治療する、方法。
【請求項３８】
前記皮膚状態が、炎症、光障害、または加齢により起こる、請求項３８記載の方法。
【請求項３９】
前記皮膚状態が、しわ、接触性皮膚炎、アトピ−性皮膚炎、日光角化症、角化異常症、表皮水疱症、剥脱性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、紅斑、円板状紅斑性狼瘡、皮膚筋炎、皮膚癌、または自然な老化によるものである、請求項３９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年７月２４日に出願された米国特許仮出願第６１／２２８，３９２号、２００９年１１月６日に出願された米国特許仮出願第６１／２５９，０７２号、２００９年１２月２日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６６４４５号、２０１０年３月３日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／２６１１９号、および２０１０年５月３日に出願された米国特許仮出願第６１／３３０，４２７号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明の実施形態は、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）および関連分子の発現および／または機能を調節するオリゴヌクレオチドを含む。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼ−ションは、ＤＮＡ複製、転写、および翻訳を含む核酸機能の多くの態様にとって重要である。ハイブリダイゼ−ションはまた、特定の核酸を検出する、または、その発現を変化させる様々な技術の中心である。アンチセンスヌクレオチドは、例えば、標的ＲＮＡにハイブリダイズし、よって、ＲＮＡスプライシング、転写、翻訳、および複製を妨害することにより遺伝子発現を乱す。アンチセンスＤＮＡは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが、ほとんどの細胞型に存在する活性であるリボヌクレア−ゼＨによる消化のための基質として機能する追加の特徴を有する。アンチセンス分子は、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の場合のように細胞中に送達させることができ、またはそれらは内在性遺伝子からＲＮＡ分子として発現させることができる。ＦＤＡは最近、アンチセンス薬、ＶＩＴＲＡＶＥＮＥ（商標）（サイトメガロウイルス網膜炎の治療のため）を承認し、アンチセンスが治療的有用性を有することを反映している。
【発明の概要】
【０００４】
１つの実施形態では、本発明は、天然アンチセンス転写物の任意の領域を標的とするアンチセンス  オリゴヌクレオチドを使用することにより、天然アンチセンス転写物の作用を阻止し、対応するセンス遺伝子の上方制御を得るための方法を提供する。前記天然アンチセンス転写物の阻止は、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよび小分子により達成することができ、それは本発明の範囲内にあると考えられることもまた本明細書で意図される。
【０００５】
１つの実施形態は、インビボまたはインビトロでの患者細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法であって、前記細胞または組織と５〜３０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドとを接触させる手順を含み、よってインビボまたはインビトロでの患者細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法を提供し、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド１〜１０２８または配列番号６のヌクレオチド１〜４２９、配列番号７のヌクレオチド１〜１５６または配列番号８のヌクレオチド１〜５９３、配列番号９の１〜３７３、配列番号１０の１〜１７１３、配列番号１１の１〜６６０、配列番号１２の１〜５８９、配列番号１３の１〜４２８、および配列番号１４の１〜４０４１の中の５〜３０連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの逆相補体に対し少なくとも５０％の配列相同性を有する。
【０００６】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドはサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列、例えば、配列番号５〜１４で示されるヌクレオチド、ならびにそれらの任意の変異体、対立遺伝子、相同体、突然変異体、誘導体、断片および相補的配列を標的とする。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、配列番号１５〜９４として示される。
【０００７】
別の実施形態は、インビボまたはインビトロでの患者細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法であって、前記細胞または組織と５〜３０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドとを接触させる手順を含み；よって、インビボまたはインビトロでの患者細胞または組織における前記サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法を提供し、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、前記サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドのアンチセンスの逆相補体に対し少なくとも５０％の配列相同性を有する。
【０００８】
別の実施形態は、インビボまたはインビトロでの患者細胞または組織におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法であって、前記細胞または組織と５〜３０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドとを接触させる手順を含み；よって、インビボまたはインビトロでの患者細胞または組織における前記サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法を提供し、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）アンチセンスポリヌクレオチドへのアンチセンスオリゴヌクレオチドに対し少なくとも５０％の配列相同性を有する。
【０００９】
１つの実施形態では、組成物は、センスおよび／またはアンチセンスサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドに結合する１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００１０】
別の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは１つ以上の修飾または置換ヌクレオチドを含む。
【００１１】
別の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは１つ以上の修飾結合を含む。
【００１２】
さらに別の実施形態では、前記修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエ−ト、メチルホスホネ−ト、ペプチド核酸、２′−Ｏ−メチル、フルオロ−または炭素、メチレンまたは他のロックド核酸（ＬＮＡ）分子を含む修飾塩基を含む。好ましくは、修飾ヌクレオチドはロックド核酸分子、例えばα−Ｌ−ＬＮＡである。
【００１３】
別の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは患者に皮下、筋肉内、静脈内または腹腔内投与される。
【００１４】
別の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは医薬組成物で投与される。治療計画は、前記アンチセンス化合物を少なくとも１回患者に投与することを含み、しかしながら、この治療は、ある期間にわたる複数回投与を含むように改善することができる。治療は１つ以上の他の型の療法と組み合わせることができる。
【００１５】
別の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドはリポソ−ム中に封入され、または担体分子（例えば、コレステロ−ル、ＴＡＴペプチド）に結合される。
【００１６】
他の態様が以下に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＳＩＲＴアンチセンスＣＶ３９６２００に対して設計されたオリゴヌクレオチドの実時間ＰＣＲ結果を示す。結果から、ＨｅｐＧ２細胞におけるＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡレベルが、ｓｉｒｔａｓ（ｓｉｒｔａｓ＿５，Ｐ＝０．０１）に対して設計されたｓｉＲＮＡの１つによる処置４８時間後、著しく増加することが示される。同じ試料において、ｓｉｒｔａｓ＿５による処置後、ｓｉｒｔａｓ  ＲＮＡは著しく減少したが、ｓｉｒｔａｓ＿６およびｓｉｒｔａｓ＿７による処置後には変化せず、これは、ＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡレベルには影響を与えなかった（図２）。ｓｉｒｔａｓ＿５、ｓｉｒｔａｓ＿６およびｓｉｒｔａｓ＿７はそれぞれ、配列番号３８、３９および４０に対応する。
【図２】ＳＩＲＴアンチセンスＣＶ３９６２００に対して設計されたオリゴヌクレオチドの実時間ＰＣＲ結果を示す。結果から、ＨｅｐＧ２細胞におけるＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡレベルが、ｓｉｒｔａｓ（ｓｉｒｔａｓ＿５，Ｐ＝０．０１）に対して設計されたｓｉＲＮＡの１つによる処置４８時間後、著しく増加することが示される。同じ試料において、ｓｉｒｔａｓ＿５による処置後、ｓｉｒｔａｓ  ＲＮＡは著しく減少したが、ｓｉｒｔａｓ＿６およびｓｉｒｔａｓ＿７による処置後には変化せず、これは、ＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡレベルには影響を与えなかった（図２）。ｓｉｒｔａｓ＿５、ｓｉｒｔａｓ＿６およびｓｉｒｔａｓ＿７はそれぞれ、配列番号３８、３９および４０に対応する。
【図３】ＳＩＲＴアンチセンスを横切るオリゴヌクレオチドウォ−クに対する結果を示す。実時間ＰＣＲ結果により、ＨｅｐＧ２細胞におけるＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが、ｓｉｒｔａｓに対し設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちの３つによる処置４８時間後、著しく増加することが示される。ＣＵＲ−０２９２〜ＣＵＲ−０３０９は、それぞれ、配列番号１５〜３２に対応する。
【図４】ＨｅｐＧ２（図４）およびＶｅｒｏ７６（図５）細胞におけるＰＳ、ＬＮＡおよび２′Ｏ  Ｍｅ修飾オリゴヌクレオチドに対する結果を示す。実時間ＰＣＲ結果により、ＨｅｐＧ２細胞におけるＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが、ＳＩＲＴ１アンチセンスに対するＰＳ、ＬＮＡ、２′ＯＭｅおよび２′ＯＭｅ  ｍｉｘｍｅｒ設計アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置４８時間後、著しく増加することが示される。ベロ細胞におけるＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡレベルもまたＳＩＲＴ１アンチセンスに対するＰＳおよびＬＮＡ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置４８時間後、増加した。ＣＵＲ−０２４５、ＣＵＲ−０７３６、ＣＵＲ  ０６８８、ＣＵＲ−０７４０およびＣＵＲ−０６６４として表されるバ−は、それぞれ、配列番号３３〜３７に対応する。
【図５】ＨｅｐＧ２（図４）およびＶｅｒｏ７６（図５）細胞におけるＰＳ、ＬＮＡおよび２′Ｏ  Ｍｅ修飾オリゴヌクレオチドに対する結果を示す。実時間ＰＣＲ結果により、ＨｅｐＧ２細胞におけるＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが、ＳＩＲＴ１アンチセンスに対するＰＳ、ＬＮＡ、２′ＯＭｅおよび２′ＯＭｅ  ｍｉｘｍｅｒ設計アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置４８時間後、著しく増加することが示される。ベロ細胞におけるＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡレベルもまたＳＩＲＴ１アンチセンスに対するＰＳおよびＬＮＡ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置４８時間後、増加した。ＣＵＲ−０２４５、ＣＵＲ−０７３６、ＣＵＲ  ０６８８、ＣＵＲ−０７４０およびＣＵＲ−０６６４として表されるバ−は、それぞれ、配列番号３３〜３７に対応する。
【図６】サル脂肪組織診のＰＣＲ結果を示す。実時間ＰＣＲ結果により、ＣＵＲ−９６３、ＳＩＲＴ１アンチセンスＣＶ３９６２００．１に対して設計されたオリゴヌクレオチドが投与されたサルからの脂肪組織診におけるＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡレベルの増加が示される。ＣＵＲ−９６３は配列番号３４に対応する。
【図７】初代培養サル肝臓肝細胞のＰＣＲ結果を示す。実時間ＰＣＲ結果は、ＳＩＲＴ１アンチセンスに対するオリゴヌクレオチドによる処置後の、ＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡレベルの増加を示す。ＣＵＲ−０２４５として表されるバ−は配列番号３３に対応する。
【図８】ＳＩＲＴアンチセンスＣＶ３９６２００に対して設計されたオリゴヌクレオチドの結果を示す。実時間ＰＣＲ結果により、ＨｅｐＧ２細胞におけるＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが、ＳＩＲＴ１アンチセンスＣＶ３９６２００に対して設計されたオリゴヌクレオチドの１つにおいて著しく増加することが示される。ＣＵＲ−１２３０、ＣＵＲ−１２３１、ＣＵＲ−１２３２およびＣＵＲ−１２３３として表されるバ−は配列番号４１〜４４に対応する。
【図９】ＳＩＲＴアンチセンスＣＶ４２８２７５に対して設計されたオリゴヌクレオチドの結果を示す。実時間ＰＣＲ結果により、ＨｅｐＧ２細胞におけるＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが、ＳＩＲＴ１アンチセンスＣＶ４２８２７５に対して設計されたオリゴヌクレオチドの２つにおいて著しく増加することが示される。ＣＵＲ−１３０２、ＣＵＲ−１３０４、ＣＵＲ−１３０３およびＣＵＲ−１３０５として表されるバ−は配列番号４５〜４８に対応する。
【図１０】実時間ＰＣＲ結果を示す。結果は、ＳＩＲＴアンチセンスＢＥ７１７４５３に対して設計されたオリゴヌクレオチドの１つによる処置４８時間後の、ＨｅｐＧ２細胞におけるＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルの著しい増加を示す。ＣＵＲ−１２６４、ＣＵＲ１２６５およびＣＵＲ−１２６６として表されるバ−はそれぞれ、配列番号４９〜５１に対応する。
【図１１】実時間ＰＣＲ結果を示す。結果は、ＳＩＲＴ１アンチセンスＡＶ７１８８１２に対して設計されたオリゴヌクレオチドの３つによる処置４８時間後に、ＨｅｐＧ２細胞におけるＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが著しい増加することを示す。ＣＵＲ−１２９４、ＣＵＲ−１２９７、ＣＵＲ−１２９５、ＣＵＲ−１２９６およびＣＵＲ−１２９８として表されるバ−はそれぞれ、配列番号５２〜５６に対応する。
【図１２】対照と比較した、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して導入させたホスホロチオエ−トオリゴヌクレオチドによるＨｅｐＧ２細胞の処置後のＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡにおける折り畳み変化＋標準偏差を示す実時間ＰＣＲ結果のグラフである。実時間ＰＣＲ結果は、ＳＩＲＴ１アンチセンスＡＷ１６９９５８に対して設計されたオリゴの２つによる処置４８時間後に、ＨｅｐＧ２細胞においてＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが著しく増加することを示す。ＣＵＲ−１３８１、ＣＵＲ−１３８２、ＣＵＲ−１３８３およびＣＵＲ−１３８４として表されるバ−はそれぞれ、配列番号５７〜６０に対応する。
【図１３】対照と比較した、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して導入させたホスホロチオエ−トオリゴヌクレオチドによる３Ｔ３細胞の処置後のＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡにおける折り畳み変化＋標準偏差を示す実時間ＰＣＲ結果のグラフである。実時間ＰＣＲ結果は、ＳＩＲＴ１マウスアンチセンスＡＫ０４４６０４に対して設計されたオリゴヌクレオチドの３つによる処置４８時間後に、３Ｔ３細胞においてＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが著しく増加することを示す。ＣＵＲ−０９４９、ＣＵＲ−０８４２、ＣＵＲ−１０９８およびＣＵＲ−１０９９として表されるバ−はそれぞれ、配列番号６７、６１、７１および７２で処置された試料に対応する。
【図１４】対照と比較した、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して導入させたホスホロチオエ−トオリゴヌクレオチドによる３Ｔ３細胞の処置後のＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡにおける折り畳み変化＋標準偏差を示す実時間ＰＣＲ結果のグラフである。実時間ＰＣＲ結果は、ＳＩＲＴ１マウスアンチセンスＡＫ０４４６０４に対して設計されたオリゴヌクレオチドの３つによる処置４８時間後に、３Ｔ３細胞においてＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが著しく増加することを示す。ＣＵＲ−０９４８、ＣＵＲ−０９４９、ＣＵＲ−０９５０、ＣＵＲ−０９５１、ＣＵＲ−０８４６、およびＣＵＲ−０８４４として表されるバ−はそれぞれ、配列番号６６〜６９、６５および６３で処置された試料に対応する。
【図１５】対照と比較した、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して導入させたホスホロチオエ−トオリゴヌクレオチドによる３Ｔ３細胞の処置後のＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡにおける折り畳み変化＋標準偏差を示す実時間ＰＣＲ結果のグラフである。実時間ＰＣＲ結果は、ＳＩＲＴ１マウスアンチセンスＡＫ０４４６０４に対して設計されたオリゴヌクレオチドの２つによる処置４８時間後に、ＨｅｐＧ２細胞においてＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが著しく増加することを示す。ＣＵＲ−０８４２、ＣＵＲ−０８４４、およびＣＵＲ−０８４５として表されるバ−はそれぞれ、配列番号６１、６３および６４で処置された試料に対応する。
【図１６】対照と比較した、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して導入させたホスホロチオエ−トオリゴヌクレオチドによる３Ｔ３細胞の処置後のＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡにおける折り畳み変化＋標準偏差を示す実時間ＰＣＲ結果のグラフである。実時間ＰＣＲ結果は、ＳＩＲＴ１マウスアンチセンスＡＫ０４４６０４に対して設計されたオリゴヌクレオチドの２つによる処置４８時間後に、ＨｅｐＧ２細胞においてＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが著しく増加することを示す。ＣＵＲ−０８４３、ＣＵＲ−０８４６として表されるバ−はそれぞれ、配列番号６２および６５で処置された試料に対応する。
【図１７】対照と比較した、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して導入させたホスホロチオエ−トオリゴヌクレオチドによるＨｅｐＧ２細胞の処置後のサ−チュイン３  ｍＲＮＡにおける折り畳み変化＋標準偏差を示す実時間ＰＣＲ結果のグラフである。ＲＴ  ＰＣＲ結果は、ｓｉｒｔ３アンチセンスＨｓ．６８３１１７に対して設計されたホスホロチオエ−トアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置４８時間後に、ＨｅｐＧ２細胞においてｓｉｒｔ３のレベルが著しく増加することを示す（ＣＵＲ−１５４５−１５５０）。ＣＵＲ−０５５１、ＣＵＲ−１５５２、ＣＵＲ−１５５５、ＣＵＲ−１５５６、ＣＵＲ−１５５３、ＣＵＲ−１５５４、ＣＵＲ−１５４５、ＣＵＲ−１５４６、ＣＵＲ−１５４８、ＣＵＲ−１５４９、ＣＵＲ−１５５０およびＣＵＲ−１５４７として表されるバ−はそれぞれ、配列番号７３〜８４で処置された試料に対応する。
【図１８】対照と比較した、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して導入させたホスホロチオエ−トオリゴヌクレオチドによるＨｅｐＧ２細胞の処置後のＳＩＲＴ６  ｍＲＮＡにおける折り畳み変化＋標準偏差を示す実時間ＰＣＲ結果のグラフである。実時間ＰＣＲ結果は、ＳＩＲＴ６アンチセンス  ＮＭ＿１３３４７５に対して設計されたオリオグの１つによる処置４８時間後に、ＨｅｐＧ２細胞においてＳＩＲＴ６  ｍＲＮＡのレベルが著しく増加することを示す。ＣＵＲ−０８７３、ＣＵＲ−０８６９〜ＣＵＲ−０８７１、ＣＵＲ−０８７４およびＣＵＲ−０８７２として表されるバ−はそれぞれ、配列番号８５〜９０で処置された試料に対応する。
【図１９】対照と比較した、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して導入させたホスホロチオエ−トオリゴヌクレオチドによるＨｅｐＧ２細胞の処置後のＳＩＲＴ６  ｍＲＮＡにおける折り畳み変化＋標準偏差を示す実時間ＰＣＲ結果のグラフである。実時間ＰＣＲ結果は、ＳＩＲＴ６アンチセンスｂｆ７７２６６２に対して設計されたオリオグの１つによる処置４８時間後に、ＨｅｐＧ２細胞においてＳＩＲＴ６  ｍＲＮＡのレベルが著しく増加することを示す。ＣＵＲ−０８７８、ＣＵＲ−０８７６、ＣＵＲ−０８７７およびＣＵＲ−０８７５として表されるバ−はそれぞれ、配列番号９１〜９４で処置された試料に対応する。
【図２０】対照と比較した、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して導入させたホスホロチオエ−トオリゴヌクレオチドによるＤＢＳ−ＦＣＬ−１細胞の処置後のＳＩＲＴ６  ｍＲＮＡにおける折り畳み変化＋標準偏差を示す実時間ＰＣＲ結果のグラフである。実時間ＰＣＲ結果は、ＳＩＲＴ６アンチセンスｂｆ７７２６６２に対して設計されたオリオグの２つならびにＮＭ＿１３３４７５に対して設計された１つのオリゴの１つによる処置４８時間後にＤＢＳ−ＦＣＬ−１細胞においてＳＩＲＴ６  ｍＲＮＡのレベルが著しく増加することを示す。ＣＵＲ−０８７６、ＣＵＲ−０８７８、ＣＵＲ−０８７５およびＣＵＲ−０８７４として表されるバ−はそれぞれ、配列番号９２、９１、９４および８９で処置された試料に対応する。
【００１８】
配列表の説明
配列番号１：ホモサピエンスサ−チュイン（サイレント接合型情報制御２相同体）１（出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））（ＳＩＲＴ１）、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿０１２２３８．３）
配列番号２：ハツカネズミサ−チュイン１（サイレント接合型情報制御２、相同体）１（出芽酵母）（ＳＩＲＴ１）ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿００１１５９５８９）
配列番号３：ホモサピエンスサ−チュイン（サイレント接合型情報制御２相同体）３（出芽酵母）（ＳＩＲＴ３）、転写変異体１、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ受入番号．：ＮＭ＿０１２２３９．５）
配列番号４：ホモサピエンスサ−チュイン６（ＳＩＲＴ６）、転写変異体１、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿０１６５３９）
配列番号５：伸長天然アンチセンス配列（ＣＶ３９６２００−伸長）
配列番号６：天然アンチセンス配列（ＣＶ４２８２７５）
配列番号７：天然アンチセンス配列（ＢＥ７１７４５３）
配列番号８：天然アンチセンス配列（ＡＶ７１８８１２）
配列番号９：天然ＳＩＲＴ１アンチセンス配列（ＡＷ１６９９５８）
配列番号１０：天然ＳＩＲＴ１マウスアンチセンス配列（ＡＫ０４４６０４）
配列番号１１：天然ＳＩＲＴ３アンチセンス配列（Ｈｓ．６８３１１７）
配列番号１２：天然ＳＩＲＴ３アンチセンス配列（ＤＡ６４５４７４）
配列番号１３：天然ＳＩＲＴ６アンチセンス配列（ＢＦ７７２６６２）
配列番号１４：天然ＳＩＲＴ６アンチセンス配列（ＡＮＫＲＤ２４）
配列番号１５〜９４：アンチセンスオリゴヌクレオチド
＊は、ホスホチオエ−ト結合を示し、＋はＬＮＡを示しｍは２′Ｏ  Ｍｅを示す。
配列番号９５〜９８−配列番号９５はＳＩＲＴ１天然アンチセンスＣＶ３９６２００のエクソン４に対応する。
配列番号９６、９７および９８はそれぞれ、フォワ−ドプライマ−配列、リバ−スプライマ−配列およびリポ−タ−配列に対応する。
配列番号９９はＣＵＲ９６２に対応し、＊はホスホチオエ−ト結合を示し、＋はＬＮＡを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のいくつかの態様が、説明のための適用例を用いて以下に記載される。多くの特定の詳細、関係および方法は、本発明を完全に理解するために示されることが理解されるべきである。しかしながら、関連技術分野における当業者は、本発明が１つ以上の特定の詳細なしで、または他の方法を用いて実施され得ることを、容易に認識するであろう。本発明は、行為または事象の順序に制限されず、というのも、いくつかの行為は異なる順序で、および／または他の行為または事象と同時に起こり得るからである。さらに、本発明による方法を実施するのに、示した行為または事象すべてが必要とされるわけではない。
【００２０】
本明細書で開示されるすべての遺伝子、遺伝子名、および遺伝子産物は、本発明で開示された組成物および方法が適用できるいずれの種の相同体にも対応することが意図される。よって、本用語は、ヒトおよびマウス由来の遺伝子および遺伝子産物を含むがそれらに限定されない。特定の種由来の遺伝子または遺伝子産物が開示される場合、この開示は例示にすぎないことが意図され、それが現れる文脈で明確に示されない限り、制限するものと解釈されるべきではないことは理解される。よって、例えば、本明細書で開示される遺伝子については、いくつかの実施形態では、ほ乳類に関連し、核酸およびアミノ酸  配列は、相同および／またはオルソロガスな遺伝子および他の動物、例えば限定はされないが、他のほ乳類、魚類、両生類、爬虫類、および鳥類由来の遺伝子産物を含むことが意図される。実施形態では、遺伝子または核酸配列はヒトである。
【００２１】
定義
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本発明を制限することを意図しない。本明細書では、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その」は、文脈で別に明確に示されない限り、同様に複数形を含むことを意図する。さらに、「含んでいる」、「含む」、「有している」、「有する」、「備えた」という用語またはそれらの変形は、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれか使用される限りにおいては、そのような用語は、「備える」という用語と同様に包括的であることが意図される。
【００２２】
「約」または「およそ」という用語は、当業者により決定される特定の値に対する許容される誤差範囲内を意味し、これは一部には、その値がどのように測定され、又は決定されるか、すなわち、測定系の限界に依存する。例えば、「約」は、当技術分野における実施ごとに、１以上の標準偏差内を意味することができる。また、「約」は、ある値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、より好ましくはさらに１％までの範囲を意味することができる。また、特に生物システムまたはプロセスに関しては、本用語は、ある値の一桁以内、好ましくは５倍以内、およびより好ましくは２倍以内を意味することができる。本出願および特許請求の範囲において特定の値が記載される場合、別記されない限り、特定の値に対し許容される誤差範囲内を意味する「約」という用語が仮定されるべきである。
【００２３】
本明細書では、「ｍＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子の現在知られているｍＲＮＡ転写物、および解明することができる任意のさらなる転写物を意味する。
【００２４】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス化合物」により、別のＲＮＡまたはＤＮＡ（標的ＲＮＡ、ＤＮＡ）に結合するＲＮＡまたはＤＮＡ分子が意味される。例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである場合、これはＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用により別のＲＮＡ標的に結合し、標的ＲＮＡの活性を変化させる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のポリヌクレオチドの発現および／または機能を上方制御または下方制御することができる。定義は、治療、診断、または他の観点から有用である任意の外来ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含むことを意味する。そのような分子としては、例えば、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ、デコイＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、治療的エディティングＲＮＡならびにアゴニストおよびアンタゴニストＲＮＡ、アンチセンスオリゴマ−化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサ−、プライマ−、プロ−ブ、および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする他のオリゴマ−化合物が挙げられる。そのようなものとして、これらの化合物は一本鎖、二本鎖、部分一本鎖、または環状オリゴマ−化合物の形態で導入され得る。
【００２５】
本発明との関連では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマ−またはポリマ−あるいはそれらの模倣物を示す。「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、その置換およびα−アノマ−形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエ−ト、メチルホスホネ−ト、などを含む、天然および／または修飾モノマ−または結合の直鎖状または環状オリゴマ−を含む。オリゴヌクレオチドは、規則的なパタ−ンのモノマ−−モノマ−相互作用、例えばＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対形成、フ−グスティ−ンまたは逆フ−グスティ−ン型塩基対形成などにより標的ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。
【００２６】
前記オリゴヌクレオチドは「キメラ」であってもよく、すなわち、異なる領域から構成される。本発明との関連では、「キメラ」化合物は、２つ以上の化学的領域、例えば、ＤＮＡ領域、ＲＮＡ領域、ＰＮＡ領域などを含むオリゴヌクレオチドである。各化学的領域は少なくとも１つのモノマ−単位、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合のヌクレオチドから構成される。これらのオリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも１つの領域を含み、ここで、オリゴヌクレオチドは１つ以上の所望の特性を示すように修飾される。オリゴヌクレオチドの所望の特性としては、例えば、ヌクレア−ゼ分解に対する抵抗性の増加、細胞取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増加が挙げられるが、それらに限定されない。そのため、オリゴヌクレオチドの異なる領域は異なる特性を有し得る。本発明のキメラオリゴヌクレオチドは、上記で記載されるように、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド類似体の混合構造として形成させることができる。
【００２７】
前記オリゴヌクレオチドは、天然ＤＮＡのように、モノマ−が連続して結合される場合、「レジスタ−」形態で結合させることができる、またはスペ−サを介して結合させることができる領域から構成させることができる。スペ−サは領域間の共有結合性「架橋」を構築し、場合によっては、約１００炭素原子を超えない長さを有することを意図される。スペ−サは異なる官能性を有してもよく、例えば、正または負の電荷を有し、特定の核酸  結合性（介入物、溝結合剤、毒素、フルオロフォアなど）を有し、親油性であり、例えば、α−へリックスを誘導するアラニン含有ペプチドのような特定の二次構造を誘発する。
【００２８】
本明細書で使用されている「サ−チュイン（ＳＩＲＴ）」は、すべてのファミリ−メンバ−、突然変異体、対立遺伝子、断片、種、コ−ドおよび非コ−ド配列、センスおよびアンチセンスポリヌクレオチド鎖などを含む。
【００２９】
本明細書で使用されている、用語サ−チュイン１、ＳＩＲＴ１、サ−チュイン、サイレント接合型情報制御２相同体１、ｈＳＩＲ２、ｈＳＩＲＴ１、ＮＡＤ依存性デアセチラ−ゼサ−チュイン−１、ＳＩＲ２Ｌ１、ＳＩＲ２様タンパク質１は文献では同じと考えられ、本出願では同じ意味で使用される。
【００３０】
本明細書で使用されている、用語「サ−チュイン３」、サ−チュイン３、サ−チュイン−３、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ−３、ｈＳＩＲＴ３、ＮＡＤ依存性デアセチラ−ゼサ−チュイン−３、ミトコンドリア、ＳＩＲ２Ｌ３、ＳＩＲ２様タンパク質３は、本出願では同じ意味で使用される。
【００３１】
本明細書で使用されている、用語「サ−チュイン６」、サ−チュイン６、サ−チュイン−６、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ−６、ＮＡＤ依存性デアセチラ−ゼサ−チュイン−６、ＳＩＲ２Ｌ６、ＳＩＲ２様タンパク質６は文献では同じと考えられ、本出願では同じ意味で使用される。
