(57)【要約】本発明は修飾型Ｃペプチドとその利用方法に関する。１つの態様において、修飾型Ｃペプチドは、Ｎ末端に結合した少なくとも１つのＰＥＧ基を含み、インビボで優れた薬物動態と生物学的活性を示すＰＥＧ化Ｃペプチド誘導体を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ−ペプチドのＮ末端に共有結合するＰＥＧ部分を含むＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項２】
前記ＰＥＧ部分が約１０ｋＤａと約８０ｋＤａの間の分子量を持つ請求項１に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項３】
前記ＰＥＧ部分が約２０ｋＤａと約６０ｋＤａの間の分子量を持つ請求項１に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項４】
前記ＰＥＧ部分が約３０ｋＤａと約５０ｋＤａの間の分子量を持つ請求項１に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項５】
前記ＰＥＧ部分が線状ポリマーである請求項１〜４のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項６】
前記ＰＥＧ部分が分枝状ポリマーである請求項１〜４のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項７】
次の構造：
【化１】
2013533217.tif 000083
を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、Ｒ１はアルキル基であり、ｎ１は２０〜８００であり、リンカーは
−Ｘ−、−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ２−、
−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、
−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−、
−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−Ｘ−ＣＯ−Ｘ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、
−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１Ｘ−、
−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−および
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−から選択され、
式中、Ｘはそれぞれ独立して−Ｏ−、−Ｓ−または-ＮＨ−から選択されるか存在せず、ｍ１はそれぞれ独立して０〜５であり、ｍ２はそれぞれ独立して１〜５であり、そして、
式中、前記リンカーがＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合する
請求項５に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項８】
−Ｘ１−（ＣＨ２）ｍ４−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ４−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ３−ＣＯ−および
−Ｘ１−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ２−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ４−ＣＯ−
から選択されるリンカーを含むＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、Ｘ１は−Ｏ−であるか存在せず、Ｘ２は−ＮＨ−であり、ｍ２は１〜５であり、ｍ３は２であり、ｍ４は２〜５である
請求項５に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項９】
構造：
【化２】
2013533217.tif 000084
を有する請求項５に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項１０】
構造：
【化３】
2013533217.tif 000085
を有する請求項５に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項１１】
構造：
【化４】
2013533217.tif 000086
を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、式中、ｎ１が２０〜８００である請求項５に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項１２】
構造：
【化５】
2013533217.tif 000087
を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、式中、ｎが２０〜８００である請求項５に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項１３】
次の構造：
【化６】
2013533217.tif 000088
を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、リンカーはそれぞれ独立して
−Ｘ−、−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ２−、
−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、
−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−、
−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−Ｘ−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−、
−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１Ｘ−、
−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−ＣＨ２）ｍ２−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−および
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−から選択され、
式中、Ｘはそれぞれ独立して−Ｏ−、−Ｓ−または-ＮＨ−から選択されるか存在せず、ｍ１はそれぞれ独立して０〜５であり、ｍ２はそれぞれ独立して１〜５であり、
式中、前記リンカーがＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合し、そして、
式中、Ｒ１はアルキル基または低級アルキル基であり、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００である
請求項６に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項１４】
次の構造：
【化７】
2013533217.tif 000089
を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、Ｒ１はアルキル基または低級アルキル基であり、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００であり、リンカーは
−Ｘ−、−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ２−、
−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−、
−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、
−Ｘ−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、
−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１Ｘ−、
−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−および
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−から選択され、
式中、Ｘはそれぞれ独立して−Ｏ−、−Ｓ−または-ＮＨ−から選択されるか存在せず、ｍ１はそれぞれ独立して０〜５であり、ｍ２はそれぞれ独立して１〜５であり、そして、
式中、前記リンカーがＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合する
請求項６に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項１５】
−Ｘ１−（ＣＨ２）ｍ４−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ４−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ３−ＣＯ−および
−Ｘ１−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ２−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ４−ＣＯ−
から選択されるリンカーを含むＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、Ｘ１は−Ｏ−であるか存在せず、Ｘ２は-ＮＨ−であり、ｍ２は１〜５であり、ｍ３は２であり、ｍ４は１〜５である
請求項１４に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項１６】
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−Ｘ−、
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−（ＣＨ２）ｍ５−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−ＣＯ−および
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ５−ＣＯ−
から選択されるリンカーを含むＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、Ｘは独立して−Ｏ−、−Ｓ−または-ＮＨ−から選択されるか存在せず、Ｘ１は−Ｏ−であるか存在せず、Ｘ２は-ＮＨ−であり、ｍ５はそれぞれ独立して１〜５から選択され、そして、ｎ３はそれぞれ独立して１〜４００から選択される
請求項１４に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項１７】
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−（ＣＨ２）ｍ６−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−ＣＯ−および
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ７−ＣＯ−
から選択されるリンカーを含むＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、Ｘ１は−Ｏ−であるか存在せず、Ｘ２は-ＮＨ−であり、ｍ５は３であり、ｍ６は独立して２または５であり、ｍ７は３であり、そして、ｎ３は１〜４００である
請求項１４に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項１８】
構造：
【化８】
2013533217.tif 000090
を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、Ｒ１はメチル基であり、ｎ１とｎ２が約４００〜５００の範囲内にあり、ＰＥＧ部分が約４０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項１９】
構造：
【化９】
2013533217.tif 000091
を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、Ｒ１はメチル基であり、ｎ１とｎ２が約４００〜５００の範囲内にあり、ＰＥＧ部分が約４０ｋＤａの分子量を有する請求項１５に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項２０】
構造：
【化１０】
2013533217.tif 000092
を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、Ｒ１はメチル基であり、ｎ１とｎ２が約４００〜５００の範囲内にあり、ＰＥＧ部分が約４０ｋＤａの分子量を有する請求項１６に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項２１】
構造：
【化１１】
2013533217.tif 000093
を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、Ｒ１はメチル基であり、ｎ１とｎ２が約４００〜５００の範囲内にあり、ＰＥＧ部分が約４０ｋＤａの分子量を有する請求項１７に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項２２】
構造：
【化１２】
2013533217.tif 000094
を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、Ｒ１はメチル基であり、ｎ１とｎ２が約４００〜５００の範囲内にあり、ＰＥＧ部分が約４０ｋＤａの分子量を有する請求項１８に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項２３】
次の構造：
【化１３】
2013533217.tif 000095
を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、リンカーはそれぞれ独立して
−Ｘ−、−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ２−、
−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−、
−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、
−Ｘ−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、
−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１Ｘ−、
−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−および
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−から選択され、
式中、Ｘはそれぞれ独立して−Ｏ−、−Ｓ−または-ＮＨ−から選択されるか存在せず、ｍ１はそれぞれ独立して０〜５であり、ｍ２はそれぞれ独立して１〜５であり、
式中、前記リンカーがＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合し、そして、
式中、Ｒ１はアルキル基または低級アルキル基であり、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００である
請求項６に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項２４】
次の構造：
【化１４】
2013533217.tif 000096
を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、リンカーは
−Ｘ−、−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ２−、
−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−、
−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、
−Ｘ−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、
−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１Ｘ−、
−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−および
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−から選択され、
式中、Ｘはそれぞれ独立して−Ｏ−、−Ｓ−または-ＮＨ−から選択されるか存在せず、ｍ１はそれぞれ独立して０〜５であり、ｍ２はそれぞれ独立して１〜５であり、
式中、前記リンカーがＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合し、そして、
式中、Ｒ１はアルキル基または低級アルキル基であり、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００である
請求項６に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項２５】
次の構造：
【化１５】
2013533217.tif 000097
を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、リンカーはそれぞれ独立して
−Ｘ−、−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ２−、
−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、
−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−、
−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、
−Ｘ−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、
−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１Ｘ−、
−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−および
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−から選択され、
式中、Ｘはそれぞれ独立して−Ｏ−、−Ｓ−または-ＮＨ−から選択されるか存在せず、ｍ１はそれぞれ独立して０〜５であり、ｍ２はそれぞれ独立して１〜５であり、
式中、前記リンカーがＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合し、そして、
式中、Ｒ１はアルキル基または低級アルキル基であり、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００である
請求項６に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項２６】
次の構造：
【化１６】
2013533217.tif 000098
を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、リンカーは
−Ｘ−、−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ２−、
−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、
−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−、
−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、            
−Ｘ−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−、
−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、
−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、
−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１Ｘ−、
−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−および
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−から選択され、
式中、Ｘはそれぞれ独立して−Ｏ−、−Ｓ−または-ＮＨ−から選択されるか存在せず、ｍ１はそれぞれ独立して０〜５であり、ｍ２はそれぞれ独立して１〜５であり、そして、
式中、前記リンカーがＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合する
請求項６に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項２７】
構造：
【化１７】
2013533217.tif 000099
を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであって、
式中、Ｒ１はメチル基であり、ｎ１とｎ２が約４００〜５００の範囲内にあり、ＰＥＧ部分が約４０ｋＤａの分子量を有する請求項２６に記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項２８】
紫外線円偏光二色性分析により判定されるように、非修飾型Ｃ−ペプチドと実質的に同じ二次構造を有する請求項１〜２７のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項２９】
イヌに皮下投与されると、前記ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも１０倍大きい血漿中薬物動態ＡＵＣプロファイルまたは血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを有する請求項１〜２８のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項３０】
非修飾型Ｃ−ペプチドの生物学的活性の少なくとも約５０％を保持する請求項１〜２９のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項３１】
非修飾型Ｃ−ペプチドの生物学的活性の少なくとも約７５％を保持する請求項１〜２９のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項３２】
３日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの平均定常状態濃度が約０．２ｎＭと約６ｎＭの間に維持される投与計画であって、請求項１〜３１のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの治療用量を前記患者に投与することを含む投与計画。
【請求項３３】
それを必要とする患者においてＣ−ペプチドのレベルを最小有効治療レベルよりも高く維持する方法であって、請求項１〜３１のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの治療用量を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項３４】
治療を必要とする患者において１つ以上の糖尿病の長期合併症を治療する方法であって、請求項１〜３１のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの治療用量を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項３５】
前記の糖尿病の長期合併症が、網膜症、末梢神経障害、自律神経障害および腎症からなる群より選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記の糖尿病の長期合併症が末梢神経障害である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記末梢神経障害が既成の末梢神経障害である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法の開始前の神経伝達速度と比較して、治療により神経伝達速度が少なくとも１０％改善することになる請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
糖尿病の患者を治療する方法であって、インスリンと併用して請求項１〜３１のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの治療用量を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項４０】
ヒトのインスリン依存性患者を治療する方法であって、
ａ）神経障害を有する前記患者にインスリンを投与する段階、
ｂ）前記患者のインスリン投与に用いられた部位とは異なる部位に請求項１〜３１のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの治療用量を前記患者に皮下投与する段階、
ｃ）前記治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの結果により生じた前記患者のインスリンの必要量の変化をモニターすることに基づいて投与されるインスリンの投薬量、投薬タイプまたは投薬頻度を調節する段階であって、前記調節された用量のインスリンが低血糖症のリスク、発生または重症度を低減し、前記調節された用量のインスリンがＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療の開始前の前記患者のインスリン用量よりも少なくとも１０％少ない段階
を含む方法。
【請求項４１】
前記ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのために直近で用いられたデポ部位と比較して異なるデポ部位に前記インスリンを皮下投与する請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
約３日以上の投与間隔で前記ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを投与する請求項３３〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
約５日以上の投与間隔で前記ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを投与する請求項３３〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
約７日以上の投与間隔で前記ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを投与する請求項３３〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが約１ｍｇ〜約４．０ｍｇである請求項３２〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが約１ｍｇである請求項３２〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが約３．５ｍｇである請求項３２〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの血漿中濃度が約０．２ｎＭよりも高く維持される請求項３３〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが皮下投与される請求項３２〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
Ｃ−ペプチド置換治療法としてそれを必要とする患者に用いるための請求項１〜３１のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド。
【請求項５１】
ヒトのインスリン依存性糖尿病の患者において低血糖症のリスクを低減するための請求項１〜３１のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの使用であって、処方計画ではインスリンの投与をさらに含み、
ａ）インスリンを前記患者に投与すること、
ｂ）前記患者のインスリン投与に用いられた部位とは異なる部位に前記ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの治療用量を投与すること、
ｃ）前記治療用量の前記ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの結果により生じる前記患者のインスリンの必要量の変化に基づいて投与されるインスリンの投薬量、投薬タイプまたは投薬頻度を調節すること
を含む使用。
【請求項５２】
前記患者が少なくとも１つの糖尿病の長期合併症を有する請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
治療を必要とする患者において１つ以上の糖尿病の長期合併症を治療するための請求項１〜３１のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの使用。
【請求項５４】
前記の糖尿病の長期合併症が、網膜症、末梢神経障害、自律神経障害および腎症からなる群より選択される請求項５２または５３に記載の使用。
【請求項５５】
前記の糖尿病の長期合併症が末梢神経障害である請求項５４に記載の使用。
【請求項５６】
前記末梢神経障害が既成の末梢神経障害である請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法の開始前の神経伝達速度と比較して、治療により神経伝達速度が少なくとも１０％改善される請求項５５または５６に記載の使用。
【請求項５８】
請求項１〜３１のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドと薬剤的に許容可能な担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項５９】
前記の薬剤的に許容可能な担体または賦形剤がソルビトールである請求項５８に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
前記ソルビトールが約２（重量／重量）％〜約８（重量／重量）％の濃度で存在する請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
前記ソルビトールが約４．７％の濃度で存在する請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
約ｐＨ５．５〜約ｐＨ６．５の範囲内のｐＨに緩衝される請求項５８〜６１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６３】
約６．０のｐＨに緩衝される請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
約５ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度のリン酸緩衝液で緩衝される請求項５８〜６３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６５】
約１０ｍＭの濃度のリン酸緩衝液で緩衝される請求項６４に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
既定の時間の４０℃での保温の後に測定される請求項１〜３１のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの安定性が、ｐＨ７．０の０．９％生理食塩水中に貯蔵される同じＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含む医薬組成物と比較して改善されていることを特徴とする請求項５８〜６５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６７】
請求項１〜３１のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドとインスリンを含む医薬組成物。
【請求項６８】
ヒトのインスリン依存性患者でのインスリン利用を低減させる方法であって、
ａ）前記患者にインスリンを投与する段階、
ｂ）前記患者のインスリン投与に用いられた部位とは異なる部位に請求項１〜３１のいずれかに記載のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの治療用量を前記患者に皮下投与する段階、
ｃ）前記治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの結果により生じた前記患者のインスリンの必要量の変化をモニターすることに基づいて投与されるインスリンの投薬量、投薬タイプまたは投薬頻度を調節する段階であって、調節された用量のインスリンが低血糖症を誘導せず、調節された用量のインスリンがＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療の開始前の前記患者のインスリン用量よりも少なくとも１０％少ない段階
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は２０１０年５月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／３４５，２９３号および２０１１年３月２日に出願された米国特許仮出願第６１／４４８，４０２号の優先権の利益を主張し、それらの開示の内容全体は参照により本明細書に記述されたかのように組み込まれたものとする。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
発明の分野
本発明は、修飾型Ｃ−ペプチドの修飾型とその利用方法に関する。１つの態様において、Ｃ−ペプチドの修飾型はＮ末端に結合する少なくとも１つのＰＥＧ基を含み、インビボで優れた薬物動態および生物学的活性を示すＰＥＧ化Ｃ−ペプチド誘導体を含む。
【０００３】
Ｃ−ペプチドはプロインスリン分子中のＡ鎖とＢ鎖の間にある連結ペプチドである。膵島β細胞の小胞体での切断とプロセッシングの後、インスリンとＣ−ペプチドが作製される。Ｃ−ペプチドはインスリンと共に等モル濃度で膵島β細胞から門脈循環へ共分泌される。その発見の後、Ｃ−ペプチドが二本鎖インスリン構造の折り畳みに寄与していることの他に、そのさらなる生物学的活性が長年の間の疑問であった。
【０００４】
１型糖尿病すなわちインスリン依存性糖尿病は一般に膵島β細胞の自己免疫性破壊に起因するインスリンとＣ−ペプチドの欠乏という特徴を有する。したがって、その患者は生命の維持のために外来性インスリンに依存する。その疾病の発病には遺伝的背景、環境要因および一時的な感染症の後の攻撃的自己免疫反応などのいくつかの因子が重要である可能性がある(Akerblom HK et al.: Annual Medicine 29(5): 383-385, (1997年))。現時点ではインスリン依存性糖尿病患者にはＣ−ペプチドが分離した外来性インスリンが提供され、したがって、外来性Ｃ−ペプチド治療法を受けていない。対照的に、大半の２型糖尿病患者は初期においてなおインスリンとＣ−ペプチドの両方を内在的に産生するが、骨格筋と脂肪組織におけるインスリン耐性という特徴を一般に有する。
【０００５】
１型糖尿病患者は１群の長期にわたる糖尿病の合併症を患い、それらは多くの場合２型糖尿病の場合よりも重症であり、広い範囲にわたる。具体的には、例えば、網膜、腎臓および神経に関する微小血管性合併症が１型糖尿病患者の罹病率と死亡率の主要な原因である。
【０００６】
インスリン依存性糖尿病患者の長期にわたる合併症の発生にＣ−ペプチド欠乏がある役割を果たす可能性があるという考えへの裏付けが増加しつつある。さらに、糖尿病モデル動物および１型糖尿病患者におけるインビボ研究ならびにインビトロ研究により、Ｃ−ペプチドはホルモン活性を有することが実証されている (Wahren J et al.: American Journal of Physiology 278: E759-E768, (2000年); Wahren J et al.: In International textbook of diabetes mellitus Ferranninni E, Zimmet P, De Fronzo RA, Keen H, Eds. Chichester, John Wiley & Sons, (2004年), p. 165-182)。したがって、通常のインスリン治療法を相補するものとしてのＣ−ペプチド利用は１型糖尿病の長期合併症の管理に対して有効な方法を提供する可能性がある。
【０００７】
Ｃ−ペプチドの治療活性にはＣ−ペプチドのＧタンパク質共役膜レセプターへの結合、Ｃａ２＋依存性細胞内シグナル伝達経路の活性化およびＭＡＰキナーゼシステムのリン酸化が関係し、ナトリウム／カリウムＡＴＰａｓｅおよび内皮性一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の活性の増大を引き起こすことが今日までの研究により示唆されている。インスリン依存性糖尿病の長期合併症の治療と予防にＣ−ペプチドが有望であるにも関わらず、短い生物学的半減期とＣ−ペプチドの皮下注射または静脈内（Ｉ．Ｖ．）投与による１日当たり複数回の投与の必要性が商業上の開発を妨げてきている。
【０００８】
本発明は、天然Ｃ−ペプチドの生物学的活性を保持し、そして、優れた薬物動態的特性を示すＰＥＧ化型Ｃ−ペプチドの開発に焦点を当てている。これらの改良された治療用形態のＣ−ペプチドは、糖尿病の長期合併症の治療のためのより効果的な最適投薬方式の開発を可能にし、投与の頻度をかなり少なくする。
【０００９】
１つの態様において、これらの治療法は 糖尿病の患者を対象とし、さらなる態様においてはインスリン依存性の患者を対象とする。１つの態様において、インスリン依存性の患者は１つ以上の糖尿病の長期合併症を患っている。
【００１０】
これらの改良された方法は、動物実験に基づいており、驚くべきことに、Ｃ−ペプチド分子のＮ末端における修飾により生じたＰＥＧ化型Ｃ−ペプチドが天然分子の生物学的活性を保持しつつ非常に優れた薬物動態性質を示すことを実証する。
【発明の概要】
【００１１】
１つの実施形態において、本発明はＣ−ペプチドのＮ末端に共有結合で結合したＰＥＧ部分を含むＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを包含する。１つの態様において、本発明のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは線状多量体ＰＥＧポリマーを含む。別の態様において、本発明のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは分枝鎖状ＰＥＧポリマーを含む。
【００１２】
これらのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ部分は約１０ｋＤａと約８０ｋＤａの間の分子量を有する。別の態様において、ＰＥＧ部分は約２０ｋＤａと約６０ｋＤａの間の分子量を有する。別の態様において、ＰＥＧ部分は約３０ｋＤａと約５０ｋＤａの間の分子量を有する。
【００１３】
これらの線状ＰＥＧ化Ｃペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは一般式（Ｉ）：
【化１】
2013533217.tif 000002
式（Ｉ）
を有する。
【００１４】
式中、Ｒ１はアルキル基、ｎ１は２０〜８００であり、リンカーは−Ｘ−、−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ２−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−Ｘ−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１Ｘ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−および−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−から選択される。
【００１５】
式中、Ｘはそれぞれ独立して−Ｏ−、−Ｓ−または-ＮＨ−から選択されるか存在せず、ｍ１はそれぞれ独立して０〜５であり、ｍ２はそれぞれ独立して１〜５であり、式中、リンカーはＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合する。
【００１６】
これらの線状ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは以下より選択されるＣ−ペプチドにＰＥＧ部分を連結するリンカーを含む；
−Ｘ１−（ＣＨ２）ｍ４−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ４−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ３−ＣＯ−、および
−Ｘ１−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ２−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ４−ＣＯ−。
【００１７】
式中、
Ｘ１は−Ｏ−または存在せず、
Ｘ２は-ＮＨ−であり、
ｍ２は１〜５であり、
ｍ３は２であり、そして、
ｍ４は２〜５である。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は次の構造を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含む。
【化２】
2013533217.tif 000003
【００１９】
式中ｎ１は約４００〜約１０００である。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は次の構造を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含む。
【化３】
2013533217.tif 000004
【００２１】
式中ｎ１は約４００〜約１０００である。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は次の構造を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含む。
【化４】
2013533217.tif 000005
【００２３】
別の実施形態において、本発明は次の構造を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含む。
【化５】
2013533217.tif 000006
【００２４】
式中、ｎは約４００〜約１０００である。
【００２５】
別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは一般式（ＩＩ）の分枝鎖状ＰＥＧを含む。
【化６】
2013533217.tif 000007
式（ＩＩ）
【００２６】
式中、Ｒ１はアルキル基、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００であり、リンカーはそれぞれ独立して下記のように定義され、そして、式中、Ｃ−ペプチドに連結するリンカーはＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合する。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は一般式（ＩＩＡ）の構造を有するＰＥＧ化 C-ペプチドを包含する。
【化７】
2013533217.tif 000008
【００２８】
式中、Ｒ１はアルキル基、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００であり、リンカーは−Ｘ−、−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ２−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−Ｘ−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１Ｘ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−および−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−から選択される。
【００２９】
