(57)【要約】  標的濃度のペルオキシカルボン酸をカルボン酸エステルから急速に生成するための方法が提供される。より具体的には、カルボン酸エステルは、過加水分解活性を有するラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのアセチルキシランエステラーゼに対する同一性を有する酵素を含む酵素触媒の存在下で、過酸化水素などの過酸素源と反応される。ポリペプチドは、構造的に、炭水化物エステラーゼファミリー７（ＣＥ−７）のメンバーとして分類される酵素である。本発明の方法によって生成されるペルオキシカルボン酸は、消毒、漂白、および他のランドリーケア用途において使用することができる。反応成分および本方法によって生成されるペルオキシカルボン酸を含む組成物も提供される。
2013506421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（１）（ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
［式中、Ｘは、式Ｒ６−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換される）であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含み、
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基によって置換される）であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基を含み、Ｒ５は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含み、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである］
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍである水への溶解度を有するエステル、
（ｉｉ）構造
【化１】
2013506421.tif 000021
［式中、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキル（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換される）であり、そしてＲ３およびＲ４は個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である］
を有するグリセリド、ならびに
（ｉｉｉ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
（２）過酸素源と、
（３）ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて参照配列の配列番号２と整列するシグネチャーモチーフを有する酵素を含み、ペルヒドロリシスを有する酵素触媒であって、該シグネチャーモチーフが、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸位置１１８−１２０におけるＲＧＱモチーフ、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置１７９−１８３におけるＧＸＳＱＧモチーフ、および
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９８−２９９におけるＨＥモチーフ
を含み、該酵素が配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する酵素触媒と
を含む一組の反応成分を選択するステップと、
（ｂ）反応成分を水性反応下で混ぜ合わせて反応混合物を形成し、それにより、酵素的に生成されたペルオキシカルボン酸を含む反応生成物が形成されるステップであって、
（１）反応混合物のｐＨが、約６．０〜約９．０の範囲内にとどまり、そして
（２）反応成分を混ぜ合わせてから１分後に生成されるペルオキシカルボン酸の濃度が、反応成分を混ぜ合わせてから５分以上の反応時間で、１００％よりも大きく超えないステップと
を含む、標的濃度のペルオキシカルボン酸の製造方法。
【請求項２】
反応成分を混ぜ合わせてから１分後に生成されるペルオキシカルボン酸の濃度が、反応成分を混ぜ合わせてから３０分以上の反応時間で、１００％よりも大きく超えない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応成分を混ぜ合わせてから１分後に生成されるペルオキシカルボン酸の濃度が、反応成分を混ぜ合わせてから５分以上の反応時間で、５０％よりも大きく超えない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
反応成分を混ぜ合わせてから１分後に生成されるペルオキシカルボン酸の濃度が、反応成分を混ぜ合わせてから５分以上の反応時間で、２０％よりも大きく超えない、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記方法によって生成されるペルオキシカルボン酸の総量が、前記反応混合物中の基質の量によっても過酸素の量によっても制限されない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
反応混合物のｐＨが約６．５〜約８．５の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
反応混合物のｐＨが約７．０〜約８．０の範囲である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
反応混合物が少なくとも１つの緩衝液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの緩衝液が、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウムの混合物、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ならびにリン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムの混合物からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
基質が、モノアセチンと、ジアセチンと、トリアセチンと、モノプロピオニンと、ジプロピオニンと、トリプロピオニンと、モノブチリンと、ジブチリンと、トリブチリンと、グルコースペンタアセタートと、キシローステトラアセタートと、アセチル化キシランと、アセチル化キシラン断片と、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセタートと、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタールと、トリ−Ｏ−アセチル−グルカールと、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールのモノエステルまたはジエステルと、プロピレングリコールジアセタートと、エチレングリコールジアセタートと、そしてこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
生成されるペルオキシカルボン酸が、過酢酸、過プロピオン酸、過酪酸、過乳酸、ペルグリコール酸、ペルメトキシ酢酸、ペル−β−ヒドロキシ酪酸、またはこれらの混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
酵素触媒が、微生物細胞、透過処理微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製酵素、または精製酵素の形態にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
酵素触媒はカタラーゼ活性がない、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
（ｃ）表面または無生物体をステップ（ｂ）において生成されるペルオキシカルボン酸と接触させ、それにより、該表面または該無生物体が消毒、脱染、脱臭または漂白されるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
（ｃ）繊維製品をステップ（ｂ）において生成されるペルオキシカルボン酸と接触させ、それにより、該繊維製品がベネフィットを受けるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ベネフィットが、消毒、漂白、脱染、脱臭、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）（１）（ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
［式中、Ｘは、式Ｒ６−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換される）であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含み、
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基によって置換される）であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基を含み、Ｒ５は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含み、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである］
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍである水への溶解度を有するエステル、
（ｉｉ）構造
【化２】
2013506421.tif 000022
［式中、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキル（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換される）であり、そしてＲ３およびＲ４は個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である］
を有するグリセリド、ならびに
（ｉｉｉ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
（２）過酸素源と、
（３）ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて参照配列の配列番号２と整列するシグネチャーモチーフを有する酵素を含み、ペルヒドロリシスを有する酵素触媒であって、該シグネチャーモチーフが、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸位置１１８−１２０におけるＲＧＱモチーフ、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置１７９−１８３におけるＧＸＳＱＧモチーフ、および
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９８−２９９におけるＨＥモチーフ
を含み、該酵素が配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する酵素触媒と
を含む一組の反応成分を選択するステップと、
（ｂ）選択された一組の反応成分を水性反応条件下で混ぜ合わせて反応混合物を形成し、それにより、酵素的に生成されたペルオキシカルボン酸を含む反応生成物が形成されるステップであって、
（１）水性反応混合物のｐＨが約６．０〜約９．０の範囲内にとどまり、そして
（２）反応成分を混ぜ合わせてから５分後に生成されるペルオキシカルボン酸の濃度が、反応成分を混ぜ合わせてから３０分以上の反応時間で、１００％よりも大きく超えないステップと
を含む、標的濃度のペルオキシカルボン酸の製造方法。
【請求項１８】
反応成分を混ぜ合わせてから５分後に生成されるペルオキシカルボン酸の濃度が、反応成分を混ぜ合わせてから３０分以上の反応時間で、５０％よりも大きく超えない、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
反応成分を混ぜ合わせてから５分後に生成されるペルオキシカルボン酸の濃度が、反応成分を混ぜ合わせてから３０分以上の反応時間で、２０％よりも大きく超えない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）（１）（ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
［式中、Ｘは、式Ｒ６−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換される）であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含み、
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基によって置換される）であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基を含み、Ｒ５は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含み、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである］
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍである水への溶解度を有するエステル、
（ｉｉ）構造
【化３】
2013506421.tif 000023
［式中、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキル（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換される）であり、そしてＲ３およびＲ４は個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である］
を有するグリセリド、ならびに
（ｉｉｉ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
（２）過酸素源と、
（３）ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて参照配列の配列番号２と整列するシグネチャーモチーフを有する酵素を含み、ペルヒドロリシスを有する酵素触媒であって、該シグネチャーモチーフが、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸位置１１８−１２０におけるＲＧＱモチーフ、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置１７９−１８３におけるＧＸＳＱＧモチーフ、および
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９８−２９９におけるＨＥモチーフ
を含み、該酵素も配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する酵素触媒と
を含む一組の反応成分と、
（ｂ）（ａ）の一組の反応成分を混ぜ合わせたときに形成される少なくとも１つのペルオキシカルボン酸と
を含む組成物。
【請求項２１】
酵素触媒がアミノ酸配列番号４を有する酵素を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
（ａ）（１）配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する酵素を含む酵素触媒と、
（２）（ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
［式中、Ｘは、式Ｒ６−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換される）であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含み、
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基によって置換される）であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基を含み、Ｒ５は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含み、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである］
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍである水への溶解度を有するエステル、
（ｉｉ）構造
【化４】
2013506421.tif 000024
［式中、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキル（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換される）であり、そしてＲ３およびＲ４は個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である］
を有するグリセリド、ならびに
（ｉｉｉ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
（３）任意選択的な緩衝液と
を含む第１のコンパートメントと、
（ｂ）（１）過酸素源、
（２）過酸化物安定剤、および
（３）任意選択的な緩衝液
を含む第２のコンパートメントと
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシカルボン酸の生合成およびその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での酵素触媒作用の分野に関する。具体的には、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）からのアセチルキシランエステラーゼに対する同一性を有する酵素を含む酵素触媒を用いてペルオキシカルボン酸を生成するための方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
ペルオキシカルボン酸組成物は有効な抗菌剤であり得る。望ましくない微生物の増殖に対して硬い表面、織物、食肉製品、生きた植物組織、および医療デバイスを清浄化、消毒および／または衛生化するためにペルオキシカルボン酸を用いる方法が記載されている（特許文献１、２、３、４、および５）。ペルオキシカルボン酸は、漂白剤としてのその使用など、種々のランドリーケア用途においても使用されている（特許文献６、７、および８）。
【０００３】
ペルオキシカルボン酸は、カルボン酸アルキルエステルと、過酸化水素などの過酸化物試薬との化学反応によって調製することができる（非特許文献１を参照）。しかしながら、わずかに塩基性〜酸性のｐＨ（約８〜約４）では、反応は、多くの商業的な消毒および／または漂白用途に適したペルオキシカルボン酸濃度を生じるのに十分に速くは進行しないことが多い。
【０００４】
化学的なペルオキシカルボン酸の生成の不都合を克服する１つの方法は、過加水分解活性を有する酵素触媒を使用することである。特許文献９、ならびに１０、１１、および１２には、構造的に炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーのメンバー（例えば、セファロスポリンＣデアセチラーゼ［ＣＡＨ］およびアセチルキシランエステラーゼ［ＡＸＥ］）であると分類され、消毒薬および／または漂白剤として使用するのに十分な濃度でカルボン酸エステル（過酸化水素などの適切な過酸素源の存在下）をペルオキシカルボン酸に転化させるために著しい過加水分解活性を特徴とする酵素が開示されている。反応成分が混合されると、炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーのいくつかのメンバーは、アルコール、ジオール、およびグリセロールのアセチルエステルから、１分間に４０００〜５０００ｐｐｍ、そして５分〜３０分の間に９０００ｐｐｍまでの過酢酸を生じるのに十分な過加水分解活性を有することが実証されている（特許文献１２）。ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは、過剰な基質、約６．０〜約８．５のｐＨ、および適切な温度範囲を含む適切な水性反応条件下で、３０分以上経過してから過酸の濃度の増大を起こすことがよくある。通常、反応のｐＨは、有効量の少なくとも１つの緩衝液を用いて維持される。このような条件を用いて生成されるペルオキシ酢酸の量は望ましい量を超過することもあるし、特定の用途のために効果的な濃度に最終的に到達するまでに時間がかかり過ぎることもある。
【０００５】
ペルオキシカルボン酸（例えば、過酢酸）の酵素的な生成は通常水性反応条件を用いて行われる。従って、エステル基質の加水分解および／またはペルオキシカルボン酸の加水分解から、対応するカルボン酸（例えば、酢酸）を生成する加水分解反応（化学的および／または酵素的）が生じることにより、所望の生成物が破壊されることが多い。酵素的な過加水分解の生成物（ペルオキシカルボン酸またはペルオキシカルボン酸および対応するカルボン酸加水分解生成物の混合物）は、特定の金属表面に対して腐食性であり得る。従って、反応中に生成されるペルオキシカルボン酸の総量を制限して、得られる溶液の腐食作用を防止または最小限にするのが望ましいこともある。例えば、１分間に２００ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ以下の過酸の生成を必要とする用途では、これらの限界をはるかに上回る最終濃度の過酸を生じる反応条件が使用されることが多い。硬い表面を消毒するために過酸をその場で発生させる用途では、効果的な消毒濃度の上限を著しく超えることなく所望の濃度の過酸を急速に発生させることにより、表面の特定の成分の腐食を制限または防止する能力があることが望ましい。洗濯物または織物の漂白のために過酸をその場で発生させる用途でも、漂白のために必要とされる濃度を上回って発生される過酸の濃度に対して同様の制限が望ましい。従って、特に過剰な基質の存在下で、所望の「標的」濃度のペルオキシカルボン酸を急速に生成するための方法を提供することが必要とされている。
【０００６】
多くのＣＥ−７炭水化物エステラーゼは、ｐＨが約６．０未満に降下したときに過加水分解活性の低下または不活性化を示し、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼのほとんどは５．０以下のｐＨで不活性化される。特許文献１３は、反応成分および条件を選択することにより、酵素触媒が過加水分解活性を少ししかまたは全く有さない値まで反応混合物のｐＨを低下させる反応生成物（すなわち、ペルオキシカルボン酸および対応するカルボン酸加水分解生成物）が形成されることによって、所望の「標的」濃度のペルオキシカルボン酸を生成する方法を教示している。反応成分および条件は、反応混合物のｐＨが１０分以内に６．０未満に降下して、生成されるペルオキシカルボン酸の濃度を制御することができるように選択される。しかしながら、６．０未満のｐＨを有する生成混合物は、特に反応生成物と接触する表面が腐食および過度の漂白の影響を受けやすい場合、一部の消毒および／または漂白用途のためには望ましくないこともある。このような状況下では、反応混合物のｐＨの実質的な降下に依存せず、酵素的に生成されるペルオキシカルボン酸の量を制御することが依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，５４５，０４７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１８３，８０７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５１８，３０７号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／００２６８４６号明細書
