(57)【要約】  抗Ｓ１Ｐ抗体または抗体フラグメントを含む組成、およびスフィンゴ脂質代謝経路の酵素のモジュレータとの組み合わせを投与する方法について記載する。このような方法により、異常なＳ１Ｐレベルと相関する疾病または疾患を有することが判明しているかまたは疑義のある患者の体内における異常なレベルまたは望ましくないレベルのＳ１Ｐを低減することが可能となり、よって、このような疾病および疾患の治療に有用となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ１Ｐの異常なレベルと関係する疾病または疾患を罹患していることが判明したかまたは疑われる患者に対して、第１の組成物と第２の組成物を投与する方法であって、
前記第１の組成物は、抗Ｓ１Ｐ抗体を含み、
前記第２の組成物は、スフィンゴ脂質代謝経路に関与する酵素のモジュレータを含む、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記患者体内の生物的に利用可能なＳ１Ｐのレベルを低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異常なレベルのＳ１Ｐと関係する疾病または疾患を治療することを意図する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗Ｓ１Ｐ抗体はＬＴ１００９であり、前記モジュレータはＳＰＨＫ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）に反応する抗体を、スフィンゴ脂質代謝経路阻害剤と組み合わせて用いることにより、Ｓ１Ｐの有効濃度を低下させる方法に関する。。このような方法を用いて、異常あるいは望ましくない量または活性のＳ１Ｐと相関する疾病および疾患を治療することができる。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
以下の記載は、本発明の理解に有用な情報を含む。本明細書中に記載される情報の全てまたは本明細書中に具体的または暗示的に記載される全ての公開文献は、先行技術であるかまたは本特許請求の範囲に記載の発明に関連するものと自白するものではない。
【０００３】
生物活性シグナル伝達脂質
脂質およびその誘導体は、単に細胞膜中の構造要素、β酸化過程、解糖過程または他の代謝過程のエネルギー源としてではなく、今や医療研究において重要な対象として考えられている。詳細には、特定の生物活性脂質は、動物およびヒトの疾病における重要な細胞外シグナル伝達メディエーターおよび／または細胞内シグナル伝達メディエーターとして機能する。「脂質シグナル伝達」とは、複数の細胞間情報伝達経路のうちいずれかを指し、細胞膜脂質を二次メッセンジャーとして用いる。また、「脂質シグナル伝達」とは、脂質シグナル伝達分子とそれに対する特定の受容体との間の直接的相互作用をも指す。脂質シグナル伝達経路は、多様な細胞外刺激（例えば、成長因子〜炎症性サイトカインにわたるもの）によって活性化され、細胞運命決定（例えば、アポトーシス、分化、および増殖）を調整する。生物活性脂質の特定およびその作用の解明が進むにつれ、生物活性脂質シグナル伝達についての研究も活発になっている。
【０００４】
生物活性脂質の例として、スフィンゴ脂質がある。スフィンゴ脂質を挙げると、スフィンゴミエリン、セラミド、セラミド−１−リン酸、スフィンゴシン、スフィンゴシルホスフォリルコリン、スフィンガニン、スフィンガニン−１−リン酸（ジヒドロ−Ｓ１Ｐ）およびスフィンゴシン−１−リン酸がある。スフィンゴ脂質およびその誘導体は、細胞外および細胞内シグナル伝達分子の１つのグループを表し、重要な細胞プロセスに対して多面発現効果を有する。生物活性シグナル伝達脂質の他の例を挙げると、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＡ）、ジアシルグリセリド（ＤＧ）、スルファチド、ガングリオシド、セレブロシド、エイコサノイド（例えば、カンナビノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン、リポキシン、エポキシエイコサトリエン酸、およびイソエイコサノイド）（例えば、ヒドロキシエイコサテトラエン酸（ＨＥＴＥ）（例えば、５−ＨＥＴＥ、１２−ＨＥＴＥ、１５−ＨＥＴＥおよび２０−ＨＥＴＥ））、非エイコサノイドカンナビノイドメディエーター、リン脂質およびその誘導体（例えば、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）およびカルジオリピンおよびリゾリン脂質（例えば、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および多様なリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ））がある。
【０００５】
スフィンゴ脂質は、ユニークなクラスの脂質であり、その性質が当初神秘的であったことから、スフィンクスになぞらえて命名された。スフィンゴ脂質は、最初は細胞膜の主要構成成分として特徴付けられていたが、最近の研究により、スフィンゴ脂質は細胞シグナル伝達および調節分子としても機能することが判明した。スフィンゴ脂質シグナル伝達メディエーターであるセラミド（ＣＥＲ）、スフィンゴシン（ＳＰＨ）およびスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は、最も盛んに研究されおてり、心臓血管系、血管形成および腫瘍生物学においてその役割が最近判明した。スフィンゴ脂質の代謝については、下記を参照されたい：Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．３６：５１１−５７３，１９９９。スフィンゴミエリンのシグナル伝達経路については、下記を参照されたい：Ｈａｎｎｕｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２５：２７−４１，１９９３；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．３６：５１１−５７３，１９９９；Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２：１０８０−１０８７１９９７；Ｏｒａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：４８３６−４８４２，１９９７；およびＳｐｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）６３：６９−８３，１９９８。
【０００６】
Ｓ１Ｐは、細胞増殖メディエーターであり、生存経路の活性化を通じてアポトーシスから保護する。ＣＥＲ／ＳＰＨレベルとＳ１Ｐとのバランスに依存するレオスタット機構により、細胞死経路へと方向づけられるかまたはアポトーシスから保護されるかが決定されることが提案されている。レオスタット機構の主要調節酵素として、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）がある。スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）の役割は、細胞死を促進させる生物活性シグナル伝達脂質（ＣＥＲ／ＳＰＨ）を細胞成長を促進させるＳ１Ｐへと変換することである。Ｓ１Ｐは、２つの方向性を有する：第１の方向では、Ｓ１ＰはＳ１Ｐリアーゼにより分解される。Ｓ１Ｐリアーゼは酵素であり、Ｓ１Ｐを開裂してホスホエタノールアミンおよびヘキサデカナールに分解する。第２の方向では、より一般的ではないが、Ｓ１ＰはＳ１Ｐホスファターゼによって加水分解されＳＰＨとなる。
【０００７】
Ｓ１Ｐの多面的生物活性は、（元は内皮分化遺伝子（ＥＤＧ）として知られた）Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のファミリを介して仲介される。５個のＧＰＣＲが、高い親和性を有するＳ１Ｐ受容体（Ｓ１ＰＲ）として特定されている（すなわち、Ｓ１Ｐ１／ＥＤＧ−１、Ｓ１Ｐ２／ＥＤＧ−５、Ｓ１Ｐ３／ＥＤＧ−３、Ｓ１Ｐ４／ＥＤＧ−６、および１９９８年になってやっと特定されたＳ１Ｐ５／ＥＤＧ−８）。Ｓ１Ｐによって誘発される多数の反応では、異なるヘテロ三量体Ｇタンパク質（Ｇｑ−，Ｇｉ，Ｇ１２−１３）およびＲｈｏファミリの小さいＧＴＰアーゼと結合する。
【０００８】
成人においては、Ｓ１Ｐが血小板およびマスト細胞から放出されて、（Ｓ１ＰＲのＫｄを超えるのに十分な）自由Ｓ１Ｐの局在パルスが生成され、これにより、創傷治癒の促進および炎症反応への進行が可能となる。通常の条件下においては、血漿中のＳ１Ｐ合計量は相当高い（３００〜５００ｎＭ）が、ほとんどのＳ１Ｐは血清タンパク質（特に、リポタンパク質（例えば、ＨＤＬ＞ＬＤＬ＞ＶＬＤＬ）およびアルブミン）によって「バッファ」され得、このため、生物的に利用可能なＳ１Ｐ（またはＳ１Ｐの遊離画分）がＳ１ＰＲをはっきりと活性化させるのには不十分である。そうではない場合、不適切な血管形成および炎症が発生し得る。Ｓ１Ｐの細胞内活動についても提案がされている。
【０００９】
細胞表面にＳ１Ｐ受容体が広範に発現することにより、多様な細胞応答がＳ１Ｐによって影響を受ける（例えば、増殖、付着、収縮、運動性、形態形成、分化、および生存）。このような応答は、細胞および組織系内のＳ１Ｐ受容体の重複発現パターンまたは別個の発現パターンに依存して発生する。また、Ｓ１Ｐと成長因子（例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ））シグナル伝達経路との間のクロストークも繰り返し報告されている。Ｓ１Ｐを含む多様な細胞プロセスの調節は、例えば神経シグナル伝達、血管緊張、創傷治癒、免疫細胞トラフィッキング、再生、および心臓血管機能に特に影響を与える。これらの系内における内因性Ｓ１Ｐのレベルが変化した場合、有害な影響の原因となり得、その結果いくつかの病態生理学的状態が発生し得る（例えば、癌、炎症、血管形成、心臓病、ぜんそく、および自己免疫疾患）。
【００１０】
最近まで、スフィンゴ脂質を用いた治療戦略においては、スフィンゴ脂質代謝経路の主要酵素（例えば、ＳＰＨＫ）を主な標的としていた。図１を参照。より最近では、Ｓａｂｂａｄｉｎｉおよびその同僚により、Ｓ１Ｐに相関する多様な疾病および疾患（例えば、心臓血管疾病、脳血管疾病、眼球疾病、および多様な癌）の治療に対して新規なアプローチが開発された。このアプローチでは、Ｓ１Ｐに特異的な抗体によってまたはこの抗体と他の治療との組み合わせによって、生物学に利用可能なＳ１Ｐのレベルを低減する。脂質メディエーターＳ１Ｐとの干渉については従来は強調されていなかった。その主な理由として、この脂質標的を直接的に軽減することは困難である点がある。なぜならば、Ｓ１Ｐに対する抗体を開発し、検出することが特に困難であるからである。しかし、最近では、Ｓ１Ｐに特異的な抗体の生成の成功が報告されている。例えば、米国特許出願シリアル番号第１１／５８８，９７３号および公開ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／０５３４４７を参照されたい。このような抗体は、例えば血清からＳ１Ｐを選択的に吸収し、細胞外Ｓ１Ｐを中和する分子スポンジとして機能する。さらに、米国特許第６，８８１，５４６号および６，８５８，３８３号ならびに米国特許出願シリアル番号第１０／０２９，３７２号も参照。スフィンゴマブ（登録商標）は、Ｌｐａｔｈ，Ｉｎｃ．によって開発されたマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、上記特許または特許出願に記載されている。スフィンゴマブは、ヒト疾病モデルにおいて効果的であることが判明している。状況によっては、ヒトの治療目的のためにはマウス抗体よりもヒト化抗体が好適であり得る。これは、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応が発生し得るからである。このような反応により、結合活性の中和および／または身体内を循環している抗体の高速除去により、前記抗体の有効性が低下しうる。前記ＨＡＭＡ反応により、その後のマウス抗体投与において毒性も発生し得る。
【００１１】
ファーストインクラスヒト化抗Ｓ１Ｐ抗体（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ、ＬＴ１００９）が現在開発されている。例えば米国特許出願シリアル番号第１１／９２４，８９０号、第１２／２５８，３３７号、第１２／２５８，３４６号、第１２／２５８，３５３号、第１２／２５８，３５５号、第１２／２５８，３８３号、第１２／６９０，０３３号および第１２／７９４，６６８号を参照されたし。この抗体ならびにその誘導体および変異体は、Ｓ１Ｐへの結合効率と、Ｓ１Ｐの中和と、Ｓ１Ｐ関連疾病状態の調節とにおいて、マウスｍＡｂよりも有利である。しかも、ヒトに用いられた場合、マウスｍＡｂの不利な点が解消される。実際、ヒト化ＬＴ１００９抗体は、動物疾病モデル中では、親（マウス）抗体よりも高活性であり、癌および加齢性黄斑変性について現在臨床試験が行われている。
【００１２】
上記したＳｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（ＬＴ１００９）のヒト臨床研究において、Ｓ１Ｐの絶対濃度は投与量に応じて増加するが、生物的に利用可能なＳ１Ｐの量は投与量に応じて増加しないことがわかっている。
【００１３】
３．定義
本発明を詳述する前に、本発明の文脈において用いられる用語の定義について説明する。これらの用語に加えて、本明細書中の他の部分において他の用語を必要に応じて定義する。本明細書中他に明記無き限り、本明細書において用いられる用語は、当業者に通常用いられる意味を持つものとする。
【００１４】
「抗体」（「Ａｂ」）または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、免疫グロブリン遺伝子、またはそのフラグメントに由来し、それらをモデルとする、またはそれらによってコードされる、抗原またはエピトープと結合可能な、あらゆる形態のペプチド、ポリペプチドまたはこれらの断片を意味する。「抗体」という用語は、本明細書では最も広範な意味で使用され、モノクローナル、ポリクローナル、多重特異性抗体、ミニ抗体、ヘテロコンジュゲート、二重特異性抗体、三重特異性抗体、キメラ抗体、合成抗体、抗体フラグメント、親抗体または抗体誘導体の相補性結合領域（ＣＤＲ）を利用した抗原に結合可能な結合剤を包含する。抗体は、本明細書において、親抗体の望ましい活性を少なくとも１つ保持するものとして定義される。望ましい活性には、抗原に特異的に結合する能力、インビトロで増殖を抑制する能力、インビボで血管形成を抑制する能力、ならびにインビトロでサイトカインプロフィールを変化させる能力が含まれ得る。
【００１５】
「抗体誘導体」は、免疫誘導部分、すなわち、抗体（例えば、任意の抗体（Ａｂ）または免疫グロブリン（Ｉｇ））由来の分子である。「抗体誘導体」とは、免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントに由来する、それらをモデルとする、またはそれらによってコードされる、抗原またはエピトープと結合可能な、あらゆる形態のペプチド、ポリペプチドまたはこれらの断片を意味する。「抗体誘導体」とは、例えば、抗体変異体、抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、多価抗体、抗体コンジュゲートなどを指し、抗原に対して所望のレベルの結合活性を保持する。
【００１６】
本明細書で用いられる「抗体フラグメント」とは、抗原結合部位またはインタクト（無傷）な抗体の可変領域を含む完全抗体の一部分を意味し、この部分は、完全抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）を含まなくてよい。あるいは、定常重鎖ドメイン（例えばＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）の部分が、「抗体フラグメント」に含まれていてもよい。抗体フラグメントは抗原結合能力を保有し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体、三重特異性抗体、単鎖抗体分子（Ｓｃ−Ｆｖ）、抗体フラグメントから形成されるミニ抗体、ナノ抗体、多重特異性抗体を含む。抗体をパパイン消化すると、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一な抗原結合フラグメントと、その名が示すように容易に結晶化する能力を有する１つの残「Ｆｃ」フラグメントとが生成される。そして、各Ｆａｂフラグメントは、１つの抗原結合部位を有する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋する能力を有する、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生する。一例として、Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含んでいる。「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最も小さな抗体フラグメントである。この領域は、堅固に非共有結合する１本の重鎖と１本の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用するこの立体構造によって、ＶＨ−ＶＬ二量体表面の抗原結合部位が決定される。つまり、６つの超可変領域が、抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、たった１つの可変ドメイン（つまり、抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりは親和性は低いものの、抗原を認識しかつ結合する能力を有する。「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、一本のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨとＶＬドメイン間に１つのポリペプチドリンカーを含み、これによってｓＦｖは、抗原結合のために望ましい構造を形成できる。
【００１７】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含むいくつかの残基が付加されている点がＦａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を含むＦａｂ’の呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元来、ヒンジシステインを間に有する１対のＦａｂ’フラグメントとして生成された。抗体フラグメントのその他の化学結合も知られている。
