(57)【要約】本明細書において、抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその断片（完全ヒト、複合改変されたヒト、ヒト化、モノクローナル、ならびにポリクローナル抗ＤＥｓｐＲ抗体、およびこれらの断片を含む）を含む新規の組成物と、様々な治療用途におけるその使用方法とを提供する。本明細書に記載する抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその断片を含む組成物は、血管新生のＤＥｓｐＲ標的化分子イメージングなどの診断およびイメージング方法において、そしてコンパニオン診断および／またはインビボの非侵襲的イメージングおよび／またはアセスメントに有用である。2013538191.tif 000035
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＥｓｐＲ（二重エンドセリン／ＶＥＧＦシグナルペプチド受容体）に特異的に結合し、かつＤＥｓｐＲ生物活性を低減または阻害する、単離された抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項２】
前記ＤＥｓｐＲが、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項３】
SEQ ID NO:１の残基１〜９を含むＤＥｓｐＲのエピトープに特異的に結合する、請求項１または２に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項４】
ＶＥＧＦシグナルペプチド（ＶＥＧＦｓｐ）の結合部位において、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項５】
前記ＶＥＧＦシグナルペプチドがSEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項６】
前記抗ＤＥｓｐＲ抗体がモノクローナル抗体またはその抗体断片である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項７】
SEQ ID NO:４の配列を含む可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項８】
SEQ ID NO:９の配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖アミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項９】
前記抗ＤＥｓｐＲ抗体がヒト化抗体またはその抗体断片である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項１０】
SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む、請求項１〜６または９のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項１１】
SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、およびSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む、請求項１〜６または９〜１０のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項１２】
前記抗ＤＥｓｐＲ抗体が、複合抗体またはその抗体断片である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項１３】
前記抗ＤＥｓｐＲ複合抗体または抗体断片が、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む、請求項１２に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項１４】
前記抗ＤＥｓｐＲ複合抗体または抗体断片が、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、およびSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む、請求項１２または１３に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項１５】
前記抗ＤＥｓｐＲ複合抗体または抗体断片が、SEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項１６】
前記抗ＤＥｓｐＲ複合抗体または抗体断片が、SEQ ID NO:１８およびSEQ ID NO:１９からなる群から選択される可変軽（ＶＬ）鎖アミノ酸配列を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項１７】
ハイブリドーマ７Ｃ５Ｃ５５またはＧ１２Ｅ８によって発現または産生される抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項１８】
ハイブリドーマ７Ｃ５Ｂ２、７Ｃ５Ｃ５５、またはＧ１２Ｅ８によって発現または産生される抗体によって示される結合パターンと類似した結合パターンを示す、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項１９】
ハイブリドーマ７Ｃ５Ｂ２、７Ｃ５Ｃ５５、またはＧ１２Ｅ８によって発現または産生される抗体によって示されるアビディティと類似したアビディティを示す、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項２０】
ハイブリドーマ７Ｃ５Ｂ２、７Ｃ５Ｃ５５、またはＧ１２Ｅ８によって発現または産生される抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項２１】
ハイブリドーマ７Ｃ５Ｃ５５またはＧ１２Ｅ８によって発現または産生される抗体の１つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項２２】
ハイブリドーマ７Ｃ５Ｂ２、７Ｃ５Ｃ５５、またはＧ１２Ｅ８によって発現または産生されるモノクローナル抗体の１つまたは複数の生物学的特徴を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項２３】
ハイブリドーマ７Ｃ５Ｂ２、７Ｃ５Ｃ５５、またはＧ１２Ｅ８によって発現または産生される抗体により結合されるＤＥｓｐＲのエピトープに特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項２４】
前記抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ'断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、単鎖断片、ダイアボディ、または直鎖抗体である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項２５】
抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片に結合されてＤＥｓｐＲに特異的な免疫結合体を形成する薬剤をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項２６】
前記抗体またはその抗体断片に結合される薬剤が、化学療法剤、毒素、放射性同位元素、小分子、ｓｉＲＮＡ、ナノ粒子、または微小気泡である、請求項２５に記載の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載のＤＥｓｐＲに特異的に結合する抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項２８】
血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害を有する対象において血管新生を阻害する方法であって、治療的に有効な量の請求項２７に記載の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項２９】
前記血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害が、癌または腫瘍である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害が、加齢性黄斑変性症、頸動脈疾患、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、神経変性障害、アルツハイマー病、肥満、子宮内膜症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、眼球の新血管発生、血管新生緑内障、骨粗鬆症、および再狭窄からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
癌または腫瘍を有する対象において腫瘍細胞侵襲性を阻害する方法であって、治療的に有効な量の請求項２７に記載の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３２】
１つまたは複数の化学療法剤、血管新生阻害剤、細胞毒性剤、または抗増殖剤の投与をさらに含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、それを必要としている対象において腫瘍成長を阻害し、腫瘍サイズまたは腫瘍転移を低減する方法であって、治療的に有効な量の請求項２７に記載の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３４】
前記ＤＥｓｐＲの発現および／または機能が、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、内皮前駆細胞、炎症細胞、腫瘍間質細胞、腫瘍血管系細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記腫瘍血管系細胞が、内皮細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、外膜細胞、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、腫瘍抵抗性および腫瘍再発を阻害する方法であって、治療的に有効な量の請求項２７に記載の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３７】
前記ＤＥｓｐＲの発現および／または機能が、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
腫瘍細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、癌細胞のオートファジーの促進により癌の進行を阻害する方法であって、治療的に有効な量の請求項２７に記載の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３９】
前記ＤＥｓｐＲの発現および／または機能が、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、オートファジーを促進する、あるいは細胞内有害物質または病原体の蓄積を低減する方法であって、治療的に有効な量の請求項２７に記載の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項４１】
前記対象がアルツハイマー病またはハンチントン病を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＤＥｓｐＲ標的化による分子イメージング方法であって、標的部分に結合される有効量の請求項２７に記載の医薬組成物を投与する工程と、前記標的部分に結合された請求項２７に記載の医薬組成物の有無を、分子イメージングを用いて決定する工程とを含む、方法。
【請求項４３】
前記分子イメージングが、造影超音波イメージング、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）、近赤外線イメージング、または光音響イメージングである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記標的部分が、抗体、ＤＥｓｐＲ結合ペプチドリガンド、小分子、ナノ粒子、ポリマー、アプタマー、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＤＥｓｐＲ発現の決定により腫瘍を層別化または分類する方法であって、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のＤＥｓｐＲに特異的に結合する抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片と細胞とを接触させる工程と、前記接触の後に、前記抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片が前記細胞に結合するかどうかを決定する工程とを含み、前記ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片の前記細胞への結合により、前記細胞がＤＥｓｐＲを発現することが示される、方法。
【請求項４６】
前記細胞が、腫瘍細胞、内皮細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、外膜細胞、腫瘍間質細胞、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記腫瘍間質細胞が、線維芽細胞、筋線維芽細胞、炎症細胞、星状細胞、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記接触される細胞が、組織生検、パラフィン包埋切片、または凍結切片内にある、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ＤＥｓｐＲ標的化ソノポレーションにより治療薬の送達を増強するための方法であって、標的化超音波送達を用いて、有効量の請求項２７に記載の医薬組成物および治療薬を、それを必要としている対象に送達する工程を含み、前記治療薬の送達が、請求項２７に記載の医薬組成物の非存在下での治療薬の送達に対して増強される、方法。
【請求項５０】
前記治療薬が、化学療法剤、小分子、ペプチド、またはアプタマーである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＤＥｓｐＲ標的化ソノポレーションにより治療薬の毒性を低減するための方法であって、標的化超音波送達を用いて、有効量の請求項２７に記載の医薬組成物および治療薬を、それを必要としている対象に送達する工程を含み、前記治療薬の毒性が、請求項２７に記載の医薬組成物の非存在下での治療薬の送達に対して低減される、方法。
【請求項５２】
前記治療薬が、化学療法剤、小分子、ペプチド、またはアプタマーである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ＤＥｓｐＲ標的化分子イメージングと、治療薬のＤＥｓｐＲ標的化送達とを組み合わせるための方法であって、有効量の治療薬および標的部分に結合される請求項２７に記載の医薬組成物を対象に投与する工程と、分子イメージングを用いて、標的部分に結合された請求項２７に記載の医薬組成物の有無を決定する工程とを含む、方法。
【請求項５４】
前記分子イメージングが、造影超音波イメージング、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）、近赤外線イメージング、または光音響イメージングである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記治療薬が、化学療法剤、小分子、ペプチド、またはアプタマーである、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５６】
血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害を有する対象において血管新生を阻害する際に使用するための、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害が、癌または腫瘍である、請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
前記血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害が、加齢性黄斑変性症、頸動脈疾患、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、神経変性障害、アルツハイマー病、肥満、子宮内膜症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、眼球の新血管発生、血管新生緑内障、骨粗鬆症、および再狭窄からなる群から選択される、請求項５７に記載の使用。
【請求項５９】
癌または腫瘍を有する対象において腫瘍細胞侵襲性を阻害する際に使用するための、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
１つまたは複数の化学療法剤、血管新生阻害剤、細胞毒性剤、または抗増殖剤をさらに含む、請求項５９に記載の使用。
【請求項６１】
細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、それを必要としている対象において腫瘍成長を阻害し、そして腫瘍サイズまたは腫瘍転移を低減する際に使用するための、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
前記ＤＥｓｐＲの発現および／または機能が、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、内皮前駆細胞、炎症細胞、腫瘍間質細胞、腫瘍血管系細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される、請求項６１に記載の使用。
【請求項６３】
前記腫瘍血管系細胞が、内皮細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、外膜細胞、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項６２に記載の使用。
【請求項６４】
細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、それを必要としている対象において腫瘍抵抗性および腫瘍再発を阻害する際に使用するための、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記ＤＥｓｐＲの発現および／または機能が、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される、請求項６４に記載の使用。
【請求項６６】
腫瘍細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、それを必要としている対象において癌細胞のオートファジーの促進により癌の進行を阻害する際に使用するための、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
前記ＤＥｓｐＲの発現および／または機能が、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
ＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、それを必要としている対象においてオートファジーを促進する、あるいは細胞内有害物質または病原体の蓄積を低減する際に使用するための、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記対象がアルツハイマー病またはハンチントン病を有する、請求項６８に記載の使用。
【請求項７０】
標的化超音波送達を用いて、それを必要としている対象に対して、ＤＥｓｐＲ標的化ソノポレーションにより治療薬の送達を増強する際に使用するための、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
前記治療薬が、化学療法剤、小分子、ペプチド、またはアプタマーである、請求項７０に記載の使用。
【請求項７２】
標的化超音波送達を用いて、それを必要としている対象に対して、ＤＥｓｐＲ標的化ソノポレーションにより治療薬の毒性を低減する際に使用するための、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項７３】
前記治療薬が、化学療法剤、小分子、ペプチド、またはアプタマーである、請求項７２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で２０１０年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／３６７，２０６号（その内容は、参照によってその全体が本明細書中に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＤＥｓｐＲに対するモノクローナル抗体と、病的血管新生および腫瘍細胞侵襲性の阻害における治療法として、そして分子イメージングおよび他の治療薬の標的化送達のための診断薬および標的剤としてのその使用とに関する。
【０００３】
政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与された契約番号ＲＲ０２５７７１の下で政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
背景
腫瘍形成における血管新生スイッチの重要な役割の確立は、抗血管新生療法の開発の背後にある理論的根拠を明白にした（Ｈａｎａｈａｎ  ＆  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ２００７）。残念ながら、副作用からの罹患率を増大させることなく癌を休止状態の管理しやすい慢性疾患まで軽減するために、全ての癌型に対して抗血管新生療法の長期の効力を獲得する能力はまだ達成されていない（Ｌｏｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、Ｆｅｒｒａｒａ  ２００９、Ａｂｄｏｌｌａｈｉ  ＆  Ｆｏｌｋｍａｎ  ２００９、Ｂｅｒｇｅｒｓ  ＆  Ｈａｎａｈａｎ  ２００８）。
【０００５】
累積的な観察によって、ＦＤＡに認可された３つのＶＥＧＦ経路阻害剤（抗ＶＥＧＦベバシズマブまたはＡｖａｓｔｉｎ、抗ＶＥＧＦＲ２スニチニブ、およびソラファニブ（ｓｏｒａｆａｎｉｂ））は全て、腫瘍の停滞（ｓｔａｓｉｓ）または収縮の形で、そして、全部ではないがほとんどの癌型が病的血管新生を示すにもかかわらず特定の癌のみに対して、一時的な改善をもたらすだけであることが示されている（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ２００５、Ｂｅｒｇｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈａｎａｈａｎ  ２００８）。さらに、抗ＶＥＧＦ経路療法では、前臨床研究において原発腫瘍の成長および転移が低減されたが（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ＆  Ｆｅｒｒａｒａ  ２００８）、最近のマウス腫瘍モデル研究では、スニチニブおよび抗ＶＥＧＦＲ２抗体、ＤＣ１０１は、原発腫瘍の成長の阻害にもかかわらず、腫瘍細胞の転移を増大し、場合によっては全生存を増大したと報告されている（Ｅｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ｐａｅｚ−Ｒｉｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。この「抗血管新生療法の難問」への対処として、累積的な観察によって、ａ）代替の血管新生促進経路の活性化および／または上方制御、ｂ）骨髄由来の血管新生促進細胞の補充、ｃ）ＶＥＧＦシグナル伝達の必要性を少なくする腫瘍血管系の周皮細胞の被覆度の増大、ｄ）絶対的な新血管発生がなくても正常組織の血管系へのアクセスを提供するための、侵襲および転移の活性化および増強［内因性抵抗のため］、ｅ）重複性血管新生促進シグナルの既存の多重度、ｆ）既存の炎症細胞媒介性の血管保護、ｇ）腫瘍血管過少、ならびにｈ）必要な血管新生を伴わない、正常血管の侵襲性および転移性の吸収（ｃｏ−ｏｐｔｉｏｎ）（Ｂｅｒｇｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈａｎａｈａｎ  ２００８）などの、回避的（ｅｖａｓｉｖｅ）および内因性の抵抗のいくつかのメカニズムが低減された（Ｌｏｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、Ｆｅｒｒａｒａ  ２００９、Ａｂｄｏｌｌａｈｉ  ＆  Ｆｏｌｋｍａｎ  ２００９、Ｂｅｒｇｅｒｓ  ＆  Ｈａｎａｈａｎ  ２００８）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書には、抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその断片（完全ヒト、複合改変された（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ヒト、ヒト化、モノクローナル、およびポリクローナル抗ＤＥｓｐＲ抗体およびこれらの断片を含む）を含む新規の組成物と、１）癌の治療に関連する抗血管新生療法および抗腫瘍細胞侵襲性、２）これらの血管疾患の治療に関連する抗血管新生アプローチ（ここで、病的血管新生は、頸動脈疾患、栄養血管の新血管発生（ｖａｓａ  ｖａｓｏｒｕｍ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）（従って、脳卒中に影響を与える）、および不安定プラークの新血管発生（従って、例えば心疾患に影響を与える）などにおける発症または進行の中で役割を果たす）、および３）神経変性疾患に関連するオートファジー促進（ｐｒｏ−ａｕｔｏｐｈａｇｙ）アプローチ（ここで、オートファジーの増大は、アルツハイマー病、ハンチントン病などにおける毒性産物またはミスフォールドされたタンパク質または異常タンパク質の蓄積を防止することができる）を含むがこれらに限定されない様々な用途におけるその使用方法とが記載されている。
【０００７】
さらに、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその断片を含む組成物は、血管新生のＤＥｓｐＲ標的化分子イメージングなどの診断およびイメージング方法において有用であり、例えば、治療に対する応答、腫瘍「血管新生スイッチ」のインビボ検出、または血管擬態（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｍｉｍｉｃｒｙ）のモニタリングにおいて使用することができる。抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその断片を含む組成物は、新規のコンパニオン診断および／またはインビボの非侵襲的イメージングおよび／またはアセスメントのために有用である。さらに、抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその断片を含む組成物を用いる治療薬の標的化送達の付加価値のある利益は、特に、全身毒性を最小限にしながら最大効力が必要とされる癌において重要である。特に、このような診断は、個別化医療で使用するための抗血管新生療法に対する新規のアプローチを提供する。従って、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその断片を含む組成物は、毒素、薬物、小分子、ペプチド、融合タンパク質、キメラタンパク質、ナノ粒子、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの形態で、治療の標的特異的送達のため、ならびに本明細書では「セラノスティクス（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）」と呼ばれる組み合わせの標的特異的診断および治療のための標的手段および／またはモジュールを構成する。
【０００８】
従って、本明細書において、いくつかの態様では、ＤＥｓｐＲ（二重エンドセリン／ＶＥＧＦシグナルペプチド受容体）に特異的に結合し、ＤＥｓｐＲ生物活性を低減または阻害する、単離された抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片が提供される。
【０００９】
本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含むＤＥｓｐＲに特異的に結合する。これらの態様のいくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:１の残基１〜９を含むＤＥｓｐＲのエピトープに特異的に結合する。これらの態様のいくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:１の残基１〜９から本質的になるＤＥｓｐＲのエピトープに特異的に結合する。これらの態様のいくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:１の残基１〜９からなるＤＥｓｐＲのエピトープに特異的に結合する。
【００１０】
本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、ＶＥＧＦシグナルペプチド（ＶＥＧＦｓｐ）の結合部位においてＤＥｓｐＲに特異的に結合する。いくつかのこのような実施形態では、ＶＥＧＦシグナルペプチドは、SEQ ID NO:２のアミノ酸配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、ＶＥＧＦシグナルペプチドは、本質的に、SEQ ID NO:２のアミノ酸配列からなる。いくつかのこのような実施形態では、ＶＥＧＦシグナルペプチドは、SEQ ID NO:２のアミノ酸配列からなる。
【００１１】
本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体はモノクローナル抗体またはその抗体断片である。
【００１２】
本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:４の配列を含む可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列を含む。
【００１３】
本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:９の配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖アミノ酸配列を含む。
【００１４】
本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:４の配列を含む可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列と、SEQ ID NO:９の配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖アミノ酸配列とを含む。
【００１５】
本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体はヒト化抗体またはその抗体断片である。
【００１６】
本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域は、本質的に、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列からなる。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列からなる。
【００１７】
本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、およびSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域は、本質的に、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、およびSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列からなる。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、およびSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列からなる。
【００１８】
本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域と、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、およびSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域とを含む。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域は、本質的に、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列からなる。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列からなる。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域は、本質的に、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、およびSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列からなる。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、およびSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列からなる。
【００１９】
本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体は、複合抗体またはその抗体断片である。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ複合抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ複合抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列から本質的になる１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ複合抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列からなる１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ複合抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、およびSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ複合抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、およびSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列から本質的になる１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ複合抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、およびSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列からなる１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む。
【００２０】
本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体は、SEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列を含む複合抗体またはその抗体断片である。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体は、SEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列から本質的になる複合抗体またはその抗体断片である。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体は、SEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列からなる複合抗体またはその抗体断片である。
【００２１】
本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体は、SEQ ID NO:１８およびSEQ ID NO:１９からなる群から選択される可変軽（ＶＬ）鎖アミノ酸配列を含む複合抗体またはその抗体断片である。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体は、SEQ ID NO:１８およびSEQ ID NO:１９からなる群から選択される可変軽（ＶＬ）鎖アミノ酸配列から本質的になる複合抗体またはその抗体断片である。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体は、SEQ ID NO:１８およびSEQ ID NO:１９からなる群から選択される可変軽（ＶＬ）鎖アミノ酸配列からなる複合抗体またはその抗体断片である。
【００２２】
これらの態様の他の実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、ハイブリドーマ７Ｃ５Ｃ５５またはＧ１２Ｅ８によって発現または産生される抗体である。
【００２３】
これらの態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、ハイブリドーマ７Ｃ５Ｂ２、７Ｃ５Ｃ５５、またはＧ１２Ｅ８によって発現または産生される抗体によって示される結合パターンと類似した結合パターンを示す。これらの態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、ハイブリドーマ７Ｃ５Ｂ２、７Ｃ５Ｃ５５、またはＧ１２Ｅ８によって発現または産生される抗体によって示される活性と類似した活性を示す。これらの態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、ハイブリドーマ７Ｃ５Ｂ２、７Ｃ５Ｃ５５、またはＧ１２Ｅ８によって発現または産生される抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合する。
【００２４】
これらの態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、ハイブリドーマ７Ｃ５Ｃ５５またはＧ１２Ｅ８によって発現または産生される抗体の１つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列を含む。これらの態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、ハイブリドーマ７Ｃ５Ｂ２、７Ｃ５Ｃ５５、またはＧ１２Ｅ８によって発現または産生されるモノクローナル抗体の１つまたは複数の生物学的特徴を有する。これらの態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、ハイブリドーマ７Ｃ５Ｂ２、７Ｃ５Ｃ５５、またはＧ１２Ｅ８によって発現または産生される抗体により結合されるＤＥｓｐＲのエピトープに特異的に結合する。
【００２５】
本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ'断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、単鎖断片、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、または直鎖抗体である。
【００２６】
本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片はさらに、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片に結合されてＤＥｓｐＲに特異的な免疫結合体を形成する薬剤を含む。いくつかのこのような実施形態では、抗体またはその抗体断片に結合される薬剤は、化学療法剤、毒素、放射性同位元素、小分子、ｓｉＲＮＡ、ナノ粒子、または微小気泡である。
【００２７】
いくつかの態様では、本明細書において、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む医薬組成物が提供される。
【００２８】
いくつかの態様では、本明細書において、血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害を有する対象において血管新生を阻害する方法が提供されており、本方法は、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む治療的に有効な量の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害は、癌または腫瘍である。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害は、加齢性黄斑変性症、頸動脈疾患、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、神経変性障害、アルツハイマー病、肥満、子宮内膜症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、眼球の新血管発生（ｏｃｕｌａｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、血管新生緑内障、骨粗鬆症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｓｏｓｉｓ）、および再狭窄からなる群から選択される。
【００２９】
いくつかの態様では、本明細書において、癌または腫瘍を有する対象において腫瘍細胞侵襲性を阻害する方法が提供されており、本方法は、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む治療的に有効な量の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、本方法はさらに、１つまたは複数の化学療法剤、血管新生阻害剤、細胞毒性剤、または抗増殖剤の投与を含む。
【００３０】
いくつかの態様では、本明細書において、細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、腫瘍または転移を有する対象において腫瘍成長を阻害し、腫瘍サイズまたは腫瘍転移を低減する方法が提供されており、本方法は、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む治療的に有効な量の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲの発現および／または機能は、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、内皮前駆細胞、炎症細胞、腫瘍間質細胞、腫瘍血管系細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される。いくつかのこのような実施形態では、腫瘍血管系細胞は、内皮細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、外膜細胞、またはこれらの任意の組み合わせである。
【００３１】
いくつかの態様では、本明細書において、細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって対象において腫瘍抵抗性および腫瘍再発を阻害する方法が提供されており、本方法は、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む治療的に有効な量の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲの発現および／または機能は、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される。
【００３２】
いくつかの態様では、本明細書において、腫瘍細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、癌細胞のオートファジーの促進により癌の進行を阻害する方法が提供されており、本方法は、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む治療的に有効な量の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲの発現および／または機能は、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される。
【００３３】
いくつかの態様では、本明細書において、細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、オートファジーを促進する、あるいは細胞内有害物質または病原体の蓄積を低減する方法が提供されており、本方法は、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む治療的に有効な量の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、対象はアルツハイマー病またはハンチントン病を有する。
【００３４】
いくつかの態様では、本明細書において、標的ＤＥｓｐＲによる分子イメージング方法が提供されており、本方法は、標的部分に結合されたＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む有効量の医薬組成物を投与することと、標的部分に結合された抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片の有無を、分子イメージングを用いて決定することとを含む。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、分子イメージングは、造影超音波イメージング、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）、近赤外線イメージング、または光音響イメージングである。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、標的部分は、抗体、ＤＥｓｐＲ結合ペプチドリガンド、小分子、ナノ粒子、ポリマー、アプタマー、またはこれらの任意の組み合わせである。
【００３５】
いくつかの態様では、本明細書において、ＤＥｓｐＲ発現の決定により腫瘍を層別化または分類する方法が提供されており、本方法は、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかと細胞を接触させることと、前記接触後に、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片が細胞に結合するかどうかを決定することとを含み、ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片の細胞への結合により、細胞がＤＥｓｐＲを発現することが示される。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、細胞は、腫瘍細胞、内皮細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、外膜細胞、腫瘍間質細胞、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかのこのような実施形態では、腫瘍間質細胞は、線維芽細胞、筋線維芽細胞、炎症細胞、星状細胞、またはこれらの任意の組み合わせである。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、接触される細胞は、組織生検、パラフィン包埋切片、または凍結切片内にある。
【００３６】
いくつかの態様では、本明細書において、ＤＥｓｐＲ標的化ソノポレーションにより治療薬の送達を増強するための方法が提供されており、本方法は、標的化超音波送達を用いて、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む有効量の医薬組成物および治療薬を、それを必要としている対象に送達することを含み、治療薬の送達は、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む医薬組成物の非存在下での治療薬の送達に対して増強または増大される。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、治療薬は、化学療法剤、小分子、ペプチド、またはアプタマーである。
【００３７】
また、本明細書において、いくつかの態様では、ＤＥｓｐＲ標的化ソノポレーションにより治療薬の毒性を低減するための方法が提供されており、本方法は、標的化超音波送達を用いて、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む有効量の医薬組成物および治療薬を、それを必要としている対象に送達することを含み、治療薬の毒性は、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む医薬組成物の非存在下での治療薬の送達に対して低減される。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、治療薬は、化学療法剤、小分子、ペプチド、またはアプタマーである。
【００３８】
いくつかの態様では、本明細書において、ＤＥｓｐＲ標的化分子イメージングと、治療薬のＤＥｓｐＲ標的化送達とを組み合わせるための方法が提供される。これらの方法は、有効量の治療薬と、標的部分に結合される本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む医薬組成物とを対象に投与することと、分子イメージングを用いて、標的部分に結合された本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片の有無を決定することとを含む。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、分子イメージングは、造影超音波イメージング、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）、近赤外線イメージング、または光音響イメージングである。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、治療薬は、化学療法剤、小分子、ペプチド、またはアプタマーである。
【００３９】
その他の態様では、本明細書において、血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害を有する対象において血管新生を阻害する際に使用するための、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む医薬組成物が提供される。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害は、癌または腫瘍である。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害は、加齢性黄斑変性症、頸動脈疾患、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、神経変性障害、アルツハイマー病、肥満、子宮内膜症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、眼球の新血管発生、血管新生緑内障、骨粗鬆症、および再狭窄からなる群から選択される。
【００４０】
いくつかの態様では、本明細書において、癌または腫瘍を有する対象において腫瘍細胞侵襲性を阻害する際に使用するための、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む医薬組成物が提供される。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、医薬組成物はさらに、１つまたは複数の化学療法剤、血管新生阻害剤、細胞毒性剤、または抗増殖剤を含む。
【００４１】
いくつかの態様では、本明細書において、細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、それを必要としている対象において腫瘍成長を阻害し、そして腫瘍サイズまたは腫瘍転移を低減する際に使用するための、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む医薬組成物が提供される。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲの発現および／または機能は、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、内皮前駆細胞、炎症細胞、腫瘍間質細胞、腫瘍血管系細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される。いくつかのこのような実施形態では、腫瘍血管系細胞は、内皮細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、外膜細胞、またはこれらの任意の組み合わせである。
【００４２】
いくつかの態様では、本明細書において、細胞中のＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、それを必要としている対象において腫瘍抵抗性および腫瘍再発を阻害する際に使用するための、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む医薬組成物が提供される。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲの発現および／または機能は、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される。
【００４３】
いくつかの態様では、本明細書において、腫瘍細胞中のおＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、それを必要としている対象において癌細胞のオートファジーの促進により癌の進行を阻害する際に使用するための、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む医薬組成物が提供される。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲの発現および／または機能は、腫瘍細胞、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、癌幹細胞、転移性腫瘍細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて阻害される。
【００４４】
いくつかの態様では、本明細書において、ＤＥｓｐＲの発現および／または機能を阻害することによって、それを必要としている対象においてオートファジーを促進する、あるいは細胞内有害物質または病原体の蓄積を低減する際に使用するための、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む医薬組成物が提供される。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、対象はアルツハイマー病またはハンチントン病を有する。
【００４５】
いくつかの態様では、本明細書において、標的化超音波送達を用いて、それを必要としている対象に対して、ＤＥｓｐＲ標的化ソノポレーションにより治療薬の送達を増強する際に使用するための、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む医薬組成物が提供される。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、治療薬は化学療法剤、小分子、ペプチド、またはアプタマーである。
【００４６】
いくつかの態様では、本明細書において、標的化超音波送達を用いて、それを必要としている対象に対して、ＤＥｓｐＲ標的化ソノポレーションにより治療薬の毒性を低減する際に使用するための、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片のいずれかを含む医薬組成物が提供される。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、治療薬は、化学療法剤、小分子、ペプチド、またはアプタマーである。
【００４７】
定義
「ＤＥｓｐＲアンタゴニスト」は、ＤＥｓｐＲ活性（エンドセリン−１またはＶＥＧＦｓｐに対するその結合を含む）を中和、遮断、阻害、抑止、低減または妨害することができる分子を指す。ＤＥｓｐＲアンタゴニストは、抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗原結合断片、受容体分子、ならびにこれらの誘導体を含み、これらは、ＤＥｓｐＲに特異的に結合することにより、ＶＥＧＦｓｐおよびエンドセリン−１などのそのリガンドに対する結合を阻害、防止、または隔離する。
