(57)【要約】補給物全体または複数の同位体標識されたアミノ酸を、試験対象の食餌中に導入する。同位体標識されたアミノ酸の大きなパーセンテージを新たに合成されるタンパク質中に対象が取り込むことを確実にするために、十分な量の同位体標識されたアミノ酸を対象に提供する。異なる組織の異なるタンパク質を個々に解析し、かつそれらの量および同位体標識のパターンを測定することができるように、異なる時点で対象から組織試料を取り出し、タンパク質を抽出および分離する。好ましい態様において、本方法論は、何千もの異なるタンパク質に関してインビボでタンパク質代謝回転の速度を測定するために、ペプチドへのタンパク質分解性消化および質量分析法による解析と組み合わせることができる。2013530402.tif 000008
2013530402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に、複数の同位体標識されたアミノ酸から構成される組成物を投与する段階；
標識されたアミノ酸を、対象のタンパク質中に取り込ませる段階；
異なる時点で対象から組織試料を採取する段階；および
採取した組織試料を解析する段階であって、存在する同位体のレベルを測定する段階
を含む、方法。
【請求項２】
解析する段階が、
タンパク質の物理的特性に基づいてタンパク質を分離すること；および
所与のサイズのタンパク質を質量分析に供し、同位体標識されたアミノ酸の同位体を検出すること
を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
アミノ酸を15Nで標識し、かつさらに、組織試料を数日間にわたって採取する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
投与する段階を、対象に組成物を食べさせることにより行う、請求項3記載の方法。
【請求項５】
組織試料を、毎日またはそれより長い間隔で採取する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
物理的特性が、タンパク質サイズ、タンパク質形状、タンパク質サイズおよび形状の組み合わせ、ならびに等電点からなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項７】
標識されたアミノ酸を、対象における複数の異なるタンパク質中に取り込ませ、かつ、解析する段階が、対象の異なる組織において異なるタンパク質を追跡することを含む、請求項2記載の方法。
【請求項８】
解析する段階が、対象の多数の異なる組織において単一のタンパク質を追跡することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
解析する段階が、第1のタイプの組織中に存在する同位体の、第2のタイプの組織に対する割合を測定することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
対象がマウスである、請求項2記載の方法。
【請求項１１】
対象がヒトであり、かつ、採取する組織試料が血液試料である、請求項3記載の方法。
【請求項１２】
解析する段階が、
タンパク質サイズ、または等電点を含むがそれに限定されないような他の物理的特性に基づいて、タンパク質を分離する段階；ならびに
所与のサイズのタンパク質を、該タンパク質における同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する段階
を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
単離したタンパク質を、トリプシンなどの酵素での部分的タンパク質分解性分解に供し；かつ、該タンパク質分解性消化のペプチド断片を、該ペプチドにおける同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
以下の段階を含む、タンパク質代謝回転に対する薬物の影響を試験する方法：
実質的に同一の試験動物の群に、複数の同位体標識されたアミノ酸から構成される組成物を食べさせる段階；
試験動物を、第1の群および第2の群に分ける段階：
薬物を第1の群に投与するが、第2の群には薬物を投与しない段階；
標識されたアミノ酸を、第1の群および第2の群における動物のタンパク質中に取り込ませる段階；
第1の群および第2の群の動物から組織試料を採取する段階；
第1の群および第2の群由来の組織試料を解析する段階であって、組織試料における同位体のレベルを測定する段階；ならびに
薬物により引き起こされるタンパク質代謝回転に対する影響を測定するために、第1の群由来の試料における同位体のレベルを、第2の群の試料における同位体のレベルと比較する段階。
【請求項１５】
第1の試験動物の群および第2の試験動物の群が、2匹またはそれより多い動物を各々含み、かつさらに、2またはそれより多い異なる時点で各群の動物から組織を採取する、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
試験動物がマウスであり、かつ、アミノ酸が15Nで標識されている、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
解析する段階が、
タンパク質サイズに基づいてタンパク質を分離する段階；ならびに
所与のサイズのタンパク質を質量分析に供し、同位体標識されたアミノ酸の同位体を検出する段階
を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
解析する段階が、
タンパク質サイズ、または等電点を含むがそれに限定されないような他の物理的特性に基づいて、タンパク質を分離する段階；ならびに
所与のサイズのタンパク質を、該タンパク質における同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する段階
を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
単離したタンパク質を、トリプシンなどの酵素での部分的タンパク質分解性分解に供し；かつ、該タンパク質分解性消化のペプチド断片を、該ペプチドにおける同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
以下のための製剤の製造における、同位体標識されたアミノ酸の使用：
対象に、複数の同位体標識されたアミノ酸から構成される製剤を投与すること；
標識されたアミノ酸を対象のタンパク質中に取り込ませること；
異なる時点で対象から組織試料を採取すること；および
存在する同位体のレベルを測定するために、採取した組織試料を解析すること。
【請求項２１】
タンパク質が、タンパク質分離を可能にする異なる物理的特性を有し；かつ
タンパク質を、同位体標識されたアミノ酸の同位体が検出され得るように質量分析に供し得る、請求項20記載の使用。
【請求項２２】
アミノ酸が15Nで標識されており、かつさらに、使用が組織試料を数日間にわたって採取することを可能にする、請求項20記載の使用。
【請求項２３】
組成物が、経口で消費可能であることを特徴とする、請求項22記載の使用。
【請求項２４】
組織試料が、毎日またはそれより長い間隔で採取され得ることを特徴とする、請求項20記載の使用。
【請求項２５】
物理的特性がタンパク質サイズである、請求項21記載の使用。
【請求項２６】
物理的特性がタンパク質サイズおよび形状である、請求項21記載の使用。
【請求項２７】
物理的特性が等電点である、請求項20記載の使用。
【請求項２８】
単離したタンパク質を、トリプシンなどの酵素での部分的タンパク質分解性分解に供し；かつ、該タンパク質分解性消化のペプチド断片を、該ペプチドにおける同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する、請求項20記載の使用。
【請求項２９】
試験動物がマウスであり、かつ、アミノ酸が15Nで標識されている、請求項23記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、アッセイ技術の分野に関連し、より詳細には、同位体標識されたアミノ酸を用いてインビボでタンパク質代謝回転を含む変化を測定する方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質濃度のシステム全体にわたる測定のために、いくつかの方法が存在する。一つのアプローチにおいて、複雑な混合物中で多数のタンパク質に特異的に結合する抗体アレイが使用される。しかしながら、タンパク質抗原と抗体との間の最適な結合は大きく変動する傾向があり、該アプローチは、プロテオーム全体にわたる解析には一般に不適当になる。第2の方法は、重同位体標準物質の使用を含む。タンパク質濃度の測定のための内部基準を提供するように、標準物質をタンパク質試料と混合する。これらの方法論は、定常状態のタンパク質レベルを測定し、インビボのプロテオーム代謝回転の動力学を解析することはできない。
【０００３】
タンパク質分子は、インビボで動力学的平衡にある：それらは、生物の寿命の間に継続的に合成され、かつ分解される（1, 2）。タンパク質の代謝回転速度は、数分から数年まで変動し得、多くの場合、その生物学的機能に適合している（3, 4）。タンパク質集団の恒常的な再生は、エネルギー集約的過程であり、さらに、細胞が環境における変化に応答してタンパク質レベルを迅速に調整することを可能にする（5, 6）。妥当なプロテオーム動力学は、正常な発生および健康の維持に不可欠である（7, 8）。例えば、タンパク質代謝回転の調節不全は、老化過程に関係しており（9）、CTFRクロライドチャンネルの増加した分解は、嚢胞性線維症の主要な原因であり（10）、かつ、タンパク質凝集物を消去できないことが、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト-ヤコブ病、および他の年齢関連疾患における病原性の蓄積をもたらす（11）。
【０００４】
