(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、生物学的に重要な三リン酸であるＡＴＰ（アデノシン三リン酸）をｐＨ７．４の水性媒体中で選択的かつ効率的に認識できる、アザ−大環状Ｚｎ（ＩＩ）−錯体（Ｌ．Ｚｎ）（スキーム１、式１Ａ）を有する新規な比色化学センサー分子について記載する。ＡＴＰは生体におけるエネルギー源なので、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）はまた、代謝プロセスの際にその場で生成されたＡＴＰに結合することを介した、生細胞における染色剤として使用することができる。Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）は、生細胞に毒性が無いと分かり、微生物細胞増殖研究をモニタリングすることができる。したがって、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）は、好適な染色剤として使用することができる。さらに、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の水への溶解性は、α−ＣＤ（シクロデキストリン）（スキーム２）の存在下で向上した。これは、生細胞のより迅速かつより強い染色を達成するために役立った。したがって、α−ＣＤを用いることにより染色効率をさらに向上させることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１Ａの化合物。
【化６】
2013533903.tif 000007
【請求項２】
本質的に非親油性である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が、比色センサーであり、生細胞が生存可能な染色剤として有用である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記生細胞が、原核細胞および真核細胞から選ばれる、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
使用される原核細胞が、バチルス属種およびシュードモナス属種である、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
使用される真核細胞が、酵母菌（サッカロミセス・セレビシエ）である、請求項３に記載の化合物。
【請求項７】
ｉ．  ３００〜６００ｒｐｍ（毎分回転数）の速度の穏やかな撹拌下で、２５〜３０℃の範囲の温度にて、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンを溶媒に溶解すること；
ｉｉ．  工程（ｉ）で得られた溶液を２〜５℃の範囲の温度で氷中に維持すること；
ｉｉｉ．  工程（ｉｉ）で得られた溶液に、トリエチルアミン塩基を、０．５〜１．０ｍＬ／分の速度で、３００〜６００ｒｐｍの速度の穏やかな撹拌下で加えること；
ｉｖ．  工程（ｉｉｉ）で得られた溶液に、別途調製したテトラヒドロフラン中の４−（４’−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリドの溶液を、１５〜６０ｍＬ／時の範囲の速度で、０〜５℃の範囲の温度で加えること；
ｖ．  工程（ｉｖ）で得られた混合物を、２５〜３０℃の温度範囲で、５〜１０時間の範囲の期間撹拌すること；
ｖｉ．  工程（ｖ）で得られた混合物を、２０〜６０分の範囲の期間、６５〜７０℃の範囲の温度で還流させること；
ｖｉｉ．  工程（ｖｉ）で得られた混合物をろ過して、リガンドの析出物を分離すること；
ｖｉｉｉ．  工程（ｖｉｉ）で得られたリガンドの析出物を洗浄し乾燥すること；
ｉｘ．工程（ｖｉｉｉ）で得られたリガンドを、２０〜２５℃の範囲の温度でアルコールに溶解すること；
ｘ．  工程（ｉｘ）で得られたリガンドの溶液に、硝酸亜鉛溶液（リガンドの０．３〜０．８モル当量）を、２０〜２５℃の範囲の温度で加えること；
ｘｉ．  工程（ｘ）で得られた溶液を、２０〜２５℃の範囲の温度で、１２〜２４時間の範囲の期間撹拌すること；
ｘｉｉ．  工程（ｘｉ）で得られた溶液を、１０〜２０℃の範囲の温度で、２〜５時間の範囲の期間激しくかき混ぜること；
ｘｉｉｉ．  工程（ｘｉｉ）で得られた析出物を、クロロホルムでろ過し洗浄して式１Ａの化合物を得ること、という工程を含む、式１Ａの化合物の調製方法。
【請求項８】
工程（ｉ）において、使用される溶媒が、クロロホルム、メタノール、ジクロロメタン、およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）からなる群から選ばれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉｘ）において、使用されるアルコールが、メタノールおよびエタノールから選ばれる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ａ．  （ｉ）グルコース酵母抽出物寒天（ＧＹＥ）培地中でサッカロミセス属種（ＭＴＣＣ ５５４８）、（ｉｉ）ニュートリエントブロス中でバチルス属種（ＭＴＣＣ ５５４９）、および（ｉｉｉ）キングＢ培地中でシュードモナス属種（ＭＴＣＣ ５５５０）を、３０〜４０℃の範囲の温度で、６〜３６時間の範囲の期間培養すること；
ｂ．  工程（ａ）の細胞を、式１Ａの化合物０．６×１０-4〜１．２×１０-4Ｍと共に、２８〜３８℃の温度範囲で、５〜２０分の範囲の期間インキュベーションすること；
ｃ．  工程（ｂ）で得られたインキュベーションされた試料を、グルテルアルデヒドを用いて、７．４〜７．６の範囲のｐＨの緩衝液中で、１０〜１２時間の範囲の期間、２８〜３８℃の範囲の温度で固定すること；
ｄ．  工程（ｃ）で得られた試料を、前記緩衝液で、０．５〜１．０時間の範囲の期間洗浄すること；
ｅ．  工程（ｄ）で得られた試料を、四酸化オスミウムおよび緩衝液で後固定し、前記緩衝液で洗浄すること；
ｆ．  勾配をつけた水エタノール系により、工程（ｅ）で得られた試料から水を除去すること；
ｇ．  前記緩衝液中で工程（ｆ）で得られた試料をすすぎ、スパッタコーター中で金でコーティングして、単純顕微鏡下で見える染色された標本を得ること；
ｈ．  異なる色強度および染色細胞の形で生細胞を区別することを含む、請求項１に記載の化合物を用いた生細胞の染色方法。
【請求項１１】
使用される緩衝液がリン酸緩衝液である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
センサーと生細胞との結合が、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析により確認される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
染料で染色した後の細胞の生存能が、細胞分裂の発生を示す凹面スライドにおけるハンギングドロップ法によって試験微生物における二分裂を観察することにより証明される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
式１Ａの化合物の可逆的結合が、光学顕微鏡およびＵＶ−Ｖｉｓ分光法を介して、クエン酸ナトリウムの２０％（ｗ／ｖ）溶液で細胞を脱染することにより確認される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
式１Ａの化合物による生細胞の染色が、生細胞の細胞壁上に存在するＡＴＰとセンサーとのヘプタ配位種の形成（ここで３個のリン酸基はＺｎと配位し、得られる31Ｐ ＮＭＲは３個のリン原子すべてに関してシフトする）により行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
式１Ａの化合物の吸収スペクトル滴定曲線が、ＡＴＰの添加後に４０ｎｍのスペクトルシフトを示し、ＡＴＰとの化合物の結合定数が、（９７８±４）Ｍ-1である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
水における式１Ａの化合物の溶解性が、α−ＣＤ（シクロデキストリン）の存在下で、約７〜７．５倍増加する、請求項１に記載の式１Ａの化合物。
【請求項１８】
Ｚｎ（ＩＩ）に基づいた比色センサーＬ．Ｚｎの吸収極大がα−ＣＤ（シクロデキストリン）の水溶液を加えると５ｎｍシフトする傾向があることを示すことにより、式１Ａの化合物の染色の強度がα−ＣＤ（シクロデキストリン）の存在下で増加する、請求項１に記載の式１Ａの化合物。
【請求項１９】
式１Ａの化合物による染色は１０〜２０分で行われ、α−ＣＤ（シクロデキストリン）の存在下では１秒〜２分で行われることにより、α−ＣＤ（シクロデキストリン）の存在下で式１Ａの化合物の染色の速度が増加すること示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
染料の無いサッカロミセス属種の細胞表面のＳＥＭ画像はなめらかであると認められたが、染料の存在下でのサッカロミセス属種の細胞表面は粗いと認められた、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
染料の無いグラム陽性菌のＳＥＭ画像はなめらかであると認められ、染料を有するものは粗いと認められた、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
染料の無いグラム陰性菌のＳＥＭ画像はなめらかであると認められ、染料を有するものは粗いと認められた、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
グラム陽性菌の染色された細胞は、染色されたグラム陰性菌のものと比較して長く見えた、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞が生存可能な染色剤として有用な式１Ａの化合物に関する。
【０００２】
【化１】
2013533903.tif 000002
【０００３】
本発明はまた、水系および生理的ｐＨにおいて、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、ピロリン酸（ＰＰｉ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、およびリン酸よりも、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に対して選択性を有するＺｎ（ＩＩ）に基づいた比色センサー（Ｚｎ（ＩＩ）のテトラアザ大環状錯体）に関する。
【０００４】
本発明はまた、純水中での溶解性に起因して、嚢胞性線維症の研究に使用される、細胞増殖動態を研究するために使用される、真核細胞および原核細胞の染色剤として有用な亜鉛錯体（Ｌ．Ｚｎ）（スキーム１、式１Ａ）に関する。
【背景技術】
【０００５】
