(57)【要約】  本発明による標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物は、前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列が含まれた少なくとも一つの鋳型にそれぞれ特異的な少なくとも一つのプライマーを含む第１プライマー群と、前記第１プライマー群のプライマーのうち共通の塩基配列が最も多いプライマー一つを選定し、それを基準に設計された少なくとも一つのプライマーであって、前記鋳型に特異的に結合するか３’末端の近くで１〜２個の塩基配列又は連続的に３つまでの塩基配列が前記鋳型とミスマッチングされながら相補的に結合する少なくとも一つのプライマーを含む第２プライマー群と、を含む。  【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物において、
前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列が含まれた少なくとも一つの鋳型にそれぞれ特異的な少なくとも一つのプライマーを含む第１プライマー群と、
前記第１プライマー群のプライマーのうち共通の塩基配列が最も多いプライマー一つを選定し、それを基準に設計された少なくとも一つのプライマーであって、前記鋳型に特異的に結合するか３’末端の近くで１〜２個の塩基配列又は連続的に３つまでの塩基配列が前記鋳型とミスマッチングされながら相補的に結合する少なくとも一つのプライマーを含む第２プライマー群と、を含む標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物。
【請求項２】
前記第１プライマー群は前記鋳型の増幅反応初期に全て消尽されるように増幅反応物に低濃度で提供され、前記第２プライマー群は前記第１プライマー群による増幅産物を鋳型にして最終増幅産物が生成されるように前記増幅反応物に高濃度で提供されることを特徴とする請求項１に記載の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物。
【請求項３】
前記最終増幅産物は、前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するように増幅されることを特徴とする請求項２に記載の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物。
【請求項４】
前記標的遺伝子がＨＰＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号６、配列番号８乃至配列番号１０で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号５及び配列番号７で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項１に記載の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物。
【請求項５】
前記標的遺伝子がＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号２５及び配列番号２６で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号２３及び配列番号２４で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項１に記載の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物。
【請求項６】
前記標的遺伝子がＨＢＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号４２乃至配列番号４８で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号４０及び配列番号４１で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項１に記載の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物。
【請求項７】
前記第２プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで増幅反応物に提供されることを特徴とする請求項１乃至請求項６のうちいずれか一項に記載の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物。
【請求項８】
標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物を含むＰＣＲ増幅キットにおいて、
前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列が含まれた少なくとも一つの鋳型にそれぞれ特異的な少なくとも一つのプライマーを含む第１プライマー群と、
前記第１プライマー群のプライマーのうち共通の塩基配列が最も多いプライマー一つを選定し、それを基準に設計された少なくとも一つのプライマーであって、前記鋳型に特異的に結合するか３’末端の近くで１〜２個の塩基配列又は連続的に３つまでの塩基配列が前記鋳型とミスマッチングされながら相補的に結合する少なくとも一つのプライマーを含む第２プライマー群と、
ポリヌクレオチド鋳型と、ＤＮＡ重合酵素と、ｄＮＴＰｓと、緩衝溶液と、を含むＰＣＲ増幅キット。
【請求項９】
前記第１プライマー群は前記鋳型の増幅反応初期に全て消尽されるように増幅反応物に低濃度で提供され、前記第２プライマー群は前記第１プライマー群による増幅産物を鋳型にして最終増幅産物が生成されるように前記増幅反応物に高濃度で提供されることを特徴とする請求項８に記載のＰＣＲ増幅キット。
【請求項１０】
前記最終増幅産物は、前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するように増幅されることを特徴とする請求項９に記載のＰＣＲ増幅キット。
【請求項１１】
前記標的遺伝子がＨＰＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号６、配列番号８乃至配列番号１０で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号５及び配列番号７で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項８に記載のＰＣＲ増幅キット。
【請求項１２】
前記標的遺伝子がＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号２５及び配列番号２６で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号２３及び配列番号２４で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項８に記載のＰＣＲ増幅キット。
【請求項１３】
前記標的遺伝子がＨＢＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号４２乃至配列番号４８で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号４０及び配列番号４１で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項８に記載のＰＣＲ増幅キット。
【請求項１４】
前記第２プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで増幅反応物に提供されることを特徴とする請求項８乃至請求項１３のうちいずれか一項に記載のＰＣＲ増幅キット。
【請求項１５】
標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物を利用した標的遺伝子増幅方法において、
（ａ）前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列が含まれた少なくとも一つの鋳型にそれぞれ特異的な少なくとも一つのプライマーを含む第１プライマー群を準備する段階と、
（ｂ）前記第１プライマー群のプライマーのうち共通の塩基配列が最も多いプライマー一つを選定し、それを基準に設計された少なくとも一つのプライマーであって、前記鋳型に特異的に結合するか３’末端の近くで１〜２個の塩基配列又は連続的に３つまでの塩基配列が前記鋳型とミスマッチングされながら相補的に結合する少なくとも一つのプライマーを含む第２プライマー群を準備する段階と、
（ｃ）ポリヌクレオチド鋳型と、ＤＮＡ重合酵素と、ｄＮＴＰｓと、緩衝溶液と、を含む増幅反応物に前記第１プライマー群の少なくとも一つのプライマーと前記第２プライマー群の少なくとも一つのプライマーを添加してＰＣＲ増幅反応を行う段階と、
（ｄ）前記ＰＣＲ増幅反応過程の初期に前記鋳型に相補的な前記第１プライマー群の少なくとも一つのプライマーが結合して増幅反応が行われ、前記第１プライマー群のプライマーが全て消尽される段階と、
（ｅ）前記第１プライマー群の少なくとも一つのプライマーによって増幅された増幅産物を鋳型にして前記第２プライマー群の少なくとも一つのプライマーによって増幅反応を追加に行う段階と、
（ｆ）前記遺伝子型分析可能配列を含み、前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するように増幅された最終増幅産物を収得する段階と、を含む標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物を利用した標的遺伝子増幅方法。
【請求項１６】
前記（ｃ）段階において、前記第１プライマー群は前記増幅反応物に低濃度で添加され、前記第２プライマー群は前記第１プライマー群に比べ高濃度で添加されることを特徴とする請求項１５に記載の標的遺伝子増幅方法。
【請求項１７】
前記（ｃ）段階において、前記増幅反応物に添加される前記第１プライマー群のプライマーの濃度は、前記第２プライマー群のプライマーの濃度の１／２〜１／２０であることを特徴とする請求項１６に記載の標的遺伝子増幅方法。
【請求項１８】
前記（ｃ）段階において、前記増幅反応物に添加される前記第１プライマー群のプライマーの濃度は、前記第２プライマー群のプライマーの濃度の１／８〜１／１６であることを特徴とする請求項１７に記載の標的遺伝子増幅方法。
【請求項１９】
前記標的遺伝子がＨＰＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号６、配列番号８乃至配列番号１０で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号５及び配列番号７で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項１５に記載の標的遺伝子増幅方法。
【請求項２０】
前記標的遺伝子がＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号２５及び配列番号２６で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号２３及び配列番号２４で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項１５に記載の標的遺伝子増幅方法。
【請求項２１】
前記標的遺伝子がＨＢＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号４２乃至配列番号４８で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号４０及び配列番号４１で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項１５に記載の標的遺伝子増幅方法。
【請求項２２】
前記第２プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで前記増幅反応物に添加されることを特徴とする請求項１５乃至請求項２１のうちいずれか一項に記載の標的遺伝子増幅方法。
【請求項２３】
標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物を利用した標的遺伝子の遺伝子型分析方法において、
（ａ）請求項１５乃至請求項２１のうちいずれか一項に定義された標的遺伝子増幅方法によって前記標的遺伝子を増幅する段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階によって増幅された、前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列を含み、前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するポリヌクレオチドを制限酵素で切断し、切断した後の断片の塩基配列が制限された範囲内であると共に変異位置塩基を含む２つ以上の一本鎖のポリヌクレオチド断片を生成する段階と、
（ｃ）前記切断された断片の分子量を測定する段階と、を含む標的遺伝子の遺伝子型分析方法。
【請求項２４】
前記制限酵素で切断した後の断片は変異位置塩基を含み、前記断片の塩基の数は２つ乃至３２個であることを特徴とする請求項２３に記載の標的遺伝子の遺伝子型分析方法。
【請求項２５】
前記（ａ）段階で増幅される前記標的遺伝子がＨＰＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号６、配列番号８乃至配列番号１０で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、第２プライマー群のプライマーは配列番号５及び配列番号７で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項２３に記載の標的遺伝子の遺伝子型分析方法。
【請求項２６】
前記（ａ）段階で増幅される前記標的遺伝子がＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号２５及び配列番号２６で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、第２プライマー群のプライマーは配列番号２３及び配列番号２４で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項２３に記載の標的遺伝子の遺伝子型分析方法。
【請求項２７】