タンパク質の代謝回転速度は、その合成および異化の相対速度により確立されている。従って、タンパク質の寿命は、細胞（転写、翻訳、タンパク質分解、自食作用）ならびに組織（発生および再生）のレベルでの複数の調節された過程、およびその生化学的特徴（構造安定性、疎水性、配列モチーフ）により影響を受ける（1, 12-15）。プロテオーム全体にわたる規模で代謝回転速度を測定できることは、これらの因子間の相互作用を解明し、かつ、プロテオーム恒常性において役割を果たす新規の過程を同定するのを助けることができる。また、その調節不全が病理学的過程に影響を及ぼすか、またはそれに起因するタンパク質を同定することもできる。
【０００５】
伝統的に、タンパク質代謝回転は、タンパク質またはバルク組織中への放射性トレーサーアミノ酸の取り込みを測定することにより研究されてきた（16-20）。現代のプロテオミクスの出現により、科学者は、質量分析計を利用して、タンパク質中への安定同位体の取り込みを検出することが可能になった（21, 22）。
【発明の概要】
【０００６】
同位体標識されたアミノ酸を使用して、インビボでタンパク質代謝回転の動力学を測定する段階が、開示される。インビボのタンパク質濃度は、タンパク質合成および分解の動力学的制御を通して維持される。これらの全体的な動力学は、複数の障害および生理活性薬物によりもたらされることが公知である。本発明は、治療用の新規の標的を同定すること、および薬物毒性の機構を解明することを含むがそれらに限定されない、疾患の診断、処置、および管理における応用のための、タンパク質動力学のインビボ解析を提供する。
【０００７】
システム生物学における進歩により、mRNAおよびタンパク質発現の全体的な解析が可能になってきているが、タンパク質動力学および代謝回転の大規模研究は、インビボで実施されていない。タンパク質代謝回転は、プロテオーム恒常性を確立する上で重要な代謝および調節機構であり、多くの生理学的および病理学的過程に影響を及ぼす。本発明は、生物全体にわたる同位体標識を使用して、多数のマウス組織において約2,500個のタンパク質の代謝回転速度を測定する。脳は、しばしばインビボ研究にとって難しい標的であるが、本発明は、4桁に及ぶ代謝回転速度を測定する。脳の肝臓および血液との比較を通して、本発明は、それぞれの組織内で、同様の機能を行うタンパク質は、しばしば同様の代謝回転速度を有することを示す。脳におけるタンパク質は、肝臓（3.0日）および血液（3.5日）のものと比較して有意により遅い代謝回転（9.0日の平均寿命）を有する。いくつかの細胞小器官（ミトコンドリアなど）内では、タンパク質は狭い範囲の寿命を有し、同調した代謝回転機構を示唆する。可変性組成の複合体内のタンパク質サブユニットは、広範な寿命を有するが、明確に定義された複合体内のものは、協調的様式で代謝回転する。全体として、データは、現在までのところ最も包括的な哺乳動物プロテオーム代謝回転のインビボ解析に相当する。本発明は、インビボでの神経変性疾患の解析を含み、標識された食餌を許容すると考えられる任意のモデル生物において、インビボのプロテオーム恒常性にアクセスするのに有用である。
【０００８】
本発明は、最初にマウスなどの実質的に同一の試験動物の群に、複数の同位体標識されたアミノ酸から構成される組成物を食べさせる段階により、タンパク質代謝回転に対する薬物の作用を試験する方法を含む。組成物は、5個もしくはそれより多くを含み得る、2個もしくはそれより多い異なる標識されたアミノ酸を含んでもよく、またはすべて天然に存在するアミノ酸を含んでもよい。組成物を試験動物に食べさせた後、試験動物を第1の群および第2の群に分ける。薬物を第1の群に投与するが、第2の群には薬物を投与しない。標識されたアミノ酸を、第1の群および第2の群における動物のタンパク質中に取り込ませる。その後、1日、2日、3日、またはそれより長くなどの任意の望ましい期間で、第1の群および第2の群の動物から組織試料を採取してもよい。試料採取は、毎時、毎日、または1日おき、またはそれより長くであってもよい。さらに、試料採取は、第1の群および第2の群内の動物の単一のタイプの組織由来であってもよく、または、各群の動物内の2種もしくはそれより多い、3種もしくはそれより多い、4種もしくはそれより多い、5種もしくはそれより多い、異なるタイプの組織であってもよい。2種の群の動物由来の組織試料を解析した後、第1の群由来の試料における同位体のレベルを、第2の群の動物由来の試料における同位体のレベルと比較する。この比較により、第1の群の試験動物に投与した薬物により引き起こされるタンパク質代謝回転への作用を測定することが可能になる。
【０００９】
解析を行う時、同一のアミノ酸配列の多数のコピーを意味する、単一のタンパク質に関して行うことができる。しかしながら、本発明は、異なるアミノ酸配列を有するタンパク質の多数のコピーを意味する、多数の異なるタンパク質について解析を行うことに適用可能である。本発明は、複数の異なるタンパク質に適用されてもよく、アミノ酸配列および／または立体配座において互いに異なる複数の分子に適用されることを意味する。本発明は、2個またはそれより多い異なるタンパク質、10個またはそれより多い異なるタンパク質、50個またはそれより多い異なるタンパク質、100個またはそれより多い異なるタンパク質、1,000個またはそれより多い異なるタンパク質に適用されてもよい。さらに、それらの異なるタンパク質は、単一の組織内または複数の異なる組織内で追跡されてもよい。タンパク質の解析は、動物内の、2種もしくはそれより多い異なる組織、5種もしくはそれより多い異なる組織、または任意の数の異なる組織において追跡されてもよい。本発明の製剤を食べさせる対象は、任意の植物または動物であり得るが、一般に、多細胞動物であり、かつ一般に、多細胞哺乳動物などの試験環境において典型的に使用される動物、例えば、マウスであり、遺伝子操作したマウスまたは特別に繁殖させたマウスであってもよい。
【００１０】
採取した組織試料の解析を、存在する同位体のレベルを測定するために行うことができる。本発明の局面は、多数の異なる組織内に存在する同位体のレベルを測定する段階を含む。
【００１１】
本発明の別の局面は、本発明の組成物の対象への単回投与に基づいて、多数の異なるタンパク質および多数の異なる組織のレベルを測定する段階を含む。従って、例えば、異なる組織においてタンパク質内に出現する標識されたアミノ酸の比を、一つの組織について別の組織に対して測定することができる。さらに、一つの組織における同一のタンパク質の別の組織に対する比を測定することができる。解析の結果として得られた情報は、異なるタイプの組織におけるタンパク質代謝回転、より具体的には、異なるタイプの組織における異なるタイプのタンパク質の代謝回転に対する薬物の作用を測定するために使用することができる。
【００１２】
本発明の一つの局面は、方法論が、同位体標識されたアミノ酸からなる食餌を食べさせることができる任意の生物に適用可能であることである。
【００１３】
本発明の別の局面は、方法が、トランスジェニックマウスを含む疾患モデルとして役立つ動物に対して使用され得ることである。
【００１４】
本発明の別の局面は、質量分析と共に使用されてもよく、かつ、個々のタンパク質または少数の選択されたタンパク質について、ならびに非常に多数のタンパク質について同時に、タンパク質代謝回転の速度に関する詳細な情報を提供し得ることである。
【００１５】
本発明のさらに別の局面は、解析されるタンパク質が、脳、肝臓、血液、筋肉、心臓、胃、脾臓、肺、および骨を含む任意のタイプの組織におけるタンパク質であり得ることである。
【００１６】
本発明の一つの局面は、多数のタンパク質を、生物学的試料内で同時に解析できることである。
【００１７】
本発明の別の局面は、標識を、完全に（100％）標識されたアミノ酸で実施できることである。従って、複雑なパルス-チェイス解析を実施すること無く、アミノ酸取り込みの単一段階速度論により、代謝回転速度を評価することができる。
【００１８】
本発明の別の局面は、トレーサー法は単に標識の総取り込みを測定できるだけであるが、質量分析法は、所与のタンパク質について部分的に標識された種の集団分布を解析できることである。従って、組織中への標識摂取などの上流の過程が律速である例において、代謝回転速度を測定することができる。
【００１９】
最近の研究は、15N濃縮されたラン藻（スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis））を補給した食餌源を用いて、ラットを同位体標識できることを示している（23）。本発明は、野生型近交系マウス（FVB）の脳におけるタンパク質のインビボ代謝回転動態を測定するために同様のアプローチを使用し、これらの動力学の血液および肝臓プロテオームに対する比較を提供する。
【００２０】
本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴は、下記により完全に説明されるような方法の詳細を読むと、当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明は、添付の図面と併せて読むと、以下の詳細な説明から最も良好に理解される。一般的な実施に従い、図面の種々の特徴は、正確な縮尺でないことが強調される。反対に、種々の特徴の寸法は、明確にするために、自由裁量により拡大されるかまたは縮小される。図面に含まれるのは、以下の図である。
【００２２】
【図１】1A、1B、および1Cを含み、1Aは、対象中に同位体標識されたアミノ酸を含ませるために本発明に従ってとられ得る段階、続いて対象から組織を採取および解析する段階を示す流れ図である。図1Bは、15Nのアミノ酸中への取り込みを図式的に示す。図1Cは、経時的な15Nの取り込みの、9個の図式的スペクトログラフを示す。
【図２】脳組織の解析を示すグラフ2A、肝臓組織の解析を示すグラフ2B、および血液組織の解析を含むグラフ2Cを含む。
【図３】左側の3Aの3個のグラフ、および右側の3Bの3個のグラフを含む。これらのグラフは、ペプチド−標識された集団および質量シフトの動態を示す。脳、肝臓、および血液から抽出した、指定したタンパク質由来の個々のペプチドについて、測定（記号）を行った。