【特許文献５】米国特許第５，６８３，７２４号明細書
【特許文献６】米国特許第３，９７４，０８２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，２９６，１６１号明細書
【特許文献８】米国特許第５，３６４，５５４号明細書
【特許文献９】米国特許出願第１１／６３８，６３５号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００９／０００５５９０号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）
【特許文献１３】米国特許出願第１２／５３９，０２５号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ」，Ｄａｎｉｅｌ  Ｓｗｅｒｎ編，第１巻，３１３−５１６頁，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
解決すべき問題は、ｐＨの著しい降下または６．０未満のｐＨに依存せずに、水性反応混合物中で所望の濃度のペルオキシカルボン酸を酵素的に生成する方法を提供することである。選択される反応成分および反応条件は、標的濃度がいったん達成されたら実質的に増大しない濃度で、所望のペルオキシカルボン酸を急速に生成することができなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の問題は、所望の濃度のペルオキシカルボン酸を５分以内に生成する（所望の濃度がいったん達成されたら実質的に増大しない）ための酵素的な方法の発見によって解決されており、ここで、反応混合物のｐＨは反応の過程を通して６．０〜９．０の間に維持される。本方法は、過加水分解活性を有する酵素を含む酵素触媒の使用を含み、前記酵素は、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）からのアセチルキシランエステラーゼに対して少なくとも９５％の同一性を有する。本発明の酵素触媒は、過剰の基質の存在下および６．０〜９．０のｐＨ範囲（他のＣＥ−７ペルヒドロラーゼでは、通常、５分以上経過した後に実質的に増大する濃度のペルオキシカルボン酸が生成される条件）においても、５分以内に実質的に安定した標的濃度のペルオキシカルボン酸濃度を有する生成混合物の急速な生成を可能にする。
【００１１】
一実施形態では標的濃度のペルオキシカルボン酸の生成方法が提供されており、本方法は、
ａ）１）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
［式中、Ｘ＝式Ｒ６−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい）であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基によって置換されていてもよい）であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基を含んでおり、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである］
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍである水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化１】
2013506421.tif 000003
［式中、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキル（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい）であり、そしてＲ３およびＲ４は個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である］
を有するグリセリド、ならびに
ｉｉｉ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
２）過酸素源と、
３）ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて参照配列の配列番号２と整列するシグネチャーモチーフを有する酵素を含み、過加水分解活性を有する酵素触媒であって、前記シグネチャーモチーフが、
ｉ）配列番号２のアミノ酸位置１１８−１２０におけるＲＧＱモチーフ、
ｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置１７９−１８３におけるＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９８−２９９におけるＨＥモチーフ
を含み、前記酵素が配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する酵素触媒と
を含む一組の反応成分を選択するステップと、
ｂ）反応成分を水性反応下で混ぜ合わせて反応混合物を形成し、それにより、酵素的に生成されたペルオキシカルボン酸を含む反応生成物が形成されるステップであって、
１）反応混合物のｐＨが、約６．０〜約９．０の範囲内にとどまり、
２）反応成分を混ぜ合わせてから１分後に生成されるペルオキシカルボン酸の濃度が、反応成分を混ぜ合わせてから５分以上の反応時間で、１００％よりも大きく超過されないステップと
を含む。
【００１２】
別の実施形態ではペルオキシカルボン酸の生成方法が提供されており、本方法は、
ａ）１）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
［式中、Ｘは、式Ｒ６−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい）であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基によって置換されていてもよい）であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基を含んでおり、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである］
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍである水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化２】
2013506421.tif 000004
［式中、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキル（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい）であり、そしてＲ３およびＲ４は個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である］
を有するグリセリド、ならびに
ｉｉｉ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
２）過酸素源と、
３）ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて参照配列の配列番号２と整列するシグネチャーモチーフを有する酵素を含み、過加水分解活性を有する酵素触媒であって、前記シグネチャーモチーフが、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸位置１１８−１２０におけるＲＧＱモチーフ、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置１７９−１８３におけるＧＸＳＱＧモチーフ、および（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９８−２９９におけるＨＥモチーフ
を含み、前記酵素が配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する酵素触媒と
を含む一組の反応成分を選択するステップと、
ｂ）反応成分を水性反応下で混ぜ合わせて反応混合物を形成し、それにより、酵素的に生成されたペルオキシカルボン酸を含む反応生成物が形成されるステップであって、
１）反応混合物のｐＨが約６．０〜約９．０の範囲内にとどまり、そして
２）反応成分を混ぜ合わせてから１分後に生成されるペルオキシカルボン酸の濃度が、反応成分を混ぜ合わせてから３０分以上の反応時間で、１００％よりも大きく超過されないステップと
を含む。
【００１３】
また別の態様では、
ａ）１）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
［式中、Ｘは、式Ｒ６−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい）であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基によって置換されていてもよい）であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基を含んでおり、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである］
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍである水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化３】
2013506421.tif 000005
［式中、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキル（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい）であり、そしてＲ３およびＲ４は個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である］
を有するグリセリド、ならびに
ｉｉｉ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
２）過酸素源と、
３）ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて参照配列の配列番号２と整列するシグネチャーモチーフを有する酵素を含み、過加水分解活性を有する酵素触媒であって、前記シグネチャーモチーフが、
ｉ）配列番号２のアミノ酸位置１１８−１２０におけるＲＧＱモチーフ、
ｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置１７９−１８３におけるＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸位置２９８−２９９におけるＨＥモチーフ
を含み、前記酵素も配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する酵素触媒と
を含む一組の反応成分と、
ｂ）（ａ）の一組の反応成分を混ぜ合わせたときに形成される少なくとも１つのペルオキシカルボン酸と
を含む組成物も提供される。
【００１４】
本発明の方法は、反応成分を混ぜ合わせたときに所望のペルオキシカルボン酸を生成する。反応成分は、使用するまで別々に保持され得る。さらなる態様では、反応成分を含むキットも提供されており、本キットは、
ａ）１）配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する酵素を含む酵素触媒と、
２）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
［式中、Ｘは、式Ｒ６−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい）であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基によって置換されていてもよい）であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基を含んでおり、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである］
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍである水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
【化４】
2013506421.tif 000006
［式中、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキル（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい）であり、そしてＲ３およびＲ４は個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である］
を有するグリセリド、ならびに
ｉｉｉ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
３）任意選択的な緩衝液と
を含む第１のコンパートメントと、
ｂ）１）過酸素源、
２）過酸化物安定剤、および
３）任意選択的な緩衝液
を含む第２のコンパートメントと
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭセファロスポリンＣデアセチラーゼ参照配列（配列番号２）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）アセチルキシランエステラーゼ（配列番号４）、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）アセチルキシランエステラーゼ（配列番号６）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アセチルキシランエステラーゼ、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ（配列番号３９）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼ（配列番号４０）、およびバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）アセチルキシランエステラーゼ（配列番号４１）を含む、ペルヒドロラーゼ活性を有するいくつかの酵素のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（バージョン１．８３）の結果を示す。酵素は全てペルヒドロラーゼ活性を有し、構造的に炭水化物エステラーゼファミリー７（ＣＥ−７）のメンバーであると分類され、全てのＣＥ−７炭水化物エステラーゼのためのシグネチャーモチーフを一緒に形成する保存サブモチーフ（下線）を共有する（Ｖｉｎｃｅｎｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３０：５９３−６０６（２００３年）および米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）を参照）。
【図１Ｂ】バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭセファロスポリンＣデアセチラーゼ参照配列（配列番号２）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）アセチルキシランエステラーゼ（配列番号４）、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）アセチルキシランエステラーゼ（配列番号６）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アセチルキシランエステラーゼ、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ（配列番号３９）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼ（配列番号４０）、およびバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）アセチルキシランエステラーゼ（配列番号４１）を含む、ペルヒドロラーゼ活性を有するいくつかの酵素のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメント（バージョン１．８３）の結果を示す。酵素は全てペルヒドロラーゼ活性を有し、構造的に炭水化物エステラーゼファミリー７（ＣＥ−７）のメンバーであると分類され、全てのＣＥ−７炭水化物エステラーゼのためのシグネチャーモチーフを一緒に形成する保存サブモチーフ（下線）を共有する（Ｖｉｎｃｅｎｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３０：５９３−６０６（２００３年）および米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）を参照）。
【００１６】
生物学的配列の簡単な説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８年）、ならびに欧州特許条約（ＥＰＣ）および特許協力条約（ＰＣＴ）規則５．２および４９．５（ａの２）および実施細則の２０８項および付録Ｃの配列表の要件と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに対して使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載される規則に従う。
【００１７】
配列番号１は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭからのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号Ｄ１０９３５）。
【００１８】
配列番号２は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭからのセファロスポリンＣデアセチラーゼのアミノ酸配列である。
【００１９】
配列番号３は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＥＵ２５５９１０）。
【００２０】
配列番号４は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＢＸ７５６３４．１）。
【００２１】
配列番号５は、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＣ＿００２６７８．２）。
【００２２】
配列番号６は、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＢＡＢ５３１７９．１）。
【００２３】
配列番号７は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＦ０３８５４７．２）。
【００２４】
配列番号８は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＡＦ７０２０２．１）。
【００２５】
配列番号９は、カナマイシン耐性遺伝子の核酸配列である。
【００２６】
配列番号１０は、プラスミドｐＫＤ１３の核酸配列である。
【００２７】
配列番号１１および１２は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５においてｋａｔＧカタラーゼ遺伝子に対する相同性を有する領域に隣接したカナマイシン遺伝子をコードするＰＣＲ産物を発生させるために使用されるプライマーである。この産物は、内在性ｋａｔＧ遺伝子を破壊するために使用した。
【００２８】
配列番号１３は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５においてｋａｔＧカタラーゼ遺伝子に対する相同性を有する領域に隣接したカナマイシン耐性遺伝子をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。この産物は、内在性のｋａｔＧ遺伝子を破壊するために使用した。
【００２９】
配列番号１４は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５中のｋａｔＧカタラーゼ遺伝子の核酸配列である。
【００３０】
配列番号１５は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５中のＫａｔＧカタラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号１６は、プラスミドｐＫＤ４６の核酸配列である。
【００３２】
配列番号１７および１８は、ｋａｔＧ遺伝子の破壊を確認するために使用されるプライマーである。
【００３３】
配列番号１９は、プラスミドｐＣＰ２０の核酸配列である。
【００３４】
配列番号２０および２１は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５においてｋａｔＥカタラーゼ遺伝子に対する相同性を有する領域に隣接したカナマイシン遺伝子をコードするＰＣＲ産物を発生させるために使用されるプライマーである。この産物は、内在性ｋａｔＥ遺伝子を破壊するために使用した。
【００３５】
配列番号２２は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５においてｋａｔＥカタラーゼ遺伝子に対する相同性を有する領域に隣接したカナマイシン耐性遺伝子をコードするＰＣＲ産物の核酸配列である。この産物は、内在性ｋａｔＥ遺伝子を破壊するために使用した。
【００３６】
配列番号２３は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５中のｋａｔＥカタラーゼ遺伝子の核酸配列である。
【００３７】
配列番号２４は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５中のＫａｔＥカタラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号２５および２６は、単一ノックアウト株Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ΔｋａｔＥ、および二重ノックアウト株Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ΔｋａｔＧΔｋａｔＥ（本明細書ではＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８と称される）におけるｋａｔＥ遺伝子の破壊を確認するために使用されるプライマーである。
【００３９】
配列番号２７および２８は、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）内にサブクローニングされたラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）アセチルキシランエステラーゼのコドン最適化型をコードするＰＣＲ産物を生成して、ｐＳＷ２２９として同定されるプラスミドを作成するために使用されるＰＣＲプライマーである。
【００４０】
配列番号２９は、プラスミドｐＳＷ２２９内のＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００４１】
配列番号３０は、プラスミドｐＳＷ２２９の核酸配列である。
【００４２】
配列番号３１および３２は、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）内にサブクローニングされたメソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）アセチルキシランエステラーゼのコドン最適化型をコードするＰＣＲ産物を生成して、ｐＳＷ２３１として同定されるプラスミドを作成するために使用されるＰＣＲプライマーである。
