(57)【要約】  機能性ペプチド中の生物活性配列としてのアミノ酸配列Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｈＲＧＤ）の使用。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着、細胞増殖及び／又は細胞分化を促進するための、機能性ペプチド中の生物活性配列としてのアミノ酸配列Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｈＲＧＤ）の使用。
【請求項２】
前記機能性ペプチド部分が、ＧｈＲＧＤ、ＹｈＲＧＤ、ＹＧｈＲＧＤ、ＧＧＧＧｈＲＧＤ、βＡｌａ−ｈＲＧＤ、ＧＡＢＡ−ｈＲＧＤ、６−アミノバレリックアミド−ｈＲＧＤ、ｈＲＧＤＳ、ｈＲＧＤＹ、ｈＲＧＤＦ、ｈＲＧＤＫ、ｈＲＧＤＶ、ｈＲＧＤＴ、ｈＲＧＤＷＰ、ｈＲＧＤＦＫ、ｈＲＧＤＹＫ、ｈＲＧＤＳＰ、ｈＲＧＤＳＰＫ、ｈＲＧＤＳＹ、ｈＲＧＤＮＰ、ｈＲＧＤＴＰ、ｈＲＧＤＳＰ、ＧｈＲＧＤＳ、ＧｈＲＧＤＹ、ＧｈＲＧＤＦ、ＧｈＲＧＤＳＹ、ＧｈＲＧＤＳＰ、ＧｈＲＧＤＳＰＫ、ＹｈＲＧＤＳ、ＧｈＲＧＤＴＰ、ＧｈＲＧＤＳＰＫ、ＧｈＲＧＤＳＰ、ＧｈＲＧＤＫ、ＧＧＧＧｈＲＧＤＳ、ＧｈＲＧＤＮＰ及びそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの配列、特にｈＲＧＤＳ、ＧｈＲＧＤＳ、ＧｈＲＧＤＳＹ、βＡｌａ−ｈＲＧＤ、ＧＡＢＡ−ｈＲＧＤ、６−アミノバレリックアミド−ｈＲＧＤ及びｈＲＧＤＷＰ、より具体的にはβＡｌａ−ｈＲＧＤ、ＧＡＢＡ−ｈＲＧＤ、６−アミノバレリックアミド−ｈＲＧＤ及びｈＲＧＤＷＰ、もっとも具体的にはｈＲＧＤＷＰを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記機能性ペプチド部分が自己集合性ペプチド部分に共有結合している、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記自己集合性ペプチド部分が、βシート、コイルドコイルαらせん構造又はペプチド三重らせん構造に自己集合することができる、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記機能性ペプチド部分が、ポリマー、特に生体適合性ポリマー、より具体的には熱応答性ポリマーに共有結合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記機能性ペプチド部分が、チオエーテル、アミノ、アミド、エステル及びエーテル結合からなる群から選択される結合を介して前記ポリマーに結合している、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
ハイドロゲル、好ましくは細胞培養のためのハイドロゲルの調製における、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｈＲＧＤ）配列を含むハイドロゲル。
【請求項１０】
前記ｈＲＧＤ配列がハイドロゲル足場の一部である、請求項９に記載のハイドロゲル。
【請求項１１】
前記ｈＲＧＤ配列が細胞接着、細胞増殖及び／又は細胞分化を促進する、請求項９又は１０に記載のハイドロゲル。
【請求項１２】
自己集合性ペプチド部分及び／又はポリマー、特に自己集合性ペプチド部分及び／又は生体適合性ポリマー、より具体的には自己集合性ペプチド部分及び／又は熱応答性ポリマーをさらに含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１３】
前記ｈＲＧＤ配列が、場合によっては結合又はさらなるペプチド配列を介して前記ペプチド部分又はポリマーの少なくとも１つに共有結合している、請求項１２に記載のハイドロゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、いずれも２０１０年１０月８日に出願された欧州特許出願第１０１８７０７０．７号及び第１０１８７０６９．９号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、生物活性アミノ酸配列ならびに、特に細胞接着、細胞増殖及び／又は細胞分化を促進するための、機能性ペプチド中のその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物活性又は生物学的に活性なペプチド（又はアミノ酸）配列は当技術分野において公知である。生物活性配列は、ＥＣＭ成分、細胞接着分子、細胞表面受容体、成長因子、サイトカイン、ケモカインなどをはじめとする多様な範囲の天然のタンパク質及びペプチドのいずれに由来することもできる。たとえば、−ＲＧＤ−配列は、フィブロネクチン中に見られるプロトタイプ細胞認識配列であり、インテグリンによって認識され、細胞付着を媒介することがよく知られている。インテグリン媒介細胞付着は、細胞の移動、成長、分化及びアポートシスに影響し、それらを調節する。
【０００４】
−ＲＧＤ−のような、細胞接着、細胞増殖及び／又は細胞分化を促進する生物活性アミノ酸配列の利用可能性にもかかわらず、特に薬物送達又は細胞及び組織培養の分野において、特定の細胞タイプを考慮して、又は特定の条件において、改善された性質を示す新たな配列が絶えず求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の目的は、細胞接着、細胞増殖及び／又は細胞分化を促進するのに特に有利な性質を有する生物活性アミノ酸配列を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、細胞接着、細胞増殖及び／又は細胞分化を促進するための、機能性ペプチド中の生物活性配列としてのアミノ酸配列Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｈＲＧＤ）の使用に関する。
【０００７】
本発明者らは、実に驚くべきことに、このアミノ酸配列が主に改善された細胞接着及び細胞増殖を示すということを見いだした。特に、本アミノ酸配列は、特に酵素的分解に対するより強い抵抗力により、より長い半減期を示す。本アミノ酸配列はまた、特定の細胞系統に対してより高い親和力を示す。
