(57)【要約】  本発明は、ヒトＣＤ１５１タンパク質に特異的に結合できる新規な抗体、特に、キメラ型およびヒト型の、マウス起源のモノクローナル抗体、更にそれらの抗体のアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列に関する。本発明は更に、癌の予防または治療的処置のための医薬としてのそれらの抗体の使用およびＣＤ１５１タンパク質の過剰発現に関連する疾患を診断する方法またはキットにおけるそれらの抗体の使用を含む。最後に、本発明は、抗体および／もしくは抗癌剤と組み合わされたまたは毒素および／もしくは放射性元素がコンジュゲートされたそのような抗体を含む生成物および／または組成物ならびに特定の癌の防止および／または処置におけるそれらの使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７、２５、もしくは３７のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖および／または配列番号８、９、２６、２７、３８、もしくは４４のアミノ酸配列を含む配列を有する重鎖を含む、キメラ抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項２】
配列番号７のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖および配列番号８のアミノ酸配列を含む配列を有する重鎖を含む、請求項１に記載のキメラ抗体。
【請求項３】
ＩｇＧ１である、請求項２に記載のキメラ抗体。
【請求項４】
配列番号７のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖および配列番号９のアミノ酸配列を含む配列を有する重鎖を含む、請求項１に記載のキメラ抗体。
【請求項５】
ＩｇＧ４である、請求項４に記載のキメラ抗体。
【請求項６】
配列番号２５または３７のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖および配列番号２６または３８のアミノ酸配列を含む配列を有する重鎖を含む、請求項１に記載のキメラ抗体。
【請求項７】
ＩｇＧ１である、請求項６に記載のキメラ抗体。
【請求項８】
配列番号４１のアミノ酸配列を含むヒンジ領域を含む、請求項７に記載のキメラ抗体。
【請求項９】
配列番号３７のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖および配列番号３８のアミノ酸配列を含む配列を有する重鎖を含む、請求項８に記載のキメラ抗体。
【請求項１０】
配列番号２５のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖および配列番号２７のアミノ酸配列を含む配列を有する重鎖を含む、請求項１に記載のキメラ抗体。
【請求項１１】
ＩｇＧ４である、請求項１０に記載のキメラ抗体。
【請求項１２】
配列番号２５のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖および配列番号４４のアミノ酸配列を含む配列を有する重鎖を含む、請求項１に記載のキメラ抗体。
【請求項１３】
ＩｇＧ２である、請求項１２に記載のキメラ抗体。
【請求項１４】
配列番号４６、４７、４８、もしくは４９のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号５０、５１、５２、もしくは５３のアミノ酸配列を含む配列を有する重鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載のキメラ抗体に由来するヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１５】
配列番号６２、６３、６４、もしくは６５のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖および／または配列番号６６、６７、６８もしくは６９のアミノ酸配列を含む配列を有する重鎖を含む、請求項１４に記載のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１６】
ＩｇＧ１である、請求項１５に記載のヒト化抗体。
【請求項１７】
配列番号６２、６３、６４、もしくは６５のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖および／または配列番号７０、７１、７２、もしくは７３のアミノ酸配列を含む配列を有する重鎖を含む、請求項１４に記載のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１８】
ＩｇＧ２である、請求項１５に記載のヒト化抗体。
【請求項１９】
以下の核酸から選択される、単離された核酸：
ａ）請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体またはその誘導体化合物もしくは機能的フラグメントの１つをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ核酸；
ｂ）前記ａ）で定義される核酸に相補的な核酸；
ｃ）配列番号１６〜１８、３４〜３６、３９、４０、４５、５４〜６１、または７４〜８５の核酸配列の少なくとも１つと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる少なくとも１８ヌクレオチドの核酸。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載のベクターを含む細胞宿主。
【請求項２２】
請求項２１に記載の細胞を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２３】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントの１つからなる化合物を活性成分として含む、組成物。
【請求項２４】
同時使用、個別使用、または時間差使用のための組合せ製品として、抗体、細胞毒性／細胞増殖抑制剤、細胞毒、または放射性元素を更に含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
医薬としての、請求項２３または２４の記載の組成物。
【請求項２６】
癌の防止または処置を意図する医薬の製造における、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントの１つおよび／または請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２７】
前記癌が、前立腺癌、肺癌、結腸癌、乳癌、または膵臓癌から選択される癌であること、請求項２６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗体、特に、キメラ型およびヒト化型の、腫瘍の成長を阻害することができる、マウス起源のモノクローナル抗体ならびにそれらの抗体のアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列に関する。特定の態様では、本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害できる新規な抗体、誘導体化合物、または機能的フラグメントに関する。本発明は更に、癌の予防および／または治療処置のための医薬としてのならびに癌を診断する方法またはキットにおけるそれらの抗体の使用を含む。最後に、本発明は、例えば抗癌剤および／または抗体と会合しているか毒素がコンジュゲートされたそのような抗体を含む生成物および／または組成物ならびに特定の癌の防止および／または処置におけるその使用を含む。
【０００２】
ＣＤ１５１はＰＥＴＡ−３またはＳＦＡ−１ともいい、テトラスパニンファミリーに属する膜タンパク質である（Boucheix and Rubinstein, 2001, Cell Mol. Life Sci. 58, 1189-1205; Hemler, 2001, J. Cell Biol. 155, 1103-1107）。ヒトでは、ＣＤ１５１は２５３個のアミノ酸を有し、４個の膜フラグメントならびに細胞外ループとも呼ばれる細胞外ドメインＥＣ１（１８アミノ酸、配列［４０〜５７］およびＥＣ２（１０９アミノ酸、配列［１１３〜２２１］）を含む。しかし、ヌクレオチド配列中、これまでにＣＤ１５１の２個のバリアントが同定されており、１つは３９５位および４０９位にそれぞれヌクレオチドＡおよびＣを有し［非特許文献３］、もう１つは、同じ位置にヌクレオチドＡおよびＣの代わりにヌクレオチドＧおよびＴを有する［非特許文献４］。その結果、ペプチド配列中に変異が観察され、それぞれ１３２位および１３７位の残基Ｋ（Ｌｙｓ）およびＰ（Ｐｒｏ）が残基Ｒ（Ａｒｇ）およびＳ（Ｓｅｒ）に変異している［Fitter et al, 1995, Blood 86(4), 1348-1355/ Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70(5), 3258-3263］。
【０００３】
ＣＤ１５１は、例えば肺癌［Tokuhara et al, 2001, Clin. Cancer Res. 7, 4109-4114］、結腸癌［Hashida et al, 2003, Br. J. Cancer 89, 158-167］、前立腺癌［Ang et al, 2004, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-1721］、または膵臓癌［Gesierich et al, 2005, Clin. Cancer Res. 11, 2840-2852］等の多くの癌で過剰発現している。
【０００４】
ＣＤ１５１を発現しないノックアウトマウスならびに種々の種類の細胞においてインビトロでＣＤ１５１の機能性および発現をブロックするための抗ＣＤ１５１抗体およびｓｉＲＮＡの使用により、ＣＤ１５１が癌に関連するいくつかの現象、例えば細胞接着（Nishiuchi et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1939-1944; Winterwood et al, 2006, Mol. Biol. Cell 17, 2707-2721）、細胞運動性（Kohno et al, 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343）、細胞遊走（Yauch et al, 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765、Testa et al, 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820、Penas et al, 2000, J. Invest. Dermatol. 114, 1126-1135、Klosek et al, 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416
）、細胞浸潤（Kohno et al, 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343、Shiomi et al, 2005, Lab. Invest. 85, 1489-1506、Hong et al, 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292）、および脈管形成（Yanez-Mo et al, 1998, J. Cell Biol. 141, 791-804、Sincock et al, 1999, J. Cell Sci. 112, 833-844、Takeda et al, 2007, Blood 109, 1524-1532）に関与することが示された。
【０００５】
テトラスパニンの注目すべき特徴の１つは、自身および多くの他の表面分子と会合して構造的な巨大分子複合体を形成できる能力である。それらの複合体内で、各テトラスパニンは１または複数の表面分子と特異的に会合することにより、テトラスパニンおよびパートナー分子から構成される一次複合体を形成している。テトラスパニンは特定の原形質膜マイクロドメインを組織することができ、テトラスパニンはそのマイクロドメインから機能的に関連し得るパートナー分子をリクルートすることができる。テトラスパニンを含む相互作用の集合は、「テトラスパニンネットワーク」または「テトラスパニンウェブ」と呼ばれている。
【０００６】
ＣＤ１５１は細胞表面上で種々の膜タンパク質と相互作用する。特に、ラミニン受容体インテグリンとの、より具体的には好ましいリガンドがラミニン５であるインテグリンα３β１またはα６β４との、特定の洗剤の作用に抵抗性である非常に安定性の高い複合体が同定されている（Yauch et al, 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765、Lammerding et al, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci USA 100, 7616-7621）。この会合には、インテグリンおよびＣＤ１５１の細胞外ドメインが関与する。ＥＣ２ループ中に位置するＣＤ１５１の配列ＱＲＤ［１９４〜１９６］が変異すると特定のインテグリンとの相互作用が消失するため、この配列が会合に非常に重要である（Kazarov et al, 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309）。更に、ＣＤ１５１／インテグリンα６β４／ｃ−Ｍｅｔ（ＨＧＦ受容体）の機能的三元複合体が腫瘍細胞中で同定されている（Klosek et al, 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416）。干渉ＲＮＡで細胞を処理することによりＣＤ１５１の発現を阻害すると、ＨＧＦにより生じる細胞の成長および遊走が阻害される。
【０００７】
ＥＣ２ループが欠失してもＣＤ１５１と他のテトラスパニンの会合が乱れないことが示されていることから、テトラスパニンのネットワーク形成に必要な、特定の細胞内でのＣＤ１５１と他のテトラスパニンとの相互作用は、ＣＤ１５１の膜領域および細胞質領域に依存すると考えられる（Berditchevski, 2001, J. Cell Sci. 114, 4143-4151）。
【０００８】
ＣＤ１５１は、種々のシグナル伝達経路の調節、例えばＰＩ４キナーゼとの会合を介したホスホイノシチド経路の調節（Yauch et al, 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765）、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ｐ３８−ＭＡＰＫ、およびＪＮＫのリン酸化を介したｃ−Ｊｕｎシグナル伝達経路の調節（Hong et al, 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292）、ＰＫＣによるインテグリンのリン酸化の調節（Zhang et al, 2001, J. Biol. Chem. 276, 25005-25013）、ＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅの活性化の調節（Shigeta et al, 2003, J. Cell Biol. 163, 165-176）により、細胞の接着、遊走、および浸潤を制御することができる。
【０００９】
細胞間の同種親和性型の相互作用も、細胞運動性およびメタロプロテイナーゼＭＭＰ−９の発現の増加に関与する（Hong et al, 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292）。これらの細胞間ＣＤ１５１−ＣＤ１５１相互作用は、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ｐ３８−ＭＡＰＫ、およびＪＮＫのリン酸化を介してｃ−Ｊｕｎの活性化を引き起こす。
【００１０】
これまで、ＣＤ１５１タンパク質への関心にも関わらず、作製されたのは２つの治療目的の抗体、すなわちモノクローナル抗体５０−６およびＳＦＡ１．２Ｂ４である。これら２つの抗体は同等な活性を有する。これらはモデル動物においてインビボで転移形成を阻害するが、インビボでの腫瘍成長に対する効果は明らかにされていない。
【００１１】
ＣＤ１５１に対するモノクローナル抗体５０−６（アイソタイプＩｇＧ１）は、ヒト類表皮癌ＨＥｐ−３細胞を用いたｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ法によりマウスで生成された（Testa et al, 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820）。
【００１２】
抗体５０−６は、ＣＤ１５１を過剰発現するようにトランスフェクトされたヒト子宮頸癌ＨｅＬａ細胞の遊走およびＨＥｐ−３細胞の遊走ならびにｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）により起こる漿尿膜新血管新生のモデルにおける脈管形成をインビトロで阻害することができる。この抗体は、ニワトリ胚の２つのモデルにおいてＨＥｐ−３細胞の接種により誘発される転移をインビボで阻害する（Testa et al, 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820）。これらのモデルにおいては、抗体５０−６の阻害活性は、肺抽出物中のタンパク質ｈｕＰＡ（ヒトウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター）の活性測定によって求められる。著者らによると、このアッセイは、肺の中のヒト細胞の存在を反映するものである。アッセイ後、抗体５０−６によってもたらされる転移（ニワトリ胚の肺へのＨＥｐ−３細胞の内転移）の減少は、対照抗体との比較で、細胞の接種後に抗体が注射されるいわゆる「自然転移」モデルで７４％、細胞と抗体が一緒に接種されるいわゆる「実験転移」モデルで５７％であると推定される。著者らによると、インビボで観察される抗体５０−６の抗腫瘍特性は、この抗体がインビトロでＨＥｐ−３細胞の増殖に何ら影響を与えなかったことから、細胞増殖抑制効果または細胞毒性効果に関連しないと考えられる。
【００１３】
抗体５０−６を産生するハイブリドーマは、参照番号ＣＲＬ−２６９６でＡＴＣＣより入手可能である（当初、参照番号５０−６［ＰＴＡ−２２７］で寄託されたハイブリドーマ）。
【００１４】
抗ＣＤ１５１モノクローナル抗体ＳＦＡ１．２Ｂ４（アイソタイプＩｇＧ１）は、ヒトＣＤ１５１遺伝子でトランスフェクトされたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を用いて腹腔内経路で免疫化した後のマウスで生成された（Hasegawa et al, 1996, J. Virol. 70, 3258-3263）。抗体ＳＦＡ１．２Ｂ４はインビトロで様々なヒト腫瘍系の細胞の浸潤および運動性を阻害することができる（Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343）。この抗体は、インビボで、ＣＤ１５１を過剰発現するようにトランスフェクトされた結腸癌系ＲＰＭＩ１４７８８および線維肉腫系ＨＴ１０８０により引き起こされる肺転移を阻害する（Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343）。
【００１５】
他のマウス抗ＣＤ１５１抗体、例えばモノクローナル抗体１４Ａ２Ｈ１（Ashman et al., 1991, Br. J. Haematol. 79, 263-270；Roberts et al., 1995, Br. J. Haematol. 89, 853-860）、ＴＳ１５１およびＴＳ１５１Ｒ（Serru et al, 1999, Biochem. J. 340, 103-111；Geary et al, 2001, Tissue Antigens 58, 141-153；Charrin et al, J. Biol. Chem. 276, 14329-14337；Chometon et al, 2006, Exp. Cell Res. 312, 983-985）等が文献中に既に記載されている。
【００１６】
複数の実験研究により、テトラスパニンが転移のサプレッサーまたはプロモーターとして作用することにより転移形成において重要な役割を果たすことが示された。ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８２等のテトラスパニンのトランスフェクションは癌系の転移の可能性を低減させる。これに対して、テトラスパニンＣＤ１５１およびＣｏ−０２９の発現は逆の効果を生じるようである。したがって、これら２つのテトラスパニンは転移のプロモーターである。これらの結果は、複数の癌（乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、結腸癌、前立腺癌、黒色腫等）において、転移がある場合に原発腫瘍でＣＤ９およびＣＤ８２の発現がより少ないことおよびこれらの発現減少からより低い生存率が予想されることを示した種々の臨床研究と一貫性を有するものである。肺癌では、ＣＤ９およびＣＤ８２の発現の複合的な減少が、これら２つの抗原の一方だけの発現が減少している場合よりも大きな転移可能性と相関していた。
