(57)【要約】  ＴＬＲ１、２、４、または６から選択されるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によって媒介される細胞活性化を阻害することができるペプチドを提供し、前記ペプチドは、ＴＬＲ１、２、４、または６から選択されるＴＬＲの膜貫通型ドメインの配列、ならびに任意で、膜貫通型ドメインに隣接する細胞質および細胞外領域からなる、またはそれらのうちで見られる配列を含む。これらのペプチドならびにそれらを含む薬学的組成物は、ＴＬＲ媒介疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも４つかつ最大３０のアミノ酸残基の合成ペプチドであって、
（ａ）ＴＬＲ１、２、４、または６から選択されるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によって媒介される細胞活性化を阻害することができるペプチドであって、ＴＬＲ１、２、４、または６から選択されるＴＬＲの膜貫通型ドメインの配列からなる、またはそれらのうちで見られる配列を含む、ペプチド、
（ｂ）αアミノ基またはαカルボキシル基を介して、前記ＴＬＲ膜貫通型ドメインに隣接する細胞質領域または細胞外領域の配列を含む、さらなるオリゴペプチドに連結される（ａ）のペプチド、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のペプチドの類似体、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）のペプチドの塩または化学誘導体、
（ｅ）ＮおよびＣ末端のそれぞれに、１つ以上の正に荷電したアミノ酸残基をさらに含む（ａ）〜（ｄ）のペプチド、ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のペプチドの環状誘導体から選択される、合成ペプチド。
【請求項２】
前記ＴＬＲは、哺乳類のＴＬＲ１、２、４、または６である、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項３】
前記哺乳類のＴＬＲは、ヒトまたはマウスのＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、またはＴＬＲ６である、請求項２に記載の合成ペプチド。
【請求項４】
（ｉ）前記ヒトＴＬＲ１は、配列番号１に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号２に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、
（ｉｉ）前記ヒトＴＬＲ２は、配列番号３に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号４に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、
（ｉｖ）前記ヒトＴＬＲ６は、配列番号５に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号６に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、
（ｖ）前記マウスＴＬＲ１は、配列番号７に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号８に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、
（ｖｉ）前記マウスＴＬＲ２は、配列番号９に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号１０に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、
（ｖｉｉｉ）前記マウスＴＬＲ６は、配列番号１１に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号１２に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、
（ｉｘ）前記マウスＴＬＲ４は、配列番号１３に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号１４に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、かつ
（ｘ）前記ヒトＴＬＲ４は、配列番号１５に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号１６に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有する、請求項３に記載の合成ペプチド。
【請求項５】
前記ヒトまたはマウスＴＬＲの２１〜３０のアミノ酸残基の推定膜貫通型ドメイン内で見られる１６〜２３のアミノ酸残基からなる、請求項３に記載の合成ペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドは、配列番号１７〜配列番号２３に記述される配列のペプチドから選択される、請求項５に記載の合成ペプチド。
【請求項７】
１４〜１９のアミノ酸残基からなり、そのうちの４〜１７個は、前記ヒトまたはマウスのＴＬＲの推定膜貫通型ドメイン内で見られ、１〜１４個、好ましくは、３〜９個は、前記膜貫通型ドメインに隣接する細胞質または細胞外領域内で見られる、請求項４に記載の合成ペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドは、配列番号２４〜配列番号４３に記述される配列のペプチドから選択される、請求項７に記載の合成ペプチド。
【請求項９】
前記類似体は、（ａ）または（ｂ）のペプチドの１つ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換、好ましくは、アラニンによる１〜４つのアミノ酸残基の置換によって得られる、請求項１（ｃ）に記載の合成ペプチド類似体。
【請求項１０】
１４〜３５個、好ましくは１６個のアミノ酸残基からなり、そのうちの６〜２１個は、ヒトまたはマウスのＴＬＲの推定膜貫通型ドメイン内で見られ、１〜１４個は、前記膜貫通型ドメインの隣接細胞質または細胞外領域内で見られ、前記細胞質領域の１〜４つのアミノ酸残基は、アラニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、もしくはセリンで置換されるか、または前記ペプチド類似体は、１つまたは２つのアミノ酸残基がアラニンで置換される前記推定膜貫通型ドメイン内のアミノ酸残基からなる、請求項９に記載の合成ペプチド類似体。
【請求項１１】
前記ペプチド類似体は、配列番号４４〜配列番号７４に記述される配列のペプチドから選択される、請求項１０に記載の合成ペプチド類似体。
【請求項１２】
化学誘導体、好ましくは、そのエステル、アミド、またはＮ−アシル誘導体の形態の、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
【請求項１３】
前記正に荷電したアミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、またはオルニチンである、請求項１（ｅ）に記載の合成ペプチド。
【請求項１４】
１つまたは２つ、好ましくは、２つのリジン残基が、ペプチド末端のうちの１つまたはその両方に付加される、請求項１３に記載の合成ペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドは、配列番号７５〜配列番号１２２に記述される配列のペプチドから選択される、請求項１４に記載の合成ペプチド。
【請求項１６】
リガンド活性化に応答してＴＬＲタンパク質の活性を調節することができる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載される合成ペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の合成ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸配列。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の合成ペプチド、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
ＴＬＲ媒介疾患の治療に使用するための、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記ＴＬＲ媒介疾患は、敗血症性ショック等の急性炎症、または前立腺癌等の癌である、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記ＴＬＲ媒介疾患は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）；急性炎症（例えば敗血症性ショック、敗血症、内毒素性ショック、血行力学的ショック、視神経炎、および敗血症症候群）；虚血後の再潅流傷害、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）；不顕性または活動性感染症（例えば、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、インフルエンザウイルス、マラリア、慢性肝炎、カンジダ症、マイコバクテリア感染症、および髄膜炎の感染）の増悪；うっ血性心不全；自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス）；慢性閉塞性肺疾患；肺細菌感染素因；肺性浮腫を伴ううっ血性心不全；リウマチ様疾患（例えば、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節炎、および他の関節炎症状）；変性疾患（例えば、粥状動脈硬化）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病）；線維性疾患；悪液質；移植片拒絶；放射線障害；喘息；ならびに胃癌、結腸癌、肝細胞癌、卵巣上皮癌、頚部扁平上皮癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、メラノーマ、および神経芽細胞腫等の癌から選択される、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
ＴＬＲ媒介疾患の治療のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の合成ペプチドの使用。
【請求項２３】
前記ＴＬＲ媒介疾患に罹患する患者に請求項１〜１５のいずれか１項に記載の有効量の合成ペプチドを投与することを含む、ＴＬＲ媒介疾患の治療のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法の分野であり、特に、ＴＬＲの膜貫通型ドメインから生じるペプチドによるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）活性化の阻害に関する。
【背景技術】
【０００２】
生来の免疫応答は、複雑で高度に制御されたプロセスである。この系の目標は、侵入病原体から広範囲に、かつ迅速に宿主を保護し、かつ獲得した免疫応答の活性化およびさらなる発達を促進することである。近年では、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のファミリーが、生来の応答および炎症反応の活性化に重要な役割を果たすことを示す多数の証拠がある（Ｆｏｓｔｅｒら、２００９、Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、２００７、Ｏ’Ｎｅｉｌｌら、２００３）。
【０００３】
ＴＬＲは、細胞外、単一膜貫通型、および細胞質のＴｏｌｌ−インターロイキン１受容体抵抗（ＴＩＲ）ドメインから構成される保存膜貫通型受容体のファミリーである。これらの受容体は、グラム陰性細菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）、グラム陽性細菌のリポテイコ酸（ＬＴＡ）、およびフラゲリン等の病原体関連の分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる広範なリガンド、ならびに多くの他の化合物を認識する。ＴＬＲは、様々な周囲からの「混入物」（障害関連の分子パターン分子、ＤＡＭＰ）の排除をもたらす、壊死事象を同定するための先天性免疫系も支援する。多くの腫瘍細胞は、免疫系によって媒介される壊死を受け、ＴＬＲを介して炎症反応のさらなる活性化につながる可能性がある。
【０００４】
それらの特定のＰＡＭＰに結合すると、これらの受容体は、例えばＴＬＲ４の場合ではホモ二量体、または例えばＴＬＲ１およびＴＬＲ６を伴うＴＬＲ２の場合ではヘテロ二量体のいずれかを形成することができる。例えば、ＬＴＡは、ＴＬＲ１または６を伴うＴＬＲ２のヘテロ二量体化をもたらし、ＬＰＳ（タンパク質ＭＤ２との複合体として）は、ＴＬＲ４ホモ二量体化をもたらす（Ｏｚｉｎｓｋｙら、２０００、Ｈａｊｊａｒら、２００１、Ｌｅｅら、２００３、Ｊｉｎら、２００７）。これは、下流シグナル伝達カスケードを引き起こし、ＮＦκＢの活性化ならびにＰ３８およびＪＮＫ等の他の生存経路をもたらす。ＴＬＲ活性化の主な生成物の１つは、炎症性プロセスの進行に多くの役割を持つ主要な炎症誘発性サイトカインであるＴＮＦαの分泌である。ＴＬＲ過剰発現または過剰活性化は、様々な疾患、例えば、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、臓器不全、不顕性または活動性ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、およびインフルエンザウイルスの感染）の増悪、先天的または獲得した肺性細菌感染素因、肺性浮腫を伴ううっ血性心不全、慢性閉塞性肺疾患、多発性骨髄腫、ＳＬＥ、狼瘡、潰瘍性大腸炎、クローン病、多発性硬化症等の免疫疾患、リウマチ様疾患、慢性肝炎、マラリア（熱帯熱マラリア原虫）、視神経炎、ウイルス性脳炎（ウエストナイル）、カンジダ症、粥状動脈硬化、変性疾患、神経変性疾患、および様々な種類の癌に関連している。極端な場合、重度の未制御の炎症性プロセスの活性化は、敗血症性ショック、臓器不全、および死をもたらす場合がある（Ｆｏｓｔｅｒら、２００９、Ｍｅｎｇら、２００４）。
【０００５】
ＴＬＲの過剰発現または過剰活性化を制御する試みは、主に、ＴＬＲ拮抗薬の使用を含む。米国特許第２０１０／０６２０２６号は、ＴＬＲが過剰に発現する疾患の管理に有用である、ポリＴＬＲ拮抗活性を有する薬剤（マイコバクテリア）を開示している。国際公開第２００９／０１９２６０号は、ＴＬＲ２拮抗薬を使用して、虚血再潅流傷害におけるＴＬＲ２の生物学的活性を減少させるための方法を開示している。国際公開第２００９／０４７７９１号は、潜在的に、炎症、自己免疫、アレルギー、喘息、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、感染症、敗血症、癌、および免疫不全の治療に有用である新規合成ＴＬＲ拮抗薬を開示している。米国特許第７，４１０，９７５号は、小分子ＴＬＲ拮抗薬を使用して、ＴＬＲを通してシグナル伝達を調節するための方法を開示している。米国特許第２００６／０２１１７５２号は、メチマゾール（甲状腺ホルモン拮抗薬）誘導体および／または環状チオン誘導体を使用して、ＴＬＲ媒介疾患もしくは障害を治療するための方法を開示している。
【０００６】
炎症は、癌形成および進行と関係があり、過去１０年にわたって大規模に研究されている。結腸癌において、ピロリ菌によって生じる炎症は、癌遺伝子の発現および腫瘍抑制因子遺伝子の下方制御を含む結腸細胞における多くの突然変異の形成をもたらすことが示されている。他の癌は、肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）によって誘発された炎症を介した肝細胞癌（ＨＣＣ）、胃癌、および肺癌を含む。
【０００７】
実際、ＴＬＲは、様々な固形腫瘍で発現および活性化されることが示されてきたが、大半は、これらの臓器の正常な細胞上で発現および活性化されない。加えて、異なる種類の腫瘍において同定されるＴＬＲの配列に相違がある（Ｓａｔｏら、２００９）。概して、これらの知見は、腫瘍がどの種類のＴＬＲ配列が発現するかを「決定する」選択的機構を有することを示唆する。様々なＴＬＲの発現および活性化は、腫瘍の微小環境を調節し、それを免疫系による排除から保護する。
【０００８】
前立腺癌に関するこれまでの大半の研究は、前立腺試料において同定される２つの主な種類の感染、すなわち、細菌感染およびウイルス感染に関連するＴＬＲ４およびＴＬＲ９に焦点が当てられていた。ＴＬＲ４は、グラム陰性細菌の構成成分を認識し、ＴＬＲ９は、ウイルスの一本鎖ＤＮＡを認識する（Ｈｕａｎｇら、２００５）。重要なことに、これらのタンパク質の発現の下方制御は、マウスにおいて、前立腺腫瘍成長、転移形成、および死亡率の減少をもたらす（Ｋｕｎｄｕら２００８）。しかしながら、これらの研究は、生体外で高度に有効であるが、生体内で適用することが困難であるｓｉＲＮＡ技術を使用した。
【０００９】
国際公開第０３／０４５４３１号は、腫瘍由来の樹状細胞阻害因子拮抗薬、つまり、ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体とＴＬＲ９作動薬の組み合わせを使用して、癌を治療するための方法を開示している。
【００１０】
最近の研究は、様々な疾患段階の前立腺切除患者に由来する前立腺切片において、グラム陽性細菌による多数の感染の発生を示す（Ｓａｅｎｚ−Ａｂａｄら、２００８、Ｓｆａｎｏｓら、２００８）。従って、我々は、リポテイコ酸によって活性化されるＴＬＲ１、２、および６も前立腺癌に役立つと仮定する。
【００１１】
上述のように、未制御ＴＬＲの活性化は、アルツハイマー病（ＡＤ）等の神経変性疾患、神経細胞の喪失を特徴とする進行性神経変性疾患、小膠細胞の活性化、星状膠細胞の再活性化、ならびに細胞内および細胞外の凝集体の蓄積をもたらす可能性がある。「アミロイド仮説」によると、大規模なフィブリルβアミロイド（ｆＡβ）の細胞外沈着物が、凝縮し、ＡＤの神経変性の主な原因である老年斑を脳に形成した。Αβの生成および排除の不均衡が数十年にわたって脳内のその安定状態レベルの増加をもたらし、アルツハイマー病を特徴付ける脳内の複合分子および細胞変化をもたらすと推測する。Αβは、長さが４０および４２の残基である２つの主要な形態をもたらす、αまたはβ分泌酵素のいずれか、および後続のγ分泌酵素によるＡＰＰ（アミロイド前駆体ペプチド）の排除によって生成される。正常な個人において、生成されたΑβの大部分は、４０のアミノ酸種であり、一方で、全Αβ形態の５〜１５％は、Αβ４２である。しかしながら、Αβ４２は、より毒性が強く、より安定した原線維を形成し、よって、アルツハイマー病により関係している。
【００１２】
大規模な研究は、アルツハイマー病における炎症の関与を示した。脳の主要な免疫エフェクター細胞は、アルツハイマー病のｆＡβ斑の部位に動員されることが知られる小膠細胞である。これらの細胞は、ｆＡβで囲まれるとき、活性化された表現型および高レベルの増殖を示し、アルツハイマー病を特徴付ける炎症表現型におけるこれらの細胞の役割を示唆する。混合された脳細胞とｆＡβを含有する培養物からの小膠細胞の除去は、主要な神経細胞上のｆＡβの毒性作用をほぼ完全に排除し、小膠細胞またはそれらの生成物がｆＡβの神経毒性作用を媒介することを示唆する。小膠細胞およびマクロファージ細胞は、アルツハイマー病の進行において役割を示すが、小膠細胞の炎症反応のいくつかの態様は、脳からのΑβの食細胞排除等の、アルツハイマー病の病原に対して好ましい影響を提示する。しかしながら、小膠細胞媒介炎症反応からの長期間の損傷は、疾患病原を悪化させる可能性がある。さらに、炎症誘発性サイトカインのレベルは、アルツハイマー病の脳に存在する斑の規模に依存する。
【００１３】