センサー分子は、一般に、結合が誘発するスペクトル（電子スペクトル、蛍光スペクトル、およびＮＭＲスペクトル）特性（発色シグナル伝達単位についての）の変化あるいは酸化還元電位データ（酸化還元活性シグナル伝達単位についての）を報告することができる、標的分析物に特異的でありシグナル伝達単位に共有結合した、レセプターフラグメントからなる。センサー分子のうち、比色センサーは、結合事象を肉眼で検出できるので、他のものと比べて明らかに優れている。［（ａ）Ｖaｚｑｕｅｚ，Ｍ．；Ｆａｂｂｒｉｚｚｉ，Ｌ．；Ｔａｇｌｉｅｔｔｉ Ａ．；Ｐｅｄｒｉｄｏ，Ｒ．Ｍ．；Ｇｏｎｚaｌｅｚ−Ｎｏｙａ，Ａ．Ｍ．；Ｂｅｒｍｅｊｏ，Ｍ．Ｒ．「Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．」２００４，４３，１９６２．（ｂ）Ｌｉｎ，Ｚ．；Ｏｕ，Ｓ．；Ｄｕａｎ，Ｃ．；Ｚｈａｎｇ，Ｂ．；Ｂａｉ，Ｚ．「Ｃｈｅｍ．ｃｏｍｍｕｎ．」２００６，６２４．（ｃ）Ｍｉｙａｊｉ，Ｈ．；Ｓｅｓｓｌｅｒ Ｊ．Ｌ．「Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．」２００１，４０，１５４．（ｄ）Ｌｉｂｒａ，Ｅ．Ｒ．；Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．Ｊ．「Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．」２００６，１４８５．（ｅ）「Ｚｈａｎｇ，Ｄ．；Ｚｈａｎｇ，Ｍ．；Ｌｉｕ Ｚ．；Ｙｕ，Ｍ．；Ｌｉ，Ｆ．；Ｙｉ，Ｔ．；Ｈｕａｎｇ，Ｃ．「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．」２００６，４７，７０９３．（ｆ）Ｈａｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｈ．「Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．」２００２，４１，３８０９．（ｇ）Ｊｏｓｅ，Ｄ．Ａ．；Ｋａｒ，Ｐ．；Ｋｏｌｅｙ，Ｄ．；Ｇａｎｇｕｌｙ，Ｂ．；Ｔｈｉｅｌ，Ｗ．；Ｇｈｏｓｈ，Ｈ．Ｎ．；Ｄａｓ，Ａ．「Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」，２００７，４６，５５７６．（ｈ）Ｊｏｓｅ，Ｄ．Ａ．；Ｋｕｍａｒ，Ｄ．Ｋ．；Ｋａｒ，Ｐ．；Ｖｅｒｍａ，Ｓ．；Ｇｈｏｓｈ，Ａ．；Ｇａｎｇｕｌｙ，Ｂ．；Ｇｈｏｓｈ，Ｈ．Ｎ．；Ｄａｓ，Ａ．「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ」，２００７，６３，１２００７．（ｉ）Ｊｏｓｅ，Ｄ．Ａ．；Ｋｕｍａｒ，Ｄ．Ｋ．；Ｇａｎｇｕｌｙ，Ｂ．；Ｄａｓ，Ａ．「Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．」２００４，６，３４４５．（ｊ）Ｊｏｓｅ，Ｄ．Ａ．；Ｋｕｍａｒ，Ｄ．Ｋ．；Ｇａｎｇｕｌｙ，Ｂ．；Ｄａｓ，Ａ．「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．」２００５，４６，５３４３．（ｋ）Ｊｏｓｅ，Ｄ．Ａ．；Ｓｉｎｇｈ，Ａ．；Ｇａｎｇｕｌｙ，Ｂ.；Ｄａｓ，Ａ．「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．」２００７，４８，３６９５（ｌ）Ｈｕ，Ｓ．；Ｇｕｏ，Ｙ．；Ｘｕ，Ｊ．；Ｓｈａｏ，Ｓ．「Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２００８，６，２０７１．］。
【０００６】
蛍光に基づいたセンサーによって低濃度の所望の分析物が検出できるということは一般に受け入れられている事実である。したがって、微量または極微量で存在する標的分析物の目視検出を可能にする比色センサーを開発することは化学者および材料科学者とっての課題である。さらに、水溶液中、特に生理的条件での標的分析物の検出は、その潜在的な応用可能性のため、さらに大きな重要性がある。
【０００７】
アニオンの選択的認識および感知用の化学センサーの設計は非常に重要な領域である［（ａ）Ｈｕ，Ｓ．；Ｇｕｏ，Ｙ．；Ｘｕａ，Ｊ．；Ｓｈａｏ，Ｓ．「Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２００８，６，２０７１，（ｂ）Ｚｅｉｄｅｒ，Ｆ．Ｈ．「Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」２００８，４７，１２６４．］。
【０００８】
この文脈において、水性環境および生理的ｐＨ下で生物学的に重要なアニオンを検出し感知することができるセンサーは、生物学的マーカーとしてその応用可能性のため、非常に重要である。［Ｋｈａｋｈ，Ｂ．Ｓ．；Ｎｏｒｔｈ，Ｒ．Ａ．「Ｎａｔｕｒｅ」，２００６，４４２，５２７．］。過去の我々の報告で［（ａ）Ｇｈｏｓｈ，Ａ．；Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ，Ａ．；Ｊｏｓｅ，Ｄ．Ａ．；Ｍｉｓｈｒａ，Ｓ．Ｋ．；Ｍｉｓｈｒａ，Ｓ．；Ｄａｓ，Ａ．「Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．」２００８，８０，５３１２．（ｂ）Ｊｏｓｅ，Ｄ．Ａ．；Ｍｉｓｈｒａ．Ｓ．；Ｇｈｏｓｈ，Ａ．；Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ，Ａ．；Ｍｉｓｈｒａ，Ｓ．Ｋ．；Ｄａｓ，Ａ．「Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００７，９，１９７９．］、我々は、リポーター基としてのペンダントアゾ官能基を有するＺｎ（ＩＩ）に基づいた配位錯体が、その場で産生されるＡＴＰに対する選択的結合を介して酵母細胞（サッカロミセス・セレビシエ）の染色に使用することができることを示した。真核微生物であるサッカロミセス・セレビシエは、ＡＴＰの形態でそのエネルギーを誘導し、当該真核細胞の表面は、負電荷を持つＡＴＰイオンに曝露されている。当該細胞は、約５分間センサー分子１．Ｚｎに曝露されると染色されることが分かった。これらの初期の結果によって我々は、原核微生物用の比色染色剤としてのより効率的なレセプター分子を発見する可能性を探るとともに、成長動態の研究に対する意欲が湧いた。この文脈において、好適な染色剤は、より実用に向いている。
【０００９】
ＡＴＰは、生物系における普遍的なエネルギー担体であり、生化学反応、能動輸送、核酸合成、筋活動、および細胞の運動に寄与する。［（ａ）Ｉｖａｎｏｖａ，Ｅ．Ｐ．；Ａｌｅｘｅｅｖａ，Ｙ．Ｖ．；Ｐｈａｍ，Ｄ．Ｋ．；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｐ．；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｄ．Ｖ．「Ｉｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」２００６，９，３７．（ｂ）Ｌｅｅｖｙ，Ｗ．Ｍ．；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｌａｋｓｈｍｉ，Ｃ．；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．；Ｍａｒｑｕｅｚ，Ｍ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ｄ．「Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．」２００６，１５９５．（ｃ）Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．Ｌ．「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．」１９８６，２３３，３０９．］サイトゾルのＡＴＰ濃度の上昇は、ＡＴＰ依存性Ｋ+チャネルの膜脱分極の機能における重要事象である。したがって、経時的に生細胞中の細胞ＡＴＰレベルを測定することは、その代謝状態の評価につながるので極めて重要である。この点に関して、生物系に対して毒性がなく、細胞増殖を維持しかつその速度を評価することができるべきであるので、染色試薬の性質は重要である。さらに、原核生物および真核生物が異なる細胞構造を有するということは周知である。原核生物は、真核生物では存在する膜結合型細胞小器官を有していない（例えば、真核生物はミトコンドリアを有する）。原核生物のなかでは、グラム陽性菌およびグラム陰性菌が、異なる細胞壁構造および化学組成を有する［（ａ）Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｃｏｘ，Ｍ．Ｍ．；「Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，第三版；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３．（ｂ）Ｂｅｒｇｅｙ，Ｄ．Ｈ．；Ｊｏｈｎ，Ｇ．Ｈ．；Ｎｏｅｌ，Ｒ．Ｋ．；Ｐｅｔｅｒ，Ｈ．Ａ．Ｓ．「Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」，第九版；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９４．］。したがって、染色剤が、より小さな細菌の膜を効果的に描写できることが染色剤とってより重要となる。したがって、そのより広範な用途を確認するため、我々は、バチルス・メガテリウムおよびシュードモナス・フルオレセンスと呼ばれる２種類の異なる生細胞を用いてこの試薬（Ｌ．Ｚｎ）（スキーム１、式１Ａ）を試験した。新鮮な水は生命にとって不可欠であり、ヒトによる消費、食品調製、および製薬などの産業用の新鮮な水の様々な水源における細菌をモニタリングする方法が、微生物学的な品質を確保するために必要とされている。様々な可能性のうち、最も一般的な方法は培養法であり、これは結果を得るためには通常は２４時間余りが必要であり、生菌のいくらかは培養するのが困難なので細菌数が時には過小評価されてしまう。さらに、定量化および酵母生存能が、発酵［（ａ）Ｃａｈｉｌｌ，Ｇ．；Ｗａｌｓｈ，Ｐ．Ｋ．；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｄ．Ｊ．「Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．」１９９９，５７，７２．（ｂ）Ｚｈａｎｇ，Ｔ．；Ｆａｎｇ，Ｈ．Ｈ．Ｐ．；「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．」２００４，２６，９８９．］、健康診断［Ｂｉｓｗａｓ，Ｋ．；Ｒｉｅｇｅｒ，Ｋ．；Ｍｏｒｓｃｈｈａ¨ｕｓｅｒ；「Ｊ．