(57)【要約】  本開示は、インフルエンザを治療するのに有用な組成物及び方法を提供する。本明細書に記載する通り、提供される組成物及び方法は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を、非イオン性界面活性剤（ＮＩＳＶ）、及び任意選択によってアジュバントを含む脂質ベシクルと組み合わせて含む、ある種の組成物の開発に基づく。ある実施形態において、提供される組成物は、これらが標準の低温流通システムにおいて貯蔵されない場合でも依然として強力である（即ち、これらは熱安定性である）。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む組成物であって、脂質ベシクルが約５０：１〜約４００：１の範囲内の脂質：抗原重量比を達成する量で組成物中に存在する脂質からなり、脂質が非イオン性界面活性剤を含む、組成物。
【請求項２】
免疫原性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む免疫原性組成物であって、脂質ベシクルが少なくとも約５０：１の脂質：抗原重量比を達成する量で組成物中に存在する脂質からなり、脂質が非イオン性界面活性剤を含む、組成物。
【請求項４】
液体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
乾燥している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む乾燥組成物であって、脂質ベシクルが少なくとも約３０：１の脂質：抗原重量比を達成する量で組成物中に存在する脂質からなり、脂質が非イオン性界面活性剤を含み、組成物の水分含量が約２重量％未満である、組成物。
【請求項７】
脂質：抗原重量比が少なくとも約１００：１である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
脂質：抗原重量比が少なくとも約２００：１である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
脂質：抗原重量比が少なくとも約２５０：１である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
脂質：抗原重量比が約３５０：１未満である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
脂質：抗原重量比が約２５０：１〜約３５０：１の範囲内である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
脂質：抗原重量比が約３００：１である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
４０℃で６ヶ月間貯蔵した場合、ＨＡＩアッセイによって決定される免疫原性の５０％未満の変化を示す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
免疫原性の１０％未満の変化を示す、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
４０℃で６ヶ月間貯蔵した場合、ＥＬＩＳＡによって決定される抗原含量の５０％未満の減少を示す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
抗原含量の１０％未満の減少を示す、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
４０℃で６ヶ月間貯蔵した場合、脂質ベシクルのない参照組成物よりも安定である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
安定性がＨＡＩアッセイによって決定される免疫原性に基づく、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
安定性がＥＬＩＳＡによって決定される抗原含量に基づく、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む免疫原性組成物であって、脂質ベシクルが非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、前記組成物が、４０℃で６ヶ月間貯蔵した場合、ＨＡＩアッセイによって決定される免疫原性の５０％未満の変化を示す、組成物。
【請求項２１】
免疫原性の１０％未満の変化を示す、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む免疫原性組成物であって、脂質ベシクルが非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、前記組成物が、４０℃で６ヶ月間貯蔵した場合、ＥＬＩＳＡによって決定される抗原含量の５０％未満の減少を示す、組成物。
【請求項２３】
抗原含量の１０％未満の減少を示す、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む免疫原性組成物であって、脂質ベシクルが非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、前記組成物が、４０℃で６ヶ月間貯蔵した場合、脂質ベシクルのない参照組成物よりも安定である、組成物。
【請求項２５】
安定性がＨＡＩアッセイによって決定される免疫原性に基づく、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
安定性がＥＬＩＳＡによって決定される抗原含量に基づく、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、
溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、
得られる生成物を均質化するステップと
を含み、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約５０：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、方法によって調製される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、
溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、
得られる生成物を均質化するステップと
を含み、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌの脂質濃度を達成する相対量及び体積で合わせる、方法によって調製される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの範囲の脂質濃度を達成する相対量及び体積で合わせる、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む組成物であって、脂質ベシクルが非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、前記組成物が、
脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、
溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、
得られる生成物を均質化するステップと
を含み、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約５０：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、方法によって調製される、組成物。
【請求項３３】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約１００：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約２００：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約２５０：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約４００：１未満の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約３５０：１未満の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３８】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約２５０：１〜約３５０：１の範囲内の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３９】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約３００：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４０】
溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む組成物であって、脂質ベシクルが非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、前記組成物が、
脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、
溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、
得られる生成物を均質化するステップと
を含み、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌの脂質濃度を達成する相対量及び体積で合わせる、方法によって調製される、組成物。
【請求項４３】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの範囲の脂質濃度を達成する相対量及び体積で合わせる、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約５０：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項４２又は４３に記載の組成物。
【請求項４５】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約１００：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約２００：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約２５０：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４８】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約４００：１未満の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４９】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約３５０：１未満の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項４４に記載の組成物。
【請求項５０】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約２５０：１〜約３５０：１の範囲内の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項４４に記載の組成物。
【請求項５１】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約３００：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項４４に記載の組成物。
【請求項５２】
溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える、請求項４２〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える、請求項４２〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原がインフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１株由来である、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原がインフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２株由来である、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５６】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原がインフルエンザＢ型株由来である、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原が、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１株、インフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２株、及びインフルエンザＢ型株の２種以上由来である、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５８】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原が、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１株、インフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２株、及びインフルエンザＢ型株由来である、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５９】
各株由来のほぼ等量のインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む１つ又は複数の不活化インフルエンザウイルスを含む、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む１つ又は複数の弱毒化インフルエンザウイルスを含む、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原がウイルス成分抗原として組成物中に存在する、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原がサブユニット抗原として組成物中に存在する、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
非イオン性界面活性剤がエステル連結している界面活性剤である、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
非イオン性界面活性剤がグリセロールエステルである、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
非イオン性界面活性剤が１−モノパルミトイルグリセロールである、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６７】
非イオン性界面活性剤がエーテル連結している界面活性剤である、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
非イオン性界面活性剤がグリコール又はグリセロールモノエーテルである、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
非イオン性界面活性剤が１−モノセチルグリセロールエーテル又はジグリコールセチルエーテルである、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７０】
脂質がイオン性両親媒性物質をさらに含む、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７１】
イオン性両親媒性物質がジセチルホスフェートである、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
脂質がステロイドをさらに含む、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７３】
ステロイドがコレステロールである、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
脂質が、非イオン性界面活性剤、イオン性両親媒性物質、及びステロイドを含む、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７５】
脂質が、１−モノパルミトイルグリセロール、ジセチルホスフェート、及びコレステロールを含む、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７６】
組成物中に存在するインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原の少なくとも一部分が脂質ベシクルと会合している、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７７】
組成物中に存在するインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原の少なくとも一部分が、脂質ベシクル内に捕捉されている、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７８】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７９】
アジュバントがＴＬＲ−４アゴニストを含む、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
アジュバントが弱毒化リピドＡ誘導体を含む、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
アジュバントがリピドＡのモノホスホリル誘導体を含む、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８２】
アジュバントがリピドＡの３−デアシルモノホスホリル誘導体を含む、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８３】
アジュバントがＴＬＲ−７／８アゴニストを含む、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８４】
アジュバントがＴＬＲ−９アゴニストを含む、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８５】
組成物中に存在するアジュバントの少なくとも一部分が脂質ベシクルと会合している、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８６】
組成物中に存在するアジュバントの少なくとも一部分が脂質ベシクルと会合していない、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８７】
脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、
溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、
得られる生成物を均質化するステップと
を含み、アジュバントを脂質と一緒に融解する、方法によって調製される、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８８】
脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、
溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、
得られる生成物を均質化するステップと
を含み、アジュバントを溶融脂質、及びインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせる、方法によって調製される、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８９】
脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、
溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、
得られる生成物を均質化し、次いで乾燥するステップと
を含み、アジュバントを、乾燥ステップの前に、得られる生成物に加える、方法によって調製される、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９０】
温度制御条件下で組成物を貯蔵することを伴わない方法によって調製された、請求項１〜８９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９１】
少なくとも一時的に８℃を超える温度で組成物を貯蔵することを伴う方法によって調製された、請求項１〜８９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９２】
少なくとも一時的に１５℃を超える温度で組成物を貯蔵することを伴う方法によって調製された、請求項１〜８９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９３】
少なくとも一時的に２０℃を超える温度で組成物を貯蔵することを伴う方法によって調製された、請求項１〜８９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９４】
少なくとも一時的に２５℃を超える温度で組成物を貯蔵することを伴う方法によって調製された、請求項１〜８９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９５】
乾燥形態の組成物を貯蔵することを伴う方法によって調製された、請求項１〜９４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９６】
インフルエンザ感染症に罹患している、又はその危険性のある対象を治療する方法であって、
乾燥形態の請求項１〜９５のいずれか一項に記載の組成物を用意するステップと、
前記組成物を再水和するステップと、
治療有効量の再水和した組成物を前記対象に投与するステップと
を含む、方法。
【請求項９７】
再水和した組成物を筋肉内注射によって投与する、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む組成物を調製する方法であって、脂質ベシクルが非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、前記方法が、
脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、
溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、
得られる生成物を均質化するステップと
を含み、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約５０：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、方法。
