(57)【要約】本発明は、パルボウイルスＶＰ１／ＶＰ２ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生じさせるためのプロセスを提供する。本発明は、さらに、パルボウイルス・ＶＬＰおよびＶＬＰを含有する免疫原性組成物を精製するための方法を提供する。本発明は、パルボウイルスのＶＰ１およびＶＰ２をコードする組換え核酸分子、および組換え核酸を含有する宿主細胞も包含する。一実施形態において、パルボウイルスのウイルス様粒子を生成する方法が提供され、この方法は、（ａ）第１の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスＶＰ１をコードするヌクレオチド配列と、第２の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む組換え核酸分子を含有する宿主細胞を提供するステップと、（ｂ）ＶＰ１タンパク質およびＶＰ２タンパク質が発現され、ＶＬＰに集合する条件下で宿主細胞を維持するステップとを包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルボウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法であって、（ａ）第１の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスＶＰ１をコードするヌクレオチド配列と、第２の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む組換え核酸分子を含有する宿主細胞を提供するステップと、（ｂ）前記ＶＰ１タンパク質およびＶＰ２タンパク質が発現され、ＶＬＰに集合する条件下で前記宿主細胞を維持するステップとを包含する、方法。
【請求項２】
ＶＰ１が、ＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＶＰ１およびＶＰ２を含有するＶＬＰが生成される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組換え核酸分子がバイシストロン性ベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の制御エレメントが前記第２の制御エレメントの改変体であり、前記改変体が、ＶＰ２と比較してＶＰ１の生成を転写的に、翻訳的に、または転写的かつ翻訳的に減少させる修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の制御エレメントが、ＶＰ１をコードする核酸の上流のＴＡＴＡボックスの少なくとも一部分の欠失、ＶＰ１をコードする核酸の上流の接合部位の欠失、ＶＰ１をコードする核酸の上流の転写開始部位もしくは転写終止部位の導入、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の制御エレメントが、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター（配列番号１９）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記宿主細胞が酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、トリの細胞、細菌、テトラヒメナの細胞またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞を、ＶＰ１およびＶＰ２が生成され、これらのタンパク質がＶＬＰに集合するのに適した培養条件下で維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＶＬＰを単離するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＶＬＰを、宿主細胞の馴化培地、宿主細胞の溶解物、宿主細胞のホモジネート、またはそれらの組み合わせから単離する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
単離された前記ＶＬＰをさらに精製する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
単離された前記ＶＬＰを、スクロースクッション、スクロース勾配遠心分離、クロマトグラフィー法、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される精製方法を用いてさらに精製する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法に従って生成される、ＶＰ１およびＶＰ２を含有するパルボウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１５】
請求項１４に記載のパルボウイルス・ＶＬＰを含む免疫原性組成物。
【請求項１６】
第１の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスＶＰ１をコードするヌクレオチド配列と、第２の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む組換え核酸であって、適切な宿主細胞内にＶＰ１をコードする前記配列とＶＰ２をコードする前記配列とが同量存在する場合、ＶＰ１が、ＶＰ２よりも低いアバンダンスで発現される、組換え核酸。
【請求項１７】
前記第１の制御エレメントが弱いプロモーターであり、前記第２の制御エレメントが強力なプロモーターである、請求項１６に記載の組換え核酸。
【請求項１８】
前記第１の制御エレメントが前記第２の制御エレメントの改変体であり、前記改変体が、ＶＰ２と比較してＶＰ１の生成を転写的に、翻訳的に、または転写的かつ翻訳的に減少させる修飾を含む、請求項１７に記載の組換え核酸。
【請求項１９】
前記修飾が、ＶＰ１をコードする核酸の上流のＴＡＴＡボックスの少なくとも一部分の欠失、ＶＰ１をコードする核酸の上流の接合部位の欠失、ＶＰ１をコードする核酸の上流の転写開始部位もしくは転写終止部位の導入、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１８に記載の組換え核酸。
【請求項２０】
前記第２の制御エレメントが、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター（配列番号１９）である、請求項１６に記載の組換え核酸。
【請求項２１】
前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であり、かつ一本鎖または二本鎖のいずれかである、請求項２０に記載の組換え核酸。
【請求項２２】
プラスミドである、請求項２１に記載の組換え核酸。
【請求項２３】
前記プラスミドが検出可能なマーカーを含む、請求項２２に記載の組換え核酸。
【請求項２４】
請求項１６から２３までのいずれか一項に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項２５】
前記組換え核酸が前記宿主細胞のゲノムに組み込まれているか、または染色体外のエレメントに保有されている、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、トリの細胞、細菌、テトラヒメナの細胞またはそれらの組み合わせである、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法に従って生成される、ＶＰ１およびＶＰ２を含有するパルボウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、診断用キット内の抗原として用いる方法。
【請求項２８】
生物学的試料中の抗パルボウイルス抗体を検出する方法であって、個体から得られた生物学的試料を準備するステップと、前記試料を、請求項１から１３までのいずれか一項に記載のパルボウイルス・ＶＬＰと組み合わせるステップと、抗体−ＶＬＰ複合体を検出するステップとを包含し、抗体−ＶＬＰ複合体が存在することにより、抗パルボウイルス抗体が前記生物学的試料中に存在することが示される、方法。
【請求項２９】
前記生物学的試料が血液試料または血清試料である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１６に記載の組換え核酸を含む免疫原性組成物を、哺乳動物における免疫応答を上昇させることができる医薬品として使用する方法。
【請求項３１】
前記医薬品を使用して、小児における伝染性紅斑、鎌状赤血球貧血、溶血性貧血、遺伝性球状赤血球症、慢性赤血球形成不全、免疫不全の患者における貧血、成人における持続性の関節症、免疫無防備状態の患者における血球減少症、マラリア原虫に同時感染している間の貧血の悪化、マラリアにおける貧血の悪化、妊娠中の女性における胎児水腫および自然流産からなる群から選択される状態を処置または予防する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
パルボウイルスＶＰ１および／またはＶＰ２に対する免疫応答を誘導する方法であって、個体に、有効量の請求項１６から２３までのいずれか一項に記載の組換え核酸を投与し、それによって、免疫応答を誘導するステップを包含する、方法。
【請求項３３】
前記組換え核酸を筋肉内注射によって投与する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３４】
パルボウイルスＶＰ１および／またはＶＰ２に対する免疫応答を誘導する方法であって、個体に、請求項１４に記載のウイルス様粒子または請求項１５に記載の免疫原性組成物を有効量で投与し、それによって、免疫応答を誘導するステップを包含する、方法。
【請求項３５】
前記ウイルス様または免疫原性組成物を筋肉内注射によって投与する、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１０年４月７日に出願された米国仮特許出願第６１／３２１８５６号（この完全な内容は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
パルボウイルスＢ１９は、免疫応答性の、血液学的に正常な個体において穏やかな自己限定性の疾病を生成するが、鎌状赤血球症または他の種類の慢性貧血を有する人においては重篤な疾病を引き起こし得る。そのような人において、パルボウイルスＢ１９は、急性の重篤な貧血を引き起こし得る。病気の人は、青白く、弱々しく、疲労している可能性がある。さらに、免疫系に問題を有する人は、パルボウイルスＢ１９に感染すると、医学的処置を必要とする慢性貧血も発症する可能性がある。白血病または癌を有する人、免疫欠損を持って生まれた人、臓器移植を受けた人、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染している人は、パルボウイルスＢ１９感染に起因する重篤な疾病についての危険性を有する。成人で最初にパルボウイルスＢ１９に接触した血液学的に正常な個体は、数週間続く関節痛（ａｒｔｈａｌｇｉａ）を示す可能性がある。妊娠中の女性のパルボウイルスＢ１９感染には、重篤な胎児の貧血に起因する胎児水腫が伴い、時には、流産または死産に至る。失血または他の理由に起因する急性貧血の人における輸血によるパルボウイルスＢ１９の獲得は、造血による貧血の矯正を妨げる可能性がある。
【０００３】
パルボウイルスＢ１９は、通常、一般にリンゴ病（ｓｌａｐｐｅｄ  ｃｈｅｅｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）として公知の第五病または伝染性紅斑と呼ばれる小児期発疹を引き起こす。パルボウイルスＢ１９に感染している人は、この疾病の、皮疹が現れる前の初期の間、伝染性である。パルボウイルスＢ１９は、皮疹が発症する前の、「ただの風邪をひいている」ように見える時点での感染した人の呼吸器分泌物（例えば、唾液、痰または鼻の粘液）において見いだされている。このウイルスは、おそらく、それらの分泌物と直接接触することにより人から人へと蔓延する。パルボウイルスＢ１９は、現在、合併症が起こり得るので、特に妊娠中の女性およびその胎児にとって、または免疫系が不健康な人にとって、重篤な疾患であると考えられている。
【０００４】
パルボウイルスＢ１９感染の症状としては、発熱、倦怠感、頭痛、筋痛、悪心、および鼻漏からなり得る穏やかな非特異的な前駆の疾病が挙げられる。症状は、典型的に、最初に感染した５〜７日後に始まる。これらの症状は、最初のウイルス血症に相当し、２〜３日のうちに消失する。およそ１週間後、頬に明るい赤色の斑状の発疹が現れ、多くの場合、口囲蒼白が伴う。びまん性斑状丘疹状皮疹は、１〜４日後に現れ、次第に消えて、そう痒性であり得、遠位の四肢（ｄｉｓｔａｌ  ｅｘｔｒｅｍｅｔｙ）に徐々に広がり得るレース状紅斑性皮疹（ｌａｃｙ  ｅｒｙｈｅｍａｔｏｕｓ  ｒａｓｈ）になり得る。
【０００５】
パルボウイルスＢ１９は、小型ＤＮＡウイルスであるパルボウイルス科ファミリーのエリスロウイルス属に属する。パルボウイルスＢ１９は、一本鎖の直鎖ＤＮＡゲノムを含有する、エンベロープを有さない正二十面体のウイルスである。パルボウイルスＢ１９ビリオンは、直径２０〜２５ｎｍであり、５．６ｋｂのゲノムを有する（Ｃｌｅｗｌｅｙ、１９８４年、Ｃｏｔｍｏｒｅ  ＆  Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ、１９８４年）。パルボウイルスＢ１９カプシドは、８３ｋＤａの副次的な構造タンパク質であるＶＰ１と、５８ｋＤａの主要な構造タンパク質であるＶＰ２とからなる。これは、２つの構造タンパク質、ＶＰ１とＶＰ２とを、約５％〜約９５％の比で含有するタンパク質の殻で囲まれた、セグメントに分かれていない一本鎖ＤＮＡゲノムを有する（Ｏｚａｗａら、１９８７年）。この２つのタンパク質の配列は、共直線性（ｃｏ−ｌｉｎｅａｒ）であり、ＶＰ２はＶＰ１のカルボキシル末端領域と同一である；しかし、ＶＰ１は、アミノ末端に追加的な２２７アミノ酸を含む。長く持続する抗体応答は、ＶＰ１タンパク質とＶＰ２タンパク質の両方を対象とし、よって、これらのタンパク質は、単独で、有意な免疫応答を起こすことが予測される。
【０００６】
昆虫細胞における、パルボウイルスＢ１９  ＶＰ１／ＶＰ２  ＶＬＰの発現および精製は、以前に記載されている（特許文献１）。パルボウイルスＢ１９に関して公知であることに関わらず、パルボウイルスＢ１９感染を予防するワクチンも実用的な医薬も存在しない。ヒト免疫グロブリンを含有する調製物が、時には、免疫不全の個体における慢性のパルボウイルスＢ１９感染を処置するために使用される。しかし、免疫グロブリンを注射することは、十分に実用的でない、長く持続しない、または、広範にわたる予防的使用もしくは常套的な予防的使用のために手頃でない。例えば、職場、保育所、または学校における社会的相互作用から第五病の人を排除することは、個体は特徴的な皮疹が発生する前にかなり伝染性であるので、ウイルスの蔓延を予防するために有効な方式ではない。よって、パルボウイルスＢ１９免疫原性材料の効率的な調製を可能にする、パルボウイルスＢ１９ワクチンを開発する改善された手法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，５０８，１８６号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、一部において、パルボウイルスのウイルス様粒子、例えば、パルボウイルスＢ１９のウイルス様粒子を生成するための方法を提供する。一部の態様では、本発明の方法は、宿主細胞に、パルボウイルスＶＰ１とパルボウイルスＶＰ２の両方を含む組換え核酸、例えば、発現ベクターなどを提供するステップと、宿主細胞を、ＶＰ１タンパク質およびＶＰ２タンパク質が発現され、パルボウイルス・ＶＬＰに集合する（ａｓｓｅｍｂｌｅ）条件下で維持するステップとを含む。別の態様では、本発明の方法は、免疫化された宿主においてＶＬＰが形成されるように、宿主において、パルボウイルスＶＰ２と、それよりも低いレベルのパルボウイルスＶＰ１の発現を導くバイシストロン性の核酸ワクチンを提供するステップを含む。
【０００９】
本発明は、パルボウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法であって、（ａ）第１の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスＶＰ１をコードするヌクレオチド配列と、第２の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む組換え核酸分子を含有する宿主細胞を提供するステップと、（ｂ）ＶＰ１タンパク質およびＶＰ２タンパク質が発現され、ＶＬＰに集合する条件下で宿主細胞を維持するステップとを含む方法に関する。好ましい方法では、ＶＰ１が、ＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成される。可溶性のＶＰ１が可溶性のＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成されることが好ましい。特定の態様では、ＶＰ１およびＶＰ２を含有するＶＬＰが生成される。組換え核酸分子はバイシストロン性ベクターであることが好ましい。特定の態様では、第１の制御エレメントは、第２の制御エレメントの改変体であり、その改変体は、ＶＰ２と比較してＶＰ１の生成を転写的に、翻訳的に、または転写的かつ翻訳的に減少させる修飾を含む。例えば、第１の制御エレメントは、ＶＰ１をコードする核酸の上流のＴＡＴＡボックスの少なくとも一部分の欠失、ＶＰ１をコードする核酸の上流の接合部位の欠失、ＶＰ１をコードする核酸の上流の転写開始部位または転写終止部位の導入、またはそれらの組み合わせを含んでよい。特定の態様では、第２の制御エレメントは、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター（配列番号１９）である。
【００１０】
宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、トリの細胞、細菌、テトラヒメナの細胞またはそれらの組み合わせであってよい。一態様では、宿主細胞を、ＶＰ１およびＶＰ２が生成され、これらのタンパク質がＶＬＰに集合するのに適した培養条件下で維持する。方法は、ＶＬＰを単離するステップをさらに含んでよい。ＶＬＰを、宿主細胞の馴化培地、宿主細胞の溶解物、宿主細胞のホモジネート、またはそれらの組み合わせから単離することができる。場合によって、単離されたＶＬＰをさらに精製することができる。単離されたＶＬＰは、スクロースクッション（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｃｕｓｈｉｏｎ）、スクロース勾配遠心分離、クロマトグラフィー法、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される精製方法を用いて精製することができる。
【００１１】
本発明は、本明細書に記載の任意の方法に従って生成される、ＶＰ１およびＶＰ２を含有するパルボウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）にも関する。
【００１２】
本発明は、パルボウイルス・ＶＬＰを含む免疫原性組成物にも関する。
【００１３】
本発明は、第１の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスＶＰ１をコードするヌクレオチド配列と、第２の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸であって、適切な宿主細胞内にＶＰ１をコードする配列とＶＰ２をコードする配列とが同量存在する場合、ＶＰ１が、ＶＰ２よりも低いアバンダンスで発現される、組換え核酸にも関する。可溶性のＶＰ１が可溶性のＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成されることが好ましい。一態様では、第１の制御エレメントは弱いプロモーターであり、第２の制御エレメントは強力なプロモーターである。第１の制御エレメントは第２の制御エレメントの改変体であってよく、その改変体は、ＶＰ２と比較してＶＰ１の生成を転写的に、翻訳的に、または転写的かつ翻訳的に減少させる修飾を含んでよい。修飾は、ＶＰ１をコードする核酸の上流のＴＡＴＡボックスの少なくとも一部分の欠失、ＶＰ１をコードする核酸の上流の接合部位の欠失、ＶＰ１をコードする核酸の上流の転写開始部位または転写終止部位の導入、またはそれらの組み合わせであってよい。第２の制御エレメントは、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター（配列番号１９）であってよい。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。組換え核酸はプラスミドであってよい。プラスミドは、検出可能なマーカーを含んでよい。
【００１４】
本発明は、本明細書に記載の組換え核酸を含む宿主細胞にも関する。組換え核酸は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれていてよい、または染色体外のエレメントに保有されていてよい。宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、トリの細胞、細菌、テトラヒメナの細胞またはそれらの組み合わせであってよい。
【００１５】
本発明は、本明細書に記載の方法に従って生成される、ＶＰ１およびＶＰ２を含有するパルボウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、治療目的および診断目的で、例えば診断用キット内の抗原として用いる方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、酵母発現ベクターｐＢＳ２４．１の図である。このベクターは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＶＬＰを生成するのに適している。
【図２】図２は、ｐＢＳ２４．１に基づく、バイシストロン性の酵母発現ベクターｐＣＤＣ．７の図である。このベクターは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてパルボウイルスＢ１９  ＶＰ１・ＶＬＰおよびパルボウイルスＢ１９  ＶＰ２・ＶＬＰを同時発現させるのに適している。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてパルボウイルスＢ１９  ＶＰ１・ＶＬＰおよびパルボウイルスＢ１９  ＶＰ２・ＶＬＰを同時発現させるために用いるｐＣＤＣ．７のヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてパルボウイルスＢ１９  ＶＰ１・ＶＬＰおよびパルボウイルスＢ１９  ＶＰ２・ＶＬＰを同時発現させるために用いるｐＣＤＣ．７のヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてパルボウイルスＢ１９  ＶＰ１・ＶＬＰおよびパルボウイルスＢ１９  ＶＰ２・ＶＬＰを同時発現させるために用いるｐＣＤＣ．７のヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてパルボウイルスＢ１９  ＶＰ１・ＶＬＰおよびパルボウイルスＢ１９  ＶＰ２・ＶＬＰを同時発現させるために用いるｐＣＤＣ．７のヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す。
【図４】図４は、最適化されたパルボウイルスＢ１９  ＶＰ１のヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す。
【図５】図５は、最適化されたパルボウイルスＢ１９  ＶＰ２のヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。
【図６】図６は、パルボウイルスＢ１９  ＶＰ２を発現させるために用いるＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター（ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして）のヌクレオチド配列（配列番号１９）を示す。
【図７】図７は、ＶＰ１の開始メチオニン（太字）からすぐ上流に天然に存在するのと同じく、ＧＡＰＤＨ配列の１０塩基がパルボウイルスＢ１９の天然ウイルス配列の１４塩基（下線が引かれている）と交換された、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターの「デルタＡｓ」バージョンのヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す。
【図８】図８は、パルボウイルスＢ１９  ＶＰ１を発現させるために用いる、ＴＡＴＡが欠失したＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター（ＢａｍＨＩ／ＭｌｕＩフラグメントとして）のヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。
【図９】図９は、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターとＶＰ１の開始メチオニン（太字）との間の接合部から上流に１ＳＳ（合成の開始−終止配列、下線が引かれている）を有するパルボウイルスＢ１９  ＶＰ１のヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す。
【図１０】図１０は、ＶＰ２に対する抗体を用いたウエスタンブロットにおける、酵母において生成される可溶性のＶＰ１および可溶性のＶＰ２の相対的な量の変動を示す。上のバンドは、ＶＰ１を表し、下の色の濃いバンドはＶＰ２を表す。ラベルは、プラスミド内に何が入っているか、または行われた修飾の種類を記載している。例えば、レーン７は、１つの開始／終止により、ＶＰ１のレベルがＶＰ２と比較して減少したことを示し、レーン８は、２つの開始／終止により、レベルがさらに減少したことを示す。
【図１１】図１１は、（Ａ）精製されたパルボウイルスＢ１９・ＶＬＰを示すクーマシーゲル、および（Ｂ）パルボウイルスＢ１９・ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す。
【図１２Ａ】図１２は、パルボウイルスＢ１９・ＶＬＰの免疫原性を実証しているＥＬＩＳＡデータを示す３つのグラフである。最も高い力価はＭＦ５９処方物で実証され、各用量濃度で同様であった。
【図１２Ｂ】図１２は、パルボウイルスＢ１９・ＶＬＰの免疫原性を実証しているＥＬＩＳＡデータを示す３つのグラフである。最も高い力価はＭＦ５９処方物で実証され、各用量濃度で同様であった。
【図１２Ｃ】図１２は、パルボウイルスＢ１９・ＶＬＰの免疫原性を実証しているＥＬＩＳＡデータを示す３つのグラフである。最も高い力価はＭＦ５９処方物で実証され、各用量濃度で同様であった。
【図１３】図１３は、ＶＰ１デルタＴＡＴＡ／ＶＰ２構築物の図である。この構築物は、本出願に記載のタンパク質の精製および実験において使用するのに適している。
