【事件の表示】
　特許第２７７７８０５号「イソアミラーゼの構造遺伝子」の請求項５、９、１２、２０ないし２７に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結論】
　訂正を認める。
　特許第２７７７８０５号の請求項１ないし２４に係る特許を維持する。
【理由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第２７７７８０５号に係る発明についての出願は、昭和６３年８月５日に特願昭６３−１９４７００号として出願され、平成１０年５月８日にその特許の設定登録がなされ、その後、椙田　慈より特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１１年１１月２４日に訂正請求がなされたものである。
ＩＩ．訂正請求
１．訂正の内容
▲１▼特許請求の範囲の請求項２０に係る記載「請求項６〜９記載のポリペプチドの製法において、」を削除する。
▲２▼特許請求の範囲の請求項２４乃至２６を削除する。
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項▲１▼は、「請求項６〜９記載のポリペプチドの製法において、」を削除するものであるから明りょうでない記載の釈明に該当し、訂正事項▲２▼は、特許請求の範囲の請求項２４乃至２６を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当する。
　そして、上記いずれの訂正も新規事項に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
３．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４，２項、及び同条３項で準用する１２６条２項から３項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
ＩＩＩ．特許異議申立
１．特許異議申立書の理由の概要
　訂正前の本件請求項５，９，１２，２０〜２７（以下、単に「請求項５，９，１２，２０〜２７」という。）に係る発明は、以下の点で特許３６条３項或いは４項に規定する要件を満たしていないものである。
（１）請求項５，１２，２７について
　本件発明に係る「シュードモナスＳＭＰＩ　ＡＴＣＣ５３６５１」は、「ＡＴＣＣ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ　Ｎｉｎｅｔｅｃｎｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９６」（甲第１号証）には見当たらず、現時点では最早一般には入手不能である。
（２）請求項９，２０〜２３について
　請求項９の「イソアミラーゼと同等の生物学的活性を有するポリペプチドをコードづけする前記構造遺伝子の領域」の「領域」とは、前記構造遺伝子の一体どの領域を指すのか具体的説明がない。また、「イソアミラーゼと同等の生物学的活性を有するポリペプチド」については、本件明細書には何らの記載もないから、そのようなポリペプチドをコードづけする遺伝子の領域とは、一体どの領域を示すのか全く不明である。
（３）請求項２０〜２３について
　請求項６〜９に係る発明は、イソアミラーゼの構造遺伝子に関する発明であって、ポリペプチドの製法に関する発明ではない。
　したがって、「請求項６〜９記載のポリペプチドの製法において」という記載のある請求項２０に係る発明は、全くその構成が不明である。
　したがって、請求項２０を引用する請求項２１〜２３に係る発明もその構成が不明である。
（４）請求項２４〜２６について
　請求項２４が構成要件とする「請求項６〜８記載のアミノ酸配列」とは何を指すのか不明であり、請求項２４を引用する請求項２５及び２６も不明である。
２．判断
（１）について
　本件発明に係る「シュードモナスＳＭＰＩ　ＡＴＣＣ５３６５１」については、ＡＴＣＣにブダペスト条約にもとづく国際寄託がなされた旨の証明書が願書に添付されているところ、ブダペスト条約にもとづく国際寄託がなされた場合には、特許存続期間は寄託されていることが、当条約により保証されているものである。
　しかるに、甲第１号証は、販売を目的としたＡＴＣＣのカタログであって、ブダペスト条約にもとづく国際寄託に係る微生物に関しては、必ずしも掲載されるものではない。
　そうすると、甲第１号証に上記微生物が記載されていないことをもって、現時点では一般には入手不能であるということはできない。
（２）について
　本件明細書には、▲１▼「本発明の他の目的は、ＤＮＡフラグメント又はその領域を包含し・・・」（特許公報１２頁２４欄４５〜４６行）、▲２▼「本発明の他の目的は、イソアミラーゼ又はその領域をコードづけする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子によって・・・」（同１３頁２５欄２〜４行）という記載があり、これらの記載によれば、「領域」とは、▲１▼の場合は「ＤＮＡフラグメント」を示し、▲２▼の場合は「イソアミラーゼ」の部分であると理解することができる。
　また、本件明細書には、「本発明の他の目的は、１−６グルコシド結合の加水分解法においてイソアミラーゼ及びイソアミラーゼと同等の生物学的活性を有するポリペプチドの使用にある。」（同１３頁２５欄１３〜１５行）との記載があり、また、実施例６には、イソアミラーゼ活性の検定について詳細な記載がある。
　そうすると、「イソアミラーゼと同等の生物学的活性を有するポリペプチド」に関しては、明細書に実質的に開示されているといえるから、「イソアミラーゼと同等の生物学的活性を有するポリペプチドをコードづけする前記構造遺伝子の領域」の「領域」という記載が不明であるということにはならない。
（３）について
　上記訂正請求にて、特許請求の範囲の請求項２０に係る記載「請求項６〜９記載のポリペプチドの製法において、」は削除されたので、もはや、請求項２０〜２３に関して記載の不備はない。
（４）について
　上記訂正請求にて、特許請求の範囲の請求項２４〜２６は、削除されたので、もはや、請求項２４〜２６に関しての記載の不備はない。
３．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１２年１月２８日（２０００．１．２８）
【訂正の要旨】
（３）訂正の内容
▲１▼訂正事項ａ
　特許請求の範囲の請求項２０中の　「請求項６〜９記載のポリペプチドの製法において、」を、不明りょうな記載の釈明を目的として削除する。
▲２▼訂正事項ｂ
　特許請求の範囲の減縮を目的として請求項２４乃至２６を削除する。
（４）請求の原因
▲１▼上記訂正事項ａについて：
　請求項２０は、請求項１３〜１６のいずれかに記載された組換えＤＮＡ分子を利用して、これら組換えＤＮＡ分子が有する遺伝子情報を、　宿主微生物を介してポリペプチドとして発現させる方法に係るものである。この請求項２０における訂正は、この点を明確にすることにより取消理由ＩＩの解消を目的とするものであり、特許法第１２０条の４第２項ただし書き第３号に規定する明りょうでない記載の釈明に該当する。
▲２▼上記訂正事項ｂについて：
　請求項２４乃至２６の削除は、取消理由ＩＩＩの解消を目的とするものであり、特許法第１２０条の４第２項ただし書き第１号に規定する特許請求の範囲の減縮に該当する。
▲３▼これら訂正は、願書に添付した明細書又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、また、特許請求の範囲を拡張し又は変更するものでもないから、特許法１２０条の４第３項で準用する第１２６条第２項及び第３項の規定に適合するものである。さらに、これら訂正の結果、取消理由ＩＩ及びＩＩＩで指摘された本件特許の明細書の記載はすべて明りょうになっており、特許法第３６条第３項及び第４項の要件を十分に充足するものであることが明白になったものと確信する。従って、上記訂正事項ａ及びｂは特許法第１２０条の４第３項で準用する第１２６条第４項の規定にも適合するである。
（５４）【発明の名称】
イソアミラーゼの構造遺伝子
（５７）【特許請求の範囲】
１　下記の式（１）で表されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、イソアミラーゼの構造遺伝子。
２　遺伝子が５′末端にＡＴＧを有する、請求項１記載のイソアミラーゼの構造遺伝子。
３　遺伝子が、５′末端に、イソアミラーゼの分泌シグナルペプチドをコードづけする下記の式（ＩＩ）で表される配列を有する、請求項１記載のイソアミラーゼの構造遺伝子。
４　シュードモナス属に属する細菌の染色体ＤＮＡによって得られたものである、請求項１記載のイソアミラーゼの構造遺伝子。
５　細菌がシュードモナスＳＭＰＩ　ＡＴＣＣ５３６５１である、請求項４記載のイソアミラーゼの構造遺伝子。
６　下記の式（ＩＩＩ）で表されるポリペプチドをコードづけするものである、請求項１記載のイソアミラーゼの構造遺伝子。
７　遺伝子が、アミノ末端アラニン（Ａｌａ）がメチオニン（Ｍｅｔ）に結合している前記式（ＩＩＩ）のポリペプチドをコードづけするものである、請求項１記載のイソアミラーゼの構造遺伝子。
８　遺伝子が、アミノ末端アラニン（Ａｌａ）が下記の分泌シグナルペプチドに結合している前記式（ＩＩＩ）のポリペプチドをコードづけするものである、請求項３記載のイソアミラーゼの構造遺伝子。
９　請求項１〜３記載のイソアミラーゼの構造遺伝子又はイソアミラーゼと同等の生物学的活性を有するポリペプチドをコードづけする前記構造遺伝子の領域。
位、ＲＢＳはリボゾーム付着部位、ＬＳは分泌シグナル配列及びＴはイソアミラ一ゼ遺伝子の転写のターミネ一夕ー配列である）で表されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項１〜３記載のイソアミラーゼの構造遺伝子を含有するＤＮＡフラグメント。
１１　シュードモナス属の細菌の染色体ＤＮＡから得られたものである、請求項１０記載のＤＮＡフラグメント。
１２　細菌がシュードモナスＳＭＰＩ　ＡＴＣＣ５３６５１である、請求項１１記載のＤＮＡフラグメント。
１３　クローニングベクターを請求項１、２、３又は１０のいずれかに記載のＤＮＡと結合することによって得られた、宿主微生物において発現する複製可能な組換えＤＮＡ分子。
１４　クローニングベクターがプラスミド又はバクテリオファージの中から選ばれるものである、請求項１３記載の組換えＤＮＡ分子。
１５　クローニングベクターが、大腸菌、桿菌類及び酵母類における発現用の複製可能なプラスミドである、請求項１４記載の組換えＤＮＡ分子。
１６　エシェリキア・コリ７５／１８（ｐＳＭ２５７）ＡＴＣＣ６４４７４としてアメリカン・タイプ・カルチャー・センターに寄託された請求項１３〜１５記載の組換えＤＮＡ分子。
１７　大腸菌、桿菌類及び酵母類の中から選ばれる微生物を請求項１３〜１６のいずれかに記載のＤＮＡ分子によって形質転換させてなる、形質転換微生物。