前記（ａ）段階で増幅される前記標的遺伝子がＨＢＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号４２乃至配列番号４８で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、第２プライマー群のプライマーは配列番号４０及び配列番号４１で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項２３に記載の標的遺伝子の遺伝子型分析方法。
【請求項２８】
前記（ａ）段階で増幅される前記標的遺伝子を増幅するための前記第２プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで提供されることを特徴とする請求項２３に記載の標的遺伝子の遺伝子型分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物、それを利用した標的遺伝子増幅方法及びそれを含むＰＣＲ増幅キット、そしてそれを利用した標的遺伝子の遺伝子型分析方法に関するものであり、更に詳しくは、標的遺伝子の多数の変異が存在する遺伝子領域を簡便で効率的にもれなく正確に増幅することができ、多数の遺伝子型を特異度と敏感度を満足しながら精密に分析することができるプライマー組成物、それを利用した標的遺伝子増幅方法及びそれを含むＰＣＲ増幅キット、そしてそれを利用した標的遺伝子の遺伝子型分析方法に関するものである。
【０００２】
また、本発明は標的遺伝子の多数の変異が存在する遺伝子領域を増幅する際、分析しようとする遺伝子配列、即ち、「遺伝子型分析可能配列」を除いては同じ遺伝子配列を有する増幅産物を生成し、制限酵素断片質量多形性法による遺伝子型分析の際現れる質量分析ピークの数字を減らして遺伝子型分析を容易にするプライマー組成物、それを利用した標的遺伝子増幅方法及びそれを含むＰＣＲ増幅キット、そしてそれを利用した標的遺伝子の遺伝子型分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
生命体の遺伝子型の分析は、疾病に対する危険度、診断、予診又は治療方法の提示などに関して広範囲に使用されている。例えば、特定人の特定遺伝子に対する変異分析を介し、疾病に対する危険度がどの程度であるかを予測して疾病を事前に予防するように誘導することができる。また、生命体に感染を起こす他の感染体、例えば、ウィルスなどの遺伝子変異分析を介して該当ウィルスが特定治療薬物に対して耐性を有するのか否かを分析することができ、このような遺伝子型分析を介して感染体の特定治療薬物に対する反応、例えば、耐性反応を予測することで患者個人に合わせた治療方法を開発することができる。
【０００４】
ヒトのゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）マップが完成されて疾病に対する危険度の測定、疾病の診断又は予診、そして薬物に対する反応の予測をより広範囲に行うことができる可能性が提示され、遺伝子型分析方法に対する関心が更に高まっている。しかし、ヒトをはじめとする生命体の遺伝子変異と疾病との関係を明確に究明するためには多数の塩基配列情報を分析しなければならないだけでなく、多様で多数の配列の変異を特異度と敏感度を全て満足しながら正確で効果的に分析することができなければならない。
【０００５】
塩基配列又は塩基の変異を分析するためには様々な方法があるが、この全ての方法を使用する前に基本的に多量の遺伝子試料を収得しなければならない。現在、研究者が遺伝子試料を収得するために最も普遍的に使用している方法は、ＤＮＡ重合酵素を利用した重合酵素連鎖反応方法（以下、「ＰＣＲ」と称する）である。前記方法は、鋳型と結合することができるプライマーを設計して遺伝子の望みの部位のみを増幅させることができる。遺伝子から増幅しようとする領域を決定し、決定した部位の３’末端の塩基配列と相補的に結合することができる塩基配列を決定し、プライマーを設計する。
【０００６】
しかし、遺伝子型分析のために選定された標的遺伝子の変異が多く存在する遺伝子領域ではプライマーの設計が容易ではない。即ち、ＰＣＲを行うためのプライマーを合成する際には細心な注意と時間が要求され、プライマーの非特異的なハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）による偽陽性産物が生成される問題点がある。特に、標的遺伝子の遺伝子型が数個存在するのではなく数十個乃至１００個以上存在する場合には、標的遺伝子の多数の変異が存在する遺伝子領域を全て正確に増幅させて遺伝子型を特異度と敏感度を全て満足しながら分析することが非常に難しい。例えば、ヒトパピローマウィルス（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ：ＨＰＶ、以下、ＨＰＶと称する）は８０個以上の変種が知られており、亜型まで含むと概ね１２０個にまで至る。
【０００７】
このように、標的遺伝子の遺伝子型が数十個以上存在する場合、標的遺伝子の多数の変異が存在する遺伝子領域に対して精密に多数個のプライマーを設計することが難しいだけでなく、特定変異を有する遺伝子領域に対しては増幅が行われないため該当遺伝子型を陰性に判定するようになる偽陰性の問題が発生するか、使用されるプライマーの種類が多くなるにつれ、上述したようなプライマーの非特異的なハイブリダイゼーションによる偽陽性問題が更に深刻になる。即ち、標的遺伝子の遺伝子型が数十個以上存在する場合、標的遺伝子の多数の変異が存在する遺伝子領域を精密に増幅する多数個のプライマーの設計は、敏感度と特異度の観点から互いにトレードオフ（ｔｒａｄｅ  ｏｆｆ）関係にあるため、敏感度と特異度を全て満足するプライマーを提供することが難しいのが現実である。
【０００８】
これに関して、一般に変異が多く存在する遺伝子領域を増幅する際使用する方法としては、混合塩基（ｍｉｘｅｄ  ｂａｓｅ）が含まれたプライマーを設計するか多数個のプライマーを設計して混合する方法がある。
【０００９】
まず、混合塩基（ｍｉｘｅｄ  ｂａｓｅ）が含まれたプライマーは、以下のように分析対象となるＡ型遺伝子及びＢ型遺伝子があると仮定すると、３番目の塩基はアデニン（Ａ）やサイトシン（Ｃ）、そして１５番目の塩基はグアニン（Ｇ）やアデニン（Ａ）に当たる混合塩基を利用して設計したものである。
【００１０】
Ａ型遺伝子：５’−ｇｇＡ  ｔｔｃ  ｇｇｇ  ｃｃｃ  ｇａＧ  ｔｃｔ−３’
Ｂ型遺伝子：５’−ｇｇＣ  ｔｔｃ  ｇｇｇ  ｃｃｃ  ｇａＡ  ｔｃｔ−３’
即ち、Ａ型遺伝子及びＢ型遺伝子に対しては、以下のような配列を有するプライマーを設計することができる。
【００１１】
５’−ｇｇＭ  ｔｔｃ  ｇｇｇ  ｃｃｃ  ｇａＲ  ｔｃｔ−３’（Ｒ＝Ａ／Ｇ，Ｍ＝Ａ／Ｃと約束して表記する）
しかし、混合塩基（ｍｉｘｅｄ  ｂａｓｅ）を多く使用するとプライマーのＴｍ値が高くなるだけでなく、鋳型の配列とは異なる塩基が合成される可能性があるため一つの鋳型から混合塩基を使用した分だけ塩基配列が異なる多数個の生成物が増幅される問題が発生する。従って、上述したＰＣＲ増幅産物の偽陽性問題を根本的に解決することができない。
【００１２】
また、他の方法としては、Ａ型遺伝子に特異的なプライマーＡとＢ型遺伝子に特異的なプライマーＢをそれぞれ設計して混合する方法であって、Ａ型遺伝子にはプライマーＡが結合し、Ｂ型遺伝子にはプライマーＢが結合してＰＣＲ増幅産物を生成する方法がある。この方法は標的遺伝子の遺伝子変異が数個である場合には有効であるが、標的遺伝子の遺伝子変異が数十個以上存在する場合、標的遺伝子の多数の変異が存在する遺伝子領域増幅の際、偽陽性問題が発生する。即ち、極端に例えば、上述した例においてＡ型遺伝子にはプライマーＡが結合し、Ｂ型遺伝子にはプライマーＢが結合して増幅されると予測したが、一つの鋳型に対してプライマーＡ及びプライマーＢによる生成物が全て増幅される場合が発生し得る。これは、初期微量の鋳型の濃度では特異的なプライマーのみが鋳型と結合することができるが、一定濃度の生成物が増幅された後には非特異的なプライマーも増幅された生成物と結合することができ、結局一つの鋳型に対して多数個のプライマーを混合せざるを得ないため塩基配列が異なる多数個の生成物が増幅される問題が発生する。
【００１３】
従って、塩基配列を分析するために先行されるＰＣＲにおいて、変異が多く存在する遺伝子領域を増幅する際、混合塩基を利用したプライマーを利用するか、多数個の特異的なプライマーを同じ濃度で混合するなどの方法を利用する場合、鋳型に非特異的なプライマーによる複製によって鋳型の正確な塩基配列の分析が不可能となる。即ち、標的遺伝子の多数の変異が存在する遺伝子領域を増幅する際には、それぞれの遺伝子型に対して１：１対応関係にプライマーを設計しては特異度と敏感度を全て満足するプライマーの設計が難しく、一方、使用されるプライマーの種類を最小化すると偽陽性率の問題はある程度解決することはできるが、特定変異に対しては増幅することができない敏感度低下の問題が必然的に発生するのである。
【００１４】
一方、一つの鋳型から配列が異なる多数個の生成物が増幅されると、  以降、塩基配列を分析する際、間違った結果をもたらす恐れがある。例えば、  ＰＣＲ−ＳＳＣＰ方法（非特許文献１）は分析しようとする塩基を含む配列を増幅した後、それぞれのチェーンに分離してから、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行う。この際、１つの塩基差によってＤＮＡチェーンの２次構造が異なるため、この差に起因した電気泳動移の移動速度の差に応じて塩基変異の有無を調査する方法である。即ち、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ方法では分析しようとする塩基のみが鋳型によって複製されて残りの配列は全て同じでなければ正確な塩基変異の調査は不可能であるが、配列が異なる多数個の生成物が増幅されると間違った結果を引き起こす恐れがある。
【００１５】
また、本出願人は遺伝子変異検出方法を改善したいわゆる「制限酵素断片質量多形性法（ＲＦＭＰ方法）」という新たな遺伝子型検査方法を開発したことがあるが、その例が特許文献１と特許文献２に開示されている。ＲＦＭＰ方法は分析しようとする塩基を含む配列を増幅した後、制限酵素で切断してその断片の分子量を測定する遺伝子型分析方法であるが、もし配列が異なる多数個の生成物が増幅されると一つの鋳型から多数個の分子量が測定される問題が発生する。また、ＲＦＭＰ方法は分析対象となる遺伝子領域の増幅された産物に対する断片の分子量を分析して遺伝子型を分析する方法であるため、質量分析グラフに多くの分子量ピークが存在すると分析が複雑で難しくなる。よって、ＲＦＭＰ方法を介して遺伝子型を分析する場合には、標的遺伝子の多数の変異が存在する遺伝子領域を増幅する際、それぞれの遺伝子型に対して１：１対応関係でプライマーを多数個製作して混合すると質量分析ピークが多くなって分析が難しくなり、分析エラーが発生する可能性が高くなる。
【００１６】
従って、本発明が属した技術分野では、標的遺伝子の多数の変異が存在する遺伝子領域を簡便で効率的にもれなく精密に増幅するプライマーとして、互いにトレードオフ（ｔｒａｄｅ  ｏｆｆ）関係である敏感度と特異度を全て満足するプライマーを提供する技術の提供が切実に要求されているといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】韓国登録特許  第１０−０４７７７６６号
【特許文献２】韓国登録特許  第１０−０６４２８２９号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｏｒｉｔａ，Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９８９，５：８８７４−８８７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は上述した問題点を解決するために、標的遺伝子の多数の変異が存在する遺伝子領域を簡便で効率的にもれなく正確に増幅することができ、多数の遺伝子型を特異度と敏感度を満足しながら精密に分析することができるプライマー組成物、それを利用した標的遺伝子増幅方法及びそれを含むＰＣＲ増幅キット、そしてそれを利用した標的遺伝子の遺伝子型分析方法を提供することにその目的がある。
【００２０】
詳しくは、本発明は分析しようとする遺伝子配列領域の周辺塩基配列に変異が多く存在する場合、それぞれの特異的なプライマーを設計し混合して利用するが、分析しようとする遺伝子配列（以下、「遺伝子型分析可能配列」と称する）を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するように増幅することで遺伝子変異が多様な塩基配列部分におけるＰＣＲを可能にすると共に正確な塩基配列又は塩基変異分析を可能にするプライマー組成物、それを利用した標的遺伝子増幅方法及びそれを含むＰＣＲ増幅キット、そしてそれを利用した標的遺伝子の遺伝子型分析方法を提供するのにその目的がある。
【００２１】
追加に、本発明は標的遺伝子の多数の変異が存在する遺伝子領域を増幅する際、分析しようとする遺伝子配列、即ち、「遺伝子型分析可能配列」を除いては同じ遺伝子配列を有する増幅産物を生成し、制限酵素断片質量多形性法による遺伝子型分析の際現れる質量分析ピークの数字を減らして遺伝子型分析を容易にするプライマー組成物、それを利用した標的遺伝子増幅方法及びそれを含むＰＣＲ増幅キット、そしてそれを利用した標的遺伝子の遺伝子型分析方法を提供することにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上述した技術的課題を解決し、上述した発明の目的に符合するように鋭意研究を重ねた結果、本発明者は標的遺伝子の多数の変異が存在する遺伝子領域を増幅する際には、それぞれの遺伝子型に対して１：１対応関係にプライマーを設計しては特異度と敏感度を全て満足するプライマーの製作が難しいため、使用されるプライマーの種類を最小化し、鋳型で塩基配列分析領域を除いた残りの配列は全て同じ配列を有するように増幅される場合、正確な塩基配列の分析が可能であるという点に着眼して本発明を完成するに至った。
【００２３】
一方、本発明の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物は下記本発明の実施例で一例として説明する制限酵素断片質量多形性法にだけ適用可能な技術ではなく、ＰＣＲ増幅産物を利用して遺伝子型を分析する多様な技術、例えば、マイクロアレイチップのような遺伝子型分析技術に適用することができる基盤技術として理解されなければならない。
【００２４】