【図１４】図１４は、パルボウイルスＢ１９のＶＰ１（配列番号２３）およびＶＰ２（配列番号２４）のアミノ酸配列を示す。ＶＰ１は、７８１アミノ酸長であり、８４ｋＤａの分子量を有する。ＶＰ２は、５５４アミノ酸長であり、５８ｋＤａの分子量を有する。
【図１５】図１５は、ＶＰ１／ＶＰ２・ＶＬＰの発現に由来するスクロース棚（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｓｈｅｌｆ）画分の（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび（Ｂ）ウェスタンを示す。
【図１６】図１６は、パルボウイルスＢ１９  ＶＰ１／ＶＰ２・ＶＬＰのＣａｐｔｏ  Ｑ溶出からの画分の（Ａ）クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび（Ｂ）α−ＶＰ１／ＶＰ２抗体でプローブしたウェスタン（Ｂ）分析を示す。
【図１７】図１７は、精製されたＶＰ１／ＶＰ２・ＶＬＰのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｓ−２００）クロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、一部において、パルボウイルスＢ１９のＶＰ１およびＶＰ２を同じ宿主細胞において発現させて、その両方のタンパク質を含有するＶＬＰを生成することができるが、ＶＬＰの生成は効率的でないという発見に基づく。現在、ＶＰ１およびＶＰ２を同じ宿主細胞（例えば、酵母細胞）において発現させると、ＶＰ１の発現により、ＶＰ２の発現およびＶＬＰの形成が抑制されることが発見されている。この結果、ＶＬＰの形成が非効率的になり、不溶性材料の量が増加する。
【００１８】
本発明は、パルボウイルスのＶＰ１タンパク質とＶＰ２タンパク質とを含有するＶＬＰの非効率的な生成に関する問題の解決法を提供する。方法は、宿主細胞において、ＶＰ１およびＶＰ２を、ＶＰ１がＶＰ２と比較して低いアバンダンスで生成されるように生成することにより、パルボウイルスのＶＰ１タンパク質とＶＰ２タンパク質とを含有するＶＬＰを生成するより優れた方式を提供する。可溶性のＶＰ１が可溶性のＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成されることが好ましい。本発明は、ＶＰ１およびＶＰ２をコードし、宿主細胞における所望の量のタンパク質の発現を駆動する組換え核酸を提供する。例えば、ＶＰ１およびＶＰ２の発現を別々のプロモーターによって制御し、各タンパク質の発現を所望の比率に制御することができる。本発明は、組換え核酸を含有する宿主細胞を用いてＶＰ１およびＶＰ２を含有するパルボウイルス・ＶＬＰを生成するための方法も提供する。これらの方法は、ＶＬＰの生成効率の改善をもたらし、トランスフェクション効率の変動性（例えば、細胞間の変動性およびバッチ間の変動性）、ＶＰ２と比較したＶＰ１の発現の変動性、およびＶＰ１によるＶＰ２の発現の抑制を含めた、ＶＰ１およびＶＰ２を発現させるために別々のベクターを使用し、それらを一緒に混合して宿主細胞を生成する先行方法に伴う変動性および品質管理の問題を減らす。
【００１９】
本発明の他の態様は、組換え核酸、宿主細胞、ＶＬＰおよびＶＬＰを含有する免疫原性組成物を生成するための方法を包含する。
【００２０】
Ｉ．  定義
本出願において使用される科学用語および技術用語は全て、別段の指定がない限り、当技術分野で一般に使用される意味を有する。本出願において使用される場合、以下の単語または句は指定された意味を有する。
【００２１】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、その内容からそうでないことが明らかでない限り、複数の言及を含むことに留意しなければならない。よって、例えば、「ａ（１つの）ポリヌクレオチド」への言及は、そのようなポリヌクレオチド２つ以上などの混合物を包含する。
【００２２】
数値ｘに関して、用語「約」は、例えば、ｘ＋１０％を意味する。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「パルボウイルス」は、哺乳動物種（例えば、ヒト、イヌ、ニワトリ、ネコ、マウス、ブタ、アライグマ、ミンク、キルハムラット（ｋｉｌｈａｍ  ｒａｔ）、ウサギ（ｌａｐｉｎｅ））に関連する全てのパルボウイルス、および広範には、パルボウイルス科ファミリーの全ての属（すなわち、パルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス）、デペンドウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、エリスロウイルス（例えば、パルボウイルスＢ１９）およびボカウイルス）をいう。パルボウイルスは、ヒトに感染する、すなわち、デペンドウイルス属、エリスロウイルス属、またはボカウイルス属のものであることが好ましい。パルボウイルスはパルボウイルスＢ１９であることが最も好ましい。いくつかの実施形態において、パルボウイルスは、パルボウイルス属由来である。パルボウイルスという用語は、出願時には特徴づけられていない分離株も包含する。
【００２４】
パルボウイルスＢ１９種は、３つの別個の遺伝子型に細分される（Ｇａｌｌｉｎｅｌｌａら、２００３年；Ｈｏｋｙｎａｒら、２００２年；Ｎｇｕｙｅｎら、２００２年；Ｓｅｒｖａｎｔら、２００２年）。これらの遺伝子型間のヌクレオチドの相違（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｙ）は、およそ１０％であり、プロモーター領域においては２０％超である。以前Ｂ１９Ｖとして公知であったウイルスは全て、遺伝子型１として分類した。遺伝子型２は、比較的まれに見いだされる。遺伝子型２が見いだされる場合、およそ４０歳よりも高齢の個体においてはるかに高い頻度で同定される。遺伝子型３のウイルスは、原型（ｐｒｏｔｙｐｅ）株Ｖ９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ００３４２１）及び原型株Ｄ９１．１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０８３２３４）によって代表される２つのサブタイプにクラスター化される（Ｐａｒｓｙａｎら、２００７年）。遺伝子型３のウイルスは、西アフリカのガーナに特有であることが示されており（Ｃａｎｄｏｔｔｉら、２００４年）、また、ブラジルの特定の地域に存在する可能性がある。
【００２５】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指し、生成物の最小の長さに限定されない。よって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義の範囲内に含まれる。全長のタンパク質およびそのフラグメントの両方がこの定義に包含される。これらの用語は、ポリペプチドの発現後（ｐｏｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化なども包含する。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を維持する限りは、天然の配列に対して修飾、例えば、欠失、付加および置換など（一般に天然に保存された）を含むタンパク質をいう。これらの修飾は、部位特異的変異誘発によるものなど、意図的なものであってよい、または、タンパク質を生成する宿主の変異によるものまたはＰＣＲ増幅に起因するエラーなどの偶発的なものであってよい。
【００２６】
「実質的に精製された」とは、一般に、物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）が、その物質が、それが存在する試料における百分率の大部分を構成するように単離することをいう。典型的に、試料において、実質的に精製された成分は、その試料の５０％、好ましくは８０％〜８５％、より好ましくは９０〜９５％を構成する。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技法は、当技術分野で周知であり、それらとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度にしたがった沈降が挙げられる。
【００２７】
「単離された」とは、ポリペプチドについて言及する場合、示された分子が、その分子が天然に見いだされる、生物全体から分離されており、別個である、または、同じ種類の他の生物学的な高分子の実質的な不在下で存在することを意味する。用語「単離された」は、ポリヌクレオチドに関しては、天然では通常それに関連している配列の全体またはその部分を欠く核酸分子；または、天然に存在するのと同様だが、それと結びついた異種配列を有する配列；または染色体から切り離された分子である。
【００２８】
「組換え」とは、本明細書において核酸分子を説明するために使用される場合、その起源または操作によって、それが天然では関連しているポリヌクレオチドの全部または一部と結びついていない、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、ウイルス起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。用語「組換え」は、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、組換えポリヌクレオチドを発現させることによって生成されるポリペプチドを意味する。一般に、下でさらに記載するように、目的の遺伝子をクローニングし、次いで、形質転換した生物において発現させる。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現してタンパク質を生成する。
【００２９】
用語「形質転換」とは、挿入するために用いる方法に関係なく、外因性のポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することをいう。例えば、直接的な取り込み、トランスフェクション、形質導入またはｆ−接合が含まれる。外因性のポリヌクレオチドは、非組み込み型ベクター、例えばプラスミドとして維持することができる、あるいは、宿主ゲノムに組み込むことができる。
【００３０】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および他のそのような単細胞の実体として培養された微生物またはそれよりも高等の真核細胞株を示す用語は、組換えベクターまたは他の移入ＤＮＡのレシピエントとして用いることができる、または用いられてきた細胞をいい、トランスフェクトされた元の細胞の元の後代を包含する。
【００３１】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に置かれると、ｉｎ  ｖｉｖｏで転写され（ＤＮＡの場合）、翻訳されて（ｍＲＮＡの場合）ポリペプチドになる核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定することができる。コード配列としては、これに限定されないが、ウイルス、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡまたはＲＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列を挙げることができる。転写終結配列は、コード配列の３’側に位置してよい。
【００３２】
典型的な「制御エレメント」としては、これらに限定されないが、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの３’側に位置する）、翻訳の開始を最適化するための配列（コード配列の５’側に位置する）、および翻訳終結配列が挙げられる。
【００３３】
用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含し、また、それらの類似体、例えば、修飾された骨格を含有するものなど（例えば、ホスホロチオエートなど）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）なども包含する。本発明は、上記のものと相補的な配列を含む核酸を包含する（例えば、アンチセンスまたはプローブする（ｐｒｏｂｉｎｇ）目的で）。
【００３４】
「作動可能に連結した」とは、そう記載されている成分がそれらの通常の機能を果たすように構成されている、エレメントの配置（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）をいう。よって、コード配列に作動可能に連結した所与のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合に、コード配列の発現をもたらすことができる。プロモーターは、コード配列の発現を導くように機能する限りは、コード配列と隣接している必要はない。よって、例えば、介在性の、翻訳されないが転写された配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在してよく、それでも、プロモーター配列はコード配列に「作動可能に連結した」とみなされ得る。
【００３５】
「にコードされる」とは、ポリペプチド配列またはその部分が、少なくとも３アミノ酸のアミノ酸配列を含有するポリペプチド配列をコードする核酸配列をいう。
【００３６】
「発現カセット」または「発現構築物」とは、目的の配列（複数可）または遺伝子（複数可）の発現を導くことができる集合体をいう。発現カセットは、一般に、上記の通り、制御エレメント、例えば、目的の配列（複数可）または遺伝子（複数可）に作動可能に連結している（それらの転写を導くために）プロモーターなどを含み、多くの場合、その上ポリアデニル化配列も含む。本発明のある特定の実施形態の範囲内では、本明細書に記載の発現カセットは、プラスミド構築物内に含有されてよい。発現カセットの成分に加えて、プラスミド構築物は、１または複数の選択マーカー、プラスミド構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル（例えば、Ｍ１３複製開始点）、少なくとも１つの多重クローニング部位、および「哺乳動物の」複製開始点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルス複製開始点）も含んでよい。
【００３７】
「精製されたポリヌクレオチド」とは、本質的に遊離している、例えば、ポリヌクレオチドが天然に関連しているタンパク質を約５０％未満、好ましくは約７０％未満、およびより好ましくは少なくとも約９０％未満含有する目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをいう。目的のポリヌクレオチドを精製するための技法は、当技術分野で周知であり、それらとしては、例えば、ポリヌクレオチドを含有する細胞を、カオトロピック作用剤を用いて破壊すること、およびポリヌクレオチド（複数可）およびタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度にしたがった沈降によって分離することが挙げられる。
【００３８】
「ベクター」は、核酸配列を標的細胞に移入することができる（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子キャリア、およびリポソーム）。典型的に、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」とは、目的の核酸の発現を導くことができる任意の核酸構築物を意味し、これは、核酸配列を標的細胞に移入することができる。よって、これらの用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」とは、一般に、Ｔ細胞受容体および／または抗体によって認識される抗原上の部位をいう。エピトープは、タンパク質抗原に由来する、またはその一部の短いペプチドであることが好ましい。しかし、この用語は、グリコペプチドおよび炭水化物エピトープ、および一次配列は連続していないが最終的に折りたたまれた構造では互いに近傍に位置するペプチドで構成される（グリコシル化などの修飾を伴う、または伴わない）タンパク質表面を有するペプチドも包含することが意図される。いくつかの異なるエピトープが単一の抗原性分子に保有され得る。エピトープは、１または複数の他の分子と共有結合的に、または非共有結合的に結びつく２つ以上の分子からできていてよい。用語「エピトープ」は、生物全体を認識する応答を刺激する、アミノ酸または炭水化物の修飾された配列も包含する。選択されたエピトープが、感染症を引き起こす感染性因子のエピトープであれば有利である。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞エピトープ」は、一般に、Ｔ細胞応答を誘導することができるペプチド構造の特徴をいい、「Ｂ細胞エピトープ」は、一般に、Ｂ細胞応答を誘導することができるペプチド構造の特徴をいう。
【００４１】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、被験体における、目的の組成物内に存在する抗原に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子によって媒介される免疫応答をいい、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔ−リンパ球および／または他の白血球によって媒介される免疫応答をいう。細胞性免疫の１つの重要な態様は、細胞溶解性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ）（「ＣＴＬ」）による抗原に特異的な応答を伴う。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）にコードされるタンパク質と結びついて提示され、細胞の表面上で発現されるペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内の微生物の破壊の誘導および促進、またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を助ける。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原に特異的な応答を伴う。ヘルパーＴ細胞は、それらの表面上にＭＨＣ分子と結びついたペプチド抗原を提示している細胞に対する非特異的なエフェクター細胞の機能を刺激すること、およびその活性の焦点を合わせることを助けるように作用する。「細胞性免疫応答」とは、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含めた、活性化されたＴ細胞および／または他の白血球によって生成される、サイトカイン、ケモカインおよび他のそのような分子の生成もいう。
【００４２】
細胞性免疫応答を惹起する免疫原性組成物またはワクチンは、脊椎動物の被験体を、細胞表面において抗原をＭＨＣ分子と結びつけて提示させることによって感作するために役立ち得る。細胞媒介性免疫応答は、それらの表面に抗原を提示している細胞、またはその近傍に向けられる。さらに、抗原に特異的なＴ−リンパ球を生じさせて、免疫化された宿主の将来の防御を可能にすることができる。
【００４３】
特定の抗原の、細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、いくつものアッセイ、例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによって、または、感作された被験体において抗原に特異的なＴ−リンパ球をアッセイすることによって決定することができる。そのようなアッセイは当技術分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３年）１５１巻：４１８９〜４１９９頁；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４年）２４巻：２３６９〜２３７６頁を参照されたい。細胞媒介性免疫応答を測定する最近の方法は、細胞内のサイトカインまたはＴ細胞集団によるサイトカインの分泌を測定することを含む、または、エピトープに特異的なＴ細胞を測定することによる（例えば、四量体技法によって）（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，  Ａ．  Ｊ．、およびＯ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，  Ｃ．  Ａ．、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８７巻（９号）１３６７〜１３７１頁、１９９８年；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｍ．  Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １５０巻：５〜２１頁、１９９６年；Ｌａｌｖａｎ，  Ａ．ら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８６巻：８５９〜８６５頁、１９９７年により概説されている）。
【００４４】
よって、免疫学的応答とは、本明細書で使用される場合、抗体の生成（例えば、細菌毒素、および細胞に進入して複製するウイルスなどの病原体を、毒素および病原体に結合することによって遮断し、典型的に、細胞を感染および破壊から保護する中和性抗体）を刺激するものであってよい。目的の抗原は、ＣＴＬの生成も惹起することができる。よって、免疫学的応答としては、以下の効果の１または複数を挙げることができる：Ｂ細胞による抗体の生成；ならびに／または、目的の組成物またはワクチンに存在する１または複数の抗原を特異的に向けさせるサプレッサーＴ細胞および／または記憶／エフェクターＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和するため、および／または抗体−補体、または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫化された宿主に防御をもたらすために役立ち得る。そのような応答は、当技術分野で周知の標準の免疫測定法および中和アッセイを使用して決定することができる（例えば、Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉら（１９８８年）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２６巻：２３１〜２３５頁；Ｄｒｅｙｅｒら（１９９９年）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（１９９９年）１５巻（１７号）：１５６３〜１５７１頁を参照されたい）。哺乳動物の先天性免疫系は、病原性生物の分子上の特徴も、免疫細胞上のＴｏｌｌ様受容体および同様の受容体分子を活性化することによって認識し、それに応答する。先天性免疫系が活性化されると、種々の非適応性の免疫応答細胞が活性化されて、例えば、種々のサイトカイン、リンフォカインおよびケモカインが生成される。先天性免疫応答によって活性化される細胞としては、単球（ｍｏｎｃｙｔｅ）および形質細胞様（ｐｌａｍａｓａｃｙｔｏｉｄ）系列（ＭＤＣ、ＰＤＣ）の未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞、ならびにガンマ、デルタ、アルファおよびベータＴ細胞およびＢ細胞などが挙げられる。よって、本発明は、先天性応答と適応応答の両方を伴う免疫応答も意図している。
【００４５】
「免疫原性組成物」は、組成物を被験体に投与することにより被験体において目的の抗原性分子に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答が発生する場合の、抗原性分子を含む組成物である。
【００４６】
用語「免疫原性」タンパク質またはポリペプチドは、上記の通り免疫学的応答を惹起するアミノ酸配列をいう。「免疫原性」タンパク質またはポリペプチドは、本明細書で使用される場合、前駆体および成熟形態、その類似体、またはその免疫原性フラグメントを含めた、問題のタンパク質の全長の天然配列または組換え配列を包含する。
【００４７】
上で定義されたパルボウイルスのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、パルボウイルスに由来する分子であり、それぞれ、これらに限定することなく、パルボウイルスの種々の分離株の任意のものを含む。分子は、問題の特定の分離株に物理的に由来する必要はないが、合成的にまたは組換えによって生成することができる。
【００４８】
具体的には、パルボウイルスＢ１９のゲノムは、３つのオープンリーディングフレームを含有する：７７ｋＤａの非構造タンパク質であるＮＳ１は、ヌクレオチド４３６〜２４５１にコードされ；副次的な構造タンパク質であるＶＰ１は、ヌクレオチド２４４４〜４７８７にコードされ、主要な構造タンパク質であるＶＰ２は、ヌクレオチド３１２５〜４７８７にコードされる（Ｃｏｒｃｏｒａｎら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂ．、２００４年）。パルボウイルスＢ１９は、構造遺伝子および非構造遺伝子を示差的に発現させることができる単一のプロモーター、ｐ６を用いる（Ｂｌｕｎｄｅｌｌら、１９８７年、Ｏｚａｗａら、１９８７年）。前述の番号付けは、パルボウイルスＢ１９のゲノムのヌクレオチド配列に対するものであるが、パルボウイルスの他の遺伝子型および分離株から得られた配列における対応する位置も、本発明に含有されるものと理解されるべきである。ＶＰ１またはＶＰ２をコードする核酸のうちのいずれか１つ、ならびにその改変体、例えば、その免疫原性フラグメントなど、ならびにそのような核酸にコードされるポリペプチドを、本発明の実施において用いることができる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「副次的な構造タンパク質」または「副次的な構造ポリペプチド」または「副次的なカプシドタンパク質」または「副次的なカプシドポリペプチド」または「ＶＰ１」は、パルボウイルスに関しては、パルボウイルスのＯＲＦ２にコードされるポリペプチドと相同または同一である配列を含むポリペプチドをいい、それらに対して少なくとも約８０〜１００％、これらの範囲内の任意の％同一性、例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列同一性などを含めた配列同一性を示す配列を含む。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「主要な構造タンパク質」または「主要な構造ポリペプチド」または「主要なカプシドタンパク質」または「主要なカプシドポリペプチド」または「ＶＰ２」は、パルボウイルスに関しては、パルボウイルスのＯＲＦ３にコードされるポリペプチドと相同または同一である配列を含むポリペプチドをいい、それらに対して少なくとも約８０〜１００％、これらの範囲内の任意の％同一性、例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列同一性などを含めた配列同一性を示す配列を含む。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、ウイルスカプシドを含有するが、ウイルスのゲノムの全部または一部、具体的には、ウイルスのゲノムの複製成分を欠く非複製的な、非感染性のウイルスの殻をいう。ＶＬＰは、一般に、１または複数のウイルスタンパク質、例えば、これらに限定されないが、カプシド、外被、殻、表面、構造タンパク質と称されるタンパク質など（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２）で構成される。パルボウイルス・ＶＬＰは、適切な発現系においてＶＰ２を組換え発現させると、自発的に形成され得る。特定のＶＬＰを生成するための方法は当技術分野で公知であり、以下により詳細に考察されている。ウイルスタンパク質を組換え発現させた後のＶＬＰの存在は、当技術分野で公知の従来の技法、例えば、電子顕微鏡法、生物物理学的な特徴付けなどを使用して検出することができる。例えば、ＶＬＰは、密度勾配遠心分離によって単離することができ、かつ／または、特徴的な密度バンド形成（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｂａｎｄｉｎｇ）によって同定することができる。あるいは、問題のＶＬＰ調製物のガラス化した水性試料において低温電子顕微鏡法を実施し、適切な曝露条件下で画像を記録することができる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「生物学的試料」は、これらに限定されないが、例えば、血液、血漿、血清、排泄物（ｆｅｃａｌ  ｍａｔｔｅｒ）、尿、骨髄、胆汁、脊髄液、リンパ液、皮膚試料、皮膚、呼吸器、腸、および泌尿生殖器の外分泌物、涙、唾液、乳、血球、器官、生検材料を含めた、被験体から単離された組織または流体の試料、ならびに、これらに限定されないが、細胞および組織、例えば組換え細胞、および細胞成分を培地中で成長させることによって生じる馴化培地を含めた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物の構成成分の試料をいう。具体的には、パルボウイルスは、生物学的試料、例えば、ウイルスに感染した個体由来のエアロゾルまたは呼吸器分泌物または血液などから得ることができる。