【００３２】
本明細書で使用されている、「に特異的なオリゴヌクレオチド」または「を標的とするオリゴヌクレオチド」という用語は、（ｉ）標的遺伝子の一部と安定な複合体を形成することができる、または（ｉｉ）標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二本鎖を形成することができる配列を有するオリゴヌクレオチドを示す。複合体および二本鎖の安定性は理論的計算および／またはインビトロアッセイにより決定することができる。ハイブリダイゼ−ション複合体および二本鎖の安定性を決定するための例示的なアッセイは、下記実施例において記載される。
【００３３】
本明細書で使用されている、「標的核酸」という用語は、ＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写されるＲＮＡ（プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、およびそのようなＲＮＡから誘導されるｃＤＮＡ、コ−ド、非コ−ド配列、センスまたはアンチセンスポリヌクレオチドを含む。オリゴマ−化合物のその標的核酸との特異的なハイブリダイゼ−ションは、核酸の正常機能を妨害する。標的核酸の機能の、これに特異的にハイブリダイズする化合物によるこの調節は一般に「アンチセンス」と呼ばれる。妨害されるＤＮＡの機能としては、例えば、複製および転写が挙げられる。妨害されるＲＮＡの機能としては、すべての生命機能、例えば、ＲＮＡのタンパク質翻訳部位へのトランスロケ−ション、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上のｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、ＲＮＡに関連する、またはそれにより促進され得る触媒活性が挙げられる。標的核酸機能のそのような妨害の全体効果は、コ−ド化産物またはオリゴヌクレオチドの発現の調節である。
【００３４】
ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」は、それらの「標的」核酸配列に対し配列特異的相同性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子により媒介される。本発明のある実施形態では、メディエ−タ−は５〜２５ヌクレオチド「低分子干渉」ＲＮＡ二本鎖（ｓｉＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは、ダイサ−として知られているリボヌクレア−ゼ酵素によるｄｓＲＮＡのプロセシングから誘導される。ｓｉＲＮＡ二本鎖産物は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と呼ばれる多タンパク質ｓｉＲＮＡ複合体に補充される。いずれの特定の理論にも縛られることを望まないが、ＲＩＳＣはその後、標的核酸（好適にはｍＲＮＡ）まで導かれると考えられ、そこでｓｉＲＮＡ二本鎖は配列特異的様式で相互作用し、触媒様式で切断を媒介する。本発明により使用することができる低分子干渉ＲＮＡは、当技術分野でよく知られた、および当業者によく知られることになるであろう手順に従い、合成、使用することができる。本発明の方法において使用するための低分子干渉ＲＮＡは好適に、約１〜約５０のヌクレオチド（ｎｔ）を有する。非制限的実施形態の実施例では、ｓｉＲＮＡは約５〜約４０ｎｔ、約５〜約３０ｎｔ、約１０〜約３０ｎｔ、約１５〜約２５ｎｔ、または約２０〜２５ヌクレオチドを含むことができる。
【００３５】
適切なオリゴヌクレオチドの選択は、核酸配列を自動的に整列させ、同一性または相同性を有する領域を示すコンピュ−タプログラムを使用することにより促進される。そのようなプログラムを使用して、例えば、デ−タベ−ス、例えばＧｅｎＢａｎｋを検索することにより、またはＰＣＲ産物を配列決定することにより得られた核酸配列が比較される。ある範囲の種からの核酸配列の比較により、種間で適切な程度の同一性を示す核酸配列の選択が得られる。配列決定されていない遺伝子の場合、サザンブロットが実施され、標的種と他の種における遺伝子間の同一性の程度が決定される。当技術分野でよく知られているように、様々な程度のストリンジェンシ−でサザンブロットを実施することにより、同一性の概算的測定値を得ることが可能になる。これらの手順により、制御される被験体における標的核酸配列に対して高い相補性度および他の種において対応する核酸配列に対しより低い相補性度を示すオリゴヌクレオチドを選択することができる。当業者は、本発明で使用するための遺伝子の適切な領域の選択においてかなりの許容範囲が存在することを認識するであろう。
【００３６】
「酵素ＲＮＡ」により、酵素活性を有するＲＮＡ分子が意味される。酵素核酸（リボザイム）は、最初に標的ＲＮＡに結合することにより作用する。そのような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素部分に非常に近接して保持される酵素核酸の標的結合部分を介して起こる。よって、酵素核酸は最初に認識し、その後塩基対形成により標的ＲＮＡに結合し、妥当な部位に結合されるとすぐに、酵素的に作用し、標的ＲＮＡを切断する。
【００３７】
「デコイＲＮＡ」により、リガンドのための天然結合ドメインを模倣するＲＮＡ分子が意味される。そのため、デコイＲＮＡは、特異的リガンドの結合のめに天然結合標的と競合する。例えば、ＨＩＶトランス活性化応答（ＴＡＲ）ＲＮＡの過剰発現は、「デコイ」として作用することができ、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質に効率的に結合し、よってＨＩＶ  ＲＮＡにおいてコ−ドされるＴＡＲ配列への結合が防止されることが示されている。これは、具体例であることが意味される。当業者であれば、これは一例にすぎず、当技術分野において一般に知られている技術を用いて他の実施形態が容易に生成され得ることを認識するであろう。
【００３８】
本明細書で使用されている、「モノマ−」という用語は典型的には、数個のモノマ−単位、例えば約３〜４から約数百のモノマ−単位の範囲のサイズのオリゴヌクレオチドを形成するための、ホスホジエステル結合またはそれらの類似体により結合されたモノマ−を示す。ホスホジエステル結合の類似体としては、以下でより完全に記載されるように、ホスホロチオエ−ト、ホスホロジチオエ−ト、メチルホスホロネ−ト、ホスホロセレノエ−ト、ホスホルアミダ−トなどが挙げられる。
【００３９】
「ヌクレオチド」という用語は、天然ヌクレオチドならびに非天然ヌクレオチドを含む。以前「非天然」と考えられていた様々なヌクレオチドがその後、自然で見いだされていることは、当業者には明らかであるはずである。よって、「ヌクレオチド」は、公知のプリンおよびピリミジン複素環含有分子だけでなく、それらの複素環類似体および互変異性体を含む。他の型のヌクレオチドの例示的な例は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンを含む分子および米国特許第５，４３２，２７２号において記載される「非天然」ヌクレオチドである。「ヌクレオチド」という用語は、これらの例ならびにそれらの類似体および互変異性体のすべておよび全部を含むことが意図される。とりわけ興味深いヌクレオチドはアデニン、グアニン、チミン、シトシン、およびウラシルを含むものであり、これらはヒトにおける治療および診断用途に関連する天然ヌクレオチドと考えられる。ヌクレオチドとしては、例えばＫｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）において記載される天然２′−デオキシおよび２′−ヒドロキシル糖、ならびにそれらの類似体が挙げられる。
【００４０】
ヌクレオチドに関連する「類似体」としては、修飾塩基部分を有する部分および／または修飾糖部分を有する合成ヌクレオチドが挙げられる。そのような類似体としては、結合特性、例えば、二本鎖または三本鎖安定性、特異性などを増強させるように設計された合成ヌクレオチドが挙げられる。
【００４１】
本明細書で使用されている、「ハイブリダイゼ−ション」は、オリゴマ−化合物の実質的に相補的な鎖の対形成を意味する。対形成の１つのメカニズムは、オリゴマ−化合物の鎖の相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（ヌクレオチド）間の水素結合（ワトソン−クリック、フ−グスティ−ンまたは逆フ−グスティ−ン水素結合であってもよい）を含む。例えば、アデニンおよびチミンは水素結合の形成を介して対形成する相補的ヌクレオチドである。ハイブリダイゼ−ションは、様々な環境下で起こり得る。
【００４２】
アンチセンス化合物は、化合物の標的核酸への結合が、標的核酸の正常機能を妨害し、機能および／または活性の調整を引き起こし、特異的結合が望ましい条件下、すなわちインビボアッセイまたは治療的処置の場合の生理的条件下、および、インビトロアッセイの場合にアッセイが実施される条件下で、アンチセンス化合物の非標的核酸配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合、「特異的にハイブリダイズ可能」である。
【００４３】
本明細書で使用されている、「ストリンジェントハイブリダイゼ−ション条件」または「ストリンジェント条件」という句は、本発明の化合物がその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列へのハイブリダイズは最小数である条件を示す。ストリンジェント条件は、配列依存的であり、異なる環境では異なっており、本発明との関連では、オリゴマ−化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェント条件」は、オリゴマ−化合物の性質および組成物ならびにそれらが研究されるアッセイにより決定される。一般に、ストリンジェントハイブリダイゼ−ション条件は、低濃度（＜０．１５Ｍ）の無機カチオン、例えばＮａ＋＋またはＫ＋＋を有する塩（すなわち、低イオン強度）、２０℃〜２５℃より高くオリゴマ−化合物：標的配列複合体のＴｍより低い温度、および変性剤、例えばホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、または洗剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在を含む。例えば、ハイブリダイゼ−ション率は、１％ホルムアミドごとに１．１％減少する。高ストリンジェンシ−ハイブリダイゼ−ション条件の例は、０．１Ｘ塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム緩衝液（ＳＳＣ）／０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、６０℃、３０分である。
【００４４】
本明細書で使用されている、「相補的」は、１または２つのオリゴマ−鎖上の２つのヌクレオチド間の正確な対形成能力を示す。例えば、アンチセンス化合物のある位置の核酸塩基が標的核酸のある位置の核酸塩基と水素結合することができ、前記標的核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチド分子である場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の水素結合の位置は、相補的位置であると考えられる。オリゴマ−化合物および別のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチド分子は、各分子内の十分な数の相補的位置が互いに水素結合することができるヌクレオチドにより占められている場合、互いに相補的である。よって、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、安定で特異的な結合がオリゴマ−化合物と標的核酸の間に起こるような、十分な数のヌクレオチドに対する正確な対形成または相補性の十分な程度を示すために使用される用語である。
【００４５】
当技術分野では、オリゴマ−化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸の配列に１００％相補的である必要はないことが理解される。さらに、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズすることができ、そのため、介在または隣接セグメントは、ハイブリダイゼ−ション事象（例えば、ル−プ構造、ミスマッチまたはヘアピン構造）に関与しない。本発明のオリゴマ−化合物は、標的とされる標的核酸配列内の標的領域に対し少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列相補性を有する。例えば、アンチセンス化合物の２０ヌクレオチドうちの１８が標的領域に相補的であるアンチセンス化合物は、そのため、特異的にハイブリダイズし、９０％相補性を表すであろう。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドによりクラスタ−化され、散在化させられ得、互いにまたは相補的ヌクレオチドに近接する必要はない。そのようなものとして、標的核酸と完全に相補的な２つの領域により隣接される、４つの（四）非相補的  ヌクレオチドを有する長さが１８ヌクレオチドのアンチセンス化合物は、標的核酸との７７．８％の全体相補性を有し、よって本発明の範囲内に含まれる。アンチセンス化合物の標的核酸の領域との％相補性は、当技術分野で知られているＢＬＡＳＴプログラム（ベ−シックロ−カルアライメントサ−チツ−ル）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを使用してル−チン的に決定することができる。％相同性、配列相同性または相補性は、例えば、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）により、デフォルト設定を使用して決定することができ、これは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを使用する（Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  （１９８１）  ２，  ４８２−４８９）。
【００４６】
本明細書で使用されている、「熱融点（Ｔｍ）」という用語は、規定イオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下での、標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度を示す。典型的には、ストリンジェント条件は、短いオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で少なくとも約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が少なくとも約３０℃である。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により達成してもよい。
【００４７】
本明細書で使用されている、「調節」は遺伝子の発現の増加（刺激）または減少（阻止）を意味する。
【００４８】
「変異体」という用語は、ポリヌクレオチド  配列との関連で使用される場合、野生型遺伝子に関連するポリヌクレオチド配列を含み得る。この定義はまた、「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」または「多型」変異体を含み得る。スプライス  変異体  は参照分子に対しかなりの同一性を有し得るが、一般に、ｍＲＮＡ  プロセシング中のエクソンの選択的スプライシングのために、ポリヌクレオチドの数がより多く、あるいはより少ない。対応するポリペプチドは、追加の機能ドメイン、あるいはドメインの欠如を有し得る。種  変異体は、個々の種によって様々であるポリヌクレオチド  配列である。野生型遺伝子産物の変異体が本発明において特に有用である。変異体は核酸  配列における少なくとも１つの  突然変異に起因し、ｍＲＮＡまたはポリペプチドが変化し、それらの構造または機能が変化し、あるいは変化しない場合がある。任意の所定の天然または組換え遺伝子は、対立形質を有さず、または１つもしくは多くの対立形質を有し得る。変異体に起こる共通の突然変異変化は、一般にヌクレオチドの自然の欠失、付加、または置換に起因する。これらの型の変化の各々は単独で、あるいは他のものとの組み合わせで、ある配列では１回以上起こりえる。
【００４９】
得られたポリペプチドは一般に、互いに著しいアミノ酸同一性を有する。多型変異体は、ある種の個体間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列の変異である。多型変異体はまた、ポリヌクレオチド配列が１つの塩基だけ変化している「一塩基多型」（ＳＮＰ）または単一塩基突然変異を含み得るＳＮＰの存在は、例えば、ある病態に対する傾向、すなわち感受性対抵抗性を有するある集団を示し得る。
【００５０】
誘導ポリヌクレオチドとしては、化学修飾、例えば、水素のアルキル、アシル、またはアミノ基による置換に供せられた核酸が挙げられる。誘導体、例えば、誘導オリゴヌクレオチドは非天然部分、例えば変化糖部分または糖間結合を含むことができる。これらの例は、ホスホロチオエ−トおよび当技術分野で知られている他の硫黄含有種である。誘導核酸はまた、標識、例えば放射性ヌクレオチド、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、コファクタ−、阻害剤、磁気粒子などを含み得る。
【００５１】
「誘導」ポリペプチドまたはペプチドは、修飾、例えば、グリコシル化、ペグ化、リン酸化、硫酸化、還元／アルキル化、アシル化、化学カップリング、または穏やかなホルマリン処理である。誘導体はまた、直接または間接的に検出可能な標識、例えば限定はされないが、放射性同位体、蛍光、および酵素標識を含むように修飾され得る。
【００５２】
本明細書で使用されている、「動物」または「患者」という用語は、例えば、ヒト、ヒツジ、ヘラジカ、シカ、ミュ−ルジカ、ミンク、ほ乳類、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、鳥類、ニワトリ、爬虫類、魚類、昆虫およびクモ類を含むことを意味する。
【００５３】
「ほ乳類」は、典型的には医療下にある温血ほ乳類（例えば、ヒトおよび家畜化動物）を含む。例としては、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、およびヒト、ならびにまさにヒトが挙げられる。
【００５４】
「治療すること」または「治療」は、ほ乳類における病態の処置を含み、（ａ）ほ乳類において、特にそのようなほ乳類がその病態にかかりやすいが、まだそれを有していると診断されていない場合、その病態が起こるのを防止すること、；（ｂ）病態を阻止すること、例えば、その発症を停止すること；および／または（ｃ）病態を軽減すること、例えば、所望のエンドポイントに到達するまで病態の退行を引き起こすことを含む。治療はまた、疾患の症状の寛解を含み（例えば、疼痛または不快感を和らげ）、そのような寛解は直接疾患に影響してもよく、しなくてもよい（例えば、原因、伝染、発現、など）。
【００５５】
本明細書で使用されている、「癌」はほ乳類において見いだされるすべての型の癌または新生物または悪性腫瘍を示し、白血病、リンパ腫、メラノ−マ、癌腫および肉腫が挙げられるが、それらに限定されない。癌は、それ自体、「腫瘍」または癌の悪性細胞を含む組織として現れる。腫瘍の例としては、肉腫および癌腫が挙げられ、例えば、限定はされないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユ−イング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、セミノ−マ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオ−マ、アストロサイト−マ、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノ−マ、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫である。本発明による開示組成物により治療することができる追加の癌としては、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵臓インスリノ−マ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、泌尿生殖器癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、および前立腺癌が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５６】
「神経疾患または障害」は、神経系および／または視覚系の任意の疾患または障害を示す。「神経疾患または障害」は、中枢神経系（脳、脳幹よび小脳）、末梢神経系（脳神経を含む）、および自律神経系（その一部が中枢および末梢神経系の両方に位置する）が関与する疾患または障害を含む。神経障害の例としては、頭痛、昏迷および昏睡、認知症、発作、睡眠障害、トラウマ、感染症、新生物ｓ、神経眼科、運動障害、脱髄性疾患、脊髄障害、ならびに末梢神経、筋肉および神経筋接合部の障害が挙げられるが、それらに限定されない。耽溺および精神疾患としては、双極性障害および統合失調症が挙げられるが、それらに限定されず、これらはまた神経障害の定義に含まれる。下記は、本発明による組成物および方法を用いて治療することができるいくつかの神経障害、症状、徴候および症候群のリストである：後天性てんかん性失語症；急性播種性脳脊髄炎；副腎白質ジストロフィ−；加齢性黄斑変性；脳梁欠損症；失認；アイカルディ症候群；アレキサンダ−病；アルパ−ス病；交代性片麻痺；血管性認知症；筋萎縮性側索硬化症；無脳症；アンジェルマン症候群；血管腫症；無酸素症；失語症；失行症；くも膜嚢胞；くも膜炎；ア−ノルド・キアリ形成異常；動静脈奇形；アスペルガ−症候群；血管拡張性失調症；注意欠陥多動性障害；自閉症；自律神経障害；背部痛；バッテン病；ベ−チェット病；ベル麻痺；良性本態性眼瞼けいれん；良性限局性筋萎縮症；良性脳圧亢進症；ビンスワンガ−病；眼瞼痙攣；Ｂｌｏｃｈ  Ｓｕｌｚｂｅｒｇｅｒ症候群；腕神経叢損傷；脳膿瘍；脳損傷；脳腫瘍（多形神経膠芽腫を含む）；脊髄腫瘍；ブラウン−セカ−ル症候群；カナバン病；手根管症候群；灼熱痛；中枢痛症候群；橋中心髄鞘融解；頭部障害；脳動脈瘤；脳動脈硬化症；脳萎縮；脳性巨人症；脳性麻痺；シャルコ−−マリ−−トゥ−ス病；化学療法誘発ニュ−ロパチ−および神経因性疼痛；キアリ奇形；舞踏病；慢性炎症性脱髄性多発ニュ−ロパチ−；慢性疼痛；慢性局所疼痛症候群；コフィン−ロ−リ−症候群；昏睡、例えば遷延性植物状態；先天性眼筋麻痺；皮質基底核変性症；頭部動脈炎；頭蓋骨癒合症；クロイツフェルト−ヤコブ病；累積外傷性障害；クッシング症候群；巨細胞性封入体病；サイトメガロウイルス感染症；ダンシングアイズ−ダンシングフィ−ト症候群；ダンディ−−ウォ−カ−症候群；Ｄａｗｓｏｎ病；ド・モルシェ症候群；Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｋｌｕｍｋｅ麻痺；認知症；皮膚筋炎；糖尿病性ニュ−ロパチ−；びまん性硬化症；自律神経障害；書字障害；失読症；ジストニア；早期乳児てんかん性脳症；トルコ鞍空洞症候群；脳炎；脳ヘルニア；脳三叉神経領域血管腫症；てんかん；Ｅｒｂ麻痺；本態性振戦；ファブリ−病；ファ−ル症候群；失神；家族性痙性麻痺；熱性痙攣；フィッシャ−症候群；Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ運動失調症；前頭側頭型認知症および他の「タウオパチ−」；ゴ−シェ病；ゲルストマン症候群；巨細胞性動脈炎；巨細胞性封入体病；グロボイド細胞白質ジストロフィ−；ギラン−バレ−症候群；ＨＴＬＶ−１−関連脊髄症；Ｈａｌｌｅｒｖｏｒｄｅｎ−Ｓｐａｔｚ病；頭部損傷；頭痛；片側顔面痙攣；遺伝性痙性対麻痺；遺伝性多発神経炎性失調；耳帯状疱疹���帯状疱疹；平山症候群；ＨＩＶ関連認知症およびニュ−ロパチ−（ＡＩＤＳの神経症状も）；全前脳症；ハンチントン病および他のポリグルタミンリピ−ト病；水無脳症；水頭症；副腎皮質ホルモン過剰症；低酸素症；免疫性脳脊髄炎；封入体筋炎；色素失調症；乳児型フィタン酸蓄積症；乳児型レフサム病；点頭てんかん；炎症性ミオパチ−；頭蓋内嚢胞；頭蓋内圧亢進；ジュベ−ル症候群；Ｋｅａｍｓ−Ｓａｙｒｅ症候群；ケネディ病；Ｋｉｎｓｂｏｕｍｅ症候群；Ｋｌｉｐｐｅｌ  Ｆｅｉｌ症候群；Ｋｒａｂｂｅ病；Ｋｕｇｅｌｂｅｒｇ−Ｗｅｌａｎｄｅｒ病；ク−ル−病；Ｌａｆｏｒａ病；Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ筋無力症候群；Ｌａｎｄａｕ−Ｋｌｅｆｆｎｅｒ症候群；延髄外側（Ｗａｌｌｅｎｂｅｒｇ）症候群；学習障害；Ｌｅｉｇｈ病；Ｌｅｎｎｏｘ−Ｇｕｓｔａｕｔ症候群；Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ症候群；白質ジストロフィ−；Ｌｅｗｙ小体型認知症；脳回欠損；閉じ込め症候群；Ｌｏｕ  Ｇｅｈｒｉｇ病（すなわち、運動ニュ−ロン疾患または筋萎縮性側索硬化症）；腰部椎間板症；ライム病−神経続発症；Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ病；大頭症；巨脳症；Ｍｅｌｋｅｒｓｓｏｎ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ症候群；Ｍｅｎｉｅｒｅ病；髄膜炎；Ｍｅｎｋｅｓ病；異染性白質ジストロフィ−；小頭症；片頭痛；Ｍｉｌｌｅｒ  Ｆｉｓｈｅｒ症候群；小発作；ミトコンドリアミオパチ−；Ｍｏｂｉｕｓ症候群；平山病；運動ニュ−ロン疾患；もやもや病；ムコ多糖症；多発脳梗塞性認知症；多巣性運動ニュ−ロパチ−；多発性硬化症および他の脱髄障害；体位性低血圧を有する多系統萎縮症；ｐ筋ジストロフィ−；重症筋無力症；ミエリン分解性びまん性硬化症；乳児のミオクロ−ヌス性脳症；ミオクロ−ヌス；ミオパチ−；先天性筋緊張症；ナルコレプシ−；神経線維腫症；神経弛緩薬性悪性症候群；ＡＩＤＳの神経症状；ル−プスの神経続発症；神経性筋強直症；神経セロイドリポフスチン症；神経細胞移動障害；Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ病；Ｏ′Ｓｕｌｌｉｖａｎ−ＭｃＬｅｏｄ症候群；後頭神経痛；潜在性脊椎管列癒合異常；Ｏｈｔａｈａｒａ症候群；オリ−ブ橋小脳萎縮症；オプソクロ−ヌス・ミオクロ−ヌス；視神経炎；起立性低血圧症；使い過ぎ症候群；錯感覚；神経変性疾患または障害（パ−キンソン病、ハンチントン病、アルツハイマ−病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、認知症、多発性硬化症ならびに他の神経細胞死と関連する疾患および障害）；先天性パラミオトニア；腫瘍随伴病；発作；Ｐａｒｒｙ  Ｒｏｍｂｅｒｇ症候群；Ｐｅｌｉｚａｅｕｓ−Ｍｅｒｚｂａｃｈｅｒ病；周期性四肢麻痺；末梢性ニュ−ロパチ−；有痛性ニュ−ロパチ−および神経因性疼痛；遷延性植物状態；広汎性発達障害；光くしゃみ反射；フィタン酸蓄積症；Ｐｉｃｋ病；はさまれた神経；下垂体腫瘍；多発性筋炎；孔脳症；ポリオ後症候群；ヘルペス後神経痛；感染後脳脊髄炎；体位性低血圧；Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群；原発性側索硬化症；プリオン病；進行性顔面片側萎縮症；進行性多巣性白質脳症；進行性硬化性ポリオジストロフィ−；進行性核上性麻痺；偽脳腫瘍；Ｒａｍｓａｙ−Ｈｕｎｔ症候群（ＩおよびＩＩ型）；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ脳炎；反射性交感神経性ジストロフィ−症候群；��ｅｆｓｕｍ病；反復性運動障害；反復性ストレス損傷；下肢静止不能症候群；レトロウイルス関連脊髄症；Ｒｅｔｔ症候群；Ｒｅｙｅｓ症候群；舞踏病；Ｓａｎｄｈｏｆｆ病；Ｓｃｈｉｌｄｅｒ病；裂脳症；中隔視神経異形成症；揺さぶられっ子症候群；帯状疱疹；Ｓｈｙ−Ｄｒａｇｅｒ症候群；Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群；睡眠時無呼吸；Ｓｏｔｏ症候群；痙縮；二分脊椎；損傷；脊髄腫瘍；脊髄性筋萎縮症；Ｓｔｉｆｆ−Ｐｅｒｓｏｎ症候群；脳卒中；Ｓｔｕｒｇｅ−Ｗｅｂｅｒ症候群；亜急性硬化性全脳炎；皮質下動脈硬化性脳症；Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病；失神；脊髄空洞症；遅発性ジスキネジア；Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ病；側頭動脈炎；脊髄係留症候群；Ｔｈｏｍｓｅｎ病；胸郭出口症候群；三叉神経痛；Ｔｏｄｄ麻痺；Ｔｏｕｒｅｔｔｅ症候群；一過性脳虚血発作；伝達性海綿状脳症；横断性脊髄炎；外傷性脳損傷；振戦；三叉神経痛；熱帯性痙性不全対麻痺症；結節性硬化症；血管性認知症（多発梗塞性認知症）；血管炎、例えば側頭動脈炎；Ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ病；Ｗａｌｌｅｎｂｅｒｇ症候群；Ｗｅｒｄｎｉｇ−Ｈｏｆｆｍａｎ病；Ｗｅｓｔ症候群；むち打ち症；Ｗｉｌｌｉａｍｓ症候群；Ｗｉｌｄｏｎ病；およびＺｅｌｌｗｅｇｅｒ症候群。
【００５７】
「代謝疾患」は、広範囲にわたる内分泌系の疾患および障害を示し、例えば、インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、耐糖能障害、高血中コレステロ−ル、高血糖、脂質異常症よび高脂血症が挙げられる。
【００５８】
「炎症」は、全身的な炎症状態および単球、白血球および／または好中球の移動および誘引と局所的に関連する病状を示す。炎症の例としては、病原生物（グラム陽性菌、グラム陰性菌、ウイルス、真菌、および寄生虫、例えば原虫および蠕虫を含む）による感染症に起因する炎症、移植片拒絶（実質臓器、例えば腎臓、肝臓、心臓、肺または角膜の拒絶、骨髄移植の拒絶、例えば移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む）、または限局性慢性または急性自己免疫またはアレルギ−反応に起因する炎症が挙げられるが、それらに限定されない。自己免疫疾患としては、急性糸球体腎炎；関節リウマチまたは反応性関節炎；慢性糸球体腎炎；炎症性腸疾患、例えばクロ−ン病、潰瘍性大腸炎および壊死性腸炎；顆粒球輸血関連症候群；炎症性皮膚疾患、例えば接触皮膚炎、アトピ−性皮膚炎、乾癬；全身性エリテマト−デス（ＳＬＥ）、自己免疫甲状腺炎、多発性硬化症、およびいくつかの形態の糖尿病、または被験体の自己の免疫系による攻撃により、病的組織破壊が起こる任意の他の自己免疫状態が挙げられる。アレルギ−反応としては、アレルギ−性喘息、慢性気管支炎、急性および遅延型過敏症が挙げられる。全身的炎症病態としては、外傷、火傷、虚血事象（例えば、心臓、脳、腸または末梢性脈管構造における血栓性事象、例えば心筋梗塞および脳卒中）後の再灌流、敗血症、ＡＲＤＳまたは多臓器障害症候群と関連する炎症が挙げられる。炎症細胞補充もまた、動脈硬化プラ−クで起こる。炎症としては、非ホジキンリンパ腫、ウェゲナ−肉芽腫症、橋本甲状腺炎、肝細胞癌、胸腺萎縮、慢性膵炎、関節リウマチ、反応性リンパ組織増生、変形性関節症、潰瘍性大腸炎、乳頭癌、クロ−ン病、潰瘍性大腸炎、急性胆嚢炎、慢性胆嚢炎、硬変、慢性唾液腺炎、腹膜炎、急性膵炎、慢性膵炎、慢性胃炎、腺筋症、子宮内膜症、急性子宮頸管炎、慢性子宮頸管炎、リンパ過形成、多発性硬化症、特発性血小板減少性紫斑病に続発する肥大、原発性ＩｇＡ腎症、全身性エリテマト−デス、乾癬、肺気腫、慢性腎盂腎炎、および慢性膀胱炎が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５９】
心血管疾患または障害としては、虚血を引き起こす可能性がある、または心臓の再灌流により引き起こされる障害が挙げられる。例としては、アテロ−ム性動脈硬化、冠動脈疾患、肉芽腫性心筋炎、慢性心筋炎（非肉芽腫性）、原発性肥大型心筋症、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、脳卒中、狭心症、心筋梗塞、心停止により引き起こされる心血管組織損傷、心臓バイパス術により引き起こされる心血管組織損傷、心原性ショック、ならびに当業者に知られている、または心臓または脈管構造の機能障害または組織損傷に関係する関連する病状、とりわけ、限定はされないがサ−チュイン３活性化に関連する組織損傷が挙げられるが、それらに限定されない。ＣＶＳ疾患としては、アテロ−ム性動脈硬化、肉芽腫性心筋炎、心筋梗塞、心臓弁疾患に続発する心筋線維症、梗塞なしの心筋線維症、原発性肥大型心筋症、および慢性心筋炎（非肉芽腫性）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６０】
ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド組成物および分子
標的
１つの実施形態では、標的は、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の核酸配列、例えば限定はされないが、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）に関連するセンスおよび／またはアンチセンス非コ−ドおよび／またはコ−ド配列を含む。
【００６１】
１つの実施形態では、標的は、ＳＩＲＴ１の核酸配列、例えば限定はされないが、ＳＩＲＴ１遺伝子に関連するセンスおよび／またはアンチセンス非コ−ドおよび／またはコ−ド配列を含む。
【００６２】
１つの実施形態では、標的は、ＳＩＲＴ３の核酸配列、例えば限定はされないが、ＳＩＲＴ３遺伝子に関連するセンスおよび／またはアンチセンス非コ−ドおよび／またはコ−ド配列を含む。
【００６３】
１つの実施形態では、標的は、ＳＩＲＴ６の核酸配列、例えば限定はされないが、ＳＩＲＴ６遺伝子に関連するセンスおよび／またはアンチセンス非コ−ドおよび／またはコ−ド配列を含む。
【００６４】
「ＳＩＲＴ１タンパク質」は、サ−チュインデアセチラ−ゼのｓｉｒ２ファミリ−のメンバ−を示す。１つの実施形態では、ＳＩＲＴ１タンパク質は、酵母Ｓｉｒ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ５３６８５）、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）Ｓｉｒ−２．１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ．ｓｕｂ．−−５０１９１２）、ヒトＳＩＲＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−０１２２３８およびＮＰ．ｓｕｂ．−−０３６３７０（またはＡＦ０８３１０６））を含む。
【００６５】
ＳＩＲＴ１  「サ−チュイン」は、ＳＩＲ２ドメイン、Ｐｆａｍファミリ−「ＳＩＲ２」−ＰＦ０２１４６（別表に添付）におけるヒットとしてスコア化されるアミノ酸配列として規定されるドメインを含む．タンパク質である。このファミリ−はＩＮＴＥＲＰＲＯデ−タベ−スにおいてＩＮＴＥＲＰＲＯ記述（エントリＩＰＲ００３０００）として参照される。タンパク質配列中の「ＳＩＲ２」ドメインの存在を同定するために、対象のポリペプチドまたはタンパク質が特定のプロファイルを有すること、タンパク質のアミノ酸配列を、ＨＭＭのＰｆａｍデ−タベ−ス（例えば、Ｐｆａｍデ−タベ−ス、リリ−ス９）に対してデフォルトパラメ−タを使用して検索することができること（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ／ＨＭＭ＿ｓｅａｒｃｈ）を決定すること。ＳＩＲ２ドメインは、ＰｆａｍにおいてＰＦ０２１４６として、ＩＮＴＥＲＰＲＯにおいてＩＮＴＥＲＰＲＯ記述（エントリＩＰＲ００３０００）としてインデックスがつけられる。Ｐｆａｍ  デ−タベ−スの記述は、’Ｔｈｅ  Ｐｆａｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ’  Ｂａｔｅｍａｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０（ｌ）：２７６−２８０  ａｎｄ  Ｓｏｎｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２８（３）：４０５−４２において見いだすことができ、ＨＭＭの詳細な記述は、例えば、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８３：１４６−１５９；  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：４３５５−４３５８；  Ｋｒｏｇｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３５：１５０１−１５３１；  ａｎｄ  Ｓｔｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ２：３０５−３１４において見いだすことができる。
