(57)【要約】インフルエンザ免疫原として有用な新規組成物を提供するための方法を提供する。その組成物は、通常は宿主により認識されない免疫原の部位に対する宿主の応答を可能にする。その新規の免疫原はワクチンとして、または抗体を開発するために用いることができる。【選択図】図３
2013518059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ウイルスにおけるように免疫優性ではないインフルエンザの免疫原性エピトープを含む、単離された組成物。
【請求項２】
ヘマグルチニンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ノイラミニダーゼを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
インフルエンザウイルス粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記の粒子が不活化されている、弱毒化されている、または非感染性である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記の組成物が糖鎖付加部位の追加または除去を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記の組成物がアミノ酸の追加、置換または欠失を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ウイルス様粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
インフルエンザウイルスの表面上に発現した、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
さらに医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤または賦形剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記のインフルエンザがヒトインフルエンザ、トリインフルエンザ、ブタインフルエンザ、イヌインフルエンザまたはウマインフルエンザである、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0001]  ヒトおよび獣医学の領域（ａｒｅｎａｓ）における認可されたワクチンの現在の集団は、一般に“クラス１病原体”と呼ばれるものに対して成功している。クラス１病原体（例えば麻疹、流行性耳下腺炎および風疹ウイルス）は、一般に：（１）乳児、非常に若い子供、子供および若年成人に感染する、または乳児、非常に若い子供、子供および若年成人において最も深刻な疾患を引き起こす；（２）比較的安定な微生物ゲノムを有する；（３）自然回復に帰着する疾患の自然経過を有する；ならびに（４）多クローン性およびマルチエピトープ抗原認識と関係する永続性のある記憶を誘導する病原体である。
【０００２】
[0002]  それに対し、クラス２病原体、例えばインフルエンザウイルス、ＨＩＶ−１、マラリア寄生虫、マイコプラズマ、例えば結核を引き起こすマイコプラズマ、トリパノソーマ、住血吸虫、リーシュマニア、アナプラズマ、エンテロウイルス、アストロウイルス、ライノウイルス、ノーウォークウイルス、毒素産生／病原性大腸菌、ナイセリア、ストレプトマイセス、分類不能（ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ）ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、癌細胞等は、正反対の特徴により特性付けられる。例えば、クラス２病原体は：（１）著しく広範囲の宿主の年齢の範囲において感染および伝染し、感染症が小児期から老年期を通して起こる、および再発する；（２）微生物の遺伝的不安定性を、それらのゲノムの定められた領域において示す（そのような病原体の成功した進化の証明）；（３）一部の場合において、頻繁になお宿主を何度も繰り返される毎年の感染症に対して脆弱にする疾患の自然回復、および／または慢性／活性または慢性／潜伏性感染状態のどちらかの確立が含まれる；（４）狭い株に特異的な保護を提供するか、保護を提供しないか、および／または増進された感染を提供するかのいずれかの、免疫優性エピトープの非常に限られたセットに向けられた、少クローン性の、早期の免疫応答を誘導する；ならびに（５）感染またはワクチン接種の後に免疫調節不全、例えばエピトープブロッキング抗体、非定型的一次免疫応答Ｉｇサブクラス、既往交差反応性リコール（ｒｅｃａｌｌ）および不適切ＴＨ１および／またはＴＨ２サイトカイン代謝を引き起こす。
【０００３】
[0003]  免疫学的レベルで、非常に異なる病因因子は、例えばＨＩＶ−１対ヒトライノウイルスに関して観察されるように、異なる病理発生および疾患の結果をもたらし得る。非常に上手くいく免疫系回避戦略、例えば“見せかけの刷り込み（Ｄｅｃｅｐｔｉｖｅ  Ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）”が進化してきており、宿主および微生物の分類群にまたがって選択され、維持されている。従って、例えば病原体の見せかけの刷り込みに起因する脊椎動物の免疫系の作戦上の失敗は、ＨＩＶ−１に感染しても、一般的な風邪のウイルスに６０年間年に平均２〜６回感染しても、基本的に同じである。
【０００４】
[0004]  抗原の送達および発現に関するいくらかの進歩が一部のクラス２微生物病原体の免疫原性を向上させたが、現在のワクチン技術は、新しい、広く有効かつ安全な、ヒトにおける使用に関して認可されたワクチンに容易に変換されてこなかった。それは、大部分において、脊椎動物の宿主防御系の起源、レパートリーの発達、維持、活性化、老化ならびに類似の、および似ていない環境における共進化を支配する基本的な法則の理解が乏しいことによるものである可能性がある。
【０００５】
[0005]  ヒトインフルエンザワクチンの開発において現在欠けているものは、ホモタイプ性（ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ）および亜型依存性がより低い免疫および保護を誘導し、従って年ごとに現在の卵に基づく技術の生産スキームでの多数の亜型の混合および生産を必要としないであろう組成物である。適切な新規の製品は、インフルエンザウイルスの亜型内抗原変異株およびヘテロ亜型（ｈｅｔｅｒｏ−ｓｕｂｔｙｐｅｓ）の両方を交差中和することができる免疫応答を誘導する、インフルエンザ組み換えＨＡまたはＮＡサブユニットワクチンである。
【０００６】
[0006]  インフルエンザはＮＩＡＩＤカテゴリーＣ病原体であり、米国において毎年３６，０００件の死亡および２２０，０００件の入院を引き起こしている。呼吸器疾患であるインフルエンザは、感染した人の咳またはくしゃみからの飛沫および／または混入した媒介物を通して広がる。より危険性の高いグループには子供および高齢者が含まれ、インフルエンザを有することは一般にインフルエンザ関連肺炎の二次合併症、上気道合併症（子供における中耳炎）および他の系の疾患（例えば心血管等）につながる。インフルエンザは史上最悪の世界的流行の源であり；１９１８年のスペイン風邪は世界中で４０００万件を超える死亡を引き起こした。米国では、毎年のインフルエンザの直接的な医療費（入院、来院、投薬等）は、４６億ドルであると見積もられている。さらに、各年１億１１００万日に及ぶ仕事日が、インフルエンザのために、病欠および失われた生産性で１年に７０億ドルより多いアメリカのビジネスへの関係する費用と共に失われている。深刻なインフルエンザの流行の直接的および間接的な費用（失われた仕事日、失われた授業日等）の合計は、１年につき少なくとも１２０億ドルである。
【０００７】
[0007]  インフルエンザウイルスは、そして二次的細菌感染症を伴う場合、過剰な罹病率および死亡率の原因であることが長い間知られてきた。合併症には、肺炎、気管支炎、うっ血性心不全、心筋炎、髄膜炎、脳炎および筋炎が含まれる。合併症に関して高い危険に晒されている人々のいくつかのグループは、慢性の肺または心血管の障害を有する人々、老人ホームが含まれる長期療養施設の居住者、および８５歳以上の人である。(インフルエンザの予防および制御に関する予防接種諮問委員会(Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP))の推奨。MMWR, 1996, Vol 45;およびThompson et al., JAMA 2003; 289:179-186)。米国における老年人口は１９７６年と１９９９年の間に２倍になっており、今後数年間に第二次大戦後の団塊の世代が年を取るにつれて上昇すると予想されている。その年齢層の人々は、６５〜６９歳の人よりもインフルエンザと関係する疾患で死ぬ可能性が１６倍高い。１９９０年代におけるインフルエンザと関係する死亡の増大への別の重要な寄与因子は、最近循環している（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）インフルエンザウイルスのより毒性の強い種類であるインフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスの優勢である。
【０００８】
[0008]  インフルエンザは一本鎖リボ核酸（ＲＮＡ）ウイルスであり、それは急速に変異して新しい毒性株になる。その株はインフルエンザＡ、ＢおよびＣの３つのグループに分類される。そのウイルスはさらにヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）という２種類の表面糖タンパク質に基づいて少なくとも１６種類のＨＡおよび少なくとも９種類のＮＡ亜型に分類される。ＮＩＡＩＤ／ＮＩＨにより後援され、１９９６〜２００４年にニューヨーク州から集められた最近のヒトインフルエンザの全ゲノム分析は、同じＨＡを共有しているにも関わらず、多数の、持続性の、系統学的に異なる系統が同じ集団の中で一緒に循環し（ｃｏ−ｃｉｒｃｕｌａｔｅ）、結果として再集合および抗原的に新しいクレードの生成をもたらしていることを明らかにした。ＨＡの抗原的可変性はなおヒトインフルエンザＡウイルスの進化に対する最有力な選択圧であるが、抗原的に新しいクレードが抗原連続変異によってではなく持続性のウイルス系統の間での再集合により生じるという発見は、現在の時代遅れの例年のインフルエンザワクチン株の選択および生成の方法に関して非常に重要である(Holmes et al., PLoS Biol. 2005 3(9):e300)。インフルエンザは、ブタ、鳥類、ウマ、イヌおよび他の哺乳類から得ることができる。
【０００９】
[0009]  例年の世界的なウイルス追跡プログラムおよびその後に続く“反動的（ｒｅａｃｔｉｏｎａｒｙ）”ワクチン生産における問題の中心にあるのは、抗原変異の問題である。抗原変異は、通常は多数の関連する遺伝子のコピーを含む、個々のタンパク質抗原の相同体をコードする特定の病原遺伝子（単数または複数）の急速な配列の変動を確実にするための進化した機構であり、それは結果としてその病原体の表面上の抗原の構造の変化をもたらす。従って、感染または再感染の間宿主の免疫系はその病原体を認識する可能性がより低く、宿主がその疾患と戦い続けることができる前にその変化した抗原を認識するために新しい抗体を作らなければならない。結果として、その宿主はそのウイルス性疾患に対して完全に免疫がある状態に留まることができない。その現象は、今日の最新のワクチン開発に挑戦する、より手ごわい、もしかすると最も手ごわい問題の１つである。
【００１０】
[0010]  驚くべきことではないが、全ての現在認可されているワクチンを用いた感染またはワクチン接種の後生じる免疫応答は、非常に亜型および株特異的である。実際、それは天然の、実験的な感染およびワクチン接種の間に誘発される抗体は、その相同なウイルスだけを中和することができることを意味する。その亜型／株特異的体液性免疫応答は、ヘマグルチニン分子の球状頭部上に見出される様々な抗原部位の相対的免疫優性によるものであるようである(Wiley et al., Nature, 1981; 289:373-378)。より具体的には、その抗体反応はＨＡの球状頭部内の５つの主要な抗原部位に位置づけられている。その５つのＨＡエピトープ（Ａ〜Ｅ）の内で、ＡおよびＢの２つの部位は最も免疫優性であり、部分的にはそのウイルスの“抗原連続変異”としてまとめて知られている繰り返し起こる点変異、Ｎ−結合型糖鎖付加部位の欠失および時々の導入による最も高い量のアミノ酸超可変性とも関係している(Cox & Bender, Semin. Virol. 1995; 6:359-70; Busch et al., Sci. 286:1921, 1999; Plotkin & Dushoff, PNAS 100:7152, 2003;およびMunoz & Deem, Vaccine 23,1144, 2005)。
【００１１】
[0011]  Francis (Ann. Int. Med., 1953, 399:203)により１９５３年に最初に記述された抗原原罪は、相同なワクチンまたは入ってきたウイルス亜型／株によってではなく交差反応するワクチンまたは入ってきたウイルス亜型／株により追加免疫された際に、結果として入ってきた抗原とよりも以前の抗原とよく反応する新しく形成された抗体をもたらす一次免疫応答である。
【００１２】
[0012]  その偶発的なリコールにより導かれる免疫特異性の喪失は、宿主の免疫系に、１回の感染の間および複数の感染の間の両方において変化するウイルスに対する同等かつ強力な体液性応答を搭載するという現実の問題を引き起こす。従って、天然の感染およびワクチン接種がより機能する交差反応性の一次および既往の免疫を生じさせるのに失敗することは、最も保存されており株をまたぐ免疫を生じさせることができる可能性のあるそれらのより免疫原性の低いエピトープに対するレパートリーの発達はその抗原性ヒエラルキー上でより低いため、驚くべきことではない。それにより免疫優性エピトープが免疫応答を抗原上のより保存されており免疫原性のより低い領域から離れるように誤った方向に向ける、その免疫学的現象は、最初は“クローンの優性（ｃｌｏｎａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｃｅ）”と名付けられ(Kohler et al., J Acquir. Immune Defic. Syndr. 1992; 5:1158-68)、それは後に“見せかけの刷り込み”と改名された(Koehler et al., Immunol. Today 1994 (10):475-8)。
【００１３】
[0013]  見せかけの刷り込みの裏にある免疫優性に関する免疫学的機構は完全には理解されておらず、どの機構もどのようにして、またはなぜ特定のエピトープが免疫調節性および免疫優性であるように進化したのかをまだ完全に説明していない。その現象において観察される免疫応答の範囲には、実験動物モデル−ウイルス負荷系において受動的保護を誘導することができる高度に株／分離株特異的中和抗体の誘導から、結合する非保護／非中和、ブロッキング抗体、およびさらにはある場合において宿主の免疫系がすぐ近くの隣接するエピトープを認識するのを妨げてＣＤ４Ｔ細胞の助けを妨害する病原体増進抗体の誘導まで幅広く含まれる。結果としてより狭く焦点を合わせたエピトープのセットをもたらす免疫優性による免疫応答の同じおびき寄せ（ｄｅｃｏｙｉｎｇ）が、宿主のヘルパーおよび細胞傷害性の細胞に仲介される免疫のＴ細胞に関して観察される(Gzyl et al., Virology 2004; 318(2):493-506; Kiszka et al., J. Virol. 2002 76(9):4222-32;およびGoulder et al., J. Virol. 2000; 74(12):5679-90)。
【００１４】
[0014]  ワクチン接種はその疾患を予防するための最高の方法であり、最新の三価死菌ウイルスおよび改変された生きた（弱毒化された）インフルエンザワクチンが、活性なウイルス株の世界中の疫学的監視に基づいて毎年開発されている。両方のワクチンがインフルエンザＡおよびインフルエンザＢ亜型を含有する。その認可されたインフルエンザワクチンは、２種類のインフルエンザＡ亜型（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１種類のインフルエンザＢ亜型からの不活性化された全体または化学的に分割された（ｓｐｌｉｔ）サブユニットの調製物からなる。インフルエンザワクチンの生産には、その選択された変異株の、連続継代または他の高収量株との再集合による卵における高収量のための適応が含まれる。選択されたインフルエンザウイルスを鶏卵中で増殖させ、そのインフルエンザのビリオンを尿膜腔液から精製する。次いで、ウイルス全体または分割されたウイルスの調製物を、不活性化剤、例えばホルマリンを用いた処理により殺す。そのワクチンに関する米国の市場の９０％より多くが、Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ（５０％より大きい市場占有率を有する）およびＣｈｉｒｏｎ（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ）（英国）という２つの会社により供給されている。鼻内ワクチンであるＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）が認可され、２００３年に最初に販売された。
【００１５】
[0015]  現在利用できるインフルエンザワクチンの限界には、以下のものが含まれる：
[0016]  （１）  高齢者における低減した有効性。高齢者の間では、特に入院している高齢者に関して、疾患に対する保護の程度がより低い(Gorse et al., J. Infec. Dis. 190:11-19, 2004)。三価サブビリオン（ｓｕｂｖｉｒｉｏｎ）インフルエンザワクチンに対する有意な抗体反応は、６５歳以上の対象の３０パーセント未満で観察された(Powers & Belshe, J. Infec. Dis. 167:584-592, 1993)；
[0017]  （２）卵中での生成。現在の製造プロセスは、鶏卵に依存している。インフルエンザウイルス株は卵の中で十分に複製しなければならず、各年大量の卵の供給が必要とされている。適切なウイルスの組み合わせを見つける必要があるため、生産は各年危険にさらされている。
【００１６】
[0018]  （３）９０年代後期におけるＡ／シドニー／５／９７のような、遅れて出現する、および連続変異した株に応じることができないこと、または１９９７年に出現した香港Ｈ５Ｎ１ウイルスのような世界的流行の可能性のある株に応じることができないこと；