【請求項９９】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約１００：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約２００：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約２５０：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約４００：１未満の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０３】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約３５０：１未満の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０４】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約２５０：１〜約３５０：１の範囲内の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０５】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約３００：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０６】
溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える、請求項９８〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える、請求項９８〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む組成物を調製する方法であって、脂質ベシクルが非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、前記方法が、
脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、
溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、
得られる生成物を均質化するステップと
を含み、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌの脂質濃度を達成する相対量で及び体積で合わせる、方法。
【請求項１０９】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの範囲の脂質濃度を達成する相対量及び体積で合わせる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約５０：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項１０８又は１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約１００：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約２００：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約２５０：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１４】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約４００：１未満の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１５】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約３５０：１未満の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１６】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約２５０：１〜約３５０：１の範囲内の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１７】
溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の約３００：１の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１８】
溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える、請求項１０８〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える、請求項１０８〜１１７のいずれか一項に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【背景】
【０００１】
[0002]インフルエンザは、ウイルスのオルソミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科に関連する呼吸器系の一般的な感染症である。ウイルスは高度に変異性であるため、通常、株の変異を考慮に入れた再調合ワクチンで毎年ワクチン接種することが必要とされる。米国において毎年開発されるワクチンの組成は、食品医薬品局ワクチン及び関連の生物学的製剤諮問委員会（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって決定される。世界保健機関（ＷＨＯ）は同様に、インフルエンザの新たな変異株を検出するために、世界的な検査室のサーベイランスネットワークを操作している（例えば、Ｌａｖａｎｃｈｙ、Ｖａｃｃｉｎｅ１７：Ｓ２４（１９９９年）を参照されたい）。選択は、最近単離したインフルエンザウイルスの抗原の分析、抗原の変異株の伝播のパターン、及び最近ワクチン接種した対象の抗体反応に基づく。
【０００２】
[0003]インフルエンザＡ型及びＢ型は、流行性のヒト疾患を引き起こす２つのタイプのインフルエンザウイルスである。インフルエンザＡ型ウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）の２つの表面抗原に基づいて亜型にさらに分類される。例えば、インフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１亜型は、ヘマグルチニン１型抗原（Ｈ１）及びノイラミニダーゼ１型抗原（Ｎ１）を有し、Ｈ３Ｎ２亜型はヘマグルチニン３型抗原（Ｈ３）及びノイラミニダーゼ２型抗原（Ｎ２）を有する。インフルエンザＢ型ウイルスは亜型に分類されない。１９７７年以来、インフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ウイルス、インフルエンザＡ型（Ｈ３Ｎ２）ウイルス、及びインフルエンザＢ型ウイルスが世界的に広まっている。ワクチン接種は、インフルエンザ感染症及び関連の合併症からの重篤な疾患の危険性が高い者に対して、インフルエンザを防止又は弱毒化する単一の最も効果的な方法として認められている。不活化インフルエンザウイルスから調製した抗原を接種すると、特異的な抗体の生成が刺激される。その株からワクチンが調製されるウイルスの株、又は密接に関連する株に対してのみ保護作用がもたらされる。
【０００３】
[0004]各年のワクチンは、次の冬に広まる可能性が高いと考えられるインフルエンザウイルスを代表する、３つのウイルス株由来の抗原を含んでいる（２タイプのＡ株及び１タイプのＢ株由来の抗原を通常含む、３価ワクチンと呼ばれる）。現在の、及び出現しつつあるインフルエンザウイルスの株の抗原の特徴により、毎年のワクチンに含まれる株を選択するベースが与えられる。ＷＨＯは毎年世界的な疫学的状況を調査し、必要であれば、現在の疫学的証拠に基づいて新たな株を推薦している。
【０００４】
[0005]インフルエンザワクチンは、世界中のインフルエンザの発生率を低減するのに成功しているが、当技術分野において、安定であり、効力を維持する改善されたインフルエンザワクチンが依然として必要とされている。
【概要】
【０００５】
[0006]本開示は、インフルエンザを治療するのに有用な組成物及び方法を提供する。本明細書に記載する通り、提供される組成物及び方法は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を、非イオン性界面活性剤（ＮＩＳＶ）、及び任意選択によってアジュバントを含む脂質ベシクルと組み合わせて含む、ある種の組成物の開発に基づく。ある実施形態において、提供される組成物は、これらが標準の低温流通システムにおいて貯蔵されない場合でも依然として強力である（即ち、これらは熱安定性である）。
【０００６】
[0007]一態様において、本開示はインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む組成物を提供し、脂質ベシクルは、約５０：１〜約４００：１の範囲内の脂質：抗原重量比を達成する量で組成物中に存在する脂質からなり、脂質は非イオン性界面活性剤を含む。ある実施形態において、提供される組成物は免疫原性である。
【０００７】
[0008]別の一態様において、本開示はインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む免疫原性組成物を提供し、脂質ベシクルは、少なくとも約５０：１の脂質：抗原重量比を達成する量で組成物中に存在する脂質からなり、脂質は非イオン性界面活性剤を含む。
【０００８】
[0009]ある実施形態において、前述の組成物は液体である。ある実施形態において、前述の組成物は乾燥している（例えば、凍結乾燥されている）。
【０００９】
[0010]別の一態様において、本開示はインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物を提供し、脂質ベシクルは、少なくとも約３０：１の脂質：抗原重量比を達成する量で組成物中に存在する脂質からなり、脂質は非イオン性界面活性剤を含み、組成物の水分含量は約２重量％未満である。ある実施形態において、脂質：抗原重量比は少なくとも４０：１又は５０：１である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は、約１．９重量％、１．８重量％、１．７重量％、１．６重量％、１．５重量％、１．４重量％、１．３重量％、１．２重量％、１．１重量％、１重量％、０．９重量％、０．８重量％、０．７重量％、０．６重量％、０．５重量％、又は０．４重量％未満である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．４重量％〜約２重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．５重量％〜約１．９重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．６重量％〜約１．８重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．７重量％〜約１．７重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．８重量％〜約１．６重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．９重量％〜約１．５重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約１重量％〜約１．４重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．５重量％〜約１重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．５重量％〜約１．５重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．５重量％〜約２重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約１重量％〜約１．５重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約１重量％〜約２重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約１．５重量％〜約２重量％の範囲である。
【００１０】
[0011]ある実施形態において、前述の組成物の１つにおける脂質：抗原重量比は、少なくとも約６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１１０：１、１２０：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、２００：１、２１０：１、２２０：１、２３０：１、２４０：１、２５０：１、２６０：１、２７０：１、２８０：１、２９０：１、又は３００：１である。ある実施形態において、前述の組成物の１つにおける脂質：抗原重量比は、約４００：１、３９０：１、３８０：１、３７０：１、３６０：１、３５０：１、３４０：１、３３０：１、３２０：１、又は３１０：１未満である。
【００１１】
[0012]ある実施形態において、前述の組成物の１つにおける脂質：抗原重量比は、約５０：１〜約６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１１０：１、１２０：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、２００：１、２１０：１、２２０：１、２３０：１、２４０：１、２５０：１、２６０：１、２７０：１、２８０：１、２９０：１、３００：１、３１０：１、３２０：１、３３０：１、３４０：１、３５０：１、３６０：１、３７０：１、３８０：１、３９０：１、又は４００：１の範囲内である。ある実施形態において、前述の組成物の１つにおける脂質：抗原重量比は、約５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１１０：１、１２０：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、２００：１、２１０：１、２２０：１、２３０：１、２４０：１、２５０：１、２６０：１、２７０：１、２８０：１、２９０：１、３００：１、３１０：１、３２０：１、３３０：１、３４０：１、３５０：１、３６０：１、３７０：１、３８０：１、又は３９０：１〜約４００：１の範囲内である。
【００１２】
[0013]ある実施形態において、前述の組成物の１つにおける脂質：抗原重量比は、約５０：１〜約１００：１、約５０：１〜約１５０：１、約５０：１〜約２００：１、約５０：１〜約２５０：１、約５０：１〜約３００：１、約５０：１〜約３５０：１、又は約５０：１〜約４００：１の範囲内である。ある実施形態において、前述の組成物の１つにおける脂質：抗原重量比は、約１００：１〜約１５０：１、約１００：１〜約２００：１、約１００：１〜約２５０：１、約１００：１〜約３００：１、約１００：１〜約３５０：１、又は約１００：１〜約４００：１の範囲内である。ある実施形態において、前述の組成物の１つにおける脂質：抗原重量比は、約１５０：１〜約２００：１、約１５０：１〜約２５０：１、約１５０：１〜約３００：１、約１５０：１〜約３５０：１、又は約１５０：１〜約４００：１の範囲内である。ある実施形態において、前述の組成物の１つにおける脂質：抗原重量比は、約２００：１〜約２５０：１、約２００：１〜約３００：１、約２００：１〜約３５０：１、又は約２００：１〜約４００：１の範囲内である。ある実施形態において、前述の組成物の１つにおける脂質：抗原重量比は、約２５０：１〜約３００：１、約２５０：１〜約３５０：１、又は約２５０：１〜約４００：１の範囲内である。ある実施形態において、前述の組成物の１つにおける脂質：抗原重量比は、約３００：１〜約３５０：１、又は約３００：１〜約４００：１の範囲内である。ある実施形態において、前述の組成物の１つにおける脂質：抗原重量比は、約３５０：１〜約４００：１の範囲内である。ある実施形態において、前述の組成物の１つにおける脂質：抗原重量比は、約２００：１、２１０：１、２２０：１、２３０：１、２４０：１、２５０：１、２６０：１、２７０：１、２８０：１、２９０：１、３００：１、３１０：１、３２０：１、３３０：１、３４０：１、３５０：１、３６０：１、３７０：１、３８０：１、３９０：１、又は４００：１である。
【００１３】
[0014]ある実施形態において、前述の組成物は、４０℃で６ヶ月間貯蔵した場合、赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）アッセイによって決定される免疫原性の５０％未満の変化を示す。ある実施形態において、提供される組成物は、免疫原性の４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は２％未満の変化を示す。
【００１４】
[0015]ある実施形態において、前述の組成物は、４０℃で６ヶ月間貯蔵した場合、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定される、抗原含量の５０％未満の減少を示す。ある実施形態において、提供される組成物は、抗原含量の４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は２％未満の減少を示す。
【００１５】
[0016]ある実施形態において、前述の組成物は、４０℃で６ヶ月間貯蔵した場合、脂質ベシクルのない参照組成物よりも安定である。ある実施形態において、安定性はＨＡＩアッセイによって決定される免疫原性に基づく。ある実施形態において、安定性はＥＬＩＳＡによって決定される抗原含量に基づく。
【００１６】
[0017]さらに別の一態様において、本開示はインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む免疫原性組成物を提供し、脂質ベシクルは非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、組成物は、４０℃で６ヶ月間貯蔵した場合、ＨＡＩアッセイによって決定される免疫原性の５０％未満の変化を示す。ある実施形態において、提供される組成物は、免疫原性の４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は２％未満の変化を示す。
【００１７】
[0018]さらに別の一態様において、本開示は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む免疫原性組成物を提供し、脂質ベシクルは非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、組成物は、４０℃で６ヶ月間貯蔵した場合、ＥＬＩＳＡによって決定される抗原含量の５０％未満の減少を示す。ある実施形態において、提供される組成物は、抗原含量の４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は２％未満の減少を示す。
【００１８】
[0019]さらに別の一態様において、本開示は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む免疫原性組成物を提供し、脂質ベシクルは非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、組成物は、４０℃で６ヶ月間貯蔵した場合、脂質ベシクルのない参照組成物よりも安定である。ある実施形態において、安定性はＨＡＩアッセイによって決定された免疫原性に基づく。ある実施形態において、安定性はＥＬＩＳＡによって決定された抗原含量に基づく。
【００１９】
[0020]ある実施形態において、前述の組成物は、脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、得られる生成物を均質化するステップとを含む方法によって調製される。
【００２０】
[0021]ある実施形態において、脂質（例えば、溶融脂質）及び水溶液を、得られる生成物において所望の脂質：抗原重量比を達成する相対量で合わせる（例えば、少なくとも約５０：１、又は前述の範囲のうちの任意の１つ）。ある実施形態において、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える。ある実施形態において、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える。
【００２１】
[0022]ある実施形態において、脂質（例えば、溶融脂質）及び水溶液を、得られる生成物において少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌの脂質濃度を達成する相対量及び体積で合わせる。ある実施形態において、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５ｍｇ／ｍｌの脂質濃度が達成される。ある実施形態において、脂質濃度は約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。ある実施形態において、脂質濃度は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。ある実施形態において、脂質濃度は約２５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、又は約５０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００２２】
[0023]ある実施形態において、脂質（例えば、溶融脂質）及び水溶液を、所望の脂質：抗原重量比（例えば、少なくとも約５０：１、又は前述の範囲の任意の１つ）、及び得られる生成物中の少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌの脂質濃度（又は、他の脂質濃度範囲の任意の１つ）の両方を達成する相対量及び体積で合わせる。
【００２３】
[0024]ある実施形態において、脂質（例えば、溶融脂質）及び抗原を、組成物の１単位投与量（例えば、再水和前に貯蔵されている密封された容器中の組成物の乾燥した単位投与量）あたり少なくとも約５ｍｇの脂質含量を達成する相対量で合わせる。ある実施形態において、組成物の１単位投与量あたり少なくとも約６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ｍｇの脂質含量が達成される。ある実施形態において、脂質含量は、約５ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５ｍｇ〜約４０ｍｇ、約５ｍｇ〜約３０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約４０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約３０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約５０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約４０ｍｇ、又は約２０ｍｇ〜約３０ｍｇの範囲である。
【００２４】
[0025]ある実施形態において、脂質（例えば、溶融脂質）及び抗原を、所望の脂質：抗原重量比（例えば、少なくとも約５０：１、又は前述の範囲の任意の１つ）及び１単位投与量あたり少なくとも約５ｍｇの脂質含量（又は他の脂質含量範囲の任意の１つ）の両方を達成する相対量で合わせる。
【００２５】
[0026]ある実施形態において、脂質（例えば、溶融脂質）及び水溶液を、所望の脂質：抗原重量比（例えば、少なくとも約５０：１、又は前述の範囲の任意の１つ）、１単位投与量あたり少なくとも約５ｍｇの脂質含量（又は他の脂質含量範囲の任意の１つ）、及び得られる生成物中の少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌの脂質濃度（又は他の脂質濃度範囲の任意の１つ）を達成する相対量及び体積で合わせる。
【００２６】
[0027]さらに別の一態様において、本開示はインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む組成物を提供し、脂質ベシクルは非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、組成物が、脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、得られる生成物を均質化するステップとを含む方法によって調製され、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の所望の脂質：抗原重量比（例えば、少なくとも約５０：１、又は前述の範囲の任意の１つ）を達成する相対量で合わせる。ある実施形態において、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える。ある実施形態において、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える。