いくつかのＴＬＲは、ＴＬＲ４のＣＤ１４等の、病原体認識の助けとなるさらなる共受容体を採用する。近年、ＴＬＲ４が、小膠細胞培養物におけるＬＰＳ治療によって、そしてより重要なことに、生体内で、大規模な神経細胞死を媒介することが示された（Ｌｅｈｎａｒｄｔら、２００３）。この知見は、今のところ微生物に対する防御に関連する受容体であるＴＬＲ４がアルツハイマー病における慢性の神経炎症に関連があるかもしれないことを示唆する。最近になって、ＴＬＲがアルツハイマー病における小膠細胞活性化に関与していたか、かつＴＬＲがＡＤの炎症反応においてどのように機能するかが、現在積極的に検証されている。様々な技術を使用して、ＣＤ１４がｆＡβ４２に結合することが示された。ｆＡβ４２とＣＤ１４との間の相互作用は、ＣＤ１４と非ｆΑβとの間の相互作用よりも２０倍大きいことがさらに示され、ＣＤ１４の結合におけるΑβの原線維構造の重要性を示す。ＴＬＲは、神経細胞アポトーシスに関与することも示されている。ｆＡβで処理された小膠細胞からの条件培地に曝された海馬神経細胞は、神経細胞死をもたらした。しかしながら、ｆＡβで処理されたＣＤ１４−／−またはＴＬＲ４−／−小膠細胞からの培地は、神経細胞を死滅させることができなかった（Ｆａｓｓｂｅｎｄｅｒら、２００４、およびＷａｌｔｅｒら、２００７）。これらのデータは、ＣＤ１４およびＴＬＲ４が神経毒性分子の生成に機能することを示唆する。さらに、近年、神経細胞がいくつかのＴＬＲを発現し、ｆＡβに曝されたとき、ＴＬＲ４の発現が神経細胞において増加し、神経細胞アポトーシスをもたらすことが見出された。この知見は、ＴＬＲ４を発現する神経細胞がＡＤの変性に対して脆弱であることを示唆する（Ｓｕｎｇ−Ｃｈｕｎら、２００８）。
【発明の概要】
【００１４】
現在、本発明に従って、任意で細胞質領域またはその類似体の配列をさらに含む、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の膜貫通型ドメインの配列に基づく合成ペプチドが、リガンドの活性化に応答してＴＬＲタンパク質の活性を調節することができることが見出された。
【００１５】
従って、本発明は、一態様において、
（ａ）ＴＬＲ１、２、４、または６から選択されるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によって媒介される細胞活性化を阻害することができるペプチドであり、前記ペプチドは、ＴＬＲ１、２、４、または６から選択されるＴＬＲの膜貫通型ドメインの配列からなる、またはそれらのうちで見られる配列を含む、
（ｂ）そのαアミノ基またはαカルボキシル基を介して、前記膜貫通型ドメインに隣接する細胞質領域または細胞外領域の配列を含む、さらなるオリゴペプチドに連結される（ａ）のペプチド、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のペプチドの類似体、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）のペプチドの塩または化学誘導体、
（ｅ）ＮおよびＣ末端のそれぞれに、１つ以上の正に荷電したアミノ酸残基をさらに含む（ａ）〜（ｄ）のペプチド、ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のペプチドの環状誘導体からなる群から選択される、少なくとも４つ、かつ最大３０のアミノ酸残基の合成ペプチドに関する。
【００１６】
同様に、本発明のペプチドは、ＴＬＲ１、２、４または６から選択されるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）分子のヘテロ二量体化またはホモ二量体化を阻害することが可能である。
【００１７】
「ＴＬＲの前記膜貫通型ドメインに隣接する細胞質領域または細胞外領域」という語句は、それぞれのＴＬＲの天然のＴＬＲ分子の前記膜貫通型ドメインに隣接する細胞質領域または細胞外領域に対応する領域を指す。例えば、ＴＬＲ１の膜貫通型ドメインまたはその一部を含むペプチドは、天然のＴＬＲ１において、前記膜貫通型領域に隣接する領域に対応する細胞外または細胞内ペプチドをさらに含むことができる。「ＴＬＲの膜貫通型ドメインの配列内に見られる配列」という語句は、膜貫通型ドメインのＣ末端またはＮ末端配列を有する部分的膜貫通型ドメインペプチドを指す。部分的配列が膜貫通型ドメインのＣ末端配列である場合、それは、そのαカルボキシル基を介して連結され、無傷野生型ＴＬＲの膜貫通型ドメインのＣ末端に隣接する細胞内領域に対応する配列のすぐ隣である。部分的配列が膜貫通型ドメインのＮ末端配列である場合、それは、そのαアミノ基を介して連結され、無傷野生型ＴＬＲの膜貫通型ドメインのＮ末端に隣接する細胞外領域に対応する配列のすぐ隣である。
【００１８】
ＴＬＲによって媒介される活性化の細胞の例は、マクロファージ、樹状細胞、および小膠細胞等の免疫細胞、神経細胞、ならびに腫瘍細胞であるが、これらに限定されない。
【００１９】
本明細書で使用される「ＴＬＲによって媒介される細胞活性化」という用語は、比較的静止状態の細胞を、ＴＬＲリガンドのＴＬＲへの結合によって達成される比較的より活性な細胞に変換すること、および例えば、細胞からのＴＮＦ−α、ＩＬ−１ｂ、およびＩＬ−６等であるが、これらに限定されない炎症誘発性サイトカインの分泌であるが、これに限定されないものによって測定される細胞の活性化をもたらすＴＬＲシグナル形質導入経路を介するシグナルの結果として生じる伝達を指す。
【００２０】
ＴＬＲによって媒介される細胞活性化を測定するための方法は、当該技術分野において周知である。ＴＬＲ媒介細胞活性を評価するために通常使用される非限定的な一例は、これらに限定されないが、細胞からのＴＮＦ−α、ＩＬ−１ｂ、およびＩＬ−６等の炎症誘発性サイトカインの分泌を追跡することである。これは、本明細書において、以下の「材料および方法」に記載される、例えば、ＥＬＩＳＡによって行うことができる。ＴＬＲによって媒介される細胞活性化を測定するための方法の別の非限定的な例は、例えば、本明細書において、以下の「材料および方法」に記載されるＮＦ−κΒ受容体ベクターを形質移入された細胞のＮＦ−κΒの活性化状態の変化を追跡することである。
【００２１】
ヘテロおよびホモ二量体化を測定するための方法は、当該技術分野において周知である。ペプチド二量体化を評価するために通常使用されるいくつかの非限定的な例は、本明細書において、以下の「材料および方法」に記載されるように、フルオレセインおよびローダミン（ＴＡＭＲＡ）標識されたペプチド（他の市販のフルオロフォアが使用され得る）用の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、４−フルオロ−７−ニトロ−［２，１，３］−ベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ；Ａｐｏｌｌｏ）標識されたペプチドを使用する膜結合アッセイ、または共免疫沈降アッセイである。
【００２２】
別の態様では、本発明は、本発明の合成ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列に関する。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、本発明に従って、少なくとも１つの合成ペプチド、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物に関する。特定の実施形態に従って、薬学的組成物は、ＴＬＲ媒介疾患の治療用である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、ＴＬＲ媒介疾患の治療のための、本発明の合成ペプチドの使用に関する。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、前記ＴＬＲ媒介疾患に罹患する患者に、任意で、薬学的に許容される担体と共に、有効量の本発明の合成ペプチドを投与することを含む、ＴＬＲ媒介疾患の治療のための方法に関する。
【００２６】
一部の実施形態では、ＴＬＲ媒介疾患は、敗血症性ショック等の急性炎症、または前立腺癌等の癌である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】ＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦα分泌に対するＴＬＲ１およびＴＬＲ２の膜貫通型ドメインに基づくペプチドの作用が、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）依存性であることを示す（図１Ａ−１Ｂ）。示される膜貫通型（ＴＭ）ペプチドｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡ（配列番号８８）、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６）、ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７）、およびｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３）の異なる濃度で、細胞を２時間インキュベートし、その後、洗浄し、低リポテイコ酸（ＬＴＡ）濃度（１００ｎｇ／ｍＬ、図１Ａ）またはリポ多糖類（ＬＰＳ，１０ｎｇ／ｍＬ、図１Ｂ）で刺激した。
【図１Ｂ】ＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦα分泌に対するＴＬＲ１およびＴＬＲ２の膜貫通型ドメインに基づくペプチドの作用が、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）依存性であることを示す（図１Ａ−１Ｂ）。示される膜貫通型（ＴＭ）ペプチドｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡ（配列番号８８）、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６）、ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７）、およびｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３）の異なる濃度で、細胞を２時間インキュベートし、その後、洗浄し、低リポテイコ酸（ＬＴＡ）濃度（１００ｎｇ／ｍＬ、図１Ａ）またはリポ多糖類（ＬＰＳ，１０ｎｇ／ｍＬ、図１Ｂ）で刺激した。
【図１Ｃ】２０μΜの示されるペプチドと共に、（図１Ｃ−１Ｄ）細胞をインキュベートし、その後、高ＬＴＡ濃度（５００ｎｇ／ｍＬ、図１Ｃ）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ、図１Ｄ）で刺激した。５時間刺激した後、ＥＬＩＳＡにより上清のＴＮＦαレベルを評価した。
【図１Ｄ】２０μΜの示されるペプチドと共に、（図１Ｃ−１Ｄ）細胞をインキュベートし、その後、高ＬＴＡ濃度（５００ｎｇ／ｍＬ、図１Ｃ）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ、図１Ｄ）で刺激した。５時間刺激した後、ＥＬＩＳＡにより上清のＴＮＦαレベルを評価した。
【図２Ａ】ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３）と他のＴＭペプチドとの間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を示す。ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃペプチドをフルオレセイン（ドナー）で標識し、ＰＣ：コレステロール大型単層小胞（ＬＵＶ）上に装填した。発光シグナルの強度の変化は、連続量のローダミン標識されたｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３；ホモ二量体、図２Ｂ）およびｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６；ヘテロ二量体、図２Ｃ）の添加により、５００〜６００ｎｍで監視された。ローダミン標識されたＴＣＲα  ＴＭドメインペプチド（Ｃｐ；ＧＬＲＩＬＬＬＫＶ−ＮＨ２、配列番号１２３）を陰性対照として使用した（図２Ａ）。
【図２Ｂ】ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３）と他のＴＭペプチドとの間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を示す。ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃペプチドをフルオレセイン（ドナー）で標識し、ＰＣ：コレステロール大型単層小胞（ＬＵＶ）上に装填した。発光シグナルの強度の変化は、連続量のローダミン標識されたｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３；ホモ二量体、図２Ｂ）およびｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６；ヘテロ二量体、図２Ｃ）の添加により、５００〜６００ｎｍで監視された。ローダミン標識されたＴＣＲα  ＴＭドメインペプチド（Ｃｐ；ＧＬＲＩＬＬＬＫＶ−ＮＨ２、配列番号１２３）を陰性対照として使用した（図２Ａ）。
【図２Ｃ】ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３）と他のＴＭペプチドとの間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を示す。ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃペプチドをフルオレセイン（ドナー）で標識し、ＰＣ：コレステロール大型単層小胞（ＬＵＶ）上に装填した。発光シグナルの強度の変化は、連続量のローダミン標識されたｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３；ホモ二量体、図２Ｂ）およびｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６；ヘテロ二量体、図２Ｃ）の添加により、５００〜６００ｎｍで監視された。ローダミン標識されたＴＣＲα  ＴＭドメインペプチド（Ｃｐ；ＧＬＲＩＬＬＬＫＶ−ＮＨ２、配列番号１２３）を陰性対照として使用した（図２Ａ）。
【図３Ａ】ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７）と他のＴＭペプチドとの間のＦＲＥＴを示す。ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’ペプチドは、フルオレセイン（ドナー）で標識され、ＰＣ：コレステロールＬＵＶ上に装填された。発光シグナルの強度の変化は、連続量のローダミン標識されたｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７；ホモ二量体、図３Ｂ）およびｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡ（配列番号８８；ヘテロ二量体、図３Ｃ）の添加により、５００〜６００ｎｍで監視された。ローダミン標識されたＴＣＲα  ＴＭドメインペプチド（Ｃｐ；ＧＬＲＩＬＬＬＫＶ−ＮＨ２、配列番号１２３）を陰性対照として使用した（図３Ａ）。
【図３Ｂ】ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７）と他のＴＭペプチドとの間のＦＲＥＴを示す。ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’ペプチドは、フルオレセイン（ドナー）で標識され、ＰＣ：コレステロールＬＵＶ上に装填された。発光シグナルの強度の変化は、連続量のローダミン標識されたｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７；ホモ二量体、図３Ｂ）およびｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡ（配列番号８８；ヘテロ二量体、図３Ｃ）の添加により、５００〜６００ｎｍで監視された。ローダミン標識されたＴＣＲα  ＴＭドメインペプチド（Ｃｐ；ＧＬＲＩＬＬＬＫＶ−ＮＨ２、配列番号１２３）を陰性対照として使用した（図３Ａ）。
【図３Ｃ】ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７）と他のＴＭペプチドとの間のＦＲＥＴを示す。ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’ペプチドは、フルオレセイン（ドナー）で標識され、ＰＣ：コレステロールＬＵＶ上に装填された。発光シグナルの強度の変化は、連続量のローダミン標識されたｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７；ホモ二量体、図３Ｂ）およびｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡ（配列番号８８；ヘテロ二量体、図３Ｃ）の添加により、５００〜６００ｎｍで監視された。ローダミン標識されたＴＣＲα  ＴＭドメインペプチド（Ｃｐ；ＧＬＲＩＬＬＬＫＶ−ＮＨ２、配列番号１２３）を陰性対照として使用した（図３Ａ）。
【図４Ａ】ＴＬＲ１の膜貫通型ドメインに基づくペプチドが模倣膜に対して高親和性を有することを示す。４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ）−標識されたｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７、図４Ａ）およびｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３、図４Ｂ）の発光を、ＬＵＶを用いた滴定により追跡した。５３０ｎｍでのシグナルの増加は、ＮＢＤ−ペプチドのＰＣ：コレステロール疎水性小胞との会合を示す。
【図４Ｂ】ＴＬＲ１の膜貫通型ドメインに基づくペプチドが模倣膜に対して高親和性を有することを示す。４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ）−標識されたｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７、図４Ａ）およびｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３、図４Ｂ）の発光を、ＬＵＶを用いた滴定により追跡した。５３０ｎｍでのシグナルの増加は、ＮＢＤ−ペプチドのＰＣ：コレステロール疎水性小胞との会合を示す。
【図５Ａ】ＴＬＲ２の膜貫通型ドメインに基づくペプチドが他のＴＬＲではなく、ＴＬＲ１タンパク質と物理的に相互作用することができることを示す。（図５Ａ）示される濃度のローダミン標識されたペプチドｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡ（配列番号８８）およびｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６）と共に、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞をインキュベートした。ペプチドを有する細胞を洗浄し、溶解し、異なるＴＬＲ抗体との共免疫沈降に可溶性画分を使用した。タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理し、標識されたペプチドの存在を蛍光スキャナ（励起−５３２ｎｍ、発光−５８５ｎｍ）で検出した。
【図５Ｂ】ＴＬＲ２の膜貫通型ドメインに基づくペプチドが他のＴＬＲではなく、ＴＬＲ１タンパク質と物理的に相互作用することができることを示す。（図５Ｂ）示されるように、特異的な抗体（αＴＬＲｌ、２および４）を用いて特異的なＴＬＲタンパク質および複合体を検出するために、タンパク質試料をウェスタンブロッドにより分析した。