【００１８】
「抗体変異体」は、本明細書では、抗体配列中の１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換によって、自然または親抗体のアミノ酸配列とアミノ酸配列が異なるが、親抗体の所望する活性を少なくとも１つ保持する分子を意味する。望ましい活性には、抗原に特異的に結合する能力、インビトロで増殖を抑制する能力、インビボで血管形成を抑制する能力、ならびにインビトロでサイトカインプロフィールを変える能力が含まれ得る。抗体変異体におけるアミノ酸の変化は、軽鎖および／または重鎖の可変領域または定常領域内で、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびヒンジ領域を含み得る。
【００１９】
「抗Ｓ１Ｐ剤」とは、Ｓ１Ｐに結合し、かつ、抗体、抗体変異体、抗体由来の分子またはＬＰＡまたはその改変体に結合する非抗体由来の物質を含む任意の治療薬を指す。
【００２０】
「抗Ｓ１Ｐ抗体」または「Ｓ１Ｐに反応する免疫誘導部分」とは、Ｓ１Ｐに結合する任意の抗体または抗体由来の分子を指す。これらの定義から理解されるように、抗体または免疫誘導部分は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、多様な手段を通じて生成され得、かつ／または動物（ヒト被験者を含む）から単離され得る。
【００２１】
「生物活性脂質」とは、脂質シグナル伝達分子を指す。生物活性脂質は、細胞外および／または細胞内シグナル伝達を媒介する点において構造脂質（例えば、膜結合型リン脂質）からは区別され、そのため、分化、移動、増殖、分泌、生存および他の細胞プロセスを調節することにより多くの種類の細胞の機能の制御に関与している。インビボにおいて、細胞外液中にみられる生物活性脂質は、他の分子（例えば、血清タンパク質（例えばアルブミンおよびリポタンパク質））と複合体を形成しているか、または「遊離」形態（すなわち、別の分子種と複合体を形成していない）であり得る。細胞外メディエーターとして、いくつかの生物活性脂質は、膜結合型イオンチャネルまたはＧＰＣＲまたは酵素または因子を活性化させ、その結果、細胞の機能または生存に変化をもたらす複雑なシグナル伝達系を活性化させることにより、細胞のシグナル伝達を変更する。細胞内メディエータとして、生物活性脂質は、細胞内成分（例えば、酵素、イオンチャネルまたは構造エレメント（例えば、アクチン））と直接相互作用することにより、作用を及ぼし得る。本発明の生物活性脂質のクラスから具体的に除外されるものとして、主に細胞膜の内葉および／または外葉の構造材として機能するホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリン、その代謝産物および誘導体がある。
【００２２】
抗体または抗体フラグメントまたは変異体の文脈における「生物学的に活性」とは、所望のエピトープと結合することができ、かつ、何らかの方法で生物学的作用を発揮し得る抗体または抗体フラグメントまたは抗体変異体を指す。生物学的効果を非限定的に挙げると、成長シグナルの調節、抗アポトーシスシグナルの調節、アポトーシスシグナルの調節、エフェクター機能カスケードの調節および他のリガンド相互作用の調節がある。
【００２３】
「バイオマーカー」は、疾病の進行または治療の効果を測定する際に有用な特定の分子的特徴を有する体内の特定の生化学物質である。例えば、Ｓ１Ｐは、特定の過剰増殖性状態および／または心血管状態に対するバイオマーカーである。
【００２４】
「心臓治療薬」とは、心臓または心筋疾病または疾患、またはこれらに起因するまたは相関する疾病または疾患を治療するための薬剤を指す。
【００２５】
「心血管治療」とは、心臓治療（心筋虚血および／または心不全の治療）ならびに心臓血管系に関連する他の疾病（例えば、心臓病）の予防および／または治療を包含する。「心臓病」という用語は、心臓組織または心筋組織に関連する任意の種類の疾病、疾患、外傷または外科的処置を包含する。特に対象となるものとして、組織リモデリングに関連する状態がある。「心臓治療薬」という用語は、心臓および心筋の疾病および疾患に起因するかまたは関連する疾病および疾患の治療に用いられる薬剤を指す。
【００２６】
「担体」とは、ハプテンへのコンジュゲーションによりハプテンを免疫原性とするよう適合された物質を指す。代表的なクラスの担体を非限定的に挙げるとタンパク質があり、その例を挙げると、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ヘマグルタニン、破傷風、およびジフテリアトキソイドがある。本発明に基づいた使用に適した担体の他のクラスおよび例が当該分野において公知である。上記の天然担体または合成担体ならびに今後発見されるかまたは発明される天然担体または合成担体を、本発明に従った用途に適合させることができる。
【００２７】
「脳血管治療」とは、脳虚血および／または低酸素症に関連する疾患および障害の予防および／または治療に向けられる療法を指す。特に注目されるものとして、限定されるものではないが、心不全を含む心臓病に起因する全虚血から起こる脳虚血および／または低酸素症がある。
【００２８】
「化学療法薬」とは、抗癌剤および他の抗過剰増殖剤を意味する。そのため、化学療法薬は、一般的に治療薬の一部である。化学療法薬の例を非限定的に挙げると、ＤＮＡ傷害薬およびＤＮＡ合成を阻害する薬剤：［アントラサイクリン（ドキソルビシン、ドノルビシン、エピルビシン））、アルキル化剤（ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、イフォスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパ、およびトリエチレンメラミン）、白金誘導体（シスプラチン、カルボプラチン、シスジアミン―ジクロロ白金）、およびトポイソメラーゼ阻害剤（カンプトサー）、抗代謝産物（例えば、カペシタビン、クロロデオキシアデノシン、シタラビン（およびその活性化形態、ａｒａ―ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、デカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、５―フルオロウラシル、５―ＤＦＵＲ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、６―メルカプトプリン、メトトレキサート、ペントスタチン、トリメトレキサート、６―チオグアニン）］、抗脈管形成剤：［ベバシズマブ、サリドマイド、サニチニブ、レナリドミド、ＴＮＰ−４７０、２―メトキシエストラジオール、ラニビズマブ、ソラフェニブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、ペガプタニブ、エンドスタチン］、血管障害剤：［フラボノイド／フラボン、ＤＭＸＡＡ、コンブレタスタチン誘導体（例えば、ＣＡ４ＤＰ、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２Ａなど）］、抗体などのバイオロジックス：［ヘルセプチン、アバスチン、パノレックス、リツキシン、ゼバリン、マイロターグ、キャンパス、ベキサール、エルビタックス］、内分泌療法：［アロマターゼ阻害剤（４―ヒドロアンドロステンジオン、エキセメスタン、アミノグルテヒミド、アナストラゾール、レトゾール）、抗エストロゲン作用薬（タモキシフェン、トレミフィン、ラオキシフェン、ファスロデックス）、ステロイド（例えば、デキサメタゾン）］、免疫調節剤：［サイトカイン（例えば、ＩＦＮ―βおよびＩＬ２）、インテグリン、他の接着タンパク質およびマトリックスメタロプロテイナーゼに対する阻害剤］、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤：［例えば、スベロイルアニリドヒドロキサム酸］、シグナル伝達阻害剤：［例えば、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ））］、熱ショックタンパク質阻害剤：［例えば、１７―Ｎ―アリルアミノ―１７―デメトキシゲルダナマイシン］、レチノイド：［例えば、全てのトランスレチノイン酸］、増殖因子受容体または増殖因子そのものの阻害剤、抗有糸分裂化合物および／またはチューブリン脱重合薬：［例えば、タキソイド（パクリタキセル、ドセタキセル、タキソテール、ＢＡＹ５９―８８６２）、ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン］、抗炎症薬：［例えば、ＣＯＸ阻害剤および細胞周期レギュレーター（例えば、チェックポイントレギュレーターおよびテロメラーゼ阻害剤）］がある。
【００２９】
「キメラ」抗体（または免疫グロブリン）という用語は、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であるが、その鎖の残りの部分は別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である重鎖および／または軽鎖を含む分子、ならびに所望の生物活性を示す限り、このような抗体のフラグメントを指す（Ｃａｂｉｌｌｙら、ｉｎｆｒａ；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．８１：６８５１（１９８４））。
【００３０】
「併用治療」とは、意図した治療効果を得るために少なくとも２つの異なる療法を提供することを含む治療計画を指す。例えば、併用治療は、２種類以上の化学的に異なる有効成分（例えば、速効型化学療法薬および抗Ｓ１Ｐ抗体あるいは２つの異なる抗体）の投与を含み得る。また、本発明の文脈においては、併用治療は、抗Ｓ１Ｐ抗体、およびスフィンゴ脂質の代謝を調節する（例えばＳＰＨＫのような酵素を阻害する）化学的に異なる第２の有効成分を投与することを含み得る。あるいは、併用治療は、他の処置（例えば、放射線療法および／または外科術）の展開を伴い得る。さらに、併用治療は、１つ以上の他の生物薬剤（例えば、抗ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦまたはｂＦＧＦ剤）、化学療法薬ならびに他の薬剤の投与を伴い得る。２つ以上の化学的に異なる活性成分を用いた併用療法については、これらの有効成分は同じ組成物の一部として投与することもできるし、あるいは異なる組成物として投与することもできることが理解される。別個の組成物として投与する場合、異なる有効成分を含む組成物を、同時または異なる時間に、同じまたは異なる経路で、同じまたは異なる投与計画を用いて投与することができる（全て、特定の背景に応じ、また、担当医の判断に従う）。同様に、併用療法に用いられる薬剤は、外科術または放射線処置の前または後に投与することができる。
【００３１】
「有効濃度」とは、例えば特定の望ましくない生物活性脂質の絶対的、相対的および／または利用可能な濃度および／または活性を指す。換言すれば、生物活性脂質の有効濃度は、その生物学的機能を行うために利用可能かつ必要な脂質の量である。本発明において、免疫誘導部分（例えば、Ｓ１Ｐに向けられたモノクローナル抗体）は、Ｓ１Ｐに結合しそして当該Ｓ１Ｐがその生物学的機能を行うことができなくなるようにすることにより、Ｓ１Ｐの有効濃度を低減することができる。この例において、脂質そのものは未だ存在している（すなわち、脂質は抗体によって分解するのではない）が、当該脂質はその受容体または他の標的と結合する能力はもはや無く、これにより下流効果の発生が防止される。生物試料（例えば全血、血漿、または血清）中のＳ１Ｐの絶対濃度および有効濃度を直接的にかつ／または間接的に測定するための適切な方法およびアッセイが存在している。さらに、患者中または患者から得られた試料中のＳ１Ｐの絶対濃度および有効濃度を直接的にかつ／または間接的に測定するための適切な方法およびアッセイは、今後も開発されるであろう。
【００３２】
「完全ヒト抗体」とは、遺伝子操作が施された（すなわち、トランスジェニックの）マウス（例えば、Ｍｅｄａｒｅｘからのもの）内において産生された抗体を指し得、このような抗体は、免疫原と共に存在すると、必ずしもＣＤＲグラフトを必要としないヒト抗体が産生され得る。これらの抗体は、動物（例えば、マウス）からの完全ヒト（１００％のヒトタンパク質配列）であり、これらの抗体において、非ヒト抗体遺伝子は抑制され、ヒト抗体遺伝子発現と置換される。出願人の考えによれば、関連ＣＤＲのためのヒトフレームワークを産生し得るこれらの遺伝子操作が施されたマウスまたは他の動物に生物活性脂質を付与した場合、生物活性脂質に対して抗体が産生され得る。
【００３３】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体とは、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。あるいは、別の見方をすれば、ヒト化抗体とは、ヒト配列の代わりに非ヒト（例えば、マウス）抗体からの選択された配列を含むヒト抗体である。ヒト化抗体は、その結合活性および／または生物活性を有意に変化させない、保存的アミノ酸置換、または同じ種または異なる種に由来する非天然残基を含み得る。このような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、ほとんどの部分では、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特性を有するマウス、ラット、ラクダ、ウシ、ヤギまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置換されている。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基に置換される。
【００３４】
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体または移入されるＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含むこともできる。これらの改変は、抗体の性能をさらに精密にし、最大限とするために行われる。そのため、一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つのそして一局面において２つの可変ドメインの全てを含み、この可変ドメインでは、全部または高頻度可変性ループの全てが非ヒト免疫グロブリンのものであり、全てのまたは実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）のうち少なくとも一部またはヒト免疫グロブリンのＦｃのうち少なくとも一部を含む。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号、Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号、Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４Ｂ１号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ８６／０１５３３、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号、Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号、Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号、Ｐａｄｌａｎら、欧州特許出願第０，５１９，５９６Ａ１号、Ｑｕｅｅｎら（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、ｖｏｌ．８６：１００２９〜１００３３を参照。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２〜５２５（１９８６）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３〜３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ。Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）およびＨａｎｓｅｎ、ＷＯ２００６１０５０６２を参照。
【００３５】
「過剰増殖性疾患」とは、制御不可能な細胞増殖に関連する疾患および障害（その例を非限定的に挙げると、癌または良性腫瘍の原因となる器官および組織の細胞の制御されない増殖を含む）を指す。内皮細胞に関連する過剰増殖性障害は、血管腫、子宮内膜症、肥満、加齢性黄斑変性および種々の網膜症などの脈管形成の疾患、ならびにアテローム性動脈硬化症の処置におけるステント留置の結果として再狭窄を引き起こす内皮細胞および平滑筋細胞の増殖などを含む。繊維芽細胞を含む過剰増殖性障害（例えば、繊維形成）を非限定的に挙げると、過剰瘢痕化疾患（すなわち、線維症）（例えば、加齢性黄斑変性症、心筋梗塞に関連する心臓リモデリングおよび心不全）、過剰創傷治癒（例えば、外科術または外傷、ケロイド、および繊維性腫瘍およびステント留置の結果として通常発生するもの）がある。
【００３６】
「免疫誘導部分」とは、任意の抗体（Ａｂ）または免疫グロブリン（Ｉｇ）を含み、免疫グロブリン遺伝子に由来してまたは免疫グロブリン遺伝子に基づいてモデル化されたかまたは免疫グロブリン遺伝子によってコードされた任意の形態のペプチド、ポリペプチド、あるいは抗原またはエピトープに結合可能なこのようなペプチドまたはポリペプチドのフラグメントを指す（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｊａｎｅｗａｙ、Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｗａｌｐｏｒｔ、Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋｅｄ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）、ＧａｒｌａｎｄＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００１）を参照）。本発明において、抗原は、脂質分子（例えば、生物活性脂質分子）である。
【００３７】