[0019]  （４）現在の全粒子またはスプリットインフルエンザワクチンによる保護は短命であり、有効性は抗原変異により流行しているインフルエンザの株において遺伝的変化が起こるにつれて衰える。理想的には、そのワクチン株は疾患を引き起こしているインフルエンザウイルス株に合致している。変化は、感染した人からの一次分離株と比較した場合に、卵で増殖させたインフルエンザウイルスのヘマグルチニンにおいて起こる可能性があり(Oxford et al., J. Gen. Virol. 72:185-189, 1989;およびRocha et al., J. Gen. Virol. 74:2513-2518, 1993)、そのワクチンの潜在的有効性を低減させる；
[0020]  （５）ワクチンを卵中で生成させることの、卵に対してアレルギー反応を起こす人に関する副作用；ならびに
[0021]  （６）現在の認可された製造系は、インフルエンザウイルスを感染させた鶏卵あたり１個のワクチンをもたらし、その生産時間はおおよそ２４週間である。
【００１７】
[0022]  従って、現在の認可されたインフルエンザワクチンは：一般的な毎年繰り返し生じる流行の間循環している抗原変異株、ならびに亜型ウイルスおよび再集合ウイルスを中和することができる抗体を誘導することができず；（２）高齢者において強い免疫応答を誘発する（ｉｌｌｉｃｉｔ）ことができず；そして（３）副作用のために広い適用可能性を見出すことができず、例えば一部のワクチンは子供に投与することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】インフルエンザの予防および制御に関する予防接種諮問委員会(Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP))の推奨。MMWR, 1996, Vol 45
【非特許文献２】Thompson et al., JAMA 2003; 289:179-186
【非特許文献３】Holmes et al., PLoS Biol. 2005 3(9):e300
【非特許文献４】Wiley et al., Nature, 1981; 289:373-378
【非特許文献５】Cox & Bender, Semin. Virol. 1995; 6:359-70
【非特許文献６】Busch et al., Sci. 286:1921, 1999
【非特許文献７】Plotkin & Dushoff, PNAS 100:7152, 2003
【非特許文献８】Munoz & Deem, Vaccine 23,1144, 2005
【非特許文献９】Francis (Ann. Int. Med., 1953, 399:203)
【非特許文献１０】Koehler et al., J Acquir. Immune Defic. Syndr. 1992; 5:1158-68
【非特許文献１１】Gzyl et al., Virology 2004; 318(2):493-506
【非特許文献１２】Kiszka et al., J. Virol. 2002 76(9):4222-32
【非特許文献１３】Goulder et al., J. Virol. 2000; 74(12):5679-90
【非特許文献１４】Gorse et al., J. Infec. Dis. 190:11-19, 2004
【非特許文献１５】Powers & Belshe, J. Infec. Dis. 167:584-592, 1993
【非特許文献１６】Oxford et al., J. Gen. Virol. 72:185-189, 1989
【非特許文献１７】Rocha et al., J. Gen. Virol. 74:2513-2518, 1993
【発明の概要】
【００１９】
[0023]  本開示は、部分的に、増進された、または新規の免疫原性を有する新規のインフルエンザ抗原に関する。目的のインフルエンザ組成物は向上したワクチンとしての役目を果たすことができ、それはエピトープの異なる配列および／または新しく認識することができるエピトープを有するウイルスまたはウイルスサブユニット抗原を提供する修飾の結果もたらされる。
【００２０】
[0024]  結果としてサブユニットＨＡ、ＮＡまたは両方、および／または同じものを含有する組成物をもたらす新規の免疫再焦点化（ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｆｏｃｕｓｉｎｇ）技術に結びついた組み換え技術のより有効かつ迅速な使用は、向上した株をまたぐ有効性を有するインフルエンザワクチンを生成することにより、ワクチン開発の現在の慣習を大きく変化させ、それによりそのウイルスの世界的な毎年の追跡の現在の慣習に関する必要性を取り除き、それは、数百万ドル、卵における生産および製造に関する毎年のスケールアップの時間および労力が含まれる転用される医療資源を節約し、ならびに人命を救うであろう。
【００２１】
[0025]  追加の特徴および利点は本明細書において記述され、それは下記の図面および詳細な記述から明らかであろう。
[0026]  下記の図面は本開示の様々な観点を例示するために提供され、決して目的の開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】[0027]  図１は、免疫再焦点化されたＨＡ抗原の試験の結果に関する表１を示す。
【図２】[0028]  図２は、個々の変異体およびそれらの配列に関する表２を示す。
【図３】[0029]  図３は、Ｈ１Ｎ１のＨＡ上の免疫再焦点化変異の例のセットのおおよその位置を描写する。パネルＡは、３個のＨＡ−１およびＨＡ−２鎖を含むＨＡ三量体の構造を描写する。パネルＢ、ＣおよびＤは、選択された変異のおおよその位置におけるアミノ酸を示すＨＡ単量体を描写する。その図はインフルエンザのＨ１Ｎ１のＨＡの構造ファイル１ＲＵ７．ｐｄｂから適合させたものであり(A/PR8/1934, Gamblin et al., Science, 303:1838-1842, 2004)、それはＲＣＳＢタンパク質データバンクにおいても見つけることができる。
【図４】[0030]  図４は、２個および３個のエピトープにおいて組み合わせ変異を提供する表３を示す。
【図５】[0031]  図５は、５個のエピトープにおいて組み合わせ変異を提供する表４を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
[0032]  インフルエンザは、本明細書において、Ａ型、Ｂ型およびＣ型が含まれるウイルスとして定義される。そのウイルスは、鳥類および様々な哺乳類、例えばネコ、イヌ、ウマ、ブタ等において見付けることができる。Ａ型はヒトにおいて最も毒性が強く、結果として季節性の流行、または時折、そしてより稀に、より致死的な世界的流行のエピソードのどちらかをもたらし得る。その型はいくつかの血清型により定義され、それはそのウイルス粒子の表面上に発現された抗原に対する宿主の免疫応答の反映である。ワクチン保護と相関するエピトープの大部分を有するウイルス表面上の２種類の構造物が、ヘマグルチニン（ＨＡまたはＨ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡまたはＮ）である。少なくとも１６種類の既知のＨ亜型および少なくとも９種類の既知のＮ亜型が存在する。ＨＡはウイルスの付着および融合を仲介する。ＮＡはシアリダーゼ活性を有する。
【００２４】
[0033]  “野生型”は、天然起源の生物またはその一部を指す。その用語は、天然のプロセスから生じた天然起源の集団の天然起源の生物中に見出される、例えば自然変異から生じ、遺伝的浮動、自然選択等により維持されている多型において見られる核酸およびタンパク質にも関連し、それには例えば組み替えの手段により得られた配列を有する核酸またはタンパク質は含まれない。
【００２５】
[0034]  “免疫原”および“抗原”は、本明細書において、例えばその分子に結合する抗体またはその分子を発現する細胞、例えばウイルスに感染した細胞を認識するＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、抗体（体液性に仲介される）および／またはＴ細胞由来（細胞に仲介される）の特異的な免疫応答を誘発する分子として互換的に用いられる。その分子は、それに特異的な抗体またはＴ細胞が結合する１個以上の部位を含有することができる。当技術において既知であるように、そのような部位はエピトープまたは決定基として知られている。抗原は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、脂質等、およびそれらの組み合わせ、例えば糖タンパク質またはリポタンパク質であることができる。免疫原性化合物もしくは生成物、または抗原性化合物もしくは生成物は、特異的免疫応答を誘発する化合物もしくは生成物であり、それは体液性、細胞性、または両方であることができる。
【００２６】
[0035]  ワクチンは、免疫防御的応答、すなわち、宿主において免疫原もしくは抗原または同じものを発現するものの負の影響を低減する応答、例えば抗体を生じさせるために用いられる免疫原または抗原である。その投与量は、当技術で既知であるような前臨床および臨床試験から引き出される、推定される、および／または決定される。多数回の用量を、当技術で既知であるように、および長期の予防的または非反応的状態を確実にするために必要である際に、投与することができる。本開示の目的に関するワクチンの有用性の成功したエンドポイントは、結果として例えば目的の抗原または免疫原に結合する血清抗体、または宿主によりいずれかの組織もしくは器官において作られる抗体の産生をもたらす、結果として起こる宿主における誘導された（例えば体液性および／またはＴ細胞に仲介される）免疫応答の存在である。一部の態様において、その何らかの方法で誘導された抗体は、同族の抗原もしくは免疫原を有する化合物、分子および同様のものと結合し、または宿主が病原体を中和する、病原体を低減する、病原体が感染する、および／または臨床疾患を引き起こすのを妨げる、および／または病原体を排除するように誘導する。その免疫応答は、当技術で既知の方法、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット等を実施することにより監視することができる。本開示の目的に関する免疫保護は、曝露された宿主におけるそのような抗病原体、抗免疫原、抗ウイルスおよび同様の免疫応答（例えばその免疫原または感染した細胞に結合する抗体および／またはＴ細胞）の存在である。それは、あらゆる既知の免疫アッセイ、例えばＥＬＩＳＡおよび／またはヘマグルチニン阻害アッセイを用いて決定することができる。あるいは、例えば循環している中和性抗ウイルス抗体の存在を確かめるために、ウイルス中和アッセイを用いることができる。本開示の目的に関して、宿主において免疫保護、すなわち循環する抗インフルエンザ抗体の存在が少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも１７日間、少なくとも２１日間、少なくとも３０日間、またはより長い間観察されることが、目的のワクチンの有効性の証拠である。あるいは、一般に、そのワクチンを作るために用いられたインフルエンザの相同の単一の株に対しておおよそ１：４０の赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価が、候補ワクチンが得られたことを合図するエンドポイントであり得る。動物モデルにおいて、曝露後の致死性におけるあらゆる遅延は、本開示の目的に関する保護の証拠であり得る。従って、インフルエンザの病原性株に曝露されたマウスの場合では、しばしば曝露後約１０日の時点で最初のマウスが死ぬ可能性がある。従って、曝露されたマウスが死ぬ最初の日が少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、またはより長い日数延長された場合、本開示の目的に関する保護であると考えられる。免疫保護の時間は、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、少なくとも４５日間、少なくとも６０日間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、またはより長い期間であることができる。好ましく���、その免疫保護は、非近交系の集団において、ならびに病原体の異なる形、亜型、株、変異株、アレル（ａｌｌｅｌｅｓ）および同様のものに対して観察される。目的の組成物は、ウイルス粒子、不活化もしくは弱毒化された（改変された生きた）そのウイルス、または例えばＮＡもしくはＨＡのようなそのウイルスのサブユニットを含むことができる。その組成物は、完全な複製するビリオン上に見出されるようなウイルスタンパク質および抗原を発現する構造物として当技術において既知であるが、本開示の文脈においては免疫的に鈍らせた（ｉｍｍｕｎｏｄａｍｐｅｎｅｄ）免疫優性エピトープを発現する、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）も含むことができる。通常、ＶＬＰは核酸の複製を可能にするウイルス核酸またはその一部を欠いており、それによりＶＬＰを非感染性にしている。
【００２７】
[0036]  別の態様において、抗原、決定基またはその一部を野生型のウイルスのゲノムの中にクローニングし、相同な野生型の遺伝子（単数または複数）を置き換えることができる。そうすると、その組み換えウイルスはその免疫的に鈍らせた分子の他は野生型のウイルスと同じである。そのウイルスはインフルエンザまたは別のウイルスキャリヤーであることができる。従って、例えば卵において十分に増殖するインフルエンザウイルスの株を免疫的に鈍らせた分子を発現するように操作することができ、その組み換えウイルスを既存の卵を用いるワクチン生産の材料および方法を用いて増殖させて免疫的に鈍らせたワクチンを得ることができる。そのワクチンを、１種類の抗原、２種類の抗原、またはより多くの抗原に対する；１種類のウイルスに対する、ウイルスの２種類以上の別々の系統、株、クレード等に対する；１つのエピトープ、２つのエピトープ、またはより多くのエピトープに対する；１つの血清型、２つの血清型、またはより多くの血清型に対する；等の免疫応答を生じさせるように合わせることができる。それは、複数の構成要素、組成物、ウイルス、ＶＬＰ等を含ませることにより得ることができ、ここで前記の構成要素、組成物、ウイルス、ＶＬＰ等の１つは目的の免疫的に鈍らせた抗原を発現し、それは複数のＨＡ型、ＮＡ型または両方に対する応答を生じさせることができる。あるいは、その複数の要素を単一の多機能組成物中で連結することができる。
【００２８】
[0037]  “免疫優性エピトープ”は、その抗原上の他のエピトープおよびその抗原の他のエピトープを効果的または機能的に排除するように宿主において選択的に免疫応答を誘発するエピトープであり、それは部分的または完全であってよい。
【００２９】
[0038]  “エピトープを免疫的に鈍らせること”は、エピトープをその宿主の免疫系がそのエピトープに対する抗体、ヘルパーまたは細胞傷害性Ｔ細胞を生成するのを実質的に妨げるように改変することである。しかし、免疫的に鈍らせることは必ずしも結果として前記のエピトープまたはそのエピトープに対する反応性の完全な除去をもたらさない。
【００３０】
[0039]  免疫再焦点化（ＩＲ）または免疫再焦点化技術（ＩＲＴ）は、免疫優性エピトープを発現する病原体に対する有効なワクチンを作り出すために用いることができる。その技法は、例えば高レベルの抗原連続変異を示す免疫優性エピトープを有することにより宿主の免疫応答を回避するために見せかけの刷り込みとして知られる戦略を進化させた生物において適用されるのが最も適切である。そのような免疫優性エピトープは通常はその病原生物の生存可能性に影響を及ぼすことなく変化させることができる複数のアミノ酸の形をとる。免疫再焦点化は免疫的に鈍らせることの同意語である。
【００３１】
[0040]  抗原の免疫優性エピトープを免疫的に鈍らせることは、結果として宿主生物におけるその抗原上の非優性エピトープに対する高力価の抗体またはＴ細胞応答の生成、および／またはそうでなければ比較的免疫的に沈黙している（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｉｌｅｎｔ）エピトープに対する抗体またはＴ細胞応答の新しい力価をもたらすことができる。そのような免疫的に鈍らせた抗原は、中程度に、または高度に可変性の、および／または保存された免疫優性エピトープ（単数または複数）を有する抗原を有する生物に対する有効なワクチンとしての役目を果たすことができる。そのような免疫優性エピトープまたは抗原に対して産生された抗体は、同族の生物に対する有効なワクチンとしての役目を果たすことができる。
【００３２】
[0041]  免疫優性エピトープは、その病原生物に感染した宿主生物からの血清またはＴ細胞反応性を調べることにより同定することができる。その血清を、宿主生物において免疫応答を引き起こしそうなその同定された抗原に結合する抗体の含有量に関して評価する。免疫優性エピトープが存在する場合、血清中の実質的に多くの抗体がその免疫優性エピトープに結合し、その抗原上に、またはその抗原中に存在する他のエピトープにはほとんどまたは全く結合しないであろう。
【００３３】
[0042]  免疫優性エピトープを同定した後、その免疫優性エピトープを、本明細書において教示する材料および方法を用いて本明細書で教示するように、および当技術で設計的事項（ｄｅｓｉｇｎ  ｃｈｏｉｃｅ）として既知であるように、免疫的に鈍らせる。そのような操作は、核酸レベルで、タンパク質のレベルで、炭水化物等のレベルで、またはそれらの組み合わせで、本明細書で教示する、および当技術で既知の方法を実施して行うことができる。
【００３４】
[0043]  例えば、Ｎ結合型炭水化物（ＣＨＯ）の存在は、そのポリペプチドの一次アミノ酸配列により決定することができる。アスパラギン、続いていずれかのアミノ酸、およびセリンまたはスレオニンでの終結からなる三つ組アミノ酸配列（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）（ここでＸはプロリンまたはアスパラギン酸以外のあらゆるアミノ酸である）は、Ｎ結合型ＣＨＯ付加の標的である。当技術で既知の方法および材料を実施してＮ結合型糖鎖付加部位をエピトープに付加する、またはエピトープから除去することができる。
【００３５】
[0044]  例えば、結果として免疫優性Ｖ３ドメイン中の過剰なＮ結合型グリカンの付加をもたらす分子的に導入されたＮ結合型シークオン（ｓｅｑｕｏｎ）（ＮＸＴ／Ｓ）を示すＨＩＶの組み換えｇｐ１２０は、野生型のＶ３エピトープを認識する抗体に結合することができない一方で他の以前は沈黙していた、または免疫原性がより低かったエピトープに対する抗体反応を誘導するような、新規の抗原特性を示した。過剰な炭化水素部分の存在は、そのＨＩＶ−１組み換えウイルスの感染的生存能力を弱めなかった。その組み換え糖タンパク質を用いて免疫した試験動物は、相同および非相同両方の野生型ＨＩＶ−１に対する感染をインビトロで中和する抗体の中程度〜高い力価を示した。従って、ｇｐ１２０／１６０のＶ３ドメイン内の免疫優性エピトープを免疫的に鈍らせることは、同じ抗原上に位置する他の中和エピトープ上に再焦点化するように免疫応答を引き起こした（米国特許第５，５８５，２５０号および第５，８５３，７２４号を参照）。
