(57)【要約】  本開示は、ネフローゼ症候群の生化学的原理を提供し、観察されたタンパク尿及び他の影響の説明を提供する。その結果、本開示は、ネフローゼ症候群を処置及び／又は予防するための方法、並びに、ネフローゼ症候群に関連する症状を緩和する方法を提供する。さらに、本開示は、ネフローゼ症候群及び本明細書において記載される他の疾患状態におけるタンパク尿を減少させるための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における糖尿病状態の処置又は予防のための方法であって、シアル酸、シアル酸前駆体又はこれらの組み合わせを被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記糖尿病状態が、糖尿病性腎症、糖尿病、ループス腎炎又は原発性糸球体疾患である、請求項２記載の方法。
【請求項３】
前記シアル酸前駆体が、構造
【化１】
2013533857.tif 000005
を有し、
式中：
Ａは、ＣＨ２又はＮＨであり；
Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｘ、Ｏ−ＣＯ−Ｘ又はＯ−Ｘ（式中、Ｘは、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルであり，各Ｂ基、Ｃ基及びＤ基に関して、Ｘは、独立して選択される）からなる群より選択され；
Ｇは、Ｈ、ＯＨ、Ｙ又はＯ−Ｙ（式中、Ｙは、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルである）である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記シアル酸前駆体が、構造
【化２】
2013533857.tif 000006
を有する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
Ｘ及びＹが、それぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ５アルキルである、請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記シアル酸前駆体が、Ｂｕ４ＭａｎＮＡｃ、３，４，６−Ｏ−Ｂｕ３ＭａｎＮＡｃ、１，３，４−Ｏ−Ｂｕ３ＭａｎＮＡｃ、Ｎ−レブリノイルシアル酸又はＮ−レブリノイルマンノサミンである、請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記シアル酸化合物が治療有効量で投与される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記投与が、ネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチドのシアリル化を回復させる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドがＡｎｇｐｔｌ４である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
被験体におけるネフローゼ症候群の処置又は予防のための方法であって、シアル酸、シアル酸前駆体又はこれらの組み合わせを被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項１１】
ネフローゼ症候群が、微小変化型疾患、巣状分節状糸球体硬化症、膜性腎症／膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎又は糖尿病性腎症と特徴付けられる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記シアル酸前駆体が、構造
【化３】
2013533857.tif 000007
を有し、
式中：
Ａは、ＣＨ２又はＮＨであり；
Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｘ、Ｏ−ＣＯ−Ｘ又はＯ−Ｘ（式中、Ｘは、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルであり，各Ｂ基、Ｃ基及びＤ基に関して、Ｘは、独立して選択される）からなる群より選択され；
Ｇは、Ｈ、ＯＨ、Ｙ又はＯ−Ｙ（式中、Ｙは、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルである）である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記シアル酸前駆体が、構造
【化４】
2013533857.tif 000008
を有する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
Ｘ及びＹが、それぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ５アルキルである、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記シアル酸前駆体が、Ｂｕ４ＭａｎＮＡｃ、３，４，６−Ｏ−Ｂｕ３ＭａｎＮＡｃ、１，３，４−Ｏ−Ｂｕ３ＭａｎＮＡｃ、Ｎ−レブリノイルシアル酸又はＮ−レブリノイルマンノサミンである、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記シアル酸化合物が治療有効量で投与される、請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
前記投与が、浮腫を軽減するか、タンパク尿を減少させるか、血漿アルブミンレベルを増加させるか、高コレステロール血症を軽減するか、高トリグリセリド血症を軽減するか、又はこれらの組み合わせである、請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
前記投与が、ネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチドのシアリル化を回復させる、請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチドがＡｎｇｐｔｌ４である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関して被験体の状態を決定するための方法であって、被験体におけるネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関連するポリペプチドのシアリル化のレベルを決定する工程、前記シアリル化のレベルを対照におけるシアリル化のレベルと比較する工程、及び、被験体におけるシアリル化のレベルが対照におけるシアリル化のレベルよりも低い場合に、被験体がネフローゼ症候群若しくは糖尿病状態に罹患しているか、又はそのリスクがあると決定する工程を含む、方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドがＡｎｇｐｔｌ４である、請求項２４記載の方法。
【請求項２２】
ネフローゼ症候群又は糖尿病状態の処置を受けている被験体における処置の有効性を決定するための方法であって、被験体におけるネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関連するポリペプチドのシアリル化のレベルを決定する工程、前記シアリル化のレベルを、対照におけるシアリル化のレベル又は処置を開始する前の被験体におけるシアリル化のレベルと比較する工程、及び、被験体におけるシアリル化のレベルが対照におけるシアリル化のレベルと同じか、若しくは近い場合に、又は、被験体におけるシアリル化のレベルが、処置を開始する前に決定した被験体におけるシアリル化のレベルと比較して、増加している場合に、処置が有効であると決定する工程。
【請求項２３】
前記ポリペプチドがＡｎｇｐｔｌ４である、請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本明細書において記載される業績に関する知見は、本発明に一定の権利を有する連邦政府によって提供されたものである。
【０００２】
本開示は、ネフローゼ症候群、糖尿病状態及びそれらに関連する病状の処置並びに予防のための方法に関する。
【０００３】
〔背景技術〕
ネフローゼ症候群は、腎臓、特に有足細胞と称される特殊な細胞及び糸球体の基底膜を損傷する様々な障害によって引き起こされる。糖尿病性腎症及び膜性糸球体腎炎（膜性腎症とも称される）は、成人における一般的な原因であるのに対して、微小変化型疾患は、子供における最も一般的な原因であるネフローゼ症候群の特性としては、尿中のタンパク質の喪失（タンパク尿）、脂質異常症（高コレステロール血症及び高トリグリセリド血症）、低アルブミン血症（低血中アルブミン又はタンパク質レベル）及び浮腫が挙げられる。タンパク尿は、過剰な血清タンパク質が尿中に存在することと定義されている。タンパク尿の特定のタイプであるアルブミン尿は、アルブミンが尿中に存在する病的状態である。
【０００４】
有足細胞（又は内臓上皮細胞）は、腎臓における糸球体毛細血管ループの細胞である。糸球体は、尿生成の最初の工程として、血液をろ過し、タンパク質などの巨大分子を引き止め、水、塩及び糖などの小分子を通過させる。有足細胞の長い突起又は「足突起」は、毛細血管に巻き付き、それらの間にスリットを残す。血液は、これらのスリットによってろ過される。ネフローゼ症候群に冒された腎臓は、有足細胞に小孔を有し、これは、タンパク質を通過させ、タンパク尿を引き起こすのに十分な大きさである。
【０００５】
タンパク質が尿中に出ると、その血中濃度が減少し、水が身体の他の領域に移動し、これが、浮腫として知られる腫れの原因となる。浮腫は、足及び脚部、腹又は腹部（腹水）並びに眼の周りによく見られるが、特に重力に反応してどこにでも生じ得る。加えて、この余分な水分は身体に貯まるので、体重が増え、疲労を経験し、自分の排尿頻度が低いことに気付き得る人が多い。
【０００６】
微小変化型疾患（ＭＣＤ）、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、膜性腎症（ＭＮ）（膜性糸球体腎炎、ＭＧＮとも称される）及び、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）などの多くの病状が、ネフローゼ症候群として分類されている。長年の間、病理学者は、光学顕微鏡で標本を観察する際に、ＭＣＤ組織の変化に気付かなかったので、名前が微小変化型疾患である。電子顕微鏡の登場により、疾患の特徴として今や知られる変化としては、有足細胞の足突起の広範な喪失、有足細胞の足突起の空胞化、及び、内臓上皮細胞の微絨毛の成長が挙げられる。糖尿病性腎症は、先進国において、ネフローゼ症候群の最も一般的な原因である。
【０００７】
高トリグリセリド血症は、トリグリセリドを分解する酵素（例えば、リポタンパク質リパーゼ）の活性の変化によって起こり得る（２〜４）。
【０００８】
ネフローゼ症候群の分子基盤は、知られていない。さらに、ネフローゼ症候群におけるタンパク尿とグルココルチコイド感受性との関連性、並びに、タンパク尿と高トリグリセリド血症との間の関連性（これらは、ネフローゼ症候群の２つの重要な要素である）は、まだ立証されていない。タンパク尿を減少させるために設計された治療は、疾患の機構の研究をさらに複雑にしている。例えば、ＭＣＤにおけるタンパク尿の処置に使用されるグルココルチコイドは、独立して、血漿トリグリセリドレベルを上昇させ（５）、血漿トリグリセリドレベルの標準化は、ネフローゼ症候群の特定の形態（例えば、ＭＣＤ）において、グルココルチコイドに対するタンパク尿の反応に後れを取る（６）。
【０００９】
本開示は、ネフローゼ症候群の生化学的原理（ＭＣＤのモデルによって確認した）の開示を提供し、観察されたタンパク尿及び他の効果の説明を提供する。その結果、本開示は、ネフローゼ症候群（例えば、限定されないが、糖尿病性腎症、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ及びＭＰＧＮ）を処置及び／又は予防するための方法、並びに、ネフローゼ症候群に関連する症状（限定されないが、タンパク尿、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低アルブミン血症及び浮腫など）を緩和する方法を提供する。さらに、本開示は、糖尿病状態及びその生理学的作用を処置並びに予防するための方法を提供する。
【００１０】
〔図面の簡単な説明〕
図１Ａ〜１Ｉは、実験的なヒトＭＣＤにおけるＡｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ及びタンパク質発現を示す。
【００１１】
図１Ａは、腎毒性血清（ＮＴＳ）の誘導が、異種期（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）タンパク尿を誘導したことを示す（ｎ＝ラット４匹／群）；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００１２】
図１Ｂは、糸球体Ａｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ発現が、図１Ａに示される腎毒性血清（ＮＴＳ）により誘導された異種期タンパク尿の間にアップレギュレーションされたことを示す（ｎ＝ラット４匹／群）；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００１３】
図１Ｃは、ＮＴＳを注射したＡｎｇｐｔｌ４−／−マウス（ｎ＝マウス４匹／群）が、有意に低いアルブミン尿を発症することを示しており、これは、疾患過程におけるＡｎｇｐｔｌ４の役割を示している；＊Ｐ＜０．０５。
【００１４】
図１Ｄは、ＮＴＳを注射したＡｎｇｐｔｌ４−／−マウス（ｎ＝マウス４匹／群）では、Ａｎｇｐｔｌ４＋／＋マウスにおける広範な消失と比較して、足突起の消失がわずか３０％であったことを示す。
【００１５】
図１Ｅは、正常ラット糸球体におけるＡｎｇｐｔｌ４が、有足細胞タンパク質ＣＤ２ＡＰと共局在していたことを共焦点画像によって示しており、これは、有足細胞における発現を示している。抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体からリコンビナントＡｎｇｐｔｌ４との反応性を奪うことにより、免疫活性を無効にした。
【００１６】
図１Ｆは、単回用量のピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮモデル）の注射後に、３日目から、Ａｎｇｐｔｌ４の顕著な糸球体ｍＲＮＡアップレギュレーションが見られたことを示す（異なる研究において、ピークは最大８０倍増加）。ＰＨＮでは、より少ないアップレギュレーションが起こり、篩過糸球体又はレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）によって単離した糸球体を使用して、抗Ｔｈｙ１．１腎炎又は非ＨＩＶ虚脱型巣状分節状糸球体硬化症（ＣＧ）のラットモデルでは、有意な変化は検出されなかった。［有意な閾値は３倍の変化である（７）］。
【００１７】
図１Ｇは、単回用量のピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮモデル）の注射後６日目に、Ａｎｇｐｔｌ４発現（赤色）が糸球体で増加しており、ＧＢＭへパラン硫酸プロテオグリカン（白色、ＰＡＮでは強度減少）及び有足細胞ネフリン（緑色）と部分的にオーバーラップ（白色矢印）していたことを示す。
【００１８】
図１Ｈは、ＰＡＮモデルの６日目の腎臓の免疫金ＥＭを示しており、これは、有足細胞（黄色矢印）及びＧＢＭ（黒色矢印）における金粒子を示している；倍率：ＥＭ４０，０００ｘ。
【００１９】
図１Ｉは、ＭＣＤ患者（ｎ＝患者５人）からの腎臓生検により、Ａｎｇｐｔｌ４（赤色）の糸球体発現が増加しており、ネフリン及びＧＢＭラミニンとかなりオーバーラップしており、内皮ＰＥＣＡＭ１染色とは周辺でのみオーバーラップしていることが明らかになったことを示す；倍率：光学顕微鏡法４００ｘ。
【００２０】
図２は、雄性Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットの作製及び特性決定を示す。
【００２１】
図２Ａは、有足細胞におけるＡｎｇｐｔｌ４の有足細胞特異的過剰発現のためのトランスジェニック（ＴＧ）ラットモデルを示す。
【００２２】
図２Ｂは、Ａｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡの組織特異的過剰発現（ｎ＝ラット３匹／群）が、有足細胞における発現と一致していることを示す；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００２３】
図２Ｃは、３月齢ヘテロ接合体ＴＧラット（ｎ＝ラット３匹／群）からのＰＡＳ染色切片、及び、ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット（矢印）における突起状の有足細胞を含む正常形態が認められたこと（倍率４００ｘ）を示す。
【００２４】
図２Ｄは、共焦点画像、及び、Ａｎｇｐｔｌ４タンパク質（倍率４００ｘ）の糸球体発現の増加が認められ、ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット（ｎ＝ラット３匹／群）における有足細胞ネフリン（倍率６３０ｘ）及びＧＢＭラミニン（倍率６３０ｘ）とオーバーラップしていたことを示す。
【００２５】
図２Ｅは、ホモ接合体ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおいて、５月齢までに、広範な足突起の消失がＥＭで認められたことを示す。
【００２６】
図２Ｆは、これらのラットの免疫金ＥＭ分析、及び、１月齢における金粒子クラスター及び散乱ＧＢＭ粒子を含むインタクトな足突起（ＦＰ）から、消失した足突起（ＥＦＰ）の反対側にＧＢＭ金粒子クラスター（これは、内皮（ＥＮＤＯ）表面まで達している）を含む部分的な消失への進行が認められ、最終的には、ＧＢＭにおいて、５月齢までに、高密度金粒子クラスターを含む広範な消失が認められたことを示す。電子顕微鏡法倍率１５，０００ｘ〜４０，０００ｘ。
【００２７】
図３は、Ａｎｇｐｔｌ４過剰発現とタンパク尿との関係を示す。
【００２８】
図３Ａは、雌性ホモ接合性ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットが、重度のアルブミン尿を発症したことを示す（ｎ＝ラット６匹／群）；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００２９】
図３Ｂは、雄性ヘテロ接合性ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットが、重度のアルブミン尿を発症したことを示す（ｎ＝ラット６匹／群）；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００３０】
図３Ｃは、雄性ホモ接合性ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットが、重度のアルブミン尿を発症したことを示す（ｎ＝ラット６匹／群）；＊＊Ｐ＜０．０１。
【００３１】
図３Ｄは、尿タンパク質（３μｇ／レーン、ＭＣＤ寛解を除く）をＧｅｌＣｏｄｅ  ｂｌｕｅ染色ＳＤＳ  ＰＡＧＥ評価した後のバンド（ｎ＝３回の測定／値）のデンシトメトリー、及び、ヒトＭＣＤに類似するＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおけるアルブミン尿（７０ｋＤａのインタクトなアルブミンバンド、矢印）の優性を示す。
【００３２】