【００４３】
配列番号３３は、プラスミドｐＳＷ２３１内のＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００４４】
配列番号３４は、プラスミドｐＳＷ２３１の核酸配列である。
【００４５】
配列番号３５および３６は、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）内にサブクローニングされたゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アセチルキシランエステラーゼのコドン最適化型をコードするＰＣＲ産物を生成して、ｐＳＷ２３６として同定されるプラスミドを作成するために使用されるＰＣＲプライマーである。
【００４６】
配列番号３７は、プラスミドｐＳＷ２３６内のＰＣＲ産物の核酸配列である。
【００４７】
配列番号３８は、プラスミドｐＳＷ２３６の核酸配列である。
【００４８】
配列番号３９は、過加水分解活性を有するサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）酵素のアミノ酸配列である（米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＡＢ７０８６９．１）。
【００４９】
配列番号４０は、過加水分解活性を有するサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）酵素のアミノ酸配列である（米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＮＰ＿２２７８９３．１）。
【００５０】
配列番号４１は、過加水分解活性を有するバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）酵素のアミノ酸配列である（米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書、Ｄｅｇｒａｓｓｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４６：１５８５−１５９１（２０００年））。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
基質、過酸素源、および過加水分解活性を有する酵素触媒を混ぜ合わせることによりペルオキシカルボン酸を生成するための方法が提供されており、ここで、酵素触媒は、ＣＥ−７シグネチャーモチーフと、配列番号４に対する少なくとも９５％のアミノ酸同一性とを有する酵素を含む。約６．０〜約９．０のｐＨ範囲内にとどまる水性反応混合物中で反応を実行する場合、酵素触媒は、他の反応成分と混ぜ合わせられる際に、ペルオキシカルボン酸生成の高い初期速度と、その後の過加水分解活性の急速な低下および／または損失とを特徴とする。これらの特徴の組み合わせは、所望の過酸濃度がいったん生じたら実質的に増大しないペルオキシカルボン酸濃度（「標的」濃度）の急速な生成を容易にする。
【００５２】
本発明の方法によって生成されるペルオキシカルボン酸の量は、反応混合物中の基質の量によっても過酸素の量によっても制限されないことが理解される。このようにして、本明細書中に記載される反応条件（過加水分解活性を有する他のＣＥ−７酵素では、通常、反応成分を混ぜ合わせてから５分より長く経過しても、実質的に増大する濃度でペルオキシカルボン酸を生成し続ける条件）下で、本発明の酵素触媒を用いて生成されるペルオキシカルボン酸の量を制御することができる。
【００５３】
本発明の方法によって生成されるペルオキシカルボン酸は、消毒、漂白、または（消毒および漂白に加えて）脱染、脱臭、およびこれらの組み合わせを含み得るランドリーケア用途のために織物に利益を提供することを含む（これらに限定されない）様々な用途で使用することができる。本発明の方法は、過剰量のペルオキシカルボン酸および／または６．０未満のｐＨが腐食または過剰漂白などの望ましくない効果を有する可能性のある用途で使用するために特に魅力的である。
【００５４】
本開示ではいくつかの用語および略語が使用される。他に具体的に記載されない限りは以下の定義が適用される。
【００５５】
本明細書で用いられる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、特許請求の範囲において言及される規定の特徴、整数、ステップ、または成分の存在を意味するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、成分またはそれらの群の存在または付加を排除しない。「含む」という用語は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語によって包含される実施形態を含むことが意図される。同様に、「から本質的になる」という用語は、「からなる」という用語によって包含される実施形態を含むことが意図される。
【００５６】
本明細書で用いられる場合、使用される材料または反応物の量を修正する「約」という用語は、例えば、濃縮物を製造するため、または実際に溶液を使用するために使用される典型的な測定および液体処理手順によって、これらの手順における故意でない誤差によって、組成物を製造する、または方法を実行するために使用される材料の製造、供給源、または純度の差異によって、および同類のことによって生じ得る数量の変動を指す。また「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物に対する平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修正されるかどうかにかかわらず、特許請求の範囲は、その量と同等の量を含む。
【００５７】
本明細書で用いられる場合、「ペルオキシカルボン酸」という用語は、過酸、ペルオキシ酸（ｐｅｒｏｘｙａｃｉｄ）、ペルオキシ酸（ｐｅｒｏｘｙ  ａｃｉｄ）、過カルボン酸およびペルオキソ酸（ｐｅｒｏｘｏｉｃ  ａｃｉｄ）と同義である。
【００５８】
本明細書で用いられる場合、「過酢酸」という用語は「ＰＡＡ」と略され、ペルオキシ酢酸、エタンペルオキソ酸、およびＣＡＳ登録番号７９−２１−０の他の全ての同義語と同義である。
【００５９】
本明細書で用いられる場合、「モノアセチン」という用語は、グリセロールモノアセタート、グリセリンモノアセタート、およびグリセリルモノアセタートと同義である。
【００６０】
本明細書で用いられる場合、「ジアセチン」という用語は、グリセロールジアセタート、グリセリンジアセタート、グリセリルジアセタート、およびＣＡＳ登録番号２５３９５−３１−７の全ての他の同義語と同義である。
【００６１】
本明細書で用いられる場合、「トリアセチン」という用語は、グリセリントリアセタート、グリセロールトリアセタート、グリセリルトリアセタート、１，２，３−トリアセトキシプロパン、１，２，３−プロパントリオールトリアセタート、およびＣＡＳ登録番号１０２−７６−１の全ての他の同義語と同義である。
【００６２】
本明細書で用いられる場合、「モノブチリン」という用語は、グリセロールモノブチラート、グリセリンモノブチラート、およびグリセリルモノブチラートと同義である。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、「ジブチリン」という用語は、グリセロールジブチラートおよびグリセリルジブチラートと同義である。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、「トリブチリン」という用語は、グリセロールトリブチラート、１，２，３−トリブチリルグリセロール、およびＣＡＳ登録番号６０−０１−５の全ての他の同義語と同義である。
【００６５】
本明細書で用いられる場合、「モノプロピオニン」という用語は、グリセロールモノプロピオナート、グリセリンモノプロピオナート、およびグリセリルモノプロピオナートと同義である。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、「ジプロピオニン」という用語は、グリセロールジプロピオナートおよびグリセリルジプロピオナートと同義である。
【００６７】
本明細書で用いられる場合、「トリプロピオニン」という用語は、グリセリルトリプロピオナート、グリセロールトリプロピオナート、１，２，３−トリプロピオニルグリセロール、およびＣＡＳ登録番号１３９−４５−７の全ての他の同義語と同義である。
【００６８】
本明細書で用いられる場合、「酢酸エチル」という用語は、酢酸エーテル、アセトキシエタン、エタン酸エチル、酢酸エチルエステル、エタン酸エチルエステル、エチル酢酸エステル、およびＣＡＳ登録番号１４１−７８−６の全ての他の同義語と同義である。
【００６９】
本明細書で用いられる場合、「乳酸エチル」という用語は、乳酸エチルエステル、およびＣＡＳ登録番号９７−６４−３の全ての他の同義語と同義である。
【００７０】
本明細書で用いられる場合、「アセチル化糖」および「アセチル化糖類」という用語は、少なくとも１つのアセチル基を含む単糖、二糖および多糖を指す。例として、グルコースペンタアセタート、キシローステトラアセタート、アセチル化キシラン、アセチル化キシラン断片、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセタート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、およびトリ−Ｏ−アセチル−グルカールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
本明細書で用いられる場合、「ヒドロカルビル」、「ヒドロカルビル基」、および「ヒドロカルビル部分」という用語は、炭素−炭素の単結合、二重結合、または三重結合および／またはエーテル結合によって結合され、それに応じて水素原子によって置換された炭素原子の直鎖、分枝状または環状配置を意味する。このようなヒドロカルビル基は、脂肪族および／または芳香族であり得る。ヒドロカルビル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、ペンチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ベンジル、およびフェニルが挙げられる。好ましい実施形態では、ヒドロカルビル部分は、炭素−炭素単結合および／またはエーテル結合によって結合され、それに応じて水素原子によって置換された炭素原子の直鎖、分枝状または環状配置である。
【００７２】
本明細書で用いられる場合、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールの「モノエステル」および「ジエステル」という用語は、式ＲＣ（Ｏ）Ｏ（式中、ＲはＣ１〜Ｃ７線状ヒドロカルビル部分である）の少なくとも１つのエステル基を含む前記化合物を指す。一実施形態では、基質は、プロピレングリコールジアセタート（ＰＧＤＡ）、エチレングリコールジアセタート（ＥＧＤＡ）またはこれらの混合物を含む。
【００７３】
本明細書で用いられる場合、「適切な酵素反応混合物」、「ペルオキシカルボン酸の発生に適切な成分」、「適切な反応成分」、「反応成分」、「反応混合物」、および「適切な水性反応混合物」という用語は、反応物および本発明の酵素触媒が接触される材料および水を指す。反応混合物の成分は本明細書において提供されており、当業者は本方法に適した成分の変化の範囲を認識する。一実施形態では、酵素反応混合物は、反応成分を混ぜ合わせると、その場でペルオキシカルボン酸を生成する。従って、反応成分は多成分系として提供され、反応成分の１つまたは複数は使用されるまで別々に保持され得る。いくつかの活性成分を分離および結合するための系および手段の設計は当該技術分野において知られており、一般に、個々の反応成分の物理的な形態に依存するであろう。例えば、反応性流体を混合したときに所望の漂白剤が生成されるいくつかの漂白用途において見られるように、いくつかの活性流体（液体−液体）系は、通常、マルチチャンバディスペンサーボトルまたは２相系を使用する（米国特許出願公開第２００５／０１３９６０８号明細書、米国特許第５，３９８，８４６号明細書、米国特許第５，６２４，６３４号明細書、米国特許第６，３９１，８４０号明細書、欧州特許第０８０７１５６Ｂ１号明細書、米国特許出願公開第２００５／０００８５２６号明細書、およびＰＣＴ公報国際公開第００／１１７１３Ａ１号パンフレット）。ペルオキシカルボン酸を発生させるために使用される多成分系の他の形態には、粉末（例えば、いくつかの市販の漂白組成物、米国特許第５，１１６，５７５号明細書）、多層錠剤（米国特許第６，２１０，６３９号明細書）、いくつかのコンパートメントを有する水溶性パケット（米国特許第６，９９５，１２５号明細書）および水を添加すると反応する固体凝集体（米国特許第６，３１９，８８８号明細書）などの、１つまたは複数の固体成分または固体−液体成分の組み合わせのために設計されたものが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００７４】
本明細書で用いられる場合、「基質」という用語は、過酸化水素などの適切な過酸素源の存在下で本発明の酵素触媒を用いて酵素的に過加水分解される反応成分を指すであろう。一実施形態では、基質は、本発明の酵素触媒を用いて酵素的に過加水分解されることが可能な少なくとも１つのエステル基を含み、それにより、ペルオキシカルボン酸が生成される。さらなる実施形態では、本発明の方法は、実質的に安定した標的濃度のペルオキシカルボン酸の生成が過剰な基質の存在下で達成される反応成分および条件を含む。
【００７５】
本明細書で用いられる場合、「反応生成物」という用語は、選択された反応成分を混ぜ合わせた後に反応混合物内で形成される化合物の混合物を指すであろう。反応生成物は、酵素的に発生されたペルオキシカルボン酸（例えば、過酢酸）と、対応するカルボン酸（例えば、酢酸）などの１つまたは複数の加水分解生成物（酵素的および／または化学的な加水分解生成物）とで構成される。一実施形態では、選択された反応成分のセットを混ぜ合わせると、反応成分を混ぜ合わせた１０分以内、好ましくは約１分〜約１０分以内に過加水分解触媒を実質的に減少および／または不活性化させる反応生成物を形成することができる反応混合物が生じ、ここで、反応混合物のｐＨは、ペルオキシカルボン酸の所望の標的濃度が達成されるまで、６．０〜９．０の間、好ましくは６．５〜８．０の間に維持される。一実施形態では、酵素触媒の過加水分解活性は、反応成分を混ぜ合わせてから１０分以内に少なくとも８０％低減される。
【００７６】
本明細書で用いられる場合、「過加水分解」という用語は、ペルオキシカルボン酸を形成するための、選択された基質と過酸化水素源との反応であると定義される。通常、無機過酸化物が触媒の存在下で選択された基質と反応されて、ペルオキシカルボン酸を生成する。本明細書で用いられる場合、「化学的な過加水分解」という用語は、基質（ペルオキシカルボン酸前駆体）が過酸化水素源と混ぜ合わせられる過加水分解反応を含み、この場合、ペルオキシカルボン酸は酵素触媒の非存在下で形成される。本明細書で用いられる場合、「酵素的な過加水分解」という用語は、ペルオキシカルボン酸を形成するための、選択された基質と過酸化水素源との反応を指し、この場合、反応は過加水分解活性を有する酵素触媒によって触媒される。
【００７７】
本明細書で用いられる場合、「ペルヒドロラーゼ活性」という用語は、タンパク質の単位質量（例えば、ミリグラム）、乾燥細胞重量、または固定化触媒重量あたりの酵素触媒活性を指す。
【００７８】
本明細書で用いられる場合、「酵素活性の１単位」または「活性の１単位」または「Ｕ」は、特定の温度で１分あたり１μｍｏｌのペルオキシカルボン酸生成物を生成するために必要とされるペルヒドロラーゼ活性の量であると定義される。
【００７９】
本明細書で用いられる場合、「酵素触媒」および「ペルヒドロラーゼ触媒」という用語は、過加水分解活性を有する酵素を含む触媒を指し、全微生物細胞、透過処理された微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つまたは複数の細胞成分、部分精製酵素、または精製酵素の形態であり得る。また酵素触媒は、化学修飾されていてもよい（例えば、ペグ化による、または架橋試薬との反応による）。またペルヒドロラーゼ触媒は、当業者によく知られている方法を用いて可溶性または不溶性の担体に固定化されていてもよく、例えば、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ」，Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ，１９９７年が参照される。本明細書中に記載されているように、過加水分解活性を有する本発明の酵素は、構造的に、酵素の炭水化物ファミリーエステラーゼファミリー７（ＣＥ−７ファミリー）のメンバーであると分類される（Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ」ｉｎ「Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，Ｈ．Ｊ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｂ．ＨｅｎｒｉｓｓａｔおよびＢ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ編，（１９９９年）Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，３−１２頁を参照）。本発明のＣＥ−７ペルヒドロラーゼ触媒は、アミノ酸配列番号４を有する酵素または配列番号４と実質的に類似している酵素を含む。実質的に類似の生物学的分子を同定するための手段は当該技術分野においてよく知られている（例えば、配列アライメントプロトコール、核酸ハイブリダイゼーション、保存シグネチャーモチーフの存在など）。１つの態様では、本発明の方法における酵素触媒は、配列番号４に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有する実質的に類似の酵素を含む。過加水分解活性を有する本発明の酵素をコードする核酸分子も本明細書中で提供される。さらなる実施形態では、本発明の方法において有用なペルヒドロラーゼ触媒は、アミノ酸配列番号４を有するポリペプチドをコードする核酸分子とストリンジェント条件でハイブリッド形成する核酸分子によってコードされる。
【００８０】
本明細書で用いられる場合、「セファロスポリンＣデアセチラーゼ」および「セファロスポリンＣアセチルヒドロラーゼ」という用語は、セファロスポリンＣおよび７−アミノセファロスポラン酸などのセファロスポリンの脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）を指す（Ｍｉｔｓｕｓｈｉｍａら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（６）：２２２４−２２２９（１９９５年）、米国特許第５，５２８，１５２号明細書、および米国特許第５，３３８，６７６号明細書）。セファロスポリンＣデアセチラーゼと分類される酵素は、多くの場合、有意なペルヒドロラーゼ活性を有することが示されている（ＤｉＣｏｓｉｍｏら、米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書）。
【００８１】
本明細書で用いられる場合、「アセチルキシランエステラーゼ」は、アセチル化キシランおよび他のアセチル化糖類の脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２、ＡＸＥ）を指す。アセチルキシランエステラーゼと分類される酵素はペルヒドロラーゼ活性を有することが示されている（ＤｉＣｏｓｉｍｏら、米国特許出願公開第２００９／０００５５９０号明細書）。
【００８２】
本明細書で用いられる場合、「バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭ」という用語は、国際寄託受入番号ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭを有する、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された細菌細胞を指す。Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭからの有意なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は既に記載されており（米国特出願許第１１／６３８，６３５号明細書）、配列番号２として提供される（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＢＡＡ０１７２９．１）。Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭペルヒドロラーゼ配列（配列番号２）は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリー内の保存構造を定義する保存ＣＥ−７シグネチャーモチーフを示すための参照配列として使用される（米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書およびＶｉｎｃｅｎｔらの上記文献）。参照配列番号２とのＣＬＵＳＴＡＬＷを用いるアミノ酸配列アライメントは、ＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を同定するために使用することができる。保存モチーフを示すいくつかのファミリー７炭水化物エステラーゼのＣＬＵＳＴＡＬアライメントの一例は、図１Ａおよび１Ｂに提供されている。小さい挿入および欠失のために、モチーフの相対的なアミノ酸位置の間のわずかな変化（通常、６個のアミノまたはそれ以下）が予想される。従って、ＣＥ−７シグネチャーモチーフを含むアミノ酸配列を参照および主張する際に、参照配列のアミノ酸残基の番号付けが使用される。
【００８３】
本明細書で用いられる場合、「ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）」という用語は、乳製品の発酵および植物材料の発酵などの非乳製品分野において使用されている細菌の種を指す（Ｓｉｅｚｅｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００８年）７４（２）：４２４−４３６）。ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）は発酵した植物材料と関連することがより多い亜種であるが、亜種ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモラ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒａ）はより一般的に乳製品の発酵に関連する。一実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性（あるいは、種々の実施形態では、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する酵素を含む。好ましい実施形態では、本発明の酵素触媒は、過加水分解活性を有し、アミノ酸配列番号４を有するラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）からのアセチルキシランエステラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＢＸ７５６３４．１）を含む。
【００８４】
本明細書で用いられる場合、「メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）」という用語は、過加水分解活性を有するアセチルキシランエステラーゼを含む好熱性細菌を指し、配列番号６（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＢＡＢ５３１７９．１）で提供される。
【００８５】