【図６Ａ】リソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）ミセル中の異なるペプチド間の構造差を示す円偏光二色性（ＣＤ）分光法を示す。（図６Ａ）ＴＬＲ１の膜貫通型ドメインに基づくペプチド、つまり、ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７）およびｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３）に対して実施されたＣＤは、Ｃ末端およびＮ末端ペプチドの両方において、特徴的なαらせん体を示す。ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３）のシグナルは、非常に弱く、αらせん体の含量が比較的低いことを示唆する。このシグナルは、高濃度の５０μΜペプチドでのみ得られたことに留意する。
【図６Ｂ】リソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）ミセル中の異なるペプチド間の構造差を示す円偏光二色性（ＣＤ）分光法を示す。ＴＬＲ２の膜貫通型ドメインに基づく（図６Ｂ）ペプチド、つまり、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡ（配列番号８８）およびｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６）は、Ｃ末端およびＮ末端ペプチドの両方において、特徴的なαらせん体を示す。
【図７Ａ】ＴＬＲ１およびＴＬＲ２の膜貫通型ドメインに基づくペプチドは、緩衝液およびＰＣ：コレステロールＬＵＶの両方で自己集合するそれらの能力が異なることを示す。（図７Ａ−７Ｂ）ローダミン接合されたＴＬＲペプチドｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡ（配列番号８８）、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６）、ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７）、およびｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３）をＨＥＰＥＳ溶液に添加し、プロテイナーゼＫの添加前と添加後に、５８５ｎｍでのそれらの発光を記録した。プロテイナーゼＫの添加は、黒色の矢印で示される。ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３）、ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７）、およびｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６）は、溶液中で、非常にわずかな程度に自己集合することができる（図７Ａ）。
【図７Ｂ】ＴＬＲ１およびＴＬＲ２の膜貫通型ドメインに基づくペプチドは、緩衝液およびＰＣ：コレステロールＬＵＶの両方で自己集合するそれらの能力が異なることを示す。（図７Ａ−７Ｂ）ローダミン接合されたＴＬＲペプチドｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡ（配列番号８８）、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６）、ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７）、およびｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３）をＨＥＰＥＳ溶液に添加し、プロテイナーゼＫの添加前と添加後に、５８５ｎｍでのそれらの発光を記録した。プロテイナーゼＫの添加は、黒色の矢印で示される。ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡ（配列番号８８）は、溶液中で高度に多量体化され（黒線、７Ｂ）、ＬＵＶの存在下で部分的に解離した（灰色線図７Ｂ）。
【図７Ｃ】ＴＬＲ１およびＴＬＲ２の膜貫通型ドメインに基づくペプチドは、緩衝液およびＰＣ：コレステロールＬＵＶの両方で自己集合するそれらの能力が異なることを示す。（図７Ｃ−７Ｄ）ＬＵＶの存在下で、ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’およびｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’の両方は、自己集合することができ、一方で、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’およびｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’は、ＬＵＶを系に添加する前と添加した後で変化しない（図７Ｃ）。
【図７Ｄ】ＴＬＲ１およびＴＬＲ２の膜貫通型ドメインに基づくペプチドは、緩衝液およびＰＣ：コレステロールＬＵＶの両方で自己集合するそれらの能力が異なることを示す。（図７Ｃ−７Ｄ）ＬＬ３７は、リポソーム中で高度に多量体化されたペプチドについての例として示される（図７Ｄ）。
【図８】ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６）は、生体内でＴＬＲ２の活性化を阻害することができることを示す。マウスをＬＴＡの単一ｉ．ｐ．注射で処理し、その後、示される濃度でｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６）で注射をするか、未処理のままであった（生理食塩水のみ、黒四角）。２回目の注射は２時間後（１ｍｇ／ｋｇ、黒三角）または１２時間後（５ｍｇ／ｋｇ、黒ひし形）に与えられた。それから１４日間、生存を監視した。未処理マウスの生存は、４８時間後に０に降下し、一方で、５ｍｇ／ｋｇのｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’  −ＣｔｏＡ（配列番号８６）は、顕著な有害作用なく、最大６２．５％のマウスを救出することができた。全群においてｎ＝８。
【図９】２つの異なる前立腺癌細胞系ＰＣ３およびＬＮＣａＰにおける様々なＴＬＲ転写（ＴＬＲ１、２、および６）のｍＲＮＡ発現を示す。転写の発現における差が細胞系の間で存在することは明らかである。全ての試験されたＴＬＲ転写を発現した細胞系は、ＰＣ３のみである。
【図１０】ＰＣ３細胞におけるＮＦｋＢ活性化、およびペプチドｈＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’（配列番号８３）を用いたその特異的阻害を示す。ＮＦｋＢの転写制御下で、細胞は、ルシフェラーゼプラスミドを形質移入された。活性化により、ＮＦｋＢは、核に転座し、ルシフェラーゼの発現を誘発する。ＬＴＡ（５０μｇ／ｍＬ）またはＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）の存在下で、細胞を２４時間活性化し、活性化因子を添加する前に、ｈＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’ペプチド（配列番号８３）（２０μｍ）と共に２時間インキュベートし、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。Ｌｕｃ発現の検出を、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏアッセイキットで実施した。
【図１１】ＰＣ３細胞の成長速度に対するペプチドの影響の評価を示す。２４時間毎に培地を替え、新しいペプチドを添加しながら、ペプチドｈＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ（配列番号８３）の存在下で、細胞を７２時間成長させた。対称細胞用にＰＢＳを添加した。
【図１２Ａ】ＬＰＳ／ＬＴＡの不在下または存在下の、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞におけるＴＧＦβおよびＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現を示す。
【図１２Ｂ】ＬＰＳ／ＬＴＡの不在下または存在下の、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞におけるＴＧＦβおよびＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現を示す。
【図１３Ａ】２０μΜの濃度のＬＰＳ／ＬＴＡおよびペプチドｈＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’（配列番号８３）の不在下または存在下での、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞におけるＴＧＦβおよびＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現を示す。
【図１３Ｂ】２０μΜの濃度のＬＰＳ／ＬＴＡおよびペプチドｈＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’（配列番号８３）の不在下または存在下での、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞におけるＴＧＦβおよびＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現を示す。
【図１４】ＴＬＲ６  Ｃ９  ＴＭＤ（配列番号８５）とＴＬＲ４  Ｃ１１  ＴＭＤ（配列番号９５）との間のＦＲＥＴを示す。ＴＬＲ４ペプチドをＮＢＤ（ドナー）で標識し、ＰＣ：コレステロールＬＵＶに装填した。発光シグナルの強度の変化は、連続量のローダミン標識されたＴＬＲ６  Ｃ  ＴＭの添加により、５００〜６００で監視された。使用したペプチドの濃度は、（上から下）０μΜ、０．０１２５μΜ、０．０２５μΜ、０．０５μΜ、０．１μΜ、０．２μΜ、０．４μΜ、および０．８μΜである。使用したドナーペプチドの濃度は、０．４μΜである。
【図１５】ＧＡＬＬＥＸアッセイを使用して測定された、生体細胞の膜におけるＴＬＲ４およびＴＬＲ６  ＴＭＤペプチドのヘテロ二量体化を示す。両方のプラスミドＴＬＲ６  Ｎ６（配列番号９６）、ＴＬＲ６  Ｃ１０（配列番号９４）、ＴＬＲ４  Ｃ３（配列番号１２２）からのＧ８３Ｉキメラを発現する株に対する活性が示される。
【図１６】マクロファージＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦα分泌に対するＴＬＲ４およびＴＬＲ６  ＴＭＤペプチドの作用を示す。２０μΜの示されるペプチドと共に、細胞を２時間インキュベートし、その後、洗浄し、２４時間、原線維βアミロイド（ｆＡβ）で刺激した（最終濃度１０μΜ）。上清のＴＮＦαレベルをＥＬＩＳＡにより評価した。ＴＬＲ  ＴＬＲ４  Ｃ１（配列番号９５）、ＴＬＲ  ４  Ｃ２（配列番号９０）、ＴＬＲ６  Ｃ９（配列番号８３）、ＴＬＲ６  Ｎ６（配列番号９６）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
１９９０年代後半、ヒトにおけるそれらの発見以来、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、生来の免疫応答の開始および進行に必須であることが多数の研究で示された。これらの受容体は、脂質代謝、癌の進行、および神経発生等の、多くの他の生理学的プロセスにおいて最も重要であることも示された（Ｈｕａｎｇら、２００７、Ｒｏｌｌｓら、２００７、Ｓｈｉら、２００６）。非常に多くの異なるプロセスにおけるそれらの本質的な役割の結果として、細胞質尾ならびに細胞外茎の両方に集中して、それらの作用および制御の様式が大規模に研究された。
【００２９】
異なるＴＬＲの細胞外ドメインおよび細胞質ドメインの両方において大規模な作業が行われたにも関わらず、これまで、これらのタンパク質の膜貫通型領域に対する作業はほとんど行われていない。しかしながら、過去２０年の間、膜タンパク質の膜貫通型ドメインがそれらの活性化および制御に大きな役割を果たす大規模な証拠が示されてきた。最近の研究は、いくつかのＴＬＲのＴＭドメインおよびそれらの隣接する疎水性領域がそれらの輸送および活性化に関与している可能性があることを示した（Ｋａｊｉｔａら、２００６、Ｎｉｓｈｉｙａら、２００６）。
【００３０】
本発明に従って、我々は、ＴＬＲ１／６およびＴＬＲ２の膜貫通型（ＴＭ）ドメインがこれらの受容体の活性化および制御に関与していることを示す証拠を提供する。Ｎ末端に対応する外因性ペプチドまたはこれらの領域の伸長したＣ末端は、ＬＴＡ刺激に応答して、ＲＡＷ２６４．７マクロファージによるＴＮＦαの分泌を阻害することができた（図１Ａおよび１Ｃ）。これらのペプチドがＴＬＲ４活性化因子であるＬＰＳに応答するＴＮＦαの分泌に影響を及ぼさないため、この阻害は、ＴＬＲ２に特異的である（図１Ｂおよび１Ｄ）。これらのペプチドは、我々の実験条件下で、ＲＡＷ２６４．７マクロファージに比較的非毒性であることが示され、全てのペプチドに対して５０μΜを超えるＬＣ５０を示した（表１）。
【００３１】
ペプチド間の相互作用は、真核生物膜を模倣するために通常使用される脂質環境を構成するＰＣ：コレステロール大型単層小胞（ＬＵＶ）にも見られた。ＴＬＲ１  ＴＭペプチドは、ヘテロ二量体に対する高い性向を伴って、ＴＬＲ２  ＴＭを有するヘテロ二量体ならびにホモ二量体を形成することができることが示された（図２Ａ〜２Ｃおよび３Ａ〜３Ｃ）。両方の場合において、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）強度は、関連のないＴＭペプチドであるＣｐ（ＴＣＲαのコアＴＭペプチド）で観察された強度より高かった。
【００３２】
これらの知見を支持するため、ＴＬＲ２のＴＭドメインに基づくペプチドが物理的にＴＬＲ１タンパク質と相互作用し、ＴＬＲ１、２、および４が相互に相互作用することができることを示すために、共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）が使用された（それぞれ、図５Ａおよび５Ｂ）。
【００３３】
これらのペプチドがオリゴマーを形成する能力の検査は、我々のＦＲＥＴ観察を支持し、ＴＬＲ１  ＴＭペプチドがある程度までＬＵＶ中でホモ二量体を形成することができることを示した。留意することは、これらの実験は、ＴＬＲ２  ＴＭペプチドは、その高い疎水性により溶液中で高度に凝集されるが、ＬＵＶを系に添加することにより、単量体状態に解離することができることを示す（図７Ａ〜７Ｂ）。
【００３４】
加えて、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡペプチド（配列番号８６）は、生体内で、ＴＬＲ２の活性化を阻害することも示した。ＬＴＡによってもたらされる急性敗血症性ショックにマウスモデルを使用することにより、我々は、このペプチドの投与が、未処理のマウスの未生存率と比較して、６０％を超えるマウスを救出することができることを示した（図８）。死が過剰で不均衡なＴＬＲ２活性化に起因したという事実により、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡペプチドは、これらの動物において、ＴＬＲ２の活性化の阻害にほぼ確実に直接関与している。死亡率がＬＴＡ注射後４８時間以降安定していたという知見は、生き残った動物が、顕著な有害作用なく、完全に、かつ不可逆的に治癒したことを示唆する。
【００３５】
本発明に従って、我々は、ＴＬＲ４／６の膜貫通型（ＴＭ）ドメインの配列を含むペプチドが、ヘテロ二量体を形成することができ、ＴＬＲ６  ＴＭ領域のＮ末端もしくはＣ末端に対応する外因性ペプチド、またはＴＬＲ４  ＴＭ領域のＣ末端に対応するペプチドが、原線維βアミロイド刺激に応答してＲＡＷ２６４．７マクロファージによるＴＮＦαの分泌を阻害することができたことを示す証拠をさらに提供する（図１６）。
【００３６】
数種類の前立腺癌系における様々なＴＬＲの発現のｍＲＮＡレベルを検査すると、ＰＣ３およびＤＵ１４５細胞の両方（高度に転移性）がほぼ全ての試験されたＴＬＲを発現し、一方で、ＬＮＣａＰおよび２２ＲＶ１（低転移性）において、ＴＬＲ１、２、および６のｍＲＮＡ転写のみが検出されたことが見出された（図９、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞のみのデータを示す）。
【００３７】
ＰＣ３細胞におけるルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）発現アッセイは、ＬＰＳ（ａ  ＴＬＲ４活性化因子）またはＬＴＡ（ＴＬＲ２活性化因子）を用いた活性化がＬｕｃ発現の著しい増加をもたらしたことを示した。ヒトＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’ペプチド（配列番号８３）の添加は、ＬＴＡ活性化において、Ｌｕｃ発現の低下をもたらしたが、ＬＰＳ活性化においては、Ｌｕｃ発現の低下をもたらさなかった（図１０）。加えて、ｈＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’ペプチド（配列番号８３）と共に細胞をインキュベーションすることにより、ＰＣ３細胞の増殖の阻害をもたらした（図１１）。
【００３８】
ＰＣ３細胞（高度に転移性）およびＬＮＣａＰ細胞（低転移性）におけるサイトカインＴＧＦβおよびＶＥＧＦの発現のｍＲＮＡレベルは、ＬＰＳおよびＬＴＡを用いた活性化により検査された。興味深いことに、刺激により、ＰＣ３細胞のみがサイトカインのｍＲＮＡ発現において著明な増加を示した（図１２）。加えて、ｈＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’ペプチド（配列番号８３）の存在下での発現レベルの降下が観察された（図１３）。
【００３９】
総合すると、我々の結果は、ＴＬＲ２、１、および６のＴＭドメインに基づくペプチドが生体外および生体内の両方においてＴＬＲ２の活性化を阻害する、ヘテロ二量体を形成する、および天然の受容体と相互作用する能力を示す。よって、それらは、ＴＬＲ２の阻害が必要である様々な病理において治療の有力な候補となる。我々の結果は、ＴＬＲ４および６のＴＭドメインに基づくペプチドがＴＬＲ４／６の活性化を阻害する、ヘテロ二量体を形成する、および天然の受容体と相互作用する能力をさらに示す。これらのペプチドは、アルツハイマー病の原線維βアミロイドに起因する神経変性の治療の有力な候補となる。
【００４０】
加えて、我々の結果は、前立腺癌細胞系上の特異的なＴＬＲアレイの発現レベル、抗炎症性サイトカインを分泌するそれらの能力、および転移を生じるその能力の間の相関関係を示す。よって、特定の腫瘍細胞における特異的なＴＬＲアレイの発現レベルは、癌の攻撃性（すなわち、転移を生じる能力）のマーカーとして診断に使用され得る。
【００４１】
一部の実施形態では、ＴＬＲは、哺乳類のＴＬＲ１、２、４、または６である。他の実施形態では、哺乳類のＴＬＲは、ヒト（ｈＴＬＲ）またはマウス（ハツカネズミ、ｍＴＬＲ）のＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、またはＴＬＲ６である。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明の合成ペプチドは、任意で、対応するＴＬＲの細胞内もしくは細胞外領域またはその両方に隣接する、ＴＬＲ１、２、４、および６から選択されるＴＬＲの膜貫通型（ＴＭ）ドメインからなる、またはその配列内に見られる配列を含み、
（ｉ）前記ヒトＴＬＲ１は、配列番号１に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号２に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、