１８　エシェリキア・コリＤＨ１である、請求項１７記載の形質転換微生物。
１９　バシラス・サチリスＳＭＳ１０８である、請求項１７記載の形質転換微生物。
２０　宿主微生物を請求項１３〜１６のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子によって形質転換させ、炭素源、窒素源及び無機塩の存在下、液状環境において、ｐＨ６、温度３０ないし４０℃で前記微生物を培養し、溶解処理した細胞又は培養基からポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製法。
２１　宿主微生物が、大腸菌、桿菌類及び酵母類の中から選ばれるものである、請求項２０記載のポリペプチドの製法。
２２　微生物が大腸菌であり、溶解処理した細胞からポリペプチドを採取する、請求項２１記載のポリペプチドの製法。
２３　微生物が枯草菌であり、ポリペプチドを培養基から採取する、請求項２１記載のポリペプチドの製法。
２４　削除
２５　削除
２６　削除
２７　培養基中、良好な生物学的活性及び熱安定性を有するイソアミラーゼを多量に生産するシュードモナスＳＭＰＩ　ＡＴＣＣ５３６５１。
【発明の詳細な説明】
　本発明は、組換えＤＮＡ技術、該技術を利用するＤＮＡ配列及びイソアミラーゼから誘導されたアミノ酸配列を単離する手段及び方法、その製造、得られる生成物及びその使用法に係る。
　さらに詳述すれば、本発明は、酵素イソアミラーゼをコードづけする遺伝子の単離及び配列決定及び該酵素のアミノ酸配列による特定化に係る。
　本発明は、イソアミラーゼ遺伝子又はそのフラグメントを包含する複製可能な組換えＤＮＡ分子、及び該組換えＤＮＡによって形質転換されかつ遺伝子生成物を発現及び／又は分泌する宿主微生物に係る。
　さらに、本発明は、イソアミラーゼ遺伝子又はそのフラグメントを含有する組換えＤＮＡ分子によって形質転換された微生物を適当な培養基で培養し、培養基又は細胞から得られた遺伝子生成物を分離することからなる、成熟イソアミラーゼ又は該成熟イソアミラーゼのものと同等の生物学的活性を発揮するイソアミラーゼのペプチドフラグメントの製法にも係る。
　直鎖状（アミロース）又は分枝状（アミロペクチン）のＤ（＋）グルコースポリマーの混合物でなるアミドは酵素によって加水分解されて、デキストロース、マルトース及び他の少糖類を含有するシロップ又は固状物を生成する。アミドの加水分解で使用される主な酵素は、アミロース中に存在する１−４グルコシド結合を切断するアミラーゼ及びアミロペクチンの１−６グルコシド結合を攻撃するイソアミラーゼ及びプルラナーゼである。
　マルトースを工業的に製造する際に使用されるアミドの多くは多量のアミロペクチンを含有するため、高収率（＞９５％）でマルトースを得るためには、２種類の酵素を組合せて使用する必要があった。
　一般に、１−６グルコシド結合を加水分解する酵素は、酵母の如き単細胞真核生物（ＭａｒｒｏＢ．及びＫｏｂａｙａｓｈｉＴ．「ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」１６７、６０６（１９５１）；ＧｕｎｊａＺ．Ｈ．ら「ザ・バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）」８１、３９２（１９６１））から高級植物（ＨｏｂｓｏｎＰ．Ｎ．ら「ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサエティー（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）１４５１（１９５１））及び細菌（Ｌｅｅ　Ｅ．Ｙ．Ｃ．ら「アーカイブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）」１２５、１０２８（１９６８））までの広い範囲の生物から生産される。
　さらに詳しくは、イソアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．６８）（分子量約９００００ドルトンを有する酵素）は、シュードモナス・アミロデラモーサ（Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ　ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）の菌株から発酵によって生産される（Ｈａｒａｄａ　Ｔ．ら「アプライド・マイクロバイオロジー（ＡＰＰｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１６、１４３９（１９６８））。
　しかしながら、シュードモナス属のすべての菌が非一ＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ　Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　Ａｓ　Ｓａｆｅ）性であるため、この方法は、完全には満足できるものではない。
　従って、食品工業での使用にあたり必須の安全性に関する要求に適合するイソアミラーゼ生産菌株を得る技術が求められている。このような特性を有する微生物は、組換えＤＮＡ技術によりＧＲＡＳ生物を形質転換させることによって得られる。
　分子遺伝学の発達により、上記技術を使用し、各種源からの遺伝物質の部分を
インビトロ
　−所望のタンパク質をコードづけするＤＮＡフラグメントを単離する工程
　−上記フラグメントをクローニングベクターに挿入し、得られたハイブリッドベクター又は組換えＤＮＡ分子を単離する工程
　−上記分子を形質転換技術によって宿主生物に挿入する工程
　−形質転換された生物を培養してＤＮＡフラグメントを発現させ、所望のタンパク質を生成する工程、及び
　−得られた発現生成物を培養基又は宿主生物から単離し、精製する工程
　この技術は、高度レベルに達しており、当該技術分野では多くの研究者によって実施されてはいるが、効果的な実験によるデータがなければ成功を予測することは困難である。組換えＤＮＡ技術によって異種タンパク質を生成するためには、かかるタンパク質をコードづけするＤＮＡ又は遺伝子配列を得る必要がある。
　これまでのところ、イソアミラーゼ又はこの酵素のアミノ酸配列をコードづけする遺伝子はいずれも知られていない。
　本発明は、まず、イソアミラーゼ遺伝子の単離、その配列決定及び特定、及びヌクレオチド配列から誘導されるイソアミラーゼのアミノ酸配列を開示する。本発明は、さらに、イソアミラーゼ遺伝子を
インビトロ
　さらに詳述すれば、本発明では、成熟イソアミラーゼのアミノ酸配列の直前に位置し、成熟イソアミラーゼの分泌に応答する分泌シグナルペプチド（リーダー配列）をコードづけするＤＮＡ末端５′配列を開示する。
　これらの知見の結果として、組換えＤＮＡを介してイソアミラーゼを生産する手段及び方法が開発された。従って、本発明の１つの目的は、純粋な形で単離されかつ配列決定されたイソアミラーゼ遺伝子を包含するＤＮＡのフラグメントにある。
　本発明の他の目的は、成熟イソアミラーゼのアミノ酸配列及びその分泌シグナル配列の特定化にある。
　本発明の他の目的は、ＤＮＡフラグメント又はその領域を包含し、宿主微生物において発現する複製可能な組換えＤＮＡ分子にある。
　本発明の他の目的は、組換えＤＮＡ分子によって形質転換され、組換えＤＮＡ分子に含有される異種ヌクレオチド配列からコード化遺伝生成物を発現及び／又は分泌する宿主微生物にある。
　本発明の他の目的は、イソアミラーゼ又はその領域をコードづけする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子によって形質転換させた宿主微生物（該微生物は成熟イソアミラーゼ又は該イソアミラーゼと同等の生物学的活性を有するポリペプチドを発現及び／又は分泌する）を適当な培養基で培養し、培養基又は微生物細胞から発現生成物を分離、精製することからなる成熟イソアミラーゼ等の製法にある。
　本発明の他の目的は、得られた成熟イソアミラーゼ及び該成熟イソアミラーゼと同等の生物学的活性を有するポリペプチドにある。
　本発明の他の目的は、１−６グルコシド結合の加水分解法においてイソアミラーゼ及びイソアミラーゼと同等の生物学的活性を有するポリペプチドの使用にある。
　本発明の他の目的は以下の記載及び実施例から明らかになるであろう。
　本発明をさらに明確にするために、使用す用語について簡単に述べる。
　
ゲノムバンク（ｇｅｎｃｍｅ　ｂａｎｋ）
　これは、各々がドナー生物由来のＤＮＡフラグメントを有する（これによってバンクが得られる）宿主微生物のクローンのすべてに関する用語である。
　ゲノムバンクは、各クローンにおける各々のフラグメントを組み合わせてドナー生物の染色体ＤＮＡの多く（又はすべて）を再構成できる場合を代表例として定義される。
　
制限酵素
　これは、特異な部位（制限酵素の認識部位と称される）でＤＮＡ分子を切断する加水分解酵素をいう。
　
クローニングベクター
　これは、宿主微生物に移される際、複製用のすべての遺伝情報を含有するＤＮＡ分子をいう。
　クローニングベクターの例としては、プラスミド及びいくつかのバクテリオファージのＤＮＡがある。
　好ましくは、組換えＤＮＡ技術では、多くの細菌及び他の微生物には細胞当たり多数のコピーが存在するため、環状のＤＮＡ二重ら線を包含するプラスミドが使用される。さらに、プラスミドＤＮＡは、宿主生物内でそれ自体を再生成するための複製開始点だけでなく、抗生物質に対する耐性の如き選択的な表現型特性をコードづけする遺伝子を含有する。この結果、選択的培養基で培養する際、所望のプラスミドを含有する宿主細胞を容易に認識できる利点がある。各種の制限酵素（それぞれプラスミドＤＮＡにおける異なる制限位置を認識する）によって特異的に切断されるため、プラスミドも有効である。
　つづいて、異種遺伝子又はそのフラグメントが切断後プラスミドＤＮＡに挿入され、再び閉環して、より大きい分子、組換えＤＮＡ分子又はハイブリッドプラスミドを形成する。
　ついで、組換えＤＮＡ分子を、形質転換と呼ばれる方法によって宿主細胞に導入する。
　得られた形質転換細胞を、プラスミドに挿入された遺伝子からコード化されたポリペプチドを生成する発酵（発現と呼ばれる工程）で使用する。
　
発現
　これは、宿主生物が与えられた遺伝子からコードづけされたタンパク質を合成する機構をいう。
　これは、転写（すなわち、ＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へ遺伝情報を移すこと）及び翻訳［すなわち、Ｊ．Ｄ．Ｗａｔｓｏｎ「モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆｔｈｅ　Ｇｅｎｅ）」Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ　Ｉｎｃ．発行、第３版１９７６）によって記載された遺伝子コードの原則（コドン、すなわち特定のアミノ酸をコードづけするヌクレオチド塩基のトリプレットに関する）に従ってｍＲＮＡからタンパク質に情報を移すこと］の過程を包含する。
