(57)【要約】  Bリンパ球刺激因子アンタゴニストを投与することによって、患者における喘息、アレルゲン誘発性呼吸器症状及び/又は肺若しくは呼吸器系のアレルギー性若しくは炎症性症状を予防する、治療する及び改善する方法を提供する。さらに、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストを投与することによって、喘息及び/又は肺若しくは呼吸器系のアレルギー性若しくは炎症性症状を罹患している患者における総血清IgEレベルを低下させる方法を提供する。Bリンパ球刺激因子アンタゴニストを投与することによって、アレルゲン誘発性気道過敏症又は患者の気道上皮における粘液含有細胞及び/若しくは粘液蓄積若しくは産生における増大を治療する、予防する又は改善する方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における喘息を治療する、予防する又は改善する方法であって、有効量の抗Bリンパ球刺激因子抗体を患者に投与し、それによって、患者における喘息を治療する、予防する又は改善するステップを含む、方法。
【請求項２】
抗Bリンパ球刺激因子抗体が患者における喘息症状の発症より前に最初に投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
喘息の症状が、喘鳴、咳嗽、胸部絞扼感、気流閉塞、気管支痙攣、気管支収縮及び息切れからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
患者における肺又は呼吸器系の炎症性症状を治療する、予防する又は改善する方法であって、有効量の抗Bリンパ球刺激因子抗体を患者に投与し、それによって、患者における肺又は呼吸器系炎症を治療する、予防する又は改善するステップを含む、方法。
【請求項５】
炎症性症状がアレルゲン誘発性気道過敏症の増進によって特徴付けられる、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
炎症性症状が粘液含有細胞、粘液蓄積又は粘液産生の増大によって特徴付けられる、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
炎症性症状が肺における細胞浸潤の増大によって特徴付けられる、請求項4に記載の方法。
【請求項８】
細胞浸潤の増大が肺への免疫細胞の浸潤の増大によるものである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
免疫細胞が、B細胞、T細胞、好酸球、好中球、マスト細胞及び他の白血球からなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
炎症性症状が、肺の急性又は慢性の炎症、肺炎、肺気腫、炎症性肺傷害、閉塞性細気管支炎、慢性気管支炎、肺サルコイドーシス、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、間質性肺疾患、特発性肺線維症、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、気管支拡張症、肺好酸球増加症、間質性線維症、嚢胞性線維症及び慢性副鼻腔炎からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
【請求項１１】
抗Bリンパ球刺激因子抗体が肺又は呼吸器系の炎症性症状の症状の発症より前に最初に投与される、請求項4に記載の方法。
【請求項１２】
肺又は呼吸器系の炎症性症状の症状が、喘鳴、咳嗽、胸部絞扼感、気流閉塞、気管支痙攣、気管支収縮及び息切れからなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
患者における肺又は呼吸器系のアレルギー性症状を治療する、予防する又は改善する方法であって、有効量の抗Bリンパ球刺激因子抗体を患者に投与し、それによって、患者における肺又は呼吸器系のアレルギー性症状を減少させる、治療する、予防する又は改善するステップを含む、方法。
【請求項１４】
アレルギー性症状が、外因性アレルギー性肺胞炎(過敏性肺炎)、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、急性及び慢性好酸球性肺炎、チャーグ・ストラウス症候群並びに特発性好酸球増多症候群からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
喘息又は肺若しくは呼吸器系のアレルギー性若しくは炎症性症状を罹患している患者における総血清IgEレベル又は抗原特異的IgEレベルを低下させる方法であって、有効量の抗Bリンパ球刺激因子抗体を患者に投与し、それによって、患者における総血清IgEレベル又は抗原特異的IgEレベルを低下させるステップを含む、方法。
【請求項１６】
患者におけるアレルゲン誘発性気道過敏症を治療する、予防する又は改善する方法であって、有効量の抗Bリンパ球刺激因子抗体を患者に投与し、それによって、患者におけるアレルゲン誘発性気道過敏症を治療する、予防する又は改善するステップを含む、方法。
【請求項１７】
患者の気道上皮における粘液含有細胞又は粘液蓄積若しくは産生におけるアレルゲン誘発性増大を治療する、予防する又は改善する方法であって、有効量の抗Bリンパ球刺激因子抗体を患者に投与し、それによって、患者の気道上皮での粘液含有細胞又は粘液蓄積若しくは産生におけるアレルゲン誘発性増大を治療する、予防する又は改善するステップを含む、方法。
【請求項１８】
肺又は呼吸器系のアレルギー性又は炎症性症状を有すると診断された患者の肺におけるアレルゲン誘発性細胞浸潤を抑制する又は低下させる方法であって、有効量の抗Bリンパ球刺激因子抗体を患者に投与し、それによって、患者の肺におけるアレルゲン誘発性細胞浸潤を抑制する又は低下させるステップを含む、方法。
【請求項１９】
細胞浸潤における増大が免疫細胞の肺への浸潤における増大によるものである、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
免疫細胞が、B細胞、T細胞、好酸球、好中球、マスト細胞及び他の白血球からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
炎症性症状が、肺の急性又は慢性の炎症、肺炎、肺気腫、炎症性肺傷害、閉塞性細気管支炎、慢性気管支炎、肺サルコイドーシス、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、間質性肺疾患、特発性肺線維症、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、気管支拡張症、肺好酸球増加症、間質性線維症、嚢胞性線維症及び慢性副鼻腔炎からなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
【請求項２２】
アレルギー性症状が、外因性アレルギー性肺胞炎(過敏性肺炎)、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、急性及び慢性好酸球性肺炎、チャーグ・ストラウス症候群並びに特発性好酸球増多症候群からなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
【請求項２３】
患者の気道上皮におけるサイトカイン産生のアレルゲン誘発性増大を治療する、予防する又は改善する方法であって、有効量の抗Bリンパ球刺激因子抗体を患者に投与し、それによって、患者の気道上皮におけるサイトカイン産生のアレルゲン誘発性増大を治療する、予防する又は改善するするステップを含む、方法。
【請求項２４】
抗Bリンパ球刺激因子抗体が、配列番号61のアミノ酸残基1〜123を含む第1アミノ酸配列と、配列番号61のアミノ酸残基141〜249を含む第2アミノ酸配列とを含む、請求項1から23のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
抗Bリンパ球刺激因子抗体がベリムマブである、請求項1から23のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
抗Bリンパ球刺激因子抗体が静脈注射、皮下注射又は噴霧によって患者に投与される、請求項1から25のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
抗Bリンパ球刺激因子抗体が1、2、4又は6カ月ごとに1回投与される、請求項1から26のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
患者におけるアレルゲンへの耐性を促進する方法であって、有効量のBリンパ球刺激因子アンタゴニストをアレルゲンへの暴露の前、間又は後に、患者に投与し、それによって、患者における喘息の又は肺若しくは呼吸器系のアレルギー性若しくは炎症性症状の症状を改善する又は予防し、アレルゲンへの耐性を促進するステップを含む、方法。
【請求項２９】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストが:
(a)TACIのBリンパ球刺激因子結合ドメインを含むタンパク質;
(b)BCMAのBリンパ球刺激因子結合ドメインを含むタンパク質;
(c)BAFF-RのBリンパ球刺激因子結合ドメインを含むタンパク質;
(d)Bリンパ球刺激因子結合ペプチド;
(e)Bリンパ球刺激因子ペプチボディー;
(f)Bリンパ球刺激因子タンパク質変種;
(g)抗Bリンパ球刺激因子抗体;及び
(h)抗Bリンパ球刺激因子受容体抗体
からなる群から選択される、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストが抗Bリンパ球刺激因子抗体である、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
抗Bリンパ球刺激因子抗体が、配列番号61のアミノ酸残基1〜123を含む第1アミノ酸配列と、配列番号61のアミノ酸残基141〜249を含む第2アミノ酸配列とを含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
抗Bリンパ球刺激因子抗体がベリムマブである、請求項30に記載の方法。
【請求項３３】
抗Bリンパ球刺激因子抗体が:
(a)可溶性Bリンパ球刺激因子タンパク質;
(b)膜結合Bリンパ球刺激因子タンパク質;
(c)配列番号2のアミノ酸残基1〜285のアミノ酸配列;
(d)配列番号2のアミノ酸残基134〜285のアミノ酸配列;
(e)(d)の三量体;及び
(f)配列番号2のポリペプチドの断片のアミノ酸配列であって、断片が少なくとも長さ30アミノ酸であり、B細胞の増殖、分化又は生存を刺激できるアミノ酸配列
からなる群から選択されるタンパク質に結合する、請求項30から32のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストが静脈注射、皮下注射又は噴霧によって患者に投与される、請求項29から33のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストが1、2、4又は6カ月ごとに1回投与される、請求項29から34のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストが喘息の又は肺若しくは呼吸器系のアレルギー性若しくは炎症性症状の症状の発症より前に最初に投与される、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
喘息の又は肺若しくは呼吸器系のアレルギー性若しくは炎症性症状の症状が、喘鳴、咳嗽、胸部絞扼感、気流閉塞、気管支痙攣、気管支収縮及び息切れからなる群から選択される、請求項36に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は喘息並びに呼吸器系の他のアレルギー性及び炎症性症状を治療するためのBリンパ球刺激タンパク質アンタゴニストの使用に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本特許出願は、参照により組み込まれる2010年6月18日出願米国仮特許出願第61/356,485号、2010年10月1日出願米国仮特許出願第61/389,018号及び2011年5月21日出願米国仮特許出願第61/488,730号の優先権を主張するものである。
【０００３】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
2011年6月17日に作成された、One 113,726Byte ASCII(Text)、ファイル名「SEQUENCELISTING.TXT」として識別され、本明細書と同時に提出されるコンピューターで読み取り可能なヌクレオチド/アミノ酸配列リストの全体を参照により本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００４】
喘息は、世界人口の7%が罹患している肺の慢性炎症性症状である。喘息は、喘鳴、胸部絞扼感、息切れ及び咳嗽を含む呼吸器症状の再発エピソード、変動する気道閉塞、気道過敏症の存在並びに慢性の気道炎症によって特徴付けられる。喘息は、全ての年齢の人々を冒すが、ほとんどの場合は小児期に始まる。合衆国では、2200万を超える人々が喘息を有することが周知であり、これらの人々の600万人近くは小児である。
【０００５】
喘息の病因の根本的となる機序を理解することにおいて進展はあるが、喘息の治療法は無い。現在の喘息治療は、喘息の症状を管理することに向けられており、気道炎症を抑制し、気管支収縮を軽減することに主に向けられている。これら全ての治療は、喘息の原因の下流にそれらの作用を発揮する。例えば慣用の喘息治療は、症状が始まった際に管理するための即効性軽減用吸引器と組み合わせて再発を予防するための長期管理薬物療法の使用を含む。副腎皮質ステロイドは、長期の喘息薬物療法で最も慣用的に処方される種類である。しかし、白内障、骨粗鬆症及び感染に関する危険の増大、副腎ホルモン産生の抑制並びに創傷治癒の低下を含む、副腎皮質ステロイドの長期使用に関連する多数の副作用がある。したがって喘息の症状を予防し、長期間の副腎皮質ステロイド治療の必要を回避するために喘息の上流メディエーターを標的にすることは望ましい。
【０００６】
マスト細胞、好酸球、Tリンパ球、マクロファージ、好中球及び上皮細胞を含む種々の細胞型が喘息並びに慢性副鼻腔炎などの呼吸器系の他のアレルギー性及び炎症性症状の病因において重要な役割を演じることが示されている。付加的にB細胞は、IgE産生及び続く好塩基球及びマスト細胞の活性化及び脱顆粒を介して疾患を引き起こすアレルギー応答の上流メディエーターとして関与している。
【０００７】
前述の観点から、B細胞を標的化することによって喘息並びに呼吸器系の他のアレルギー性及び炎症性症状を治療する、予防する及び/又は改善する方法が必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、喘息、アレルゲン誘発性呼吸器症状並びに呼吸器系(例えば鼻孔、上咽頭、咽頭、気管、細気管支、気管支、肺及び/又は肺胞)の他のアレルギー性及び炎症性症状を治療する、予防する及び/又は改善するためのBリンパ球刺激因子アンタゴニストの使用方法を提供する。
【０００９】
本発明の一実施形態は、患者において喘息を治療する、予防する又は改善する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、患者において喘息を治療する、予防する又は改善するステップを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の他の実施形態は、患者において、外因性アレルギー性肺胞炎(過敏性肺炎)並びに、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、急性及び慢性好酸球性肺炎、チャーグ・ストラウス症候群及び特発性好酸球増多症候群を含む好酸球性肺傷害などの肺又は呼吸器系のアレルギー性症状を治療する、予防する又は改善する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者において肺又は呼吸器系のアレルギー性症状を治療する、予防する又は改善するステップを含む方法を提供する。肺又は呼吸器系のアレルギー性症状は、アレルゲン誘発性気道過敏症の増進及び/又は粘液含有細胞の増加によって特徴付けられる。付加的に肺又は呼吸器系のアレルギー性症状は、B細胞、マスト細胞又は他の白血球及びリンパ球などの免疫系細胞の細胞浸潤の増大によって特徴付けられる。
【００１１】
本発明の他の実施形態は、患者における慢性副鼻腔炎などの呼吸器系(例えば鼻孔、上咽頭、咽頭、気管、細気管支、気管支、肺及び/又は肺胞)の炎症性症状を治療する、予防する又は改善する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者における呼吸器系のアレルギー性炎症性症状を治療する、予防する又は改善するステップを含む方法を提供する。
【００１２】
本発明の他の実施形態は、患者における肺の炎症性症状を治療する、予防する又は改善する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者における肺炎症を減少させる、治療する、予防する又は改善するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
肺又は呼吸器系の炎症性症状は、アレルゲン誘発性気道過敏症の増進及び/又は粘液含有細胞の増加によって特徴付けられる。付加的に肺又は呼吸器系の炎症性症状は、B細胞、マスト細胞又は他の白血球及びリンパ球などの免疫系細胞の細胞浸潤の増大によって特徴付けられる。
【００１４】
本発明の他の実施形態は、喘息又は鼻孔、上咽頭、咽頭、気管、細気管支、気管支、肺及び/若しくは肺胞のアレルギー性若しくは炎症性症状を罹患している患者において総血清IgEレベルを低下させる方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者において総血清IgEレベルを低下させるステップを含む方法を提供する。他の実施形態において本発明は、喘息又は鼻孔、上咽頭、咽頭、気管、細気管支、気管支、肺及び/若しくは肺胞のアレルギー性若しくは炎症性症状を罹患している患者においてIgEレベルのアレルゲン誘発性増大を低下させる方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者においてIgEレベルのアレルゲン誘発性増大を低下させるステップを含む方法を提供する。
【００１５】
本発明の他の実施形態は、患者においてアレルゲン誘発性気道過敏症を予防する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者においてアレルゲン誘発性気道過敏症を予防するステップを含む方法を提供する。
【００１６】
本発明の他の実施形態は、患者の気道上皮における粘液含有細胞のアレルゲン誘発性増大を予防する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者の気道上皮における粘液含有細胞のアレルゲン誘発性増大を予防するステップを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の実施形態は、患者においてアレルゲン誘発性気道過敏症を治療する又は改善する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者においてアレルゲン誘発性気道過敏症を抑制するステップを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明の他の実施形態は、患者の気道上皮の粘液含有細胞におけるアレルゲン誘発性増大を治療する又は改善する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者の気道上皮の粘液含有細胞におけるアレルゲン誘発性増大を抑制するステップを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明における使用のための好ましいアンタゴニストは、Bリンパ球刺激因子タンパク質に結合する抗体である。本発明における使用のための付加的なBリンパ球刺激因子アンタゴニストは:CALMタンパク質(TACI)のBリンパ球刺激因子結合ドメインを含むタンパク質;B細胞成熟抗原(BCMA)のBリンパ球刺激因子結合ドメインを含むタンパク質;B細胞活性化因子受容体(BAFF-R)のBリンパ球刺激因子結合ドメインを含むタンパク質;Bリンパ球刺激因子結合ペプチド又はポリペプチド;Bリンパ球刺激因子ペプチボディー;Bリンパ球刺激因子タンパク質変種;及び抗Bリンパ球刺激因子受容体抗体を含む。
【００２０】
続く図面は本発明の例示的実施形態であり、特許請求の範囲によって網羅される本発明の範囲を限定することを意味しない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】喘息のネズミモデルにおける抗BLyS抗体の予防的及び治療的投与の効果を例示する一連のグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)はオボアルブミン(OVA)20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作された。マウスは、33、35、37及び39日目にPBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによってチャレンジされた。10F4予防(Pro)と表示したマウスの一群はOVAでのチャレンジの前、20及び27日目にi.p.注射によってモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)100μgで処置された(予防群)。10F4治療(Ther)と表示した他のマウスの群は34日目にi.p.注射によってモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)100μgで処置された(治療群)。対照は、(1)34日目にi.p.注射によってアイソタイプ対照抗体(精製アメリカンハムスターIgG1(クローンG235-2356;BD Pharmingen))100μgで処置されたマウス群(Iso.Cont)、(2)34、36及び38日目(すなわちOVAチャレンジとは異なる日ごと)にi.p.注射によってPBS 100μl中の水溶性デキサメタゾン50μgで処置されたマウス群(Dex)、(3)PBSで感作及びチャレンジされたマウス群(PBS)、並びに(4)無処置のままとしたマウス群(Naive)を含んだ。全てのマウスは、40日目に屠殺された。図1Aは、各処置群(x軸)についてのIgEの総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。図1Bは、各処置群(x軸)についての脾臓におけるB220+B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。図1Cは、各処置群(x軸)についての血液中のB220+B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。図1Dは、各処置群(x軸)についての血清中のBLySタンパク質の総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。
【図２】喘息のネズミモデルにおける抗BLyS抗体の投与の効果を例示する一連のグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)はOVA 20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作された。マウスは、33、35、37、39、47、49、51及び53日目にPBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによってチャレンジされた。マウスは34、41及び48日目にi.p.注射によって、100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)又はアイソタイプ対照抗体のいずれかで処置された。全てのマウスは、54日目に屠殺された。図2Aは、各処置群(x軸)についてのIgEの総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。図2Bは、各処置群(x軸)についての脾臓におけるB220+B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。図2Cは、各処置群(x軸)についての血液中のB220+B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。図2Dは、各処置群(x軸)についての血清中のBLySタンパク質の総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。
【図３】喘息のネズミモデルにおける抗BLyS抗体の投与の効果を例示する一連のグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)はOVA 20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作された。マウスは、33、35、37、39、47、49、51、53、61、63、65及び67日目にPBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによってチャレンジされた。マウスは34、41、48及び55日目にi.p.注射によって、100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)又はアイソタイプ対照抗体のいずれかで処置された。全てのマウスは、68日目に屠殺された。図3Aは、各処置群(x軸)についてのIgEの総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。図3Bは、各処置群(x軸)についての脾臓におけるB220+B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。図3Cは、各処置群(x軸)についての血液中のB220+B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。図3Dは、各処置群(x軸)についての血清中のBLySタンパク質の総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。
【図４】喘息のネズミモデルにおける抗BLyS抗体の投与の長期的効果を例示する一連のグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)はOVA 20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作された。マウスは、33、35、37、39、47、49、51、53、61、63、65、67、120、122、124及び126日目にPBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによってチャレンジされた。マウスは34、41、48及び55日目にi.p.注射によって、100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)又はアイソタイプ対照抗体のいずれかで処置された。対照として、マウスはPBSで感作及びチャレンジされたか又は無処置のまま(Naive)のいずれかとした。全てのマウスは、127日目に屠殺された。図4Aは、各処置群(x軸)についてのIgEの総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。図4Bは、各処置群(x軸)についての脾臓におけるB220+B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。図4Cは、各処置群(x軸)についての血液中のB220+B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。
【図５】喘息のネズミモデルにおける抗BLyS抗体の投与の長期的効果を例示する一連のグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)はOVA 20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作された。マウスは、33、35、37、39、47、49、51、53、61、63、65、67、120、122、124、126、152、154、156及び158日目にPBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによってチャレンジされた。対照として、No Rxと表示されたマウスの一群は無処置のままとした。2X 10F4と表示されたマウスの一群は34及び41日目にi.p.注射によって、100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置された。4X 10F4と表示されたマウスの一群は34、41、48及び55日目にi.p.注射によって、100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置された。全てのマウスは、159日目に屠殺された。図5Aは、各処置群(x軸)についてのIgEの総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。図5Bは、各処置群(x軸)についての脾臓におけるB220+B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。図5Cは、各処置群(x軸)についての血液中のB220+B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。
【図６】喘息のネズミモデル由来の肺切片の写真である。OVA感作及びチャレンジされたマウスは、図1に示すとおり、100μgのモノクローナル抗BLyS抗体10F4又はアイソタイプ対照抗体のいずれかで2回処置された。肺切片は単離され、粘液蓄積及び細胞浸潤(すなわち、これだけに限らないがB細胞、T細胞、好酸球、好中球及び/又はマスト細胞を含む免疫系細胞の浸潤)を検出するためにヘマトキシリン/エオシン及びアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ(PAS)で染色された。
【図７】喘息のネズミモデル由来の肺切片の写真である。OVA感作及びチャレンジされたマウスは、図2に示すとおり、100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)又はアイソタイプ対照抗体のいずれかで3回処置された。肺切片は単離され、粘液蓄積及び細胞浸潤(すなわち、これだけに限らないがB細胞、T細胞、好酸球、好中球及び/又はマスト細胞を含む免疫系細胞の浸潤)を検出するためにヘマトキシリン/エオシン及びアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ(PAS)で染色された。
【図８】喘息のネズミモデル由来の肺切片の写真である。OVA感作及びチャレンジされたマウスは、図3に示すとおり、100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)又はアイソタイプ対照抗体のいずれかで4回処置された。肺切片は単離され、粘液蓄積及び細胞浸潤(すなわち、これだけに限らないがB細胞、T細胞、好酸球、好中球及び/又はマスト細胞を含む免疫系細胞の浸潤)を検出するためにヘマトキシリン/エオシン及びアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ(PAS)で染色された。
【図９】喘息のネズミモデル由来の肺切片の写真である。OVA感作及びチャレンジされたマウスは、図4に示すとおり、100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)又はアイソタイプ対照抗体のいずれかで4回処置された。肺切片は単離され、粘液蓄積及び細胞浸潤(すなわち、これだけに限らないがB細胞、T細胞、好酸球、好中球及び/又はマスト細胞を含む免疫系細胞の浸潤)を検出するためにヘマトキシリン/エオシン及びアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ(PAS)で染色された。
【図１０】喘息のネズミモデルにおけるOVA特異的IgEレベルについての抗BLyS抗体の予防的及び治療的投与の効果を例示するグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)は、図1に示すとおり処置され、OVA特異的IgEレベルが各処置群から単離された血清において検出された。図10は、各処置群(x軸)について血清中で検出されたOVA特異的IgEのpg/ml(y軸)を例示するグラフである。
【図１１】喘息のネズミモデル由来の肺切片の写真である。OVA感作及びチャレンジされたマウスは、図1に示すとおり、100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)(10F4治療と表示)又はアイソタイプ対照抗体(アイソタイプ対照治療と表示)のいずれかで34日目に処置された。肺切片は単離され、粘液蓄積及び細胞浸潤(すなわち、これだけに限らないがB細胞、T細胞、好酸球、好中球及び/又はマスト細胞を含む免疫系細胞の浸潤)を検出するためにヘマトキシリン/エオシン及びアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ(PAS)で染色された。
【図１２】喘息のネズミモデル由来の肺切片の写真である。メスBALB/cマウス(8-10週齢)は、オボアルブミン(OVA)20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作された。マウスは、33、35、37及び39日目にPBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによってチャレンジされた。10F4予防と表示されたマウスの一群は、OVAでのチャレンジの前、20及び27日目にi.p.注射によって、100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置された。アイソタイプ対照予防と表示された他のマウスの群は、OVAでのチャレンジの前、20及び27日目にi.p.注射によって、アイソタイプ対照抗体(精製アメリカンハムスターIgG1(クローンG235-2356;BD Pharmingen)で処置された。肺切片は単離され、粘液蓄積及び細胞浸潤(すなわち、これだけに限らないがB細胞、T細胞、好酸球、好中球及び/又はマスト細胞を含む免疫系細胞の浸潤)を検出するためにヘマトキシリン/エオシン及びアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ(PAS)で染色された。
【図１３】喘息のネズミモデルにおける細胞肺浸潤の量についての抗BLyS抗体の予防的及び治療的投与の効果を例示するグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)はオボアルブミン(OVA)20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作された。マウスは、33、35、37及び39日目にPBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによってチャレンジされた。10F4予防(Pro)と表示したマウスの一群はOVAでのチャレンジの前、20及び27日目にi.p.注射によってモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)100μgで処置された(予防群)。10F4治療(Ther)と表示した他のマウスの群を34日目にi.p.注射によってモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置した(治療群)。対照は、(1)OVAでのチャレンジの前、20及び27日目にi.p.注射によってアイソタイプ対照抗体(精製アメリカンハムスターIgG1(クローンG235-2356;BD Pharmingen))100μgで処置したマウス群(Iso.Pro)(予防群)、(2)34日目にi.p.注射によってアイソタイプ対照抗体(精製アメリカンハムスターIgG1(クローンG235-2356;BD Pharmingen))100μgで処置したマウス群(Iso.Ther)(治療群)、(3)34、36及び38日目(すなわちOVAチャレンジとは異なる日ごと)にi.p.注射によってPBS 100μl中の水溶性デキサメタゾン50μgで処置したマウス群(Dex)、(4)PBSで感作及びチャレンジしたマウス群(PBS)、並びに(5)無処置のままとしたマウス群(Naive)を含んだ。全てのマウスは、40日目に屠殺された。図13は、各処置群(x軸)について細胞浸潤によって覆われた肺面積の百分率(y軸)を例示するグラフである。*は、p値<0.05を表し、**はp<0.01を表す。
【図１４】喘息のネズミモデルにおける好酸球及びマスト細胞の肺浸潤の量についての抗BLyS抗体の治療的投与の効果を例示する一連のグラフである。OVA感作及びチャレンジされたマウスは、図1に示すとおり、100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)(10F4 Therと表示)又はアイソタイプ対照抗体(Isotype Therと表示)のいずれかで34日目に処置された。他の群のマウスは、PBSで感作及びチャレンジされた(PBSと表示)。図14Aは、各処置群(x軸)について肺面積1mm2あたりに検出された好酸球の数(y軸)を例示するグラフである。図14Bは、各処置群(x軸)について肺面積1mm2あたりに検出されたマスト細胞の数(y軸)を例示するグラフである。
【図１５】喘息のネズミモデルにおける抗BLyS抗体の予防的及び治療的投与の効果を例示する一連のグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)は、OVAで感作され、図1に示すとおり処置された。図15Aは、各処置群(x軸)について脾臓におけるB220+B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。図15Bは、各処置群(x軸)について血液中のB220+B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。
【図１６】喘息のネズミモデルにおける抗BLyS抗体及び抗IL-13抗体の予防的及び治療的投与の効果を例示する一連のグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)はオボアルブミン(OVA)20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作された。マウスは、33、35、37及び39日目にPBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによってチャレンジされた。予防処置群(すなわちOVAでのチャレンジの前)は、(1)20及び27日目にi.p.注射によって100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置されたマウス、10F4予防(Pro)と表示、(2)20及び27日目にi.p.注射によってアイソタイプ対照抗体(精製アメリカンハムスターIgG1(クローンG235-2356;BD Pharmingen))で処置されたマウス、アイソタイプ(Iso)予防(Pro)と表示、並びに(3)20及び27日目にi.p.注射によって100μgの抗IL-13抗体(R&D Systems;カタログ番号MAB413)で処置されたマウス、抗IL-13予防(Pro)と表示、を含む。治療処置群は、(1)34日目にi.p.注射によってモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置されたマウス、10F4治療(Ther)と表示、(2)34日目にi.p.注射によって100μgのアイソタイプ対照抗体(精製アメリカンハムスターIgG1(クローンG235-2356;BD Pharmingen))で処置されたマウス、アイソタイプ(Iso)治療(Ther)と表示、(3)34日目にi.p.注射によって100μgの抗IL-13抗体(R&D Systems;カタログ番号MAB413)で処置されたマウス、抗IL-13治療(Ther)と表示、並びに(4)34日目にi.p.注射によって100μgの抗IgE抗体(BD Pharmingen;カタログ番号553416)で処置されたマウス、抗IgE治療(Ther)と表示、を含んだ。予防的及び治療的アイソタイプ対照群に加えて、続く対照群(1)34、36及び38日目(すなわちOVAチャレンジとは異なる日ごと)にi.p.注射によってPBS 100μl中の水溶性デキサメタゾン50μgで処置されたマウス群(Dex)、(2)PBSで感作及びチャレンジされたマウス群(PBS)、並びに(3)無処置のままとしたマウス群(Naive)も含まれた。全てのマウスは、40日目に屠殺された。図16Aは、アイソタイプ予防、10F4予防、抗IL-13予防、デキサメタゾン、PBS及び無処置の群について(x軸)、血清中に検出されたIgEの総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。図16Bは、アイソタイプ治療、10F4治療、抗IL-13治療、抗IgE治療、PBS及び無処置の群について(x軸)、血清中に検出されたIgEの総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。
【図１７】喘息のネズミモデルにおける抗BLyS抗体及び抗IL-13抗体の予防的及び治療的投与の効果を例示するグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)は、図16に記載のとおりOVA感作及び処置された。図17は、各処置群について(x軸)、血清中に検出されたBLySタンパク質の総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。
【図１８】喘息のネズミモデルにおける抗BLyS抗体及び抗IL-13抗体の予防的及び治療的投与の効果を例示するグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)は、図16に記載のとおりOVA感作及び処置された。図18は、各処置群について(x軸)、気管支肺胞洗浄液中に検出されたIL-13タンパク質の総pg/ml(y軸)を例示するグラフである。
【図１９】喘息のネズミモデルにおける好酸球及び好中球細胞の肺浸潤の量についての抗BLyS抗体の治療的投与の効果を例示する一連のグラフである。OVA感作及びチャレンジされたマウスは、図1に示すとおり、100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)(10F4 Therと表示)又はアイソタイプ対照抗体(Iso Therと表示)のいずれかで34日目に処置された。他の群のマウスは、PBSで感作及びチャレンジされた(PBSと表示)。図19Aは、各処置群(x軸)について肺面積1mm2あたりに検出された好酸球の数(y軸)を例示するグラフである。図19Bは、各処置群(x軸)について肺面積1mm2あたりに検出された好中球の数(y軸)を例示するグラフである。
【図２０】喘息のネズミモデルにおける抗BLyS抗体の投与の効果を例示する一連のグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)はOVA 20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作された。マウスは、33、35、37及び39日目にPBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによってチャレンジされた。マウスは、34日目、36日目又は38日目にi.p.注射によって100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)又はアイソタイプ対照抗体のいずれかで処置された。全てのマウスは、40日目に屠殺された。図20Aは、各処置群(x軸)について血清中に検出されたIgEの総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。図20Bは、各処置群(x軸)について、脾臓におけるB220+B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。図20Cは、各処置群(x軸)について、肺におけるB220+B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。
【図２１】喘息のネズミモデルにおける抗BLyS抗体及び抗IL-13抗体の予防的及び治療的投与の効果を例示する一連のグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)は、図16に記載のとおり処置され、各処置群から単離された血清中においてOVA特異的IgEレベルが検出された。図21Aは、デキサメタゾン(Dex)、PBS及び無処置の群と比較して各予防処置群について(x軸)血清中に検出されたOVA特異的IgEのpg/ml(y軸)を例示するグラフである。図21Bは、デキサメタゾン(Dex)、PBS及び無処置の群と比較して各治療処置群について(x軸)血清中に検出されたOVA特異的IgEのpg/ml(y軸)を例示するグラフである。
【図２２】喘息のネズミモデル由来の肺切片の写真である。OVA感作及びチャレンジされたマウスは、図16に示すとおり、100μgの抗IL-13抗体(抗IL-13治療と表示)又は100μgの抗IgE抗体(抗IgE治療と表示)のいずれかで34日目に処置された。肺切片は単離され、粘液蓄積及び細胞浸潤(すなわち、これだけに限らないがB細胞、T細胞、好酸球、好中球及び/又はマスト細胞を含む免疫系細胞の浸潤)を検出するためにヘマトキシリン/エオシン及びアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ(PAS)で染色された。
【図２３】喘息のネズミモデル由来の肺切片の写真である。OVA感作及びチャレンジされたマウスは、図16に示すとおり、100μgの抗IL-13抗体で20及び27日目に(IL-13予防と表示)、又はPBS 100μl中の50μgの水溶性デキサメタゾンで34、36及び38日目に(デキサメタゾンと表示)のいずれかで処置された。肺切片は単離され、粘液蓄積及び細胞浸潤(すなわち、これだけに限らないがB細胞、T細胞、好酸球、好中球及び/又はマスト細胞を含む免疫系細胞の浸潤)を検出するためにヘマトキシリン/エオシン及びアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ(PAS)で染色された。
【図２４】慢性喘息のネズミモデルにおける抗BLyS抗体の投与の効果を例示する一連のグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)はOVA 20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作された。マウスは、33、35、37、39、54、56、58、60、73、75、77、79、93、95、97及び99日目にPBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによってチャレンジされた。マウスは、34及び41日目(d34/41)、61及び68日目(d61/68)又は80及び87日目(d80/87)にi.p.注射によって100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)又はアイソタイプ対照抗体のいずれかで処置された。アイソタイプ対照群に加えて、続く対照群(1)PBSで感作及びチャレンジされたマウス群(PBS)、並びに(2)OVAで感作及びチャレンジされ、無処置のままとしたマウス群(No Rx)も含まれた。全てのマウスは、100日目に屠殺された。図24Aは、各10F4処置群並びにPBS及び無処置対照群(x軸)について血清中のIgEの総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。図24Bは、各10F4処置群及び無処置対照群(x軸)について、BAL液中のIgEの総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。