【００２７】
[0028]さらに別の一態様において、本開示はインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む組成物を提供し、脂質ベシクルは非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、組成物が、脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、溶融脂質をインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、得られる生成物を均質化するステップとを含む方法によって調製され、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ（又は他の脂質濃度範囲の任意の１つ）の脂質濃度を達成する相対量及び体積で合わせる。ある実施形態において、溶融脂質及び水溶液を、所望の脂質：抗原重量比（例えば、少なくとも約５０：１、又は前述の範囲の任意の１つ）及び得られる生成物中の少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ（又は、他の脂質濃度範囲の任意の１つ）の脂質濃度の両方を達成する相対量及び体積で合わせる。ある実施形態において、脂質含量はまた、１単位投与量あたり少なくとも約５ｍｇ（又は、他の脂質含量範囲の任意の１つ）である。ある実施形態において、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える。ある実施形態において、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える。
【００２８】
[0029]ある実施形態において、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１株由来である。ある実施形態において、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２株由来である。ある実施形態において、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＢ型株由来である。ある実施形態において、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１株、インフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２株、及びインフルエンザＢ型株の２種以上由来である。ある実施形態において、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１株、インフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２株、及びインフルエンザＢ型株由来である。ある実施形態において、提供される組成物は、各株由来のほぼ等量のインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む。
【００２９】
[0030]ある実施形態において、提供される組成物は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む、１つ又は複数の不活化インフルエンザウイルスを含む。ある実施形態において、提供される組成物は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む、１つ又は複数の弱毒化インフルエンザウイルスを含む。ある実施形態において、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原は、ウイルス成分抗原（ｓｐｌｉｔ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ）として存在する。ある実施形態において、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原は、サブユニット抗原として存在する。ある実施形態において、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原の少なくとも一部分は脂質ベシクルと会合している。ある実施形態において、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原の少なくとも一部分は脂質ベシクル内に捕捉されている。
【００３０】
[0031]ある実施形態において、提供される組成物はアジュバントをさらに含む。ある実施形態において、提供される組成物はＴＬＲ−４アゴニストアジュバントを含む。ある実施形態において、提供される組成物は弱毒化リピドＡ誘導体を含む。ある実施形態において、提供される組成物はリピドＡのモノホスホリル誘導体を含む。ある実施形態において、提供される組成物はリピドＡの３−デアシルモノホスホリル誘導体を含む。ある実施形態において、ＴＬＲ−４アゴニストアジュバントの少なくとも一部分は脂質ビヒクルと会合している。ある実施形態において、ＴＬＲ−４アゴニストアジュバントは、提供される組成物を調製する間に脂質と同時融解される。ある実施形態において、提供される組成物の調製の間に、ＴＬＲ−４アゴニストアジュバントを、溶融脂質、及びインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせる（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と混合し、その後これを溶融脂質と合わせることによって）。ある実施形態において、提供される組成物を乾燥（例えば、凍結乾燥）する前にＴＬＲ−４アゴニストアジュバントを加える。
【００３１】
[0032]ある実施形態において、提供される組成物は、温度制御条件下で組成物を貯蔵することを伴わない方法によって調製される。ある実施形態において、提供される組成物は、少なくとも一時的に８℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、又は３５℃を超える温度で組成物を貯蔵することを伴う方法によって調製される。
【００３２】
[0033]ある実施形態において、提供される組成物は、乾燥（例えば、凍結乾燥）形態の組成物を貯蔵することを伴う方法によって調製される。
【００３３】
[0034]別の一態様において、本開示は、乾燥（例えば、凍結乾燥）形態の前述の組成物の１つを提供するステップと、組成物を再水和するステップと、治療有効量の再水和した組成物を対象に投与するステップとによって、インフルエンザ感染症に罹患している、又はその危険性のある対象を治療する方法を提供する。ある実施形態において、再水和した組成物を筋肉内注射によって投与する。
【００３４】
[0035]さらに別の一態様において、本開示はインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む組成物を調製する方法を提供し、脂質ベシクルは非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、方法は、脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、溶融脂質をインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、得られる生成物を均質化するステップとを含み、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の所望の脂質：抗原重量比（例えば、少なくとも約５０：１又は前述の範囲の任意の１つ）を達成する相対量で合わせる。ある実施形態において、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える。ある実施形態において、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える。
【００３５】
[0036]さらに別の一態様において、本開示は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原及び脂質ベシクルを含む組成物を調製する方法を提供し、脂質ベシクルは非イオン性界面活性剤を含む脂質からなり、方法は、脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、得られる生成物を均質化するステップとを含み、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ（又は、他の脂質濃度範囲の任意の１つ）の脂質濃度を達成する相対量及び体積で合わせる。ある実施形態において、溶融脂質及び水溶液を、所望の脂質：抗原重量比（例えば、少なくとも約５０：１、又は前述の範囲の任意の１つ）及び得られる生成物中、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ（又は他の脂質濃度範囲の任意の１つ）の脂質濃度の両方を達成する相対量及び体積で合わせる。ある実施形態において、溶融脂質を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える。ある実施形態において、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】[0037]  例示のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントである、リン酸化ヘキサアシル二糖（アンモニウム塩）即ちＰＨＡＤ（アラバマ州、アラバスターのＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．から）の化学構造を示す図である。
【図２】[0038]  別の例示のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントである、ジ［３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソニル］−リピドＡ（アンモニウム塩）（アラバマ州、アラバスターのＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．から）の化学構造を示す図である。
【図３】[0039]  実施例２、表４に記載する通り、例示のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントであるＰＨＡＤを有するＮＩＳＶと調合した（グループ２）、又はＮＩＳＶと調合しない（グループ３）いずれかの、マウスにおける例示の認可のインフルエンザワクチンの（「標準のマウス単位投与量」が標準のヒト単位投与量の０．１×である場合、即ち、ヒトとマウスとの間のサイズの違いを考慮に入れた後の、１／３０×標準のヒト単位投与量での投与量節約型）、ＮＩＳＶ又はアジュバント中に調合しない（グループ１）認可のインフルエンザワクチンと比べた（「標準のマウス単位投与量」が標準のヒト単位投与量の０．１×である場合、即ち、ヒトとマウスとの間のサイズの違いを考慮に入れた後の、０．１×標準のヒト単位投与量での投与量等価）、Ｈ１Ｎ１ウイルスに対する効力を示す図である。
【図４】[0040]  実施例２、表４に記載する通り、例示のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントであるＰＨＡＤを有するＮＩＳＶと調合した（グループ２）、又はＮＩＳＶと調合しない（グループ３）いずれかの、マウスにおける例示の認可のインフルエンザワクチンの（１／３０×標準のヒト単位投与量の投与量節約型）、ＮＩＳＶ又はアジュバント中に調合しない（グループ１）認可のインフルエンザワクチンと比べた（０．１×標準のヒト単位投与量での投与量等価）、Ｈ３Ｎ２ウイルスに対する効力を示す図である。
【図５Ａ】[0041]  マウスにおける非調合の（即ち、「そのまま」用いた）認可のインフルエンザワクチン（０．１×標準のヒト単位投与量での投与量等価）対、ＮＩＳＶと調合し（１／３０×標準のヒト単位投与量での投与量節約型）アジュバント非添加の認可のインフルエンザワクチン、又は増大量の（１〜５０μｇ）例示のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントであるＰＨＡＤを有するＮＩＳＶと調合した認可のインフルエンザワクチンの、Ｈ１Ｎ１ウイルス（Ａ）及びＨ３Ｎ２ウイルス（Ｂ）に対する効力投与量反応を示す図である。全ての組成物をマウス中にＩＭ注射し、第２の免疫化１５日後に試験した。結果を、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２に対するＨＡＩ力価として、並びに同じデータセット（単数又は複数）に対する相乗平均（単数又は複数）として示す。
【図５Ｂ】[0041]  マウスにおける非調合の（即ち、「そのまま」用いた）認可のインフルエンザワクチン（０．１×標準のヒト単位投与量での投与量等価）対、ＮＩＳＶと調合し（１／３０×標準のヒト単位投与量での投与量節約型）アジュバント非添加の認可のインフルエンザワクチン、又は増大量の（１〜５０μｇ）例示のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントであるＰＨＡＤを有するＮＩＳＶと調合した認可のインフルエンザワクチンの、Ｈ１Ｎ１ウイルス（Ａ）及びＨ３Ｎ２ウイルス（Ｂ）に対する効力投与量反応を示す図である。全ての組成物をマウス中にＩＭ注射し、第２の免疫化１５日後に試験した。結果を、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２に対するＨＡＩ力価として、並びに同じデータセット（単数又は複数）に対する相乗平均（単数又は複数）として示す。
【図６】[0042]  実施例４、表６に記載する通り、例示のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントであるＰＨＡＤを有するＮＩＳＶと調合した、又はＮＩＳＶと調合しないいずれかの、マウスにおける例示の認可のインフルエンザワクチン（１／３０×標準のヒト単位投与量での投与量節約型）の、ＮＩＳＶ又はアジュバント中への調合なしの認可のインフルエンザワクチン（０．１×標準のヒト単位投与量での投与量等価）に比べた、Ｈ１Ｎ１ウイルス及びＨ３Ｎ２ウイルスに対する効力を示す図である。全ての組成物を４℃及び４０℃で６ヶ月貯蔵し、次いでマウス中にＩＭ注射し、第２の免疫化の１５日後に血清を試験した。結果をＨ１Ｎ１又はＨ３Ｎ２に対するＨＡＩ力価として示す。
【図７】[0043]  実施例４、表６に記載する通り、ＮＩＳＶと調合した、マウスにおけるアジュバント非添加の例示の認可のインフルエンザワクチン（０．１×標準のヒト単位投与量での投与量節約型）の、認可のインフルエンザワクチン（０．１×標準のヒト単位投与量での投与量等価）に比べたＨ１Ｎ１ウイルス及びＨ３Ｎ２ウイルスに対する効力を示す図である。全ての組成物を４℃及び４０℃で６ヶ月貯蔵し、次いでマウス中にＩＭ注射し、第２の免疫化の１５日後に血清を試験した。結果をＨ１Ｎ１又はＨ３Ｎ２に対するＨＡＩ力価として示す。
【図８Ａ】[0044]  ｓＥＬＩＳＡによって決定した、（Ａ）ＮＩＳＶと調合した、又は（Ｂ）ＮＩＳＶなしの、市販のフルゾン（Ｆｌｕｚｏｎｅ）（登録商標）に対するＨＡ抗原含量のｉｎ  ｖｉｔｒｏデータを示す図である；４℃、２５℃、及び４０℃で貯蔵し、Ｔ＝０、１、３、及び６ヶ月。比較は両方とも投与量節約型であり、例示のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントであるＰＨＡＤでアジュバント添加した。
【図８Ｂ】[0044]  ｓＥＬＩＳＡによって決定した、（Ａ）ＮＩＳＶと調合した、又は（Ｂ）ＮＩＳＶなしの、市販のフルゾン（Ｆｌｕｚｏｎｅ）（登録商標）に対するＨＡ抗原含量のｉｎ  ｖｉｔｒｏデータを示す図である；４℃、２５℃、及び４０℃で貯蔵し、Ｔ＝０、１、３、及び６ヶ月。比較は両方とも投与量節約型であり、例示のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントであるＰＨＡＤでアジュバント添加した。
【図９】[0045]  非調合の市販のインフルエンザワクチンであるフルゾン（登録商標）、フルビリン（Ｆｌｕｖｉｒｉｎ）（登録商標）、及びフルラバル（ＦｌｕＬａｖａｌ）（登録商標）対ＮＩＳＶと調合した同じ市販のインフルエンザワクチンに対するＨＡ抗原含量のｉｎ  ｖｉｔｒｏデータを示す図である。再構成した試料のアリコートをｓＥＬＩＳＡによって分析して、４℃及び４０℃でＴ＝３ヶ月の組成物に対する抗原含量（又は「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力」）を決定した。
【図１０】[0046]  ＮＩＳＶと調合し例示のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントであるＰＨＡＤでアジュバント添加した、又はＮＩＳＶと調合しアジュバント非添加いずれかの、アカゲザルにおける、ＮＩＳＶ又はアジュバント中に調合しない例示の認可のインフルエンザワクチンの（「標準のサル単位投与量」が標準のヒト単位投与量の１×である場合、１／３×標準のヒト単位投与量での投与量節約型）、認可のインフルエンザワクチンに比べた（「標準のサルの単位投与量」が標準のヒト単位投与量の１×である場合、１×標準のヒト単位投与量の投与量等価）、Ｈ３Ｎ２ウイルスに対する効力を示す図である。
【図１１Ａ】[0047]  非調合の市販のフルゾン（登録商標）（試験品８）対脂質：抗原比３００：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（試験品３）、脂質：抗原比１００：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（試験品２）、及び脂質：抗原比３０：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（試験品１）に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏのＨＡ抗原含量を示す図である。再構成した試料のアリコートをｓＥＬＩＳＡによって分析して、４０℃で（Ａ）Ｔ＝０及び（Ｂ）Ｔ＝３ヶ月の４つの組成物に対する抗原含量（又は「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力」）を決定した。
【図１１Ｂ】[0047]  非調合の市販のフルゾン（登録商標）（試験品８）対脂質：抗原比３００：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（試験品３）、脂質：抗原比１００：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（試験品２）、及び脂質：抗原比３０：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（試験品１）に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏのＨＡ抗原含量を示す図である。再構成した試料のアリコートをｓＥＬＩＳＡによって分析して、４０℃で（Ａ）Ｔ＝０及び（Ｂ）Ｔ＝３ヶ月の４つの組成物に対する抗原含量（又は「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力」）を決定した。
【図１２Ａ】[0048]  実施例７に記載する通り、様々な脂質：抗原比、脂質濃度、及び脂質含量の、様々なＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物の（Ａ）Ｈ１Ｎ１ウイルス及び（Ｂ）Ｈ３Ｎ２ウイルスに対する効力を示す図である。Ｔ＝０に組成物をマウス中にＩＭ注射し、第２の免疫化の１５日後に血清を試験した。結果をＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２に対する個々のＨＡＩ力価、並びに同じデータセット（単数又は複数）に対する相乗平均（単数又は複数）として示す。
【図１２Ｂ】[0048]  実施例７に記載する通り、様々な脂質：抗原比、脂質濃度、及び脂質含量の、様々なＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物の（Ａ）Ｈ１Ｎ１ウイルス及び（Ｂ）Ｈ３Ｎ２ウイルスに対する効力を示す図である。Ｔ＝０に組成物をマウス中にＩＭ注射し、第２の免疫化の１５日後に血清を試験した。結果をＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２に対する個々のＨＡＩ力価、並びに同じデータセット（単数又は複数）に対する相乗平均（単数又は複数）として示す。
【図１３Ａ】[0049]  実施例７に記載する通り、様々な脂質：抗原比、並びに様々な脂質濃度（均質化及び／又は再構成の間）の、様々なＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物の（Ａ）Ｈ１Ｎ１ウイルス及び（Ｂ）Ｈ３Ｎ２ウイルスに対する効力を示す図である。全ての組成物を４℃及び４０℃で３ヶ月間貯蔵し、次いでマウス中にＩＭ注射し、第２の免疫化１５日後に血清を試験した。結果をＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２に対するＨＡＩ力価の相乗平均として示す。
【図１３Ｂ】[0049]  実施例７に記載する通り、様々な脂質：抗原比、並びに様々な脂質濃度（均質化及び／又は再構成の間）の、様々なＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物の（Ａ）Ｈ１Ｎ１ウイルス及び（Ｂ）Ｈ３Ｎ２ウイルスに対する効力を示す図である。全ての組成物を４℃及び４０℃で３ヶ月間貯蔵し、次いでマウス中にＩＭ注射し、第２の免疫化１５日後に血清を試験した。結果をＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２に対するＨＡＩ力価の相乗平均として示す。
【定義】
【００３７】
[0050]本開示を通して、以下の段落において規定するいくつかの語を用いる。
【００３８】
[0051]本明細書で用いられる「抗原」の語は、抗体によって認識される１つ又は複数のエピトープ（直鎖状、高次構造、又は両方のいずれか）を含む物質を意味する。いくつかの実施形態において、抗体はヒト抗体であり、いくつかの実施形態において、抗原に曝露されたヒト生物体において産生され、いくつかの実施形態において、このような曝露は血流中の曝露によって生じ、又は血流中の曝露を含む。ある実施形態において、抗原は「免疫原」であることができる。
【００３９】
[0052]本明細書で用いられる「免疫反応」の語は、宿主動物において誘発される反応を意味する。免疫反応は、細胞免疫、体液性免疫を意味することができ、又は両方を伴うことができる。免疫反応は、免疫系の一部分に限定されうる。例えば、ある実施形態において、増大したＩＦＮγ反応は免疫反応であるとみなされる。ある実施形態において、粘膜のＩｇＡ反応は（例えば、鼻及び／又は直腸の洗浄液中で測定して）免疫反応であるとみなされる。ある実施形態において、全身性のＩｇＧ反応（例えば、血清中で測定された）は免疫反応であるとみなされる。ある実施形態において、赤血球凝集を抑制する抗体の、宿主動物による生成は、例えば、赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）アッセイにおいて測定して、免疫反応であるとみなされる。
【００４０】
[0053]本明細書で用いられる「免疫原性」の語は、宿主動物において非宿主の実体（例えば、インフルエンザウイルス）に対する免疫反応を生成する物質を意味するのに用いられる。ある実施形態において、免疫反応は、ワクチンによって、特定の感染性生物体（例えば、インフルエンザウイルス）に対して誘発される防御免疫のベースを形成する。ある実施形態において、免疫原性物質はヒトにおける免疫反応を生成する。ある実施形態において、免疫原性物質は、ヒト身体などの身体の血流と接触した場合に免疫反応を生成する。
【００４１】