本明細書で用いられる場合、「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」という用語は、過加水分解活性を有するアセチルキシランエステラーゼを含む好熱性細菌を指し、配列番号８（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＡＦ７０２０２．１）で提供される。
【００８６】
本明細書で用いられる場合、「サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）」という用語は、過加水分解活性を有するアセチルキシランエステラーゼを含む細菌を指し、配列番号３９（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＡＢ７０８６９、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書）で提供される。
【００８７】
本明細書で用いられる場合、「サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８」という用語は、過加水分解活性を有するアセチルキシランエステラーゼを含む好熱性細菌を指し、配列番号４０（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＮＰ＿２２７８９３．１、米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書）で提供される。
【００８８】
本明細書で用いられる場合、「バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３」および「バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）」という用語は、過加水分解活性を有するアセチルキシランエステラーゼを含む細菌を指し、配列番号４１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＪ２４９９５７、米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書）で提供される。
【００８９】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的な化学構造単位を指す。本明細書では、特定のアミノ酸を同定するために以下の略語が使用される。
【００９０】
【表１】
2013506421.tif 000007
【００９１】
本明細書で用いられる場合、核酸分子は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で第１の分子の一本鎖が他の分子にアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸断片と「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００１年）において例示されている。温度およびイオン強度条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。
【００９２】
ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である
。核酸をハイブリッド形成するために適切なストリンジェンシーは、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍの値も大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに相当する）は、以下の順：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡで低下する。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための式が誘導されている（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、上記）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、上記）。１つの態様では、ハイブリッド形成可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリッド形成可能な核酸の最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さであり、さらにより好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの長さであり、さらにより好ましくは少なくとも３００ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは少なくとも８００ヌクレオチドの長さである。さらに、当業者は、プローブの長さなどの因子に従って必要であれば温度および洗浄溶液の塩濃度が調整され得ることを認識するであろう。
【００９３】
本明細書で用いられる場合、「同一性パーセント」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列間、または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、「同一性」は、場合によっては、このような配列のストリング間のマッチによって決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８年）、「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９３年）、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ」（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４年）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）、および「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９１年）において記載される方法を含むがこれらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に利用可能なンピュータプログラムにおいて体系化されている。配列アライメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ベクターＮＴＩバージョン７．０のＡｌｉｇｎＸプログラム（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、またはＥＭＢＯＳＳ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ、Ｒｉｃｅら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６、（６）２７６−２７７頁（２０００年））を用いて実施され得る。配列の多重アライメントは、アライメントのＣＬＵＳＴＡＬ法（すなわち、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、例えばバージョン１．８３）（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１−１５３（１９８９年）、Ｈｉｇｇｉｎｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４年）、およびＣｈｅｎｎａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１（１３）：３４９７−５００（２００３年）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅを介してＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能）をデフォルトパラメータと共に用いて実施することができる。ＣＬＵＳＴＡＬＷタンパク質アライメントのために適切なパラメータには、ＧＡＰ存在ペナルティー＝１５、ＧＡＰ伸長＝０．２、マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ（例えば、Ｇｏｎｎｅｔ２５０）、タンパク質ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質ＧＡＰ���ＩＳＴ＝４、およびＫＴＵＰＬＥ＝１が含まれる。一実施形態では、速いまたは遅いアライメントがデフォルト設定と共に使用され、遅いアライメントが好ましい。あるいは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法（バージョン１．８３）を用いるパラメータを修正して、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ伸長＝１、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６４）、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＴＯＰ  ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５も使用することができる。
【００９４】
本明細書で用いられる場合、「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものでもよいし、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアには、ＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０年）、およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（例えば、バージョン１．８３、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２），４６７３−４６８０（１９９４年）、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、１９９２年会議，１１１−２０．編：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ベクターＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）およびＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｖ．４．０５が含まれ得るがこれらに限定されない。本出願に関連して、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、他に指定されない限り、分析結果が言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことは理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」は、最初の初期化の際にソフトウェアと共に元々ロードされた、ソフトウェア製造業者により設定された任意の値のセットまたはパラメータセットを意味するであろう。
【００９５】
本明細書で用いられる場合、「生物学的汚染物質」という用語は、１つまたは複数の不要なおよび／または病原性の生物学的実体を指し、微生物、胞子、ウィルス、プリオン、およびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。本発明の酵素を用いて、生存可能な生物学的汚染物質の存在を低減および／または除去するために有用である、効果的な濃度の少なくとも１つの過カルボン酸を生成することができる。好ましい実施形態では、生物学的汚染物質は生存可能な病原性微生物である。
【００９６】
本明細書で用いられる場合、「消毒する」という用語は、生物学的汚染物質を破壊する、またはその増殖を防止する過程を指す。本明細書で用いられる場合、「消毒薬」という用語は、生物学的汚染物質の破壊、中和、または増殖の阻害により消毒する薬剤を指す。通常、消毒薬は、無生物体または表面を処理するために使用される。本明細書で用いられる場合、「防腐剤」という用語は、疾患を保有する微生物の増殖を阻害する化学薬品を指す。実施形態の１つの態様では、生物学的汚染物質は病原性微生物である。
【００９７】
本明細書で用いられる場合、「抗ウィルス剤（ｖｉｒｕｃｉｄｅ）」という用語は、ウィルスを阻害または破壊する薬剤を指し、「抗ウィルス薬（ｖｉｒｉｃｉｄｅ）」と同義である。ウィルスを阻害または破壊する能力を示す薬剤は、「抗ウィルス」活性を有すると説明される。ペルオキシカルボン酸は、抗ウィルス活性を有することができる。本発明と共に使用するのに適し得る当該技術分野で既知の典型的な代替の抗ウィルス剤としては、例えば、アルコール、エーテル、クロロホルム、ホルムアルデヒド、フェノール、ベータプロピオラクトン、ヨウ素、塩素、水銀塩、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、エチレングリコール、第４級アンモニウム化合物、酵素、および洗剤が挙げられる。
【００９８】
本明細書で用いられる場合、「殺生物剤（ｂｉｏｃｉｄｅ）」という用語は、微生物を不活性化または破壊する化学物質（通常は広範囲）を指す。微生物を不活性化または破壊する能力を示す化学物質は、「殺生物（ｂｉｏｃｉｄａｌ）」活性を有すると説明される。ペルオキシカルボン酸は、殺生物活性を有することができる。本発明における使用に適し得る当該技術分野で既知の典型的な代替の殺生物剤としては、例えば、塩素、二酸化塩素、クロロイソシアヌラート、次亜塩素酸塩、オゾン、アクロレイン、アミン、塩素化フェノール（ｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ  ｐｈｅｎｏｌｉｃ）、銅塩、有機硫黄化合物、および第４級アンモニウム塩が挙げられる。
【００９９】
本明細書で用いられる場合、「最小殺生物濃度」という語句は、特定の接触時間に、標的微生物の生存可能な集団において所望の致死的で不可逆的な低減を生じ得る殺生物剤の最小濃度を指す。有効性は、処理後の生存可能な微生物の減少のｌｏｇ１０によって測定することができる。１つの態様では、標的とされる生存可能な微生物の処理後の減少は、少なくとも３−ｌｏｇの減少、より好ましくは少なくとも４−ｌｏｇの減少、最も好ましくは少なくとも５−ｌｏｇの減少である。別の態様では、最小殺生物濃度は、生存可能な微生物細胞の少なくとも６−ｌｏｇの減少である。
【０１００】
本明細書で用いられる場合、「過酸素源」および「過酸素の源」という用語は、水溶液中にある場合に約１ｍＭ以上の濃度の過酸化水素を提供することができる化合物を指し、過酸化水素、過酸化水素付加物（例えば、尿素−過酸化水素付加物（過酸化カルバミド））、過ホウ酸塩、および過炭酸塩が含まれるが、これらに限定されない。本明細書において記載されるように、水性反応混合物中の過酸素化合物によって提供される過酸化水素の濃度は、反応成分を混ぜ合わせたときに最初は少なくとも１ｍＭ以上である。一実施形態では、水性反応混合物中の過酸化水素濃度は、少なくとも１０ｍＭである。別の実施形態では、水性反応混合物中の過酸化水素濃度は、少なくとも１００ｍＭである。別の実施形態では、水性反応混合物中の過酸化水素濃度は、少なくとも２００ｍＭである。別の実施形態では、水性反応混合物中の過酸化水素濃度は、５００ｍＭ以上である。さらに別の実施形態では、水性反応混合物中の過酸化水素濃度は、１０００ｍＭ以上である。水性反応混合物中の酵素基質、例えばトリグリセリドに対する過酸化水素のモル比（Ｈ２Ｏ２：基質）は約０．００２〜２０でよく、好ましくは約０．１〜１０、最も好ましくは約０．５〜５でよい。
【０１０１】
本明細書で用いられる場合、「有益な薬剤」という用語は、有用な利点または好ましい効果を促進または増強するものを指す。一実施形態では、消毒、漂白、脱染、脱臭、およびこれらの任意の組み合わせなどの所望の利益を達成するために、ペルオキシカルボン酸を含む組成物などの有益な薬剤を織物に適用させる方法が提供される。
【０１０２】
本明細書で用いられる場合、「実質的な増大ではない」、「有意な増大ではない」、および「超過されない」という用語は、特定の時点で測定されたペルオキシカルボン酸濃度に対して反応混合物中のペルオキシカルボン酸の濃度の増大を指す場合に使用され、特定の時点とは、反応成分が混ぜ合わせられて（それにより、ペルオキシカルボン酸が生成される）からの時間を指す。本発明の方法は、特定の時点で、実質的に安定した濃度のペルオキシカルボン酸を生成する。本明細書で用いられる場合、「実質的に安定した濃度」は、定義された時間間隔にわたって１００％よりも大きく増大しない反応混合物中のペルオキシカルボン酸の濃度（すなわち、２×以下である）を指すであろう。一実施形態では、反応成分を混ぜ合わせてから１分後に生成されるペルオキシカルボン酸の濃度は、１分後の濃度の変化が比較される参照濃度である。濃度の変化は、参照時間濃度に対する濃度変化パーセント（％）で報告することができる。別の実施形態では、ペルオキシカルボン酸の参照濃度は、反応成分を混ぜ合わせてから５分後に測定される濃度である。一実施形態では、ペルオキシカルボン酸濃度の実質的でない増大は、特定の時点で測定される参照濃度よりも、１００％以下の増大（すなわち、２×）、好ましくは５０％以下、最も好ましくは２０％以下だけ高いと定義されるであろう。
【０１０３】
一実施形態では、反応成分を混ぜ合わせてから１分後に生成されるペルオキシカルボン酸の濃度は、反応成分を混ぜ合わせてから３０分以上、好ましくは５分以上の反応時間で、１００％よりも大きく超過されず、好ましくは５０％よりも大きく超過されず、より好ましくは２０％よりも大きく超過されない（すなわち、増大されない）。
【０１０４】
別の実施形態では、反応成分を混ぜ合わせてから５分後に生成されるペルオキシカルボン酸の濃度は、反応成分を混ぜ合わせてから３０分以上の反応時間で、１００％よりも大きく超過されず、好ましくは５０％よりも大きく超過されず、より好ましくは２０％よりも大きく超過されない（すなわち、増大されない）。
【０１０５】
本明細書で用いられる場合、「シグネチャーモチーフ」、「ＣＥ−７シグネチャーモチーフ」、および「診断モチーフ」という用語は、定義される活性を有する酵素のファミリー間で共有される保存構造を指す。シグネチャーモチーフは、定義される基質ファミリーに対して類似の酵素活性を有する構造的に関連する酵素のファミリーを定義および／または同定するために使用することができる。シグネチャーモチーフは、単一の連続アミノ酸配列であっても、あるいはシグネチャーモチーフを一緒に形成する不連続の保存モチーフの集まりであってもよい。通常、各保存モチーフは保存アミノ酸配列によって表される。ＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を同定するための手段は本明細書に記載されている。
【０１０６】
過加水分解活性およびＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する炭水化物エステラーゼファミリー７酵素
ＣＥ−７炭水化物エステラーゼのファミリーに属する酵素は、ＣＥ−７シグネチャーモチーフを一緒に形成する不連続モチーフの集まりを共有する（Ｖｉｎｃｅｎｔらの上記文献によって定義される）。ＣＥ−７エステラーゼのためのシグネチャーモチーフは、３つの保存モチーフを含む（残基位置の番号付けは参照配列番号２に関連する）：
ａ）Ａｒｇ１１８−Ｇｌｙ１１９−Ｇｌｎ１２０、
ｂ）Ｇｌｙ１７９−Ｘａａ１８０−Ｓｅｒ１８１−Ｇｌｎ１８２−Ｇｌｙ１８３、および
ｃ）Ｈｉｓ２９８−Ｇｌｕ２９９。
【０１０７】
通常、アミノ酸残基位置１８０のＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、またはスレオニンである。触媒トライアッド（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｔｒｉａｄ）に属する３つのアミノ酸残基のうちの２つは太字である。一実施形態では、アミノ酸残基位置１８０のＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、およびスレオニンからなる群から選択される。
【０１０８】
触媒トライアッドに属するアミノ酸残基は太字である。位置２６９のアスパラギン酸残基（Ａｓｐ２６９）は、触媒トライアッドの第３のメンバーである（Ｓｅｒ１８１−Ａｓｐ２６９−Ｈｉｓ２９８、全ての残基位置は配列番号２のアミノ酸の番号付けに関連する）。
【０１０９】
ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーのメンバーは、過酸化水素などの適切な過酸素源の存在下でカルボン酸エステルからペルオキシカルボン酸を生成するために適切な過加水分解活性を有することが示されている（ＤｉＣｏｓｉｍｏら、米国特許出願第１２／１４３，３７５号明細書）。本発明のペルヒドロラーゼはＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーのメンバーである。本発明のペルヒドロラーゼのＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントは、本発明のペルヒドロラーゼがＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属することを示す（図１Ａおよび１Ｂ、表２）。
【０１１０】
いくつかのよく知られているグローバルなアライメントアルゴリズムを用いて、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を表す２つ以上のアミノ酸配列を整列させて、酵素がＣＥ−７シグネチャーモチーフで構成されているかどうかを決定することができる。整列された配列は本発明の参照配列（配列番号２）と比較され、シグネチャーモチーフの存在が決定される。一実施形態では、参照アミノ酸配列（本明細書で用いられる場合、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭからのペルヒドロラーゼ配列（配列番号２））を用いるＣＬＵＳＴＡＬアライメント（例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ）を用いて、ＣＥ−７エステラーゼファミリーに属するペルヒドロラーゼを同定する。保存アミノ酸残基の相対的な番号付けは、整列された配列内の小さい挿入または欠失（例えば、６個以下のアミノ酸）を考慮に入れるために、参照アミノ酸配列の残基の番号付けに基づく。
【０１１１】
ＣＥ−７シグネチャーモチーフを含む配列を同定する（参照配列と比較したときに）ために使用することができる他の適切なアルゴリズムの例としては、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３−４５３（１９７０年）、グローバルアライメントツール）、ならびにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１年）、ローカルアライメントツール）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメントは、デフォルトパラメータを用いて実行される。適切なデフォルトパラメータの例としては、ＧＡＰオープンペナルティー＝１０およびＧＡＰ伸長ペナルティー＝０．５と共にＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスの使用が挙げられる。
【０１１２】
米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書は、ペルヒドロラーゼ活性を有するいくつかのＣＥ−７酵素間で、全体的な同一性パーセントの比較を提供しており、保存ＣＥ−７シグネチャーモチーフを有するメンバー間で、多くの場合、非常に低い同一性パーセントが観察されることが示される。ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーのメンバー間のＢＬＡＳＴＰ比較は表１に提供される。表１で提供されるＣＥ−７酵素はその全長にわたって比較的低い全体的な同一性パーセントを有し得るが、メンバーの全てが表２に示されるように保存ＣＥ−７シグネチャーモチーフを共有する。
【０１１３】
【表２】
2013506421.tif 000008