【図４】図4Aの3個のグラフおよび図4Bの3個のグラフを含み、質量シフトおよび標識集団の測定の生物学的再現を示す。丸および三角は、異なる時点で測定した2匹の異なるマウスを示す。脳（AおよびB）、肝臓（CおよびD）、ならびに血液（EおよびF）における標識された集団（A、C、およびE）ならびに質量シフト（B、D、およびF）の比較により、標識の速度は異なるマウス間で非常に類似していることが示される。
【図５】グラフ5Aおよび5Bを含み、タンパク質代謝回転速度の測定を示す。図5Aは、血液より抽出した血清アルブミンについての平均の標識された集団の曲線を示す。記号は、62個の検出したペプチドについての中央値を表す。黒矢印のバーは、ペプチド間の標準偏差を表す。より色が薄いバーは、SEMを表す。図5Bは、同一のタンパク質に属するペプチドの代謝回転における変動の全体的な解析を示す。四角は、3種の組織のすべてのタンパク質解析のために、単一のタンパク質を網羅するペプチドの代謝回転速度の変動係数（CV）の中間四分位範囲（IQR）を示す。
【図６】6Aの3個の棒グラフおよび6Bの3個の点グラフを含み、脳、肝臓、および血液におけるタンパク質代謝回転速度の分布および比較を示す。6Aは、代謝回転速度の分布を示す。脳において、タンパク質はより長い代謝回転時間を有するが、血液および肝臓タンパク質の分布は、より速い代謝回転速度の傾向があった。6Bにおいて、組織間の代謝回転速度の比較を示し、灰色の点は、ミトコンドリアタンパク質を表す。
【図７】機能と代謝回転との間の相関を示す。遺伝子オントロジー（GO）データベースに基づく機能カテゴリーを、Y軸に沿って列挙したカテゴリーにクラスター化した。GOクラスターに属するタンパク質についての代謝回転速度は、示された速度瓶について高い統計学的有意性（P＜0.001）で濃縮された（灰色のスケーリングにより示す）。
【図８】多タンパク質複合体を含む解析したサブユニットタンパク質の代謝回転速度を示す。四角は、代謝回転速度および多タンパク質複合体に関与するタンパク質の分布を示す。エラーバーは、速度の範囲全体を表し、点は、外れ値を表す。括弧内の数字は、解析しかつ分布に表したタンパク質サブユニットの数を示す。多数の組織において観察した複合体は、同一の四角を共有する。白い四角は、その組織においてのみ検出した複合体を示す。
【図９】図9Aおよび図9Bの図解を含み、アミノ酸標識プールとタンパク質代謝回転とのデコンボリューションを可能にする偏在的に標識された飼料の利用を示す。図9Aは、タンパク質内の単一のプローブのみを標識することができる場合である（上の横列）。標識された集団の動態は、代謝回転速度、またはアミノ酸プールにおける15Nの利用可能性を反映し得る。1個より多いプローブが存在する場合、標識された集団の質量分布を解析することにより、これらの2種のパラメータをデコンボリューションすることができる。図9Bにおいて、本研究で解析したトリプシンペプチド中に各アミノ酸が出現する頻度を示す。大部分のペプチドは、2個より少ない任意の所与のアミノ酸を含有し、単一の標識されたアミノ酸を用いたSILAC標識実験において上記のデコンボリューションを難しくする。リジンおよびアルギニン（星により示す）は、SILAC解析において共通に使用される2個のプローブである。
【図１０】10Aの3個のグラフおよび10Bの3個のグラフを含む。相関する、タンパク質レベルに対するマウスにおける代謝回転速度（10A）および細胞培養に対する代謝回転速度（10B）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
治療用の標的を同定するための本アッセイ方法論および同一物を使用する方法が記載される前に、本発明が、記載される特定のアッセイおよび方法に限定されず、従って当然変動してもよいことが、理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される用語法は、特定の態様を説明する目的のみのためであり、かつ限定的であるようには意図されないこともまた、理解されるべきである。
【００２４】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈が明らかに別の方法で指図しない限り下限の単位の十分の一までの各介在値もまた、具体的に開示されることが、理解される。任意の規定された値または規定された範囲における介在値と、任意の他の規定された値またはその規定された範囲における介在値との間の各々のより小さい範囲が、本発明内に包含される。規定された範囲における任意の具体的に除外された限界に応じて、これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して範囲に含まれてもよく、または除外されてもよく、かつ、より小さい範囲にいずれかの限界が含まれるか、いずれも含まれないか、または両方とも含まれる各範囲もまた、本発明内に包含される。規定された範囲が、一つまたは両方の限界を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００２５】
別の方法で定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、いくつかの潜在的かつ好ましい方法および材料が、次に記載される。本明細書において言及されるすべての刊行物は、該刊行物が引用されるものに関連して方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み入れられる。本開示は、矛盾が存在する程度まで組み入れられる刊行物の任意の開示に取って代わることが、理解される。
【００２６】
本明細書において、および添付の特許請求の範囲において使用される際、単数形である「一つの」、「ある」、および「その」は、文脈が明らかに別の方法で指図しない限り、複数の指示対象を含むことが注目されなければならない。従って、例えば、「標識」への言及は、複数のそのような標識を含み、「動物対象」への言及は、1種または複数の、言及されたタイプの動物、および当業者に公知であるその同等物への言及を含む、などである。
【００２７】
本明細書において議論される刊行物は、本出願の出願日より前の開示について単に提供されるだけである。本発明における何も、先行発明のために本発明がそのような刊行物に先立つ権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる可能性があり、独立して確認する必要があり得る。
【００２８】
発明全般
方法は、図1の流れ図に示すように、生物の食餌に同位体標識されたアミノ酸の補給物全体を導入する段階からなる。該同位体標識されたアミノ酸は、15N、13C、2H、または18Oを含むがそれらに限定されない、成分化学的構成要素の安定同位体を含有し得る。いくつかの態様において、飽和濃度の該同位体標識されたアミノ酸を、図1に示すマウスなどの試験対象に食べさせる。生物（図1においてマウスとして示すが、ヒトを含む別の生き物であり得る）の代謝が、最大パーセンテージの同位体標識（例えば、15N）を新たに合成されるタンパク質中に取り込むことを確実にするのに十分な期間にわたって、給餌を継続する。あるいは、飽和濃度未満の同位体標識されたアミノ酸を試験対象に食べさせるが、食べさせる濃度は、十分な同位体標識（例えば、15N）を新たに合成されるタンパク質中に取り込ませ、質量分析法または当技術分野において公知である他の方法による測定を可能にするのに十分である。飽和レベルは、対象におけるすべてのタンパク質の25％、50％、75％、90％、99％、またはそれより多くであり得る。組織試料を、24、48、72、96時間毎を含む任意の間隔であり得る、異なる時点で採取する。異なる時に取得した組織試料を解析することにより、生物内の任意のタンパク質中への同位体の取り込みを測定する。
【００２９】
試験対象は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、またはネコを含むがそれらに限定されない、任意の動物であり得る。
【００３０】
マウスから取得した3種の異なるタイプの試料の例を、図2A、2B、および2Cに示す。タンパク質を試料から抽出し、ゲルを用いてタンパク質分離を行う。この標識方法論を質量分析と連結させて、インビボでのタンパク質代謝回転の速度を測定する。脳（2A）、肝臓（2B）、および血液（2C）において約2,500個のタンパク質の代謝回転速度を測定でき、本開示を読んだ当業者は、本技術が20,000個より多い異なるタンパク質についてタンパク質代謝回転速度を測定できることを理解するであろう。種々の態様において、本発明の方法は、単一の試料由来の、1、2、3、4、5、10、50、100、1000、2000、5000、10000、20000個、またはそれより多くのタンパク質を測定することができる。本方法論は、任意の生物において使用することができ、かつ、トランスジェニックマウスなどのインビボ疾患モデルと共に使用することができる。
【００３１】
本発明は、プロテオーム動力学に対する生理活性薬物の作用を測定するのに有用である。投与前後のタンパク質代謝回転の速度を比較することにより、治療の標的とする作用および毒性作用を測定することが可能になる。
【００３２】
方法はまた、新規の薬物標的を同定するために使用することができる。疾患モデルにおけるプロテオーム動力学の解析により、その調節不全が疾患をもたらすか、または疾患により引き起こされるタンパク質を同定することが可能になる。そのように、本明細書において開示される技術は、神経変性障害を含む多くの疾患において特徴となるプロテオーム動力学における変化を研究するための堅牢な方法論を提供する。
【００３３】
方法は、疾患の活性、重症度、もしくは予後をモニタリングするため、または疾患を有する患者の管理のために使用することができる。疾患を有する患者におけるプロテオーム動力学の解析は、評定、処置、および医学的管理のための測定基準またはバイオマーカーを提供することができる。