【００６６】
ミトコンドリアサ−チュインの中で、ＳＩＲＴ３は最も頑強なデアセチラ−ゼ活性を有する。実際、ＳＩＲＴ４またはＳＩＲＴ５ノックアウト動物と比較して、著しく高いレベルのミトコンドリアタンパク質アセチル化がＳＩＲＴ３−ヌルマウスの肝臓で検出された。しかしながら、多くのＳＩＲＴ３基質および共沈タンパク質：アセチルＣｏＡシンタ−ゼ２、Ｋｕ７０、ＦＯＸＯ３ａ、ミトコンドリア複合体Ｉ（ＮＤＵＦＡ９）のサブユニット９、グルタミン酸デヒドロゲナ−ゼおよびイソクエン酸デヒドロゲナ−ゼ２が同定されているという事実にかかわらず、ＳＩＲＴ３の生理的役割についてはほとんど知られていない。
【００６７】
ＳＩＲＴ３は主要ミトコンドリアデアセチラ−ゼである。ミトコンドリアタンパク質はＳＩＲＴ３ノックアウトマウスにおいて高アセチル化を示すが、ＳＩＲＴ４またはＳＩＲＴ５ノックアウトマウスでは示さない。アセチルＣｏＡシンタ−ゼ２（ＡｃｅＣＳ２）、酢酸をアセチルＣｏＡに変換するミトコンドリア酵素は、同定された最初のＳＩＲＴ３のミトコンドリア基質であった。ＳＩＲＴ３によるリシン６４２でのＡｃｅＣＳ２の脱アセチル化は、アセチルＣｏＡシンタ−ゼ活性を活性化し、トリカルボン酸回路に流れ込むアセチルＣｏＡを増加させる。グルタミン酸デヒドロゲナ−ゼ（ＧＤＨ）、エネルギ−生産に関与する別のミトコンドリアタンパク質は、ＳＩＲＴ３により脱アセチル化される。ＧＤＨはまた、ＳＩＲＴ４によりＡＤＰリボシル化することができ、その酵素活性が減少される。これは、ＳＩＲＴ３が細胞代謝において重要な役割を果たすことを示す。ＳＩＲＴ３はまた、選択的アポト−シス経路および細胞増殖制御に関与することが示されている。ＳＩＲＴ５ではなく、ＳＩＲＴ３およびＳＩＲＴ４は細胞生存に関してＮＡＤ＋レベルを調節するＮＡＤ＋サルベ−ジ経路に関与している。さらに、ｈＳＩＲＴ３遺伝子における可変性は、ヒト長寿に関係している。
【００６８】
サイレント情報制御因子−２遺伝子（Ｓｉｒ２）は、出芽酵母におけるクロマチン、ゲノム安定性、および寿命の制御に関連するＮＡＤ依存性ヒストンデアセチラ−ゼをコ−ド化する。クロマチンサイレンシングを促進することにより、Ｓｉｒ２は、いくつかの遺伝子座での転写を阻止し、リボソ−ムＤＮＡ（ｒＤＮＡ）リピ−トでの組換えを抑制する。Ｓｉｒ２に突然変異を有する酵母は、ｒＤＮＡ組換えとの関連でゲノム不安定性を増加させ、ひいては複製寿命−この生物における生殖老化のマ−カ−を短くする。逆に、ｒＤＮＡ組換えを抑制するＳｉｒ２の余分なコピ−は、複製寿命を増加させる。Ｓｉｒ２のこれらの効果は、クロマチン調節によりゲノム安定化を促進する遺伝子が、生命体寿命、老化、および加齢性病理の制御に対する重要な貢献者になり得るパラダイムを示唆する。
【００６９】
寿命制御におけるＳｉｒ２因子に対する保存役割と一致して、多細胞生物Ｃ．エレガンスおよびキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）におけるＳｉｒ２タンパク質の活性の増加はまた、寿命を増加させる。しかしながら、これらのＳｉｒ２因子は、ゲノム安定化とは独立したメカニズムを介して動作することができ、それらの生理的分子基質は依然として不明確である。ほ乳類では、いくつかのＳｉｒ２ファミリ−メンバ−、ＳＩＲＴ１−ＳＩＲＴ７が存在する。ＳＩＲＴは、ほ乳類寿命および加齢性プロセスの候補制御因子として非常に興味深い。この状況では、いくつかのほ乳類ＳＩＲＴは、加齢性分子経路および疾患に影響する機能を有する。しかしながらほ乳類ＳＩＲＴの初期の研究は、これらの酵素を生物化学標的におよび出芽酵母Ｓｉｒ２とは異なる細胞機能に関連づけた。
【００７０】
ほ乳類ＳＩＲＴ６遺伝子欠損マウスの作成は、寿命、クロマチン、およびゲノム安定性の関連制御におけるＳＩＲＴ６の潜在的な役割を明らかにした。この状況では、マウスにおけるＳＩＲＴ６欠損は、著しく短くなった寿命および早期老化の病態と重なる急性変性表現型に至る。さらに、ＳＩＲＴ６ノックアウトマウス細胞はゲノム不安定性およびＤＮＡ損傷過敏症を有する。生物化学分画アッセイでは、ＳＩＲＴ６タンパク質は、クロマチンに富む細胞分画と優先的に結合する。総合して、これらの観察は、ＳＩＲＴ６がクロマチン制御とＤＮＡ修復をつなぎ合わせることを示唆した。しかしながら、そのようなプロセスにおけるＳＩＲＴ６の生理的役割は未だ、証明されていない。
【００７１】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ファミリ−メンバ−と関連する疾患または障害を防止または治療するために使用される。アンチセンス化合物を使用して得られた幹細胞から再生された細胞／組織で治療することができる例示的なサ−チュイン（ＳＩＲＴ）媒介疾患および障害は下記を含む：癌（例えば、乳癌、結腸直腸癌、ＣＣＬ、ＣＭＬ、前立腺癌）、神経変性疾患または障害（例えば、アルツハイマ−病（ＡＤ）、ハンチントン病、パ−キンソン」）病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、およびポリグルタミン凝集により引き起こされる障害）；骨格筋疾患（例えば、デュシャンヌ筋ジストロフィ−、骨格筋萎縮、ベッカ−型ジストロフィ−、または筋緊張性ジストロフィ−）；代謝疾患または障害（例えば、インスリン抵抗性、糖尿病、２型糖尿病、肥満、耐糖能障害、代謝症候群、成人発症型糖尿病、糖尿病性腎症、高血糖、糖尿病性腎症、高コレステロ−ル血症、脂質異常症高脂血症および加齢性代謝疾患など）、インスリンレベルの制御障害に関連する疾患または障害、ニュ−ロパチ−（例えば、感覚ニュ−ロパチ−、自律神経ニュ−ロパチ−、運動性ニュ−ロパチ−、網膜症）、ケトン体産生状態と関連する疾患または障害、エネルギ−恒常性障害と関連する疾患または障害、アセチルＣｏＡシンタ−ゼ２活性障害と関連する疾患または障害、代謝恒常性と関連する疾患または障害、脂質代謝疾患または障害、熱産生障害と関連する疾患または障害、ミトコンドリア機能障害と関連する疾患または障害、ニュ−ロパチ−（例えば、感覚ニュ−ロパチ−、自律神経ニュ−ロパチ−、運動性ニュ−ロパチ−、網膜症）、肝臓疾患（例えば、アルコ−ル乱用による、または肝炎、脂肪肝疾患など）；加齢性黄斑変性、骨疾患（例えば、骨粗鬆症）、血液病（例えば、白血病）；肝臓疾患（例えば、アルコ−ル乱用によるまたは肝炎）；肥満；骨吸収、加齢性黄斑変性、ＡＩＤＳ関連認知症、ＡＬＳ、ベル麻痺、アテロ−ム性動脈硬化、心臓病（例えば、心臓調律不全、慢性うっ血性心不全、虚血性脳卒中、冠動脈疾患および心筋症）、慢性変性疾患（例えば、心筋疾患）、慢性腎不全、２型糖尿病、潰瘍、白内障、老視、糸球体腎炎、ギラン−バレ−症候群、出血性卒中、関節リウマチ、炎症性腸疾患、ＳＬＥ、クロ−ン病、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺疾患、皮膚の老化、尿失禁、ミトコンドリア機能障害と関連する疾患または障害（例えば、ミトコンドリアミオパチ−、脳症、レ−バ−病、リ−脳症、ピアソン病、乳酸アシド−シス、「ミトコンドリア脳症、乳酸アシド−シスおよび脳卒中様症状」（ＭＥＬＡＳ）など）ならびに神経細胞死と関連する疾患または障害、変性症候群、老化、テロメア機能障害と関連する疾患または障害、クロマチン制御障害と関連する疾患または障害、早期細胞老化と関連する疾患または障害、ＳＩＲＴ６媒介ＤＮＡ修復障害と関連する疾患または障害ならびに望まれていない細胞消失により特徴づけられる病状。
【００７２】
別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）と関連する疾患または障害を患う、またはそれを発症する危険のある患者において、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の正常発現および／または正常機能を調節する。
【００７３】
本発明の実施形態では、治療および／または美容法ならびに関連するオ−ダ−メ−ド治療が皮膚の処置を必要とする、または皮膚の処置を必要とするであろう病状を発症する危険のある被験体に提供される。診断は、例えば、被験体のＳＩＲＴ状態に基づき実施することができる。皮膚などのある組織における患者のＳＩＲＴ発現レベルは、当業者に知られており、本明細書のどこかに記載されている方法により、例えば、ＰＣＲまたは抗体に基づいた検出方法を用いて組織を分析することにより、決定することができる。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態は、例えば、皮膚においてＳＩＲＴの発現を上方制御するためにＳＩＲＴアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、皮膚の処置および／または化粧用途のための組成物を提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、配列番号４〜１６として示されている。本明細書に組み込まれる米国特許第７，５４４，４９７号、’Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｉｆｅｓｐａｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ’は、サ−チュインタンパク質のその基質に対するＫｍを減少させることによりサ−チュイン活性を調節する薬剤のための潜在的な化粧用途を記載する。実施形態では、細胞はインビボで本発明のオリゴヌクレオチドにより処置され、細胞寿命が増加され、またはアポト−シスが防止される。例えば、皮膚は、本明細書で記載されるように、皮膚、例えば、上皮細胞を処置することにより、老化、例えば、しわの発現から保護することができる。例示的な実施形態では、皮膚を、本明細書で記載されるＳＩＲＴアンチセンス化合物を含む医薬または化粧組成物と接触させる。例示的な皮膚障害または皮膚の状態としては、炎症、日焼けによる損傷または自然老化と関連する、またはそれらにより引き起こされる障害または疾患が挙げられる。例えば、組成物は、接触皮膚炎（刺激性接触皮膚炎およびアレルギ−性接触皮膚炎を含む）、アトピ−性皮膚炎（アレルギ−性湿疹としても知られている）、日光角化症、角質化障害（湿疹を含む）、表皮水疱症疾患（天疱瘡を含む）、剥離性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、紅斑（多形性紅斑および結節性紅斑を含む）、太陽または他の光源により引き起こされる損傷、円板状エリテマト−デス、皮膚筋炎、皮膚癌および自然老化の影響の防止または治療に有用である。
【００７５】
サ−チュインはジヒドロテストステロン誘導アンドロゲン受容体シグナリングを妨害することが報告されている。（例えば、Ｆｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  ’Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＳＩＲＴ１，’  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２６（２１）：  ８１２２−８１３５（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。本発明の実施形態では、ＳＩＲＴアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物は、例えば、頭皮においてＳＩＲＴの発現を上方制御しアンドロゲン受容  シグナリングを阻止し、よって、アンドロゲン性脱毛症（脱毛）を防止する。実施形態では、脱毛症を患う患者は、局所または全身製剤のいずれかが投与される。
【００７６】
一実施形態では、本明細書で記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に局所用薬物投与に適合された局所用担体を含み、当技術分野で知られている任意のそのような材料を含む局所製剤に組み入れられる。局所用担体は所望の形態、例えば、軟膏、ロ−ション、クリ−ム、マイクロエマルジョン、ゲル、油、溶液などの組成物を提供するように選択することができ、天然または合成供給源のいずれかの材料から構成することができる。選択された担体は局所製剤の活性剤または他の成分に悪影響を与えないことが好ましい。本明細書で使用するために好適な局所用担体の例としては、水、アルコ−ルおよび他の無毒性有機溶媒、グリセリン、鉱物油、シリコ−ン、ワセリン、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン、ワックスなどが挙げられる。製剤は、無色、無臭軟膏、ロ−ション、クリ−ム、マイクロエマルジョンおよびゲルとしてもよい。
【００７７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、軟膏に組み入れることができ、これは一般に半固体調製物であり、典型的にはワセリンまたは他の石油誘導体を基本とする。使用される特定の軟膏ベ−スは、当業者に認識されるように、最適薬物送達を提供し、好ましくは、他の望ましい特性、例えば、皮膚軟化性なども提供するものである。他の担体またはビヒクルのように、軟膏ベ−スは、不活性、安定、非刺激性および非感作性でなければならない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．）において説明されるように、軟膏ベ−スは４つのクラスに分類することができる：油性ベ−ス；乳化できるベ−ス；エマルジョンベ−ス；および水溶性ベ−ス。油性軟膏ベ−スとしては、例えば、植物油、動物から得られる脂肪、および石油から得られる半固体炭化水素が挙げられる。乳化できる軟膏ベ−スは、吸収性軟膏ベ−スとしても知られており、水をほとんどまたは全く含まず、例えば、ヒドロキシステアリンスルフェ−ト、無水ラノリンおよび親水ワセリンが挙げられる。エマルジョン軟膏ベ−スは油中水（Ｗ／Ｏ）エマルジョンまたは水中油（Ｏ／Ｗ）エマルジョンであり、例えば、セチルアルコ−ル、モノステアリン酸グリセリン、ラノリンおよびステアリン酸が挙げられる。例示的な水溶性軟膏ベ−スは様々な分子量のポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧｓ）から調製される（例えば、上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓを参照されたい）。
【００７８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはロ−ション中に組み入れられてもよく、これは一般に摩擦なしで皮膚表面に適用される調製物であり、典型的には液体または半液体調製物であり、この中では、活性剤を含む固体粒子が、水またはアルコ−ルベ−ス中に存在する。ロ−ションは通常、固体の懸濁液であり、水中油型の液体油状エマルジョンを含んでもよい。ロ−ションは、より多くの流体組成物を適用するのが容易なため、大きな体面積を治療するための好ましい製剤である。一般に、ロ−ション中の不溶性物質は微粉化されることが必要である。ロ−ションは典型的には、活性剤を皮膚と接触させて局在化させ、保持するために有用な、より良好な分散物および化合物を生成させるために懸濁化剤、ｎ、例えば、メチルセルロ−ス、カルボキシメチルセルロ−スナトリウム、などを含む。本発明の方法と共に使用するための例示的なロ−ション製剤は、親水ワセリンと混合されたプロピレングリコ−ル、例えばＢｅｉｅｒｓｄｏｒｆ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）から商標名Ａｑｕａｐｈｏｒ．ｓｕｐ．ＲＴＭで得られるものを含む。
【００７９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはクリ−ム中に組み入れられてもよく、これは一般に粘性液体または半固体エマルジョンであり、水中油または油中水のいずれかである。クリ−ムベ−スは、水洗性であり、油相、乳化剤および水相を含む。油相は一般に、ワセリンおよび脂肪アルコ−ル、例えばセチルまたはステアリルアルコ−ルから構成され；水相は通常、必ずではないが、体積で油相を超え、一般に湿潤剤を含む。クリ−ム製剤中の乳化剤は、上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓで説明されるように、一般に非イオン性、アニオン性、カチオン性または両性界面活性剤である。
【００８０】
本発明のアンチセンス  オリゴヌクレオチドはマイクロエマルジョン中に組み入れられてもよく、これは一般に界面活性剤  分子の界面膜により安定化された２つの非混和性  液体、例えば  油  および水の、熱力学的安定であり、等方的に透明な分散物である（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、１９９２）、ｖｏｌｕｍｅ  ９）。マイクロエマルジョン調製物では、界面活性剤（乳化剤）、共界面活性剤（共乳化剤）、油相および水相が必要である。好適な界面活性剤としては、エマルジョン調製物で有用な任意の界面活性剤、例えば、典型的にはクリ−ム調製物で使用される乳化剤が挙げられる。共界面活性剤（または「共乳化剤」）は一般に、ポリグリセロ−ル誘導体、グリセロ−ル誘導体および脂肪アルコ−ルの群から選択される。好ましい乳化剤／共乳化剤の組み合わせは、一般に、必ずではないが、下記からなる群より選択される：モノステアリン酸グリセリンおよびステアリン酸ポリオキシエチレン；ポリエチレングリコ−ルおよびパルミトステアリン酸エチレングリコ−ル；およびトリ（カプリル酸およびカプリン酸）グリセリルおよびオレオイルマクロゴ−ルグリセリド。水相は水だけでなく、典型的には、緩衝剤、グルコ−ス、プロピレングリコ−ル、ポリエチレングリコ−ル、好ましくは低分子量ポリエチレングリコ−ル（例えば、ＰＥＧ３００およびＰＥＧ４００）、および／またはグリセロ−ル、などを含むが、油相は一般に、例えば、脂肪酸エステル、修飾植物油、シリコ−ン油、モノ、ジ、およびトリグリセリドの混合物、ＰＥＧのモノおよびジエステル（例えば、オレオイルマクロゴ−ルグリセリド）、などを含む。
【００８１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはゲル製剤中に組み入れられてもよく、これは一般に、小無機粒子からなる懸濁液（２相系）または担体液体全体に実質的に均一に分散された大有機分子（単相ゲル）のいずれかから構成される半固体系である。単相ゲルは、例えば、活性剤、担体液体および好適なゲル化剤、例えばトラガカント（２〜５％）、アルギン酸ナトリウム（２〜１０％）、ゼラチン（２〜１５％）、メチルセルロ−ス（３〜５％）、カルボキシメチルセルロ−スナトリウム（２〜５％）、カルボマ−（０．３〜５％）またはポリビニルアルコ−ル（１０〜２０％）を共に組み合わせ、特性半固体生成物が生成するまで混合することにより製造することができる。他の好適なゲル化剤としては、メチルヒドロキシセルロ−ス、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン、ヒドロキシエチルセルロ−スおよびゼラチンが挙げられる。ゲルは一般に水性担体液体を使用するが、アルコ−ルおよび油もまた担体液体として使用することができる。
【００８２】
当業者に公知の様々な添加物を、製剤、例えば、局所製剤中に含ませてもよい。添加物の例としては、可溶化剤、皮膚透過増強剤、乳白剤、保存剤（例えば、抗酸化剤）、ゲル化剤、緩衝剤、界面活性剤（特に非イオン性および両性界面活性剤）、乳化剤、軟化薬、増粘剤、安定化剤、湿潤剤、着色剤、芳香剤、などが挙げられるが、それらに限定されない。可溶化剤および／または皮膚透過増強剤を、乳化剤、軟化薬および保存剤と共に含ませることが特に好ましい。最適局所製剤はおよそ：２ｗｔ％〜６０ｗｔ％、好ましくは２ｗｔ％〜５０ｗｔ％の可溶化剤および／または皮膚透過増強剤；２ｗｔ％〜５０ｗｔ％、好ましくは２ｗｔ％〜２０ｗｔ％の乳化剤；２ｗｔ％〜２０ｗｔ％の軟化薬；および０．０１〜０．２ｗｔ％保存剤を含み、活性剤および担体（例えば、水）が製剤の残りを構成する。
【００８３】
皮膚透過増強剤は、かなりのサイズの壊れていない皮膚領域を通過させるように治療レベルの活性剤の通過を促進するように機能する。好適な増強剤は、当技術分野でよく知られており、例えば下記が挙げられる：低級アルカノ−ル、例えばメタノ−ルエタノ−ルおよび２−プロパノ−ル；アルキルメチルスルホキシド、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、デシルメチルスルホキシド（Ｃ．ｓｕｂ．１０ＭＳＯ）およびテトラデシルメチルスルホキシド；ピロリドン、例えば２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドンおよび  Ｎ−（−ヒドロキシエチル）ピロリドン；尿素；Ｎ，Ｎ−ジエチルｍ−トルアミド；Ｃ．ｓｕｂ．２−Ｃ．ｓｕｂ．６アルカンジオ−ル；種々の溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）およびテトラヒドロフルフリルアルコ−ル；および１−置換アザシクロヘプタン−２−オン、特に１−ｎ−ドデシルシクラザシクロヘプタン−２−オン（ラウロカプラム；商標名Ａｚｏｎｅ．ｓｕｐ．ＲＴＭとしてＷｈｉｔｂｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｖａ．から入手可能）。
【００８４】
可溶化剤の例としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：親水性エ−テル、例えばジエチレングリコ−ルモノエチルエ−テル（エトキシジグリコ−ル、Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ．ｓｕｐ．ＲＴＭとして市販されている）およびジエチレングリコ−ルモノエチルエ−テルオレエ−ト（Ｓｏｆｉｃｕｔｏｌ．ｓｕｐ．ＲＴＭとして市販されている）；ポリエチレンヒマシ油誘導体、例えばポリオキシ３５ヒマシ油、ポリオキシ４０水素化ヒマシ油、など；ポリエチレングリコ−ル、特に低分子量ポリエチレングリコ−ル、例えばＰＥＧ３００およびＰＥＧ４００、ならびにポリエチレングリコ−ル誘導体、例えばＰＥＧ−８カプリル酸／カプリン酸グリセリル（Ｌａｂｒａｓｏｌ．ｓｕｐ．ＲＴＭとして市販されている）；アルキルメチルスルホキシド、例えばＤＭＳＯ；ピロリドン、例えば２−ピロリドンおよびＮ−メチル−２−ピロリドン；ならびにＤＭＡ。多くの可溶化剤はまた、吸収増強剤として作用することができる。単一の可溶化剤を製剤に組み入れてもよく、可溶化剤混合物を組み入れてもよい。
【００８５】
好適な乳化剤および共乳化剤としては、マイクロエマルジョン製剤に関して記載される乳化剤および共乳化剤が挙げられるが、それらに限定されない。軟化薬としては、例えば、プロピレングリコ−ル、グリセロ−ル、ミリスチン酸イソプロピル、ポリプロピレングリコ−ル−２（ＰＰＧ−２）ミリスチルエ−テルプロピオネ−ト、などが挙げられる。
【００８６】
他の活性剤、例えば、他の抗炎症薬、鎮痛薬、抗菌薬、抗真菌薬、抗生物質、ビタミン、抗酸化剤、および日焼け防止製剤中で一般に見られる日焼け止め剤もまた、製剤中に含めることができ、アントラニレ−ト、ベンゾフェノン（特にベンゾフェノン−３）、カンファ−誘導体、シンナマ−ト（例えば、メトキシ桂皮酸オクチル）、ジベンゾイルメタン（例えば、ブチルメトキシジベンゾイルメタン）、ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）およびその誘導体、およびサリチラ−ト（例えば、オクチルサリチラ−ト）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８７】
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、非コ−ド領域を含むがそれらに限定されないサ−チュイン（ＳＩＲＴ）のポリヌクレオチドに特異的である。サ−チュイン（ＳＩＲＴ）標的は、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の変異体；サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の突然変異体、例えばＳＮＰ；サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の非コ−ド配列；対立遺伝子、断片などを含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ分子である。
【００８８】
本発明の実施形態によれば、標的核酸分子はサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドのみに限定されず、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）のアイソフォ−ム、受容体、相同体、非コ−ド領域などに及ぶ。
【００８９】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、変異体、対立遺伝子、相同体、突然変異体、誘導体、断片およびそれに対する相補的配列を含むが、それらに限定されない、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）標的の天然アンチセンス配列（コ−ドおよび非コ−ド領域に対し天然アンチセンス）を標的とする。好ましくは、オリゴヌクレオチドはアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子である。
【００９０】
別の実施形態では、本発明のオリゴマ−化合物はまた、化合物のヌクレオチド位置の１つ以上に異なる塩基が存在する変異体を含む。例えば、第１のヌクレオチドがアデニンである場合、この位置でチミジン、グアノシン、シチジンまたは天然もしくは  非天然  ヌクレオチドを含む変異体が生成され得る。これは、アンチセンス化合物のいずれにおいても実施され得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、アンチセンス化合物と標的の間の相同性、配列相同性または相補性は約５０％〜約６０％である。いくつかの実施形態では、相同性、配列相同性または相補性は約６０％〜約７０％である。いくつかの実施形態では、相同性、配列相同性または相補性は約７０％〜約８０％である。いくつかの実施形態では、相同性、配列相同性または相補性、は約８０％〜約９０％である。いくつかの実施形態では、相同性、配列相同性または相補性は約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％である。
【００９２】
アンチセンス化合物は、化合物の標的核酸への結合が、標的核酸の正常機能を妨害し、活性の損失を引き起こし、特異的結合が望ましい条件下でアンチセンス化合物の非標的核酸配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合、特異的にハイブリダイズ可能である。そのような条件としては、すなわち、インビボアッセイまたは治療的処置の場合の生理的条件、および、インビトロアッセイの場合にアッセイが実施される条件が挙げられる。
【００９３】
アンチセンス化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ、置換などに関係なく、化合物の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ  分子への結合が、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ  分子の正常機能を妨害し、有用性の損失を引き起こし、特異的結合が望ましい条件下、すなわちインビボアッセイまたは治療的処置の場合の生理的条件下、および、インビトロアッセイの場合にアッセイが実施される条件下で、アンチセンス化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００９４】
別の実施形態では、限定はされないが、例えば、ＰＣＲ、ハイブリダイゼ−ションなどを用いて同定され、伸長されたアンチセンス配列、配列番号５〜１４で示される１つ以上の配列、などを含むサ−チュイン（ＳＩＲＴ）のタ−ゲッティングは、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の発現または機能を調節する。１つの実施形態では、発現または機能、対照に比べ上方制御される。別の実施形態では、発現または機能は、対照に比べ下方制御される。
【００９５】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲ、ハイブリダイゼ−ションなどを用いて同定され、伸長されたアンチセンス配列を含む配列番号１５〜９４として示される核酸配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、１つ以上修飾ヌクレオチド、より短いまたはより長い断片、修飾結合などを含むことができる。修飾結合またはヌクレオチド間結合の例としては、ホスホロチオエ−ト、ホスホロジチオエ−トなどが挙げられる。別の実施形態では、ヌクレオチドはリン誘導体を含む。本発明の修飾オリゴヌクレオチド中の糖または糖類似体部分に結合され得るリン誘導体（または修飾リン酸基）は、モノホスフェ−ト、ジホスフェ−ト、トリホスフェ−ト、アルキルホスフェ−ト、アルカンホスフェ−ト、ホスホロチオエ−トなどとすることができる。上記ホスフェ−ト類似体の調製、およびそれらのヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドへの組み込みはまた、それ自体、知られており、本明細書で記載する必要はない。
【００９６】
アンチセンスの特異性および感受性はまた、治療用途のために当業者により利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物および人間における病態の治療における治療薬部分として使用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、安全で効果的にヒトに投与され、多くの臨床試験が現在、進行中である。よって、確実に、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、とりわけヒトの治療のための治療計画において有用なものとなるように構成することができる有用な治療方式とすることができる。
【００９７】
本発明の実施形態では、オリゴマ−アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドは標的核酸分子に結合し、標的遺伝子によりコ−ド化される分子の発現および／または機能を調節する。妨害されるＤＮＡの機能としては、例えば、複製および転写が挙げられる。妨害されるＲＮＡの機能としては、すべての生命機能、例えば、ＲＮＡのタンパク質翻訳部位への転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上ｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡと関連する、またはＲＮＡにより促進され得る触媒活性が挙げられる。機能は、所望の機能によって、上方制御され、あるいは阻止され得る。
【００９８】
前記アンチセンス化合物としては、アンチセンスオリゴマ−化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサ−、プライマ−、プロ−ブ、および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする他のオリゴマ−化合物が挙げられる。そのようなものとして、これらの化合物は一本鎖、二本鎖、部分一本鎖、または環状オリゴマ−化合物の形態に導入され得る。
【００９９】
アンチセンス化合物を特定の核酸分子の標的とすることは、本発明との関連では、多段階プロセスとすることができる。前記プロセスは通常、その機能が調節されることとなる標的核酸の同定から始まる。この標的核酸は、例えば、その発現が特定の障害または疾患状態と関連する細胞遺伝子（またはその遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、または感染因子由来の核酸分子とすることができる。本発明では、標的核酸はサ−チュイン（ＳＩＲＴ）をコ−ド化する。
【０１００】
タ−ゲッティングプロセスはまた通常、アンチセンス相互作用が起きて、所望の効果、例えば、発現調節が得られるように、少なくとも１つの標的領域、セグメント、または標的核酸内の部位の決定を含む。本発明との関連で、「領域」は、少なくとも１つの同定可能な構造、機能または特性を有する標的核酸の部分として規定される。標的核酸の領域内にセグメントが存在する。「セグメント」は、標的核酸内のより小さな部分またはサブ部分として規定される。本発明では、「部位」、標的の位置として規定される。
【０１０１】
１つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の天然アンチセンス配列に結合し、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）（配列番号１〜３）の発現および／または機能を調節する。アンチセンス配列の例としては、配列番号４〜２９が挙げられる。
【０１０２】
別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの１つ以上セグメントに結合し、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の発現および／または機能を調節する。セグメントはサ−チュイン（ＳＩＲＴ）センスまたはアンチセンスポリヌクレオチドの少なくとも５つの連続ヌクレオチドを含む。
【０１０３】
別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の天然アンチセンス配列に特異的であり、オリゴヌクレオチドのサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の天然アンチセンス配列への結合は、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の発現および／または機能を調節する。
【０１０４】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、配列番号１５〜９４で示される配列、例えば、ＰＣＲ、ハイブリダイゼ−ションなどを用いて同定および伸長されたアンチセンス配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチド、より短いまたはより長い断片、修飾結合などを含むことができる。修飾結合またはヌクレオチド間結合の例としては、ホスホロチオエ−ト、ホスホロジチオエ−トなどが挙げられる。別の実施形態では、ヌクレオチドはリン誘導体を含む。本発明の修飾オリゴヌクレオチド中の糖または糖類似体部分に結合され得るリン誘導体（または修飾リン酸基）は、モノホスフェ−ト、ジホスフェ−ト、トリホスフェ−ト、アルキルホスフェ−ト、アルカンホスフェ−ト、ホスホロチオエ−トなどとすることができる。上記ホスフェ−ト類似体の調製、およびそれらのヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドへの組み込みはまた、それ自体、知られており、本明細書で記載する必要はない。