「阻害」とは、特に生物学的現象の文脈において、低減、抑制または遅延を意味する。例えば、「腫瘍形成の阻害」をもたらす処置とは、腫瘍を全く形成しないこと、または無治療対照群の場合よりも腫瘍形成が遅いかまたは腫瘍数が少ないことを意味し得る。
【００３８】
本発明の文脈において、「液体組成物」とは、製造者からエンドユーザー（例えば、医師または看護士）へ供給される充填済みの最終形態において、固体とは対照的な液体または溶液であるものを指す。ここで、「固体」とは、液体または溶液でない組成物を指す。例えば、固体には、リオフィライゼーション、凍結乾燥、沈殿および類似の手法によって調製された乾燥組成物が含まれる。
【００３９】
本明細書中で用いられる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体または前記抗体の集合を指す。その集団に含まれる個々の抗体は、わずかな量で存在し得る自然発生突然変異の可能性があること以外は、本質的に同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位に向けられている。さらに、一般に異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられている。修飾詞「モノクローナル」は、その抗体をいずれかの特定の方法によって生産することが必要である旨を示すものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５））によって初めて記載されたハイブリドーマ法によって作製することができるか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製することができる。「モノクローナル抗体」はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４〜６２８（１９９１））およびＭａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９１））に記載されている技術または当該分野において公知の他の方法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。本明細書中、モノクローナル抗体は特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体の対応する配列と同一または相同であるが、その鎖の残りの部分は、別種に由来する、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属す抗体、ならびに所望の生物活性を示す限りは、そのような抗体のフラグメンの対応する配列と同一または相同であるキメラ抗体を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。
【００４０】
「単剤療法」とは、単回投与としての投与であれ、経時的に複数回の投与であれ、１種類の治療に有効な量の化合物の送達に基づく治療計画を指す。
【００４１】
「新生物」または「癌」とは、異常かつ制御不能な細胞成長を指す。「新生物」、すなわち腫瘍または癌とは、異常でり、制御されずかつ無秩序な細胞成長の増殖であり、一般に癌と呼ばれる。新生物は良性または悪性であり得る。破壊的な増殖、浸潤性および転移の特性を持つ新生物は、悪性または癌性である。浸潤性とは、一般に組織の境界を規定している基底膜を破り、周囲組織の浸潤または破壊による新生物の局部的拡散を指し、それによりしばしば身体の循環系に入り込む。転移とは、典型的には、リンパ管または血管による腫瘍細胞の伝播を指す。転移とはまた、漿液腔、またはくも膜下もしくは他の空間を通じた直接的拡大による腫瘍細胞の移動を指す。転移の過程を通じて、腫瘍細胞が身体の他の部位への移動し、最初出現部位から遠隔領域へと新生物が形成される。
【００４２】
本明細書中、「親」抗体とは、変異体の作製に用いられるアミノ酸配列によってコードされているものである。親抗体は、天然抗体であり得るか、または、変異体（例えば、キメラ抗体）であり得る。例えば、親抗体は、ヒト化またはヒト抗体であり得る。
【００４３】
本発明の「特許性のある」組成物、方法、装置、または製品とは、分析が実施される時点においてその内容が特許性に関する全ての法定要件を満たすことを意味する。例えば、新規性、非自明性などに関して、後の調査により、１以上のクレームが新規性、非自明性などを否定することになる１以上の実施形態を包含することが明らかになった場合、「特許性のある」実施形態に限定されるクレームは、当然ながら、具体的に特許性のない実施形態を排除する。また、本明細書に添付したクレームは、最も広い妥当な範囲を提供するとともに、それらの有効性を保持するものとして解釈される。さらに、特許性に関する１以上の法定要件が訂正されるか、あるいは、本願が特許として出願または発行される時点から１以上の添付クレームの妥当性が疑問視される時点までにおいて、特許性に関する特定の法定要件を満たすかどうかを評価するための基準が変化する場合には、クレームは、（１）それらの有効性を保持し、（２）その状況下において最も広い妥当な解釈を提供するものと解釈されるべきである。
【００４４】
「薬学上許容される塩」とは、本発明の薬剤および化合物の生物学的有効性および特性を保持し、かつ、生物学的にまたは他の点において不都合がない塩を指す。多くの場合、本発明の薬剤および化合物は、荷電基（例えば、荷電アミノ基および／またはカルボキシル基またはそれに類似する基）の存在に起因して、酸塩および／または塩基塩を形成することができる。薬学上許容される酸付加塩は、無機酸および有機酸から製造することができ、薬学上許容される塩基付加塩は、無機および有機塩基から製造することができる。薬学上許容される塩の総説に関しては、Ｂｅｒｇｅら（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．６６，１〜１９を参照されたし。
【００４５】
「複数（の）」とは、１を超えることを意味する。
【００４６】
「分離された」、「精製された」、「単離された」および同様の用語は、サンプルを収容する容器内に含まれるサンプルの１つ以上の成分が、容器内に存在する１つ以上のその他のサンプル成分の存在下で、物理的に除去されるかまたは希釈されるか、あるいはされたことを意味する。分離または精製ステップ中に除去または希釈され得るサンプル成分を挙げると、化学反応生成物、非反応化学物質、タンパク質、炭水化物、脂質、および非結合分子がある。
【００４７】
本明細書中、「種」は、多様な文脈で用いられる（例えば化学療法剤の特定の種）。それぞれの文脈において、この用語は、特定の文脈において言及される種類において化学的に区別できない分子集団を指す。
【００４８】
「特異的」または「特異性」とは、抗原−抗体の相互作用の文脈において、抗体とその標的エピトープとの間の選択的な非無作為相互作用を指す。ここで、「抗原」という用語は、抗体分子または他の免疫誘導部分により認識され、結合する分子を指す。抗体が結合する抗原の特異的部分は、「エピトープ」と呼ばれる。この相互作用は、これらの分子間の適切な化学的または分子的な相互作用を可能にする構造的、疎水性／親水性および／または静電気的な特性の存在に依存する。そのため、抗体は、その標的抗原のエピトープと「結合する」（または「特異的に結合する」）あるいはその標的抗原のエピトープ「に反応性がある」（または「特異的に反応性がある」）あるいは同等にその標的抗原のエピトープ「に対して反応性がある」（または「に対して特異的に反応性がある」）と一般的に言うことができる。抗体は、当技術分野で一般的に、抗体の抗原との結合に関して、抗原「に対して」または短く「に」と記載される。そのため、「Ｓ１Ｐに結合する抗体」、「Ｓ１Ｐに対して反応性がある抗体」、「Ｓ１Ｐに反応する抗体」、「Ｓ１Ｐに対する抗体」、および「抗Ｓ１Ｐ抗体」は全て、当該分野において同じ意味を有する。抗体分子の結合特異性についての試験は、所望の抗原に対する結合と、無関連の抗原または抗原類似体または抗原混合物に対する結合とを付与された一連の条件下において比較することにより、行うことができる。好適には、本発明による抗体は、無関連の抗原と、または標的抗原の類似体とさえ、有意な結合をしない。「特異的に会合する」および「特異的会合」などは、２つの分子間の特異的な非無作為の相互作用を指し、この相互作用は、分子間の適切な化学的または分子的相互作用を可能とする構造的、疎水的／親水的、および／または静電的特徴の存在に依存する。
【００４９】
本明細書中用いられる「スフィンゴ脂質」という用語は、当該分野においてスフィンゴ脂質として知られているクラスの化合物を指し、その例を非限定的に挙げると、以下の化合物がある（対応する化合物の化学式、構造等の情報については、ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｌｉｐｉｄｍａｐｓ．ｏｒｇを参照）。
スフィンゴイド塩基［ＳＰ０１］
スフィング―４―エニン（スフィンゴシン）［ＳＰ０１０１］
スフィンガニン［ＳＰ０１０２］
４−ヒドロキシスフィンガニン（フィトスフィンゴシン）［ＳＰ０１０３］
スフィンゴイド塩基ホモログおよび変異体［ＳＰ０１０４］
スフィンゴイド塩基１−リン酸［ＳＰ０１０５］
リゾスフィンゴミエリンおよびリゾグリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０１０６］
Ｎ―メチル化スフィンゴイド塩基［ＳＰ０１０７］
スフィンゴイド塩基アナログ［ＳＰ０１０８］
セラミド［ＳＰ０２］
Ｎ―アシルスフィンゴシン（セラミド）［ＳＰ０２０１］
Ｎ―アシルスフィンガニン（ジヒドロセラミド）［ＳＰ０２０２］
Ｎ―アシル―４−ヒドロキシスフィンガニン（フィトセラミド）［ＳＰ０２０３］
アシルセラミド［ＳＰ０２０４］
セラミド１−リン酸［ＳＰ０２０５］
ホスホスフィンゴ脂質［ＳＰ０３］
セラミドホスホコリン（スフィンゴミエリン）［ＳＰ０３０１］
セラミドホスホエタノールアミン［ＳＰ０３０２］
セラミドホスホイノシトール［ＳＰ０３０３］
ホスホノスフィンゴ脂質［ＳＰ０４］
中性グリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０５］
単純Ｇｌｃ系（ＧｌｃＣｅｒ、ＬａｃＣｅｒなど）［ＳＰ０５０１］
ＧａｌＮＡｃｂ１−３Ｇａｌａ１−４Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｇｌｏｂｏ系）［ＳＰ０５０２］
ＧａｌＮＡｃｂ１−４Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｇａｎｇｌｉｏ系）［ＳＰ０５０３］
Ｇａｌｂ１−３ＧｌｃＮＡｃｂ１−３Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｌａｃｔｏ系）［ＳＰ０５０４］
Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ１−３Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｎｅｏｌａｃｔｏ系）［ＳＰ０５０５］
ＧａｌＮＡｃｂ１−３Ｇａｌａ１−３Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃ−（ＩｓｏＧｌｏｂｏ系）［ＳＰ０５０６］
ＧｌｃＮＡｃｂ１−２Ｍａｎａ１−３Ｍａｎｂ１−４Ｇｌｃ−（Ｍｏｌｌｕ系）［ＳＰ０５０７］
ＧａｌＮＡｃｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ１−３Ｍａｎｂ１−４Ｇｌｃ−（Ａｒｔｈｒｏ系）［ＳＰ０５０８］
Ｇａｌ−（Ｇａｌａ系）［ＳＰ０５０９］
その他［ＳＰ０５１０］
酸性グリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０６］
ガングリオシド［ＳＰ０６０１］
スルホグリコスフィンゴ脂質（スルファチド）［ＳＰ０６０２］
グルクロノスフィンゴ脂質［ＳＰ０６０３］
ホスホグリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０６０４］
その他［ＳＰ０６００］
塩基性グリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０７］
両性グリコスフィンゴ脂質［ＳＰ０８］
砒素スフィンゴ脂質［ＳＰ０９］
【００５０】
「スフィンゴ脂質代謝経路」という用語には、図１に示す化合物および酵素だけでなく、自然発生する前駆体、代謝産物、ならびにこのような化合物のデノボ合成に関与する酵素も含む。
【００５１】
「被験者」または「患者」とは、本発明方法が効果をもたらすことのできる処置（治療）を必要とする動物を意味する。本発明に従って治療され得る動物は、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、特に好ましい例である霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）などの哺乳類が属する、脊椎動物を含む。
【００５２】
「治療薬」とは、治療効果を提供することを意図した薬物または化合物を意味する。
【００５３】
「治療有効量」（または「有効量」）とは、例えば、かかる治療を必要とする被験者に投与した際に治療効果をもたらすために十分な有効成分（例えば、本発明による薬剤）の量を意味する。したがって、何をもって本発明に従う組成物の治療有効量とするかは、当業者によって容易に決定され得る。癌治療との関連において、「治療有効量」とは、特定の癌と相関する１つ以上の遺伝子発現の増加または低下、腫瘍量の減少、癌細胞の溶解、生体試料（例えば、バイオプシー（生検）および全血、血漿、血清、尿などのような体液のアリコート）における１つ以上の癌細胞の細胞死マーカーの検出、アポトーシスまたはその他の細胞死経路の誘導を含む、癌細胞の生存または代謝に関連する１つ以上のパラメータの客観的に計測される変化を生じる量である。勿論、治療有効量は、個々の被験者とその病状、被験者の体重および年齢、疾患状態の重症度、選択された特定の化合物、従うべき投与計画、投与時期、投与方法などによって異なるが、これら全ては、当業者によって容易に決定され得る。併用療法との関連においては、何をもって特定の有効成分の治療有効量とするかは、単独療法（即ち、有効成分として１つの化学的実体のみを用いる治療法）として投与されるときの治療有効量とは異なる可能性がある。
【００５４】
本明細書で用いられる「治療」または「治療の」という用語には、疾患、障害または傷害の処置および／または予防を広範に含む。本発明の「治療」薬は、疾患または障害を予防または保護しうる。この予防または保護には、対象となる個人のリスク（薬理遺伝学的リスク）を同定することも含む。また、本発明の「治療」薬は、疾患または障害を、緩和または治癒しうる。また、本発明の「治療」薬は、臨床症状の進行を停止または遅延しうる。また、本発明の「治療」薬は、疾病、疾患または障害に関連した不快感、痛み、物理的な制約を、低減しうる、あるいはその頻度を低減しうる。また、本発明の「治療」薬は、他の治療、処置の補助剤として使用されうる。本明細書中用いられる「処置」または「処置する」という用語には、疾病または疾患に対するどのような対処も含みうる。例えば、「処置」または「処置する」には、疾病または疾患に対する予防または保護（即ち、医学的症状が発症しないようにすること）、疾患または障害を抑制すること（即ち、臨床症状の発現を停止、または遅延、または抑止すること）、および／または疾患または障害を緩和すること（即ち、臨床症状を退行させること）を含む。言うまでもなく、疾患または障害を「予防すること」と「抑止すること」を区別するのは、最終的に誘導されるイベントが未知であり潜在的である可能性があるため、いつでも可能であるとは限らない。「治療の必要がある」ものとは、既に障害を罹患しているもの、ならびに障害が予防されるべきものを含む。したがって、「予防法」という用語は、「予防すること」ならびに「抑止すること」の双方を包含するタイプの「治療」を意味する。したがって、「保護」という用語は「予防」を含む。
【００５５】
「治療法」という用語は、化学療法剤および細胞毒薬、放射線療法、外科手術、遺伝子療法、ＤＮＡワクチンとＤＮＡ療法、ｓｉＲＮＡ療法、抗血管新生療法、免疫療法、骨髄移植、アプタマーおよび生物製剤（例えば抗体と抗体変異体、レセプターデコイ、その他のタンパク質基剤）等を用いる、疾患または障害の治療全般を意味する。
【発明の概要】
【００５６】
本発明によって提供される特許性のある方法は、Ｓ１Ｐの有効濃度を低減するように、抗Ｓ１Ｐ抗体（または抗体フラグメント）を、さらには、スフィンゴ脂質代謝経路の酵素のモジュレータを患者に投与することを含む。このような方法を用いて、望ましくないＳ１Ｐレベルまたは活性と相関するかまたは望ましくないＳ１Ｐレベルまたは活性によって特徴つけられる疾病および疾患を持つことが判明しているかまたは疑われる患者を治療することができる。好適な実施形態において、前記抗Ｓ１Ｐ抗体はＬＴ１００９であり、前記モジュレータは、ＳＰＨＫ阻害剤である。このような方法を用いて、例えば、抗Ｓ１Ｐ抗体または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントを患者に投与することにより、Ｓ１Ｐの絶対濃度の増加を低減またはゼロにすることができる。
【００５７】
以下、本発明の上記の局面および他の局面ならびに実施形態について、より詳細に説明する。本発明の上記の局面および他の局面は、以下の詳細な説明、添付図面および特許請求の範囲からより明らかとなる。本発明の実施または試験の際、本明細書中に記載の方法および材料に類似または均等の方法および材料を用いることが可能であるが、好適な方法および材料について、以下に説明する。なお、以下の材料、方法および例はひとえに例示的なものであり、限定を意図していない。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
本出願は、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を含む本出願のコピーは求めに応じ、必要な料金を払えば提供される。各図面の簡単な要約を以下に示す。
【００５９】
【図１】スフィンゴ脂質代謝経路のダイアグラムである。
【００６０】
【図２】患者の血漿中のＳ１Ｐレベルを示す２つのプロットである。上のプロットは、ＬＴ１００９の第一相ヒト臨床試験に参加している患者において、（プロット隣の凡例に示すような）５つの異なる投与量それぞれにおける血漿のＳ１Ｐの合計濃度または絶対濃度を示す。下のプロットは、血漿中のＳ１Ｐの有効濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