【００５３】
「被験体」は、これらに限定することなく、チンパンジーなどの非ヒト霊長類および他の類人猿およびサル種を含めたヒトおよび他の霊長類；農場動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなど；家庭内哺乳動物、例えば、イヌおよびネコなど；げっ歯類、例えば、マウス、ラットおよびモルモットなどを含めた実験動物；家禽、野鳥および猟鳥、例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽の鳥類、アヒル、ガチョウなどを含めた鳥類などを含めた、脊索動物亜門の任意のメンバーを意味する。この用語は、特定の年齢を示さない。よって、成体個体および新生仔個体のどちらも包含されるものとする。
【００５４】
「治療有効量」は、免疫原性組成物に関しては、抗体を生成させるため、またはパルボウイルス感染を処置もしくは予防するためのいずれかの免疫学的応答を誘導するであろう免疫原（例えば、免疫原性ポリペプチド、融合タンパク質、ポリタンパク質、ＶＬＰ、または抗原をコードする核酸）の量を意味する。そのような応答は、一般に、被験体において、組成物に対する抗体媒介性免疫応答および／または分泌性免疫応答もしくは細胞性免疫応答の発生をもたらすであろう。通常、そのような応答は、これらに限定されないが、以下の効果の１または複数を含む；免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＭなどの任意の免疫学的クラス由来の抗体の生成；Ｂリンパ球およびＴリンパ球の増殖；免疫学的な細胞（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｅｌｌ）に対する活性化シグナル、増殖シグナルおよび分化シグナルをもたらすこと；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞および／またはγσＴ細胞集団の増大。
【００５５】
本発明の目的のために、アジュバントの「有効量」は、共投与された（ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）抗原または抗原をコードする核酸に対する免疫学的応答を増強する量となる。
【００５６】
本明細書で使用される「処置」は、（ｉ）伝統的なワクチンの場合と同様に感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の低減または排除、および（ｉｉｉ）問題の病原体の実質的な排除または完全な排除、のいずれかをいう。処置は、予防的に（感染する前に）、または治療的に（感染した後に）実施することができる。
【００５７】
発明を実施するための形態
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、それ自体が当然変動し得る、特に例示されている分子またはプロセスのパラメータに限定されないことが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、単に本発明の特定の実施形態を説明するためのものであり、限定的なものではないことも理解されるべきである。さらに、本発明の実施は、別段の指定のない限り、その全てが当技術分野の通常の技術の範囲内である、ウイルス学、微生物学、分子生物学、組換えＤＮＡ技法および免疫学の従来の方法を用いるであろう。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２０００年）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ＆ＩＩ巻（Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；およびＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４版、２００１年（Ｂ．  Ｎ．  ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．  Ｍ．  Ｋｎｉｐｅ編）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．  Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ａ．  Ｌ．  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．、ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．  ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．  Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）を参照されたい。本明細書に記載のものと同様または同等であるいくつもの方法および材料を本発明の実施において用いることができるが、本明細書には、好ましい材料および方法が記載されている。さらに、本明細書において引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、上記のものであろうが下記のものであろうが、これによってそれらの全体が参照により組み込まれる。
【００５８】
Ａ．核酸
本発明は、パルボウイルスＶＰ１およびパルボウイルスＶＰ２をコードする組換え核酸分子に関する。コードされるＶＰ１およびＶＰ２は、任意の所望のパルボウイルス、または任意の所望の組み合わせ由来であってよい。コードされるＶＰ１およびＶＰ２は、ヒトに感染するパルボウイルス、すなわち、デペンドウイルス属、エリスロウイルス属、またはボカウイルス属のパルボウイルス由来であることが好ましい。パルボウイルスは、パルボウイルスＢ１９であることが最も好ましい。一部の態様では、ＶＰ１をコードする配列およびＶＰ２をコードする配列、ならびにそれらのそれぞれの制御エレメントは、別々の核酸分子、例えば、別々のベクター上にある。ＶＰ１をコードする配列およびＶＰ２をコードする配列、ならびにそれらのそれぞれの制御エレメントは、単一の核酸分子、例えば、バイシストロン性ベクターなどの成分であることが好ましい。
【００５９】
パルボウイルスのＶＰ１タンパク質およびＶＰ２タンパク質は、天然に存在するタンパク質、例えば、パルボウイルスＢ１９の天然に存在するＶＰ１のアミノ酸配列などと同じ、または実質的に同じアミノ酸配列を有してよい。所望に応じて、いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、天然に存在する配列と、１または複数のアミノ酸の置換、付加および／または欠失により異なってよい。ＶＰ１またはＶＰ２におけるアミノ酸残基の約１０％未満または約５％未満が置換されている、付加されている、または欠失していることが好ましい。ＶＰ１タンパク質またはＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列は、天然に存在するパルボウイルスのＶＰ１タンパク質またはＶＰ２タンパク質と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であることが好ましい。アミノ酸配列の変動は、一般に、ＶＰ１タンパク質またはＶＰ２タンパク質の間で保存されておらず、よって、タンパク質の、ＶＬＰを形成する能力に干渉しない領域において許容される。所望に応じて、変異（例えば、アミノ酸の置換、付加または欠失）を導入して、ある特定の機能を変化させることができ、例えば、ＶＰ１を変異させて、そのホスホリパーゼ活性を不活化することができる。例えば、ＶＰ１のアミノ酸配列は、点変異（例えば、Ｈｉｓ１５３Ａｌａ）、またはＷＯ０６／０３２６９７、ＥＰ１７９１８５８またはＵＳ２００７０２８６８７０に記載の任意の変異を含有してよい。
【００６０】
本発明の組換え核酸は、ＶＰ１およびＶＰ２の転写および／または翻訳の独立した調節をもたらし、したがって、ＶＰ１をコードする配列とＶＰ２をコードする配列が適切な宿主細胞内に同量存在する場合、ＶＰ１が、ＶＰ２に対して低いアバンダンスで発現される。可溶性のＶＰ１が可溶性のＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成されることが好ましい。いくつかの実施形態において、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列において使用されるコドンおよびＶＰ２をコードするヌクレオチド配列において使用されるコドンは、ＶＰ１をコードする配列とＶＰ２をコードする配列が適切な宿主細胞内に同量存在する場合、ＶＰ１が、ＶＰ２に対して低いアバンダンスで発現されるように選択される。可溶性のＶＰ１が可溶性のＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成されることが好ましい。これは、例えば、ＶＰ２をコードする、コドン最適化されたヌクレオチド配列、および、ＶＰ１をコードする、コドン最適化されていないまたは脱コドン最適化（ｃｏｄｏｎ  ｄｅｏｐｔｉｍｉｚｅ）されたヌクレオチド配列を用いて実現することができる。
【００６１】
他の実施形態において、ＶＰ１をコードする配列とＶＰ２をコードする配列が適切な宿主細胞内に同量存在する場合、ＶＰ１が、ＶＰ２に対して低いアバンダンスで発現されるように、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列およびＶＰ２をコードするヌクレオチド配列を異なる制御エレメントに作動可能に連結する。可溶性のＶＰ１が可溶性のＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成されることが好ましい。ＶＰ１およびＶＰ２の発現のための制御エレメントは、ＶＰ１をコードする配列とＶＰ２をコードする配列が所望の宿主細胞内に同量存在する場合、ＶＰ１が、所望の宿主細胞によって、ＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成されるように選択される。これは、一般に、ＶＰ１およびＶＰ２の転写、翻訳、または転写および翻訳に影響を及ぼす制御エレメントを使用して実現される。例えば、ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列は、強力なプロモーターに作動可能に連結していてよく、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列は、弱いプロモーターに作動可能に連結していてよい。使用するプロモーターは、ＶＰ１の発現とＶＰ２の発現を独立して調節することを可能にする任意のプロモーターであってよい。酵母において発現させるための例示的な強力なプロモーターは、ｐＢＳ２４．１に組み込まれたＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターである（図１）。酵母において発現させるための例示的な弱いプロモーターは、ＹＰＴＩ構成的活性プロモーターである。Ｓｅａｒｓら、Ｙｅａｓｔ  １４巻：７８３〜７９０頁（１９９８年）を参照されたい。酵母または他の宿主細胞において用いるための他の適切な強力なプロモーターおよび弱いプロモーターは当技術分野で公知である。例えば、哺乳動物細胞において発現させるための強力なプロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。細菌において発現させるための例示的な強力なプロモーターは、ｒｅｃＡプロモーターである。細菌において発現させるための例示的な弱いプロモーターは、ａｒａＢＡＤプロモーターである。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列は、所望の宿主細胞において発現させるのに適したプロモーターに作動可能に連結しており、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列は、そのプロモーターの改変体、例えば、発現脱最適化（ｄｅｏｐｔｉｍｉｚｅ）された改変体などに作動可能に連結している。改変体プロモーターは、ＶＰ１の発現をＶＰ２と比較して低下させる（例えば、可溶性のＶＰ１を可溶性のＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成させる）ために、親プロモーターに対してさまざまな方式で修飾することができる。例えば、改変体プロモーターは、ＶＰ１をコードする核酸の上流の転写エレメントの配列の変更、またはＶＰ１をコードする核酸の上流の転写エレメントの一部の欠失、例えば、ＶＰ１をコードする核酸の上流の１または複数の転写開始部位の導入による、ＶＰ１をコードする核酸の上流の１または複数の転写終止部位の導入による、またはそれらの任意の組み合わせによるＴＡＴＡボックスまたは接合部位の全部または一部の変更または欠失などによって修飾することができる。これらのプロモーターの機能性部分は、当技術分野で周知であり、任意の所望のプロモーターにおいて容易に同定し、修飾することができる。組換え核酸は、所望に応じて、ＶＰ１をコードする配列とＶＰ２をコードする配列が所望の宿主細胞内に同量存在する場合、ＶＰ１が、所望の宿主細胞によって、ＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成されるように、他の調節エレメント、例えば、エンハンサー結合部位、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、誘導性プロモーター、抑制因子、ＲＮＡの安定性に影響を及ぼすエレメント、ｓｉＲＮＡ、スプライス部位など、ならびにそれらの欠失および変更を含有してよい。
【００６３】
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターに作動可能に連結している、ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列（図６、配列番号１９）、およびＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターの改変体に作動可能に連結している、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列を含有し、それにより、ＶＰ１の発現がＶＰ２と比較して減少する（例えば、可溶性のＶＰ１が可溶性のＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成される）。本発明において用いるのに適した改変体ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターの例としては、プロモーターの１または複数の部分（例えば、約１ｎｔ〜約２０ｎｔの部分）が天然のパルボウイルス配列の部分と交換されている改変体、例えば、「デルタＡｓ」改変体など（図７、配列番号２０）、ＴＡＴＡボックスの全部または一部が欠失または変化している改変体、例えば、ＴＡＴＡ欠失改変体など（図８、配列番号２１）、１または複数の転写開始配列および／または転写終止配列を含有する改変体、例えば、１ＳＳ改変体など（図９、配列番号２２）、およびこれらの修飾の任意の組み合わせを含有するプロモーターが挙げられる。他の実施形態において、ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列を所望の宿主細胞において発現させるためにコドン最適化し、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列は所望の宿主細胞において発現させるためのコドン最適化をしない、または例えば、好ましいコドンではないコドンを用いることによって脱コドン最適化（ｃｏｄｏｎ  ｄｅｏｐｔｉｍｉｚｅ）する。
【００６４】
ＶＰ１およびＶＰ２の発現を制御する発現制御エレメントは、任意の所望のＶＰ１：ＶＰ２の発現比率（％：％）、例えば、約４９：５１、約４０：６０、約３０：７０、約２５：７５、約２０：８０、約１５：８５、約１０：９０、約９：９１、約８：９２、約７：９３、約６：９４、約５：９５、約４：９６、約３：９７、約２：９８、約１：９９、約２：９８〜約２０：８０、約５：９５〜約２０：８０、約５：９５〜約１５：８５、または約７：９３〜約１２：８８などが生成するように選択してよい。発現比率は、可溶性のＶＰ１：可溶性のＶＰ２の比率であることが好ましい。
【００６５】
いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、ＶＰ１の発現がＶＰ２の発現に対して低くなることにより、ＶＰ１に媒介されるＶＰ２の発現、集合および／または安定性の抑制が低下し、その結果、ＶＰ１およびＶＰ２を含有するＶＬＰのより効率的な生成およびより高い収率がもたらされると考えられている。
【００６６】
パルボウイルスタンパク質をコードする核酸は、任意の適切な方法を用いて構築することができ（例えば、化学合成によって、組換えＤＮＡ技術を用いて）、また、種々の形態をとってよい（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクターなど）。組換え構築物を生成するための多くの適切な方法が当技術分野では周知であり、慣例的である。例えば、組換え核酸は、ＶＰ１タンパク質もしくはＶＰ２タンパク質の部分をコードする配列を含む２以上のオリゴヌクレオチドから、または標準の分子生物学技法を用いてオリゴヌクレオチドをライゲーションして全長のＶＰ１タンパク質もしくはＶＰ２タンパク質をコードする配列を形成することによって生成することができる。例えば、米国特許第６，６３２，６０１号および米国特許第６，６３０，２９８号を参照されたい。核酸は、実質的に純粋な形態で調製されることが好ましい（すなわち、他の宿主細胞または非宿主細胞の核酸を実質的に含まない）。
【００６７】
目的のＶＰ１タンパク質および／またはＶＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、感染した個体由来の呼吸器分泌物または血液中に存在するウイルスＲＮＡに由来するゲノムライブラリーから単離することができる。あるいは、パルボウイルスの核酸は、感染したヒトまたは他の哺乳動物から、または感染した個体から収集した呼吸器分泌物もしくは血液から単離することができる。ＰＣＲなどの増幅方法を使用して、パルボウイルスのゲノムＲＮＡまたはパルボウイルスをコードするｃＤＮＡのいずれかからポリヌクレオチドを増幅することができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、化学的に合成することができる。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列に対する適切なコドンを用いて設計することができる。合成構築物は、ＶＰ２タンパク質またはＶＰ１／ＶＰ２タンパク質が生成される目的の宿主細胞において発現させるために最適化されたコドンを含有することが好ましい。目的のポリヌクレオチドの完全な配列は、標準の方法によって調製した重複しているオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、完全なコード配列に組み立てることができる。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１年）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２巻：７５６頁；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３巻：１２９９頁；Ｊａｙら（１９８４年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５９巻：６３１１頁；Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９５年）Ｇｅｎｅ  １６４巻：４９〜５３頁を参照されたい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡであってよい。ポリヌクレオチドは、タンパク質および脂質などの他の成分がなく単離されることが好ましい。
【００６８】
あるいは、特定のヌクレオチド配列は、所望の配列を有するベクターから得ることができる、または、当技術分野で公知の種々のオリゴヌクレオチド合成技法、例えば、部位特異的変異誘発および適切な場合にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法などを用いて完全にまたは部分的に合成することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい。具体的には、所望のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を得る１つの方法は、重複している合成オリゴヌクレオチドの相補的なセットをアニーリングし、次いで適切なＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、ライゲーションされたヌクレオチド配列をＰＣＲによって増幅することによる。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８巻：４０８４〜４０８８頁を参照されたい。さらに、オリゴヌクレオチド特異的合成（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ  ５４巻：７５〜８２頁）、既存のヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻：３２３〜３２７頁およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９巻：１５３４〜１５３６頁）、およびギャップ形成された（ｇａｐｐｅｄ）オリゴヌクレオチドの、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いた酵素的穴埋め（Ｑｕｅｅｎら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：１００２９〜１００３３頁）を用いることができる。
【００６９】
ＶＰ１タンパク質および／またはＶＰ２タンパク質をコードする組換え構築物は、発現ベクターなどの適切なベクターにおいて、従来の方法を使用して調製することができる。好ましい組換え構築物、例えば、発現ベクターなどは、パルボウイルスＶＰ１タンパク質をコードする核酸配列およびパルボウイルスＶＰ２タンパク質をコードする核酸配列を含む。組換え構築物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの組み合わせの形態であってよく、また、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。例えば、構築物は、プラスミド、直鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ｍＲＮＡ、自己複製するＲＮＡ（例えば、アルファウイルスベースのレプリコン）などの形態であってよい。
【００７０】
所望の宿主細胞において組換えタンパク質を発現させるためのいくつもの適切なベクターが当技術分野では周知であり、慣例的である。適切なベクターは、これらに限定されないが、以下の１または複数を含めたいくつもの成分を含有してよい：複製開始点；選択マーカー遺伝子；１もしくは複数の発現制御エレメント、例えば、転写性の制御エレメントなど（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、および／または１もしくは複数の翻訳シグナル；ならびに選択された宿主細胞（例えば、哺乳動物起源の宿主細胞または異種哺乳動物もしくは非哺乳動物種由来の宿主細胞）の分泌経路にターゲティングするためのシグナル配列またはリーダー配列。例えば、昆虫細胞における発現のために、適切なバキュロウイルス発現ベクター、例えば、ｐＦａｓｔＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを使用して、組換えバキュロウイルス粒子を生成することができる。バキュロウイルス粒子を増幅し、昆虫細胞に感染させるために使用して、組換えタンパク質を発現させる。哺乳動物細胞における発現のために、所望の哺乳動物の宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）において構築物の発現を駆動するベクターを用いる。同様に、酵母における発現のために、所望の酵母宿主細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において発現を駆動するベクターを用いる。
【００７１】