（ｉｉ）前記ヒトＴＬＲ２は、配列番号３に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号４に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、
（ｉｖ）前記ヒトＴＬＲ６は、配列番号５に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号６に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、
（ｖ）前記マウスＴＬＲ１は、配列番号７に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号８に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、
（ｖｉ）前記マウスＴＬＲ２は、配列番号９に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号１０に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、
（ｖｉｉｉ）前記マウスＴＬＲ６は、配列番号１１に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号１２に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、
（ｉｘ）前記マウスＴＬＲ４は、配列番号１３に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号１４に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、かつ
（ｘ）前記ヒトＴＬＲ４は、配列番号１５に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号１６に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有する。
【００４３】
推定ＴＭドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔ／ｓｗｉｓｓｐｏｒｔデータベースから取得したが、他（同一または類似する）の推定ＴＭドメインは、Ｐａｓｑｕｉｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｍｏｄｒａｋａｓ，１９９９のニューラルネットワーク（Ａｎ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １９９９  Ａｕｇ；１２（８）：６３１−４）等の当業者に容易に利用可能な、あらゆる他の既知のアルゴリズムを使用して計算された可能性がある。よって、開示される推定ＴＭドメイン配列は、可能な例であり、本発明のペプチドを開示される配列に限定するように解釈されるべきではない。例えば、異なるアルゴリズムを使用して推定されたＴＭドメインは、ＴＬＲポリペプチドのアミノ酸配列に沿ったいくつかのアミノ酸によって置換され得、異なる長さのものであり得る。
【００４４】
特定の実施形態では、合成ペプチドは、前記ヒトまたはマウスＴＬＲの２１〜３０個のアミノ酸残基の推定膜貫通型ドメイン内で見られる１６〜２３個のアミノ酸残基からなる。他の実施形態では、合成ペプチドは、配列番号１７〜配列番号２３に記述される配列のペプチドから選択される。
【００４５】
一部の実施形態では、合成ペプチドは、１４〜１９個のアミノ酸残基からなり、そのうちの４〜１７個は、前記ヒトまたはマウスのＴＬＲの推定膜貫通型ドメイン内で見られ、１〜１４個、好ましくは、３〜９個は、前記膜貫通型ドメインに隣接する細胞質領域内で見られる。他の実施形態では、合成ペプチドは、配列番号２４〜配列番号４３に記述される配列のペプチドから選択される。
【００４６】
本明細書で使用される「類似体」という用語は、１つ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換を指す。アミノ酸残基の置換により得られた類似体を調製するとき、置換は、累積的に、対応する非置換される親ペプチドの部分の容量、疎水性−親水性パターン、および電荷を実質的に変化させないものから選択されることが重要である。よって、疎水性残基は、総合効果が対応する非置換される親ペプチドの容量、疎水性−親水性パターン、および電荷を実質的に変化させない限り、すなわち、ＴＬＲの結合モチーフが保たれる限り、親水性残基で置換されるか、またはその逆であり得る。
【００４７】
よって、特定の実施形態では、合成ペプチドの類似体は、１つ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換、好ましくは、アラニンによる１〜４つのアミノ酸残基の置換によって得られる。他の実施形態では、合成ペプチド類似体は、１４〜３５個、好ましくは１６個のアミノ酸残基からなり、そのうちの６〜２１個、好ましくは、そのうちの８つは、ヒトまたはマウスのＴＬＲの推定膜貫通型ドメイン内で見られ、１〜１４個、好ましくは、８つは、前記膜貫通型ドメインの隣接細胞質または細胞外領域内で見られ、細胞質領域の１〜４つのアミノ酸残基は、アラニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、もしくはセリンで置換されるか、またはペプチド類似体は、１つまたは２つのアミノ酸残基がアラニンで置換される前記推定膜貫通型ドメイン内のアミノ酸残基、好ましくは、１８個のアミノ酸残基からなる。よって、特定の実施形態に従って、合成ペプチドは、配列番号４４〜配列番号７４の配列から選択される配列を有する。これらの合成ペプチドの全てにおいて、システイン残基は、合成を容易にするためにアラニンに変異された。このアプローチが通常使用され、ＴＭドメイン内のシステイン残基が、通常、膜タンパク質の活性に影響を及ぼさないという事実に基づく（Ｆｒｉｌｌｉｎｇｏｓら、１９９８、Ｈｅら、１９９６）。
【００４８】
Ｄ、Ｌ−アミノ酸類似体も、本発明の範囲に含まれる。これらの類似体は、水への良好な可溶性およびタンパク質分解酵素による制御された分解等の高度な薬学的特性を保有することができる。
【００４９】
ペプチドおよびその類似体の他の修飾も、本発明によって想定されることを理解するべきである。よって、本発明のペプチドまたは類似体は、リガンド活性化に応答して、ＴＬＲタンパク質の活性を調節するその有用性を可能にするペプチドの機能の少なくとも一部分を保持する、その「化学誘導体」を含むことが意図される。
【００５０】
本発明のペプチドまたは類似体の「化学誘導体」は、通常はペプチドの一部ではない、さらなる化学的部分を含有する。ペプチドの共有結合による修飾は、本発明の範囲内に含まれる。そのような修飾は、ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導化剤と反応させることによって分子の中に導入され得る。多くのそのような化学誘導体およびそれらを作製するための方法は、当該技術分野において周知である。
【００５１】
特定の実施形態では、化学誘導体は、合成ペプチドのエステル、アミド、またはＮ−アシル誘導体である。Ｎ−アシル誘導体は、任意で、Ｃ６−Ｃ１８カルボン酸のアシル基、好ましくは、飽和または不飽和Ｃ６−Ｃ１８脂肪酸のアシル基である。脂肪酸の例としては、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、トランス−ヘキサデカン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、およびエライジン酸が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ペプチドは、ペプチドの安定性を増加し、その投与後に対象から排除される速度を変化させるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非タンパク質ポリマーに共有結合的に連結される。ＰＥＧは、約１０００〜約５０００Ｄａ以上の分子量を有する置換された、または非置換されたポリマーである。そのようなポリマーの他の非限定的な例は、ポリ（プロピレングリコール）またはポリ（オキシアルキレン）である。
【００５２】
本発明のペプチドおよび類似体の塩も、本発明の範囲に含まれる。本明細書で使用される「塩」という用語は、カルボキシル基の塩、およびペプチド分子のアミノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩は、当該技術分野に公知の手段により形成され得、無機塩、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、第二鉄塩、または亜鉛塩等、および例えば、トリエタノールアミン、アルギニン、またはリジン等のアミン類、ピペリジン、プロカイン等で形成されるもの等の有機塩基を付加する塩を含む。酸付加塩は、例えば、鉱酸（例えば、塩酸または硫酸等）を伴う塩、および有機酸（例えば、酢酸またはシュウ酸）を付加する塩を含む。安定性、可溶性等が考慮される限り、そのような化学誘導体および塩は、好ましくは、ペプチドの薬学的特性を修飾するために使用される。
【００５３】
特定の実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端のそれぞれに付加される、正に荷電したアミノ酸残基は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、またはオルニチンから選択される。他の実施形態では、１つ、または２つ、好ましくは２つのリジン残基が、ペプチド末端のうちの１つ、またはその両方、好ましくは、両方の末端に付加される。ペプチドの末端でのリジン残基の付加は、生理学的流体におけるそれらの可溶性を向上するのに役立つ。よって、好ましい実施形態では、合成ペプチドは、配列番号７５〜配列番号１２２から選択される配列を有する。
【００５４】
環状ペプチドは、ペプチドのＮおよびＣ末端の両方で、システイン残基を用いて、またはそれなしで、固相法によって合成され得る。システインのない環化は、Ｎ末端を保護し、Ｃ末端を活性化し、その後、Ｎ末端を脱保護し、なお樹脂に結合されたままであるが、ＣおよびＮ末端基を反応させることにより実行される。ペプチドがＮおよびＣ末端でシステイン残基を含有するとき、ＨＦ切断およびＲＰ−ＨＰＬＣ精製後、ペプチドは、低濃度でＰＢＳ（ｐＨ７．３）に可溶化され、１２時間後に環化が完了する。環状ペプチドは、ＲＰ−ＨＰＬＣでさらに精製され、それらの組成を確認するためにアミノ酸分析、およびそれらの単量体状態を確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを受ける。
【００５５】
特定の実施形態では、本発明の合成ペプチドは、リガンド活性化に応答して、ＴＬＲタンパク質の活性を阻害することができる。
【００５６】
別の態様では、本発明は、本発明の合成ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列に関する。
【００５７】
さらに別の態様では、本発明は、本発明に従って、少なくとも１つの合成ペプチド、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物に関する。特定の実施形態に従って、薬学的組成物は、ＴＬＲ媒介疾患の治療用である。
【００５８】
別の態様では、本発明は、ＴＬＲ媒介疾患の治療のための、本発明の合成ペプチドの使用に関する。
【００５９】
さらに別の態様では、本発明は、前記ＴＬＲ媒介疾患に罹患する患者に、任意で、薬学的に許容される担体と共に、有効量の本発明の合成ペプチドを投与することを含む、ＴＬＲ媒介疾患の治療のための方法に関する。
【００６０】
一部の実施形態では、ＴＬＲ媒介疾患は、敗血症性ショック等の急性炎症、または前立腺癌等の癌である。他の実施形態では、ＴＬＲ媒介疾患は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性炎症（例えば敗血症性ショック、敗血症、内毒素性ショック、血行力学的ショック、視神経炎、および敗血症症候群）、虚血後の再潅流傷害、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、不顕性または活動性感染（例えば、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、インフルエンザウイルス、マラリア、慢性肝炎、カンジダ症、マイコバクテリア感染症、および髄膜炎の感染）の増悪、うっ血性心不全、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス）、慢性閉塞性肺疾患、肺細菌感染素因、肺性浮腫を伴ううっ血性心不全、リウマチ様疾患（例えば、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節炎、および他の関節炎症状）、変性疾患（例えば、粥状動脈硬化）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病）、線維性疾患、悪液質、移植片拒絶、放射線障害、喘息ならびに胃癌、結腸癌、肝細胞癌、卵巣上皮癌、頚部扁平上皮癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、メラノーマ、および神経芽細胞腫等の癌から選択される。
【００６１】
経口、静脈内、皮下、関節内、筋肉内、吸入、鼻孔内、くも膜下腔内、腹腔内、皮内、経皮、または経腸経路を含む他の既知の経路を含む、あらゆる適切な投与経路が本発明に包含される。好ましい実施形態では、本発明のペプチドまたは類似体は、経口、鼻孔内、または皮下経路によって投与される。
【００６２】
本発明の組成物の投与における用量範囲は、例えば、ＴＬＲの過剰発現または過剰活性化が制御され、さらに疾患が有意に治療される、所望の作用をもたらす程度に大きくなくてはならない。用量は、望まれない交差反応、全身性免疫抑制、アナフィラキシー反応等の有害な副作用を引き起こすほど多くてはならない。
【００６３】
本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例および添付の図で、より詳細に説明される。
【実施例】
【００６４】
本明細書の以下の実施例において、本発明のペプチドは、それらの配列番号によって表される。推定ＴＭドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔ／ｓｗｉｓｓｐｏｒｔデータベースから取得した。
ペプチドのリスト：
配列番号１−ＬＬＩＶＴＩＶＡＴＭＬＶＬＡＶＴＶＴＳＬＣ（推定ＴＭヒトＴＬＲ１）；
配列番号２−ＤＦＨＭＳＥＬＳＣＮＩＴＬＬＩＶＴＩＶＡＴＭＬＶＬＡＶＴＶＴＳＬＣＩＹＬＤＬＰＷ（推定ＴＭ＋隣接領域−ヒトＴＬＲ１）；
配列番号３−ＡＬＶＳＧＭＣＣＡＬＦＬＬＩＬＬＴＧＶＬＣＨ  （推定ＴＭヒトＴＬＲ２）；
配列番号４−ＤＶＲＬＳＶＳＥＣＨＲＴＡＬＶＳＧＭＣＣＡＬＦＬＬＩＬＬＴＧＶＬＣＨＲＦＨＧＬＷ（推定ＴＭ＋隣接領域−ヒトＴＬＲ２）；
配列番号５−ＬＬＩＶＴＩＧＡＴＭＬＶＬＡＶＴＶＴＳＬＣ（推定ＴＭヒトＴＬＲ６）；
配列番号６−ＤＦＨＭＳＥＬＳＣＮＩＴＬＬＩＶＴＩＧＡＴＭＬＶＬＡＶＴＶＴＳＬＣＩＹＬＤＬＰＷ（推定ＴＭ＋隣接領域−ヒトＴＬＲ６）；
配列番号７−ＶＬＬＴＶＴＩＧＡＴＭＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬ（推定ＴＭマウスＴＬＲ１）；
配列番号８  ＤＦＨＭＳＰＬＳＣＤＴＶＬＬＴＶＴＩＧＡＴＭＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬＣＬＹＦＤＬＰＷＹＶＲ（推定ＴＭ＋隣接領域−マウスＴＬＲ１）；
配列番号９−ＡＡＬＶＳＧＶＣＣＡＬＬＬＬＩＬＬＶＧＡＬ（推定ＴＭマウスＴＬＲ２）；配列番号１０−ＲＬＱＤＡＲＰＳＶＬＥＣＨＱＡＡＬＶＳＧＶＣＣＡＬＬＬＬＩＬＬＶＧＡＬＣＨＨＦＨＧＬＷＹＬＲ（推定−ＴＭ＋隣接領域−マウスＴＬＲ２）；
配列番号１１−ＶＬＬＴＩＴＩＧＡＴＭＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬ（推定ＴＭマウスＴＬＲ６）；
配列番号１２−ＤＦＨＭＳＰＬＳＣＤＴＶＬＬＴＩＴＩＧＡＴＭＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬＣＬＹＦＤＬＰＷＹＶＲ（推定ＴＭ＋隣接領域−マウスＴＬＲ６）．
配列番号１３  ＴＩＩＳＶＳＶＶＳＶＩＶＶＳＴＶＡＦＬＩＹＨＦＹＦＨＬＩＬＩ（推定ＴＭ  ｍＴＬＲ４）
配列番号１４  ＴＩＩＳＶＳＶＶＳＶＩＶＶＳＴＶＡＦＬＩＹＨＦＹＦＨＬＩＬＩＡＧＣＫＫＹＳＲＧＥＳＩＹ（推定ＴＭ＋隣接する領域−マウスＴＬＲ４）
配列番号１５  ＴＩＩＧＶＳＶＬＳＶＬＶＶＳＶＶＡＶＬＶＹ（推定ＴＭ  ｈＴＬＲ４）
配列番号１６  ＳＬＮＩＴＣＱＭＮＫＴＩＩＧＶＳＶＬＳＶＬＶＶＳＶＶＡＶＬＶＹＫＦＹＦＨＬＭＬＬ（推定ＴＭ＋隣接領域−ヒトＴＬＲ４）
配列番号１７−ＬＬＩＶＴＩＶＡＴＭＬＶＬＡＶＴＶ（推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲｌ）；
配列番号１８−ＡＬＶＳＧＭＣＣＡＬＦＬＬＩＬＬＴＧ（推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ２）；
配列番号１９−ＬＬＴＶＴＩＧＡＴＭＬＶＬＡＶＴＧＡ（推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ１）；
配列番号２０−ＡＬＶＳＧＶＣＣＡＬＬＬＬＩＬＬＶＧ（推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ２）；
配列番号２１−ＴＩＩＧＶＳＶＬＳＶＬＶＶＳＶＶＡＶＬＶＹ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ４）；
配列番号２２−ＶＳＶＬＳＶＬＶＶＳＶＶＡＶＬＶＹ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ４）；
配列番号２３−ＬＩＶＴＩＧＡＴＭＬＶＬＡＶＴＶＴ（推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）；
配列番号２４−ＬＡＶＴＶＴＳＬＣＩＹＬＤＬＰＷＹＬＲ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｈＴＬＲｌ）；
配列番号２５−ＬＩＬＬＴＧＶＬＣＨＲＦＨＧＬＷ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｈＴＬＲ２）；
配列番号２６−ＬＡＶＴＧＡＦＬＣＬＹＦＤＬＰＷ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｍＴＬＲ１）；
配列番号２７−ＬＩＬＬＶＧＡＬＣＨＨＦＨＧＬＷ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｍＴＬＲ２）；
配列番号２８−ＶＶＳＶＶＡＶＬＶＹＫＦＹＦＨＬＭＬ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭおよび隣接する細胞質ｈＴＬＲ４）；
配列番号２９−ＡＦＬＩＹＨＦＹＦＨＬＩＬＩＡＧＣ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ４＋ｃｙｔｏ）；
配列番号３０−ＶＡＦＬＩＹＨＦＹＦＨＬＩＬＩＡＧ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ４＋ｃｙｔｏ）；
配列番号３１−ＨＦＹＦＨＬＩＬＩＡＧＣＫＫＹ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ４＋ｃｙｔｏ）；
配列番号３２−ＳＣＤＴＶＬＬＴＶＴＩＧＡＴＭＬＶ（推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６＋ｅｘｔｒａ）；