[0054]本明細書で用いられる「治療有効量」の語は、治療上の投薬計画の部分として投与する場合、治療する対象において意義深い利益を示すのに十分な量を意味する。当業者であれば、いくつかの実施形態において、特定の組成物は、治療上の投薬計画において投与する単位剤形に好適な量を含む場合、このような量を単一の単位投与量として投与する場合に意義深い利益を達成するのに不十分であることがあっても、治療有効量を含むとみなすことができる。当業者であれば、治療有効量の免疫原性組成物は、例えば、所望の生物学的エンドポイント、組成物の性質、投与経路、治療する対象の健康、サイズ、及び／又は年齢などの因子に応じて、組成物を投与する異なる対象に対して異なりうることをさらに理解されよう。いくつかの実施形態において、治療有効量は、特定の治療上の投薬計画の（例えば、伝統的な「追加免疫」計画など、単回投与又は一連の投与）部分として投与する場合に有益な効果に相関しているものである。いくつかの実施形態において、治療有効量は、治療上のライセンス供与体（ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ  ｂｏｄｙ）（例えば、食品医薬品局又は欧州医薬品庁）によって特定の治療用の投薬計画の部分として認可されているものである（例えば、認可の１価のワクチンに対して、ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＢｌｏｏｄＶａｃｃｉｎｅｓ／Ｖａｃｃｉｎｅｓ／ＡｐｐｒｏｖｅｄＰｒｏｄｕｃｔｓ／ｕｃｍ１８１９５０．ｈｔｍ、認可の３価のワクチンに対して、ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＢｌｏｏｄＶａｃｃｉｎｅｓ／Ｖａｃｃｉｎｅｓ／ＡｐｐｒｏｖｅｄＰｒｏｄｕｃｔｓ／ｕｃｍ０９４０４５．ｈｔｍの、食品医薬品局によって記載されている様々な認可のインフルエンザワクチンに対する添付文書を参照されたい）。
【００４２】
[0055]本明細書で用いられる「治療」（又は「治療する」、「治療される」、「治療」など）の語は、疾患、疾患の症状（１つ又は複数）、又は疾患に対する素因を緩和し、軽減し、変更し、寛解し、改善し、又は影響を及ぼす目的で、疾患、疾患の症状、若しくは疾患に対する素因に罹患しており、又は感受性である対象に、提供される組成物を投与することを意味する。ある実施形態において、「治療する」の語は対象のワクチン接種を意味する。一般的に、治療は、疾患の１つ又は複数の症状又は特徴の重症度及び／又は頻度における低減を実現することができ、並びに／或いは１つ又は複数のこのような症状又は特徴の発症を遅らせることができる。
【ある実施形態の詳細な説明】
【００４３】
[0056]ワクチンは全て長時間で効力を失い、効力を失う速度は温度依存的である。したがって、ワクチンを使用時まで凍結条件下（殆んどの場合、２℃〜８℃の間）で貯蔵することによってワクチンの効力を確実に維持するために、低温流通システムが確立されている。ワクチンの貯蔵及び分配のための低温流通の確立は大仕事であり、維持は難しい。最善の努力をしても、低温流通は、維持の不適当な又は旧式の冷蔵装置、モニタリング不十分、低温流通手順の遵守不十分、及び装置の故障の原因となる停電などの多くの理由で、意図通りにいつも機能するとは限らないことも明白である。その結果、低温流通におけるワクチンは温度の逸脱（即ち、標的範囲外の温度）にしばしば曝される。
【００４４】
[0057]対象に安定で強力なインフルエンザワクチンを確実に投与するために、液体組成物において主に市販されている、入手される現在のインフルエンザ３価ワクチンに対して、低温流通の必要性及び適切なワクチン管理の重要さを理解することが重要である。インフルエンザワクチンが適切に維持されない場合（例えば、２℃〜８℃の必要とされる温度範囲内に保持されない場合）、ワクチンは不安定になり、このため次に、ワクチン接種された対象が免疫化後に血清学的に転換しない結果となり得る、効力に対する重大な影響がある。ワクチン接種した対象は、免疫化されているので守られていると信じているが、この場合も、実際に、ワクチンが温度の逸脱に起因する不安定性から強力でないため、依然としてインフルエンザ感染にかかりやすい。
【００４５】
[0058]本開示は、このような問題のいくつかを解決する、インフルエンザを治療するための組成物及び方法を提供する。本明細書に記載する通り、提供される組成物及び方法は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を、非イオン性界面活性剤（ＮＩＳＶ）及び任意選択によってアジュバントを含む脂質ベシクルと合わせて含むある種の組成物の開発に基づく。ある実施形態において、提供される組成物は、標準の低温流通システムにおいて貯蔵されない場合でも依然として強力である（即ち、これらは熱安定性である）。
【００４６】
１．インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原
[0059]一般的に、本開示の組成物はインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む。本発明にしたがって利用されるヘマグルチニン抗原は全長の野生型ヘマグルチニン抗原に制限されず、本明細書で用いられる「ヘマグルチニン抗原」の語は、したがって、免疫原性のフラグメント及び全長の野生型ヘマグルチニン抗原の変異株も包含する。「ヘマグルチニン抗原」の語は、前述のあらゆるものを含む融合タンパク質及びコンジュゲートも包含する。提供される組成物中のヘマグルチニン抗原の量は、当技術分野において知られている任意の方法によって決定することができる。いくつかの実施形態において、ヘマグルチニン抗原の量はＥＬＩＳＡ（例えば、１つ又は複数の亜型に特異的なｓＥＬＩＳＡ）によって決定することができる。この取組みは、ウイルス成分ワクチンにおける抗原の量を標準化するのに一般に用いられる。
【００４７】
[0060]用いられるヘマグルチニン抗原のタイプに対する制限はない。特に、ヘマグルチニン抗原は、単一のインフルエンザウイルス株又はインフルエンザウイルス株の組合せから取ることができる。上記に記載した通り、現在のインフルエンザワクチンは通常、２株のインフルエンザＡウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２）並びに１株のインフルエンザＢ型に由来する抗原を含む「３価」ワクチンである。このように、ある実施形態において、本開示の３価の組成物は、インフルエンザＡのＨ１Ｎ１株、インフルエンザＡのＨ３Ｎ２株、及びインフルエンザＢ型株由来のヘマグルチニン抗原を含むことができる。ある３価の組成物は、これらの株の各々由来のほぼ等量のヘマグルチニン抗原を含むことができる。
【００４８】
[0061]当技術分野において１価ワクチンも知られており、本発明によって包含される。いくつかの実施形態において、提供される組成物は１価である。１価ワクチンは、例えばパンデミックの状況などにおいて得に有用であるとしばしば考えられている。１価のパンデミックインフルエンザワクチンは、単一のＡ株由来のヘマグルチニン抗原を含む可能性が最も高い。いくつかの実施形態において、１価の組成物において用いるためのヘマグルチニン抗原は、パンデミックインフルエンザ株に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、１価の組成物において用いるためのヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＡ（ブタ起源のＨ１Ｎ１）株由来である。実施例において実証する通り、インフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２株由来のヘマグルチニン抗原を（単独で、又は他の抗原と組み合わせて）含む組成物は、この株由来の抗原は高温に対して特に感受性であると考えられるため、とくに興味深い。
【００４９】
[0062]用いるヘマグルチニン抗原の源（即ち、天然、組換え、合成など）に対する制限もない。インフルエンザから防御するために世界中で優先的に３タイプのワクチン、即ち、全ウイルスワクチン、ウイルスの外部構成成分及び内部構成成分を含むウイルス成分ワクチン、並びにウイルスの外部構成成分（ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ）だけからなるサブユニットワクチンが用いられている。
【００５０】
[0063]ある実施形態において、本発明の組成物は、ヘマグルチニン抗原を含む１つ又は複数の全ウイルスを含む。ある実施形態において、インフルエンザウイルスは不活化である。不活化インフルエンザウイルスを調製するのにあらゆる方法を用いることができることが理解されよう。国際公開第０９／０２９６９５号は、不活化全ウイルスワクチンを生成するための例示の方法を記載している。一般的に、これらの方法は、宿主細胞においてインフルエンザウイルスを増殖させ、任意選択によって宿主細胞を溶解してウイルスを放出させ、ウイルスを単離し、次いで不活化することを伴う。ワクチン調製のためにウイルスを不活化するのに、化学的処理（例えば、数ある中で、ホルマリン、ホルムアルデヒド）が一般に用いられる。しかし、例えば、塩素での処理、高温への曝露など、他の技術を用いることができることも理解されたい。これらの処理において、外側のビリオン被膜は典型的にインタクトのままであり、複製機能が損なわれる。ある実施形態において、インフルエンザウイルスは弱毒化される。当技術分野においてよく知られている通り、弱毒化ウイルスで調製されるワクチンの一利点は、完全な感染を引き起こさずにｉｎ  ｖｉｖｏで複製する能力に起因する、より高い免疫原性に対する可能性にある。弱毒化株から調製される生ウイルスワクチンは、病原性がないが、宿主中で依然として複製することができるのが好ましい。弱毒化インフルエンザウイルスを調製するのに当技術分野において用いられている一方法は、複数の細胞培養物を通してウイルス株を連続的に通過させることを伴うウイルス適応である。長時間で株は変異し、次いで弱毒化株を同定することができる。ある実施形態において、ウイルスを様々な細胞培養物を通して通過させてもよい。ある実施形態において、低温で１つ又は複数の細胞培養ステップを行うのが有利であることが立証され得る。
【００５１】
[0064]ある実施形態において、本発明にしたがって利用されるインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原は、ウイルス成分ワクチン技術に基づく。ウイルス成分ワクチンは、ウイルスの最も免疫原性の部分（例えば、ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ）を高濃度含むのが典型的であり、免疫原性の劣るウイルスタンパク質、並びに卵（ウイルスを生成するのに用いられる）又は外来性物質（例えば、トリ白血病ウイルス、他の微生物体、及び細胞デブリ）から存在する非ウイルス性タンパク質の濃度は低減する。一般的に、ウイルス成分ワクチンは、典型的には有機溶媒又は洗剤（例えば、トリトンＸ−１００）でのウイルス粒子の破壊、及びショ糖勾配にわたる遠心分離又はクロマトグラフィーカラムにわたる尿膜腔液の通過などによって、ウイルスタンパク質を様々な程度に分離又は精製することを伴う物理学的プロセスによって調製される。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子の破壊及び分離の後に、透析又は限外ろ過を行う。ウイルス分離の方法及び適切な分離剤は当技術分野において知られている（例えば、米国特許公開第２００９０１５５３０９号を参照されたい）。
【００５２】
[0065]ある実施形態において、本発明にしたがって利用されるインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原は、サブユニットワクチンの技術に基づくものである。一般的にサブユニットワクチンは、効果的なワクチン接種に必要とされるインフルエンザウイルスの部分（例えば、防御免疫反応の誘発）だけを含む。いくつかの実施形態において、サブユニットのインフルエンザ抗原はウイルス粒子から調製される（例えば、ウイルスの特定の構成成分の精製）。いくつかの実施形態において、サブユニットのインフルエンザ抗原は、組換え法によって調製される（例えば、細胞培養物における発現）。例えば、米国特許第５，８５８，３６８号は、ＤＮＡ技術を用いて組換えインフルエンザワクチンを調製する方法を記載している。得られる３価インフルエンザワクチンは、流行性の可能性を有するインフルエンザウイルス株からクローニングされた組換えのヘマグルチニン抗原の混合物をベースにしている。組換えのヘマグルチニン抗原は、培養の昆虫細胞中のバキュロウイルス発現ベクターから生成され、非変性性の条件下で精製された、全長の、非切断の糖タンパク質である。いくつかの実施形態において、サブユニット抗原は、合成法（例えば、ペプチド合成）によって産生される。サブユニットのワクチンは、ＷＨＯによって決定される選択された株から調製される、精製されたヘマグルチニン抗原も含むことができる。
【００５３】
[0066]ある実施形態において、ヘマグルチニン抗原は、１つ又は複数の認可インフルエンザワクチンから供給されてもよい。ある実施形態において、ヘマグルチニン抗原を（任意選択によって、ノイラミニダーゼ抗原などの他の抗原とともに）、認可のインフルエンザワクチンから精製することができ、次いで提供される組成物において利用することができる。ある実施形態において、認可のインフルエンザワクチンは、いかなる精製なしに「そのまま」用いることができる。表１は、認可のインフルエンザワクチンの非限定的なリストである。これら認可のワクチンに関する完全な処方情報及び詳細は、ワクチン自体と一緒に供給される添付文書から、製造元若しくは供給業者から、及び／又は食品医薬品局から得ることができる（例えば、認可の１価ワクチンに対して、ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＢｌｏｏｄＶａｃｃｉｎｅｓ／Ｖａｃｃｉｎｅｓ／ＡｐｐｒｏｖｅｄＰｒｏｄｕｃｔｓ／ｕｃｍ１８１９５０．ｈｔｍ、認可の３価ワクチンに対して、ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／  ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＢｌｏｏｄＶａｃｃｉｎｅｓ／Ｖａｃｃｉｎｅｓ／  ＡｐｐｒｏｖｅｄＰｒｏｄｕｃｔｓ／ｕｃｍ０９４０４５．ｈｔｍを参照されたい）。これら添付文書の内容は、その全文が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５４】
【表１】
2013533259.tif 000003
【００５５】
[0067]以下の段落において、本発明者らは、本開示の組成物及び方法において用いることができる、これら及び他の例示のインフルエンザ抗原について論じる。
【００５６】
[0068]不活化３価インフルエンザ成分ワクチンであるフルゾン（登録商標）は、Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｉｎｃ．によって開発及び製造され、本開示にしたがって用いることができる。フルゾン（登録商標）は、有胚鶏卵中で増殖させたインフルエンザウイルスから調製される滅菌の懸濁液を含む。ウイルス含有液を収集し、ホルムアルデヒドで不活化する。インフルエンザウイルスを、連続流遠心分離（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆｌｏｗ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて直線ショ糖密度勾配溶液中で濃縮し、精製する。次いで、ウイルスを、非イオン性界面活性剤であるオクトキシノール−９（トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（登録商標）Ｘ−１００）を用いて化学的に破壊し、ウイルス成分抗原を生成する。ウイルス成分を、次いで、化学的手段によってさらに精製し、リン酸ナトリウム緩衝等張塩化ナトリウム溶液中に懸濁する。フルゾン（登録商標）ワクチンを、次いで、インフルエンザ季節に対する必要性にしたがって標準化し、３つの原型株を代表する、各々ＨＡ１５μgの推奨される割合において、単位投与量０．５ｍｌあたりヘマグルチニン抗原（ＨＡ）４５μｇを含むように調合する（例えば、２００７〜２００８年のワクチンは、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、及びＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４株由来のＨＡで調製した）。フルゾン（登録商標）は筋肉内（ＩＭ）注射用に調合されている。
【００５７】
[0069]本開示にしたがって用いることができる、認可のインフルエンザワクチンの別の一例は、不活化３価インフルエンザ成分ワクチンであり、Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｉｎｃによってやはり開発及び製造された、バキシグリップ（登録商標）である。バキシグリップ（登録商標）は、フルゾン（登録商標）に対して上記で概略したプロセスに同様の様式で調製され、筋肉内注射用に同様に調合されている。
【００５８】
[0070]本開示にしたがって用いることができる、認可のインフルエンザワクチンのさらに別の一例は、フルミスト（登録商標）である。フルミスト（登録商標）は、鼻腔内噴霧によって投与するための、弱毒化３価生ワクチンである。フルミスト（登録商標）中のインフルエンザウイルス株は、温度制限性の増殖及び弱毒化の表現型をもたらす３つの遺伝子変異を有する。抗原の性質及び遺伝子修飾されたインフルエンザウイルスの蓄積効果は、これらが上咽頭において複製して防御免疫を誘発することができることである。フルミスト（登録商標）を生成するために、特定病原体除去（ＳＰＦ）卵を好適なウイルス株の各々と一緒に接種し、インキュベートしてワクチンウイルスの複製を可能にする。これらの卵の尿膜腔液を回収し、プールし、次いでろ過によって澄明にする。ウイルスを限外ろ過によって濃縮し、安定化バッファーで希釈して最終のショ糖及びリン酸カリウム濃度を得る。次いで、ウイルス回収物をろ過滅菌して１価のバルクを生成する。３つの株由来の１価のバルクを引き続きブレンドし、必要に応じて希釈して、３価のバルクワクチンを生成するために安定化バッファーで所望の効力を達成する。次いで、バルクワクチンを、経鼻投与するための個々の噴霧器中に直接充填する。予め充填した冷蔵のフルミスト（登録商標）噴霧器は各々、単位投与量０．２ｍｌを１回分含んでいる。単位投与量０．２ｍｌは各々、好適な３つのウイルス株各々の弱毒化生インフルエンザウイルスの再集合体を１０６．５〜７．５ＦＦＵ含む。
【００５９】
[0071]上記に記載した通り、いくつかのインフルエンザワクチンが現在認可されている。任意の１つ又は組合せのこれらの認可のインフルエンザワクチンを、本明細書に記載する脂質ベシクルと組み合わせることができることを理解されたい。例えば、市販のフルゾン（登録商標）をこのやり方で組み合わせて組成物を生成することができる。いくつかの実施形態において、認可インフルエンザワクチンは最初に精製される（例えば、アジュバント又はワクチン中の他の試薬を除去するために）。いくつかの実施形態において、認可のインフルエンザワクチンは、本明細書に記載する脂質ベシクルと調合する前に精製されない（即ち、これらは「そのまま」使用される）。
【００６０】
ＩＩ．アジュバント
[0072]本開示の組成物はアジュバントを含むことができる。当技術分野においてよく知られている通り、アジュバントは免疫反応を増強する薬剤である（例えば、「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻、Ｐｏｗｅｌｌ及びＮｅｗｍａｎ編集、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びＬｏｎｄｏｎ、１９９５年を参照されたい）。
【００６１】
[0073]トール様受容体（ＴＬＲ）は、病原体に関連する分子パターンを認識し、したがって自己の分子と非自己分子との間を区別する上で身体を助ける、ショウジョウバエトール受容体に相同のタンパク質のファミリーである。ウイルスの病原体に共通の物質は、病原体関連の分子パターンとしてＴＬＲによって認識される。例えば、制限なく、ＴＬＲ−４はリポ多糖におけるパターンを認識すると考えられており（ＴＬＲ−４はまたＣＤ２８４又は分化２８４の一群としてデザインされている）、ＴＬＲ−７／８は一本鎖ＲＮＡ及び小型合成分子を認識すると考えられており、ＴＬＲ−９は非メチル化の細菌ＤＮＡ又は合成のオリゴヌクレオチドを認識すると考えられている。このようなパターン認識によってＴＬＲが誘発される場合、炎症並びに先天性免疫反応及び適応免疫反応の活性化をもたらす、一連のシグナル伝達のイベントが生じる。
【００６２】
[0074]いくつかの実施形態において、提供される組成物はＴＬＲ−４アゴニストアジュバントを含む。ＴＬＲ−４によって認識される分子パターンを含む数々の合成リガンド（ＴＬＲ−４アゴニスト）がアジュバントとして開発されており、提供される組成物中に含まれうる。モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）及び３−デアシルモノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）などの弱毒化リピドＡ誘導体（ＡＬＤ）は、ＴＬＲ−４に対するアゴニストである例示のアジュバントである。ＡＬＤは、リピドＡの有害作用を低減又は修飾するように変更又は構築されているリピドＡ様分子である。これらの有害作用には、発熱性、局所シュワルツマン（Ｓｈｗａｒｔｚｍａｎ）反応性、及びニワトリ胚５０％致死量アッセイ（ＣＥＬＤ５０）において評価される毒性が含まれる。ＭＰＬ及び３Ｄ−ＭＰＬはそれぞれ、米国特許第４，４３６，７２７号及び第４，９１２，０９４号に記載されている。ＭＰＬは最初、強力であるが高度に毒性の免疫系モジュレーターである、腸内細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の成分であるリピドＡに由来していた。ＭＰＬの例示の合成誘導体は、ＰＣＴ国際公開第９５／１４０２６号、並びに米国特許公開第２００８０１３１４６６号及び第２００９０１８１０７８号にも記載されている。３Ｄ−ＭＰＬは、３位で還元性末端のグルコサミンにエステル連結しているアシル残基が選択的に除去されている点でＭＰＬと異なる（例えば、米国特許第４，８７７，６１１号、第４，８６６，０３４号、及び第４，９１２，０９４号を参照されたい）。ＭＰＬ、３Ｄ−ＭＰＬ、及びこれらの誘導体は、脂肪酸鎖長を変化させると数々の脂肪酸置換パターン（即ち、ヘプタアシル、ヘキサアシル、ペンタアシルなど）の混合を含むことができることが理解されよう。このように様々な形態のＭＰＬ及び３Ｄ−ＭＰＬが、これらの混合物を含めて本開示に包含される。
【００６３】
[0075]ＭＰＬは、アラバマ州、アラバスターのＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．から、ＰＨＡＤ又はリン酸化ヘキサアシル二糖（アンモニウム塩）として入手できる。図１はＰＨＡＤの化学構造を示す。別の例示のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントである、ジ［３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソニル］−リピドＡ（アンモニウム塩）の構造を図２に示す（やはりアラバマ州、アラバスターのＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．から）。いくつかの実施形態において、これら又は他のＡＬＤを、例えば、２％スクアレン／ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（商標）８０乳液中、トレハロースジマイコレート（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）と組み合わせることができる（例えば、英国特許第２１２２２０４号を参照されたい）。
【００６４】