【００４８】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体（全長またはインタクトモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ならびに所望の生物活性および特異性を示す限りは抗体断片（以下を参照）を含む。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、結合部位を有するポリペプチドドメインが選択的に結合することができる生体分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物）を指す。標的は、例えば、細胞内標的（例えば、細胞内タンパク質標的）、または細胞表面標的（例えば、膜タンパク質、受容体タンパク質）であり得る。好ましくは、標的は、細胞表面タンパク質などの細胞表面標的である。
【００５０】
「特異性」という用語は、本明細書に記載されるような抗体またはその抗体断片が結合することのできる異なるタイプの抗原または抗原決定基の数を指す。抗体またはその抗体断片の特異性は、アフィニティおよび／またはアビディティに基づいて決定することができる。抗原と抗原結合タンパク質との解離平衡定数（ＫＤ）によって表されるアフィニティは、抗原決定基と、抗体またはその抗体断片などの抗原結合タンパク質の抗原結合部位との間の結合強度の尺度であり、ＫＤの値が低いほど、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合強度が強い。あるいは、アフィニティは、１／ＫＤであるアフィニティ定数（ＫＡ）で表すこともできる。当業者には明らかであるように、アフィニティは、関心対象の特異的抗原に応じて、それ自体が既知の方法で決定することができる。従って、本明細書において定義されるような抗体またはその抗体断片は、前記アミノ酸配列またはポリペプチドが別の標的またはポリペプチドに結合するアフィニティよりも少なくとも１０倍、例えば、少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、そして最大１００００倍またはそれ以上大きいアフィニティ（上記のとおりであり、例えば、ＫＤ値で適切に表現される）で第１の抗原に結合する場合に、第２の標的または抗原と比較して、第１の標的または抗原に「特異的である」といわれる。
【００５１】
アビディティは、抗原結合分子（本明細書に記載される抗体またはその抗体断片など）と、関連の抗原との間の結合の強度の尺度である。アビディティは、抗原決定基と、抗原結合分子上のその抗原結合部位との間のアフィニティ、および抗原結合分子上に存在する関連の結合部位の数の両方に関連する。通常、抗原結合タンパク質（本明細書に記載される抗体またはその抗体断片など）は、１０−５〜１０−１２モル／リットル以下、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、より好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）（すなわち１０５〜１０１２リットル／モル以上、好ましくは１０７〜１０１２リットル／モル以上、より好ましくは１０８〜１０１２リットル／モルの結合定数（ＫＡ））で、その同族または特異的抗原に結合し得る。１０−４モル／リットルよりも大きいＫＤ値（あるいは１０４Ｍ−１よりも小さいＫＡ値）は一般にどれも非特異的結合を示すと考えられる。有意である（例えば、特異的）と考えられる生物学的相互作用に対するＫＤは、通常、１０−１０Ｍ（０．１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲である。相互作用が強いほど、そのＫＤは低い。好ましくは、本明細書に記載される抗体またはその抗体断片上の結合部位は、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、たとえば５００ｐＭ未満アフィニティで所望の抗原に結合し得る。抗原結合タンパク質の抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析および／または競合的結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイ、ならびに当該技術分野においてそれ自体が既知のこれらの種々の変化形、そして本明細書中で言及されるその他の技術を含む、それ自体が既知の適切な方法で決定することができる。
【００５２】
従って、本明細書で使用される場合、「選択的に結合」または「特異的に結合」は、本明細書に記載される抗体またはその抗体断片が、１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）以下、例えば、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ以下のＫＤで、細胞表面に存在する分子などの標的に結合する能力を指す。特異的な結合は、例えば、ポリペプチド剤のアフィニティおよびアビディティ、ならびにポリペプチド剤の濃度によって影響され得る。当業者は、適切な細胞結合アッセイにおけるポリペプチド剤の滴定などの任意の適切な方法を用いて、本明細書に記載されるポリペプチド剤が標的に選択的に結合する適切な条件を決定することができる。
【００５３】
本明細書に記載されるように、「抗原」は、抗体またはその抗体断片などのポリペプチド剤上の結合部位によって結合される分子である。通常、抗原は抗体リガンドによって結合され、インビボで抗体応答を上昇させることができる。抗原は、ポリペプチド、タンパク質、核酸または他の分子であり得る。従来の抗体およびその断片の場合、可変ループ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＨ１、Ｈ２、Ｈ３）によって定義される抗体結合部位は、抗原に結合することができる。「抗原決定基」という用語は、抗原結合分子によって、より詳細には前記分子の抗原結合部位によって認識される抗原上のエピトープを指す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」は、連続アミノ酸、またはタンパク質の三次折り畳み構造によって隣接される非連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、通常、変性溶媒にさらされたときに保持されるが、三次折り畳み構造によって形成されるエピトープは、通常、変性溶媒により処理されると失われる。エピトープは、通常、独特の空間配置の少なくとも３、より一般的には少なくとも５、約９、または約８〜１０のアミノ酸を含む。「エピトープ」は、免疫グロブリンＶＨ／ＶＬ対によって従来通りに結合される構造の単位を含む。エピトープは抗体に対する最小限の結合部位を定義し、従って、抗体の特異性の標的を表す。単一ドメイン抗体の場合、エピトープは、単離された状態で可変ドメインによって結合される構造の単位を表す。「抗原決定基」および「エピトープ」という用語は、本明細書では、交換可能に使用することもできる。
【００５５】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原に対するものである。さらに、通常異なる決定因子（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対するものである。「モノクローナル」という修飾語は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されてはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって製造することもできるし、あるいは組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照）によって製造することもできる。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）、またはＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。モノクローナル抗体は、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、およびヒトモノクローナル抗体を含むがこれらに限定されないあらゆる種のものであり得る。
【００５６】
「抗体断片」という用語は、本明細書で使用される場合、インタクト抗体の一部のみを含むタンパク質断片を指し、一般に、インタクト抗体の抗原結合部位を含むことにより、抗原に対する結合能力が保持される。本発明の定義によって包含される抗体断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片、（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ'断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片、（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメイン、ならびにＣＨ１ドメインのＣ末端の１つまたは複数のシステイン残基を有するＦｄ'断片、（ｖ）抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖ断片、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））、（ｖｉｉ）単離ＣＤＲ領域、（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ'断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ'）２断片、（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば、単鎖Ｆｖ、ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：５８７９−５８８３（１９８８））、（ｘ）同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む２つの抗原結合部位を有する「ダイアボディ」（例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書、国際公開第９３／１１１６１号パンフレット、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照）、（ｘｉ）相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「直鎖抗体」（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）、および米国特許第５，６４１，８７０号明細書）が挙げられる。
【００５７】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含有する抗体断片である。この領域は、堅固に結合した（例えば、ｓｃＦｖでは本質的に共有結合であり得る）１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。それは、この配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互に作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を定義するということである。６つのＣＤＲまたはこれらのサブセットは、集合的に、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でも、通常は結合部位全体よりも低いアフィニティであるが、抗原を認識および結合する能力を有する。
【００５８】
本明細書および特許請求の範囲を通して、免疫グロブリン重鎖中の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）（ワールドワイドウェブ上でも入手可能であり、参照によってその全体が本明細書中に明確に援用される）にあるようなＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔのようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基の番号付けを指す。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「抗体可変ドメイン」は、相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）（ＣＤＲ、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、およびフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む、抗体分子の軽鎖および重鎖の一部を指す。ＶＨは重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインを指す。本発明において使用される方法によると、ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７  ａｎｄ  １９９１））に従って定義することができる。抗体または抗原結合断片のアミノ酸の番号付けもＫａｂａｔの番号付けに従う。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」（ＣＤＲ、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）という用語は、その存在が抗原結合のために必要である抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として識別される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔにより定義されるように「相補性決定領域」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基約２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、および／または「高頻度可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基約２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含むことができる。いくつかの場合には、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔに従って定義されるＣＤＲ領域および高頻度可変ループの両方からのアミノ酸を含むことができる。例えば、抗体４Ｄ５の重鎖のＣＤＲＨ１は、アミノ酸２６〜３５を含む。
【００６１】
「フレームワーク領域」（以下、ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、通常、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４として識別される４つのＦＲを有する。ＣＤＲがＫａｂａｔに従って定義される場合、軽鎖ＦＲ残基は、残基約１−２３（ＬＣＦＲ１）、３５−４９（ＬＣＦＲ２）、５７−８８（ＬＣＦＲ３）、おおび９８−１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基中の残基約１−３０（ＨＣＦＲ１）、３６−４９（ＨＣＦＲ２）、６６−９４（ＨＣＦＲ３）、および１０３−１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。ＣＤＲが高頻度可変ループからのアミノ酸残基を含む場合、軽鎖ＦＲ残基は、軽鎖中の残基約１−２５（ＬＣＦＲ１）、３３−４９（ＬＣＦＲ２）、５３−９０（ＬＣＦＲ３）、および９７−１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基中の残基約１−２５（ＨＣＦＲ１）、３３−５２（ＨＣＦＲ２）、５６−９５（ＨＣＦＲ３）、および１０２−１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。いくつかの場合には、ＣＤＲがＫａｂａｔによって定義されるＣＤＲおよび高頻度可変ループのもの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基は、それに応じて調整されるであろう。例えば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６−Ｈ３５を含む場合、重鎖ＦＲ１残基は１−２５の位置にあり、ＦＲ２残基は３６−４９の位置にある。
【００６２】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変および定常ドメインと、重鎖の可変ドメインおよび第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含有する。Ｆ（ａｂ'）２抗体断片は一対のＦａｂ断片を含み、これらは一般に、これらのカルボキシ末端付近で、これらの間にあるヒンジシステインによって共有結合されている。抗体断片のその他の化学的結合も当該技術分野において知られている。
【００６３】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含み、これは、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望される構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ  １１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００６４】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨおよびＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインは別の鎖の相補的なドメインと対形成して、２つの抗原結合部位を作らざるを得ない。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書、国際公開第９３／１１１６１号パンフレット、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてより完全に説明されている。
【００６５】
「直鎖抗体」という語句は、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載される抗体を指す。簡単に言うと、これらの抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。直鎖抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
【００６６】
本明細書中のモノクローナル抗体は特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかあるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であり、鎖の残りの部分が、別の種に由来するかあるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）と、所望の生物活性を示す限りはならびにこのような抗体の断片とを含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００６７】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むように操作または設計されたキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域からの残基が、所望の特異性、アフィニティ、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域からの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらに良くするために行われる。一般に、ヒト化抗体は、高頻度可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そしてＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことができる。またヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。本明細書で使用される場合、「複合ヒト抗体」は、特定のタイプの改変またはヒト化抗体である。
【００６８】
「ヒト抗体」、「非改変ヒト抗体」、または「完全ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するもの、および／または本明細書中に開示されるヒト抗体を製造するための技術のいずれかを用いて製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、当該技術分野において既知の種々の技術を用いて産生され得る。一実施形態では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、そのファージライブラリーはヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９−３１４（１９９６）、Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：６１５７−６１６２（１９９８））、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。ヒト抗体は、内在性マウス免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化された遺伝子導入動物、例えばマウスに、ヒト免疫グロブリン座位を導入することによって製造することもできる。チャレンジにおいて、ヒト抗体の産生が観察され、これは、遺伝子再構成、構築、および抗体レパートリーを含む全ての点でヒトにおいて見られるものに酷似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、同第５，５４５，８０６号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書、および以下の科学出版物：Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化により調製することができる（このようなＢリンパ球は個体から回収されてもよいし、あるいはインビトロで免疫化されていてもよい）。例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）、および米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照されたい。
【００６９】
「アフィニティ成熟」抗体は、その１つまたは複数のＣＤＲ中に１つまたは複数の変化を有するものであり、これらの変化を持たない親抗体と比較して、抗原に対する抗体のアフィニティの改善をもたらす。好ましいアフィニティ成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル濃度、あるいはさらにピコモル濃度のアフィニティを有し得る。アフィニティ成熟抗体は、当該技術分野において既知の手順によって産生される。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）には、ＶＨおよびＶＬドメインのシャッフリングによるアフィニティ成熟が記載されている。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム変異誘発は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）、Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）、およびＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）によって記載されている。
【００７０】
抗体の「機能的抗原結合部位」は、標的抗原に結合することができるものである。抗原結合部位の抗原結合アフィニティは、必ずしも、抗原結合部位が誘導される親抗体ほど強くはないが、抗原に結合する能力は、抗体の抗原への結合を評価するために知られている様々な方法のいずれか１つを用いて測定可能でなければならない。さらに、本明細書中の多価抗体の抗原結合部位のそれぞれの抗原結合アフィニティは、定量的に同じである必要はない。多量体抗体については、機能的抗原結合部位の数は、米国特許出願公開第２００５０１８６２０８号明細書の実施例２に記載されるように、超遠心分離分析を用いて評価することができる。この分析方法によると、多量体抗体に対する標的抗原の異なる比率が組み合わせられ、異なる数の機能的結合部位を仮定して、複合体の平均分子量が計算される。これらの理論値は、機能的結合部位の数を評価するために、得られた実際の実験値と比較される。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「遮断」抗体または抗体「アンタゴニスト」は、それが結合する抗原の生物活性を阻害または低減するものである。例えば、ＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニスト抗体はＤＥｓｐＲに結合して、例えば、ＤＥｓｐＲがＶＥＧＦｓｐに結合して、血管新生を誘発する、血管内皮細胞の増殖を誘発する、あるいは血管透過性を誘発する能力を阻害する。特定の実施形態では、遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を完全に阻害する。
【００７２】
他に示されない限り、「多価抗体」という語句は、本明細書全体を通して、３つ以上の抗原結合部位を含む抗体を示すために使用される。例えば、多価抗体は３つ以上の抗原結合部位を有するように改変されており、一般に、天然配列ＩｇＭまたはＩｇＡ抗体ではない。
【００７３】
指定された抗体の「生物学的特徴」を有する抗体は、同じ抗原に結合する他の抗体と区別されるその抗体の生物学的特徴の１つまたは複数を有するものである。
【００７４】
関心対象の抗体により結合される抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるものなどのルーチン的な交差遮断（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）アッセイを実施することができる。
【００７５】
「種依存性抗体」は、第１の哺乳類種からの抗原に対して、第２の哺乳類種からのその抗原の相同体に対するよりも強い結合アフィニティを有するものである。通常、種依存性抗体はヒト抗原に「特異的に結合する」（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８Ｍ以下、最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合アフィニティ（ＫＤ）値を有する）が、第２の非ヒト哺乳類種からの抗原の相同体に対して、ヒト抗原に対するその結合アフィニティよりも少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い結合アフィニティを有する。種依存性抗体は上記のような種々のタイプの抗体のいずれであってもよいが、通常は、ヒト化またはヒト抗体である。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「抗体突然変異体」または「抗体変異体」は、種依存性抗体のアミノ酸配列変異体を指し、ここで、種依存性抗体のアミノ酸残基の１つまたは複数が修飾されている。このような突然変異体は、必然的に、種依存性抗体との１００％未満の配列同一性または類似性を有する。一実施形態では、抗体突然変異体は、種依存性抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有するであろう。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書では、候補配列をアライメントさせ、必要であればギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成した後に、種依存性抗体残基と同一（すなわち、同じ残基）または類似（すなわち、共通の側鎖特性に基づいて同じ群からのアミノ酸残基、以下を参照）である候補配列中のアミノ酸残基の割合であると定義される。Ｎ末端、Ｃ末端、または内部の伸長、欠失、または可変ドメインの外側の抗体配列内への挿入はどれも、配列同一性または類似性に影響を与えると解釈されてはならない。
【００７７】
本明細書に記載されるアミノ酸配列を含有する抗体またはポリペプチドの半減期を増大させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号明細書に記載されるように、抗体（特に、抗体断片）にサルベージ受容体結合エピトープを結合させることができる。例えば、サルベージ受容体結合エピトープをコードする核酸分子は、改変された核酸分子によって発現される融合タンパク質が、サルベージ受容体結合エピトープおよび本明細書に記載されるポリペプチド配列を含むように、本明細書に記載されるポリペプチド配列をコードする核酸にインフレームで連結させることができる。本明細書で使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子生体内血清半減期の増大の原因であるＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７３９−７６６（２０００）、表１）。また、そのＦｃ領域における置換および血清半減期の増大を有する抗体は、国際公開第００／４２０７２号パンフレット、国際公開第０２／０６０９１９号パンフレット、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４（２００１）、Ｈｉｎｔｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３−６２１６（２００４））に記載されている。別の実施形態では、血清半減期は、例えば、他のポリペプチド配列の付着によって増大され得る。例えば、本発明の方法において有用な抗体または他のポリペプチドは、血清アルブミンが抗体またはポリペプチドに結合するように、血清アルブミンまたはＦｃＲｎ受容体に結合する血清アルブミンの一部または血清アルブミン結合ペプチドに付着されることが可能であり、例えば、このようなポリペプチド配列は国際公開第０１／４５７４６号パンフレットに開示されている。一実施形態では、付着される血清アルブミンペプチドは、ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（SEQ ID NO:３）のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Ｆａｂの半減期はこれらの方法によって増大される。また、付加的な血清アルブミン結合ペプチド配列については、Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）も参照されたい。
【００７８】
「キメラＤＥｓｐＲ受容体タンパク質」は、少なくとも２つの異なるタンパク質に由来し、そのうちの少なくとも１つがＤＥｓｐＲタンパク質であるアミノ酸配列を有するＤＥｓｐＲ分子である。特定の実施形態では、キメラＤＥｓｐＲタンパク質は、ＤＥｓｐＲに結合してそのＤＥｓｐＲの生物活性を阻害することができる。
【００７９】
「単離」抗体は、その天然環境の成分から同定および分離および／または回収されたものである。その天然環境の汚染物質成分は、抗体の診断または治療的な使用を妨害し得る物質であり、酵素、ホルモン、およびその他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含むことができる。特定の実施形態では、抗体は、（１）例えば、Ｌｏｗｒｙ法により決定されるように、抗体が９５重量％を超える、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシークエネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒの使用によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を獲得するのに十分な程度まで、あるいは（３）クーマシブルーまたは銀染色を用いた還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質になるまで精製されるであろう。単離抗体は、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内のその場での抗体を含む。しかしながら、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製工程により調製されるであろう。
【００８０】
「断片」とは、抗体またはその抗体断片、あるいは基準核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上を好ましくは含有する核酸分子などの、ポリペプチドの一部を意味する。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、またはそれ以上のヌクレオチド、あるいは１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、１９０、２００のアミノ酸又はそれ以上を含有することができる。
【００８１】
「抗血管新生剤」または「血管新生阻害剤」は、血管新生、脈管形成、または望ましくない血管透過性を直接または間接的に阻害する小分子量の物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離タンパク質、組換えタンパク質、抗体、またはこれらの結合もしくは融合タンパク質を指す。抗血管新生剤が、血管新生因子またはその受容体に結合して、その血管新生活性を遮断する薬剤を含むことは、理解されるべきである。例えば、抗血管新生剤は、本明細書を通して定義されるかあるいは当該技術分野において知られている血管新生剤に対する抗体または他のアンタゴニストであり、例えば、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ａ受容体（例えば、ＫＤＲ受容体またはＦｌｔ−１受容体）に対する抗体、ＶＥＧＦ−トラップ、ＧｌｅｅｖｅｃＴＭ（メシル酸イマチニブ）などの抗ＰＤＧＦＲ阻害剤であるが、これらに限定されない。抗血管新生剤は、天然の血管新生阻害剤、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチンなども含む。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ'Ａｍｏｒｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３：２１７−３９（１９９１）、Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：３１７２−３１７９（２００３）（例えば、悪性メラノーマにおける抗血管新生療法を記載する表３）、Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５：１３５９−１３６４（１９９９）、Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６５４９−６５５６（２００３）（例えば、既知の抗血管新生因子を記載する表２）、およびＳａｔｏ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：２００−２０６（２００３）（例えば、表１は、臨床試験で使用される抗血管新生剤を記載する）を参照されたい。
【００８２】
「抗癌療法」という用語は、癌の治療において有用な治療法を指す。抗癌治療薬の例としては、例えば、手術（ｓｕｒｇｅｒｙ）、化学療法剤、成長阻害剤、細胞毒性剤、放射線療法で使用される薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、および癌を治療するための他の薬剤、例えば、抗ＨＥＲ−２抗体（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、抗ＣＤ２０抗体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）））、血小板由来の成長因子阻害剤（例えば、ＧｌｅｅｖｅｃＴＭ（メシル酸イマチニブ））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡまたはＶＥＧＦ受容体の１つまたは複数に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、および他の生物活性および有機化学剤などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの組み合わせも本明細書に含まれる。
【００８３】
「細胞毒性剤」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の機能を阻害または防止し、そして／あるいは細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤、および細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素または酵素活性毒素などの毒素（その断片および／または変異体を含む）を含むことが意図される。
【００８４】
「化学療法剤」は、癌の治療において有用な化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリチイレンチオホスホラミドおよびトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビセレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロランブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマ１ＩおよびカリチアマイシンオメガＩ１）などの抗生物質（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照）；ジネマイシンＡを含むジネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連の色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝産物；デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキセート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、ストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトレキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルホルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシンおよびアンサマイトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）などのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２'，２"−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミト���クトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（クレモホル（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）を含まない）、パクリタキセルのアルブミン操作されたナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌ．）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）（５−ＦＵおよびロイコボリンを伴うイリノテカンの治療計画を含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン治療計画（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；細胞増殖を低減するＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）））およびＶＥＧＦ−Ａの阻害剤、ならびに上記のもののいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
またこの定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）などの抗ホルモン剤（例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、およびＦＡＲＥＳＴＯＮトレミフェンが含まれる）；副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなど；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、ＰＫＣ−アルファ、ＲａｌｆおよびＨ−Ｒａｓなどの接着（ａｂｈｅｒａｎｔ）細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの；ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）およびＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ならびに上記のもののいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体も含まれる。
【００８６】
「成長阻害剤」は、本明細書で使用される場合、インビトロおよび／またはインビボでの細胞の成長を阻害する化合物または組成物を指す。従って、成長阻害剤は、Ｓ期における細胞の割合を著しく低減するものであり得る。成長阻害剤の例には、細胞周期の進行（Ｓ期以外の場所における）を遮断する薬剤、例えば、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘発する薬剤が含まれる。典型的なＭ期ブロッカーとしては、ビンカ（ｖｉｎｃａｓ）（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキソール（登録商標）、およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンが挙げられる。Ｇ１を停止する薬剤はＳ期の停止にも波及し、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤である。さらなる情報は、「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ」ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎおよびＩｓｒａｅｌ編、第１章、Ｍｕｒａｋａｍｉらによる表題「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）、特に１３頁において見出すことができる。
【００８７】
「プロドラッグ」という用語は、本出願において使用される場合、親薬物と比較して腫瘍細胞に対する細胞毒性が低く、酵素的に活性化されるかあるいはより活性な親形態に変換されることが可能である、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態を指す。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，"Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ"Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）およびＳｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，"Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照されたい。本明細書に記載されるプロドラッグには、より活性な細胞毒性の遊離薬物に変換することができる、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、ベータ−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換され得るフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは場合により置換され得るフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。本発明において使用するためにプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞毒性薬の例としては、上記の化学療法剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８８】
「放射線療法」とは、細胞が正常に機能する能力を制限するように細胞への十分な損傷を誘発するため、または細胞を完全に破壊するための、定方向ガンマ線またはベータ線の使用を意味する。投与量および治療期間を決定するために当該技術分野において多数の方法が知られていることは認識されるであろう。典型的な治療は１回の投与で与えられ、典型的な投与量は１日当たり１０〜２００単位（グレイ）の範囲である。
【００８９】
「低減または阻害する」とは、好ましくは２０％以上、３０％以上、４０％以上、４５％以上、より好ましくは５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、最も好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。低減または阻害は、例えば、治療されている障害の症状、転移または微小転移の存在または大きさ、原発腫瘍の大きさ、休止状態の腫瘍の存在または大きさ、あるいは血管新生障害における血管の大きさまたは数を指すことができる。
【００９０】
「静脈内注入」という用語は、約５分よりも長い時間、好ましくは約３０分〜９０分間にわたって動物またはヒト対象の静脈内へ薬物を導入することを指すが、本発明によると、静脈内注入は、代替的に、１０時間以内で実施される。「静脈内ボーラス投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｂｏｌｕｓ）」または「静脈内急速投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｐｕｓｈ）」という用語は、体が薬物を約１５分以内、好ましくは５分以内に受け入れるように動物またはヒトの静脈内へ薬物を投与することを指す。
【００９１】
「皮下投与」という用語は、薬物容器からの比較的ゆっくりとした持続送達によって、動物またはヒト対象の皮膚の下、好ましくは皮膚と皮下組織との間のポケット内に薬物を導入することを指す。ポケットは、皮膚をつまむかまたは引き上げて皮下組織から離すことによって作ることができる。
【００９２】
「皮下注入」という用語は、薬物容器からの比較的ゆっくりとした持続送達によって、３０分以下、または９０分以下を含む（限定はされない）時間で、動物またはヒト対象の皮膚の下、好ましくは皮膚と皮下組織との間のポケット内に薬物を導入することを指す。場合により、注入は、動物またはヒト対象の皮膚の下に埋め込まれる薬物送達ポンプの皮下移植によって行うことができ、ポンプは、３０分間、９０分間、また治療計画の長さに及ぶ期間などの所定期間、所定の量の薬物を送達する。
【００９３】
「皮下ボーラス投与」という用語は、動物またはヒト対象の皮膚の下への薬物投与を指し、ボーラス薬物送達は、好ましくは、約１５分未満、より好ましくは５分未満、最も好ましくは６０秒未満である。投与は、好ましくは、皮膚と皮下組織との間のポケット内であり、ポケットは、例えば、皮膚をつまむかまたは引き上げて皮下組織から離すことによって作られる。
【００９４】
「障害」は、例えば、本明細書中に記載される抗体による治療から利益を得るであろう任意の状態である。これには、哺乳類を問題の障害にかかりやすくする病状を含む慢性および急性の障害または疾患が含まれる。本明細書において治療される障害の非限定的な例としては、癌；良性および悪性腫瘍；白血病およびリンパ系悪性腫瘍；神経細胞、膠細胞、アストロサイト、視床下部および他の腺性、マクロファージ、上皮、間質および割腔の障害；ならびに炎症性、血管新生および免疫性の障害が挙げられる。
【００９５】
「標識」という語は、本明細書において使用される場合、ポリペプチドに直接または間接的に結合される検出可能な化合物または組成物を指す。標識はそれ自体が検出可能であってよいし（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、あるいは酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒することもできる。
【００９６】
「対象」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳類、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコなどを含むがこれらに限定されない哺乳類を意味する。好ましくは、対象はヒトである。患者も本明細書では対象である。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ＤＥｓｐＲ（以前は、Ｄｅａｒと呼ばれ、ＤｅａｒとしてＧｅｎ  Ｂａｎｋに寄託）欠損またはノックアウト（Ｄｅａｒ−／−）マウスを用いて、ＤＥｓｐＲが胚発生において重要な血管新生プレーヤーであることを示す。
【図２】パワードップラー分析を用いて、組織血管分布の低下を示す成体ハプロ不全（＋／−）マウスにおいてみられるように、ＤＥｓｐＲが成体組織血管分布に寄与することを示す。
【図３】Ａ〜Ｅは、基礎的および血管新生の両方の管形成条件下で、臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（図３Ａ〜３Ｃ）および微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）において免疫染色することによって、ＤＥｓｐＲおよびＶＥＧＦｓｐが検出されることを示す。重要なことには、ＨＵＶＥＣ（図３Ｄ）およびＨＭＥＣ（図３Ｅ）の血管新生アッセイにおいて、抗ＤＥｓｐＲ（Ａｂ１）および抗ＶＥＧＦｓｐ（Ａｂ２）の両抗体を用いて、血管新生の新生血管の管長の阻害が見られる（ＨＵＶＥＣおよびＨＭＥＣの両方に対して、Ｔｕｋｅｙの全ペアワイズ多重比較Ｐ＜０．００１）。作成される新生血管の分枝および相互接続を含む他の血管新生パラメータについても同様の知見が認められた。
【図４】Ａ〜Ｄは、免疫染色を用いて、ＤＥｓｐＲおよびＶＥＧＦｓｐが腫瘍細胞においても検出され、細胞膜および核膜内にＶＥＧＦｓｐおよびＤＥｓｐＲが共存していることを実証する。ＤＥｓｐＲの細胞膜および核膜発現は多数の腫瘍細胞型において検出され、抗ＤＥｓｐＲ療法が種々の癌型に対して有効であることが示される。ＤＥｓｐＲ発現は、ヒト肺非小細胞癌ＮＣＩ−Ｈ７２７、肺巨細胞腫ＴＩＢ−２２３／ＧＣＴ、乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図４Ａ〜４Ｃ）およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８、膀胱癌２５３ＪＢＶ、結腸腺癌ＳＷ４８０、肝細胞癌ＨＥＰ３Ｂ、メラノーマＳＫ−ＭＥＬ−２、骨肉腫ＭＧ−６３、卵巣腺癌ＨＴＢ−１６１／ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ３、前立腺腺癌ＰＣ−３ｍｍ２、および膵癌ＣＲＬ−１４６９／ＰＡＮＣ−１において検出される（図４Ｄ）。
【図５】Ａ〜Ｃは、ＨＣＩ−Ｈ２９２肺粘表皮癌、およびＨＥＰＧ２肝細胞癌（図５Ａ）、およびＣＣＬ−８６／Ｒａｊｉ  Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫においてＤＥｓｐＲ発現が検出されなかったことを示し、従って陽性観察の特異性が示される。ＮＣＩ−７２７肺癌細胞（図５Ｂ）における知見は、Ｇｒ．ＩＩＩ肺腺癌の腫瘍切片の免疫染色で確証される（図５Ｃ）。
【図６】Ａ〜Ｂは、対照（Ｃ）および免疫前抗体治療（ＰＩ）とは対照的に、転移性乳房腫瘍ＭＤＡ−ＭＢ−２３１および膵臓腺癌ＰＡＮＣ−１細胞株の２つの検査細胞株において、抗ヒトＤＥｓｐＲ抗体治療によるＤＥｓｐＲ阻害が腫瘍細胞侵襲性を阻害することを示す。
【図７】抗ＤＥｓｐＲ治療されたラット（□）が、模擬処理した対照（■）と比較して最小限の腫瘍成長を示したことを示す。両側ｔ−検定＊Ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１。
【図８】Ａ〜Ｄは、免疫組織化学的分析を用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞と同様に乳房腫瘍細胞においてＤＥｓｐＲが発現され（図８Ａ）、正常な乳房組織では発現されない（図８Ｂ）ことを示す。さらに、治療されたラットの残存腫瘍は、腫瘍細胞の内腔への侵食による腫瘍血管の内皮の破壊を示した模擬処理した腫瘍（図８Ｄ）とは対照的に、血管の正常化（図８Ｃ）を示した。
【図９】選択されたモノクローナル抗体の特徴付けを示す。モノクローナル抗体２Ｅ４Ａ８、２Ｅ４Ｂ１１、２Ｅ４Ｈ１０、５Ｇ１２Ｅ８、７Ｃ５Ｂ２、７Ｃ５Ｃ５、８Ｅ７Ｄ１１、８Ｅ２Ｆ６、Ｅ２Ｇ４および８Ｅ７Ｆ８を、標準手順を用いる間接的なＥＬＩＳＡによって検査した。以下のように、１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含有する上清からの連続希釈を検査した：１＝１／２、２＝１／４、３＝１／８、４＝１／１６、５＝１／３２、６＝１／６４、７＝１／１２８、８＝１／２５６、９＝１／５１２、１０＝１／１０２４、１１＝１／２０４８および１２＝１／４０９６。
【図１０】検査したモノクローナル抗体のウェスタンブロット分析を示す。特異性を確認するために、低（５Ｇ１２Ｅ８）、中（２Ｅ４Ｈ６）、および高アフィニティ（７Ｃ５Ｂ２）モノクローナル抗体を、サブクローン上清およびその後のその後精製された抗体と共に検査した。抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体は、ヒトＤＥｓｐＲの推定１０ｋＤのタンパク質に特異的である。ウェスタンブロット分析は、ヒトＤＥｓｐＲの期待される１０ｋＤ分子量のタンパク質を検出するために、Ｃｏｓ１ヒトＤＥｓｐＲトランスフェクト細胞から抗原として単離される全細胞タンパク質を用いて実施され、一次抗体は、３つの選択されたクローンの精製抗体およびサブクローン上清を１０％のゲル濃度で含んだ。３．０７ｇのＴｒｉｓ、１４．４ｇのグリシン、２００ｍｌのメタノール、８００ｍｌのｄＨ２Ｏのトランスファー緩衝液と共にニトロセルロース（ＰＩＥＲＣＥ）を使用した。ＨＲＰ−抗マウス多価免疫グロブリン（Ｓｉｇｍａ  ＃０４１２）１：１００，０００、ＥＣＬ試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｋｉｔ  ＃３４０９４）、染色試薬Ｋｏｄａｋ  ＲＰ−Ｘ−Ｏｍａｔ、およびｘ−フィルム（Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ｆｉｌｍ  ＃ＸＢＴ−１）を使用した。ウェスタンブロット結果は、相対アフィニティに関係なく抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体の特異性を実証し、従って、２つ以上の成功した抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体が同定される。結果は、最高の相対アフィニティおよび特異性を有するモノクローナル抗体クローンがクローン７Ｃ５Ｂ２であることを示す。
【図１１】Ａ〜Ｃは、ＤＥｓｐＲに対するモノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２およびポリクローナル抗体調製物による血管新生の異なるパラメータの阻害を示す。７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体は、管形成を受けるＨＵＶＥＣ、膵臓腺癌ＰＡＮＣ−１、および乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を免疫染色することが示された。図１１Ａは、新生血管の複雑さの尺度としての分枝点の平均数を示し、新生血管密度の尺度としての管の全長が図１１Ｂに示される。図１１Ｃは、モノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２によるインビトロの血清誘導性ＨＵＶＥＣ管形成の濃度依存性阻害を示す。２％のＦＢＳ（対照）、または２％のＦＢＳ＋モノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２（０．０５〜５００ｎＭ）が補充された基本培地中、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）をＭａｔｒｉｇｅｌ被覆ウェル上に成長させた。血清誘導性管形成の割合は、対照条件下で成長させたＨＵＶＥＣと、指示されたモノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２補充培地中で成長させたＨＵＶＥＣとの間の差異として決定した。インビトロ管形成アッセイにおけるウェル当たりの管の全長の％およびウェル当たりの分枝点の総数が与えられる。データは、平均±標準誤差で示される。各実験条件を５つのレプリカウェルにおいて実施した。管の全長のＥＣ５０＝４．３４±０．４５ｎＭ、＃分枝点のＥＣ５０＝３．９７±０．５１ｎＭ。
