(57)【要約】本発明は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で腫瘍壊死因子と結合する修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１（ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）ポリペプチドまたはその断片を提供する。本発明の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片は、生体内に存在するタンパク質分解酵素に対する向上した抵抗性を示し、よって、改善された生体利用率及び吸収率を示す。【選択図】図４
2013507913.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１として記載された天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１のアミノ酸配列において６１番、６８番、７８番、８５番、１０６番、１０７番、１０９番、１２１番、１２８番、１３３番、１３５番、１３６番、１３８番、１４１番、１５０番、１５６番、１６１番、２００番、２０３番、２０６番及び２０７番からなる群から選ばれる１または２以上の位置のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列；
配列番号１として記載される天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１のアミノ酸配列の４１番乃至２１１番からなるアミノ酸配列において６１番、６８番、７８番、８５番、１０６番、１０７番、１０９番、１２１番、１２８番、１３３番、１３５番、１３６番、１３８番、１４１番、１５０番、１５６番、１６１番、２００番、２０３番、２０６番及び２０７番からなる群から選ばれる１または２以上の位置のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列；
配列番号１として記載される天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１のアミノ酸配列の４１番乃至１６６番からなるアミノ酸配列において６１番、６８番、７８番、８５番、１０６番、１０７番、１０９番、１２１番、１２８番、１３３番、１３５番、１３６番、１３８番、１４１番、１５０番、１５６番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列；または、
配列番号１として記載される天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１のアミノ酸配列の４１番乃至１４８番からなるアミノ酸配列において、６１番、６８番、７８番、８５番、１０６番、１０７番、１０９番、１２１番、１２８番、１３３番、１３５番、１３６番、１３８番及び１４１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項２】
配列番号１として記載された天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１のアミノ酸配列において６８番、８５番、１０９番、１２８番、１３３番、１３５番、１４１番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列；
配列番号１として記載される天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１のアミノ酸配列の４１番乃至２１１番からなるアミノ酸配列において６８番、８５番、１０９番、１２８番、１３３番、１３５番、１４１番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列；
配列番号１として記載される天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１のアミノ酸配列の４１番乃至１６６番からなるアミノ酸配列において６８番、８５番、１０９番、１２８番、１３３番、１３５番、１４１番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列；または
配列番号１として記載される天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１のアミノ酸配列の４１番乃至１４８番からなるアミノ酸配列において６８番、８５番、１０９番、１２８番、１３３番、１３５番及び１４１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項３】
配列番号１として記載された天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１のアミノ酸配列において６８番、１０９番、１３３番、１３５番、１４１番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列；
配列番号１として記載される天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１のアミノ酸配列の４１番乃至２１１番からなるアミノ酸配列において６８番、１０９番、１３３番、１３５番、１４１番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列；
配列番号１として記載される天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１のアミノ酸配列の４１番乃至１６６番からなるアミノ酸配列において６８番、１０９番、１３３番、１３５番、１４１番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列；または
配列番号１として記載される天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１のアミノ酸配列の４１番乃至１４８番からなるアミノ酸配列において６８番、１０９番、１３３番、１３５番及び１４１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項４】
６１番、１０７番、１６１番、２０３番の位置のＫがＱまたはＮに；６８番、１５０番、１５６番の位置のＬがＩまたはＶに；７８番、２０７番の位置のＤがＱまたはＮに；８５番、１３８番、２００番、２０６番の位置のＥがＱまたはＮに；１０６番、１２１番、１２８番、１３３番の位置のＲがＨまたはＱに；１０９番の位置のＭがＩまたはＶに；１３５番の位置のＹがＩまたはＨに；１３６番の位置のＷがＨまたはＳに；１４１番の位置のＦがＩまたはＶに置換された、請求項１に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項５】
１または２以上の位置におけるアミノ酸修飾が、Ｋ６１Ｑ、Ｋ６１Ｎ、Ｌ６８Ｉ、Ｌ６８Ｖ、Ｄ７８Ｑ、Ｅ８５Ｎ、Ｒ１０６Ｈ、Ｒ１０６Ｑ、Ｋ１０７Ｑ、Ｍ１０９Ｉ、Ｒ１２１Ｈ、Ｒ１２１Ｑ、Ｒ１２８Ｈ、Ｒ１２８Ｑ、Ｒ１３３Ｑ、Ｙ１３５Ｉ、Ｙ１３５Ｈ、Ｗ１３６Ｈ、Ｗ１３６Ｓ、Ｅ１３８Ｑ、Ｅ１３８Ｎ、Ｆ１４１Ｉ、Ｆ１４１Ｖ、Ｌ１５０Ｉ、Ｌ１５６Ｉ、Ｋ１６１Ｑ、Ｋ１６１Ｎ、Ｅ２００Ｑ、Ｋ２０３Ｑ、Ｅ２０６Ｑ、Ｄ２０７Ｑ、及びＤ２０７Ｎからなる群から選ばれる１または２以上のアミノ酸修飾である、請求項１に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項６】
１または２以上の位置におけるアミノ酸修飾が、Ｌ６８Ｉ、Ｌ６８Ｖ、Ｅ８５Ｎ、Ｍ１０９Ｉ、Ｒ１２８Ｈ、Ｒ１３３Ｑ、Ｙ１３５Ｉ、Ｗ１３６Ｓ、Ｆ１４１Ｉ、Ｆ１４１Ｖ、Ｋ１６１Ｑ、及びＫ１６１Ｎからなる群から選ばれる１または２以上のアミノ酸修飾である、請求項１に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項７】
１または２以上の位置におけるアミノ酸修飾が、Ｌ６８Ｉ、Ｌ６８Ｖ、Ｒ１３３Ｑ、Ｙ１３５Ｉ、Ｆ１４１Ｉ、Ｋ１６１Ｑ、及びＫ１６１Ｎからなる群から選ばれる１または２以上のアミノ酸修飾である、請求項１に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項８】
一つのアミノ酸修飾を含む、請求項１に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項９】
アミノ酸修飾は、２個のアミノ酸修飾であり、２個のアミノ酸修飾は、Ｒ１３３Ｑ、Ｆ１４１Ｖ、Ｋ１６１Ｑ、Ｋ１６１Ｎ、Ｅ２００ＱまたはＤ２０７Ｎから選択される１個のアミノ酸修飾とＬ６８Ｖである、請求項１に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項１０】
アミノ酸修飾は、Ｌ６８Ｖ／Ｋ１６１Ｑ、Ｌ６８Ｖ／Ｋ１６１Ｎ、またはＬ６８Ｖ／Ｄ２０７Ｎから選ばれる、請求項１に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項１１】
配列番号１８、１９、３３、５２、６２、６９、７０、７３、７８、７９、９４、９５、１０９、１２８、１３８、１４５、１４６、１４９、１５４、１５５、１６４、１６５、１７８、１７９、１９３、２１２、２２２、２２９、２３０、２３３、２３８、２３９、２４８、２４９、または２５８−２６６で表現されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項１２】
配列番号１８、１９、６９、７０、７８、９４、９５、１４５、１４６、１５４、１６４、１６５、１７８、１７９、２２９、２３０、２３８、２４８、２４９、または２６１−２６３で表現されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項１３】
タンパク質分解酵素に対する向上した抵抗性を有する、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項１４】
請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片の２つまたは３つ以上が共有結合により連結された、ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片の複合体。
【請求項１５】
ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片が、さらに、糖化、アシル化、メチル化、リン酸化、ハシル化、カルバミル化、硫酸化、プレニル化、酸化、グアニジル化、アミジン化、カルバミル化、トリニトロフェニル化、ニトロ化、またはペグ化されたものである、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド(ＴＮＦＲＩポリペプチド)またはその断片。
【請求項１６】
請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片をコードする塩基配列を含む遺伝子。
【請求項１７】
大腸菌内発現に適合するようにコドンが操作された配列番号５の塩基配列に基づいて製造された、請求項１６に記載の遺伝子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項２０】
大腸菌である、請求項１9に記載の細胞。
【請求項２１】
請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片を含む薬剤学的製剤。
【請求項２２】
請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片を含む、成人呼吸困難症候群、食欲不振、癌、慢性疲労症候群、移植片対宿主拒否反応、痛覚過敏、炎症性腸疾患、神経炎症性疾患、脳虚血を含む虚血／再潅流傷害、各々神経変性の原因になりうる外傷、癲癇、出血または発作の結果としての脳損傷、糖尿病、多発性硬化症、眼病、疼痛、膵炎、肺線維症、リウマチ性関節炎、骨関節炎、若年性（リウマチ性）関節炎、血清反応陰性多発性関節炎、強直性脊髄炎、ライター症候群及び反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎、脳血管炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及び多発性筋痛、リウマチ性及び巨細胞性動脈炎、敗血性ショック、放射線療法の副作用、全身性紅斑性狼瘡、側頭下顎関節疾患、甲状腺炎及び組織移植からなる群から選ばれるＴＮＦ媒介疾病の予防または治療用の薬剤学的組成物。
【請求項２３】
成人呼吸困難症候群、食欲不振、癌、慢性疲労症候群、移植片対宿主拒否反応、痛覚過敏、炎症性腸疾患、神経炎症性疾患、脳虚血を含む虚血／再潅流傷害、各々神経変性の原因になりうる外傷、癲癇、出血または発作の結果としての脳損傷、糖尿病、多発性硬化症、眼病、疼痛、膵炎、肺線維症、リウマチ性関節炎、骨関節炎、若年性（リウマチ性）関節炎、血清反応陰性多発性関節炎、強直性脊髄炎、ライター症候群及び反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎、脳血管炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及び多発性筋痛、リウマチ性及び巨細胞性動脈炎、敗血性ショック、放射線療法の副作用、全身性紅斑性狼瘡、側頭下顎関節疾患、甲状腺炎及び組織移植からなる群から選ばれるＴＮＦ媒介疾病の予防または治療のための請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片の用途。
【請求項２４】
請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片をＴＮＦ媒介疾病の予防または治療が必要な対象に投与することを含む、ＴＮＦ媒介疾病の予防または治療方法であって、
前記ＴＮＦ媒介疾病は、成人呼吸困難症候群、食欲不振、癌、慢性疲労症候群、移植片対宿主拒否反応、痛覚過敏、炎症性腸疾患、神経炎症性疾患、脳虚血を含む虚血／再潅流傷害、各々神経変性の原因になりうる外傷、癲癇、出血または発作の結果としての脳損傷、糖尿病、多発性硬化症、眼病、疼痛、膵炎、肺線維症、リウマチ性関節炎、骨関節炎、若年性（リウマチ性）関節炎、血清反応陰性多発性関節炎、強直性脊髄炎、ライター症候群及び反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎、脳血管炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及び多発性筋痛、リウマチ性及び巨細胞性動脈炎、敗血性ショック、放射線療法の副作用、全身性紅斑性狼瘡、側頭下顎関節疾患、甲状腺炎及び組織移植からなる群から選ばれるものである方法。
【請求項２５】
請求項１６に記載の遺伝子またはこれを含むベクターを含む、成人呼吸困難症候群、食欲不振、癌、慢性疲労症候群、移植片対宿主拒否反応、痛覚過敏、炎症性腸疾患、神経炎症性疾患、脳虚血を含む虚血／再潅流傷害、各々神経変性の原因になりうる外傷、癲癇、出血または発作の結果としての脳損傷、糖尿病、多発性硬化症、眼病、疼痛、膵炎、肺線維症、リウマチ性関節炎、骨関節炎、若年性（リウマチ性）関節炎、血清反応陰性多発性関節炎、強直性脊髄炎、ライター症候群及び反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎、脳血管炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及び多発性筋痛、リウマチ性及び巨細胞性動脈炎、敗血性ショック、放射線療法の副作用、全身性紅斑性狼瘡、側頭下顎関節疾患、甲状腺炎及び組織移植からなる群から選ばれるＴＮＦ媒介疾病の予防または治療用の薬剤学的組成物。
【請求項２６】
請求項１６に記載の遺伝子またはこれを含むベクターを用いることを含む、請求項１乃至第１２のいずれか１項に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で腫瘍壊死因子と結合する修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１（ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）ポリペプチドまたはその断片及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
炎症は抗原刺激により起こる身体の防御作用である。しかし、有害な抗原物質が除去された後にも炎症が発生したり、炎症反応が自己抗原のような不適切な刺激により起きたりすると、病理学的に悪化することになる。このような炎症反応には種々のサイトカインが関与し、特に、炎症調節の役割を果たすサイトカインとして腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ；以下、‘ＴＮＦ’という。）が確認された。
【０００３】
ＴＮＦは、腫瘍細胞を除去するタンパク質として初めて発見された（Ｃａｒｓｗｅｌｌ等、ＰＮＡＳ  ７２：３６６６−３６７０  １９７５；Ｏｌｄ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：６３０−６３２  １９８５；Ｂｅｕｔｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：５５２−５５４  １９８５）。ＴＮＦは、単球及び大食細胞を含む多数の細胞形態において産生されるサイトカインで、炎症反応に直接関与する。少なくとも２種類のＴＮＦ（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）があり、これらのそれぞれは三量体として作用し、交差結合受容体により細胞内信号伝達を開始するものと知られている（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６５：１４４９７−１４５０４）。生体内でＴＮＦは炎症反応を誘発することによって細胞免疫反応及び防御機作を調節すると同時に、多数の互いに異なる標的細胞に対する重要な生理学的効果を有する（Ｓｅｌｂｙ等、Ｌａｎｃｅｐ  １：４８３  １９８８；Ｓｔａｒｎｅｓ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ８２：１３２１  １９８８；Ｏｌｉｆｆ等、Ｃｅｌｌ  ５０；５５５  １９８７；Ｗａａｇｅ等、Ｌａｎｃｅｐｔ  １：３５５  １９８７、Ａｇｇａｒｗａｌ等、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：７４５−７５６  ２００３）。しかし、ＴＮＦが過量存在すると、リウマチ性関節炎、退行性関節炎、乾癬、クローン病などのような病的状態が発生し、これを阻害することで疾病への治癒効果があることが確認された（Ｆｅｌｄｍａｎｎ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２４５−１２５０  ２００３；Ｋｏｏｌｏｏｓ等、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  １２：１２５−１３１  ２００７；Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓ等、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２６：１５９３−１６１０  ２００４；Ｒｏｔｈｅ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：７９８−８０２  １９９３；Ｋａｆｒｏｕｎｉ等、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．７４：５６４−５７１  ２００３；Ｒａｈｍａｎ等、Ｐｌｏｓ  Ｐａｔｈｏｇ．２：ｅ４  ２００６；Ｃｈａｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：５１６１３−６１６２１  ２００３；Ｗａｊａｎｔ等、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１０：４５−６５  ２００３）。