【００３６】
[0045]  あるいは、その免疫優性エピトープの特定のアミノ酸を置き換えて、置換して、または欠失させて免疫原性を鈍らせることができる。免疫的に鈍らせることは、その免疫優性エピトープの１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸またはより多くのアミノ酸を、例えばその抗原をコードする核酸の部位特異的変異誘発により置き換える、置換する、または欠失させることにより起こすことができる。核酸および／またはポリペプチドを変化させるための方法は本明細書において提供され、当技術において既知である。
【００３７】
[0046]  免疫的に鈍らせることは、様々な技術のいずれか、例えばそのエピトープの特定のアミノ酸を変化させる、置換する、もしくは欠失させること、または例えばそのエピトープに、もしくはそのエピトープの近くに糖鎖付加部位を追加することにより影響を及ぼすことができる。本明細書で教示するように、その変化は当技術で既知の方法を実施することによりポリペプチドのレベルで、またはポリヌクレオチドのレベルで達成することができる。従って、ポリペプチドは１個以上の分子、基、化合物および同様のものをエピトープ上または中の標的部位に付加する、それから欠失させる、または置換することにより変化させることができる。例えば、特定のアミノ酸を化学的に誘導体化することができ、または余分な基、例えば多糖類、例えばポリエチレングリコールを有するように修飾することができる。
【００３８】
[0047]  免疫原性構造物の操作の後、その変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）（すなわち、目的の操作された抗原、すなわち、目的の免疫的に鈍らせた抗原）の、インフルエンザの１種類以上の免疫優性エピトープに結合する定められた既知の抗体への結合のスクリーニング分析を用いて、免疫的に鈍らせることが起きたかどうかを決定することができる。例えば、その免疫優性エピトープの一次アミノ酸配列に１個以上の変化を含有させるようにポリペプチドを合成することができる。あるいは、その免疫優性エピトープの核酸配列を、免疫的に鈍らせたエピトープを発現するように改変することができる。従って、その核酸配列を、アミノ酸置換、挿入、欠失等を発現するように例えば部位特異的変異誘発により改変することができ、そのいくつかはその免疫優性エピトープに、またはその近くにさらに修飾を導入する、例えば糖鎖付加部位、例えばその免疫優性エピトープに、またはその近くにＮ−糖鎖付加またはＯ−糖鎖付加を引き起こす変異等を導入することができる。
【００３９】
[0048]  従って、目的のポリペプチド中の１個以上の免疫的に鈍らせたエピトープをコードする目的の核酸を、設計的事項として、当技術で既知であるような、および一般に商業的に入手可能な材料および方法を実施して、クローニングおよび／または発現ベクター中に配置することができる。例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、レプリコン等を用いることができ、また、多くのものが商業的に入手可能である。ウイルスベクターには、アデノウイルス、ＡＡＶ、アルファウイルス、ファージ等から得られたウイルスベクターが含まれる。インフルエンザを用いることもできる。目的のベクターを増殖させるための適切な宿主細胞は既知であり、それには原核細胞、真核細胞、細菌、昆虫細胞、哺乳類細胞等が含まれる。その細胞がその目的の組み換えタンパク質を分泌するように設計することができる。そのポリペプチドを精製して免疫原として用いることができる。
【００４０】
[0049]  あるいは、そのポリペプチドをインフルエンザゲノムを含むベクターまたはインフルエンザウイルスの中に、一般にそのポリペプチドが由来する相同なコード配列を置き換えることにより挿入して、前記のインフルエンザウイルス、ウイルス様粒子または構造物、ウイルス表面構造構成要素、サブユニット等の上でのその免疫再焦点化されたポリペプチドの発現を可能にすることができる。
【００４１】
[0050]  従って、その免疫再焦点化技術はベクター技術に依存せず、多数の発現系に適用することができる。従って、その免疫再焦点された抗原は多くの現在利用されている、および新規のワクチンベクターの中に組み込むことができ、それには以下のものが含まれるが、それらに限定されない：１）現在許容できる技術を用いて、例えば培養哺乳類細胞またはニワトリ胚中で産生されるための組み換えインフルエンザウイルス；２）組み換え温度感受性インフルエンザウイルス、例えばＦｌｕ−Ｍｉｓｔ；３）スプリットワクチン；４）昆虫、哺乳類、酵母、細菌、または他の細胞において発現されるサブユニットワクチン；５）ＤＮＡ発現プラスミド；ならびに６）異種ウイルス発現系、例えば、組み換えワクシニアウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、および同様のもの。
【００４２】
[0051]  その免疫再焦点化されたＨＡ抗原を含有する免疫原の精製のための多数の方法が、当技術において既知である。その免疫再焦点化されたＨＡ抗原を組み込む組み換えウイルスを、認可されたワクチンの調製において現在用いられている、確立されて認可された技法を用いて精製する。
【００４３】
[0052]  昆虫、哺乳類または他のインビトロ発現系において生成されたサブユニットワクチンは、一般に行われるクロマトグラフィー、分離および生成、例えばイオン交換、レクチン結合樹脂、サイズ分画、抗体親和性等を用いて精製することができる。加えて、その免疫原を、精製を容易にするように設計された融合ドメインと共に発現させることができる。例えば、ＨＡ抗原を例えばポリヒスチジン融合物として発現させ、金属で活性化された樹脂上での迅速かつ単純化された精製を可能にすることができる。そのような融合パートナーは、そのように望まれるならば、当技術で既知の方法を用いる特異的なタンパク質分解的切断により除去することができる。
【００４４】
[0053]  エピトープ変異タンパク質（野生型と異なる変異体エピトープ）および同様のものを得るための１つの手順は、“アラニンスキャン変異誘発”である(Cunningham & Wells, Science 244:1081 1085 (1989);およびCunningham & Wells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6434-6437 (1991))。１個以上の残基をアラニン（Ａｌａ）またはポリアラニン残基（単数または複数）により置き換える。次いでその置換に機能的感受性を示す残基を、その置換の部位において、またはその置換の部位に関してさらなる、または他の変異を導入することにより精密化することができる。従って、アミノ酸配列の変化を導入するための部位は予め決められているが、その変異の性質自体は予め決められている必要はない。そのスキャンされた残基の望まれる特性に依存して、他のアミノ酸を用いて類似の置換を試みることができる。加えて、代用されるアミノ酸は、例えばその置き換えられるアミノ酸の大きさ、形状または他のパラメーターに基づいて選択されてよい。例えば、大きさおよび形状における変化を最小限にしてエピトープの電荷を低減するために、グルタミンをグルタミン酸の代わりに用いることができる。
【００４５】
[0054]  改変すべきアミノ酸残基を同定するためのより体系的な方法は、免疫系の刺激または免疫優性抗体認識に関わる残基および免疫系の刺激または免疫優性抗体認識にほとんどまたは全く関わりのない残基を同定することを含む。関わっている残基のアラニンスキャンを実施し、それぞれのＡｌａ変異体を、免疫優性エピトープに対する免疫系の刺激または免疫優性抗体認識の低減に関して試験する。別の態様において、免疫系の刺激にほとんどまたは全く関わりのない残基を選択して改変する。改変には、１個以上の残基の削除、残基の置換または目的の残基に隣接する１個以上の残基の挿入が含まれ得る。１態様において、その改変には別のアミノ酸によるその残基の置換が含まれる。保存的置換が最初の置換であり得る。そのような置換が結果として免疫系の刺激の誘導または既知の免疫優性抗体による増大した反応性をもたらす場合、別の保存的置換を行ってより実質的な変化が得られるかどうかを決定することができる。
【００４６】
[0055]  免疫系の応答をその免疫優性エピトープから離れるように変化させるための能力におけるさらにもっと実質的な改変は、ある部位に通常存在しているアミノ酸と特性がより実質的に異なるアミノ酸を選択することにより成し遂げることができる。従って、そのような置換は：（ａ）その置換の領域におけるポリペプチド主鎖の、例えばシートもしくはらせん状立体構造のような構造；（ｂ）その標的部位におけるその分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）その側鎖のかさ（ｂｕｌｋ）を維持しながら行うことができる。
【００４７】
[0056]  例えば、その天然起源のアミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
[0057]  （１）疎水性：メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）およびイソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）；
[0058]  （２）中性、親水性：システイン（ＣまたはＣｙｓ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、スレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）およびグルタミン（ＱまたはＧｌｎ）；
[0059]  （３）酸性：アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）およびグルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）；
[0060]  （４）塩基性：ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）およびアルギニン（ＲまたはＡｒｇ）；
[0061]  （５）鎖の方向付けに影響を与える残基：グリシン（ＧまたはＧｌｙ）およびプロリン（ＰまたはＰｒｏ）、ならびに
[0062]  （６）芳香族：トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、チロシン（ＹまたはＴｙｒ）およびフェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）。
【００４８】
[0063]  非保存的置換は、アミノ酸を別のグループからのアミノ酸と交換することを伴うことができる。保存的置換は、１つのアミノ酸のグループ内からの別のアミノ酸との交換を伴うことができる。
【００４９】
[0064]  好ましいアミノ酸置換は免疫優性エピトープを鈍らせるアミノ酸置換であるが、例えば：（１）タンパク質分解の受けやすさを低減する、（２）酸化の受けやすさを低減する、（３）免疫系刺激活性を変化させる、および／または（４）そのような類似体の他の物理化学的または機能的特性を与える、または改変するアミノ酸置換も含まれ得る。類似体には、その天然由来のペプチド配列以外の配列の様々な変異タンパク質も含まれ得る。例えば、その天然由来の配列または変異タンパク質の配列において単独または多数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）がなされてよい。保存的アミノ酸置換は一般に、そのＲ基または側鎖のかさまたは立体構造における変化に関するものを除いて、その親配列の構造的特徴を実質的に変化させるべきではない（例えば、置き換えアミノ酸は親配列もしくは変異タンパク質配列において生じるらせんを壊す、またはその親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を混乱させる傾向があるべきではない）(Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, ed., W. H. Freeman and Company, ニューヨーク(1984); Introduction to Protein Structure, Branden & Tooze, eds., Garland Publishing, ニューヨーク州ニューヨーク(1991));およびThornton et al. Nature 354:105 (1991))。
【００５０】
[0065]  通常、変化した生物学的特性を有するエピトープ変異体は、その親分子のアミノ酸配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列の同一性または類似性、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびしばしば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。親アミノ酸配列に関する同一性または類似性は、本明細書において、その配列を整列させて必要ならばギャップを導入して最大パーセントの配列の同一性を達成した後の、その親分子の残基と同一（すなわち同じ残基）または類似（すなわち共通の側鎖の特性に基づく同じグループ（上記）からのアミノ酸残基）であるその候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。
【００５１】
[0066]  例えば分子を免疫的に鈍らせるための、または機能的均等物を得るための目的の分子の共有結合的修飾は本開示の範囲内に含まれ、それは免疫的に鈍らせることを除いて増進された、追加の、または異なる特徴または特性を有していてよく、または有していなくてよい。そのようなものは、化学合成により、または適用可能であればその分子の酵素的もしくは化学的切断により作ることができる。その分子の他のタイプの共有結合的修飾を、その分子の標的とするアミノ酸残基を、選択された側鎖と、またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応することができる有機性誘導体化剤と反応させることにより、その分子の中に導入することができる。
【００５２】
[0067]  また、様々な有機化学の材料および方法を実施してエピトープの構成要素を修飾することができる。例えば、ＷＯ０５／３５７２６は、生体分子上に見出される置換基を導入する、修飾する、変更する、置き換える、等のための様々な方法を教示している。
【００５３】
[0068]  例えば、システイニル残基はα−ハロアセテート類（および対応するアミン類）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応してカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じることができる。システイニル残基は、例えばブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸（α-bromo-β-(5-imidozoyl)propionic acid）、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド類、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル  ２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクラ−４−ニトロフェノール（2-chloromercura-4-nitrophenol）またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化することができる。
【００５４】
[0069]  ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化することができる。ｐ−ブロモフェナシルブロミドを用いることもでき、その反応は好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中でｐＨ６．０で実施される。
【００５５】
[0070]  リシニルおよびαアミノ末端残基をコハク酸または他のカルボン酸の無水物と反応させてその残基の電荷を逆転させることができる。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、イミドエステル類、例えばメチルピコリンイミデート、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素および２，４−ペンタンジオンが含まれ、そのアミノ酸はグリオキシル酸と共にトランスアミナーゼに触媒されることができる。
【００５６】
[0071]  アルギニル残基は、１種類の、またはいくつかの一般に用いられる試薬、例えばフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応により修飾することができる。アルギニン残基の誘導体化は、しばしばアルカリ性の反応条件を必要とする。さらに、その試薬はアルギニンと同様にリシンのεアミノ基と反応する可能性がある。
【００５７】
[0072]  チロシル残基の特異的な修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンを用いて行うことができる。例えば、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用いてそれぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成することができる。
【００５８】
[0073]  カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド類（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｃ−Ｒ’）（ここでＲおよびＲ’は異なるアルキル基であることができる）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により修飾することができる。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換することができる。
【００５９】