【図１２】Ａ〜Ｃは、モノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌（図１２Ａ）およびＰＡＮＣ−１膵癌（図１２Ｂ）細胞株における腫瘍細胞侵襲性を阻害することを実証する（Ｐ＜０．００１＊、＜０．０１＊）。図１２Ｃは、モノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞侵襲の阻害の用量反応曲線を示す（ＥＣ５０＝３．５５±０．３２ｎＭ）。データは、５回の繰り返しの平均±標準誤差である。＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１（一元配置ＡＮＯＶＡ、全ペアワイズ多重比較Ｔｕｋｅｙ検定）。
【図１３】Ａ〜Ｄは、インビトロ血清誘導性ＨＵＶＥＣ管形成に対する抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２（ＩｇＧ２ｂアイソタイプ）の効果を示す（確立したインビトロ血管新生アッセイ）。２％のＦＢＳ（対照Ｃ１）、または２％のＦＢＳ＋ポリクローナル抗ｈＤＥＳＰＲ抗体の免疫前ＩｇＧアイソタイプ対照（５００ｎＭ、対照Ｃ２）、または２％のＦＢＳ＋抗ｈＤＥＳＰＲｍＡＢのＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（５００ｎＭ、Ｃ３対照）、または２％のＦＢＳ＋ポリクローナル抗ｈＤＥｓｐＲ（５００ｎＭ、Ｐ）、または２％のＦＢＳ＋モノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２（５００ｎＭ、Ｍ）が補充された基本培地中、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）をＭａｔｒｉｇｅｌ被覆ウェル上に成長させた。インビトロ管形成アッセイを用いて、ウェル当たりの形成された管の平均数定量分析は図１３Ａに示され、ウェル当たりの分枝点の平均数は図１３Ｂに示され、ウェル当たりの接続の平均数は図１３Ｃに示され、ウェル当たりの管の平均全長（ｍｍ）は図１３Ｄに示される。データは、平均±標準誤差で示される。各実験条件を５つのレプリカウェルにおいて実施した。統計的有意差（それぞれの対照条件と比較して）は以下のように示される：＊Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡの後、全ペアワイズ多重比較Ｔｕｋｅｙ検定）。
【図１４】Ａ〜Ｂは、抗ヒトＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体を用いて、同じスライド上の腫瘍および正常組織を表すコア生検標本で構成されるヒト腫瘍組織アレイの免疫組織化学的分析を示す。ホルマリン固定したパラフィン包埋コア生検切片を用いて、特異性および検出感度を最適化する条件をまず検査した。二重免疫蛍光実験を実施して、ヒトＤＥｓｐＲ発現およびＣＤ１３３発現（後者は癌幹細胞のマーカーとしての機能を果たす）を評価した。抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体を１：１０、市販の抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体を１：２０希釈で用いて、抗原回復を実施した。抗ヒトＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体を用いるヒト腫瘍組織アレイの代表的な免疫組織化学的分析により、図１４Ａに示されるように、ＩＩ期の肺癌腫瘍細胞においてｈＤＥｓｐＲ（Ａｌｅｘａ−５６８ｒｅｄ）の発現の増大が検出された。いくつかの腫瘍細胞はヒトＤＥｓｐＲおよびＣＤ１３３の両方に対して二重陽性で免疫染色され、他の腫瘍細胞は、ＣＤ１３３に対してのみ免疫染色された。これらの観察は、ヒトＤＥｓｐＲがＣＤ１３３陽性癌幹細胞、およびＣＤ１３３陰性腫瘍細胞にも存在することを実証する。図１４Ｂに示されるように、対照的に、正常な肺標本は、ヒトＤＥｓｐＲまたはＣＤ１３３に対して免疫染色を示さない。
【図１５】Ａ〜Ｂは、正常なヒト膵臓には最小限のＤＥｓｐＲ発現があり（図１５Ｂ）、α平滑筋アクチンが正の対照としての機能を果たすが、対照的に、ＩＶ期の膵癌腫瘍細胞および腫瘍血管はＤＥｓｐＲ発現の増大を示す（図１５Ａ）ことを示す。
【図１６】Ａ〜ＤはＤＥｓｐＲ標的化超音波分子イメージングを実証し、ＤＥｓｐＲ特異的抗体（図１６Ａ）がＤＥｓｐＲ＋内皮病変（図１６Ｂ）および栄養血管の血管新生（図１６Ｃ）を検出することを示す。コントラスト強度の定量化は、統合されたＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏ−ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアを用いて行われ（図１６Ｄ）、ＤＥｓｐＲ（−）内皮および栄養血管における低コントラスト強度、およびアイソタイプ−微小気泡対照のいずれとも対照的に、ＤＥｓｐＲ＋頸動脈内皮および栄養血管におけるコントラスト強度の増大を実証する。Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡおよびペアワイズ多重比較。抗ＤＥｓｐＲ抗体はビオチン化され、超音波分析およびイメージングのためにストレプトアビジン−ＰＥＧ被覆された市販の微小気泡に結合される。
【図１７】Ａ〜Ｆは、抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体を用いて、ヒト乳房組織におけるＤＥｓｐＲ発現（図１７Ａ〜１７Ｃ）、正常、グレード−１、Ｔ１侵襲性腺管癌におけるＤＥｓｐＲ発現（図１７Ｄ〜１７Ｆ）の免疫組織化学的分析を示す。図１７Ａは正常な乳房組織を示し、ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡおよびＤＡＰＩ核染色の３Ｘ−オーバーレイは乳房筋上皮細胞におけるａＳＭＡ発現を検出するが、上皮細胞および微小血管におけるＤＥｓｐＲの発現は検出されない。図１７ＢはＤＥｓｐＲおよびＤＡＰＩ核染色の２Ｘ−免疫蛍光オーバーレイを示し、正常な乳房組織においてＤＥｓｐＲ発現がないことを確認する。図１７ＣはＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩ免疫蛍光および拡散コントラスト（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）イメージング（ＤＩＣ）の４Ｘ−オーバーレイであり、正常な乳房上皮および内皮における組織モルホロジー、ａＳＭＡの発現、およびＤＥｓｐＲの非／最小限の発現を描写する。図１７Ｄは、Ｇｒ．Ｉ−Ｔ１侵襲性腺管癌におけるＤＡＰＩ、ａＳＭＡおよびＤＥｓｐＲ免疫蛍光の３Ｘ−オーバーレイであり、血管内皮におけるＤＥｓｐＲ発現、および乳房組織におけるａＳＭＡとの共存を検出する。図１７Ｅは、パネル１７Ｄに示される乳癌のＤＡＰＩおよびＤＥｓｐＲの２Ｘ−オーバーレイであり、ＤＥｓｐＲ発現を強調する。図１７Ｆは、ＤＡＰＩ、ａＳＭＡ、ＤＥｓｐＲ、ＤＩＣの４Ｘ−オーバーレイであり、上皮細胞および微小血管の組織モルホロジーを有するＤＥｓｐＲ空間的発現を解明する。バー＝２０ミクロン。
【図１８】Ａ〜Ｆは、正常な膵臓組織（図１８Ａ〜１８Ｃ）正常、およびグレード−３、Ｔ３膵管癌（図１８Ｄ〜１８Ｆ）におけるＤＥｓｐＲ発現のモノクローナル抗体免疫組織化学的分析を示す。図１８Ａは、ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡおよびＤＡＰＩ核染色の３Ｘ−オーバーレイによる正常膵臓組織が、微小血管において最小限のＤＥｓｐＲ発現を検出することを示す。図１８Ｂは、組織モルホロジーのＤＩＣイメージングと共に、ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩの４Ｘ−免疫蛍光オーバーレイを示す。図１８Ｃ（左）は、ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩ免疫蛍光の３Ｘ−オーバーレイを示し、（右）は、ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩ、および組織モルホロジーのための拡散コントラストイメージング（ＤＩＣ）の４ｘ−オーバーレイを示し、正常な内皮におけるａＳＭＡの発現およびＤＥｓｐＲの非／最小限の発現を示す。図１８Ｄは、Ｇｒ．３−Ｔ３膵管癌におけるＤＡＰＩ、ａＳＭＡおよびＤＥｓｐＲ免疫蛍光の３Ｘ−オーバーレイが、血管内皮におけるＤＥｓｐＲ発現およびａＳＭＡとの共存を検出することを示す。図１８Ｅは、図１９Ｄに示される画像のＤＡＰＩおよびＤＥｓｐＲの２Ｘ−オーバーレイを示し、ＤＥｓｐＲ発現を強調する。図１８Ｆは、ＤＡＰＩ、ａＳＭＡ、ＤＥｓｐＲの３Ｘ−オーバーレイを示し、膵管癌細胞におけるＤＥｓｐＲ発現の増大を示す。バー＝２０ミクロン。
【図１９】Ａ〜Ｅは、代表的な造影超音波（ＣＥＵ）画像を示し、コントラスト強度シグナル（ＣＩＳ）が描かれる。図１９Ａは、ＭＢＤのＤＥｓｐＲ標的化分子イメージングを示す。遺伝子導入ラット−Ｒ１は、ＣＥＵ陽性イメージングおよび音響破壊の後のＣＩＳピークの特徴的な降下を実証する（｜）。図１９Ｂは、その後の遺伝子導入ラット−Ｒ１におけるアイソタイプ微小気泡（ＭＢＣ）イメージングを示し、低ピークのＣＩＳレベルならびにＣＩＳの破壊前および破壊後の「平らな（ｆｌａｔ−ｌｉｎｅ）」パターン（ＣＩＵ陰性イメージングを示す）を示す。図１９Ｃは、非遺伝子導入ラット−Ｒ２におけるＭＢＤＤＥｓｐＲ標的化分子イメージングを示し、ＭＢＣＣＥＵ陰性イメージングと同様のＣＥＵ陰性イメージングを実証する。図１９Ｄは、種々の研究群の中のＣＩＳ差（Δ）のグラフを示し、ＴｇＭＢＤＣＥＵ＋群におけるＣＥＵ陰性イメージングのイメージングが他のＣＥＵ陰性群から区別されることが記録される。図２０Ｅは、全ての遺伝子導入ラット（Ｔｇ＋）および非遺伝子導入ラット（ｎｏｎＴｇ）の間のＣＩＳ差のグラフを示す。斜線バーは、ＭＢＤ注入ＣＥＵ＋と、ＭＢＤ注入ＣＥＵ遺伝子導入ラットとの間の閾値を表す。ＭＢのボーラス注射の１分後の血液プール、ＣＥＵ画像は、種々のラットの中での同等のＭＢ注入および動きアーチファクトからの最小限のコントラスト強度シグナルを実証する。１−Ｐｒｅ、標的（もしあれば）のＭＢへの接着を可能にするために、そして内腔中の最小限の（もしあったとしても）循環ＭＢを記録するために、ボーラス注入の４分後から得られる音響破壊前ＣＥＵ画像。ＣＩＳプロット上の＃１に相当する画像。２−Ｐｏｓｔ、散乱プロット上の＃２に相当する音響破壊後のＣＥＵ画像。ＣＩＳ−ｐｌｏｔ、代表的な対象領域（水色で包囲）におけるコントラスト強度シグナル（ＣＩＳ）の散乱プロット。＃１、音響破壊前に検出されたＣＩＳ；＃２、音響破壊後に検出されたＣＩＳ（２）。黒線およびその後の間隙は、ＣＩＳ散乱プロットにおける音響破壊の期間を記す。ＭＢＤ、ＤＥｓｐＲ標的化微小気泡；ＭＢｃ、対照アイソタイプ標的化微小気泡；Ｔｇ、遺伝子導入ラット；非Ｔｇ、非遺伝子導入対照ラット；ＣＥＵ＋、ＣＥＵ陽性イメージング；ＣＥＵ−、ＣＥＵ陰性イメージング、Δ  コントラスト強度、破壊前／破壊後ＣＩＳ差；＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図２０】Ａ〜Ｈは、代表的なＭＢＤ特異的造影超音波（ＣＥＵ）陽性画像を示し、遺伝子導入ラット、Ｒ３における接着ＭＢＤ微小気泡の音響破壊の複雑なパターンが示される。図２０Ａは代表的なＣＥＵ画像を示し、ボーラス注入の１分後に頸動脈内腔を充満する循環ＭＢＤの血液プールが記録される。ＣＣＡ、総頸動脈；ＥＣＡ、外頸動脈；ＩＣＡ、内頸動脈；＊、ＣＣＡ分岐点。図２０Ｂ〜２０Ｄは、パネル２０Ｅ中の対応する対象領域（ＲＯＩ）指すために同じ破線ブロックが記された、コントラスト強度シグナルの散乱プロットを示す。（２０Ｂ）白い実線；（２０Ｃ）、白い斜線；（２０Ｄ）白い点線のＲＯＩ。図２０Ｅは、散乱プロットｂ、ｃ、ｄ上の＃１に相当する代表的なＣＥＵ画像を示し、音響破壊前の直前の接着ＤＥｓｐＲ標的化微小気泡（ＭＢＤ）が記録される（黒い線）。接着ＭＢＤは、白い実線、白い斜線、および白い点線で包囲された３つのＲＯＩにおいて見られる。図２０Ｆは、散乱プロットｂ〜ｄ上の＃２に相当する代表的なＣＥＵ画像を示し、異なるＲＯＩの＃１におけるレベルとそれぞれ比較したシグナル強度の音響後破壊低下が示される。図２０Ｇは、散乱プロットｂ〜ｄ上の＃３に相当する代表的なＣＥＵ画像を示し、異なるＲＯＩにおけるコントラスト強度シグナルにおける音響後破壊二次ピークが示される。図２０Ｈは、散乱プロット上の＃４に相当する代表的なＣＥＵ画像を示し、アイソタイプ対照またはＭＢＤ注入ＣＥＵ陰性画像において観察されるベースラインレベルに近づくコントラスト強度シグナルの低下が記録され、低バックグラウンドＣＩＳレベルが実証される。
【図２１】Ａ〜Ｈは、ラット−Ｒ１（パネル２１Ａ〜２１Ｄ）、およびラット−Ｒ３（パネル２１Ｅ〜２１Ｈ）に対応する、ＤＥｓｐＲ陽性分子イメージングを用いる頸動脈の代表的な組織学的および蛍光免疫染色分析を示す。図２１Ａは、頸動脈内皮のマッソントリクローム染色切片を示す。図２１Ｂ〜２１２Ｃは、ＤＥｓｐＲ発現の蛍光免疫染色およびＤＡＰＩ核染色がオーバーレイされた微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像を示す。図２１Ｄは、内皮のＤＩＣ画像がオーバーレイされた対照のアイソタイプａｂ免疫染色およびＤＡＰＩ核染色を示す。図２１Ｅは頸動脈マッソントリクローム染色切片を示し、外膜栄養血管の新血管の増大が示される。囲まれた領域は図２１Ｆではより高い倍率で示され、ｒｂｃ−充填栄養血管が記録される。図２１Ｇは蛍光免疫染色を示し、栄養血管および周囲細胞におけるＤＥｓｐＲ陽性発現が検出される。図２１ＨはαＳＭＡおよびＤＥｓｐＲによる二重免疫染色を示し、ＤＥｓｐＲ陽性新血管におけるαＳＭＡの同時発現が検出される。→、接着ＤＥｓｐＲ標的化微小気泡ＭＢＤ；白い矢じりは、パネル２１Ｇおよび２１Ｈにおける栄養血管の新生血管を指し示す；ｍ、培地；バー＝１０ミクロン  パネル２１Ａ〜２１Ｄ、２１Ｆ；２０ミクロン  パネル２１Ｅ、２１Ｇ、２１Ｈ。
【図２２】Ａ〜Ｅは、ＭＢＤ特異的ＣＥＵ陽性イメージング（２２Ｂ、２２Ｃ）およびＣＥＵ陰性イメージング（２２Ｄ、２２Ｅ）を示すラットからの頸動脈の代表的な蛍光免疫染色分析を示す。図２２Ａは、破壊前ＣＩＳピークレベルの散乱ドットプロットを示し、ＭＢＤ特異的ＣＥＵ陽性（ＣＥＵ＋）とＣＥＵ陰性（ＣＥＵ−）イメージングとの間の閾値（斜線バー）が強調される。図２２Ｂは、頸動脈内皮および拡張した栄養血管のＤＥｓｐＲ陽性免疫染色；培地中の平滑筋細胞（ＳＭＣ）におけるαＳＭＡ陽性免疫染色を示す。いくらかの栄養血管の新血管はＤＥｓｐＲおよびαＳＭＡに対して二重免疫染色される。図２２Ｃは、対応するＤＩＣ画像を示し、頸動脈および栄養血管の構造層が示される。図２２Ｄは、ＣＥＵ陰性イメージングを示すラット頸動脈（本明細書では、非Ｔｇラット−Ｒ２で示される）において、代表的な最小限〜全くないＤＥｓｐＲ発現を示す。ＣＥＵ陰性遺伝子導入ラットの頸動脈から同様の画像が得られる。αＳＭＡ免疫染色は、培地中のＳＭＣの発現を検出する。培地中の低レベルのαＳＭＡ免疫染色は両方の頸動脈における合成ＳＭＣ表現型を示し、高血圧のリモデリングと一致する。図２２Ｄは、対応するＤＩＣ場像を示し、頸動脈および外膜の構造層が示され、栄養血管の拡張はない。バー＝２０ミクロン（２２Ｂ、２２Ｃ）、１０ミクロン（２２Ｄ、２２Ｅ）。ｍ、培地；ａｄｖ、外膜；白い小さい矢印、内皮；白い大きい矢印、栄養血管。
【図２３】Ａ〜Ｇは、インビトロでの抗ヒトＤＥｓｐＲ標的化微小気泡（ＭＢＤ）のヒト内皮細胞ＨＵＶＥＣへの結合の位相コントラスト蛍光顕微鏡分析を示す。増大するＤＥｓｐＲ標的化微小気泡（ＭＢＤ）対細胞比は、（２３Ａ）８×、（２３Ｂ）８０×、および（２３Ｃ）８００×である。（２３Ｄ）アイソタイプ対照（ＭＢＣ）は８００×であり、（２３Ｅ）非標的化対照ＭＢＯは８００×である。（２３Ｆ）ＨＵＶＥＣの％であり、結合ＭＢ（■）およびＭＢ結合なし（□）である。図２３Ｇは、ＭＢ対細胞比を増大させて、結合細胞当たりのＭＢの数（平均＋／−ｓｅｍ）を示す。ＭＢＤは、アイソタイプ対照ＭＢＣおよび対照非標的化ＭＢＯと比較する。＊＊＊、ＡＮＯＶＡ  Ｐ＜０．０００１。
【図２４】Ａ〜Ｆは、肝臓（２４Ａ〜２４Ｃ）および膵臓（２４Ｄ〜２４Ｆ）の非癌性および癌性組織におけるＤＥｓｐＲ発現を示す。（２４Ａ）隣接の正常肝臓組織；（２４Ｂ、２４Ｃ）２人の患者からの肝癌Ｔ−２；（２４Ｄ）、隣接の正常膵臓組織；（２４Ｅ、２４Ｆ）２人の患者からの膵管癌グレードＩＩＩ−ＩＶ。黒い矢印、微小血管；発現にほぼ比例する色の強度を有する、ＤＥｓｐＲ陽性免疫染色のＤＡＢ検出；ヘマトキシリン核対比染色。バー、２０ミクロン。
【図２５】Ａ〜Ｆは、ヒト組織アレイ：胃（２５Ａ〜２５Ｃ）および乳房（２５Ｄ〜２５Ｆ）の非癌性および癌性組織におけるＤＥｓｐＲ発現を示す。（２５Ａ）隣接の正常胃組織；（２５Ｂ）胃癌Ｔ−３、（２５Ｃ）胃癌の肺への転移；（２５Ｄ）線維症を有する隣接の正常乳房組織；（２５Ｅ）胸部髄様癌（ｂｒｅａｓｔ  ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）Ｔ−２；（２５Ｆ）乳房腫瘍のリンパ節への転移。黒い矢印、血管内皮；発現にほぼ比例する色の強度を有するＤＥｓｐＲ陽性免疫染色のＤＡＢ検出；ヘマトキシリン核対比染色。バー、２０ミクロン。
【図２６】Ａ〜Ｆは、肺および結腸の非癌性および癌組織におけるＤＥｓｐＲ発現を示す。（２６Ａ）隣接の正常肺；（２６Ｂ）Ｇｒ−Ｉ肺腺癌；（２６Ｃ）、Ｇｒ．ＩＩＩ，Ｔ２肺腺癌；（２６Ｄ）隣接の正常結腸；（２６Ｅ、２６Ｆ）結腸腺癌Ｇｒ．ＩＩＩ−ＩＶ、Ｔ２。白い矢印、内皮；黒い矢印→、癌細胞における核膜のＤＥｓｐＲ免疫染色。発現にほぼ比例する色の強度を有するＤＥｓｐＲ免疫染色のＤＡＢ検出；ヘマトキシリン核対比染色。バー、２０ミクロン  ２６Ａ〜２６Ｃ；２５ミクロン  ２６Ｄ；１０ミクロン  ２６Ｅ、２６Ｆ。
【図２７】Ａ〜Ｆは、種々の組織型の癌細胞株におけるＤＥｓｐＲ発現を示す。（２７Ａ）非小細胞肺癌細胞株、＃ＮＣＩ−Ｈ７２７；（２７Ｂ）結腸癌、ＳＷ４８０  Ｄｕｋｅ型Ｂ；（２７Ｃ）膵癌、ＰＡＮＣ−１；（２７Ｄ）乳腺癌転移、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；（２７Ｅ）膀胱癌２５３Ｊ  ＢＶ；（２７Ｆ）前立腺腺癌ＰＣ−３ｍｍ２。→、癌細胞における核膜のＤＥｓｐＲ免疫染色、発現にほぼ比例する色の強度を有するＤＥｓｐＲ免疫染色のＤＡＢ検出；ヘマトキシリン核対比染色。バー、２０ミクロン  Ａ〜Ｆ。
【図２８】Ａ〜Ｂは、ヒト特異的抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体の特徴付けを示す。（２８Ａ）１０の候補モノクローナル抗体クローンの間接ＥＬＩＳＡによる分析が示される。１μｇ／ｍｌのｍＡｂを含有する上清からの連続希釈は、以下のように検査した：１＝１／２、２＝１／４、３＝１／８、４＝１／１６、５＝１／３２、６＝１／６４、７＝１／１２８、８＝１／２５６、９＝１／５１２、１０＝１／１０２４、１１＝１／２０４８および１２＝１／４０９６。白いひし形、選択されたＭａｂ７ｃ５ｂ２クローン、オープンシンボル、他のすべて。（２８Ｂ）精製Ｍａｂ（レーン１〜３）、および「スーパークローン」上清（レーン４〜６）、および対照としての機能を果たすＰＢＳ（レーン７）のウェスタンブロット分析が描かれる。レーン１および４の７Ｃ５Ｂ２Ｍａｂを選択（ひし形）。抗ＤＥｓｐＲ  Ｍａｂ免疫染色および抗ＶＥＧＦｓｐ免疫染色によるＨＵＶＥＣの二重免疫染色を実施し、ＤＥｓｐＲおよびＶＥＧＦｓｐの共存を決定した。
【図２９】Ａ〜Ｃは、モノクローナル抗体によるＤＥｓｐＲ阻害が、インビトロＨＵＶＥＣアッセイにおいて血管新生を低減することを実証する。抗ＤＥｓｐＲ  Ｍａｂを用いるＨＵＶＥＣのＤＥｓｐＲ免疫染色を実施した。（２９Ａ）ＥＣ５０＝４．３４＋／−０．４５ｎＭを有する管の全長／ウェル（○）、およびＥＣ．５０  ３．９７＋／−０．５１ｎＭを有する管の分枝点の数（●）を測定する、血管新生の抗ＤＥｓｐＲ  Ｍａｂ阻害の用量反応曲線。（２９Ｂ）対照の非処置細胞（３０Ｃ）、免疫前血清（ＰＩ）およびＰａｂおよびＭａｂそれぞれのＩｇＧ２ｂアイソタイプ（Ｉｓｏ）対照と比較した、抗ＤＥｓｐＲポリクローナル（Ｐａｂ）およびモノクローナル（Ｍａｂ）抗体によるＤＥｓｐＲ阻害の際の管の全長変化の分析。（２９Ｃ）対照（Ｃ、ＰＩ、Ｉｓｏ）と比較した、ＰａｂおよびＭａｂ抗ＤＥｓｐＲ  ａｂ阻害により阻害される分枝点の平均数（＃）の分析。データは、４回の繰り返しの平均＋／−ｓｅｍで表される。＊、Ｐ＜０．０１（ＡＮＯＶＡの後、全ペアワイズ多重比較Ｔｕｋｅｙ検定）。
【図３０】Ａ〜Ｃは、モノクローナル抗体によるＤＥｓｐＲ阻害が、インビトロＨＵＶＥＣアッセイにおいて血管新生を低減することを実証する。抗ＤＥｓｐＲ  ＭａｂによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞およびＰＡＮＣ−１膵癌細胞株のＤＥｓｐＲ陽性免疫染色を実施した。（３０Ａ）ＭＤＡ＝ＭＢ−２３１乳癌細胞侵襲性の抗ＤＥｓｐＲ  Ｍａｂにより増大するＤＥｓｐＲ阻害の用量反応曲線（黒）、ＥＣ５０＝３．５５＋／−０．３２ｎＭ。（３０Ｂ〜３０Ｃ）対照の非処置細胞、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞のＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（３１Ｂ）、およびＰＡＮＣ−１膵臓細胞株（３１Ｃ）と比較した、抗ＤＥｓｐＲ  Ｍａｂ阻害により阻害される細胞侵襲性の分析。全てのデータは、４回の繰り返しの平均＋／−ｓｅｍで示される；＊、Ｐ＜０．０１；＊＊、Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡの後、全ペアワイズ多重比較Ｔｕｋｅｙ検定）。
【図３１】Ａ〜Ｆは、ヒト乳房組織におけるＤＥｓｐＲ発現の免疫組織化学的分析を示す。（３１Ａ〜３１Ｃ）正常；（３１Ｄ〜３１Ｆ）グレード−１、Ｔ１侵襲性腺管癌。３１Ａ．正常乳房組織：ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡおよびＤＡＰＩ核染色の３Ｘ−オーバーレイは、乳房筋上皮細胞においてａＳＭＡ発現を検出するが、上皮細胞（白い三角の矢じり→）および微小血管（白い円形矢じり）におけるＤＥｓｐＲの発現は検出しない。３１Ｂ、ＤＥｓｐＲおよびＤＡＰＩ核染色の２Ｘ−免疫蛍光オーバーレイは、正常乳房組織においてＤＥｓｐＲ発現がないことを確認する。３１Ｃ、ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩ免疫蛍光および拡散コントラストイメージング（ＤＩＣ）の４Ｘ−オーバーレイは、組織モルホロジー、正常乳房上皮および内皮におけるａＳＭＡの発現、およびＤＥｓｐＲの非／最小限の発現を描く。３１Ｄ、Ｇｒ．Ｉ−Ｔ１侵襲性腺管癌におけるＤＡＰＩ、ａＳＭＡおよびＤＥｓｐＲ免疫蛍光の３Ｘ−オーバーレイは、血管内皮におけるＤＥｓｐＲ発現、および乳房組織におけるａＳＭＡとの共存を検出する。３１Ｅ、パネルｄに示される乳癌のＤＡＰＩおよびＤＥｓｐＲの２Ｘ−オーバーレイは、ＤＥｓｐＲ発現を強調する。３１Ｆ、ＤＡＰＩ、ａＳＭＡ、ＤＥｓｐＲ、ＤＩＣの４Ｘ−オーバーレイは、組織モルホロジーと共にＤＥｓｐＲの空間的発現を明らかにする。（白い三角の矢じり→）、上皮細胞；（白い円形矢じり）、微小血管。ＤＥｓｐＲ陽性；ａＳＭＡ陽性；ＤＡＰＩ核染色；ａＳＭＡおよびＤＥｓｐＲの共存；バー＝２０ミクロン。
【図３２】Ａ〜Ｆは、抗ＤＥｓｐＲ  Ｍａｂを用いる膵臓組織におけるＤＥｓｐＲ発現の免疫組織化学的分析を実証する。（３２Ａ〜３２Ｃ）正常；（３２Ｄ〜３２Ｆ）グレード−３、Ｔ３膵管癌。（３２Ａ）正常膵臓組織：ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡおよびＤＡＰＩ核染色の３Ｘ−オーバーレイは、パネル３２Ｂにおいてより良く見られる微小血管における最小限のＤＥｓｐＲ発現を検出する。（３２Ｂ）４Ｘ−免疫蛍光オーバーレイ：ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩ、および組織モルホロジーのＤＩＣイメージング。（３２Ｃ）左：ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩ免疫蛍光の３Ｘ−オーバーレイ；右：ＤＥｓｐＲ、ａＳＭＡ、ＤＡＰＩおよび組織モルホロジー拡散コントラストイメージング（ＤＩＣ）の４ｘ−オーバーレイは、正常内皮において、ａＳＭＡ発現および非／最小限のＤＥｓｐＲの発現を示す。（３２Ｄ）Ｇｒ．３−Ｔ３膵管癌におけるＤＡＰＩ、ａＳＭＡおよびＤＥｓｐＲ免疫蛍光の３Ｘ−オーバーレイは、血管内皮におけるＤＥｓｐＲ発現、およびａＳＭＡとの共存を検出する。（３２Ｅ）パネル３２Ｄに示される画像のＤＡＰＩおよびＤＥｓｐＲの２Ｘ−オーバーレイはＤＥｓｐＲ発現を強調する。（３２Ｆ）ＤＡＰＩ、ａＳＭＡ、ＤＥｓｐＲの３Ｘ−オーバーレイは、膵管癌細胞におけるＤＥｓｐＲ発現の増大（白い→）を示す。上皮細胞；（白い円形矢じり）、微小血管。ＤＥｓｐＲ陽性；ａＳＭＡ陽性；ＤＡＰＩ核染色；ａＳＭＡおよびＤＥｓｐＲの共存；バー＝２０ミクロン。
【図３３】７Ｃ５Ｂ２ハイブリドーマから得られる抗体のＲＴ−ＰＣＲ産物の１％アガロースゲル分離を実証する。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ  ＤＮＡゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ．ｎｏ．Ｓ３３１０２）によりゲルを染色し、紫外光に関して撮影した。サイズマーカー（Ｌ）は、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒＴＭ１Ｋｂ  Ｐｌｕｓ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ｃａｔ．ｎｏ．ＳＭ１３３１）である。ＩｇＧＶＨ、ＩｇＭＶＨ、ＩｇκＶＬおよびＩｇλＶＬのそれぞれに対する定常領域プライマーを有するマウスシグナル配列に対する縮重プライマープールを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【図３４】７Ｃ５Ｂ２抗体の可変重鎖アミノ酸（SEQ ID NO:４）およびヌクレオチド（SEQ ID NO:３）配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。
【図３５】複合７Ｃ５Ｂ２抗体の可変軽鎖アミノ酸（SEQ ID NO:９）およびヌクレオチド（SEQ ID NO:８）配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。
【図３６】本明細書に記載される方法を用いて生成された複合抗ＤＥｓｐＲヒト化７Ｃ５Ｂ２抗体の例示的な可変重鎖アミノ酸（SEQ ID NO:１３）およびヌクレオチド配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。
【図３７】本明細書に記載される方法を用いて生成された複合抗ＤＥｓｐＲヒト化７Ｃ５Ｂ２抗体の例示的な可変重鎖アミノ酸（SEQ ID NO:１４）およびヌクレオチド配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。
【図３８】本明細書に記載される方法を用いて生成された複合抗ＤＥｓｐＲヒト化７Ｃ５Ｂ２抗体の例示的な可変重鎖アミノ酸（SEQ ID NO:１５）およびヌクレオチド配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。
【図３９】本明細書に記載される方法を用いて生成された複合抗ＤＥｓｐＲヒト化７Ｃ５Ｂ２抗体の例示的な可変重鎖アミノ酸（SEQ ID NO:１６）およびヌクレオチド配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。
【図４０】本明細書に記載される方法を用いて生成された複合抗ＤＥｓｐＲヒト化７Ｃ５Ｂ２抗体の例示的な可変重鎖アミノ酸（SEQ ID NO:１７）およびヌクレオチド配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。
【図４１】本明細書に記載される方法を用いて生成された複合抗ＤＥｓｐＲヒト化７Ｃ５Ｂ２抗体の例示的な可変軽鎖アミノ酸（SEQ ID NO:１８）およびヌクレオチド配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。
【図４２】本明細書に記載される方法を用いて生成された複合抗ＤＥｓｐＲヒト化７Ｃ５Ｂ２抗体の例示的な可変軽鎖アミノ酸（SEQ ID NO:１９）およびヌクレオチド配列を示す。ＣＤＲの定義およびタンパク質配列の番号付けはＫａｂａｔに従う。
【発明を実施するための形態】
【００９８】
詳細な説明
本明細書では、抗ＤＥｓｐＲ抗体およびそのＤＥｓｐＲ結合断片を含む新規の組成物と、抗血管新生および抗腫瘍増殖および侵襲性療法、例えば、癌の治療、ならびに頸動脈疾患、栄養血管の新血管発生（従って、例えば脳卒中に影響を与える）、および不安定プラークの新血管発生（従って、例えば心疾患に影響を与える）などのように病的血管新生が役割を果たす血管疾患の治療におけるその使用方法とが提供される。さらに、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体およびそのＤＥｓｐＲ結合断片を含む組成物は、腫瘍生検におけるＤＥｓｐＲ発現を決定して、個別化医療アプローチ、血管新生のＤＥｓｐＲ標的化分子イメージングのための可能なレスポンダー（ｒｅｐｏｓｎｄｅｒ）を同定するためのコンパニオン診断などの評価およびイメージング方法において有用であり、例えば、治療に対する応答、腫瘍「血管新生スイッチ」のインビボ検出または血管擬態の連続的なモニタリングにおいて使用することができる。さらに、このような診断は、個別化医療用途において使用するための抗血管新生療法に対する新規のアプローチを提供する。さらに、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体およびそのＤＥｓｐＲ結合断片を含む組成物は、ナノ粒子、ポリプレックス、微小粒子などの送達剤と組み合わせて、他の診断および治療組成物のための標的部分として有用である。
【００９９】
ベバシズマブ、スニチニブ、およびソラファニブ治療などの、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ２受容体経路を標的する治療法は、最近、一時的な利益しか有さないことが示されており、抗ＶＥＧＦ治療の後にＶＥＧＦレベルの１０倍の増大が検出され（Ｗｉｌｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５およびＣａｒｍｅｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２００５）、ＶＥＧＦＲ２阻害剤（スニチニブ）治療の後に、転移の増悪が見られるように、フィードバック血管新生応答が促進または誘発されると思われる。
【０１００】
対照的に、本発明者らは、ＶＥＧＦシグナルペプチド（ＶＥＧＦｓｐ）とその受容体「ＤＥｓｐＲ」または「二重エンドセリン−１／ＶＥＧＦｓｐ受容体」との相互作用によって重要で非冗長かつ明確な役割が果たされるという彼らの発見に基づいて、ＶＥＧＦ系の別の血管新生アームを発見した。本発明者らは、ａ）ＤＥｓｐＲヌル変異が、異常な胚性脈管形成および血管新生によるＥ１０．５−Ｅ１２．５胚性致死をもたらす（Ｈｅｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００５）こと、ｂ）ＥＴ１結合について観察されるものに等しい高アフィニティで、ＶＥＧＦｓｐがＤＥｓｐＲに結合する（Ｈｅｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００５）こと、ｃ）ラット乳房腫瘍モデルにおけるＤＥｓｐＲ抗体媒介の阻害、およびＤＥｓｐＲ＋／−マウスにおけるＤＥｓｐＲハプロ不全が、インビボで腫瘍成長を低減する（Ｈｅｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００５）こと、ｄ）ＶＥＧＦｓｐが、成体ラット大動脈輪血管新生をシミュレートする（Ｄｅｃａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）こと、そしてｅ）ＤＥｓｐＲが成体血管新生を媒介し、本明細書に記載されるように、頸動脈アテローム硬化性栄養血管の新血管発生中にその発現が増大されることを見出した。
【０１０１】
本明細書に記載されるように、本発明者らは、さらに、ａ）雄および雌の両方におけるいくつかのヒト癌腫瘍血管（例えば、乳房、肺、肝臓、膀胱、膵臓、胃、食道、結腸など）において、そして驚くことに、乳房、肺、神経膠芽腫、膀胱、メラノーマ、および膵臓の腫瘍細胞を含む様々な腫瘍細胞において（腫瘍組織アレイおよび腫瘍細胞株アレイをそれぞれ用いて）、ならびに癌幹細胞または癌幹様細胞または腫瘍開始細胞において、ＤＥｓｐＲ発現が増大されること、ｂ）培養腫瘍細胞中の核および細胞膜の両方においてＤＥｓｐＲおよびＶＥＧＦｓｐが共存されること、ｃ）ＶＥＧＦｓｐが、腫瘍細胞の増殖および侵襲性の両方を刺激すること、そしてｄ）ポリクローナルおよびモノクローナル抗ヒトＤＥｓｐＲ抗体によるＤＥｓｐＲ阻害が血管新生および腫瘍細胞侵襲性を強く抑制し、腫瘍成長速度を低下させ、腫瘍サイズを著しく低下させることを実証する。
【０１０２】
ＤＥｓｐＲ
二重エンドセリン−１／ＶＥＧＦシグナルペプチド活性化受容体（ＤＥｓｐＲ）（以前は、ＤＥＡＲ）は、最初に、Ｄａｈｌ食塩感受性高血圧ラット脳ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされ、同等のアフィニティを有するＣａ２＋動員性伝達経路結合エンドセリン−１（ＥＴ−１）およびアンジオテンシン−ＩＩ（Ａｎｇ  ＩＩ）に結合される単一の膜貫通受容体であることが示された。（Ｒｕｉｚ−Ｏｐａｚｏ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｕａｌ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１／Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．４：９６−１０８）。それに続く分子的研究は、マウスオルソログがＡｎｇＩＩとは相互作用をしないが、代わりに等しいアフィニティを有するＥＴ−１および血管内皮成長因子シグナルペプチド（ＶＥＧＦｓｐ）に結合することを解明した。マウスにおけるＤＥｓｐＲ−／−二重突然変異欠損は、脈管形成障害、異常な血管新生および血管網の形成による胚性致死をもたらした。またＤＥｓｐＲ−／−胚は、過剰に入り組んだ（ｈｙｐｅｒｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）神経上皮および終脳から髄脳への調節不全の神経管分化によって特徴付けられる異常なニューロン新生も示した（Ｈｅｒｒｅｒａ  ＶＬＭ，ｅｔ  ａｌ．，（２００５），Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｄｅａｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ：ｎｅｗ  ｐｌａｙｅｒ  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２３：２５７−２６８）。この表現型は、ＶＥＧＦ＋／−欠損マウスにおける神経管の発生で観察されるアポトーシス促進効果とは著しく反対であるが、脈管形成および血管新生における異常性は類似している（Ｈｅｒｒｅｒａ  ＶＬＭ，ｅｔ  ａｌ．，（２００５））。
【０１０３】
従って、「ＤＥｓｐＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在する対立遺伝子、スプライス変異体、およびこれらの処理された型と共に、例えば、Ｇｌｏｒｉｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．２００７により記載されるような
2013538191.tif 000003
のヒトアミノ酸天然配列を有する８５−アミノ酸二重エンドセリン／ＶＥＧＦシグナルペプチド受容体（ＤＥｓｐＲ）を指す。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、ＤＥｓｐＲ「天然配列」またはＤＥｓｐＲ「野生型配列」ポリペプチドは、天然由来のＤＥｓｐＲポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。従って、天然配列ポリペプチドは、任意の哺乳類からの天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列を有することができる。このような天然配列ポリペプチドは天然から単離することもできるし、組換えまたは合成手段によって産生することもできる。「天然配列」ポリペプチドという用語は、特に、ポリペプチドの天然に存在する切断型または分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に存在する変異型（例えば、代替的スプライス型）、およびポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体を包含する。
【０１０５】
ＤＥｓｐＲポリペプチド「変異体」は、ＤＥｓｐＲポリペプチドの天然配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なＤＥｓｐＲポリペプチドを意味する。このような変異体は、例えば、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端において１つまたは複数のアミノ酸残基が付加または欠失されたポリペプチドを含む。通常、変異体は、天然配列ポリペプチドと、少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１０６】
ＤＥｓｐＲは、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーの一部であり、エンドセリン−１およびＶＥＧＦシグナルペプチド（ＶＥＧＦｓｐ）と結合する。ＶＥＧＦｓｐは、ヒト配列
2013538191.tif 000004
を有する。通常、本明細書で使用される場合、ＤＥｓｐＲは、ヒトＤＥｓｐＲを指す。「ＤＥｓｐＲ」という用語は、８５−アミノ酸ヒト二重エンドセリン／ＶＥＧＦシグナルペプチド受容体の特異的アミノ酸配列を含むポリペプチド切断型または断片を指すためにも使用される。ＤＥｓｐＲのこのような任意の形態への言及は、本出願では、例えば「ＤＥｓｐＲ（１−９）」によって識別され得る。
【０１０７】
ＤＥｓｐＲアンタゴニスト＆抗ＤＥｓｐＲ抗体
本明細書には、ＤＥｓｐＲ活性（エンドセリン−１またはＶＥＧＦｓｐに対するその結合を含む）を中和、遮断、阻害、抑止、低減または妨害することができるＤＥｓｐＲアンタゴニストを含む組成物および方法が提供されている。ＤＥｓｐＲアンタゴニストは、抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗原結合断片、受容体分子、小分子、ナノ粒子、ポリプレックス、これらの組み合わせおよび誘導体を含むがこれらに限定されず、これらは、ＤＥｓｐＲに特異的に結合することにより、ＶＥＧＦｓｐおよびエンドセリン−１などのそのリガンドに対する結合を阻害、防止、または隔離する。
【０１０８】
抗ＤＥｓｐＲ抗体および抗体産生
従って、本明細書において提供されるいくつかの態様では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはＤＥｓｐＲ標的に特異的なその抗体断片であり、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片はＤＥｓｐＲ標的に特異的に結合し、ＤＥｓｐＲ生物活性を低減または阻害する。いくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲはヒトＤＥｓｐＲである。いくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲ標的は、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列またはその対立遺伝子もしくはスプライス変異体を含む。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「抗ＤＥｓｐＲ抗体」は、十分なアフィニティおよび特異性でＤＥｓｐＲに結合する抗体を指す。例えば、選択される抗体は通常ＤＥｓｐＲに対する結合アフィニティを有し、抗体は１０−５Ｍ〜１０−１０ＭのＫＤ値でヒトＤＥｓｐＲと結合することができる。本明細書で使用される場合、「選択的に結合する」または「特異的に結合する」は、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片が、１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）以下、例えば１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたはそれ以下のＫＤでＤＥｓｐＲと結合する能力を指す。
【０１１０】
抗体アフィニティは、例えば、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（ＰＣＴ出願国際公開第２００５／０１２３５９号パンフレットに記載されるＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および競合アッセイ（例えば、ＲＩＡ競合アッセイ）によって決定することができる。本明細書に記載される特定の態様では、抗ＤＥｓｐＲ抗体は、ＤＥｓｐＲ活性が関与する疾患または状態を標的として妨害する際の治療薬として使用することができる。また、抗ＤＥｓｐＲ抗体は他の生物活性アッセイを受けて、例えば、治療補助薬としてのその有効性、または診断補助薬としてのその有効性などを評価することもできる。このようなアッセイは当該技術分野において知られており、抗体の標的抗原および使用目的に依存する。例としては、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ、腫瘍細胞成長阻害アッセイ（例えば、国際公開第８９／０６６９２号パンフレットに記載される）、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体媒介細胞毒性（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５，５００，３６２号明細書）、ならびにアゴニスト活性または造血アッセイ（国際公開第９５／２７０６２号パンフレットを参照）が挙げられる。抗ＤＥｓｐＲ抗体を査定するために使用することができるその他の生物活性アッセイは、実験セクションにおいて本明細書で記載される。
【０１１１】
従って、本明細書に記載される組成物および方法において有用な抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、十分なアフィニティおよび特異性でＤＥｓｐＲに結合する、すなわちＤＥｓｐＲに特異的であり、ＤＥｓｐＲの生物活性を低減または阻害することができる任意の抗体またはその抗体断片を含む。
【０１１２】
従って、本明細書では、いくつかの態様では、ＤＥｓｐＲに結合して、ＤＥｓｐＲ生物活性を阻害する、またはＤＥｓｐＲとＶＥＧＦｓｐとの相互作用を遮断する、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片が提供される。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、ＶＥＧＦｓｐは、SEQ ID NO:２の配列を含む配列を有する。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、ＤＥｓｐＲの細胞外部分を含むＤＥｓｐＲのエピトープに対して特異的である。本明細書に記載されるこれらの態様およびこのような全ての態様のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:１のアミノ酸１〜９を含むＤＥｓｐＲのエピトープに対して特異的である。
【０１１３】
本明細書に記載される組成物および方法と共に有用な抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗体断片のさらなる説明および例、ならびにこれらの製造方法および特徴付けは以下に提供される。
【０１１４】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関連の抗原、例えばＤＥｓｐＲ（１−９）およびアジュバントの多数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって、好ましくは動物中で上昇される。いくつかの実施形態では、二官能性または誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここで、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を用いて、関連の抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に結合させることが有用であり得る。
【０１１５】
動物は、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質または結合体（それぞれ、ウサギまたはマウスについて）を３体積のフロイント完全アジュバントと混ぜ合わせ、この溶液を多部位で皮内に注射することによって、抗原、免疫原性結合体、または誘導体に対して免疫化され得る。１か月後に、動物は、多部位における皮下注射によってフロイント完全アジュバント中の最初の量の１／５〜１／１０のペプチドまたは結合体で追加免疫される。７〜１４日後に、動物は採血され、抗体力価について血清がアッセイされる。動物は力価プラトーまで追加免疫される。好ましくは、動物は、同じ抗原であるが、異なるタンパク質に結合され、そして／あるいは異なる架橋剤により結合された結合体により追加免疫される。結合体は、タンパク質融合体として組換え細胞培養において作ることもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤を適切に使用して免疫応答を高めることもできる。
【０１１６】
モノクローナル抗体
好ましくは、本明細書に記載される組成物および方法と共に使用するための抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体またはその断片である。「モノクローナル抗体」という用途は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原に対するものである。さらに、通常異なる決定因子（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対するものである。本明細書に記載されるＤＥｓｐＲに特異的なモノクローナル抗体を製造するための種々の方法は当該技術分野において入手可能である。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて製造することもできるし、あるいは、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）によって製造することもできる。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）、またはＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【０１１７】
抗ＤＥｓｐＲ「抗体断片」という用語は、少なくとも、インタクト抗体の抗原結合部位を含み、従って抗原に結合する能力を保持しているタンパク質断片を指す。抗体断片という用語によって包含される抗体断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片、（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ'断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片、（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメイン、ならびにＣＨ１ドメインのＣ末端の１つまたは複数のシステイン残基を有するＦｄ'断片、（ｖ）抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖ断片、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））、（ｖｉｉ）単離ＣＤＲ領域、（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ'断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ'）２断片、（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば、単鎖Ｆｖ、ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：５８７９−５８８３（１９８８））、（ｘ）同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン、（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む２つの抗原結合部位を有する「ダイアボディ」（例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書、国際公開第９３／１１１６１号パンフレット、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照）、（ｘｉ）相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「直鎖抗体」（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）、および米国特許第５，６４１，８７０号明細書）が挙げられる。
【０１１８】
抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマ法において、マウス、またはハムスターもしくはマカクザルなどの他の適切な宿主動物は、本明細書に記載されるように免疫化され、免疫化のために使用されるＤＥｓｐＲタンパク質またはその断片に特異的に結合し得る抗体を産生するかあるいは産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化することもできる。次に、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて、骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１１９】
このように調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含有するの適切な培地中で、播種および成長される。例えば、親骨髄腫細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）が欠けている場合には、ハイブリドーマのための培地は、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。
【０１２０】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体の産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に対して選択的なものでる。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株は、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するものなどのマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞株もヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１２１】
ハイブリドーマ細胞が成長している培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって決定される。
【０１２２】
所望の特異性、アフィニティ、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されたら、クローンは限界希釈手順によりサブクローニングされ、標準的な方法により成長される（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的のための適切な培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで成長させることもできる。
【０１２３】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、タンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地、腹水、または血清から適切に分離される。
【０１２４】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる）を用いて容易に単離され、配列決定され得る。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源としての機能を果たす。単離されたらすぐに、ＤＮＡは発現ベクター内に配置させることができ、これは次に、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得るために、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされる（さもなければ免疫グロブリンタンパク質が産生されない）。抗体の組換え産生は、以下により詳細に説明される。
【０１２５】
抗ＤＥｓｐＲハイブリドーマおよびそのモノクローナル抗体
本明細書に記載される特定の態様では、抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体には、本明細書に記載されるハイブリドーマ７Ｃ５Ｂ２によって産生または発現され、「７Ｃ５Ｂ２抗体」と呼ばれるモノクローナル抗ＤＥｓｐＲ抗体７Ｃ５Ｂ２、およびその誘導体または抗原結合断片（例えば、「７Ｃ５Ｂ２可変重鎖」または「７Ｃ５Ｂ２」可変軽鎖を含む）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２６】
本明細書に記載されるように、７Ｃ５Ｂ２ハイブリドーマは、本明細書において「７Ｃ５Ｂ２抗ＤＥｓｐＲ抗体」または「７Ｃ５Ｂ２抗体」と命名されるモノクローナル抗体を産生し、これは、ＤＥｓｐＲに対して非常に特異的であり、ＤＥｓｐＲ生物活性を強力に阻害することができる。７Ｃ５Ｂ２抗ＤＥｓｐＲ抗体は、その生物学的特徴により、本明細書に記載される組成物および方法（治療および診断用途を含む）のために特に有用であるとされる。従って、７Ｃ５Ｂ２抗体の配列分析を本明細書に記載されるように実施して、本明細書に記載される組成物および方法において使用するための７Ｃ５Ｂ２抗体の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列、ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を同定した。
【０１２７】
本明細書および特許請求の範囲を通して、免疫グロブリン重鎖中の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）（ワールドワイドウェブ上でも入手可能であり、参照によってその全体が本明細書中に明確に援用される）にあるようなＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔのようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基の番号付けを指す。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「抗体可変ドメイン」は、相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、およびフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む、抗体分子の軽鎖および重鎖の一部を指す。ＶＨは重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインを指す。本明細書において使用される方法によると、ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７  ａｎｄ  １９９１））に従って定義することができる。抗体または抗原結合断片のアミノ酸の番号付けもＫａｂａｔの番号付けに従う。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」（ＣＤＲ、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）という用語は、その存在が抗原結合のために必要である抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として識別される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔにより定義されるように「相補性決定領域」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基約２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、および／または「高頻度可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基約２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含むことができる。いくつかの実施形態では、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔに従って定義されるＣＤＲ領域および高頻度可変ループの両方からのアミノ酸を含むことができる。
【０１３０】