図３Ｅは、３月齢ヘテロ接合体ＴＧ雄性ラットにおけるトランスジェニックタンパク質を特異的に検出するための、抗Ｖ５抗体との免疫金ＥＭ、並びに、ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットの消失した足突起（ＥＦＰ）及びＧＢＭにおいて、金粒子が認められたことを示す；ＥＭ４０，０００ｘ。
【００３３】
図３Ｆは、ヘテロ接合体雄性ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４（低用量）におけるＰＡＮの誘導、野生型同腹子と比較したタンパク尿の悪化を示す（ｎ＝ラット８匹／群）；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００３４】
図３Ｇは、ＰＡＮを誘導した後に、１日目から隔日でグルココルチコイド（ＰＡＮ−Ｓ）処置したラットが、６日目にタンパク尿の一時的な減少を示したことを示す（ｎ＝ラット４匹／群）；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【００３５】
図３Ｈは、３Ｇの研究からの糸球体遺伝子発現の研究であり、Ａｎｇｐｔｌ４がグルココルチコイド感受性遺伝子であることを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１
図４は、Ａｎｇｐｔｌ４シアリル化とタンパク尿との関係を示す。
【００３６】
図４Ａは、灌流した糸球体からのタンパク質の二次元ゲル電気泳動（２００μｇタンパク質／ゲル）及びウエスタンブロットを示す（上パネル、コントロール；中央パネルＰＡＮ；下パネルＰＡＮ＋グルココルチコイド添加）。コントロールのパネルにおいて、分析により、Ａｎｇｐｔｌ４の少量の断片（赤色矢印；１）及び単量体（黄色矢印；２）、並びに、中ｐＩ又は高ｐＩに移動するＡｎｇｐｔｌ４の大量の低オリゴマー（ピンク色矢印；３）の存在が明らかになった。ＰＡＮ６日目において（中央パネル）、高ｐＩ及び中ｐＩオリゴマー型が増加していたのに対して（ピンク色矢印、３；オレンジ色矢印４）、グルココルチコイド処置（図３Ｇを参照）はこの増加を鈍らせる（下パネル）。中ｐＩに移動するＡｎｇｐｔｌ４の中で、断片が抗リン酸スレオニン抗体と反応したのに対して、オリゴマーはシアル酸結合レクチンＭＡＡと反応する（ＰＡＮに関する例示、独立したブロットからの抜粋）。
【００３７】
図４Ｂは、図４Ａからのウエスタンブロットのデンシトメトリー分析を示す；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００３８】
図４Ｃは、コントロールとインキュベーションし、ＭＡＡレクチンに対する抗体（最上部のパネル）、抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体（上中央パネル）でプローブしたＡｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３安定細胞株；シアル酸前駆体ＭａｎＮＡｃ（２５ｍＭ）とインキュベーションし、抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体（下中央パネル）でプローブしたＡｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３安定細胞株、並びに、シアル酸前駆体ＭａｎＮＡｃ（２５ｍＭ）とインキュベーションし、ＭＡＡレクチンに対する抗体（下パネル）でプローブしたＡｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３安定細胞株からのタンパク質の二次元ゲル電気泳動（１５０μｇタンパク質／ゲル）及びウエスタンブロットを示す。濃縮上清の分析により、高ｐＩ型（上中央パネルの緑色矢印及び直線）から、ＭＡＡ反応性である中ｐＩ型（下中央パネル及び下パネルの青色矢印）へのシフトが明らかになった。
【００３９】
図４Ｄは、水道水に溶解させた１ｍｇ／ｍｌＭａｎＮＡｃをＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットに１２日間摂食させると、１８時間のアルブミン尿の有意な減少（１２日目の最低値はベースラインの５９．４±３．３％であった）を引き起こしたが、ウォシュアウトの１２日後にベースライン値に戻り、ウォシュアウトの２４日目には未処置コントロールのＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットの値に近づいたことを示す（図６における個々の教示及びパイロット研究データ）。パネルｄにおいて、すべての＊差異は、ベースライン値に対するものである。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００４０】
図５は、ＨＥＫ２９３安定細胞株によって産生されたリコンビナントＡｎｇｐｔｌ４の特性決定を示す。
【００４１】
図５Ａは、ｐｃＤＮＡ−ラットＡｎｇｐｔｌ４−Ｖ５−Ｈｉｓ発現構築物で安定的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞株が、コントロールの空ベクター細胞株と比較して、Ａｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ発現の５５，０００倍のアップレギュレーションを示したことを示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１
図５Ｂは、Ａｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３細胞が、無血清条件下で、ほぼインタクトなタンパク質を上清に分泌したことを示す（二次元ゲル電気泳動、並びに、免疫前血清及び抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体を用いたウエスタンブロットによって確認した）。
【００４２】
図５Ｃは、ヒト血漿２００μｇ（ｎ＝患者４人／群）の二次元ゲル電気泳動を示しており、ＭＣＤが再発した患者においてのみ、５５〜７０ｋＤａ  ｐＩ８〜８．５Ａｎｇｐｔｌ４タンパク質の血中濃度の上昇が認められたことを実証している（ＭＣＤ再発パネルにおける楕円形）。中ＰＩ単量体及びオリゴマーの血中濃度の上昇は、再発したＭＣＤ患者（ＭＣＤ再発パネルにおける矢印）で認められ、単量体は、ＭＮを有する患者（ＭＮパネルにおける矢印）においてのみ認められた。
【００４３】
図６は、ＭａｎＮＡｃの投与が、ラットモデルにおけるアルブミン尿を減少させたことを示す。
【００４４】
図６Ａは、漸増用量のＭａｎＮＡｃ（１〜８ｍｇ／ｍｌ）を投与した重度のアルブミン尿ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットを用いたパイロット研究からのアルブミン尿追跡の代表的なものを示す。この研究により、ＭａｎＮＡｃが、これらの動物におけるアルブミン尿を減少させたことが明らかになった。
【００４５】
図６Ｂは、ＭａｎＮＡｃ（１ｍｇ／ｍｌ）で処置した試験群のＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットからの個々の追跡を示しており、これにより研究は終了した。これらのラットで時間と共にアルブミン尿の増加が起こったことを確認するために、研究開始前に、１２日間とは別に２回採尿した。この研究により、ＭａｎＮＡｃ（１ｍｇ／ｍｌ）が、これらの動物におけるアルブミン尿を減少させたことが明らかになった。
【００４６】
図６Ｃは、抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体又はレクチンＳＮＡ  Ｉ（ｎ＝３ブロット／条件）を使用した、１２日目のＭａｎＮＡｃ又はコントロールＴＧラットから糸球体の二次元電気泳動及びウエスタンブロッティング（２００μｇタンパク質／ゲル）を示す。再現可能な中ｐＩのＡｎｇｐｔｌ４スポットは赤色楕円形（１）によって、及び高ｐＩは緑色楕円形（２）によって縁取られている。中ｐＩのスポットは、シアル酸結合レクチンＳＮＡ  Ｉとも反応する。
【００４７】
図６Ｄは、図６ＣのＡｎｇｐｔｌ４スポットのデンシトメトリーを示しており、ＭａｎＮＡＣ摂食ラットにおいて、中ｐＩ型のパーセンテージが有意に増加していることを示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００４８】
図７は、ピューロマイシンアミノヌクレオシドネフローゼ（ＰＡＮモデル）を有するＭａｎＮＡｃ処置ラットにおけるネフローゼ症候群パラメーターの改善を示す。図７Ａ〜７Ｄにおいて、ピューロマイシンアミノヌクレオシド（１０ｍｇ／１００ｇｍ）をラット（ｎ＝ラット５匹／群）に単回静脈内注射し、４日目（これは、タンパク尿の発症と同時である）から、水道水に溶解させたＭａｎＮＡＣ８０ｍｇ／Ｋｇ体重で処置した。
【００４９】
図７Ａは、ピューロマイシンアミノヌクレオシドの投与後６日目において、ＭａｎＮＡｃ処置ラットのタンパク尿が有意に減少したことを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．０１。
【００５０】
図７Ｂは、ピューロマイシンアミノヌクレオシドの投与後６日目において、ＭａｎＮＡｃ処置ラットの血漿アルブミンレベルが有意に改善したことを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．０１。
【００５１】
図７Ｃは、ピューロマイシンアミノヌクレオシドの投与後６日目において、ＭａｎＮＡｃ処置ラットの高コレステロール血症が有意に減少したことを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．０１。
【００５２】
図７Ｄは、ピューロマイシンアミノヌクレオシドの投与後６日目において、ＭａｎＮＡｃ処置ラットの高トリグリセリド血症が有意に減少したことを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．０１。
【００５３】
図８は、糖尿病動物のタンパク尿に対するＭａｎＮＡｃ治療の効果を示す。
【００５４】
図８Ａは、抗Ａｎｇｐｔｌ４Ａｂを使用した、糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス及びコントロールｄｂ／ｍマウスに由来する糸球体の二次元ゲル電気泳動並びにウエスタンブロット分析を示す。この結果は、コントロールと比較して、糖尿病マウス糸球体において、Ａｎｇｐｔｌ４（これは、タンパク尿の病因に関与する高ｐＩ型を含む）の発現が増加していることを示す。
【００５５】
図８Ｂは、抗Ａｎｇｐｔｌ４Ａｂを使用した、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満ラット及びコントロールの正常血糖ラットに由来する糸球体の二次元ゲル電気泳動並びにウエスタンブロット分析を示す。この結果は、コントロールと比較して、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満ラットに由来するラット糸球体において、Ａｎｇｐｔｌ４（これは、タンパク尿の病因に関与する高ｐＩ型を含む）の発現が増加していることを示す。
【００５６】
図８Ｃは、ＭａｎＮａｃ処置が、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満ラットにおけるタンパク尿を減少させたことを示す。１３週齢雄性Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満ラットを、７０及び１４０ｍｇ／Ｋｇの水道水に溶解させたＭａｎＮＡｃ又はプレーンな水道水で処置した（ｎ＝ラット４匹／群）。ＭａｎＮＡｃ処置群において、タンパク尿の有意な減少が認められた。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【００５７】
図９は、様々な種に由来するＡｎｇｐｔｌ４のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１及び２は、ヒトに由来するアミノ酸及びｃＤＮＡ配列（タンパク質変異体１アイソフォームａ、ロングフォーム；下線部のアミノ酸配列は４０及び１６１〜１６４位）を示す；配列番号３及び４は、ヒトに由来するアミノ酸及びｃＤＮＡ配列（タンパク質変異体３アイソフォームｂ、ショートフォーム；下線部のアミノ酸配列は４０及び１６１〜１６４位）を示す；配列番号５及び６は、ラットに由来するアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を示す；配列番号７及び８は、マウスに由来するアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。
【００５８】
〔発明の概要〕
第１の態様では、本開示は、被験体におけるネフローゼ症候群の処置及び／又は予防方法を提供する。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、微小変化型疾患（ＭＣＤ）、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、膜性腎症（ＭＮ）／膜性糸球体腎炎（ＭＧＮ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。この方法は、シアル酸又はシアル酸前駆体を被験体に投与する工程を含む。シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、治療有効用量で投与され得る。前記投与は、ネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させ、それによって被験体におけるネフローゼ症候群を処置又は予防する。
【００５９】
第２の態様では、本開示は、被験体におけるＭＣＤの処置及び／又は予防方法を提供する。この方法は、シアル酸又はシアル酸前駆体を被験体に投与する工程を含む。シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、治療有効用量で投与され得る。前記投与は、ネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させ、それによって被験体におけるネフローゼ症候群を処置又は予防する。
【００６０】
第３の態様では、本開示は、ネフローゼ症候群の１つ以上の症状（例えば、限定されないが、タンパク尿、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症及び浮腫）を緩和する方法を提供する。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。この方法は、シアル酸又はシアル酸前駆体を被験体に投与する工程を含む。シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、治療有効用量で投与され得る。前記投与は、ネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させ、それによって被験体におけるネフローゼ症候群の１つ以上の症状を緩和する。
【００６１】
第４の態様では、本開示は、被験体におけるタンパク尿を減少させるための方法を提供する。一実施態様では、被験体は、ネフローゼ症候群に罹患している。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。別の実施態様では、被験体は、糖尿病状態（例えば、限定されないが、糖尿病性腎症、糖尿病、ループス腎炎又は原発性糸球体疾患）に罹患している。具体的な実施態様では、タンパク尿は、ポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の脱シアリル化によって引き起こされる。この方法は、シアル酸又はシアル酸前駆体を被験体に投与する工程を含む。シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、治療有効用量で投与され得る。前記投与は、タンパク尿の誘導に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させ、それによって被験体におけるタンパク尿を減少させる。
【００６２】
第５の態様では、本開示は、被験体における浮腫を軽減する方法を提供する。一実施態様では、被験体は、ネフローゼ症候群に罹患している。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。具体的な実施態様では、浮腫は、ポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の脱シアリル化によって引き起こされる。この方法は、シアル酸又はシアル酸前駆体を被験体に投与する工程を含む。シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、治療有効用量で投与され得る。前記投与は、浮腫の誘導に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させ、それによって被験体における浮腫を軽減する。
【００６３】
第６の態様では、本開示は、被験体における高コレステロール血症を軽減する方法を提供する。一実施態様では、被験体は、ネフローゼ症候群に罹患している。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。具体的な実施態様では、高コレステロール血症は、少なくとも一部は、ポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の脱シアリル化によって引き起こされる。この方法は、シアル酸又はシアル酸前駆体を被験体に投与する工程を含む。シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、治療有効用量で投与され得る。前記投与は、高コレステロール血症の誘導に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させ、それによって被験体における高コレステロール血症を軽減する。
【００６４】
第７の態様では、本開示は、被験体における高トリグリセリド血症を軽減する方法を提供する。一実施態様では、被験体は、ネフローゼ症候群に罹患している。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。具体的な実施態様では、高トリグリセリド血症は、ポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の脱シアリル化によって引き起こされる。この方法は、シアル酸又はシアル酸前駆体を被験体に投与する工程を含む。シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、治療有効用量で投与され得る。前記投与は、高トリグリセリド血症の誘導に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させ、それによって被験体における高トリグリセリド血症を軽減する。
【００６５】
第８の態様では、本開示は、糖尿病性腎症、糖尿病、ループス腎炎若しくは原発性糸球体疾患の処置及び／又は予防方法を提供する。具体的な実施態様では、前記病状は、ポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の脱シアリル化によって引き起こされる。この方法は、シアル酸又はシアル酸前駆体を被験体に投与する工程を含む。シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、治療有効用量で投与され得る。前記投与は、ポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させ、それによって被験体における前記病状を処置又は予防する。
【００６６】