【０００８】
「生物活性配列」又は「生物学的に活性な配列」とは、特定の生物学的機能、ここでは細胞接着（もしくは細胞付着）、細胞増殖及び／又は細胞分化（もしくは細胞表現型の誘発）の促進を有するアミノ酸配列をいう。例示的な細胞分化は、多能性又は全能性細胞、たとえば幹細胞から専用の細胞タイプ、たとえば骨細胞、筋細胞、インスリン分泌細胞などへの転換である。
【０００９】
本明細書において使用される語「アミノ酸」（Ｘａａ）とは、少なくとも１つのＮＲ1Ｒ2基、好ましくはＮＨ2基及び少なくとも１つのカルボキシル基を含む任意の化合物をいう。本発明のアミノ酸は、天然のアミノ酸又は非天然のアミノ酸、天然由来又は合成であることができる。天然のアミノ酸は、グリシンを除き、キラルな炭素原子を含有する。別段指示されない限り、Ｌ配置の天然アミノ酸を含有する化合物が好ましい。アミノ酸は、たとえばβアラニン（βＡｌａ）、γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、５−アミノ吉草酸、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、フェニルグリシン、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、ホモアルギニン（Ｈａｒ又はｈＲ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ノルバリン、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、イソセリン、ホモセリン（Ｈｓｅ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、アロトレオニン、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、エチオニン、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、シスチン、フェニルアラニン、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、シトルリン、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）及び４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ又はＯ）から選択することができる。
【００１０】
本明細書において使用される語「ペプチド」はペプチド及びペプチド類似物を含む。ペプチド類似物は天然のアミノ酸及び非天然のアミノ酸を含む。ペプチド類似物はまた、グリコシル化のような修飾を含むこともできる。すべてのアミノ酸はＬ又はＤ異性体であることができる。ペプチド又はペプチド類似物はまた、天然由来のアミノ酸と同様に機能するアミノ酸模倣体を含むこともできる。ペプチドはまた、修飾されたＲ基又は修飾されたペプチド主鎖を有するアミノ酸類似物から形成されることもできる。ペプチド類似物は通常、アミド結合とは異なる少なくとも１つの結合、たとえばウレタン、尿素、エステル又はチオエステル結合をペプチド配列中に含む。本発明のペプチド又はペプチド類似物は、直鎖状、環式又は分岐鎖状であることができ、好ましくは直鎖状である。
【００１１】
「機能性ペプチド部分」とは、生物活性配列を含むペプチド部分、したがって、生物学的活性を示すペプチド部分をいう。
【００１２】
本発明において、アミノ酸配列Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｈＲＧＤ）は、そのものが、細胞接着、細胞増殖及び／又は細胞分化を促進する、機能性ペプチド部分の生物活性配列に相当することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】１、３及び７日後の、オクタペプチド、ｈＲＧＤ及びＲＧＤ修飾オクタペプチドに基づくハイドロゲルの光学顕微鏡写真である。
【図２】１、３及び１１日後の、オクタペプチド、ｈＲＧＤ及びＲＧＤ修飾オクタペプチドに基づくハイドロゲルの蛍光光学顕微鏡写真である。
【図３】１日後の、オクタペプチド、ｈＲＧＤ及びＲＧＤ修飾オクタペプチドに基づくハイドロゲルの光学顕微鏡写真である。
【図４】１及び３日後の、オクタペプチド、ｈＲＧＤ及びＲＧＤ修飾オクタペプチドに基づくハイドロゲルの蛍光光学顕微鏡写真である。
【図５】オクタペプチド、ＲＧＤ及びｈＲＧＤ修飾オクタペプチドに基づくハイドロゲル中、０、１、２、３、５、７、１０及び１４日後の細胞数である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
特定の実施形態において、アミノ酸配列Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｈＲＧＤ）はまた、細胞接着、細胞増殖及び／又は細胞分化を促進する、機能性ペプチド部分のより長い生物活性配列の一部であることもできる。
【００１５】
この特定の実施形態の第１の態様において、ｈＲＧＤ配列は、そのＮ末端（ＮＨ2）に共有結合したさらなるアミノ酸を含んでもよい。生物活性配列は、たとえば、（Ｘａａ）n−ｈＲＧＤ配列（式中、Ｘａａは、任意の天然又は非天然のアミノ酸であり、ｎは１〜１０である）から選択されてもよい。ｎ個のＸａａアミノ酸は同じであってもよいし異なってもよい。そのような配列の好適な例は、ＧｈＲＧＤ、ＹｈＲＧＤ、ＹＧｈＲＧＤ、ＧＧＧＧｈＲＧＤ、βＡｌａ−ｈＲＧＤ、ＧＡＢＡ−ｈＲＧＤ及び６−アミノバレリックアミド（aminovalericamide）−ｈＲＧＤである。
【００１６】
この特定の実施形態の第２の態様において、ｈＲＧＤ配列は、そのＣ末端（ＣＯＯＨ）に共有結合したさらなるアミノ酸を含んでもよい。生物活性配列は、たとえば、ｈＲＧＤ−（Ｘａａ）m配列（式中、Ｘａａは、任意の天然又は非天然のアミノ酸であり、ｍは１〜１０である）から選択されてもよい。ｍ個のＸａａアミノ酸は同じであってもよいし異なってもよい。そのような配列の好適な例は、ｈＲＧＤＳ、ｈＲＧＤＹ、ｈＲＧＤＦ、ｈＲＧＤＫ、ｈＲＧＤＶ、ｈＲＧＤＴ  ｈＲＧＤＷＰ、ｈＲＧＤＹＫ、ｈＲＧＤＦＫ、ｈＲＧＤＳＰ、ｈＲＧＤＳＰＫ、ｈＲＧＤＳＹ、ｈＲＧＤＮＰ、ｈＲＧＤＴＰ及びｈＲＧＤＳＰ、特にｈＲＧＤＷＰである。