７Ｃ５Ｂ２ハイブリドーマから得られる配列の配列分析によって得られるような、７Ｃ５Ｂ２抗体のＶＨまたは重鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列は、
2013538191.tif 000005
である。
【０１３１】
７Ｃ５Ｂ２抗体のＶＨドメインの対応するアミノ酸は、
2013538191.tif 000006
である。
【０１３２】
７Ｃ５Ｂ２抗体のＶＨドメインの１０アミノ酸相補性決定領域１またはＣＤＲ１は、
2013538191.tif 000007
である。７Ｃ５Ｂ２抗体のＶＨドメインの１６アミノ酸ＣＤＲ２は、
2013538191.tif 000008
である。７Ｃ５Ｂ２抗体のＶＨドメインの１１アミノ酸ＣＤＲ２は、
2013538191.tif 000009
である。
【０１３３】
７Ｃ５Ｂ２ハイブリドーマから得られる配列の配列分析によって得られるような、７Ｃ５Ｂ２抗体のＶＬまたは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列は、
2013538191.tif 000010
である。
【０１３４】
７Ｃ５Ｂ２抗体のＶＬドメインの対応するアミノ酸は、
2013538191.tif 000011
である。
【０１３５】
７Ｃ５Ｂ２抗体のＶＬドメインの１６アミノ酸相補性決定領域１またはＣＤＲ１は、
2013538191.tif 000012
である。７Ｃ５Ｂ２抗体のＶＬドメインの７アミノ酸ＣＤＲ２は、
2013538191.tif 000013
である。７Ｃ５Ｂ２抗体のＶＬドメインの９アミノ酸ＣＤＲ２は、
2013538191.tif 000014
である。
【０１３６】
表１に示されるように、７Ｃ５Ｂ２抗体の重鎖および軽鎖可変領域の配列分析は、ヒト生殖細胞系配列に対する強い相同性を示す。
【０１３７】
（表１）
2013538191.tif 000015
【０１３８】
従って、本明細書において提供される態様のいくつかの実施形態では、７Ｃ５Ｂ２抗体の重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列、すなわち、SEQ ID NO:３、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:８、および／またはSEQ ID NO:９は、例えば、本明細書中の他の場所に記載されるようなヒト化抗体を生成するために使用することができる。
【０１３９】
いくつかの態様では、７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体の１つまたは複数の生物学的特徴を有し、ＤＥｓｐＲに特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。本明細書で使用される場合、７Ｃ５Ｂ２抗体などの指定された抗体の「生物学的特徴」を有する抗体は、同じ抗原に結合する他の抗体特別されるその抗体の生物学的特徴の１つまたは複数を有するものである。
【０１４０】
従って、これらの態様のいくつかのこのような実施形態では、７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体の生物学的特徴を有するということは、所与の集団に対する７Ｃ５Ｂ２抗体のＥＤ５０値における、あるいはその前後のＥＤ５０値（すなわち、集団の５０％において治療的に有効な用量）を有すること；所与のパラメータまたは表現型に対する７Ｃ５Ｂ２抗体のＥＣ５０値における、あるいはその前後のＥＣ５０値（すなわち、所与のパラメータまたは表現型の最大半量の阻害を達成する用量）を有することを含み得る。特定の任意の投与量の効果は、適切なバイオアッセイによってモニターすることができる。例えば、これらの態様のいくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲに特異的に結合し、７Ｃ５Ｂ２抗体の１つまたは複数の生物学的特徴を有する抗体によって阻害される所与のパラメータまたは表現型は、インビトロ管形成アッセイにおける管の平均総数、インビトロ管形成アッセイにおける管の平均全長、インビトロ管形成アッセイにおける分枝点の平均数、インビトロ管形成アッセイにおける血管接続の平均数、および／または腫瘍細胞侵襲性を含むことができるが、これらに限定されない。
【０１４１】
従って、阻害される表現型が管の平均全長である実施形態では、インビトロ管形成アッセイを用いて測定されるように、７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体の生物学的特徴を有するモノクローナル抗体のＥＣ５０値は、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下である。いくつかのこのような実施形態では、モノクローナル抗体のＥＣ５０値は、３．０〜５．０ｎＭの範囲、３．１〜４．９ｎＭの範囲、３．２〜４．８ｎＭの範囲、３．３〜４．７ｎＭの範囲、３．４〜４．６ｎＭの範囲、３．５〜４．５ｎＭの範囲、３．６〜４．４ｎＭの範囲、３．７〜４．３ｎＭの範囲、３．８〜４．２ｎＭの範囲、または３．９〜４．１ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体の生物学的特徴を有するモノクローナル抗体の管の平均全長を阻害するためのＥＣ５０値は、３．８ｎＭ〜４．８ｎＭの範囲である。
【０１４２】
例えば、阻害される表現型が分枝点の数である実施形態では、インビトロ管形成アッセイを用いて測定されるように、７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体の生物学的特徴を有するモノクローナル抗体のＥＣ５０値は、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下である。いくつかのこのような実施形態では、モノクローナル抗体のＥＣ５０値は、３．０〜５．０ｎＭの範囲、３．１〜４．９ｎＭの範囲、３．２〜４．８ｎＭの範囲、３．３〜４．７ｎＭの範囲、３．４〜４．６ｎＭの範囲、３．５〜４．５ｎＭの範囲、３．６〜４．４ｎＭの範囲、３．７〜４．３ｎＭの範囲、３．８〜４．２ｎＭの範囲、または３．９〜４．１ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体の生物学的特徴を有するモノクローナル抗体の分枝点の総数を阻害するためのＥＣ５０値は、３．４ｎＭ〜４．５ｎＭの範囲、３．５ｎＭ〜４．４ｎＭの範囲、３．６ｎＭ〜４．３ｎＭの範囲、３．７ｎＭ〜４．２ｎＭの範囲、３．８ｎＭ〜４．１ｎＭの範囲、３．９ｎＭ〜４．０ｎＭの範囲である。
【０１４３】
例えば、阻害される表現型が腫瘍細胞侵襲性である実施形態では、インビトロで測定されるように、７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体の生物学的特徴を有するモノクローナル抗体のＥＣ５０値は、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下である。いくつかのこのような実施形態では、モノクローナル抗体のＥＣ５０値は、３．０〜５．０ｎＭの範囲、３．１〜４．９ｎＭの範囲、３．２〜４．８ｎＭの範囲、３．３〜４．７ｎＭの範囲、３．４〜４．６ｎＭの範囲、３．５〜４．５ｎＭの範囲、３．６〜４．４ｎＭの範囲、３．７〜４．３ｎＭの範囲、３．８〜４．２ｎＭの範囲、または３．９〜４．１ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体の生物学的特徴を有するモノクローナル抗体の腫瘍細胞侵襲性を阻害するためのＥＣ５０値は、３．２ｎＭ〜３．９ｎＭの範囲、３．３ｎＭ〜３．８ｎＭ、３．４ｎＭ〜３．７ｎＭの範囲、または３．５ｎＭ〜３．６ｎＭの範囲である。
【０１４４】
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法において使用するための抗ＤＥｓｐＲ抗体は、モノクローナル抗ＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２抗体と同じＤＥｓｐＲのエピトープ（単数または複数）に結合するモノクローナル抗体を含む。
【０１４５】
本明細書に記載される他の態様では、本明細書に記載される組成物および方法において使用するための抗ＤＥｓｐＲ抗体には、「７Ｃ５Ｃ５抗体」と呼ばれる、本明細書に記載されるハイブリドーマ７Ｃ５Ｃ５によって産生または発現されるモノクローナル抗ＤＥｓｐＲ抗体７Ｃ５Ｃ５、およびその誘導体または断片；モノクローナル抗ＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｃ５抗体と同じＤＥｓｐＲのエピトープまたはエピトープに結合するモノクローナル抗体；「５Ｇ１２Ｅ８抗体」と呼ばれる、本明細書に記載されるハイブリドーマ５Ｇ１２Ｅ８によって産生または発現されるモノクローナル抗ＤＥｓｐＲ抗体５Ｇ１２Ｅ８、およびその誘導体または断片；モノクローナル抗ＤＥｓｐＲ５Ｇ１２Ｅ８抗体と同じＤＥｓｐＲのエピトープまたはエピトープに結合するモノクローナル抗体；ならびにハイブリドーマ２Ｅ４Ａ８、２Ｅ４Ｂ１１、２Ｅ４Ｈ１０、８Ｅ７Ｄ１１、８Ｅ２Ｆ６、Ｅ２Ｇ４および８Ｅ７Ｆ８によって産生されるモノクローナル抗体が含まれる。
【０１４６】
ハイブリドーマによる生成および産生に加えて、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技術を用いて生成される抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）には、それぞれファージライブラリーを用いたマウスおよびヒト抗体の単離が記載される。その後の刊行物には、鎖シャッフリングによる高アフィニティ（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに非常に大きいファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））が記載される。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代わる実行可能な技術である。
【０１４７】
ＤＥｓｐＲに特異的に結合する抗体または抗体断片をコードするＤＮＡ配列は、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を相同マウス配列の代わりに用いることによって（米国特許第４，８１６，５６７号明細書、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、あるいは、本明細書において他でも説明されるような非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって、修飾することができる。
【０１４８】
このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインを置換することができるか、あるいは、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインを置換して、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作ることができる。
【０１４９】
ヒト化およびヒト抗体
本明細書において、いくつかの態様では、本明細書に記載される組成物および方法において使用するためのヒト化抗ＤＥｓｐＲ抗体が提供される。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体を指す。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域からの残基が、所望の特異性、アフィニティ、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域からの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらに良くするために行われる。一般に、ヒト化抗体は、高頻度可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そしてＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことができる。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むこともできる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【０１５０】
ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は「移入」残基と呼ばれることが多く、通常、「移入」可変ドメインから取り込まれる。ヒト化は、本質的にＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、齧歯類ＣＤＲをヒト抗体の対応する配列のためのＣＤＲ配列の代わりに使用することによって実施することができる。従って、このようなヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）、この場合、非ヒト種からの対応する配列によって、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少数が置換されている。実際には、ヒト化抗体は、通常、いくつかのＣＤＲ残基および恐らくいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体における類似部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。いくつかの実施形態では、マウス抗ＤＥｓｐＲ抗体７Ｃ５Ｂ２の可変重鎖（SEQ ID NO:４）および／または可変軽鎖（SEQ ID NO:９）ドメインのアミノ酸配列を含む１つまたは複数の可変ドメインを含むヒト化抗体が提供される。
【０１５１】
従って、本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、ヒト化抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片の１つまたは複数の重鎖および／または１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域は、本明細書に記載される７Ｃ５Ｂ２抗体の配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の可変重鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、またはSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の可変軽鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の可変重鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、またはSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含み、そして１つまたは複数の可変軽鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む。
【０１５２】
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、ヒト化抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体は、ヒトＤＥｓｐＲのそのリガンドに対する結合を遮断する本明細書に記載されるマウス抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２からの、突然変異ヒトＩｇＧ１フレームワーク領域ならびに１つまたは複数の重鎖および／または１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の可変重鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、またはSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の可変軽鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の可変重鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、またはSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含み、そして１つまたは複数の可変軽鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体は、ヒトＤＥｓｐＲのそのリガンドに対する結合を遮断する本明細書に記載されるマウス抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２からの、突然変異ヒトＩｇＧ４フレームワーク領域ならびに１つまたは複数の重鎖および／または１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の可変重鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、またはSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の可変軽鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、１つまたは複数の可変重鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、またはSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含み、そして１つまたは複数の可変軽鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む。
【０１５４】
ヒト化抗体の製造において使用される軽鎖および重鎖のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従って、７Ｃ５Ｂ２抗体のもの（それぞれSEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:９）などの齧歯類抗体の可変重鎖および軽鎖ドメインのアミノ酸配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。次に、齧歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れられる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体コンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体に対して同じフレームワークを使用することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【０１５５】
抗体は、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体７Ｃ５Ｂ２の抗原に対する高アフィニティおよび他の有利な生物学的特性（例えば、抗血管新生特性）を保持してヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法によると、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いる親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは市販されており、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列のほぼ確実な三次元コンホメーション構造を説明および表示するコンピュータプログラムを利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能性における残基の可能な役割の分析すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能になる。このようにして、レシピエントおよび移入配列からＦＲ残基を選択して組み合わせることができ、標的抗原に対するアフィニティの増大などの所望の抗体特性が達成される。一般に、ＣＤＲ残基は直接かつ最も実質的に、抗原結合への影響に関与する。
【０１５６】
ＶＥＧＦ抗原に対するものである例示的なヒト化抗体およびそのアフィニティ成熟変異体は、例えば、２００５年２月２６日に発行された米国特許第６，８８４，８７９号明細書に記載されている。
【０１５７】
あるいは、現在、内在性免疫グロブリンの産生がなくても、免疫化の際、ヒト抗体の全レパートリーを産生することができる遺伝子導入動物（例えば、マウス）を作ることが可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内在性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖細胞系突然変異体マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移動は、抗原負荷の際にヒト抗体の産生をもたらすであろう。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）、およびＤｕｃｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８（１９９２）を参照されたい。
【０１５８】
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０））を使用して、非免疫化ドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体断片をインビトロで産生することができる。この技術によると、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄなどの繊維状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面に機能性抗体断片として提示される。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能特性に基づいた選択は、これらの特性を示す抗体コードする遺伝子の選択も生じる。従って、ファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、様々な形式で実施することができ、これらの概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源は、ファージディスプレイのために使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、本質的に、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載される技術に従って、多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を単離することができる。また、米国特許第５，５６５，３３２号明細書および同第５，５７３，９０５号明細書も参照されたい。
【０１５９】
ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞によって生成することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号明細書および同第５，２２９，２７５号明細書を参照）。
【０１６０】
複合ヒト抗体の設計＆生成
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、最初に脱免疫化１００％改変ヒト抗体を生成する複合ヒト抗体技術を用いて、例えば、Ａｎｔｉｔｏｐｅにより記載されるような技術を用いて、本明細書に記載される組成物および方法において使用するためのヒト化複合抗ＤＥｓｐＲ抗体を調製することができる。
【０１６１】
簡単に言うと、本明細書で使用される場合、「複合ヒト抗体」は、出発マウス前駆体抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体（７Ｃ５Ｂ２抗体など）の抗原結合に重要であるモノクローナル抗体配列を保持するように選択され、「コンピュータでの手段」を用いて、可能性のあるＴ細胞エピトープの存在について全てフィルタリングされた無関係のヒト抗体のＶ領域に由来する多数の配列セグメント（「複合体」）を含む（Ｈｏｌｇａｔｅ  ＆  Ｂａｋｅｒ，２００９）。ヒト配列セグメントを出発抗体Ｖ領域のすべての切片と適合（ｃｌｏｓｅ  ｆｉｔ）させ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを最初から削除することにより、この技術は、「１００％改変ヒト」治療抗体の開発において免疫原性を回避することが可能になるが、抗原特異性に必要な配列の事前分析により最適なアフィニティおよび特異性は保持される（Ｈｏｌｇａｔｅ  ＆  Ｂａｋｅｒ  ２００９）。
【０１６２】
本明細書に記載されるように、Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢを用いてマウス抗ｈＤＥｓｐＲ抗体Ｖ領域の構造モデルを作り、抗体の結合特性に必須である可能性のあるＶ領域内の重要な「制約（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｉｎｇ）」アミノ酸を同定するために分析した。いくつかのフレームワーク残基と一緒にＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義を用いる）内に含有される残基が重要であると考えた。SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:９として本明細書に記載されるような抗ｈＤＥｓｐＲのＶＨおよびＶＬ（Ｖκ）配列はいずれも典型的なフレームワーク残基を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３モチーフは、本明細書中の他の場所に記載されるように、多くのマウス抗体に匹敵する。
【０１６３】
上記の分析から、抗ｈＤＥｓｐＲの複合ヒト配列は、ＣＤＲの外側では許容範囲の広い代替物により作成され得るが、ＣＤＲ配列内では狭いメニューの可能な代替残基のみで作成され得ると決定された。分析によって、いくつかのヒト抗体由来の対応する配列セグメントを組み合わせて、マウス配列中のものと類似または同一のＣＤＲを作成できることが示された。ＣＤＲの外側および隣接の領域については、本明細書に記載される組成物および方法と共に使用するための新規の抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体Ｖ領域の可能な構成要素として、広い選択範囲のヒト配列セグメントが同定された（例えば、表１を参照）。
【０１６４】
これらの分析に基づいて、新規の抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体変異体を作成するために使用され得る配列セグメントの大きな予備セットを選択し、ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に結合するペプチドのコンピュータによる分析のためのｉＴｏｐｅＴＭ技術を用い（Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００８）、既知の抗体配列関連のＴ細胞エピトープのＴＣＥＤＴＭ（Ｔ細胞エピトープデータベース）を用いて（Ｂｒｙｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）分析した。ヒトＭＨＣクラスＩＩに対する著しい非ヒト生殖細胞系バインダーとして同定された配列セグメント、またはＴＣＥＤＴＭに対して著しいヒットを記録した配列セグメントを廃棄した。これにより、セグメントセットの縮小が得られ、これらの組み合わせを上記のように再度分析して、セグメント間の接合部が潜在的なＴ細胞エピトープを含有しないことを保証した。次に、選択されたセグメントを組み合わせて、合成のための重鎖および軽鎖Ｖ領域配列を生成した。
【０１６５】
従って、本明細書には、抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体または改変されたヒト抗体の産生において使用するための可変重鎖および軽鎖配列が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体は、
2013538191.tif 000016
からなる群から選択される可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列を含むことができる。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体は、
2013538191.tif 000017
および
2013538191.tif 000018
からなる群から選択される可変軽い（ＶＬ）鎖アミノ酸配列を含むことができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体は、SEQ ID NO:５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体は、SEQ ID NO:６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体は、SEQ ID NO:７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むことができる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体は、SEQ ID NO:１０の配列を含む軽鎖ＣＤＲ１領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体は、SEQ ID NO:１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体は、SEQ ID NO:１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むことができる。
【０１６９】
抗体断片
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、例えば、抗ＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２抗体；SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、またはSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む抗ＤＥｓｐＲ抗体；SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む抗ＤＥｓｐＲ抗体；SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列を含む抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体；またはSEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１８、およびSEQ ID NO:１９からなる群から選択される可変軽（ＶＬ）鎖アミノ酸配列を含む抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体などのＤＥｓｐＲに特異的な抗体は、その抗体断片に処理または加工することができる。
【０１７０】
抗体断片の製造のために種々の技術が開発されており利用可能である。従来、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク質消化によって誘導されてきた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）。しかしながら、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞によって直接製造することができる。例えば、抗体断片は、上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ'−ＳＨ断片は大腸菌から直接回収され、化学的に結合されて、Ｆ（ａｂ'）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ'）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片の製造のための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の実施形態では、選り抜きの抗体断片は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号パンフレットを参照されたい。
【０１７１】
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、ヒトＤＥｓｐＲ特異的抗体断片は、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含むＦａｂ断片である。Ｆａｂ断片は、軽鎖の可変および定常ドメイン、ならびに重鎖の可変ドメインおよび第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。いくつかのこのような実施形態では、ＶＨドメインは、SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される。いくつかのこのような実施形態では、ＶＨドメインは、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、ＶＬドメインは、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１８、およびSEQ ID NO:１９からなる群から選択される。いくつかのこのような実施形態では、ＶＬドメインは、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む。
【０１７２】
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、ヒトＤＥｓｐＲ特異的抗体断片は、ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ'断片である。
【０１７３】
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、ヒトＤＥｓｐＲ特異的抗体断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含むＦｄ断片である。いくつかのこのような実施形態では、ＶＨドメインは、SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される。いくつかのこのような実施形態では、ＶＨドメインは、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む。
【０１７４】
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、ヒトＤＥｓｐＲ特異的抗体断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメイン、ならびにＣＨ１ドメインのＣ末端の１つまたは複数のシステイン残基を含むＦｄ'断片である。いくつかのこのような実施形態では、ＶＨドメインは、SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される。いくつかのこのような実施形態では、ＶＨドメインは、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む。
【０１７５】
単鎖ＦｖまたはｓｃＦｖ抗体断片は抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含み、これは、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望される構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ  １１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。従って、本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、ヒトＤＥｓｐＲ特異的抗体断片は、抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインを含むＦｖ断片である。いくつかのこのような実施形態では、ＶＨドメインは、SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される。いくつかのこのような実施形態では、ＶＨドメインは、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、ＶＬドメインは、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１８、およびSEQ ID NO:１９からなる群から選択される。いくつかのこのような実施形態では、ＶＬドメインは、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む。
【０１７６】
ダイアボディという用語は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨおよびＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインは別の鎖の相補的なドメインと対形成して、２つの抗原結合部位を作らざるを得ない。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書、国際公開第９３／１１１６１号パンフレット、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてより完全に記載される。
【０１７７】
従って、本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、ヒトＤＥｓｐＲ特異的抗体断片は２つの抗原結合部位を含むダイアボディであり、同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）結合され重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。いくつかのこのような実施形態では、ＶＨドメインは、SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される。いくつかのこのような実施形態では、ＶＨドメインは、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、ＶＬドメインは、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１８、およびSEQ ID NO:１９からなる群から選択される。いくつかのこのような実施形態では、ＶＬドメインは、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む。
【０１７８】
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、ヒトＤＥｓｐＲ特異的抗体断片は、ＶＨドメインを含むｄＡｂ断片である。いくつかのこのような実施形態では、ＶＨドメインは、SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される。いくつかのこのような実施形態では、ＶＨドメインは、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む。
【０１７９】
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、ヒトＤＥｓｐＲ特異的抗体断片は、単離されたＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、単離ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、単離ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む。
【０１８０】
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、ヒトＤＥｓｐＲ特異的抗体断片は、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ'断片を含む二価の断片を含むＦ（ａｂ'）２断片である。
【０１８１】
直鎖抗体は、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載されるような抗体を指す。簡単に言うと、これらの抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。直鎖抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
【０１８２】
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、ヒトＤＥｓｐＲ特異的抗体断片は、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む直鎖抗体である。いくつかのこのような実施形態では、ＶＨドメインは、SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される。いくつかのこのような実施形態では、ＶＨドメインは、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、ＶＬドメインは、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１８、およびSEQ ID NO:１９からなる群から選択される。いくつかのこのような実施形態では、ＶＬドメインは、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む。
【０１８３】
これらの態様の他の実施形態では、ヒトＤＥｓｐＲ特異的抗体断片は、本明細書に記載され、ハイブリドーマ７Ｃ５Ｂ２によって産生されるモノクローナル抗ＤＥｓｐＲ抗体７Ｃ５Ｂ２と同じエピトープに対する特異性を有する。
【０１８４】
ＤＥｓｐＲ阻害抗体のいくつかのさらなる例は、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４１５９４（その内容は参照によってその全体が本明細書中に援用される）に記載されている。
【０１８５】
他のアミノ酸配列の修飾
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＥｓｐＲに特異的な抗体またはその抗体断片のアミノ酸配列の修飾が考えられる。例えば、抗体の結合アフィニティおよび／または他の生物学的特性を改善することが望ましいことがある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体核酸内に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、あるいはペプチド合成によって調製される。このような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内における残基からの欠失および／または残基への挿入および／または残基の置換が含まれる。最終構築物に到達するために欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせが行われるが、ただし、最終構築物が所望の特徴、例えば結合特異性、生物活性の阻害を有さなければならない。アミノ酸の変化は、抗体の翻訳後プロセス（グリコシル化部位の数または位置の変化など）も変更し得る。
【０１８６】
変異誘発のための好ましい位置である抗体の特定の残基または領域を同定するために有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）によって記載されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基または基が同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの帯電残基）、中性または負帯電アミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）により置換されて、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を与える。置換に対する機能感受性を実証するアミノ酸位置は、次に、さらなるまたは他の変異体を置換部位においてまたは置換部位に対して導入することによって精錬される。従って、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決められているが、突然変異それ自体の性質は、予め決定する必要はない。例えば、所与の部位における突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム変異誘発が標的コドンまたは領域において行われ、発現された抗体変異体は、所望の活性についてスクリーニングされる。
【０１８７】
アミノ酸配列の挿入は、長さが１つの残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの範囲であるアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または多数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、または細胞毒性ポリペプチドに融合された抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増大させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ）またはポリペプチドに対する抗体のＮ末端またはＣ末端の融合が含まれる。
【０１８８】
別のタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基で置換された、抗体分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発のために最も興味深い部位は高頻度可変領域を含むが、本明細書に記載されるＤＥｓｐＲに特異的な抗体またはその抗体断片において使用するるためにＦＲ変化も考えられる。
【０１８９】
ＤＥｓｐＲに特異的な抗体またはその抗体断片の生物学的特性の置換修飾は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造（例えば、シート状またはらせん形構造として）と、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性と、あるいは（ｃ）側鎖の大部分と、を保持することに対するこれらの効果が著しく異なる置換を選択することによって達成される。アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従って分類することができる（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５））：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、（２）非帯電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
【０１９０】
あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて分類することができる：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、（２）中生親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、（５）鎖の方向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換は、これらの種類の１つの中のメンバーを別の種類と交換することを伴うであろう。
【０１９１】
ＤＥｓｐＲに特異的な抗体またはその抗体断片の適切なコンホメーションの維持に関与しないシステイン残基はどれも、一般的にはセリンによって置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止することができる。逆に、システイン結合を抗体に付加して、その安定性を改善することができる（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。
【０１９２】
特に好ましいタイプの置換変異体は、親抗体（例えば、モノクローナル抗ＤＥｓｐＲ抗体７Ｃ５Ｂ２、あるいは本明細書において提供されるＤＥｓｐＲに特異的なヒト化もしくはヒト抗体またはその抗体断片）の１つまたは複数の高頻度可変領域残基を置換することを含む。一般に、結果として生じる、さらなる発達のために選択される変異体は、これらを生成した親抗体に対して改善された生物学的特性を有するであろう。このような置換変異体を産生するために都合の良い方法は、ファージディスプレイを用いるアフィニティ成熟を伴う。簡単に言うと、いくつかの高頻度可変領域部位（例えば、６〜７部位）が突然変異されて、各部位において全ての可能なアミノ置換を生じる。このように生成された抗体変異体は、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として、繊維状ファージから一価で提示される。次に、ファージ提示変異体は、本明細書に開示されるように、その生物活性（例えば、結合アフィニティ）についてスクリーニングされる。修飾のための候補高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を実施して、抗原結合に著しく寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。
【０１９３】
代替的または付加的に、ＤＥｓｐＲに特異的な抗体またはその抗体断片と、ヒトＤＥｓｐＲとの間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。このような接触残基および隣接残基は、本明細書において詳述される技術に従う置換のための候補である。このような変異体が生成されたら、変異体のパネルに、本明細書に記載されるようなスクリーニングを受けさせ、１つまたは複数の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体またはその抗体断片を、さらなる開発のために選択することができる。
【０１９４】
抗体の別のタイプのアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、抗体中に見出される１つまたは複数の炭水化物部分を欠失すること、および／または抗体中に存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０１９５】
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ−連結またはＯ−連結のいずれかである。Ｎ−連結は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。従って、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作る。Ｏ−連結グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはスレオニンに対する、Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトース、またはキシロースなどの糖の１つの付着を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用することができる。
【０１９６】
ＤＥｓｐＲに特異的な抗体またはその抗体断片へのグリコシル化部位の付加は、上記のトリペプチド配列（Ｎ−連結グリコシル化部位に対する）の１つまたは複数を含有するように、アミノ酸配列を変更することによって達成される。変更は、元の抗体の配列（Ｏ−連結グリコシル化部位に対する）に対して、１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の付加、または１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基による置換によって行うこともできる。
【０１９７】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに付着される炭水化物を変更することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号明細書（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）には、抗体のＦｃ領域に付着されるフコースを欠いた成熟炭水化物構造を有する抗体が記載されている。また、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１Ａ１号明細書（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）も参照されたい。炭水化物中の二分岐Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が抗体のＦｃ領域に付着された抗体は、国際公開第０３／０１１８７８号パンフレット（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）および米国特許第６，６０２，６８４号明細書（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）で参照される。オリゴ糖中の少なくとも１つのガラクトース残基が抗体のＦｃ領域に付着された抗体は、国際公開第９７／３００８７号パンフレット（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）に報告されている。また、変更された炭水化物がそのＦｃ領域に付着された抗体については、国際公開第９８／５８９６４号パンフレット（Ｒａｊｕ，Ｓ．）および国際公開第９９／２２７６４号パンフレット（Ｒａｊｕ，Ｓ．）も参照されたい。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、例えば、抗体の抗原依存性の細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を増強するように、本明細書に記載されるＤＥｓｐＲに特異的な抗体またはその抗体断片をエフェクター機能に関して修飾することが望ましいこともある。これは、１つまたは複数のアミノ酸置換を抗体またはその抗体断片のＦｃ領域に導入することによって達成することができる。代替的または付加的に、システイン残基をＦｃ領域に導入することができ、これにより、この領域において鎖間ジスルフィド結合の形成が可能になる。このように生成されたホモダイマー抗体は、改善された内部移行能力ならびに／または増大された補体媒介性の細胞死滅および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有することができる。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照されたい。抗腫瘍活性が増強されたホモダイマー抗体は、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるように、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することもできる。あるいは、二重Ｆｃ領域を有する抗体を改変することができ、これにより、抗体は増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）を参照されたい。
【０１９９】
例えば、国際公開第００／４２０７２号パンフレット（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）には、ヒトエフェクター細胞の存在下で改善されたＡＤＣＣ機能を有する抗体が記載されており、この抗体は、そのＦｃ領域にアミノ酸置換を含む。好ましくは、改善されたＡＤＣＣを有する抗体は、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、および／または３３４に置換を含む（残基のＥｕ番号付け）。好ましくは、変更されたＦｃ領域は、これらの位置の１つ、２つまたは３つにおける置換を含む、あるいはこれらの位置の１つ、２つまたは３つにおける置換からなるヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域である。このような置換は、場合により、Ｃ１ｑ結合および／またはＣＤＣを増大させる置換と組み合わせられる。
【０２００】
変更されたＣ１ｑ結合性および／または補体依存性の細胞毒性（ＣＤＣ）を有する抗体は、国際公開第９９／５１６４２号パンフレット、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号明細書、米国特許第６，２４２，１９５Ｂ１号明細書、米国特許第６，５２８，６２４Ｂ１号明細書および米国特許第６，５３８，１２４号明細書（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。抗体は、そのＦｃ領域のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３１３、３３３および／または３３４（残基のＥｕ番号付け）の１つまたは複数におけるアミノ酸置換を含む。
【０２０１】