　各種のコドンが同じアミノ酸をコードづけできるが、各アミノ酸については、これらの特殊なコドンのみであり、他にはない。転写は、プロモーターとして公知の領域（ポリメラーゼＲＮＡによって認識及び結合される）において開始する。
　ついで、得られたｍＲＮＡの情報が、コード化されたアミノ酸配列を有するポリペプチドに翻訳される。
　翻訳は開始シグナル（ＡＴＧ）に従って始まり、ターミネーションコドンで終了する。
　
プライマー
　これは、通常、塩基１５ないし２０個を含有し、酵素法によって配列決定されるシングルら線の領域に相補的なオリゴヌクレオチドである。
　
遺伝子
　これは、
構造遺伝子
　次に、図面について説明する。
　第１図はＳａｕ３Ａゲノムバンクから選ばれたいくつかのクローンを含有するＭ９＋アミロペクチン寒天培地（ｐＨ６．０）を示す。ヨウ素で染色した後、クローン９（Ａ）及び１７（Ｂ）は、イソアミラーゼ活性を表示する紫色のリングを示す。
　第２図はクローン９から抽出されたプラスミドｐＳＭ２５７の制限地図である。
　第３図はクローン１７から抽出されたプラスミドｐＳＭ２５８の制限地図である。
　第４図は制限酵素による消化の後、ハイブリッドプラスミドの電気泳動挙動による比較分析の結果を示す。クローン９（ｐＳＭ２５７）のプラスミドを酵素Ｓａｕ３Ａ（２）及びＨｐａＩＩ（５）によって消化し、クローン１７（ｐＳＭ２５６）からのプラスミド（３及び６）及びシングルベクターｐＵＣ１２（１及び４）と比較した。Ｍは分子量のマーカーである。
　第５図は抗−イソアミラーゼ抗体での処理によるイソアミラーゼの存在に関する分析の結果を示す。１はクローン９によるタンパク質、２は大腸菌７１／１８からのタンパク質、３は精製イソアミラーゼ１００ｎｇに係る。
　第６図はベクターＭ１３ｍｐ８におけるプラスミドｐＳＭ２５７から得られたＳｍａ１−ＢａｍＨＩフラグメント（１９００ｂｐ）及びＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメント（１３００ｂｐ）のク
ローニングのダイアグラムである。
　第７図、第７（Ａ）図及び第７（Ｂ）図はイソアミラーゼ遺伝子を含有するシュードモナスＳＭＰＩから得られた染色体ＤＮＡの３３３５ｂｐフラグメントのヌクレオチド配列を示す。
　第８図、第８（Ａ）図及び第８（Ｂ）図はイソアミラーゼをコードづけする構造遺伝子のヌクレオチド配列（２２５０ｂｐからなる）及び該ヌクレオチド配列から誘導される酵素のアミノ酸配列（アミノ酸７５０個）を表す。
　第９図、第９（Ａ）図及び第９（Ｂ）図はイソアミラーゼの構造遺伝子及び調節及び分泌配列を含有するシュードモナスＳＭＰＩから得られた染色体ＤＮＡのフラグメントのヌクレオチド配列を表す。
　イソアミラーゼ及びそのシグナル配列（ＬＳ）をコードづけするフラグメントは２３２８ｂｐを含み、アミノ酸７７６個を含有するタンパク質をコードづけする。
　該配列において、以下の記号を使用する。
　第１０図はプラスミドｐＳＭ２６２の制限地図である。
　第１１図は大腸菌における発現及び分泌用のハイブリッドプラスミドｐＳＭ２８９の制限地図である。
　第１２図は枯草菌における発現及び分泌用のハイブリッドプラスミドｐＳＭ２９０の制限地図である。
　本発明によれば、上記酵素をコードづけする遺伝子を単離するにあたり、イソアミラーゼを生産し得るシュードモナス属に属する各種の菌を使用できる。
　好ましくは、発明者らの研究室で単離され、良好な活性及び熱安定性を有するイソアミラーゼを高収率（約１２５Ｕ／ｍｌ）で生産し得るシュードモナス属の菌株（シュードモナスＳＭＰＩ）を使用できる。
　この菌株について、その染色体又はプラスミドにイソアミラーゼ遺伝子が存在するか否かを調べるため、Ｋａｄｏ及びＬｉｕの技術（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）」
１４５
　従って、染色体ＤＮＡの消化に適する制限酵素を使用し、シュードモナスＳＭＰＩのゲノムバンクを構成することによって、イソアミラーゼの遺伝子を単離した。　
　さらに詳述すれば、微生物から抽出した染色体ＤＮＡを別々に制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＢＲＬ）及びＳａｕ３Ａ（ＢＲＬ）によって消化して、シュードモナスＳＭＰＩの２つのゲノムバンクを構成した。消化反応を、緩衝溶液中、温度３７℃又は約３７℃、所望の消化が達成されるに充分な時間で実施した。
　得られたＤＮＡフラグメントから、３０００ないし４０００塩基対（ｂｐ）のサイズを有するもののみを精製した。
　このようなサイズの選択は、イソアミラーゼの分子量が公知であるため、その遺伝子のサイズを約３０００ないし４０００ｂｐと概算できたことによって決定したものである。
　ついで、得られたＤＮＡのＥｃｏＲＩ及びＳａｕ３Ａフラグメントの２つの集団を、大腸菌における発現用クローニングベクターに、ベクター１分子当たり１つのＤＮＡシングルフラグメントを結合させるに適する条件下で挿入した。
　さらに詳しくは、緩衝溶液中、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）の存在下、温度４ないし３７℃、好ましくは１３ないし１８℃で反応を行った。
　この目的に適するベクターは、当分野で通常使用される大腸菌プラスミド又はバクテリオファージの中から選ばれる。
　さらに詳述すれば、Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ．ら（「ジーン（Ｇｅｎｅ）」
１９
　この場合、外来のＤＮＡフラグメントが合体されたクローンを区別する容易かつ迅速な方法である。
　実際、プラスミドはβ−ラクタマーゼ及びβ−ガラクトキシダーゼに係る遺伝子を有しており、大腸菌の宿主菌株がアンピシリン含有培地で生育できるようになる。外来のフラグメントがβ−ガラクトキシダーゼに係る遺伝子に存在する制限部位（特にクローニングベクターに適する）間に挿入される場合には、遺伝子は破壊され、もはや酵素を生産できない。
　このように、ラクトースと類似する基質（染料減成分子）を使用することによって、元のプラスミドを含有するクローン（ブルーに着色される）から組換えクローン（着色されない）を区別することが可能である。
　本発明に従い、ｐＵＣ１２から得たプラスミドＤＮＡを、制限酵素（β−ガラクトキシダーゼのヌクレオチド配列の内側を切断する）によって消化して直鎖状とし、反応混合物から沈殿、分離した後、リガーゼで処理して、予めＥｃｏＲＩ及びＳａｕ３Ａでの消化によって得たシュードモナスＳＭＰＩの染色体ＤＮＡのフラグメントに結合させた。
　リガーゼによる反応の前にプラスミドが再び環化することを防止するため、プラスミドＤＮＡ分子をアルカリホスファターゼ（分子の５ｎ末端から硫酸基を除去し、リガーゼの存在下における３′末端ＯＨの縮合を阻止する酵素）によって処理した。
　リガーゼによる反応を、プラスミド：ＤＮＡフラグメントの比としてプラスミドが多くなる量、好ましくは２：１で使用して実施した。
　反応終了後、Ｍａｎｄｅｌ　Ｍ．及びＨｉｇａの方法（「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）」
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　この目的に好適な大腸菌は、エシェリキア・コリ　ＪＭ　８３（ｐｒｏ，ａｒａ，△ｌａｃｐｒｏ，ｓｔｒａＡ，φ８０ｄ，ｌａｃＺ　Ｍ１５）、エシェリキア・コリ　ＨＢ　１０１（Ｆ−，ｈｓｄ　Ｓ２０（ｒ−Ｂ，ｍ−Ｂ）ｒｅｃ　Ａ１３，ａｒａ−１４，ｐｒｏＡ２，Ｌａｃ　Ｙｌ，ｇａｌＫ２，ｒｐｓ　Ｌ２０（ＳｍＲ），Ｘｙ１−５，ｍｔｌ−１，ｓｕｐ　Ｅ４４λ）、エシェリキア・コリ　ＪＭ　１０１（ｌａｃ，ｐｒｏ，ｓｕｐＥ，ｔｈｉＦ′ｐｒｏＡＢ，ｌａｃ−ｑ）及びエシェリキア・コリ　７１／１８△（１ａｃ−ｐｒｏＡＢ），ｔｈｉ，ｓｕｐＥ，［Ｆ′，ｐｒｏＡＢ，ｌａｃＩ−ｑＺ　Ｍ１５］から選ばれる。
　形質転換した細胞を使用して、選択的なものとした培地に置き、ハイブリッドプラスミドを含有するクローン単離した。ｐＵＣ１２はＤＮＡ　μ９当たりコロニー２×１０６以上の効率で形質転換されている。
　ついで、得られたゲノムバンクを分析して、イソアミラーゼ遺伝子を含有するクローンの存在を検知した。これは、特殊なＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーション又は直接の発現によるスクリーニングの如き各種の方法によって行なわれる。
　第１の方法は、主にイソアミラーゼのアミノ酸配列の少なくとも一部の決定に基づくものである。この情報は、小さなヌクレオチドフフラグメント［適当にマーク付けされる際、一般に公知の技術（Ｈａｇｎｅｓｓ　Ｄ．Ｓ．「Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．」７２、３９６１（１９７５）；Ｍｅｓｏｎ　Ｐ．Ｊ．ら「ヌクレイック・アシッド・ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」２４５Ｐ（１９８５）、ＩＲＬ　ＰＲＥＳＳ　発行）に従って（＋）のクローンを決定するために使用される］の合成に利用される。
　一方、第２の方法は、イソアミラーゼ遺伝子は該遺伝子を含有するゲノムバンクのクローンから発現されるとの仮定に基づくものでる。
　仮に、このクローンがアミロペクチンを含有する培地で生育する場合には、アミロペクチンは減成されるはずであり、この減成は比色法によって検知される。従って本発明では、アミロペクチンを含有しかつｐＨ≦６．０に緩衝化した最小培地を使用し、直接的な発現によって、シュードモナスＳＭＰＩの２種類のゲノムバンクの組換えクローンを検定した。つづいて、酵素の存在によるアミロペクチンの減成をヨウ素蒸気によって実証した。
　この方法を使用して、プレート培地での検定に対して明らかな（＋）の応答を示す２種類のクローン（いずれもＳａｕ３Ａゲノムバンクからのもの）を単離した。これら２種類のクローンのイソアミラーゼ生産の可能性を、ウエスタンーブロット法（Ｈａｍｅｓ　Ｂ．Ｄ．ら「ゲル・エレクトロホレシス・オブ・プロテインズ（Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」２９０Ｐ（１９８１）、ＩＲＬ　ＰＲＥＳＳ発行）に従い、特殊な抗−イソアミラーゼ抗体を使用する免疫検定によって確認した。
　次に、これら２種類の（＋）コロニーのハイブリッドプラスミドの制限地図を決定した。
　実際には、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　Ｈ．Ｃ．ら（「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．）」