ウイルスベクターは、真核細胞において本発明のＶＬＰ、例えば、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを含めたポックスファミリーのウイルスに由来するものなどのＶＬＰを生成するために用いることができる。さらに、Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．（１９９３年）６７巻：４０１７〜４０２６頁およびＳｅｌｂｙら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．（１９９３年）７４巻：１１０３〜１１１３頁に記載のワクシニアに基づく感染／トランスフェクション系も、本発明における用途がある。この系では、まず、細胞に、バクテリオファージのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換えワクシニアウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染させる。このポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを担持する鋳型のみを転写するという点で優れた特異性を示す。感染させた後に、細胞を、Ｔ７プロモーターによって駆動される目的のＤＮＡを用いてトランスフェクトする。組換えワクシニアウイルス由来の細胞質において発現されたポリメラーゼにより、トランスフェクトされたＤＮＡがＲＮＡに転写され、次いでそれが、宿主の翻訳機構によりタンパク質に翻訳される。あるいは、「前駆体」系の場合と同様に、Ｔ７を精製タンパク質または酵素として加えることができる（ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（１９８６年）１８９巻：１１３〜１３０頁）。この方法により、多量のＲＮＡおよびその翻訳生成物（複数可）が、細胞質内で、高レベルで一過性に生成される。
【００７２】
組換え核酸は、パルボウイルスＢ１９  ＶＰ１タンパク質をコードする第１の核酸配列およびパルボウイルスＢ１９  ＶＰ２タンパク質をコードする第２の核酸配列を含んでよく、各核酸配列は、別々のプロモーターによって制御される。パルボウイルスＢ１９のＶＰ１タンパク質およびＶＰ２タンパク質ならびにそれらのそれぞれの制御配列は、組換え核酸（例えば、プラスミド）において任意の所望の方向または順番で現れてよく、本明細書で使用される場合、言葉「第１の核酸」および「第２の核酸」によって限定されない。
【００７３】
組換え核酸は、パルボウイルスＢ１９  ＶＰ１の発現を、パルボウイルスＢ１９  ＶＰ２と比較して転写的におよび／または翻訳的に減少させる修飾を含むプラスミドであってよい。修飾は、ＴＡＴＡボックスの配列の全部または一部の欠失または変更、パルボウイルスＢ１９  ＶＰ１をコードする核酸の上流の接合部位の配列の欠失または変更、パルボウイルスＢ１９  ＶＰ１をコードする核酸の上流の１または複数の転写開始部位および／もしくは転写終止部位の導入、またはこれらの修飾の任意の組み合わせであってよい。例えば、修飾は、ＴＡＴＡボックスの一部の欠失およびパルボウイルスＢ１９  ＶＰ１をコードする核酸の上流の接合部位の欠失であってよい、または修飾は、パルボウイルスＢ１９  ＶＰ１をコードする核酸の上流の２つ以上の転写開始部位および／または転写終止部位の導入であってよい。
【００７４】
所望に応じて、組換え核酸は、検出可能なマーカーを含んでよいベクターであってよい。例えば、検出可能なマーカーは、１または複数の抗生物質に対する耐性を付与するポリペプチドであってよい。
【００７５】
Ｂ．宿主細胞
本発明は、本明細書に記載の、パルボウイルスＶＰ１およびパルボウイルスＶＰ２をコードする組換え核酸分子を含有する組換え宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列およびＶＰ２をコードするヌクレオチド配列、ならびにそれらのそれぞれの制御エレメントは、別々の核酸分子、例えば、別々のベクター上にある。これらの実施形態において、宿主細胞は、２つの異なる組換え核酸分子を含有する。宿主細胞は、実質的に等量の、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列とＶＰ２をコードするヌクレオチド配列（例えば、実質的に等量の、２つの異なる組換え核酸）を含有することが好ましい。ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列、ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列、ならびにそれらのそれぞれの制御エレメントは、単一の核酸分子、例えば、バイシストロン性ベクターなどの成分であることがより好ましい。これらの実施形態において、宿主細胞は、複数のコピーで存在し得る単一の組換え核酸分子を含有する。
【００７６】
組換え宿主細胞は、本明細書に記載の核酸分子の任意のものを含有してよい。適切な宿主細胞としては、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、昆虫細胞（例えば、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、およびげっ歯類（例えば、ハムスター）、トリの細胞（例えば、ニワトリ、アヒル、およびガチョウ、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種）、テトラヒメナの細胞（例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）またはそれらの組み合わせが挙げられる。適切な酵母株としては、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤ２株、ＪＳＣ３１０株、ＡＤ３株およびＡＤ４株が挙げられる。
【００７７】
多くの適切な昆虫細胞および哺乳動物細胞が当技術分野で周知である。適切な昆虫細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ５細胞、シュナイダーＳ２細胞、およびＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞（親のＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ  ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得たクローン単離株）が挙げられる。適切な哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞、典型的に、せん断されたアデノウイルス５型ＤＮＡにより形質転換される）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、２９３−Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲＣ．６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）、アカゲザル胎仔肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬ−１６０）、メイディン・ダービー・ウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（「ＭＤＣＫ」）細胞（例えば、ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４；またはＭＤＣＫ  ３３０１６、ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞などが挙げられる。適切なトリの細胞としては、例えば、ニワトリ胚性幹細胞（例えば、ＥＢｘ（登録商標）細胞）、ニワトリ胚線維芽細胞、ニワトリ胚性生殖細胞、アヒルの細胞（例えば、ＡＧＥ１．ＣＲ細胞株およびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ細胞株（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ）、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７巻：４９７５〜４９８２頁（２００９年）およびＷＯ２００５／０４２７２８に記載されている）、ＥＢ６６細胞などが挙げられる。
【００７８】
適切な昆虫細胞発現系、例えば、バキュロウイルス系などは、当業者に公知であり、例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７年）に記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、とりわけ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡからキットの形態で市販されている。トリ細胞発現系も当業者に公知であり、例えば、米国特許第５，３４０，７４０号；同第５，６５６，４７９号；同第５，８３０，５１０号；同第６，１１４，１６８号；および同第６，５００，６６８号；欧州特許ＥＰ０７８７１８０Ｂ；欧州特許出願ＥＰ０３２９１８１３．８；ＷＯ０３／０４３４１５；およびＷＯ０３／０７６６０１に記載されている。同様に、酵母、細菌および哺乳動物細胞の発現系も当技術分野で公知であり、例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編、１９８９年）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。
【００７９】
Ｃ．ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成
本発明は、ＶＰ１およびＶＰ２を含有するパルボウイルス・ＶＬＰを生成するためのプロセスを提供する。ＶＬＰは、任意の所望のパルボウイルス由来のＶＰ１およびＶＰ２、または任意の所望の組み合わせを含有してよい。本明細書に記載の通り、ＶＰ１タンパク質およびＶＰ２タンパク質は、天然に存在するパルボウイルスのＶＰ１またはＶＰ２と同じ、または実質的に同じアミノ酸配列を有してよい、あるいは、１もしくは複数のアミノ酸の置換、欠失または付加を含有してよい。例えば、ＶＰ１を変異させて、そのホスホリパーゼ活性を不活化することができる。例えば、ＶＰ１のアミノ酸配列は、点変異（例えば、Ｈｉｓ１５３Ａｌａ）、またはＷＯ０６／０３２６９７、ＥＰ  １７９１８５８もしくはＵＳ２００７０２８６８７０に記載の任意の変異を含有してよい。ＶＰ１およびＶＰ２を含有するＶＬＰは、ヒトに感染するパルボウイルス、すなわち、デペンドウイルス属、エリスロウイルス属、またはボカウイルス属のパルボウイルス由来であることが好ましい。ＶＬＰは、パルボウイルスＢ１９  ＶＰ１およびパルボウイルスＢ１９  ＶＰ２を含有することが最も好ましい。プロセスは、ＶＰ１およびＶＰ２を生成する宿主細胞を、本明細書に記載の通り、組換え核酸にコードされるＶＰ１タンパク質およびＶＰ２タンパク質が生成され、ＶＰ１およびＶＰ２を含有するＶＬＰに集合させる条件下で維持するステップを含む。本発明の方法では、ＶＰ１は、宿主細胞により、ＶＰ２に対して低いアバンダンスで生成される。可溶性のＶＰ１が可溶性のＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成されることが好ましい。場合によって、プロセスは、ＶＬＰを培養培地から、細胞溶解物もしくはホモジネートから、またはそれらの任意の組み合わせから単離または精製するステップをさらに含む。
【００８０】
一部の態様では、方法は、ＶＰ１タンパク質およびＶＰ２タンパク質をコードする組換え核酸を含有する宿主細胞を、ＶＰ１およびＶＰ２が発現され、ＶＰ１およびＶＰ２が自己集合してＶＬＰを形成するのに適した条件下で培養するステップを含む。ＶＬＰの形成に適した条件は周知であり、当業者が容易に決定することができる。例えば、酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および昆虫細胞（ＳＦ９）におけるウイルス粒子の生成について記載している米国特許第７，５２７，８０１号、および、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＶＬＰの生成について記載しているＴａｕｂｅ，  Ｓ．ら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５０巻：１４２５〜１４３１頁（２００５年）を参照されたい。所望に応じて、方法は、パルボウイルス・ＶＬＰを、培養培地、細胞（例えば、細胞溶解物またはホモジネートから）またはそれらの組み合わせから単離または精製するステップをさらに含んでよい。一部の好ましい実施形態において、ＶＬＰを生成するために用いる宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、またはそれらの組み合わせであり、宿主細胞は、ＶＰ２と比較して少ないＶＰ１を生成する。
【００８１】
本明細書に記載の通り、宿主細胞は、ＶＰ１およびＶＰ２をコードする核酸に作動可能に連結している個々の制御エレメントに起因して、ならびに／またはＶＰ１およびＶＰ２をコードする組換え核酸の他の特徴、例えば、最適化されたコドンの使用および脱最適化（ｄｅｏｐｔｉｍｉｚｅ）されたコドンの使用などに起因して、ＶＰ１をＶＰ２と比較して低いアバンダンスで生成する（例えば、可溶性のＶＰ１を可溶性のＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成する）。そのような制御エレメント（例えば、プロモーター）および特徴（例えば、コドンの使用）により、ＶＰ１およびＶＰ２の相対的な生成を制御することが可能になる。ＶＰ１をＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成することを可能にする任意の適切な宿主細胞をこの方法において用いることができる。例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、昆虫細胞（例えば、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、およびげっ歯類（例えば、ハムスター）、トリの細胞（例えば、ニワトリ、アヒル、およびガチョウ）、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種）、テトラヒメナの細胞（例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）またはそれらの組み合わせを用いることができる。小規模培養条件および大規模培養条件を含めた、そのような宿主細胞を維持して組換え核酸の発現を可能にするための適切な方法は当技術分野で公知である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞または昆虫細胞である。より詳細な実施形態において、宿主細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤ２株、ＪＳＣ３１０株、ＡＤ３株、ＡＤ４株またはそれらの組み合わせなどの酵母細胞である。
【００８２】
いくつかの実施形態において、提供される宿主細胞は、ＶＰ１をコードする組換え核酸分子およびＶＰ２をコードする組換え核酸分子の２つの異なる組換え核酸分子を含有する。他の実施形態において、提供される宿主細胞は、ＶＰ１をコードする配列、ＶＰ２をコードする配列、およびそれらのそれぞれの制御エレメントを含む単一の組換え核酸分子（複数のコピーで存在してよい）を含有する。例えば、これらの実施形態において、組換え核酸は、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列が第１の制御配列に作動可能に連結しており、ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列が第２の制御配列に作動可能に連結しているバイシストロン性ベクターであってよい。例えば、ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列は、強力なプロモーターに作動可能に連結していてよく、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列は、弱いプロモーターに作動可能に連結していてよい。酵母において発現させるための例示的な強力なプロモーターは、ｐＢＳ２４．１に組み込まれたＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターである（図１）。酵母において発現させるための例示的な弱いプロモーターは、ＹＰＴＩ構成的活性プロモーターである。Ｓｅａｒｓら、Ｙｅａｓｔ  １４巻：７８３〜７９０頁（１９９８年）を参照されたい。酵母または他の宿主細胞において用いるための他の適切な強力なプロモーターおよび弱いプロモーターは当技術分野で公知である。使用するプロモーターは、ＶＰ１の発現とＶＰ２の発現を独立して調節することを可能にする任意のプロモーターであってよい。
【００８３】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列が、所望の宿主細胞において発現させるのに適したプロモーターに作動可能に連結しており、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列が、そのプロモーターの改変体、例えば、発現脱最適化（ｄｅｏｐｔｉｍｉｚｅ）された改変体などに作動可能に連結している組換え核酸を含有する。改変体プロモーターは、ＶＰ１の発現をＶＰ２と比較して低下させる（例えば、可溶性のＶＰ１を可溶性のＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成する）ために、さまざまな方式で親プロモーターに対して修飾することができる。例えば、改変体プロモーターは、ＶＰ１をコードする核酸の上流の転写エレメントの一部の欠失、例えば、ＴＡＴＡボックス、接合部位の全部または一部の配列の欠失または変更などによって、ＶＰ１をコードする核酸の上流の１または複数の転写開始部位の導入によって、ＶＰ１をコードする核酸の上流の１または複数の転写終止部位の導入によって、それらの任意の組み合わせによって修飾することができる。これらのプロモーターの機能性部分は当技術分野で周知であり、任意の所望のプロモーターにおいて容易に同定し、修飾することができる。組換え核酸は、所望に応じて、ＶＰ１をコードする配列とＶＰ２をコードする配列が所望の宿主細胞内に同量存在する場合、ＶＰ１が、所望の宿主細胞によって、ＶＰ２よりも低いアバンダンスで生成されるように、他の調節エレメント、例えば、エンハンサー結合部位、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位など、ならびにそれらの欠失および変更を含有してよい。
【００８４】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターに作動可能に連結している、ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列（図６、配列番号１９）、およびＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターの改変体に作動可能に連結している、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列を含有する組換え核酸を含み、それにより、ＶＰ１の発現がＶＰ２と比較して減少する。本発明において用いるのに適した改変体ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターの例としては、プロモーターの１または複数の部分（例えば、約１塩基〜約２０塩基の部分）が天然のパルボウイルス配列の部分と交換されている改変体、例えば、「デルタＡｓ」改変体など（図７、配列番号２０）、ＴＡＴＡボックスの全部または一部が欠失または変化している改変体、例えば、ＴＡＴＡ欠失改変体など（図８、配列番号２１）、１または複数の転写開始配列および／または転写終止配列を含有する改変体、例えば、１ＳＳ改変体など（図９、配列番号２２）、およびこれらの修飾の任意の組み合わせを含有するプロモーターが挙げられる。他の実施形態において、宿主細胞は、所望の宿主細胞において発現させるためにコドン最適化された、ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列、および所望の宿主細胞において発現させるためにコドン最適化されていない、または例えば、好ましいコドンではないコドンを用いることによって脱コドン最適化（ｃｏｄｏｎ  ｄｅｏｐｔｉｍｉｚｅ）された、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列を含有する組換え核酸を含む。
【００８５】
提供される宿主細胞は、ＶＰ１およびＶＰ２の発現を制御する発現制御エレメントが、任意の所望のＶＰ１：ＶＰ２の発現比率が生成するように選択された組換え核酸を含有してよい。例えば、宿主細胞は、ＶＰ１およびＶＰ２を、ＶＰ１：ＶＰ２の発現比率（％：％）約４９：５１、約４０：６０、約３０：７０、約２５：７５、約２０：８０、約１５：８５、約１０：９０、約９：９１、約８：９２、約７：９３、約６：９４、約５：９５、約４：９６、約３：９７、約２：９８、約１：９９、約２：９８〜約２０：８０、約５：９５〜約２０：８０、約５：９５〜約１５：８５、または約７：９３〜約１２：８８で生成してよい。発現比率は、可溶性のＶＰ１：可溶性のＶＰ２の比率であることが好ましい。
【００８６】
方法の特定の実施形態において、宿主細胞は、ＶＰ１およびＶＰ２、好ましくはパルボウイルスＢ１９  ＶＰ１およびパルボウイルスＢ１９  ＶＰ２をコードする発現ベクターを含む。例えば、発現ベクターは、ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している調節エレメント、およびＶＰ１をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している、その調節エレメントの改変体を含むプラスミドであってよい。改変体調節エレメントにより、ＶＰ１の発現がＶＰ２と比較して転写的に、翻訳的に、または転写的かつ翻訳的に減少する。改変体調節エレメントは、例えば、ＴＡＴＡボックス配列の一部の変更または欠失、ＶＰ１遺伝子の上流の接合部位の一部の欠失、またはそれらの組み合わせを有してよい。改変体調節エレメントは、その代わりに、またはそれに加えて、１または複数の、ＶＰ１コード配列の上流の転写開始部位／転写終止部位の導入を含有してよい。そのような改変体調節エレメント、および本明細書に記載のその他の改変体調節エレメントにより、効率的なＶＰ１／ＶＰ２・ＶＬＰの生成が可能になる。改変体調節エレメントが、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している場合、改変体調節エレメントは、本明細書に記載の特定の修飾の任意の１または複数を、任意の所望の組み合わせで含有してよい（例えば、ＴＡＴＡボックスの配列の全部または一部の欠失または変更、Ａリッチ接合領域の全部または一部の欠失または変更、ＶＰ１コード配列の上流の１または複数の転写開始部位および／または転写終止部位の導入、およびそれらの任意の組み合わせ）。例えば、ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している改変体調節エレメントは、ｉ）ＴＡＴＡボックスの配列の全部または一部の欠失または変更、およびＡリッチ接合領域の全部または一部の欠失または変更；ｉｉ）ＴＡＴＡボックスの配列の全部または一部の欠失または変更、および１または複数の、ＶＰ１コード配列の上流の転写開始部位および／または転写終止部位の導入；またはｉｉｉ）Ａリッチ接合領域の全部または一部の欠失または変更、および１または複数の、ＶＰ１コード配列の上流の転写開始部位および／または転写終止部位の導入を含んでよい。
【００８７】
一部の態様では、方法は、ＶＬＰを、宿主細胞の培養培地（例えば、馴化培地）、宿主細胞（例えば、細胞溶解物、細胞ホモジネート）またはそれらの組み合わせから単離または精製するステップをさらに含む。ＶＬＰは、宿主細胞の培養培地、すなわち、馴化培養培地から直接単離または精製することが好ましい。しかし、所望に応じて、例えば遠心分離によって宿主細胞を回収することができ、任意の適切な方法を用いて宿主細胞のホモジネートまたは溶解物を形成することができ、そのホモジネートまたは溶解物からＶＬＰを単離することができる。細胞を溶解しても、ＶＬＰを実質的にインタクトなままに保つために用いることができる適切な化学的方法、物理的方法または機械的方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、（Ｅ．  Ｌ．  Ｖ．  ＨａｒｒｉｓおよびＳ．  Ａｎｇａｌ編、１９９０年）に記載されている。
【００８８】
ＶＬＰは、培養培地または宿主細胞、例えば、細胞溶解物またはホモジネートから、任意の適切な方法を用いて単離することができる。ＶＬＰの完全性を維持する適切な方法、例えば、密度勾配遠心分離、例えば、スクロース勾配、ＰＥＧ沈殿、ペレット形成など（例えば、Ｋｉｒｎｂａｕｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．（１９９３年）６７巻：６９２９〜６９３６頁を参照されたい）、ならびにクロマトグラフィー、例えば、イオン交換クロマトグラフおよびゲルろ過クロマトグラフを含めた標準の精製技法を用いることができる。スクロースクッションまたはスクロース勾配での遠心分離は、ＶＬＰを、ＶＰ１およびＶＰ２の単量体またはオリゴマーから、および他の細胞成分から単離するための都合のよい方法である。これらの方法は、単独で、連続的に、またはより大きな精製スキームに組み込んで用いることができる。例えば、スクロースクッションまたはスクロース勾配で精製されたＶＬＰは、その後、所望に応じて、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ろ過の技法または任意の他の適切な方法を用いてさらに精製することができる。
【００８９】
一実施形態において、本発明は、パルボウイルス・ＶＬＰを宿主細胞から単離する方法であって、宿主細胞の溶解物またはホモジネートを調製するステップと；任意の適切な方法を用いて宿主細胞の溶解物またはホモジネートから前記ＶＬＰを分離するステップと；前記ＶＬＰをさらに精製するステップとを含む方法を提供する。本発明のこの態様によるＶＬＰの精製は、例えば、スクロース勾配によって精製することを含んでよい。
【００９０】
本発明は、さらに、本明細書に記載の方法を用いて作製したＶＬＰを提供する。いくつかの実施形態において、方法は、ＶＰ１タンパク質およびＶＰ２タンパク質をコードする組換え核酸を含有する宿主細胞を、ＶＰ１およびＶＰ２が発現され、ＶＰ１およびＶＰ２が自己集合してＶＬＰを形成するのに適した条件下で培養するステップを含む。所望に応じて、方法は、ＶＬＰを、宿主細胞の培養培地（例えば、馴化培地）、宿主細胞（例えば、細胞溶解物、細胞ホモジネート）またはそれらの組み合わせから単離または精製するステップをさらに含んでよい。
【００９１】
Ｄ．免疫原性組成物