第９の態様では、本開示は、第１〜第８の態様の方法における使用のための組成物を提供する。この組成物は、シアル酸又は１つ以上のシアル酸前駆体を含む。一実施態様では、シアル酸前駆体は、ＭａｎＮＡｃである。別の実施態様では、シアル酸前駆体は、ＭａｎＮＡｃの誘導体である。前記組成物は、ＭａｎＮＡｃ及び１つ以上のＭａｎＮＡｃの誘導体並びに第２の薬剤を含み得る。
【００６７】
第１０の態様では、本開示は、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関して被験体の状態を決定する方法を提供する。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。一実施態様では、糖尿病状態は、糖尿病性腎症、糖尿病、ループス腎炎又は原発性糸球体疾患である。具体的な実施態様では、糖尿病状態は、糖尿病性腎症である。一実施態様では、前記方法は、被験体において、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関連するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）のレベル、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関連するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）のシアリル化のレベル、又は、これらの組み合わせを決定する。被験体から決定されたポリペプチドのシアリル化の量及び／又はレベルは、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態に罹患していないと診断された被験体（対照被験体）からの対応する量及びレベルと比較され得る。前記量及びレベルは、参照基準とも比較され得る。対照被験体又は参照基準と比較したシアリル化のレベルの減少は、被験体がネフローゼ症候群若しくは糖尿病状態に罹患しているか、又はそのリスクがあることを示す；シアリル化のレベルは、高ｐＩ型ポリペプチド（これは、脱シアリル化されている）に関して決定され得る。
【００６８】
第１１の態様では、本開示は、ネフローゼ症候群若しくは糖尿病状態の処置を受けている被験体における、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態の処置の有効性を決定する方法を提供する。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。一実施態様では、糖尿病状態は、糖尿病性腎症、糖尿病、ループス腎炎又は原発性糸球体疾患である。具体的な実施態様では、糖尿病状態は、糖尿病性腎症である。処置中に被験体から決定されたポリペプチドのシアリル化の量及び／又はレベルは、処置を開始する前の被験体からの対応する量及び／又はレベルと比較され得る。前記量及びレベルは、参照基準とも比較され得る。処置を開始する前に決定されたシアリル化のレベルと比較した、処置を受けている被験体におけるシアリル化のレベルの増加は、処置が所望の効果を有していることを示す；シアリル化のレベルは、高ｐＩ型ポリペプチド（これは、脱シアリル化されている）に関して決定され得る。さらに、処置中に被験体から決定されたポリペプチドの量及び／又はレベルは、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態に罹患していないと診断された被験体（対照被験体）の対応する量及び／又はレベルと比較され得る。前記量及びレベルは、参照基準とも比較され得る。処置中に被験体から得られたシアリル化のレベルが、対照被験体からのシアリル化のレベル若しくは参照と同じか、又は近いことは、処置が所望の効果を有していることを示す；シアリル化のレベルは、高ｐＩ型ポリペプチド（これは、脱シアリル化されている）に関して決定され得る。
【００６９】
第１２の態様では、本開示は、ネフローゼ症候群、糖尿病状態若しくはそれらに関連する病状を処置又は予防するのに有効な化合物を同定する方法を提供する。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。一実施態様では、糖尿病状態は、糖尿病性腎症、糖尿病、ループス腎炎又は原発性糸球体疾患である。具体的な実施態様では、糖尿病状態は、糖尿病性腎症である。一般的には、前記スクリーニング方法は、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）を発現するアッセイ系（以下により詳細に記載される）を提供する工程、試験されるべき試験化合物をアッセイ系に導入する工程、及び、ポリペプチドのシアリル化のレベルに対する試験化合物の効果を決定する工程を含む。
【００７０】
〔詳細な説明〕
以下の議論において、いくつかの物品及び方法は背景及び導入目的で記載される。本明細書において先行技術の「承認」として解釈されるものはなにもない。出願人は、必要に応じ、本明細書に照会された物品及び方法が適用できる法律の条項のもとに先行技術を構成しないことを証明する権利を、明確に保有する。
【００７１】
ネフローゼ症候群及びそれに関連するタンパク尿の病因を調査している間に、γ２腎毒性血清（ＮＴＳ、全糸球体に対する血清）をラットに注射し、特異的に発現した糸球体遺伝子のパネルを同定した（７）。ネフローゼ症候群及びタンパク尿の病因に関与することがこれまでに知られていなかった２つの遺伝子を同定した。これらの遺伝子の１つは、有足細胞で発現している転写因子ジンクフィンガーホメオボックス３（ＺＨＸ３）をコードしており、現在のところ、ＭＣＤの病因に重要な役割を果たすことが示されている（７）。もう１つの遺伝子であるアンジオポイエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）は、有足細胞で非常にアップレギュレーションされていた。ピューロマイシンネフローゼ（ＰＡＮ）を含むヒト糸球体疾患の動物モデル、ＭＣＤ、受動ハイマン腎炎（ＰＨＮ）のモデル、膜性腎症（ＭＮ）及び抗Ｔｈｙ１．１腎炎のモデル、メサンギウム傷害のモデルにおいて、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の発現を分析した。
【００７２】
アンジオポイエチン様タンパク質は、高トリグリセリド血症及び腫瘍転移の進行に関与しており、アンジオポイエチンと機能的に異なっている。Ａｎｇｐｔｌ４は、肝臓及び脂肪組織で高度に発現しているＰＰＡＲγ（８）及びＰＰＡＲα（９）標的遺伝子であり、白色脂肪組織及び肝臓を絶食させることによって強力に誘導され、酸素正常条件下における血管内皮細胞のアポトーシス生存因子である（１０）。Ａｎｇｐｔｌ４は、ＬＰＬの強力な阻害剤であり（１１）、静脈内注射したか、又はアデノウイルスを介して発現させた後に、高トリグリセリド血症を誘導する（１２、１３）。他の研究は、ノーザンブロット分析によって、Ａｎｇｐｔｌ４の発現が心筋細胞及び骨格筋でより少ないこと、並びに、腎臓全体における低レベルの発現を示した（８）。最近の人口に基づくＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の研究は、ヒトのトリグリセリドレベルに影響を与える変異を明らかにしている（１４、１５）。
【００７３】
タンパク尿におけるＡｎｇｐｔｌ４の役割は、これまでに報告されていない。本開示は、ネフローゼ症候群及び糖尿病状態の病因における、有足細胞によって分泌されたＡｎｇｐｔｌ４の決定的な役割ことを示す。本開示は、ネフローゼ症候群の実験的な一形態において、有足細胞により分泌されたＡｎｇｐｔｌ４の大部分が脱シアリル化されていること、及び、シアル化の改善がタンパク尿、浮腫、高コレステロール血症及び高トリグリセリド血症を劇的に軽減し、Ａｎｇｐｔｌ４の電気泳動を正常化することを初めて実証した。Ａｎｇｐｔｌ４は、ネフローゼ症候群の病因に直接的に関与する最初のグルココルチコイド感受性遺伝子であり、ネフローゼ症候群におけるタンパク尿と高トリグリセリド血症との間の最初の直接的な関連性である。ヒト（タンパク質変異体１アイソフォームａ、ロングフォームタンパク質変異体３アイソフォームｂ、ショートフォーム）、ラット及びマウスに由来するＡｎｇｐｔｌ４アミノ酸並びにｃＤＮＡ配列を、図８に示す。
【００７４】
〔定義〕
本明細書において使用される「予防」、「予防する」、「予防している」、「抑制」、「抑制する」及び「抑制している」という用語は、疾患若しくは病状の症状、態様又は特徴の発症前に、このような病状、態様若しくは特徴を予防又は軽減するために開始される一連の動作（例えば、化合物又は医薬組成物の投与）を指す。このような予防又は抑制は、絶対的に有用である必要はない。
【００７５】
本明細書において使用される「処置」、「処置する」及び「処置している」という用語は、疾患若しくは病状の症状、態様又は特徴の発症後に、このような病状、態様若しくは特徴を排除又は軽減するために開始される一連の動作（例えば、化合物又は医薬組成物の投与）を指す。このような処置は、絶対的に有用である必要はない。
【００７６】
本明細書において使用される「処置を必要とする」という用語は、患者が処置を必要とするか、又は患者が処置により恩恵を受けるであろうという介護者によってなされる判断を指す。この判断は、介護者の専門領域の範疇にあり、本開示の方法若しくは化合物によって処置可能な疾患又は病状の結果として、患者が病気であるか、又は病気になるであろうという知識を含む、様々な要素に基づいてなされる。
【００７７】
本明細書において使用される「予防を必要とする」という用語は、患者が予防を必要とするか、又は患者が予防により恩恵を受けるであろうという介護者によってなされる判断を指す。この判断は、介護者の専門領域の範疇にあり、本開示の方法若しくは化合物によって予防可能な疾患又は病状の結果として、患者が病気になるか、又は病気になる可能性があるという知識を含む、様々な要素に基づいてなされる。
【００７８】
本明細書において使用される「個人」、「被験体」又は「患者」という用語は、哺乳類、例えばマウス、ラット、他の齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ又は霊長類及びヒトなどの任意の動物を指す。この用語は、雄若しくは雌又は両方を特定し得るか、又は雄若しくは雌を除外し得る。
【００７９】
本明細書において使用される「治療有効量」という用語は、疾患若しくは病状の任意の症状、態様又は特徴に対して、任意の検出可能なプラス効果を発揮できる、単独での、又は医薬組成物の一部としての化合物の量を指す。このような効果は、絶対的に有用である必要はない。シアル酸又はシアル酸前駆体について言及する場合、「治療有効量」という用語は、ポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）を正常なシアリル化パターンに回復させるのに十分なシアル酸若しくはシアル酸前駆体の量、又は、被験体におけるタンパク尿若しくはネフローゼ症候群の別の症状を軽減するのに十分なシアル酸若しくはシアル酸前駆体の量を指す。
【００８０】
「薬学的に許容し得る誘導体」という用語は、被験体に投与した場合に、本開示のシアル酸若しくはシアル酸前駆体又はそれらの代謝産物若しくは残留物を（直接的又は間接的に）提供できる、本開示のシアル酸若しくはシアル酸前駆体の任意の薬学的に許容し得る塩、エステル、エステルの塩、溶媒和物又は他の誘導体を意味する。特に好ましい誘導体は、本開示のシアル酸又はシアル酸前駆体が被験体に投与された場合に、（例えば、経口投与された化合物がより容易に血液に吸収されるようにすることによって）これらの生体利用効率を高めるか、所定の生物学的区画へのシアル酸前駆体の送達を高めるか、溶解度を増加させて注射による投与を可能にするか、代謝を変化させるか、又は排出速度を変化させるものである。一実施態様では、誘導体は、プロドラッグである。
【００８１】
「薬学的に許容し得る塩」という用語は、特に示さない限り、本開示のシアル酸若しくはシアル酸前駆体に存在し得る酸性又は塩基性基の塩を含む。
【００８２】
「約」及び「およそ」という用語は、一般的には、測定の種類又は精度に既定される測定量の誤差又は変動の許容し得る程度を意味する。典型的には、誤差又は変動の例示的な程度は、所定の値又は値域の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。生物系に関して、「約」という用語は、誤差の許容し得る標準偏差、好ましくは所定の値の２倍以下を指す。本明細書において記載される数量は、特に明記しない限り、およそであり、これは、「約」及び「およそ」という用語が、特に明記しない場合に推測され得ることを意味する。
【００８３】
（処置及び予防方法）
本開示は、ネフローゼ症候群の処置及び／又は予防方法を提供する。さらに、本開示は、ＭＣＤの処置及び／又は予防の方法を提供する。加えて、本開示は、ネフローゼ症候群の１つ以上の症状（例えば、限定されないが、タンパク尿、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症及び浮腫）を緩和する方法を提供する。特にさらに、本開示は、タンパク尿を減少させるための方法を提供する。特にさらに、本開示は、浮腫を軽減するための方法を提供する。本開示は、高コレステロール血症及び高トリグリセリド血症を軽減するための方法も提供する。本開示は、糖尿病状態若しくはそれに関連する生理的病状の処置及び／又は予防のための方法も提供する。加えて、本開示は、シアル酸若しくは１つ以上のシアル酸前駆体又はこれらの組み合わせを含む医薬組成物を提供する。
【００８４】
一実施態様では、本開示の教示は、ネフローゼ症候群の処置又は予防を必要とする被験体におけるネフローゼ症候群の処置及び／又は予防を提供する。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。前記方法は、シアル酸又はシアル酸前駆体を被験体に投与する工程を含む。前記投与は、ネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させる。それによって、前記投与は、被験体におけるネフローゼ症候群を処置及び／又は予防する。シアル酸又はシアル酸前駆体は、治療有効量で投与され得る。さらに、シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、投与され得る。前記方法は、前記処置及び／又は予防を必要とする被験体を同定することをさらに含み得る。
【００８５】
別の実施態様では、本開示の教示は、ＭＣＤの処置又は予防を必要とする被験体におけるＭＣＤの処置及び／又は予防を提供する。前記方法は、シアル酸又はシアル酸前駆体を被験体に投与する工程を含む。前記投与は、ＭＣＤの病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させる。それによって、前記投与は、被験体におけるＭＣＤを処置及び／又は予防する。シアル酸又はシアル酸前駆体は、治療有効量で投与され得る。さらに、シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、投与され得る。前記方法は、前記処置及び／又は予防を必要とする被験体を同定することをさらに含み得る。
【００８６】
さらなる実施態様では、本開示の教示は、ネフローゼ症候群の１つ以上の症状（例えば、限定されないが、タンパク尿、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症及び浮腫）を緩和する方法を提供する。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。前記方法は、シアル酸又はシアル酸前駆体を被験体に投与する工程を含む。前記投与は、ネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させる。それによって、前記投与は、被験体におけるネフローゼ症候群の１つ以上の症状（例えば、限定されないが、タンパク尿及び浮腫、ネフローゼ症候群）を緩和する。シアル酸又はシアル酸前駆体は、治療有効量で投与され得る。さらに、シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、投与され得る。前記方法は、前記処置及び／又は予防を必要とする被験体を同定することをさらに含み得る。
【００８７】
特にさらなる実施態様では、本開示の教示は、被験体におけるタンパク尿を減少させるための方法を提供する。一実施態様では、被験体は、ネフローゼ症候群に罹患している。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。別の実施態様では、被験体は、タンパク尿、例えば、限定されないが、糖尿病性腎症、糖尿病、ループス腎炎又は原発性糸球体疾患によって特徴付けられる障害に罹患している。具体的な実施態様では、タンパク尿は、少なくとも一部は、ポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の脱シアリル化によって引き起こされる。前記方法は、シアル酸又はシアル酸前駆体を被験体に投与する工程を含む。前記投与は、タンパク尿の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させる。それによって、前記投与は、被験体におけるタンパク尿を減少させる。シアル酸又はシアル酸前駆体は、治療有効量で投与され得る。さらに、シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、投与され得る。前記方法は、前記減少を必要とする被験体を同定することをさらに含み得る。
【００８８】
さらにさらなる実施態様では、本開示の教示は、被験体における浮腫を軽減するための方法を提供する。一実施態様では、被験体は、ネフローゼ症候群に罹患している。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。具体的な実施態様では、浮腫は、少なくとも一部は、ポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の脱シアリル化によって引き起こされる。前記方法は、シアル酸若しくはシアル酸前駆体又はこれらの組み合わせを被験体に投与する工程を含む。前記投与は、タンパク尿の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させる。それによって、前記投与は、被験体におけるタンパク尿を減少させる。シアル酸又はシアル酸前駆体は、治療有効量で投与され得る。さらに、シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、投与され得る。前記方法は、前記軽減を必要とする被験体を同定することをさらに含み得る。
【００８９】
さらにさらなる実施態様では、本開示の教示は、被験体における高コレステロール血症を軽減するための方法を提供する。一実施態様では、被験体は、ネフローゼ症候群に罹患している。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。具体的な実施態様では、高コレステロール血症は、少なくとも一部は、ポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の脱シアリル化によって引き起こされる。前記方法は、シアル酸又はシアル酸前駆体を被験体に投与する工程を含む。前記投与は、高コレステロール血症の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させる。それによって、前記投与は、被験体における高コレステロール血症を軽減する。シアル酸又はシアル酸前駆体は、治療有効量で投与され得る。さらに、シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、投与され得る。前記方法は、前記軽減を必要とする被験体を同定することをさらに含み得る。
【００９０】