式中、Ｘはそれぞれ独立して−Ｏ−、−Ｓ−または-ＮＨ−から選択されるか存在せず、ｍ１はそれぞれ独立して０〜５であり、ｍ２はそれぞれ独立して１〜５であり、式中、リンカーはＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合する。
【００３０】
これらの分枝鎖状ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは以下より選択されるＣ−ペプチドにＰＥＧ部分を連結するリンカーを含む；
−Ｘ１−（ＣＨ２）ｍ４−ＣＯ−
−Ｘ１−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ４−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ３−ＣＯ−、および
−Ｘ１−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ２−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ４−ＣＯ−。
【００３１】
式中、
Ｘ１は−Ｏ−または存在せず、
Ｘ２は-ＮＨ−であり、
ｍ２は１〜５であり、
ｍ３は２であり、そして、
ｍ４は１〜５である。
【００３２】
これらの分枝鎖状ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは以下より選択されるＣ−ペプチドにＰＥＧ部分を連結するリンカーを含む；
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−Ｘ−、
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−（ＣＨ２）ｍ５−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−ＣＯ−、および
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ５−ＣＯ−。
【００３３】
式中、Ｘは独立して−Ｏ−、−Ｓ−または-ＮＨ−から選択されるか存在せず、Ｘ１は−Ｏ−であるか存在せず、Ｘ２は-ＮＨ−であり、ｍ５はそれぞれ独立して１〜５から選択され、ｎ３はそれぞれ独立して１〜４００から選択される。
【００３４】
これらの分枝鎖状ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは以下より選択されるＣ−ペプチドにＰＥＧ部分を連結するリンカーを含む；
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−（ＣＨ２）ｍ６−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−ＣＯ−、および
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ７−ＣＯ−。
【００３５】
式中、
Ｘ１は−Ｏ−であるか存在せず、
Ｘ２は-ＮＨ−であり、
ｍ５は３であり、
ｍ６は独立して２または５であり、
ｍ７は３であり、そして、
ｎ３は１〜４００である。
【００３６】
別の実施形態において、本発明は次の構造を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含む。
【化８】
2013533217.tif 000009
【００３７】
式中、Ｒ１はアルキル基、ｎ１は２００〜８００であり、ｎ２は２００〜８００である。
【００３８】
別の実施形態において、本発明は次の構造を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含む。
【化９】
2013533217.tif 000010
【００３９】
式中、Ｒ１はアルキル基、ｎ１は２００〜８００であり、ｎ２は２００〜８００である。
【００４０】
別の実施形態において、本発明は次の構造を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含む。
【化１０】
2013533217.tif 000011
【００４１】
式中、Ｒ１はアルキル基、ｎ１は２００〜８００であり、ｎ２は２００〜８００であり、ｎ３は１〜４００である。
【００４２】
別の実施形態において、本発明は次の構造を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含む。
【化１１】
2013533217.tif 000012
【００４３】
式中、Ｒ１はアルキル基、ｎ１は２００〜８００であり、ｎ２は２００〜８００であり、ｎ３は１〜４００である。
【００４４】
別の実施形態において、本発明は次の構造を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含む。
【化１２】
2013533217.tif 000013
【００４５】
式中、Ｒ１はアルキル基、ｎ１は２００〜８００であり、ｎ２は２００〜８００であり、ｎ３は１〜４００である。
【００４６】
別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは一般式（ＩＩＩ）の分枝鎖状ＰＥＧを含む。
【化１３】
2013533217.tif 000014
式（ＩＩＩ）
式中、Ｒ１はアルキル基、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００であり、式中、リンカーはそれぞれ独立して下記のように定義され、そして、式中、Ｃ−ペプチドに連結するリンカーはＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合する。
【００４７】
式（ＩＩＩ）のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの１つの実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは構造（ＩＩＩＡ）を有する。
【化１４】
2013533217.tif 000015
式（ＩＩＩＡ）
式中、Ｒ１はアルキル基、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００であり、式中、リンカーは下記のように定義され、そして、Ｃ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合する。
【００４８】
別の実施形態において、本発明は次の構造を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含む。
【化１５】
2013533217.tif 000016
式中、Ｒ１はアルキル基、ｎ１は２００〜８００であり、ｎ２は２００〜８００である。
【００４９】
別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは一般式（ＩＶ）の分枝鎖状ＰＥＧを含む。
【化１６】
2013533217.tif 000017
式（ＩＶ）
【００５０】
式中、Ｒ１はアルキル基、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００であり、式中、リンカーはそれぞれ独立して下記のように定義され、式中、リシン残基をＣ−ペプチドに連結するリンカーはＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基とリシン残基のＣ末端カルボキシレート基と結合し、そして、式中、リシン部分をＰＥＧ部分に連結するリンカーはリシン分子のアミノ基を介して結合する。
【００５１】
別の実施形態において、本発明は次の構造を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含む。
【化１７】
2013533217.tif 000018
【００５２】
式中、Ｒ１はアルキル基、ｎ１は２００〜８００であり、ｎ２は２００〜８００である。
【００５３】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのある態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドはイヌに皮下投与されるとき、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約５倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを有する。
【００５４】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのある態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドはイヌに皮下投与されるとき、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約６倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを有する。
【００５５】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのある態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドはイヌに皮下投与されるとき、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約７倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを有する。
【００５６】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのある態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドはイヌに皮下投与されるとき、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約８倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを有する。
【００５７】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのある態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドはイヌに皮下投与されるとき、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約１０倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを有する。
【００５８】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのある態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドはイヌに皮下投与されるとき、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約１５倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを有する。
【００５９】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのある態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドはイヌに皮下投与されるとき、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約２０倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを有する。
【００６０】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのある態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドはイヌに皮下投与されるとき、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約２５倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを有する。
【００６１】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのある態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドはイヌに皮下投与されるとき、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約５０倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを有する。
【００６２】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのある態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドはイヌに皮下投与されるとき、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約７５倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを有する。
【００６３】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのある態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドはイヌに皮下投与されるとき、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約１００倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを有する。
【００６４】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのある態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは非修飾型Ｃ−ペプチドと等効力の生物学的活性を有する。本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのある態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは非修飾型Ｃ−ペプチドの少なくとも約９５％の生物学的活性を保持する。本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのある態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは非修飾型Ｃ−ペプチドの少なくとも約９０％の生物学的活性を保持する。本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのある態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは非修飾型Ｃ−ペプチドの少なくとも約８０％の生物学的活性を保持する。本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは非修飾型Ｃ−ペプチドの少なくとも約７０％の生物学的活性を保持する。本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは非修飾型Ｃ−ペプチドの少なくとも約６０％の生物学的活性を保持する。本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは非修飾型Ｃ−ペプチドの少なくとも約５０％の生物学的活性を保持する。本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは非修飾型Ｃ−ペプチドの少なくとも約４０％の生物学的活性を保持する。本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは非修飾型Ｃ−ペプチドの少なくとも約３０％の生物学的活性を保持する。本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは非修飾型Ｃ−ペプチドの少なくとも約２０％の生物学的活性を保持する。本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは非修飾型Ｃ−ペプチドの少なくとも約１０％の生物学的活性を保持する。本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、そのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは非修飾型Ｃ−ペプチドの少なくとも約５％の生物学的活性を保持する。
【００６５】
別の実施形態において、本発明は、本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの治療用量を患者に投与することを含み、３日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの平均定常状態濃度を約０．２ｎＭと約６ｎＭの間に維持する投与計画を包含する。
【００６６】
別の実施形態において、本発明は、本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの治療用量を患者に投与することを含み、３日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの平均定常状態濃度を約０．４ｎＭと約６ｎＭの間に維持する投与計画を包含する。
【００６７】
別の実施形態において、本発明は、本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの治療用量を患者に投与することを含み、３日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの平均定常状態濃度を約０．６ｎＭと約８ｎＭの間に維持する投与計画を包含する。
【００６８】
別の実施形態において、本発明は、本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの治療用量を患者に投与することを含み、３日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの平均定常状態濃度を約０．８ｎＭと約１０ｎＭの間に維持する投与計画を包含する。
【００６９】
別の実施形態において、本発明は、本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの治療用量を患者に投与することを含み、治療を必要とする患者における最小有効治療レベルを超えるレベルにＣ−ペプチドを維持する方法を包含する。
【００７０】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、哺乳類動物に有効治療用量を皮下投与するとき、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは悪性の副作用が実質的に無い。
【００７１】
別の実施形態において、本発明は、本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの治療用量を患者に投与することを含み、治療を必要とする患者において１つ以上の糖尿病の長期合併症を治療する方法を包含する。
【００７２】
別の実施形態において、 本発明は、インスリンと併用して本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを患者に投与することを含む糖尿病の患者を治療する方法を包含する。
【００７３】
これらの方法のどれかの１つの態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、約３日以上の投与間隔で投与される。これらの方法のどれかの１つの態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、約４日以上の投与間隔で投与される。これらの方法のどれかの１つの態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、約５日以上の投与間隔で投与される。これらの方法のどれかの１つの態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、約６日以上の投与間隔で投与される。これらの方法のどれかの１つの態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、約７日以上の投与間隔で投与される。
【００７４】
ある実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法の開始前の神経伝達速度と比較して、神経伝達速度が治療によって少なくとも１０％改善することになる。
【００７５】
これらの方法のどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの血漿中濃度は約０．１ｎＭ以上に維持される。これらの方法のどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの血漿中濃度は約０．２ｎＭ以上に維持される。これらの方法のどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの血漿中濃度は約０．３以上に維持される。これらの方法のどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの血漿中濃度は約０．４ｎＭ以上に維持される。
【００７６】
これらの方法のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが皮下投与される。これらの方法のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが経口投与される。
【００７７】
別の実施形態において、本発明は、Ｃ−ペプチド置換治療法として治療を必要とする患者に本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかを利用することを包含する。
【００７８】
別の実施形態において、本発明は、治療を必要とする患者において１つ以上の糖尿病の長期合併症を治療するために本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかを利用することを包含する。ある実施形態において、糖尿病の長期合併症は、網膜症、末梢神経障害、自律神経障害および腎障害からなる群より選択される。ある実施形態において、糖尿病の長期合併症は末梢神経障害である。ある実施形態において、末梢神経障害は既成の末梢神経障害である。ある実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法の開始前の神経伝達速度と比較して、神経伝達速度が治療によって少なくとも１０％改善することになる。
【００７９】
別の実施形態において、本発明は薬剤的に許容可能な担体または賦形剤と本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかを含む医薬組成物を包含する。ある実施形態において、薬剤的に許容可能な担体または賦形剤はソルビトールである。ある実施形態において、ソルビトールは約２％から約８％（重量／重量）の濃度である。ある実施形態において、ソルビトールは約４．７％の濃度である。ある実施形態において、医薬組成物は約ｐＨ５．５から約ｐＨ６．５の範囲のｐＨに緩衝される。ある実施形態において、医薬組成物は約６．０のｐＨに緩衝される。ある実施形態において、医薬組成物は約５ｍＭから約２５ｍＭの濃度のリン酸緩衝液で緩衝される。ある実施形態において、医薬組成物は約１０ｍＭの濃度のリン酸緩衝液で緩衝される。これらの実施形態のどれかの１つの態様において、前記医薬組成物は、本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかを４０℃で既定時間保温した後に測定されるその安定性がｐＨ７．０で同じＰＥＧ化Ｃ−ペプチドと０．９％生理食塩水を含む医薬組成物と比較して向上したことを特徴とする。異なる実施形態において、前記既定時間は約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間または約６週間である。
【００８０】
別の実施形態において、本発明はインスリンと本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかを含む医薬組成物を包含する。
【００８１】
ある実施形態は、ヒトのインスリン依存性糖尿病の患者における低血糖症のリスクを低減するために、開示されるＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかをインスリンの投与をさらに含む計画において使用することを包含する。その計画は、ａ）インスリンを患者に投与すること、ｂ）治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを患者のインスリン投与に用いられたのとは別の部位に投与すること、ｃ）治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの結果変化した患者のインスリン要求性に基づいて投与されるインスリンの投薬量、投薬タイプまたは投薬頻度を調節することを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、前記患者は少なくとも１つの糖尿病の長期合併症を有する。
【００８３】
ある実施形態はヒトのインスリン依存性の患者を治療する方法を包含し、その方法は以下の段階を含む；ａ）神経障害を有する患者にインスリンを投与する段階、ｂ）開示されるＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの治療用量を患者のインスリン投与に用いられたのとは別の部位に皮下投与する段階、ｃ）治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの結果変化した患者のインスリン要求性のモニターに基づき投与されるインスリンの投薬量、投薬タイプまたは投薬頻度を調節する段階。その段階において、調節されたインスリン用量により低血糖症のリスク、発生または重症度が低減し、調節されたインスリン用量はＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療の開始前の患者のインスリン用量よりも少なくとも１０％少ない。
【００８４】
ある実施形態はヒトのインスリン依存性の患者におけるインスリン利用を低減させる方法を包含し、その方法は以下の段階を含む；ａ）インスリンを患者に投与する段階、ｂ）開示されるＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの治療用量を患者のインスリン投与に用いられたのとは別の部位に皮下投与する段階、ｃ）治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの結果変化した患者のインスリン要求性のモニターに基づき投与されるインスリンの投薬量、投薬タイプまたは投薬頻度を調節する段階。その段階において、調節されたインスリン用量では低血糖症は誘起されず、調節されたインスリン用量はＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療の開始前の患者のインスリン用量よりも少なくとも１０％少ない。
【００８５】
本発明の原理を利用する例示的な実施形態を述べる以下の詳細な説明とそれに付随する図面を参照することにより、本発明の特徴と利点をよりよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、４０ｋＤａの本発明の分枝鎖状ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの逆相クロマトグラムを示す。
【図２】図２は、４０ｋＤａの本発明の分枝鎖状ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図３】図３は、２０ｋＤａの本発明の直鎖状ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの逆相クロマトグラムを示す。
【図４】図４は、２０ｋＤａの本発明の直鎖状ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図５Ａ】図５は、単回皮下投与後のイヌでの非修飾型Ｃ−ペプチドの血漿中濃度時間プロファイルを示す。図５Ａは１日の時間尺度でのプロファイルを示す。図５Ｂは１２日の時間尺度でのプロファイルを示す。
【図５Ｂ】図５は、単回皮下投与後のイヌでの非修飾型Ｃ−ペプチドの血漿中濃度時間プロファイルを示す。図５Ａは１日の時間尺度でのプロファイルを示す。図５Ｂは１２日の時間尺度でのプロファイルを示す。
【図６】図６は、２０ｋＤａの直鎖状ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（菱形）と４０ｋＤａの分枝鎖状ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（正方形）の単回皮下投与後のイヌでのＣ−ペプチドの線形目盛を用いる血漿中濃度時間プロファイルを示す。
【図７】図７は、２０ｋＤａの直鎖状ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（菱形）と４０ｋＤａの分枝鎖状ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（正方形）の単回皮下投与後のイヌでのＣ−ペプチドの片対数目盛を用いる血漿中濃度時間プロファイルを示す。
【図８Ａ】図８は、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの単回皮下投与後のイヌでのＣ−ペプチドの血漿中濃度時間プロファイルを示す。図８Ａは線形目盛を用いて表されたデータを示す。図８Ｂは片対数形式で表されたデータを示す。
【図８Ｂ】図８は、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの単回皮下投与後のイヌでのＣ−ペプチドの血漿中濃度時間プロファイルを示す。図８Ａは線形目盛を用いて表されたデータを示す。図８Ｂは片対数形式で表されたデータを示す。
【図９Ａ】図９は、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの単回皮下投与後のイヌでのＣｍａｘとＡＵＣ（０−ｔ）を示す。図９ＡはＣｍａｘを示し、そして、図９ＢはＡＵＣ（０−ｔ）を示す。
【図９Ｂ】図９は、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの単回皮下投与後のイヌでのＣｍａｘとＡＵＣ（０−ｔ）を示す。図９ＡはＣｍａｘを示し、そして、図９ＢはＡＵＣ（０−ｔ）を示す。
【図１０Ａ】図１０は、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの単回皮下投与後のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットでの平均（±ＳＤ）Ｃ−ペプチド血漿中濃度時間プロファイルを示す。パネルＡ，線形目盛；パネルＢ，片対数目盛。
【図１０Ｂ】図１０は、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの単回皮下投与後のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットでの平均（±ＳＤ）Ｃ−ペプチド血漿中濃度時間プロファイルを示す。パネルＡ，線形目盛；パネルＢ，片対数目盛。
【図１１Ａ】図１１は、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの単回皮下投与後のカニクイザルでの平均（±ＳＤ）Ｃ−ペプチド血漿中濃度時間プロファイルを示す。パネルＡ，線形目盛；パネルＢ，片対数目盛。
【図１１Ｂ】図１１は、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの単回皮下投与後のカニクイザルでの平均（±ＳＤ）Ｃ−ペプチド血漿中濃度時間プロファイルを示す。パネルＡ，線形目盛；パネルＢ，片対数目盛。
【図１２Ａ】図１２は、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの複数回皮下投与後のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットでの平均Ｃ−ペプチド血漿中濃度時間プロファイルを示す。パネルＡ，オス、線形目盛；パネルＢ，メス、線形目盛；パネルＣ，オス、片対数目盛；パネルＤ，メス、片対数目盛。
【図１２Ｂ】図１２は、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの複数回皮下投与後のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットでの平均Ｃ−ペプチド血漿中濃度時間プロファイルを示す。パネルＡ，オス、線形目盛；パネルＢ，メス、線形目盛；パネルＣ，オス、片対数目盛；パネルＤ，メス、片対数目盛。
【図１２Ｃ】図１２は、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの複数回皮下投与後のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットでの平均Ｃ−ペプチド血漿中濃度時間プロファイルを示す。パネルＡ，オス、線形目盛；パネルＢ，メス、線形目盛；パネルＣ，オス、片対数目盛；パネルＤ，メス、片対数目盛。
【図１２Ｄ】図１２は、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの複数回皮下投与後のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットでの平均Ｃ−ペプチド血漿中濃度時間プロファイルを示す。パネルＡ，オス、線形目盛；パネルＢ，メス、線形目盛；パネルＣ，オス、片対数目盛；パネルＤ，メス、片対数目盛。
【図１３Ａ】図１３は、Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットでのＣｍａｘとＡＵＣ（０−ｔ）の間の関係を用量の関数として示す。パネルＡ，Ｃｍａｘ、最初の投与；パネルＢ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最初の投与；パネルＣ，Ｃｍａｘ、最後の投与；パネルＤ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最後の投与。
【図１３Ｂ】図１３は、Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットでのＣｍａｘとＡＵＣ（０−ｔ）の間の関係を用量の関数として示す。パネルＡ，Ｃｍａｘ、最初の投与；パネルＢ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最初の投与；パネルＣ，Ｃｍａｘ、最後の投与；パネルＤ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最後の投与。
【図１３Ｃ】図１３は、Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットでのＣｍａｘとＡＵＣ（０−ｔ）の間の関係を用量の関数として示す。パネルＡ，Ｃｍａｘ、最初の投与；パネルＢ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最初の投与；パネルＣ，Ｃｍａｘ、最後の投与；パネルＤ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最後の投与。
【図１３Ｄ】図１３は、Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットでのＣｍａｘとＡＵＣ（０−ｔ）の間の関係を用量の関数として示す。パネルＡ，Ｃｍａｘ、最初の投与；パネルＢ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最初の投与；パネルＣ，Ｃｍａｘ、最後の投与；パネルＤ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最後の投与。
【図１４Ａ】図１４は、複数回皮下投与でのカニクイザルでの平均Ｃ−ペプチド血漿中濃度時間プロファイルを示す。パネルＡ，オス、線形目盛；パネルＢ，メス、線形目盛；パネルＣ，オス、片対数目盛；パネルＤ，メス、片対数目盛。
【図１４Ｂ】図１４は、複数回皮下投与でのカニクイザルでの平均Ｃ−ペプチド血漿中濃度時間プロファイルを示す。パネルＡ，オス、線形目盛；パネルＢ，メス、線形目盛；パネルＣ，オス、片対数目盛；パネルＤ，メス、片対数目盛。
【図１４Ｃ】図１４は、複数回皮下投与でのカニクイザルでの平均Ｃ−ペプチド血漿中濃度時間プロファイルを示す。パネルＡ，オス、線形目盛；パネルＢ，メス、線形目盛；パネルＣ，オス、片対数目盛；パネルＤ，メス、片対数目盛。
【図１４Ｄ】図１４は、複数回皮下投与でのカニクイザルでの平均Ｃ−ペプチド血漿中濃度時間プロファイルを示す。パネルＡ，オス、線形目盛；パネルＢ，メス、線形目盛；パネルＣ，オス、片対数目盛；パネルＤ，メス、片対数目盛。
【図１５Ａ】図１５は、カニクイザルでのＣｍａｘとＡＵＣ（０−ｔ）の間の関係を用量の関数として示す。パネルＡ，Ｃｍａｘ、最初の投与；パネルＢ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最初の投与；パネルＣ，Ｃｍａｘ、最後の投与；パネルＤ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最後の投与。
【図１５Ｂ】図１５は、カニクイザルでのＣｍａｘとＡＵＣ（０−ｔ）の間の関係を用量の関数として示す。パネルＡ，Ｃｍａｘ、最初の投与；パネルＢ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最初の投与；パネルＣ，Ｃｍａｘ、最後の投与；パネルＤ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最後の投与。
【図１５Ｃ】図１５は、カニクイザルでのＣｍａｘとＡＵＣ（０−ｔ）の間の関係を用量の関数として示す。パネルＡ，Ｃｍａｘ、最初の投与；パネルＢ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最初の投与；パネルＣ，Ｃｍａｘ、最後の投与；パネルＤ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最後の投与。
【図１５Ｄ】図１５は、カニクイザルでのＣｍａｘとＡＵＣ（０−ｔ）の間の関係を用量の関数として示す。パネルＡ，Ｃｍａｘ、最初の投与；パネルＢ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最初の投与；パネルＣ，Ｃｍａｘ、最後の投与；パネルＤ，ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、最後の投与。
【図１６】図１６は、８週までの間、処理した４群のラットのそれぞれの群での尾部神経伝達速度（ＮＣＶ）を示す（実施例６を参照のこと。）。この図および次の３つの図では、グループ１は賦形剤対照を表し（ストレプトゾトシン［ＳＴＺ］無し）、グループ２は賦形剤とＳＴＺで処理されたグループを表し、グループ３はＳＴＺと１．０ｍｇ／ｋｇ／週（１．０ｍｇ／ｍｌ）のヒトＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを表し（実施例１２）、そして、グループ４はＳＴＺと３．０ｍｇ／ｋｇ／週（１．０ｍｇ／ｍｌ）のヒトＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（実施例１２）を表す。図１６において、パネルＡは基線ＮＣＶ測定値を表し、そして、パネルＢは賦形剤のみの投与または１．０か３．０ｍｇ／ｋｇ／週のどちらかでのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの投与のどちらかの（基線から）４週間の期間の後の尾部ＮＣＶを示す。図１６パネルＣは賦形剤のみの投与または１．０か３．０ｍｇ／ｋｇ／週のどちらかでのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの投与のどちらかの（基線から）８週間の期間の後の尾部ＮＣＶを示す。
【図１７Ａ】図１７は、図１６に記載されるものと同じ４群の動物の各々における指ＮＣＶを示す。図１７においてパネルＡは基線測定値を示し、そして、パネルＢは、賦形剤のみの投与または１．０か３．０ｍｇ／ｋｇ／週のどちらかでのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの投与のどちらかの（基線から）４週間の期間の後での指ＮＣＶを示す。図１７パネルＣは、賦形剤のみの投与または１．０か３．０ｍｇ／ｋｇ／週のどちらかでのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの投与のどちらかの（基線から）８週間の期間の後での指ＮＣＶを示す。
【図１７Ｂ】図１７は、図１６に記載されるものと同じ４群の動物の各々における指ＮＣＶを示す。図１７においてパネルＡは基線測定値を示し、そして、パネルＢは、賦形剤のみの投与または１．０か３．０ｍｇ／ｋｇ／週のどちらかでのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの投与のどちらかの（基線から）４週間の期間の後での指ＮＣＶを示す。図１７パネルＣは、賦形剤のみの投与または１．０か３．０ｍｇ／ｋｇ／週のどちらかでのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの投与のどちらかの（基線から）８週間の期間の後での指ＮＣＶを示す。
【図１７Ｃ】図１７は、図１６に記載されるものと同じ４群の動物の各々における指ＮＣＶを示す。図１７においてパネルＡは基線測定値を示し、そして、パネルＢは、賦形剤のみの投与または１．０か３．０ｍｇ／ｋｇ／週のどちらかでのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの投与のどちらかの（基線から）４週間の期間の後での指ＮＣＶを示す。図１７パネルＣは、賦形剤のみの投与または１．０か３．０ｍｇ／ｋｇ／週のどちらかでのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの投与のどちらかの（基線から）８週間の期間の後での指ＮＣＶを示す。
【図１８】図１８は、実験の全経過時間にわたる図１７に記載されるものと同じ４処理群における指ＮＣＶの相対変化を示す。
【図１９】図１９は、図１６および図１７に記載されるものと同じ４処理群における尾部および指ＮＣＶの処置から８週間後の基線測定値に対する相対変化を示す。
【図２０】図２０はＣ−ペプチド、ＰＥＧ試薬およびＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのフーリエ変換赤外分光分析（ＦＴ−ＩＲ）を示す。
【図２１】図２１は、Ｃ−ペプチド、ＰＥＧ試薬およびＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのフーリエ変換赤外分光分析（ＦＴ−ＩＲ）の拡大領域を示す。
【図２２】図２２は、重水中で収集されたＣ−ペプチド、ＰＥＧ試薬およびＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのフーリエ変換赤外分光分析（ＦＴ−ＩＲ）を示す。
【図２３】図２３は、重水中で収集されたＣ−ペプチド、ＰＥＧ試薬およびＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのフーリエ変換赤外分光分析（ＦＴ−ＩＲ）を示す。
【図２４】図２４は、キモトリプシンとの保温後のＣ−ペプチド（１ｍｇ／ｍＬ）とＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（１０ｍｇ／ｍＬ）のペプチドマップを示す。
【図２５】図２５は、ＰＢＳ緩衝液中の（約０．６ｍｇ／ｍＬの）ＰＥＧ化Ｃ-ペプチドの正規化された沈降係数分布を示す。
【図２６】図２６は、Ｃ-ペプチドとＰＥＧ化Ｃ-ペプチドの円偏光二色性分析を示す。
【図２７】図２７は、実施例１２のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの試料のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の結果を示す。
【図２８】図２８は、実施例１２の２０ｋＤａのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドと４０ｋＤａのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの重ね合わせたクロマトグラムを示す。
【図２９】図２９は、実施例１２のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのゲル電気泳動であるドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す。
【図３０】図３０は、天然Ｃ−ペプチドと比較したＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの生物学的活性のＥＲＫリン酸化アッセイでの評価の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