[0074]  グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、中性または塩基性条件下で頻繁に脱アミド化されてそれぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になる。それらの残基の脱アミド化された形は、本開示の範囲内に入る。
【００６０】
[0075]  他の修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリニルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジンのαアミノ基のメチル化(Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., サンフランシスコ, pp. 79-86 (1983))、ならびにＮ末端アミンのアセチル化およびあらゆるＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【００６１】
[0076]  別のタイプの共有結合性修飾には、グリコシド類、糖、糖類、および同様のものの目的の分子への化学的または酵素的カップリングが含まれる。用いられるカップリング方式に依存して、その糖（単数または複数）を：（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離のカルボキシル基；（ｃ）遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのスルフヒドリル基；（ｄ）遊離のヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基；（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンの芳香族残基；または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。そのような方法は、ＷＯ８７／０５３３０において、およびAplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)において記述されている。糖残基は、例えばグルコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ等を用いて酵素的に付加することもできる。
【００６２】
[0077]  目的の分子上に存在するあらゆる炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に成し遂げることができる。例えば化学的糖鎖除去は、その分子の、結果として連結している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたは全ての糖の開裂をもたらす一方でその分子の残りの部分を完全なままにしておく化合物、トリフルオロメタンスルホン酸、または均等な化合物への曝露を必要とする可能性がある。化学的糖鎖除去は、例えばHakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987)において、およびEdge et al., Anal. Biochem. 118:131 (1981)において記述されている。分子上の炭水化物部分の酵素的開裂は、例えばThotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350(1987)において記述されているような様々なエンドグリコシダーゼ類およびエキソグリコシダーゼ類のいずれかにより達成することができる。従って、マンノシダーゼ、フコシダーゼ、グルコサミノシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｏｓｉｄａｓｅ）、ガラクトシダーゼ等を用いることができる。
【００６３】
[0078]  インフルエンザのＨＡ、ＮＡ等をコードしているＲＮＡまたはＤＮＡは容易に単離され、一般に用いられる手順を用いて（例えばその関連する遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより；Innis et al. in PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic (1990)およびSanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463 (1977)）配列決定される。一度単離すると、そのＤＮＡを発現ベクター中に入れることができ、次いでそれを宿主細胞、例えば大腸菌細胞、ＮＳ０細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞中に入れて、その組み換え宿主細胞中で目的のタンパク質の合成を得る。そのＲＮＡまたはＤＮＡはまた、例えば塩基を置換して特定の宿主細胞におけるコドン使用頻度に関して最適化することにより、または異種のポリペプチドのコード配列に共有結合的に連結することにより修飾することができる。
【００６４】
[0079]  このように、本明細書で教示するように、１個以上の免疫的に鈍らせたエピトープをコードし、発現する目的のポリヌクレオチドを、当技術で既知であるような分子生物学ならびに組み換えの材料および方法を実施して発現させ、目的の組み換えポリペプチドの源を得ることができる。
【００６５】
[0080]  別の態様において、１個以上の免疫的に鈍らせたエピトープをコードする目的のポリヌクレオチドを、インフルエンザゲノム中の相同な野生型の配列と置き換えて、その１個以上の免疫的に鈍らせたエピトープを発現するウイルス、ウイルス様構造物またはそのサブユニットをもたらすことができる。従って、そのウイルス株を標準的な技法、例えば現在用いられている卵に基づく技術を用いて増殖させて免疫原を生成することができ、それをワクチンとして単独で用いることができ、または現在の二価および三価ワクチンを模するために他の有効薬剤、例えば改変されていないウイルスもしくは複数のウイルスと組み合わせることができる。
【００６６】
[0081]  インフルエンザウイルス、抗原、それらの構成要素、サブユニット、ＨＡ、ＮＡおよび同様のものの“機能性断片、部分、変種、派生物または類似体”および同様のもの、ならびにそれらの形（ｆｏｒｍｓ）という語句および用語、ならびにそれらの組み合わせは、その変種、派生物、類似体および同様のものが由来する野生型または親要素または元の免疫的に鈍らせていない抗原と共通する質的生物学的活性を有する要素を指す。例えば、ＨＡの機能性部分、断片または類似体は、天然のＨＡが刺激するように免疫応答を刺激する機能性部分、断片または類似体であるが、その応答はそのＨＡ上の異なるエピトープに対してであってよい。
【００６７】
[0082]  従って、目的のウイルスの機能的均等物、またはその部分もしくは派生物は、本開示の範囲内に含まれる。用語“機能的均等物”には、インフルエンザに対する免疫応答を刺激する能力を有するウイルスおよびその部分が含まれる。
【００６８】
[0083]  従って、一度候補となる免疫的に鈍らせたポリペプチドが同定されたら、免疫的に鈍らせる、および以前は沈黙していたエピトープを発掘する（ｕｎｃｏｖｅｒｉｎｇ）目的を維持しながらそのアミノ酸配列に改変を行うことは、十分に当業者の技術の範囲内である。従って、例えば、そのコード核酸を本明細書で言及する２つの目標に悪影響を及ぼさないアミノ酸挿入、欠失または置換をコードするように改変することができる。別の態様において、そのアミノ酸は、本明細書で言及する２つの目標に悪影響を及ぼさない限りで当技術で既知の材料および方法を実施して修飾、誘導体化、置換等がなされる。本明細書で教示するように、元の免疫的に鈍らせたポリペプチドからのそのような変化および改変は、その機能的均等物であると考えられる。免疫的に鈍らせることの程度は、本明細書で教示するような、または当技術で既知であるようなインビトロまたは動物アッセイにおいて定量化することができる。同様に、以前は沈黙していたエピトープに対する応答を可能にすることの程度は、本明細書で教示するような、または当技術で既知であるようなインビトロまたは動物アッセイにおいて定量化することができる。元の免疫的に鈍らせた配列に対して改変がなされた場合、本明細書で教示する２つの目標の一方の程度における許容できる低減の程度は設計的事項である。一般に、反応性の２５％より大きくない低減は、通常、その望みはその免疫優性エピトープに対する反応を可能な限り少なくすることであるため、許容される。従って、元の免疫的に鈍らせた配列に対する改変が例えば、例えばその免疫優性エピトープに対する抗体を用いるＥＬＩＳＡにおいて決定されるようなそれに対する反応性の元の免疫的に鈍らせたエピトープにおける無反応と比較した２５％の復帰を示す場合、それは機能的均等物に関する反応性における許容できる低減と考えることができるであろう。２０％より大きくない低減、１５％より大きくない低減、１０％より大きくない低減、５％より大きくない低減、または低減なしは、免疫的に鈍らせた抗原の機能的均等物に関して許容できると考えられる可能性がある。同様に、以前は沈黙していたエピトープに対する今の反応性に関して、２５％より大きくない低減は、通常、その望みはその以前は沈黙していたエピトープに対する反応を可能な限り多くすることであるため、許容される。従って、元の免疫的に鈍らせた配列に対する改変が例えば、例えばその以前は沈黙していたエピトープに対して産生された抗体を用いるＥＬＩＳＡにおいて決定されるようなその以前は沈黙していたエピトープに対する反応性の元の免疫的に鈍らせたエピトープにおける最大限の反応性と比較した２５％の低下を示す場合、それは機能的均等物に関する反応性における許容できる低減と考えることができるであろう。２０％より大きくない低減、１５％より大きくない低減、１０％より大きくない低減、５％より大きくない低減、または低減なしは、以前は沈黙していたエピトープを発現する抗原の機能的均等物に関して許容できると考えられる可能性がある。
【００６９】
[0084]  目的のインフルエンザウイルスの一部、例えばＨＡ、ＮＡ、Ｍ２または組み合わせを有する膜または非膜製剤、およびあらゆる他のインフルエンザ抗原の製剤は、当技術で既知の方法を実施して得ることができる。１個以上の免疫優性非保護的エピトープ（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｏｎ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ）（ＩＤＮＰＥ、それには株特異的であるがより幅の狭い免疫を刺激するエピトープも含まれる）を、例えば分子内改変（例えば削除、電荷の変更、１個以上のＮ結合型シークオンの追加等）により除去して、または鈍らせて抗原として未処置の動物に与える場合、ＩＤＮＰＥに対する変更は、ＢおよびＴ細胞レベルのどちらかまたは両方において、準優性（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）の、または以前は沈黙していたエピトープに対して新しい免疫応答のヒエラルキーを誘導し得る(Garrity et al., J. Immunol. (1997) 159(1):279-89)。本明細書において記述されるその技術は“免疫再焦点化”として知られている。
【００７０】
[0085]  一度変更がなされたら、その変更がここで改変された免疫優性エピトープ、その“鈍らせたエピトープ、抗原等”の反応性を変化させる、例えば低減するかどうかは、本明細書で教示するように、または当技術で既知であるように決定される。それは、その鈍らせた抗原のその優性エピトープと反応することが知られている定められた抗血清との反応性を、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにより決定することにより、インビトロで試験することができる。それらの定められた抗血清との低減した反応性を示す候補を、それらの鈍らせた抗原が免疫原性でありその宿主がそれに対する免疫応答を生じるかどうかを決定するためのインビボでの試験のために選択する。従って、例えば、当技術で既知であるようにマウスをその鈍らせた抗原に対して免疫し、血清を得てそれとの反応性に関してインビトロアッセイで試験する。次いでその抗血清を野生型のウイルスに対して試験して、その抗体がまだその野生型のエピトープまたはその野生型の抗原を認識するかどうかを決定することができる。それは例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおいて行うことができる。後者は情報価値があり、その特定の免疫優性エピトープが結合するかどうか、ならびにその抗血清がインフルエンザと反応性であるままである場合、そのマウス抗血清と反応性であるエピトープを有する分子の大きさ、およびおそらく正体を明らかにすることができる。
【００７１】
[0086]  免疫再焦点化されるワクチンの候補は、適切な免疫応答の刺激のために、正確に折りたたまれるように、および天然同様の立体構造的エピトープの形をとるように設計される。抗原性試験の前に、精製したＨＡ抗原の立体構造依存性抗体および細胞表面上のウイルス受容体に結合する能力を評価するのが慣習的である。そのような相互作用を評価するための方法は当技術で周知であり、広く利用可能である。
【００７２】
[0087]  商業的ワクチンとしての免疫再焦点化された抗原の開発の前に、非臨床試験がしばしば必要とされる。１つの方法において、動物、例えばマウス、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ラット、フェレット等にその免疫再焦点化されたワクチンの候補を注射し、またはそうでなければそれで免疫する。免疫処置の後、その免疫血清の集団（ｐａｎｅｌ）を、精製された抗原またはウイルスに対する反応性（結合活性）、赤血球凝集阻害（ウイルス受容体相互作用の阻害、ＨＩ）およびウイルス中和（培養細胞の感染の阻害、および／または培養細胞における複製の阻害、ＶＮ）が含まれる多数の活性に関して評価する。血清反応性を評価するための方法は、当技術で周知である。
【００７３】
[0088]  免疫再焦点化された抗原で免疫した動物からの血清の非相同ＨＩおよびＶＮ活性の、変異していない抗原で免疫した動物からの血清との比較を用いて、防御免疫の幅の広がりおよび防御免疫への向上を評価する。従って、ＨＩおよびＶＮアッセイを、その抗原性試験において産生された様々な免疫血清を用いて、Ｈ１Ｎ１の非相同株またはインフルエンザウイルスの他の血清型に対して実施する。試験血清のＨＩまたはＶＮ力価の、改変されていない抗原での免疫処置からの血清と比較した増大は、前記の試験血清を産生させるために用いられた抗原が、幅の広がった、および向上した免疫を刺激することを示す。
【００７４】
[0089]  目的のワクチン候補の選択の分析の範例をさらに例示するため、図１の表１において仮定的なデータセットを提供する。免疫再焦点化されたＨＡ抗原（Ｍｕｔ  Ｈ１、Ｍｕｔ  Ｈ２、Ｍｕｔ  Ｈ３およびＭｕｔ  Ｈ４）はＡ／カリフォルニア／０４／２００９株に由来しており、それを相同および非相同のウイルスに対する抗ウイルス活性に関して試験する。非相同のウイルス（株２〜４）を、親であるカリフォルニア／０４／２００９（Ｃａｌ／０４／０９）株からの抗原性の相違の増大の順に示す。全ての免疫原は、改変されていない抗原（ＷＴ−ＨＡ）により誘導されたＨＩおよびＶＮの力価と同等のＨＩおよびＶＮの力価を刺激した。Ｍｕｔ−Ｈ１からの血清は、両方のアッセイにより決定した際に、株２〜４に対して、ＷＴ−ＨＡからの力価と比較して統計的により高いレベルの抗ウイルス活性を含有する。Ｍｕｔ−Ｈ２およびＭｕｔ−Ｈ３からの血清は株２に対して２倍の高さのＨＩおよびＶＮ活性の力価を有するが、それはその血清希釈系列が２倍希釈で行われた場合、統計的に有意ではない可能性がある。しかし、Ｍｕｔ−Ｈ２およびＭｕｔ−Ｈ３からの血清は、より高度に異なる株３および４に対して、有意により高いＨＩおよびＶＮの力価を有する。表１において示すデータの分析は、Ｍｕｔ−Ｈ１またはＭｕｔ−Ｈ２が通常インフルエンザの前臨床試験において相関物として測定される最も高いレベルの抗ウイルス活性を刺激することを示唆している。
【００７５】
[0090]  追加の動物モデル試験を実施して、免疫再焦点化された抗原の候補の防御免疫をさらに評価することができる。そのような試験の１例において、フェレットのグループを改変されていない抗原またはリードする（ｌｅａｄｉｎｇ）免疫再焦点化された候補（例えば表１で示したＭｕｔ−Ｈ２）で免疫する。免疫処置後、そのフェレットの２つのグループをサブグループに分け、それぞれのサブグループに、インフルエンザの相同または非相同の株のどちらか、例えば表１において言及した株からのウイルスを接種する（負荷をかける）。負荷後２週間の間、疾患、病理発生およびウイルス複製の測定結果を集める。Ｍｕｔ−Ｈ２で免疫し、非相同の株で負荷をかけたフェレットがＷＴ−ＨＡで免疫したグループと比較して疾患およびウイルス複製を低減させたことを示すその測定結果の分析は、Ｍｕｔ−Ｈ２は幅の広がった免疫を刺激し、向上したワクチン候補であることを示している。
【００７６】
[0091]  もはや親免疫優性抗原に結合する既知の抗血清とはほとんどまたは全く反応しないが宿主において免疫原性のままである、それらの候補となる免疫的に鈍らせた抗原を、さらなる試験のための候補ワクチンとして選択する。候補は、免疫認識のための免疫再焦点化されたエピトープを標的化する一方で、親免疫優性抗原に対する増進された反応性を刺激してもよい。例えば、それに対するマウス抗血清を標準化された抗ウイルスに基づくアッセイにおいていくつかのインフルエンザ株との反応性に関して試験して、その抗体の反応性がどの程度包括的であるか、すなわち、その鈍らせた抗原上の新規に認識されるエピトープがより広い範囲のインフルエンザ株まで包括的であるかどうか、およびその抗体が広い抗ウイルス活性を有するかどうかを決定することができる。
【００７７】
[0092]  従って、組み換えＨＡ（ｒＨＡ）サブユニットタンパク質ワクチンは、インフルエンザウイルスの相同な株からの負荷に対して保護するのに十分であることができる。ｒＨＡは、より高齢の成人においても免疫原として用いることができる。本明細書で教示するような第２世代の免疫再焦点化されたＨＡサブユニットワクチンは、非相同の株に対しても防御免疫を誘導することができるであろう(Treanor et al., J. Infectious Diseases 2006; 193:1223-8)。従って、例えば、目的の候補ワクチンは同族の抗原、例えばＨ１に対してだけでなく、ＨＩの異なる株または分離株に対して、およびＨ２、Ｈ３、Ｈ４等に対しても保護することができる。
【００７８】
[0093]  １態様において、インフルエンザのＨＡおよびＮＡを、宿主の免疫応答を免疫防御的応答、好ましくは多種多様な株等に対して有効な広い範囲およびスペクトルの免疫防御的応答のための新規の標的としてのＨＡおよびＮＡ上の他の非優性部位に再焦点化するための標的として選択した。