【００３４】
現在のプロテオーム技術は、定常状態のタンパク質濃度を測定できるだけであり、タンパク質動力学を測定することはできない。動力学の重要性は、発生および疾患の調査において決定的である（Hellerstein, M. K. (2004) New stable isotope-mass spectrometric techniques for measuring fluxes through intact metabolic pathways in mammalian systems: introduction of moving pictures into functional genomics and biochemical phenotyping, Metab. Eng. 6, 85-100）。
【００３５】
タンパク質代謝回転の測定についての大部分の以前の方法は、標的タンパク質の大規模な精製後に個々のタンパク質を測定できるだけであった（Nikolov, E. N., Dineva, B. B., Dabeva, M. D., and Nikolov, T. K. (1987) Turnover of ribosomal proteins in regenerating rat liver after partial hepatectomy, Int. J. Biochem. 19, 159-163；Verzijl, N., DeGroot, J., Thorpe, S. R., Bank, R. A., Shaw, J. N., Lyons, T. J., Bijlsma, J. W., Lafeber, F. P., Baynes, J. W., and TeKoppele, J. M. (2000) Effect of collagen turnover on the accumulation of advanced glycation end products, J. Biol. Chem. 275, 39027-39031）。多数のタンパク質の代謝回転を同時に測定するために以前に開示された方法は、単一のアミノ酸標識（例えば、15N-リジン、13C-ロイシン、2H-ロイシン）の投与に基づいている。これらの方法はすべて、部分的に、以前の方法で達成される同位体標識のはるかにより低い程度のために、本明細書において開示される方法と比較して測定される代謝回転速度の感度および精度を低下させる、技術的限界を有する。理論により束縛されること無く、タンパク質においてまたはタンパク質に由来するペプチドにおいて個々の標識されたアミノ酸で達成される同位体標識は、すべてのアミノ酸が同位体標識される時に達成されるものほど広範囲に及ばないため、新たに合成される（「標識された」）タンパク質と以前より存在する（「標識されていない」）タンパク質との間の区別は、以前の方法でははるかにより難しい。
【００３６】
本明細書に開示および説明される方法論は、何千もの個々のタンパク質の代謝回転を、個々のタンパク質の精製無しで同時に測定することを可能にする。薬物投与の間のプロテオーム動力学の測定は、プロテオームに対する薬物の作用を評定することを可能にすると考えられる。合成または分解における代償性変化のために、薬物の投与は、その標的タンパク質の全体的な濃度を動揺させない可能性がある。従って、タンパク質濃度をモニタリングする現在の方法は、プロテオーム恒常性に対する薬物の作用を評価することができない。
【００３７】
本明細書に開示および説明される方法論の2番目の重要な特徴は、生きている動物において実施できることである。以前には、何百ものタンパク質についてのタンパク質動力学の多くの測定が、細胞培養において実施されてきた。しかしながら、本発明の方法論は、このアプローチを、複雑な生物およびより関連性のある疾患モデルへ広げる。
【００３８】
本発明の方法の特定の態様を行うために、15N無機塩を使用して、スピルリナの培養用の培養液を作製する。図1の流れ図に示すように、乾燥した15N標識された藻類を使用して、マウスの食餌中のタンパク質を供給する。
【００３９】
種々の態様において、15N、13C、2H、または18Oを含むがそれらに限定されない、1種または複数の同位体標識を使用することができる。いくつかの態様において、同位体標識は、1個または複数の異なるアミノ酸に取り込まれ、異なる同位体標識された組成物を作製することができる。
【００４０】
いくつかの態様において、同位体標識された組成物は、摂食させることができ、例えば、固体もしくは液体形態において消費させることができ、試験対象中に注射または注入することができる。他の態様において、同位体標識された組成物は、移植可能な装置を介して送達することができる。種々の態様において、1種または複数の同位体標識された組成物は、同時にまたは連続的に送達することができ、かつ、1種または複数の以前に記載された送達の経路（摂食、注入など）を介して送達することができる。
【００４１】
いくつかの態様において、同位体標識された組成物は、既知の量で試験対象に送達することができる。いくつかの例において、これは、試験対象から取得した試料における同位体標識の量を定めるために有用であり得る。相対的な量の解析、または同位体標識の有無を測定する場合など、いくつかの例においては、同位体標識の量は、既知である必要はない。
【００４２】
図1に示す「経時的に組織を採取する」段階において示されるように、指定された時点で試料を取得する。組織試料は任意の時間に取得することができ、手頃な時間は、4日毎に1回である。取り出した組織試料を均質化し、1D SDS-PAGEゲルにおいて分子量に従って分画する。ゲル内消化により、ペプチドをゲルから遊離させる。遊離したペプチドを、次に、LC/MS/MSにより解析する。
【００４３】
標識されたペプチドの分子量における変化および相対的な集団を、プロテオーム全体にわたるバイオインフォマティクス解析において比較する。新たに合成されるタンパク質に関して解析から得られるデータを測定し、脳（2A）、肝臓（2B）、および血液（2C）の各々について個々のタンパク質の結果を、図2A、2B、および2Cに示す。組織特異的タンパク質の各々のタイプについて列挙する。さらに、図2A、2B、および2Cの右端に、タンパク質の総数を示す。
【００４４】
タンパク質代謝回転に対する薬物の作用の試験
本発明のアッセイ方法論は、タンパク質代謝回転に対する薬物の作用を試験する方法において使用することができる。実質的に同一の試験動物の群に、複数の同位体標識されたアミノ酸から構成される組成物を食べさせる段階により、方法を行う。図1に示すように、動物に、有機塩および15N標識を含む、同位体標識された藻類食物源を食べさせてもよい。飽和濃度のアミノ酸を提供して、生物の代謝が、最大パーセンテージの同位体標識を新たに合成されるタンパク質中に取り込むことを確実にするために、十分な量の食物を動物に食べさせる。郡内の動物は、すべて実質的に同一であり、トランスジェニックマウスなどのトランスジェニック動物であってもよい。
【００４５】
試験動物を、第1の群および第2の群に分ける。試験する薬学的に活性を有する薬物を第1の群に投与し、第2の群には薬物を投与しない。薬物は、給餌の前、間、または後に投与してもよい。一つの態様において、同位体標識された食物での給餌が開始する際に、薬物を投与する。
【００４６】
同位体標識が、第1の群および第2の群の両方において動物のタンパク質中に取り込まれるように、十分な時間を経過させる。この期間は、数時間から数日、数週間、またはそれより長くまで変動し得る。一般に、給餌は、数日間にわたって継続すると考えられる。この時間中に、組織試料を動物から採取することができる。一つの態様において、組織試料のすべてを、動物のすべてから実質的に同一の時間に取得する。採取を2回またはそれより多い回数繰り返し、採取は実質的に同一の期間中に動物のすべてで行う。
【００４７】
組織試料を採取した後、必要な場合は、それらを均質化し、解析に供してもよい。解析は、第1の群の試験動物および第2の群の試験動物の両方において試料組織中に存在する同位体のレベルを測定する段階を含む。解析を行って、試料中に存在する同位体のレベルを測定する。試料は、動物の各々の単一のタイプの組織由来であってもよいし、またはいくつかの異なるタイプの組織由来であってもよい。
【００４８】
いったん解析が完了し、かつ特定の組織タイプにおける同位体のレベルを測定すると、第1の群の動物において測定した同位体レベルを、第2の群の動物における同位体レベルと比較する。この比較によって、もしあれば、試験薬物により引き起こされるタンパク質代謝回転に対する作用を測定することが可能になり、その作用を、組織の特定のタンパク質において見ることができる。
【００４９】
定義
「プロテオーム」という用語は、ゲノム、細胞、組織、または生物により発現されるタンパク質のセット全体を指す。プロテオームとは、所与のタイプの細胞または生物において所与の時間に定義された条件の下で発現されるタンパク質のセットである。特定のタイプの組織の細胞についてのプロテオームが、同一の生物由来の異なるタイプの組織の細胞のプロテオームとは異なることを、当業者は理解するであろう。特に真核生物においてプロテオームがゲノムより大きく、生物において遺伝子が存在する際により多くのタンパク質が存在することを示すことを、当業者はまた理解するであろう。これは、遺伝子の選択的スプライシング、ならびに、グリコシル化およびリン酸化などの翻訳後修飾による。
【００５０】
プロテオームが、ゲノムには欠如している少なくとも2種のレベルの複雑性を有することを、当業者は理解するであろう。ゲノムがヌクレオチドの配列に画定される時、プロテオームは、存在するタンパク質の配列の総数に限定され得ない。プロテオームの情報は、（1）プロテオームにおけるタンパク質の構造、および（2）タンパク質間の機能的相互作用の情報を必要とする。
【００５１】