Ｇｅｎｅ」，２００３，３０７，１５１．］、排水処理［Ｄａｎ，Ｎ．Ｐ．；Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ，Ｃ．；Ｂａｓｕ，Ｂ．「Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」２００３，８７，５１．］、歯垢［Ｍｉｌｌｓａｐ，Ｋ．Ｗ．；Ｍ．ｖａｎ ｄｅｒ，Ｈ．Ｃ．；Ｂｏｓ，Ｒ．；Ｂｕｓｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｊ．ＦＥＭＳ，「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．」１９９８，２１，３２１．］、および生物工学システム［Ｎａｒｖｈｕｓ，Ｊ．Ａ．；Ｇａｄａｇａ，Ｔ．Ｈ．「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」２００３，８６，５１Ｓ．］には重要である。このため、細胞の実施可能な染色に基づいた、より迅速でより確実な方法の開発が必要である。蛍光染色試薬はより一般的であるが、比色分析染色剤の使用は、検出技術が単純なので、それ自体重要である。簡単な光学顕微鏡を用いて、染色細胞を見ることができる。多くの場合、特定の蛍光マーカー（例えば、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジクロリドＤＡＰＩ）で染色された細胞は生育不能である［Ｂａｓｋｉｎ，Ｄ．Ｓ．；Ｎｇｏ，Ｈ．；Ｄｉｄｅｎｋｏ，Ｖ．Ｖ．「Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．」２００３，７４，３６１．］。さらに、比較的注目度の少ない重要な側面の１つは、酵母におけるエネルギー依存性プロセスの時間プロファイル作用であり、これは、我々が、増殖している菌と結合しているＡＴＰを介した（つまり増殖動態応答に対するその相関性）迅速、容易、かつ正確な様式での生物プロセスをモニタリングすることを可能にする。
【００１０】
より重要なことには、亜鉛錯体（Ｌ．Ｚｎ）（スキーム１、式１Ａ）は、その場で生じたＡＴＰに対する結合を介した、様々な生体細胞用の比色分析染色剤として使用することができる。この染料は、本質的には非親油性であり、生菌（真核生物および原核生物）に対して毒性が無いことが分かった。さらに、染色細胞は、そのそれぞれの培地中で増殖することが分かり、これにより、染色後であっても菌の生存能力が維持されることが確認された。
【００１１】
Ｓｈａｗｎ Ｃ．ＭｃＣｌｅｓｋｅｙら．「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」２００３，１２５，１１１４．の論文を参照でき、ここでは、チップを用いたアレイの文脈における、センサーと指示薬置換アッセイとのコンビナトリアルライブラリーの使用により、構造が類似している分析物を水溶液中で区別することが可能になることが報告された。超分子化学の原理をパターン認識と合わせるがこの感知プロトコルにつながる。彼らは、個々のライブラリメンバー間の交差反応性を調査する手段として、分析物と他のリン酸誘導体との混合物とを分析した。ここで、この研究の欠点は、センサーが三リン酸に対して選択的なことであるが、我々のシステムは、ＡＴＰのみに選択的である。
【００１２】
Ｃｈｕｎ Ｌｉら「Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．」２００５，４４，６３７１の論文を参照すると、ここでは、水溶液中で作動するＡＴＰ用の新規な比色かつ蛍光センサーが開発された。この知見は、水溶性共役ポリマーの用途を拡大するだけでなく、ＡＴＰの容易なモニタリングのための新規な手法を提供する。したがって、彼らは、彼らのシステムが、プローブの膜透過性を向上させるために、ポリチオフェン中の置換基を適切に設計した後に通常の細胞アッセイに適用できることになると期待している。しかし、ここでは彼らは生細胞の染色は確認しなかった。
【００１３】
Ｓｈｅｎｌｉａｎｇ Ｗａｎｇら「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」２００６，１２８，１０３８０の論文を参照すると、ここでは、ターンオン（turn-on）ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）蛍光センサーが初めて発見されているので、したがって半設計（semi-designed）多様性指向型センサー手法からはほど遠いものである。ＧＴＰに対するＧ４９のこのかつてない高選択性およびその可視緑色蛍光の増加に基づいて、彼らは、この化合物を「ＧＴＰ Ｇｒｅｅｎ」と呼ぶことを提案している。主な欠点としては、肉眼で検出することができる可視的な色の変化を彼らは何も見出さなかったことである。彼らは単にＧＴＰのフルオロセンサーに伴う変化を示すのみである。
【００１４】
Ｏｋｏｈら「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，４５，１４７６４」の論文を参照すると、ここでは、大腸菌のリン酸結合タンパク質に基づいた無機リン酸（Ｐｉ）用の新規なバイオセンサーが開示された。２種類のシステイン変異体が導入され、６−ヨードアセトアミドテトラメチルローダミンで標識化された。互いに物理的に接近し、正しく配向すると、２つのローダミン染料は相互作用し、非共有結合性二量体を形成する。この状態では、単量体ローダミンの高蛍光強度とは異なり、蛍光はわずかであるかまたは無い。Ｐｉ結合に伴う立体構造の変化の結果としてローダミン間の距離および配向が変化するように標識部位が配置される。この移動は、染料間の相互作用の程度を変化させる。試験されたもの（Ａ１７Ｃ、Ａ１９７Ｃ）の最も良い変異体は、Ｐｉが結合すると蛍光強度が平均して〜１８倍増加する。センサーの用途としては、ヘリカーゼがＤＮＡに沿って移動するにつれたリアルタイムでのＡＴＰ加水分解の測定用に示されている。ローダミンフルオロフォアの使用およびこの二重標識戦略の可能性の両方から、この新規なセンサーの利点が検討されている。ここでは、彼らは無機リン酸を研究したのみであり、生体リン酸に伴う変化を示さなかった。これは、この系の主な欠点である。
【００１５】
Ａｋｉｏ Ｏｊｉｄａら「Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ Ｊ．」２００６，１，５５５の論文を参照すると、ヌクレオシドピロリン酸（ヌクレオシドＰＰ）誘導体は、細胞中に広く存在し、様々な生物学的事象に極めて重要な役割を果たすことが記載されていた。彼らは、配位化学を利用したヌクレオシドＰＰ用の新規な蛍光化学センサーを報告している。２個のＺｎ（ＩＩ）−ジピコリルアミン単位を含む当該化学センサーは、水溶液中でヌクレオシドＰＰに強く結合し（ＰＰ結合に関してＫa＞１０６Ｍ-1）、二重発光の変化によりそれらを感知する。詳細な蛍光およびＵＶ／Ｖｉｓスペクトル研究により、ヌクレオシドＰＰに結合する際の化学センサーの発光変化が示された。これは、アニオンに誘導された配位の転位に基づいた特殊な感知システムである。彼らはまた、ヌクレオシドＰＰ変換を伴う２つの重要な生物学的プロセス（アピラーゼにより触媒されたヌクレオシドＰＰの加水分解およびｂ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼにより触媒されたグリコシル転移）のリアルタイムモニタリングにおけるこれらの化学センサーの有用性を実証した。主な問題としては、肉眼で検出することができる可視的な色の変化を彼らは何も見出さなかったことである。彼らが示すものはすべて発光（luminescence）を介したものである。
【００１６】
Ａｋｉｏ Ｏｊｉｄａら「Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．」２００６，４５，５５１８の論文を参照すると、ここでは、近年大きな注目を集めている生物学的に重要なアニオンに対する分子認識および感知システムの開発が説明されていた。様々なアニオンの中でも、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、無機ピロリン酸、およびリンタンパク質などのヌクレオシドピロリン酸を含むリン酸誘導体が、生物学的システムにおけるそれらの中心的な役割のため、重要な感知標的となる。ＡＴＰは、普遍的なエネルギー源としてだけでなく、多くの生物学的プロセスにおける細胞外シグナル伝達の媒介物質としても知られており、タンパク質のリン酸化は、生細胞中のシグナル伝達カスケードの遍在的な調節機構と認識されている。ここでは、彼らはまた、可視的な色の変化を何も示さなかった。彼らは、新規な蛍光化学センサーを開発したのみである。
【００１７】
Ｚｄｅｎｅｋ Ｋｅｊｉｋら「Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．」，２００６，１５３３の論文を参照すると、ここでは、ＡＴＰ用のセンサーとして１種のテトラブルシン（tetrabrucin）−ポルフィリンが報告されていた。彼らは、ＡＤＰおよびＡＭＰの存在下でのＡＴＰに対する選択性を設計し試験した。しかし、このシステムの欠点は、彼らはピロリン酸用の蛍光プローブを１種見出したが、どのような生物学的用途にも使用できるかどうかの説明がないことである。
【００１８】
Ｙａｓｕｙｕｋｉ Ｔｓｕｂｏｉら，「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ」，２００７，２５３，８４２２の論文を参照すると、ここでは、マイクロチップアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）センサーの製作において使用される有望な技術として研究された酵素ルシフェラーゼのレーザー誘起前方転写（laser-induced forward transfer）（ＬＩＦＴ）が示された。ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）がルシフェラーゼの析出用の基質として選択された。ガラスおよびポリスチレンなどの他の固体基質と比較して、ＰＤＭＳは、その柔軟性によって、ルシフェラーゼのマイクロスポットの固定化用の優れた基質になることが分かった。３５５ｎｍのレーザーを用いたＰＤＭＳ基質へのルシフェラーゼのＬＩＦＴはうまくいったが、当該酵素の生物活性は維持された。ルシフェラーゼに起因する黄色の発光が、ルシフェリンとＡＴＰとの酵素反応からのＰＤＭＳチップ上に移動したスポットから観察された。マイクロチップＡＴＰセンサーもＰＤＭＳチップに小さなフォトダイオードを付着させることにより作成された。作成されたマイクロチップに基づいて、スポットからの発光強度とＡＴＰ濃度とのミカエリス・メンテンの関係が確認された。ＬＩＦＴ技術とＰＤＭＳ基質との組み合わせを用いてバイオセンサーを作成する可能性は非常に高いことが示された。彼らは、材料科学の面からある程度の応用を行ったが、彼らのシステムによる生物学上の応用は示されなかった。