さらにさらなる実施態様では、本開示の教示は、被験体における高トリグリセリド血症を軽減するための方法を提供する。一実施態様では、被験体は、ネフローゼ症候群に罹患している。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。具体的な実施態様では、高トリグリセリド血症は、少なくとも一部は、ポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の脱シアリル化によって引き起こされる。前記方法は、シアル酸又はシアル酸前駆体を被験体に投与する工程を含む。前記投与は、高トリグリセリド血症の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させる。それによって、前記投与は、被験体における高トリグリセリド血症を軽減する。シアル酸又はシアル酸前駆体は、治療有効量で投与され得る。さらに、シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、投与され得る。前記方法は、前記軽減を必要とする被験体を同定することをさらに含み得る。
【００９１】
さらにさらなる実施態様では、本開示の教示は、被験体における糖尿病状態若しくはそれに関連する生理的病状の処置及び／又は予防のための方法を提供する。一実施態様では、糖尿病状態は、糖尿病性腎症、糖尿病、ループス腎炎又は原発性糸球体疾患である。具体的な実施態様では、糖尿病状態は、糖尿病性腎症である。一実施態様では、糖尿病状態に関連する生理的病状は、タンパク尿である。具体的な実施態様では、糖尿病状態は、少なくとも一部は、ポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の脱シアリル化によって引き起こされる。前記方法は、シアル酸又はシアル酸前駆体を被験体に投与する工程を含む。前記投与は、糖尿病状態の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）の正常なシアリル化を回復させる。それによって、前記投与は、被験体における糖尿病状態を処置及び／又は予防する。シアル酸又はシアル酸前駆体は、治療有効量で投与され得る。さらに、シアル酸又はシアル酸前駆体は、医薬組成物の一部として単独で又は第２の薬剤と併用して、投与され得る。前記方法は、前記処置及び／又は予防を必要とする被験体を同定することをさらに含み得る。
【００９２】
〔診断方法〕
本開示は、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関して被験体の状態を決定する方法を提供する。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。一実施態様では、糖尿病状態は、糖尿病性腎症、糖尿病、ループス腎炎又は原発性糸球体疾患である。具体的な実施態様では、糖尿病状態は、糖尿病性腎症である。
【００９３】
一実施態様では、前記方法は、被験体において、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関連するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）のレベル、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関連するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）のシアリル化のレベル、又は、これらの組み合わせを決定する。特定の実施態様では、高ｐＩ型ポリペプチドのレベルが決定される。この型が脱シアリル化され、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態を示すことが示された。被験体から決定されたポリペプチドのシアリル化の量及び／又はレベルは、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態に罹患していないと診断された被験体（対照被験体）からの対応する量及びレベルと比較され得る。前記量及びレベルは、参照基準とも比較され得る。対照被験体又は参照基準と比較したシアリル化のレベルの減少は、被験体がネフローゼ症候群若しくは糖尿病状態に罹患しているか、又はそのリスクがあることを示す；上述にように、シアリル化のレベルは、高ｐＩ型ポリペプチド（これは、脱シアリル化されている）に関して決定され得る。
【００９４】
さらに、本開示は、ネフローゼ症候群若しくは糖尿病状態の処置を受けている被験体における、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態の処置の有効性を決定する方法を提供する。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症と特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。一実施態様では、糖尿病状態は、糖尿病性腎症、糖尿病、ループス腎炎又は原発性糸球体疾患である。具体的な実施態様では、糖尿病状態は、糖尿病性腎症である。
【００９５】
一実施態様では、前記方法は、被験体において、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関連するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）のレベル、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関連するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）のシアリル化のレベル、又は、これらの組み合わせを決定する。特定の実施態様では、高ｐＩ型ポリペプチドのレベルが決定される。この型が脱シアリル化され、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態を示すことが示された。処置中に被験体から決定されたポリペプチドのシアリル化の量及び／又はレベルは、処置を開始する前の被験体からの対応する量及び／又はレベルと比較され得る。処置を開始する前に決定されたシアリル化のレベルと比較した、処置を受けている被験体におけるシアリル化のレベルの増加は、処置が所望の効果を有していることを示す；上述にように、シアリル化のレベルは、高ｐＩ型ポリペプチド（これは、脱シアリル化されている）に関して決定され得る。さらに、処置中に被験体から決定されたポリペプチドの量及び／又はレベルは、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態に罹患していないと診断された被験体（対照被験体）の対応する量及び／又はレベルと比較され得る。前記量及びレベルは、参照基準とも比較され得る。処置中に被験体から得られたシアリル化のレベルが、対照被験体からのシアリル化のレベル若しくは参照と同じか、又は近いことは、処置が所望の効果を有していることを示す；上述にように、シアリル化のレベルは、高ｐＩ型ポリペプチド（これは、脱シアリル化されている）に関して決定され得る。
【００９６】
シアリル化のタンパク質レベル及びレベルを決定するための当技術分野において公知の任意の方法は、限定されないが、本明細書において記載されるあらゆる方法を含む前記方法において使用され得る。
【００９７】
図５Ｃは、この方法の有用性を示す。様々な病状を有する患者（ｎ＝患者４人／群）からのヒト血漿２００μｇを二次元ゲル電気泳動によって分析し、抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体を使用してウエスタンブロットを準備した。この図は、ＭＣＤが再発した患者のみが、脱シアリル化型Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチド（５５〜７０ｋＤａ  ｐＩ８〜８．５型のこのＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは、楕円形によって示される）を血中に有していたことを実証している；このポリペプチドは、ＭＣＤが寛解した患者には存在しなかった。再発したＭＣＤ患者（矢印）において、血中の中ｐＩ単量体及びオリゴマーの増加が認められ、単量体は、ＭＮ（矢印）においてのみ認められた。
【００９８】
あらゆる上記処置方法は、米国仮出願番号６１／３５１，８６６及び６１／４８３，８５４（これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているポリペプチドを投与する方法と共に使用され得る。
【００９９】
（スクリーニング方法）
また、本開示は、ネフローゼ症候群、糖尿病状態若しくはそれらに関連する病状（例えば、限定されないが、タンパク尿、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又は浮腫）を処置又は予防するのに有効な化合物を同定するための方法に関する。一実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ又はＭＧＮと特徴付けられる。別の実施態様では、ネフローゼ症候群は、ＭＣＤと特徴付けられる。一実施態様では、糖尿病状態は、糖尿病性腎症、糖尿病、ループス腎炎又は原発性糸球体疾患である。具体的な実施態様では、糖尿病状態は、糖尿病性腎症である。前記化合物は、医薬組成物に含まれる有効成分として、又は単独で投与するのに有用であり得る。一実施態様では、この方法は、ネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）のシアリル化のレベルを決定する工程を含む。
【０１００】
一般的には、前記スクリーニング方法は、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）を発現するアッセイ系（以下により詳細に記載される）を提供する工程、試験されるべき試験化合物をアッセイ系に導入する工程、及び、ポリペプチドのシアリル化のレベルに対する試験化合物の効果を決定する工程を含む。この方法は、ポリペプチドのシアリル化のレベルに影響を与える候補若しくは試験化合物又は薬剤（ポリペプチド、機能性核酸、炭水化物、抗体、小分子又は他の分子）を同定することを含む。次いで、前記化合物は、適切な系（例えば、限定されないが、本明細書において記載される動物モデル系）においてさらに試験され、同定された化合物の活性を決定し得る。候補化合物は、様々なアッセイ（例えば、限定されないが、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）を発現する細胞を使用するアッセイ、又は、単離されたポリペプチドを用いたアッセイ）を使用して同定される。様々なアッセイは、前記ポリペプチドの様々な変異体（例えば、全長、生物学的に活性な断片、又は、所望のポリペプチドの全部若しくは一部を含む融合タンパク質）を使用し得る。また、前記ポリペプチドは、任意の適切な哺乳類種（例えば、ヒト、ラット又はマウス）に由来し得る；具体的な実施態様では、ポリペプチドは、ヒトに由来する。
【０１０１】
アッセイが全細胞の使用を含む場合、細胞は、ネフローゼ症候群又は糖尿病状態の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）を自然に発現し得るか、又はそれを発現するように改変され得る。後者の場合、従来の分子生物学技術によって（例えば、前記ポリペプチドを含むウイルスを細胞に感染させることによって）、細胞は、所望のポリペプチドを発現するように改変され得る。また、細胞は、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクションされた原核細胞又は真核細胞であり得る。このような場合、全長ポリペプチド、断片、又は、前記ポリペプチドの少なくとも一部を含む融合タンパク質が使用され得る。例示的なアッセイ系は、本明細書において記載される。
【０１０２】
様々なスクリーニングアッセイが、本明細書において記載される症状、疾患状態及び病状に対する試験化合物の効果を測定することを伴うｉｎ  ｖｉｖｏアッセイと組み合わせられ得る。このような実施態様では、化合物は、ネフローゼ症候群若しくは糖尿病状態又はそれらに関連する病状（例えば、限定されないが、タンパク尿、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又は浮腫）に関連するパラメーターに影響を与えるかを決定するために、評価され得る。前記パラメーターとしては、１）高コレステロール血症、減少、高トリグリセリド血症又は関連病状の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）のシアリル化のレベル、及び２）高コレステロール血症、減少、高トリグリセリド血症又は関連病状の病因に関与する高ｐＩ型ポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）（これらの型は、脱シアリル化されている）の量を決定すること；３）全部又は特定の成分に関してタンパク質排泄のレベルを決定すること；及び４）腎臓形態（例えば、限定されないが、有足細胞）に対する試験化合物の影響を決定することが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
一実施態様では、前記スクリーニングアッセイは、例えば、高コレステロール血症、減少、高トリグリセリド血症の病因に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）のシアリル化のレベルを決定すること、及び、試験化合物の存在下において、試験化合物の非存在下と比較した前記ポリペプチドのシアリル化のレベルの差異を検出することによって実施され得る。特定の実施態様では、高ｐＩ型の前記ポリペプチドが特に検査される（この型は、脱シアリル化されている）。前記スクリーニングアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでもよいし、（全細胞又は溶解物を用いた）細胞培養に基づくものでもよいし、又は動物モデルに基づくものでもよい。本開示のあらゆるアッセイは、前記方法において使用され得る。
【０１０４】
スクリーニング方法に使用するのに好適な試験化合物は、任意の適切な供給源（例えば、従来の化合物ライブラリー）から得られ得る。試験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行固相又は液相ライブラリー、解析を必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における任意の多数の方法を使用しても得られ得る。生物学的ライブラリー法は、ペプチドライブラリーに限定されるのに対して、他の４つの方法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小分子ライブラリーに適用可能である。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見られ得る。化合物のライブラリーは、溶液中で、又はビーズ、細菌、胞子、プラスミド若しくはファージ上で提示され得る。
【０１０５】
前記方法において、高ｐＩ型Ａｎｇｐｔｌ４は、５５〜７０ｋＤａに移動し、８〜８．５のｐＩを有するポリペプチドを指す。
【０１０６】
本開示は、本明細書において開示されるあらゆる化合物及び／又は組成物を含み得る、本開示のあらゆる方法を実行するためのキット、あるいは本開示の方法を実施するのに有用なキットも提供する。
【０１０７】
（シアル酸前駆体）
本開示は、シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）又はシアル酸前駆体の様々な使用を提供する。
【０１０８】
一実施態様では、シアル酸前駆体は、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ；２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−マンノース又はＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンとも称される）である。ＭａｎＮＡｃの構造は、下記式Ｉに示される。
【０１０９】
【化１】
2013533857.tif 000002
【０１１０】
別の実施態様では、シアル酸前駆体は、下記式Ｉａによって定義される。
【０１１１】
【化２】
2013533857.tif 000003
【０１１２】
式中：
Ａは、ＣＨ２又はＮＨであり；
Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｘ、Ｏ−ＣＯ−Ｘ又はＯ−Ｘ（式中、Ｘは、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルであり、各Ｂ基、Ｃ基、Ｄ基及びＥ基に関して、Ｘは（存在する場合は）、独立して選択される）からなる群より選択され；
Ｇは、Ｈ、ＯＨ、Ｙ又はＯ−Ｙ（式中、Ｙは、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルである）である。
【０１１３】
式Ｉ及びＩａの化合物は、いす形配座によっても同様に表され得ると理解される。
【０１１４】
一実施態様では、Ｘ及び／又はＹは、独立して、Ｃ１〜Ｃ５アルキルである。特定の実施態様では、Ｘ及び／又はＹは、プロピルである；さらなる実施態様では、Ｘ及び／又はＹは、ブチルである。
【０１１５】
一実施態様では、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＧの少なくとも１つは、Ｈ又はＯＨではない。さらなる実施態様では、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＧの少なくとも２つは、Ｈ又はＯＨではない。さらにさらなる実施態様では、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＧの少なくとも３つは、Ｈ又はＯＨではない。さらに別の実施態様では、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＧのいずれも、Ｈ又はＯＨではない。
【０１１６】
特定の実施態様では、Ｇは、ＣＨ３であり、Ａは、ＣＨ２であり、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥの少なくとも１つは、Ｈ又はＯＨではない。さらに特定の実施態様では、Ｇは、ＣＨ３であり、Ａは、ＣＨ２であり、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥの少なくとも２つは、Ｈ又はＯＨではない。さらにさらなる特定の実施態様では、Ｇは、ＣＨ３であり、Ａは、ＣＨ２であり、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥの少なくとも３つは、Ｈ又はＯＨではない。さらにさらなる特定の実施態様では、Ｇは、ＣＨ３であり、Ａは、ＣＨ２であり、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥの少なくともすべては、Ｈ又はＯＨではない。このような場合、一実施態様では、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ独立して、ＣＯ−Ｘであり得る。
【０１１７】
Ｇが、ＣＨ３であり、Ａが、ＣＨ２であり、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥが、それぞれＯＨである場合、化合物は、ＭａｎＮＡｃ（式Ｉ）であることに留意する。
【０１１８】