【００１７】
ＣＤ１５１の過剰発現が、肺癌、結腸癌、前立腺癌等の特定の癌の攻撃性と関連し、予後不良の要因と見なされ得ることが、複数の後向き研究により示されている（Tokuhara et al, 2001, Clin. Cancer Res. 7, 4109-4114；Hashida et al, 2003, Br. J. Cancer 89, 158-167；Ang et al, 2004, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-1721）。これらのケースにおいて、平均生存率は、ＣＤ１５１を発現しない腫瘍を有する患者に比べ、ＣＤ１５１を発現する腫瘍を有する患者において実際に低くなっている。
【００１８】
種々のヒト腫瘍系（ＨｅＬａ、ＲＰＭＩ１４７８８、Ａ１７２、ＨＴ１０８０）において、対応する遺伝子のトランスフェクションによりもたらされるＣＤ１５１の過剰発現は、トランスフェクト細胞の運動性、遊走、および浸潤の増加を引き起こす（Testa et al, 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820；Kohno et al, 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343）。これらの現象は、抗ＣＤ１５１抗体の存在下で阻害される。
【００１９】
キメラ抗体とは、所与の種の抗体に由来する天然の可変（軽鎖および重鎖）領域を含有する抗体であって、前記所与の種と異なる種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域と会合している抗体を意味する。
【００２０】
本発明に係るキメラ型の抗体またはそのフラグメントは、遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターと、本発明に係る非ヒト、特にマウスのモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列と、ヒト抗体の定常領域をコードする配列とを含む組換えＤＮＡをクローニングすることによって作製することができる。このような組換え遺伝子によりコードされる本発明のキメラ抗体は、例えばマウス−ヒトキメラであり得、この抗体の特異性はマウスＤＮＡに由来する可変領域により決まり、アイソタイプはヒトＤＮＡに由来する定常領域により決まる。キメラ抗体の作製方法については、例えばVerhoeyn et al.（BioEssays, 8:74, 1988）を参照することができる。
【００２１】
第１の態様では、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を含む配列を有するか最適なアラインメント後に配列番号７と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する軽鎖および／または配列番号８もしくは９のアミノ酸配列を含む配列を有するか最適なアラインメント後に配列番号８もしくは９と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する重鎖を含むことを特徴とする、キメラ抗体または誘導化合物（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）もしくは機能的フラグメントに関する。
【００２２】
配列番号８および９の２つの重鎖配列はそれぞれヒトのアイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ４に対応する。
【００２３】
したがって、本発明の第１の態様は、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む、キメラ抗体ｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００２４】
本発明の第２の態様は、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む、キメラ抗体ｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ４］またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００２５】
別の好ましい態様では、本発明のキメラ抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号２５もしくは３７のアミノ酸配列を含む配列を有するか最適なアラインメント後に配列番号２５もしくは３７の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する軽鎖および／または配列番号２６、２７、３８、もしくは４４のアミノ酸配列を含む配列を有するか最適なアラインメント後に配列番号２６、２７、３８、もしくは４４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する重鎖を含むことを特徴とする。
【００２６】
配列番号２６および３８の２つの重鎖配列はヒトのアイソタイプＩｇＧ１に対応し、配列番号２７の重鎖はヒトのアイソタイプＩｇＧ４に対応し、配列番号４４の重鎖配列はヒトのアイソタイプＩｇＧ２に対応する。
【００２７】
したがって、本発明の第１の態様は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む、キメラ抗体ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００２８】
本発明の第２の態様は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む、キメラ抗体ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ４］またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００２９】
本発明の第３の態様は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む、キメラ抗体ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］［ＴＨ７］またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００３０】
本発明の第４の態様は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む、キメラ抗体ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ２］またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００３１】
本発明に係る抗体の「機能的フラグメント」とは、特に、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは「単鎖」を表す）、Ｆａｂ、Ｆ（Ａｂ’）２、Ｆａｂ’、もしくはｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント等の抗体フラグメント、または二重特異性抗体、または半減期が延長されているであろう任意のフラグメントを意味すると理解される。そのような機能的フラグメントは以下に詳細に説明される。
【００３２】
本発明に係る抗体の「誘導体化合物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」とは、特に、ペプチドフレームワークすなわち「スキャフォールド」と、その認識能力を保存するために元の抗体のＣＤＲの少なくとも１つと、を含む結合タンパク質を意味すると理解される。そのような誘導体化合物は当業者に周知であり、以下で更に詳細に説明される。
【００３３】
より好ましくは、本発明は、遺伝子組換えまたは化学合成により得られる、特にキメラであるかヒト化された、本発明に係る抗体、その誘導体化合物、またはその機能的フラグメントを含む。
【００３４】
好ましい態様によれば、本発明に係る抗体、またはその誘導体化合物もしくは機能的フラグメントの１つは、モノクローナル抗体からなることを特徴とする。
【００３５】
「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体集団に由来する抗体と理解される。より具体的には、集団の個々の抗体は、自然に生じ得る最低限の量存在し得る少数の可能性のある変異体を除き、同一である。言い換えると、モノクローナル抗体は、ただ１つの細胞クローン（例えば、ハイブリドーマ；均質な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた真核宿主細胞、均質な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた原核宿主細胞等）の増殖により得られる均質な抗体からなり、通常、１種類の同じクラスおよびサブクラスの重鎖ならびに１種類だけの軽鎖により特徴付けられる。モノクローナル抗体は非常に特異性が高く、単一の抗原に対して作られている。更に、種々の決定基、すなわちエピトープに対して作られた種々の抗体を含むのが通例であるポリクローナル抗体標品とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに対して作られている。
【００３６】
本発明は天然型の抗体に関するものではなく、すなわち、それらは天然の環境から採取されたものではなく、天然源から出発して精製により単離または獲得することができたか、遺伝子組換えまたは化学合成により得ることができたものであり、したがって、後述するようにそれらは非天然アミノ酸を含有してもよいと理解されなければならない。
【００３７】
ＩＭＧＴの固有の番号付与システムは、抗原、鎖型、または種に関わらず可変ドメインを比較できるように定義されている［Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997)；Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)；Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)］。この番号付与システムにおいて、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ  ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＴＲＰ）等の保存されているアミノ酸は常に同じ位置を保持する。したがって、ＩＭＧＴの固有の番号付与システムにより、スキャフォールド領域の標準化された境界が定められ（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６位、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５位、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４位、およびＦＲ４＿ＩＭＧＴ：１１８〜１２８位）、また、相補性決定領域、すなわちＣＤＲの標準化された境界が定められる（ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８位、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５位、およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７位）。「ホール（ｈｏｌｅ）」または「スペース（ｓｐａｃｅ）」は占有されていない位置を表すので、ＩＭＧＴによるＣＤＲの長さは非常に重要な情報になる。ＩＭＧＴのシステムは、グラフィカルな２次元表示に用いられ（これはＩＭＧＴパールネックレスと呼ばれる）［Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002)；Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)］、また、ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢと呼ばれる３次元構造にも用いられる［Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)］。
【００３８】
本明細書において、抗体化合物またはその配列に関連する「ポリペプチド」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は相互に交換可能である。
【００３９】
本発明は天然型の抗体に関するものではなく、すなわち、それらは天然の環境から採取されたものではなく、天然源から出発して精製により単離もしくは獲得され得たものまたは遺伝子組換えもしくは化学合成により得られ得たものであり、したがって、後述するようにそれらは非天然アミノ酸を含有してもよいと理解されなければならない。
【００４０】
本発明において、２つの核酸またはアミノ酸配列の間の「同一性パーセンテージ」とは、最良のアラインメント（最適なアラインメント）後に得られる、比較されている２つの配列の間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは完全に統計学的であり、２つの配列間の差はそれらの全長にわたってランダムに分布すると理解される。２つの核酸またはアミノ酸配列間の配列比較は通常、それらの配列を最適にアラインメントした後に比較することにより行われ、前記比較はセグメントごとに、すなわち「比較ウィンドウ」によって行うことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手動で行う他に、Smith and Waterman (1981)［Ad. App. Math. 2:482］の局所的相同性アルゴリズムを用いるか、Neddleman and Wunsch (1970)［J. Mol. Biol. 48:443］の局所的相同性アルゴリズムを用いるか、Pearson and Lipman (1988)［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444］の類似性サーチ法を用いるか、それらのアルゴリズムを利用したコンピューターソフトウェア（ウィスコンシン州マディソン、サイエンスドライブ５７５のジェネティックス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅに含まれるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡまたは比較ソフトウェアＢＬＡＳＴ  ＮもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐ）を用いて行うことができる。
【００４１】
２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、最適にアラインメントされた配列を比較することにより決定され、そらら２つの配列間での最適なアラインメントのために、比較対象の核酸またはアミノ酸配列は、参照配列に対して付加または欠失を含有してもよい。同一性パーセンテージは、２つの配列間でヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同じである同一ポジションの数を決定し、この同一ポジションの数を比較ウィンドウ中の全ポジション数で割り、得られた結果に１００を掛けて２配列間の同一性パーセンテージを得ることにより計算される。
【００４２】
例えば、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」（Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250）を用いてよく、使用するパラメーターはデフォルトで与えられているものを使用し（特に、パラメーター「ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ」は５、「ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ」は２；マトリックスの選択は、例えばプログラムが示唆する「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」である）、比較される２つの配列間の同一性パーセンテージはプログラムによって直接算出される。
【００４３】
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有するアミノ酸配列として、参照配列に対して特定の変化、特に少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加、もしくは置換、切断、または延長を有するアミノ酸配列が好ましい。１または複数の連続的または非連続的アミノ酸の置換の場合、置換されるアミノ酸が「同等な」アミノ酸で置換されている置換が好ましい。本発明において、「同等なアミノ酸」という表現は、以下の特に実施例中に記載するように、対応する抗体の生物学的活性を基本的に変化させずに、基本構造のアミノ酸の１つに取って代わることができる、任意のアミノ酸を意味する。
【００４４】
これらの同等なアミノ酸は、置換されているアミノ酸との構造的相同性に基づいてまたは生成され得る種々の抗体間の生物学的活性比較試験の結果に基づいて決定することができる。
【００４５】
非限定的な例として、以下の表１は、対応する改変抗体の生物学的活性を基本的に変化させることなく行うことができる置換の可能性を示し、当然のことながら、同じ条件下で逆の置換も可能である。
【００４６】
【表１】
2013507114.tif 000002
【００４７】
前述の通り、本発明は、本発明に係る抗体に由来する任意の化合物にも同様に関する。
【００４８】
より具体的には、本発明に係る抗体またはその誘導体化合物もしくは機能的フラグメントの１つは、前記誘導体化合物が、元の抗体のパラトピックな認識特性が完全にまたは一部保存されるように少なくとも１つのＣＤＲがグラフトされたペプチドスキャフォールドを含む結合タンパク質からなることを特徴とする。
【００４９】
本発明に記載されているＣＤＲの配列のうちの１または複数の配列は、免疫グロブリンの種々のタンパク質スキャフォールド上、すなわちフレームワーク上に提供することもできる。この場合、タンパク質配列は、グラフト化された１または複数のＣＤＲのフォールディングに好ましいペプチド骨格を再創出することを可能とし、それにより、ＣＤＲのパラトピックな抗原認識特性を保存することが可能になる。
【００５０】
一般的に、当業者であれば、元の抗体に由来するＣＤＲの少なくとも１つをグラフトするタンパク質スキャフォールドの種類を決定する方法が分かるであろう。より具体的には、選択のために、そのようなスキャフォールドは以下に挙げる最大数の基準を満たさなければならないことが知られている（Skerra A., J. Mol. Recogn. 13, 2000, 167-187）：
・系統発生的によく保存されていること；
・３次元構造が公知であること（例えば、結晶学、ＮＭＲ分光法、または当業者に公知の任意の他の技術から）；
・サイズが小さいこと；
・転写後修飾がほとんどまたは全くないこと；および／または
・産生、発現、および精製が用意であること。
【００５１】
そのようなタンパク質スキャフォールドの起源は、限定されるものではないが、以下から選択される構造であり得る：フィブロネクチン、好ましくは３型フィブロネクチンの１０番目のドメイン、リポカリン、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）(Skerra A., J. BiotechnoL, 2001, 74(4):257-75)、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡのドメインＢに由来するプロテインＺ、チオレドキシンＡ、および「アンキリンリピート」（Kohl et al, PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705）、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」、または「テトラトリコペプチド」型の反復モチーフを有するタンパク質。
【００５２】
また、例えば、以下のサソリ、昆虫、植物、軟体動物等に由来する毒素または神経型ＮＯ合成酵素のタンパク質阻害剤（ＰＩＮ）に由来するスキャフォールドも挙げることができる。
【００５３】
何ら限定されるものではないが、そのようなハイブリッド構造の例としては、ＰＩＮのループの１つへの抗ＣＤ４抗体すなわち１３Ｂ８．２のＣＤＲ−Ｈ１（重鎖）の挿入を挙げることができ、それにより得られる新規な結合タンパク質は元の抗体と同じ結合特性を保持している（Bes et al., BBRC 343, 2006, 334-344）。また、例として、ネオカルチノスタチンのループの１つへの抗リゾチームＶＨＨ抗体のＣＤＲ−Ｈ３（重鎖）のグラフト化も挙げることができる（Nicaise et al., 2004）。
【００５４】
