(57)【要約】  本願は、少なくとも15モル％のポルフィリン-リン脂質結合体の二重層を含むナノ小胞であって、結合体は、リン脂質側鎖に共有結合されたポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含むナノ小胞に関する。ナノ小胞は、光熱治療、光音響画像化および蛍光画像化のために使用することができる。本願はまた、該ナノ小胞の製造方法を開示する。
2013507399.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも15モル％のポルフィリン-リン脂質結合体の二重層を含むナノ小胞であって、ポルフィリン-リン脂質結合体が、１種のリン脂質の脂質側鎖に、好ましくはsn-1またはsn-2の位置で、共有結合された１種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含むナノ小胞。
【請求項２】
少なくとも25モル％のポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載のナノ小胞。
【請求項３】
少なくとも35モル％のポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載のナノ小胞。
【請求項４】
少なくとも45モル％のポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載のナノ小胞。
【請求項５】
少なくとも55モル％のポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載のナノ小胞。
【請求項６】
少なくとも65モル％のポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載のナノ小胞。
【請求項７】
少なくとも75モル％のポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載のナノ小胞。
【請求項８】
少なくとも85モル％のポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載のナノ小胞。
【請求項９】
少なくとも95モル％のポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載のナノ小胞。
【請求項１０】
ポルフィリン-リン脂質結合体におけるポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体が、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、テトラフェニルポルフィリン、ピロフェオホルビド、バクテリオクロロフィル、クロロフィルa、ベンゾポルフィリン誘導体、テトラヒドロキシフェニルクロリン、プルプリン、ベンゾクロリン、ナフトクロリン、ベルジン、ロジン、ケトクロリン、アザクロリン、バクテリオクロリン、トリポルフィリン、ベンゾバクテリオクロリン、広義のポルフィリンおよびポルフィリン異性体から成る群より選択される請求項1〜9のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項１１】
広義のポルフィリンが、テキサフィリン、サプフィリンまたはヘキサフィリンであり、ポルフィリン異性体が、ポルフィセン、転化されたポルフィリン、フタロシアニンまたはナフタロシアニンである請求項10記載のナノ小胞。
【請求項１２】
ポルフィリン−リン脂質結合体におけるリン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールを含む請求項1〜11のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項１３】
リン脂質が、12〜22個の炭素のアシル側鎖を含む請求項12記載のナノ小胞。
【請求項１４】
ポルフィリン−リン脂質結合体におけるポルフィリンがピロフェオホルビド-a酸である請求項1〜9のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項１５】
ポルフィリン−リン脂質結合体におけるポルフィリンがバクテリオクロロフィル誘導体である請求項1〜9のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項１６】
ポルフィリン−リン脂質結合体におけるリン脂質が1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリンである請求項1〜9のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項１７】
ポルフィリン−リン脂質結合体がPyro-脂質である請求項1〜9のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項１８】
ポルフィリン−リン脂質結合体がオキシ-バクテリオクロロフィル-脂質である請求項1〜9のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項１９】
ポルフィリンが、0〜20個の炭素の炭素鎖リンカーによってリン脂質上のグリセロール基に結合される請求項1〜13のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項２０】
PEGをさらに含む請求項1〜19のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項２１】
PEG-脂質をさらに含む請求項1〜19のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項２２】
PEG-DSPEをさらに含む請求項1〜19のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項２３】
PEGまたはPEG-脂質が、約5モル％の量で存在する請求項20〜22のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項２４】
ナノ小胞が実質的に球形であり、約30nm〜約200nmの直径である請求項1〜23のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項２５】
ナノ小胞が実質的に球形であり、約100nmの直径である請求項1〜23のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項２６】
ナノ小胞が実質的に球形であり、約30nmの直径である請求項1〜23のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項２７】
ポルフィリン−リン脂質結合体が、その中にキレート化された金属、任意的に金属の放射性同位体、を含む請求項1〜26のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項２８】
金属がZn、CuおよびPdから成る群より選択される請求項27記載のナノ小胞。
【請求項２９】
その中に封入された活性剤、好ましくは治療剤または診断薬、好ましくは化学療法剤、例えばドキソルビシンをさらに含む請求項1〜28のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項３０】
ターゲッティング分子、好ましくは抗体、ペプチドまたはアプタマーをさらに含む請求項1〜29のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項３１】
ターゲッティング分子が葉酸である請求項30記載のナノ小胞。
【請求項３２】
二重層が、コレステロール、好ましくは30-50モル％のコレステロールをさらに含む請求項1〜31のいずれか１項記載のナノ小胞。
【請求項３３】
ナノ小胞を製造する方法であって：
a.   ポルフィリン-リン脂質結合体を緩衝液中で混合し、ポルフィリン-リン脂質結合体は、１種のリン脂質の脂質側鎖に、好ましくはsn-1および/またはsn-2の位置で、共有結合された１種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含むこと；
b.  段階(a)の混合物を押出して、少なくとも15モル％のポルフィリン-リン脂質結合体の二重層を含むポルフィリン-リン脂質二重層ナノ小胞を生じること
を含む方法。
【請求項３４】
ポルフィリン-リン脂質結合体が、その中にキレート化された金属を含む請求項33記載の方法。
【請求項３５】
ナノ小胞を製造する方法であって、
a.   ポルフィリン-リン脂質結合体を緩衝液中で混合し、ポルフィリン-リン脂質結合体は、１種のリン脂質の脂質側鎖に、好ましくはsn-1および/またはsn-2の位置で、共有結合された１種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含むこと；
b.   段階(a)の混合物を超音波処理して、少なくとも15モル％のポルフィリン-リン脂質結合体の二重層を含むポルフィリン-リン脂質二重層ナノ小胞を生じること
を含む方法。
【請求項３６】
対象において標的領域に光力学的治療を行う方法であって、
a.  請求項1〜32のいずれか１項に記載されるナノ小胞を提供すること；
b.   ナノ小胞を対象に投与すること；および
c.  標的領域でナノ小胞に、ある波長の光を照射し、光の該波長は、ポルフィリン-リン脂質結合体を活性化させて、一重項酸素を生成すること
を含む方法。
【請求項３７】
ナノ小胞が、消光された状態で照射される請求項36記載の方法。
【請求項３８】
対象において標的に光熱治療を行う方法であって、
a.   請求項1〜32のいずれか１項に記載されるナノ小胞を提供すること；
b.   ナノ小胞を対象に投与すること；および
c.  標的領域でナノ小胞に、ある波長の光を照射し、光の該波長は、ナノ小胞の温度を上昇させること
を含む方法。
【請求項３９】
ナノ小胞が、消光されない状態で照射される請求項38記載の方法。
【請求項４０】
対象において標的領域を画像化する方法であって、
a.   請求項1〜32のいずれか１項に記載されるナノ小胞を提供すること；
b.   ナノ小胞を対象に投与すること；
c.   標的領域でナノ小胞に、ある波長の光を照射し、ナノ小胞は、光の該波長に応答して、光音響信号を送ること；ならびに
d.   標的領域でその光音響信号を測定および/または検出すること
を含む方法。
【請求項４１】
対象において標的領域を画像化する方法であって、