【０１１４】
表１のペルヒドロラーゼ活性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼは全て、図１Ａおよび１Ｂ（下線）ならびに表２に示されるようなＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する
。
【０１１５】
【表３】
2013506421.tif 000009
【０１１６】
本発明の実施例は、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）ペルヒドロラーゼ（配列番号６）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ペルヒドロラーゼ（配列番号８）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号２）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）（配列番号３９）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）（配列番号４０）、およびバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）（配列番号４１）からのペルヒドロラーゼと比較して、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ペルヒドロラーゼ（配列番号４）に特有の特性を説明する。より具体的には、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ペルヒドロラーゼは、反応成分を混ぜ合わせてから５分後、好ましくは１分後に実質的に増大しない標的のペルオキシカルボン酸濃度を急速に生じる能力を特徴とする。実施例で説明されるように、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ペルヒドロラーゼに特有である急速な酵素不活性化はｐＨの実質的な降下とは無関係であり、ここで、反応混合物のｐＨは、酵素触媒反応の過程を通して、６．０〜約９．０、好ましくは６．５〜８．５の間の範囲内にとどまる。酵素触媒が、配列番号４に対するアミノ酸同一性が少なくとも９５％である過加水分解活性を有する酵素を含む限り、所望の濃度は、選択される反応成分の量を調整することによって制御することができる。一実施形態では、酵素触媒は、アミノ酸配列番号４の過加水分解活性を有する酵素を含む。別の実施形態では、反応成分は、反応成分を混ぜ合わせてから５分以内（反応成分が混ぜ合わせられ、それにより酵素的な過加水分解が開始されたときから測定される）、好ましくは１分以内に所望の濃度が達成される条件下で混ぜ合わせられ、ここで、ペルオキシカルボン酸濃度は、所望の濃度が達成された後は実質的に増大しない。
【０１１７】
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ペルヒドロラーゼに実質的に類似しているＣＥ−７酵素
当業者は、本発明の範囲が、配列番号４により提供されるようなラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ペルヒドロラーゼと実質的に類似した過加水分解活性を有するＣＥ−７酵素を含むことを認識するであろう。本明細書で用いられる場合、「実質的に類似」は、配列番号４に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、ＣＥ−７シグネチャーモチーフを含むアミノ酸配列を有する酵素を指すことができ、ここで、得られる酵素は、過加水分解酵素に特徴的な機能特性を保持する（すなわち、高過加水分解活性、続いてｐＨの実質的な降下とは無関係に生じる過加水分解活性の損失）。一実施形態では、本発明の酵素はさらにＣＥ−７シグネチャーモチーフを含む。
【０１１８】
一実施形態では、「実質的に類似」という用語は、配列番号４に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸同一性を有し、ＣＥ−７シグネチャーモチーフを含むＣＥ−７ペルヒドロラーゼのアミノ酸配列をコードする核酸分子を指すために使用され得る。例えば、所与の部位で化学的に等価なアミノ酸の生成をもたらすが、コードされるタンパク質の機能特性に影響を与えない遺伝子の改変が一般的であることは、当該技術分野ではよく知られている。本発明の目的のために、置換は、以下の５つの群：
１．  小さい脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、
２．  極性の負帯電残基およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、
３．  極性の正帯電残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、
４．  大きい脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）、ならびに
５．  大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐ．
のうちの１つの中での交換であると定義される。
【０１１９】
従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンに対するコドンは、別のあまり疎水性でない残基（グリシンなど）またはより疎水性の残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコードするコドンによって置換され得る。同様に、１つの負帯電残基による別の残基の置換（アスパラギン酸によるグルタミン酸の置換など）、あるいは１つの正帯電残基による別の残基の置換（リジンによるアルギニンの置換など）をもたらす変化も、機能的に等価な産物を生じることが予想され得る。多くの場合、タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の改変をもたらすヌクレオチドの変化も、タンパク質の活性を変更しないと予想されるであろう。
【０１２０】
提唱される変更のそれぞれは、コードされる産物に特徴的な生物活性の保持の決定と同様に、当該技術分野において十分にルーチン的な技能の範囲内である。一実施形態では、実質的に類似の核酸配列は、高度にストリンジェントな条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃による洗浄）下で配列番号３の相補的配列とハイブリッド形成するその能力によって定義される。
【０１２１】
１つの態様では、適切な核酸分子は過加水分解活性を有するポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有すると共に、ＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する。本発明の適切な核酸分子は、長さが約３００〜約３４０のアミノ酸、好ましくは約３１０〜約３３０のアミノ酸、最も好ましくは約３１２のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【０１２２】
本明細書で用いられる場合、「ｐＨの実質的な降下」または「ｐＨの実質的な変化」は、酵素触媒反応の過程を通して、約１を上回るｐＨの降下を指す。反応混合物のｐＨは、反応の過程を通して、約６．０未満には降下せず、好ましくは約６．０〜約９．０の間、より好ましくは約６．５〜約８．５の間、さらにより好ましくは約７．０〜約８．５の間、最も好ましくは約７．０〜約８．０の間で維持され得ることが理解される。
【０１２３】
本明細書で用いられる場合、「反応の過程を通して」は、最初に反応成分を混ぜ合わせて反応混合物を形成（本発明の触媒を用いて酵素的な過加水分解を開始）してから、酵素触媒が過加水分解活性を示さなくなる時点まで測定される期間を指す。過加水分解活性の損失は、反応混合物中のペルオキシカルボン酸濃度（所望の標的濃度（または濃度範囲）がいったん達成されたら、もうあまり増大しなくなる）によって決定または推測することができる。
【０１２４】
カルボン酸エステルおよび過酸化水素からのペルオキシカルボン酸の酵素に触媒される調製のための適切な反応条件
過加水分解活性を有する酵素触媒の存在下で、カルボン酸エステルおよび無機過酸化物（過酸化水素、過ホウ酸ナトリウムまたは過炭酸ナトリウムなど）を反応させることによって、少なくとも１つのペルオキシカルボン酸を含む水性混合物を生成するための方法が提供され、ここで、酵素触媒は、ＣＥ−７シグネチャーモチーフおよび配列番号４に対する少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する酵素を含み、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ペルヒドロラーゼに特徴的な特性、すなわち５分以内、好ましくは１分以内に反応混合物中でペルオキシカルボン酸を急速に生成する（少なくとも次の３０分（あるいは、好ましい実施形態によって定義されるその他の時点）にわたって実質的に増大しない）ことができるペルヒドロラーゼ活性を保持する。
【０１２５】
一実施形態では、適切な基質は、以下の式：
［Ｘ］ｍＲ５
［式中、Ｘは、式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい）であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、または環状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基によって置換されていてもよい）であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基を含んでおり、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである］
によって提供されるエステルを含み、前記エステルは、２５℃において少なくとも５ｐｐｍである水中の溶解度を有する。
【０１２６】
別の実施形態では、適切な基質は、式：
【化５】
2013506421.tif 000010
（式中、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキル（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい）であり、Ｒ３およびＲ４は個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
のグリセリドを含む。
【０１２７】
別の実施形態では、Ｒ６はＣ１〜Ｃ７線状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい）であり、場合により、１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよい。さらに好ましい実施形態では、Ｒ６はＣ２〜Ｃ７線状ヒドロカルビル部分（場合により、ヒドロキシル基によって置換されていてもよい）であり、そして／あるいは場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよい。
【０１２８】
適切な基質は、アセチル化単糖類、二糖類、および多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類も含む。別の実施形態では、アセチル化糖類は、アセチル化キシラン、アセチル化キシランの断片、アセチル化キシロース（キシローステトラアセタートなど）、アセチル化グルコース（グルコースペンタアセタートなど）、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセタート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール、およびアセチル化セルロースからなる群から選択される。好ましい実施形態では、アセチル化糖類は、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセタート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール、およびアセチル化セルロースからなる群から選択される。
【０１２９】
別の実施形態では、適切な基質は、モノアセチンと、ジアセチンと、トリアセチンと、モノプロピオニンと、ジプロピオニンと、トリプロピオニンと、モノブチリンと、ジブチリンと、トリブチリンと、グルコースペンタアセタートと、キシローステトラアセタートと、アセチル化キシランと、アセチル化キシラン断片と、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセタートと、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタールと、トリ−Ｏ−アセチル−グルカールと、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールのモノエステルまたはジエステルと、そしてこれらの混合物からなる群から選択される。さらなる実施形態では、適切な基質は、プロピレングリコールジアセタート（ＰＧＤＡ）、エチレングリコールジアセタート（ＥＤＧＡ）、またはこれらの混合物を含む。
【０１３０】
別の実施形態では、カルボン酸エステルは、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、基質は、１つまたは複数のエステル基を含むＣ１〜Ｃ６ポリオールである。好ましい実施形態では、Ｃ１〜Ｃ６ポリオールのヒドロキシル基のうちの１つまたは複数は、１つまたは複数のアセトキシ基によって置換されている（１，３−プロパンジオールジアセタート、１，４−ブタンジオールジアセタートなど）。
【０１３１】
別の実施形態では、適切な基質は、酢酸エチル、乳酸メチル、乳酸エチル、グリコール酸メチル、グリコール酸エチル、メトキシ酢酸メチル、メトキシ酢酸エチル、３−ヒドロキシ酪酸メチル、３−ヒドロキシ酪酸エチル、２−アセチルクエン酸トリエチル、グルコースペンタアセタート、グルコノラクトン、グリセリド（モノ、ジ、およびトリグリセリド）、例えば、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン（グリセリルジプロピオナート）、トリプロピオニン（１，２，３−トリプロピオニルグリセロール）、モノブチリン、ジブチリン（グリセリルジブチラート）、トリブチリン（１，２，３−トリブチリルグリセロール）、アセチル化糖類、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【０１３２】
さらなる実施形態では、適切な基質は、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、トリブチリン、酢酸エチル、および乳酸エチルからなる群から選択される。さらに別の態様では、基質は、ジアセチン、トリアセチン、酢酸エチル、および乳酸エチルからなる群から選択される。
【０１３３】
カルボン酸エステルは、酵素に触媒される過加水分解の際に所望の濃度のペルオキシカルボン酸を生成するために十分な濃度で、反応混合物中に存在する。カルボン酸エステルは反応混合物中に完全に溶解性である必要はないが、ペルヒドロラーゼ触媒によってエステルが対応するペルオキシカルボン酸へ転化できるようにするために十分な溶解度を有する。カルボン酸エステルは、反応混合物の０．０００５重量％〜４０重量％の濃度、好ましくは反応混合物の０．１重量％〜２０重量％の濃度、より好ましくは反応混合物の０．５重量％〜１０重量％の濃度で反応混合物中に存在する。カルボン酸エステルの重量％は、場合により、カルボン酸エステルの溶解限度より大きくてもよいので、水、酵素触媒、および過酸化物源から構成される反応混合物中のカルボン酸エステルの濃度は少なくとも０．０００５重量％であり、カルボン酸エステルの残りは２相の水／有機物反応混合物の第２の別個の相として残る。添加されるカルボン酸エステルのすべてが水性反応混合物中に直ちに溶解しなければならないわけではなく、全ての反応成分の初期混合の後、付加的な連続または不連続な混合は任意である。
【０１３４】
本発明の反応成分によって生成されるペルオキシカルボン酸は、本発明の酵素触媒が使用される限り、選択される基質に応じて変化し得る。一実施形態では、生成されるペルオキシカルボン酸は、過酢酸、過プロピオン酸、過酪酸、過乳酸、過グリコール酸、過メトキシ酢酸、過β−ヒドロキシ酪酸、またはこれらの混合物である。
【０１３５】
過酸素源は、過酸化水素、過酸化水素付加物（例えば、尿素−過酸化水素付加物（過酸化カルバミド））、過ホウ酸塩および過炭酸塩を含むことができるが、これらに限定されない。反応混合物中の過酸素化合物の濃度は、０．００３３重量％〜約５０重量％、好ましくは０．０３３重量％〜約４０重量％、より好ましくは０．３３重量％〜約３０重量％の範囲であり得る。
【０１３６】
多くのペルヒドロラーゼ触媒（全細胞、透過処理された全細胞、および部分精製された全細胞抽出物）は、カタラーゼ活性を有することが報告されている（ＥＣ  １．１１．１．６）。カタラーゼは、過酸化水素の酸素および水への転化を触媒する。１つの態様では、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素触媒には、カタラーゼ活性がない。別の態様では、反応混合物にカタラーゼ阻害剤が添加される。カタラーゼ阻害剤の例としては、アジ化ナトリウムおよび硫酸ヒドロキシルアミンが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、必要に応じてカタラーゼ阻害剤の濃度を調整することができる。カタラーゼ阻害剤の濃度は、通常、０．１ｍＭ〜約１Ｍ、好ましくは約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲である。１つの態様では、アジ化ナトリウムの濃度は通常約２０ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲であり、硫酸ヒドロキシルアミンの濃度は通常約０．５ｍＭ〜約３０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭである。
【０１３７】
宿主細胞におけるカタラーゼ活性は、よく知られた技術（トランスポゾン変異誘発、ＲＮＡアンチセンス発現、標的化変異誘発、およびランダム変異誘発を含むがこれらに限定されない）を用いて、カタラーゼ活性の原因である遺伝子の発現を破壊することによって、下方制御または除去することができる。好ましい実施形態では、内在性カタラーゼ活性をコードする遺伝子は、下方制御または破壊（すなわち、ノックアウト）される。本明細書で用いられる場合、「破壊された」遺伝子は、改変された遺伝子によってコードされるタンパク質の活性および／または機能がもう存在しない遺伝子である。遺伝子を破壊するための手段は当該技術分野においてよく知られており、対応するタンパク質の活性および／または機能が存在しなくなる限り、遺伝子への挿入、欠失、または突然変異を含むことができるがこれらに限定されない。さらに好ましい実施形態では、産生宿主は、ｋａｔＧおよびｋａｔＥからなる群から選択される破壊されたカタラーゼ遺伝子を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生宿主である（参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）を参照）。別の実施形態では、産生宿主は、ｋａｔＧおよびｋａｔＥカタラーゼ遺伝子の両方における下方制御および／または破壊を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。ｋａｔＧおよびｋａｔＥの二重ノックアウトを含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が調製されており、本明細書中ではＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＫＬＰ１８と記載されている（実施例３）。
【０１３８】
水性反応混合物中の触媒の濃度は触媒の特定の触媒活性に依存し、所望の反応速度を得るように選択される。過加水分解反応における触媒の重量は、通常、全反応体積の０．０００５ｍｇ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０１０ｍｇ〜２．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。触媒は、当業者によく知られた方法を用いて可溶性または不溶性担体に固定化されてもよく、例えば、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ」，Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ，１９９７年が参照される。固定化触媒の使用は、その後の反応における触媒の回収および再使用を可能にする。酵素触媒は、全微生物細胞、透過処理された微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製または精製酵素、およびこれらの混合物の形態であり得る。
【０１３９】
１つの態様では、カルボン酸エステルの化学的な過加水分解と酵素的な過加水分解との組み合わせによって発生されるペルオキシカルボン酸の濃度は、所望のｐＨにおいて漂白または消毒のために有効な濃度のペルオキシカルボン酸を提供するのに十分である。別の態様では、本発明の方法は、所望の有効な濃度のペルオキシカルボン酸を生成するための酵素および酵素基質の組み合わせを提供し、ここで、酵素を添加しないと、著しくより低い濃度のペルオキシカルボン酸が生成される。無機過酸化物と酵素基質との直接的な化学反応による酵素基質の化学的な過加水分解もいくつかあり得るが、所望の用途において有効な濃度のペルオキシカルボン酸を提供するために十分な濃度のペルオキシカルボン酸が発生されないことがあり、全ペルオキシカルボン酸濃度の有意な増大は、反応混合物への適切なペルヒドロラーゼ触媒の添加によって達成される。
【０１４０】
酵素的な過加水分解によって発生されるペルオキシカルボン酸（例えば、過酢酸）の濃度は、酵素的な過加水分解反応の開始から５分以内、より好ましくは１分以内に、一般に、少なくとも約２ｐｐｍ、好ましくは少なくとも２０ｐｐｍ、好ましくは少なくとも１００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約２００ｐｐｍのペルオキシカルボン酸であり、より好ましくは少なくとも３００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも５００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも７００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約１０００ｐｐｍのペルオキシカルボン酸であり、最も好ましくは少なくとも２０００ｐｐｍのペルオキシカルボン酸である。
【０１４１】
ペルオキシカルボン酸を含む生成混合物は、場合により、希釈剤（水、または大部分は水で構成される溶液を含む）によって希釈されて、所望のより低い標的濃度のペルオキシカルボン酸との混合物を生じてもよい。１つの態様では、所望の濃度（または濃度範囲）のペルオキシカルボン酸を生成するために必要とされる反応時間は約５分以内、より好ましくは約１分以内である。
【０１４２】
他の態様では、ある濃度の生物学的汚染物質で汚染された表面または無生物体は、前記反応成分を混ぜ合わせてから約１分〜約１６８時間以内に、または約１分〜約４８時間以内に、または前記反応成分を混ぜ合わせてから約１分〜２時間以内に、またはこの中の任意の時間間隔で、本明細書中に記載される方法に従って形成されたペルオキシカルボン酸と接触される。
【０１４３】