[0076]当業者であれば、他の適切なＴＬＲ−４アゴニストアジュバントを特定することができる。例えば、ＰＣＴ国際公開第９８／５０３９９号又は米国特許第６，３０３，３４７号及び第６，７６４，８４０号に開示されているものなどのアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）を用いることができる。他の適切なＴＬＲ−４アゴニストは、ＰＣＴ国際公開第０３／０１１２２３号及び国際公開第０３／０９９１９５号に記載されている（例えば、国際公開第０３／０１１２２３号の４〜５頁又は国際公開第０３／０９９１９５号の３〜４頁に開示されている化合物Ｉ〜ＩＩＩ、特に国際公開第０３／０１１２２３号においてＥＲ８０３０２２、ＥＲ８０３０５８、ＥＲ８０３７３２、ＥＲ８０４０５３、ＥＲ８０４０５７、ＥＲ８０４０５８、ＥＲ８０４０５９、ＥＲ８０４４４２、ＥＲ８０４６８０、及びＥＲ８０４７６４として開示されている化合物）。
【００６５】
[0077]いくつかの実施形態において、提供する組成物は、約１μｇ〜５０μｇの間のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントを含む。ある実施形態において、提供される組成物は、約１〜４０μｇ、１〜３０μｇ、１〜２０μｇ、１〜１０μｇ、又は１〜５μｇの間のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントを含む。ある実施形態において、提供される組成物は、約１０〜４０μｇ、１０〜３０μｇ、又は１０〜２０μｇの間のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントを含む。ある実施形態において、提供される組成物は、約１〜２μｇ、１〜３μｇ、１〜４μｇ、１〜５μｇ、１〜６μｇ、１〜７μｇ、１〜８μｇ、１〜９μｇ、又は１〜１０μｇの間のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントを含む。ある実施形態において、提供される組成物は、約５〜２０μｇ、５〜１８μｇ、５〜１６μｇ、５〜１４μｇ、５〜１２μｇ、５〜１０μｇ、５〜９μｇ、５〜８μｇ、又は５〜７μｇの間のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントを含む。
【００６６】
[0078]いくつかの実施形態において、提供される組成物はＴＬＲ−７／８アゴニストアジュバントを含む。ＴＬＲ−７／８によって認識される分子パターンを含む数々の合成リガンド（ＴＬＲ−７／８アゴニスト）がアジュバントとして開発されており、提供される組成物に含まれてもよい。例示のＴＬＲ−７／８リガンドには、それだけには限定されないが、各々カリフォルニア州、サンディエゴのＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手できる、ＣＬ０７５（チアゾロキノロン誘導体）、ＣＬ０９７（高度に水溶性のイミダゾキノリン化合物）、及びＲ８４８（低分子量の合成イミダゾキノリン化合物）が含まれる。いくつかの場合において、チミジンホモポリマーホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドである、ポリ（ｄＴ）を、イミダゾキノリンと組み合わせて用いてＴＬＲ−８媒介性シグナル伝達を増大及び／又はＴＬＲ−７媒介性シグナリル伝達を低減することができる（例えば、Ｊｕｒｋら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３６巻（７）、１８１５〜２６頁、２００６年を参照されたい）。当業者であれば、本発明にしたがって用いるための適切な量及び／又はＴＬＲ−７／８アゴニストアジュバントの誘導体を同定することができる。
【００６７】
[0079]いくつかの実施形態において、提供される組成物はＴＬＲ−９アゴニストアジュバントを含む。一般的に、細菌のＤＮＡは、哺乳動物のＤＮＡとは対照的に、非メチル化２’−デオキシリボ（シチジン−ホスフェートグアノシン）（ＣｐＧ）ジヌクレオチドが豊富であり、哺乳動物のＤＮＡは典型的に、殆んどメチル化されているＣｐＧジヌクレオチドを低頻度で含んでいる。非メチル化のＣｐＧは特に塩基性の状況においてＣｐＧモチーフと呼ばれ、ＴＬＲ−９によって免疫系を活性化することが示されている。いくつかの場合において、ＴＬＲ−９がＣｐＧ  ＤＮＡを認識することにより、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１２）の生成がもたらされる。ＣｐＧモチーフは、特定の種において高レベルのＴＬＲ−９刺激をもたらす保存されているコア配列を含みうる。例えば、ＧＡＣＧＴＴはマウスＴＬＲ−９を高度に刺激することが示されており、１つを超えるＣｐＧ及びコア配列ＧＴＣＧＴＴを含むＣｐＧモチーフはヒトＴＬＲ−９を刺激することが示されている。ＴＬＲ−９によって認識される分子パターンを含む数々の合成リガンド（ＴＬＲ−９アゴニスト）がアジュバントとして開発されており、提供される組成物中に含まれうる。当業者であれば、本発明にしたがって用いるためのＴＬＲ−９アゴニストアジュバントの適切な量及び／又は誘導体を同定することができる。
【００６８】
[0080]ある実施形態において、アジュバントの少なくとも一部分は脂質ベシクルと会合している。ある実施形態において、アジュバントの少なくとも一部分は脂質ベシクルと会合していない。ある実施形態において、アジュバントは、提供される組成物を調製する間に脂質と同時融解される。ある実施形態において、アジュバントを、提供される組成物を調製する間に、溶融脂質及びインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせる（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と混合し、その後これを溶融脂質と合わせることによって）。ある実施形態において、アジュバントを加えた後に提供される組成物を乾燥（例えば、凍結乾燥）する。
【００６９】
ＩＩＩ．脂質ベシクル
[0081]一般的に、本開示の組成物は、非イオン性界面活性剤を含む脂質からなる脂質ベシクルを含む。このような脂質ベシクルを、本明細書において、「非イオン性界面活性剤ベシクル」即ち「ＮＩＳＶ」とも呼ぶ。当技術分野においてよく知られている通り、ベシクルは、一般的に、１つ又は複数の脂質二重層によって封入されている水性コンパートメントを有する。
【００７０】
非イオン性界面活性剤
[0082]好適な両親媒性の性質を有する任意の非イオン性界面活性剤を用いて、本発明にしたがって用いるためのベシクルを形成することができる。制限なく、適切な界面活性剤の例には、グリセロールをベースとするエステル連結している界面活性剤が含まれる。このようなグリセロールエステルは、例えば、各アシル部分に炭素原子を少なくとも１０個含む、２つの高級脂肪族アシル基のうちの１つを含むことができる。このようなグリセロールをベースとする界面活性剤は、グリセロール単位最高５個など、１個を超えるグリセロール単位を含むことができる。Ｃ１２〜Ｃ２０アルカノイル部分又はアルケノイル部分（例えば、カプロイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、オレイル、又はステアロイル）を含むものなどのグリセロールモノエステルを用いることができる。例示のエステル連結している界面活性剤は、１−モノパルミトイルグリセロールである。
【００７１】
[0083]或いは、又は更に、エステル連結している界面活性剤を、本発明による非イオン性界面活性剤として用いることができ、又は本発明による非イオン性界面活性剤として含むことができる。例えば、グリセロール又は炭素原子最高４個の低級脂肪族グリコールを有するグリコール（例えば、エチレングリコール）をベースとするエステル連結している界面活性剤が適切である。このようなグリコールをベースとする界面活性剤は、最高５個のグリコール単位など、１個を超えるグリコール単位を含むことができる（例えば、ジグリコールセチルエーテル（ｄｉｇｌｙｃｏｌｃｅｔｙｌ  ｅｔｈｅｒ）及び／又はポリオキシエチレン−３−ラウリルエーテル）。Ｃ１２〜Ｃ２０アルカニル部分又はアルケニル部分、例えば、カプリル、ラウリル、ミリスチル、セチル、オレイル、又はステアリルを含むものを含む、グリコール又はグリセロールモノエーテルを用いることができる。用いることができるエチレンオキシド縮合生成物には、ＰＣＴ国際公開第８８／０６８８２号に開示されているもの（例えば、ポリオキシエチレン高級脂肪族エーテル及びアミン界面活性剤）が含まれる。例示のエーテル連結している界面活性剤には、１−モノセチルグリセロールエーテル及びジグリコールセチルエーテルが含まれる。
【００７２】
イオン性両親媒性物質
[0084]本発明にしたがって用いるための脂質ベシクルを作製するのに用いられる脂質は、例えば、ベシクルが負の電荷を帯びるように、イオン性両親媒性物質を組み入れることができることを理解されたい。例えば、これはベシクルを安定化し、効果的な分散をもたらすのを助けることができる。
【００７３】
[0085]制限なく、高級アルカン酸及びアルケン酸（例えば、パルミチン酸、オレイン酸）などの酸性物質、或いはジアルキルホスフェート（例えば、ジセチルホスフェート、又はホスファチジン酸若しくはホスファチジルセリン）などのホスフェートを含む酸性基を含む他の化合物、並びに高級アルキルサルフェート（例えば、セチルサルフェート）などのサルフェートモノエステルを全て、この目的に用いることができる。イオン性両親媒性物質が存在する場合は、１重量％〜５０重量％の間（例えば、１〜５％、１〜１０％、１〜１５％、１〜２０、１〜２５％、１〜３０％、１〜３５％、１〜４０％、１〜４５％、５〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、１０〜１５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１５〜２０％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、２０〜２５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２５〜３０％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、３０〜３５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３５〜４０％、３５〜４５％、３５〜５０％、４０〜４５％、４０〜５０％、又は４５〜５０％）の非イオン性界面活性剤を典型的に含む。
【００７４】
疎水性材料
[0086]本発明によるベシクルを形成するために、脂質は、二重層を形成することができる高分子量の好適な疎水性材料（例えば、ステロイド（例えば、コレステロールなどのステロール））を組み入れることもできる。二重層を形成することができるこのような高分子量の疎水性材料（例えば、ステロイド（例えば、コレステロールなどのステロール））が存在すると、それにベシクルの物理的性質が依存する二重層が形成するのを助ける。材料が存在する場合は、２０重量％〜１２０重量％の間（例えば、２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜１００％、２０〜１１０％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜１００％、３０〜１１０％、３０〜１２０％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜１００％、４０〜１１０％、４０〜１２０％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜１００％、５０〜１１０％、５０〜１２０％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜１００％、６０〜１１０％、６０〜１２０％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜１００％、７０〜１１０％、７０〜１２０％、８０〜９０％、８０〜１００％、８０〜１１０％、８０〜１２０％、９０〜１００％、９０〜１１０％、９０〜１２０％、１００〜１１０％、１００〜１２０％、又は１１０〜１２０％）の非イオン性界面活性剤を典型的に含む。
【００７５】
例示の脂質ベシクル
[0087]ある実施形態において、本発明にしたがって用いるための脂質ベシクルは、非イオン性界面活性剤、イオン性両親媒性物質、及びステロイドを含む。ある実施形態において、脂質ベシクルは、１−モノパルミトイルグリセロール、ジセチルホスフェート、及びコレステロールを含む。
【００７６】
[0088]ある実施形態において、本発明にしたがって用いるための脂質ベシクルは、非イオン性界面活性剤、イオン性両親媒性物質、及びステロイドから本質的になる。ある実施形態において、脂質ベシクルは、１−モノパルミトイルグリセロール、ジセチルホスフェート、及びコレステロールから本質的になる。
【００７７】
[0089]ある実施形態において、本発明にしたがって用いるための脂質ベシクルは、輸送増強性分子を含まず、又は輸送増強性分子が本質的にない。いくつかの実施形態において、本発明にしたがって用いるための脂質ベシクルは、「胆汁酸」（例えば、コール酸及びケノデオキシコール酸）、胆汁酸のグリシン又はタウリンとのコンジュゲーション生成物（例えば、グリココール酸及びタウロコール酸）、デオキシコール酸及びウルソデオキシコール酸、並びにこれら各々の酸の塩を含めた誘導体を含まず、又はこれらが本質的にない。いくつかの実施形態において、本発明にしたがって用いるための脂質ベシクルは、アシルオキシ化アミノ酸（例えば、アシルカルニチン及びその塩、並びにパルミトイルカルニチン）を含まず、又はこれらが本質的にない。
【００７８】
脂質：抗原重量比
[0090]本発明は、提供される組成物の免疫原性及び熱安定性は両方とも、本組成物中に存在する脂質及びヘマグルチニン抗原の相対量によって少なくとも部分的に制御されるという驚くべき発見をもたらすものである。
【００７９】
[0091]例えば、本発明者らは実験を通して、脂質含量の高い（例えば、脂質：抗原重量比が約４５０：１である）組成物は、脂質含量がわずかに低い（例えば、脂質：抗原重量比が約３００：１である）組成物よりもはるかに免疫原性が劣ることを見出した。脂質含量が低い組成物ほど一般に免疫原性が高くなるが、これらは熱安定性が劣ることも本発明者らは見出している（例えば、脂質：抗原重量比が約３０：１では殆んど熱安定性がないことを本発明者らは観察している）。これらの実験の所見に鑑みて（実施例においてより詳しく論じる）、本発明者らはここで、免疫原性及び熱安定性の両方である新たなセットの組成物を規定し、提供することができる。ある実施形態において、提供される組成物は、少なくとも約５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１１０：１、１２０：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、２００：１、２１０：１、２２０：１、２３０：１、２４０：１、２５０：１、２６０：１、２７０：１、２８０：１、２９０：１、又は３００：１の脂質：抗原重量比を有する。ある実施形態において、脂質：抗原重量比は、約４００：１、３９０：１、３８０：１、３７０：１、３６０：１、３５０：１、３４０：１、３３０：１、３２０：１、又は３１０：１未満である。ある実施形態において、脂質：抗原重量比は約５０：１〜約６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１１０：１、１２０：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、２００：１、２１０：１、２２０：１、２３０：１、２４０：１、２５０：１、２６０：１、２７０：１、２８０：１、２９０：１、３００：１、３１０：１、３２０：１、３３０：１、３４０：１、３５０：１、３６０：１、３７０：１、３８０：１、３９０：１又は４００：１の範囲内である。ある実施形態において、脂質：抗原重量比は、約５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１１０：１、１２０：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、２００：１、２１０：１、２２０：１、２３０：１、２４０：１、２５０：１、２６０：１、２７０：１、２８０：１、２９０：１、３００：１、３１０：１、３２０：１、３３０：１、３４０：１、３５０：１、３６０：１、３７０：１、３８０：１、又は３９０：１〜約４００：１の範囲内である。ある実施形態において、脂質：抗原重量比は、約５０：１〜約１００：１、約５０：１〜約１５０：１、約５０：１〜約２００：１、約５０：１〜約２５０：１、約５０：１〜約３００：１、約５０：１〜約３５０：１、又は約５０：１〜約４００：１の範囲内である。ある実施形態において、脂質：抗原重量比は、約１００：１〜約１５０：１、約１００：１〜約２００：１、約１００：１〜約２５０：１、約１００：１〜約３００：１、約１００：１〜約３５０：１、又は約１００：１〜約４００：１の範囲内である。ある実施形態において、脂質：抗原重量比は、約１５０：１〜約２００：１、約１５０：１〜約２５０：１、約１５０：１〜約３００：１、約１５０：１〜約３５０：１、又は約１５０：１〜約４００：１の範囲内である。ある実施形態において、脂質：抗原重量比は、約２００：１〜約２５０：１、約２００：１〜約３００：１、約２００：１〜約３５０：１、又は約２００：１〜約４００：１の範囲内である。ある実施形態において、脂質：抗原重量比は、約２５０：１〜約３００：１、約２５０：１〜約３５０：１、又は約２５０：１〜約４００：１の範囲内である。ある実施形態において、脂質：抗原重量比は、約３００：１〜約３５０：１、又は約３００：１〜約４００：１の範囲内である。ある実施形態において、脂質：抗原重量比は、約３５０：１〜約４００：１の範囲内である。ある実施形態において、脂質：抗原重量比は、約２００：１、２１０：１、２２０：１、２３０：１、２４０：１、２５０：１、２６０：１、２７０：１、２８０：１、２９０：１、３００：１、３１０：１、３２０：１、３３０：１、３４０：１、３５０：１、３６０：１、３７０：１、３８０：１、３９０：１、又は４００：１である。
【００８０】
脂質ベシクルを作製するための方法
[0092]ＰＣＴ国際公開第９３／１９７８１号において言及されているものなど、非イオン性界面活性剤を含む脂質ベシクルを調製するためのいくつかの技術が知られている。例示の技術は、非イオン性界面活性剤の膜（及び任意の他の成分脂質）を、炭化水素又は塩素化炭化水素の溶媒（例えば、クロロホルム）などの有機溶媒からロータリーエバポレーションによって調製する、ロータリーフィルムエバポレーション（ｒｏｔａｒｙ  ｆｉｌｍ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）法である（例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌ及びＡｌｅｘａｎｄｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４０巻、１２７４頁、１９８８年を参照されたい）。得られる薄膜を、次いで、水性バッファー中再水和する。
【００８１】
[0093]脂質ベシクルを生成するための別の一方法は、Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４２巻、５３頁、１９９０年によって開示されている。この方法は、非イオン性界面活性剤（及び任意の他の成分脂質）を融解し、水性バッファーの存在下激しく混和して水和することを伴う。
【００８２】
[0094]別の一方法は、せん断力の存在下の脂質の水和を伴う。このようなせん断力を適用するのに用いることができる装置はよく知られている（例えば、ＰＣＴ国際公開第８８／０６８８２号を参照されたい）。音波処理及び超音波処理も、脂質ベシクルを形成するのに、又は脂質ベシクルのサイズを変更するのに有効な手段である。
【００８３】
[0095]ある実施形態において、ヘマグルチニン抗原の少なくとも一部分は脂質ベシクルと会合している（この場合、本明細書で用いられる「会合」の語は任意の形態の物理的相互作用を包含する）。ある実施形態において、ヘマグルチニン抗原の少なくとも一部分は脂質ベシクル内に捕捉されている。会合及び捕捉は任意のやり方で実現され得る。例えば、ロータリーフィルムエバポレーション法において、膜を（任意選択によってアジュバントと一緒に）抗原の存在下で水和することができる。他の方法において、水相中の抗原を、予め形成させた脂質ベシクルと合わせ、急速冷凍にかけ、その後凍結乾燥する、脱水−再水和法を用いることができる（例えば、Ｋｉｒｂｙ及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２巻、９７９頁、１９８４年を参照されたい）。或いは、又は更に、予め形成させたベシクルを抗原と混合し、液体窒素中繰返し急速冷凍し、関連する脂質の転移温度を超える温度に温める凍結融解法を用いることができる（例えば、Ｐｉｃｋ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２１２巻、１９５頁、１９８１年を参照されたい）。抗原の会合の他に、脱水−再水和法及び凍結−融解法も、アジュバントを脂質ベシクルと同時に会合させることができる。
【００８４】
[0096]ある実施形態において、本発明にしたがって用いるための脂質ベシクルは、成分脂質を融解して溶融脂質を生成するステップと、溶融脂質を、ヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせるステップと、得られる生成物を均質化するステップとを含む方法によって調製される。ある実施形態において、溶融脂質を、ヘマグルチニン抗原を含む水溶液に加える。ある実施形態において、ヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質に加える。
【００８５】
[0097]ある実施形態において、溶融脂質及び水溶液を、得られる生成物中の少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌの脂質濃度を達成する相対量及び体積で合わせる。実際、実験により、また実施例において記載する通り、本発明者らは、脂質及び抗原を１０ｍｇ／ｍｌを超える脂質濃度で均質化する場合、得られた組成物は低濃度の脂質を用いた場合よりも温度安定性である傾向があることを見出した（実施例を参照されたい）。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、抗原及び脂質ベシクルを含む望ましい組成物（熱安定性の組成物を特に含む）を提供し、この組成物は、特定の特徴（例えば、改善された熱安定性）を組成物に授けるのに本明細書において確立された特定化された脂質濃度を含んでいる。
【００８６】
[0098]ある実施形態において、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５ｍｇ／ｍｌの脂質濃度が達成される。ある実施形態において、脂質濃度は約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。ある実施形態において、脂質濃度は約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。ある実施形態において、脂質濃度は約２５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、又は約５０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００８７】
[0099]ある実施形態において、溶融脂質及び水溶液を、所望の脂質：抗原重量比（例えば、少なくとも約５０：１、又は上記に列挙した前述の脂質：抗原重量比範囲の任意の１つ）、及び得られる生成物中の少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌの脂質濃度（又は上記に列挙した他の脂質濃度範囲の任意の１つ）の両方を達成する相対量及び体積で合わせる。
【００８８】
[0100]ある実施形態において、提供される組成物を調製する間、アジュバントを脂質と同時融解する。ある実施形態において、提供される組成物を調製する間、アジュバントを、溶融脂質、及びインフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液と合わせる（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、溶融脂質と合わせる前に混合することによって）。ある実施形態において、アジュバントを、提供される組成物を乾燥（例えば、凍結乾燥）する前に加える。