【０００４】
腫瘍壊死因子受容体（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下、‘ＴＮＦＲ’という。）は、ＴＮＦと結合するサイトカイン受容体である。
【０００５】
ＴＮＦＲは、今のところ、ｐ５５−ＴＮＦＲＩとｐ７５−ＴＮＦＲＩＩと知られた２種類が発見されている。ＴＮＦＲIは、哺乳類のほぼ全ての細胞で発現すると知られており、ＴＮＦＲＩＩは、免疫システム及び内皮細胞で制約的に発現すると知られている。
【０００６】
これらの両受容体は２８％のアミノ酸配列の類似性を示す。両受容体とも細胞外ドメインを有し、４個のシステイン−リッチ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ）ドメインを有している。
【０００７】
ＴＮＦＲＩは、細胞質部分に細胞死滅信号を起こす“デスドメイン（ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ）”を有するが、ＴＮＦＲIIにはデスドメインがなく、現在までＴＮＦＲIIの機能は明確に定義されていない。また、ＴＮＦＲIとＴＮＦＲIIは、リガンドであるＴＮＦ−αに対する親和力において相違する。ＴＮＦＲIがＴＮＦＲIIに比べて３０倍以上親和力が高いと知られている（Ｔａｒｔａｇｌｉａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１８５４２−１８５４８  １９９３；Ｂｅｒｎａｒｄ等、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ７：７５９−７７０  １９９５）。この親和力の相違から、ＴＮＦＲIに対する医薬品の開発が多く試みられてきている。
【０００８】
細胞表面についているＴＮＦＲは、タンパク質分解酵素により切断されて水溶性ＴＮＦＲを生成し、水溶性ＴＮＦＲは、過量存在するＴＮＦを中和させてＴＮＦの濃度を調節する作用を担う。自己免疫疾患または慢性炎症では、このような調節能力を越えるＴＮＦ濃度を有していると知られている。
【０００９】
人為的にＴＮＦの信号伝達を調節するために、ＴＮＦ合成阻害、ＴＮＦの放出阻害、ＴＮＦの信号伝達阻害などの、様々なＴＮＦ阻害方法が適用されてきた。ＴＮＦ阻害方法のうち、ＴＮＦＲとＴＮＦとの結合を妨害してＴＮＦの信号伝達を阻害する方法が、医薬品の開発に適用されてきた。その一例に、ＴＮＦＲIIの細胞膜外部分と抗体のＦｃ部分とを融合して作ったエタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）と、ＴＮＦと結合する抗体としてアダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）などが、リウマチ性関節炎、乾癬、強直性脊髄炎などの治療剤として全世界で用いられている。
【００１０】
上記のリウマチ性関節炎治療剤エタネルセプトと同じ技術を適用して抗体のＦｃとＴＮＦＲIの細胞外ドメインとを結合させた融合タンパク質であるレネルセプト（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）についてヨーロッパ及び米国で臨床２相まで進行されたし（Ｆｕｒｓｔ等、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３０：２１２３−２１２６  ２００３；Ｒａｕ等、Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３０：６８０−６９０  ２００３  Ａｒｂｒａｈａｍ等、Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２９：５０３−５１０  ２００１）、ＴＮＦＲI二量体（ｄｉｍｅｒ）とポリエチレングリコール化水溶性ＴＮＦＲI（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＴＮＦＲI）分子に関する研究が進行された（Ｃａｒｌ等、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５８：１７３−１８１  １９９９；Ｓｏｌｏｒｚａｎｏ等、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：１１１９−１１３０  １９９８；ｃａｒｌ等、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｉｖｅｗｓ  ５５：１３１５−１３３６  ２００３；Ｈｏｎｇｈｕｉ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：４９０−４９７  ２００５；Ｙｕｇａｌ等、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １７２：１４１１−１４１８  ２００８）。
【００１１】
また、ＴＮＦＲIの免疫原性を下げると共にＴＮＦとの結合力を高めるための方法として、アミノ酸配列を修飾する研究が進行された。特に、ＴＮＦＲIのアミノ酸配列の一部を置換して抗体発生を減らしたＴＮＦＲI突然変異体、及びＴＮＦＲIとＴＮＦとの結合力を増大させた突然変異体が知られている（米国特許第７，１４４，９８７号）。
【００１２】
ＴＮＦＲとＴＮＦとの結合に関与する活性部位を見出すための多くの研究が進行されてきた。ＴＮＦＲの４番目のドメインはＴＮＦとの結合に必須のものではなく、２番目と３番目のドメインを欠失させるとＴＮＦ結合活性を喪失することが知られている（Ｃｏｒｃｏｒａｎ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３３：８３１−８４０  １９９４；Ｃｈｉｎ−Ｈｓｕｅｈ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８７４−２８７８  １９９５；Ｓｃａｌｌｏｎ等、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ７：７５９−７７０  １９９５）。また、ＴＮＦＲIとＴＮＦとの結合に３番目のドメインの一定部位を欠損させることができ、ヒトＴＮＦＲ１ポリペプチド（配列番号１）の５９番から１４３番までのアミノ酸からなるアミノ酸配列が、ＴＮＦＲIの生物学的活性を示す部位として知られている（米国特許第６，９８９，１４７号）。
【００１３】
したがって、この部位でＴＮＦＲIとＴＮＦとの結合がなされるため、それ以外の領域では相当な添加基、脱落基または置換基を含むことができる。
【００１４】
一方、ＴＮＦＲＩは、生体内利用率を高めるために、完全な長さのＴＮＦＲIよりはＴＮＦＲIポリペプチド断片が用いられており、タンパク質分解酵素による切断可能性を最小化しながら細胞透過率を高めるための効果的な注射剤及び経口投与用製剤とするためには、最小限の大きさに製造されることが要求される。
【００１５】
また、タンパク質治療剤は、体内循環で代謝、腎臓におけるろ過作用（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）、及び胃腸管、組織、血液などにおけるタンパク質分解酵素による分解などのような一般的な過程により除去されるため、生体内でタンパク質固有の活性を維持しつつ、目的とする場所まで送達することは非常に困難である。特に、タンパク質分解酵素による除去は、経口、血管注射、筋肉注射などによる投与時にタンパク質治療剤の半減期に多大な影響を与える。
【００１６】
タンパク質治療剤の一つとして、生体内のＴＮＦを調節するヒト腫瘍壊死因子阻害剤が注射剤の形態で開発されているが、注射剤投与は痛み及び感染の危険などの問題を招く。そのため、注射投与回数を軽減したり経口投与したりするなどの他の方法が要求される。そのためには、ヒト腫瘍壊死因子の安全性を高めることが必須であるが、上記のタンパク質分解酵素による分解がその大きな障害となる。
【００１７】
したがって、経口用タンパク質治療剤の開発における重要な目標の一つは、生物学的活性を有しながらタンパク質分解酵素には抵抗性を有するタンパク質治療剤を開発することである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でＴＮＦ阻害作用を有しながら、胃腸管、細胞質及び血液中に存在するタンパク質分解酵素に対する向上した抵抗性を有する修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１（ＴＮＦＲＩ）ポリペプチドまたはその断片を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
特に定義しない限り、下記の用語は、本発明の詳細な説明及び特許請求の範囲で以下に定義された意味を有するとする。
【００２０】
本発明で定義された“ヒト腫瘍壊死因子受容体−１”、または“ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド”（以下、ＴＮＦＲIまたはＴＮＦＲIポリペプチド）は、ヒト由来で、４５５個のアミノ酸で構成され、ＴＮＦと結合するポリペプチドのことをいう。
【００２１】
本発明で定義された“ヒト腫瘍壊死因子受容体−１断片”、または“ヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチド断片”（以下、ＴＮＦＲI断片またはＴＮＦＲIポリペプチド断片）は、ＴＮＦＲIの配列と互いに相応するアミノ酸の配列が１００％一致し、一つ以上のアミノ酸残基が欠失しているＴＮＦＲIの一部分である。欠失したアミノ酸残基は、Ｎ末端、Ｃ末端または内部を含む、ポリペプチド内のいずれかの箇所でよい。この断片は、ＴＮＦＲIと一つ以上の生物学的特性を共有する。断片の代表例は、ＴＮＦＲIのＮ末端４１番目のアミノ酸から１０８個または１２６個のアミノ酸を有するもので、これらはそれぞれ、本願においてＴＮＦＲI１０８、ＴＮＦＲI１２６と命名する。
【００２２】
本発明で定義された“ＴＮＦＲI（突然）変異体”、“ＴＮＦＲI断片（突然）変異体”または“修飾されたＴＮＦＲIポリペプチド”、“修飾されたＴＮＦＲIポリペプチド断片”は、下記に定義されるように、天然または組換え細胞から分離されたＴＮＦＲIポリペプチドまたはその断片と１００％未満の配列同一性を有するＴＮＦＲIポリペプチドまたはその断片のことを指す。一般に、ＴＮＦＲI変異体は、野生型または天然型ＴＮＦＲIまたはＴＮＦＲI断片と約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。配列同一性は、好ましくは約７５％以上でよく、８０％以上、約８５％以上、９０％以上の順にさらに好ましく、最も好ましくは９５％以上でよい。
【００２３】
本発明で定義された“単一変異体”は、ヒト腫瘍壊死因子受容体−１またはヒト腫瘍壊死因子受容体−１断片のアミノ酸配列において１箇所に突然変異が生じた変異体のことをいう。
【００２４】
本発明で定義された“二重変異体”は、ヒト腫瘍壊死因子受容体−１またはヒト腫瘍壊死因子受容体−１断片のアミノ酸配列において２箇所に突然変異が生じた変異体のことをいう。
【００２５】
本発明で定義された“三重変異体”は、ヒト腫瘍壊死因子受容体−１またはヒト腫瘍壊死因子受容体−１断片のアミノ酸配列において３箇所に突然変異が生じた変異体のことをいう。
【００２６】
本発明で定義された“ＴＮＦＲＩｍ”は、ＴＮＦＲIのアミノ酸配列のうち、Ｎ末端の４１番目のアミノ酸からｍ個のアミノ酸配列からなるＴＮＦＲI断片のことをいう。例えば、ＴＮＦＲI１０８断片は、ＴＮＦＲI  Ｎ末端４１番目のアミノ酸から１０８個のアミノ酸配列を有するＴＮＦＲI断片である。他の例として、ＴＮＦＲI１２６は、ＴＮＦＲI  Ｎ末端４１番目のアミノ酸から１２６個のアミノ酸からなるＴＮＦＲI断片である。
【００２７】
本発明で定義された“Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩｍ”は、大腸菌でＴＮＦＲIを発現させるために、Ｎ末端に、ＴＮＦＲIアミノ酸配列にないメチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）が添加されたＮ末端４１番アミノ酸からｍ個のアミノ酸個数を有するＴＮＦＲI断片のことをいう。
【００２８】
本発明で定義された“ｘＡｚ”は、アミノ酸配列においてＡ番目のアミノ酸ｘがｚに置換されたものを意味する。例えば、Ｋ４８Ｑは、４８番のアミノ酸のリシン（Ｌｙｓ）がグルタミン（Ｇｌｎ）に置換されたものを意味する。
【００２９】
本発明は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）及び/または生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でＴＮＦ阻害作用を有しながら、タンパク質分解酵素に対する向上した抵抗性を有する修飾されたＴＮＦＲIポリペプチドまたはその断片、及びその製造方法、並びにそれらの用途に関するものである。
【００３０】
本発明者らは、生体内及び／または生体外で安全性の増大したＴＮＦＲI変異体を開発するために鋭意研究した結果、天然型ＴＮＦＲI断片のアミノ酸配列のうち、タンパク質分解酵素により認識されて切断される１または２以上のアミノ酸を、タンパク質分解酵素により切断されないと共に物理化学的特性を大きく変化させないアミノ酸に置換することによって、タンパク質分解酵素に対する抵抗性の向上したＴＮＦＲI変異体を完成するに至った。
【００３１】
したがって、本発明は、天然型ＴＮＦＲIポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列のうち、特定位置の１または２以上のアミノ酸を修飾することによって、タンパク質分解酵素に対する抵抗性が向上した修飾されたＴＮＦＲIポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００３２】
本発明の修飾されたＴＮＦＲIポリペプチドまたはその断片は、薬剤学的生体内利用率に優れており、糖鎖を含まなくとも活性を示すことから、動物細胞の他、微生物細胞においても容易に生成することができる。
【００３３】
本発明についてより詳細に説明すると、下記の通りである。
【００３４】
本発明は、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲIポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列において、６１番、６８番、７８番、８５番、１０６番、１０７番、１０９番、１２１番、１２８番、１３３番、１３５番、１３６番、１３８番、１４１番、１５０番、１５６番、１６１番、２００番、２０３番、２０６番及び２０７番からなる群から選ばれる１または２以上の位置；より好ましくは、６８番、８５番、１０９番、１２８番、１３３番、１３５番、１３６番、１４１番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置；最も好ましくは、６８番、１０９番、１３３番、１３５番、１３６番、１４１番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置におけるアミノ酸修飾を含む修飾されたＴＮＦＲIポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００３５】
上記位置におけるアミノ酸修飾は、修飾されていないＴＮＦＲIポリペプチドまたはその断片に比べて、タンパク質分解酵素に対する増加した抵抗性を有させる修飾であり、アミノ酸の置換の他、タンパク質翻訳後修飾のような上記位置のアミノ酸に対する他の化学的な修飾、例えば、炭水化物部位による糖化、アシル化（ａｃｙｌａｔｉｏｎ）（例、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）またはサクシニル化（ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｉｏｎ））、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、ハシル化（ｈａｓｙｌａｔｉｏｎ）、カルバミル化（ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、プレニル化（ｐｒｅｎｙｌａｔｉｏｎ）、酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、グアニジル化（ｇｕａｎｉｄｉｎａｔｉｏｎ）、アミジン化（ａｍｉｄｉｎａｔｉｏｎ）、カルバミル化（ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ）（例、カルバモイル化（ｃａｒｂａｍｏｙｌａｔｉｏｎ））、トリニトロフェニル化（ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｔｉｏｎ）、ニトロ化（ｎｉｔｒａｔｉｏｎ）、ペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）などを含む。本発明の修飾されたＴＮＦＲIポリペプチドまたはその断片は、上記位置のアミノ酸修飾によって体内タンパク質分解酵素に対する増加した抵抗性を示す。このような化学的な修飾は、当業界で公知の通常の方法によってアミノ酸を操作することによって達成することができる。
【００３６】
本発明は、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲIポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列において、６１番、６８番、７８番、８５番、１０６番、１０７番、１０９番、１２１番、１２８番、１３３番、１３５番、１３６番、１３８番、１４１番、１５０番、１５６番、１６１番、２００番、２０３番、２０６番及び２０７番からなる群から選ばれる１または２以上の位置におけるアミノ酸が置換されたＴＮＦＲIポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００３７】
好ましくは、本発明は配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲIポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列において、６８番、８５番、１０９番、１２８番、１３３番、１３５番、１３６番、１４１番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置、より好ましくは、６８番、１０９番、１３３番、１３５番、１３６番、１４１番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置のアミノ酸が置換されたＴＮＦＲIポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００３８】