本明細書に記載されるＤＥｓｐＲに特異的な抗体の血清半減期を増大させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号明細書に記載されるように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に、抗体断片）に組み込むことができる。本明細書で使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボの血清半減期を増大することに関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【０２０２】
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合性が改善され、半減期が増大された抗体は、国際公開第００／４２０７２号パンフレット（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）および米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号明細書（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合性を改善する１つまたは複数の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。例えば、Ｆｃ領域は、位置２３８、２５０、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１４、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８または４３４の１つまたは複数における置換を有することができる（残基のＥｕ番号付け）。改善されたＦｃＲｎ結合性を有する好ましいＦｃ領域含有抗体変異体は、そのＦｃ領域の位置３０７、３８０および４３４（残基のＥｕ番号付け）の１つ、２つまたは３つにおけるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、抗体は３０７／４３４突然変異を有する。
【０２０３】
３つ以上（好ましくは、４つ）の機能的抗原結合部位を有する、ＤＥｓｐＲに特異的な改変抗体も考えられる（米国特許出願公開第２００２／０００４５８７Ａ１号明細書、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）。
【０２０４】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野において知られている様々な方法によって調製される。これらの方法には、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、あるいは、抗体の早期に調製した変異体または非変異体型のオリゴヌクレオチド媒介性（または部位指向性）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、およびカセット変異誘発による調製が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０５】
免疫結合体
これらの態様のいくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＥｓｐＲに特異的な抗体および抗体断片を含む免疫結合体は、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、小分子、ｓｉＲＮＡ、ナノ粒子、標的剤（例えば、微小気泡）、または放射性同位元素（すなわち、放射性結合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））などの薬剤に結合されて、使用され得る。このような免疫結合体は、例えば、診断、セラノスティック、または標的方法において使用することできる。
【０２０６】
このような免疫結合体の生成において有用な化学療法剤は本明細書に記載されている。使用することができる酵素的に活性な毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテスフォルディイ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ  ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が挙げられる。放射性結合体抗体の産生のために様々な放射性核種が利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅが挙げられる。
【０２０７】
本明細書に記載されるＤＥｓｐＲに特異的抗体な抗体と、細胞毒性剤との結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ）など）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トルエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアナートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤のいずれかを用いて作ることができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素−１４−標識化１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合するための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号パンフレットを参照されたい。
【０２０８】
他の実施形態では、ＤＥｓｐＲ特異的抗体またはその抗体断片は、腫瘍のプレターゲッティングにおいて利用するために、「受容体」（例えば、ストレプトアビジンなど）に結合させることができ、ここで、抗体−受容体結合体が対象に投与された後、清浄剤（ｃｌｅａｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を用いて未結合の結合体が循環から除去され、そして、細胞毒性剤（例えば、放射性ヌクレオチド）に結合される「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。いくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲ特異的抗体またはその抗体断片はビオチンに結合されることが可能であり、そして、例えば血管新生の分子イメージングにおいて使用するために、ビオチン結合された抗体またはその抗体断片はさらに、ストレプトアビジン結合剤または被覆剤（ストレプトアビジン被覆微小気泡など）に結合または連結することができる。
【０２０９】
免疫リポソーム
本明細書に記載されるＤＥｓｐＲに特異的な抗体およびその抗体断片は、免疫リポソームとして処方することもできる。抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）、ならびに米国特許第４，４８５，０４５号明細書および同第４，５４４，５４５号明細書に記載されるような、当該技術分野において既知の方法によって調製される。循環時間が高められたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号明細書に開示されている。
【０２１０】
特に有用なリポソームは、例えば、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて、逆相蒸発法により生成することができる。リポソームは規定の細孔サイズのフィルタを通して押出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるように、ジスルフィド交換反応によってリポソームに結合させることができる。化学療法剤は、場合により、リポソーム内に含有されていてもよい。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照されたい。
【０２１１】
ハイブリドーマ細胞株７Ｃ５Ｂ２、７Ｃ５Ｃ５、および５Ｇ１２Ｅ８は、維持および貯蔵されている。
【０２１２】
抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその断片の組成物ならびに治療的および診断的な使用
本明細書に記載される特定の態様は、ＤＥｓｐＲが成体組織血管分布に寄与するとともに、胚発生中の血管新生において重要な役割を果たし、そしてさらに、ＤＥｓｐＲが驚くことに特定の腫瘍細胞、癌幹細胞もしくは幹様細胞、または腫瘍開始細胞において、ならびに腫瘍周囲の血管内皮細胞、周皮細胞、および平滑筋細胞において発現されるという、本発明者らによる発見に部分的に基づく。本発明者らは、さらに、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗体断片などのＤＥｓｐＲ特異的阻害剤を用いるＤＥｓｐＲの阻害が、細胞侵襲性、腫瘍成長（腫瘍容積または腫瘍量など）を含む腫瘍転移を特徴付ける様々なパラメータ、ならびに新生血管の長さ、新生血管の分枝、および血管相互接続の形成を含む血管新生を特徴付けるパラメータを阻害できることを発見した。本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗体断片は、さらに、抗体−標的ソノポレーションに非常に適しており、例えば超音波法を用いて投与される場合に浸透および効力の増強を実証する。さらに、本発明者らは、ＤＥｓｐＲが様々な病態のための診断マーカーとしての機能を果たすことを決定した。
【０２１３】
抗血管新生療法および治療
血管新生は、新しく発生する血管の組織内への成長（新血管発生）、および現存の血管の標的部位への取込みの両方を含む組織血管発生のプロセスである。血管は、酸素および栄養物が生きている組織に供給され、老廃物が生きている組織から除去される手段である。血管新生は、重要な生物学的プロセスであり得る。例えば、血管新生は、生殖、発達および創傷治癒において必須である。逆に、不適切な血管新生は、深刻なマイナスの結果を有し得る。例えば腫瘍が、急速に成長して転移することを可能にする、十分な酸素および栄養物の供給を有するのは、血管新生の結果として固形腫瘍の血管が発生された後だけである。
【０２１４】
新しい血管の成長が疾患に関連する症状の原因であるか、あるいはそれに寄与する場合には、本明細書に記載される組成物および方法を用いる血管新生の阻害は、疾患の有害な効果を低減することができる。非限定的な例としては、腫瘍、頸動脈疾患、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、炎症性疾患、再狭窄などが挙げられる。有害な組織の成長を支持するために新しい血管の成長が必要とされる所では、本明細書に記載される組成物および方法を用いる血管新生の阻害は組織への血液供給を低減することができ、それにより、血液供給の要求に基づいて組織塊の低減に寄与することができる。非限定的な例としては、腫瘍が厚さ数ミリメートルを超えて成長するために、そして固形腫瘍転移のために、新血管発生が連続的な要件である腫瘍の成長が挙げられる。別の例は冠動脈プラークの拡大である。
【０２１５】
病的血管新生と呼ばれる血管新生がマイナスの結果をもたらすと考えられる様々な疾患または障害、または血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害が存在し、それには、炎症性障害（例えば、免疫性および非免疫性炎症、慢性関節リウマチおよび乾癬など）、血管の不適切または不都合な侵襲に関連する障害（例えば、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、再狭窄、アテローム性動脈硬化プラーク中の毛細血管増殖および骨粗鬆症など）、ならびに癌関連障害（例えば、固形腫瘍、固形腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後線維増殖症、血管腫、カポージ肉腫および腫瘍成長を支持するために新血管発生を必要とする同様の癌など）が含まれるがこれらに限定されない。本明細書に記載される態様の好ましい実施形態では、本方法は、癌を有する対象における血管新生の阻害に関する。
【０２１６】
例えば、抗ＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２抗体；SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、またはSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む抗ＤＥｓｐＲ抗体；SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む抗ＤＥｓｐＲ抗体；SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列を含む抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体；またはSEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１８、およびSEQ ID NO:１９からなる群から選択される可変軽（ＶＬ）鎖アミノ酸配列およびその断片を含む抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体などの、本明細書に記載されるＤＥｓｐＲに特異的な抗体および抗体断片は、抗血管新生療法の組成物および方法において使用することができる。これらの抗血管新生療法は、栄養物を提供して腫瘍成長を支持するために必要とされる現存の腫瘍血管および腫瘍血管の発達を阻害することを目的とした新規の癌治療戦略として使用することができる。血管新生は原発腫瘍成長および転移の両方に関与するので、本明細書に記載されるＤＥｓｐＲに特異的な抗体および抗体断片を用いる抗血管新生治療は、原発部位における腫瘍の新生物成長を阻害すると共に、二次部位における腫瘍の微小および巨大転移を防止することができるため、他の治療法による腫瘍の攻撃が可能になる。
【０２１７】
さらに、例えば、抗ＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２抗体；SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、またはSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む抗ＤＥｓｐＲ抗体；SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む抗ＤＥｓｐＲ抗体；SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列を含む抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体；またはSEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１８、およびSEQ ID NO:１９からなる群から選択される可変軽（ＶＬ）鎖アミノ酸配列およびその断片を含む抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体などの、本明細書に記載されるＤＥｓｐＲに特異的な抗体および抗体断片は、抗転移治療法において使用することができる。このような抗転移療法は、本明細書にさらに記載されるように、微小転移および巨大転移の治療および／または阻害のたに、腫瘍血管発生および腫瘍細胞侵襲性の同時阻害を阻害することを目的とした新規の癌治療戦略を提供する。さらに、ＤＥｓｐＲは、本明細書において実証されるように癌幹細胞を含む腫瘍細胞においても発現されるので、ＤＥｓｐＲ特異性抗体またはその抗体断片の免疫結合体は、本明細書に記載されるように、毒素、細胞毒性またはプロアポトーシス剤などの任意の薬剤への結合によって生成することができ、腫瘍細胞および癌幹細胞の死滅を直接標的とすることによって腫瘍成長をさらに阻害することできる。
【０２１８】
従って、例えば、抗ＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２抗体；SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、またはSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む抗ＤＥｓｐＲ抗体；SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む抗ＤＥｓｐＲ抗体；SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列を含む抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体；またはSEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１８、およびSEQ ID NO:１９からなる群から選択される可変軽（ＶＬ）鎖アミノ酸配列、およびその断片を含む抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体などの本明細書に記載されるＤＥｓｐＲに特異的な抗体および抗体断片を含む方法および組成物を用いて治療することができる血管新生依存性疾患および障害は、血管の成長による影響を受ける疾患および障害である。言い換えると、「血管新生依存性疾患または障害」は、疾患の病理学的進行のために豊富な血液供給および血管増殖に依存している疾患または障害（例えば、転移性腫瘍）、あるいは、異常な血管増殖の直接的な結果である疾患または障害（例えば、糖尿病性網膜症および血管腫）を指す。
【０２１９】
本明細書に記載される組成物および方法を用いて治療することができる血管新生依存性疾患または障害の非限定的な例としては、異常な血管増殖、腹水形成、乾癬、加齢性黄斑変性症、甲状腺過形成、子癇前症、関節リウマチおよび変形性関節炎、頸動脈疾患、栄養血管の新血管発生、不安定プラークの新血管発生、神経変性障害、アルツハイマー病、肥満、胸水、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、糖尿病性／他の網膜症、眼球の新血管発生（血管新生緑内障および角膜血管新生など）、血管の不適切または不都合な侵襲に関連する障害、例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、血管新生緑内障、再狭窄、アテローム性動脈硬化プラーク中の毛細血管増殖および骨粗鬆症など、ならびに癌関連の障害、例えば、固形腫瘍、固形腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後線維増殖症、血管腫、カポージ肉腫、腫瘍成長を支持するために新血管発生を必要とする癌などが挙げられる。
【０２２０】
従って、本明細書には、血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害（この疾患または障害は、血管新生の阻害によって治療することができる）を有する対象または個体の組織において血管新生を阻害する方法が記載されている。一般に、方法は、血管新生阻害量のＤＥｓｐＲ阻害剤を含む治療的に有効な量の組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、血管新生によって調節される疾患または障害を有するか、あるいはその危険性がある対象を選択または診断することを含む。
【０２２１】
本明細書に記載されるこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲ阻害剤は、抗体またはその抗体断片である。従って、いくつかの態様では、ＤＥｓｐＲ標的に特異的な抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片が提供され、ここで、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片はＤＥｓｐＲ標的に特異的に結合してＤＥｓｐＲ生物活性を低減または阻害し、従って、血管新生に依存する疾患または障害を有する対象において血管新生が阻害される。
【０２２２】
いくつかのこのような実施形態では、ＤＥｓｐＲはヒトＤＥｓｐＲである。いくつかのこのような実施形態では、ＤＥｓｐＲ標的は、SEQ ID NO:１またはその対立遺伝子変異体を含む配列を有する。これらの方法のいくつかのこのような実施形態では、ＤＥｓｐＲに特異的に結合してＤＥｓｐＲ生物活性を阻害する抗体またはその抗体断片は、ＤＥｓｐＲとＶＥＧＦｓｐとの相互作用を遮断する。いくつかのこのような実施形態では、ＶＥＧＦｓｐは、SEQ ID NO:２の配列を含む配列を有する。いくつかのこのような実施形態では、抗体またはその抗体断片は、ＤＥｓｐＲの細胞外部分を含むＤＥｓｐＲのエピトープに対して特異的である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:１のアミノ酸１〜９を含むＤＥｓｐＲのエピトープに対して特異的である。
【０２２３】
血管新生を阻害するためのこれらの組成物および方法のいくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、抗ＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２抗体またはその断片である。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、またはSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、またはSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域と、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域とを含む。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１８、およびSEQ ID NO:１９からなる群から選択される可変軽（ＶＬ）鎖アミノ酸配列およびその断片を含む。
【０２２４】
血管新生を阻害するためのこれらの組成物および方法の他の実施形態では、７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体の１つまたは複数の生物学的特徴を有する、ＤＥｓｐＲに特異的に結合するモノクローナル抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片が提供される。いくつかのこのような実施形態では、７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体の生物学的特徴を有するということは、所与の集団に対する７Ｃ５Ｂ２抗体のＥＤ５０値における、あるいはその前後のＥＤ５０値（すなわち、集団の５０％において治療的に有効な用量）を有すること；または所与のパラメータまたは表現型に対する７Ｃ５Ｂ２抗体のＥＣ５０値における、あるいはその前後のＥＣ５０値（すなわち、所与のパラメータまたは表現型の最大半量の阻害を達成する用量）を有することを含み得る。例えば、これらの態様のいくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲに特異的に結合する抗体によって阻害される所与のパラメータまたは表現型は、インビトロ管形成アッセイにおける管の平均総数、インビトロ管形成アッセイにおける管の平均全長、インビトロ管形成アッセイにおける分枝点の平均数、インビトロ管形成アッセイにおける血管接続の平均数、および腫瘍細胞侵襲性を含むことができるが、これらに限定されない。
【０２２５】
血管新生を阻害するためのこれらの組成物および方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される血管新生を阻害するための組成物および方法において使用するためのヒト化抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体またはその抗体断片が提供される。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片の１つまたは複数の可変重鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:５〜SEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片の１つまたは複数の可変軽鎖ＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:１０〜SEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、またはSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域と、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域とを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体は、突然変異ヒトＩｇＧ１フレームワーク領域と、SEQ ID NO:５〜SEQ ID NO:７からなる群、およびSEQ ID NO:１０〜SEQ ID NO:１２からなる群から選択されるおよび抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含み、ヒトＤＥｓｐＲのそのリガンドに対する結合を遮断する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＤＥｓｐＲ抗体は、突然変異ヒトＩｇＧ４フレームワーク領域と、SEQ ID NO:５〜SEQ ID NO:７からなる群、およびSEQ ID NO:１０〜SEQ ID NO:１２からなる群から選択される抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含み、ヒトＤＥｓｐＲのそのリガンドに対する結合を遮断する。
【０２２６】
これらの態様の他の実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体は、本明細書に記載されるモノクローナル抗ＤＥｓｐＲ抗体７Ｃ５Ｂ２と同じエピトープに対する特異性を有する抗体断片であり、ハイブリドーマ７Ｃ５Ｂ２によって産生される。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体は、７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体のSEQ ID NO:５〜SEQ ID NO:７からなる群から選択される１つまたは複数の可変重鎖ＣＤＲ配列および／またはSEQ ID NO:１０〜SEQ ID NO:１２からなる群から選択される１つまたは複数の可変軽鎖ＣＤＲ配列を含む抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体断片はＦａｂ断片である。いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体断片はＦａｂ'断片である。いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体断片はＦｄ断片である。いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体断片はＦｄ'断片である。いくつかの実施形態では、抗体断片はＦｖ断片である。いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体断片はｄＡｂ断片である。いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体断片は、単離ＣＤＲ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体断片はＦ（ａｂ'）２断片である。いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体断片は単鎖抗体分子である。いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体断片は、２つの抗原結合部位を含むダイアボディである。いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体断片は、一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む直鎖抗体である。
【０２２７】
従って、いくつかの態様では、血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害は癌であり、この場合、急速に分裂する新生癌細胞は、その腫瘍の連続的な成長を維持するために、効率的な血液供給を必要とする。原発腫瘍部位および二次腫瘍部位において本明細書に記載される組成物および治療方法を用いて、血管新生または腫瘍細胞侵襲性またはこれらの組み合わせを阻害することは、疾患の転移および進行を予防および制限する働きをする。
【０２２８】
従って、いくつかの態様では、本明細書において、癌または腫瘍を有するか、あるいはその危険性がある対象を治療するための方法が提供されており、本方法は、有効量の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片を投与することを含む。癌を治療するためのこれらの方法のいくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、抗ＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２抗体またはその断片である。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、およびSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、およびSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域と、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、およびSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域とを含む。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１８、およびSEQ ID NO:１９からなる群から選択される可変軽（ＶＬ）鎖アミノ酸配列およびその断片を含む。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、本方法はさらに、癌または腫瘍を有するか、あるいはその危険性がある対象をまず選択または診断することを含むことができる。いくつかのこのような実施形態では、対象の診断は、本明細書中の他の場所に記載されるように、標識、例えば、放射性標識、または分子イメージングのために使用される標識に結合された抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片を対象に投与することを含むことができる。このような実施形態では、標識化された抗ＤＥｓｐＲ抗体または抗体断片の検出は、癌または腫瘍を有する対象を示す。
【０２３０】
「癌」および「癌性」という用語は、通常、未制御の細胞成長によって特徴付けられる、哺乳類の生理学的な状態を指す、あるいは説明する。この定義には、良性および悪性癌、ならびに休止状態の腫瘍または微小転移が含まれる。従って、「癌」または「腫瘍」という用語は、本明細書で使用される場合、身体器官および組織（癌幹細胞および腫瘍血管ニッチを含む）の正常な機能を妨害する、制御されない細胞成長を指す。癌または腫瘍を有する対象は、対象の体内に客観的に測定可能な癌細胞が存在する対象である。この定義には、良性および悪性癌、ならびに休止状態の腫瘍または微小転移が含まれる。その最初の位置から遊走し、生命維持に必要な器官に播種する癌は、罹患した器官の機能的悪化を経て、最終的には対象の死をもたらし得る。白血病などの造血器癌は、対象における正常の造血区画を打ち負かすことができ、それにより造血不全（貧血、血小板減少および好中球減少の形で）に至り、最終的には死が引き起こされる。
【０２３１】
「転移」とは、その原発部位から体内の他の場所への癌の広がりを意味する。癌細胞は原発腫瘍から離脱し、リンパ管および血管を貫通し、血流中を循環し、体内の他の場所の正常組織における遠位の病巣で成長（転移）することができる。転移は、局所的または遠位であり得る。転移は連続的なプロセスであり、原発腫瘍から離脱し、血流中を移動し、遠位の部位で停止する腫瘍細胞に付随する。新しい部位で細胞は血液供給を確立し、成長して、生命にかかわる塊を形成し得る。腫瘍細胞内の刺激性および阻害性分子経路の両方がこの挙動を制御し、遠位の部位での腫瘍細胞と宿主細胞との間の相互作用も顕著である。
【０２３２】
転移は、ほとんどの場合、特定の症状のモニタリングに加えて、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャン、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、血液および血小板数、肝機能調査、胸部Ｘ線および骨のスキャンの単独でまたは組み合わせて使用することによって検出される。
【０２３３】
癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより特定の例としては、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳およびＣＮＳ癌、乳癌、腹膜の癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸および直腸癌、結合組織癌、消化器系の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭部および頸部の癌、胃癌（胃腸癌を含む）、神経膠芽腫、肝癌、肝細胞腫、上皮内新生物、腎臓癌または腎癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む）、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含む）、メラノーマ、骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、口腔癌（例えば、口唇、舌、口、および咽頭）、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系の癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮または子宮内膜癌、泌尿器系の癌、外陰癌、ならびに他の癌腫および肉腫、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む））、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄芽球性白血病、および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、およびメイグス症候群に関連する異常な血管増殖が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３４】
他の態様では、本明細書に記載される組成物および方法は、アテローム性動脈硬化プラークおよびアテローム性動脈硬化症の治療または阻害またはイメージングにおいて使用される。アテローム性動脈硬化症は血管疾患の最も一般的な形態であり、ほとんどの冠動脈疾患、大動脈瘤、脳血管疾患および下肢の動脈疾患の根底にある大動脈の障害である（Ｌｉｂｂｙ，「Ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｂｒａｕｎｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（編集者），Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，２００１，ｐｐ．１３７７−１３８２）。アテローム性動脈硬化症の発症は、損傷に対する反応として起こる（Ｌｉｂｂｙ，「Ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｂｒａｕｎｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（編集者），Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐａ．，２００１，ｐｐ．１３７７−１３８２）。細胞が正常に機能する能力の損失をもたらす内皮への損傷はわずかであり得る。内皮への損傷のタイプの例としては、高コレステロール血症および機械的ストレスが挙げられる（Ｒｏｓｓ，１９９９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４０：１１５）。
【０２３５】
アテローム性動脈硬化症のプロセスは炎症を含み、白血球（例えば、リンパ球、単球、およびマクロファージ）は、多くの場合、アテローム性動脈硬化症の発達を通して存在する。アテローム性動脈硬化症は、単球が活性化され、血流から動脈壁内へ移動したときに始まる。そこで、泡沫細胞に形質転換され、コレステロールおよび他の脂肪材料が集められる。やがて、これらの脂肪を含んだ泡沫細胞が蓄積して、動脈壁の内膜にアテロームを形成し、壁の肥厚および硬化を引き起こす。アテロームは中動脈および大動脈全体に散乱され得るが、通常、動脈が分枝するところに形成される。アテローム性動脈硬化症は心疾患に至ることが多く、脳卒中または他の血管に関する問題（跛行など）も引き起こし得るので、その治療および診断は重要である。
【０２３６】
従って、本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、アテローム性動脈硬化プラークおよびアテローム硬化性動脈の栄養血管における病的血管新生（冠動脈および頸動脈疾患）は危険であり、そして／あるいは不安定プラークの進行および破壊の原因因子であると考えられる。従って、いくつかのこのような実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法を用いて治療される血管新生障害を有する対象は、アテローム性動脈硬化症を有し得るか、あるはその危険性があり得る。本明細書で使用される場合、「アテローム性動脈硬化症」は、動脈内における多数のアテローム性プラークの形成によって引き起こされる動脈の硬化をもたらす動脈血管の疾患を指す。アテローム性動脈硬化症は、冠動脈心疾患事象、脳血管事象、急性冠動脈症候群、および間欠性跛行を含むがこれらに限定されない、他の病態に関連し得る。例えば、冠動脈のアテローム性動脈硬化症は、一般に、冠動脈疾患、心筋梗塞、冠動脈血栓症、および狭心症を引き起こす。中枢神経系に分布している動脈のアテローム性動脈硬化症は、脳卒中および一過性脳虚血を誘発することが多い。末梢循環では、アテローム性動脈硬化症は間欠性跛行および壊疽を引き起こし、四肢の生存を危険にさらし得る。臓器循環の動脈のアテローム性動脈硬化症は、腸間膜虚血を引き起こし得る。アテローム性動脈硬化症は、腎臓に直接影響を与え得る（例えば、腎臓動脈狭窄）。また、１つまたは複数の非致死性のアテローム硬化性疾患事象を既に経験している人は、このような事象の再発の可能性がある人である。
【０２３７】
これらの他の疾患は、時には、アテローム性動脈硬化症以外によって引き起こされる、あるいはアテローム性動脈硬化症以外に関連することもある。従って、いくつかの実施形態では、まず、本明細書に記載される組成物を対象に投与する前にアテローム性動脈硬化症が存在することが診断される。対象は、アテローム性動脈硬化症の症状のマーカーの少なくとも１つが存在すれば、「アテローム性動脈硬化症と診断される」、あるいは「アテローム性動脈硬化症を有すると選択される」。１つのこのような実施形態では、人間がアテローム性動脈硬化症の家族歴を有すれば、あるいは高コレステロールに対する既知の遺伝子突然変異または多型を有すれば、対象は「選択される」。一実施形態では、対象は、他の炎症性障害が存在しない場合に、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の増大レベルを測定することによって診断される。他の実施形態では、アテローム性動脈硬化症は、ホモシステイン、フィブリノーゲン、リポタンパク質（ａ）、または小さいＬＤＬ粒子の血清レベルを測定することによって診断される。あるいは、冠動脈中のカルシウムレベルを測定するコンピュータ断層撮影スキャンを用いて、アテローム性動脈硬化症を有する対象を選択することができる。一実施形態では、アテローム性動脈硬化症は、炎症性サイトカインの増大によって診断される。一実施形態では、アテローム性動脈硬化症を有する個体を選択するための指標として、インターロイキン−６の増大レベルが使用される。他の実施形態では、アテローム性動脈硬化症を有する個体を選択するための指標としてインターロイキン−８および／またはインターロイキン−１７の増大レベルが使用される。
【０２３８】
他の態様では、本明細書に記載される組成物および方法は、加齢性黄斑変性症において生じる血管新生の遮断または阻害において使用される。例えば、ＶＥＧＦは、滲出型または新生血管型の加齢性黄斑変性症において生じるものと同様に、眼の脈絡膜層から網膜への異常な血管成長に寄与することが知られている。ＡＭＤまたはＡＲＭＤ（加齢性黄斑変性症）と呼ばれることが多い黄斑変性症は、６５歳以上の米国人における失明および盲目の主な原因である。網膜の下で新しい血管が成長し（新血管発生）、血液および流体を漏出させる。この漏出は、感光性の網膜細胞に永久的な損傷を引き起こし、細胞が死滅し、中心視野の盲点または網膜黄斑が生じる。従って、本明細書に開示される方法には、抗血管新生療法により加齢性黄斑変性症に対して治療されている対象が包含される。
【０２３９】
他の態様では、本明細書に記載される組成物および方法は、異常な血管成長が糖尿病性眼疾患および糖尿病性黄斑浮腫に関連する糖尿病性網膜症を有する対象において生じる血管新生の遮断または阻害において使用される。糖尿病による小さい血餅によって網膜内の正常な血管が損傷を受けると、新しい血管成長に至る連鎖反応が刺激される。しかしながら、バックアップ血管は不完全であり、漏出し（浮腫を引き起こす）、出血し、網膜を剥離する瘢痕組織を促進し、深刻な視力の低下がもたらされる。このような成長は糖尿病性網膜症の顕著な特徴であり、先進国の若者の間の盲目の主な原因である。従って、本明細書に開示される方法には、糖尿病性網膜症および／または糖尿病性黄斑浮腫に対して治療された患者も包含される。
【０２４０】
他の態様では、本明細書に記載される組成物および方法は、関節リウマチを有する対象において生じる血管新生の遮断または阻害において使用される。関節リウマチ（ＲＡ）は、滑膜組織の腫脹、白血球の侵入および血管新生、または新しい血管成長を特徴とする。関節リウマチ（ＲＡ）における関節の滑膜裏層の拡張、およびそれに続くパンヌスによる下側の軟骨および骨の侵襲は、酸素および栄養物に対する要求の増大に対処するために、滑膜への血管供給の増大を必要とする。血管新生は、現在、ＲＡのパンヌスの形成および維持における重要な事象として認識されている（Ｐａｌｅｏｌｏｇ，Ｅ．Ｍ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．２００２；４  Ｓｕｐｐｌ  ３：Ｓ８１−９０；Ａｆｕｗａｐｅ  ＡＯ，Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２００２；１７（３）：９６１−７２）。早期ＲＡでも、最も早期の組織学的観察のいくつかは血管である。単核球浸潤は、豊かな血管系と共に、滑膜組織を特徴付ける。血管新生は炎症性パンヌスの形成に不可欠であり、血管新生がなければ、白血球の侵入は起こり得ない（Ｋｏｃｈ，Ａ．Ｅ．，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．２０００，５９  Ｓｕｐｐｌ  １：ｉ６５−７１）。新しい血管の形成の破壊は、炎症部位への栄養物の送達を防止するだけでなく、ＶＥＧＦの付加的な活性、血管透過性因子のようなＲＡにおける強力な血管新生促進因子による関節腫脹も低減し得る。抗ＶＥＧＦヘキサペプチドＲＲＫＲＲＲ（ｄＲＫ６）は、関節炎の重症度を抑制および軽減することができる（Ｓｅｕｎｇ−Ａｈ  Ｙｏｏ，ｅｔ．ａｌ．，２００５、上記）。従って、本明細書に開示される方法には、関節リウマチを有するか、あるいは関節リウマチに対して治療されている対象が包含される。
【０２４１】
他の態様では、本明細書に記載される組成物および方法は、アルツハイマー病を引き起こす遮血管新生の遮断または阻害において使用される。アルツハイマー病（ＡＤ）は、世界的に、最も一般的な認知症の原因である。ＡＤは、ニューロンの変性、そして最終的には認知症に至る過剰な脳アミロイド沈着を特徴とする。ＡＤの正確な原因はまだ分かっていない。疫学的研究によって、非ステロイド系抗炎症薬、スタチン、ヒスタミンＨ２受容体遮断薬、またはカルシウムチャネル遮断薬（これらは全て、抗血管新生効果を有する心血管薬である）の長期使用は、アルツハイマー病を予防し、そして／あるいはＡＤ患者の予後に影響を与えるように見えることが示されている。従って、脳血管系におけるＡＤ血管新生は、ＡＤにおいて重要な役割を果たし得る。アルツハイマー病において、脳内皮は、皮質ニューロンを選択的に死滅させるベータ−アミロイド斑および神経毒性ペプチドの前駆物質を分泌する。さらに、血管系におけるアミロイド沈着は内皮細胞アポトーシスおよび内皮細胞活性化をもたらし、新血管発生に至る。血管形成は、ＶＥＧＦアンタゴニストＳＵ４３１２およびスタチンによって遮断され得る。これは、抗血管新生戦略がＡＤおける内皮細胞活性化を妨害可能であり（Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓｓ  Ｃ．，ｅｌ．ａｌ．，２００６、Ｇｒａｍｍａｓ  Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．，１９９９）、ＡＤを予防および／または治療するために使用可能であることを示す。従って、本明細書に開示される方法には、アルツハイマー病に対して治療されている対象が包含される。
【０２４２】
他の態様では、本明細書に記載される組成物および方法は、脳内の虚血領域で起こる血管新生の遮断または阻害において使用され、この血管新生は、浮腫、漏出性新血管に寄与し、虚血性脳卒中事象の後に、対象に出血性形質転換が生じやすくなり、脳卒中事象からの罹患率および死亡リスクが悪化し得る。本明細書に記載される組成物および方法を用いる漏出性血管新生の新血管の阻害は、虚血性脳卒中事象からの神経障害を低減すると共に、出血性脳卒中への進行を予防することができる。現在、虚血性の出血性形質転換に対する治療法も、脳卒中からの神経障害を低減するための有効な治療法も存在していない。
【０２４３】
他の態様では、本明細書に記載される組成物および方法は、肥満において起こる血管新生の遮断または阻害において使用される。肥満における脂肪生成は、分化脂肪細胞、ストローマ細胞、および血管の間の相互作用を伴う。血管形成および脂肪生成、ならびに既存の血管系からの新しい血管の発芽の間の密接な空間的および時間的相互関係を脂肪細胞分化に結合させた。脂肪生成／血管新生細胞クラスタは、形態学的および免疫組織化学的に、脂肪組織の肥満の後期に高い頻度で見られるクラウン様構造とは区別することができる。抗血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）抗体の投与は血管新生を阻害するだけでなく、脂肪生成／血管新生細胞クラスタの形成も阻害した。これは、脂肪生成および血管新生の結合が、肥満における脂肪細胞の分化のために必須であり、そしてＶＥＧＦがそのプロセスの重要なメディエータであることを示す（Ｓａｔｏｓｈｉ  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ．ａｌ．，２００７，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５６：１５１７−１５２６）。血管新生阻害剤、ＴＮＰ−４７０はマウスにおいて食事誘発性および遺伝性の肥満を防止できたことが示されている（Ｅｂｂａ  Ｂｒａｋｅｎｈｉｅｌｍ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４；９４：１５７９）。ＴＮＰ−４７０は脂肪組織における血管分布を低減し、それにより脂肪組織の成長および肥満発生の速度を阻害した。従って、本明細書に記載される方法には、肥満に悩んでいる対象が包含される。
【０２４４】
他の態様では、本明細書に記載される組成物および方法は、子宮内膜症で生じる血管新生の遮断または阻害において使用される。過剰な子宮内膜の血管新生は、子宮内膜症の発症における重要なメカニズムとして提案される（Ｈｅａｌｙ，ＤＬ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｕｐｄａｔｅ．１９９８  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；４（５）：７３６−４０）。子宮内膜症を有する患者の子宮内膜は、内皮細胞増殖の増強を示した。さらに、正常な女性と比較したときに、子宮内膜症を有する女性の子宮内膜ではより多くの血管において細胞接着分子インテグリンｖβ３の発現が上昇されている。米国特許第６，１２１，２３０号明細書には、子宮内膜症の治療における抗ＶＥＧＦ剤の使用が記載されており、この特許は参照によって本明細書に援用される。従って、本明細書に開示される方法には、子宮内膜症を有するか、あるいは子宮内膜症の治療を受けている対象が包含される。
【０２４５】
本明細書に記載されるように、皮膚、筋肉、腸、結合組織、関節、骨および同様の組織を含む、様々な組織または器官（構築された組織で構成される）はどれも病態における血管新生を支持することができ、血管新生刺激の際に、血管が侵入することができる。
【０２４６】
種々の実施形態において本明細書に記載されるように治療される個体または対象は、望ましくはヒト患者であるが、本方法は全ての哺乳類に関して有効であると理解されるべきであり、「患者」または「対象」という用語には、全ての哺乳類が含まれることが意図される。これに関連して、哺乳類は、血管新生に関連する疾患の治療が望ましいあらゆる哺乳類種を含むと理解される。「対象」および「個体」という用語は本明細書では交換可能に使用され、本明細書に記載されるＤＥｓｐＲ特異的抗体および抗体断片の動物（例えば、ヒト）レシピエントを指す。ヒト対象などの特定の動物に特異的である病状の治療については、「対象」という用語は、その特定の動物を指す。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳類」という用語は本明細書では交換可能に使用され、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、雌ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類などの哺乳類が含まれる。「対象」という用語は、哺乳類、爬虫類、両生類および魚類を含むがこれらに限定されないあらゆる脊椎動物も包含する。しかしながら、対象は、ヒトなどの哺乳類、または飼いならされた哺乳類（例えば、イヌ、ネコ、ウマなど）、もしくは生産用哺乳類（例えば、雌ウシ、ヒツジ、ブタなど）などの他の哺乳類であることが有利であり、対象という用語に同様に包含される。
【０２４７】
投与方式
本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片などのＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニスト剤は、対象に有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって、それを必要としている対象に投与することができる。本明細書で使用される場合、「投与する」および「導入する」という用語は交換可能に使用され、炎症部位または癌部位などの所望の部位において、所望の効果が生じるようにこのような薬剤の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片を対象内に入れることを指す。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、全身的あるいは所望の表面または標的に薬剤を送達する任意の投与モード（注射、注入、点滴、および吸入投与を含むことができるが、これらに限定されない）によって、阻害すべき血管新生の障害を有する対象に投与される。抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片が腸内で不活性化から保護され得る限りは、経口投与形態も考えられる。「注射」には、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、角皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内注射および注入が含まれるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、静脈内注入または注射によって投与される。
【０２４９】
「非経口投与」および「非経口で投与される」という語句は、本明細書で使用される場合、経腸および局所投与以外の投与モード、通常は注射による投与モードを指す。「全身性投与」、「全身的に投与される」、「末梢投与」および「末梢に投与される」という用語は、本明細書で使用される場合、二重特異性または多特異性のポリペプチド剤の、標的部位、組織、または器官、例えば腫瘍部位への直接的以外の投与を指し、薬剤は対象の循環系に入り、従って、代謝および他の同様のプロセスを受ける。
【０２５０】
本明細書に記載されるＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストは、既知の方法に従って、例えば、ボーラスのような静脈内投与、またはある期間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節の内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所、または吸入経路によって、対象、例えばヒト対象に投与される。例えば、血管新生が発生している腫瘍または癌部位への局所投与は、広範な副作用または毒性がＤＥｓｐＲアンタゴニストの使用と関連している場合に特に所望される。エキソビボ戦略も、いくつかの実施形態では治療用途のために使用することができる。エキソビボ戦略は、ＤＥｓｐＲアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを有する対象から得られる細胞をトランスフェクトまたは形質導入することを含む。トランスフェクトまたは形質導入された細胞は次に対象に戻される。細胞は、造血細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、または筋肉細胞を限定なしに含む広範なタイプのいずれでもあり得る。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストが抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片である場合、抗体またはその抗体断片は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内を含む任意の適切な手段によって投与され、そして局所的な免疫抑制治療が所望される場合には、病巣内投与によって投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、パルス注入によって、特に抗体の用量を減らして適切に投与される。好ましくは、投薬は注射によって、最も好ましくは、投与が短時間であるか慢性的であるかに部分的に依存して静脈内または皮下注射によって与えられる。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニスト化合物は、障害または腫瘍位置が許す場合には局所的に、例えば直接注射によって投与され、注射は定期的に繰り返すことができる。またＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストは、例えば休止状態の腫瘍または微小転移の局所的な再発または転移を防止または低減するために、対象に全身的に、あるいは腫瘍細胞、例えば腫瘍または腫瘍の外科的切除後の腫瘍床に直接送達することができる。
【０２５３】
ソノポレーションによる投与
抗体標的化ソノポレーション法は、本明細書において提供される抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗体断片を含む治療組成物の有効性および効力を増強するために、本明細書に記載される血管新生の阻害方法のいくつかの実施形態において使用することが考えられる。
【０２５４】
本発明者らは、抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体および抗体断片を含む医薬組成物のＤＥｓｐＲ標的化ソノポレーションが、腫瘍成長および転移の低減の驚くべき増強（組成物の浸透および送達の増強を示す）を提供し、病的血管新生の部位、腫瘍細胞、および腫瘍開始細胞または癌幹細胞または癌幹様細胞への送達を増強することを発見した。さらに、本発明者らは、小分子化合物または他の薬物化合物などの他の治療薬と組み合わせた、抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗体断片のソノポレーションを使用して、他の治療薬の送達を増強することができ、従って標的化および増強された送達の手段が提供されることを発見した。
【０２５５】
従って、本明細書に記載される血管新生の阻害方法のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗体断片は、ソノポレーションによって、それを必要としている対象に投与される。
【０２５６】
本明細書で使用される場合、「ソノポレーション」は、細胞形質膜の透過性を一時的に修正することにより、治療薬などの大きい分子の取込みを可能にするための、好ましくは超音波周波数の音波の使用、または超音波と造影剤（例えば、安定化微小気泡）との相互作用を指す。ソノポレーションにより引き起こされる膜透過性は一過性であり、超音波暴露の後、薬剤は細胞内に捕捉されたままである。ソノポレーションは、大きい分子の搬送を増強するために、微小気泡の音響キャビテーションを使用する。