a.   請求項1〜32のいずれか１項に記載されるナノ小胞を提供すること；
b.   ナノ小胞を対象に投与すること；ならびに
c.  標的領域において蛍光を測定および/または検出すること
を含む方法。
【請求項４２】
光力学的治療を行うための、請求項1〜32のいずれか１項記載のナノ小胞の使用。
【請求項４３】
光熱治療を行うための、請求項1〜32のいずれか１項記載のナノ小胞の使用。
【請求項４４】
光音響画像化を行うための、請求項1〜32のいずれか１項記載のナノ小胞の使用。
【請求項４５】
蛍光画像化を行うための、請求項1〜32のいずれか１項記載のナノ小胞の使用。
【請求項４６】
ナノ小胞内に装填される化学療法薬、例えばドキソルビシン、のデリバリと組合せて光熱治療を行うための、請求項1〜32のいずれか１項記載のナノ小胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ナノ小胞、より詳細にはポルフィゾーム(porphysome)、すなわちリン脂質側鎖に結合したポルフィリンから形成されるポルフィリン二重層を有するナノ小胞の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
強く光を吸収する成分を利用する治療および診断技術は、とりわけ、蛍光および比色による検出1,2、光熱および光力学的治療3-5、光音響断層撮影法（また光音響による断層撮影法として知られる）6-9、光学振動数領域画像化(optical frequency domain imaging)10、および多様な技術11を包含する。無機ナノ粒子は光と強く相互作用するので、これらの技術のための剤として使用することができる。例えば量子ドットは、貴重な蛍光プローブであり、105〜106M-1cm-1の範囲に吸光係数を有する12。金ナノ粒子は、おおよそ109〜1011 M-1cm-1の非常に高い吸光係数のために、比色検出、光熱および光音響技術のために有用である13。最近の進歩14にもかかわらず、光学活性な無機ナノ粒子は、未だ広い臨床での実施を達成しておらず、これは、一般にナノ粒子表面に限定され、長期間の安全性が懸念される薬剤装填に因る15-18。それとは対照的に、有機ナノ粒子（リポソーム、ミセル、ナノスフィアおよびポリマーソーム(polymersome)を包含する）は、確固とした安全性プロフィール、生物学的利用能および薬剤デリバリ能力の結果として、広範囲の人の治療用途を見出した18。しかしながら、有機ナノ粒子は一般に近赤外で光を吸収しないので、バイオフォトニクス(biophotonics)のために限られた用途を有してきた。強く光を吸収する有機小分子であるポルフィリンによって超分子集合体を形成することができるが、これらの構成物は、安定性、溶解性またはバイオフォトニック有用性の欠如のために、生物学的な道具として十分に探求されなかった19。
【０００３】
光力学的治療(photodynamic therapy)は、光増感剤を光と合わせて、望まれない細胞を根絶する。他の疾病治療と比べて、PDTは、光および光増感剤が交わるところのみで細胞を殺すので、身体の他の組織および器官は損傷しないですむという利点を与える。この10年間、PDTは、広い範囲の眼の疾病22、皮膚科の疾病23および特に腫瘍形成の疾病24のための生存可能な治療オプションとして確立されてきた。PDTは、一重項酸素により引き起こされる細胞損傷により誘導される壊死またはアポトーシスによって望まれない細胞を破壊することができる有用な癌治療として出現した25。ポルフィリン誘導体は、高い一重項酸素量子収率および大きい吸光係数のために、最も広く使用される光増感剤である26。しかしながら、慣用のポルフィリンは疎水性分子であるので、しばしば化学的に変性してより親水性になるようにしなければならないか、またはデリバリ手段を使用しなければならない。それだけで、光増感剤のデリバリは、PDTの重要な要素である。光増感剤のリポソーム処方物は、広範な実施が見出され27、また商業的な成功であることが示された（Novartis’ Visudyne（ノバルティス社のビスダイン）; Biotec’s（バイオテク社の）フォスカン(Foscan）, フォスリップ(Foslip)および フォスペグ(Fospeg)）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
PDTは、多くの他の治療と比べてより少ない副作用を有するが、標的の周囲の組織への損傷は、より有効な治療のための限定要因である。したがって、ある種の望まれない細胞に対して向けられるPDTは、魅力的な考えである。しかしながら、抗体を用いて光増感剤の方向を変える試みは、抗体作用を阻害する前に抗体に結合することができる光増感剤の数が少ないので、妨げられてきた28。抗体によって、光増感剤を装填したリポソームを標的に向かわせることは実際的ではない。というのは、光増感剤は、in vivoでは、リポソームから血清蛋白質へと急速に再分配するからである。光熱治療は、標的部位で光が熱に変換される、将来有望な疾病治療法である。生成した熱はそこで、限られた組織を破壊する。光音響画像化は、ナノ秒パルスのレーザーおよび光熱拡大に頼って音波を生成し、これが任意の光学技術の最も深い深度構造解像度を提供することができる、新たな画像化法である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの態様によれば、少なくとも15モル％のポルフィリン-リン脂質結合体の二重層を含むナノ小胞が提供され、ポルフィリン-リン脂質結合体は、１種のリン脂質の脂質側鎖に、好ましくはsn-1およびsn-2の位置で、共有結合された１種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含む。
【０００６】
さらなる態様によれば、ナノ小胞を製造する方法であって、
a.   ポルフィリン-リン脂質結合体を緩衝液中で混合し、ポルフィリン-リン脂質結合体は、１種のリン脂質の脂質側鎖に、好ましくはsn-1および/またはsn-2の位置で、共有結合された１種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含むこと；
b.  段階(a)の混合物を押出して、少なくとも15モル％のポルフィリン-リン脂質結合体の二重層を含むポルフィリン-リン脂質二重層ナノ小胞を生じること
を含む方法が提供される。
【０００７】
さらなる態様によれば、ナノ小胞を製造する方法であって、
a.   ポルフィリン-リン脂質結合体を緩衝液中で混合し、ポルフィリン-リン脂質結合体は、１種のリン脂質の脂質側鎖に、好ましくはsn-1および/またはsn-2の位置で、共有結合された１種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含むこと；
b.   段階(a)の混合物を超音波処理して、少なくとも15モル％のポルフィリン-リン脂質結合体の二重層を含むポルフィリン-リン脂質二重層ナノ小胞を生じること
を含む方法が提供される。
【０００８】
さらなる態様によれば、対象において標的領域に光力学的治療を行う方法であって、
a.  本明細書に記載されるナノ小胞を提供すること；
b.   ナノ小胞を対象に投与すること；および
c.  標的領域でナノ小胞に、ある波長の光を照射し、光の該波長は、ポルフィリン-リン脂質結合体を活性化させて、一重項酸素を生成すること
を含む方法が提供される。
【０００９】
さらなる態様によれば、対象において標的に光熱治療を行う方法であって、
a.  本明細書に記載されるナノ小胞を提供すること；
b.   ナノ小胞を対象に投与すること；および
c.  標的領域でナノ小胞に、ある波長の光を照射し、光の該波長は、ナノ小胞の温度を上昇させること
を含む方法が提供される。
【００１０】
さらなる態様によれば、対象において標的領域を画像化する方法であって、
a.  本明細書に記載されるナノ小胞を提供すること；
b.   ナノ小胞を対象に投与すること；
c.   標的領域でナノ小胞に、ある波長の光を照射し、ナノ小胞は、光の該波長に応答して、光音響信号を送ること；ならびに
d.   標的領域でその光音響信号を測定および/または検出すること
を含む方法が提供される。
【００１１】
さらなる態様によれば、対象において標的領域を画像化する方法であって、
a.  本明細書に記載されるナノ小胞を提供すること；
b.   ナノ小胞を対象に投与すること；および
c.  標的領域において蛍光を測定および/または検出すること
を含む方法が提供される。
【００１２】
さらなる態様によれば、光力学的治療を行うための、本明細書に記載されるナノ小胞の使用が提供される。
【００１３】
さらなる態様によれば、光熱治療を行うための、本明細書に記載されるナノ小胞の使用が提供される。
【００１４】
さらなる態様によれば、光音響画像化を行うための、本明細書に記載されるナノ小胞の使用が提供される。
【００１５】
さらなる態様によれば、蛍光画像化を行うための、本明細書に記載されるナノ小胞の使用が提供される。
【００１６】
さらなる態様によれば、ナノ小胞内に装填される化学療法薬、例えばドキソルビシン、のデリバリと組合せて光熱治療を行うための、本明細書に記載されるナノ小胞の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の実施態様は、以下の説明および添付の図面を参照することによって、最良の理解を得ることができる。図面において：
【図１】図１は、ピロフェオホルビド(pyropheophorbide)-脂質結合体（Pyro-脂質と表される）の合成を示す。
【図２】図２は、Pyro-脂質の純度および同一性（identity)を示す。左：良好な純度を示す、ポルフィリン-脂質のRP-HPLCクロマトグラム。右：Pyro-脂質の予想されるマススペクトル。
【図３】図３は、オキシ-バクテリオクロロフィル-脂質の合成を示す。
【図４】図４は、金属Pyro-脂質の生成を示す。
【図５】図５は、亜鉛およびパラジウムポルフィリン-脂質結合体の純度および質量を示す。左のパネルはHPLC溶出を示し、右のパネルは予想されるマススペクトルを示す。
【図６】図６は、種々のポルフィゾームの生成を示す。ポルフィゾームは、PBS中0.5mg/mLの濃度で、100nmのポリカーボネート膜を使用した押出しによって、95％の種々のポルフィリン-脂質および5％のポリエチレングリコール-2000結合脂質（PEG-脂質）を用いて形成された。A)  種々のポルフィゾームの規格化された吸収スペクトル。B)  約100nmの単分散粒径を示す種々のポルフィゾームの動的光散乱。