【００１７】
この特定の実施形態の第３の態様においては、上記第１及び第２の態様を組み合わせてもよく、ｈＲＧＤ配列は、そのＮ及びＣ末端両方に共有結合したさらなるアミノ酸を含み、すなわち（Ｘａａ）n−ｈＲＧＤ−（Ｘａａ）m（式中、Ｘａａは、任意の天然又は非天然のアミノ酸であり、ｎは１〜１０であり、ｍは１〜１０である）である。そのような配列は、たとえば、ＧｈＲＧＤＳ、ＧｈＲＧＤＹ、ＧｈＲＧＤＦ、ＹＧｈＲＧＤ、ＧｈＲＧＤＳＹ、ＧｈＲＧＤＳＰ、ＧｈＲＧＤＳＰＫ、ＹｈＲＧＤＳ、ＧｈＲＧＤＴＰ、ＧｈＲＧＤＳＰＫ、ＧｈＲＧＤＳＰ、ＧｈＲＧＤＫ、ＧＧＧＧｈＲＧＤＳ、ＧｈＲＧＤＮＰ及びそれらの組み合わせ、特にＧｈＲＧＤＳ、ＧｈＲＧＤＳＹからなる群から選択されてもよい。
【００１８】
したがって、本発明はまた、細胞接着、細胞増殖及び／又は細胞分化を促進するための、機能性ペプチド中の、ＧｈＲＧＤ、ＹｈＲＧＤ、ＹＧｈＲＧＤ、ＧＧＧＧｈＲＧＤ、βＡｌａ−ｈＲＧＤ及びＧＡＢＡ−ｈＲＧＤ、６−アミノバレリックアミド−ｈＲＧＤ、ｈＲＧＤＳ、ｈＲＧＤＹ、ｈＲＧＤＦ、ｈＲＧＤＫ、ｈＲＧＤＶ、ｈＲＧＤＴ、ｈＲＧＤＷＰ、ｈＲＧＤＦＫ、ｈＲＧＤＹＫ、ｈＲＧＤＳＰ、ｈＲＧＤＳＰＫ、ｈＲＧＤＳＹ、ｈＲＧＤＮＰ、ｈＲＧＤＴＰ及びｈＲＧＤＳＰ、ＧｈＲＧＤＳ、ＧｈＲＧＤＹ、ＧｈＲＧＤＦ、ＧｈＲＧＤＳＹ、ＧｈＲＧＤＳＰ、ＧｈＲＧＤＳＰＫ、ＹｈＲＧＤＳ、ＧｈＲＧＤＴＰ、ＧｈＲＧＤＳＰＫ、ＧｈＲＧＤＳＰ、ＧｈＲＧＤＫ、ＧＧＧＧｈＲＧＤＳ、ＧｈＲＧＤＮＰ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される生物活性配列、特にｈＲＧＤＳ、ＧｈＲＧＤＳ、ＧｈＲＧＤＳＹ、βＡｌａ−ｈＲＧＤ、ＧＡＢＡ−ｈＲＧＤ、６−アミノバレリックアミド−ｈＲＧＤ及びｈＲＧＤＷＰ、より具体的にはβＡｌａ−ｈＲＧＤ、ＧＡＢＡ−ｈＲＧＤ、６−アミノバレリックアミド−ｈＲＧＤ及びｈＲＧＤＷＰ、もっとも好ましくはｈＲＧＤＷＰの使用に関する。
【００１９】
さらなる特定の実施形態において、場合によってはさらなるアミノ酸をそのＮ及び／又はＣ末端に含むｈＲＧＤ配列はまた、そのＮ末端においてメルカプトプロピオン酸（Ｍｐｒ）に結合していることもできる。そのようは配列は、Ｍｐｒ−（Ｘａａ）n−ｈＲＧＤ−（Ｘａａ）m（式中、Ｘａａは、互いに独立して選択される任意の天然又は非天然のアミノ酸であり、ｎは０〜１０であり、ｍは０〜１０である）と読むことができる。なおさらなる実施形態において、２つのメルカプトプロピオン酸部分が、特にジ硫黄結合を介して共有結合していてもよい。そのようは配列は一般に、（Ｘａａ）m−ＤＧｈＲ−（Ｘａａ）n−Ｍｐｒ−Ｍｐｒ−（Ｘａａ）n'−ｈＲＧＤ−（Ｘａａ）m'（式中、（Ｘａａ）は、互いに独立して選択される任意の天然又は非天然のアミノ酸であり、ｎ及びｎ’は、独立して、０〜１０の範囲であり、ｍ及びｍ’は、独立して、０〜１０の範囲である）と読める。
【００２０】
本発明において、機能性ペプチド部分は、ｈＲＧＤ配列を含む生物活性配列に一致することができる。機能性ペプチド部分はまた、ｈＲＧＤ配列を含む生物活性配列に加えて、さらなるアミノ酸を含むこともできる。
【００２１】
特に好ましい実施形態にしたがって、機能性ペプチド部分は、少なくとも１つ以上のｈＲＧＤ配列、たとえば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０のｈＲＧＤ配列、好ましくは少なくとも１つ以上のｈＲＧＤＷＰ配列、たとえば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０のｈＲＧＤＷＰ配列を含む。この特に好ましい実施形態において、機能性ペプチド部分は、先に定義した生物活性配列の前、後又は間にさらなるアミノ酸を含んでもよい。
【００２２】
ｈＲＧＤＷＰ配列及びそれらの派生物は、細胞外マトリックス中で細胞接着タンパク質を模倣する利点を提供し、その後、細胞表面上のインテグリンタンパク質に結合することができる。
【００２３】
本発明の第１の態様において、生物活性アミノ酸配列Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｈＲＧＤ）を含む機能性ペプチド部分は自己集合性ペプチド部分に共有結合している。
【００２４】
「自己集合性ペプチド」とは、自己集合することができるペプチド、すなわち、多くのランダムな立体配座を有する非自己集合性ペプチドドメインとは対照的に、特異的に画定された立体配座へとフォールディングするドメインを画定するペプチドをいう。自己集合性アミノ酸配列は当技術分野において公知であり、本発明にしたがって、βシート、コイルドコイルαらせん構造、ペプチド三重らせん構造又はそれらの組み合わせへと集合することができるペプチド配列が好ましい。
【００２５】
コイルドコイル構造へと自己集合することができるペプチド部分は、たとえば、αらせんコイルドコイル構造を提供するペプチドアミノ酸配列である。これは、ペプチド一次配列の両親媒性パターンに依存する三次構造である。この実施形態のペプチド部分は、多様な疎水性及び極性残基を含み、通常、少なくとも１０のアミノ酸で構成されている。たとえば、らせんペプチド部分は、すべての極性残基をらせんの一面に有し、すべての疎水性残基をらせんの他方の側に有するように設計されている。このらせんが、２つ以上のらせん鎖の一部を形成し、コイルドコイル構造を形成することができる。らせんどうしは疎水性相互作用を介して会合し、コイルドコイルを形成する。ペプチド部分の配列は、たとえば、ロイシンジッパー配列であることができる。
【００２６】
βシートへと自己集合することができるペプチド部分は、ペプチド鎖に対して垂直な分子間水素結合によって安定化されたβシートを提供する。自己集合は、β鎖の間の水素結合相互作用を通して起こる。β鎖は、ほぼ完全に伸長した立体配座にある主鎖を有する一定の長さのポリペプチド鎖である。βシート構造は、平行又は逆平行β鎖から形成されることができる。この実施形態のβシートの例は、アミロイド様構造へと自己集合することができるペプチド部分である。βシートへと自己集合することができるペプチド部分は一般に、少なくとも５つ又は６つのアミノ酸を含む。