「同位体標識」という用語は、システムを通して試料物質の通過を追跡するための任意の技術を指す。物質は、その化学組成中に同位体を取り込むことにより標識される。同位体は、15N、または当業者により使用される他の同位体、例えば、13C、14C、40K、および水素同位体、ならびにそれらの組み合わせであってもよい。標識された同位体は、少なくとも2種の異なる方法において検出され得る。同位体は、異なる質量を有する。従って、異なる同位体、特に当業者により安定同位体と呼ばれるものの組成物内の存在は、質量分析法を用いて分離することができる。同位体を含有する分子はまた、同位体を含有しないものとは異なる振動モードを有する。従って、これらの異なる振動モードを、赤外分光分析を用いて検出することができる。安定同位体の他の特徴（磁気スピンなど）を、当技術分野において公知である方法により（例えば、核磁気共鳴により）検出することができる。
【００５２】
データ解析
提供されるデータは、質量シフトにおけるバーストを示し、食餌性藻類由来の局所的プールにおける15N標識されたアミノ酸の急速な増加を示す。最初の増加は、肝臓および血液におけるよりも脳において低く、食餌性アミノ酸の輸送を反映する。15N標識されたアミノ酸は、脳に到達する前に、血液に入り、かつ、消化管および肝臓を含む多数の組織を横切る。多数の組織を通る連続的な流動により、局所的脳プール中へ流入するより前に、（局所的な代謝および異化過程を通して）14N標識されたアミノ酸の導入が可能になる。従って、脳において、局所的脳プールの15N標識の最初のバーストは、上流組織と比較して低下している。質量シフトの2番目のより緩徐な相は、異化および代謝過程を通したアミノ酸の「再循環」に対応する。換言すると、内部タンパク質の分解により、15N標識されたアミノ酸の食餌による供給は常に希釈される。アミノ酸プールの完全な標識が達成され得る前に、14Nを含有するタンパク質の内部プールを、完全に枯渇させる必要がある。脳において、持続性の再循環相は、肝臓および血液と比較してより緩徐である。脳タンパク質が、肝臓および血液タンパク質と比較して相対的に長命であり、長期の再循環相をもたらすと仮定すると、この結果が期待される。このモデルを洗練するために、これらの種々の組織における遊離アミノ酸濃縮動態のさらなる解析を使用することができるであろう。
【００５３】
定常状態のタンパク質レベルは、それら自体では、代謝回転速度を予測しない。タンパク質の静的レベルは、合成および分解速度の相対比により確立されるが、その寿命は、これらの速度の大きさにより決定される。この観念は、本発明者らのデータにより支持される。トリプシンペプチドのプロテオーム解析において、タンパク質の相対的な定常状態レベルは、そのタンパク質から期待されるペプチドの理論的な数に対する観察可能なペプチドの比により大雑把に概算することができる［Protein Abundance Index (PAI)］（37）。本発明者らのデータ内では、代謝回転速度とPAIとの間に有意な相関は無く（図10Aおよび10B）、同様の存在度を有するタンパク質が、広範な代謝回転速度を有し得ることを示唆する。
【００５４】
本発明者らのデータは、タンパク質代謝回転が、組織、細胞小器官、およびタンパク質複合体のレベルで調節されていることを示唆する。代謝回転の速度は、一般に、血液および肝臓と比較して脳においてより遅い。脳におけるバルクタンパク質代謝回転の相対的に遅い速度が、以前に観察されている（18, 21）。本発明者らは、これが、単に脳に独自に発現している安定なタンパク質の存在のためだけではなく、3種の組織間で共有されているタンパク質が、脳においてより長い、すなわち2〜5倍の半減期を有するためであることを示す。ラットにおいて、1グラムの肝臓当たりの器官特異的代謝速度が、脳の相当する量よりも5倍大きいと概算されていることは、興味深いことである（38）。該観察は、これらの2種の組織の代謝速度における差異が、主として、プロテオーム代謝回転に対するエネルギー関与における差異のためであり得ることを示唆する。
【００５５】
本発明者らは、特定の細胞小器官に局在化するタンパク質の代謝回転速度中で、統計学的に有意な類似性を観察する。ミトコンドリアタンパク質は、ミトコンドリアDNAによりコードされていようとまたは核DNAによりコードされていようと、図7に示すように同様の代謝回転速度を有する。ミトコンドリアタンパク質および核タンパク質は、細胞質タンパク質より長い半減期を有する傾向にあり、細胞質タンパク質は、次に、小胞体のタンパク質より安定である。いくつかの細胞小器官について、この協調的代謝回転は、分解の主要経路としての自食作用を反映する可能性がある。自食作用を通した単位としてのミトコンドリアの代謝回転（マイトファジー）は、細胞におけるミトコンドリア調節の主要な方法であることが公知である（39, 40）。ミトコンドリアタンパク質の寿命は、肝臓および脳の間で変動し、異なる組織特異的マイトファジー速度を示唆するものである。
【００５６】
多くのタンパク質複合体について、構成サブユニットの代謝回転速度は、小さな範囲内に入る。脳および肝臓における20Sプロテアソームコア複合体は、狭い範囲の代謝回転速度を有する。多数の20Sサブタイプが、細胞および組織中に存在することが示唆されている（41）が、本発明者らのデータは、代替的なプロテアソーム組成物がまれであるか、または標準的なコア複合体と同一の寿命を有するかのいずれかであることを示唆する。リボソームおよびプロテアソームなどの、豊富な多タンパク質複合体の合成は、細胞にとって考慮すべきエネルギー投資に相当する。これらの複合体の協調的代謝回転は、オーファンサブユニットの存在を回避するための細胞によるエネルギー保存戦略に相当する可能性がある。例えば、タンパク質およびRNAリボソームサブユニット中の代謝回転の調節が、以前に確証された（20）。本発明者らは、Cop9シグナロソーム複合体（CNS）などの少数の複合体について、広範な代謝回転速度を観察した。CNSは、特定の発生過程に関連するユビキチン-プロテアソーム分解経路の調節された成分である（42）。変動するサブユニット組成および活性を有する別個のCNS集団が、同定されている（43）。本発明者らのデータは、これらの観察と一致して、別個の半減期を有する多数のCNS集団の存在を示唆する。
【００５７】
培養したHeLa細胞の最近の解析は、約600個のタンパク質の代謝回転速度を測定することに成功した（22）。本発明者らは、これらのうち、約150個の相同なマウスタンパク質を、本発明者らのインビボデータセットにおいて少なくとも1種の組織について見出した。データの比較により、培養物における代謝回転速度とマウスにおける代謝回転速度との間にほとんど相関が無いことが明らかになる（図10B）。実際に、培養物において測定した代謝回転速度は、インビボの測定値よりも有意に速かった。この変動性は、形質転換された細胞株の継続的に増殖する性質のためである可能性がある。分化した細胞とは異なり、分裂する細胞株は、新たに生成する娘細胞に供給するために継続的なタンパク質産生を必要としている。肝細胞の増殖を通して起こる肝重の再生は、見かけのタンパク質半減期を低下させることが示された（20）。さらに、恐らくインビボでタンパク質代謝回転を調節する機構のいくつか（例えば、自食作用、組織再生）は培養物中に存在しないため、HeLa細胞における半減期の範囲は、対応するインビボでの測定値よりもはるかに広いように見られる。これらの結果は、インビボのプロテオーム恒常性のモデルとしての培養細胞株の限界を強調する。
【００５８】
低い存在度のタンパク質の将来の動態解析は、確立されている精製技術を用いた組織ホモジェネートの分画により行うことができる。タンパク質代謝回転の測定を定量的プロテオーム戦略と組み合わせる将来の研究により、プロテオーム全体にわたる規模で絶対的なタンパク質分解速度を確立することが可能になるであろう。本研究は、標識された食餌を実験設計中に組み入れることができる任意のモデル生物および環境条件において、インビボのタンパク質代謝回転のプロテオーム全体にわたる解析を実施するために必要な方法論および理論的枠組みを提供する。該アプローチは、特に、タンパク質代謝回転が正常な機能に不可欠であり（32, 33）、かつミスフォールディングされたタンパク質凝集物の蓄積が神経変性疾患の主要な特性である（44, 45）脳において、プロテオーム恒常性と関心対象の生物学的表現型との間の関係を解析するために、一般に有用であると考えられる。
【００５９】
分光測定法
単離されたペプチドの配列およびタンパク質の同定は、MASCOT（Matrix Science Ltd, UK）（Perkins, D N, et al. (1999) "Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data" Electrophoresis 20, 3551-3567）またはSEQUEST（商標, University of Washington, Seattle Wash.）などの、タンデム質量分析法およびコンピューター支援データベース検索プログラムの組み合わせにより、決定することができる（McCormack, A. L. et al. (1996) "Direct Analysis and Identification of Proteins in Mixtures by LC/MS/MS and Database Searching at the Low-Femtomole Level", Anal. Chem. 69, 767-776；Eng, J. K. et al. (1994) "An Approach to Correlate Tandem Mass Spectral Data of Peptides with Amino Acid Sequences in a Protein Database" J. Amer. Soc. Mass. Spectrom., 5, 976-989；米国特許第5,538,897号 (1996年7月23日) Yates, IIIら）。MASCOTおよびSEQUESTは両方とも、すべての公知のゲノム配列を利用し、すべての可能な理論的CIDスペクトルを計算し、かつ、マッチおよび配列同定のためにそれらを実験的CIDスペクトルと比較し、それらのすべては参照により本明細書に組み入れられる。