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　２つのプラスミドのうち１つ（ｐＳＭ２５７）は約３２００ｂｐの挿入部（ＥｃｏＲＩ制限部位、ＢａｍＨＩ部位及びＳｓｔＩ部位を含有することが判明した）を有していた。他のプラスミド（ｐＳＭ２５８）は、第１のプラスミドと同じ制限部位を含有する約３０００ｂｐの挿入部を有していた。
　ついで、プラスミドを２種類の酵素（頻繁に切断を行う）で順次消化した。該プラスミドはサイズはわずかに異なるが、電気泳動では同じ挙動を示した。
　本発明に従い、約３２００ｂｐの染色体ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列を決定した。
　この決定は、Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔの技術（「Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．」
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使用することによって行われる。
　後者の方法（非常に長くかつ多少知られているＤＮＡフラグメントの配列決定に特に好適である）では、配列決定に供するフラグメントがシングルら線（鋳型）及びプライマーとして定義されかつ該シングルら線の開始領域に対して相補的である小さいオリゴヌクレオチド（塩基１５−２０個）の形状で利用できるものであることが要求される。従って、本発明では、約３２００ｂｐの染色体ＤＮＡフラグメントをベクター内でサブクローン化し、Ｓａｎｇｅｒ法によって配列決定した。この目的に適するベクターは、ウイルス、プラスミド又はバクテリオファージである。好ましくは、ファージベクターＭ１３ｍｐ８（Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ．ら「Ｇｅｎｅ」
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　本発明の目的に関してはファージベクターＭ１３ｍｐ８が特に好ましい。これは、そのＤＮＡが大腸菌の細胞に存在する際には二重ら線形で単離され、一方その感染サイクルの終了時、細菌細胞を出たファージが培養基の上澄み液中に流入する際にはシングルら線形であるためである。
　本発明では、イソアミラーゼ遺伝子を２つのフラグメントに分割し、各々をファージベクターＭ１３ｍｐ８に挿入した。
　さらに詳述すれば、遺伝子内にＢａｍＨＩ部位及び該遺伝子の前後に他の２つの部位が存在するとの利点から、プラスミドｐＳＭ２５７を制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ及びＸｂａＩで消化した。得られたフラグメントの端を、ＤＮＡポリメラーゼ１酵素（ラージフラグメント又はＫｌｅｎＯＷフラグメント）で処理して平らにし、フラグメントを電気泳動によって分離し、つづいて常法に従って溶出した。
　得られたフラグメント（それぞれ約１９００ｂｐ（ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ）及び約１３００ｂｐ（ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ）を含有する）を、ＳｍａＩ酵素によって直鎖状とした後、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在下でＭ１３ｍｐ８ファージに挿入し、ついでリガーゼ混合物を大腸菌のコンピテント細胞を形質転換するために使用した。
　組換えクローン、すなわちハイブリッドベクターを有するクローンを同定した後、２つのフラグメントの配向を、制限酵素により適当に切断することによって決定した。
　さらに詳述すれば、１９００ｂｐフラグメントを含有するハイブリッドベクターを、フラグメント内部で対称にかつベクター内ではフラグメントのすぐ近くで切断する制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。予想した如く、結果は配向に応じて３００ｂｐ又は１６００ｂｐのセグメントであった。同様に、１３００ｂｐフラグメントを有するプラスミドでは、酵素ＳｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した場合、配向に応じて５００ｂｐ及び８００ｂｐのセグメントを与えた。
　Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ．により「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」
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　プラスミドｐＳＭ２５７に挿入されたＤＮＡフラグメントは３３３５ｂｐを含有し、一方、酵素イソアミラーゼをコードづけする領域は２３２８ｂｐ（アミノ酸７７６個に相当）を含有することがわかった。
　公知の方法に従い自動タンパク質シーケンサーを使用して３３３５ｂｐフラグメントの一方の端から塩基約１０００個の位置にある所望の酵素のアミノターミナル配列に相当する５４個のヌクレオチドの配列を決定した。成熟イソアミラーゼの構造遺伝子の５′末端を正確に同定するためこの方法を利用したものであり、２２５０ｂｐ（アミノ酸約７５０個に相当）を含有することがわかった。
　分泌形タンパク質から予想されるように、成熟イソアミラーゼの構造遺伝子の直上に、タンパク質の分泌に応答するメチオニン（−ＡＴＧ−）で始まる代表的なシグナル配列（アミノ酸２６個）（ＬＳ）が見られた。このＬＳは、細胞膜外にタンパク質を運ぶために必要な高度に疎水性の構造によって特徴づけられる。タンパク質の移動後、膜ペプチダーゼによってＬＳを除去する。ペプチダーゼの認識部位はＡｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａの配列で同一と見なされ、第２のアラニンの後で切断が行われる。
　これは、発明者らによって精製した分泌タンパク質のアミノターミナル配列のデータにより確認され、該配列はＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｎである。
　翻訳を開始させる−ＡＴＧ−の前のヌクレオチド約１０個のところに、配列ＧＧＡＧＧを有する代表的なリボゾームの結合部位（ＲＢＳ）も見られた。
　ＬＳからヌクレオチド約１３０個上方の位置に、マルトースによる誘発に感応するプロモーターのコンセンサス配列（−ＧＧＡＴＧＡ−）と類似する構造（−ＧＧＡＴＧＴ−）が見られた。
　この配列の前方ヌクレオチド３５個のところに、転写の開始部と見られる−Ｇ−残基が存在する。
　この−Ｇ−の前ヌクレオチド１０個のところに、プルラナーゼ［その遺伝子はマルトースによって誘発される（Ｃｈａｎｐａｎ　Ｃ．ら「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）」１６４（２）、６３９（１９８５））］の類似″−１０領域に近似した−ＴＣＴＡＴＴ−構造がある。この遺伝子の後方でストップコドン−ＴＡＧ−の後ヌクレオチド約１０個のところに、△Ｇ［Ｔｉｎｏｃｏらの方法（「ネーチャー・ニュー・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ．）
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　後述の配列データに基づき、イソアミラーゼ又はその領域をコードづけする遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントを使用し、プラスミドの如き複製可能なクローニングベクターを使用して、イソアミラーゼ又は該イソアミラーゼと同等の生物学的活性を有するポリペプチドを生産する組換えＤＮＡを構成できる。
　本発明の好適な１具体例では、成熟イソアミラーゼをコードづけする構造遺伝子を、シュードモナスの配列とは異なるプロモーター及び分泌配列の後方に位置することによってプラスミドベクターに挿入できる。この目的は、強力なプロモーター（すなわち、これらの後方の遺伝子の発現を非常に効果的に案内できかつ当分野で公知のプロモーターの中から選択される）によって達成される。
　かかるプロモーターの例としては、トリプトファンシステム（ｔｒｐ）、ラクトースシステム（ｌａｃ）又はＰ１及びＴ５の如きバクテリオファージにおけるものである。
　しかしながら、他の多くのプロモーターも同定され、使用されており、その配列の詳細もＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔらによって公表されている（「セル（Ｃｅｌｌ）」２０、２６９（１９８０））。
　分泌シグナルタンパク質をコードづけするヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡの分野で一般的に使用されているものの中から選択される。
　この目的に適する配列の例としては、サブチリシン及びニュートラルプロテアーゼがある。
　本発明の他の具体例によれば、シュードモナスの配列とは異なる調節配列のコントロールの下、プラスミドベクターに、調節配列を使用することなく、イソアミラーゼをコードづけする遺伝子を位置せしめることによって組換えＤＮＡ分子を構成できる。
　上述の具体例のいずれかに従って操作して得られた組換えＤＮＡ分子を、通常、細菌及び酵母から選ばれかつ各種文献に開示された方法によってコンピテントとされた宿主微生物を形質転換させるために使用する。
　ついで、このように形質転換された微生物を使用し、イソアミラーゼ又はイソアミラーゼ活性を有するポリペプチドの発酵による製造を行う。
　好ましくは、大腸菌Ｋ１２、桿菌類及びサッカロミセス類でなる群がら選ばれる。
　これらの中で、ヒトに対する病原性がなく、合成された異種タンパク質を直接培養基に分泌し得ることから、枯草菌が特に好適である。
　この場合、つづく所望タンパク質の回収及び精製の工程が簡単であるとの利点が得られる。
　本発明の好適な具体例では、大腸菌及び枯草菌でイソアミラーゼを発現する組換えＤＮＡ分子を、これら細菌において複製可能なクローニングベクターに、ＬＳ及びイソアミラーゼの構造遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントを挿入することによって構成する。
　さらに詳しくは、イソアミラーゼＲＢＳの直前にＮａｒＩ制限部位が存在するため、プラスミドｐＳＭ２５７から約２４００ｂｐのＤＮＡフラグメントを単離することが可能であった。該フラグメントは、シュードモナスＳＭＰＩの元のプロモーターを含有することなく、分泌シグナルペプチド及び成熟イソアミラーゼをコードづけする配列を含有する。後述の実施例４に記載する如くして中間プラスミドを構成した後、大腸菌での発現のためクローニングベクターｐＵＣ１２に上記フラグメントを挿入した。