最後に、上述のように、このようなペプチドスキャフォールドは、元の抗体に由来する１〜６個のＣＤＲを含み得る。必須ではないが、好ましくは、当業者は抗体の特異性を主に担うことが知られている重鎖に由来する少なくとも１つのＣＤＲを選択する。目的のための公知の技術を用いた関連するＣＤＲの選択は当業者には明らかである（Bes et al., FEBS letters 508, 2001 67-74）。
【００５５】
明らかに、これらの例は何ら限定するものではなく、当業者に既知または自明の他の構造も本特許出願の保護の範囲内に含まれると見なされなければならない。
【００５６】
よって、本発明は、ａ）系統発生的に良く保存されており、ｂ）構造が強固であり、ｃ）３次元分子組織が周知であり、ｄ）サイズが小さく、且つ／またはｅ）安定性特性を変化させずに欠失および／または挿入により改変することができる領域を含むタンパク質から前記ペプチドスキャフォールドが選択されることを特徴とする、抗体またはその誘導体化合物もしくは機能的フラグメントの１つに関する。
【００５７】
好ましい態様では、本発明に係る抗体またはその誘導体化合物もしくは機能的フラグメントの１つは、ペプチドスキャフォールドが以下のｉ〜ｉｉｉから選択されることを特徴とする：ｉ）フィブロネクチン、好ましくは３型フィブロネクチンの１０番目のドメイン、リポカリン、アンチカリン、黄色ブドウ球菌のプロテインＡのドメインＢに由来するプロテインＺ、チオレドキシン、に由来するスキャフォールド、ｉｉ）「アンキリンリピート」、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」、または「テトラトリコペプチドリピート」型の反復モチーフを有するタンパク質、およびｉｉｉ）神経型ＮＯ合成酵素のタンパク質阻害剤（ＰＩＮ）。
【００５８】
本発明の別の態様では、前述した抗体の機能的フラグメントについても同様の言及がなされる。
【００５９】
より具体的には、本発明は、機能的フラグメントが、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、およびｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント、ならびに二重特異性抗体、ならびにペグ化フラグメントのような半減期が延長されているであろう任意のフラグメントから選択されることを特徴とする、抗体またはその誘導体化合物もしくは機能的フラグメントの１つに関する。
【００６０】
本発明に係る抗体のそのような機能的フラグメントは、例えばＦｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは単鎖を表す）、Ｆａｂ、Ｆ（Ａｂ’）２、Ｆａｂ’、もしくはｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント、または二重特異性抗体、あるいは化学修飾、例えばポリ（エチレン）グリコール等のポリ（アルキレン）グリコールの付加（「ペグ化」）（ペグ化フラグメントはＦｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（Ａｂ’）２−ＰＥＧ、またはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）（「ＰＥＧ」はＰｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ）Ｇｌｙｃｏｌの表記に由来）によりまたはリポソーム、マイクロスフェア、もしくはＰＬＧＡ中に取り込ませることにより半減期が延長されているであろう任意のフラグメントからなり、前記フラグメントは、本発明に係る特徴的ＣＤＲの少なくとも１つを含み、特に、一般に、それが由来する抗体の活性を部分的であっても発揮することができる。
【００６１】
好ましくは、前記機能的フラグメントは、それが由来する抗体の重鎖または軽鎖の可変部の部分的配列を含み、前記部分的配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性および十分な親和性、好ましくはそれが由来する抗体の少なくとも１／１００、より好ましくは少なくとも１／１０の親和性を保持するのに十分な長さである。
【００６２】
そのような機能的フラグメントは、それが由来する抗体の配列からの、少なくとも５個の連続するアミノ酸、好ましくは１０、１５、２５、５０、または１００個の連続するアミノ酸を含む。
【００６３】
少なくとも以下を含む機能的フラグメントも好ましい：
・配列番号７に含まれる軽鎖の３つのＣＤＲおよび配列番号７の配列からの１１２個の連続するアミノ酸、好ましくは１１５、１２５、１７５、２００、または２１０個の連続するアミノ酸；および／または
・配列番号８または９に含まれる重鎖の３つのＣＤＲおよび配列番号８または９の配列からの１１９個の連続するアミノ酸、好ましくは１２５、１５０、２００、２５０、または３００個の連続するアミノ酸。
【００６４】
少なくとも以下を含む機能的フラグメントも好ましい：
・配列番号２５または３７に含まれる軽鎖の３つのＣＤＲおよび配列番号２５または３７の配列からの１０８個の連続するアミノ酸、好ましくは１１５、１２５、１７５、２００、または２１０個の連続するアミノ酸；および／または
・配列番号２６、２７、または３８に含まれる重鎖の３つのＣＤＲおよび配列番号２６、２７、または３８の配列からの１２０個の連続するアミノ酸、好ましくは１２５、１５０、２００、２５０、または３００個の連続するアミノ酸。
【００６５】
好ましくは、これらの機能的フラグメントは、一般にそれが得られた抗体と同じ結合特異性を有するＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（Ａｂ’）２、Ｆ（Ａｂ’）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ型のフラグメント、または二重特異性抗体である。本発明によれば、本発明の抗体のフラグメントは、前述した抗体から出発して、ペプシンもしくはパパイン等の酵素を用いた消化および／または化学的還元を用いたジスルフィドブリッジの切断等の方法により得ることができる。本発明に含まれる抗体フラグメントは、当業者に同様に周知である遺伝子組換え技術によって、あるいは例えばアプライドバイオシステムズ社等から供給されているような自動ペプチド合成機を用いたペプチド合成によっても得ることができる。
【００６６】
別の特定の態様によれば、本発明は、マウスとは異なる種、特にヒトの抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域を更に含むことを特徴とする、本発明に係るキメラ抗体またはその誘導体化合物もしくは機能的フラグメントの１つに関する。
【００６７】
本発明の別の態様によれば、ヒト化抗体またはその誘導体化合物もしくは機能的フラグメントの１つは、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域がそれぞれラムダまたはカッパ領域およびガンマ−１、ガンマ−２、またはガンマ−４領域であることを特徴とする。
【００６８】
別の態様によれば、本発明は、本発明に係るキメラモノクローナル抗体ｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］およびｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ４］が由来する第１のマウスハイブリドーマ、特に２００８年２月２２日に番号Ｉ−３９２０でＣｅｎｔｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）（フランス、パリのパスツール研究所）に寄託されたマウス起源のハイブリドーマに関する。前記ハイブリドーマは、免疫化したＢａｌｂ／ｃマウス脾細胞およびＳｐ  ２Ｏ  Ａｇ  １４ミエローマ細胞系の融合により得られた。
【００６９】
最後に、別の態様によれば、本発明は、本発明に係るキメラモノクローナル抗体ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］およびｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ４］が由来する第２のマウスハイブリドーマ、特に２００８年２月２１日に番号Ｉ−３９１９でＣｅｎｔｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）（フランス、パリのパスツール研究所）に寄託されたマウス起源のハイブリドーマに関する。前記ハイブリドーマは、免疫化したＢａｌｂ／ｃマウス脾細胞およびＳｐ  ２Ｏ  Ａｇ  １４ミエローマ細胞系の融合により得られた。
【００７０】
以下の表２に、本発明に係る種々の抗体に対応する種々のアミノ酸配列を、参考のためにＩＭＧＴに従って定義されるＣＤＲ配列ならびにキメラ軽鎖および重鎖と共に要約する。
【００７１】
【表２】
2013507114.tif 000003
【００７２】
本発明に係る抗体には、ヒト化抗体（Ｈｚまたはｈｚ）と言及される特別なキメラ型の抗体も含有される。
【００７３】
ヒト化抗体とは、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含み且つ抗体分子の他の部分が１（または複数）のヒト抗体またはヒト生殖系列に由来する抗体を意味すると理解される。更に、（ＦＲと呼ばれる）骨格のセグメントの残基の一部を、結合親和性を保存するために改変してもよい（Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988；Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988）。
【００７４】
本発明に係るヒト化抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の技術（例えば、文献Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992；Mountain et al, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992；またはBebbington et al, Bio/Technology, 10:169-175, 1992に記載されている技術等）により作製することができる。本発明に係るそのようなヒト化抗体は、インビトロでの診断法またはインビボでの予防的および／もしくは治療的処置における使用に好ましい。他のヒト化技術、例えば、欧州特許第０４５１２６１号、同第０６８２０４０号、同第０９３９１２７号、同第０５６６６４７号、米国特許第５，５３０，１０１号、同第６，１８０，３７０号、同第５，５８５，０８９号、および同第５，６９３，７６１号の主題である、ＰＤＬに記載されている「ＣＤＲグラフト化（ＣＤＲ  Ｇｒａｆｔｉｎｇ）」の技術等も当業者に公知である。更に、米国特許第５，６３９，６４１号、同第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号、および同第５，８７７，２９３号を挙げることができる。
【００７５】
更に、本発明は前述のキメラ抗体に由来するヒト化抗体にも関する。
【００７６】
好ましくは、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域は、それぞれ、ラムダまたはカッパ領域およびガンマ−１、ガンマ−２、またはガンマ−４領域である。
【００７７】
より具体的には、以下の実施例に関してより明らかになるように、本出願人は、本発明に係る抗体のヒト化バリアントを複数作製した。
【００７８】
別の好ましい態様では、本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号４６、４７、４８、もしくは４９のアミノ酸配列を含む配列を有するか最適なアラインメント後に配列番号４６、４７、４８、もしくは４９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号５０、５１、５２、もしくは５３のアミノ酸配列を含む配列を有するか最適なアラインメント後に配列番号５０、５１、５２、もしくは５３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
【００７９】
本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖可変ドメインＨｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ１と、配列番号５０のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ２、配列番号５２のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ３、および配列番号５３のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４からなる群から選択される重鎖可変ドメインとを含むことを特徴とする。
【００８０】
本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖可変ドメインＨｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ２と、配列番号５０のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ２、配列番号５２のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ３、および配列番号５３のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４からなる群から選択される重鎖可変ドメインとを含むことを特徴とする。
【００８１】
本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖可変ドメインＨｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ３と、配列番号５０のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ２、配列番号５２のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ３、および配列番号５３のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４からなる群から選択される重鎖可変ドメインとを含むことを特徴とする。
【００８２】
本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号４９を含む配列を有する軽鎖可変ドメインＨｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ４と、配列番号５０のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ２、配列番号５２のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ３、および配列番号５３のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４からなる群から選択される重鎖可変ドメインとを含むことを特徴とする。
【００８３】
本発明の第１の好ましい態様は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン配列および配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ１ＶＨＶａｒ１またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００８４】
本発明の第２の好ましい態様は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン配列および配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ２ＶＨＶａｒ２またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００８５】
本発明の第３の好ましい態様は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン配列および配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ３ＶＨＶａｒ３またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００８６】
本発明の第４の好ましい態様は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン配列および配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ４ＶＨＶａｒ４またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００８７】
別の態様では、本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６２、６３、６４、もしくは６５のアミノ酸配列を含む配列を有するか最適なアラインメント後に配列番号６２、６３、６４、もしくは６５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する軽鎖ならびに／または配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、もしくは７３のアミノ酸配列を含む配列を有するか最適なアラインメント後に配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、もしくは７３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する重鎖を含むことを特徴とする。
【００８８】
より具体的には、本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントはＩｇＧ１であり、また、配列番号６２、６３、６４、もしくは６５のアミノ酸配列を含む配列を有するか最適なアラインメント後に配列番号６２、６３、６４、もしくは６５と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する軽鎖および／または配列番号６６、６７、６８、もしくは６９のアミノ酸配列を含む配列を有するか最適なアラインメント後に配列番号６６、６７、６８、もしくは６９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する重鎖を含むことを特徴とする。
【００８９】
本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６２のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ１と、配列番号６６のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ１（Ｇ１）、配列番号６７のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ２（Ｇ１）、配列番号６８のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ３（Ｇ１）、および配列番号６９のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４（Ｇ１）からなる群から選択される重鎖とを含むことを特徴とする。
【００９０】
本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ２と、配列番号６６のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ１（Ｇ１）、配列番号６７のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ２（Ｇ１）、配列番号６８のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ３（Ｇ１）、および配列番号６９のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４（Ｇ１）からなる群から選択される重鎖とを含むことを特徴とする。
【００９１】
本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ３と、列番号６６のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ１（Ｇ１）、配列番号６７のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ２（Ｇ１）、配列番号６８のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ３（Ｇ１）、および配列番号６９のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４（Ｇ１）からなる群から選択される重鎖とを含むことを特徴とする。
【００９２】