本発明は、本明細書に記載の方法によって生成されるＶＰ１およびＶＰ２を含有するパルボウイルス・ＶＬＰを含む免疫原性組成物、および本明細書に記載のパルボウイルスのＶＰ１およびＶＰ２をコードする組換え核酸を含有する免疫原性組成物も提供する。
【００９２】
免疫原性組成物は、単一の型のＶＬＰ、または２種以上の異なるＶＬＰ、および所望に応じて１または複数の追加的な抗原の混合物を含んでよい。抗原は、例えば、予防的な（すなわち、感染を予防するための）免疫原性組成物または治療的な（感染を処置するための）免疫原性組成物中で、個別に、または組み合わせて投与することができる。免疫原性組成物は、所望の効果を実現するために、２回以上与えてよい（例えば、「初回刺激（ｐｒｉｍｅ）」投与、その後の１または複数の「追加刺激（ｂｏｏｓｔ）」）。同じ組成物を、１または複数の初回刺激ステップおよび１または複数の追加刺激ステップで投与してよい。あるいは、初回刺激および追加刺激のために異なる組成物を用いてよい。例えば、核酸組成物を初回刺激のために投与してよく、ＶＬＰ組成物を追加刺激のために追加してよい、またはその逆もまた同様である。
【００９３】
パルボウイルスのＶＰ１およびＶＰ２をコードする組換え核酸を含有する免疫原性組成物において、組換え核酸は、本明細書に記載の任意の組換え核酸、例えば、直鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、自己複製するＲＮＡなどであってよい。所望に応じて、核酸は、ヌクレアーゼ分解に対する安定性および／または抵抗性を改善するために１または複数の修飾塩基を含有してよい。所望に応じて、免疫原性核酸は、細胞による核酸の取り込みを容易にするため、および／またはヌクレアーゼ分解を低下させるために、１または複数の成分、例えば、カチオン性の微小粒子またはナノ粒子、カチオン性脂質なども含んでよい。
【００９４】
免疫原性組成物は、一般に、１または複数の「薬学的に許容される賦形剤またはビヒクル」、例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどを、単独で、または組み合わせて含む。免疫原性組成物は、典型的に、上記の成分に加えて、１または複数の「薬学的に許容されるキャリア」を含む。これらとしては、それ自体は、組成物を受容する個体に有害な抗体の生成を誘導しない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、典型的に、大型の、ゆっくりと代謝される高分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸共重合体、および脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソームなど）などである。そのようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、補助的な物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが存在してよい。薬学的に許容される成分の徹底的な考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００年）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．第２０版、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において入手可能である。
【００９５】
薬学的に許容される塩、例えば、無機塩類、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩など、ならびに有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩なども、本発明の免疫原性組成物において用いることができる。
【００９６】
所望に応じて、抗原は、リポソームおよび粒子キャリア、例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチドｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）の微小粒子またはナノ粒子などに吸着させる、その中に閉じ込める、またはその他の方法でそれと結びつけることができる。抗原は、免疫原性を増強するために、キャリアタンパク質に結合体化することができる。Ｒａｍｓａｙら（２００１年）Ｌａｎｃｅｔ  ３５７巻（９２５１号）：１９５〜１９６頁；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ（１９９９年）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７  Ｓｕｐｐｌ  ２巻：Ｓ２８〜３６頁；Ｂｕｔｔｅｒｙ  ＆  Ｍｏｘｏｎ（２０００年）Ｊ  Ｒ  Ｃｏｌｌ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｌｏｎｄ  ３４巻：１６３〜１６８頁；Ａｈｍａｄ  ＆  Ｃｈａｐｎｉｃｋ（１９９９年）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  １３巻：１１３〜１３３頁、ｖｉｉ；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ（１９９８年）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４７巻：５６３〜５６７頁；欧州特許第０４７７５０８号；米国特許第５，３０６，４９２；ＷＯ９８／４２７２１；Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｃｒｕｓｅら編）ＩＳＢＮ  ３８０５５４９３２６、特に１０巻：４８〜１１４頁；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ＩＳＢＮ：０１２３４２３３６８または０１２３４２３３５Ｘを参照されたい。
【００９７】
本発明の免疫原性組成物は、他の免疫調節剤と併せて投与することができる。例えば、本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含んでよい。好ましいアジュバントとしては、これらに限定されないが、下記のアジュバントの以下の１または複数の型が挙げられる。本発明の免疫原性組成物は、投与する前にアジュバントと予め混合することもできる。
【００９８】
一実施形態において、免疫原性組成物は、パルボウイルスＢ１９・ＶＬＰ（例えば、１ｍｌ当たりタンパク質０．０５μｇ、０．５μｇ、５μｇ）およびＭＦ５９Ｃ．１アジュバントを含み、最終的な体積の５０％がＭＦ５９Ｃ．１アジュバントである。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、０．８ｍｇ／ｍｌのパルボウイルスＢ１９・ＶＬＰおよびアジュバントとしてＭＦ５９Ｃ．１を、最終的な体積１：１で含む。
【００９９】
ミョウバン
一実施形態において、本発明において用いるためのアジュバントは、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２））、またはミョウバン誘導体、例えば、リン酸緩衝液中の抗原をミョウバンと混合し、次いで、水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウムなどの塩基を用いて滴定し、沈殿させることによってｉｎ−ｓｉｔｕで形成されるミョウバン誘導体などである。
【０１００】
レチノイン酸
一実施形態において、本発明において用いるためのアジュバントは、ビタミンＡの酸化形態であり、部分的なビタミンＡ機能のみを持つレチノイン酸である。
【０１０１】
ＭＦ５９Ｃ．１
一実施形態において、本発明において用いるためのアジュバントは、クエン酸緩衝液中の水中油エマルジョン（スクアレン）であるＭＦ５９Ｃ．１である。ＭＦ５９Ｃ．１は、有効なアジュバントであり、パルボウイルスＢ１９に対する高い力価の中和性抗体の生成を増強することが示されている（Ｂａｌｌｏｕら、ＪＩＤ、１８７巻：６７５〜６７８頁（２００３年））。
【０１０２】
鉱質を含有する組成物
本発明においてアジュバントとして用いるのに適した、鉱質を含有する組成物としては、無機塩、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩などが挙げられる。本発明は、無機塩、例えば、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩などを包含する［例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．．．（１９９５年）Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍの第８章および９章を参照されたい］、または、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）を取り、吸着が好ましい化合物と、異なる鉱質化合物との混合物を包含する。鉱質を含有する組成物は、金属塩の粒子として処方することもできる。
【０１０３】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶である。式ＡｌＯ（ＯＨ）で表すことができるオキシ水酸化アルミニウムは、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のようなその他のアルミニウム化合物から、赤外（ＩＲ）分光法により、特に１０７０ｃｍ−１での吸収バンドおよび３０９０〜３１００ｃｍ−１での強いショルダーの存在により区別できる［Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ…  （１９９５）  ｅｄｓ．  Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ．  ＩＳＢＮ：  ０３０６４４８６７Ｘ．  Ｐｌｅｎｕｍ．の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、半分の高さでの回折バンドの幅（ｗｉｄｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｂａｎｄ  ａｔ  ｈａｌｆ  ｈｅｉｇｈｔ）（ＷＨＨ）により反映され、結晶性が乏しい粒子は、より小さい晶子サイズのために、より大きな線の広がりを示す。表面積は、ＷＨＨが増加するにつれて増加し、より高いＷＨＨの値を有するアジュバントは、抗原吸着のための能力がより大きいことが観察されている。繊維状の形態（例えば透過型電子顕微鏡写真で観察されるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的に約１１であり、すなわちアジュバント自体は生理的ｐＨにて正の表面電荷を有する。ｐＨ７．４にてＡｌ＋＋＋１ｍｇあたり１．８〜２．６ｍｇのタンパク質の吸着能力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【０１０４】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、少量の硫酸塩も頻繁に含有しているヒドロキシリン酸アルミニウムである（すなわち、アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェート（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｕｌｆａｔｅ））。これらは、沈殿により得ることができ、沈殿の間の反応条件および濃度は、塩中のヒドロキシルのホスフェートによる置換の程度に影響する。ヒドロキシリン酸塩は、通常、ＰＯ４／Ａｌモル比が０．３〜１．２である。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在により厳密なＡｌＰＯ４から区別できる。例えば、３１６４ｃｍ−１（例えば２００℃に加熱時）でのＩＲスペクトルのバンドは、構造上のヒドロキシルの存在を示す［Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ…  （１９９５）  ｅｄｓ．  Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ．  ＩＳＢＮ：  ０３０６４４８６７Ｘ．  Ｐｌｅｎｕｍ．の第９章］。
【０１０５】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、通常、０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、より好ましくは０．９５±０．１である。リン酸アルミニウムは、特にヒドロキシリン酸塩について、一般的に、非晶質である。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍｌで含まれる。リン酸アルミニウムは、一般的に、粒子状である（例えば透過型電子顕微鏡写真で観察されるような板状の形態）。この粒子の典型的な直径は、任意の抗原を吸着した後に０．５〜２０μｍ（例えば約５〜１０μｍ）の範囲である。ｐＨ７．４にてＡｌ＋＋＋１ｍｇあたり０．７〜１．５ｍｇタンパク質の吸着能力が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【０１０６】
リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルのホスフェートによる置換の程度と反比例し、この置換の程度は、沈殿により塩を調製するために用いる反応条件および反応物の濃度に依存して変動できる。ＰＺＣは、溶液中の遊離ホスフェートイオンの濃度を変化させること（より多いホスフェート＝より酸性側のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝剤のような緩衝剤を加えること（ＰＺＣをより塩基性にする）によっても変更される。本発明に従って用いられるリン酸アルミニウムは、通常、４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば約５．７のＰＺＣを有する。
【０１０７】
本発明の組成物を調製するために用いるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液またはトリス緩衝液）を含有してよいが、これは必ずしも必要ではない。懸濁物は、滅菌されており、発熱物質を含まないことが好ましい。懸濁物は、例えば、１．０ｍＭから２０ｍＭの間、好ましくは５ｍＭから１５ｍＭの間、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離の水性ホスフェートイオンを含むことができる。懸濁物は、塩化ナトリウムも含んでよい。
【０１０８】
一実施形態において、アジュバント成分としては、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物が挙げられる。この場合、リン酸アルミニウムが水酸化アルミニウムよりも多く、例えば、少なくとも２：１、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比で存在してよい。
【０１０９】
患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどであることが好ましい。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間である。最大≦０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
【０１１０】
油エマルジョン
本発明においてアジュバントとして用いるのに適した油エマルジョン組成物としては、ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョン［Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．．．（１９９５年）Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍの第１０章］（マイクロフルダイザーを用いてサブミクロンの粒子に処方した５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５）が挙げられる。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も用いることができる。
【０１１１】
種々の適切な水中油エマルジョンが公知であり、それらは、代表的には、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、油（複数可）および界面活性剤（複数可）は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、一般的には、直径５μｍ未満であり、有利には、上記エマルジョンは、理想的にはサブミクロンの直径の油滴を有し、これらの小さいサイズは、マイクロフルイダイザーを用いて安定なエマルジョンを得ることにより達成される。２２０ｎｍ未満のサイズの液滴は、フィルタ滅菌に供することができるので好ましい。
【０１１２】
本発明は、動物（例えば魚類）または植物の供給源からのもののような油とともに使用することができる。植物油の供給源は、堅果、種子および穀粒を含む。ピーナツ油、大豆油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に入手可能な堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られるホホバ油を用いることができる。種子油は、紅花油、綿実油、ひまわり種子油、ごま種子油などを含む。穀粒の群において、コーン油が最も容易に入手可能であるが、コムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなどのようなその他の穀類の穀粒の油も用いてよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発する適切な材料の加水分解、分離およびエステル化により調製し得る。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝可能であり、よって本発明の実施において用いてよい。動物の供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化およびその他の手段の手順は、当該技術において周知である。ほとんどの魚類は、容易に回収し得る代謝可能な油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油および鯨ろうのような鯨油は、本明細書において用い得る魚油のいくつかの例である。いくつかの分岐鎖油が、５炭素イソプレンユニットで生化学的に合成され、一般的に、テルペノイドとよばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして公知の分岐不飽和テルペノイドを含有する。他の好ましい油は、トコフェロールである（下記参照のこと）。スクアレンを含む水中油エマルジョンが特に好ましい。油の混合物を用いることができる。
【０１１３】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性比）により分類できる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてより好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、それらに限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎとよばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーのようなＤＯＷＦＡＸ（商標）の商標の下で販売されるエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得るオクトキシノール、特にオクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）のようなラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）；ならびにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレートのようなソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知である）を含む界面活性剤を用いることができる。エマルジョンに含むために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。上記したように、Ｔｗｅｅｎ８０のような洗浄剤は、以下の実施例にみられる熱安定性に寄与し得る。
【０１１４】
界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物を用いることができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０））およびオクトキシノール（例えば、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００））の組み合わせも適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールとを含む。
【０１１５】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えばＴｗｅｅｎ８０）０．０１〜１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＴｒｉｔｏｎシリーズのその他の洗浄剤）０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えばラウレス９）０．１〜２０％、好ましくは、０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％である。
【０１１６】
本発明で有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントは、以下のものを含むが、それらに限定されない：
・スクアレンとＴｗｅｅｎ８０とＳｐａｎ８５とのサブミクロンのエマルジョン。エマルジョンの体積での組成は、約５％スクアレン、約０．５％ポリソルベート８０および約０．５％Ｓｐａｎ８５であり得る。重量の点において、これらの比率は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０および０．４８％Ｓｐａｎ８５になる。このアジュバントは、「ＭＦ５９」として公知である。ＭＦ５９エマルジョンは、有利には、シトレートイオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
【０１１７】
・スクアレンとαトコフェロールとポリソルベート８０とを含むエマルジョン。これらのエマルジョンは、２〜１０％スクアレン、２〜１０％トコフェロールおよび０．３〜３％Ｔｗｅｅｎ８０を有してよく、スクアレン：トコフェロールの重量比は、より安定なエマルジョンを提供するので、好ましくは≦１（例えば、０．９０）である。スクアレンとＴｗｅｅｎ８０とは、約５：２の体積比または約１１：５の重量比で存在してよい。あるこのようなエマルジョンは、Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳ中に溶解して２％溶液を得て、次いで９０ｍｌのこの溶液を、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌスクアレン）の混合物と混合し、次いで混合物を微小流動化する（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅ）ことにより作製できる。得られるエマルジョンは、１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径のサブミクロンの油滴を有し得る。
【０１１８】
・スクアレンとトコフェロールとＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）とのエマルジョン。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬ（下記参照のこと）も含んでよい。エマルジョンは、リン酸緩衝液を含有してよい。
【０１１９】
・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）とＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）とトコフェロール（例えばα−トコフェロールスクシネート）とを含むエマルジョン。エマルジョンは、これらの３成分を、約７５：１１：１０の質量比で含んでよく（例えば７５０μｇ／ｍｌ  ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１００μｇ／ｍｌ  α−トコフェロールスクシネート）、これらの濃度は、抗原からのこれらの成分のいずれの寄与も含むべきである。エマルジョンは、スクアレンも含んでよい。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬ（下記参照のこと）も含んでよい。水相は、リン酸緩衝液を含有してよい。
【０１２０】
・スクワランとポリソルベート８０とポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）とのエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中で処方できる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドについての有用な送達ビヒクルであり、スレオニル−ＭＤＰとともに「ＳＡＦ−１」アジュバント中で用いられている（０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクワラン、２．５％ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。これは、「ＡＦ」アジュバントにおけるように、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしで用いることもできる（５％スクワラン、１．２５％ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。微小流動化が好ましい。
【０１２１】
・スクアレンと水性溶媒とポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）と疎水性非イオン性界面活性剤（例えばソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ８０」のようなソルビタンエステルまたはマンニドエステル）とを含むエマルジョン。エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、かつ／または少なくとも９０％の油滴（体積による）が２００ｎｍ未満のサイズである。エマルジョンは、アルジトール、凍結保護剤（例えばドデシルマルトシドおよび／またはスクロースのような糖）、および／またはアルキルポリグリコシドの１または複数も含んでよい。このようなエマルジョンは、凍結乾燥してよい。