【図２５】慢性喘息のネズミモデルにおける抗BLyS抗体の投与の効果を例示するグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)は図24に示すとおりOVA感作及び処置された。図25は、未処置群を除く各処置群について(x軸)、肺におけるB220+B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。
【図２６】慢性喘息のネズミモデルにおける抗BLyS抗体の投与の効果を例示する一連のグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)は図24に示すとおりOVA感作及び処置された。図26Aは、各10F4処置群及び無処置対照群について(x軸)気管支肺胞洗浄液中に検出されたIL-13タンパク質の総pg/ml(y軸)を例示するグラフである。図26Bは、各10F4処置群並びに無処置及びPBS対照群について(x軸)気管支肺胞洗浄液中に検出されたIL-4タンパク質の総pg/ml(y軸)を例示するグラフである。図26Cは、各10F4処置群並びに無処置及びPBS対照群について(x軸)気管支肺胞洗浄液中に検出されたIL-5タンパク質の総pg/ml(y軸)を例示するグラフである。図26Dは、各10F4処置群並びに無処置及びPBS対照群について(x軸)気管支肺胞洗浄液中に検出されたTNF-αタンパク質の総pg/ml(y軸)を例示するグラフである。
【図２７】慢性喘息のネズミモデル由来の肺切片の写真である。OVA感作及びチャレンジされたマウスは、未処置のままである(No Rxと表示)又は、図24に示すとおり、100μgモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で34及び41日目(d34/41 10F4Rxと表示)に、61及び68日目(d61/68 10F4Rxと表示)に又は80及び87日目(d80/87 10F4Rxと表示)に処置された。肺切片は単離され、粘液蓄積及び細胞浸潤(すなわち、これだけに限らないがB細胞、T細胞、好酸球、好中球及び/又はマスト細胞を含む免疫系細胞の浸潤)を検出するためにヘマトキシリン/エオシン及びアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ(PAS)で染色された。
【図２８】慢性喘息のネズミモデルにおける循環血清中のIgEレベルへのOVA感作及びチャレンジの長期的効果を例示するグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)はOVA 20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作された。マウスは、33、35、37、39、47、49、51、53、61、63、65、67、120、122、124、126、152、154、156、158、249、251、253及び255日目にPBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによってチャレンジされた。対照マウスは未処置のままとした(naive)。マウスは、実験経過全体を通じて40、54、68、127、159及び256日目に屠殺された。図28は、各処置群(x軸)について血清中のIgEの総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。
【図２９】慢性喘息のネズミモデルにおける抗BLyS抗体の投与の長期的効果を例示するグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)は図28に示すとおりOVAで感作及びチャレンジされた。マウスは、34、41、48及び55日目にi.p.注射によって100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置された(4x 10F4)又は対照として無処置のまま(No Rx)のいずれかとした。マウスは、実験経過全体を通じて54、68、127及び256日目に屠殺された。図29は、各処置群(x軸)について血清中のIgEの総ng/ml(y軸)を例示するグラフである。
【図３０】慢性喘息のネズミモデルでの細胞肺浸潤の量における抗BLyS抗体の投与の効果を例示するグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)は図28に示すとおりOVAで感作及びチャレンジされた。マウスは、34及び41日目に(10F4 2x)、又は34、41、48及び55日目に(4x 10F4)i.p.注射によって100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置された。対照は、(1)OVA感作及びチャレンジされ、未処置のままとしたマウスの群(UnRx)、並びに(2)未処置のままとした(すなわちマウスは感作、チャレンジ又は処置されなかった)マウスの群(naive)を含んだ。マウスは、68日目に屠殺された。図30は、各処置群(x軸)について細胞浸潤によって覆われた肺面積の百分率(y軸)を例示するグラフである。*は、無処置マウス(Unrx)と比較したp値<0.05を表す。
【図３１】慢性喘息のネズミモデル由来の肺切片の写真である。メスBALB/cマウス(8-10週齢)は図28に示すとおりOVA感作及びチャレンジされた。マウスは、34、41、48及び55日目にi.p.注射によって100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置された(4X 10F4)又は対照として無処置のままとした(No Rx)。マウスは54及び68日目に屠殺された。肺切片は単離され、粘液蓄積及び細胞浸潤(すなわち、これだけに限らないがB細胞、T細胞、好酸球、好中球及び/又はマスト細胞を含む免疫系細胞の浸潤)を検出するためにヘマトキシリン/エオシン及びアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ(PAS)で染色された。
【図３２】慢性喘息のネズミモデル由来の肺切片の写真である。メスBALB/cマウス(8-10週齢)は図28に示すとおりOVA感作及びチャレンジされた。マウスは、34、41、48及び55日目にi.p.注射によって100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置された(4X 10F4)又は対照として無処置のままとした(No Rx)。マウスは、127及び159日目に屠殺された。肺切片は単離され、粘液蓄積及び細胞浸潤(すなわち、これだけに限らないがB細胞、T細胞、好酸球、好中球及び/又はマスト細胞を含む免疫系細胞の浸潤)を検出するためにヘマトキシリン/エオシン及びアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ(PAS)で染色された。
【図３３】慢性喘息のネズミモデルでの脾臓中でのB細胞再構成についての抗BLyS抗体の投与の効果を例示するグラフである。メスBALB/cマウス(8-10週齢)は図28に示すとおりOVA感作及びチャレンジされ、34日目に(10F4)、34及び41日目に(2X 10F4)又は34、41、48及び55日目に(4x 10F4)i.p.注射によって100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置された。対照として一群のマウスを無処置のままとした(すなわちマウスは感作、チャレンジ又は処置されなかった)(naive)。マウスは、実験経過全体を通じて40、68、159及び256日目に屠殺された。図33は、各処置群について(x軸)、脾臓中に検出された正常化B細胞の百分率(y軸)を例示するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、Bリンパ球刺激因子(BLyS)タンパク質のアンタゴニストの使用方法に関する。具体的な実施形態において本発明は、患者において喘息、アレルゲン誘発性呼吸器症状又は他の呼吸器系(例えば鼻孔、上咽頭、咽頭、気管、細気管支、気管支、肺及び/又は肺胞)のアレルギー性若しくは炎症性症状を治療、予防及び/又は改善するためのBリンパ球刺激因子のアンタゴニストの使用方法を提供する。Bリンパ球刺激因子は、当技術分野においてニュートロカイン-アルファ(Neutrokine-alpha)、TALL-1、THANK、BAFF、zTNF4又はTNFSF13Bとも称される。具体的な実施形態において本発明は、患者において喘息、アレルゲン誘発性呼吸器症状又は他の呼吸器系(例えば鼻孔、上咽頭、咽頭、気管、細気管支、気管支、肺及び/又は肺胞)のアレルギー性若しくは炎症性症状を治療、予防及び/又は改善するためにBリンパ球刺激因子タンパク質に免疫特異的に結合する抗体及び関連する分子の使用に関する。
【００２３】
Bリンパ球刺激因子タンパク質は、in vivo及びin vitroの両方においてB細胞増殖及び分化を誘導する腫瘍壊死因子(「TNF」)スーパーファミリーの一員である(Moore et al.,Science,285:260-263(1999))。Bリンパ球刺激因子タンパク質は、増殖誘導リガンド(APRIL)(28.7%、配列番号4)、TNF-アルファ(16.2%)及びリンホトキシン-アルファ(LT-アルファ)(14.1%)とアミノ酸配列同一性を共有している(Moore、上記)。全長Bリンパ球刺激因子遺伝子は、II型膜結合型タンパク質の特徴的非疎水性配列が先行して、アミノ酸47と73との間に膜貫通領域ドメインを有する285アミノ酸ポリペプチドをコードしている。TNFファミリーの他のメンバーと同様に、Bリンパ球刺激因子タンパク質は、三量体タンパク質として機能する。細胞表面でのBリンパ球刺激因子の発現では、生物学的に活性な三量体を放出するために細胞外ドメインがアミノ酸134で切断される。
【００２４】
Bリンパ球刺激因子タンパク質は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー由来の3種の異なる受容体に結合することが周知である。これらの受容体はCAMLタンパク質(TACI、GenBank受入番号AAC51790、配列番号63)、B細胞成熟抗原(BCMA、GenBank受入番号NP 001183、配列番号65)及びB細胞活性化因子受容体(BAFF-R、GenBank受入番号NP 443177、配列番号67)である。(例えば、Gross,et al.,(2000)Nature 404:995-999、Thompson et al.,(2001)Science 293:2108-2111及びYan et al.,(2000)Nature Immunol.1:252-256を参照されたい)。受容体の発現は、主としてBリンパ球に限定されている(Moore, et al.,(1999)Science 285:260-263)。
【００２５】
Bリンパ球刺激因子は、B細胞増殖、分化及び生存を促進する。Bリンパ球刺激因子の循環レベルは、B細胞の成熟のための必須条件である(例えばTreml et al.,(2009)Cell Biochem.Biophys.,53(1):1-16を参照されたい)。付加的にBリンパ球刺激因子は、T細胞にもいくつかの作用を有することが示されている(例えばMacKay et al.,(1999)J. Exp. Med.,190:1697-1710、Huard et al.,(2001)J.Immunol.,167:6225-6231、Huard et al.,(2004)Int.Immunol.,16:467-475、Ng et al.,(2004)J.Immunol.,173:807-817を参照されたい)。本明細書に参照されるとおりBリンパ球刺激因子タンパク質は、全長Bリンパ球刺激因子タンパク質、可溶性Bリンパ球刺激因子タンパク質、膜結合Bリンパ球刺激因子タンパク質、Bリンパ球刺激因子タンパク質の断片、Bリンパ球刺激因子タンパク質の誘導体及びBリンパ球刺激因子タンパク質のスプライス変種を包含する。Bリンパ球刺激因子タンパク質及びBリンパ球刺激因子アンタゴニストを作製する、アッセイする及び使用する方法は、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第6,881,401号、米国特許出願公開第2009/0104189 A1号に記載されている。
【００２６】
喘息は、気道が遮断又は狭窄し呼吸困難を生じる肺の疾患である。喘息は、一般に2種類:アレルギー性(外因性)喘息及び非アレルギー性(内因性)喘息に分類される。
【００２７】
アレルギー性(外因性)喘息は、アレルギー性反応によって引き起こされる症状によって特徴付けられる。アレルギー性喘息は、薬物療法で部分的に改善可能な気道閉塞及び炎症である。アレルギー性喘息は、喘息の最も一般的な形態であり、喘息を有する人の50%超を冒している。アレルギー性及び非アレルギー性喘息の症状の多くは同じである(咳嗽、喘鳴、息切れ又は呼吸促迫及び胸部絞扼感)。しかしアレルギー性喘息は、ちりダニアレルゲン、ペットのフケ、花粉、カビなどのアレルゲンの吸入によって引き起こされ、喘息症状を生じる。
【００２８】
非アレルギー性(内因性)喘息は、アレルギーとは関連の無い要因によって引き起こされる。アレルギー性喘息と同様に、非アレルギー性喘息は、薬物療法で少なくとも部分的に改善可能な気道閉塞及び炎症によって特徴付けられるが、しかしこの種類の喘息における症状はアレルギー性反応に関連しない。アレルギー性及び非アレルギー性喘息の症状の多くは同じだが、非アレルギー性喘息は、不安、ストレス、運動、冷気、乾燥した空気、過換気、煙、ウイルス又は他の刺激物質などの他の要因によって引き起こされる。非アレルギー性喘息において免疫系は反応に関与しない。
【００２９】
気道炎症、気道閉塞及び気道過敏症は、喘息の特徴的性質である。気道過敏症は、非特異的刺激に対して気道閉塞を生じる気道の過剰な応答によって定義される。多数のサイトカインが気道炎症、気道閉塞及び気道過敏症に関与することが示されている。例えばBarnes,J Clin Invest.,(2008)118(11):3546-3556を参照されたい。例えばIL-13は、気道過敏症、杯状細胞異形性及び粘液分泌過多(これら全ては気道閉塞に寄与する)を含むアレルギー性肺疾患の多数の特徴を誘発することが示されている。例えばWills-Karp et al.,(1998)Science,282(5397):2258-2261を参照されたい。
【００３０】
免疫応答、詳細にはB細胞及び/又はT細胞の増殖、分化又は生存を抑制するBリンパ球刺激因子アンタゴニストの投与は、喘息又は鼻孔、上咽頭、咽頭、気管、細気管支、気管支、肺及び/若しくは肺胞の他のアレルギー性又は炎症性症状を予防する及び治療することにおいて効果的な治療法である。Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの投与は、喘息に関連する症状(例えば非アレルギー性又はアレルギー性喘息に関連する症状)を予防する及び/又は治療するためにも使用されうる。Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの投与は、肺の急性又は慢性の炎症、肺炎、肺気腫、炎症性肺傷害、閉塞性細気管支炎、慢性気管支炎、肺サルコイドーシス、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、間質性肺疾患、特発性肺線維症、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、気管支拡張症、肺好酸球増加症、間質性線維症及び嚢胞性線維症などの肺又は呼吸器系の他の炎症性症状に関連する症状を予防する、改善する及び/又は治療するためにも使用されうる。
【００３１】
肺上皮と鼻腔上皮の両方において同じ機序が炎症カスケードの根底をなしているので、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの投与は慢性副鼻腔炎などの呼吸器又は鼻腔の炎症性症状に関連する症状を予防する、改善する及び/又は治療するためにも使用されうる。慢性副鼻腔炎は、12週間より長く持続している鼻及び副鼻腔の粘膜の炎症によって特徴付けられる。臨床的症状は、鼻閉若しくは鼻うっ血、鼻汁、顔面痛若しくは圧感、嗅覚の低下若しくは喪失、内視鏡所見(ポリープ、粘液膿性汁及び浮腫又は閉塞)並びに/又はCTスキャン異常(前部副鼻腔(ostiomeatal complex)及び/又は副鼻腔洞(sinuses)内の粘膜変化)を含む場合がある。例えばFokkens et al.,Allergy,60:583-601(2005)を参照されたい。慢性副鼻腔炎は、喘息又は肺の他の炎症性症状としばしば同時に生じる。
【００３２】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの投与は、外因性アレルギー性肺胞炎(過敏性肺炎)並びに、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、急性及び慢性好酸球性肺炎、チャーグ・ストラウス症候群並びに特発性好酸球増多症候群を含む好酸球性肺傷害などの肺又は呼吸器系のアレルギー性症状に関連する症状を予防する、改善する及び/又は治療するためにも使用されうる。
【００３３】
例えば、アンタゴニストの投与によるBリンパ球刺激因子の中和は、非アレルギー性及びアレルギー性喘息を含む喘息を治療するために、肺のアレルギー性症状を治療するために、鼻孔、上咽頭、咽頭、気管、細気管支、気管支、肺及び/又は肺胞のアレルギー性又は炎症性症状を治療するために、喘息又は鼻孔、上咽頭、咽頭、気管、細気管支、気管支、肺及び/又は肺胞のアレルギー性若しくは炎症性症状を罹患している患者における総血清IgE若しくはアレルゲン誘発性IgEを低下させるために、喘息又は鼻孔、上咽頭、咽頭、気管、細気管支、気管支、肺及び/又は肺胞のアレルギー性若しくは炎症性症状を罹患している患者におけるサイトカインレベルを低下させるために、アレルゲン誘発性気道過敏症を予防及び/又は治療するために、並びに気道上皮における粘液含有細胞のアレルゲン誘発性増大を予防及び/又は治療するために使用されうる。
【００３４】
一実施形態において本発明は、患者における喘息(非アレルギー性及びアレルギー性喘息を含む)を治療する、予防する又は改善する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者における喘息を治療する、予防する又は改善するステップを含む方法を提供する。
【００３５】
他の実施形態において本発明は、患者において、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、急性及び慢性好酸球性肺炎、チャーグ・ストラウス症候群、外因性アレルギー性肺胞炎(過敏性肺炎)及び特発性好酸球増多症候群を含む好酸球性肺傷害などの肺又は呼吸器系のアレルギー性症状を治療する、予防する又は改善する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者において肺又は呼吸器系のアレルギー性症状を治療する、予防する又は改善するステップを含む方法を提供する。肺又は呼吸器系のアレルギー性症状は、アレルゲン誘発性気道過敏症の増進によって及び/又は粘液含有細胞の増加によって特徴付けられる。
【００３６】
他の実施形態において本発明は、患者における呼吸器系の炎症性症状(例えば鼻孔、上咽頭、咽頭、気管、細気管支、気管支、肺及び/又は肺胞の炎症性症状)を治療する、予防する又は改善する方法であって、リンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者における呼吸器系炎症を治療する、予防する又は改善するBステップを含む方法を提供する。呼吸器系の炎症性症状は、アレルゲン誘発性気道過敏症の増進によって及び/又は粘液含有細胞の増加によって特徴付けられる。付加的に呼吸器系の炎症性症状は、B細胞、T細胞、好酸球、好中球及び/若しくはマスト細胞又は他の白血球などの免疫系細胞の肺への細胞浸潤の増大によって特徴付けられる。
【００３７】
一実施形態において本発明は、患者における慢性副鼻腔炎慢性を治療する、予防する又は改善する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者における慢性副鼻腔炎を治療する、予防する又は改善するステップを含む方法を提供する。
【００３８】
他の実施形態において本発明は、患者における肺の炎症性症状を治療する、予防する又は改善する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者における肺炎症を治療する、予防する又は改善するステップを含む方法を提供する。肺の炎症性症状は、アレルゲン誘発性気道過敏症の増進によって及び/又は粘液含有細胞の増加によって特徴付けられる。付加的に肺の炎症性症状は、B細胞、T細胞、好酸球、好中球及び/若しくはマスト細胞又は他の白血球などの免疫系細胞の肺への細胞浸潤の増大によって特徴付けられる。
【００３９】
他の実施形態において本発明は、喘息又は鼻孔、上咽頭、咽頭、気管、細気管支、気管支、肺及び/若しくは肺胞のアレルギー性若しくは炎症性症状を罹患している患者において総血清IgEレベルを低下させる方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者において総血清IgEレベルを低下させるステップを含む方法を提供する。
【００４０】
他の実施形態において本発明は、喘息又は鼻孔、上咽頭、咽頭、気管、細気管支、気管支、肺及び/若しくは肺胞のアレルギー性若しくは炎症性症状を罹患している患者においてIgEレベルのアレルゲン誘発性増大を低下させる方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者においてIgEレベルのアレルゲン誘発性増大を低下させるステップを含む方法を提供する。
【００４１】
さらに他の実施形態において本発明は、患者においてアレルゲン誘発性気道過敏症を予防する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、ステップを含む患者においてアレルゲン誘発性気道過敏症を予防する方法を提供する。本発明は、患者においてアレルゲン誘発性気道過敏症を治療する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者においてアレルゲン誘発性気道過敏症を抑制するステップを含む方法も提供する。
【００４２】
他の実施形態において本発明は、患者の気道上皮の粘液含有細胞又は粘液の蓄積若しくは産生におけるアレルゲン誘発性増大を予防する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者の気道上皮における粘液含有細胞又は粘液の蓄積若しくは産生におけるアレルゲン誘発性増大を予防するステップを含む方法を提供する。本発明は、患者の気道上皮の粘液含有細胞又は粘液の蓄積若しくは産生におけるアレルゲン誘発性増大を治療する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者の気道上皮における粘液含有細胞又は粘液の蓄積若しくは産生におけるアレルゲン誘発性増大を抑制するステップを含む方法も提供する。他の実施形態において本発明は、肺又は呼吸器系の炎症性症状を予防する、治療する及び/又は改善する方法を提供する。肺又は呼吸器系の炎症性症状は、これだけに限らないが急性又は慢性の肺の炎症、肺炎、肺気腫、炎症性肺傷害、閉塞性細気管支炎、慢性気管支炎、肺サルコイドーシス、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、間質性肺疾患、特発性肺線維症、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、気管支拡張症、肺好酸球増加症、間質性線維症及び嚢胞性線維症を含む。
【００４３】
他の実施形態において本発明は、喘息又は鼻孔、上咽頭、咽頭、気管、細気管支、気管支、肺及び/又は肺胞のアレルギー性若しくは炎症性症状を罹患している患者におけるサイトカインレベルを低下させるための方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者におけるサイトカインレベルを低下させるステップを含む方法を提供する。さらなる実施形態において本発明は、患者の気道上皮におけるサイトカイン産生のアレルゲン誘発性増大を治療する、予防する又は改善する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与し、それによって、患者の気道上皮におけるサイトカイン産生のアレルゲン誘発性増大を治療する、予防する又は改善するステップを含む方法を提供する。リンホカイン(T細胞によって分泌され、免疫応答を制御するサイトカイン)、炎症性サイトカイン(炎症プロセスを増幅及び持続させるサイトカイン)、増殖因子(細胞生存を促進し、気道の構造変化をもたらすサイトカイン)、ケモカイン(炎症性細胞に対して走化作用があるサイトカイン)及び抗炎症性サイトカイン(炎症応答をネガティブに調節するサイトカイン)を含む多数のサイトカインは、気道炎症、気道閉塞及び気道過敏症に関与することが示されている。例えば上記Barnesを参照されたい。したがって一実施形態において本発明は、患者のリンホカイン、炎症性サイトカイン、増殖因子、ケモカイン及び/又は抗炎症性サイトカインのアレルゲン誘発性増大を治療する、予防する又は改善する方法であって、抗Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を患者に投与するステップを含む方法を提供する。例示的サイトカインは、これだけに限らないがIL-4、IL-5、IL-9、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IL-25、IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-α、TSLP、EGF、GM-CSF、NGF、SCF、TGF-β、VEGF、FGFs、TGF-α、CTGF、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24、CCL26、CXCL1、CXCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11及びCXCL12を含む。
【００４４】
一実施形態において本発明は、患者においてアレルゲンへの耐性を促進する方法であって、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量をアレルゲンへの暴露の前、間又は後に患者に投与し、それによって、患者において肺炎症を改善する又は予防し、アレルゲンへの耐性を促進するステップを含む方法を提供する。
【００４５】
さらに他の実施形態において本発明は、喘息、アレルゲン誘発性呼吸器症状又は肺若しくは呼吸器系の他のアレルギー性若しくは炎症性症状の治療、予防及び/又は改善におけるBリンパ球刺激因子アンタゴニストの使用を提供する。本発明は、喘息、アレルゲン誘発性呼吸器症状又は肺若しくは呼吸器系の他のアレルギー性若しくは炎症性症状の治療、予防及び/又は改善における使用のためのBリンパ球刺激因子アンタゴニストも提供する。付加的に本発明は、喘息、アレルゲン誘発性呼吸器症状又は肺若しくは呼吸器系の他のアレルギー性若しくは炎症性症状の治療、予防及び/又は改善のための薬剤調製のためのBリンパ球刺激因子アンタゴニストの使用を提供する。
【００４６】
他の実施形態において本発明は、喘息、アレルゲン誘発性呼吸器症状又は肺若しくは呼吸器系の他のアレルギー性若しくは炎症性症状の治療、予防及び/又は改善における抗Bリンパ球刺激因子抗体の使用を提供する。本発明は、喘息、アレルゲン誘発性呼吸器症状又は肺若しくは呼吸器系の他のアレルギー性若しくは炎症性症状の治療、予防及び/又は改善における使用のための抗Bリンパ球刺激因子抗体も提供する。付加的に本発明は、喘息、アレルゲン誘発性呼吸器症状又は肺若しくは呼吸器系の他のアレルギー性若しくは炎症性症状の治療、予防及び/又は改善のための薬剤調製のための抗Bリンパ球刺激因子抗体の使用を提供する。
【００４７】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、Bリンパ球刺激因子誘導シグナル伝達を低下させる又は抑制する。例えば本発明のアンタゴニストは、Bリンパ球刺激因子誘導シグナル伝達を抑制又は下方制御するためにBリンパ球刺激因子タンパク質とその受容体との間の相互作用を破壊できる。Bリンパ球刺激因子のその受容体との結合については阻止しないが、Bリンパ球刺激因子誘導シグナル伝達を抑制又は下方制御する本発明のアンタゴニストも本明細書に示す本発明に合致して使用されうる。詳細には、未結合のBリンパ球刺激因子タンパク質、受容体結合Bリンパ球刺激因子タンパク質、又は未結合及び受容体-結合の両方のBリンパ球刺激因子タンパク質を特異的に認識することによってBリンパ球刺激因子誘導シグナル伝達を阻止する本発明のアンタゴニストは、本明細書に示す本発明に合致して使用されうる。
【００４８】
一実施形態において本発明のアンタゴニストは、可溶性Bリンパ球刺激因子(配列番号2のアミノ酸134から285)を選択的に標的化し、生物学的活性を阻害する。他の実施形態において本発明のBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、患者に投与された場合に自己反応性B細胞アポトーシスを誘導する。
【００４９】
Bリンパ球刺激因子誘導シグナル伝達を抑制又は下方制御するための本発明のアンタゴニストの能力は、本明細書に記載又は他に当技術分野において周知の技術によって決定されうる。例えばBリンパ球刺激因子誘導受容体活性化及びシグナル伝達分子の活性化は、免疫沈降に続くウエスタンブロット分析によって受容体のリン酸化(例えばチロシン及び/若しくはスレオニン)又はシグナル伝達分子を検出することによって決定されうる。
【００５０】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、TACIのBリンパ球刺激因子タンパク質結合ドメインを含むタンパク質、BCMAのBリンパ球刺激因子タンパク質ドメインを含むタンパク質、BAFF-RのBリンパ球刺激因子結合ドメインを含むタンパク質、Bリンパ球刺激因子結合ペプチド若しくはポリペプチド、Bリンパ球刺激因子タンパク質に結合するペプチボディー、Bリンパ球刺激因子タンパク質変種及び/又は抗Bリンパ球刺激因子受容体抗体(例えばTACI、BAFF-R及び/又はBCMA)を含む本明細書に記載の任意のBリンパ球刺激因子アンタゴニストなどの当業者に周知の任意のBリンパ球刺激因子アンタゴニストであってよい。
【００５１】
Bリンパ球刺激因子のアンタゴニストは、結合性及び/又は阻害性の抗体、アンチセンス核酸、リボザイム並びに不活性Bリンパ球刺激因子ポリペプチドを含む。これらは、例えば(一つ若しくは複数の)免疫抑制剤として、又はBリンパ球刺激因子誘導B細胞活性化に関連しているERK1、COX2及びサイクリンD2が関与するシグナル伝達経路の阻害剤として臨床的又は実用的応用が見出されることが期待される。
【００５２】
一実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、(a)可溶性Bリンパ球刺激因子タンパク質、(b)膜結合Bリンパ球刺激因子タンパク質、(c)配列番号2のアミノ酸残基1-285のアミノ酸配列、(d)配列番号2のアミノ酸残基134-285のアミノ酸配列、(e)配列番号2のアミノ酸残基134-285の三量体、(f)配列番号2のアミノ酸残基1-285と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列であって、B細胞増殖、分化又は生存を刺激するアミノ酸配列、(g)配列番号2のアミノ酸残基134-285と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列であって、B細胞増殖、分化又は生存を刺激するアミノ酸配列、(h)配列番号2のアミノ酸残基134-285と少なくとも90%同一である(例えば少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%同一である)アミノ酸配列の三量体、及び(i)配列番号2のポリペプチドの断片のアミノ酸配列であって、断片が少なくとも長さ30アミノ酸であり、断片がB細胞増殖、分化又は生存を刺激できるアミノ酸配列、に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体である。
【００５３】
好ましい実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、配列番号60又は配列番号61のVH及び/又はVLドメインと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む。他の好ましい実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、Human Genome Sciences,Inc.からのBENLYSTA(登録商標)(ベリムマブ)である。他の好ましい実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、配列番号72の残基1-126と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%同一であるアミノ酸配列及び配列番号73の残基143-251と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む。他の好ましい実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、配列番号72の残基1-126と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%同一である第一アミノ酸配列及び配列番号73の残基143-251と少なくとも85%同一である第二アミノ酸配列を含む。他の実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第7,605,236号において開示及び特許請求された抗体である。
【００５４】
他の実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、膜結合及び可溶性Bリンパ球刺激因子の両方に対して中和活性を有する完全なヒトIgG4モノクローナル抗体であるLY2127399(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)である。Kikly et al.,Characterization of LY2127399,A Neutralizing Antibody for BAFF(Arthritis & Rheumatism,Volume 60,October 2009 Abstract Supplement)を参照されたい。他の実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第7,317,089号において開示及び特許請求された抗体である。
【００５５】
一実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、免疫グロブリン(例えばIgG、IgA、IgE、IgM若しくはIgD)のFcドメインなどの異種タンパク質に融合したBリンパ球刺激因子受容体(例えばTACI、BAFF-R及び/若しくはBCMA)又はその断片を含む。例えばBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、免疫グロブリンG1 Fcドメインに融合したTACIを含みうる。具体的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、ATACICEPT(商標)(CAS  登録番号845264-92-8)である。
【００５６】
Bリンパ球刺激因子受容体タンパク質、その断片及び変種並びにそれらに対する抗体は、例えばPCT公開WO03/014294、WO02/066516、WO02/024909、WO03/014294、WO03/024991、WO02/094852及びWO04/011611並びに米国特許公開第US20030148445号、第US20030099990号、第US2005070689号、第US2005043516号及び第US2003012783号に記載されている。前述の参考資料はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５７】
好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子受容体は可溶性である。他の好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子受容体は、免疫グロブリン分子(例えば、TACI(GenBank受入番号AAC51790、配列番号63)のアミノ酸残基1-154、BCMA(GenBank受入番号NP_001183、配列番号65)のアミノ酸1-48又はIgG分子のFc領域に融合したBAFF-R(GenBank受入番号NP_443177、配列番号67)のアミノ酸1-81)のFc領域に融合している。
【００５８】
他の実施形態において、本発明の方法において使用されうるBAFF-Rタンパク質は、配列番号67のアミノ酸1から70及び/又は配列番号71のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドである。配列番号71は、BAFF-R中のアミノ酸20(バリン)がアスパラギンに置換され、BAFF-R中のアミノ酸27(ロイシン)がプロリンに置換されているBAFF-Rのアミノ酸1から70を示す。他の実施形態において本発明の方法において使用されうるBAFF-Rタンパク質は、配列番号71のアミノ酸2から70を含む単離されたポリペプチドである。上に記載のポリペプチドと少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%又は95%同一、さらにより好ましくは少なくとも96%、97%、98%、99%又は100%同一であるポリペプチドも本発明の方法において使用されうる。
【００５９】
一実施形態においてBリンパ球刺激因子受容体アンタゴニストは、Bリンパ球刺激因子結合ペプチド又はポリペプチドである。Bリンパ球刺激因子結合ペプチド又はポリペプチドは、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる例えば国際特許公開第WO05/005462号、第WO05/000351号、第WO02/092620号、第WO02/16412号、第WO02/02641号及び第WO02/16411号並びに米国特許公開第US2006135430号、第US2006084608号、第US2003194743号、第US20030195156号及び第US2003091565号において記載されている。Bリンパ球刺激因子結合ペプチド又はポリペプチドはその全体が参照により本明細書に組み込まれる例えばSun et al.,(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.346:1158-1162にも記載されている。本発明の方法において使用されうるBリンパ球刺激因子結合ペプチドは、繊維状ファージのコートタンパク質との融合によって提示されたランダムペプチド配列から同定された短いポリペプチドを含む。ファージ提示ペプチドライブラリー技術の考察については、例えばScott et al.(1990),Science 249: 386、Devlin et al.(1990),Science 249:404、1993年6月29日出願米国特許第5,223,409号、1998年3月31日出願米国特許第5,733,731号、1996年3月12日出願米国特許第5,498,530号、1995年7月11日出願米国特許第5,432,018号、1994年8月16日出願米国特許第5,338,665号、1999年7月13日出願米国特許第5,922,545号、1996年12月19日公開WO 96/40987及び1998年4月16日公開WO 98/15833(それぞれその全体が参照により組み込まれる)を参照されたい。
【００６０】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されうるBリンパ球刺激因子結合ペプチドは、配列番号68のアミノ酸配列、配列番号69のアミノ酸配列又は配列番号70のアミノ酸配列を含む。
【００６１】
一実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、Bリンパ球刺激因子ペプチボディーを含む。本発明において使用されうる例示的Bリンパ球刺激因子ペプチボディーは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,259,137号に記載されている。具体的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、米国特許第7,259,137号に記載されているAGP3ペプチボディーである。他の実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、Anthera PharmaceuticalsからのA-623ペプチボディーである。他の実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、配列番号68と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むペプチボディーである。他の実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、配列番号68からなるペプチボディーである。
【００６２】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、喘息症状又は肺若しくは呼吸器系のアレルギー性若しくは炎症性症状の症状の発症の前、間及び/又は後に投与されうる。一実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、喘息(アレルギー性及び非アレルギー性の喘息を含む)又は肺若しくは呼吸器系のアレルギー性若しくは炎症性症状の症状の発症より前に最初に投与される。例えばBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、喘息又は肺若しくは呼吸器系のアレルギー性若しくは炎症性症状を有すると診断されているが症状を感じていない患者に、患者における喘息症状又は肺若しくは呼吸器系のアレルギー性若しくは炎症性症状の症状の再発を予防するために投与されうる。代替としてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、喘息又は肺若しくは呼吸器系のアレルギー性若しくは炎症性症状を有すると診断されており、一つ又は複数の症状(例えば鼻閉、喘鳴、咳嗽、胸部絞扼感、気流閉塞、気管支痙攣、気管支収縮又は息切れ)を感じている患者に、患者における一つ又は複数の喘息症状又は肺若しくは呼吸器系のアレルギー性若しくは炎症性症状の症状を治療する又は改善するために投与されうる。
【００６３】
本発明の一実施形態において患者は、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの初回用量に続いてBリンパ球刺激因子アンタゴニストの定期的な維持量で治療される。そのような維持量は、喘息又は肺のアレルギー性若しくは炎症性症状を治療及び/又は予防するために短くは一年又は長くは患者の生涯にわたって投与されうる。例えばBリンパ球刺激因子アンタゴニストの維持量は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15又は20年間投与されうる。Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの維持量は、例えば1週間に約1回、2週間ごとに約1回、1カ月に約1回投与されうる又は当業者によって定期的に投与されうる。一実施形態において維持量は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12カ月ごとに約1回投与される。
【００６４】
場合によりBリンパ球刺激因子アンタゴニストの維持量は、患者の生涯にわたり必要とされない。したがって本発明の一実施形態において、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの維持量は、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストが約3カ月間、6カ月間、1年間、18カ月間又は2年間だけ投与されるなどのように低減、漸減及び/又は最終的に中断されうる。場合によりBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12週間だけ投与されうる。
【００６５】
Bリンパ球刺激因子維持量の効果的な低減又は漸減は、維持量の投与頻度を低減することによって又は維持量の濃度を経時的に低減することによってのいずれかで達成されうる。例えば維持量の濃度は、各維持量あたり約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%少ないBリンパ球刺激因子アンタゴニストを投与することによって低減されうる。例えば維持量は、維持量の濃度が0に達するまで各投与あたり約10%ずつ低減されうる。代替として維持量は、維持量が0に達するまで10%、次いで20%、次いで40%などに維持量を低減することによって漸減されうる。付加的漸減治療計画は、Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト漸減への患者の応答に基づいて当業者によって決定されうる。
【００６６】
いくつかの実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、IgE抗体価力価の増加の診断後のBリンパ球刺激因子アンタゴニストの投与に続いてIgE抗体価が減少するまで投与される。
【００６７】
好ましくはBリンパ球刺激因子アンタゴニストを使用する治療は、患者にBリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効量を投与することによって達成される。
【００６８】
処方及び投与
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、個々の患者の臨床状態(特にBリンパ球刺激因子アンタゴニスト単独での治療の副作用)、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの送達部位、投与方法、投与の計画及び一般医に周知の他の要因を考慮して適切な医療行為と合致する様式で処方及び投与される。
【００６９】
したがって本明細書の目的のための(一つ又は複数の)Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの「有効量」は、そのような考慮により決定される。詳細には、投与される(一つ又は複数の)Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの有効投与量は、生物学的半減期、生物学的利用率及び毒性などのパラメーターに対処する当業者に十分に周知の手順を通じて決定されうる。そのような決定は、特に本明細書において提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００７０】
一般的命題として、非経口的に投与されるBリンパ球刺激因子アンタゴニストの一用量あたりの合計薬学的有効量は、上に記載のとおり治療的裁量の対象ではあるが、患者の体重1kgあたり約1マイクログラム/日から10mg/日の範囲内である。より好ましくはこの用量は、1kgあたり少なくとも0.01mg/日及びヒトに対して最も好ましくは1kgあたり約0.01から1mg/日の間である。
【００７１】
他の実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、ヒトに1kgあたり0.0001から0.045mg/日の間の用量で、好ましくは1kgあたり0.0045から0.045mg/日の間の用量で、より好ましくはヒトに1kgあたり約45マイクログラム/日の用量で、及びマウスに1kgあたり約3mg/日の用量で投与される。