【００２７】
本発明のこの第１の態様の好ましい実施形態にしたがって、自己集合することができるペプチド部分は、ペプチドが好適な条件において提供されるとき、ハイドロゲルを形成することができる。ハイドロゲルとは、多量の水及び生物学的流体を吸収する能力を有する親水性化合物、通常はポリマーの三次元ネットワークである。ネットワークは、化学的架橋（共有結合的、イオン的）によって形成されることもできるし、物理的架橋（絡み合い、結晶子、水素結合）によって形成されることもできる。一般に、ハイドロゲルは、ゲルの質量に対して少なくとも２０質量％の水を含むことができる三次元構造である。ハイドロゲルによる水の吸収は、結果として、その寸法の有意な増大、すなわち有意な膨張を生じさせる。
【００２８】
本発明のこの第１の態様のもう１つの好ましい実施形態にしたがって、βシートへと自己集合することができるペプチド部分は、疎水性アミノ酸と荷電アミノ酸とを交互に含むオクタペプチド部分である。疎水性アミノ酸は、多くの場合、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）及びノルロイシン（Ｎｌｅ）からなる群、特にフェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）及びノルロイシン（Ｎｌｅ）からなる群から選択される。荷電アミノ酸は、通常、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）からなる群、特にアルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）及びリジン（Ｌｙｓ又はＫ）からなる群から選択される。
【００２９】
オクタペプチド部分は、たとえば、ＦＥＦＫＦＥＦＫ、ＦＥＦＥＦＫＦＫ、ＦＤＦＫＦＤＦＫ、ＦＤＦＤＦＫＦＫ、ＦＥＦＲＦＥＦＲ、ＦＥＦＥＦＲＦＲ、ＹＤＹＫＹＤＹＫ、ＹＤＹＤＹＫＹＫ、ＹＥＹＲＹＥＹＲ、ＹＥＹＫＹＥＹＫ、ＹＥＹＥＹＫＹＫ、ＷＥＷＫＷＥＷＫ、ＷＥＷＥＷＫＷＫ、ＷＤＷＫＷＤＷＫ、ＷＤＷＤＷＫＷＫからなる群から選択されてもよい。もっとも好ましくは、アミノ酸配列はＦＥＦＫＦＥＦＫ又はＦＥＦＥＦＫＦＫである。
【００３０】
本発明の第２の態様において、生物活性アミノ酸配列Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｈＲＧＤ）を含む機能性ペプチド部分は、ポリマー、特に生体適合性ポリマー、より具体的には熱応答性ポリマーに共有結合している。
【００３１】
「生体適合性ポリマー」とは、生体と適合性であるポリマーをいう。好適な例は、ポリエステル類、たとえばポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート類、たとえばポリ（ヒドロキシブチレート−ｃｏ−バレレート）（ＰＨＢＶ）、ポリカプロラクトン類、ポリアクリルアミド類、たとえばポリヒドロキシアクリルアミド（ｐＨＰＭＡ）、ポリ無水物、ポリイミド、ポリ無水物−ｃｏ−イミド及び多糖類、たとえばキトサンである。
【００３２】
「熱応答性ポリマー」とは、温度の上昇又は低下のような外部熱的刺激に暴露されると、立体配座変化のような物理的変化を受けるポリマーをいう。熱的刺激に応答して物理的変化を受ける熱応答性ポリマーの能力が、当技術分野において、これらのポリマーをスマート材料のカテゴリーに分類する。
【００３３】
水溶液中での大部分のポリマーの行動とは反対に、熱応答性ポリマーは、高温でより水不溶性、すなわちより疎水性になる。可溶性から不溶性への上記相転移を提供する温度は、当技術分野において、一般に中性ｐＨの脱イオン水中で測定される下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）と指定されている。特に好適な熱応答性ポリマーは、ＬＣＳＴが約３２℃であると測定されているポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）又はＰＮＩＰＡＡｍである。他の特に好適な熱応答性ポリマーはＰＮＩＰＡＡｍコポリマーである。ＰＮＩＰＡＡｍコポリマーは、ＮＩＰＡＡｍ及び親水性又は疎水性モノマーから選択される少なくとも１つの他のモノマーを含むコポリマーである。好適な親水性モノマーは、たとえば、Ｎ−メタクリロイル−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミド、ヒドロキシエチルアクリルアミド、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、Ｎ−アクリルアミド−１−デオキシソルビトール、ヒドロキシルエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシフェニルメタクリレート、２−ヒドロキシプロピルアクリレート、４−ヒドロキシブチルメタクリレート、２−メタクリルオキシエチルグルコシド、ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテルモノメタクリレート、ビニル−４−ヒドロキシブチルエーテル及びそれらの誘導体（ポリ（エチレングリコール）含有モノマーが特に好適である）ならびにヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）である。好適な疎水性モノマーは、アミド基のアミン窒素が１つ以上のアルキル残基で置換されているアクリルアミドモノマー、たとえば、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−オクチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ドデシルメタアクリルアミド、Ｎ−オクタデシルアクリルアミド、プロピル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、オクチルトリフェニルメチルアクリルアミド、ブチルトリフェニルメチルアクリルアミド、オクタデシルトリフェニルメチルアクリルアミド、フェニルトリフェニルメチルアクリルアミド、ベンジルトリフェニルメチルアクリルアミド及びそれらの誘導体に由来する。