本発明は、Ｓ１Ｐに対するヒト化モノクローナル抗体を用いて患者を治療することにより、患者の血液、血清および／または血漿中のＳ１Ｐの絶対レベルが投与量に依存した形態で増加する（ただし、生物的に利用可能な生物活性のある「遊離した」Ｓ１Ｐの量はそうではない）という驚くべき観察結果に基づく。抗Ｓ１Ｐ抗体または抗Ｓ１Ｐ抗体フラグメントの投与後に投与量に依存した絶対Ｓ１Ｐレベルの増加を低減または回避することが望ましい場合があるため、本発明による方法を用いれば、以下に詳述するように、Ｓ１Ｐレベルのその後の増加を回避または低減することが可能となる。
【００６２】
１．抗Ｓ１Ｐ抗体化合物
本発明による方法は、抗Ｓ１Ｐ剤（特に抗Ｓ１Ｐ抗体および抗体フラグメント）を含む組成と、スフィンゴ脂質代謝経路の酵素のモジュレータを含む組成との組み合わせを投与することを含み、これにより、異常なＳ１Ｐレベルと相関する疾病または疾患が判明しているかまたは疑われる患者中のＳ１Ｐの有効濃度を低減させる。
【００６３】
Ａ．抗体の調製
まず、抗Ｓ１Ｐ抗体および抗体フラグメントについて説明する。当該分野において既知のように、抗体分子（すなわち、免疫グロブリン）は、分子量がおよそ１５０ｋＤａの大きな糖タンパク質分子であり、通常は２つの重鎖ポリペプチドおよび２つの軽鎖ポリペプチドからなる。各重鎖（Ｈ）はおよそ５０ｋＤａである。各軽鎖（Ｌ）はおよそ２５ｋＤａである。各免疫グロブリン分子は通常、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる。これら２つの重鎖は、ジスルフィド結合によって相互に連結し、その数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各軽鎖は、１つの共有結合ジスルフィド結合により、重鎖に連結される。任意の所与の天然抗体分子において、２つの重鎖および２つの軽鎖は同一であり、２つの同一の抗原結合部位を有し、そのため、二価（すなわち、同一の分子２つに同時に結合する能力を有する）であるといわれる。
【００６４】
任意の脊椎動物種からの抗体分子の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なる種類であるカッパ（ｋ）およびラムダ（ｌ）のうちの１つに割り当てることができる。２種類の軽鎖の比は、種によって異なる。一例として、平均ｋ／ｌ比は、マウスの場合に２０：１であり、ヒトの場合に２：１であり、ウシの場合に１：２０である。
【００６５】
任意の脊椎動物種からの抗体分子の重鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、アイソタイプと呼ばれる５つの明瞭に異なる種類のいずれかを割り当てることができる。いくつかのアイソタイプは、数種のサブタイプを有する。５つの主要な免疫グロブリンクラスは、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、および免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）である。ＩｇＧは、最も多いアイソタイプであり、数種のサブクラス（ヒトでは、ＩｇＧ１、２、３および４）を有する。Ｆｃフラグメントおよびヒンジ領域は、異なるアイソタイプの抗体において異なり、その機能特性を決定づける。しかしながら、これらのドメインの全体的な構成は全てのアイソタイプにおいて類似している。
【００６６】
本発明の方法の実施に適した抗Ｓ１Ｐ抗体は、任意の適切な方法によって生成することができる。特に好適な抗体として、モノクローナル抗体がある（特に、「ヒト化」されたものまたは完全ヒト抗体とみなされるもの）。本発明では、組み換え技術を用いて生成された抗Ｓ１Ｐ抗体（または抗体フラグメント）が好適に用いられる。任意の適切な発現システムが利用可能であり、その後抗体が精製される。
【００６７】
抗Ｓ１Ｐ抗体をヒト化するには、非ヒト抗Ｓ１Ｐ抗体を先ず生成することが多い。例えば、マウス抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体ＬＴ１００２は以下の文献に記載のように生成された：米国特許出願シリアル番号第１１／９２４，８９０号、１２／２５８，３３７号、１２／２５８，３４６号、１２／２５８，３５３号、１２／２５８，３５５号、１２／２５８，３８３号、１２／６９０，０３３号、および１２／７９４，６６８号。
【００６８】
簡単に言うと、抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。まず、誘導体化Ｓ１Ｐを担体タンパク質と結合させる。その結果得られた免疫原を用いて、マウスを免疫化する。抗体力価が上昇し平衡になった後、Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により初めて記載されたハイブリドーマ法を用い、または組換えＤＮＡ法を含む他の好適な方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）を用いて、Ｓ１Ｐに対するモノクローナル抗体を生成する。抗Ｓ１Ｐ抗体を生成するマウスリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを形成する。その後、Ｓ１Ｐに対するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞成長培地をアッセイする。好適には、多様なモノクローナル抗体種の結合特異性は、免疫沈降またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））により、判定する。多様なモノクローナル抗体種の結合親和性が決定可能である。
【００６９】
所望の特異性、親和性および／または活性の抗Ｓ１Ｐ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定した後、クローンを制限希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９〜１０３（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、１９８６年））により、増殖させることができる。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、通常の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ―セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィー）により、培養培地、腹水または血清から適宜分離される。
【００７０】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、通常の手順（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用すること）により、容易に単離および配列決定される。単離後、免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を発現ベクター内に移入することができ、次にこれを、通常は免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞）へトランスフェクトする。その後、組み換え抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体の産生を行って、所望の量の抗体種を産生する。抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体ＬＴ１００２は、このような組み換え抗Ｓ１Ｐ抗体の生成の特に好適な例である。
【００７１】
抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体（例えば、ＬＴ１００２）を得た後、ヒト投与用に抗体をさらに最適化することができる。抗体のヒト化の一般的な方法については、例えば以下の文献に記載されている：ＵＳ５８６１１５５、ＵＳ１９９６０６５２５５８、ＵＳ６４７９２８４、ＵＳ２００００６６０１６９、ＵＳ６４０７２１３、ＵＳ１９９３０１４６２０６、ＵＳ６６３９０５５、ＵＳ２００００７０５６８６、ＵＳ６５００９３１、ＵＳ１９９５０４３５５１６、ＵＳ５５３０１０１、ＵＳ５５８５０８９、ＵＳ１９９５０４７７７２８、ＵＳ５６９３７６１、ＵＳ１９９５０４７４０４０、ＵＳ５６９３７６２、ＵＳ１９９５０４８７２００、ＵＳ６１８０３７０、ＵＳ１９９５０４８４５３７、ＵＳ２００３２２９２０８、ＵＳ２００３０３８９１５５、ＵＳ５７１４３５０、ＵＳ１９９５０３７２２６２、ＵＳ６３５０８６１、ＵＳ１９９７０８６２８７１、ＵＳ５７７７０８５、ＵＳ１９９５０４５８５１６、ＵＳ５８３４５９７、ＵＳ１９９６０６５６５８６、ＵＳ５８８２６４４、ＵＳ１９９６０６２１７５１、ＵＳ５９３２４４８、ＵＳ１９９１０８０１７９８、ＵＳ６０１３２５６、ＵＳ１９９７０９３４８４１、ＵＳ６１２９９１４、ＵＳ１９９５０３９７４１１、ＵＳ６２１０６７１、ＵＳ６３２９５１１、ＵＳ１９９９０４５０５２０、ＵＳ２００３１６６８７１、ＵＳ２００２００７８７５７、ＵＳ５２２５５３９、ＵＳ１９９１０７８２７１７、ＵＳ６５４８６４０、ＵＳ１９９５０４５２４６２、ＵＳ５６２４８２１、およびＵＳ１９９５０４７９７５２。多様なヒト化抗Ｓ１Ｐ抗体（例えば、ＬＴ１００９）を生成するための方法について、米国特許出願シリアル番号第１１／９２４，８９０、１２／２５８，３３７、１２／２５８，３４６、１２／２５８，３５３、１２／２５８，３５５、１２／２５８，３８３、１２／６９０，０３３、および１２／７９４，６６８に記載がある。
【００７２】
ヒト化のほかに選択可能な方法として、ヒト抗Ｓ１Ｐ抗体も生成できる。例えば、今では、免疫されると、内在性免疫グロブリンを産生することなく、ヒト抗体の完全なレパートリーを生じることができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作成することが可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系突然変異マウスにおける抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子の同形接合性が欠如すると、内在性の抗体産生の完全な阻害が発生することが、記載されている。このような生殖細胞系突然変異マウスにおいてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを移入すると、抗原投与時にヒト抗体の産生が起こる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、ＹｅａｒｉｎＩｍｍｕｎｏ．、７：３３（１９９３）；および米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号および第５，５４５，８０７号を参照されたい。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーに由来してもよい（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）；および米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号）。上述のように、ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化されたＢ細胞（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照）または他の好適な方法によっても、作製可能である。
【００７３】
特定の実施形態において、前記抗Ｓ１Ｐ抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントの作製のために、多様な技術が開発されている。従来、これらのフラグメントは、完全抗体のタンパク質加水分解性消化によって得られてきた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ２４：１０７−１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：８１（１９８５）を参照）。しかし、これらのフラグメントは、今や、組換え宿主細胞によって直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ'−ＳＨフラグメントは大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ（ａｂ'）２フラグメントを形成させることができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３−１６７（１９９２））。別の実施形態において、Ｆ（ａｂ'）２は、Ｆ（ａｂ'）２分子のアセンブリを促進するように、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。別のアプローチによれば、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２フラグメントは、組換え宿主細胞培地から直接単離することができる。抗体フラグメントの生産のための他の技術が、当業者にとって明らかである。
【００７４】
いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する多重特異性（例えば、二重特異性）ヒト化または変異体抗Ｓ１Ｐ抗体を作製することが望ましい場合がある。例示的な二重特異性抗体は、スフィンゴ脂質の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ'）２二重特異性抗体）として、作製することができる。
【００７５】
また、二価を超える抗体も意図される。例えば、三重特異性抗体が作製可能である。Ｔｕｔｔｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。１アームにつき１以上の結合部位を含む抗Ｓ１Ｐ抗体またはそのフラグメントは、本明細書において「多価」抗体と呼ばれる。例えば、本発明の「二価」抗体は、Ｆａｂまたはそのフラグメント当たり２つの結合部位を含み、本発明の「三価」ポリペプチドはＦａｂまたはそのフラグメントにつき３つの結合部位を含む。本発明の多価ポリマーにおいて、Ｆａｂ当たり２以上の結合部位は、同じまたは異なる抗原と結合する可能性がある。例えば、本発明の多価ポリペプチドにおける２以上の結合部位は、同じ抗原、例えば、該抗原の同じ部分もしくはエピトープ、または該抗原の２以上の同じもしくは異なる部分もしくはエピトープに向けられてもよく、かつ／または異なる抗原に向けられてもよく、あるいはそれらの組合せであってもよい。よって、例えば本発明の二価ポリペプチドは２つの同じ結合部位を含んでもよく、抗原の第一の部分もしくはエピトープに向けられた第一の結合部位と、該抗原の同じ部分もしくはエピトープに、または該抗原の別部分もしくはエピトープに向けられた第二の結合部位を含んでなり得るか、あるいは抗原の第一の部分もしくはエピトープに向けられた第一の結合部位と、異なる抗原に向けられた第二の結合部位を含み得る。しかしながら、以上の記載から明らかなように、本発明の多価ポリペプチドが同じまたは異なる抗原に向けられるいずれかの数の結合部位を含み得るという点で、本発明は上記に限定されない。
【００７６】
抗Ｓ１Ｐ抗体のその他の修飾が利用可能である。例えば、本発明はまた、トキシン（例えば、細菌、真菌、植物、動物由来の酵素活性を有するトキシン、またはそれらのフラグメント）のような細胞毒剤、あるいは放射性同位元素（例えば、放射性コンジュゲート）にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体を含む免疫コンジュゲートに関連する。コンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（ジメチルアジプイミダート塩酸塩など）、活性エステル類（ジスクシイミジルスベリン酸塩など）、アルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−アゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアン酸塩（トリエン２，６−ジイソシアナートなど）、ビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）のような様々な二機能性タンパク質カップリング剤を用いて作成される。
【００７７】
例えば、標的組織および細胞への浸透性を増強するために、完全抗体ではなく抗体フラグメントを用いる方が望ましい場合がある。この場合、その血清半減期を延長するために、抗体フラグメントを修飾することが望ましい場合がある。これは、例えば、抗体フラグメントへのサルベージ受容体結合エピトープの組み込みにより（例えば、抗体フラグメントの適当な領域の突然変異によるか、または（例えば合成ＤＮＡまたはペプチドによる）ペプチドタグにエピトープを組み込んだ後にいずれかの末端または中間部において抗体フラグメントと融合させことにより）、達成可能である（例えば、米国特許第６，０９６，８７１号参照）。
【００７８】
前記抗Ｓ１Ｐ抗体（またはそのフラグメント）の共有結合修飾も、本発明の範囲内に含まれる。前記抗Ｓ１Ｐ抗体（またはそのフラグメント）の共有結合修飾は、適用可能であれば、化学合成によりまたは抗体の酵素的または化学的切断により、作製され得る。前記抗体（またはそのフラグメント）の他のタイプの共有結合的修飾は、抗体の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることにより、分子に導入される。ポリペプチドの共有結合的修飾の例は、米国特許第５，５３４，６１５号に記載されており、本明細書中、同文献を参考のため特に援用する。好適な種類の抗体の共有結合修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に示される方法により、多様な非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）のうちの１つに抗体を結合させることを含む。
【００７９】
Ｂ．医薬製剤
抗Ｓ１Ｐ抗体（または抗体フラグメント）の治療製剤は、所望の純度を有する抗体と任意の生理学上許容される担体、賦形剤または安定化剤（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）を参照）を、凍結乾燥製剤または水溶液の形で混合することにより、保存向けに調製される。許容される担体、賦形剤または安定化剤は用いる用量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸およびその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００８０】