別の態様では、本明細書中に記載される方法に従って形成されたペルオキシカルボン酸はランドリーケア用途において使用され、ここで、ペルオキシカルボン酸は織物と接触されて、消毒、漂白、脱染、脱臭またはこれらの組み合わせなどの利益を提供する。ペルオキシカルボン酸は、織物の予洗処理剤、洗濯洗剤、染み抜き剤、漂白組成物、脱臭組成物、およびリンス剤を含む様々なランドリーケア製品において使用することができるが、これらに限定されない。一実施形態では、標的表面に対するペルオキシカルボン酸を生成するための本発明の方法はその場で実行される。
【０１４４】
反応の温度は、反応速度と酵素触媒活性の安定性との両方を制御するように選択される。反応の温度は、反応混合物の氷点（約０℃）よりもわずかに高い温度から約７５℃までの範囲でよいが、好ましい反応温度の範囲は約５℃〜約５５℃である。
【０１４５】
ペルオキシカルボン酸を酵素的に生成している間の反応混合物のｐＨは、約６．０〜約９．０、好ましくは約６．５〜約８．５、さらにより好ましくは約６．５〜約７．５の範囲のｐＨに維持される。一実施形態では、反応混合物のｐＨは、反応成分を混ぜ合わせてから少なくとも３０分間は、約６．５〜約８．５の範囲である。反応混合物のｐＨは、リン酸、ピロリン酸、重炭酸、酢酸、またはクエン酸を含むがこれらに限定されない適切な緩衝液の添加または取り込みによって制御することができる。一実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液および重炭酸緩衝液から選択される。緩衝液の濃度は、使用される場合には、通常０．１ｍＭ〜１．０Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜３００ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭである。
【０１４６】
別の態様では、酵素的な過加水分解反応混合物は、反応混合物中のカルボン酸エステルの溶解速度を高めるための分散剤としての役割を果たす有機溶媒を含有し得る。このような溶媒には、プロピレングリコールメチルエーテル、アセトン、シクロヘキサノン、ジエチレングリコールブチルエーテル、トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、イソプロパノール、エタノール、プロピレングリコール、およびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
別の態様では、酵素的な過加水分解生成物は、望ましい機能性を提供する付加的な成分を含有し得る。これらの付加的な成分は、緩衝液、洗剤ビルダー（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｂｕｉｌｄｅｒ）、増粘剤、乳化剤、界面活性剤、湿潤剤、防蝕剤（例えばベンゾトリアゾール）、酵素安定剤、および過酸安定剤（例えば金属イオンキレート化剤）を含むが、これらに限定されない。付加的な成分の多くは洗剤産業においてよく知られている（例えば、参照によって本明細書に援用される米国特許第５，９３２，５３２号明細書に記載されるものを参照されたい）。乳化剤の例としては、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。増粘剤の例としては、ＬＡＰＯＮＩＴＥ（登録商標）ＲＤ、コーンスターチ、ＰＶＰ、ＣＡＲＢＯＷＡＸ（登録商標）、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）、ＣＡＢＯＳＩＬ（登録商標）、ポリソルベート２０、ＰＶＡ、およびレシチンが挙げられるが、これらに限定されない。緩衝系の例としては、リン酸ナトリウム一塩基性／リン酸ナトリウム二塩基性、スルファミン酸／トリエタノールアミン、クエン酸／トリエタノールアミン、酒石酸／トリエタノールアミン、コハク酸／トリエタノールアミン、および酢酸／トリエタノールアミンが挙げられるが、これらに限定されない。界面活性剤の例としては、（ａ）エチレンオキシドまたはプロピレンオキシドのブロックコポリマー、エトキシル化またはプロポキシル化線状および分枝状第１級および第２級アルコール、ならびに脂肪族ホスフィンオキシドなどの非イオン性界面活性剤、（ｂ）第４級アンモニウム化合物、特に、３つのＣ１〜Ｃ２アルキル基に結合した窒素原子にＣ８〜Ｃ２０アルキル基がさらに結合した第４級アンモニウム化合物などのカチオン性界面活性剤、（ｃ）アルカンカルボン酸（例えば、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸）、アルキルホスホナート、アルカンスルホナート（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム「ＳＤＳ」）、または線状もしくは分枝状アルキルベンゼンスルホネート、アルケンスルホナートなどのアニオン性界面活性剤、ならびに（ｄ）アミノカルボン酸、アミノジカルボン酸、アルキルベタイン、およびこれらの混合物などの両性および両性イオン界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。付加的な成分は、香料、染料、過酸化水素安定剤（例えば、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸（ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）２０１０、Ｓｏｌｕｔｉａ  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート剤）、ＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ、ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）０５２０、ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）０５３１、酵素活性の安定剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、および洗剤ビルダーを含むことができる。
【０１４８】
別の態様では、酵素的な過加水分解生成物は、消毒および／または漂白すべき表面または無生物体との接触の前に所望の濃度のペルオキシカルボン酸を発生させるために予め混合されてもよい。
【０１４９】
別の態様では、酵素的な過加水分解生成物は、消毒すべき表面または無生物体との接触の前に所望の濃度のペルオキシカルボン酸を発生させるために予め混合されないが、代わりに、所望の濃度の過カルボン酸を発生させる反応混合物の成分は、消毒すべき表面または無生物体と接触されて、所望の濃度のペルオキシカルボン酸を発生させる。いくつかの実施形態では、反応混合物の成分はその場所で結合または混合される。いくつかの実施形態では、反応成分はその場所に送達または適用され、その後混合または結合されて、所望の濃度のペルオキシカルボン酸を発生させる。
【０１５０】
ペルヒドロラーゼ触媒を用いるペルオキシカルボン酸の生成
ペルオキシカルボン酸はいったん生成されると非常に反応性であり、変数（温度およびｐＨを含むがこれらに限定されない）に依存して長時間にわたって濃度が低下し得る。従って、特に液体配合物については種々の反応成分を別々に保持することが望ましい場合がある。１つの態様では、過酸化水素源は、基質またはペルヒドロラーゼ触媒のいずれか、好ましくは両方から隔てられる。これは、多数のコンパートメントを有するディスペンサーの使用を含むがこれに限定されない様々な技術を用いて（米国特許第４，５８５，１５０号明細書）、ペルヒドロラーゼ触媒と、無機過酸化物および本発明の基質とを使用時に物理的に混ぜ合わせて水性の酵素的過加水分解反応を開始させることによって達成することができる。ペルヒドロラーゼ触媒は、場合により、反応チャンバの本体内に固定化されていてもよいし、あるいは処理の標的とされる表面および／または物体と接触させる前に、ペルオキシカルボン酸を含む反応生成物から分離（例えば、ろ過など）されてもよい。ペルヒドロラーゼ触媒は液体マトリックス中に存在してもよいし、あるいは固体形態（例えば、粉末または錠剤）であってもよいし、あるいは固体マトリックス内に埋め込まれてもよく、これはその後、基質と混合されて酵素的な過加水分解反応を開始させる。さらなる一態様では、ペルヒドロラーゼ触媒は溶解性または多孔質のポーチ内に含有されてもよく、これは水性基質マトリックスに添加されて、酵素的過加水分解を開始させる。付加的なさらなる態様では、酵素触媒を含む粉末は基質（例えばトリアセチン）中に懸濁され、使用時に、水中の過酸素源と混合される。
【０１５１】
ペルオキシカルボン酸および過酸化水素の濃度の決定方法
本発明の方法において、反応物および生成物を分析するために様々な分析方法を使用することができ、これには、滴定、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、質量分析（ＭＳ）、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）、Ｕ．Ｋａｒｓｔら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９（１７）：３６２３−３６２７（１９９７年））によって記載される分析手順、ならびに米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書において記載されるような２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾタゾリン（ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈａｚｏｌｉｎｅ））−６−スルホナート（ＡＢＴＳ）アッセイ（Ｓ．Ｍｉｎｎｉｎｇら、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３７８：２９３−２９８（１９９９年）および国際公開第２００４／０５８９６１Ａ１号パンフレット）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５２】
ペルオキシカルボン酸の最小殺生物濃度の決定
Ｊ．Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎら（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５０：６３−７３（２００２年））によって記載される方法は、ペルオキシカルボン酸、または過酸化水素および酵素基質の最小殺生物濃度（ＭＢＣ）を決定するために使用することができる。アッセイ法は、ＸＴＴの還元阻害に基づいており、ここで、ＸＴＴ（（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩、モノナトリウム塩）は、４９０ｎｍまたは４５０ｎｍで測定される光学濃度（ＯＤ）の変化によって微生物の呼吸活性を示す酸化還元色素である。しかしながら、消毒薬および防腐剤の活性を試験するために利用可能な様々なその他の方法が存在し、生存可能なプレートのカウント、直接的な顕微鏡のカウント、乾燥重量、濁度測定、吸光度、バイオルミネセンスなどが含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｍｏｕｒ  Ｓ．「Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ」，第５版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ，２００１年を参照）。
【０１５３】
酵素的に調製されたペルオキシカルボン酸組成物の使用
本発明の方法に従って生成した、酵素触媒により発生されたペルオキシカルボン酸は、様々な硬い表面／無生物体の用途において生物学的汚染物質の濃度を低減するために使用することができ、例えば、医療機器（例えば、内視鏡）、織物（例えば、衣類、カーペット）、食品の調理用の表面、食品貯蔵および食品包装装置、食品の包装に使用される材料、鶏の孵化場および成育施設、動物の囲い、ならびに微生物および／または抗ウィルス活性を有する使用済みプロセス水の汚染除去のために使用することができる。酵素により発生されたペルオキシカルボン酸は、プリオン（例えば、特定のプロテアーゼ）を不活性化して、さらに殺生物活性を提供するように設計された配合物中で使用することができる。好ましい態様では、本発明のペルオキシカルボン酸組成物は、特に、加圧滅菌することができない医療機器および食品包装装置のための消毒剤として有用である。ペルオキシカルボン酸含有配合物は、ＧＲＡＳまたは食品グレード成分（酵素、酵素基質、過酸化水素、および緩衝液）を用いて調製することができるので、酵素により発生されたペルオキシカルボン酸は、動物の屠殺体、食肉、果物および野菜の汚染除去のため、または加工食品の汚染除去のためにも使用することができる。酵素により発生されたペルオキシカルボン酸は、その最終形態が粉末、液体、ゲル、フィルム、固体またはエアロゾルである製品に組み込むことができる。酵素により発生されたペルオキシカルボン酸は、有効な汚染除去をそれでも提供する濃度まで希釈されてもよい。
【０１５４】
有効な濃度のペルオキシカルボン酸を含む組成物は、表面または物体と、本発明の方法によって生成された生成物とを接触させることによって、生物学的汚染物質で汚染された（汚染された疑いがある）表面および／または無生物体を消毒するために使用することができる。本明細書で用いられる場合、「接触させる」は、清浄化および消毒するのに十分な時間、有効な濃度のペルオキシカルボン酸を含む消毒組成物と、生物学的汚染物質で汚染された疑いがある表面または無生物体とを接触した状態に置くことを指す。接触には、噴霧、処理、浸漬、フラッシング、注入（上または中に）、混合、混ぜ合わせ、ペインティング、コーティング、適用、添加が含まれ、そして、有効な濃度のペルオキシカルボン酸を含むペルオキシカルボン酸溶液もしくは組成物、または有効な濃度のペルオキシカルボン酸を形成する溶液もしくは組成物と、ある濃度の生物学的汚染物質で汚染された疑いがある表面または無生物体との、その他の方法による連通も含まれる。消毒薬組成物は、清浄化および消毒の両方を提供するために清浄化組成物と併用されてもよい。あるいは、単一の組成物で清浄化および消毒の両方を提供するために、配合物中に清浄化剤（例えば、界面活性剤または洗剤）が組み込まれてもよい。
【０１５５】
有効な濃度のペルオキシカルボン酸を含む組成物は、少なくとも１つの付加的な抗菌剤、プリオン分解プロテアーゼの組み合わせ、抗ウィルス剤、殺胞子剤、または殺生物剤を含有することもできる。これらの薬剤と、特許請求される発明によって生成されるペルオキシカルボン酸との組み合わせは生物学的汚染物質で汚染された（汚染された疑いがある）表面および／または物体を清浄化および消毒するために使用される場合に、増大したおよび／または相乗的な効果を提供することができる。適切な抗菌剤には、所望の程度の微生物防護を提供するの十分な量の、カルボン酸エステル（例えば、ｐ−ヒドロキシアルキルベンゾアートおよびアルキルシンナマート）、スルホン酸（例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸）、ヨウ素化合物または活性ハロゲン化合物（例えば、元素ハロゲン、ハロゲン酸化物（例えば、ＮａＯＣｌ、ＨＯＣｌ、ＨＯＢｒ、ＣｌＯ２）、ヨウ素、ハロゲン間化合物（ｉｎｔｅｒｈａｌｉｄｅ）（例えば、一塩化ヨウ素、二塩化ヨウ素、三塩化ヨウ素、四塩化ヨウ素、塩化臭素、一臭化ヨウ素、または二臭化ヨウ素）、ポリハロゲン化物、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、次亜臭素酸塩、次亜臭素酸、クロロ−およびブロモ−ヒダントイン、二酸化塩素、および亜塩素酸ナトリウム）、有機過酸化物（過酸化ベンゾイル、過酸化アルキルベンゾイル、オゾン一重項酸素発生剤、およびこれらの混合物を含む）、フェノール誘導体（ｏ−フェニルフェノール、ｏ−ベンジル−ｐ−クロロフェノール、ｔｅｒｔ−アミルフェノールおよびＣ１〜Ｃ６アルキルヒドロキシベンゾアートなど）、第４級アンモニウム化合物（塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウムおよびこれらの混合物など）、ならびにこのような抗菌剤の混合物が含まれる。有効な量の抗菌剤には、約０．００１重量％〜約６０重量％の抗菌剤、約０．０１重量％〜約１５重量％の抗菌剤、または約０．０８重量％〜約２．５重量％の抗菌剤が含まれる。
【０１５６】
一つの態様では、本発明の方法によって形成されるペルオキシカルボン酸は、ある場所の上におよび／またはある場所で適用される場合に、生存可能な生物学的汚染物質（生存可能な微生物集団）の濃度を低減するために使用することができる。本明細書で用いられる場合、「場所」は、消毒または漂白に適した標的表面の一部または全てを含む。標的表面には、潜在的に生物学的汚染物質で汚染され得る全ての表面が含まれる。非限定的な例としては、食品または飲料産業において見られる装置の表面（タンク、コンベヤー、床、ドレーン、冷凍庫、装置の表面、壁、バルブ、ベルト、パイプ、ドレーン、ジョイント、割れ目、これらの組み合わせなど）、建物の表面（壁、床、および窓など）、非食品産業関連のパイプおよびドレーン（水処理施設、プールおよび温泉場、ならびに発酵タンクを含む）、病院または動物病院の表面（壁、床、ベッド、装置（内視鏡など）、病院／動物病院または他のヘルスケア環境で着用される衣類（衣類、手術着（ｓｃｒｕｂ）、靴を含む）、および他の病院または動物病院の表面など）、レストランの表面、浴室の表面、トイレ、衣服および靴、家禽、ウシ、乳牛、ヤギ、ウマおよびブタなど家畜のための納屋または畜舎の表面、家禽またはエビのための孵化場、ならびに医薬品または生物医薬品の表面（例えば、医薬品または生物医薬品の製造装置、医薬品または生物医薬品の成分、医薬品または生物医薬品の賦形剤）が挙げられる。付加的な硬い表面には、牛肉、鶏肉、豚肉、野菜、果物、シーフード、そしてこれらの組み合わせなどの食品も含まれる。場所は、感染した（ｉｎｆｅｃｔｅｄ）リネンまたはその他の織物などの吸水材料を含むこともできる。また場所は、収穫された植物または植物製品（種子、球茎、塊茎、果実、および野菜を含む）、生育中の植物、特に作物用に生育中の植物（穀草類、葉野菜およびサラダ用作物、根菜、豆類、ベリー状の果実、柑橘果実および硬い果物を含む）も含む。
【０１５７】
硬い表面材料の非限定的な例は、金属（例えば、鋼、ステンレス鋼、クロム、チタン、鉄、銅、真鍮、アルミニウム、およびこれらの合金）、鉱物（例えばコンクリート）、ポリマーおよびプラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリブタジエン、ポリ（アクリロニトリル、ブタジエン、スチレン）、ポリ（アクリロニトリル、ブタジエン）、アクリロニトリルブタジエンなどのポリオレフィン、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、およびナイロンなどのポリアミド）である。付加的な表面としては、レンガ、タイル、セラミック、磁器、木、ビニール、リノリウム、およびカーペットが挙げられる。
【０１５８】
本発明の方法によって形成されるペルオキシカルボン酸は、漂白、脱染、および脱臭を含むがこれらに限定されない利益を織物に提供するために使用されてもよい。本発明の方法によって形成されるペルオキシカルボン酸は、織物の予洗処理剤、洗濯洗剤、染み抜き剤、漂白組成物、脱臭組成物、およびすすぎ（ｒｉｎｓｉｎｇ）剤を含むが、これらに限定されないあらゆるランドリーケア製品において使用することができる。
【０１５９】
組換え微生物の発現
本発明の配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞中、特に微生物宿主の細胞において生成され得る。本発明の遺伝子および核酸分子の発現のための好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌ファミリーにおいて見出すことができ、広範な温度、ｐＨ値、および溶媒耐性にわたって増殖する微生物宿主である。例えば、細菌、酵母、および糸状菌はどれも適切に本発明の核酸分子の発現の宿主となり得ると考えられる。ペルヒドロラーゼは、細胞内、細胞外、または細胞内および細胞外の両方の組み合わせにおいて発現され得るが、ここで、細胞外発現によって、発酵産物からの所望のタンパク質の回収は、細胞内発現によって産生されるタンパク質の回収方法よりも容易になる。転写、翻訳およびタンパク質生合成装置は、細胞バイオマスを発生させるために使用される細胞原料に対して不変なままであり、機能性遺伝子は構わずに発現されるであろう。宿主株の例としては、アスペルギルス属、トリコデルマ属、サッカロミセス属、ピキア属、ファフィア属、クルイベロミセス属、カンジダ属、ハンゼヌラ属、ヤロウィア属、サルモネラ属、バチルス属、アシネトバクター属、ザイモモナス属、アグロバクテリウム属、エリスロバクター属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム属、クロマチウム属、フラボバクテリウム属、サイトファーガ属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ストレプトミセス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリア属、マイコバクテリウム属、ディノコッカス属、エシェリキア属、エルウィニア属、パンテア属、シュードモナス属、スフィンゴモナス属、メチロモナス属、メチロバクター属、メチロコッカス属、メチロサイナス属、メチロミクロビウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス属、シネコシスティス属、シネココッカス属、アナベナ属、チオバチルス属、メタノバクテリウム属、クレブシエラ属、およびミキソコッカス属などの細菌、真菌または酵母種が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、細菌宿主株には、エシェリキア属、バチルス属、およびシュードモナス属が含まれる。好ましい実施形態では、細菌宿主細胞は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【０１６０】
工業的な生成
ペルヒドロラーゼ触媒を産生するために様々な培養方法を適用することができる。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現される特定の遺伝子産物の大規模生成は、バッチおよび連続培養方法の両方によって生成することができる。バッチおよび流加培養方法は一般的であり、当該技術分野においてよく知られており、その例は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，第２版，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）およびＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７（１９９２年）において見出すことができる。
【０１６１】
所望のペルヒドロラーゼ触媒の商業的な産生は、連続培養を用いて達成することもできる。連続培養は開放系であり、定義される培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に、等量の条件培地が処理のために除去される。一般に、連続培養は、主に細胞が対数増殖期にあるときに、細胞を一定の高い液相密度に維持する。あるいは、連続培養は固定化細胞を用いて実施することもでき、ここで、炭素および栄養物は連続的に添加され、価値のある産物、副産物または老廃物は細胞塊から連続的に除去される。細胞の固定化は、天然および／または合成材料で構成される様々な固体担体を用いて実施することができる。
【０１６２】
バッチ、流加発酵、または連続培養からの所望のペルヒドロラーゼ触媒の回収は、当業者に知られている方法のいずれかによって達成され得る。例えば、酵素触媒が細胞内で産生される場合、細胞ペーストは遠心分離または膜ろ過によって培地から分離され、場合により水または所望のｐＨの水性緩衝液で洗浄され、次に、所望のｐＨの水性緩衝液中の細胞ペーストの懸濁液はホモジナイズされて、所望の酵素触媒を含有する細胞抽出物を生じる。細胞抽出物は、場合により、セライトまたはシリカなどの適切なろ過助剤を通してろ過され、酵素触媒溶液から不要なタンパク質を沈殿させるための加熱処理工程の前に細胞片が除去されてもよい。次に、所望の酵素触媒を含有する溶液は、膜ろ過または遠心分離によって、沈殿した細胞片およびタンパク質から分離されてもよく、得られた部分精製酵素触媒溶液は、付加的な膜ろ過によって濃縮され、次に場合により、適切なキャリア（例えば、マルトデキストリン、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはこれらの混合物）と混合され、噴霧乾燥されて所望の酵素触媒を含む固体粉末を生じる。