【００８９】
[0101]いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤（任意選択によって、他の脂質成分と一緒に）を１２０℃〜１５０℃の間の範囲の温度（例えば、１２０℃〜１２５℃、１２０℃〜１３０℃の間、１２０℃〜１４０℃の間、１３０℃〜１４０℃の間、１３５℃〜１４５℃の間、又は１４０℃〜１４５℃の間）で融解する。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤（任意選択によって、他の脂質成分と一緒に）を約１２０℃、約１２５℃、約１３０℃、約１３５℃、約１４０℃、約１４５℃、又は約１５０℃で融解する。いくつかの実施形態において、ヘマグルチニン抗原を含む水溶液は温度制御されている。いくつかの実施形態において、ヘマグルチニン抗原を含む水溶液を、添加のステップの間、約５０℃未満の温度（例えば、約４５℃未満、約４０℃未満、約３５℃未満、約３０℃未満、約２５度未満など）に保持する。いくつかの実施形態において、ヘマグルチニン抗原を含む水溶液を約２５℃〜約５０℃の間の範囲の温度に保持する。いくつかの実施形態において、ヘマグルチニン抗原を含む水溶液を室温に保持する。
【００９０】
[0102]ある実施形態において、ベシクルは、乾燥（例えば、凍結乾燥）形態の脂質成分を提供するステップと、乾燥材料をヘマグルチニン抗原を含む水溶液と再水和するステップとを含むプロセスによって作製される。乾燥材料は、例えば、脂質成分を融解し、次いで溶融生成物を凍結乾燥することによって調製することができる。
【００９１】
[0103]以下により詳しく記載する通り、いくつかの実施形態において、提供される組成物を貯蔵前に乾燥（例えば、凍結乾燥）し、引き続き使用前に水和してもよい。
【００９２】
ベシクルサイズ及び加工
[0104]提供される組成物は、ある範囲のサイズの脂質ベシクルの混合物を典型的に含んでいる。いくつかの実施形態において、＞９０％のベシクルの直径が最頻値（例えば、１０００±５００ｍｍ）の５０％以内にある。いくつかの実施形態において、分布はより狭いことがあり、例えば、＞９０％のベシクルの直径は最頻値の４０、３０、２０、１０、又は５％以内にあってもよい。いくつかの実施形態において、音波処理又は超音波処理を用いて、ベシクル形成を促進及び／又はベシクルサイズを変更することができる。いくつかの実施形態において、ろ過、透析、及び／又は遠心分離を用いてベシクルサイズの分布を調節することができる。
【００９３】
[0105]一般的に、本開示によって生成される脂質ベシクルは任意のサイズとすることができる。ある実施形態において、提供される組成物は、最頻の直径が約０．１μｍ〜約１０μｍ、例えば、約０．１μｍ〜約５μｍ、約０．５μｍ〜約２μｍ、又は約０．８μｍ〜約１．５μｍの範囲であるベシクルを含むことができる。ある実施形態において、最頻の直径は１０μｍを超えることができ、例えば、約１０μｍ〜約２０μｍ又は約１５μｍ〜約２５μｍの範囲とすることができる。ある実施形態において、最頻の直径は約０．１μｍ〜約２０μｍ、約０．１μｍ〜約１５μｍ、約０．１μｍ〜約１０μｍ、約０．５μｍ〜約２０μｍ、約０．５μｍ〜約１５μｍ、約０．５μｍ〜約１０μｍ、約１μｍ〜約２０μｍ、約１μｍ〜約１５μｍ、又は約１μｍ〜約１０μｍの範囲とすることができる。
【００９４】
凍結乾燥
[0106]ワクチンの液体組成物は、ワクチンの導入以来デフォルトプレゼンテーション（ｄｅｆａｕｌｔ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）であった。現存する液体ワクチンの殆んどは、高温ではなく、冷蔵下で貯蔵するために開発されており、その結果これらの安定性は最適ではないことがある。認可のインフルエンザワクチンは全て、現在、液体として調合及び貯蔵される。水性の環境において、インフルエンザ抗原は物理的及び化学的の分解に曝され、そのため不活化及び効力の減少がもたらされうる。
【００９５】
[0107]上記で論じた通り、ある実施形態において、乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示の方法は乾燥（例えば、凍結乾燥）のステップを含む。
【００９６】
[0108]一般的に、凍結乾燥は、問題の調製物の冷凍、次いで凍結した溶媒（単数又は複数）を固相から気体へ直接昇華させるための周囲の圧力の低下（及び任意選択によって調製物の加熱）（即ち、乾燥段階）を伴う。乾燥段階は第１及び第２の乾燥段階に分けることができる。
【００９７】
[0109]凍結段階は、調製物を容器（例えば、フラスコ、エッペンドルフチューブなど）中に配置し、任意選択によって機械冷凍（例えば、ドライアイス及びメタノール、液体窒素などを用いて）によって冷却される浴中で容器を回転させることによって行うことができる。いくつかの実施形態において、凍結ステップは、調製物を、調製物の共融点未満である温度に冷却することを伴う。共融点は、調製物の固相及び液相が共存することができる最低温度で生じるため、材料をこの点未満の温度に維持することで、蒸発ではなく昇華が後のステップにおいて生じるのが確実になる。
【００９８】
[0110]乾燥段階（又は、２つの乾燥段階を用いる場合は第１の乾燥段階）は、圧力を低減すること、及び任意選択によって溶媒（単数又は複数）が昇華することができる点に調製物を加熱することを伴う。この乾燥段階は、典型的に、調製物から溶媒（単数又は複数）の大部分を除去する。冷凍段階及び乾燥段階は必ずしも別々の段階ではないが、任意のやり方で組み合わせることができる。例えば、ある実施形態において、冷凍段階と乾燥段階とが重複してもよい。
【００９９】
[0111]第２の乾燥段階を任意選択によって用いて、冷凍段階の間に吸着された残りの溶媒（単数又は複数）を除去することができる。乾燥段階が完了した後、凍結乾燥した脂質生成物を任意選択によって密封する前に、不活性ガス（例えば、窒素又はヘリウム）で真空を破壊することができる。
【０１００】
[0112]ショ糖、アミノ酸、又はゼラチン若しくは血清アルブミンなどのタンパク質などの賦形剤を用いて、乾燥プロセス及び貯蔵の間、抗原を保護することができる。いくつかの実施形態において、凍結乾燥保護剤を用いることができる。いくつかの実施形態において、アジュバントを凍結乾燥保護剤と一緒に加えることができる。例示の凍結乾燥保護剤には、ショ糖、トレハロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジメチルスクシネートバッファー（ＤＭＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、マンニトール、及びデキストランが含まれる。
【０１０１】
[0113]本開示は、提供される組成物のある好ましい実施形態は、特に低い（例えば、約２重量％未満の）水分含量を有するものであることを確立するものである。実験を通して（実施例においてより詳しく記載する通り）、本発明らは、脂質含量のより高い乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物の残留水分含量はより低い傾向がある（例えば、約２重量％未満）ことを決定した。上記で注目した通り、脂質含量のより高い組成物はより熱安定性である傾向がある。いかなる理論に限定しようとするものではないが、本発明者らは、脂質含量のより高い組成物の熱安定性の性質のいくつか又は全ては、組成物のより低い残留水分含量によって部分的に駆り立てられ得ると仮定している。したがって、ある実施形態において、本開示の組成物は低水分含量（例えば、約２重量％未満）に規定され、低水分含量をもたらす。ある実施形態において、提供される組成物は、少なくとも５０：１（又は、上記に列挙した前述の脂質：抗原重量比の範囲の任意の１つ）の脂質：抗原重量比を有する。ある実施形態において、これらの組成物は、より低い脂質：抗原重量比（例えば、少なくとも約４０：１又は３０：１）を有することができる。本発明者らの水分含量の結果に基づき、これらの低脂質含量組成物は、凍結乾燥プロセスの間により広範な乾燥ステップを必要とすることがある。
【０１０２】
[0114]ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は、約１．９重量％、１．８重量％、１．７重量％、１．６重量％、１．５重量％、１．４重量％、１．３重量％、１．２重量％、１．１重量％、１重量％、０．９重量％、０．８重量％、０．７重量％、０．６重量％、０．５重量％、又は０．４重量％未満である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．４重量％〜約２重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．５重量％〜約１．９重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．６重量％〜約１．８重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．７重量％〜約１．７重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．８重量％〜約１．６重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．９重量％〜約１．５重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約１重量％〜約１．４重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．５重量％〜約１重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．５重量％〜約１．５重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約０．５重量％〜約２重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約１重量％〜約１．５重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約１重量％〜約２重量％の範囲である。ある実施形態において、提供される組成物の水分含量は約１．５重量％〜約２重量％の範囲である。
【０１０３】
乾燥組成物の再水和
[0115]乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物を、それを必要とする対象に投与する前に再水和する。いくつかの実施形態において、このような再水和は、乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物を水溶液と混合することによって実現される。いくつかの実施形態において、水溶液はバッファーを含む。例えば、制限なく、ＰＣＢバッファー、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４バッファー、ＰＢＳバッファー、ビシン（ｂｉｃｉｎｅ）バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＯＰＳバッファーなどを用いることができる。ＰＣＢバッファーは、プロピオン酸ナトリウム、カコジル酸ナトリウム、及びビス−Ｔｒｉｓプロパンを２：１：２のモル比で混合することによって生成される。加えるＨＣｌの量を変化させることで、４〜９の範囲のｐＨにわたって緩衝することができるようになる。いくつかの実施形態において、炭酸塩バッファーを用いることができる。
【０１０４】
乾燥組成物の貯蔵
[0116]ある実施形態において、乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物を、再水和、及びそれを必要とする対象への投与の前にある期間（例えば、数日、数週間、又は数ヶ月）貯蔵することができる。ある実施形態において、乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物を、温度制御されていない条件下で貯蔵する。ある実施形態において、乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物を、貯蔵の間８℃を超える温度（例えば、１５℃、２０℃、又は２５℃を超える温度）に少なくとも一時的に曝す。ある実施形態において、乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物を、１０℃〜４０℃の範囲の温度、２０℃〜３０℃の範囲の温度、室温などに少なくとも一時的に曝す。
【０１０５】
[0117]ある実施形態において、乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物は熱安定性である。ある実施形態において、乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物は、４０℃で６ヶ月間貯蔵した場合に、脂質ベシクルのない参照乾燥組成物よりも安定である。ある実施形態において、安定性は、ＨＡＩアッセイによって決定する免疫原性に基づく。ある実施形態において、安定性はＥＬＩＳＡによって決定する抗原含量に基づく。
【０１０６】
[0118]ある実施形態において、乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物は、４０℃で６ヶ月貯蔵した場合に、ＨＡＩアッセイによって決定される免疫原性の５０％未満の変化を示す。ある実施形態において、乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物は、免疫原性の４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は２％未満の変化を示す。
【０１０７】
[0119]ある実施形態において、乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物は、４０℃で６ヶ月間貯蔵した場合に、ＥＬＩＳＡによって決定される抗原含量の５０％未満の減少を示す。ある実施形態において、乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物は、抗原含量の４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は２％未満の減少を示す。
【０１０８】
[0120]ある実施形態において、これらの効果は、乾燥組成物を、６ヶ月ではなく、ちょうど１ヶ月間、２ヶ月間、又は３ヶ月間貯蔵した後に観察される。ある実施形態において、これらの効果は、乾燥組成物を４０℃ではなく、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、又は３５℃で貯蔵した後に観察される。
【０１０９】
[0121]ある実施形態において、乾燥組成物の抗原性及び／又は免疫原性は、１〜６ヶ月の期間、８℃を超える温度（例えば、１０℃〜４０℃の範囲の温度、２０℃〜３０℃の範囲の温度、室温など）に曝しても、貯蔵の間、依然として本質的に変化しない。
【０１１０】
[0122]ある実施形態において、このような高温で乾燥組成物を貯蔵すると、ＥＬＩＳＡで測定して、及び同じ期間２℃〜８℃の間で貯蔵した同等の乾燥組成物に比べて抗原の抗原性の２０％未満（例えば、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満）を破壊する。
【０１１１】
[0123]ある実施形態において、このような高温で乾燥組成物を貯蔵すると、ＨＡＩ力価測定に基づいて、及び同じ期間２℃〜８℃の間で貯蔵した同等の乾燥組成物に比べて抗原の免疫原性の２０％未満（例えば、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満）を破壊する。
【０１１２】
[0124]ある実施形態において、乾燥組成物の貯蔵後の抗原性及び／又は免疫原性は、同じ高温下で貯蔵したが脂質ベシクルなしで調合したその他の点で同等の乾燥組成物よりも少なくとも１．５倍（例えば、少なくとも約２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、又は５倍）大きい。いくつかの実施形態において、抗原性のレベルは、ＥＬＩＳＡを用いて得られた測定値に基づく。いくつかの実施形態において、免疫原性のレベルは、ＨＡＩ力価測定に基づく。
【０１１３】
[0125]いくつかの実施形態において、１つ又は複数のこれらの抗原性及び／又は免疫原性の結果は、乾燥組成物を２５℃で１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、又は４ヶ月間貯蔵した場合に得られる。いくつかの実施形態において、これらの結果は、乾燥組成物を、１５℃、２０℃、３０℃、３５℃、又は４０℃で１ヶ月間貯蔵した場合に得られる。いくつかの実施形態において、これらの結果は、乾燥組成物を、１５℃、２０℃、３０℃、３５℃、又は４０℃で２ヶ月間貯蔵した場合に得られる。いくつかの実施形態において、これらの結果は、乾燥組成物を、１５℃、２０℃、３０℃、３５℃、又は４０℃で３ヶ月間貯蔵した場合に得られる。いくつかの実施形態において、これらの結果は、乾燥組成物を、１５℃、２０℃、３０℃、３５℃、又は４０℃で４ヶ月間貯蔵した場合に得られる。いくつかの実施形態において、これらの結果は、乾燥組成物を、１５℃、２０℃、３０℃、３５℃、又は４０℃で６ヶ月間貯蔵した場合に得られる。
【０１１４】
例示の組成物
[0126]ある実施形態において、提供される組成物は、アジュバントの性質を有するさらなる薬剤を含まず、又はアジュバントの性質を有するさらなる薬剤が本質的にない（即ち、提供される組成物は、アジュバント非添加である）。ある実施形態において、提供される組成物は、ＴＬＲアゴニストアジュバント（即ち、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−７／８、ＴＬＲ−９などのアゴニストアジュバント）を含まず、又はＴＬＲアゴニストアジュバントが本質的にない。ある実施形態において、提供される組成物は、ＴＬＲ−３アゴニストアジュバント（例えば、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）又はＰｏｌｙ（ＩＣ：ＬＣ））を含まず、又はＴＬＲ−３アゴニストアジュバントが本質的にない。ある実施形態において、提供される組成物は、ＴＬＲ−４アゴニストアジュバント（例えば、ＭＰＬ又は３Ｄ−ＭＰＬ）を含まず、又はＴＬＲ−４アゴニストアジュバントが本質的にない。ある実施形態において、提供される組成物は、ＴＬＲ−５アゴニストアジュバントを含まず、又はＴＬＲ−５アゴニストアジュバントが本質的にない。ある実施形態において、提供される組成物は、ＴＬＲ−７／８アゴニストアジュバントを含まず、又はＴＬＲ−７／８アゴニストアジュバントが本質的にない。ある実施形態において、提供される組成物は、ＴＬＲ−９アゴニストアジュバントを含まず、又はＴＬＲ−９アゴニストアジュバントが本質的にない。
【０１１５】
ＩＶ．投与量及び投与
[0127]本開示の方法は、成人及び小児を含めたヒトにおけるインフルエンザ感染症を治療するのに有用である。しかし、一般的に、これらは任意の動物で用いることもできる。ある実施形態において、本明細書の方法は、獣医学的応用、例えば、イヌ及びネコの応用に用いられる。所望により、本明細書の方法を、家畜、例えば、ヒツジ、トリ、ウシ、ブタ、及びウマの品種でも用いることができる。
【０１１６】
[0128]本明細書に記載する組成物を、一般的に、免疫反応を誘発するのに必要又は十分であるような量及び時間において投与する。投薬計画は、ある期間にわたる単一の単位投与量又は複数の単位投与量からなることができる。投与すべき提供される組成物の正確な量は対象によって変化することがあり、いくつかの因子に依存しうる。このように、一般的に、用いられる正確な投与量は、処方する医師によって決定され、対象の体重及び投与経路だけでなく、対象の年齢並びに症状の重症度及び／又は感染症の危険性にもよることが理解されよう。ある実施形態において、提供される組成物は、約１μｇ〜１００μｇの範囲のある投与量のヘマグルチニン抗原を含む。例えば、ある実施形態において、範囲は約２〜５０μｇ、５〜５０μｇ、２〜２０μｇ、５〜２０μｇなどの間とすることができる。ある実施形態において、ヘマグルチニン抗原の投与量は、約５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇなどとすることができる。ある実施形態において、これらの投与量を単一の単位投与量として投与する。ある実施形態において、単位投与量を数回にわたって投与する（例えば、１〜１２ヶ月によって分割される１〜３単位投与量）。ある実施形態において、ヘマグルチニン抗原は認可のヒトインフルエンザワクチンから取ったものであり、組成物をヘマグルチニン抗原の単位投与量が標準のヒト単位投与量未満で（例えば、標準のヒト単位投与量の１０〜９０％、１０〜８０％、１０〜７０％、１０〜６０％、１０〜５０％、１０〜４０％、１０〜３０％、１０〜２０％、２０〜９０％、２０〜８０％、２０〜７０％、２０〜６０％、２０〜５０％、２０〜４０％、２０〜３０％、３０〜９０％、３０〜８０％、３０〜７０％、３０〜６０％、３０〜５０％、３０〜４０％、４０〜９０％、４０〜８０％、４０〜７０％、４０〜６０％、４０〜５０％、５０〜９０％、５０〜８０％、５０〜７０％、５０〜６０％、６０〜９０％、６０〜８０％、６０〜７０％、７０〜９０％、７０〜８０％、又は８０〜９０％の範囲において）あるようにヒトに投与する。例えば、標準のヒト単位投与量が、ヘマグルチニン抗原４５μｇを含む組成物の単回投与を求める場合（例えば、フルゾン（登録商標）、フルビリン（登録商標）、又はフルラバル（登録商標）を参照されたい）、ある実施形態において、本開示の方法は、ヘマグルチニン抗原４５μｇ未満（例えば、ヘマグルチニン抗原４０μｇ、３５μｇ、３０μｇ、２５μｇ、２０μｇ、又は１５μｇ）を含む提供される組成物の単回投与を対象に投与することを含むことができる。
【０１１７】
[0129]いくつかの実施形態において、提供される組成物におけるヘマグルチニン抗原及びＴＬＲ−４アゴニストアジュバント（例えば、ＭＰＬ又は３Ｄ−ＭＰＬ）の量は、各単位投与量がヘマグルチニン抗原約１〜１００μｇ（例えば、約２〜８０μｇ、５〜７０μｇ、又は約１０〜５０μｇ）、及びＴＬＲ−４アゴニストアジュバント（例えば、ＭＰＬ又は３Ｄ−ＭＰＬ）約１〜１００μｇ（例えば、約１〜５０μｇ、約１．５〜５０μｇ、約２．５〜５０μｇ、約２．５〜５０μｇ、約２．５〜４０μｇ、約２．５〜３０μｇ、約２．５〜２０μｇ、又は約２．５〜１０μｇ）を含むような量である。
【０１１８】
[0130]ある実施形態において、提供される組成物は、注射によるなど、非経口的に送達するように調合される。このような実施形態において、投与は、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、若しくは皮下、又は注入若しくは無針注射の技術によるものであってもよい。ある実施形態において、組成物は筋肉内送達用に調合されうる。このような非経口投与に対して、上記で論じた通り、組成物を乾燥形態において調製及び維持し、投与前に再水和することができる。注射用組成物のｐＨを、当技術分野において知られている通り、メタンスルホン酸など、薬学的に許容される酸で調節することができる。用いることができる他の許容されるビヒクル及び溶媒には、リンガー溶液及びＵ．Ｓ．Ｐが含まれる。さらに、滅菌の不揮発性油が、溶媒又は懸濁媒体として慣例的に用いられる。この目的で、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の無刺激性の不揮発性油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を、注射剤の調製において用いる。注射用組成物は、例えば、細菌保持フィルター（ｂａｃｔｅｒｉａｌ−ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｌｔｅｒ）を通したろ過によって、又は使用前に滅菌水若しくは他の滅菌注射用媒体に溶解又は分散することができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み入れることによって、滅菌することができる。
【実施例】
【０１１９】