【００６０】
以下の参照文献は、タンパク質の同定への質量分析技術の応用、特にプロテオーム解析に関連するものに関し、それらのすべては参照により本明細書に組み入れられる：Ideker T, Thorsson V, Ranish J A, Christmas R, Buhler J, Eng J K, Bungarner R, Goodlett D R, Aebersold R, Hood L "Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network." Science. May 4, 2001;292(5518):929-34；Gygi S P, Aebersold R. "Mass spectrometry and proteomics." Curr Opin Chem Biol. October 2000;4(5):489-94.；Gygi S P, Rist B, Aebersold R "Measuring gene expression by quantitative proteome analysis" Curr Opin Biotechnol." August 2000;1 1(4):396-401；Goodlett D R, Bruce J E, Anderson G A, Rist B, Pasa-Tolic L, Fiehn O, Smith R D, Aebersold R. "Protein identification with a single accurate mass of a cysteine-containing peptide and constrained database searching." Anal Chem. Mar. 15, 2000;72(6):1112-8.；およびGoodlett D R, Aebersold R, Watts J D. "Quantitative in vitro kinase reaction as a guide for phosphoprotein analysis by mass spectrometry." Rapid Commun Mass Spectrom. 2000;14(5):344-8；Zhou, H. et al (April 2001) Nature Biotechnol. 19:375-378。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例は、本発明を作成および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されないし、かつ、下記の実験が行われたすべてまたは唯一の実験であることを表すようには意図されない。使用する数（例えば、量、温度など）に関しては正確性を確保する努力を行っているが、いくつかの実験誤差および偏差が占めるはずである。別の方法で示さない限り、部分は重量による部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、かつ圧力は大気圧または大気圧付近である。
【００６２】
実施例1
偏在的に15N標識された藻類の大規模産生
長期の標識研究に必要な藻類を取得するために、本発明者らは、バブルリフト循環装置ベースの閉ループバイオリアクターを構築した。本発明者らは、唯一の窒素源として15N濃縮されたNaNO3を用いて、ほぼ均一な15N標識されたスピルリナを、1Lの培養液当たり3gの藻類の収率で生産した。スピルリナの質量スペクトル解析により、最終的な同位体濃縮は、＞99.5％15Nであることが示された。本発明者らの研究の全体に必要とされる標識された飼料を、約60Lのスピルリナ培養により供給した。
【００６３】
藻類ペプチドおよびペプチド特異的な相対的同位体強度
藻類の食餌の最大同位体濃縮を、4種の高い存在度のスピルリナタンパク質由来のペプチドを用いて測定した。天然（t＝0）および15N濃縮された（t＝無限大）スピルリナタンパク質由来の同一のペプチドの同位体濃縮を、比較した。タンパク質の、Uniprotに列挙された名称、アクセッション番号、および分子量（MW）を含む、ペプチド特異的な情報を取得した。ペプチド特異的な質量／電荷（m/z）、電荷状態（z）、およびアミノ酸配列を測定した。得られた期待値は、ペプチド配列を無作為に割り当てることができるProtein Prospector検索エンジンにより割り当てられる確率であった。各ペプチドについて、濃縮されていない（t＝0）および15N濃縮された（t＝無限大）スピルリナの、時点の15N取り込み測定値を取得した。
【００６４】
藻類の食餌でのマウスの維持
スピルリナベースの食餌を食べさせたマウスは、13週間の継続的な給餌の後にも亜慢性毒性を有さなかった（24）。本発明者らの食餌製剤は、刊行されているプロトコルと同様であった（21, 23）。全身の健康について毎日、および体重について少なくとも1週間に2回、マウスを検査した。体重は毎日変動したが、いずれのマウスも、藻類の食餌の前の体重の有意な分画（＞20％）を減らしたり増やしたりしなかった。
【００６５】
ペプチド同定
コンピュータースクリプトを利用して、データの計算解析を実施した。ペプチド、タンパク質、およびそれらの測定した動態パラメータを含むデータをすべて処理した。
【００６６】
検出したペプチドおよびタンパク質についての相対的同位体強度
標識時間経過を通してモニタリングしたペプチドおよびタンパク質の各々を、組織（脳、肝臓、血液）に従ってカテゴリー化した。
【００６７】
ペプチドについて、Uniprotに列挙された名称、アクセッション番号、分子量（MW）、質量／電荷（m/z）、電荷状態（z）、およびアミノ酸配列を割り当てた。列挙された液体クロマトグラフィー（LC）滞留時間でペプチドが見出され得る生データファイルを示すように、分画ファイル名称を与えた。期待値を、ペプチド配列を無作為に割り当てることができるProtein Prospector検索エンジンにより割り当てられる確率として決定した。各ペプチドについて、時点の15N取り込み測定値を決定した。遅滞時間（t0）および集積速度（k0）は、時点により記載される指数関数的集積曲線を計算するために使用するフィッティングパラメータである。本研究において、本発明者らは、代謝回転が測定されなかった（すなわち、0.001日-1より遅い代謝回転速度）ペプチドと、後期の時点で観察されなかったペプチドとを区別しなかった。本発明者らは、二つの場合を識別するために、同一のタンパク質に属するペプチド間の類似性解析を頼りにした。
【００６８】
Protein Prospectorリバースデータベース検索（25）において95％より大きい信頼を有して割り当てられたペプチドのみを、その後の解析に使用した。後期の時点で収集した試料について、15N標識されたペプチドを以下に基づいて同定した：（i）ゲルの分子量領域；（ii）0日試料において観察されるように期待されるLC滞留時間；および（iii）ペプチドのMW、C、O、S、およびH原子の天然の同位体分布、ならびに0.0037〜0.995（それぞれ、15Nの天然および藻類の存在度）にわたる14N/15N比に基づいて期待される質量分布。本発明者らは、4,619個の脳ペプチド、7,226個の肝臓ペプチド、および1,968個の血液ペプチドについて、下記の表1に示すように、高い統計学的信頼を有して9時点すべてで、同定しかつ質量分布を数量化することができた。
【００６９】
（表１）本研究において解析したペプチドおよびタンパク質の数
2013530402.tif 000003
★9時点すべてで検出したペプチドのみを、タンパク質解析に使用した。
†規定された数のペプチドを解析しかつ平均化した、タンパク質の数。
【００７０】
任意の所与の時点で2連の動物から得られたデータは、最小の変動を示した（図4A、B、C、D、E、およびF）。
【００７１】
典型的な動態標識パターンの例として、脳由来のコフィリン-1ペプチド（NIILEEGKEILVGDVGQTVDDPYTTFVK）の時間依存的質量増加を、図1Cに示す。15Nの取り込みの2種の独立したパラメータが、明白である。第1に、期待される標識されていない質量分布（0日）の外側にあたるペプチドピークの面積の画分において、時間依存的増加がある。第2に、標識された集団の質量中心（図1C、矢印）は、経時的に増加する。本発明者らは、完全に標識された試料に対する標識されていない試料の比に正規化したこれらの2種の測定値を、それぞれ「標識された集団」および「質量シフト」と呼ぶ。コフィリン-1ペプチドについて、15N標識された集団は、標識の1日後に取得した試料において明らかに見える（図1C）。標識されたタンパク質集団は、最も早期の時点でも、天然の同位体分布から良好に分離され、天然および同位体質量分布のデコンボリューションの必要性を打ち消す。
【００７２】
コフィリン-1およびいくつかの他のペプチドについての、標識された集団および質量シフトのプロットを、図2Aおよび2Bの6個のグラフに示す。複数の動態傾向が、データにおいて明白である。第1に、質量シフトにおける増加は二相性であり、急速な最初のバースト、その後の長期の（緩徐な）相を有する。第2に、質量シフト動態は、同一の組織から抽出したペプチド間では類似しているが、3種の解析した組織間では異なる。具体的には、脳において、最初の急速な相は、肝臓および血液と比較してより低い振幅を有し、かつ第2の相は、より遅い速度を有する。第3に、標識された集団は、約1日の最初の遅滞相を有し、その後単一の指数関数的増加が続く。そして最後に、標識された集団の動態は、解析したペプチド間で高度に可変である。
【００７３】
タンパク質代謝回転の計算
歴史的に、トレーサー標識実験においてタンパク質代謝回転の動態を解釈するために、種々の単純化されたモデルが使用されている（26-28）。これらのモデルは、観察される標識摂取の動態傾向を、アミノ酸およびタンパク質の理論的プールの動態流入および流出からなる反応機構と調和させようとする（17, 26）。本明細書において、本発明者らは、3プールモデル（図1B）を利用して、観察される動態傾向（図1Cにおけるコフィリン-1ペプチドおよび図2にプロットされたペプチドにより例証される）を説明する。