【００１９】
Ｄａｓら「Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．」，２００７，９，１９７９および「Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．」，２００８，８０，５３１２の論文を参照すると、ここでは、ピコリルアミン誘導体との新規な発色性のＺｎ（ＩＩ）錯体、および様々な生物学的に重要なリン酸とのその相互作用が水溶液（ｐＨ〜７．２）中で研究されている。可視的な色の変化は、ＡＴＰとの結合で検出することができるが、他の生物学的に関連するアニオン（ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＰＰｉ、またはリン酸）を使用すると、そのような変化は観察されない。ミトコンドリア（真核生物中の）によりその場で生じたＡＴＰに対する結合を介して、様々な生体細胞用の染色剤としてＺｎ錯体を使用することができる。原核生物（細菌）に関しては、ミトコンドリアを有していないので、細胞膜が細胞のエネルギー変換を行う。ＡＴＰは、真核生物では全く見られない細胞膜上の原核生物の特殊な細胞構造において産生される。これら染色された細胞は、通常の光学顕微鏡法で見ることができる。この試薬は、グラム陽性およびグラム陰性菌（原核生物）を区別するためであっても使用することができる。この染料は、本質的には非親油性であり、生菌（真核生物および原核生物）に対して毒性が無いことが分かった。さらに、染色された細胞は、それぞれの培地中で増殖することが分かり、これにより、市販の多くの他の染料と違って、染色後であっても当該微生物の生存能力が維持されることが確認された。我々の過去の研究では、主な問題は溶解性であり、上記化合物は純水に可溶ではなく、センサーを可溶化するためには５％エタノールが必要であり、同時に、染色の色強度は、本発明と比較すると低かった。
【００２０】
Ｐｅｎｇ Ｊｉａｎｇら「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，２００７，４６，１２９７９の論文を参照すると、ここでは、ＰＩＩシグナル伝達タンパク質は、天然では最も広く分布するシグナル伝達タンパク質に含まれ、細菌から高等植物までの範囲の生物中での窒素同化を制御することが開示された。ＰＩＩタンパク質は、細胞の代謝状態のシグナルを統合し、シグナル伝達酵素または重要な代謝酵素であるレセプターと相互作用したり調節したりする。大腸菌を用いた過去の研究では、ＰＩＩは、ＰＩＩのシグナル伝達機能はすべてＰＩＩへのＡＴＰの結合を必要とすることと、ＡＴＰ結合はＰＩＩへのＲ−ケトグルタル酸の結合と相乗的であることを示した。さらに、窒素および炭素状態の細胞シグナルであるＲ−ケトグルタル酸は、ＰＩＩの機能を強力に調節することが観察された。彼らは、再構成されたシグナル伝達システムにおいて、ＡＤＰが、２種類の大腸菌ＰＩＩレセプターであるＡＴａｓｅおよびＮＲＩＩ（ＮｔｒＢ）のＰＩＩ調節に対してと、シグナル伝達ＵＴａｓｅ／ＵＲによるＰＩＩウリジニリル化に対して劇的な効果を有することを実証した。ＡＤＰは、Ｒ−ケトグルタル酸に拮抗的に作用した、すなわち、低アデニリレート（adenylylate）エネルギー充足は、窒素制限のシグナル伝達を減少するように作用した。再構成されたシグナル伝達システムで起こる相互作用を個々に研究することにより、彼らは、実質的にすべてのＰＩＩおよびＰＩＩ−ＵＭＰ相互作用がすべてＡＤＰにより影響されることを観察した。彼らはまた、特定の条件下では、ＰＩＩ三量体の３つのヌクレオチド結合部位がＡＴＰおよびＡＤＰの組み合わせにより占められる可能性があることを示唆している。全体として、結果は、ＰＩＩタンパク質が、Ｒ−ケトグルタル酸のセンサーとして働くことに加えて、アデニリレート（adenylylate）エネルギー充足の直接的なセンサーとして働く能力を有することを示す。彼らは、生体細胞の染色に関しては研究していない。
【００２１】
Ｈａｏ Ｗａｎｇら「Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．」，２００８，６，１６２の論文を参照すると、ここでは、ＡＴＰ用の新規なダイトピックコール酸に基づいた蛍光化学センサーが記載されていた。リン酸であるＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＴＴＰとのその相互作用が調査されている。ＡＴＰが、ｐＨ７．４にて、センサーの１：１ＣＨ3ＣＮ水溶液に加えられると、蛍光の著しい減少が観察されたが、他のゲスト分子は、はるかに小さな効果を示した。センサーとＡＴＰとの錯体は、ＵＶ、1Ｈ、13Ｃ、および31Ｐを組み合わせたＮＭＲ分光法で確認された。このセンサーの特殊さは、それぞれの結合定数から証明されるように、他のヌクレオチドよりも、３３〜１２４倍の選択性でＡＴＰと結合するということである。このセンサーは非常に感受性の高い検出プローブであるので、たった３０ｎＭのＡＴＰでセンサーの蛍光を１５％消光することができる。彼らは、センサーシステムをＡＴＰと選択的に結合させたが、生体細胞を染色するためにはセンサーを使用しておらず、またセンサーは生理学的条件で作用しなかった。
【００２２】
Ｔａｅ−Ｈｙｕｋ Ｋｗｏｎら「Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．」２００８，１４，９６１３の論文を参照すると、ここでは、他のヌクレオチドと比べて、ＨＥＰＥＳ緩衝液中でチミジン５’−三リン酸（ＴＴＰ）への結合に際して選択的な発光増加を表すアンサンブルセンサーシステムが報告された。当該アンサンブルシステムは、エネルギー受容体およびエネルギー供与体から成っていた。ヌクレオチドのうち、ＴＴＰに対する選択的認識および発光増加は、Ｚｎ2+−サイクレン（サイクレン＝１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン）に対するチミン単位の強い結合およびｍＣＰ部分とＦＩｒｐｉｃ部分との分子間エネルギー移動により達成された。彼らは、このセンサーを用いた生物学的用途は何ら示さなかった。
【００２３】
Ａｋｉｈｉｋｏ Ｉｓｈｉｄａら「Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ」，２００８，３９２，９８７の論文を参照すると、ここでは、酵素的サイクリングおよびＦｅ（ＩＩＩ）−キシレノールオレンジ（ＸＯ）錯体形成を用いたＡＴＰのアッセイ用比色法の開発が記載された。黄色から紫まではっきりとした色の変化を示すＦｅ（ＩＩＩ）−ＸＯ錯体の色の特徴は、スクリーニング作業における目視の助けになる。この方法では、微量のＡＴＰはピルビン酸に変換され、これは、カップリングされた酵素反応により指数関数的にさらに増幅された。最終的に、ピルビン酸は、ピルビン酸オキシダーゼ反応およびＦｅ（ＩＩ）酸化によって、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＸＯ錯体に変換された。アッセイ結果として、黄色または紫色が観察され、黄色は、ＡＴＰ濃度が試験の基準よりも低いことを示し、紫色は、ＡＴＰ濃度が基準よりも高いことを示す。当該方法は、牛乳に加えた大腸菌細胞から抽出したＡＴＰのアッセイに応用された。彼らは、生体細胞の染色に関しての研究や、どのような細胞増殖動態の研究も行わなかった。
【００２４】
Ｙｉｍｉｎ Ｓｕｎら「Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２００８，６，３０４４の論文を参照すると、ここでは、グアニジノカルボニルピロール部分を有する新規な４−アミノ−１，８−ナフタルイミドに基づいた蛍光化学センサーが開示された。当該センサーは、水溶液中でＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、および他の無機アニオンと比べてピロリン酸との選択的な蛍光増加を示す。このシステムの主な欠点は、彼らが、当該システムを何らの生体細胞とも確認しなかったことである。
【００２５】
Ｉｔａｒｕ Ｈａｍａｃｈｉら「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」２００８，１３０，１２０９５の論文を参照すると、ここでは、小分子化学センサーを用いた蛍光感知が、様々な生体物質の機能の解明のための汎用性のある技術であることが記載された。この蛍光化学センサーは、金属−アニオン配位化学を用いたＡＴＰなどのヌクレオシドポリリン酸用に開発された。当該化学センサーは、ヌクレオシドポリリン酸に関して、結合モチーフとしての２，２’−ジピコリルアミン（Ｄｐａ）−Ｚｎ（ＩＩ）の部位２つと蛍光感知単位としてのキサンテンとからなる。化学センサー１−２Ｚｎ（ＩＩ）は、大きな蛍光増強（Ｆ／Ｆｏ＞１５）および強い結合親和性を伴ってヌクレオシドポリリン酸を選択的に感知するが、一リン酸種および様々な他のアニオンでは、検出可能な蛍光変化は誘導されなかった。１−２Ｚｎ（ＩＩ）の「ターンオン」蛍光は、新規の機構に基づいており、これは、先例のない亜鉛結合水の求核攻撃により形成された非蛍光非共役状態からキサンテン環の共役形態の結合誘導性の回復を伴う。当該センサーが選択的かつ高感受性でヌクレオシドポリリン酸を検出する能力により、生細胞中の貯蔵されるＡＴＰ微粒子の蛍光視覚化における生物分析に当該センサーを適用することができ、当該センサーの潜在的有用性を示している。彼らは、ある程度の生体細胞染色を研究し、共焦点顕微鏡を介して細胞染色を示したが、我々の本発明では、簡単な光学顕微鏡を介して染色細胞を見ることができる。
【００２６】
Ｈｏｎｇｍｅｉ Ｗｕら「Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」２００９，４８，４０８の論文を参照すると、ここでは、他のリボヌクレオチドと比べた水性媒体中のアデノシン三リン酸の選択的検出のための、メタ部位にて中心にあるベンゼン環内のアミド基を含む２つの三座Ｎ2Ｏ単位を調節することにより調製された、発色団単位と水素結合トリガー部位とからなるメタロヘリカルトライアングルが開発された。彼らは、センサーシステムをＡＴＰと選択的に結合させたが、生体細胞との染色剤としてのセンサーを研究していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