[0131]以下の実施例は、本明細書に記載するある組成物を作製し、実践するいくつかの例示の様式を記載するものである。これらの実施例は説明の目的にすぎず、本明細書に記載する組成物及び方法の範囲を制限しようとするものではないことを理解されたい。
【０１２０】
実施例１：熱安定性の凍結乾燥免疫原性組成物
[0132]本実施例は、筋肉内（ＩＭ）注射用の熱安定性の凍結乾燥免疫原性組成物を調製するための方法を記載する。非イオン性界面活性ベシクル（ＮＩＳＶ）組成物は全て、逆融解法によって調製した。以下の脂質を用いた：１−モノパルミトイルグリセロール（非イオン性界面活性剤）、コレステロール（ステロイド）、及びジセチルホスフェート（イオン性両親媒性物質）。具体的に述べると、モル比５：４：１の脂質（１−モノパルミトイルグリセロール（ＭＰＧ）４９６ｍｇ、コレステロール（ＣＨＯ）４６４ｍｇ、及びジセチルホスフェート（ＤＣＰ）１６４ｍｇ）を、ガラス製ビーカーの側面に粉末が確実に付着しないように、ガラス製平底ビーカー中に配置した。この例示の組成物中、１２ｍｇ（投与量節約型組成物に対して）又は４ｍｇ（投与量等価組成物に対して）いずれかのリン酸化ヘキサアシル二糖（アンモニウム塩）（ＰＨＡＤ、図１に示す例示のＴＬＲ−４アゴニストアジュバント、アラバマ州、アラバスターのＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ，Ｉｎｃ．から入手できる）を任意選択によって加え、他の脂質と一緒に同時融解した。ビーカーを固定し、アルミニウム製ホイルで覆い、１２０〜１２５℃に加熱した油浴中、ガラス棒を用いて時折かき混ぜながら脂質を融解した。脂質を融解する間に、濃縮リン酸バッファーを以下の通り調製した：ラミナーフローフード中、Ｎａ２ＨＰＯ４５．９８０ｇ及びＮａＨ２ＰＯ４１．３６３ｇを滅菌水２０ｍｌ中に溶解し、ｐＨを測定し、溶液を０．４５μｍ滅菌フィルターを通してろ過し、このバッファー０．７９６ｍｌをフルゾン（登録商標）インフルエンザワクチン（２００９〜２０１０季節性；Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）４０ｍｌに加えた。フルゾン（登録商標）インフルエンザワクチン（２００９〜２０１０季節性；Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）は、４５μｇ／０．５ｍｌの濃度のインフルエンザＨＡ抗原を含む、不活化３価インフルエンザ成分ワクチンである。（各０．５ｍｌは以下のインフルエンザウイルス株の各々からＨＡ抗原１５μｇを含む：Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７；Ｈ３Ｎ２、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７、及びＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８）。緩衝した抗原保存液を３０〜３５℃、８０００ｒｐｍで均質化し、溶液を均質化しながら迅速に（結晶化を防ぐために）溶融脂質をビーカー中に移し、この点で８０００ｒｐｍの均質化を３０〜３５℃で１０分間続けた。得られた脂質−抗原懸濁液を、３０〜３５℃、２２０±１０ｒｐｍで１〜２時間振盪した。このステップの後、工程中の試料を採取してｐＨ及び粒子サイズ分布（ＰＳＤ）を決定した。最後に４００ｍＭショ糖水溶液４０ｍｌをＮＩＳＶ−抗原溶液４０ｍｌに加え、３０〜３５℃、２２０±１０ｒｐｍで５分間振盪した。アリコートを採取し（投与量節約型組成物に対して０．５ｍｌ／バイアル、及び投与量等価組成物に対して１．５ｍｌ／バイアル）、終夜又はそれより長く−８０℃で凍結し、引き続き以下の表２に概略する凍結乾燥サイクルにおける標的の凍結乾燥パラメーター、及び様々な充填体積に対して以下の表３に示す主な乾燥時間設定点にしたがって凍結乾燥した。
【０１２１】
【表２】
2013533259.tif 000004
【０１２２】
【表３】
2013533259.tif 000005
【０１２３】
[0133]ＮＩＳＶと調合されないが抗原及びアジュバントを含む対照試料は、以下の手順にしたがって調製した：ＰＨＡＤ１２ｍｇ（投与量節約型組成物）又は４ｍｇ（投与量等価組成物）を４００ｍＭショ糖溶液４０ｍｌ中に再懸濁し、この懸濁液を引き続きフルゾン（登録商標）インフルエンザワクチン（２００９〜２０１０季節性；Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）と混合し、３０〜３５℃、２２０±１０ｒｐｍで５分間振盪した。この非調合の抗原−アジュバント溶液をバイアル中に分注し（投与量節約型組成物に対して０．５ｍｌ／バイアル、及び投与量等価組成物に対して１．５ｍｌ／バイアル）、終夜又はそれより長く−８０℃で凍結し、上記表２において概略した凍結乾燥サイクル、及び様々な充填体積に対して上記表３に記載した主な乾燥時間設定点において、標的の凍結乾燥パラメーターにしたがって引き続き凍結乾燥した。
【０１２４】
[0134]凍結乾燥組成物を全て、投与前にＷＦＩ０．７５ｍｌ中で再水和した。以下により詳しく論じる通り、いくつかの試験は、対照として液体形態において提供されるフルゾン（登録商標）インフルエンザワクチンを用いた（即ち、凍結乾燥を含まない調合ステップなしで）。
【０１２５】
実施例２：免疫原性組成物でのマウスのインフルエンザ免疫化
[0135]実施例１に記載した通りに調製した組成物を、６〜８週齢ＢＡＬＢ／Ｃメスマウスにおいて試験した（１試験グループあたり最低８動物）。マウスを、対照又は再水和組成物５０μｌで、０日目に１回及び１４日目に１回の２回、筋肉内免疫化した。免疫化前、次いで第１及び第２の免疫化後の試験グループにおいて全てのマウスから採血して体液性免疫反応を評価した。以下の表４に概略する通り、（１）０．１×標準のヒト単位投与量に等しい（「標準マウス単位投与量」は０．１×標準のヒト単位投与量、即ち、ヒトとマウスとの間のサイズの違いを考慮に入れた後）投与量等価フルゾン（登録商標）（陽性対照；非調合及びアジュバント非添加）（グループ／試験品１）；（２）ＮＩＳＶ及びアジュバントのＰＨＡＤ（０．００５ｍｇ）と調合した１／３０×標準のヒト単位投与量に等しい投与量節約型フルゾン（登録商標）（グループ／試験品２）；又は（３）ＮＩＳＶなしでアジュバントのＰＨＡＤ（０．００５ｍｇ）と調合した１／３０×標準のヒト単位投与量に等しい投与量節約型フルゾン（登録商標）（グループ／試験品３）のいずれかを動物に投与した。
【０１２６】
【表４】
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【０１２７】
実施例３：免疫原性組成物の効力の赤血球凝集抑制アッセイ
[0136]効力試験に対して、ＨＡＩアッセイを用いて動物における免疫学的反応を測定した。ＨＡＩアッセイは、インフルエンザウイルスの感染又はワクチン接種に起因する血清中のＨＡ抗体を検出するのに用いられる血清学的技術である。ＨＡＩ力価はヒトにおけるインフルエンザからの防御に相関する。ＨＡＩ抗体力価は、４赤血球凝集単位を用いて完全な赤血球凝集を示す血清の最高希釈の逆数として表される。ＨＡＩ力価が１：４０又はそれを超えると血清保護的（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）であると考えられ、ワクチン接種の後及び前に採取した試料中のＨＡＩ力価における４倍の増大は抗体陽転の分類に必要と考えられる最小の増大である。結果は、ＨＡＩ力価の逆関数及びＨＡＩ力価の相乗平均として表される。ＨＡＩアッセイは以下の通りに行った。簡潔に述べると、免疫化したマウス由来の血清のＰＢＳ中２倍希釈の系列を９６ウェルＶ底プレートにおいて調製し、４赤血球凝集単位（ＨＡＵ）のＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７（Ｈ１Ｎ１）又はＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）５０μｌと３０分間、室温でインキュベートした。次に、ニワトリ赤血球（０．５ｖ／ｖ％希釈）（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ、カナダ、オタワ）５０μｌをプレート上の全ウェルに加え、室温で１．５時間インキュベートした。ニワトリ赤血球を凝集させることができる最高希釈を、次いで決定した。
【０１２８】
[0137]相乗平均、中央値、及び平均値の標準誤差を決定した。ソフトウエアグラフパッドプリズム５（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５）を用いて統計学的分析を行った。対応のあるｔ検定によって対応する標本を評価し、スチューデントのｔ検定によって対応のない標本を評価した。ｐ値≦０．０５を統計的に有意であるとみなした。免疫化前に得られた値に比べて最終の免疫化後１４日後のワクチン接種反応の≧２倍の増大によって陽性の反応を示した。これらのアッセイの結果を以下に記載する。
【０１２９】
[0138]このマウスの試験において、本発明者らは、実施例２、表４に記載する３つの組成物の効力を評価した。試験１３日目（Ｐ１Ｖｄ１３）及び２９日目（Ｐ２Ｖｄ１５）にマウスから得た血液に対してＨＡＩアッセイを行った。
【０１３０】
[0139]図３は、最初の免疫化１３日後のＨ１Ｎ１  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７に対する平均ＨＡＩ力価を示す（Ｐ１Ｖｄ１３）。グループ２の動物（表４；アジュバント添加した投与量節約型ＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物）に対して、Ｈ１Ｎ１に対する平均ＨＡＩ力価はグループ３の動物（表４；ＮＩＳＶなしのアジュバント添加した投与量節約型フルゾン（登録商標）組成物）よりも有意に高く、また対照のグループ１の動物よりもやはり高かったことが分かる（表４；アジュバント非添加及び非調合の投与量等価フルゾン（登録商標））。アジュバント添加した投与量節約型ＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ２）は、対照のアジュバント非添加及び非調合の投与量等価フルゾン（登録商標）（グループ１）よりも単位投与量の３分の１効力が高かったが、ＮＩＳＶなしのアジュバント添加した投与量節約型フルゾン（登録商標）組成物（グループ３）は高くなかったことも観察された。
【０１３１】
[0140]図４は、第１の免疫化１３日後のＨ３Ｎ２  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７に対する平均ＨＡＩ力価を示す（Ｐ１Ｖｄ１３）。グループ２の動物（表４；アジュバント添加した投与量節約型ＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物）に対して、Ｈ３Ｎ２に対する平均ＨＡＩ力価は、グループ３の動物（表４；ＮＩＳＶなしのアジュバント添加した投与量節約型フルゾン（登録商標）組成物）よりも有意に高く、また対照のグループ１の動物（表４；アジュバント非添加及び非調合の投与量等価フルゾン（登録商標））よりもやはり高かったことが分かる。繰り返すと、アジュバント添加した投与量節約型ＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ２）は、対照のアジュバント非添加の非調合の投与量等価フルゾン（登録商標）（グループ１）よりも単位投与量の３分の１効力が高かったが、ＮＩＳＶなしのアジュバント添加した投与量節約型フルゾン（登録商標）組成物（グループ３）は高くなかったことも観察された。第２の免疫化後（Ｐ２Ｖｄ１５）様々なグループにおける動物の免疫反応において同様の傾向が観察された。一般的に、第２の免疫化１５日後（Ｐ２Ｖｄ１５）に測定したＨＡＩ力価は、最初の免疫化１３日後に観察されたＨＡＩ力価よりもおよそ４〜５倍高かった。
【０１３２】
[0141]例示のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントのＰＨＡＤの免疫反応に対する投与量依存性を決定するために、陽性対照、及び実施例１において記載した方法（他の脂質と同時融解したＰＨＡＤを増大させたことを除いて）によって調製した５つの異なるＮＩＳＶ組成物を、６〜８週齢のＢＡＬＢ／Ｃメスマウスにおいて試験した（１試験グループあたり最低８動物）。６試験グループを以下の表５において概略する。マウスを、対照又は再水和した組成物５０μｌで、０日目に１回、及び１４日目に１回の２回筋肉内免疫化した。予め免疫化した試験グループ、並びに次いで第１及び第２の免疫化後の試験グループにおける全てのマウスから血清試料を採取し、実施例３に記載した通りＨＡＩアッセイを用いて分析した。
【０１３３】
【表５】
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【０１３４】
[0142]図５は、第２のワクチン接種１５日後に採取した血清試料を用いて、実施例３のＨＡＩ力価アッセイによって決定した、マウスにおける効力投与量反応を示す。図５において見られる通り、ＰＨＡＤ５μｇ（グループ５）は、投与量節約型ＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物の効力を、対照のアジュバント非添加及び非調合の投与量等価フルゾン（登録商標）（グループ１）の効力におよそ適合するまで増大し、より高投与量のＰＨＡＤ（１５μｇ及び５０μｇ）（それぞれグループ４及び３）は、効力を対照のおよそ３倍に増大した。図５Ａ及びＢは、例示のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントであるＰＨＡＤアジュバントは、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２の両方に対して投与量依存性の様式で効力を増大したことを示すものである。
【０１３５】
実施例４：凍結乾燥した免疫原性組成物の熱安定性試験
[0143]実施例１にしたがって調製した、凍結乾燥した免疫原性組成物（ＮＩＳＶ）の安定性を、３つの貯蔵温度条件（５℃±３℃、２５℃±２℃、及び４０℃±２℃）で最高６ヶ月間評価した。生物学的製剤の安定性の特徴をプロファイルする、安定性を指摘するアッセイ又はパラメーターは１つも存在しない。ＦＤＡによって規定される通り（ＦＤＡ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ．  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｔ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｏｒ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ）、生物学的製剤に対する安定性試験は、一般に、効力；水分含量（凍結乾燥の場合）、ｐＨ、無菌性、又は生物汚染度のコントロールを示す安定性である物理化学的測定値；発熱原性、及び全般的な安全性に対して試験しなければならない。その結果、数々のアッセイを用いた安定性を指摘するプロファイルは、生物学的製剤の同一性、純度、及び効力における変化を典型的に検出する保証を提供する。
【０１３６】
[0144]本明細書で用いられる「効力」の語は、その意図する効果を達成し、適切なｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの定量方法によって決定される生成物の特定の性能又は能力を意味する。ｉｎ  ｖｉｖｏのマウス効力アッセイを、長時間及び３つの異なる貯蔵温度で、貯蔵した組成物の効力を評価するのに用いた。以下の表６に示す通り、対照の組成物及び凍結乾燥組成物を様々な温度で最高６ヶ月間貯蔵し、その後これらを再水和し（凍結乾燥組成物の場合）、マウスにＩＭ投与した（実施例２に記載した通り）。次いで、免疫反応を、実施例３のＨＡＩアッセイを用いて決定した。
【０１３７】
【表６】
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【０１３８】
[0145]組成物を、外観（色及び乳白度）に対してやはり分析し、その後の再水和を粒子サイズ分布（ＰＳＤ）及びｐＨに対して分析した。再水和した試料のアリコートを、４℃で２０分間、２４０００ｒｐｍの超遠心機で遠心分離し、上清及びペレット分画を除去し、抽出し、ｓＥＬＩＳＡによって分析して抗原含量（「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力」とも記載する）を決定した。再水和した材料の安定性を、再水和後４〜６時間にわたって試験した。特定の時間点で、凍結乾燥組成物中の脂質を、ＨＰＬＣを用いて純度及び分解に対して分析した。凍結乾燥組成物中の水分含量を、カールフィッシャーアッセイを用いて評価した。安定性試験に用いた組成物は無菌ではなかった。しかし、調合方法は、脂質を＞１００℃に加熱し、無菌のフルゾン（登録商標）を含む無菌ろ過したバッファー溶液に溶融脂質を加えることを伴っていた。調合方法を、ラミナーフローフード中、及び凍結乾燥の間Ｔｙｖｅｋ滅菌バッグの使用、及び滅菌窒素を用いた戻し充填など、低微生物含量（生物汚染度）条件下で行った。生物汚染度は、試料をトリプトソイ寒天（ＴＳＡ）上に塗抹し、３０〜３５℃で３〜５日間インキュベートすることによって総好気性微生物数（１グラムあたりのＣＦＵ）として、並びに試料をサブロー寒天（ＳＤＡ）上に塗抹し、２０〜２５℃で５〜７日間インキュベートすることによって総真菌数（Ｔｏｔａｌ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｙｅａｓｔｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｄｓ  Ｃｏｕｎｔ）（１グラムあたりのＣＦＵ）として評価した。
【０１３９】
[0146]ＩＣＨ三極調和ガイドライン（ＩＣＨ  Ｈａｒｍｏｎｉｚｅｄ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ）：安定性試験ガイドライン（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）Ｑ１Ａ（Ｒ２）に概略される通り、全体的な勧告を、安定性試験を実施する間に続けた。提唱される安定性を指摘する試験を以下の表７に列挙するが、表中「月」はおよそ４週であり、Ｘは必要とされる試験を示し、Ｏは任意の試験を示す。
【０１４０】
【表７】
2013533259.tif 000009
【０１４１】
[0147]図６は、投与量節約型のアジュバント添加したＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ２：ＮＩＳＶ、ＴＬＲ−４アゴニストアジュバント）のマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ効力（第２のワクチン接種１５日後に採取した血清試料を用いて実施例３に記載した通りにアッセイしたＨＡＩ力価）対投与量節約型のアジュバント添加したフルゾン（登録商標）組成物（グループ３：ＮＩＳＶなし、ＴＬＲ−４アゴニストアジュバント）及び投与量等価のアジュバント非添加及び非調合のフルゾン（登録商標）対照（グループ１：ＮＩＳＶなし、ＴＬＲ−４アゴニストアジュバントなし）を示す。対照の組成物及び凍結乾燥組成物を４℃又は４０℃で６ヶ月間貯蔵した後、実施例２に記載した通りマウス中にＩＭ注射した。図６において分かる通り、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２に対するＨＡＩ力価は、投与量節約型のアジュバント添加したＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ２）は４℃又は４０℃で最高６ヶ月間貯蔵した場合に同等に強力であったが、投与量等価のアジュバント非添加の非調合のフルゾン（登録商標）対照（グループ１）及び投与量節約型のアジュバント添加したフルゾン（登録商標）組成物（グループ３）は両方とも、同じ６ヶ月の時間点にわたって４０℃対４℃で貯蔵した場合に効力を失ったことを実証している。
【０１４２】
[0148]図７は、投与量等価のアジュバント非添加のＮＩＳＶフルゾン組成物（グループ７：ＮＩＳＶ、ＴＬＲ−４アゴニストアジュバントなし）対投与量等価のアジュバント非添加及び非調合のフルゾン（登録商標）対照（グループ１：ＮＩＳＶなし、ＴＬＲ−４アゴニストアジュバントなし）に対するマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ効力を示す（第２のワクチン接種１５日後に採取した血清試料を用いて実施例３に記載した通りにアッセイしたＨＡＩ力価）。対照の組成物及び凍結乾燥組成物を４℃又は４０℃で６ヶ月間貯蔵した後、実施例２に記載した通りにマウス中にＩＭ投与した。図７において分かる通り、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２に対するＨＡＩ力価は、投与量等価のアジュバント非添加のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ７）は４℃又は４０℃で最高６ヶ月間貯蔵した場合に同等に強力であったが、投与量等価のアジュバント非添加及び非調合のフルゾン（登録商標）対照（グループ１）は同じ６ヶ月の時間点にわたって４０℃対４℃で貯蔵した場合に効力を失ったことを実証している。
【０１４３】
[0149]図８は、以下の組成物：（Ａ）投与量節約型のアジュバント添加ＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ２）、及び（Ｂ）投与量節約型のアジュバント添加フルゾン（登録商標）組成物（グループ３）に対する、様々な貯蔵期間（時間点Ｔ＝０、１、３、及び６ヶ月）並びに様々な温度（４℃、２５℃、及び４０℃）の後のｉｎ  ｖｉｔｒｏのＨＡ抗原含量を示す。ＨＡ抗原含量の値は、上記に記載した通りｓＥＬＩＳＡによって決定した。組成物を遠心分離し、ペレット及び上清中のＨＡ抗原の量を、示す通り別々に測定した。図８において分かる通り、結果は、フルゾン（登録商標）をＮＩＳＶと一緒に調合し、４０℃で最高６ヶ月貯蔵した場合、ＨＡ抗原含量の減少は最小であったが（グループ２、図８Ａ）、フルゾン（登録商標）をＮＩＳＶと一緒に調合せず、４０℃で貯蔵した場合にＨＡ含量は着実に減少した（グループ３、図８Ｂ）ことを実証している。
【０１４４】
[0150]外観：外観における最も顕著な時間依存性及び温度依存性の変化は凍結乾燥ケークの融解であり、これは凍結乾燥した非−ＮＩＳＶ含有対照組成物全てにおいて、４０℃での貯蔵後に観察され、２５℃の貯蔵後により低い程度で観察された。いかなる理論によっても拘束するつもりはないが、これらの非−ＮＩＳＶ凍結乾燥組成物において観察された凍結乾燥ケークの融解は、第２の乾燥の開始前にケークの乾燥が不完全であったことによるものではないと考えられた。凍結乾燥ケークは全て、凍結乾燥後は申し分なかったが、貯蔵時間にわたって温度を次第に上げると収縮し、液化した。
【０１４５】
[0151]残留水分：凍結乾燥ケーク中の残留水分を、カールフィッシャーアッセイを用いて決定し、水分重量パーセントによって表した。いかなる理論によっても拘束するつもりはないが、凍結乾燥ケークの残留水分含量は、組成物の安定性と反比例しうると考えられる。時間ゼロ（凍結乾燥直後）の、凍結乾燥したＮＩＳＶ−非含有組成物グループにおける合計残留水分は、凍結乾燥したＮＩＳＶ−含有組成物中の残留水分よりも高く、それぞれ残留水分約２〜４％対約１〜２％であることが観察された。一般的に、凍結乾燥の間にＮＩＳＶが存在すると、残留水分含量がより低い結果になる。凍結乾燥したＮＩＳＶ−含有組成物を高温（例えば、２５℃、４０℃）で長期間（例えば、最高６ヶ月）貯蔵した場合、残留水分における観察不可能な変化は極めて少ない〜存在しなかった（データは示さず）。
【０１４６】
[0152]粒子サイズ分布：凍結乾燥のＮＩＳＶ−含有組成物及び非ＮＩＳＶ−含有組成物の両方において、４０℃（及び２５℃ではずっと低い程度に）で、サイズ分布及び平均粒子サイズにおける明白な変化が存在した（データは示さず）。粒子サイズ分布及び平均粒子サイズにおけるこれらの変化は、あらゆるＮＩＳＶ−含有組成物に対して４℃では観察されなかった。
【０１４７】
[0153]ｐＨ：全ての組成物のｐＨは、４℃、２５℃、又は４０℃で貯蔵した場合、およそ同じであり、６ヶ月の試験の経過にわたって観察可能な傾向を示さなかった。
【０１４８】