上記配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲIポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列において、６１番、６８番、７８番、８５番、１０６番、１０７番、１０９番、１２１番、１２８番、１３３番、１３５番、１３６番、１３８番、１４１番、１５０番、１５６番、１６１番、２００番、２０３番、２０６番及び２０７番位置のアミノ酸置換は、本来のアミノ酸がタンパク質分解酵素により認識されて切断されないと共に物理化学的特性を大きく変化させないアミノ酸に置換されたもので、好ましくは、Ｒ(Arg)はＱ(Gln)またはＨ(His)に；Ｅ(Glu)はＱ(Gln)またはＮ(Asn)に；Ｋ(Lys)はＱ(Gln)またはＮ(Asn)に；Ｄ(Asp)はＮ(Asn)またはＱ(Gln)に；Ｍ(Met)はＩ(Ile)またはＶ(Val)に；Ｐ(Pro)はＡ(Ala)またはＳ(Ser)に；Ｙ(Tyr)はＩ(Ile)またはＨ(His)に；Ｆ(Phe)はＩ(Ile)またはＶ(Val)に；Ｗ(Trp)はＨ(His)またはＳ(Ser)に；Ｌ(Leu)はＩ(Ile)またはＶ(Val)に置換される。
【００３９】
本発明は、また、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列において、Ｋ６１Ｑ、Ｋ６１Ｎ、Ｌ６８Ｉ、Ｌ６８Ｖ、Ｄ７８Ｑ、Ｅ８５Ｎ、Ｒ１０６Ｈ、Ｒ１０６Ｑ、Ｋ１０７Ｑ、Ｍ１０９Ｉ、Ｒ１２１Ｈ、Ｒ１２１Ｑ、Ｒ１２８Ｈ、Ｒ１２８Ｑ、Ｒ１３３Ｑ、Ｙ１３５Ｉ、Ｙ１３５Ｈ、Ｗ１３６Ｈ、Ｗ１３６Ｓ、Ｅ１３８Ｑ、Ｅ１３８Ｎ、Ｆ１４１Ｉ、Ｆ１４１Ｖ、Ｌ１５０Ｉ、Ｌ１５６Ｉ、Ｋ１６１Ｑ、Ｋ１６１Ｎ、Ｅ２００Ｑ、Ｋ２０３Ｑ、Ｅ２０６Ｑ、Ｄ２０７Ｑ及びＤ２０７Ｎからなる群から選ばれる１または２以上のアミノ酸置換を含む修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００４０】
好ましくは、本発明は、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列において、Ｌ６８Ｉ、Ｌ６８Ｖ、Ｅ８５Ｎ、Ｍ１０９Ｉ、Ｒ１２８Ｈ、Ｒ１３３Ｑ、Ｙ１３５Ｉ、Ｗ１３６Ｓ、Ｆ１４１Ｉ、Ｆ１４１Ｖ、Ｋ１６１Ｑ及びＫ１６１Ｎからなる群、好ましくは、Ｌ６８Ｉ、Ｌ６８Ｖ、Ｍ１０９Ｉ、Ｒ１３３Ｑ、Ｙ１３５Ｉ、Ｗ１３６Ｓ、Ｆ１４１Ｉ、Ｆ１４１Ｖ、Ｋ１６１Ｑ及びＫ１６１Ｎからなる群、より好ましくはＬ６８Ｉ、Ｌ６８Ｖ、Ｒ１３３Ｑ、Ｙ１３５Ｉ、Ｆ１４１Ｉ、Ｋ１６１Ｑ及びＫ１６１Ｎからなる群から選ばれる１または２以上のアミノ酸置換を含む修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００４１】
好ましくは、本発明は、上記言及したアミノ酸修飾を１個または２個含む修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００４２】
すなわち、本発明は、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列において、Ｋ６１Ｑ、Ｋ６１Ｎ、Ｌ６８Ｉ、Ｌ６８Ｖ、Ｄ７８Ｑ、Ｅ８５Ｎ、Ｒ１０６Ｈ、Ｒ１０６Ｑ、Ｋ１０７Ｑ、Ｍ１０９Ｉ、Ｒ１２１Ｈ、Ｒ１２１Ｑ、Ｒ１２８Ｈ、Ｒ１２８Ｑ、Ｒ１３３Ｑ、Ｙ１３５Ｉ、Ｙ１３５Ｈ、Ｗ１３６Ｈ、Ｗ１３６Ｓ、Ｅ１３８Ｑ、Ｅ１３８Ｎ、Ｆ１４１Ｉ、Ｆ１４１Ｖ、Ｌ１５０Ｉ、Ｌ１５６Ｉ、Ｋ１６１Ｑ、Ｋ１６１Ｎ、Ｅ２００Ｑ、Ｋ２０３Ｑ、Ｅ２０６Ｑ、Ｄ２０７Ｑ及びＤ２０７Ｎからなる群から選ばれる１または２のアミノ酸置換を含む修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を；好ましくは、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列においてＬ６８Ｉ、Ｌ６８Ｖ、Ｅ８５Ｎ、Ｍ１０９Ｉ、Ｒ１２８Ｈ、Ｒ１３３Ｑ、Ｙ１３５Ｉ、Ｗ１３６Ｓ、Ｆ１４１Ｉ、Ｆ１４１Ｖ、Ｋ１６１Ｑ及びＫ１６１Ｎからなる群から選ばれる１または２のアミノ酸置換を含む修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を；より好ましくは、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列においてＬ６８Ｉ、Ｌ６８Ｖ、Ｒ１３３Ｑ、Ｙ１３５Ｉ、Ｆ１４１Ｉ、Ｋ１６１Ｑ及びＫ１６１Ｎからなる群から選ばれる１または２のアミノ酸置換を含む修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００４３】
また、上記２個のアミノ酸置換を含む修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片の好ましい具体例として、本発明は、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列において、Ｌ６８Ｖ、Ｒ１３３Ｑ、Ｆ１４１Ｖ、Ｋ１６１Ｑ、Ｋ１６１Ｎ、Ｅ２００Ｑ及びＤ２０７Ｎからなる群から選ばれる２個のアミノ酸置換を含む修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。好ましくは、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列においてＲ１３３Ｑ、Ｆ１４１Ｖ、Ｋ１６１Ｑ、Ｋ１６１Ｎ、Ｅ２００ＱまたはＤ２０７Ｎから選ばれる１個のアミノ酸置換及びＬ６８Ｖの２個のアミノ酸置換を含む修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。より好ましくは、本発明は、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列において、Ｌ６８Ｖ／Ｋ１６１Ｑ、Ｌ６８Ｖ／Ｋ１６１Ｎ、またはＬ６８Ｖ／Ｄ２０７Ｎから選ばれるアミノ酸置換を含む修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００４４】
上記配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドの断片は、天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドと実質的に同等の効果を示す、天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドの一部分を意味する。本願では、特に、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番乃至２１１番からなるアミノ酸配列（配列番号２;ＴＮＦＲＩ１７１）、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番乃至１６６番からなるアミノ酸配列（配列番号３；ＴＮＦＲＩ１２６）、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩのアミノ酸配列の４１番乃至１４８番からなるアミノ酸配列（配列番号４;ＴＮＦＲＩ１０８）が用いられる。しかし、本発明の配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドの断片は、然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドと実質的に同等の効果を示すものであればよく、上記したＴＮＦＲＩ１７１、ＴＮＦＲＩ１２６、ＴＮＦＲＩ１０８に限定されることはない。
【００４５】
上記修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドの“断片”は、修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドと実質的に同等の効果を示し、当業者により容易に製造可能な修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドの一部分を意味する。
【００４６】
そのため、本発明のタンパク質分解酵素に対する抵抗性が向上した、修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片の範ちゅうには、以下に記述されるものが含まれる。
【００４７】
本発明は、配列番号１として記載される天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１のアミノ酸配列の４１番乃至２１１番からなるアミノ酸配列において、６１番、６８番、７８番、８５番、１０６番、１０７番、１０９番、１２１番、１２８番、１３３番、１３５番、１３６番、１３８番、１４１番、１５０番、１５６番、１６１番、２００番、２０３番、２０６番及び２０７番からなる群から選ばれる１または２以上の位置でのアミノ酸修飾；好ましくは、６８番、８５番、１０９番、１２８番、１３３番、１３５番、１３６番、１４１番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置でのアミノ酸修飾；より好ましくは６８番、１０９番、１３３番、１３５番、１３６番、１４１番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置でのアミノ酸修飾を含む、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片（ＴＮＦＲＩ１７１変異体またはその断片）を提供する。ここで、アミノ酸修飾は、上記位置におけるアミノ酸修飾について、上述した具体的な修飾及び好ましい修飾が同一に適用される。
【００４８】
本発明は配列番号１として記載される天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１のアミノ酸配列の４１番乃至１６６番からなるアミノ酸配列において、６１番、６８番、７８番、８５番、１０６番、１０７番、１０９番、１２１番、１２８番、１３３番、１３５番、１３６番、１３８番、１４１番、１５０番、１５６番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置でのアミノ酸修飾；好ましくは、６８番、８５番、１０９番、１２８番、１３３番、１３５番、１３６番、１４１番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置でのアミノ酸修飾；より好ましくは、６８番、１０９番、１３３番、１３５番、１３６番、１４１番及び１６１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置でのアミノ酸修飾を含む修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片（ＴＮＦＲＩ１２６変異体またはその断片）を提供する。ここで、アミノ酸修飾は、上記位置におけるアミノ酸修飾に関して上述した具体的な修飾及び好ましい修飾が同一に適用される。
【００４９】
本発明は、配列番号１として記載される天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体−１のアミノ酸配列の４１番乃至１４８番からなるアミノ酸配列において、６１番、６８番、７８番、８５番、１０６番、１０７番、１０９番、１２１番、１２８番、１３３番、１３５番、１３６番、１３８番及び１４１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置でのアミノ酸修飾；好ましくは、６８番、８５番、１０９番、１２８番、１３３番、１３５番、１３６番及び１４１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置でのアミノ酸修飾；より好ましくは、６８番、１０９番、１３３番、１３５番、１３６番及び１４１番からなる群から選ばれる１または２以上の位置でのアミノ酸修飾を含む修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片（ＴＮＦＲＩ１０８変異体またはその断片）を提供する。ここで、アミノ酸修飾は、上記位置におけるアミノ酸修飾について、上述した具体的な修飾及び好ましい修飾が同一に適用される。
【００５０】
本発明は、また、配列番号１として記載されるアミノ酸配列を有するＴＮＦＲＩポリペプチドと実質的に同じポリペプチドにおいて、上述したアミノ酸修飾またはそれに相応する修飾を含む修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。上記の“配列番号１として記載されるアミノ酸配列を有するＴＮＦＲＩポリペプチドと実質的に同じポリペプチド”とは、ＴＮＦＲＩの本質的な活性を害さない数と種類のアミノ酸修飾、すなわち、アミノ酸置換、欠失、付加またはその他の修飾を含むポリペプチドを意味する。具体的には、本発明は、配列番号１として記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性を有する変異体において上述のアミノ酸修飾に相応する修飾を含む、修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００５１】
上述の変異体は、配列番号１として記載された配列を有するポリペプチドと、本発明のタンパク質分解酵素に対する抵抗性向上のためのアミノ酸修飾を除けば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するもので、ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドの対立遺伝子型変異体同種型、組織特異的な同種型及びそれらの対立遺伝子型変異体、一つ以上のアミノ酸突然変異、置換、欠失、挿入または追加を有している合成変異体、核酸を翻訳することによって製造された合成分子、ヒト及び非ヒト組織及び細胞から抽出したタンパク質、キメラＴＮＦＲＩポリペプチド及びその修飾された形態を含むことができる。
【００５２】
上述の“相応する修飾”とは、異なる同種型であるポリペプチド同士間に比較される残基の修飾を意味する。すなわち、配列番号１として記載される天然型ヒトＴＮＦＲＩポリペプチドのアミノ酸配列と配列アラインメント（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）時に、機能的に不変であると把握される残基を有する位置における、本発明のタンパク質分解酵素に対する抵抗性の向上のためのアミノ酸修飾に相応する修飾を意味する。当業界における熟練者であれば、それらのポリペプチドから相応する残基の修飾を容易に把握することができる。例えば、当業者は、保存的で且つ同一のアミノ酸残基をガイドとして用いてＴＮＦＲＩポリペプチドの配列を整列することによって、相応する残基を同定することができる。
【００５３】
本発明は、また、配列番号６乃至配列番号２６６で表現されたアミノ酸配列を含むＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片、好ましくは、配列番号１８、１９、３３、５２、６２、６９、７０、７３、７８、７９、９４、９５、１０９、１２８、１３８、１４５、１４６、１４９、１５４、１５５、１６４、１６５、１７８、１７９、１９３、２１２、２２２、２２９、２３０、２３３、２３８、２３９、２４８、２４９、または２５８乃至２６６で表現されたアミノ酸配列を含むＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片、より好ましくは、配列番号１８、１９、６９、７０、７８、９４、９５、１４５、１４６、１５４、１６４、１６５、１７８、１７９、２２９、２３０、２３８、２４８、２４９、または２６１乃至２６３で表現されたアミノ酸を含むＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００５４】
上記の本発明の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、上記アミノ酸修飾に加えて、タンパク質翻訳後修飾のような他の化学的な修飾、例えば、炭水化物部位による糖化、アシル化（ａｃｙｌａｔｉｏｎ）（例、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）またはサクシニル化（ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｉｏｎ））、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、ハシル化（ｈａｓｙｌａｔｉｏｎ）、カルバミル化（ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、プレニル化（ｐｒｅｎｙｌａｔｉｏｎ）、酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、グアニジル化（ｇｕａｎｉｄｉｎａｔｉｏｎ）、アミジン化（ａｍｉｄｉｎａｔｉｏｎ）、カルバミル化（ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ）（例、カルバモイル化（ｃａｒｂａｍｏｙｌａｔｉｏｎ））、トリニトロフェニル化（ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｔｉｏｎ）、ニトロ化（ｎｉｔｒａｔｉｏｎ）、ペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）を、タンパク質分解酵素に対する抵抗性の増加、免疫原性の減少、または生物学的活性の維持または増加のために含むことができる。
【００５５】
本発明は、また、上記のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を提供する。
【００５６】
本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片をコードする遺伝子は、大腸菌内発現を最適化するために操作された遺伝子を含む。ヒトと大腸菌の遺伝子コドンが異なるため、ヒト遺伝子を大腸菌で発現させる場合に、発現収率が低い。そこで、本発明では、ヒトＴＮＦＲＩ遺伝子に基づいて大腸菌発現に適合するように操作された遺伝子、例えば配列番号５のＴＮＦＲＩ遺伝子を用いることができる。該遺伝子は、大腸菌発現ベクター（例えば、ｐＥＴ４４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：７１１２２−３））に挿入してコドンなしの大腸菌細胞（例：ＢＬ２１（ＤＥ３））で発現時に、ヒトＴＮＦＲＩ遺伝子よりも高い発現量を示す。そのため、該遺伝子を用いてＴＮＦＲＩ断片及びＴＮＦＲＩ変異体を大腸菌内で効果的に産生することができる。
【００５７】
本発明は、また、上記遺伝子を含むベクターを提供する。本発明で遺伝子導入のために使用可能なベクターは、当業界に公知のベクターを用いることができ、好ましくは、図１、図５の切断地図を有するベクターを用いることができる。
【００５８】
本発明は、また、上記ベクターで形質転換された微生物または動物細胞を提供する。本発明で、ベクターの形質転換のために使用可能な微生物または動物細胞は、当業界で用いられる形質転換のための公知の微生物または動物細胞とすればよく、好ましくは、大腸菌細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などを用いることができ、より好ましくは、大腸菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３））を用いることができる。
【００５９】
本発明は、大腸菌を用いたＴＮＦＲＩの製造方法を提供する。
【００６０】
ＴＮＦＲＩは、動物細胞を用いて産生可能である（Ｂｅｒｎｉｅ等、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．３０１：４１８−４２６  ２００２；Ｓｃａｌｌｏｎ等、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．７：７５９−７７０  １９９５）。
