(57)【要約】  本開示は、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、少なくとも１つのＮＲＡＳタンパク質および／もしくは少なくとも１つのＭＥＫ１タンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つの突然変異の有無を検出すること、およびその後、前記突然変異の有無に基づき、ＢＲａｆ阻害剤または他の好適な薬剤から選択される化学療法薬による治療を開始、改変、または中止することが組み込まれた方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とするヒトにおいてＶ６００変異を示す黒色腫を治療する方法であって、
前記黒色腫がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、またはＭＥＫ１  Ｐ３８７変異のうち少なくとも１つを示すかどうかを決定すること、および
前記黒色腫がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、またはＭＥＫ１  Ｐ３８７変異のうち少なくとも１つを示す場合に、
ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の組合せ、または
ＢＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の組合せ
のうち少なくとも１つの有効量を前記ヒトに投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
治療を必要とするヒトにおいてＶ６００変異を示す黒色腫を治療する方法であって、
前記黒色腫がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、またはＭＥＫ１  Ｐ３８７変異のうち少なくとも１つを示すかどうかを決定すること、および
前記黒色腫がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、またはＭＥＫ１  Ｐ３８７変異のうち少なくとも１つを示す場合に、
ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の組合せ、または
ＢＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の組合せ、または
ＢＲＡＦ阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤の組合せ
のうち少なくとも１つの有効量を前記ヒトに投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項３】
治療を必要とするヒトにおいてＶ６００変異を示す黒色腫を治療する方法であって、
前記黒色腫がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、またはＭＥＫ１  Ｐ３８７変異のうち少なくとも１つを示すかどうかを決定すること、および
前記黒色腫がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、またはＭＥＫ１  Ｐ３８７変異のうち少なくとも１つを示す場合に、
ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の組合せ、または
ＢＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の組合せ、または
ＢＲＡＦ阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤の組合せ、または
ＢＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤の組合せ
のうち少なくとも１つの有効量を前記ヒトに投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項４】
治療を必要とするヒトにおいてＶ６００変異を示す黒色腫を治療する方法であって、
前記黒色腫がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１Ｑ５６Ｐ変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異のうち少なくとも１つを示すかどうかを決定すること、および
前記黒色腫がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異のうち少なくとも１つを示す場合に、  ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の組合せ、または
ＢＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の組合せ、または
ＢＲＡＦ阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤の組合せ、または
ＢＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤の組合せ
のうち少なくとも１つの有効量を前記ヒトに
投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項５】
前記黒色腫がＶ６００ＥおよびＶ６００Ｋから選択されるＶ６００変異を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記黒色腫がＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｋ変異、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｈ変異、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｌ変異、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｎ変異、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｅ変異、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｐ変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６Ｔ変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６Ｐ変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６Ｖ変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７Ｌ変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６Ｐ変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１Ｓ変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４Ｌ変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９Ｌ変異のうち少なくとも１つを示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＢＲＡＦ阻害剤が式：
【化１】
2013543008.tif 000016
を有する化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
ＢＲＡＦ阻害剤が式：
【化２】
2013543008.tif 000017
を有する化合物（ＰＬＸ４０３２）、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＭＥＫ阻害剤が式：
【化３】
2013543008.tif 000018
を有する化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＰＩ３Ｋ阻害剤が式：
【化４】
2013543008.tif 000019
を有する化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＲＡＦ阻害剤を用いた治療方法に関する。具体的には、本発明は、感受性のある癌腫を有するヒト被験者を治療する方法、および被験者を特定の遺伝子バリエーションの有無に従ってＢＲＡＦ阻害剤で治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
個別化医療の時代にあっては、癌治療は、治療される患者および腫瘍に見られる遺伝子マーカーまたは他のバイオマーカーに基づき、ますます狙いが定められる。今日、多くの治療が、過去の全身的な治療ではなく、特定の細胞機構にねらいを定めている。
【０００３】
最近、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫキナーゼ経路（ＭＡＰＫ経路として知られる）の理解の高まりにより、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤が癌治療に用いるために検討されている。特に、この理解は、増殖因子、ホルモン、サイトカインなどに応答したＲａｓタンパク質の活性化がＲａｆキナーゼのリン酸化および活性化を刺激し、これが次にＭＥＫ１およびＭＥＫ２キナーゼをリン酸化および活性化し、これらがその後ＥＲＫ１および２キナーゼをリン酸化および活性化するというものである。
【０００４】
ＭＡＰＫ置換キナーゼにおける突然変異は、この経路の成長シグナル機能に負の影響を及ぼし、広範なヒトの癌の確立、発達および進行をもたらすと考えられている。Ｂ−Ｒａｆキナーゼの自然突然変異がかなりのパーセンテージのヒト黒色腫(Davies, H., et al., Nature (2002) 9:1-6; Garnett, M.J. & Marais, R., Cancer Cell (2004) 6:313-319)、および甲状腺癌(Cohen et al J. Nat. Cancer Inst. (2003) 95(8) 625-627およびKimura et al Cancer Res. (2003) 63(7) 1454-1457)、ならびにそれより割合は少ないがなお有意な頻度で、その他のいくつかの癌で見出されている。
【０００５】
グラクソスミスクラインは、式（Ｉ）：
【化１】
2013543008.tif 000002
の化合物（以下、化合物Ａと称する）
を含む化合物系を発見した（国際公開第ＷＯ２００９／１３７３９１号として公開されている国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４２６８２に従前に記載されている）。
【０００６】
これらの化合物は、ＲＡＦキナーゼ阻害剤であることが判明している。特に、式（Ｉ）の化合物は、ヒト野生型ＢＲＡＦおよびＣＲＡＦに対して、ならびにＢＲＡＦＶ６００Ｅ、ＢＲＡＦＶ６００Ｋ、ＢＲＡＦＶ６００Ｄ、ＢＲＡＦＶ６００Ｌ、およびＢＲＡＦＶ６００Ｒをはじめとする、ヒト黒色腫および他の癌に多いいくつかの変異型に対して強力かつ選択的な阻害剤であることが示されている。Ｖ６００Ｅ変異はＢＲＡＦの優性突然変異であり、かつ、ＢＲＡＦ変異は大多数の黒色腫に見られることから、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異に対するこの化合物の有効性は、黒色腫などの癌の治療に重要である。
【０００７】
以後、さらなるバイオマーカーの発見および組み込みによって個別化医療のアプローチはいっそう精密になる機会が存続する。特に式（Ｉ）の化合物および同じクラスのＢＲａｆ阻害剤に関して、さらなるバイオマーカーおよびそれらの疾患および治療との関連の同定は、効力のない治療を避けつつ、特に利益を受けそうな対象に治療の狙いを定める助けとなり得る。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、少なくとも１つのＮＲＡＳ遺伝子および／もしくは少なくとも１つのＭＥＫ１遺伝子における少なくとも１つの突然変異、または前記タンパク質における変更の有無を検出すること、およびその後、前記突然変異の有無に基づき、ＢＲａｆ阻害剤または他の好適な薬剤から選択される化学療法薬による治療を開始、改変、または中止することが組み込まれた方法を対象とする。本発明はまた、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、少なくとも１つのＮＲＡＳ遺伝子および／もしくは少なくとも１つのＭＥＫ１遺伝子における少なくとも１つの突然変異、または前記タンパク質における変更の有無を検出すること、およびその後、前記突然変異の有無に基づき、ＢＲａｆ阻害剤またはＭＥＫ１阻害剤または他の好適な薬剤から選択される化学療法薬による治療を開始、改変、または中止することが組み込まれた方法を対象とする。より詳しくは、本発明は、Ｖ６００変異型黒色腫を治療する方法であって、コドン６１および／または１４６におけるＮＲＡＳ変異（例えば、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｎ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６ＰもしくはＡ１４６Ｖ）、コドン５９におけるＭＥＫ１欠失、コドン３８７におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｐ３８７Ｓ）、またはコドン５６におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｑ５６Ｐ）、またはコドン１２１におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｃ１２１Ｓ）、またはコドン１２４におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｐ１２４Ｌ）、またはコドン１２９におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｆ１２９Ｌ）のうちの１つまたは組合せを検出すること（なお、このような突然変異は、ＢＲａｆ阻害剤またはＭＥＫ１阻害剤による治療に対する耐性の高い確率を示す）、およびその後、前記検出に基づき、前記癌治療を改変することを含んでなる方法がある。
【０００９】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、コドン６１および／または１４６におけるＮＲＡＳ変異（例えば、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｎ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｐ、もしくはＡ１４６Ｖ）、コドン５９におけるＭＥＫ１欠失、コドン３８７におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｐ３８７Ｓ）、またはコドン５６におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｑ５６Ｐ）、またはコドン１２１におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｃ１２１Ｓ）、またはコドン１２４におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｐ１２４Ｌ）、またはコドン１２９におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｆ１２９Ｌ）のうちの１つまたは組合せの存在（または不在）を検出する工程、およびそれに基づき、ＢＲａｆ阻害剤またはＭＥＫ１阻害剤に対する応答または応答期間（または無進行生存）を予測する工程を含んでなる方法がある。
【００１０】
本発明の別の実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、コドン６１および／または１４６におけるＮＲＡＳ変異（例えば、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｎ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｐ、もしくはＡ１４６Ｖ）、コドン５９におけるＭＥＫ１欠失、コドン３８７におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｐ３８７Ｓ）、またはコドン５６におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｑ５６Ｐ）、またはコドン１２１におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｃ１２１Ｓ）、またはコドン１２４におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｐ１２４Ｌ）、またはコドン１２９におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｆ１２９Ｌ）のうちの１つまたは組合せの規模を検出する工程、およびそれに基づき、ＢＲａｆ阻害剤またはＭＥＫ１阻害剤に対する応答または応答期間（または無進行生存）を予測する工程を含んでなる方法がある。
【００１１】
本発明の別の実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、コドン６１および／または１４６におけるＮＲＡＳ変異（例えば、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｎ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｐ、もしくはＡ１４６Ｖ）、コドン５９におけるＭＥＫ１欠失、コドン３８７におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｐ３８７Ｓ）、またはコドン５６におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｑ５６Ｐ）、またはコドン１２１におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｃ１２１Ｓ）、またはコドン１２４におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｐ１２４Ｌ）、またはコドン１２９におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｆ１２９Ｌ）のうちの１つまたは組合せの存在（または不在）を検出する工程、およびそれに基づき、化合物Ａもしくは化合物Ｂおよび／またはその塩に対する応答または応答期間（または無進行生存）を予測する工程を含んでなる方法がある。
【００１２】
本発明の別の実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、コドン６１および／または１４６におけるＮＲＡＳ変異（例えば、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｎ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｐ、もしくはＡ１４６Ｖ）、コドン５９におけるＭＥＫ１欠失、コドン３８７におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｐ３８７Ｓ）、またはコドン５６におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｑ５６Ｐ）、またはコドン１２１におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｃ１２１Ｓ）、またはコドン１２４におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｐ１２４Ｌ）、またはコドン１２９におけるＭＥＫ１変異（例えば、Ｆ１２９Ｌ）のうちの１つまたは組合せの規模を検出する工程、およびそれに基づき、化合物Ａまたはその塩に対する応答または応答期間（または無進行生存）を予測する工程を含んでなる方法がある。
【００１３】
本発明の別の実施形態によれば、ある個体においてＢＲａｆ阻害剤またはＭＥＫ１阻害剤耐性に対する傾向を決定する方法であって、個体からサンプルを準備すること（このサンプルはＤＮＡまたはＲＮＡを含んでなる）；および前記ＢＲａｆ阻害剤耐性の指標とする配列を検出するプライマーを使用することにより前記傾向を特定することを含んでなる方法がある。前記特定工程はさらに、プライマーからの重合が起こった際に、ＢＲａｆ阻害剤またはＭＥＫ１阻害剤耐性の指標となる配列がＮＲＡＳ  ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＭＥＫ１  ＤＮＡもしくはＲＮＡ中に存在するような、好適な重合条件にプライマーを置くこととして定義することができる。特定の実施形態においては、個体は黒色腫を有する。この方法は、ＢＲａｆ阻害剤療法の前に行うことができる。特定の実施形態においては、前記配列が個体において同定された場合、それは予後および／または治療情報を提供する。
【００１４】
本発明の別の実施形態によれば、ＢＲａｆ阻害剤またはＭＥＫ１阻害剤による治療の開始後に、耐性を付与するＮＲＡＳ変異またはＭＥＫ１変異が同定されれば、その療法は少なくとも一部の療法耐性問題を回避するように調整される。例えば、代替抗癌薬療法が用いられ、例えば、代替化学療法薬、および／または化合物Ａまたはその塩の用量変更が用いられる。
【００１５】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、第１のＢＲａｆ阻害剤を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、またはＭＥＫ１  Ｑ５６Ｐ変異、またはＣ１２１Ｓ変異、Ｐ１２４Ｌ変異、またはＦ１２９Ｌ変異のうち少なくとも１つを有するかどうかを決定する工程、および前記突然変異または欠失突然変異が存在すれば、第２のＢＲａｆ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組合せを投与することを含んでなる方法がある。しかし、第１および第２のＢＲａｆ阻害剤は同じである必要はない。
【００１６】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、またはＭＥＫ１  Ｑ５６Ｐ変異、またはＣ１２１Ｓ変異、Ｐ１２４Ｌ変異、またはＦ１２９Ｌ変異のうち少なくとも１つを有するかどうかを決定する工程、および前記突然変異または欠失が存在すれば、第２のＢＲａｆ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組合せを投与することを含んでなる方法がある。有利には、第２のＢＲａｆ阻害剤はＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩である。有利には、ＭＥＫ阻害剤は化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩である。