【０１２２】
・０．５〜５０％の油と、０．１〜１０％のリン脂質と、０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤とを含むエマルジョン。好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。
【０１２３】
・非代謝性油（例えば軽鉱油（ｌｉｇｈｔ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ））と少なくとも１種の界面活性剤（例えばレシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０）とのサブミクロンの水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性物質結合体（例えば脂肪族アミンをデスアシルサポニンに、グルクロン酸のカルボキシル基を介して付加することにより生成される、ＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンのような添加物を含んでよい。
【０１２４】
・鉱油と、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコールと、非イオン性親水性界面活性剤（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）とを含むエマルジョン（ＷＯ２００６／１１３３７３を参照のこと）。
【０１２５】
・鉱油と、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコールと、非イオン性親油性界面活性剤（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）とを含むエマルジョン（ＷＯ２００６／１１３３７３を参照のこと）。
【０１２６】
・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（例えばコレステロール）とが、らせん状ミセルとして会合しているエマルジョン。
【０１２７】
組成物中の抗原（ＶＬＰ）およびアジュバントは、典型的に、患者に送達される時には、混和物中にあるであろう。エマルジョンは、抗原（ＶＬＰ）と、製造中に混合することができる、または、送達時に即席で混合することができる。よって、アジュバントおよび抗原（ＶＬＰ）は、使用時に最終的な処方物にすぐ準備できる、包装または分配されたワクチン中に別々に保持することができる。抗原（ＶＬＰ）は、一般に、最終的に２つの液体を混合することによってワクチンを調製するために、水性の形態であろう。混合するための２つの液体の体積比は、変動してよいが（例えば、５：１と１：５の間）、一般に約１：１である。
【０１２８】
サポニン処方物（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．．．（１９９５年）Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍの第２２章を参照されたい）
サポニン処方物も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。サポニンは、広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花において見いだされるステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の不均一な群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮由来のサポニンがアジュバントとして広く研究されている。サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ソープルート（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））から商業的に取得可能である。サポニンアジュバント処方物としては、ＱＳ２１などの精製された処方物、ならびにＩＳＣＯＭなどの脂質処方物が挙げられる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）として販売されている。
【０１２９】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されてきた。これらの技法を用いて特異的に精製された画分が同定されており、それらとしては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。サポニンはＱＳ２１であることが好ましい。ＱＳ２１の生成方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。サポニン処方物は、コレステロールなどのステロールも含んでよい。
【０１３０】
サポニンとコレステロールの組み合わせを使用して、免疫賦活性複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特の粒子を形成することができる（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．．．（１９９５年）Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍの第２３章）。ＩＳＣＯＭは、典型的には、リン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなども含む。任意の公知のサポニンをＩＳＣＯＭに用いることができる。ＩＳＣＯＭはＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１または複数を含むことが好ましい。ＩＳＣＯＭは、ＷＯ９６／３３７３９にさらに記載されている。場合によって、ＩＳＣＯＭは、追加的な洗浄剤を欠いてよい。
【０１３１】
ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。これらの構造は、一般に、場合によってリン脂質と組み合わされる、またはリン脂質と一緒に処方される、ウイルス由来の１または複数のタンパク質を含有する。これらは、一般に、非病原性、非複製的であり、概して、いかなる天然のウイルスのゲノムも含有しない。ウイルスタンパク質を、組換え生成することができる、またはウイルス全体から単離することができる。ビロソームまたはＶＬＰにおいて用いるのに適したこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス（例えば、ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、コアタンパク質またはカプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（例えば、コートタンパク質など）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）に由来するタンパク質が挙げられる。
【０１３２】
細菌誘導体または微生物誘導体
本発明において用いるのに適したアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性の誘導体など、リピドＡ誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を包含する。
【０１３３】
ＬＰＳの無毒性の誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４、５または６のアシル化された鎖を有する３脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。好ましい３脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの「小粒子」形態は、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４に開示されている。そのような３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２μｍの膜を通して滅菌ろ過するのに十分小さい（ＥＰ−Ａ−０６８９４５４）。他の無毒性のＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣体（ｍｉｍｉｃ）、例えば、ＲＣ−５２９などのアミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体などが挙げられる。
【０１３４】
リピドＡ誘導体としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のリピドＡの誘導体、例えば、ＯＭ−１７４などが挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、Ｍｅｒａｌｄｉら（２００３年）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１巻：２４８５〜２４９１頁およびＰａｊａｋら（２００３年）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１巻：８３６〜８４２頁に記載されている。
【０１３５】
本発明においてアジュバントとして用いるのに適した免疫賦活性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含有するヌクレオチド配列（リン酸結合によってグアノシンと連結した、メチル化されていないシトシンを含有するジヌクレオチド配列）が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含有する二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも、免疫賦活性であることが示されている。
【０１３６】
ＣｐＧは、ヌクレオチドの修飾／類似体、例えば、ホスホロチオエート修飾などを含んでよく、また、二本鎖または一本鎖であってよい。参考文献であるＫａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１巻：２３９３〜２４００頁；ＷＯ０２／２６７５７、およびＷＯ９９／６２９２３は、可能性のある類似体の置換、例えば、グアノシンの、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンとの交換を開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、Ｋｒｉｅｇ（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９巻：８３１〜８３５頁；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅら（２００２年）ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３２巻：１７９〜１８５頁；ＷＯ９８／４０１００；ＵＳ６，２０７，６４６；ＵＳ６，２３９，１１６；およびＵＳ６，４２９，１９９においてさらに考察されている。
【０１３７】
ＣｐＧ配列（例えば、ＧＴＣＧＴＴモチーフまたはＴＴＣＧＴＴモチーフなど）は、ＴＬＲ９に向けられ得る（Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３１巻（第３部）：６５４〜６５８頁）。ＣｐＧ配列は、例えば、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮなど、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であってよい、または、例えば、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮなどＢ細胞応答誘導により特異的であってよい。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら（２００３年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０巻：４０６１〜４０６８頁；Ｋｒｉｅｇ（２００２年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３巻：６４〜６５頁およびＷＯ０１／９５９３５において考察されている。ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮであることが好ましい。
【０１３８】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、受容体を認識するために５’末端を利用できるように構築することが好ましい。場合によって、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、それらの３’末端に付着させて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成することができる。例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３１巻（第３部）：６５４〜６５８頁およびＫａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）ＢＢＲＣ  ３０６巻：９４８〜９５３頁；Ｂｈａｇａｔら（２００３年）ＢＢＲＣ  ３００巻：８５３〜８６１頁およびＷＯ０３／０３５８３６を参照されたい。
【０１３９】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドに基づく特に有用なアジュバントは、ＩＣ−３１（商標）として公知である（Ｓｃｈｅｌｌａｃｋら（２００６年）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４巻：５４６１〜７２頁）。よって、本発明で用いるアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つの（好ましくは複数の）ＣｐＩモチーフ（すなわち、イノシンと連結してジヌクレオチドを形成しているシトシン）を含めたオリゴヌクレオチド（例えば、１５〜４０ヌクレオチド）と（ｉｉ）少なくとも１つの（好ましくは複数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列（複数可）を含めたオリゴペプチド（例えば、５〜２０アミノ酸）などのポリカチオンポリマーの混合物を含んでよい。オリゴヌクレオチドは、２６ｍｅｒの配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号１）を含むデオキシヌクレオチドであってよい。ポリカチオンポリマーは、１１−ｍｅｒのアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号２）を含むペプチドであってよい。
【０１４０】
細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を、本発明においてアジュバントとして用いることができる。タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来することが好ましい。解毒されたＡＤＰ−リボシル化毒素の、粘膜アジュバントとしての使用は、ＷＯ９５／１７２１１に記載されており、非経口的なアジュバントとしての使用は、ＷＯ９８／４２３７５に記載されている。毒素または類毒素は、ＡサブユニットおよびＢサブユニットの両方を含むホロ毒素の形態であることが好ましい。Ａサブユニットは、解毒性変異を含有することが好ましく；Ｂサブユニットは変異していないことが好ましい。アジュバントは、解毒されたＬＴ変異体、例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２などであることが好ましい。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の、アジュバントとしての使用は、Ｂｅｉｇｎｏｎら（２００２年）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７０巻：３０１２〜３０１９頁；Ｐｉｚｚａら（２００１年）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９巻：２５３４〜２５４１頁；Ｐｉｚｚａら（２０００年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２９０巻：４５５〜４６１頁；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら（２０００年）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６８巻：５３０６〜５３１３頁；Ｒｙａｎら（１９９９年）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６７巻：６２７０〜６２８０頁；Ｐａｒｔｉｄｏｓら（１９９９年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６７巻：２０９〜２１６頁；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら（２００３年）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２巻：２８５〜２９３頁；Ｐｉｎｅら（２００２年）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ８５巻：２６３〜２７０頁およびＴｅｂｂｅｙら（２０００年）Ｖａｃｃｉｎｅ  １８巻：２７２３〜３４頁に見いだすことができる。有用なＣＴ変異体はＣＴ−Ｅ２９Ｈである。アミノ酸置換についての数値での参照は、その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれるＤｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら（１９９５年）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １５巻：１１６５〜１１６７頁に記載のＡＤＰ−リボシル化毒素のＡサブユニットとＢサブユニットのアラインメントに基づくことが好ましい。
【０１４１】
ヒト免疫調節物質
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したヒト免疫調節物質としては、サイトカイン、例えば、インターロイキンなど（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）（ＷＯ９９／４０９３６およびＷＯ９９／４４６３６）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。好ましい免疫調節物質はＩＬ−１２である。
【０１４２】
生体接着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜接着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）
生体接着剤および粘膜接着剤も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。適切な生体接着剤としては、エステル化されたヒアルロン酸ミクロスフェア（Ｓｉｎｇｈら）（２００１年）Ｊ  Ｃｏｎｔ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７０巻：２６７〜２７６頁）、または粘膜接着剤、例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋した誘導体などが挙げられる。キトサンおよびその誘導体も、本発明においてアジュバントとして用いることができる（ＷＯ９９／２７９６０）。
【０１４３】
微小粒子
微小粒子も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を用いて、生分解性かつ無毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成された微小粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、場合によって、それを、負に荷電した表面を有するように処理する（例えば、ＳＤＳを用いて）または正に荷電した表面を有するように処理する（例えば、ＣＴＡＢなどの陽イオン洗浄剤を用いて）。
【０１４４】
リポソーム（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．．．（１９９５年）Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍの第１３章および１４章）
アジュバントとして用いるのに適したリポソーム処方物の例は、ＵＳ６，０９０，４０６、ＵＳ５，９１６，５８８およびＥＰ  Ａ０６２６１６９に記載されている。
【０１４５】
ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物
本発明において用いるのに適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル（ＷＯ９９／５２５４９）を包含する。そのような処方物としては、さらに、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）ならびに少なくとも１つの追加的な非イオン性界面活性剤、例えば、オクトキシノールなどと組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）が挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１４６】
ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、Ａｎｄｒｉａｎｏｖら（１９９８年）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９巻：１０９〜１１５頁およびＰａｙｎｅら（１９９８年）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ３１巻：１８５〜１９６頁に記載されている
ムラミルペプチド
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル（ｎｏｒｍｕｒａｍｙｌ）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１４７】
イミダゾキノロン（Ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）化合物
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびその同族化合物（例えば、「レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）３Ｍ」）が挙げられ、Ｓｔａｎｌｅｙ（２００２年）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２７巻：５７１〜５７７頁およびＪｏｎｅｓ（２００３年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ４巻：２１４〜２１８頁においてさらに記載されている。
【０１４８】
本発明は、上記のアジュバントの１または複数の態様の組み合わせも含んでよい。例えば、以下のアジュバント組成物を本発明において用いることができる：（１）サポニンおよび水中油エマルジョン（ＷＯ９９／１１２４１）；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性のＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（ＷＯ９４／００１５３）；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性のＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（場合によって、＋ステロール）（ＷＯ９８／５７６５９）；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンの組み合わせ（欧州特許出願第０８３５３１８号、同第０７３５８９８号および同第０７６１２３１号）；（６）サブミクロンのエマルジョンに微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅ）した、またはボルテックスしてより大きな粒子サイズのエマルジョンを生じさせた、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ；（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁の骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１または複数の細菌の細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；および（８）１または複数の無機塩類（例えば、アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの無毒性の誘導体（例えば、３ｄＭＰＬなど）。
【０１４９】
免疫賦活剤としての機能を果たす他の物質は、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ．．．（１９９５年）Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編  ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ．  Ｐｌｅｎｕｍの第７章に開示されている。水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用は、特に小児において有用であり、一般に、抗原はこれらの塩に吸着される。水中スクアレンエマルジョンも、特に高齢者において好ましい。有用なアジュバントの組み合わせとしては、Ｔｈ１アジュバントとＴｈ２アジュバントの組み合わせ、例えば、ＣｐＧとミョウバンの組み合わせ、またはレシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）とミョウバンの組み合わせなどが挙げられる。リン酸アルミニウムと３ｄＭＰＬの組み合わせを用いてもよい。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＶＰ１およびＶＰ２を含有するパルボウイルス・ＶＬＰ、およびＭＦ５９などのアジュバントを含有する免疫原性組成物である。ＶＬＰとアジュバント（例えば、ＭＦ５９）は、予め混合し、単一の組成物として提供することができる、または、投与する前に混合するための別々の成分として提供することができる。