【００６１】
ＴＮＦＲＩを大腸菌で発現させる場合に、構造的に活性を持たない封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）の形態で発現するから、活性を有するタンパク質へのリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）過程が要求される（Ｓｉｌｖｉａ等、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３０：８５−９０  １９９５；Ｋａｒｉｎ等、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．７：２６−３８  １９９５）。そのため、本発明の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は大腸菌で封入体の形態で発現させ、これをリフォールディング過程を通じて活性を有するＴＮＦＲＩにした後、これをゲルろ過クロマトグラフィ方法などで精製して得ることができる。また、本発明の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、親水性の融合タンパク質をつけて発現する方法、低い温度で培養する方法などを用いて大腸菌で封入顆粒の形態ではなく可溶性タンパク質の形態とすることができる。本願の実施例では、親水性のＮｕｓＡタンパク質をＴＮＦＲＩタンパク質のＮ末端に結合させることによって、大腸菌で可溶性のタンパク質としてＴＮＦＲＩを製造した。
【００６２】
また、本発明は、上記遺伝子を適当なベクターに導入し、このベクターで宿主細胞を形質転換し、これにより得られた形質転換体を培地で培養してＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を得る、ＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片の製造方法を提供する。
【００６３】
本発明は、また、ＴＮＦにより媒介される疾病や内科症状（以下、‘ＴＮＦ媒介疾病’という。）に対する治療方法を提供する。ＴＮＦ媒介疾病、それに伴う後遺症及びその関連症状の例は、次の通りである：成人呼吸窮迫症候群；食欲不振；癌（例えば白血病）；慢性疲労症候群；移植片対宿主拒否反応；痛覚過敏；炎症性腸疾患；神経炎症性疾患；脳虚血を含む虚血性／再潅流傷害；各々神経変性の原因となり得る外傷、癲癇、出血又は発作の結果としての脳損傷；糖尿病（例えば若年性１型糖尿病）；多発性硬化症；眼病；疼痛；膵炎；肺線維症；リウマチ性疾患（例えばリウマチ性関節炎、骨関節炎、若年性（リウマチ性）関節炎、血清反応陰性多発性関節炎、強直性脊髄炎、ライター症候群及び反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎、脳血管炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及びリウマチ性多発性筋痛及び巨細胞性動脈炎）；敗血性ショック；放射線療法の副作用；全身性紅斑性狼瘡；側頭下顎関節疾患；甲状腺炎及び組織移植。
【００６４】
本発明は、また、上記の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を含むリウマチ性関節炎またはＴＮＦ媒介疾病の予防または治療用組成物を提供する。
【００６５】
本発明は、また、上記の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターまたは該ベクターで形質転換された微生物または動物細胞を含むリウマチ性関節炎またはＴＮＦ媒介疾病の予防または治療用組成物を提供する。
【００６６】
本発明の薬剤学的組成物は、経口及び吸入投与の他、静脈及び皮下投与もできる。この薬剤学的組成物は、目的とする純度を有するＴＮＦＲＩ変異体を、薬剤学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって貯蔵または投与用に製造することができる。これらの物質は、使用する投与量及び濃度において服用者に毒性がないものであり、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩及び他の有機酸塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような酸化防止剤；ポリアルギニン；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゲラチンまたは免疫グロブリン）；低分子量（約１０個未満の残基を有する）ペプチド；ポリビニルピロリドンのような親水性重合体；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、およびセルロースまたはその誘導体を含むその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；および／または、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン界面活性剤を含む。
【００６７】
本発明の薬剤学的組成物は、注射用滅菌組成物の形態で当業界における通常の方法により製造することができる。この注射用滅菌組成物は、賦形剤、例えば、水またはごま油、落花生油または綿実油のような天然植物性オイル、またはオレイン酸エチルのような合成脂肪賦形剤中の活性化合物の溶液または懸濁液を含むことができる。該注射用滅菌組成物には、さらに緩衝剤、防腐剤、酸化防止剤などを、当業界で通常的に用いる様態で混入することができる。
【００６８】
本発明の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片、またはこれをコードする遺伝子または該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された微生物または動物細胞は、上記ＴＮＦ媒介疾患の治療的に有効な量で薬剤学的組成物中に含まれる。
【００６９】
上記の「治療的に有効な量」は、研究者、獣医師、医師またはその他臨床医により考えられる動物またはヒトにおいて生物学的または医学的反応を誘導する活性成分または薬学的組成物の量を意味するもので、これは、治療される疾患または障害の症状緩和を誘導する量を含む。本発明の有効成分に対する治療上有効投与量及び投与回数は、所望の効果によって変わることは当業者には自明である。そのため、投与される最適の投与量は、当業者が容易に決定することができ、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれている有効成分及び他の成分の含量、剤形の種類、及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の排出率、治療期間、同時使用される薬物をはじめとする様々な因子によって調節することができる。例えば、成人に対して、本発明のＴＮＦＲＩ変異体を１日１回投与時に、０．０１〜１，０００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは、０．１〜１００ｍｇ／体重ｋｇの用量で投与することが好ましい。
【００７０】
また、本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、他の療法に対する付加物として投与されてもよく、治療される適応症（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）に適する他の薬剤学的組成物と併用して投与することができる。本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、１または２以上の公知のまたは新規の抗炎症性薬物のうちの任意の薬物と別個にまたは併用して投与することができる。かかる薬物に該当する化合物に関する情報は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ，Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ，Ｓｈａｒｐ  ＆  Ｄｏｈｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ（１９９２）、及びＰｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓ、ピージェイビーパブリケーションリミッテッドから見つけることができる。
【００７１】
上記併用使用の一例として、本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、リウマチ性疾病［例えば、ライム病、若年性（リウマチ性）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ性関節炎及び黄色ブドウ球菌誘導性（“敗血性”）関節炎］のような急性及び慢性炎症を含む、ＴＮＦ媒介疾病の治療のために、非ステロイド性、抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤｓ）として分類される炎症調節のための第一線薬と共に用いることができる。
【００７２】
上記併用使用の他の例として、本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、上記ＴＮＦ媒介疾病及び多発性硬化症治療のために、一つ以上の徐々に作用する抗リウマチ性薬物（ＳＡＡＲＤｓ）または疾病修飾性抗リウマチ性薬物（ＤＭＡＲＤＳ）、その薬物前駆体エステルまたは薬剤学的に許容される塩のいずれかと共に使用することができる。
【００７３】
上記併用使用の他の例として、本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、上記のＴＮＦ媒介疾病の治療のために、一つ以上のＣＯＸ２阻害剤、その薬物前駆体エステルまたは薬剤学的に許容される塩のいずれかと共に使用することができる。
【００７４】
本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、上記のＴＮＦ媒介疾病の治療のために、一つ以上の抗菌薬、薬物前駆体エステル、または薬剤学的に許容される塩のいずれかと共に使用することができる。
【００７５】
本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、上記のＴＮＦ媒介疾病の治療のために、一つ以上の次の化合物のいずれかと共に使用することができる：顆粒球菌体刺激因子タリドミド、テニダブ、チアパパント、ニメスリド、パナビア、ロリプラム、サルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）；バルサラジド（ｂａｌｓａｌａｚｉｄｅ）；オルサラジン（ｏｌｓａｌａｚｉｎｅ）；メサラジン（ｍｅｓａｌａｚｉｎｅ）；プレドニソロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）；ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）；メチルプレドニソロン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）；ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）；メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）；シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）；ペプチドＴ；（１Ｒ，３Ｓ）−シス−１−［９−（２，６−ジアミノプリニル）］−３−ヒドロキシ−４−シクロペンテンヒドロクロリド、（１Ｒ，３Ｒ）−トランス−１−［９−（２，６−ジアミノ）プリン］−３−アセトキシシクロペンタン、（１Ｒ，３Ｒ）−トランス−１−［９−アデニル］−３−アジドシクロペンタンヒドロクロリド、及び（１Ｒ，３Ｒ）−トランス−１−［６−ヒドロキシ−プリン−９−イル］−３−アジドシクロペンタン。
【００７６】
本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、上記のＴＮＦ媒介疾病の治療のために、一つ以上の付加的ＴＮＦ阻害剤と共に使用することができる。ＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦの生体内合成または細胞外放出を遮断する化合物及びタンパク質であり、次のものを含む：抗ＴＮＦ抗体［例えば、ＭＡＫ  １９５Ｆ  Ｆａｂ抗体（Ｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），１ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１４７）；ＣＤＰ  ５７１抗ＴＮＦモノクロナール抗体（Ｒａｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，３４：３３４−３４２）；ＢＡＹ  Ｘ１３５１マウスの抗腫瘍壊死因子モノクロナール抗体（Ｋｉｅｆｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），７ｔｈ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，９）；ＣｅｎＴＮＦ  ｃＡ２抗ＴＮＦモノクロナール抗体（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｌａｎｃｅｔ，３４４：１１２５−１１２７  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｌａｎｃｅｔ、３４４：１１０５−１１１０）］。
【００７７】
本発明は、また、上記のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を含む薬剤学的製剤を提供する。好ましくは、本発明の薬剤学的製剤は、薬剤学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【００７８】
本発明の薬剤学的製剤は、経口剤、吸入剤、注射剤、粘膜投与製剤、及び外用剤からなる群から選ばれる薬剤学的製剤でよい。
【００７９】
本発明の薬剤学的製剤は、薬剤的に許容可能な希釈剤、保存剤、溶解剤、乳化剤、アジュバントまたは運搬体などを治療に効果的な量で含む。また、本発明の薬剤学的製剤は、当業界で用いられる通常の緩衝溶液（例えば、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタスルファイトナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、そしてバルク希釈剤（例えば、乳糖、マンニトール）のような添加剤を含むことができる。これらの添加剤は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸リポソームなどのポリマー組成物を用いて粒子性物質として提供することができる。また、本発明の薬剤学的製剤は、循環系内の持続性増加のために、ヒアルロン酸を含むことができる。本発明の薬剤学的製剤は、選択的に薬剤学的運搬体、賦形物、あるいは培地として薬剤学的に許容される液体、半固体、あるいは固体希釈物を含むことができる。これらの物質にはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、澱粉類、砂糖、デキストロース、アカシアガム、カルシウムリン酸塩、ミネラルオイル、ココアバター、及びテオブロマオイルなどを含むことができ、これに限定されない。
【００８０】
本発明の薬剤学的製剤は、また、胃腸管環境、そして腸内における生物学的な活性を有する物質の分泌から保護されるようにする安定した添加物質を含む。
【００８１】
本発明の薬剤学的製剤は、公知の技術、例えば、混合、溶解、顆粒化、ドラジェ化（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）、研和（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）または錠剤化工程を用いて製造される。
【００８２】
本発明の薬剤学的製剤は、液体（例：懸濁液、エリキシル及び／または溶液）、または固体（例：粉末、錠剤及び／またはカプセル）形態であり、デポー（ｄｅｐｏｔ）形態に剤形化することができる。該デポー製剤は、非デポー製剤よりも一般的に長時間作用性である。該デポー製剤は、適切な重合体または疎水性物質（例：適切なオイルのうちエマルジョン）またはイオン交換樹脂または難溶性誘導体（例えば難溶性塩）を用いて製造する。また、本発明の薬剤学的製剤は、リポソーム及びエマルジョンのような送達システムを含む。特定送達システムは、疎水性化合物を含む製剤を含めて特定薬剤学的製剤を製造するのに有用であり、ジメチルスルホキシドのような有機溶媒を用いることができる。本発明の他の様態として、本発明の薬剤学的製剤は、薬剤学的製剤を特定組織や細胞類型に送達するように考案された一つ以上の組織特異的送達分子を含む。例えば、特定の様態において、薬剤学的製剤は、組織特異的抗体で被覆されたリポソームを含む。
【００８３】
好ましくは、本発明の薬剤学的製剤は、固体形態の経口投与製剤にすることができる。固体投与形態は、錠剤、カプセル、丸薬、トローチ、ペレットなどの形態を含む。
【００８４】
リポソームやプロテイノイドカプセル化も、本発明の組成物を製剤化するのに用いることができる。これらのリポソームは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）のようなリン脂質、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、及びポリアスパラギン酸塩アミドのような親水性ポリマーで製造することができる。
【００８５】
一方、本発明の薬剤学的製剤中に含まれた上記のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、必要によっては、経口投与を効果的にするために化学的に修飾することができる。一般に、化学的な修飾は、ＴＮＦＲＩ変異体ポリペプチド内に１または２以上の残基をつけることに相当する。ここで、残基は、タンパク質分解酵素に抵抗性を持たせる物質、または、胃腸管から血流中への吸収を助ける物質でよい。好ましくは、上記化学的修飾のための残基は、本発明の薬剤学的製剤の全体的な安全性を増加させることで、人体内で循環時間を増加させる化学的修飾のための残基でよい。これら残基の例は、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共同複合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリポリプロリンなどでよい。使用可能な他のポリマーには、ポリ−１，３−ジオキサン及びポリ−１，３，６−チオキソケインなどがある。最も好ましくは、ポリエチレングリコール残基（ペグ化）が用いられる。
【００８６】
本発明の経口投与用形態の薬剤学的製剤の吸収率を増加させるための運搬体として、ソジウムＮ−（８−［２−ヒドロオキシベンゾイル］アミノ）カプリレート（ＳＮＡＣ）のような修飾されたアリファティックアミノ酸の塩を用いることができる。
【００８７】
本発明の薬剤学的製剤は、顆粒や粒子の大きさが略１ｍｍのペレット形態の多重微粒子状に製剤化することができる。この場合、製剤は、カプセル形態でもよく、多重微粒子状の製剤は、粉末、軽く押された充填物、あるいは錠剤などの形態でもよい。また、該製剤は圧縮によって製造されてもよい。