本明細書の製剤はまた、処置される特定の処方の必要に応じて１を超える有効化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補足的活性を有するものを含んでもよい。このような分子は、意図した目的に効果的な量の組合せで適切に存在する。
【００８１】
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によるか、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、それぞれ例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルションとして捕捉してもよい。このような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【００８２】
インビボ投与に用いる製剤は無菌でなければならない。これは、例えば無菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
【００８３】
徐放性製剤が調製され得る。徐放性製剤の好適な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの成型品の形である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬｕｐｒｏｎＤｅｐｏｔ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日以上分子の放出が可能であるが、ある特定のヒドロゲルはより短い期間だけタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間留まる場合、それらは３７℃で水分に曝される結果として変性または凝集する場合があり、その結果、生物活性の低下および免疫原性の変化を招く可能性がある。関与する機構に応じて安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互作用を介した分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが見出されれば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥させること、水分含量を制御すること、適当な添加剤を使用すること、および特殊なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成することができる。
【００８４】
本発明において用いられる抗体の全身投与の好適な製剤について、米国特許出願シリアル番号第１２／４１８，５９７号中に開示がある。上記および他の抗Ｓ１Ｐ抗体製剤は、多様な用途において有用である（例えば、疾病、疾患または外傷の治療）。本発明の１つ以上のヒト化抗スフィンゴ脂質抗体を含む医薬組成物は、このような治療のためのキットおよび医療デバイスに取り入れることができる。医療デバイスを用いて、必要としている患者に対して本発明の医薬組成物を投与することができ、本発明の一実施形態によれば、このようなデバイスを含むようにキットが提供される。このようなデバイスおよびキットは、本発明の医薬組成物の日常投与（例えば、自己投与）用に設計され得る。このようなデバイスおよびキットはまた、緊急用途（例えば、救急車または救急治療室、または外科手術用、または負傷の可能性があるが万全な医学治療を迅速に得ることが不可能な場所における活動（例えば、ハイキングおよびキャンピング、または戦闘状態））用に設計することもできる。
【００８５】
２．スフィンゴ脂質代謝経路阻害剤
Ｓ１Ｐ産生を低減するために、スフィンゴ脂質代謝経路（図１）の１つ以上の酵素の阻害剤を抗Ｓ１Ｐ抗体または抗体フラグメントと組み合わせて投与する。簡単に言うと、デノボスフィンゴ脂質合成は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼによる３−ケト−ジヒドロスフィンゴシンの合成から始まる。その後、これが還元されて、ジヒドロスフィンゴシンが形成される。ジヒドロスフィンゴシンは、（ジヒドロ）−セラミド合成酵素（ＣｅｒＳまたはＣＳとも呼ぶ）によってアシル化されて、ジヒドロセラミドが形成される。これが不飽和化されて、セラミドが形成される。その後、セラミドがセラミドキナーゼによってリン酸化されて、セラミド−１−リン酸が形成される。あるいは、グリコシルセラミドシンターゼまたはガラクトシルセラミドシンターゼによって、セラミドがグリコシル化される場合もある。さらに、スフィンゴミエリンシンターゼによるホスホリルコリン頭部の付加により、セラミドがスフィンゴミエリンに変換される。最後に、セラミドは、セラミダーゼの基質として機能してスフィンゴシンを形成することもできる。前記スフィンゴシンをスフィンゴシンキナーゼがリン酸化することにより、Ｓ１Ｐが形成される。Ｓ１Ｐを脱リン酸化することにより、スフィンゴシンが再形成されうる。
【００８６】
サルベージ経路により、これらの代謝産物がセラミドに復帰されうる。例えば、複雑なグリコスフィンゴ脂質が加水分解されることにより、グリコシルセラミドおよびガラクトシルセラミドとなる。その後、グリコシルセラミドおよびガラクトシルセラミドがベータグルコシダーゼおよびベータガラクトシダーゼによって加水分解され、セラミドが再生されうる。同様に、スフィンゴミエリンはスフィンゴミエリナーゼによって分解されてセラミドを形成することができる。スフィンゴ脂質はスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼによって、非スフィンゴ脂質へと変換されうる。スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼは、エタノールアミンフォスフェイトおよびヘキサデセナールの形成を触媒する。
【００８７】
上述したように、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）は、スフィンゴ脂質代謝経路中の酵素であり、スフィンゴシンからスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）へのリン酸化を触媒する。２つのＳＰＨＫアイソフォーム（ＳＰＨＫ１およびＳＰＨＫ２）が報告されており、それぞれ別個の機能を示す。ＳＰＨＫ１は、細胞成長および生存を促進させる。その発現は、癌（例えば、白血病）においてアップレギュレートされ、癌進行と関連付けられる。一方、ＳＰＨＫ２が過剰発現した場合、反対の結果となる。
【００８８】
ＳＰＨＫ１は主要酵素であり、Ｓ１Ｐ／セラミドレオスタットを調節する。Ｓ１ＰおよびＳＰＨＫ１は、白血病細胞および白血病細胞株双方において、一般的に用いられる細胞毒性薬に起因するアポトーシスに対する耐性と関連することが報告されている。Ｓ１Ｐの前駆体であるスフィンゴシンおよびセラミドは成長停止およびアポトーシス誘発と関連付けられ、Ｓ１Ｐは、癌進行（例えば、細胞成長および生存）において多数の重要なプロセスを調節する。よって、これらの相互交換型スフィンゴ脂質代謝産物間のバランスは、細胞運命を決定する細胞レオスタットとしてみなされている。
【００８９】
スフィンゴシンキナーゼ阻害剤２（ＳＰＨＫＩ２；４−［［４−（４−クロロフェニル）−２−チアゾリル］アミノ］−フェノール；ＣＡＳｎｏ．３１２６３６−１６−１；分子式：Ｃ１５Ｈ１１ＣｌＮ２ＯＳ；分子量：３０２．８；米国特許出願シリアル番号第１０／４６２，９５４号、公開番号第２００４００３４０７５Ａ１）は、抗増殖活性を備えたＳＰＨＫ１の効果的な選択的阻害剤である（Ｆｒｅｎｃｈら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．６３：５９６２−５９６９）。ＳＰＨＫＩ２は、０．５μＭのＩＣ５０で、ヒト組み換えＧＳＴ−ＳＰＨＫ１の非ＡＴＰ拮抗阻害を示すことが報告されており、６０μＭまでの濃度でＥＲＫ２、ＰＩ３−キナーゼまたはＰＫＣαに対する阻害は無い。ＳＰＨＫＩ２もまた、いくつかのヒト癌細胞株（Ｔ−２４、ＭＣＦ−７、ＮＣＩ／ＡＤＲ、およびＭＣＦ−７／ＶＰ）の増殖を阻害することが報告されており、そのＩＣ５０値は、低μＭの範囲内（０．９〜４．６μＭ）である（Ｆｒｅｎｃｈら、上記参照）。
【００９０】
Ｐａｕｇｈら（（２００８）Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１１２、ｎｏ．４：１３８２−１３９１；米国特許出願シリアル番号第１２／３８７，２２８号、公開番号第２０１０００３５９５９Ａ１）により、スフィンゴシン類似体である（２Ｒ、３Ｓ、４Ｅ）−Ｎ−メチル−５−（４’−ペンチルフェニル）−２−アミノペント−４−エン−１、３−ジオール（ＳＫ１−Ｉ（ＢＭＬ−２５８））が、水溶性で、かつ（Ｓ１Ｐレベルの低減だけでなく、プロアポトーシス前駆体であるセラミドのレベルの増加も可能にする）ＳＰＨＫ１のアイソザイムに特異的で、かつ有力な阻害剤として同定されている。報告によれば、ＳＫ１−Ｉは、ＳＰＨＫ２、ＰＫＣまたは多数の他のタンパク質キナーゼを阻害しない。また、ヒト白血病Ｕ９３７およびＪｕｒｋａｔ細胞の成長および生存の低減と、Ｂｃｌ−２の切断およびアポトーシスの向上を可能にすることも報告されている。さらに、ＳＫ１−Ｉは、健常な末梢血単核白血球を許容しつつ、急性骨髄性白血病患者から単離された白血病芽細胞中のアポトーシスを有効に発生させることが報告されている。また、ＡＭＬ異種移植腫瘍の成長も大幅に低下させることが報告されている（Ｐａｕｇｈら、上記参照）。
【００９１】
ＦＴＹ７２０（フィンゴリモド；２−アミノ−２［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１、３−ジオール塩酸塩（例えば、米国特許第６，００４，５６５号参照）は、合成スフィンゴシン類似体であり、免疫抑制特性を有する。ＦＴＹ７２０は、セラミド合成酵素阻害剤としての機能も有することが報告されている。ＦＴＹ７２０は、インビボでリン酸化されると考えられ、いくつかのＳ１Ｐ受容体を通じてＳ１Ｐと同様の効果を示す。ヒト肺動脈内皮細胞において、ＦＴＹ７２０は、セラミドシンターゼ２を阻害することが報告されており、その結果、ジヒドロセラミド、セラミド、スフィンゴシンおよびＳ１Ｐの細胞レベルが低下し、ＳＰＨＫ１活性によって媒介されるジヒドロスフィンゴシンおよびジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸（ＤＨＳ１Ｐ）のレベルが増加する。そのため、ＦＴＹ７２０を用いることで、セラミドシンターゼを通じて、シグナル伝達スフィンゴ脂質の細胞内バランスの調節が可能となる。セラミドシンターゼは、セラミドのデノボ合成に関与する酵素である。（Ｂｅｒｄｙｓｈｅｖら、（２００９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、ｖｏｌ．２８４：５４６７−５４７７）。
【００９２】
非アイソザイム−非特異的ＳＰＨＫ阻害剤（例えば、Ｌ−トレオ−ジヒドロスフィンゴシン（サフィンゴール）およびＮ、Ｎ−ジメチルスフィンゴシン（ＤＭＳ）は、白血病細胞に対して細胞毒性作用を有する。
【００９３】
スフィンゴ脂質代謝経路の酵素の上記および他の阻害剤を抗Ｓ１Ｐ抗体または抗体フラグメントと共に用いることにより、本発明の方法を実行することができる。これらの阻害剤およびＳ１Ｐ抗体または抗体フラグメントは、医薬組成物（典型的には液体形態）として送達される。前記医薬組成物は、適切な生理的に受容可能な担体、賦形剤および／または安定剤を含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）参照）。特定の患者へのこのような組成の投与量は、多くの要素に応じて異なり、治療対象患者の絶対Ｓ１Ｐレベルの安定化（好ましくは低減）を達成するために、担当医師の裁量に任される。
【００９４】
３．用途
Ｓ１Ｐの活性または有効濃度あるいは前駆体または代謝産物を変化させるための薬剤は、異常Ｓ１Ｐレベルまたは活性と相関する疾病および疾患の治療において有用である。これらの薬剤（例えば、抗体）は、このような望ましくない生物活性脂質の有効濃度を変化させることにより、機能する。例えばＳ１Ｐの有効濃度を低下させることとは、Ｓ１Ｐまたはその望ましくない効果（下流作用を含む）を「中和する」ことであると言うことができる。ここで、Ｓ１Ｐが「望ましくない」とは、例えばシグナル伝達分子として疾患過程に関与すること、または過剰に存在する場合に疾患に寄与することを指す。
【００９５】
特定の理論に縛られることを望むものではないが、Ｓ１Ｐおよび／またはその代謝産物または下流エフェクターの不適切な濃度は、様々な疾患および障害の発症を引き起こすかまたは関与し得ると考えられる。本発明の組成物および方法は、Ｓ１Ｐのｉｎ  ｖｉｖｏ有効濃度を低下させることによって、これらの疾患および障害を処置するために使用することができる。特に、本発明の組成物および方法は、少なくとも部分的に、異常な新血管新生、脈管形成、繊維形成、線維症、瘢痕化、炎症および免疫応答を特徴とする疾患を処置するのに有用であると考えられる。
【００９６】
生物活性脂質に対する抗体によって治療され得る数種の疾患の例を以下に記載する。例えば、米国特許出願シリアル番号第１１／９２４，８９０号、１２／２５８，３３７号、１２／２５８，３４６号、１２／２５８，３５３号、１２／２５８，３５５号、１２／２５８，３８３号、ならびに米国特許出願シリアル番号第１１／９２５，１７３号および１２／４４６，７２３号を参照されたい。
【００９７】
患者体内の望ましくないスフィンゴ脂質の量を制御するための１つの方法として、１つ以上のスフィンゴ脂質に結合する１つ以上のヒト化抗スフィンゴ脂質抗体を含む組成物を提供し、これにより前記組成物を望ましくない遊離スフィンゴ脂質のレベルを低下させるための治療「スポンジ」として機能させる方法がある。化合物が「遊離している」と表現した場合、その化合物は、その望ましくない効果を及ぼすサイトに到達するのに何ら制限を受けていない状態を意味する。典型的には、遊離化合物は血液および組織中に存在し、これらの血液および組織のいずれか自身が遊離化合物によって作用を受けるサイトを含むか、あるいは、これらの血液および組織から化合物が遊離して作用するサイトへと移動することができる。遊離化合物は、化合物を望ましくない化合物へと変換させる任意の酵素による作用を受ける際にも、利用可能であり得る。
【００９８】
任意の特定の理論に縛られることを望むものではないが、特定の疾病状態において、Ｓ１Ｐ（あるいはその代謝産物または前駆体）の量が望ましくないレベルまで増加した場合、心臓および心筋疾病および疾患の発症の原因となるかまたはそのような発症に寄与すると考えられている。
【００９９】
スフィンゴ脂質は肝組織の線維成長および創傷治癒、血管の創傷治癒、ならびに他の疾病または疾患（例えば、癌、血管形成、過度の線維症および炎症に関与する多様な眼球疾病）にも寄与するため、本開示の組成および方法を用いて、これらの疾病および疾患ならびに心臓および心筋疾病および疾患を治療することが可能である。
【０１００】
スフィンゴ脂質に基づいた治療の１つの形態において、望ましくない毒性スフィンゴ脂質の実際のインビボ濃度、相対的インビボ濃度および／または利用可能なインビボ濃度を低下させるように、スフィンゴ脂質代謝経路を操作する。本発明によって提供される組成および方法によれば、ヒト化抗スフィンゴ脂質抗体を患者に投与して望ましくない毒性スフィンゴ脂質（例えば、Ｓ１Ｐ）またはその代謝産物と結合させることにより、疾病、疾患または外傷を治療または予防する。
【０１０１】
４．投与方法
本明細書に記載されている疾患および症状の処置は、種々の製剤およびデバイスを用いる様々な経路によって本発明の薬剤および組成物を投与することにより行うことができる。好適な薬学上許容される希釈剤、担体および賦形剤は当技術分野でよく知られている。当業者ならば、任意の特定の処置プロトコールで投与すべき量を容易に決定できるとことが分かるであろう。抗Ｓ１Ｐ抗体の好適な量は、１０μｇ／用量〜１０ｇ／用量の範囲内、好ましくは１０ｍｇ／用量〜１ｇ／用量の範囲内にある。
【０１０２】
薬剤物質は、限定されるものではないが全身、皮下、皮内、粘膜（吸入によるものを含む）および局所投与を含む当技術分野で既知の技術によって投与することができる。粘膜は、身体の内腔をつなぐ上皮組織を指す。例えば、粘膜は、口、食道、胃、腸および肛門を含む消化管；鼻腔、気管、気管支および肺を含む気道；および性器を含む。本明細書では、粘膜には、眼の外表面、すなわち角膜および結膜も含まれる。局所投与は潜在的な全身性副作用を制限でき、治療効果もなお認められるので、（全身投与に対して）局所投与が有利であり得る。
【０１０３】
本発明において用いられる医薬組成物は、限定されるものではないが、溶液、エマルションおよびリポソーム含有製剤を含む。これらの組成物は、限定されるものではないが、既製の液体、自己乳化固体および自己乳化半固体を含む多様な成分から調製することができる。
【０１０４】
本発明に用いられる医薬製剤は、製薬業で周知の従来技術に従って調製することができる。このような技術には、有効成分を医薬担体または賦形剤と会合させるステップを含む。好ましい担体は、特に該組成物がヒトの治療的使用を意図したものである場合には、薬学上許容されるものを含む。非ヒト治療（例えば、愛玩動物、家畜、魚または家禽の処置）では、獣医学上許容される担体も使用することができる。一般に、該製剤は、有効成分を液体担体または微粉固体担体または双方と、均一かつ緊密に会合させた後、必要であればその生成物を成形することによって調製される。
【０１０５】
本発明の組成物は、限定されるものではないが、錠剤、カプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤および浣腸などの多くの可能な投与形のいずれかへ製剤化することができる。また、本発明の組成物は、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として製剤化することもできる。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁液の粘度を高める物質をさらに含有し得る。該懸濁液はまた安定化剤を含んでもよい。
【０１０６】
一実施形態では、該医薬組成物は、泡沫として製剤化および使用することができる。医薬泡沫は、限定されるものではないが、エマルション、ミクロエマルシン、クリーム、ゼリーおよびリポソームなどの製剤を含む。
【０１０７】