発明の詳細な説明
定義
用語「活性がある」または「活性化された」がある特定の官能基と合わせて使用されるとき、それらは、別の分子上で求電子試薬または求核試薬と容易に反応する反応性官能基を意味する。これは、反応するために強力な触媒または非常に非実用的な反応条件を必要とする官能基（すなわち、「非反応」基または「不活性」基）と対照的である。本明細書において使用されるように、用語「官能基」またはその任意の同義語はその保護化形態ならびに非保護化形態を包含するとされている。
【００８８】
用語「アルコキシ基」は−Ｏ−Ｒ基を意味し、式中、Ｒはアルキル基または置換アルキル基、好ましくはＣ１〜６アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基など）である。
【００８９】
用語「アルキル基」は炭化水素を、典型的には１から１２原子までの長さの炭化水素を意味する。炭化水素は分枝状または線状であることができ、そして、飽和型であることが好ましいが必須ではない。アルキル基の例にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、2-メチルブチル基、2-エチルプロピル基などが含まれる。本明細書において使用されるように、「アルキル基」にはシクロアルキルならびにシクロアルキレンアルキル類が含まれる。用語「低級アルキル基」は1個から6個までの炭素原子を含むアルキル基を意味し、そして、直鎖状または分枝状であることができる。
【００９０】
本明細書において使用される用語「Ｃｍａｘ」は、モニターされた放出期間中に生じる薬剤の最大血清中濃度または最大血漿中濃度である。
【００９１】
本明細書において使用される用語「Ｃｍｉｎ」は治療期間の放出期間中に生じる薬剤の最小血清中濃度または最小血漿中濃度である。
【００９２】
本明細書において使用される用語「Ｃａｖｅ」は、放出プロファイル曲線（ＡＵＣ）の下の面積を放出経過時間で除算することにより得られる薬剤の平均血清中濃度または平均血漿中濃度である。
【００９３】
本明細書において使用される用語「Ｃｓｓ−ａｖｅ」は、少なくとも５回の消失半減期の間に投薬した後の複数回投与計画の間に得られる薬剤の平均定常状態濃度である。一度でも薬剤の平均定常状態濃度が得られると、投薬間隔の間では薬剤の濃度が変動するということが認識されるであろう。
【００９４】
本明細書において使用される用語「ｔｍａｘ」はＣｍａｘが観察される投薬後の時間である。
【００９５】
本明細書において使用される用語「ＡＵＣ」は血清中または血漿中濃度時間曲線の曲線下面積を意味し、試料収集間隔の全体に関して台形公式により計算される。
【００９６】
用語「生物学的利用能」は投与された薬剤うちの循環系に達した薬剤の量を意味し、パーセントで表される。生物学的に利用可能な物質の量は、投与後に始まり既定の時点で終わる期間の薬剤の放出プロファイルについて計算されたＡＵＣとして定義されることができる。当技術分野において理解されているように、既定の時点（Ｘ軸）での対象（Ｙ軸）として生物学的に活性のある薬剤の血清中レベルをグラフ化することにより放出プロファイルが作成される。生物学的利用能 はしばしば％生物学的利用能という表現で言及され、それは薬剤の持続性放出組成物の投与の後にその（Ｃ−ペプチドなどの）薬剤について達成される生物学的利用能であって、同等の用量の薬剤を静脈内投与した後にその薬剤について達成される生物学的利用能で除算し、１００で乗算したものである。
【００９７】
「保存的アミノ酸置換」または「保存的変異」という表現はあるアミノ酸の共通する性質を有する別のアミノ酸による置換を意味する。個々のアミノ酸の間で共通の性質を定義する機能的な方法は同属の生物の対応するタンパク質の間でのアミノ酸変化の正規化された頻度を解析することである (Schulz GE および RH Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag (1979年))。そのような解析によれば、あるグループのアミノ酸が好んで互いを交換しあう場合、アミノ酸のグループが定義され得る。したがって、それらは全体のタンパク質構造への影響についてもっともよく互いに類似している(Schulz GE and RH Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag (1979年))。
【００９８】
この方法で定義されるアミノ酸のグループの例にはグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニンおよびヒスチジンからなる「荷電／極性グループ」、プロリン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる「芳香族または環状グループ」、ならびに、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、セリン、トレオニンおよびシステインからなる「脂肪族グループ」が含まれる。
【００９９】
各グループ内でサブグループが特定されることもできる。例えば、リシン、アルギニンおよびヒスチジンから成る「正荷電サブグループ」、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる「負荷電サブグループ」、ならびに、アスパラギンおよびグルタミンからなる「極性サブグループ」からなるサブグループに荷電／極性アミノ酸のグループを細分化することができる。芳香族または環状グループを、プロリン、ヒスチジンおよびトリプトファンからなる「窒素環サブグループ」ならびにフェニルアラニンおよびチロシンからなる「フェニルサブグループ」からなるサブグループに細分化することができる。バリン、ロイシンおよびイソロイシンからなる「大脂肪族非極性サブグループ」、メチオニン、セリン、トレオニンおよびシステインからなる「脂肪族やや極性サブグループ」ならびにグリシンおよびアラニンからなる「小残基サブグループ」からなるサブグループに脂肪族グループを細分化することができる。
【０１００】
保存的変異の例には上記のサブグループ内のアミノ酸のアミノ酸置換が含まれる。例えば、正電荷が維持され得るようにアルギニンのリシンとの置換、そして、その逆が含まれる。負電荷が維持され得るようにアスパラギン酸のグルタミン酸との置換、そして、その逆が含まれる。遊離-OH基が維持され得るようにトレオニンのセリンとの置換、そして、その逆が含まれる。遊離 -NH2 基が維持されうるようにアスパラギンのグルタミンとの置換が含まれる。「半保存的変異」には上述の同じグループ内のアミノ酸だが同じサブグループを共にしないアミノ酸のアミノ酸置換が含まれる。例えば、アスパラギン酸のアスパラギンへの変異またはアスパラギンのリシンへの変異など、すべて同じグループだが異なるサブグループのアミノ酸が関係する。「非保存的変異」には異なるグループ間でのアミノ酸置換、例えばロイシンのリシンとの置換、セリンのフェニルアラニンとの置換などが含まれる。
【０１０１】
用語「ダルトン」、「Ｄａ」または「Ｄ」は質量の任意単位を意味し、炭素１２の各種の質量の１２分の１は１．６５７  ×  １０−２４ｇに等しい。用語「ｋＤａ」はキロダルトン（すなわち、１０００ダルトン）のことである。
【０１０２】
用語「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ）」、「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）」または「糖尿病性症状」は、特に指示されない限り、全ての形態の糖尿病を包含する。用語「１型糖尿病患者」または「１型糖尿病」は約７．０ｍｍｏＬ／Ｌよりも高い空腹時血漿グルコース濃度と約０．２ｎｍｏＬ／Ｌ以下の空腹時Ｃ−ペプチドレベルを有する患者を意味する。用語「１．５型糖尿病患者」または「１．５型糖尿病」は約７．０ｍｍｏＬ／Ｌよりも高い空腹時血漿グルコース濃度と約０．４ｎｍｏＬ／Ｌ以下の空腹時Ｃ−ペプチドレベルを有する患者を意味する。用語「２型糖尿病患者」または「２型糖尿病」は約７．０ｍｍｏＬ／Ｌよりも高い空腹時血漿グルコース濃度とＣ−ペプチドレベルの正常な生理的範囲（約０．４７から２．５ｎｍｏＬ／Ｌ）の範囲内またはそれよりも高い空腹時Ｃ−ペプチドレベルを有する患者を一般的に意味する。最初に２型糖尿病患者であると診断された患者が後にインスリン依存性糖尿病を発生する可能性があり、そして、たとえ、彼らのＣ−ペプチドのレベルが１．５型または１型糖尿病患者のレベル（＜０．２ｎｍｏｌ／Ｌ）に落ちても、２型の患者であると診断されたままである可能性があることが認識されるであろう。
【０１０３】
用語「インスリン依存性患者」または「インスリン依存性糖尿病」は、明示されない限り、正常なグルコースレベルを適切に維持するためにインスリン投与を必要とするあらゆる形態の糖尿病患者／糖尿病を包含する。
【０１０４】
糖尿病はしばしば空腹時血中グルコースレベル、インスリンレベルまたは（典型的にはヘモグロビンＡ１ｃ、Ｈｂ１ｃ、ＨｂＡ１ｃまたはＡ１Ｃと称される）糖化ヘモグロビンのレベルを測定することにより診断される。正常な成人のグルコースレベルは６０〜１２６ｍｇ／ｄＬである。正常なインスリンレベルは３０〜６０ｐｍｏＬ／Ｌである。正常なＨｂＡ１ｃレベルは一般的に６％未満である。世界保健機構は糖尿病について空腹時血漿中グルコース濃度の診断値を７．０ｍｍｏＬ／Ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）以上（全血では６．１ｍｍｏＬ／Ｌもしくは１１０ｍｇ／ｄＬ）または１１．１ｍｍｏＬ／Ｌ以上の（２００ｍｇ／ｄＬ以上の）２時間後血中グルコースレベルと定義している。糖尿病の高いリスクを示唆する、または、示すその他の値には、１４０／９０ｍｍＨｇ以上に上昇した動脈圧、血漿中トリグリセリド類の上昇（１．７ｍｍｏＬ／Ｌ［１５０ｍｇ／ｄＬ］以上）、および／または、低ＨＤＬコレステロール（男性については０．９ｍｍｏＬ／Ｌ［３５ｍｇ／ｄＬ］未満、女性については１．０ｍｍｏＬ／Ｌ［３９ｍｇ／ｄＬ］未満）、中心性肥満（３０ｋｇ／ｍ２を超えるＢＭＩ）、尿中アルブミン排泄速度が２０μｇ／分以上の、または、アルブミンクレアチニン比率が３０ｍｇ／ｇ以上である微量アルブミン尿症が含まれる。
【０１０５】
用語「送達薬剤」は、治療薬の経口送達に有効な担体化合物または担体分子を意味し、そして、「担体」と互換的に使用することが可能である。
【０１０６】
用語「相同性」は、類似の機能またはモチーフを有する遺伝子またはタンパク質を同定するために用いられる配列類似性の数学に基づく比較を説明する。本発明の核酸配列およびタンパク質配列を、例えば、そのほかのファミリーメンバー、関連の配列またはホモログを同定するために、「問い合わせ配列」として使用して公のデータベースに対して検索を行うことができる。Altschul et al.: J. Mol. Biol. 215: 403-410, (1990年)のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いてそのような検索を行うことができる。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワードレングス＝１２の条件を用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実行し、本発明の核酸分子に対して相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３の条件を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を実行し、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップアラインメントを得るために、Altschul et al.: Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402, (1997年)において説明されるようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、各プログラムの初期設定パラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ）を使用することができる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。）。
【０１０７】
用語「相同な」は、同じ種の動物のスーパーファミリー由来のタンパク質（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）ならびに異なる種の動物由来の相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖ポリペプチド；Reeck et al.: Cell 50: 667, (1987年)を参照のこと。)を含む「共通する進化上の起源」を有する２つのタンパク質の間の関係を意味する。そのようなタンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、パーセント同一性という表現であろうと、特定の残基もしくはモチーフおよび保存位置の存在によろうと、それらの配列類似性によって反映される配列相同性を有する。特定の実施形態において、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、ＣＬＵＳＴＡＬなどの公知の配列比較アルゴリズムにより決定されるように、既定の長さの核酸配列について少なくとも約８５％の、より好ましくは少なくとも約９０％または少なくとも約９５％のヌクレオチドが一致するとき、２つの核酸配列は「実質的に相同である」または「実質的に類似する」。そのような配列の例は本発明の具体的な遺伝子の対立異型または種異型である。実質的に相同な配列はまた、ハイブリダイゼーションによって、例えば、その特定の系について定義されるストリンジェントな条件でのサザンハイブリダイゼーションにおいて同定される可能性がある。
【０１０８】
同様に、本発明の特定の実施形態において、８０％より多くのアミノ酸残基が同一であるとき、または、約９０％以上のアミノ酸残基が類似している（すなわち、機能的に同一である）とき、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同である」または「実質的に類似する」。好ましくは、類似の、または、相同なポリペプチド配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，バージョン７，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）  ｐｉｌｅｕｐプログラムを用いる、または、上記のプログラムおよびアルゴリズムのうちのどれかを用いるアラインメントにより同定される。前記プログラムは、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズムを初期設定値、ギャップクリエーションペナルティー＝−（１＋１／３ｋ）、ｋはギャップ拡張数であり、平均マッチ＝１、平均ミスマッチ＝−０．３３３で用いることができる。
【０１０９】
本明細書において使用されるように、２つ以上の配列を配列マッチングが最大化するように、すなわち、ギャップと挿入を考慮して整列させるとき、「同一性」はそれらの配列での対応する位置における同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味する。Computational Molecular Biology, Lesk AM, Ed., Oxford University Press, New York, (1988年)、Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith DW, Ed., Academic Press, New York, (1993)、Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin AM and Griffin HG, Eds., Humana Press, New Jersey, (1994年)、Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje G, Academic Press, (1987年)およびSequence Analysis Primer, Gribskov M and Devereux J, Eds., M Stockton Press, New York, (1991年)およびCarillo H and Lipman D, SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988年)に記載される方法を含むがこれらに限定されない公知の方法によって同一性を容易に計算することができる。同一性を決定する方法は試験する配列間で最大の一致をもたらすように設計されている。さらに、同一性を決定する方法は公に利用可能なコンピュータプログラムに集約化されている。２つの配列間で同一性を決定するコンピュータプログラム方法にはＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux J et al.: Nucleic Acids Res. 12(1): 387, (1984年))、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ(Altschul SF et al.: J. Molec. Biol. 215: 403-410, (1990年)およびAltschul SF et al.: Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, (1997年))が含まれるがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴ  ＸプログラムはＮＣＢＩおよびその他の情報源から公に利用可能である(BLAST Manual, Altschul SF et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul SF et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, (1990年))。配列間の類似性を決定するために周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム(Smith TF, Waterman MS: J. Mol. Biol. 147(1): 195-197, (1981年))もまた使用することができる。
【０１１０】
用語「インスリン」は、インスリンリスプロ（ｒＤＮＡ起源）：ヒューマログ（１．５ｍＬ，１０ｍＬ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，インディアナポリス，インディアナ州）、ｂｅｅｆおよびｐｏｒｋ由来インスリン注射（レギュラーインスリン）（レギュラーイレチンＩ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ヒト：ｒＤＮＡ：ヒューマリンＲ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ノボリンＲ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，ニューヨーク，ニューヨーク州）、半合成品：ヴェロスリン（ヒト型）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ｒＤＮＡヒト，緩衝化型：ヴェロスリンＢＲ，ｐｏｒｋ：レギュラーインスリン（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、精製ｐｏｒｋ：ｐｏｒｋレギュラーイレチンＩＩ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、レギュラー精製ｐｏｒｋインスリン（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびレギュラー（濃縮型）イレチンＩＩＵ−５００（５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）などの速効型、インスリン亜鉛懸濁液，ｂｅｅｆおよびｐｏｒｋ：レンテイレチンＧＩ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ヒト，ｒＤＮＡ：ヒューマリンＬ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ノボリンＬ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、精製ｐｏｒｋ：レンテイレチンＩＩ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、イソフェンインスリン懸濁液（ＮＰＨ）：ｂｅｅｆおよびｐｏｒｋ：ＮＰＨイレチンＩ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ヒト，ｒＤＮＡ：ヒューマリンＮ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ノボリンＮ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、精製ｐｏｒｋ：ＰｏｒｋＮＰＨイーチンＩＩ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＮＰＨ−Ｎ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）などの中等度作用型、ならびに、インスリン亜鉛懸濁液，持続型（ウルトラレンテ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ヒト、ｒＤＮＡ：ヒューマリンＵ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）などの長時間作用型を含むがこれらに限定されないあらゆる形態のインスリンを包含する。
【０１１１】
用語「測定すること」または「測定」は、臨床試料中の所与の物質か患者由来試料中の所与の物質のどちらかの有無、数量もしくは量（それは有効量であり得る。）を評価することを意味し、そのような物質の定性的または定量的濃度レベルの導出を含み、または、そうでなければ、患者の臨床上のパラメーターの数値もしくはカテゴリー化を評価することを意味する。
【０１１２】
本明細書において使用される用語「食事」は標準食、および／または、混合食を意味する。
【０１１３】
用語「平均」が薬物動態値の前にあるとき（例えば、平均ｔｍａｘ）、それは、特定されない限り、薬物動態値の計算による平均値を表す。
【０１１４】
本明細書において使用される用語「平均基線レベル」は、例えば、 単回臨床試験または複数回臨床試験の組合せにまたがって、比較の基準として用いられるある値の測定、計算またはレベルを意味し、それは統計学的に有意な数の対象についての平均値である。
【０１１５】
用語「複数回投与」は、患者が少なくとも２服用量の薬剤組成物をその組成物の投与間隔にしたがって受容する ことを意味する。
【０１１６】
「神経障害を有する患者」または「神経障害を持つ」患者の文脈での用語「神経障害」は、サンアントニオ糖尿病性神経障害会議において概説された（サンアントニオ糖尿病性神経障害会議報告書および提言 Ann. Neurol. 24 99-104 (1988年)）、簡単に述べると、１）多発性神経障害の臨床徴候、２）神経機能不全の症状、３）少なくとも２つの神経での神経伝達消失、または、４）定量的感覚消失を含む４つの基準のうち少なくとも１つにその患者が合致することを意味する。用語「既成の神経障害」は、サンアントニオ糖尿病性神経障害会議において概説された４つの基準のうち少なくとも２つにその患者が合致することを意味する。用語「初発性神経障害」は、神経伝達消失のみでその他の神経障害の症状を示さない患者に関連している。
【０１１７】
用語「正常なグルコースレベル」は用語「正常血糖の」および「正常な」と互換的に使用され、そして、約６．１ｍｍｏＬ／Ｌ（１１０ｍｇ／ｄＬ）未満の空腹時静脈血漿グルコース濃度に当てはまる。正常血糖よりも高い持続性グルコースレベルは前糖尿病性症状と考えられる。
【０１１８】
本明細書において使用されるように、本発明の文脈における用語「患者」は哺乳類動物であることが好ましい。哺乳類動物はヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであり得るがこれらの例に限定されない。好都合なことにヒト以外の哺乳類をインスリン依存性糖尿病または糖尿病性症状の動物モデルとなる患畜として用いることができる。患者はオスまたはメスであり得る。患者は、インスリン依存性糖尿病または糖尿病性症状を持つと以前に診断され、または、同定され、所望により、糖尿病への治療介入が既に行われた、または、行われているものであり得る。患者はまた糖尿病の長期合併症を患っているものであり得る。その患者はヒトであることが好ましい。
【０１１９】
本明細書において使用される用語「ＰＥＧ」「ポリエチレングリコール」または「ポリ（エチレングリコール）」は任意の水溶性ポリ（エチレングリコール）を意味し、そして、ｎが２から約８００までの整数である−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−の構造を含む分子を包含する。一般に使用されるＰＥＧは末端封止ＰＥＧであり、ＰＥＧの一端はアルコキシ基などの比較的不活性な基で封止され、一方、他方の末端は、さらに修飾することができるヒドロキシル基である。しばしば用いられる封止基はメトキシ基であり、対応する末端封止ＰＥＧはしばしばｍＰＥＧと表示される。ｎｏｔｉｏｎ  ＰＥＧはｍＰＥＧの代わりにしばしば用いられる。本発明の具体的なＰＥＧの形態は分枝状ＰＥＧ，線状ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧなどであり、ＰＥＧ基は多分散系であることが典型的であり、約１．０５未満の多分散指数を有する。本発明の所与の分子量を有するＰＥＧ部分は一定範囲のエチレングリコール（またはエチレンオキシド）モノマーからなることが典型的であるであろう。例えば、分子量２０００ＤａのＰＥＧ部分は、４３±１０個のモノマー、平均約４３個のモノマーからなることが典型的であるであろう。用語「ＰＥＧ化」はＰＥＧのＣ−ペプチドなどの別の分子への共有結合を意味する。
【０１２０】
Ｃ−ペプチドの置換治療法の文脈における用語「置換用量」は、血中のＣ−ペプチドまたはＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのレベルを望ましい範囲内に、特に最小有効治療レベル以上に維持するＣ−ペプチドまたはＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの用量を意味する。ある態様において、置換用量は、投与間隔の間に平均定常状態濃度Ｃ−ペプチドまたはＰＥＧ化Ｃ−ペプチドレベルを約０．１ｎＭの最小レベルよりも高いレベルに維持する。ある態様において、置換用量は、投与間隔の間に平均定常状態濃度Ｃ−ペプチドまたはＰＥＧ化Ｃ−ペプチドレベルを約０．２ｎＭの最小レベルよりも高いレベルに維持する。ある態様において、置換用量は、投与間隔の間に平均定常状態濃度Ｃ−ペプチドまたはＰＥＧ化Ｃ−ペプチドレベルを約０．４ｎＭの最小レベルよりも高いレベルに維持する。
【０１２１】
インスリンまたはＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの投与モードに関して用語「皮下」または「皮下に」または「Ｓ．Ｃ．」は、ボーラス注射として、または、まとめて皮膚と称される真皮および表皮の直下の皮膚の層である皮下組織の中に、または、その下に移植可能な装置を介して投与される薬剤に関連する。皮下投与、および／または、皮下移植に好ましい部位には、上腕の外側の領域、へその近くの周りの領域（２インチの円）を除くウエストの直ぐ上または直ぐ下が含まれる。寛骨の直ぐ後ろの臀部の上部領域。大腿の前部、外側への途中、大腿の上部から４インチ下、膝頭から４インチ上。
【０１２２】
用語「単回投与」は、患者が単回用量の薬剤組成物を受容したこと、または、投与と投与の間に休薬期間を設けて単回用量を繰り返し投与したことを意味する。「単回投与」として、または、「定常状態」でと特に指示されない限り、本明細書において開示され、そして、請求される 薬物動態パラメーターは単回投与条件と複数回投与条件の両方を包含する。
【０１２３】
用語「配列類似性」は、共通の進化上の起源を共有する、または、共有しない可能性がある核酸配列またはアミノ酸配列間の同一性または対応の程度に関連する (前述のReeck et al.を参照のこと。)。しかしながら、一般的な利用法および本願において、用語「相同な」は、「非常に」などの副詞で修飾されるとき、配列類似性を意味することができ、共通の進化上の起源に関連する、または、関連しない可能性がある。 
【０１２４】
「統計学的に有意である」とは、偶然その結果が生じた可能性はないということを意味する。当技術分野において公知の任意の方法により統計学的有意性を決定することができる。ｐ値が一般的に使用される有意性の尺度に含まれ、それは、帰無仮説が真であるとき、観察された事象が生じるであろう頻度または蓋然性のことである。得られたｐ値が有意レベルよりも小さいとき、帰無仮説は棄却される。単純な事例では、有意レベルは０．０５以下のｐ値で定義される。
【０１２５】
本明細書において定義されるように、用語「持続性放出」、「長期放出」または「デポー製剤」は、単回用量の薬剤の直接Ｉ．Ｖ．投与または直接Ｓ．Ｃ．投与の後にその薬剤が有効である期間よりも長い期間にわたって起こる持続性放出組成物または持続性放出装置からのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドなどの薬剤の放出に関連する。１つの態様において、持続性放出は、少なくとも約１〜２週間、約２〜４週間、約１〜２か月、約２〜３か月または約３〜６か月の期間にわたって起こる放出であるであろう。ある態様において、持続性放出は約６か月〜約１年の期間にわたって起こる放出であるであろう。本明細書においてさらによく説明されるように、持続性放出装置（例えば、プログラムで制御できるポンプまたは浸透圧により駆動するポンプ）または持続性放出組成物の種類、および使用するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの種類（例えば、モノマーの比率、分子量、ブロック組成およびポリマー類のさまざまな組合せ）、ポリペプチド負荷、および／または、所望の効果を産み出すための賦形剤の選択が放出の継続と放出のレベルに影響を与えることができる。
【０１２６】
様々な持続性放出プロファイルを本発明の方法のいずれにも従って提供することができる。「持続性放出プロファイル」は、移植／刺入またはその他の薬剤を体内に投与する方法の過程で起こる放出全体のうちの５０％未満の放出が投与後の最初の２４時間の間に起こる放出プロファイルを意味する。本発明の好ましい実施形態において、長期放出プロファイルは、ａ）移植／刺入またはその他の方法による投与後４８時間と７２時間の間の時点に存在する５０％放出ポイント、ｂ）移植／刺入またはその他の方法による投与後７２時間と９６時間の間の時点に存在する５０％放出ポイント、ｃ）移植／刺入またはその他の方法による投与後９６時間と１１０時間の間の時点に存在する５０％放出ポイント、ｄ）移植／刺入またはその他の方法による投与後１週間と２週間の間の時点に存在する５０％放出ポイント、ｅ）移植／刺入またはその他の方法による投与後２週間と４週間の間の時点に存在する５０％放出ポイント、ｆ）移植／刺入またはその他の方法による投与後４週間と８週間の間の時点に存在する５０％放出ポイント、ｇ）移植／刺入またはその他の方法による投与後８週間と１６週間の間の時点に存在する５０％放出ポイント、ｈ）移植／刺入またはその他の方法による投与後１６週間と５２週間（１年）の間の時点に存在する５０％放出ポイント、および、ｉ）移植／刺入またはその他の方法による投与後５２週間と１０４週間の間の時点に存在する５０％放出ポイントからなる群より選択される。
【０１２７】
さらに、持続性放出組成物の使用により薬剤血漿中濃度の「変動度」（「ＤＦＬ」）を減少することができる。ＤＦＬは、薬剤の血漿中レベルが投与間隔の経過にわたってどれほど変化するかということの測定値である（Ｃｍａｘ−Ｃｍｉｎ／Ｃｍｉｎ）。Ｉ．Ｖ．投与などの単純な事例について、消失半減期（Ｔ１／２）と投与間隔の間の関係により変動を判定することができる。投与間隔が半減期に等しいとき、トラフ濃度はまさにピーク濃度の半分であり、変動度は１００％である。したがって、（同じ投与間隔で）低減したＤＦＬを有する持続性放出組成物は、ピークとトラフの血漿中レベルの差が減少したことを意味する。ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの持続性放出組成物を受容する患者が、同じ投与間隔で非長期放出組成物を受容する患者でのＤＦＬのおよそ５０％、４０％または３０％のＤＦＬを有することが好ましい。
【０１２８】
用語「治療すること」または「治療」は、患者において病気の少なくとも１つの症状を除去する、緩和する、遅延させる、低減させる、反転させる、改善する、管理する、または、予防することを意味する。用語「治療すること」はまた発病（すなわち、疾病の臨床状態前の期間）を停止させる、遅延させる、および／または、病気の発生もしくは悪化のリスクを低減させることを意味することもできる。
【０１２９】
本明細書において使用されるように、用語「治療有効量」、「予防有効量」または「診断有効量」は投与後の所望の生物学的応答を引き出すために必要なインスリンまたはＰＥＧ化Ｃ−ペプチドなどの薬剤の量である。
【０１３０】
用語「単位用量形態」はヒト患者および患畜に適切であり、そして、当技術分野において公知であるように個別に包装された物理的に分けられた単位を意味する。本発明の目的のため、治療有効量の薬剤を含む本発明の剤形は、治療効果を達成するために、１以上の単位用量（例えば、経口投与用の錠剤、カプセル剤、粉剤、半固形剤［例えば、ゼラチンカプセル剤またはフィルム剤］、液剤、注射用のアンプルまたはバイアル、充填済みの注射筒）を含有することができると考えられる。本発明の目的のため、剤形の好ましい実施形態は皮下注射可能な剤形であることがさらに考えられる。
【０１３１】
用語「約」または「およそ」は、当業者により決定される特定の数値の許容可能な誤差範囲内であることを意味し、それは、部分的には、その数値が測定された、または、決定された方法、すなわち、測定系の限界に依存するであろう。例えば、「約」は、当技術分野において１実施あたり１標準偏差以上の範囲内であることを意味することができる。あるいは、前記組成物に関して、「約」は２０％までの範囲の、好ましくは１０％までの範囲の、さらに好ましくは５％までの範囲のプラスマイナスを意味することができる。
【０１３２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈の中で明確に示されない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（分子）」への言及はそのような分子の１つ以上を包含し、「ａ  ｒｅａｇｅｎｔ（試薬）」はそのような様々な試薬の１つ以上を包含し、「ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗体）」への言及はそのような様々な抗体の１つ以上を包含し、そして、「ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ（方法）」への言及は、修飾することができるであろう、または、本明細書に記載の方法および医薬組成物に置き換えることができるであろう当業者に公知の同等の工程および方法を包含する。
【０１３３】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は本発明が属する技術分野の当業者により共通して理解されるものと同じ意味を持つ。表Ａに記載の次の略語は本開示のある部分で用いられる。
【表１】
2013533217.tif 000019
【表１−２】
2013533217.tif 000020
【０１３４】
本発明の実施または試験にあたって本明細書において記載されるものに類似の、または、同等の任意の方法、組成物、試薬、細胞を用いることができるが、本明細書に好ましい方法と材料が記載される。
【０１３５】
特許文献および特許申請文献を含むがこれらに限定されない、本明細書において引用される全ての出版物および参考文献は、各出版物または参考文献が完全に記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれていると具体的に、そして、個々に示されているものとして、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本願が優先権を主張する任意の特許申請もまた、出版物と参考文献について上述した様式で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
本発明の実施は、他に示されない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を用いるであろう。そして、それらは当業者の能力の範囲内である。文献中にそのような技術は説明される。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, および T. Maniatis, 1989年, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, 1〜3巻, Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubel, F. M. et al. (1995年および定期的な増補; Current Protocols in Molecular Biology, 9章, 13章, および 16章, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)、B. Roe, J. Crabtree, および A. Kahn, 1996年, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons、J. M. Polak および James O'D. McGee, 1990年, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press、M. J. Gait (編集者), 1984年, Oligo nucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press、D. M. J. Lilley および J. E. Dahlberg, 1992年, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press、Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes 編集のHandbook of Drug Screening, (2001年, New York, N.Y., Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9)、Jane Roskams および Linda Rodgers編集のLab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, 2002年, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3、Harris, JM, および Zalipsky, S,編集 Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications, ACS, Washington, 1997年、Veronese, F., および J.M. Harris, 編集, Peptide and protein PEGylation, Advanced Drug Delivery Reviews, 54(4) 453-609 (2002年)、Zalipsky, S., et al., Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications内の "Use of functionalized Poly(Ethylene Glycols) for modification of polypeptides" を参照のこと。これらの一般的な原本の各々は参照により本明細書に組み込まれる。 
【０１３７】
先に議論した出版物は、本願の提出年月日以前に単に公開を目的として提供されている。本明細書内の何物も、先行発明を理由として本発明がそのような開示よりも先行するといえないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
【０１３８】
１．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
ＰＥＧは多くの水性溶媒および有機性溶媒における優れた溶解性を有する良く知られたポリマーであり、低毒性、免疫原性の欠如を示し、そして、透明、無色、無臭で安定している。これらとその他の理由のため、ＰＥＧは付加に好ましいポリマーとして選択されてきた。しかし、このことは単に例示を目的として用いられたものであり限定を目的としたものではない。ポリビニルアルコール、ポリ（プロピレングリコール）などのようなその他のポリ（アルキレンオキシド）類、ポリ（オキシエチル化グリセロール）などのようなポリ（オキシエチル化ポリオール）類、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルプロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／マレイン酸無水物およびポリアミノ酸類を含むがこれらに限定されないその他の水溶性ポリマーを用いて類似の製品を得ることができる。当業者は、所望の投薬量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性およびその他の考慮事項に基づいて所望のポリマーを選択することができるであろう。
【０１３９】
そのようなポリマーを活性部分と複合体化するための代表的な高分子試薬と方法は、Harris, J.M. および Zalipsky, S.,編集, Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications, ACS, Washington, 1997年、Veronese, F., および J.M. Harris, 編集, Peptide and Protein PEGylation, Advanced Drug Delivery Reviews, 54(4); 453-609 (2002年)、Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J.M. Harris, 編集, Plenus Press, New York (1992年)内のZalipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides"、Zalipsky (1995年) Advanced Drug Reviews 16:157-182、および、Roberts et al., Adv. Drug Delivery Reviews, 54, 459-476 (2002)に記載されている。
【０１４０】
多様なＰＥＧ誘導体が市販されており且つ本発明のＰＥＧ複合体の調製における使用に適している。例えば、ＮＯＦ社のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）シリーズ（ｗｗｗ．ｐｅｇ−ｄｒｕｇ．ｃｏｍ）は、様々な方法によるＣ−ペプチドへのカップリングのためのスクシニミジルエステル、メトキシ−ＰＥＧアミン類、マレイミド類およびカルボン酸類などのメトキシポリエチレングリコール類および活性化ＰＥＧ誘導体を含む多数のＰＥＧ誘導体を提供し、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社のＡｄｖａｎｃｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎもまた治療術の安全性と効果を改善する多様なＰＥＧカップリング技術を提供する。本発明のＣ−ペプチド複合体の形成に用いられるそのほかのＰＥＧ類にはＰｏｌｙｐｕｒｅ社（ノルウェー）、ＱｕａｎｔａＢｉｏＤｅｓｉｇｎ社ＬＴＤ（オハイオ州）およびＳｕｎｂｉｏ，Ｉｎｃ社（韓国）から入手可能なものが含まれる。本発明の複合体の形成における使用に適切なさらなるＰＥＧ試薬と複合体形成方法はPasut. G., et al., Expert Opin. Ther. Patents (2004年),14(6) 859-893に記載される。
【０１４１】
特許、特許出願公開および関連する出版物の検索によっても、本開示を読む当業者に重要で見込みがあるＰＥＧカップリング技術とＰＥＧ誘導体が提供されるであろう。例えば、米国特許第７，０２６，４４０号、第６，８５８，７３６号、第６，８２８，４０１号、第６．６０２，４９８号、第６，４９５，６５９号、第６，４４８，３６９号、第６，４３６，３８６号、第５，９９０，２３７号、第５，９３２，４６２号、第５，９００，４６１号、第５，８２４，７８４号、第５，７３９，２０８号、第５．６７２，６６２号、第５，６５０，２３４号、第５，６２９，３８４号、第５，２５２，７１４号および第４，９０４，５８４号はそのような技術および誘導体およびそれらの製造方法を記載する。これらの内容の全体が参照により組み込まれる。
【０１４２】