【図７】図７は、超音波処理による30nmのポルフィゾームの生成を示す。DLS測定は、再水和され、超音波処理された（赤）Pyro-脂質が、100nmのポリカーボネート膜を通した押出しによって作られた（青）ポルフィゾームより小さいポルフィゾームを生成したことを示す。
【図８】図８は、TEM、1％酢酸ウラニルで染色されたポルフィゾームの透過型電子顕微鏡写真、により示されるポルフィゾームの構造を示す。二重層の特徴は、より高い倍率で明らかになることに注目されたい。
【図９】図９は、ポルフィゾームのサブユニットおよび構造の概略表示を示す。左のパネルは、円中に強調されたホスホコリン先端基(headgroup)および六角形中に強調されたポルフィリンを有する、Pyro-脂質の化学構造を示す。右のパネルは、ポルフィゾームの概略表示を示す。
【図１０】図10は、著しい活性化能力を示すポルフィゾームを示す。A)  PC:Chol(3:2)リポソーム中でのPyro-脂質の滴定。FDETは、ポルフィゾームが0.5％の洗剤（Triton X-100）を用いて溶解された後の蛍光を示し、F0は、ポルフィゾームの初期の蛍光を示す。B)   ポルフィゾームの活性化は、遊離のPyroまたはNBD-脂質を有するリポソームよりはるかに高い。少量のPEG脂質の組み込みは、最も高い活性化能力を生じた。
【図１１】図11は、ポルフィゾームによる効率的な光熱変換を示す。5μLの液滴を150mWの670nmのレーザーで照射し、赤外線カメラを用いて画像化した。リポソームは、標準のPC:Chol(3:2)組成物を用いて形成された。右側のスペクトルのレジェンドは、20℃で紫、そしてインディゴ、青、緑、黄色、オレンジを経て赤へと進み、55℃でピンクを示す。上部の２つのパネル、PBSおよびリポソーム、は青中心を示す。下部の２つのパネル、金ナノロッド(nanorod)およびポルフィゾーム、はオレンジおよび黄色を経て緑の外端へと進む、赤中心を示す。
【図１２】図12は、ポルフィゾームの強い光音響特性を示す。A)   760nmでピコモル範囲までも低い、オキシバクテリオクロロフィルポルフィゾーム感度。B)   ポルフィゾーム自己集合体は光音響信号を生成する。ポルフィゾームが洗剤を用いて壊されるとき、溶液中同じ量の吸収を有するにもかかわらず、光音響信号は弱められた。C)  適度の濃度のポルフィゾームは、ウシ全血より11倍大きい信号を有していた。これらのポルフィゾーム濃度では、ポルフィゾーム当たり100,000個のポルフィリン-脂質分子が想定される。エラーバーは、少なくとも10回測定の標準偏差を示す。
【図１３】図13は、コントラスト剤としてポルフィゾームを用いた、ラットにおけるin vivo標識リンパ節のマッピングを示す。A)  画像化の時間経過。BVは、血管を表し、ポルフィゾーム注入前には動物の足の皮膚内に見える。標識リンパ節(SLN)およびリンパ管(LV)は、皮膚内注入の15分後に、容易に見えるようになる。B)  2時間後、ラットを殺し、動物の両側の２つの標識リンパ節を摘出し、光音響断層撮影に供した。ポルフィゾームを注入した左側のリンパ節のみが、検出可能であった。３つの別々の実験からの典型的なデータ。
【図１４】図14は、示差走査熱量測定を示し、Pyro-脂質が転移温度を有していないことを示す。DSC は、PBS中で、脂質濃度5mg/mLにて行われた。
【図１５】図15は、葉酸塩リガンド標的化によるポルフィゾームの標的に向けられた活性化の生細胞画像化を示す。KB細胞は、示されたポルフィゾームと共に、共焦点顕微鏡の下で2時間インキュベートされた。
【図１６】図16は、葉酸塩受容体を発現する細胞におけるポルフィゾーム取込みの、固定された細胞の画像化を示す。KB細胞は、示されたポルフィゾームと共に、共焦点顕微鏡の下で2時間インキュベートされた。核はDAPIで染色された。
【図１７】図17は、標的に向けられたポルフィゾームを用いるPDT処理を示す。KB細胞は、葉酸塩結合ポルフィゾームまたは通例のポルフィゾームと共に4時間インキュベートされた後、示された光量にて670nmのレーザーで処理された。次の日、細胞生存能力をMTTアッセイを用いて評価した。ポルフィゾーム濃度は、ポルフィゾーム当たり100,000個のポルフィリン-脂質分子という想定に基づいた。星印は、高い光フルエンスおよびポルフィゾーム濃度は最もたくさん細胞を殺したことを示す。エラーバーは、n=4での標準偏差を示す。
【図１８】図18は、KB異種移植片-保有マウスへのポルフィゾーム（7.5ピコモル）のI.V.注入後の蛍光活性化を示す。注入後、マウスからの蛍光信号はほとんどなく、ポルフィゾームが消光されていたことを示すことに注目されたい。腫瘍取込み後、ポルフィゾームは消光されず、腫瘍において蛍光が検出可能であった。
【図１９】図19は、ポルフィゾームが酵素的に生物分解性であり、in vivoで十分に耐性があることを示す。a,   ポルフィゾームの酵素分解。ポルフィゾームは、1%Toriton X-100で溶解され、PBS中でリパーゼと共にインキュベートされた。分解は、HPLC-MS分析を用いて調べた。精製されたピロフェオホルビドは、ペルオキシダーゼと共にインキュベートされ、分解は680nmでの吸光度の減少を監視することによって検証された。b,  1000mg/kgのポルフィゾームまたはPBSの静脈内投与後のマウス質量変化（平均+/-SD, n=3）。c,   ポルフィゾームまたはPBSの静脈内投与されたマウスについての血液試験パラメータ（平均+/-SD, n=3）。ガンマグロブリントランスフェラーゼの結果についての幾つかの試験値は5U/L未満として得られたので、5U/L未満の全ての値は5U/Lとして報告される。d,  1000mg/kgのポルフィゾームまたはPBSのI.V.注入後2週間のマウスからの示された器官の典型的なヘマトキシリンおよびエオジン染色部分。
【図２０】図20は、ポルフィゾームの能動的および受動的な装填を示す。a,  カルボキシフルオレセイン(C.F.)の受動的装填。30モル％コレステロールを有さない(Porph.)か、有して（Chol. Porph. ）構成されたポルフィゾームを、250mMのC.F.中で押出し、ゲルろ過を行って、C.F.の組み込みを決定した。Pyro（青）およびC.F.（緑）の蛍光が、0.5％Triton X-100中で測定されて、消光を回避した。b,   C.F.（緑）を装填されたChol. Porph.の（青）蛍光消光。スペクトルは、0.5％Triton X-100の添加前（点線）および後（実線）にとられ、最大蛍光に規格化された。c,  硫酸アンモニウム勾配を用いたドキソルビシン(Dox.)の能動的装填。50モル％コレステロールを有さない(Porph.)か、有している（Chol. Porph. ）ポルフィゾームのゲルろ過画分の蛍光分析（*ポルフィゾームが溶出し始めたときに集めた）。pyro（青）およびDox.（緑）の蛍光が0.5％Triton X-100中で測定されて、消光を回避した。d,   Dox.を装填されたChol. Porph.におけるpyroの蛍光消光。規格化されたスペクトルが、0.5％Triton X-100の添加前（実線）および後（点線）に測定された。e,  C.F.を受動的に装填された（黒線）か、またはドキソルビシンを能動的に装填された（灰色線）ポルフィゾームのサイズ分布。
【図２１】図21は、in vivoにおける光熱変換器としてのポルフィゾームを示す。a,  携帯用の660nmレーザーを用いる光熱治療用装備。b,  PBSまたは42mg/kgポルフィゾームを24時間前にI.V.注入されたKB腫瘍保有マウスにおける典型的熱応答。熱画像は、レーザー照射（1.9W/cm2）の60秒後に得られた。c,  60秒のレーザー照射中の最大腫瘍温度（1群当たり5匹のマウスについての平均+/-SD）。d,   ポルフィゾームを使用する光熱治療に対する治療応答を証明する写真。e)  示された条件で治療された腫瘍保有マウスの生存図。マウスは、腫瘍が10mmの寸法に達したときに殺された（各群についてn=5）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書において、「ポルフィゾーム」は、リポソームのような構造および装填能力、構造依存性ナノスケールの光変換特性、優れた生体適合性を示し、種々のバイオフォトニクス用途に見込みがある、リン脂質-ポルフィリン結合体のサブユニットから自己集合された有機ナノ粒子として説明される。ポルフィリンサブユニットを組み込む他のポルフィリン小胞および２ブロック(diblock)コポリマーが記載されてきたが、低いポルフィリン密度は、より小さい吸光係数および、ポルフィゾームの新規な特性を生み出す特徴的な顕著な蛍光自己消光の不在を結果として生じた20,21。
【００１９】
ポルフィリンはしばしば、デンドリマー29およびナノ細線30の形成を包含する、ナノ構造用途において使用される。近年、ポルフィリンの水不溶性球形の集合体が記載された31。しかしながら、ポルフィゾームと比べて、これらのナノ粒子は、蛍光自己消光および光変換を促すことが示された、異なるタイプのサブユニットを用いて開発された。
【００２０】
いくつかの実施態様において、ポルフィゾームは、ポルフィゾーム当たり約100,000個のポルフィリン分子を含有するポルフィリン-脂質結合二重層を含む。それらはポルフィリンサブユニットによって形成され、安定化されているので、ポルフィゾームは、ある範囲の細胞ターゲッティング部分を用いて、細胞に向けられることができる。ポルフィゾームは、以下でさらに詳細に記載されるように、異なるタイプのポルフィリンを用いて形成される能力、異なるタイプの金属をキレート化する能力および種々の寸法で形成される能力を有して、非常に用途が広い。さらには、ポルフィゾームは、活性化の前に高い消光および光熱変換効率を有して、新たなナノスケールの特性を表す。
【００２１】
光力学的治療(PDT)のためにポルフィリンをリポソームに組み込むことは、注目を集めたが、ポルフィゾームは、２つの重要な利点を提供する：1)  他のリポソームのPDT処方物より1-2倍程度高い大きさの有効装填量および、2)  初めて、たくさんの光増感剤を身体の特定の位置に向かわせることを可能にする方法（他の処方物は、投与したなら、血漿タンパク質に再分配する）。種々の金属のポルフィリン脂質中への挿入は、ポルフィゾームの形成を妨げず、安定な亜鉛およびパラジウム二重層ポルフィゾームが生成され、標的金属治療のための新たな道を開いた。ポルフィゾームは、異なるタイプのポルフィリンから形成することができ、種々の寸法にあつらえることができた。ポルフィゾームは、以前に記載された何よりも大幅に大きい、先例のない蛍光および一重項酸素活性化を示した。活性化の前に、高く消光された状態において、ポルフィゾームは、金ナノロッド(nanorod)に匹敵する光熱変換効率を有して励起光を散逸し、これは、ポルフィゾームが、光熱および光音響プローブとして有用であり得ることを示唆する。葉酸塩結合ポルフィゾームの取り込みおよび活性化は、葉酸塩受容体を発現する細胞において受容体仲介エンドサイトーシスによって誘発することができ、それらの細胞は、その後光照射すると破壊された。新規であり、標的を定めることができ、さらに治療活性なナノ粒子として、ポルフィゾームは、光力学的治療および他の領域の研究において多くの用途を見出すことを期待される。