配列番号３３−ＳＰＬＳＣＤＴＶＬＬＴＶＴＩＧＡＴ（推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６＋ｅｘｔｒａ）；
配列番号３４−ＴＶＬＬＴＶＴＩＧＡＴＭＬＶＬＡＶ（推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６＋ｅｘｔｒａ）；
配列番号３５−ＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬＣＬＹＦＤＬＰ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６＋ｃｙｔｏ）；
配列番号３６−ＧＡＦＬＣＬＹＦＤＬＰＷＹＶＲＭＬ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６＋ｃｙｔｏ）；
配列番号３７−ＴＩＧＡＴＭＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬＣ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６＋ｃｙｔｏ）；
配列番号３８−ＭＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬＣＬＹＦＤＬ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６＋ｃｙｔｏ）；
配列番号３９−ＭＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬＡＬＹＦＤＬ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６＋ｃｙｔｏ）；
配列番号４０−ＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬＣＬＹＦＤＬＰ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６＋ｃｙｔｏ）；
配列番号４１−ＧＡＦＬＣＬＹＦＤＬＰＷＹＶＲＭＬ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６＋ｃｙｔｏ）；
配列番号４２−ＡＶＴＶＴＳＬＣＩＹＬＤＬＰＷＹ（隣接する細胞質を伴う推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）；
配列番号４３−ＳＥＬＳＣＮＩＴＬＬＩＶＴＩＧＡＴＭ（隣接する細胞外を伴う推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）；
配列番号４４−ＬＡＶＴＧＡＦＬＡＬＹＦＤＬＰＷ（ＣからＡへの置換を伴う推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｍＴＬＲ１）；
配列番号４５−ＬＡＶＴＧＡＦＬＡＬＹＦＡＬＰＷ（ＣからＡ、およびＤからＡへの置換を伴う推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｍＴＬＲ１）；
配列番号４６−ＬＡＶＴＧＡＦＬＡＳＹＦＤＬＰＷ（ＣからＡへ、およびＬ６０５Ｓの置換を伴う推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｍＴＬＲ１）；
配列番号４７−ＬＩＬＬＶＧＡＬＡＨＨＦＨＧＬＷ（ＣからＡへの置換を伴う推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｍＴＬＲ２）；
配列番号４８−ＬＩＬＬＶＧＡＬＡＡＡＦＡＧＬＷ（ＣからＡ、および３ＨからＡへの置換を伴う推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｍＴＬＲ２）
配列番号４９−ＡＬＶＳＧＶＡＡＡＬＬＬＬＩＬＬＶＧ（ＣからＡへの置換を伴う推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ２）．
配列番号５０−ＡＦＬＩＹＨＦＹＦＨＬＩＬＩＡＧＡＡＦＬＩＹＨＦＹＦＨＬＩＬＩＡＧＸＡ（ＸはＡまたはＳ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ４）；
配列番号５１−ＦＬＩＹＸＦＹＦＸＬＩＬＩＡＧＣ（Ｘは、Ｒ、Ｋ、ＨまたはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ４）；
配列番号５２−ＶＡＦＬＩＹ  ＸＦＹＦＸＬＩＬＩＡＧ（Ｘは、Ｒ、Ｋ、Ｈ、またはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ４）；
配列番号５３−ＸＦＹＦＸＬＩＬＩＡＧＣＫＫＹ（Ｘは、Ｒ、Ｋ、Ｈ、またはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ４）；
配列番号５４−ＳＡＤＴＶＬＬＴＶＴＡＣＤＴＶＬＬＴＶＴ  ＩＧＡＴＭＬＶ（ＳはＡ＋ｅｘｔｒａに置換される、推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号５５−ＳＸＤＴＶＬＬＴＶＴ  ＩＧＡＴＭＬＶ（Ｘは、ＡまたはＳ＋ｅｘｔｒａを示す、推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号５６−ＳＣＤＡＶＬＬＡＶＡ  ＩＧＡＡＭＬＶ（ＴからＡへの置換＋ｅｘｔｒａを伴う、推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号５７−ＡＰＬＡＣＤＴＶＬＬＴＶＴＩＧＡＴ（ＳからＡへの置換＋ｅｘｔｒａを伴う、推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号５８−ＴＶＬＬＴＶＴＩＧＡＴＩＬＶＬＡＶ（ＭからＩへの置換＋ｅｘｔｒａを伴う、推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号５９−ＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬＸＬＹＦＤＬＰ（ＸはＳまたはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号６０−ＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬＣＬＹＦＸＬＰ（ＸはＥまたはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号６１−ＧＡＦＬＸＬＹＦＤＬＰＷＹＶＲＭＬ（ＸはＳまたはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号６２−ＧＡＦＬＣＬＹＦＤＬＰＷＹＶＲＩＬ（ＭからＩへの置換＋ｃｙｔｏを伴う、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号６３−ＴＩＧＡＴＩＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬＣ（ＭからＩへの置換＋ｃｙｔｏを伴う、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号６４−ＭＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬＸＬＹＦＤＬ（ＸはＳまたはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号６５−ＭＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬＡＬＹＦＸＬ（ＸはＥまたはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号６６−ＩＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬＡＬＹＦＤＬ（ＭからＩへの置換＋ｃｙｔｏを伴う、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号６７−ＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬＣＬＹＦＸＬＰ（ＸはＥまたはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号６８−ＬＶＬＡＶＴＧＡＦＬＸＬＹＦＤＬＰ（ＸはＳまたはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号６９−ＧＡＦＬＸＬＹＦＤＬＰＷＹＶＲＭＬ（ＸはＳまたはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号７０−ＧＡＦＬＣＬＹＦＸＬＰＷＹＶＲＭＬ（ＸはＥまたはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号７１−ＧＡＦＬＣＬＹＦＤＬＰＷＹＶＸＭＬ（ＸはＫまたはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号７２−ＧＡＦＬＣＬＹＦＤＬＰＷＹＶＲＩＬ（ＭからＩへの置換＋ｃｙｔｏを伴う、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）；
配列番号７３−ＶＶＳＶＶＡＶＬＶＹＫＸＹＸＨＬＭＬ（ＸがＦまたはＡを表す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ４および隣接する細胞質）；
配列番号７４−ＴＩＧＡＴＭＬＶＬＡＶＴＶＴＡＬＣＩ（ＳはＡに置換される、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）；
配列番号７５−ＫＫＬＬＩＶＴＩＶＡＴＭＬＶＬＡＶＴＶＫＫ  ｋｋ（推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲｌ）ｋｋ；
配列番号７６−ＫＫＡＬＶＳＧＭＣＣＡＬＦＬＬＩＬＬＴＧＫＫ  ｋｋ（推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ２）ｋｋ；
配列番号７７−ＫＫＬＬＴＶＴＩＧＡＴＭＬＶＬＡＶＴＧＡＫＫ  ｋｋ（推定Ｎ−ｔｅｒｍ  −ＴＭ  ｍＴＬＲ１）ｋｋ；
配列番号７８−ＫＫＡＬＶＳＧＶＣＣＡＬＬＬＬＩＬＬＶＧＫＫ  ｋｋ（推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ２）ｋｋ；
配列番号７９−ＫＫＬＡＶＴＶＴＳＬＣＩＹＬＤＬＰＷＹＬＲＫＫ  ｋｋ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｈＴＬＲｌ）ｋｋ；
配列番号８０−ＫＫＬＩＬＬＴＧＶＬＣＨＲＦＨＧＬＷＫＫ  ｋｋ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｈＴＬＲ２）ｋｋ；
配列番号８１−ＫＫＬＡＶＴＧＡＦＬＣＬＹＦＤＬＰＷＫＫ  ｋｋ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  マウスＴＬＲｌ）ｋｋ；
配列番号８２−ＫＫＬＩＬＬＶＧＡＬＣＨＨＦＨＧＬＷＫＫ  ｋｋ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｍＴＬＲ２）ｋｋ；
配列番号８３−ＫＫＬＡＶＴＧＡＦＬＡＬＹＦＤＬＰＷＫＫ  ｋｋ（ＣからＡへの置換を伴う、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｍＴＬＲ１）ｋｋ；
配列番号８４−ＫＫＬＡＶＴＧＡＦＬＡＬＹＦＡＬＰＷＫＫ  ｋｋ（ＣからＡ、およびＤからＡへの置換を伴う、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｍＴＬＲ１）ｋｋ；
配列番号８５−ＫＫＬＡＶＴＧＡＦＬＡＳＹＦＤＬＰＷＫＫ  ｋｋ（ＣからＡおよびＬ６０５Ｓへの置換を伴う、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｍＴＬＲ１）ｋｋ
配列番号８６−ＫＫＬＩＬＬＶＧＡＬＡＨＨＦＨＧＬＷＫＫ  ｋｋ（ＣからＡへの置換を伴う、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｍＴＬＲ２）ｋｋ；
配列番号８７−ＫＫＬＩＬＬＶＧＡＬＡＡＡＦＡＧＬＷＫＫ  ｋｋ（ＣからＡ、および３ＨからＡへの置換を伴う、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ＋Ｃｙｔｏ  ｍＴＬＲ２）ｋｋ；
配列番号８８−ＫＫＡＬＶＳＧＶＡＡＡＬＬＬＬＩＬＬＶＧＫＫ  ｋｋ（ＣからＡへの置換を伴う、推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ２）ｋｋ；
配列番号８９−ＹＨＦＹＦＨＬＩＬＩＡＧＳＫＫ  ＫＫＡＦＬＩ  Ｙ  ＸＦＹＦＸＬＩ  ｋｋ（Ｘは、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ４）；
配列番号９０−ＹＨＦＹＦＨＬＩＬＩＡＧＸＳＫＫ（ＸはＳまたはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ４）ｋｋ；
配列番号９１−ＫＫＡＦＬＩＹＸＦＹＦＸＬＩ  ｋｋ（Ｘは、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ４；Ｃ１）；
配列番号９２−ＫＫＬＬＡＶＡＩＧＡＡＭＬＶＬＡＶＡＧＫＫ  ｋｋ（ＴからＡへの置換を伴う、推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号９３−ＫＫＬＡＶＴＧＡＦＬＸＬＹＤＬＰＷＫＫ  ｋｋ（Ｘは、Ｃ、Ｓ、またはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号９４−ＫＫＬＡＶＴＧＡＦＬＣＬＹＸＬＰＷＫＫ  ｋｋ（Ｘは、Ｄ、Ｅ、またはＡ＋ｃｙｔｏを示す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号９５−ＫＫＡＦＬＩＹＨＦＹＦＨＬＩ  ｋｋ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ４）；
配列番号９６−ＫＫＬＬＴＶＴＩＧＡＴＭＬＶＬＡＶＴＧＫＫ  ｋｋ（推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号９７−ＫＬＬＴＶＴ  ＩＧＡＴＭＬＶＬＡＶ  ＴＧＫＫ  ｋ（推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｍＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号９８−ＫＫＴＩＩＧＶＳＶＬＳＶＬＶＶＳＶＶＡＶＬＶＹＫＫ  ｋｋ（推定ＴＭ  ｈＴＬＲ４）ｋｋ
配列番号９９−ＫＫＶＳＶＬＳＶＬＶＶＳＶＶＡＶＬＶＹＫＫ  ｋｋ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ４）ｋｋ；
配列番号１００−ＫＫＶＬＶＶＳＶＶＡＶＬＶＹＫＦＹＦＨＬＭＬＫＫ  ｋｋ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭおよび隣接する細胞質ｈＴＬＲ４）ｋｋ；
配列番号１０１−ＫＫＡＶＴＶＴＳＬＣＩＹＬＤＬＰＷＹＫＫ（隣接する細胞質を伴う、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）ｋｋ
配列番号１０２−ＫＫＬＩＶＴＩＧＡＴＭＬＶＬＡＶＴＶＴＫＫ  ｋｋｘｘｘｘｘ（推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号１０３−ＫＫＶＸＶＬＸＶＬＶＶＸＶＶＡＶＬＶＹＫＫ  ｋｋ（ＸがＳまたはＡのいずれかを表す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ４）ｋｋ；
配列番号１０４−ＫＫＶＳＶＬＳＶＬＶＶＳＶＶＡＶＬＶＡＫＫ  ｋｋ（ＹはＡに置換される、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ４；Ｃ５）ｋｋ）；
配列番号１０５−ＫＫＶＶＡＶＶＡＶＬＶＹＫＦＹＦＨＬＭＬＫＫ  ｋｋ（ＳがＡに置換される、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ４および隣接する細胞質）ｋｋ；
配列番号１０６−ＫＫＶＶＳＶＶＡＶＬＶＸＫＦＸＦＨＬＭＬＫＫ（ＸがＹまたはＡを表す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ４および隣接する細胞質）；
配列番号１０７−ＫＫＶＶＳＶＶＡＶＬＶＹＸＦＹＦＸＬＭＬＫＫ（Ｘが、Ｈ、もしくはＫ、もしくはＲ、もしくはＡを表す、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ４および隣接する細胞質）；
配列番号１０８−ＫＫＳＥＬＳＣＮＩＴＬＬＩＶＴＩＧＡＴＭＫＫ  ｋｋ（隣接する細胞外を伴う、推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号１０９−ＫＫＶＬＡＶＴＶＴＳＬＣＩＹＬＤＬＰＷＹＫＫ  ｋｋ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号１１０−ＫＫＳＥＬＳＡＮＩＴＬＬＩＶＴＩＧＡＴＭＫＫ  ｋｋ（ＣがＡに置換される、推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号１１１−ＫＫＸＥＬＸＣＮＩＴＬＬＩＶＴＩＧＡＴＭＬＶＫＫ  ｋｋ（ＸがＳまたはＡを表す、隣接する細胞外を伴う、推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号１１２−ＫＫＳＸＬＳＣＮＩＴＬＬＩＶＴＩＧＡＴＭＫＫ  ｋｋ（Ｘが、Ｄ、もしくはＥ、もしくはＡを表す、隣接する細胞外を伴う、推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号１１３−ＫＫＳＥＬＳＣＮＩＸＬＬＩＶＸＩＧＡＸＭＫＫ  ｋｋ（ＸがＴまたはＡを表す、隣接する細胞外を伴う、推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号１１４−ＫＫＳＥＬＳＣＮＩＴＬＬＩＶＴＩＧＡＴＡＫＫ  ｋｋ（ＭがＡに置換される、隣接する細胞外を伴う、推定Ｎ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号１１５−ＫＫＶＬＡＶＴＶＴＳＬＡＩＹＬＤＬＰＷＹＫＫ  ｋｋ（ＣがＡに置換される、隣接する細胞質を伴う、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号  １１６−ＫＫＶＬＡＶＴＶＴＳＬＣＩＹＬＸＬＰＷＹＫＫ  ｋｋ（Ｘが、Ａ、もしくはＤ、もしくはＥを表す、隣接する細胞質を伴う、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）  ｋｋ；
配列番号１１７−ＫＫＶＬＡＶＴＶＴＳＬＣＩＹＬＤＬＡＷＹＫＫ  ｋｋ（ＰがＡに置換される、隣接する細胞質を伴う、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号１１８−ＫＫＶＬＡＶＴＶＴＡＬＣＩＹＬＤＬＰＷＹＫＫ  ｋｋ（ＳがＡに置換される、隣接する細胞質を伴う、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号１１９−ＫＫＶＬＡＶＸＶＸＳＬＣＩＹＬＤＬＰＷＹＫＫ  ｋｋ（ＸがＡまたはＴを表す、隣接する細胞質を伴う、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号１２０−ＫＫＶＬＡＶＴＶＴＳＬＣＩＹＬＤＬＰＡＹＫＫ  ｋｋ（ＷがＡに置換される、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号１２１−ＫＫＶＬＡＶＴＶＴＳＬＣＩＹＬＤＬＰＷＡＫＫ  ｋｋ（ＹがＡに置換される、推定Ｃ−ｔｅｒｍ−ＴＭ  ｈＴＬＲ６）ｋｋ；