【００８８】
本発明の薬剤学的製剤は、また、発色剤や香辛料をさらに含み、例えば、リポソームやミクロスフェアカプセルの形態に製剤化することができる。
【００８９】
また、本発明の薬剤学的製剤内有効成分である上記のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片の吸収を増加させるために、脂肪酸、オレイン酸、リノレン酸などのような添加剤を用いることができる。
【００９０】
一方、本発明の薬剤学的製剤は、放出制御性製剤でよい。このような製剤内有効成分である上記のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片は、非活性の担体に含まれて、拡散あるいは溶解の機転によって制御されて放出される。また、この放出制御性製剤は、徐々に分解される担体、例えば、アルギン酸、多糖類などを含むことができる。該放出制御性製剤の他の形態には、ＯＲＯＳ治療システム（Ｏｓｍｏｔｉｃ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、アルジャ社製）に基づく形態でよい。この放出制御性製剤は、半透過性膜内に本発明の有効成分であるＴＮＦＲＩ変異体が充填され、その内部に水が流入することで当該有効成分を一つの小さい孔を通して浸透圧効果にてはみ出させる。また、本発明の放出制御性製剤は、腸溶性コーティング物質でコーティングすることによって、遅延された薬物放出効果を示すことができる。
【００９１】
本発明の薬剤学的製剤はまた、フィルムでコーティングされたタブレットの形態でよく、このフィルムコーティングに用いられる物質には、次の２群がある。第一の群は、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキセチルセルロース、メチルヒドロキシル−エチルセルロース、ヒドロキシルプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、ソジウムカルボキシ−メチルセルロース、プロビドンそしてポリエチレングリコールなどのような非腸溶性物質であり、第二の群は、フタル酸のエステルのような腸溶性物質である。具体的には、腸溶性物質には、腸溶性高分子、すなわち、腸溶性セルロース誘導体、腸溶性アクリル酸系共重合体、腸溶性マレイン酸系共重合体、腸溶性ポリビニル誘導体、及びこれらの混合物からなる群から選ばれるいずれかが用いられる。腸溶性セルロース誘導体は、ヒプロメロースアセテートスクシネート、ヒプロメロースフタレート、ヒドロキシメチルエチルセルロースフタレート、セルロースアセテートフタレート、セルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートマレート、セルロースベンゾエートフタレート、セルロースプロピオネートフタレート、メチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース及びエチルヒドロキシエチルセルロースフタレートから選ばれる１または２以上の腸溶性アクリル酸系共重合体は、スチレン−アクリル酸共重合体、アクリル酸メチル−アクリル酸共重合体、アクリル酸メチルメタクリル酸共重合体、アクリル酸ブチル−スチレン−アクリル酸共重合体、メタクリル酸−メタクリル酸メチル共重合体（例えば、オイドラギットＬ１００、オイドラギットＳ、デグザ社製）、メタクリル酸・アクリル酸エチル共重合体（例えば、オイドラギットＬ１００−５５、デグザ社製）、及びアクリル酸メチル−メタクリル酸−アクリル酸オクチル共重合体から選ばれる１または２以上の腸溶性マレイン酸系共重合体は、酢酸ビニル−マレイン酸無水物共重合体、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、スチレン−マレイン酸モノエステル共重合体、ビニルメチルエーテル−マレイン酸無水物共重合体、エチレン−マレイン酸無水物共重合体、ビニルブチルエーテル−マレイン酸無水物共重合体、アクリロニトリル−アクリル酸メチル・マレイン酸無水物共重合体、及びアクリル酸ブチル−スチレン−マレイン酸無水物共重合体から選ばれる１または２以上、または上記腸溶性ポリビニル誘導体は、ポリビニルアルコールフタレート、ポリビニルアセタールフタレート、ポリビニルブチレートフタレート、及びポリビニルアセトアセタールフタレートから選ばれる１または２以上である。
【００９２】
上記コーティング物質の混合物が最適のフィルムコーティングのために用いられてもよい。フィルムコーティングは、ファンコーター、流動層造粒機または圧縮コーティング機で行うことができる。
【００９３】
本発明の放出制御性薬剤学的製剤は、また、持続放出のために、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセル形態の半透過性固相疎水性重合体マトリックス内に、本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を含むことができる。この持続放出のためのマトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル［例：Ｌａｎｇｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７，１９８１及びＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５，１９８２に記載されたポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）］、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号、ヨーロッパ特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸及びガンマエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体（Ｓｉｄｍａｎ等、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６，１９８３）、非分解性エチレン−ビニルアセテート（上記のＬａｎｇｅｒ等の文献）、分解性乳酸−グリコール酸共重合体（例：リュープロンデポー（Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ）（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ヨーロッパ特許第１３３９８８号）を含む。
【００９４】
カプセル化したタンパク質が長期間体内に滞留すると、３７℃で湿気に露出された結果、変性または凝集することがあり、その結果、生物学的活性の損失、免疫原性の変化を招くことがある。そのため、関連メカニズムに基づいて公知の方法を用いてタンパク質安定化を達成することができる。例えば、凝集メカニズムがジスルフィド交換を通じた分子間Ｓ−Ｓ結合を形成するものと知られた場合、スルフヒドリル残基を変性し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を調節し、適当な添加剤を使用し、特定重合体マトリックス組成物を開発することによって安定化させることができる。
【００９５】
本発明は、また、本発明のＴＮＦＲＩ変異体、及びこれを含む薬剤学的製剤の使用方法を提供する。当該薬剤学的製剤は、注射、経口投与、鼻腔内投与、経皮投与、または他の方法を用いた投与が可能である。該方法には、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、真皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、乳房内（ｉｎｔｒａｍａｍｍａｒｙ）、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、眼内（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ）、肺内（ｉｎｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｙ）あるいは皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、舌下（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ）、肛門（ａｎａｌ）、膣（ｖａｇｉｎａｌ）、外科的注入（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）などがある。この治療は、単回投与または一定期間にわたる反復投与でよい。
【００９６】
また、本発明の薬剤学的製剤は、肺を通した送達方法によって伝えられてもよい。本発明の薬剤学的製剤は、ほ乳動物の肺を通して息をする間に送達され、それは肺の上皮細胞を通りながら血流中に吸収される。
【００９７】
肺を通した薬物の送達のために考案された様々な機械的装置を、本発明の薬剤学的製剤の肺を通した送達のために用いることができる。これらは、ネブライザー、目盛り付き用量吸入器、及び粉吸入器などを含め、当業界で市販されている種々の機器を含む。
【００９８】
本発明の薬剤学的製剤は、これらの装置への適用を最適化するために適切に製剤化することができる。一般に、それぞれの製剤は、適用された装置の形態によって特異的であり、場合によって、希釈剤、アジュバント、または運搬体にさらに推進剤を適切に併用することができる。
【００９９】
肺を通した送達のための本発明の薬剤学的製剤は、粒子性物質とすることが好ましく、それの平均粒径は、略１０μｍ以下である。最も好ましくは、０．５〜５μｍにし、遠くの肺まで効果的に送達されるようにする。
【０１００】
肺を通した送達のための本発明の薬剤学的製剤は、また、運搬体として、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース及びソルビトールのような炭水化物を含むことができる。上記製剤には、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＤＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＳＰＣ）及びジオレオイルホスファチジルコリン（Ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＯＰＣ）などをさらに挙げることができる。なお、当該製剤は、天然または合成界面活性剤を含むことができる。該製剤は、なお、ポリエチレングリコール環状デキストランのようなデキストラン胆汁酸と他の関連した誘導体、及び緩衝溶液の製剤として用いられるアミノ酸をさらに含むことができる。
【０１０１】
また、本発明の薬剤学的製剤の肺を通した送達のために、リポソーム、マイクロカプセルまたはミクロスフェア、包接錯体または運搬体の他の形態が用いられてもよい。
【０１０２】
本発明の薬剤学的製剤をネブライザーを用いて肺に送達する場合に、ジェットまたは超音波を共に使用することができる。ネブライザーに適用するための本発明の薬剤学的製剤は、溶液１ｍｌ当たり略０．１〜２５ｍｇのＴＮＦＲＩ変異体を含む。また、このネブライザー用製剤は、緩衝溶液と単糖類を含み、これらは、例えば、タンパク質安定化及び浸透圧安定に寄与する。なお、当該ネブライザー用製剤は、エアロゾルの形成において溶液の原子化に起因するタンパク質の凝集を誘発する表面を減らす目的で界面活性剤を含むことができる。
【０１０３】
目盛り付き用量吸入器のための本発明の薬剤学的製剤は、一般に、本発明のＴＮＦＲＩ変異体を含む組成物を細かい粉にして、界面活性剤の補助下に推進剤に混合した形態である。該推進剤は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、あるいはジクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１，１，１，２−テトラフルオロエタンのようなヒドロカーボン、またはこれらの組み合わせでよい。上記使用可能な適切な界面活性剤は、ソルビタントリオレート及び大豆レシチンを含む。オレイン酸も同様、界面活性剤に用いることができる。
【０１０４】
粉吸入器から放出される本発明の薬剤学的製剤は、本発明のＴＮＦＲＩ変異体を含む組成物を含む細かい乾燥粉状にし、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはキシリトールのような希釈剤を含むことができる。これらは、粉状の製剤を機器装置から分散させることを促すことができる。
【０１０５】
なお、本発明の薬剤学的製剤は、鼻腔を通した送達のための製剤でもよい。鼻を通した送達は、タンパク質治療剤が鼻に入ってきた後に直ちに血流中に入るようにし、肺に治療剤が積もることを防ぐ。鼻腔を通した送達のための本発明の薬剤学的製剤は、デキストランまたは環状デキストランなどを含む。本発明の薬剤学的製剤は、その他の粘膜組織を通して伝えられるための製剤でもよい。
【０１０６】
本発明の薬剤学的製剤の投与用量は、上述した疾病を治療する方法について医師により薬物の効果を変形させるような要因、例えば、年齢、状態、体重、性別、食餌、ある感染による重症度、投与時点などのその他臨床学的な条件による要因に基づいて決定しなければならない。
【０１０７】
本発明の薬剤学的製剤は、単回または継続的投与が可能である。ただし、初回投与後に一定の循環系濃度を維持させるために継続的な投与をすることが好ましい。効果的な投与用量及び方法は、当業界で公知の一般技術に基づいて最適化すればよく、反復投与回数は、各患者の薬動学的な因子と投与経路によって可変でよい。なお、投与用量、用法及び投与回数は、投与された薬物の物理的な状態、安全性、生体内放出速度、生体内除去率などに基づいて最適化することができる。また、投与経路に基づく適切な投与用量を、体重、体表面積、臓器の大きさによって計算することができる。適切な用量は、適切な用量−反応資料と血中濃度の資料と共に判断して確定しなければならない。最終の投与法は医師により決定されるが、医師は、薬物の非活性、患者の重症度、薬物に対する患者の反応程度、年齢、調子、体重、性別、食餌及びその他臨床学的な要因を考慮して処方しなければならない。研究が進行されるにつれて、種々の疾病及び条件に対応する適切な投与用量と処方期間に関するより多くの情報が出現すると予想される。
【発明の効果】
【０１０８】
本発明の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１（ＴＮＦＲＩ）ポリペプチドまたはその断片は、タンパク質分解酵素に対して増加した抵抗性を有するため、注射剤または経口剤として投与時に、改善された生体利用率及び吸収率を示し、よって、持続型注射剤及び経口用タンパク質製剤として有用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、ＮｕｓＡタンパク質をコードする遺伝子を有しているｐＥＴ４４ａベクターにＴＮＦＲＩ１０８遺伝子を挿入して、ＮｕｓＡの融合されたＴＮＦＲＩ１０８を発現する大腸菌発現ベクターを作製する過程を示す模式図である。
【図２】図２は、ｐＥＴ４４ａ−ＮｕｓＡ−ＴＮＦＲＩ１０８発現ベクターで形質転換された大腸菌においてＮｕｓＡの融合されたＴＮＦＲＩ１０８の発現を確認し、金属親和クロマトグラフィ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）と疎水性クロマトグラフィ（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で純粋に精製した写真である。
【図３】図３は、ＴＮＦ−αに対するＴＮＦＲＩ１０８断片（対照群）とＴＮＦＲＩ１０８断片単一変異体ＴＮＦＲＩ１０８−６８の結合力をＢＩＡｃｏｒｅ分析（３Ａ）とＥＬＩＳＡ分析（３Ｂ）から確認したグラフである。
【図４】図４は、ＴＮＦＲＩ１０８断片に対するＴＮＦＲＩ１０８断片単一変異体ＴＮＦＲＩ１０８−１４、ＴＮＦＲＩ１０８−６４、及びＴＮＦＲＩ１０８−６８のタンパク質分解酵素抵抗性増加を確認したグラフである。
【図５】図５は、ｐＥＴ４４ａベクターにＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６またはＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１遺伝子を挿入して、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６またはＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１を発現する大腸菌発現ベクターを作製する過程を示す模式図である。
【図６】図６Ａは、ゲルろ過クロマトグラフィクロマトグラム（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）を用いてＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６、及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１タンパク質の溶出を確認した図（分画Ａ４）であり、図６Ｂは、精製したＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１を還元状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法で分析した結果を示す写真である。
【図７】図７は、ＴＮＦ−αに対するＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６断片（対照群）とＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６断片変異体Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６−１４、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６−６４、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６−６５、及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６−６８の結合力をＥＬＩＳＡ方法で測定したグラフである。
【図８】図８Ａは、ＴＮＦ−αに対するＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１断片（対照群）とＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１断片変異体Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−８３、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−８４、及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−９２の結合力を測定した図であり、図８Ｂは、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１断片に対するＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１断片単一変異体Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−８３、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−８４、及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−９２のタンパク質分解酵素抵抗性増加を確認したグラフである。