まず、本発明の明細書で使用される用語を説明すると以下のようである。
【００２５】
本発明の明細書で使用される「制限酵素断片質量多形性法（以下、「ＲＦＭＰ方法」と称する）」とは、分析対象の遺伝子をＰＣＲを介して増幅させた後、変異が位置した塩基配列部位を認識する制限酵素を利用して切断すると塩基の変異有無に応じて切断された遺伝子断片の質量が異なるようになるが、このような切断された遺伝子断片の質量差を測定して遺伝子型を分析する方法を意味する（特許文献１と特許文献２を参照）。
【００２６】
また、本発明の明細書で使用される「制限酵素認識配列」という用語は、上述した「ＲＦＭＰ方法」を行う際、互いに異なる制限酵素によって同時に又は隣接して認識される配列であって、切断される配列と一致しなくてもよい配列を意味する。詳しくは、後述する本発明の実施例で一例として使用された制限酵素ＦｏｋＩとＢｔｓＣＩは全てＧＧＡＴＧ配列を認識するが、切断される位置は認識配列の３’末端からそれぞれ９番目／１３番目と２番目／０番目塩基の次である。一方、制限酵素認識配列を認識する本発明で使用され得る２つの制限酵素は、本発明の目的に使用され得る全ての制限酵素、即ち、互いに同じ最適温度又は互いに異なる最適温度を有する制限酵素であることが好ましく、その中でも互いに異なる最適温度を有するものがより好ましい。相対的に低い最適温度を有する制限酵素としては、例えば、ＦｏｋＩ，ＢｂｖＩ，ＢｓｇＩ，ＢｃｇＩ，ＢｐｍＩ，ＢｓｅＲＩ，Ｍｍｅ１Ｉ，ＡｖａＩＩ又はＢａｅＩなどがあり、相対的に高い最適温度を有する制限酵素としては、例えば、ＢｔｓＣＩ，ＢｓｔＦ５Ｉ，ＴａｑＩ，ＢｓａＢＩ，ＢｔｒＩ，ＢｓｔＡＰＩ，ＦａｕＩ，Ｂｃ１Ｉ，ＰｃｉＩ又はＡｐｏＩなどがある（特許文献１と特許文献２を参照）。
【００２７】
また、本発明の詳細な説明全般で使用される「トリガープライマー（Ｔｒｉｇｇｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ，ＴＰ；第１プライマー群とも称する）」という用語は、標的遺伝子の遺伝子型分析可能配列が含まれた鋳型にそれぞれ特異的なプライマーであり、ＰＣＲ反応初期に全て消尽されるようにプライマーの濃度をＰＣＲ反応物に低濃度で混合するプライマーを意味する。
【００２８】
また、本発明の詳細な説明全般で使用される「増幅プライマー（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｍｅｒ，ＡＰ；第２プライマー群とも称する）」という用語は、標的遺伝子の遺伝子塩基配列を整列して遺伝子型分析可能配列を決定し、プライマー結合部分を選択して準備されたプライマーであり、特定鋳型と特異的に結合するか３’末端の近くで好ましくは１〜２個の塩基配列、連続的に３つまでの塩基配列が多様な鋳型とミスマッチングを許容しながら相補的に結合するように設計され、前記トリガープライマーによるＰＣＲ増幅産物を鋳型としてＰＣＲ最終増幅産物が生成されるようにプライマーの濃度をＰＣＲ反応物に高濃度で混合するプライマーを意味する。通常は多数の標的遺伝子の遺伝子型分析可能配列が含まれた鋳型の３’末端の近くの配列に対してそれぞれ特異的なプライマー、即ち、トリガープライマー（ＴＰ）を多数個製作し、このようなトリガープライマー（ＴＰ）のうち共通配列が最も多いプライマーを一つ選定して増幅プライマー（ＡＰ）として決定する。
【００２９】
そして、本発明の詳細な説明全般で使用される「遺伝子型分析可能配列」という用語は、分析対象となる標的遺伝子の変異が多く存在する遺伝子領域であって、該当標的遺伝子の遺伝子型を他の遺伝子型と特異的に区別する配列（塩基配列又はアミノ酸配列）を意味する。
【００３０】
本発明の一実施例による標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物は、
前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列が含まれた少なくとも一つの鋳型にそれぞれ特異的な少なくとも一つのプライマーを含む第１プライマー群と、
前記第１プライマー群のプライマーのうち共通の塩基配列が最も多いプライマー一つを選定し、それを基準に設計された少なくとも一つのプライマーであって、前記鋳型に特異的に結合するか３’末端の近くで１〜２個の塩基配列又は連続的に３つまでの塩基配列が前記鋳型とミスマッチングされながら相補的に結合する少なくとも一つのプライマーを含む第２プライマー群と、を含む。
【００３１】
本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記第１プライマー群は前記鋳型の増幅反応初期に全て消尽されるように増幅反応物に低濃度で提供され、前記第２プライマー群は前記第１プライマー群による増幅産物を鋳型にして最終増幅産物が生成されるように前記増幅反応物に高濃度で提供されることを特徴とする。
【００３２】
好ましくは、前記増幅反応物に提供される第１プライマー群の濃度は前記鋳型の増幅反応初期（例えば、１０乃至１５ＰＣＲ増幅サイクル）で前記鋳型と結合し、前記鋳型の増幅産物を一定濃度まで増幅した後には全て消尽されるように濃度を調整することがよい。例えば、前記第１プライマー群のプライマーの濃度は前記第２プライマー群のプライマーの濃度の１／２〜１／２０が好ましく、１／８〜１／１６が更に好ましいが、それに制限されずに反応条件に応じて変化し得る。
【００３３】
本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記増幅反応物に提供される前記第１プライマー群のプライマーの個数には制限がないが、前記増幅反応物に提供される前記第１プライマー群と前記第２プライマー群の総プライマーの濃度は２μＭ  以内であることが好ましい。
【００３４】
本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記第１プライマー群のプライマーは３’末端の塩基配列で４つ以上の塩基が前記鋳型と相補的であるべきであり、その他の塩基配列でも連続的に３つを超過する塩基が前記鋳型とミスマッチングされる場合、結合が難しい。
【００３５】
本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記第１プライマー群のそれぞれのプライマーは変異が存在する塩基配列が前記鋳型と相補的に結合するように設計し、その他の塩基配列は共通の配列として前記第２プライマー群のプライマーと同じく設計され、プライマーの長さも同じく設計することが好ましい。
【００３６】
本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記最終増幅産物は前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するように増幅されることを特徴とする。
【００３７】
本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記標的遺伝子がＨＰＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号６、配列番号８乃至配列番号１０で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号５及び配列番号７で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。
【００３８】
本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記標的遺伝子がＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号２５及び配列番号２６で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号２３及び配列番号２４で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。
【００３９】
本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記標的遺伝子がＨＢＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号４２乃至配列番号４８で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号４０及び配列番号４１で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。
【００４０】
一方、本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記第１プライマー群のプライマーは必ずしもフォワードプライマーとリバースプライマーの一対で提供される必要はなく、例えば、リバースプライマーのみ提供する場合、前記第２プライマー群のフォワードプライマーと対を成して増幅反応が起こるようになる。前記第２プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで前記増幅反応物に提供される。
【００４１】
また、本発明の一実施例による標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物を含むＰＣＲ増幅キットは、前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列が含まれた少なくとも一つの鋳型にそれぞれ特異的な少なくとも一つのプライマーを含む第１プライマー群と、前記第１プライマー群のプライマーのうち共通の塩基配列が最も多いプライマー一つを選定し、それを基準に設計された少なくとも一つのプライマーであって、前記鋳型に特異的に結合するか３’末端の近くで１〜２個の塩基配列又は連続的に３つまでの塩基配列が前記鋳型とミスマッチングされながら相補的に結合する少なくとも一つのプライマーを含む第２プライマー群と、ポリヌクレオチド鋳型と、ＤＮＡ重合酵素と、ｄＴＮＰｓと、緩衝溶液と、を含む。
【００４２】
本発明の一実施例によるＰＣＲ増幅キットにおいて、前記第１プライマー群は前記鋳型の増幅反応初期に全て消尽されるように増幅反応物に低濃度で提供され、前記第２プライマー群は前記第１プライマー群による増幅産物を鋳型にして最終増幅産物が生成されるように前記増幅反応物に高濃度で提供されることを特徴とする。
【００４３】
好ましくは、前記増幅反応物に提供される第１プライマー群の濃度は前記鋳型の増幅反応初期（例えば、１０乃至１５ＰＣＲ増幅サイクル）で前記鋳型と結合し、前記鋳型の増幅産物を一定濃度まで増幅した後には全て消尽されるように濃度を調整することが好ましい。例えば、前記第１プライマー群のプライマーの濃度は前記第２プライマー群のプライマーの濃度の１／２〜１／２０が好ましく、１／８〜１／１６が更に好ましいが、それに制限されずに反応条件に応じて変化し得る。
【００４４】
本発明の一実施例によるＰＣＲ増幅キットにおいて、前記増幅反応物に提供される前記第１プライマー群のプライマーの個数には制限がないが、前記増幅反応物に提供される前記第１プライマー群と前記第２プライマー群の総プライマーの濃度は２μＭ  以内であることが好ましい。
【００４５】
本発明の一実施例によるＰＣＲ増幅キットにおいて、前記最終増幅産物は前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するように増幅されることを特徴とする。
【００４６】
本発明の一実施例によるＰＣＲ増幅キットにおいて、前記標的遺伝子がＨＰＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号６、配列番号８乃至配列番号１０で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号５及び配列番号７で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。
【００４７】
本発明の一実施例によるＰＣＲ増幅キットにおいて、前記標的遺伝子がＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号２５及び配列番号２６で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号２３及び配列番号２４で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。
【００４８】
本発明の一実施例によるＰＣＲ増幅キットにおいて、前記標的遺伝子がＨＢＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号４２乃至配列番号４８で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号４０及び配列番号４１で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。
【００４９】
本発明の一実施例によるＰＣＲ増幅キットにおいて、前記第２プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで前記増幅反応物に提供される。
【００５０】
また、本発明の一実施例の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物を利用した標的遺伝子増幅方法は、
（ａ）前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列が含まれた少なくとも一つの鋳型にそれぞれ特異的な少なくとも一つのプライマーを含む第１プライマー群を準備する段階と、
（ｂ）前記第１プライマー群のプライマーのうち共通の塩基配列が最も多いプライマー一つを選定し、それを基準に設計された少なくとも一つのプライマーであって、前記鋳型に特異的に結合するか３’末端の近くで１〜２個の塩基配列又は連続的に３つまでの塩基配列が前記鋳型とミスマッチングされながら相補的に結合する少なくとも一つのプライマーを含む第２プライマー群を準備する段階と、
（ｃ）ポリヌクレオチド鋳型と、ＤＮＡ重合酵素と、ｄＮＴＰｓと、緩衝溶液と、を含む増幅反応物に前記第１プライマー群の少なくとも一つのプライマーと前記第２プライマー群の少なくとも一つのプライマーを添加してＰＣＲ増幅反応を行う段階と、
（ｄ）前記ＰＣＲ増幅反応過程の初期に前記鋳型に相補的な前記第１プライマー群の少なくとも一つのプライマーが結合して増幅反応が行われ、前記第１プライマー群のプライマーが全て消尽される段階と、
（ｅ）前記第１プライマー群の少なくとも一つのプライマーによって増幅された増幅産物を鋳型にして前記第２プライマー群の少なくとも一つのプライマーによって増幅反応を追加に行う段階と、