【００７９】
[0094]  例えば、ＨＡはＡ〜Ｅとして知られる５個の免疫優性部位またはエピトープを有する。部位ＡにはＨＡ型株のアミノ酸１４０〜１４６が含まれ、それは配列ＫＲＲＳＮＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有する。ワイオミング株において、その部位は既に香港株と比較してそれと関係する３個の糖鎖付加部位を有する。従って、１つのアプローチは、部位Ａにより定められるループ構造を、例えばＫＲＲＳＮＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）配列の例えばＧＧによる置き換えにより除去することである。
【００８０】
[0095]  部位Ｂには、配列ＳＤＱＩＳＬＹＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を有するＨＡのアミノ酸１８９〜１９７が含まれる。それは配列ＫＹＫＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を有するアミノ酸１５８〜１６１と相互作用するらせんを形成する。ＱＩＳの代わりにＮＡＳを用いる；ＳＬＹの代わりにＮＩＴを用いる；１５８においてＫＹＫの代わりにＮＳＴを用いる；そして１５９においてＹＫＹの代わりにＮＴＳを用いるなど、いくつかの可能性のある変更をＢ部位に対して行うことができ、それらの変更の全てがそれらの４つの部位にＮ−糖鎖付加配列を導入する。
【００８１】
[0096]  部位Ｃには、配列ＫＣＮを有するアミノ酸２７６〜２７８が含まれる。ＫＣＮの代わりにＮＣＴを用いることができる。
[0097]  部位Ｄには、アミノ酸２０１〜２２０における大きな逆並行ループが含まれる。そのループ全体を削除することができる。また、部位２０１〜２０３において糖鎖付加部位ＮＩＴをＲＩＴの代わりに用いることができる。
【００８２】
[0098]  部位Ｅには、アミノ酸７９〜８２、ＦＱＮＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）が含まれる。糖鎖付加部位ＮＥＴをＱＮＫの代わりに用いることができる。
[0099]  上記の変更は組み合わせることができ、例えば、部位ＢにおけるＮＳＴおよびＮＴＳの変更のどちらかを、部位Ｃおよび／またはＥに対する提案された典型的な変更と組み合わせることができる。
【００８３】
[00100]  上記の免疫優性部位に対する変化は、本明細書で教示するような、および当技術で既知であるようなクローニング、部位特異的変異誘発、遺伝子合成増幅等により得ることができる。
【００８４】
[00101]  従って、上記のＡ部位の変更は、プライマーＡＴｏｐ：ＧＧＡＡＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＧＣｇｇｃｇｇｔＴＴＣＴＴＴＡＧＴＡＧＡＴＴＧＡＡＴＴＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびＡＢｏｔｔｏｍ：ＣＣＡＡＴＴＣＡＡＴＣＴＡＣＴＡＡＡＧＡＡａｃｃｇｃｃＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＴＧＴＴＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を用いる部位特異的変異誘発により得ることができ、上記の欠失およびその欠失部位におけるＧＧジペプチドの挿入を含有する配列ＧＴＳＳＡＣＧＧＦＦＳＲＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）が得られる。
【００８５】
[00102]  そのＢ部位の変更は、プライマーＢ１Ｔｏｐ：ＣＡＡＡＴＣＡＧＣＣＴＡＴＡＴＧＣＴａａｔＧＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＡＡＴＣＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびＢ１ｂｏｔｔｏｍ：ＧＴＧＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣａｔｔＡＧＣＡＴＡＴＡＧＧＣＴＧＡＴＴＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を用いて配列ＱＩＳＬＹＡＮＡＳＧＲＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を生じる；プライマーＢ２Ｔｏｐ：ＣＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＴＡＣＧＧＡＣａａｔＧＡＣａｃＡＡＴＣＡＧＣＣＴＡＴＡＴＧＣＴＣＡＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）およびＢ２ｂｏｔｔｏｍ：ＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＡＴＡＧＧＣＴＧＡＴＴｇｔＧＴＣａｔｔＧＴＣＣＧＴＡＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を用いて配列ＨＨＰＶＴＤＮＤＴＩＳＬＹＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を生じる；プライマーＢ３Ｔｏｐ：ＣＧＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＡＡＴＣＡａｔＣＴＡｔｃＴＧＣＴＣＡＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）およびＢ３Ｂｏｔｔｏｍ：ＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴＴＧＡＧＣＡｇａＴＡＧａｔＴＧＡＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を用いて配列ＤＳＤＱＩＮＬＳＡＱＡＳＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）を生じる；プライマーＢ４ｔｏｐ：ＧＡＡＴＴＧＧＴＴＧＡＣＣＣＡＣＴＴＡＡＡｔＴＡＣＡｃＡＴＡＣＣＣＡＧＣＡＴＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）およびＢ４ｂｏｔｔｏｍ：ＧＴＣＡＣＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＧＧＧＴＡＴｇＴＧＴＡａＴＴＴＡＡＧＴＧＧＧＴＣＡＡＣＣＡＡＴＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）を用いて配列ＮＷＬＴＨＬＮＹＴＹＰＡＬＮＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）を生じる；ならびにプライマーＢ５ｔｏｐ：ＧＡＡＴＴＧＧＴＴＧＡＣＣＣＡＣＴＴＡＡＡＡａＡＣＡＡＡａｃＣＣＣＡＧＣＡＴＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＴＡＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）およびＢ５ｂｏｔｔｏｍ：ＣＡＴＡＧＴＣＡＣＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＧＧＧｇｔＴＴＴＧＴｔＴＴＴＴＡＡＧＴＧＧＧＴＣＡＡＣＣＡＡＴＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）を用いて配列ＮＷＬＴＨＬＫＮＫＴＰＡＬＮＶＴＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）を生じることにより得ることができる。
【００８６】
[00103]  そのＣ部位の変更は、プライマーＣ１ｔｏｐ：ＧＡＴＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＣＡＴＴＧＧＣＡＡｔＴＧＣＡｇＴＴＣＴＧＡＡＴＧＣＡＴＣＡＣＴＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）およびＣ１ｂｏｔｔｏｍ：ＧＧＡＧＴＧＡＴＧＣＡＴＴＣＡＧＡＡｃＴＧＣＡａＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＣＡＴＣＴＧＡＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）を用いて配列ＳＤＡＰＩＧＮＣＳＳＥＣＩＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）を生じることにより得ることができる。
【００８７】
[00104]  そのＤ部位の変更は、プライマーＤ１Ｔｏｐ：ＣＴＡＴＡＴＧＣＴＣＡＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＡａｔＡＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＣＣＡＡＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）およびＤ１Ｂｏｔｔｏｍ：ＣＴＴＴＴＧＧＴＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＴａｔＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＡＴＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）を用いて配列ＬＹＡＱＡＳＧＮＩＴＶＳＴＫＲＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を得ることにより得ることができる。
【００８８】
[00105]  そのＥ部位の変更は、プライマーＥ１Ｔｏｐ：ＧＡＴＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡＡＴＡＡＧＡｃＡＴＧＧＧＡＣＣＴＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）およびＥ１ｂｏｔｔｏｍ：ＧＴＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＧＧＴＣＣＣＡＴｇＴＣＴＴＡＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）を用いて配列ＤＧＦＱＮＫＴＷＤＬＦＶＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）を生じることにより得ることができる。
【００８９】
[00106]  ＨＡＳ１：ＣＡＧＴＣＣＴＣＡＴＣＡＧＡＴＣＣＴＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）、ＨＡＳ２：ＧＧＴＡＡＧＧＧＡＴＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）プライマーを、ＨＡＳ３：ｃｇｃｇａｔｔｇｃｇｃｃａａａｔａｔｇｃｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）を陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）として用いて、配列決定のために用いることができる。
【００９０】
[00107]  その抗原部位の多くは荷電したアミノ酸残基に富む。別のアプローチは、それらの荷電した残基を、それの変わりにアラニン残基を用いることにより置き換えることである。そのような変更の例には以下のものが含まれる：部位ＡにおいてＫＲＲをＡＧＡに；部位ＢにおいてＫＹＫＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）をＡＹＫＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）に、およびＳＤＱＩをＳＡＱＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）に；部位ＣにおいてＫＣＮをＡＣＮに、ならびに部位ＤにおいてＲＩＴをＡＩＴに。
【００９１】
[00108]  加えて、部位Ｂにおける疎水性チロシン残基の機能を評価するための変異は、ＳＬＹをＳＬＴで置き換えることで得ることができる。
[00109]  Ｂ細胞エピトープに加えて、Ｔ細胞エピトープも免疫的に鈍らせることができる。残基１７７〜１９９の領域における主なＣＤ４エピトープは、既に標的としたＢ部位の外側のＭＨＣクラスＩＩ結合エピトープを含む。残基ＬＹＩＷＧＶＨＨＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）における、Ｔ細胞応答を鈍らせるための変異には、ＬＹＩＷをＶＹＩＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）またはＶＴＩＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）で置き換えること；およびＶＨＨＰをＩＨＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）で置き換えることが含まれる。
【００９２】
[00110]  別の態様において、１個以上の免疫的に鈍らせたエピトープを含む目的の組み換えポリペプチド、または同じものを含むビヒクル、例えばウイルス様粒子、ウイルスのサブユニット組成物を免疫原として用いて、それに対する特異的な抗体または抗血清を得ることができ、それは通常は免疫原性ではないが今は免疫優性エピトープ（単数または複数）を免疫的に鈍らせたため免疫原性であるエピトープを認識する。その抗体は、当技術で既知の材料および方法を用いて作ることができ、従って、動物を免疫して血清を集めることによりポリクローナルであることができ、または免疫グロブリンの投与の現在の実施と同様に同じものに曝露されたヒトから得ることができると考えられ、または既知の材料および方法を実施してモノクローナルであることができる。ヒト化またはヒト抗体を得るための方法を実施すること、ならびに前記の抗体を免疫原性を最小限にするために操作すること、例えば当技術で既知であるように炭水化物、例えばＰＥＧ分子、および他の置換基を付加して、通常は免疫優性ではないエピトープに対するそのインフルエンザ抗体上の免疫原性部位を隠すことは、有益である可能性がある；例えば米国特許第５，８２１，３３７号およびＷＯ０９／３２６６１を参照。その抗体を集めて受動的なワクチン（ｐａｓｓｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅ）として投与することができる。
【００９３】
[00111]  試験のため、例えば前臨床データを得る目的で、目的の免疫原を非ヒト哺乳類に投与する。典型的な非ヒト哺乳類には、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類および他の哺乳類が含まれる。そのような哺乳類は、その配合物を用いて処置する予定の疾患に関する確立された動物モデルであってよく、または目的の免疫原の毒性を研究するために用いられてよい。それらの態様のそれぞれにおいて、用量段階的増大（ｄｏｓｅ  ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ）試験をその哺乳類において実施することができる。
【００９４】
[00112]  規制当局、例えばヒト用の製品に関して米食品医薬品局または欧州医薬品庁からの承認を得るため、生物学的医薬はその関係する規制当局により定められた純度、安全性および効力の基準を満たさなければならない。それらの基準を満たすワクチンを生産するため、その組み換え生物は、例えば伝達性海綿状脳症（本明細書において“ＴＳＥ”と呼ぶ）を含まないことを保証されている培地中で維持することができる。
【００９５】
[00113]  従って、好ましい態様は組み換えサブユニットワクチンの使用に関するが、細菌においてヒトにおける使用のために設計されたプラスミドを選択および維持するために抗生物質耐性マーカーを用いるのがいつも理想的であるとは限らないため、そのワクチンをコードする配列を有するプラスミドは例えば非抗生物質選択マーカーを有することができる。従って、１態様において、本開示は、例えば分解酵素を、前記の分解酵素の基質を炭素の源として含有する培地における細菌の増殖を可能にすることにより、選択マーカーとして利用する選択戦略を提供する。そのような分解酵素の例には、ラクトースの取り込みおよびβ−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＹＺ（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｊ０１６３６、Ｊ０１６３７、Ｋ０１４８３またはＫ０１７９３）が含まれるが、それに限定されない。定められた培地において代謝的利点を提供する他の選択マーカーには以下のものが含まれるが、それらに限定されない：ガラクトースの利用に関してｇａｌＴＫ（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｘ０２３０６）、スクロースの利用に関してｓａｃＰＡ（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｊ０３００６）、トレハロースの利用に関してｔｒｅＰＡＲ（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ５４２４５）、キシロースの利用に関してｘｙｌＡＢ（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＣＡＢ１３６４４およびＡＡＢ４１０９４）、等。あるいは、その選択は毒性アレル、例えばｓａｃＢアレル（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿３９１３２５）を阻害するためのアンチセンスｍＲＮＡの使用を含むことができる。
【００９６】