【００７２】
持続的に与えられる場合、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、典型的には1kgあたり約1マイクログラム/時間から約50マイクログラム/時間の投与速度で、1日あたり注射1-4回によって又は、例えばミニポンプを使用する継続的な皮下注入によってのいずれかで投与される。経静脈バッグ(intravenous bag)溶液も使用されうる。
【００７３】
変化を観察するために必要な治療の長さ及び治療後に応答が生じるまでの間隔は、所望の効果に応じて変化する。
【００７４】
具体的な実施形態において、非経口的に投与されるBリンパ球刺激因子アンタゴニストの一用量あたりの合計薬学的有効量は、上に記載のとおり治療的裁量の対象ではあるが、患者の体重1kgあたり約0.1マイクログラム/日から45マイクログラム/日の範囲内である。より好ましくはこの用量は、1kgあたり少なくとも0.1マイクログラム/日であり、最も好ましくはタンパク質に関して、ヒトについて1kgあたり約0.01から50マイクログラム/日の間である。Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、持続注入、1日あたり複数回(例えば1日に3回以上、若しくは1日2回)に分散した注射、1日に1回の注射又は断続的に与えられる分散注射(例えば1日2回、1日1回、1日おき、1週間に2回、1週間に1回、2週間に1回、1カ月に1回、2カ月に1回及び1年に4回)として投与されうる。持続的に与えられる場合Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、典型的には1kgあたり約0.001から10マイクログラム/時間から約50マイクログラム/時間の投与速度で、1日あたり注射1-4回で又は例えばミニポンプを使用する持続的皮下注入のいずれかによって投与される。
【００７５】
治療中におけるBリンパ球刺激因子アンタゴニストへの生物の暴露は、治療的及び/又は薬理学的に効果的な投与計画の決定において重要な役割を演じる場合もある。比較的長期間にわたるBリンパ球刺激因子アンタゴニストの比較的低い用量の反復投与などの投与量の違いは、比較的短期間のBリンパ球刺激因子アンタゴニストの比較的高い用量での反復投与で達成されるものとは治療的に及び/又は薬理学的に区別できる効果を有する場合がある。
【００７６】
Freireich,E.J.ら、(Cancer Chemotherapy Reports50(4):219-44(1966))によって与えられた等価表面積投与量変換係数を使用して、当業者は、所与の実験系においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストの使用から得られたデータを別の実験系において投与される一用量あたりのBリンパ球刺激因子アンタゴニストの薬理学的有効量の正確な推定値に好都合に転換できる。マウスでのBリンパ球刺激因子アンタゴニストの投与から得られた実験データは、Freireichら、によって与えられた変換係数を通じて、ラット、サル、イヌ及びヒトにおけるBリンパ球刺激因子アンタゴニストの薬理学的有効量の正確な推定値に転換されうる。続く変換表(表1)は、Freireichらによって提供されたデータの要約である。表1は、一つの種由来のmg/kgを単位として表された用量を、表に示す他の種におけるmg/kgとして表された等価表面積投与量に変換するためのおおよその係数を与える。
【表１】
2013530188.tif 000002
【００７７】
したがって、例えば表1において提供される変換係数を使用して、マウスでの用量50mg/kgは、(50mg/kg)x(1/4)=12.5mg/kgであることからサルでのおよその用量12.5mg/kgに変換される。付加的な例としてマウスでの用量0.02、0.08、0.8、2及び8 mg/kgは、それぞれヒトでの1.667マイクログラム/kg、6.67マイクログラム/kg、66.7マイクログラム/kg、166.7マイクログラム/kg及び0.667mg/kg,の有効量と等価である。
【００７８】
特定の実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニスト(例えば抗体)の放射標識形態の投与は意図される。適用される放射測定投与量は、大幅に変動する。放射標識Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト組成物は、体重70kgあたり約0.1から約100mCiの用量で投与されうる。他の実施形態において放射標識Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト組成物は、体重70kgあたり約0.1から約50mCiの用量で投与されうる。他の実施形態において放射標識Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト組成物は、体重70kgあたり約0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90又は100mCiの用量で投与されうる。
【００７９】
放射標識Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト組成物は、体重1kgあたり約0.1から約10mCiの用量で投与されうる。他の実施形態において放射標識Bリンパ球刺激因子抗体アンタゴニストは、体重1kgあたり約0.25から約5mCiの用量で投与されうる。具体的な実施形態において放射標識Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト組成物は、体重1kgあたり約0.35、0.70、1.35、1.70、2.0、2.5又は3.0mCiの用量で投与されうる。
【００８０】
放射標識Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト組成物は、約1から約50mCi/m2の用量で投与されうる。他の実施形態において放射標識Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト組成物は、約10から約30mCi/m2の用量で投与されうる。具体的な実施形態において放射標識Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト組成物は、10、15、20、25又は30mCi/m2の用量で投与されうる。
【００８１】
放射標識Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト組成物中の合計Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの濃度は、例えば約1マイクログラム/kgから約1mg/kgまで変動する場合がある。具体的な実施形態において、放射標識Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト組成物中のBリンパ球刺激因子アンタゴニストの総濃度は、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100マイクログラム/kgでありうる。
【００８２】
ヒトの全身におよそ500cGyを与える放射活性の量は、131Iで約825mCiと見積もられる。投与される放射活性の量は、選択された同位元素に部分的に依存する。90Y治療については、約1から約200mCiの放射活性量が、好ましい量は1から150mCi、1から100mCi(例えば60mCi)が最も好ましいとして、適切であると考えられる。投与された放射活性の量から組織投与量を見積もる好ましい手段は、予測線量測定の推定を得るために画像診断又はトレーサー量での他の薬物動態学的投与計画を実施することである。個人に投与するための放射線医薬品の適切な用量の決定において、個々の器官についての最大耐量と比較してそれらの器官が受ける放射線の量を考慮することが必要である。そのような情報は当業者に周知であり、例えば両方ともそれら全体が参照により本明細書に組み込まれるEmami et al.,International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics 21:109-22(1991)及びMeredith,Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 17:83-99(2002)を参照されたい。
【００８３】
例えば全身への200から600cGy(又はより高く)の範囲での「高用量」プロトコールは、骨髄が毒性のために放射線量を限定する組織であることから骨髄置換プロトコールの支援を必要とする場合がある。
【００８４】
一実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニスト(例えば抗体)のヨウ素化形態を含む組成物は、アスコルビン酸ナトリウム、ジェントラン(gentran)-40及びグリセロールなどの放射線保護材及び血漿増補剤も含みうる。具体的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストのヨウ素化形態を含む組成物は、10.0mMクエン酸ナトリウム、140.0mM塩化ナトリウム、8.7mM HEPES、4%(w/v)アスコルビン酸ナトリウム、3.3%(w/v)ジェントラン-40中に処方される。
【００８５】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、単独又は、薬学的に許容される担体などの担体を含む組成物(例えば医薬組成物)中で投与されうる。一実施形態において「薬学的に許容される担体」は、非毒性の固体、半流動性又は液体の注入剤、希釈剤、封入材料又は任意の種類の補助的製剤を意味する。具体的な実施形態において「薬学的に許容される」は、連邦若しくは州政府の規制機関によって承認されたもの又は米国薬局方若しくは動物及びより詳細にはヒトにおける使用のために他に一般に認識される薬局方に列挙されたものを意味する。この実施形態による適切な薬学的担体の非限定的例は、E.W.Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"において提供されており、水及び(ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの)石油、動物、植物又は合成由来を含む油などの滅菌液を含む。医薬組成物が静脈内に投与される場合には水が好ましい担体である。生理食塩水並びに水溶性ブドウ糖及びグリセロール溶液は液体担体として、特に注射可能な液体用に使用されうる。適切な薬学的賦形剤は、デンプン、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。
【００８６】
所望により組成物は、少量の湿潤剤又は乳化剤又はpH緩衝剤も含みうる。これらの組成物は、液体、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、徐放性製剤などの形態をとりうる。
【００８７】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、単独又は、これだけに限らないが化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス剤、ステロイド性及び非ステロイド性抗炎症剤、慣用の免疫療法剤及びサイトカインを含む他の治療剤との組合せで投与されうる。組合せは、同時に(例えば混合物、別々だが同時に、若しくは同時に)又は逐次的に投与されうる。これは、組合せ剤が治療用混合物として一緒に投与されている提示物及び組合せ剤が別々にだが同時に(例えば同一個体に別々の静脈内経路を通じてなど)投与される手順も含む。「組合せ」投与は、化合物又は薬剤の内の一つが最初に投与され、二番目が続く分離された投与もさらに含む。
【００８８】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、単独又は一つ若しくは複数のアジュバントとの組合せで投与されうる。Bリンパ球刺激因子アンタゴニストと共に投与されうるアジュバントは、これだけに限らないがミョウバン、ミョウバンに加えてデオキシコール酸(ImmunoAg)、MTP-PE(Biocine Corp.)、QS21(Genentech, Inc.)、BCG及びMPLを含む。具体的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、ミョウバンとの組合せで投与される。他の具体的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、QS-21との組合せで投与される。Bリンパ球刺激因子アンタゴニストと共に投与されうるさらなるアジュバントは、これだけに限らないがモノホスホリピド免疫調節剤、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、アルミニウム塩、MF-59及びビロソーム(virosomal)アジュバント技術を含む。
【００８９】
さらなる実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、抗生物質剤との組合せで投与される。投与されうる抗生物質剤は、これだけに限らないがアモキシシリン、アミノグリコシド、ベータラクタム(糖ペプチド)、ベータラクタマーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン、マクロライド、メトロニダゾール、ペニシリン、キノロン、リファンピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメトプリムスルファメトキサゾール及びバンコマイシンを含む。
【００９０】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストとの組合せで投与されうる慣用の非特異的免疫抑制剤は、これだけに限らないがステロイド、シクロスポリン、シクロスポリン類似物、シクロホスファミド、シクロホスファミドIV、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、アザチオプリン、FK-506、15-デオキシスパガリン及び、T細胞に応答する機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤を含む。Bリンパ球刺激因子アンタゴニストとの組合せで投与されうる他の免疫抑制剤は、これだけに限らないがプレドニゾロン、メトトレキサート、サリドマイド、メトキサレン、ラパマイシン、レフルノミド、ミゾリビン(BREDININ(商標))、ブレキナル、デオキシスパガリン及びアザスピラン(SKF 105685)を含む。
【００９１】
具体的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、免疫抑制剤との組合せで投与される。投与されうる免疫抑制調製物は、これだけに限らないがORTHOCLONE OKT(登録商標)3(ムロモナブ-CD3)、SANDIMMUNE(商標)、NEORAL(商標)、SANGDYA(商標)(シクロスポリン)、PROGRAF(登録商標)(FK506、タクロリムス)、CELLCEPT(登録商標)(活性代謝物がミコフェノール酸である、ミコフェノール酸モテフィル)、IMURAN(商標)(アザチオプリン)、グルココルチコステロイド、DELTASONE(商標)(プレドニソン)及びHYDELTRASOL(商標)(プレドニゾロン)などの副腎皮質ステロイド、FOLEX(商標)及びMEXATE(商標)(メトトレキサート)、OXSORALEN-ULTRA(商標)(メトキサレン)、RITUXAN(商標)(リツキシマブ)並びにRAPAMUNE(商標)(シロリムス)を含む。
【００９２】
好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、ステロイド療法との組合せで投与される。投与されうるステロイドは、これだけに限らないが経口副腎皮質ステロイド、プレドニゾン及びメチルプレドニゾロン(例えばIVメチルプレドニゾロン)を含む。具体的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、プレドニゾンとの組合せで投与される。さらなる具体的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、プレドニゾン及び免疫抑制剤との組合せで共に投与される。プレドニゾンとの組合せで投与されうる免疫抑制剤は、本明細書において記載されるものであり、これだけに限らないがアザチオプリン、シクロホスファミド及びシクロホスファミドIVを含む。他の具体的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、メチルプレドニゾロンとの組合せで投与される。さらなる具体的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、メチルプレドニゾロン及び免疫抑制剤との組合せで投与される。メチルプレドニゾロンとの組合せで投与されうる免疫抑制剤は、本明細書において記載されるものであり、これだけに限らないがアザチオプリン、シクロホスファミド及びシクロホスファミドIVを含む。
【００９３】
好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、抗マラリア剤との組合せで投与される。投与されうる抗マラリア剤は、これだけに限らないがヒドロキシクロロキン、クロロキン及び/又はキナクリンを含む。
【００９４】
好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、NSAIDとの組合せで投与される。
【００９５】
付加的実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、単独又は一つ若しくは複数の静注用免疫グロブリン製剤との組合せで投与される。投与されうる静注用免疫グロブリン製剤は、これだけに限らないがGAMMAR(商標)、IVEEGAM(商標)、SANDOGLOBULIN(商標)、GAMMAGARD S/D(商標)及びGAMIMUNE(商標)を含む。
【００９６】
付加的実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、単独又は抗炎症剤との組合せで投与される。投与されうる抗炎症剤は、これだけに限らないがグルココルチコイド及び非ステロイド性抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、e-アセトアミドカプロン酸、S-アデノシルメチオニン、3-アミノ-4-ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン(amixetrine)、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール(ditazol)、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセプロール、パラニリン(Paranyline)、ペリソキサール、ピホキシム(pifoxime)、プロカゾン、プロキザゾール及びテニダップを含む。
【００９７】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストを含む医薬組成物は、経口、経直腸、非経口、皮下、大槽内(intracisternally)、膣内、腹腔内、局所(粉剤、軟膏、滴下又は経皮パッチによる)、頬側に又は経口若しくは経鼻スプレー(例えば蒸気又は粉剤の吸入による)として投与されうる。組成物は、トリグリセリドなどの伝統的な結合剤及び担体と共に坐薬として処方されうる。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を含みうる。適切な薬学的担体の例は、E.W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。そのような組成物は、治療的有効量のBリンパ球刺激因子アンタゴニストを、好ましくは精製形態で患者への適切な投与のための形態を提供するために適切な量の担体と共に含む。処方は投与の様式に適していなければならない。
【００９８】
用語「非経口」は、本明細書において静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内(intrasternal)、皮下及び関節内注射並びに点滴を含む投与の様式を意味して使用される。
【００９９】
好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、皮下に投与される。他の好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、鼻腔内又は鼻粘膜を通じて投与される。経鼻投与のための医薬組成物は、当技術分野において十分に周知である。
【０１００】
他の好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、医薬組成物として静脈内投与される。典型的には静脈内投与のための組成物は滅菌等張水性緩衝液剤中の溶液である。必要に応じて組成物は、可溶化剤及び、注射部位の疼痛を緩和するためにリグノカインなどの局所麻酔剤も含みうる。一般に成分は、活性剤の量を表示したアンプル若しくは袋などの密封した容器中に別々に又は、例えば凍結乾燥粉末若しくは水不含有濃縮剤として、単位投与形態中に一緒に混合されてのいずれかで供給される。組成物が注入によって投与される場合は、滅菌医薬品等級の水若しくは生理食塩水を含む注入ビンで調剤されうる。組成物が注射によって投与される場合は、成分が投与前に混合されうるように注射用の滅菌水若しくは生理食塩水のアンプルが提供されうる。
【０１０１】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、徐放性の系によっても適切に投与される。徐放性用組成物の適切な例は、適切なポリマー物質(例えば加工された形態での半透過性ポリマーマトリクス、例えばフィルム又はマイクロカプセルなど)、適切な疎水性物質(例えば許容されるな油中の乳剤など)又はイオン交換樹脂及び難溶性誘導体(例えば難溶性塩など)を含む。
【０１０２】
徐放性マトリクスは、ポリ乳酸(米国特許第3,773,919号及びEP 0058481)、L-グルタミン酸とガンマ-エチル-L-グルタミン酸との共重合体(Sidman,U.et al.,Biopolymers 22:547-556(1983))、ポリ(2-メタクリル酸ヒドロキシエチル)(R.Langer et al.,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277(1981)及びR.Langer,Chem.Tech.12:98-105(1982))、エチレン酢酸ビニル(R.Langer et al.,Id.)又はポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(EP 0133988)を含む。
【０１０３】
好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる例えば米国特許第4,938,763号、第5,278,201号、第5,278,202号、第5,324,519号、第5,340,849号及び第5,487,897号並びに国際特許出願公開第WO 01/35929号、第WO 00/24374号及び第WO 00/06117号に記載のとおり生分解性、ポリマー剤送達系において処方される。具体的な好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、Atrix Laboratories,Inc.(Fort Collins,Colorado)のATRIGEL(登録商標)Biodegradable Systemを使用して処方される。他の具体的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、Alkermes,Inc.(Cambridge,MA)から入手可能であるProLease(登録商標)sustained release systemを使用して処方される。
【０１０４】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの製剤中に使用されうる生分解性ポリマーの例は、これだけに限らないがポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ酸無水物、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステルアミド(polyesteramide)、ポリオルトエステル(polyorthoester)、ポリジオキサノン(polydioxanones)、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカーボネート、ポリオルトカーボネート、ポリホスファゼン(polyphosphazene)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ吉草酸、シュウ酸ポリアルキレン、ポリアルキレンコハク酸、ポリ(リンゴ酸)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(メチルビニルエーテル)、ポリ(無水マレイン酸)、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシセルロース、キチン、キトサン及び上記物質の共重合体、ターポリマー又は組合せ若しくは混合物を含む。好ましいポリマーは、結晶化の程度が低く、より疎水性のものである。これらのポリマー及び共重合体は、水素結合の程度も高いポリグリコリド及びキチンなどの結晶性の高いポリマーよりも生体適合性溶媒においてより可溶性である。望ましい溶解性パラメーターを有する好ましい物質は、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン及びこれらとグリコリド(溶解度を増強するさらに非結晶性の領域がある)との共重合体である。具体的な好ましい実施形態において、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの製剤中に使用されうる生分解性ポリマーは、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)である。分子量、疎水性及びラクチド/グリコリド比などのポリマーの性質は、所望の薬剤Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト放出プロファイルを得るために変更されうる(その全体が参照により本明細書に組み込まれる例えばRavivarapu et al.,Journal of Pharmaceutical Sciences 89:732-741(2000)を参照されたい)。
【０１０５】
生分解性ポリマー用の溶媒が無毒性、水混和性及び他に生体適合性であることも好ましい。そのような溶媒の例はこれだけに限らないが、N-メチル-2-ピロリドン、2-ピロリドン、C2からC6のアルカノール類、C1からC15のアルコール類、ジオール、トリオール、及びテトラオール (エタノール、グリセリン、プロピレングリコール及びブタノールなど);C3からC15のアルキルケトン類(アセトン、ジエチルケトン及びメチルエチルケトンなど);C3からC15のエステル類(酢酸メチル、酢酸エチル及び乳酸エチルなど);アルキルケトン類(メチルエチルケトンなど);C1からC15のアミド(ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド及びカプロラクタムなど);C3からC20のエーテル(テトラヒロドフラン及びソルケタール(solketal)など);tween類、トリアセチン、炭酸プロピレン、デシルメチルスルホキシド、ジメチルスルホキシド、オレイン酸、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オンを含む。他の好ましい溶媒は、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、ジプロピレングリコール、トリブチリン、オレイン酸エチル、グリセリン、グリコフラール(glycofural)、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸、ポリエチレングリコール、炭酸プロピレン及びクエン酸トリエチルである。最も好ましい溶媒は、溶媒和能力及びそれらの適合性によってN-メチル-2-ピロリドン、2-ピロリドン、ジメチルスルホキシド、トリアセチン及び炭酸プロピレンである。
【０１０６】
付加的にBリンパ球刺激因子アンタゴニスト及び生分解性ポリマーを含む処方は、放出速度改変剤及び/又はポア形成剤も含みうる。放出速度改変剤の例は、これだけに限らないが、脂肪酸、トリグリセリドなどの疎水性化合物、有機溶媒、可塑性化合物及び親水性化合物を含む。適切な速度改変剤は、例えば2-酢酸エトキシエチル、酢酸メチル、酢酸エチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジメチル、フタル酸ジブチル、アジピン酸ジメチル、コハク酸ジメチル、シュウ酸ジメチル、クエン酸ジメチル、クエン酸トリエチル、アセチルクエン酸トリブチル、アセチルクエン酸トリエチル、三酢酸グリセロール、セバシン酸ジ(n-ブチル)などのモノ-、ジ-及びトリカルボン酸のエステル;プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ソルビトールなどのポリヒドロキシアルコール類;脂肪酸類;トリグリセリド、エポキシ化大豆油及び他のエポキシ化植物油などのグリセロールのトリエステル類;コレステロールなどのステロール類;C6からC12のアルカノール、2-エトキシエタノールなどのアルコール類を含む。放出速度改変剤は、単独で又は他のその様な薬剤との組合せで使用されうる。放出速度改変剤の適切な組合せは、これだけに限らないがグリセリン/プロピレングリコール、ソルビトール/グリセリン、エチレンオキシド/プロピレンオキシド、ブチレングリコール/アジピン酸などを含む。好ましい放出速度改変剤は、これだけに限らないがクエン酸ジメチル、クエン酸トリエチル、ヘプタン酸エチル、グリセリン及びヘキサンジオールを含む。ポリマー組成物中で使用されうる適切なポア形成剤は、これだけに限らないがショ糖及びブドウ糖などの糖類、塩化ナトリウム及び炭酸ナトリウムなどの塩類、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール及びポリビニルピロリドンなどのポリマーを含む。規定のポアサイズを提供する、塩及び糖などの固体結晶は好ましい。
【０１０７】
具体的な好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、BEMA(商標)BioErodible Mucoadhesive System、MCA(商標)MucoCutaneous Absorption System、SMP(商標)Solvent MicroParticle System又はAtrix Laboratories,Inc.(Fort Collins,Colorado)のBCP(商標)BioCompatible Polymer Systemを使用して処方されうる。
【０１０８】
徐放性組成物は、リポソームに封入された本発明の組成物も含む(一般にLanger,Science 249:1527-1533(1990)、Treat et al.,in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.317-327 and 353-365(1989))を参照されたい。Bリンパ球刺激因子アンタゴニストを含有するリポソームは、本質的に周知の方法によって調製されうる:DE 3,218,121、Epstein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82:3688-3692(1985)、Hwang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77:4030-4034(1980)、EP 0052322、EP 0036676、EP 0088046、EP 0143949、EP 0142641、日本特許出願第83-118008号、米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号並びにEP 0102324。通常リポソームは、脂質含有量が約30モルパーセントコレステロール (選択された割合は最適なBリンパ球刺激因子アンタゴニスト療法のために調整される)より多い小さな(約200-800オングストローム)単層型である。
【０１０９】
他の実施形態において本発明の徐放性組成物は、当技術分野において周知の結晶製剤を含む。
【０１１０】
さらに付加的実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、ポンプによって送達される(Langer、上記、Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)、Buchwald et al.,Surgery 88:507(1980)、Saudek et al.,N.Engl.J.Med.321:574(1989)を参照されたい)。
【０１１１】
他の放出制御系は、Langerによる総説(Science 249:1527-1533(1990))において考察されている。
【０１１２】
非経口投与のために、一実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、所望程度の純度で単位投与注射用形態(液剤、懸濁剤又は乳剤)中に薬学的に許容される担体(すなわち使用される用量及び濃度においてレシピエントに無毒性であり、製剤の他の成分と適合可能であるもの)と混合することによって一般に処方される。例えば製剤は、好ましくは酸化剤及びポリペプチドに有害であることが周知である他の化合物を含まない。
【０１１３】
一般に製剤は、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストを液体担体若しくは微粉化した固体担体又は両方に均一かつ密接に接触させることによって調製される。したがって必要な場合は、産生物は所望の剤形に加工される。好ましくは担体は、非経口担体であり、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。そのような担体ビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル液及びブドウ糖溶液を含む。固定油及びオレイン酸エチルなどの非水性ビヒクルは、本明細書においてリポソームと同様に有用である。
【０１１４】
担体は、等張性及び化学的安定性を増強する物質などの少量の添加物を適切に含有する。その様な物質は、使用される用量及び濃度においてレシピエントに無害でありリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸及び他の有機酸又はそれらの塩などの緩衝剤;アスコルビン酸などの抗酸化剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアルギニンなどのアミノ酸;単糖、二糖及び、セルロース若しくはその誘導体、ブドウ糖、マンノース、ショ糖又はデキストリンを含む他の炭水化物、;EDTAなどのキレート剤;マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール;ナトリウムなどの対イオン;クレゾール、フェノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール及びパラベンなどの保存剤及び/或いはポリソルベート、ポロキサマー又はPEGなどの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１１５】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、典型的にはそのようなビヒクル中に約0.001mg/mlから250mg/ml又は0.1mg/mlから100mg/ml、好ましくは1-10mg/ml又は1-10mg/mlの濃度で、約3から10又は3から8、より好ましくは5-8、最も好ましくは6-7のpHで処方される。特定の前述の賦形剤、担体又は安定化剤の使用が塩の形成を生じることは理解される。
【０１１６】
治療的投与のために使用されるBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、滅菌されていなければならない。滅菌は、滅菌濾過膜(例えば0.2ミクロン膜)を通す濾過によって容易に達成される。一般に治療用Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、滅菌接続口を有する容器、例えば皮下注射用針で貫通可能な共栓を有する静脈注射用溶液袋又はバイアル中に入れられる。
【０１１７】
通常Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、単回又は多回投与容器、例えば密封されたアンプル又はバイアル中で、水性溶液として又は再構成用の凍結乾燥製剤として保存される。凍結乾燥製剤の例として、10mlバイアルは濾過滅菌済1%(w/v)Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト水性溶液5mlを充填され、得られた混合物は凍結乾燥される。注入溶液は、凍結乾燥Bリンパ球刺激因子アンタゴニストを注入用静菌水を使用して再構築することによって調製される。
【０１１８】
代替としてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、凍結乾燥形態で単一用量容器中に保存される。注入選択物は、注射用滅菌担体を使用して再構築される。
【０１１９】
本発明は、本発明の医薬組成物の一つ又は複数の成分(例えばBリンパ球刺激因子アンタゴニスト)を充填した一つ又は複数の容器を含む医薬品パック又はキットも提供する。場合によりそのような(一つ又は複数の)容器に付随するのは、医薬品又は生物学的産生物の製造、使用又は販売を監督する行政機関によって規定された書式での通知書であり、通知書はヒトへの投与のための製造、使用又は販売の行政機関による承認を表す。
【０１２０】
治療的及び/又は予防的投与及び組成物
本発明は、Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト、好ましくは抗Bリンパ球刺激因子抗体の有効量の、典型的には医薬組成物中での対象への投与による治療、抑制及び予防の方法を提供する。好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、実質的に精製されている(例えば、効果を限定する又は望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない)。対象は、好ましくは、これだけに限らないが、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス、ラットハムスター、ブタ、マイクロブタ、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ヒト以外の霊長類及びヒトなどの哺乳類を含む動物である。最も好ましい実施形態において対象はヒトである。
【０１２１】
種々の送達系が周知であり、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストを投与するために使用されうる、例えばリポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現できる組換え細胞、受容体調節エンドサイトーシス(例えばWu and Wu,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987)を参照されたい)、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築など。導入方法は、これだけに限らないが皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口経路を含む。化合物又は組成物は、任意の好都合な経路、例えば注入又はボーラス投与によって、上皮又は皮膚粘膜の内膜(例えば口腔粘膜、直腸及び腸の粘膜など)を通じた吸収によって投与されることができ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されうる。投与は全身性又は局所であってよい。付加的にBリンパ球刺激因子アンタゴニストを中枢神経系に、脳室内及びくも膜下腔内注射を含む任意の適切な経路によって導入することが望ましい場合があり、脳室内注射は、例えばOmmayaリザーバーなどのリザーバーに接続された脳室内カテーテルによって促進される場合がある。例えば吸引器又は噴霧器の使用及びエアロゾル化剤を含む処方の使用による、肺への投与も使用されうる。
【０１２２】
具体的な実施形態において、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストを治療が必要な領域へ局所的に投与することが望ましい場合があり、これは例えば(限定することなく)手術中の局所注入、局所適用(例えば手術後の創傷被覆と併せて)、注射によって、カテーテルの手段によって、坐薬の手段によって又はインプラント(前記インプラントは多孔性、非多孔性又は、シラスティック膜などの膜又は繊維を含むゼラチン状物質である)の手段によって達成されうる。好ましくは、抗体を含むタンパク質を投与する場合には、タンパク質が吸収されない物質を使用するように注意しなければならない。
【０１２３】
他の実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、ベシクル中で、詳細にはリポソーム中で送達されうる(Langer,Science 249:1527-1533(1990)、Treat et al.,in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365(1989)、Lopez-Berestein、同書、pp.317-327を参照されたい、一般に同書を参照されたい)。
【０１２４】
さらに他の実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、放出制御系において送達されうる。一実施形態においてポンプは使用されうる(Langer,上記、Sefton,CRC Crit.Ref. Biomed.Eng.14:201(1987)、Buchwald et al.,Surgery 88:507(1980)、Saudek et al.,N.Engl.J.Med.321:574(1989)を参照されたい)。他の実施形態においてポリマー物質は、使用されうる(Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Press, Boca Raton,Florida(1974)、Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984)、Ranger and Peppas,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983)を参照されたい、Levy et al.,Science 228:190(1985)、During et al.,Ann.Neurol.25:351(1989)、Howard et al.,J.Neurosurg.71:105(1989)も参照されたい)。さらに他の実施形態において放出制御系は、治療的標的に(すなわち脳に、全身用量のごく一部だけを必要として)近接して置いてもよい(例えばGoodson,in Medical Applications of Controlled Release,上記、vol.2,pp.115-138(1984)を参照されたい)。
【０１２５】
他の放出制御系は、Langerによる総説において考察されている(Science 249:1527-1533(1990))。
【０１２６】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストがタンパク質又は抗体をコードしている核酸である具体的な実施形態において、核酸はそれがコードするタンパク質の発現を促進するためにin vivoで、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築するステップ及びそれを(例えばレトロウイルスベクター(米国特許第4,980,286号を参照されたい)の使用によって又は直接注入によって又は微粒子銃法(例えば遺伝子銃、Biolistic、Dupont)若しくは脂質でコートするステップ若しくは細胞表面受容体若しくは形質移入剤の使用によって又は核に進入することが周知であるホメオボックス様ペプチドと連結されて投与されるステップなどによって(例えばJoliot et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868(1991)を参照されたい))細胞内になるように投与するステップによって投与されうる。代替として核酸は、相同組換えによって細胞内に導入され、発現のために宿主細胞DNA中に取り込まれうる。
【０１２７】
患者に投与されるBリンパ球刺激因子アンタゴニスト(例えば抗Bリンパ球刺激因子抗体)の投与量は、典型的には、患者の体重1kgあたり0.1mgから100mgである。好ましくは患者に投与される投与量は、患者の体重1kgあたり0.1mgと20mgとの間、より好ましくは患者の体重1kgあたり1mgから10mgである。一般にヒト抗体は、外来ポリペプチドへの免疫応答のために他の種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期を有することから、アンタゴニストが抗体である場合はヒト抗体の低い投与量及び低い頻度での投与がしばしば可能になる。Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト(例えば抗Bリンパ球刺激因子抗体)投与の投与量及び頻度は、例えば脂質化などの修飾によりアンタゴニストの取り込み及び組織浸透(例えば脳内への)を増強するステップによって低減されうる。
【０１２８】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、中性又は塩形態として処方されうる。薬学的に許容される塩は、塩化水素、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの陰イオンと形成されたもの及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄(III)、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの陽イオンと形成されたものを含む。
【０１２９】
アンタゴニスト-アッセイ及び分子
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、小さな有機分子、ペプチド、ポリペプチド(Bリンパ球刺激因子タンパク質と重要な類似性を共有しているタンパク質など)、抗体(本明細書に記載のとおり、その断片、類似物及び誘導体を含む)及びBリンパ球刺激因子タンパク質に結合し、Bリンパ球刺激因子活性(例えばB細胞の増殖、分化若しくは生存又は、Bリンパ球刺激因子受容体分子などのBリンパ球刺激因子タンパク質結合分子に結合するBリンパ球刺激因子タンパク質の能力)を低下、抑制又は失わせる抗体をコードしている核酸であることもできる。
【０１３０】
他のBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、アンチセンス分子を含む。アンチセンス技術は、アンチセンスDNA若しくはRNAを通じて又は三重らせん形成を通じて遺伝子発現を制御するために使用されうる。アンチセンス技術は例えばOkano,J.Neurochem.56: 560(1991);"Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Press,Boca Raton,FL(1988)において考察されている。アンチセンス技術は、アンチセンスDNA若しくはRNAを通じて又は三重らせん形成を通じて遺伝子発現を制御するために使用されうる。アンチセンス技術は例えばOkano,J.Neurochem.56:560(1991);"Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Press,Boca Raton,FL(1988)において考察されている。三重らせん形成は、例えばLee et al.,Nucleic Acids Research 6:3073(1979)、Cooney et al.,Science 241:456(1988)及びDervan et al.,Science 251:1360(1991)において考察されている。方法は、ポリヌクレオチドの相補的DNA又はRNAへの結合に基づいている。例えば、配列番号2のポリペプチドの細胞外ドメインをコードしているポリヌクレオチドの5'コード部分は、長さ約10から40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために使用されうる。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的に設計され、それによりBリンパ球刺激因子の転写及び産生を妨げる。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、in vivoでmRNAにハイブリダイズし、mRNA分子のBリンパ球刺激因子ポリペプチドへの翻訳を遮断する。上に記載のオリゴヌクレオチドは、Bリンパ球刺激因子の産生を阻害するためにアンチセンスRNA又はDNAがin vivoで発現されうるように細胞に送達されることもできる。
【０１３１】
一実施形態において本発明のBリンパ球刺激因子アンチセンス核酸は、外来性配列からの転写によって細胞内で産生される。例えばベクター又はその一部は、転写され、Bリンパ球刺激因子のアンチセンス核酸(RNA)を産生する。そのようなベクターは、Bリンパ球刺激因子アンチセンス核酸をコードする配列を含有する。そのようなベクターは、所望のアンチセンスRNAを産生するために転写されうる限り、エピソームに留まることができる又は染色体に組み込まれうる。そのようなベクターは、当技術分野において標準的な組換えDNA技術法によって構築されうる。ベクターは、脊椎動物細胞における複製及び発現のために使用されるプラスミド、ウイルス性、又は当技術分野において周知の他のものでありうる。Bリンパ球刺激因子又はその断片をコードする配列の発現は、脊椎動物細胞において、好ましくはヒト細胞において作用する当技術分野において周知の任意のプロモーターによってなされうる。そのようなプロモーターは、誘導性又は構成的であってよい。そのようなプロモーターは、これだけに限らないがSV40初期プロモーター領域(Bernoist and Chambon,Nature 29:304-310(1981)、ラウス肉腫ウイルスの3'末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamoto et al.,Cell22:787-797(1980))、ヘルペスチミジンプロモーター(Wagner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445(1981))、メタロチオネイン遺伝子の制御配列(Brinster, et al.,Nature 296:39-42(1982))などを含む。
【０１３２】
アンチセンス核酸は、Bリンパ球刺激因子遺伝子のRNA転写物の少なくとも一部分に相補的な配列を含む。しかし完全な相補性は、好ましいが、必要ではない。「RNAの少なくとも一部分に相補的な」配列は、本明細書においてRNAにハイブリダイズ可能であり、安定な二重らせんを形成するために十分な相補性を有する配列を意味し、二重らせんBリンパ球刺激因子アンチセンス核酸の場合は、したがって二重鎖DNAの一本鎖が検査されてよく又は三重鎖形成がアッセイされてよい。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度及びアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般にハイブリダイズする核酸が大きくなると、Bリンパ球刺激因子RNAが安定な二重鎖(又は場合により三重鎖であってよい)を形成できるままで含有できる塩基ミスマッチは多くなる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的手順の使用によってミスマッチの許容できる程度を確認できる。
【０１３３】
メッセージの5'末端に相補的なオリゴヌクレオチド(例えばAUG開始コドンまでの及びそれを含む5'非翻訳配列)は、翻訳の阻害において最も効率的に作用するはずである。しかしmRNAの3'非翻訳配列に相補的な配列も同様にmRNAの翻訳を阻害することに効果的であることが示されている。一般にWagner,R.,1994,Nature 372:333-335を参照されたい。したがってBリンパ球刺激因子遺伝子の5'-又は3'-非翻訳領域、非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、外来性Bリンパ球刺激因子mRNAの翻訳を阻害するためのアンチセンス手法において使用されうる。mRNAの5'非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、AUG開始コドンの相補物を含むべきである。mRNAコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、あまり効率的な翻訳の阻害剤ではないが本発明に併せて使用されうる。Bリンパ球刺激因子mRNAの5'-、3'-又はコード領域のいずれにハイブリダイズするように設計されようと、アンチセンス核酸は長さ少なくとも6ヌクレオチドであるべきであり、好ましくは長さ6から約50ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。具体的な態様においてオリゴヌクレオチドは、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド又は少なくとも50ヌクレオチドである。
【０１３４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、これだけに限らないが5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルクエオシン(beta-D-galactosylqueosine)、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルクエオシン(beta-D-mannosylqueosine)、5-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン(wybutoxosine)、シュードウラシル(pseudouracil)、クエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、及び2,6-ジアミノプリンを含む群から選択される少なくとも一つの修飾された塩基成分を含みうる。
【０１３５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、これだけに限らないがアラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース及びヘキソースを含む群から選択される少なくとも一つの修飾された糖成分も含みうる。
【０１３６】
さらに他の実施形態においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、これだけに限らないがホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミド酸、ホスホロジアミド酸、メチルホスホン酸、アルキルホスホトリエステル及びホルムアセタール又はそれらの類似物を含む群から選択される少なくとも一つの修飾されたリン酸骨格を含む。
【０１３７】
さらに他の実施形態においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アルファ-アノマーオリゴヌクレオチドである。アルファ-アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的RNAと特異的二重鎖ハイブリッド(通常のベータユニットとは逆に鎖が相互に平行に走っている)を形成する(Gautier et al.,Nucl.Acids Res.15:6625-6641(1987))。オリゴヌクレオチドは、2-0-メチルリボヌクレオチド(Inoue et al.,Nucl.Acids Res.15:6131-6148(1987))又はキメラRNA-DNA類似物(Inoue et al.,FEBS Lett.215:327-330(1997))である。
【０１３８】
ポリヌクレオチドは、当技術分野において周知の標準的方法によって、例えば自動化DNA合成機(Biosearch、Applied Biosystemsなどから商業的に入手可能なものなど)の使用によって合成されうる。例としてホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinら(Nucl. Acids Res.16:3209(1988))の方法によって合成されることができ、メチルホスホン酸オリゴヌクレオチドは、制御された多孔性ガラスポリマー支持体などの使用(Sarin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:7448-7451(1988))によって調製されうる。
【０１３９】
Bリンパ球刺激因子コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドは使用されうるが、転写された非翻訳領域に相補的なものは最も好ましい。
【０１４０】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、Bリンパ球刺激因子受容体又はBリンパ球刺激因子に特異的な抗体も含む。アンタゴニスト抗体は、Bリンパ球刺激因子又はBリンパ球刺激因子受容体免疫原を使用する任意の種々の標準的方法によって調製されうる。Bリンパ球刺激因子免疫原は、完全なBリンパ球刺激因子ポリペプチド配列(配列番号2)並びに、例えばリガンド結合ドメイン、TNF-保存ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び/若しくは細胞内ドメイン又は任意のこれらの組合せを含むBリンパ球刺激因子ポリペプチド断片を含む。
【０１４１】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体アンタゴニストは、Tartaglia and Goeddel,J.Biol.Chem.267(7):4304-4307(1992))、Tartaglia et al.,Cell 73:213-216(1993))及び国際特許出願公開WO 94/09137において開示の方法により産生させることができ、好ましくは特異的(すなわちBリンパ球刺激因子タンパク質又はその断片に結合する)である。本明細書において使用される用語「抗体」(Ab)又は「モノクローナル抗体」(mAb)は、抗原に結合できる無処理の分子及びその断片(例えばFab及びF(ab')断片など)を含んで意味する。Fab、Fab'及びF(ab')断片は、無処理の抗体のFc断片を欠失しており、循環からより迅速に除去され、無処理抗体より少ない非特異的組織結合を有する場合がある(Wahl et al.,J.Nucl.Med.,24:316-325(1983))。
【０１４２】
好ましい方法においてアンタゴニスト抗体はmAbである。そのようなmAbは、融合細胞技術(Kohler and Millstein,Nature 256:495-497(1975)及び米国特許第4,376,110号、Harlow et al., Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1988、Monoclonal Antibodies and Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses,Plenum Press,New York,NY,1980、Campbell、"Monoclonal Antibody Technology,"In:Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Volume 13(Burdon et al.,eds.)Elsevier,Amsterdam(1984))を使用して調製されうる。
【０１４３】
Bリンパ球刺激因子に結合するタンパク質及び他の化合物も、本発明の内容において有用なアンタゴニスト候補である。そのような結合化合物は、酵母ツーハイブリッド系を使用して「捕捉」されうる(Fields and Song,Nature 340:245-246(1989))。酵母ツーハイブリッド系の改変バージョンは、Roger Brent及び協力者らよって記載されている(Gyuris,Cell 75:791-803(1993)、Zervos et al.,Cell 72:223-232(1993))。好ましくは酵母ツーハイブリッド系は、(リガンド結合ドメイン、TNF-保存ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン若しくは細胞内ドメイン又はその任意の組合せを含む)Bリンパ球刺激因子タンパク質又はその断片に結合する化合物を捕捉するために使用される。そのような化合物は、良いアンタゴニスト候補である。
【０１４４】
付加的に上記のツーハイブリッドアッセイを使用して、Bリンパ球刺激因子受容体又はその一部の細胞外又は細胞内ドメインは、Bリンパ球刺激因子受容体とin vivoで相互作用する細胞性タンパク質を同定するためにも使用されうる。その様なアッセイはBリンパ球刺激因子受容体機能の潜在的アンタゴニスト活性を有するリガンドを同定するためにも使用されうる。このスクリーニングアッセイは、ネズミTNF-RIIの細胞質ドメインと相互作用するタンパク質を同定するために以前から使用されており、二つの受容体関連タンパク質の同定を導いた。Rothe et al.,Cell 78:681(1994)。Bリンパ球刺激因子受容体の細胞質ドメインに結合するそのようなタンパク質及びアミノ酸配列は、本発明のアンタゴニストの良い候補である。
【０１４５】
他のスクリーニング技術は、例えばScience,246:181-296(1989)において記載された受容体活性化によって生じる細胞外pH変化を測定する系における、Bリンパ球刺激因子受容体を発現する細胞(例えば形質移入したCHO細胞)の使用を含む。他の例において潜在的アンタゴニストは、Bリンパ球刺激因子受容体を発現する細胞に接触する場合があり、二次メッセンジャー応答(例えばシグナル伝達)は、潜在的アンタゴニストが有効であるかどうか決定するために測定されうる。
【０１４６】
抗体
一実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、Bリンパ球刺激因子生物学的活性を中和する抗Bリンパ球刺激因子抗体である。抗Bリンパ球刺激因子抗体は、例えば可溶性Bリンパ球刺激因子タンパク質、膜結合Bリンパ球刺激因子タンパク質、配列番号2のアミノ酸少なくとも134から285をコードしているポリヌクレオチドによってコードされており細胞培養物から精製された組換えBリンパ球刺激因子タンパク質、及び/又は配列番号2のアミノ酸少なくとも134から285をコードしているポリヌクレオチドによってコードされた組換えBリンパ球刺激因子タンパク質に結合できる。
【０１４７】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、Bリンパ球刺激因子タンパク質と少なくとも一つのその受容体との間の相互作用を部分的に又は完全にのいずれかで破壊する抗体も含む。Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、受容体特異的抗体及びリガンド特異的抗体(すなわち抗Bリンパ球刺激因子抗体)の両方を含む。含まれるのは、リガンド結合を阻止しないが受容体活性化を阻止する受容体特異的抗体である。受容体活性化(すなわちシグナル伝達)は、本明細書に記載の又は他の当技術分野において周知の技術によって決定されうる。さらに含まれるのは、リガンド結合及び受容体活性化の両方を阻止する受容体特異的抗体である。同様に含まれるのは、リガンドに結合しリガンドの受容体への結合を阻止する中和抗体及びリガンドに結合し、それにより受容体活性化を阻止するがリガンドの受容体への結合を阻止しない抗体である。さらに含まれるのは、Bリンパ球刺激因子がBリンパ球刺激因子受容体に結合するかどうかにかかわらずBリンパ球刺激因子に結合する抗体である。
【０１４８】
いくつかのアンタゴニストモノクローナル抗体が、既に記載され、参照により本明細書に組み込まれるとおりBリンパ球刺激因子タンパク質に対して生成されている(例えば米国特許第7,317,089号及び米国特許出願公開第2009/0104189号、第2008/0050381号及び第2005/0255532号を参照されたい)。一実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、米国特許第7,317,089号及び米国特許出願公開第2009/0104189号、第2008/0050381号及び第2005/0255532号において記載の任意の抗Bリンパ球刺激因子抗体である。好ましい実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、Human Genome Sciences,IncからのBENLYSTA(登録商標)(ベリムマブ)である。他の実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、LY2127399(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)である。他の実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、米国特許第7,317,089号において開示された/特許請求された抗体である。
【０１４９】
他の実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、米国特許第7,317,089号及び米国特許出願公開第2009/0104189号、第2008/0050381号及び第2005/0255532号において記載された一つ若しくは複数の抗体又はHuman Genome Sciences,Inc.からの抗Bリンパ球刺激因子抗体BENLYSTA(登録商標)(ベリムマブ)、又は抗Bリンパ球刺激因子抗体LY2127399(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,INから)と同じ一つ又は複数の生物学的特徴を有する任意の抗Bリンパ球刺激因子抗体である。「生物学的特徴」は、これらの既に記載された抗体のin vitro又はin vivoでの活性又は性質、例えば、Bリンパ球刺激因子タンパク質(例えば配列番号2のポリペプチド、Bリンパ球刺激因子タンパク質の成熟形態、Bリンパ球刺激因子タンパク質の膜結合形態、Bリンパ球刺激因子タンパク質の可溶性形態(配列番号2のアミノ酸134から285)並びにBリンパ球刺激因子タンパク質の抗原及び/又はエピトープ領域)に結合する能力、Bリンパ球刺激因子/Bリンパ球刺激因子受容体結合を実質的に遮断する能力、又はBリンパ球刺激因子調節生物学的活性(例えばB細胞増殖及び免疫グロブリン産生の刺激)を遮断する能力を意味する。場合により、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、米国特許第7,317,089号及び米国特許出願公開第2009/0104189号、第2008/0050381号及び第2005/0255532において既に記載された又は、Human Genome Sciences,Inc.からの抗Bリンパ球刺激因子抗体BENLYSTA(登録商標)(ベリムマブ)及び抗Bリンパ球刺激因子抗体LY2127399(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,INから)を含む本明細書に具体的に参照された少なくとも一つの抗体と同じエピトープに結合する任意の抗Bリンパ球刺激因子抗体である。そのようなエピトープは、当技術分野において周知のアッセイを使用して日常的に決定されうる。
【０１５０】
他の実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、抗Bリンパ球刺激因子タンパク質の可溶性形態だけに特異的に結合する。
【０１５１】
抗Bリンパ球刺激因子抗体は、Bリンパ球刺激因子の膜結合形態及び可溶性形態の両方にも結合できる。
【０１５２】
上に記載のとおり、抗Bリンパ球刺激因子抗体は、in vitro及び/又はin vivoでBリンパ球刺激因子受容体に結合するBリンパ球刺激因子の能力を抑制する又は低下させる抗体を含む。具体的な実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、in vitroでBリンパ球刺激因子受容体に結合するBリンパ球刺激因子の能力を抑制する又は低下させる。他の非排他的な具体的な実施形態において、抗Bリンパ球刺激因子抗体は、in vivoでBリンパ球刺激因子受容体に結合するBリンパ球刺激因子の能力を抑制する又は低下させる。そのような抑制は、本明細書に記載される又は他に当技術分野において周知の技術を使用してアッセイされうる。
【０１５３】
上に記載のとおり抗Bリンパ球刺激因子抗体は、in vitro及び/又はin vivoでBリンパ球刺激因子調節生物学的活性を抑制する又は低下させる抗体を含む。具体的な実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、in vitroでBリンパ球刺激因子調節B細胞増殖を抑制する又は低下させる。そのような抑制は、当技術分野において周知のB細胞増殖アッセイを日常的に変更することによってアッセイされうる。他の非排他的な具体的な実施形態において、抗Bリンパ球刺激因子抗体は、in vivoでBリンパ球刺激因子調節B細胞増殖を抑制又は低下させる。具体的実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、米国特許出願公開第2009/0104189号に記載のとおり15C10又はそのヒト化形態である。他の好ましい具体的な実施形態において、抗Bリンパ球刺激因子抗体は、米国特許出願公開第2009/0104189号に記載のとおり16C9又はそのヒト化形態である。したがって本発明の具体的な実施形態において16C9及び/若しくは15C10抗体又はそのヒト化形態は、可溶性Bリンパ球刺激因子に結合し、それによりB細胞増殖を抑制(部分的又は完全にのいずれかで)するために使用される。他の好ましい具体的な実施形態において、抗Bリンパ球刺激因子抗体は、Human Genome Sciences,Inc.からのBENLYSTA(登録商標)(ベリムマブ)である。他の好ましい具体的な実施形態において、抗Bリンパ球刺激因子抗体は、LY2127399(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)である。他の好ましい具体的な実施形態において、抗Bリンパ球刺激因子抗体は、米国特許出願公開第2008/0050381号に記載のとおり4H4である。
【０１５４】
上に記載のとおりBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、Human Genome Sciences,Inc.からの抗Bリンパ球刺激因子抗体BENLYSTA(登録商標)(ベリムマブ)、及び抗Bリンパ球刺激因子抗体LY2127399(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)を含む本明細書に具体的に参照された抗体の少なくとも一つと同じエピトープにin vitro及び/又はin vivoで特異的に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体を含む。
【０１５５】
具体的な実施形態において、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、in vitroで配列番号2のAla-134付近からCyc-146付近までのアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体を含む。他の具体的、非排他的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、in vivoで配列番号2のAla-134付近からCyc-146付近までのアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体を含む。具体的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、in vitroで配列番号2のSer-171付近からPhe-194付近までのアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体を含む。他の具体的、非排他的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、in vivoで配列番号2のSer-171付近からPhe-194付近までのアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体を含む。他の具体的、非排他的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、in vitroで配列番号2のLys-173からLys-188までのアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体を含む。他の具体的、非排他的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、in vivoで配列番号2のLys-173からLys-188までのアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体を含む。
【０１５６】
付加的、具体的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、in vitroで配列番号2のGlu-223付近からTyr-246付近までのアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体を含む。他の具体的、非排他的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、in vivoで配列番号2のGlu-223付近からTyr-246付近までのアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体を含む。他の具体的、非排他的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、in vitroで配列番号2のVal-227からAsn-242までのアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体を含む。他の具体的、非排他的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、in vivoで配列番号2のVal-227からAsn-242までのアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体を含む。他の具体的、非排他的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、in vitroで配列番号2のPhe-230からCys-245までのアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体を含む。他の具体的、非排他的な実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、in vivoで配列番号2のPhe-230からCys-245までのアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体を含む。
【０１５７】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、米国特許第7,317,089号及び米国特許出願公開第2009/0104189号、第2008/0050381号及び第2005/0255532号に既に記載された又はHuman Genome Sciences,Inc.からの抗Bリンパ球刺激因子抗体BENLYSTA(登録商標)(ベリムマブ)及び抗Bリンパ球刺激因子抗体LY2127399(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)を含む本明細書において具体的に参照された任意の抗Bリンパ球刺激因子抗体の結合を競合的に阻害する抗Bリンパ球刺激因子抗体も含む。競合的阻害は、当技術分野において周知の任意の方法によって、例えば本明細書に記載の競合的結合アッセイを使用して決定されうる。好ましい実施形態において抗体は、米国特許第7,317,089号及び米国特許出願公開第2009/0104189号、第2008/0050381号及び第2005/0255532号に既に記載された又はHuman Genome Sciences,Inc.からの抗Bリンパ球刺激因子抗体BENLYSTA(登録商標)(ベリムマブ)及び抗Bリンパ球刺激因子抗体LY2127399(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)を含む本明細書において具体的に参照された任意の抗Bリンパ球刺激因子抗体の、配列番号2のポリペプチド又は配列番号2のアミノ酸残基134-285を含むポリペプチドへの結合を少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%競合的に阻害する。
【０１５８】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2005/0255532号に記載のscFvのVH及びVLドメインを含む抗Bリンパ球刺激因子抗体も含む。
【０１５９】
Bリンパ球刺激因子のポリペプチド又はポリペプチド断片に免疫特異的に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体(抗体断片又はその変種を含む又は代替としてそれからなる分子を含む)は、米国特許第7,220,840号に記載のVH相補性決定領域(「CDR」)(すなわちVH CDR1、VH CDR2又はVH CDR3)の任意の一つ、二つ、三つ若しくはそれ以上の及び/又は米国特許第7,220,840号に記載のVL CDR(すなわちVL CDR1、VL CDR2又はVL CDR3)の任意の一つ、二つ、三つ若しくはそれ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含みうる又は代替としてそれからなりうる。一実施形態において抗体は、米国特許第7,220,840号に記載のVH CDR1の任意の一つの及び/又は米国特許第7,220,840号に記載のVL CDR1の任意の一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む又は代替としてそれからなる。他の実施形態において抗体は、米国特許第7,220,840号に記載のVH CDR2の任意の一つの及び/又は米国特許第7,220,840号に記載のVL CDR2の任意の一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む又は代替としてそれからなる。好ましい実施形態において抗体は、米国特許第7,220,840号に記載のVH CDR3の任意の一つの及び/又は米国特許第7,220,840号に記載のVL CDR3の任意の一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む又は代替としてそれからなる。Bリンパ球刺激因子の可溶性形態、Bリンパ球刺激因子の膜結合形態及び/又はBリンパ球刺激因子の可溶性形態及び膜結合形態の両方に免疫特異的に結合する、これらの抗体の断片又は変種(例えば米国特許第7,220,840号に記載の任意の一つのアミノ酸配列を有するVHドメイン、VH-CDR、VLドメイン又はVL CDRを含む)を含む又は代替としてそれらからなる分子も、これらの抗体をコードする核酸分子として及び/又は分子として本発明に包含される。
【０１６０】
他の実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体(抗体断片又はその変種を含む又は代替としてそれからなる分子を含む)は、Bリンパ球刺激因子のポリペプチド又はポリペプチド断片に免疫特異的に結合し、米国特許第7,220,840号に記載のVH CDR1の任意の一つ、米国特許第7,220,840号に記載のVH CDR2の任意の一つ、及び/又は米国特許第7,220,840号に記載のVH CDR3の任意の一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む又は代替としてそれからなる。他の実施形態において抗体は、米国特許第7,220,840号に記載のVL CDR1の任意の一つ、米国特許第7,220,840号に記載のVL CDR2の任意の一つ及び/又は米国特許第7,220,840号に記載のVL CDR3の任意の一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む又は代替としてそれからなる。好ましい実施形態において抗体は、米国特許第7,220,840号に記載の同じscFvに対応する少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ又はそれ以上のCDRを含む又は代替としてそれからなり、より好ましくはVLドメインのCDR1、CDR2、及びCDR3は同じscFvに対応する又はVHドメインのCDR1、CDR2、及びCDR3は同じscFvに対応する並びに最も好ましくは六つ全てのCDRが米国特許第7,220,840号に記載の同じscFvに対応する。Bリンパ球刺激因子の可溶性形態、Bリンパ球刺激因子の膜結合形態及び/又はBリンパ球刺激因子の可溶性形態及び膜結合形態の両方に免疫特異的に結合する、これらの抗体の断片又は変種を含む又は代替としてそれらからなる分子(例えば米国特許第7,220,840号に記載の任意の一つのアミノ酸配列を有するVHドメイン、VH CDR、VLドメイン又はVL CDRを含む)も、これらの抗体をコードする核酸分子として及び/又は分子として本発明に包含される。
【０１６１】
Bリンパ球刺激因子のポリペプチド又はポリペプチド断片に免疫特異的に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体(その抗体断片又は変種を含む又は代替としてそれからなる分子を含む)は、米国特許第7,220,840号に記載のVHドメイン、VHCDR、VLドメイン又はVLCDRを含む抗Bリンパ球刺激因子抗体又はその抗体断片のアミノ酸配列と少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含みうる又は代替としてそれからなりうる。これらの抗体をコードする核酸分子も本発明によって包含される。
【０１６２】
他の実施形態において、Bリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体(抗体断片又はその変種を含む又は代替的にそれからなる分子を含む)は、米国特許第7,220,840号に記載の任意の一つのVHドメインと少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む又は代替としてそれからなる。他の実施形態において、Bリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合する抗体は、米国特許第7,220,840号に記載の任意の一つのVH CDRと少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む又は代替としてそれからなる。他の実施形態において、Bリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合する抗体は、米国特許第7,220,840号に記載の任意の一つのVH CDR3と少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む又は代替としてそれからなる。これらの抗体をコードする核酸分子も本発明に包含される。
【０１６３】
他の実施形態において、Bリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合する抗Bリンパ球刺激因子抗体(抗体断片又はその変種を含む又は代替としてそれからなる分子を含む)は、米国特許第7,220,840号に記載の任意の一つのVLドメインと少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む又は代替としてそれからなる。他の実施形態において、Bリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合する抗体は、米国特許第7,220,840号に記載の任意の一つのVL CDRと少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む又は代替としてそれからなる。他の実施形態において、Bリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合する抗体は、米国特許第7,220,840号に記載の任意の一つのVL CDR3と少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む又は代替としてそれからなる。これらの抗体をコードする核酸分子も本発明に包含される。
【０１６４】
他の好ましい実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、米国特許第7,220,840号に記載のscFvの断片(例えばVHドメイン、VLドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2又はVLCDR3)又は変種を含む抗体のBリンパ球刺激因子ポリペプチドへの結合を競合的に阻害する。好ましい実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、米国特許第7,220,840号に記載のscFvの断片(例えばVHドメイン、VLドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2又はVLCDR3)又は変種を含む抗体のBリンパ球刺激因子ポリペプチドへの結合を競合的阻害アッセイにおいて1%から10%の間で低下させる。好ましい実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体は、米国特許第7,220,840号に記載のscFvの断片(例えばVHドメイン、VLドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2又はVLCDR3)又は変種を含む抗体のBリンパ球刺激因子ポリペプチドへの結合を競合的阻害アッセイにおいて1%から10%の間で低下させる。
【０１６５】
米国特許出願公開第2005/0255532号に記載のscFvのVH及びVLドメインを含む抗Bリンパ球刺激因子抗体を発現する細胞株は、American Type Culture Collection(「ATCC(商標)」)に表2に列挙した日付に寄託され、表2に示すATCC(商標)寄託番号を付与された。ATCC(商標)は、10801 University Boulevard、Manassas、VA 20110-2209、USAに位置する。ATCC(商標)寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際的認識に関するブダペスト条約の条項によりなされた。
【表２】
2013530188.tif 000003
【０１６６】
したがって一実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、米国特許出願公開第2005/0255532号に開示のscFvのVH及びVLドメインを含む抗Bリンパ球刺激因子抗体である。
【０１６７】
好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、細胞株NSO-B11-15によって発現される抗Bリンパ球刺激因子抗体である。
【０１６８】
好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、細胞株NSO-抗Bリンパ球刺激因子6D08-18によって発現される抗Bリンパ球刺激因子抗体である。
【０１６９】
好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、細胞株NSO-抗Bリンパ球刺激因子116A01-60によって発現される抗Bリンパ球刺激因子抗体である。
【０１７０】
好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、細胞株IO26C04Kによって発現される抗Bリンパ球刺激因子抗体である。
【０１７１】
好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、細胞株IO50A12によって発現される抗Bリンパ球刺激因子抗体である。
【０１７２】
好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、細胞株NSO-B11によって発現される抗Bリンパ球刺激因子抗体である。
【０１７３】
具体的な実施形態において上に記載の具体的な抗体は、本明細書に記載の又は他に当技術分野において周知の技術を使用してヒト化され、次いで本明細書に記載の治療剤として使用される。
【０１７４】
他の具体的な実施形態において上に列挙した任意の抗体は、可溶性形態で使用される。
【０１７５】
他の具体的な実施形態において上に列挙した任意の抗体は、毒素又は標識(下に記載のとおり)とコンジュゲートされる。そのようなコンジュゲート抗体は、細胞の特定の集団を殺すために又は細胞の特定の集団を定量するために使用される。好ましい実施形態においてそのようなコンジュゲート抗体は、表面にBリンパ球刺激因子受容体を発現しているB細胞を殺すために使用される。
【０１７６】
上に考察の通り、次にBリンパ球刺激因子に対する抗体は、当業者に十分に周知の技術を使用してBリンパ球刺激因子を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成するために利用されうる(例えばGreenspan & Bona,FASEB J.7(5):437-444(1989)及びNissinoff,J.Immunol.147(8):2429-2438(1991)を参照されたい)。例えばBリンパ球刺激因子に結合し、Bリンパ球刺激因子多量体化及び/又はリガンドへの結合を競合的に阻害する抗体は、Bリンパ球刺激因子TNF多量体化及び/又はドメインへの結合を「模倣」し、結果としてBリンパ球刺激因子及び/又はそのリガンドに結合し、中和する抗イディオタイプ抗体を生成するために利用されることができる。そのような中和抗イディオタイプ又はそのような抗イディオタイプのFab断片は、Bリンパ球刺激因子リガンドを中和するための治療計画において使用されうる。例えばそのような抗イディオタイプ抗体は、Bリンパ球刺激因子に結合するために又はB細胞系列の細胞表面上のBリンパ球刺激因子受容体に結合するために使用されることができ、それによりBリンパ球刺激因子調節B細胞活性化、増殖及び/又は分化を遮断する。
【０１７７】
好ましい実施形態においてBリンパ球刺激因子アンタゴニストは、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸残基の近接配列を含む、又は代替としてそれからなるBリンパ球刺激因子ポリペプチドに結合するアンタゴニスト抗体である。具体的な実施形態においてアンタゴニスト抗体は、ホモマーの、特にホモ三量体のBリンパ球刺激因子ポリペプチドに結合する。他の具体的な実施形態において、アンタゴニスト抗体は、ヘテロマーの、特にヘテロ三量体のBリンパ球刺激因子ポリペプチド(Bリンパ球刺激因子ポリペプチド2個とAPRILポリペプチド(例えば配列番号20若しくは配列番号47)1個とを含有するヘテロ三量体又はBリンパ球刺激因子ポリペプチド1個とAPRILポリペプチド2個とを含有するヘテロ三量体など)に、免疫特異的に結合する。
【０１７８】
免疫特異的結合は、非特異的な結合を除くが、他の抗原との交差反応性を排除する必要はない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。本発明において有用であるアンタゴニスト抗体は、Bリンパ球刺激因子への免疫特異的結合及び他の抗原との交差反応性について当技術分野において周知の任意の方法によってアッセイされうる。詳細には、Bリンパ球刺激因子の可溶性形態又は膜結合形態に免疫特異的に結合する抗体の能力及び特定の種(例えばネズミ、サル又はヒト、好ましくはヒト)由来のBリンパ球刺激因子ポリペプチドに対する抗体、断片又は変種の特異性は、本明細書に記載の又は他に当技術分野において周知の技術を使用して又は日常的に変更して決定されうる。
【０１７９】
免疫特異的結合及び交差反応性を分析するために使用されうる免疫アッセイは、これだけに限らないが、数例を挙げるとウエスタンブロット、放射免疫アッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光免疫アッセイ及びプロテインA免疫アッセイなどの技術を使用する競合及び非競合アッセイ系を含む。そのようなアッセイは日常的であり、当技術分野において十分に周知である(例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれるAusubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1 John Wiley & Sons,Inc.,New Yorkを参照されたい)。例示的免疫アッセイは、下に簡潔に記載される(しかし限定を意図しない)。
【０１８０】
明細書において他に定義する場合を除き、抗Bリンパ球刺激因子抗体による特異的結合又は免疫特異的結合は、抗Bリンパ球刺激因子抗体がBリンパ球刺激因子には結合するが、タンパク質の同じファミリーの他のタンパク質(例えば他のTNFファミリーリガンド)など、Bリンパ球刺激因子以外のタンパク質には顕著に結合(すなわち交差反応)しないことを意味する。Bリンパ球刺激因子タンパク質に結合し、他のタンパク質には交差反応しない抗体は、全ての条件において前記他のタンパク質に結合しない抗体である必要はなく、むしろBリンパ球刺激因子特異的抗体は、治療における使用に適する(すなわち治療において過度の有害作用を生じない)ように、前記他のタンパク質に結合するその能力と比較してBリンパ球刺激因子に優先的に結合する。抗体が結合するタンパク質の部分がエピトープとして周知であることは十分に周知である。エピトープは、線状(すなわちタンパク質配列中の連続的アミノ酸残基からなる)又はコンフォメーショナル(すなわちタンパク質の一次構造において近接していないがタンパク質の二次、三次又は四次構造によって集まる一つ又は複数のアミノ酸残基からなる)のいずれであってもよい。Bリンパ球刺激因子特異的抗体がBリンパ球刺激因子のエピトープに結合することを考慮すると、Bリンパ球刺激因子に特異的に結合する抗体は、所与のBリンパ球刺激因子特異的抗体によって結合されるエピトープのBリンパ球刺激因子断片又は変種中での存在又は不在に応じて、Bリンパ球刺激因子の断片に及び/又はBリンパ球刺激因子の変種(例えばBリンパ球刺激因子と少なくとも90%同一であるタンパク質)に結合してもしなくてもよい。同様に本発明のBリンパ球刺激因子特異的抗体は、抗体によって認識されるエピトープの相同分子種中での存在又は不在に応じてBリンパ球刺激因子(その断片を含む)の種相同分子種に結合する場合がある。付加的に本発明のBリンパ球刺激因子特異的抗体は、Bリンパ球刺激因子の修飾形態、例えばBリンパ球刺激因子融合タンパク質に結合できる。本発明の抗体がBリンパ球刺激因子融合タンパク質に結合する場合抗体は、結合が特異的であるために融合タンパク質のBリンパ球刺激因子成分と接触して結合形成しなければならない。Bリンパ球刺激因子に特異的に結合する抗体は、例えば免疫アッセイ又は当業者に周知の他の技術によって同定されうる。