【００３４】
熱応答性ポリマーは、ハイドロゲルの調製、より具体的にはスマートハイドロゲル、すなわち環境に敏感なハイドロゲルの調製に使用することができる。これらのスマートハイドロゲルは、圧力、ｐＨ、温度又はイオン強度のような環境刺激に応答して可逆性の体積変化を受けることができ、生物医学及び薬学分野、特に細胞及び組織培養の分野において使用されるのに特に適したものとなっている。
【００３５】
本発明のこの第２の特定の態様において、生物活性アミノ酸配列Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｈＲＧＤ）を含む機能性ペプチド部分は、好ましくは、好ましくはチオエーテル、アミノ、アミド、エステル及びエーテル結合からなる群から選択される結合を介してポリマーに共有結合している。そのような結合は、直接的に、すなわち、ポリマーの原子と機能性ペプチドの原子との間の共有結合であることもできるし、間接的に、すなわち、結合基を介するものであることもできる。結合基の好適な例は、とりわけ、直鎖状又は分岐鎖状のアルカン類、特に炭素原子１〜１０個を含むポリメチレン基である。結合基の他の例は、たとえば、ポリエーテル基、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００３６】
本発明の第３の態様において、ｈＲＧＤ配列を含む機能性ペプチド部分は、自己集合性ペプチド及びポリマーの両方、特に自己集合性ペプチド及び生体適合性ポリマーの両方、より具体的には自己集合性ペプチド及び熱応答性ポリマーの両方に共有結合している。
【００３７】
さらなる実施形態において、本発明はまた、ハイドロゲル、好ましくは細胞培養のためのハイドロゲルの調製において細胞接着、細胞増殖及び／又は細胞分化を促進するための、機能性ペプチド中の生物活性配列としてのアミノ酸配列Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｈＲＧＤ）の使用に関する。
【００３８】
本発明はまた、ｈＲＧＤ配列を含むハイドロゲル、特に、ｈＲＧＤ配列がハイドロゲル足場の一部であるハイドロゲルに関する。「ハイドロゲル足場」とは、ハイドロゲル構造に通じる物質、すなわち、ハイドロゲル構造を生じさせるポリマー又は自己集合性ペプチドを含む物理的実体をいう。前記ハイドロゲルにおいて、先に定義したｈＲＧＤ配列は、好ましくは、細胞接着、細胞増殖及び／又は細胞分化を促進する。
【００３９】
さらなる好ましい実施形態において、本発明のハイドロゲルはさらに、先に定義した自己集合性ペプチド部分及び／又はポリマーを含む。なおさらなる好ましい実施形態において、ｈＲＧＤ配列は、場合によっては結合及び／又はさらなるペプチド配列を介して、先に定義した自己集合性ペプチド部分又はポリマーの少なくとも１つに共有結合している。したがって、本発明は、ｈＲＧＤ配列ならびに自己集合性ペプチド部分及び／又はポリマー、特に自己集合性ペプチド部分及び／又は生体適合性ポリマー、より具体的には自己集合性ペプチド部分及び／又は熱応答性ポリマーを含むハイドロゲルに関する。
【００４０】
本ハイドロゲルは、細胞及び組織培養に特に適しており、たとえば、改善された細胞接着及び細胞増殖を提供する。本ハイドロゲルは、たとえば、細胞、好ましくは繊維芽細胞、軟骨細胞もしくは幹細胞を培養するために、又は再生医学のために使用することができる。
【００４１】
本ハイドロゲルは、二次元又は三次元細胞培養システムにおいて使用することもできる。
【００４２】
参照により本明細書に組み込まれる特許、特許出願及び刊行物の開示が用語を不明瞭にし得る程度に本出願明細書の記載と矛盾する場合、本出願明細書の記載が優先するものとする。
【００４３】
以下、本発明を、その範囲を限定することなくさらに説明する。
【実施例】
【００４４】
実施例１
以下、（ｈ）ＲＧＤとは、ＲＧＤ、ｈＲＧＤ又はそれらの混合物を使用することができることを意味する。
【００４５】
１．１  保護されたオクタペプチドの合成
オクタペプチドＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＦＥＦＫＦＥＦＫ）は、Ａ．  Ｍａｓｌｏｖｓｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｓｙｍｐ．，  ２９６，  ２４８−２５３（２０１０）に開示されているようにして、ＣｈｅｍＴｅｃｈ  ＡＣＴ  ９０ペプチド合成装置上、溶媒としてのＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）及び標準的な固相ペプチドプロトコルを使用して合成することができる。
【００４６】
オクタペプチドはまた、液相法（Ｚ／Ｂｏｃ／ＯｔＢｕ又はＦｍｏｃ／Ｂｏｃ／ＯｔＢｕ手法）において合成することもできる。この特定の場合においては、Ｎ末端位置の保護基の脱保護中でさえ、側保護基が配列上に残り、それにより、Ｚ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨが得られる。
【００４７】
１．２  保護されたオクタペプチドのエステル化
このエステル化工程は、文献：Ｐ．  Ｊｏｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ５４，  ３，  ６１７−６２６，  １９８９にしたがって実施した。Ｚ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ５０ｇ（３２ｍｍｏｌ）及び炭酸セシウム５．３ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５００ｍｌ中に導入した。ヨードエタン（ＥｔＩ）５．５ｍｌを加え、溶液を４８℃で２時間加熱した。塩のろ過及びＤＭＦの部分的蒸発ののち、濃縮物を２．５％ＫＨＳＯ4５００ｍｌに注加し、ろ過し、水洗し、最後に温かいエタノール５００ｍｌで洗浄した。真空下（４５℃）乾燥させたのち、Ｚ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＥｔに相当する固体４７ｇを得た。収率＝８４％。
【００４８】
１．３  保護されたオクタペプチドエチルエステルの水素化分解