本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ４と、配列番号６６のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ１（Ｇ１）、配列番号６７のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ２（Ｇ１）、配列番号６８のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ３（Ｇ１）、および配列番号６９のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４（Ｇ１）からなる群から選択される重鎖とを含むことを特徴とする。
【００９３】
本発明の第１の好ましい態様は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ１ＶＨＶａｒ１（Ｇ１）またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００９４】
本発明の第２の好ましい態様は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ２ＶＨＶａｒ２（Ｇ１）またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００９５】
本発明の第３の好ましい態様は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ３ＶＨＶａｒ３（Ｇ１）またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００９６】
本発明の第４の好ましい態様は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ４ＶＨＶａｒ４（Ｇ１）またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００９７】
本発明の第５の好ましい態様は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ３ＶＨＶａｒ２（Ｇ１）またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００９８】
本発明の第６の好ましい態様は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ２ＶＨＶａｒ３（Ｇ１）またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【００９９】
より具体的には、本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントはＩｇＧ２であり、また、配列番号６２、６３、６４、もしくは６５のアミノ酸配列を含む配列を有するか最適なアラインメント後に配列番号６２、６３、６４、もしくは６５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する軽鎖および／または配列番号７０、７１、７２、もしくは７３のアミノ酸配列を含む配列を有するか最適なアラインメント後に配列番号７０、７１、７２、もしくは７３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する重鎖を含むことを特徴とする。
【０１００】
本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６２のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ１と、配列番号７０のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ１（Ｇ２）、配列番号７１のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ２（Ｇ２）、配列番号７２のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ３（Ｇ２）、および配列番号７３のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４（Ｇ２）からなる群から選択される重鎖とを含むことを特徴とする。
【０１０１】
本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ２と、配列番号７０のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ１（Ｇ２）、配列番号７１のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ２（Ｇ２）、配列番号７２のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ３（Ｇ２）、および配列番号７３のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４（Ｇ２）からなる群から選択される重鎖とを含むことを特徴とする。
【０１０２】
本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ３と、配列番号７０のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ１（Ｇ２）、配列番号７１のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ２（Ｇ２）、配列番号７２のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ３（Ｇ２）、および配列番号７３のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４（Ｇ２）からなる群から選択される重鎖とを含むことを特徴とする。
【０１０３】
本発明のヒト化抗体または誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ４と、配列番号７０のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ１（Ｇ２）、配列番号７１のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ２（Ｇ２）、配列番号７２のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ３（Ｇ２）、および配列番号７３のアミノ酸配列を含む配列を有するＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４（Ｇ２）からなる群から選択される重鎖とを含むことを特徴とする。
【０１０４】
本発明の第１の好ましい態様は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ１ＶＨＶａｒ１（Ｇ２）またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【０１０５】
本発明の第２の好ましい態様は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ２ＶＨＶａｒ２（Ｇ２）またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【０１０６】
本発明の第３の好ましい態様は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ３ＶＨＶａｒ３（Ｇ２）またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【０１０７】
本発明の第４の好ましい態様は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号７３のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ４ＶＨＶａｒ４（Ｇ２）またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【０１０８】
本発明の第５の好ましい態様は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ３ＶＨＶａｒ２（Ｇ２）またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【０１０９】
本発明の第６の好ましい態様は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖配列および配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含むヒト化抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＬＶａｒ２ＶＨＶａｒ３（Ｇ２）またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを開示する。
【０１１０】
以下の表３に、本発明に係る種々の抗体に対応する種々のアミノ酸配列を、参考のためにＩＭＧＴに従い定義されるＣＤＲ配列ならびに種々のヒト化軽鎖および重鎖と共に要約する。
【０１１１】
【表３】
2013507114.tif 000004
【０１１２】
ヒンジ領域を安定化してより均質な抗体を発現させるために、Angal et al., 1993に記載されているようにＩｇＧ４由来抗体を更に改変してもよい（Ｓｅｒ２２６からＰｒｏへの変化）。
【０１１３】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプに対応する態様における抗体の更なる特徴は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）および／またはＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）等のエフェクター機能を有することである。
【０１１４】
免疫グロブリンの重鎖は、Ｆｄ領域、ヒンジ領域、およびＦｃ領域（結晶化可能フラグメント）の３つの機能的領域に分けられる。Ｆｄ領域は、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、軽鎖と共にＦａｂ、すなわち抗原結合性断片を形成する。Ｆｃフラグメントは、免疫グロブリンのエフェクター機能を担い、エフェクター機能には、例えばエフェクター細胞の同族Ｆｃ受容体への補体の固定および結合が含まれる。ヒンジ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤの免疫グロブリンクラスに見られ、Ｆｃ領域に対してＦａｂ部分が空間中で自由に動けるようにする柔軟なスペーサーとして働く。ヒンジドメインは構造的に多様であり、免疫グロブリンのクラスおよびサブクラス間で配列および長さのどちらも異なる。
【０１１５】
結晶学的研究によれば、免疫グロブリンのヒンジ領域は構造的および機能的に更に３つの領域、すなわち上側ヒンジ（ｕｐｐｅｒ  ｈｉｎｇｅ）、コア、および下側ヒンジ（ｌｏｗｅｒ  ｈｉｎｇｅ）に細分することができる（Shin et al., Immunological Reviews 130:87, 1992）。上側ヒンジはＣＨ１のカルボキシル末端から動きを制限するヒンジ中の最初の残基まで、通常、２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合を形成する最初のシステイン残基までのアミノ酸を含む。上側ヒンジ領域の長さは、抗体のセグメントの柔軟性に関連する。コアヒンジ領域は重鎖間ジスルフィドブリッジを含有する。下側ヒンジ領域は、ＣＨ２ドメインのアミノ末端をつなぎ、ＣＨ２ドメインの残基を含む。ヒトＩｇＧ１のコアヒンジ領域は、配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓを含有し、これはジスルフィド結合形成により二量体化した時に、軸として働くと考えられている環状オクタペプチドを生じ、柔軟性を付与する。免疫グロブリンのヒンジ領域ポリペプチド配列の構造および柔軟性により可能なコンホメーション変化は、抗体のＦｃ部分のエフェクター機能に影響を与え得る。
【０１１６】
本発明の特定の態様によれば、本発明に係るキメラ抗体は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むヒンジ領域を含むことを特徴とする。
【０１１７】
より具体的には、キメラ抗体ｃ２１４Ｂ２は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む配列を有する軽鎖および配列番号３８のアミノ酸配列を含む配列を有する重鎖を含む。
【０１１８】
更に、以下の実施例に示されるように、本発明に係る抗体は、腫瘍細胞の増殖を阻害できるという点で、これまで知られている抗体と異なる。
【０１１９】
前述したように、ＣＤ１５１タンパク質はテトラスパニンファミリーに属し、そのため、細胞外ループとも呼ばれる２個の細胞外ドメインＥＣ１（１８アミノ酸、配列［４０〜５７］）およびＥＣ２（１０９アミノ酸、配列［１１３〜２２１］）を含有する。
【０１２０】
本発明によれば、使用される抗体は、細胞外ドメインに位置する少なくとも１つのエピトープに結合することができる。好ましくは、前記抗体は、自身をループＥＣ１および／またはＥＣ２に固定する。
【０１２１】
より具体的には、本発明の好ましい態様では、それぞれＣＤ１５１タンパク質のアミノ酸４０〜５７および１１３〜２２１に対応する細胞外ループ１（ＥＣ１）および／または２（ＥＣ２）、好ましくはＥＣ２、に含まれるエピトープに結合できる少なくとも１つの抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的フラグメントの１つの使用が記載される。
【０１２２】
ＥＣ１ループ［４０〜５７］は１８アミノ酸を含有し、理論重量は２００２．２Ｄａである。
【０１２３】
ＥＣ２ループ［１１３〜２２１］はＮ−グリコシル化部位（残基Ａｓｎ１５９）および３個のジスルフィドブリッジを形成する６個のシステイン残基を有する。テトラスパニン、特にＣＤ１５１のＥＣ２ループの構造モデルがテトラスパニンＣＤ８１のＥＣ２ループの３次元構造に基づいて提唱されている（Seigneuret et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 40055-40064）。そのモデルに基づくと、テトラスパニンは、３個のαヘリックスおよび特異的可変ドメインから構成される一般的な比較的保存されたスキャフォールドを有する。ＣＤ１５１では、このスキャフォールドは領域［１１３〜１５７］および［２０９〜２２１］で構成されると考えられ、可変ドメインは領域［１５８〜２０８］で構成されると考えられる。
【０１２４】
ＥＣ２ループの可変ドメインは特に、ＣＤ１５１とインテグリンファミリーのタンパク質との特異的相互作用に関与すると考えられる。定方向突然変異実験により、インテグリンα３β１またはα６β４等の特定のラミニン受容体インテグリンとのＣＤ１５１の会合において、領域［１９３〜２０８］、より正確にはトリペプチドＱＲＤ［１９４〜１９６］および１９２位のシステイン残基の重要性が特に示された（Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309）。
【０１２５】
更により好ましくは、本発明は、ＥＣ２領域のエピトープに結合できる少なくとも１つの抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的フラグメントの１つの使用に関する。
【０１２６】
新規な態様では、本発明は、以下の核酸から選択されることを特徴とする単離された核酸に関する：
ａ）上記ａ）で定義された抗体またはその誘導体化合物もしくは機能的フラグメントの１つをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ核酸；
ｂ）上記で定義した核酸に相補的な核酸；
ｃ）高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１６〜１８、３４〜３６、３９、４０、４５、５４〜６１、もしくは７４〜８５の核酸配列の少なくとも１つまたは最適なアラインメント後に前記配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する配列とハイブリダイズできる少なくとも１８ヌクレオチドの核酸。
【０１２７】
以下の配列の群から選択される核酸配列の少なくとも１つと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる少なくとも１８ヌクレオチドの核酸がより好ましい：
・配列番号１６の配列を起源とし、配列番号７の配列のフラグメントａａ１１２〜２１８をコードする配列；
・配列番号１７の配列を起源とし、配列番号８の配列のフラグメントａａ１１９〜４４８をコードする配列；
・配列番号１８の配列を起源とし、配列番号９の配列のフラグメントａａ１１９〜４４５をコードする配列；
・配列番号３４の配列を起源とし、配列番号２５の配列のフラグメントａａ１０８〜２１４をコードする配列；
・配列番号３５の配列を起源とし、配列番号２６の配列のフラグメントａａ１２０〜４４９をコードする配列；および
・配列番号３６の配列を起源とし、配列番号２７の配列のフラグメントａａ１２０〜４４６をコードする配列。
・配列番号３９の配列を起源とし、配列番号３７の配列のフラグメントａａ１０８〜２１４をコードする配列；および
・配列番号４０の配列を起源とし、配列番号３８の配列のフラグメントａａ１２０〜４４９をコードする配列。
・配列番号４５の配列を起源とし、配列番号４４の配列のフラグメントａａ１３９〜４６３をコードする配列；
・配列番号７４の配列を起源とし、配列番号６２の配列のフラグメントａａ１０８〜２１４をコードする配列；
・配列番号７５の配列を起源とし、配列番号６３の配列のフラグメントａａ１０８〜２１４をコードする配列；
・配列番号７６の配列を起源とし、配列番号６４の配列のフラグメントａａ１０８〜２１４をコードする配列；
・配列番号７７の配列を起源とし、配列番号６５の配列のフラグメントａａ１０８〜２１４をコードする配列；
・配列番号７８の配列を起源とし、配列番号６６の配列のフラグメントａａ１２０〜４４９をコードする配列；
・配列番号７９の配列を起源とし、配列番号６７の配列のフラグメントａａ１２０〜４４９をコードする配列；
・配列番号８０の配列を起源とし、配列番号６８の配列のフラグメントａａ１２０〜４４９をコードする配列；
・配列番号８１の配列を起源とし、配列番号６９の配列のフラグメントａａ１２０〜４４９をコードする配列；
・配列番号８２の配列を起源とし、配列番号７０の配列のフラグメントａａ１２０〜４４４をコードする配列；
・配列番号８３の配列を起源とし、配列番号７１の配列のフラグメントａａ１２０〜４４４をコードする配列；
・配列番号８４の配列を起源とし、配列番号７２の配列のフラグメントａａ１２０〜４４４をコードする配列；および
・配列番号８５の配列を起源とし、配列番号７３の配列のフラグメントａａ１２０〜４４４をコードする配列。
【０１２８】
以下の表４に、本発明に係る抗体に関係する種々のヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴに従い定義されるＣＤＲ配列ならびにキメラ軽鎖および重鎖と共に要約する。
【０１２９】
【表４】
2013507114.tif 000005
【０１３０】
以下の表５に、本発明に係る抗体に関係する種々のヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴに従い定義されるＣＤＲ配列ならびに種々のヒト化軽鎖および重鎖と共に要約する。
【０１３１】
【表５】
2013507114.tif 000006
【０１３２】
核酸、核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列という用語は、本明細書において相互に交換可能に使用されており、非天然ヌクレオチドを含んでも含まなくてもよい核酸のフラグメントまたは領域を定義することを可能にする、修飾されていてもいなくてもよい、ヌクレオチドの正確な連結を意味し、これは二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、および前記ＤＮＡの転写産物にも同様に対応し得ると理解される。
【０１３３】
また、本発明において、本発明は、天然の染色体環境にあるヌクレオチド配列、すなわち天然の状態にあるヌクレオチド配列に関するものではないと理解されなければならない。これらは、単離および／または精製された配列であり、すなわち、例えば複製することにより直接または間接的に抽出されており、そららの環境は少なくとも部分的に改変されている。また、本発明において、これらは、例えば宿主細胞を用いた遺伝子組換えにより得られるまたは化学合成により得られる単離された核酸を意味すると理解される。
【０１３４】
最適なアラインメント後に好ましい配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性パーセンテージを有する核酸配列とは、参照配列に対して特定の改変、特に欠失、切断、延長、キメラ融合、および／または置換、特に点置換等を有する核酸配列を意味すると理解される。これらは、特に後述するように、好ましくは、遺伝暗号の縮重により参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列または好ましくは高ストリンジェンシー条件下で参照配列と特異的にハイブリダイズできる相補的配列である。