基本的には、これらの製剤は最終生成物の成分およびコンシステンシーにおいて様々である。このような組成物および製剤の調製に対するノウハウは、製薬および調剤分野の技術者には一般に知られており、本発明の組成物の製剤に適用することができる。
【０１０８】
一実施形態において、本発明の実行において用いられる組成物は、例えば、局所用点滴剤または軟膏、眼周囲の注射を介して眼へ、体腔内的に埋め込みデポ剤を介して、前房または硝子体中へ、または全身的に注射もしくは経口投与により送達することができる。抗体および阻害剤の使用量は、当業者によって容易に決定することができる。
【０１０９】
治療薬を眼へ送達する従来のアプローチとしては、局所適用、全身投与後の眼への再分布または直接的な眼球内／眼周囲の注射が含まれる［Ｓｕｌｔａｎａ，ｅｔａｌ．（２００６），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ３：２０７−２１７；Ｇｈａｔｅ  ａｎｄ  Ｅｄｅｌｈａｕｓｅｒ（２００６），Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ，ｖｏｌ３：２７５−２８７；およびＫａｕｒ  ａｎｄ  Ｋａｎｗａｒ（２００２），Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｖｏｌ２８：４７３−４９３］。抗Ｓ１Ｐまたは他の抗生物活性脂質抗体治療薬は、これらのいずれの方法とも併用可能であるが、全て、利点と欠点がある程度認識されている。局所点滴剤は便利であるが、鼻涙排液で洗い流されるため、主として前眼部へは適用した薬剤の５％未満、後眼部へはそれよりさらに少ない量しか送達できないことが多い。点眼剤に加え、スプレー剤は、局所投与のための別の様式を与える。３つめの様式は、製剤と眼球表面との接触時間を長くするために使用され得る眼用軟膏またはエマルションであるが、視野のぼやけ、瞼のもつれが問題となり得る。眼球障害を処置するための治療剤の全身投与は、全身を薬剤の潜在毒性に曝すおそれがあるので、このような局所的アプローチが依然として好ましい。
【０１１０】
加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、後部ブドウ膜炎および緑内障が米国および他の先進国で視力喪失の主因であるため、後眼部の処置は医学上重要である。Ｍｙｌｅｓ，ｅｔａｌ．（２００５），ＡｄｖＤｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ；５７：２０６３−７９。後眼部への薬剤送達の最も有効な様式は、扁平部を介した硝子体内注射である。しかしながら、直接的注射は、該送達を達成するために熟練した医療従事者を必要とし、多くの患者において処置を制限する懸念が生じる。眼周囲注射、すなわち結膜下、眼球裏、眼球周辺および後部テノン嚢下注射を含むアプローチは、硝子体内注射よりもいくぶん侵入性が小さい。反復的および長期の硝子体内注射は硝子体出血、網膜剥離または眼内炎などの合併症を引き起こし得る。
【０１１１】
本発明の実行において有用な医薬組成物の投与は、より新しい眼球送達系の１つを用いて行ってもよく［Ｓｕｌｔａｎａ，ｅｔａｌ．（２００６），ＣｕｒｒｅｎｔＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ３：２０７−２１７；およびＧｈａｔｅａｎｄＥｄｅｌｈａｕｓｅｒ（２００６），ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎｉｏｎ，ｖｏｌ３：２７５−２８７］、これには（ａ）眼球インサート（可溶性、浸食性、非浸食性またはヒドロゲル系）、角膜シールド、例えば、眼に対する薬剤の制御送達を提供するコラーゲンに基づく眼帯およびコンタクトレンス、（ｂ）眼内でゲル形態に変換される点滴剤として投与の簡易性を提供し、これにより眼内の薬剤のある程度の徐放効果を提供するｉｎｓｉｔｕゲル化系、（ｃ）標的化送達、生体適合性および視力のぼやけがないという利点を提供するリポソーム、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅｓ）／ディスコーム（ｄｉｓｃｏｍｅｓ）などの小胞系、（ｄ）眼内への良好な保持を提供する粘膜付着系、（ｅ）プロドラッグ、（ｆ）浸透促進剤、（ｇ）凍結乾燥担体系、（ｈ）微粒子、（ｉ）サブミクロンエマルション、（ｊ）イオン泳動、（ｋ）デンドリマー、（ｌ）生体接着性マイクロスフェアを含むマイクロスフェア、（ｍ）ナノスフェアおよび他のナノ粒子、（ｎ）コラソーム（ｃｏｌｌａｓｏｍｅ）および（ｏ）相加的またはさらには相乗的な、有益な効果を提供するために１以上の上述の系を組み合わせる薬剤送達系などの徐放性または制御放出系が含まれる。これらのアプローチの大部分は、前眼部を標的とし、前眼部の疾患を標的とするのに有効であり得る。しかしながら、比較的低分子量の脂質は眼内での移動がかなり許容されるようであるので、これらの１以上のアプローチは後眼部の生物活性脂質の濃度に影響を与えるのにやはり有用であり得る。さらに、Ｆａｂフラグメントなどのより低分子量の抗体変異体で製造されれば、前眼部に導入された抗体も、眼全域に拡散することができる可能性がある。認可されたものや開発中のものなど（前掲の参照文献を参照）、後眼部に対する徐放性薬剤送達系も使用可能である。
【０１１２】
従前に述べたように、後部網膜、脈絡膜および黄斑の疾患の処置は、医学上極めて重要である。これに関して、経強膜的イオン泳動［Ｅｌｊａｒｒａｔ−Ｂｉｎｓｔｏｃｋ  ａｎｄ  Ｄｏｍｂ（２００６），Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１０：４７９−８９］は重要な前進であり、後眼部に抗体を送達する効果的な方法を提供し得る。
【０１１３】
また、療法の性能を改良するために製剤化した抗体に添加することができる様々な賦形剤は、この療法をより便利にするか、または製剤化した抗体がその意図し、認可された目的のためにのみ使用されることを担保する。賦形剤の例としては、ｐＨを制御する化学物質、抗菌薬、抗体効力の失効を防ぐための保存剤、眼球使用専用の製剤であることを識別するための染料、製剤中の抗体の濃度を高めるための可溶化剤、浸透促進剤および浸透圧および／または粘度を調節するための薬剤が挙げられる。例えばプロテアーゼの阻害剤は、抗体の半減期を延長するために加えることができる。一実施形態では、抗体は、眼に好適なｐＨでリン塩緩衝生理食塩水を含む溶液として硝子体内注射によって眼に送達される。
【０１１４】
また、抗Ｓ１Ｐ剤（例えば、ヒト化抗体）および／またはスフィンゴ脂質代謝経路阻害剤は、上記した製剤またはデバイスの１つで投与されるプロドラッグが得られるように化学的に修飾することもできる。その後、内在酵素の作用によって活性型の抗体が放出される。本願で考えられる、可能性のある眼球酵素としては、種々のシトクロムｐ４５０、アルデヒドレダクターゼ、ケトンレダクターゼ、エステラーゼまたはＮ−アセチル−β−グルコサミダーゼである。抗体に対する他の化学修飾はその分子量を増加させ、結果として眼における抗体の滞留時間を延長させることができる。このような化学修飾の例としては、ペグ化[Harris
and Chess (2003), Nat Rev Drug Discov; 2: 214-21]、ジスルフィド［Ｓｈａｕｎａｋら、（２００６），Ｎａｔ  ＣｈｅｍＢｉｏｌ；２：３１２−３］またはチオール［Ｄｏｈｅｒｔｙら、（２００５），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ；１６：１２９１−８］などの官能基に一般的なまたは特異的な処理であり得る。
【０１１５】
５．治療での使用
治療用途のための抗Ｓ１Ｐ抗体およびスフィンゴ脂質経路阻害剤は、上記に記載のような薬学的に許容される剤形で、哺乳類（好ましくはヒト）に投与される。剤形には、ボーラスとして静脈内投与、または一定期間にわたって持続注入、あるいは筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、吸入ルートによってヒトに投与し得るものも含む。
【０１１６】
疾患の予防または治療のための適切な投与量は、上記に定義するような、治療される疾患のタイプ、疾患の重症度と経過、抗体が予防または治療目的で投与されるか否か、過去の治療、患者の既往歴と抗体に対する応答、担当医師の判断に基づいて決めることになる。抗体および阻害剤を含む組成物は、一回または一連の治療にわたって、患者に適宜投与される。
【０１１７】
疾患のタイプと重症度に基づき、例えば、１回以上の個別の投与または持続注入による、抗体約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）が、患者への投与のための初回の候補投与量である。典型的な日毎または週毎の用量は、上記に言及する理由に基づき、約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲である。数日間またはそれ以上にわたる反復投与については、症状によって、疾患症状の所望する抑止が起こるまで治療が反復される。しかしながら、他の投与計画も有益であり得る。この治療の進行は、例えば、Ｘ線撮影を含む、従来の技術またはアッセイによって容易にモニターされる。
【０１１８】
本発明の別の実施形態によれば、疾患の予防または治療における抗体の有効性は、抗体を連続的に、または例えば化学療法的抗癌薬など、その目的に有効である別の薬剤と組み合わせて投与することにより改良することができる。このような他の薬剤は投与される組成物中に存在してもよいし、あるいは別に投与してもよい。抗体は連続的に、または他の薬剤と組み合わせて適宜投与される。
【０１１９】
６．製品
本発明の別の局面において、本発明の方法の実行に有用な材料を含む製品が提供される。当該製品は、１つ以上の容器を含む。この１つ以上の容器は、抗Ｓ１Ｐ抗体含有組成物、スフィンゴ脂質代謝経路中の酵素のモジュレータ（好適には阻害剤）、およびラベルを含む。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジおよび試験管が含まれる。これらの容器はガラスまたはプラスチックなどの種々の材料からなってよい。これらの容器は、症状を処置するのに有効な組成物を収容し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、この容器は静脈溶液バッグまたは皮下注射針が貫通可能なストッパーを備えたバイアルであり得る）。好ましくは、容器は、内容物の安全な保存および輸送に適した箱または包装材に収納される。そして、容器または包装材には、ラベルが添付される。製品はさらに、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学上許容されるバッファーを含む第二の容器を含み得る。それはさらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用説明の添付文書を含む、商業的および使用者の立場から望ましい他の物を含んでもよい。
【０１２０】
本発明は、下記の実施例を参照すればより良く理解できる。これらの実施例は単に現在本発明の実施に関して知られている最良の形態を例示することを意図したものである。本発明の範囲は、これに限定されるものではない。
【実施例】
【０１２１】
実施例１：低Ｓ１ＰキャリーオーバーのＬＴ１００９抗体の精製
臨床前使用または臨床使用のために純度が高くかつ高品質の抗体を生産することは、治療薬開発において極めて重要である。細胞性タンパク質、ＤＮＡおよびウィルスが無いだけでなく、抗体が完全に活性でありかつ患者投与時にその標的に結合できるようにするために、調製抗体中にはいかなる抗原も含まれるべきではない。一般的に、抗体の精製および製剤により抗原は除去されるが、特に哺乳動物細胞発現系で抗体が生成された場合、抗スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）モノクローナル抗体であるＬＴ１００９の精製後、有意なレベルのＳ１Ｐキャリーオーバーが何度か精製抗体から確認された。これは、Ｓ１Ｐが、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）によって合成される生物活性脂質であるからである。例えばトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株ＬＨ１２７５（ＡＴＣＣアクセス番号第ＰＴＡ―８４２２）からのＬＴ１００９生産時において、通常の細胞内シグナル伝達の結果かつ／または細胞死亡後の細胞破裂の結果、Ｓ１Ｐの細胞内プールが培地中に放出されうる。細胞馴化培地（上清）内に発現されたＬＴ１００９抗体は、このＳ１Ｐに結合することができる。培養が進むにつれ、より多くのＳ１Ｐが放出され得、ＬＴ１００９との複合体として上清中に蓄積し得る。理論に縛られることは望まないものの、培地中での抗体とＳ１Ｐとの接触回数が多くなるほど、その細胞外Ｓ１ＰがＬＴ１００９に結合し、調製抗体中にキャリーオーバーすると考えられる。ＣＨＯ細胞で生成された場合、ＬＴ１００９抗体調製物は、抗体モルあたり０．５モル（５０モルパーセント、ｍｏｌ％）の余分なＳ１Ｐを含み得る。そのため、Ｓ１Ｐキャリーオーバー量を低減するため、上流および下流処理双方において、粗製採取物中のＳ１Ｐ量の最小化および精製時のＳ１Ｐの除去の促進のための工程を設ける必要がある。
【０１２２】
Ｓ１Ｐ定量化方法：
ＬＴ１００９抗体の多様な調製中のＳ１Ｐの濃度を、ＷｉｎｄＲｏｓｅＡｎａｌｙｔｉｃａを用いてＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ−ＭＳ法によって測定した。質量分析は高速かつ高感度であり、適切に適用した場合、分析物量をピコグラム単位で定量化することができる。この分析方法においてとられるアプローチは、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＣ）により、Ｓ１Ｐをエレクトロスプレー質量分析計源内に導入することである。このＲＰＣ工程において、タンパク質、塩および他の夾雑物からＳ１Ｐが分離される。クロマトグラフィー工程後、Ｓ１Ｐを前記源中でイオン化し、イオントラップ質量分析計に送る。適切な質量対電荷比（ｍ／ｚ＝３８０）のイオンを除く全イオンがトラップから排出される。残りのイオンはイオントラップ中でフラグメント化され、特異的な娘イオン（ｍ／ｚ＝２６４）を監視する。その結果から、三次元分析（ＲＰＣ保持時間、ｍ／ｚ３８０の親イオン、およびｍ／ｚ２６４の娘イオン）によって、サンプルの同一性が確認される。これら３つの基準を満たす他の任意の化合物は無い可能性が高い。さらに、ＭＳ−ＭＳ工程により、信号対雑音が最大化され、そのため感度が有意に上昇する。抽出工程は不要であるため、内部標準は不要である。さらに、サンプルをＨＰＬＣ−ＭＳ中に直接注入すると、回復および感度が上昇し、複雑度および分析時間が低減する。
【０１２３】
比較のため、選択された抗体調製物からの抽出物中のＳ１Ｐ濃度を、Ｓ１Ｐ定量化ＥＬＩＳＡを用いて決定した。４倍量の過度の１：２クロロホルム：メタノールを１ｍｇ／ｍｌの抗体サンプルに加えて、Ｓ１Ｐを抽出した。水／有機溶液に対し広範なボルテックスおよび超音波処理を行って抗体脂質複合体を崩壊させ、氷上でインキュベートした。遠心分離後、スピードバックを用いて可溶性画分を蒸発させ、乾燥したＳ１Ｐを脱脂ヒト血清に再懸濁した。再懸濁サンプル中のＳ１Ｐ濃度を、抗Ｓ１Ｐ抗体およびＳ１Ｐコーティングコンジュゲートを用いて競合ＥＬＩＳＡによって決定した。このコーティングコンジュゲートは、共有結合で結合したＳ１Ｐ‐ＢＳＡであり、化学合成チオール化Ｓ１Ｐとマレイミド活性化ＢＳＡとを結合させることにより、作製した。Ｓ１Ｐ標準として、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ、２．６８ｍＭＫＣｌ、１０．１ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）中に単原子層Ｓ１Ｐを超音波処理によって可溶化させて、１０μＭＳ１Ｐ（Ｓ１Ｐ‐ＢＳＡ複合体）を調製した。このＳ１Ｐ‐ＢＳＡ複合体溶液を、適切な濃度まで（２μＭまで）脱脂ヒト血清によってさらに希釈した。０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．５）で希釈したＳ１Ｐコーティング材料で、マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ、高結合プレート）を、３７℃で１時間コーティングした。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ―２０で室温で１時間ブロッキングした。一次インキュベーションのため、０．４μｇ／ｍＬビオチン標識抗Ｓ１Ｐ抗体、指定量のＳ１Ｐ‐ＢＳＡ複合体および試験対象サンプルを、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに加えた。室温で１時間インキュベーションを行った後、プレートを洗浄し、その後、室温で１時間、各ウェルあたり１００μｌで、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（１：２０，０００希釈）でプレートをインキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質でペルオキシダーゼ反応を行い、１ＭＨ２ＳＯ４の付加によって反応を停止させた。ＴｈｅｒｍｏＭｕｌｔｉｓｋａｎＥＸを用いて、４５０ｎｍの光学密度を測定した。
【０１２４】
Ｓ１Ｐの最小化のための上流処理：
血清中には汚染Ｓ１Ｐが含まれており、ＣＨＯ細胞そのものによって生成された汚染Ｓ１Ｐが血清に付加される可能性があるため、上流処理のためには、無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０７４３―０２９）中でのＣＨＯ細胞の培養は必須である。無血清培地の使用に加えて、広範囲の細胞死亡の前にバイオリアクターから抗体を回収すると、Ｓ１Ｐの細胞内プールが培地に放出されるのが回避される。さらに、回収後すぐに下流処理を開始すると、Ｓ１Ｐの存在下にＬＴ１００９がおかれる時間と、最終調製物にキャリーオーバーされる脂質の量とが最小化される。上流処理時のＳ１Ｐレベルを最小化する試みにも拘わらず、粗製採取物内に有意なＳ１Ｐが残留することが多く、典型的には、抗体のモルあたり０．１〜０．２モル比（１０〜２０ｍｏｌ％）の結合Ｓ１Ｐが残留する。
【０１２５】
そのため、Ｓ１Ｐキャリーオーバーレベルが極めて低いＬＴ１００９材料を生成するために、抗体調製物から脂質を除去するための下流の方法を開発した（＜０．４ｍｏｌ％をＨＰＬＣ−ＭＳ−ＭＳによって測定）。
【０１２６】