【０１５１】
Ｅ．投与
本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与されるであろう。直接的な送達は、例えば、シリンジおよび皮下針を用いた非経口的な注射（例えば、皮下に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、もしくは組織の間質腔（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｓｐａｃｅ）へ）、または粘膜を通じて、例えば、直腸投与、経口投与（例えば、錠剤、噴霧）、膣への投与、局所投与、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与（例えば、ＷＯ９９／２７９６１を参照されたい）または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与（例えば、ＷＯ０２／０７４２４４およびＷＯ０２／０６４１６２を参照されたい）、鼻腔内投与（例えば、ＷＯ０３／０２８７６０を参照されたい）、眼への投与、耳への投与、肺への投与または他の粘膜投与などによって実現することができる。免疫原性組成物も、皮膚の表面に直接移すことによって局所的に投与してもよい。局所投与は、いかなるデバイスも利用することなく、または包帯または包帯様デバイスを利用して裸の皮膚を免疫原性組成物と接触させることによって実現することができる（例えば、米国特許第６，３４８，４５０号を参照されたい）。
【０１５２】
投与形式は、非経口的な免疫化、粘膜免疫化、または粘膜免疫化と非経口的な免疫化の組み合わせであることが好ましい。投与形式は、１〜３週間離した合計１〜２回のワクチン接種での非経口的な免疫化、粘膜免疫化、または粘膜免疫化と非経口的な免疫化の組み合わせであることがさらに好ましい。投与経路は、これらに限定されないが、経口的な送達、筋肉内の送達および経口的な送達および筋肉内の送達の組み合わせを含むことが好ましい。特に好ましい投与形式は、例えば、シリンジおよび皮下針を用いた筋肉内注射によるものである。免疫原性組成物は、２用量で筋肉内に投与することが好ましい。
【０１５３】
本発明の組成物は、常套的な小児期免疫化と、または青年期の女性に送達されるヒトパピローマウイルスおよび／もしくはＢ群連鎖球菌（ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓｔｒｅｐ）ワクチン接種と同時に投与することができる。
【０１５４】
粘膜病原体由来の抗原、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ抗原などに対する粘膜免疫応答および全身免疫応答は、粘膜に初回刺激し、その後全身的に追加刺激する免疫化により増強し得ることがすでに実証されている（Ｖａｊｄｙら（２００３年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１０巻：８６〜９４頁）。いくつかの実施形態において、パルボウイルスによる感染を処置または予防するための方法は、それを必要とする被験体に、１または複数のパルボウイルス抗原を含む第１の免疫原性組成物を、粘膜に投与し、次いで、１または複数のパルボウイルス抗原を含む第２の免疫原性組成物を治療有効量で非経口的に投与することを含む。
【０１５５】
免疫原性組成物は、全身免疫および／または粘膜免疫を惹起するため、好ましくは増強された全身免疫および／または粘膜免疫を惹起するために用いることができる。
【０１５６】
免疫応答は、血清ＩｇＧ免疫応答および／または腸のＩｇＡ免疫応答の誘導を特徴とすることが好ましい。
【０１５７】
上記の通り、初回刺激−追加刺激方法は、１または複数の遺伝子送達ベクターおよび／またはポリペプチド抗原を「初回刺激」ステップで送達し、その後、１または複数の第２の遺伝子送達ベクターおよび／またはポリペプチド抗原を「追加刺激」ステップで送達する場合に用いることが好ましい。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の１または複数の遺伝子送達ベクターまたはポリペプチド抗原を用いた初回刺激および追加刺激の後に、１または複数のポリペプチドを含有する組成物（例えば、パルボウイルス抗原を含むポリペプチド）をさらに追加刺激する。ＶＬＰは、ポリペプチドを含有する組成物である。ＶＬＰは、適切な遺伝子送達ベクターで免疫化した宿主において形成することができる。
【０１５８】
共投与を伴う任意の方法では、種々の組成物を任意の順序で送達することができる。よって、複数の異なる組成物または分子を送達することを含む複数の実施形態において、核酸の全てがポリペプチドの前に送達される必要はない。例えば、初回刺激ステップは、１または複数のポリペプチドを送達することを含んでよく、追加刺激は、１もしくは複数の核酸および／または１もしくは複数のポリペプチドを送達することを含む。複数のポリペプチドを投与した後に、複数の核酸の投与を行うことができる、またはポリペプチドおよび核酸の投与を任意の順序で実施することができる。よって、本明細書に記載の遺伝子送達ベクターの１または複数、および本明細書に記載のポリペプチドの１または複数を、任意の順序で任意の投与経路によって共投与することができる。よって、本明細書に記載のポリヌクレオチドとポリペプチドの任意の組み合わせを使用して、免疫反応を惹起することができる。
【０１５９】
（ｉ）投薬レジメン
投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールに従ってもよい。多回用量は、一次免疫化スケジュールおよび／または追加免疫化スケジュールで用いることができる。多回用量スケジュールにおいて、様々な用量を、同じまたは異なる経路、例えば非経口的な初回刺激および粘膜での追加刺激、粘膜での初回刺激および非経口的な追加刺激などにより与えてよい。例えば、多回用量スケジュールは、初回刺激、その後の２回の追加刺激を含んでよい。初回刺激用量および／または追加刺激用量は、アジュバントと共投与することが好ましいであろう。
【０１６０】
投薬レジメンにより、抗体応答のアビディティが増強され、中和特性を持つ抗体がもたらされることが好ましい。ｉｎ−ｖｉｔｒｏ中和アッセイを用いて、中和性抗体について検査することができる（例えば、Ａｓａｎａｋａら（２００５年）Ｊ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １０２巻：１０３２７頁；Ｗｏｂｕｓら（２００４年）ＰＬＯＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２巻（１２号）；ｅ４３２頁；およびＤｕｂｅｋｔｉら（２００２年）Ｊ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６６巻：４００頁を参照されたい）。
【０１６１】
血清抗体レベルとパルボウイルスによって引き起こされる疾患からの防御との相関が強力な場合がある。
【０１６２】
上記のパルボウイルス・ＶＬＰを、哺乳動物、例えば、マウス、ヒヒ、チンパンジー、またはヒトなどに投与して、パルボウイルスに特異的なＴ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで活性化することができる。投与は、針またはシリンジを用いた注射を含めた非経口注射、鼻腔内注射、筋肉内注射または皮下注射を含めた当技術分野で公知の任意の手段によるものでよい。
【０１６３】
パルボウイルス・ＶＬＰを含む本発明の組成物は、使用される特定の組成物と適合する様式で、かつ免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答および／または体液性応答）、好ましくは防御免疫応答を誘導するために有効な量で投与する。
【０１６４】
パルボウイルスに特異的なＴ細胞応答は、とりわけ、５１Ｃｒ放出アッセイ、リンパ球増殖アッセイによって、またはＩＦＮ−γを細胞内染色することによって測定することができる。タンパク質は、パルボウイルスに感染していない哺乳動物に投与することができる、または、パルボウイルスに感染している哺乳動物に投与することができる。組成物中のタンパク質の詳細な投与量は、これらに限定されないが、組成物を投与する哺乳動物の種、年齢、および全身状態、ならびに組成物の投与形式を含めた多くの因子に左右されるであろう。本発明の組成物の有効量は、常套的な実験のみを用いて容易に決定することができる。適切な用量を同定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルを用いることができる。一般に、０．５ｍｇ、０．７５ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇまたは５０ｍｇのパルボウイルスポリペプチドまたはＶＬＰを、大型の哺乳動物、例えば、ヒヒ、チンパンジー、またはヒトなどに投与するであろう。所望に応じて、共起刺激分子またはアジュバントも、組成物の前、その後、またはそれと一緒に提供することができる。
【０１６５】
本発明の組成物を送達することによって生じる、パルボウイルスに特異的なＴ細胞の活性化を含めた哺乳動物の免疫応答は、投与量、投与経路、または追加刺激レジメンを変動させることによって増強することができる。本発明の組成物は、単回投与スケジュール、または、好ましくは、ワクチン接種の一次過程が１〜１０の別個の用量を含み、その後、その後の免疫応答を維持し、かつ／または強化するために必要な時間間隔で他の用量を与え、例えば、１〜４カ月で第２の用量を与え、必要に応じて、その後、数か月後に１または複数の用量を与える多回用量スケジュールで与えてよい。
【０１６６】
Ｆ．免疫応答の効力を決定するための試験
治療的な処置の効力を評価する１つの方式は、本発明の組成物を投与した後に、感染をモニターすることを伴う。予防的処置の効力を評価する１つの方式は、組成物を投与した後に、本発明の組成物中の抗原に対する免疫応答をモニターすることを伴う。
【０１６７】
本発明の免疫原性組成物のタンパク質成分の免疫原性を評価する別の方式は、タンパク質を組換えによって発現させること、および患者の血清または粘膜からの分泌物を免疫ブロットによってスクリーニングすることである。タンパク質と患者の血清の間の陽性の反応は、患者が以前問題のタンパク質に対する免疫応答を展開したことがあること、すなわち、タンパク質が免疫原であることを示す。この方法は、免疫優性のタンパク質および／またはエピトープを同定するためにも用いることができる。
【０１６８】
治療的な処置の効力を調査する別の方式は、本発明の組成物を投与した後に、感染をモニターすることを伴う。予防的処置の効力を調査する１つの方式は、組成物を投与した後に、本発明の組成物中の抗原に対する全身免疫応答をモニターすること（例えば、ＩｇＧ１生成レベルおよびＩｇＧ２ａ生成レベルをモニターすることなど）および／または粘膜免疫応答をモニターすること（例えば、ＩｇＡ生成レベルをモニターすることなど）を伴う。典型的に、血清特異的な抗体応答は、免疫化した後、攻撃する前に決定されるが、一方、粘膜特異的な抗体体応答は、免疫化し、攻撃した後に決定される。
【０１６９】
現在、本発明のヒトパルボウイルス（例えば、パルボウイルスＢ１９）免疫原性組成物によって誘導される防御免疫を評価するための、承認された動物モデルはない。しかし、そのような組成物の免疫応答を誘導する能力は、本明細書に記載の通り、適切な動物において評価することができる。本発明の、他の、ヒトパルボウイルスではない免疫原性組成物は、宿主、例えば、ヒトへの投与に先立って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ動物モデルおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて評価することができる。特に有用なマウスモデルとしては、腹腔内免疫化の後に、腹腔内攻撃または鼻腔内攻撃のいずれかを行うモデルが挙げられる。
【０１７０】
本発明の免疫原性組成物の効力は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、感染の動物モデル、例えば、モルモットまたはマウスまたはアカゲザルに、免疫原性組成物を用いて攻撃することによって決定することもできる。免疫原性組成物は、攻撃用株と同じ株に由来してもしなくてもよい。免疫原性組成物は、攻撃用株と同じ株から導き出せることが好ましい。
【０１７１】
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方であってよい。免疫応答は、改善された、または増強された、または変化した免疫応答であってよい。免疫応答は、全身免疫応答および粘膜免疫応答の一方または両方であってよい。免疫応答は、増強された全身応答および／または粘膜応答であることが好ましい。
【０１７２】
増強された全身免疫および／または粘膜免疫は、増強されたＴＨ１免疫応答および／またはＴＨ２免疫応答に反映される。免疫応答の増強は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの生成の増加を含むことが好ましい。粘膜免疫応答は、ＴＨ２免疫応答であることが好ましい。粘膜免疫応答は、ＩｇＡの生成の増加を含むことが好ましい。
【０１７３】
活性化されたＴＨ２細胞は、抗体生成を増強し、よって、細胞外の感染に対する応答において価値がある。活性化されたＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０の１または複数を分泌し得る。ＴＨ２免疫応答により、将来の防御のためにＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび記憶Ｂ細胞が生成され得る。
【０１７４】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２免疫応答に関連するサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０など）の１または複数の増加、またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび記憶Ｂ細胞の生成の増加のうち１または複数を含んでよい。増強されたＴＨ２免疫応答は、ＩｇＧ１生成の増加を含むようになることが好ましい。
【０１７５】
ＴＨ１免疫応答は、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答に関連するサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦβなど）の１または複数の増加、活性化されたマクロファージの増加、ＮＫ活性の増加、またはＩｇＧ２ａの生成の増加のうち１または複数を含んでよい。増強されたＴＨ１免疫応答は、ＩｇＧ２ａ生成の増加を含むようになることが好ましい。
【０１７６】
本発明の免疫原性組成物、具体的には、本発明の１または複数の抗原を含む免疫原性組成物は、単独で、または他の抗原と組み合わせて、場合によってＴｈ１応答および／またはＴｈ２応答を惹起することができる免疫調節剤と一緒に用いることができる。
【０１７７】
免疫応答は、抗体媒介性免疫機構であってよい。抗体は、血清抗体、より好ましくは、中和性血清抗体であることが好ましい。本発明の免疫原性組成物は、主に、抗体力価（例えば、全抗体および／または中和性抗体）を、任意の適切な方法、例えば、パルボウイルスＶＰ１および／またはＶＰ２に対する免疫応答性を評価するためのウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡなどを用いて評価することにより試験することができる（Ｗｏｎｇら、Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８２巻（５号）：２４７０〜２４７６頁（２００８年）；Ｂｏｓｔｉｃら、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、１７９巻：６１９〜６２６頁（１９９９年））。
【０１７８】
本発明の免疫原性組成物は、感染に有効に対処するために、細胞媒介免疫応答ならびに体液免疫応答の両方を惹起するようになることが好ましい。この免疫応答により、１または複数の感染性抗原に曝露させると直ちに応答し得る、長く持続する（例えば、中和性）抗体媒介免疫および細胞媒介免疫が誘導されることが好ましいであろう。例として、患者の血液試料中の中和性抗体の形跡は、それらの形成が、パルボウイルス感染においてウイルスを排除するために決定的に重要であるので、防御についての代理のパラメータとみなされる（ＹｏｕｎｇおよびＢｒｏｗｎ、ＮＥＪＭ  ３５０巻：５８６〜９７頁、２００４年を参照されたい）。
【０１７９】
本発明は、１または複数の免疫調節剤、例えば、アルミニウム塩などの無機塩など、およびＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドを含む免疫原性組成物も含む。免疫原性組成物は、アルミニウム塩とＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドの両方を含むことが最も好ましい。あるいは、免疫原性組成物は、ＡＤＰリボシル化毒素、例えば、解毒されたＡＤＰリボシル化毒素など、およびＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドを含む。１または複数の免疫調節剤はアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントは、上でさらに説明されているＴＨ１アジュバントおよびＴＨ２アジュバントからなる群の１または複数から選択することができる。
【０１８０】
Ｇ．医薬品としての免疫原性組成物の使用
本発明は、医薬品として使用するための本発明の組成物も提供する。医薬品は、哺乳動物における免疫応答を生じさせることができること（すなわち、免疫原性組成物である）が好ましく、ワクチンであることがより好ましい。本発明は、哺乳動物における免疫応答を上昇させるための医薬品の製造における本発明の組成物の使用も提供する。医薬品は、ワクチンであることが好ましい。ワクチンを使用して、小児における伝染性紅斑、赤血球悪液質の患者における一過性の骨髄無形成クリーゼ、通常鎌状赤血球貧血、溶血性貧血または遺伝性球状赤血球症、慢性赤血球形成不全および免疫不全の患者における貧血、免疫抑制された個体における持続感染、成人における持続性の関節症、免疫無防備状態の患者における持続性の、時には致死的な血球減少症、マラリア原虫に同時感染している間の貧血の悪化、マラリアにおける貧血の悪化および妊娠中の女性における胎児水腫または自然流産を予防および／または処置することが好ましい。
【０１８１】
本発明は、本明細書に記載の組成物を用いて免疫応答を誘導する、または増大させるための方法を提供する。免疫応答は、防御的であることが好ましく、抗体媒介免疫および／または細胞媒介免疫を含んでよい（全身免疫および粘膜免疫を含む）。免疫応答は、追加刺激応答を含む。
【０１８２】
本発明は、有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む、哺乳動物における免疫応答を上昇させるための方法も提供する。免疫応答は、防御的であることが好ましく、抗体媒介免疫および／または細胞媒介免疫を伴うことが好ましい。免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答の一方または両方を含むことが好ましい。方法により、追加刺激応答が生じてよい。
【０１８３】
哺乳動物は、ヒトであることが好ましい。免疫原性組成物が、予防的使用のためのワクチンであることが好ましい場合、ヒトは、小児（例えば、よちよち歩きの幼児または乳児、好ましくは就学前、好ましくは１歳以下または３歳以降（好ましくは１〜４歳））またはティーンエイジャー（青年期）であることが好ましい；ワクチンが治療的使用のためのものである場合、ヒトは、ティーンエイジャーまたは成人であることが好ましい。小児用ワクチンは、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与することもできる。ヒトは、ティーンエイジャー（青年期）であることが好ましい。ヒトは、青年期前のティーンエイジャーであることがより好ましい。ヒトは、青年期前の女性または男性であることがさらに好ましい。青年期前の男性または女性はおよそ９〜１２歳であることが好ましい。青年期の男性または女性は、およそ１５〜１９歳であることが好ましい。男性または女性はおよそ２０〜４９歳であることが好ましい。男性または女性は、４９歳を超えていることが好ましい。ヒトは高齢者、好ましくはおよそ６０〜８０歳であることが好ましい。
【０１８４】
本発明の免疫原性組成物（例えば、ワクチン）が有益であり得る他の集団としては、６〜１０歳の小児；昼間保育を受けている小児；学齢の小児および上記の小児集団および／または高齢者集団；慢性貧血患者；鎌状赤血球貧血の小児；遺伝性球状赤血球症の小児；女児、出産可能な年齢の青年期または成人の女性、例えば、先天性感染（胎児の感染）を予防するため；マラリアまたは鉤虫にかかる危険性がある地理的な地域（例えば、マラリアまたは鉤虫が風土病である地域）に住んでいる小児；免疫抑制される小児または成人（例えば、癌患者、移植を待っている患者）；失血を伴い、輸血を必要とする可能性が高い外科的処置が予定されている小児または成人；移植レシピエント、および免疫無防備状態の個体が挙げられる。
【０１８５】
Ｈ．キット
本発明は、本発明の免疫原性組成物の１または複数の容器を含むキットも提供する。組成物は、個々の抗原がそうであり得るように、液体の形態であってよい、または凍結乾燥されてよい。組成物用の適切な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスティックを含めた種々の材料から形成されていてよい。容器は、滅菌アクセスポートを有してよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で穴をあけることができる止め栓を有するバイアルであってよい）。
【０１８６】
キットは、薬剤的に許容できる緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、またはブドウ糖溶液などを含む第２の容器をさらに含んでよい。これは、他の薬学的に許容される処方用溶液、例えば、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジまたは他の送達デバイスなどを含めた、最終使用者にとって有用な他の材料も含有してよい。キットは、アジュバントを含む第３の成分をさらに含んでよい。
【０１８７】
キットは、免疫誘導する方法のため、または感染を処置するための使用説明書を含有する添付文書も含んでよい。添付文書は、承認されていないドラフト添付文書であってよい、または食品医薬品局（ＦＤＡ）または他の規制機関によって承認された添付文書であってよい。
【０１８８】
本発明は、本発明の免疫原性組成物を予め満たした送達デバイス、例えば、皮下針を有する、または有さないシリンジなども提供する。
【０１８９】
本発明は、上記の方法によって生成されるＶＬＰを、パルボウイルスについて血清陽性を決定するための抗原として用いる診断用キットも提供する。診断用キットは、本明細書に記載のパルボウイルス・ＶＬＰ、および、個体がパルボウイルスに結合する抗体について血清陽性であるかどうかを決定するための１または複数の補助的な試薬を含有してよい。適切な補助的な試薬としては、例えば、緩衝液、二次抗体または検出抗体（例えば、標識された抗ヒトＩｇ抗体、標識された抗イヌＩｇ抗体）、検出剤などが挙げられる。一実施例では、キットは、パルボウイルス・ＶＬＰ、およびＥＬＩＳＡまたは他の適切な免疫測定法を実施するための補助的な試薬を含有する。キットは、診断アッセイを実施するための説明書をさらに含んでよい。
【実施例】
【０１９０】
以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の例である。実施例は、単に例示的な目的で提供されており、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものではない。
【０１９１】
２種の等しい強度のプロモーターの制御下にあるＶＰ１およびＶＰ２を含有する最初のプラスミドを、伝統的な分子生物学的技法を用いて生じさせた。次いで、ＶＰ１の前のプロモーターを上記の通り修飾した（例えば、ＴＡＴＡ欠失、Ａリッチ上流配列の種々の欠失、ＶＰ１開始コドンの上流の開始／終止部位の導入）。
【０１９２】
【表１】
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第１のステップは、ｐＣＤＣ７酵母発現ベクター（図２）にクローニングするのに適したＭｌｕＩ−ＳａｌＩ制限末端を有する、ＶＰ１のためのＰＣＲ生成物、そして、ｐＣＤＣ７の第２の発現カセットにクローニングするのに適したＡｖｒＩＩ−ＮｏｔＩ制限末端を有する、ＶＰ２のためのＰＣＲ生成物を生成するためのものであった。さらに、ＶＰ１配列またはＶＰ２配列の５’末端の制限部位と開始Ｍｅｔの間にＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡ（配列番号１５）配列を導入した。
【０１９３】
ＶＰ２については、ＰＣＲ増幅反応は、１００ｎｇのｐＭＫ−ＲＧ＿ｐａｒｖｏ＿ｓｈａｄｅ＿ｖｐ１、プライマーであるＶＰ２−ＡＮ１およびＶＰ２−ＡＮ２各５０ｐｍｏｌ、ＭｇＣｌ２を含む１０×緩衝液１０μｌ、それぞれ１．２５ｍＭのｄＮＴＰ１６μｌ、Ｈ２Ｏ最大１００μｌおよびＲｏｃｈｅ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲキット由来のＤＮＡポリメラーゼ０．７５μｌを含有した。増幅条件：９５℃で５分、３５サイクルの９５℃で３０秒、６０℃で１分、７２℃で２分、その後に、単回の７２℃で７分の伸長サイクルおよび４℃での保持。
【０１９４】
ＶＰ２  ＰＣＲ反応物を、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して精製し、ＡｖｒＩＩおよびＮｏｔＩを、最終的な体積３００μｌ中各酵素１２０ｕで用い、３７℃で３時間消化した。次いで、１６８５ｂｐのＡｖｒＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、１％アガロースＧＴＧ（遺伝子技術グレード）から、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて精製した。
【０１９５】
ＶＰ２  ＡｖｒＩＩ−ＮｏｔＩゲル精製ＰＣＲ生成物１５ｎｇを、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキットを用いて、脱リン酸化された、ゲル精製したｐＴ７Ｂｌｕｅ２  ＡｖｒＩＩ−ＮｏｔＩベクターとライゲーションした。室温で２０分後、ライゲーション反応物を使用してコンピテントなＨＢ１０１を形質転換し、次いで、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で平板培養した。ミニプレッププラスミドＤＮＡを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中で成長させた単一のアンピシリン耐性コロニーから調製した；ＤＮＡの一部を、ＡｖｒＩＩ＋ＮｏｔＩを用いて消化して、ＶＰ２挿入物の存在を確認した。３つの陽性のクローン由来のプラスミドを、配列決定を用いて解析した。