Ａｉｋｏ Ｎｏｎａｋａら「Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２００８，６，３６２１の論文を参照すると、ここでは、水溶液中における多リン酸の蛍光検出用の新規な手法が記載されている。ＺｎＩＩ−ＤＰＡ（ＤＰＡ＝ジピコリルアミン）−付加フェニルボロン酸は、アリザリン染料と共にアセンブリを形成し、この中では、当該染料が、ＺｎＩＩ−ＤＰＡ部分における配位亜鉛（ＩＩ）と結合しやすいことが開示されている。推定分析物としてピロリン酸（ＰＰｉ）を加えることによって錯体が再編成され、代替のボロン酸エステルアセンブリが産生され、これは、肉眼で検出可能な蛍光の増加をもたらす。当該システムが、他のリン酸と比べてＰＰｉ選択性を示したことは興味深いことである。このシステムの欠点は、彼らは、様々なリン酸と結合し、一種類のリン酸に選択的に結合するものではないセンサーを見出したので、したがってこれはＡＴＰに対して選択的なセンサーではない。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
＜本発明のＺｎ（ＩＩ）に基づいた比色センサーＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）と「Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．」２００８，８０，５３１２〜５３１９および「Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔｓ．」２００７，９，１９７９〜１９８２に記載のＺｎ（ＩＩ）に基づいた比色センサー１．Ｚｎ（スキーム１ｂ）との比較＞
本発明者らの過去の論文（「Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ」，２００７，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１０，１９７９〜１９８２および「Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．」２００８，８０，５３１２〜５３１９）に記載のＺｎ（ＩＩ）に基づいた錯体［１．Ｚｎ（スキーム１ｂ）］は、本発明に記載の［Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）］とは異なる。これらの２つの論文で報告した所見は、実用化され得る染色剤はいずれも、水溶液に完全に可溶性でなければならないので、１．Ｚｎは、純粋な水溶液における有用性の面では重大な欠点を有することを示した。１．Ｚｎは、水に不溶性であり、これを可溶化するためには一定量のアルコールを使用しなければならず、その後にこの試薬のこのアルコール溶液を染色目的に使用することができる。しかしながら、当該錯体は、原核細胞および真核細胞に毒性が無いことが分かったが、アルコールの使用は、生体に対するある程度の副作用がある場合があるので望ましくないかあるいは実際の細胞染色実験には許容されなかった。本発明は、この問題を克服することができた。
【００２９】
本特許出願では、我々は、式１Ａの、Ｚｎ（ＩＩ）に基づいた別の錯体Ｌ．Ｚｎを報告し、これは、肉眼で検出することができる関連する色の変化を伴ってＡＴＰに結合することができる。
【００３０】
この新規な試薬は水に完全に可溶性であり、したがって、細胞染色実験に関する任意の実用用途に適しており、かつ最もふさわしいものである。さらに、ＡＴＰに結合すると、この錯体の吸収極大は、４０ｎｍ（４６３ｎｍから５０３ｎｍまで）シフトし、これは、我々が過去の論文で報告した試薬（１．Ｚｎ）と比較して、より特徴的かつより鮮明な色の変化をもたらした。
【００３１】
我々の過去の試薬（１．Ｚｎ）では、シフトは、エタノール−水性緩衝液中でわずかに２１ｎｍであった。本発明のＺｎ（ＩＩ）−錯体Ｌ．Ｚｎ（本特許出願で報告の）の４０ｎｍというより大きなシフトは、スペクトル測定には極めて重要であり、したがって、細胞増殖動態研究には極めて重要である。
【００３２】
さらに、適切なセンサーは、至適な結合定数値を有することが望ましい。本特許出願で報告の本発明のＺｎ（ＩＩ）−錯体の結合定数は、我々が過去に報告した（１．Ｚｎ）の（１１３０±６）Ｍ-1）よりも低い（９７８±４）Ｍ-1である。これにより、過去に報告したＺｎ（ＩＩ）−錯体（１．Ｚｎ）と比較して、このセンサーはより可逆的にＡＴＰに結合することができる。
【００３３】
より重要なことには、このＺｎ（ＩＩ）−試薬のより高い溶解度は、α−シクロデキストリン（α−ＣＤ）（図８ではａ＝Ｌ．Ｚｎのみ、ｂ＝Ｌ．Ｚｎ＋α−ＣＤ）の使用を介して達成することができる。α−ＣＤの存在下では、図８に見られるように、α−ＣＤを加えることにより、水溶液中のＬ．Ｚｎの溶解度は増加し、より多量のＬ．Ｚｎが溶液に移ることを示す色強度が増加する。このような所見は、過去の試薬１．Ｚｎについては報告されなかった。α−ＣＤの使用は、薬物担体としては一般的であり、生細胞に対して完全に無毒であることが知られている。したがって、Ｚｎ（ＩＩ）−錯体（本特許出願で報告の）と組み合わせたα−ＣＤの使用は、より高濃度でのこのセンサー分子の使用機会を提供し、これはより良好な色の変化の達成（図１３、Ｄ１はα−ＣＤを使用せず、Ｄ２はα−ＣＤを使用）、および生細胞のより迅速な染色に役立つことができる。
【００３４】
α−ＣＤの存在下で本発明のＺｎ（ＩＩ）−試薬（Ｌ．Ｚｎ）を用いると、２分間のみのインキュベーションで真核および原核（グラム陽性／グラム陰性）細胞を染色できるが；過去の試薬（１．Ｚｎ）では、発色には細胞を１０分間インキュベーションする必要があった。さらに、染色細胞（本発明のＺｎ（ＩＩ）−錯体を使用）の色強度は、過去に報告したものと比較して、はるかに強かった。これは、構造変動によってのみ達成され得るものである（１．Ｚｎで報告したようなビスピコリルアミンに代わり、本発明の研究のアザ大環状リガンドの使用）（スキーム１ｂ）。
【００３５】
本発明のＺｎ（ＩＩ）−錯体は、ＣＴＰと比較して、ＡＴＰに対して、より選択性があることが分かり、ＣＴＰに伴う色変化はほぼ無視され得るものである（図２ａ）。
【００３６】
合成のばらつき：合成法によって、過去に報告したＺｎ（ＩＩ）−錯体（１．Ｚｎ）の合成に使用したリガンドは、ジピコリルアミンと４−（４−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリド（１：１．０５モル当量）とを０℃で反応させることにより合成して最もよい収率を達成した。本発明のリガンド（Ｌ）の合成のため、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンを４−（４’−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリド（１：１モル当量）と室温（３０℃）で１０時間反応させ、次いで１時間還流させた。４−（４−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリドの濃度を増加させる試みはいずれも、複数の生成物および不純物を生じることになり、これらの不純物を除去することは非常に困難であった。さらに、反応温度も、妥当な収率を達成するためには極めて重要である。０℃での反応では、本発明の研究で所望される生成物の収率が非常に低くなる。さらに、本発明の研究では、Ｚｎ（ＩＩ）−錯体の精製（未反応の有機試薬の除去）は、ＣＨＣｌ3を用いた洗浄により達成され、これは、当該有機溶媒におけるその溶解性がより高いので過去の研究では可能ではなかった。この精製工程は、所望のＺｎ（ＩＩ）−錯体（Ｌ．Ｚｎ）の精製を非常に容易にし、最も純粋な形態でのその単離に役立った。さらに、過去の複合体（１．Ｚｎ）における中心のＺｎ（ＩＩ）は、ビスピコシルアミン官能基の３個の窒素原子に配位し、これが、中心のＺｎ（ＩＩ）に対する３個のリン酸酸素の結合の可能性を制限する。本発明の系（Ｌ．Ｚｎ）では、テトラアザ大環状部分の４個のＮ原子が、中心のＺｎ（ＩＩ）に結合し、配位するＮ−原子の面より上にＺｎ（ＩＩ）−イオンがとどまり、これが、中心のＺｎ（ＩＩ）に対する３個のリン酸Ｏ−原子の配位に役立ち（スキーム１ａ）、最終的に、ＡＴＰに結合した際のより良いスペクトル変化および可視的な色の変化をもたらす。
【００３７】
【化２】
2013533903.tif 000003
【００３８】
本発明のセンサー分子（Ｌ．Ｚｎ）の応用可能性および過去に報告した分子（１．Ｚｎ）の限界：このタイプの比色センサー分子は、嚢胞性線維症についての研究に非常に有用であり得る。というのも、これがその場で産生されるＡＴＰの定量的な検出を可能にするからであり、これは細胞のエネルギー効率を示す。この測定は、ＡＴＰが、嚢胞性線維症に対して重要である、非常に重要なタンパク質のほとんどを調節するので、重要性が非常に大きい。さらに、このタイプの比色センサーは、ＡＴＰの量を定量する方法としてフローサイトメトリーを用いた実験に懸濁細胞と共に使用することもできる。言うまでもなく、結合剤は、ＡＴＰに対して選択的であり、水溶液中で活性でなければならない。
【００３９】
このような用途には、いかなるアルコールや他の有機溶媒の使用をも避けることが必須である。過去に報告した（Ｄ１およびＤ２）化合物１．Ｚｎの大きな欠点は、特定の量のアルコールを使用しなければならず、これがこの試薬を実用的な目的に使用する可能性を制限することである。純粋な水溶液を使用して、細胞染色研究用に本発明の錯体（Ｌ．Ｚｎ）が用いられる。主成分の１つは、この（Ｌ．Ｚｎ）錯体の合成には珍しく（過去の錯体１．Ｚｎと比較した場合）、これが違い、より正確には、向上した溶解性および染色特性をもたらす。合成法において、見かけ上は些細であるが、非常に重要な違いがあり、これが所望の化合物Ｌ．Ｚｎを最大の収率で達成する際に非常に重要である。
【００４０】
アルコールのいくつかの重大な副作用：アルコールを飲む１つの影響は「血球凝集」であり、これは赤血球が互いに凝集し、微小血管を塞ぎ、組織が酸素不足に陥り、細胞死を招く。この細胞死は、脳において最も深刻であり、多くの場合認識されない。アルコールは他の食品のようには消化されず、変換されて細胞や組織に運ばれる代わりに；アルコールは、通常の消化過程を回避して直接血流に乗る。アルコールの約２０パーセントは胃壁を介して血液へ直接吸収され、８０パーセントは小腸を介して血流へ吸収される。
【００４１】
［発明の目的］
本発明の主な目的は、Ｚｎ（ＩＩ）に基づいた比色センサー（スキーム１、式１Ａ）を調製し、好適な生細胞用染色剤としてのその使用方法を開発することである。
【００４２】
本発明の別の目的は、目視検出が可能な色の変化を伴ってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に選択的に結合する化学センサーを用いた、検出手法を開発することである。
【００４３】
本発明のさらに別の目的は、水溶液または生理的条件におけるＡＴＰの検出方法を標準化することである。
【００４４】
本発明のさらに別の目的は、水における化学センサーの溶解性の向上に適した手法を見出すことである。
【００４５】
本発明のさらに別の目的は、光学顕微鏡を用いた、酵母（真核生物）細胞ならびにグラム陽性菌およびグラム陰性菌（原核生物）細胞などの生体（微生物）中のＡＴＰの検出に適した手法を開発することである。
【００４６】