本発明によるＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、約４，０００Ｄａ〜８０，０００Ｄａの範囲内で変わる分子量を有するＰＥＧ部分を持つ。分子量の範囲は、典型的には、約４０００Ｄａから約１０，０００Ｄａまで、約１０，０００Ｄａから約２０，０００Ｄａまで、約２０，０００Ｄａから約３０，０００Ｄａまで、約３０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａまで、約４０，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａまで、約５０，０００Ｄａから約６０，０００Ｄａまで、約６０，０００Ｄａから約７０，０００Ｄａまで、および約７０，０００Ｄａから約８０，０００Ｄａまでであろう。ＰＥＧ部分の平均分子量の非限定的な例は、約１０，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、および約８０，０００Ｄａである。
【０１４３】
実質的には全てのＰＥＧポリマーが多様な分子質量の混合物として存在するので、ＰＥＧの分子量（ＭＷ）は数平均（Ｍｎ）分子量、重量平均（Ｍｗ）分子量またはｚ−平均（Ｍｚ）分子量として報告されることが典型的である。この３つのうちで重量平均が、おそらく、最も役に立つ。なぜなら、それが、様々なサイズのポリマー鎖のそのポリマーの全体挙動への寄与をかなり説明し、そして、目的の物理的特質の大半と最もよく相関するからである。
【数１】
2013533217.tif 000021
【数２】
2013533217.tif 000022
【数３】
2013533217.tif 000023
式中、「Ｎｉ」は、ポリマー混合物中の分子量「Ｍｉ」の分子のモル分率（または分子数の分数）である。ＭｗのＭｎに対する比率は多分散指数（ＰＤＩ）として知られており、そして、分布の幅をおおまかに示す。非常に狭いＭＷ分布を有する特別なポリマーではＰＤＩは１．０（下限）に近づく。
【０１４４】
本発明のＰＥＧ基は、典型的には、所与の分子量ではある範囲のエチレングリコール（またはエチレンオキシド、ＯＣＨ２ＣＨ２）モノマーからなるであろう。例えば、分子量２０００ＤａのＰＥＧ基は、典型的には、４３±１０個のモノマーから、平均では約４３〜４４個のモノマーからなるであろう。
【０１４５】
本発明のＰＥＧ基は、典型的には、多数のサブユニットを含むであろう。例えば、本請求の化合物のいずれにおいても各ｎ、ｎ１またはｎ２またはｎ３はそれぞれ独立して約１から約１０００まで、約１から約８００まで、約１から約６００まで、約１から約４００まで、約１から約３００まで、約１から約２００までであり得る。適切なＰＥＧ基は、サブユニットの数（すなわち、ｎ１、ｎ２およびｎ３）が約８００から約１０００まで、約８００から約９５０まで、約６００から約８５０まで、約４００から約６５０まで、約２００から約４５０まで、約１８０から約３５０まで、約１００から約１５０まで、約３５から約５５まで、約４２から約６２まで、約１２から約２５サブユニットまで、約１から１０サブユニットまでからなる群より独立して選択されるものである。ある実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは約４０ｋＤａの分子量を有し、したがって分枝鎖状ＰＥＧ類の各ＰＥＧ鎖のｎ１とｎ２は約４４０〜約５５０または約４５０〜約５２０の範囲内であるであろう。
【０１４６】
前述のいずれかの総分子量を有する分枝型のＰＥＧポリマー（例えば、２つ以上の１０，０００Ｄａ〜２０，０００ＤａのＰＥＧポリマーなどを含む分枝状で４０，０００ＤａのＰＥＧポリマー）も使用することができる。
【０１４７】
本明細書に記載される代表的な分枝状ポリマーには次の一般構造、（ＰＥＧ）ｙ−［コア］−［リンカー］、を有するものが含まれる。
【０１４８】
式中、「［コア］」は、２本以上のＰＥＧアームを伸長している中心分子またはコア分子であり、変数「ｙ」はＰＥＧアームの数を表し、そして、「［リンカー］」は、典型的には、［コア］をＣ−ペプチドに連結する（下記でさらに定義される）任意の連結部分を表す。分枝鎖状ＰＥＧ類のある別の実施形態において、少なくとも１つのポリマーアームはＣ−ペプチドとの反応に適切な末端官能基（例えば、ＮＨＳ部分）を有する。本発明の分枝鎖ポリマーがＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合することが典型的である。
【０１４９】
さらに別の実施形態において、リンカー部分は加水分解に安定なリンカー、または代わりに、分解可能なリンカーのどちらかであることができ、その結合が生理的条件下で加水分解され得ることを意味し、例えば、その結合はエステル、加水分解可能なカルバミン酸エステルまたは他のそのような基を含む。重合体骨格内の分解可能な結合として役立つだけではなく、本発明のある実施形態の場合においては、Ｃ−ペプチドへの水溶性ポリマーの共有結合に役立つ加水分解可能な結合には炭酸エステル、例えば、アミンとアルデヒドの反応から生ずるイミン（例えば、Ouchi et al. (1997年) Polymer Preprints 38(l):582-3を参照のこと。）、例えば、アルコールをリン酸基と反応させることにより形成されるリン酸エステル、例えば、ヒドラジドとアルデヒドの反応により形成されるヒドラゾン、例えば、アルデヒドとアルコールの反応により形成されるアセタール、例えば、ギ酸エステルとアルコールの間の反応により形成されるオルトエステル、および、あるウレタン（カルバミン酸エステル）の結合が含まれる。本発明に従う放出可能なＣ−ペプチド複合体の調製に使用されるＰＥＧ試薬の例は、米国特許第６，３４８，５５８号、第５，６１２，４６０号、第５，８４０，９００号、第５，８８０，１３１号および第６，３７６，４７０号に記載される。放出可能なリンカーはＣ−ペプチド内の任意の残基と結合することができ、そして、Ｎ末端アミノ酸に限定されないことが典型的である。
【０１５０】
上記の式、（ＰＥＧ）ｙ−［コア］−［リンカー］、によって一般的に表されるもののような分枝状ＰＥＧ類は約２本のポリマーアーム〜約８本のポリマーアームを有することができる（すなわち、「ｙ」は２から約８までの範囲である。）。そのような分枝状ＰＥＧ類は、典型的には、２から約４ポリマーアームを有することが好ましい。マルチアームポリマーには２、３、４、５、６、７または８本のＰＥＧアームを有するものが含まれる。
【０１５１】
上述の分枝状ＰＥＧ類におけるコア分子は、その後さらに機能化されるポリオール類を含む。そのようなポリオール類には１から１０個までの炭素原子を有する、および、１から１０個のヒドロキシル基を有する脂肪族ポリオール類が含まれ、それにはエチレングリコオール、アルカンジオール類、アルキルグリコール類、アルキリデンアルキルジオール類、アルキルシクロアルカンジオール類、１，５−デカリンジオール、４，８−ビス（ヒドロキシメチル）トリシクロデカン、シクロアルキリデンジオール類、ジヒドロキシアルカン類、トリヒドロキシアルカン類などが含まれる。脂環型ポリオール類も使用することができ、それにはマンニトール、ソルビトール、イノシトール、キシリトール、ケブラキトール、トレイトール、アラビトール、エリトリトール、アドニトール、ダルシトール、ファコース（ｆａｃｏｓｅ）、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、ソルボース、マンノース、ピラノース、アルトロース、タロース、タジトース（ｔａｇｉｔｏｓｅ）、ピラノース類、ショ糖、ラクトース、マルトースなどのような直鎖糖類または閉環型糖類および糖アルコール類が含まれる。その他の脂肪族ポリオール類にはグリセルアルデヒド、グルコース、リボース、マンノース、ガラクトースの誘導体および関連の立体異性体が含まれる。使用することができるその他のポリオール類にはクラウンエーテル、シクロデキストリン類、デキストリン類およびデンプンやアミロースなどのその他の炭水化物が含まれる。典型的なポリオール類にはグリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトールおよびトリメチロールプロパンが含まれる。その他の適切なコアにはリシンおよびその他のポリアミン類が含まれ、そしてＰＥＧ部分には複数の末端官能基が含まれる。
【０１５２】
２本のアーム、３本のアーム、４本のアームおよび８本のアームを有するマルチアームＰＥＧの例は当技術分野において公知であり、そして、市販されており、および／または、当業者に公知の技術に従ってそれらを調製することができる（Pasut et al., (2004年) Protein, peptide and non-peptide drug PEGylation for therapeutic application Expert Opinin. Ther. Patents 14(6) 859-894を全体として参照のこと。）。本発明のＣ−ペプチド複合体の形成に用いられるその他の分枝状ＰＥＧ類には米国特許出願公開第２００５０００９９８８号、第２００６０１９４９４０号、第２００９０２３４０７０号、第２００７００３１３７１号、米国特許第６，６６４，３３１号、第６，３６２，２５４号、第６，４３７，０２５号、第６，５４１，５４３号、第６，６６４，３３１号、第６，７３０，３３４号、第６，７７４，１８０号、第６，８３８，５２８号、第７，０３０，２７８号、第７，０２６，４４０号、第７，０５３，１５０号、第７，１５７，５４６号、第７，２２３，８０３号、第７，２６５，１８６号、第７，４１９，６００号、第７，４３２，３３０号、第７，４３２，３３１号、第７，５１１，０９４号、第７，５２８，２０２号、第７，５８９，１５７号および国際公開番号第ＷＯ２００５０００３６０号、第ＷＯ２００５１０８４６３号、第ＷＯ２００５１０７８１５号、第ＷＯ２００５０２８５３９号および第ＷＯ２００６０５１０８４６３号に記載されるものが含まれる。
【０１５３】
本明細書において使用される線状ＰＥＧ類またはマルチアームＰＥＧ類の例には以下にさらに記載される一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のＰＥＧ類が含まれる。
【０１５４】
１つの態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは一般式（Ｉ）の線状ＰＥＧを含む。
【化１８】
2013533217.tif 000024
式（Ｉ）
【０１５５】
式中、Ｒ１はアルキル基であり、ｎ１は２０〜８００であり、そして、式中、リンカーは下記に定義され、および、Ｃ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合する。
【０１５６】
別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは一般式（ＩＩ）の分枝鎖状ＰＥＧを含む。
【化１９】
2013533217.tif 000025
式（ＩＩ）
【０１５７】
式中、Ｒ１はアルキル基であり、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００であり、式中、各リンカーは独立して下記のように定義され、そして、式中、Ｃ−ペプチドに連結するリンカーはＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合する。
【０１５８】
式（ＩＩ）のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの１つの実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは構造（ＩＩＡ）を有する。
【化２０】
2013533217.tif 000026
式（ＩＩＡ）
【０１５９】
式中、Ｒ１はアルキル基であり、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００であり、式中、リンカーは下記のように定義され、および、Ｃ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合する。
【０１６０】
別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは一般式（ＩＩＩ）の分枝鎖状ＰＥＧを含む。
【化２１】
2013533217.tif 000027
式（ＩＩＩ）
【０１６１】
式中、Ｒ１はアルキル基であり、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００であり、式中、各リンカーは独立して下記のように定義され、そして、式中、Ｃ−ペプチドに連結するリンカーはＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合する。
【０１６２】
式（ＩＩＩ）のＰＥＧ化 C-ペプチドの１つの実施形態 において、ＰＥＧ化 C-ペプチドは構造（ＩＩＩＡ）を有する。
【化２２】
2013533217.tif 000028
式（ＩＩＩＡ）
【０１６３】
式中、Ｒ１はアルキル基であり、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００であり、そして、式中、リンカーは下記のように定義され、および、Ｃ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合する。
【０１６４】
別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは一般式（ＩＶ）の分枝鎖状ＰＥＧを含む。
【化２３】
2013533217.tif 000029
式（ＩＶ）
【０１６５】
式中、Ｒ１はアルキル基であり、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００であり、そして、式中、各リンカーは独立して下記のように定義され、そして、式中、リシン残基をＣ−ペプチドに連結するリンカーはＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基とリシン残基のＣ末端カルボキレート基に結合し、そして、式中、リシン部分をＰＥＧ部分に連結するリンカーはリシン分子のアミノ基を介して結合する。
【０１６６】
式（ＩＶ）のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの別の実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは構造（ＩＶＡ）を有する。
【化２４】
2013533217.tif 000030
式（ＩＶＡ）
【０１６７】
式中、Ｒ１はアルキル基であり、ｎ１は２０〜８００であり、ｎ２は２０〜８００であり、そして、式中、リンカーは下記のように定義され、および、Ｃ−ペプチドのＮ末端アミノ基に結合する。
【０１６８】
当業者は、Ｃ−ペプチド複合体の形成に用いる線状ＰＥＧ類および分枝鎖状ＰＥＧ類について記載する前述の議論は決して完全無欠というわけではなく、そして、単に例示としているだけであること、および、本明細書に記載される品質を有する全ての高分子物質および分枝状ＰＥＧ構造物が考慮されていることを理解するであろう。さらに、本発明に基づき、当業者は、通常の実験を用いて、例えば、本明細書に記載されるように、前記複合体を患者に投与し、そして、定期的に血液試料および／または尿試料を採取することにより各複合体のクリアランスプロファイルを得ることで別のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの適切なサイズと最適の構造を容易に決定することができる。各試験複合体について一連のクリアランスプロファイルがいったん得られると、所望のクリアランスプロファイルを有する複合体または複合体の混合物を決定することができる。
【０１６９】
２．リンカー部分
Ｃ−ペプチドと水溶性ポリマーの間の特定の結合は、その結合の望ましい安定性、その疎水性、使用される特定の結合化学、および水溶性への影響、およびＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの凝集状態を含む多数の因子に依存する。結合の例は加水分解に安定であり、そして、水溶性の代表的な適切なリンカーはアミド基、ウレタン基（カルバミン酸基としても知られる）、アミン基、チオエーテル基（スルフィド基としても知られる）またはウレア基（カルバミド基としても知られる）の任意の組合せを含むことができる。
【０１７０】
適切な水溶性リンカー部分の多くの例が市販されており、および／または、これらを当業者に公知の技術に従って調製することができる。リンカー部分のある例示的な例は以下に記述される。対応する活性化中間物は下記の表Ｄ１およびＤ２において提供される。
【０１７１】
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの１つの実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは以下より独立して選択される１つ以上のリンカーを含む；
−Ｘ−、−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ２−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−、
−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−Ｘ−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−、−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１Ｘ−、
−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−、
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−Ｘ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−、−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ−および
−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＯ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ２−ＣＯ−。
【０１７２】
式中、各Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−から独立して選択されるか存在せず、各ｍ１は独立して０〜５であり、そして、各ｍ２は独立して１〜５である。
【０１７３】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの別の実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは以下より独立して選択される１つ以上のリンカーを含む；
−Ｘ１−（ＣＨ２）ｍ４−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ４−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ３−ＣＯ−および
−Ｘ１−（ＣＨ２）ｍ２−Ｘ２−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ４−ＣＯ−。
【０１７４】
式中、Ｘ１は−Ｏ−であるか存在せず、Ｘ２は−ＮＨ−であり、ｍ２は独立して１〜５であり、ｍ３は２であり、そして、ｍ４は１〜５である。
【０１７５】
式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの別の実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは以下より独立して選択される１つ以上のリンカーを含む；
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−Ｘ−、
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−（ＣＨ２）ｍ５−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−ＣＯ−および
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ５−ＣＯ−。
【０１７６】
式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−から独立して選択されるか存在せず、Ｘ１は−Ｏ−であるか存在せず、Ｘ２は−ＮＨ−であり、各ｍ５は独立して１〜５より選択され、そして、各ｎ３は独立して１〜４００より選択される。
【０１７７】
式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの別の実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは以下より独立して選択される１つ以上のリンカーを含む；
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−（ＣＨ２）ｍ６−ＣＯ−、
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−ＣＯ−および
−Ｘ１−ＣＯ−Ｘ２−（ＣＨ２）ｍ５−Ｘ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ３−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ７−ＣＯ−。
【０１７８】
式中、Ｘ１は−Ｏ−であるか存在せず、Ｘ２は−ＮＨ−であり、ｍ５は３であり、ｍ６は独立して２または５であり、ｍ７は３であり、そして、ｎ３は１〜４００である。
【０１７９】
式（ＩＶ）のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの別の実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは以下より独立して選択される１つのリンカーを含む；
−Ｘ−、−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｍ２−および−Ｘ１−Ｃ（Ｏ）−Ｘ２−。
【０１８０】
式中、Ｘは−Ｏ−または−Ｓ−または−ＮＨ−であるか存在せず、Ｘ１とＸ２は独立して−ＮＨ−または−Ｏ−から選択されるか存在せず、ｍ２は独立して１〜５である。
【０１８１】
当業者は、Ｃ−ペプチド複合体の形成に用いるリンカー部分について記載する前述の議論は決して完全無欠というわけではなく、そして、単に例示としているだけであること、および、本明細書に記載される品質を有する全てのリンカーが考慮されていることを理解するであろう。
【０１８２】
さらに、本明細書に記載される教示に基づき、当業者は、通常の実験を用いてリンカーの適切なサイズと最適な構造を容易に決定することができる。例えば、様々なリンカー部分を有する多数の異なる市販のＰＥＧ誘導体を試験し、その結果のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの生物学的活性、可溶性および安定性の特徴を調べることによって。
【０１８３】
３．活性化官能基と反応条件
ヒトＣ−ペプチドの唯一の天然遊離アミノ基はＮ末端アミノ基であり、したがって様々な市販の活性化ＰＥＧ類と標準的なカップリング方法を用いてＣ−ペプチドのＮ末端アミノ基への高分子ＰＥＧ基の選択的複合体化を容易に達成することができる。
【０１８４】
ある方法では、スクシニミジル誘導体（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ））のような活性化エステルなどの活性化官能基を介してＣ−ペプチドをＰＥＧ試薬と複合体化する。この方法では、反応性エステルを有するＰＥＧが適切なｐＨ条件下の水性媒質中において室温または４℃で数時間から一晩でＣ−ペプチドと反応する。本明細書に記載されるリンカーを介して前記高分子試薬が活性化官能基に結合することが典型的である。
【０１８５】
やや塩基性のｐＨ条件下の、例えば、約７．５から約８の範囲のｐＨからジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはアセトニトリルまたはそれらの組合せのような極性非プロトン性溶媒中において室温または４℃でＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ基）を有するＰＥＧ試薬を用いるＮ末端ＰＥＧ化を行うことが典型的である。反応時間は典型的には１〜２４時間の範囲であるが、反応のｐＨと温度に依存する。
【０１８６】
シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１０等量）の存在下、４℃、約５〜１０のｐＨという穏やかな条件で約２０〜３６時間アルデヒド基を有するＰＥＧ試薬を用いるＮ末端ＰＥＧ化を行うことが典型的である。例えば、ｐＨ５．０〜６．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液または１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でＮ末端ＰＥＧ化を行うことができる。前記緩衝液は２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムをさらに含むことができる。ｍＰＥＧアルデヒドに対する化合物のモル比は１：５〜１：１０であり得る。それから、外界温度または冷蔵温度でＰＥＧ化物は一晩撹拌される。
【０１８７】
約８〜８．３のｐＨのホウ酸緩衝液またはリン酸緩衝液を用いて室温で一晩ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル基を有するＰＥＧ試薬を用いるＮ末端ＰＥＧ化を行うことが典型的である。
【０１８８】
全てのカップリング反応について、Ｃ−ペプチドに対する高分子試薬の比率を変えることができる。例えば、高分子試薬が等分子数の比率から１０倍分子数が過剰の比率までを用いることができる。典型的には、２倍まで分子数が過剰の高分子試薬が十分である。活性化ＰＥＧ類の例には、例えば、表Ｄ１および表Ｄ２に記載されるものが含まれる。次の表では、選択したＰＥＧ化試薬が記載されている。明らかに、その他の活性基およびリンカーを用いることができ、そして、それらは当業者に公知である。
【表２−１】
2013533217.tif 000031
【表２−２】
2013533217.tif 000032
【表２−３】
2013533217.tif 000033
【表３−１】
2013533217.tif 000034
【表３−２】
2013533217.tif 000035
【０１８９】
反応緩衝液の中和の後に任意の従来の方法、例えば、イロプロピルエーテルを用いる沈殿とその次の逆相ＨＰＬＣまたはイオン交換クロマトグラフィーによりＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを精製することができる。
【０１９０】
４．治療形態のＣ−ペプチド 
本明細書において使用される用語「Ｃ−ペプチド」または「プロインスリンＣ−ペプチド」にはＣ−ペプチド活性を保持する全ての天然型Ｃ−ペプチドおよび合成型Ｃ−ペプチドが含まれる。そのようなＣ−ペプチドにはヒトペプチドならびにその他の種および属、好ましくは、哺乳類に由来するペプチドが含まれる。好ましくは、「Ｃ−ペプチド」はアミノ酸配列ＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱ（表Ｄ３内の配列番号１）を有するヒトＣ−ペプチドを意味する。
【０１９１】
多様な種に由来するＣ−ペプチドの配列が決定され、そして、それらは少なくとも機能的に互換的であると当技術分野において知られている。したがって、ヒト以外の種または属に由来するＣ−ペプチドである異型を選択することは日常的な問題であろう。Ｃ−ペプチドのいくつかのそのような異型（すなわち、その他の種由来の代表的なＣ−ペプチド）が表Ｄ３に示される（配列番号１〜２９を参照のこと。）。
【表４−１】
2013533217.tif 000036
【表４−２】
2013533217.tif 000037
【表４−３】
2013533217.tif 000038
【表４−４】
2013533217.tif 000039
【表４−５】
2013533217.tif 000040
【０１９２】
したがって、ヒトならびにその他の種由来のＣ−ペプチド（配列番号１〜２９）のすべてのそのようなホモログ、オーソログおよび天然アイソフォームが、それらが検出可能なＣ−ペプチド活性を保持する限り、本発明の方法および医薬組成物のいずれにも含まれる。
【０１９３】
Ｃ−ペプチドはその天然型であり得る。すなわち、様々な種において自然に現れる様々な異型であり得る。それらをヒトＣ−ペプチドと機能的に同等の異型として見ることができる。または、それらはＣ−ペプチドの機能的に同等の天然型派生物である可能性がある。それらのアミノ酸配列は、例えば、（例えば、Ｎ末端またはＣ末端または両方からの）短縮または他のアミノ酸欠質、付加、挿入、置換または翻訳後修飾によって、異なる可能性がある。例えば、Ｃ−ペプチドのピログルタミル異型、イソアスパラチル異型、タンパク質分解異型、グリコシル化異型、酸化型異型、異性体化異型および脱アミノ化異型を含むＣ−ペプチドの翻訳後修飾物および分解産物を含む天然の化学的派生物もまた本発明の方法および医薬組成物のいずれにも特に含まれる。
【０１９４】
タンパク質またはペプチドの有益な活性を保持しながらそれらの配列を合成的に修飾することは当技術分野において公知であり、当技術分野において標準的で文献に広く記載される技術、例えば、核酸の無作為突然変異導入もしくは部位特異的突然変異導入、切断および連結を用いて、または、アミノ酸もしくはポリペプチド鎖の化学合成もしくは化学修飾を介してこれを達成することがでる。同様に、Ｃ−ペプチド異型をもちいて免疫原性が生じる場合、例えば、免疫原性の弱い形態を同定するために潜在的なＴ細胞エピトープを特定する自動化コンピュータ認識プログラムおよび指向性進化方法を用いることで免疫原性に関する事項を処理する、および／または、収めることは当技術分野の範囲内である。
【０１９５】
活性が保持される限り、本発明の方法および医薬粗組成物のいずれにおいても任意のそのような修飾物も、または、それらの組合せも作成することができるし、用いることができる。前記分子のＣ末端が活性に重要であることが知られている。それ故、任意のそのようなＣ−ペプチド異型または派生物において、好ましくは、Ｃ−ペプチドのＣ末端が保存されているべきであり、より好ましくは、Ｃ−ペプチドのＣ末端ペンタペプチド（ＥＧＳＬＱ）（配列番号３１）が保存されているべきであり、または、十分であるべきである(Henriksson M et al.: Cell Mol. Life Sci. 62: 1772-1778, (2005年)を参照のこと。）。先に述べたように、アミノ酸配列の修飾はアミノ酸置換によるものである可能性があり、例えば、あるアミノ酸がペプチドの物理化学的特徴を保存する別のアミノ酸に置換される可能性がある（例えば、ＡはＧによって、置換されることができ、逆もまた成り立ち、ＶはＡまたはＬによって置換されることができ、ＥはＤによって置換されることができ、逆もまた成り立ち、ＱはＮによって置換されることができる。）。一般的に、置き換わるアミノ酸は置き換えられるアミノ酸と類似の特質、例えば、疎水性、親水性、電気陰性度、かさ高い側鎖などを有する。
【０１９６】
Ｃ−ペプチド配列の中央部（例えば、ヒトＣ−ペプチドの残基１３〜２５）への修飾により、Ｃ−ペプチドの機能的な派生物または異型を作成することができる。したがって、本発明の方法または医薬組成物のいずれにおいても使用することができるＣ−ペプチドは天然のＣ−ペプチドのアミノ酸配列、例えば、配列番号１のヒトＣ−ペプチド配列または表Ｄ３に示されるその他の天然Ｃ−ペプチド配列のいずれとも実質的に相同である、または、実質的に類似のアミノ酸配列を有する可能性がある。あるいは、Ｃ−ペプチドは表Ｄ３に示される配列番号１〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列と、好ましくは、配列番号１の天然ヒト配列と少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の同一性を持つアミノ酸配列を有する可能性がある。好ましい実施形態において、本発明の方法または医薬組成物のいずれにおいても使用されるＣ−ペプチドは表Ｄ３より選択される配列と少なくとも８０％同一である。別の態様において、本発明の方法または医薬組成物のいずれにおいても使用されるＣ−ペプチドはヒトＣ−ペプチド（配列番号１）と少なくとも８０％同一である。上述したようにＣ−ペプチドの任意のアミノ酸を変えることができるけれども、ヒトＣ−ペプチド（配列番号１）の位置３、１１および２７またはその他の種のＣ−ペプチドにおいて対応する位置もしくは同等の位置にあるグルタミン酸残基が保存されていることが好ましい。配列番号１の位置３、１１および２７にあるグルタミン酸残基（または、対応するＧｌｕ残基）の全てが保存されていることが好ましい。あるいは、ヒトＣ−ペプチドのＧｌｕ２７（または非ヒトＣ−ペプチドの対応するグルタミン酸残基）が保存されていることが好ましい。本発明の方法または医薬組成物のいずれにおいても使用することができるＣ−ペプチドの機能的な同等の形態の例はアミノ酸配列、
ＥＸＥＸＸＱＸＸＸＸＥＬＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡＬＢＸＸＸＱ（配列番号３０）、
ＧＸＥＸＸＱＸＸＸＸＥＬＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡＬＢＸＸＸＱ（配列番号３３）
を含む。
【０１９７】
本明細書において使用されるように、Ｘは任意のアミノ酸である。Ｎ末端残基はＧｌｕかＧｌｙのどちらかであり得る（それぞれ、配列番号３０または配列番号３３）。当技術分野において周知の技術に従い、天然Ｃ−ペプチド配列と機能的に同等の派生物または異型を容易に調製することができ、そして、それには天然Ｃ−ペプチドの機能活性、例えば、生物学的活性を有するペプチド配列が含まれる。
【０１９８】
天然Ｃ−ペプチド配列または合成Ｃ−ペプチド配列の断片もまた、それらが生じたペプチドの望ましい機能上の特質を有する可能性があり、そして、本発明の方法または医薬組成物のいずれにおいても使用することができる。したがって、本明細書において使用される用語「断片」は、その断片がその分子全体の生物学的活性または治療上有益な活性を保持することを条件として、Ｃ−ペプチドの断片を含む。前記断片はまたＣ−ペプチドのＣ末端断片を含むことができる。望ましい断片には、天然Ｃ−ペプチドの残基１５〜３１、さらにとりわけ残基２０〜３１が含まれる。ペンタペプチドＥＧＳＬＱ（配列番号３１）（天然ヒトＣ−ペプチドの残基２７〜３１）を含むペプチドもまた好ましい。したがって、前記断片は、例えば、４〜３０アミノ酸または５〜２０残基にサイズが変わることができる。国際公開第ＷＯ９８／１３３８４号に適切な断片が開示され、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９９】
前記断片はまたＣ−ペプチドのＮ末端断片、典型的には配列ＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬ（配列番号３２）を有する断片を含むことができ、または、２つの酸性アミノ酸残基を含み、前記の２つの酸性アミノ酸残基がそれらのα炭素の間で９〜１４Ａの距離で空間的に分けられている立体構造を適用することができるＣ−ペプチドの断片を含むことができる。Ｎ末端伸長部および／またはＣ末端伸長部または隣接配列を有する断片もまた含まれる。そのような伸長ペプチドの長さは変化することが可能であるが、典型的には５０、３０、２５または２０アミノ酸以下の長さである。代表的な適切な断片は米国特許第６，６１０，６４９号に記載され、これによりその全体が参照によって組み込まれる。
【０２００】
そのような場合、前記の伸長配列または隣接配列は自然の、または、天然のＣ−ペプチドおよび、特に、その断片が由来するＣ−ペプチドに本来備わっていないアミノ酸配列であるということが認識されるであろう。そのようなＮ末端および／またはＣ末端伸長配列または隣接配列は、例えば、１から１０個までの、１から６個までの、１から５個までの、１から４個までの、または、１から３個までのアミノ酸を含む。
【０２０１】
本明細書において使用される用語「派生物」は、したがって、天然配列と比較すると修飾を有するＣ−ペプチド配列またはその断片を意味する。そのような修飾は１つ以上のアミノ酸欠質、付加、挿入および／または置換であり得る。これらは連続的でも非連続的でもあり得る。代表的な異型は、配列番号１〜３３のいずれかと比較すると、１〜６つの、またはより好ましくは、１〜４つの、１〜３つの、または、１つの、または、２つのアミノ酸置換、挿入および／または欠質を有するものを包含することができる。置換されるアミノ酸は任意のアミノ酸、特によく知られた２０種の通常のアミノ酸（アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ））のうちの１つである可能性がある。Ｃ−ペプチドの任意のそのような異型または派生物を本発明の方法または医薬組成物のいずれにおいても使用することができる。
【０２０２】
天然Ｌ−アミノ酸の異性体、例えば、Ｄ−アミノ酸を上記の形態のＣ−ペプチドに組み込むことおよび本発明の方法または医薬組成物のいずれにおいても使用することができる。その他の異型が１つの、または、複数のアミノ酸のアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合ならびに配列内挿入を包含する可能性がある。より長いペプチドは、配列番号１〜３３のいずれかのようなＣ−ペプチド配列のうちの１つ以上の複数のコピーを含む可能性がある。挿入アミノ酸配列異型は１つ以上のアミノ酸残基がタンパク質のある部位に導入されているものである。欠質異型は前記配列からの１つ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。異型は、自然に現れるような、例えば、その他の種に、または、地理上の差異により現れるような、例えば、異なる対立遺伝子の異型を含むことができる。Ｃ−ペプチドの全てのそのような異型、派生物、融合タンパク質または断片を本明細書において開示される方法、請求または医薬組成物のいずれにも包含し、使用することができ、そして、用語「Ｃ−ペプチド」に包含する。
【０２０３】
Ｃ−ペプチドのＰＥＧ化形態、Ｃ−ペプチド異型、派生物およびその断片は、それらが検出可能なＣ−ペプチド活性を持つという点で機能的に同等である。とりわけ、それらは少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、または、１００％よりも高い天然プロインシュリンＣ−ペプチド、特に、ヒトＣ−ペプチドの活性を示す。したがって、それらはプロインシュリンＣ−ペプチドとして機能することができ、すなわち、Ｃ−ペプチドそれ自体に置き換わることができる。そのような活性は、インビボ試験系またはインビトロ試験系において示される生理的反応であろうと天然Ｃ−ペプチドが介在する任意の生物学的活性または反応であろうと、例えば、酵素アッセイにおいて、または、試験組織、膜もしくは金属イオンへの結合において天然Ｃ−ペプチドにより示される任意の活性を意味する。したがって、Ｃ−ペプチドがカルシウム流入を引き起こし、そして、ＥＲＫ１および２、ＣＲＥＢ、ＰＫＣ、ＧＳＫ３、ＰＩ３Ｋ、ＮＦ−κＢおよびＰＰＡＲγのリン酸化を含み、ＭＡＰキナーゼ経路のリン酸化などのある範囲の細胞内シグナル伝達カスケードを開始し、ｅＮＯＳ、Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰａｓｅおよび広範囲の転写因子の発現を上昇することになることが知られている。問題のＣ−ペプチド（例えば、断片または派生物）を内皮細胞、腎臓細胞、線維芽細胞および免疫細胞を含む適切な標的組織由来の細胞に添加または投与してこれらの経路のうちのいずれかの活性化または発現上昇を分析することによりＣ−ペプチド活性のアッセイを行うことができる。そのようなアッセイは、例えば、Ohtomo Y et al. (Diabetologia 39: 199-205, (1996年))、Kunt T et al. (Diabetologia 42(4): 465-471, (1999年))、Shafqat J et al. (Cell Mol. Life Sci. 59: 1185-1189, (2002年))、Kitamura T et al. (Biochem. J. 355: 123-129, (2001年))、Hills およびBrunskill (Exp Diab Res 2008年)に記載されており、国際公開第WO 98/13384号またはOhtomo Y et al. (前述)またはOhtomo Y et al. (Diabetologia 41: 287-291, (1998年))に記載されているもののようである。内皮性一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）活性に基づくウシ大動脈細胞とレポーター細胞アッセイを用いるＣ−ペプチド活性のアッセイもまた Kunt T et al.（前述）に記載されている。Ｃ−ペプチド活性の評価または分析をするために、特定の細胞への結合を用いることもでき、例えば、Rigler R et al. (PNAS USA 96: 13318-13323, (1999年))、Henriksson M et al. (Cell Mol. Life Sci. 57: 337-342, (2000年))およびPramanik A et al. (Biochem Biophys. Res. Commun. 284: 94-98, (2001年))に記載されるように、例えば、蛍光相関分光法を用いてヒト 腎尿細管細胞、皮膚線維芽細胞および伏在静脈内皮細胞由来の細胞膜への結合を用いることができる。
【０２０４】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、哺乳類動物に皮下投与されると、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約５倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを持つ。
【０２０５】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、哺乳類動物に皮下投与されると、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約６倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを持つ。
【０２０６】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、哺乳類動物に皮下投与されると、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約７倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを持つ。
【０２０７】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、哺乳類動物に皮下投与されると、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約８倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを持つ。
【０２０８】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、哺乳類動物に皮下投与されると、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約１０倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを持つ。
【０２０９】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、哺乳類動物に皮下投与されると、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約１５倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを持つ。
【０２１０】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、哺乳類動物に皮下投与されると、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約２０倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを持つ。
【０２１１】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、哺乳類動物に皮下投与されると、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約２５倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを持つ。
【０２１２】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、哺乳類動物に皮下投与されると、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約５０倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを持つ。