【０１０５】
当技術分野で知られているように、翻訳開始コドンは典型的には５′−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子では５′−ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンはまた、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」または「ＡＵＧ開始コドン」と呼ばれる。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５′−ＧＵＧ、５′−ＵＵＧまたは５′−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し；５′ＡＵＡ、５′−ＡＣＧおよび５′−ＣＵＧは、インビボで機能することが示されている。よって、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、多くのコドン配列を有することができるが、それにもかかわらず、それぞれの場合における開始アミノ酸は典型的には、メチオニン（真核生物）またはホルミルメチオニン（原核生物）である。真核生物および原核生物遺伝子は、２つ以上の代替開始コドンを有することができ、特定の細胞型または組織において、あるいは特定の組の条件下で、翻訳開始のために、それらのいずれか一つが優先的に使用され得る。本発明との関連で、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、そのようなコドンの配列に関係なく、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）をコ−ド化する遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するためにインビボで使用される１つまたは複数のコドンを示す。遺伝子の翻訳終止コドン（または「停止コドン」）は、３つの配列、すなわち、５′−ＵＡＡ、５′−ＵＡＧおよび５′−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列はそれぞれ、５′−ＴＡＡ、５′−ＴＡＧおよび５′−ＴＧＡである）のうちの１つを有し得る。
【０１０６】
「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンから両方向に（すなわち、５′または３′）約２５〜約５０近接ヌクレオチドを含むそのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部を示す。同様に、「停止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンから両方向に（すなわち、５′または３′）約２５〜約５０近接ヌクレオチドを含むそのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部を示す。結果的に、「開始コドン領域」（または「翻訳開始コドン領域」）および「停止コドン領域」（または「翻訳終止コドン領域」）は、本発明のアンチセンス化合物で効果的に標的され得るすべての領域である。
【０１０７】
オ−プンリ−ディングフレ−ム（ＯＲＦ）または「コ−ド領域」は、当技術分野で翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間の領域を示すことが知られており、これはまた、効果的に標的され得る領域である。本発明との関連で、標的領域は遺伝子のオ−プンリ−ディングフレ−ム（ＯＲＦ）の翻訳開始または終止コドンを含む遺伝子内領域である。
【０１０８】
別の標的領域は、翻訳開始コドンから５′方向のｍＲＮＡの部分を示すことが当技術分野で知られている５′非翻訳領域（５′ＵＴＲ）を含み、よって、ｍＲＮＡの５′キャップ部位と翻訳開始コドンの間のヌクレオチド（または、遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む。さらに別の標的領域は、翻訳終止コドンから３′方向のｍＲＮＡの部分を示すことが当技術分野で知られている３′非翻訳領域（３′ＵＴＲ）、よって、ｍＲＮＡの翻訳終止コドンと３′末端の間のヌクレオチド（または、遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む。ｍＲＮＡの５′キャップ部位は、５′−５′トリホスフェ−ト結合を介してｍＲＮＡの最５′−残基に結合されたＮ７−メチル基グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５′キャップ領域は、５′キャップ構造自体、ならびにキャップ部位に隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むと考えられる。本発明のための別の標的領域は５′キャップ領域である。
【０１０９】
いくつかの真核生物ｍＲＮＡ転写物は直接翻訳されるが、多くは、「イントロン」として知られている１つ以上の領域を含み、これらは、翻訳される前に転写物から切除される。残りの（そのため翻訳される）領域は「エクソン」として知られ、共にスプライシングされ連続ｍＲＮＡ配列を形成する。１つの実施形態では、スプライス部位、すなわち、イントロン−エクソン接合部またはエクソン−イントロン接合部のタ−ゲッティングは、疾患において異常なスプライシングが実施され、または疾患において特定のスプライス産物の過剰生産が実施された状況では、特に有用である。再配列または欠失による異常な融合接合部は、標的部位の別の実施形態である。異なる遺伝子源由来の２つ（またはそれ以上）のｍＲＮＡのスプライシングプロセスにより生産されたｍＲＮＡ転写物は、「融合転写物」として知られている。イントロンは、例えば、ＤＮＡまたはプレｍＲＮＡに標的されるアンチセンス化合物を使用して、効果的に標的することができる。
【０１１０】
別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのコ−ドおよび／または非コ−ド領域に結合し、標的分子の発現および／または機能を調節する。
【０１１１】
別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは天然アンチセンスポリヌクレオチドに結合し、標的分子の発現および／または機能を調節する。
【０１１２】
別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはセンスポリヌクレオチドに結合し、標的分子の発現および／または機能を調節する。
【０１１３】
選択的ＲＮＡ転写物を、ＤＮＡの同じゲノム領域から生産させることができる。これらの選択的転写物は一般に「変異体」として知られている。より特定的には、「プレｍＲＮＡ変異体」は、同じゲノムＤＮＡから生産された他の転写物とは開始または停止位置のいずれかが異なり、イントロンおよびエクソン配列の両方を含む同じゲノムＤＮＡから生産される転写物である。
【０１１４】
スプライシング中に１つ以上のエクソンもしくイントロン領域、またはそれらの一部が切除されると、プレｍＲＮＡ変異体は、より小さな「ｍＲＮＡ変異体」を生成する。結果として、ｍＲＮＡ変異体は、プロセシングされたプレｍＲＮＡ変異体となり、各独特のプレｍＲＮＡ変異体は、常に、スプライシングの結果として独特のｍＲＮＡ変異体を生成しなければならない。これらのｍＲＮＡ変異体はまた、「選択的スプライス変異体」としても知られている。プレｍＲＮＡ変異体のスプライシングが起こらない場合、プレｍＲＮＡ変異体はｍＲＮＡ変異体と同一である。
【０１１５】
変異体は、転写を開始または停止させる選択的シグナルの使用により生成させることができる。プレｍＲＮＡｓおよびｍＲＮＡｓは、１を超える開始コドンまたは停止コドンを有することができる。選択的開始コドンを使用するプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに由来する変異体は、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「選択的開始変異体」として知られている。選択的停止コドンを使用するそれらの転写物は、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「選択的停止変異体」として知られている。１つの特定の型の選択的停止変異体は「ポリＡ変異体」であり、この場合、生成された複数の転写物は、転写機構による「ポリＡ停止シグナル」の１つの選択的セレクションに起因し、よって、独特のポリＡ部位で終止する転写物が生成される。本発明との関連で、本明細書で記載される変異体の型はまた、標的核酸の実施形態となる。
【０１１６】
アンチセンス化合物がハイブリダイズする標的核酸の位置は、活性アンチセンス化合物が標的とする標的領域の少なくとも５−ヌクレオチドの長さの部分として規定される。
【０１１７】
ある例示的な標的セグメントの特定の配列が本明細書で示されているが、当業者であれば、これらは、本発明の範囲内にある特定の実施形態を説明し、記載するように機能することは認識されるであろう。追加の標的セグメントは、この開示を考慮して当業者により容易に同定可能である。
【０１１８】
例示的な標的セグメント内から選択された、少なくとも５つの（５）連続ヌクレオチドのストレッチを含む長さ５〜１００ヌクレオチドの標的セグメントは、同様にタ−ゲッティングに好適であると考えられる。
【０１１９】
標的セグメントは、例示的な標的セグメントの１つの５′末端から少なくとも５つの連続ヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含むことができる（残りのヌクレオチドは、標的セグメントの５′末端のすぐ上流から開始し、ＤＮＡまたはＲＮＡが約５〜約１００ヌクレオチドを含むまで続く同じＤＮＡまたはＲＮＡの連続ストレッチである）。同様に、標的セグメントは例示的な標的セグメントの１つの３′末端から少なくとも５つの連続ヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列により表される（残りのヌクレオチドは、標的セグメントの３′末端のすぐ下流から開始し、ＤＮＡまたはＲＮＡが約５〜約１００ヌクレオチドを含むまで続く同じＤＮＡまたはＲＮＡの連続ストレッチである）。本明細書で示される標的セグメントを手にした当業者は、必要以上の実験なしで、さらなる標的セグメントを同定することができるであろう。
【０１２０】
１つ以上標的領域、セグメントまたは部位が同定されるとすぐに、標的に十分相補的な、すなわち、十分よく、かつ十分な特異性でハイブリダイズし、所望の効果を提供するアンチセンス化合物が選択される。
【０１２１】
本発明の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、特定の標的のアンチセンス鎖に結合する。オリゴヌクレオチドは長さが少なくとも５ヌクレオチドであり、各オリゴヌクレオチドがオ−バ−ラップ配列を標的とするように合成することができ、そのため、オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの全長に及ぶように合成される。標的はまた、コ−ドならびに非コ−ド領域を含む。
【０１２２】
１つの実施形態では、特定の核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的される。アンチセンス化合物を特定の核酸に標的させることは、多段階プロセスである。プロセスは通常、その機能が調節されることとなる核酸配列の同定から始まる。これは、例えば、その発現が特定の障害または疾患状態と関連する細胞遺伝子（またはその遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、または非コ−ドポリヌクレオチド例えば、非コ−ドＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）とすることができる。
【０１２３】
ＲＮＡは、下記に分類することができる（１）メッセンジャ−ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（タンパク質に翻訳される）および（２）非タンパク質コ−ドＲＮＡ（ｎｃＲＮＡｓ）。ｎｃＲＮＡは、マイクロＲＮＡ、アンチセンス転写物および他の高密度の停止コドンを含み、いずれの広範囲「オ−プンリ−ディングフレ−ム」も欠失した転写ユニット（ＴＵ）を含む。多くのｎｃＲＮＡはタンパク質コ−ド遺伝子座の３′非翻訳領域（３′ＵＴＲ）の開始部位から始まると考えられる。ｎｃＲＮＡはしばしば希であり、ＦＡＮＴＯＭコンソ−シウムにより配列決定されたｎｃＲＮＡの少なくとも半分は、ポリアデニル化されていないと考えられる。ほとんどの研究者は、明白な理由で、プロセシングされ、細胞質に輸送されたポリアデニル化ｍＲＮＡに焦点をあててきた。近年、非ポリアデニル化核ＲＮＡの組が非常に大きい可能性があること、多くのそのような転写物は遺伝子間領域に起因することが示された。ｎｃＲＮＡが遺伝子発現を制御し得るメカニズムは、標的転写物との塩基対形成による。塩基対形成により機能するＲＮＡは、下記にグル−プ分けすることができる：（１）同じ遺伝子位置であるが、それらが作用するＲＮＡに対し逆鎖上でコ−ド化され、そのため、それらの標的に対し完全な相補性を示すシスコ−ド化ＲＮＡ、および（２）それらが作用するＲＮＡとは異なる染色体位置でコ−ドされ、一般に、それらの標的と完全な塩基対形成能力を示さないトランスコ−ド化ＲＮＡ。
【０１２４】
理論に縛られることは望まないが、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドによるアンチセンスポリヌクレオチドの混乱は、対応するセンスメッセンジャ−ＲＮＡの発現を変化させることができる。しかしながら、この制御は、不調和（アンチセンスノックダウンはメッセンジャ−ＲＮＡ上昇となる）または調和（アンチセンスノックダウンは同時メッセンジャ−ＲＮＡ減少となる）のいずれかとすることができる。これらの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス転写物のオ−バ−ラップまたは非オ−バ−ラップ部分に標的させることができ、そのノックダウンまたは隔離が得られる。コ−ド化ならびに非コ−ド化アンチセンスは、同一の様式で標的させることができ、そのいずれかのカテゴリは、対応するセンス転写物を調和または不調和のいずれかの様式で制御することができる。標的に対して使用するための新規オリゴヌクレオチドを同定する際に使用される戦略は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるアンチセンスＲＮＡ転写物のノックダウンまたは所望の標的を調節する任意の他の手段に基づくことができる。
【０１２５】
戦略１：不調和制御の場合、アンチセンス転写物のノックダウンは、従来の（センス）遺伝子の発現を上昇させる。後者の遺伝子が、公知または推定薬物標的をコ−ド化する場合、そのアンチセンスカウンタ−パ−トのノックダウンは、おそらく、受容体アゴニストまたは酵素刺激剤の作用を模倣するであろう。
【０１２６】
戦略２：調和制御の場合、アンチセンスおよびセンス転写物を同時にノックダウンさせ、よって、従来の（センス）遺伝子発現の相乗的な減少を達成するであろう。例えば、ノックダウンを達成するのにアンチセンスオリゴヌクレオチドが使用される場合、この戦略を使用して、センス転写物に標的される１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンス転写物に別のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または同時にオ−バ−ラップセンスおよびアンチセンス転写物を標的する単一のエネルギ−的に対称なアンチセンスオリゴヌクレオチドを適用することができる。
【０１２７】
本発明によれば、アンチセンス化合物としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物、例えばｓｉＲＮＡ化合物、および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズし、その機能を調節する他のオリゴマ−化合物が挙げられる。そのようなものとして、それらは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ様、ＲＮＡ様、またはそれらの混合物とすることができ、あるいは、これらの１つ以上の模倣物とすることができる。これらの化合物は一本鎖、二本鎖、環状またはヘアピン・オリゴマ−化合物としてもよく、構造要素、例えば内部または末端バルジ、ミスマッチまたはル−プを含み得る。アンチセンス化合物はル−チン的に直線的に調製されるが、一緒にすることができ、またはそうでなければ環状および／または分枝するように調製することができる。アンチセンス化合物は、コンストラクト、例えば、ハイブリダイズされ、全体または部分二本鎖化合物を形成する二本鎖、またはハイブリダイゼ−ションおよび全体または部分二本鎖化合物の形成を可能にする十分な自己相補性を有する一本鎖を含むことができる。二本鎖は、内部で、３′または５′末端を残して結合させることができ、または結合させて連続ヘアピン構造またはル−プを形成することができる。ヘアピン構造は、５′または３′末端のいずれかでオ−バ−ハングを含んでもよく、一本鎖特性の延長を生成させる。二本鎖化合物は任意で、末端にオ−バ−ハングを含むことができる。さらなる修飾は、末端の１つ、選択されたヌクレオチド位置、糖位置またはヌクレオシド間結合の１つに結合されたコンジュゲ−ト基を含むことができる。また、二本鎖は非核酸部分またはリンカ−基を介して結合させることができる。１本鎖から形成される場合、ｄｓＲＮＡはそれ自体逆戻りして二本鎖を形成する自己相補的ヘアピン型分子の形態をとることができる。よって、ｄｓＲＮＡは完全または部分二本鎖とすることができる。遺伝子発現の特異的な調節はトランスジェニック株細胞におけるｄｓＲＮＡヘアピンの安定発現により達成することができるが、いくつかの実施形態では、遺伝子発現または機能は上方制御される。二本鎖、またはそれ自体逆戻りして二本鎖を形成する自己相補的ヘアピン型分子の形態をとる一本鎖から形成される場合、二本鎖（または一本鎖の二本鎖形成領域）はワトソン−クリック様式で塩基対形成する相補的ＲＮＡ鎖である。
【０１２８】
ひとたび系に導入されると、本発明の化合物は標的核酸の切断または他の修飾を引き起こす１つ以上の酵素または構造タンパク質の活性を誘発するか、または、占有性に基づくメカニズムを介して働くことができる。一般に、核酸（オリゴヌクレオチドを含めて）は「ＤＮＡ様」（つまり、一般に、１つ以上の２′−デオキシ糖を有し、さらに一般に、Ｕ塩基よりもＴ塩基である）または「ＲＮＡ様」（つまり一般に、２′−ヒドロキシまたは２′−修飾糖および、一般に、Ｔ塩基よりもＵ塩基である）とされる。核酸ヘリックスは、最も一般的にはおよびＢ型などの１つ以上のタイプの構造を取ることができる。一般に、Ｂ型様の構造を有するオリゴヌクレオチドは「ＤＮＡ様」であり、Ａ型様の構造を有するものは「ＲＮＡ様」であると考えられる。いくつかの（キメラ）実施形態において、アンチセンス化合物はＡ型およびＢ型領域を含んでもよい。
【０１２９】
別の実施形態において、所望のオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス化合物は、修飾結合、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含有するアンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド；マイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；小さい一過性低分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）；または低分子ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）；小ＲＮＡ誘導遺伝子活性化（ＲＮＡａ）；小活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、またはこれらの組み合せのうち少なくとも１つを含む。
【０１３０】
さらに、ｄｓＲＮＡは「小ＲＮＡ誘導遺伝子活性化」またはＲＮＡａと呼ばれるメカニズムである遺伝子発現を活性化することができる。ｄｓＲＮＡｓ標的化遺伝子プロモ−タ−は関連遺伝子に対する強力な転写活性化を誘導する。「小活性化ＲＮＡ」（ｓａＲＮＡ）と呼ばれる合成ｄｓＲＮＡｓを用いたヒト細胞においてＲＮＡａが示された。
【０１３１】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの小さい二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる進化的に保存されているメカニズムのトリガ−であると見出されている。ＲＮＡｉは常に遺伝子サイレンシングにつながる。しかしながら、以下の実施例の項において詳説するような場合では、オリゴヌクレオチドがサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドおよびそのコ−ドされた産物の発現および／または機能を増強することが示された。また、ｄｓＲＮＡｓは小活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）の機能を果たす。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、遺伝子プロモ−タ−におけるシ−ケンスを標的として、ｓａＲＮＡｓがｄｓＲＮＡ誘導転写活性化（ＲＮＡａ）と呼ばれる現象において標的遺伝子発現を誘導するであろう。
【０１３２】
また別の実施形態では、本明細書中で同定された「標的セグメント」をサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの発現を調節する追加の化合物でのスクリ−ニングに用いてもよい。「モジュレ−タ−」とはサ−チュイン（ＳＩＲＴ）をコ−ド化する核酸分子の発現を増減し、標的セグメントと相補的である５−ヌクレオチド部分を少なくとも含むような化合物である。このスクリ−ニング方法はサ−チュイン（ＳＩＲＴ）のセンスまたは天然のアンチセンスポリヌクレオチドをコ−ド化する核酸分子の標的セグメントを１つ以上の候補モジュレ−タ−に接触させるステップと、例えば配列番号１５から９４のサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドをコ−ド化する核酸分子の発現を増減させる１つ以上の候補モジュレ−タ−を選択するステップとを含む。候補モジュレ−タ−またはモジュレ−タ−群がサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドをコ−ド化する核酸分子の発現を調節することができる（例えば、減少するまたは増加する）と示されると、前記モジュレ−タ−まは次に、標的のサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの機能の更なる調査研究において、または本発明に従った研究、診断、または治療用因子としての使用に関して用いてもよい。
【０１３３】
天然のアンチセンス配列を標的にすることで標的遺伝子の機能を調節する。例えば、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）（例としては、受入番号ＮＭ＿０１２２３８．３、ＮＭ＿００１１５９５８９、ＮＭ＿０１２２３９、ＮＭ＿０１６５３９）がある。一態様において、標的はサ−チュイン（ＳＩＲＴ）のアンチセンスのポリヌクレオチドである。一態様において、アンチセンスのオリゴヌクレオチドはサ−チュイン（ＳＩＲＴ）のポリヌクレオチド（例としては、受入番号ＮＭ＿０１２２３８．３、ＮＭ＿００１１５９５８９、ＮＭ＿０１２２３９、ＮＭ＿０１６５３９がある）、変異体、対立遺伝子、イソフォ−ム、相同体、変異体、誘導体、断片およびこれらに対する相補的な配列のセンスおよび／または天然のアンチセンス配列を標的とする。好ましくは、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子であり、かつ、標的がアンチセンスおよび／またはセンスサ−チュイン（ＳＩＲＴ）のポリヌクレオチドのコ−ド化と非コ−ド化の両領域を含む。
【０１３４】
また、本発明の標的セグメントは本発明の各相補的アンチセンスオリゴマ−化合物と組み合わせ、安定化二本鎖（二本鎖化）オリゴヌクレオチドを形成する。
【０１３５】
そのような二本鎖オリゴヌクレオチド部位は、標的発現を調節しアンチセンスメカニズムを介したＲＮＡプロセシングと同様に翻訳を制御することが本分野では示されている。さらに、前記二本鎖部位は化学修飾の対象となりうる。例えば、そのような二本鎖部位は標的に対する二本鎖のアンチセンス鎖の古典的ハイブリダイゼ−ションによって標的を阻害し、それにより、標的の酵素分解を引き起こすと示された。
【０１３６】
一態様において、アンチセンスのオリゴヌクレオチドはサ−チュイン（ＳＩＲＴ）のポリヌクレオチド（例としては、受入番号ＮＭ＿０１２２３８．３、ＮＭ＿００１１５９５８９、ＮＭ＿０１２２３９、ＮＭ＿０１６５３９がある）、変異体、対立遺伝子、イソフォ−ム、相同体、変異体、誘導体、断片およびこれらに対する相補的な配列を標的とする。好ましくは、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。
【０１３７】
本発明の実施形態によって、標的核酸分子はサ−チュイン（ＳＩＲＴ）のみに限定されず、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）分子のイソフォ−ム、受容体、相同体等に広がる。
【０１３８】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）のポリヌクレオチドの天然のアンチセンス配列、例えば配列番号５から１４で定められるポリヌクレオチド、および変種、対立遺伝子、相同体、変異体、誘導体、断片およびこれらに対する相補的な配列を標的とする。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は配列番号１５から９４で定められる。
【０１３９】
一実施形態において、オリゴヌクレオチドはサ−チュイン（ＳＩＲＴ）のアンチセンスの核酸配列に対して相補的、または結合しているが、これにはサ−チュイン（ＳＩＲＴ）のポリヌクレオチドと関連する非コ−ド化センスおよび／またはアンチセンス配列を含み、さらに、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の分子の発現および／または機能を調節する。
【０１４０】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは配列番号５から１４で定められるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の天然のアンチセンスの核酸配列に対して相補的、または結合しているが、さらに、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の分子の発現および／または機能を調節する。
【０１４１】
一態様において、オリゴヌクレオチドは配列番号１５から９４の少なくとも５つの連続的ヌクレオチドの配列を含むが、さらに、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の分子の発現および／または機能を調節する。
【０１４２】
ポリヌクレオチド標的にはサ−チュイン（ＳＩＲＴ）のファミリ−メンバ−、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の変種を含有するサ−チュイン（ＳＩＲＴ）、ＳＮＰｓを含有するサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の変異体、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の非コ−ド化配列、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の対立遺伝子、種の変異体、断片等を含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。
【０１４３】
別の実施形態において、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドを標的とするオリゴヌクレオチドはアンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小さい一過性低分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、または低分子ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）、小ＲＮＡ誘導遺伝子活性化（ＲＮＡａ）、または、小活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）を含む。
【０１４４】
別の実施形態において、配列番号５から１４などのサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの標的化はこれら標的の発現または機能を調節する。一実施形態において、対照と比べて発現または機能はアップレギュレ−ションしている。別の実施形態において、対照と比べて発現または機能はダウンレギュレ−ションしている。
【０１４５】
別の実施形態において、アンチセンスの化合物は配列番号１５から９４に定める。これらのオリゴヌクレオチドは１つ以上の修飾されたヌクレオチド、より短いまたはより長い断片、修飾結合等を含むことができる。
【０１４６】
別の実施形態において、配列番号１５から９４までは１つ以上のＬＮＡヌクレオチドを含む。
【０１４７】
所望の標的核酸の調節は当技術分野で公知の数種類の方法で実施することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等である。酵素的核酸分子（例えば、リボザイム）はヌクレオチド塩基配列特異的な様式にて他の分離された核酸分子を繰返し切断する能力を含め、１つ以上の種々の反応を触媒することが可能な核酸分子である。そのような酵素的核酸分子は、実質的に如何なるＲＮＡ転写物を標的とすることに使用することができる。
【０１４８】
配列の特異性により、トランス切断酵素的核酸分子はヒト疾患への治療用因子として有望である。酵素的核酸分子は細胞のＲＮＡを背景にして特異的ＲＮＡ標的を切断するように設計することが可能である。そのような切断はｍＲＮＡを非機能的なものとし、そしてそのＲＮＡからの発現を消失させる。このようにして、疾患状態に関連するタンパク質の合成を選択的に阻害することができる。
【０１４９】
一般に、ＲＮＡ切断活性を持つ酵素的核酸は標的ＲＮＡとの最初の結合によって活性化する。そのような結合は、標的ＲＮＡは切断する作用のある分子の酵素部分に近接して保持されている酵素的核酸の標的結合部分を通して起こる。従って、酵素的核酸は相補塩基対合によって第１に標的ＲＮＡを認識し、そして次に結合し、更に正しい部位に結合した後、標的ＲＮＡの切断するように酵素的に作用する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断はコ−ド化タンパク質の合成を指向する能力を破壊する。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的を結合させ切断した後は、別の標的を探索するためにそのＲＮＡから剥離し、新しい標的と結合と切断を繰り返すことができる。
【０１５０】
インビトロ選択（進化）戦略などの数種類のアプロ−チは、ホスホジエステル結合およびアミド結合の切断ならびに連結反応などのさまざまな反応を触媒することが可能な新しい核酸触媒の進化に使用されている。
【０１５１】
触媒活性にとって最適なリボザイムの開発は遺伝子発現を制御する目的のためにＲＮＡ切断活性を持つリボザイムを用いる戦略に顕著に寄与するであろう。例えば、ハンマ−ヘッドリボザイムは飽和（１０ｍＭ）濃度のＭｇ２＋補助因子の存在下で約１ｍｉｎ−１である触媒反応速度定数（ｋｃａｔ）で機能する。人工「ＤＮＡリガ−ゼ」リボザイムが、約１００ｍｉｎ−１の反応定数で対応する自己改質反応を触媒することが示されている。加えて、ＤＮＡから作成された基質結合ア−ムを有する特定の修飾ハンマ−ヘッドリボザイムは、１００ｍｉｎ−１近くでの複数のタ−ンオ−バ速度でＲＮＡ切断を触媒する。最後に、ハンマ−ヘッドの触媒芯内の特定の残基を特定のヌクレオチドアナログで置換すると触媒反応速度が１０倍向上することを示す修飾リボザイムを生じる。最も自然な自己切断性リボザイムによるインビトロの場合と比べて有意に高い触媒反応速度で、リボザイムが化学的形質転換の促進をすることができることを示している。次に、特定の自己切断性リボザイムの構造は最大の触媒活性を生み出すように最適化してもよく、またはＲＮＡホスホジエステル切断が有意に速い速度を示す全く新しいＲＮＡモチ−フを作製することができる。
【０１５２】
「ハンマ−ヘッド」モデルに適合するＲＮＡ触媒によるＲＮＡ基質の分子内切断は１９８７年に初めて示された。ＲＮＡ触媒は回収され複数のＲＮＡ分子と反応し、真に触媒であることが示された。
【０１５３】
標的配列を有する必要な塩基対合を維持するために、「ハンマ−ヘッド」モチ−フに基づいて設計された触媒ＲＮＡは触媒ＲＮＡにおける適切な塩基変化を行い特定の標的配列を切断するために使用されている。これにより、触媒ＲＮＡを使用して特定の標的配列の切断が可能となり、「ハンマ−ヘッド」モデルに基いて設計された触媒ＲＮＡがインビボで特定の基質ＲＮＡを切断するといえる。
【０１５４】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が哺乳動物および哺乳動物細胞中での遺伝子発現を調節する強力なツ−ルとなった。このアプロ−チは発現プラスミドまたはウイルス、およびｓｉＲＮＡ処理される小さいヘアピンＲＮＡｓのコ−ド化配列を使用し、ＲＮＡ自体またはＤＮＡのいずれかとして小さい二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の送達を必要とする。この系では活性の細胞質にプレ−ｓｉＲＮＡｓを効率的に送達させることができ、かつ、遺伝子発現のために調節性で組織特異的プロモ−タの使用が可能となる。
【０１５５】
一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドまたはアンチセンス化合物はリボ核酸（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、またはこれらのミメティック、キメラ、類似体、相同体のオリゴマ−もしくはポリマ−を含む。この用語は、天然に存在するヌクレオチド、糖およびヌクレオシド間共有結合（骨格）から成るオリゴヌクレオチドならびに同様の機能がある天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば増強された細胞取り込み、核酸標的に対する増強された親和性、およびヌクレア−ゼ存在下での増加した安定性などの望ましい特性を有するため、しばしば天然型よりも望ましい。
【０１５６】