【０１３５】
高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションとは、ＤＮＡの２つの相補的フラグメント間でのハイブリダイゼーションを維持することができるように温度およびイオン強度の条件が選択されていることを意味する。例として、前述のポリヌクレオチドフラグメントを定義するためのハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェンシー条件は、好ましくは以下の通りである。
【０１３６】
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは２段階で行われる：（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウムの溶液に相当）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハルト液、５％硫酸デキストラン、および１％サケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中での４２℃、３時間のプレハイブリダイゼーション；（２）プローブのサイズに応じた温度（すなわち、１００ヌクレオチドより大きいサイズのプローブでは４２℃）で２０時間の適切なハイブリダイゼーション、次いで、２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中で２０℃、２０分間の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で２０℃、２０分間の洗浄を１回。最後の洗浄は、１００ヌクレオチドを超えるサイズのプローブでは０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で６０℃にて３０分間行う。当業者は、上記の規定のサイズのポリヌクレオチドのための高ストリンジェンシー条件を、Sambrook et al., (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor)の教示に従い、より大きいまたは小さいサイズのオリゴヌクレオチド用に適合させることができる。
【０１３７】
本発明は更に、本発明に係る核酸を含むベクターに関する。
【０１３８】
本発明は、特に、本発明に係るヌクレオチド配列を含有するクローニングおよび／または発現ベクターに関する。
【０１３９】
本発明に係るベクターは、好ましくは、特定の宿主細胞中でのヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能にするエレメントを含む。次いで、ベクターは、プロモーター、翻訳の開始および終結シグナル、ならびに適切な転写調節領域を含まなければならない。ベクターは、宿主細胞中に安定に維持することができなければならず、必要に応じて、翻訳されたタンパク質を分泌させる特定のシグナルを有してもよい。これらの種々のエレメントは、使用される細胞宿主に応じて当業者により選択および最適化される。そのために、本発明に係るヌクレオチド配列は、選択された宿主内の自己複製ベクター中に挿入してもよく、選択された宿主に組み込まれるベクターであってもよい。
【０１４０】
そのようなベクターは、当業者が通常用いる方法により調製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヒートショック、または化学的方法等の標準的な方法により好適な宿主中に導入することができる。
【０１４１】
本発明に係るベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。これらは、本発明に係るヌクレオチド配列をクローニングまたは発現するための宿主細胞の形質転換に有用である。
【０１４２】
本発明はまた、本発明に係るベクターにより形質転換されたまたは本発明に係るベクターを含有する宿主細胞を含む。
【０１４３】
細胞宿主は、原核系から選択してもよく、真核系から選択されてもよく、例えば細菌細胞、酵母細胞、または動物細胞、特に哺乳動物細胞から選択されてよい。昆虫細胞または植物細胞を使用してもよい。
【０１４４】
本発明は更に、本発明に係る形質転換細胞を含む、ヒト以外の動物に関する。
【０１４５】
別の態様によれば、本発明は、以下の工程を含むことを特徴とする、本発明に係る抗体またはその機能的フラグメントの１つを産生する方法に関する：
ａ）好適な培養培地中および好適な培養条件下での本発明に係る宿主細胞の培養；および
ｂ）前記培養培地または前記培養細胞からその結果産生された前記抗体またはその機能的フラグメントの回収。
【０１４６】
本発明に係る形質転換細胞は、本発明に係る組換えポリペプチドの調製方法にも使用することができる。本発明に係るベクターおよび／またはベクターで形質転換された細胞を用いることを特徴とする、組換え型の本発明に係るポリペプチドの調製方法自体も本発明に含まれる。好ましくは、本発明に係るベクターで形質転換された細胞を前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養し、前記組換えペプチドを回収する。
【０１４７】
既に述べたように、細胞宿主は原核系から選択されてもよく、真核系から選択されてもよい。特に、そのような原核系または真核系における分泌を容易にする本発明に係るヌクレオチド配列を同定することが可能である。したがって、そのような配列を有する本発明に係るベクターは、分泌されることを意図した組換えタンパク質の産生に有利に使用することができる。実際、これらの目的の組換えタンパク質の精製は、これらが宿主細胞の内部ではなく細胞培養液の上清に存在することにより、容易になる。
【０１４８】
本発明に係るポリペプチドを化学合成により調製することも可能である。そのような調製方法も本発明に主題に含まれる。当業者には、化学合成の方法、例えば固相を用いた技術（特にSteward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd Ed., (1984)参照）、部分的固相を用いた技術、フラグメントの縮合を用いた技術、または従来の溶液中での合成を用いた技術は公知である。対応する非天然アミノ酸を含有していてもよい化学合成で得られたポリペプチドも本発明に含まれる。
【０１４９】
本発明に係る方法により得ることができる抗体またはその誘導体化合物もしくは機能的フラグメントも本発明に含まれる。
【０１５０】
更に別の態様では、本発明は、更に二重特異性である、すなわち、ＣＤ１５１以外のヒトタンパク質またはヒト受容体に特異的に結合できることを特徴とする上記の抗体に関する。
【０１５１】
二重特異性、または二機能性の抗体は、同じ分子中で２つの異なる可変領域が組み合わされた第２世代のモノクローナル抗体を構成する（Hollinger and Bohlen, 1999, Cancer and metastasis rev. 18: 411-419）。その有用性は、新規なエフェクター機能をリクルートする能力または腫瘍細胞表面上の複数の分子を標的にする能力により、診断分野および治療分野の両方で実証されている。これらの抗体は、化学的方法（Glennie MJ et al. 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375；Repp R. et al. 1995 J. Hemat. 377-382）または体細胞的方法（Staerz U.D. and Bevan M.J. 1986 PNAS 83, 1453-1457；Suresh M.R. et al. 1986 Method Enzymol. 121: 210-228）により得ることができ、更に、好ましくは,、ヘテロ二量体を形成させることで求める抗体の精製方法を容易化することができる遺伝子工学技術（Merchand et al. 1998 Nature Biotech. 16: 677-681）によっても得ることができる。
【０１５２】
これらの二重特異性抗体は、ＩｇＧ全体として、二重特異性Ｆａｂ’２として、Ｆａｂ’ＰＥＧとして、または二重特異性抗体もしくは二重特異性ｓｃＦｖとして構築することができ、更に、標的の抗原それぞれに対して２つの固定部位が存在する四価の二重特異性抗体（Park et al. 2000 Mol. Imnmunol. 37(18): 1123-30）または前述のようにそのフラグメントとしても構築することができる。
【０１５３】
二重特異性抗体の産生および投与が２種類の特異的抗体の産生ほど面倒でないことによる経済的利点に加え、そのような二重特異性抗体の使用は、処置の毒性が低減されるという利点がある。二重特異性抗体を使用することで、実際、循環する抗体の全体量を低減することができ、その結果、潜在的な毒性を低減することができる。
【０１５４】
本発明の好ましい態様では、二重特異性抗体は二価または四価の抗体である。
【０１５５】
最後に、本発明は、医薬としての上記の抗体またはその誘導体化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【０１５６】
本発明は更に、本発明に係る抗体またはその誘導体化合物もしくは機能的フラグメントの１つからなる化合物を活性成分として含む医薬組成物に関する。好ましくは、前記抗体に、補形剤および／または薬学的に許容されるキャリアが添加される。
【０１５７】
更に別の態様によれば、本発明は更に、同時使用、個別使用、または時間差使用のための組合せ製品（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ）として、少なくとも１つの他の抗体、細胞毒性(cytotoxic)／細胞増殖抑制(cytostatic)剤、細胞毒、または放射性元素を更に含む、上記医薬組成物に関する。
【０１５８】
「同時使用」とは、同じ１つの製剤に含有される本発明に係る組成物の２つの化合物の投与と理解される。
【０１５９】
「個別使用」とは、別個の製剤に含有される本発明に係る組成物の２つの化合物の同時投与として理解される。
【０１６０】
「時間差使用（ｔｉｍｅ−ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｕｓｅ）」とは、それぞれが別個の製剤に含有される本発明に係る組成物の２つの化合物の逐次投与として理解される。
【０１６１】
一般的に、本発明に係る組成物は、癌の処置の有効性をかなり増加させる。言い換えると、本発明に係る抗体の治療効果は、細胞毒性薬剤の投与により予想外に増強される。本発明に係る組成物によりその結果得られるもう１つの主な利点は、使用する活性成分の有効量がより少なくなることに関連し、これにより、副次的影響、特に細胞毒性薬剤の影響が現れるリスクを回避または低減することができる。更に、本発明に係るこの組成物は、予期される治療効果をより迅速に達成することを可能にするはずである。
【０１６２】
「抗癌治療薬剤」または「細胞毒性薬剤」は、患者に投与された時に、患者における癌の発症を処置または防止する物質として理解されるべきである。そのような薬剤の非限定的な例として、「アルキル化」剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、血管形成阻害剤、抗エストロゲン薬、抗アンドロゲン薬、または免疫調節剤を挙げることができる。
【０１６３】
そのような薬剤は、例えば、ＶＩＤＡＬの腫瘍学および血液学に関する頁の「細胞毒性薬剤」の欄に記載されており、この文献に参照として記載されているそのような細胞毒性化合物が本発明において好ましい細胞毒性薬剤として挙げられる。
【０１６４】
「アルキル化剤」とは、細胞内の任意の分子（好ましくは核酸（例えばＤＮＡ））に共有結合するかこれをアルキル化できる任意の物質を意味する。そのようなアルキル化剤の例として、ナイトロジェンマスタード、例えばメクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン塩酸塩、ピポブロマン、プレドニムスチン第二リン酸ナトリウム（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、またはエストラムスチン；オキサゾホリン（ｏｘａｚｏｐｈｏｒｉｎｅ）、例えばシクロホスファミド、アルトレタミン、トロホスファミド、スルホスファミド、またはイホスファミド；アジリジンまたはエチレン−イミン、例えばチオテパ、トリエチレンアミン、またはアルテトラミン（ａｌｔｅｔｒａｍｉｎｅ）；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、ストレプトゾシン、フォテムスチン、またはロムスチン；アルキルスルホン酸塩、例えばブスルファン、トレオスルファン、またはインプロスルファン；トリアゼン、例えばダカルバジン；および白金複合体、例えばシスプラチン、オキサリプラチン、またはカルボプラチンを挙げることができる。
【０１６５】
「代謝拮抗薬」とは、特定の活性、一般的にはＤＮＡ合成、を妨げることで細胞成長および／または細胞代謝をブロックする物質を意味する。代謝拮抗薬の例としては、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、クロロデオキシアデノシン、５−アザシチジン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシン、およびペントスタチンを挙げることができる。
【０１６６】
「抗腫瘍抗生物質」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質の合成を防止または阻害できる化合物を意味する。そのような抗腫瘍抗生物質の例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、およびプロカルバジンが含まれる。
【０１６７】
「有糸分裂阻害剤」は細胞周期および有糸分裂の正常な進行を防止する。一般的に、微小管阻害剤または「タキソイド」、例えばパクリタキセルおよびドセタキセルは、有糸分裂を阻害することができる。ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン等のビンカアルカロイドも有糸分裂を阻害することができる。
【０１６８】
「クロマチン機能阻害剤」または「トポイソメラーゼ阻害剤」とは、トポイソメラーゼＩ、ＩＩ等のクロマチン再構築タンパク質の正常な機能を阻害する物質を意味する。そのような阻害剤の例としては、トポイソメラーゼＩに対してはカンプトテシン、更にその誘導体、例えばイリノテカンまたはトポテカン、トポイソメラーゼＩＩに対してはエトポシド、リン酸エチポシド、およびテニポシドが含まれる。
【０１６９】
「血管新生阻害剤」とは、血管の成長を阻害する任意の薬物、化合物、物質、または薬剤を意味する。血管新生阻害剤の例としては、限定されるものではないが、ラゾキシン、マリマスタット、バチマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、イロマスタット、ＣＧＳ−２７０２３Ａ、ハロフジノン、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、サリドマイド、ＣＤＣ  ５０１、ＤＭＸＡＡ、Ｌ−６５１５８２、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン−アルファ、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチン、およびビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）が含まれる。
【０１７０】
「抗エストロゲン薬」または「抗エストロゲン剤」とは、エストロゲンの作用を低減、拮抗、または阻害する任意の物質を意味する。そのような薬剤の例としては、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、イオドキシフェン、アナストロゾール、レトロゾール、およびエキセメスタンが挙げられる。
【０１７１】
「抗アンドロゲン薬」または「抗アンドロゲン剤」とは、アンドロゲンの作用を低減、拮抗、または阻害する任意の物質を意味する。抗アンドロゲン薬の例としては、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、スピロノラクトン、酢酸シプロテロン、フィナステリド、およびシミチジンが挙げられる。
【０１７２】
免疫調節物質とは免疫系を刺激する物質である。そのような免疫調節物質の例としては、インターフェロン、インターロイキン、例えばアルデスロイキン、ＯＣＴ−４３、デニロイキンジフリトクス、またはインターロイキン−２；腫瘍壊死因子、例えばタソネルミン；またはその他の種類の免疫調節物質、例えばレンチナン、シゾフィラン、ロキニメックス、ピドチモド、ペガデマーゼ、チモペンチン、ポリＩ：Ｃ、もしくはレバミソールと５−フルオロウラシルの組合せが含まれる。
【０１７３】
更なる詳細について、当業者はFrench Association of Teachers of Therapeutic Chemistryから刊行された"Traite de chimie therapeutique, Vol. 6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, ed. TEC & DOC, 2003"というタイトルのマニュアルを参照することができる。
【０１７４】
特に好ましい態様では、本発明に係る組合せ製品の形態の前記組成物は、前記細胞毒性薬剤が同時使用のために前記抗体に化学的に結合していることを特徴とする。
【０１７５】
特に好ましい態様では、本発明に係る前記組成物は、前記細胞毒性／細胞増殖抑制剤が、紡錘体の阻害剤または安定化剤、好ましくはビノレルビンおよび／またはビンフルニンおよび／またはビンクリスチンから選択されることを特徴とする。
【０１７６】
前記細胞毒性薬剤と本発明に係る前記抗体の間の結合を容易化するために、特に、例えばポリエチレングリコール等のポリ（アルキレン）グリコール、更にはアミノ酸等のスペーサー分子を、結合させる２つの化合物の間に導入することができ、あるいは別の態様では、本発明に係る前記抗体と反応できる機能が導入された前記細胞毒性薬剤の活性誘導体を使用することができる。これらの結合技術は当業者に周知であり、本明細書で詳細に説明しない。
【０１７７】
別の態様によれば、本発明は、前記抗体の少なくとも１つまたはその誘導体化合物もしくは機能的フラグメントの１つが細胞毒および／または放射性元素にコンジュゲートしていることを特徴とする組成物に関する。
【０１７８】
好ましくは、前記毒素または前記放射性元素は、腫瘍細胞の成長または増殖を防止することができ、特に前記腫瘍細胞を完全に不活性化することができる。
【０１７９】
更に好ましくは、前記毒素は、腸内細菌毒素、特にシュードモナス属の外毒素Ａである。
【０１８０】
好ましくは抗体とコンジュゲートしている、治療法に使用される放射性元素（すなわち放射性同位元素）は、ガンマ線を発する放射性同位元素、好ましくはヨウ素１３１、イットリウム９０、金１９９、パラジウム１００、銅６７、ビスマス２１７、アンチモン２１１である。ベータ線およびアルファ線を発する放射性同位元素も治療法に用いることができる。
【０１８１】
本発明に係る少なくとも１つの抗体またはその機能的フラグメントとコンジュゲートしている毒素または放射性元素とは、特に２つの化合物の間の共有結合により（連結分子を導入してもよい）、前記少なくとも１つの抗体に前記毒素または前記放射性元素を結合させることができる任意の手段を意味すると理解される。
【０１８２】
コンジュゲートの要素の全部または一部の化学的（共有）結合、静電的結合、または非共有結合を可能にする薬剤のうち、特に、ベンゾキノン、カルボジイミド、より具体的にはＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］−カルボジイミドヒドロクロリド）、ジマレイミド、ジチオビス−ニトロ−安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）、紫外線（ＵＶ）と反応する１または複数のフェニルアジド基と共に１または複数の基を有する「架橋（ｂｒｉｄｇｉｎｇ）」剤と呼ばれる薬剤、特に好ましくはＮ−［−４−（アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、および６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）を挙げることができる。
【０１８３】
特に放射性元素のための、別の形態の結合は、二官能性イオンキレート剤の使用からなり得る。
【０１８４】
それらのキレーターの中でも、金属、特に放射性金属と免疫グロブリンを結合させるために開発されたＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）に由来するキレーターを挙げることができる。したがって、リガンド−金属錯体の安定性および剛性を増大させるように炭素鎖上の種々な基をＤＴＰＡおよびその誘導体で置換することができる（Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991)；米国特許第４，８３１，１７５号）。
【０１８５】