【００２２】
本明細書に記載されるナノ小胞はリン脂質またはその誘導体の二重層を含む膜によって形成される、小さく、典型的には200nm未満の小胞（すなわち、泡または嚢）である。しかしながら、標準の脂質の技術を使用すると、当業者はまた、巨大な単層性の小胞または平面の脂質二重層のような非常に大きい二重層を生成させることができる。
【００２３】
１つの態様に従えば、少なくとも15モル％のポルフィリン-リン脂質結合体の二重層を含むナノ小胞が提供され、ここで、ポルフィリン-リン脂質結合体は、１種のリン脂質の脂質側鎖に、好ましくはsn-1またはsn-2の位置で、共有結合された１種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含む。
【００２４】
好ましい実施態様において、ナノ小胞は少なくとも25, 34, 45, 55, 65, 75, 85 および95モル％の順に、増大する好ましさで、ポルフィリン−リン脂質結合体を含む。
【００２５】
本発明のナノ小胞を構成するポルフィリン−リン脂質結合体は、ポルフィリン、ポルフィリン誘導体およびポルフィリン類似体を含む。典型的なポルフィリンは、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリンおよびテトラフェニルポルフィリンを包含する。典型的なポルフィリン誘導体は、ピロフェオホルビド、バクテリオクロロフィル、クロロフィルa、ベンゾポルフィリン誘導体、テトラヒドロキシフェニルクロリン、プルプリン、ベンゾクロリン、ナフトクロリン、ベルジン(verdin)、ロジン(rhodin)、ケトクロリン、アザクロリン(azachlorin)、バクテリオクロリン、トリポルフィリン(tolyporphyrin)およびベンゾバクテリオクロリンを包含する。ポルフィリン類似体は、広義のポルフィリン族（例えばテキサフィリン(texaphyrin)、サプフィリン(sapphyrin)およびヘキサフィリン(hexaphyrin)）ならびにポルフィリン異性体（例えばポルフィセン(porphycene)、転化されたポルフィリン、フタロシアニンおよびナフタロシアニン(naphthalocyanine)）を包含する。
【００２６】
好ましくは、広義のポルフィリンは、テキサフィリン(texaphyrin)、サプフィリン(sapphyrin)、またはヘキサフィリン(hexaphyrin)であり、ポルフィリン異性体は、ポルフィセン(porphycene)、転化されたポルフィリン、フタロシアニンまたはナフタロシアニン(naphthalocyanine)である。
【００２７】
本明細書において使用されるように、「リン脂質」は、ホスフェート基を有する親水性先端基および疎水性脂質末端を有する脂質である。
【００２８】
いくつかの実施態様において、ポルフィリン−リン脂質結合体中のリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールを含む。
【００２９】
好ましくは、リン脂質は、12〜22個の炭素のアシル側鎖を含む。
【００３０】
いくつかの実施態様において、ポルフィリン−リン脂質結合体中のポルフィリンは、ピロフェオホルビド-a酸である。別の実施態様において、ポルフィリン−リン脂質結合体中のポルフィリンは、バクテリオクロロフィル誘導体である。
【００３１】
いくつかの実施態様において、ポルフィリン−リン脂質結合体中のリン脂質は、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリンである。
【００３２】
いくつかの実施態様において、ポルフィリン−リン脂質結合体はPyro-脂質である。
【００３３】
他の実施態様において、ポルフィリン−リン脂質結合体は、オキシ-バクテリオクロロフィル-脂質である。
【００３４】
いくつかの実施態様において、ポルフィリンは、0〜20個の炭素の炭素鎖リンカーによってリン脂質上のグリセロール基に結合される。
【００３５】
いくつかの実施態様において、ナノ小胞はさらに、PEG、好ましくはPEG-脂質、さらに好ましくはPEG-DSPEを含む。好ましくはPEGまたはPEG-脂質は、約5モル％の量で存在する。
【００３６】
いくつかの実施態様において、ナノ小胞は実質的に球形であり、約30nm〜約200nmの直径、好ましくは約100nmの直径、または約30nmの直径である。
【００３７】
いくつかの実施態様において、ポルフィリン−リン脂質結合体は、その中にキレート化された金属、任意的に金属の放射性同位体、好ましくはZn、CuまたはPdを含む。
【００３８】
広く種々の生物活性剤もしくは治療剤、製薬物質または薬剤を、ポルフィゾームの内部に封入することができる。
【００３９】
いくつかの実施態様において、ナノ小胞はさらに、その中に封入された活性剤、好ましくは治療剤もしくは診断薬、好ましくは化学療法剤、例えばドキソルビシンを含む。
【００４０】
「治療剤」という語は、当技術分野で認められた、生物学的、生理学的または薬理学的に活性な物質である任意の化学的部分をいう。治療剤（また「薬剤」と称する）の例は、良く知られた参考文献、例えばMerck Index、Physicians Desk Reference、およびThe Pharmacological Basis of Therapeuticsに記載されており、それらは、限定されることなく、薬物；ビタミン；無機物サプリメント；疾病もしくは疾患の処置、予防、診断、治療もしくは緩和のために使用される物質；身体の構造または機能に影響を及ぼす物質；または、生理学的環境中におかれた後に生物学的に活性になるか、もしくはより活性になる、プロドラッグを包含する。患者に投与されたときに、対象組成物から隣接組織または体液中に放出されることができる種々の形態の治療剤を使用することができる。
【００４１】
「診断」または「診断剤」は、診断のために使用することができる任意の化学的部分である。例えば、診断剤は、画像化剤、例えば放射性同位体、例えばインジウムもしくはテクネチウム、を含むもの；ヨウ素もしくはガドリニウムを含むコントラスト剤；酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、GFP、アルカリホスファターゼもしくはβ-ガラクトシダーゼ；蛍光物質、例えばユーロピウム誘導体；発光性物質、例えばN-メチルアクリジウム誘導体等を包含する。
【００４２】
いくつかの実施態様において、ナノ小胞はさらに、ターゲッティング分子、好ましくは抗体、ペプチド、アプタマーまたは葉酸を含む。
【００４３】
「ターゲッティング(targeting)分子」は、例えば、標的とする細胞の表面上の受容体もしくは他の分子に結合することによって、ナノ小胞を特定の標的に向かわせることができる任意の分子である。ターゲッティング分子は、タンパク質、ペプチド、核酸分子、糖もしくは多糖、受容体リガンドまたは他の小分子であり得る。特異性の程度は、ターゲッティング分子の選択によって調節することができる。例えば、抗体は典型的には高い特異性を示す。これらは、ポリクローナル、モノクローナル、フラグメント、組み換え体または単鎖であることができ、その多くは、市販されていて入手可能であるか、または標準の技術を使用して容易に得られる。
【００４４】
いくつかの実施態様において、ナノ小胞の二重層はさらに、コレステロール、好ましくは30-50モル％のコレステロールを含む。
【００４５】
さらなる態様に従えば、ナノ小胞を製造する方法であって、ポルフィリン-リン脂質結合体を緩衝液中で混合し、ポルフィリン-リン脂質結合体が、1種のリン脂質の脂質側鎖に、好ましくはsn-1および/またはsn-2の位置で、共有結合された1種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含むこと；ならびに混合物を押出して、少なくとも15モル％のポルフィリン-リン脂質結合体の二重層を含むポルフィリン-リン脂質二重層ナノ小胞を生じること、を含む方法が提供される。
【００４６】
好ましくは、ポルフィリン-リン脂質結合体は、その中にキレート化された金属を含む。
【００４７】
さらなる態様に従えば、ナノ小胞を製造する方法であって、ポルフィリン-リン脂質結合体を緩衝液中で混合し、ポルフィリン-リン脂質結合体が、1種のリン脂質の脂質側鎖に、好ましくはsn-1および/またはsn-2の位置で、共有結合された1種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含むこと、ならびに混合物を超音波処理して、少なくとも15モル％のポルフィリン-リン脂質結合体の二重層を含むポルフィリン-リン脂質二重層ナノ小胞を生じること、を含む方法が提供される。
【００４８】
さらなる態様に従えば、対象において標的領域に光力学的治療を行う方法であって、本明細書に記載されるナノ小胞を提供すること；ナノ小胞を対象に投与すること；および、標的領域でナノ小胞にある波長の光を照射し、光の該波長は、ポルフィリン-リン脂質結合体を活性化させて、一重項酸素を生成すること、を含む方法が提供される。好ましくは、ナノ小胞は、消光されない状態で照射される。
【００４９】
さらなる態様に従えば、対象において標的に光熱治療を行う方法であって、本明細書に記載されるナノ小胞を提供すること；ナノ小胞を対象に投与すること；および、標的領域でナノ小胞に、ある波長の光を照射し、光の該波長は、ナノ小胞の温度を上昇させること、を含む方法が提供される。好ましくは、ナノ小胞は、消光された状態で照射される。
【００５０】
さらなる態様に従えば、対象において標的領域を画像化する方法であって、本明細書に記載されるナノ小胞を提供すること；ナノ小胞を対象に投与すること；標的領域でナノ小胞に、ある波長の光を照射し、ナノ小胞は、光の該波長に応答して、光音響信号を送ること；ならびに、標的領域でその光音響信号を測定および/または検出すること、を含む方法が提供される。
【００５１】
さらなる態様に従えば、対象において標的領域を画像化する方法であって、本明細書に記載されるナノ小胞を提供すること；ナノ小胞を対象に投与すること；および、標的領域において蛍光を測定および/または検出すること、を含む方法が提供される。