本発明に従って、前記オリゴヌクレオチドまたは「アンチセンス化合物」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、これらのＲＮＡ、ＤＮＡ、ミメティック、キメラ、類似体、相同体）、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、標的核酸の少なくとも一部に対してのハイブリダイゼ−ションをしてその機能を調節するｓａＲＮＡ、ａＲＮＡおよび他のオリゴマ−化合物などの一本鎖または二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物を含む。そのために、これらはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ様、ＲＮＡ様、またはこれらの混合物などであり、またはこれらの１つ以上の模倣物であってよい。これらのオリゴマ−化合物は、一本鎖、二本鎖、環状またはヘアピン・オリゴマ−化合物の形で導入されることも可能であり、そして内部または末端のバルジ、ミスマッチまたはル−プなどを含有することも可能である。アンチセンス化合物は通常通りに直線状に調製されるものであるが、結合が可能で、またはさもなくば環状および／または分岐鎖に調製される。アンチセンス化合物は、例えば完全もしくは部分的な二本鎖化合物を形成するためにハイブリダイズさせた２つの鎖または完全または部分的な二本鎖化合物のハイブリダイゼ−ションおよび形成を可能にするのに十分な自己相補性を有する一本鎖などの構築物を含むことが可能である。２つの鎖は、遊離３′または５′終端を残して内部的に結合が可能で、または連続ヘアピン構造またはル−プを形成するように結合が可能である。このヘアピン構造は、一本鎖特徴の伸長を生じさせる５′または３′終端上にオ−バ−ハングを含む。この二本鎖化合物は末端のオ−バ−ハングを任意に含むことができる。更なる修飾は末端の１つ以上、選択されたヌクレオチド位置、糖位置またはインタ−ヌクレオシド結合の１つに結合された共役基を含むことができる。または、前記２つの鎖は非核酸部位またはリンカ−基を介して結合することができる。１つの鎖のみから形成された場合、ｄｓＲＮＡは二本鎖を形成するように自身を折り畳む自己相補的ヘアピンタイプ分子の形態をとることができる。従って、ｄｓＲＮＡは完全な、または部分的な二本鎖になることができる。遺伝子発現の特異的調節をトランスジェニック細胞株におけるｄｓＲＮＡヘアピンの安定した発現により得ることができる。２つの鎖、または二本鎖を形成するために自身を折り畳んだ自己相補的ヘアピンタイプ分子の形態をとった一本鎖から形成された場合、その２つの鎖（または一本鎖の二本鎖形成領域）はワトソン−クリック様式の塩基対である相補的ＲＮＡ鎖である。
【０１５７】
ひとたび系に導入されると、本発明の化合物は標的核酸の切断または他の修飾を引き起こす１つ以上の酵素または構造タンパク質の活性を誘発するか、または、占有性に基づくメカニズムを介して働くことができる。一般に、核酸（オリゴヌクレオチドを含めて）は「ＤＮＡ様」（つまり、一般に、１つ以上の２′−デオキシ糖を有し、かつ、一般に、Ｕ塩基よりもＴ塩基である）または「ＲＮＡ様」（つまり、一般に、２′−ヒドロキシまたは２′−修飾糖および、一般に、Ｔ塩基よりもＵ塩基である）とされる。核酸ヘリックスは最も一般的にはＡ型およびＢ型などの１つ以上のタイプの構造を取ることができる。一般に、Ｂ型様の構造を有するオリゴヌクレオチドは「ＤＮＡ様」であり、Ａ型様の構造を有するものは「ＲＮＡ様」であると考えられる。いくつか（キメラ）の実施形態において、アンチセンス化合物はＡ型およびＢ型領域を含んでもよい。
【０１５８】
本発明に基づくアンチセンス化合物は長さが約５つから約８０のヌクレオチド（つまり、約５から約８０の結合ヌクレオシド）からのアンチセンス部分を含むことができる。これはアンチセンス鎖の長さまたはアンチセンス化合物の部分をさす。言い換えれば、本発明の１本鎖アンチセンス化合物は５から約８０のヌクレオチドを含み、さらに、本発明の二本鎖アンチセンス化合物（例えば、ｄｓＲＮＡなど）はセンス鎖およびアンチセンス鎖または長さが５から約８０のヌクレオチドの部分を含む。これは長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９または８０のヌクレオチド、またはそれらのあらゆる範囲内のアンチセンス部分を包含することを本分野の当業者は、理解するであろう。
【０１５９】
一実施形態において、本発明のアンチセンス化合物は長さが１０から５０のヌクレオシドのアンチセンス部分を有する。これは長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０のヌクレオチドのアンチセンス部分を有する、またはそれらのあらゆる範囲内のオリゴヌクレオチドを具体化することを本分野の当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは長さが１５のヌクレオチドである。
【０１６０】
一実施形態において、本発明のアンチセンスまたはオリゴヌクレオチド化合物は長さが１２または１３から３０のヌクレオシドを有する。これは長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のヌクレオチドのアンチセンス部分を有する、またはそれらのあらゆる範囲内のアンチセンス化合物を具体化することを本分野の当業者は理解するであろう。
【０１６１】
別の実施形態において、本発明のオリゴマ−化合物は化合物中の１つ以上のヌクレオチド位置において異なる塩基が存在する変種をさらに含む。例えば、第１のヌクレオチドがアデノシンの場合、この位置にチミジン、グアノシンまたはシチジンを含む変種を生成することができる。このことはアンチセンスまたはｄｓＲＮＡ化合物のいかなる位置においてもすることができる。つぎに、標的核酸の発現を阻害するその能力を決定するために、これら化合物は本明細書中に記載された方法を用いて試験できる。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、アンチセンス化合物と標的との間の相同性、配列相同性または相補性は、約４０％から約６０％である。いくつかの実施形態において、相同性、配列相同性または相補性は、約６０％から約７０％である。いくつかの実施形態において、相同性、配列相同性または相補性は、約７０％から約８０％である。いくつかの実施形態において、相同性、配列相同性または相補性は、約８０％から約９０％である。いくつかの実施形態において、相同性、配列相同性または相補性は、約９０％、約７５％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％である。
【０１６３】
別の実施形態において、例えば配列番号４から２９に定める核酸分子などのアンチセンスオリゴヌクレオチドは１つ以上の置換または修飾を含む。一実施形態において、前記ヌクレオチドはロックド核酸（ＬＮＡ）を用いて置換される。
【０１６４】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドはサ−チュイン（ＳＩＲＴ）および配列番号１から１４に定めた配列に関連したコ−ド化および／または非コ−ド化配列の核酸分子センスおよび／またはアンチセンスの１つ以上の領域を標的とする。さらに、オリゴヌクレオチドは配列番号１から１４のオ−バ−ラップした領域を標的化している。
【０１６５】
本発明の特定のオリゴヌクレオチドはキメラオリゴヌクレオチドである。本発明の文脈において、「キメラオリゴヌクレオチド」または「キメラ」は各々が少なくとも１つのヌクレオシドを構成しながら２つ以上の化学的に明白な領域を含むオリゴヌクレオチドである。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドは１つ以上の有益な特性（例えば、高まったヌクレア−ゼ耐性、高まった細胞への取込み、標的に対しての高まった結合親和性など）およびＲＮＡ：ＤＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる酵素類の基質である領域を付与する修飾ヌクレオシドの少なくとも１つの領域を含む。例を挙げると、ＲＮＡｓｅＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞由来のエンドヌクレア−ゼである。従って、ＲＮＡｓｅＨの活性化はＲＮＡ標的の切断を引き起こし、それにより、遺伝子発現のアンチセンス調節の効率を非常に高める。この結果、キメラオリゴヌクレオチドを使用した場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエ−トデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、同等の結果をより短いオリゴヌクレオチドで得ることができることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動および必要であれば糖分野で公知の、関連する核酸ハイブリダイゼ−ション技術によって通常通りに検出することができる。一実施形態において、キメラオリゴヌクレオチドは標的結合親和性を高めるように修飾された少なくとも１つの領域、ならびに、通常、ＲＮＡｓｅＨの基質として機能する領域を含む。この標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性（この場合は、核酸コ−ド化Ｒａｓ）はオリゴヌクレオチド／標的対のＴｍを測定することで通常通りに決定されるが、ここでの温度はオリゴヌクレオチドと標的が解離する温度であり、この解離は分光光度的に検出される。Ｔｍが高いほど標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性が大きくなる。
【０１６６】
本発明のキメラアンチセンス化合物は上述したような２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドの模倣物の複合構造として形成してもよい。また、そのような化合物はハイブリッドまたはギャップマ−と当分野において呼ばれている。そのようなハイブリッド構造の調合を教示した代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許番号第５、０１３、８３０号、５、１４９、７９７号、５、２２０、００７号、５、２５６、７７５号、５、３６６、８７８号、５、４０３、７１１号、５、４９１、１３３号、５、５６５、３５０号、５、６２３、０６５号、５、６５２、３５５号、５、６５２、３５６号、および５、７００、９２２号明細書を含み、参照によりそれぞれ本明細書に組み入れられる。
【０１６７】
別の実施形態において、修飾されたオリゴヌクレオチドの領域は糖の２′位置で修飾された少なくとも１つのヌクレオチド、最も好ましくは、２′−Ｏ−アルキル、２′−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルまたは２′−フルオロ修飾ヌクレオシドを含む。その他の実施形態において、ＲＮＡ修飾は、ピリミジンのリボ−スにおける２′−フルオロ、２′−アミノおよび２′Ｏ−メチル修飾、ＲＮＡの３′末端での脱塩基残基または逆塩基を含む。そのような修飾はオリゴヌクレオチドに通常通り組入れられ、かつ、これらのオリゴヌクレオチドは所与の標的と比較すると２′−デオキシオリゴヌクレオチドと比べてより高いＴｍ（つまり、より高い標的結合親和性）を示している。そのような高まった親和性の効果により遺伝子発現のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド阻害を大きく増強する。ＲＮＡｓｅ  ＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞由来のエンドヌクレア−ゼである。従って、ＲＮＡｓｅＨの活性化はＲＮＡ標的の切断を引き起こし、それにより、ＲＮＡｉ阻害の効率を大きく増強する。ＲＮＡ標的の切断をゲル電気泳動により通常通りに示すことができる。別の実施形態において、さらに、キメラオリゴヌクレオチドはヌクレア−ゼ耐性を増強するように修飾される。細胞は核酸を劣化させることができる種々のエキソヌクレア−ゼおよびエンドヌクレア−ゼを含む。多くのヌクレオチド  およびヌクレオシド修飾を組み入れたオリゴヌクレオチドは天然のオリゴデオキシヌクレオチド類よりもヌクレア−ゼ消化に対してより耐性であることが示されてきた。ヌクレア−ゼ耐性は細胞抽出物または分離されたヌクレア−ゼ溶液を用いてオリゴデオキシヌクレオチドをインキュベ−トすることにより、および時間を経て未改変オリゴヌクレオチドの度合の測定をすることにより、普通はゲル電気泳動で通常通り測定される。ヌクレア−ゼ耐性を増強するように修飾されたオリゴヌクレオチドは、未修飾オリゴヌクレオチドと比べてより長い時間、無傷のまま生き続ける。種々のオリゴヌクレオチド修飾がヌクレア−ゼ耐性を増強し、または付与することが示されている。少なくとも１つのホスホロチオエ−ト修飾を含むオリゴヌクレオチドが現在ではより好ましい。いくつかの場合においては、さらに、標的結合親和性を増強するオリゴヌクレオチド修飾はヌクレア−ゼ耐性を独立して増強することができる。望ましい修飾の一部はＤｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．，  ２８：３６６−３７４に記載されている。
【０１６８】
本発明において考えられる一部のオリゴヌクレオチドの特定の実施例は、例えば、ホスホロチオエ−ト、ホスホトリエステル、メチルホスホン酸エステル、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子または複素環糖間結合などの修飾骨格を含有するオリゴヌクレオチドを含む。大部分がホスホロチオエ−ト骨格を持つオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子骨格を持つオリゴヌクレオシドであり、そして特に、ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２〔メチレン（メチルイミノ）あるいはＭＭＩ骨格として知られている〕、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２〔ここで、本来のホスホジエステル骨格はＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨとして示される〕である。Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ２８：３６６−３７４で開示するアミド骨格も好ましい。さらには、モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，０３４，５０６）。ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格などの他の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格をポリアミド骨格で置換し、ヌクレオシドはポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接または間接に結合している。また、オリゴヌクレオチドは１つ以上の置換糖部分を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは２′位でＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３  ＯＣＨ３、ＯＣＨ３  Ｏ（ＣＨ２）ｎ  ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎ  ＮＨ２またはＯ（ＣＨ２）ｎ  ＣＨ３、ここで、ｎは１から約１０である；Ｃ１からＣ１０の低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリ−ルまたはアラルキル；Ｃｌ；  Ｂｒ；  ＣＮ；  ＣＦ３；  ＯＣＦ３；  Ｏ−、Ｓ−、またはｎ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２  ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；リポ−タ−基；挿入基；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、および同様な特性を有する他の置換基の１つを含む。修飾には２′−メトキシエトキシ（２′−Ｏ−ＣＨ２  ＣＨ２  ＯＣＨ３、２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても公知）を含む。他の修飾には２′−メトキシ（２′−Ｏ−ＣＨ３）、２′−プロポキシ（２′−ＯＣＨ２  ＣＨ２ＣＨ３）および２′−フルオロ（２′−Ｆ）を含む。また、同様な修飾をオリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３′末端ヌクレオチドの糖の３′位、および５′末端ヌクレオチドの５′位で行うこともできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル群の位置におけるシクロブチル部位などの糖模倣物も保持する。
【０１６９】
さらに、または代わりに、オリゴヌクレオチドは核酸塩基（当分野においてしばしば単に「塩基」という）の修飾または置換を含んでもよい。本明細書においては、「非修飾」または「天然」のヌクレオシドはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾ヌクレオシドは天然の核酸に低頻度で、または一過的に認められるヌクレオシドを含み、それらは例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に５−メチルシトシン（また、５−メチル−２′デオキシシトシンと呼び、しばしば５−Ｍｅ−Ｃという）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣおよびジェントビオシルＨＭＣ、ならびに合成ヌクレオシド、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニンおよび２、６−ジアミノプリンである。当分野で公知の「普遍的な」塩基、例えば、イノシンを含めてもよい。５−Ｍｅ−Ｃ置換は核酸二本鎖の安定性を０．６−１．２℃上昇させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．  Ｓ．，  ｉｎ  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．  Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，  Ｂ．，  ｅｄｓ．，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  １９９３，  ｐｐ．  ２７６−２７８）、かつ、現在、塩基置換である。
【０１７０】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性または細胞への取り込みを増強する１つ以上の部分またはコンジュゲ−トを、オリゴヌクレオチドに化学結合させることを意味する。そのような部分としては、限定するものではないが、脂質部分、例えばコレステロ−ル部分、コレステロ−ル部分、チオエ−テル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオ−ル、チオコレステロ−ル、脂肪族鎖、例えばドデカンジオ−ル残基またはウンデシル残基、リン脂質、例えばジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−ルまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネ−ト、ポリアミン鎖またはポリエチレングリコ−ル鎖、あるいはアダマンタン酢酸がある。親油性部分を含むオリゴヌクレオチド、およびそのようなオリゴヌクレオチドの調合法は、当分野において、例えば、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．５、１３８、０４５号、５、２１８、１０５号および５、４５９、２５５号において公知である。
【０１７１】
全ての場所で所与のオリゴヌクレオチドが均一に修飾される必要なく、そして事実上、上述の修飾の１つ以上が単一のオリゴヌクレオチドに、またはオリゴヌクレオチド内部の単一のヌクレオシドにおいて組入れられてもよい。本発明はこれまでに定義されたキメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含む。
【０１７２】
別の実施形態において、本発明の核酸分子はもう１つ別の部分、限定されるものではないが、脱塩基型ヌクレオチド、ポリエ−テル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、またはポリハイドロカ−ボン化合物が共役されている。当業者は、これらの分子が核酸分子を含有する１つ以上のいかなるヌクレオチドに、糖、塩基またはリン酸基の数か所の位置で結合できることを認識するであろう。
【０１７３】
本発明に従って使用されたオリゴヌクレオチドは、固相合成のよく知られた技術によって都合よくおよび通常通りに製造する。そのような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどを含むいくつかの製造供給元によって販売されている。そのような合成に対するあらゆる他の手段を利用してもよい。オリゴヌクレオチドの実際の合成は十分に当事者の能力の範囲内である。また、ホスホチオエ−トおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調合するための同様な技術を使用することはよく知られている。コレステロ−ル修飾オリゴヌクレオチドなどの蛍光標識、ビオチン化または他の修飾オリゴヌクレオチドを合成するために、類似の技術およびビオチン、フルオレセイン、アクリジンまたはソラレン修飾アミダイトおよび／またはＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡから入手可能）などの市販されている修飾アミダイトならびに調製孔ガラス（ＣＰＧ）産物を使うこともまた周知である。
【０１７４】
本発明に従って、オリゴヌクレオチドの力価、特異性および作用持続時間を増強し投与経路を広げるためのＬＮＡモノマ−の使用などの修飾の使用はＭＯＥ、ＡＮＡ、ＦＡＮＡ、ＰＳなどの最近の化学薬品を含む。このことは、ＬＮＡモノマ−により最近のオリゴヌクレオチドにおける一部のモノマ−を置換することで達成できる。ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは親化合物に類似したサイズ、またはより大きいか、あるいは好ましくはより小さいサイズを有してもよい。そのようなＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは約７０％、より好ましくは約６０％以下、最も好ましくは約５０％以下のＬＮＡモノマ−を含むものであり、これらのサイズは約５から２５ヌクレオチドの間、より好ましくは約１２から２０ヌクレオチドの間である。
【０１７５】
修飾オリゴヌクレオチド骨格は、限定されるものではないが、ホスホロチオエ−ト、キラルホスホロチオエ−ト、ホスホロジチオエ−ト、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３′−アルキレンホスホネ−トおよびキラルホスホネ−トを含むメチルおよび他のアルキルホスホネ−ト、ホスフィネ−ト、３′−アミノホスホラミダイトおよびアミノアルキルホスホラミダイトを含むホスホラミダイト、チオノホスホラミダイト、チオノアルキルホスホネ−ト、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常３′−５′結合を保持するボラノリン酸、これらの２′−５′結合類似体、および逆位極性を保持するそれらを含み、ここにおいてヌクレオシド単位の隣接する対は３′−５′から５′−３′または２′−５′から５′−２′である。さらに、種々の塩、混合塩および遊離酸の形も含まれる。
【０１７６】
結合を含有する上述のリンの調合を教示した代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許番号第３、６８７、８０８号、４、４６９、８６３号、４、４７６、３０１号、５、０２３、２４３号、５、１７７、１９６号、５、１８８、８９７号、５、２６４、４２３号、５、２７６、０１９号、５、２７８、３０２号、５、２８６、７１７号、５、３２１、１３１号、５、３９９、６７６号、５、４０５、９３９号、５、４５３、４９６号、５、４５５、２３３号、５、４６６、６７７号、５、４７６、９２５号、５、５１９、１２６号、５、５３６、８２１号、５、５４１、３０６号、５、５５０、１１１号、５、５６３、２５３号、５、５７１、７９９号、５、５８７、３６１号、および５、６２５、０５０号明細書を含み、参照によりそれぞれ本明細書に組み入れられる。
【０１７７】
リン原子を含有しない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルインタ−ヌクレオシド結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルインタ−ヌクレオシド結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環式インタ−ヌクレオシド結合により形成された骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を持つ骨格、シロキサン骨格、硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホン酸塩およびスルホンアミド骨格、アミド骨格、およびＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２混合構成成分を有する他の骨格を含む。
【０１７８】
上述のオリゴヌクレオチドの調合を教示した代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許番号第５、０３４、５０６号、５、１６６、３１５号、５、１８５、４４４号、５、２１４、１３４号、５、２１６、１４１号、５、２３５、０３３号、５、２６４、５６２号、５、２６４、５６４号、５、４０５、９３８号、５、４３４、２５７号、５、４６６、６７７号、５、４７０、９６７号、５、４８９、６７７号、５、５４１、３０７号、５、５６１、２２５号、５、５９６、０８６号、５、６０２、２４０号、５、６１０、２８９号、５、６０２、２４０号、５、６０８、０４６号、５、６１０、２８９号、５、６１８、７０４号、５、６２３、０７０号、５、６６３、３１２号、５、６３３、３６０号、５、６７７、４３７号、および５、６７７、４３９号明細書を含み、参照によりそれぞれ本明細書に組み入れられる。
【０１７９】
他のオリゴヌクレオチド模倣物では、ヌクレオチド単位の糖およびインタ−ヌクレオシド結合、つまり骨格は新規の群で置換されている。塩基単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼ−ションのため維持する。優れたハイブリタイゼ−ション特性を持つことが示されたオリゴヌクレオチド模倣物であるオリゴマ−化合物の１つはペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は骨格を含むアミドで置換され、特にアミノエチルグリシン骨格に置換される。核酸塩基は保持され、そしてバックボ−ンのアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調合を教示した代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許番号第５、５３９、０８２号、５、７１４、３３１号、および  ５、７１９、２６２号明細書を含み、参照によりそれぞれ本明細書に組み入れられる。
【０１８０】
ＰＮＡ化合物のさらなる教示はＮｉｅｌｓｅｎら（１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，  １４９７−１５００に記載されている。
【０１８１】
本発明の別の実施形態において、ホスホロチオエ−ト骨格を持つオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子骨格を持つオリゴヌクレオシドであり、そして特に、メチレン（メチルイミノ）あるいはＭＭＩ骨格として知られているＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２であり、ここで、本来のホスホジエステル骨格は上述の米国特許番号第  ５、４８９、６７７号および上述の米国特許番号第  ５、６０２、２４０号のアミド骨格のＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２として示される。さらには、上述の国特許番号第５、０３４、５０６号のモルホリノ骨格構造をもつオリゴヌクレオチドである。
【０１８２】
また、修飾オリゴヌクレオチドは１つ以上の置換糖部分を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは２′位置で以下の１つを含む。ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；またはＯアルキル−Ｏ−アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換もしくは無置換Ｃ〜ＣＯアルキルまたはＣ２〜ＣＯ  アルケニルおよびアルキニルであってもよい。特には、Ｏ  （ＣＨ２）ｎ  ＯｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎ、ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、ａｎｄ  Ｏ（ＣＨ２ｎＯＮ（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２であり、ここでｎおよびｍは１から約１０までであり得る。他のオリゴヌクレオチドは２′位置で以下の１つを含む。Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、またはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、リポ−タ−基、挿入基、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、および同様な特性を有する他の置換基から選択された糖置換基を有する。１つの修飾は、２′−メトキシエトキシ（２′−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２′−ＭＯＥとしても知られている）、すなわちアルコキシアルコキシ基を含む。更なる修飾は、以下の実施例に記載されているような２′−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２′−ＤＭＡＯＥとしても知られている）、および２′−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２′−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２′−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち２′−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【０１８３】
他の修飾は２′−メトキシ（２′−Ｏ  ＣＨ３）、２′−アミノプロポキシ（２′−Ｏ  ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２′−フルオロ（２′−Ｆ）を含む。また、同様な修飾を糖上の他の位置、特に３′末端ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの３′位置、または結合オリゴヌクレオチドで、および５′末端ヌクレオチドの５′位置で行うこともできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の位置におけるシクロブチル部位などの糖模倣物も保持する。そのような修飾糖鎖構造の調合を教示した代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許番号第４、９８１、９５７号、５、１１８、８００号、５、３１９、０８０号、５、３５９、０４４号、５、３９３、８７８号、５、４４６、１３７号、５、４６６、７８６号、５、５１４、７８５号、５、５１９、１３４号、５、５６７、８１１号、５、５７６、４２７号、５、５９１、７２２号、５、５９７、９０９号、５、６１０、３００号、５、６２７、０５３号、５、６３９、８７３号、５、６４６、２６５号、５、６５８、８７３号、５、６７０、６３３号、および５、７００、９２０号明細書を含み、参照によりそれぞれ本明細書に組み入れられる。
【０１８４】
オリゴヌクレオチドは核酸塩基（当分野においてしばしば単に「塩基」という）の修飾または置換を含んでもよい。本明細書で使用するとき、「非修飾」または「天然」のヌクレオチドはプリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）含む。修飾ヌクレオチドは５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチレニルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノピリジン、６−メチル、およびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルおよびアデニンおよびグアニンのほかのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオ−ル、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（特に５−ブロモ）、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然ヌクレオチドを含む。
【０１８５】
さらに、ヌクレオチドは米国特許番号第３、６８７、８０８号に記載され、「Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８−８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ、Ｊ．Ｉ．、ｅｄ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、  １９９０に記載され、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、「Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」、１９９１、３０、６１３頁に記載され、かつ、Ｓａｎｇｈｖｉ、Ｙ．Ｓ．、Ｃｈａｐｔｅｒ  １５、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、２８９−３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ、Ｓ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ、Ｂ．  ｅａ．、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３に記載されたヌクレオチドを含む。特定のこれら核酸塩基は、本発明のオリゴマ−化合物の結合親和性を増加するために特に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、および２−アミノプロピル−アデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換基は０．６〜１．２℃で核酸二本鎖の安定性を増加し（Ｓａｎｇｈｖｉ、  Ｙ．Ｓ．、  Ｃｒｏｏｋｅ、  Ｓ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ、  Ｂ．、  ｅｄｓ、  ′Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ′、  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、  １９９３、  ｐｐ．  ２７６−２７８）、かつ、現在、塩基置換であり、２′−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた時に特に有用であることが示された。
【０１８６】