例えば、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）およびその誘導体は、遊離形態または金属イオンとの錯体の形態のいずれかで医学および生物学において長い間非常に幅広く使用されてきており、金属イオンと安定なキレートを形成し、癌療法における放射性免疫複合体の開発のための抗体等の治療上または診断上関心のあるタンパク質に結合するという顕著な特徴を有する（Meases et al., (1984)；Gansow et al. (1990)）。
【０１８６】
また、本発明に係る前記コンジュゲートを形成する前記少なくとも１つの抗体は、その機能的フラグメント、特にｓｃＦｖフラグメント等のＦｃ構成要素を欠くフラグメントから選択されることが好ましい。
【０１８７】
本発明は、癌の防止もしくは処置のためまたは癌の防止もしくは処置に使用するための、好ましくは癌の処置のための、本発明に係る抗体または組成物を更に含む。
【０１８８】
同様に、本発明は、癌の防止または処置を意図した医薬の製造における本発明に係る抗体または組成物の使用を含む。
【０１８９】
本発明はまた、腫瘍細胞の増殖を阻害することを目的とする医薬の製造におけるまたはそのような医薬としての、好ましくはヒト化された、本発明に係る抗体またはその誘導体化合物もしくは機能的フラグメントの１つおよび／または組成物の使用に関する。一般的に、本発明は、癌を防止または処置することを意図した医薬の製造における、好ましくはヒト化された、本発明に係る抗体またはその誘導体化合物もしくは機能的フラグメントの１つおよび／または組成物の使用に関する。
【０１９０】
防止および／または処置され得る癌の中でも、前立腺癌、骨肉腫肺癌、乳癌、子宮内膜癌、結腸癌、多発性骨髄腫または卵巣癌、膵臓癌、または任意のその他の癌が好ましい。
【０１９１】
好ましくは、前記癌は、前立腺癌、肺癌、結腸癌、乳癌、および／または膵臓癌から選択される癌である。
【０１９２】
更に別の態様では、本発明は、ＣＤ１５１の発現レベルに関連する疾患の診断方法における好ましくはインビトロでの本発明に係る抗体の使用に関する。より具体的には、本発明は、ＣＤ１５１タンパク質の異常な存在が疑われる生体サンプルから開始する、ＣＤ１５１タンパク質が過剰発現または低発現する疾患のインビトロでの診断方法に関し、前記方法は、前記生体サンプルを本発明に係る抗体に接触させることからなり、前記抗体は適宜標識することができる。
【０１９３】
好ましくは、前記診断方法におけるＣＤ１５１タンパク質に関連する前記疾患は癌である。
【０１９４】
前記抗体またはその機能的フラグメントの１つは、検出可能および／または定量可能なシグナルを得るために標識された免疫複合体または抗体の形態であり得る。
【０１９５】
本発明に係る標識された抗体またはその機能的フラグメントとしては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、α−Ｄガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素、もしくはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素とまたはビオチン、ジゴキシゲニン、もしくは５−ブロモ−デオキシウリジン等の分子などがコンジュゲートされたものであり得る免疫複合体として言及される抗体が含まれる。本発明に係る抗体またはその機能的フラグメントに蛍光標識がコンジュゲートされてもよく、蛍光標識としては、特に、フルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ローダミンおよびその誘導体、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ダンシル、ウンベリフェロンが含まれる。そのようなコンジュゲートにおいて、本発明の抗体またはその機能的フラグメントは当業者に公知の方法で調製され得る。これらは、酵素または蛍光標識に直接結合してもよく、スペーサー基または連結基、例えばグルタルアルデヒド等のポリアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、またはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）を介して、または治療用コンジュゲートについて上記で述べたような結合剤の存在下で結合してもよい。フルオレセイン型の標識を含むコンジュゲートは、イソチオシアナートとの反応により調製することができる。
【０１９６】
更に、他のコンジュゲートは、ルミノール、ジオキセタン等の化学発光標識、ルシフェラーゼ、ルシフェリン等の生物発光標識、またはヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３３、臭素７７、テクネチウム９９ｍ、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ガリウム６７、ガリウム６８、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、水銀１０７、水銀２０３、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、スカンジウム４７、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、フッ素１８、イットリウム１９９、ヨウ素１３１等の放射性標識も含み得る。放射性同位元素を抗体に前述したＥＤＴＡまたはＤＴＰＡ等のキレート剤を介してまたは直接的に結合させるための既存の当業者に公知の方法を診断において放射性元素に用いることができる。したがって、クロラミンＴ技術による［Ｉ１２５］Ｎａを用いた標識［Hunter W.M. and Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495］またはCrockford et al.（米国特許第４４２４２００号）の技術によるテクネチウム９９ｍを用いた標識、またはHnatowich（米国特許第４４７９９３０号）に記載されているようにＤＴＰＡを介して固定された標識も挙げることができる。
【０１９７】
本発明はまた、ＣＤ１５１タンパク質を発現または過剰発現している細胞に生物学的活性化合物を特異的に標的化することを意図した医薬の製造における本発明に係る抗体の使用に関する。
【０１９８】
本発明において、生物学的活性化合物とは、細胞の活性、特にその成長、増殖、または遺伝子の転写もしくは翻訳を変化させることができる、特に阻害することができる、任意の化合物を意味すると理解される。
【０１９９】
本発明は更に、好ましくは標識された、特に放射標識された、本発明に係る抗体またはその機能的フラグメントの１つを含むインビボ診断試薬および医学的イメージング、特に細胞によるＣＤ１５１タンパク質の発現または過剰発現に関連する癌の検出におけるその使用に関する。
【０２００】
本発明は更に、医薬としての、本発明に係る、組合せ生成物の形態の組成物または抗ＣＤ１５１と毒素もしくは放射性元素とのコンジュゲートに関する。
【０２０１】
好ましくは、本発明に係る組合せ生成物の形態の前記組成物または前記コンジュゲートに、補形剤および／または薬学的に許容されるキャリアが添加される。
【０２０２】
本明細書中、薬学的に許容されるキャリアとは、副次的反応を生じさせずに、例えば活性化合物の投与を容易にするか、体内でのその寿命または有効性を増大させるか、溶液中へのその溶解性を増大させるか、その保存を改善することを可能にすることができる、医薬組成物に含まれる化合物または化合物の組合せを意味すると理解される。そのような薬学的に許容されるキャリアは周知であり、選択される活性化合物の投与の性質および形態に応じて当業者が適合させる。
【０２０３】
好ましくは、それらの化合物は、全身経路、特に静脈内経路、筋肉内、皮内、腹腔内、もしくは皮下経路、または経口経路で投与される。より好ましくは、本発明に係る抗体を含む組成物は、時間をずらして複数回に分けて投与される。
【０２０４】
これらの最適な投与形態、投与レジメン、および生薬形態は、患者に適した処置を確定する際に一般的に考慮される基準、例えば患者の年齢または体重、彼または彼女の全身状態の重篤度、処置の忍容性、および確かめられている副次的効果に従って決定することができる。
【０２０５】
したがって、本発明は、ＣＤ１５１を発現または過剰発現する細胞に生物学的活性化合物を特異的に標的化することを意図した医薬の製造における抗体またはその機能的フラグメントの１つの使用に関する。
【０２０６】
本発明のその他の特徴および利点は本明細書の以下の説明および実施例ならびに図面から明らかになるであろう。図面の説明を以下に示す。
【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１】ＣＤ１５１タンパク質のヌクレオチド配列およびタンパク質配列（それぞれ配列番号３７および配列番号３８）を示す図である。配列上にＥＣ１およびＥＣ２ループを示す。
【図２】ＣＤ１５１タンパク質が属するテトラスパニンの構造、より具体的には２個の細胞外ループＥＣ１およびＥＣ２を示す図である。
【図３】Ａ〜Ｅは、前立腺癌患者におけるＣＤ１５１分子の発現を示す図である。各文字が患者１名の研究に対応し、各患者について、上のパネルが腫瘍に隣接する正常組織に対応し、下のパネルが腫瘍組織に対応する。
【図４】Ａ〜Ｃは、肺癌患者におけるＣＤ１５１分子の発現を示す図である。各文字が患者１名の研究に対応し、各患者について、上のパネルが腫瘍に隣接する正常組織に対応し、下のパネルが腫瘍組織に対応する。
【図５】Ａ〜Ｄは、ＮＩＨ  ３Ｔ３−ＣＤ１５１細胞、ＰＣ３細胞、およびＡ５４９細胞の表面上でのマウス抗体２０３Ｂ６によるＣＤ１５１の認識のフローサイトメトリーによる分析を示す図である。
【図６】Ａ〜Ｄは、ＮＩＨ  ３Ｔ３−ＣＤ１５１細胞、ＰＣ３細胞、およびＡ５４９細胞の表面上でのマウス抗体２１４Ｂ２によるＣＤ１５１の認識のフローサイトメトリーによる分析示す図である。
【図７】重鎖および軽鎖について、マウス２１４Ｂ２のＶ領域およびＪ領域と最も近いマウス生殖系列とのアラインメントを示す図である。
【図８】２１４Ｂ２軽鎖のヒト化と種々の優先順位（Ｐｒｉｏｒｉｔｙ  Ｒａｎｋｉｎｇ）を示す図である。番号１は高優先度（標的認識、ＣＤＲの提示、および全体的３次元構造に対する影響が大きいと推定される）；番号２は中優先度；番号３は低優先度（標的認識、ＣＤＲの提示、および全体的３次元構造に対する影響が小さいと推定される）。
【図９】２１４Ｂ２重鎖のヒト化と種々の優先順位を示す図である。番号１は高優先度（標的認識、ＣＤＲの提示、および全体的３次元構造に対する影響が大きいと推定される）；番号２は中優先度；番号３は低優先度（標的認識、ＣＤＲの提示、および全体的３次元構造に対する影響が小さいと推定される）。
【図１０】キメラ抗体ｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］およびｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］のウェスタンブロットによる特異性実験を示す図である。
【図１１Ａ】図１１ＡおよびＢは、マウスＭａｂ２０３Ｂ６および２１４Ｂ２のキメラ型ｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］（Ａ）およびｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］（Ｂ）による、組換えＥＣ２への結合の阻害を示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび１１Ｂは、マウスＭａｂ２０３Ｂ６および２１４Ｂ２のキメラ型ｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］（Ａ）およびｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］（Ｂ）による、組換えＥＣ２への結合の阻害を示す図である。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、Ａ：ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］およびＢ：ｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］を用いた、ＰＣ３へのキメラ抗体の結合を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび１２Ｂは、Ａ：ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］およびＢ：ｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］を用いた、ＰＣ３へのキメラ抗体の結合を示す図である。
【図１３】アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞系であるＰＣ３の腫瘍成長に対するｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］Ｍａｂのインビボ活性を示す図である。
【図１４】ＰＣ３細胞接着に対する種々の型のＭａｂ２１４Ｂ２の影響を顕微鏡分析した図である。
【図１５Ａ】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＰＣ３細胞接着に対する種々の型のＭａｂ２１４Ｂ２の影響をＡＴＰアッセイを用いて分析した図である。各ウェル中で、０〜２０００００細胞／ウェルのＰＣ３の標準曲線を用いて接着細胞の数を求めた。結果は以下のように示されている：非処理細胞を基準（１００％）とし、処理細胞を基準に対する％で表す。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＰＣ３細胞接着に対する種々の型のＭａｂ２１４Ｂ２の影響をＡＴＰアッセイを用いて分析した図である。各ウェル中で、０〜２０００００細胞／ウェルのＰＣ３の標準曲線を用いて接着細胞の数を求めた。結果は以下のように示されている：非処理細胞を基準（１００％）とし、処理細胞を基準に対する％で表す。
【図１６】２１４Ｂ２重鎖可変ドメインとヒト生殖系列ｈＩＧＨＶ１−２＊０２およびＩＧＨＪ６＊０１のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。２１４Ｂ２ＶＨアミノ酸配列を、選択されたヒトアクセプターフレームワーク配列とアラインメントさせ、２１４Ｂ２とヒト生殖系列の間で異なる各残基に優先順位を付けた。１が最も高い優先度を示し、４が最も低い優先度を示す優先順位に従って、残基を逆突然変異させる。Ｖａｒ１〜Ｖａｒ４の配列は、構築された２１４Ｂ２  ＶＨドメインのヒト化バリアントに相当し、逆突然変異させた残基が太字で示されている。バリアント１（Ｖａｒ１）は逆突然変異がなく、最もヒトに近いバリアントを表す。
【図１７】２１４Ｂ２軽鎖とヒト生殖系列ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１およびＩＧＫＪ２＊０１のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。２１４Ｂ２  ＶＬアミノ酸配列を、選択されたヒトアクセプターフレームワーク配列とアラインメントさせた。ＶＬ  Ｖａｒ１〜Ｖａｒの３配列は、構築された２１４Ｂ２  ＶＬドメインのヒト化バリアントに相当し、逆突然変異させた残基が太字で示されている。バリアント１（Ｖａｒ１）は逆突然変異がなく、最もヒトに近いバリアントを表す。バリアント２は１３個の逆変異を有し、最もマウスに近いバリアントである。バリアント３は５個の逆変異を有する。
【図１８】キメラ２４１Ｂ２とヒト化２１４Ｂ２の種々のバリアントとによるマウス抗体ｍ２４Ｂ２の交差ブロッキングを示す図である。２１４Ｂ２のヒト化バリアント（ｈｚ２１４Ｂ２）が元の抗体ｍ２１４Ｂ２を交差ブロックする活性を、ヒト抗原ＣＤ１５１の組換え細胞外ループ２（ＥＣ２）を用いたＥＬＩＳＡにより評価した。ヒト化バリアントの活性をキメラ２１４Ｂ２と比較した。ＶＨバリアント２および３の全組合せで、キメラ抗体と同様な強い活性が示された。
【図１９】ビオチン化抗体ｍ２４Ｂ２の交差ブロックによるヒト化抗体ｈｚ２１４Ｂ２のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＥＣ２のＥＬＩＳＡにおいて元の抗体を交差ブロックした２１４Ｂ２のヒト化バリアントをフローサイトメトリーで更に評価した。ビオチン化抗体ｍ２１４Ｂ２を用いてＰＣ３細胞上のヒトＣＤ１５１を検出した。この結合は、種々の濃度の２１４Ｂ２のヒト化バリアントでブロックされた。キメラ２１４Ｂ２抗体を基準として用いた。ヒト化バリアント３および４（Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ３ＶＬＶａｒ３およびＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４ＶＬＶａｒ４）が最も強い交差ブロック活性を示した（Ｂ）。
【図２０】抗体ｃ２１４Ｂ２（Ｇ１）、ｃ２１４Ｂ２（Ｇ２）、Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ３ＶＬＶａｒ３（Ｇ１）、およびＨｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４ＶＬＶａｒ４（Ｇ１）の親和性のＢＩＡＣｏｒｅ分析を示す図である。Ａ、抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ３ＶＬＶａｒ３（Ｇ１）、Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４ＶＬＶａｒ４（Ｇ１）、およびｃ２１４Ｂ２（Ｇ１）のＢＩＡＣｏｒｅのセンサーグラム。Ｂ、抗体−ＥＣ２複合体の親和定数および半減期。
【図２１】ＰＣ３異種移植モデルに対する種々のアイソタイプのキメラｃ２１４Ｂ２Ｍａｂのインビボ活性を示す図である。Ａ：ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ４］および［ＩｇＧ１］（ＴＨ７）およびＢ：ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ２］。
【実施例】
【０２０８】
実施例１：ＣＤ１５１分子の発現の研究
前立腺癌または肺癌の患者から得たヒト組織のサンプルにおいて、ＣＤ１５１タンパク質の発現を免疫組織化学（ＩＨＣ）により調べた。これらの患者については、腫瘍に隣接する正常組織のスライドが利用可能であったので、正常組織に対して腫瘍組織の発現レベルを較正するために含めた。
【０２０９】
これらの実験では、市販の「Ｔｉｓｓｕｅ  ａｒｒａｙ」型のスライドを用いる。脱パラフィン後、ペプシン（ラブビジョン社（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ）製、ｒｅｆ．ＡＰ−９００７−００５）を含有する酵素溶液を利用して３０℃で抗原のアンマスキングを行う。この工程の後、セクションを過酸化水素（シグマ社製）の０．３％水溶液中でインキュベートすることにより内因性ペルオキシダーゼを除去する工程を行う。次いで、Ｕｌｔｒａ−Ｖ−Ｂｌｏｃｋ（ラブビジョン社製、ｒｅｆ．ＴＡ−１２５−ＵＢ）の溶液を用いて非特異的部位を飽和させ、市販のマウス抗ＣＤ１５１抗体（セロテック社（Ｓｅｒｏｔｅｃｈ）製、Ｒｅｆ．ＭＣＡ  １８５６）を終濃度５μｇ／ｍｌで用いて標識化を行う。マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ダコ・サイトメーション社（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）製、Ｒｅｆ．Ｘ０９３１）を陰性実験対照として用いる。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｄｕａｌ  Ｌｉｎｋ可視化システム（ダコ・サイトメーション社製、Ｒｅｆ．Ｋ４０６１）を用いて標識を可視化する。参照用のＤＡＢペルオキシダーゼ基質はダコ・サイトメーション社製のＳ３３０９である。
【０２１０】
図３Ａ〜３Ｅに示される結果は、前立腺腫瘍を発症している患者の何人かでＣＤ１５１分子が過剰発現していることを示している。この過剰発現は、試験された患者の２０％で非常に顕著（患者ＡおよびＣ）または中程度であり得る（患者ＡおよびＤ）。また、内皮細胞でのレベルを除き、対応する正常な前立腺組織はＣＤ１５１を発現していないかまたはわずかにしか発現せず、発現していても、腺様構造に限定されているようである。患者ＥはＣＤ１５１を発現していない腫瘍の例である。
【０２１１】
肺癌の場合（図４Ａ〜４Ｃ）、正常肺組織の特定の細胞において中程度（患者Ａ）から顕著（患者Ｂ）の発現が観察される。しかし、腫瘍組織は、非常に高密度の強く標識された細胞を示している（患者ＡおよびＢ）。患者ＣはＣＤ１５１を発現していない腫瘍の例である。
【０２１２】
実施例２：抗体の作製および分泌
ＣＤ１５１遺伝子のトランスフェクションにより作製した、表面にヒトＣＤ１５１を発現する２０×１０６個のＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を用いて、皮下経路でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。初回免疫は、フロイント完全アジュバントの存在下で行い、次の２回はフロイント不完全アジュバントの存在下で行った。融合の３日前に、最後の１０×１０６個のＮＩＨ  ３Ｔ３−ＣＤ１５１細胞の追加免疫注射を腹腔内経路で行った。次いで、Kohler and Milsteinに記載されている従来技術を用いて、マウス脾臓細胞をＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞と１／１の比率で融合させた。