式Ｉに該当する代表的な誘導体としては、Ｂｕ４ＭａｎＮＡｃ、３，４，６−Ｏ−Ｂｕ３ＭａｎＮＡｃ又は１，３，４−Ｏ−Ｂｕ３ＭａｎＮＡｃ（このような化合物は、２０１０年４月１４日にアクセプトされたＡｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ．ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ１０７１９−０１０−９２９２−３に記載されている）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
さらなるシアル酸前駆体としては、Ｎ−レブリノイルシアル酸（ＳｉａＬｅｖ）及びＮ−レブリノイルマンノサミン（ＭａｎＬｅｖ）（Ｃｈａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０００  Ｏｃｔ；１（１０）：１０４９−５６）が挙げられる。
【０１２０】
これらの化合物のすべての鏡像異性体型は、上記説明に含まれる。
【０１２１】
（組成物）
本開示の有用な組成物は、本開示の処置及び予防方法に有用な１つ以上の化合物（例えば、限定されないが、シアル酸、シアル酸前駆体、本開示において、又は本開示のスクリーニング方法によって同定される化合物）を含む。一実施態様では、前記化合物は、ポリペプチド（例えば、限定されないが、Ａｎｇｐｔｌ４）のシアリル化を増加させる。特定の実施態様では、化合物は、シアル酸前駆体である。例示的なシアル酸前駆体としては、ＭａｎＮＡｃ及びＭａｎＮＡｃ誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
開示される組成物は、薬学的に許容し得る担体と組み合わせて、１つ以上の前記化合物を含み得る。このような担体及び製剤化方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｌｉｍｍｅｒ，ｅｄｉｔｏｒ）に見られ得る。投与に好適な薬学的に許容し得る組成物を形成するために、このような組成物は、治療有効量の化合物を含む。
【０１２３】
本開示の医薬組成物は、本開示の処置及び予防方法に使用され得る。このような組成物は、本明細書において開示される処置及び予防方法において効果的である治療有効量の化合物を送達するのに十分な量で、被験体に投与される。治療有効量は、限定されないが、被験体の状態、体重、性別及び年齢などの様々な要素によって変わり得る。他の要素としては、投与形態及び部位が挙げられる。本開示の組成物は、被験体に１回だけ投与され得るか、又は被験体に複数回投与され得る。さらに、組成物が、被験体に複数回投与される場合、限定されないが、１回／日、１回／週又は１回／月などの様々なレジメンが使用され得る。また、組成物は、被験体に１日当たり複数回投与され得る。潜在的副作用を最小化しながら最適活性を得るために、治療有効量及び適切な投与レジメンは、定期試験によって決定され得る。加えて、他の薬剤の同時投与又は連続投与が望ましい場合もある。
【０１２４】
本開示の組成物は、本明細書において記載される様々な剤形及びレジメンで投与され得る。例示的な用量としては、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約７５０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重又は少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられるが、これらに限定されない。シアル酸前駆体の１日用量は、約０．１ｇ／日〜約７５ｇ／日、約０．５ｇ／日〜約５０ｇ／日、約１ｇ／日〜約１０ｇ／日、約０．１ｇ／日〜約５ｇ／日、約０．１ｇ／日〜約３ｇ／日及び約０．１ｇ／日〜約１ｇ／日の範囲であり得る。
【０１２５】
医薬組成物は、当技術分野において公知の任意の方法で被験体に提供され得る。例示的な投与経路としては、経口、皮下、直腸、非経口、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、局所、経皮（ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、骨内、筋肉内、皮膚、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、胸腔内、肺内、鼻腔内又は肺の経路が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
本開示の組成物は、化合物の溶解性、半減期、吸収などを向上させる薬剤をさらに含み得る。さらに、本開示の組成物は、好ましくない副作用を軽減するか、及び／又は、又は化合物の毒性を減少させる薬剤をさらに含み得る。このような薬剤の例は、限定されないが、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｌｉｍｍｅｒ，ｅｄｉｔｏｒ）などの様々なテキストに記載されている。
【０１２７】
本開示の組成物は、様々な投与剤形で投与され得る。例えば、組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル、小袋、ドロップ、トローチ、丸薬、粉末、顆粒、エリキシル剤、チンキ、液剤、懸濁液、エリキシル剤、シロップ、軟膏、クリーム、ペースト、乳液又は静脈内投与若しくは注射用の溶剤などの形態で投与され得る。他の剤形としては、パッチ機構又は軟膏による経皮投与が挙げられる。これらはいずれも、持続放出及び／又は徐放性製剤を提供するために改変され得る。
【０１２８】
本開示において、医薬組成物は、限定されないが、ビヒクル、アジュバント、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤、不活性充填剤、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、結合剤、滑剤、緩衝剤、崩壊剤及び担体並びに添加剤（例えば、限定されないが、着色料及び香味剤）（本明細書において担体と総称される）などの薬学的に許容し得る担体をさらに含み得る。典型的には、薬学的に許容し得る担体は、活性化合物に対して化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有しない。薬学的に許容し得る担体としては、ポリマー及びポリマーマトリックスが挙げられ得る。薬学的に許容し得る担体の性質は、使用される特定の剤形及び組成物の他の特性に応じて異なり得る。
【０１２９】
例えば、限定されないが、錠剤、カプセル、小袋、ドロップ、トローチ、丸薬、粉末又は顆粒などの固形形態による経口投与のために、化合物は、非毒性の薬学的に許容し得る経口不活性担体（例えば、限定されないが、不活性な充填剤、適切な結合剤、滑剤、崩壊剤及び添加剤）と組み合わせられ得る。適切な結合剤としては、限定されないが、デンプン、ゼラチン、天然糖（例えば、グルコース又はβラクトース）、コーン甘味料、天然又は合成ゴム（例えば、アカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが挙げられる。これらの剤形に使用される滑剤としては、限定されないが、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤としては、限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが挙げられる。錠剤は、１つ以上の以下のものを含み得る：ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、グァーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸及び本明細書において記載される他の担体。ドロップは、香味料（通常、スクロース及びアカシア又はトラガカント）中に有効成分を含み得、トローチも同様に、不活性な基剤（例えば、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア）中に有効成分を含み、乳液及びゲルは、有効成分に加えて、当技術分野において公知の担体を含む。
【０１３０】
経口液体形態（例えば、限定されないが、チンキ、液剤、懸濁液、エリキシル剤、シロップ）のために、本開示の核酸分子は、水、生理食塩水又はアルコールなどの希釈剤に溶解され得る。さらに、経口液体形態は、適切に風味付けした懸濁化剤又は分散剤（例えば、合成又は天然ゴム、例えば、トラガカント、アカシア、メチルセルロースなど）を含み得る。また、所望により又は必要な場合は、適切な着色剤又は他の添加剤も、混合物に組み込まれ得る。使用され得る他の分散剤としては、ゼラチンなどが挙げられる。
【０１３１】
非経口投与に好適な製剤としては、水性又は非水性の滅菌等張注射液（これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び製剤を患者の血液と等張にする溶質を含み得る）及び水性又は非水性の滅菌懸濁液（これは、懸濁化剤、可溶化剤、濃化剤、安定化剤及び保存剤を含み得る）が挙げられる。化合物は、生理学的に許容し得る界面活性剤（例えば、限定されないが、石鹸、油又は合成洗剤）、懸濁化剤（例えば、限定されないが、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロース）若しくは乳化剤及び他の薬学的なアジュバントを添加して、又は添加せずに、水、生理食塩水、デキストロース水溶液及び関連する糖水溶液などの滅菌液又は液体混合物、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノール、ヘキサデシルアルコール）、グリコール（例えば、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール（例えば、ポリ（エチレングリコール）４００）グリセロールケータル（例えば、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール）、エーテル、油、脂肪酸、脂肪酸エステル又はグリセリド又はアセチル化脂肪酸グリセリド、などの生理学的に許容し得る希釈剤に溶解させて投与され得る。
【０１３２】
非経口製剤に使用され得る油としては、石油、動物油、植物油又は合成油が挙げられる。油の具体例としては、ピーナッツ、大豆、ゴマ、綿実、コーン、オリーブ、ペトロラタム及び鉱物が挙げられる。非経口製剤に使用するのに好適な脂肪酸としては、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ソルビタンオレイン酸モノエステル及びポリエチレンオキサイドとプロピレングリコールの濃縮によって得られる疎水性基を有する高分子量エチレンオキサイド付加物）、オレイン酸、ステアリン酸及びイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチル及びイソプロピルミリスチン酸は、適切な脂肪酸エステルの例である。非経口製剤に使用するのに好適な石鹸としては、脂肪酸アルカリ金属塩、アンモニウム及びトリエタノールアミン塩が挙げられ、適切な合成洗剤としては、（ａ）例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハロゲン化物及びアルキルピリジニウムハロゲン化物などの陽イオン洗剤、（ｂ）例えば、アルキル、アリール及びオレフィンスルフォン酸、アルキル、オレフィン、エーテル及びモノグリセリド硫酸塩及びスルホサクシネートなどの陰イオン洗剤、（ｃ）例えば、脂肪族アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド及びポリオキシエチレンポリプロピレン共重合体などの非イオン洗剤、（ｄ）例えば、アルキルベータ−アミノプロピオネート及び２−アルキルイミダゾリン第４アンモニウム塩などの両性洗剤、並びに（ｅ）それらの混合物が挙げられる。
【０１３３】
適切な保存剤及び緩衝剤は、このような製剤において使用され得る。注射部位の炎症を最小化又は除去するために、このような組成物は、約１２〜約１７の親水性・親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１つ以上の非イオン界面活性剤を含み得る。このような製剤中の界面活性剤の量は、５重量％〜１５重量％の範囲である。
【０１３４】
本開示の核酸分子を含む局所用剤形（例えば、限定されないが、軟膏、クリーム、ペースト、乳液）は、当技術分野において周知の様々な担体材料（例えば、アルコール、アロエベラジェル、アラトニン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥ油、鉱物油、ＰＰＧ２ミリスチルなど）と混合されて、クリーム又はジェル製剤のアルコール溶液、局所洗浄剤、洗浄クリーム、スキンジェル、スキンローション及びシャンプーを形成し得る。皮膚剥離剤又は皮膚研磨調製物の含有物も使用され得る。このような局所調製物は、パッチ、包帯若しくは経皮送達用の衣服に適用され得るか、又は包帯若しくは創傷若しくは皮膚損傷の部位への直接送達用の衣服に適用され得る。
【０１３５】
本開示の化合物は、小型の単層ベシクル、大型の単層ベシクル及び多層ベシクルなどのリポソーム送達システムの形態でも投与され得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンなどの様々なリン脂質から形成され得る。このようなリポソームは、特定の細胞型又は特定のグループの細胞型にリポソームを直接送達するためのモノクローナル抗体も含み得る。
【０１３６】
本開示の化合物は、標的を設定可能な薬物担体としての可溶性ポリマーと結合され得る。このようなポリマーとしては、限定されないが、ポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドエフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドエフェノール又はパルミトイル残基で置換したポリエチル−エネオキシドポリリシンが挙げられ得る。さらに、本発明の合成物は、薬物の制御放出を達成するのに有用な生体分解性ポリマーのクラス（例えば、ポリ乳酸、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリヒドロピラン、ポリシアノアクリル酸及びヒドロゲルの架橋共重合体又は両親媒性ブロック共重合体）と結合され得る。
【０１３７】
さらに、本明細書において開示されるシアル酸又はシアル酸前駆体は、食品サプリメントとして投与され得るか、又は食品若しくは飲料商品に組み込まれ得る。
【０１３８】
〔実施例〕
以下の結果において、使用した方法は、本開示の方法セクション及びそこで引用した参考文献に詳述されている方法であった。
【０１３９】
（実験的なヒト糸球体疾患における有足細胞Ａｎｇｐｔｌ４発現のアップレギュレーション）
Ａｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ発現は、ラット糸球体において、ＮＴＳの注射後２４時間の、相補的かつ白血球非依存性異種期タンパク尿のピーク時に、アップレギュレーション（７０倍）している（図ｌＡ及び１Ｂ）。Ａｎｇｐｔｌ４−／−マウスへのＮＴＳの注射は、タンパク尿（図１Ｃ）の有意な減少及び足突起の消失（図１Ｄ）を引き起こしたが、これは、糸球体疾患におけるＡｎｇｐｔｌ４の重要な役割を示唆している。正常なラット糸球体は、有足細胞タンパク質ＣＤ２ＡＰと共局在した毛細血管ループパターンでＡｎｇｐｔｌ４を発現している（図１Ｅ）。さらなる研究により、幼若ラットにおいて、単回用量のピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮモデル）を静脈内注射した後に、早期（３日目、すなわちタンパク尿の発症前）かつプログレッシブなＡｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ発現がアップレギュレーションされることが明らかになり（図１Ｆ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、近位尿細管シグナルが同時に変化することなく、末梢毛細血管ループパターンでアップレギュレーションされることを確認した（データは示さず）。受動ハイマン腎炎において、タンパク尿の発症後に、Ａｎｇｐｔｌ４発現がわずかに増加し始めることが認められた（図１Ｆ）。対照的に、Ａｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ発現は、抗Ｔｈｙ１．１腎炎で、又は、虚脱型巣状分節状糸球体硬化症（１８）を有する患者に由来する血清を注射することによってラットで誘導した虚脱型巣状分節状糸球体硬化症で変化しなかった（図１Ｆ）。Ａｎｇｐｔｌ４タンパク質発現は、ＰＡＮの誘導後に、有足細胞で劇的に増加しており（図１Ｇ）、免疫金電子顕微鏡法（ＥＭ）により、糸球体基底膜（ＧＢＭ）とかなりオーバーラップしていることを確認した（図１Ｈ）。グルココルチコイド感受性ＭＣＤを有する患者、並びに、年齢及び性別適合コントロールからの生検（図１Ｉ）により、コントロールの腎臓生検におけるかすかな有足細胞パターン、及び、有足細胞における発現の増加と、それに伴うＧＢＭとのさらなるオーバーラップ及び内皮周辺との斑点状のオーバーラップが明らかになった。
【０１４０】
（Ａｎｇｐｔｌ４の有足細胞特異的過剰発現は、選択的なタンパク尿及び有足細胞の足突起の消失をもたらす）
有足細胞特異的Ａｎｇｐｔｌ４過剰発現のためのトランスジェニックラットモデルを開発し、図２Ａに示す（ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧ）。Ａｎｇｐｔｌ４を通常発現している臓器におけるｍＲＮＡ発現の分析により、発現の特異性を確認した（図２Ｂ）。３月齢ヘテロ接合体雄性ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットの組織学的評価により、突起状の有足細胞（図２Ｃ）を含む糸球体の外見が光学顕微鏡検査では正常であること、及び、共焦点画像により有足細胞のＡｎｇｐｔｌ４発現が増加していること（図２Ｄ）が明らかになった。５月齢ホモ接合体及びほぼヘテロ接合体のＴＧラット（図２Ｅ）の電子顕微鏡検査により、広範な足突起の消失が明らかになった。ホモ接合体ＴＧラットの免疫金ＥＭにより、１〜５月齢における、ＧＢＭにおけるＡｎｇｐｔｌ４の蓄積と、足突起の消失の漸進的進行との間の相関が明らかになった（図２Ｆ）。両樹立系統のＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットは、重度のアルブミン尿を発症した。雌性ホモ接合体及び雄性ヘテロ接合体ラットは、早ければ１月齢に、アルブミン尿を発症した（図３Ａ〜３Ｃ）。時間の経過と共に、雌性ホモ接合体は最大１００倍、雄性ヘテロ接合体は最大２０倍、そして雄性ホモ接合体は５００倍以上増加したアルブミン尿を発症した。雌性ヘテロ接合体は、アルブミン尿症ではなかった。９０％以上の尿タンパク質は、インタクトなアルブミンを含み（図３Ｄ）、それによって、これらのラットは、選択的なタンパク尿の最初のモデルとなる。導入遺伝子発現タンパク質を特異的に検出するために、抗Ｖ５抗体を使用して免疫金ＥＭを行ったところ、ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットの有足細胞及びＧＢＭにおいて、金粒子が認められた（図３Ｅ）。ＰＡＮの注射後、有足細胞により分泌されたＡｎｇｐｔｌ４のタンパク尿促進作用を維持すると、ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットは、野生型同腹子よりもタンパク尿を発症した（図３Ｆ）。血圧は、野生型コントロールと比較して、タンパク尿ヘテロ接合体ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４ラットにおいて、有意に低かった（データは示さず）。以前にも公開したように（２０）、ＰＡＮにおけるタンパク尿は、６日目において部分的にグルココルチコイド感受性であり（図３Ｇ）、このグルココルチコイド感受性のいくつかは、Ａｎｇｐｔｌ４に関連している（図３Ｈ）。