配列番号１２２−ＫＫＳＶＩＶＶＳＴＶＡＦＬＩ（推定Ｃ−ｔｅｒｍ  ＴＭ  ｍＴＬＲ４）
配列番号１２３−ＧＬＲＩＬＬＬＫＶ（ＴＣＲαのコアＴＭペプチド）
材料および方法
（ｉ）ペプチド合成および精製。ＡＢＩ  ４３３Ａ自動ペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、９−フルオレニルメトキシルカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相法により、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）上でペプチドを合成した。ペプチド合成に続き、９５％ＴＦＡ、２．５％Ｈ２０、および２．５％トリエチルシランと共に、３時間インキュベートすることにより、樹脂からペプチドを切断した。Ｖｙｄａｃ  Ｃ４カラム（Ｇｒａｃｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＩ）で、ＲＰ−ＨＰＬＣ（９８％超）により粗ペプチドの精製を実施した。エレクトロスプレー質量分光法により、ペプチドの組成を確認した。
【００６５】
（ｉｉ）細胞培養−マクロファージ。ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ（ＡＴＣＣ（登録商標）番号−ＴＩＢ−７１）で生体外アッセイを実施した。１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、および抗生物質（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）で補足されたＤＭＥＭ中で、細胞を成長させた。５％のＣ０２を含有する加湿雰囲気で、インキュベータを３７℃に設定した。
【００６６】
（ｉｉｉ）ＸＴＴ細胞毒性アッセイ。１ウェル当り１×１０４細胞（ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ、ＡＴＣＣ（登録商標）番号−ＴＩＢ−７１）を、９６ウェルプレート上で一晩成長させた。翌日、９０μＬの新しい培養培地、および異なる濃度の異なるペプチドｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡ（配列番号８８）、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６）、ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７）、およびｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３）を含有する１０μＬの緩衝液で培地を交換した。ペプチドの濃度は、０．７８〜１００μΜの範囲である。その後、各ウェルに５０μＬの２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサリニド分子内塩（ＸＴＴ）反応液（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を添加する前に、細胞を２時間インキュベートした。前述のように、生存率を判定した（Ｐａｐｏら、２００４およびＰａｐｏら、２００６）。各ペプチドのＬＣ５０（５０％の細胞が死滅する濃度）を、用量依存細胞生存率曲線から得た。
【００６７】
（ｉｖ）ＴＬＲ活性化に応答するＲＡ  Ｗ２６４．７によるＴＮＦα分泌。１ウェル当り２×１０５細胞を、９６ウェルプレートで一晩培養した。翌日、全ての補足物質を含む新しいＤＭＥＭで培地を交換した。ＴＬＲペプチドｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡ（配列番号８８）、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６）、ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７）、および  ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３）をＤＭＳＯに溶解し、異なる濃度で細胞に添加した。ＤＭＳＯの最終濃度は、全群において１％であった。ペプチドと共に、細胞を２時間インキュベートし、その後、２回洗浄し、ＬＴＡ（ＴＬＲ２活性化因子であるリポテイコ酸）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＬＰＳ（ＴＬＲ４活性化因子であるリポ多糖類）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する新しい培地と共にインキュベートした。ＬＴＡ濃度は、異なる実験間で変動した。細胞を３７℃で５時間インキュベートした後、各処理からの培地の試料を回収し、−２０℃で保管した。製造者のプロトコルに従って、マウスＴＮＦα酵素結合免疫吸着アッセイキット（Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｍｏｇ）を使用して、各試料のＴＮＦα濃度を評価した。全ての実験は、三つ組で実施された。
【００６８】
（ｖ）ペプチドの蛍光標識。蛍光標識において、我々は、以下のフルオロフォアを使用した：４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ−Ｆ，ＢｉｏＣｈｅｍｉｋａ）、４−フルオロ−７−ニトロ−［２，１，３］−ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ  Ａｐｏｌｌｏ）、５（６）−カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，ＢｉｏＣｈｅｍｉｋａ）、および５（６）−カルボキシテトラメチルローダミンＮ−スクシンイミジルエステル（ＴＡＭＲＡ，ＢｉｏＣｈｅｍｉｋａ）。樹脂結合ペプチドを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解された列挙されるフルオロフォアのうちのいずれかで処理し、樹脂結合Ｎ末端フルオロフォアペプチドの形成を導いた。２％のＤＩＥＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＴＡＭＲＡおよびフルオレセイン溶液に添加した。１時間（ＮＢＤ）または一晩（ＴＡＭＲＡおよびフルオレセイン）、インキュベーションを行った。インキュベーション後、樹脂をＤＭＦ、その後、塩化メチレンで十分に洗浄し、窒素流下で乾燥させ、その後、上の（ｉ）に記載されるように精製した。
【００６９】
（ｖｉ）フルオレセイン／ＮＢＤおよびローダミン（ＴＡＭＲＡ）標識されたペプチドの蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）。前述の押出方法（Ｃｏｈｅｎら、２００８）を使用して、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（１０：１，ｗ／ｗ）から構成される大型単層小胞（ＬＵＶ）を調製した。ドナーとしてフルオレセイン標識されたペプチド、およびアクセプターとしてローダミン標識されたペプチドを使用した一対のペプチドで、蛍光実験を実施した。励起を４９４ｎｍ（１０ｎｍスリット）に設定し、発光を５００〜６００ｎｍ（１０ｎｍスリット）で走査して、Ｃａｒｙ  ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により、室温で蛍光スペクトルを得た。典型的な実験では、フルオレセイン標識されたペプチドは、最初に、ＤＭＳＯ中の原液（０．１μＭのペプチドおよび０．２５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯの最終濃度）から、ＨＥＰＥＳ緩衝液中にＰＣ：コレステロールＬＵＶ（１００μΜ）を含有する溶液に添加された。続いて、０．０２５〜０．４μΜの範囲の最終濃度にローダミン標識されたペプチドを連続添加した。ローダミン標識されたペプチドを添加する前と添加した後に、蛍光スペクトルを得た。蛍光値は、ＨＥＰＥＳのみを添加することによって得られた発光の変化を減算することによって修正された。最大ＦＲＥＴ値は、５２１ｎｍでのドナーペプチドの発光の変化を計算することによって得られた。
【００７０】
（ｖｉｉ）膜結合アッセイ。ＰＣ：コレステロールＬＵＶを、再蒸留水に溶解された０．１μΜのＮＢＤ標識されたペプチドに連続して添加した。系が平衡に達するまで、励起を４６７ｎｍ（１０−ｎｍスリット）に設定して、脂質／ペプチドモル比の機能として、ＮＢＤ発光（５３０ｎｍ；ΔＦ）の変化を監視した。背景を考慮するため、同じ波長のＬＵＶのみの発光を減算した。ＮＢＤは、疎水性環境でその発光を変化させることが知られているため（Ｒａｐａｐｏｒｔら、１９９１）、プローブ発光の変化は、疎水性界面に結合したペプチドの量を表し、従って、我々にとってＬＵＶに結合するペプチドを評価することが可能になる。我々の系は、特定の脂質／ペプチド比で結合平衡（Ｆｍａｘ）に達し、従って、親和定数は、定常状態親和性モデルを使用して、ＮＢＤ標識されたペプチドの発光の平衡レベルと脂質濃度との間の関係から計算され得る。親和定数は、よって、非線形最小２乗（ＮＬＬＳＱ）分析によって判定された。ＮＬＬＳＱ適合は、以下の
Ｙ（ｘ）＝Ｋａ＊Ｘ＊Ｆｍａｘ／（１＋Ｋａ＊Ｘ）（方程式１）
方程式を使用して行われ、
式中、Ｘは、脂質濃度であり、Ｆｍａｘは、脂質の添加前と添加後のＮＢＤ標識されたペプチドの発光の最大差（それは、最大脂質ペプチド結合、または平衡−結合応答を表す）であり、Ｋａは、Ｍ−１の親和定数である。
【００７１】
（ｖｉｉｉ）共免疫沈降アッセイ。２．５＊１０６ＲＡＷ２６４．７（マウスマクロファージ、ＡＴＣＣ（登録商標）番号−ＴＩＢ−７１）細胞を、０、５、または１０μΜのローダミン標識されたペプチドと共に、２時間、３７℃でインキュベートした。ペプチドを含む細胞を洗浄し、氷冷のＲＩＰＡ緩衝液（トリスｐＨ７．４、２０ｍＭ、ＮａＣｌ１３７ｍＭ、グリセロール１０％、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１％、デオキシコール酸ナトリウム０．５％、ＳＤＳ０．１％、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル１：１００希釈）で溶解した。４℃で、１４，０００ＲＰＭで１５分間遠心分離した後、可溶性画分を分離し、異なるＴＬＲ抗体と共に２時間インキュベートした。さらに一晩インキュベーションするために、タンパク質Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を添加した。ビーズを冷ＰＢＳで５回洗浄し、ＳＤＳトリシン緩衝液（Ｎｏｖｅｘ（登録商標），ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１：２に希釈し、９５℃で１０分間沸騰させた。試料を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理した。標識されたペプチドの存在をＴｙｐｏｏｈｎ蛍光スキャナ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ）で検出した。励起を５３２ｎｍ、および発光を５８５ｎｍに設定した。標準ＥＣＬ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、ウエスタンブロット分析によりＴＬＲタンパク質の検出を実施した。使用した一次抗体は、抗ＴＬＲ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ＴＬＲ２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、および抗ＴＬＲ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）であり、使用した二次抗体は、抗ラット（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）であった。
【００７２】
（ｉｘ）円偏光二色性（ＣＤ）分光法。Ａｖｉｖ２０２分光偏光計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）でＣＤ測定を実施した。１ｍｍの経路長の温度自動調節石英キュベットを使用して、スペクトルを走査した。全ての測定は、２５℃で行われた。各スペクトルの平均記録時間は、１９０〜２６０ｎｍの波長範囲で、１ｎｍステップで２０秒であった。１％のリゾ−ホスファチジルコリン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中１０μΜ（ＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’のみ５０μΜ）の濃度で、ペプチドを走査した。
【００７３】
（ｘ）自己集合アッセイ。ローダミン標識されたペプチドをＤＭＳＯに溶解し、４００μｌのＨＥＰＥＳまたは０．１ｍＭのＰＣ：コレステロール溶液に添加し、平衡した（ペプチドの最終濃度は、０．１μΜ、ＤＭＳＯ  ０．０２５％ｖ／ｖ）。ＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ（登録商標）発光分光計（ＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を使用して、プロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加前と添加後の蛍光発光の強度の変化を追跡した。励起波長を５３０ｎｍ、発光を５８０ｎｍに設定し、プロテイナーゼＫの最終濃度は、６２．５μｇ／ｍＬであった。蛍光の増加は、ペプチドがオリゴマーとして存在することを示す（Ｐａｐｏら、２００２）。全ての蛍光測定は、２５℃で実施された。
【００７４】
（ｘｉ）生体内研究。ＴＬＲ２過剰活性化により生じる急性敗血症性ショックに対するＴＬＲ  ＴＭペプチドの作用を検査するために、我々は、前述のマウスモデルを使用した（Ｍｅｎｇら、２００４）。簡潔に、１２週齢のＣ５７の雌の黒マウス（Ｈａｒｌａｎによって供給された）を、２００μｇ／ｍＬのＤ−ガラクトースアミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する生理食塩水溶液（ｐＨ６．５）でＩＰ注射される１００μｇのＬＴＡで処理した。処理されたマウスは、１、５、および１０ｍｇ／ｋｇの用量のペプチドの注射を２回受けた。最初の注射は、ＬＴＡ注射時に与えられ、２回目の注射は、２時間（１ｍｇ／ｋｇ）または１２時間（５および１０ｍｇ／ｋｇ）後に与えられた。ＬＴＡ注射後９６時間、動物の生存を監視した。生体内実験に使用したペプチドは、ＨＰＬＣ精製中に添加されたトリフルオロ酢酸陰イオンを交換するために、２０％の酢酸で２回処理された。全群において、ｎ＝８である。
【００７５】
（ｘｉｉ）細胞系−前立腺癌。既知のアンドロゲン依存性の特徴、および転移を誘発する能力を有する数種類の前立腺癌系（親切にもＷｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＳｃｉｅｎｃｅのＰｒｏｆ．Ｚｅｌｉｇ  Ｅｓｈｈａｒにより提供された）を使用した。ＰＣ３（ＡＴＣＣ（登録商標）番号ＣＲＬ−１４３５Ｄ）およびＤＵ１４５（ＡＴＣＣ（登録商標）番号ＨＴＢ−８ＩＤ）は、高度に転移性であり、アンドロゲン依存性であることが知られており、進行性前立腺癌の細胞系モデルと広く考えられている。２２ＲＶ１（ＡＴＣＣ（登録商標）番号ＣＲＬ−２５０５Ｄ、アンドロゲン依存性）およびＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ（登録商標）番号ＣＲＬ−１７４０Ｄ、アンドロゲン依存性）は、低転移性として知られる。
【００７６】
（ｘｉｉｉ）前立腺癌細胞系におけるＴＬＲ発現。上の（ｘｉｉ）に記載される４つの前立腺癌細胞系、つまり、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ（高度に転移性）ならびにＬＮＣａＰおよび２２ＲＶ１（低転移性）におけるＴＬＲ１、２、および６のｃＤＮＡの存在を検査するために、ＰＣＲ反応を実施した。ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標（全ＲＮＡの単離にすぐ使用可能な試薬一式，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、製造者の指示に従って、細胞溶解物から全ＲＮＡを回収した。オリゴｄＴをアニーリングすることにより、ＲＮＡのこのプールからｍＲＮＡだけを確保し、その後、各ＴＬＲ遺伝子に特異的なプライマーを使用した。プライマーは、ＰｕｂＭｅｄツールおよびデータベースを使用して生成された。
【００７７】
（ｘｉｖ）前立腺癌細胞系におけるＴＬＲ活性化に応答するＮＦｋＢ転写活性。ＮＦｋＢ応答要素は、広く研究されており、核内のＮＦｋＢ分子の存在についての具体的な指標として機能することが知られている。そのような転位は、標的転写をもたらす、ＴＬＲのシグナル伝達カスケードの活性化により生じる。このＤＮＡ要素は、遺伝子の上流のルシフェラーゼ発現プラスミドの中に導入され、よって、核におけるＮＦｋＢの存在について、レポータープラスミドを生成する。細胞はプラスミドを形質移入され、２４時間後、それぞれ、ＴＬＲ４およびＴＬＲ２を通してシグナル伝達カスケードを誘発するために、ＬＰＳ／ＬＴＡで処理された。活性化を確認するために、製造者の指示に従ってＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、Ｌｕｃの発現レベルを評価した。
【００７８】
実施例１．ＴＬＲ２／１／６のＴＭドメインのＮおよびＣ末端に対応するペプチドは、ＬＴＡ活性化時、ＲＡＷ２６４．７マクロファージによるＴＮＦαの分泌を阻害することができる。
【００７９】
ＴＬＲ２およびＴＬＲ１／６の膜貫通型（ＴＭ）ドメインの役割を検査するために、我々は、最初に、これらのタンパク質の推定ＴＭドメインを同定した。本明細書において、配列番号１〜配列番号１６と称される配列を有するペプチドは、ヒトおよびマウスからのＴＬＲ１、２、および６について、それぞれ、推定ＴＭドメイン、ならびに隣接する細胞質領域および細胞外領域を有する推定ＴＭの配列を含む。推定ＴＭドメインは、２１〜２２のアミノ酸長である。短い疎水性領域は、細胞内側からＴＭドメインに隣接する。ＴＬＲ１およびＴＬＲ６  ＴＭドメインのアミノ酸配列は、事実上同一である。
【００８０】
ＴＬＲ２の活性化におけるそれらの役割を検証するために、我々は、ＴＬＲ２またはＴＬＲ１  ＴＭドメインのいずれかに対応する合成ペプチドを添加するアプローチを使用し、ＴＬＲ２活性化因子であるリポテイコ酸（ＬＴＡ）によるマクロファージ活性化に影響を及ぼすそれらの能力を試験した。この系は、外因的に添加されたＴＭペプチドが、そのＴＭドメインとの相互作用を通して特定のタンパク質の活性に影響を及ぼすことができることを示す大規模な証拠に基づく（Ｂｅｎｎａｓｒｏｕｎｅら、２００４）。最初に、我々は、ＴＬＲ２およびＴＬＲ１の各ＴＭドメインのために、１つがＮ末端ＴＭに対応し、もう一方が伸長したＣ末端ＴＭドメインに対応する、それぞれ、約２０のアミノ酸を含有する２つの重複するペプチドを設計した（表１）。この領域は、このタンパク質の多量体化を制御することが示されたＴＬＲ４の類似領域に対応するため、我々は、Ｃ末端ＴＭドメインを伸長することを選択した。加えて、我々は、様々な置換により、これらのペプチドの類似体を合成した。いくつかのペプチドにおいて、ＴＭドメイン内のシステイン残基は、通常、膜タンパク質の活性に影響を及ぼさないため、合成を容易にするために、システイン残基をアラニンに変異させた（表１）。加えて、可溶性を向上させるために、これらのペプチドの端にリジンが付加された。
【００８１】