本発明の別の目的は、グラム陽性菌とグラム陰性菌とを区別するために、この化学センサーの使用の可能性を検討することである。
【００４７】
本発明の別の目的は、化学センサーの適性を試験することである。
【００４８】
本発明の別の目的は、細胞増殖動態を研究するための手法を確立することである。
【００４９】
［発明の概要］
したがって、本発明は、式１Ａの化合物を提供する。
【００５０】
【化３】
2013533903.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、下記の種々のアニオン（〜１７．０ｍＭ）の存在下における２５℃でのＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ〜７．２）中でのＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（８．８７μＭ）の吸光度スペクトルを示す；１：ＡＴＰ；２：ＣＴＰ；３：ＡＤＰ；４：Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-、ＣＨ3ＣＯＯ-、Ｈ2ＰＯ4-、ＰＰｉ、ＳＯ42-、ＮＯ3-、ＣＮ-、ＡＭＰ、ＳＣＮ-。
【図２】図２は、種々のリン酸イオンの存在下および非存在下での水溶液中でのＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（８．８７μＭ）の色の変化を示す。左から右に：ブランク、およびＨ2ＰＯ4-、ＰＰｉ、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ添加（アニオン濃度〜５００μＭ）。
【図３】図３は、ｐＨ７．２（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）で２５℃にてＬ．Ｚｎ（ＩＩ）−化合物（スキーム１、式１Ａ）（９．４６μＭ）の水溶液に（［ＡＴＰ］＝０〜１７．２８ｍＭ）を加えた際の吸収スペクトルの滴定曲線を表すグラフを示す。
【図４】図４は、ｐＨ７．２（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）で２５℃にてＬ．Ｚｎ（ＩＩ）−化合物（スキーム１、式１Ａ）（１．７９μＭ）に（［ＣＴＰ］＝０〜１０．１７ｍＭ）を加えた際の吸収スペクトルの滴定曲線を表すグラフを示す。
【図５】図５は、ｐＨ７．２（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）で２５℃にてＬ．Ｚｎ（ＩＩ）−化合物（スキーム１、式１Ａ）（８．８６μＭ）にＡＤＰ（［ＡＤＰ］＝０〜６．５５ｍＭ）を添加した際の吸収スペクトルの滴定曲線を表すグラフを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、２５℃でのＬ．Ｚｎ−ＡＴＰ（スキーム１、式１Ｂ）の結合の様式を明らかにするために、５００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ（モデル番号Ａｄｖａｎｃｅ−ＤＰＸ−５００）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いてＤ2Ｏ中で記録した31Ｐ ＮＭＲスペクトルを表すグラフを示す；ＡＴＰ（Ａ）のみ、およびＡＴＰとＺｎ（ＩＩ）−錯体（Ｂ）、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、２５℃でのＬ．Ｚｎ−ＡＴＰ（スキーム１、式１Ｂ）の結合の様式を明らかにするために、５００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ（モデル番号Ａｄｖａｎｃｅ−ＤＰＸ−５００）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いてＤ2Ｏ中で記録した31Ｐ ＮＭＲスペクトルを表すグラフを示す；ＣＴＰ（Ｃ）のみ、およびＺｎ（ＩＩ）−錯体と結合したＣＴＰ（Ｄ）、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）。
【図７】図７は、化合物（７．２μＭ）および過剰のＡＴＰ（９００μＭ）が存在する場合のＥＳＩ（電子スプレーイオン化）質量分析の結果を表すグラフを示し、Ｌ．Ｚｎ−ＡＴＰ（スキーム１、式１Ｂ）の形成と一致する。Ｌ．Ｚｎ−ＡＴＰ（スキーム１、式１Ｂ）（モノナトリウム塩）の分子量は１０８１である。（使用機器：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ（登録商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＭＡＸ四重極イオントラップ機器、サンホセ、カリフォルニア州、米国）
【図８】図８は、２５℃の水溶液中での、様々な［α−ＣＤ］（０〜２．３ｍＭ）との、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（８．３μＭ）の系統的なスペクトル変化を示す。はめ込み画像は、再蒸留および脱イオン水における（ａ）α−ＣＤの非存在下および（ｂ）存在下でのＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の飽和溶液の色の画像である。
【図９Ａ】図９Ａは、２５℃での、（Ａ）染色していない酵母細胞ならびに（Ｂ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（１．１６×１０-4Ｍ）および（Ｃ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（５×１０-4Ｍ）とα−ＣＤ（２．９２×１０-3Ｍ）とで染色した酵母細胞の光学顕微鏡画像を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、２５℃での、（Ａ）染色していない、（Ｂ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（０．６６×１０-4Ｍ）、および（Ｃ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（０．５×１０-3Ｍ）とα−ＣＤ（２．９２×１０-3Ｍ）とで染色したグラム陽性菌の光学顕微鏡画像を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、２５℃での、（Ａ）染色していない、（Ｂ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（０．６６×１０-4Ｍ）、および（Ｃ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（０．５×１０-3Ｍ）とα−ＣＤ（２．９２×１０-3Ｍ）とで染色したグラム陰性菌の光学顕微鏡画像を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、（ａ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（２．９７μＭ）／ＡＴＰ（１３．６ｍＭ）の存在下でのＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）／ＡＴＰ（１３．６ｍＭ）およびクエン酸ナトリウム溶液（２０％（ｗ／ｖ））、（ｂ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（７．１μＭ）／酵母の存在下／Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（７．１μＭ）＋酵母細胞の存在下およびこれにクエン酸ナトリウム溶液（３５％（ｗ／ｖ））を加えたものの吸収スペクトルを表す。スペクトルは２５℃で記録した。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、（Ａ）Ｌ．Ｚｎ−α．ＣＤ（０．５ｍＭ）［α．ＣＤ］＝（２．９２ｍＭ）で染色、（Ｂ）Ｌ．Ｚｎ（６６μＭ）で染色した酵母、ならびに（Ｃ）クエン酸ナトリウム（２０％Ｗ／Ｖ）で処理後のＬ．Ｚｎ−α．ＣＤ染色酵母細胞、（Ｄ）クエン酸ナトリウム（２０％Ｗ／Ｖ）で処理後のＬ．Ｚｎ染色酵母細胞の光学顕微鏡画像を示す。
【図１１】図１１は、（Ａ）ブランクの酵母細胞、（Ｂ）Ｌ．Ｚｎ錯体（スキーム１、式１Ａ）で処理した酵母細胞、（Ｃ）ブランクのグラム陰性菌細胞、（Ｄ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）錯体で処理したグラム陰性菌細胞、（Ｅ）グラム陽性菌細胞、および（Ｆ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）錯体で処理したグラム陽性菌細胞のＳＥＭ画像を表す。［Ｌ．Ｚｎ］＝０．１１６ｍＭ。
【図１２】図１２は、経時的な細胞数の変化から得られた（ａ）サッカロミセス・セレビシエ、（ｃ）シュードモナス・フルオレセンス（ｅ）バチルス・メガテリウムの増殖曲線を示す。Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（Ｄ−１）（０．１０６ｍＭ）およびＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（０．１６４ｍＭ）とα−ＣＤ（０．９３８ｍＭ）（Ｄ−２）との存在下での、（ｂ）サッカロミセス・セレビシエ、（ｄ）シュードモナス・フルオレセンス、および（ｆ）バチルス・メガテリウムの水性培地の６００ｎｍでの吸光度の相対的変化。２５℃で試験を行った。
【図１３】図１３は、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）［（Ｄ−１）（０．１０６ｍＭ）およびＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（０．１６４ｍＭ）とα−ＣＤ（０．９３８ｍＭ）（Ｄ−２）］とで染色し、異なる時間間隔でモニタリングした酵母細胞の光学顕微鏡画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明の実施形態では、当該化合物は本質的には非親油性である。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、当該化合物は、生細胞用に好適な染色剤として有用な比色センサーである。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、当該生細胞は、原核細胞および真核細胞から選ばれる。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、使用される原核細胞は、バチルス属種およびシュードモナス属種である。
【００５６】