【０１４１】
（有足細胞により分泌されたＡｎｇｐｔｌ４及びリコンビナントＡｎｇｐｔｌ４の特性決定）
Ａｎｇｐｔｌ４は急速に分泌されるので、糸球体タンパク質のウエスタンブロットは、通常、Ａｎｇｐｔｌ４産生を過小評価している。コントロール（上のパネル）、６日目のＰＡＮモデル（中央のパネル）及びグルココルチコイドを同時投与した６日目のＰＡＮモデル（下のパネル）に由来する糸球体において、二次元電気泳動及びウエスタンプロッティング（図４Ａ）によって、Ａｎｇｐｔｌ４を分析した。二次元ゲル電気泳動において、正常な糸球体におけるほとんどのＡｎｇｐｔｌ４は、中ｐＩでグリコシル化低オリゴマーとして移動したが（ピンク色矢印；３）、グリコシル化されたインタクトな７０ＫＤａ及び切断型の両方のあまり目立たない部分（赤色矢印；１）並びに非グリコシル化４５ＫＤａ単量体型（黄色矢印；２）も認められた（図４Ａ及び４Ｂ）。ＰＡＮにおいて、中ｐＩオリゴマー（これは、シアル酸結合レクチン（マーキア・アムーレンシス）（ＭＡＡ）と反応する）及び高ｐＩオリゴマー（これは、ＭＡＡ反応性ではない）は両方とも、増加していた（ピンク色矢印、３及びオレンジ色矢印；４）（図４Ａ及び４Ｂ）。この増加は、グルココルチコイドとＰＡＮで処置したものにおいては鈍かったが、過度に大量の高ｐＩオリゴマーが認められた。ウエスタンブロットのデンシトメトリー分析を図４Ｂに示す。
【０１４２】
図５Ａは、ｐｃＤＮＡ−ラットＡｎｇｐｔｌ４−Ｖ５−Ｈｉｓ発現構築物で安定的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞株が、コントロールの空ベクター細胞株と比較して、Ａｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ発現の５５，０００倍のアップレギュレーションを示したことを示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。図５Ｂは、Ａｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３細胞が、無血清条件下で、ほぼインタクトなタンパク質を上清に分泌したことを示す（二次元ゲル電気泳動、並びに、免疫前血清及び抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体を用いたウエスタンブロットによって確認した）。
【０１４３】
Ａｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３安定細胞株を使用して、Ａｎｇｐｔｌ４のシアリル化をｉｎ  ｖｉｔｒｏ（図４Ｃ）で研究した。ＨＥＫ２９３細胞は、通常、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドを全く発現しないか、又はわずかに発現している；ｐｃＤＮＡ−ラットＡｎｇｐｔｌ４−Ｖ５−Ｈｉｓ発現構築物でトランスフェクションした後に、この細胞株は、コントロールの空ベクター細胞株と比較して、Ａｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ発現の５５，０００倍のアップレギュレーションを示した（図５Ａ）。さらに、ＨＥＫ２９３−Ａｎｇｐｔｌ４細胞株によって発現されたＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドは、通常、この細胞株によって分泌され、低ｐＩ末端でわずかに追跡されるＭＡＡ反応性であるため（図４Ｃ上パネル及び上中央パネル、緑色矢印１及び図５Ｂ）、ほとんど脱シアリル化されている。細胞株をシアル酸前駆体Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ；図４Ｃ、下中央パネル及び下パネル）とインキュベーションすると、タンパク質が中ｐＩにシフトし、ＭＡＡに対する反応性が増加し（青色矢印、２）、その結果、シアリル化が増加したが、これは、シアリル化が、Ａｎｇｐｔｌ４のディファレンシャル電気泳動において重要な役割を果たすことを示している。
【０１４４】
ＰＡＮにおいて、脱シアリル化Ａｎｇｐｔｌ４の増加が認められたので、タンパク尿の病因におけるこの脱シアリル化の役割を研究した。図６Ａは、漸増用量のＭａｎＮＡｃを投与した重度のアルブミン尿ラットを用いたパイロット研究からのアルブミン尿追跡の代表的なものを示す。この研究により、ＭａｎＮＡｃが、これらの動物におけるアルブミン尿を減少させたことが明らかになった。しかしながら、これらのラットにおけるアルブミン尿を減少させるには、多くの用量が必要であった。より効率的かつ直説的な研究を行うために、野生型ラットよりも１５〜２５倍高いアルブミン尿のラットをさらなる分析に使用した。
【０１４５】
水道水に溶解させたＭａｎＮＡｃ（１ｍｇ／ｍｌ）を投与したＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット（図４Ｄ）は、ベースラインと比較して、１２日間でアルブミン尿が４０％超減少したのに対して、水道水を投与したコントロールのＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおけるアルブミン尿は、研究期間中に２．５倍増加した。図６Ｂは、ＭａｎＮＡｃ（１ｍｇ／ｍｌ）で処置した試験群のＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットからの個々の追跡を示しており、これにより研究は終了した。これらのラットで時間と共にアルブミン尿の増加が起こったことを確認するために、研究開始前に、１２日間とは別に２回採尿した。この研究により、ＭａｎＮＡｃ（１ｍｇ／ｍｌ）が、これらの動物におけるアルブミン尿を減少させたことが明らかになった。
【０１４６】
１２日目（図６Ｃ及び６Ｄ）に安楽死させたラットからの糸球体Ａｎｇｐｔｌ４に関するウエスタンブロットのデンシトメトリー分析により、中ｐＩ  Ａｎｇｐｔｌ４画分が、４８．３＋５％（コントロールのラット）〜７２．９＋１．４％（ＭａｎＮＡｃ処置ラット）増加したことが示された（図６Ｄ）。中ｐＩ画分は、シアル酸結合レクチン（サムブクス  二ゲラ）（ＳＮＡ  Ｉ）とも反応したが、これは、ＭａｎＮＡｃ処置ラットにおけるＡｎｇｐｔｌ４のシアリル化が増加したことを裏付けている（図６Ｃ）。
【０１４７】
図７は、ＭＣＤのモデルであるＰＡＮを有するＭａｎＮＡｃ処置ラットにおけるネフローゼ症候群パラメーターの改善を示す。ピューロマイシンアミノヌクレオシド（１０ｍｇ／１００ｇｍ）をラット（ｎ＝ラット５匹／群）に単回静脈内注射し、４日目（これは、タンパク尿の発症と同時である）から、水道水に溶解させたＭａｎＮＡＣ８０ｍｇ／Ｋｇ体重で処置した。６日目のデータを示す。コントロールのＰＡＮラットと比較した場合に、ＭａｎＮＡＣ処置ラットにおいて、タンパク尿の有意な減少（図７Ａ）、血漿アルブミンレベルの改善（図７Ｂ）、コレステロールの減少（図７Ｃ）及びトリグリセリドの減少（図７Ｄ）が認められた。これらのデータは、上記結果と一致している。
【０１４８】
アルブミン尿などのタンパク尿は、糖尿病などの本明細書において記載される他の疾患で認められている。ｄｂ／ｄｂマウスを使用して、糖尿病におけるＡｎｇｐｔｌ４の役割も分析した。ｄｂ／ｄｂは、離乳してすぐの過食症の肥満マウスとして、Ｊａｃｋｓｏｎ研究室で１９６６年に最初に同定された。糖尿病遺伝子（ｄｂ）は、常染色体劣性遺伝する。ｄｂ遺伝子は、レプチン受容体のＧからＴへの点変異（これは、脂肪細胞由来のホルモンであるレプチンのスプライシング異常及びシグナル伝達不全の原因となる）をコードする。視床下部におけるレプチンシグナル伝達の欠損は、持続性の過食症及び肥満の原因となり、その結果、レプチン及びインスリンレベルが高くなる。いくつかの研究は、アルブミン排泄率が、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて８週齢の初期に８〜６２倍高いことを立証した。アルブミン尿の範囲は、雄性ｄｂ／ｄｂマウスにおいて６８〜３０３μｇ／２４時間であるのに対して、年齢適合テロ接合体同腹子においては４〜２１μｇ／２４時間である。
【０１４９】
図８Ａ〜Ｃは、糖尿病動物におけるタンパク尿に対するＭａｎＮＡｃ治療の効果を示す。図８Ａは、糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス及びコントロールｄｂ／ｍマウスに由来する糸球体の二次元ゲル電気泳動並びにウエスタンブロット分析を示す。この分析により、糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス糸球体において、Ａｎｇｐｔｌ４（これは、タンパク尿の病因に関与する高ｐＩ脱シアリル化型を含む）の発現が増加していることが示された。これらの高ｐＩ脱シアリル化型Ａｎｇｐｔｌ４は、ＭａｎＮＡｃ及びＭａｎＮＡｃ誘導体などのシアル酸前駆体治療に感受性である。
【０１５０】
図８Ｂは、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満ラットに由来する糸球体の二次元ゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析を示す。この分析により、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満ラット糸球体において、Ａｎｇｐｔｌ４（これは、タンパク尿の病因に関与する高ｐＩ脱シアリル化型を含む）の発現が増加していることが示された。これらの高ｐＩ脱シアリル化型Ａｎｇｐｔｌ４は、ＭａｎＮＡｃ及びＭａｎＮＡｃ誘導体などのシアル酸前駆体治療に感受性である。図８Ｃは、シアル酸前駆体による処置が、このモデルにおけるタンパク尿を減少させたことを示す。図８Ｃにおいて、１３週齢雄性Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満ラットを、水道水に溶解させたＭａｎＮＡｃ又はプレーンな水道水で処置した（ｎ＝ラット４匹／群）。最大２０日間に、７０ｍｇ／Ｋｇ及び増加用量１４０ｍｇ／ＫｇのＭａｎＮＡｃ処置群において、タンパク尿の有意な減少が認められた。
【０１５１】
これらの結果は、シアル酸前駆体の投与が、Ａｎｇｐｔｌ４の正常なシアリル化を回復させることによって、糖尿病を処置することを示す。図８Ｃに示されるように、シアル酸前駆体の投与は、本明細書において記載されるＡｎｇｐｔｌ４ポリペプチドの正常なシアリル化を回復させることによって、糖尿病で観察されるタンパク尿を減少させる。
【０１５２】
本開示は、有足細胞により分泌されたＡｎｇｐｔｌ４の、ネフローゼ症候群の病因における重要な役割（これは、ＭＣＤのモデルを使用して実証した）及びネフローゼ症候群に関連する病状（例えば、限定されないが、タンパク尿）におけるＡｎｇｐｔｌ４の役割を示す。本開示は、ヒト腎臓生検において有足細胞のＡｎｇｐｔｌ４発現が増加していること、ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおいてアルブミン尿が５００倍超増加しているという選択的なタンパク尿、Ａｎｇｐｔｌ４遺伝子のグルココルチコイド感受性、並びに、光学及び電子顕微鏡の知見がヒトＭＣＤと一致していることを示す。さらに、ＮＴＳを注射したＡｎｇｐｔｌ４−／−マウスにおけるタンパク尿及び足突起の消失の有意な減少によって、タンパク尿の発症及び足突起の消失におけるＡｎｇｐｔｌ４の役割を確認した。信頼できるＭＣＤのマウスモデルがないため、ＮＴＳを使用する必要があった。
【０１５３】
ＭＣＤにおける有足細胞による高ｐＩＡｎｇｐｔｌ４の分泌は、Ａｎｇｐｔｌ４がＧＢＭに結合するのを促進する可能性があり、過去の研究は、Ａｎｇｐｔｌ４がへパラン硫酸プロテオグリカンに結合することを示している（２１）。これは、Ａｎｇｐｔｌ４が有足細胞でＴＧ発現している齧歯類において、ＧＢＭ電荷が減少していること（これは、ＭＣＤの特徴である）とよく相関している。電荷は、流れの方向に逆らって、高ｐＩＡｎｇｐｔｌ４がＧＢＭを通過して輸送されるのを促進する可能性がある。有足細胞から分泌された活性オリゴマー型Ａｎｇｐｔｌ４は、スレオニンリン酸化されておらず、Ａｎｇｐｔｌ４のシアリル化の増加は、タンパク尿を減少させたので、シアリル化の変化により、大部分のｐＩ変化、及び、タンパク尿におけるＡｎｇｐｔｌ４の生物学的役割が説明される。ラット及びヒトＡｎｇｐｔｌ４のそれぞれにおいて、シアル酸残基が組み込まれ得る２つの予測Ｏ−及びＮ−グリコシル化部位がある。シアル酸前駆体による処置は、ネフローゼ症候群（例えば、限定されないが、ＭＣＤ）、及びおそらく、Ａｎｇｐｔｌ４が役割を果たしている糖尿病のようなよく見られる多系統疾患におけるタンパク尿を減少させるための新たな潜在的治療ツールの構成要素となる。
【０１５４】
加えて、まだ不明確ではあるが、有足細胞又は内皮細胞により分泌された因子は、おそらく、ＭＣＤの病因において、Ａｎｇｐｔｌ４と相乗的に作用している。ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおいて、有足細胞により分泌されたＡｎｇｐｔｌ４は、糸球体毛細血管ループに依然として結合しているか、又は近位尿細管によって取り込まれる尿スペースにエスケープしている。これらのラットにおいて低用量ＰＡＮ（これは、さらなる透過性因子をこれらのラットに提供する）を誘導した後に、有足細胞により分泌されたＡｎｇｐｔｌ４は、血中にエスケープする。また、ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおいて、さらなる透過性因子を欠如させることにより、タンパク尿が、ＰＡＮ又はＭＣＤを有する患者よりも緩やかに発症することが説明される可能性がある。
【０１５５】
これらは、シアル酸前駆体の投与が、Ａｎｇｐｔｌ４ポリペプチドの正常なシアリル化を回復させ、ネフローゼ症候群に関連する生理学的異常（例えば、限定されないが、ＭＣＤ、ＦＳＧＳ、ＭＮ／ＭＧＮ、ＭＰＧＮ又は糖尿病性腎症）、糖尿病、ループス腎炎又は原発性糸球体疾患を軽減することを示している。その結果、本開示は、前記病状の処置を提供する。
【０１５６】
〔方法〕
（全長ラットＡｎｇｐｔｌ４のクローニング、及び、全長リコンビナントＡｎｇｐｔｌ４に対する抗体の作製）
本発明者らの過去の実験（７）からの１２１８ｂｐの全長ラットＡｎｇｐｔｌ４オープンリーディングフレーム（終止コドンを除く）を、真核生物発現用のｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＢ及び原核生物発現用のｐＥＴ２８ａにクローニングした。大腸菌により発現された精製全長タンパク質を、ウサギ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．Ｃｈｉｃａｇｏ  ＩＬ  ＵＳＡ）でポリクローナル抗体（これは、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットによって試験した）を作製するのに使用した。抗体反応性のバンドを、ＧｅｌＣｏｄｅ  ｂｌｕｅ染色したゲルから切り出し、トリプシン分解し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦによってＡｎｇｐｔｌ４ペプチド配列の存在を確認した。抗血清の一部を、抗原に対してアフィニティー精製した。特に明記しない限り、記載したすべての研究は、この抗体を使用した。ラットＡｎｇｐｔｌ４のＮ末端部分（シグナルペプチドを除くアミノ酸７〜８６）に対するさらなるポリクローナル抗体を、ウサギで同様に生産した。
【０１５７】
（ヒト糸球体疾患の動物モデルにおけるタンパク尿の誘導）
すべての動物実験は、施設内ＩＡＣＵＣによって承認された。ＷＴラットにおけるタンパク尿（ｎ＝ラット４匹／群）の動物モデルの誘導は、丸括弧内の過去の刊行物に記載されている：ＰＡＮ（７）、ＰＨＮ（７）、グルココルチコイドを有するＰＡＮ（２０）、非ＨＩＶ虚脱型糸球体症（１８）、腎毒性血清誘導性異種期タンパク尿（７）；これらの参考文献は、このような教示に関して、参照により本明細書に組み込まれる。２００ｍｃｇの抗Ｔｈｙ１．１（Ｏｘ−７ハイブリドーマ）の注射によって抗Ｔｈｙ１．１腎炎を誘導するか、又はコントロールＩｇＧ  ＩＶを異なる群の雄性Ｗｉｓｔａｒラットに注射し（１００〜１２５ｇｍ、ｎ＝ラット４匹／群）、２４〜７２時間後にラットを安楽死させた。
【０１５８】
以下の技術は、過去の刊行物に記載されている：ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲ（２６）、共焦点画像（７）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（２７）、プロモーター−レセプター試験（７）、免疫金ＥＭ（２６）、ウエスタンブロットのための糸球体摘出及び処理（２６）、ＰＥＩ法による電荷の評価（２８）；これらの参考文献は、このような教示に関して、参照により本明細書に組み込まれる。アルシアンブルー染色のために、酢酸を使用して、染色液のｐＨを２．５に調整し、０．１％ヌクレアファストレッド溶液を対比染色として使用した。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して、糸球体基底膜アルシアンブルー染色（糸球体２０個／ラット、ラット３匹／群）のデンシトメトリーを評価した。Ｇｅｌ−Ｐｒｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、二次元ゲルウエスタンブロットのデンシトメトリーを評価した。ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲプライマー及びプローブを表１にリスト化する。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに関して、ジゴキシゲニン標識化プローブは、ＯＲＦのｂｐ１〜５４８を含むラットＡｎｇｐｔｌ４用である。
【０１５９】
ヘパリン処理ＬＰＬ活性のためのサンプルを得るために、安楽死前１５分に、１０単位／１００ｇｍ体重のブタヘパリンをラットに静脈内注射し、Ｒｏａｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ）のアッセイを使用して、活性を測定した。空腹状態で血清トリグリセリドを測定した。
【０１６０】
（Ａｎｇｐｔｌ４−／−マウスへのＮＴＳの注射）
Ａｎｇｐｔｌ４−／−マウスは、好意的なギフトとして、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ  ＵＳＡ）からＳａｎｄｅｒ  Ｋｅｒｓｔｅｎに提供された。研究プロトコールは、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＡｎｉｍａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。１．５ｍｇのγ２−ＮＴＳ又は通常のヒツジ血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ  ＵＳＡ）を、１１週齢雄性Ａｎｇｐｔｌ４−／−又は＋／＋マウス（ｎ＝マウス４匹／群）に静脈内注射し、４８時間の時点でスポット尿サンプルを採取し、７２時間の時点でマウスを安楽死させ、生化学的測定のために血漿を採取し、組織学的分析のために腎臓を保存した。ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ＴＸ  ＵＳＡ）によって、尿アルブミンを評価し、質量分析によって、尿クレアチニンを測定した。足突起の消失を評価するために、コントロール処置Ａｎｇｐｔｌ４＋／＋マウスの透過型電子顕微鏡写真において、足突起の平均幅を最初に測定した（１０回の等間隔測定／ループ、３個のループ／糸球体、３個の糸球体／腎臓、３個の腎臓／群）。消失は、平均幅の２．５倍超の増加として記載した。ＮＴＳ処置又はコントロール処置Ａｎｇｐｔｌ４−／−マウスにおいて、足突起の合計数及び消失した数をカウントした。