（ｆ）前記遺伝子型分析可能配列を含み、前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するように増幅された最終増幅産物を収得する段階と、を含む。
【００５１】
本発明の一実施例による標的遺伝子増幅方法において、前記（ｃ）段階において前記第１プライマー群は前記増幅反応物に低濃度で添加され、前記第２プライマー群は前記第１プライマー群に比べ高濃度で添加されることを特徴とする。
【００５２】
好ましくは、前記（ｃ）段階で前記増幅反応物に添加される前記第１プライマー群のプライマーの濃度は前記第２プライマー群のプライマーの濃度の１／２〜１／２０が好ましく、１／８〜１／１６が更に好ましいが、それに制限されずに反応条件に応じて変化し得る。
【００５３】
本発明の一実施例による標的遺伝子増幅方法において、前記（ｃ）段階において前記増幅反応物に添加される前記第１プライマー群と前記第２プライマー群の総プライマーの濃度は２μＭ  以内であることが好ましい。
【００５４】
本発明の一実施例による標的遺伝子増幅方法において、前記標的遺伝子がＨＰＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号６、配列番号８乃至配列番号１０で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号５及び配列番号７で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。
【００５５】
本発明の一実施例による標的遺伝子増幅方法において、前記標的遺伝子がＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号２５及び配列番号２６で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号２３及び配列番号２４で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。
【００５６】
本発明の一実施例による標的遺伝子増幅方法において、前記標的遺伝子がＨＢＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号４２乃至配列番号４８で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号４０及び配列番号４１で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。
【００５７】
本発明の一実施例による標的遺伝子増幅方法において、前記第２プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで前記増幅反応物に添加される。
【００５８】
本発明の一実施例による標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物を利用した標的遺伝子の遺伝子型分析方法は、
（ａ）上述したような標的遺伝子増幅方法によって前記標的遺伝子を増幅する段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階によって増幅された、前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列を含み、前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するポリヌクレオチドを制限酵素で切断し、切断した後の断片の塩基配列が制限された範囲内であると共に変異位置塩基を含む２つ以上の一本鎖のポリヌクレオチド断片を生成する段階と、
（ｃ）前記切断された断片の分子量を測定する段階と、を含む。
【００５９】
本発明の一実施例の標的遺伝子の遺伝子型分析方法において、前記制限酵素で切断した後の断片は変異位置塩基を含み、前記断片の塩基の数は２つ乃至３２個であることを特徴とする。
【００６０】
本発明の一実施例による標的遺伝子の遺伝子型分析方法において、前記（ａ）段階で増幅される前記標的遺伝子がＨＰＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号６、配列番号８乃至配列番号１０で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号５及び配列番号７で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。
【００６１】
本発明の一実施例による標的遺伝子の遺伝子型分析方法において、前記（ａ）段階で増幅される前記標的遺伝子がＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号２５及び配列番号２６で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号２３及び配列番号２４で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。
【００６２】
本発明の一実施例による標的遺伝子の遺伝子型分析方法において、前記（ａ）段階で増幅される前記標的遺伝子がＨＢＶ遺伝子である場合、前記第１プライマー群のプライマーは配列番号４２乃至配列番号４８で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第２プライマー群のプライマーは配列番号４０及び配列番号４１で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。
【００６３】
一方、本発明の一実施例による標的遺伝子の遺伝子型分析方法において、前記（ａ）段階で増幅される前記標的遺伝子を増幅するための前記第２プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで提供される。
【発明の効果】
【００６４】
本発明によると標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を簡便で効率的にもれなく精密に増幅することができ、多数の遺伝子型を特異度と敏感度を満足しながら精密に分析することができる。詳しくは、本発明はＰＣＲでトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用することで、変異が多く存在する遺伝子領域を増幅する際、分析しようとする遺伝子配列（以下、「遺伝子型分析可能配列」と称する）を除いた部分では同じ遺伝子配列を有する増幅産物が生成されるようにすることで遺伝子変異が多様な塩基配列部分におけるＰＣＲを可能にすると共に正確な塩基配列又は塩基変異分析を可能にする。
【００６５】
追加に、本発明によると、「遺伝子型分析可能配列」を除いては同じ遺伝子配列を有する増幅産物を生成し、制限酵素断片質量多形性法による遺伝子型分析を行う際現れる質量分析ピークの数字を減らして遺伝子型分析を容易にする長所がある。
【００６６】
よって、本発明は塩基変異の分析を必要とするバイオ、医学及び薬学分野などの多様な分野に利用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明によるトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅において、多数の変種遺伝子を簡便で効率的にもれなく増幅することができ、多数の遺伝子型を精密に分析することができる方法を説明する概略図である。
【図２】本発明によるトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅後ＲＦＭＰ方法を行って得たＨＰＶ５９遺伝子型のマルディ・トフマススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）グラフである。
【図３】本発明によるトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅後ＲＦＭＰ方法を行って得たＨＰＶ１６遺伝子型のマルディ・トフマススペクトロメトリーグラフである。
【図４】本発明によるトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅後ＲＦＭＰ方法を行って得たＨＰＶ５１遺伝子型のマルディ・トフマススペクトロメトリーグラフである。
【図５】本発明によるトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅後ＲＦＭＰ方法を行って得たＨＰＶ６８遺伝子型のマルディ・トフマススペクトロメトリーグラフである。
【図６】ヒトのＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子がヘテロ（０２０１／０５０１）である場合、本発明によるトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅後ＲＦＭＰ方法を行って得たヘテロ（０２０１／０５０１）遺伝子型のマルディ・トフマススペクトロメトリーグラフである。
【図７】ヒトのＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子がヘテロ（０３０１／０４０１）である場合、本発明によるトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅後ＲＦＭＰ方法を行って得たヘテロ（０３０１／０４０１）遺伝子型のマルディ・トフマススペクトロメトリーグラフである。
【図８】塩基変異の際、アデフォビル耐性を誘発するＨＢＶ重合酵素の２３６番目のコドンがＡＡＣで、アミノ酸アスパラギン（Ａｓｎ）をコーディングする野生型ＨＢＶ遺伝子である場合、本発明によるトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅後ＲＦＭＰ方法を行って得た野生型ＨＢＶ遺伝子型のマルディ・トフマススペクトロメトリーグラフである。
【図９】塩基変異の際、アデフォビル耐性を誘発するＨＢＶ重合酵素の２３６番目のコドンがＡＣＴで、アミノ酸トレオニン（Ｔｈｒ）をコーディングする突然変異型ＨＢＶ遺伝子である場合、本発明によるトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅後ＲＦＭＰ方法を行って得た突然変異型ＨＢＶ遺伝子型のマルディ・トフマススペクトロメトリーグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく記述する。本発明の下記の実施例は本発明を具体化するだけのものであって、本発明の権利範囲を制限または限定するものでないことはもちろんである。本発明の詳細な説明および実施例から本発明が属する技術分野の専門家が容易に類推できるのは、本発明の権利範囲に属するものと解釈される。本発明にて引用された参考文献は、本発明に参考として統合される。
【００６９】
実施例１．ＨＰＶ（Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）の遺伝子型分析
ヒトの子宮頸癌を誘発すると知られているヒトパピローマウィルス（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，「ＨＰＶ」と略称する）の遺伝子型分析を上述したような制限酵素断片質量多形性法（以下、「ＲＦＭＰ方法」と称する）を利用して行った。本実施例１は、ＨＰＶ  ＤＮＡを対象に実施された。
【００７０】
ＨＰＶはパポバウィルス（ｐａｐｏｖａ  ｖｉｒｕｓ）系列に属するＤＮＡウィルスで、７２個の外殻単位タンパク質体（ｃａｐｓｏｍｅｒ）で形成された２０面体であって、７，９００個の塩基配列が二重円形ＤＮＡで形成されている。ＨＰＶはゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）を構成している塩基配列の類似性に応じて１２０種類余りの他の亜型で分けられる。これらの１２０種類余りの亜型のうち３０種類余りが下部生殖器に感染されると知られており、子宮頸部の上皮内の腫瘍と子宮頸癌を誘発する危険度に応じてＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−２６，ＨＰＶ−３０，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５６，ＨＰＶ−５７，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５９，ＨＰＶ−６７，ＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−７３，ＨＰＶ−７４などの高危険群（ｈｉｇｈ  ｒｉｓｋ  ｔｙｐｅ）と、ＨＰＶ−２ａ，ＨＰＶ−３，ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１０，  ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−３２，ＨＰＶ−３４，ＨＰＶ−４０，ＨＰＶ−４２，ＨＰＶ−４３，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５４，ＨＰＶ−５５，ＨＰＶ−６１，ＨＰＶ−６９，ＨＰＶ−７０などの低危険群（ｌｏｗ  ｒｉｓｋ  ｔｙｐｅ）で分けられる（Ｍｕｎｏｚ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２００３，３４８（６）：５２８−２７）。よって、ＨＰＶの遺伝子型分析及び検査において、多様な変異を分析するために検査対象となる数十種のＨＰＶ  ＤＮＡに対して全て増幅を行わなければならない難しさがあり、また高危険群検査における特異度と敏感度を全て満足することが特に難しい。
【００７１】