【００１７】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、またはＭＥＫ１  Ｑ５６Ｐ変異、またはＣ１２１Ｓ変異、Ｐ１２４Ｌ変異、またはＦ１２９Ｌ変異のうち少なくとも１つを有するかどうかを決定する工程、およびＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩およびＭＥＫ阻害剤である化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００１８】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミドメタンスルホネートを投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、またはＭＥＫ１  Ｑ５６Ｐ変異、またはＣ１２１Ｓ変異、Ｐ１２４Ｌ変異、またはＦ１２９Ｌ変異のうち少なくとも１つを有するかどうかを決定する工程、およびＮ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミドメタンスルホネートおよびジメチルスルホキシド溶媒和物としてのＮ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル｝アセトアミドの組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００１９】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、第１のＢＲａｆ阻害剤を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、またはＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、またはＭＥＫ１  Ｑ５６Ｐ変異、またはＣ１２１Ｓ変異、Ｐ１２４Ｌ変異、またはＦ１２９Ｌ変異のうち少なくとも１つを有するかどうかを決定する工程、および前記突然変異または欠失が存在すれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００２０】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、またはＭＥＫ１  Ｑ５６Ｐ変異、またはＣ１２１Ｓ変異、Ｐ１２４Ｌ変異、またはＦ１２９Ｌ変異のうち少なくとも１つを有するかどうかを決定する工程、および前記突然変異または欠失が存在すれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。有利には、ＭＥＫ阻害剤は、化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩である。
【００２１】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、またはＭＥＫ１  Ｑ５６Ｐ変異、またはＣ１２１Ｓ変異、Ｐ１２４Ｌ変異、またはＦ１２９Ｌ変異のうち少なくとも１つを有するかどうかを決定する工程、およびＰＩ３Ｋ阻害剤である化合物Ｃまたはその薬学的に許容可能な塩とＭＥＫ阻害剤である化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００２２】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミドメタンスルホネートを投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、またはＭＥＫ１  Ｐ３８７変異のうち少なくとも１つを有するかどうかを決定する工程、および２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドとジメチルスルホキシド溶媒和物としてのＮ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル｝アセトアミドの組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００２３】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、第１のＢＲａｆ阻害剤を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、またはＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、またはＭＥＫ１  Ｑ５６Ｐ変異、またはＣ１２１Ｓ変異、Ｐ１２４Ｌ変異、またはＦ１２９Ｌ変異のうち少なくとも１つを有するかどうかを決定する工程、および前記変異または欠失が存在すれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤とＢＲａｆ阻害剤の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００２４】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、またはＭＥＫ１  Ｑ５６Ｐ変異、またはＣ１２１Ｓ変異、Ｐ１２４Ｌ変異、またはＦ１２９Ｌ変異のうち少なくとも１つを有するかどうかを決定する工程、および前記変異または欠失が存在すれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤とＢＲａｆ阻害剤の組合せを投与することを含んでなる方法がある。有利には、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、化合物Ｃまたはその薬学的に許容可能な塩である。
【００２５】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、またはＭＥＫ１  Ｑ５６Ｐ変異、またはＣ１２１Ｓ変異、Ｐ１２４Ｌ変異、またはＦ１２９Ｌ変異のうち少なくとも１つを有するかどうかを決定する工程、およびＰＩ３Ｋ阻害剤である化合物Ｃまたはその薬学的に許容可能な塩とＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００２６】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミドメタンスルホネートを投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、またはＭＥＫ１  Ｑ５６Ｐ変異、またはＣ１２１Ｓ変異、Ｐ１２４Ｌ変異、またはＦ１２９Ｌ変異のうち少なくとも１つを有するかどうかを決定する工程、および２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドおよび３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミドメタンスルホネートの組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００２７】
さらなる実施形態においては、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する上記の任意の方法は、ＢＲａｆ阻害剤、例えば、化合物ＡまたはそのＰＬＸ４０３２塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、またはＭＥＫ１  Ｑ５６Ｐ変異、またはＣ１２１Ｓ変異、Ｐ１２４Ｌ変異、またはＦ１２９Ｌ変異のうち少なくとも１つを有するかどうかを決定する工程、およびＢＲａｆ阻害剤とＭＥＫ１阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤の組合せを投与する工程を含んでなる。なおさらなる実施形態においては、ＢＲａｆ阻害剤、ＭＥＫ１阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤の組合せは、化合物Ａと化合物Ｂと化合物Ｃの組合せである。
【００２８】
化合物Ａもしくはその塩、またはＰＬＸ４０３２もしくはその塩などの特定の療法に対して耐性を付与する突然変異は、癌の発症前もしくは発症後にしてもよく、またはその療法の開始前もしくは開始後に存在してもよい。特定の実施形態においては、薬剤耐性を付与する突然変異は、治療前に極めて低頻度ですでに存在している。薬剤治療の選択圧下で、変異型クローンは他の細胞よりも速く増殖し、薬剤耐性および急速進行をもたらす。本発明の特定の態様によれば、既存の耐性付与突然変異と応答または臨床応答期間の可能性との相関分析がある。例えば、治療前の既存の突然変異の頻度を、予後および治療決定のための腫瘍マーカーとして用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＮＲＡＳのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（遺伝子受託番号ＮＭ＿００２５２４．３）。コドンＱ６１およびＡ１４６の位置とそれらの各ヌクレオチド配列を示す。
【図２】ＭＥＫ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（遺伝子受託番号ＮＭ＿００２７５５．３）。コドンＫ５９およびＰ３８７の位置とそれらの各ヌクレオチド配列を示す。
【図３】ＢＲＡＦ  Ｖ６００ＥとＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６の同時突然変異を有する黒色腫細胞は、ＲＡＳ  ＧＴＰアーゼ活性の増強を示した。
【図４】ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６の同時突然変異、場合により、ＭＥＫ１  Ｐ３８７のさらなる同時突然変異を有するＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ黒色腫細胞は、ＢＲＡＦ阻害剤である化合物Ａに耐性であるが、化合物Ａと化合物Ｂの組合せには感受性である（クローニングアッセイ）。
【図５】ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６の同時突然変異、場合により、ＭＥＫ１  Ｐ３８７のさらなる同時突然変異を有するＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ黒色腫細胞は、ＢＲＡＦ阻害剤である化合物Ａに耐性であるが、化合物Ｂと化合物Ｃの組合せには感受性である（クローニングアッセイ）。
【図６】２種類のＢＲＡＦ阻害剤、化合物ＡおよびＰＬＸ４０３２、ＭＥＫ１阻害剤である化合物Ｂ、およびＰＩ３Ｋ阻害剤である化合物Ｃの画像である。
【図７】種々の濃度の、ＢＲＡＦ阻害剤である化合物Ａにおける、種々のＡ３７５  Ｆ１１黒色腫細胞株クローンの相対的細胞増殖のグラフである。
【図８】化合物Ａに対する耐性を獲得したＡ３７５クローンにおける、化合物Ａ（ＢＲＡＦ阻害剤）、化合物Ｂ（ＭＥＫ阻害剤）、化合物Ｃ（ＰＩ３Ｋ阻害剤）およびそれらの組合せの細胞増殖阻害アッセイをまとめた表である。
【図９】化合物Ａに対する耐性を獲得したＹＵＳＩＴ１クローンにおける、化合物Ａ、化合物Ｂ、および化合物Ｃ、およびそれらの組合せの細胞増殖阻害アッセイをまとめた表である。
【図１０】４つのＡ３７５クローンを化合物Ａ（ＢＲＡＦ阻害剤）で処理した場合のシグナル伝達効果を、親クローン（Ａ３７５）と比較したウエスタンブロットの画像である。
【図１１】細胞を化合物Ａで２４時間処理した後に、抽出し、ＢＲＡＦまたはＣＲＡＦ抗体で免疫沈降させた場合のウエスタンブロットを表し、化合物ＡがＢＲＡＦ−ＣＲＡＦヘテロ二量体複合体を誘導することを示している。親Ａ３７５、ならびに１２Ｒ５−３および１６Ｒ６−４クローン。
【図１２】ＮＲＡＳ  ｓｈＲＮＡで処理した細胞（ＮＲＡＳクローン２および９）または処理しなかった細胞（対照クローン２および７）の相対的増殖のグラフであり、ＮＲＡＳの発現の低下が化合物Ａ（ＢＲＡＦ阻害剤）に対する感受性を回復させることを示している。
【図１３】ＮＲＡＳ  ｓｈＲＮＡで処理した細胞（ＮＲＡＳクローン２および９）または処理しなかった細胞（対照クローン２および７）の相対的増殖のグラフであり、ＮＲＡＳの発現の低下が化合物Ｂ（ＭＥＫ１阻害剤）に対する感受性を回復させることを示している。
【図１４】ＮＲＡＳ  ｓｈＲＮＡで処理した、または処理しなかった、また化合物Ａ（ＢＲＡＦ阻害剤）で処理した、または処理しなかったＡ３７５クローンの溶解液のウエスタンブロットであり、化合物ＡがＭＥＫおよびＥＲＫのリン酸化を低下させることを示している。
【図１５】外因性変異型ＮＲＡＳタンパク質を発現し、かつ、種々の量の化合物Ａ（ＢＲＡＦ阻害剤）の存在下で増殖するＡ３７５細胞の相対的増殖のグラフである。
【図１６】化合物Ｂ（ＭＥＫ１阻害剤）で３日間処理した後の、外因性ＮＲＡＳ変異体を発現するＡ３７５細胞の相対的増殖のグラフである。化合物Ｂ（ＭＥＫ１阻害剤）で３日間処理した後の、Ａ３７５ＰＦ１１（白丸）、ＦＬＡＧ−ＮＲＡＳＱ６１Ｋを発現する５つのＡ３７５ＰＦ１１クローン（黒い印）およびＦＬＡＧ−ＮＲＡＳＡ１４６Ｔを発現する２つのＡ３７５ＰＦ１１クローン。
【図１７】親（Ａ３７５）および外因性変異型ＮＲＡＳＱ６１ＫおよびＮＲＡＳＡ１４６Ｔクローンを発現するＡ３７５細胞のウエスタンブロットの画像であり、変異型ＮＲＡＳを発現する細胞は、ＭＥＫ、ＥＲＫ、およびＳ６Ｐリン酸化のリン酸化に低下を示さないことを示している。
【図１８】モデル化された化合物Ｂ（ＭＥＫ１阻害剤）のＭＥＫ１タンパク質への結合の画像である。
【図１９】種々の量の化合物Ａで処理した後の、外因性ＭＥＫ１変異体を発現するＡ３７５細胞の相対的増殖のグラフである。
【図２０】量の化合物Ｂで処理した後の、外因性ＭＥＫ１変異体を発現するＡ３７５細胞の相対的増殖のグラフである。
【図２１】化合物Ａで処理した後の、外因性ＭＥＫ１変異体を発現するＡ３７５細胞の溶解液のウエスタンブロットである。
【図２２】ｓｉＲＮＡで処理してＭＥＫ１またはＭＥＫ２の発現をノックアウトしたＡ３７５親細胞および化合物Ａ耐性細胞の相対的増殖のグラフである。
【図２３】ＭＥＫ１およびＭＥＫ２  ｓｉＲＮＡで処理したＡ３７５細胞における発現または発現の欠如を検出するウエスタンブロットの画像である。
【図２４】化合物Ａ、化合物Ｂまたはそれらの１０：１の一定モル比での組合せで３日間処理した後の、Ａ３７５ＰＦ１１（Ａ．）、ならびに化合物Ａに対する耐性を獲得したＡ３７５ＰＦ１１由来クローンである１２Ｒ５−１（Ｂ．）、１２Ｒ５−３（Ｃ．）、１６Ｒ６−２（Ｄ．）、および１６Ｒ６−４（Ｅ．）の相対的増殖曲線のグラフを表す。
【図２５】化合物Ａ、化合物Ｂ、またはそれらの１０：１の一定モル比での組合せで３日間処理した後の、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ（Ｂ．）、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｋ（Ｃ．、Ｄ．）、およびＮＲＡＳ  Ａ１４６Ｔ（Ｅ．、Ｆ．）またはビヒクルを安定発現する細胞の相対的増殖曲線のグラフを表す。
【図２６】化合物Ａ、化合物Ｂ、またはそれらの１０：１の一定モル比での組合せで３日間処理した後の、ベクター(Vector)であるＭＥＫ１  ＷＴ、ＭＥＫ１  Ｋ５９ｄｅｌ、およびＭＥＫ１  Ｑ５６Ｐで形質導入したＡ３７５ＰＦ１１の、ビヒクルと比べた代表的増殖曲線を表す。
【図２７】０、０．１、０．３および１μＭの化合物Ａの存在下、化合物Ｂの応答用量で３日間処理した後の、化合物Ａに対する耐性を獲得したＡ３７５ＰＦ１１由来クローンである１２Ｒ５−３、１６Ｒ６−４、および１２Ｒ５−５の代表的増殖曲線を表す。比較のため、種々の量の化合物Ｂ単独で処理したＡ３７５ＰＦ１１細胞を示す（破線、白丸）。
【図２８】さらなる増殖アッセイの結果の代表的画像を表し、１μＭ化合物Ａ(Compuond A)（ＢＲＡＦ阻害剤）と０．１μＭ化合物Ｂの組合せが、ＮＲＡＳ変異型クローンの細胞増殖を９０％超阻害したことを示している。
【図２９】化合物Ａ、化合物Ｂ、または両方の存在下で種々のＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路分子のリン酸化を検出する、種々のＡ３７５変異体のウエスタンブロットを表す。
【図３０】化合物Ａ（ＢＲＡＦ阻害剤）または化合物Ｂ（ＭＥＫ１阻害剤）を伴って、または伴わずに、化合物Ｃ（ＰＩ３Ｋ阻害剤）で処理したＡ３７５変異型細胞の細胞溶解液におけるＭＥＫ、ＥＲＫ、Ｓ６Ｐ、およびＡＫＴのリン酸化を検出するウエスタンブロットを表す。
【図３１】さらなる増殖アッセイの結果の代表的画像を表し、化合物Ａ（ＢＲＡＦ阻害剤）または化合物Ｂ（ＭＥＫ１）のいずれかと化合物Ｃ（ＰＩ３Ｋ阻害剤）の組合せによる増殖阻害の増強を示している。
【図３２】種々のＭＥＫ１変異体を発現する細胞に対する化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃ、ならびにそれらの組合せによる処理の細胞増殖阻害アッセイをまとめた表である。
【図３３】化合物Ａまたは化合物Ｂの存在下での、種々のＭＥＫ１変異体を発現する細胞の相対的増殖曲線のグラフを表す。
【図３４】化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、または示されている組合せで処理したＹＵＳＩＴ  Ｑ６１Ｋクローンの細胞増殖阻害アッセイをまとめた表である。
【図３５】化合物Ａの存在下での、種々のＭＥＫ１変異体を発現する細胞の相対的増殖のグラフを表す。
【発明の具体的な説明】
【００３０】
突然変異および突然変異の検出
本発明は、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトにおけるＮＲＡＳ  Ｑ６１変異、ＮＲＡＳ  Ａ１４６変異、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、またはＭＥＫ１  Ｐ３８７変異のうちの１つまたは組合せの検出に基づく。
【００３１】
本明細書において、用語「Ｒａｓタンパク質」は、細胞シグナル伝達に関与するＧＴＰアーゼのサブファミリーであるｒａｓサブファミリーに属する任意のタンパク質を意味する。当技術分野で公知のように、Ｒａｓの活性化は、細胞の増殖、分化および生存を引き起こす。Ｒａｓタンパク質には、限定されるものではないが、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓが含まれる。
【００３２】
本明細書において、「Ｒａｓタンパク質をコードする遺伝子」とは、任意のＲａｓタンパク質をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドの任意の部分を意味する。この用語の意味の範囲内には、Ｒａｓをコードするエキソンが含まれる。Ｒａｓタンパク質をコードする遺伝子には、限定されるものではないが、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓの一部または全部をコードする遺伝子が含まれる。
【００３３】
「ＮＲＡＳタンパク質」は、ヒトにおいてはＮＲＡＳ（神経芽腫ＲＡＳウイルス（ｖ−ｒａｓ）癌遺伝子ホモログ）遺伝子によりコードされるＧＴＰアーゼ酵素である。
【００３４】
用語「変異型ＮＲＡＳタンパク質」および「Ｎ−ｒａｓ変異」は、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｎ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｐ、またはＡ１４６Ｖから選択される少なくとも１つの突然変異を有するＮ−ｒａｓタンパク質を意味する。変異型Ｎ−ｒａｓポリペプチドとしては、限定されるものではないが、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、誘導変異体、置換変異体、欠失変異体、および／または挿入変異体、融合ポリペプチド、相同分子種、および種間ホモログが挙げられる。特定の実施形態においては、変異型Ｎ−ｒａｓポリペプチドは、Ｃ末端またはＮ末端に、限定されるものではないが、リーダー配列残基、ターゲティング残基、アミノ末端メチオニン残基、リシン残基、タグ残基および／または融合タンパク質残基などの付加的残基を含む。
【００３５】
ＭＥＫ１タンパク質、すなわち、二重特異性マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ１は、ヒトにおいてはＭＡＰ２Ｋ１遺伝子によりコードされる酵素である。用語「変異型ＭＥＫ１タンパク質」および「ＭＥＫ１変異」は、５９ｄｅｌＫおよびＰ３８７ＳもしくはＱ５６ＰもしくはＣ１２１ＳもしくはＰ１２４ＬもしくはＦ１２９Ｌから選択される少なくとも１つの突然変異を有するＭＥＫ１タンパク質、または１７５−１７７  ＡＡＧ欠失もしくはＣ１１５９Ｔから選択される少なくとも１つの突然変異を有するＭＡＰ２Ｋ１遺伝子を意味する。
【００３６】
さらに、変異型ＮＲＡＳまたはＭＥＫ１ポリペプチドには、そのポリペプチド、またはそのポリペプチドの全長の一部のペプチドをコードする遺伝子、またはそのポリペプチドが欠失されている、またはその細胞に存在しないポリペプチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子も含む。例えば、ＮＲＡＳタンパク質は、細胞によって末端切断型で産生される場合がある。欠失とは、遺伝子または遺伝子によりコードされるタンパク質の全部または一部が存在しないことを意味し得る。
【００３７】
用語「Ｖ６００変異型Ｂ−ｒａｆタンパク質」および類似の用語は、Ｖ６００位に突然変異を含んでなるＢ−ｒａｆポリペプチドを意味する。Ｂ−ｒａｆタンパク質は、限定されるものではないが、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、誘導変異体、置換変異体、欠失変異体、および／または挿入変異体、融合ポリペプチド、相同分子種、および種間ホモログをはじめとする他の突然変異も含み得る。特定の実施形態によれば、変異型Ｂ−ｒａｆポリペプチドは、Ｃ末端またはＮ末端に、限定されるものではないが、リーダー配列残基、ターゲティング残基、アミノ末端メチオニン残基、リシン残基、タグ残基および／または融合タンパク質残基などの付加的残基を含む。特定のＶ６００  Ｂ−ｒａｆ変異体としては、限定されるものではないが、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｒ、およびＶ６００Ｌから選択されるアミノ酸置換を有するＢＲＡＦが含まれる。例えば、Halilovic and Solvit (2008) Current Opinion in Pharmacology 8:419-26の図２を参照。
【００３８】
当技術分野で理解されるように用語「野生型」は、遺伝子改変のない天然集団に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を意味する。これもまた当技術分野で理解されるように、「突然変異体」は、それぞれ野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに見られる対応するアミノ酸または核酸と比較して、アミノ酸または核酸に少なくとも１つの改変を有するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列を含む。突然変異体という用語には、最も高頻度に見られる（野生型）核酸鎖に比べて、核酸鎖の配列に塩基対の違いが１つだけ存在する一塩基多型（ＳＮＰ）が含まれる。