【０１８１】
特に好ましい実施形態において、本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、ホモマーの、特にホモ三量体のBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合し、多量体の個々のタンパク質要素はBリンパ球刺激因子の成熟形態(例えば配列番号2のアミノ酸残基134-285)からなる。他の具体的な実施形態において本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、ヘテロマーの、特にヘテロ三量体のBリンパ球刺激因子ポリペプチド(Bリンパ球刺激因子ポリペプチド2個とAPRILポリペプチド1個とを含有するヘテロ三量体又はBリンパ球刺激因子ポリペプチド1個とAPRILポリペプチド2個とを含有するヘテロ三量体)に結合し、Bリンパ球刺激因子ヘテロマーの個々のタンパク質要素はBリンパ球刺激因子のいずれかの成熟細胞外可溶性部分又はAPRILの成熟細胞外可溶性部分からなる。
【０１８２】
具体的な実施形態においてアンタゴニスト抗体は、Bリンパ球刺激因子単量体タンパク質のコンフォメーショナルエピトープに結合する。具体的な実施形態において本発明のアンタゴニスト抗体は、Bリンパ球刺激因子多量体の、特に三量体のタンパク質のコンフォメーショナルエピトープに結合する。他の実施形態においてアンタゴニスト抗体は、Bリンパ球刺激因子がヘテロ三量体を形成する(例えばAPRILポリペプチド(例えば配列番号20又は配列番号47))場合に、又はBリンパ球刺激因子と異種性ポリペプチドとの融合タンパク質において存在する可能性がある異種性ポリペプチドを含むBリンパ球刺激因子の近位から生じたコンフォメーショナルエピトープに結合する。
【０１８３】
一実施形態においてアンタゴニスト抗体は、配列番号2のアミノ酸配列を有する若しくはATCC(商標)寄託番号97768に含有されるcDNAクローンによってコードされるBリンパ球刺激因子ポリペプチド又は上のポリペプチドの一部(すなわち断片)を含むポリペプチドに免疫特異的に結合する。別の実施形態においてアンタゴニスト抗体は、配列番号19のアミノ酸配列若しくはATCC(商標)寄託番号203518に含有されるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する単離されたBリンパ球刺激因子ポリペプチド又は上のポリペプチドの一部(すなわち断片)を含むポリペプチドに結合する抗体に結合する。
【０１８４】
本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、単離されたポリペプチドとしてのBリンパ球刺激因子ポリペプチドにそれらの天然に存在する状態及び/又はそれらの天然でのコンホメーションにおいて結合する。「単離されたポリペプチド」は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドを意図する。したがって組換え宿主細胞によって産生された及び/又は含有されるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたと考えられる。同様に「単離されたポリペプチド」として意図されるのは、組換え宿主細胞から部分的に又は実質的に精製されているポリペプチドである。したがって本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、組換え的に産生されたBリンパ球刺激因子ポリペプチドに結合できる。
【０１８５】
本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、細胞表面に発現されたBリンパ球刺激因子にも結合でき、前記Bリンパ球刺激因子ポリペプチドは、前記ポリヌクレオチドの発現を制御する制御配列に作動可能に結合する配列番号2のアミノ酸1から285をコードするポリヌクレオチドによってコードされる。特定の実施形態において、細胞表面で発現される前記Bリンパ球刺激因子ポリペプチドは、組換えBリンパ球刺激因子ポリペプチドである。他の実施形態において、細胞表面で発現される前記Bリンパ球刺激因子ポリペプチドは、天然に存在するBリンパ球刺激因子ポリペプチドである。非限定的な例として、本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、細胞表面で発現されるBリンパ球刺激因子(Bリンパ球刺激因子を発現している細胞からのBリンパ球刺激因子の可溶性形態の放出を阻止する又は減少させるように、配列番号2に示されるBリンパ球刺激因子配列のLys-132及び/又はArg-133は、他のアミノ酸残基に変異されている又はどちらも除去されている)に結合できる。
【０１８６】
本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、細胞によって分泌されるBリンパ球刺激因子にも結合でき、ここで前記Bリンパ球刺激因子ポリペプチドは、前記ポリヌクレオチドの発現を制御する制御配列に作動可能に結合する配列番号2のアミノ酸1から285をコードしているポリヌクレオチドによってコードされている。特定の実施形態において、細胞によって分泌される前記Bリンパ球刺激因子ポリペプチドは、組換えBリンパ球刺激因子ポリペプチドである。他の実施形態において細胞によって分泌される前記Bリンパ球刺激因子ポリペプチドは天然に存在するBリンパ球刺激因子ポリペプチドである。
【０１８７】
本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、ATCC(商標)受託番号97768を有するプラスミドに含有されるcDNAによってコードされる、又は寄託されたクローンに含有されるヌクレオチド配列にハイブリダイズ(例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で)する核酸によってコードされる配列番号2のアミノ酸配列を含む又は代替としてそれからなるポリペプチドに免疫特異的に結合する。本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、ATCC(商標)受託番号97768を有するプラスミドに含有されるcDNAによってコードされる、又は寄託されたクローンに含有されるヌクレオチド配列にハイブリダイズ(例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で)する核酸によってコードされる配列番号2のアミノ酸配列の断片にも結合する。
【０１８８】
付加的に本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、ATCC(商標)受託番号203518を有するプラスミドに含有されるcDNAによってコードされる、又は寄託されたクローンに含有されるヌクレオチド配列にハイブリダイズ(例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で)する核酸によってコードされる配列番号19のアミノ酸配列を、含む又は代替としてそれからなるポリペプチドに結合する。本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、ATCC(商標)受託番号203518を有するプラスミドに含有されるcDNAによってコードされる又は寄託されたクローンに含有されるヌクレオチド配列にハイブリダイズ(例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で)する核酸によってコードされる配列番号19のアミノ酸配列の断片にも結合する。
【０１８９】
具体的な実施形態において、本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、寄託されたクローンに含有されるcDNAによってコードされる、又は寄託されたクローンに含有されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする(例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で)核酸によってコードされる配列番号2に含有されるアミノ酸配列を、含む又は代替としてそれからなるポリペプチドを含むポリペプチド断片に免疫特異的に結合する。タンパク質断片は、「独立している」ことができる又は、その断片が部分若しくは領域を、最も好ましくは単一の連続的領域を形成するより大きなポリペプチド中に含まれうる。本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体によって結合されうるポリペプチド断片の代表例は、例えば配列番号2のアミノ酸残基:1-50、51-100、101-150、151-200、201-250及び/又は251-285付近を含む又は代替としてそれからなる断片を含む。さらにポリペプチド断片は、少なくとも長さ10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、175又は200アミノ酸でありうる。
【０１９０】
具体的な実施形態において本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、配列番号2のアミノ酸残基:1-46、31-44、47-72、73-285、73-83、94-102、148-152、166-181、185-209、210-221、226-237、244-249、253-265及び/又は277-285を含む又は代替としてそれからなるポリペプチド断片に結合する。具体的な実施形態において本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、配列番号2のアミノ酸165-171を含むエピトープに結合する。
【０１９１】
本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、Bリンパ球刺激因子タンパク質の細胞内ドメイン(例えば配列番号2のアミノ酸残基1-46)、Bリンパ球刺激因子タンパク質の膜貫通ドメイン(例えば配列番号2のアミノ酸残基47-72)、Bリンパ球刺激因子タンパク質の細胞外ドメイン(例えば配列番号2のアミノ酸残基73-285)、Bリンパ球刺激因子タンパク質の成熟可溶性細胞外ドメイン(例えば配列番号2のアミノ酸残基134-285)、Bリンパ球刺激因子タンパク質のTNF保存ドメイン(例えば配列番号2のアミノ酸残基191-284)を含む又は代替としてそれからなるポリペプチド断片に、及びBリンパ球刺激因子タンパク質の細胞外ドメインに融合した細胞内ドメイン(例えば配列番号2のアミノ酸残基73-285に融合したアミノ酸残基1-46)を含む又は代替としてそれからなるポリペプチドに結合する。
【０１９２】
本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、これだけに限らないがポリクローナル、モノクローナル、多選択性、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、Fab発現ライブラリーによって産生される断片、抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば本発明の抗体に対する抗id抗体を含む)、及び上のいずれかのエピトープ結合断片を含む。本明細書において使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を意味する。免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスであってよい。好ましい実施形態において免疫グロブリンは、IgG1又はIgG4アイソタイプである。免疫グロブリンは、重鎖及び軽鎖の両方を有してよい。IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY重鎖のアレイは、カッパ又はラムダ形態の軽鎖と対になってよい。
【０１９３】
最も好ましくは本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、ヒト抗原結合抗体断片であり、これだけに限らないがFab、Fab'及びF(ab')2、Fd、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(sdFv)及びVL又はVHドメインのいずれかを含む断片を含む。一本鎖抗体を含む抗原結合抗体断片は、(一つ若しくは複数の)可変領域を単独で又は、次の:ヒンジ領域、CH1、CH2及びCH3ドメインの全体又は一部との組合せで含みうる。抗原結合断片は、ヒンジ領域、CH1、CH2及びCH3ドメインを有する(一つ又は複数の)可変領域の任意の組合せも含む。本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、鳥類及び哺乳類を含む任意の動物由来でありうる。好ましくは抗体は、ヒト、ネズミ(例えばマウス及びラット)、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリである。本明細書において使用する「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、又は上に及び例えばKucherlapatiらによる米国特許第5,939,598号に記載のとおり一つ若しくは複数のヒト免疫グロブリンについて遺伝子導入され、内在性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
【０１９４】
本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性(trispecific)又はそれ以上の多選択性であってよい。多選択性抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であってよく、又はBリンパ球刺激因子タンパク質及び異種性ポリペプチド若しくは固体支持物質などの異種性エピトープの両方に対して特異的であってよい。例えば国際特許出願公開第WO 93/17715号、第WO 92/08802号、第WO91/00360号及び第WO 92/05793号、Tutt,et al.,J. Immunol.147:60-69(1991)、米国特許第4,474,893号、第4,714,681号、第4,925,648号、第5,573,920号、第5,601,819号、Kostelny et al.,J.Immunol.148:1547-1553(1992)を参照されたい。
【０１９５】
抗Bリンパ球刺激因子抗体は、他のモノクローナル若しくはキメラ抗体と又は例えば抗体と相互作用するエフェクター細胞の数若しくは活性を増大させるために役立つリンホカイン若しくは造血性増殖因子(例えばIL-2、IL-3及びIL-7など)との組合せにおいて有利に利用されうる。
【０１９６】
抗Bリンパ球刺激因子抗体は、単独で又は他の種類の処置(例えば放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、抗腫瘍剤、抗生物質及び免疫グロブリン)との組合せで投与されうる。一般に患者と同じ種である種に由来する又は種に反応性(抗体の場合)の産生物の投与は好ましい。したがって好ましい実施形態においてヒト抗体、断片、誘導体、類似体又は核酸は、ヒト患者に投与される。別の実施形態において、キメラ、ヒト化又は非ヒトモノクローナル抗体は、ヒト患者に投与される。
【０１９７】
本発明の内容において有用な抗体は、当技術分野において周知の任意の適切な方法によって生成されうる。ポリクローナル抗体は、当技術分野において十分に周知の種々の手順によって産生されうる。例えばポリペプチドは、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために、これだけに限らないがウサギ、マウス、ラットなどを含む種々の宿主動物に投与されうる。宿主の種に応じて、これだけに限らないがフロイント(完全及び不完全)、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性物質、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール並びにBCG(カルメット・ゲラン桿菌)(bacille Calmette-Guerin)及びコリネバクテリウム・パルバム(corynebacterium parvum)などの潜在的に有用なヒトアジュバントを含む種々のアジュバントが免疫学的応答を増大させるために使用されうる。そのようなアジュバントも当技術分野において十分に周知である。
【０１９８】
モノクローナル抗体は、融合細胞、組換え及びファージ提示技術又はこれらの組合せの使用を含む当技術分野において周知の各種の技術を使用して調製されうる。例えばモノクローナル抗体は、当技術分野において周知のもの及び例えばHarlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)、Hammerling,et al.,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)(前記参照文献はその全体が参照により組み込まれる)において教示されるものを含む融合細胞技術を使用して産生されうる。本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は融合細胞技術を通じて産生された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は任意の真核生物、原核生物又はファージクローンを含む単一クローン由来の抗体を意味し、それが産生された方法を意味しない。
【０１９９】
「モノクローナル抗体」は、2個のタンパク質(すなわち重鎖及び軽鎖)を含む又は代替としてそれからなりうる。
【０２００】
融合細胞技術を使用して特異的抗体を産生する及びスクリーニングするための方法は、当技術分野において日常的であり十分に周知である。非限定的な例においてマウスは、ポリペプチド又はポリペプチドを発現している細胞で免疫されうる。一度免疫応答が検出される(例えば抗原に対して特異的な抗体がマウス血清中に検出される)とマウス脾臓は回収され、脾細胞が単離される。次いで脾細胞は、十分に周知の技術によって任意の適切な骨髄腫細胞、例えばATCC(商標)から入手可能な細胞株SP20由来の細胞と融合される。融合細胞は、限定希釈によって選択及びクローン化される。次いで融合細胞クローンは、当技術分野において周知の方法によってポリペプチドに結合できる抗体を分泌する細胞に関してアッセイされる。通常高レベルの抗体を含有する腹水液は、陽性融合細胞クローンを有する免疫化されたマウスによって生成されうる。
【０２０１】
特定のエピトープを認識する抗体断片は、周知の技術によって生成されうる。例えばFab及びF(ab')2断片は、パパイン(Fab断片を産生するために)又はペプシン(F(ab')2断片を産生するために)などの酵素を使用する免疫グロブリン分子のタンパク質分解性切断によって産生されうる。F(ab')2断片は、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のCH1ドメインを含有する。
【０２０２】
例えば本発明の内容において有用なアンタゴニスト抗体は、当技術分野において周知の種々のファージ提示法を使用しても生成されうる。ファージ提示法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードしているポリヌクレオチド配列を保持しているファージ粒子の表面に提示される。詳細な実施形態において、そのようなファージは、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー(例えばヒト又はネズミ)から発現される抗原結合ドメインを提示するために利用されうる。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現しているファージは、例えば標識抗原又は固体表面若しくはビーズに結合若しくは捕捉された抗原を使用して、抗原で選択又は同定されうる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、ファージ遺伝子III又は遺伝子VIIタンパク質のいずれかと組換え的に融合されたFab、Fv又はジスルフィド安定化Fv抗体ドメインを有するファージから発現されるfd及びM13結合ドメインを含む繊維状ファージである。抗体を作製するために使用されうるファージ提示法の例は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれるBrinkman et al.,J.Immunol.Methods 182:41-50(1995)、Ames et al.,J.Immunol.Methods 184:177-186(1995)、Kettleborough et al.,Eur.J.Immunol.24:952-958(1994)、Persic et al.,Gene 187 9-18(1997)、Burton et al.,Advances in Immunology 57:191-280(1994)、国際特許出願公開第WO 90/02809号、第WO 91/10737号、第WO 92/01047号、第WO 92/18619号、第WO 93/11236号、第WO 95/15982号、第WO 95/20401号及び米国特許第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号及び第5,969,108号において開示されるものを含む。
【０２０３】
上の参照文献において記載されたとおり、ファージ選択後にファージ由来の抗体コード領域は、ヒト抗体又は任意の他の望ましい抗原結合断片を含む抗体全体を生成するために単離及び使用されることができ、例えば下に詳細に記載するとおり哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む任意の所望の宿主において発現されうる。例えば、Fab、Fab'及びF(ab')2断片を組換え的に産生する技術は、国際特許出願公開第WO 92/22324号、Mullinax et al.,BioTechniques 12(6):864-869(1992)並びにSawai et al.,AJRI 34:26-34(1995)及びBetter et al.,Science 240:1041-1043(1988)(前記参照文献はその全体が参照により組み込まれる)において開示されるものなどの当技術分野において周知の方法を使用して用いられうる。
【０２０４】
一本鎖Fv及び抗体を産生するために使用されうる技術の例は、米国特許第4,946,778号及び第5,258,498号、Huston et al.,Methods in Enzymology 203:46-88(1991)、Shu et al.,PNAS 90:7995-7999(1993)及びSkerra et al.,Science 240:1038-1040(1988)に記載のものを含む。抗体のヒトでのin vivo使用及びin vitro検出アッセイを含むいくつかの使用のために、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を使用することは好ましい場合がある。キメラ抗体は、ネズミモノクローナル抗体由来の可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体など、抗体のそれぞれの部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を産生するための方法は、当技術分野において周知である。例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれるMorrison,Science 229:1202(1985);Oi et al.,BioTechniques 4:214(1986)、Gillies et al.,(1989) J.Immunol.Methods 125:191-202、米国特許第5,807,715号、第4,816,567号及び第4,816,397号を参照されたい。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の一つ又は複数の相補的決定領域(CDR)及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有し、所望の抗原に結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させる、好ましくは改善するためにCDR供与抗体からの対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において十分に周知の方法によって、例えば抗原結合のために重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRとフレームワーク残基との相互作用のモデル化及び特定の位置での通常でないフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるQueen et al.米国特許第5,585,089号、Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)を参照されたい)。抗体は、例えばCDR-移植法(EP 0239400、国際特許出願公開第WO 91/09967号、米国特許第5,225,539号、第5,530,101号及び第5,585,089号)、ベニヤリング(veneering)又はリサーフェシング(resurfacing)(EP 0592106、EP 0519596、Padlan,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)、Studnicka et al.,Protein Engineering 7(6):805-814 (1994)、Roguska et al.,PNAS 91:969-973(1994))、及び鎖シャッフリング(chain shuffling)(米国特許第5,565,332号)を含む当技術分野において周知の種々の技術を使用してヒト化されうる。
【０２０５】
ファージ提示技術を使用して、Bリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合する一本鎖抗体分子(「scFv」)は、可溶性Bリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合するscFv、膜結合形態のBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合するscFv、並びに可溶性形態及び膜結合形態の両方のBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合するscFvを含んで、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,220,840号に記載のとおり同定されている。米国特許第7,220,840号に記載のscFvの断片又は変種を含む、又は代替としてそれからなり(例えば米国特許第7,220,840号の表1に参照されるものの任意の一つのアミノ酸配列を有するVHドメイン、VH CDR、VLドメイン又はVL CDRを含む)、可溶性形態のBリンパ球刺激因子、膜結合形態のBリンパ球刺激因子及び/又は可溶性形態及び膜結合形態の両方のBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合する分子は、これらのscFvをコードする核酸分子及び/又は分子として本発明に包含される。
【０２０６】
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療処置のために特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使用する上に記載のファージ提示法を含む当技術分野において周知の種々の方法によって作製されうる。それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,444,887号及び第4,716,111号並びに国際特許出願公開第WO 98/46645号、第WO 98/50433号、第WO 98/24893号、第WO 98/16654号、第WO 96/34096号、第WO 96/33735号及び第WO 91/10741も参照されたい。
【０２０７】
ヒト抗体は、機能的内在性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを使用しても産生されうる。例えばヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、マウス胚性幹細胞にランダムに又は相同組換えによって導入されうる。代替としてヒト可変領域、定常領域及び多様性領域(diversity region)は、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えてマウス胚性幹細胞に導入されうる。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に又は同時に非機能的にされうる。詳細には、JH領域のホモ接合性欠失は、内在性抗体産生を阻止する。改変された胚性幹細胞は、増殖され、キメラマウスを産生するために胚盤胞にマイクロインジェクトされる。次いでキメラマウスは、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を作製するために飼育される。トランスジェニックマウスは、選択された抗原(例えば本発明のポリペプチドの全体又は一部)で通常の様式で免疫化される。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来の融合細胞技術を使用して免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスに含まれるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化の際に再編成し、続いてクラススイッチ及び体細胞変異を受ける。したがってそのような技術を使用して、治療に有用なIgG、IgA、IgM及びIgE抗体を産生することは可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概説のために、Lonberg and Huszar,Int.Rev.Immunol.13:65-93(1995)を参照されたい。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術及びそのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な考察については、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第WO 98/24893号、第WO 92/01047号、第WO 96/34096号、第WO 96/33735号、欧州特許第0598877号、米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、第5,885,793号、第5,916,771号及び第5,939,598を参照されたい。付加的にAbgenix,Inc.(Freemont,CA)及びGenpharm(San Jose,CA)などの企業は、上に記載のものに類似する技術を使用して選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事できる。
【０２０８】
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「ガイド選択(guided selection)」と称される技術を使用して生成されうる。この手法において選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体は、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択をガイドするために使用される(Jespers et al.,Bio/technology 12:899-903(1988))。
【０２０９】
好ましい実施形態において本発明の内容において有用な抗体は、可溶性形態のBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合し、可溶性形態のBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合する米国特許出願公開第2005/0255532号に記載の一つ又は複数のscFvに対応するVHドメイン、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLドメイン、VL CDR1、VL CDR2及び/又はVL CDR3を含む、又は代替としてそれからなる。別の好ましい実施形態において本発明の内容において有用な抗体は、膜結合形態のBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合し、膜結合形態のBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合する米国特許出願公開第2005/0255532号に記載の一つ又は複数のscFvに対応するVHドメイン、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLドメイン、VL CDR1、VL CDR2及び/又はVL CDR3を含む、又は代替としてそれからなる。さらに別の好ましい実施形態において本発明の内容において有用な抗体は、可溶性形態及び膜結合性形態のBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合し、可溶性形態及び膜結合性形態のBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合する米国特許出願公開第2005/0255532号に記載の一つ又は複数のscFvに対応するVHドメイン、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLドメイン、VL CDR1、VL CDR2及び/又はVL CDR3を含む、又は代替としてそれからなる。これらの抗体をコードする核酸分子も本発明によって包含される。
【０２１０】
本発明は、少なくとも一つのBリンパ球刺激因子ポリペプチド(好ましくは配列番号2のアミノ酸134-285)を含むヘテロ三量体タンパク質に免疫特異的に結合する抗体(抗体断片又はその変種を含む又は代替としてそれからなる分子を含む)も提供し、前記抗体は米国特許第7,220,840号に参照されるVHドメインのいずれか一つとVLドメインのいずれか一つのアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む又は代替としてそれからなる。これらの抗体(例えば米国特許第7,220,840号において参照される任意の一つのアミノ酸配列を有するVHドメイン、VH CDR、VLドメイン又はVL CDRを含む)の断片又は変種を含む、又は代替としてそれからなり、少なくとも一つのBリンパ球刺激因子ポリペプチドを含むヘテロ三量体タンパク質に免疫特異的に結合する分子も、これらの抗体をコードする核酸分子及び/又は分子として本発明に包含される。
【０２１１】
本発明は、Bリンパ球刺激因子(例えば可溶性Bリンパ球刺激因子及び膜結合性Bリンパ球刺激因子)に免疫特異的に結合し、当技術分野において周知の方法を使用してBリンパ球刺激因子への免疫特異的結合を日常的にアッセイされうる抗体(抗体断片又はその変種(誘導体を含む)を含む又は代替としてそれからなる分子を含む)を提供する。本発明の抗体及び抗体断片又は変種(誘導体を含む)は、例えば一つ又は複数のアミノ酸配列変更(アミノ酸残基の追加、欠失、置換及び/又は挿入)を含みうる。これらの変更は、一つ若しくは複数のフレームワーク領域及び/又は一つ若しくは複数のCDRにおいて作製されうる。本発明の抗体(抗体断片並びにその変種及び誘導体を含む)は、当技術分野において周知の方法によって日常的に作製されうる。本明細書においてその配列が具体的に開示されるVHドメイン、VH CDR、VLドメイン及びVL CDRのいずれかの断片又は変種を含む、又は代替としてそれからなる分子は、本発明に合致して用いられうる。これらの抗体及び分子(断片、変種及び誘導体を含む)をコードする核酸分子も本発明によって包含される。
【０２１２】
具体的な実施形態において本発明は、配列番号60又は配列番号61のアミノ酸配列を有する一本鎖Fv(scFV)を包含する。
【０２１３】
具体的な実施形態において本発明は、配列番号60又は配列番号61のアミノ酸配列を有するscFv由来のVHドメインを含む抗体又はその断片であって、Bリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合する抗体又はその断片を包含する。
【０２１４】
具体的な実施形態において本発明は、配列番号60又は配列番号61のアミノ酸配列を有するscFv由来のVLドメインを含む抗体又はその断片であって、Bリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合する抗体又はその断片を包含する。
【０２１５】
具体的な実施形態において本発明は、配列番号60又は配列番号61のアミノ酸配列を有するscFv由来のVLドメインを含む抗体又はその断片であって、Bリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合し、配列番号60又は配列番号61のアミノ酸配列を有するscFv由来のVHドメインも含む抗体又はその断片を包含する。
【０２１６】
具体的な実施形態において本発明は、配列番号60のアミノ酸配列を有するscFv由来のVLドメインを含む抗体又はその断片であって、Bリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合し、配列番号60のアミノ酸配列を有するscFv由来のVHドメインも含む抗体又はその断片を包含する。
【０２１７】
具体的な実施形態において本発明は、配列番号61のアミノ酸配列を有するscFv由来のVLドメインを含む抗体又はその断片であって、Bリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合し、配列番号61のアミノ酸配列を有するscFv由来のVHドメインも含む抗体又はその断片を包含する。
【０２１８】
具体的な実施形態において本発明の抗体又はその断片は、免疫グロブリン分子全体である。
【０２１９】
具体的な実施形態において本発明の抗体又はその断片は、Fab断片である。
【０２２０】
具体的な実施形態において本発明の抗体及びその断片は、Fv断片である。
【０２２１】
具体的な実施形態において本発明は、異種性ポリペプチドに共有結合で連結された本発明の抗体及びその断片を含むキメラタンパク質を包含する。
【０２２２】
具体的な実施形態において本発明は、二つ以上のタイプの抗体又はその断片若しくは変種を含む組成物を包含し、それぞれのタイプがBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合し、抗体又はその断片のそれぞれのタイプが配列番号60又は配列番号61のアミノ酸配列を有する異なるscFv由来のVHドメインを含む。
【０２２３】
具体的な実施形態において本発明は、二種以上のタイプの抗体又はその断片若しくは変種を含む組成物を包含し、それぞれのタイプがBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合し、抗体又はその断片のそれぞれのタイプが配列番号60又は配列番号61のアミノ酸配列を有する異なるscFv由来のVLドメインを含む。
【０２２４】
具体的な実施形態において本発明は、二種以上のタイプの抗体又はその断片若しくは変種を含む組成物を包含し、それぞれのタイプがBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合し、抗体又はその断片のそれぞれのタイプが配列番号60又は配列番号61のアミノ酸配列を有する異なるscFv由来のVLドメインを含み、抗体又はその断片のそれぞれのタイプが配列番号60又は配列番号61のアミノ酸配列を有する異なるscFv由来のVHドメインをさらに含む。
【０２２５】
具体的な実施形態において本発明は、二種以上のタイプの抗体又はその断片若しくは変種のパネルを包含し、それぞれのタイプがBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合し、抗体又はその断片のそれぞれのタイプが配列番号60又は配列番号61のアミノ酸配列を有する異なるscFv由来のVHドメインを含む。
【０２２６】
具体的な実施形態において本発明は、二種以上のタイプの抗体又はその断片若しくは変種のパネルを包含し、それぞれのタイプがBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合し、抗体又はその断片のそれぞれのタイプが配列番号60又は配列番号61のアミノ酸配列を有する異なるscFv由来のVLドメインを含む。
【０２２７】
具体的な実施形態において本発明は、二種以上のタイプの抗体又はその断片若しくは変種のパネルを包含し、それぞれのタイプがBリンパ球刺激因子に免疫特異的に結合し、抗体又はその断片のそれぞれのタイプが配列番号60又は配列番号61のアミノ酸配列を有する異なるscFv由来のVLドメインを含み、抗体又はその断片のそれぞれのタイプが配列番号60又は配列番号61のアミノ酸配列を有する異なるscFv由来のVHドメインをさらに含む。
【０２２８】
配列番号60のVLドメインは、配列番号60のアミノ酸残基1-123を含み、配列番号60のVHドメインは、配列番号60のアミノ酸残基141-249を含む。したがって一実施形態において本発明は、配列番号60のアミノ酸残基1-123を含む第一アミノ酸配列及び配列番号60のアミノ酸残基141-249を含む第二アミノ酸配列を含む抗BLyS抗体を包含する。
【０２２９】
配列番号61のVLドメインは、配列番号61のアミノ酸残基1-123を含み、配列番号61のVHドメインは、配列番号61のアミノ酸残基141-249を含む。したがって一実施形態において本発明は、配列番号61のアミノ酸残基1-123を含む第一アミノ酸配列及び配列番号61のアミノ酸残基141-249を含む第二アミノ酸配列を含む抗BLyS抗体を包含する。
【０２３０】
配列番号60のVLCDR1、VLCDR2及びVLCDR3領域は、アミノ酸残基163-173、189-195及び228-238をそれぞれ含む。配列番号60のVHCDR1、VHCDR2及びVHCDR3領域は、アミノ酸残基26-35、50-66及び99-112をそれぞれ含む。したがって一実施形態において本発明は、配列番号60のアミノ酸残基26-35、50-66、99-112、163-173、189-195及び228-238を含む抗BLyS抗体を包含する。
【０２３１】
配列番号61のVLCDR1、VLCDR2及びVLCDR3領域は、アミノ酸残基163-173、189-195及び228-238をそれぞれ含む。配列番号61のVHCDR1、VHCDR2及びVHCDR3領域は、アミノ酸残基26-35、50-66及び99-112をそれぞれ含む。したがって一実施形態において本発明は、配列番号61のアミノ酸残基26-35、50-66、99-112、163-173、189-195及び228-238を含む抗BLyS抗体を包含する。
【０２３２】
具体的な実施形態において本発明は、Human Genome Sciences,Incからの抗体BENLYSTA(登録商標)(ベリムマブ)を包含する。
【０２３３】
本発明は、本発明の抗体及びその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをさらに提供する。本発明は、(例えば上に定義の)ストリンジェントな又は低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で抗体(好ましくは本発明のポリペプチドに特異的に結合する)、好ましくは配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。別の好ましい実施形態において抗体は、配列番号19のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。別の好ましい実施形態において抗体は、配列番号23のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。別の好ましい実施形態において抗体は、配列番号28のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。別の好ましい実施形態において抗体は、配列番号30のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。別の好ましい実施形態において抗体は、配列番号39のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。別の好ましい実施形態において抗体は、配列番号40のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。別の実施形態において抗体は、配列番号41のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。別の実施形態において抗体は、配列番号42のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。別の実施形態において抗体は、配列番号43のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。別の実施形態において抗体は、配列番号44のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。
【０２３４】
当技術分野において周知の任意の方法によってポリヌクレオチドは得ることができ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は決定されうる。例えば抗体のヌクレオチド配列が周知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築されることができ(例えばKutmeier et al.,BioTechniques 17:242(1994)に記載のとおり)、簡潔には抗体をコードする配列の一部を含有する重複したオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーション、並びにライゲーションされたオリゴヌクレオチドのPCRによる増幅を含む。
【０２３５】
代替として抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給原由来の核酸から生成されうる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手できないが抗体分子の配列は周知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成されうる又は適切な供給原(例えば、抗体cDNAライブラリー或いは本発明の抗体を発現するために選択された融合細胞などの抗体を発現している任意の組織又は細胞から生成されたcDNAライブラリー若しくは単離された核酸、好ましくはポリA+RNA)から配列の3'及び5'末端にハイブリダイズできる合成プライマーを使用するPCR増幅によって、若しくは同定する特定の遺伝子配列(例えば抗体をコードするcDNAライブラリー由来のcDNAクローン)に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得ることができる。PCRによって生成された増幅核酸は、次いで当技術分野において十分に周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクターにクローン化されうる。
【０２３６】