【０２５７】
従って、本方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗体断片の標的化送達を達成するために、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗体断片などの抗ＤＥｓｐＲ治療剤は、微小気泡などの超音波造影剤と混ぜ合わせられて、血管新生障害の治療を必要としている対象に局所的または全身的に注射されることが可能であり、超音波が結合され、さらに規定された領域、例えば、腫瘍部位に焦点が合わせられ得る。さらに、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は腫瘍血管内皮を標的とすることが知られており、従って、ソノポレーションは、腫瘍内皮細胞においてＤＥｓｐＲ発現が増大した領域に方向付けられる。オペレータにより決定される焦点式超音波に加えて、微小気泡の抗ＤＥｓｐＲ標的化は、抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体自体を含む任意の治療薬の、ソノポレーションに媒介された前記標的化癌領域への侵入の増強を標的とするために使用され得る。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗体断片の標的化送達を達成するために、焦点式超音波法を使用する。本明細書で使用される場合、ＨＩＦＵまたは「高密度焦点式超音波」は、高密度超音波を用いて、被覆または周囲の健全な組織に損傷を引き起こすことなく悪性または病原性組織を加熱および破壊する非侵襲性治療法を指す。通常、ＨＩＦＵは組織切除技術において使用されており、凝固壊死および構造破壊を含むＨＩＦＵ治療の生物学的効果は、固形腫瘍部位などの切除を必要とする組織において誘発され得る。しかしながら、Ｋｈａｉｂｕｌｌｉｎａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．２００８  Ｆｅｂ；４９（２）：２９５−３０２、および国際公開第２０１０１２７３６９号パンフレット（これらの内容は、参照によってその全体が本明細書中に援用される）に記載されるように、ＨＩＦＵは、抗体またはその抗体断片などの治療薬の送達手段としても使用することができる。
【０２５９】
造影超音波（ＣＥＵＳ）を用いる方法も、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ阻害剤と共に使用することが考えられる。造影超音波（ＣＥＵＳ）は、超音波造影媒体および超音波造影剤の従来の医療用超音波検査への適用を指す。超音波造影剤は、音波が物質間の界面から反射される様々な方法に依存する薬剤を指す。これは、小さい気泡またはより複雑な構造の表面であり得る。市販の造影媒体は、体循環へ静脈内投与されるガス充填微小気泡を含む。微小気泡は、高度のエコー輝度、すなわち物体が超音波を反射する能力を有する。微小気泡中の気体と、体の軟組織周辺部との間のエコー輝度の違いは非常に大きく、超音波の後方散乱、または超音波の反射を増強し、エコー輝度の違いが大きいことによりコントラストが増大した独特の超音波画像を生じる。造影超音波は、本明細書に記載される組成物および方法と共に使用して、本明細書に記載されるように、血管新生依存性障害などの様々な状態および障害を画像形成することができる。
【０２６０】
本明細書に記載される組成物および方法と共に使用するために様々な微小気泡造影剤が利用可能である。微小気泡は、そのシェルの構成、気体コアの構成、および標的とされるかどうかが異なり得る。
【０２６１】
微小気泡のシェル材料は、微小気泡が免疫系によってどの程度容易に取り込まれるかを決定する。より親水性のシェル材料はより容易に取り込まれる傾向があり、循環中の微小気泡の滞留時間を短くする。これは、コントラストイメージングに使用可能な時間を低減する。シェル材料は、微小気泡の機械的弾性にも影響を与える。材料が弾性であるほど、破裂する前に耐えることができる音響エネルギーが大きくなる。現在の微小気泡シェルにおいて使用される材料の例としては、Ｌｉｎｄｎｅｒ，Ｊ．Ｒ．２００４  Ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．３：５２７−３２（その内容は参照によってその全体が本明細書中に援用される）に記載されるように、アルブミン、ガラクトース、脂質、およびポリマーが挙げられる。
【０２６２】
微小気泡の気体コアは、エコー輝度を決定するので、超音波造影微小気泡の重要な部分である。気泡が超音波周波数フィールドに捕獲され得る場合、これらは圧縮し、振動し、そして特有のエコーを反射する。このエコーは、造影超音波において強力で独特な超音波画像を生じる。気体コアは、例えば、空気、またはペルフルオロカーボンもしくは窒素のような重い気体で構成され得る。重い気体は水溶性が低いので、微小気泡から漏出して、エコー輝度を損なう可能性が低い。従って、重い気体のコアを有する微小気泡は、循環中でより長く存続する可能性がある。
【０２６３】
シェルまたは気体コアの組成に関係なく、微小気泡サイズは、通常、かなり均一である。これらは、直径１〜４マイクロメートルの範囲内であり得る。それにより、微小気泡は赤血球よりも小さくなり、循環および微小循環を通って容易に流れることができる。
【０２６４】
ＤＥｓｐＲなどの血管新生障害に特有の受容体に結合する標的リガンドは微小気泡に結合させることができ、微小気泡複合体が罹患または異常組織などの対象の領域に選択的に蓄積可能になる。標的化造影超音波として知られているこの形式の分子イメージングは、標的化微小気泡が対象の領域に結合したときにだけ強力な超音波シグナルを発生するであろう。標的化造影超音波は、医学的診断および医学的治療の療法において多数の用途を有する。抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片などのＤＥｓｐＲに結合する薬剤により標的化される微小気泡は、小さいボーラスにおいて全身的に注射される。これらのＤＥｓｐＲ標的化微小気泡は循環系を通って移動することができ、最終的にそのそれぞれの標的を見出し、特異的に結合する。次に、超音波が対象の領域に向けられる。十分な数のＤＥｓｐＲ標的化微小気泡がその領域に結合されたら、その圧縮性気体コアは、高周波数の音響エネルギー場に応答して振動する。ＤＥｓｐＲ標的化微小気泡は、微小気泡と組織との間の桁違いなエコー輝度の差異に起因して、周囲の組織と全く対照的である独特のエコーも反射する。超音波システムは強いエコー輝度を対象領域の造影画像に変換し、結合したＤＥｓｐＲ標的化微小気泡の位置が明らかになる。次に、結合した微小気泡の検出は、対象領域がＤＥｓｐＲを発現していることを示すことができ、これは、特定の病状を示すか、あるいは対象領域内の特定の細胞を同定することができる。さらに、標的化ソノポレーションは、ＤＥｓｐＲ標的化微小気泡が付着された部位において行うことができ、従って、エコーを発生する微小気泡にカプセル化されるかそこに支持された任意の治療薬（薬物、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、小分子）の標的化搬送が達成される。
【０２６５】
従って、本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片、例えば、抗ＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２抗体またはその断片、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、またはSEQ ID NO:７からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ領域を含む抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片；SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、またはSEQ ID NO:１２からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ領域を含む抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片；SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７からなる群から選択される可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列を含む抗ＤＥｓｐＲ抗体または抗体断片；および／またはSEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１８、およびSEQ ID NO:１９からなる群から選択される可変軽（ＶＬ）鎖アミノ酸配列を含む抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片などが、標的化超音波送達を用いて、血管新生障害（例えば、癌など）の治療を必要としている対象に投与される。いくつかのこのような実施形態では、標的化超音波送達は、造影剤として、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片が結合し得る微小気泡を使用することを含む。いくつかのこのような実施形態では、標的化超音波はＨＩＦＵである。
【０２６６】
医薬製剤
本明細書に記載される方法の臨床用途のために、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片などのＤＥｓｐＲアンタゴニストの投与は、非経口投与、例えば、静脈内、粘膜、例えば、鼻腔内、眼球、または他の投与モードのための医薬組成物または医薬製剤への処方を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、任意の薬学的に許容可能なキャリア化合物、材料、または組成物と共に投与することができ、対象に有効な治療がもたらされる。従って、本明細書に記載される方法において使用するための医薬製剤は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な成分と組み合わせて、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片を含有することができる。
【０２６７】
「薬学的に許容可能な」という語句は、正しい医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、過敏、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わず、合理的な利益／リスク比と釣り合って、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。「薬学的に許容可能なキャリア」という語句は、本明細書で使用される場合、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、媒体、カプセル化材料、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくは亜鉛、もしくはステアリン酸（ｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ））、または抗ＤＥｓｐＲ抗体もしくはその抗体断片の安定性、溶解度、もしくは活性の維持に関与する溶媒カプセル化材料などの、薬学的に許容可能な材料、組成物または媒体を指す。各キャリアは、製剤の他の成分と適合性であり、そして患者に有害でないという意味で、「許容可能」でなければならない。「賦形剤」、「キャリア」、「薬学的に許容可能なキャリア」などの用語は、本明細書では交換可能に使用される。
【０２６８】
本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、以下の：（１）例えば、無菌溶液もしくは懸濁液、または徐放性製剤として、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外の注射による非経口投与、（２）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、または徐放性パッチもしくはスプレーとしての局所用途、（３）例えば、ペッサリー、クリームまたはフォムとしての腟内または直腸内投与、（４）眼による投与（５）経皮投与、（６）経粘膜投与、または（７９）経鼻投与に適しているものを含む、固体、液体またはゲル形態における化合物を対象へ投与するために特に処方することができる。さらに、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、患者に移植することもできるし、あるいは薬物送達系を用いて注射することもできる。例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４：１９９−２３６（１９８４）、Ｌｅｗｉｓ，ｅｄ．「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）、米国特許第３，７７３，９１９号明細書、および米国特許第３５３，２７０，９６０号明細書を参照されたい。
【０２６９】
本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片などのＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニスト剤の治療製剤は、所望の純度を有するＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストを、任意的な薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で貯蔵用に調製することができる。許容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度においてレシピエントに無毒であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチルまたはプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。例示的な凍結乾燥抗ＶＥＧＦ抗体製剤は、参照によって本明細書中に明確に援用される国際公開第９７／０４８０１号パンフレットに記載されている。
【０２７０】
場合によるが好ましくは、本明細書に記載される組成物を含む製剤は、薬学的に許容可能な塩、通常、例えば塩化ナトリウムを、好ましくはほぼ生理学的な濃度で含有する。場合により、本発明の製剤は、薬学的に許容可能な防腐剤を含有することができる。いくつかの実施形態では、防腐剤の濃度は、０．１〜２．０％（通常、ｖ／ｖ）の範囲である。適切な防腐剤には、医薬品分野において既知のものが含まれる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、おおよびプロピルパラベンは、防腐剤の例である。場合により、本発明の製剤は、０．００５〜０．０２％の濃度の薬学的に許容可能な界面活性剤を含むことができる。
【０２７１】
また、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗体断片などのＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストを含む組成物の治療製剤は、治療中の特定の徴候のために必要なものとして、２つ以上の活性化合物（好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的な活性を有するもの）を含有することもできる。例えば、いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ上の異なるエピトープに結合する抗体）、ＶＥＧＦＲ、またはＥｒｂＢ２（例えば、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ）に結合する抗体をさらに提供することが望ましいこともある。あるいは、またはさらに、組成物は、細胞毒性剤、サイトカイン、成長阻害剤および／またはＶＥＧＦＲアンタゴニストを含むことができる。このような分子は、意図される目的のために有効である量で組み合わせられて適切に存在する。
【０２７２】
本明細書に記載されるＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストを含む組成物の治療製剤の活性成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、あるいは界面重合、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルによって、それぞれ、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにおいて、マイクロカプセル中に捕捉して調製することもできる。このような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、徐放性調製物を使用することができる。徐放性調製物の適切な例としては、抗ＤＥｓｐＲ抗体などのＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、ここで、マトリックスは、成形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸およびｙエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射用ミクロスフェア）など、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日以上にわたる分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短い期間でタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が体内に長期間とどまる場合、３７℃における水分への暴露の結果としてこれらは変質するかあるいは凝集することがあり、その結果、生物活性が損失され、免疫原性の変化が生じ得る。関与するメカニズムに応じて安定化のための合理的な戦略が考案され得る。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが見出されれば、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、適切な添加剤を用いて含水量を調節し、特定のポリマーマトリックス組成物を生じさせることによって、安定化を達成することができる。
【０２７４】
本明細書に記載される方法において、非経口投与などのインビボ投与のために使用される治療製剤は無菌であり得るが、これは、無菌ろ過膜によるろ過、または当業者に知られている他の方法によって容易に達成される。
【０２７５】
投与量および持続期間
抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗体断片などの本明細書に記載されるＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストは、良好な医療行為と調和するように処方、服用、および投与される。これに関連して検討するための因子には、治療中の特定の障害、治療中の特定の対象、個々の対象の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、および開業医に知られているその他の因子が含まれる。投与すべきＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストの「治療的に有効な量」はこのような検討により決定され、癌を回復させ、治療し、または安定化するため、進行までの時間（無進行生存の持続期間）を長くするため、あるいは腫瘍、休止状態の腫瘍、または微小転移の発生または再発を治療または予防するために必要な最小量を指す。ＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストは、場合により、癌または発癌リスクを予防または治療するために現在使用されている１つまたは複数の付加的な治療薬と共に処方される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するＶＥＧＦ特異的アンタゴニストの量、障害または治療の種類、および上記のその他の因子に依存する。これらは、一般に、これまでの使用と同じ投与量および投与経路で、あるいはこれまで使用された投与量の約１〜９９％で使用される。
【０２７６】
疾患の種類および重症度に応じて、例えば、１つまたは複数の別の投与によって、あるいは持続注入によって対象へ投与するために、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）のＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストが初期候補投与量である。典型的な１日の投与量は、上記の因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であろう。特に望ましい投与量としては、例えば、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および１５ｍｇ／ｋｇが挙げられる。条件に応じて数日またはそれ以上にわたる反復投与の場合には、上記の方法または当該技術分野において既知の方法によって測定されるように、例えば、癌が治療されるまで治療は持続される。しかしながら、他の投与計画も有用であり得る。１つの非限定的な例では、ＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストが抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片であれば、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇの用量範囲（５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇを含むがこれらに限定されない）で、週に１回、２週間に１回、または３週間に１回投与される。本明細書に記載される方法の使用の経過は、従来の技術およびアッセイによって容易に監視することができる。
【０２７７】
本明細書に記載される方法を用いる治療法の持続期間は、医学的に必要と示される限り、あるいは所望の治療効果（例えば、本明細書に記載されるもの）が達成されるまで継続するであろう。特定の実施形態では、本明細書に記載されるＤＥｓｐＲ特異的抗体または抗体断片などのＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニスト療法は、１か月間、２か月間、４か月間、６か月間、８か月間、１０か月間、１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、１０年間、２０年間、あるいは対象の寿命までの年数の間継続される。
【０２７８】
治療の効力
本明細書に記載されるＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストを含む組成物の治療製剤を含む癌の治療方法の効力は、腫瘍退縮、腫瘍の重量またはサイズの収縮、進行までの期間、生存期間、無進行生存、全奏効率、反応の持続期間、および生活の質を含むがこれらに限定されない、癌治療の評価において一般的に使用される種々のエンドポイントによって測定することができる。ＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニスト、例えば、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗体断片は、腫瘍血管系、癌細胞、およびいくつかの癌幹細胞サブセットを標的とするので、これらは独特の種類の抗癌剤の多標的化を表し、従って、薬物に対する臨床反応の独特の尺度および定義を必要とし得る。例えば、二次元分析において５０％よりも大きい腫瘍収縮は、反応を宣言するための標準的なカットオフである。しかしながら、本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、原発腫瘍の収縮がなかても転移性の広がりの阻害を引き起こすこともできるし、あるいは単に腫瘍増殖抑制（ｔｕｍｏｒｉｓｔａｔｉｃ）効果を示すだけのこともある。従って、例えば、血管新生の血漿または尿中マーカーの測定、および標識（例えば、微小気泡など）に結合されたＤＥｓｐＲ抗体または抗体断片を用いた分子イメージングによる反応の測定を含む、抗血管新生療法の効力を決定するための新規のアプローチを使用しなければならない。癌の場合、治療的に有効な量のＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、癌細胞の数を低減し、腫瘍サイズを低減し、癌細胞の末梢器官への浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで遅延、好ましくは停止）し、腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで遅延、好ましくは停止）し、腫瘍成長をある程度まで阻害し、そして／あるいは障害に関連する症状の１つまたは複数をある程度まで軽減することができる。ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片は、現存する癌細胞の成長を阻害し、そして／あるいは癌細胞を死滅させ得る範囲内で、細胞増殖抑制および／または細胞毒性であり得る。癌療法のために、インビボの効力は、例えば、生存の持続期間、無進行生存（ＰＦＳ）の持続期間、奏効率（ＲＲ）、反応の持続期間、および／または生活の質をアッセイすることによって測定することができる。
【０２７９】
他の実施形態において、本明細書には、癌に対する感受性が高いか、あるいは癌であると診断されたヒト対象の無進行生存を増大させるための方法が記載される。疾患の進行までの時間は、薬物投与から疾患の進行または死亡までの時間として定義される。好ましい実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片などのＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニスト、および１つまたは複数の化学療法剤を用いる本発明の併用治療は、化学療法単独による治療と比較したときに、少なくとも約１か月、１．２か月、２か月、２．４か月、２．９か月、３．５か月、好ましくは約１〜約５か月、無進行生存を著しく増大させる。別の実施形態では、本明細書に記載される本方法は、癌に対する感受性が高いか、あるいは癌であると診断され、種々の治療法で治療されている、ヒト対象群における奏効率を著しく増大させる。奏効率は、治療に対して反応した治療対象の割合であると定義される。一実施形態では、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片などのＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニスト、および１つまたは複数の化学療法剤を用いる本明細書に記載される併用治療は、化学療法単独で治療された群と比較して、治療対象群における奏効率を著しく増大させる。
【０２８０】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、「治療している」、または「回復」という用語は、疾患または障害に関連する状態の進行または重症度を逆行、軽減、回復、阻害、減速または停止させることが目的である、治療的な処置を指す。「治療」という用語は、慢性的な免疫状態（慢性的な感染または癌などであるが限定されない）に関連する状態、疾患または障害の少なくとも１つの有害な効果または症状の低減または軽減を含む。治療は、一般に、１つまたは複数の症状または臨床マーカーが低減されれば「有効」である。あるいは、治療は、疾患の進行が低減または停止されれば「有効」である。すなわち、「治療」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、少なくとも、進行の低下、または治療しない場合に予想され得る症状の悪化を停止することを含む。有益なまたは所望の臨床結果には、検出可能であろうと検出不能であろうと、１つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の進行の遅延または減速、病状の回復または緩和、および寛解（部分的でも全体でも）が含まれるが、これらに限定されない。疾患の「治療」という用語は、疾患の症状または副作用からの解放を提供する（対症的な治療を含む）ことも含む。
【０２８１】
例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、癌、または過剰もしくは不必要な血管新生を特徴とする他のこのような障害の症状を軽減するために、有効量の本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片を対象に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「癌の症状を軽減する」は、癌に関連する任意の状態または症状を回復または低減させる。治療していない同等の対照と比較して、このような低減または予防の程度は、任意の標準技術で測定されるように、少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、または１００％である。理想的には、当該技術分野において既知の任意の方法によって決定されるように、癌は完全に除去され、この場合、癌は治療されたと考えられる。癌に対して治療されている患者は、開業医によりこのような状態にあると診断された患者である。診断は、任意の適切な手段によって行うことができる。診断および監視は、例えば、生物サンプル中の癌細胞のレベルの検出（例えば、組織またはリンパ節生検、血液検査、または尿検査）、生物サンプル中の癌の代用マーカーのレベルの検出、特定の癌に関連する症状の検出、またはこのような癌感染に特有の免疫応答に関与する免疫細胞の検出を含むことができる。
【０２８２】
「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患または障害の少なくとも１つまたは複数の症状を軽減するために必要とされる抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片の量を指し、所望の効果を提供する、すなわち新しい血管の形成を阻害するのに十分な量の薬理学的組成物に関する。従って、「治療的に有効な量」という用語は、明細書に記載される方法を用いて、典型的な対象に投与されたときに特定の効果をもたらすのに十分である抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片の量を指す。本明細書で使用される場合の有効量は、疾患の症状の発達を遅延させる、症状の疾患の経過を変更する（例えば、限定はされないが、疾患の症状の進行を遅延させる）、あるいは疾患の症状を逆行させるために十分な量も含み得る。従って、正確な「有効量」を特定することは不可能である。しかしながら、所与のどんな場合についても、適切な「有効量」は、日常的な実験だけを用いて当業者によって決定することができる。
【０２８３】
有効量、毒性、および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％まで死に至る用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。投与量は、使用される剤形および使用される投与経路に応じて変わり得る。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で表すことができる。大きな治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療的に有効な用量は、初めに、細胞培養アッセイから見積もることができる。また、細胞培養または適切な動物モデルにおいて決定されるように、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するための用量を動物モデルにおいて処方することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定することができる。任意の特定の投与量の効果は、適切なバイオアッセイによって監視することができる。投与量は医師によって決定され、観察される治療の効果に適合するように必要に応じて調整され得る。
【０２８４】
併用抗血管新生療法
他の実施形態では、血管新生阻害量の抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片などの抗ＤＥｓｐＲ阻害剤を含む治療的に有効な量の組成物を対象に投与することによって、血管新生に依存するか、あるいは血管新生により調節される疾患または障害を有する対象または個体の組織における血管新生を阻害するために提供される方法は、さらに、血管新生阻害剤、化学療法、放射線、手術、または血管新生を阻害することが当業者に知られている他の治療などの１つまたは複数の付加的な治療の投与を含むことができる。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法はさらに、抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片などの少なくとも１つのＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストと、１つまたは複数の付加的な抗癌療法との組み合わせの投与を含む。付加的な抗癌療法の例としては、手術、放射線療法（照射療法）、生物療法、免疫療法、化学療法、またはこれらの療法の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、細胞毒性剤、抗血管新生および抗増殖剤をＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストと組み合わせて使用することができる。
【０２８６】
方法および使用のいずれかの特定の態様では、本発明は、有効量の抗ＤＥｓｐＲ抗体および１つまたは複数の化学療法剤を、局所再発または未治療の癌に対する感受性が高いか、あるいは診断された対象に投与することによる癌の治療を提供する。本発明の併用治療法および使用において様々な化学療法剤を使用することができる。本明細書に記載される方法においてい使用することが考えられる化学療法剤の例示的かつ非限定的なリストは、「定義」において提供されるか、本明細書中に記載される。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、１つまたは複数の化学療法剤を伴うＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニスト（例えば、混合物）またはこれらの任意の組み合わせの投与を含む。特定の実施形態では、化学療法剤は、例えば、カペシタビン、タキサン、アントラサイクリン、パクリタキセル、ドセタキセル、パクリタキセルタンパク質結合粒子（例えば、ＡｂｒａｘａｎｅＴＭ）、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シクロホスファミドまたはこれらの療法の組み合わせである。本明細書で使用される場合、併用投与は、別個の製剤または単一の医薬製剤を用いる同時投与、および何れかの順序での連続投与を含み、好ましくは、両方の（または全ての）活性剤がその生物活性を同時に発揮する間には時間がある。このような化学療法剤の準備および投薬予定は、製造者の指示に従って、あるいは熟練した開業医によって経験的に決定されるように使用することできる。化学療法の準備および投薬予定は、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ（１９９２）にも記載されている。従って、いくつかの実施形態では、化学療法剤は、ＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストの投与の前または後に行うこともできるし、あるいはこれらは同時に与えることもできる。
【０２８８】
本明細書に記載される方法のいくつかの他の実施形態では、本発明の抗体などのＤＥｓｐＲアンタゴニストとの併用腫瘍療法のために有用な他の治療薬には、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２としても知られている）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、またはＴＮＦなどの、腫瘍成長に関与する他の因子のアンタゴニストが含まれる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のサイトカインを対象に投与することも有益であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲアンタゴニストは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、成長阻害剤が最初に投与された後、ＤＥｓｐＲアンタゴニストが投与され得る。しかしながら、同時投与またはＤＥｓｐＲアンタゴニストが最初の投与も考えられる。成長阻害剤のために適切な投与量は現在使用されている量であり、成長阻害剤およびＤＥｓｐＲアンタゴニストの併用作用（相乗効果）に起因して低減され得る。
【０２８９】
本明細書に記載される抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗体断片などのＤＥｓｐＲ阻害剤と組み合わせて使用され得る追加の血管新生阻害剤の例としては、直接血管新生阻害剤、アンジオスタチン、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、アレステン（Ａｒｒｅｓｔｅｎ）、カンスタチン（Ｃａｎｓｔａｔｉｎ）、コンブレタスタチン、エンドスタチン、ＮＭ−３、トロンボスポンジン、タムスタチン、２−メトキシエストラジオール、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、パニツムマブ（ＶｅｃｔｉｂｉｘＴＭ）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））およびビタキシン（Ｖｉｔａｘｉｎ）、ならびに間接血管新生阻害剤のＺＤ１８３９（Ｉｒｅｓｓａ）、ＺＤ６４７４、ＯＳＩ７７４（Ｔａｒｃｅｖａ）、ＣＩ１０３３、ＰＫＩ１６６６、ＩＭＣ２２５（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、ＰＴＫ７８７、ＳＵ６６６８、ＳＵ１１２４８、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、およびＩＦＮ−α、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）、ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標）（サリドマイド）、およびＩＦＮ−αが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法で使用するための追加の血管新生阻害剤は、多数の血管新生促進成長因子受容体の小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を含み（限定はされない）、抗癌療法として現在承認されている３つのＴＫＩは、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））、およびスニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））である。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法で使用するための血管新生阻害剤は、テムシロリムス（ＴｏｒｉｃｅｌＴＭ）、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））、サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標））、およびＤｏｘｙｃｙｃｌｉｎなどの、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳類標的）の阻害剤を含むが、これらに限定されない。
【０２９２】
他の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための血管新生阻害剤には、ＶＥＧＦ経路を標的とする１つまたは複数の薬物が含まれる。ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））は、癌に対する使用が承認される、新しい血管を標的とする第１の薬物であった。これは、ＶＥＧＦに結合すことにより、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）に到達するのを遮断するモノクローナル抗体である。スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））およびソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））などの他の薬物は、ＶＥＧＦ受容体自体に付着して、ＶＥＧＦ受容体がオンにされるのを防止する小分子である。このような薬物は、集合的に、ＶＥＧＦ阻害剤と呼ばれる。ＶＥＧＦ／ＶＰＦタンパク質がＶＥＧＦＲと相互作用をすると、例えば、受容体と相互作用するために利用可能な量を低減することによるリガンドＶＥＧＦ阻害、あるいは、受容体の内因性チロシンキナーゼ活性の阻害のいずれかが、この経路の機能を遮断する。この経路は内皮細胞の成長、ならびに透過性を調節し、これらの機能は、ＶＥＧＦＲによって媒介される。
【０２９３】
従って、本明細書に記載されるように、血管新生阻害剤として使用するための「ＶＥＧＦ阻害剤」は、ＶＥＧＦタンパク質の機能を阻害する（ＶＥＧＦ受容体タンパク質の機能の阻害を含む）ことによって、細胞の成長、増殖および生存を促進するシグナリング経路に対して直接的または間接的な効果を生じるあらゆる化合物または薬剤を含む。これらは、アンチセンス核酸などの修飾および非修飾核酸、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ剤、ペプチド、ペプチド模倣薬、受容体、リガンド、および抗体を含むがこれらに限定されない、ＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害するあらゆる有機または無機分子を含むｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦ経路の成分を標的とし、ＶＥＧＦ経路を阻害することができる。好ましいＶＥＧＦ阻害剤には、例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡの抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であるＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ａｖｅｎｔｉｓ）が含まれる。追加のＶＥＧＦ阻害剤としては、ＣＰ−５４７，６３２（３−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−５−［３−（４−ピロリジン１−イル−ブチル）−ウレイド］−イソチアゾール−４−カルボン酸アミド塩酸塩、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．，ＮＹ）、ＡＧ１３７３６、ＡＧ２８２６２（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、ＳＵ５４１６、ＳＵ１１２４８、＆ＳＵ６６６８（以前はＳｕｇｅｎ  Ｉｎｃ．、現在はＰｆｉｚｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ＺＤ−６４７４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＶＥＧＦ−Ｒ２および−Ｒ１を阻害するＺＤ４１９０（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＣＥＰ−７０５５（Ｃｅｐｈａｌｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｆｒａｚｅｒ，ＰＡ）、ＰＫＣ  ４１２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＥＥ７８８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＺＤ−２１７１）、ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）（ＢＡＹ４３−９００６、ソラフェニブ、Ｂａｙｅｒ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＯｎｙｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、バタラニブ（ＰＴＫ−７８７、ＺＫ−２２２５８４としても知られている、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＆  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ：ＡＧ）、ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブオクタナトリウム、ＮＸ−１８３８、ＥＹＥ−００１、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．／Ｇｉｌｅａｄ／Ｅｙｅｔｅｃｈ）、ＩＭ８６２（グルファニド二ナトリウム（ｇｌｕｆａｎｉｄｅ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ）、Ｃｙｔｒａｎ  Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）、ＶＥＧＦＲ２選択的モノクローナル抗体ＤＣ１０１（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｉｂｏｚｙｍｅ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）およびＣｈｉｒｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からの合成リボザイムであるアンジオザイム（ａｎｇｉｏｚｙｍｅ）、Ｓｉｒｎａ−０２７（ｓｉＲＮＡベースのＶＥＧＦＲ１阻害剤、Ｓｉｒｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）Ｃａｐｌｏｓｔａｔｉｎ、ＶＥＧＦ受容体の可溶性外部ドメイン、Ｎｅｏｖａｓｔａｔ（ＡＥｔｅｒｎａ  Ｚｅｎｔａｒｉｓ  Ｉｎｃ，Ｑｕｅｂｅｃ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＺＭ３２���８８１（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ．ＣＡ，ＵＳＡ）、ペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ）（Ｅｙｅｔｅｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、抗ＶＥＧＦアプタマー、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
【０２９４】
ＶＥＧＦ阻害剤は、米国特許第６，５３４，５２４号明細書および同第６，２３５，７６４号明細書（いずれもその全体が援用される）にも開示されている。追加のＶＥＧＦ阻害剤は、例えば、国際公開第９９／２４４４０号パンフレット（１９９９年５月２０日公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ９９／００７９７号（１９９９年５月３日出願）、国際公開第９５／２１６１３号パンフレット（１９９５年８月１７日公開）、国際公開第９９／６１４２２号パンフレット（１９９９年１２月２日公開）、米国特許出願公開第２００６００９４０３２号明細書「ＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡ剤（ｓｉＲＮＡ  ａｇｅｎｔｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＶＥＧＦ）」、米国特許第６，５３４，５２４号明細書（ＡＧ１３７３６を開示）、米国特許第５，８３４，５０４号明細書（１９９８年１１月１０日発行）、国際公開第９８／５０３５６号パンフレット（１９９８年１１月１２日公開）、米国特許第５，８８３，１１３号明細書（１９９９年３月１６日発行）、米国特許第５，８８６，０２０号明細書（１９９９年３月２３日発行）、米国特許第５，７９２，７８３号明細書（１９９８年８月１１日発行）、米国特許第６，６５３，３０８号明細書（２００３年１１月２５日発行）、国際公開第９９／１０３４９号パンフレット（１９９９年３月４日公開）、国際公開第９７／３２８５６号パンフレット（１９９７年９月１２日公開）、国際公開第９７／２２５９６号パンフレット（１９９７年６月２６日公開）、国際公開第９８／５４０９３号パンフレット（１９９８年１２月３日公開）、国際公開第９８／０２４３８号パンフレット（１９９８年１月２２日公開）、国際公開第９９／１６７５５号パンフレット（１９９９年４月８日公開）、および国際公開第９８／０２４３７号パンフレット（１９９８年１月２２日公開）、国際公開第０１／０２３６９号パンフレット（２００１年１月１１日公開）、米国仮特許出願第６０／４９１，７７１号明細書（２００３年７月３１日出願）、米国仮特許出願第６０／４６０，６９５（号明細書２００３年４月３日出願）、および国際公開第０３／１０６４６２Ａ１号パンフレット（２００３年１２月２４日公開）に記載されている。ＶＥＧＦ阻害剤の他の例は、国際特許公報の国際公開第９９／６２８９０号パンフレット（１９９９年１２月９日公開）、国際公開第０１／９５３５３号パンフレット（２００１年１２月１３日公開）および国際公開第０２／４４１５８号パンフレット（２００２年６月６日公開）に開示されている。
【０２９５】
他の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための血管新生阻害剤には、アルファ−２抗プラスミン剤（断片）、アンジオスタチン（プラスミノーゲン断片）、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、軟骨由来の阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＤ５９補体断片、エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩ断片）、フィブロネクチン断片、ｇｒｏ−ｂｅｔａ（Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン）、ヘパリナーゼヘパリン六糖断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターフェロンアルファ／ベータ／ガンマ、インターフェロン誘発性タンパク質（ＩＰ−１０）、インターロイキン−１２、クリングル５（プラスミノーゲン断片）、ベータ−トロンボグロブリン、ＥＧＦ（断片）、ＶＥＧＦ阻害剤、エンドスタチン、フィブロネクチオン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｏｎ）（４５ｋＤ断片）、高分子量キニノーゲン（ドメイン５）、ＨＧＦのＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３断片、ＰＦ−４、セルピンプロテイナーゼ阻害剤８、ＴＧＦ−ベータ−１、トロンボスポンジン−１、プロサポシン、ｐ５３、アンジオアレスチン（ａｎｇｉｏａｒｒｅｓｔｉｎ）、メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）、２−メトキシエストラジオール、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化剤阻害剤、プロラクチン１６ｋＤ断片、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、レチノイド、テトラヒドロコルチゾール−Ｓトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−ｂ）、バスキュロスタチン（ｖａｓｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）、およびバソスタチン（カルレティキュリン断片）、パミドロネートサリドマイド、ＴＮＰ４７０、アミノ−ビスホスホナートゾレドロン酸などのビスホスホナートファミリー、ＲＣ−３０９５およびＲＣ−３９４０−ＩＩなどのボンベシン／ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）アンタゴニスト（Ｂａｊｏ１  ＡＭ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２００４）９０，２４５−２５２）、抗ＶＥＧＦペプチドＲＲＫＲＲＲ（ｄＲＫ６）（Ｓｅｕｎｇ−Ａｈ  Ｙｏｏ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ，２００５，１７４：５８４６−５８５５）などの抗血管新生因子が含まれる。
【０２９６】
従って、抗ＤＥｓｐＲ抗体およびその抗体断片などのＤＥｓｐＲ阻害剤の投与に関連して、血管新生を阻害する化合物は、臨床的に適切な方法での投与が、少なくとも統計的に有意な割合の患者に対して、症状の改善、治癒、疾患負荷の低減、腫瘍量または細胞の数の低下、寿命の延長、生活の質の改善、または特定の種類の疾患または状態の治療に精通している医師によって肯定的であると通常認められるその他の効果などの有益な効果をもたらすことを示す。
【０２９７】
追加のＤＥｓｐＲ阻害剤の例としては、ＶＥＧＦｓｐ、ＥＴ−１および／または他のＥＴ−１またはＶＥＧＦｓｐ様リガンドのＤＥｓｐＲへの結合を遮断する分子、ＤＥｓｐＲの下流シグナル伝達事象を妨害する化合物、または受容体の活性化を阻害する他の化合物もしくは薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。このような化合物はＤＥｓｐＲに結合して、ＶＥＧＦｓｐ、ＥＴ−１または他の模倣リガンドの結合を防止することができる。ＶＥＧＦｓｐに結合するＤＥｓｐＲドメインに結合する小分子、可溶性ＤＥｓｐＲ受容体、ＤＥｓｐＲ  ＥＴ−１および／またはＶＥＧＦｓｐ結合ドメインを含有するペプチドなどを含むその他の阻害剤も考えられる。
【０２９８】
本明細書に記載される組成物は、治療中の特定の徴候のために必要なものとして２つ以上の活性化合物を含有することもき、これらの活性化合物は、好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的な活性を有するものである。例えば、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、またはＥｒｂＢ２（例えば、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ）に結合する抗体またはアンタゴニストをさらに提供することが望ましいこともある。代替的または付加的に、組成物は、細胞毒性剤、サイトカイン、成長阻害剤および／またはＶＥＧＦＲアンタゴニストを含むことができる。このような分子は、意図される目的のために有効である量で組み合わせられて適切に存在する。
【０２９９】
本明細書に記載される方法および使用のいずれかの特定の態様では本発明の抗体、による癌の併用療法に有用なその他の治療薬には、他の抗血管新生剤が含まれる。ＣａｒｍｅｌｉｅｔおよびＪａｉｎ（２０００）によって記載されるものを含む多数の抗血管新生剤が同定されており、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるヒト化抗ＤＥｓｐＲ抗体またはその抗体断片などのＤＥｓｐＲアンタゴニストは、ＶＥＧＦ変異体、可溶性ＶＥＧＦ受容体断片、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの低分子量阻害剤、およびこれらの任意の組み合わせなどのＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニストと組み合わせて使用される。代替的または付加的に、２つ以上の抗ＤＥｓｐＲアンタゴニストを対象に同時投与することができる。
【０３００】
本明細書に記載されるような疾患の治療のために、ＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストの適切な投与量は、上記のような、治療される疾患の種類、疾患の重症度および経過、ＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストが予防的目的で投与されるか治療的目的で投与されるか、以前の治療指標、対象の病歴およびＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニスト対する反応、ならびに主治医の裁量に依存するであろう。ＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストは、一度で、あるいは一連の治療にわたって対象に適切に投与される。併用治療体制では、本明細書に記載されるＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストおよび１つまたは複数の抗癌治療薬は、治療的に有効な量または相乗的な量で投与される。本明細書で使用される場合、治療的に有効な量は、ＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストおよび１つまたは複数の他の治療薬の同時投与、あるいは本明細書に記載される組成物の投与が、本明細書に記載される癌の低減または阻害をもたらすような量である。治療的に相乗的な量は、特定の疾患に関連する状態または症状を相乗的または有意に低減または除去するために必要なＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストおよび１つまたは複数の他の治療薬の量である。