本発明の別の実施形態では、使用される真核細胞は酵母（サッカロミセス・セレビシエ）である。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、式１Ａの化合物の調製方法は、下記の工程を含む：
ｉ．３００〜６００ｒｐｍ（毎分回転数）の速度の穏やかな撹拌下で、２５〜３０℃の範囲の温度にて、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンを溶媒に溶解すること；
ｉｉ．工程（ｉ）で得られた溶液を２〜５℃の範囲の温度で氷中に維持すること；
ｉｉｉ．工程（ｉｉ）で得られた溶液に、トリエチルアミン塩基を、０．５〜１ｍＬ／分の速度で、３００〜６００ｒｐｍの速度の穏やかな撹拌下で加えること；
ｉｖ．工程（ｉｉｉ）で得られた溶液に、別途調製したテトラヒドロフラン中の４−（４−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリドの溶液を、１５〜６０ｍＬ／時の範囲の速度で、０〜５℃の範囲の温度で加えること；
ｖ．工程（ｉｖ）で得られた混合物を、２５〜３０℃の温度範囲で、５〜１０時間の範囲の期間撹拌すること；
ｖｉ．工程（ｖ）で得られた混合物を、２０〜６０分の範囲の期間、６５〜７０℃の範囲の温度で還流させること；
ｖｉｉ．工程（ｖｉ）で得られた混合物をろ過して、リガンドの析出物を分離すること；
ｖｉｉｉ．工程（ｖｉｉ）で得られたリガンドの析出物を洗浄し乾燥すること；
ｉｘ．工程（ｖｉｉｉ）で得られたリガンドを、２０〜２５℃の範囲の温度でアルコールに溶解すること；
ｘ．工程（ｉｘ）で得られたリガンドの溶液に、硝酸亜鉛溶液（リガンドの０．３〜０．８モル当量）を、２０〜２５℃の範囲の温度で加えること；
ｘｉ．工程（ｘ）で得られた溶液を、２０〜２５℃の範囲の温度で、１２〜２４時間の範囲の期間撹拌すること；
ｘｉｉ．工程（ｘｉ）で得られた溶液を、１０〜２０℃の範囲の温度で、２〜５時間の範囲の期間激しくかき混ぜること；
ｘｉｉｉ．工程（ｘｉｉ）で得られた析出物を、クロロホルムでろ過し洗浄して式１Ａの化合物を得ること。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、当該溶媒は、クロロホルム、メタノール、ジクロロメタン、およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）からなる群から選ばれる。
【００５９】
本発明の別の実施形態では、使用するアルコールは、メタノールおよびエタノールから選ばれる。
【００６０】
本発明の別の実施形態では、式１の化合物を用いた、生細胞の染色方法であって、当該工程は下記を含む：
ａ．（ｉ）グルコース酵母抽出物寒天（ＧＹＥ）培地中でサッカロミセス属種（ＭＴＣＣ ５５４８）、（ｉｉ）ニュートリエントブロス中でバチルス属種（ＭＴＣＣ ５５４９）、および（ｉｉｉ）キングＢ培地中でシュードモナス属種（ＭＴＣＣ ５５５０）を、３０〜４０℃の範囲の温度で、６〜３６時間の範囲の期間培養すること；
ｂ．工程（ａ）の細胞を、式１Ａの化合物０．６×１０-4〜１．２×１０-4Ｍと共に、２８〜３８℃の温度範囲で、５〜２０分の範囲の期間インキュベーションすること；
ｃ．工程（ｂ）で得られたインキュベーションされた試料を、グルテルアルデヒドを用いて、７．４〜７．６の範囲のｐＨの緩衝液中で、１０〜１２時間の範囲の期間、２８〜３８℃の範囲の温度で固定すること；
ｄ．工程（ｃ）で得られた試料を、上記緩衝液で、０．５〜１．０時間の範囲の期間洗浄すること；
ｅ．工程（ｄ）で得られた試料を、四酸化オスミウムおよび緩衝液で後固定し、上記緩衝液で洗浄すること；
ｆ．勾配をつけた水エタノール系により、工程（ｅ）で得られた試料から水を除去すること；
ｇ．前記緩衝液中で工程（ｆ）で得られた試料をすすぎ、スパッタコーター中で金でコーティングして、単純顕微鏡下で見える染色標本を得ること；
ｈ．異なる色強度および染色細胞の形で生細胞を区別すること。
【００６１】
本発明の別の実施形態では、使用される緩衝液は、リン酸緩衝液である。
【００６２】
本発明の別の実施形態では、センサーと生細胞との結合は、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析により確認される。
【００６３】
本発明の別の実施形態では、染料で染色した後の細胞の生存能が、細胞分裂の発生を示す凹面スライドにおけるハンギングドロップ法によって試験微生物における二分裂を観察することにより証明される。
【００６４】
さらに本発明の別の実施形態では、式１Ａの化合物の可逆的結合が、光学顕微鏡およびＵＶ−Ｖｉｓ分光法を介して、クエン酸ナトリウムの２０％（ｗ／ｖ）溶液で細胞を脱染することにより確認される。
【００６５】
本発明の別の実施形態では、式１Ａの化合物による生細胞の染色が、生細胞の細胞壁上に存在するＡＴＰとセンサーとのヘプタ配位種の形成（ここで３個のリン酸基はＺｎと配位し、得られる31Ｐ ＮＭＲは３個のリン原子すべてに関してシフトする）により行われる。
【００６６】
本発明の別の実施形態では、式１Ａの化合物の吸収スペクトル滴定曲線は、ＡＴＰの添加後に４０ｎｍのスペクトルシフトを示し、ＡＴＰとの化合物の結合定数は、（９７８±４）Ｍ-1である。
【００６７】
本発明の別の実施形態では、水における式１Ａの化合物の溶解性が、α−ＣＤ（シクロデキストリン）の存在下で、約７〜７．５倍増加する。
【００６８】
本発明の別の実施形態では、Ｚｎ（ＩＩ）に基づいた比色センサーＬ．Ｚｎの吸収極大がα−ＣＤ（シクロデキストリン）の水溶液を加えると５ｎｍシフトする傾向があることを示すという点で、式１Ａの化合物の染色の強度がα−ＣＤ（シクロデキストリン）の存在下で増加する。
【００６９】
本発明の別の実施形態では、式１Ａの化合物による染色は１０〜２０分で起こり、α−ＣＤ（シクロデキストリン）の存在下では１秒〜２分で起こるので、α−ＣＤ（シクロデキストリン）の存在下で式１Ａの化合物の染色の速度が増加すること示す。
【００７０】
本発明の別の実施形態では、染料の無いサッカロミセス属種の細胞表面のＳＥＭ画像はなめらかであると認められたが、対照的に染料を有するものは粗いと認められた。
【００７１】
本発明の別の実施形態では、染料の無いグラム陽性菌のＳＥＭ画像はなめらかであると認められたが、染料を有するものは粗いと認められた。
【００７２】
本発明の別の実施形態では、染料の無いグラム陰性菌のＳＥＭ画像はなめらかであると認められたが、染料を有するものは粗いと認められた。
【００７３】
本発明の別の実施形態では、グラム陽性菌の染色された細胞は、染色されたグラム陰性菌のものと比較して長く見えた。
【００７４】
本発明のさらに別の実施形態では、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンは、６〜１５ミリモルの濃度域にある。
【００７５】
本発明の別の実施形態では、トリエチルアミンの添加速度は、０．５〜１．０ｍＬ／分の範囲から選ばれる。
【００７６】
本発明のさらに別の実施形態では、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）−ベンゼンスルホニルクロリドは、１５〜２０ｍＭの濃度域にある。
【００７７】
本発明のさらに別の実施形態では、４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）−ベンゼンスルホニルクロリドの添加速度は、１５〜６０ｍＬ／時の範囲から選ばれる。
【００７８】
本発明のさらに別の実施形態では、反応混合物は、５〜１０時間の範囲の期間、２５〜３０℃の範囲の温度を維持しながら撹拌される。
【００７９】
本発明のさらに別の実施形態では、反応混合物は、２０〜６０分の範囲の期間還流される。
【００８０】
本発明のさらに別の実施形態では、このように調製したリガンドは、１４〜２０ｍＭの範囲の濃度および２０〜３０℃の範囲の温度を維持しながら、溶媒に溶解される。
【００８１】
本発明のさらに別の実施形態では、硝酸亜鉛溶液は、リガンドの０．３〜０．８モル当量で使用される。
【００８２】
本発明のさらに別の実施形態では、リガンドと硝酸亜鉛溶液との反応混合物は、１２〜２４時間の範囲の期間、２０〜３０℃の温度範囲で撹拌される。
【００８３】
本発明のさらに別の実施形態では、最終反応混合物は、１０〜２０℃の範囲の温度で、２〜５時間の範囲の期間静止位置に維持される。
【００８４】
本発明のさらに別の実施形態では、培養された種は、０．１〜０．１５ｍＭの濃度範囲で、２８〜３８℃の範囲の温度で、５〜２０分の範囲の期間、センサーとインキュベーションされる。
【００８５】
本発明のさらに別の実施形態では、生物試料は、センサーで染色される。
【００８６】
本発明のさらに別の実施形態では、酵母細胞（真核生物）グラム陽性菌およびグラム陰性菌（原核生物）は、同一のセンサーで染色した際の染色された細胞の色強度に基づいて区別することができる。
【００８７】
本発明のさらに別の実施形態では、曝露後の試験微生物のコロニーは、その生存能を確認するために、寒天培地プレート上に線画することにより増殖される。
【００８８】
［図面の簡単な説明］
スキーム１は、Ｚｎ（ＩＩ）−アザ大環状錯体（Ｌ．Ｚｎ）（スキーム１、式１Ａ）の合成を示し、またＬ．ＺｎとＡＴＰとの結合様式（スキーム１、式１Ｂ）を示す。
【００８９】
スキーム２は、α−ＣＤ（α−シクロデキストリン）によるＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の包接機構を示す。
【００９０】
図１は、下記の種々のアニオン（〜１７．０ｍＭ）の存在下における２５℃でのＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ〜７．２）中でのＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（８．８７μＭ）の吸光度スペクトルを示す；１：ＡＴＰ；２：ＣＴＰ；３：ＡＤＰ；４：Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-、ＣＨ3ＣＯＯ-、Ｈ2ＰＯ4-、ＰＰｉ、ＳＯ42-、ＮＯ3-、ＣＮ-、ＡＭＰ、ＳＣＮ-。
【００９１】
図２は、種々のリン酸イオンの存在下および非存在下での水溶液中でのＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（８．８７μＭ）の色の変化を示す。左から右に：ブランク、およびＨ2ＰＯ4-、ＰＰｉ、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ添加（アニオン濃度〜５００μＭ）。
【００９２】
図３は、ｐＨ７．２（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）で２５℃にてＬ．Ｚｎ（ＩＩ）−化合物（スキーム１、式１Ａ）（９．４６μＭ）の水溶液に（［ＡＴＰ］＝０〜１７．２８ｍＭ）を加えた際の吸収スペクトルの滴定曲線を表すグラフを示す。