【００５２】
さらなる態様に従えば、光力学的治療を行うための、本明細書に記載されるナノ小胞の使用が提供される。
【００５３】
さらなる態様に従えば、光熱治療を行うための、本明細書に記載されるナノ小胞の使用が提供される。
【００５４】
さらなる態様に従えば、光音響画像化を行うための、本明細書に記載されるナノ小胞の使用が提供される。
【００５５】
さらなる態様に従えば、蛍光画像化を行うための、本明細書に記載されるナノ小胞の使用が提供される。
【００５６】
以下の実施例は、本発明の種々の態様を説明するものであり、本明細書に開示される本発明の広い態様を限定しない。
実施例
【００５７】
材料および方法
Pyro-脂質（リソ-ホスファチジルコリン(16:0)- ピロフェオホルビド）の合成
以下のものを10mLの無水ジクロロメタン中で合わせた：49.6mg（0.1ミリモル）の1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（Avanti Polar Lipids）、26.7mg（0.05ミリモル）のピロフェオホルビド-a酸（先に記載したように、Spirulina Pacificaから精製した）、0.05ミリモルのEDC（Sigma）、0.025ミリモルのDMAP（Sigma）および1滴のDIPEA（Sigma）。反応混合物を、暗室中でアルゴン下で室温にて48時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を薄層クロマトグラフィー(TLC)精製（20 x 20 cmの、蛍光指示薬を予めコーティングされたシリカゲルTLC板、1.5mm厚）に供した。クロロホルム-メタノール-氷酢酸-水65：25：8：2（体積：体積）を、溶媒として使用した。Rf=0.4を有する主要な帯を板から分離し、溶出して、最終収率45％を与えた。Pyro-脂質の純度および同定をHPLCおよびマススペクトル法で確認した後、窒素下で乾燥し、1μモルの一定分量で、アルゴン下-20℃にて貯蔵した。
【００５８】
オキシバクテリオクロロフィル-脂質の合成
室温にて、49.6mg（0.1ミリモル）の1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、30.5mg（0.05ミリモル）のバクテリオフェオホルビド-a酸、0.05ミリモルのEDC、0.025ミリモルのDMAPおよび1滴のDIPEAを、10mLの無水DCMに添加した。反応混合物を、暗室中でアルゴン下で室温にて48時間撹拌した。TLCは、純Bchl酸と比べることにより、なおBchl酸のスポットがあることを示した。溶媒を蒸発させ、残渣をTLC板精製（20 x 20 cmの、蛍光指示薬を予めコーティングされたシリカゲルTLC板、1.5mm厚）に供した。クロロホルム-メタノール-氷酢酸-水65：25：8：2（体積：体積）を、展開系として使用した。最終生成物は、Rf=0.4を有して、38％収率で得られた。最終生成物を自然酸化して、オキシBchl-脂質を生じ、これは、マススペクトル測定により検証した。精製後、純度およびマススペクトルを分析用HPLC-MSによって確認した。脂質を一定分量採り、乾燥し、アルゴン下で-20℃にて貯蔵した。
【００５９】
金属Pyro-脂質の生成
キレート化された金属を有するポルフィリン−脂質結合体を生成するために、10倍過剰の遊離の酢酸亜鉛または塩化パラジウムを、アルゴン下で室温にて1時間、メタノール中のPyro-脂質と共にインキュベートした。遊離の金属を、5回のブタノール水抽出によって除去した。次に金属ポルフィリン脂質を一定分量採り、乾燥し、アルゴン下で-20℃にて貯蔵した。ポルフィリン脂質の安定な金属組込み、純度および同一性をHPLCおよびマススペクトル測定によって確認した。
【００６０】
標準的ポルフィゾームの形成
標準の製造法で、95モル％のポルフィリン−脂質を、クロロホルム中に溶解された5モル％のジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000 (PEG-PE)と、またはクロロホルム中の1%1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[フォレート(ポリエチレングリコール)-2000で補足された4% PEG-PE (Folate-PEG-PE)と共にメタノール中に溶解し、窒素気体流下で乾燥し、減圧下でさらに1時間乾燥した。リン酸緩衝塩水（PBS、150mMのNaCl、10mMのリン酸塩、ｐH7.4）で水和するまで、脂質フィルムをアルゴン気体下で-20℃にて貯蔵し、その後5回の凍結-解凍サイクルに供した。ポルフィゾーム懸濁物を、アヴァンティ多重押し出し機(Avanti Mini-Extruder)を用いて、65℃にて100nmの孔径のポリカーボネート膜を通して15回押出した。ポルフィゾームは、使用するまで、アルゴン下4℃にて貯蔵した。通常のポルフィゾーム濃度は0.5mg/mLであった。
【００６１】
小さい30nmポルフィゾームの形成
小さい30nmのポルフィゾームを形成するために、純ポルフィリン−脂質膜を、0.1mgのポルフィリン−脂質を用いて生成し、窒素下および減圧下で乾燥した。フィルムを200μLの水で再水和し、55℃にて10分間超音波処理した。小さいポルフィゾームは、使用するまで、アルゴン下4℃にて貯蔵した。
【００６２】
ポルフィゾームの寸法および形の特性決定
リポソームの寸法を、モルヴァンナノサイザー(Malvern Nanosizer)（モルヴァンインスツルメンツ社(Malvern Instruments Ltd.)、 ウスターシア、英国）を用いて測定した。リポソーム溶液をPBS中で希釈し、それぞれ15ランで3回測定を行い、結果を平均した。
【００６３】
ポルフィゾームの活性化能力の特性決定
発光スペクトルを、2nmスリット幅を用いてフルオロマックス蛍光光度計(Flouromax fluorometer)（ホリバジョビンイーボン(Horiba Jobin Yvon)、エディソン、ニュージャージー州）によって記録した。PyroおよびPyro-脂質を含むリポソームは、420nmにて励起され、NBDを含むものは470nmにて励起された。蛍光強度は、Pyro/Pyro-脂質 およびNBDについてそれぞれ、600nm〜750nmおよび500nm〜600nmで集められた。各試料の蛍光倍率自己消光(fluorescence fold self-quenching)F/F0は、0.5％Triton X-100の存在下での蛍光を洗剤の不在下での蛍光で割ることによって決定した。
【００６４】
ポルフィゾームの光熱特性の特性決定
示された溶液の5μLの液滴を、一片のパラフィルム上に置き、150mWの出力で670nmのレーザーを照射した。温度較正赤外線カメラ（Mikroshot）を用いて、温度を監視した。
【００６５】
ポルフィゾームの光音響特性の特性決定
先に記載した22超音波変換器を有するTi：サファイアチューナブルレーザー装備を用いて、光音響測定を行った。測定は、PBS溶液中でオキシバクテリオクロロフィルポルフィゾームを用いて760nmで行った。ポルフィゾームの光音響信号を、ウシ全血と比較し、また1% Triton X-100を用いて溶解したポルフィゾームと比較した。in vivo研究のために、Sprague-Dawleyラット（200g）および左前足に注入した9nMのポルフィゾーム100μLを使用して、ポルフィゾームを用いての標識リンパ節およびリンパ管のマッピングを行った。注入および光音響測定の前に、関心のある範囲の毛を剃った。
【００６６】
示差走査熱量測定
カロリメトリーサイエンシズ社（Calorimetry Sciences Corp.）の6100 Nano示差走査熱量計(リンドン(Lindon)、ユタ州)を用いて、PBS中のDMPC、HSPC、Lyso PCおよびPyro-脂質の5mg/ml試料について、示差走査熱量測定を行った。測定前に30分間、試料を減圧中に置いた。1℃/分の走査速度を、全ての試料に使用した。対照としてPBSを使用し、PBSの１回走査サイクルをベースラインとして使用した。それぞれの脂質について、3回の冷却および加熱走査を行い、結果を平均して、脂質の相転移温度を決定した。
【００６７】
共焦点顕微鏡観察
KB細胞を、10%FBSを有する葉酸塩を含まないRPMI1640培地(Invitrogen)中で連続的に培養した。細胞は、画像化の前の日にウェル当たり40,000個の細胞で、8部屋の共焦室に接種した。培地を除き、細胞を、血清なしの葉酸塩を含まない培地中でポルフィゾームと共にインキュベートした。2時間のポルフィゾームインキュベーション後に、共焦点顕微鏡(Olympus)を用いて細胞を画像化した。蛍光励起のために、633nmレーザーを使用した。
【００６８】
ポルフィゾームおよびPDT処理後の細胞の生存能力
KB細胞を、10%FBSを有する葉酸塩を含まないRPMI1640培地(Invitrogen)中で、96個のウェルのプレートに接種した。5％CO2インキュベータ中で、37℃にて16時間のインキュベーション後、培地を、ポルフィゾームを含むRPMI1640培地に交換した。細胞を4時間インキュベートした後、0、24および60秒の処理時間で120mWcm-2フルエンス速度で670nmレーザーを使用して、3つの異なる光フルエンス（1、5または10Jcm-2）でPDTにて処理した。24時間後、細胞の生存能力を、MTTトレーサー、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(Invitrogen)を用いて評価した。
【００６９】
結果および検討
種々のポルフィゾームサブユニットの生成
いくつかの異なるポルフィリン−脂質結合体を開発し、ポルフィゾーム形成のために使用した。ポルフィゾームは最初に、ホスファチジルコリン(16:0)- ピロフェオホルビド（Pyro-脂質と称する）のサブユニットから形成した。図１に示されるように、簡易な、以前記載した32アシル化反応を使用して、市販されていて入手可能なリソリン脂質およびピロフェオホルビド（先に報告された33本発明者らの実験室で合成された光増感剤）を用いて、Pyro-脂質を形成した。化合物の同一性および純度は、HPLCおよびマススペクトル測定を用いて確認した（図２）。ピロフェオホルビドの他に、別のポルフィリン−脂質構成物を、より長い波長を吸収するバクテリオクロロフィルを用いて合成して、オキシバクテイロクロロフィル-脂質を生成した（図３）。広く種々の金属イオンは、ポルフィリン環内でキレート化されるとよく知られている。ポルフィゾームが金属キレート化された二重層を用いて形成され得るかどうかを試験するために、我々は、図4に示されるように、単にPyro-脂質を過剰の金属イオンと共にインキュベートし、数回のブタノール-水抽出で遊離の金属イオンを除去することによって、種々の金属Pyro-脂質を生成した。金属ポルフィリン−脂質の純度および同一性は、HPLCおよびマススペクトル測定を用いて確認した（図５）。