【０２１３】
次いで、融合に得られたハイブリドーマから上清に分泌された抗体を、ＥＬＩＳＡによりＣＤ１５１の組換え細胞外ループＥＣ２認識能について、また、フローサイトメトリーによりヒトＰＣ３前立腺癌腫瘍系の表面に発現されているＣＤ１５１について、スクリーニングした。
【０２１４】
ＥＬＩＳＡでは、５μｇ／ｍｌの組換え細胞外ループＥＣ２を含むＰＢＳで９６ウェルプレートを＋４℃で１晩感作させた。ＰＢＳで洗浄した後、ウェルを０．５％ゼラチンのＰＢＳ溶液で３７℃、１時間、飽和させ、その後、ＰＢＳで再度洗浄した。ハイブリドーマ培養上清を希釈せずに評価する（３７℃で１時間インキュベーション）。ペルオキシダーゼをコンジュゲートさせたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（米国ジャクソン社（Ｊａｃｋｓｏｎ）製、１／５０００に希釈）と３７℃で１時間インキュベートし、続けてペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢ、フランス、インターキム社（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）製）と周囲温度で１０分間インキュベートすることで、固定されたＥＣ２ループに結合した抗体を検出する。１Ｍの硫酸を添加することにより反応を停止させ、光学濃度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定する。
【０２１５】
９６ウェルプレート上でフローサイトメトリー分析を行う。希釈していないハイブリドーマ上清を、先にウェルに入れておいた１０００００個のＰＣ３細胞に添加する。＋４℃で２０分間インキュベートし、洗浄した後、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）製、１／５００に希釈）を添加する。＋４℃で更に２０分間インキュベートした後、細胞蛍光計（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）を用いて蛍光強度（ＭＦＩ）を求める。
【０２１６】
スクリーニングの最後に、２０３Ｂ６および２１４Ｂ２の２つのハイブリドーマが選択された（選択基準：ＥＬＩＳＡでＯＤ＞０．５およびフローサイトメトリーでＭＦＩ＞５０）。これら２つのハイブリドーマについて得られた結果を以下の表６に示す。
【０２１７】
【表６】
2013507114.tif 000007
【０２１８】
クローニング後、選択された各ハイブリドーマのクローンを増幅した。マウス抗体アイソタイプ決定キット（ＳＢＡ  ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ、サザン・バイオテック社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）製）を用いて各培養上清について産生された抗体のアイソタイプを決定し、以前に記載されている条件下でマウスＮＩＨ  ３Ｔ３系および安定なトランスフェクタントＮＩＨ  ３Ｔ３−ＣＤ１５１、次いでヒト腫瘍系の肺癌Ａ５４９、前立腺癌ＤＵ１４５、および膵臓癌ＢｘＰＣ３の最終的な特徴解析をＥＬＩＳＡ（細胞外ループＥＣ２）およびフローサイトメトリーにより行った。上清の抗体濃度は、ＥＬＩＳＡ分析では５μｇ／ｍｌ、フローサイトメトリー分析では１０μｇ／ｍｌに調整した。得られた結果を以下の表７に示す。
【０２１９】
【表７】
2013507114.tif 000008
【０２２０】
図５Ａ〜５Ｄおよび６Ａ〜６Ｄは、マウス抗体２０３Ｂ６および２１４Ｂ２について得られた、フローサイトメトリーよる、ＮＩＨ  ３Ｔ３−ＣＤ１５１細胞、ＰＣ３細胞、およびＡ５４９細胞の認識プロファイルを示す図である。これらのプロファイルは、抗ＣＤ１５１抗体５０−６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６９６）を用いて得られたものに匹敵し、ＣＤ１５１に対するこれらの抗体の特異性を実証するものである。
【０２２１】
その後、これらのハイブリドーマをＣＮＣＭ、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15に寄託した。
【０２２２】
実施例３：キメラおよびヒト化抗体のクローニングおよび産生
マウス２０３Ｂ６および２１４Ｂ２Ｍａｂのキメラ型およびヒト化型を設計した。これらはヒトのＣカッパおよびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４定常ドメインのいずれかに遺伝的に融合させた目的マウス抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインに相当する。同様に、以下に記載するヒト化型はヒトＩｇＧ１／カッパまたはＩｇＧ４／カッパ分子として産生される。全ての組換えＭａｂは、ＨＥＫ２９３／ＥＢＮＡシステムをｐＣＥＰ４発現ベクター（米国、インビトロジェン社製）と用いて一過性トランスフェクションにより産生される。
【０２２３】
２０３Ｂ６および２１４Ｂ２Ｍａｂの軽鎖および重鎖（キメラまたはヒト化）の可変ドメインに対応する全ヌクレオチド配列は包括的遺伝子合成により合成された（ルクセンブルクのＧｅｎｅｃｕｓｔ社）。これらを、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４免疫グロブリンの軽鎖（Ｃカッパ）または重鎖［ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３］のいずれかの定常ドメインの全コード配列を有するｐＣＥＰ４ベクター（米国、インビトロジェン社製）中にサブクローニングした。全てのクローニング工程はLaboratory manual（Sambrook and Russel, 2001）に記載されている従来の分子生物学的技術に従ってまたは供給業者の取扱説明書に従って行った。各遺伝子コンストラクトを、Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーターサイクルシークエンシングキット（米国、アプライドバイオシステムズ社製）を用いたヌクレオチドシークエンシングにより完全に検証し、３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（米国、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析した。
【０２２４】
懸濁液に順応させたＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞（米国、インビトロジェン社製）を、ルーチンに、オービタルシェーカー（回転速度１１０ｒｐｍ）上で２５０ｍｌフラスコを用いて、６ｍＭのグルタミンが添加された５０ｍｌの無血清培地Ｅｘｃｅｌｌ  ２９３（ＳＡＦＣ  バイオサイエンス社（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）製）中で成長させた。水中に終濃度１ｍｇ／ｍｌで混合して調製した２５ｋＤａの直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ポリサイエンス社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）製）およびプラスミドＤＮＡ（重鎖と軽鎖のプラスミド比１：１で終濃度１．２５μｇ／ｍｌ）を用いて、２．１０６細胞／ｍＬで一過性のトランスフェクションを行った。トランスフェクションの４時間後に、培養液を１体積の新鮮な培養培地で希釈して、最終細胞密度を１０６細胞／ｍｌにした。細胞生存度およびＭａｂ産生に基づいて培養プロセスをモニタリングした。典型的には、培養は４〜５日間維持された。プロテインＡ樹脂（米国、ＧＥヘルスケア社製）を用いた従来のクロマトグラフィーによるアプローチを用いてＭａｂを精製した。
【０２２５】
種々のＭａｂは全て、機能的評価に適したレベルで産生される。
【０２２６】
実施例４：マウス抗ＣＤ１５１抗体２１４Ｂ２可変ドメインのヒト化
マウス２１４Ｂ２抗体の重鎖可変ドメインＶＨおよび軽鎖可変ドメインＶＬを、ＩＭＧＴのライブラリーおよびツール（http://imgt.cines.fr）を用いて免疫遺伝学的に分析した。以下に記載するヒト化の戦略は、固有のＩＭＧＴの番号付与スキーム（Lefranc, 1997）に基づく。最初に、各ドメインについて選択されたマウス生殖系列を、ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎツールを用いて、ＩＭＧＴ  ＬＩＧＭ  ＤＢデータベースに対するＢＬＡＳＴサーチにより同定する。マウスＩＧＫＶ６−２０＊０１生殖系列は、再編成された２１４Ｂ２のＶ領域と９７．９％の同一性を示し、ＩＧＫＪ２＊０１は２１４Ｂ２のＪ領域と完全に同一であった（図７）。重鎖について、２１４Ｂ２のＶ領域はマウスＩＧＨＶＳ１３０＊０１生殖系列と最も相同性が高く（図７、約９６％の同一性）、Ｊ領域について、マウスＩＧＨＪ４＊０１は最も近いＪ生殖系列遺伝子に対応している（図７、９４％の同一性、１残基異なる）。多様性Ｄ生殖系列遺伝子は、マウスＩＧＨＤ５−１＊０１に対応し、これは本質的にＣＤＲ３に対応する。
【０２２７】
マウス２１４Ｂ２Ｍａｂのヒト化の例として、ＣＤＲグラフト化による従来の戦略を以下に記載する。重鎖および軽鎖それぞれを個々にヒト化し、そのそれぞれの対応するキメラまたはヒト化物のいずれかとの共発現により評価する。
【０２２８】
２１４Ｂ２軽鎖ＶＬのヒト化
Ａｓｎ１に対応する変則的な残基が同定され、これはいくつかのマウス生殖系列Ｖ遺伝子に存在するが、ヒトには存在しない。この残基はＣＤＲ１に近接しているため、選択されたヒトＶ遺伝子で見られるような、この残基のＧｌｕへの改変には注意が必要であり得、評価が必要である（図８）。その他に、マウス２１４Ｂ２軽鎖ＣＤＲのグラフト化に最も適したヒト生殖系列のサーチから可能性のあるヒットが２つ特定された。１つ目は、マウスＩＧＫＶ６−２０＊０１に最も近い相同性を示すヒトＶ領域に相当し、これはヒトＩＧＫＶ３−７＊０２生殖系列アレルである（６８．４％の同一性）。しかし、そのＣＤＲ１は２１４Ｂ２のＣＤＲ１よりも１アミノ酸長いので、これらのＣＤＲアンカーは結局ＣＤＲ１のグラフト化に最適ではない（図８参照）。２つ目のヒトドナー生殖系列はＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１であり得る。これはマウスＩＧＫＶ６−２０＊０１と６４％同一であるが、ＣＤＲの長さは同じである（６：３、図８）。２１４Ｂ２のＶＬと選択されたヒトＶ遺伝子との間の異なる残基それぞれに推定される重要性の評価基準としては、限定されるものではないが、ベルニエゾーン（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｚｏｎｅ）中での局在、ＣＤＲアンカーに近い位置であること、同じヒト生殖系列群の別のアレル中における同じ位置に存在することが含まれる。
【０２２９】
ＩＧＫＶ６−２０＊０１のＶ遺伝子を検討した結果、ベルニエゾーン内の１個の残基がｍ２１４Ｂ２およびｍＩＧＫＶ６−２０＊０２のどちらとも異なっており（Ａ８４）、これは高い優先度で考慮する必要があり、マウスのままで最初保存する必要がある（図８、番号１）。その他に、２個の重要な残基がＣＤＲ１およびＣＤＲ２のアンカーであるＶ３９およびＮ６６に相当し、これらも高優先度に順位付けられ、マウスのままで最初保存される。３個の残基が、ＣＤＲアンカーに位置が近いため、考慮の優先度が中程度の残基として順位付けられる（図８、Ｋ２４、Ｙ６８、およびＨ１０３）。残りのアミノ酸（番号３として順位付けられている）は、ヒト化重鎖の全体的コンホメーションおよびＣＤ１５１の認識に対する影響が弱いと考えられ、これらはヒトの対応するアミノ酸で容易に置換することができる。
【０２３０】
ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１のＶ遺伝子を考慮した結果、ベルニエゾーン内の１個の残基がｍ２１４Ｂ２およびｍＩＧＫＶ６−２０＊０２のどちらとも異なっており（Ａ８４）、これは高い優先度で考慮する必要があり、マウスのままで最初保存する必要がある（図８、番号１）。その他に、２個の重要な残基がＣＤＲ１およびＣＤＲ２のアンカーであるＶ３９およびＮ６６に相当し、これらも高優先度に順位付けられ、マウスのままで最初保存される。５個の残基が、ＣＤＲアンカーに位置が近いため（図８、Ｋ２４、Ｓ４０、Ｙ６８、およびＨ１０３）またはＣＤＲ１に近いため（図８、Ｖ３）、考慮の優先度が中程度の残基として順位付けされる。残りのアミノ酸（番号３として順位付けられている）は、ヒト化重鎖の全体的コンホメーションおよびＣＤ１５１の認識に対する影響が弱いと考えられ、これらはヒトの対応するアミノ酸で容易に置換することができる。
【０２３１】
Ｊ領域を検討した結果、ヒトＩＧＫＪ２＊０１遺伝子はｍ２１４ＢおよびｍＩＧＫＪ２＊０１のどちらとも異なる１個の残基（Ｇ）を含有する。この領域は本質的にＦＲ４に相当するので、最初で完全にヒト化してよい（図８）。
【０２３２】
ＩＭＧＴ−ＣＤＲ３配列（ＧＱＴＹＳＦＰＹＴ）は配列を改変せずにそのままグラフト化する。
【０２３３】
２１４Ｂ２重鎖のヒト化
マウス２１４Ｂ２重鎖ＣＤＲのグラフト化に最も適したヒト生殖系列のサーチから、ヒトＩＧＨＶ１−２＊０２Ｖ遺伝子アレルに対応する好ましいヒットを１つ同定した。これはマウスＩＧＨＶＳ１３０＊０１生殖系列遺伝子に６６％同一であり、ＣＤＲの長さが同じである。２１４Ｂ２＿ＶＨとＩＧＨＶ１−２＊０２はＦＲ中で２８ヶ所で異なっていた（図９）。密接に関連するヒトＩＧＨＶ１−４６＊０３生殖系列も好適であり、これも異なる残基の数が同じであり、同様に２８個中１５個がＦＲ３中に位置している。これら２８個の異なる残基それぞれに推定される重要性の評価基準としては、限定されるものではないが、ベルニエゾーン中での局在、ＣＤＲアンカーに近い位置であること、同じヒト生殖系列群の別のアレル中における同じ位置に存在することが含まれる。
【０２３４】
ＩＧＨＶ１−２＊０２のＶ遺伝子を検討した結果、ベルニエゾーン内の５個の残基がｍ２１４Ｂ２およびＩＧＨＶＳ１３０＊０１のどちらとも異なり（Ｉ５３、Ｅ５５、Ａ７６、Ｌ７８、Ｖ８０）、これらは高い優先度で考慮する必要があり、マウスのままで最初保存する必要がある（図９、番号１）。その他に、Ｎ６８およびＥ６９が、ＣＤＲ２アンカーの近くに位置するため、考慮の優先度が中程度の残基として順位付けされる（図９）。残りの２１個のアミノ酸は、ヒト化重鎖の全体的コンホメーションおよびＣＤ１５１の認識に対する影響が弱いと考えられ、これらはヒトの対応するアミノ酸で容易に置換することができる。
【０２３５】
ＩＧＨＶ１−４６＊０３のＶ遺伝子を検討した結果、ベルニエゾーン内の７個の残基がｍ２１４Ｂ２およびＩＧＨＶＳ１３０＊０１のどちらとも異なり（Ｉ５３、Ｅ５５、Ｎ６６、Ａ７６、Ｌ７８、Ｖ８０、Ａ８７）、これらは高い優先度で考慮する必要があり、マウスのままで最初保存する必要がある（図９、番号１）。その他に、Ｎ６８およびＥ６９が、ＣＤＲ２アンカーの近くに位置するため、考慮の優先度が中程度の残基として順位付けされる（図９）。残りの１９個のアミノ酸は、ヒト化重鎖の全体的コンホメーションおよびＣＤ１５１の認識に対する影響が弱いと考えられ、これらはヒトの対応するアミノ酸で容易に置換することができる。
【０２３６】
Ｊ領域を検討した結果、ヒトＩＧＨＪ６＊０１遺伝子は、ｍ２１４Ｂ２およびｍＩＧＨＪ４＊０１のどちらとも異なる３個の残基を含有する。この領域は本質的にＦＲ４に相当するので、最初で完全にヒト化してよい（図９）。
【０２３７】
ＣＤＲ３の配列に本質的に相当する多様性Ｄ遺伝子（ＡＲＡＲＳＦＹＹＡＭＤＣ）は改変せずにグラフト化する。
【０２３８】
上記の全てのアミノ酸が考慮すべき重要な位置である。これらの位置のそれぞれについてヒト対マウス残基の全組合せをヒト化プロセス中に検討する。ヒト化型の選択は、どれだけヒトのものに近いか（ｈｕｍａｎｎｅｓｓ）ならびに保存されているインビトロおよびインビボでの機能的特性に基づく。
【０２３９】
実施例５：ウェスタンブロットによる抗体特異性
ウェスタンブロットによりキメラ抗体ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］およびｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］の特異性を最初に評価した。簡潔に述べると、精製した組換え大細胞外ループＥＣ２（２〜８μｇ）およびＨＴ−２９細胞ライセート(lysate)（１０〜５０μｇ）を１２％アクリルアミドゲル（バイオ・ラッド社製）にローディングした。非還元条件下での電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、精製された０．５μｇ／ｍｌのキメラ抗体ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］およびｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］と、次いで、ペルオキシダーゼがコンジュゲートされたウサギポリクローナル抗ヒトＩｇ（ＧＥヘルスケア社製）と、更にインキュベートした。タンパク質は化学発光により検出した。ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］およびｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］の両方がウェスタンブロットで全長ＣＤ１５１を認識することができた（図１０）。更に、これらは、組換えＥＣ２ループに対する反応性により評価されるように、大きな細胞外ループに特異的であることも示された（図１０）。
【０２４０】
実施例６：ＥＬＩＳＡによる競合実験
キメラ抗体ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］およびｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］が、それらの対応するマウス型の組換えＥＣ２ループへの結合を阻害する能力を評価するために、ＥＬＩＳＡにより交差競合実験を更に行った。簡潔に述べると、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを５μｇ／ｍｌの組換えＥＣ２を含むＰＢＳを用いて４℃で一晩コーティングした。８０ｎｇ／ｍｌのマウスＭａｂ２０３Ｂ６および２１４Ｂ２を、種々の濃度（０．０１〜２０μｇ／ｍｌ）のそれらの対応するキメラ抗体型の存在下または非存在下にて３７℃で１時間更にインキュベートした。対照実験ではマウス抗体を添加しなかった。西洋ワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートされたポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧをＰＢＳの１／５０００希釈で添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢと室温で１０分間インキュベートした後、１Ｍの硫酸を用いて反応を停止し、４５０ｎｍの光学濃度を測定した。図１１Ａ〜１１Ｂは、キメラ抗体ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］およびｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］がそれぞれマウス型の２１４Ｂ２および２０３Ｂ６に取って代わることができたことを示している。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて算出したＩＣ５０値は、ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］およびｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］についてそれぞれ０．６９μｇ／ｍｌおよび０．７１μｇ／ｍｌであった。
【０２４１】
実施例７：前立腺癌細胞へのキメラ抗体の結合
前立腺癌細胞ＰＣ３へのキメラ抗体ｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］およびｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］の結合をフローサイトメトリーで評価した。簡潔に述べると、種々の濃度のｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］またはｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］存在下、１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳバッファー中、４℃で２０分間、ＰＣ３細胞を１．１０５細胞／１００μｌでインキュベートした。細胞を更に洗浄し、Ａｌｅｘａ４８８がコンジュゲートされたヤギ抗ヒト抗体（モレキュラー・プローブ社製、ＰＢＳで１／５００希釈）と４℃で２０分間インキュベートした。標識された細胞を洗浄し、遠心し、先ほどのバッファー（１５０μｌ）に再懸濁した後、Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて分析した。生細胞のみに対して分析を行うために、ヨウ化プロピジウムを添加した。ＰＣ３細胞の表面に発現されたＣＤ１５１へのキメラ抗体ｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］およびｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］の結合は抗体濃度に応じて増加した（図１２Ａ〜１２Ｂ）。ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］およびｃ２０３Ｂ６［ＩｇＧ１］はそれぞれ２．５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌでプラトーに達した。このことは、ＰＣ３細胞へのこれらの抗体の結合が非常に特異的であることを示している。