我々の結果は、ＴＬＲ２およびＴＬＲ１のＴＭドメインに由来する合成ペプチド、つまり、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡ（配列番号８８）、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６）、ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７）、およびｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３）が、ＬＴＡ活性化後、マクロファージからのＴＮＦαの分泌を著しく阻害することができたことを示す（図１Ａ〜１Ｄ）。阻害は、１０μΜのペプチド濃度で最高の用量依存性であり、低ＴＬＲ２活性化下で実施された。活性化は、１００ｎｇ／ｍＬのＬＴＡにより達成され、約５０ｐｇ／ｍＬのＴＮＦα分泌をもたらした（図１Ａ）。しかしながら、全てのペプチド濃度において、ＴＬＲ４作動薬であるリポ多糖類（ＬＰＳ）により誘発されたＴＮＦαの分泌に対する作用は見られなかった（図１Ｂ）。
【００８２】
この阻害が高レベルのＴＬＲ２活性化下で起こることが可能であるかどうかを試験するために、マクロファージ細胞を５００ｎｇ／ｍＬのＬＴＡで刺激し、これは約５００ｐｇ／ｍＬのＴＮＦαレベルをもたらした。これらの条件下で、２０μΜのＴＬＲ  ＴＭペプチドは、ＴＮＦαの分泌を４０〜６０％減少させた（図１Ｃ）。ペプチドは、それらの毒性濃度よりはるかに低い濃度で使用された（表１）。総合すると、これらの知見は、それらが密接に関連するタンパク質ＴＬＲ４の活性化に影響を及ぼさないため、ＴＬＲ２およびＴＬＲ１  ＴＭペプチドの作用が
【００８３】
【表１】
2013538558.tif 000002
【００８４】
ＴＬＲ２に対して特異的であることを示唆する（図１Ｄ）。これらの実験の結果を確認するために、さらに２つの対照を追加した。第１に、ペプチドのみの添加は、ＴＮＦα分泌の基底レベルを変化させなかった（結果は示さず）。第２に、ペプチドは、ＸＴＴ毒性アッセイにおいて明らかにされるように、我々の実験条件下でマウスマクロファージに対して毒性ではなかった（表１）。
【００８５】
実施例２．ＦＲＥＴ実験は、ＴＬＲ  ＴＭペプチドがホモ二量体よりヘテロ二量体を形成する傾向が高いことを明らかにする。
【００８６】
大型単層小胞（ＬＵＶ）内の合成ＴＭペプチドの相互作用を探査するために、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）分析を使用した。哺乳類細胞の外葉を模倣するために、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（１０：１）ＬＵＶを使用した。フルオレセインで標識されたＴＬＲｌ  ＴＭペプチドｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７）およびｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３）をドナーとして、ローダミンで標識されたそれらの対応物であるＴＬＲ２  ＴＭペプチドｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡ（配列番号８８）、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６）をアクセプターとして使用した。連続量のローダミン標識されたペプチドの添加後の、フルオレセイン接合ペプチドの発光の減少の測定は、対のペプチド間の相互作用についての指標として機能した。
【００８７】
ＴＬＲ１  ＴＭ由来ＴＭペプチドは、ＴＬＲ２  ＴＭペプチドと共にホモ二量体ならびにヘテロ二量体の両方を形成することができた（図２Ａ〜２Ｃおよび３Ａ〜３Ｃ）。ＴＬＲ１  ＴＭのＣ末端およびＮ末端ペプチドは、ホモ二量体よりヘテロ二量体の形成に非常に高い性向を示した。ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’ホモ二量体について計算されたＦＲＥＴの最大は、１６．１±１．９％であった（図２Ｂ）。ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’ホモ二量体は、１４．２±２．３％のＦＲＥＴを示し（図３Ｂ）、一方で、ｍＴＬＲ１／２  Ｃ’およびｍＴＬＲ１／２  ＴＭ  Ｎ’ヘテロ二量体は、それぞれ、２０．６±１．７％および２５．３±２．０％の最大のシグナル減少をもたらした（図２Ｃ  および３Ｃ）。ＴＣＲαのコアＴＭペプチドであるローダミン接合Ｃｐ（配列番号１２３）は、陰性対照として使用され、著しい蛍光シグナルの減少を示さなかった（図２Ａおよび３Ａ）。総合すると、これらの知見は、異なるＴＭが相互に相互作用する能力を示し、これらのタンパク質がそれらの活性化のためにヘテロ二量体化への変化を必要するという事実と一致する。我々のＦＲＥＴの結果は、これらのタンパク質のＴＭドメインもこの遷移に関与する因子であることを示唆する。
【００８８】
実施例３．ＴＬＲ１  ＴＭペプチドは、高親和でモデル膜に結合する。
【００８９】
この特性は、我々の計算されたＦＲＥＴの結果に重要であるため、我々は、ＴＬＲ１  ＴＭペプチドがモデル膜に結合する能力を判定した。ＬＵＶに結合するペプチドの画分は、観察されたＦＲＥＴシグナルの強度と相関するため、このパラメータを定義することは重要である。従って、連続量のＬＵＶの添加後の、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ）接合ペプチドの発光の増加の測定は、真核生物膜に対するそれらの親和性についての指標として機能する。ＮＢＤの発光は、疎水性環境の中に挿入されるとき、増加する。
【００９０】
ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡおよびｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’標識されたペプチド（それぞれ、配列番号８３および配列番号７７）の両方は、ＰＣ：コレステロールリポソームに対して高い親和性を示し、Ｋａ値は、それぞれ、７．８×ｌ  ０４Ｍ−１および１．５×ｌ０４Ｍ−１である（図４Ａおよび４Ｂ）。これらの比較的高いＫａ値は、ＦＲＥＴ実験において、ペプチドがリポソームに完全に結合したことを示す。
【００９１】
実施例４．ＴＬＲ２  ＴＭペプチドは、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４よりもＴＬＲ１タンパク質と物理的に相互作用することができる。
【００９２】
我々の仮説を支持するために、我々は、ＴＬＲタンパク質のＴＬＲ  ＴＭペプチドとの相互作用を検出するために、共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）実験を実施した。この実験アプローチは、ＴＬＲ  ＴＭペプチドに接合される蛍光プローブ（ローダミン）およびＴＬＲタンパク質に対する特異的抗体を使用する。ペプチドを含む細胞溶解物を、タンパク質Ｇビーズに結合された特異的ＴＬＲ抗体と共にインキュベートした。これらの複合体は、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを受けた。蛍光ペプチドの存在は、蛍光スキャナで確認され、沈殿したＴＬＲの存在は、ウエスタンブロット分析を使用して確認された。
【００９３】
１０μΜで、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡおよびｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡペプチド（それぞれ、配列番号８８および配列番号８６）の両方は、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４抗体と比較して、ＴＬＲ１抗体でより顕著に沈殿した（図５Ａ〜５Ｂ）。これらの結果は、ＦＲＥＴの結果と一致し、ＴＬＲ１タンパク質が優先的にＴＬＲ２  ＴＭペプチドと会合することを示唆する我々のモデルを支持した。ウエスタンブロット分析は、ペプチドの添加の有無に関わらず、ＴＬＲ２／１および４が一緒に共沈殿することを明らかにした（図５Ｂ）。これらの結果は、これらのタンパク質が原形質膜上に巨大複合体を形成し、少なくとも生体外で、相互に相互作用することができるという見解をさらに高める。
【００９４】
実施例５．ＴＬＲ２／１  ＴＭペプチドは、α−らせん体であり、緩衝液および脂質環境で複合体を形成するその能力が異なる。
【００９５】
ＴＬＲ  ＴＭペプチドの構造−機能関係のより良い理解を得るために、我々は、脂質界面におけるそれらの構造ならび自己集合するそれらの能力を判定した。円偏光二色性（ＣＤ）分光法を使用して、我々は、リソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）ミセルにおけるそれらの構造を判定した。図６Ａ〜６Ｂに見られるように、ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’（配列番号７７）ならびにｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡおよびｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（それぞれ、配列番号８８および配列番号８６）は、ＬＰＣミセルにおいて、αらせん構造を採用する。これらのペプチドにおいて得られたシグナルは、１０μΜのペプチド濃度で、比較的強かった（２０８および２２２ｎｍで、θ＝約１５〜２０×１０−３度×ｃｍ２／デシモル）。
【００９６】
ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８３）は、１０μΜでシグナルを示さず、５０μΜで弱いαらせんシグナルのみを生じた（図６Ａ）。これは、このペプチドが検査した他のペプチドよりαらせん体含量が低いことを示唆する。しかしながら、我々は、低シグナルがさらなるβシート構造または低挿入率のためであったという可能性を排除することはできない。
【００９７】
加えて、膜活性ペプチドのこの特性は、それらの活性に影響を及ぼすことが示されているため（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、２００６ｂ、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら２００６ｃ）、我々は、ホモオリゴマーにおけるこれらのペプチドが自己集合する能力を検査した。我々は、溶液中および膜界面上の両方で、この特徴を試験した。我々は、５８０ｎｍで、溶液のみ、またはＰＣ：コレステロールＬＵＶを含有する溶液におけるローダミン標識されたペプチドの初期発光を測定し、プロテアーゼＫを培地に添加した後、経時的に発光の増加を追跡した。経時的な蛍光の高く、かつ迅速な増加は、フルオロフォア接合ペプチドがオリゴマー急冷状態にあることを示した。陽性対称として、既知のオリゴマー抗菌ペプチドＬＬ３７（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、２００６ａ）を使用した。
【００９８】
ＨＥＰＥＳ溶液において、ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’およびｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（それぞれ、配列番号７７）および配列番号８３）ならびにｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡ（配列番号８６）は、経時的な蛍光の増加が非常に遅く、これらのペプチドが、ある程度、溶液中でオリゴマーを形成することを示唆する（図７Ａ）。それらの比較的遅い発光の増加に見られることができるように、これらの自己オリゴマーは、プロテアーゼ処理によって解離され得る。逆に、このペプチドの低い初期発光速度により明らかにされることができるように、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡ（配列番号８８）は、溶液中で凝集体を形成する性向が非常に強いことを明らかにした。これらの凝集体は、プロテアーゼＫを溶液に添加することにより解離されないが（図７Ｂ、黒線）、ＬＵＶを系に添加することにより部分的に溶解することが示され（図７Ｂ、灰色線）、脂質環境において、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｎ’−ＣｔｏＡペプチドはモノマー形態を好むことを示唆する。
【００９９】
ＬＵＶを含有する溶液において、異なる図式が見られた。ＴＬＲ２  ＴＭペプチドは、プロテアーゼの処理前と処理後にいずれの変化も示さなかったが、ＴＬＲ１  ＴＭペプチドは、ある程度解離することが示され、これらのペプチドがある程度膜にホモオリゴマーを形成することを示唆する（図７Ｃ）。これらの結果は、我々のＦＲＥＴ結果と明らかに一致し、ｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｎ’およびｍＴＬＲ１  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡの両方がホモ二量体を形成するために自己集合することができることを示唆する。予想通り、陽性対称のＬＬ３７は、脂質環境において、高度なオリゴマーペプチドの特徴である、非常に高く、かつ迅速な蛍光の回復を示した（図７Ｄ）。
【０１００】
実施例６．ＴＬＲ２  ＴＭドメインに基づくペプチドは、生体内で、ＴＬＲ２の過剰活性化を阻害することができる。
【０１０１】
生体内での我々のペプチドの活性を試験するために、我々は、ＴＬＲ２の過剰活性化に起因する急性敗血症性ショックについて、マウスモデルを使用した。マウスは、１００μｇのＬＴＡでｉ．ｐ．注射され、その後、異なる治療計画で、ｍＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’−ＣｔｏＡペプチド（配列番号８６）（材料および方法のセクション（ｘｉ）を参照）または生理食塩水のみで処理された。図８に見られるように、生理食塩水のみで処理されたマウスの生存率は、ＬＴＡ注射後４８時間内に０％に降下した。逆に、１または５ｍｇ／ｋｇのペプチドで処理されたマウスは、ＬＴＡ注射後最大１４日まで、それぞれ、５０％および６２．５％の生存率を示した。全ての実験中、ペプチドで処理されたマウスは、顕著な有害作用を示さなかった。
【０１０２】
実施例７．転移性および非転移性前立腺癌細胞系におけるＴＬＲの特異的発現。
【０１０３】
我々は、数種類の前立腺癌細胞系におけるＴＬＲの発現のｍＲＮＡレベルを判定した：高度に転移性であることが知られているＰＣ３およびＤＵ１４５、ならびに低転移性であることが知られている２２ＲＶ１およびＬＮＣａＰ（データは、ＰＣ３およびＬＮＣａＰについてのみ提示される）。興味深いことに、ＰＣ３細胞は、全ての試験したＴＬＲ（１、２、および６）を発現し、一方で、ＬＮＣａＰにおいては、ＴＬＲ１、２、および６のｍＲＮＡ転写物のみが検出された（図９）。次いで、我々は、これらの転写物がこれらの細胞上で実際に機能するかどうかを試験した。この目的を達成するために、我々は、核におけるＮＦｋＢの存在の基づくルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）発現アッセイを使用し、よって、ＴＬＲ活性化のシグナル伝達カスケードの最終生成物を報告する。ＬＰＳ（ＴＬＲ４活性化因子）またはＬＴＡ（ＴＬＲ２活性化因子）の存在下で、ＰＣ３細胞をインキュベートすることにより、Ｌｕｃ発現が著しく増加した（図１０）。
【０１０４】
実施例８．ＬＲ２のＴＭＤに由来する合成ペプチドは、前立腺癌細胞系の活性化に影響を与える。
【０１０５】
我々は、ヒトＴＬＲ１、２、および５のＴＭドメインのＮ末端またはＣ末端ドメインのいずれかに対応するペプチドを合成した。各ＴＭドメインは、２つの重複する配列に分割された（表２）。活性および毒性実験は、推定上の細胞内ドメインからの隣接する５つのアミノ酸を含む、ヒトＴＬＲ２のＴＭドメインのＣ末端ドメインに対応するペプチドで実施された（配列番号８３、下の表２のｈＴＬＲ２−Ｃ、可溶性を増加させるために、その末端のそれぞれで２つのリジン残基で伸長された）。ペプチドは、最大１００μΜの濃度で（最大濃度が試験された、データは示さず）、ＰＣ３またはＬＮＣａＰ細胞系のいずれに対して毒性ではなかった。
【０１０６】
【表２】
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【０１０７】
次いで、ＬＴＡおよびＬＰＳによるそれらの活性化時にＴＬＲのシグナル伝達カスケードを阻害するその能力を試験するために、ｈＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’ペプチド（配列番号８３）を試験した。ペプチド（２０μΜ）の存在下で、ＬＴＡを用いて活性化されたとき、Ｌｕｃ発現は、ＰＣ３細胞において、４０％阻害された（図１０）。重要なことに、細胞がＬＰＳで活性化されたとき、ペプチドは、活性化を阻害することができず、阻害の特異性を指摘する（図１０）。基底線の減少が存在するという事実に対する可能な説明は、正常な成長条件での培養細胞によるＤＡＭＰの分泌を通したＴＬＲの活性化によるものかもしれない。
【０１０８】
重要な疑問は、図１０に示されるペプチドにより誘発された細胞活性化の減少が、細胞成長速度の減少ももたらすかどうかということである。実際、２０μΜのペプチドと共に細胞を７２時間インキュベートすることにより（新しく溶解したペプチドが２４時間毎に添加された）、増殖が２０％阻害された（図１１）。
【０１０９】
実施例９．ペプチドによるサイトカインｍＲＡの発現の阻害。
【０１１０】
転移性細胞の主な特色の１つは、様々なサイトカインの分泌によるそれらの環境に影響を与えるそれらの能力である。最も影響力のあるサイトカインの２つは、血管の形成を誘発するＶＥＧＦ、および例えば、免疫細胞の耐性を誘発し、アポトーシスを阻害するＴＧＦβである。従って、我々は、ＬＰＳおよびＬＴＡによるそれらの活性化時の、細胞におけるそれらのサイトカインのｍＲＮＡの発現、および活性化に対するペプチドの作用を判定した。興味深いことに、刺激により、ＰＣ３細胞のみがサイトカインのｍＲＮＡの発現において著明な増加を示した（図１２）。加えて、ｈＴＬＲ２  ＴＭ  Ｃ’ペプチド（配列番号８３）の存在下での発現レベルの降下が観察された（図１３）。これらの知見は、ＰＣ３細胞におけるＴＬＲの存在が癌の重篤度（攻撃性）および転移を形成するその能力の一因となるという仮説に我々を導く。よって、本発明のＴＬＲ  ＴＭペプチドは、細胞の成長速度および細胞が転移を形成する能力を示すことができる、新しい診断バイオマーカーとして使用され得る。
【０１１１】
実施例１０．前立腺癌細胞におけるＴＬＲ発現のレベル、それらの機能、および転移を生成するそれらの能力の間の相関関係。
【０１１２】
タンパク質レベルで、転移性および非転移性細胞系の両方で発現したＴＬＲのレパートリーを、ウエスタンブロットにより検査した。
【０１１３】
様々なＴＬＲの機能性、すなわち、抗炎症性サイトカインを分泌するそれらの能力は、対応するリガンド（ＴＬＲ１／２／６にはＬＴＡ）によるそれらの活性化を介して試験され、ＥＬＩＳＡアッセイにより判定された。
【０１１４】
実施例１１．ＴＬＲの活性化は、それらの集合体またはヘテロ集合体（ＴＬＲ１、２、およびＴＬＲ６／２）を必要とする。
【０１１５】
ＴＬＲ１、２、および６の膜貫通型ドメイン（ＴＭＤ）の集合プロセスへの寄与は、生体細胞においてＴＭＤ−ＴＭＤホモ二量体およびヘテロ二量体集合体を検索することにより検査された。生細菌においてホモ二量体化を検出するためにＴｏｘＲ−ＴＭ−ＭａｌＥ系を（Ｌａｎｇｏｓｃｈら、１９９６、Ｇｅｒｂｅｒら、２００１）、そしてヘテロ二量体形成を検出するためにＬｅｘＡ−ＴＭ−ＭａｌＥ系を使用する（Ｌｉｎｄｎｅｒら、２００６、Ｋｏｒａｚｉｍら、２００６における実験詳細、Ｇｅｒｂｅｒら、２００４、およびＰａｐｏら、２００２）。
【０１１６】