　単離した組換えＤＮＡ分子をｐＳＭ２８９と名付け、大腸菌ＤＨｌ細胞の形質転換に使用した。
　これら細胞は、プレート培地又は特殊な液状培地で培養する際、イソアミラーゼを発現及び分泌した（後述の実施例６のデータによって示される）。
　本発明に従い、ＬＳと共にイソアミラーゼの構造遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントをハイブリッドプラスミドｐＳＭ２８９からＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして取り出し、枯草菌における発現及び複製用のクローニングベクターに挿入した。
　この目的のため、枯草菌における複製開始点、クロラムフェニコールに対する耐性をコードづけする遺伝子及び強力な合成プロモーターを含有するファージのプラスミドｐＳＭ２６８（その構成については後述の実施例５に詳述する）を使用した。上記強力なプロモーターのコントロールの下、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを配置せしめ、得られた組換えＤＮＡ分子（ｐＳＭ２９０）を単離した。
　クローニング操作の間に配列の再配列が生じていないことを確認するため、イソアミラーゼ構造遺伝子とプロモーターとの間の結合領域を配列決定した。
　結果は予測したとおりの配列を示した。
　ついで、ＤｕｂｒａｕＤ．及びＤａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ　Ｒ．の方法（「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」５６、２０９（１９７１））によってコンピテントとした枯草菌の細胞を、ｐＳＭ　２９０を使用して形質転換させた。
　本発明によれば、各種機関に寄託された分譲可能な枯草菌類の各種の菌株を使用できる。
　さらに詳しくは、枯草菌ＭＳ１０８（ｒｅｃ−、Ｌｉｓ−、１ｅｕ−）を使用し、形質転換物質を適当な培地（たとえばＶＹ＋クロラムフェニコール）で選択した。
　ついで、（＋）のクローンをＭ９及びＭＢ培地のプレート上及び液体培地中、温度約３７℃で１６時間培養した。
　その後、培養基及び細胞抽出物中のイソアミラーゼを、Ｙｏｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ａ．らの方法（「ビオシミカ・エ・ビオ・フィジアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）」２１２、４５８−４６９（１９７０））によって定量した。
　その結果によれば、これら微生物は、酵素イソアミラーゼを発現できるだけでなく、元の菌株（シュードモナスＳＭＰＩ）によって得られるものに匹敵する量で分泌できる。
　さらに、シュードモナスＳＭＰＩの場合、インキュベーション後約７２−１２０時間でイソアミラーゼの最適生産に達するが、枯草菌（ｐＳＭ２９０）に関しては１６時間にすぎない。
　ハイブリッドプラスミドｐＳＭ２５７（大腸菌）７１／１８（ｐＳＭ２５７）及び菌株シュードモナスＳＭＰＩについては１９８７年７月２４日にアメリカン・タイプ・カルチャー・センターに寄託してあり、寄託番号はそれぞれＡＴＣＣ６７４７４及びＡＴＣＣ５３６５１である。
　以下の実施例は本発明を限定することなく説明するものである。
　実施例１
　
シュードモナスＳＭＰＩから染色体ＤＮＡの抽出
　ＨＳＭ発酵培養基（マルトース２０ｇ／ｌ、グルタミン酸Ｎａ４ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４　１．５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　１ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．５ｇ／ｌ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ　０．１ｇ／ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ　０．１ｇ／ｌ及びＮａＣｌ　０．１ｇ／ｌ；ｐＨ５．５）１００ｍｌに菌株シュードモナスＳＭＰＩを接種し、撹拌しながら（２２０ｒｐｍ）、３０℃に５日間維持した。その後、遠心分離機Ｓｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−５ＢモデルＳＳ３４において４℃で遠沈して（１０分、５０００ｒｐｍ）、細胞を培養基から分離し、２５％ショ糖、１００ｍＭ　ＮａＣｌ及び５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の溶液で洗浄し（２×１２０ｍｌ、前記と同じ条件下で遠心分離し、リゾチーム（ＳＩＧＭＡ）１ｍｇ／ｍｌを含有する緩衝液（１００ｍＭ　ＥＤＴＡ及び５０ｍＭ　ＮａＣｌ；ｐＨ６．９）１０ｍｌ中に再度懸濁させた。得られた懸濁液を穏やかに撹拌しながら３７℃に３０分間維持し、ついで１０％ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）１ｍｌと混合し、６０℃に１０分間維持し、１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣｌ及び１５ｍＭクェン酸ナトリウム）中、３７℃で３０分間予じめインキュベートしたプロナーゼ１ｍｇ／ｍｌと混合し、３７℃に２時間維持した。ＮａＣｌを添加して最終濃度１Ｍとした後、冷たい（−２０℃）エタノール２又は３容でＤＮＡを沈殿させ、ガラス棒で集め、０．ｌ×ＳＳＣ　１０ｍｌ中に再度懸濁させた。この懸濁液を穏やかに撹拌しながら常温（２０−２５℃）に１夜維持し、ＲＮＡｓｅ（１０μｇ／ｍｌを添加した後、３７℃に３０分間維持した。溶液の塩濃度をｌ×ＳＳＣとした。タンパク質をフェノール（１容）で抽出した後、該溶液にイソプロパノールを滴加することによってＤＮＡを沈殿させ、穏やかに撹拌しながら常温に維持した。
　ついで、遠心分離してＤＮＡを回収し、０．１×ＳＳＣ１ｍｌに再度懸濁させた。
　染色体ＤＮＡの量（分光光度計Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　５１５を使用し、ＯＤ　２６０における分光測光によって評価）は０．６４５ｍｇ／ｍｌであった。
　実施例２
　
イソアミラーゼ遺伝子のクローニング
　
ａ）ＥｃｏＲＩおけるシュードモナスＳＭＰＩゲノムバンクの調製
　前記実施例１に記載の如くして得られた染色体ＤＮＡ８０μｇを緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ及び１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２；ｐＨ７．５）８００μｌに懸濁させ、酵素ＥｃｏＲＩ（ＢＲＬ）３７５単位（Ｕ）の存在下、３７０℃で２．５時間インキュベートした。
　ついで、ＤＮＡ混合物をショ糖グラディエント（１０−４０％）に負荷し、ＢｅｃＫｍａｎＳＷ２８ローターにおいて２０℃で遠心分離した（２０時間、２５０００ｒｐｍ）。
　その後、グラディエントをフラクションに分け、各フラクションの一部を０．７％アガロース上、２０Ｖ、１夜の条件下における電気泳動によって分析して所望のサイズ（３０００−４０００ｂｐ）を有するフラグメントを含有するフラクションを同定した。これらフラクションを集め、エタノールにより−２０℃でＤＮＡを沈殿させ、１２０００ｒｐｍで１５分間遠沈して分離した。ついで、ＥｃｏＲＩにより予じめ消化した大腸菌からのプラスミドｐＵＣ１２にＤＮＡを挿入した。
　ｐＵＣ１２（２８００ｂｐ）７μｇを、上述の組成を有する反応混合物７０μ４中、ＥｃｏＲＩ（ＢＲＬ）１０Ｕにより３７℃で１時間消化した。
　ついで、プラスミドＤＮＡを−２０℃でエタノールによって沈殿させ、遠心分離機Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆにおいて４℃で遠沈して（１５分間、１２０００ｒｐｍ）分離し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ　ＥＤＴＡ）５０μｌ中に再度懸濁させ、酵素ＣＩＰ（仔ウシの腸内ホスファーゼ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）１Ｕにより３７℃で３０分間処理した。
　この溶液にＨ２Ｏ　４０μｌ、１０×ＳＴＥ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｌｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ；ｐＨ８）１０μ４及び１０％硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）５μｌを添加することによって酵素反応を停止させた。
　前述の如くして沈殿させたプラスミド２．６μ９を、３０００−４０００ｂｐＤＮＡフラグメントを含有するグラディエントからの混合物１．３μｇと共に、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）２０Ｕの存在下、緩衝液（６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　ＡＴＰ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び１０ｍＭジチオトレイトール；ｐＨ７．６）１３０μ４（最終容量）中、１４℃で１２時間インキュベートした。
　リガーゼ混合物２μｌずつを使用し、５０ｍＭ　ＣａＣｌ２による処理（Ｍａｎｄｅｌ　Ｍ及びＨｉｇａ「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」５３、１５４（１９７０））によってコンピテントとした大腸菌７１／１８細胞（Ｍｉｌｌｅｒ　Ｊ．Ｈ．「エキスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」Ｃｏｒｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｌａｂ発行（１９７２））３００μ４を形質転換させた。
　アンピシリン５０μ９／ｌ、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）０．０５ｍＭ及び０．２％Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−ヨードリル−Ｄ−ガラクトピラノシド）を添加して選択的とした２ＸＹＴ培地（１６ｇ／ｌ　Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇ／ｌ　Ｂａｃｔｏ−Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ）及び１０ｇ／ｌ　ＮａＣｌ）に細胞を接種し、恒温室において３７℃で１２時間インキュベートすることによって形質転換体を選別した。