【００７０】
ポルフィゾームの生成および特性決定
ポルフィゾームは、100nmのポリカーボネート膜を有する慣用のリポソーム押出し装置を使用して、リン酸塩緩衝塩水(PBS)で水和させたポルフィリン−脂質フィルムを用いて、難なく生成された。生体適合性のために、5モル％のPEG-脂質を、95モル％のポルフィリン−脂質と共に含めた。PEGは、リポソームを安定化し、より良い薬物動態学的プロフィールのためにより長く循環中にそれらを保持することが知られている35。ポルフィゾームは、生成された種々のタイプのポルフィリン−脂質を使用してうまく押し出された。ポルフィゾームは、図6Aに示されるように、使用されたポルフィリン−脂質のタイプに従って変化する吸収スペクトルを有していた。ポルフィゾームが近赤外領域で強い吸収を有し、標準のPyro-脂質ポルフィゾームは680nmで吸収し、オキシバクテリオクロロフィルポルフィゾームは赤外で100nm遠い(deeper)波長で吸収することは注目に値する。in vivo光学用途のために、ナノ粒子は近赤外波長で稼働し、それで励起および発光の光が身体組織からの散乱および吸収を避けることが必須である。異なるタイプのポルフィゾームは異なる波長で吸収したので、それらは、特定の波長に限られる用途に提供することができる。亜鉛ポルフィゾームのシフトした吸収スペクトルは、亜鉛が完全にポルフィゾーム中にキレート化されたことを示す。というのは、亜鉛はポルフィリン吸収においてシフトを誘導するからである。動的光散乱(DLS)を使用して、種々のポルフィゾームの粒径を査定した。図6Bに示されるように、3つのタイプのポルフィゾーム全てが、約100nmの優れたサイズ分布を有し、高度に単分散のナノ粒子を形成した。100nmのポルフィゾームは、非常に望ましいサイズである。というのは、このサイズは、高められた透過性および保持効果によって、腫瘍におけるリポソームの蓄積のために最適なサイズとして認識されるからである36。100nmのポルフィゾームは幾つかの目的のために適当であり得るが、他の場合には、より小さく、全ての脈管構造の中および外で容易に拡散し得るポルフィゾームを使用することが望ましくあり得る。超音波処理は通常、50nmより小さいリポソームを製造するのに使用される。より小さいポルフィゾームを製造するために、水で水和されたPyro-脂質フィ
ルムが10分間超音波に供された。図7に示されるように、この手順は、安定な30nmのポルフィゾームを生じ、これは、押出しによって生成される100nmのポルフィゾームよりはるかに小さい。DLSは、押出されたポルフィゾームは平均して100nmであり、単分散であることを示したが、ポルフィゾームが基本的に新しい特性決定されていない物質を示し、抽出ポルフィゾーム構造はなお確認されていなかったので、構造のより詳細が望まれた。透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して、陰性染料として酢酸ウラニルを用いてポルフィゾームを調べた。図8に示されるように、ポルフィゾームの形は完全に球形であり、より高いTEM倍率ではっきりと見ることができるポルフィリン二重層の特徴を有していた。円形の形は、厳しい条件での染色の間およびTEMの画像化プロセスの間持続し、ポルフィゾームが非常に安定であり、明確に規定された球構造を有していることを示唆した。これらの小胞はほぼ完全に、結合されたポルフィリン脂質から成っていたので、観察された構造は、直径100nmの球形ナノ小胞を形成するポルフィリン二重層である。
【００７１】
得られた化学および構造のデータに基づいて、ポルフィゾームの概略描写が図９に与えられる。Pyro-脂質サブユニットの化学構造が左に示され、ホスホコリン先端基が赤い円中に強調され、結合されたポルフィリン部分が青の六角形中に強調されている。ポルフィゾーム構造の概略描写は、同じサブユニットの色表示を使用して、右に示される。以前の研究は、100nmのリポソーム中に約100,000個の脂質があることを示した37,38。ポルフィゾームは慣用のリポソームと同じ先端基を有するので、ポルフィゾームは、粒子当たり同様の数のサブユニットを含むことが予想される。ピロフェオホルビドの吸光係数が非常に大きいので（97,000M-1cm-1）、集合したポルフィゾームはおよそ109〜1010 M-1cm-1の吸光係数を有すると見積もられる。この吸光係数は、量子ドットより約1000〜10,000倍大きく、一方、ポルフィゾームのサイズはたった約2〜10倍大きいだけである。
【００７２】
ナノ構造として、ポルフィゾームは、ポルフィリンの装填に関して、慣用のリポソームに比べて多くの利点を提供する。リポソームは、約15モル％より高い遊離ポルフィリンの濃度では形成することができない。そのような濃度では、リポソームは不安定であり、したがって、より小さいモル百分率が使用されなければならない。ポルフィゾームは、ポルフィリンの装填において10〜100倍の改善を達成することができる。というのは、100モル％までのポルフィリンを組み込むことができるからである。光増感剤を処方したリポソームが投与されるとき、光増感剤は容易に血清タンパク質へ再分配し、これは、リポソームの標的への志向の使用を無効にする。ポルフィゾームは、光増感剤結合物から安定に形成され、従って、高い有効装填量の光増感剤の標的への志向が、初めて現実のものとなる。ポルフィゾームは、粒子当たり約10個の光増感剤までに限定される慣用の抗体結合光増感剤と比べて、10,000倍の装填の改善を提供する。
【００７３】
ポルフィゾームは先例のない活性化能力を有する光増感剤である
ポルフィゾームは、一緒に接近して配置されたポルフィリンの２つの球形層を有するので、細胞組み込みおよび活性化の前に自己消光しやすい。図10Aに示されるように、Pyro-脂質の、PC:Chol(3:2比)から成る標準リポソーム中への滴定は、活性化能力における驚くほどの増加をもたらす。100％Pyro-脂質で構成されるポルフィゾームは、洗剤を添加すると、1300倍の活性化を示した。活性化能力の増加は、Pyro-脂質濃度の関数としてほぼ直線であった。図10Bは、最大量の遊離のPyro（15％）を用いて形成されたリポソームは10倍の活性化しか証明しなかったことを示す。より高い百分率の遊離のPyroの脂質フィルムへの組み込みは、フィルムの再水和の間、完全には可溶化されることができなかった。このことは、組み込まれた遊離のPyroが二重層中で無作為に配向され、それに対して、ポルフィゾームのポルフィリン二重層はナノ構造を実際に安定化することを示唆する。5％のPyro-脂質をDSPCで置換すると、高い転移温度を有する脂質は、ポルフィゾームの活性化能力を顕著には変えなかった。しかしながら、DSPE-PEGが組み込まれたとき、活性化能力は1500倍より大きく増加した。DSPE-PEGはまた、ポルフィゾームの長期間安定性を改善し、これは、4℃で貯蔵したとき2カ月を超えて安定なままであった。さらにPEGは、薬剤の薬物動態学および生体分布(biodistribution)を改善する。Pyro-脂質が、官能性側鎖が異なる（Pyro対NBD）蛍光トレーサー脂質であるNBD-脂質で置換されたとき、22倍の活性化しか観察されなかった。DLSは、安定なリポソームは95モル％のNBD-脂質を用いて形成することができなかったことを示し、安定なポルフィゾームの生成におけるポルフィリン相互作用の安定化効果を強調する。
【００７４】
ポルフィゾームの生体適合性
我々は次に、ポルフィゾームの可能な臨床用途に関連する要因について調べた。ポルフィゾームは、酵素的な分解をしやすかった（図19a）。洗剤およびリパーゼと一緒にインキュベーションすると、リン脂質構造は開裂され、主要な芳香族生成物はピロフェオホルビドであり、これはポルフィリン−脂質を生成する合成反応における出発物質であった。クロロフィルのように、ピロフェオホルビドは、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素と一緒にインキュベートされるとき、無色のピロールへと酵素的に開裂されることが知られている。我々は、ポルフィリン吸収の減少を監視することによってこの分解を検証し、ピロフェオホルビドがペルオキシダーゼによって有効に分解され得ることを確かめた。我々の知識では、これは、酵素的に生物分解性の光活性なナノ粒子の最初の例である。我々は次に、予備的研究を行って、ポルフィゾームの可能性のある毒性について調べた。マウスを、高い投与量のポルフィゾーム（1000mg/kg）で処理したとき、主な挙動変化または体重の減少の欠如によって示されるように（図19b）、マウスは一般的に、2週間にわたって健康なままであった。2週間の時点で、マウスを殺し、血液試験を行った（図19c）。肝機能試験は、マウスの肝機能が、いくらか胆汁酸およびアラニントランスフェラーゼが上昇した（正常値の上限範囲の2倍未満）こと以外は、一般に正常であったことを示した。赤血球細胞カウントおよび特性は、大投与量のポルフィリン−脂質によって影響を受けず、これは、内因性ポルフィリン（ヘム）の生理学的調節を妨げなかった。影響を受けなかった白血球細胞カウントは、ポルフィゾームが、マウスに与えられた高い投与量でさえ、2週間の時点で免疫原性でなかったことを意味する。肝臓、脾臓および腎臓の死後の組織病理学試験は、これらの器官は良好な状態であり、高い静脈内ポルフィゾーム投与量によって強い影響を受けなかったことを示した（図19d）。
【００７５】
ポルフィゾームの大きな水性コアの装填