[00114]  本明細書で記述する新規ワクチンおよび配合物を配合するために用いられる具体的な方法は本開示に重要ではなく、以下のものから選択することができ、またはそれらが含まれることができる：生理的緩衝液(Felgner et al.、米国特許第５，５８９，４６６号(1996))；リン酸アルミニウムまたはアルミニウムヒドロキシホスフェート(例えばUlmer et al., Vaccine, 18:18 (2000))、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬまたはＭＰＬＡとも呼ばれる；Schneerson et al. J. Immunol., 147:2136-2140 (1991)；例えば、Sasaki et al. Inf. Immunol., 65:3520-3528 (1997)；およびLodmell et al. Vaccine, 18:1059-1066 (2000))、ＱＳ−２１サポニン(例えばSasaki et al., J. Virol., 72:4931 (1998))；デキサメタゾン(例えば、Malone et al., J. Biol. Chem. 269:29903 (1994))；ＣｐＧ  ＤＮＡ配列(Davis et al., J. Immunol., 15:870 (1998))；インターフェロンα(Mohanty et al., J. Chemother. 14(2):194-197, (2002))、リポ多糖類（ＬＰＳ）拮抗薬(Hone et al., J. Human Virol., 1: 251-256 (1998))等。アジュバントの使用および商業的入手可能性は、当技術で既知であるように、設計的事項である。
【００９７】
[00115]  目的の免疫再焦点化技術はアジュバントおよび免疫変調成分とは無関係であるため、本明細書で教示する方法を実施して生成された抗原またはそれと反応する抗体は、アジュバント、例えばＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌならびにＮｏｖａｒｔｉｓおよびＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのような会社により開発された新規組成物（例えば、ＭＦ５９およびＡＳ０３）と、ならびに変調成分および増進剤、例えばＣｐＧおよびサイトカイン類と適合する。
【００９８】
[00116]  本明細書における配合物は、処置される特定の適応症に必要である際は、１種類より多くの有効化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する有効化合物を含有してもよい。例えば、さらにアジュバントを提供することが望ましい可能性がある。そのような分子はその意図される目的に有効である量での組み合わせで存在するのが適切である。そのアジュバントは順次、抗原投与の前または後に投与することができる。
【００９９】
[00117]  目的の免疫原は、第２の構成要素、例えば同じものにコンジュゲートした、または同じものと混合された療法的部分と共に、コンジュゲートとして、組み合わせで別々に、使用前に混合して等で療法薬として投与して用いることができ、例えばLevine et al., eds., New Generation Vaccines. 第２版、Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク州ニューヨーク, 1997)を参照。その他の療法剤（単数または複数）は、意図される目的のために用いられるあらゆる薬物、ワクチンおよび同様のものであることができる。従って、その療法剤は、生物学的物質、小分子等であることができる。目的の免疫原は、例えば免疫的に鈍らせた、または免疫的に鈍らせていない、第２のインフルエンザ免疫原性組成物、第３の第２の（ｔｈｉｒｄ  ｓｅｃｏｎｄ）インフルエンザ免疫原性組成物等と共に同時に、または順次投与することができる。従って、目的の免疫的に鈍らせた抗原を既存のワクチンと組み合わせて二価ワクチン、三価ワクチン等を形成することができるが、そのアプローチはその既存のワクチンが卵において作られる場合、その使用を最小限にするであろう。あるいは、目的の免疫的に鈍らせた抗原を１種類より多くの他の抗原、サブユニット、構成要素、ＶＬＰ等と組み合わせて多価ワクチンを形成することができる。
【０１００】
[00118]  用語“小分子”および類似の用語には、ペプチド、ペプチド模倣薬、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、炭水化物、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、モルあたり約１０，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機（ｈｅｔｅｒｏｒｇａｎｉｃ）および有機金属化合物が含まれる）、モルあたり約５，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、モルあたり約１，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、モルあたり約５００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、およびそれらの塩類、エステル類、組み合わせ、ならびに免疫応答を刺激する、または免疫原性である、または望まれる薬理的活性を有するそのような化合物の他の医薬的に許容できる形が含まれるが、それらに限定されない。
【０１０１】
[00119]  従って、本開示の免疫原は単独で、または第２の免疫原もしくはその処置される疾患に関する処置が含まれる他のタイプの処置との組み合わせで投与されてよい。その第２の構成要素は免疫賦活薬であることができる。
【０１０２】
[00120]  加えて、本開示の免疫原を様々なエフェクター分子、例えば異種のポリペプチド、薬物等にコンジュゲートさせてよく、例えばＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰＯ３９６，３８７を参照。免疫原は、療法的部分、例えば抗生物質（例えば療法剤）またはアジュバントにコンジュゲートさせてよい。
【０１０３】
[00121]  本開示の療法化合物は、インフルエンザと関係する少なくとも１種類の症状を緩和する。本開示の製品は、当技術で既知であるような、または本明細書で記述するような医薬的に許容できる組成物中で提供されてよい。用語“生理的に許容できる”、“医薬的に許容できる”等は、連邦もしくは州政府の規制当局により承認されていること、またはヒトにおける使用に関して米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に載っていることを意味する。
【０１０４】
[00122]  目的の製品は、あらゆる許容できる方法で哺乳類に投与することができる。導入の方法には、非経口、皮下、経皮、腹腔内、肺内、鼻腔内、硬膜外、吸入および経口経路、ならびに免疫抑制処置に関して望まれるならば病巣内投与が含まれるが、それらに限定されない。非経口注入には、筋肉内、皮内、静脈内、動脈内または腹腔内投与が含まれる。その製品または組成物は、あらゆる好都合な経路により、例えば注入または大量瞬時注射により、上皮または粘膜皮膚の裏層（例えば口の粘膜、直腸および腸の粘膜等）を通した吸収により投与されてよく、他の生物学的に有効な薬剤と一緒に投与されてよい。投与は全身的または局所的であることができる。加えて、本開示の療法的製品または組成物を、脳室内および髄腔内注射が含まれるいずれかの適切な経路により中枢神経系の中に導入するのが望ましい可能性があり；脳室内注射は、例えばオマヤリザーバーのようなリザーバーに取り付けた脳室内カテーテルにより容易になる可能性がある。加えて、その製品は、特に目的の製品の低下する用量のパルス注入により適切に投与することができる。好ましくは、その投与は注射、好ましくは部分的にその投与が短期であるか長期であるかに依存して静脈内または皮下注射により与えられる。
【０１０５】
[00123]  様々な他の送達系が知られており、本開示の製品を投与するために用いることができ、それには例えばリポソーム、微粒子またはマイクロカプセルへの封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）が含まれる(Langer, Science 249:1527 (1990); Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein et al., eds., (1989)参照)。
【０１０６】
[00124]  その有効成分は、コロイド性薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて、それぞれ例えばコアセルベーション（ｃｏａｓｃｅｒｖａｔｉｏｎ）技法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタシレート）（ｐｏｌｙ−（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中に捕捉されてよい。そのような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences,第１６版, A. Osal, Ed. (1980)において開示されている。
【０１０７】
[00125]  肺投与も、例えば吸入器または噴霧器の使用およびエアロゾル化剤を用いた配合により利用することができる。目的の組成物を患者の肺の中に乾燥粉末組成物の形で投与してもよく、例えば米国特許第６，５１４，４９６号を参照。
【０１０８】
[00126]  本開示の療法的製品または組成物を処置を必要とする領域に局所的に投与するのが望ましい可能性があり；それは例えば（限定としてではない）局所的注入、局所適用により、注射により、カテーテルを用いて、坐剤を用いて、またはインプラントを用いて達成することができ、前記のインプラントは多孔性、非多孔性、またはゼラチン状物質からなり、それにはヒドロゲル類または膜、例えばｓｉｌａｓｔｉｃ膜または線維が含まれる。好ましくは、本開示の製品を投与する場合、それにそのタンパク質が吸収または吸着しない物質を用いるように注意する。
【０１０９】
[00127]  さらに別の態様において、その製品は制御放出系で送達することができる。１態様において、ポンプを用いてよい(Langer, Science 249:1527 (1990); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980);およびSaudek et al., NEJM 321:574 (1989)参照)。別の態様において、ポリマー性物質を用いることができる(Medical Applications of Controlled Release, Langer et al., eds., CRC Press (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen et al., eds., Wiley (1984); Ranger et al., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983)参照;Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989);およびHoward et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)も参照)。さらに別の態様において、制御放出系をその療法的標的の近くに配置することができる。
【０１１０】
[00128]  目的の製品の使用のために持続放出製剤を調製することができる。持続放出製剤の適切な例には、その免疫原を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは成形された物品、例えば薄膜またはマトリックスの形である。そのような持続放出マトリックスの適切な例には、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、分解不能なエチレン−酢酸ビニル、分解可能な乳酸−グリコール酸コポリマー類（例えば乳酸−グリコール酸コポリマーからなる注射可能なマイクロスフェア類）およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。ポリマー、例えばエチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸は１００日間を越える分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲル類はより短い期間の間（ｆｏｒ  ａｎｄ  ｄｕｒｉｎｇ）細胞、タンパク質および製品を放出する。関係する機構に応じた安定化のために、合理的な戦略を考案することができる。
【０１１１】
[00129]  その組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続放出配合物、デポー剤および同様のものの形をとることができる。その組成物は、伝統的な結合剤およびキャリヤー、例えばトリグリセリド類を用いて坐剤として配合することができる。経口配合物には標準的なキャリヤー、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等が含まれることができる。適切なキャリヤーの例が“Remington's Pharmaceutical Sciences,”Martinにおいて記述されている。そのような組成物は、有効量のその免疫原を、好ましくは精製された形で、その患者に適当な投与のための形を提供するために適切な量のキャリヤーと一緒に含有するであろう。当技術で既知であるように、その配合物は投与の方式に合うように構成されるであろう。
【０１１２】
[00130]  その製品の療法配合物は、凍結乾燥された配合物または水溶液としての貯蔵のために、望まれる程度の純度を有するその製品を任意の当技術において典型的に用いられる医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤、賦形剤または安定剤、すなわち緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｆｉｅｒｓ）、非イオン性洗浄剤、抗酸化剤および他の種々の添加剤と混合することにより調製されてよい；Remington's Pharmaceutical Sciences,第１６版, Osol, ed. (1980)参照。そのような添加剤は一般に、用いられる投与量および濃度においてその受容者に対して非毒性であり、従ってその賦形剤、希釈剤、キャリヤー等は医薬的に許容でき、または一般に安全であるとみなされている。
【０１１３】
[00131]  免疫再焦点化されたポリペプチド（それには、他のウイルス性もしくは非ウイルス性ポリペプチドとの組み合わせでの、他のインフルエンザタンパク質が含まれる、混入タンパク質を実質的に含まないサブユニットとして；組み換えウイルス、ＶＬＰにおいて、もしくはウイルスもしくは細胞由来の１種類以上のタンパク質との組み合わせで発現もしくは生成することができる目的のＩＲポリペプチドとして；単離された分子として発現もしくは生成することができ、次いでウイルスもしくは細胞由来の１種類以上のタンパク質と組み合わせることができるＩＲポリペプチドとして；等で生成することができる抗原、その一部、エピトープ、決定基等、またはそれに対する抗体が含まれる）は、実質的に純粋な形で得る、または作ることができる。“単離された”または“精製された”免疫原またはワクチンは、それからその免疫原もしくはワクチンが得られた培地からの混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成された構成要素を含有する用いられた培地の中の化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。用語“細胞下の物質を実質的に含まない”には、細胞を破壊して構成要素にして、それをその細胞の細胞下の構成要素（死細胞および細胞の一部、例えば細胞膜、細胞形骸（ｇｈｏｓｔｓ）および同様のものが含まれる）から分離することができ、それからその免疫原もしくはワクチンを単離する、または組み換えにより生成する、細胞の調製が含まれる。従って、細胞下の物質を実質的に含まない免疫原またはワクチンには、（乾燥重量により）約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２．５％または１％未満の細胞下の混入物または目的の生成物と異なるあらゆる他の要素を有するその免疫原またはワクチンの製剤が含まれる。
【０１１４】
[00132]  本明細書で用いられる際、免疫原またはワクチンを含む液体配合物の文脈における用語“安定性”および“安定な”は、配合物中のその免疫原またはワクチンの、所与の製造、調製、輸送および貯蔵条件下での熱的および化学的凝集、分解または断片化への、例えば１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、またはより長い期間の耐性を指す。本開示の“安定な”配合物は、所与の製造、調製、輸送および貯蔵条件下で、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％以上の生物学的活性を保持する。前記の免疫原またはワクチン製剤の安定性は、当業者に既知の方法により凝集、分解または断片化の程度により評価することができ、それには基準と比較した例えば顕微鏡を用いる物理的観察、粒子の大きさおよび数の決定等が含まれるが、それらに限定されない。
【０１１５】
[00133]  用語“キャリヤー”は、それと共にその療法的物質が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような生理的キャリヤーは、無菌の液体、例えば水ならびに石油、動物、植物または合成由来の油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油および同様のものが含まれる油であることができる。水はその医薬組成物が静脈内に投与される場合に適切なキャリヤーである。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注射可能な溶液のための液体キャリヤーとして用いることができる。適切な医薬的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、エタノールおよび同様のものが含まれる。その組成物は、望まれるならば、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨもしくは緩衝剤も含有することができる。そのキャリヤーには塩および／または緩衝剤が含まれることができる。
【０１１６】