【０２１３】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、哺乳類動物に皮下投与されると、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約７５倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを持つ。
【０２１４】
本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、哺乳類動物に皮下投与されると、非修飾型Ｃ−ペプチドよりも少なくとも約１００倍大きい血漿中または血清中薬物動態ＡＵＣプロファイルを持つ。
【０２１５】
１つの態様において、前記哺乳類動物はイヌである。１つの態様において、前記哺乳類動物はラットである。１つの態様において、前記哺乳類動物はヒトである。
【０２１６】
５．Ｃ−ペプチドとＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの製造
標準的な固相ペプチド合成を用いて合成的に、または、組換え技術により、例えば、ヒトプロインシュリンからのヒトインスリン製造における副産物として、または、遺伝子改変宿主を用いてＣ−ペプチドを製造することができる（国際公開第WO 1999007735号、Jonasson P, et al., J Biotechnol. (2000年) 76(2-3):215-26、 Jonasson P, et al., Gene (1998年);210(2):203-10、Li SX, Tian et al., Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai) (2003) 35(11):986-92、Nilsson J, et al.,  J Biotechnol. (1996) 48(3):241-50、Huang YB, et al., Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) (2006) 38(8):586-92を全般的に参照のこと）。
【０２１７】
Ｎ末端へのカップリングを指向する別の方法において、ペプチド合成中にＰＥＧ試薬またはリシン残基をＣ−ペプチドの所望の位置に組み込むことができる。この方法において、１つ以上のＰＥＧの部位選択的導入を達成することができる。例えば、複合体化ペプチドの部位選択的合成について記載する国際特許公開第ＷＯ９５／００１６２号を参照のこと。
【０２１８】
例えば、米国特許第６，５００，６４５号に記載されるようなインスリン生合成に用いられる周知の技術により問題のＣ−ペプチドをコードするＤＮＡ配列を適切な宿主細胞で発現してＣ−ペプチドを製造することができる。Ｃ−ペプチドは直接的に発現されることができ、または、米国特許第６，５５８，９２４号に記載されるように産物の収量を増やすために多量体化したコンストラクトとして発現されることができる。多量体化した産物は培養ブロスから単離した後にインビトロで切断される。
【０２１９】
確立された標準的な方法、例えば、Beaucage et al. (1981年) Tetrahedron Letters 22:1859-1869により記載されるホスフォアミダイト方法またはMatthes et al. (1984年) EMBO Journal 3:801-805により記載される方法によってＣ−ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を合成で調製することができる。ホスフォアミダイト方法によれば、オリゴヌクレオチドが、例えば、自動化ＤＮＡ合成機で合成され、精製され、二本鎖化され、そして、結合されて合成ＤＮＡコンストラクトが形成される。ＤＮＡコンストラクトを調製する現在好まれる方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるものである。
【０２２０】
前記ポリヌクレオチド配列はその起源がゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび合成ＤＮＡの混合である可能性もある。例えば、リーダーペプチドをコードするゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列をＡ鎖およびＢ鎖をコードするゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列に結合することが可能であり、その後、周知の手順に従い相同組換えのため所望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入して、または、好ましくは適切なオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲにより所望の配列を作成して前記ＤＮＡ配列をある部位で修飾することが可能である。
【０２２１】
前記組換え方法は、典型的には、選択した微生物または宿主細胞で複製することが可能であり、本発明の親単鎖インスリンをコードするポリヌクレオチド配列を持つベクターを利用するであろう。前記組換えベクターは自律複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在し、その複製は染色体の複製とは独立しているベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体である可能性がある。
【０２２２】
前記ベクターは自己複製を確実にする何らかの手段を含んでいる可能性がある。あるいは、前記ベクターは、宿主細胞に導入されるとゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものである可能性がある。さらに、１つのベクターもしくはプラスミド、または、宿主細胞のゲノムに組み込まれるＤＮＡ全体をあわせて含む２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンを用いることができる。ベクターは線状プラスミドまたは閉環型プラスミドである可能性があり、好ましくは、ベクターの宿主細胞のゲノムへの安定的な組み込みを可能にするエレメントまたは細胞中でのゲノムと独立したベクターの自律複製を可能にするエレメントを含むであろう。
【０２２３】
前記組換え発現ベクターは酵母内で複製することができる。ベクターが酵母内で複製することを可能にする配列の例は、酵母プラスミド２ｐｍ複製遺伝子ＲＥＰ１〜３および複製起点である。形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つ以上の選択マーカーをベクターが含むことができる。選択マーカーは、その産物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属への耐性、栄養要求株に対して原栄養株などを提供する遺伝子である。細菌用選択マーカーの例はバチルス‐サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくはバチルス‐リケニフォルミス（Ｂｕｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｄａｌ遺伝子またはアンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性もしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーである。糸状菌宿主細胞において用いられる選択マーカーには、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）が含まれる。酵母宿主細胞での適切なマーカーはＡＤＥ２、Ｈ１５３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３である。酵母に適切な選択マーカーはシゾサッカロマイセス‐ポンペ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｐｅ）ＴＰＩ遺伝子（Russell (1985年) Gene 40:125-130)である。
【０２２４】
前記ベクターにおいて、前記ポリヌクレオチド配列は適切なプロモーター配列に機能するように結合している。プロモーターは、変異型プロモーター、短縮型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含み、選択した宿主細胞で転写活性を示す任意の核酸配列である可能性があり、そして、宿主細胞と同種または異種のどちらかの細胞外ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【０２２５】
細菌性宿主細胞において転写を管理するために適切なプロモーターの例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、ストレプトマイセス‐セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、バチルス‐サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス‐リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス‐ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース生産性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス‐アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）およびバチルス‐リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）から得られたプロモーターである。糸状菌性宿主細胞において転写を管理するために適切なプロモーターの例は、アスペルジラス‐オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール‐ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルジラス‐ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼおよびアスペルジラス‐ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）酸安定α−アミラーゼの遺伝子から得られたプロモーターである。酵母宿主において、有用なプロモーターは出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＭａｌ、ＴＰＩ、ＡＤＨまたはＰＧＫのプロモーターである。典型的には、本発明のＣ−ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列はまた適切なターミネーターと機能するように結合されるであろう。酵母において適切なターミネーターはＴＰＩターミネーター(Alber et al. (1982年) J. Mol. AppI. Genet. 1:419-434)である。
【０２２６】
本発明の親単鎖インスリンをコードするポリヌクレオチド配列、プロモーターおよびターミネーターをそれぞれ結合し、選択した宿主での複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するために用いられる手順は当業者に周知である。最初に本発明の単鎖インスリンをコードするＤＮＡ配列全体を含むＤＮＡコンストラクトを調製し、その次にこの断片を適切な発現ベクターに挿入するか、または、個々の要素についての遺伝情報をコードするＤＮＡを順番に挿入し、連結するかのどちらかにより、ベクターを構築することができると理解されるであろう。
【０２２７】
本発明のＣ−ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターが宿主細胞に導入され、ベクターが染色体組み込み体として、または、自己複製染色体外ベクターとして維持される。用語「宿主細胞」は、複製の間に生じる変異のため親細胞と同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞は単細胞微生物、例えば、原核生物または非単細胞微生物、例えば、真核生物である可能性がある。有用な単細胞は、バチルス属の細胞、ストレプトマイセス属の細胞を含むがこれらに限定されないグラム陽性細菌、または、大腸菌およびシュードモナス属の種などのグラム陰性細菌のような細菌細胞である。真核生物細胞は哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞であり得る。１つの実施形態において、宿主細胞は酵母細胞である。酵母生物は、培養すると大量の本発明の単鎖インスリンを産生する任意の適切な酵母生物であり得る。適切な酵母生物の例は、酵母の種である出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス‐クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、シゾサッカロマイセス‐ウバルム（Ｓａｃｃｈｏｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）、クルイベロマイセス‐ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ‐ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア‐パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア‐メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア‐クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ヤロウイア‐イルポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｉｌｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ属の種、カンジダ‐ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ‐カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、ゲオトリクム属の種およびゲオトリクム‐ファーメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）より選択される株である。
【０２２８】
酵母細胞の形質転換は、例えば、自体公知の方法での形質転換の前のプロトプラスト形成により影響を受ける可能性がある。その細胞を培養するために用いられる培地は酵母生物の培養に適切な任意の通常培地である可能性がある。そのかなりの割合が正確にプロセッシングを受けた形態で培地中に存在することになる分泌された単鎖インスリンを従来の技法により培地から回収することができ、それには遠心分離、濾過による培地からの酵母細胞の分離またはイオン交換マトリックスもしくは逆相吸着マトリックスによるインスリン前駆体の捕捉、例えば、硫酸アンモニウムなどの塩を用いた上清もしくは濾液のタンパク質性成分の沈殿、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー技法による精製が含まれる。
【０２２９】
６．使用方法
１つの態様において、本発明は、本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの治療用量を患者に投与することを含み、治療を必要とする患者において最小有効治療レベルよりも上にＣ−ペプチドレベルを維持する方法を包含する。
【０２３０】
別の態様において、本発明は、本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの治療用量を患者に投与することを含み、治療を必要とする患者において１つ以上の糖尿病の長期合併症を治療する方法を包含する。
【０２３１】
別の態様において、本発明は、インスリンと併用して本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの治療用量を患者に投与することを含み、糖尿病の患者を治療する方法を包含する。
【０２３２】
別の態様において、本発明は、治療を必要とする患者においてＣ−ペプチド置換治療法または投薬として用いられる本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのいずれをも包含する。
【０２３３】
広義では、糖尿病は、身体がそれ自身のインスリンに適切に反応できない、または、十分なインスリンを生産しない、または、その両方の状況を意味する。インスリン産生の障害の一次的な結果は、血中のグルコースの蓄積であり、そして、Ｃ−ペプチド欠損により様々な短期の、および長期合併症になる。糖尿病には３つの主要な形態が存在する。
【０２３４】
１型糖尿病：  １型糖尿病は身体がインスリンとＣ−ペプチドを産生することができないことの結果である。糖尿病であると診断される米国人の５〜１０％は１型糖尿病を有すると推定されている。現在では１型糖尿病を有するほぼすべての人物がインスリン注射を携帯しているにちがいない。用語「１型糖尿病」は、小児発症糖尿病、若年性糖尿病およびインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含むそれ以前のいくつかの用語に取って代わっている。１型糖尿病の患者にとって、Ｃ−ペプチドの基礎レベルは典型的には約０．２０ｎＭ未満である(Ludvigsson et al.: New Engl. J. Med. 359: 1909-1920, (2008年))。
【０２３５】
２型糖尿病：  ２型糖尿病は細胞がインスリンに適切に反応できない症状である組織インスリン耐性の結果であり、時には相対的なインスリン欠損と組み合わされる。用語「２型糖尿病」は、成人発症糖尿病、肥満関連糖尿病および非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を含むそれ以前のいくつかの用語に取って代わっている。基礎状態の２型糖尿病患者にとって、約０．８ｎＭのＣ−ペプチドレベル（０．６４〜１．５６ｎＭの範囲）および約５．７ｎＭグルコース刺激レベル（３．７〜７．７ｎＭの範囲）が報告されている(Retnakaran R et al.: Diabetes Obes. Metab. (2009年) DOI 10.11 111/j.1463-1326.2009.01129.x、Zander et al.: Lancet 359: 824-830, (2002年))。
【０２３６】
１型および２型の糖尿病患者に加えて、成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）または成人晩発性自己免疫性糖尿病または「遅発性１型」糖尿病および時にはまた「１．５型」もしくは「１および半分型」糖尿病と称される糖尿病のサブクラスがますます認識されつつある。この疾患では、糖尿病の発症は一般には３５歳以降に起こり、そして、インスリン産生細胞の成分に対する抗体が常に存在し、このことは自己免疫活性がＬＡＤＡの重要な特徴であることを示している。見られるものは主としてグルタミン酸でカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）に対する抗体である。幾人かのＬＡＤＡ患者は肥満指数（ＢＭＩ）の上昇または肥満、インスリン耐性および異常血液脂質を有する２型患者と類似する表現型を示す。ＬＡＤＡの遺伝的特徴は１型および２型の糖尿病の両方の特徴と類似する。糖尿病の初登場の後の最初の６〜１２か月間では患者はインスリン投与を必要としない可能性があり、そして、食事制限および／または経口抗糖尿病薬物療法を介して比較的正常な血糖を維持することができる。しかしながら、最終的には、全ての患者が、おそらく膵島β細胞の漸進的な破壊へと至る進行性自己免疫活性の結果として、インスリン依存性となる。この段階では、ＬＡＤＡの患者は低レベルの内在性インスリンまたはＣ−ペプチドを示すかそれらが存在せず、そして、１型糖尿病患者に類似の末梢神経、腎臓または眼に関する糖尿病の長期合併症を発生しやすく、そして、したがって、Ｃ−ペプチド治療法の候補となる(Palmer et al.: Diabetes 54(suppl 2): S62-67, (2005年)、Desai et al.: Diabetic Medicine 25(suppl 2): 30-34, (2008年)、Fourlanos et al.: Diabetologia 48: 2206-2212, (2005))。
【０２３７】
妊娠性糖尿病：  以前には決して糖尿病を有していなかったが妊娠中に高血糖（グルコース）レベルを有している妊婦が妊娠性糖尿病を得ると言われている。妊娠性糖尿病は全ての妊婦の約４％に悪影響を与える。それは２型（または、まれに１型）糖尿病の発生に先立つ可能性がある。
【０２３８】
いくつかのその他の形態の糖尿病がこれらとは別に分類される。インスリン分泌の遺伝的欠損による先天的糖尿病、嚢胞性繊維症関連糖尿病、高用量のグルココルチコイド類により誘導されるステロイド糖尿病および単一遺伝性糖尿病のいくつかの形態が例に含まれる。
【０２３９】
したがって、これらの方法のいずれにおいても用語「患者」は糖尿病のうちのいずれかの症状のより多くのうちの１つを有する個人を意味する。これらの方法のどれかの１つの態様において、用語「患者」はインスリン依存性糖尿病のうちのいずれかの症状のより多くのうちの１つを有する個人を意味する。これらの方法のどれかの１つの態様において、用語「患者」は２型糖尿病のうちのいずれかの症状のより多くのうちの１つを有する個人を意味する。これらの方法のどれかの１つの態様において、用語「患者」はＬＡＤＡの症状のより多くのうちの１つを有する個人を意味する。これらの方法のどれかの１つの態様において、用語「患者」は妊娠性糖尿病の症状のより多くのうちの１つを有する個人を意味する。したがって、これらの方法のどれかの１つの態様において、用語「患者」は約０．４ｎＭ未満の空腹時Ｃ−ペプチドレベルを有する個人を意味する。これらの方法のどれかの別の態様において、用語「患者」は約０．２ｎＭ未満の空腹時Ｃ−ペプチドレベルを有する個人を意味する。
【０２４０】
糖尿病の急性合併症には、その疾病が適切に管理されないときに生じる可能性がある低血糖症、糖尿病性ケトアシドーシスまたは非ケトン性高浸透圧性昏睡が含まれる。重症の長期合併症も発生する可能性があり、下記でそれらについてより詳しく議論する。
【０２４１】
別の態様において、本発明は、本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの治療用量を患者に投与することを含み、１つ以上の糖尿病の長期合併症を治療する方法を包含する。
【０２４２】
別の態様において、本発明は、インスリンと併用して本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの治療用量を患者に投与することを含み、糖尿病の患者を治療する方法を包含する。
【０２４３】
この文脈で、「併用して」は、１）同じ一体型剤形のうちの部分、２）必ずしも同日ではないが、典型的には同日での別々だが同じ治療処置または治療計画の一部としての投与に当てはまる。１つの態様において、本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのうちのいずれかについては決まった１日用量を投与することができ、インスリンについては必要に応じて摂取することができる。
【０２４４】
別の態様において、本発明は、治療を必要とする患者において１つ以上の糖尿病の長期合併症を治療するために用いられる本特許請求のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのいずれをも包含する。
【０２４５】
これらの方法のいずれにおいても用語「１型糖尿病の長期合併症」または「糖尿病の長期合併症」は血糖制御障害およびインスリン依存性糖尿病に関連するＣ−ペプチド欠乏の長期合併症を意味する。１型糖尿病の長期合併症は１型糖尿病患者に関連することが典型的である。しかしながら、その用語はまた膵島β細胞の喪失の結果としてＣ−ペプチド欠乏を発生し、したがって、インスリン依存性にもなる１．５型および２型糖尿病の患者において生じる糖尿病の長期合併症も意味することができる。広義では、多くのそのような合併症が血管の一次的障害（血管障害）から生じ、結果として生じるその後の問題は（細小血管の障害による）「微小血管障害」と（動脈への障害による）「巨大血管障害」の下でグループ化される。
【０２４６】
用語「糖尿病の長期合併症」の範囲内に含まれる具体的な疾病および疾患には、小動脈瘤を有する初期網膜症、増殖性網膜症および黄斑浮腫を含む網膜症、知覚運動性多発性神経障害、有痛性感覚性神経障害、急性運動神経障害、頭蓋限局性および多巣性多発性神経障害、胸腰部神経根障害、近位糖尿病性神経障害ならびにエントラップメント神経障害および圧迫性神経障害を含む限局性四肢神経障害を包含する末梢神経障害、心臓血管系、胃腸管、呼吸器系、泌尿生殖系、発汗運動機能および乳頭機能に関連する自律神経障害、ならびに、微量アルブミン尿症、顕性タンパク尿症および末期腎不全を有する疾患を含む腎症が含まれるがこれらに限定されない。
【０２４７】
微小循環性灌流の障害が糖尿病患者における神経障害と網膜症の両方の発病に重要であるように見える。これは次に、高血糖介在性の血管内皮性機能の混乱を反映し、プロテインキナーゼＣの過剰活性化、一酸化窒素（ＮＯ）の利用能の低下、スーパーオキサイドとエンドセリン‐１（ＥＴ−１）産生の上昇、インスリン機能の障害、プロスタサイクリン／ＰＧＥ１の合成の減少および白血球の活性上昇と内皮接着という結果になる。これは究極的には破滅的な臨床事象群である。
【０２４８】
したがって、いくつかの実施形態において、用語「患者」は糖尿病の長期合併症の症状のより多くのうちの１つを有する個人を意味する。
【０２４９】
糖尿病性網膜症は微小血管障害に至る細小血管に対する全身性障害の眼における症状である。網膜症では、網膜における脆弱で低品質の新しい血管の成長ならびに黄斑浮腫（黄斑の膨張）が重篤な視力喪失または失明につながる可能性がある。増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）の一部として眼の裏で新しい血管が形成するとき、それらは流血し（出血）、視力をぼんやりとさせる可能性がある。それは、１０年以上糖尿病を有している全ての患者の８０％までに悪影響を与えている。
【０２５０】
糖尿病性網膜症の症状はしばしば進展が遅く、微妙であり、そして、視力のかすみおよび進行性の視力の喪失を含む。より急速に視力喪失の原因となる可能性がある黄斑浮腫は、しばらくは何の警戒サインを有さない可能性がある。しかしながら、一般的に黄斑浮腫を有する人物はかすんだ視力を持つ可能性があり、それが読書や運転などの事をすることが困難となる。いくつかの場合では、視力は１日の間に良くなったり悪くなったりする。
【０２５１】
したがって、いくつかの実施形態において、用語「患者」は糖尿病性網膜症の症状のより多くのうちの１つを有する個人を意味する。
【０２５２】
糖尿病性神経障害は、神経に必要物を供給する細小血管（神経脈管）に関係する糖尿病性微小血管傷害に関連する神経障害性疾患である。糖尿病性神経障害に関連する可能性がある比較的に共通する症状には第３脳神経麻痺、単神経障害、多発性単神経障害、糖尿病性筋委縮、有痛性多発性神経障害、自律神経障害および胸腹部神経障害が含まれる。
【０２５３】
糖尿病性神経障害は全ての末梢神経、つまり痛覚線維、運動ニューロン、自律神経に悪影響を与える。したがって、全てが神経で管理されているので、それは必ず全ての器官と系に悪影響を与える可能性がある。影響される器官系と身体の部分に基づくいくつかの別個の症候群が存在するが、これらは決して他を排除するものではない。患者は知覚運動性自律性神経障害または任意のその他の組合せを持つ可能性がある。影響を受ける神経に応じて症状は変化し、そして、記載されたもの以外の症状を含む可能性がある。たいてい、症状は何年もの間に徐々に進行する。
【０２５４】
糖尿病性神経障害の症状には四肢のしびれと刺痛、知覚異常（身体の部分の知覚の減少または喪失）、下痢、勃起機能不全、尿失禁（膀胱制御の喪失）、インポテンツ、顔、口および瞼の弛み、視力の変化、めまい、筋力低下、嚥下困難、発話障害、線維束性収縮（筋収縮）、無オルガスム症および焼けるような痛みまたは電気の刺激のような痛みが含まれる。
【０２５５】
さらに、神経障害により様々な神経が様々な様式で悪影響を受ける。知覚運動性多発性神経障害では短い神経線維よりも長い神経線維でより影響が大きい。なぜなら、神経伝達速度は神経の長さに比例して遅くなるからである。この症候群では、知覚の減少および反射運動の喪失が最初に各足の足指で起き、次に上方に拡がっていく。それは、通常、しびれのグローブ‐ストッキング分布、感覚の喪失、知覚異常および夜間の痛みとして説明される。その痛みは、焼けるような感覚、刺すような感覚、疼痛または鈍い痛みのように感じる可能性がある。ピンや針で刺されたような感覚が共通する。固有感覚、つまり肢が空間中のどこに存在するかの感覚の喪失が早くに影響を受ける。これらの患者は破片のような異物の上を歩いているとき、または、合わない靴を履いて胼胝ができているときに、感じることができない。結果として、患者は足と脚に潰瘍と感染症を起こす危険性があり、それらの切断に至る可能性がある。同様に、これらの患者は膝頭、踵または足の多発骨折を起こす可能性があり、そして、シャルコー関節症になる可能性がある。運動性機能の喪失は、背屈、足指の拘縮、骨間筋機能の喪失をもたらし、指の収縮、いわゆる槌状足指に至る。これらの拘縮は足だけでなく手でも起こり、筋系の喪失が手を痩せ衰えて骨ばっているように見せる。筋機能の喪失は進行性である。
【０２５６】
自律神経障害は心臓、 胃腸系および泌尿生殖系に機能する自律神経系に影響を与える。糖尿病患者において最も一般に認識される自律 機能不全 は 、立ちあがったときの起立性低血圧または起立性失神である。糖尿病性自律神経障害の場合、それは、血液を絶え間なく十分に脳に流し続けるために心臓と血管が心拍数と血管緊張を適切に調節することに失敗したことに起因する。この症状には正常な呼吸と共に見られる心拍数の通常の変化の喪失がたいてい付随する。これらの２つの所見は自律神経障害を示唆する。
【０２５７】
胃腸系の症状には、胃排出遅延、胃不全麻痺、吐き気、腹部膨満および下痢が含まれる。多くの糖尿病患者が糖尿病のために経口薬を摂取するため、これらの医薬の吸収は胃排出遅延によって大いに影響を受ける。血糖が正常である、または、既に低血糖であるときに経口糖尿病薬が食前に摂られ、数時間後まで、または、時には数日後まで吸収されない場合、これは低血糖症に至る可能性がある。小腸のゆっくりとした動きが細菌の過剰増殖の原因となる可能性があり、高血糖によってそれが悪化する。これによって腹部膨満、ガス発生および下痢になる。
【０２５８】
泌尿生殖系の症状には、頻尿、尿意切迫、尿失禁および尿閉が含まれる。尿閉により 膀胱憩室、膀胱結石、逆流性 腎症および頻繁な尿路感染になる可能性がある。したがって、これらの方法のいずれにおいても用語「患者」は自律神経障害の症状のより多くのうちの１つを有する個人を意味する。
【０２５９】
したがって、いくつかの実施形態において、用語「患者」は糖尿病性神経障害の症状のより多くのうちの１つを有する個人を意味する。これらの方法のどれかの別の態様において、患者は腓腹神経での知覚神経伝達速度（ＳＣＶ）の低下（調和のとれた正常な個人での身長補正基準値−１．５ＳＤ未満）を特徴とする「既成の末梢神経障害」を有している。ある実施形態において、用語「患者」は初発性神経障害の症状のより多くのうちの１つを有する個人を意味する。
【０２６０】
したがって、ある実施形態において、本発明は、対象の、または、患者の身長調節知覚神経伝達速度または運動神経伝達速度の低下を治療する、または、防御する方法を包含する。この方法の１つの態様において、運動神経伝達速度は初期神経伝達速度である。別の実施形態において、運動神経伝達速度はピーク神経伝達速度である。
【０２６１】
ある実施形態において、前記対象は糖尿病の患者である。ある実施形態において、前記対象は少なくとも１つの糖尿病の長期合併症を有する。１つの態様において、患者は、類似の伸長の調和のとれた対象グループについての平均ピーク神経伝達速度から少なくとも約２標準偏差であるピーク神経伝達速度を示す。１つの態様において、患者は３５ｍ／秒よりも速いピーク神経伝達速度を有する。本請求の方法のどれかの１つの態様において、患者は４０ｍ／秒よりも速いピーク神経伝達速度を有する。１つの態様において、患者は４５ｍ／秒よりも速いピーク神経伝達速度を有する。１つの態様において、患者は５０ｍ／秒よりも速いピーク神経伝達速度を有する。
【０２６２】
本請求の方法のどれかの１つの態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約１．５ｍ／秒に改善することになる。これらの方法の別の態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約２．０ｍ／秒に改善することになる。これらの方法の別の態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約２．５ｍ／秒に改善することになる。これらの方法の別の態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約３．０ｍ／秒に改善することになる。これらの方法の別の態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約３．５ｍ／秒に改善することになる。これらの方法の別の態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約４．０ｍ／秒に改善することになる。これらの方法の別の態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約４．５ｍ／秒に改善することになる。これらの方法の別の態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約５．０ｍ／秒に改善することになる。これらの方法の別の態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約５．５ｍ／秒に改善することになる。これらの方法の別の態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約６．０ｍ／秒に改善することになる。これらの方法の別の態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約７．０ｍ／秒に改善することになる。これらの方法の別の態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約８．０ｍ／秒に改善することになる。これらの方法の別の態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約９．０ｍ／秒に改善することになる。これらの方法の別の態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約１０．０ｍ／秒に改善することになる。これらの方法の別の態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約１５．０ｍ／秒に改善することになる。これらの方法の別の態様において、治療により神経伝達速度が少なくとも約２０．０ｍ／秒に改善することになる。
【０２６３】
これらの方法のどれかのある実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法の開始前のピーク神経伝達速度と比較して、治療によりピーク神経伝達速度が少なくとも１０％改善することになる。これらの方法のどれかのある実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法の開始前のピーク神経伝達速度と比較して、治療によりピーク神経伝達速度が少なくとも１５％改善することになる。これらの方法のどれかのある実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法の開始前のピーク神経伝達速度と比較して、治療によりピーク神経伝達速度が少なくとも２０％改善することになる。これらの方法のどれかのある実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法の開始前のピーク神経伝達速度と比較して、治療によりピーク神経伝達速度が少なくとも２５％改善することになる。これらの方法のどれかのある実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法の開始前のピーク神経伝達速度と比較して、治療によりピーク神経伝達速度が少なくとも３０％改善することになる。これらの方法のどれかのある実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法の開始前のピーク神経伝達速度と比較して、治療によりピーク神経伝達速度が少なくとも４０％改善することになる。これらの方法のどれかのある実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法の開始前のピーク神経伝達速度と比較して、治療によりピーク神経伝達速度が少なくとも５０％改善することになる。
【０２６４】
糖尿病性腎症は腎臓糸球体中の毛細血管の血管傷害により引き起こされる進行性腎臓疾患である。それはネフローゼ症候群とびまん性糸球体硬化症を特徴とする。それは長期の糖尿病に起因し、そして、多くの西洋諸国ではそれは透析の第１原因である。
【０２６５】
慢性糖尿病（発症後１５年以上）の患者に糖尿病性腎症の症状を見ることができる。その疾患は進行性であり、男性においてより頻繁に見られる。糖尿病性腎症はアメリカ合衆国での慢性腎不全と終末期腎臓病の最も一般的な原因である。１型と２型の糖尿病を有する両方の人々にリスクがある。血中グルコースレベルの管理が不十分である場合、そのリスクはより高い。さらに、いったん、腎症になると、その血圧の管理が不十分である患者で最も速い進行速度が見られる。その血中のコレステロールレベルが高い人々もその他の人々よりもずっと高いリスクを有する。
【０２６６】
糖尿病性腎症の経過において最も早い段階に検出できる変化は糸球体濾過障壁の異常である。この段階で、腎臓は尿中に正常よりも多くの血清アルブミンの混入を許し始め（アルブミン尿）、そして、鋭敏なアルブミンの医学的検査によりこれを検出することができる。この段階は「微量アルブミン尿」と呼ばれる。糖尿病性腎症が進行すると、結節性糸球体硬化症によって破壊される糸球体が増える。尿中に排泄されるアルブミンの量が増えると、通常の尿分析技術によってそれを検出することができる。この段階では、腎生検は明確に糖尿病性腎症を示す。
【０２６７】
糸球体硬化症によって引き起こされる腎不全により体液濾過欠損および腎臓機能のその他の疾患になる。血圧が増加し（高血圧）、そして、身体中の体液貯留と血漿膠質浸透圧の低下が浮腫の原因となる。その他の合併症は腎動脈の動脈硬化症とタンパク質尿症である可能性がある。
【０２６８】
その初期経過を通じて糖尿病性腎症は症状が無い。それらは後期に発生し、そして、それらは尿中へ多量のタンパク質を排泄した結果である、または、腎不全に起因する可能性がある。症状には浮腫、たいていは午前中に眼の周りに現れる腫脹、後には脚の浮腫みなどの全身的な浮腫みが生じる可能性がある腫脹、（タンパク質尿が原因の）泡のある、または、過剰に泡立つ尿、（体液の蓄積による）意図していない体重の増加、食欲減退（食欲不振）、吐き気および嘔吐、不調（一般的な不快感）、疲労感、頭痛、頻繁な吃逆および掻痒が含まれる。
【０２６９】
したがって、いくつかの実施形態において、用語「患者」は糖尿病性腎症の症状のより多くのうちの１つを有する個人を意味する。
【０２７０】
拡張機能障害と最終的には心不全に至る心臓への損傷である糖尿病性心筋症（ＤＣＭ）。糖尿病では非常に一般的である大血管疾患および加速化アテローム硬化症は別として、ＤＣＭは、糖尿病冠動脈アテローム硬化症と高血圧が無い糖尿病の患者に心室機能不全が発病するときに診断される臨床状態である。ＤＣＭは心室拡張、筋肥大、顕著な間質性線維症、および拡張機能不全の存在下で低下する、または、維持される収縮機能を機能的な特徴とする可能性がある。
【０２７１】
ＤＣＭの１つの特性は長期の潜伏段階であり、その間にその疾患が進行するが完全に症状が無い。大半の場合、ＤＣＭは同時に起こる高血圧または冠動脈疾患と共に発見される。最初期の徴候の１つは心室充満にはほとんど影響が無い穏やかな左心室拡張機能不全である。また、糖尿病の患者は左心室コンプライアンスまたは左心室肥大または両者の組合せに関連するＤＣＭの微妙な徴候を示す可能性がある。頸静脈波の中で顕著な「ａ」波は特筆に値し、そして、心収縮を通して心尖拍動が過剰活動性または持続性である可能性がある。心収縮機能不全、左心室拡張および徴候的な心臓麻痺の発症の後に頸静脈圧が上昇する可能性があり、そして、心尖拍動が下方左に移されるであろう。これらの場合、収縮期の僧房弁雑音はまれである。構造的な心臓病を持たない患者の６０％ではこれらの変化はＤＣＭと関連する可能性がある様々な心電図上の変化に付随する。しかし、たいていは初期の無症状段階ではそうではない。後に症状が進行して、ＱＴ間隔の延長により線維症が示される可能性がある。ＤＣＭの定義が同時に起こるアテローム硬化症と高血圧を排除しているため、肥大と線維症が非常に明白となるこの疾患の非常に後期の段階まで、灌流には、または、心房ナトリウム利尿性ペプチドのレベルには変化が無い。
【０２７２】
ある実施形態において、用語「患者」は糖尿病性心筋症の症状のより多くのうちの１つを有する個人を意味する。
【０２７３】
糖尿病の巨大血管性障害には扁桃炎または心筋梗塞（心臓発作）に至る冠動脈疾患、卒中（主に虚血性）、間欠性跛行（身体運動関連足脚痛）の一因となる末梢血管傷害ならびに糖尿病性足病変および糖尿病性筋壊死が含まれる。
【０２７４】
ある実施形態において、用語「患者」は糖尿病の巨大血管性障害の症状のより多くのうちの１つを有する個人を意味する。
【０２７５】
低血糖症の予防法
ある実施形態において、本発明は、インスリンの投与を追加的に含む処方計画においてヒトのインスリン依存性糖尿病の患者で低血糖症のリスクを低減させるために開示されるＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかを使用することを包含し、その計画は、ａ）前記患者にインスリンを投与すること、ｂ）治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを前記患者のインスリン投与に用いられたのとは別の部位に投与すること、ｃ）前記治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの結果変化した前記患者のインスリン要求性に基づいて投与されるインスリンの投薬量、投薬タイプまたは投薬頻度を調節することを含む。
【０２７６】
別の態様において、本発明は、ヒトのインスリン依存性の患者におけるインスリン利用を低減させる方法を包含し、その方法は以下の段階を含む；ａ）前記患者にインスリンを投与する段階、ｂ）開示されるＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのどれかの治療用量を前記患者のインスリン投与に用いられたのとは別の部位に皮下投与する段階、ｃ）前記治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの結果変化した前記患者のインスリン要求性のモニターに基づき投与されるインスリンの投薬量、投薬タイプまたは投薬頻度を調節する段階であって、前記の調節されたインスリン用量では高血糖症は誘起されず、前記の調節されたインスリン用量はＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療の開始前の前記患者のインスリン用量よりも少なくとも１０％少ない段階。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，８５５，１７７号を参照のこと。）
【０２７７】
これらの方法のいずれにおいても用語「低血糖症」または「低血糖事象」は、患者を危険にさらす可能性がある異常に低い血漿中グルコース濃度の全てのエピソードに当てはまる。米国糖尿病協会のワークグループは、インスリン依存性糖尿病の人に７０ｍｇ／ｄＬ（３．９ｍｍｏＬ／Ｌ）未満の血漿中グルコース濃度の低血糖症を発病する可能性について関心を持つように提言した。したがって、本請求の方法のどれかの１つの態様において、用語「低血糖症」または「低血糖事象」は、患者の血漿中グルコース濃度が約７０ｍｇ／ｄＬ（３．９ｍｍｏＬ／Ｌ）未満まで低下する状況に当てはまる。
【０２７８】
低血糖症は糖尿病の治療における重大な医学的合併症であり、そして、１型糖尿病を有する大半の人と進行した２型糖尿病を有する多くの人で病的状態の再発の原因となり、そして、時には致命的である。さらに、低血糖症は後の血漿中グルコース濃度の低下に対する生理学的な、および、行動上の防御機構を損ない、したがって、再発性低血糖症の悪循環を引き起こす。したがって、低血糖症の予防は糖尿病の治療ならびに糖尿病の長期合併症の治療において非常に重要である。
【０２７９】
不運なことに、低血糖症は１型糖尿病の大半の人にとり人生の現実である(Cryer PE et al.: Diabetes 57: 3169-3176, (2008年))。平均的な患者は無数の無症候性低血糖症のエピソードを有し、そして、週に２つの症候性低血糖症のエピソードに苦しみ、糖尿病の存続期間では数千のそのようなエピソードを有する。彼または彼女は、１年に１つ以上、しばしば癲癇の発作または昏睡状態を伴う重篤で一時的に身体機能を麻痺させる低血糖症のエピソードを経験する。
【０２８０】