【００３９】
本明細書において、被験体の腫瘍細胞を含む細胞（またはＤＮＡもしくは他の生体サンプル）を、ある遺伝子の突然変異または多型対立遺伝子に関して「遺伝子型決定」するとは、その遺伝子または遺伝子発現産物（例えば、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはタンパク質）のどの対立遺伝子型または多型および／または野生型または体細胞突然変異型が被験体（またはサンプル）に存在するか、または存在しないかを検出すること意味する。このような遺伝子から発現された関連するＲＮＡまたはタンパク質も、多型バリエーションの検出に使用可能である。本発明の目的では、「遺伝子型決定」は、サンプルからの体細胞突然変異ならびに遺伝子型突然変異の決定を含む。本明細書において、対立遺伝子は、他の対立遺伝子変異体の可能性が排除された場合に「検出」することができ、例えば、特定の核酸の位置がアデニン（Ａ）でもチミン（Ｔ）でもまたはシトシン（Ｃ）でもないと分かった場合に、その位置にはグアニン（Ｇ）が存在すると結論付けることができる（すなわち、被験体においてＧが「検出」または「診断」される）。配列バリエーションは、直接（例えば、シーケンシング、例えば、ＥＳＴシーケンシングまたは部分的もしくは完全ゲノムシーケンシングによる）、または間接的に（例えば、制限断片長多型分析、または既知配列のプローブのハイブリダイゼーション検出、または参照鎖コンフォメーション多型による）、または他の既知の方法を用いて検出することができる。
【００４０】
遺伝子もしくはＰＣＲ産物、またはその断片もしくは一部を含む任意の核酸の配列は、当技術分野で公知の任意の方法（例えば、化学的シーケンシングまたは酵素的シーケンシング）によって配列決定することができる。ＤＮＡの「化学的シーケンシング」は、Maxam and Gilbert (1977) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560)の方法などの方法を表し、この方法では、個々の塩基特異的反応を用いてＤＮＡがランダムに切断される。ＤＮＡの「酵素的シーケンシング」は、Sanger (Sanger, et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463)の方法などの方法を表し得る。
【００４１】
従来の分子生物学、微生物学、およびシーケンシング技術を含む組換えＤＮＡ技術は当業者に周知である。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (本明細書では「Sambrook, et al., 1989」); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover編 1985);オリゴヌクレオチド合成(M. J. Gait ed. 1984);核酸ハイブリダイゼーション(B. D. Hames & S. J. Higgins編(1985));転写および翻訳(B. D. Hames & S. J. Higgins編(1984));動物細胞培養(R. I. Freshney編(1986));固定化細胞および酵素(IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)参照。
【００４２】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）親和性アッセイは、従来のハイブリダイゼーションアッセイの派生型である(Nielsen et al., Science 254:1497-1500 (1991); Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. 114:1895-1897 (1992); James et al., Protein Science 3:1347-1350 (1994))。ＰＮＡは、ワトソン−クリックの塩基対形成の法則に従う構造的ＤＮＡミミックであり、標準的ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイで使用される。ＰＮＡ／ＤＮＡのミスマッチはＤＮＡ／ＤＮＡのミスマッチよりも不安定であり、相補的ＰＮＡ／ＤＮＡ鎖は相補的ＤＮＡ／ＤＮＡ鎖よりも強い結合する形成するので、ＰＮＡはハイブリダイゼーションアッセイにおいてより高い特異性を示す。
【００４３】
ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子バリエーションおよび多型を検出するために開発された(Taton et al., Science 289:1757-60, 2000; Lockhart et al., Nature 405:827-836 (2000); Gerhold et al., Trends in Biochemical Sciences 24:168-73 (1999); Wallace, R. W., Molecular Medicine Today 3:384-89 (1997); Blanchard and Hood, Nature Biotechnology 149:1649 (1996))。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラスまたはナイロン基板上に高速ロボットによって形成され、既知の属性を有するＤＮＡ断片（「プローブ」）を含む。マイクロアレイは、既知のＤＮＡ断片とおよび未知のＤＮＡ断片（「標的」）を照合するために使用される。
【００４４】
ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子における用語「少なくとも１つの突然変異」およびその文法上の変形は、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、誘導変異体、置換変異体、欠失変異体、末端切断変異体、および／または挿入変異体、融合ポリペプチド、相同分子種、および／または種間ホモログのうち１以上を有するポリペプチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。例として、ＮＲＡＳタンパク質の少なくとも１つの突然変異は、細胞内で産生される少なくとも１つのＮＲＡＳタンパク質について、ＮＲＡＳタンパク質をコードするポリペプチドまたは遺伝子の全配列のうち一部がその細胞には存在しないか、または発現されない、ＮＲＡＳタンパク質を含む。例えば、ＮＲＡＳタンパク質は、末端切断型で細胞により産生されてもよく、その末端切断部の配列については野生型であってもよい。欠失は、遺伝子または遺伝子によりコードされているタンパク質の全部または一部が存在しないことを意味し得る。さらに、細胞内で発現される、または細胞によりコードされるタンパク質のうちあるものは突然変異型であり得、同じ細胞内で産生される同じタンパク質の他のコピーは野生型であり得る。別の例として、ＮＲＡＳタンパク質における突然変異は、同じＮＲＡＳタンパク質の野生型に比べて、そのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸の違いを有するＮＲＡＳタンパク質を含む。
【００４５】
本明細書において、「遺伝子の異常」は、欠失、置換、付加、転座、被験体の細胞の通常の天然核酸含量に比べての増幅などを意味する。
【００４６】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は互換的に用いられ、本明細書においては、一般用語として天然タンパク質、断片、ペプチド、またはポリペプチド配列の類似体を指して用いられる。従って、天然タンパク質、断片、および類似体はポリペプチド類の種類である。
【００４７】
ポリペプチド配列の突然変異に関して「Ｘ＃Ｙ」という表記は当技術分野で認知されており、ここで、「＃」は、突然変異の位置をそのポリペプチドのアミノ酸番号で示し、「Ｘ」は、野生型アミノ酸配列においてその位置に見られるアミノ酸を示し、「Ｙ」は、その位置における変異アミノ酸を示す。例えば、Ｋ−ｒａｓポリペプチドに関して「Ｇ１２Ｓ」の表記は、野生型Ｋ−ｒａｓ配列のアミノ酸番号１２にはグリシンが存在し、そのグリシンが変異型Ｋ−ｒａｓ配列ではセリンに置換されていることを示す。
【００４８】
本明細書において、用語「増幅」およびその文法上の変形は、染色体相補物に１以上の余分な遺伝子コピーが存在することを意味する。特定の実施形態においては、Ｒａｓタンパク質をコードする遺伝子を細胞内で増幅させることができる。ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、ある種の癌との相関が見出されている。ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、ヒト唾液腺および胃癌由来細胞株、胃および結腸腺癌、ならびに乳腺癌で見出されている。Semba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6497-6501 (1985); Yokota et al., Oncogene, 2:283-287 (1988); Zhou et al., Cancer Res., 47:6123-6125 (1987); King et al., Science, 229:974-976 (1985); Kraus et al., EMBO J., 6:605-610 (1987); van de Vijver et al., Mol. Cell. Biol., 7:2019-2023 (1987); Yamamoto et al., Nature, 319:230-234 (1986)。
【００４９】
本明細書において、「過剰発現される」およびタンパク質またはポリペプチドの「過剰発現」ならびにその文法上の変形は、所与の細胞がある特定のタンパク質を正常細胞に比べて多数産生することを意味する。例として、ｒａｓタンパク質は、非腫瘍細胞に比べて腫瘍細胞で過剰発現され得る。さらに、変異型ｒａｓタンパク質は、細胞内で野生型ｒａｓタンパク質に比べて過剰発現され得る。当技術分野で理解されるように、細胞内でのポリペプチドの発現レベルは、アクチンなどのハウスキーピング遺伝子に対して正規化することができる。場合によっては、特定のポリペプチドを、非腫瘍細胞に比べて腫瘍細胞で低発現とすることもできる。
【００５０】
本明細書において、「少なくとも１つの遺伝子産物の発現に必要な核酸」とは、遺伝子の任意の一部をコードする、かつ／または必ずしもコード配列を含まなくても、遺伝子産物をコードする核酸に機能的に連結される核酸配列を意味する。例として、少なくとも１つの遺伝子産物の発現に必要な核酸配列としては、限定されるものではないが、エンハンサー、プロモーター、調節配列、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化配列、および／またはコード配列が含まれる。特定の細胞でのポリペプチドの発現レベルは、限定されるものではないが、細胞ゲノムにおける種々の調節エレメントおよび／または非コード配列の突然変異、欠失および／または置換によって達成され得る。
【００５１】
本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変型である、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドの高分子形態を意味する。この用語には、一本鎖型および二本鎖型のＤＮＡが含まれる。
【００５２】
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然型および非天然型オリゴヌクレオチド結合によって相互連結された天然型および改変型ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に２００塩基長以下を含んでなるポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長、最も好ましくは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは、通常一本鎖であるが（例えば、プローブの場合）、オリゴヌクレオチドは二本鎖であってもよい（例えば、遺伝子突然変異体の構築に用いる場合）。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかであり得る。
【００５３】
オリゴヌクレオチドプローブ、またはプローブは、一般に約８ヌクレオチド長〜数百ヌクレオチド長の範囲の大きさの核酸分子である。このような分子は一般に、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で核酸配列とハイブリダイズすることにより、サンプルにおいてそのような標的核酸配列を同定するために使用される。ハイブリダイゼーション条件は、前記に詳細に記載されている。
【００５４】
ＰＣＲプライマーは核酸配列でもあるが、ＰＣＲプライマーは一般に、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるかなり短いオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブは、当業者ならば、標的配列からの配列情報を用いて、容易に開発および作製することができる（例えば、Sambrook et al., 前掲またはGlick et al., 前掲参照）。
【００５５】
当技術分野で公知のように、ＮＲＡＳ、ＭＥＫ１およびＢＲＡＦ変異を検出する上で用いるのにＰＣＲおよび／またはシーケンシングに基づくいくつかの方法が知られており、限定されるものではないが、Brose, et al. Cancer Research 62:6997-7000 (2002)、Solit et al, Cancer Research 70(14): 5901-5911 (1010)、Xu, et al. Cancer research 63:4561-4567 (2003)を含むいくつかの研究論文および米国特許、ならびに米国特許第７，７４５，１２８号、およびいくつかの市販のキット（Ｄｘｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、およびＱｕｅｓｔ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ参照）に示されている。一般に、シーケンシングまたはＰＣＲ用のプライマーおよびプローブは、Ｑ６１Ｋ（Ｃ１８１Ａ）、Ｑ６１Ｈ（Ａ１８３ＣまたはＡ１８３Ｔ）、Ｑ６１Ｒ（Ａ１８２Ｇ）、Ｑ６１Ｌ（Ａ１８２Ｔ）、Ｑ６１Ｎ（Ｃ１８１Ａ、Ａ１８３Ｃ）、Ｑ６１Ｅ（Ｃ１８１Ｇ）、Ｑ６１Ｐ（Ａ１８２Ｃ）、Ａ１４６Ｔ（Ｇ４３６Ａ）、Ａ１４６Ｐ（Ｇ４３６Ｃ）およびＡ１４６Ｖ（Ｃ４３７Ｇ）のコドン変異、ならびに遺伝子受託番号ＮＭ＿００２５２４．３を有するＮＲＡＳの配列（図１）、コドン５９におけるＭＥＫ１欠失の突然変異（ＡＡＧ欠失）またはＰ３８７Ｓ（Ｃ１１５９Ｔ）、遺伝子受託番号ＮＭ＿００２７５５．３を有するＭＥＫ１の配列（図２）に基づいて設計することができる。
【００５６】
Ｒａｓ／Ｒａｆに関して野生型または変異型のいずれかである癌は、公知の方法によって同定される。例えば、野生型または変異型Ｒａｓ／Ｒａｆ腫瘍細胞は、ＤＮＡ増幅とシーケンシング技術、ＤＮＡおよびＲＮＡ検出技術（限定されるものではないが、それぞれノーザンおよびサザンブロットを含む）、および／または種々のバイオチップおよびアレイ技術によって同定することができる。野生型および変異型ポリペプチドは、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットまたは免疫組織化学などの免疫診断技術を含む、種々の技術によって検出することができる。
【００５７】
黒色腫
好適には、本発明は、限定されるものではないが、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、肢端黒子型黒色腫、および脈絡膜眼内黒色腫、眼内黒色腫(ocular intraocular melanoma)、およびブドウ膜眼内黒色腫などの黒色腫のサブタイプを含む、ＢＲＡＦ  Ｖ６００変異型黒色腫を治療する、またはその重篤度を軽減する方法に関する。
【００５８】
本明細書において、用語「癌」、「新生物」、および「腫瘍」は互換的に用いられ、単数形または複数形のいずれかで、宿主生物に対して病的となる悪性化を受けた細胞を意味する。原発性癌細胞（すなわち、悪性化部位の近傍から得られた細胞）は、十分確立された技術、特に、組織学的検査によって非癌性細胞から容易に識別することができる。本明細書において、癌細胞の定義には、原発性癌細胞を含むだけでなく、癌細胞祖先に由来するいずれの細胞も含む。これには、転移癌細胞、ならびに癌細胞に由来するin vitro培養物および細胞株が含まれる。通常固形腫瘍として顕在化する癌のタイプに関していう場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲ画像、Ｘ線、超音波もしくは触診などの手段により、腫瘍塊に基づいて検出可能なもの、および／または患者から取得可能なサンプルにおける１以上の癌特異的抗原の発現によって検出可能なものである。
【００５９】
当技術分野で周知のように、腫瘍は、腫瘍の最初の位置または原発位置から１以上の他の身体組織または部位へ転移する場合がある。特に、中枢神経系への転移（すなわち、二次性ＣＮＳ腫瘍）、特に、脳への転移（すなわち、脳転移）は、乳癌、肺癌、黒色腫、腎癌および結腸直腸癌などの腫瘍および癌に関して、十分な報告がある。本明細書において、被験体における「新生物」、「腫瘍」または「癌」の治療のための使用または方法という場合には、原発性新生物、腫瘍または癌のための使用および治療だけでなく、適当であれば、転移（すなわち、転移性腫瘍増殖）のための使用および治療も含む。
【００６０】
ＢＲａｆ耐性を克服する療法
ＢＲＡＦ＋ＭＥＫ
前記のようにＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を示す、従って、ＢＲａｆ阻害剤による治療に耐性を持つ傾向があるＶ６００変異型黒色腫が、タイプの異なる阻害剤からなる少数の選択薬の組合せでやはり治療可能であることが見出された。
【００６１】
驚くことに、ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を示すＶ６００変異型黒色腫は、ＢＲａｆ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組合せで治療可能であり、その結果、細胞増殖阻害は個々の薬剤の相加作用を上回る。
【００６２】
例として、ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を示すＶ６００変異型黒色腫は、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩と式（ＩＩ）：
【化２】
2013543008.tif 000003
のＭＥＫ阻害剤（以下、「化合物Ｂ」）またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物の組合せで治療すると、応答を示し細胞増殖阻害が回復されることが示された。
【００６３】
化合物Ｂは、ＵＳＡＮ名トラメチニブとしても知られる。
【００６４】
以下の実施例の節に示されるように、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物と式（ＩＩ）のＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物の組合せは、以前にＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａに曝され、かつ、実施例により示され、また、ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異の提示との相関が見出されているようにＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａに対して耐性を発達させた腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する。前記組合せは、いずれの単剤よりも優れた、ＮＲＡＳ変異細胞の阻害をもたらす。
【００６５】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、第１のＢＲａｆ阻害剤を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を有するかどうかを決定する工程、および前記ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異が存在すれば、第２のＢＲａｆ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。しかし、第１および第２のＢＲａｆ阻害剤は同じである必要はない。
【００６６】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を有するかどうかを決定する工程、および前記ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異が存在すれば、第２のＢＲａｆ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の組合せを投与する工程を含む方法がある。有利には、第２のＢＲａｆ阻害剤は、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩である。有利には、ＭＥＫ阻害剤は、化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩である。
【００６７】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を有するかどうかを決定する工程、およびＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩とＭＥＫ阻害剤である化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩の組合せを投与する工程をを含んでなる方法がある。
【００６８】
前記のように、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を示し、従って、ＢＲａｆ阻害剤による治療に耐性を持つ傾向があるＶ６００変異型黒色腫が、タイプの異なる阻害剤からなる少数の選択薬の組合せでやはり治療可能であることが見出された。
【００６９】
驚くことに、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を示すＶ６００変異型黒色腫は、ＢＲａｆ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組合せで治療可能であり、その結果、細胞増殖阻害は個々の薬剤の相加作用を上回る。
【００７０】