Ｓ１Ｐを減少させる下流処理：
従来、培養上清または腹水からの抗体精製では、アフィニティークロマトグラフィーが用いられる。このワンステップ方法では、高度に架橋されたアガロース（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号Ｎｏ１７‐５１９９‐０４）に共有結合的に結合した組換えプロテインＡが用いられる。プロテインＡは、モノクローナル抗体のＦｃドメインのリガンドとして機能する。プロテインＡおよびＳ１Ｐ結合部位は別個であるため、ＬＴ１００９がプロテインＡ樹脂と結合した場合、Ｓ１Ｐは解離しない。ＬＴ１００９に対する高親和性および水溶性バッファーへの低溶解性により、高塩濃度バッファーでの広範囲洗浄（下記を参照）を行った後でも、ＬＴ１００９と結合したＳ１Ｐが確実に残留する。そのため、従来の抗体精製プロセスでは、プロテインＡクロマトグラフィー、低ｐＨウイルス不活化の後、中和、陰イオン交換Ｑクロマトグラフィー、ウイルスナノろ過および最終限外ろ過／ダイアフィルトレーションを行っても、同時精製された（ＬＴ１００９に結合した）Ｓ１Ｐは除去されなかった。ＬＴ１００９に結合したＳ１Ｐを分離するために、結合機構の特殊な特徴が利用できる。
【０１２７】
研究によれば、ＬＴ１００９のＳ１Ｐ結合活性は、ｐＨ＜４．０またはｐＨ＞８．５において低減することが分かった。しかし、結合Ｓ１Ｐの低減のために、ｐＨ＜４．０においてプロテインＡクロマトグラフィーを実行することは不可能である。なぜならば、このような低いｐＨにおいては抗体はプロテインＡ樹脂に結合しないからである。そのため、ＬＴ１００９に結合したＳ１Ｐを低減させるために、高塩濃度とｐＨ８．５での洗浄工程をプロテインＡクロマトグラフィーにおいて採用した。さらに研究を進めたところ、高塩濃度バッファー（６５０ｍＭのＮａＣｌ）および５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）では、ＬＴ１００９から有効にＳ１Ｐを除去できなかった。塩濃度をさらに０．６５Ｍから１Ｍ（ｐＨ８．５）へと増加し、高塩濃度洗浄工程をカラム容量４個からカラム容量５個に増やしても、残留Ｓ１Ｐのより少ない生成物は得られなかった。
【０１２８】
Ｓ１Ｐ除去のための金属キレーターの使用：
開発されたキレーティング方法においては、ＣＨＯ細胞バイオリアクターキャンペーンから作製された２体積量の未精製ＬＴ１００９抗体回収物と、５０ｍＭリン酸カリウム、１ＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡおよび５％グリセロール（ｐＨ８．０）を含む１体積量のプロテインＡＩｇＧ結合バッファー（「Ｐｉｅｒｃｅ結合バッファー」、ＰｉｅｒｃｅＰｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＲｏｃｋｆｏｒｄＩＬ）とを事前混合した。この方法では、プロテインＡカラムをＰｉｅｒｃｅ結合バッファーにより平衡化し、事前混合された粗製採取物をロードし、１０カラム容量の同一結合バッファーで洗浄した。その結果得られた精製ＬＴ１００９中のＳ１Ｐの含有量を、定量化ＥＬＩＳＡによって測定したところ、モルパーセントで２倍以上少なかった。
【０１２９】
金属キレーター（例えば、ＥＤＴＡ）は、ＬＴ１００９抗体調製物中のＳ１Ｐキャリーオーバーの有効な低減において重要またはさらには必須であると現在考えられている。実際、二価金属カチオンをキレート化するＥＤＴＡ存在下でＬＴ１００９の力価測定を行うと、Ｓ１Ｐ結合が抑制されることが分かる。このようなＬＴ１００９からＳ１Ｐを分離するＥＤＴＡの能力は、ＬＴ１００９精製時におけるＳ１Ｐの除去を促進すると考えられる。結合バッファーおよび洗浄バッファー中に２ｍＭＥＤＴＡを付加したところ、抗体溶出画分中のＳ１Ｐキャリーオーバーが２倍有効に低減した。本研究における初期Ｓ１Ｐのレベルは比較的低いが、ＥＤＴＡを採用することで、初期Ｓ１Ｐレベルが高い場合でもサンプル中の脂質キャリーオーバーが大幅に減少するはずである点に留意されたい。以下の例に限定されることなく、他の金属キレーター（例えば、ＥＧＴＡ、ヒスチジン、リンゴ酸およびフィトケラチン）も、Ｓ１Ｐの抗体からの分離に有用であり得る。ＥＧＴＡおよびＥＤＴＡは、現在、抗Ｓ１Ｐ抗体からＳ１Ｐを分離するための好適な二価金属キレーターである。
【０１３０】
これらの結果に基づいて、新規の高塩濃度バッファーが、Ｌｐａｔｈ社によって開発された。この新規の高塩濃度バッファーは、Ｐｉｅｒｃｅバッファーに匹敵するｐＨおよび伝導率を有しており、このバッファーを用いる新規の事前混合工程を、ＬＴ１００９の製造プロセスに採用した。
【０１３１】
下流精製プロセスを以下に挙げる：
■０．１８２ＬＫＰｉ高塩濃度ＥＤＴＡバッファーに対して２Ｌの粗製採取物の比で、粗製採取物と、４Ｘカリウム高塩濃度ＥＤＴＡバッファー（２００ｍＭＫＰｉ、４ＭＮａＣｌ、８ｍＭＥＤＴＡ、２０％グリセロール、ｐＨ８．０）との事前混合。この工程は、Ｓ１ＰのＬＴ１００９への結合防止、およびＳ１ＰのＬＴ１００９からの分離のためのものである。
■粗製採取物および高塩濃度バッファーの混合物のプロテインＡカラムへの捕獲と、Ｓ１Ｐ除去のための、１０カラム容量の高塩濃度ＥＤＴＡバッファーによるカラム洗浄。
■低ｐＨ（３．６〜３．８）での、プロテインＡ樹脂からのＬＴ１００９の溶出。
■ウイルス不活化のため、プロテインＡ溶出液の低ｐＨ（３．６〜３．８）での保持の後、溶出液の中性ｐＨへの中和。
■残留宿主細胞のタンパク質およびヌクレオチドならびに浸出プロテインＡの除去のための、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ陰イオン交換Ｑクロマトグラフィー。
■ウイルス除去のためのさらなる工程として、ＶｉｒｏｓａｒｔＣＰＶナノフィルターを用いたナノろ過。
■タンパク質濃度調整および最終製剤のための最終ＵＦ／ＤＦろ過。
【０１３２】
Ｓ１Ｐ除去のための低ｐＨおよびＣ８樹脂の使用：
精製時の金属キレーター（例えば、ＥＤＴＡ）の使用に加えて、Ｓ１Ｐの疎水性を利用して、精製抗体調製物から脂質を除去することも可能である。この方法では、下記のツーステッププロセスが用いられる：１）抗体からの脂質の分離、および２）水溶性環境からの脂質の物理的分離。抗体調製物からの分離を促進するための容易かつロバストな方法として、ｐＨ誘導脂質除去（ｐＨｉＬ）処理を用いる。
【０１３３】
抗体は一般的には、低ｐＨにおいて、顕著に低減した抗原結合親和性を示す。リン脂質（例えば、Ｓ１ＰおよびＬＰＡ）に対して生成された抗体は、特定の抗体および脂質によっては、ｐＨ３．０〜３．５では脂質と結合しない。解離を促進するための正確なｐＨを決定する際、結合を抑制しかつインタクトなＩｇＧを維持できるｐＨを決定するために、ｐＨ滴定実験を行う必要がある。これにより、ｐＨ増加後に結合活性を回復できる。換言すれば、抗体は不可逆的に不活性化されない。このｐＨが決定された後、４℃において臨界ｐＨ（例えば、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０〜３．５）を下回るまで、抗体をバッファーに対して透析する。これらの条件下において、脂質および抗体はどちらとも、溶液中に解離した成分として存在する。透析された溶液を、材料（例えば、Ｃ８シリカ樹脂（例えば、ＳｅｐＰａｋカートリッジ、Ｗａｔｅｒｓ、カタログ番号ＷＡＴ０３６７７５））に通す。この材料は、脂質と結合し、脂質フリーのタンパク質の分離を促進する。その結果、遊離脂質が疎水性樹脂に不可逆的に結合し（Ｃ８シリカ樹脂の場合）、抗体は有意な損失無く通過する（収率〜９０％）。脂質のほとんどは、カートリッジを１回通過させれば除去でき、さらに通過させることで、脂質除去を小幅に増加させることができる（下記表１）。
【０１３４】
【表１】
2013543479.tif 000002
【０１３５】
上述した金属キレート化およびｐＨｉＬ法は、単一の精製手順に容易に採用することができる。ＥＤＴＡは、ほとんどのバッファーと適合可能であり、抗体安定性、溶解性またはプロテインＡ結合に悪影響を与えない。精製時において、大量のＥＤＴＡ含有バッファーによって結合ＩｇＧを洗浄すると、Ｓ１Ｐの一部がＳ１Ｐ−ＬＴ１００９複合体から除去され、他の金属依存性抗原−抗体複合体も強力に分離される。ＥＤＴＡ洗浄で脂質を十分に除去できない場合、プロテインＡカラムからの溶出液をｐＨｉＬ法を用いて処理することができる。プロテインＡからの結合ＩｇＧの溶出は典型的には、低ｐＨバッファー（ｐＨ＜３．０）を用いて達成される。抗脂抗体を脂質結合の臨界ｐＨまたはこれを下回るｐＨでカラムから溶出した場合、サンプルをＣ８シリカ樹脂に付加するだけで、脂質を除去できる。必要ならば、樹脂に付加する前に、ｐＨを容易に調節することができる。
【０１３６】
実施例２：ＬＴ１００９を含有する製剤
１．序論
以下の実施例では、Ｓ１Ｐに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体ＬＴ１００９を含むいくつかの製剤の安定性を評価するための実験について説明する。ＬＴ１００９は、２本の同一な軽鎖と２本の同一な重鎖を含む工学設計された完全長のＩｇＧ１ｋアイソタイプ抗体であり、約１５０ｋＤａの総分子量を有する。軽鎖と重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｓ１Ｐに対して産生されたマウスモノクローナル抗体に由来し、さらにＣＤＲの１つにＣｙｓからＡｌａへの置換を含んでいる。ＬＴ１００９では、ヒトフレームワーク領域が、抗体の総アミノ酸配列の約９５％を占めており、高い親和性と特異性でＳ１Ｐに結合する。
【０１３７】
本実施例に記載の試験の目的は、ＬＴ１００９の安定性と生理活性を長期間維持可能であり、全身投与に適する好ましい製剤を１つ以上開発することであった。公知のように、分子の高次構造の維持（すなわち安定性）は、少なくとも部分的にはタンパク質の分子環境および保存条件に依存する。好適な製剤は、抗体を安定させるのみならず、注射された際に患者によって忍容されなければならない。そのため、この試験では、試験された多様な製剤は、１１ｍｇ／ｍＬまたは４２ｍｇ／ｍＬのＬＴ１００９、さらに異なるｐＨ、塩、および非イオン系界面活性剤の濃度を含んだ。さらに、３つの異なる保存温度（５℃、２５℃、および４０℃）で調査した（それぞれ、実際の条件、加速条件、および温度ストレス条件に対応）。安定性は、５つの異なる時点で、多様な製剤から得た代表的サンプルを用いて評価された：試験開始時および２週間後、１ヵ月後、２ヵ月後、および３ヵ月後。各時点において、試験は、目視検査、注射針通過性性（３０ゲージ注射針を通して吸入した場合）、およびサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を含んだ。また、ある一定の温度以上では、タンパク質は変性し、いくらかの凝集体形成が生じるため、タンパク質の安定性を評価するために、円二色性（ＣＤ）分光測定法も使用した。観察された遷移は、見かけの変性または「融解」温度（Ｔｍ）と呼ばれ、タンパク質の相対的安定性を示す。
【０１３８】
２．材料および方法
ａ．ＬＴ１００９
製剤サンプル（各〜０．６ｍＬ）は、２４ｍＭリン酸ナトリウム、１４８ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．５中にＬＴ１００９を４２ｍｇ／ｍＬ含有する水性ストック溶液から生成した。２４ｍＭリン酸ナトリウム、１４８ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．５溶液を用いて水性ストック溶液を所望する濃度に希釈することにより、ＬＴ１００９を１１ｍｇ／ｍＬ含有するサンプルを調製した。異なるｐＨ値を有するサンプルを調製するために、ＬＴ１００９（１１ｍｇ／ｍＬおよび４２ｍｇ／ｍＬ）の各濃度のｐＨを、０．１ＭＨＣｌまたは０．１ＭＮａＯＨをそれぞれ使用して、当初の６．５の値から、６．０または７．０に調整した。異なるＮａＣｌ濃度を有するサンプルを調製するために、塩濃度を、当初の１４８ｍＭから３００ｍＭまたは４５０ｍＭに上げるために、５ＭＮａＣｌをサンプルに添加した。異なる非イオン系界面活性剤濃度を有するサンプルを調製するために、最終濃度が２００ｐｐｍまたは５００ｐｐｍとなるように、ポリソルベート−８０をサンプルに添加した。サンプルを全て、０．２２μｍのＰＶＤＦ膜シリンジフィルターに通し、滅菌済みの発熱物質を取り除いた１０ｍＬの血清バイアル内に無菌的に濾過した。その後、バイアルをそれぞれ、低剥離性のＰＴＦＥで裏打ちされたストッパーで密封した。このストッパーは、キャップにクリンプされることで、所定位置に固定され、汚染物から保護されている。安定性チャンバーに置く前に、バイアルを短時間２〜８℃で保管し、その後、下記の３つの指定保存条件のうちの１つに合わせて調節した安定性チャンバー内に垂直に配置した。４０℃（±２℃）／７５％（±５％）相対湿度（ＲＨ）、２５℃（±２℃）／６０％（±５％）ＲＨ、または５℃（±３℃）／大気ＲＨ。試験された製剤の変量の概要を以下の表２に示す。
【０１３９】
【表２】
2013543479.tif 000003
【０１４０】
ｂ．サンプルの取り出し
各製剤のサンプルを、以下の表３に記載のスケジュールに従って分析した。全時点について、各保存条件についてバイアル１瓶を使用した。サンプルを取り出す日に、バイアルを各安定性チャンバーから取り出して、１５０μＬの各サンプルをそれぞれ対応するラベルがついた別のバイアルに移して、試験前に１時間ベンチの上に静置した。試験対象の分注を抜き取った後、元のバイアルは、すぐに定められた安定性チャンバーに戻した。
【０１４１】
【表３】
2013543479.tif 000004
【０１４２】
ｃ．分析手順
所定の時点について、各サンプルからの分注を使って、目視観察、注射針通過性、ｐＨ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元および非還元条件の両方）、ＳＥ−ＨＰＬＣ、およびＩＥＦを含む一連の標準分析を実施した。タンパク質濃度は、ＵＶ分光測定法によって測定した（ＯＤ−２８０）。円二色性（ＣＤ）試験も実施した。
【０１４３】
円二色性分光測定法は、製剤試験とは別に行った。Ａｖｉｖ２０２ＣＤ分光光度計を使用して、分析を実施した。近紫外部ＣＤスペクトルは、４００〜２５０ｎｍの範囲で収集した。この領域では、ジスルフィドおよび芳香族側鎖が、ＣＤシグナルに寄与する。遠紫外波長領域（２５０〜１９０ｎｍ）において、スペクトルは、ペプチド骨格に起因する。βシートタンパク質に通常使用される波長である、２０５ｎｍの観察によって、温度変性曲線を作成した。２５℃〜８５℃まで加熱しながら、サンプル０．１ｍｇ／ｍｌを使って、データを収集した。データは、１℃のインクリメントで集めた。そのような変性スキャンに要した合計時間は、７０〜９０分であった。平均時間は２秒であった。
【０１４４】
３．結果と考察
分析した全サンプルについて、目視による外観に経時的な変化はなかった。同様に、注射適性検査により、サンプルは、３０ゲージ注射針を備えたシリンジに問題なく吸入されることが実証された。多様な分析検査の結果は一貫しており、ＳＥ−ＨＰＬＣは、ＬＴ１００９の優れた安全性評価法であることが明らかになった。これらの結果は、塩濃度が上昇すると、凝集物の生成と小さな非凝集不純物の生成のどちらも減少することを示した。また、ｐＨを低下させると、凝集物と不純物形成が低下することも発見された。さらに、ポリソルベート−８０の濃度を２００ｐｐｍよりも高く上昇させても、ＬＴ１００９がそれ以上は安定しないことも、明らかになった。１１ｍｇ／ｍＬのＬＴ１００９を含むサンプルに対してＳＥ‐ＨＰＬＣ実験を行い、４２ｍｇ／ｍＬのＬＴ１００９を含むサンプルについて得られた結果と同様の結果が得られたが、ＬＴ１００９の濃度が低い方が、高濃度と比較して凝集物形成の可能性が低いことを示し、これは、全ての試験条件下で、高濃度の抗体の安定性が僅かに低いようであることを示している。
【０１４５】
円二色性試験から、ＬＴ１００９は、水溶液中では、ＴｙｒおよびＴｒｐ両残基周辺が秩序正しい環境であり、明確な三次構造をとることが発見された。また、抗体分子中の少なくともいくつかのジスルフィドは、結合に幾分かの負荷を有しているが、これは、鎖内および鎖間ジスルフィドが存在する場合には、稀なことではない。ＬＴ１００９の二次構造は、これと言って目立ったところはなく、βシート構造に一貫する遠紫外ＣＤスペクトルを提示することが発見された。観察された遷移は、見かけの変性または「融解」温度（Ｔｍ）と呼ばれる。加熱によって、ＬＴ１００９は、ｐＨ７．２では、約７３℃の見かけＴｍを示した。見かけのＴｍは、ｐＨ６．０では約７７℃まで上昇した。これらの結果は、僅かに酸性のｐＨは、ＬＴ１００９の水性製剤の長期的安定性を増強することを示す。ＮａＣｌおよび／またはポリソルベート−８０の添加もまた、更なる安定性を与えた。
【０１４６】
合わせて、これらの実験データは、ＬＴ１００９は、抗体濃度とは無関係に、ｐＨ６および４５０ｍＭＮａＣｌ周辺で最も安定性があることを示す。実際、ＳＥ−ＨＰＬＣ試験は、ポリソルベート−８０の濃度を２００ｐｐｍに維持しながら、塩濃度を４５０ｍＭまで増加させ、ｐＨを６．０まで下げると、ＬＴ１００９の安定性に極めて有益な効果があることを示した。ポリソルベート−８０を２００ｐｐｍ以上含ませても、凝集体形成に対する更なる緩和効果がなかったが、これは恐らくは、２００ｐｐｍにおいて既に臨界ミセル濃度を超えていたためである。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、試験条件下ではＬＴ１００９の凝集体形成が塩濃度の上昇に伴って低下した事実は、凝集体形成は、少なくとも部分的には、疎水的相互作用よりむしろ分子間のイオン相互作用により深く基づいていることを示している可能性がある。ｐＨを７から６に下げると凝集体形成が減少するという観察は、低ｐＨにおけるアミノ酸ヒスチジンの疎水性の低下によって説明できる。最後に、ＬＴ１００９濃度上昇時に観察された凝集体形成の傾向の増大は、分子が適切な場所で、適切な時間に互いにぶつかり合う機会が増えて凝集体を形成することにより、簡単に説明され得る。
【０１４７】
これらの実験によって示されるように、好適な水性ＬＴ１００９製剤は、２４ｍＭリン酸、４５０ｍＭＮａＣｌ、２００ｐｐｍポリソルベート−８０、ｐＨ６．１を有するものである。この医薬品は、患者に投与する前に、おそらく多量のＰＢＳを含む輸液バッグ中に注入することによって希釈されるため、本製剤の比較的高い浸透圧は、全身投与について問題をもたらすことはないであろう。
【０１４８】
実施例３：抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体からのＦａｂフラグメントの分離