全体的にみれば、２型糖尿病では低血糖症は低頻度である。しかしながら、低血糖症のリスクは２型糖尿病の経過の後期になるほど徐々に頻度が高くなり、そして、血糖管理にとって制限的に成る。Ｄｏｎｎｅｌｌｙらの予期的な集団ベースのデータ(Diabetes Med. 22: 749-755, (2005年))は、インスリン治療を受けた２型糖尿病での低血糖症の全体的な発生率は１型糖尿病での発生率のおよそ３分の１であることを示している。全ての低血糖症の発生率、および、重篤な低血糖症の発生率は、それぞれ１型糖尿病では１００人年あたり４，３００エピソードと１１５エピソードであり、それぞれ２型糖尿病では１００人年あたり１６００エピソードと３５エピソードであった。
【０２８１】
低血糖事象の重症度に基づいて低血糖症を分類することができる。例えば、米国糖尿病協会のワークグループは、次の糖尿病における低血糖症の分類を提案している：１）重篤な低血糖症（すなわち、他人の介護を必要とする低血糖症性昏睡）、２）文書化される症候性低血糖症（症状があり血漿中グルコース濃度が７０ｍｇ／ｄＬ未満である）、３）無症候性低血糖症（血漿中グルコース濃度が７０ｍｇ／ｄＬ未満であり症状が無い）、４）おそらく症候性低血糖症（低血糖症に起因する症状を持つが血漿中グルコース測定値が無い）、および５）相対的低血糖症（７０ｍｇ／ｄＬより高い血漿中グルコース濃度を有するがそのレベルに向かってグルコース濃度が低下する）。
【０２８２】
したがって、本明細書に開示される方法のどれかの別の態様において、用語「低血糖症」は重篤な低血糖症および／または低血糖症性昏睡に当てはまる。これらの方法のどれかの別の態様において、用語「低血糖症」は症候性低血糖症に当てはまる。これらの方法のどれかの別の態様において、用語「低血糖症」はおそらく症候性低血糖症に当てはまる。これらの方法のどれかの別の態様において、用語「低血糖症」は無症候性低血糖症に当てはまる。これらの方法のどれかの別の態様において、用語「低血糖症」は相対的低血糖症に当てはまる。
【０２８３】
インスリンの種類と投与形態
様々な長さの活性（活性プロファイル）を提供するように開発されてきた、１８０を超える世界中で入手可能な個々のインスリン製剤が存在する。これらのうちおよそ２５％が可溶性インスリン（非修飾型）であり、約３５％が長期または中期作用型基底インスリンであり（ＮＰＨ［中間型プロタミンハーゲドルン］インスリンまたはレンテインスリン［インスリン亜鉛懸濁液］または等電点が上昇するように修飾された形態［インスリングラルギン］またはアシル化されるように修飾された形態［インスリンデテミル］と混合された基底インスリン。これらの形態は低い可溶性、遅い皮下吸収速度、可溶性インスリンに対して長い作用期間を有する。）であり、約２％が急速作用型インスリン（例えば、アミノ酸交換により操作され、自己会合性が減少し皮下吸収が上昇したインスリン）であり、そして、約３８％がプレミックス型インスリン（例えば、短期作用型インスリン、中期作用型インスリンおよび長期作用型インスリンの混合物。これらの製剤には１日の注射回数を減らす利点がある。）である。
【０２８４】
米国で市販されている短期作用型インスリン製剤にはレギュラーインスリンと急速作用型インスリンが含まれる。レギュラーインスリンは３０〜６０分の作用開始時間、１．５〜２時間の効果のピーク時間および５〜１２時間の活性期間を有する。アスパルト（ノボ  ラピッド）、リスプロ（ヒューマログ）およびグルリジン（アピドラ）などの急速作用型インスリンは１０〜３０分の作用開始時間、約３０分間の効果のピーク時間および３〜５時間の活性期間を有する。
【０２８５】
ＮＰＨインスリンおよびレンテインスリンなどの中期作用型インスリンは１〜２時間の作用開始時間、４〜８時間の効果のピーク時間および１０〜２０時間の活性期間を有する。
【０２８６】
ウルトラレンテインスリンなどの長期作用型インスリンは２〜４時間の作用開始時間、８〜２０時間の効果のピーク時間および１６〜２４時間の活性期間を有する。長期作用型インスリンのその他の例には、グラルギンおよびデテミルが含まれる。グラルギンインスリンは１〜２時間の作用開始時間および２４時間の作用期間を有するがピーク効果は無い。
【０２８７】
多くの場合、糖尿病の管理にインスリンを用いる処方計画は長期作用型インスリンと短期作用型インスリンを組み合わせる。例えば、Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．のランタスは、長期作用型非経口血中グルコース低下剤である組換えヒトインスリン類似体であり、その比較的長い作用期間（２４時間まで）はその比較的遅い吸収速度に直接関係する。ランタスは１日１回、好ましくは就寝時に皮下投与され、正常な膵臓により供給されるインスリンのゆっくりとして安定した（基底の）分泌に類似して、持続的にインスリンを提供するといわれている。そのような長期作用型インスリン活性により、顕著なピークが無い２４時間にわたって比較的に一定した濃度／時間プロファイルが生ずる結果となり、したがって、それが患者の基底インスリンとして長期作用型インスリンが１日に１回投与されることを可能にする。そのような長期作用型インスリンは、投与されると、インスリンへの付加物の力によるというよりもむしろ化学組成物の力による長期作用性効果を有する。
【０２８８】
ＯＭＮＩＰＯＤ（商標）インスリン管理システム（Ｉｎｓｕｌｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，マサチューセッツ州）の商標で販売されているシステムなどのインスリン連続点滴のための自動化無線コントロールシステムがさらに最近になり開発されている。これらのシステムは、２つの個別の部分からなるシステムによる血中グルコース監視技術を用いて連続皮下インスリン送達を提供する。このシステムは毎日のインスリン注射を不要とし、そして、チューブを介して連結される従来のインスリンポンプを必要としない。
【０２８９】
ＯＭＮＩＰＯＤ（商標）は点滴セットのように皮膚上に着用する小さくて軽い装置である。それは、個人用糖尿病マネージャー（ＰＤＭ）から無線で伝達されるプログラム済みの指令によってインスリンを送達する。ＰＤＭは無線方式であり、カスタマイズしたインスリン送達指令でＯＭＮＩＰＯＤ（商標）インスリン管理システムをプログラムし、システムの作動をモニターし、そして、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）の商標で販売されている血中グルコース試験ストリップを用いて血中グルコースレベルを調べるために使用する携帯式の装置である。その装置とＰＤＭをつなぐチューブがない。服の下にＯＭＮＩＰＯＤ（商標）インスリン管理システムを着用し、ＰＤＭを別にバックパック、ブリーフケースまたはハンドバッグに入れて携帯することができる。現在利用可能なインスリンポンプと同様に、ＯＭＮＩＰＯＤ（商標）インスリン管理システムは、複数の基底速度とボーラスオプション、ボーラス計算の示唆、安全点検および警報といった特徴と共に完全にプログラム可能な連続皮下インスリン送達を特色として備える。
【０２９０】
糖尿病患者のインスリン治療の目的は、典型的には、患者が１日を通して生理的範囲内の血中グルコースレベルと正常な炭水化物代謝を持つように、十分なインスリンを投与することである。糖尿病の個人の膵臓は１日を通して十分なインスリンを分泌しないので、インスリン治療法を通して糖尿病を効果的に管理するために、基底インスリンとして知られる、食物が消化されていないときに血中グルコース濃度を制御し、細胞にエネルギーを供給し続けるために必要なインスリンをゆっくりと安定して放出するための長期にわたるインスリン治療が施されなくてはならない。基底インスリンは食間の、および、終夜のグルコース産生を抑制するために必要であり、そして、２４時間の期間にわたる患者の正常な膵臓基底インスリン分泌を模倣していることが好ましい。こうして、糖尿病の患者は約２４時間の作用期間を有する長期作用型インスリンの単回用量を毎日皮下投与することができる。
【０２９１】
さらに、食後のグルコースレベルの上昇に対処することによりインスリン治療法を通して糖尿病を効果的に管理するために、ボーラス速効性治療もまた施されなくてはならない。一般的に皮下投与される、ボーラスインスリンは投与後およそ１時間で血漿中インスリンレベルの上昇をもたらし、それによって食事後の高血糖を制限する。このように、１日の中で食事時間などの患者の血中グルコースレベルが大変高くなる傾向がある時に、これらの追加の量の、例えば、５〜６時間の作用期間を有するレギュラーインスリンを皮下投与することができる。ボーラスインスリンと組み合わせた基底インスリンの投与に代わるものとして、長期作用型基底インスリンの代わりにより低い用量のボーラスインスリンを反復的に、および、定期的に投与することができ、そして、必要に応じてボーラスインスリンを食後に投与することができる。
【０２９２】
現在では、レギュラー皮下注射型インスリンは食事時間の３０〜４５分前に投与することを勧められている。結果として、糖尿病の患者および他のインスリン利用者は彼らの食事と彼らの食事に関係する彼らのインスリン投与について大掛かりな計画に携わらなければならない。不運なことに、インスリンの投与と食事の消化の間に起こる可能性がある介在性事象が、予想されるグルコースの行程に影響を与える可能性がある。
【０２９３】
さらに、投与されたインスリンがあまりにも長い時間にわたって治療効果をもたらす場合、例えば、食事の消化の結果として起こるグルコースレベルの上昇が既に低下した後に、低血糖症の可能性もある。実施例において概説されるように、この低血糖症のリスクは、インスリン必要性の低下のため、Ｃ−ペプチドで処置された患者で増大する。
【０２９４】
したがって、本明細書に開示される方法のどれかの１つの態様において、本発明は、患者に投与されるインスリンの平均１日量をＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法の開始後に約５％〜約５０％だけ低減させることにより、患者の低血糖症を発生するリスクを低減させる方法を包含する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約５％〜約４５％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約５％〜約４０％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約５％〜約３５％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約５％〜約３０％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約５％〜約２５％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約５％〜約２０％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約５％〜約１５％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約５％〜約１０％だけ低減する。
【０２９５】
別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約２％〜約１０％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約２％〜約１５％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約２％〜約２０％だけ低減する。
【０２９６】
別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約１０％〜約５０％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約１０％〜約４５％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約１０％〜約４０％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約１０％〜約３５％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約１０％〜約３０％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約１０％〜約２５％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約１０％〜約２０％だけ低減する。別の態様において、投与されるインスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、少なくとも１０％だけ低減する。
【０２９７】
これらの方法のどれかの１つの態様において、投与される短期作用型インスリンの用量が上述のいずれかの規定範囲だけ選択的に低減する。これらの方法のどれかの別の態様において、投与される中期作用型インスリンの用量が上述のいずれかの規定範囲だけ選択的に低減する。これらの方法のどれかの１つの態様において、投与される長期作用型インスリンの用量が上述のいずれかの規定範囲だけ選択的に低減する。
【０２９８】
これらの方法のどれかの別の態様において、投与される中期および長期作用型インスリンの用量が上述のいずれかの規定範囲だけ独立して低減し、一方、短期作用型インスリンの用量は実質的に不変のままである。
【０２９９】
これらの方法の１つの態様において、投与される短期作用型インスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約５％〜約５０％だけ低減する。別の実施形態において、投与される短期作用型インスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約５％〜約３５％だけ低減する。別の実施形態において、投与される短期作用型インスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約１０％〜約２０％だけ低減する。これらの方法の１つの態様において、食事のために食前に投与される短期作用型インスリンの用量が低減する。これらの方法の別の態様において、午前中または夜間に投与される短期作用型インスリンの用量が低減する。これらの方法のどれかの別の態様において、投与される短期作用型インスリンの用量が低減し、一方、患者に投与される長期作用型および／または中期作用型インスリンの用量は実質的に不変である。
【０３００】
本明細書に開示される方法のどれかの別の態様において、本発明は、患者に投与される中期作用型インスリンの平均１日量をＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法の開始後に約５％〜約３５％だけ低減させることにより患者の低血糖症を発生するリスクを低減させる方法を包含する。これらの方法の１つの態様において、投与される中期作用型インスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約５％〜約５０％だけ低減する。別の実施形態において、ｔｈｅｄｏｓｅｏｆ中期作用型インスリン投与の用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約５％〜約３５％だけ低減する。別の実施形態において、投与される中期作用型インスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約１０％〜約２０％だけ低減する。これらの方法の別の態様において、午前中または夜間に投与される中期作用型インスリンの用量が低減する。これらの方法のどれかの別の態様において、投与される中期作用型インスリンの用量が低減し、一方、患者に投与される短期作用型インスリンの用量は実質的に不変である。
【０３０１】
本明細書に開示される方法のどれかの別の態様において、 本発明は、患者に投与される長期作用型インスリンの平均１日量をＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法の開始後に約５％〜約５０％だけ低減させることにより患者の低血糖症を発生するリスクを低減させる方法を包含する。１つの実施形態において、 投与される長期作用型インスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約５％〜約３５％だけ低減する。別の実施形態において、 投与される長期作用型インスリンの用量が、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療開始前の患者のインスリン用量と比較して、約１０％〜約２０％だけ低減する。これらの方法の別の態様において、午前中または夜間に 投与される長期作用型インスリンの用量が低減する。これらの方法のどれかの別の態様において、投与される長期作用型インスリンの用量が低減し、一方、患者に投与される短期作用型インスリンの用量は実質的に不変である。
【０３０２】
ある好ましい実施形態において、患者は、治療前の基線レベルと比較して、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドでの治療の後に低血糖症を発生するリスクの低減を経験する間にインスリン利用とインスリン感受性の改善を達成する。好ましくは、統計学的に有意なＨＯＭＡ（ホメオスタシスモデル評価）の減少傾向によりインスリン利用とインスリン感受性の改善が測定される(Turner et al.: Metabolism 28(11): 1086-1096, (1979年))。
【０３０３】
典型的には、インスリン投与のために直近で用いられた部位と同じ部位にＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは皮下投与されないであろう。すなわち、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドとインスリンは異なる部位に注射されるであろう。１つの態様において具体的には、ＰＥＧ化投与の部位は、典型的には、インスリン投与のために直近で用いられた部位から少なくとも約１０ｃｍ離れているであろう。別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド投与の部位は、典型的には、インスリン投与のために直近で用いられた部位から少なくとも約１５ｃｍ離れているであろう。別の態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド投与の部位は典型的には、インスリン投与のために直近で用いられた部位から少なくとも約２０ｃｍ離れているであろう。
【０３０４】
異なる部位の例には、例えば、左腕および右腕への注射または左大腿および右大腿への注射または左臀部もしくは右臀部への注射または腹部の反対側への注射が含まれるがこれらに限定されない。異なる部位のその他の明確な異なる形態には、腕および大腿への注射または腕および臀部への注射または腕および腹部への注射などが含まれる。
【０３０５】
さらに、当業者、すなわち医師または糖尿病患者は、インスリン注射の様々な注射部位の選択法についての開示を提供する先行技術教示およびインスリン投与についての多数の教科書およびガイドに基づき、異なる部位のその他の組合せでＰＥＧ化Ｃ−ペプチドとインスリンを投与する方法を認識し、そして、理解するであろう。例えば、次の代表的な教科書 (Learning to live well with diabetes, Cheryl Weiler編集, (1991年) DCI Publishing, Minneapolis, ミネソタ州、American Diabetes Association Complete Guide to Diabetes, ISBN 0-945448-64-3 (1996年))を参照のこと。
【０３０６】
本請求の方法のどれかの１つの態様において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、直近でインスリン投与に用いられた部位に対して腹部の反対側に、およそ１５〜２０ｃｍ離して投与される。
【０３０７】
７．医薬組成物
１つの態様において、本発明は、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドおよび薬剤的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を包含する。
【０３０８】
ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの送達に適切な医薬組成物およびその製剤方法は当業者には容易に明らかとなるであろう。そして、それらは公知の担体、希釈剤または賦形剤のいずれかを含むことができる。そのような組成物とその製剤方法は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第１９版(Mack Publishing Company, 1995年)に見つけることができる。
【０３０９】
１つの態様において、前記医薬組成物は薬剤的に有効な成分の無菌の水溶液および／または懸濁液、エアロゾル、軟膏などの形態であることができる。水溶液である製剤が最も好ましい。そのような製剤は、典型的には、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドそれ自体、水、および安定剤として作用する１つ以上の緩衝液（例えば、リン酸含有緩衝液）、および所望により１つ以上の保存剤を含む。そのような製剤は、例えば、約１〜２００ｍｇ、約３〜１００ｍｇ、約３〜８０ｍｇ、約３〜６０ｍｇ、約３〜４０ｍｇ、約３〜３０ｍｇ、約０．３〜３．３ｍｇ、約１〜３．３ｍｇ、約１〜２ｍｇ、約１〜３．３ｍｇ、約２〜３．３ｍｇまたは本明細書において記述される範囲のいずれか、例えば、約２００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１００ｍｇ、約８０ｍｇ、約６０ｍｇ、約５０ｍｇ、約４０ｍｇ、約３０ｍｇ、約２０ｍｇまたは約１０ｍｇまたは約８ｍｇまたは約６ｍｇまたは約５ｍｇまたは約４ｍｇまたは約３ｍｇまたは約２ｍｇまたは約１ｍｇまたは約０．５ｍｇのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含み、そして、本発明のさらなる態様を構成する。
【０３１０】
医薬組成物はＰＥＧ化 C-ペプチドの薬剤的に許容可能な塩を含むことができる。 適切な塩についての概説について、Stahl および Wermuthによる Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (Wiley-VCH, 2002年)を参照のこと。適切な塩基性塩が非毒性塩を形成する塩基から形成される。代表例には、アルミニウム、アルギニン、ベンザチン、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジオーラミン、グリシン、リシン、マグネシウム、メグルミン、オラミン、カリウム、ナトリウム、トロメタミンおよび亜鉛の塩が含まれる。酸と塩基のヘミ塩、例えば、ヘミ硫酸塩およびヘミカルシウム塩を形成することもできる。１つの実施形態において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを薬剤的に許容可能な正荷電イオンと共にゲルとして調製することができる。
【０３１１】
１つの態様において、前記正荷電イオン は１価の金属イオンであることができる。１つの態様において、前記金属イオンはナトリウムおよびカリウムから選択される。
【０３１２】
１つの態様において、前記正荷電イオンは２価の金属イオンであることができる。１つの態様において、前記金属イオンはカルシウム、マグネシウムおよび亜鉛から選択される。
【０３１３】
ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを１日のどの時間でも投与することができる。ヒトにとって、使用される用量は約０．１から２００ｍｇ／週までのＰＥＧ化Ｃ−ペプチド、例えば、約０．１から０．３ｍｇ／週まで、約０．３〜１．５ｍｇ／週、約１ｍｇ〜約３．５ｍｇ／週、約１．５〜２．２５ｍｇ／週、約２．２５〜３．０ｍｇ／週、約３．０〜６．０ｍｇ／週、約６．０〜１０ｍｇ／週、約１０〜２０ｍｇ／週、約２０〜４０ｍｇ／週、約４０〜６０ｍｇ／週、約６０〜８０ｍｇ／週、約８０〜１００ｍｇ／週、約１００〜１２０ｍｇ／週、約１２０〜１４０ｍｇ／週、約１４０〜１６０ｍｇ／週、約１６０〜１８０ｍｇ／週、および約１８０〜約２００ｍｇ／週の範囲であることができる。
【０３１４】
ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの使用される総１週間量は約１ｍｇ〜約３．５ｍｇ、約１ｍｇ〜約２０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約１５０ｍｇまたは約１５０ｍｇ〜約２００ｍｇであることが好ましい。
【０３１５】
ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの総１週間量は約０．１ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約１．５ｍｇ、約２ｍｇ、約２．５ｍｇ、約３ｍｇ、約３．５ｍｇ、約４ｍｇ、約４．５ｍｇ、約５ｍｇ、約５．５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１２ｍｇ、約１５ｍｇ、約１８ｍｇ、約２１ｍｇ、約２４ｍｇ、約２７ｍｇ、約３０ｍｇ、約３３ｍｇ、約３６ｍｇ、約３９ｍｇ、約４２ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇまたは約２００ｍｇであり得る。（上で言及されるＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの質量は送達システムの生物学的利用能に依存し、そして、およそ４０，０００Ｄａの分子質量を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの使用法に基づくことが認識されるであろう。）
【０３１６】
これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは約１ｍｇから約４５ｍｇまでの範囲の１週間量を含む。これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは約３ｍｇから約１５ｍｇまでの範囲の１週間量を含む。これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは約３０ｍｇから約６０ｍｇまでの範囲の１週間量を含む。これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは約６０ｍｇから約１２０ｍｇまでの範囲の１週間量を含む。
【０３１７】
これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは患者の血漿中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの約０．２ｎＭと約６ｎＭの間の平均定常状態濃度（Ｃｓｓ−ａｖｅ）を維持する。
【０３１８】
これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが、３日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの約０．２ｎＭと約６ｎＭの間の平均定常状態濃度を維持するように患者に提供される。これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが、４日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの約０．２ｎＭと約６ｎＭの間の平均定常状態濃度を維持するように患者に提供される。これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが、５日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの約０．２ｎＭと約６ｎＭの間の平均定常状態濃度を維持するように患者に提供される。これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが、少なくとも１週間の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの約０．２ｎＭと約６ｎＭの間の平均定常状態濃度を維持するように患者に提供される。これらの方法と医薬組成物のいずれかにおいて、毎日の皮下注射により治療用量を投与する。これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、持続性放出製剤または装置により治療用量を投与する。
【０３１９】
これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが、３日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの約０．４ｎＭと約８ｎＭの間の平均定常状態濃度を維持するように患者に提供される。これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが、４日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの約０．４ｎＭと約８ｎＭの間の平均定常状態濃度を維持するように患者に提供される。これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが、５日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの約０．４ｎＭと約８ｎＭの間の平均定常状態濃度を維持するように患者に提供される。これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが、７日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの約０．４ｎＭと約８ｎＭの間の平均定常状態濃度を維持するように患者に提供される。
【０３２０】
これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが、３日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの約０．６ｎＭと約８ｎＭの間の平均定常状態濃度を維持するように患者に提供される。これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが、４日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの約０．６ｎＭと約８ｎＭの間の平均定常状態濃度を維持するように患者に提供される。これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが、５日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの約０．６ｎＭと約８ｎＭの間の平均定常状態濃度を維持するように患者に提供される。これらの方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、治療用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが、７日以上の投与間隔を用いるとき、患者の血漿中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの約０．６ｎＭと約８ｎＭの間の平均定常状態濃度を維持するように患者に提供される。
【０３２１】
前記用量が溶液中に存在することができ、または、存在しないことができる。前記服用量が溶液中に加えられる場合、前記服用量の体積は変化し得ると認識されるであろうが、典型的には、２０μＬ〜２ｍＬであろう。好ましくは、皮下投与の服用量は、２０００μＬ、１５００μＬ、１２００μＬ、１０００μＬ、９００μＬ、８００μＬ、７００μＬ、６００μＬ、５００μＬ、４００μＬ、３００μＬ、２００μＬ、１００μＬ、５０μＬまたは２０μＬの体積中に加えられるであろう。
【０３２２】
溶液中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの服用量は保存剤および／または緩衝剤を含むこともできる。例えば、保存剤であるｍ−クレゾールまたはフェノールを用いることができる。保存剤の典型的な濃度には、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬまたは５ｍｇ／ｍＬが含まれる。したがって、ある範囲の保存剤の濃度には、０．２〜１０ｍｇ／ｍＬ、特に０．５〜６ｍｇ／ｍＬまたは０．５〜５ｍｇ／ｍＬが含まれる可能性がある。使用することができる緩衝剤の例には、ヒスチジン（ｐＨ６．０）、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６〜７．５）または炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ７〜７．５）が含まれる。ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの用量は、天然の、もしくは、完全なＣ−ペプチド、Ｃ−ペプチド断片、Ｃ−ペプチド派生物またはその他の機能的に同等なＣ−ペプチド異型のうちの１つ以上を含むことができると認識されるであろう。
【０３２３】
８．投与方法
ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの１回分の用量はヒトＣ−ペプチド（配列番号１）の全長およびＣ末端Ｃ−ペプチド断片ＥＧＳＬＱ（配列番号３１）および／またはＣ−ペプチドホモログまたはＣ−ペプチド派生物を含むことができる。さらに、前記用量は、必要に応じて、Ｃ−ペプチドの断片、例えば、ＥＧＳＬＱを含むだけであり得る。したがって、用語「Ｃ−ペプチド」は単一のＣ−ペプチド実体または様々な「Ｃ−ペプチド」の混合物を包含することができる。ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの投与は、経口投与、非経口投与、局所投与または皮下投与、吸入または持続性送達装置もしくは組成物の移植を含む医療技術分野で公知の適切な方法によるものであることができる。１つの態様において、投与は皮下投与によるものである。
【０３２４】
経口投与に適切な本発明の医薬組成物は、例えば、前記薬剤を胃での分解から保護する１つの外被または複数の外被（腸溶カプセル）により好んで被覆される無菌で精製されたストックパウダー形態のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含み、それによりこれらの物質の歯肉からの吸収または小腸での吸収を可能にすることができる。前記組成物中の有効成分の全量は９９．９９〜０．０１重量％まで変化することができる。
【０３２５】
経口投与のために、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含む医薬組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤などの形態をとることができる。ポリビニルピロリドン、ショ糖、ゼラチンおよびアラビアゴムなどの結着剤と共に、デンプンおよび、好ましくは、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプンおよびある種の複合ケイ酸塩などの様々な崩壊剤に加えて、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムおよびリン酸カルシウムなどの様々な賦形剤を含む錠剤が用いられる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの滑沢剤がしばしば成形目的に非常に有益である。同種の固形組成物を軟質および重質充填ゼラチンカプセルに充填剤として用いることもできる。この点で好ましい材料には、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール類が含まれる。水性懸濁液および／またはエリキシル剤が経口投与に望ましいとき、本発明の化合物を様々な甘味剤、着香剤、着色剤、乳化剤および／または懸濁剤ならびに水、エタノール、プロピレングリコールおよびその様々な同様の組合せ物などの希釈剤と組み合わせることができる。
【０３２６】
非経口投与に適切な本発明で使用される医薬組成物は、好ましくは受容者の血液と等張にされた、薬剤的に有効な成分の無菌の水性溶液および／または懸濁液であることが典型的である。そのような組成物は、塩化ナトリウム、グリセリン、グルコース、マンニトール、ソルビトールなどのような賦形剤、塩、炭水化物および（好ましくは３から９までのｐＨに緩衝する）緩衝剤を一般的に含む。
【０３２７】
いくつかの応用のために、無菌の非水性溶液として、または、無菌の発熱物質の無い水などの適切な賦形剤と合わせて使用される乾燥形態として非経口投与用の医薬組成物を適切に製剤することができる。無菌条件下での非経口製剤の調製、例えば、凍結乾燥による調製は当業者に周知の標準的製薬技術を用いて容易に成し遂げることができる。
【０３２８】
本発明で使用されるＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含む医薬組成物を皮膚または粘膜に局所投与、経皮（皮内）投与または経皮投与することもできる。即放性および／または徐放性であるように局所投与用の医薬組成物を製剤することができる。徐放性製剤には、遅延性放出、持続性放出、パルス性放出、制御性放出、標的型放出およびプログラム型放出が含まれる。この目的のための典型的な製剤には、ゲル剤、ヒドロゲル剤、外用水薬、溶液、クリーム剤、軟膏、粉剤、被覆材、泡剤、フィルム剤、皮膚パッチ剤、ウェハー剤、移植剤、スポンジ剤、線維剤、包帯剤およびミクロ乳剤が含まれる。リポソームを使用することもできる。典型的な担体には、アルコール、水、鉱物油、液体ワセリン、白色ワセリン、グリセリン、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールが含まれる。透過促進剤を組み込むことができる。例えば、Finnin and Morgan: J. Pharm. Sci. 88(10): 955-958, (1999年)を参照のこと。局所投与のその他の方法には、電気穿孔法、イオントフォレーシス、フォノフォレーシス、ソノフォレーシスおよびマイクロニードルもしくはニードルフリー（例えば、ＰＯＷＤＥＲＪＥＣＴ（商標）、ＢＯＪＥＣＴ（商標））注射による送達が含まれる。
【０３２９】
非経口投与用のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの医薬組成物を、血流に、筋肉に、または、内臓に直接投与することができる。非経口投与に適切な方法には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、脳室内投与、尿道内投与、胸骨内投与、頭蓋内投与、筋肉内投与、滑膜内投与および皮下投与が含まれる。非経口投与に適切な装置には、ニードル（マイクロニードルを含む）注射器、ニードルフリー注射器および点滴技術が含まれる。
【０３３０】
典型的には、直近でインスリン投与に用いられた部位と同じ部位にＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは皮下投与されないであろう。本請求の方法と医薬組成物のどれかの１つの態様において、直近でインスリン投与に用いられた部位に対して腹部の反対側にＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが投与される。本請求の方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、上腕にＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが投与される。本請求の方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、腹部にＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが投与される。本請求の方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、臀部の上部にＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが投与される。本請求の方法と医薬組成物のどれかの別の態様において、大腿の前部にＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが投与される。
【０３３１】
非経口投与用製剤を、即放性および／または持続放出性であるように製剤することができる。持続性放出組成物には、遅延性放出、徐放性放出、パルス性放出、制御性放出、標的型放出およびプログラム型放出が含まれる。したがって、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを懸濁液として、または、持続性放出をもたらす移植型デポのような投与用の固形物、半固形物または揺変性液体として製剤する可能性がある。そのような製剤の例には、薬剤コーティングステントおよび薬剤コーティング半固形物、および薬剤が負荷された（ＤＬ−乳酸−グリコール酸）共重合体（ＰＧＬＡ）、（ＤＬ−ラクチド−グリコリド）共重合体（ＰＬＧ）またはポリ乳酸（ＰＬＡ）の層状小胞またはミクロ粒子、ヒドロゲル剤(Hoffman AS: Ann. N.Y. Acad. Sci. 944: 62-73 (2001年))、Ｆｌａｍｅｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．により開発されたＭｅｄｕｓａシステムなどのポリアミノ酸ナノ粒子システム、Ａｔｒｉｘ，  Ｉｎｃ．により開発されたＡｔｒｉｇｅｌおよびＤｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより開発されたＳＡＢＥＲ（ショ糖酢酸イソ酪酸エステル長期放出）などの非水性ゲルシステム、およびＳｋｙｅＰｈａｒｍａにより開発されたＤｅｐｏＦｏａｍなどの脂質ベースシステムを含む懸濁液が含まれるがこれらに限定されない。
【０３３２】
所望の用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを長期にわたって送達することができる持続性放出装置は当技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，０３４，２２９号、第５，５５７，３１８号、第５，１１０，５９６号、第５，７２８，３９６号、第５，９８５，３０５号、第６，１１３，９３８号、第６，１５６，３３１号、第６，３７５，９７８号、および第６，３９５，２９２号は、溶液または懸濁液などの活性剤製剤を所望の速度で長期にわたって（すなわち、１週間より長く１年以上までの範囲の期間）送達することができる浸透圧駆動性装置を教示する。その他の持続性放出装置の例には、例えば、ＯｍｎｉＰｏｄ（商標）インスリン管理システム（Ｉｎｓｕｌｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｏｄｍａｎ，Ｒａｙｎｈａｍ，マサチューセッツ州、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ミネソタ州、Ｉｎｔａｒｃｉａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，カリフォルニア州、およびＴｒｉｃｕｍｅｄ  Ｍｅｄｉｎｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ，ドイツ）から入手可能であり、有益作用剤製剤の一定流量、調節可能流量またはプログラム可能流量をもたらす調節器タイプのポンプが含まれる。さらなる装置の例は米国特許第６，２８３，９４９号、第５，９７６，１０９号、第５，８３６，９３５号、および第５，５１１，３５５に記載される。
【０３３３】
治療レベルの所望の活性剤を長期にわたって送達するように設計されているので、医療提供者を頻繁に訪れることなく、または、自己投薬を繰り返すことなく、移植可能な送達システムにより所望の活性剤の長期治療投与が、好都合なことに、もたらされ得る。したがって、移植可能送達装置は、患者の服薬コンプライアンスを向上し、投与部位でのかぶれを低減し、医療提供者の職業事故を少なくし、廃棄危険物を低減し、そして、投薬管理の向上を通じた治療効力が上昇するように機能することができる。
【０３３４】
移植した送達装置から生体分子物質を長期にわたって送達しようと努めるとき、様々な問題の中でも、２つの問題が処理されなければならない。第１に、前記生体分子物質は、その装置の作動寿命にわたって上昇した温度（すなわち、３７℃以上）でその物質の安定性を実質的に維持する製剤内に含まれていなければならない。第２に、長期にわたって移植された装置から所望の作動環境に前記生体分子物質を送達することを可能にするように、その生体分子物質が製剤されなければならない。前記生体分子物質が、低流速（すなわち、≦１００μＬ／日）で長期にわたって装置から送達される流動性組成物に含まれる場合、この２番目の問題は特に困難であることが判明している。
【０３３５】
脱アミド、酸化、加水分解およびラセミ化を含むいくつかの異なる機構のうちの１つ以上を介してＣ−ペプチドのようなペプチド薬剤が分解する可能性がある。意義深いことには、関連のある分解経路の多くで水は反応物質である。さらに、水は可塑剤として作用し、生体分子物質の構造変性と不可逆的な凝集を促進する。生体分子物質の水性製剤により作られた安定性の問題を克服するために、公知の凍結乾燥技術、スプレー乾燥技術または脱水技術によるような公知の造粒プロセスを用いて生体分子物質の乾燥粉末製剤が作られている。生体分子物質の乾燥粉末製剤が適切な安定性という特徴をもたらすことが示されているが、長期にわたって安定なだけではなく、流動可能であり、移植可能な送達装置から容易に送達可能でもある製剤を提供することが望ましいであろう。