抗体のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が一度決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、さまざまなアミノ酸配列を有する抗体を生成するために(例えばアミノ酸置換、欠失及び/又は挿入を作製するために)、ヌクレオチド配列の操作のための当技術分野において十分に周知の方法(例えば組換えDNA技術、部位特異的変異誘発、PCRなど(例えばどちらもその全体が参照により本明細書に組み込まれるSambrook et al.,1990,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY及びAusubel et al.,eds.,1998,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NYにおいて記載の技術を参照されたい))を使用して操作されうる。
【０２３７】
具体的な実施形態において重鎖及び/又は軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、当技術分野において十分に周知の方法によって、例えば配列の高頻度可変性領域を決定するために他の重鎖及び軽鎖可変領域の周知のアミノ酸配列との比較によって、相補性決定領域(CDR)の配列を同定するために検査されうる。日常的な組換えDNA技術を使用して、一つ又は複数のCDRはフレームワーク領域中に(例えば上に記載のとおり非ヒト抗体をヒト化するためにヒトフレームワーク領域中に)挿入されうる。フレームワーク領域は、天然に存在する又は共通フレームワーク領域であってよく及び好ましくはヒトフレームワーク領域である(ヒトフレームワーク領域の表に関して、例えばChothia et al.,J.Mol.Biol.278: 457-479(1998)を参照されたい)。好ましくはフレームワーク領域とCDRとの組合せによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは上に考察のとおり、一つ又は複数のアミノ酸置換は、フレームワーク領域中に作製されることができ、好ましくはアミノ酸置換は抗体のその抗原への結合を改善する。付加的にそのような方法は、一つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合を欠失している抗体分子を生成するために、鎖間ジスルフィド結合に加わっている一つ又は複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換若しくは欠失を作製するために使用されうる。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本発明に包含され、当技術分野の技術の範囲内である。
【０２３８】
付加的に、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングするステップによる「キメラ抗体」の産生のために開発された技術(Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855(1984)、Neuberger et al.,Nature 312:604-608(1984)、Takeda et al.,Nature 314:452-454(1985))は、使用されうる。上に記載のとおりキメラ抗体は、(ネズミmAb由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有するものなど)それぞれの部分が異なる動物種由来である分子、例えばヒト化抗体である。
【０２３９】
代替として一本鎖抗体の産生のための記載された技術(米国特許第4,946,778号、Bird,Science 242:423-42(1988)、Huston et al.,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)及びWard et al.,Nature 334:544-54(1989))は、一本鎖抗体を産生するために適用されうる。一本鎖抗体は、Fv領域の重鎖及び軽鎖断片をアミノ酸橋を介して連結することによって形成され、一本鎖ポリペプチドが生じる。大腸菌(E. coli)における機能的Fv断片の構築のための技術も使用されうる(Skerra et al.,Science 242:1038-1041(1988))。
【０２４０】
抗体産生方法
本発明の抗体は、抗体の合成のための当技術分野において周知の任意の方法によって、具体的には化学合成によって、又は好ましくは組換え発現技術によって産生されうる。
【０２４１】
本発明の抗体又はその断片、誘導体若しくは類似物(例えば本発明の抗体の重鎖若しくは軽鎖又は本発明の一本鎖抗体)の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。本発明の抗体分子又は抗体の重鎖若しくは軽鎖又はその一部(好ましくは重鎖若しくは軽鎖可変領域を含有する)をコードするポリヌクレオチドが一度得られると、抗体分子産生のためのベクターは、当技術分野において十分に周知の技術を使用して組換えDNA技術によって産生されうる。したがって抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現することによりタンパク質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に十分に周知の方法は、抗体コード配列並びに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために使用されうる。これらの方法は、例えばin vitro組換えDNA技術、合成技術及びin vivo遺伝的組換えを含む。したがって本発明は、本発明の抗体分子又はその重鎖若しくは軽鎖、又は重鎖若しくは軽鎖可変ドメインをコードし、プロモーターに作動可能に連結したヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ(例えば国際特許出願公開第WO 86/05807号及び第WO 89/01036号、並びに米国特許第5,122,464号を参照されたい)、抗体の可変ドメインは完全な重鎖又は軽鎖の発現のためにそのようなベクターにクローン化されうる。
【０２４２】
発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞に移行され、次いで形質移入された細胞は、本発明の抗体を産生するために従来技術によって培養される。したがって本発明は、本発明の抗体又はその重鎖若しくは軽鎖又は本発明の一本鎖抗体をコードし、異種性プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。好ましい実施形態において二重鎖抗体の発現のために重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターは、下に詳述されるとおり免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞で同時発現されうる。
【０２４３】
種々の宿主発現ベクター系が本発明の抗体分子を発現するために利用されうる。そのような宿主発現系は、それにより目的のコード配列が産生され、続いて精製されるビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換又は形質移入された場合に本発明の抗体分子を原位置で発現できる細胞も表す。これらは、これだけに限らないが、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA若しくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物(例えば大腸菌、枯草菌(B.subtilis));抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えばサッカロマイッセス(Saccharomyces)、ピキア(Pichia));抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系;抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルス(cauliflower mosaic virus)、CaMV;タバコモザイクウイルス(tobacco mosaic virus)、TMV)を感染させた若しくは組換えプラスミド発現ベクター(例えばTiプラスミド)で形質転換された植物細胞系;又は哺乳類細胞のゲノム由来(例えばメタロチオネインプロモーター)若しくは哺乳類ウイルス由来(例えばアデノウイルス後期プロモーター;ワクチニアウイルス7.5Kプロモーター)のプロモーターを含有する組換え発現構築物を含む哺乳類細胞系(例えばCOS、CHO、BHK、293、3T3細胞)を含む。好ましくは大腸菌などの細菌細胞、より好ましくは真核細胞(特に組換え抗体分子全体の発現のための)は、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳類細胞は、ヒトサイトメガロウイルス(cytomegalovirus)由来の主要な中間初期遺伝子プロモーター要素(intermediate early gene promoter)などのベクターと併せて抗体のための効果的な発現系である(Foecking et al.,Gene 45:101(1986)、Cockett et al.,Bio/Technology 8:2(1990))。
【０２４４】
細菌系において多数の発現ベクターが、発現される抗体分子の使用目的に応じて有利に選択されうる。例えば抗体分子の医薬組成物の生成のために多量のそのようなタンパク質が産生される場合、容易に精製される融合タンパク質産生物の高レベル発現を目的とするベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターは、これだけに限らないが、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列がlac Zコード領域と共にインフレームで個々にベクターにライゲーションされうる大腸菌発現ベクターpUR278(Ruther et al.,EMBO J.2:1791(1983));pINベクター(Inouye & Inouye,Nucleic Acids Res.13:3101-3109(1985)、Van Heeke & Schuster,J.Biol.Chem.24:5503-5509(1989))などを含む。pGEXベクターもグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)を伴う融合タンパク質としての外来性ポリペプチドを発現するために使用されうる。一般にそのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリクスグルタチオン-アガロースビーズへの吸着及び結合に続く遊離グルタチオンの存在下での溶出によって溶菌させた細胞から容易に精製されうる。pGEXベクターは、クローン化された標的遺伝子産物がGST成分から放出されうるように、トロンビン又は第Xa因子プロテアーゼの切断部位を含むように設計される。
【０２４５】
昆虫系においてはオートグラファ・カルフォルニカ核多核体ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)(AcNPV)は、外来性遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞で増殖する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須領域(例えばポリヘドリン遺伝子(polyhedrin gene))中に個々にクローン化され、AcNPVプロモーター(例えばポリヘドリンプロモーター)の制御下に位置付けられうる。
【０２４６】
哺乳類宿主細胞においてはウイルスに基づく多数の発現系が利用されうる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合は、目的の抗体コード配列はアデノウイルス転写/翻訳制御複合体(例えば後期プロモーター及び三部リーダー配列(tripartite leader sequence))にライゲーションされうる。次いでこのキメラ遺伝子は、in vitro又はin vivo組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入されうる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えばE1又はE3領域)への挿入は、感染宿主中で生存可能であり、抗体分子を発現できる組換えウイルスをもたらす(例えばLogan & Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:355-359(1984)を参照されたい)。特異的開始シグナルも挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のために必要である場合がある。これらのシグナルは、ATG開始コドン及び隣接配列を含む。さらに開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために所望のコード配列の読み枠と一致していなければならない。これらの外来性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成両方のさまざまな由来であってよい。発現効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどの含有によって増強されうる(Bittner et al.,Methods in Enzymol.153:51-544(1987)を参照されたい)。
【０２４７】
付加的に、挿入配列の発現を調節する又は所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾及び処理する宿主細胞株が選択されうる。タンパク質産生物のそのような修飾(例えば糖鎖付加)及び処理(例えば切断)は、タンパク質の機能に関して重要である場合がある。さまざまな宿主細胞がタンパク質及び遺伝子産物の翻訳後処理及び修飾に関して特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株又は宿主系が発現される外来性タンパク質の正確な修飾及び処理を確実にするために選択されうる。この目的のために、遺伝子産物の一次転写物の適切な処理、糖鎖付加及びリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用されうる。そのような哺乳類宿主細胞は、これだけに限らないがCHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38及び詳細には例えばBT483、Hs578T、HTB2、BT20及びT47Dなどの乳癌細胞株並びに例えばCRL7030及びHs578Bstの正常乳腺細胞株を含む。
【０２４８】
組換えタンパク質の長期間、高収量の産生のために、安定な発現は好ましい。例えば抗体分子を安定に発現する細胞株は、遺伝子操作されうる。ウイルス性の複製開始点を含有する発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は適切な発現制御要素(例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など)及び選択可能マーカーによって制御されたDNAで形質転換されうる。外来性DNAの導入に続いて、遺伝子操作された細胞は、富栄養培地(enriched media)中で1-2日間増殖させ、次いで選択培地に交換されうる。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞にそれらの染色体中にプラスミドを安定に組み込ませ、次にクローン化されて細胞株に拡張されうる増殖巣を形成するように増殖させる。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を遺伝子操作するために有利に使用されうる。そのような遺伝子操作された細胞株は、抗体分子と直接又は間接に相互作用する化合物のスクリーニング及び評価において特に有用である場合がある。
【０２４９】
これだけに限らないが単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al.,Cell 11:223(1977))、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202(1992))及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al.,Cell 22:817(1980))を含む多数の選択系が使用されうる、遺伝子はそれぞれtk-、hgprt-又はaprt-細胞において使用されうる。同様に代謝拮抗剤耐性は、以下の遺伝子:dhfr、メトトレキサートに対する耐性を付与する(Wigler et al.,Natl.Acad.Sci.USA 77:357(1980)、O'Hare et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527(1981));gpt、ミコフェノール酸に対する耐性を付与する(Mulligan & Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072(1981));neo、アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与する(Clinical Pharmacy 12:488-505、Wu and Wu,Biotherapy 3:87-95(1991)、Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993)、Mulligan,Science 260:926-932(1993)及びMorgan and Anderson,Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993)、May,1993,TIB TECH 11(5):155-215);並びにhygro、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する(Santerre et al.,Gene 30:147(1984))についての選択に基づいて使用されうる。組換えDNA技術の分野において一般に周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために日常的に適用されることができ、そのような方法はその全体が参照として本明細書に組み込まれる例えば、Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(1993)、Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)及びChapters 12 and 13,Dracopoli et al.(eds),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley & Sons,NY(1994)、Colberre-Garapin et al.,J.Mol.Biol.150:1(1981)において記載されている。
【０２５０】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大されうる(総説に関してはBebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,Vol.3.(Academic Press,New York,1987)を参照されたい)。抗体を発現しているベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増大は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させる。増幅される領域が抗体遺伝子と関連することから、抗体の産生も増大する(Crouse et al.,Mol.Cell.Biol.3:257(1983))。
【０２５１】
宿主細胞は、重鎖由来ポリペプチドをコードする第一発現ベクター及び軽鎖由来ポリペプチドをコードする第二発現ベクターの本発明の2個の発現ベクターを同時形質移入されうる。2個のベクターは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの等量の発現を可能にする同一の選択可能マーカーを含有できる。代替として、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現可能である単一のベクターも使用されうる。そのような場合、有害な遊離重鎖の過剰を回避するために軽鎖は重鎖の前に位置付けられるべきである(Proudfoot,Nature 322:52(1986)、Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2197(1980))。重鎖及び軽鎖についてのコード配列はcDNA及びゲノムDNAを含みうる。
【０２５２】
本発明の抗体分子が動物によって、化学合成によって、又は組換え発現されて一度産生されると、例えば、クロマトグラフィー(例えばイオン交換、アフィニティー、詳細にはプロテインAに続く特異的な抗原に対する親和性によって、及び大きさを選別するカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差(differential solubility)又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的技術による免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野において周知の任意の方法によって精製されうる。付加的に本発明の抗体又はその断片は、精製を促進するために本明細書に記載の異種性のポリペプチド配列又は当技術分野において周知の他に融合されうる。
【０２５３】
本発明は、融合タンパク質を生成するために本発明のポリペプチド(又はその一部、好ましくはポリペプチドの少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90若しくは100アミノ酸)に組換え的に融合された又は化学的にコンジュゲートされた(共有結合的及び非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む)抗体を包含する。融合は、直接である必要は無く、リンカー配列を介して生じてもよい。抗体は、本発明のポリペプチド(又はその一部、好ましくはポリペプチドの少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90若しくは100アミノ酸)以外の抗原に特異的であってよい。例えば抗体は、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合させる又はコンジュゲートさせることによって、本発明のポリペプチドを特定の細胞型に対してin vitro又はin vivoのいずれかにおいて標的化するために使用されうる。本発明のポリペプチドに融合又はコンジュゲートされた抗体は、in vitroでの免疫アッセイ及び当技術分野において周知の方法を使用する精製方法においても使用されうる。例えばその全体が参照により組み込まれるHarbor et al.,上記及び国際特許出願公開第WO 93/21232号、EP 0439095、Naramura et al.,Immunol.Lett.39:91-99(1994)、米国特許第5,474,981号、Gillies et al.,PNAS 89:1428-1432(1992)、Fell et al.,J.Immunol.146:2446-2452(1991)を参照されたい。
【０２５４】
本発明は、可変領域以外の抗体ドメインに融合又はコンジュゲートした本発明のポリペプチドを含む組成物をさらに含む。例えば本発明のポリペプチドは、抗体Fc領域又はその一部に融合又はコンジュゲートされうる。本発明のポリペプチドに融合された抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、CH1ドメイン、CH2ドメイン及びCH3ドメイン又は全てのドメイン若しくはその一部の任意の組合せを含みうる。ポリペプチドは、多量体を形成するように上の抗体部分に融合又はコンジュゲートもされうる。例えば本発明のポリペプチドに融合したFc部分は、Fc部分間のジスルフィド結合を介して二量体を形成できる。より高い多量体形態もポリペプチドをIgA及びIgMの一部に融合することによって作製されうる。本発明のポリペプチドを抗体部分に融合又はコンジュゲートするための方法は、当技術分野において周知である。例えば米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号及び第5,112,946、EP 0307434、EP 0367166、国際特許出願公開第WO 96/04388号及び第WO 91/06570号、Ashkenazi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539(1991)、Zheng et al.,J.Immunol.154:5590-5600(1995)及びVil et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-11341(1992)(前記参照文献はその全体が参照により組み込まれる)を参照されたい。
【０２５５】
上に考察のとおり、配列番号2のポリペプチド、ポリペプチド断片又は変種に対応するポリペプチドは、ポリペプチドのin vivo半減期を増大させるために、又は当技術分野において周知の方法を使用する免疫アッセイにおける使用のために上記抗体部分に融合又はコンジュゲートされうる。さらに配列番号2に対応するポリペプチドは、精製を促進するために上記抗体部分に融合又はコンジュゲートされうる。同様に上記で考察したとおり、配列番号19のポリペプチド、ポリペプチド断片又は変種に対応するポリペプチドは、ポリペプチドのin vivo半減期を増大させるために、又は当技術分野において周知の方法を使用する免疫アッセイにおける使用のために上記抗体部分に融合又はコンジュゲートされうる。さらに配列番号19に対応するポリペプチドは、精製を促進するために上記抗体部分に融合又はコンジュゲートされうる。報告された一例は、ヒトCD4ポリペプチドの最初の二つのドメインと哺乳類免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の定常領域の種々のドメインとからなるキメラタンパク質を記載している(EP 0394827、Traunecker et al.,Nature 331:84-86(1988)。ジスルフィドで連結された二量体構造(IgGによる)を有する抗体に融合又はコンジュゲートされた本発明のポリペプチドは、単量体で分泌されたタンパク質又はタンパク質断片単独よりも他の分子に結合する及び中和することにおいてもより効率的である場合もある(Fountoulakis et al.,J.Biochem.270:3958-3964(1995))。多くの場合、融合タンパク質のFc部分は、治療及び診断において有益であり、それにより例えば薬物動態学的特性の改善をもたらすことができる(EP 0232262)。代替として融合タンパク質が発現、検出及び精製された後にFc部分を削除することは、望ましい。例えば融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合、Fc部分は治療及び診断を妨げる場合がある。例えば創薬において、hIL-5などのヒトタンパク質は、hIL-5のアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイのためにFc部分に融合されている(Bennett et al.,J.Molecular Recognition 8:52-58(1995)、Johanson et al.,J.Biol.Chem.270:9459-9471(1995)を参照されたい。
【０２５６】
さらに、本発明の抗体又はその断片は、精製を促進するためにペプチドなどのマーカー配列に融合されうる。好ましい実施形態においてマーカーアミノ酸配列は、特にpQEベクター(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)において提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くは商業的に入手可能である。Gentz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824(1989)において記載されているとおり、例えばヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製のために有用な他のペプチドタグは、これだけに限らないがインフルエンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する「HA」タグ(Wilson et al.,Cell 37:767(1984))及び「flag」タグを含む。
【０２５７】
本発明は、診断剤又は治療剤にコンジュゲートした抗体又はその断片をさらに包含する。抗体は、例えば所与の治療計画の有効性を決定するための臨床試験手続きの一部として例えば腫瘍の発達又は進行をモニターするために診断用に使用されうる。検出は、抗体を検出可能な物質に結合させることによって促進されうる。検出可能な物質の例は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々のポジトロン放出断層撮影を使用するポジトロン放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンを含む。検出可能な物質は、抗体(又はその断片)に直接又は、当技術分野において周知の技術を使用して中間体(例えば当技術分野において周知のリンカーなど)を介して間接的に結合又はコンジュゲートされうる。本発明による診断的使用のための抗体にコンジュゲートされうる金属イオンについては、例えば米国特許第4,741,900号を参照されたい。適切な酵素の例は西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼを含み;適切な補欠分子族複合体の例はストレプトアビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンを含み;適切な蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオロセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンを含み;発光物質の例はルミノールを含み;生物発光物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを含み;並びに適切な放射性物質の例はヨウ素(131I、125I、123I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115mIn、113mIn、12In、111In)及びテクネチウム(99Tc、99mTc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及び117Tinを含む。
【０２５８】
さらに抗体及びその断片は、細胞毒(例えば細胞分裂阻害剤若しくは細胞破壊剤)などの治療用成分、治療剤又は放射性金属イオン(例えば、例えば213Biなどのアルファ放射体)にコンジュゲートされうる。具体的な実施形態において本発明の抗体は、これだけに限らないが111In、177Lu、90Y、166Ho及び153Smを含む放射性金属イオンをポリペプチドにコンジュゲートするために有用な大環状キレーターに結合される。好ましい実施形態において本発明の抗体に結合した大環状キレーターに付随する放射性金属イオンは、111Inである。好ましい実施形態において本発明の抗体に結合した大環状キレーターに付随する放射性金属イオンは、90Yである。具体的な実施形態において大環状キレーターは、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸(DOTA)である。他の具体的な実施形態においてDOTAは、リンカー分子を介して本発明のBリンパ球刺激因子ポリペプチドに結合される。DOTAをポリペプチドにコンジュゲートするために有用なリンカー分子の例は、当技術分野において一般に周知であり、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれるDeNardo et al.,Clin Cancer Res.4(10):2483-90(1998)、Peterson et al.,Bioconjug. Chem.10(4):553-7(1999)及びZimmerman et al,Nucl.Med.Biol.26(8):943-50(1999)を参照されたい。付加的に、抗体にコンジュゲートされうるキレート剤並びにそれらの作製及び使用方法を開示する米国特許第5,652,361号及び第5,756,065号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５９】
細胞毒又は細胞傷害性物質は、細胞に有害な任意の薬剤を含み、小分子毒及び細菌、真菌、植物若しくは動物由来の酵素的に活性な毒素又はそれらの断片などの分子を含む。例は、パクリタキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド(VP-16)、テノポシド(tenoposide)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにこれらの類似体又は相同体を含む。治療剤は、これだけに限らないが代謝拮抗剤(例えばメトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン(5-fluorouracil decarbazine))、アルキル化剤(例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル(thioepa chlorambucil)、メルファラン、カルムスチン(BSNU)及びロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC及びシス-白金ジクロロジアミン(II)(DDP)シスプラチン(cis-dichlorodiamine platinum (II) (DDP) cisplatin))、アントラサイクリン(例えばダウノルビシン(以前はダウノマイシン)及びドキソルビシン)、抗生物質(例えばダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアントラマイシン(AMC))並びに有糸分裂阻害剤(例えばビンクリスチン及びビンブラスチン)、インプロスルファン、ピポスルファン(piposulfan)、ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドパ(meturedopa)、ウレドパ(uredopa)、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)、トリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)、クロルナファジン(chlornaphazine)、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、ノブエンビキン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード、クロロゾトシン、ホテムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、アクラシノマイシン(aclacinomysin)、アザセリン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアルニシン(calichearnicin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルチノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、デトルビシン(detorubicin)、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、デノプテリン(denopterin)、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキサート、フルダラビン、チアミプリン(thiamiprine)、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FU、カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン、アミノグルテチミド、ミ���タン、トリロスタン、フロリン酸(frolinic acid)、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド(aldophosphamide glycoside)、アミノレブリン酸、アムサクリン、ベストラブシル(bestrabucil)、ビスアントレン(bisantrene)、エダトラキサート、デフォファミン(defofamine)、デルネコルチン(dernecolcine)、ジアジクォン(diaziquone)、エルフォルニチン(elfornithine)、酢酸エリプチニウルン(elliptiniurn acetate)、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン、ミトグアゾン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット(phenamet)、ピラルビシン、ポドフィリン酸、2-エチルヒドラジド、プロカルバジン、PSKO、ラゾキサン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジコン、2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン(gacytosine)、アラビノシド(「Ara-C」)、タキソイド、例えば、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ)、ドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Rh6ne-Poulenc Rorer, Antony, France)、ゲムシタビン、イホスファミド、ビノレルビン、ナベルビン、ノバントロン、テニポシド、アミノプテリン、ゼローダ、イバンドロン酸、CPT-11、トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000、ジフルオロメチルオルニチン(DMFO)、レチノイン酸、エスペラミシン、カペシタビン、及び上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体を含む。この定義に同様に含まれるのは、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性4(5)-イミダゾール、4ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY 117018、オナプリストン(onapristone)、トレミフェン(フェアストン)を含む抗エストロゲン剤、並びにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤、並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体などの腫瘍においてホルモン作用を制御又は抑制するように作用する抗ホルモン剤である。
【０２６０】
本発明のコンジュゲートは、所与の生物学的応答を改変するために使用されることができ、治療剤又は薬剤成分は、古典的化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば薬剤成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドであってよい。そのようなタンパク質は、例えばアブリン、リシンA、シュードモナス菌体外毒素又はジフテリア毒素などの毒素;腫瘍壊死因子、アルファ-インターフェロン、ベータ-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えばTNF-アルファ、TNF-ベータ、AIM I(国際特許出願公開第WO 97/33899号を参照されたい)、AIM II(国際特許出願公開第WO 97/34911号を参照されたい)、Fasリガンド(Takahashi et al.,Int.Immunol.,6:1567-1574(1994))、VEGI(国際特許出願公開第WO 99/23105号を参照されたい)、CD40リガンド、血栓剤(thrombotic agent)又は抗血管新生剤、例えばアンジオスタチン若しくはエンドスタチンなどのタンパク質;又は例えばリンホカイン、インターロイキン-1(「IL-1」)、インターロイキン-2(「IL-2」)、インターロイキン-6(「IL-6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF」)、顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」)又は他の増殖因子などの生体応答修飾物質を含む。
【０２６１】
抗体は、標的抗原の免疫アッセイ又は精製のために特に有用である固体支持体にも結合されうる。そのような固体支持体は、これだけに限らないがガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンを含む。
【０２６２】
そのような治療成分を抗体にコンジュゲートするための技術は十分に周知であり、例えばArnon et al.,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy",in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),pp. 243-56(Alan R.Liss,Inc.1985)、Hellstrom et al.,"Antibodies For Drug Delivery",in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson et al.(eds.),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)、Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",in Monoclonal Antibodies‘84:Biological And Clinical Applications,Pinchera et al.(eds.),pp.475-506 (1985)、"Analysis,Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy",in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin et al.(eds.),pp.303-16(Academic Press 1985)及びThorpe et al.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev. 62:119-58(1982)を参照されたい。
【０２６３】
代替として抗体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,676,980号においてSegalによって記載されたとおりヘテロコンジュゲート抗体を形成するために第二の抗体にコンジュゲートされうる。
【０２６４】
治療用成分がそれにコンジュゲートされていてもいなくても、単独又は(一つ又は複数の)細胞傷害性因子及び/若しくは(一つ又は複数の)サイトカインとの組合せで投与される抗体は、治療剤として使用されうる。
【０２６５】
抗体結合に関するアッセイ
本発明の抗体は、当技術分野において周知の任意の方法によって免疫特異的結合についてアッセイされうる。使用されうる免疫アッセイは、これだけに限らないがいくつかを挙げると、ウエスタンブロット、放射免疫アッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光免疫アッセイ、プロテインA免疫アッセイ、などの技法を使用する競合的及び非競合的アッセイ系を含む。そのようなアッセイは、日常的であり、当技術分野において十分に周知である(例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれるAusubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New Yorkを参照されたい)。例示的免疫アッセイは下に簡潔に記載される(しかし限定の目的を意図しない)。
【０２６６】
一般に免疫沈降プロトコールは、タンパク質ホスファターゼ及び/又はプロテアーゼ阻害剤(例えばEDTA、PMSF、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム)を添加したRIPA緩衝液(1% NP-40又はTriton-X100、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、0.15 M NaCl、0.01 Mリン酸ナトリウムpH 7.2、1%トラジロール)などの溶解緩衝液中に細胞集団を溶菌するステップ、目的の抗体を細胞可溶化物に添加するステップ、4℃で一定時間(例えば1-4時間)インキュベートするステップ、プロテインA及び/又はプロテインGセファロースビースを細胞可溶化物に添加するステップ、4℃で約1時間又はそれ以上インキュベートするステップ、ビーズを溶解緩衝液中で洗浄するステップ並びにビーズをSDS/試料緩衝液中に再懸濁するステップを含む。目的の抗体が具体的な抗原を免疫沈降させる能力は、例えばウエスタンブロット分析によって評価されうる。当業者は、抗体の抗原への結合を増大させ、バックグラウンドを減少させるように変更されうるパラメーター(例えばセファロースビースで細胞可溶化物を予備洗浄するステップ)に関して知識が豊富である。免疫沈降プロトコールに関するさらなる考察については、例えばAusubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York at 10.16.1を参照されたい。
【０２６７】
一般にウエスタンブロット分析は、タンパク質試料を調製するステップ、ポリアクリルアミドゲル(例えば抗原の分子量に応じて8%-20% SDS-PAGE)中でのタンパク質試料の電気泳動、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、PVDF又はナイロンなどの膜にタンパク質試料を移行させるステップ、膜をブロッキング溶液中(例えば3% BSA又は脱脂乳を含むPBS)でブロッキングするステップ、洗浄緩衝液(例えばPBS-Tween 20)中で膜を洗浄するステップ、ブロッキング緩衝液中に希釈された一次抗体(目的の抗体)で膜をブロッキングするステップ、洗浄緩衝液中で膜を洗浄するステップ、酵素基質(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)又は放射性分子(例えば32P又は125I)にコンジュゲートされており、ブロッキング緩衝液中に希釈された二次抗体(一次抗体を認識する、例えば抗ヒト抗体)で膜をブロッキングするステップ、洗浄緩衝液中で膜を洗浄するステップ、及び抗原の存在を検出するステップを含む。当業者は、検出されるシグナルを増大させ、バックグラウンドノイズを低下させるために変更されうるパラメーターに関して知識が豊富である。ウエスタンブロット手順に関するさらなる考察については、例えばAusubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York at 10.8.1を参照されたい。