ポルフィリン二重層の最も驚くべき観察の１つは、大きな水性コアであり、これは、荷を装填する可能性を有する（図８）。一般に表面の吸着または結合によって荷を装填する無機ナノ粒子、例えば金ナノ粒子とちがって、ポルフィゾームは、自由にその全容積を満たすことができる。ポルフィゾーム（5％PEG-脂質を含む）を250mMのカルボキシフルオレセイン溶液を用いて水和し、押出したとき、ゲルろ過によって示されるように、限られた量のカルボキシフルオレセインしかポルフィゾーム中に安定に閉じ込められなかった（図20a）。コレステロールはホスファチジルコリンに基づくリポソーム内の化合物の装填を増すことが知られているので、本発明者らは、30モル％のコレステロールを処方物中に含め、受動的カルボキシフルオレセイン装填を繰り返した。コレステロールを含むポルフィゾームは、コレステロールを欠くポルフィゾームより20倍大きい高効率で、カルボキシフルオレセインを装填することができた。この高い装填濃度で、カルボキシフルオレセイン自体は、ポルフィゾーム中で自己消光された（図20b、左）。さらに、ポルフィゾームは、ほぼ完全に自己消光されたままであり（図20b、右）、その特徴的な光変換挙動が保持されたことを示した。予想されるように、カルボキシフルオレセインの受動装填は、水和溶液中の全蛍光団の少しの部分を閉じ込めるだけだった。最も効果的な薬剤装填技術の１つは能動装填であり、これは、pHもしくはイオン勾配を使用して両親媒性弱塩基分子をリポソームおよびポリマーソーム(polymersome)中に濃縮する。この装填技術の重要性は、最初の臨床的に実施されたナノ粒子であるDoxil（商標）により反映され、これは、能動的に装填されたドキソルビシンのリポソーム処方物である。我々は、ドキソルビシン対pyro-脂質のモル比1：5を用いて、硫酸アンモニウム勾配法43を適用して、ドキソルビシンをポルフィゾーム中に能動的に装填した。コレステロールの添加なしに、ドキソルビシンの幾らかの装填がゲルろ過によって観察されたが、溶液から組み込まれた全ドキソルビシンの部分は約10％であった（図20c）。しかしながら、50モル％のコレステロールをポルフィゾーム処方物に添加したとき、強い能動装填が達成され、ポルフィゾームは、溶液中の全ての遊離のドキソルビシン
の90％をポルフィゾームコア中に装填した。大きいモル％のコレステロールを使用したが、コレステロールはホスファチジルコリンサブユニットの空間の四分の一を占めるのみであると予想され44、かくしてポルフィリン二重層密度をわずかに減らすだけであるので、ポルフィリン密度へのその効果は限られていた。このことは、図20dにおいて示される保持された極度のポルフィリン自己消光によって支持される。装填されていないポルフィゾームと同様の光変換特性を有することの他に、能動的および受動的の両方で装填されたポルフィゾームは、単分散性を維持し、150nm〜200nmのサイズを示した（図20e）。
【００７６】
光変換器としてのポルフィゾーム
光熱治療は、金ナノロッドの高い光熱変換効率のような発見39によって示されるように、関心が増している領域である。それらの大きい吸収係数および細胞取込みの前の非常に消光された状態のために、ポルフィゾームの光熱特性が研究された（図11）。温度較正赤外線カメラを使用すると、670nmのレーザーを用いる150mWのレーザー照射下で、PBSも標準PC:Chol(3:2)リポソームも有意の光熱応答を生じなかった。670nmで0.8の吸収を有する金ナノロッドがレーザーで照射されると、熱が効率的に生成され、赤外線カメラによって検出された。同じ吸収を有するポルフィゾームが測定されたとき、同様の量の光熱転換を生じた。かくして、同様の光熱効果を生じたが、ポルフィゾームは、温熱療法および光音響用途のために有用であり得る、金属ではなくて柔軟なナノ粒子を示す。
【００７７】
実際に、in vitroで測定されたとき、ポルフィゾームは、低いピコモル濃度およびナノモル濃度まで検出可能である非常に強い光音響信号を生成し、血液の信号を超えて容易に検出可能であった（図12AおよびC）。ポルフィゾームは金ナノ粒子に匹敵する光音響信号を有するが、生体適合性および薬剤装填に関して利点を有する。さらには、洗剤の添加は光音響信号を減じ、サブユニットの自己集合体が光変換特性を生じる理由であることの直接証明を与える（図12B）。光音響プローブとしてのポルフィゾームの使用は、ポルフィゾームを、in vivoでラットにおいて標識リンパ節を有効に写像するのに使用することによって、検証された（図13）。標識リンパ節の検出および検討は、胸部癌転移の状態を評価することにおいて一般に使用される手順であり、ポルフィゾームを使用する光音響断層撮影法は、in vivoでノイズに対して高い信号を有する、これらの標識リンパ節を検出するのに優れた方法であった。ポルフィゾームは明らかに、ターゲッティングリガンドに依存せずに、標識リンパ節をマッピングした（これらの節はしたがって、転移癌を含み得るか、または含み得ない）。適当なターゲッティングリガンドを用いると、ポルフィゾームは、追加的に癌細胞中に取り込まれることができ、結果として消光および蛍光の生成を生じる。
【００７８】
Pyro-脂質の熱特性をさらに検討するために、示差走査熱量測定を使用した（図14）。DMPCおよびHSPCの対照脂質は、予想されるように挙動し、それぞれ24℃および52℃の転移温度を示した。興味あることには、Pyro-脂質は明確な転移温度を示さず、ポルフィゾームは脂質が相を変えるとき生じる転移温度を示さない可能性があることを示唆する。95℃に15分間加熱し、室温まで冷却した後で、ポルフィゾームは、約100nmの良好なサイズ分布を保持した。合わせて考えると、これらのデータは、ポルフィゾームが熱的に安定であると共に良好な光熱および光音響変換器であることを示す。
【００７９】
ポルフィゾームは、ポルフィリン光増感剤の著しく高い有効装填量を有するが、不活性な状態では、著しく消光された蛍光を示し、一重項酸素生成も消光されていることを示唆する40。ポルフィゾームが標的に向けられ、細胞中で活性化されることができることを示すために、我々は、多くの癌において過剰発現される受容体である葉酸塩受容体を標的にした41。葉酸塩受容体を発現することがよく知られている42ので、KB癌細胞を使用した。葉酸塩ポルフィゾームは、1モル％の葉酸塩-PEG脂質、4モル％のPEG-脂質および95％のPyro-脂質を組み込むことによって製造した。ポルフィゾームの取り込みは、生細胞共焦点顕微鏡を使用して調べた。図15に示されるように、葉酸塩を付けられたポルフィゾームがKB細胞と共に2時間インキュベートされたとき、細胞にポルフィゾームが取り込まれるだけでなく、高い蛍光信号は、ポルフィゾームが取り込まれると活性化されたことを示す。というのは、ポルフィゾームは活性化の前には本質的に蛍光性でないからである。活性化のメカニズムは、エンドサイトーシス中にポルフィゾームがばらばらになることであり得る。蛍光の脱消光(dequenching)は一重項酸素脱消光に相関するので、ポルフィゾームは、特異的ターゲッティングが起こると、おそらく一重項酸素応答を増加させたものと考えられる。葉酸塩ターゲッティング部分を欠くポルフィゾームは最小の取り込みを示した。細胞が過剰の葉酸と共にインキュベートされるとき、葉酸塩を付けられたポルフィゾームは有効には取り込まれず、取込みのメカニズムの特異性を示す。我々はまた、核染色および固定細胞画像化を用いてポルフィゾームの取り込みを調べた（図16）。ポルフィゾームの取り込みはまた、葉酸塩結合に依存性であった。生細胞の画像化を用いると、ポルフィゾームは核から排除されたが、固定細胞画像化において、細胞中のポルフィゾームの分布は非常に均一であった。これは、生細胞においては、ポルフィゾームは2時間の時点でエンドソーム中に区分され、細胞中でのポルフィゾームの再分配のためにさらなる時間が必要とされ得ることを示し得る。ポルフィゾームが腫瘍を有するマウス中に静脈内注入されるとき、最初にマウスにおいて取るに足らない蛍光があった（図18、左）。これは、ポルフィゾームが最初にin vivoで消
光されたことを証明する。時間が経つにつれて、ポルフィゾームは腫瘍中に蓄積し、脱消光された（図18、右）。これは、ポルフィゾームが、蛍光画像化（およびまた光力学的治療）のための低背景プローブとして使用され得ることを証明する。
【００８０】
ポルフィゾームが、特異的および分子的標的メカニズムによって細胞を殺すことができることを示すために、KB細胞を、1モル％の葉酸ターゲッティング脂質を含むか、または含まないポルフィゾームと一緒にインキュベートした。次に細胞を種々の強度のレーザー照射にさらした。図17に示されるように、ポルフィゾームが仲介する細胞殺は、ポルフィゾーム濃度ならびに光線量強度の両方に量応答性であった。ポルフィゾームへの葉酸脂質組み込みは、有効なPDTのために必要とされた。共焦点顕微鏡の結果と一致して、葉酸塩標的化ポルフィゾーム仲介PDT細胞殺は、インキュベーション中に過剰の遊離の葉酸塩が添加されるときに抑制され、ポルフィゾームのターゲッティングおよび細胞殺の特異性を確認した。
【００８１】
有機ナノ粒子のバイオフォトニック治療の可能性を示すために、我々は次に、ポルフィゾームを、光熱治療のための剤として使用する予備的実験を行った。出力750mWの658nmのレーザー（電力密度1.9W/cm2を有する）を使用して、ポルフィゾーム投与後の異種移植片を有するマウスにおけるKB腫瘍を照射した（図21a）。処理の24時間前に、マウスに42mg/kgのポルフィゾームを静脈内注入した。ポルフィゾームまたはPBSの投与の24時間後、腫瘍をレーザーで1分間照射し、熱カメラを用いて温度を監視した（図21b）。ポルフィゾーム群における腫瘍温度は、急速に60℃に達したが、それに対して、PBSを注入したマウスの腫瘍は、40℃までに限られた（図21c）。処理後、ポルフィゾームおよびレーザー処理群のマウスでは、腫瘍上にかさぶたが成長したが、それに対して、レーザーのみの群およびポルフィゾーム単独の群はそうではなかった。2週間後、かさぶたは治り、処理された群の腫瘍は永久に破壊された（図21d）。ポルフィゾームおよび光で処理されたマウスの腫瘍とちがって、レーザー処理のみ、またはポルフィゾーム注入のみを受けたマウスの腫瘍は、急速に増殖し続け、それらの群のマウスの全てが21日以内に安楽死させなければならなかった（図21e）。この光熱実験は、1g/kg静脈内投与量でのポルフィゾームの安全性を前提として、少なくとも25の治療指数を有する治療に相当した。
【００８２】
結論
新たなナノ粒子およびそれらが有する新規な特性は、成長するナノテクノロジー革命の陰の推進力である。ポルフィゾームは、治療用途に良く合わせられる新規なナノスケールの特性を有する基本的に異なるタイプのナノ粒子を示す。ポルフィゾームは用途が広く、種々の光学および寸法特性を有して製造することができる。ポルフィゾームは、金属キレート化された二重層を有して形成されることができ、標的に向けられる金属デリバリのための新しい道を示す。それぞれのポルフィゾームは約100,000個の光増感剤の集合体であるので、ポルフィゾームはPDTのための並ぶもののない光増感剤有効装填量を有することができる。さらに、それらは標的を定めることができる、光増感剤の慣用のリポソーム処方物のために存在しなかった特性である。細胞に取り込まれると、ポルフィゾームは活性化され、活性化すると1000倍まで蛍光が増加する。ポルフィゾームは、光熱転換のための現在の標準である金ナノロッドと同じ範囲で光熱変換効率を示すが、ナノロッドと違って、ポルフィゾームは、生物分解性で、かつin vivoで良好な耐性がある有機の性質を有する。他の光学活性なナノ粒子と違って、ポルフィゾームの大きな水性コアは、蛍光団および薬剤を装填することができる。多様なフォトン画像化能力に加えて、ポルフィゾームは、薬剤装填ならびに光力学および光熱治療のための固有の適合性に基づく大きな治療可能性を有する。