[00134]  緩衝剤は、ｐＨを生理的条件に近い範囲に維持するのを助ける。緩衝剤は好ましくは約２ｍＭから約５０ｍＭまでの範囲の濃度で存在する。本開示と共に使用するための適切な緩衝剤には、有機酸および無機酸の両方、ならびにそれらの塩類、例えばシトレート緩衝剤（例えばクエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物等）、スクシネート緩衝剤（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物等）、タルタレート緩衝剤（例えば酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物等）、フマレート緩衝剤（例えばフマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物等）、グルコネート緩衝剤（例えばグルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物等）、オキサレート緩衝剤（例えばシュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物等）、ラクテート緩衝剤（例えば乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物等）およびアセテート緩衝剤（例えば酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物等）が含まれる。ホスフェート緩衝剤、カーボネート緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、トリメチルアミン塩類、例えばトリス、ＨＥＰＥＳおよび他のそのような既知の緩衝剤を用いることができる。
【０１１７】
[00135]  微生物の増殖を遅くするために保存剤を添加してよく、それは０．２％から１％まで（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加されてよい。本開示と共に使用するための適切な保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾール、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚｙａｃｏｎｉｕｍ  ｈａｌｉｄｅ）（例えば、塩化物、臭化物およびヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン類、例えばメチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールが含まれる。
【０１１８】
[00136]  本開示の液体組成物の生理的等張性を確実にするために等張剤が存在していてよく、それには多価糖アルコール類、好ましくは三価またはより多価の糖アルコール類、例えばグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールが含まれる。多価アルコール類は、その他の成分の相対的な量を考慮して、約０．１重量％〜約２５重量％、好ましくは約１重量％〜約５重量％の量で存在することができる。
【０１１９】
[00137]  安定剤は、機能が充填剤から療法剤を可溶化する、または変性もしくは容器壁面への接着を防ぐのを助ける添加剤まで及び得る、広いカテゴリーの賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール類；アミノ酸、例えばアルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン等；有機性の糖または糖アルコール類、例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、アラビトール、エリトリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロールおよび同様のもの（シクリトール類、例えばイノシトールが含まれる）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー類；硫黄を含有する還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（すなわち約１０残基より小さい）；タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン類；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、糖類、単糖類、例えばキシロース、マンノース、フルクトースまたはグルコース；二糖類、例えばラクトース、マルトースおよびスクロース；三糖類、例えばラフィノース；多糖類、例えばデキストラン等であり得る。安定剤は、免疫原の部あたり０．１から１０，０００ｗ／ｗまでの範囲で存在することができる。
【０１２０】
[00138]  追加の種々の賦形剤には、充填剤（例えばデンプン）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メチオニンまたはビタミンＥ）および共溶媒が含まれる。
【０１２１】
[00139]  本明細書で用いられる際、用語“界面活性剤”は、両親媒性構造を有する有機物質、すなわち反対の溶解度傾向（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｎｄｅｎｃｉｅｓ）を有する基、典型的には油溶性炭化水素鎖および水溶性イオン基からなる有機物質を指す。界面活性剤は、界面活性部分の電荷に応じて、陰イオン性、陽イオン性および非イオン性界面活性剤に分類することができる。界面活性剤はしばしば様々な医薬組成物および生物学的物質の製剤のための湿潤剤、乳化剤、可溶化剤および分散剤として用いられる。
【０１２２】
[00140]  その療法剤の可溶化を助けるため、およびその療法的タンパク質を撹拌に誘導される凝集に対して保護するため、非イオン性界面活性剤または洗浄剤（“湿潤剤”としても知られている）を添加してよく、それはその配合物がそのタンパク質の変性を引き起こすことなく剪断表面応力に曝露されることも可能にする。適切な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート類（２０、８０等）、ポリオキサマー類（ｐｏｌｙｏｘａｍｅｒｓ）（１８４、１８８等）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール類およびポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル類（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）、ＴＷＥＥＮ−８０（登録商標）等）が含まれる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在していてよい。
【０１２３】
[00141]  本明細書で用いられる際、用語“無機塩”は、金属または金属のように作用する基による酸の水素または酸の一部または全部の置き換えの結果として生じる、炭素を含有しないあらゆる化合物を指し、それはしばしば医薬組成物および生物学的物質の製剤において張性（ｔｏｎｉｃｉｔｙ）調節化合物として用いられる。最も一般的な無機塩類は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４等である。
【０１２４】
[00142]  本開示は、約５．０から約７．０まで、または約５．５から約６．５まで、または約５．８から約６．２まで、または約６．０、または約６．０から約７．５まで、または約６．５から約７．０までの範囲のｐＨを有する免疫原またはワクチンの液体配合物を提供することができる。
【０１２５】
[00143]  本開示は、診療所または実験室で見られる市販の冷蔵庫および冷凍庫で見られる温度、例えば約−２０℃から約５℃までにおいて安定性を有する液体配合物のような配合物を含み、前記の安定性は、例えば約６０日間、約１２０日間、約１８０日間、約１年間、約２年間またはより長い期間の貯蔵目的に関して、例えば顕微鏡分析により評価される。本開示の液体配合物は、使用前に室温で少なくとも数時間、例えば１時間、２時間または約３時間の、例えば粒子分析により評価されるような安定性も示す。
【０１２６】
[00144]  希釈剤の例には、リン酸緩衝生理食塩水、膀胱における胃酸に対する緩衝のための緩衝剤、例えばスクロースを含有するシトレート緩衝剤（ｐＨ７．４）、ビカーボネート緩衝剤（ｐＨ７．４）単独、またはアスコルビン酸、ラクトース、もしくはアスパルテームを含有するビカーボネート緩衝剤（ｐＨ７．４）が含まれる。キャリヤーの例には、例えば脱脂乳中に見出されるタンパク質、糖類、例えばスクロース、またはポリビニルピロリドンが含まれる。典型的にはこれらのキャリヤーは約０．１〜９０％（ｗ／ｖ）の濃度で用いられるが、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で用いられるであろう。
【０１２７】
[00145]  インビボでの投与のために用いられる予定の配合物は、無菌でなければならない。それは、例えば滅菌濾過膜を通した濾過により成し遂げることができる。例えば、本開示の細胞下配合物は、濾過により滅菌することができる。
【０１２８】
[00146]  経口製剤の場合、目的の配合物には、摂取のためのより口に合う形を提供するため、香味料、臭気物質、香り、着色料、界面活性剤、結合剤等の１種類以上が含まれることができる。
【０１２９】
[00147]  その免疫原またはワクチン組成物は、優れた医療行為と調和する方法で配合、投薬および投与されるであろう。考慮のための要因には、その疾患の重篤さ、処置される特定の哺乳類、その個々の患者の臨床状態、その障害の原因、その薬剤の送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール作成、および医師に既知の他の要因が含まれる。投与する予定のその免疫原またはワクチンの“療法上有効量”は、そのような考慮すべき事柄により支配されると考えられ、それは標的とする疾患、病気または障害を予防する、改善する、または処置するのに必要な最小限の量であることができる。
【０１３０】
[00148]  抗原またはワクチンの量は、標的の宿主において望まれる体液性および／または細胞に仲介される免疫応答または保護を誘導するのに十分な量である。投与される本開示の免疫原またはワクチンの量は、その対象の種、その宿主の身体的特徴、例えば年齢、体重等、好まれる送達方式等に依存して様々であろう。一般に、用いられる投与量は約１０〜約１５００μｇ／用量であることができる。比較すると、現在のサブユニット製剤はウイルスの３種類の亜型からの要素を含有する。その三価ワクチンは一般に、約７〜約２５μｇのその３種類の寄与している株のそれぞれからのＨＡを含有する。それは目的のワクチン組成物を用量設定するための出発点として役立つ可能性がある。
【０１３１】
[00149]  本明細書で用いられる際、用語“有効量”は、標的とされる疾患の重篤さおよび／または期間を低減する、その１種類以上の症状を改善する、標的とされる疾患の前進を防ぐ、もしくは標的とされる疾患の後退を引き起こすのに十分である、または結果として標的とされる疾患もしくはその１種類以上の症状の発現、再発、開始、もしくは進行の予防をもたらすのに十分である、療法（例えば予防または療法剤）の量を指す。例えば、目的の処置は、ベースラインまたは正常なレベルに基づいて少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％その宿主の生存可能性を増大させる、または疾患の重篤さを低減することができる。別の態様において、療法または予防剤の有効量は、標的とされる疾患の症状、例えばインフルエンザの症状または病気の期間を少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％低減する。用語“療法上有効量”も本明細書において同義語として用いられる。
【０１３２】
[00115]  必要な場合、その組成物には可溶化剤および注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔薬、例えばリドカインまたは他の“カイン”麻酔薬も含まれていてよい。
[00151]  一般に、その成分は別々に、または単位剤形中で一緒に混合されてのどちらかで、例えば有効薬剤の量を示す密封された容器、例えばアンプルまたは小さい袋（ｓａｃｈｅｔ）の中の乾燥した凍結乾燥された粉末または水を含まない濃縮物として供給される。その組成物が注入により投与される予定である場合、それは無菌の医薬グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて分配することができる。その組成物が注射により投与される場合、その成分を投与の前に混合することができるように、注射のための滅菌水のアンプルを例えばキット中で提供することができる。あるいは、そのアンプルは目的の有効薬剤を含有する流体を、例えば使用前に希釈するための濃縮物として、または投与の準備ができた形で含むことができる。別の態様において、目的の配合物は、単一の、使用の準備ができたプレゼンテーション（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）に適した用量および体積で提供される。
【０１３３】
[00152]  本明細書の上記で記述した障害の処置に有用な物質を含有する製品が提供される。その製品は容器およびラベルを含むことができる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が含まれる。その容器は様々な材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成されてよい。その容器には目的の組成物が入っており、無菌のアクセスポート（ａｃｃｅｓｓ  ｐｏｒｔ）を有していてよい（例えば、その容器は皮下注射針により突き通すことができる栓を有する静脈注射用の溶液の袋またはバイアルであってよい）。その容器上の、またはその容器に付随するラベルには、その組成物がインフルエンザを処置するために用いられることが示されている。その製品はさらに、医薬的に許容できる緩衝剤、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液を含む第２の容器を含んでいてよい。それにはさらに、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用のための指示を含む添付文書が含まれる、商業的および使用者の立場から望ましい他の材料が含まれていてよい。
【０１３４】
[00153]  本開示には例えば、例えば能動的または受動的なワクチンとしての使用のための目的の免疫原性またはワクチン組成物、その相同体、誘導体等、および同じものの使用のための説明書等を含むキットも含まれる。その説明書には、その組成物、誘導体等を調製するための指示が含まれていてよい。その組成物は液体の形であることができ、または一般に乾燥した、または凍結乾燥された固体の形で与えられることができる。そのキットは適切な他の試薬、例えば緩衝剤、再構成溶液および意図される使用のための他の必要な成分を含有することができる。予め決められた量の試薬とその使用のための、例えば療法的使用のための説明書の包装された組み合わせが意図される。加えて、他の添加剤、例えば安定剤、緩衝剤および同様のものが含まれてよい。その様々な試薬の相対的な量は試薬の溶液の濃縮物を提供するように変更されてよく、それは使用者に柔軟性、空間の節約、試薬の節約等を提供する。そのキットは送達の手段、例えば針を含有する道具、例えばシリンジを含むことができ、それは場合により必要な時の送達のために目的の組成物を予め装填することができる。
【０１３５】
[00154]  本明細書の上記で論じた参考文献の全ての引用は、あらゆるそのような参考文献が本開示に対する先行技術であるという自認であると解釈されてはならない。本明細書で引用される全ての参考文献を、本明細書にそのまま援用する。
【０１３６】
[00155]  本開示はここで以下の限定的でない実施例により例示されるであろう。
【実施例】
【０１３７】
実施例１
[00156]  上記のように、ワイオミング株（Ｈ３Ｎ２）由来の８種類の免疫的に鈍らせた、および再焦点化されたヘマグルチニン遺伝子を設計し、操作した。例えば、ヌクレオチドを部位特異的変異誘発により置換して、複合炭水化物修飾につながるＮ結合型シークオン、および／またはアミノ酸の欠失および／または電荷の変化を、株特異的エピトープを含有する５個の主要な免疫原性であり高度に変動可能な部位に導入した。
【０１３８】
[00157]  特により大きな抗原性部位において、それぞれの変化による免疫的に鈍らせることの大きさを最大限にする一方で鈍らせるために必要な野生型アミノ酸の変更の数を低減し、一方でその糖タンパク質および受容体結合ドメインの立体構造的複雑さへのあらゆる影響を最小限にするため、Ｎ結合型シークオンの導入を用いた。場合によっては、３アミノ酸ほどの少ない変更しか必要でない。抗原部位Ｂ（１８７〜１９６）は、Ｂ細胞およびＣＤ４ヘルパーＴ細胞のＩＤＮＰＥの両方を標的とする。
【０１３９】
[00158]  研究をはかどらせるため、ＤＮＡおよびタンパク質サブユニットワクチンの両方を操作した。ＤＮＡ免疫処置のため、完全長のヘマグルチニン遺伝子をｐＴｒｉＥｘベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの後ろにクローニングした。哺乳類細胞のｐＴｒｉＥｘ−ＨＡコンストラクトによる一過性形質移入は、天然のウイルスタンパク質に似ているその完全長のヘマグルチニン遺伝子は三量体として発現され、細胞膜抽出物から可溶化することができることを実証した。
【０１４０】
[00159]  ９グループの非近交系マウスをその８種類の変異導入した、および１種類の未改変の完全長野生型ＨＡ糖タンパク質を含有するＤＮＡコンストラクトで免疫した。１０番目のグループを、陰性対照のために空のｐＴｒｉＥｘベクターで免疫した。
【０１４１】
[00160]  ＤＮＡ発現ベクターに加えて、組み換えタンパク質を免疫処置のために生成した。そのＨＡ外部ドメインは、その三量体糖タンパク質スパイクの組み立ておよび宿主細胞受容体の結合のためのドメインを含有する。加えて、その膜貫通および細胞質ドメインの除去は、組み換えＨＡ三量体を培養上清の中に放出させる。従って、その変異導入したＨＡ遺伝子のそれぞれをその外部ドメインの末端で切り詰め、ファージＴ７プロモーターを有するベクターの中にクローニングした。その外部ドメインベクターの、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する組み換えワクシニアウイルスを感染させた細胞中への形質移入は、結果としてその培地中に分泌されるＨＡ三量体の産生をもたらした。その外部ドメイン三量体を、タンパク質免疫原としての使用のために精製した。
【０１４２】
[00161]  マウスを予め採血しておいた。マウスの１つのグループを陰性対照として用いて、他方のグループを未改変（野生型）の抗原で免疫した。