【００７４】
アミノ酸の全体的（生物全体にわたる）プールは、2種の供給源：外部の食餌および内部の代謝／異化により供給することができる。全体的プールは、タンパク質合成において使用される局所的（組織全体にわたる）プールのためにアミノ酸を提供する。アミノ酸は、全体的プールからシステムを出る（排出される）ことができる。このモデルに従って、本発明者らの研究における標識された集団は、所与の時間で代謝回転しているタンパク質プールの分画を表し、かつ、標識された集団の質量シフトは、局所的アミノ酸プールにおける不安定な窒素の濃縮を反映する。質量シフトの程度は、起源の組織の特性であり、任意の個々のタンパク質の特徴ではない。逆に、標識された集団の動態は、ペプチドの代謝回転速度を表し、かつ、高度に可変であることが期待されるものである。遅滞期間の後、標識された集団は、指数関数的に増加する。この相を単一指数方程式に適合させることにより、ペプチド代謝回転の速度の測定が可能である。
【００７５】
本発明者らのデータセットにおける大部分のタンパク質は、1個より多いペプチドにより表される。単一のタンパク質を網羅するペプチド間の代謝回転動態における変動性は、約0.25の典型的な変動係数を有し、かなり低かった（図5Aおよび5B）。単一のタンパク質に属し、かつ標識された集団の同様の動態プロファイルを有するペプチドを、各タンパク質について標識された集団の曲線を得るために平均化した。タンパク質平均値に関して0.9未満のピアソン相関を有するペプチドとして定義される外れ値は、除外した。血液から抽出した血清アルブミンについて示すように、平均化したタンパク質曲線を単一指数方程式に適合させ、各タンパク質についての代謝回転速度を測定した（図6Aおよび6B）。
【００７６】
測定した代謝回転の速度は、0.002日-1から10日-1の、4桁に及んだ。脳において、タンパク質は、より長い代謝回転時間を有したが、血液および肝臓タンパク質の分布は、より速い代謝回転速度の傾向があった（図6Aおよび6B）。脳ペプチドについての中央代謝回転速度は、それぞれ血液および肝臓タンパク質についての0.23および0.20日-1と比較して、0.075日-1であった。従って、脳、肝臓、および血液におけるタンパク質の平均寿命は、それぞれ9.0、3.0、および3.5日である。
【００７７】
脳に独自に発現しているタンパク質の多くは、遅い代謝回転の速度を有した。例えば、ミエリン鞘の豊富な構成要素であるミエリン塩基性タンパク質は、1年に至るまでの半減期を有した。さらに、3種の組織すべてに存在するタンパク質は、脳においてより長い代謝回転時間を示した（図6〜8）。特に、ミトコンドリアタンパク質（図6B）は、肝臓および血液と比較して脳において、はるかにより遅い代謝回転速度を有する傾向がある。
【００７８】
代謝回転速度の関数への相関
本発明者らは、次に、本発明者らの研究において動態解析したタンパク質の代謝回転速度と他の生物学的特性との間の統計学的に有意な相関を見出そうと努めた。本発明者らは、血液、肝臓、および脳におけるタンパク質に関連した遺伝子オントロジー（GO）タームのリスト（30）を作製し、その後、-3〜2 log日-1にわたり、かつ0.25 log日-1の間隔で0.5 log日-1により重複する代謝回転速度に従って、瓶中にタンパク質を分離した。各速度瓶におけるGOタームの相対普及率を、その瓶におけるGOタームに属する観察されるタンパク質の数と、無作為の機会により期待される数との間の比として計算した。濃縮の統計学的有意性を、フィッシャーの正確検定のp値を計算することにより判定した（31）。本発明者らは、p＜0.001の統計学的有意性で、1個または複数の速度瓶に濃縮された330個のGOタームを同定し、それらは、脳について108個のターム、肝臓について124個、および血液について98個を含んだ（図7）。多数のGOタームは、階層的様式において互いに関連し得る（30）。従って、同一の群の遺伝子は、多数の関連したGOタームの濃縮を引き起こし得る。この冗長性を打ち消すために、データにおいて重複する群のタンパク質（30％またはそれより多い重複）により表されたGOタームを、経験的に指定されたクラスター中に群分けした。各クラスターについての瓶濃縮を、構成GOタームの各々について濃縮を平均化することにより判定した。
【００７９】
分泌タンパク質（アポリポタンパク質、カイロミクロン、補体因子）、ならびに、シグナル伝達およびタンパク質フォールディングに関与するタンパク質（例えば、シャペロン）は、最速の代謝回転の速度を有する。本発明者らは、これらのタンパク質について、2〜10時間の半減期を測定した。ヌクレオソームに含有されるタンパク質（例えば、ヒストン）、およびミエリン鞘の維持に関与するタンパク質は、1年に至るまでの測定した半減期を有し、最長の代謝回転速度を示した。細胞小器官に関連した異なるタンパク質は、同様の速度で代謝回転する。例えば、ミトコンドリアタンパク質は、一般に、長い半減期を示し、ERに常在する大部分のタンパク質は、6〜10日の半減期を有した（図7）。図7は、特定の半減期を有するタンパク質について濃縮される機能的カテゴリーの網羅的リストではないことが、注目されるべきである。図7は、高い統計学的信頼度（p＜0.001）を有する濃縮の測定を可能にするのに十分な数の、本発明者らのデータセットにおけるタンパク質により表された、機能的カテゴリーに限定されている。
【００８０】
タンパク質複合体サブユニットの代謝回転
GOアノテーションを使用して、高度に不均一のタンパク質複合体（例えば、微小管、ヌクレオソームなど）を除外した、多タンパク質複合体に属するタンパク質をデータセットにおいて同定した。本発明者らは、≧5個のタンパク質サブユニットを含有する複合体を本発明者らのデータセットにおいて同定し、かつそれらの代謝回転速度の分布をプロットした（図8）。各複合体内に含有されるタンパク質、およびそれらのそれぞれの代謝回転速度を取得した。例外無く、脳および肝臓の両方において同定されたすべてのタンパク質複合体は、肝臓においてよりも脳においてより遅く代謝回転した。例えば、プロテアソームの12個のサブユニットを、脳および肝臓の両方において同定した。脳において観察されたサブユニットの平均半減期は8日であったが、肝臓におけるサブユニットの平均半減期は4日であった。プロテアソームのサブユニット間の半減期は同様であり、脳において1.3日のみの標準偏差を有した。ATP合成酵素およびリボソームなどの多くの大きく、豊富な複合体のサブユニットは、同様に狭い範囲の代謝回転速度を有する。
【００８１】
参照文献
2013530402.tif 000004
2013530402.tif 000005
2013530402.tif 000006
2013530402.tif 000007
【００８２】
前述は、単に本発明の原理を例証するに過ぎない。本明細書において明確に記載されるかまたは示されていないが、本発明の原理を具体化し、かつその精神および範囲内に含まれる種々の配置を、当業者が考案できるであろうことが、認識されると考えられる。その上、本明細書において列挙されるすべての実施例および条件付きの言い回しは、主に、本発明の原理、および当技術分野を促進するように本発明者らにより与えられる概念を読者が理解するのを手助けするように意図され、かつ、そのような具体的に列挙される実施例および条件に限定されるわけではないように解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、局面、および態様、ならびにそれらの具体例を列挙する、本明細書におけるすべての陳述は、それらの構造的および機能的同等物の両方を包含するように意図される。加えて、そのような同等物は、現在公知の同等物、および将来開発される同等物の両方、すなわち、構造にかかわらず同一の機能を果たす、開発される任意の要素を含むことが意図される。従って、本発明の範囲は、本明細書において示されかつ説明される例示的な態様に限定されるようには意図されない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲により具体化される。
【図１】
2013530402.tif 000009
【図２】
2013530402.tif 000010
【図３】
2013530402.tif 000011
【図４】
2013530402.tif 000012
【図５】
2013530402.tif 000013
【図６】
2013530402.tif 000014
【図７】
2013530402.tif 000015
【図８】
2013530402.tif 000016
【図９】
2013530402.tif 000017
【図１０】
2013530402.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成25年4月11日(2013.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のための製剤の製造における、同位体標識されたアミノ酸の使用：
対象に、複数の同位体標識されたアミノ酸から構成される製剤を投与すること；
標識されたアミノ酸を対象のタンパク質中に取り込ませること；
異なる時点で対象から組織試料を採取すること；および
存在する同位体のレベルを測定するために、採取した組織試料を解析すること。
【請求項２】
タンパク質が、タンパク質分離を可能にする異なる物理的特性を有し；かつ
タンパク質を、同位体標識されたアミノ酸の同位体が検出され得るように質量分析に供し得る、請求項1記載の使用。
【請求項３】
アミノ酸が15Nで標識されており、かつさらに、使用が組織試料を数日間にわたって採取することを可能にする、請求項1記載の使用。
【請求項４】
製剤が、経口で消費可能であることを特徴とする、請求項3記載の使用。
【請求項５】
組織試料が、毎日またはそれより長い間隔で採取され得ることを特徴とする、請求項1記載の使用。