【００８３】
本発明の好ましい実施態様を本明細書において説明したが、本発明の意図または添付される請求の範囲から離れることなく、それに対する変更を行うことができることを、当業者は理解するであろう。以下の、本明細書に記載される全ての参考文献は、引用することによってその全部が組み込まれる。
【００８４】
参考文献
1. チャン(Chan), W.C.W. & ニー(Nie), S. Science 281, 2016-2018, 1998.
2. ストルホフ(Storhoff), J.J., ルーカス(Lucas), A.D., ガリメラ(Garimella), V., バオ(Bao), Y.P. & ミュラー(Muller), U.R. Nat. Biotechnol. 22, 883-887, 2004.
3. ドルマンス(Dolmans), D.E., フクムラ(Fukumura), D. &ジャイン(Jain), R.K. Nat. Rev. Cancer 3, 380-387, 2003.
4. オネアル(O'Neal), D.P., ヒルシュ(Hirsch), L.R., ハラス(Halas), N.J., ペイン(Payne), J.D. & ウエスト(West), J.L. Cancer Lett. 209, 171-176 2004.
5. ファン(Huang), X., エル-セイド(El-Sayed), I.H.,クィャン( Qian), W. & エル-セイド(El-Sayed), M.A. J. Am. Chem. Soc. 128, 2115-2120, 2006.
6. オラエフスキー(Oraevsky), A.A. Proc. SPIE 2676, 22-31, 1996.
7. オラエフスキー(Oraevsky), A.A. & カラブトフ(Karabutov), A.A. Biomedical Photonics Handbook , 2003 版; ヴォ-ディン(Vo-Dinh), T., 編; CRC Press: Boca Raton, 34.1 - 34.34, 2003.
8. スー(Xu), M. & ワン(Wang), L.V. Rev. Sci. Instrum. 77, 041101 2006.
9. ワン(Wang), L.V. Nat. Photonics 3, 503-509, 2009.
10.     ヴァコク(Vakoc), B.J. ら、Nat. Med. 15, 1219-1223, 2009.
11.     ウェイススレダー(Weissleder), R. & ピテット(Pittet), M.J. Nature 452, 580-589, 2008.
12.     クロストラネク(Klostranec), J.M. & チャン(Chan), W. Adv. Mater. 18, 1953-1964, 2006.
13.     ユェラビデ(Yguerabide), J. & ユェラビデ(Yguerabide), E.E. Anal. Biochem. 262, 137-156, 1998.
14.     ラル(Lal), S., クレア(Clare), S.E. & ハラス(Halas), N.J. Accounts of Chemical Research 41, 1842-1851, 2008.
15.     ゴシュ(Ghosh), P. Advanced Drug Delivery Reviews 60, 1307-1315, 2008.
16.     レウィンスキー(Lewinski), N., コルビン(Colvin), V. & ドレゼク(Drezek), R. Small 4, 26-49, 2008.
17.     ネル(Nel), A., キシャ(Xia), T., マドラー(Madler), L. & リー(Li), N. Science 311, 622-627, 2006.
18.ピア(Peer), D.ら、 Nat. Nanotechnol. 2, 751-760, 2007.
19.ドレイン(Drain), C.M., バロット(Varotto), A. &ラジヴォィェビク( Radivojevic), I. Chem. Rev. 109, 1630-1658, 2009.
20.     コマツ(Komatsu), T., モリタケ(Moritake), M., ナカガワ(Nakagawa), A. & ツチダ(Tsuchida), E. Chem. Eur. J. 8, 5469-5480, 2002.
21.     ゴログシャン(Ghoroghchian), P.P. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 2922-2927, 2005.
22. ウッドバーン(Woodburn), K. W.; エンゲルマン(Engelman), C. J.; ブルーメンクランツ(Blumenkranz) & M. S. レティナ(Retina) (フィラデルフィア、ペンシルベニア州), 22, 391-405, 2002.
23. バビラス(Babilas), P.; カレル(Karrer), S.; シドロフ(Sidoroff), A.; ランドサラー(Landthaler), M. & セイミース(Szeimies), R. Photodermatology, Photoimmunology Photomedicine, 21, 142-149, 2005.
24. ブラウン(Brown), S. B. Lancet Oncology, 5, 508, 2004.
25. ドーティー(Dougherty), T., ら、J. Natl. Cancer Inst., 90, 889-905, 1998.
26. スターンバーグ(Sternberg), E. D.; ドルフィン(Dolphin), D. & ブルックナー(Bruckner), C. Tetrahedron 54, 4151-4202, 1998.
27. チェン(Chen), B.; ポグー(Pogue), B. W. & ハサン(Hasan), T. Expert Opin. Drug Deliv. 2, 477-487, 2005.
28. ミラー(Miller), G. G.;ローン(Lown) & J. W. Drug Dev. Res. 42, 182-197, 1997.
29. マトス(Matos), M. S.ら、Macromolecules 33, 2967-2973, 2000.
30.ツダ(Tsuda), A. & オスカ(Osuka), A., Science 293, 79-82, 2001.
31.ワン(Wang), L.; リウ(Liu), H. & ハオ(Hao), J. Chem. Comm. 1353, 2009.
32. メイソン(Mason), J. T.; ブロッコリ(Broccoli), A. V. & フアン(Huang), C. Anal. Biochem. 113, 96-101, 1981.
33. ツェン(Zheng), G. ら、Bioconj. Chem. 13, 392-396, 2002.
34. ビエサガ(Biesaga), M.; ピルジンスカ(Pyrzynska), K.; トロジャノウィクツ(Trojanowicz), M. Talanta 51, 209-224, 2000.
35. パパハジョポウロス(Papahadjopoulos)ら、  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 11460-11464, 1991.
36. ナガヤス(Nagayasu), A.;ウチヤマ( Uchiyama), K. & キワダ(Kiwada), H. Advanced Drug Delivery Rev. 40, 75-87, 1999.
37.シュナイダー( Schnyder), A.; クラーヘンビュール(Krahenbuhl), S.;トロク(Torok), M.; ドレウェ(Drewe), J. & フウィラー(Huwyler), J. Biochem. J, 377, 61-67, 2004.
38. シ(Shi), N. & パードリッジ(Pardridge), W. M. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 7567-7572, 2000.
39. ファン(Huang), X.; エル-セイド(El-Sayed), I. H.; クィャン(Qian), W. & エル-セイド(El-Sayed), M. A. J. Am. Chem. Soc. 128, 2115-2120, 2006.
40. ロベル(Lovell), J. F ら、J. Phys. Chem. B 113, 3203-3211, 2009.
41. サディマック(Sudimack), J. & リー(Lee), R. J. Advanced Drug Delivery Rev. 41, 147-162, 2000.
42.リー(Lee), R. J. & ロウ(Low), P. S. J. Biol. Chem. 269, 3198-3204, 1994.
43. ハラン(Haran), G., コーヘン(Cohen), R., バー(Bar), L.K. & バレンホルツ(Barenholz), Y. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes 1151, 201-215, 1993.
44.ハンセン( Hansen), C.B., カオ(Kao), G.Y., モーセ(Moase), E.H., ザリプスキー(Zalipsky), S. & アレン(Allen), T.M. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes 1239, 133-144, 1995.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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