例として、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を示すＶ６００変異型黒色腫は、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩とＭＥＫ阻害剤である化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩の組合せで治療すると、応答を示し細胞増殖阻害が回復されることが示された。
【００７１】
以下の実施例の節に示されるように、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩およびＭＥＫ阻害剤である化合物Ｂまたは薬学的に許容可能な塩の組合せは、以前にＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａに曝され、かつ、実施例により示され、また、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異の提示との相関が見出されているようにＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａに対して耐性を発達させた腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する。前記組合せは、いずれの単剤よりも優れた、ＭＥＫ１変異細胞の阻害をもたらす。
【００７２】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、第１のＢＲａｆ阻害剤を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＭＥＫ１  Ｋ５９欠失またはＭＥＫ１  Ｐ３８７変異を有するかどうかを決定する工程、および前記ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異が存在すれば、第２のＢＲａｆ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。しかし、第１および第２のＢＲａｆ阻害剤は同じである必要はない。
【００７３】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、  ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を有するかどうかを決定する工程、および前記ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異が存在すれば、第２のＢＲａｆ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。有利には、第２のＢＲａｆ阻害剤は、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩である。有利には、ＭＥＫ阻害剤は、化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物である。
【００７４】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であった、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を有するかどうかを決定する工程、およびＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩とＭＥＫ阻害剤である化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００７５】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド  メタンスルホネートを投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を有するかどうかを決定する工程、およびＮ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド  メタンスルホネートおよびジメチルスルホキシド溶媒和物としてのＮ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル｝アセトアミドの組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００７６】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド  メタンスルホネートを投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を有するかどうかを決定する工程、およびＮ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド  メタンスルホネートおよびジメチルスルホキシド溶媒和物としてのＮ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル｝アセトアミドの組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００７７】
混乱を避けるため、Ｖ６００変異ＢＲＡＦ黒色腫における前記の欠失または突然変異のいずれか、すなわち、コドン６１におけるＮＲＡＳ変異、コドン１４６におけるＮＲＡＳ変異、コドン５９におけるＭＥＫ１欠失、またはコドン３８７、５６、１２１、１２４もしくは１２９におけるＭＥＫ１変異のいずれか１つが、ＢＲＡＦ阻害剤、例えば、阻害剤である化合物Ａによる前記黒色腫の治療に対する応答の低下または耐性と相関があることを明示しておく。同様に、Ｖ６００変異ＢＲＡＦ黒色腫における前記の欠失または突然変異のいずれかを組み合わせたものが、ＢＲＡＦ阻害剤、例えば、阻害剤である化合物Ａによる前記黒色腫の治療に対する応答の低下または耐性と相関があることも明示しておく。さらに、単独でまたは任意の組合せで存在する、Ｖ６００変異ＢＲＡＦ黒色腫における前記の欠失または突然変異が、本明細書に記載の化合物Ａと化合物Ｂの組合せによる前記黒色腫の有効な治療の可能性の増大と相関があることも明示しておく。
【００７８】
化合物Ａは、その薬学的に許容可能な塩とともに、引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ特許公開ＷＯ２００９／１３７３９１で、特に癌の治療において、ＢＲａｆ活性の阻害剤として有用であるとして開示および特許請求されている。化合物Ａは、本出願の実施例５８ａ〜５８ｅによって具現化される。
【００７９】
化合物Ｂは、その薬学的に許容可能な塩およびまたその溶媒和物とともに、引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ２００５／１２１１４２で、特に癌の治療において、ＭＥＫ活性の阻害剤として有用であるとして開示および特許請求されている。化合物Ｂは、実施例４−１の化合物である。化合物Ａは、引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ２００５／１２１１４２に記載されているように製造することができる。好適には、化合物Ｂは、ジメチルスルホキシド溶媒和物の形態である。好適には、化合物Ｂは、ナトリウム塩の形態である。好適には、化合物Ｂは、水和物、酢酸、エタノール、ニトロメタン、クロロベンゼン、１−ペンタノール(1-pentancol)、イソプロピルアルコール、エチレングリコールおよび３−メチル−１−ブタノールから選択される溶媒和物の形態である。これらの溶媒和物および塩形態は、当業者ならば、引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ２００５／１２１１４２から製造することができる。
【００８０】
化合物Ａと化合物Ｂの組合せ投与は、好適な処方および用法とともに、その教示が引用することにより本明細書の一部とされ、前記組合せを投与する種々の潜在的方法と同程度に有益な信頼できる、２０１０年１０月１５日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５２８０８に開示されている。
【００８１】
化合物ＡおよびＢは、個別にまたは双方とも溶媒和物として提供してもよい。本明細書において、用語「溶媒和物」は、溶質（本発明では、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物またはその塩）と溶媒によって化学量論的に形成される可変の複合体を意味する。本発明の目的のこのような溶媒は、溶質の生物活性に干渉してはならない。好適な溶媒の例としては、限定されるものではないが、水、メタノール、ジメチルスルホリド(dimethylsulforide)、エタノールおよび酢酸が挙げられる。一実施形態によれば、使用する溶媒は薬学的に許容可能な溶媒である。好適な薬学的に許容可能な溶媒の例としては、限定されるものではないが、水、エタノールおよび酢酸が挙げられる。別の実施形態においては、使用する溶媒は水である。
【００８２】
化合物ＡおよびＢは、多形として知られる特徴である、２つ以上の形態で結晶化する能力を持ち得、このような多様な形態（「多形」）も化合物ＡおよびＢの範囲内にあると理解される。多形は一般に、温度もしくは圧力またはその両方の変化に応じて生じ、結晶化プロセスの変動の結果として生じ得る。多形は、Ｘ線回折図形、溶解度、および融点などの当技術分野で公知の種々の物理的特徴によって識別することができる。
【００８３】
好適には、本発明による組合せの一部として投与される化合物Ａの量（非塩／非溶媒和物量の重量に基づく）は、約１０ｍｇ〜約６００ｍｇから選択される量であろう。好適には、この化合物Ａの選択量は、１日１〜４回投与される。好適には、化合物Ａは、１日２回、１５０ｍｇの量で投与される。
【００８４】
好適には、本発明による組合せの一部として投与される化合物Ｂの量（非塩／非溶媒和物量の重量に基づく）は、約０．１２５ｍｇ〜約１０ｍｇから選択される量で投与される。
【００８５】
ＭＥＫ＋ＰＩ３Ｋ
驚くことに、ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を示すＶ６００変異型黒色腫は、ＰＩ３Ｋ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組合せで治療可能であり、その結果、細胞増殖阻害は個々の薬剤の相加作用を上回る。
【００８６】
例として、ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を示すＶ６００変異型黒色腫は、式（ＩＩＩ）：
【化３】
2013543008.tif 000004
のＰＩ３Ｋ阻害剤（以下、「化合物Ｃ」と称する）またはその薬学的に許容可能な塩とＭＥＫ阻害剤である化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩の組合せで治療すると、応答を示し細胞増殖阻害が回復されることが示された。
【００８７】
以下の実施例の節に示されるように、ＰＩ３Ｋ阻害剤である化合物Ｃまたはその薬学的に許容可能な塩とＭＥＫ阻害剤である化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩の組合せは、以前にＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａに曝され、かつ、実施例により示されているように、また、ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異の提示との相関が見出されているようにＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａに対して耐性を発達させた腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する。前記組合せは、いずれの単剤よりも優れた、ＮＲＡＳ変異細胞の阻害をもたらす。
【００８８】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、第１のＢＲａｆ阻害剤を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を有するかどうかを決定する工程、および前記ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異が存在すれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００８９】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を有するかどうかを決定する工程、および前記ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異が存在すれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。有利には、ＭＥＫ阻害剤は、化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩である。
【００９０】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を有するかどうかを決定する工程、およびＰＩ３Ｋ阻害剤である化合物Ｃまたはその薬学的に許容可能な塩とＭＥＫ阻害剤である化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００９１】
驚くことに、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を示すＶ６００変異型黒色腫は、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組合せで治療可能であり、その結果、細胞増殖阻害は個々の薬剤の相加作用を上回る。
【００９２】
例として、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を示すＶ６００変異型黒色腫は、ＰＩ３Ｋ阻害剤である化合物Ｃまたはその薬学的に許容可能な塩とＭＥＫ阻害剤である化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩の組合せで治療すると、応答を示し細胞増殖阻害が回復されることが示された。
【００９３】
以下の実施例の節に示されるように、ＰＩ３Ｋ阻害剤である化合物Ｃまたはその薬学的に許容可能な塩とＭＥＫ阻害剤である化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩の組合せは、以前にＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａに曝され、かつ、実施例により示されているように、また、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異の提示との相関が見出されているようにＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａに対して耐性を発達させた腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する。前記組合せは、いずれの単剤よりも優れた、ＭＥＫ１変異細胞の阻害をもたらす。
【００９４】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、第１のＢＲａｆ阻害剤を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を有するかどうかを決定する工程、および前記ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異が存在すれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００９５】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を有するかどうかを決定する工程、および前記ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異が存在すれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。有利には、ＭＥＫ阻害剤は、化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩である。
【００９６】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を有するかどうかを決定する工程、およびＰＩ３Ｋ阻害剤である化合物Ｃまたはその薬学的に許容可能な塩とＭＥＫ阻害剤である化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００９７】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド  メタンスルホネートを投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を有するかどうかを決定する工程、および２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドとジメチルスルホキシド溶媒和物としてのＮ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル｝アセトアミドの組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００９８】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド  メタンスルホネートを投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を有するかどうかを決定する工程、および２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドとジメチルスルホキシド溶媒和物としてのＮ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル｝アセトアミドの組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【００９９】
混乱を避けるため、Ｖ６００変異ＢＲＡＦ黒色腫における上記の欠失または突然変異のいずれか、すなわち、コドン６１におけるＮＲＡＳ変異、コドン１４６におけるＮＲＡＳ変異、コドン５９におけるＭＥＫ１欠失、またはコドン３８７、５６、１２１、１２４もしくは１２９におけるＭＥＫ１変異のいずれか１つが、ＢＲＡＦ阻害剤、例えば、阻害剤である化合物Ａによる前記黒色腫の治療に対する応答の低下または耐性と相関があることを明示しておく。同様に、Ｖ６００変異ＢＲＡＦ黒色腫における前記の欠失または突然変異のいずれかを組み合わせたものが、ＢＲＡＦ阻害剤、例えば、阻害剤である化合物Ａによる前記黒色腫の治療に対する応答の低下または耐性と相関することも明示しておく。さらに、単独でまたは任意の組合せで存在する、Ｖ６００変異ＢＲＡＦ黒色腫における上記の欠失または突然変異が、本明細書に記載の化合物Ｂと化合物Ｃの組合せによる前記黒色腫の有効な治療の可能性の増大と相関することも明示しておく。
【０１００】
化合物Ｃと組み合わせて使用する化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩は、前記の通りに製造することができる。
【０１０１】
化合物Ｃ、ならびにその薬学的に許容可能な塩および溶媒和物は、その薬学的に許容可能な塩とともに、その全開示が引用することにより本明細書の一部とされる国際公開第ＷＯ２００８／１４４４６３号で、特に癌の治療において、ＰＩ３Ｋ活性の阻害剤として有用であるとして開示および特許請求されている。化合物Ｃはまた、ｍ−ＴＯＲ阻害剤としても作用することができ、ｍ−ＴＯＲ阻害活性を有することが知られている。化合物Ｂは具体例としての化合物であり、ＷＯ’４６３公報の実施例３４５に従って製造することができる。
【０１０２】
化合物Ｂと化合物Ｃの組合せ投与は、好適な処方および用法とともに、その教示が引用することにより本明細書の一部とされ、前記組合せを投与する種々の潜在的方法と同程度に有益な信頼できる、２０１０年９月２８日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５０４９５に開示されている。
【０１０３】
組み合わせて使用する場合、化合物Ｂおよび／または化合物Ｃは溶媒和物の形態であってもよく、溶媒和物は、溶質（本明細書では、化合物Ｂもしくはその塩および／または化合物Ｃもしくはその塩）と溶媒によって化学量論的に形成される可変の複合体であると理解される。本発明の目的のこのような溶媒は、溶質の生物活性に干渉しないかもしれない。好適な溶媒の例としては、限定されるものではないが、水、メタノール、ジメチルスルホキシド、エタノールおよび酢酸が挙げられる。好適には、使用する溶媒は薬学的に許容可能な溶媒である。好適な薬学的に許容可能な溶媒の例としては、限定されるものではないが、水、ジメチルスルホキシド、エタノールおよび酢酸が挙げられる。好適には、使用する溶媒は水である。
【０１０４】
好適には、化合物Ｃは、その遊離塩基の形態で提供される。あるいは、本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩は、当業者により、本開示に従って、容易に製造される。
【０１０５】
好適には、化合物Ｂと化合物Ｃの組合せの一部として投与される化合物Ｂの量（１用量当たりの遊離または非塩および非溶媒和物化合物の量）は、約０．１２５ｍｇ〜約１０ｍｇから選択される量であり、例えば、その量は約５ｍｇであり得る。
【０１０６】
好適には、化合物Ｂと化合物Ｃの組合せの一部として投与される化合物Ｃの量（１用量当たりの遊離または非塩および非溶媒和物化合物の量）は、約０．２５ｍｇ〜約７５ｍｇから選択される量であり、好適には、その量は約６ｍｇ〜約１２ｍｇから選択され、好適には、その量は約１０ｍｇである。
【０１０７】
Ｂ  ＲＡＦ  ＋  ＰＩ３Ｋ
さらなる実施形態においては、ＢＲａｆ阻害剤とＰＩ３Ｋ阻害剤の組合せが使用可能である。好適には、前記のような化合物Ａと前記のような化合物Ｃが使用可能である。
【０１０８】
驚くことに、ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異またはＭＥＫ１変異を示すＶ６００変異型黒色腫は、ＢＲＡＦ阻害剤とＰＩ３Ｋ阻害剤の組合せで治療可能であり、その結果、細胞増殖阻害は個々の薬剤の相加作用を上回る。
【０１０９】
例として、ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を示すＶ６００変異型黒色腫は、式（ＩＩＩ）：
【化４】
2013543008.tif 000005
のＰＩ３Ｋ阻害剤（以下、「化合物Ｃ」と称する）またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物とＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物の組合せで治療すると、応答を示し細胞増殖阻害が回復されることが示された。
【０１１０】