【０１６１】
（保管したヒトのサンプルを用いた研究）
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｎａｃｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｉａ，Ｍｅｘｉｃｏ  ＣｉｔｙのＩＲＢにより承認されたプロトコールによって得られたサンプルで、保管したヒト腎臓生検（ｎ＝生検５個／条件）の免疫染色を行った。これらの研究に使用したコントロールの腎臓生検は、性別及び年齢適合プロトコール移植前生検であった。二次元ゲル電気泳動及びウエスタンブロット用の保管したヒト血清（ｎ＝サンプル４個／条件）を、以前に公開した研究（２９）から入手した。
【０１６２】
（トランスジェニックラットの作製：）
以下のように、ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットを作製した：ベクターｐＴＲＥ−ｔｉｇｈｔをＳｔｕＩ及びＥｃｏＲＩで消化して、ｂｐ２７８〜３２４の間にある最小ＣＭＶプロモーターを除去し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで５’オーバーハングをブラントエンドし、再ライゲーションして、ｐＴＲＥ−ｔｉｇｈｔ  ＭＰ（プロモーターなし）を作製した。有足細胞特異的発現のために、Ｃ末端Ｖ５タグを有するラットＡｎｇｐｔｌ４  ｃＤＮＡ構築物（シグナル配列を含む）を、ＳＶ４０ポリＡテイルの上流に配置した。公開されているヒトＮＰＨＳ２プロモーター構築物を鋳型（ｇｉ２２６５２６６１）として使用するＤＭＳＯなしのＰＣＲによって、ヒトＮＰＨＳ２プロモーターを上流にクローニングし、発現を向上させるために、ｂｐ２３４３〜２５６８の間に天然に存在するループを除去した。
【０１６３】
消化したＤＮＡ構築物をＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ受精卵にマイクロインジェクションし（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎで行った）、偽妊娠した宿主Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙの雌に着床させることによって、トランスジェニックラットを作製し、構築物特異的プライマー及びプローブ並びにコントロールのゲノムプロラクチンプライマー及びプローブの組み合わせを使用する通常のＰＣＲ及びＴａｑＭａｎゲノムＤＮＡリアルタイムＰＣＲ戦略によって、得られた子の遺伝子型を特定した。有足細胞特異的発現のための２つの樹立系統を作製した。４世代にわたり安定であったＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット系統７４０（５コピーの導入遺伝子）からのデータを示す。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ  ＵＳＡ）を使用して、尿中の総タンパク質を評価し、ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ＴＸ  ＵＳＡ）によって、アルブミン尿を評価した。
【０１６４】
（ラット血圧の測定）
５月齢の野生型ラット及びタンパク尿へテロ接合体ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット６匹において、Ｈｅｔｔｅｒａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｙ  ＮＣ  ＵＳＡ）のＳＣ−１０００装置を使用するｔａｉｌ  ｃｕｆｆ法によって、血圧及び脈拍数を測定した。１群当たり、８０回の測定の最小値を分析した。
【０１６５】
（安定細胞株及びリコンビナントＡｎｇｐｔｌ４タンパク質の開発並びに特性決定）
コントロールの空ベクター安定細胞株と共に、ラットＡｎｇｐｔｌ４  ｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５／Ｈｉｓ構築物を使用して、安定細胞株を開発した。Ａｎｇｐｔｌ４安定細胞株は、ラットＡｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡを５５，２５３±５，１５５倍アップレギュレーションしており（参照値１とした検出不可能なベースラインを上回る）、無血清条件下で７０ｋＤａタンパク質を分泌し、血清の存在下で５５ｋＤａタンパク質を分泌する。ニッケルアフィニティーカラムを使用して、全長Ｖ５−Ｈｉｓタグ化タンパク質を無血清培地からアフィニティー精製した。二次元ゲル上で実施したウエスタンブロット研究により、ほとんどのリコンビナントＡｎｇｐｔｌ４が、高等電点（８．３〜８．５）タンパク質として移動し、非リン酸化であることが明らかになった。
【０１６６】
（プロモーター−レセプター研究。）
以前に公開（３１）したマウスＡｎｇｐｔｌ４プロモーターは、肝臓において、ＡＴＧの上流１８３ｂｐに転写開始部位を有していた。本発明者らは、マウス腎臓ｍＲＮＡを使用して５’ＲＡＣＥ及びプライマー伸長分析を行い、腎臓において同じ転写開始部位を確認した。次に、ＢＡＣクローンＲＰ２３−２７Ｄ５を鋳型として使用して、転写開始部位の上流の断片２ＫｂをｐＳＥＡＰ２ベーシックにクローニングした。ＢＡＣクローンＲＰ１１−８８６Ｐ１６を使用して、２ＫｂのヒトＡｎｇｐｔｌ４プロモーター構築物を同様に作製した。
【０１６７】
マウスＡｎｇｐｔｌ４用のＡｎｇｐｔｌ４−ｐＳＥＡＰ又は空ベクタープロモーター−レセプター構築物でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞及びＧＥＣをデキサメタゾン（１０−３Ｍ）とインキュベーションすると、４８時間の時点でＳＥＡＰ活性の低下を示す。グルココルチコイドレセプターは、レセプターアンタゴニストミフェプリストン（２ｘ１０−５Ｍ）によって無効化されているので、この活性の低下は、グルココルチコイドレセプターによって媒介されている。ヒトプロモーターのグルココルチコイド感受性も評価した（デキサメタゾン１０−４Ｍ）。ｐβｇａｌベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  ＣＡ  ＵＳＡ）を使用して、すべてのトランスフェクション反応を標準化した。
【０１６８】
（ＭａｎＮＡｃを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ研究）
リコンビナントタンパク質のシアリル化に対するｍａｎＮＡｃの効果を研究するために、Ａｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３安定細胞株又はｐｃＤＮＡ３．１−ＨＥＫ２９３コントロール安定細胞株を、１５ｃｍディッシュでコンフルエンスに増殖させ、温ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、２５ｍＭ  ｍａｎＮＡｃを含むか、又は含まないフェノールレッド不含有無血清ＤＭＥＭで４８時間インキュベーションし、その後、培地を回収し、濃縮し、タンパク質アッセイを行い、二次元ゲル上にロードした（２００μｇ／ゲル）。ウサギ抗Ａｎｇｐｔｌ４（全長）抗体、免疫前ウサギ血清並びにレクチンＳＮＡ  Ｉ−ＨＲＰ及びＭＡＡ−ＨＲＰ（Ｅ−Ｙ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ  ＣＡ  ＵＳＡ）を使用して、糸球体又はリコンビナントタンパク質のウエスタンブロットを行った。
【０１６９】
続いて、中ｐＩＡｎｇｐｔｌ４（ＭａｎＮＡｃ処置）又は高ｐＩＡｎｇｐｔｌ４（未処置）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、Ｈｉｓタグ精製タンパク質、又は、Ａｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３安定的から同じ方法で回収した濃縮上清を使用した。コントロールのタンパク質を、コントロールの安定細胞株の上清から濃縮した。
【０１７０】
重度のアルブミン尿ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４ラットにおけるパイロット研究により、大量のＭａｎＮＡｃ（８ｍｇ／ｍｌ水道水）が、アルブミン尿の２０〜３０％の減少を維持するのに必要であることが明らかになった。研究を安価に行うために、野生型ラットよりも１５〜２５倍高いアルブミン尿の３〜３．５月齢雄性ヘテロ接合体ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４ラット７匹に、水道水に溶解させたＭａｎＮＡｃ１ｍｇ／ｍｌを１２日間投与し（ＭａｎＮＡｃ段階）、その後、３匹を安楽死させ、他のラットは、さらに２４日間、プレーンな水道水に戻した（ウオッシュアウト段階）。アルブミン尿の増加を確認するために、研究前に１８時間の尿採取を２回行い（−１２日目及び０日目）、研究中は定期的に行った。ベースラインのアルブミン尿レベルに関して、ほぼ同年齢の別の雄性ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４ラット７匹を評価し、普通の水道水を投与し（コントロール群）、１２日目に３匹を安楽死させ、他のラットは３６日目まで追跡調査し、その後、アルブミン尿を再評価し、動物を安楽死させた。各ラットの１日当たりの水分摂取量をチャート化した。各安楽死の時点で、潅流後に腎臓を取り出し、二次元ゲル電気泳動のために糸球体を単離し、処理した。各ラットに関して、０日目のアルブミン尿は１００％を意味し、その後のアルブミン尿の値はすべて、０日目に対して相対的に表した。
【０１７１】
（統計的分析）
ＧｒａｐｈＰａｄ  ＩｎＳｔａｔソフトウェア（バージョン３．０５）を使用する事後分析試験によるＡＮＯＶＡによって、３つ以上の群の間のタンパク尿又は遺伝子発現の差異の分析を行った。２つの群の比較に関して、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ２００３の対応のないＳｔｕｄｅｎｔｓ  ｔ−検定を使用した。
【０１７２】
上記記載は、本開示の方法及び他の教示を例示し、説明するものである。加えて、本開示は、開示される方法及び他の教示の特定の実施形態のみを示し、説明するものであるが、上述のように、本開示の教示は、様々な他の組み合わせ、改良及び環境で使用することが可能であり、本明細書において表される教示の範囲内で、当業者の技能及び／又は知識に応じて、変更又は修正することが可能であると理解されるべきである。本明細書において記載される上記実施形態は、本開示の方法及び他の教示を実施する際の公知の最良の形態を説明し、当業者が、このような又は他の実施形態において、特定の用途又は使用に必要な様々な修正を加えて、本開示の教示を利用できるようにすることをさらに意図している。従って、本開示の方法及び他の教示は、本明細書において開示される厳密な実施形態及び実施例を限定することを意図するものではない。引用されるすべての参考文献は、それが本開示に完全に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
【表１】
2013533857.tif 000004
【０１７４】
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【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】図１Ａ〜１Ｉは、実験的なヒトＭＣＤにおけるＡｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ及びタンパク質発現を示す。
【０１７６】
図１Ａは、腎毒性血清（ＮＴＳ）の誘導が、異種期（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）タンパク尿を誘導したことを示す（ｎ＝ラット４匹／群）；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０１７７】
図１Ｂは、糸球体Ａｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ発現が、図１Ａに示される腎毒性血清（ＮＴＳ）により誘導された異種期タンパク尿の間にアップレギュレーションされたことを示す（ｎ＝ラット４匹／群）；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０１７８】
図１Ｃは、ＮＴＳを注射したＡｎｇｐｔｌ４−／−マウス（ｎ＝マウス４匹／群）が、有意に低いアルブミン尿を発症することを示しており、これは、疾患過程におけるＡｎｇｐｔｌ４の役割を示している；＊Ｐ＜０．０５。
【０１７９】
図１Ｄは、ＮＴＳを注射したＡｎｇｐｔｌ４−／−マウス（ｎ＝マウス４匹／群）では、Ａｎｇｐｔｌ４＋／＋マウスにおける広範な消失と比較して、足突起の消失がわずか３０％であったことを示す。
【０１８０】
図１Ｅは、正常ラット糸球体におけるＡｎｇｐｔｌ４が、有足細胞タンパク質ＣＤ２ＡＰと共局在していたことを共焦点画像によって示しており、これは、有足細胞における発現を示している。抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体からリコンビナントＡｎｇｐｔｌ４との反応性を奪うことにより、免疫活性を無効にした。
【０１８１】
図１Ｆは、単回用量のピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮモデル）の注射後に、３日目から、Ａｎｇｐｔｌ４の顕著な糸球体ｍＲＮＡアップレギュレーションが見られたことを示す（異なる研究において、ピークは最大８０倍増加）。ＰＨＮでは、より少ないアップレギュレーションが起こり、篩過糸球体又はレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）によって単離した糸球体を使用して、抗Ｔｈｙ１．１腎炎又は非ＨＩＶ虚脱型巣状分節状糸球体硬化症（ＣＧ）のラットモデルでは、有意な変化は検出されなかった。［有意な閾値は３倍の変化である（７）］。
【０１８２】
図１Ｇは、単回用量のピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮモデル）の注射後６日目に、Ａｎｇｐｔｌ４発現（赤色）が糸球体で増加しており、ＧＢＭへパラン硫酸プロテオグリカン（白色、ＰＡＮでは強度減少）及び有足細胞ネフリン（緑色）と部分的にオーバーラップ（白色矢印）していたことを示す。
【０１８３】
図１Ｈは、ＰＡＮモデルの６日目の腎臓の免疫金ＥＭを示しており、これは、有足細胞（黄色矢印）及びＧＢＭ（黒色矢印）における金粒子を示している；倍率：ＥＭ４０，０００ｘ。
【０１８４】
図１Ｉは、ＭＣＤ患者（ｎ＝患者５人）からの腎臓生検により、Ａｎｇｐｔｌ４（赤色）の糸球体発現が増加しており、ネフリン及びＧＢＭラミニンとかなりオーバーラップしており、内皮ＰＥＣＡＭ１染色とは周辺でのみオーバーラップしていることが明らかになったことを示す；倍率：光学顕微鏡法４００ｘ。
【図２】図２は、雄性Ａｎｇｐｔｌ４トランスジェニックラットの作製及び特性決定を示す。
【０１８５】
図２Ａは、有足細胞におけるＡｎｇｐｔｌ４の有足細胞特異的過剰発現のためのトランスジェニック（ＴＧ）ラットモデルを示す。
【０１８６】
図２Ｂは、Ａｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡの組織特異的過剰発現（ｎ＝ラット３匹／群）が、有足細胞における発現と一致していることを示す；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０１８７】
図２Ｃは、３月齢ヘテロ接合体ＴＧラット（ｎ＝ラット３匹／群）からのＰＡＳ染色切片、及び、ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット（矢印）における突起状の有足細胞を含む正常形態が認められたこと（倍率４００ｘ）を示す。
【０１８８】
図２Ｄは、共焦点画像、及び、Ａｎｇｐｔｌ４タンパク質（倍率４００ｘ）の糸球体発現の増加が認められ、ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラット（ｎ＝ラット３匹／群）における有足細胞ネフリン（倍率６３０ｘ）及びＧＢＭラミニン（倍率６３０ｘ）とオーバーラップしていたことを示す。
【０１８９】
図２Ｅは、ホモ接合体ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおいて、５月齢までに、広範な足突起の消失がＥＭで認められたことを示す。
【０１９０】
図２Ｆは、これらのラットの免疫金ＥＭ分析、及び、１月齢における金粒子クラスター及び散乱ＧＢＭ粒子を含むインタクトな足突起（ＦＰ）から、消失した足突起（ＥＦＰ）の反対側にＧＢＭ金粒子クラスター（これは、内皮（ＥＮＤＯ）表面まで達している）を含む部分的な消失への進行が認められ、最終的には、ＧＢＭにおいて、５月齢までに、高密度金粒子クラスターを含む広範な消失が認められたことを示す。電子顕微鏡法倍率１５，０００ｘ〜４０，０００ｘ。
【図３】図３は、Ａｎｇｐｔｌ４過剰発現とタンパク尿との関係を示す。
【０１９１】
図３Ａは、雌性ホモ接合性ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットが、重度のアルブミン尿を発症したことを示す（ｎ＝ラット６匹／群）；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０１９２】
図３Ｂは、雄性ヘテロ接合性ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットが、重度のアルブミン尿を発症したことを示す（ｎ＝ラット６匹／群）；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０１９３】
図３Ｃは、雄性ホモ接合性ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットが、重度のアルブミン尿を発症したことを示す（ｎ＝ラット６匹／群）；＊＊Ｐ＜０．０１。
【０１９４】
図３Ｄは、尿タンパク質（３μｇ／レーン、ＭＣＤ寛解を除く）をＧｅｌＣｏｄｅ  ｂｌｕｅ染色ＳＤＳ  ＰＡＧＥ評価した後のバンド（ｎ＝３回の測定／値）のデンシトメトリー、及び、ヒトＭＣＤに類似するＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットにおけるアルブミン尿（７０ｋＤａのインタクトなアルブミンバンド、矢印）の優性を示す。
【０１９５】
図３Ｅは、３月齢ヘテロ接合体ＴＧ雄性ラットにおけるトランスジェニックタンパク質を特異的に検出するための、抗Ｖ５抗体との免疫金ＥＭ、並びに、ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットの消失した足突起（ＥＦＰ）及びＧＢＭにおいて、金粒子が認められたことを示す；ＥＭ４０，０００ｘ。
【０１９６】
図３Ｆは、ヘテロ接合体雄性ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４（低用量）におけるＰＡＮの誘導、野生型同腹子と比較したタンパク尿の悪化を示す（ｎ＝ラット８匹／群）；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０１９７】
図３Ｇは、ＰＡＮを誘導した後に、１日目から隔日でグルココルチコイド（ＰＡＮ−Ｓ）処置したラットが、６日目にタンパク尿の一時的な減少を示したことを示す（ｎ＝ラット４匹／群）；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【０１９８】