[00162]  実験の別のセットにおいて、主なグループのマウスを、１０マイクログラムの変異導入したＨＡ糖タンパク質のＤＮＡ（０．１ｍＬの滅菌水中）のそれぞれの大腿４頭筋中への注射により免疫した。残りの５週間の後、そのマウスを第２のＤＮＡ免疫処置で追加免疫した。さらに４〜５週間後、そのマウスをそれぞれ１０マイクログラムの精製した外部ドメイン糖タンパク質の２回の皮下免疫処置により再度追加免疫した。第１のタンパク質免疫処置は完全フロイントアジュバント中で配合し、第２のタンパク質免疫処置は不完全フロイントアジュバント中で配合した。最後の免疫処置の２週間後、そのマウスを安楽死させ、血清のために血を抜いた。
【０１４３】
[00163]  その血清を、１）ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ形式における変異体および野生型ＨＡタンパク質への反応性、２）ペプチドＥＬＩＳＡによる線状エピトープの認識、３）立体構造エピトープのプロテアーゼによる分解からの保護、ならびに４）相同および非相同のインフルエンザ株の赤血球凝集阻害およびウイルス中和による機能的試験に関して試験した。
【０１４４】
[00164]  免疫再焦点化されたＨＡサブユニットで操作された抗原の集団で免疫したマウスからの血清は、結果としてＨＡ特異的ＥＬＩＳＡにより測定した際に高い力価の抗血清の生成をもたらした。マウスの全てのグループは、野生型のＨＡに対して１：１００〜３００，０００の範囲の力価を示した。様々な変異導入したＨＡ糖タンパク質のダウンセレクション（Ｄｏｗｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を、その抗血清の標準的なＨＩアッセイにおいて亜型をまたぐＨＩ抗体を示す能力に基づいて行った。
【０１４５】
[00165]  Ｈ３Ｎ２  Ａ／ワイオミング／０３／２００３の変異体Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、ＣＥ、ＣＥＢ４、ＣＥＢ５、およびＤ１は、そのアッセイにおいて用いた非相同ウイルス亜型の集団に対して等しい、またはより高い亜型をまたぐＨＩおよび／またはウイルス中和力価を示した。従って、免疫的に鈍らせることおよび再焦点化は、結果として、標準化され受け入れられている代用のＨＩおよびウイルス中和アッセイによりインビトロで測定した際に有意に向上した亜型をまたぐ抗ウイルス保護を誘導することができるＨＡ糖タンパク質サブユニットワクチンの候補の生成をもたらした。
【０１４６】
[00166]  変異体Ａ２はＨＡのＡエピトープにおける変異であり、ここでＫＲＲＳＮＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）がＧＧにより置き換えられている。Ｂ１はＨＡのＢエピトープにおける変異であり、ここでアミノ酸１９７において糖鎖付加部位が導入されている（ＱＩＳがＮＡＳに）。Ｂ２はＨＡのＢエピトープにおける変異であり、ここでアミノ酸１８９において糖鎖付加部位が導入されている（ＳＤＱがＮＶＴに）。Ｂ３はＨＡのＢエピトープにおける変異であり、ここでアミノ酸１９３において糖鎖付加部位が導入されている（ＳＬＹがＮＩＴに）。ＣＥは２つの変異を含有しており、糖鎖付加部位がＣエピトープ中に位置２７６において導入されており（ＫＣＮ→ＮＣＴ）、糖鎖付加部位がＥエピトープ中に位置８３において追加されている（ＮＫＫ→ＮＫＴ）。ＣＥＢ４はＢエピトープにおいて追加の変異を有するＣＥであり、位置１５８において糖鎖付加部位が追加されている（ＫＹＫ→ＮＳＴ）。ＣＥＢ５はＢエピトープにおいて追加の変異を有するＣＥであり、位置１５９において糖鎖付加部位が追加されている。Ｄ１はＨＡのＤエピトープにおける変異であり、ここでアミノ酸２０１において糖鎖付加部位が導入されている（ＲＩＴがＮＩＴに）。
【０１４７】
[00167]  実験の別のセットにおいて、再焦点化されたポリペプチド抗原を、Ｈ３Ｎ２ウイルスの異なる株と比較した場合のヘマグルチニン阻害力価および血清中和力価に関して試験した。その変異体はＡ／ワイオミング／２００３株に由来していた。上記のように、Ｍ３はＢ２エピトープを有し；Ｍ５はＣＥエピトープを有し；そしてＭ６はＢ４ＣＥエピトープを有する。Ａ／ワイオミング／２００３株ウイルスを野生型陽性対照として、キャリヤー単独を陰性対照として、マウスを様々な変異タンパク質に曝露させた。次いでマウスの血清を、３種類の株：同族のワイオミング株、パナマ／１９９９およびウェリントン／２００４株に対するヘマグルチニン阻害力価に関して試験した。他のマウス血清を、同族のワイオミング株、コリア／２００３、コリア／２００２、福建／２００２、ブリスベン／０９／２００６およびブリスベン／１０／２００７株に対する血清中和力価に関して試験した。キャリヤー単独に曝露されたマウスからの対照血清はワイオミング、パナマおよびウェリントン株と反応する特異的なヘマグルチニン阻害抗体を生成しなかった（力価＝１０）。
【０１４８】
[00168]  野生型のワイオミングウイルスに曝露されたマウスは、ワイオミングおよびウェリントン株と反応し（力価＝１２８０）、パナマ株とわずかに反応する（力価＝２２６）抗血清を生成した。Ｍ５変異体は、ワイオミングおよびウェリントン株と野生型の２倍強く反応し（力価＝２５６０）、パナマ株とごくわずかに弱く反応する（力価＝１９２０）抗血清を生成した。Ｍ６変異体は、パナマ株およびワイオミング株とＭ５変異体が反応するのとおおよそ同じレベルで反応する（それぞれ力価＝２５６０および１２８０）抗血清を生成した。しかし、そのＭ６変異体は、ウェリントン株に曝露された際に全ての他の力価よりも４倍高い力価を有する高度に阻害する抗血清を生成した（力価＝１０２４０）。
【０１４９】
[00169]  従って、免疫再焦点化は結果として、三重に改変された変異タンパク質を用いた場合のウェリントン株に対する非常に高い応答と共に、同族の株とは別に２種類の他の株に対する幅の広がった応答をもたらした。中和試験において、キャリヤーに曝露されたマウスは特異的な抗体を産生しなかった。ワイオミングに曝露されたマウスはワイオミングと強く反応する抗血清を生成し（力価＝６４０）；コリアおよびブリスベン２００６に関する力価はワイオミングの力価の４分の１であり（力価＝１６０）；ブリスベン２００７とは本質的に反応性がなかった（力価＝２０）。Ｍ３変異タンパク質はマウスにおいてワイオミング、ブリスベン２００６およびブリスベン２００７に対して野生型免疫原の４倍反応性である（力価＝２５６０）マウス抗血清を生成した。その抗血清はコリアとは反応しなかった（力価＝３）。Ｍ５に曝露されたマウスはワイオミングと反応する（力価＝８０）抗血清を生成し、それはブリスベン２００６と２倍反応性であり（力価＝１６０）、コリアと３０倍反応性であった（力価＝２５６０）。その抗血清はブリスベン２００７とは実質的に反応しなかった（力価＝２０）。このように、目的の免疫再焦点化された抗原を用いて、３種類の他の株に対する幅の広がった応答が得られた。
【０１５０】
[00170]  従って、目的の組成物は、親株と比較して未来に存在するウイルスに対する、および過去により一般的に見付けられたウイルスに対する防御免疫を刺激した。従って、ブリスベン／０７に基づく免疫再焦点化されたＨ３Ｎ２ワクチンはまだ進化していないウイルスに対する保護的応答を刺激し、それにより次の数年にわたって再配合の必要性を回避するであろう。過去および未来両方の全てのＨ３Ｎ２株に対して保護するように、免疫再焦点化されたワイオミングに基づく、またはブリスベンに基づくワクチンを開発することができる。
【０１５１】
実施例２
[00171]  ブタ様Ｈ１Ｎ１ｖ  Ａ／カリフォルニア／０４／２００９株の免疫再焦点化されたヘマグルチニン抗原の設計は、免疫優性エピトープ、進化および配列の多様性ならびに構造データの分析が含まれる多数の考慮すべき事柄に基づく。免疫応答を免疫優性の非常に可変性の部位から離れ、より幅の広い保護的エピトープに向けて再焦点化するように、以下の変異を設計する。
【０１５２】
[00172]  本明細書で教示するように、免疫再焦点化変異は、糖鎖付加部位の削除、追加または減算（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）、およびエピトープの電荷、ハイドロパシー、またはいくつかの他の化学的特性に影響を与える置換が含まれるいくつかの形をとることができる。糖鎖付加の追加は、比較的大きい部分を有するエピトープを隠す一方で、電荷が抗体が抗原と相互作用する特定の部位上に焦点を変える利点を有する。様々なインフルエンザ株および血清型のＨＡタンパク質の間の高い程度の構造的類似性のため、関連するＡ／ＰＲ８／３４の３Ｄ構造の分析を用いてそのＨＡ配列の推定されるループおよび他の柔軟な部位を同定した。Ａ／カリフォルニア／０４／２００９のＨＡをＡ／ＰＲ８／３４のＨＡと整列させて、ＰＲ８の同定された残基をＣａｌ／０４／０９に置き換えた。
【０１５３】
[00173]  図２は、免疫をより幅広く保護する応答に向けて再焦点化するように意図された一部位変異を示す表２を提供する。最初の提案された変異は、主に糖鎖付加のパターンおよび／または局所的な電荷の要素に影響を及ぼすアミノ酸置換で構成されている。その変異は、株特異的応答に寄与する免疫優性エピトープを同定するために用いられた入手可能な配列および構造データに基づいて選択された。
【０１５４】
[00174]  その配列および変異は表２において、Ｎ末端から開始してＨＡ糖タンパク質に沿ってエピトープ部位に関連付けるように配列されている。Ｄ部位のＣ末端部分（２１４から始まる）および融合ドメイン（３１４から始まる）を含む残基は、表中の空間を節約して使うために埋め合わせた。
【０１５５】
[00175]  その変異は以下のように設計された：
[00176]  （ｉ）エピトープＣの変異Ｍ１およびＭ３ならびにエピトープＥのＭ６およびＭ７は、モノクローナル抗体との結合に関わりがあることが示されている部位の中にある、または密接にその近くにあるものとして選択された。それらは高度に柔軟なループ中にあり、高い配列の可変性を有する領域にあるため、我々はそれらが株特異的免疫に寄与していると予想する；（ｉｉ）変異Ｍ１、Ｍ２、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１４、Ｍ１６、Ｍ１８、Ｍ２０、Ｍ２２、Ｍ２３、およびＭ２５は、糖鎖付加部位を免疫優性の株特異的部位の中に導入する一方で同時にそのエピトープ中のアミノ酸と関係する電荷を変化させるという二重の目的にかなう；
[00177]  （ｉｉｉ）変異Ｍ３、Ｍ４、Ｍ７、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１３、Ｍ１５、Ｍ１７、Ｍ１９、Ｍ２１、Ｍ２４、およびＭ２６は、荷電したアミノ酸残基を荷電していない残基で置換する；
[00178]  （ｉｖ）変異Ｍ５は、糖鎖付加をＥエピトープに追加して（他のＣおよびＥ変異が再焦点化するように）免疫を融合ドメインまたはＨＡ−１  ＨＡ−２融合部位中の保存された要素に向けて再焦点化する特定の目的にかなう；ならびに（ｖ）変異Ｍ２５およびＭ２６は、ＨＡ１−ＨＡ２切断部位および融合ドメイン（表１において部位‘ｆ’で表す）に近接して位置する免疫優性部位を標的として、免疫をこれらの高度に保存された部位に再焦点化する。
【０１５６】
[00179]  図３は、Ａ／ＰＲ８／３４  ＨＡ構造の構造上に重ね合わせた一部位変異の部分集合を同定する。図１は、その変異が主に高度に柔軟なループ中に挿入されて、その組み換えタンパク質の天然同様の折りたたみを乱すことなくエピトープを隠していることを示している。変異のその可変性のループ中への挿入は、ほとんどの立体構造的なエピトープが形成され得ることを確実にする。
【０１５７】
実施例３
[00180]  ＨＡ変異は、例えば既知の方法、例えば部位特異的変異誘発（クイックチェンジ）または例えば遺伝子合成を用いて操作することができる。一般に、クイックチェンジ変異は単一または二重変異の誘導のために用いることができ、一方で遺伝子合成はより複雑な組み合わせのために用いることができる。
【０１５８】
[00181]  一部位変異はそれぞれのエピトープの特定の残基に向けられた免疫再焦点化技法を評価するのに最も有用である。しかし、病原体は長期の免疫圧力を回避するために１個より多くの免疫優性の可変性エピトープ（見せかけのエピトープまたはデコトープ（ｄｅｃｏｔｏｐｅ））を利用するため、向上した免疫再焦点化された抗原は変異を多数の抗原性部位に組み込むことができる。２または３個のエピトープ中に変異を含有する免疫再焦点化されたＨＡ抗原の例を、表３を示す図４において提供する。５個のエピトープ全てにおいて変異を含有する免疫再焦点化されたＨＡ抗原の例を、表４を示す図５において提供する。表３および４の両方において、その変異は表２を示す図２において示した一部位変異の組み合わせで構成される。表３で示すような構造モデルの分析は、選択された変異が電荷、立体阻害、または他の好ましくない結果の点で互いを妨害する見込みが低減されると考えられるような組み合わせ変異の設計において有用である。
【０１５９】
[00182]  免疫再焦点化されたＨＡの候補の評価の目的に関して、一部の組み合わせが糖鎖付加の挿入からなり、一方で他の組み合わせが主にそのエピトープにおける静電荷を低減するだけの置換からなる変異の組み合わせを試験することはためになる。
【０１６０】
[00183]  表中の変異のリストは当技術における教習における例を目的とするものであり、一度教習されたら、類似の部位において、または類似の目的のために設計された追加の変異を、本明細書で教示した材料および方法を実施することにより得ることができる。
【０１６１】
[00184]  実施例３で記述したＨ１Ｎ１  ＨＡ配列に基づく抗原をワクチンとして用いて、全てのＨ１Ｎ１変異株に対する幅の広がった免疫を刺激することができる。本明細書で教示したように、そのＨ１Ｎ１に基づく抗原が他の血清型、例えばＨ２、Ｈ５等からのインフルエンザ株に対する防御免疫を刺激することができるように追加の変異を作ることができる。
【０１６２】
[00185]  本明細書で教示した抗原設計法を用いて、インフルエンザの他の血清型、例えばＨ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７、Ｈ９および他のものに基づくワクチンまたは抗体を生成することができる。
【０１６３】
[00186]  そのような変異は、療法、診断または他の適用のために用いることができる幅広く反応する抗体を生成する目的のために免疫を刺激するように設計することができる。
【０１６４】
[00187]  アジュバントのそのような変異との組み合わせた使用は、交差反応性免疫の幅広さにおける追加の向上をもたらし得る。
実施例４
[00188]  組み換え免疫原の安全性、毒性および効力を、（ｉ）一般的な安全性試験、ならびに急性および慢性毒性試験が含まれる２１  ＣＦＲ６１０における指針に従って評価する。
【０１６５】
[00189]  免疫原性のデータは、ヒトインフルエンザワクチンに十分に応答する、受け入れられている動物モデル（例えばモルモット、マウス、フェレットまたはコトンラット）に由来する。その研究には、その最終製品に関して意図される株を含有するワクチンを用いる用量および投与間隔に従う免疫応答の評価が含まれる。関連する動物モデルにおける免疫原性試験を用いて、特に新規のインフルエンザウイルスのためのワクチンの製造プロセスの実証段階の間の生産の一貫性に証拠を提供する。動物試験のために選択される適切な非臨床エンドポイントには、死亡、体重の低下、ウイルスの排出速度、臨床徴候、例えば発熱、眼鼻分泌等が含まれる。
【０１６６】
[00190]  フェレットまたは他の適切な動物のグループに、３００μｇの目的の免疫原を含有する１００μｌの免疫原を腹腔内に接種する。適切な陰性および陽性対照を用いる。
【０１６７】
[00191]  その動物を、全身の健康状態および体重に関して、感染後１４日間監視する。偽薬を与えられた動物と同様に、免疫原を与えられた動物はその観察期間の間健康なままであり、体重が低下せず、疾患の明白な徴候も示さない。
【０１６８】
[00192]  より厳重な安全性試験のため、動物のグループに３００μｇのその免疫原を注射する。
[00193]  接種の１日後、それぞれのグループ中の３匹の動物を安楽死させ、その脾臓、肺および肝臓のホモジェネートを免疫原に関して分析する。感染後４、８、１２、および１６週の時点で、それぞれのグループ中の３匹の動物を安楽死させ、脾臓、肝臓および肺のホモジェネートを得て、免疫原の存在を評価するために分析する。
【０１６９】
[00194]  その免疫原は、有害な健康への作用が観察されず、その動物の体重が内部標準としての偽薬を接種した動物と比較して正常な速度で増加する場合、安全であると考えられる。
【０１７０】
[00195]  免疫原の急性および慢性毒性を評価するため、フェレットのグループに３００μｇのその免疫原を段階的用量で、または生理食塩水を皮内接種する。
[00196]  接種の３日後、それぞれのグループ中の８匹の動物を安楽死させ、その免疫原のその動物への急性作用を評価する。接種後２８日の時点で、それぞれのグループ中の残りの８匹の動物を安楽死させ、その動物へのあらゆる慢性作用を評価する。両方の時点において、それぞれの動物の体重を得る。加えて、その注射部位の肉眼的病理および外観を調べる。それぞれの時点において血液化学のために血液を採取し、内臓および注射部位の組織病理学を実施する。
【０１７１】
[00197]  他の動物には０、１４および６０日の時点で合計３用量のワクチンを与え、ヘマグルチニンに対する免疫応答をその動物から１０日間隔で収集した血清を用いてＥＬＩＳＡにより測定する。インフルエンザウイルスの中和を、例えばその最初のワクチン接種の８０日後に収集した血清において測定する。
【０１７２】
[00198]  本明細書で記述した現在好まれる態様に対する様々な変更および修正は当業者には明らかであろうことは理解されるべきである。そのような変更および修正は、本主題の精神および範囲から逸脱することなく、ならびにその意図される利点を減らすことなく行うことができる。従って、そのような変更および修正は添付される特許請求の範囲に含まれることを意図する。
【０１７３】
[00199]  本明細書で引用された全ての参考文献を、本明細書にそのまま援用する。
参考文献
【０１７４】
【化１】
2013518059.tif 000003
【０１７５】
【化２】
2013518059.tif 000004
【図１】
2013518059.tif 000005
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図３】
2013518059.tif 000009
【国際調査報告】
2013518059.tif 000010
2013518059.tif 000011