実施例５：他のアジュバント及び抗原を有する凍結乾燥免疫原性組成物の熱安定性
[0154]本試験の目的は、様々なタイプのアジュバント及び抗原は、ＮＩＳＶと調合した場合に熱安定性であるか否かを決定することであった。これらの代替のアジュバント及び抗原を試験するために、様々な組成物（単数又は複数）の最適化（例えば、アジュバント濃度の最適化など）は完了しなかったことに留意されたい。
【０１４９】
[0155]様々なアジュバント：様々なアジュバントを有する非イオン性界面活性剤ベシクル（ＮＩＳＶ）組成物は全て、実施例１に記載した逆融解法によって調製した。詳しく述べると、各組成物に対して、モル比５：４：１の脂質（ＭＰＧ１４７．５９ｍｇ、ＣＨＯ１３８．２５ｍｇ、及びＤＣＰ４９．６６ｍｇ）をガラス製平底ビーカー中に配置した。ビーカーを固定し、覆い、１２０〜１２５℃に加熱した油浴中、ガラス棒を用いて時折かき混ぜながら脂質を融解した。実施例１に記載した通りに調製した濃縮リン酸バッファー（０．２２４ｍｌ）をラミナーフローフード中、フルゾン（登録商標）インフルエンザワクチン（２０１０〜２０１１季節性；Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）１１．６７ｍｌに加えた。緩衝した抗原保存液を３０〜３５℃、８０００ｒｐｍで均質化し、溶液を均質化しながら迅速に（結晶化を防ぐために）溶融脂質をビーカー中に移した。８０００ｒｐｍの均質化を３０〜３５℃で１０分間続けた。得られた脂質−抗原懸濁液を、３０〜３５℃、２２０±１０ｒｐｍで１〜２時間振盪した。等体積の４００ｍＭショ糖水溶液を各アジュバント（アジュバント３．５ｍｇ）と一緒に、各ＮＩＳＶ−抗原溶液に加え、３０〜３５℃、２２０±１０ｒｐｍで５分間振盪した。アリコートを採取し（０．５ｍｌ／バイアル）、終夜又はそれより長く−８０℃で凍結し、引き続き表２に概略する凍結乾燥サイクルにおける標的の凍結乾燥パラメーター及び様々な充填体積に対して表３に示す主な乾燥時間設定点にしたがって凍結乾燥した。
【０１５０】
[0156]凍結乾燥したアジュバント添加した組成物を４℃又は４０℃で３ヶ月間貯蔵し、次いでＷＦＩ０．７５ｍｌ中で再水和した後、実施例２に記載した通りマウス中にＩＭ注射した。再水和した組成物のｉｎ  ｖｉｖｏの効力を、第２のワクチン接種１５日後にワクチン接種したマウスから採取した血清試料においてアッセイした（Ｈ１Ｎ１に対するＨＡＩ力価を実施例３に記載した通りに測定した）。結果を以下の表８に示す。これらの結果は、投与量節約型のアジュバント添加したフルゾン（登録商標）組成物（グループ１及び２）は、アジュバントのタイプに関係なく４℃又は４０℃で最高３ヶ月間貯蔵した場合、等しく強力であることを実証するものである。これらの投与量節約型のアジュバント添加したＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ１及び２）の全体的な効力は、投与量等価のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ３）の全体的な効力よりも低かった。フラジェリン（ＴＬＲ−５アゴニストアジュバント）でも試験を行ったが、試験した投与量はマウスに対して毒性であった。
【０１５１】
【表８】
2013533259.tif 000010
【０１５２】
[0157]様々な抗原：様々なインフルエンザ抗原の非イオン性界面活性剤ベシクル（ＮＩＳＶ）組成物を、実施例１に記載した逆融解法によって調製した。詳しく述べると、各組成物に対して、モル比５：４：１の脂質（ＭＰＧ４０４ｍｇ、ＣＨＯ３７８ｍｇ、及びＤＣＰ１３４ｍｇ）をガラス製平底ビーカー中に配置した。ビーカーを固定し、覆い、１２０〜１２５℃に加熱した油浴中、ガラス棒を用いて時折かき混ぜながら脂質を融解した。実施例１に記載した通りに調製した濃縮リン酸バッファー（０．６１５ｍｌ）をラミナーフローフード中、フルゾン（登録商標）インフルエンザワクチン（２０１０〜２０１１季節性；Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）３２ｍｌ、フルビリン（登録商標）インフルエンザワクチン（２０１０〜２０１１季節性；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、又はフルラバル（登録商標）インフルエンザワクチン（２０１０〜２０１１季節性、ＧＳＫ）に加えた。フルゾン（登録商標）インフルエンザワクチン（２０１０〜２０１１季節性；Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）は、不活化３価インフルエンザ成分ワクチンであり、４５μｇ／０．５ｍｌの濃度のインフルエンザＨＡ抗原を含んでいる（各０．５ｍｌは、以下のインフルエンザウイルス株の各々からＨＡ抗原１５μｇを含んでいる：Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  Ｘ−１７９Ａ、Ｈ３Ｎ２、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９  Ｘ−１８７；及びＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８）。フルビリン（登録商標）インフルエンザワクチン（２０１０〜２０１１季節性；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）は、不活化３価インフルエンザ成分ワクチンであり、４５μｇ／０．５ｍｌの濃度のインフルエンザＨＡ抗原を含んでいる（各０．５ｍｌは、以下のインフルエンザウイルス株の各々からＨＡ抗原１５μｇを含んでいる：Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  Ｘ−１８１；Ｈ３Ｎ２、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９Ｘ−１８７；及びＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８）。フルラバル（登録商標）インフルエンザワクチン（２０１０〜２０１１季節性；ＧＳＫ）も、不活化３価インフルエンザ成分ワクチンであり、４５μｇ／０．５ｍｌの濃度のインフルエンザＨＡ抗原を含んでいる（各０．５ｍｌは、以下のインフルエンザウイルス株の各々からＨＡ抗原１５μｇを含んでいる：Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  Ｘ−１８１；Ｈ３Ｎ２、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９  Ｘ−１８７；及びＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８）。緩衝した抗原保存液を３０〜３５℃、８０００ｒｐｍで均質化し、溶液を均質化しながら迅速に（結晶化を防ぐために）溶融脂質をビーカー中に移し、この点で８０００ｒｐｍの均質化を３０〜３５℃で１０分間続けた。得られた脂質−抗原懸濁液を、３０〜３５℃、２２０±１０ｒｐｍで１〜２時間振盪した。等体積の４００ｍＭショ糖水溶液を各ＮＩＳＶ／抗原溶液の各々に加え、３０〜３５℃、２２０±１０ｒｐｍで５分間振盪した。アリコートを採取し（１．５ｍｌ／バイアル）終夜又はそれより長く−８０℃で凍結し、引き続き表２に概略する凍結乾燥サイクルにおける標的の凍結乾燥パラメーター及び様々な充填体積に対して表３に示す主な乾燥時間設定点にしたがって凍結乾燥した。
【０１５３】
[0158]組成物を４℃及び４０℃で３ヶ月間貯蔵し、次いでＷＦＩ０．７５ｍｌ中再水和した後、実施例２に記載した通りマウス中にＩＭ注射した。図９は、４℃又は４０℃で３ヶ月間貯蔵した後の組成物の「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力」を示す（ＨＡ抗原含量は、実施例４に記載した通り、ｓＥＬＩＳＡによって決定した）。結果は、インフルエンザ抗原（フルゾン（登録商標）、フルビリン（登録商標）、又はフルラバル（登録商標））をＮＩＳＶと調合した場合、４０℃で最高３ヶ月間貯蔵するとＨＡ抗原含量の減少は最小であったが、インフルエンザ抗原（フルゾン（登録商標）、フルビリン（登録商標）、又はフルラバル（登録商標））をＮＩＳＶと調合しなかった場合、ＨＡ抗原含量が着実に減少したことを実証している。
【０１５４】
実施例６：免疫原性組成物でのサルのインフルエンザ免疫化
[0159]非ヒト霊長動物モデルにおいて免疫原性を試験するために、最高６ヶ月間４℃、２５℃、及び４０℃のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏで熱安定性が実証された組成物を、アカゲザルにおいても試験した。サルに、（ａ）投与量等価量（１×標準のヒト単位投与量即ち４５μｇ）のアジュバント非添加及び非調合のフルゾン（登録商標）陽性対照、又は（ｂ）例示のＴＬＲ−４アゴニストアジュバントのＰＨＡＤ（５０μｇ）と、又はそれなしで、ＮＩＳＶと調合した、投与量節約型の量（１／３×標準のヒト単位投与量即ち１５μｇ）のフルゾン（登録商標）のいずれかの注射を２回（０、２８日）投与した。ＩＭ注射前及び後に（第２の注射後最大１０週間）血清試料を採取し、実施例３に記載した通りＨＡＩアッセイによって分析した。ＨＡＩアッセイをＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２に対して行い、Ｈ３Ｎ２に対するデータを、３治療グループに対して図１０に示す。図１０に示す通り、ＰＨＡＤでアジュバント添加した、又はアジュバント非添加いずれかの投与量節約型ＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物は、アカゲザルにおいて第２のＩＭ投与後最大１０週、アジュバント非添加及び非調合のフルゾン（登録商標）陽性対照に比べて優れた免疫原性を示した。
【０１５５】
実施例７：熱安定性における脂質：抗原比、脂質濃度、及び脂質含量の役割
[0160]熱安定性において脂質が果たす役割を試験するために、免疫原性組成物を、均質化及び再構成の間、様々な脂質：抗原比、単位投与量あたりの様々な脂質含量、及び様々な脂質濃度での逆融解法（実施例１に記載した通り）を用いて調合した。試験した様々な組成物を、以下の表９に記載する。この試験の目的は、４℃及び４０℃で貯蔵して３ヵ月後のフルゾン（登録商標）ＮＩＳＶ組成物の熱安定性を決定することであった。
【０１５６】
【表９】
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【０１５７】
[0161]ＮＩＳＶは以下の脂質からなっていた：１−モノパルミトイルグリセロール（ＭＰＧ、非イオン性界面活性剤）、コレステロール（ＣＨＯ、ステロイド）、及びジセチルホスフェート（ＤＣＰ、イオン性両親媒性物質）。モル比５：４：１の脂質を維持するために、表９に記載する量を量り分け、ガラス製平底ビーカー中に配置し、１２０℃〜１２５℃の加熱油浴中で実施例１に記載した通り、ガラス棒を用いて時折かき混ぜながら融解した。脂質を融解する間、表９に示す体積の濃縮リン酸バッファーを表９に示す通り好適な体積のフルゾン（登録商標）に加えた。次いで、緩衝した抗原保存液を３０〜３５℃、８０００ｒｐｍで均質化し、溶液を均質化しながら迅速に（結晶化を防ぐために）溶融脂質をビーカー中に移し、この点で８０００ｒｐｍの均質化を３０〜３５℃で１０分間続けた。得られたＮＩＳＶ−抗原懸濁液を、３０〜３５℃、２２０±１０ｒｐｍで１〜２時間振盪した。最後に、等体積の４００ｍＭショ糖水溶液をＮＩＳＶ−抗原溶液に加え、３０〜３５℃、２２０±１０ｒｐｍで５分間振盪した。アリコートを採取し（１ｍｌ／バイアル）終夜又はそれより長く−８０℃で凍結し、引き続き表２に概略する凍結乾燥サイクルにおける標的の凍結乾燥パラメーター及び様々な充填体積に対して以下の表３に示す主な乾燥時間設定点にしたがって凍結乾燥した。
【０１５８】
[0162]組成物（表１０に記載する）を最高３ヶ月４℃又は４０℃で貯蔵し、次いでマウスにＩＭ投与した（実施例２に記載した通り）。ワクチン接種したマウスにおける免疫反応を、実施例３に記載したＨＡＩアッセイを用いて決定した。Ｉｎ  ｖｉｖｏの効力の他に、凍結乾燥ケークの目視検査、ｓＥＬＩＳＡによる抗原含量の測定、及び凍結乾燥ケークの水分含量の測定を含めた、実施例４に記載したいくつかのさらなる安定性試験を組成物に対して行った。
【０１５９】
【表１０】
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【０１６０】
[0163]組成物中の残留水分を、カールフィッシャーアッセイを用いて決定し、水分重量パーセントとして表し、表１１に示す。脂質：抗原比の低いＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（３０：１及び１００：１）対脂質：抗原比の高いＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（３００：１）の残留水分を比較すると明白な違いが存在した。一般的に、脂質：抗原比の低いＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物は、脂質：抗原比の高いＮＩＳＶ組成物（３００：１−１．５３％又はそれ未満）よりも水分含量が高かった（３０：１−２．８７％及び１００：１−１．８１％）。本発明者らは、均質化の間、脂質濃度に応じた脂質：抗原比３００：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物中の残留水分における違いも観察した。このように、均質化の間、より低い脂質濃度で調製した組成物の残留水分含量は１．２１％〜１．５３％の範囲であったが（試験品３、４、６）、均質化の間より高い脂質濃度で調製した組成物の残留水分含量は低く、０．５４％〜０．６６％の範囲であった（試験品５及び７）。様々な脂質：抗原比及び脂質濃度はまた、凍結乾燥ケーク中の全脂質含量として表すこともできる。脂質含量に対してこの測定を用いることで、脂質含量と残留水分との間の相関が可能となり、脂質含量の低い凍結乾燥ケークの残留水分含量は高く、脂質含量の高い凍結乾燥ケークの残留水分含量は低い。凍結乾燥ケーク中の脂質含量をまた、Ｔ＝０、４℃でＴ＝３ヶ月、及び４０℃でＴ＝３ヵ月後のケークの外観と比べた。Ｔ＝０では、ＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物の凍結乾燥ケークは全て、脂質含量に関係なく、白色の外観で、形成は良好で、マイクロコラプスがなかった。４℃でＴ＝３ヶ月にＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物の凍結乾燥ケーク全てに対しても、同様の観察がなされた。しかし、４０℃でＴ＝３ヶ月では、ＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物の凍結乾燥ケークの全てはインタクトではないようであり、脂質含量の低い２つの凍結乾燥ケーク、即ち、試験品１（１．３５ｍｇ）及び試験品２（４．５ｍｇ）はコラプスし、メルトバック（ｍｅｌｔｅｄ  ｂａｃｋ）していると考えられたが、脂質含量の高い凍結乾燥ケークの全て、即ち、試験品３〜７（６．７５ｍｇ以上）は、この高温で３ヶ月間貯蔵した後でも、依然としてインタクトと考えられた。均質化の間の脂質濃度を脂質含量の代わりに用いた場合に、同じ相関が観察された：試験品１（２．７ｍｇ／ｍｌ）及び試験品２（９ｍｇ／ｍｌ）を、試験品３〜７（１３．５ｍｇ／ｍｌ以上）と比べられたい。
【０１６１】
【表１１】
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【０１６２】
[0164]図１１は、非調合の市販のフルゾン（登録商標）（試験品８）対脂質：抗原比３００：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（試験品３）、脂質：抗原比１００：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（試験品２）、及び脂質：抗原比３０：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（試験品１）に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏのＨＡ抗原含量を示す。再水和した組成物のアリコートを、４℃で２０分間、２４０００ｒｐｍの超遠心機で遠心分離し、上清及びペレット分画を除去し、抽出し、実施例４に記載した通り、ｓＥＬＩＳＡによって分析して抗原含量（又は「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力」）を決定した。抗原含量を、Ｔ＝０、及び４０℃で３ヶ月間貯蔵後（４０℃でＴ＝３ヶ月）、４つの組成物に対して決定した。非調合のフルゾン（登録商標）対照（試験品８）及び脂質：抗原比が最小の（３０：１）ＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（試験品１）の両方に対して、ＨＡ抗原含量の著しい減少が、ｓＥＬＩＳＡによって４０℃で３ヶ月間貯蔵後に検出された。４０℃で３ヶ月間貯蔵後、市販のフルゾン（登録商標）に対してオリジナルのＨＡ含量の７０％が残存し、脂質：抗原比が最小の（３０：１）ＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（試験品１）に対してオリジナルのＨＡ含量の４０％だけが残存した。これとは対照的に、脂質：抗原比が高い（１００：１及び３００：１）ＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物は、４０℃で３ヶ月間貯蔵しても、長時間でＨＡ抗原含量の減少を殆んど示さなかった。
【０１６３】
[0165]図１２は、表１０に記載したＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物全て（グループ１〜７）対非調合のフルゾン（登録商標）対照（グループ８）に対する、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの効力を示す（ＨＡＩ力価は、第２のワクチン接種１５日後に採取した血清試料を用いて実施例３に記載した通りにアッセイした）。示した結果は、（Ａ）Ｈ１Ｎ１及び（Ｂ）Ｈ３Ｎ２に対するものであり、ＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物及び非調合のフルゾン（登録商標）対照は全て、Ｔ＝０では概ね効力が同じであったことを実証している（Ｈ１Ｎ１に対するＨＡＩ力価の平均−１８９．９；Ｈ３Ｎ２に対するＨＡＩ力価の平均−１７７．５）。
【０１６４】
[0166]図１３は、非調合のフルゾン（登録商標）対照（グループ８）対脂質：抗原比３００：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ３）、脂質：抗原比１００：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ２）、及び脂質：抗原比３０：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ１）に対する、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの効力を示す（ＨＡＩ力価は、第２のワクチン接種１５日後に採取した血清試料を用いて実施例３に記載した通りにアッセイした）。全ての組成物を４℃又は４０℃で３ヶ月間貯蔵した後、マウス中にＩＭ注射した。示した結果は、（Ａ）Ｈ１Ｎ１及び（Ｂ）Ｈ３Ｎ２に対するものであり、脂質：抗原比３００：１及び１００：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ２及び３）は、４℃又は４０℃で最高３ヶ月間貯蔵した場合等しく強力であったが、非調合のフルゾン（登録商標）対照（グループ８）及び脂質：抗原比３０：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ１）は同じ３ヶ月の期間にわたって４０℃で貯蔵した場合効力を失ったことを実証している。
【０１６５】
[0167]図１３はまた、均質化及び再構成の間、脂質濃度低範囲（グループ４）、脂質濃度中範囲（グループ３）、及び脂質濃度高範囲（グループ５）の異なる３つの脂質濃度での脂質：抗原比３００：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物に対する、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの効力を示す（ＨＡＩ力価は、第２のワクチン接種１５日後に採取した血清試料を用いて実施例３に記載した通りにアッセイした）。全ての組成物を４℃又は４０℃で３ヶ月間貯蔵した後、マウス中にＩＭ注射した。示した結果は、（Ａ）Ｈ１Ｎ１及び（Ｂ）Ｈ３Ｎ２に対するものであり、ＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物の中範囲及び高範囲（グループ３及び５）は、４℃又は４０℃で最高３ヶ月間貯蔵した場合等しく強力であったが、脂質濃度低範囲のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ４）は同じ３ヶ月の期間にわたって４０℃で貯蔵した場合効力の最小の減少を示したことを実証している。脂質濃度低範囲の脂質：抗原比３００：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（均質化の間、脂質濃度１３．５ｍｇ／ｍｌ）は、脂質：抗原比３０：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（均質化の間、脂質濃度２．７ｍｇ／ｍｌ）ほど脂質濃度は低くなかった。
【０１６６】
[0168]図１３はまた、均質化の間異なる３つの脂質濃度、及び再構成時同じ脂質濃度での、脂質濃度低範囲（グループ６）、脂質濃度中範囲（グループ３）、及び脂質濃度高範囲（グループ７）の脂質：抗原比３００：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物に対する、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの効力を示す（ＨＡＩ力価は、第２のワクチン接種１５日後に採取した血清試料を用いて実施例３に記載した通りにアッセイした）。全ての組成物を４℃又は４０℃で３ヶ月間貯蔵した後、マウス中にＩＭ注射した。示した結果は、（Ａ）Ｈ１Ｎ１及び（Ｂ）Ｈ３Ｎ２に対するものであり、中範囲及び高範囲のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ３及び７）は、４℃又は４０℃で最高３ヶ月間貯蔵した場合等しく強力であったが、脂質濃度低範囲のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（グループ６）は同じ３ヶ月の期間にわたって４０℃で貯蔵した場合、効力の最小の減少を示したことを実証している。脂質濃度低範囲の脂質：抗原比３００：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（均質化の間、脂質濃度１３．５ｍｇ／ｍｌ）は、脂質：抗原３０：１のＮＩＳＶフルゾン（登録商標）組成物（均質化の間、脂質濃度２．７ｍｇ／ｍｌ）ほど脂質濃度は低くなかった。
【０１６７】
他の実施形態
[0169]本開示の他の実施形態は、当業者であれば、本明細書を考慮して、又は本明細書に開示する開示を実践すれば明らかであろう。本明細書及び実施例は例示にすぎないとみなされるものとされ、本開示の真の範囲は以下の特許請求の範囲によって指摘される。本明細書に言及されるあらゆる参考文献の内容は、その全文が参照によって本明細書に組み込まれる。
【関連出願の相互参照】
【０１６８】
[0001]本出願は、各々の全文が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１０年７月６日出願の米国特許仮出願第６１／３６１，８９８号、及び２０１１年１月１０日出願の米国特許仮出願第６１／４３１，２１８号の優先権を主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【国際調査報告】
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