【０３３６】
したがって、本請求の方法と医薬組成物のどれかの１つの態様において、非水性薬剤製剤中にＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが提供され、持続性放出型移植可能装置からＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが送達され、その装置において、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは３７℃で少なくとも２か月間の間は安定である。
【０３３７】
ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド用の代表的な非水性製剤には、ポリマー、溶剤および界面活性剤のうちの少なくとも２つを使用して製剤される非水性賦形製剤について記載する国際公開第ＷＯ００／４５７９０号において開示されるものが含まれる。
【０３３８】
国際公開第ＷＯ９８／２７９６２号は、ポリマー、そのポリマーを溶解して粘性があるゲルを形成することができる溶剤、有益薬剤、および乳化剤を含み、粘性があるゲル中に分散する液滴相の形態である注射可能デポゲル組成物を開示する。
【０３３９】
国際公開第ＷＯ０４０８９３３５号は、ポリマーと溶剤の組合せを用いて形成される水混和性の賦形剤になる非水性賦形剤を開示する。本明細書において使用されるように、用語「水混和性の」は、溶剤由来のポリマーが相分離することなく、選択した作動環境に典型的な温度範囲で水と全ての比で、非常に粘性があるポリマー相が形成されるように混合され得る賦形剤に当てはまる。本発明の目的にとって、「非常に粘性があるポリマー相」は、賦形剤が水と混合される前の賦形剤の粘性よりも高い粘性を示す組成物を含むポリマーに当てはまる。
【０３４０】
したがって、本請求の方法のどれかの別の態様において、少なくとも１つの薬剤送達口を有する貯留槽および安定な非水性薬物製剤を含む持続性放出装置中にＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが提供される。これらの方法と医薬組成物の１つの態様において、その製剤は少なくともＰＥＧ化Ｃ−ペプチド、および少なくとも１つのポリマーと少なくとも１つの溶剤を含む非水性単一相賦形剤であって水混和性の賦形剤をふくみ、その中で前記薬剤が１つ以上の賦形剤成分に不溶性であり、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド製剤が３７℃で少なくとも２か月間安定である。１つの態様において、前記溶剤は、グリコフロール、ベンジルアルコール、テトラグリコール、ｎ−メチルピロリドン、グリセロールホルマール、プロピレングリコールおよびその組合せからなる群より選択される。
【０３４１】
特に、２か月の期間製剤を３７℃に維持した後にＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのわずかに約３５％が酸化、脱アミド化および加水分解などの化学的経路により分解される場合、非水性製剤は化学的に安定であると考えられ、同じ条件で製剤中に含まれるＣ−ペプチドのわずかに約１５％が凝集を通して劣化する場合、その製剤は物理的に安定であると考えられる。３７℃で約２か月経った後にＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの少なくとも約６５％が物理的に、そして、化学的に安定なままでいる場合、本発明によれば薬物製剤は安定である。
【０３４２】
ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを鼻腔内に、または、吸入により、典型的には、乾燥粉末の形態で（単体で、例えば、ラクトースとの乾燥混合物の形態の混合物として、または、例えば、ホスファチジルコリンなどのリン脂質と混合された混合成分粒子としてのどれかで）乾燥粉末吸入器から、１，１，１，２−テトラフルオロエタンまたは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンなどの適切な噴霧剤を使用して、または、使用せずにエアロゾルスプレーとして加圧コンテナ、ポンプ、スプレー、噴霧器（好ましくは、細かい霧を作成する電気流体力学を用いる噴霧器）またはネブライザーから、または、点鼻剤として投与することができる。鼻腔内使用のために、前記粉末は、例えば、キトサンまたはシクロデキストリンのような生体付着剤を含むことができる。加圧コンテナ、ポンプ、スプレー、噴霧器またはネブライザーは、例えば、エタノール、水性エタノールまたは活性成分の分散、可溶化または長期放出に適切なその他の薬剤、溶剤としての噴出剤およびソルビタントリオレエート、オレイン酸またはオリゴ乳酸などの任意の界面活性剤を含む本発明の化合物の溶液または懸濁液を含有する。
【０３４３】
乾燥粉末製剤または懸濁液製剤での使用の前に、前記薬剤製品は吸入による送達に適切なサイズ（典型的には５μｍ未満）に微粒子化される。スパイラルジェット製粉、流動層製粉、ナノ粒子形成用超臨界流体プロセッシング、高圧均質化または噴霧乾燥などの任意の適切な方法によりこれを達成することができる。
【０３４４】
吸入装置により送達される製剤における本発明のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの粒子サイズは、Ｃ−ペプチドが肺、そして好ましくは、下気道または肺胞に入り込む能力にとって重要である。送達されたＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの少なくとも約１０％が肺に沈着し、好ましくは約１０％〜約２０％が、または、それ以上が肺に沈着するように本発明のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを製剤することが好ましい。サイズが約２ｐｍ〜約３ｐｍの粒子で口呼吸するヒトの肺への沈着の最大効率が得られることが知られている。粒子のサイズが５ｐｍを超えると、肺への沈着は実質的に減少する。サイズが約１ｐｍより小さい粒子は肺への沈着が減少する原因となり、そして、治療上有効であるのに十分な量の粒子を送達することが困難になる。したがって、吸入により送達されるＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの粒子は約１０ｐｍ未満の粒子サイズを有することが好ましく、約１ｐｍ〜約５ｐｍの範囲にあることがより好ましい。選択した吸入装置における所望の粒子サイズをもたらすようにＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの製剤を選択する。
【０３４５】
乾燥粉末としての投与に好都合なことに、本発明のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは約１０ｐｍ未満の、好ましくは約１〜５ｐｍの粒子サイズの特定の形態に調製される。好ましい粒子サイズは患者の肺の肺胞への送達に有効である。乾燥粉末が主として、粒子の大部分のサイズが所望の範囲にあるように製造された粒子からなることが好ましい。好都合なことに、乾燥粉末の少なくとも約５０％が約１０ｐｍ未満の直径を有する粒子からなる。噴霧乾燥、製粉または本発明のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドおよびその他の所望の成分を含有する溶液の臨界点濃縮により、そのような製剤を達成することができる。本発明において有用な粒子の作製にも適切なその他の方法は当技術分野において公知である。
【０３４６】
前記粒子は通常、コンテナ中の乾燥粉末製剤と分離しており、その後、キャリア気流により患者の肺に輸送される。典型的には、現在の乾燥粉末吸入器では、固形物を粉砕する力は患者の吸入のみによってもたらされる。別のタイプの吸入器では、患者の吸入により作られた気流が粒子の塊を壊す羽根車モーターを活性化する。
【０３４７】
吸入器または注入器で用いられる（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースから作られる)カプセル、 ブリスターおよびカートリッジは、本発明の化合物、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉体ベース、および１−ロイシン、マンニトールまたはステアリン酸マグネシウムなどの性能調整剤の混合粉末を含むように製剤されることができる。ラクトースは無水 または１水和物の形態であることができ、後者が好ましい。その他の 適切な 賦形剤には、デキストラン、グルコース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、ショ糖およびトレハロースが含まれる。
【０３４８】
細かい霧を作成するために電気流体力学を用いる噴霧器に適切な溶液製剤は１回の作動に付き１００μｇから２００ｍｇまでのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含有することができ、作動体積は１μＬから１００μＬまで変化することができる。典型的な製剤はＰＥＧ化Ｃ−ペプチドプロピレングリコール、滅菌水、エタノールおよび塩化ナトリウムを含むことができる。プロピレングリコールの代わりに用いることができるその他の溶剤には、グリセロールおよびポリエチレングリコールが含まれる。メントールおよびレボメントールなどの適切な香料またはサッカリンもしくはサッカリンナトリウムなどの適切な甘味料を吸入投与／鼻腔内投与向けの本発明のそれらの製剤に添加することができる。吸入投与／鼻腔内投与用の製剤は即放性および／または徐放性であるように、例えば、ＰＧＬＡを用いて製剤され得る。徐放性製剤には、遅延性放出、持続性放出、パルス性放出、制御性放出、標的型放出およびプログラム型放出が含まれる。
【０３４９】
乾燥粉末吸入器とエアロゾル剤の場合、定量を送達するバルブを用いて投薬量を判定する。本発明による単位は、典型的には、１ｍｇから２００ｍｇまでのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含む定用量または「ひと吹き」を投与するように整えられている。総１日量は典型的には、単回投与で投与することができ、または、より一般には分割投与として１日を通して投与することができる１ｍｇ〜２００ｍｇの範囲にあるであろう。
【０３５０】
本発明の実施に適切な市販されている吸入装置の例は、ＴＵＲＢＨＡＬＥＲ（商標）（Ａｓｔｒａ）、ＲＯＴＡＨＡＬＥＲ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、ＤＩＳＫＵＳ（登録商標）、ＳＰＩＲＯＳ（商標）吸入器（Ｄｕｒａ）、ＡＥＲＸ（商標）（Ａｒａｄｉｇｍ）の商標の下Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにより市場に出されている装置、およびＵＬＴＲＡＶＥＮＴ（登録商標）噴霧器（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、ＡＣＯＲＮ  ＩＩ（登録商標）噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＶＥＮＴＯＬＩＮ（登録商標）計量投与吸入器（Ｇｌａｘｏ）およびＳＰＩＮＨＡＬＥＲ（登録商標）粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ）などの商標のもと市販されている。
【０３５１】
キットもまた本発明に考慮される。典型的なキットは、薬剤的に許容可能な製剤にＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを含むＰＥＧ化Ｃ−ペプチド製剤用の容器、好ましくはバイアル、および説明書および／または製品パンフレットもしくは製品ラベルを含むであろう。１つの態様において、低血糖症のリスク、発生または重症度を低減するために、説明書にはインスリン依存性患者に前記ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを投与するための投与計画が含まれる。１つの態様において、キットには、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法を開始するとき、インスリンの投与を約５％〜約３５％だけ低減させるための説明書が含まれている。別の態様において、説明書には、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法を開始するとき、血中グルコースレベルを綿密にモニターするようにとの患者への指示が含まれている。別の態様において、説明書には、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド治療法を開始するとき、患者が低血糖症になりやすくするような状況または環境を避けるようにとの患者への指示が含まれている。
【実施例】
【０３５２】
略語  次の略語が 明細および実施例で用いられている。：ＡＣＮはアセトニトリルであり、ＢｚｌとＢｎはベンジルであり、ＤＩＥＡはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドであり、ｔＢｕはｔｅｒｔ−ブチルであり、ＴＳＴＵはＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラートであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＥｔＯＡｃは酢酸エチルであり、ＤＩＰＥＡとＤＩＥＡはジイソプロピルエチルアミンであり、ＨＯＡｔは１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールであり、ＮＭＰはＮ−メチルピロリジン−２−オンであり、ＴＥＡはトリエチルアミンであり、ＳＡはシナピン酸であり、Ｓｕは１−スクシンイミジル＝２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルであり、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、ＤＣＭはジクロロメタンであり、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドであり、ＲＴは室温である。一般的方法：次の実施例と一般的方法が明細中に特定される中間化合物と最終産物に当てはまる。あるいは、本明細書に開示される、または、そうでなければ従来のその他の反応を本発明の対応する化合物の調製に応用することが可能であろう。全ての調製方法において、全ての出発物質が公知であるか、公知の出発物質から容易に調製することが可能である。別に示されない限り、全ての温度が摂氏温度（℃）で表され、収率について言及するとき、全ての部とパーセンテージが重量基準（すなわち、重量／重量）であり、溶剤および溶出液について言及するとき、全ての部は体積基準（すなわち、体積／体積）である。
【０３５３】
実施例１：分枝鎖ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの調製
【化２５】
2013533217.tif 000041
Ｒ１はメチル基であり、ｎ１とｎ２は約４５０〜約５２０である。
１ｇのヒトＣ−ペプチド（配列番号１）（０．３３ｍＭ）を２５ｍＬのＤＭＦ／水（２０ｍＬ／５ｍＬ）に溶解した。ｐＨをＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）で７．８に調整した。おおよその分子量が４０，０００ＤａであるＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ２（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（１．８５ｇの活性化ＰＥＧ（０．０４ｍＭ））のＤＭＦ／水／ＡＣＮ（２５ｍＬ／５ｍＬ／１０ｍＬ）中の溶液を次に加え、反応物を室温で一晩撹拌した。
【０３５４】
前記溶液を精製水で７００ｍＬに希釈した。ＤＭＦの濃度は６％（体積／体積）である。ｐＨを酢酸で４〜４．５に調整し、濾過した。ＹＭＣ−ＯＤＳカラム（２．５ｘ３０ｃｍ）と０．５％酢酸（移動相Ａ）／１００ｍＭ酢酸ナトリウム（移動相Ｂ）／ＡＣＮ（移動相Ｃ）濃度勾配を用いるＨＰＬＣにより前記溶液を精製した。３カラム体積の９０％Ａ／１０％Ｃでカラムを平衡化することにより分離を完了した。ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが９０％Ｂ／１０％Ｃに負荷され、９０％Ｂ／１０％Ｃ（３カラム体積）で洗浄され、引き続いて１カラム体積の９０％Ａ／１０％Ｃの均一濃度洗浄液により洗浄された。２カラム体積にわたる９０％Ａ／１０％Ｃで開始し７０％Ａ／３０％Ｃまでのマルチ直線濃度勾配とそれに引き続いて行われる５カラム体積にわたる７０％Ａ／３０％Ｃからなり５０％Ａ／５０％Ｃまで上昇する直線濃度勾配により溶出が達成された。
【０３５５】
ＨＰＬＣ（１４０ｍＬ）由来の溶出液をまとめたものを７０ｍＬの精製水で希釈し、２５℃で蒸発乾燥させて体積を１３０ｍＬにした。最終濃度は１２ｇ／Ｌであった。前記溶液を凍結乾燥して１５００ｍｇのＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（収率８０％）を産出した。
【０３５６】
精製の後に回収された画分を逆相高速クロマトグラフィー（ＨＰＣ）およびサイズ排除ＨＰＣによって分析した。Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣＢＥＨ  Ｃ１８  １７  μＭカラムおよびＡＣＮと０．１％ＴＦＡの移動相を用いる逆相ＨＰＬＣを行い、０．２５ｍＬ／分の流速、４０℃のカラム温度および５ｍｇ／ｍＬの試料濃度で３分間にわたる２４％〜４０％ＡＣＮとそれに続く１分間の４０％〜９０％ＡＣＮの二成分直線濃度勾配を用いて逆相ＨＰＬＣを行った。図１に代表的なクロマトグラムが示されている。
【０３５７】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５，１０／３００ＧＬカラムおよび２．７ｍＭ  ＫＣｌと０．１３７Ｍ  ＮａＣｌを含むｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液の移動相による０．５ｍＬ／分の流速での均一濃度溶出を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。図２に代表的なクロマトグラムが示されている。
【０３５８】
実施例２：その他の分枝鎖ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの調製
実施例１に記載されているのと同様の反応条件およびＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ２の代わりに次の試薬を用いて、分子量が１０ｋＤａ〜８０ｋＤａの次のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを容易に調製することが可能である。
【０３５９】
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＴＳを用いて、Ｒ１がメチル基である
【化２６】
2013533217.tif 000042
が産出される。
【０３６０】
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ３−４００ＴＳ１００Ｕを用いて、Ｒ１がメチル基である
【化２７】
2013533217.tif 000043
が産出される。
【０３６１】
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ３−４００ＧＳ１００Ｕを用いて、Ｒ１がメチル基である
【化２８】
2013533217.tif 000044
が産出される。
【０３６２】
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ３−４００ＨＳ１００Ｕを用いて、Ｒ１がメチル基である
【化２９】
2013533217.tif 000045
が産出される。
【０３６３】
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＬＹ−４００ＮＳを用いて、Ｒ１がメチル基である
【化３０】
2013533217.tif 000046
が産出される。
【０３６４】
活性中間体
【化３１】
2013533217.tif 000047
を用いて、Ｒ１がメチル基である
【化３２】
2013533217.tif 000048
が産出される。
【０３６５】
実施例３：直鎖ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの調製
実施例１に記載されているのと同様の反応条件およびＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ２の代わりに次の試薬を用いて、分子量が５ｋＤａ〜８０ｋＤａの次のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを容易に調製することが可能である。
【０３６６】
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＧＳ
【化３３】
2013533217.tif 000049
【０３６７】
精製の後に回収された画分を逆相ＨＰＣおよびサイズ排除ＨＰＣによって分析した。Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣＢＥＨ  Ｃ１８  １７  μＭカラムおよびＡＣＮと０．１％ＴＦＡの移動相を用いる逆相ＨＰＬＣを行い、０．２５ｍＬ／分の流速、４０℃のカラム温度および５ｍｇ／ｍＬの試料濃度で３分間にわたる２４％〜４０％ＡＣＮとそれに続く１分間の４０％〜９０％ＡＣＮの二成分直線濃度勾配を用いて逆相ＨＰＬＣを行った。図３に代表的なクロマトグラムが示されている。
【０３６８】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５，１０／３００ＧＬカラムおよび２．７ｍＭ  ＫＣｌと０．１３７Ｍ  ＮａＣｌを含むｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液の移動相による０．５ｍＬ／分の流速での均一濃度溶出を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。図４に代表的なクロマトグラムが示されている。
【０３６９】
実施例４：その他の直鎖ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの調製
実施例１に記載されているのと同様の反応条件およびＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ２の代わりに次の試薬を用いて、分子量が５ｋＤａ〜８０ｋＤａの次の線状ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを容易に調製することが可能である。
【０３７０】
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＣＳを用いて、
【化３４】
2013533217.tif 000050
が産出される。
【０３７１】
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＨＳを用いて、
【化３５】
2013533217.tif 000051
が産出される。
【０３７２】
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＴＳを用いて、
【化３６】
2013533217.tif 000052
が産出される。
【０３７３】
ＳＵＮＢＩＯ  Ｐ１ＰＡＬ−３０を用いて、
【化３７】
2013533217.tif 000053
が産出される。
【０３７４】
ＳＵＮＢＩＯ  Ｐ１ＡＰＡＬ−３０を用いて、
【化３８】
2013533217.tif 000054
が産出される。
【０３７５】
ＳＵＮＢＩＯ  Ｐ１ＴＰＡＬ−５を用いて、
【化３９】
2013533217.tif 000055
が産出される。
【０３７６】
ＳＵＮＢＩＯ  Ｐ１ＢＡＬ−３０を用いて、
【化４０】
2013533217.tif 000056
が産出される。
【０３７７】
ＳＵＮＢＩＯ  Ｐ１ＡＢＡＬ−３０を用いて、
【化４１】
2013533217.tif 000057
が産出される。
【０３７８】
ＳＵＮＢＩＯ  Ｐ１ＴＢＡＬ−５を用いて、
【化４２】
2013533217.tif 000058
が産出される。
【０３７９】
実施例５：イヌにおける薬物動態特性の測定
薬物動態（ＰＫ）試験を、非修飾型Ｃ−ペプチドを用いるビーグル犬でのＣ−ペプチドＰＫプロファイルを決定するために行った。
【０３８０】
方法：２匹の雄イヌと１匹の雌イヌがリン酸緩衝生理食塩水中に製剤された非修飾型合成ヒトＣ−ペプチド（２０ｍｇ／ｍＬ）を皮下に受容した（０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍＬ／ｋｇ）。静脈穿刺によりイヌから採血し、１４日にわたる既定の時点で血液試料を採取した。血液の遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）の後に血漿試料を得て、それを分析まで−８０℃で貯蔵した。優良試験所基準（ＧＬＰ）能力を有する臨床試験受託機関（ＣＲＯ）（ＭｉｃｒｏＣｏｎｓｔａｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州）が生物分析試験を実施した。ヒトＣ−ペプチド測定用の市販のキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、カタログ番号１０−１１３６−０１）に基づく酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術を製造業者の説明書を用いて行うことによりＣ−ペプチドの血漿中レベルを測定した。結果をＣ−ペプチド濃度として表した。ＰＫ分析のために、定量限界未満レベル（ＢＱＬ）を０として取扱い、名目上の時点を全ての計算に用いた。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ５．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，カリフォルニア州）のモデル２００を用いて各動物についての個々の血漿中濃度‐時間データに基づき標準的なモデル独立方法によりＰＫパラメーターを決定した。
【０３８１】
結果：全ての動物が試験期間を乗り切って生き残った。臨床的異常の欠如に基づくと、各処置は忍容性が高かった。下記の表Ｅ１に、イヌに非修飾型Ｃ−ペプチドを皮下投与した後のＣ−ペプチドの最大濃度（Ｃｍａｘ）と曲線下面積（ＡＵＣ（０−ｔ））の値の平均値±標準偏差（ＳＤ）が示されている。投与後１日後と投与後１２日間後の対応する線形目盛での血漿中Ｃ−ペプチド濃度の平均値±ＳＤ−時間プロファイルがそれぞれ図５Ａと図５Ｂに示されている。非修飾型Ｃ−ペプチドの単回投与により、ピークが急速に蓄積することとなり、次にイヌの血流循環からＣ−ペプチドが急速に喪失されることになった。非修飾型Ｃ−ペプチドの使用により、半日以内にＣ−ペプチドの循環レベルがＢＱＬとなった。
【表５】
2013533217.tif 000059
【０３８２】
２番目のＰＫ試験を、異なる分子量の２つの代表的なＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（２０ｋＤａの線状ＰＥＧ（実施例３）および４０ｋＤａの分枝状ＰＥＧ（実施例１））を用いるビーグル犬でのＣ−ペプチドＰＫプロファイルを決定するために行った。結果を非修飾型Ｃ−ペプチドの結果と比較した。
【０３８３】
方法：３匹の雄イヌがリン酸緩衝生理食塩水中に製剤された２０ｋＤａのＰＥＧ化合成ヒトＣ−ペプチド（５０．８ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ化Ｃ−ペプチド）を皮下に受容し（０．５ｍｇ／ｋｇのＣ−ペプチド当量、０．０９ｍＬ／ｋｇ）、そして、３匹の雄イヌがリン酸緩衝生理食塩水中に製剤された４０ｋＤａのＰＥＧ化合成ヒトＣ−ペプチド（８２．５ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ化Ｃ−ペプチド）を皮下に受容した（０．５ｍｇ／ｋｇのＣ−ペプチド当量、０．０１２ｍＬ／ｋｇ）。静脈穿刺によりイヌから採血し、２１日にわたる既定の時点で血液試料を採取した。血液の遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）の後に血漿試料を得て、それを分析まで−８０℃で貯蔵した。ＧＬＰ能力を有するＣＲＯ（ＭｉｃｒｏＣｏｎｓｔａｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州）が生物分析試験を実施した。ヒトＣ−ペプチド測定用の市販のキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、カタログ番号１０−１１３６−０１）に基づくＥＬＩＳＡ技術をＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの品質管理用標準品を用いて行うことによりＣ−ペプチドの血漿中レベルを測定した。結果をＣ−ペプチド濃度として表した。ＰＫ分析のために、ＢＱＬを０として取扱い、名目上の時点を全ての計算に用いた。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ５．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，カリフォルニア州）のモデル２００を用いて各動物についての個々の血漿中濃度‐時間データに基づき標準的なモデル独立方法によりＰＫパラメーターを決定した。
【０３８４】
結果：全ての動物が試験期間を乗り切って生き残った。臨床的異常の欠如に基づくと、各処置は忍容性が高かった。非修飾型Ｃ−ペプチドに対して比較すると、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの使用によりイヌでのＣ−ペプチドの曝露が２０ｋＤａの線状ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドで投与後少なくとも４日に、そして、４０ｋＤａの分枝鎖ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドで投与後少なくとも１５日に延長された。
【０３８５】
下記の表Ｅ２にイヌに２０ｋＤａの線状ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドと４０ｋＤａの分枝鎖ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを皮下投与した後のＣ−ペプチドの最大濃度（Ｃｍａｘ）、曲線下面積（ＡＵＣ（０−ｔ））および半減期（Ｔ１／２）の値の平均値±ＳＤが示されている。線形目盛と片対数目盛での対応する血漿中Ｃ−ペプチド濃度の平均値±ＳＤ−時間プロファイルがそれぞれ図６と図７に示されている。
【表６】
2013533217.tif 000060
【０３８６】
驚くことに、４０ｋＤａのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの皮下投与後のＣｍａｘとＡＵＣ（０−ｔ）の値はそれぞれ２０ｋＤａのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの対応する値よりも２．２６倍および６．６７倍高かった。したがって、４０ｋＤａの分枝鎖ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドは、２０ｋＤａのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドと比較して、または、非修飾型Ｃ−ペプチドと比較して、かなり向上したＰＫ特質を提供する。３番目のＰＫ試験を、リン酸緩衝生理食塩水中に製剤されたより低い用量の４０ｋＤａの分枝鎖ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（０．００６、０．０２５および０．１ｍｇ／ｋｇ、ＰＥＧ化合成ヒトＣ−ペプチド（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ２により作製された４０ｋＤａのＰＥＧ、実施例１）の単回皮下注射による）を用いてビーグル犬で行った。
【０３８７】
方法：Ｃ−ペプチドの血漿中レベルを１４日にわたって測定した。非臨床ＣＲＯ（Ｂｉｏ−Ｑｕａｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州）が試験の動物部分を行った。投薬日（第０日）では９匹の雄イヌと雌イヌはそれぞれ７〜１２ｋｇおよび６〜８ｋｇの体重であった。試験中に動物に食物を与え、第０日、第１日および第２日に摂食量を判定した。第７日および第１４日にも体重を測定した。第０日の２日前に各動物の背中の注射する領域を毛刈りして清浄にした。３群のイヌ（ｎ＝２匹のオスおよび１匹のメス／群）が存在した。
【０３８８】
グループ１は、（０．００５ｍｇ／ｋｇのＣ−ペプチド当量を含有する）０．０５ｍＬ／ｋｇの用量で２ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを２５Ｇのニードルでの単回皮下注射により受容した。
【０３８９】
グループ２は、（０．００１２５ｍｇ／ｋｇのＣ−ペプチド当量を含有する）０．０１２５ｍＬ／ｋｇの用量で２ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを２５Ｇのニードルでの単回皮下注射により受容した。
【０３９０】
グループ３は、（０．０００３ｍｇ／ｋｇのＣ−ペプチド当量を含有する）０．０１５ｍＬ／ｋｇの用量で０．４ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを２５Ｇのニードルでの単回皮下注射により受容した。
【０３９１】
静脈穿刺によりイヌから採血し、第０日（投与前、３０分、１時間、３時間および６時間）ならびに第１日、第２日、第３日、第４日、第７日、第１０日および第１４日に血液試料を採取した。血液の遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）の後に血漿試料を得て、それを分析まで−８０℃で貯蔵した。ＧＬＰ能力を有するＣＲＯ（ＭｉｃｒｏＣｏｎｓｔａｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州）が生物分析試験を実施した。ヒトＣ−ペプチド測定用の市販のキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、カタログ番号１０−１１３６−０１）に基づくＥＬＩＳＡ技術をＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの品質管理用標準品を用いて行うことによりＣ−ペプチドの血漿中レベルを測定した。結果をＣ−ペプチド濃度として表した。ＰＫ分析のために、ＢＱＬを０として取扱い、名目上の時点を全ての計算に用いた。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ５．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，カリフォルニア州）のモデル２００を用いて各動物についての個々の血漿中濃度‐時間データに基づき標準的なモデル独立方法によりＰＫパラメーターを決定した。
【０３９２】
結果：全ての動物が試験期間を乗り切って生き残った。臨床的異常の欠如に基づくと、各処置は忍容性が高かった。下記の表Ｅ３に、イヌにＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを単回皮下投与した後のＣ−ペプチドの最大濃度（Ｃｍａｘ）、曲線下面積（ＡＵＣ（０−ｔ））および半減期（Ｔ１／２）の値の平均値±ＳＤが示されている。線形目盛と片対数目盛での対応する血漿中Ｃ−ペプチド濃度の平均値±ＳＤ−時間プロファイルがそれぞれ図８Ａと図８Ｂに示されている。Ｃ−ペプチドの最大濃度（Ｃｍａｘ）および曲線下面積（ＡＵＣ（０−ｔ））の値の平均値±ＳＤがそれぞれ図９Ａと図９Ｂに示されている。
【表７】
2013533217.tif 000061
【０３９３】
要約すると、イヌで４０ｋＤａのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを増加して単回皮下投与した後にＣ−ペプチドの曝露が非常に増加した。２番目と３番目のイヌでのＰＫ試験の結果により、４０ｋＤａの分枝鎖ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが、２０ｋＤａのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドと比較して、または、非修飾型Ｃ−ペプチドと比較して（イヌでの１番目のＰＫ試験）、非常に向上したＰＫ特質の準備をすることが確かめられた。さらに、４０ｋＤａの分枝鎖ＰＥＧ化は試験した用量では意味のある悪性の副作用を示さなかった。
【０３９４】
実施例７：単回皮下投与後のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットでの薬物動態
０．０４１３、０．１６７および０．６６４ｍｇ／ｋｇの用量での単回皮下投与の後に４０ｋＤａのＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（実施例１２）のＰＫをＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２匹／性／群）で評価した。投与前と投与後１４日間、血液試料を回収した。イヌを用いる試験で上述したように、ＥＬＩＳＡ法を用いてＰＥＧ化Ｃ−ペプチドについて血漿試料を分析した。「ノンコンパートメント」法を用いて個々のＰＫパラメーターを推定した。図１０に単回皮下投与後の平均（±ＳＤ）血漿中濃度−時間プロファイルが図示され、対応するＰＫパラメーターが表Ｅ４に概説されている。
【表８】
2013533217.tif 000062
【０３９５】
実施例８：単回皮下投与後のカニクイザルでの薬物動態
０．０８２７ｍｇ／ｋｇの用量での単回皮下投与の後に４０ｋＤａのＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（実施例１２）のＰＫをカニクイザル（２匹／性）で評価した。投与前と投与後１４日間、血液試料を回収した。イヌを用いる試験で上述したように、ＥＬＩＳＡ法を用いてＣＢＸ１２９８０１について血漿試料を分析した。「ノンコンパートメント」法を用いて個々のＰＫパラメーターを推定した。図１１に単回皮下投与後の平均（±ＳＤ）血漿中濃度−時間プロファイルが図示され、対応するＰＫパラメーターが表Ｅ５に概説されている。
【表９】
2013533217.tif 000063
【０３９６】
ピーク濃度は２日以内に生じ、Ｔ１／２は約５．４日であることをこれらの結果は示している。前記のサルは絶食していなかったため、そして、検出抗体がサルのＣ−ペプチドと交差反応するため、４０ｋＤａのＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（実施例１２）についての結果は内在性Ｃ-ペプチドレベルを含む。したがって、測定されるＰＥＧ化Ｃ−ペプチドレベルがより低い後半の時点（すなわち、第１０日および第１４日）では、内在性のサルＣ-ペプチドの寄与が結果を混乱させる可能性があるだろう。第１４日の時点を分析から取り除くと、Ｔ１／２は３．７日である。要約すると、これらの単回投与ＰＫ試験について、皮下投与後にＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの血漿中濃度のピークは通常１〜５日以内に生じる。用量の増加と共にＡＵＣとＣｍａｘが上昇し、そして、それらは一般に用量と比例関係にある。
【０３９７】
実施例９：非修飾型Ｃ−ペプチドを用いる反復投与薬物動態試験
ラットで４週間までの、および、カニクイザルで１３週間までの非ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを用いて行われた５回のＧＬＰ毒物学試験において、移植した浸透圧ポンプを介してＣ−ペプチドを連続的に皮下注入した。試験を通じてＣ−ペプチドの血漿中濃度を定期的に測定し、そして、表Ｅ６に示すように各試験について曝露期間中の定常状態濃度（Ｃｓｓ）を決定した。
【表１０】
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【０３９８】
結論すると、これらの毒物試験では投与期間を通じてＣ−ペプチドレベルが持続した。
【０３９９】
実施例１０：反復投与薬物動態試験
ラットとサルで複数回投与した後に４０ｋＤａのＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（実施例１２）のＰＫを評価した。これらの試験は下記に要約される。
【０４００】
（毎週の）反復皮下投与後のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  ラットの２８日間の薬物動態
方法：５回の投薬について２．７４、８．２２および２７．４ｍｇ／ｋｇ／週の用量での複数回皮下投与の後にＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（各時点あたり３匹／性／群）で４０ｋＤａのＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（実施例１２）のＰＫを評価した。１回目の投薬の前、および１回目の投薬後７日間、血液試料を回収した。２回目の投薬の後から４回目の投薬までにトラフ血液試料を回収した。最後の投薬（５回目の投薬）の後に、血液試料を２８日間回収した。以前に説明したように、ＥＬＩＳＡ法を用いてＰＥＧ化Ｃ−ペプチドについて血漿試料を分析した。「ノンコンパートメント」法、および性別を基準とした各用量についての平均濃度‐時間プロファイルを用いてＰＫパラメーターを推定した。
【０４０１】
結果：性別を基準とした複数回皮下投与による平均（±ＳＤ）血漿中濃度−時間プロファイルが図１２に図示され、対応するＰＫパラメーターが表Ｅ７に概説される。用量と１次の間の関係
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【０４０２】
全体としては、第１４日〜第２１日までに定常状態に達することをこれらの結果は示している。用量の増加と共に曝露が増加し、血漿中濃度のピークが第１日と第３日の間に生じる。１回目と最後の投薬の後のＡＵＣとＣｍａｘは、評価した範囲にわたって用量と比例関係にあるようであり、定常状態のＡＵＣは１回目の投薬後のＡＵＣに類似しているようである（１回目の投薬に対する定常状態のＡＵＣの比が０．７から１．５までの範囲にある）。Ｔ１／２は３回の投薬にまたがって、そして、１回目の投薬と最後の投薬の後では類似しているようである（約１．５日）。メスでの全身性曝露はオスよりも約２倍高い。投薬の中止後の２８日間の回復期において、全ての用量について検出可能な薬剤レベルがおよそ２週間持続したが、１匹のオス（２．７４ｍｇ／ｋｇ／週）と１匹のメス（８．２２ｍｇ／ｋｇ／週）を除いて回復期の最後では薬剤が検出できなかった。抗薬剤抗体（ＡＤＡ）アッセイの最初の技術的困難のため、抗ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド抗体について結果が利用できない。高曝露、一般的に用量に比例する結果、および１回目と最後のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの投与の間の一貫したクリアランスが、どんな抗体形成も少しも曝露に影響しないようであるという主張を支持する。
【０４０３】
（毎週の）反復皮下投与後のカニクイザルの２８日間の薬物動態
方法：５回の投薬について１．３３、４．０および１３．３ｍｇ／ｋｇ／週の用量での複数回皮下投与によりカニクイザル（５匹／性／群）で４０ｋＤａのＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（実施例１２）のＰＫを評価した。１回目の投薬の前、および１回目の投薬後７日間、血液試料を回収した。２回目の投薬の後から４回目の投薬までにトラフ血液試料を回収した。最後の投薬（５回目の投薬）の後に、血液試料を２８日までの間回収した。以前に説明したように、ＥＬＩＳＡ法を用いてＰＥＧ化Ｃ−ペプチドについて血漿試料を分析した。「ノンコンパートメント」法を用いてＰＫパラメーターを推定した。
【０４０４】
結果：性別を基準とした複数回皮下投与による平均血漿中濃度−時間プロファイルが図１４に図示され、対応するＰＫパラメーターが表Ｅ８に概説される。用量と曝露の１次パラメーター（ＡＵＣおよびＣｍａｘ）の間の関係が図１５に示されている。
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【０４０５】