　リガーゼ混合物全量から、組換えコロニー６０００個を得た。
　アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬｕｒｉａ寒天培地（Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＤＩＦＣＯ）、５９／ｌ　Ｂａｃｔｏ−Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ）及び５９／ｌ　ＮａＣｌ）のプレート上で、コロニーを１００個の群に移した。
　
ｂ）Ｓａｕ３ＡにおけるシュードモナスＳＭＰＩのゲノムバンクの調製
　シュードモナスＳＭＰＩの染色体ＤＮＡ７８μｇを、反応緩衝液（６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ　ＮａＣｌ及び　５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）１００μｌ中、３７℃、３０分間で酵素Ｓａｕ３Ａ（ＢＲＬ）１６Ｕにより部分的に消化した。
　このようにして消化したＤＮＡ混合物をショ糖グラディェント上に負荷し、３０００ないし４０００ｂｐのＤＮＡフラグメントを含有するフラクションを寒天ゲル上での電気泳動によって同定した。操作条件は上記ａ）のものと同じである。
　反応混合物（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭＮａＣｌ　及び　５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）７０μｌ中、３７℃、２時間で酵素ＭａｍＨＩ（ＢＲＬ）５０ＵによってｐＵＣ１２７μｇを消化した。
　ついで、プラスミドＤＮＡを−２０℃においてエタノールで沈殿させ、遠心分離し、前記ａ）の如く、再環化を防止するため酵素ＣＩＰ（仔ウシの腸内ホスファターゼ）で処理した。ＤＮＡ１６０ｎｇを、グラディエントから得られた３０００−４０００ｂｐフラグメントを含有する混合物８０ｎｇと共に、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１０Ｕの存在下、反応混合物１００μｌ中、４℃において１８時間インキュベートした。
　リガーゼ混合物２μｌを上述の方法によってコンピテントした大腸菌７１／１８細胞３００μｌの形質転換に使用し、２ｘＹＴ寒天培地上に置き、３７℃で１２時間インキュベートした。
　リガーゼ混合物全体から組換えコロニー６３００個が得られた。
　アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬｕｒｉａ寒天培地（Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ　Ｂａｃｔｏ−Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌ　ＮａＣｌ）のプレート上で、コロニーを１００個の群に移した。
　
ｃ）ＥｃｏＲＩ及びＳａｕ３Ａゲノムバンクの直接発現によるスクリーニング
　ＥｃｏＲＩ及びＳａｕ３Ａゲノムバンクから得たコロニーを、レプリカ平板法（ＨａｙｅｓＷ．「Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｓｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｖｉｒｕｓｅｓ」ｐ１８７、Ｗｉｌｅｙ発行、１９６８年）によって、Ｍ９＋グルコース最小培地（６ｇ／ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４、３ｇ／ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌＮａＣｌ、１ｇ／ｌ　ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ　ＣａＣｌ２、０．２％グルコース、０．５％寒天及び１％アミロペクチン；ｐＨ６．０）のプレート上に移し、３７℃で４８時間インキュベートした。
　ついで、ヨウ素フレーク２ｇ、ＫＩ　１ｇ、ＥｔＯＨ（９５％）２５ｍｌ、Ｈ２Ｏ　７５ｍｌの組成を有する溶液（ＨａｒａｄａＴ．ら「ＡＰＰｌ．ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」２８、３３６（１９７４））を使用して、コロニーをヨウ素蒸気に１−２分間さらした。ＥｃｏＲＩゲノムバンクからのコロニーは（−）の結果を示したが、Ｓａｕ３Ａゲノムバンクからの２つのコロニー（コロニー９及び１７と称する）は、同じ条件下でシュードモナスＳＭＰＩを生育させる際に観察されたものと同一のアミロペクチン減成リング（第１図）を示した。これは、これらコロニーがイソアミラーゼを生産できることを示し、従って、コロニー内に上記酵素をコードづけする遺伝子が存在することを示す。
　形質転換していない大腸菌７１／１８細胞を、コントロールとして、Ｍ９＋アミロペクチン最小培地上、ｐＨ６．０、３７℃で４８時間生育させ、ヨウ素蒸気で処理したところ、減成リングを示さなかった。
　さらに、最小培地において他のｐＨ値で生育させた場合、ｐＨ＞６．０ではコロニー９及び１７が減成リングを示さないことがわかった。
　
ｂ）（＋）コロニーの制限酵素による分析
　コロニー９及び１７中に存在する組換えプラスミドを大量抽出によって単離し、制限酵素ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｔＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＳａｌＩによって処理した後、０．８％アガロースゲル上、１００Ｖ、２時間での電気泳動によって分析した。
　コロニー９から単離したプラスミドｐＳＭ２５７は約３２００ｂｐの挿入体（ＥｃｏＲＩ部位、ＢａｍＨＩ部位及びＳｓｔＩ部位を含有しており、その正確な位置を第２図に示す）を含有していた。コロニー１７から単離したプラスミドｐＳＭ２５８は、プラスミドｐＳＭ２５７と同じ制限部位を含有する約３０００ｂｐの挿入体を有していた。
　このプラスミドの制限地図を第３図に示す。
　ついで、これら２種類のプラスミドをＳａｕ３Ａ及びＨｐａＩＩＩの如き２種類の酵素（頻繁に切断する）で消化し、同じ酵素で処理したプラスミドｐＵＣ１２及び分子量マーカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）と比較した。
　得られた消化ハイブリッドのポリアクリルアミドでの分析では、いずれの場合とも同じではあるが、ｐＵＣ１２について得られたものとは異なる電気泳動挙動を示した（第４図）。
　
ｅ）ウエスタン−ブロットによる分析
　コロニー９及び１７から得られた細胞をＭ９＋アミロペクチン培地（ｐＨ６）のプレートから採取し、ＳＴＳ緩衝液（１２５ｍＭ　ＴｒｉＳ−ＨＣｌ、３％２−メルカプトエタノール、３％硫酸ドデシルナトリウム及び２０％グリセリン；ｐＨ６．８）１０μｌに溶解させた。
　ついで、溶液を、不連続ポリアクリルアミド−ＳＴＳゲル（Ｈａｍｅｓ　Ｂ．Ｄ．「Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」２９０、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ発行、１９８１年）に負荷し、１２５Ｖ、２時間で展開した。
　タンパク質を、Ｐａｒｋｅｒ　Ｒ．Ｇ．らの方法（「ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」
６５
　リガーゼ混合物全体を大腸菌７１／１８のコンピテント細胞の形質転換に使用し、Ｌ寒天プレート上で組換えコロニーを選別した。
　ハイブリッドファージベクターを含有するコロニーを分析に供し、制限酵素によって適当に切断することによりフラグメントの配向を決定した。
　たとえば１９００ｂｐフラグメントを有するハイブリッドベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（フラグメント及びベクターにおいて、フラグメントの極近辺で対称的に切断する）で消化した場合、配向によって、３００ｂｐ又は１６００ｂｐのフラグメントを生成した。同様に、１３００ｂｐを有するプラスミドを酵素ＳｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した場合、Ｓｃｈｕｌｌ　４５μｍフラグメントを得た後、Ｔｏｗｂｉｎ　Ｈ．らの開示に従って（「ＰＮＡＳ　ＵＳＡ」Ｖｏｌ．７６、４３５０−４３５４（１９７９））、ペルオキシダーゼと共役せしめた抗−イソアミラーゼ抗体及びウサギ抗−ＩｇＧ抗体によってフィルターを処理した。
　結果（第５図に示す）は、（＋）の反応、すなわちタンパク質と抗−イソアミラーゼ抗体との特異な反応を示した。
　実施例３
　
Ｍ１３ｍｐ８における約３２００ｐｂ染色体ＤＮＡフラグメントのクローニング及びその配列決定
　プラスミドｐＳＭ２５７　５．２μｇを、酵素ＳｍａＩ（ＢＲＬ）１０Ｕを含有する緩衝液２０μｌ中、２５℃で１時間消化し、反応液の容量を１５μｌとした後、ＢａｍＨＩ（ＢＲＬ）１０Ｕによって３７℃で１時間消化した。プラスミドｐＳＭ２５７２．６μｇを、緩衝液５０μｌ中、３７℃、２時間で、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ（ＢＲＬ）それぞれ１０Ｕによって消化した。
　６５℃で１０分間処理することによって酵素反応を停止し、得られたＤＮＡフラグメントを酵素ＤＮＡポリメラーゼＩ（ラージフラグメント又はＫｌｅｎｏｗフラグメント）２Ｕで処理して、その端部を平らにさせた。
　ついで、アガロースゲル上での電気泳動によって、ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（約１９００ｂｐ）及びＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメント（約１３００ｂｐ）を分離した。その後、これらのフラグメントからは、配向に応じて、それぞれ３００ｂｐ及び１６００ｂｐのセグメント、５００ｂｐ及び８００ｂｐのセグメントが得られた。２種類のフラグメントを含有するプラスミドをα、β、γ及びδと名付けた（第６図）。
　つづいて、Ｍｅｓｓｉｎｇの方法（「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」
１０１
　ついで、Ｓｔｒａｕｓｓらによって開示された連続プライマー法（「Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．」
１５４
７４
　配列決定反応を、トレーサーとしてα［３２ｐ］ｄＡＴＰを含有する「ＤＮＡシーケンシングシステム（ＮＥＮ）」を使用し、常法に従って実施した。