【０３０１】
ＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストおよび１つまたは複数の他の治療薬は、腫瘍、休止状態の腫瘍、または微小転移の発生または再発を低減または除去するために十分な量および時間で、同時または連続して投与することができる。ＤＥｓｐＲ特異的アンタゴニストおよび１つまたは複数の他の治療薬は、腫瘍の再発の見込みを防止または低減する維持療法として投与することができる。
【０３０２】
当業者には理解されるように、化学療法剤または他の抗癌剤の適切な用量は、一般に、およそ、例えば、化学療法剤が単独であるいは他の化学療法剤と組み合わせて投与される場合の臨床治療において既に使用されている用量である。治療されている状態に応じて恐らく投与量の変動が起こるであろう。治療を施す医師は、個々の対象に対する適切な用量を決定することができるであろう。
【０３０３】
上記の治療体制に加えて、対象は放射線療法を受けることができる。
【０３０４】
本明細書に記載される方法、使用および組成物のいずれかの特定の実施形態では、投与されるＤＥｓｐＲ抗体は、インタクトな裸の抗体である。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲ抗体は、細胞毒性剤と結合され得る。本方法および使用のいずれかの特定の実施形態では、結合されたＤＥｓｐＲ抗体および／またはそのＤＥｓｐＲ抗体断片は、細胞によって内部に取り入れられ、その結果、これらが結合する癌細胞を殺すことにおいて、結合体の治療効力が増大される。いくつかの実施形態では、ＤＥｓｐＲ抗体および／またはそのＤＥｓｐＲ抗体断片に結合された細胞毒性剤は、癌細胞内の核酸を標的とするか、あるいは癌細胞内の核酸を妨害する。このような細胞毒性剤の例は、マイタンシノイド、カリチアマイシン、リボヌクレアーゼおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼを含み、本明細書中の他の場所にさらに記載される。
【０３０５】
本明細書において他で定義されない限り、本出願と関連して使用される科学技術用語は、この開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。本発明が本明細書に記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬などに限定されず、従って変わり得ることは理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は特定の実施形態を説明するためだけのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することは意図されない。免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，２００６（ＩＳＢＮ０−９１１９１０−１８−２）；Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｌｕｔｔｍａｎｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００６において見出すことができる。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＸ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００７（ＩＳＢＮ−１３：９７８０７６３７４０６３４）；Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（１９８２）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２  ｅｄ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（１９８９）；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９８６）；またはＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｖｏｌ．１���２，Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｒｌ  Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ（１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ）（Ｆｒｅｄ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ．ａｌ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ．ａｌ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ．ａｌ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）において見出すことができ、これらは全て、参照によってその全体が本明細書中に援用される。
【０３０６】
本明細書で使用される場合、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、提示される定義済みの要素に加えて、他の要素も存在し得ることを意味する。「を含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
【０３０７】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、所与の実施形態に必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のその実施形態の基本的および新規または機能的な特徴に実質的に影響を与えない付加的な要素の存在を可能にする。
【０３０８】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、本明細書に記載されるような組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素を指し、実施形態のその記載において列挙されていないあらゆる要素を排除する。
【０３０９】
さらに、文脈によって別に要求されない限り、単数形の用語は複数も含み、複数形の用語は単数も含むものとする。本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明白にそうでないと指示しない限り、複数の参照も含む。従って、例えば、「ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ」への参照は、１つまたは複数の方法（ｍｅｔｈｏｄ）、および／または本明細書に記載される、および／または本開示を読めば当業者に明らかになり得る種類のステップなどを含む。
【０３１０】
作用実施例以外、あるいは別に指示される場合以外では、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表す全ての数は、全ての場合に「約」という用語で修飾されていると理解されるべきである。「約」という用語は、百分率と関連して使用される場合、±１％を意味し得る。
【０３１１】
本発明が本明細書に記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬などに限定されず、従って変わり得ることは理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は特定の実施形態を説明するためだけのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することは意図されない。
【０３１２】
確認される全ての特許および他の刊行物は、例えば、本発明と関連して使用され得るこのような刊行物中に記載される方法論を説明および開示する目的で、参照によって本明細書中に明確に援用される。これらの刊行物は、本特許出願の出願日よりも前のその開示についてのみ提供される。この点に関していかなるものも、先行発明という理由で、あるいは任意の他の理由で、本発明者らがこのような開示に先行する権利がないことの承認であると解釈されてはならない。日付に関する全ての記述またはこれらの文書の内容に関する説明は本出願人が入手可能な情報の基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するどんな承認にもならない。
【０３１３】
本発明は、限定的であると解釈されてはならない以下の実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【０３１４】
実施例１
腫瘍血管新生および腫瘍細胞侵襲性の阻害としての、新規抗ヒト二重エンドセリン−１／ＶＥＧＦｓｐ受容体（抗ｈＤＥｓｐＲ）モノクローナル抗体治療の開発
ＤＥｓｐＲは、ＤＥｓｐＲ−／−ノックアウトマウスにおいて見られるように胚発生における重要な血管新生プレーヤーであり（Ｈｅｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００５）、パワードップラー分析により示される組織血管分布の低下を示す成体ハプロ不全（＋／−）マウスにおいて見られるように、成体組織の血管分布に寄与する（図２）。
【０３１５】
腫瘍侵襲および転移と、ＶＥＧＦ標的化療法に対する内因性および回避的な抵抗との関連に基づいて、抗侵襲性および抗転移性薬と抗血管新生療法との組み合わせは、分析のために重要である（Ｂｅｒｇｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈａｎａｈａｎ  ２００８）。ＤＥｓｐＲおよびＶＥＧＦｓｐ発現は、ヒト内皮細胞において検出され、腫瘍血管において増大され、腫瘍組織アレイの癌細胞および種々の確立した転移性癌細胞株において検出され、そしてＤＥｓｐＲの阻害は、血管新生および腫瘍細胞侵襲性の両方を減少させるので、抗癌療法のためのこの新しい治療命令は、本明細書中に示されるように、対応する確立したインビトロアッセイを用いて、ＤＥｓｐＲ阻害を含む新規の治療法によって対処することができる。
【０３１６】
ＤＥｓｐＲおよびＶＥＧＦｓｐは、基礎的および血管新生の両方の管形成条件下で、臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）および微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣＳ）における免疫染色によって検出した（図３Ａ〜３Ｅ）。重要なことには、ＨＵＶＥＣ（図３Ｄ）およびＨＭＥＣ（図３Ｅ）の血管新生アッセイにおいて、抗ＤＥｓｐＲ（Ａｂ１）および抗ＶＥＧＦｓｐ（Ａｂ２）抗体の両方の抗体を用いて、血管新生の新生血管の長さの阻害が見られる（ＨＵＶＥＣおよびＨＭＥＣの療法に対して、Ｔｕｋｅｙのペアワイズ多重比較Ｐ＜０．００１）。作成される新生血管の分枝および相互接続などの他の血管新生パラメータを用いて、同様の知見が観察された。同様に重要なのは、ＤＥｓｐＲおよびＶＥＧＦｓｐが腫瘍細胞においても検出され、細胞膜および核膜内にＶＥＧＦｓｐおよびＤＥｓｐＲが共存していたことである。代表的な免疫染色は、図３Ａ〜３Ｃに示される。
【０３１７】
ＤＥｓｐＲ細胞膜および核膜発現は多数の腫瘍細胞型において検出された。これは、抗ＤＥｓｐＲ療法が種々の癌型に対して有効であることを示す。簡単に言うと、ＤＥｓｐＲ発現は、ヒト肺非小細胞癌ＮＣＩ−Ｈ７２７、肺巨細胞腫ＴＩＢ−２２３／ＧＣＴ；乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図４Ａ〜４Ｃ）およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８、膀胱癌２５３ＪＢＶ、結腸腺癌ＳＷ４８０、肝細胞癌ＨＥＰ３Ｂ、メラノーマＳＫ−ＭＥＬ−２、骨肉腫ＭＧ−６３、卵巣腺癌ＨＴＢ−１６１／ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ３、前立腺腺癌ＰＣ−３ｍｍ２、および膵癌ＣＲＬ−１４６９／ＰＡＮＣ−１（図４Ｄ）において検出された。ＤＥｓｐＲ発現は、ＨＣＩ−Ｈ２９２肺粘表皮癌、およびＨＥＰＧ２肝細胞癌（図５Ａ）、およびＣＣＬ−８６／Ｒａｊｉ  Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫では検出されず、従って陽性観察の特異性ことが示された。ＮＣＩ−７２７肺癌細胞（図５Ｂ）における知見をＧｒ．ＩＩＩ肺腺癌（図５Ｃ）の腫瘍切片の免疫染色において実証した。
【０３１８】
図６Ａ〜６Ｂに示されるように、対照（Ｃ）および免疫前抗体治療（ＰＩ）とは対照的に、転移性の乳房腫瘍ＭＤＡ−ＭＢ−２３１および膵臓腺癌ＰＡＮＣ−１細胞株の２つの検査細胞株において、抗ヒトＤＥｓｐＲ抗体治療によるＤＥｓｐＲ阻害は、腫瘍細胞侵襲性を阻害する。ＤＥｓｐＲ阻害により腫瘍血管新生および腫瘍細胞侵襲性の療法を標的にできることは、攻撃的な腫瘍および現在の抗ＶＥＧＦ療法に対する回避的抵抗において見られる複合血管新生−転移表現型に対してより有効に対処することができる。
【０３１９】
抗ラットＤＥｓｐＲ抗体を用いた免疫適格性ラットの照射誘発された乳房腫瘍モデルにおいて、インビボの証拠も実証された（Ｈｅｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。図７に示されるように、抗ＤＥｓｐＲ治療されたラットは、模擬処理した対照と比較して、最小限の腫瘍成長を示した。
【０３２０】
一致して、乳房腫瘍の免疫組織化学的分析は、ヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞と同様に腫瘍細胞におけるＤＥｓｐＲ発現を示し（図８Ａ）、正常な乳房組織では発現は示されなかった（図８Ｂ）。重要なのは、腫瘍細胞の内腔への侵食による腫瘍血管の内皮の破壊を示した模擬処理した腫瘍（図８Ｄ）とは対照的に、治療ラットにおける残存腫瘍が血管の正常化（図８Ｃ）を示したことである。
【０３２１】
臨床的に、現在のＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２標的化療法にＶＥＧＦｓｐ／ＤＥｓｐＲ標的化抗血管新生療法を付加すると、相加的または相乗的に、癌患者における全生存を増大させる所望のエンドポイントをもたらすことができる。いくつかのＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２療法が既にクリニックにあると仮定して、本明細書に記載されるような抗ＤＥｓｐＲ療法のトランスレーションナルな開発はこの付加を提供するために行われる。
【０３２２】
ロジスティックに、本明細書に記載される実験は、強いアフィニティ、特異性および機能性を示す前駆体ポリクローナル抗ラットＤＥｓｐＲ抗体（図７および８Ａ〜８Ｄ、Ｈｅｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００５）およびポリクローナル抗ヒトＤＥｓｐＲ抗体（図５Ａ〜５Ｃおよび６Ａ〜６Ｂ、Ｇｌｏｒｉｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．２００７）の開発の成功を実証する。
【０３２３】
ＤＥｓｐＲ標的化抗血管新生療法および標的特異的分子イメージングのために本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗体療法アプローチを選択することの重要な利点が存在する。ヒト化／全ヒトモノクローナル抗体療法（Ａｂ−Ｒｘ）は、急速に成長している種類のヒト治療法であり（Ｃａｒｔｅｒ  ２００６）、小分子剤を含む新しい化学物質が５％である（Ｉｍａｉ  ＆  Ｔａｋａｏｋａ  ２００６）のと比較して、１８〜２４％の比較的高い成功率を有する。
【０３２４】
我々は、ｈＤＥｓｐＲの細胞外アミノ末端に位置する９−アミノ酸（ａａ）−長いエピトープを用いて、本明細書では７Ｃ５Ｂ２抗体と呼ばれるヒトＤＥｓｐＲに特異的なマウスモノクローナル抗体開発および検証した（Ｇｌｏｒｉｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０３２５】
簡単に言うと、ｈＤＥｓｐＲのＮＨ２末端の９アミノ酸、すなわちＤＥｓｐＲ（１−９）を含むＫＬＨ結合抗原ペプチドを用いて、マウスを免疫化した。４回の注射の後、遊離抗原ペプチドを抗原として抗体力価をスクリーニングするために血清を採取した。最良の力価を示すマウスを融合実験のために使用した。遊離抗原ペプチドを抗原として用いてＥＬＩＳＡによって、融合したクローンの上清をスクリーニングした。全ての陽性クローンを２４ウェルプレートに移し、ＥＬＩＳＡによって再検査／確認した。１０の最良クローンをさらなる検査のために選択し、これは、候補モノクローナル抗体、抗ｈＤＥｓｐＲモノクローナル抗体を含んでいた。同定された１０の最良クローンからの上清を用いるＥＬＩＳＡによって、予想されるモノクローナル抗体の相対アフィニティを決定した。
【０３２６】
抗原性ｈＤＥｓｐＲ９−ａａペプチドの相対的なモノクローナル抗体アフィニティの分析により、クローン７Ｃ５Ｃ５および７Ｃ５Ｂ２が最強のアフィニティを有するモノクローナル抗体として同定された。これらの２つは、抗原ペプチドに対するそのより高いアフィニティに基づいた拡張およびその後の大規模産生のために選択した。
【０３２７】
特異性を確認するために、低（５Ｇ１２Ｅ８）、中（２Ｅ４Ｈ６）、および高アフィニティ（７Ｃ５Ｂ２）モノクローナル抗体を、サブクローン上清およびその後の精製抗体の検査によるウェスタンブロット分析について検査した。候補の抗ｈＤＥｓｐＲモノクローナル抗体は、ｈＤＥｓｐＲの推定１０ｋＤのタンパク質に特異的であった。ウェスタンブロット分析は、ｈＤＥｓｐＲの期待される１０ｋＤ分子量のタンパク質を検出するために、Ｃｏｓ１  ｈＤＥｓｐＲトランスフェクト細胞から単離される全細胞タンパク質を抗原として用いて実行され、一次抗体は、３つの選択されたクローンの精製抗体およびサブクローン上清を１０％ゲル濃度で含んだ。３．０７ｇのＴｒｉｓ、１４．４ｇのグリシン、２００ｍｌのメタノール、８００ｍｌのｄＨ２０のトランスファー緩衝液と共にニトロセルロース（ＰＩＥＲＣＥ）を使用した。ＨＲＰ−抗マウス多価免疫グロブリン（Ｓｉｇｍａ  ＃０４１２）１：１００，０００、ＥＣＬ試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｋｉｔ  ＃３４０９４）、染色試薬Ｋｏｄａｋ  ＲＰ−Ｘ−Ｏｍａｔ、およびｘ−フィルム（Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ｆｉｌｍ  ＃ＸＢＴ−１）を使用した。
【０３２８】
ウェスタンブロット結果は、相対アフィニティに関係なく抗ｈＤＥｓｐＲモノクローナル抗体の特異性を実証し、従って、２つ以上の成功した抗ｈＤＥｓｐＲモノクローナル抗体が同定された。検査した抗体のうち、最高の相対アフィニティおよび特異性を有するモノクローナル抗体クローンはクローン７Ｃ５Ｂ２であった。
【０３２９】
確立したインビトロアッセイを用いて候補抗ｈＤＥｓｐＲｍＡｂ−Ｒｘｔｉｃが抗血管新生であることを確認するために、上位の候補抗ｈＤＥｓｐＲモノクローナル抗体を血管新生パラメータの阻害について検査した。
【０３３０】
ヒト細胞に特異的な抗血管新生特性を査定するために、ヒト臍帯静脈細胞（ＨＵＶＥＣ）に基づく市販の検証済みの確立した血管新生アッセイを使用した。形成された血管新生管の数、「新血管」または管が分枝する能力（＃分枝点）、前記新生血管が分枝して接続し、複雑な接続形成する能力（＃分枝＝接続）、および新生血管の長さ（ｍｍにおける管長）によって表される血管新生の強さなどの多重インビトロアッセイ血管新生パラメータを監視した。それに応じて、精製７Ｃ５Ｂ２抗ＤＥＳＰＲモノクローナル抗体がＨＵＶＥＣＳ血管新生能力をインビトロで阻害するする能力を査定した。
【０３３１】
新生血管の長さおよび分枝点の数を、８０％を超えて阻害することができる抗ｈＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体の最適な有効濃度をまず査定した。抗血管新生効力のためのこの最適な阻害剤濃度は、５００ｎＭの抗ｈＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体であることが分かった。次に、一連の実験でこの濃度を用いて、血管新生のその他のインビトロパラメータを評価した。
【０３３２】
抗ｈＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体は、形成される新生血管の数、分枝点、分枝接続および管長などの、血管新生の種々のインビトロパラメータを有効に阻害する。抗ｈＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体は検証済みのポリクローナル抗体よりも優れてはいなくても同様に機能し、従って、モノクローナル療法としてのその可能性が検証される。
【０３３３】
抗ｈＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体は、腫瘍血管内皮および／またはヒト癌組織における腫瘍細胞に対する特異的結合についても検査した。抗ｈＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体は、同じスライドに腫瘍および正常組織を示すコア生検標本で構成されるヒト腫瘍組織アレイの免疫組織化学的アレイにおいて評価した。ホルマリン固定したパラフィン包埋コア生検切片検出の特異性および感受性を示す条件を検査した。ｈＤＥｓｐＲ発現およびＣＤ１３３発現を評価するために二重免疫蛍光実験を実施した。後者は、推定癌幹細胞に対するマーカーとして機能する。抗原回復を実施し、抗ｈＤＥｓｐＲモノクローナル抗体を１：１０、市販の抗ＣＤ１３３ｍＡｂを１：２０希釈で使用した。
【０３３４】
図１４Ａ〜１４Ｂに示されるように、抗ｈＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体を用いるヒト腫瘍組織アレイの代表的な免疫組織化学的分析により、ＩＩ期の肺癌腫瘍細胞におけるｈＤＥｓｐＲの発現の増大が検出された（図１４Ａ）。いくつかの腫瘍細胞は、ｈＤＥｓｐＲおよびＣＤ１３３の両方に対する二重免疫染色に陽性であり、他の腫瘍細胞はＣＤ１３３に対して免疫染色される。これらの観察は、ｈＤＥｓｐＲが、仮定上のＣＤ１３３陽性の癌幹細胞およびＣＤ１３３陰性腫瘍細胞にも存在することを実証する。対照的に、正常な肺標本はｈＤＥｓｐＲまたはＣＤ１３３に対する免疫染色を示さない（図１４Ｂ）。さらに、抗ＤＥｓｐＲ、抗ＣＤ１３３および抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体の組み合わせによる免疫蛍光法によって検出されるように、ＮＢＣ  ｍｄａ−ｍｂ−２３１細胞、膵管腺癌Ｐａｎｃ１細胞、神経膠芽腫細胞、および乳癌細胞を含む、様々なＣＤ１３３＋癌幹細胞サブセットにおいてＤＥｓｐＲ発現の増大を観察した。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、癌幹細胞または癌発症（ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ）細胞を標的にすることによって、腫瘍抵抗性および／または再発のための標的化治療において使用することができる。
【０３３５】
従って、要約すると、ＥＬＩＳＡにより９ａａの長さのエピトープへの高アフィニティ結合を示したこのマウス抗体「７Ｃ５Ｂ２」（図９）は、ウェスタンブロットにより特異性を実証し（図１０）、管形成を受けているＨＵＶＥＣ（図３Ａ〜３Ｅ）および膵臓腺癌ＰＡＮＣ−１、および乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を免疫染色する。
【０３３６】
我々は、ヒトＤＥｓｐＲに特異的なポリクローナル（Ｐａｂ）およびモノクローナル抗ＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２の両方が、ＨＵＶＥＣにおける血管新生の種々のパラメータ：新生血管の複雑さの尺度としての分枝点の平均数（図１０Ａ）、および新生血管密度の尺度としての管の全長（図１０Ｂ）を阻害する（図１０Ａ〜１０Ｃ）ことを示すことによって、インビトロでの機能的効力を実証した。阻害に対する用量反応曲線（図１０Ｃ）は、両方の血管新生パラメータを阻害するために等しい頑強さを示した。重要なのは、マウス７Ｃ５Ｂ２が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌およびＰＡＮＣ−１膵癌細胞株における腫瘍細胞侵襲性も阻害することである。
【０３３７】
従って、このマウス抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体７Ｃ５Ｂ２は、高アフィニティ、特異性、および機能性を有することが示され、本明細書に記載されるような抗ＤＥｓｐＲ複合脱免疫化全ヒト抗体の開発のための出発抗体としての機能を果たす。
【０３３８】
従って、本明細書には、現在の抗ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２抗血管新生療法に対する回避的および内因性の抵抗に対処することを目的とした新規の抗体療法として使用するための、抗ｈＤＥｓｐＲ複合脱免疫化全ヒトモノクローナル抗体（ｃｄＨＭＡｂ）の開発、特徴付け、およびインビトロ効力検査が記載される。
【０３３９】
我々は、Ａｎｔｉｔｏｐｅの複合ヒト抗体技術を選択して、抗体治療法のために抗ｈＤＥｓｐＲ脱免疫化ヒトモノクローナル抗体を生成した（Ａｎｔｉｔｏｐｅ，２０１０）。この技術は、ファージおよび遺伝子導入マウス技術から得られる非脱免疫化ヒト抗体とは対照的に最初に脱免疫化１００％ヒト抗体を生じる。簡単に言うと、複合ヒト抗体は、非関連ヒト抗体のＶ領域に由来する多数の配列セグメントを含み（「複合体」）、出発マウス前駆体抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体の抗原結合に重要なモノクローナル抗体配列を保持するように選択され、専売「ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｔｏｏｌｓ」（Ｈｏｌｇａｔｅ  ＆  Ｂａｋｅｒ  ２００９）を用いて潜在的なＴ細胞エピトープの存在について選別される。ヒト配列セグメントと出発抗体Ｖ領域の全てのセクションとの密接な適合と、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの最初からの排除は、抗原特異性に必要な配列の事前分析により最適なアフィニティおよび特異性を保持しながら、「１００％ヒト」治療抗体の発生において免疫原性を回避する（Ｈｏｌｇａｔｅ  ＆  Ｂａｋｅｒ  ２００９）。免疫原性は、１００％ヒトモノクローナル抗体の臨床用途を妨害し得る（Ｃｈｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。
【０３４０】
簡単に言うと、「複合ヒト抗体」は、７Ｃ５Ｂ２抗体などの出発マウス前駆体抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体の抗原結合に重要なモノクローナル抗体配列を保持するように選択された非関連ヒト抗体のＶ領域に由来する多数の配列セグメントを含み（「複合体」）、これは、「ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｔｏｏｌｓ」（Ｈｏｌｇａｔｅ  ＆  Ｂａｋｅｒ  ２００９）を用いて潜在的なＴ細胞エピトープの存在について選別されている。ヒト配列セグメントと出発抗体Ｖ領域の全てのセクションとの密接な適合と、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの最初からの排除とによって、この技術は、抗原特異性に必要な配列の事前分析により最適なアフィニティおよび特異性を保持しながら、「１００％ヒト」治療抗体の発生において免疫原性を回避することができる（Ｈｏｌｇａｔｅ  ＆  Ｂａｋｅｒ  ２００９）。
【０３４１】
本明細書に記載されるように、Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢを用いてマウス抗ｈＤＥｓｐＲ抗体Ｖ領域の構造モデルを作り、抗体の結合特性に必須である可能性のあるＶ領域内の重要な「制約」アミノ酸を同定するために分析した。いくつかのフレームワーク残基と一緒にＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義を用いる）内に含有される残基が重要であると考えた。SEQ ID NO:４およびSEQ ID NO:９として本明細書に記載されるような抗ｈＤＥｓｐＲのＶＨおよびＶＬ（Ｖκ）配列はいずれも典型的なフレームワーク残基を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３モチーフは、多くのマウス抗体に匹敵する。
【０３４２】
上記の分析から、抗ｈＤＥｓｐＲの複合ヒト配列は、ＣＤＲの外側では許容範囲の広い代替物により作成され得るが、ＣＤＲ配列内では狭いメニューの可能な代替残基のみで作成され得ると決定された。分析によって、いくつかのヒト抗体由来の対応する配列セグメントを組み合わせて、マウス配列中のものと類似または同一のＣＤＲを作成できることが示された。ＣＤＲの外側および隣接の領域については、本明細書に記載される組成物および方法と共に使用するための新規の抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体Ｖ領域の可能な構成要素として、広い選択範囲のヒト配列セグメントが同定された（例えば、表１を参照）。
【０３４３】
これらの分析に基づいて、新規の抗ＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体変異体を作成するために使用され得る配列セグメントの大きな予備セットを選択し、ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に結合するペプチドのコンピュータによる分析のためのｉＴｏｐｅＴＭ技術を用い（Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００８）、既知の抗体配列関連のＴ細胞エピトープのＴＣＥＤＴＭ（Ｔ細胞エピトープデータベース）を用いて（Ｂｒｙｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）分析した。ヒトＭＨＣクラスＩＩに対する著しい非ヒト生殖細胞系バインダーとして同定された配列セグメント、またはＴＣＥＤＴＭに対して著しいヒットを記録した配列セグメントを廃棄した。これにより、セグメントセットの縮小が得られ、これらの組み合わせを上記のように再度分析して、セグメント間の接合部が潜在的なＴ細胞エピトープを含有しないことを保証した。次に、選択されたセグメントを組み合わせて、合成のための重鎖および軽鎖Ｖ領域配列を生成した。本明細書において提供され、上記方法を用いて生成される例示的な重鎖Ｖ領域配列には、SEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７が含まれる。本明細書において提供され、上記方法を用いて生成される例示的な重鎖Ｖ領域配列には、SEQ ID NO:１８〜SEQ ID NO:１９が含まれる。
【０３４４】
本明細書に記載される抗体のインビトロ効力は、いくつかの実施形態ではＰＡＮＣ−１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１などの同時培養癌細胞と共に設定され、いくつかの実施形態では酸素正常状態および低酸素（２％Ｏ２）状態で設定される血管新生アッセイにおいて、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈細胞）およびＨＭＥＣ（成体ヒト微小血管内皮細胞）の血管新生の用量反応阻害を調べることによって評価される（図３Ａ〜３Ｅ、１０Ａ〜１０Ｃを参照）。ＨＵＶＥＣおよびＨＭＥＣはいずれも、以下の理由で使用される：ＨＵＶＥＣ当該分野で標準的であるが、これらの細胞は臍帯静脈に由来するので、成体微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）も使用される。さらに、血管新生は、回避的および内因性の抵抗に寄与する、癌細胞が産生する血管新生因子をより良くシミュレートするために、血管新生アッセイに通常添加されるウシ胎児血清に加えて、同時培養癌細胞を用いて評価される。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、低酸素は血管新生のトリガーの１つであり、現在の抗ＶＥＧＦ治療法に対する根本的な回避的抵抗の疑いがある要因の１つであるので、インビトロ効力アッセイは、酸素正常状態および２％Ｏ２低酸素中で実行される。複合脱免疫化モノクローナル抗体媒介性のインビトロの腫瘍細胞侵襲性の阻害は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＰＡＮＣ−１細胞を用いて、確立した定量的アッセイを用いることによって分析される。またこれらは、低酸素に関連することが知られているより攻撃的な腫瘍細胞表現型を治療するために、酸素正常状態および２％Ｏ２−低酸素状態で実行される。
【０３４６】
抗ｈＤＥｓｐＲ阻害の効果は、非処置対照、アイソタイプ対照、マウス前駆体抗ｈＤＥｓｐＲモノクローナル抗体対照、およびベバシズマブ対照を含み得る対照と比較される。血管新生および腫瘍細胞侵襲性アッセイの各点は、少なくとも５回の繰り返しで行われる。さらに、上位２つの候補リードについては、用量反応曲線阻害反応も実施され、ここで各投与量は、少なくとも５回の繰り返しを用いて検討される。
【０３４７】
アッセイは、有意の変化を査定するために一元配置ＡＮＯＶＡおよび多重ペアワイズ比較によって分析することができる。各候補リード（例えば、５〜１０）による対照からの阻害％の平均レベルを用いて、例えば、酸素正常状態および低酸素状態の両方において、そしてそれぞれ、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＰＡＮＣ−１癌細胞株の両方において、種々のアッセイに従ってこれらをランク付けし、最高のランクの２つが血管新生および腫瘍細胞侵襲性の最良の阻害剤に相当する上位２つのリードを同定する。
【０３４８】
腫瘍アッセイ分析を行い、異なる癌組織型からのヒト生検コアサンプルの組織アレイにおいて腫瘍細胞および腫瘍新血管を検出するために、それぞれの特異性および感受性を実証する。これは、脳、膵臓、肺、乳房、卵巣、前立腺、膀胱、結腸、胃からの固形腫瘍を表す組織アレイパネルにおいて実施される。結果は、マウス前駆体抗ｈＤＥｓｐＲ  Ｍａｂ−Ｈ１の検証において使用されるのと同じ免疫化学条件を仮定して、特異性について分析される。図示されるように、正常ヒト膵臓ではＤＥｓｐＲ発現は最小限であるが、ＩＶ期の膵癌は、膵臓腫瘍細胞および腫瘍血管においてＤＥｓｐＲ発現の増大を示す。複合脱免疫化モノクローナル抗体候補リードはランク付けされ、腫瘍組織アレイ免疫組織化学においてシグナル対ノイズ比が最適であり、腫瘍細胞および腫瘍新血管の最良の検出を有した上位２つの候補が決定される。これは、マウス前駆体抗ｈＤＥｓｐＲ  Ｍａｂを用いて得られる腫瘍アレイ免疫染色観察と比較することができる。
【０３４９】
Ｔ細胞エピトープのコンピュータによるスクリーニングを用いて本明細書に記載されるの抗体を脱免疫化して免疫原性を最小化および低減することに加えて、最小免疫原性の複合全ヒトＭａｂを選択するために、複合ヒト化抗ｈＤＥｓｐＲ複合体脱免疫化モノクローナル抗体を、免疫原性についてインビトロで検査した。免疫原性のスクリーニングは、臨床観察と相関することが証明されている、５０のドナーの代表を用いて実施することができる（Ｂａｋｅｒ  ＆  Ｊｏｎｅｓ  ２００７）。
【０３５０】
免疫原性検定は、特異性および効力の他のインビトロアッセイと共に、最良アフィニティ（ＥＬＩＳＡ）、特異性（ウェスタンブロット分析）、インビトロ効力（血管新生および腫瘍細胞侵襲性の阻害）および最低免疫原性を含む因子の組み合わせに基づいて最上位の抗ｈＤＥｓｐＲリードの選択を可能にする。インフリキシマブ、アレムツズマブについての臨床研究において議論されているように（ｒｅｖｉｅｗ  ｂｙ  Ｂａｋｅｒ  ＆  Ｊｏｎｅｓ  ２００７）標的特異性および全ヒト化であるにもかかわらず、高免疫原性がａｂ治療効力を限定するので（Ｉｗａｉ  ＆  Ｔａｋａｏｋａ  ２００６）、複合抗体ヒト化プロセスにおいてＴ細胞エピトープを排除することによる低免疫原性の事前確認、およびエキソビボＴ細胞アッセイ技術を用いることによる低免疫原性の確認は、、重要なトランスレーショナルリサーチステップである。
【０３５１】
上位の複合脱免疫化モノクローナル抗体リードは、免疫無防備状態マウスの確立したヒト癌細胞株異種移植および転移モデルにおいて、腫瘍成長、血管新生および転移の抗ＤＥｓｐＲ媒介性の阻害を検査することによってインビボ効力について検査される。公開された報告において観察されるように回避的抵抗（乳癌）および内因性抵抗（膵癌）を代表する癌組織型も検査した。例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌およびＰＡＮＣ−１膵癌細胞株が使用される。というのは、これはいずれも、異種移植および転移脾臓注入モデルを作成するために使用することができるからである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のためには、同所性および転移モデルのヌードマウスが使用される（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ｒｏｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。ＰＡＮＣ−１異種移植皮下モデルのヌードマウスが記載されるように使用され（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００８）、ＰＡＮＣ−１転移モデルのためには、ＮＯＧマウスが記載されるように使用される（Ｓｕｅｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。
【０３５２】
抗ヒトＤＥｓｐＲ特異的（例えば、複合脱免疫化モノクローナル抗体の主要なリード）および抗ヒトＶＥＧＦ特異的（ベバシズマブ）抗体、ならびにマウスＤＥｓｐＲ特異的Ｍａｂの戦略的使用によって、１）抗ＶＥＧＦ療法だけと比較した抗ＤＥｓｐＲ療法の効力を査定することができる、そして２）抗ＤＥｓｐＲおよび抗ＶＥＧＦ抗体の組み合わせを用いて相乗的な効力を決定することができる。
【０３５３】
臨床的な癌療法のシナリオをシミュレートするために、腫瘍の大きさが２００〜３００ｍｍである場合に異種移植モデルにおける治療を始める。転移モデルにおける抗ＤＥｓｐＲ療法の効力を査定するために、癌細胞の脾臓内注入の５日後に開始される持続的な治療計画を、記載されるように査定した（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。スニチニブで観察される転移のリスクの増大（Ｅｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２００９）を、抗ＤＥｓｐＲ療法が誘発するかどうかを評価するために、Ｅｂｏｓの実験が実施され、それによって、癌細胞注入の７日前から始まり７用量について毎日、抗マウスＤＥｓｐＲ  Ｍａｂが注入される。ベバシズマブについては記載されるように２×／週（Ｒｏｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．２００９）、および抗ＤＥｓｐＲについては３×／週（Ｈｅｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００５）、ＩＰで与えられる各抗体治療のために２５０μｇが使用される。
【０３５４】
治療結果は多角的なパラメータによって評価され、例えば、高解像度Ｖｅｖｏ７７０超音波イメージングおよびパワードップラー分析による、同所性乳房腫瘍および皮下膵臓腫瘍の腫瘍容積および腫瘍血管新生の連続イメージングによって評価される。全生存が決定され、このエンドポイントにおいて、悪性腫瘍表現型：核グレード、間質の腫瘍細胞侵襲、腫瘍細胞血管擬態、腫瘍新血管の完全性の損失、およびマクロファージ浸潤の組織学的分析と共に、腫瘍サイズおよび血管新生の反復超音波イメージングおよび組織学的分析が行われる。
【０３５５】
ヘテロ接合型ＤＥｓｐＲ＋／−マウスは１年を超えて生存して繁殖する。これは、Ｅ１１．５で胚性致死であるＶＥＧＦ＋／−ハプロ不全とは対照的である。しかしながら、抗ＶＥＧＦ（ベバシズマブ）および抗ＶＥＧＦＲ２（スニチニブ、ソラファニブ）療法を受けている患者において有害作用が観察されているので、本明細書に記載される抗ヒトＤＥｓｐＲ特異的抗体は、これらの作用についても検査される。潜在的な有害作用のパラメータの分析は、ｃｄＨＭＡｂ−Ｈ１およびｍＤＥｓｐＲ−Ｍａｂで治療されたＰＡＮＣ−１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルにおいて行われる。例えば、ａ）潜在的な心毒性は、連続的な非侵襲性超音波心機能分析によって監視することができ、ｂ）潜在的な高血圧症は、テールカフ（ｔａｉｌ  ｃｕｆｆ）ＢＰによって監視することができ、ｃ）潜在的な腸穿孔は、エンドポイントで死後解剖検査において監視することができ、ｄ）潜在的な出血性血栓症は、検査および血管超音波およびＤｏｐｐｌｅｒ  ｆｌｏｗ分析によって監視することができ、そしてｅ）肝機能検査、腎機能検査、総血球数、血液化学などの毒性スクリーンは、研究のエンドポイントで実施することができる。これらのパラメータは、模擬処理され、年令が適合された腫瘍モデル対照の場合と比較される。
【０３５６】
ＶＥＧＦＲ２標的化腫瘍新血管と比較して、ＤＥｓｐＲ標的化新血管の造影超音波イメージングによる治療に応答する腫瘍血管新生および腫瘍細胞血管擬態変化の分子イメージングの分析
腫瘍における血管新生の分子イメージングは、抗ＶＥＧＦＲ２抗体に向けられた微小気泡を用いる造影超音波イメージングによって実証されており、実行されるイメージングおよび造影分析は、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｖｅｖｏ７７０高解像度超音波システムを用いる（Ｗｉｌｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。我々はこの同じシステムを用いて、頸動脈疾患進行および脳卒中リスクに関連する遺伝子導入ラットのアテローム硬化性モデルの頸動脈疾患の栄養血管の血管新生において、抗ＤＥｓｐＲ抗体に向けられた微小気泡を検出した（Ｄｅｃａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。図１６Ａ〜１６Ｄに示されるように、ＤＥｓｐＲ標的化分子イメージング（１６Ａ）はＤＥｓｐＲ＋内皮病変（１６Ｂ）および栄養血管の血管新生（１６Ｃ）を検出する。コントラスト強度の定量化は、統合ソフトウェアを用いて行われる（１６Ｄ）。
【０３５７】
ＤＥｓｐＲ標的化分子イメージングは、異種移植腫瘍細胞血管擬態に適用可能な分子イメージングのための標的モジュールとして、複合脱免疫化モノクローナル抗体を検査するために使用され、微小気泡は血管内腔に拘束される。本明細書に記載されるような複合脱免疫化モノクローナル抗体を用いるマウスＤＥｓｐＲ特異的分子イメージングは、マウス由来の腫瘍血管新生を監視するために実施され、ＶＥＧＦＲ２特異的分子イメージングと比較される。本明細書に記載される観察は、ＤＥｓｐＲに特異的な複合脱免疫化モノクローナル抗体がマウスモデルにおける腫瘍細胞血管擬態の分子イメージングのための標的モジュールとしての機能を果たすことができ、ＤＥｓｐＲ発現の分子イメージングが腫瘍血管新生を評価するために翻訳可能な診断的インビボイメージング様式を提供し、そしてＤＥｓｐＲ特異的分子イメージングの比較分析が腫瘍細胞血管擬態および腫瘍血管新生の異なる寄与への新しい洞察を提供するという証拠を提供する。
【０３５８】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植同所性腫瘍モデルおよびＰＡＮＣ−１異種移植異所性腫瘍モデルの両方、ならびにＰＡＮＣ−１脾臓内注入肝臓転移モデルは分子イメージング実験のために使用される。アイソタイプ抗体分子イメージングは、ＤＥｓｐＲ陽性分子イメージングの特異性を決定するための対照として使用される。比較分析を検証するために、抗ＤＥｓｐＲおよび抗ＶＥＧＦＲ２分子イメージングに対する同じ条件に従う。例えば、複合脱免疫化モノクローナル抗体を使用して腫瘍細胞血管擬態を標的とすることができ；抗ＤＥｓｐＲ複合脱免疫化モノクローナル抗体を使用して、ヒト異種移植腫瘍においてマウス新生血管形成モノクローナル抗体を標的とすることができ；抗ＶＥＧＦＲ２を比較基準として使用することができ、そしてアイソタイプ抗体を負の対照として使用することができる。
【０３５９】
参考文献
2013538191.tif 000019
2013538191.tif 000020
2013538191.tif 000021
【０３６０】
実施例２
遺伝子導入されたアテローム性動脈硬化症ラットモデルにおけるＤＥｓｐＲ標的化造影超音波マイクロイメージングによる栄養血管の新血管発生の分子イメージング
頸動脈栄養血管の新血管発生が脳卒中および心臓事象のリスクの増大に関連することを考慮して、標的特異的造影超音波（ＣＥＵ）マイクロイメージングによる頸動脈栄養血管の新血管発生の分子イメージングを調べるために、本明細書に記載されるインビボ研究を設計した。従って、ＤＥｓｐＲ（デュアルエンドセリン１／ＶＥＧＦｓｐ受容体）標的化微小気泡（ＭＢＤ）およびＶｅｖｏ７７０マイクロイメージングシステムおよびＣＥＵ−イメージングソフトウェアを用いて、頸動脈疾患（ＣＡＤ）を有するオスの遺伝子導入ラットおよび非遺伝子導入対照において分子イメージングを実施した。
【０３６１】
ＤＥｓｐＲ標的化ＣＥＵ陽性イメージングは、５／５匹の非遺伝子導入対照ラットの対照のアイソタイプ標的化微小気泡（ＭＢＣ）−ＣＥＵイメージング（ｎ＝８）およびＭＢＤＣＥＵイメージングにおけるＣＩＳレベルおよび差が著しくより低いことと対照的に、７／１３匹の遺伝子導入ラットでは、著しくより高いコントラスト強度シグナル（ＣＩＳ）レベルおよび破壊前／後のＣＩＳ差を示すことが分かった（Ｐ＜０．０００１）。エキソビボ免疫蛍光分析により、ＭＢＤのＤＥｓｐＲ陽性内皮細胞への結合、ならびにＤＥｓｐＲに標的化されたコントラスト強度シグナルの増大と栄養血管の新生血管および内膜病変におけるＤＥｓｐＲ発現との関連が実証された。インビトロ分析により、ＭＢＣまたは非標識化微小気泡と対照的に、結合細胞％およびＭＢＤ数／細胞が増大した、ＭＢＤのＤＥｓｐＲ陽性ヒト内皮細胞への用量依存性結合が実証された（Ｐ＜０．０００１）。
【０３６２】
二重エンドセリン−１（ＥＴ１）／血管内皮成長因子シグナルペプチド（ＶＥＧＦｓｐ）受容体またはＤＥｓｐＲ（ＧｅｎＢａｎｋに寄託されるように、以前はｄｅａｒ遺伝子）［１］は、胚性および胚体外血管新生の欠如、背側大動脈の脈管形成の中断、および異常な心臓発達に起因してｄｅｓｐｒ−／−ノックアウトマウスにより示される胚性致死表現型から推定される、血管新生の発達における重要な役割を果たす［２］。ＶＥＧＦ＋／−ハプロ不全マウスでは同様の異常な脈管形成および血管新生表現型が示されるが、ｄｅｓｐｒ−／−欠損マウスは明確な神経管表現型を示す［２−４］。血管新生の発達におけるその役割と一致して、ＤＥｓｐＲの阻害は、成体ラット乳房腫瘍およびマウスメラノーマにおける腫瘍血管新生および腫瘍成長の低減をもたらす［２］。
【０３６３】
本明細書で血管疾患の新血管発生の「分子イメージング」と呼ばれる標的特異的な造影超音波検査（ＣＥＵ）イメージングの開発は、頸動脈栄養血管の新血管発生が脳卒中のリスクの増大と関連するので重要である［５，６］。しかしながら、栄養血管の新血管の成功した分子イメージングは報告されていないが、非標的化ＣＥＵイメージングによる検出は報告されている［７］。一方、種々の標的を検出する種々の疾患モデルにおける成功した分子イメージング［８，９］は、腫瘍および後肢虚血の血管新生におけるαｖβ３［１０，１１］、腫瘍血管新生におけるＶＥＧＦＲ２［１２］、移植拒絶反応におけるＩＣＡＭ−１［１３］、悪性リンパ節におけるＬ−セレクチン［１４］、およびアテローム性動脈硬化症におけるＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１［１５］、心筋虚血におけるｐ−セレクチン［１６，１７］、血栓症におけるＧＩＩｂ／ＩＩＩａおよびフィブリノーゲン［１８，１９］などの、種々の疾患状況における分子イメージングの可能性を示している。ＶＥＧＦＲ２−、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１を標的とする研究における血管疾患の新血管発生の分子イメージングは、損傷で誘発された血管の新血管発生の高脂血症ウサギモデルにおいて栄養血管の新血管を検出しなかった［９，２０］。
【０３６４】
本明細書では、遺伝子導入の高脂血症、高血圧症の頸動脈疾患ラットモデルにおいて、頸動脈病変および拡張した栄養血管の新血管におけるＤＥｓｐＲの分子イメージングが実証されている。
【０３６５】
材料および方法
動物
血管病変または拡張した栄養血管の新血管における病的血管新生の分子イメージング研究を容易にするために、高血圧症−アテローム性動脈硬化症を危険因子として有する頸動脈疾患ラットモデル、Ｔｇ２５［ｈＣＥＴＰ］Ｄａｈｌ−Ｓラットモデル、加速された脳卒中［２１］または遅発型冠動脈心疾患を発症するためのヒトコレステリルエステル転送タンパク質の遺伝子導入Ｔｇ２５を選択した［２２］。脳卒中［２１］または冠動脈アテローム性動脈硬化症表現型［２２］の疾患経過に沿って早期中間点付近にあるように計画された４月齢の遺伝子導入オスラット（ｎ＝１３）は、ＤＥｓｐＲ標的化分子イメージングのために研究した（ｎ＝１３）。ＭＢＤ注入された非遺伝子導入の非アテローム硬化性の同腹子を負の生物対照として研究した（ｎ＝５）。以下のサブグループ：ＭＢＤ特異的ＣＥＵ陽性イメージングを示した４匹の遺伝子導入ラット、および４匹の新規遺伝子導入ラットを有する、アイソタイプ特異的ＭＢＣ注入された遺伝子導入ラット（ｎ＝８）を、負のイメージング対照をとして同時に研究した。
【０３６６】
標的特異ＣＥＵ分子イメージング
コントラストモードソフトウェアを有するＶｅｖｏ７７０高解像度超音波システムと、マウスの腫瘍血管新生におけるＶＥＧＦＲ２の分子イメージングに対して検証済みのストレプトアビジン被覆「標的準備された（ｔａｒｇｅｔ  ｒｅａｄｙ）」ＭｉｃｒｏＭａｒｋｅｒ微小気泡（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ，Ｃａｎａｄａ）とを使用した［１２］。微小気泡をラットＤＥｓｐＲ陽性内皮細胞に向けるために、標的準備されたＭｉｃｒｏＭａｒｋｅｒ微小気泡をストレプトアビジン−ビオチン結合によりビオチン化抗ＤＥｓｐＲ抗体（ＭＢＤ）に連結させた。対照として、標的準備されたＭｉｃｒｏＭａｒｋｅｒ微小気泡をビオチン化アイソタイプ抗体（ＭＢＣ）に連結させた。各ボーラスを、２００マイクロリットルの生理食塩水中３〜４×１０８の微小気泡で構成し、ラット尾静脈に８秒間にわたって注入した。
【０３６７】
ラット頸動脈のＣＥＵイメージングは、ＭＢ−標的結合の最適化、交絡因子の除去、および再現可能なＣＥＵイメージングの確認を目的とした一連のステップを含んだ。まず頸動脈のベースライン画像を得て、スキャンヘッドを固定化して、総頸動脈、外頸動脈、および内頸動脈の最適なＢモード表示を１つの２Ｄ画像に保持した。ＭＢボーラス注入の１分後に、Ｂモードイメージングによって全てのラットに対してＭＢ血液プールを記録して、ＭＢ注入を確認し、周囲組織にコントラスト強度がないことを実証した。４〜５分間待機して、ＤＥｓｐＲ陽性内皮標的へのＭＢＤの接着を可能にし［１２］、非結合循環微小気泡の排除を可能にした［２３］。ほとんどの循環ＭＢの排除によって、Ｖｅｖｏ７７０イメージングシステムを用いる検出に対して検証された接着ＭＢによるコントラスト強度シグナルの増大の検出が容易になる［２３］。接着ＭＢは、予め設定されたＣｏｎｔｒａｓｔ  Ｅｎｈａｎｃｅｄソフトウェア（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ，Ｃａｎａｄａ）を用いて記載されるように実施される音響破壊の際のコントラスト強度の損失によって定義される［１２］。
【０３６８】
頸動脈における４つの対象領域（ＲＯＩ）を監視した：総頸動脈、分岐点、外頸動脈および内頸動脈。音響破壊の前および後のコントラスト強度シグナルを検出するＶｅｖｏ７７０イメージングプラットフォーム（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ，Ｃａｎａｄａ）に対して検証された造影分析プログラムを用いて、接着標的化微小気泡の後方散乱から得られるコントラスト強度シグナル（ＣＩＳ）の定量化を行った。対側頸動脈を直ちに検査し、同じＣＥＵイメージングプロトコールに従った。あらゆる残存ＭＢの完全な排除を可能にするために２０分置いた後で、同一手順に従うアイソタイプ特異的ＭＢＣによる次のＣＥＵイメージングのために、予め設定した破壊シーケンスを実施した。定量的な比較分析のために、音響破壊前と破壊後のコントラスト強度シグナル間の差、ＣＩＳ差、ならびにこれらのそれぞれの破壊前ＣＩＳピークレベルをラットごとにそれぞれの各頸動脈に対して研究した。
【０３６９】
ラット頸動脈の組織学および免疫蛍光染色
ＣＥＵイメージングの後、頸動脈分岐点を含む、総頸動脈（ＣＣＡ）、外頸動脈（ＥＣＡ）および内頸動脈（ＩＣＡ）頸動脈の周囲組織を保存して、頸動脈をひとまとめに採取した。ＥＣＡをＩＣＡよりも長く切断し、両者を区別できるようにした。頸動脈ごとに長手方向の一連の切片を得て（５０〜１００切片）、１０番目ごとにスライドをマッソントリクロームで染色することにより、ＣＥＵイメージングにおけるＲＯＩに対応する、適切な方向付けおよび部位特異的な分析を可能にした。次に関心対象のＭＴ染色スライドに隣接する連続切片を免疫染色した。二重免疫蛍光染色は、連続的な抗原回復、バックグラウンドの低下のための処理、ブロッキング、４℃で一晩の一次抗体によるインキュベーション、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５６８ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧによる４℃で一晩の二次抗体インキュベーション、洗浄、およびＤＡＰＩを有するＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いるモニタリグによって、脱パラフィン化された切片において行った。負の対照は、抗ラットＤＥｓｐＲ抗体に対するウサギアイソタイプ抗体を用いて行った。蛍光イメージングおよび微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡撮影のためにＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ２ｐｌｕｓ顕微鏡を使用して、免疫染色切片に対する形態学的情報オーバーレイを提供した。頸動脈に沿った適切な方向付けおよび部位特異的な同定のために低倍率２．５×を使用した。
【０３７０】
ＭＢＤおよびＤＥｓｐＲ陽性内皮細胞の相互作用のインビトロ分析
ヒト特異的ＤＥｓｐＲ標的化ＭＢＤは、抗ヒトＤＥｓｐＲモノクローナル抗体の使用を除いてラット特異的ＤＥｓｐＲ分子イメージングの場合と同一の手順に従って作成した。固定数のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＩＢＩＤＩパーフュージョン６レーンμスライドＶＩ（ｉｂｉｄｉＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に播種した。２４時間後、ＭＢＤ型の微小気泡を以下のＭＢ−細胞比で注入した：８×、８０×、および８００×。負の対照は８００×ＭＢＣおよび８００×非標的化微小気泡ＭＢＯで構成した。これら全て、同じ６レーンマイクロフローチャンバスライドにおいて２０ダイン／ｃｍ２せん断応力で一方向に流して注入した。４５分間のインキュベーションの後、ＤＡＰＩ核染色を実施して、過剰のＭＢを同じせん断応力でＨＵＶＥＣ培地により洗浄した。位相コントラストおよび落射蛍光顕微鏡法を、６つのランダムな高倍率視野において実施した。細胞および微小気泡を顕微鏡撮影によって記録し、結合ＭＢを有する細胞の割合、および細胞当たりのＭＢの数についてカウントした。ＭＢＤ、ＭＢＣおよび非標的化微小気泡ＭＢＯを比較した。
【０３７１】
統計分析
値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表される。データは、Ｐｒｉｓｍ  ５統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ，ＣＡ）を用いて分析した。適用可能な場合には、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎ多重比較検定またはＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ多重ペアワイズ比較検定を使用した。２つの群の比較のためには、Ｐｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ，ＣＡ）を用いて、ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ  Ｗａｌｌｉｓ検定を実施した。
【０３７２】
結果
頸動脈のＤＥｓｐＲ標的化分子イメージング
頸動脈疾患における血管疾患関連の血管新生を検出することが必要とされると仮定して［５，６］、頸動脈疾患の病変または栄養血管の新血管発生における病的血管新生の造影超音波（ＣＥＵ）イメージングのための内皮標的として機能することができるかどうかを決定するために、ＤＥｓｐＲを検査した。頸動脈疾患のＴｇ２５ラットモデルを使用し、アテローム硬化性疾患経過の中間点にあるように計画された４月齢のオスＴｇ２５ラットと、年令を適合させた非遺伝子導入のオス同腹子と比較した［２１，２２］。冠動脈疾患と比較して、頸動脈疾患の調査は、動きアーチファクト（ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ａｒｔｉｆａｃｔ）が少ない戦術的な実験システムを提供する。