【請求項６】
投与される製剤が15Nの濃縮されたラン藻（スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis））である、請求項2記載の使用。
【請求項７】
物理的特性がタンパク質サイズおよび形状である、請求項2記載の使用。
【請求項８】
物理的特性が等電点である、請求項1記載の使用。
【請求項９】
単離したタンパク質を、トリプシンなどの酵素での部分的タンパク質分解性分解に供し；かつ、該タンパク質分解性消化のペプチド断片を、該ペプチドにおける同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する、請求項1記載の使用。
【請求項１０】
対象がマウスであり、かつ、アミノ酸が15Nで標識されている、請求項4記載の使用。
【請求項１１】
以下の段階を含む方法によって得られた採取した組織試料：
対象に、複数の同位体標識されたアミノ酸から構成される組成物を投与する段階；
標識されたアミノ酸を、対象のタンパク質中に取り込ませる段階；
異なる時点で対象から組織試料を採取する段階；および
採取した組織試料を解析し、存在する同位体のレベルを測定する段階。
【請求項１２】
解析が、
タンパク質の物理的特性に基づいてタンパク質を分離すること；および
所与のサイズのタンパク質を質量分析に供し、同位体標識されたアミノ酸の同位体を検出すること
を含む、請求項11記載の採取した組織試料。
【請求項１３】
アミノ酸が15Nで標識され、かつさらに、組織試料が数日間にわたって採取される、請求項11記載の採取した組織試料。
【請求項１４】
以下の段階を含む、タンパク質代謝回転に対する薬物の影響を試験する方法：
実質的に同一の非ヒト試験動物の群に、複数の同位体標識されたアミノ酸から構成される製剤を食べさせる段階；
試験動物を、第1の群および第2の群に分ける段階：
薬物を第1の群に投与するが、第2の群には薬物を投与しない段階；
標識されたアミノ酸を、第1の群および第2の群における非ヒト試験動物のタンパク質中に取り込ませる段階；
第1の群および第2の群の動物から組織試料を採取する段階；
第1の群および第2の群由来の組織試料を解析し、かつ組織試料における同位体のレベルを測定する段階；ならびに
薬物により引き起こされるタンパク質代謝回転に対する影響を測定するために、第1の群由来の試料における同位体のレベルを、第2の群の試料における同位体のレベルと比較する段階。
【請求項１５】
第1の試験動物の群および第2の試験動物の群が、2匹またはそれより多い動物を各々含み、かつさらに、2またはそれより多い異なる時点で各群の動物から組織を採取する、請求項14記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
[本発明1001]
対象に、複数の同位体標識されたアミノ酸から構成される組成物を投与する段階；
標識されたアミノ酸を、対象のタンパク質中に取り込ませる段階；
異なる時点で対象から組織試料を採取する段階；および
採取した組織試料を解析する段階であって、存在する同位体のレベルを測定する段階
を含む、方法。
[本発明1002]
解析する段階が、
タンパク質の物理的特性に基づいてタンパク質を分離すること；および
所与のサイズのタンパク質を質量分析に供し、同位体標識されたアミノ酸の同位体を検出すること
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
アミノ酸を15Nで標識し、かつさらに、組織試料を数日間にわたって採取する、本発明1001の方法。
[本発明1004]
投与する段階を、対象に組成物を食べさせることにより行う、本発明1003の方法。
[本発明1005]
組織試料を、毎日またはそれより長い間隔で採取する、本発明1001の方法。
[本発明1006]
物理的特性が、タンパク質サイズ、タンパク質形状、タンパク質サイズおよび形状の組み合わせ、ならびに等電点からなる群より選択される、本発明1002の方法。
[本発明1007]
標識されたアミノ酸を、対象における複数の異なるタンパク質中に取り込ませ、かつ、解析する段階が、対象の異なる組織において異なるタンパク質を追跡することを含む、本発明1002の方法。
[本発明1008]
解析する段階が、対象の多数の異なる組織において単一のタンパク質を追跡することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
解析する段階が、第1のタイプの組織中に存在する同位体の、第2のタイプの組織に対する割合を測定することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
対象がマウスである、本発明1002の方法。
[本発明1011]
対象がヒトであり、かつ、採取する組織試料が血液試料である、本発明1003の方法。
[本発明1012]
解析する段階が、
タンパク質サイズ、または等電点を含むがそれに限定されないような他の物理的特性に基づいて、タンパク質を分離する段階；ならびに
所与のサイズのタンパク質を、該タンパク質における同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する段階
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
単離したタンパク質を、トリプシンなどの酵素での部分的タンパク質分解性分解に供し；かつ、該タンパク質分解性消化のペプチド断片を、該ペプチドにおける同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する、本発明1001の方法。
[本発明1014]
以下の段階を含む、タンパク質代謝回転に対する薬物の影響を試験する方法：
実質的に同一の試験動物の群に、複数の同位体標識されたアミノ酸から構成される組成物を食べさせる段階；
試験動物を、第1の群および第2の群に分ける段階：
薬物を第1の群に投与するが、第2の群には薬物を投与しない段階；
標識されたアミノ酸を、第1の群および第2の群における動物のタンパク質中に取り込ませる段階；
第1の群および第2の群の動物から組織試料を採取する段階；
第1の群および第2の群由来の組織試料を解析する段階であって、組織試料における同位体のレベルを測定する段階；ならびに
薬物により引き起こされるタンパク質代謝回転に対する影響を測定するために、第1の群由来の試料における同位体のレベルを、第2の群の試料における同位体のレベルと比較する段階。
[本発明1015]
第1の試験動物の群および第2の試験動物の群が、2匹またはそれより多い動物を各々含み、かつさらに、2またはそれより多い異なる時点で各群の動物から組織を採取する、本発明1014の方法。
[本発明1016]
試験動物がマウスであり、かつ、アミノ酸が15Nで標識されている、本発明1014の方法。
[本発明1017]
解析する段階が、
タンパク質サイズに基づいてタンパク質を分離する段階；ならびに
所与のサイズのタンパク質を質量分析に供し、同位体標識されたアミノ酸の同位体を検出する段階
を含む、本発明1014の方法。
[本発明1018]
解析する段階が、
タンパク質サイズ、または等電点を含むがそれに限定されないような他の物理的特性に基づいて、タンパク質を分離する段階；ならびに
所与のサイズのタンパク質を、該タンパク質における同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する段階
を含む、本発明1014の方法。
[本発明1019]
単離したタンパク質を、トリプシンなどの酵素での部分的タンパク質分解性分解に供し；かつ、該タンパク質分解性消化のペプチド断片を、該ペプチドにおける同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する、本発明1014の方法。
[本発明1020]
以下のための製剤の製造における、同位体標識されたアミノ酸の使用：
対象に、複数の同位体標識されたアミノ酸から構成される製剤を投与すること；
標識されたアミノ酸を対象のタンパク質中に取り込ませること；
異なる時点で対象から組織試料を採取すること；および
存在する同位体のレベルを測定するために、採取した組織試料を解析すること。
[本発明1021]
タンパク質が、タンパク質分離を可能にする異なる物理的特性を有し；かつ
タンパク質を、同位体標識されたアミノ酸の同位体が検出され得るように質量分析に供し得る、本発明1020の使用。
[本発明1022]
アミノ酸が15Nで標識されており、かつさらに、使用が組織試料を数日間にわたって採取することを可能にする、本発明1020の使用。
[本発明1023]
組成物が、経口で消費可能であることを特徴とする、本発明1022の使用。
[本発明1024]
組織試料が、毎日またはそれより長い間隔で採取され得ることを特徴とする、本発明1020の使用。
[本発明1025]
物理的特性がタンパク質サイズである、本発明1021の使用。
[本発明1026]
物理的特性がタンパク質サイズおよび形状である、本発明1021の使用。
[本発明1027]
物理的特性が等電点である、本発明1020の使用。
[本発明1028]
単離したタンパク質を、トリプシンなどの酵素での部分的タンパク質分解性分解に供し；かつ、該タンパク質分解性消化のペプチド断片を、該ペプチドにおける同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する、本発明1020の使用。
[本発明1029]
試験動物がマウスであり、かつ、アミノ酸が15Nで標識されている、本発明1023の方法。
本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴は、下記により完全に説明されるような方法の詳細を読むと、当業者に明らかになるであろう。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013530402000001.app
【国際調査報告】
2013530402.tif 000019