以下の実施例の節に示されるように、ＰＩ３Ｋ阻害剤である化合物Ｃまたはその薬学的に許容可能な塩とＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物の組合せは、以前にＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａに曝され、かつ、実施例により示されており、および、ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異の提示との相関が見出されているようにＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａに対して耐性を発達させた腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する。前記組合せは、いずれの単剤よりも優れた、ＮＲＡＳ変異細胞の阻害を示す。
【０１１１】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、第１のＢＲａｆ阻害剤を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を有するかどうかを決定する工程、および前記ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異が存在すれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＢＲＡＦ阻害剤の組合せを投与することを含んでなる方法がある。
【０１１２】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を有するかどうかを決定する工程、および前記ＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異が存在すれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤とＢＲａｆ阻害剤の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。有利には、ＢＲａｆ阻害剤は、化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物である。
【０１１３】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を有するかどうかを決定する工程、およびＰＩ３Ｋ阻害剤である化合物Ｃまたはその薬学的に許容可能な塩とＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【０１１４】
驚くことに、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を示すＶ６００変異型黒色腫は、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤とＢＲａｆ阻害剤の組合せで治療可能であり、その結果、細胞増殖阻害は個々の薬剤の相加作用を上回る。
【０１１５】
例として、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を示すＶ６００変異型黒色腫は、ＰＩ３Ｋ阻害剤である化合物Ｃまたはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物とＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩の組合せで治療すると、応答を示し細胞増殖阻害が回復されることが示された。
【０１１６】
以下の実施例の節に示されるように、ＰＩ３Ｋ阻害剤である化合物Ｃまたはその薬学的に許容可能な塩とＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物の組合せは、以前にＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａに曝され、かつ、実施例により示されており、および、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異の提示との相関が見出されているようにＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａに対して耐性を発達させた腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する。前記組合せは、いずれの単剤よりも優れた、ＭＥＫ１変異細胞の阻害をもたらす。
【０１１７】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、第１のＢＲａｆ阻害剤を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を有するかどうかを決定する工程、および前記ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、または  ＭＥＫ１  Ｆ１２９変異が存在すれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤とＢＲａｆ阻害剤の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【０１１８】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を有するかどうかを決定する工程、および前記ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異が存在すれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤とＢＲａｆ阻害剤の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。有利には、ＢＲａｆ阻害剤は、化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩である。
【０１１９】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を有するかどうかを決定する工程、およびＰＩ３Ｋ阻害剤である化合物Ｃまたはその薬学的に許容可能な塩とＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩の組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【０１２０】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、ＢＲａｆ  Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド  メタンスルホネートを投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６変異を有するかどうかを決定する工程、および２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドとＮ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド  メタンスルホネートの組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【０１２１】
本発明の一実施形態によれば、Ｖ６００変異型黒色腫に罹患しているヒトを治療する方法であって、Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド  メタンスルホネートを投与する工程、前記ヒトの黒色腫腫瘍組織がＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＭＥＫ１  Ｐ３８７変異、ＭＥＫ１  Ｑ５６変異、ＭＥＫ１  Ｃ１２１変異、ＭＥＫ１  Ｐ１２４変異、またはＭＥＫ１  Ｆ１２９変異を有するかどうかを決定する工程、および２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドとＮ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド  メタンスルホネートの組合せを投与する工程を含んでなる方法がある。
【０１２２】
混乱を避けるため、Ｖ６００変異ＢＲＡＦ黒色腫における前記の欠失または突然変異のいずれか、すなわち、コドン６１におけるＮＲＡＳ変異、コドン１４６におけるＮＲＡＳ変異、コドン５９におけるＭＥＫ１欠失、またはコドン３８７、５６、１２１、１２４もしくは１２９におけるＭＥＫ１変異のいずれか１つが、ＢＲＡＦ阻害剤、例えば、阻害剤である化合物Ａによる前記黒色腫の治療に対する応答の低下または耐性と相関があることを明示しておく。同様に、Ｖ６００変異ＢＲＡＦ黒色腫における前記の欠失または突然変異のいずれかを組み合わせたものが、ＢＲＡＦ阻害剤、例えば、阻害剤である化合物Ａによる前記黒色腫の治療に対する応答の低下または耐性と相関することも明示しておく。さらに、単独でまたは任意の組合せで存在する、Ｖ６００変異ＢＲＡＦ黒色腫における前記の欠失または突然変異が、本明細書に記載の化合物Ａと化合物Ｃの組合せによる前記黒色腫の有効な治療の可能性の増大と相関することも明示しておく。
【０１２３】
化合物Ｃと組み合わせて使用する化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩は、上記の通りに製造することができる。
【０１２４】
化合物Ｃ、ならびにその薬学的に許容可能な塩および溶媒和物は、その薬学的に許容可能な塩とともに、その全開示が引用することにより本明細書の一部とされる国際公開第ＷＯ２００８／１４４４６３号で、特に癌の治療において、ＰＩ３Ｋ活性の阻害剤として有用であるとして開示および特許請求されている。化合物Ｃはまた、ｍ−ＴＯＲ阻害剤としても作用することができ、ｍ−ＴＯＲ阻害活性を有することが知られている。
【０１２５】
化合物Ａと化合物Ｃの組合せ投与は、好適な処方および用法とともに、それぞれが引用することにより本明細書の一部とされ、前記組合せを投与する種々の潜在的方法と同程度に有益な信頼できる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５２２４２（国際公開第ＷＯ２０１１／０４６８９４号として公開）に開示されている。
【０１２６】
組み合わせて使用する場合、化合物Ａおよび／または化合物Ｃは溶媒和物の形態であってもよく、溶媒和物は、溶質（本明細書では、化合物Ａもしくはその塩および／または化合物Ｃもしくはその塩）と溶媒によって化学量論的に形成される可変の複合体であると理解される。本発明の目的のこのような溶媒は、溶質の生物活性に干渉しないかもしれない。好適な溶媒の例としては、限定されるものではないが、水、メタノール、ジメチルスルホキシド、エタノールおよび酢酸が挙げられる。好適には、使用する溶媒は薬学的に許容可能な溶媒である。好適な薬学的に許容可能な溶媒の例としては、限定されるものではないが、水、ジメチルスルホキシド、エタノールおよび酢酸が挙げられる。好適には、使用する溶媒は水である。
【０１２７】
好適には、化合物Ｃは、その遊離塩基の形態で提供される。あるいは、本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩は、当業者により、本開示に従って、容易に製造される。
【０１２８】
好適には、化合物Ａと化合物Ｃの組合せの一部として投与される化合物Ａの量（１用量当たりの遊離または非塩および非溶媒和物化合物の量）は、約０．１２５ｍｇ〜約１０ｍｇから選択される量であり、例えば、その量は約５ｍｇであり得る。
【０１２９】
好適には、化合物Ａと化合物Ｃの組合せの一部として投与される化合物Ｃの量（１用量当たりの遊離または非塩および非溶媒和物化合物の量）は、約０．２５ｍｇ〜約７５ｍｇから選択される量であり、好適には、その量は約６ｍｇ〜約１２ｍｇから選択され、好適には、その量は約１０ｍｇである。
【０１３０】
さらなる組合せ
さらなる実施形態においては、他のＢＲａｆ、ＭＥＫ、例えば、ＭＥＫ１、およびＰＩ３Ｋ阻害剤による治療を用いる。例えば、一実施形態においては、ＢＲａｆ阻害剤はＰＬＸ４０３２である。さらなる実施形態においては、治療は、少なくともＰＬＸ４０３２と化合物Ｂ、またはＰＬＸ４０３２と化合物Ｃを投与することを含んでなる。別の実施形態においては、治療は、ＰＬＸ４０３２と化合物Ａと化合物Ｃを投与することを含んでなる。
【０１３１】
さらなる実施形態においては、以下のＭＥＫ１阻害剤：ＡＺＤ６２４４、Ｅｉｓａｉ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．のＡＥ６２０１、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡのＡＳ  ７０３０２６、ＲｏｃｈｅのＲ７４２０、ＲｏｃｈｅおよびＣｈｕｇａｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．  ＬｔｄのＲ７１６７、武田薬品工業株式会社のＴＡＫ−７３３、Ａｒｄｅａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．およびＢａｙｅｒのＲＤＥＡ１１９、ならびにＵＣＢグループのＷＸ−５５５のうち少なくとも１つを用いる。好ましい実施形態においては、ＭＥＫ１阻害剤はアロステリックＭＥＫ１阻害剤である。さらなる実施形態は、Fremin et al., Journal of Hematology & Oncology 2010, 3:8（１つにはその中のＭＥＫ１阻害剤の化学構造および名称の引用を目的として、引用することにより本明細書の一部とされる）に列挙されているＭＥＫ１阻害剤を含む。さらなる実施形態においては、治療は、本段落に列挙されている、もしくは本明細書の一部とされる参照文献に記載されているＭＥＫ１阻害剤と化合物Ａ、または本段落に列挙されている、もしくは本明細書の一部とされる参照文献に記載されているＭＥＫ１阻害剤と化合物Ｃを投与することを含んでなる。
【０１３２】
別の実施形態においては、以下のＰＩ３Ｋ阻害剤：ＣＡＬ１０１、ＰＸ−８６６、ＢＫＭ１２０、ＸＬ１４７、ＧＤＣ０９４１、ＰＸ−８６６、ＣＡＬ１０１、ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＸＬ７６５、ＳＦ１１２６のうち少なくとも１つが用いられる。示されているこれらの化合物の構造は、引用することにより本明細書の一部とする。さらなる実施形態においては、治療は、以下の組合せ：本段落に列挙されているＰＩ３Ｋ阻害剤と化合物Ａ、本段落に列挙されているＰＩ３Ｋ阻害剤と化合物Ｂ、ＰＩ３Ｋ阻害剤とＰＬＸ４０３２と化合物Ｂのうち少なくとも１つを投与することを含んでなる。
【０１３３】
一般に、本発明の癌治療においては、治療する感受性腫瘍に対して活性を有するいずれかの抗新生物薬が併用投与される。このような薬剤の例は、Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita and S. Hellman(編), 第6版(2001年2月15日), Lippincott Williams & Wilkins Publishersに見出すことができる。上述のＢＲａｆ、ＭＥＫおよびＰＩ３Ｋ阻害剤との組合せに有用な典型的抗新生物薬としては、限定されるものではないが、抗微小管剤、例えば、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイド；白金錯体；アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、オキサザホスホリン、アルキルホスホネート、ニトロソ尿素、およびトリアゼン；抗生物質、例えば、アントラサイクリン、アクチノマイシンおよびブレオマイシン；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、エピポドフィロトキシン；代謝拮抗物質、例えば、プリンおよびピリミジン類似体および葉酸拮抗化合物；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、カンプトテシン；ホルモンおよびホルモン類似体；シグナル伝達経路阻害剤；受容体チロシンキナーゼ阻害剤；セリン−トレオニンキナーゼ阻害剤；非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤；血管新生阻害剤；免疫治療薬；アポトーシス促進薬；および細胞周期シグナル伝達阻害剤が挙げられる。
【０１３４】
本発明はまた、Ｖ６００変異型黒色腫を治療する方法であって、別の抗新生物薬に加えて、ＭＥＫ阻害剤である化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩を、ＢＲａｆ阻害剤である化合物Ａもしくはその薬学的に許容可能な塩および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤である化合物Ｃもしくはその薬学的に許容可能な塩のいずれかと組み合わせて投与することを含んでなる方法も提供する。このような組合せで使用されるさらなる有効成分または有効成分群（抗新生物薬剤）は以下の通りである。
【０１３５】
抗微小管または抗有糸分裂剤、例えば、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンなど）；ジテルペノイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（商標））およびその類似体ドセタキセル；白金錯体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド、メルファラン、およびクロラムブシル；アルキルホスホネート、例えば、ブスルファン；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン；およびトリアゼン、例えば、ダカルバジン。
【０１３６】
本発明と併用可能な付加的抗新生物薬としては、抗生物質系抗新生物、例えば、アクチノマイシン（ダクチノマイシンなど）、アントラサイクリン（ダウノルビシンおよびドキソルビシンなど）；およびブレオマイシン；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、エピポドフィロトキシン（エトポシドおよびテニポシドなど）が挙げられる。
【０１３７】
本発明と併用可能な付加的抗新生物薬としては、代謝拮抗物質型新生物薬、例えば、フルオロウラシル（５−フルオロ−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）ピリミジンジオン、５−フルオロデオキシウリジン（フロクスウリジン）および５−フルオロデオキシウリジンモノホスフェート）、メトトレキサート、シタラビン、メルカプトプリン(mecaptopurine)（ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ（商標））、チオグアニン（ＴＡＢＬＯＩＤ（商標））、およびゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（商標））が挙げられる。
【０１３８】
本発明と併用可能な付加的抗新生物薬としては、カンプトテシン（カンプトテシン、およびトポイソメラーゼＩ阻害剤として利用可能または開発中のカンプトテシン誘導体、例えば、イリノテカン、トポテカン、および７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０−カンプトテシンの種々の光学形態を含む）；イリノテカンＨＣｌ（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（商標））；イリノテカン；およびトポテカンＨＣｌ（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（商標））が挙げられる。
【０１３９】
本発明と併用可能なさらなる抗新生物薬としては、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）およびＭＡＢＴＨＥＲＡ（商標））；オファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（商標））が挙げられ；ｍＴＯＲ阻害剤としては、限定されるものではないが、ラパマイシンおよびラパログ、ＲＡＤ００１またはエベロリムス（アフィニトール）、ＣＣＩ−７７９またはテムシロリムス、ＡＰ２３５７３、ＡＺＤ８０５５、ＷＹＥ−３５４、ＷＹＥ−６００、ＷＹＥ−６８７およびＰｐ１２１；ベキサロテン（タルグレチン（商標））；およびソラフェニブ（ネクサバール（商標））が挙げられる。
【０１４０】
本発明の組合せは、癌治療に有用なホルモンと併用可能である。癌治療に有用なホルモンおよびホルモン類似体としては、限定されるものではないが、副腎皮質ステロイド、例えば、プレドニゾンおよびプレドニゾロン；アミノグルテチミドおよびその他のアロマターゼ阻害剤、例えば、アナストロゾール、レトラゾール(letrazole)、ボラゾール(vorazole)、およびエキセメスタン；プロゲストリン(progestrin)、例えば、酢酸メゲストロール；エストロゲン、アンドロゲン、ならびに抗アンドロゲン作用薬、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロンおよび５α−レダクターゼ（フィナステリドおよびデュタステリドなど）；抗エストロゲン作用薬、例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン(iodoxyfene)、および米国特許第５，６８１，８３５号、同第５，８７７，２１９号、および同第６，２０７，７１６号に記載されているものなどの選択性エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭＳ）；ならびに前立腺癌の治療のために黄体形成ホルモン（ＬＨ）および／または卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を刺激するゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）およびその類似体、例えば、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト(antagagonist)、例えば、酢酸ゴセレリンおよびルプロリド(luprolide)が挙げられる。
【０１４１】