【０１９６】
ＶＰ１については、ＰＣＲ増幅反応は、１００ｎｇのｐＭＫ−ＲＧ＿ｐａｒｖｏ＿ｓｈａｄｅ＿ｖｐ１、プライマーであるＶＰ１−ＭＳ１およびＶＰ１−ＭＳ２各５０ｐｍｏｌ、５’Ｈｏｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２．５×）４０μｌおよびＨ２Ｏ最大１００μｌを含有した。増幅条件：９５℃で５分、３５サイクルの９５℃で３０秒、６０℃で１分、７２℃で２分、その後に、単回の７２℃で７分の伸長サイクルおよび４℃での保持。
【０１９７】
ＶＰ１  ＰＣＲ反応物を、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して精製し、ＭｌｕＩおよびＳａｌＩを、最終的な体積３００μｌ中各酵素１２０ｕで用い、３７℃で３時間消化した。次いで、２３６６ｂｐのＭｌｕＩ−ＳａｌＩフラグメントを、１％アガロースＧＴＧ（遺伝子技術グレード）から、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて精製した。
【０１９８】
ＶＰ１  ＭｌｕＩ−ＳａｌＩゲル精製ＰＣＲ生成物のアリコートを、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキットを用いて、脱リン酸化された、ゲル精製したｐＧＥＭ４Ｚ  ＭｌｕＩ−ＳａｌＩベクターとライゲーションした。室温で２０分後、ライゲーション反応物を使用してコンピテントなＨＢ１０１を形質転換し、次いで、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で平板培養した。ミニプレッププラスミドＤＮＡを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中で成長させた単一のアンピシリン耐性コロニーから調製した；ＤＮＡの一部を、ＭｌｕＩ＋ＳａｌＩを用いて消化して、ＶＰ１  挿入物の存在を確認した。３つまたは４つの陽性のクローン由来のプラスミドを、配列決定を用いて解析した。
【０１９９】
次に、ＶＰ２制限フラグメントおよびＶＰ１制限フラグメントを、配列を確認したサブクローンから調製した。ＶＰ２については、１０μｇのｐＴ７Ｂｌｕｅ２．ＡｖｒＩＩ．ＮｏｔＩ．Ｐａｒｖｏ．ＶＰ２＃１１を、それぞれ最終的な体積２００μｌ中８０ユニットのＡｖｒＩＩおよびＮｏｔＩを用い、３７℃で２．５時間消化した。ＶＰ１については、１２μｇのｐＧＥＭ４Ｚ．ｏｐｔｉ．Ｐａｒｖｏ．ＶＰ１＃３を、それぞれ最終的な体積３００μｌ中１００ｕのＭｌｕＩおよびＳａｌＩを用い、３７℃で３時間消化した。ＶＰ１フラグメントにベクターが混入することを防止するために、ＰｖｕＩ酵素をＶＰ１プレップ消化物に含めた。ＶＰ２フラグメントおよびＶＰ１フラグメントを、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて１％アガロースＧＴＧから精製した。
【０２００】
バイシストロン性の酵母発現ベクターｐＣＤＣ７を、ＡｖｒＩＩ＋ＮｏｔＩを用いて消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化し、次いで、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて１％アガロースＧＴＧから精製した。ＶＰ２  ＡｖｒＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントおよそ９０ｎｇを、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキットを用いて、反応生成物２０μｌ中約３０ｎｇのＡｖｒＩＩ−ＮｏｔＩ  ｐＣＤＣ７ベクターとライゲーションした。室温で２０分後、ライゲーション反応物を使用してコンピテントなＨＢ１０１を形質転換し、次いで、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で平板培養した。ミニプレッププラスミドＤＮＡを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中で成長させた単一のアンピシリン耐性コロニーから調製した；プラスミドＤＮＡを、ＡｖｒＩＩ＋ＮｏｔＩを用いて消化して、ＶＰ２挿入物の存在を確認した。
【０２０１】
ＶＰ１をｐＣＤＣ７の第２の発現カセットにクローニングするためのベクターを調製するために、およそ１０μｇのｐＣＤＣ７．ＰａｒｖｏＢ１９．ＶＰ２＃１１プラスミドＤＮＡを、それぞれ最終的な体積２００μｌ中１００ｕのＭｌｕＩおよびＳａｌＩを用い、３７℃で３時間消化した。次いで、消化されたプラスミドを、７ｕの仔ウシ腸アルカリホスファターゼを用い、３７℃で１時間脱リン酸化した。次に、ベクターをＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて１％アガロースＧＴＧから精製した。
【０２０２】
最終的に、ゲル精製したＶＰ１  ＭｌｕＩ−ＳａｌＩフラグメント約１００ｎｇを、ｐＣＤＣ７．ＰａｒｖｏＢ１９．ＶＰ２＃１１ＭｌｕＩ−ＳａｌＩベクター約６０ｎｇと、２つの別々の２０μｌライゲーション反応においてＲｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキットを用いてライゲーションした。室温で２０分後、ライゲーション反応物を使用してコンピテントなＨＢ１０１を形質転換し、次いで、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で平板培養した。ミニプレッププラスミドＤＮＡを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中で成長させた単一のアンピシリン耐性コロニーから調製した；プラスミドＤＮＡを、ＭｌｕＩ＋ＳａｌＩを用いて消化して、ＶＰ１挿入物の存在を確認した。ｐＣＤＣ７．ＰａｒｖｏＢ１９．ＶＰ２．ＶＰ１＃２を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  １００ｍｌにおいて増幅のために選択し、その後、Ｑｉａｇｅｎ  ＭａｘｉＰｒｅｐキットを用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
【０２０３】
次に、ΔＴＡＴＡプロモーター制限フラグメントを、配列を確認したサブクローンから調製した。ｐＴ７Ｂｌｕｅ２．ΔＴＡＴＡ＃９およそ８μｇを、それぞれ最終的な体積３００μｌ中１２０ユニットのＢａｍＨＩおよびＭｌｕＩを用い、３７℃で４時間消化した。ＢａｍＨＩ−ＭｌｕＩ酵母発現ベクターを、５μｇのｐＣＤＣ７．ＰａｒｖｏＢ１９．ＶＰ２．ＶＰ１＃２を、それぞれ反応体積２００μｌ中８０ユニットのＢａｍＨＩおよびＭｌｕＩを用いて消化し、次いで３７℃で１時間、１０ｕの仔ウシ腸アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化することによって調製した。プロモーターおよびベクターフラグメントの両方を、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて１％アガロースＧＴＧから精製した。
【０２０４】
最終的に、１３３３ｂｐのＢａｍＨＩ−ＭｌｕＩ  ΔＴＡＴＡプロモーターフラグメント約２０ｎｇを、２０μｌの反応において約２０ｎｇのＢａｍＨＩ−ＭｌｕＩ  ｐＣＤＣ７ベクター（先の段落に記載の）と、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキットを用いてライゲーションした。室温で２０分後、ライゲーション反応物を使用してコンピテントなＨＢ１０１を形質転換し、次いで、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で平板培養した。ミニプレッププラスミドＤＮＡを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中で成長させた単一のアンピシリン耐性コロニーから調製した；ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ＋ＭｌｕＩを用いて消化して、１３３３ｂｐのΔＴＡＴＡプロモーターの存在を確認した。ｐＣＤＣ７．ＰａｒｖｏＢ１９．ＶＰ２＋ΔＴＡＴＡ．ＶＰ１＃１６を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  １００ｍｌにおいて増幅のために選択し、その後、Ｑｉａｇｅｎ  ＭａｘｉＰｒｅｐキットを用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
【０２０５】
（実施例１）
酵母におけるパルボウイルスＢ１９の発現
パルボウイルスＢ１９のＶＰ２遺伝子およびＶＰ１遺伝子を、以下の通り特徴づけられるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＤ３において同時発現させた：ＭＡＴａ、ｌｅｕ２、ｕｒａ３−５２、ｐｒｂ１−１１２２、ｐｅｐ４−３、ｐｒｃ１−４０７，ｇａｌ２、［ｃｉｒ○］：：ｐＤＭ１５（ｐＧＡＰ／ＡＤＲ１：：Ｇ４１８Ｒ），：：Ｙｉｐ５ΔｌｅｕＡＤ。
【０２０６】
酵母をＹＥＰＤプレート上に画線した後、形質転換するためのコンピテント細胞を調製するための単一のコロニーを選択する。酵母の形質転換を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓ．Ｃ．  ＥａｓｙＣｏｍｐ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎキットを使用して実施した。ｕｒａ−８％グルコース選択プレート上に形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）を得た。ｕｒａ−８％グルコース選択プレート上の単一のコロニーに関して、数個の形質転換体を画線した。次いで、プラスミドのコピー数を増加させるために、単一のコロニーをｌｅｕ−８％グルコース選択プレート上にパッチした。
【０２０７】
単一のコロニーパッチのうちの数個について小規模発現調査を行った。まず、ｌｅｕ−７．１％グルコース培地中で一晩培養物３ｍｌを成長させた。次いで、ｌｅｕ−培養物を、ＹＥＰＤまたはＶｅｇｇｉｅ  ＹＥＰＤ中に１：２０希釈した。培養物を３０℃または２５℃で４８〜７２時間振とうした。培地からグルコースが枯渇すると誘導が起こった。
【０２０８】
細胞ペレットを解凍し、水中で洗浄し、目盛り付きのチューブ内でペレットにし、充填細胞体積（ｐａｃｋｅｄ  ｃｅｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ）を推定できるようにした。次いで、異なる発現培養物の密度の差異を正規化するために、各ペレットを、充填細胞体積と等しい体積の冷たい溶解緩衝液（１０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．５、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５ＭのＮａＣｌ）に再懸濁させた。細胞／緩衝液懸濁物のアリコートを、洗浄したガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ８７７２）を用いて、４℃、最高速度で１時間ボルテックスすることにより溶解した。粗製の溶解物を、４℃の微量遠心分離機（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中、１３Ｋで３０分遠心分離して不溶性画分をペレットにした。上清のタンパク質の濃度を決定した後、１５０μｌのＳＤＳ試料緩衝液＋５０ｍＭのＤＴＴ中で試料３００μｇを調製した。その間に、不溶性のペレット画分（ＩＰ）を、１ｍｌのＳＤＳ試料緩衝液＋５０ｍＭのＤＴＴに再懸濁させた。可溶性画分および不溶性画分の試料を、４〜２０％トリス−グリシンゲルにローディングする前に煮沸した。可溶性画分については、１０μｌ（２０μｇの総タンパク質）をローディングし；不溶性のペレットについては、５μｌをローディングした。
【０２０９】
ゲルを２連で泳動させた（ｒｕｎ）−１つはクーマシー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎ）用であり、１つはパルボウイルスＢ１９に対するマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−５８１７８）でプローブするウエスタンブロット用であった。
【０２１０】
同じプロトコールを使用して４つの異なるコロニーを分析して、コロニー間の変動性を認識した。７２時間振とうフラスコ発現培養物４つに、４つの単一の−コロニーＬｅｕ−パッチ由来の細胞を接種した。図９ｂのウエスタンブロットは、各構築物の４つのコロニー由来の可溶性のＶＰ２およびＶＰ１についての変動性の範囲を示す。
【０２１１】
（実施例２）
パルボウイルスＢ１９精製プロトコール
ウシ血清アルブミン（ａｌｕｍｉｎ）（ＢＳＡ）を用いたＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、タンパク質の濃度を決定するための標準の参照として使用した。一部の場合では、ＢＣＡの結果で較正することによって示される通り１吸光度単位＝１ｍｇ／ｍｌと仮定して、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を用いた。
【０２１２】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのゲル（ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリス  カタログ番号ＮＰ０３２２ＢＯＸ）およびＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ  ＳＤＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号ＮＰ０００２−０２）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために用いたマーカーは、Ｆｕｌｌ  ｒａｎｇｅ  ｒａｉｎｂｏｗ分子量マーカー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＲＰＮ８００Ｅ）であった。Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ３〜１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＢＮ１００３ＢＯＸ）を、Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＢＮ２００７およびＮａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥマーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号１５１−１９０１）と一緒に用いた。ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを、Ｔｅｋｎｏｖａからのクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）Ｒ−２５０染色溶液（カタログ番号Ｃ１０５０）を用いて染色した。
【０２１３】
ウエスタンブロット分析によって純度および正体を得るために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをＩ−Ｂｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってニトロセルロース膜にブロッティングした。酵母の混入物を決定するために、Ｙｅａｓｔ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡキットを使用した（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ−ＣＹＧＮＵＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ｆ１３５）。
【０２１４】
ＶＰ１とＶＰ２の両方を発現している酵母細胞からパルボウイルスＢ１９のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を精製した。酵母細胞を溶解緩衝液に再懸濁させ、高圧（２５，０００ｐｓｉ）で複数回マイクロフルダイザー内を通過させて細胞を破壊した。低スピードで回転（１５，０００×ｇ）させて細胞の残屑を分離した後、上清を、４時間の高スピード回転（１００，０００×ｇ）に供して、２０％／７０％スクロースステップクッションに入れた。クッションを分画し、ＶＬＰを含有する画分を、緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ）で希釈した。ＶＬＰをｃａｐｔｏ  Ｑカラムにローディングし、高塩濃度で溶出した。ＶＬＰを含有する溶出画分を濃縮し、緩衝液をより低い塩濃度の緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ）と交換し、４℃で貯蔵した。
【０２１５】
パルボウイルスＢ１９  ＶＰ１／ＶＰ２・ＶＬＰを、９０％超の純度にまで精製し、同一のサイズだと考えられる（約２６ｎｍ）（図１１Ａ、１１Ｂ）。ゲルは、ＶＰ２／ＶＰ１（デルタＴＡＴＡ）ＶＬＰに基づく。部位特異的な変異体を含有する追加的なＶＬＰを構築した。
【０２１６】
スクロース棚クッションおよび分画
３８ｍＬのポリアロマーチューブ（Ｓｅｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中にスクロース棚を調製した。スクロース棚は２つの層：２０％スクロース５ｍＬおよび７０％スクロース２６ｍＬを有する。清澄化した溶解物６ｍＬを、スクロースの最上部に穏やかに加えた。このステップは、最大８ｍＬの清澄化した溶解物を用いて実施し、２ｍＬ未満の７０％スクロースを使用した。スクロース棚を、４℃、ＪＳ−２４ローター内で１００，０００×ｇで４時間遠心分離した。
【０２１７】
Ｐｉｓｔｏｎ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ（ＢｉｏＣｏｍｐ）を用いて上部からスクロース棚を分画して１ｍＬの画分にした。２０％：７０％スクロースの界面において目的のＶＬＰが見いだされた。ＶＬＰを含有する画分のＢｒｉｘ値は２８．５から３８．５の間であった（一般に画分１２から１４の間）。ＶＰ１とＶＰ２の両方を認識する市販の抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＢｉｏＴｅｃｈ  カタログ番号ｓｃ−７１８５２）を用いたウェスタンを実施して、ＶＬＰの位置および濃度を調査した。この材料を、４℃で少なくとも１週間、タンパク質分解せずに貯蔵した。
【０２１８】
Ｃａｐｔｏ  Ｑクロマトグラフィー
ＶＰ１／ＶＰ２特異的な抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＢｉｏＴｅｃｈ  カタログ番号ｓｃ−７１８５２）を用いたウェスタン分析により、スクロース棚から最大量のタンパク質を含有する画分を同定した。これらの画分をプールした、または別々に保持した（特定の試行に基づく）。これらの画分を、緩衝液Ａ（２５ｍＭのトリス，１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で１：４希釈し、予め洗浄しかつ予め平衡化したカラムに６ｃｍ／時間でローディングした。ローディングされたタンパク質の中になお存在するスクロースにより、タンパク質がより速い流速（すなわち、６０ｃｍ／時間）でカラムに結合することが部分的に妨げられた。ＮａＣｌ勾配を用いて、結合したタンパク質を溶出した。クロマトグラフィーを以下の通り実行した：
緩衝液Ａ：２５ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５；緩衝液Ｂ：２５ｍＭのトリス、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５；洗浄：緩衝液Ａを用いて５ＣＶ；勾配：０〜４０％のＢ（１０ＣＶ）；洗浄：１００％のＢ、５ＣＶ；流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ。分画：溶出の間に１ｍｌ。約５％のＢから約１０％のＢまでプール。１１．６。
緩衝液の交換および濃縮。
【０２１９】
ＶＰ１バンドを超える強度、またはそれと同等の強度のバンドがないようにＣａｐｔｏ  Ｑ画分を選択した。これらの画分をプールし、５０ｋＤａのカットオフＵｌｔｒａ４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−再生セルロース）コンセントレーターを用いた濃縮および希釈方法によって２５ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌに緩衝液交換した。最終濃度は約０．８ｍｇ／ｍＬであった。このプロセスにより、＞９５％純粋である材料がもたらされ、内毒素は低い検出可能レベルであったか、検出できないレベルであった。この材料は、使用する前に＞１カ月貯蔵することができた。一般的な収率は、バイオマス２０グラムに対して、精製された材料およそ１．５ｍｇであった（１Ｌの振とうフラスコでの結果）。
【０２２０】
【表２】
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（実施例３）
パルボウイルスＢ１９・ＶＬＰの分析
ＶＬＰの純度
クーマシーおよびウェスタン分析によってＶＬＰの純度が示された。クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび対応するウェスタンの例が図１６に示されている
ＶＬＰの同定
２つの抗体を用いてＶＬＰの同定を行った。１つの抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＢｉｏＴｅｃｈ  カタログ番号ｓｃ−７１８５２）は、共通のＶＰ２領域を認識し、よって、ＶＰ１とＶＰ２の両方を同定することができる（α−ＶＰ１／ＶＰ２抗体）。第２の抗体（ＵＳＢｉｏ  Ｐ３１１３−８１Ｄ）は、ＶＰ１に独特の領域だけを認識し、よって、ＶＰ１のみを同定することができる。完全に煮沸されていない画分が還元されると、ＶＰ２の二量体がなお目に見える。予測通り、α−ＶＰ１抗体で膜をプローブすると、ＶＰ２バンドは存在しないが、同じＶＰ１バンドが目に見える。
【０２２１】
ＶＬＰの特徴
ＶＬＰに集合しなかったタンパク質を除去するためにスクロース棚を用いてＶＬＰを選択した。精製されたＶＬＰを、単量体の含有量について、ＳＥＣ、ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ、ＤＬＳおよび電子顕微鏡法を用いて分析した。結果により、ＶＬＰが、ＶＬＰを代表する単一の高分子量種で＞９９％であることが確認された（図１７）。
【０２２２】
ＶＬＰの安定性
ＶＬＰは、ＭＦ５９中および２５ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中の両方で、４℃で少なくとも３カ月安定に見えた。これは、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ、パルボウイルスに特異的な抗体を用いたウェスタン、ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥおよび電子顕微鏡法を用いて検査した。さらに、ＶＬＰは、０．０５％ＳＤＳを用いて分裂させて単量体にすることができたが、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ではできなかった。
【０２２３】
内毒素検査
タンパク質を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳシステムを用いて内毒素について分析した。これは、内毒素のＬｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ検出を用いるカートリッジに基づくシステムである（製品コードＰＴＳ２０）。アッセイを、Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｕｆｆｅｒ（製品コードＢＧ１２０）を製造者の指示通りに用いて実施して、二次的な活性化経路を通じてβ−グルカン（酵母細胞壁の成分）によって生じる偽のバックラウンドシグナルを減少させた。複数のアッセイからの結果により、材料の用量５μｇ当たりの範囲が０．０３６ＥＵ／用量から検出可能限界の０．０１３ＥＵ／用量を下回るまでであろうことが実証された。
【０２２４】
（実施例４）
マウスの免疫原性データ
Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝１０）において免疫原性を試験した。免疫前の血清を、第１の免疫化の前日に取得した。免疫化は、異なるアジュバント（リン酸緩衝生理食塩水、ミョウバン、またはＭＦ５９）とともにさまざまな濃度（０．０５μｇ、０．５μｇまたは５μｇ）のＩＭによって施した。２０日目にマウスから採血し、２１日目にマウスに第２の免疫化を受けさせた。第２の免疫化の３週間後（３ｗｐ２、４１日目）にマウスから再度採血し、４２日目にマウスに第３の免疫化を施した。５６日目（２ｗｐ３−第２の２週間後）および８４日目（６ｗｐ３−第３の６週間後）に血清試料を再度取得した。
【０２２５】
各ワクチン群について血清をプールした（ＰＢＳワクチン接種についてｎ＝５、他の全ての群についてｎ＝１０）。パルボウイルスＢ１９・ＶＬＰでコーティングしたプレートを用いてＩｇＧ  ＥＬＩＳＡを実施した（図１２）。ＭＦ５９処方物で最も高い力価が実証され、各用量濃度で同様であった。
【０２２６】
（実施例５）
細胞に基づく中和
中和アッセイは、ｑＲＴ−ＰＣＲに基づき、ウイルス基質としてＣＤ３６＋およびおよびグロボシド＋（主要な細胞受容体）である赤血球前駆細胞を用いた。アッセイにより、感染中にのみ存在するＲＮＡ配列の存在または非存在を測定した。中和力価を決定するために、血清を、ウイルスと一緒にプレインキュベートした後、細胞と混合した。４８時間後に細胞を回収し感染についてプローブした。免疫化したマウスについての最も高い中和力価は、６×１０４であった。このアッセイで検査した回復期のヒト血清は、１×１０４の中和力価（ＩＣ５０）を有した。
【０２２７】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１７】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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