一方、ＨＰＶのゲノム構造は大きく初期転写部位Ｅ（ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｉｏｎ）と後期転写部位Ｌ（ｌａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｉｏｎ）、そして発現されない部位であるＬＣＲ（ｌｏｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｇｉｏｎ）で分けられ、ＨＰＶのゲノム構造は発病の様相と危険度、予後に大きな影響を及ぼす。特に、初期転写部位のうちＥ６とＥ７遺伝子はＨＰＶが感染細胞のゲノム内に入っている間に発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）され、発癌に最も重要な役割をすると知られている。例えば、高危険群に属するＨＰＶのＥ６とＥ７遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ）であるｐ５３とｒｂ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）遺伝子から発現されるタンパク質とそれぞれ結合してそれらのタンパク質を不活性化し、その結果細胞周期（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ）の調節と細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）機序が阻害されることで子宮頸部の正常細胞が癌細胞に変形される。それに対し、ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１などの低危険群に属するＨＰＶの場合、腫瘍抑制遺伝子から発現されるタンパク質を不活性化させる能力が落ちるため、子宮頸癌を誘発しにくいと知られている（Ｂａｒｂｏｓａ  Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅ６  ａｎｄ  Ｅ７  ｇｅｎｅｓ  ｖａｒｙ  ａｍｏｎｇ  ＨＰＶｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：２９２−２９８，１９９１）。
【００７２】
よって、Ｅ６とＥ７遺伝子のような標的遺伝子の内の変異を検出して遺伝子型を正確に分析すると高危険群ＨＰＶの感染可否を検査することができ、それによって子宮頸癌の誘発原因を事前に探知することができる。以下の実施例では、本出願人が開発したＲＦＭＰ方法に上述したようなトリガープライマー及び増幅プライマーを使用してＨＰＶ遺伝子型を分析する方法を説明する。
【００７３】
１．ＰＣＲ増幅
約８０種類余りのＨＰＶ遺伝子塩基配列を整列して「遺伝子型分析可能配列」を決定し、プライマー結合部分を選択して一対の増幅プライマー（ＡＰ）を製作した。即ち、増幅プライマー（ＡＰ）は３’末端の近くで好ましくは１〜２個の塩基配列、最大限連続的に３つの塩基配列が多様なＨＰＶ  ＤＮＡ鋳型とミスマッチングされながら相補的に結合するように設計した。例えば、３’末端の近くの無作為な配列に対して多様なＨＰＶ  ＤＮＡ鋳型にそれぞれ特異的なプライマー、即ち、トリガープライマー（ＴＰ）を多数個製作し、このようなトリガープライマー（ＴＰ）のうち共通配列が最も多いプライマーを一つ選定して増幅プライマー（ＡＰ）として決定する。このように設計製作された高濃度の増幅プライマー（ＡＰ）と低濃度のトリガープライマー（ＴＰ）の混合物を利用してＰＣＲを実施した。
【００７４】
分析対象となる高危険群ＨＰＶ遺伝子において、プライマーによって増幅される鋳型ＤＮＡの配列（５’→３’）は以下のようである。
【００７５】
ＨＰＶ５９
ＧＣＴＣＡＧＧＧＴＴＴＡＡＡＣＡＡＴＧＧｔａｔａｔｇｔｔｇｇｃａｃａａｔｃａａｔｔｇｔＴＴＴＴＡＡＣＡＧＴＴＧＴＡＧＡＴＡＣＴＡＣＴＣＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＴＣＴＴ（配列番号１）
ＨＰＶ１６
ＧＣＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＡＴＡＡＴＧＧｃａｔｔｔｇｔｔｇｇｇｇｔａａｃｃａａｃｔａＴＴＴＧＴＴＡＣＴＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＡＴＧ（配列番号２）
ＨＰＶ５１
ＧＣＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＡＡＴＡＡＴＧＧｃａｔｔｔｇｃｔｇｇａａｃａａｔｃａｇｃｔｔＴＴＴＡＴＴＡＣＣＴＧＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＡＴＴＴＡ（配列番号３）
ＨＰＶ６８
ＧＣＡＣＡＧＧＧＡＣＡＣＡＡＣＡＡＴＧＧｔａｔｔｔｇｔｔｇｇｃａｔａａｔｃａａｔｔａＴＴＴＣＴＴＡＣＴＧＴＴＧＴＧＧＡＴＡＣＣＡＣＴＣＧＣＡＧＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴ（配列番号４）
ＨＰＶの鋳型ＤＮＡ配列のうち下線で示した配列は以下のプライマー１乃至プライマー６が結合される部位である。それぞれのＨＰＶ鋳型ＤＮＡ配列の前方に下線で示した部分はフォワードプライマーが結合する部位であり、それぞれのＨＰＶ鋳型ＤＮＡ配列の後方に下線で示した部分はリバースプライマーが結合する部位である。小文字で記された塩基は「遺伝子型分析可能配列」である。
【００７６】
＊フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒｓ）
プライマー１．５’−ＧＣＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＡｇｇａｔｇＡＡＴＧＧ−３’（２４ｍｅｒ）（配列番号５）
プライマー２．５’−ＧＣＡＣＡＧＧＧＴＴＴＡＡＡｇｇａｔｇＡＡＴＧＧ−３’（２４ｍｅｒ）（配列番号６）
＊リバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒｓ）
プライマー３．５’−ＧＴＡＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＣｇｇａｔｇＴＡＡＣＡＡＡ−３’（２６ｍｅｒ）（配列番号７）
プライマー４．５’−ＧＴＡＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＣｇｇａｔｇＴＴＡＡＡＡＡ−３’（２６ｍｅｒ）（配列番号８）
プライマー５．５’−ＧＴＡＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＣｇｇａｔｇＴＡＡＴＡＡＡ−３’（２６ｍｅｒ）（配列番号９）
プライマー６．５’−ＧＴＡＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＣｇｇａｔｇＴＡＡＧＡＡＡ−３’（２６ｍｅｒ）（配列番号１０）
ＨＰＶ１６ＤＮＡ鋳型を基準にすると、前記フォワードプライマーのうちプライマー１は増幅プライマー（ＡＰ）であり、プライマー２はトリガープライマー（ＴＰ）になる。また、前記リバースプライマーのうちプライマー３は増幅プライマー（ＡＰ）であり、プライマー４乃至プライマー６はトリガープライマー（ＴＰ）となる。フォワードプライマーは３’末端の配列で５つの塩基をＨＰＶ  ＤＮＡ鋳型に相補的に設計し、リバースプライマーは３’末端の配列で７つの塩基をＨＰＶ  ＤＮＡ鋳型に相補的に設計した。前記プライマーにおいて、小文字で記された配列はＦｏｋＩ及びＢｔｓＣＩの制限酵素認識配列であって、本実施例ではＲＦＭＰ方法を利用するためにＦｏｋＩとＢｔｓＣＩの制限酵素認識配列を挿入した。
【００７７】
例えば、プライマー１はフォワード増幅プライマー（ＡＰ）として全てのＨＰＶ遺伝子型において３’末端の５つの塩基配列が一致するように設計し、プライマー２はＨＰＶ５９ＤＮＡ鋳型に相補的なフォワードトリガープライマー（ＴＰ）としてＨＰＶ５９ＤＮＡ鋳型が連続的に４つ以上の塩基配列（総４つ、太文字で記した塩基配列参照）でプライマー１のフォワード増幅プライマー（ＡＰ）とミスマッチングされて相補的ではないため、ＨＰＶ５９に対してのみ特別に特異的に設計した。
【００７８】
そして、プライマー３はリバース増幅プライマー（ＡＰ）としてＨＰＶ１６ＤＮＡ鋳型を基準にすると３’末端の７つの塩基配列が一致するように設計するが、全てのＨＰＶ遺伝子型に対しても３’末端の７つの塩基配列が１〜２個の塩基配列、最大限連続的に３つの塩基配列とのミスマッチングを許容しながら相補的に結合するように設計した。プライマー４はＨＰＶ３４、ＨＰＶ５９及びＨＰＶ７３に相補的なリバーストリガープライマー（ＴＰ）として３’末端の４番目の塩基（Ａ）及び６番目の塩基（Ｔ）を前記プライマー３とは異なるように変異を与えて特異的に設計した（太文字で記した塩基参照）。プライマー５はＨＰＶ５１、ＨＰＶ７０及びＨＰＶ８２に相補的なリバーストリガープライマー（ＴＰ）として３’末端の４番目の塩基（Ｔ）を前記プライマー３とは異なるように変異を与えて特異的に設計し（太文字で記した塩基参照）、プライマー６はＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８に相補的なリバーストリガープライマー（ＴＰ）として３’末端の４番目の塩基（Ｇ）を前記プライマー３とは異なるように変異を与えて特異的に設計した（太文字で記した塩基参照）。
【００７９】
ＰＣＲ緩衝溶液（ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）（１ｘ）、ＭｇＳＯ４  ２ｍＭ、ｄＮＴＰ  ２００ｍＭ、白金Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１０９６６−０２６）  ０．５Ｕ、プライマー１とプライマー３をそれぞれ０．４μＭ、プライマー２とプライマー４をそれぞれ０．０５μＭ、プライマー５とプライマー６をそれぞれ０．０２５μＭ、分析対象となるＨＰＶ  ＤＮＡ  １００ｎｇを入れ、総反応体積を２５μｌに合わせた。そして、以下のような条件でＰＣＲ反応を行った（図１のステップ（Ａ）に当たる）。
【００８０】
９４℃５分、
９４℃１５秒  ４５℃１５秒  ７２℃１５秒（４５サイクル）、
７２℃５分。
【００８１】
初期ＰＣＲ反応によっては、それぞれのＨＰＶ鋳型に相補的なトリガープライマー（ＴＰ）が結合してＰＣＲ増幅されて増幅産物が生成される（図１のステップ（Ａ）に当たる）。この際、ＨＰＶ５９ＤＮＡ鋳型にはプライマー２及びプライマー４、ＨＰＶ５１ＤＮＡ鋳型にはプライマー１及びプライマー５、そしてＨＰＶ６８ＤＮＡ鋳型にはプライマー１及びプライマー６が結合して以下のような増幅産物が生成され、ＨＰＶ１６ＤＮＡ鋳型には初期反応から増幅プライマー（ＡＰ）であるプライマー１及びプライマー３が結合し、以下のような増幅産物が生成される。それぞれのＨＰＶ  ＤＮＡ鋳型において、初期ＰＣＲ反応（１０〜１５サイクル）によって生成されるＨＰＶ  ＤＮＡ断片の配列は以下のようである（５’→３’）。
【００８２】
ＨＰＶ５９
ＧＣＡＣＡＧＧＧＴＴＴＡＡＡｇｇａｔｇＡＡＴＧＧ［ｔａｔａｔｇｔｔｇｇｃａｃａａｔｃａａｔｔｇｔ］ＴＴＴＴＴＡＡｃａｔｃｃＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＡＣ（配列番号１１）
ＨＰＶ１６
ＧＣＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＡｇｇａｔｇＡＡＴＧＧ［ｃａｔｔｔｇｔｔｇｇｇｇｔａａｃｃａａｃｔａ］ＴＴＴＧＴＴＡｃａｔｃｃＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＡＣ（配列番号１２）
ＨＰＶ５１
ＧＣＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＡｇｇａｔｇＡＡＴＧＧ［ｃａｔｔｔｇｃｔｇｇａａｃａａｔｃａｇｃｔｔ］ＴＴＴＡＴＴＡｃａｔｃｃＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＡＣ（配列番号１３）
ＨＰＶ６８
ＧＣＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＡｇｇａｔｇＡＡＴＧＧ［ｔａｔｔｔｇｔｔｇｇｃａｔａａｔｃａａｔｔａ］ＴＴＴＣＴＴＡｃａｔｃｃＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＡＣ（配列番号１４）
一方、それぞれのＨＰＶ  ＤＮＡ鋳型に特異的なトリガープライマー（ＴＰ）が結合（ＨＰＶ１６ＤＮＡの場合、増幅プライマー（ＡＰ）がトリガープリマー（ＴＰ）の役割をしてＨＰＶ１６ＤＮＡ鋳型に結合）して増幅が行われるが、ＰＣＲ増幅過程において初期に低濃度で入れたトリガープライマー（ＴＰ）が全て消尽されてそれぞれのＨＰＶ  ＤＮＡ断片が一定濃度まで増幅された後には、それぞれのＨＰＶ  ＤＮＡ断片のプライマー結合配列一部においてトリガープライマー（ＴＰ）とは異なる増幅プライマー（ＡＰ）がＨＰＶ  ＤＮＡ鋳型に結合して増幅が行われるようになる（図１のステップ（Ｂ））。これは、増幅プライマー（ＡＰ）であるプライマー３の最初設計の際、全てのＨＰＶ遺伝子型において３’末端の７つの塩基配列が１〜２個の塩基配列、最大限連続的に３つの塩基配列とのミスマッチングを許容しながら相補的に結合するように設計し、ＰＣＲ増幅の際、トリガープライマー（ＴＰ）より高濃度で入れたため可能であるといえる。
【００８３】
これで、本実施例によると、「遺伝子型分析可能配列」のみが多様なＨＰＶ  ＤＮＡ鋳型によって複製され、その他の配列（以下の塩基配列で大括弧（［］）で示した塩基配列を除いた配列）は増幅プライマー（ＡＰ）によって複製されて同じ塩基配列を有するようになる（図１のステップ（Ｃ））。最終ＰＣＲ増幅生成物は増幅プライマー（ＡＰ）による増幅生成物が大部分を占めるようになり、トリガープライマー（ＴＰ）による増幅生成物は分析結果に影響を及ぼさないほどの微量のみが存在する。それぞれのＨＰＶ  ＤＮＡ鋳型において、最終的に生成されるＨＰＶ  ＤＮＡ断片の配列は以下のようである（５’→３’）。
【００８４】
ＨＰＶ５９
ＧＣＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＡｇｇａｔｇＡＡＴＧＧ［ｔａｔａｔｇｔｔｇｃａｃａａｔｃａａｔｔｇｔ］ＴＴＴＧＴＴＡｃａｔｃｃＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＡＣ（配列番号１５）
ＨＰＶ１６
ＧＣＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＡｇｇａｔｇＡＡＴＧＧ［ｃａｔｔｔｇｔｔｇｇｇｇｔａａｃｃａａｃｔａ］ＴＴＴＧＴＴＡｃａｔｃｃＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＡＣ（配列番号１６）
ＨＰＶ５１
ＧＣＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＡｇｇａｔｇＡＡＴＧＧ［ｃａｔｔｔｇｃｔｇｇａａｃａａｔｃａｇｃｔｔ］ＴＴＴＧＴＴＡｃａｔｃｃＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＡＣ（配列番号１７）
ＨＰＶ６８
ＧＣＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＡｇｇａｔｇＡＡＴＧＧ［ｔａｔｔｔｇｔｔｇｇｃａｔａａｔｃａａｔｔａ］ＴＴＴＧＴＴＡｃａｔｃｃＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＡＣ（配列番号１８）
前記ＰＣＲを介して生成された配列において、小文字で記された部位は制限酵素認識配列であり、下線で示した部位は制限酵素による切断によって生成される断片の配列であり、大括弧（［］）で示した部位は「遺伝子型分析可能配列」である。
【００８５】
一方、本発明ではＨＰＶ５９，ＨＰＶ１６，ＨＰＶ５１，ＨＰＶ６９に対してのみトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅を実施したが、上述したＨＰＶのタイプのうちその他の多様な種類の高危険群ＨＰＶ及び／又は低危険群ＨＰＶに対してもトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅を応用することができるということは本発明が属した技術分野の当業者であれば容易に理解できるはずである。
【００８６】
２．制限酵素による切断、精製及び脱塩
前記ＰＣＲを介して増幅された生成物にＦｏｋＩ（ＮＥＢ  Ｒ１０９Ｌ）  １Ｕ、ＢｔｓＣＩ（ＮＥＢ  Ｒ０６４７Ｓ）  １Ｕ、５０ｍＭ  ポタシウムアセテート、２０ｍＭ  トリス−アセテート（Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ）、１０ｍＭ  マグネシウムアセテート及び１ｍＭ  ＤＴＴ（２５℃でＰＨ７．９）を入れ、３７℃で１時間反応させた。
【００８７】
制限酵素で処理した前記溶液から切断されたＤＮＡ断片を純粋分離した後、分離されたＤＮＡ断片の分子量を測定することが好ましい。例えば、制限酵素によって切断されたＤＮＡ断片の純粋分離のために、Ｏａｓｉｓ（Ｗａｔｅｒｓ）  Ｃ１８イオン樹脂交換カラム（Ｃ１８  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を利用してもよい。まず、前記制限酵素で処理した溶液に０．１５Ｍ  トリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ，ｐＨ７．６）７０μｌを入れて１分間放置する。カラムに１００％アセトニトリル（ＡＣＮ；Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）と０．１Ｍ  ＴＥＡＡ  １ｍｌを通過させてレジン（Ｒｅｓｉｎ）を活性化させた後、前記制限酵素で処理した溶液と０．１５Ｍ  ＴＥＡＡとの混合液１００μｌ、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ  ２ｍｌ及び３次蒸留水  １ｍｌを順番に完全に通過させる。収集プレート（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ）の上に前記カラムを位置させ、７０％ＡＣＮ  １００μｌを入れて通過させる。溶出液が収集プレートに集められると、前記収集プレートを１２０℃で６０分間乾燥させる。
【００８８】
３．マルディ・トフマススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）
マルディマトリックス（ＭＡＬＤＩ  ｍａｔｒｉｘ）［２２．８ｍｇ  アンモニウムシトレート、１４８．５ｍｇ  ヒドロキシピコリン酸（ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１．１２ｍｌ  アセトニトリル、７．８ｍｌ  Ｈ２Ｏ］４μｌをマルディ・トフマススペクトロメトリー（Ｂｉｆｌｅｘ  ＩＶ、Ｂｒｕｋｅｒ）のアンカーチッププレート（Ａｎｃｈｏｒ  ｃｈｉｐ  ｐｌａｔｅ）に予め点滴（ｄｏｔｔｉｎｇ）した後、３７℃で３０分間乾燥させる。精製及び脱塩過程を経た収集プレートのサンプルに３次蒸留水を１０μｌ入れて溶かした後、乾燥されたマルディマトリックスの上に２μｌ点滴し、マルディマトリックスを更に３７℃で３０分間乾燥させた後、マルディ・トフマススペクトロメトリーで分析する。分析方法はマルディ・トフマススペクトロメトリーのマニュアルに従う。
【００８９】
前記反応によって生成された断片の分子量をマルディ・トフマススペクトロメトリーで分析した結果は図２乃至図５に示したようであり、多様なＨＰＶに対する分析結果を整理して分子量として下記表１に示した。下記表１の結果に基づいて、ＨＰＶ遺伝子型を決定することができる。
【００９０】
下記表１は増幅プライマー（ＡＰ）によって増幅された生成物に基づいて予測した断片の分子量を示したものであって、トリガープライマー（ＴＰ）によって増幅された生成物による断片の分子量とは差がある。本実施例によると、それぞれのトリガープライマー（ＴＰ）を反応濃度以上で混合した際には増幅プライマー（ＡＰ）による断片の分子量とトリガープライマー（ＴＰ）による断片の分子量が同時に現れることを確認することができた。それぞれのトリガープライマー（ＴＰ）を反応濃度以下で混合した際には該当ＨＰＶ遺伝子の分析が行われなかった。
【００９１】
一方、図２乃至図５に示したＨＰＶ５９，ＨＰＶ１６，ＨＰＶ５１及びＨＰＶ６８遺伝子型のマルディ・トフマススペクトロメトリーグラフを分析すると、本実施例による増幅産物では増幅プライマー（ＡＰ）による断片の分子量のみが確認されることが分かる。よって、本発明によるトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅後ＲＦＭＰ方法は、多数の変種遺伝子を簡便で効率的にもれなく増幅することができ、多数の遺伝子型を精密に分析することができる長所がある。
【００９２】
【表１】
2013529898.tif 000003
【００９３】
実施例２．ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）−ＤＱＢ１遺伝子型分析
一方、本発明によるトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅が多様な遺伝子型分析に利用可能であるのか否かを追加に確認した。そのために、ヒトの免疫反応に関する主な組織適合性抗原であるＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ）−ＤＱＢ１遺伝子型分析をトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅の後、ＲＦＭＰ方法を利用して行った。実施例２はヒトのゲノムＤＮＡを対象に行った。
【００９４】
１．ＰＣＲ増幅
約１００種類余りのＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子塩基配列を整列して「遺伝子型分析可能配列」を決定し、プライマー結合部分を選択して一対の増幅プライマー（ＡＰ）を製作した。また、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１タイプの３’末端と５’末端の特異的な配列に対してＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１  ＤＮＡ鋳型と相補的に結合するように一対のトリガープレイマー（ＴＰ）を設計した。このように設計製作された高濃度の増幅プライマー（ＡＰ）と低濃度のトリガープライマー（ＴＰ）の混合物を利用してＰＣＲを実施した。
【００９５】
分析対象となるＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子において、プライマーによって増幅される鋳型ＤＮＡの配列（５’→３’）は以下のようである。
【００９６】
ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１
ＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣｇｃｇｔｇｃｇｇｇｇｔｇｔｇａｃｃａｇａｃＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣ（配列番号１９）
ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１
ＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣＡＧＡＧＣｇｃｇｔｇｃｇｔｃｔｔｇｔｇａｇｃａｇａａＧＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣ（配列番号２０）
ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０１
ＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣＣＧＡＧＣｔｃｇｔｇｃｇｇｇｇｔｇｔｇａｃｃａｇａｔＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣ（配列番号２１）
ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１
ＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣｇｃｇｔｇｃｇｔｔａｔｇｔｇａｃｃａｇａｔＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＣＡＣＧＣＴＴＣＧＡＣ（配列番号２２）
ＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子の鋳型ＤＮＡ配列のうち、下線で示した配列は以下のプライマー７乃至プライマー１０が結合される部位である。それぞれのＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子の鋳型ＤＮＡ配列の前方に下線で示した部分はフォワードプライマーが結合する部位であり、それぞれのＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子の鋳型ＤＮＡ配列の後方に下線で示した部分はリバースプライマーが結合する部位である。小文字で記された塩基は「遺伝子型分析可能配列」である。
【００９７】
プライマー７．５’−ＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣｇｇａｔｇＧＡＣＧＧＡＧＣ−３’（３０ｍｅｒ）（配列番号２３）
プライマー８．５’−ＧＣＧＴＧＣＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＣＧＧＴｇｇａｔｇＡＴＡＧＡＴＧＴ−３’（３３ｍｅｒ）（配列番号２４）
プライマー９．５’−ＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣｇｇａｔｇＧＡＣＡＧＡＧＣ−３’（３０ｍｅｒ）（配列番号２５）
プライマー１０．５’−ＧＣＧＣＡＣＧＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＧＧＴｇｇａｔｇＡＴＡＧＡＴＧＣ−３’（３３ｍｅｒ）（配列番号２６）
フォワードプライマーであるプライマー７は増幅プライマー（ＡＰ）であり、フォワードプライマーであるプライマー９はトリガープライマー（ＴＰ）となる。また、リバースプライマーであるプライマー８は増幅プライマー（ＡＰ）であり、リバースプライマーであるプライマー１０はトリガープライマー（ＴＰ）となる。フォワードプライマーは３’末端の配列で４つの塩基をＨＬＡ−ＤＱＢ１  ＤＮＡ鋳型に相補的に設計し、リバースプライマーは３’末端の配列で７つの塩基をＨＬＡ−ＤＱＢ１  ＤＮＡ鋳型に相補的に設計した。前記プライマーにおいて、小文字で記された配列はＦｏｋＩ及びＢｔｓＣＩの制限酵素認識配列であって、本実施例ではＲＦＭＰ方法を利用するためにＦｏｋＩとＢｔｓＣＩの制限酵素認識配列を挿入した。
【００９８】
例えば、プライマー７はフォワード増幅プライマー（ＡＰ）として全てのＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子型において３’末端の４つの塩基配列が一致するように設計し、プライマー９はＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１  ＤＮＡ鋳型に相補的なフォワードトリガープライマー（ＴＰ）として３’末端の１つの塩基配列（Ａ；太文字で記した塩基配列参照）でプライマー７のフォワード増幅プライマー（ＡＰ）と相補的ではないため、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１に対して特別に特異的に設計した。
【００９９】
また、プライマー８はリバース増幅プライマー（ＡＰ）としてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１タイプを除いた全てのＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子型において３’末端の７つの塩基配列が一致するように設計し、プライマー１０はＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１  ＤＮＡ鋳型に相補的なリバーストリガープライマー（ＴＰ）として３’末端の１つの塩基配列と５’末端の５つの塩基配列を特異的に設計した。
【０１００】
ＰＣＲ緩衝溶液（ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）（１ｘ）、ＭｇＳＯ４  ２ｍＭ、ｄＮＴＰ  ２００ｍＭ、白金Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１０９６６−０２６）  ０．５Ｕ、プライマー７とプライマー８をそれぞれ０．４μＭ、プライマー９とプライマー１０をそれぞれ０．０２５μＭ、ヒトＤＮＡ  １００ｎｇを入れ、総反応体積を２５μｌに合わせた。そして、以下のような条件でＰＣＲ反応を行った（図１のステップ（Ａ）に当たる）
９４℃５分、
９４℃１５秒  ４５℃１５秒  ７２℃１５秒（４５サイクル）、
７２℃５分。
【０１０１】