精製全ＩｇＧ調製物をプロテアーゼパパインで処理することにより、可変ドメインおよびＣｋおよびＣｈ１定常ドメイン双方からなるＦａｂフラグメントを、一対のＣｈ２およびＣｈ３ドメインを含むＦｃドメインから分離した。このＦａｂフラグメントは、１つの可変領域全体を保持しているため、抗体とエピトープの１：１相互作用の生化学的探求のための有用なツールとして機能する。さらに、Ｆａｂフラグメントは柔軟性に欠け、また一般的に天然精製全ＩｇＧに固有のグリコシル化にも欠けるため、Ｆａｂフラグメントは、一般的には、単結晶ｘ線回折による構造研究のための優秀なプラットホームである。
【０１４９】
精製されたインタクトな抗Ｓ１ＰＩｇＧを、３７℃で２時間、消化バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．２、２ｍＭＥＤＴＡ中で、１００：１ＬＴ１００９：パパイン）中で、活性化パパイン（５．５ｍＭシステイン―ＨＣＬ、１ｍＭＥＤＴＡ、７０μＭ２―メルカプトエタノール中で、３７℃で０．５時間インキュベートされた１０ｍｇ／ｍｌパパイン）によって処理した。その後、プロテアーゼ反応を５０ｍＭヨードアセトアミドでクエンチし、２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ９で透析し、２ｘ５ｍｌＨｉＴｒａｐＱカラムにロードした。直線勾配２０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８、０．５ＭＮａＣｌにより結合タンパク質を溶出させ、４ｍｌ画分中に収集した。抗Ｓ１ＰＦａｂフラグメントを含む画分をプールし、２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８で平衡化されたプロテインＡカラムにロードした。Ｆａｂフラグメントがフロースルー画分中に存在する一方、インタクトな抗体およびＦｃフラグメントは樹脂に結合した。Ｆａｂフラグメントをｃｅｎｔｒｉｃｏｎ―ＹＭ３０遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号４２０９）を用いて濃縮し、２５ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７で透析し、４℃で保存した。
【０１５０】
実施例４：分析方法
この実施例では、本発明との関連において有用ないくつかの分析方法について詳述する。
【０１５１】
ａ．定量的ＥＬＩＳＡ
ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（ＢｅｔｈｙｌＡ８０−１０４Ａ、１ｍｇ／ｍｌ）を炭酸緩衝液（１００ｍＭＮａＨＣＯ３、３３．６ｍＭＮａ２ＣＯ３、ｐＨ９．５）にて１：１００希釈した。３７℃で１時間１００μｌ／ウェルのコーティング溶液でインキュベートすることによりプレートをコーティングした。プレートをＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭＴｒｉｓ、０．１４ＭＮａＣｌ、０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．０）で４回洗浄し、３７℃で１時間２００μｌ／ウェルＴＢＳ／ＢＳＡ（５０ｍＭＴｒｉｓ、０．１４ＭＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、ｐＨ８．０）でブロッキングした。試料および標準は、２回検定しても十分な量を、非結合型プレートにて調製した。
【０１５２】
標準はヒト標準血清（ＢｅｔｈｙｌＲＳ１０−１１０、４ｍｇ／ｍｌ）をＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ（５０ｍＭＴｒｉｓ、０．１４ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．０）で次の濃度に希釈することにより調製した：５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、３１．２５ｎｇ／ｍｌ、１５．６２５ｎｇ／ｍｌ、７．８１２５ｎｇ／ｍｌ、０．０ｎｇ／ｍｌ。試料の吸光度（ＯＤ）が標準曲線の範囲内になるようにＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡで適切に希釈することによって、試料を調製した。最も線形の範囲は１２５ｎｇ／ｍｌ〜１５．６２５ｎｇ／ｍｌであった。プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、１００μｌの標準／試料調製液を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次にプレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡで１：１５０，０００に希釈したＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＢｅｔｈｙｌＡ８０−１０４Ｐ、１ｍｇ／ｍｌ）によって３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄し、４℃に冷却した１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を用いて発色した。７分後に１ＭＨ２ＳＯ４（１００μｌ／ウェル）で反応を停止した。ＯＤを４５０ｎｍで測定し、データをＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｚｍソフトウェアで分析した。
【０１５３】
ｂ．直接結合ＥＬＩＳＡ
３７℃で１時間、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）にて希釈した脱脂ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でコンジュゲートしたＳ１Ｐで、マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Costar, Corning Inc., Lowell MA, Cat No. 3361）を一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ、２．６８ｍＭＫＣｌ、１０．１ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄し、室温で１時間または４℃で一晩ＰＢＳ／ＢＳＡ／ｔｗｅｅｎ−２０によりブロッキングした。一次インキュベーション（室温で１時間）として、抗体の希釈系列（０．４μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．０１２５μｇ／ｍＬ、０μｇ／ｍＬ）をミクロプレート（ウェル当たり１００ｍｌ）に添加した。プレートを洗浄し、ウェル当たり１００μｌの１：２０，０００に希釈したＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−００３）で１時間室温でインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼをテトラメチルベンジジン基質（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ０４４０）で発色させ、１ＭＨ２ＳＯ４を添加することにより停止した。Ｔｈｅｒｍｏ  ＭｕｌｔｉｓｋａｎＥＸを用いて４５０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定した。生データをＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアへ転送し、飽和結合曲線の４パラメータ非線形最小二乗法により、半最大結合濃度（ＥＣ５０）および最大結合吸収度（Ｖｍａｘ）を求めた。
【０１５４】
ｃ．脂質競合アッセイ
溶液中で、多様な脂質が特定の抗体（または抗体フラグメント）がＳ１Ｐに直接結合するのを阻害する能力を、ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを用いて試験した。０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で希釈したＳ１Ｐで、マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３３６１）を１時間、３７℃でコーティングした。プレートをＰＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ、２．６８ｍＭＫＣｌ、１０．１ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ−２０により室温で１時間または４℃で一晩ブロッキングした。一次培養のため、０．４μｇ／ｍＬの抗体および指定量の脂質を前記ＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加し、室温にて１時間培養した。プレートを洗浄し、１ウェルにつき１００μｌのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（１：２０，０００希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５―０３５―００３）またはＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）抗体（１：５０，０００希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９―０３５―００３）で、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、テトラメチルベンジジン基質でペルオキシダーゼ反応を行って発色し、１ＭのＨ２ＳＯ４を加えることにより、反応を停止させた。光学密度（ＯＤ）を、ＴｈｅｒｍｏＭｕｌｔｉｓｋａｎＥＸを用いて４５０ｎｍにおいて測定した。Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いたＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロットの線形回帰分析により、最大結合吸収度（Ｖｍａｘ）および阻害パーセントを計算した。
【０１５５】
ｄ．表面プラズモン共鳴
結合データは全て、ＰｒｏｔｅＯｎ光学バイオセンサ（ＢｉｏＲａｄ、ＨｅｒｃｕｌｅｓＣＡ）で収集した。チオール化脂質をマレイミド修飾ＧＬＣセンサー・チップ（カタログ番号１７６−５０１１）に結合した。まず、ＧＬＣチップをスルホＮＨＳ／ＥＤＣの同量混合で７分間活性化し、次いでエチルジアミンによる７分間のブロッキングを実施した。次に、ＨＢＳランニングバッファー（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．００５％ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）中で、スルホＭＢＳ（ＰｉｅｒｃｅＣｏＲｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、カタログ番号２２３１２）を、０．５ｍＭの濃度で表面に流した。チオール化脂質をＨＢＳランニングバッファー中で１０、１、および０．１μＭの濃度に希釈して７分間注入し、異なる脂質密度の表面を得た（〜１００、〜３００および〜１４００ＲＵ）。次に、最高濃度として２５ｎＭから開始した３倍希釈系列を使用して、ＷＴおよび変異体抗体の結合データを収集した。１００ｍＭＨＣｌの１０秒のパルスによって表面を復元した。データはすべて２５℃で収集した。対照は、標準表面およびブランク注入とした。結合パラメータを抽出するために、１サイトモデルおよび２サイトモデルを用いて、データにグローバルフィッティングを行った。
【０１５６】
上記および他の分析方法の利用を通じて、ＬＴ１００９は、親和性が約８〜５０ｎＭであるＳ１Ｐ受容体よりも、Ｓ１Ｐに対してより高い結合親和性（１００ｐＭ未満）を有することが判明した。さらにＬＴ１００９は、７０種類の生物活性脂質種に対して交差反応をしないことが判明した。したがってＬＴ１００９は、Ｓ１Ｐに対して非常に特異的である。
【０１５７】
実施例５：ＬＴ１００９の第一相ヒト臨床試験結果
この実施例では、多中心非盲検単一アーム第一相投与量増加試験をＳｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（ＬＴ１００９）について行った結果のうちいくつかを記述する。この試験においては、単一治療薬としてＳｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（ＬＴ１００９）を、毎週静脈内に注入することによって、進行した難治性の固形腫瘍（腎臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳腫瘍、メラノーマ腫瘍および唾液腺腫瘍）に罹患している３０人の患者に対して投与した。本試験の目的には、Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂの安全性、耐性、および用量制限毒性（ただし、存在する場合）を明らかにすることが含まれる。試験投与量は、１、３、１０、１７、および２４ｍｇ／ｋｇであった。Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂの投与は、サイクル１では、１日目、１５日目、２２日目および２９日目に行い、その後の全サイクルでは毎週行った（１サイクル＝４週）。初期、Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂの点滴は９０分かけて行い、その後投与時間を短縮することを容認した。患者サンプルからのＳ１Ｐの逐次測定、絶対リンパ球カウントの経時的評価、および一連のバイオマーカー（ＶＥＧＦ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＰＩＧＦ−１）の定期的測定により、薬力学作用を評価した。
【０１５８】
本試験に登録した前記３０人の患者のうち、２８人が処置を受け、２１人が試験を完了した。試験中、重篤な悪影響は観察されず、投与量低減は不要であった。最高投与量（２４ｍｇ／ｋｇ）を９人の患者に投与した際の点滴関連反応の結果、投与中断が２回発生した。しかし、これらの反応は、予防的治療および／または毎週の点滴継続と共に改善した。ごく一部の患者において他の悪影響が見られた（下痢（３人の患者）、嘔吐（３人の患者）、および貧血（１人の患者））。
【０１５９】
患者に２４ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した後１〜２４時間以内に、絶対リンパ球カウントが平均で４８％急激に低下した。これらの患者において、７日間でリンパ球カウントが少なくとも部分的に回復した。これより低い投与量の患者については、１〜２４時間後のリンパ球カウントの評価は行わなかった。その代わりに、リンパ球カウントを毎週平均として評価した。その結果、投与量に依存したリンパ球カウントの低下がみられた。
【０１６０】
タンパク質バイオマーカーＶＥＧＦ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＰＩＧＦ−１を投与後７日間測定した。その結果、試験時におけるどの時点においても、いずれのマーカについても顕著な差はみられなかった。
【０１６１】
合計すなわち絶対Ｓ１Ｐは、投与量に依存して顕著に増加した（図２上を参照）。しかし、投与量が変化しても、生物活性の、すなわち「遊離した」Ｓ１Ｐの量に顕著な変化はみられなかった（図２下を参照）。スフィンゴ脂質代謝経路の酵素のモジュレータの併用治療により、投与量に依存した絶対Ｓ１Ｐレベルの増加を低減または軽減させることができるであろう。
【０１６２】
この試験から、Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（ＬＴ１００９）は全般的に極めて耐性が高く、また毎週のスケジュールで良好に投与できることが分かった。意義深いことに、臨床効果の証拠も観察された。例えば、１人のカルチノイド腫瘍患者に対して毎週３ｍｇ／ｋｇの投与を行ったところ、２００８年９月の初期治療から安定した病態を示した。多くの他の患者においても、安定した病態が長期にわたってみられた（例えば、腺様嚢胞がん患者において１２ヶ月、メラノーマが進行した患者（６ヶ月）において４〜６ヶ月、乳がん、直腸癌および腎臓癌患者（４ヶ月）において４〜６ヶ月）。
【０１６３】
本明細書において記載し、主張する組成物および方法の全ては、本開示内容に照らして過度の実験を行うことなく、作り、実行することができる。本発明の組成物および方法について、好ましい実施形態を記載してきたが、該組成物および方法に変形を加えてもよいことは当業者には明らかである。添付の特許請求の範囲によって定義されるように、当業者に明白な同様の代替物および改変の全ては、本発明の精神および範囲内であると考えられる。
【０１６４】
本明細書に記載した全ての特許、特許出願および刊行物は、本発明が属する分野の技術者のレベルを示している。全ての特許、特許出願および刊行物（優先権または別の利益を主張するものを含む）は、個々の刊行物が具体的かつ個別に引用することにより本明細書の一部とされることが示されたのと同程度に引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１６５】
本明細書において例示的に記載した本発明は、本明細書において具体的に開示されていない任意の要素の不在下でも適切に実施し得る。よって、例えば、本明細書におけるいずれの場合においても、用語「含んでなる」、「から本質的になる」および「からなる」はいずれも、残る２つの用語のいずれかと置き換えてよい。使用した用語および表現は、限定ではなく説明の言葉とし用いられ、かかる用語および表現の使用において、示しまたは記載した特徴の均等物またはその一部分を排除する意図はなく、主張した本発明の範囲内で様々な改変が可能であることが認識される。従って、本発明を好ましい実施形態に従って具体的に開示してきたが、当業者ならば本明細書に開示した概念の任意選択の特徴、改良および変形を用い得ること、そしてかかる改良および変形は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の精神および範囲内であると考えられることを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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