【０１６３】
量、濃度、またはその他の値もしくはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または上限の好ましい値および下限の好ましい値の一覧のいずれかで与えられる場合、これは、範囲が別々に開示されているかどうかにかかわらず、任意の範囲の上限または好ましい値と任意の範囲の下限または好ましい値との任意の対から形成される全ての範囲を具体的に開示すると理解されるべきである。本明細書において数値の範囲が列挙される場合、他に記載されない限り、その範囲は、その両端点ならびに範囲内の全ての整数および分数を含むことが意図される。範囲を定義する場合、本発明の範囲は、列挙される特定の値に限定することは意図されない。
【実施例】
【０１６４】
一般的な方法
以下の実施例は、好ましい実施形態を実証するために提供される。以下の実施例において開示される技術は、本明細書において開示される方法の実施において十分に機能することが発明者によって発見された技術を示し、従って、その実施のために好ましいモードを構成すると考えられることは、当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本発明の開示を考慮して、開示される特定の実施形態において多くの変化が成され、そしてそれでもなお本開示の方法の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができると認識すべきである。
【０１６５】
全ての試薬および材料は、他に指定されない限り、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０１６６】
本明細書における以下の略語は、以下のように、測定、技術、特性、または化合物の単位に相当する：「ｓｅｃ」または「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ｐｐｍ」は１００万分の１を意味し、「ｗｔ」は重量を意味し、「ｗｔ％」は重量パーセントを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｇ」は重力を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィを意味し、「ｄｄＨ２Ｏ」は蒸留および脱イオン水を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥細胞重量を意味し、「ＡＴＣＣ」または「ＡＴＣＣ（登録商標）」はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を意味し、「Ｕ」はペルヒドロラーゼ活性の単位を意味し、「ｒｐｍ」は１分間の回転数を意味し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味する。
【０１６７】
ＨＰＬＣ法：
プレカラムＳｕｐｅｌｃｏ  Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃５９５９０−Ｕ）を備えたＳｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８カラム（１０ｃｍ×４．０ｍＭ、５μｍ）（カタログ＃５６９４２２−Ｕ）、１０マイクロリットルの注入体積、１．０ｍＬ／分および周囲温度におけるＣＨ３ＣＮ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃２７０７１７）および脱イオンＨ２Ｏによる勾配法。
【０１６８】
【表４】
2013506421.tif 000011
【０１６９】
実施例１
ｋａｔＧカタラーゼ破壊Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築
配列番号１１および配列番号１２と同定されるプライマーを用いるＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で分間１、３０サイクル）によって、カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ、配列番号９）をプラスミドｐＫＤ１３（配列番号１０）から増幅して、配列番号１３と同定されるＰＣＲ産物を生じた。ｋａｔＧ核酸配列は配列番号１４として提供され、対応するアミノ酸配列は配列番号１５である。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ（登録商標）４７０７６ＴＭ）を、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ遺伝子を含有する温度感受性プラスミドｐＫＤ４６（配列番号１６）で形質転換し（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ，２０００年，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５）、ＬＢ−ａｍｐプレートにおいて３０℃で２４時間選択した。エレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ、０．２ｃｍキュベット、２．５ｋＶ、２００Ｗ、２５μＦ）によって、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６を５０〜５００ｎｇのＰＣＲ産物で形質転換し、ＬＢ−ｋａｎプレートにおいて３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーをＬＢ−ｋａｎプレート上に画線し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＫＤ４６プラスミドをキュアリングした。コロニーをチェックして、ｋａｎＲ／ａｍｐＳの表現型を確認した。ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システム（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて数個のコロニーからゲノムＤＮＡを単離し、配列番号１７および配列番号１８と同定されるプライマーを用いてＰＣＲによりチェックして、ｋａｔＧ遺伝子の破壊を確認した。いくつかのｋａｔＧ破壊株を、ＦＬＰリコンビナーゼを含有する温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（配列番号１９）で形質転換し、ｋａｎ遺伝子を切除するために使用し、ＬＢ−ａｍｐプレートにおいて３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーをＬＢプレート上に画線し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＣＰ２０プラスミドをキュアリングした。２つのコロニーをチェックして、ｋａｎＳ／ａｍｐＳの表現型を確認し、ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１およびＭＧ１６５５ＫａｔＧ２と命名した。
【０１７０】
実施例２
ｋａｔＥカタラーゼ破壊Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築
配列番号２０および配列番号２１と同定されるプライマーを用いるＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって、カナマイシン耐性遺伝子（配列番号９）をプラスミドｐＫＤ１３（配列番号１０）から増幅して、配列番号２２と同定されるＰＣＲ産物を生じた。ｋａｔＥ核酸配列は配列番号２３として提供され、対応するアミノ酸配列は配列番号２４である。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ（登録商標）４７０７６ＴＭ）を、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ遺伝子を含有する温度感受性プラスミドｐＫＤ４６（配列番号１６）で形質転換し、ＬＢ−ａｍｐプレートにおいて３０℃で２４時間選択した。エレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ、０．２ｃｍキュベット、２．５ｋＶ、２００Ｗ、２５μＦ）によって、ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６を５０〜５００ｎｇのＰＣＲ産物で形質転換し、ＬＢ−ｋａｎプレートにおいて３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーをＬＢ−ｋａｎプレート上に画線し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＫＤ４６プラスミドをキュアリングした。コロニーをチェックして、ｋａｎＲ／ａｍｐＳの表現型を確認した。ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システム（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いてゲノムＤＮＡを数個のコロニーから単離し、配列番号２５および配列番号２６と同定されるプライマーを用いてＰＣＲによりチェックして、ｋａｔＥ遺伝子の破壊を確認した。いくつかのｋａｔＥ破壊株を、ＦＬＰリコンビナーゼを含有する温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（配列番号１９）で形質転換し、ｋａｎ遺伝子を切除するために使用し、ＬＢ−ａｍｐプレートにおいて３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーをＬＢプレート上に画線し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＣＰ２０プラスミドをキュアリングした。２つのコロニーをチェックして、ｋａｎＳ／ａｍｐＳの表現型を確認し、ＭＧ１６５５ＫａｔＥ１およびＭＧ１６５５ＫａｔＥ２と呼んだ。
【０１７１】
実施例３
ｋａｔＧカタラーゼおよびｋａｔＥカタラーゼ破壊Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＫＬＰ１８）の構築
配列番号２０および配列番号２１と同定されるプライマーを用いるＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって、カナマイシン耐性遺伝子（配列番号９）をプラスミドｐＫＤ１３（配列番号１０）から増幅して、配列番号２２と同定されるＰＣＲ産物を生じた。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１（実施例１）を、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ遺伝子を含有する温度感受性プラスミドｐＫＤ４６（配列番号１６）で形質転換し、ＬＢ−ａｍｐプレートにおいて３０℃で２４時間選択した。エレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ、０．２ｃｍキュベット、２．５ｋＶ、２００Ｗ、２５μＦ）によって、ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１／ｐＫＤ４６を５０〜５００ｎｇのＰＣＲ産物で形質転換し、ＬＢ−ｋａｎプレートにおいて３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーをＬＢ−ｋａｎプレート上に画線し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＫＤ４６プラスミドをキュアリングした。コロニーをチェックして、ｋａｎＲ／ａｍｐＳの表現型を確認した。ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システムを用いてゲノムＤＮＡを数個のコロニーから単離し、配列番号２５および配列番号２６と同定されるプライマーを用いてＰＣＲによりチェックして、ｋａｔＥ遺伝子の破壊を確認した。いくつかのｋａｔＥ破壊株（ΔｋａｔＥ）を、ＦＬＰリコンビナーゼを含有する温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（配列番号１９）で形質転換し、ｋａｎ遺伝子を切除するために使用し、ＬＢ−ａｍｐプレートにおいて３７℃で２４時間選択した。数個のコロニーをＬＢプレート上に画線し、４２℃で一晩インキュベートして、ｐＣＰ２０プラスミドをキュアリングした。２つのコロニーをチェックして、ｋａｎＳ／ａｍｐＳの表現型を確認し、ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１ＫａｔＥ１８．１およびＭＧ１６５５ＫａｔＧ１ＫａｔＥ２３と呼んだ。ＭＧ１６５５ＫａｔＧ１ＫａｔＥ１８．１は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８と称される。
【０１７２】
実施例４
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受入番号ＡＢＸ７５６３４．１）において報告されるようなラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする遺伝子を、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現に対して最適化されたコドン（ＤＮＡ  ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて合成した。続いて、配列番号２７および配列番号２８として同定されるプライマーを用いるＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって遺伝子を増幅した。得られた核酸産物（配列番号２９）をｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）にサブクローニングして、ｐＳＷ２２９（配列番号３０）として同定されるプラスミドを生じた。プラスミドｐＳＷ２２９を用いてＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（二重カタラーゼノックアウト、実施例３）を形質転換して、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２９として同定される株を生じた。ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２９を、ＬＢ培地中３７℃で振とうさせながらＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５まで増殖させ、この時点で、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度になるまで添加し、インキュベーションを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、全可溶性タンパク質の１０〜２０％でペルヒドロラーゼの発現を確認した。
【０１７３】
実施例５
メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受入番号ＢＡＢ５３１７９．１）において報告されるようなメソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする遺伝子を、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現に対して最適化されたコドン（ＤＮＡ  ２．０）を用いて合成した。続いて、配列番号３１および配列番号３２として同定されるプライマーを用いるＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって遺伝子を増幅した。得られた核酸産物（配列番号３３）をｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングして、ｐＳＷ２３１（配列番号３４）として同定されるプラスミドを生じた。プラスミドｐＳＷ２３１を用いてＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（二重カタラーゼノックアウト、実施例３）を形質転換して、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２３１として同定される株を生じた。ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２３１を、ＬＢ培地中３７℃で振とうさせながらＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５まで増殖させ、この時点で、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度になるまで添加し、インキュベーションを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、全可溶性タンパク質の１０−２０％でペルヒドロラーゼの発現を確認した。
【０１７４】
実施例６
ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受入番号ＡＡＦ７０２０２．１）において報告されるようなゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする遺伝子を、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現に対して最適化されたコドン（ＤＮＡ  ２．０）を用いて合成した。続いて、配列番号３５および配列番号３６として同定されるプライマーを用いるＰＣＲ（９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、７０℃で１分間、３０サイクル）によって遺伝子を増幅した。得られた核酸産物（配列番号３７）をｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングして、ｐＳＷ２３６（配列番号３８）として同定されるプラスミドを生じた。プラスミドｐＳＷ２３６を用いてＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（二重カタラーゼノックアウト）を形質転換して、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２３６として同定される株を生じた。ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２３６を、ＬＢ培地中３７℃で振とうさせながらＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５まで増殖させ、この時点で、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度になるまで添加し、インキュベーションを２〜３時間続けた。細胞を遠心分離によって収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、全可溶性タンパク質の１０〜２０％でペルヒドロラーゼの発現を確認した。
【０１７５】
実施例７
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（Ｌｌａ）ペルヒドロラーゼ、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２９
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（Ｌｌａ）のペルヒドロラーゼを発現する株ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２９を、ペルヒドロラーゼ発現のＩＰＴＧ誘発を組み込んだ振とうフラスコ培養において調製および増殖した（実施例４）。５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中２０重量％の細胞懸濁液を１６，０００ｐｓｉ（約１１０．３２ＭＰａ）で操作されるＦｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｅｌｌに２回通すことによって、収集した細胞ペーストの抽出物を調製した。次に、抽出物を２０，０００×ｇ（５℃）で遠心分離して細胞片を除去し、続いて、−８０℃で貯蔵する前に抽出物を全てアリコートに等分した。次に、清澄化抽出物の２つの２５０μＬアリコートを６５℃または７５℃のいずれかで２０分間加熱した後、氷浴中で冷却した。次に、加熱処理した抽出物を１４，０００ｒｐｍで遠心分離して、加熱沈殿タンパク質を除去した。次に、製造業者の使用説明書に従って、清澄化、加熱処理した抽出物においてＢＣＡアッセイ（タンパク質決定のためのビシンコニン酸キット、Ｓｉｇｍａカタログ番号ＢＣＡ１−ＫＴ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を実施して、加熱処理の前後のタンパク質濃度を決定した。結果は、以下の表４に示される。
【０１７６】
【表５】
2013506421.tif 000012
【０１７７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ペルヒドロラーゼを全可溶性タンパク質の百分率として評価した。加熱前、６５℃の加熱処理、および７５℃の加熱処理抽出物のタンパク質負荷は５μｇ／レーンであった。６５℃の加熱処理サンプルは８５〜９０％の純度であると推定された。７５℃で２０分間の加熱処理は、清澄化抽出物からのペルヒドロラーゼタンパク質の消失をもたらした。
【０１７８】
比活性の決定のために、トリアセチン（２５０ｍＭ）、過酸化水素（１０００ｍＭ）、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）および１５μｇ／ｍＬの６５℃の清澄化抽出物タンパク質または２０μｇ／ｍＬの７５℃の加熱処理した清澄化抽出物タンパク質のいずれかを用いて、反応を実行した。１、２、３、４、および５分において反応をサンプリングした後、Ｋａｒｓｔ誘導体化プロトコール（Ｋａｒｓｔら、上記）を用いて分析し、反応混合物のアリコート（０．０４０ｍＬ）を取り出し、水中５ｍＭのリン酸０．９６０ｍＬと混合し、希釈サンプルのｐＨをｐＨ４未満に調整すると反応は直ちに終了した。得られた溶液を、１２，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により、ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）ＭＣ−フィルタユニット（３０，０００分画分子量（ＮＭＷＬ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＵＦＣ３ＬＫＴ００）を用いてろ過した。得られたろ液のアリコート（０．１００ｍＬ）を、０．３００ｍＬの脱イオン水を含有する１．５ｍＬのスクリューキャップＨＰＬＣバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ、＃５１８２−０７１５）に移し、次に、アセトニトリル中２０ｍＭのＭＴＳ（メチル−ｐ−トリル−スルフィド）０．１００ｍＬを添加し、バイアルにフタを閉め、内容物を手短に混合した後、光のない状態で、約２５℃で１０分間のインキュベーションを行った。次に、各バイアルに、０．４００ｍＬのアセトニトリルおよび０．１００ｍＬのトリフェニルホスフィン（ＴＰＰ、４０ｍＭ）のアセトニトリル溶液を添加し、バイアルに再度フタを閉め、得られた溶液を混合し、光のない状態で、約２５℃で３０分間インキュベートした。次に、各バイアルに、０．１００ｍＬの１０ｍＭのＮ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド（ＤＥＥＴ、ＨＰＬＣ外部標準）を添加し、得られた溶液をＨＰＬＣにより分析した。