そのような修飾糖鎖構造の調合を教示した代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許番号第３、６８７、８０８号ならびに４、８４５、２０５号、５、１３０、３０２号、５、１３４、０６６号、５、１７５、２７３号、５、３６７、０６６号、５、４３２、２７２号、５、４５７、１８７号、５、４５９、２５５号、５、４８４、９０８号、５、５０２、１７７号、５、５２５、７１１号、５、５５２、５４０号、５、５８７、４６９号、５、５９６、０９１号、５、６１４、６１７号、５、７５０、６９２号、および５、６８１、９４１号明細書を含み、参照によりそれぞれ本明細書に組み入れられる。
【０１８７】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞への取り込みを増強する１つ以上の部分またはコンジュゲ−トを、オリゴヌクレオチドに化学結合させることを意味する。
【０１８８】
そのような部分は、これに限定されるものではないが、コレステロ−ル部分、コ−ル酸、チオエ−テル（例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオ−ル）、チオコレステロ−ル、脂肪族鎖（例えばドデカンジオ−ル、またはウンデシル残基）、リン脂質（例えばジ−ヘキサデシル−グリセロ−ルまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−Ｓ−Ｈ−ホスホネ−ト、ポリアミンまたはポリエチレングリコ−ル鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロ−ル部分などの脂質部分を含む。
【０１８９】
そのような修飾糖鎖構造の調合を教示した代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許番号第４、８２８、９７９号、４、９４８、８８２号、５、２１８、１０５号、５、５２５、４６５号、５、５４１、３１３号、５、５４５、７３０号、５、５５２、５３８号、５、５７８、７１７号、５、５８０、７３１号、５、５８０、７３１号、５、５９１、５８４号、５、１０９、１２４号、５、１１８、８０２号、５、１３８、０４５号、５、４１４、０７７号、５、４８６、６０３号、５、５１２、４３９号、５、５７８、７１８号、５、６０８、０４６号、４、５８７、０４４号、４、６０５、７３５号、４、６６７、０２５号、４、７６２、７７９号、４、７８９、７３７号、４、８２４、９４１号、４、８３５、２６３号、４、８７６、３３５号、４、９０４、５８２号、４、９５８、０１号、５、０８２、８３０号、５、１１２、９６３号、５、２１４、１３６号、５、０８２、８３０号、５、１１２、９６３号、５、２１４、１３６号、５、２４５、０２２号、５、２５４、４６９号、５、２５８、５０６号、５、２６２、５３６号、５、２７２、２５０号、５、２９２、８７３号、５、３１７、０９８号、５、３７１、２４１号、５、３９１、７２３号、５、４１６、２０３号、５、４５１、４６３号、５、５１０、４７５号、５、５１２、６６７号、５、５１４、７８５号、５、５６５、５５２号、５、５６７、８１０号、５、５７４、１４２号、５、５８５、４８１号、５、５８７、３７１号、５、５９５、７２６号、５、５９７、６９６号、５、５９９、９２３号、５、５９９、９２８号および５、６８８、９４１号明細書を含み、参照によりそれぞれ本明細書に組み入れられる。
【０１９０】
ドラッグデリバリ−
本発明の化合物はドラッグデリバリ−および標的の有効性確認の分野においても適用できる。本発明は、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドと病状、表現型または状態との間に存在する関連性を解明するためのドラッグデリバリ−作用における本明細書で同定された化合物および標的セグメントの使用を含む。これらの方法は、サンプル、組織、細胞または器官を本発明の化合物と接触させる工程、投与後のある時点でサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドおよび／または関連した表現型または化学エンドポイントの核酸またはタンパク質レベルを測定する工程と、選択的に測定値と非処理サンプルまたは本発明の更なる化合物で処理したサンプルを比較する工程とを有する、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドとを決定する工程または調節する工程を含む。これらの方法は、他の実験と平行してまたは組み合わせて実行され、標的バリデ−ションの工程で未知遺伝子の機能を決定する、または特定の疾患、状態、または表現型の治療または予防のための標的として特異的遺伝子産物の機能を決定することができる。
【０１９１】
遺伝子発現のアップレギュレ−ションまたは阻害の評価
外因性の核酸の宿主細胞または器官への移動は宿主細胞または器官中の核酸の存在を直接検出することで評価することができる。そのような検出は本分野において周知であるいくつかの方法で達成できる。例えば、外因性の核酸の存在はサザンブロット法または核酸に関連するヌクレオチド配列を特異的に増幅するプライマ−を使ったポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＰ）技術で検出できる。また、外因性の核酸の発現は遺伝子発現解析を含めた従来の方法を使って測定できる。例えば、外因性の核酸から生成したｍＲＮＡはノ−ザンブロットおよび逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使って検出と定量できる。
【０１９２】
また、外因性の核酸から生成したｍＲＮＡの発現は酵素活性またはリポ−タ−  蛋白質活性を測定して検出できる。例えば、アンチセンス変調活性は外因性の核酸がエフェクタ−ＲＮＡを生成するのを指標として標的核酸発現の増減として間接的に測定できる。配列保存に基づき、プライマ−は標的遺伝子のコ−ド化領域を増幅するように設計し使用することができる。第１に、各遺伝子からの高発現コ−ド化領域はモデルコントロ−ル遺伝子を形成するのに使用することができ、ただし、コ−ド化または非コ−ド化領域を使用することができる。各コントロ−ル遺伝子はリポ−タ−コ−ド化領域とポリ（Ａ）シグナルとの間のコ−ド化領域に挿入することで組み立てられる。これらのプラスミドは遺伝子の上流部分におけるリポ−タ−遺伝子および３′非コ−ド化領域における有望なＲＮＡｉ標的を用いてｍＲＮＡの生成を行う。個々のアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性はリポ−タ−遺伝子の調節によりアッセイされる。リポ−タ−遺伝子はアセトヒドロキシ酸シンタ−ゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリ性ホスファタ−ゼ（ＡＰ）、βガラクトシダ−ゼ（ＬａｃＺ）、βグルクロニダ−ゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコ−ルアセチルトランスフェラ−ゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、セイヨウワサビペルオキシダ−ゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラ−ゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンタ−ゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンタ−ゼ（ＯＣＳ）およびその誘導体が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコ−ル、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサ−ト、ホスフィノトリシン、ピュ−ロマイシンおよびテトラサイクリン耐性を付与する多くの選択マ−カ−が利用可能である。リポ−タ−遺伝子の調節を測定する方法は当該分野でよく知られ、限定されるものではないが、蛍光定量法（例えば、蛍光スペクトロスコピ−、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＳＣ）、蛍光顕微鏡）、抗生物質耐性判定を含む。
【０１９３】
ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ３およびＳＩＲＴ６タンパク質ならびにｍＲＮＡ発現は当事者に周知で、かつ、本明細書の別の箇所に記載されている方法を用いてアッセイすることができる。例えば、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイをタンパク質レベルの測定に使用することができる。ＥＬＩＳＡ用のサ−チュイン（ＳＩＲＴ）抗体はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、  ＭＮ）、  Ａｂｃａｍ、  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、  ＭＡから市販されている。
【０１９４】
実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理したサンプル（例えば、インビボまたはインビトロでの細胞または組織）のＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ３およびＳＩＲＴ６発現（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）は対照サンプル中のサ−チュイン（ＳＩＲＴ）発現との比較で評価する。例えば、当事者に公知の方法を使用して、タンパク質または核酸の発現をモック処置された、または無処理サンプルの発現に対して比較することができる。あるいは、望ましい情報に応じて対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、変化したまたは異なる配列を有するもの）で処理したサンプルとの比較をすることができる。別の実施形態において、処理と未処理サンプルの中でのサ−チュイン（ＳＩＲＴ）タンパク質または核酸の発現の違いは、処理と未処理サンプルの中での異なる核酸（研究者が適切と見なすいかなる標準を含み、例えば、ハウスキ−ピング遺伝子）の発現の違いと比較することができる。
【０１９５】
所望の形で観察された違いは、例えば、対照と比較する比率または割合の形式で表すことができる。実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した資料中のサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、未処理サンプルまたは対照核酸による処理サンプルに対して約１．２５倍から約１０倍または以上まで増減する。実施形態において、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、少なくとも約１．２５倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９倍、少なくとも約９．５倍、または、少なくとも約１０倍以上増減する。
【０１９６】
キット、研究試薬、診断薬、および治療薬
本発明の化合物は診断薬、治療薬、および予防、および研究試薬ならびにキットの成分として利用することができる。さらに、特定の遺伝子の機能を明らかにするために、または、生物学的経路の種々のメンバ−の機能を区別するために、優れた特異性を用いて遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドはしばしば当事者により使用される。
【０１９７】
キットおよび診断薬において、ならびに種々の生物系においての使用の場合、本発明の化合物は単独でまたは他のオリゴマ−化合物または療法との組み合わせで、細胞および組織内で発現した遺伝子の一部のまたは全体の相補鎖の発現パタ−ンを解明するためのディファレンシャル（差次的）および／またはコンビナトリアル（組み合わせ）解析における手段として使用することができる。
【０１９８】
本明細書で使用するとき、用語「生物系」または「系」とは、発現する、またはサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の産物を発現する能力があるいかなる器官、細胞、細胞培養または組織として定義される。これらは、限定されるものではないが、ヒト、トランスジェニック動物、細胞、細胞培養、組織、異種移植片、移植およびこれらの組み合せを含む。
限定されない１実施例として、１以上のアンチセン化合物で処理された細胞または組織内の発現パタ−ンは、アンチセンス化合物で処理されていない対照細胞または組織と比較され、産生された前記パタ−ンは例えば疾患関連、シグナル経路、細胞性局在、発現レベル、サイズ、検討された遺伝子の構造または機能に関連するような遺伝子発現のディファレンシャルレベルに対して解析される。これらの解析は、発現パタ−ンに影響を及ぼす他の化合物の存在下または非存在下で、刺激または未刺激細胞上で実行することができる。
本分野では既知である遺伝子発現解析の方法の例としては、ＤＮＡアレイまたはマイクロアレイ（Ｂｒａｚｍａ  ａｎｄ  Ｖｉｌｏ、  （２０００）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、  ４８０、  １７−２４；  Ｃｅｌｉｓ、  ｅｔ  ａｌ．、  （２０００）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、  ４８０、  ２−１６）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続解析）（Ｍａｄｄｅｎ、  ｅｔ  ａｌ．、  （２０００）  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ、  ５、  ４１５−  ４２５）、ＲＥＡＤＳ（消化ｃＤＮＡｓの制限酵素増幅）（Ｐｒａｓｈａｒ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｍａｎ、  （１９９９）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、  ３０３、  ２５８−７２）、ＴＯＧＡ（総遺伝子発現解析）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、  ｅｔ  ａｌ．、  （２０００）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、  ９７、  １９７６−８１）、タンパク質アレイおよびプロテオミクス（Ｃｅｌｉｓ、  ｅｔ  ａｌ．、  （２０００）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、  ４８０、  ２−１６；  Ｊｕｎｇｂｌｕｔ、  ｅｔ  ａｌ．、  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、  １９９９、  ２０、  ２１００−１０）、発現配列タグ（ＥＳＴ）シ−クエンシング（Ｃｅｌｉｓ、  ｅｔ  ａｌ．、  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、  ２０００、  ４８０、  ２−１６；  Ｌａｒｓｓｏｎ、  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、  ２０００、  ８０、  １４３−５７）、サブトラクティブＲＮＡフィンガ−プリンティング（ＳｕＲＰ）（Ｆｕｃｈｓ、  ｅｔ  ａｌ．、  （２０００）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２８６、  ９１−９８；  Ｌａｒｓｏｎ、  ｅｔ  ａｌ．、  （２０００）  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ４１、  ２０３−２０８）、サブトラクティブクロ−ニング、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）（Ｊｕｒｅｃｉｃ  ａｎｄ  Ｂｅｌｍｏｎｔ、  （２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３、  ３１６−２１）、比較ゲノムハイブリダイゼ−ション（Ｃａｒｕｌｌｉ、  ｅｔ  ａｌ．、  （１９９８）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｕｐｐｌ．、  ３１、  ２８６−９６）、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼ−ション）技術（Ｇｏｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｕｓｔｅｒｓｏｎ、  （１９９９）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、  ３５、  １８９５−９０４）および質量分析法（Ｔｏ、  Ｃｏｍｂ．  （２０００）  Ｃｈｅｍ．  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ、  ３、  ２３５−４１）を含む。
【０１９９】
これらの化合物はサ−チュイン（ＳＩＲＴ）をコ−ド化する核酸に対してのハイブリダイゼ−ションをするので本発明の化合物は研究と診断に有益である。例えば、そのような効率を有し、効果的なサ−チュイン（ＳＩＲＴ）モジュレ−タ−となると本明細書に開示されたような条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、好都合な遺伝子増幅または検出の条件下でそれぞれ効果的なプライマ−またはプロ−ブある。これらのプライマ−およびプロ−ブは、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）をコ−ド化する核酸分子の特異的な検出を必要とする方法において、およびサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の更なる研究における検出または使用に対する核酸分子の増幅において有用である。アンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼ−ション、特にサ−チュイン（ＳＩＲＴ）をコ−ド化する核酸に対する本発明のプライマ−およびプロ−ブは、本分野で周知である手段によって検出することができる。そのような手段はオリゴヌクレオチドへの酵素共役、オリゴヌクレオチドの放射線ラベル、または他のあらゆる最適な検出手段を含む。サンプル内のサ−チュイン（ＳＩＲＴ）のレベルを検出するためのそのような検出手段を用いるキットも調合してもよい。
【０２００】
アンチセンスの特異性および感受性も治療用途に対して本分野の当業者によって利用される。アンチセンス化合物はヒトを含む動物における病状の治療における治療部分として利用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤は、ヒトに対して安全で効果的に投与されており、たくさんの治験が現在進行中である。従って、アンチセンス化合物は、細胞、組織、および動物（特にヒト）の治療に対する治療投与計画において有用であるように設定される有用な治療法となり得ると確定された。
【０２０１】
治療用にサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドの発現を調節することによって治療され得る病気または障害を患っている疑いがある動物、特にヒトは本発明に従ってアンチセンス化合物を投与することによって治療される。例えば、限定されない一実施例では、この方法はサ−チュイン（ＳＩＲＴ）モジュレ−タ−の治療有効量を投与が必要な動物に投与することを含む。本発明のサ−チュイン（ＳＩＲＴ）モジュレ−タ−はサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の活性を効果的に調節するか、またはサ−チュイン（ＳＩＲＴ）タンパク質の発現を調節する。一実施形態において、動物におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の活性または発現は対照との比較において約１０％の割合で阻害される。好ましくは、動物におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の活性または発現は約３０％の割合で阻害される。より好ましくは、動物におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の活性または発現は５０％以上の割合で阻害される。従って、対照との比較においてオリゴマ−化合物はサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ｍＲＮＡの発現を、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％調節する。
【０２０２】
一実施形態において、対照との比較においてサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の活性および発現および／または動物においては、約１０％上昇する。好ましくは、動物におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の活性または発現は約３０％の割合で上昇する。より好ましくは、動物におけるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の活性または発現は５０％以上の割合で上昇する。従って、対照との比較においてオリゴマ−化合物はサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ｍＲＮＡの発現を、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％調節する。
【０２０３】
例えば、サ−チュイン（ＳＩＲＴ）の発現の減少は動物の血清、血液、脂肪組織、肝臓または他の体液、組織または器官から測定してもよい。好ましくは、解析される前記の液体、組織または器官はサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ペプチドおよび／またはサ−チュイン（ＳＩＲＴ）タンパク質それ自体をコ−ド化する核酸分子を含む。
【０２０４】
本発明の化合物は適切な薬学的に許容される希釈剤または担体に化合物の有効量を添加することで医薬組成物に利用することができる。また、本発明の化合物および方法の使用は予防的にも有用である。
【０２０５】
コンジュゲ−ト
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞への取り込みを増強する１つ以上の部分またはコンジュゲ−トを、オリゴヌクレオチドに化学結合させることを意味する。これらの部分またはコンジュゲ−トは一級または二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した共役基を含むことができる。本発明の共役基は、干渉物質、リポ−タ−分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコ−ル、ポリエ−テル、オリゴマ−の薬力学的特性を増強する基、およびオリゴマ−の薬物動態的特性を増強する基を含む。一般的な共役基はコレステロ−ル、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ロ−ダミン、クマリン、および色素を含む。本発明の文脈における薬力学的特性を増強する基は、取り込み、分解に対する増強された耐性、および／または標的核酸との強化された配列特異的ハイブリダイゼ−ションを含む。本発明の文脈における薬物動態的特性を増強する基は、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝および排出を含む。代表的な共役基は国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号（１９９２年１０月２３日に出願）および米国出願番号第６、２８７、８６０号に開示されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０６】
そのような部分は、これに限定されるものではないが、コレステロ−ル部分、コ−ル酸、チオエ−テル（例えばヘキシル−５−トリチルチオ−ル）、チオコレステロ−ル、脂肪族鎖（例えばドデカンジオ−ル、またはウンデシル残基）、リン脂質（例えばジ−ヘキサデシル−グリセロ−ルまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−Ｓ−Ｈ−ホスホネ−ト、ポリアミンまたはポリエチレングリコ−ル鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロ−ル部分などの脂質部分を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリイオド安息香酸、フルフェナム酸、ホリニン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツレ−ト、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤、または抗生物質などの薬剤物質を活性化するためにも共役される。
【０２０７】
そのような修飾糖鎖構造の調合を教示した代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許番号第４、８２８、９７９号、４、９４８、８８２号、５、２１８、１０５号、５、５２５、４６５号、５、５４１、３１３号、５、５４５、７３０号、５、５５２、５３８号、５、５７８、７１７号、５、５８０、７３１号、５、５８０、７３１号、５、５９１、５８４号、５、１０９、１２４号、５、１１８、８０２号、５、１３８、０４５号、５、４１４、０７７号、５、４８６、６０３号、５、５１２、４３９号、５、５７８、７１８号、５、６０８、０４６号、４、５８７、０４４号、４、６０５、７３５号、４、６６７、０２５号、４、７６２、７７９号、４、７８９、７３７号、４、８２４、９４１号、４、８３５、２６３号、４、８７６、３３５号、４、９０４、５８２号、４、９５８、０１３号、５、０８２、８３０号、５、１１２、９６３号、５、２１４、１３６号、５、０８２、８３０号、５、１１２、９６３号、５、２１４、１３６号、５、２４５、０２２号、５、２５４、４６９号、５、２５８、５０６号、５、２６２、５３６号、５、２７２、２５０号、５、２９２、８７３号、５、３１７、０９８号、５、３７１、２４１号、５、３９１、７２３号、５、４１６、２０３号、５、４５１、４６３号、５、５１０、４７５号、５、５１２、６６７号、５、５１４、７８５号、５、５６５、５５２号、５、５６７、８１０号、５、５７４、１４２号、５、５８５、４８１号、５８７、３７１号、５、５９５、７２６号、５、５９７、６９６号、５、５９９、９２３号、５、５９９、９２８号および５、６８８、９４１号明細書を含む。
【０２０８】
製剤
本発明の組成物は例えば、リポソ−ム、受容体標的分子、経口、直腸、局所的または取り込み、分配および／または吸収を補助するための他の製剤として他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合される、封入される、共役される、または関連する。そのような取り込み、分配および／または吸収補助製剤の調合を教示する代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許番号第５、１０８、９２１号、５、３５４、８４４号、５、４１６、０１６号、５、４５９、１２７号、５、５２１、２９１号、５、５４３、１６５号、５、５４７、９３２号、５、５８３、０２０号、５、５９１、７２１号、４、４２６、３３０号、４、５３４、８９９号、５、０１３、５５６号、５、１０８、９２１号、５、２１３、８０４号、５、２２７、１７０号、５、２６４、２２１号、５、３５６、６３３号、５、３９５、６１９号、５、４１６、０１６号、５、４１７、９７８号、５、４６２、８５４号、５、４６９、８５４号、５、５１２、２９５号、５、５２７、５２８号、５、５３４、２５９号、５、５４３、１５２号、５、５５６、９４８号、５、５８０、５７５号、および５、５９５、７５６号明細書を含み、参照によりそれぞれ本明細書に組み入れられる。
【０２０９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的発現および／または機能を調節するためにベクタ−の文脈において投与する必要が生じないが、本発明の実施形態はハイブリッドプロモ−タ−遺伝子配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド発現のための発現ベクタ−構築物に関連し、かつ、強い構成的なプロモ−タ−活性、または所望の時に誘導できるプロモ−タ−活性を有する。
【０２１０】
一実施態様において、発明の運用は適切な核酸送達系を使用して前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを投与することを含む。一実施形態において、そのような系はポリヌクレオチドに操作可能な形でリンクされている非ウイルス性ベクタ−を含む。そのような非ウイルス性ベクタ−の例はオリゴヌクレオチドのみ（例えば、配列番号１５から９４など）または、適切なタンパク質、多糖または脂質製剤との併用などを含む。
【０２１１】
さらに、適切な核酸送達系はウイルスベクタ−、特に、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルパ−依存性アデノウイルス、レトロウイルス、またはセンダイウイルス（ＨＶＪ）とリポソ−ムの融合体のうち少なくとも１つに由来する配列を含む。好ましくは、ウイルスベクタ−はポリヌクレオチドに操作可能な形でリンクされている強力な真核生物プロモ−タ−、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモ−タ−を含む。
【０２１２】
さらに、ベクタ−はウイルスベクタ−融合タンパク質および化学的抱合体を含む。レトロウイルス・ベクタ−はモロニ−マウス白血病ウイルスおよびＨＩＶ−１に基づくウイルスを含む。ＨＩＶ−１に基づくウイルスベクタ−の１つは少なくとも２つのベクタ−を含み、ここで、１ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子はＨＩＶゲノム由来であり、ｅｎｖ遺伝子は別のウイルス由来である。ＤＮＡウイルスベクタ−が好ましい。これらのベクタ−はｏｒｔｈｏｐｏｘまたはａｖｉｐｏｘベクタ−などのｐｏｘベクタ−、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ）などのヘルペスウイルス・ベクタ−、アデノウイルスベクタ−およびアデノ随伴ウイルスベクタ−を含む。
【０２１３】
本発明のアンチセンス化合物は、あらゆる薬学的に許容可能な塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物への投与で生物活性代謝産物またはそれらの残留物を（直接的または間接的に）提供することができる他の化合物を含む。
【０２１４】
用語「薬学的に許容可能な塩」は本発明の化合物の生理的に、および薬学的に許容される塩、つまり親化合物の所望の生物学的活性を保持し、かつ、望ましくない毒性作用を付与しない塩を言う。オリゴヌクレオチドの薬学的に許容可能な塩およびその用途の例は米国特許番号第６、２８７、８６０号に詳細に記載されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１５】
本発明は本発明のアンチセンス化合物を含有する医薬品組成物および製剤をも含む。本発明の薬学的組成物は、局所的または全身的治療のどちらが望ましいか、および治療される領域に依存して多くの方法で投与される。投与は（膣および直腸運搬を含む眼および粘膜を含む）局所的であってよく、肺性、例えば、噴霧器によるものも含めた粉末またはエアロゾルの吸入またはガス注入、気管内、鼻腔内、上皮および経皮、経口的または非経口的であってよい。非経口的投与は静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射または注入、または頭蓋内（例えば、くも膜下腔内または脳室内）投与を含む。
【０２１６】
中枢神経系の組織の治療する場合は例えば、脳脊髄液への注射または注入により投与することができる。脳脊髄液へのアンチセンスＲＮＡの投与は米国特許公開番号２００７／０１１７７７２号「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｓｌｏｗｉｎｇ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ＡＬＳ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ」に記載されており、その内容全体を参考文献としてここに援用する。
【０２１７】
本発明のアンチセンスオリゴオリゴヌクレオチドを中枢神経系の細胞に投与するように意図している場合には、投与は血液脳関門を通過して主題のアンチセンスオリゴヌクレオチドの浸透を促進する１つ以上の製剤を用いて行ってもよい。注射は例えば、皮質内嗅領または海馬で行ってもよい。筋組織中の運動ニュ−ロンへのアデノウイルスベクタ−投与による神経栄養因子の送達は米国出願番号第６、６３２、４２７号「ｄｅｎｏｖｉｒａｌ−ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ」に記載されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１８】
例えば、線条体、視床、海馬、または黒質などの脳へのベクタ−の直接的送達は当分野で知られており、かつ、米国出願番号第６、７５６、５２３号「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ」に記載されており、参照により本明細書に組み入れられる。投与については急速である注射、時間をかけて緩やかな注入、または徐放性製剤の投与で行ってもよい。
【０２１９】
また、主題のアンチセンスオリゴオリゴヌクレオチは、望ましい薬剤学的または薬動力学的性質がある製剤を用いて連結または共役される。例えば、トランスフェリンレセプタ−への抗体などを血液脳関門に通過させての浸透または送達を促進するために、アンチセンスオリゴオリゴヌクレオチは当分野で公知のどんな物質にも連結することができ、かつ、静脈内注射で投与することができる。アンチセンス化合物は例えば、アンチセンス化合物をより有効になるように、および／または血液脳関門を通過するアンチセンス化合物の送達を増やすようなウイルスベクタ−と連結することができる。また、血液脳関門破壊は、限定されるものではないが、ｍｅｓｏ−エリトリト−ル、キシリト−ル、Ｄ（＋）ガラクト−ス、Ｄ（＋）ラクト−ス、Ｄ（＋）キシロ−ス、ダルシト−ル、Ｄ（＋）ミオイノシト−ル、Ｌ（−）フルクト−ス、Ｄ（−）マンニト−ル、Ｄ（＋）ブドウ糖、Ｄ（＋）アラビノ−ス、Ｄ（−）アラビノ−ス、セロビオ−ス、Ｄ（＋）マルト−ス、Ｄ（＋）ラフィノ−ス、（＋）メリビオ−ス、Ｄ（−）リボ−ス、アドニト−ル、Ｄ（＋）アラビト−ル、Ｌ（−）アラビト−ル、Ｄ（＋）フコ−ス、Ｌ（−）フコ−ス、Ｄ（−）リキソ−ス  、（＋）  リキソ−ス、およびＬ（−）リキソ−スを含む、またはアミノ酸、限定されるものではないが、グルタミン、リシン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、チロシン、バリン、およびタウリンを含む糖の注入により達成することができる。血液脳関門浸透を増強する方法と材料は米国特許番号第４、８６６、０４２号「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ」、６、２９４、５２０号「Ｍａｔｅｒｉａｌ  ｆｏｒ  ｐａｓｓａｇｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ」、および６、９３６、５８９号「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ」に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２０】