【図９】図９は、ＴＮＦ−αに対するＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１断片（対照群）とＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１断片二重変異体Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−２０４、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−２０５、及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−２０６の結合力をＥＬＩＳＡ方法で確認したグラフである。
【図１０】図１０は、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１断片に対するＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１断片二重変異体Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−２０４（図１０Ａ）、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−２０５（図１０Ｂ）、及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−２０６（図１０Ｃ）のタンパク質分解酵素抵抗性増加を確認したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
本発明の利点及び特徴、並びにそれらを達成する方法は、後述する実施例から明確になるであろう。ただし、本発明は、以下に開示される実施例に限定されない。
【０１１１】
本発明のＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を製造するために、既に誘電体が公開されているヒトＴＮＦＲＩ誘電体情報を用いた。
【０１１２】
ＴＮＦＲＩ断片遺伝子を重合酵素連鎖反応（以下、ＰＣＲ）方法を用いて合成し、これをベクターｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ａ１３８０）にクローニングし、これを再び大腸菌発現のためのｐＥＴ４４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：７１１２２−３）に挿入して、微生物発現ベクターを作った（図１）。これをＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｃ６０１０−０３）に形質転換して、ＮｕｓＡの融合されたＴＮＦＲＩ断片が細胞内可溶性タンパク質として産生されることを確認したし、発現されたＴＮＦＲＩは、９６ウェルプレートを用いるクロマトグラフィ方法で純粋に精製した。
【０１１３】
また、ｐＥＴ４４ａ発現ベクターを用いてＮｕｓＡのないＴＮＦＲＩ断片のみを発現する発現ベクターを作製した（図５）。この時、ＴＮＦＲＩ断片は封入体（ｉｎｃｕｌｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）として発現された。封入体として発現されたＴＮＦＲＩ断片は、変性溶液を用いて可溶化し、リフォルディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）過程を経て活性のあるタンパク質とし、ゲルろ過クロマトグラフィ方法で精製した。
【０１１４】
タンパク質分解酵素に抵抗性を有する変異体を作製するために、ＴＮＦＲＩ断片のタンパク質分解酵素による切断位置を推定した。ＴＮＦＲＩ断片のアミノ酸配列上の胃腸管、細胞内及び血液中に存在する代表的なタンパク質分解酵素１０種に対する切断位置を、Ｅｘｐａｓｙ（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）から提供するｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｕｔｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ／）プログラムを用いて推定した。
【０１１５】
タンパク質分解酵素により切断されると予測されたアミノ酸を、構造的変化が少ないと共にタンパク質分解酵素により切断されないアミノ酸に置換するために、ＰＡＭ２５０マトリックス（Ｗ．Ａ  Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＦＡＳＴＰ  ａｎｄ  ＦＡＳＴＡ、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｒ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（ＩＳＢＮ  ０−１２−１８２０８４−Ｘ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ）１８３：６３−９８（１９９０））を用いた。先に推定された位置のアミノ酸を、ＰＡＭ２５０マトリックスにおいて０以上の正数値を有するアミノ酸のうちタンパク質分解酵素により認識されないアミノ酸に置換して、修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片を製造した。
【０１１６】
上記決定されたＴＮＦＲＩ変異体をコードする遺伝子をＮｕｓＡの融合された可溶性タンパク質形態として発現するベクターを鋳型に、位置指定突然変異体生成（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法で各変異体ベクターを作製した。これをＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）に形質転換して、ＮｕｓＡの融合されたＴＮＦＲＩ断片を細胞内可溶性タンパク質として産生し、活性及びタンパク質分解酵素抵抗性を分析した。ＮｕｓＡ融合による影響を確認するために、ＮｕｓＡのないＴＮＦＲＩ突然変異体を産生し、活性及びタンパク質分解酵素抵抗性を比較分析した。
【０１１７】
以下、本発明の修飾されたＴＮＦＲＩポリペプチドまたはその断片の製造及び確認についてより詳細に説明する。
【０１１８】
［製造例］ＴＮＦＲＩ遺伝子断片の作製：ＴＮＦＲＩ１７１遺伝子の製造
【０１１９】
ヒトＴＮＦＲＩは４個の細胞外ドメインを有しており、そのうち、ＴＮＦＲＩの３つのドメイン（ＴＮＦＲＩ１２６）だけでもＴＮＦ−αに対する結合が可能であり、それ以上の欠損が存在してもＴＮＦ−αとの結合に影響がないと報告されている。そこで、配列番号１として記載されたヒトＴＮＦＲＩポリペプチドの４１番から１７１個のアミノ酸を有するＴＮＦＲＩ１７１（配列番号２）、ヒトＴＮＦＲＩの４１番から１２６個のアミノ酸を有するＴＮＦＲＩ１２６（配列番号３）、４１番から１０８個のアミノ酸を有するＴＮＦＲＩ１０８（配列番号４）を、本発明の変異体を製造するための候補ペプチドとして選定した。このような変異体を産生するために、ＴＮＦＲＩ１７１の塩基配列を、大腸菌内発現に容易となるように、大腸菌に合うコドンを用いて修飾した（配列番号５）。これを、ＰＣＲ方法を用いる遺伝子合成方法で作製した。
【０１２０】
上記合成された大腸菌発現用ＴＮＦＲＩ１７１遺伝子配列（配列番号５）を、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ａ１３８０）ベクターに挿入するために、１ｕｌのｐＧＥＭ−Ｔベクターに合成遺伝子３ｕｌを添加し、１ｕｌリガーゼ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｍ２２００Ｓ）とライゲーション溶液（２ｘ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を入れた後、常温で５分間反応させた。反応溶液２ｕｌを取ってＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＲＨ１１９−Ｊ８０）に入れ、３７℃で２分間熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーを、アンピシリンの含まれているＬＢ液体培地で培養した後、プラスミドを分離し、ＰＣＲを使用するｄｄＮＴＰに蛍光物質を標識する方式で遺伝子配列を確認した（ソルジェント、韓国）。この遺伝子をｐＧＥＭ−ＴＮＦＲＩ１７１と命名した。以下では、ＴＮＦＲＩ１７１以外のＴＮＦＲＩ１２６、ＴＮＦＲＩ１０８遺伝子は、先に得られたｐＧＥＭ−ＴＮＦＲＩ１７１遺伝子を鋳型にＰＣＲ方法で確保した。
【０１２１】
［実施例１］ＴＮＦＲＩ単一変異体の設計
【０１２２】
変異体作製のために、まず、タンパク質分解酵素に抵抗性を有する変異体を設計した。突然変異位置決定は、ＴＮＦＲＩ１７１アミノ酸配列について、下記の表１に表示された胃腸管、細胞及び血液中に存在する代表的なタンパク質分解酵素１０種に対する切断位置を、Ｅｘｐａｓｙ（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）から提供するｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｕｔｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｕｔｔｅｒ／）プログラムを用いて推定し、推定された切断部位のアミノ酸を、構造的変化が少ないと共にタンパク質分解酵素により切断されないアミノ酸に置換した。置換されるアミノ酸の決定は、ＰＡＭ２５０マトリックス（ｍａｔｒｉｘ）を用いた。ＰＡＭ２５０マトリックスには、それぞれのアミノ酸に対して正数、０、負数の値を有する１９種の対応アミノ酸を参照して、タンパク質分解酵素により切断されないと共に正数または０の値を有するアミノ酸を、置換するアミノ酸と決定した。
【０１２３】
【表１】
2013507913.tif 000003
【０１２４】
上記の方法によって設計されたＴＮＦＲＩ変異体の目録は、表２に示す。
【０１２５】
【表２】
2013507913.tif 000004
【０１２６】
＊下記の実施例と関連して、上記表のｘは、変異体番号１番乃至７６番については１０８、１２６または１７１でよく、変異体番号７７番乃至８４番については１２６または１７１でよく、変異体番号８５番乃至９２番については１７１でよい。
【０１２７】
［実施例２］ＴＮＦＲＩ１０８変異体の製造
【０１２８】
（１）ＴＮＦＲＩ１０８遺伝子及び発現ベクターの製造
【０１２９】
大腸菌で可溶性のＴＮＦＲＩ１０８タンパク質を発現するために、ＮｕｓＡ遺伝子を含む商業的に利用可能なｐＥＴ４４ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：７１１２２−３）を用いて発現ベクターを構成した。
【０１３０】
具体的に、ＴＮＦＲＩ１０８遺伝子は、上記製造例で作製されたｐＧＥＭ−ＴＮＦＲＩ１７１プラスミドを鋳型にＰＣＲを行って確保した。この時、ｐＥＴ４４ａベクターへのクローニングのために、５’末端にＳｍａ Ｉ、３’末端にＨｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素認識部位を付加した。
【０１３１】
正方向プライマー：５'−ｃｃｃｃｇｇｇｇｃｇａｔｇａｃｇａｔｇａｃａａａｇａｔａｇｃｇｔｇｔｇｃｃｃｇ−３'
【０１３２】
逆方向プライマー：５'−ｔａａｇｃｔｔａｔｔａｃａｇｇｇａｇｃａａｔｔａａａａｃａｃｔｇｇ−３'
【０１３３】
ＰＣＲは、１次変性９５℃５分、２次変性９５℃１分、プライマー接合６０℃４０秒、伸長反応７２℃１分の過程中に、２次変性において伸長反応を２５回反復して行った後、最終酵素反応を７２℃１０分行って反応を終了した。増幅された遺伝子２ｕｌを用いてメーカーで提示した方法によってｐｃＤＮＡ３．３  ＴＯＰＯ  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｋ８３００−０１）に挿入した。反応溶液２ｕｌを取ってＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＲＨ１１９−Ｊ８０）に入れ、４２℃で１分間熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーをアンピシリンの含まれているＬＢ液体培地で培養した後、プラスミドを分離し、ｄｄＮＴＰに蛍光物質を標識する方式で遺伝子配列を確認し（ソルジェント、韓国）、ｐｃＤＮＡ３．３−ＴＮＦＲＩ１０８と命名した。
【０１３４】
上記作製されたｐｃＤＮＡ３．３−ＴＮＦＲＩ１０８ベクターとｐＥＴ４４ａベクターにそれぞれ制限酵素（Ｓｍａ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ）を添加し、３７℃で３時間反応させた。制限酵素処理後に１％アガロースゲル電気泳動を行って該当の大きさのＤＮＡバンドをかみそりで切り取り、ＤＮＡ抽出キット（ＧｅｎｅＡｌｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１０２−１０２）を用いて抽出した。抽出したｐＥＴ４４ａベクターとＴＮＦＲＩ１０８遺伝子ＤＮＡは、リガーゼ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｍ２２００Ｓ）を用いて連結反応をさせた。反応溶液２ｕｌを取ってＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＲＨ１１９−Ｊ８０）に入れて３７℃で２分間熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーをアンピシリンの含まれているＬＢ液体培地で培養した後プラスミドを分離して、ＴＮＦＲＩ１０８大腸菌発現ベクターを作製した（図１）。作製されたＴＮＦＲＩ１０８大腸菌発現ベクターはｐＥＴ４４ａ−ＮｕｓＡ−ＴＮＦＲＩ１０８プラスミドと命名した。
【０１３５】
（２）ＴＮＦＲＩ１０８単一変異体をコードするＤＮＡの製造
【０１３６】
位置特異的ＴＮＦＲＩ１０８単一変異体を作製するために位置指定突然変異体作製（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法によりＴＮＦＲＩ１０８単一変異体を作製した。ＴＮＦＲＩ１０８単一変異体の作製に用いたプライマーを、下記の表３に示す。
【０１３７】
具体的には、上記ｐＥＴ４４ａ−ＮｕｓＡ−ＴＮＦＲＩ１０８プラスミドを鋳型に、下記の表３の１〜７６番変異体に該当するプライマーの各対を２０ｐｍｏｌｅになるように蒸溜水に溶かした後、Ｐｆｕポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応を行って部位特異的変異体を作製した。増幅反応に用いられた溶液の構成は、次の通りである。ｐＥＴ４４ａ−ＮｕｓＡ−ＴＮＦＲＩ１０８プラスミドＤＮＡ １．０ｕｌ、２０ｐｍｏｌｅの正方向プライマー１．０ｕｌ、２０ｐｍｏｌｅの逆方向プライマー１．０ｕｌ、２Ｘ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＰＣＲバッファ２５．０ｕｌ、２００ｕＭのｄＮＴＰ ４．０ｕｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｒ０４４Ａ）０．５ｕｌ及び１７．５ｕｌ蒸溜水を入れて５０ｕｌの反応溶液を作った。
【０１３８】
ＰＣＲは、１次変性９８℃５分、２次変性９８℃３０秒、プライマー接合５５℃３０秒、伸長反応７２℃９分の過程中に、２次変性において伸長反応を１７回反復して進行した後、最終酵素反応を７２℃１０分間行い、反応を終了した。
【０１３９】
ＰＣＲ産物はＤｐｎ Ｉ酵素で３７℃、２時間処理して大腸菌由来のＤＮＡを分解し、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを確保した。ＤＮＡ溶液２ｕｌを取ってＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞（ＲＢＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＲＨ１１９−Ｊ８０）に入れ、４２℃で１分間熱衝撃を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーを、アンピシリンの含まれているＬＢ液体培地で培養した後プラスミドを分離し、塩基配列分析から部位特異的な突然変異の完成を確認した。
【０１４０】
【表３−１】
2013507913.tif 000005
【０１４１】
【表３−２】
2013507913.tif 000006
【０１４２】
【表３−３】
2013507913.tif 000007
【０１４３】
（３）ＴＮＦＲＩ１０８及びＴＮＦＲＩ１０８変異体の発現
【０１４４】
上記作製したプラスミド溶液１ｕｌを取ってＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｃ６０１０−０３）コンピテント細胞に入れ、４２℃で１分間熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。ｐＥＴ４４ａ−ＮｕｓＡ−ＴＮＦＲＩ１０８及びＴＮＦＲＩ１０８変異体ベクターを含んでいる大腸菌（ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３））を、１００ｕｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンの入っている５ｍｌＬＢ液体培地（ＢＤ、Ｃａｔ．Ｎｏ：２４４６２０）に接種して３７℃で１６時間通気培養した。培養液を１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンの入っている５０ｍｌ培地に接種して６００ｎｍの吸光度が０．６〜０．８になるまで培養し、最終濃度が１．０ｍＭ濃度になるようにＩＰＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｔｈｉｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｉ９００３）を添加して発現を誘導した。発現誘導後、３７℃で３時間通気培養を続けた。培養細胞を５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞を収集した。
【０１４５】
（４）ＴＮＦＲＩ１０８及びＴＮＦＲＩ１０８変異体の精製
【０１４６】
上記収集した細胞を細胞破砕後に上層液を回収し、金属親和クロマトグラフィで１次精製後に疎水性クロマトグラフィで２次精製して、純度９０％以上の試料を得た。
【０１４７】
具体的に、上記収集した細胞を、６００ｎｍ吸光度が１０になるように再懸濁溶液（２５ｍＭトリス溶液（ｐＨ８．５））で再懸濁した。再懸濁した試料をソニケーター（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）（Ｓｏｎｉｃｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＶＣＸ７５０）を用いて細胞破砕して、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上層液を回収した。９６ウェルフィルタプレート（Ｐａｌｌ、Ｃａｔ Ｎｏ：ＰＮ５０６５）に３００ｕｌハイパーセルレジン（Ｐａｌｌ、Ｃａｔ Ｎｏ：２００９３−０１０）をローディングし、４カラム体積の蒸溜水洗浄後に、２カラム体積の０．１Ｍ ＮｉＣｌ２を付加してニッケルイオンをレジンに結合させた。２カラム体積の蒸溜水を流した後、平衡化溶液（２５ｍＭトリス、０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５））で６カラム体積で洗浄した。２カラム体積の試料を付加した後、４カラム体積の平衡化溶液を用いて結合していない試料を除去した。１０カラム体積の洗浄溶液（２５ｍＭトリス、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）（ｐＨ８．５））で洗浄し、カラムに結合しているＴＮＦＲＩ１０８を回収するために、２カラム体積の溶出溶液（２５ｍＭトリス、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．５））で溶出した。