【０１７９】
また、ペルヒドロラーゼを添加せずに対照反応も実施し、化学的な過加水分解の相対速度を評価した。６５℃で加熱処理したタンパク質を含有する反応は、１分で１１００ｐｐｍのＰＡＡを生成し、２、３、４、または５分では、さらなるＰＡＡは生成されなかった。７５℃で加熱処理したタンパク質を含有する反応は、酵素を含まない対照反応に対して、有意な濃度のＰＡＡを生成しなかった。
【０１８０】
実施例８
メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）ペルヒドロラーゼ（Ｍｌｏ、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２３１）
メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）のペルヒドロラーゼを発現する株ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２３１を、ペルヒドロラーゼ発現のＩＰＴＧ誘発を組み込んだ振とうフラスコ培養において調製および増殖した（実施例５）。次に、１ｍＭのジチオスレイトールを含有する５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、２０重量％の細胞懸濁液を調製した。次に、均一な細胞懸濁液を、１６，０００ｐｓｉ（約１１０．３２ＭＰａ）で操作されるＦｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｅｌｌに２回通した。次に、粗抽出物を２０，０００×ｇ（５℃）で２５分間遠心分離して、細胞片を除去した。次に、数本のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ試験管（それぞれ、２５０μＬの抽出物を含有する）に抽出物を等分した。次に、これらの抽出物サンプルのうちの２つを６５℃または７５℃で２０分間加熱した。各加熱処理に続いて、１４，０００ｒｐｍでの遠心分離の後、各サンプルの加熱沈殿タンパク質を除去した。次に、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を実施して、加熱処理の前後のサンプルのタンパク質濃度を決定した。結果は表５に示される。
【０１８１】
【表６】
2013506421.tif 000013
【０１８２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、ペルヒドロラーゼの精製の度合いを評価した。メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）ペルヒドロラーゼとして同定されるペルヒドロラーゼのバンドは、６５℃または７５℃のいずれかにおける抽出物の加熱処理の後に消失し、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）ペルヒドロラーゼがこれらの温度で変性されることが示された。清澄化された非加熱抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、低レベルのペルヒドロラーゼ発現（全可溶性タンパク質の約５％）示した。ペルヒドロラーゼ比活性の決定のために、トリアセチン（２５０ｍＭ）、過酸化水素（１０００ｍＭ）、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）、および清澄化抽出物の非加熱タンパク質（１００μｇ／ｍＬ）を含有する反応を実行した。反応（２５℃）を５分間毎分サンプリングした。Ｋａｒｓｔ誘導体化プロトコール（Ｋａｒｓｔら、上記）を用いてサンプルを過酢酸（ＰＡＡ）生成について分析した後、ＨＰＬＣ分析を行った。比活性は３．９Ｕ／ｍｇであった。
【０１８３】
Ｍｌｏペルヒドロラーゼの発現の改善のために第２の振とうフラスコ増殖プロトコールを使用した。プロトコールは、１０ｍＬの培地を含む１２５ｍＬの使い捨てのバッフル付フラスコにおける種段階と、２つの１Ｌのバッフル付フラスコ（各フラスコに２５０ｍＬの培地を含む）における産生段階とを含む。種フラスコのための培地は、酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ、５．０ｇ／Ｌ）、Ｋ２ＨＰＯ４（１０．０ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（７．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．０ｇ／Ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（４．０ｇ／Ｌ）およびクエン酸第二鉄アンモニウム（０．１０ｇ／Ｌ）を含有した。培地のｐＨを６．８に調整し、０．２ミクロンフィルタによるろ過によって培地を殺菌した。殺菌後の添加は、グルコース５ｇ／Ｌ、微量元素溶液（５ｍＬ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４（５ｍＭ）、およびアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含んでいた。微量元素溶液は、クエン酸一水和物（１０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４水和物（２ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４七水和物（０．２ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４五水和物（０．０２ｇ／Ｌ）およびＮａＭｏＯ４二水和物（０．０２ｇ／Ｌ）を含有した。種フラスコに１ｍＬの凍結ストックを接種し、７ＯＤ５５０までインキュベートした。３７℃および３００ｒｐｍのインキュベータシェーカーにおいて種フラスコおよび産生フラスコをインキュベートした。産生フラスコのための培地は、酵母抽出物の濃度を２ｇ／Ｌに低下させた点を除いて、種フラスコと同じであった。各産生フラスコに７ｍＬの種培養物を播種した。ＩＰＴＧを約３ＯＤ５５０において０．１ｍＭまで添加してから、インキュベーションを１２時間続け、ここで、増殖は約９ＯＤまで進んだ。遠心分離によって細胞を収集し、−８０℃においてさらなる処理のために細胞ペレットを凍結させた。上記のようにこの収集した細胞ペーストから抽出物を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに基づいて、ペルヒドロラーゼは、全可溶性清澄化抽出物タンパク質の約１０％を表すと推定された。Ｋａｒｓｔ誘導体化プロトコール（Ｋａｒｓｔら、上記）を用いた後、ＨＰＬＣ分析によって比活性を決定し、比活性は３．６Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
【０１８４】
実施例９
ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｇｓｔ、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２３６）：ペルヒドロラーゼの評価
ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｇｓｔ、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２３６）を振とうフラスコ中で増殖および誘発させた後、上記のように抽出物を調整した（実施例７）。次に、抽出物のサンプル（２５０μＬ）を６５℃または７５℃のいずれかで２０分間加熱した後、遠心分離して加熱沈殿タンパク質を除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、加熱および非加熱の清澄化抽出物においてペルヒドロラーゼ純度を推定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに基づいて、ペルヒドロラーゼは、非加熱および加熱抽出物（７５℃）の可溶性タンパク質の５％未満を表すと推定された。６５℃で加熱処理した清澄化抽出物中のペルヒドロラーゼは、全可溶性タンパク質の１５〜２０％を表すと推定された。
【０１８５】
ＴＡ（２５０ｍＭ）、過酸化水素（１０００ｍＭ）、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）、および１００μｇ／ｍＬの清澄化、非加熱または加熱処理した（６５℃）抽出物タンパク質を含有する反応（２５℃）の後に比活性を決定した。１分のサンプリングで５分間の反応を実施した後、Ｋａｒｓｔ誘導体化プロトコール（Ｋａｒｓｔら、上記）およびＨＰＬＣ分析を行った。比活性は、４．４Ｕ／ｍｇ非加熱タンパク質および３．３Ｕ／ｍｇ加熱処理タンパク質であると決定された。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ペルヒドロラーゼが熱安定性であれば、加熱処理タンパク質の比活性は、非加熱タンパク質の比活性よりも高いことが予想されるであろう。清澄化、加熱処理した抽出物タンパク質の比活性は、清澄化した非加熱抽出物タンパク質の比活性よりも低く、ペルヒドロラーゼは６５℃でやや安定なだけであることが示された。
【０１８６】
実施例１０
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのペルヒドロラーゼを用いる過酢酸の生成
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのペルヒドロラーゼを発現する形質転換体（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２９）の細胞抽出物を調製した（実施例７）。次に、粗抽出物を２０，０００×ｇおよび５℃で遠心分離し、細胞片を除去して清澄化細胞抽出物を生成し、これを全可溶性タンパク質についてアッセイした（タンパク質決定のためのビシンコニン酸キット、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＢＣＡ１−ＫＴ）。清澄化抽出物を６５℃で２０分間加熱した後、すぐに氷／水浴中で冷却した。得られた混合物を遠心分離して沈殿したタンパク質を除去し、清澄化、加熱処理した細胞抽出物を集め、前述のように全可溶性タンパク質についてアッセイした。清澄化、加熱処理した細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ペルヒドロラーゼが少なくとも８５〜９０％純粋であることを示した。前述のように、清澄化、加熱処理した細胞抽出物を全可溶性タンパク質についてアッセイし、ドライアイス中で凍結し、−８０℃で貯蔵した。
【０１８７】
トリアセチン、過酸化水素、および５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）または５０ｍＭの重炭酸ナトリウ緩衝液（ｐＨ８．５）中の加熱処理、遠心分離した細胞抽出物（８．８ｍｇ／ｍＬ）（上記のように調製）からの５０μｇ／ｍＬの全タンパク質を含有する反応（２ｍＬの全体積）を２４℃で実行した。各反応条件に対する対照反応を実行して、抽出物タンパク質を添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成される過酢酸の濃度を決定した。反応混合物中の過酢酸の濃度は、実施例７で記載されるようなＫａｒｓｔらの方法に従って決定した。５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中で１分間、５分間および３０分に生成される過酢酸濃度は表６に記載され、５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中の濃度は表７に記載される。ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ペルヒドロラーゼによって生成される過酢酸の濃度は、反応の５〜３０分後に有意に増大しなかったが、Ｍ．ロティ（Ｍ．ｌｏｔｉ）、Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）ペルヒドロラーゼにより同様の反応条件下で生成される過酢酸の濃度は、通常、反応の５分後に増大し続けた（以下の実施例１１〜１５を参照）。
【０１８８】
【表７】
2013506421.tif 000014
【０１８９】
【表８】
2013506421.tif 000015
【０１９０】
実施例１１
メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）からのペルヒドロラーゼを用いる過酢酸の生成（比較）
メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）からのペルヒドロラーゼを発現する形質転換体（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２３１）の細胞抽出物を、Ｍｌｏペルヒドロラーゼの発現の改善のための振とうフラスコ増殖プロトコールによって調製される細胞を用いて、実施例８に記載されるように調製した。清澄化した非加熱細胞抽出物をドライアイス中で凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【０１９１】
トリアセチン、過酸化水素、および５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中の清澄化した非加熱細胞抽出物（２２．８ｍｇ／ｍＬ）（上記のように調製）からの５００μｇ／ｍＬの全タンパク質を含有する反応（２ｍＬの全体積）を２４℃で実行した。対照反応を実行して、抽出物タンパク質を添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成される過酢酸の濃度を決定した。反応混合物中の過酢酸の濃度は、Ｋａｒｓｔら（上記）の方法に従って決定した。１分、５分および３０分で生成される過酢酸濃度は表８に記載される。
【０１９２】
【表９】
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【０１９３】
実施例１２
ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのペルヒドロラーゼを用いる過酢酸の生成（比較）
ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのペルヒドロラーゼを発現する形質転換体（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２３６）の細胞抽出物を実施例９に記載されるように調製した。清澄化した非加熱細胞抽出物をドライアイス中で凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【０１９４】
トリアセチン、過酸化水素、および５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中の清澄化した非加熱細胞抽出物（２１．４ｍｇ／ｍＬ）（上記のように調製）からの５００μｇ／ｍＬの全タンパク質を含有する反応（２ｍＬの全体積）を２４℃で実行した。各反応条件に対する対照反応を実行して、抽出物タンパク質を添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成される過酢酸の濃度を決定した。反応混合物中の過酢酸の濃度は、Ｋａｒｓｔら（上記）の方法に従って決定した。１分、５分および３０分で生成される過酢酸濃度は表９に記載される。
【０１９５】
【表１０】
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【０１９６】
実施例１３
サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼによって生成される過酢酸（比較）
サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのペルヒドロラーゼを発現するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６）の細胞抽出物を、ジチオスレイトール（１ｍＭ）を含有する５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の細胞ペーストの懸濁液（２０重量％の湿細胞重量）を１６，０００ｐｓｉ（約１１０ＭＰａ）の作動圧力を有するＦｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓに２回通すことによって調製した。次に、粗抽出物を２０，０００×ｇで遠心分離し、細胞片を除去して清澄化細胞抽出物を生成し、これを全可溶性タンパク質についてアッセイした（タンパク質決定のためのビシンコニン酸キット、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。清澄化抽出物を７５℃で２０分間加熱した後、すぐに氷／水浴中で冷却した。得られた混合物を遠心分離して、沈殿したタンパク質を除去し、清澄化、加熱処理した細胞抽出物を集め、前述のように、全可溶性タンパク質についてアッセイした。清澄化、加熱処理した細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ペルヒドロラーゼが少なくとも９０％純粋であることを示した。清澄化、加熱処理した細胞抽出物をドライアイス中で凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【０１９７】
トリアセチン、過酸化水素、および５０μｇ／ｍＬの清澄化、加熱処理した細胞抽出物（上記のように調製）を含有する反応（１０ｍＬの全体積）を、２５ｍＭの重炭酸緩衝液（初期反応ｐＨ約８．１）を用いて２５℃で実行した。各反応条件に対する対照反応を実行して、抽出物タンパク質を添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成される過酢酸の濃度を決定した。反応混合物中の過酢酸の濃度の決定は、Ｋａｒｓｔら（上記）によって記載される方法に従って実施した。２５０ｍＭまたは１００ｍＭのいずれかの過酸化水素を用いたときに１分、５分および３０分で生成される過酢酸濃度は表１０に記載される。
【０１９８】
【表１１】
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【０１９９】
実施例１４
サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８ペルヒドロラーゼによる過酢酸の生成（比較）
サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのペルヒドロラーゼを発現する形質転換体（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７）の細胞抽出物を、ジチオスレイトール（１ｍＭ）を含有する０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の細胞ペーストの懸濁液（２０重量％の湿細胞重量）を１６，０００ｐｓｉ（約１１０ＭＰａ）の作動圧力を有するＦｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓに２回通すことによって調製した。次に、粗抽出物を２０，０００×ｇで遠心分離し、細胞片を除去して清澄化細胞抽出物を生成し、これを全可溶性タンパク質についてアッセイした（タンパク質決定のためのビシンコニン酸キット、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。清澄化抽出物を７５℃で２０分間加熱した後、すぐに氷／水浴中で冷却した。得られた混合物を遠心分離して、沈殿したタンパク質を除去し、清澄化、加熱処理した細胞抽出物を集め、前述のように全可溶性タンパク質についてアッセイした。清澄化、加熱処理した細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ペルヒドロラーゼが少なくとも８５−９０％純粋であることを示した。清澄化、加熱処理した細胞抽出物をドライアイス中で凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【０２００】
トリアセチン、過酸化水素および清澄化、加熱処理した細胞抽出物（上記のように調製）を含有する反応（２ｍＬの全体積）を、２５ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（初期ｐＨ約８．１）を用いて２５℃で実行した。各反応条件に対する対照反応を実行して、抽出物タンパク質を添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成される過酢酸の濃度を決定した。反応混合物中の過酢酸の濃度の決定は、Ｋａｒｓｔら（上記）によって記載される方法に従って実施した。２５０ｍＭまたは１００ｍＭのいずれかの過酸化水素を用いて１分、５分および３０分で生成される過酢酸濃度は表１１に記載される。
【０２０１】
【表１２】
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【０２０２】
実施例１５
ペルヒドロラーゼによる過酢酸の生成（比較）
バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９５）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６）、またはバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ３１９５４ＴＭ（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９４）からのペルヒドロラーゼを発現する形質転換体の細胞抽出物を、ジチオスレイトール（１ｍＭ）を含有する０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の細胞ペーストの懸濁液（２０重量％の湿細胞重量）を１６，０００ｐｓｉ（約１１０ＭＰａ）の作動圧力を有するＦｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓに２回通すことによって調製した。次に、粗抽出物を２０，０００×ｇで遠心分離し、細胞片を除去して清澄化細胞抽出物を生成し、これを全可溶性タンパク質についてアッセイした（タンパク質決定のためのビシンコニン酸キット、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。上澄みをドライアイス中で凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【０２０３】
５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（初期ｐＨ７．２または６．５）中のトリアセチン、過酸化水素および遠心分離した細胞抽出物の上澄み（上記のように調製）を含有する反応（１０ｍＬの全体積）を２５℃で実行した。各反応条件に対する対照反応を実行して、抽出物タンパク質を添加せずに過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生成された過酢酸の濃度を決定した（データは示されない）。反応混合物中の過酢酸の濃度の決定は、Ｋａｒｓｔら（上記）によって記載される方法に従って実施した。１分、５分および３０分で生成される過酢酸濃度は表１３に記載される。
【０２０４】
【表１３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2013506421.tif 000026
【配列表】
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【国際調査報告】
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2013506421.tif 000028