主題のアンチセンス化合物は、例えばリポソ−ム、受容体標的分子、経口、直腸、局所的または取り込み、分配および／または吸収を補助するための他の製剤として、他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合される、封入される、共役される、または関連する。例えば、カチオン脂質を、オリゴヌクレオチドの取り込みを容易にするために含めてもよい。取り込みを容易にするために示されるそのような１つの組成物はＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、  ＭＤから市販されている）である。
【０２２１】
少なくとも１つの２′−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると信じられている。局所的投与に対する薬学的組成物および製剤は、経皮的パッチ、軟膏、ロ−ション、クリ−ム、ゲル、飴、坐薬、スプレ−、液体および粉末を含む。通常の薬学的担体、水溶液、粉末または油性基剤、増粘剤、およびそれらの同等物は、必要または望ましい。コ−ティングコンド−ム、グロ−ブ等も有用である。
【０２２２】
単回投薬剤形で好都合に提供されてもよい本発明の薬学的製剤は、製薬業界で周知の従来の技術に基づいて調合してもよい。そのような技術は薬学的担体または賦形剤と活性成分を結合させる工程を含む。一般に、製剤は液体担体もしくは微粉砕固体担体またはその両方を本活性化合物と均一かつ十分に組み合わせ、次に必要に応じて生成物を成形することにより製造される。
【０２２３】
本発明の組成物は、限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐剤、および浣腸剤などの多数の可能な投薬形態のうち任意のものに製剤化することができる。本発明の組成物は水性、非水性、または混合媒質中の懸濁剤としても製剤化することができる。水性懸濁剤は例えば、カルボキシメチルセルロ−スナトリウム、ソルビト−ル、および／またはデキストランを含有する懸濁剤の粘度を増加させる物質をさらに含んでもよい。懸濁剤は安定化剤を含んでもよい。
【０２２４】
本発明の薬学的組成物は、これに限定されるものではないが、溶液、乳濁剤、発泡剤、およびリポソ−ム含有製剤を含む。本発明の薬学的組成物および製剤は１以上の浸透増強剤、担体、賦形剤、または他の活性または不活性成分を有する。
【０２２５】
典型的には、乳濁剤が通常は直径０．１μｍを超える小滴の形で他方の流体に分散している流体の不均質な系である。乳濁剤は分散した相の外に追加の成分、および水相、油相または分離した相として存在してもよい実薬を含んでもよい。マイクロエマルジョンは本発明の実施形態として含まれる。乳濁剤とその用途は当分野で周知であり、米国特許番号第６、２８７、８６０号に詳細に記載されている。
【０２２６】
本発明の製剤はリポソ−ム製剤を含む。本発明において使用される用語「リポソ−ム」は球状二重膜（単数、または複数）に配置された両親媒性脂質からなる小胞を意味する。リポソ−ムは親油性物質および送達すべき組成物を含む水性内部媒体からなる膜を持つ単層または多層の小胞である。カチオン性リポソ−ムは安定な複合体を形成するために負に荷電されたＤＮＡ分子と相互作用すると考えられる正に荷電されたリポソ−ムである。ｐＨ感受性または負に荷電されたリポソ−ムは複合体を形成するよりもＤＮＡを集めると考えられる。カチオン性と非カチオン性リポソ−ムの両方が細胞へＤＮＡを送達するのに用いられている。
【０２２７】
また、リポソ−ムは「立体的安定化」リポソ−ムを含み、この用語は本明細書で使用するとき１つ以上の特殊化脂質を含むリポソ−ムを言う。リポソ−ムに組込まれる場合、これらの特殊化脂質は特殊化脂質が欠損したリポソ−ムに比べて増強された循環時間のリポソ−ムを生む。立体的安定化リポソ−ムの例は、リポソ−ムの小胞を形成している脂質部分の部分が１つ以上の糖脂質を含み、あるいはリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）部分などの１つ以上の親水性ポリマ−で誘導されているリポソ−ムである。リポソ−ムとその用途は米国特許番号第６、２８７、８６０号に詳細に記載されている。
【０２２８】
さらに、本発明の薬学的製剤および化合物は界面活性剤を含む。医薬品の中での界面活性剤、製剤および乳濁剤中での使用は当分野において周知である。界面活性剤およびその用途の例は米国特許番号第６、２８７、８６０号に詳細に記載されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２２９】
一実施形態において、本発明は核酸、特にオリゴヌクレオチドの効率的送達をさせるために種々の膜透過性促進剤を使用する。細胞膜を横切っての非親油性薬剤の拡散に加えて、膜透過性促進剤は親油性薬剤の透過性を増強をもする。膜透過性促進剤は５つの大分類、つまり、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレ−ト化剤、および非キレ−ト化ノン−サ−ファクタントの１つに属すると分類できる。膜透過性促進剤およびその用途の例は米国特許番号第６、２８７、８６０号に詳細に記載されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２３０】
当業者であれば製剤が意図した用途、つまり、投与経路に基づいて通常通り設計されたことを認識するであろう。
【０２３１】
局所投与に対しての製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが脂質、リポソ−ム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレ−ト化剤および界面活性剤などの局所的運搬因子と混合される処方を含む。脂質およびリポソ−ムは、中性（例えば、ジオレオイルフォスファチジルＤＯＰＥエタノ−ルアミン、ジミリストイルフォスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルフォスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルフォスファチジルグリセロ−ルＤＭＰＧ）、およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルフォスファチジルエタノ−ルアミンＤＯＴＭＡ）を含む。
【０２３２】
局所的または他の投与する場合、本発明のオリゴヌクレオチドをリポソ−ム中に封入してもよく、または、特にカチオン性リポソ−ムに対して複合体を形成してもよい。また、オリゴヌクレオチドは特にカチオン性リポソ−ムに対して脂質に複合体化してもよい。脂肪酸及びこれらのエステル、その薬学的に許容される塩、およびこれらの用途は米国特許番号第６、２８７、８６０号に詳細に記載されている。
【０２３３】
経口投与に対する組成物および製剤は、粉末または顆粒、微粒子、ナノ粒子、水または非水溶性溶媒における懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、小袋、錠剤または微小錠剤を含む。増粘剤、香料添加物、希釈剤、乳濁剤、分散補助剤、または結合剤は望ましい。経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが１以上の浸透増強剤、界面活性剤、キレ−ト化剤との組み合わせで投与される製剤である。界面活性剤は脂肪酸および／またはエステルまたはそれらの塩類、胆汁酸および／またはその塩を含む。胆汁酸／塩類および脂肪酸およびそれらの使用はさらに米国特許番号第６、２８７、８６０号に記載されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２３４】
さらには例えば、胆汁酸／塩との組み合わせでの脂肪酸／塩類などの浸透増強剤の組み合わせである。特に組み合わせは、ラウリル酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。更なる浸透増強剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエ−テル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエ−テルを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒状形態で、または微小顆粒またはナノ顆粒を形成するような複合体で経口的に送達される。オリゴヌクレオチド複合体因子およびそれらの用途はさらに、米国特許番号第６、２８７、８６０号に記載されており、参照により本明細書に組み入れられる。非経口、髄腔内、または脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝液、希釈剤、ならびに浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容できる担体または賦形剤を非限定的な例とする他の適切な添加剤もまた含有しうる滅菌水溶液を含んでもよい。
【０２３５】
本発明のある態様は、一つ以上の化合物と非アンチセンスメカニズムにより機能する一つ以上の化学療法剤を含む薬学的組成物を提供する。当該化学療法剤の例には、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、サイトシンアラビノシド、ビス−フルオロエチル−ニトロソ尿素、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア、ナイトロジェンマスタ−ド、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザ−シチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシピロキシ−シクロ−ホスホラミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサ−ト（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソ−ル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサ−ト、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロ−ル（ＤＥＳ）などの癌化学療法剤が含まれるが、それに限定されるわけではない。本発明の化合物を使用する場合には、そのような化学療法剤は個別に（例えば、５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド）、逐次的に（例えば、或る期間の５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド後、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド）、または１つ以上の他の化学療法剤と組み合わせ（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド、あるいは５−ＦＵ、放射線治療およびオリゴヌクレオチド）で使用してもよい。非ステロイド系抗炎症薬および副腎皮質ステロイド薬を非限定的に含めた抗炎症薬、ならびにリビビリン、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビルを非限定的に含めた抗ウイルス薬もまた本発明の組成物と組み合わせることができる。アンチセンス化合物と他の非アンチセンス薬との組み合せもまた本発明の範囲内に属する。二つまたはそれ以上の組み合わされた化合物を一緒にまたは連続的に使用してもよい。
【０２３６】
別の関連する実施例において、本発明の組成物は第一の核酸を標的とした１つ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第二の核酸標的を標的とした１つ以上の追加的アンチセンス化合物を含んでもよい。例えば、第１の標的はサ−チュイン（ＳＩＲＴ）の特定のアンチセンス配列で、かつ、第２の標的は別のヌクレオチド配列に由来する領域であってよい。または、本発明の組成物は同じサ−チュイン（ＳＩＲＴ）核酸標的の異なる領域を標的とした２つ以上のアンチセンス化合物を含んでもよい。アンチセンス化合物の多くの実施例は本明細書中で図示したが、他の例は当分野で公知の適切な化合物から選択してもよい。二つまたはそれ以上の組み合わされた化合物を一緒にまたは連続的に使用してもよい。
【０２３７】
用量
薬学的組成物の製剤およびそれに続く投与（用量）は、本分野の当業者の範囲内であると信じられている。用量は、何日から何ヶ月にも亘る治療の経過での、または治療が効果を表すまたは前記病状の減少が達成されるまでの、治療される病状の重症度および反応性に依存する。最適投薬スケジュ−ルは、患者の体内における薬剤蓄積の測定から計算することができる。当業者は最適用量、投薬方法論、および反復率を間単に決定できる。最適な用量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的有効性に依存して変更され、一般的にインビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であると見出されたＥＣ５０に基づいて推定することができる。一般的に、用量は０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重であり、１日、１週間、１ヵ月、または１年に１回以上、または２年から２０年に１回投与される。本分野の当業者は、体液または組織における前記薬剤の測定滞留時間および濃度に基づいて投薬の反復率を簡単に推定できる。成功した治療に続いて患者が病状の再発を予防するための維持治療を受けることが望ましく、前記オリゴヌクレオチドは０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲で１日に１回以上から２０年に１回の維持用量で投与される。
【０２３８】
実施形態において、患者は少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００ｍｇ体重の薬用量で治療される。アンチセンスオリゴヌクレオチドの或る注射用量がは米国特許番号第７、５６３、８８４号「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＴＰ１Ｂ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３９】
上記に記載された本発明の様々な実施形態を説明したが、これらは例示するために示されたものであって、限定することを目的としたものではない。開示されている実施形態に対する様々な改変を本明細書の開示に従って、本発明の精神または範囲から逸脱することなしに行うことができる。したがって、本発明の間口および範囲は上述の実施形態のいずれかによって限定されるべきではない。
【０２４０】
本明細書の中で挙げられたすべての文書は引用により全体で本明細書の中に組み込まれている。本出願で引用されたすべての刊行物および特許書類が個々の特許出願または特許書類においてそれぞれ記載されているものと同じ限度で全ての目的のためにその参照により組み入れられる。本書類における参照文献の引用により、出願人はいかなる引用が従来技術となることは認めない。本発明の組成物および方法についての実施形態をを以下の実施例において説明する。
【０２４１】
実施例
以下の非限定的な例は発明の選択された実施態様を説明するために役立つ。比率の変化および示された成分要素における代替は当業者に自明であり、かつ、本発明の実施形態の範囲内に含まれることが認識される。
【０２４２】
実施例１：サ−チュイン（ＳＩＲＴ）および／またはサ−チュイン（ＳＩＲＴ）ポリヌクレオチドのセンス鎖に対する核酸分子アンチセンスに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計
上記のように、「特異的なオリゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド標的」は、（ｉ）標的遺伝子の部分と安定な複合体を形成可能な、または、（ｉｉ）標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物の部分と安定な二本鎖を形成が可能な配列を有するオリゴヌクレオチドを言う。
【０２４３】
適当なオリゴヌクレオチドの選択は核酸配列を自動的に整列させ、かつ、同一性または相同性の領域を示すコンピュ−タプログラムを用いることで容易になる。そのようなプログラムは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋなどのデ−タベ−スの検索またはＰＣＲ産物の配列により得られた核酸配列を比較するのに使用する。種の範囲からの核酸配列の比較により、種の間の同一性について適当な程度に示す核酸配列の選択を可能にする。配列されていない遺伝子の場合は、サザンブロットを実施することで標的種および他の種における遺伝子間の同一性の程度の決定が可能となる。当分野で周知のであるストリンジェンシ−の程度の様々な段階でサザンブロットを実施することで、同一性の大体の基準を取得することができる。これらの方法により、制御対象の被験体において標的核酸配列に対して高度の相補性を示し、かつ、他の種において対応する核酸配列に対する低度の相補性を示すオリゴヌクレオチドの選択をすることができる。本発明において使用する遺伝子の適切な領域を選択ではかなりの自由があることは、当業者であれば自明であろう。
【０２４４】
アンチセンス化合物は、標的核酸への化合物の結合が標的核酸の正常機能を干渉し機能および／または活性の調節を起こす場合、および、特異的な結合が望ましい条件下、すなわちインビボアッセイまたは治療上処置における生理学条件下、およびインビトロアッセイの場合にアッセイを実行する条件下で前記アンチセンス化合物の非標的核酸配列への非特異的結合を避けるのに十分な程度に相補的である場合、「特異的にハイブリダイズ可能」である。
【０２４５】
本明細書に記載されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼ−ション特性を当分野で周知の１つ以上のインビトロアッセイにより決定することができる。例えば、本明細書に記載されたオリゴヌクレオチドの特性は、融解曲線アッセイを用いて標的天然アンチセンスと潜在的な薬物分子との間の結合力を決定することで得ることができる。
【０２４６】
標的天然アンチセンスと潜在的な薬物分子（以下、Ｍｏｌｒｃｕｌｒｅ）との間の結合力を、分子間相互作用の力を計測する確立した方法、例えば、融解曲線アッセイを用いて推定することができる。
【０２４７】
融解曲線アッセイは天然アンチセンス／Ｍｏｌｒｃｕｌｒｅについて二本鎖から一本鎖立体配座への急速な移行が起こる温度を決定する。２つの分子間の相互作用強度の信頼のおける指標として、この温度は広く受け入れられている。
【０２４８】
Ｍｏｌｒｃｕｌｒｅの結合部位に対応する実際の天然アンチセンスＲＮＡ分子または合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のｃＤＮＡコピ−を用いて融解曲線アッセイを実施することができる。このアッセイを実施するのに必要な全ての試薬を含む複数のキット（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．  ＭｅｌｔＤｏｃｔｏｒ  ｋｉｔ）が市販されている。これらのキットは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）結合色素（ＡＢＩ  ＨＲＭ色素、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ等など）の１つを含有する好適な緩衝液を含む。ｄｓＤＮＡ色素の特性は遊離形態で蛍光をほとんど発しないが、しかし、ｄｓＤＮＡと結合した場合には高度に蛍光することである。
【０２４９】
アッセイを実施するためには、ｃＤＮＡまたは対応するオリゴヌクレオチドは特定の製造業者のプロトコ−ルに従った濃度でのＭｏｌｒｃｕｌｒｅと混合する。予め形成しておいたｄｓＤＮＡ複合体すべてを解離させるために、混合物を９５℃に加熱し、徐々に室温、またはキットの製造業者が定義したより低い温度まで冷却して、ＤＮＡ分子をアニ−ルした。次に、反応により生成された蛍光の量デ−タの同時連続収集を用いて、新しく作られた複合体を徐々に９５℃まで加熱した。蛍光強度は反応中に存在するｄｓＤＮＡの量と反比例する。デ−タをキットと互換性のあるリアルタイムＰＣＲ装置（例えば、ＡＢＩ′ｓ  ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ＳｙｓｔｅｍまたはＬｉｇｈｔＴｙｐｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、  Ｌｅｗｅｓ、  ＵＫ）を使って収集することができる。
【０２５０】
融解ピ−クは適切なソフトウエア（例えば、ＬｉｇｈｔＴｙｐｅｒ  （Ｒｏｃｈｅ）またはＳＤＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｃｕｒｖｅ、  ＡＢＩ）を用いて温度（Ｘ軸）に対する温度（−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄＴ）に関する蛍光のマイナスの導関数をプロットすることで作られる。デ−タをｄｓＤＮＡ複合体から一本鎖分子への急速な移行の温度を同定するために解析する。この温度はＴｍと呼ばれ、２つの分子間の相互作用の強度に正比例する。典型的には、Ｔｍは４０℃を超える。
【０２５１】
実施例２  ＳＩＲＴポリヌクレオチドの調節
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＨｅｐＧ２細胞の投与
ＡＴＣＣ（ｃａｔ＃  ＨＢ−８０６５）由来のＨｅｐＣ２細胞を増殖培地（ＭＥＭ／ＥＢＳＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｃａｔ  ＃ＳＨ３００２４、またはＭｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ  ＃  ＭＴ−１０−０１０−ＣＶ）＋１０％ＦＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃  ＭＴ３５−  ０１１−ＣＶ）＋ペニシリン／ストレプトマイチン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃  ＭＴ３０−００２−ＣＩ））の中で３７度と５％ＣＯ２で増殖させた。実験の１日前に、６ウェルプレ−トに１．５ｘ１０５／ｍｌの密度でリプレ−ティングしたあと、３７度と５％ＣＯ２でインキュベ−トしておいた。実験の当日に、６ウェルプレ−ト上の培地を新しい増殖培地に代えた。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを２０μＭの濃度に希釈した。この溶液の２μｌを４０００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃３１９８５−０７０）および４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃  １１６６８０１９）を用いて室温で２０分間インキュベ−トしてから、ＨｅｐＣ２細胞を持つ６ウェルプレ−トの各ウエルに塗布した。オリゴヌクレオチドに代えて２μｌの水を含む同様の混合液をモックトランスフェクトされた対照に使用した。３７度と５％ＣＯ２で３〜１８時間インキュベ−トした後に、培地を新しい増殖培地に代えた。アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入から４８時間後に培地を除去し、続けて、製造業者の指示書に従い、Ｐｒｏｍｅｇａ（ｃａｔ  ＃  Ｚ３１０５）製造のＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍまたはＱｉａｇｅｎ（ｃａｔ＃  ７４１８１）製造のＲＮｅａｓｙ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてＲＮＡを細胞から抽出した。製造業者のプロトコ−ルの記載に従いＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  （ｃａｔ＃ＡＢ１４５３Ｂ）製造のＶｅｒｓｏ  ｃＤＮＡ  ｋｉｔまたは  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ｃａｔ＃  ４３６８８１３）を用いて、６００ｎｇのＲＮＡを実施している逆転写反応に添加した。ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｉｘ（ｃａｔ＃４３６９５１０）およびＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ製造のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ：  Ｈｓ００２０２０２１＿ｍ１、  Ｈｓ００２０２０３０＿ｍ１および  Ｈｓ００２１３０３６＿ｍ１）により設計されたプライマ−／プロ−ブを用いて、逆転写反応からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法で遺伝子発現をモニタ−するのに使用した。ＰＣＲサイクルはＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて５０℃で２分、９５℃で１０分、（９５℃で１５秒、６０℃で１分）の４０サイクルを使用した。
【０２５２】
投与されたサンプルとモックトランスフェクトされたサンプル間の１８Ｓ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｄＣｔ  ｖａｌｕｅｓ  の差異に基づいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後の遺伝子の倍数変化を計算した。
【０２５３】
結果
リアルタイムＰＣＲの結果はＨｅｐＧ２細胞のＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルがＳＩＲＴ１アンチセンスＣＶ３９６２００に対してアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与４８時間後において有意に増加したことを示す（図３および４）。
【０２５４】
アルタイムＰＣＲの結果はＨｅｐＧ２細胞のＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルがＳＩＲＴ１アンチセンスＣＶ３９６２００に対して設計された１つのオリゴヌクレオチドにおいて有意に増加したことを示す（図８）。
【０２５５】
アルタイムＰＣＲの結果はＨｅｐＧ２細胞のＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルがＳＩＲＴ１アンチセンスＣＶ４２８２７５に対して設計された２つのオリゴヌクレオチドにおいて有意に増加したことを示す（図９）。
【０２５６】
この結果はＳＩＲＴアンチセンスＢＥ７１７４５３に対して設計された１つのオリゴヌクレオチドの投与４８時間後においてＨｅｐＧ２細胞のＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルの有意な増加を示す（図１０）。
【０２５７】
この結果はＳＩＲＴ１アンチセンスＡＶ１８８１２に対して設計されたオリゴヌクレオチドの内の３つの投与４８時間後においてＨｅｐＧ２細胞のＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが個々に有意に増加したことを示す（図１１）。
【０２５８】
リアルタイムＰＣＲの結果はＳＩＲＴ１アンチセンスＡＷ１６９９５８に対して設計されたオリゴの内の２つの投与４８時間後においてＨｅｐＧ２細胞のＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルの有意な増加を示す（図１２）。
【０２５９】
ＲＴ  ＰＣＲの結果はＨｅｐＧ２細胞のｓｉｒｔ３レベルがｓｉｒｔ３アンチセンスＨｓ．６８３１１７（ＣＵＲ−１５４５−１５５０）に対して設計されたホスホロチオエ−トアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与４８時間後において増加したことを示す（図１７）。
【０２６０】
リアルタイムＰＣＲの結果はＳＩＲＴ６アンチセンスＮＭ  １３３４７５に対して設計されたオリゴの内の１つの投与４８時間後においてＨｅｐＧ２細胞のＳＩＲＴ６のレベルが有意に増加したことを示す（図１８）
【０２６１】
リアルタイムＰＣＲの結果はＳＩＲＴ６アンチセンスｂｆ７７２６６２に対して設計されたオリゴの内の１つの投与４８時間後においてＨｅｐＧ２細胞のＳＩＲＴ６のレベルが有意に増加したことを示す（図１９）。
【０２６２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた３Ｔ３細胞の投与
ＡＴＣＣ（ｃａｔ＃  ＣＲＬ−１６５８）由来の３ＴＣが増殖培地（ＭＥＭ／ＥＢＳＳ  （Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｃａｔ  ＃ＳＨ３００２４、またはＭｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ  ＃  ＭＴ−１０−０１０−ＣＶ）＋１０％ＦＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃  ＭＴ３５−  ０１１−ＣＶ）＋ペニシリン／ストレプトマイチン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃  ＭＴ３０−００２−ＣＩ））の中で３７度と５％ＣＯ２で増殖させた。実験の１日前に６ウェルプレ−トに１．５ｘ１０５／ｍｌの密度でリプレ−ティングしたあと、３７度と５％ＣＯ２でインキュベ−トしておいた。実験の当日に６ウェルプレ−ト上の培地を新しい増殖培地に代えた。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを２０μＭの濃度に希釈した。この溶液の２μｌを４００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃３１９８５−０７０）および４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃  １１６６８０１９）を用いて室温で２０分間インキュベ−トしてから、３Ｔ３細胞を持つ６ウェルプレ−トの各ウエルに塗布した。オリゴヌクレオチドに代えて２μｌの水を含む同様の混合液をモックトランスフェクトされた対照に使用した。３７度と５％ＣＯ２で３〜１８時間インキュベ−トした後に、培地を新しい増殖培地に代えた。アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入から４８時間後に培地を除去し、続けて、製造業者の指示書に従い、Ｐｒｏｍｅｇａ（ｃａｔ  ＃  Ｚ３１０５）製造のＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍまたはＱｉａｇｅｎ（ｃａｔ＃  ７４１８１）製造のＲＮｅａｓｙ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてＲＮＡを細胞から抽出した。製造業者のプロトコ−ルの記載に従いＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  （ｃａｔ＃ＡＢ１４５３Ｂ）製造のＶｅｒｓｏ  ｃＤＮＡ  ｋｉｔまたは  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ｃａｔ＃  ４３６８８１３）を用いて、６００ｎｇのＲＮＡを実施している逆転写反応に添加した。ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｉｘ（ｃａｔ＃４３６９５１０）およびＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ製造のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ：  Ｈｓ００２０２０２１＿ｍ１）により設計されたプライマ−／プロ−ブを用いて、逆転写反応からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法で遺伝子発現をモニタ−するのに使用した。ＰＣＲサイクルはＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて５０℃で２分、９５℃で１０分、（９５℃で１５秒、６０℃で１分）の４０サイクルを使用した。
【０２６３】
投与されたサンプルとモックトランスフェクトされたサンプル間の１８Ｓ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｄＣｔ  ｖａｌｕｅｓ  の差異に基づいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後の遺伝子の倍数変化を計算した。
【０２６４】
結果
リアルタイムＰＣＲの結果はＳＩＲＴ１マウスアンチセンスＡＫ０４４６０４に対して設計されたオリゴヌクレオチドの内の３つの投与４８時間後にＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが３Ｔ３細胞において有意に増加したことを示す（図１３）。
【０２６５】
リアルタイムＰＣＲの結果はＳＩＲＴ１マウスアンチセンスＡＫ０４４６０４に対して設計されたオリゴヌクレオチドの内の５つの投与４８時間後にＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが３Ｔ３細胞において有意に増加したことを示す（図１４）。
【０２６６】
リアルタイムＰＣＲの結果はＳＩＲＴ１マウスアンチセンスＡＫ０４４６０４に対して設計されたオリゴヌクレオチドの内の２つの投与４８時間後にＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが３Ｔ３細胞において有意に増加したことを示す（図１５）。
【０２６７】
リアルタイムＰＣＲの結果はＳＩＲＴ１マウスアンチセンスＡＫ０４４６０４に対して設計されたオリゴヌクレオチドの内の２つの投与４８時間後にＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが３Ｔ３細胞において有意に増加したことを示す（図１６）。
【０２６８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＶｅｒｏ７６細胞の投与