【０２６８】
ELISAは、抗原を調製するステップ、96ウエルマイクロタイタープレートのウエルを抗原でコートするステップ、酵素的基質(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)などの検出可能な化合物にコンジュゲートされた目的の抗体をウエルに添加し、一定時間インキュベートするステップ及び抗原の存在を検出するステップを含む。ELISAにおいて目的の抗体は、検出可能な化合物にコンジュゲートされる必要はなく、その代わりに検出可能な化合物にコンジュゲートされた二次抗体(目的の抗体を認識する)がウエルに添加されてもよい。さらに抗原でウエルをコーティングする代わりに、抗体がウエルにコートされてもよい。この場合、検出可能な化合物にコンジュゲートされた二次抗体は、コートされたウエルへの目的の抗原の添加後に添加されてよい。当業者は、検出されるシグナルを増大させるために変更させうるパラメーター及び当技術分野において周知のELISAの他の変更について知識が豊富である。ELISAに関するさらなる考察については、例えばAusubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York at 11.2.1を参照されたい。
【０２６９】
抗原への抗体の結合親和性及び抗体-抗原相互作用のオフ速度(off-rate)は、競合的結合アッセイによって決定されうる。競合的結合アッセイの一例は、非標識抗原の存在量を漸増させての標識抗原(例えば3H又は125I)と目的の抗体とのインキュベーション及び標識抗原に結合した抗体の検出を含む放射免疫アッセイである。目的の抗体の具体的な抗原への親和性及び結合オフ速度は、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定されうる。二次抗体との競合も放射免疫アッセイを使用して決定されうる。この場合抗原は、標識化合物(例えば3H又は125I)とコンジュゲートされた目的の抗体と、非標識二次抗体の存在量を漸増させてインキュベートされる。
【０２７０】
治療的又は予防的活性の実証
Bリンパ球刺激因子アンタゴニスト又はその医薬組成物は、好ましくはヒトにおける使用の前にin vitroで、次いでin vivoで所望の治療的又は予防的活性に関して検査される。例えばBリンパ球刺激因子アンタゴニスト又はその医薬組成物の治療的又は予防的有用性を実証するためのin vitroアッセイは、細胞株又は患者組織試料での有効性を評価するステップを含む。細胞株及び/又は組織試料での効果は、これだけに限らないがロゼット形成アッセイ及び細胞溶解アッセイを含む当業者に周知の技術を利用して決定されうる。特定の化合物の投与が指示されるかどうかを決定するために使用されうるin vitroアッセイは、患者組織試料を培養物中で増殖させ、化合物に暴露する又はそうでなければ化合物を投与し、そのような化合物の組織試料への効果が観察される、in vitro細胞培養アッセイを含む。
【０２７１】
（実施例）
本発明について一般に記載してきた同様の事柄は、例示の方法により提供され、限定を意図しない続く実施例を参照することによってさらに容易に理解される。当業者は、続く実施例を容易に管理できる。
【実施例１】
【０２７２】
本実施例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,220,840号に既に記載のとおり、scFvのライブラリー由来のBリンパ球刺激因子タンパク質に対して方向付けられた抗体断片の単離を実証する。
【０２７３】
ヒトPBLから単離された天然に存在するV遺伝子は、ドナーが暴露されていてもされていなくてもよいBリンパ球刺激因子タンパク質に対する活性を有する抗体断片の大きなライブラリー中に組み入れられる(例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第5,885,793号を参照されたい)。
【０２７４】
ライブラリーのレスキュー
scFvのライブラリーは、WO92/01047(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載のとおりヒトPBLのRNAから構築される。ファージ提示抗体断片をレスキューするために、ファージミドを含むおよそ109個の大腸菌を1%ブドウ糖及び100マイクログラム/mlアンピシリンを含有する2x TY 50ml(2xTY-AMP-GLU)に接種するために使用し、振盪してO.D.0.8に増殖させた。この培養物5mlを2xTY-AMP-GLU 50mlに接種し、デルタ遺伝子3ヘルパー(M13デルタ遺伝子III、WO92/01047を参照されたい)の2x108 TUを添加し、培養物を振盪せずに37℃、45分間、次いで振盪して37℃、45分間インキュベートした。培養物を4000r.p.m.で10分間遠心分離し、ペレットを100マイクログラム/mlアンピシリン及び50マイクログラム/mlカナマイシンを含有する2x TY 2リットルに再懸濁し、一晩増殖させた。ファージはWO92/01047に記載のとおり調製する。
【０２７５】
M13デルタ遺伝子IIIは、次のとおり調製する:M13デルタ遺伝子IIIヘルパーファージは遺伝子IIIタンパク質をコードしていないことから、抗体断片を提示しているファージ(ミド)は、抗原に結合するより大きな結合活性を有する。感染性M13デルタ遺伝子III粒子は、ファージ形態形成中に野生型遺伝子IIIタンパク質を供給するpUC19誘導体を有する細胞中でヘルパーファージを増殖させることによって作製される。培養物を振盪せずに37℃で1時間、次いで振盪して37℃でさらに1時間インキュベートする。細胞を遠沈させ(IEC-Centra 8,4000 revs/分で10分間)、100マイクログラム/mlアンピシリン及び25マイクログラム/mlカナマイシンを含有する2x TYブロス(2x TY-AMP-KAN)300mlに再懸濁し、37℃で振盪して一晩増殖させた。ファージ粒子を精製し、培養培地から2 PEG沈殿(Sambrook et al.,1990)によって濃縮し、PBS 2 mlに再懸濁し、0.45マイクロメートルフィルター(Minisart NML;Sartorius)を通し、最終濃度およそ1013形質導入単位/mlを得る(アンピシリン耐性クローン)。
【０２７６】
ライブラリーのパニング
Immunotubes(Nunc)を、本発明のポリペプチド100マイクログラム/ml又は10マイクログラム/mlのいずれかを含むPBS 4mlで一晩コートする。チューブを2% Marvel-PBSで2時間、37℃でブロックし、次いでPBSで3回洗浄する。ファージおよそ1013 TUをチューブに添加し、室温で30分間、ターンテーブルで上下に回転させながらインキュベートし、次いで静置してさらに1.5時間置く。チューブをPBS 0.1% Tween-20で10回洗浄し、PBSで10回洗浄する。ファージを100mMトリメチルアミン1mlを添加し、ターンテーブルで上下に15分間回転させ、その後溶液を1.0M Tris-HCl、pH 7.4 0.5mlで速やかに中和することによって溶出する。次いでファージは、溶出したファージを細菌と37℃、30分間インキュベートするステップによってmid-log大腸菌TG1 10mlに感染させるために使用する。次いで大腸菌を1%ブドウ糖及び100マイクログラム/mlアンピシリンを含有するTYEプレートに蒔く。次いで得られた細菌ライブラリーを、上に記載のとおり続く選択のためのファージを調製するためにデルタ遺伝子3ヘルパーファージでレスキューする。次いでこのプロセスを繰り返して、合計4回の親和性精製医を行い、3及び4回目には、チューブ洗浄をPBS、0.1% Tween-20で20回及びPBSで20回に増やす。
【０２７７】
結合剤の特徴付け
選択の三回目及び四回目から溶出されたファージを大腸菌HB2151を感染させるために使用し、可溶性scFvをアッセイのために単一コロニーから産生させる(Marks,et al.,1991)。50mM炭酸水素、pH9.6中の本発明のポリペプチド10ピコグラム/mlでコートしたマイクロタイタープレートでELISAを実施する。ELISAでの陽性クローンをPCRフィンガープリント法(例えばWO92/01047を参照されたい)、次いで配列分析によってさらに特徴付ける。
【実施例２】
【０２７８】
本実施例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,881,401号及び米国特許出願公開第2009/0104189 A1号に既に記載のとおり、Bリンパ球刺激因子タンパク質受容体相互作用の抗Bリンパ球刺激因子タンパク質モノクローナル抗体での中和を実証する。
【０２７９】
モノクローナル抗体を以下の方法によりBリンパ球刺激因子タンパク質に対して生成した。簡潔にはマウスにフロイント完全アジュバント100マイクロリットル中に乳化させたPBS 100マイクロリットル中のHisタグBリンパ球刺激因子タンパク質50マイクログラムを皮下注射(背側前部)した。フロイント不完全アジュバント中のBリンパ球刺激因子タンパク質25マイクログラムの3回の追加的皮下注射を2週間間隔で行った。動物は、PBS中のBリンパ球刺激因子タンパク質25マイクログラムの最終腹腔内追加免疫を与える前に一カ月休息させた。4日後マウスを屠殺し、脾細胞を融合のために採取した。
【０２８０】
「融合」のプロセスは、既に記載の方法への製造者による変更(Gefter,M.L.,et al.Somatic Cell Genet 3:231-36(1977)、Boehringer Mannheim, PEG 1500(カタログ番号783641)製品記述、を参照されたい)に従って、PEG 1500(Boehringer Mannheim)を使用して脾臓1個由来の脾細胞を2x107個のP3X63Ag8.653形質細胞腫細胞と融合するステップによって実施された。
【０２８１】
融合後、細胞を20%FBS及び4%Hybridoma Supplement(Boehringer Mannheim)を添加したHAT培地400mlに再懸濁し、1ウエルあたり200μリットルの密度で96ウエルプレートに分注した。融合後7日目に培地100マイクロリットルを吸引し、新鮮培地100マイクロリットルで置き換えた。融合後14日目に融合細胞を抗体産生についてスクリーニングした。
【０２８２】
融合細胞上清を、プレートに固定したBリンパ球刺激因子タンパク質への結合についてELISAでスクリーニングした。PBS中1mlあたり2マイクログラムの濃度のBリンパ球刺激因子タンパク質を1ウエルあたり100マイクロリットルで一晩インキュベートすることによってプレートをBリンパ球刺激因子タンパク質でコートした。融合細胞上清をPBSで1:10に希釈し、Bリンパ球刺激因子タンパク質コートプレートの個々のウエルに入れ、一晩4℃でインキュベートした。翌日プレートを0.1% Tween-20を含有するPBSで3回洗浄し、anti-mouse IgG ABC system(Vector Laboratories)を使用して発色させた。発色反応は、1ウエルあたり25mlの2M H2SO4の添加で停止させた。次いでプレートを450nmで読み取った。
【０２８３】
融合細胞上清をIsostripを使用してIgアイソタイプについて検査した。クローニングは、HT培地での限界希釈法によって実施した。HBSS 0.9ml中の細胞約3x106個をプリスタンで予備刺激したマウスに注射した。7-9日後に19g針を使用して腹水を回収した。全ての抗体をActa FPLC system(Pharmacia)を使用してプロテインGアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０２８４】
初回及び2回連続の皮下注射後に、3匹全てのマウスは強い免疫応答を発症し、Bリンパ球刺激因子タンパク質コートプレートでのELISAによって評価した血清力価は10-7であった。
【０２８５】
一実験において、陽性マウス由来の脾細胞を使用して1000を超える初代融合細胞が生成された。その917個を抗Bリンパ球刺激因子タンパク質抗体の産生についてスクリーニングした。スクリーニングは、全ての陽性クローンを検出するために1:1に希釈した上清を使用して実施した。スクリーニングした融合細胞917個のうち、76個が陽性であり、その内17個がIgG産生細胞であることが見出された。親和性試験及びクローニング後、その内9個をさらなる増殖及び精製のために選択した。
【０２８６】
精製した全てのモノクローナル抗体は、ウエスタンブロット分析及びELISAの両方において、さまざまな形態のBリンパ球刺激因子タンパク質(Hisタグ及びバキュロウイルス系から産生されたタンパク質を含む)に結合可能であった。9個の内6個のクローンは、THP-1細胞表面上のBリンパ球刺激因子タンパク質にも結合可能であった。しかし検査した抗体で溶液からBリンパ球刺激因子タンパク質を捕捉できるものはなかった。
【０２８７】
細胞表面に発現されたBリンパ球刺激因子タンパク質を認識するが溶液中ではせず、in vivo並びにin vitroでの単球及びB細胞アッセイにおける中和研究のために使用できる高親和性抗Bリンパ球刺激因子モノクローナル抗体が生成された。これらの抗体は、ウエスタンブロットでのBリンパ球刺激因子タンパク質の高感度検出のためにも有用である。
【０２８８】
別の実験において、陽性マウス由来の脾細胞を使用して1000を超える初代融合細胞が生成された。次いで初代融合細胞729個を抗Bリンパ球刺激因子タンパク質抗体の産生についてスクリーニングした。スクリーニングは、高親和性のクローンだけを取り出すために1:10に希釈した上清を使用してストリンジェントな条件下で実施した。スクリーニングした融合細胞729個のうち、16個のIgM及び7個のIgG産生細胞(後者のうち4個は強いIgMバックグラウンドを示した)を含んで23個が陽性であった。本実験において、IgG抗体のアイソタイプ分布は、IgG2サブクラスに偏っていた。7個のIgG融合細胞の内の3個は、IgG2サブクラスの抗体を産生し、2個はIgG2bサブクラスの抗体を産生し、残りの2個はIgG1産生細胞であった。
【０２８９】
第二実験で生成された全ての陽性融合細胞由来の上清をB細胞のBリンパ球刺激因子タンパク質調節増殖を抑制する能力について検査した。最初のスクリーニング実験において、IgG中和抗体を産生する融合細胞2個が検出された(これらは抗体16C9及び12C5)。付加的実験において融合細胞(すなわち16C9及び12C5)のIgG中和活性が確認され、融合細胞15C10及び4A6由来の追加的に2個の強く中和する上清が同定された。
【０２９０】
続いてクローン3個をin vivoで増殖させ(単一クローン、すなわち15C10もホローファイバー系で増殖させた)、抗体をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。クローン3個全てがTHP-1細胞表面上のBリンパ球刺激因子タンパク質に結合でき、溶液中のBリンパ球刺激因子タンパク質にも結合(すなわち「捕捉」)できた。
【０２９１】
具体的には実験は、上の第二実験において記載の抗Bリンパ球刺激因子タンパク質モノクローナル抗体を抗体がBリンパ球刺激因子タンパク質/Bリンパ球刺激因子タンパク質受容体結合を中和するかどうかを決定するために使用して実施した。簡潔には、Bリンパ球刺激因子タンパク質をEZ-link T NHS-biotin reagent(Pierce,Rockford, IL)を使用してビオチン化した。ビオチン化Bリンパ球刺激因子タンパク質を次いでBリンパ球刺激因子タンパク質に結合する細胞表面タンパク質を同定するために使用した。予備実験は、Bリンパ球刺激因子タンパク質がBリンパ球細胞上の受容体に結合することを実証した。
【０２９２】
上に記載の第二実験において生成された抗Bリンパ球刺激因子タンパク質抗体の封入体は、Bリンパ球刺激因子タンパク質のBリンパ球刺激因子受容体への結合を中和した。具体的な実施形態において抗Bリンパ球刺激因子抗体15C10は、Bリンパ球刺激因子タンパク質のBリンパ球刺激因子受容体への結合を中和する。
【０２９３】
したがって上に記載の第二実験において生成された抗Bリンパ球刺激因子モノクローナル抗体(詳細には抗体15C10)は、膜結合及び可溶性の両方のBリンパ球刺激因子タンパク質を認識かつ結合し、Bリンパ球刺激因子タンパク質/Bリンパ球刺激因子受容体結合をin vitroで中和する。
【実施例３】
【０２９４】
本実施例は、抗体15C10と3D4との間の競合的結合研究を実証する。
【０２９５】
抗体15C10及び3D4が類似の又は別のエピトープと結合するかどうかを決定するために競合的結合研究を実施した。
【０２９６】
可溶性Bリンパ球刺激因子タンパク質を15C10又は3D4抗体と共に予備インキュベートした。本実施例以下において、Bリンパ球刺激因子タンパク質と予備インキュベートした抗体を「競合抗体」と称する。予備インキュベーション後、可溶性Bリンパ球刺激因子タンパク質-競合抗体複合体を、3D4又は15C10のいずれかをコートしたELISAプレートで捕捉させた。本実施例以下において、ELISAプレート上にコートされた抗体を「捕捉抗体」と称する。結合及び洗浄ステップ後、3D4又は15C10をコートしたELISAプレートに捕捉された可溶性Bリンパ球刺激因子タンパク質-競合抗体複合体を、ビオチン化ポリクローナル抗Bリンパ球刺激因子タンパク質抗体に続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなどのストレプトアビジン結合検出試薬を使用して検出した。
【０２９７】
競合抗体とEILSAプレート上の捕捉抗体との間に競合がなければ(すなわち2個の抗体が重複しないエピトープに結合する場合)、可溶性Bリンパ球刺激因子タンパク質は、ELISAプレート上の捕捉抗体への結合を阻止されず、ELISAは陽性シグナルを示す。一方、競合抗体とEILSAプレート上の捕捉抗体との間に競合がある場合(すなわち2個の抗体が重複する又は同一のエピトープに結合する場合)、ELISAプレート上に結合する可溶性Bリンパ球刺激因子タンパク質の量は減少し(又は無く)、ELISAは、2個の抗体の間に競合が無い場合のシグナルと比較して減少したシグナルを示す。
【０２９８】
上の記載と類似のアッセイをモノクローナル抗体15C10及び3D4を使用して実施した場合、どちらの抗体を競合抗体としどちらの抗体を捕捉抗体とするかにかかわらず2個の抗体が相互に競合したことが見出された。これらの結果は、15C10及び3D4は少なくとも重複するエピトープを有することを示す。アイソタイプが一致している無関係な特異性(Bリンパ球刺激因子タンパク質非結合性)の対照は、結合に関して競合できなかった。
【実施例４】
【０２９９】
本実施例は、in vivoでのBリンパ球刺激因子(BLyS)タンパク質中和が、総IgEレベル、粘液蓄積及び肺における細胞の浸潤を低下させることによって肺のアレルゲン誘発性アレルギー性若しくは炎症性症状を予防、改善及び/又は治療できることを実証する。具体的には、中和モノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)の喘息のネズミモデルでの投与は、肺炎症を誘発することが周知であるアレルゲンへの暴露の前又は後に投与した場合に、気管支又は肺の炎症の発症を予防した。
【０３００】
BLySは、B細胞の成熟及び生存を駆動する鍵となるタンパク質である。アレルゲンへの暴露が気道過敏症、肺好酸球増加症、抗原特異的血清IgEレベルの上昇及び気道上皮粘液含有量の増大を生じる十分に特徴付けられたアレルギー性喘息のネズミモデルを、喘息などの肺のアレルギー性若しくは炎症性症状の治療及び予防のための潜在的治療剤としての抗BLySmAbの使用を調査するために使用した。
【０３０１】
オボアルブミン感作及びチャレンジ
メスBALB/cマウス(8-10週齢)をオボアルブミン(OVA)(Sigma-Aldrich)20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作した。33日目に開始して4日間1日おきにマウスをPBS中の10mg/mlオボアルブミンを40分間噴霧することによってチャレンジした(すなわちマウスを33、35、37及び39日目にチャレンジした)。マウスは、最後のオボアルブミンチャレンジ後、40日目に屠殺した。対照マウスはPBSで感作及びチャレンジした又は無処置のまま(naive)のいずれかであり、40日目に屠殺した。屠殺において、血液、肺、気管支肺胞洗浄(BAL)液及び脾臓を動物から取り出した。血液は遠心分離し、血清を取り出した。
【０３０２】
OVA感作マウスにおける10F4及びデキサメタゾン処置
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストが肺炎症の発症を予防する能力を評価するために、OVA感作マウスの一群をOVAでのチャレンジの前、20及び27日目にi.p.注射によって100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置した(予防群)。10F4は、参照により本明細書に組み込まれるSchoz et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2008 October 7;105(40):15517-15522に既に記載のとおりネズミBLySを中和する、モノクローナルIgG1ハムスター抗ネズミBLyS抗体である。対照として、OVA感作マウスの一群をOVAでのチャレンジの前、20及び27日目にi.p.注射によって100μgのアイソタイプ対照抗体(精製アメリカンハムスターIgG1(クローンG235-2356;BD Biosciences))で処置した(アイソタイプ対照予防(Iso Pro)群)。
【０３０３】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストが肺炎症を予防、改善又は治療する能力を評価するために、OVA感作マウスの一群を34日目(すなわちOVAチャレンジ中)にi.p.注射によって100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置した(治療群)。対照として、OVA感作マウスの一群を34日目にi.p.注射によって100μgのアイソタイプ対照抗体(精製アメリカンハムスターIgG1(クローンG235-2356;BD Biosciences))で処置した(アイソタイプ対照治療(Iso Ther又はIso Cont)群)。
【０３０４】
10F4の効能をグルココルチコイドでの古典的処置と比較するために、OVA感作マウスの一群に水溶性デキサメタゾン(DEX)(Sigma-Aldrich)(PBS 100μl中50μg)をi.p注射によってOVAチャレンジとは異なる日ごと(すなわちデキサメタゾンは34、36、38日目に投与した)に与えた。
【０３０５】
マウスのPBS及びnaive群は無処置のままとした。
【０３０６】
全てのマウスを40日目に屠殺した。
【０３０７】
図1Dに示すとおり、アイソタイプ対照抗体で(Iso. Cont.)又はデキサメタゾンで(Dex)処置したマウス及び無処置(naive)マウスと比較して、予防群(10F4 Pro)又は治療群(10F4 Ther)においては血清BLySレベルにおける顕著な低下があった。これらのデータは、抗BLyS mAb 10F4での処置がin vivoでのBLyS中和を導くことを確認する。
【０３０８】
総IgE ELISA
血清IgEをBD Biosciences Mouse OptEIA Total IgE ELISA Kitを使用して検出した。簡潔にはプレートを捕捉抗体でコートし、PBS中2% BSAでブロックし、血清希釈物を2時間インキュベートした。検出抗体及びSav-HRP試薬を添加し、1時間インキュベートした。TMB基質溶液を添加し、30分間インキュベートした。洗浄は、0.05% Tween 20を添加したPBSを使用して実施した。
【０３０９】
図1Aに示すとおり、総IgEレベルは、アイソタイプ対照抗体で処置したOVA感作及びチャレンジマウス(Iso.Cont.)において顕著に上昇していた(平均IgEレベル=3708ng/ml)。アイソタイプ対照マウスにおいて観察された総IgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大は、デキサメタゾン(DEX)(平均IgEレベル=1058ng/ml)又は10F4(10F4 Ther.)(平均IgEレベル=955.1ng/ml)のいずれかで処置したマウスにおいて顕著に低下していた(図1A)。これらのデータは、BLySアンタゴニストの単一用量(治療群)が6日以内での総IgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大を効果的に低下させたことを実証する。さらにこれらのデータは、BLySアンタゴニストが総IgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大を低下させることにおいて古典的副腎皮質ステロイド処置と同様に効果的であることを実証する。
【０３１０】
驚くべきことに、総IgEレベルは、予防群(OVAチャレンジの前に10F4抗BLyS抗体で処置したマウス)(10F4 Pro)において顕著に低下していた(平均IgEレベル=1573ng/ml)(図1A)。これらのデータは、アレルゲンチャレンジ前のBLySアンタゴニストでの処置が総IgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大を予防したことを実証する。
【０３１１】
予測されたとおり、総IgEレベルはPBSで感作及びチャレンジしたマウス(平均IgEレベル=103.8ng/ml)及び無処置(naive)マウス(平均IgEレベル=26.17ng/ml)において非常に低かった(図1A)。
【０３１２】
OVA特異的IgE ELISA
OVA特異的血清IgEをMD Bioproducts OVA-IgE ELISA kit(カタログ番号M036005)を製造者のプロトコールに従って使用して検出した。
【０３１３】
図10に示すとおり、OVA特異的IgEレベルは、アイソタイプ対照抗体で処置したOVA感作及びチャレンジマウス(Iso. Cont.)において顕著に上昇していた。アイソタイプ対照マウスにおいて観察されたOVA特異的IgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大は、デキサメタゾン(DEX)又は10F4(10F4 Ther.)のいずれかで処置したマウスにおいて顕著に低下していた(図10)。これらのデータは、BLySアンタゴニストの単一用量(治療群)が6日以内でのOVA特異的(すなわちアレルゲン特異的)IgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大を効果的に低下させたこと実証する。さらにこれらのデータは、BLySアンタゴニストがアレルゲン特異的IgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大を低下させることにおいて古典的副腎皮質ステロイド処置と同様に効果的であることを実証する。
【０３１４】
驚くべきことに、OVA特異的IgEレベルは、予防群(OVAチャレンジの前に10F4抗BLyS抗体で処置したマウス)(10F4 Pro)において顕著に低下していた(図10)。これらのデータは、アレルゲンチャレンジ前のBLySアンタゴニストでの処置がアレルゲン特異的IgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大を予防したことを実証する。
【０３１５】
フローサイトメトリー
B細胞の10F4調節を測定するために、血液及び脾細胞をPacific Blue又はPE (BD Biosciences)にコンジュゲートした抗CD45R/B220で染色した。細胞は脾細胞にゲートされ、CD45R/B220+細胞はリンパ球ゲートの一定割合であった。データをFACs Calibur又はFacs Cantoフローサイトメーターのいずれかで収集し、FlowJo (Tree Star)を使用して分析した。図1B及び15Aに示すとおり、脾臓におけるB220+B細胞の百分率は、予防群(10F4 Pro.)及び治療群(10F4 Ther.)において顕著に低下しており、予測されたとおり抗BLyS mAb 10F4での処置がin vivoで脾臓におけるB220+B細胞の低下を導くことを確認している。同様にB220+B細胞の百分率における低下は、予防群(10F4 Pro.)及び治療群(10F4 Ther.)由来のマウスの血液において検出された(図1C及び15B)。同程度の量のB220+B細胞がアイソタイプ対照、デキサメタゾン、PBS及び無処置の群のマウスの脾臓において検出された(図1B及び15A)が、B220+B細胞の百分率における減少が、アイソタイプ対照、PBS及び無処置の群のマウスと比較して、デキサメタゾンで処置したマウスの血液において検出された(図1C及び15B)。
【０３１６】
肺組織診断
10F4処置の効果を測定するためにOVA又はPBSのいずれかでの最後の噴霧の24時間後に肺を組織診断によって分析した。肺を10%ホルマリンで膨張させ、10%ホルマリン中に固定し、脱水し、パラフィンにマウントし、切片化し、ヘマトキシリン/エオシンで染色した。気道粘液は、標準的プロトコールを使用することによるアルシアンブルー/過ヨウ素酸-シッフ(PAS)反応によって同定した。
【０３１７】
図6に示すとおり、粘液蓄積及び細胞浸潤は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの34日目と比較して10F4で処置したマウス(10F4治療群)の34日目において顕著に低下していた。これらのデータは、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストでの処置が肺での粘液蓄積、粘液含有細胞又は免疫細胞の通常の細胞浸潤におけるアレルゲン誘発性増大を抑制したことを実証する。
【０３１８】
肺浸潤分析
肺試料における細胞浸潤の量を定量するために、特定のアルゴリズムAperio  からのGenieを利用した。簡潔には肺試料を標準的プロトコールを使用して過ヨウ素酸シッフ染色及びヘマトキシリンで染色した。染色した肺組織をAperio CS systemを使用して、顕微鏡デジタル画像を得るために拡大率20 xで走査した。次いで画像を研究者によって分類された目的の面積を同定及び測定するためにGenieを使用して分析した。ポジティブコントロールスライドを使用して、細胞密度及び形態学に基づいて浸潤面積を検出するためにGenieをプログラム化した。Genieを浸潤測定に関して調整後、肺の総面積を得るために各肺組織に輪郭を描き、次いで浸潤面積を測定した。肺の総面積における浸潤の百分率を各群の比較のために使用した。n=2を有するPBS群及び無処置対照群を除いて各群は、n=4を有した。分析した各肺の総面積は、94+2.1 mm2(平均+ SEM)であった。独立t検定を統計解析のために使用した。
【０３１９】
図13に示すとおり肺における細胞浸潤は、PBSで感作及びチャレンジしたマウス並びに無処置(naive)マウスと比較して、20及び27日目(予防群)(Iso. Pro.)又は34日目(治療群)(Iso. Ther.)のいずれかにアイソタイプ対照抗体で処置したOVA感作及びチャレンジマウスにおいて顕著に上昇していた(図13)。*はp値<0.05を表し、**はp<0.01を表す(図13)。
【０３２０】
34日目にアイソタイプ対照抗体で処置したマウス(Iso. Ther.)において観察された細胞浸潤におけるアレルゲン誘発性増大は、34日目に10F4で(10F4 Ther.)(治療群)又はデキサメタゾンで(Dex)処置したマウスにおいて顕著に低下していた(図13)。これらのデータは、BLySアンタゴニストの単一用量(治療群)が6日以内での肺での細胞浸潤におけるアレルゲン誘発性増大を効果的に低下させたことを実証する。さらにこれらのデータは、BLySアンタゴニストが肺における免疫細胞の細胞浸潤におけるアレルゲン誘発性増大を低下させることにおいて古典的副腎皮質ステロイド処置と同様に効果的であることを実証する。
【０３２１】
細胞浸潤は、アイソタイプ対照予防群(OVAチャレンジの前の20及び27日目にアイソタイプ対照抗体で処置したマウス)と比較して予防群(OVAチャレンジの前の20及び27日目に10F4抗BLyS抗体で処置したマウス)(10F4予防)において顕著に低下していた(図13)。これらのデータは、アレルゲンチャレンジ前のBLySアンタゴニストでの処置が肺での免疫細胞の細胞浸潤におけるアレルゲン誘発性増大を予防したことを実証する。
【０３２２】
好中球、好酸球及びマスト細胞数
屠殺において、気管支肺胞洗浄(BAL)液を肺から回収し、次いで肺を10%ホルマリンで膨張させた。次いで肺をホルマリン中に入れて、固定し、ヘマトキシリン/エオシンで染色した。(1)PBSで感作及びチャレンジしたマウス、(2)34日目に10F4で処置した動物(10F4 Ther)(治療群)、及び(3)34日目にアイソタイプ対照抗体で処置した動物(Isotype Ther)由来のヘマトキシリン/エオシン染色肺切片を好中球、好酸球及びマスト細胞の計数のためにCharles River Laboratories,Pathology Associates (Frederick,MD)に送った。全ての計数はDr.Julia Baker,BVMS, DipRCPath, MRCVSによって実施された。計数は次の手順を使用して実施した。切片あたり10視野の肺実質を40x拡大で検査し、各視野における好中球、好酸球及びマスト細胞の数を計数した。次いで一視野あたりの平均細胞数を算出した。直径(D)を200μmと測定し、式A-π(D/2)2を使用して面積(A)は31416μm2と算出された。1mm2あたりの細胞数は式(平均/31416)x1000000を使用して導いた。
【０３２３】
図14A-B及び19A-Bに示すとおり、34日目に10F4で治療的に処置したマウスは、アイソタイプ対照で処置したマウスと比較して肺において顕著に少ない好中球、好酸球及びマスト細胞を有した。これらのデータは、BLySアンタゴニストの単一用量(治療群)が6日以内での好酸球及びマスト細胞の肺への遊走におけるアレルゲン誘発性増大を効果的に低下させたことを実証する。
【０３２４】
本実施例において示された実験の結果は、in vivo BLyS中和が総IgEレベル、粘液蓄積及び肺における細胞浸潤を低下させることによって肺のアレルゲン誘発性アレルギー性又は炎症性症状を改善及び/又は治療できることを実証する。詳細には、喘息ネズミモデルでの中和抗BLySモノクローナル抗体(mAb)の投与は、肺炎症を誘発することが周知であるアレルゲンへの暴露の前に投与される場合は、肺炎症の発症を予防し、肺炎症を誘発することが周知であるアレルゲンへの暴露後に投与される場合は肺炎症を予防、改善又は治療する。本実施例において示された実験の結果は、抗BLyS mAbなどのBLySアンタゴニストの使用が、喘息などの肺のアレルギー性又は炎症性症状の治療又は予防のための潜在的治療であることを実証する。
【実施例５】
【０３２５】
本実施例は、喘息のネズミモデルでの中和抗BLyS mAbの反復投与が、総IgEレベル、粘液蓄積及び肺における細胞の浸潤を低下させることによって肺炎症を減少、治療、予防及び/又は改善したことを実証する。
【０３２６】
オボアルブミン感作及びチャレンジ
メスBALB/cマウス(8-10週齢)をオボアルブミン(OVA)(Sigma-Aldrich)20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作した。マウスをPBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによって33、35、37、39、47、49、51、53、61、63、65及び67日目にチャレンジした。マウスは、最後のオボアルブミンチャレンジ後、54日目又は68日目のいずれかに屠殺した。
【０３２７】
OVAチャレンジマウスにおける10F4処置
アレルゲンチャレンジと同時に投与した場合にBリンパ球刺激因子アンタゴニストが肺炎症を減少、治療、予防及び/又は改善する能力を評価するために、マウスを100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)又はアイソタイプ対照抗体でi.p.注射によって34、41、48及び55日目(すなわちOVAチャレンジ中)に処置した。したがって、合計3回の10F4投与を受けたマウスを54日目に屠殺し、合計4回の10F4投与を受けたマウスを68日目に屠殺した。
【０３２８】
予測されたとおり10F4で3回(図2D)又は4回(図3D)処置したマウスでは、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスと比較して血清BLySレベルが顕著に低下していた。これらのデータは、抗BLyS mAb 10F4での処置がin vivo BLyS中和を導いたことを確認する。
【０３２９】
総IgE ELISA
血清IgEを実施例4に記載のとおりBD Biosciences Mouse OptEIA Total IgE ELISA Kitを使用して検出した。予測されたとおり、総IgEレベルは、アイソタイプ対照抗体で3回処置したマウス(Isotype)において顕著に上昇していた(平均IgEレベル=6313ng/ml)(図2A)。対照的に、10F4で3回処置したマウス(10F4)において総IgEレベルは顕著に低下していた(平均IgEレベル=3243ng/ml)(図2A)。同様にアイソタイプ対照抗体で4回処置したマウス(Isotype)(平均IgEレベル=6882ng/ml)と比較して10F4で4回処置したマウス(10F4)において総IgEレベルは、顕著に低下していた(平均IgEレベル=2917ng/ml)(図3A)。これらのデータは、数回のアレルゲンチャレンジ中のBLySアンタゴニストの反復投与が総IgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大を効果的に低下させたことを実証する。
【０３３０】
フローサイトメトリー
CD45R/B220+細胞を実施例4に記載のとおりフローサイトメトリーによって検出した。B220+B細胞の脾臓(図2B)及び血液(図2C)における百分率は、アイソタイプ対照抗体で3回処置したマウス(Isotype)と比較して、10F4で3回処置したマウス(10F4)において顕著に低下していた。同様にB220+B細胞の脾臓(図3B)及び血液(図3C)における百分率は、アイソタイプ対照抗体で4回処置したマウス(Isotype)と比較して、10F4で4回処置したマウス(10F4)において顕著に低下していた。これらの結果は、抗BLyS mAb 10F4での処置がin vivoでのB細胞の低下を導いたことを確認する。
【０３３１】
肺組織診断
肺を実施例4に記載のとおり組織診断によって分析した。図7に示すとおり、粘液蓄積及び細胞浸潤は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウス(Isotype)と比較して10F4で3回処置したマウス(10F4)において顕著に低下していた。同様の結果が10F4で4回処置したマウスにおいて観察された(図8)。これらのデータは、数回のアレルゲンチャレンジ中のBリンパ球刺激因子アンタゴニストでの反復的処置が粘液蓄積、粘液含有細胞又は肺での免疫細胞の通常の細胞浸潤におけるアレルゲン誘発性増大を抑制したことを実証する。
【０３３２】
本実施例において示された実験の結果は、喘息ネズミモデルでの中和抗BLySモノクローナル抗体(mAb)の反復治療的投与が総IgEレベル、粘液蓄積及び肺における細胞浸潤を低下させることによって肺のアレルゲン誘発性アレルギー性又は炎症性症状を減少、予防、改善及び/又は治療することを実証する。本実施例において示された実験の結果は、抗BLyS mAbなどのBLySアンタゴニストの使用が、喘息などの肺のアレルギー性又は炎症性症状の治療又は予防のための潜在的治療であることを実証する。
【実施例６】
【０３３３】
本実施例は、喘息のネズミモデルでの中和抗BLyS mAbの治療的投与が、総IgEレベル、粘液蓄積及び肺における細胞の浸潤を中和抗BLyS mAbの最終投与後72日間低下させたことを実証する。
【０３３４】
オボアルブミン感作及びチャレンジ
メスBALB/cマウス(8-10週齢)をオボアルブミン(OVA)(Sigma-Aldrich)20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作した。マウスをPBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによって33、35、37、39、47、49、51、53、61、63、65、67、120、122、124及び126日目にチャレンジした。マウスは、最終オボアルブミンチャレンジ後の127日目に屠殺した。対照マウスは、PBSで感作及びチャレンジした又は無処置のまま(naive)のいずれかであり、127日目に屠殺した。
【０３３５】
OVAチャレンジマウスにおける10F4処置
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストが慢性アレルゲン誘発性の肺炎症を減少、治療、予防及び/又は改善する能力を評価するために、マウスを、100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)又はアイソタイプ対照抗体のいずれかでi.p.注射により34、41、48及び55日目(すなわちOVAチャレンジ中)に処置した。したがってマウスは合計4回の10F4投与を受け、10F4の最終投与は屠殺の72日間前に行われた。
【０３３６】
総IgE ELISA
血清IgEを実施例4に記載のとおりBD Biosciences Mouse OptEIA Total IgE ELISA Kitを使用して検出した。総IgEレベルは、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスの127日目(Isotype)において顕著に上昇していた(平均IgEレベル=10062ng/ml)(図4A)。驚くべきことに総IgEレベルは、抗BLyS抗体治療が55日目に中止されたにもかかわらず10F4で処置したマウスの127日目(10F4)において顕著に低下していた(平均IgEレベル=6878ng/ml)(図4A)。これらのデータは、BLySアンタゴニストでの反復処置が、BLySアンタゴニストの最終投与の72日後までIgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大に対して効果的に保護したことを実証する。総IgEレベルのアレルゲン誘発性増大における低下は、抗BLyS抗体の最終投与に続いてマウスがOVAでさらに8回チャレンジされても観察された。
【０３３７】
図4Aに示すとおり総IgEは、予測されたとおりPBSで感作及びチャレンジしたマウス(平均IgEレベル=0ng/ml)及び無処置のマウス(naive)(平均IgEレベル=0ng/ml)では検出されなかった。
【０３３８】
フローサイトメトリー
実施例4に記載のとおり、CD45R/B220+細胞をフローサイトメトリーによって検出した。B220+B細胞の脾臓(図4B)及び血液(図4C)における百分率は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウス(Isotype)、PBSで感作及びチャレンジしたマウス(PBS)並びに無処置マウス(naive)と比較して、10F4で処置したマウス(10F4)において顕著に低下していた。これらの結果は、抗BLyS mAb 10F4での処置がin vivoでのB細胞の低下を導いたことを確認する。
【０３３９】
肺組織診断
肺を実施例4に記載のとおり組織診断によって分析した。図9に示すとおり、粘液蓄積及び細胞浸潤は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウス(Isotype)と比較して10F4で処置したマウス(10F4)において顕著に低下していた。これらのデータは、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストでの反復処置が肺での粘液蓄積、粘液含有細胞又は肺での免疫細胞の通常の細胞浸潤におけるアレルゲン誘発性増大をBLySアンタゴニストの最終投与の72日後まで抑制したことを実証する。
【０３４０】
本実施例において示された実験の結果は、喘息ネズミモデルでの中和抗BLySモノクローナル抗体(mAb)の反復治療的投与が総IgEレベル、粘液蓄積及び肺における細胞浸潤を中和抗BLyS mAbの最終投与後72日間低下させたことを実証する。本実施例において示された実験の結果は、抗BLyS mAbなどのBLySアンタゴニストの使用が、喘息などの肺のアレルギー性又は炎症性症状の治療、予防及び/又は改善のための潜在的治療であることを実証する。さらに本実施例において示された実験の結果は、中和抗BLySモノクローナル抗体(mAb)の反復治療的投与が、アレルゲン誘発性肺炎症の発症を顕著に遅延させ、したがって肺の慢性アレルギー性又は炎症性症状の治療又は予防のための潜在的治療であることを実証する。
【実施例７】
【０３４１】
本実施例は、in vivoでBリンパ球刺激因子(BLyS)タンパク質の中和が、喘息のネズミモデルにおいて投与後104日目まで総IgEレベルの低下に持続的効果を有することを実証する。
【０３４２】
オボアルブミン感作及びチャレンジ
メスBALB/cマウス(8-10週齢)をオボアルブミン(OVA)(Sigma-Aldrich)20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作した。マウスをPBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによって33、35、37、39、47、49、51、53、61、63、65、67、120、122、124、126、152、154、156及び158日目にチャレンジした。マウスは、最後のオボアルブミンチャレンジ後の159日目に屠殺した。
【０３４３】
OVAチャレンジマウスにおける10F4処置
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストが慢性肺炎症を長期間予防、治療又は改善する能力を評価するために、マウスを100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)でi.p.注射によって34及び41日目に(2X 10F4)又は34、41、48及び55日目に(4X 10F4)処置した。対照マウスは無処置のままとした(No Rx)。
【０３４４】
総IgE ELISA
血清IgEを実施例4に記載のとおりBD Biosciences Mouse OptEIA Total IgE ELISA Kitを使用して検出した。図5Aに示すとおり総IgEレベルは、無処置マウス(No Rx)(平均IgEレベル=8697ng/ml)及び10F4で2回処置したマウス(2X 10F4)(平均IgEレベル=9534ng/ml)、と比較して、10F4で4回処置したマウス(4X 10F4) (平均IgEレベル=4439ng/ml)において顕著に低下していた。驚くべきことにこれらのデータは、BLySアンタゴニストでの処置が、最終投与後104日目までIgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大に対して効果的に保護したことを実証する。10F4で4回処置したマウス(4X 10F4)での総IgEレベルのアレルゲン誘発性増大における低下は、抗BLyS抗体の最終投与に続いてマウスがOVAでさらに12回チャレンジされても観察された。
【０３４５】
フローサイトメトリー
実施例4に記載のとおり、CD45R/B220+細胞をフローサイトメトリーによって検出した。B220+B細胞の脾臓における百分率を各処置群について図5Bに示し、B220+B細胞の血液における百分率を各処置群について図5Cに示す。既に報告されたとおり、10F4のin vivo半減期は約2週間である(Schoz et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2008 October 7;105(40):15517-15522を参照されたい)。したがって10F4での最終処置後100日を超えた後では、10F4で2回又は4回処置したマウスにおいてたとえあってもわずかな10F4抗体だけが活性であるはずである。図5B及び5Cに示すとおり、10F4で2回又は4回処置したマウスでのB220+B細胞レベルは159日目までに正常に戻っており、これらのマウスにおいてたとえあってもわずかな10F4抗体だけが活性であるという仮説と一致している。付加的にB細胞の10F4処置以前のレベルへの回復は、B細胞の完全な再構成がなされたという証拠も提供する。驚くべきことに図5Aに示すとおり、10F4で4回(4x 10F4)処置したマウスは、無処置マウスと比較して159日目まで総IgEレベルにおける顕著な低下を維持した。