初期ＰＣＲ反応によっては、それぞれのＨＬＡ−ＤＱＢ１鋳型に相補的なトリガープライマー（ＴＰ）が結合してＰＣＲ増幅されて増幅産物が生成される（図１のステップ（Ａ）に当たる）。例えば、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１タイプのＤＮＡ鋳型にはプライマー９及びプライマー１０が結合して以下のような増幅産物が生成される。ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１タイプのＤＮＡ鋳型において、初期ＰＣＲ反応（１０〜１５サイクル）によって生成されるＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１  ＤＮＡ断片の配列は以下のようである（５’→３’）。
【０１０２】
ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１
ＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣｇｇａｔｇＧＡＣＡＧＡＧＣ［ｇｃｇｔｇｃｇｔｃｔｔｇｔｇａｇｃａｇａａ］ＧＣＡＴＣＴＡＴｃａｔｃｃＡＣＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＧＣ（配列番号２７）
一方、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１タイプに特異的なトリガープライマー（ＴＰ）が結合して増幅が行われるが、ＰＣＲ増幅過程において初期に低濃度で入れたトリガープライマー（ＴＰ）が全て消尽されてそれぞれのＨＬＡ−ＤＱＢ１  ＤＮＡ断片が一定濃度まで増幅された後には、それぞれのＨＬＡ−ＤＱＢ１  ＤＮＡ断片のプライマー結合配列一部においてトリガープライマー（ＴＰ）とは一部配列が異なる増幅プライマー（ＡＰ）がＨＬＡ−ＤＱＢ１  ＤＮＡ鋳型に結合して増幅が行われるようになる（図１のステップ（Ｂ））。これは、増幅プライマー（ＡＰ）であるプライマー８の最初設計の際、全てのＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子型において３’末端の７つの塩基配列が１〜２個の塩基配列、最大限連続的に３つの塩基配列とのミスマッチングを許容しながら相補的に結合するように設計し、ＰＣＲ増幅の際、トリガープライマー（ＴＰ）より高濃度で入れたため可能であるといえる。
【０１０３】
これで、本実施例によると、「遺伝子型分析可能配列」のみが多様なＨＬＡ−ＤＱＢ１  ＤＮＡ鋳型によって複製され、その他の配列（以下の塩基配列で大括弧（［］）で示した塩基配列を除いた配列）は増幅プライマー（ＡＰ）によって複製されて同じ塩基配列を有するようになる（図１のステップ（Ｃ））。最終ＰＣＲ増幅生成物は増幅プライマー（ＡＰ）による増幅生成物が大部分を占めるようになり、トリガープライマー（ＴＰ）による増幅生成物は分析結果に影響を及ぼさないほどの微量のみが存在する。それぞれのＨＬＡ−ＤＱＢ１  ＤＮＡ鋳型において、最終的に生成されるＨＬＡ−ＤＱＢ１  ＤＮＡ断片の配列は以下のようである（５’→３’）。
【０１０４】
ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１
ＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣｇｇａｔｇＧＡＣＧＡＧＣ［ｇｃｇｔｇｃｇｇｇｇｔｇｔｇａｃｃａｇａｃ］ＡＣＡＴＣＴＡＴｃａｔｃｃＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＣＡＣＧＣ（配列番号２８）
ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１
ＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣｇｇａｔｇＧＡＣＧＧＡＧＣ［ｇｃｇｔｇｃｇｔｃｔｔｇｔｇａｇｃａｇａａ］ＡＣＡＴＣＴＡＴｃａｔｃｃＡＣＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＴＣＧＣＡＣＧＣ（配列番号２９）
ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０１
ＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣｇｇａｔｇＧＡＣＧＡＧＣ［ｔｃｇｔｇｃｇｇｇｇｔｇｔｇａｃｃａｇａｔ］ＡＣＡＴＣＴＡＴｃａｔｃｃＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＣＡＣＧＣ（配列番号３０）
ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１
ＴＧＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣｇｇａｔｇＧＡＣＧＡＧＣ［ｇｃｇｔｇｃｇｔｔａｔｇｔｇａｃｃａｇａｔ］ＡＣＡＴＣＴＡＴｃａｔｃｃＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＣＡＣＧＣ（配列番号３１）
前記ＰＣＲを介して生成された配列において、小文字で記された部位は制限酵素認識配列であり、下線で示した部位は制限酵素による切断によって生成される断片の配列であり、大括弧（［］）で示した部位は「遺伝子型分析可能配列」である。前記増幅生成物の生成原理は、実施例１と同じである。
【０１０５】
一方、本発明ではＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１，ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１，ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０１，ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１に対してのみトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅を実施したが、上述したＨＬＡ−ＤＱＢ１タイプのうちその他の多様な種類の対立遺伝子に対してもトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅を応用することができるということは本発明が属した技術分野の当業者であれば容易に理解できるはずである。
【０１０６】
２．制限酵素による切断、精製及び脱塩
実施例１と同じ方法で行った。
【０１０７】
３．マルディ・トフマススペクトロメトリー
実施例１と同じ方法で行った。
【０１０８】
前記反応によって生成された断片の分子量をマルディ・トフマススペクトロメトリーで分析した結果は図６乃至図７に示したようであり、多様なＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子に対する分析結果を整理して分子量として下記表２に示した。下記表２の結果に基づいて、ＨＬＡ−ＤＱＢ１の遺伝子型を決定することができる。
【０１０９】
下記表２は増幅プライマー（ＡＰ）によって増幅された生成物に基づいて予測した断片の分子量を示したものであって、トリガープライマー（ＴＰ）によって増幅された生成物による断片の分子量とは差がある。本実施例によると、それぞれのトリガープライマー（ＴＰ）を０．０２５μＭ以上混合した際には増幅プライマー（ＡＰ）による断片の分子量とトリガープライマー（ＴＰ）による断片の分子量が同時に現れることを確認することができた。一方、トリガープライマー（ＴＰ）を０．０２５μＭ以下で混合した際には該当ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子の分析が行われなかった。
【０１１０】
一方、図６にはヒトのＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子がヘテロ（０２０１／０５０１）である場合の遺伝子型のマルディ・トフマススペクトロメトリーグラフが示されており、図７にはヒトのＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子がヘテロ（０３０１／０４０１）である場合の遺伝子型のマルディ・トフマススペクトロメトリーグラフが示されている。これらのマルディ・トフマススペクトロメトリーグラフを分析すると、本実施例による増幅産物では増幅プライマー（ＡＰ）による断片の分子量のみが確認されることが分かる。よって、本発明によるトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅の後、ＲＦＭＰ方法は多数の変種遺伝子を簡便で効率的にもれなく増幅することができ、多数の遺伝子型を精密に分析することができる長所がある。
【０１１１】
【表２】
2013529898.tif 000004
【０１１２】
実施例３．Ｂ型肺炎ウィルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）ＤＮＡ重合酵素のアデフォビルに対する耐性関連塩基変異分析
ヒトにＢ型肺炎を誘発させるＢ型肺炎ウィルスのＤＮＡ重合酵素の遺伝子内には塩基変異が多く現れる。それらの部位のうち一部の塩基変異によってＢ型肺炎の治療剤であるアデフォビル（Ａｄｅｆｏｖｉｒ）に対する耐性が発生するが、アミノ酸Ａ１８１Ｖ／Ｔ，Ｎ２３６Ｔなどが原因突然変異として報告されている。一方、本発明によるトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅が多様な遺伝子型分析に利用可能であるのか否かを追加に確認するために、アデフォビル薬剤に耐性を有するＢ型肺炎ウィルスの遺伝子型分析をトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅の後、ＲＦＭＰ方法を利用して行った。本実施例３は、ＨＢＶ  ＤＮＡを対象に実施された。
【０１１３】
１．ＰＣＲ増幅
Ｂ型肺炎ウィスルのＤＮＡ重合酵素遺伝子の内の２３６番目のアミノ酸の塩基配列を分析するために一対の増幅プライマー（ＡＰ）を製作し、多形性を有する２３７番目のアミノ酸、２３８番目のアミノ酸の塩基配列に対して、多様なＨＢＶ  ＤＮＡ鋳型にそれぞれ特異的なプライマー、即ち、トリガープライマー（ＴＰ）を多数個設計した。このように設計製作された高濃度の増幅プライマー（ＡＰ）と低濃度のトリガープライマー（ＴＰ）の混合物を利用してＰＣＲを実施した。
【０１１４】
分析対象となるＨＢＶ遺伝子において、プライマーによって増幅される鋳型ＤＮＡの配列（５’→３’）は以下のようである。
【０１１５】
ＨＢＶ＃１（一般型）
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴａａａｃＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号３２）
ＨＢＶ＃２
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴａａａｃＣＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号３３）
ＨＢＶ＃３
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴａａａｃＣＣＴＧＡＴＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号３４）
ＨＢＶ＃４
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴａａａｃＣＣＴＣＡＴＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号３５）
ＨＢＶ＃５
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴａａａｃＣＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号３６）
ＨＢＶ＃６
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴａａａｃＣＡＴＡＣＴＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号３７）
ＨＢＶ＃７
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴａａａｃＣＡＴＧＡＴＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号３８）
ＨＢＶ＃８
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴａａａｃＣＡＴＣＡＴＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号３９）
ＨＢＶの鋳型ＤＮＡ配列のうち下線で示した配列は以下のプライマー１１乃至プライマー１９が結合される部位である。それぞれのＨＢＶ鋳型ＤＮＡ配列の前方に下線で示した部分はフォワードプライマーが結合する部位であり、それぞれのＨＢＶ鋳型ＤＮＡ配列の後方に下線で示した部分はリバースプライマーが結合する部位である。小文字で記された塩基は「遺伝子型分析可能配列」である。
【０１１６】
＊フォワードプライマー
プライマー１１．５’−ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ−３’（３９ｍｅｒ）（配列番号４０）
＊リバースプライマー
プライマー１２．５’−ＣＣＣＡＡＣＧＴＴＴｇｇａｔｇＧＧＴＴＴＴＡＴＴＡＧＧ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号４１）
プライマー１３．５’−ＣＣＣＡＡＣＧＴＴＴｇｇａｔｇＧＧＴＴＴＴＡＧＴＡＧＧ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号４２）
プライマー１４．５’−ＣＣＣＡＡＣＧＴＴＴｇｇａｔｇＧＧＴＴＴＴＡＴＣＡＧＧ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号４３）
プライマー１５．５’−ＣＣＣＡＡＣＧＴＴＴｇｇａｔｇＧＧＴＴＴＴＡＴＧＡＧＧ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号４４）
プライマー１６．５’−ＣＣＣＡＡＣＧＴＴＴｇｇａｔｇＧＧＴＴＴＴＡＴＴＡＴＧ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号４５）
プライマー１７．５’−ＣＣＣＡＡＣＧＴＴＴｇｇａｔｇＧＧＴＴＴＴＡＧＴＡＴＧ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号４６）