【０１４８】
金属親和クロマトグラフィで溶出されたタンパク質溶液に４００ｍＭ濃度になるように１．０Ｍ硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）溶液を添加した。９６ウェルフィルタプレートに３００ｕｌのフェニルセファロースレジン（ＧＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１７−１０８２０１）をローディングし、６カラム体積の平衡化溶液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（Ｎａ２ＰＯ４）、４００ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．０））を流した。金属親和クロマトグラフィ溶出液をカラムに付加し、２カラム体積の平衡化溶液を流して、結合していないタンパク質を除去した。１０カラム体積の洗浄溶液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（Ｎａ２ＰＯ４）、１６０ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．０））で洗浄して、６カラム体積の溶出溶液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））で溶出した。溶出された試料を１００ｕｇ／ｍＬ以上の濃度に濃縮した後、ブラッドフォード法を用いて定量した。精製した全ての試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて純度を確認した（図２）。
【０１４９】
［実験例１］リガンド（ＴＮＦ−α）とＴＮＦＲＩ１０８との結合力の確認
【０１５０】
細胞内可溶性タンパク質として産生されたＴＮＦＲＩ１０８断片及びＴＮＦＲＩ１０８単一変異体（ＴＮＦＲＩ１０８−６８）を、金属親和クロマトグラフィと疎水性クロマトグラフィ方法を用いて純粋分離した。該精製したＴＮＦＲＩ１０８断片（対照群）及びＴＮＦＲＩ１０８断片変異体はブラッドフォード法を用いて定量し、ＥＬＩＳＡ分析とＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いてＴＮＦ−αとの結合力を測定した（図３）。
【０１５１】
具体的に、ＢＩＡｃｏｒｅ分析は、ＣＭ５チップ（ｃｈｉｐ）を用いてＢＩＡｃｏｒｅ３０００システムで分析した。チップの１番目のセルは、ＴＮＦ−αを固定化せずに、０．０５Ｍ ＮＨＳ／０．２Ｍ ＥＤＣ溶液を用いて活性化させ、１．０Ｍ エタノールアミン塩酸塩（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ｐＨ８．５）で非活性化のみを行った。２番目のセルは、キネティック（ｋｉｎｅｔｉｃ）分析のために、ＴＮＦ−αを８００ＲＵだけ固定化した。ＣＭ５チップを０．０５Ｍ ＮＨＳ／０．２Ｍ ＥＤＣ溶液を用いて活性化させ、ＴＮＦ−αを８００ＲＵまで固定化した。８００ＲＵのＴＮＦ−αを固定化した後、１．０Ｍエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ８．５）を反応させて非活性化させた。各試料分析は、１００ｍＭ ＮａＣｌの含まれている２５ｍＭトリス（ｐＨ８．５）溶液を流速１５ｕＬ／ｍｉｎで流しつつ、チップの２番目のセルのＲＵ値から１番目のセルのＲＵ値を引くことによって分析した。試料の注入は、キネティックモード（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｅ）において１００ｕｇ／ｍＬと５０ｕｇ／ｍＬをそれぞれ２４０秒注入し、解離時間（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）は９００秒とした。再分析のために洗浄溶液（５ｍＭ ＮａＯＨ、１０ｍＭ ＮａＣｌ）をクイック注入モード（Ｑｕｉｃｋｉｎｊｅｃｔ  ｍｏｄｅ）で２０秒間注入した。両濃度のセンサグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）結果を、ＢＩＡｃｏｒｅ結果プログラムを用いて処理することによって結合力を決定した（図３Ａ）。図３で確認した通り、本発明のＴＮＦＲＩ１０８単一変異体（ＴＮＦＲＩ１０８−６８）は、ＴＮＦＲＩ１０８と比較して同等レベルの結合力を示した。
【０１５２】
具体的に、ＥＬＩＳＡ分析のために９６ウェルプレート（ＣｏＳｔａｒ、Ｃａｔ．Ｎｏ：２５９２）に１．０ｕｇ／ｍｌ濃度になるように１００ｕｌ ＴＮＦ−αを注入した後、４℃で１６時間固定化した。洗浄溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて３回プレートを洗浄した後、１％ＢＳＡの含まれているＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液で２時間常温で反応させた。それぞれのウェルに約１．５ｕｇ／ｍｌ〜１００ｕｇ／ｍＬに該当する試料１００ｕｌを注入した後、常温で２時間反応させた。洗浄溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて３回プレートを洗浄した後、マウスから得たＴＮＦＲ複合抗体（ＲｎＤ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＤＹ２２５）を２００ｎｇ／ｍｌになるように１００ｕｌを注入した後、常温で２時間反応させた。洗浄溶液を用いて３回プレートを洗浄した後、ＨＲＰの融合された二次抗体（ＲｎＤ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＤＹ２２５）を２００倍希釈して１００ｕｌを注入し、常温で１５分反応させた。洗浄溶液を用いて３回プレートを洗浄した後、基質溶液である３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＲｎＤ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＤＹ９９９）を１００ｕｌ注入して常温で１５分反応させ、１．０Ｍ硫酸溶液（Ｓａｍｃｈｕｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｓ２１２９）５０ｕｌを注入して反応を停止させた。４５０、５４０ｎｍのＶｍａｘ読み取り器（ＭＤ、モデル名：ＶｅｒｓａＭａｘ）を用いて吸光度を読み取った。ＴＮＦＲＩ１０８とＴＮＦ−αとの結合力を、濃度による吸光度変化から確認した。（図３Ｂ）
【０１５３】
［実験例２］ＴＮＦＲＩ１０８及びＴＮＦＲＩ１０８変異体のタンパク質分解酵素抵抗性の確認
【０１５４】
ＴＮＦＲＩ１０８断片及びＴＮＦＲＩ１０８断片変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性は、純粋分離された精製液の全体タンパク質濃度を測定して、豚のパンクレアチン（ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ）を総タンパク質（純粋分離したＴＮＦＲＩ１０８精製液の総タンパク質をブラッドフォード法により定量した値）量の２４％になるように処理し、ＴＮＦＲＩ１０８断片及びＴＮＦＲＩ１０８断片変異体の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を調べることで、ＴＮＦＲＩ１０８ポリペプチド断片に比べてタンパク質分解酵素に抵抗性を有するＴＮＦＲＩ１０８断片変異体を確認することができた。
【０１５５】
タンパク質分解酵素に抵抗性を有する変異体ＴＮＦＲＩ１０８を同定するために、パンクレアチン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｐ７５４５）処理による各変異体の半減期を決定した後、ＴＮＦＲＩ１０８に比べて半減期の増加した変異体を選別する方法を用いた。代表的なＴＮＦＲＩ１０８−１４、ＴＮＦＲＩ１０８−６４、ＴＮＦＲＩ１０８−６８変異体のパンクレアチン（パンクレアチン）処理に対する抵抗性増加結果は、図４に示す。
【０１５６】
具体的に、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ）で定量したＴＮＦＲＩ１０８（対照群）と各変異体の濃度をＰＢＳ溶液を用いて１００ｕｇ／ｍｌにした後、２５０ｕｌタンパク質試料を５００ｕｌ遠心分離チューブに用意した。パンクレアチン６ｕｇの含まれている０．１Ｍリン酸ナトリウム３０ｕｌを試料に添加して３７℃で反応させた。反応後、０分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４０分、６０分に３０ｕｌ試料を取り、５ｕｌタンパク質分解酵素阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１１８３６１７０００１）の入っている２７０ｕｌの５％ＢＳＡ溶液に入れて混合した後に、液体窒素に保管した。実験し終わった試料は、ＥＬＩＳＡ定量方法（ＲｎＤ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＤＹ２２５）により切断されていない量を分析し、ＴＮＦＲＩ１０８変異体の半減期を求めた。ＴＮＦＲＩ１０８の半減期を基準にした時の各変異体の相対的半減期を百分率で表示した（表４）。
【０１５７】
【表４】
2013507913.tif 000008
【０１５８】
［実施例３］ＴＮＦＲＩ１２６変異体の製造
【０１５９】
（１）Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体を発現する発現ベクターの製造
【０１６０】
上記のＴＮＦＲＩ１０８を用いた単一変異体選別を、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体を用いて確認した。このために、変異体７、８、９、１０、１４、６４、６５、６８、７３、７４をＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６の形態とし、タンパク質分解酵素抵抗性を確認した。
【０１６１】
具体的に、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６を発現するための大腸菌発現ベクターの作製は、ｐＥＴ４４ａベクターにＴＮＦＲＩ１２６遺伝子を挿入して完了した。ＴＮＦＲＩ１２６遺伝子は、上記の製造例で製造されたｐＧＥＭ−ＴＮＦＲＩ１７１を鋳型に、下記のようなプライマーを用いてＰＣＲを行って確保した。プライマー配列において、５'末端にＮｄｅ Ｉ、３'末端にＢａｍＨ Ｉ制限酵素部位を添加し、ｐＥＴ４４ａベクターのＮｕｓＡタンパク質が除去されたＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６形態にした。
【０１６２】
正方向プライマー：５'−ａｃａｔａｔｇｇａｔａｇｃｇｔｇｔｇｃｃｃｇｃ−３'
【０１６３】
逆方向プライマー：５'−ｃｇｇａｔｃｃｔｔａａｃａａａｃｔｇｔａｔｔｃｔｇｃｔｔｃ−３'
【０１６４】
ＰＣＲは、１次変性９８℃５分、２次変性９８℃３０秒、プライマー接合５５℃３０秒、伸長反応７２℃１分の過程中に、２次変性において伸長反応過程を２５回反復して進行させた後、次の最終酵素反応を７２℃１０分行って反応を終了した。増幅された遺伝子とｐＥＴ４４ａベクターに制限酵素（Ｎｄｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ）を添加して３７℃で３時間反応させた。制限酵素処理後１％アガロースゲル電気泳動を行って該当の大きさのＤＮＡバンドをかみそりで切り取り、ＤＮＡ抽出キットを用いて抽出した。５０ｎｇのｐＥＴ４４ａベクターと２００ｎｇのＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６遺伝子を添加し、２Ｘライゲーションプレミックス１０ｕｌを入れ、最終的に滅菌された蒸溜水を入れて２０ｕｌになるようにし、反応物を常温で５分間反応させた。反応液２ｕｌを取ってＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）細胞に入れ、３７℃で２分間熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。コロニーをアンピシリンの含まれているＬＢ液体培地で培養した後にプラスミドを分離し、遺伝子配列分析により遺伝子配列を確認した。上記過程から得たプラスミドをｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６プラスミドと命名した（図５）。
【０１６５】
（２）Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体の発現
【０１６６】
上記作製したプラスミド溶液１ｕｌを取ってＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｃ６０１０−０３）コンピテント細胞に入れ、４２℃で１分間熱衝撃を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。発現ベクターを含んでいる大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）を、１００ｕｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンが入っている５０ｍｌのＹＰ培地（ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ：Ｍｅｒｃｋ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１０３７５３、ｐｅｐｔｏｎｅ：ＢＤ、Ｃａｔ．Ｎｏ：２４３６２０、ＮａＣｌ：Ｍｅｒｃｋ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１０６４０４９０２５）に接種し、３７℃で１６時間通気培養した。培養された培地は、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン含有の２５０ｍｌＹＰ培地が入っている１フラスコに、６００ｎｍの吸光度が０．１になるように接種した。３７℃で培養して６００ｎｍの吸光度が３〜４の時に、最終濃度が１．０ｍＭ濃度になるようにＩＰＴＧを添加して発現を誘導した。発現誘導後、３７℃で３時間さらに通気培養を続けた後、細胞を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞を収集した。
【０１６７】
（３）Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体の精製
【０１６８】
収集した細胞を再懸濁溶液（５０ｍＭトリス、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５））で再懸濁した。懸濁細胞の破砕は、ソニケーター（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）（Ｓｏｎｉｃｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＶＣＸ７５０）で行った。細胞破砕後、８０００ｘｇ、１０℃、３０分間遠心分離し、上層液を捨て、沈殿されたペレットを３５ｍＬペレット洗浄溶液（５０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％トリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）（ｐＨ８．０））で懸濁し、８０００ｘｇ、１０℃、２０分間遠心分離した。上層液を捨て、ペレットを再懸濁溶液３５ｍＬで再懸濁し、８０００ｘｇ、１０℃、２０分間遠心分離した。この洗浄されたペレットは直ちに使用する、または、−８０℃で凍結保管した。
【０１６９】
該得られたペレットに６ｍＬ変性溶液（６〜８Ｍ尿素（Ｕｒｅａ）または６〜８Ｍ塩化グアニジン（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２Ｍ ＮａＣｌ）を添加して完全に溶解した。溶解後、０．４５ｕｍシリンジフィルタを用いて溶解されていないペレットを除去した。可溶化したペレット溶液をリフォルディング溶液（５０ｍＭトリス、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＬ−アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）（ｐＨ７．５））に２０倍希釈し、４℃で１２〜２４時間ゆっくり撹はんしつつリフォルディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）を誘導した。
【０１７０】
リフォルディングされたＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体を精製するために、リフォルディング溶液を、３ｋＤのアミコンウルトラ（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＵＦＣ９００３２４）を用いて２０倍濃縮した。濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（ＧＥ）レジンをＸＫ２５／７０（ＧＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１９−０１４６−０１）カラムにパッキングしたゲルろ過クロマトグラフィを用いて精製した。
【０１７１】
具体的に、リフォルディングされた試料をカラムにローディングする前に４〜５カラム体積の平衡化溶液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０））を用いてカラムを平衡化させた。カラムに２ｍＬ試料をローディングした後、５．０ｍＬ／ｍｉｎの流速で平衡化溶液を流しつつ５ｍＬずつ分画して試料を採取した。採取した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した後、９０％以上の純度を示す分画のみを取った（図６）。Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６とＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体を同じ方法で精製した。
【０１７２】
［実験例３］リガンド（ＴＮＦ−α）に対するＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体の結合力の確認
【０１７３】
精製して得た純度９０％以上の純度を有するＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６（対照群）及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体の濃度をブラッドフォード法を用いて定量し、ＥＬＩＳＡ分析法を用いてＴＮＦ−αに対する結合力を確認した。