【０３４６】
本実施例において示された実験の結果は、in vivoでのBリンパ球刺激因子(BLyS)タンパク質中和が慢性肺炎症の予防、治療又は改善において持続的効果を有することを実証する。詳細には、喘息のネズミモデルでの中和抗BLyS mAbの反復投与は、10F4で4回処置したマウスにおいて投与後104日目まで総IgEレベルを顕著に低下させた。本実施例において示された実験の結果は、抗BLyS mAbなどのBLySアンタゴニスト使用が、喘息などの肺のアレルギー性又は炎症性症状の治療、予防及び/又は改善のための潜在的治療であることを実証する。さらに本実施例において示された実験の結果は、中和抗BLySモノクローナル抗体(mAb)の反復治療的投与が、アレルゲン誘発性肺炎症の発症を顕著に遅延させ、したがって肺の慢性アレルギー性又は炎症性症状の治療又は予防のための潜在的治療であることを実証する。
【実施例８】
【０３４７】
本実施例は、in vivoでBリンパ球刺激因子(BLyS)タンパク質中和が、デキサメタゾン又は抗IL-13抗体と同様に効果的に肺のアレルゲン誘発性アレルギー性又は炎症性症状を予防、改善及び/又は治療できることを実証する。
【０３４８】
IL-13は、多数の細胞型から、しかしアレルギー性炎症及び疾患の重要なメディエーターである2型ヘルパーT(Th2)細胞から特に分泌されるサイトカインである。IL-13は、全てが気管閉塞に寄与する気道過敏症、杯状細胞異形成及び粘液分泌過多を含むアレルギー性肺疾患の多数の特性を誘導する。IL-4は、これらの生理学的変化に寄与するがIL-13より重要ではない。IL-13は、肺へのアレルギー性エフェクター細胞の動員のために必要であるケモカインの分泌も誘導する。
【０３４９】
オボアルブミン感作及びチャレンジ
メスBALB/cマウス(8-10週齢)をオボアルブミン(OVA)(Sigma-Aldrich)20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作した。33日目に開始して4日間1日おきにマウスをPBS中の10mg/mlオボアルブミンを40分間噴霧することによってチャレンジした(すなわちマウスを33、35、37及び39日目にチャレンジした)。マウスは、最後のオボアルブミンチャレンジ後40日目に屠殺した。対照マウスはPBSで感作及びチャレンジした又は無処置のまま(naive)とし、40日目に屠殺した。屠殺において、血液、肺、気管支肺胞洗浄(BAL)液及び脾臓を動物から取り出した。付加的に血液は遠心分離し、血清を取り出した。
【０３５０】
OVA感作マウスにおける10F4、抗IL-13、抗IgE及びデキサメタゾンでの処置
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストが肺炎症の発症を予防する能力を評価するために、OVA感作マウスの一群をOVAでのチャレンジの前、20及び27日目にi.p.注射によって100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置した(10F4予防群)。10F4の効能を他の抗体処置と比較するために、OVA感作マウスの一群をOVAでのチャレンジの前、20及び27日目にi.p.注射によって100μgの抗IL-13抗体(R&D Systems;カタログ番号MAB413)で処置した(IL-13予防群)。対照として、OVA感作マウスの一群をOVAでのチャレンジの前、20及び27日目にi.p.注射によって100μgのアイソタイプ対照抗体(精製アメリカンハムスターIgG1(クローンG235-2356;BD Biosciences))で処置した(アイソタイプ対照予防群)。
【０３５１】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストが肺炎症を予防、改善又は治療する能力を評価するために、OVA感作マウスの一群を34日目(すなわちOVAチャレンジ中)にi.p.注射によって100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置した(10F4治療群)。10F4の効能を他の抗体処置と比較するために、OVA感作マウスの一群を34日目(すなわちOVAチャレンジ中)にi.p.注射によって100μgの抗IL-13抗体(R&D Systems;カタログ番号MAB413)で処置した(IL-13治療群)。対照として、OVA感作マウスの一群を34日目(すなわちOVAチャレンジ中)にi.p.注射によって100μgの抗IgE抗体(BD Pharmingen、カタログ番号553416)で処置し(IgE治療群)、OVA感作マウスの一群を34日目にi.p.注射によって100μgのアイソタイプ対照抗体(精製アメリカンハムスターIgG1(クローンG235-2356;BD Biosciences))で処置した(アイソタイプ対照治療群)。
【０３５２】
10F4の効能をグルココルチコイドでの古典的処置と比較するために、OVA感作マウスの一群にi.p.注射によって水溶性デキサメタゾン(DEX) (Sigma-Aldrich)(PBS 100μl中の50μg)をOVAチャレンジと異なる日ごとに(すなわちデキサメタゾンは34、36及び38日目に投与した)与えた。
【０３５３】
マウスのPBS及びnaive群は無処置のままとした。
【０３５４】
全てのマウスを40日目に屠殺した。
【０３５５】
図17に示すとおり、予測されたとおり10F4予防群(10F4 Pro)又は10F4治療群(10F4 Ther)において血清BLySレベルにおける顕著な低下があった。残りの処置計画は、図17に示すとおり循環Bリンパ球刺激因子レベルへのさまざまな効果を示した。
【０３５６】
総IgE ELISA
血清IgEをHuman Genome Sciences,Inc.(Rockville,MD)によって開発されたtotal IgE ELISAを使用して検出した。予測されたとおり、総IgEレベルは、PBSで感作及びチャレンジしたマウス並びに無処置(naive)マウスと比較して、OVAで感作及びチャレンジし予防的(Iso Pro)に又は治療的(Iso Ther)にアイソタイプ対照抗体で処置したマウスにおいて顕著に上昇していた(図16A-B)。
【０３５７】
アイソタイプ対照マウスにおいて観察された総IgEレベルでのアレルゲン誘発性増大は、34日目に10F4(10F4 Ther)又は抗IL-13(IL-13 Ther)で治療的に処置したマウス及びデキサメタゾン処置したマウス(Dex)において顕著に低下していた(図16A-B)。これらのデータは、BLySアンタゴニストの単一用量(治療群)が6日以内の総IgEレベルのアレルゲン誘発性増大を低下させることにおいてデキサメタゾン又は抗IL-13抗体と同様に効果的であったことを実証する。さらにこれらのデータは、BLySアンタゴニストが総IgEレベルのアレルゲン誘発性増大を低下させることにおいて古典的副腎皮質ステロイド処置又はIL-13アンタゴニストと同様に効果的であることを実証する。
【０３５８】
総IgEレベルは、OVAチャレンジの前に抗IL-13で予防的に処置したマウス(IL-13 Pro)における総IgEレベルでの中程度の低下と比較して、OVAチャレンジの前に10F4で予防的に処置したマウス(10F4 Pro)において顕著に低下していた(図16A)。これらのデータは、アレルゲンチャレンジの前のBLySアンタゴニストでの処置が、IL-13アンタゴニストでの処置と同程度に又はより良く、総IgEレベルのアレルゲン誘発性増大を予防したことを実証する。
【０３５９】
予測されたとおりIgEは、抗IgE抗体で治療的に処置したマウス(IgE Ther)では検出されなかった(図16B)。
【０３６０】
OVA特異的IgE ELISA
OVA特異的血清IgEをMD Bioproducts OVA-IgE ELISA kit(カタログ番号M036005)を製造者のプロトコールに従って使用して検出した。
【０３６１】
予測されたとおり、OVA肺特異的IgEレベルは、PBSで感作及びチャレンジしたマウス及び無処置(naive)マウスと比較して、OVA感作及びチャレンジし、予防的(Iso Pro)又は治療的(Iso Ther)にアイソタイプ対照抗体で処置したマウスにおいて顕著に上昇していた(図21A-B)。
【０３６２】
アイソタイプ対照マウスにおいて観察されたOVA肺特異的IgEレベルでのアレルゲン誘発性増大は、抗IL-13抗体で34日目に治療的に処置したマウス(IL-13 Ther)及びデキサメタゾン処置マウス(Dex)でのOVA肺特異的IgEレベルの中程度の低下と比較して、10F4(10F4 Ther)又は抗IgE抗体(抗IgE Ther)で34日目に治療的に処置したマウスにおいて顕著に低下していた(図21B)。これらのデータは、BLySアンタゴニストの単一用量(治療群)が6日以内でのOVA肺特異的IgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大の低下において抗IgE抗体と同様に効果的であったことを実証する。さらにこれらのデータは、BLySアンタゴニストがOVA肺特異的IgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大を低下させることにおいて古典的副腎皮質ステロイド処置又はIL-13アンタゴニストより効果的であることを実証する。
【０３６３】
OVA肺特異的IgEレベルは、OVAチャレンジの前に抗IL-13で予防的に処置したマウス(IL-13 Pro)及びデキサメタゾン処置マウス(Dex)におけるOVA肺特異的IgEレベルと比較して、OVAチャレンジの前に10F4で予防的に処置したマウス(10F4 Pro)において顕著に低下していた(図21A)。これらのデータは、アレルゲンチャレンジ前のBLySアンタゴニストでの処置が、OVA肺特異的IgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大を予防したことを実証する。これらのデータは、アレルゲンチャレンジ前のIL-13アンタゴニストでの処置が、OVA肺特異的IgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大に効果を有さなかったことを実証する。
【０３６４】
肺組織診断
肺を実施例4に記載のとおり組織診断によって分析した。図11及び22に示すとおり、粘液蓄積及び細胞浸潤は、34日目にアイソタイプ対照抗体(アイソタイプ対照治療的)又は抗IgE抗体(抗IgE治療的)で処置したマウスと比較して、34日目に10F4(10F4治療的)で又は抗IL-13抗体(抗IL-13治療的)で処置したマウスにおいて顕著に低下していた。これらのデータは、BLySアンタゴニストでの処置(治療群)が粘液蓄積、粘液含有細胞又は肺での免疫細胞の通常の細胞浸潤におけるアレルゲン誘発性増大を抑制することにおいて抗IL-13抗体での治療と同様に効果的であったことを実証する。さらにこれらのデータは、BLySアンタゴニストが粘液蓄積、粘液含有細胞又は肺での免疫細胞の通常の細胞浸潤におけるアレルゲン誘発性増大を抑制することにおいてIgEアンタゴニストより効果的であることを実証する。
【０３６５】
驚くべきことに粘液蓄積及び細胞浸潤は、OVAチャレンジの前にアイソタイプ対照抗体(アイソタイプ対照予防的)(図12を参照されたい)又は抗IL-13抗体(抗IL-13予防的)(図23を参照されたい)で処置したマウスと比較して、OVAチャレンジの前に10F4(10F4予防的)(図12を参照されたい)で処置したマウスにおいて顕著に低下していた。これらのデータは、アレルゲンチャレンジの前のBLySアンタゴニストでの処置が粘液蓄積、粘液含有細胞又は肺での免疫細胞の通常の細胞浸潤におけるアレルゲン誘発性増大を予防したことを実証する。
【０３６６】
付加的に粘液蓄積及び細胞浸潤は、デキサメタゾンで処置したマウス(図23を参照されたい)と比較して、34日目に10F4で処置したマウス(10F4治療的)(図11を参照されたい)及びOVAチャレンジの前に10F4(10F4予防的)(図12を参照されたい)で処置したマウスにおいて低下していた。これらのデータは、BLySアンタゴニストでの処置が粘液蓄積、粘液含有細胞又は肺での免疫細胞の通常の細胞浸潤におけるアレルゲン誘発性増大を予防又は抑制することにおいて、古典的副腎皮質ステロイド処置と同様に効果的であったことを実証する。
【０３６７】
IL-13 ELISA
IL-13レベルをIL-13 ELISA (eBioscience、カタログ番号88-7137-22)を製造者のプロトコールに従って使用して気管支肺胞洗浄(BAL)液中で検出した。
【０３６８】
図18に示すとおり、10F4で予防的に処置した動物(10F4-pro)、アイソタイプ対照抗体で治療的及び予防的に処置した動物(それぞれIso Pro及びIso Ther)又は抗IL-13抗体で治療的に処置した動物(IL-13-ther)と比較して、10F4で治療的に処置した動物(10F4 ther)由来のBAL液中に検出されたIL-13レベルはわずかに減少していた。付加的にIL-13レベルは、全ての抗体処置群と比較してデキサメタゾンで処置したマウス(Dex)において低下していた(図18)。
【０３６９】
本実施例において示された実験の結果は、in vivoでのBLyS中和は、肺のアレルゲン誘発性アレルギー性又は炎症性症状を、少なくともデキサメタゾン又は抗IL-13抗体と同様に効果的に予防、改善及び/又は治療できることを実証する。詳細には、喘息ネズミモデルでの中和抗BLySモノクローナル抗体(mAb)の投与は、肺炎症を誘発することが周知であるアレルゲンへの暴露の前又は後に投与した場合に、抗IL-13抗体と同程度又はより良く総IgEレベル及びOVA特異的IgEレベルを低下させた。付加的に本実施例において示された実験の結果は、抗BLyS処置は、気道炎症に常に関与するIL-13などの肺における特定のサイトカインの減少を導いたことを実証する。
【実施例９】
【０３７０】
本実施例は、Bリンパ球刺激因子(BLyS)アンタゴニストのアレルゲンチャレンジ開始時(すなわち最初のアレルゲンチャレンジの1又は3日後)の投与が、肺のアレルゲン誘発性アレルギー性又は炎症性症状を予防、改善及び/又は治療できることを実証する。
【０３７１】
オボアルブミン感作及びチャレンジ
メスBALB/cマウス(8-10週齢)をオボアルブミン(OVA)(Sigma-Aldrich)20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作した。33日目に開始して4日間1日おきにマウスをPBS中の10mg/mlオボアルブミンを40分間噴霧することによってチャレンジした(すなわちマウスを33、35、37及び39日目にチャレンジした)。
【０３７２】
OVA感作マウスにおける10F4処置
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストの投与がアレルゲンチャレンジ中に肺炎症を予防、改善又は治療することにおいて効果的であるかどうかを評価するために、OVA感作マウスを34日目(d34 10F4群)、36日目(d36 10F4群)又は38日目(d38 10F4群)(すなわちOVAチャレンジ中)にi.p.注射によって100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)で処置した。対照として、OVA感作マウスを34日目、36日目又は38日目のいずれかにi.p.注射によって100μgのアイソタイプ対照抗体(精製アメリカンハムスターIgG1(クローンG235-2356;BD Biosciences))で処置した(アイソタイプ群)。
【０３７３】
全てのマウスを最後のオボアルブミンチャレンジ後、40日目に屠殺した。屠殺において、血液、肺、気管支肺胞洗浄(BAL)液及び脾臓を動物から取り出した。血液は遠心分離し、血清を取り出した。
【０３７４】
総IgE ELISA
血清IgEを実施例4に記載のとおりBD Biosciences Mouse OptEIA Total IgE ELISA Kitを使用して検出した。予測されたとおり、総IgEレベルは、アイソタイプ対照抗体(Isotype)で処置したマウスにおいて顕著に上昇していた(図20A)。対照的に、総IgEレベルはOVAチャレンジの34日目(d34 10F4)又は36日目(d36 10F4)に10F4で処置したマウスにおいて顕著に低下していた(図20A)。OVAチャレンジの38日目に10F4で処置したマウス(d38 10F4)における総IgEレベルは、アイソタイプ対照抗体で処置したマウス(Isotype)における総IgEレベルと同様であった(図20A)。これらのデータは、アレルゲンチャレンジ開始時(すなわち最初のアレルゲンチャレンジの1又は3日後)のBLySアンタゴニストの投与が総IgEレベルのアレルゲン誘発性増大を効果的に低下させたことを実証する。
【０３７５】
フローサイトメトリー
実施例4に記載のとおり、CD45R/B220+細胞をフローサイトメトリーによって検出した。B220+B細胞の脾臓における百分率を各処置群について図20Bに示し、B220+B細胞の肺における百分率を各処置群について図20Cに示す。図20Bに示すとおり、B220+B細胞の脾臓における百分率は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウス(Isotype)及びOVAチャレンジの38日目に10F4で処置したマウス(D38 10F4)と比較して、OVAチャレンジの34日目(D34 10F4)及び36日目(D36 10F4)に10F4で処置したマウスにおいて顕著に低下していた。図20Cに示すとおり、B220+B細胞の肺における百分率は、アイソタイプ対照抗体で処置したマウス(Isotype)と比較して、OVAチャレンジの34日目(D34 10F4)、36日目(D36 10F4)及び38日目(D38 10F4)に10F4で処置したマウスにおいて顕著に低下していた。これらの結果は、アレルゲンチャレンジ開始中(すなわち最初のアレルゲンチャレンジの1又は3日後)の抗BLyS mAb 10F4での処置がin vivoでB細胞の顕著な低下を導いたことを確認する。
【０３７６】
本実施例において示された実験の結果は、アレルゲンチャレンジ開始時のin vivoでのBLyS中和は、肺のアレルゲン誘発性アレルギー性又は炎症性症状を、予防、改善及び/又は治療できることを実証する。詳細には、喘息のネズミモデルにおける最初のアレルゲンチャレンジの1又は3日後の中和抗BLyS mAbの投与は、総血清IgEレベル及び肺及び脾臓中のB細胞におけるアレルゲン誘発性増大を顕著に低下させた。
【実施例１０】
【０３７７】
本実施例は、Bリンパ球刺激因子(BLyS)アンタゴニストの投与が、肺の慢性アレルゲン誘発性アレルギー性又は炎症性症状を予防、改善及び/又は治療できることを実証する。
【０３７８】
オボアルブミン感作及びチャレンジ
メスBALB/cマウス(8-10週齢)をオボアルブミン(OVA)(Sigma-Aldrich)20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作した。マウスを、PBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによって33、35、37、39、54、56、58、60、73、75、77、79、93、95、97及び99日目にチャレンジした。マウスは、最後のオボアルブミンチャレンジ後、100日目に屠殺した。対照マウスはPBSで感作及びチャレンジし、100日目に屠殺した。屠殺において、血液、肺、気管支肺胞洗浄(BAL)液及び脾臓を動物から取り出した。付加的に血液は遠心分離し、血清を取り出した。
【０３７９】
OVAチャレンジマウスにおける10F4処置
抗原での反復チャレンジ後にBリンパ球刺激因子アンタゴニストが慢性肺炎症を予防、治療又は改善する能力を評価するために、マウスを、100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)でi.p.注射によって34及び41日目(d34/41 10F4)(すなわち4回目のアレルゲンチャレンジ後)、61及び68日目(d61/68 10F4)(すなわち8回目のアレルゲンチャレンジ後)又は80及び87日目(D80/87 10F4)(すなわち12回目のアレルゲンチャレンジ後)のいずれかに処置した。対照としてOVA感作マウスは100μgのアイソタイプ対照抗体(精製アメリカンハムスターIgG1(クローンG235-2356;BD Biosciences))でi.p.注射によって34及び41日目(d34/41 Iso)(すなわち4回目のアレルゲンチャレンジ後)、61及び68日目(d61/68 Iso)(すなわち8回目のアレルゲンチャレンジ後)又は80及び87日目(D80/87 Iso)(すなわち12回目のアレルゲンチャレンジ後)のいずれかに処置した。付加的対照として、マウスの一群を無処置のままとした(No Rx)。
【０３８０】
総IgE ELISA
血清中及びBAL液中の総IgEを実施例4に記載のとおりBD Biosciences Mouse OptEIA Total IgE ELISA Kitを使用して検出した。図24Aに示すとおり、総血清IgEレベルは、34及び41日目に(d34/41 10F4)又は61及び68日目(d61/68 10F4)に10F4で処置したマウスと比較して、80及び87日目に10F4で処置したマウス(d80/87 10F4)において顕著に低下していた。予測されたとおり、PBSで感作及びチャレンジしたマウス(PBS)において低いレベルの総血清IgEが検出された(図24A)。
【０３８１】
図24Bに示すとおり総BAL液IgEレベルは、無処置マウス(No Rx)と比較して、61及び68日目(d61/68 10F4)並びに80及び87日目(d80/87 10F4)に10F4で処置したマウスにおいて顕著に低下していた。付加的に無処置マウス(No Rx)と比較して総BAL液IgEレベルの中程度の低下が、34及び41日目(d34/41 10F4)に10F4で処置したマウスにおいて観察された(図24B)。
【０３８２】
これらのデータは、BLySアンタゴニストでの処置が、反復的抗原チャレンジ後に投与した場合に血清及びBAL液中のIgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大を効果的に低下させたことを実証する。
【０３８３】
フローサイトメトリー
実施例4に記載のとおり、肺におけるCD45R/B220+細胞をフローサイトメトリーによって検出した。図25に示すとおり、B220+B細胞の肺における百分率は、34及び41日目に(d34/41 10F4)、61及び68日目(d61/68 10F4)に並びに80及び87日目(d80/87 10F4)に10F4で処置したマウスにおいて、対応するアイソタイプ対照処置マウス(それぞれd34/41 Iso、d61/68 Iso及びd80/87 Iso)と比較して顕著に低下していた。これらの結果は、反復的アレルゲンチャレンジ後の抗BLyS mAb 10F4での処置が、in vivoでのB細胞の顕著な低下を導いたことを確認する。これらのデータは、B細胞の低下におけるBLySアンタゴニストでの処置の効果が、続く反復的アレルゲンチャレンジ後にさらなる処置を伴わずに維持されることも実証する。
【０３８４】
IL-13 ELISA
IL-13レベルをIL-13 ELISA (eBioscience、カタログ番号88-7137-22)を製造者のプロトコールに従って使用してBAL液中で検出した。図26Aに示すとおり、IL-13レベルは、無処置マウス(no Rx)と比較して、34及び41日目(d34/41 10F4 Rx)に、61及び68日目(d61/68 10F4 Rx)に並びに80及び87日目(d80/87 10F4 Rx)に10F4で処置したマウスにおいて顕著に低下していた。これらのデータは、BLySアンタゴニストでの処置が、反復的抗原チャレンジ後に投与した場合にBAL液中のIL-13レベルにおけるアレルゲン誘発性増大を効果的に低下させたことを実証する。
【０３８５】
IL-4、IL-5及びTNF-α  ELISA
IL-4、IL-5及びTNF-αレベルをTH1/TH2 ELISA kit(MESO Scale、カタログ番号K15013C-1)を製造者のプロトコールに従って使用してBAL液中で検出した。
【０３８６】
IL-4レベルは、無処置マウス(no Rx)並びに34及び41日目(d34/41 10F4 Rx)並びに61及び68日目(d61/68 10F4 Rx)に10F4で処置したマウスと比較して、80及び87日目(d80/87 10F4 Rx)に10F4で処置したマウスにおいて顕著に低下していた(図26B)。IL-4レベルは、無処置マウス(no Rx)並びに34及び41日目(d34/41 10F4 Rx)に10F4で処置したマウスと比較して、80及び87日目(d80/87 10F4 Rx)に10F4で処置したマウスにおいて顕著に低下していた(図26C)。IL-4レベルの中程度の低下が、無処置マウスと比較して、61及び68日目に10F4で処置したマウス(d61/68 10F4 Rx)において観察された(図26C)。同様にTNF-αレベルは、無処置マウス(no Rx)並びに34及び41日目(d34/41 10F4 Rx)に10F4で処置したマウスと比較して、80及び87日目(d80/87 10F4 Rx)に10F4で処置したマウスにおいて顕著に低下しており、TNF-αレベルの中程度の低下が無処置マウスと比較して、61及び68日目(d61/68 10F4 Rx)に10F4で処置したマウスにおいて観察された(図26D)。予測されたとおり、低レベルのIL-4、IL-5及びTNF-αがPBSで感作及びチャレンジしたマウス(PBS)において検出された(図26B-D)。
【０３８７】
これらのデータは、BLySアンタゴニストでの処置が、反復的抗原チャレンジ後に投与した場合にBAL液中のサイトカインIL-4、IL-5及びTNF-αにおけるアレルゲン誘発性増大を効果的に低下させたことを実証する。
【０３８８】
肺組織診断
肺を実施例4に記載のとおり組織診断によって分析した。図27に示すとおり、粘液蓄積及び細胞浸潤は、無処置マウス(No Rx)並びに34及び41日目に10F4で処置したマウス(d34/41 10F4 Rx)と比較して、80及び87日目に10F4で処置したマウス(d80/87 10F4 Rx)において顕著に低下していた。付加的に粘液蓄積及び細胞浸潤における中程度の低下が無処置マウス(No Rx)と比較して、61及び68日目に10F4で処置したマウス(d61/68 10F4 Rx)において観察された。これらのデータは、反復的アレルゲンチャレンジ後のBリンパ球刺激因子アンタゴニストでの処置が、肺での粘液蓄積、粘液含有細胞又は肺での免疫細胞の通常の細胞浸潤におけるアレルゲン誘発性増大を抑制したことを実証する。
【０３８９】
本実施例において示された実験の結果は、反復的抗原チャレンジ後に投与した場合にBLySアンタゴニストでの処置が、(1)血清及びBAL液中のIgEレベル、(2)肺でのB細胞レベル、(3)BAL液中のサイトカイン並びに(4)肺での粘液沈着及び細胞浸潤、におけるアレルゲン増大を効果的に低下させたことを実証する。BLySアンタゴニストが最終抗原チャレンジ(すなわち13-16回目)の前に投与されたことを考慮すると、これらのデータはBLySアンタゴニストでの処置が、(1)血清及びBAL液中のIgEレベル、(2)肺でのB細胞レベル、(3)BAL液中のサイトカイン並びに(4)肺での粘液沈着及び細胞浸潤におけるアレルゲン誘発性増大に対して効果的に保護したことも実証する。これらのデータは、BLySアンタゴニストでの処置の効果が、さらなる処置を伴わずに続く反復的アレルゲンチャレンジ後に維持されることも実証する。したがって本実施例において示された実験の結果は、反復的抗原チャレンジ後のin vivo BLyS中和が肺のアレルゲン誘発性アレルギー性又は炎症性症状を予防、改善及び/又は治療できることを実証する。
【実施例１１】
【０３９０】
本実施例は、in vivo Bリンパ球刺激因子(BLyS)タンパク質中和が、投与後201日間まで喘息のネズミモデルにおいて総IgEレベルを低下させる持続的効果を有することを実証する。
【０３９１】
オボアルブミン感作及びチャレンジ
メスBALB/cマウス(8-10週齢)をオボアルブミン(OVA)(Sigma-Aldrich)20μg(PBS中200μg/mlの0.1ml)の腹腔内(i.p.)注射で1から19日目まで1日おきに感作した。マウスを、PBS中の10mg/ml OVAを40分間噴霧することによって33、35、37、39、47、49、51、53、61、63、65、67、120、122、124、126、152、154、156、158、249、251、253及び255日目にチャレンジした。対照マウスは無処置のままとした(naive)。マウスは、実験の経過を通じて40、54、68、127、159及び256日目に屠殺した。
【０３９２】
OVAチャレンジマウスにおける10F4処置
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストが慢性肺炎症を予防、治療又は改善する長期的能力を評価するために、マウスを、100μgのモノクローナルIgG1ハムスター抗マウスBLyS(クローン10F4)でi.p.注射によって34日目(10F4)、34及び41日目(2x 10F4)又は34、41、48及び55日目(4x 10F4)に処置した。対照マウスは無処置のままとした(No Rx又はUnrx)。
【０３９３】
総IgE ELISA
血清IgEを実施例4に記載のとおりBD Biosciences Mouse OptEIA Total IgE ELISA Kitを使用して(図28)又は実施例8に記載のとおりHuman Genome Sciences,Inc.(Rockville,MD)によって開発されたtotal IgE ELISAを使用して検出した(図29)。Human Genome Sciences,Inc.によって開発されたtotal IgE ELISAは、BD BiosciencesからのMouse OptEIA Total IgE ELISA Kitとは異なるプロトコール及び異なる標準を利用する。したがって図28及び29に表されるデータの結果は、二つの異なるELISAが図28及び29にそれぞれ表されるデータを作製するために利用されたことから直接比較できない。
【０３９４】
40日目、54日目、68日目、127日目、159日目又は256日目に屠殺した、naiveマウス並びにOVA感作及びチャレンジした無処置マウス(10F4を投与されなかったマウス)における循環総血清IgEのレベルを図28に示す。無処置マウスにおいて総血清IgEのレベルは、naiveマウスと比較して実験経過全体を通じて増加していた(図28)。
【０３９５】
図29に示すとおり血清IgEレベルは、10F4で4回(4x 10F4)処置し、次いで54日目、68日目、127日目又は256日目に屠殺したマウスにおいて、対応する無処置OVA感作及びチャレンジマウス(No Rx)と比較して顕著に低下していた。驚くべきことに血清IgEレベルにおける顕著な低下が対応する無処置OVA感作及びチャレンジマウス(No Rx)と比較して、10F4の最終投与の13日後、72日後及び201日後(それぞれ68日目、127日目及び256日目)に屠殺したマウスにおいて観察された。
【０３９６】
これらのデータは、BLySアンタゴニストでの処置が、最終投与の201日後までIgEレベルにおけるアレルゲン誘発性増大に対して効果的に保護したことを実証する。付加的にこれらのデータは、総IgEレベルのアレルゲン誘発性増大が、抗BLyS抗体の最終投与に続いてマウスをOVAでさらに16回までチャレンジしても10F4で4回処置したマウス(4X 10F4)においては顕著に低下していたことを実証する。
【０３９７】
肺浸潤分析
細胞浸潤を実施例4に記載のとおり68日目に屠殺したマウス由来の肺試料において定量した。naive対照群(naive)はn=3を有し、無処置対照群(Unrx)はn=6を有し、34及び41日目に10F4で処置した群(10F4 2x)はn=6を有し、34、41、48及び55日目に10F4で処置した群(4x 10F4)はn=5を有した。分析した各肺の総面積は64 ± 4.8 mm2 (平均±SEM)であった。統計解析のためにダネットのポストテストを伴うANOVAを使用した。
【０３９８】
図30に示すとおり肺における細胞浸潤は、68日目に屠殺したnaiveマウス(naive)と比較して、68日目に屠殺した無処置OVA感作及びチャレンジマウス(Unrx)において顕著に上昇していた。無処置マウスにおいて観察された細胞浸潤のアレルゲン誘発性増大は、10F4で34及び41日目に処置し、68日目に屠殺したマウス(10F4 2x)並びに10F4で34、41、48及び55日目に処置し、68日目に屠殺したマウス(10F4 4x)において顕著に低下していた(図30)。*は、無処置マウス(Unrx)と比較したp値<0.05を表す。
【０３９９】
これらのデータは、BLySアンタゴニストの4回用量の投与が最終投与の13日後まで肺における細胞浸潤のアレルゲン誘発性増大を効果的に低下させたことを実証する。
【０４００】
肺組織診断
肺を実施例4に記載のとおり組織診断によって分析した。図30に示す肺浸潤分析と一致して粘液蓄積及び細胞浸潤は、34、41、48及び55日目に10F4で処置し54日目(10F4 D54)又は68日目(10F4 D68)に屠殺したマウスにおいて、対応する無処置OVA感作及びチャレンジマウス(それぞれNo Rx D54及びNo Rx D68)と比較して、顕著に低下していた(図31)。しかし、34、41、48及び55日目に10F4で処置し127日目(10F4 D127)又は159日目(10F4 D159)に屠殺したマウスにおいては、対応する無処置OVA感作及びチャレンジマウス(それぞれNo Rx D127及びNo Rx D159)と比較して、粘液蓄積及び細胞浸潤における顕著な減少は観察されなかった(図32)。これらのデータは、4回用量のBLySアンタゴニストの投与が、最終投与の13日後まで肺での粘液蓄積、粘液含有細胞又は肺での免疫細胞の通常の細胞浸潤におけるアレルゲン誘発性増大を抑制したことを実証する。
【０４０１】
B細胞再構成
脾臓中のCD45R/B220+細胞を実施例4に記載のとおりフローサイトメトリーによって検出し、正常化B細胞の百分率を算出した。図33に示すとおり、完全なB細胞再構成が10F4で4回処置したマウスの脾臓において159日目までに観察された。
【０４０２】
本実施例において示された実験の結果は、in vivoでのBLySタンパク質中和が慢性肺炎症の予防、治療又は改善において持続的効果を有することを実証する。詳細には、喘息ネズミモデルでの中和抗BLySモノクローナル抗体(mAb)の反復投与は、10F4で4回処置したマウスにおいて投与後201日目まで総IgEレベルを顕著に低下させた。したがって本実施例において示された実験の結果は、中和抗BLyS mAbの反復治療投与は、最終投与後201日目まで慢性再発性オボアルブミンチャレンジからマウスを保護したことを実証する。本実験において利用された慢性チャレンジモデルは、慢性喘息患者の病態及び血清IgEレベルを再現できる。したがって本実施例において示された実験の結果は、抗BLyS mAbなどのBLySアンタゴニスト使用が、喘息などの肺のアレルギー性又は炎症性症状の治療、予防及び/又は改善のための潜在的治療であることを実証する。
【０４０３】
実施例4から11において示された実験は、抗BLyS mAb(クローン10F4)の潜在的治療としての使用を喘息のネズミモデルにおいて調査した。喘息は、マウスのオボアルブミン(OVA)誘発モデルにおいて感作及びチャレンジによって誘発した。マウスは、OVAで慢性的にチャレンジされ、予防的(OVA感作後だがチャレンジ前)又は治療的(OVA感作後でチャレンジ中)のいずれかで抗BLyS mAbで処置した。実施例4から11において示された実験の結果は、抗BLyS mAbで処置したマウスでは、気管支及び全身性の炎症が顕著に低下していたことを実証する。処置について、循環総IgE及びOVA特異的IgEにおける顕著な低下、並びに粘液産生及び炎症性肺浸潤における著しい低下が観察された。抗BLyS処置は、循環及び脾臓のB細胞の減少を導いただけでなく、気道炎症に常に関与する肺の特定のサイトカインの発現も下方制御した。これらの結果は、抗BLyS抗体又はBLySアンタゴニストでの治療介入が慢性喘息又は肺若しくは呼吸器系の他のアレルギー性若しくは炎症性症状の治療において有用でありうることを示唆する。
【０４０４】
本発明が、前述の記載及び実施例において詳細に記載された以外にも実施されうることは明白である。本発明の多数の改変及び変更は、上の教示に照らして可能であり、したがって添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【０４０５】
本明細書において引用した全ての刊行物(特許、特許出願、学術論文、実験マニュアル、書籍又は他の文書)の開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０４０６】
さらに同封して提出する配列表はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。付加的に次の米国仮特許出願及び米国非仮特許出願並びに国際特許出願のそれぞれの開示全体(明細書、配列表及び図面を含む)は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる:2004年2月11日出願米国仮特許出願第60/543,261号、2004年6月18日出願第60/580,387号、2004年10月12日出願第60/617,191号、2002年4月1日出願第60/368,548号、2001年12月7日出願第60/336,726号、2001年11月16日出願第60/331,478号、2001年10月31日出願第60/330,835号、2001年10月18日出願第60/329,747号、2001年10月17日出願第60/329,508号、2000年8月15日出願第60/225,628号、2000年8月23日出願第60/227,008号、2000年9月22日出願第60/234,338号、2000年10月17日出願第60/240,806号、2000年11月30日出願第60/250,020号、2001年3月6日出願第60/276,248号、2001年5月25日出願第60/293,499号、2001年6月7日出願第60/296,122号、2001年7月13日出願第60/304,809号、1999年3月2日出願第60/122,388号、1999年3月12日出願第60/124,097号、2000年3月26日出願第60/126,599号、1999年4月2日出願第60/127,598号、1999年4月16日出願第60/130,412号、1999年4月23日出願第60/130,696号、1999年4月27日出願第60/131,278号、1999年4月29日出願第60/131,673号、1999年5月28日出願第60/136,784号、1999年6月6日出願第60/142,659号、1999年7月27日出願第60/145,824号、1999年11月24日出願第60/167,239号、1999年12月3日出願第60/168,624号、1999年12月16日出願第60/171,108号、1999年12月23日出願第60/171,626号、2000年1月14日出願第60/176,015号及び1997年1月14日出願第60/036,100号;2003年12月19日出願米国(非仮)特許出願第10/739,042号、2003年12月16日出願第10/735,865号、2002年10月16日出願第10/270,487号、2001年8月14日出願第09/929,493号、2000年6月8日出願第09/588,947号、2000年6月8日出願第09/589,285号、2000年6月8日出願第09/589,286号、2000年6月8日出願第09/589,287号、2000年6月8日出願第09/589,288号、2000年2月22日出願第09/507,968号、1999年2月23日出願第09/255,794号及び1998年1月12日出願第09/005,874号;並びに2001年8月15日出願国際特許出願PCT/US01/25549、2000年2月22日出願PCT/US00/04336、及び1996年10月25日出願PCT/US96/17957。
【図１】
2013530188.tif 000004
【図２】
2013530188.tif 000005
【図３】
2013530188.tif 000006
【図４】
2013530188.tif 000007
【図５】
2013530188.tif 000008
【図６】
2013530188.tif 000009
【図７】
2013530188.tif 000010
【図８】
2013530188.tif 000011
【図９】
2013530188.tif 000012
【図１０】
2013530188.tif 000013
【図１１】
2013530188.tif 000014
【図１２】
2013530188.tif 000015
【図１３】
2013530188.tif 000016
【図１４】
2013530188.tif 000017
【図１５】
2013530188.tif 000018
【図１６】
2013530188.tif 000019
【図１７】
2013530188.tif 000020
【図１８】
2013530188.tif 000021
【図１９】
2013530188.tif 000022
【図２０】
2013530188.tif 000023
【図２１】
2013530188.tif 000024
【図２２】
2013530188.tif 000025
【図２３】
2013530188.tif 000026
【図２４】
2013530188.tif 000027
【図２５】
2013530188.tif 000028
【図２６】
2013530188.tif 000029
【図２７】
2013530188.tif 000030
【図２８】
2013530188.tif 000031
【図２９】
2013530188.tif 000032
【図３０】
2013530188.tif 000033
【図３１】
2013530188.tif 000034
【図３２】
2013530188.tif 000035
【図３３】
2013530188.tif 000036
【配列表】
2013530188000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年2月19日(2013.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
喘息、アレルゲン誘発性呼吸器症状または肺若しくは呼吸器系の他のアレルギー性若しくは炎症性症状を治療、予防及び/又は改善するために用いるBリンパ球刺激因子のアンタゴニスト。
【請求項２】
Bリンパ球刺激因子のアンタゴニストが
(a)TACIのBリンパ球刺激因子結合ドメインを含むタンパク質;
(b)BCMAのBリンパ球刺激因子結合ドメインを含むタンパク質;
(c)BAFF-RのBリンパ球刺激因子結合ドメインを含むタンパク質;
(d)Bリンパ球刺激因子結合ペプチド;
(e)Bリンパ球刺激因子ペプチボディー;
(f)Bリンパ球刺激因子タンパク質変種;
(g)抗Bリンパ球刺激因子抗体;及び
(h)抗Bリンパ球刺激因子受容体抗体
からなる群より選択される、請求項１に記載のBリンパ球刺激因子のアンタゴニスト。
【請求項３】
Bリンパ球刺激因子アンタゴニストが抗Bリンパ球刺激因子抗体である、請求項１または２に記載のBリンパ球刺激因子のアンタゴニスト。
【請求項４】
抗Bリンパ球刺激因子抗体が、配列番号61のアミノ酸残基1〜123を含む第1アミノ酸配列と、配列番号61のアミノ酸残基141〜249を含む第2アミノ酸配列とを含む、請求項１または２に記載のBリンパ球刺激因子のアンタゴニスト。
【請求項５】
抗Bリンパ球刺激因子抗体がベリムマブである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のBリンパ球刺激因子のアンタゴニスト。
【請求項６】
抗Bリンパ球刺激因子抗体が
(a)可溶性Bリンパ球刺激因子タンパク質、
(b)膜結合Bリンパ球刺激因子タンパク質、
(c)配列番号2のアミノ酸残基1〜285のアミノ酸配列、
(d)配列番号2のアミノ酸残基134〜285のアミノ酸配列、
(e)(d)の三量体、及び
(f)配列番号2のポリペプチドの断片のアミノ酸配列であって、断片が少なくとも長さ30アミノ酸であり、B細胞の増殖、分化又は生存を刺激できるアミノ酸配列、
からなる群から選択されるタンパク質に結合する、請求項３〜５のいずれか１項に記載のBリンパ球刺激因子のアンタゴニスト。
【請求項７】
抗Bリンパ球刺激因子抗体が肺又は呼吸器系の喘息若しくはアレルギー性若しくは炎症性の症状の発症より前に最初に投与される、請求項３〜６のいずれか１項に記載のBリンパ球刺激因子のアンタゴニスト。
【請求項８】
Bリンパ球刺激因子のアンタゴニストが静脈注射、皮下注射又は噴霧によって患者に投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のBリンパ球刺激因子のアンタゴニスト。
【請求項９】
Bリンパ球刺激因子のアンタゴニストが1、2、4又は6カ月ごとに1回投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のBリンパ球刺激因子のアンタゴニスト。
【請求項１０】
喘息の又は肺若しくは呼吸器系のアレルギー性若しくは炎症性の症状が、喘鳴、咳嗽、胸部絞扼感、気流閉塞、気管支痙攣、気管支収縮及び息切れからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のBリンパ球刺激因子のアンタゴニスト。
【請求項１１】
Bリンパ球刺激因子のアンタゴニストが炎症性症状を治療、予防及び/又は改善するために用いられ、該炎症性症状が
(a)  アレルゲン誘発性気道過敏症の増進、
(b)  粘液含有細胞、粘液蓄積又は粘液産生の増大、或いは
(c)  肺における細胞浸潤の増大
によって特徴付けられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のBリンパ球刺激因子のアンタゴニスト。
【請求項１２】
Bリンパ球刺激因子のアンタゴニストが、肺の急性又は慢性の炎症、肺炎、肺気腫、炎症性肺傷害、閉塞性細気管支炎、慢性気管支炎、肺サルコイドーシス、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、間質性肺疾患、特発性肺線維症、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、気管支拡張症、肺好酸球増加症、間質性線維症、嚢胞性線維症及び慢性副鼻腔炎からなる群から選択される炎症性症状の治療、予防及び/又は改善のために用いられるものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のBリンパ球刺激因子のアンタゴニスト。
【請求項１３】
Bリンパ球刺激因子のアンタゴニストが、外因性アレルギー性肺胞炎(過敏性肺炎)、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、急性及び慢性好酸球性肺炎、チャーグ・ストラウス症候群並びに特発性好酸球増多症候群からなる群から選択されるアレルギー性症状の治療、予防及び/又は改善のために用いられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のBリンパ球刺激因子のアンタゴニスト。
【請求項１４】
Bリンパ球刺激因子のアンタゴニストが、患者におけるアレルゲン誘発性気道過敏症の治療、予防及び/又は改善のために用いられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のBリンパ球刺激因子のアンタゴニスト。
【請求項１５】
Bリンパ球刺激因子のアンタゴニストが、患者におけるアレルゲンへの耐性を促進するためのものであり、Bリンパ球刺激因子アンタゴニストがアレルゲンへの暴露の前、間又は後に、投与され、それによって、患者における喘息の又は肺若しくは呼吸器系のアレルギー性若しくは炎症性の症状を改善する又は予防し、アレルゲンへの耐性を促進する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のBリンパ球刺激因子のアンタゴニスト。
【国際調査報告】
2013530188.tif 000037
2013530188.tif 000038
2013530188.tif 000039