　電気泳動による分離に使用した装置は、Ｍａｃｒｏｐｈｏｒシークケシングシステム（ＬＫＢ）である。
　イソアミラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に関連するいくつかの問題がある（ゲル上各フラグメントが同様の移動を生ずる）。これらは、ＭｉｚｕｓａｗａＳ．らによって開示された方法（「Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃｉｄｓＲｅｓｅｒ．」１４（３）、１３１９（１９８６））に従い、グアノシン（すなわち、７位に窒素原子がなく、従って、近接するヌクレオチドと２次構造を形成しうるヌクレオチドの能力を大いに低減させるＣ７デアザｄＧＴＰ）を使用することによって回避される。配列の複雑な領域を明確にするための他の方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ラージフラグメント）の代りに酵素インバース・トラスクリプターゼを使用することである。
　配列決定の結果、シュードモナスＳＭＰＩの染色体ＤＮＡのフラグメントは３３３５ｂｐを含有し、酵素をコードづけする領域は２３２８ｂｐ（アミノ酸７７６個に相当する）を含有していた（第７−８図）。
　第９図は、遺伝子調節配列を含むイソアミラーゼの構造遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
　ヌクレオチド組成（その配列を第９図に示す）から推測されるアミノ酸組成を下記第１表に示す（芳香族及び飽和脂肪族残基３０％が存在するため著しい疎水特性を示す）。
　実施例４
　
大腸菌における発現及び分泌用ｐＳＭ２８９組換えＤＮＡ分子の構成
　
Ａ）プラスミドｐＳＭ２２１の構成
　プラスミドｐＵＣ１２５μｇを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＢＲＬ）によって、該酵素の供給者が指示する方法に従って消化し、該プラスミドからポリリンカーを単離し、採取した。
　ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含有しないプラスミドベクターを、１８塩基対を含有しかつ下記配列を有する合成オリゴヌクレオチド（末端にＥｃｏＲＩ制限部位　及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有し、中間にＳｐｈＩ制限部位及びＡｖａＩ制限部位を有する）とりガーゼによって結合させた。
　
Ｂ）プラスミドｐＳＭ２６２の構成
　プラスミドｐＳＭ２５７５μｇを、制限酵素ＳｐｈＩ及びＳｍａＩ（ＢＲＬ）２０Ｕによって、該酵素の供給者が指示する方法に従って消化した。
　消化混合物を、酵素反応を停止するため６５℃で１０分間処理した後、５％アクリルアミドゲル上に負荷し、イソアミラーゼ遺伝子を含有する約２４００ｂｐのＳｐｈＩ−ＳｍａＩフラグメントを溶出した。
　ついで、予じめ酵素ＡｖａＩで消化し、挿入体のＳｍａＩ末端に適合するようにＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理し、最後に制限酵素ＳｐｈＩで処理したプラスミドｐＳＭ２２１（１μｇ）に、上記フラグメント１μｇを挿入した。
　ＳｐｈＩ−ＳｍａＩフラグメントと上記の如く消化したプラスミドｐＳＭ２２１との間のリガーゼ反応を、リガーゼ緩衝液（５０μ４）中、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１Ｕの存在下、１４℃、１８時間で実施した。反応終了後、リガーゼ混合物１０μｌを使用して、５０ｍＭＣａＣｌ２での処理によってコンピテントとした大腸菌７１／１８細胞２００μｌの形質転換を行った。
　５０ｍｇ／ｌアンピシリン、０．０５ｍＭ　ＩＰＴＧ（イソプロピルＤ−チオガラクトピラノシド）及び０．０２％Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−ヨードリル−Ｄ−ガラクトピラノシド）を添加することによって選択的なものとした２ｘＹＴ培地（１６ｇ／ｌ　Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ、１０ｇ／ｌ　Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、１ｇ／ｌ　ＮａＣｌ）上に展開し、恒温室において３７℃で１２時間インキュベートした。組換えプラスミド［ＢｉｒｎｂｏｉｍＨ．Ｃ及びＤｏｌｙ　Ｊ．の方法（「ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．」７、１５１５（１９７９）によって抽出］を制限酵素によって分析した。
　良好な割合のコロニーが予想したように挿入された所望のフラグメントを含有することが確認された。
　これらプラスミドの１つ（ｐＳＭ２６２）は第１０図に示す制限地図によって特徴づけ
られる。
　
Ｃ）プラスミドｐＳＭ２８９の構成
　プラスミド　ｐＳＭ２５７　１０μｇを制限酵素ＮａｒＩ（ＢＲＬ）４０Ｕによって３７℃、１時間で消化し、特殊な緩衝液１００μｌ（最終容量）中、３０分間、常温（２０−２５℃）においてＫｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼＩと反応させて、その端部を平らにした。
　ついで、混合物を３７℃、１時間で制限酵素ＢａｍＨＩ　４０Ｕによって消化し、５％アクリルアミドゲル上に負荷し、リーダーペプチド及びイソアミラーゼ構造遺伝子の最初のヌクレオチド３９０個を含有する５１１ｂｐ　ＮａｒＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（ａ）を溶出した。
　残りの部分、すなわち遺伝子の２０１０ｂｐ（ｂ）を、プラスミドｐＳＭ２６２（５μｇ）を制限酵素ＢａｍＨＩ　２０Ｕ及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＢＲＬ）２０Ｕで消化することによって得。
　同時に、ベクターｐＵＣ１２（ｃ）５μｇを、まず制限酵素ＳｍａＩ　２０Ｕによって該酵素の供給者が指示する緩衝液中、２５℃、１時間で消化し、ＮａＣｌを添加して塩の濃度を最終濃度５０ｍＭに変化させた後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ　２０Ｕにより３７℃、１時間で消化した。
　リガーゼ緩衝液５０μｌ（最終濃度）中、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１Ｕの存在下で、ベクター（ｃ）１００ｎｇ、挿入体（ｂ）１００ｎｇ及び挿入体（ａ）３５ｎｇを１４℃において１夜反応させた。
　反応終了後、リガーゼ反応混合物１０ｎｇを使用して、Ｈａｎａｈａｎによって開示されたように（「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」
１６６
　ついで、２ｘＹＴ培地のプレート上（３７℃、１８時間）で形質転換体を選別した。形質転換クローンから組換えプラスミドを抽出した。制限酵素による分析では、予想したパターンを示した。
　この組換えプラスミド（ｐＳＭ２８９）の制限地図を第１１図に示す。
　実施例５
　
枯草菌における発現及び分泌用ｐＳＭ２９０組換えＤＮＡ分子の構成
　
Ａ）プラスミドｐＳＭ２６８の構成
　ｐＳＭ２１４　ＡＴＣＣ６７３２０　３容（各々１μｇ）を３７℃、１時間でＢｇｌＩＩ　５Ｕ及びＢａｍＨＩ　５Ｕで消化した。
　得られたＤＮＡフラグメントをヌクレアーゼＢａｌ３１　０．３Ｕと２３℃において、２、３及び４分間インキュベートすることによってその端を侵食させ、つづいて標準条件下、ＤＮＡポリメラーゼＩ−ラージフラグメントで修繕した。
　得られた各種の鎖長を有する分子を、１４℃、１夜でのＴ４　ＤＮＡリガーゼによる処理によって再環化させた。
　ついで、リガーゼ反応混合物を使用し、ＤｕｂｎａｕＤ．及びＤａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ　Ｒ．によって開示された方法（「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」５６、２０９（１９７１））によりコンピテントとした枯草菌の菌株ＳＭＳ１０８（ｒｅｃ−，ｈｉｓ−，ｌｅｕ−）を形質転換させた。
　形質転換体を、クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを含有するＶＹプレート（２５ｇ／ｌ　Ｖｅａｌ　ＩｎｆｕｓｉｏｎＢｒｏｔｈ，５ｇ／ｌ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ）上で選別した。
　得られたクローンから抽出したプラスミドを各種制限酵素によって分析した。
　組換えプラスミド（ｐＳＭ２６８）は、枯草菌の複製開始点及び抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性をコントロールする遺伝子（ＣＡＴ遺伝子）を含有するものの最小（約５０００ｂｐ）のものであった。
　該プラスミド１０μｇを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ各４Ｕにより、３７０Ｃ、１時間で消化した。
　６５℃に１０分間維持して酵素反応を停止させた後、消化混合物を低融点アガロースゲル上に負荷し、枯草菌の複製開始点及びＣＡＴ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（４２００ｂｐ）を溶出し、「Ｇｅｎｅ　ｃｌｅａｎ」システム（ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎＢ．及びＧｉｌｌｅｓｐｉｅＤ．「Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．」７６、６１５（１９７９））によって精製した。
　同時に、プラスミドｐＳＭ２８９（５μｇ）を、緩衝剤混合物２０μβ中、３７℃、１時間でＨｉｎｄＩＩＩ　１０Ｕによって消化し、得られた切断生成物をアガロースゲル上での電気泳動によってチェックした後、３７℃、１５分間でＥｃｏＲＩ　５Ｕによって消化した。
　ついで、アガロースゲル上での電気泳動及びエレクトロ溶出によって、消化混合物からＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（約２４００ｂｐ）を単離した。
　
Ｂ）ｐＳＭ２９０の構成
　４２００ｂｐフラグメント５００ｎｇ及び２４００ｂｐフラグメント１μｇを、リゲーション緩衝液１５μｌ中、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１Ｕの存在下、１５０Ｃ、１夜の条件で結合させた。該反応混合物３００ｎｇを使用して枯草菌ＳＭＳ１０８のコンピテント細胞１００μｌを形質転換させ、クロラムフェニコールを混合したＶＹ培地上で形質転換体を選別した。