【０３７３】
Ｖｅｖｏ７７０超音波造影イメージングシステムと、対照アイソタイプ微小気泡（ＭＢＣ）と比較したＤＥｓｐＲ標的化微小気泡（ＭＢＤ）とを用いて、７／１３匹の遺伝子導入ラットの総頸動脈（ＣＣＡ）、頸動脈分岐点、近位の内頸動脈および／または外頸動脈に沿った種々の対象領域（ＲＯＩ）において、ＭＢＤ特異的ＣＥＵ陽性イメージング検出した。ＭＢＤ特異的ＣＥＵ陽性イメージングは、循環微小気泡が排除された後にコントラスト強度シグナルの安定的な増大が検出され、音響破壊の際に減少すると定義した（図１９Ａ）。破壊前ピークコントラスト強度シグナルおよび破壊前／後のコントラスト強度シグナルの差（ＣＩＳ差）は、ＭＢＤ特異的ＣＥＵ陽性画像では、アイソタイプＭＢＣ注入ラット（図１９Ｂ）およびＭＢＤ注入非遺伝子導入対照ラット（ｎ＝５）において観察されるＣＥＵイメージングと比較して、著しく高かった（図１９Ａ、表２）。後者の２つは経験的にＣＥＵ陰性イメージングを定義する。特に、ＭＢＤ特異的ＣＥＵ陽性イメージングを示す７匹の遺伝子導入ラットのうち４匹は両方の頸動脈においてＣＥＵ陽性イメージングを示したが、３匹は、対側頸動脈においてＣＥＵ陰性イメージングを示し、ＭＢＤ特異的ＣＥＵ陽性イメージングの選択性が示唆され、特異性と一致した（表２）。さらに、６匹の遺伝子導入ラットは、ＭＢＣ対照ラット（図１９Ｂ）およびＭＢＤ注入非遺伝子導入対照（図１９Ｃ）で観察されるＣＥＵ陰性イメージングに類似した、低いピークコントラスト強度シグナル、「平らな」破壊前／後のＣＩＳプロットパターン、および最小限のＣＩＳ差を有するＣＥＵ陰性イメージングを示した（図１９Ｄ、１９Ｅ、表２）。
【０３７４】
要するに、これらの観察は、ＭＢＤベースのＣＥＵ陽性画像が特異的であり、前記頸動脈中の接着ＭＢＤによるものであるという有力な証拠を提供する。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびｐｏｓｔ−ｈｏｃ多重比較検定による統計分析は、ＭＢＤ特異的ＣＥＵ陽性イメージングのＣＩＳ差が、各ＣＥＵ陰性イメージング研究群とそれぞれ比較して著しく高い、Ｐ＜０．０００１ことを立証する（表２、図１９Ｄ）。興味深いことに、ＣＥＵ陽性イメージングは遺伝子導入ラットだけで検出され、オスの典型的なモデル疾患経過の早期中間点と同等の４月齢において遺伝子導入ラットの５４％がＭＢＤ特異的ＣＥＵ陽性イメージングを示すので［２１、２２］、平均ＣＩＳ差は遺伝子導入ラットとその非遺伝子導入対照との間で著しく異なる（Ｐ＜０．０００１）（図１９Ｅ）。ＭＢＤ注入時に７／１３匹の遺伝子導入ラットがＣＥＵ陽性イメージングを示し、６／１３匹がＣＥＵ陰性イメージングを示すことから、疾患経過の４か月中間点におけるＭＢＤＣＥＵイメージングのＣＩＳ差に基づいた遺伝子導入ラットのサブグルーピングは明白である（図１９Ｅ）。
【０３７５】
興味深いことに、最高ＭＢＤ特異的ＣＩＳ差を有する３匹の遺伝子導入ラットのＣＩＳプロットは、予想される音響破壊後のシグナル強度の降下を示したが、コントラスト強度シグナルの二次ピークを有した後、続いて低／ベースラインレベルまで低下した（図２０Ａ〜２０Ｈ）。この音響／破裂破壊後のパターンは、特定の一連の微小気泡事象（降下を説明する微小気泡の断片化、二次ピークを説明する残留微小気泡の音響刺激の後、次のベースラインレベルへの着実な低下を説明する音響的に駆動される拡散）と一致する。
【０３７６】
組織学的分析は、ＤＥｓｐＲ陽性内皮細胞におけるＭＢＤ微小気泡を検出する
予想外に、マッソントリクローム染色による組織学的分析は、図示されるＣＥＵ陽性イメージングによりＲ１：ＭＢＤラットから得られる内皮細胞にまだ付着しているかあるいは内膜病変にある少数の微小気泡を検出した（図２１Ａ）。隣接する一連の断片における対応するＤＥｓｐＲ免疫染色は、ＤＥｓｐＲ陽性内皮細胞に対するＭＢＤ微小気泡の接着性を確認した（図２１Ｂ、２１Ｃ）。アイソタイプ抗体による免疫染色は、ＤＥｓｐＲ陽性免疫染色の特異性を確認する（図２１Ｄ）。要するに、これらの観察は、ＤＥｓｐＲ陽性内皮に対するＭＢＤ結合およびＭＢＤ結合の特異性を確証する。ＰＢＳ緩衝４％パラホルムアルデヒド固定化、パラフィン包埋および脱パラフィン化を経たＰＥＧ被覆Ｔａｒｇｅｔ−ｒｅａｄｙ  ＭｉｃｒｏＭａｒｋｅｒ微小気泡（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｎａｄａ）の生存は、ＰＥＧベースの生体材料が、固定化、パラフィン包埋、脱パラフィン化およびマッソントリクローム染色を生き残るという我々の観察と同様である［２４］。
【０３７７】
図２０Ａ〜２０Ｈに示されるＲ３：ＭＢＤラットの組織学的分析は、栄養血管の新生血管におけるＤＥｓｐＲ陽性発現（図２１Ｇ）と共に、内皮ＤＥｓｐＲ陽性発現および内腔内皮症状の増大、ならびに新血管発生による著しい頸動脈栄養血管の拡張（図２１Ｅ、２１Ｆ）も検出した。ＤＥｓｐＲおよびα−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）による二重免疫蛍光免疫染色は、頸動脈栄養血管においてＤＥｓｐＲ＋αＳＭＡ陽性免疫染色のいくらかの共存を検出した（図２１Ｈ）。
【０３７８】
ＤＥＳＰＲ発現の増大は、ＤＥｓｐＲ陽性分子イメージングと関連付けられる
ＤＥｓｐＲ発現の増大レベルおよび／または領域が、ＣＩＳ差（図１９Ｄ）およびより高い破壊前のＣＩＳピークレベル（図２２Ａ）によって定義されるＭＢＤ特異的ＣＥＵ陽性イメージングに関連付けられるかどうかを決定するために、抗ＤＥｓｐＲおよび抗α−平滑筋アルファアクチン（αＳＭＡ）抗体により二重免疫蛍光染色を実施した。後者は、培地における血管平滑筋細胞の免疫染色のための正の対照として機能する。ＭＢＤ特異的両側ＣＥＵ陽性イメージング、ＭＢＤ注入された両側ＣＥＵ陰性イメージング、および片側ＣＥＵ陽性／ＣＥＵ陰性イメージングにより、代表のラットからの一連の切片を分析した（ｎ＝３／群）。免疫蛍光法および微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡の分析は、ＭＢＤ特異的ＣＥＵ陽性イメージングが、頸動脈内膜病変におけるＤＥｓｐＲ＋発現、栄養血管の新血管発生、および栄養血管の新血管におけるＤＥｓｐＲ＋発現（図２１Ｂ、２１Ｃ、２２Ｂ、２２Ｃ、表２）と関連付けられることを示した。対照的に、ＭＢＤ−ＣＥＵ陰性分子イメージングを示すラット頸動脈は、あったとしても最小限のＤＥｓｐＲ＋内皮発現と関連付けられた（図２２Ｄ、表２）。拡張した栄養血管と比較して、頸動脈中膜の平滑筋細胞（ＳＭＣ）における低レベルのαＳＭＡ発現も注目された（図２２Ａ）。これは、理論によって束縛または限定されることを望まないが、αＳＭＡ発現が合成または増殖性ＳＭＣにおいて誘発されない（ｄｅｉｎｄｕｃｅｄ）ので、これらの高血圧ラットにおけるＳＭＣの合成状態に起因する可能性が最も高い［２５］。これらの観察は、このラットモデルにおけるＭＢＤ特異的ＣＥＵ陽性イメージングを、内膜病変および栄養血管の新生血管密度の両方において、ＤＥｓｐＲ発現強度および領域の増大に結び付ける。
【０３７９】
ＤＥｓｐＲ陽性内皮細胞に対する用量反応のＭＢＤ接着性のインビトロ分析
ＭＢＤのＤＥｓｐＲ陽性細胞との相互作用をさらに精査するために、インビトロのＭＢＤ接着性の用量反応を検査した。内皮細胞の標準化初代培養を利用するため、そしてヒトにおける分子イメージングへのトランスレーショナルな洞察を獲得するために、ヒト特異的抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体によって検出されるように、増殖および血管新生促進培養条件においてＤＥｓｐＲを発現するヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用した。８×、８０×、および８００×のＭＢＤ対細胞比で増大する数のＭＢＤを用いて、８００×ＭＢＣ（図２３Ｄ）および非標的化ＭＢＯ（図２３Ｅ）がそれぞれ６．８％および８．２％のＨＵＶＥＣと結合したのとは対照的に、ＭＢＤが８０×のＭＢＤ：細胞比で１００％結合されている（図２３Ａ〜２３Ｃ）ことによってＨＵＶＥＣは増加的に結合されることが観察された（図２３Ｆ）。さらに、４５分間のインキュベーションおよび２０ｄｙｎｅ／ｃｍ２よりも大きい大動脈様せん断応力を有する流速での洗浄の後、細胞当たり結合したＭＢの数の分析によって、８×、８０×から８００×へ増大させせたときに、細胞当たり結合したＭＢの数の有意な差が以下のように明らかにされた：２．３、１７および４９ＭＢ／細胞（非標的化ＭＢおよびアイソタイプＭＢＣについてはわずか０．６および１．１ＭＢ／細胞である）（ＡＮＯＶＡ  Ｐ＜０．０００１）。これらの観察は、ＭＢ−細胞相互作用の相対的安定性および特異性を反映する。重要なことに、ＭＢと細胞の接触の際、高用量８００×ＭＢＤでも細胞毒性は観察されなかった。
【０３８０】
腫瘍血管新生のＶＥＧＦＲ２標的化分子イメージングは報告されているが［１２］、栄養血管の新血管発生のこれまでのＶＥＧＦＲ２標的化分子イメージングは、他の血管接着分子標的と共にうまくいかなかったことから、これらの報告の著者は、栄養血管の流れは、標的特異的ＣＥＵ分子イメージングのための技術的な障害であり得ると提言している［９］。従って、本明細書で実証される頸動脈疾患におけるＤＥｓｐＲ陽性内皮細胞の分子イメージング（図１９Ａ〜２２Ｅ）は、頸動脈疾患内皮および拡張栄養血管のインビボ分子イメージングのための新規の研究および診断ツールを提供する。理論によって束縛または限定されることを望まないが、最適な超音波イメージングパラメータが与えられれば、標的特異的ＣＥＵ分子イメージングにおける特異な成功のためにあり得る因子は、標的の発現のレベルおよび／または領域によって定義される分子の閾値における差異、そして／あるいは、標的血管の密度およびサイズならびに標的血管における流れによって定義される技術的な閾値における差異であり得る。検出可能な標的化ＣＥＵ陽性イメージングまたは分子イメージングのために、これらの閾値は同時に越えられなければならない。より具体的には、頸動脈損傷に誘発されるマウスモデルにおける栄養血管の新血管発生について報告されるＶＥＧＦＲ２を標的とする陰性分子イメージング結果とは対照的に、ＤＥｓｐＲ発現のレベル、内腔内皮症状の程度、および栄養血管の新血管発生密度は、本明細書で使用されるより大きいサイズのラット頸動脈疾患モデルと共に、頸動脈疾患のＴｇ２５ラットモデルにおける頸動脈栄養血管のＤＥｓｐＲ標的化ＣＥＵ陽性イメージングの成功に寄与する因子を構成する［９］。さらに、ＣＥＵ陰性遺伝子導入ラットとＣＥＵ陽性遺伝子導入ラットとの間の差異は、ＣＩＳ差（図１９Ｅ）および破壊前ＣＩＳピークレベル（図２２Ａ）のための推定閾値を明らかにする。ＣＥＵ陽性イメージングに対して観察されるこの閾値は、ＤＥｓｐＲ標的化ＣＥＵ陽性イメージングが病的血管新生のための非侵襲性のバイオマーカーであり、疾患進行のための予測値を有し得るという証拠を提供する。
【０３８１】
驚くことに、標的特異的分子イメージングの検出の成功のための分子および技術的閾値は、反射率が微小気泡自体の濃度に直接比例するという原理と一致する［２６］。より具体的には、より大きいＤＥｓｐＲ発現およびＤＥｓｐＲ陽性内皮細胞のより大きい密度は、内腔においても栄養血管においても、本明細書に記載される方法では結合微小気泡のより大きい濃度に変換することができる。これは次に、理論によって束縛または限定されることを望まないが、白血球による微小気泡の貪食とは対照的に、微小気泡−細胞結合が微小気泡の反射率を低下させないので、より大きい反射率および検出レベルに変換できることが予想される［２７］。ほとんどの循環微小気泡の排除の後、そして音響破壊の前に、標的特異的微小気泡の安定な結合は、陰性またはバックグラウンドのコントラスト強度よりも有意に大きい比較的安定したコントラスト強度レベルを示す（図２０ｄ、ＡＮＯＶＡ  Ｐ＜０．０００１）。高周波数イメージングは微小気泡の断片化またはガス拡散を誘発することができるので、理論によって束縛または限定されることを望まないが、音響破壊の前にもわずかな低下が観察され得る。しかしながら、音響破壊の際、断片化によるコントラスト強度の降下は、微小気泡の結合を確認するために観察される（図１９Ａ〜１９Ｅ）。理論によって束縛または限定されることを望まないが、微小気泡共鳴［２８］を低下させ得る高密度ＲＯＩにおける微小気泡相互作用に起因して、あるいは、微小血管内の微小気泡が音響断片化の根底にある１０倍の直径変動に到達できないことから、音響断片化は完全でないこともある［２９］。さらに、理論によって束縛または限定されることを望まないが、ガス放出および比較的低い流れを有する不完全な断片化は、頸動脈内腔と比較して栄養血管中で予測され得るように、ラット−Ｒ３において観察される二次ピークを構成した後、ゆっくり低下してベースラインレベルまで戻る。この実験の時点で、循環する微小気泡はあったとしても最小限なので、二次ピークは恐らく補給によるものではない（図１９Ａ〜１９Ｅ、２０Ａ〜２０Ｈ）。ラット−Ｒ３がラット−Ｒ１よりも高いコントラスト強度レベルに到達するという事実はより大きい微小気泡濃度を示唆し、これは微小気泡間の相互作用による音響破壊も低下することができる［２８］。特に、音響断片化は微小気泡結合を確証するが、音響断片化のパターンまたは拡散は、微小気泡濃度ならびに結合部位の血管径および流れへの洞察も提供することができる。これは、マウス大動脈根アテローム性動脈硬化症に対して報告されたもの［３０］に対する新規の代替分子イメージングパラダイムを提供する。現在の設定におけるＣＥＵイメージングは他の実施形態では成功しているが、栄養血管の流れのイメージングのための血管内超音波について観察されるように、接着性微小気泡の非線形イメージングを使用して、より大きい感度および／または改善された定量化を提供することができる［３１］。
【０３８２】
ＭＢＤによって標的とされる細胞％における用量依存性の増大および細胞当たりのＭＢの数における用量依存性の増大の検出（図２３Ａ〜２３Ｇ）は、ＤＥｓｐＲ標的化ＭＢ−細胞相互作用の安定した相互作用、動態学、特異性および非毒性への洞察を与える。より重要なことに、ヒト内皮細胞およびヒト特異的抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体を標的化のために用いてインビトロ研究を実施し、ＭＢ−細胞の結合が４５分後に高せん断応力洗浄に耐え、接触時に細胞毒性を生じないことを考えれば、ＭＢＤ−細胞相互作用のこれらのインビトロ観察は、有用な治療および診断ツールとしての病的血管新生のＤＥｓｐＲ標的化分子イメージングを実証する。
【０３８３】
要するに、分子イメージングのコントラスト強度レベルの比較分析、微小気泡−内皮間の結合の組織学的確認、ＤＥｓｐＲ陽性分子イメージングがＤＥｓｐＲ陽性の内皮細胞発現に関連されるという免疫染色の確認、および音響破壊後の結合した微小気泡の挙動の一致したパターンは、頸動脈疾患ラットモデルにおける頸動脈内皮および栄養血管の新血管発生の標的特異的分子イメージングが、ＤＥｓｐＲを標的とする本明細書に記載される方法および試薬を用いて実現可能であることを実証する。栄養血管の新血管発生および頸動脈疾患の病変のインビボ分子イメージングのための成功した標的としてのＤＥｓｐＲの同定は、動物モデルにおける栄養血管の新血管発生および頸動脈疾患進行の内皮変化の長期的研究を容易にすることができる。安定したＭＢＤ−ＨＵＶＥＣ結合のインビトロ観察と共に、データは、疾患進行および合併症のリスクの推定のために、心血管疾患の病態生理学的変化の早期検出における本明細書に記載される分子イメージング技術の使用を実証する。
【０３８４】
参考文献：
2013538191.tif 000022
2013538191.tif 000023
2013538191.tif 000024
【０３８５】
（表２）
2013538191.tif 000025
【０３８６】
実施例３
癌における二重エンドセリン−１／ＶＥＧＦｓｐ受容体（ＤＥｓｐＲ）：二重抗血管新生／抗腫瘍細胞侵襲性療法に対する標的
現在の抗ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２療法に対する内因性および外因性の抵抗性の発生が観察されている。本明細書に記載されるように、ＤＥｓｐＲ発現は、原発性および転移性腫瘍のαＳＭＡ陽性およびαＳＭＡ陰性の血管内皮において、そして種々のヒト癌組織型および細胞株の腫瘍細胞膜および核膜において増大することが分かる。さらに、本明細書に記載されるヒト特異的抗ＤＥｓｐＲ抗体治療を用いるＤＥｓｐＲ阻害は、ヒト内皮細胞血管新生および腫瘍細胞侵襲性を低下させる。さらに、リガンド特異的ＤＥｓｐＲシグナル伝達プロファイルが、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２のものとは異なることが分かった。従って、本明細書には、二重腫瘍細胞および内皮送達のため、および二重抗血管新生／抗侵襲性療法のためのＤＥｓｐＲの標的化を実証するデータが記載されている。
【０３８７】
序論
癌発症における血管新生スイッチの重要な役割は認識されているが［１］、血管内皮成長因子および／またはその受容体に向けられた抗血管新生療法、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２中心の抗血管新生療法は、単独でもあるいは他の抗癌療法と組み合わせても、癌が休止状態の管理しやすい慢性疾患まで低下されるような長期にわたる効力の期待された治療目標を達成していない［２−５］。累積的な観察は、ＦＤＡ認可の３つのＶＥＧＦ経路阻害剤（抗ＶＥＧＦベバシズマブまたはＡｖａｓｔｉｎ、抗ＶＥＧＦＲ２スニチニブ、およびソラファニブ）が全て、腫瘍の停滞または収縮の形で、そして全てではないがほとんどの癌型が病的血管新生を示すにもかかわらず特定の癌だけに対して、著しいが一時的な改善をもたらすことを示している［２，６］。さらに、抗ＶＥＧＦ経路療法は前臨床研究において原発腫瘍の成長および転移を低減しているが［７］、最近のマウス腫瘍モデル研究では、スニチニブおよび抗マウスＶＥＧＦＲ２抗体、ＤＣ１０１は、原発腫瘍成長の阻害にもかかわらず、腫瘍細胞の転移を増大させ、場合によっては全生存を増大させたことが報告されている［８，９］。累積的な観察は、理論によって束縛または限定されることを望まないが、重複性血管新生促進シグナルの既存の多重度、代替の血管新生促進経路の上方制御、骨髄由来の血管新生促進の細胞の補充、ＶＥＧＦシグナル伝達の必要性を除去する腫瘍血管系の周皮細胞被覆度の増大、ならびに血管新生を必要としない正常血管の侵襲性および転移性吸収などの内因性および回避的な抵抗のいくつかのメカニズムを暗示する［２−５］。さらに、ヒトにおけるベバシズマブ抗ＶＥＧＦ療法［１０］およびマウスにおける抗ＶＥＧＦＲ２ａｂ療法［１１］の際にＶＥＧＦレベルの１０倍の増大が検出されており、理論によって束縛または限定されることを望まないが、これは回避的抵抗に起因し得る。
【０３８８】
ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦｓｐ（血管内皮成長因子シグナルペプチド）は両方とも同じ同一のプロペプチドに由来し、ＶＥＧＦの１０倍の「リバウンド」増大は、理論によって束縛または限定されることを望まないが、付随して１０倍のＶＥＧＦｓｐの増大も生じ得る。従ってその結果、その受容体である二重エンドセリン１／ＶＥＧＦｓｐ受容体またはＤＥｓｐＲ（以前は、Ｄｅａｒと呼ばれ、ＧｅｎＢａｎｋにＤｅａｒで寄託）を活性化する、ＶＥＧＦｓｐの切断後の機能が１０倍増大される［１２］。ＤＥｓｐＲノックアウトマウス脈管形成の停止および血管新生の不在を示し、Ｅ１０．５〜Ｅ１２．５日の胚性致死が生じる［１３］。一致して、ＤＥｓｐＲハプロ不全は合成メラノーマ腫瘍成長の低下を生じ、抗ＤＥｓｐＲ抗体阻害は、照射誘発された乳房腫瘍を有するラットにおいて腫瘍成長および腫瘍血管新生を低下させた［１３］。さらに、ＤＥｓｐＲの他のリガンドはエンドセリン−１（ＥＴ１）であり［１２］、全ての他の既知のＥＴ１受容体、ＥＴａおよびＥＴｂは、そのそれぞれのノックアウトマウスモデルにおいて胚性致死性血管新生表現型を示さない［１４，１５，１６］。
【０３８９】
本明細書には、抗ヒトＤＥｓｐＲ抗体阻害を使用し、抗ＤＥｓｐＲ抗体療法のマウス前駆体を特徴付ける、新規の抗血管新生戦略が記載される。ＤＥｓｐＲはいくつかの固体腫瘍細胞および腫瘍血管内皮において上方制御され、ヒト特異的抗ＤＥｓｐＲポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、インビトロのヒト内皮細胞の管形成および腫瘍細胞の侵襲性を阻害し、ＤＥｓｐＲは既知のリガンド特異的シグナル伝達経路を用いて血管新生および癌細胞侵襲性を媒介することが分かった。
【０３９０】
材料および方法
細胞株および抗体の発生
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＰＡＮＣ−１細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン（ＧＰＳ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で維持した。ＰＡＮＣ−１細胞は、高グルコース、１０％ＦＢＳおよびＧＰＳを有するＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で保持した。ヒト臍帯静脈内皮細胞、ＨＵＶＥＣは、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手し、２％ＦＢＳおよびＧＰＳを含有するＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉａ−２（ＥＧＭ−２）中に保持した。モノクローナル抗体の発生は、ｈＤＥｓｐＲの９アミノ酸ＤＥｓｐＲ  ＮＨ２末端ペプチド、Ｍ１ＴＭＦＫＧＳＮＥ９を抗原として用いて、ＰｒｏＭａｂ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）によって特注で実施した。ハイブリドーマ上清のスクリーニングおよび候補モノクローナル抗体の最初の特徴付けは、遊離ｈＤＥｓｐＲ抗原ペプチドを抗原として用いてＥＬＩＳＡにより実施した。
【０３９１】
ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット分析によるモノクローナル抗体の特徴付け
Ｍ１ＴＭＦＫＧＳＮＥ９抗原ペプチドを、マイクロタイタープレートのウェル上に直接被覆した。一次抗体の適切な希釈物を３７℃で１時間インキュベートした。次に、ウェルを、１：９０００のＨＲＰ標識化抗ＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ  ｃａｔ＃Ａ０１６８）と共に３７℃で１時間インキュベートした。３，３'５，５'−テトラメチルベンジジン基質（３７℃で１０分間のインキュベーション）の添加によって反応を視覚化し、４５０ｎｍで分光光度的に読み取った。ウェスタンブロット分析は、ｈＤＥｓｐＲを安定的に発現するＣｏｓ１細胞トランスフェクタントからの全細胞タンパク質抽出物（４０μｇ）［１７］と、ｈＤＥｓｐＲ特異的合成ペプチドに対して産生された、対応する候補モノクローナル抗体とを等量で用いて、記載されるように行った［１７］。免疫反応性のｈＤＥｓｐＲ（１０ｋＤａのポリペプチド）は、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる化学発光により検出した。
【０３９２】
血管新生のためのＨＵＶＥＣ管形成アッセイ
有効な第２継代のヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣ（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｏｒｅｇｏｎ）を入手し、第４継代まで培養してから、穏やかなトリプシン処理を用いて８０％のコンフルエンスで回収した。次に、細胞ペレットを、Ｍ−２００（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｏｒｅｇｏｎ）１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦおよび１０μｇ／ｍｌのヘパリンを含有する無血清培地（基本培地）中で２回洗浄した。次に、細胞をこの無血清培地中に再懸濁させ、９６ウェルプレートの血管新生システム：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｂｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭＭａｔｒｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＡ）に、２０，０００細胞／ウェル（１００μＬ）で播種した。基本培地を単独で、あるいは以下の：２％のＦＢＳ、２０ｎＭのＶＥＧＦ、２０ｎＭのＶＥＧＦｓｐ、２０ｎＭのＥＴ１のうちの１つまたは複数と共に使用して、種々の血管新生および抗血管新生条件を示されるように４通りにアッセイした。阻害のために使用した抗体を全てアフィニティ精製して、以下の濃度：５００ｎＭの抗ｈＤＥｓｐＲポリクローナル抗体（Ｐａｂ）、５００ｎＭの抗ｈＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体（Ｍａｂ）、５００ｎＭの抗ＶＥＧＦｓｐ  Ｐａｂで使用し、対応するアイソタイプ対照については、Ｐａｂに対しては５００ｎＭの免疫前ＩｇＧ（７５μｇ／ｍｌ）、そして抗ｈＤＥｓｐＲ  Ｍａｂに対しては５００ｎＭのＩｇＧ２ｂのいずれかを使用した。以下のような種々の実験条件を４通りで検査した：基本培地単独（ＢＭ）、２％のＦＢＳを有するＢＭ；２０ｎＭのＶＥＧＦを有するＢＭ；２０ｎＭのＶＥＧＦｓｐを有するＢＭ；２０ｎＭのＥＴ１を有するＢＭ；２０ｎＭのＶＥＧＦおよび５００ｎＭ（７５μｇ／ｍｌ）の免疫前ＩｇＧを有するＢＭ；２０ｎＭのＶＥＧＦおよび５００ｎＭの抗ＶＥＧＦｓｐを有するＢＭ；２０ｎＭのＶＥＧＦおよび５００ｎＭの抗ｈＤＥｓｐＲを有するＢＭ；２０ｎＭのＶＥＧＦｓｐおよび５００ｎＭの抗ｈＤＥｓｐＲを有するＢＭ；２０ｎＭのＥＴ１および５００ｎＭの抗ｈＤＥｓｐＲを有するＢＭ；２％のＦＢＳおよび５００ｎＭの抗ＶＥＧＦｓｐを有するＢＭ；ならびに２％のＦＢＳおよび５００ｎＭの抗ｈＤＥｓｐＲを有するＢＭ。その他の実験では、抗ｈＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２ｍＡｂの濃度を増大させて（０．０５〜５００ｎＭ）検査した。次に、ＨＵＶＥＣを３７℃で１６時間において指定されるような種々の条件でインキュベートし、その後、得られた血管新生の管形成を顕微鏡下で見て、ウェルの約７０％（中央部分）の画像を分析のために撮影した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ−ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて、各血管新生条件に対して種々のパラメータ、すなわち、管の全長、管の平均長さ、管の平均厚さ、細胞凝集体の長さの２倍よりも長い管様の伸長を有する細胞のクラスタであると定義される分枝点の数、直列または並列の管様構造間の３つ以上の接続であると定義される接続の数、および管状構造によって結合される閉鎖多角形の数を測定した。
【０３９３】
侵襲アッセイ
ＢＤ  Ｂｉｏ−Ｃｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ侵襲アッセイシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＰＡＮＣ−１細胞の侵襲アッセイを記載されるように［１８］実施した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＰＡＮＣ−１細胞を成長培地中に懸濁させ、予め被覆されたトランスウェルチャンバ（３×１０４細胞／ウェル）に播種した。次に、トランスウェルチャンバを２４ウェルプレートに入れ、これに、基本培地のみ、あるいは種々の濃度の抗体を含有する基本培地を添加した。細胞を１６時間インキュベートし、侵入細胞を固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ染色により染色した。ウェル当たりの侵入細胞の数を顕微鏡下でカウントした。各条件を４回繰り返して評価した。
【０３９４】
腫瘍組織アレイおよび腫瘍細胞の免疫染色
ヒト癌細胞株アレイＤＥｓｐＲ免疫染色は、我々の社内のポリクローナルヒト特異的抗ＤＥｓｐＲ抗体を用いて、Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．により特注で実施した。腫瘍組織アレイをＰａｎｔｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手し、濃度依存性免疫染色１：１０、１：５０、１：１００の実証の後、１：２０でポリクローナルおよびモノクローナル抗ｈＤＥｓｐＲ抗体を用いてＤＥｓｐＲに対して免疫染色した。ポリクローナル抗体を用いて、記載されるようにデオキシアミノベンジジン免疫染色を行った［１３］。以下のステップにより脱パラフィン化切片において二重免疫蛍光染色を行った：抗原回復、バックグラウンドを低下させるための処置、ブロッキング、４℃で一晩の一次抗体によるインキュベーション、４℃で一晩の二次抗体インキュベーション（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５６８ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いる）、洗浄、およびＤＡＰＩを有するＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるモニタリング。負の対照は、抗ラットＤＥｓｐＲ抗体に対するウサギアイソタイプ抗体を用いて行った。蛍光イメージングおよび顕微鏡撮影のためにＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ２ｐｌｕｓ顕微鏡を使用した。
【０３９５】
Ａｂ−マイクロアレイによるシグナル伝達タンパク質の多重分析
ＤＥｓｐＲによる種々のシグナル伝達経路のリガンド依存性調節の分析は、ＫｉｎｅｘＴＭ抗体マイクロアレイシステムを用いて、５０６のリンタンパク質特異的抗体にわたってデュプリケートで、あるいは多数回繰り返して、そして７４０のシグナル伝達分子の汎特異的（ｐａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体にわたって、Ｋｉｎｅｘｕｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｋｉｎｅｘｕｓ，Ｃａｎａｄａ）により特注で実施した。ＥＴ１−およびＶＥＧＦｓｐ−ＤＥｓｐＲ活性化の多重シグナル伝達経路に対する効果は、リガンド処理（ＥＴ１、１０ｎＭ、ＶＥＧＦｓｐ、１０ｎＭ）の３０分後に、Ｃｏｓ１−ｈＤＥｓｐＲ永久細胞トランスフェクタントを用いて、非処理対照におけるそれぞれの非活性化ＤＥｓｐＲと比較して分析した。全ての蛍光シグナルをバックグラウンドに対して基準化した。データは、対照からの変化率（％ＣＦＣ）、あるいは非処置トランスフェクタント適合対照と比較した、ＥＴ１またはＶＥＧＦｓｐ処理の３０分後に検出される変化のそれぞれで提供される。％ＣＦＣ＝［処置Ａｖｅ−対照Ａｖｅ］／対照Ａｖｅ×１００である。％ＣＦＣ＞２５％が有意差として提唱されるが、＞５０％ＣＦＣを示し、デュプリケート間の％誤差範囲が検定および対照サンプルの両方に対して２０％未満である値だけを提供した。％誤差範囲＝［デュプリケートｎ−平均］／平均。％ＣＦＣの計算において低い方のデュプリケートを用いて％ＣＦＣが＞５０％のままであれば、＞２０％の％誤差を許容した。
【０３９６】
統計分析
ＳｉｇｍａＳｔａｔ  ２．０３ソフトウェアパッケージを用いて正規性を確認してから、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）の後に全ペアワイズ多重比較Ｔｕｋｅｙ検定を実施した。Ｐ＜０．０５は統計的に有意であると見なした。
【０３９７】
結果
ＤＥｓｐＲ発現は、ヒト腫瘍細胞および腫瘍血管において増大される
ヒト癌組織および細胞においてＤＥｓｐＲ特異的発現パターンを調べた。ヒト特異的抗ＤＥｓｐＲポリクローナル抗体を用いて腫瘍組織アレイ分析を実施した［１７］。ラット特異的抗ＤＥｓｐＲ抗体［１３］免疫染色のラットの照射誘発された乳房腫瘍モデル観察と一致して、ヒト腫瘍組織アレイにおけるＤＥｓｐＲ発現の免疫組織化学的分析は、肝臓、膵臓（図２４Ａ〜２４Ｆ）、胃、乳房（図２５Ａ〜２５Ｆ）、結腸および肺（図２６Ａ〜２６Ｆ）の癌の薄壁の腫瘍血管内皮において、それぞれの正常組織の生検コアの血管内皮（動脈内皮でも微小血管内皮でも）と比較して、ＤＥｓｐＲ発現の増大を検出した（図２４Ａ〜２４Ｆ、２５Ａ〜２５Ｆ、および２６Ａ〜２６Ｆ）。特に、肺における胃癌転移巣（図２５Ｃ）およびリンパ節における乳癌転移巣（図２５Ｆ）の血管内皮もＤＥｓｐＲ免疫染色の増大を示す。さらに、膵臓（図２４Ｅ、２４Ｆ）、胃（図２５Ｂ、２５Ｃ）、乳房（図２５Ｅ）、肺（図２６Ｃ）および結腸（図２６Ｅ、２６Ｆ）の腫瘍細胞は、細胞膜、細胞質および核膜に細胞内局在したＤＥｓｐＲ発現の増大を示す。本明細書において実証される腫瘍新血管および腫瘍細胞におけるこのＤＥｓｐＲ発現の増大は、ＤＥｓｐＲが腫瘍新血管発生および腫瘍形成の両方における役割を果たすことを示す。
【０３９８】
腫瘍細胞における発現をさらに確認するために、次に、種々のタイプの既に特徴付けられて確立された癌細胞株を検査する癌細胞アレイのＤＥｓｐＲ免疫染色を実施した（表３）。あったとしても最小限のＤＥｓｐＲ発現を有する検査した細胞株の少数とは対照的に、いくつかの癌細胞株は、高い核グレード（ｎｕｃｌｅａｒ  ｇｒａｄｅ）に関連する核膜ＤＥｓｐＲ発現を有するＤＥｓｐＲ発現を示す（表３、図２７Ａ〜２７Ｆ）。代表的な顕微鏡写真は、全てではないがほとんどの腫瘍細胞の核膜において最強のＤＥｓｐＲ免疫染色を有する腫瘍細胞発現を実証する。選択的核膜免疫染色（図２７Ａ〜２７Ｆ）は、いくつかの癌細胞株における陰性の免疫染色と共に、ＤＥｓｐＲ免疫染色の特異性を確認する（表３）。重要なことに、これらの観察は、本明細書に記載される癌組織断片の観察（図２４Ａ〜２４Ｆ、２５Ａ〜２５Ｆ、および２６Ａ〜２６Ｆ）と一致する。核膜局在は、ＤＥｓｐＲが、受容体媒介性のシグナル伝達を超えた細胞膜と核膜との間のクロストークにおける役割を果たし得ることを示す。
【０３９９】
Ｎ末端９−ａａ細胞外ドメインに対して生成される高アフィニティの抗ｈＤＥｓｐＲモノクローナル抗体
抗血管新生戦略としての抗ＤＥｓｐＲ阻害を調べるために、ＤＥｓｐＲ免疫染色で使用されるヒト特異的抗ＤＥｓｐＲポリクローナル抗体を発生させるための戦略使用と同一のヒトＤＥｓｐＲのＮ末端細胞外ドメインにわたる９−ａａペプチドを用いてヒト特異的抗ＤＥｓｐＲモノクローナル抗体を発生させた（図２４Ａ〜２４Ｆ、２５Ａ〜２５Ｆ、２６Ａ〜２６Ｆ、および２７Ａ〜２７Ｆ）［１７］。６７のハイブリドーマクローンから、予備スクリーンにより上位１０の候補モノクローナル抗体ハイブリドーマクローンを同定し、次にこれを、間接ＥＬＩＳＡによって、９−ａａペプチドＮ末端ドメインに対するアフィニティについて分析した（図２８Ａ）。対照非トランスフェクトＣｏｓ１細胞を対照とした、Ｃｏｓ１−ｈＤＥｓｐＲトランスフェクタントから単離したｈＤＥｓｐＲタンパク質（１０ｋＤａ）に対するｍａｂ媒介性の結合のウェスタンブロット分析による特異性の分析によって、ハイブリドーマクローン７Ｃ５Ｂ２を同定した。図２８Ｂに示されるように、７Ｃ５Ｂ２抗ｈＤＥｓｐＲモノクローナル抗体ハイブリドーマクローンは、「スーパークローン」上清および精製モノクローナル抗体の両方のような特異性を示した。７Ｃ５Ｂ２のアイソタイピングは、このモノクローナル抗体がマウスＩｇＧ２ｂアイソタイプの抗体クラスに属することを示した。
【０４００】
ヒト臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＤＥｓｐＲおよびそのリガンドＶＥＧＦｓｐの共存
ＨＵＶＥＣにおける二重免疫染色による受容体−リガンド共存の分析は、抗ｈＤＥｓｐＲモノクローナル抗体を用いて血管新生促進条件下で培養された内皮細胞膜において、ＤＥｓｐＲの特異的な検出を示した。二重免疫染色は、抗ＶＥＧＦｓｐポリクローナル抗体を用いて、ＤＥｓｐＲと、そのリガンドＶＥＧＦｓｐとの共存を検出したので、抗ｈＤＥｓｐＲモノクローナル抗体がＤＥｓｐＲを特異的に標的とすることが実証される。抗ＤＥｓｐＲポリクローナル抗体も同一の結果を与えた。
【０４０１】
抗ｈＤＥｓｐＲポリクローナル抗体および７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体による抗ＤＥｓｐＲ阻害は血管新生を低減する
次に、ＤＥｓｐＲの７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体阻害の血管新生に対する効果を、確立されたインビトロＨＵＶＥＣに基づく血管新生アッセイを用いて査定した。まず、７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体が、血管新生促進条件下でＨＵＶＥＣによって形成される管／「新血管」において細胞膜ＤＥｓｐＲ発現を検出することが示され、従って、この血管新生アッセイシステムの使用が検証された。次に、インビトロ血管新生の２つの確立したパラメータである、血管新生促進条件下でＨＵＶＥＣにより形成された新生血管の全管長および分枝を分析した。０．０５〜５００ｎＭの可変用量の７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体を用いて、管の全長および分枝点の数の両方について血管新生阻害の濃度依存性が実証され、全強度阻害用量として５００ｎＭの７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体が同定される（図２９Ａ）。次に、新しく発生した７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体と、既に特徴付けられた抗ｈＤＥｓｐＲポリクローナル抗体とを比較する、独立した反復阻害実験にこの用量を適用した。ポリクローナル抗体および７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体のそれぞれについて、非処置の対照、ならびに免疫前およびＩｇＧ２ｂアイソタイプ特異的な負の対照と比較して、５００ｎＭの抗ｈＤＥｓｐＲ抗体は、管の全長および分枝点の平均数で測定される血管新生を著しく阻害した（全ペアワイズ多重比較Ｔｕｋｅｙ検定によるＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０１）。他の血管新生パラメータである管の数および分枝相互接続も著しく阻害された。一致して、ポリクローナル抗ＶＥＧＦｓｐ抗体も、ＨＵＶＥＣにおける血管新生を阻害する。
【０４０２】
抗ｈＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体の免疫染色および腫瘍細胞侵襲性の阻害の分析
ＤＥｓｐＲ阻害は血管新生を低減することが示されると、ＤＥｓｐＲは種々の腫瘍細胞系（図２７Ａ〜２７Ｆ）、および癌組織（図２４Ａ〜２４Ｆ、２５Ａ〜２５Ｆ、および２６Ａ〜２６Ｆ）で検出されるので、次に、７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体媒介性の抗ＤＥｓｐＲ阻害の、腫瘍細胞侵襲性に対する効力を査定した。攻撃的な乳癌および膵癌を表す２つの癌細胞株、それぞれＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＰＡＮＣ−１癌細胞株を調べた。７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体による免疫染色により、両方の細胞株における核膜および細胞膜ＤＥｓｐＲ発現、ならびに細胞質内発現が検出された。機能分析により、３．５５±０．３２ｎＭのＥＣ５０を有する０．０５〜５００ｎＭの７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体の腫瘍細胞侵襲性の濃度依存性阻害が検出された。５００ｎＭの７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体を用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図３０Ｂ）およびＰＡＮＣ１（図３０Ｃ）細胞の両方において、それぞれ対照の非処置細胞およびＩｇＧ２ｂアイソタイプ処置細胞と比較して、ＤＥｓｐＲ阻害を観察した（ＡＮＯＶＡの後、全ペアワイズ多重比較検定、それぞれＰ＜０．００１およびＰ＜０．０１）。これらの観察は、血管新生（図２９Ｂ〜２９Ｃ）および腫瘍細胞侵襲性（図３０Ｂ〜３０Ｃ）の両方に対するＤＥｓｐＲ阻害の二重効果を示す。
【０４０３】
腫瘍血管内皮および腫瘍細胞の抗ｈＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体−免疫染色
血管新生および腫瘍細胞侵襲性に対するＤＥｓｐＲ阻害の効力が示されたので、次に、正常なものと対照的な乳癌および膵癌組織における７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体−免疫染色を評価して、抗ｈＤＥｓｐＲポリクローナル抗体を用いて検出されるように腫瘍血管内皮および腫瘍細胞におけるＤＥｓｐＲ発現の増大を確認すると共に（図２４Ａ〜２４Ｆ、２５Ａ〜２５Ｆ、および２６Ａ〜２６Ｆ）、７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体のＤＥｓｐＲ標的プロファイルを描写した。
【０４０４】
微小血管周皮細胞および癌組織間質筋線維芽細胞を追跡するためのＤＥｓｐＲおよびアルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の二重免疫染色により、正常な乳房組織血管および乳房上皮細胞における最小限のＤＥｓｐＲ発現と、乳房筋上皮細胞および細動脈平滑筋細胞における正常なαＳＭＡ発現とが検出され、最小限〜全くないＤＥｓｐＲ発現が強調される（図３１Ａ〜３１Ｃ）。対照的に、侵襲性腺管癌代表的な乳癌組織断片では、二重免疫染色は、腫瘍微小血管内皮、αＳＭＡを同時発現する微小血管および細動脈、ならびに腺管癌上皮細胞において顕著なＤＥｓｐＲ発現を検出した（図３１Ｄ〜３１Ｆ）。また腫瘍血管発生の増大は非癌性の「正常」対照組織（図３１Ａ〜３１Ｃ）と比較して注目される。
【０４０５】
同様に、正常な膵臓では、動脈中膜平滑筋細胞（図３２Ｃ）における強力なαＳＭＡ発現と対照的に、微小血管（図３２Ａ〜３２Ｃ）、および動脈内皮において最小限のＤＥｓｐＲ発現が検出される。対照的に、ＤＥｓｐＲ発現は、膵癌αＳＭＡ陰性微小血管およびαＳＭＡ陽性微小血管ならびに細動脈内皮（図３２Ｄ〜３２Ｅ）において増大される。乳癌上皮細胞およびＰＡＮＣ−１癌細胞株において観察されるように、膵癌腺管癌上皮細胞は、際立ったＤＥｓｐＲ陽性免疫染色を示す（図３２Ｆ）。
【０４０６】
ＤＥｓｐＲシグナル伝達のホスホプロテオーム分析
リンタンパク質特異的抗体アレイを用いて、永久Ｃｏｓ１細胞ＤＥｓｐＲトランスフェクタントにおいて、その二重リガンド（それぞれＥＴ１およびＶＥＧＦｓｐ）への結合の際にＤＥｓｐＲにより活性化されるリガンド特異的シグナル伝達経路を同定した（表４）。Ｃｏｓ１細胞は内在性ＤＥｓｐＲ、ＥＴ１またはＶＥＧＦＲ２発現を持たないので、これらの細胞を使用した。非処置および処置Ｃｏｓ１−ＤＥｓｐＲトランスフェクタントを比較した。表４に示されるように、リガンドに関係なく、ＤＥｓｐＲのホスホプロテオーム（＞５０％ＣＦＣのシグナル伝達リンタンパク質に限定）は、血管新生、腫瘍細胞侵襲性または転移のメカニズムに関与することが知られているシグナル伝達経路を活性化した。さらに、ＤＥｓｐＲのＥＴ１またはＶＥＧＦｓｐ活性化のいずれかのためのいくつかのＤＥｓｐＲ−リン酸化シグナル伝達分子は、神経細胞または造血幹細胞のいずれかに直接連結されており、いくつかはＥＲＫ１／２、ＦＡＫ、Ｍｅｔ、ＰＫＣ−アルファ、ＳＨＰ２、Ｓｍａｄ、ＳＴＡＴ１、およびＳＴＡＴ３などの癌幹細胞の再生にも関与する（表３）。本明細書には、ＦＡＫ、ＥＲＫ１／２、Ｒａｆ、ＰＫＣαのようないくつかのシグナル伝達分子については、ＤＥｓｐＲのホスホプロテオームはＶＥＧＦＲ２／ＶＥＧＦと重複することが言及される［１９］。しかしながら、ＤＥｓｐＲ／ＥＴ１およびＤＥｓｐＲ／ＶＥＧＦｓｐの集団的なシグナル伝達複合体（表３）はＶＥＧＦＲ２／ＶＥＧＦａについて記載されるものとは全く異なり［１９］、従って、ＶＥＧＦＲ２またはＦｌｋ１欠損突然変異体はＥ８．５〜Ｅ９．５日の間に早期に死亡したが、Ｅ１０．５〜Ｅ１２．５日の間の同一の胚性致死を有するＤＥｓｐＲ［１３］およびＶＥＧＦに対する欠損突然変異体の異常な血管新生表現型から推定されるように［２０，２１］、非冗長性の血管新生の役割が確認される［２２］。
【０４０７】
論考
抗腫瘍血管発生療法のための新規標的としてのＤＥｓｐＲ
正常組織に適当した対照とは対照的である、腫瘍血管内皮におけるＤＥｓｐＲ発現の増大の検出、腫瘍間質のαＳＭＡ陰性の毛細血管／微小血管と、αＳＭＡ陽性の細動脈および動脈との両方におけるＤＥｓｐＲ発現の検出、ならびにＤＥｓｐＲ阻害により成功した血管新生の阻害は全て、ＤＥｓｐＲが、腫瘍血管新生および現存または「成熟」腫瘍の微小血管系の両方と目的とした治療法のための新規の標的あることを実証する。より具体的には、αＳＭＡ陽性の微小血管に対するＤＥｓｐＲの標的化は、理論によって限定または束縛されることを望まないが、αＳＭＡ陽性の周皮細胞鞘によって示されるようにその「成熟」に起因してもはやＶＥＧＦに依存しないか、あるいは、現存する微小血管系の「吸収」に起因してＶＥＧＦに対して非依存性である間質血管系を有すると考えられる、抗ＶＥＧＦ療法に抵抗性の腫瘍に対処することができる［２］。さらに、抗ＶＥＧＦ療法と共に併用されるＤＥｓｐＲの標的化は、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦｓｐが共通のプロペプチドに由来するので、抗ＶＥＧＦ療法において観察されるＶＥＧＦの１０倍の増大を伴って、同時に起こることが予想されるＶＥＧＦｓｐの１０倍の増大に対処することができる［１０］。
【０４０８】
リガンド特異的ＤＥｓｐＲホスホプロテオームからの洞察
低酸素誘導因子−１アルファ（ＨＩＦ１α）の安定化が低酸素でＶＥＧＦ、従ってＶＥＧＦｓｐを誘発すると考えれば、ＶＥＧＦｓｐ−ＤＥｓｐＲ活性化によるＢＲＣＡ１のリン酸化およびＰＣＮＡ発現の誘発（表３）は、ＤＥｓｐＲが、低酸素において活性化される必要なＤＮＡ修復反応に寄与し得る［２４］、従って低酸素性微小環境にもかかわらず、ＤＥｓｐＲ陽性の内皮および癌細胞は、低酸素誘発性の細胞周期停止およびアポトーシスを受けるよりも増殖できるようになることを示す［２４，２５］。肝細胞成長因子受容体ＭＥＴはＥＴ１／ＤＥｓｐＲ刺激を受けると誘発され、Ｓｍａｄ１／５／９はＤＥｓｐＲ／ＶＥＧＦｓｐの活性化においてリン酸化されるので、内皮細胞における血管新生および癌細胞における侵襲性に関与するＶＥＧＦｓｐ／ＤＥｓｐＲ、ＭＥＴ／ＨＧＦ、およびＴＧＦβ／Ｓｍａｄ経路の間のクロストークおよび／または冗長性のメカニズムが示される。重要なのは、ＤＥｓｐＲがＢＲＣＡ１およびＳＴＡＴ３をリン酸化することであり、ＢＲＣＡ１およびＳＴＡＴ３は両方ともＨＩＦ１αを安定化することが示されており、Ｒａｆ１と共に、ＶＥＧＦ、従ってＶＥＧＦｓｐの誘発をもたらす。さらに、ＶＥＧＦｓｐ／ＤＥｓｐＲによるＢＲＣＡ１のリン酸化［２６］、ならびにＥＴ１／ＤＥｓｐＲおよびＶＥＧＦｓｐ／ＤＥｓｐＲの両方によるＳＴＡＴ３のリン酸化はいずれも、低酸素を必要とすることなくＨＩＦ１−アルファＤＥｓｐＲ媒介性の安定化をもたらすことができ、従来の治療法に対する腫瘍抵抗性に寄与し得る、構成的なＨＩＦ１−α媒介性血管新生促進およびＤＮＡ修復反応促進が起こる。
【０４０９】
二重抗血管新生／抗癌細胞侵襲性の治療パラダイムの標的としてのＤＥｓｐＲ阻害
腫瘍血管内皮における発現に加えて、ＤＥｓｐＲは、確立された癌細胞株と、乳房癌、膵癌、肺癌、胃癌、膀胱癌および結腸癌の組織学セクションの両方にみられる固形腫瘍上皮細胞において発現される（図２４Ａ〜２４Ｆ、２５Ａ〜２５Ｆ、２６Ａ〜２６Ｆ、および２７Ａ〜２７Ｆ）。抗ＤＥｓｐＲ阻害がインビトロ血管新生を低減する（図２８Ａ〜２８Ｂ）のと同じように、７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体−阻害は、２つの攻撃的な癌細胞株、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（および−４６８）および膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１において腫瘍細胞侵襲性を低下させする（図２９Ａ〜２９Ｃ）。従って、本明細書に記載される組成物および方法を用いる抗ｈＤＥｓｐＲモノクローナル抗体−阻害により血管新生および腫瘍細胞侵襲性の両方に関与する受容体としての標的ＤＥｓｐＲは強くて新しい抗腫瘍療法を提供し、本明細書に記載される抗ｈＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２モノクローナル抗体の抗ｈＤＥｓｐＲモノクローナル抗体−治療前駆体としての使用を実証する。
【０４１０】
さらに、血管新生および転移メカニズムの二重標的化は、次世代の抗癌治療戦略のための新規の方法を含む［２］。本明細書に記載されるデータは、標的ＤＥｓｐＲを使用して二重治療パラダイムを達成可能であることを実証する。膵臓腫瘍新生血管および腫瘍細胞の両方における発現の増大は、抗ＤＥｓｐＲ阻害による血管新生および膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１細胞侵襲性の阻害と共に、全体で、抗ＤＥｓｐＲ療法が膵癌のための新しい治療アプローチを提供し得ることを示す。本明細書で示されるＤＥｓｐＲ阻害、ならびに腫瘍内皮および腫瘍細胞の二重標的化送達のための標的ＤＥｓｐＲによって起こる抗血管新生および抗侵襲性の組み合わせは、いくつかの実施形態では、次世代の抗腫瘍／抗血管新生の二重癌治療およびその方法のための治療基礎として使用することができる［２］。
【０４１１】
（表３）
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【０４１２】
（表４）
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【０４１３】
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【０４１４】
実施例４：７Ｃ５Ｂ２抗体配列決定およびｈＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体変異体の生成
本明細書には、マウスハイブリドーマ７Ｃ５Ｂ２によって発現されるモノクローナル抗体（抗ｈＤＥｓｐＲ）から得られる配列決定結果が記載されており、ここで、７Ｃ５Ｂ２抗体の重鎖および軽鎖Ｖ領域（ＶＨおよびＶＬ）配列は決定されており、例示的な抗ｈＤＥｓｐＲ複合ヒト抗体変異体が設計されている。
【０４１５】
生存可能な凍結ハイブリドーマ細胞ペレットから、ＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡの逆転写の後、抗体特異的転写物のＰＣＲ増幅を実施した。抗体の重鎖および軽鎖Ｖ領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を決定し、配列データを分析した。次に、本明細書に記載されるように、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  ＡｎｔｉｂｏｄｙＴＭ技術を用いて全ヒト化抗体を設計した。
【０４１６】
方法および結果
ＲＮＡ抽出、ＲＴ−ＰＣＲおよびクローニング
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）−４ＰＣＲキット（Ａｍｂｉｏｎ  ｃａｔ．ｎｏ．ＡＭ１９１４）を用いて、ＲＮＡを細胞ペレットから抽出した。ＩｇＧＶＨ、ＩｇＭＶＨ、ＩｇκＶＬおよびＩｇλＶＬのそれぞれに対する定常領域プライマーマウスシグナル配列のための縮重プライマープールを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。６つの縮重プライマープールのセット（ＨＡ〜ＨＦ）を用いて重鎖Ｖ領域ＲＮＡを用いて増幅し、８つの縮重プライマープールのセットを用いて軽鎖Ｖ領域ｍＲＮＡを増幅し、κクラスタに対しては７つ（ＫＡ〜ＫＧ）、λクラスタに対しては１つであった（ＬＡ）。
【０４１７】
重鎖Ｖ領域については、ＩｇＧＶＨ逆転写プライマーおよびプライマープールＨＣから期待されるサイズの増幅産物を得た。軽鎖Ｖ領域については、増幅産物は、ＩｇκＶＬ逆転写プライマーおよび軽鎖プライマープールＫＢ、ＫＣ、ＫＤ、およびＫＧから得た（図３３）。上記プールのそれぞれからのＰＣＲ産物を精製し、「ＴＡ」クローニングベクター（ｐＧＥＭ（Ｒ）−Ｔ  Ｅａｓｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１３６０）にクローニングした。６つのＶＨおよび２４のＶκクローンを配列決定した。
【０４１８】
プールＨＣからの５つのクローンにおいて単一の機能性ＶＨ遺伝子を同定し、プライマープールＫＧからの６つのクローンにおいて単一の機能性Ｖκ遺伝子配列を同定した。プライマープールＫＢおよびＫＣからの１２のクローンは、通常はハイブリドーマ融合パートナーＳＰ２／０と関連される異常な転写物（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ３５６６９）を含有することが分かり、プールＫＤからの６つのクローンは、機能性Ｖκ転写物を含有しないことが分かった。
【０４１９】
キメラ抗体
ＡｎｔｉｔｏｐｅのＶＨおよびＶκ鎖発現ベクターへのクローニングのために隣接の制限酵素部位を導入するプライマーを用いて、ＶＨおよびＶκ（プールＫＧ）遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＶＨ領域はＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いてクローニングし、Ｖκ領域はＢｓｓＨＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を用いてクローニングした。全ての構築物を配列決定により確認した。
【０４２０】
リン酸カルシウム沈殿を用いて、キメラ抗体構築物をＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。上清を採取する前に、一過性トランスフェクションを３日間インキュベートした。
【０４２１】
配列分析
ハイブリドーマ７Ｃ５Ｂ２から得られる配列の分析は、表１に要約される。重鎖および軽鎖Ｖ領域は、その最も近いヒト生殖細胞系配列に対して良好な相同性を示し（それぞれ、６４％および８２％）、個々のフレームワーク配列は、ヒト生殖細胞系データベース中に密接な相同体を有する。
【０４２２】
複合ヒト抗体の設計
Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  ＡｎｔｉｂｏｄｙＴＭ可変領域配列の設計
Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢを用いてマウス抗ｈＤＥｓｐＲ７Ｃ５Ｂ２抗体Ｖ領域の構造モデルを作り、抗体の結合特性に必須である可能性のあるＶ領域内の重要な「制約」アミノ酸を同定するために分析した。いくつかのフレームワーク残基と一緒にＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義を用いる）内に含有される残基が重要であると考えた。抗ｈＤＥｓｐＲのＶＨおよびＶκ配列はいずれも典型的なフレームワーク残基を含有し、ＣＤＲ１、２および３モチーフは、多くのマウス抗体に匹敵する。
【０４２３】
上記の分析から、抗ｈＤＥｓｐＲの複合ヒト配列は、ＣＤＲの外側では許容範囲の広い代替物により作成され得るが、ＣＤＲ配列内では狭いメニューの可能な代替残基のみで作成され得ると考えられた。分析によって、いくつかのヒト抗体由来の対応する配列セグメントを組み合わせて、マウス配列中のものと類似または同一のＣＤＲを作成できることが示された。ＣＤＲの外側および隣接の領域については、本明細書に記載される新規のＣｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  ＡｎｔｉｂｏｄｙＴＭＶ領域の構成要素として、広い選択範囲のヒト配列セグメントが同定された（表１を参照）。
【０４２４】
変異体の設計
上記の分析に基づいて、抗ｈＤＥｓｐＲ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｈｕｍａｎ  ＡｎｔｉｂｏｄｙＴＭ変異体を作成するために使用され得る配列セグメントの大きな予備セットを選択し、ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に結合するペプチドのコンピュータによる分析のためのｉＴｏｐｅＴＭ技術を用い（Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００８）、既知の抗体配列関連のＴ細胞エピトープのＴＣＥＤＴＭ（Ｔ細胞エピトープデータベース）を用いて（Ｂｒｙｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）分析した。ヒトＭＨＣクラスＩＩに対する著しい非ヒト生殖細胞系バインダーとして同定された配列セグメント、またはＴＣＥＤＴＭに対して著しいヒットを記録した配列セグメントを廃棄した。これにより、セグメントセットの縮小が得られ、これらの組み合わせを上記のように再度分析して、セグメント間の接合部が潜在的なＴ細胞エピトープを含有しないことを保証した。
【０４２５】
次に、選択されたセグメントを組み合わせて、合成のための重鎖および軽鎖Ｖ領域配列を生成した。抗ｈＤＥｓｐＲのために、明細書中に詳述される配列を有する、５つのＶＨ鎖（SEQ ID NO:１３〜SEQ ID NO:１７）および２つのＶκ鎖（SEQ ID NO:１８およびSEQ ID NO:１９）を設計した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２３Ｇ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【国際調査報告】
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