プライマー１８．５’−ＣＣＣＡＡＣＧＴＴＴｇｇａｔｇＧＧＴＴＴＴＡＴＣＡＴＧ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号４７）
プライマー１９．５’−ＣＣＣＡＡＣＧＴＴＴｇｇａｔｇＧＧＴＴＴＴＡＴＧＡＴＧ−３’（２７ｍｅｒ）（配列番号４８）
ＨＢＶ＃１  ＤＮＡ鋳型を基準にすると、フォワードプライマーであるプライマー１１は増幅プライマー（ＡＰ）であり、前記リバースプライマーのうちプライマー１２は増幅プライマー（ＡＰ）であり、プライマー１３乃至プライマー１９はトリガープライマー（ＴＰ）でとなる。フォワードプライマーは３’末端の配列で１９個の塩基をＨＢＶ  ＤＮＡ鋳型に相補的に設計し、リバースプライマーは３’末端の配列で１２個の塩基をＨＢＶ  ＤＮＡ鋳型に相補的に設計した。前記プライマーにおいて、小文字で記された配列はＦｏｋＩ制限酵素認識配列であって、本実施例ではＲＦＭＰ方法を利用するためにＦｏｋＩの制限酵素認識配列を挿入した。
【０１１７】
例えば、プライマー１１はフォワード増幅プライマー（ＡＰ）として全てのＨＢＶ遺伝子型において３’末端の１９個の塩基配列が一致するように設計し、プライマー１２はリバース増幅プライマー（ＡＰ）としてＨＢＶ＃１  ＤＮＡ鋳型を基準にすると３’末端の１２個の塩基配列が一致するように設計するが、全てのＨＢＶ遺伝子型に対しても３’末端の１２個の塩基配列が１〜２個の塩基配列、最大限連続的に３つの塩基配列とのミスマッチングを許容しながら相補的に結合するように設計した。
【０１１８】
そして、変種ＨＢＶの場合、ＤＮＡの３’末端で一般型ＨＢＶとは異なる塩基配列を有している点を踏まえて、プライマー１３乃至１９はＨＢＶ  ＤＮＡの２３７番目のアミノ酸塩基配列及び２３８番目のアミノ酸塩基配列に対する変異別特異的なプライマーとして設計した。即ち、プライマー１３はＨＢＶ＃２に相補的なリバーストリガープライマー（ＴＰ）として３’末端の５番目の塩基（Ｇ）を前記プライマー１２とは異なるように変異を与えて特異的に設計し（太文字で記した塩基参照）、プライマー１４はＨＢＶ＃３に相補的なリバーストリガープライマー（ＴＰ）として３’末端の４番目の塩基（Ｃ）を前記プライマー１２とは異なるように変異を与えて特異的に設計し（太文字で記した塩基参照）、プライマー１５はＨＢＶ＃４に相補的なリバーストリガープライマー（ＴＰ）として３’末端の４番目の塩基（Ｇ）を前記プライマー１２とは異なるように変異を与えて特異的に設計し（太文字で記した塩基参照）、プライマー１６はＨＢＶ＃５に相補的なリバーストリガープライマー（ＴＰ）として３’末端の２番目の塩基（Ｔ）を前記プライマー１２とは異なるように変異を与えて特異的に設計し（太文字で記した塩基参照）、プライマー１７はＨＢＶ＃６に相補的なリバーストリガープライマー（ＴＰ）として３’末端の２番目の塩基（Ｔ）及び５番目の塩基配列（Ｇ）を前記プライマー１２とは異なるように変異を与えて特異的に設計し（太文字で記した塩基参照）、プライマー１８はＨＢＶ＃７に相補的なリバーストリガープライマー（ＴＰ）として３’末端の２番目の塩基（Ｔ）及び４番目の塩基配列（Ｃ）を前記プライマー１２とは異なるように変異を与えて特異的に設計し（太文字で記した塩基参照）、最後にプライマー１９はＨＢＶ＃８に相補的なリバーストリガープライマー（ＴＰ）として３’末端の２番目の塩基（Ｔ）及び４番目の塩基配列（Ｇ）を前記プライマー１２とは異なるように変異を与えて特異的に設計した（太文字で記した塩基参照）。
【０１１９】
ＰＣＲ緩衝溶液（ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）（１ｘ）、ＭｇＳＯ４  ２ｍＭ、ｄＮＴＰ  ２００ｍＭ、白金Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１０９６６−０２６）  ０．５Ｕ、プライマー１１とプライマー１２をそれぞれ０．４μＭ、プライマー１３とプライマー１４をそれぞれ０．０７μＭ、プライマー１５とプライマー１６をそれぞれ０．０４μＭ、プライマー１７、１８及び１９はそれぞれ０．０５μＭ、分析対象となるＨＢＶ  ＤＮＡ  １００ｎｇを入れ、総反応体積を２５μｌに合わせた。そして、以下のような条件でＰＣＲ反応を行った（図１のステップ（Ａ）に当たる）
９４℃５分、
９４℃１５秒  ４５℃１５秒  ７２℃１５秒（４５サイクル）、
７２℃５分。
【０１２０】
初期ＰＣＲ反応によっては、それぞれのＨＢＶ鋳型に相補的なトリガープライマー（ＴＰ）が結合してＰＣＲ増幅されて増幅産物が生成される（図１のステップ（Ａ）に当たる）。この際、ＨＢＶ＃２  ＤＮＡ鋳型にはプライマー１１及びプライマー１３、ＨＢＶ＃３  ＤＮＡ鋳型にはプライマー１１及びプライマー１４、ＨＢＶ＃４  ＤＮＡ鋳型にはプライマー１１及びプライマー１５、  ＨＢＶ＃５  ＤＮＡ鋳型にはプライマー１１及びプライマー１６、ＨＢＶ＃６  ＤＮＡ鋳型にはプライマー１１及びプライマー１７、ＨＢＶ＃７  ＤＮＡ鋳型にはプライマー１１及びプライマー１８、そしてＨＢＶ＃８  ＤＮＡ鋳型にはプライマー１１及びプライマー１９が結合して以下のような増幅産物が生成され、ＨＢＶ＃１  ＤＮＡ鋳型には初期反応から増幅プライマー（ＡＰ）であるプライマー１１及びプライマー１２が結合し、以下のような増幅産物が生成される。それぞれのＨＢＶ  ＤＮＡ鋳型において、初期ＰＣＲ反応（１０〜１５サイクル）によって生成されるＨＢＶ  ＤＮＡ断片の配列は以下のようである（５’→３’）。
【０１２１】
ＨＢＶ＃１（一般型）
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号４９）
ＨＢＶ＃２
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号５０）
ＨＢＶ＃３
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＣＴＧＡＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号５１）
ＨＢＶ＃４
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＣＴＣＡＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号５２）
ＨＢＶ＃５
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号５３）
ＨＢＶ＃６
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＡＴＡＣＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号５４）
ＨＢＶ＃７
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＡＴＧＡＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号５５）
ＨＢＶ＃８
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＡＴＣＡＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号５６）
一方、それぞれのＨＢＶ  ＤＮＡ鋳型に特異的なトリガープライマー（ＴＰ）が結合（ＨＢＶ＃１  ＤＮＡの場合、増幅プライマー（ＡＰ）がトリガープリマー（ＴＰ）の役割をしてＨＢＶ＃１  ＤＮＡ鋳型に結合）して増幅が行われるが、ＰＣＲ増幅過程において初期に低濃度で入れたトリガープライマー（ＴＰ）が全て消尽されてそれぞれのＨＢＶ  ＤＮＡ断片が一定濃度まで増幅された後には、それぞれのＨＢＶ  ＤＮＡ断片のプライマー結合配列一部においてトリガープライマー（ＴＰ）とは一部配列が異なる増幅プライマー（ＡＰ）がＨＢＶ  ＤＮＡ鋳型に結合して増幅が行われるようになる（図１のステップ（Ｂ））。これは、増幅プライマー（ＡＰ）であるプライマー１２の最初設計の際、全てのＨＢＶ遺伝子型において３’末端の１２個の塩基配列が１〜２個の塩基配列、最大限連続的に３つの塩基配列とのミスマッチングを許容しながら相補的に結合するように設計し、ＰＣＲ増幅の際、トリガープライマー（ＴＰ）より高濃度で入れたため可能であるといえる。
【０１２２】
これで、本実施例によると、「遺伝子型分析可能配列」のみが多様なＨＢＶ  ＤＮＡ鋳型によって複製され、その他の配列（以下の塩基配列で大括弧（［］）で示した塩基配列を除いた配列）は増幅プライマー（ＡＰ）によって複製されて同じ塩基配列を有するようになる（図１のステップ（Ｃ））。最終ＰＣＲ増幅生成物は増幅プライマー（ＡＰ）による増幅生成物が大部分を占めるようになり、トリガープライマー（ＴＰ）による増幅生成物は分析結果に影響を及ぼさないほどの微量のみが存在する。それぞれのＨＢＶ  ＤＮＡ鋳型において、最終的に生成されるＨＢＶ  ＤＮＡ断片の配列は以下のようである（５’→３’）。
【０１２３】
ＨＢＶ＃１（一般型）
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号５７）
ＨＢＶ＃２
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号５８）
ＨＢＶ＃３
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号５９）
ＨＢＶ＃４
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号６０）
ＨＢＶ＃５
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号６１）
ＨＢＶ＃６
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号６２）
ＨＢＶ＃７
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号６３）
ＨＢＶ＃８
ＴＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴｇｇａｔｇＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴ［ａａａｃ］ＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＣＣｃａｔｃｃＡＡＡＣＧＴＴＧＧＧ（配列番号６４）
前記ＰＣＲを介して生成された配列において、小文字で記された部位は制限酵素認識配列であり、下線で示した部位は制限酵素による切断によって生成される断片の配列であり、大括弧（［］）で示した部位は「遺伝子型分析可能配列」である。前記増幅生成物の生成原理は、実施例１と同じである。
【０１２４】
一方、本発明ではＨＢＶ＃１からＨＢＶ＃８に対してのみトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅を実施したが、上述した他の多様な変種ＨＢＶに対してもトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅を応用することができるということは本発明が属した技術分野の当業者であれば容易に理解できるはずである。
【０１２５】
２．制限酵素による切断、精製及び脱塩  
実施例１と同じ方法で行った。
【０１２６】
３．マルディ・トフマススペクトロメトリー
実施例１と同じ方法で行った。
【０１２７】
前記反応によって生成された断片の分子量をマルディ・トフマススペクトロメトリーで分析した結果は図８乃至図９に示したようであり、多様なＨＢＶに対する分析結果を整理して分子量として下記表３に示した。下記表３の結果に基づいて、ＨＢＶ遺伝子型を決定することができる。
【０１２８】
下記表３は増幅プライマー（ＡＰ）によって増幅された生成物に基づいて予測した断片の分子量を示したものであって、トリガープライマー（ＴＰ）によって増幅された生成物による断片の分子量とは差がある。本実施例によると、それぞれのトリガープライマー（ＴＰ）を反応濃度以上で混合した際には増幅プライマー（ＡＰ）による断片の分子量とトリガープライマー（ＴＰ）による断片の分子量が同時に現れることを確認することができた。それぞれのトリガープライマー（ＴＰ）を反応濃度以下で混合した際には該当ＨＢＶ遺伝子の分析が行われなかった。
【０１２９】
一方、図８には塩基変異の際、アデフォビルへの耐性を誘発するＨＢＶ重合酵素の２３６番目のコドンがＡＡＣで、アミノ酸アスパラギン（Ａｓｎ）をコーディングする野生型ＨＢＶ遺伝子型である場合のマルディ・トフマススペクトロメトリーグラフが示されており、図９には塩基変異の際、アデフォビルへの耐性を誘発するＨＢＶ重合酵素の２３６番目のコドンがＡＣＴで、アミノ酸トレオニン（Ｔｈｒ）をコーディングする突然変異型ＨＢＶ遺伝子型である場合のマルディ・トフマススペクトロメトリーグラフが示されている。これらのマルディ・トフマススペクトロメトリーグラフを分析すると、本実施例による増幅産物では増幅プライマー（ＡＰ）による断片の分子量のみが確認されることが分かる。よって、本発明によるトリガープライマー（ＴＰ）と増幅プライマー（ＡＰ）を利用したＰＣＲ増幅の後、ＲＦＭＰ方法は多数の変種遺伝子を簡便で効率的にもれなく増幅することができ、多数の遺伝子型を精密に分析することができる長所がある。
【０１３０】
【表３】
2013529898.tif 000005
【０１３１】
以上、本発明を前記実施例を挙げて説明したが、本発明はこれに制限されるものでない。当業者であれば本発明の趣旨および範囲を外れることなく修正、変更することができ、このような修正と変更もまた本発明に属するものであることを知ることができる。
【図２】
2013529898.tif 000006
【図３】
2013529898.tif 000007
【図４】
2013529898.tif 000008
【図５】
2013529898.tif 000009
【図６】
2013529898.tif 000010
【図７】
2013529898.tif 000011
【図８】
2013529898.tif 000012
【図９】
2013529898.tif 000013
【図１】
2013529898.tif 000014
【配列表】
2013529898000001.app
【国際調査報告】
2013529898.tif 000015
2013529898.tif 000016
2013529898.tif 000017
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2013529898.tif 000023
2013529898.tif 000024