Ｚ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＥｔ２１．６ｇ（１３．６ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＡ）２１５ｍｌ中に溶解した。溶液を窒素で数回フラッシュしたのち、Ｐｄ／Ｓｉ１４．５ｇ（２質量％）を加えた。水素の導入によって水素化分解を開始した。２時間の反応ののち、懸濁液を０．４５μｍフィルタに通し、Ｐｄ／ＳｉをＤＭＡによって洗浄した。Ｈ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＥｔに相当する集めたろ液を、さらに精製することなく次の工程に使用した。収率は定量的であった。
【００４９】
実施例２：保護されたＭｐｒ−ｈＲＧＤＷＰの合成
Ｓ−トリチル（又はトリフェニルメチル）メルカプトプロピオニルホモアルギニルグリシン（Ｍｐｒ（トリチル）−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−ＯＨ）７．３ｇ（１２．０ｍｍｏｌ）を、ピリジン１ｍｌを含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）７５ｍｌ中に溶解した。ひとたび溶液を−１０±５℃に冷却したならば、塩化ピバロイル（ＰｉｖＣｌ）１．６ｇを加えた。５〜１０分の活性化ののち、Ｎ−トリメチルシリルアセトアミド（ＴＭＡ）６．１ｇを含有するＤＭＦ１０ｍｌ中に可溶化したＯ−ｔ−ブチルアスパラギルトリプトファニルプロリン（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ）６．３ｇ（１２．７ｍｍｏｌ）を加えた。その後、反応混合物を室温に戻した。
【００５０】
反応の完了のＨＰＬＣ制御ののち、水１６．４ｍｌを加えた。部分的濃縮ののち、メタノール３５ｍｌによって希釈した濃縮物を２．５％水性ＮａＨＣＯ3１５５ｍｌに注加した。析出物を水で数回洗浄し、真空下に乾燥させた。Ｍｐｒ（Ｔｒｔ）−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨに相当するオフホワイト色の生成物１０．６ｇを得た。収率＝８７％。
【００５１】
実施例３
３．１  保護されたＭｐｒ−ｈＲＧＤＷＰとオクタペプチドとのカップリング
Ｍｐｒ（Ｔｒｔ）−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ１３．９ｇ（１３．２ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸２．５ｇ及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）６．２ｇを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＡ）中Ｈ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＥｔ（１２ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。ひとたび溶液が得られたならば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）２．７ｇを室温で加えた。少なくとも８時間かく拌したのち、反応混合物を２．５％水性ＫＨＳＯ4３００ｍｌに注加した。ろ過ののち、析出物をエタノール（２７０ｍｌ）によって３回洗浄し、真空下４５℃で乾燥させた。配列Ｍｐｒ（Ｔｒｔ）−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＥｔに相当するオフホワイト色の固体２６．３ｇを得た。収率＝７２％。
【００５２】
３．２  保護されたＭｐｒ−ｈＲＧＤＷＰ−オクタペプチドの最終的脱保護
次いで、Ｍｐｒ（Ｔｒｔ）−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＥｔ５ｇ（１．９ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ１００ｍｌ、ＣＨ2Ｃｌ2１００ｍｌ、トリイソプロピルシラン（（ｉＰｒ）3ＳｉＨ）９ｍｌ、水２．２ｍｌ及びＥｔＯＨ２．２ｍｌを含有する溶液に導入した。約１時間の反応ののち、反応混合物を冷たいイソプロピルエーテル（ＩＰＥ）２００ｍｌに注加した。ろ過し、ＩＰＥによって数回洗浄したのち、ペプチドを真空下（４５℃）乾燥させた。Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＯＥｔに相当するオフホワイト色のペプチド３ｇを得た。収率＝８８％。
【００５３】
この配列の純度を高めるために、分取ＨＰＬＣ、次いで凍結乾燥を使用することもできる。
【００５４】
実施例４：保護されたＭｐｒ−ＲＧＤＷＰの合成
４．１  Ｚ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨの合成
Ｚ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＯＨ３．４ｇ（１０．０ｍｍｏｌ）を、ピリジン０．８６ｍｌを含有するジクロロメタン（ＣＨ2Ｃｌ2）／Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）（１／１）混合物８０ｍｌ中に溶解した。ひとたび溶液を−１０±５℃に冷却したならば、塩化ピバロイル（ＰｉｖＣｌ）１．３ｇを加えた。５〜１０分の活性化ののち、Ｎ−トリメチルシリルアセトアミド（ＴＭＡ）５．２９ｇを含有するＣＨ2Ｃｌ2０．３ｍｌ中に可溶化したＡｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ５．２１ｇ（１０．６ｍｍｏｌ）を加えた。その後、反応混合物を室温に戻した。
【００５５】
反応の完了のＨＰＬＣ制御ののち、水１０ｍｌを加えた。部分的濃縮ののち、メタノール３０ｍｌで希釈した濃縮物を２．５％水性ＮａＨＣＯ3１４０ｍｌに注加した。析出物を水で数回洗浄した。
【００５６】