本発明の組合せはさらに、シグナル伝達経路阻害剤、例えば、受容体チロシンキナーゼ、非受容体型チロシンキナーゼ、ＳＨ２／ＳＨ３ドメイン遮断薬、セリン／トレオニンキナーゼ、ホスホチジル(phosphotidyl)イノシトール−３キナーゼ、ミオイノシトールシグナル伝達、およびＲａｓ癌遺伝子、例えば、増殖因子受容体（例えば、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦｒ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦｒ）、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ４、ｒｅｔ、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦｒ）、免疫グロブリン様ドメインおよび上皮細胞増殖因子相同性ドメイン（ＴＩＥ−２）を有するチロシンキナーゼ、インスリン増殖因子−Ｉ（ＩＧＦＩ）受容体、マクロファージコロニー刺激因子（ｃｆｍｓ）、ＢＴＫ、ｃｋｉｔ、ｃｍｅｔ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体、Ｔｒｋ受容体（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、およびＴｒｋＣ）、エフリン（ｅｐｈ）受容体、およびＲＥＴ原癌遺伝子）の阻害剤と併用することができる。例示的なシグナル伝達経路阻害剤として、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ２二重阻害剤であるラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ／Ｔｙｖｅｒｂ（商標））がある。
【０１４２】
増殖因子受容体キナーゼでないチロシンキナーゼは、非受容体型チロシンキナーゼと呼ばれる。本発明において有用な、抗癌薬の標的または潜在的標的となる非受容体型チロシンキナーゼには、ｃＳｒｃ、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｊａｋ、ｃＡｂｌ、ＦＡＫ（接着斑キナーゼ）、ブルトン型チロシンキナーゼ、およびＢｃｒ−Ａｂｌが含まれる。このような非受容体型キナーゼおよび非受容体型チロシンキナーゼ機能を阻害する薬剤は、Sinh, S. and Corey, S.J., (1999) Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research 8 (5): 465-80;およびBolen, J.B., Brugge, J.S., (1997) Annual review of Immunology. 15: 371-404に記載されている。
【０１４３】
ＳＨ２／ＳＨ３ドメイン遮断薬は、種々の酵素またはアダプタータンパク質（ＰＩ３−Ｋ  ｐ８５サブユニット、Ｓｒｃファミリーキナーゼ、アダプター分子（Ｓｈｃ、Ｃｒｋ、Ｎｃｋ、Ｇｒｂ２）およびＲａｓ−ＧＡＰを含む）においてＳＨ２またはＳＨ３ドメイン結合を破壊する薬剤である。抗癌薬の標的としてのＳＨ２／ＳＨ３ドメインは、Smithgall, T.E. (1995), Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 34(3) 125-32で考察されている。
【０１４４】
セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤には、ＭＡＰキナーゼカスケード遮断薬（Ｒａｆキナーゼ（ｒａｆｋ）、マイトジェンまたは細胞外調節キナーゼ（ＭＥＫ）、および細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）の遮断薬；ならびにタンパク質キナーゼＣファミリーメンバー遮断薬、例えば、ＰＫＣ（α、β、γ、ε、μ、λ、ι、ζ）の遮断薬を含む）が含まれる。ＩｋＢキナーゼファミリー（ＩＫＫａ、ＩＫＫｂ）、ＰＫＢファミリーキナーゼ、ａｋｔキナーゼファミリーメンバー、およびＴＧＦβ受容体キナーゼがある。このようなセリン／トレオニンキナーゼおよびその阻害剤は、Yamamoto, T., Taya, S., Kaibuchi, K., (1999), Journal of Biochemistry. 126 (5) 799-803; Brodt, P, Samani, A., and Navab, R. (2000), Biochemical Pharmacology, 60. 1101-1107; Massague, J., Weis-Garcia, F. (1996) Cancer Surveys. 27:41-64; Philip, P.A., and Harris, A.L. (1995), Cancer Treatment and Research. 78: 3-27, Lackey, K. et al Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (10), 2000, 223-226;米国特許第６，２６８，３９１号;およびMartinez-Iacaci, L., et al, Int. J. Cancer (2000), 88(1), 44-52に記載されている。
【０１４５】
ＰＩ３−キナーゼ、ＡＴＭ、ＤＮＡ−ＰＫおよびＫｕの遮断薬を含むホスホチジル(phosphotidyl)イノシトール−３キナーゼファミリーメンバーの阻害剤も本明細書において有用である。このようなキナーゼは、Abraham, R.T. (1996), Current Opinion in Immunology. 8 (3) 412-8; Canman, C.E., Lim, D.S. (1998), Oncogene 17 (25) 3301-3308; Jackson, S.P. (1997), International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29 (7):935-8;およびZhong, H. et al, Cancer res, (2000) 60(6), 1541-1545で考察されている。
【０１４６】
本発明ではまた、ホスホリパーゼＣ遮断薬およびミオイノシトール類似体などのミオイノシトールシグナル伝達阻害剤も有用である。このようなシグナル阻害剤は、Powis, G., and Kozikowski A., (1994) New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy ed., Paul Workman and David Kerr, CRC press 1994, Londonに記載されている。
【０１４７】
シグナル伝達経路阻害剤のもう１つの群がＲａｓ遺伝子の阻害剤である。このような阻害剤としては、ファルネシルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、およびＣＡＡＸプロテアーゼの阻害剤、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムおよび免疫療法が含まれる。このような阻害剤は、野生型の突然変異体ｒａｓを含む細胞においてｒａｓの活性化を遮断し、それにより、抗増殖薬として作用することが示されている。Ｒａｓ癌遺伝子の阻害は、Scharovsky, O.G., Rozados, V.R., Gervasoni, S.I. Matar, P. (2000), Journal of Biomedical Science. 7(4) 292-8; Ashby, M.N. (1998), Current Opinion in Lipidology. 9 (2) 99-102;およびBioChim. Biophys. Acta, (19899) 1423(3):19-30で考察されている。
【０１４８】
前述のように、受容体キナーゼリガンド結合に対する抗体アンタゴニストは、シグナル伝達阻害剤としても働き得る。この群のシグナル伝達経路阻害剤は、受容体チロシンキナーゼの細胞外リガンド結合ドメインに対するヒト化抗体の使用を含む。例えば、Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｃ２２５  ＥＧＦＲ特異的抗体（Green, M.C. et al, Monoclonal Antibody Therapy for Solid Tumors, Cancer Treat. Rev., (2000), 26(4), 269-286参照）；ハーセプチン（商標）ｅｒｂＢ２抗体（Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer:erbB Family Receptor Tyrosine Kinases, Breast cancer Res., 2000, 2(3), 176-183参照）；および２ＣＢ  ＶＥＧＦＲ２特異的抗体（Brekken, R.A. et al, Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by a monoclonal Anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice, Cancer Res. (2000) 60, 5117-5124参照）。
【０１４９】
非受容体型抗血管新生阻害剤を含む抗血管新生薬も有用であり得る。血管内皮増殖因子の効果を阻害するもの（例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ［アバスチン（商標）］）および他の機構によって働く化合物（例えば、リノミド、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤、エンドスタチンおよびアンギオスタチン）などの抗血管新生薬がある。
【０１５０】
免疫療法レジメンに使用される薬剤も、本発明の化合物との組合せに有用であり得る。免疫療法アプローチには、例えば、インターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインでのトランスフェクションのような患者の腫瘍細胞の免疫原性を高めるためのex-vivoおよびin-vivoアプローチ、Ｔ細胞アネルギーを低下させるためのアプローチ、サイトカイントランスフェクト樹状細胞などのトランスフェクト免疫細胞を用いるアプローチ、サイトカイントランスフェクト腫瘍細胞株を用いるアプローチおよび抗イディオタイプ抗体を用いるアプローチが含まれる。
【０１５１】
アポトーシス誘導レジメンに使用される薬剤（例えば、ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド）も本発明の組合せに使用可能である。
【０１５２】
細胞周期シグナル伝達阻害剤には、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ６が含まれ、これらに対する阻害剤は、例えば、Rosania et al, Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(2):215-230に記載されている。
【０１５３】
治療方法
本発明の組合せは治療上有効な量でヒトに投与される。一般に、投与される本発明の薬剤の治療上有効な量は、例えば、被験体の年齢および体重、治療を必要とする厳密な病態、病態の重篤度、処方物の性質、ならびに投与経路を含む多くの因子によって異なる。最終的には、治療上有効な量は担当医の裁量にある。用法に関する指針は、本明細書において、化合物Ａの投与に関して、また、記載されている化合物の組合せに関して示す。
【０１５４】
本明細書において、療法に関する用語「治療」または「治療する」は、特定の病態を緩和すること、病態の症状を排除または軽減すること、病態の進行、浸潤もしくは転移拡散を減速または排除すること、および過去に罹患した被験体の病態の再発を予防するまたは遅延させることを意味する。本発明はさらに、治療を必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）におけるいくつかの病態の治療を目的とした薬剤の製造のための本発明の化合物の使用を提供する。
【０１５５】
本明細書において、用語「有効量」は、例えば研究者または医師が求める、組織、系、動物またはヒトの生物学的応答または医学的応答を誘発する薬物または医薬剤の量を意味する。さらに、用語「治療上有効な量」は、そのような量を受容しなかった対応する被験体に比べて、治療の改善、治癒、予防、または疾患、障害もしくは副作用の改善、または疾患もしくは障害の進行の減速をもたらす任意の量を意味する。この用語はまた、その範囲内に、正常な生理機能を促進するのに効果的な量も含む。
【０１５６】
これらの化合物は、両方の化合物を含む単一の医薬組成物として同時に投与することによって、本発明に従って組み合わせて使用してもよい。あるいは、この組合せは、それぞれ化合物のうちの一方を含む別個の医薬組成物として、例えば、一方の化合物を最初に投与し、他方を次に投与するという逐次様式で別個に投与してもよい。このような逐次投与は、時間的に近接していても（例えば、同時）、時間的に離れていてもよい。さらに、これらの化合物は同じ投与形で投与されるかどうかは問題ではなく、例えば、一方の化合物が局所投与され、他方の化合物が経口投与されてもよい。好適には、両方の化合物は経口投与される。よって、本発明の一実施形態においては、１用量以上の一方の化合物が、１用量以上の他方の化合物と同時にまたは別個に投与される。
【０１５７】
本発明によれば、一方の化合物を負荷用量として投与してもよく、本明細書において、用語「負荷用量」は、例えば、薬物の血中濃度レベルを急速に上昇させるために被験体に投与される、維持用量よりも高い用量の一方または他方の化合物の単回用量または短期計画を意味すると理解される。
【０１５８】
本明細書において、用語「維持用量」は、連続的に投与され（例えば、少なくとも２回）、化合物の血中濃度レベルを治療上有効なレベルまでゆっくり上昇させるか、またはこのような治療上有効なレベルを維持することを意図する用量を意味すると理解される。維持用量は、一般に、１日に１回投与され、維持用量の１日用量は、負荷用量の総１日用量よりも低い。
【０１５９】
好適には、本発明の組合せは、「特定期間」内に投与される。用語「特定期間」およびその派生語は、本明細書において、一方の化合物と他方の化合物の投与の間の時間間隔を意味する。特に断りのない限り、この特定期間は同時投与を含み得る。本発明の両方の化合物が１日に１回投与される場合、この特定期間は１日の間に第１の化合物と第２の化合物が投与されることを意味する。一方または両方の化合物が１日２回以上投与される場合には、特定期間は、特定の日の各化合物の最初の投与に基づいて計算される。特定期間を計算する場合に、特定の日の間の、１回目の後の化合物の投与は総て考慮しない。好適には、化合物が「特定期間」内に投与され、かつ、同時に投与されない場合、それらは両方とも互いに約２４時間以内に投与される。本明細書において、約４５分間隔以内の両方の化合物の投与は同時投与とみなされる。好適には、両方の化合物は、少なくとも１日の特定期間内に投与され、治療が必要とされなくなるまで続けられる。
【０１６０】
あるいは、治療クールの間、これらの化合物は第２の期間内の第１の期間内で、例えば、７日間のうち１〜４日間投与してよく、第２の期間にはいずれか一方の化合物が投与されるか、いずれの化合物も投与されない。
【０１６１】
これらの化合物は逐次投与してもよい。用語「逐次投与」およびその派生語は、本明細書において、一方の化合物が連続２日間以上投与され、その後、他方の化合物が連続２日間以上投与されることを意味する。また、本明細書では、これらの化合物の逐次投与間に設ける休薬日も意図する。本明細書において、休薬日は、一方の化合物の連続投与の後、他方の化合物が投与されるまでの、いずれの化合物も投与されない日数、例えば、１〜１４日間である。
【０１６２】
逐次投与に関して、好適には、一方の化合物が１日〜連続３０日間投与され、その後、任意選択の休薬日の後、他方の化合物が１日〜連続３０日間投与される。
【０１６３】
さらなる定義
本明細書において、用語「薬剤」は、組織、系、動物、哺乳動物、ヒト、またはその他の被験体において所望の効果をもたらす物質を意味すると理解される。従って、用語「抗新生物薬」は、組織、系、動物、哺乳動物、ヒト、またはその他の被験体において抗新生物効果をもたらす物質を意味すると理解される。また、「薬剤」は単一化合物または２種類以上の化合物の組合せもしくは組成物であってよいと理解される。
【０１６４】
一般に、本発明の塩は薬学的に許容可能な塩である。用語「薬学的に許容可能な塩」の範囲内に包含される塩は、本発明の化合物の無毒な塩を意味する。本発明の化合物の塩は、本発明の化合物の置換基上の窒素から誘導される酸付加塩を含み得る。代表的な塩としては、以下の塩：酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストール酸塩、エシル酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート(glycollylarsanilate)、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル、硝酸メチル、硫酸メチル、マレイン酸一カリウム、ムケート(mucate)、ナプシル酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミン、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラトウロン酸塩(polygalacturonate)、カリウム、サリチル酸塩、ナトリウム、ステアリン酸塩、スバセチン酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド、トリメチルアンモニウムおよび吉草酸塩が挙げられる。薬学的に許容可能でない他の塩も本発明の化合物の製造において有用である場合があり、これらも本発明のさらなる態様をなす。塩は当業者により容易に製造され得る。
【０１６５】
療法における使用に関して、本発明に従って使用される化合物は原料化学物質として投与され得る場合もあるが、有効成分を医薬組成物として提供することもできる。よって、本発明はさらに、化合物の１以上の組合せと１以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。担体、希釈剤または賦形剤は、その処方物の他の成分と適合し、医薬製剤とすることができ、そのレシピエントに有害でないという点で許容されるものでなければならない。本発明の別の態様によれば、化合物を１以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と混合することを含む医薬組成物の製造方法も提供される。使用される医薬組成物のこのような要素は、別個の医薬組合せとして提供してもよいし、または１つの医薬組成物として一緒に処方してもよい。よって、本発明はさらに、そのうち１つが化合物Ａ、ＢまたはＣのうちの１つおよび１以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物と、別の化合物Ａ、ＢまたはＣおよび１以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物との組合せによる治療方法またはそのような組合せの使用を提供する。
【０１６６】
医薬組成物は、単位用量当たりに所定量の有効成分を含有する単位投与形で提供してよい。当業者に知られているように、用量当たりの有効成分の量は、治療される病態、投与経路、ならびに患者の年齢、体重および状態によって異なる。好ましい単位投与組成物は、有効成分の１日用量または部分用量、またはその適当な分割用量を含有するものである。さらに、このような医薬組成物は、製薬分野で周知のいずれの方法によって調製してもよい。
【実施例】
【０１６７】
実験
方法
化学薬品および試薬
リン酸化ＡＫＴ(Phospho-AKT)（Ｔ３０８）、リン酸化ＡＫＴ(Phospho-AKT)（Ｓ４７３）、ＡＫＴ、ＥＲＫ、リン酸化Ｓ６Ｐ(Phospho-S6P)（Ｓ２３５／２３６）、Ｓ６Ｐ、サイクリンＤ１(cyclin D1)、リン酸化ＭＥＫ１／２(Phospho-MEK1/2)（Ｓ２１７／Ｓ２２１）、ＭＥＫ１／２、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２および開裂ＰＡＲＰに対する抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入した。ＧＡＰＤＨ、ＲＡＦ−１、ＢＲＡＦおよびＡＲＡＦに対する一次抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。二リン酸化ＥＲＫ１／２(Diphospho-ERK1/2)（Ｔ２０２／Ｙ２０４）に対する抗体はＳｉｇｍａから購入し、ｐ２７ｋｉｐ１に対する抗体はＥｐｉｔｏｍｉｃｓから購入した。抗マウスＩＲＤＹＥ（商標）８００ＣＷ抗体はＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。抗ウサギＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）６８０抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物ＣおよびＰＬＸ４０３２（２０）は、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓで合成されたものであり、それらの構造を図７に示す。
【０１６８】
細胞株
Ａ３７５細胞株（ＡＴＣＣから入手）から、ＢＲＡＦ阻害剤に対する感受性の増大に基づいて、クローン分離株（以下「Ａ３７５  Ｆ１１」と称する）を得た。Ａ３７５  Ｆ１１細胞を漸増濃度の化合物Ａに曝露させ、１．２６μＭまたは１．６μＭの終濃度で維持した。化合物Ａの存在下で増殖するように選択されたこれらのＡ３７５  Ｆ１１細胞の混合集団から単細胞クローンとして１２Ｒ５−３、１２Ｒ８−１、１２Ｒ８−３、１６Ｒ５−５、１６Ｒ６−２、１６Ｒ６−３および１６Ｒ６−４が得られた。総ての細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地で増殖させた。
【０１６９】
ＹＵＳＩＴ１黒色腫細胞はＹａｌｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手した。ＢＲＡＦ阻害剤である化合物Ａに対する感受性の増大に基づいて、合計１３種のＹＵＳＩＴ１  化合物Ａ耐性クローンが得られた。具体的には、ＹＵＳＩＴ１細胞を漸増濃度の化合物Ａに曝露させ、化合物Ａ  ０．１マイクロモル／Ｌの終濃度で維持した。化合物Ａの存在下で増殖することができた集団からの限界希釈により、単細胞クローン、例えば、ＹＵＳＩＴ１−Ｂ５、ＹＵＳＩＴ１−Ｂ１１、ＹＵＳＩＴ１−Ｂ３１クローンが単離された。Ａ３７５  Ｆ１１細胞と同じ培地で細胞を増殖させた。
【０１７０】
ＰＣＲおよび配列解析
Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｍａｘｗｅｌｌ  １６  Ｃｅｌｌ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を使用して、ｇＤＮＡ単離物を調製した。ｇＤＮＡ  ＰＣＲプライマーは総てＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，  Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，  Ｉｏｗａ）に発注した。ＰＣＲプライマーにはＭ１３ユニバーサルシーケンシングプライマー配列を付加した。Ｒｏｃｈｅ社製ＦａｓｔＰＣＲ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＲＯＣＨＥ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）を使用して、ＰＣＲ反応を実施した。９５℃で２０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で４５秒間の３５サイクルと、その後に７２℃で７分の伸長を行って、ＤＮＡを増幅させた。細胞株サンプルに対して使用する前に、総てのｇＤＮＡプライマーをＰｒｏｍｅｇａ社製Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）において試験した（ＱＣ）。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ社製ＡｍＰｕｒｅ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）を使用して、ＰＣＲ産物を精製した。ＡＢ社製ｖ３．１  ＢｉｇＤｙｅ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて、精製されたＰＣＲ産物の直接配列決定を行い、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ社製ＣｌｅａｎＳｅｑ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）を使用して、シーケンシング反応液を精製した。Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３７３０ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を使用して、シーケンシング反応液を解析した。総ての配列結果データを集積し、Ｃｏｄｏｎ  Ｃｏｄｅ  Ａｌｉｇｎｅｒ（ＣｏｄｏｎＣｏｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｄｅｄｈａｍ，  ＭＡ）を使用して解析した。プライマー配列は以下の通りである。
【０１７１】
【表１】
2013543008.tif 000006
【０１７２】
【表２−１】
2013543008.tif 000007
【表２−２】
2013543008.tif 000008
【０１７３】
【表３】
2013543008.tif 000009
【０１７４】
【表４】
2013543008.tif 000010
【０１７５】
各プライマーのテールにはＭ１３ユニバーサルプライマーが付加されている。テール部分は小文字である（シーケンシングのために使用される）。「ｂ」表示のプライマーは、指定のエキソンを増幅させるために使用される代替プライマーである。
【０１７６】
ヒト神経芽腫ＲＡＳウイルス癌遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）ｃＤＮＡのクローニングおよびＦＬＡＧタグ標識
ヒトＮＲＡＳ−ＷＴをＰＣＲ増幅するために使用されるプライマーを、公開されているヒト５’および３’ＵＴＲ配列（ＮＭ＿００２５２４．３）のＵＴＲフランキング領域に基づいて設計した。プライマーＮＲＡＳｆｏｒｎｅｓｔ（５’−ＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＧＧＴＧ  ３’）（配列番号１０７）およびＮＲＡＳｒｅｖＮＥＳＴ（５’−ＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣ−３’）（配列番号１０８）を使用して、全長ＯＲＦを増幅させた。得られたＯＲＦをｐＣＲ  ＢＬＵＮＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）にＴＯＰＯクローニングし、二本鎖配列を確認した。このプラスミドを、ＮＲＡＳ−ＷＴ  ＦＬＡＧタグ標識反応および突然変異誘発反応の鋳型として使用した。プライマーＮＲＡＳｆｌａｇｔａｇ（５’  ｃａｃｃＡＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＧＡ  ａｔｇ  ａｃｔ  ｇａｇｔａｃａａａｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇ−３’）（配列番号１０９）およびＮＲＡＳｒｅｖＮＥＳＴ（５’ＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣ−３’）（配列番号１１０）を使用して、５’ＦＬＡＧタグを組み込んだ。ヒト骨髄ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，  ＣＡ）を鋳型として使用し、総てのＰＣＲ反応でＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ）を使用した。一次反応およびネスト反応は、販売者の使用説明書に従い、次のパラメーターを使用して実施した：ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製ＰＴＣ２００サーモサイクラーにおいて、１ｋｂにつき、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で１５秒間として２９サイクルと、その後、最後に７２℃で１０分の伸長を行った。ＦＬＡＧタグ付加物は５９℃でアニーリングされた。得られたＯＲＦをｐｃＤＮＡ３．１Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＯＰＯクローニングし、二本鎖配列を確認した。
【０１７７】
突然変異誘発  ＮＲＡＳ：Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１ＲおよびＡ１４６Ｔ
ヒトＮＲＡＳの全長ＯＲＦ（ＮＭ＿００２５２４．３）を前記のように調製し、突然変異誘発反応およびＦＬＡＧタグ標識反応で鋳型として使用した。ＰＣＲ増幅にはＰｆｕＵｌｔｒａポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）を使用した。反応は、９５℃で３０秒間、６０℃で６０秒間および７２℃で１４分間の１６サイクルを行い、４℃に保った。突然変異誘発を完了させた後、各反応物にＤｐＮＩ酵素を加え、形質転換の前に３７℃でのインキュベーションを完了させた。クローンを配列決定し、所望の変異を確認した。配列解析に続いて、プラスミド調製物を準備し、５’ＦＬＡＧタグを前記のように組み込んだ。得られたＯＲＦをｐｃＤＮＡ３．１Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＯＰＯクローニングし、二本鎖配列を確認した。
【０１７８】
突然変異誘発プライマー：
【０１７９】
【化５】
2013543008.tif 000011
【０１８０】
ＢａｃＭＡＭプラスミドの構築
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを有するヒトＭＥＫ１のコード領域をＰＣＲ増幅させ、ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した。このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＦＮｃｍｖＮＡベクターにクローニングした（１）。得られたｐＦＮｃｍｖＮＡ−ヒトＭＥＫ１プラスミドに、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｉｎｇ部位特異的突然変異誘発（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって、使用プライマーを用い、以下の位置に変異誘発した。
【０１８１】
【表５】
2013543008.tif 000012
【０１８２】
ＢａｃＭａｍの作製
ＢａｃＭａｍウイルスを、基本的には、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）に基づいた記載の通りに作製した（１）。簡単に述べると、ｐＦＮｃｍｖＮＡ−ヒトＭＥＫ１およびｐＦＮｃｍｖＮＡ−ヒトＭＥＫ２ならびにそれらの変異誘導体をＤＨ１０Ｂａｃ細胞に形質転換した。得られた組換えバクミドＤＮＡを使用して、Ｓｆ９細胞にトランスフェクトした。３〜４日後、ＢａｃＭａｍのＰ０バッチを回収し、それらを使用して、Ｓｆ９細胞を感染させ、Ｐ１バッチのＢａｃＭａｍを作製した。
【０１８３】
ＲＡＳ活性化アッセイ：
ＲＡＳ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、活性型ＲＡＳの量を決定した。簡単に述べると、マグネシウム溶解バッファーに溶解させた１００μｇの総タンパク質を、ＲＡＦ−１−ＲＢＤでコーティングしたグルタチオンプレートに加えた。抗Ｒａｓ抗体を使用した化学発光により、捕捉されたＲＡＳをプレートリーダーで検出した。活性型ＲＡＳを化学発光シグナルとして、タンパク質を添加していない対照の減算後に任意単位（ＡＵ）で記録した。
【０１８４】
クローニングアッセイ：
１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地において６ウェルディッシュ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に１ウェル当たり５Ｋで細胞を播種した。翌日、細胞を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地中の指定の化合物で処理した。１４日のアッセイ期間中に一度、化合物処理液を交換した。１４日後、培地を除去し、０．５％メチレンブルー／５０％エタノール溶液で少なくとも３０分間細胞を染色した。染色液を除去し、蒸留水によりプレートをすすぎ、風乾した。フラットベッドスキャナー（ＨＰ）を使用して、染色した６ウェルプレートの完全画像をＪＰＥＧファイルとして取り込んだ。
【０１８５】
細胞増殖阻害アッセイおよび組合せデータの解析
細胞播種の前に、化合物、例えば、化合物Ａを用いずに、総ての細胞を最低７２時間培養した。細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地の９６ウェル組織培養プレート（ＮＵＮＣ  １３６１０２）において、１ウェル当たり１，０００細胞で全細胞をアッセイした。播種のおよそ２４時間後に、化合物または一定モル比の２種の薬剤の組合せ、例えば、１０：１比の化合物Ａと化合物Ｂ、の１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地による１０の３倍連続希釈液に細胞を曝露した。化合物の存在下で３日間細胞をインキュベートした。製造業者のプロトコールに従ってＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えることによりＡＴＰレベルを決定した。簡単に述べると、各プレートにＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）を加え、３０分間インキュベートし、その後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｌプレートリーダーにおいて０．５秒の積算時間で発光シグナルを読み取った。化合物または化合物組合せでの３日間の処理後、ビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理した細胞とＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）シグナルを比較して、細胞増殖の阻害を評価した。細胞増殖は、ビヒクル（ＤＭＳＯ）処理した対照ウェルとの相対値として計算した。対照の細胞増殖の５０％を阻害する化合物の濃度（ＩＣ５０）は、次式、ｙ＝（Ａ＋（Ｂ−Ａ）／（１＋（Ｃ／ｘ）＾Ｄ））（式中、Ａは最小反応（ｙｍｉｎ）であり、Ｂは最大反応（ｙｍａｘ）であり、Ｃは曲線の変曲点（ＥＣ５０）であり、Ｄはヒル係数である）の非線形回帰を用いて、ｙ＝ビヒクル対照の５０％のときに補間された。
【０１８６】
逆補間された(back-interpolated)ＩＣ５０値と、Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙによって導き出された相互に非排他的な式：ＣＩ＝Ｄａ／ＩＣ５０（ａ）＋Ｄｂ／ＩＣ５０（ｂ）＋（Ｄａ×Ｄｂ）／（ＩＣ５０（ａ）×ＩＣ５０（ｂ））
（式中、ＩＣ５０（ａ）は化合物ＡのＩＣ５０であり；ＩＣ５０（ｂ）は化合物ＢのＩＣ５０であり；Ｄａは、細胞増殖の５０％を阻害した、化合物Ｂと組み合わせた化合物Ａの濃度であり；Ｄｂは、細胞増殖の５０％を阻害した、化合物Ａと組み合わせた化合物Ｂの濃度である）を用いて計算された組合せ指数（ＣＩ）を使用して、効力に対する組合せ効果を評価した。一般に、ＣＩ値＜０．９、０．９〜１．１の間、または＞１．１はそれぞれ、相乗作用、相加作用および拮抗作用を示す。一般に、ＣＩ数が小さくなるほど、相乗作用の強さは高まる。
【０１８７】
反応スケールに対する組合せ効果は、Peterson and Novick(2007)およびPeterson(2010)[[Peterson and Novick, 2007; Peterson, 2010]により詳細に記載されている非線形調合の概念に基づき、Ｅｘｃｅｓｓ  Ｏｖｅｒ  Ｈｉｇｈｅｓｔ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｇｅｎｔ（ＥＯＨＳＡ）により定量した。ＥＯＨＳＡ値は、組み合わせた場合の成分用量レベルでの最良の単剤に比べて、組合せによってもたらされる改善（本明細書では、「パーセンテージポイント」（ｐｐｔ）の差）の増加と定義される。単剤処置および組合せ処理では、一定用量比の化合物に細胞を曝露し、用量反応曲線を実験データに当てはめ、回帰モデルを使用して解析した。用量反応曲線に沿ったＩＣ５０の特定の総用量レベルにおいて、ＥＯＨＳＡの統計的推論を行うために用量組合せ（ＩＣ５０に対応する）を決定した。より具体的には、用量ｄ１の薬物１と用量ｄ２の薬物２を必要とする組合せ薬物実験では、その組合せでの平均応答が、用量ｄ１の薬物１または用量ｄ２の薬物２に対する平均応答よりも優れているならば、（すなわち、総用量＝ｄ１＋ｄ２）は正のＥＯＨＳＡ値を有すると言える。
【０１８８】
Ａ３７５細胞のトランスフェクション
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ａ３７５細胞を指定のＮＲＡＳ構築物でトランスフェクトした。０．１μＭ化合物Ａを用いて安定な単細胞トランスフェクタントを選択し、クローニングシリンダーを用いて単離した。Ｇ４１８を用いて選択する場合、ベクターであるＮＲＡＳ野生型およびＮＲＡＳ変異型プラスミドのＡ３７５へのトランスフェクション後にコロニーが観察された。トランスフェクトされたクローンを、１０％ＦＢＳおよび０．１μＭ化合物Ａを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地で維持し、増殖実験およびウエスタンブロット実験では化合物Ａを用いずに播種した。
【０１８９】
小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を介する、ＮＲＡＳのノックダウン
Ａ３７５にＮＲＡＳを標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルス（ＴＲＣＮ００００３００４４２）またはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）製の非標的化対照（ＳＨＣ００２Ｖ）で形質導入した。ｓｈＲＮＡレンチウイルスが安定に組み込まれた細胞を、ピューロマイシンを用いて選択し、クローニングシリンダーを用いて単細胞クローンを単離した。安定に組み込まれたクローンを、後の実験のためにピューロマイシン中で維持した。
【０１９０】
ｓｉＲＮＡを介するノックダウン
ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＭＡＰ２Ｋ１（Ｄ−００３５７１−０１、Ｄ−００３５７１−０４およびＤ−００３５７１−０５）、ＭＡＰ２Ｋ２（Ｄ−００３５７３−０１およびＤ−００３５７３−０２）のシングルオリゴｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）および非標的化対照（Ｄ−００１２１０−０２およびＤ−００１２１０−０５）の指定細胞へのリバーストランスフェクションを、４８時間おいて２回行った。２回目のトランスフェクションの１日後、増殖およびタンパク質抽出のためにそれらの細胞を播種した。播種の２４時間後にタンパク質を抽出した。タンパク質に対して前記のようにウエスタンブロット解析を行った。７２時間後の相対的細胞増殖をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）により決定した。
【０１９１】
Ａ３７５細胞のＢａｃＭＡＭ形質導入
ＭＥＫ１  ｃＤＮＡを使用してＢａｃＭＡＭ構築物を作製し、部位特異的突然変異誘発法を用いて、ＭＥＫ１に変異誘発した。ＢａｃＭＡＭウイルス粒子は、補足の方法に記載の通りに調製した。Ａ３７５細胞に指定のＢａｃＭＡＭウイルスで形質導入した。形質導入の４８時間後、後の増殖および前記のウエスタンブロット解析のために細胞を播種した。
【０１９２】
化合物Ｂ  ＭＥＫ１モデルの構築
Ｍａｅｓｔｒｏのタンパク質調製ウィザード（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，  ＬＬＣ）を使用したモデル構築のために、結晶構造３ＥＱＧ（２３）を調製した。水素を付加し、二重結合を割り当て、一部の水を削除し、Ｈ結合を割り当て、最後に、ＩｍｐｒｅｆおよびＯＰＬＳ２００５力場を使用して、その構造のエネルギーの最小化を行った。このステップでは重原子収束閾値０．１５オングストロームを使用した。その構造において小分子化合物Ｂをアロステリック阻害剤と手動で大まかに調製し(aligned)、その後、この、他の阻害剤を除去した。ＭａｅｓｔｒｏによるＭａｃｒｏｍｏｄｅｌと、ＯＰＬＳ２００５力場を使用して、タンパク質を固定された状態に保つことにより、化合物Ｂ  Ｍｅｋ１複合体のエネルギーを最小化した。化合物Ｂのアセチル化アニリノ部分は、さらなる精密化(refinement)が必要であると思われ、Ｍａｃｒｏｍｏｄｅｌを使用したコンフォメーション探索を行った。最後に、Ｍａｃｒｏｍｏｄｅｌを使用して、リガンドと、距離が７オングストロームまでの非主鎖原子とのエネルギーの最小化を行った。モデルの目視検査では、化合物ＢのアセチルＮＨと隣接するアルギニンとの間に１つだけ潜在的に疑わしい相互作用が示された。しかしながら、阻害剤のこの部分はフレキシブルなＰループ中にあり、溶媒に露出してもいるので、そのモデルは例示目的にかなっていると判断した。
【０１９３】
ＤＮＡ解析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗｉｄｅ  Ｈｕｍａｎ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ  ６．０チップでのＳＮＰ解析により、化合物Ａに対する耐性を獲得したクローンは、状態による同一性およびＡｒｒａｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（Ｏｍｉｃｓｏｆｔ）における適正な計算による同一性によって判定した場合に９５％を超える類似性を有することから、それらがＡ３７５から誘導されたことが確認された。
【０１９４】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現解析
化合物Ａおよび化合物Ｂ単独、ならびに相互に組み合わせた場合の２４時間の化合物処理後のＡ３７５との比較のために１６Ｒ６−４を選択した。各クローンまたは各クローン処理には、２つまたは３つの独立したサンプルを使用した。ＲＮＡおよびｃＤＮＡを調製し、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，  ＣＡ）で、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２アレイを使用して、スタンダードＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコールに従って、マイクロアレイ解析を行った。ＭＡＳ５によりＲＮＡマイクロアレイシグナルを正規化した。Ａｒｒａｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（Ｏｍｉｃｓｏｆｔ）を使用して、ＱＣおよびデータ解析を行った。ＭＡＤスコア＜−５のサンプルは以降の解析から除外した。ｐ値＜０．０５および＞２倍変化値で一元配置ＡＮＯＶＡを適用することにより、差次的に発現されている遺伝子を同定した。カットオフ判定基準を満たしたが平均強度が１００未満であったプローブセットは除外した。
【０１９５】
結果
Ａ３７５  Ｆ１１黒色腫細胞
Ａ３７５  Ｆ１１細胞を漸増濃度の化合物Ａへ曝露した後、化合物Ａに対する耐性を獲得したＡ３７５  Ｆ１１黒色腫細胞から誘導された１０系統を単離した。ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳおよびＭＡＰ２Ｋ１（ＭＥＫ１）について、ゲノムＤＮＡを配列決定した。表１に示されるように、総てのクローンは、親Ａ３７５  Ｆ１１細胞で認められるＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅのホモ接合変異を保有していた。ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅの他、化合物Ａ耐性黒色腫細胞は、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失（１２Ｒ５−１および１２Ｒ５−５）、ＮＲＡＳ  Ｑ６１ＲもしくはＡ１４６Ｔ（１２Ｒ９、１２Ｒ５−５、１２Ｒ５−３、１２Ｒ８−１）またはＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｋおよび／もしくはＡ１４６ＴとＭＥＫ１  Ｐ３８７Ｓ（１６Ｒ６−３、１５Ｒ５−５、１６Ｒ６−２および１６Ｒ６−４）の両方、の異型接合変異も有している。具体的には、１２Ｒ５−１および１２Ｒ５−５細胞は、ＭＥＫ１においてリジン５９欠失（Ｈｅｔ  ５９ｄｅｌＫ）をもたらす、ＭＡＰ２Ｋ１遺伝子の１７５−１７７ヌクレオチドにおけるＡＡＧの欠失（Ｈｅｔ  １７５−１７７ｄｅｌＡＡＧ）を有し；１２Ｒ５−３、１２Ｒ８−１および１２Ｒ８−３系統は、アミノ酸１４６のアラニンのトレオニンへの変化をもたらすＮＲＡＳ  Ｇ４３６Ａ（Ａ１４６Ｔ）の異型接合変異を有し；１６Ｒ６−３細胞は、ＮＲＡＳ  Ｇ４３６Ａ（Ａ１４６Ｔ）と、アミノ酸３８７のプロリンのセリンへの変化をもたらすＭＡＰ２Ｋ１  Ｃ１１５９Ｔ（Ｐ３８７Ｐ／Ｓ）の両方の異型接合変異を有し；１２Ｒ９系統は、アミノ酸６１のグルタミンのアルギニンへの変化をもたらすＮＲＡＳ  Ａ１８２Ｇ（Ｑ６１Ｒ）の異型接合変異を有し；１６Ｒ５−５および１６Ｒ６−２系統は、アミノ酸６１のグルタミンのリジンへの変化をもたらすＮＲＡＳ  Ｃ１８１Ａ（Ｑ６１Ｋ）と、ＭＡＰ２Ｋ１  Ｃ１１５９／Ｔ（Ｐ３８７Ｓ）の異型接合変異を有し；１６Ｒ６−４細胞は、ＮＲＡＳ  Ｃ１８１Ａ（Ｑ６１Ｋ）、ＮＲＡＳ  Ｇ４３６Ａ（Ａ１４６Ｔ）およびＭＡＰ２Ｋ１  Ｃ１１５９／Ｔ（Ｐ３８７Ｓ）の異型接合変異を有する。配列決定により、これらのクローンは、付加的なＢＲＡＦ変異を導入することなくホモ接合性ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異を保有していることが確認された。加えて、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＡＲＡＦ、ＣＲＡＦまたはＰＴＥＮにおいても突然変異は確認されなかった。総てのクローンは、Ａ３７５親系統由来の、Ｉ２２０の同義ＭＥＫ２多型を保有した。上のデータは、ＭＥＫ１  Ｋ５９欠失、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｋ／Ｒおよび／もしくはＡ１４６Ｔ変異、またはＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｋおよび／もしくはＡ１４６ＴとＭＥＫ１  Ｐ３８７Ｓの両方の変異が、ＢＲＡＦ  Ｖ６００変異型黒色腫における、ＢＲＡＦ阻害剤である化合物Ａに対する耐性と関係していることを示している。