ＡＴＣＣ（ｃａｔ＃  ＣＲＬ−１５８７）由来のＶｅｒｏ７６増殖培地（ＭＥＭ／ＥＢＳＳ  （Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｃａｔ  ＃ＳＨ３００２４、またはＭｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ  ＃  ＭＴ−１０−０１０−ＣＶ）＋１０％ＦＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃  ＭＴ３５−  ０１１−ＣＶ）＋ペニシリン／ストレプトマイチン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃  ＭＴ３０−００２−ＣＩ））の中で３７度と５％ＣＯ２で増殖させた。実験の１日前に、６ウェルプレ−トに１．５ｘ１０５／ｍｌの密度でリプレ−ティングしたあと、３７度と５％ＣＯ２でインキュベ−トしておいた。実験の当日に、６ウェルプレ−ト上の培地を新しい増殖培地に代えた。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを水中で２０μＭの濃度に希釈した。この溶液の２μｌを４００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃３１９８５−０７０）および４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃  １１６６８０１９）を用いて室温で２０分間インキュベ−トしてから、Ｖｅｒｏ細胞を持つ６ウェルプレ−トの各ウエルに塗布した。オリゴヌクレオチドに代えて２μｌの水を含む同様の混合液をモックトランスフェクトされた対照に使用した。３７度と５％ＣＯ２で３〜１８時間インキュベ−トした後に、培地を新しい増殖培地に代えた。アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入から４８時間後に培地を除去し、続けて、製造業者の指示書に従い、Ｐｒｏｍｅｇａ（ｃａｔ  ＃  Ｚ３１０５）製造のＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍまたはＱｉａｇｅｎ（ｃａｔ＃  ７４１８１）製造のＲＮｅａｓｙ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてＲＮＡを細胞から抽出した。製造業者のプロトコ−ルの記載に従いＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  （ｃａｔ＃ＡＢ１４５３Ｂ）製造のＶｅｒｓｏ  ｃＤＮＡ  ｋｉｔを用いて、６００ｎｇのＲＮＡを実施している逆転写反応に添加した。ＢＩ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｉｘ（ｃａｔ＃４３６９５１０）およびＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ製造のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ：  Ｈｓ００２０２０２１＿ｍ１）により設計されたプライマ−／プロ−ブを用いて、逆転写反応からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法で遺伝子発現をモニタ−するのに使用した。ＰＣＲサイクルはＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた５０℃で２分、９５℃で１０分、（９５℃で１５秒、６０℃で１分）の４０サイクルを使用した。投与されたサンプルとモックトランスフェクトされたサンプル間の１８Ｓ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｄＣｔ  ｖａｌｕｅｓ  の差異に基づいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後の遺伝子の倍数変化を計算した。
結果：リアルタイムＰＣＲの結果はＶｅｒｏ細胞のＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルがＳＩＲＴ１アンチセンスＣＶ３９６２００に対してアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与４８時間後において有意に増加したことを示す（図５）。
【０２６９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＤＢＳ細胞の投与
ＡＴＣＣ（ｃａｔ＃  ＣＣＬ−１６１）由来のＤＢＳ増殖培地（ＭＥＭ／ＥＢＳＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｃａｔ  ＃ＳＨ３００２４、またはＭｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ  ＃  ＭＴ−１０−０１０−ＣＶ）＋１０％ＦＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃  ＭＴ３５−  ０１１−ＣＶ）＋ペニシリン／ストレプトマイチン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃  ＭＴ３０−００２−ＣＩ））の中で３７度と５％ＣＯ２で増殖させた。実験の１日前に、６ウェルプレ−トに１．５ｘ１０５／ｍｌの密度でリプレ−ティングしたあと、３７度と５％ＣＯ２でインキュベ−トしておいた。実験の当日に、６ウェルプレ−ト上の培地を新しい増殖培地に代えた。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを２０μＭの濃度に希釈した。この溶液の２μｌを４００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃３１９８５−０７０）および４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃  １１６６８０１９）を用いて室温で２０分間インキュベ−トしてから、３Ｔ３細胞を持つ６ウェルプレ−トの各ウエルに塗布した。オリゴヌクレオチドに代えて２μｌの水を含む同様の混合液をモックトランスフェクトされた対照に使用した。３７度と５％ＣＯ２で３〜１８時間インキュベ−トした後に、培地を新しい増殖培地に代えた。アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入から４８時間後に培地を除去し、続けて、製造業者の指示書に従いＰｒｏｍｅｇａ（ｃａｔ  ＃  Ｚ３１０５）製造のＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍまたはＱｉａｇｅｎ（ｃａｔ＃  ７４１８１）製造のＲＮｅａｓｙ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてＲＮＡを細胞から抽出した。製造業者のプロトコ−ルの記載に従いＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  （ｃａｔ＃ＡＢ１４５３Ｂ）製造のＶｅｒｓｏ  ｃＤＮＡ  ｋｉｔまたは  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｃａｔ＃  ４３６８８１３）を用いて６００ｎｇのＲＮＡを実施している逆転写反応に添加した。ＢＩ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｉｘ（ｃａｔ＃４３６９５１０）およびＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ製造のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ：  Ｈｓ００２１３０３６＿ｍ１）により設計されたプライマ−／プロ−ブを用いて逆転写反応からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法で遺伝子発現をモニタ−するのに使用した。ＰＣＲサイクルはＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた５０℃で２分、９５℃で１０分、（９５℃で１５秒、６０℃で１分）の４０サイクルを使用した。
【０２７０】
投与されたサンプルとモックトランスフェクトされたサンプル間の１８Ｓ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｄＣｔ  ｖａｌｕｅｓ  の差異に基づいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後の遺伝子の倍数変化を計算した。
結果：リアルタイムＰＣＲの結果はＳＩＲＴ６アンチセンスｂｆ７７２６６２に対して設計されたオリゴの内の２つおよび、およびＮＭ＿１３３４７５に対して設計された１つのオリゴの投与４８時間後においてＤＢＳ細胞のＳＩＲＴ６のレベルが有意に増加したことを示す（図２０）。
【０２７１】
実施例３：ＳＩＲＴ遺伝子発現の調節
材料および方法
裸のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＨｅｐＧ２細胞の投与
ＡＴＣＣ（ｃａｔ＃  ＨＢ−８０６５）由来のＨｅｐＣ２細胞を増殖培地（ＭＥＭ／ＥＢＳＳ  （Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｃａｔ  ＃ＳＨ３００２４、またはＭｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ  ＃  ＭＴ−１０−０１０−ＣＶ）＋１０％ＦＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃  ＭＴ３５−  ０１１−ＣＶ）＋ペニシリン／ストレプトマイチン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ｃａｔ＃  ＭＴ３０−００２−ＣＩ））の中で３７度と５％ＣＯ２で増殖させた。実験の１日前に６ウェルプレ−トに１．５ｘ１０５／ｍｌ  の密度でリプレ−ティングしたあと、３７度と５％ＣＯ２でインキュベ−トしておいた。実験の当日に６ウェルプレ−ト上の培地を新しい増殖培地の１．５ｍｌ／ウエルで置換えた。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを水中で２０μＭの濃度に希釈した。この溶液の２μｌを４００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃３１９８５−０７０）および４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃  １１６６８０１９）を用いて室温で２０分間インキュベ−トしてから、ＨｅｐＧ２細胞を持つ６ウェルプレ−トの各ウエルに塗布した。オリゴヌクレオチドに代えて２μｌの水を含む同様の混合液をモックトランスフェクトされた対照に使用した。３７度と５％ＣＯ２で３〜１８時間インキュベ−トした後に培地を新しい増殖培地に代えた。アンチセンスオリゴヌクレオチド導入７２時間後、上述したように細胞を再投与した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与から４８時間後に培地を除去し、続けて、製造業者の指示書に従いＰｒｏｍｅｇａ（ｃａｔ  ＃  Ｚ３１０５）製造のＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍまたはＱｉａｇｅｎ（ｃａｔ＃  ７４１８１）製造のＲＮｅａｓｙ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてＲＮＡを細胞から抽出した。製造業者のプロトコ−ルの記載に従いＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  （ｃａｔ＃ＡＢ１４５３Ｂ）製造のＶｅｒｓｏ  ｃＤＮＡ  ｋｉｔを用いて６００ｎｇのＲＮＡを実施している逆転写反応に添加したＢＩ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｉｘ（ｃａｔ＃４３６９５１０）およびＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ製造のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ：Ｈｓ００２０２０２１＿ｍ１、  Ｈｓ００２０２０３０＿ｍ１  ａｎｄ  Ｈｓ００２１３０３６＿ｍ１）により設計されたプライマ−／プロ−ブを用いて逆転写反応からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法で遺伝子発現をモニタ−するのに使用した。ＰＣＲサイクルはＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた５０℃で２分、９５℃で１０分、（９５℃で１５秒、６０℃で１分）の４０サイクルを使用した。投与されたサンプルとモックトランスフェクトされたサンプル間の１８Ｓ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｄＣｔ  ｖａｌｕｅｓ  の差異に基づいてアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後の遺伝子の倍数変化を計算した。
【０２７２】
特注設計されたｅｘｏｎ４のＴａｑｍａｎアッセイを目指すプライマ−およびプロ−ブ。ＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＴＧＴＣＴＧＴＴＴＣＡ（配列番号９５）、ＳＩＲＴ１天然のアンチセンスＣＶ３９６２００。
フォワ−ドプライマ−配列、ＣＣＡＴＣＡＧＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣＡＡＡ（配列番号９６）
リバ−スプライマ−配列、ＡＣＡＴＴＡＴＡＴＣＡＴＡＧＣＴＣＣＴＡＡＡＧＧＡＧＡＴＧＣＡ（配列番号９７）
リポ−タ−配列、ＣＡＧＡＧＴＴＴＣＡＡＴＴＣＣＣ（配列番号９８）
【０２７３】
結果
この結果はｓｉｒｔａｓ（ｓｉｒｔａｓ＿５、  Ｐ＝０．０１）に対して設計されたｓｉＲＮＡｓの内の１つの投与４８時間後においてＨｅｐＧ２細胞のＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルが個々に有意に増加したことを示す。同じサンプルにおいてｓｉｒｔａｓ＿５投与後にｓｉｒｔａｓＲＮＡのレベルは有意に減少したが、しかしｓｉｒｔａｓ＿６およびｓｉｒｔａｓ＿７投与後には変化がなく、これらはＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡのレベルに作用しない（図２）。ｓｉｒｔａｓ＿５、ｓｉｒｔａｓ＿６およびｓｉｒｔａｓ＿７は配列番号３９、３９および４０にそれぞれ対応する。
【０２７４】
初代サル肝細胞の投与
初代サル肝細胞をＲｘＧｅｎ  Ｉｎｃ．による培養に導入し６ウェルプレ−トにプレ−ティングした。以下のようにしてオリゴヌクレオチドで投与した。６ウェルプレ−ト上の培地を５％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、４ｕｇ／ｍｌインシュリン、１ｕＭデキサメタゾン、１０ｕｇ／ｍｌ  Ｆｕｎｇｉｎ（ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ、  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を補充したＷｉｌｌｉａｍ′ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ（Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ＃Ｗ４１２８）から成る新しい増殖培地に代えた。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを２０μＭの濃度に希釈した。この溶液の２μｌを４００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃３１９８５−０７０）および４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃  １１６６８０１９）を用いて室温で２０分間インキュベ−トしてから、細胞を持つ６ウェルプレ−トの各ウエルに塗布した。オリゴヌクレオチドに代えて２μｌの水を含む同様の混合液をモックトランスフェクトされた対照に使用した。３７度と５％ＣＯ２で３〜１８時間インキュベ−トした後に、培地を新しい増殖培地に代えた。アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入から４８時間後に培地を除去し、続けて、製造業者の指示書に従い、Ｐｒｏｍｅｇａ（ｃａｔ  ＃  Ｚ３１０５）製造のＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍまたはＱｉａｇｅｎ（ｃａｔ＃  ７４１８１）製造のＲＮｅａｓｙ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてＲＮＡを細胞から抽出した。製造業者のプロトコ−ルの記載に従いＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ｃａｔ＃ＡＢ１４５３Ｂ）製造のＶｅｒｓｏ  ｃＤＮＡ  ｋｉｔを用いて６００ｎｇのＲＮＡを実施している逆転写反応に添加した。ＢＩ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｉｘ（ｃａｔ＃４３６９５１０）およびＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ製造のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ：Ｈｓ００２０２０２１＿ｍ１、  Ｈｓ００２０２０３０＿ｍ１  ａｎｄ  Ｈｓ００２１３０３６＿ｍ１）により設計されたプライマ−／プロ−ブを用いて逆転写反応からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法で遺伝子発現をモニタ−するのに使用した。ＰＣＲサイクルはＭｘ４０００サ−マルサイクラ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて５０℃で２分、９５℃で１０分、（９５℃で１５秒、６０℃で１分）の４０サイクルを使用した。投与されたサンプルとモックトランスフェクトされたサンプル間の１８Ｓ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｄＣｔ  ｖａｌｕｅｓ  の差異に基づいてアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後の遺伝子の倍数変化を計算した。
結果  結果を図７に示した。リアルタイムＰＣＲの結果はＳＩＲＴ１ＳＩＲＴ１アンチセンスに対してオリゴヌクレオチドの投与後においてｍＲＮＡのレベルの増加を示した。
【０２７５】
実施例４：アフリカミドリザルにおけるＣＵＲ９６３の有効性および行動研究の期間
本研究の目的はヒト以外の霊長類モデルにおける静脈内投与したのちのＳＩＲＴ１遺伝子を制御する不一致の非コ−ド化アンチセンス配列のアンチセンスノックダウンの効果を評価し比較することであった。ＳＩＲＴ１調節配列を阻害するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド被験物質はＣＵＲ９６３と指定する。
ＣＵＲ  ９６３：  ＋Ｇ＊＋Ｔ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｇ＊＋Ａ＊＋Ｇ＊＋Ａ（配列番号３４）
ＣＵＲ  ９６２（対照）：  ＋Ｇ＊＋Ｃ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊＋Ｔ＊＋Ｔ＊＋Ｇ（配列番号９９）
【０２７６】
規制試験指針
受け入れられる毒性学的基本原則に従い、医薬品規制ハ−モナイゼ−ション（ＩＣＨ）Ｈａｒｍｏｎｉｚｅｄ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  （Ｎｏｎ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｄｕｃｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＩＣＨ  Ｍ３（ｍ）、  ２０００  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ９）および治療剤の試験についての通常受け入れられる方法を満たすように本試験を設計した。
【０２７７】
被験および対照物質
被験物質の同定および調合
被験物質、ＣＵＲ−９６３は化学的に安定したアンチセンスオリゴヌクレオチドである。静脈内投与媒体はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
【０２７８】
媒体のキャラクタリゼ−ション
ＰＢＳ媒体についての組成物、バッチ番号、使用期限および保存条件（温度および明暗）についてはサプライヤ−から得た。
【０２７９】
被験物質保存および管理
被験物質および媒体はスポンサ−および製造業者から提供され受領した保存条件に応じて保存した。
【０２８０】
被験物質製剤の解析
被験物質製剤のサンプルは被験物質製剤の濃度、安定性および均一性の解析のために凍結保存される。
【０２８１】
試験系を薦めする理由
霊長類は潜在的有害性の指数として行政当局が受け入れる好適な非げっ歯類であり、そのための膨大な背景デ−タが入手可能である。アフリカミドリサルは複数の人間生理的および疾患状態についての高度に臨床的には意義のあるモデルである。
【０２８２】
静脈内投与経路は潜在的ヒト臨床適用経路に対応する。被験物質の投与はアフルカミドリサルで以前に実施された類縁化合物についての用量検討試験の結果に基づいている。
【０２８３】
被験物質の標的配列が霊長類として１００％の相同性をもつている種で高度に保存されているのでアフルカミドリサルは選択すべき霊長類として選択された。加えて、被験物質は合成オリゴヌクレオチドである。この結果、霊長類での投与により他の種というよりもヒトにおいて見るであろう取り込みをより反映するこれらの化合物の有効性の優れた評価を可能にする。
【０２８４】
動物
種：種はＣｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｓａｂａｅｕｓ、非ヒト霊長類である。
【０２８５】
系統：系統はＳｔ．Ｋｉｔｔｓ原産のアフルカミドリサルである。
【０２８６】
原産地：原産地はＲｘＧｅｎ、Ｌｏｗｅｒ  Ｂｏｕｒｒｙｅａｕ、Ｓｔ．  Ｋｉｔｔｓ、Ｗｅｓｔ  Ｉｎｄｉｅｓである。
【０２８７】
予測される年齢：対象動物の予測される年齢は成人である。
【０２８８】
予想される体重：サルの予想される体重は約３〜４ｋｇである。実際の範囲が変わる可能性があるがデ−タ内で記載される。
【０２８９】
性別：対象動物の性別は成人のメスである。
【０２９０】
動物数：１０頭の動物数の中からスクリ−ニングにより８頭が試験登録に適していると識別した。
【０２９１】
試験頭数：試験頭数はメス８頭である。
【０２９２】
試験頭数の根拠：この実験はアフルカミドリサルにおける被験物質の治療効力を評価するという主要な目的およびこの種におけるオリゴヌクレオチドのこのタイプの全身投与に関するこれまでの研究と矛盾なく、できる限り少ない数の動物を使用するように設計した。
【０２９３】
動物の明細：体重の範囲が３〜４ｋｇの１０頭のアフリカミドリサルが本試験に登録された。サルは島に生息する野生化個体群から人道的に捕捉された未服薬成人動物である。捕捉されたサルは可能性のある寄生虫数を除くために駆虫薬の投与を受けた、さらに試験登録のスクリ−ニング前において最低４週間、隔離して観察した。補足されたサルの年齢は、高齢の動物を試験から排除しながらサイズと歯牙状の構造から推定した。試験登録の前に、それぞれのサルについて歩行運動および器用さを含めて臨床検査を実施した。血液サンプルを採血して総合的な臨床的、化学特性および全血球計算ならびに脂質検査値を調べるためにＡｎｔｅｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍｅｍｐｈｉｓ、  ＴＮ）へ送った（明細は９．２項および３１９５６７９２８を参照）。Ｓｔ．Ｋｉｔｔｓのサルの正常範囲と比較して決定される異常検査値があるサルは試験から除外した。この基準を満たす８頭のサルを識別するために、必要な場合には動物を追加してスクリ−ニングを行い１０頭のサルをスクリ−ニングした。試験を開始する前に、個々のハウジングに慣れるようにするために１週間、選択されたサルを個々のケ−ジに移す。実験に適したとみなされる動物のみを試験に登録する。生デ−タおよび最終報告書に試験開始時の実際（予測）年齢および体重範囲を詳細に示す。
【０２９４】
動物の健康と福祉：動物の福祉についての最高基準に従い、さらにＳｔ．Ｋｉｔｔｓ農業省および米国保健社会福祉省で規定されたガイドラインに従った。全ての試験は実験動物のケアとハウジングに関するこれらの要件およびすべての適用される行為準則に則って実施される。獣医学的なケア、手術、および検討に関する全ての適用される基準がＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓとして含まれる。Ｓｔ．Ｋｉｔｔｓの施設はプロトコ−ルを検討し、ガイドラインで要求されている施設の検査を行う動物実験委員会を持っている。ガイド、＃Ａ４３８４−０１  （Ａｘｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ／Ｓｔ．  Ｋｉｔｔｓ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）にて要求されているように当財団はＯｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅに提出された承認された保証を有している。この試験において規定する研究によって提起される非ヒト霊長動物の獣医学的なケアの特別な問題もバイオハザ−ドの問題も無い。
【０２９５】
ハウジングおよび環境：手術前および犠牲にするまでの手術後の期間は投与による影響を検出するために、動物を個別にハウジングした。個別のケ−ジが置かれている霊長類室はＵＳＤＨＨＳのガイドラインで推奨されているように１２：１２時間昼−夜周期に近似する北緯１７度での環境光により全体を照らす。ＲｘＧｅｎ霊長類室は外に完全に換気される。シ−リングファンによるさらなる空気の運動がＳｔ．Ｋｉｔｔｓにおいて年間を通して典型的な２３〜３５℃の一定の目標温度を維持する。２４時間の間の（制御できない）極端な温度および相対湿度を毎日測定した。試験の間、ケ−ジを定期的に清掃した。
【０２９６】
飼料および水：各動物には標準的なサル用の固形飼料（ＴｅｋＬａｄ、  Ｍａｄｉｓｏｎ、  ＷＩ）を毎日、約９０グラム与えた。飼料の具体的な栄養組成を記録した。微生物学的純度のために水を定期的に分析した。基本食餌および水供給における汚染物質の受け入れられるレベルの基準は飼料製造業者および定期的な施設の水評価のそれぞれにより作成された分析的な仕様の範囲内であった。水はヒトが消費するものとして受け入れられる認定に必要な全ての基準を見たした。
【０２９７】
試験計画
動物の識別および無作為化：割り当ては体重および血漿コレステロ−ルプロファイルに基づいて層別無作為化手順の方法で行った。群に割り当てする前後では各動物を腹部の刺青で識別した。通常行う健康診査の過程での識別の方法として全てのコロニ−動物に刺青を付けた。ケ−ジ内にハウジングされた個体を識別するためにケ−ジ計画を作成し、かつ、個々のケ−ジに取付けられた標識タグにより個別のサルはさらに識別された。
【０２９８】
群サイズ、投与および識別番号：動物を各郡が４頭である２つの投与群に割り当てた。施設における番号体系に従って各サルに具体的な動物識別番号を与えた。この体系はそれぞれのサル、文字の後に３桁の数が続く、例えばＹ０３２などで一義的に識別する。
【０２９９】
投与経路および頻度：１０分ほどかけて用手による注入により静脈内送達を行い動物は第１日、第３日、および第５日に１日１回投与される。注入速度は２４ｍＬ／ｋｇ／ｈである。投薬方法を行う前と間はケタミンとキシラジンで動物を鎮静させた。静脈カテ−テル（Ｔｅｒｕｍｏ  ｍｉｎｉ  静脈輸液セット、２０ゲ−ジの針、または類似で適切な静脈輸液セット）を伏在静脈に挿入した。サルに対する投与は動物が目覚めた直後で食事をする前の８：００と１０：００ａ．ｍ．の間に為された。下記の血液化学の項に記載したように血漿コレステロ−ルおよび他の脂質濃度を評価する血液サンプルを各注入の前に採血した。コレステロ−ル測定に与える食品効果を最小限にするために血液採血は両サンプリング時間帯の食事の前である。
【０３００】
臨床観察：投与に対する反応の目に見える兆候すべてを毎日の投与日に記録した。加えて、外観および全身状態などの物理特性について動物を少なくとも１週間に１回検査した。
【０３０１】
体重：投与期間および治療後の期間、体重を１週間間隔で記録した。
【０３０２】
摂取量：個々の摂取量は数値化していない。しかしながら、摂取パタ−ンについてはモニタ−して大きな変化はノ−トした。
【０３０３】
死亡率および罹患率：死亡率および罹患率を記録する。試験責任者および、もし可能ならスピンサ−のモニタリング担当科学者と協議してから早期犠牲に関する決定をする。病理組織検査のために肝臓、腎臓、心臓およびひ臓、肺組織の採取を行い早期に死亡または殺された動物は部険の対象となる。早期犠牲の場合、血液サンプルを採血（可能であれば）しパラメ−タを決定する。正規の勤務時間帯の後で死亡した動物が見つかった場合は、一晩冷凍保存し次の勤務時間が開始するときに剖検を行う。動物の状態が早期犠牲にならざる得ない場合にはペントバルビタ−ルナトリウムを静脈へ過剰投与して安楽死させる。全ての研究は動物使用の原則に従う。本試験が従わなければならない中程度と指定される手続において重篤度を指示している米国保健社会福祉省の霊長動物施設に関する基準に従うことをＲｘＧｅｎに対して法律が要求している。
【０３０４】
臨床検査
脂肪生検：第２６試験日にＹ７７５を除く全ての試験に使うサルに対して、へその下の１ｃｍの正中切開を通して組織抽出をすることで皮下脂肪の生検を実施した。生検物を２ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を含む標識クリオチュウブに直ちに浸し、一晩４℃でインキュベ−トした後はＲＮＡｌａｔｅｒを吸引してサンプルチュ−ブを液体窒素中で急速冷凍した。液体窒素での輸送の後は標的遺伝子のリアルタイムｑＰＣＲのために全ＲＮＡを単離した。
【０３０５】
結果：リアルタイムＰＣＲがインビトロのＳＩＲＴ１発現（ＡｐｏＡ１アンチセンスＤＡ３２７４０９に対して設計。デ−タは示されていない。）に対して作用しないオリゴヌクレオチドであるＣＵＲ−９６２（配列番号９９）を投与されたサルと比較して、ＳＩＲＴ１アンチセンスＣＶ３９６２００．１に対して設計されたオリゴヌクレオチドであるＣＵＲ−９６３を投与されたサルからの脂肪生検におけるｍＲＮＡのレベルの増加を示した。ｍＲＮＡレベルはリアルタイムＰＣＲで決定した（図６）。
【０３０６】
実施例５：アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドによるサ−チュイン（ＳＩＲＴ）のインビボ調節
アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の投与：ＳＩＲＴ１ＡＳに特異的であるアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を肥満と糖尿病を誘発させるために高脂肪食を１２週間食べさせたＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスに投与する（Ｐｕｒｕｓｈｏｔｈａｍ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、  （２００９）  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ９、  ｐ．  ３２７−３３８）。ＡＳＯのマウスへの投与は高脂肪食の実施時に開始する。マウスに、通常生理食塩溶液で調製されたＡＳＯを５ｍｇ／ｋｇの濃度で週１回ＩＰ注射した。
【０３０７】
体重の測定および摂餌：ＡＳＯのＩＰ注射の前にマウスの体重および摂餌を週２回測定する。
【０３０８】
血液ブドウ糖の測定：尾静脈からの血液サンプルを採血して給食時および絶食時の血液ブドウ糖濃度を各週測定した。
【０３０９】
ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）：ＧＴＴをマウス当たり、高脂肪食の摂餌途中（第４週）および終了近い時点（１０週）で２回行う。血流からグルコ−ス丸薬を急速に除去する能力であるマウスのブドウ糖負荷についてＧＴＴにより知ることができる。これは糖尿病の測定である。マウスは一晩、１６時間絶食している。マウスにブドウ糖２ｇ／ｋｇをＩＰ注射する。これは、３０ｇの体重のマウスについて０．２ｍｌ  ３０％（ｗ／ｖ）の最終体積になる。ブドウ糖注射前および注射後５分、１５分、３０分、６０分、９０分および１２０分の時点でブドウ糖測定が行われる。ＩＰブドウ糖注射の前にイソフルランによる麻酔状態で尾が終わる部分から１ｍｍ戻った尾の先を切ってブドウ糖値を測定する。血液液滴をストリップに吸引させてグルコミタ−でブドウ糖濃度を測定する。ＧＴＴをマウス当たり、高脂肪食の摂餌途中（第４週）および終了近い時点（１０週）で２回行う。血流からグルコ−ス丸薬を急速に除去する能力であるマウスのブドウ糖負荷についてＧＴＴにより知ることができる。これは糖尿病の測定である。
【０３１０】
インスリン負荷試験：マウスを９ａｍから３ｐｍまでの６時間絶食させる。次に、マウスに０．５−１Ｕ  インシュリン／ｋｇをＩＰ注射した。最終の注射用量が０．１−０．１５ｍｌになるようにインシュリン濃度を調節する。注射前および注射後５分、１５分、３０分、４５分、および６０分の時点でブドウ糖測定が行われる。ＧＴＴに記載するように血液を採血する。ブドウ糖のレベルのモニタリングに加えて、ＩＴＴの間はマウスの行動を常に観察する。低血糖は動物が極端に静かになり不快を示す行動の変化として現れることがある。低血糖を防ぐには血液ブドウ糖濃度が５０ｍｇ／ｍｌ以下になり始めたら、または不快の兆候が観察されたらすぐに最終体積でブドウ糖０．１−０．１５ｍｌのＩＰ注射を行う。
【０３１１】
顔面静脈穿刺：頚部皮膚における把持の張りを通して首の血管を軽く押しながらマウスの首筋および爪の基部を拘束する。採血部位は下顎角の僅か前方の顎である。針／ランセットの先端が皮膚をちょうど通過するまで採決部位の皮膚を１８Ｇの針または９０度の角度でランセットで穿刺する。マイクロヘマトクリットチュ−ブを用いて血液サンプルを採血する。血液を採血した後で、頚部における把持を緩め、さらに止血させるためにガ−ゼスポンジで挿入部位を圧する。０．０５〜０．２ｍｌの血液をこの方法で採血する。この方法は高脂肪食での第５週に１回だけ行い、もし心穿刺が有効でない場合には最終的に第１２週に行う（以下参照）。市販されているＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、  ＭＮ、  Ａｓｓａｙ  Ｐｒｏ  Ｓｔ．  Ｃｈａｒｌｅｓ、  ＭＯ、  Ｍａｂｔｅｃｈ、  Ｍａｒｉｅｍｏｎｔ、  ＯＨ）を用いてブドウ糖および脂質（インスリン、アディポネクチンおよびレプチンなど）の代謝を調節する血中ホルモンを測定する。
【０３１２】
心穿刺：高脂肪食の第１２週の終了時に、マウスに連続イソフルラン吸入により麻酔をかける。イソフルランおよび酸素が供給されるインダクションボックスにマウスを入れて麻酔を導入する。マウスの背中を押さえる。心臓は２７／Ｇ針で穿刺する。放血した後は、確実に死亡させるために頭を斬首する。今後の研究（ＲＮＡおよびタンパク質測定、ならびに組織学）のために組織（肝臓、膵臓、白色および褐色脂肪組織、および骨格筋）を採取する。約０．５〜１ｍｌの血液を採血して糖・脂質代謝の数種類の重要なパラメ−タ（ブドウ糖、インシュリンコレステロ−ル、トリグリセリド、遊離脂肪酸、レプチン、アディポカイン、ステロイド、甲状腺ホルモン）の決定に使用する。この方法が困難な場合には、代わりとしてイソフルランによる麻酔状態で顔面静脈穿刺法により採血する（上記参照）。
【０３１３】
本発明が、１以上の実施形態に関して示し、述べたが、等価の変更や修正は、本明細書の記載や、理解及び図面に基づいて、当業者が気づくであろう。さらに、本発明の特別な特徴は、いくつかの実施形態の１つのみに関して開示されているけれども、そのような特徴は、いくらかの与えられた、あるいは特別な応用に望ましく、かつ有利であるように、他の実施形態の１以上の特徴と結合されてもよい。
【０３１４】
本開示の要約により読者が迅速に技術的開示の性質を確認できる。以下の請求の範囲または意義を解釈あるいは制限するために使用されるものではないことの理解の下に提出するものである。
【図１】
2013500017.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013500017.tif 000023
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