図３Ｈは、３Ｇの研究からの糸球体遺伝子発現の研究であり、Ａｎｇｐｔｌ４がグルココルチコイド感受性遺伝子であることを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１
。
【図４】図４は、Ａｎｇｐｔｌ４シアリル化とタンパク尿との関係を示す。
【０１９９】
図４Ａは、灌流した糸球体からのタンパク質の二次元ゲル電気泳動（２００μｇタンパク質／ゲル）及びウエスタンブロットを示す（上パネル、コントロール；中央パネルＰＡＮ；下パネルＰＡＮ＋グルココルチコイド添加）。コントロールのパネルにおいて、分析により、Ａｎｇｐｔｌ４の少量の断片（赤色矢印；１）及び単量体（黄色矢印；２）、並びに、中ｐＩ又は高ｐＩに移動するＡｎｇｐｔｌ４の大量の低オリゴマー（ピンク色矢印；３）の存在が明らかになった。ＰＡＮ６日目において（中央パネル）、高ｐＩ及び中ｐＩオリゴマー型が増加していたのに対して（ピンク色矢印、３；オレンジ色矢印４）、グルココルチコイド処置（図３Ｇを参照）はこの増加を鈍らせる（下パネル）。中ｐＩに移動するＡｎｇｐｔｌ４の中で、断片が抗リン酸スレオニン抗体と反応したのに対して、オリゴマーはシアル酸結合レクチンＭＡＡと反応する（ＰＡＮに関する例示、独立したブロットからの抜粋）。
【０２００】
図４Ｂは、図４Ａからのウエスタンブロットのデンシトメトリー分析を示す；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０２０１】
図４Ｃは、コントロールとインキュベーションし、ＭＡＡレクチンに対する抗体（最上部のパネル）、抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体（上中央パネル）でプローブしたＡｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３安定細胞株；シアル酸前駆体ＭａｎＮＡｃ（２５ｍＭ）とインキュベーションし、抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体（下中央パネル）でプローブしたＡｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３安定細胞株、並びに、シアル酸前駆体ＭａｎＮＡｃ（２５ｍＭ）とインキュベーションし、ＭＡＡレクチンに対する抗体（下パネル）でプローブしたＡｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３安定細胞株からのタンパク質の二次元ゲル電気泳動（１５０μｇタンパク質／ゲル）及びウエスタンブロットを示す。濃縮上清の分析により、高ｐＩ型（上中央パネルの緑色矢印及び直線）から、ＭＡＡ反応性である中ｐＩ型（下中央パネル及び下パネルの青色矢印）へのシフトが明らかになった。
【０２０２】
図４Ｄは、水道水に溶解させた１ｍｇ／ｍｌＭａｎＮＡｃをＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットに１２日間摂食させると、１８時間のアルブミン尿の有意な減少（１２日目の最低値はベースラインの５９．４±３．３％であった）を引き起こしたが、ウォシュアウトの１２日後にベースライン値に戻り、ウォシュアウトの２４日目には未処置コントロールのＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットの値に近づいたことを示す（図６における個々の教示及びパイロット研究データ）。パネルｄにおいて、すべての＊差異は、ベースライン値に対するものである。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５】図５は、ＨＥＫ２９３安定細胞株によって産生されたリコンビナントＡｎｇｐｔｌ４の特性決定を示す。
【０２０３】
図５Ａは、ｐｃＤＮＡ−ラットＡｎｇｐｔｌ４−Ｖ５−Ｈｉｓ発現構築物で安定的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞株が、コントロールの空ベクター細胞株と比較して、Ａｎｇｐｔｌ４  ｍＲＮＡ発現の５５，０００倍のアップレギュレーションを示したことを示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１
図５Ｂは、Ａｎｇｐｔｌ４−ＨＥＫ２９３細胞が、無血清条件下で、ほぼインタクトなタンパク質を上清に分泌したことを示す（二次元ゲル電気泳動、並びに、免疫前血清及び抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体を用いたウエスタンブロットによって確認した）。
【０２０４】
図５Ｃは、ヒト血漿２００μｇ（ｎ＝患者４人／群）の二次元ゲル電気泳動を示しており、ＭＣＤが再発した患者においてのみ、５５〜７０ｋＤａ  ｐＩ８〜８．５Ａｎｇｐｔｌ４タンパク質の血中濃度の上昇が認められたことを実証している（ＭＣＤ再発パネルにおける楕円形）。中ＰＩ単量体及びオリゴマーの血中濃度の上昇は、再発したＭＣＤ患者（ＭＣＤ再発パネルにおける矢印）で認められ、単量体は、ＭＮを有する患者（ＭＮパネルにおける矢印）においてのみ認められた。
【図６】図６は、ＭａｎＮＡｃの投与が、ラットモデルにおけるアルブミン尿を減少させたことを示す。
【０２０５】
図６Ａは、漸増用量のＭａｎＮＡｃ（１〜８ｍｇ／ｍｌ）を投与した重度のアルブミン尿ＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットを用いたパイロット研究からのアルブミン尿追跡の代表的なものを示す。この研究により、ＭａｎＮＡｃが、これらの動物におけるアルブミン尿を減少させたことが明らかになった。
【０２０６】
図６Ｂは、ＭａｎＮＡｃ（１ｍｇ／ｍｌ）で処置した試験群のＮＰＨＳ２−Ａｎｇｐｔｌ４  ＴＧラットからの個々の追跡を示しており、これにより研究は終了した。これらのラットで時間と共にアルブミン尿の増加が起こったことを確認するために、研究開始前に、１２日間とは別に２回採尿した。この研究により、ＭａｎＮＡｃ（１ｍｇ／ｍｌ）が、これらの動物におけるアルブミン尿を減少させたことが明らかになった。
【０２０７】
図６Ｃは、抗Ａｎｇｐｔｌ４抗体又はレクチンＳＮＡ  Ｉ（ｎ＝３ブロット／条件）を使用した、１２日目のＭａｎＮＡｃ又はコントロールＴＧラットから糸球体の二次元電気泳動及びウエスタンブロッティング（２００μｇタンパク質／ゲル）を示す。再現可能な中ｐＩのＡｎｇｐｔｌ４スポットは赤色楕円形（１）によって、及び高ｐＩは緑色楕円形（２）によって縁取られている。中ｐＩのスポットは、シアル酸結合レクチンＳＮＡ  Ｉとも反応する。
【０２０８】
図６Ｄは、図６ＣのＡｎｇｐｔｌ４スポットのデンシトメトリーを示しており、ＭａｎＮＡＣ摂食ラットにおいて、中ｐＩ型のパーセンテージが有意に増加していることを示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７】図７は、ピューロマイシンアミノヌクレオシドネフローゼ（ＰＡＮモデル）を有するＭａｎＮＡｃ処置ラットにおけるネフローゼ症候群パラメーターの改善を示す。図７Ａ〜７Ｄにおいて、ピューロマイシンアミノヌクレオシド（１０ｍｇ／１００ｇｍ）をラット（ｎ＝ラット５匹／群）に単回静脈内注射し、４日目（これは、タンパク尿の発症と同時である）から、水道水に溶解させたＭａｎＮＡＣ８０ｍｇ／Ｋｇ体重で処置した。
【０２０９】
図７Ａは、ピューロマイシンアミノヌクレオシドの投与後６日目において、ＭａｎＮＡｃ処置ラットのタンパク尿が有意に減少したことを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．０１。
【０２１０】
図７Ｂは、ピューロマイシンアミノヌクレオシドの投与後６日目において、ＭａｎＮＡｃ処置ラットの血漿アルブミンレベルが有意に改善したことを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．０１。
【０２１１】
図７Ｃは、ピューロマイシンアミノヌクレオシドの投与後６日目において、ＭａｎＮＡｃ処置ラットの高コレステロール血症が有意に減少したことを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．０１。
【０２１２】
図７Ｄは、ピューロマイシンアミノヌクレオシドの投与後６日目において、ＭａｎＮＡｃ処置ラットの高トリグリセリド血症が有意に減少したことを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．０１。
【図８】図８は、糖尿病動物のタンパク尿に対するＭａｎＮＡｃ治療の効果を示す。
【０２１３】
図８Ａは、抗Ａｎｇｐｔｌ４Ａｂを使用した、糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス及びコントロールｄｂ／ｍマウスに由来する糸球体の二次元ゲル電気泳動並びにウエスタンブロット分析を示す。この結果は、コントロールと比較して、糖尿病マウス糸球体において、Ａｎｇｐｔｌ４（これは、タンパク尿の病因に関与する高ｐＩ型を含む）の発現が増加していることを示す。
【０２１４】
図８Ｂは、抗Ａｎｇｐｔｌ４Ａｂを使用した、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満ラット及びコントロールの正常血糖ラットに由来する糸球体の二次元ゲル電気泳動並びにウエスタンブロット分析を示す。この結果は、コントロールと比較して、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満ラットに由来するラット糸球体において、Ａｎｇｐｔｌ４（これは、タンパク尿の病因に関与する高ｐＩ型を含む）の発現が増加していることを示す。
【０２１５】
図８Ｃは、ＭａｎＮａｃ処置が、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満ラットにおけるタンパク尿を減少させたことを示す。１３週齢雄性Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満ラットを、７０及び１４０ｍｇ／Ｋｇの水道水に溶解させたＭａｎＮＡｃ又はプレーンな水道水で処置した（ｎ＝ラット４匹／群）。ＭａｎＮＡｃ処置群において、タンパク尿の有意な減少が認められた。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図９Ａ】図９Ａは、様々な種に由来するＡｎｇｐｔｌ４のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１及び２は、ヒトに由来するアミノ酸及びｃＤＮＡ配列（タンパク質変異体１アイソフォームａ、ロングフォーム；下線部のアミノ酸配列は４０及び１６１〜１６４位）を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、配列番号３及び４は、ヒトに由来するアミノ酸及びｃＤＮＡ配列（タンパク質変異体３アイソフォームｂ、ショートフォーム；下線部のアミノ酸配列は４０及び１６１〜１６４位）を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、配列番号５及び６は、ラットに由来するアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、配列番号７及び８は、マウスに由来するアミノ酸及びｃＤＮＡを示す。
【図１】
2013533857.tif 000009
【図２】
2013533857.tif 000010
【図３】
2013533857.tif 000011
【図４】
2013533857.tif 000012
【図５】
2013533857.tif 000013
【図６】
2013533857.tif 000014
【図７】
2013533857.tif 000015
【図８】
2013533857.tif 000016
【図９Ａ】
2013533857.tif 000017
【図９Ｂ】
2013533857.tif 000018
【図９Ｃ】
2013533857.tif 000019
【図９Ｄ】
2013533857.tif 000020
【配列表】
2013533857000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年3月8日(2013.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における糖尿病状態の処置又は予防のための組成物であって、シアル酸、シアル酸前駆体又はこれらの組み合わせを含む組成物。
【請求項２】
前記糖尿病状態が、糖尿病性腎症、糖尿病、ループス腎炎又は原発性糸球体疾患である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記シアル酸前駆体が、構造
【化１】
2013533857.tif 000021
を有し、
式中：
Ａは、ＣＨ２又はＮＨであり；
Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｘ、Ｏ−ＣＯ−Ｘ又はＯ−Ｘ（式中、Ｘは、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルであり，各Ｂ基、Ｃ基及びＤ基に関して、Ｘは、独立して選択される）からなる群より選択され；
Ｇは、Ｈ、ＯＨ、Ｙ又はＯ−Ｙ（式中、Ｙは、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルである）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記シアル酸前駆体が、構造
【化２】
2013533857.tif 000022
を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
Ｘ及びＹが、それぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ５アルキルである、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記シアル酸前駆体が、Ｂｕ４ＭａｎＮＡｃ、３，４，６−Ｏ−Ｂｕ３ＭａｎＮＡｃ、１，３，４−Ｏ−Ｂｕ３ＭａｎＮＡｃ、Ｎ−レブリノイルシアル酸又はＮ−レブリノイルマンノサミンである、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記シアル酸化合物が治療有効量で投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチドのシアリル化を回復させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドがＡｎｇｐｔｌ４である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
被験体におけるネフローゼ症候群の処置又は予防のための組成物であって、シアル酸、シアル酸前駆体又はこれらの組み合わせを含む組成物。
【請求項１１】
ネフローゼ症候群が、微小変化型疾患、巣状分節状糸球体硬化症、膜性腎症／膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎又は糖尿病性腎症と特徴付けられる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記シアル酸前駆体が、構造
【化３】
2013533857.tif 000023
を有し、
式中：
Ａは、ＣＨ２又はＮＨであり；
Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｘ、Ｏ−ＣＯ−Ｘ又はＯ−Ｘ（式中、Ｘは、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルであり，各Ｂ基、Ｃ基及びＤ基に関して、Ｘは、独立して選択される）からなる群より選択され；
Ｇは、Ｈ、ＯＨ、Ｙ又はＯ−Ｙ（式中、Ｙは、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルである）である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記シアル酸前駆体が、構造
【化４】
2013533857.tif 000024
を有する、請求項１０記載に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｘ及びＹが、それぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ５アルキルである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記シアル酸前駆体が、Ｂｕ４ＭａｎＮＡｃ、３，４，６−Ｏ−Ｂｕ３ＭａｎＮＡｃ、１，３，４−Ｏ−Ｂｕ３ＭａｎＮＡｃ、Ｎ−レブリノイルシアル酸又はＮ−レブリノイルマンノサミンである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記シアル酸化合物が治療有効量で投与される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
浮腫を軽減するか、タンパク尿を減少させるか、血漿アルブミンレベルを増加させるか、高コレステロール血症を軽減するか、高トリグリセリド血症を軽減するか、又はこれらの組み合わせを行う、請求項１０記載に記載の組成物。
【請求項１８】
ネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチドのシアリル化を回復させる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ポリペプチドがＡｎｇｐｔｌ４である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関して被験体の状態を決定するための方法であって、
被験体から採取された血漿におけるネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関連するポリペプチドのシアリル化のレベルを決定する工程、
前記シアリル化のレベルを対照におけるシアリル化のレベルと比較する工程、及び、
被験体から採取された血漿におけるシアリル化のレベルが対照におけるシアリル化のレベルよりも低い場合に、被験体がネフローゼ症候群若しくは糖尿病状態に罹患しているか、又はそのリスクがあると決定する工程を含む、方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドがＡｎｇｐｔｌ４である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ネフローゼ症候群又は糖尿病状態の処置を受けている被験体における処置の有効性を決定するための方法であって、
被験体から採取された血漿におけるネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関連するポリペプチドのシアリル化のレベルを決定する工程、
前記シアリル化のレベルを、対照におけるシアリル化のレベル又は処置を開始する前の被験体から採取された血漿におけるシアリル化のレベルと比較する工程、及び、
被験体から採取された血漿におけるシアリル化のレベルが、対照におけるシアリル化のレベルと同じか、若しくは近い場合に、又は、被験体から採取された血漿におけるシアリル化のレベルが、処置を開始する前に決定した被験体から採取された血漿におけるシアリル化のレベルと比較して、増加している場合に、処置が有効であると決定する工程を含む、方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドがＡｎｇｐｔｌ４である、請求項２２に記載の方法。