【０１９６】
【表６】
2013543008.tif 000013
【０１９７】
ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異を含む化合物Ａ獲得耐性細胞においてＮＲＡＳ  Ｑ６１および／またはＡ１４６Ｔ変異が検出されたことは、注目すべきであり、予想外であった。さらに、図３にて示されるように、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異とＱ６１Ｋおよび／またはＡ１４６ＴのＮＲＡＳ変異を有する耐性細胞１６Ｒ６−４、１２Ｒ５−３および１２Ｒ８−１は、これらのＮＲＡＳ変異のない黒色腫細胞（Ａ３７５  Ｆ１１細胞）と比較して、ＲＡＳ  ＧＴＰａｓｅ活性が増加していた。ＲＡＳ  ＧＴＰアーゼ活性の増加は、ＮＲＡＳ変異によるものと考えられる。例えば、ＮＲＡＳ  Ｑ６１変異は、Ｒａｓタンパク質をＧＴＰ結合状態に固定し、その下流エフェクターの活性化が後に続くことによりＮＲＡＳ活性を増加させることが報告されている(Taparowsky et al, cell, 34:581-586,1983)。
【０１９８】
化合物Ａに対する耐性を獲得したＡ３７５  Ｆ１１クローンにおいて、細胞増殖阻害に対する化合物Ａ、化合物Ｂまたはそれらの組合せの効果を判定した（表２および図４）。野生型ＮＲＡＳおよびＭＥＫ１を有するＡ３７５  Ｆ１１  ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異細胞は、単剤としての、および、組み合わせた場合の化合物Ａまたは化合物Ｂによる細胞増殖阻害に対して感受性が高かった。これに対して、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異株、ＭＥＫ１  ５９ｄｅｌＫ変異を有する１２Ｒ５−１および１２Ｒ５−５、ＮＲＡＳ  Ａ１４６Ｔ変異を有する１２Ｒ５−３、１２Ｒ８−１および１２Ｒ８−３、ＮＲＡＳ  Ａ１４６ＴおよびＭＥＫ１  Ｐ３８７Ｓの両方を有する１６Ｒ６−３株、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒを有する１２Ｒ９、ＮＲＡＳ  Ｑ６１／ＫおよびＭＥＫ１  Ｐ３８７Ｓを有する１６Ｒ５−５および１６Ｒ６−２、ならびにＮＲＡＳ  Ｑ６１／Ｋ、ＮＲＡＳ  Ａ１４６ＴおよびＭＥＫ１  Ｐ３８７Ｓ変異を有する１６Ｒ６−４は、ＢＲＡＦ阻害剤である化合物Ａに対して耐性であり（ＩＣ５０＞１０μＭ）、ＭＥＫ阻害剤である化合物Ｂに対して感受性の低下を示した。しかしながら、ＮＲＡＳもしくはＭＥＫ１変異のいずれか、またはＮＲＡＳおよびＭＥＫ１変異の両方を有するこれらのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異株は、化合物Ａおよび化合物Ｂの組合せに対して感受性であり、ＩＣ５０は、化合物Ａについては０．１７８〜０．３９２μＭの範囲であり、化合物Ｂについては０．０１８〜０．０３９μＭの範囲であった。１０：１モル比での化合物Ａと化合物Ｂの組合せでは、ＥＯＳＨＡによって示されるように細胞増殖阻害の増強を示した。
【０１９９】
【表７】
2013543008.tif 000014
【０２００】
同様に、表３および図５に示されるように、化合物ＡであるＢＲＡＦ阻害剤に対する耐性と、ＭＥＫ１  ５９ｄｅｌＫ；ＮＲＡＳ  Ａ１４６；またはＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｋおよび／もしくはＡ１４６およびＭＥＫ１  Ｐ３８７の同時突然変異のそれぞれを有するＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異型黒色腫細胞は、化合物ＢのＭＥＫ阻害剤と化合物ＣのＰＩ３Ｋ阻害剤の組合せに対して感受性であった。化合物Ｂと化合物Ｃの組合せではＩＣ５０は０．０１３〜０．０４３μＭの範囲であった。化合物Ｂと化合物Ｃの等モルの組合せでは、示されているような同時突然変異を有する総ての黒色腫細胞において、ＣＩ値は０．２５〜０．６７の間で相乗的であり、かつ／またはＥＯＨＳＡ値≧１０ｐｐｔで細胞増殖阻害を増強した。
【０２０１】
【表８】
2013543008.tif 000015
【０２０２】
細胞増殖アッセイにより、Ａ３７５クローンは化合物Ａに対して耐性である（ＩＣ５０＞１０μｍｏｌ／Ｌ）ことが示された（図７）。さらに、Ａ３７５クローンは、別のＢＲＡＦ阻害剤であるＰＬＸ４０３２に対しても耐性であり（ＩＣ５０＞１０μｍｏｌ／Ｌ、データは示されていない）、ＭＥＫ阻害剤である化合物Ｂに対する感受性については親Ａ３７５細胞に比べて１０分の１以下となった（図８）。
【０２０３】
ＹＵＳＩＴ１クローン
ＹＵＳＩＴ１細胞から誘導された、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ変異を有する複数のクローンを、０．１μｍｏｌ／Ｌの化合物Ａの存在下での増殖能力に基づいて選択した。ＹＵＳＩＴ１クローンは、親ＹＵＳＩＴ１細胞に比べて、化合物Ａに対する感受性が３８分の１以下となったことを示し（ＩＣ５０＞０．５μｍｏｌ／Ｌ）、化合物Ｂに対する感受性が３分の１〜７分の１となったことを示した（ＩＣ５０ｓ、０．００２〜０．００５μｍｏｌ／Ｌ）（図９）。ＹＵＳＩＴ１から誘導された耐性クローンは、Ａ３７５から誘導されたものと同様に、調べた３種のクローンのうち３種においてＮＲＡＳＱ６１Ｋを獲得していた。これらのクローンはＢＲＡＦＶ６００ＫおよびＭＥＫ２Ｅ２７Ｋを保有していた。
【０２０４】
図３４に示されるように、化合物Ａに対する耐性を獲得したＹＵＳＩＴ１クローンは、化合物Ｂに対する感受性の低下を示し、化合物Ｃに対しても同様の感受性を示した。ＹＵＳＩＴ１クローンでは、化合物Ａと化合物Ｂの組合せはやや相乗的からほぼ相加的であり（組合せ指数ＣＩは０．８〜０．９２）、効力は若干増強した（図９）。ＹＵＳＩＴ１クローンでは、化合物Ａと化合物Ｃの組合せは相乗的からほぼ相加的であった。同様に、ＹＵＳＩＴ１耐性クローンでは、化合物Ｂと化合物Ｃの組合せは相乗的〜ほぼ相加的であった。どちらの組合せも最も有効な単剤の効力より若干大きかった。
【０２０５】
化合物Ａで処理した獲得耐性クローンにおけるＭＡＰキナーゼシグナル伝達の向上
４種の代表的なＡ３７５クローンを化合物Ａで処理し、ウエスタンブロットによって、親クローンとの比較によりシグナル伝達の影響について分析した（図１０）。化合物Ａの不在下では、Ａ３７５および耐性クローンの両方が、ＭＥＫ、ＥＲＫおよびＳ６リボゾームタンパク質（Ｓ６Ｐ）の高レベルのリン酸化を示し、低レベルのＴ３０８リン酸化ＡＫＴを示した。ＡＲＡＦ、ＢＲＡＦおよびＣＲＡＦタンパク質レベルは耐性クローンと親細胞との間では類似していた（図７、データは示されていない）。Ａ３７５細胞では、化合物ＡによってＭＥＫ、ＥＲＫおよびＳ６Ｐのリン酸化は７５％を超える強い阻害を受け、サイクリンＤ１タンパク質レベルは６５％を超える減少を示した（図１０）。化合物Ａでの処理を受けた耐性クローンでは、これらの影響は減少した。例えば、ＭＥＫリン酸化は３０〜７０％減少し、一方、ＥＲＫおよびＳ６Ｐリン酸化の減少はそれぞれ、５０％未満、２５％未満であった。親系統とは異なり、化合物Ａ処理を受けたクローンでは、サイクリンＤ１タンパク質レベルは依然として高かった。
【０２０６】
ＮＲＡＳ変異が化合物Ａに対する耐性に介在する
次に、ＮＲＡＳＡ１４６Ｔ（１２Ｒ５−３および１２Ｒ８−１）またはＮＲＡＳＱ６１ＫおよびＮＲＡＳＡ１４６Ｔ（１６Ｒ６−４）を有する３種の代表的なクローンにおいて、観察されたＮＲＡＳ変異についての化合物Ａおよび化合物Ｂ感受性に対する影響を評価した。これらのクローンでは、活性型ＲＡＳレベルは、親の場合に比べて２．５〜７倍増加した（図３、データは示されていない）。１２Ｒ５−３（ＮＲＡＳＡ１４６Ｔ）および１６Ｒ６−４（ＮＲＡＳＱ６１ＫおよびＮＲＡＳＡ１４６Ｔ）の両方において、化合物Ａは、ＢＲＡＦＶ６００Ｅを有するＣＲＡＦの共沈を増加させた（図１１）。１６Ｒ６−４では、ｓｈＲＮＡによるＮＲＡＳの安定した減少により、化合物Ａ（図１２）および化合物Ｂ（図１３）に対する感受性、ならびにＭＥＫおよびＥＲＫのリン酸化を減少させる化合物Ａの能力（図１４）が一部回復した。化合物Ａおよび化合物Ｂに対する感受性の一部回復は、ＮＲＡＳの安定したノックダウンを受けた１２Ｒ５−３および１２Ｒ８−１でも観察された（データは示されていない）。
【０２０７】
ＮＲＡＳＱ６１ＫまたはＮＲＡＳＡ１４６Ｔ変異が化合物Ａに対する耐性を増大させることをさらに確認するために、これらの突然変異とネオマイシン耐性遺伝子をコードするプラスミドをＡ３７５細胞にトランスフェクトした。Ｇ４１８を用いた選択では、変異ＮＲＡＳを発現しないクローンが作出された（データは示されていない）。しかしながら、低用量の化合物Ａ（０．１μＭ）を用いた選択による場合には、変異ＮＲＡＳを発現するクローンが得られた。化合物Ａを用いて選択した場合、モック(Mock)または野生型ＮＲＡＳトランスフェクションではコロニーを形成することができなかった。変異ＮＲＡＳを発現するクローンは、化合物Ａ（図１５）および化合物Ｂ（図１６）による細胞増殖阻害に対して非感受性であり、化合物Ａ処理後のＭＥＫ、ＥＲＫおよびＳ６Ｐリン酸化ならびにサイクリンＤ１タンパク質の減少もなかった（図１７）。
【０２０８】
ＭＥＫ変異が化合物Ａに対する耐性を付与する
次に、化合物Ａ耐性クローンに見られるＫ５９ｄｅｌおよびＰ３８７Ｓ  ＭＥＫ変異がＭＥＫを活性化し、化合物Ａおよび化合物Ｂに対する耐性を増大し得るかどうかを検討した。Ｋ５９は、ＭＥＫのコアキナーゼドメインの前の負の調節ヘリックスに隣接して存在する。ヘリックスＡはＭＥＫ１の不活性型コンフォメーションを安定化させるという仮説がある。このコンフォメーションは、図１８に示す化合物Ｂのようなアロステリック阻害剤と結合するコンフォメーションと同じであるかまたは類似している。ＭＥＫ１Ｑ５６Ｐなどの、この調節ヘリックスにおける突然変異は、非リン酸化ＭＥＫ１を活性化し、ＢＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤に対する感受性を低下させることが示されている(Emery CM et al., Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106:20411-6)。Ｐ３８７は、ＭＥＫ１の負の調節に関与するＴ３８６に隣接して、特定の立体構造を持たないＭＥＫ１のＣ末端に存在する(Fischmann TO, et al. Biochemistry, 2009, 48: 2661-74)。
【０２０９】
図１９、図３２、ならびに図２０、図３５および図３６に示されるように、Ａ３７５細胞においてＭＥＫ１Ｋ５９ｄｅｌ、ＭＥＫ１Ｑ５６Ｐ、ＭＥＫ１Ｃ１２１Ｓ、ＭＥＫ１Ｐ１２４ＬおよびＭＥＫ１Ｆ１２９Ｌが発現されたことにより、増殖を阻害する化合物Ａの能力は、モックおよび野生型ＭＥＫ１（ＩＣ５０＝０．０３０μＭおよび０．０２８μＭ）と比べて低下した（それぞれ、ＩＣ５０＝０．１７９μＭ、≧０．４２０μＭ、≧０．３３０μＭ、０．０８４μＭおよび０．１４０μＭ）。ＭＥＫ１Ｋ５９ｄｅｌ、ＭＥＫ１Ｑ５６Ｐ、ＭＥＫ１Ｃ１２１Ｓ、ＭＥＫ１Ｐ１２４ＬおよびＭＥＫ１Ｆ１２９Ｌの発現により、化合物Ｂに対する感受性は低下した（図２０）。増殖データと一致して、化合物Ａでの処理後にＥＲＫリン酸化が維持されたのはＭＥＫ１Ｑ５６ＰおよびＭＥＫ１Ｋ５９ｄｅｌだけであった（図２１）。同様に、ＭＥＫ１Ｑ５６ＰおよびＭＥＫ１Ｋ５９ｄｅｌを発現する細胞では、ｐ２７ｋｉｐ１の誘導はなかった。Ｓ６Ｐリン酸化の阻害の欠如はＭＥＫ１Ｑ５６Ｐにおいて最も顕著であったが、ＭＥＫ１Ｋ５９ｄｅｌではなお認められた。ＭＥＫ１Ｑ５６ＰおよびＭＥＫ１Ｋ５９ｄｅｌの両方が、ＥＲＫの基底リン酸化の増加を示した。
【０２１０】
本発明者らのＡ３７５クローンにおける化合物Ａ耐性に寄与するＭＥＫ変異を確認するために、１２Ｒ５−１および１２Ｒ５−５において、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＭＥＫ１をノックダウンさせた。化合物の不在下で、１２Ｒ５−１では細胞増殖が７５％を超える減少、１２Ｒ５−５では６０％を超える減少を示し、これらのクローンはＭＥＫ１ダウンレギュレーションに対して感受性が強く、ＭＥＫ１依存を示した（図２２、図２３）。ＭＥＫ２ノックダウンによる増殖への影響はなかった。
【０２１１】
化合物Ａ獲得耐性黒色腫細胞は化合物Ａおよび化合物Ｂの組合せに対して感受性である
耐性クローンでは化合物Ａを受けてＥＲＫリン酸化が維持されることが示されたため、ＢＲＡＦおよびＭＥＫの複合阻害によってこの耐性を克服することができるかどうかを検証した。化合物Ａおよび化合物Ｂの一定モル比１０：１での組合せでは、ＮＲＡＳまたはＭＥＫ１変異とは関係なく、総ての獲得耐性クローンにおいて増殖阻害が増強された（図８）。化合物Ａの単剤活性がないことから組合せ指数を計算することはできなかったが、ｅｘｃｅｓｓ  ｏｖｅｒ  ｈｉｇｈｅｓｔ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｇｅｎｔ（ＥＯＳＨＡ）によって、化合物Ｂ単独と比べた場合に、ＩＣ５０において細胞増殖阻害の１９〜５０％増強という利益が示された（図８および図２４）。化合物Ａおよび化合物Ｂの組合せでの同様の利益が、ＮＲＡＳＱ６１ＫおよびＮＲＡＳＡ１４６Ｔを安定に発現し（図２５）、またはＭＥＫ１Ｋ５９ｄｅｌおよびＭＥＫ１Ｑ５６Ｐで形質導入し、またはＭＥＫ１Ｋ５９ｄｅｌ、ＭＥＫ１Ｑ５６Ｐ、ＭＥＫ１Ｃ１２１Ｓ、ＭＥＫ１Ｐ１２４ＬおよびＭＥＫ１Ｆ１２９Ｌで形質導入した（図２６、図３２）Ａ３７５細胞においても認められた。
【０２１２】
獲得したＮＲＡＳ変異を有する総てのクローンでは、１マイクロモルの化合物Ａによって化合物Ｂに対する感受性がほぼ回復した（図２７）。しかしながら、クローン１６Ｒ６−４（ＮＲＡＳＱ６１ＫおよびＮＲＡＳＡ１４６Ｔ）および１２Ｒ５−５（ＭＥＫ１Ｋ５９ｄｅｌ）では、同様の投与で、化合物Ｂに対する感受性の一部しか回復しなかった。獲得耐性クローンを用いた拡大増殖アッセイでは、１μＭ化合物Ａと０．０１μＭ化合物Ｂとの組合せによって、ＮＲＡＳ変異株クローンにおいて細胞増殖の＞９０％が阻害された（図２８）。ＮＲＡＳ変異株クローンにおける増殖阻害はＭＥＫ１Ｋ５９ｄｅｌクローンの場合においてより顕著であり、ＭＥＫ１Ｋ５９ｄｅｌクローンで同様の効果を観察するにはより高い濃度の化合物Ｂが必要であった。
【０２１３】
化合物Ａと化合物Ｂの組合せをさらに特徴付けるために、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路に対するこの組合せの影響を調べた。図２９に示されるように、単剤の化合物Ａまたは化合物Ｂは、Ａ３７５においてＥＲＫおよびＳ６Ｐリン酸化を効果的に減少させた。これらの阻害剤は、サイクリンＤ１を減少させ、ｐ２７ｋｉｐ１を増加させるのに十分なものであった。組み合わせた場合、ＥＲＫおよびＳ６Ｐリン酸化はさらに減少したが、一方、サイクリンＤ１またはｐ２７ｋｉｐ１タンパク質レベルは向上をほとんど示さなかった。獲得耐性クローンの代表的なサブセットにおいて、化合物Ａ単独では、ＥＲＫまたはＳ６Ｐリン酸化、あるいはサイクリンＤ１およびｐ２７ｋｉｐ１タンパク質レベルに対してほとんど影響はなかった。化合物Ｂ単独では、ＥＲＫのリン酸化が減少した。組み合わせた場合、ＮＲＡＳ変異株クローンにおけるＥＲＫリン酸化レベルは、化合物Ａで処置したＡ３７５で観察されるレベルまで減少した。ＭＥＫ１Ｋ５９ｄｅｌクローンでは、この組合せ処理によるＥＲＫリン酸化に対する影響は減少した。加えて、クローンへの組合せ投与によって、サイクリンＤ１は減少し、ｐ２７ｋｉｐ１は増加したが、化合物Ａで処理したＡ３７５と同じ程度までではなかった。組合せ処理したクローンでは種々の程度でＳ６Ｐリン酸化の減少が観察された。Ａ３７５および耐性クローンの両方において、ＡＫＴリン酸化はわずかに減少したかまたは変化しなかった。
【０２１４】
化合物Ａと化合物Ｂの組合せによって、化合物Ａに対する耐性を獲得したクローンのシグナル伝達および増殖が減少したことから、１６Ｒ６−４クローン（ＮＲＡＳＱ６１ＫおよびＮＲＡＳＡ１４６Ｔ、ＭＥＫ１Ｐ３８７Ｓ）におけるこの組合せの全体的な遺伝子調節効果を評価した。１６Ｒ６−４細胞において認められた耐性と一致して、化合物Ａ処理によって、代謝（ＰＨＧＤＨ、ＰＣＫ２、ＡＳＮＳ）および小分子輸送（ＳＬＣ１Ａ４、ＣＨＡＣ１）に関連しているごく少数の遺伝子が改変された。化合物Ａに化合物Ｂを加えることで、遺伝子発現は、この組合せで処理したＡ３７５細胞において見られた変化と実質的に共通するように改変された（図９、データは示されていない）。上記のマイクロアレイ解析を使用して判定した場合、耐性クローンではその組合せによって、細胞増殖および生存に関連する遺伝子（例えば、ＣＣＮＤ１、ＣＤＣ２５Ａ、ＰＣＮＡ、ＭＹＣ、ＭＣＬ１）が、親細胞の化合物Ａまたは化合物Ｂ処理と同様にダウンレギュレートされた（データは示されていない）。アポトーシスと関係がある転写物（例えば、ＢＩＫ、ＣＡＳＰ１、ＣＡＲＤ６）は、その組合せで処理した耐性クローンにおいてアップレギュレートされたが、いずれかの単剤で処理した親細胞の場合と同じ程度までではなかった。１６Ｒ６−４およびＡ３７５の両方においてその組合せにより、ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達に依存する転写物（例えば、ＤＵＳＰ４，ＤＵＳＰ５、ＤＵＳＰ７、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＦＯＸＣ２、ＳＰＲＹ２）および代替経路に関連するアップレギュレートされた転写（例えば、ＲＡＢ２６、ＲＨＯＢ、ＳＮＡＩ２）は減少した。これらのデータは、化合物Ａと化合物Ｂの組合せが、親におけるＲＡＦまたはＭＥＫ阻害と関連する遺伝子発現をほぼ回復させ、顕著な細胞増殖阻害をもたらすことを示している。ＭＡＰＫ経路およびＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路の両方を阻害することによって、化合物Ａに対する耐性を獲得したクローンにおける細胞増殖阻害は増強される。
【０２１５】
化合物Ａと化合物Ｂの組合せは、耐性クローンの増殖を著しく阻害したが、残るＳ６Ｐリン酸化はそれらのクローンにおいて存続した。Ｓ６Ｐリン酸化はＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路の活性化によって誘導され得るため、化合物Ａまたは化合物Ｂと化合物Ｃとの組合せ。化合物Ｃに対して低い感受性を示した総てのクローンを評価した（図８）。代表的な耐性クローンの化合物Ｃ処理では、ＡＫＴリン酸化は減少し、Ｓ６Ｐリン酸化はわずかに減少した（図３０）。化合物Ａまたは化合物Ｂと化合物Ｃとを合わせることにより、Ｓ６Ｐリン酸化およびサイクリンＤ１タンパク質はさらに減少した。ＭＥＫおよびＥＲＫのリン酸化は、化合物Ａまたは化合物Ｂ単独での処理の場合と類似していた。１６Ｒ６−４などの一部のクローンでは、化合物Ｃと化合物Ａまたは化合物Ｂとの組合せによってアポトーシスの指標であるＰＡＲＰの断片化が増加した。１２Ｒ５−１などの他のクローンは高い基礎レベルのＰＡＲＰ断片化を示した。化合物Ａと化合物Ｃとを合わせることにより、ＮＲＡＳ変異を有するクローン７種のうち５種と、２種のＭＥＫ１Ｋ５９ｄｅｌクローンにおいて細胞増殖阻害が増強された（ＥＯＳＨＡ＞１０ｐｐｔ）（図８）。化合物Ｂと化合物Ｃの組合せは、クローン９種のうち８種において相乗的であり（ＣＩ＜０．８）、９種総てのクローンにおいて、ＮＲＡＳまたはＭＥＫ１変異状態に関係なく、細胞増殖阻害を増強した（ＥＯＳＨＡ＞２０ｐｐｔ）（図８）。長期増殖アッセイにより、化合物Ａまたは化合物Ｂと化合物Ｃとの組合せによる増殖阻害の増強を確認した（図３１）。一般に、耐性クローンは、使用した濃度で化合物Ｃと化合物Ｂを組み合わせた場合、細胞増殖阻害に対する感受性はより高かった。しかしながら、１μｍｏｌ／Ｌの化合物Ａと０．０３μｍｏｌ／Ｌの化合物Ｃの場合ではかなりの活性が認められた。化合物Ａを化合物Ｃと組み合わせた場合の増殖抑制効果は、化合物Ａと化合物Ｂの組合せ、ならびに化合物Ｂと化合物Ｃの組合せの場合に認められるほど強力ではなかった。これらの組合せについては、ＮＲＡＳ変異を有するＹＵＳＩＴ１クローンにおいても同様の利益が認められた（図９）。
【図１】
2013543008.tif 000020
【図２】
2013543008.tif 000021
【図３】
2013543008.tif 000022
【図４】
2013543008.tif 000023
【図５】
2013543008.tif 000024
【図６】
2013543008.tif 000025
【図７】
2013543008.tif 000026
【図８】
2013543008.tif 000027
【図９】
2013543008.tif 000028
【図１０】
2013543008.tif 000029
【図１１】
2013543008.tif 000030
【図１２】
2013543008.tif 000031
【図１３】
2013543008.tif 000032
【図１４】
2013543008.tif 000033
【図１５】
2013543008.tif 000034
【図１６】
2013543008.tif 000035
【図１７】
2013543008.tif 000036
【図１８】
2013543008.tif 000037
【図１９】
2013543008.tif 000038
【図２０】
2013543008.tif 000039
【図２１】
2013543008.tif 000040
【図２２】
2013543008.tif 000041
【図２３】
2013543008.tif 000042
【図２４】
2013543008.tif 000043
【図２５】
2013543008.tif 000044
【図２６】
2013543008.tif 000045
【図２７】
2013543008.tif 000046
【図２８】
2013543008.tif 000047
【図２９】
2013543008.tif 000048
【図３０】
2013543008.tif 000049
【図３１】
2013543008.tif 000050
【図３２】
2013543008.tif 000051
【図３３】
2013543008.tif 000052
【図３４】
2013543008.tif 000053
【図３５】
2013543008.tif 000054
【配列表】
2013543008000001.app
【国際調査報告】
2013543008.tif 000055
2013543008.tif 000056