【０２４２】
実施例８：前立腺ＰＣ３異種移植モデル上のＣＤ１５１に対するキメラ抗体ｃ２１４Ｂ２］ＩｇＧ１］の抗腫瘍活性
組織アレイ解析法を用いて前立腺組織上でのＣＤ１５１の過剰発現が以前に示されている。前立腺癌細胞がＣＤ１５１標的化療法に応答性であるのかどうかを調べるために、ＣＤ１５１に対するキメラｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］をＰＣ３異種移植モデルにおいてインビボで試験した。ＰＣ３細胞系は、ＡＴＣＣにより提供されたアンドロゲン非依存性の細胞系であり、１０％ＦＣＳを添加したＦ１２Ｋ培地中で成長させる。５百万個のＰＣ３細胞を６週齢の雌スイスマウスに皮下移植した。移植の５日後に、腫瘍が測定可能であり、ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］キメラ抗体の腹腔内注射を開始する前にマウスを６頭のグループ２つにランダム化した。１回投与当たり２ｍｇのｃ２１４Ｂ２を負荷量として注射し、その後、１回投与当たり１ｍｇの注射を週２回行った。腫瘍体積を週２回評価し、以下の式で算出した：π／６×長さ×幅×高さ。図１３に示す結果から、図中でｃ２１４Ｂ２で参照されているｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１］がＰＣ３細胞の腫瘍成長をインビボで有意に阻害することが示された。この結果は、ＣＤ１５１を標的化することが癌の有効な治療法であり得ることを示している。
【０２４３】
実施例９：ＴＨ７ヒンジ変異体の改変
ヒンジ領域が免疫グロブリンの可変ドメインの柔軟性に大きく関与することは当業者に周知である（Brekke et al., 1995；Roux et al., 1997参照）。２１４Ｂ２Ｍａｂのキメラ化プロセス中、マウス定常ドメインＩＧＨＧ１を、ヒト起源の同等なＩＧＨＧ１部分で置換した。対応するヒンジ領域のアミノ酸配は非常に多様性が高いので、マウスＩｇＧ１ヒンジに似せるために、Ｃｙｓ残基を１個付加し、２アミノ酸分長さを短くすることで、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域を改変した。
【０２４４】
マウスおよびヒトの野生型ＩｇＧ１ヒンジ領域ならびに改変されたＴＨ７ヒンジ領域の比較を以下に示す（ＩＭＧＴの固有なＣドメインの番号付に従う）：
マウスＩｇＧ１ヒンジ領域  ＰＲＤＣＧＣＫＰ−ＣＩ−ＣＴ（配列番号４３）
ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域    ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４２）
改変したＴＨ７ヒンジ領域  ＰＫＳＣＤＣ−Ｈ−ＣＰＰＣＰ（配列番号４１）
（下線はヒトＩｇＧ１ヒンジ領域中に導入した３個の改変部分を示す）。
【０２４５】
実施例１０：キメラ２１４Ｂ２Ｍａｂおよびヒンジ改変型Ｍａｂの産生
キメラまたは改変されたヒンジ領域を含有する全ての型のＭａｂは、一過性のトランスフェクションにより、またＨＥＫ２９３／ＥＢＮＡシステムをｐＣＥＰ４発現ベクター（米国、インビトロジェン社製）と用いることにより産生された。
【０２４６】
マウス由来可変ドメイン２１４Ｂ２  ＶＨおよびＶＬに対応する全ヌクレオチド配列は包括的遺伝子合成により合成された（独、ジーンアート社（Ｇｅｎｅａｒｔ））。これらを、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの定常ドメイン［ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３］の全コード配列を有するｐＣＥＰ４ベクター（米国、インビトロジェン社製）中にサブクローニングした。ヒンジ領域の改変は、｛Ｎｈｅ１Ｉ−Ｂｃｌ１｝制限フラグメントを所望の改変を有する同等な部分で交換することによりなされ、各｛Ｎｈｅ１Ｉ−Ｂｃｌ１｝フラグメントは包括的遺伝子合成（ドイツ、ジーンアート社）により合成された。全てのクローニング工程はLaboratory manual（Sambrook and Russel, 2001）に記載されている従来の分子生物学的技術に従ってまたは供給業者の取扱説明書に従って行った。各遺伝子コンストラクトを、Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーターサイクルシークエンシングキット（米国、アプライドバイオシステムズ社製）を用いたヌクレオチドシークエンシングにより完全に検証し、３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（米国、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析した。
【０２４７】
懸濁液に順応させたＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞（米国、インビトロジェン社製）を、ルーチンに、オービタルシェーカー（回転速度１１０ｒｐｍ）上で２５０ｍｌフラスコを用いて、６ｍＭのグルタミンが添加された５０ｍｌの無血清培地Ｅｘｃｅｌｌ  ２９３（ＳＡＦＣ  バイオサイエンス社製）中で成長させた。水中に終濃度１ｍｇ／ｍｌで混合して調製した２５ｋＤａの直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ポリサイエンス社製）およびプラスミドＤＮＡ（重鎖と軽鎖のプラスミド比１：１で終濃度１．２５μｇ／ｍｌ）を用いて、２×１０６細胞／ｍＬで一過性のトランスフェクションを行った。トランスフェクションの４時間後に、培養液を１体積の新鮮な培養培地で希釈して、最終細胞密度を１０６細胞／ｍｌにした。細胞生存度およびＭａｂ産生に基づいて培養プロセスをモニタリングした。典型的には、培養は４〜５日間維持された。プロテインＡ樹脂（米国、ＧＥヘルスケア社製）を用いた従来のクロマトグラフィーによるアプローチを用いてＭａｂを精製した。
【０２４８】
ｃ２１４Ｂ２［ＴＨ７］ＩｇＧ１Ｍａｂは機能的評価に適したレベルで産生された。産生レベルは通常、１ｌの精製Ｍａｂ当たり１５〜３０ｍｇである。
【０２４９】
実施例１１：細胞接着アッセイ
第１のアッセイ
トリプシンを用いてディッシュからＰＣ３前立腺癌細胞を剥離させ、無血清Ｆ１２ｋ培地で３回洗浄し、同じ培地に再度懸濁した。細胞（１００，０００細胞／ウェル）を、１μｇ／ｍｌのラミニン１でコーティングされた９６ウェルプレートにプレーティングした。試験する以下の型の抗ＣＤ１５１Ｍａｂを終濃度１０μｇ／ｍｌで同時に添加した：マウスＩｇＧ１Ｍａｂ  ｍ２１４Ｂ２、ｃ２１４Ｂ２と呼ばれる非改変キメラＩｇＧ１抗体型、およびｃＴＨ７−２１４Ｂ２と呼ばれるＴＨ７を改変したキメラＩｇＧ１抗体型。マウスおよびヒトのＩｇＧ１抗体をアイソタイプ対照抗体として用いた。最終的な条件は以下の通りである：１００，０００細胞／ウェルおよび抗体１０μｇ／ｍｌ。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをはたいて、無血清Ｆ１２ｋ培地で２回洗浄した。分析前に、１００μｌの無血清Ｆ１２ｋ培地を各ウェルに分注した。細胞接着に対する抗体の影響を評価するために、位相差顕微鏡下でウェルの写真を撮った（図１４）。その後、接着した細胞の数をＡＴＰアッセイにより決定した（図１５Ａ）。
【０２５０】
マウス２１４Ｂ２抗体およびキメラＴＨ７−２１４Ｂ２抗体は細胞間相互作用を変化させることができ（図１４）、同等にＰＣ３細胞接着を増加させることができたが（図１５Ａ）、非改変キメラ型の２１４Ｂ２（ｃ２１４Ｂ２）では何ら影響が観察されず、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と同様であった。
【０２５１】
第２のアッセイ
トリプシンを用いてディッシュからＰＣ３前立腺癌細胞を剥離させ、無血清Ｆ１２ｋ培地で３回洗浄し、同じ培地に再度懸濁した。細胞（１００，０００細胞／ウェル）を、１μｇ／ｍｌのラミニン１でコーティングされた９６ウェルプレートにプレーティングした。試験する以下の型の抗ＣＤ１５１Ｍａｂを終濃度０．４μｇ／ｍｌで同時に添加した：マウスＩｇＧ１Ｍａｂ  ｍ２１４Ｂ２およびキメラＩｇＧ１−ＴＨ７、ＩｇＧ４−ＴＨ７、およびＩｇＧ２抗体型。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをはたいて、無血清Ｆ１２ｋ培地で２回洗浄した。分析前に、１００μｌの無血清Ｆ１２ｋ培地を各ウェルに分注した。細胞接着に対する種々の抗体の影響を評価するために、接着した細胞の数をＡＴＰアッセイにより決定した。
【０２５２】
種々のキメラ型の２１４Ｂ２が、細胞間相互作用を変えることができ、ＰＣ３細胞接着を増加させることができた（図１５Ｂ）。キメラ型ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ１−ＴＨ７］、ｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ４−ＴＨ７］、およびｃ２１４Ｂ２［ＩｇＧ２］により誘導された影響は、マウス型ｍ２１４Ｂ２により誘導された影響と同等であった。これらのキメラ抗体は、非処理細胞ならびに種々の対照抗体ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、およびｈＩｇＧ４で処理された細胞と比べて約４０％のＰＣ３細胞接着の増加を誘導した。
【０２５３】
実施例１２：２１４Ｂ２Ｍａｂのヒト化
一般的手順
ＣＤＲグラフト化の一般的規則を適用して２１４Ｂ２抗ＣＤ１５１抗体のヒト化を行った。ＣＤＲおよびフレームワーク（ＦＲ）領域の免疫遺伝学的分析および定義を、ＩＭＧＴの固有の番号付与スキームならびにＩＭＧＴのライブラリーおよびツール（Lefranc, 1997−www.imgt.org)）を用いて行った。
【０２５４】
元の抗体のエピトープに対するヒト化バリアントの親和性を、元の抗体をヒト化抗体で交差ブロックすることにより評価した。元の抗体の濃度を一定に保ち、ヒト化抗体を段階希釈した。キメラ抗体をこれらの実験における陽性対照および基準とした。ＥＬＩＳＡによる親和性およびフローサイトメトリーアッセイによりヒト化抗体を評価した。ＥＬＩＳＡをベースにしたアッセイでは、ヒトＣＤ１５１の第２の細胞外ドメイン（ＥＣ２）を組換えにより発現させ、６ヒスチジンタグで精製した。精製されたＥＣ２タンパク質を用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、ＨＲＰがコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ抗体を用いてマウスの元の抗体を検出することで、ヒト化抗ＣＤ１５１抗体の結合を間接的に測定した。ヒト化抗ＣＤ１５１抗体のＣＤ１５１への結合を、ヒト前立腺癌細胞系ＰＣ３を用いたフローサイトメトリーにより評価した。ビオチン化された元のマウス抗ＣＤ１５１抗体と交差ブロックすることにより親和性を決定した。ビオチン化抗体は、フルオレセインがコンジュゲートされたストレプトアビジンを用いて検出した。ＢｉａＣｏｒｅ分析により親和定数（Ｋｄ）を測定した。
【０２５５】
これらのアッセイを用いて、組換えヒト化バージョンの抗ＣＤ１５１抗体の特徴を解析した。可変ドメインは、ヒトＩｇＧ１／ｋ定常ドメインで構成され、哺乳動物用の発現ベクターｐＣＥＰにクローニングされた。組換えＩｇＧ１／κ由来抗体をＨＥＫ２９３細胞中で一時的に発現させた。発現培養上清を濾過し、プロテインＡセファロースを用いて抗体を精製した。精製された抗体をＰＢＳで再度緩衝化し、ＥＬＩＳＡにより抗体濃度を決定した。
【０２５６】
２１４Ｂ２重鎖のヒト化
マウス２１４Ｂ２重鎖ＣＤＲのグラフト化に最適なヒト生殖系列のサーチから、ヒトＩＧＨＶ１−２＊０２Ｖ遺伝子アレルに対応する好ましいヒットを１つ特定した。これはマウスＩＧＨＶＳ１３０＊０１生殖系列遺伝子と６６％同一であり、ＣＤＲの長さが同じである。２１４Ｂ２＿ＶＨとＩＧＨＶ１−２＊０２はＦＲ中で２８ヶ所が異なっていた。これら２８個の異なる残基それぞれに推定される重要性の評価基準としては、限定されるものではないが、ベルニエゾーン中での局在、ＣＤＲアンカーに近い位置であること、同じヒト生殖系列群の別のアレル中における同じ位置に存在することが含まれる。
【０２５７】
ＩＧＨＶ１−２＊０２のＶ遺伝子を検討した結果、ベルニエゾーン内の５個の残基がｍ２１４Ｂ２およびｍＩＧＨＶＳ１３０＊０１のどちらとも異なり（Ｉ５３、Ｅ５５、Ａ７６、Ｌ７８、Ｖ８０）、これらを高い優先度で考慮し、マウスのままで最初保存した（図１６）。その他に、Ｎ６７も、ＣＤＲ２アンカーの近くに位置するため、高い優先度で考慮すべき残基として順位付けされる。
【０２５８】
Ｊ領域を検討した結果、ヒトＩＧＨＪ６＊０１遺伝子は、ｍ２１４Ｂ２およびｍＩＧＨＪ４＊０１のどちらとも異なる３個の残基を含む。この領域は本質的にＦＲ４に相当するので、最初で完全にヒト化してよい。ＣＤＲ３の配列に本質的に相当する多様性Ｄ遺伝子（ＡＲＡＲＳＦＹＹＡＭＤＣ）は改変せずにグラフト化した。
【０２５９】
２１４Ｂ２軽鎖ＶＬのヒト化
マウス２１４Ｂ２軽鎖ＣＤＲのグラフト化に最適なヒト生殖系列のサーチから、可能性のある２つのヒットを特定した。
【０２６０】
Ａｓｎ１に対応する変則的な残基が同定され、これはいくつかのマウス生殖系列Ｖ遺伝子に存在するが、ヒトには存在しない。この残基はＣＤＲ１に近接しているため、選択されたヒトＶ遺伝子で見られるような、この残基のＧｌｕへの改変には注意が必要であり得、評価する必要がある。
【０２６１】
１つ目は、ヒトＩＧＫＶ３Ｄ−７＊０１生殖系列アレルと相同性が最も近いヒトＶ領域に相当する。しかしそのＣＤＲ１は２１４Ｂ２のＣＤＲ１よりも１アミノ酸長いので、このＣＤＲは結局ＣＤＲグラフト化に最適ではない。そこで、ヒト生殖系列ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１が選択された。これはマウス生殖系列アレルＩＧＫＶ６−２０＊０１との同一性が６４％であり、ＣＤＲの長さが同じである。２１４Ｂ２ＶＬと選択されたヒトＶ遺伝子との間の異なる残基それぞれに推定される重要性の評価基準としては、限定されるものではないが、ベルニエゾーン中での局在、ＣＤＲアンカーに近い位置であること、同じヒト生殖系列群の別のアレル中における同じ位置に存在することが含まれる。
【０２６２】
ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１のＶ遺伝子を検討した結果、ベルニエゾーン内の１個の残基が２１４Ｂ２およびｍＩＧＫＶ６−２０＊０２のどちらとも異なっており（Ａ８４）、これは高い優先度で考慮する必要があり、マウスのままで最初保存する必要がある。その他に、２個の重要な残基がＣＤＲ１アンカーおよびＣＤＲ２アンカーのＶ３９およびＮ６６に相当する。これらも優先度が高く順位付けされ、マウスのままで最初保存される。５個の残基が、ＣＤＲアンカーに位置が近いため（Ｋ２４、Ｓ４０、Ｙ６８、およびＨ１０３）またはＣＤＲ１に近接するため（Ｖ３）、考慮の優先度が中程度として順位付けられる。残りのアミノ酸（番号３として順位付けられている）は、ヒト化重鎖の全体的コンホメーションおよびＣＤ１５１の認識に対する影響が弱いと考えられ、これらはヒトの対応するアミノ酸で容易に置換された。
【０２６３】
Ｊ領域を検討した結果、ヒトＩＧＫＪ２＊０１遺伝子は、ｍ２１４Ｂ２およびｍＩＧＫＪ２＊０１のどちらとも異なる１個の残基（Ｇ）を含む。この領域は本質的にＦＲ４に相当するので、最初で完全にヒト化した。
【０２６４】
ＩＭＧＴ−ＣＤＲ３配列（ＧＱＴＹＳＦＰＹＴ）は配列を改変せずにそのままグラフト化した。
【０２６５】
最初の一連の実験では、ＥＬＩＳＡでヒト化抗体を試験した。ＶＨのバリアント１、バリアント２、およびバリアント３のそれぞれを、ＶＬの３つの異なるバリアントと組み合わせた。ＶＨバリアント１の全てのコンストラクトはマウス抗体と競合する能力を示さない（図１７、Ａ）。これは、この抗体の抗原認識にフレームワーク中の構造的残基が重要であることを最初に示すものである。ＶＬＶａｒ１とＶＨＶａｒ２またはＶＨＶａｒ３の組合せは、キメラ抗体と比べて、元の抗体をブロックする能力がはるかに低かった。したがって、これらのバリアントについてはその後の評価を行わなかった。抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４ＶＬＶａｒ４を含む他の全てのバリアントはキメラ抗体と同様なブロック活性を示す（図１８、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。
【０２６６】
全体抗原ＣＤ１５１への結合のモデルとしてＥＣ２への結合を用いた。細胞表面上の抗原への親和性をフローサイトメトリーで評価した。抗体Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４ＶＬＶａｒ４で最も高レベルの交差ブロック活性が測定された。これらの結果は、抗体２１４Ｂ２の結合特性を維持するために比較的多くの逆変異が必要であることを示している。
【０２６７】
Ｈｚ２１４Ｂ２ＶＨＶａｒ４ＶＬＶａｒ４のフレームワーク中のヒト残基の割合を計算したところ、２２６残基中２２個の非ヒト残基が含まれており、これは９０．３％のｇｅｒｍｉｎａｌｉｔｙ  ｉｎｄｅｘに等しい。
【０２６８】
ヒトＣＤ１５１の細胞外ループ２（ＥＣ２）を用いたＢＩＡＣｏｒｅ分析によりキメラ抗体および２つのヒト化バリアントの親和性を決定した（図２０）。
【０２６９】
実施例１３：ＰＣ３異種移植モデルに対する種々のアイソタイプのキメラｃ２１４Ｂ２Ｍａｂのインビボ活性
２１４Ｂ２Ａｂのキメラコンストラクトを評価するために、胸腺欠損マウスにアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞系ＰＣ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４３５）から５．１０６個の細胞を移植した。移植５日後に、腫瘍体積は６８〜１０８ｍｍ３（π／６×長さ×幅×高さ）に達し、マウスを６頭のグループにランダム化した。試験するビヒクルまたは抗体を腹腔内投与した。処置されたマウスは、５日目（Ｄ５）に１頭当たり２ｍｇの負荷量を投与され、１２日目（Ｄ１２）に追加注射された。腫瘍体積を週に２回評価した。
【０２７０】
図２１Ａおよび２１Ｂに示す結果から、調べた全てのキメラ型が、ＰＣ３異種移植モデルに対して同様に大きなインビボでの効果を示すことが示された。
【０２７１】
【表８】
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2013507114.tif 000010
【図７】
2013507114.tif 000011
【図８】
2013507114.tif 000012
【図９】
2013507114.tif 000013
【図１１Ａ】
2013507114.tif 000014
【図１１Ｂ】
2013507114.tif 000015
【図１６】
2013507114.tif 000016
【図１７】
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【図２０】
2013507114.tif 000018
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2013507114.tif 000022
【図５】
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【図６】
2013507114.tif 000024
【図１０】
2013507114.tif 000025
【図１２Ａ】
2013507114.tif 000026
【図１２Ｂ】
2013507114.tif 000027
【図１３】
2013507114.tif 000028
【図１４】
2013507114.tif 000029
【図１５Ａ】
2013507114.tif 000030
【図１５Ｂ】
2013507114.tif 000031
【図１８】
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【図１９】
2013507114.tif 000033
【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2013507114.tif 000035
2013507114.tif 000036
2013507114.tif 000037