【０１７４】
９６ウェルプレートにＴＮＦＲＩ１９０（配列番号１においてＴＮＦＲＩの２２番目のアミノ酸から２１１番目のアミノ酸までの１９０個のアミノ酸からなるタンパク質、Ｒ＆Ｄ社、Ｃａｔ Ｎｏ：６３６−Ｒ１−０２５−ＣＦ）を１ｕｇ／ｍｌ濃度で１００ｕｌローディングした後、４℃で１６時間固定化した。洗浄溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）３００ｕｌで３回各ウェルを洗浄した後、ブロッキング溶液（５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）３００ｕｌを各ウェルに入れ、室温で２時間反応させた。その後、洗浄は、上述と同じ方法で行った。分析しようとする試料を５００ｎＭ、１２５ｎＭ、３１ｎＭ、７．８ｎＭ、１．９ｎＭ、０．４８ｎＭ、０．１２ｎＭ、０．０３ｎＭで製造した後、各ウェルに１００ｕｌずつデュプリケート（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）ローディングした。試料のローディングした各ウェルに５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを１００ｕｌずつ入れ、室温で２時間反応させた。洗浄溶液で洗浄後に、１００ｕｇ／ｍＬのＴＮＦ−α抗体溶液を１／１０００に希釈した後、各ウェルに１００ｕｌずつ入れて室温で２時間反応させた。洗浄溶液で洗浄後に、基質溶液を各ウェルに１００ｕｌずつ入れて室温で１５分反応させ、基質溶液である３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＲｎＤ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＤＹ９９９）を１００ｕｌ注入した後、常温で１５分反応させ、１．０Ｍ硫酸溶液（Ｓａｍｃｈｕｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｓ２１２９）５０ｕｌを注入して反応を停止させた。４５０、５４０ｎｍのＶｍａｘ読み取り器（ＭＤ、モデル名：ＶｅｒｓａＭａｘ）を用いて吸光度を読み取った。
【０１７５】
Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体の結合力は、濃度による吸光度の変化から確認した（図７）。
【０１７６】
［実験例４］Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体のタンパク質分解酵素抵抗性の確認
【０１７７】
ＴＮＦＲＩ１０８に代えてＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６変異体を用いる以外は、上記の実験例２と同じ方法を用いてタンパク質分解酵素抵抗性を評価した（表５）。ＴＮＦＲＩ１０８においてタンパク質分解酵素抵抗性の高い変異体１４、６４、６８、７３、７４は、依然として高いタンパク質分解酵素抵抗性を示したし、ＴＮＦＲ１０８において低く測定された変異体９、１０は、低いタンパク質分解酵素抵抗性を示した。
【０１７８】
【表５】
2013507913.tif 000009
【０１７９】
［実施例４］ＴＮＦＲＩ１７１変異体の製造
【０１８０】
（１）Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体を発現する発現ベクターの製造
【０１８１】
実施例１で設計された単一変異体のうち、ＴＮＦＲＩの４番目のドメインに存在する単一変異体をＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１として産生し、評価を行った。
【０１８２】
そのために、大腸菌でＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体を発現する発現ベクターを作製した。
【０１８３】
具体的に、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１遺伝子（配列番号２６７）は、上記製造例で作製されたｐＧＥＭ−ＴＮＦＲＩ１７１プラスミドを鋳型にＰＣＲを行った後に確保した。この時、ｐＥＴ４４ａベクターへのクローニングのために、５'末端にＮｄｅ Ｉ、３'末端にＢａｍＨ Ｉ制限酵素認識部位を付加した。
【０１８４】
ＰＣＲ増幅に用いられたプライマーは、下記の通りである。
【０１８５】
正方向プライマー：５'−ａｃａｔａｔｇｇａｔａｇｃｇｔｇｔｇｃｃｃｇｃ−３'
【０１８６】
逆方向プライマー：５'−ｃｇｇａｔｃｃｔｔａｔｇｔｇｇｔｇｃｃｔｇａｇｔｃｃｔｃ−３'
【０１８７】
ＰＣＲは、１次変性９８℃５分、２次変性９８℃３０秒、プライマー接合５５℃３０秒、伸長反応７２℃１分の過程中に、２次変性において伸長反応過程を２５回反復して行った後、最終酵素反応を７２℃１０分行い、反応を終了した。増幅された遺伝子とｐＥＴ４４ａベクターに制限酵素（Ｎｄｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ）を添加し、３７℃で３時間反応させた。制限酵素処理後に１％アガロースゲル電気泳動を行い、該当の大きさのＤＮＡバンドをかみそりで切り取り、ＤＮＡ抽出キットを用いて抽出した。５０ｎｇのｐＥＴ４４ａベクターと２００ｎｇのＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１遺伝子を添加し、２Ｘライゲーションプレミックス１０ｕｌを入れ、最終的に滅菌された蒸溜水を入れて２０ｕｌになるようにし、反応物を常温で５分間反応させた。反応液２ｕｌを取ってＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）細胞に入れ、３７℃で２分間熱衝撃を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。コロニーをアンピシリンの含まれているＬＢ液体培地で培養した後プラスミドを分離し、遺伝子配列分析から遺伝子配列を確認した。上記過程から得られたプラスミドをｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１プラスミドと命名した。
【０１８８】
Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体は、ｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１プラスミドを鋳型に、表６の変異体に該当するプライマーを用いてＰＣＲ反応を行って作製した。
【０１８９】
【表６】
2013507913.tif 000010
【０１９０】
増幅反応に用いられた溶液の構成は、次の通りである。ｐＥＴ４４ａ−Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１鋳型プラスミドＤＮＡ １．０ｕｌ、２０ｐｍｏｌｅの正方向プライマー１．０ｕｌ、２０ｐｍｏｌｅの逆方向プライマー１．０ｕｌ、２Ｘ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＰＣＲバッファ２５．０ｕｌ、２００ｕＭのｄＮＴＰ４．０ｕｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｒ０４４Ａ）０．５ｕｌ、及び１７．５ｕｌの蒸溜水を入れ、これで５０．０ｕｌの反応溶液を作った。
【０１９１】
ＰＣＲは、１次変性９８℃５分、２次変性９８℃３０秒、プライマー接合５５℃３０秒、伸長反応７２℃９分の過程中に、２次変性において伸長反応を１７回反復して行った後、最終酵素反応を７２℃１０分行って反応を終了した。
【０１９２】
ＰＣＲ産物は、Ｄｐｎ Ｉ酵素で３７℃、２時間処理して大腸菌由来のＤＮＡを分解し、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを確保した。ＤＮＡ溶液２ｕｌを取ってＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＲＨ１１９−Ｊ８０）に入れ、４２℃で１分間熱衝撃を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーをアンピシリンの含まれているＬＢ液体培地で培養した後にプラスミドを分離し、塩基配列分析から部位特異的な突然変異の完成を確認した。
【０１９３】
（２）Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体の発現
【０１９４】
作製したＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体プラスミドを抽出した後、上記の実施例３−（２）の方法で発現を誘導した。Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６に代えてＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１を用いる以外は同じ方法で発現を行った。
【０１９５】
（３）Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体の精製
【０１９６】
発現したＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体を、上記の実施例３−（３）の方法で精製した。Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６に代えてＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１を用いる以外は同じ方法で精製を行った（図６）。
【０１９７】
［実験例５］リガンド（ＴＮＦ−α）に対するＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体の結合力の確認
【０１９８】
実験例３のＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６に代えてＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１を用いる以外は同じ方法で活性評価を行った。代表として、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−８３、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−８４、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−９２変異体の結合力測定結果を、図８Ａに示す。
【０１９９】
［実験例６］Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体のタンパク質分解酵素抵抗性の確認
【０２００】
ＴＮＦＲＩ１０８に代えてＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１及びＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１変異体を用いる以外は上記の実験例２と同じ方法を用いてタンパク質分解酵素抵抗性を評価した（表７）。代表として、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−８３、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−８４、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−９２変異体のパンクレアチン処理に対する抵抗性増加結果を、図８Ｂに示す。
【０２０１】
【表７】
2013507913.tif 000011
【０２０２】
［実施例５］ＴＮＦＲＩ二重変異体の設計
【０２０３】
本発明者らはさらに、単一変異体において安全性の向上した突然変異体を組み合わせて、２個のアミノ酸が置換された二重変異体を設計した。二重変異体は、単一変異体においてタンパク質分解酵素に対する抵抗性が著しく増加した変異体１４、６４、７４、８３、８４、８５、９２位置を組み合わせることで設計した。二重変異体の設計目録を表８に示す。
【０２０４】
【表８】
2013507913.tif 000012
【０２０５】
［実施例６］Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１二重変異体の製造
【０２０６】
（１）Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１二重変異体を発現する発現ベクターの作製
【０２０７】
実施例５で設計された二重変異体は、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１で産生して評価を行った。そのために、大腸菌でＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１二重変異体を発現する発現ベクターを作製した。
【０２０８】
具体的に、表８に記述された二重変異体のうち変異体２０１、２０２、２０４、２０５、２０６、２０８は、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−１４単一変異体のプラスミドを鋳型に、表９に表示されたプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって二重変異体をコードするＤＮＡを作製した。二重変異体のうち、変異体２０３はＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−６４単一変異体のプラスミドを鋳型に、変異体２０７はＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−８３単一変異体のプラスミドを鋳型に、変異体２０９はＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−８５単一変異体のプラスミドを鋳型に、表９に示したプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって、二重変異体をコードするＤＮＡを作製した。
【０２０９】
増幅反応に用いられた溶液の構成は、次の通りである。上記の各鋳型プラスミドＤＮＡ１．０ｕｌ、２０ｐｍｏｌｅの正方向プライマー１．０ｕｌ、２０ｐｍｏｌｅの逆方向プライマー１．０ｕｌ、２Ｘ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＰＣＲバッファ２５．０ｕｌ、２００ｕＭのｄＮＴＰ ４．０ｕｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｒ０４４Ａ）０．５ｕｌ、及び１７．５ｕｌ蒸溜水を入れ、これで５０．０ｕｌの反応溶液を作った。
【０２１０】
ＰＣＲは、１次変性９８℃５分、２次変性９８℃３０秒、プライマー接合５５℃３０秒、伸長反応７２℃９分の過程中に、２次変性で伸長反応を１７回反復して行った後、最終酵素反応を７２℃１０分行って反応を終了した。
【０２１１】
【表９】
2013507913.tif 000013
【０２１２】
ＰＣＲ産物は、Ｄｐｎ Ｉ酵素で３７℃、２時間処理して大腸菌由来のＤＮＡを分解し、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを確保した。ＤＮＡ溶液１ｕｌを取ってＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞に入れ、４２℃で１分間熱衝撃を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているＬＢ固体培地で静置培養してコロニーを得た。コロニーをアンピシリンの含まれているＬＢ液体培地で培養した後にプラスミドを分離し、塩基配列分析から部位特異的な突然変異の完成を確認した。
【０２１３】
（２）Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１二重変異体の発現
【０２１４】
作製したＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１二重変異体プラスミドを抽出した後、上記の実施例３−（２）の方法で発現を誘導した。Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６に代えてＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１二重変異体を用いる以外は同じ方法で発現を行った。
【０２１５】
（３）Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１二重変異体の精製
【０２１６】
発現したＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１二重変異体を上記の実施例３−（３）の方法で精製した。Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６に代えてＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１二重変異体を用いる以外は同じ方法で精製を行った。
【０２１７】
［実験例７］リガンド（ＴＮＦ−α）に対するＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１二重変異体の結合力の確認
【０２１８】
実験例３のＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１２６に代えてＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１二重変異体を用いる以外は同じ方法で活性評価を行った。代表的な二重変異体Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−２０４、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−２０５、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−２０６変異体の結合力測定結果を、図９に示す。
【０２１９】
［実験例８］Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１二重変異体のタンパク質分解酵素抵抗性の確認
【０２２０】
ＴＮＦＲＩ１０８に代えてＭｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１二重変異体を用いる以外は、上記の実験例２と同じ方法を用いてタンパク質分解酵素抵抗性を評価した（表１０）。代表的な二重変異体Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−２０４、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−２０５、Ｍｅｔ−ＴＮＦＲＩ１７１−２０６変異体のパンクレアチン処理に対する抵抗性増加結果を、図１０に示す。
【０２２１】
【表１０】
2013507913.tif 000014
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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