全体としては、およそ第１４日までに定常状態に達することをこれらの結果は示している。用量の増加と共に曝露が増加し、血漿中濃度のピークが第１日と第２日の間に生じる。１回目と最後の投薬の後のＡＵＣとＣｍａｘは、評価した範囲にわたって用量と比例関係にあるようであり、定常状態のＡＵＣｔａｕは１回目の投薬後に観察されたＡＵＣよりもおよそ３０％〜９０％高いようである。Ｔ１／２は３回の投薬にまたがって、そして、１回目の投薬と最後の投薬の後では類似しているようである（約３日）。メスでの全身性曝露はオスで観察されたものと類似している。投薬の中止後に検出可能な薬剤のレベルは両方の回復期用量（４．０および１３．３ｍｇ／ｋｇ／週）で持続した。しかしながら、全ての用量について時間経過と共にＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの血漿中濃度が顕著に減少し、回復期の最後までに実質的により低いものとなった（定量の下限のおよそ２〜３倍）。回復期の最後では、低い方の２つの用量で中程度のＡＤＡ反応が、そして、高い用量で強い反応があった。しかしながら、投薬を通じて、そして、投薬の完了後もかなりのレベルの薬剤が存在するので、抗体の存在はサルのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドへの曝露に意味があるほど影響を与えなかった。
【０４０６】
実施例１１：ＳＴＺ誘導糖尿病ラットにおける神経伝達速度（ＮＣＶ）への効果
糖尿病ラットにおけるＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの神経伝達速度への効果を評価するために、ＳＴＺ誘導糖尿病ラットに４０ｋＤａの分枝状ＰＥＧ（実施例１２）を８週間投与した。結果を非修飾型ヒトＣ−ペプチドの結果と比較することもした。実施例１において記載されたものと同じ４０ｋＤａの分枝状ＰＥＧに連結するＰＥＧ化ラットＣ−ペプチドおよび非修飾型ラットＣ−ペプチド。
【０４０７】
プロトコルおよび方法：ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を、５０ｍｇ／ｍＬの標準ＳＴＺ溶液の１ｍＬを注射することにより５０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。オスのＳｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットをＨａｒｌａｎより入手した。ラットの平均体重は約４００ｇであり、ラットに標準食（ＴＤ２０１４）を与え、トウモロコシの穂軸の床敷を有する標準的な高さ８インチの孔なしプラスチックに個体ごとにラットを収容した。試験期間中に１２時間明期、１２時間暗期の明暗周期、７２±８゜Ｆの平均温度、および３０％〜７０％の相対的湿度を用いて動物を収容した。８週間の期間に、表Ｅ９に記載される投薬計画に従って、動物に投薬した。
【表１３】
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【０４０８】
直近の体重に基づいて各動物に投与する各薬剤の必要用量を計算した。賦形剤として無菌リン酸緩衝生理食塩水を用いた。
【０４０９】
前治療相試験の実行：どんな異常、痛みまたは苦痛のサインをも確認するために処理開始前に動物を観察し、そして、それらが観察されたとき、どんな記録された所見をも臨床獣医と議論した。処理群のランダム化のためにＳＴＺ処理（第１日）の前に体重を測定し、第７日および第１１日、その後は週ごとに体重を測定した。処理群のランダム化で、ＳＴＺ処理前（第１日）に食物量を測定し、第７日および第１１日、その後は週ごとに食物量を測定した。Ｃ−ペプチド（＜０．４ｎＭ）、全血中グルコース値（４００−６００ｍｇ／ｄＬ）および体重値に基づいて動物を処理層のためにランダム化した（表Ｅ５を参照のこと）。Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｔ．（ブロックランダム化割り当てツール）を用いてランダム化を達成した。皮下移植ポンプ（Ａｌｚｅｔポンプモデル２ＭＬ４）を第１０日と第３９日に外科的に移植した。
【０４１０】
治療相試験の実行：ランダム化のために第３日に尾部出血による採血を行い、グルコースおよび／またはＣ−ペプチドのために第７日および第１１日、その後は週ごとに採血を行った。ＳＴＺ注射前に６時間、毎グルコース評価前に３時間動物を絶食させ、試験のその他の時間では動物に任意に餌を与えた。（表Ｅ１０を参照のこと。）
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【０４１１】
電気生理的エンドポイント：踵、外果の後ろに位置する活動記録電極および後足の第２指の付け根にある刺激陰極を用いて指神経活動電位を記録した。刺激陰極と活動電極の間の距離を初期脱分極性電流の立ち上がりまでの絶対潜時で除算することにより速度を計算した。
【０４１２】
（視覚的に決定する）尾の毛の生え際より１０ｍｍ下に位置する活動記録電極と６０〜７０ｍｍさらに遠位に位置する刺激陰極を用いて尾部神経活動電位を記録した。刺激陰極と活動電極の間の距離を初期脱分極性電流の立ち上がりまでの絶対潜時で除算することにより速度を計算した。
【０４１３】
後足の内在筋に位置する活動電極と踵の近く、外果の後ろに位置する刺激陰極を用いて脛骨運動神経伝達を記録した。
【０４１４】
動物の準備：全ての記録期間中、イソフランで動物を麻酔し、動物を腹臥位に置いた。電気生理的記録法の実行中、呼吸と温度をモニターした。
【０４１５】
電極：活動電極、基準電極および接地電極の設置を各様相に適合させ、そして、それらは各対象における骨標識点に対して配置される。全てのＰＮＳ記録のために１，０００Ｈｚでおよそ５０ｋΩのインピーダンスを有するプラチナニードル電極（Ｇｒａｓｓ−Ｔｅｌｅｆａｃｔｏｒ，Ｃｏ．）を活動リード線と基準リード線の両方に用いた。
【０４１６】
温度制御：記録期間を通じて３５．５℃と３８．０℃の間に直腸温度を維持した。
【０４１７】
データ処理：ユニティーゲインプリアンプを用いて神経電気シグナルをインピーダンス整合し、多極フィルターを用いて神経電気シグナルを帯域通過させ、０．５〜５０Ｋのゲイン係数を用いて神経電気シグナルを作動増幅した。各様相についてフィルター設定を調整した。各記録シリーズについて６０Ｈｚ干渉を最小化し、シグナルノイズ比を適切化するために共通モード拒絶レベルとゲイン係数を調整した。増幅されたシグナルは誘起刺激に時間的関連をつけられ、選択されたチャンネルに多重送信され、標本抽出された最も高い頻度の５倍よりも高い比率でデジタル化される。アーティファクトについて（既定の拒絶レベル、デジタル化されたウインドウの８０％を用いて）データを精査し、試験中の様相に適切なエポックについてデータをデジタルで平均化した。シグナルノイズ比を最適化し、そして、立ち上がりまでの潜時の測定値とピーク振幅の測定値の両方の正確な評価を容易にするために各平均に含まれるスウィープの数を各測定値について調整した。
【０４１８】
データのスコア化：全ての電気生理的データをシグナルの最適化の後にスコア化した。立ち上がりまでの潜時を０．０１ミリ秒単位で刺激アーティファクトから最短脱分極の開始まで測定した。振幅を感覚反応については０．０１μＶ単位で、そして、運動反応については０．０１ｍＶ単位で基線から脱分極のピークまで測定した。デジタルトレースをたどる内部コンピューターカーソルを用いて全ての測定を行った。全ての波形がデジタル的に記録装置に記憶され、さらなるオフライン解析のために利用可能であった。
【０４１９】
較正：電気生理的記録の日毎に現場で増幅器とフィルターを較正した。
【０４２０】
終末相試験の実行：ＣＯ２吸入により動物を麻酔し、引き続いて特定の時点で心臓穿刺を行った。
【０４２１】
結果：神経伝達速度（ＮＣＶ）の基線測定
【０４２２】
ＳＴＺの投与後８〜９日、および、グループ２〜４のラットの各々で高血糖症の存在が確認された後に最初のＮＣＶ評価が行われた（上記の表Ｅ４を参照のこと）。賦形剤またはＰＥＧ化ヒトＣ−ペプチドのどんな投与の前でもある（すなわち、基線）その時点で、ＳＴＺ誘発末梢多発性神経障害の明確で有意な証拠が存在した。基線評価で、齢が一致する対照群における所見と比較して、ＳＴＺ処理群の各々において最大尾部ＮＣＶは１０ｍ／秒よりわずかに大きい値（およそ１８％）だけ減少した（図１６Ａ）。その時点で、最大指ＮＣＶは３〜４ｍ／秒だけ減少し（図１７Ａ）、そして、脛骨遠位潜時がおよそ同１０％の値だけ延長された（遅くなった速度と整合する）。第４週での神経伝達速度（ＮＣＶ）の測定。
【０４２３】
図１６Ｂと１７Ｂは、賦形剤のみの投与、または、１．０か３．０ｍｇ／ｋｇ／週のどちらか用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの投与のどちらかの（基線から）４週間の期間後の４群の各々における尾部ＮＣＶと指ＮＣＶを図示する。この４週間の期間中に、グループ２の１匹のラットとグループ３の５匹のラットおよびグループ４の１匹のラットが死亡した。同じ部分集団の対象にまたがって比較し続けるために、これらの失われたラットに由来するデータが図１６Ａと１７Ａの基線値より省略されている。
【０４２４】
試験した４週間の期間にわたって尾部と指の神経の両方について対照群のＮＣＶが相対的に一定のままでいた（図１８）。しかしながら、予想されたように、ＳＴＺのみの群で尾部と指の神経の両方の速度が減少し続けた。純粋な遠位指感覚神経にとって、最初の４週間の処理期間にわたっておよそ３ｍ／秒（１０％）の追加の速度減少があった（図１８）。ＮＣＶの継続的な速度減少は、高血糖と内在性Ｃ−ペプチド欠乏に至り、最終的には経膜電流の変化、神経節における微小環境の変化、軸索委縮に至り、究極的にはワーラー変性に至るＳＴＺ誘発性膵臓β細胞破壊に起因する遠位神経の進行性損傷と一致しする。
【０４２５】
脛骨運動反応の絶対潜時は、継続する動物の成長を反映して、第４週での評価時では全ての群においてわずかにより長かったが、しかしながら、試験の最初の４週間の経過にわたってこの測定値とほとんど、または、全くグループ間で差がなかった（データを示さず）。
【０４２６】
基線から４週間の期間にわたってＰＥＧ化ヒトＣ−ペプチドで共処理した群の各々の生き残ったラットについてＮＣＶがＳＴＺのみの群での所見と比較して遅い速度で減少した（図１８）。しかしながら、第４週の時点での効果は小さかった。
【０４２７】
第８週での神経伝達速度（ＮＣＶ）の測定
【０４２８】
図１６Ｃと１７Ｃは、第８週の時点での４群の各々における尾部ＮＣＶと指ＮＣＶを図示する。試験期間にわたって、対照群における混合尾部神経のＮＣＶが基線値よりおよそ４ｍ／秒（７％）増加した（図１９）。この変化は、詳細に記録されているミエリンおよび軸索の断面径の出生後の継続性増大と整合する。どのグループにおいても基線評価後の第４週と第８週の間にさらに動物が死ぬことはなかった。
【０４２９】
対照群では、８週間の期間にわたって指神経についてＮＣＶに基線から相対的にほとんど変化がなかった（図１８および１９）。対照的に、ＳＴＺのみの群（グループ２）でのＮＣＶはこの期間にわたって減少し続けた。この低下の進行は高血糖と内在性Ｃ−ペプチドの産生の喪失により誘導される継続的損傷と整合する。第８週までに、ＳＴＺのみの群における指ＮＣＶが基線から＞４ｍ／秒（１４％）だけ減少し、齢が一致する対照群における値から２０％より多い値だけ減少した。対照的に、８週間の試験期間にわたってＰＥＧ化ヒトＣ−ペプチドで共処理された群では指神経ＮＣＶは安定であった（グループ３）、または、実際には向上した（グループ４）（図１８）。
【０４３０】
表Ｅ１１とＥ１２はそれぞれ基線から第８週の評価時点までの指ＮＣＶと尾部ＮＣＶにおけるパーセント変化を概説する。
【表１５】
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【表１６】
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【０４３１】
結論：齢が一致する対照群（グループ１）と比較してＳＴＺで処理された群（グループ２〜４）において指ＮＣＶと尾部ＮＣＶの両方の実質的な速度低下があった。これらの効果はＳＴＺの投与後８〜９日である基線で明らかであったが、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの共投与前であった。
【０４３２】
ＳＴＺのみで処理した群における８週間の試験期間中の指神経について、ＮＣＶの進行性速度低下が記載された。１．０か３．０ｍｇ／ｋｇ／週のどちらかの用量でのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの共投与がこの継続的低下を防いだ。３．０ｍｇ／ｋｇ／週の用量のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドで共処理された群では、ＳＴＺ誘発神経障害の後の８週間の期間に指神経ＮＣＶがわずかに改善されることさえあった。
【０４３３】
試験した期間にわたって、ＳＴＺのみにより誘導される神経障害に対してＰＥＧ化Ｃ−ペプチドでの共処理が神経保護を提供したことをこの試験の結果は示唆する。純粋な指感覚神経について、この効果は特に明らかである。部分的には対象の実験初期での喪失 のため、この試験は投与量に関連するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの利益の違いについて初めての洞察だけを提供するが、指のデータに高用量グループでわずかに大きい利益を裏付ける様子がある。
【０４３４】
尾部神経のデータは、グループ２〜４の基線に明白に現れたＳＴＺ処理の実質的な負の影響を示した。８週間の試験期間中に尾部ＮＣＶにおける速度低下のさらなる証拠は存在しなかった。しかしながら、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドで共処理された２つの群に対照群での傾向（表Ｅ１２）に近似する速度の改善があった。ＳＴＺのみの群で観察された改善よりもグループ３および４における改善が大きかった。第４週でそうであったように、グループ間で脛骨運動反応にほとんど変化がない（データを示さず）。
【０４３５】
天然Ｃ−ペプチドがＰＥＧ化されているとき、そのペプチドの生物学的活性が維持され、そのペプチドがＰＥＧ化されていることがその循環半減期を延長し、それにより置換投与の頻度を減らすことをこれらの結果は示している。ＰＥＧ化ヒトＣ−ペプチドの低用量群および高用量群ならびにＰＥＧ化ラットＣ−ペプチド群における第３週の投薬２日後に評価された平均最大血漿中濃度はそれぞれおよそ１２９ｎＭ、４３１ｎＭおよび１２ｎＭであった（データを示さず）。試験の終末における平均細小血漿中濃度は、ＰＥＧ化ヒトＣ−ペプチドの低用量群および高用量群ならびにＰＥＧ化ラットＣ−ペプチド群においてそれぞれ、およそ２２ｎＭ、９４ｎＭおよび２ｎＭであった。ＰＥＧ化ヒトＣ−ペプチドが非修飾型Ｃ−ペプチドの有益な生物学的特質を保持し、糖尿病の長期合併症の治療と予防の両方に有効であることが結論される。特に、本実験は、ヒトＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが糖尿病に関連する神経障害の治療に有効であることを立証する。
【０４３６】
実施例１２：ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの優良製造規範（ＧＭＰ）バッチの調製
大要
【化４３】
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ＰＥＧ化：Ｎ−メチルモルホリンの存在下でヒトＣ−ペプチド（ナトリウム塩）のＮ末端をおよそ４０ｋＤａの分枝状ＮＨＳエステルＰＥＧ誘導体（ＳＵＮＢＲＩＧＨ  Ｔ ＧＬ２−４００ＧＳ２（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））とカップリングすることにより１工程でヒトＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの合成を行った。
【０４３７】
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ２（１１５ｇ）を最初に６００ｍＬのアセトニトリル／水（５０／５０）溶液に溶解する。結果生じる溶液を撹拌し、そして、１７５ｍＬのアセトニトリル／水溶液にヒトＣ−ペプチド（７．９ｇ）を含む別の溶液を添加し、引き続いて１．２ｍＬのＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を加えた。ＮＭＭの添加を約１時間の間隔で数回繰り返し、各添加の前にＨＰＬＣにより反応の進行をモニターした。この過程を約８〜１０回繰返し、次に反応物を約８〜１２時間、一晩撹拌した。ＨＰＬＣ分析により完了したと一度反応が確かめられると、結果生じる反応混合物を精製段階に続けて進めた。このプロセスの間にいくつかのサブロットが調製され、以下に記載するように精製のために次に混合されることが典型的である。
【０４３８】
分取逆相クロマトグラフィーによる粗ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの精製
粗ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド溶液を６倍体積の０．１％ＴＦＡ／水で希釈した。ｐＨを≦３のｐＨに調整し、そして、逆相シリカ（Ｄｉａｓｏｇｅｌ  Ｃ−１８，１５μｍ，３００オングストローム）を用いる分取ＨＰＬＣにより精製した。希釈ＴＦＡ水溶液中のアセトニトリルの濃度勾配（緩衝液Ａは０．１％ＴＦＡであり、緩衝液Ｂは１００％ＡＣＮである：５分間に０〜２５％Ｂの勾配、次に１００分間に２５％〜５０％Ｂの勾配、そして次に産物が溶出するまでこのままでいる。）を適用することにより吸着したＰＥＧ化Ｃ−ペプチドをカラムから溶出した。２３０ｎｍの紫外線により溶出液をモニターした。≧９０の純度、＞６．０％のＮＳＩを有する画分をプールする。＞７０％の純度を有する画分を再生利用することが可能である。
【０４３９】
分取逆相クロマトグラフィーによるＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの脱塩と精製
逆相シリカを用いる分取ＨＰＬＣにより前工程から得られた混合純粋画分を脱塩し、そして、精製した。希釈ＴＦＡ水溶液によりカラムを洗浄し、引き続いて酢酸アンモニウム水溶液で洗浄した。次に希釈酢酸水溶液中のアセトニトリルの濃度勾配（緩衝液Ａは２％酢酸であり、緩衝液Ｂは１００％ＡＣＮである：５分間に０〜２５％Ｂの勾配、次に７５分間に２５％〜５０％Ｂの勾配、そして次に産物が溶出するまでこのままでいる。）を適用してカラムからＰＥＧ化Ｃ−ペプチドを溶出した。２３０ｎｍの紫外線により溶出液をモニターした。クロマトグラフィーから得られた純粋画分（≧９５％の純度、＞３．０％のＮＳＩ）をプールし、そして、凍結乾燥した。＞８０％の純度を有する画分をさらなる精製のために再生利用することが可能である。
【０４４０】
分取ＨＰＬＣによるＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのイオン交換精製
上記の工程由来の粗凍結乾燥ＰＥＧ化ヒトＣ−ペプチド（〜１８０ｇ）を５％アセトニトリル／水溶液に溶解し、イオン交換カラム（ＤＥＡＥ５２セルロース）にアプライした。次にカラムを約５０Ｌの水で洗浄し、そして、約４０Ｌの塩化ナトリウム（１Ｍ）／酢酸アンモニウム（１Ｍ）水溶液でカラムから産物を溶出した。２３０ｎｍの紫外線により溶出液をモニターした。クロマトグラフィーから得られた純粋画分（≧９２％の純度、＞４％の単一でない不純物（ＮＳＩ））をプールし、そして、脱塩／精製を続けて行った。＞８０％の純度を有する画分を再生利用することが可能である。
【０４４１】
逆相クロマトグラフィーによるＣＢＸ１２９８０１の脱塩と精製
イオン交換クロマトグラフィー工程由来の純粋画分を等量の水で希釈し、そして、分取ＨＰＬＣカラム（シリカ）にアプライした。次にカラムを２％希酢酸（１カラム体積）で洗浄し、そして、希酢酸中のアセトニトリルの溶液（緩衝液Ａは２％酢酸であり、緩衝液Ｂは１００％ＡＣＮである：５分間に０〜２５％Ｂの勾配、次に５０分間に２５％〜５０％Ｂの勾配、そして次に産物が溶出するまでこのままでいる。）を用いて産物を溶出した。２３０ｎｍの紫外線により溶出液をモニターした。クロマトグラフィーから得られた純粋画分（≧９５％の純度、＞３．０％のＮＳＩ）をプールし、そして、凍結乾燥した。＞８０％の純度を有する画分を再生利用することが可能である。
【０４４２】
ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの凍結乾燥
前精製由来の産物を約１５〜２０ｇ／Ｌの濃度で２％酢酸水溶液中に再構成し、当稀有乾燥して純粋ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド原薬がその遊離酸として生じた。
【０４４３】
実施例１３：ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの生物物理学的特徴
上記の実施例１２において記載されたように調製された、紫外線検出を用いるＲＰ−ＨＰＬＣにより判定された９９．５％の純度を有するＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのバッチを、別に記さない限り、下記の分析調査に用いた。実行された構造研究は表Ｅ１３に記載される。全ての解析が前記原薬の化学構造を確認する。
【表１７】
2013533217.tif 000075
【０４４４】
上に記載される構造解明試験に加えて、上記の実施例１２に記載されるＰＥＧ化Ｃ−ペプチドに対して追加の特性試験が実行された。これらの追加の試験は表Ｅ１４に記載されている。
【０４４５】
マススペクトロメトリー（ＭＳ）による分子質量：前記原薬の分子質量を確かめるためにマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いた。前記試料は、およそｍ／ｚ４５７４３を中心として観察された広範囲の１荷の擬分子イオンクラスターを有するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを陽イオンに与えた。
【０４４６】
フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴ−ＩＲ）：ＴＧＳ検出器と１回反射型セレン化亜鉛結晶装着ＡＴＲアクセサリーを装備したＪａｓｃｏ４２００ＦＴ−ＩＲ分光光度計でＣ−ペプチド、ＰＥＧ試薬およびＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのＦＴ−ＩＲスペクトルを収集した。テフロン性の棒を用いて固形試料をセレン化亜鉛結晶に押し付けた。残留水分のピークをスペクトルから差し引いた。図２０と図２１（拡大領域）に結果が示されている。ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのスペクトルはＰＥＧ試薬のスペクトルに非常に類似している。ＰＥＧに対するペプチドの質量比を考えると、これは驚くべきことではない。
【０４４７】
しかしながら、図２１に示されるように、アミドＩ領域にわずかな差がある。具体的には、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのアミドＩのバンドは１６２７ｃｍ−１と１６５３ｃｍ−１に２つのピークを示すが、一方、遊離Ｃ−ペプチドのスペクトルは１６３４ｃｍ−１に１つの幅広いアミドＩのバンドピークを示すのみである。１６３０ｃｍ−１近傍のアミドＩバンドは、普通は、βシート構造またはβターンと関連しており、一方、１６５０ｃｍ−１近傍のアミドＩバンドは、普通は、αヘリックスの不規則またはランダムコイル構造に割り当てられる。１６５３ｃｍ−１での吸光度の出現は、Ｃ−ペプチドと比較して、よりランダムな前記ＰＥＧ化ペプチドの構造と整合する。
【０４４８】
アミドＩ領域の差異はアミド基と溶剤の水の間の水素結合に起因するのか調べるために、図２２と図２３に示されているように、ＦＴ−ＩＲスペクトルを重水中で収集した。重水のスペクトルの収集のために、重水中の試料を６μｍのスペーサーを有する２枚のフッ化カルシウムのウインドウの間に配置した。
【０４４９】
重水中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのＦＴ−ＩＲスペクトルは（１５６６ｃｍ−１で）最小強度のアミドＩＩバンドを示し、これは全てのアミノ基がＨ−Ｄ交換を経ることを示している。Ｈ−Ｄ交換すると、アミドＩＩバンドは１５６６ｃｍ−１から１４６５ｃｍ−１にシフトする（アミドＩＩ’バンドになる）。重水中に高濃度（約２５ｍｇ／ｍＬ）と低濃度（約１２．５ｍｇ／ｍＬ）の両方の遊離Ｃ−ペプチドに対応する強度のアミドＩＩが残っており、このことは、未変換のアミド基がいくらか存在することを示している。未変換のアミド基はβターン内の分子内水素結合または高濃度でペプチドオリゴマー（凝集体）間形成された分子間水素結合により保護されているようである。重水中のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドにとって、有効なＣ−ペプチド濃度は４０ｋＤａのＰＥＧに対するＣ−ペプチドの低い質量比のためずっと低い。
【０４５０】
しかしながら、（図２３に示される）第２の派生的なＦＴ−ＩＲスペクトルから見ることができるように、高濃度のＣ−ペプチド試料（約２５ｍｇ／ｍＬ）に対応するアミドＩ’バンドは１６３９ｃｍ−１に主なピークであって１６４５ｃｍ−１に肩を有するピークを示し、一方、低濃度の試料（約１２．５ｍｇ／ｍＬ）は１６３９ｃｍ−１と１６４５ｃｍ−１の両方で主なピークを示す。このことは、アミドＩ’領域の差異は濃度に関連する可能性があることをしめしている。ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのスペクトルと対照的に、遊離Ｃ−ペプチドのスペクトルは１６３５〜１６４０ｃｍ−１の近傍でより高い強度を示し、このことは、遊離Ｃ−ペプチドにより多くのβターンが存在することを示している。低濃度の試料の評価を不可能にするＣ−ペプチド試料のより希釈された試料ではノイズに対するシグナルが貧弱であることに留意すべきである。
【０４５１】
アミノ酸分析による個々のアミノ酸の特定と比率：アミノ酸成分のアイデンティティおよび正しい比率を確かめるために、実施例１２で調製されたＰＥＧ化Ｃ−ペプチドについてアミノ酸分析を実行した。強酸でのペプチドの加水分解、イオン交換カラムでのアミノ酸の分離、そして最後に、ニンヒドリン誘導体化後の溶出物の検出がこの方法に含まれる。表Ｅ１４にその試験の結果が示されている。アミノ酸分析からの結果により、実験誤差内のＰＥＧ化Ｃ−ペプチド中のアミノ酸のアイデンティティと理論的相対出現率が確認される。
【表１８】
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【０４５２】
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による個々のアミノ酸の特定とキラリティー：実施例１２のキラルアミノ酸分析を、アミノ酸残基成分のキラリティーを調べるために、実行した。前記ペプチドを重水化溶剤（ＤＣｌ／Ｄ２Ｏ）中で加水分解し、Ｎ（Ｏ，Ｓ）−フルオロアセチルアミノ酸エステルとして誘導体化し、そして、ＧＣ−ＭＳを用いて分析して各アミノ酸エナンチオマーを決定する。Ｃｈｉｒａｓｉｌ−Ｖａｌコート非活性化ガラスキャピラリーを用いてＧＣを行った。キャリアーガスは水素であった。表Ｅ１５に結果が示されている。得られた値により、実施例１２のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの構造を構成するアミノ酸に予想されるキラリティーが確認される。
【表１９】
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【０４５３】
ＭＳ／ＭＳによるアミノ酸配列：ＰＥＧの大きいサイズと多分散性を考えて、最終中間産物段階でＭＳ／ＭＳによりシークエンシングを実行する。その過程により作られた産物イオンスペクトルから構造情報を得ることを意図して完全な試料分子を故意に断片化する技術であるＣＩＤ（衝突誘起解離）を用いるＭＳ／ＭＳを実行することにより、実施例１２のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのアミノ酸配列を調べた。
【０４５４】
ＭＳ／ＭＳスペクトルで観察される断片イオンのタイプは、１次配列、内部エネルギーの量、そのエネルギーが導入された様式、荷電状態などを含む多くの因子に依存する。受容されている断片イオンの命名法はRoepstorffおよびFohlmanにより最初に提唱され [Biomedical Spectrometry, 1984年, 11(11): 601]、その後にJohnson ら[Annals of Chemistry, 1987年, 59(21): 2621-2625]により改変されている。
【０４５５】
断片は、それらが少なくとも１つの電荷を有する場合、検出されるだけであろう。この電荷がＮ末端断片に保持される場合、そのイオンはａ、ｂまたはｃのどれかとして分類される。その電荷がＣ末端に保持される場合、そのイオンのタイプはｘ、ｙまたはｚのどれかである。下付き文字は断片における残基の数を示す。
【０４５６】
電荷を有するプロトンに加えて、ｃイオンとｙイオンが前駆体ペプチドからさらなるプロトンを抽出する。したがって、６つの１荷の配列イオンがあり得る。これらの構造は１荷電性プロトンを含有することに留意すること。エレクトロスプレーイオン化において、ペプチドは一般的に２つまたは３つの電荷を有するので、断片イオンが１つよりも多いプロトンを有する可能性がある。
【０４５７】
Crokerら[Journal of Biomolecular Techniques, 2000年, 11巻, 3号, 135-141]によって開発されたコンピュータープログラムを用いて予想される複数荷電ｂイオンおよびｙイオンおよび断片イオンを計算した。表Ｅ１６およびＥ１７に結果が示されている。断片化とＭＳ／ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ／ＭＳによる配列分析により、実施例１２の最終中間産物のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの示唆される一次配列が確認された。
【表２０−１】
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【表２０−２】
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【表２１−１】
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【表２１−２】
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【０４５８】
ペプチドマッピング：ペプチドマップはタンパク質のタンパク質分解酵素を用いる消化により作成される断片化パターンである。ペプチド断片のパターンは特定のタンパク質で特徴的であり、そして、構造を特定するために用いることができる。Ｃ−ペプチドをマップする方法は以前に開発され、そして、４断片がマススペクトロメトリーにより同定された。図２４の下のパネルに示されるように、４断片はアミノ酸２５〜３１（断片Ａと呼ぶ）、１３〜２４（断片Ｂと呼ぶ）、１〜１２（断片Ｃと呼ぶ）および１〜２４（断片をＤと呼ぶ）を含む。
【０４５９】
Ｃ−ペプチド（１ｍｇ／ｍＬ）とＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（１０ｍｇ／ｍＬ）が２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液に溶解される並列比較が実行された。１ｍＬの各試料に４０μＬの０．２５ｍｇ／ｍＬキモトリプシンを加え、その試料を３７℃で４時間保温した。ギ酸を添加して消化を止め、試料をＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。図２４に結果が示されている。
【０４６０】
ＰＥＧ化Ｃ-ペプチドについて予想されたように、ＰＥＧ部分がＮ末端に結合しているので、断片Ｃ（１〜１２）とＤ（１〜２４）は観察されなかった。実施例１２のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドについて断片２５〜３１および１３〜２４が観察された。１４分でのピークが未消化のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドであるかどうか調べるために、消化に関するタイムコース試験を２７時間にわたって実行した。追加的な断片は得られなかったが、これは完了しつつある消化に整合する。さらに、どのような分離も達成され得るか調べるために拡張濃度勾配を用いるＲＰ−ＨＰＬＣにより未消化ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドと消化されたＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの５０／５０混合物を分析した。しかしながら、１つのピークだけが観察された。したがって、１４分でのピークはＰＥＧ化１〜１２断片と１〜２４断片を含み、おそらく実施例１２の完全なＰＥＧ化Ｃ−ペプチドをいくらか含むと結論される。その分子のクロマトグラフィーでの挙動が大きいＰＥＧ部分により支配されているため、これらの断片を分離することができないことは予期しないことではない。
【０４６１】
カウンターイオンの不在：脱塩工程後にカウンターイオンがほとんど、または、全く残っていないことを確実にするためにアンモニウム含量はイオンクロマトグラフィー（ＩＣ）により、酢酸はＨＰＬＣにより、そして、ナトリウム含量はＩＣＰ／ＭＳにより測定された。
【０４６２】
アンモニウム含量は０．０３５（重量／重量）％であると判断され、そして、ナトリウム含量は０．０２％であるとわかり、それらは指定限界よりも下であった。
【０４６３】
原薬中のカウンターイオンのレベルは低いけれども、モルベースで計算すると、最終原薬に対するアンモニア（０．９モル比）および／またはナトリウム（０．４モル比）のある関係を示している可能性がある。
【０４６４】
分析超遠心分離による沈降速度：ＰＥＧ化Ｃ-ペプチド中の任意の凝集体の均一性と分布状態を評価するために、分析超遠心分離において沈降速度を測定した。この技術を用いて、凝集体をその異なる沈降係数に基づいて検出することができる。沈降速度は物理学的原理に基づく絶対的な方法である。その較正は長さと時間の基本単位に基づき、基準として標準分子を必要としない。沈降係数は分子の形ならびに分子質量に依存し、したがって、モノマーの沈降係数が既知のときでさえ、オリゴマーの沈降係数を予測することができない。
【０４６５】
図２５にＰＥＧ化Ｃ-ペプチドのロット１００８−１３４の（約０．６ｍｇ／ｍＬの濃度での）ＰＢＳ緩衝液中での正規化沈降係数分布が示されている。０．８０２Ｓでの主なピークは９８．１％であり、このことは試料が均一であることを示している。（非ＰＥＧ化）Ｃ−ペプチドの沈降係数は約０．４〜０．５Ｓの範囲にあると以前には判断された。この範囲でシグナルは検出されなかったが、このことは、遊離Ｃ-ペプチドが存在しないことを示している。さらに、沈降係数は４０ｋＤａの分枝状ＰＥＧ（０．８２Ｓ）と一致する。
【０４６６】
Ｃ-ペプチドとＰＥＧ化Ｃ-ペプチドの円偏光二色性分析：Ｃ−ペプチドとＰＥＧ化Ｃ−ペプチドについて遠近紫外光円偏光二色性（ＣＤ）分析を実行した。試料を、４．７％ソルビトールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に、Ｃ−ペプチドについては１ｍｇ／ｍＬの濃度で、および、ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドについては（０．６９ｍｇ／ｍＬのＣ−ペプチドと同等である）約１０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ペプチド濃度（１または０．６９ｍｇ／ｍＬ）、平均残基重量（９７．４）およびセルの経路長（吸光度測定には１ｃｍまたはＣＤには０．０２ｃｍ）を用いて溶剤分を差し引いたスペクトルを平均残基楕円率に変換した。Ｊａｓｃｏ  Ｊ−７１５分光偏光計で測定を実行した。
【０４６７】
図２６に示されるように、芳香族基とジスルフィド結合が存在しない（図２６の上のパネルに示されている）ので、近紫外光領域におけるＣ-ペプチド（上の線）とＰＥＧ化Ｃ-ペプチド（下の線）の平均残基楕円率は両方の試料について基本的に０である。
【０４６８】
Ｃ−ペプチドとＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの遠紫外光ＣＤスペクトルは、二次構造が大部分は乱されていることを示している。αヘリックスに典型的な２２０および２０８ｎｍでの二重極小値が無く、そして、逆平行βシートに典型的な２１７ｎｍでの谷が無い。
【０４６９】
濃度について補正するとき、ＣＤ分析は、Ｃ−ペプチドとＰＥＧ化Ｃ−ペプチドについてほぼ同一なスペクトル形状を示す（図２６の下のパネル）（試料の重量は水または塩／溶剤について補正していなかったので、濃度の推定値にはいくらか誤差が存在することに留意すること）。したがって、ＰＥＧ化は前記ペプチドの２次構造を変えないことが結論付けられ得る。
【０４７０】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）：図２７に示されるように、実施例１２のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの（２０ｍＭリン酸緩衝液，４．７％ソルビトール，ｐＨ６．０中に１００μｇの）試料をサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。
【０４７１】
ＳＥＣ方法の適格性評価の部分として、２０ｋＤａのＰＥＧ化ペプチドを独立的に合成し、そして、ＳＥＣにより分析してその方法がサイズに基づいて関連する化合物を区別することができることを示した。図２８に実施例１２のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドと２０ｋＤａのＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの（同じ緩衝液系で両方の試料を１００μｇ負荷した）クロマトグラムを重ね合わせたものが示されている。図２８に見ることができるように、低い分子量のピークほど後でＳＥＣカラムから溶出される。主なピークの前にピークが無いことにより、より大きい分子量の分子種が実施例１２のＰＥＧ化Ｃ−ペプチドに認識できるレベルで存在しないことが示される。同様に、主なピークの後にピークが無いことにより、より小さい分子量の分子種が認識できるレベルで存在しないことが示される。
【０４７２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ゲル電気泳動を、４〜１２％のトリス−グリシンゲルを用いて行った。図２９において示されるように、分子量標準品（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２プレステイン標準品を参照のこと）をレーン２および１０にアプライした。レーン４、６および８に２μｇから１０μｇまでの範囲の異なる量のＰＥＧ化Ｃ-ペプチドをアプライした。クマシー染色により６４〜９８ｋＤａの間に１本の染まり方が強いバンドが視覚化された。ＰＥＧの流体力学的半径はタンパク質マーカーの分子量に基づいて予想されるサイズよりも大きいことが知られている。したがって、この結果は予期しないことではない。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果はまた、他のより高分子量の夾雑物が存在しないことも示している。
【０４７３】
活性プロファイリング：ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドの試料を標準の非標識Ｃ−ペプチドと比較して、そのＰＥＧ化産物が非標識ペプチドの活性を保持することを確認した。
【０４７４】
方法：ヒト腎臓（ＨＫ２）細胞を（非コート）９６穴（ｂｌ／ｃｌ）プレートに２０，０００細胞／穴の密度で蒔き、そして、４８時間培養した。実験当日、ＨＫ２細胞を洗浄し、そして、０．５％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ中で１時間飢餓状態に置いた。細胞を１ｎＭ（最終濃度）で５分間処理し、１０回これを繰り返した。Ｃ−ペプチドＰＥＧ  ＧＭＰ（ロット番号１−ＦＩＮ−０９８８）、Ｃ−ペプチドＰＥＧ  Ｔｏｘ（１００７−１１９）、Ｃ−ペプチドＰＥＧ  Ｔｏｘ（１００８−０９０）、非修飾型Ｃ−ペプチド（２０９４００−３）およびＣ−ペプチドＰＥＧ基準物質（１００８−１３４）を等量ずつ加えた。プレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。総処理時間は７〜１０分であった。処理後すぐに細胞を２％（最終濃度）パラホルムアルデヒドで固定化し、そして、氷冷メタノールを用いて透過処理した。次に標準的なプロトコルに従って、細胞を抗ｐＥＲＫ抗体で処理し、そして、チラミド増幅付きの蛍光抗体法を用いてプレートを処理した。
【０４７５】
結果：ＰＥＧ化Ｃ−ペプチドが非ＰＥＧ化産物の活性を保持しており、そして、この活性がいくつかの異なるロットのＣ−ペプチドにまたがって一致することを図３０に示される結果が示す。
【０４７６】
実施例１４：医薬開発
ＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（実施例１）が水性溶液として製剤されるので、製剤の実施に影響する可能性がある重要な生理化学的特質は原薬の溶解性、ｐＨ、イオン強度および浸透圧である。これらの因子の全てがＰＥＧ化Ｃ−ペプチドのＰＥＧ部分の安定性に影響する可能性があり、そして、この実施例で評価される。
【０４７７】
２０ｍｇ／ｍＬの濃度の原薬は製剤緩衝液中での溶解限度（１００ｍｇ／ｍＬまで）よりずっと低い。以下に記述するように製品の安定性を最適化するために原薬と両立できる賦形剤が選択されている。薬剤製品に使用される賦形剤は（１塩基性および２塩基性）リン酸ナトリウム、ソルビトール、水酸化ナトリウムおよび注射用蒸留水である。すべての賦形剤が公定書に準じ、米国薬局方（ＵＳＰ）に概説される基準に合致する。賦形剤の選択とそれらのレベルは本実施例に記載される。
【０４７８】
緩衝液の選択：医薬調製物に一般に用いられており、生理的ｐＨで良い緩衝能を有するため、最初の評価にリン酸緩衝液を選択した。様々なｐＨ（６．０、６．５、７．０および７．５）の１０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液中に約１ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（実施例１２）を溶解することによりｐＨ選別試験を行った。試料を４０℃で９日間貯蔵し、次にＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。すべての試料がかなり分解されたが（約４０％以上）、これはペプチド−ＰＥＧ複合体のＰＥＧ成分の分解と一致する。さらに、全ての製剤のｐＨが０．７〜１．０ｐＨ単位だけ下方にシフトしたが、このことは、緩衝能が不十分であることを示している。それにもかかわらず、低い方のｐＨで安定性が上昇する明らかな傾向を観察することができた。すなわち、ｐＨ６．０で始まる製剤がそれぞれｐＨ６．５、７．０および７．５よりも好ましかった。したがって、６．０の標的ｐＨが選択された。
【０４７９】
等張化剤：等張化剤（生理食塩水またはソルビトール）を選択するために２番目の製剤試験を行った。等張の薬剤製品溶液を作製するために生理食塩水（０．９％）またはソルビトール（４．７％）の濃度を選択した。生理食塩水（０．９％）かソルビトール（４．７％）のどちらかを含む２０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液にＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（実施例１）（１ｍｇ／ｍＬ）を溶解した。ｐＨを６．０に調整した。試料を５℃および４０℃で貯蔵した。等張化剤の添加によりこれらの製剤の安定性は大いに改善した（データを示さず）。４０℃で４週間後に両方の等張剤が約２〜３％の面積‐純度％の下落を有する同等の結果をもたらした。４０℃で１２週間後にソルビトール含有製剤が明らかに優れており、約７２％の面積‐純度％の下落を示す生理食塩水含有製剤と比較してソルビトール含有製剤は面積‐純度％の下落が約７％であった（ＰＥＧの分解に対応する）。５℃では、１２週間後にどちらの製剤でも分解がほとんど〜まったく観察されなかった。安定性の促進の結果に基づいて、ソルビトールを等張剤として選択した。
【０４８０】
イオン強度：イオン強度の製剤の安定性への影響を評価するために第３の製剤試験を行った。４．７％ソルビトールを含みｐＨ６．０に調整された１０ｍＭ、２０ｍＭおよび５０ｍＭの濃度のリン酸緩衝液にＰＥＧ化Ｃ−ペプチド（実施例１２）の溶液を約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。試料を５℃および４０℃で貯蔵した。表Ｅ１８に結果が要約されている。
【表２２】
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【０４８１】
５℃では３か月後に全ての製剤が同様に見えた。ｐＨの内容または面積‐純度％に認識可能な変化はなかった。４０℃では全ての製剤についてｐＨ，純度および含量が減少した。最も良い結果が１０ｍＭのリン酸濃度で得られたが、これは高イオン強度が安定性に負の影響を与える可能性があることを示している。したがって、１０ｍＭのリン酸が緩衝液の濃度として選択された。
【０４８２】
前述の記述から、当業者は本発明の基本的特徴を容易に確認することができ、そして、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更と修正を行って様々な利用法と条件に本発明を適合させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2013533217.tif 000109
【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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