　得られたクローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素を使用して分析した。
　分析したプラスミドのうち２つが予想した構造のイソアミラーゼ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを有していることが確認された。
　これらのプラスミドの１つ（ｐＳＭ２９０）は第１２図に示す制限地図によって特徴づけられる。
　「ｐｕｃシーケンシングキット」（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用して、プラスミドｐＳＭ２９０の正確な構成をチェックするヌクレオチド配列を得た。
　実施例６
　
イソアミラーゼの発現及び分泌
　
Ａ）プレート上でのイソアミラーゼ活性の検定
　Ｈａｒａｄａによって開示されたイソアミラーゼ活性を証明する方法（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ　Ｔ．ら「Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」２８、３３６（１９７４））を変形して、各種組換えクローンからイソアミラーゼを生産するクローンをピックアップした。
　プラスミドｐＳＭ２８９を含有する大腸菌ＤＨ１細胞を、最小培地Ｍ９＋０．２％グルコース及び／又はマルトース（６ｇ／ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４、３ｇ／ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌ　ＮａＣｌ、１ｇ／ｌ　ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ　ＣａＣｌ２、１．５％寒天）＋１％アミロペクチン（基質及びインデューサーとして）及び５０μｇ／ｍｌアンピシリンで生育させた。培地のｐＨをＨＣｌによって６．８とした。
　プラスミドｐＳＭ２９０によって形質転換させた枯草菌ＳＭＳ１０８の細胞を、１％アミロペクチン、５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール及び５０μｇ／ｍｌ　Ｎｉｓｉｄｉｎａ及びロイシンを混合したＭ９培地＋０．２％グルコース及び／又はマルトースで生育させた。
　枯草菌に関して使用した他の培地は、０．２％グルコース及び／又はマルトースを含有するＭＢ培地（２ｇ／ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１８．３ｇ／ｌ　Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、６ｇ／ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ｌクエン酸Ｎａ・２Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）＋１％アミロペクチン、１．５％寒天、５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール及び５０μｇ／ｍｌ上述のアミノ酸である。
　これら培地のｐＨを６．０に調整した。
　コロニーを３７℃で約２４時間生育させ、ついでヨウ素蒸気（ヨウ素フレーク２ｇ、ＫＩ　１ｇ、エタノール（９５％）２５ｍｌ及び水２５ｍｌ）にさらした。
　２分間さらした後、イソアミラーゼを生産する大腸菌ＤＨ２（ｐＳＭ２８９）のコロニーは目立つ青色のリングを示し、枯草菌ＳＭＳ１０８（ｐＳＭ２９０）のクローンは、上記菌株によって生産されたα−アミラーゼによる干渉のため、より淡いリングを示した。
　
Ｂ）液中におけるイソアミラーゼ活性の検定
　大腸菌ＤＨ２（ｐＳＭ２８９）及び枯草菌ＳＭＳ１０８（ｐＳＭ２９０）の細胞を、それぞれＭ９培地５０ｍｌ、Ｍ９培地及びＭＢ培地各５０ｍｌに接種し、穏やかに撹拌しながら３７℃で１６時間培養した。
　ついで、大腸菌細胞から周辺質を抽出し、大腸菌及び枯草菌から全タンパク質を抽出した。
　実際には、Ｋｏｓｈｌａｎｄ及びＢｏｔｓｔｅｉｎの方法（「Ｃｅｌｌ」２０（３）、７４９−７８０（１９８０））に従い、下記の如く操作して、周辺質タンパク質を抽出した。細菌培養基２ｍｌをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離において、１２００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。
　ついで、ペレットを回収し、３０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４）及び５０ｍＭＮａＣｌで２回洗浄し、上述の如く遠心分離し、最後に２０％ショ糖、３０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４）及び１ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液１ｍｌ中に懸濁させた。
　得られた懸濁液を常温（２０−２５℃）に５分間維持し、一定時間毎に撹拌し、４℃で５分間遠心分離し、最後に４℃に維持した蒸留水１ｍｌ中に懸濁させた。
　得られた懸濁液を氷浴中で１０分間インキュベートし、４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液中に所望の周辺質フラクションを得た。
　使用した溶液のいずれにも、プロテアーゼ阻害剤、すなわちＰＭＳＦ（塩化フェニル−メチル−スルホニル）及びＥＤＴＡを最終濃度それぞれ１ｍＭ及び５ｍＭで含有する。
　このフラクション４００μｌ（必要であれば、ＡＭＹＣＯＮシステムによって濃縮する）をイソアミラーゼ活性の検定に使用した。
　一方、各細菌培養基１０ｍｌを４℃、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって全タンパク質を抽出した。
　得られた細胞ペレットを、１０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４）、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ及び５ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液１容によって２回洗浄し、上述の如く遠心分離した。
　ついで、ペレットを、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含有する１０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４）５ｍｌ中に再び懸濁させた。
　細胞懸濁液をＦｒｅｎｃｈｉ−ｐｒｅｓｓ（ＡＭＩＮＣＯ）により２５００ｐｓｉで処理して細菌の細胞壁を破壊し、細胞成分を放出させた。
　枯草菌細胞の場合、Ｆｒｅｎｃｈｉ−ｐｒｅｓｓによる細胞融解前に、リゾチーム５ｍｇ／ｍｌと３７℃で１０分間インキュベートして細胞壁の抵抗性を低減させた。　ついで、上澄み液、細胞抽出物及び周辺質抽出物中におけるイソアミラーゼ活性を、ＹｏｋｏｂａｙａｓｈｉＡ．らによって記載された方法（「Ｂ．Ｂ．Ａ．」２１２、４５８−４６９（１９７０））に従って測定した。
　実際には、４０℃に維持した１％（ｗ／ｖ）アミロペクチン（ＳＩＧＭＡ）水溶液２ｍｌを、酢酸塩緩衝液（ｐＨ４）４００μｌ及び被検定溶液４００μｌと混合した。
　得られた混合物を４０℃に１時間維持し、反応開始時（Ｔ０）及び反応終了時（Ｔ１）に分析用サンプル（４００μｌ）を採取した。
　比色反応及び分光光度計による読み取りを行う前に、サンプルをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機において常温、１０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離して、吸収の測定を妨害する懸濁物質を除去した。
　遠心分離後、サンプルを、ヨウ素試薬（０．２％（ｗ／ｖ）Ｉ、２％（ｗ／ｖ）ＫＩ及び０．２％（ｗ／ｖ）Ｈ２ＳＯ４を水で２０ｍｌとしたもの）４００μｌと混合し、常温に約１５分間維持した。
　分光光度計Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　５５１Ｓにおいて、上述の如く調製したブランク（サンプルの代わりに酢酸塩緩衝液を使用したもの）に対する６１０ｎｍの吸収を測定した。
　純粋なイソアミラーゼを使用して、（＋）のコントロールも調製した。
　用語「イソアミラーゼ単位」は、６１０ｎｍにおける分光光度計の読みを４０℃、
１時間で０．０１　ＯＤ上昇させるイソアミラーゼの量をいう。
　大腸菌及び枯草菌に関して得られた結果をそれぞれ第２表及び第３表に示す。
　第３表のデータによって示されるように、枯草菌は、プラスミドｐＳＭ２９０によって形質転換された際には、元のシュードモナスＳＭＰＩのものに匹敵する量でイソアミラーゼを合成できるだけでなく、特に培養基内に該酵素を分泌できる。さらに、該酵素の最適生産レベルに関し、シュードモナスＳＭＰＩでは５日であるのに対し、枯草菌（ｐＳＭ２９０）ではわずか１６時間で最適生産レベルに達する。
【図面の簡単な説明】
　第１図は形質転換されたクローンを選別する際の状態を示す図、第２図はプラスミドｐＳＭ２５７の制限地図を示す図、第３図はプラスミドｐＳＭ２５８の制限地図を示す図、第４図はハイブリッドプラスミドの電気泳動挙動による比較分析の結果を示す写真、第５図はイソアミラーゼの存在に関する分析の結果を示す写真、第６図はベクターＭ１３ｍｐ８におけるプラスミドｐＳＭ２５７から得られたＳｍａｌ−ＢａｍＨＩフラグメント（１９００ｂｐ）及びＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメント（１３００ｂｐ）のクローニングの進行を表すダイアグラム、第７図、第７（Ａ）図及び第７（Ｂ）図はイソアミラーゼ遺伝子を含有するシュードモナスＳＭＰＩから得られた染色体ＤＮＡの３３３５ｂｐヌクレオチド配列を示す図、第８図、第８（Ａ）図及び第８（Ｂ）図はイソアミラーゼをコードづけする構造遺伝子のヌクレオチド配列及び該ヌクレオチド配列から誘導される酵素のアミノ酸配列を表す図、第９図、第９（Ａ）図及び第９（Ｂ）図はイソアミラーゼの構造遺伝子及び調節及び分泌配列を含有するシュードモナスＳＭＰＩから得られた染色体ＤＮＡのフラグメントのヌクレオチド配列を表す図、第１０図はプラスミドｐＳＭ２６２の制限地図を示す図、第１１図は大腸菌における発現及び分泌用のハイブリッドプラスミドｐＳＭ２８９の制限地図を示す図、及び第１２図は枯草菌における発現及び分泌用のハイブリッドプラスミドｐＳＭ２９０の制限地図を示す図である。