最小二量体化モチーフを同定するため、ならびに野生型集合体と競合する配列を同定するために、合成ペプチド（実施例８に記載される、上の表２）をＴｏｘＲ−ＴＭ−ＭａＩＥおよびＬｅｘＡ−ＴＭ−ＭａＩＥ系の中に移植する。このような方法で、最も短い活性ペプチドを得る。
【０１１７】
ＴｏｘＲおよびＬｅｘＡ系の結果に基づき、様々なＴＬＲ  ＴＭＤペプチドおよびそれらの類似体（切断型および脂肪酸接合された突然変異体）を合成した。ホモおよびヘテロ集合体は、様々な生物物理学的方法を使用して判定された（実験詳細は、Ｋｏｒａｚｉｍら、２００６、Ｇｅｒｂｅｒら、２００４、およびＰａｐｏら、２００２において得られる）。ペプチドは、ＴｏｘＲおよびＬｅｘＡ系内に挿入される野生型ＴＭＤの二量体化に干渉する能力について試験された。
【０１１８】
実施例１２．ＴＬＲ活性化を阻害する合成ペプチドの能力は、それらの天然リガンド（ＬＰＳ、ＬＴＡ）により誘発された。
【０１１９】
ＴｏｘＲ−ＴＭ−ＭａＩＥおよびＬｅｘＡ−ＴＭ−ＭａＩＥ構造体における野生型ＴＭＤの集合体に対して顕著な作用を示したペプチド（実施例１１、上記）が使用された。合成ペプチドがそれらの天然リガンド（ＬＰＳ、ＬＴＡ）により誘発されるＴＬＲ活性化を阻害する能力は、（ｉ）ＮＦ−κΒ（ＮＦ−κＢ誘発性報告系）の活性化状態における変化の測定、（ｉｉ）リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）またはマイクロアレイ分析（いくつかの具体的な場合においてのみ）による、炎症誘発性／抗炎症関連分子の発現における変化の測定、および（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡによる炎症誘発性サイトカインＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、およびＶＥＧＦの分泌の追跡によって検査される。結果は、ＴＬＲ天然リガンド（ＬＰＳ、ＬＴＡ）の活性または非刺激細胞に標準化される。
【０１２０】
検査された前立腺癌細胞は、ヒトアンドロゲン依存性（ＡＤ）および非依存性（ＡＩ）細胞系：（ｉ）ＣＬ１ヒトＰＣ細胞（ＡＤ  ＬＮＣａＰを培養することにより生成されたＬＮＣａＰのＡＩサブクローン）；（ｉｉ）２２ＲＶ１ヒトＰＣ細胞（ＡＤ  ＣＷＲ２２のＡＩサブクローン）：ＰＳＡ＋、転移性、ＡＴＣＣ株；（ｉｉｉ）ＰＣ−３：ＡＩ、ＰＳＡ＋、転移性、ＡＴＣＣ株；（ｉｖ）ＤＵ−１４５：ＡＩ、ＰＳＡ−、転移性、ＡＴＣＣ株；（ｖ）ＣＷＲ２２：ＡＤ、ＰＳＡ−、原発性前立腺癌細胞；（ｖｉ）ＷＩＳＨ−２：ＡＩ、ＰＳＡ−、前立腺の小細胞癌を含む。
【０１２１】
正常なヒト前立腺および他の非癌細胞は、（ｉ）ＣＲＬ−１１６０９：組織学的に正常なヒト成人前立腺細胞からの上皮細胞：ＡＤ、ＰＳＡ＋；転移性、ＡＴＣＣ株；（ｉｉ）３Ｔ３正常線維芽細胞；（ｉｉｉ）ＯＬ包皮線維芽細胞；（ｉｖ）ヒトリンパ球；（ｖ）ヒトＲＢＣを含む。
【０１２２】
実施例１３．生体内での合成ペプチドの抗癌活性。
【０１２３】
腫瘍内、ＩＰ、またはＩＶでそれらを適用することによって合成ペプチド（表２）の抗癌活性を試験するために、ヌードマウスの前立腺異種移植片を生成する。微小環境に対する作用は、この領域で分泌された腫瘍なサイトカインおよびケモカインを検出すること、ならびに腫瘍周辺に侵入する細胞集団、例えばＴ−ｒｅｇｓ、ＭＤＳＣ等を特徴付けることにより試験される。
【０１２４】
実施例１４．ＴＬＲ４およびＴＬＲ６に由来する膜貫通型ペプチドは、ヘテロ二量体化が可能である。
【０１２５】
アルツハイマー病の場合において、作業仮説は、ＴＬＲ４およびＴＬＲ６がヘテロ二量体化するため、我々は、それらの活性化におけるＴＭＤの役割を検証した。これらの受容体のＴＭＤに由来するペプチドは、標準的な手順により、我々の研究室で合成され、精製された。
【０１２６】
生体細胞の膜におけるヘテロ二量体化を検証する目的において、２つの異なるレポーター系を使用した。ＴＭドメインのホモ二量体化を検出するために、我々の研究室で日常的に使用されるＴｏｘＲ系を採用した（上記参照）。我々は、ヘテロ二量体化ＴＭセグメントを検出するための大腸菌の２−ハイブリッド系（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｄ．Ｍ．（２００３）．ＧＡＬＬＥＸ，ａ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｌｉｃｅｓ  ｉｎ  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，  ３１０５−３１１１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）であるＧＡＬＬＥＸレポーター系により、ＴＭドメイン内のヘテロ二量体化を検出するための新しい修飾系も構築した。この系およびそれを使用するための指針は、親切にも、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍａｉｎｚ，ＧｅｒｍａｎｙのＰｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｄｉｒｋ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒにより、我々に提供される。これらの系は、ヘテロ二量体化に重要であるＴＭＤ内に領域を同定するために、我々に、ＴＬＲ４および６の様々なＴＭ領域および突然変異体をスクリーニングすることを可能にする。これらのレポーター系を使用して、我々は、主としてヘテロ二量体化の一因となるアミノ酸残基、そして最終的に先天性免疫系細胞の活性化および炎症誘発性媒介物の分泌をもたらす二量体化を阻害するのに最も効率的なペプチドを同定することができる。
【０１２７】
ペプチドは、膜で共集合するその能力について検証された。その目的のため、我々は、ＴＬＲ  ＴＭペプチドを４−クロロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−フッ化ジアゾール［Ａｐｏｌｌｏからのニトロベンズオキサジアゾール（ＮＢＤ）−Ｆ］およびローダミンで標識した。膜環境を模倣するために、我々は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）（１０：１，ｗ／ｗ）から構成される大型単層小胞（ＬＵＶ）を使用した。我々は、エネルギードナーとしてＮＢＤ標識されたＴＬＲ４ペプチド、およびエネルギーアクセプターとしてローダミン標識されたＴＬＲ６ペプチドを使用することにより、ＦＲＥＴ実験を実施した。図１４は、我々の作業仮説を支持する強いＦＲＥＴを示す。
【０１２８】
図１５は、大腸菌内膜における膜タンパク質のヘテロ二量体化を追跡するための２ハイブリッド系であるＧＡＬＬＥＸ集合系を使用した、異なるＴＬＲ４およびＴＬＲ６膜貫通型（ＴＭ）セグメントの二量体化活性を示す。本方法は、異なるＤＮＡ結合特異性を有する２つのＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインによるレポーター遺伝子活性の抑制に基づく。膜貫通型ドメインに結合されるとき、ヘテロ二量体会合がβ−ガラクトシターゼ合成の抑制により報告される。
【０１２９】
二量体化は、二量体を形成するその能力に欠ける変異体グリコフォリンＡ、ＧＰＡであるＧ８３Ｉ、および陽性対照のＧＰＡと比較して示された。このアッセイにおいて、低シグナルは、二量体化を示し（左から最初の３つの棒と陽性対称ＧＰＡ）、比較的高いシグナルは、二量体を形成することができないことを示す。
【０１３０】
実施例１６．ＴＬＲ４およびＴＬＲ６に由来する膜貫通型ペプチドは、マクロファージＴＬＲの活性化を阻害することができる。
【０１３１】
ＴＬＲは、ヘテロ二量体状態で活性化されることが示されてきた。よって、我々は、ＴＬＲ４  ＣＩ（配列番号９５）、ＴＬＲ  ４  Ｃ２（配列番号９０）、ＴＬＲ６  Ｃ９（配列番号８３）、ＴＬＲ６  Ｎ６（配列番号９６）のペプチドがＴＬＲ４およびＴＬＲ６のヘテロ集合を制御し、マウスマクロファージ細胞系の活性化をもたらす能力を研究した。マクロファージの活性化は、炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−αの分泌レベルによって引き起こされた。アルツハイマー病における炎症誘発性媒介物の分泌におけるそれらの関与が既に開示されたため、この実験はマクロファージで行われた。
【０１３２】
図１６に示されるように、可溶性ＴＬＲ６およびＴＬＲ４  ＴＭペプチドの添加は、ｆＡβで刺激した後のマクロファージ活性化を阻害した。
【０１３３】
実施例１７．合成ペプチドの機能的研究。
【０１３４】
完全長受容体の活性を損ない、かつ原線維β−アミロイドによるマクロファージおよび／または小膠細胞活性化の新規阻害剤として機能するそれらの能力について、ＴＬＲ４およびＴＬＲ６ペプチドをさらに分析した。これは、ペプチドの存在下および不在下で、いくつかの実験方法によって検査される。本方法は、
（１）ｆＡβで刺激した後の、ＮＦ−κΒの活性化状態における変化を追跡する。ＨＥＫ２９３細胞は、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、およびＮＦ−κΒルシフェラーゼレポーター遺伝子を同時形質移入される。リガンドで刺激した後、細胞を溶解し、二重ルシフェラーゼアッセイレポーター系を使用して、レポーター遺伝子の活性を測定した。この系は、我々が、未処理細胞と比較して、ルシフェラーゼの減少をもたらす、異なるペプチドの活性化レベルを判定することを可能にする。さらに、異なる遺伝子型を伴う細胞を使用することにより、我々が、系の特異性を推定することを可能にする、
（２）ＲＴ−ＰＣＲにより、炎症誘発性関連分子の発現における変化を追跡する、
（３）ＥＬＩＳＡにより、炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１ｂ、およびＩＬ−６の分泌を追跡することを含む。
【０１３５】
全ての実験において、ペプチドの作用は、非刺激細胞に標準化される。我々は、最初にＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージを使用し、その後、マウスＢＶ−２小膠細胞を使用して、このアッセイを繰り返す。最後に、我々は、マウス神経細胞、野生型、およびノックアアウト小膠細胞（ＴＬＲ４−／−、ＴＬＲ６−／−）を使用して、小膠細胞誘発された神経毒性を評価するために、神経毒性アッセイを利用する。ｆＡＢと共に７２時間インキュベートした後、共焦点顕微鏡を使用して、神経細胞の生存を計算する。ＲＯＳおよびＮＯの測定は、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）還元アッセイにより行われ、一酸化窒素は、Ｇｒｉｅｓｓ反応により測定される。
【０１３６】
ＴＭＤ由来ペプチドがＮＯ分泌を阻害する能力を検査するために、１ウェル当り１×１０５細胞を、９６ウェルプレートで一晩培養した。翌日、全ての補足物を含む新しいＤＭＥＭで培地を交換し、ＤＭＳＯに溶解したＴＬＲペプチドを、異なる濃度で細胞に添加した。ＤＭＳＯの最終濃度は、全群において１％である。ペプチドと共に細胞を２時間インキュベートし、その後、各処理からの培地の試料を回収し、直ちにキットに使用した後、２回洗浄し、１０μΜの原線維βアミロイドを含有する新しい培地と共に３７℃で５〜２４時間インキュベートした。
【０１３７】
Ｇｒｉｅｓｓ試薬系（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＮＯ２を検出し、スルファニルアミドおよびＮ−１−ナフチルエチレンジアミンジヒドロクロリドを使用する化学反応に基づく。
【０１３８】
実施例１８．アルツハイマー病のＴｇＣＲＮＤ８マウスモデルにおけるＴＬ４およびＴＬＲ６  Ｔｍドメインのペプチドの治療有効性の評価。
【０１３９】
ＴｇＣＲＮＤ８アミロイド前駆体タンパク質遺伝子導入マウスを、最大２４のＩＰ、ＩＶ、および頭蓋内処理において、ＴＬＲ４およびＴＬＲ６  ＴＭドメインに由来するペプチドで処理し、アミロイドコア斑点の形成および行動的研究により、アルツハイマー病の発達速度を監視し、加えて、生体内での小膠細胞活性化のレベルを評価するために、ＩＬ−Ιβ、ＴＮＦα、およびＩＬ−６の免疫組織学染色を実施する。
【０１４０】
参考文献
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Ｊｉｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｅ．，Ｈｅｏ，Ｊ．Ｙ．，Ｌｅｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｍ．，Ｐａｉｋ，Ｓ．Ｇ．，Ｌｅｅ，Ｈ．＆Ｌｅｅ，Ｊ．Ｏ．（２００７）．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＬＲ１−ＴＬＲ２  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉ−ａｃｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ．Ｃｅｌｌ  １３０，１０７１−１０８２．
Ｋａｊｉｔａ，Ｅ．，Ｎｉｓｈｉｙａ，Ｔ．＆Ｍｉｗａ，Ｓ．（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３４３，５７８−８４．
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Ｋｕｎｄｕ，Ｓ．Ｄ．，Ｌｅｅ，Ｃ，Ｂｉｌｌｉｐｓ，Ｂ．Ｋ．，Ｈａｂｅｒｍａｃｈｅｒ，Ｇ．Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｑ．，Ｌｉｕ，Ｖ．，Ｗｏｎｇ，Ｌ．Ｙ．，Ｋｌｕｍｐｐ，Ｄ．Ｊ．＆Ｔｈｕｍｂｉｋａｔ，Ｐ．（２００８）．Ｔｈｅ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ−  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６８，２２３−９．
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Ｌｅｈｎａｒｄｔ  Ｓ，Ｍａｓｓｉｌｌｏｎ  Ｌ，Ｆｏｌｌｅｔｔ  Ｐ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＦＥ，Ｒａｔａｎ  Ｒ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＰＡ，Ｖｏｌｐｅ  ＪＪ，Ｖａｒｔａｎｉａｎ  Ｔ（２００３）Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＮＳ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：８５１４−８５１９
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Ｍｅｎｄｒｏｌａ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｂ．，Ｋｉｎｇ，Ｍ．Ｃ．＆Ｌｅｍｍｏｎ，Ｍ．Ａ．（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，４７０４−１２．
Ｍｅｎｇ，Ｇ．，Ｒｕｔｚ，Ｍ．，Ｓｃｈｉｅｍａｎｎ，Ｍ．，Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｊ．，Ｇｒａｂｉｅｃ，Ａ．，Ｓｃｈｗａｎｄｎｅｒ，Ｒ．，Ｌｕｐｐａ，Ｐ．Ｂ．，Ｅｂｅｌ，Ｆ．，Ｂｕｓｃｈ，Ｄ．Ｈ．，Ｂａｕｅｒ，Ｓ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．＆Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇ，Ｃ．Ｊ．（２００４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３，１４７３−８１．
Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ａ．，Ｐａｕｌ−Ｃｌａｒｋ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｇ．Ｗ．，ＭｃＭａｓｔｅｒ，Ｓ．Ｋ．＆Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ，Ｎ．（２００７）Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １９３，３２３−３０．
Ｎｉｓｈｉｙａ，Ｔ．，Ｋａｊｉｔａ，Ｅ．＆Ｍｉｗａ，Ｓ．（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３４１，１１２８−３４．
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Ｐａｐｏ，Ｎ．，Ｓｅｇｅｒ，Ｄ．，Ｍａｋｏｖｉｔｚｋｉ，Ａ．，Ｋａｌｃｈｅｎｋｏ，Ｖ．，Ｅｓｈｈａｒ，Ｚ．，Ｄｅｇａｎｉ，Ｈ．＆Ｓｈａｉ，Ｙ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６，５３７１−５３７８．
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Ｓｕｎｇ−Ｃｈｕｎ  Ｔａｎｇａ，ｂ，ｃ，Ｊｕｓｔｉｎ  Ｄ．Ｌａｔｈｉａａ，Ｐｒａｄｅｅｐ  Ｋ．Ｓｅｌｖａｒａｊｆ，Ｄｏｎｇ−Ｇｙｕ  Ｊｏａ，ｄ，Ｍｏｈａｍｅｄ  Ｒ．Ｍｕｇｈａｌａ，Ａｉｗｕ  Ｃｈｅｎｇａ，Ｄｏｍｉｎｉｃ  Ａ．Ｓｉｌｅｒａ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｒ．Ｍａｒｋｅｓｂｅｒｙｅ，Ｔｈｉｒｕｍａ  Ｖ．Ａｒｕｍｕｇａｍｆ，ａｎｄ  Ｍａｒｋ．  Ｐ．Ｍａｔｔｓｏｎａ，ｇ，（２００８）Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−４  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ａｍｙｌｏｉｄ  β−Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ４−Ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２１３（１）：１１４−１２１
Ｓｔｅｗａｒｔ  ＣＲ，Ｓｔｕａｒｔ  ＬＭ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  Ｋ，ｖａｎ  Ｇｉｌｓ  ＪＭ，Ｄｅｎｇ  Ｊ，Ｈａｌｌｅ  Ａ，Ｒａｙｎｅｒ
ＫＪ，Ｂｏｙｅｒ  Ｌ，Ｚｈｏｎｇ  Ｒ，Ｆｒａｚｉｅｒ  ＷＡ，Ｌａｃｙ−Ｈｕｌｂｅｒｔ  Ａ，Ｅｌ  Ｋｈｏｕｒｙ  Ｊ，Ｇｏｌｅｎｂｏｃｋ  ＤＴ，Ｍｏｏｒｅ  ＫＪ．（２０１０）３．ＣＤ３６  ｌｉｇａｎｄｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  ａｎｄ  ６  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（２）：１５５−６１．
Ｗａｌｔｅｒ  Ｓ，Ｌｅｔｉｅｍｂｒｅ  Ｍ，Ｌｉｕ  Ｙ，Ｈｅｉｎｅ  Ｈ，Ｐｅｎｋｅ  Ｂ，Ｈａｏ  Ｗ，Ｂｏｄｅ  Ｂ，Ｍａｎｉｅｔｔａ  Ｎ，Ｗａｌｔｅｒ  Ｊ，Ｓｃｈｕｌｚ−Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  Ｗ，Ｆａｓｓｂｅｎｄｅｒ  Ｋ（２００７）Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  ｉｎ  ｎｅｕｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０：９４７−９５６
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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