Ｚ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨに相当する得られた湿潤な生成物９．１ｇをアセトニトリル／水／メタノール（容量比７９／２０／１）の沸騰混合物約２００ｍｌに加えた。固体を可溶化したのち、溶液を徐々に冷ました。この冷まし工程中、２．５％水性ＮａＨＣＯ3３４０ｍｌを注加した。白色固体の出現ののち、懸濁液をさらに０℃で少なくとも１０時間かく拌した。ろ過及びアセトニトリル／水（１／２）１００ｍｌによる数回の洗浄ののち、ペプチドを真空下（４５℃）乾燥させた。Ｚ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨに相当するオフホワイト色のペプチド（含水率５％）６ｇが得られた。収率＝７０％。
【００５７】
４．２  Ｈ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨの合成
Ｚ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ２０，０ｇ（２２．２ｍｍｏｌ）を、３７％水性ＨＣｌ  １．８５ｍｌを含有するメタノール／水（９５／５）混合物２４０ｍｌ中に溶解した。溶液を窒素で数回フラッシュしたのち、Ｐｄ／Ｓｉ２３．６ｇ（２質量％）を加えた。水素の導入によって水素化分解を開始した。２時間の反応ののち、懸濁液を０．４５μｍフィルタに通し、Ｐｄ／Ｓｉをメタノール／水（９５／５）混合物によって洗浄した。集めたろ液を真空下に濃縮し、さらに共沸濃縮によって水をアセトニトリルによって置換した。析出物をろ過し、洗浄し、真空下に乾燥させた。Ｈ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ．ＨＣｌに相当するオフホワイト色の粉末（含水率１．８％）１３．１ｇを得た。収率＝８５％。
【００５８】
４．３  Ｍｐｒ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨの合成
Ｈ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ．ＨＣｌ  ８．０８ｇ（１１ｍｍｏｌ）を、４５℃で、８．０〜８．５の範囲のｐＨ（ＫＨＣＯ3バッファ）の水／ジオキサン（１／２）混合物１５０ｍｌに加えた。５等分したＭｐｒ（Ｔｒｔ）ＯＳｕ５ｇ（１０．４ｍｍｏｌ）を規則的間隔で上記溶液に加えた。ＨＰＬＣによる反応の完了の制御ののち、反応混合物を水４００ｍｌに注加し、ジオキサン画分を真空下に蒸発させた。懸濁液のろ過ののち、実施例４．１に記載されたプロトコルにしたがって湿潤な固体を処理して、Ｍｐｒ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ（保護されたＭｐｒ−ＲＧＤＷＰ）を得た。収率＝７４％。
【００５９】
実施例５
５．１  保護されたＭｐｒ−ＲＧＤＷＰとオクタペプチドとのカップリング
次いで、実施例３．２において使用されたプロトコルにしたがって、Ｍｐｒ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨをＨ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＥｔにカップリングした。収率＝７４％。
【００６０】
５．２  保護されたＭｐｒ−ＲＧＤＷＰ−オクタペプチドの最終的脱保護
次いで、保護されたＭｐｒ−ｈＲＧＤＷＰ−オクタペプチドの脱保護のために実施例３．２において使用されたプロトコルにしたがって、保護されたＭｐｒ−ＲＧＤＷＰ−オクタペプチドを脱保護した。収率＝８７％。
【００６１】
この配列の純度を高めるために、分取ＨＰＬＣ、次いで凍結乾燥を使用することもできる。
【００６２】
実施例６：ハイドロゲル調製
６．２  プロトコルＩ
６．２．１  ２Ｄ細胞培養
オクタペプチド１６．３ｍｇ及びｈＲＧＤ−オクタペプチド７．３ｍｇ又はＲＧＤ−オクタペプチド（オクタペプチド／（ｈ）ＲＧＤ−オクタペプチドモル比８０／２０）６．６ｍｇを９０℃の蒸留水１ｍｌ中に３時間かけて溶解した。冷ましたのち、試料を細胞培養ウェルプレートに移し、３７℃で１２時間インキュベートした。その後、試料を、細胞培地（ＤＭＥＭ  Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）により、その培地をゲル上で８回交換しながら１０分間洗浄した。試料を３７℃のインキュベータに戻して一晩置き、翌日、洗浄を繰り返した。試料を再びインキュベータに入れて一晩置き、翌日、ゲルの表面に細胞を接種した。
【００６３】
６．２．２  ３Ｄ細胞培養
オクタペプチド１６．３ｍｇ及びｈＲＧＤ−オクタペプチド７．３ｍｇ又はＲＧＤ−オクタペプチド（オクタペプチド／（ｈ）ＲＧＤ−オクタペプチドモル比８０／２０）６．６ｍｇを、蒸留水と１×ダルベッコリン酸緩衝食塩水との９０℃の混合物（比７０／３０）１ｍｌ中に３時間かけて溶解した。冷ましたのち、試料５００μｌを、０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液４０μｌとともに各細胞培養ウェルプレートに入れ、かく拌した。その後、培地中に懸濁させた細胞１００μｌをウェルに加え、かく拌した。その後、細胞培地１００μｌをウェル中のゲルの上に加え、ウェルプレートをインキュベータに入れた。
【００６４】
６．１  プロトコルＩＩ
２Ｎ  ＮａＯＨ１２５μｌをダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）５．１ｍｌに加えた。溶液を激しく振とうし、オクタペプチド／（ｈ）ＲＧＤＷＰ−オクタペプチド混合物（質量比８０／２０）を含有するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（濃度ペプチド２００ｍｇ／ＤＭＳＯ１ｍｌ）７１５μｌに素速く加えた。すぐに形成したゲルを３分間振とうした。得られたゲルを、５μｍ膜上、ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）１５ｍｌによって４回洗浄した。洗浄したゲルを、２Ｄ細胞培養に直接使用するか、又は、その後、バイアルに移し入れ、ＤＭＥＭ（ゲル量の５〜１０％）によってわずかに希釈し、数分間振とうするかした。その後、懸濁したゲルを培養フラスコに移し入れ、３Ｄ細胞培養のための細胞を接種した。
【００６５】
実施例７：細胞培養
以下の実験においては、３つのハイドロゲル、すなわち、自己集合性オクタペプチドＦＥＦＫＦＥＦＫに基づくハイドロゲル、ＲＧＤ修飾オクタペプチド（Ｍｐｒ−ＲＧＤＷＰ−ＦＥＦＫＦＥＦＫ）に基づくハイドロゲル及びｈＲＧＤ修飾オクタペプチド（Ｍｐｒ−ｈＲＧＤＷＰ−ＦＥＦＫＦＥＦＫ）に基づくハイドロゲルを比較した。
【００６６】
光学顕微鏡を使用して細胞形態及び細胞付着を観察した。
【００６７】
７．１  ２Ｄ実験
７．１．１  細胞形態
ゲル表面上のヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦ）の細胞付着性を試験した。図１は、１、３及び７日後に撮られた、オクタペプチド、ｈＲＧＤ及びＲＧＤ修飾オクタペプチドに基づくハイドロゲルの光学顕微鏡写真を示す。
【００６８】
これらの写真から、ＦＥＦＫＦＥＦＫハイドロゲル表面に接種された細胞が培養１、３及び７日後に丸みのある形態を示したということが見てとれる。７日間の培養期間中、ｈＲＧＤ修飾ハイドロゲル表面には広範囲な細胞伸長が観察されたが、ＲＧＤ修飾ハイドロゲル表面に接着した細胞は、１日目と３日目との間で相対的に伸長が小さい細胞形態を示した。これらの光学顕微鏡写真から、ｈＲＧＤＷＰ−ＦＥＦＫＦＥＦＫハイドロゲル上の細胞伸長がＲＧＤＷＰ−ＦＥＦＫＦＥＦＫハイドロゲル上の細胞伸長に比べて優れているということが見てとれる。
【００６９】
７．１．２  細胞生存度
ハイドロゲル表面上のＨＤＦの細胞生存度を、光学顕微鏡により、生死染色を使用して目視的に分析した。酵素的反応を介して達成される細胞内エステラーゼ活性により、カルセインＡＭ（非蛍光性）をカルセイン（強蛍光性）に転換した。この強蛍光カルセインを生細胞内に保持して、緑色の蛍光を生成させた。死細胞の損傷した膜は、ＥｔｈＤ−１溶液が核酸に結合して、それにより、死細胞中で赤色の蛍光を生成することを許した。図２は、１、３及び１１日後に撮られた、オクタペプチド、ｈＲＧＤ及びＲＧＤ修飾オクタペプチドに基づくハイドロゲルの蛍光光学顕微鏡写真を示す。生細胞に対応する緑色の蛍光は写真中では淡いグレーに見える。赤色の蛍光は観察されなかった。
【００７０】
蛍光顕微鏡写真は、ＦＥＦＫＦＥＦＫハイドロゲル上の細胞の大部分が、培養７日目までに丸みのある形態を示すようになることを示す。非常に少数の死細胞しか記録されなかった。対照的に、画像は、培養１日目及び３日目ののち、ｈＲＧＤ修飾ハイドロゲル上に接種されたＨＤＦが、ＲＧＤ修飾ゲル上に接種されたものに比べて大きく伸長した形態を示すことを明らかにした。これらの結果は、実施例７．１．１において提示された光学顕微鏡画像と十分に相関したものである。１日置きの培地交換が、細胞増殖を促進するのに十分な栄養素を提供した。その結果、非常に少数の死細胞しか検出されなかった。
【００７１】
７．２  ３Ｄ実験
２Ｄ実験と同様に、ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦ）の行動を分析した。
【００７２】
７．２．１  細胞形態
実施例７．１．１と同様に、ゲル表面上のヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦ）の細胞形態を試験した。図３は、１日後に撮られた、オクタペプチド、ｈＲＧＤ及びＲＧＤ修飾オクタペプチドに基づくハイドロゲルの光学顕微鏡写真を示す。
【００７３】
ＦＥＦＫＦＥＦＫハイドロゲル中に封入された細胞が培養１日後に丸みのある形態を示したということが明らかである。ｈＲＧＤ修飾ハイドロゲル内には広範囲な細胞伸長が観察されたが、ＲＧＤ修飾ハイドロゲル中に埋め込まれた細胞は、１日目で、相対的に伸長が小さい細胞形態を示した。非修飾ハイドロゲルと修飾ハイドロゲルとの間で細胞形態の有意な差が認められた。これらの光学顕微鏡写真から、ｈＲＧＤＷＰ−ＦＥＦＫＦＥＦＫハイドロゲル内の細胞伸長がＲＧＤＷＰ−ＦＥＦＫＦＥＦＫハイドロゲル内の細胞伸長よりも優れているということが見てとれる。
【００７４】
７．２．２  細胞生存度
実施例７．１．２と同様に、生死染色を使用して、ゲル内に封入されたＨＤＦの細胞生存度を目視的に分析した。図４は、１及び３日後に撮られた、オクタペプチド、ｈＲＧＤ及びＲＧＤ修飾オクタペプチドに基づくハイドロゲルの蛍光光学顕微鏡写真を示す。生細胞に対応する緑色の蛍光は写真中では淡いグレーに見える。死細胞に対応する赤色の蛍光が、オクタペプチドに対応する写真中に見られる（丸で囲んだ点）。
【００７５】
これらの蛍光顕微鏡写真は、ＦＥＦＫＦＥＦＫハイドロゲル内に封入された細胞の大部分が、培養３日目までに丸みのある形態を示すようになることを示す。１日目、死細胞が観察された。３日目、細胞生存度は改善し、したがって、死細胞は少数しか検出されなかった。対照的に、１日目と３日目との間に、ｈＲＧＤ修飾ハイドロゲル内に埋められたＨＤＦは、ＲＧＤ修飾ハイドロゲル内に埋められたＨＤＦに比べて非常に伸長した形態を示すということが見てとれる。
【００７６】
７．２．３  細胞増殖
血球計を使用する細胞計数法を実施して、３Ｄ培養システム中のＨＤＦの細胞増殖を定量化した。図５は、オクタペプチド、ＲＧＤ及びｈＲＧＤ修飾オクタペプチドに基づくハイドロゲル中、それぞれ０、１、２、３、５、７、１０及び１４日後の細胞数を示す。
【００７７】
最高の細胞数及び生細胞の割合はｈＲＧＤ修飾ハイドロゲル中で観察された。最低の細胞数は非修飾ＦＥＦＫＦＥＦＫシステム中で観察された。ＲＧＤ修飾ハイドロゲル中の細胞数は時間とともに着実に増加したが、生存の割合及び細胞増殖の程度は変動した。ｈＲＧＤハイドロゲルとＲＧＤ修飾ハイドロゲルとの間の大きな差は、一部には、ゲル間の剛性の差に対する細胞応答によるものと考えられる。集められたレオロジーデータは、３つのハイドロゲルの強度及びβシート含量の明確な差を示す（表１を参照）。
【００７８】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2013538864.tif 000009
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