【００９３】
図４は、ｐＨ７．２（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）で２５℃にてＬ．Ｚｎ（ＩＩ）−化合物（スキーム１、式１Ａ）（１．７９μＭ）に（［ＣＴＰ］＝０〜１０．１７ｍＭ）を加えた際の吸収スペクトルの滴定曲線を表すグラフを示す。
【００９４】
図５は、ｐＨ７．２（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）で２５℃にてＬ．Ｚｎ（ＩＩ）−化合物（スキーム１、式１Ａ）（８．８６μＭ）にＡＤＰ（［ＡＤＰ］＝０〜６．５５ｍＭ）を添加した際の吸収スペクトルの滴定曲線を表すグラフを示す。
【００９５】
図６Ａは、２５℃でのＬ．Ｚｎ−ＡＴＰ（スキーム１、式１Ｂ）の結合の様式を明らかにするために、５００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ（モデル番号Ａｄｖａｎｃｅ−ＤＰＸ−５００）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いてＤ2Ｏ中で記録した31Ｐ ＮＭＲスペクトルを表すグラフを示す；ＡＴＰ（Ａ）のみ、およびＡＴＰとＺｎ（ＩＩ）−錯体（Ｂ）、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）。
【００９６】
図６Ｂは、２５℃でのＬ．Ｚｎ−ＡＴＰ（スキーム１、式１Ｂ）の結合の様式を明らかにするために、５００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ（モデル番号Ａｄｖａｎｃｅ−ＤＰＸ−５００）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いてＤ2Ｏ中で記録した31Ｐ ＮＭＲスペクトルを表すグラフを示す；ＣＴＰ（Ｃ）のみ、およびＺｎ（ＩＩ）−錯体と結合したＣＴＰ（Ｄ）、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）。
【００９７】
図７は、化合物（７．２μＭ）および過剰のＡＴＰ（９００μＭ）が存在する場合のＥＳＩ（電子スプレーイオン化）質量分析の結果を表すグラフを示し、Ｌ．Ｚｎ−ＡＴＰ（スキーム１、式１Ｂ）の形成と一致する。Ｌ．Ｚｎ−ＡＴＰ（スキーム１、式１Ｂ）（モノナトリウム塩）の分子量は１０８１である。（使用機器：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ（登録商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＭＡＸ四重極イオントラップ機器、サンホセ、カリフォルニア州、米国）
図８は、２５℃の水溶液中での、様々な［α−ＣＤ］（０〜２．３ｍＭ）との、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（８．３μＭ）の系統的なスペクトル変化を示す。はめ込み画像は、再蒸留および脱イオン水における（ａ）α−ＣＤの非存在下および（ｂ）存在下でのＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の飽和溶液の色の画像である。
【００９８】
図９Ａは、２５℃での、（Ａ）染色していない酵母細胞ならびに（Ｂ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（１．１６×１０-4Ｍ）および（Ｃ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（５×１０-4Ｍ）とα−ＣＤ（２．９２×１０-3Ｍ）とで染色した酵母細胞の光学顕微鏡画像を示す。
【００９９】
図９Ｂは、２５℃での、（Ａ）染色していない、（Ｂ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（０．６６×１０-4Ｍ）、および（Ｃ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（０．５×１０-3Ｍ）とα−ＣＤ（２．９２×１０-3Ｍ）とで染色したグラム陽性菌の光学顕微鏡画像を示す。
【０１００】
図９Ｃは、２５℃での、（Ａ）染色していない、（Ｂ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（０．６６×１０-4Ｍ）、および（Ｃ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（０．５×１０-3Ｍ）とα−ＣＤ（２．９２×１０-3Ｍ）とで染色したグラム陰性菌の光学顕微鏡画像を示す。
【０１０１】
図１０Ａは、（ａ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（２．９７μＭ）／ＡＴＰ（１３．６ｍＭ）の存在下でのＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）／ＡＴＰ（１３．６ｍＭ）およびクエン酸ナトリウム溶液（２０％（ｗ／ｖ））、（ｂ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（７．１μＭ）／酵母の存在下／Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（７．１μＭ）＋酵母細胞の存在下およびこれにクエン酸ナトリウム溶液（３５％（ｗ／ｖ））を加えたものの吸収スペクトルを表す。スペクトルは２５℃で記録した。
【０１０２】
図１０Ｂは、（Ａ）Ｌ．Ｚｎ−α．ＣＤ（０．５ｍＭ）［α．ＣＤ］＝（２．９２ｍＭ）で染色、（Ｂ）Ｌ．Ｚｎ（６６μＭ）で染色した酵母、ならびに（Ｃ）クエン酸ナトリウム（２０％Ｗ／Ｖ）で処理後のＬ．Ｚｎ−α．ＣＤ染色酵母細胞、（Ｄ）クエン酸ナトリウム（２０％Ｗ／Ｖ）で処理後のＬ．Ｚｎ染色酵母細胞の光学顕微鏡画像を示す。
【０１０３】
図１１は、（Ａ）ブランクの酵母細胞、（Ｂ）Ｌ．Ｚｎ錯体（スキーム１、式１Ａ）で処理した酵母細胞、（Ｃ）ブランクのグラム陰性菌細胞、（Ｄ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）錯体で処理したグラム陰性菌細胞、（Ｅ）グラム陽性菌細胞、および（Ｆ）Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）錯体で処理したグラム陽性菌細胞のＳＥＭ画像を表す。［Ｌ．Ｚｎ］＝０．１１６ｍＭ。
【０１０４】
図１２は、経時的な細胞数の変化から得られた（ａ）サッカロミセス・セレビシエ、（ｃ）シュードモナス・フルオレセンス（ｅ）バチルス・メガテリウムの増殖曲線を示す。Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（Ｄ−１）（０．１０６ｍＭ）およびＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（０．１６４ｍＭ）とα−ＣＤ（０．９３８ｍＭ）（Ｄ−２）との存在下での、（ｂ）サッカロミセス・セレビシエ、（ｄ）シュードモナス・フルオレセンス、および（ｆ）バチルス・メガテリウムの水性培地の６００ｎｍでの吸光度の相対的変化。２５℃で試験を行った。
【０１０５】
図１３は、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）［（Ｄ−１）（０．１０６ｍＭ）およびＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（０．１６４ｍＭ）とα−ＣＤ（０．９３８ｍＭ）（Ｄ−２）］とで染色し、異なる時間間隔でモニタリングした酵母細胞の光学顕微鏡画像を示す。
【０１０６】
［発明の詳細な説明］
本発明は、中間体リガンドである（Ｅ）−４−（（４−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１−イルスルホニル）フェニル）ジアゼニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（Ｌ）（スキーム１、式２）は、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンと（Ｅ）−４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）ジアゼニル）ベンゼン−１−スルホニルクロリドとの反応により合成されたことを規定する。これは、対応するＺｎ（ＩＩ）−錯体（Ｌ．Ｚｎ（ＩＩ））（スキーム１、式１Ａ）の合成のために、非水性溶媒中でのＺｎ（ＮＯ3）2との反応に使用する前にさらに精製した。この錯体は、中性の水溶液または生理的なｐＨの溶液中で、肉眼に検出でき得る関連する色の変化を伴って、ＡＴＰおよびＣＴＰなどの三リン酸と結合することが分かった。これは、真核生細胞および原核生細胞用の、可能性のある染色剤としてこのＺｎ（ＩＩ）−錯体を使用する可能性を切り開くものである。このＺｎ（ＩＩ）−試薬は、ＣＴＰの検出にも使用することができるが、ＡＴＰと比較するとＣＴＰに対するこの錯体の親和性ははるかに低い。これらの所見に基づいて、本発明は、様々な（化学的および生物学的）アッセイ方法を伴う多くの分析技術を介して徐々に開発された。
【０１０７】
本発明は、ＡＴＰに対する選択性を有するＺｎ（ＩＩ）−アザ大環状環に基づいた錯体であるＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）を提供する。
【０１０８】
本発明は、Ｚｎ（ＩＩ）に基づいた比色センサーの調製方法を提供し、当該方法は、下記工程を含む：
ｉ．５０〜１００ｍＬの容量範囲でかつクロロホルム、メタノール、ジクロロメタン、テトラヒドロフランなどの範囲の溶媒を使用して、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンを６〜１５ｍＭの濃度範囲で溶解すること；
ｉｉ．工程（ｉ）の溶液を２〜５℃の温度範囲に保持し、トリエチルアミン塩基を、緩やかな撹拌下で０．５〜１ｍＬ／分の速度で加え、次いで、１５〜６０ｍＬ／時の範囲の速度で４−（４−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリドの１５〜２５ｍＭ溶液を加えた；
ｉｉｉ．工程（ｉｉ）で得られた混合物を、２５〜３０℃の温度範囲で、５〜１０時間の範囲の期間撹拌すること；
ｉｖ．混合物を２０〜６０分の範囲の期間還流させること；
ｖ．析出物をＴＨＦでろ過し次いで洗浄し、その後固形物を乾燥させてリガンドを得ること；
ｖｉ．２０〜２５℃の温度範囲で、リガンドをアルコールに溶解して、１４〜２０ｍＭの範囲の濃度を得ること；
ｖｉｉ．工程（ｖｉ）で調製した溶液に、２０〜２５℃の温度範囲で、リガンドの０．３〜０．８モル当量の範囲の硝酸亜鉛水溶液を加えること；
ｖｉｉｉ．工程（ｖｉｉ）の溶液を、同じ温度範囲で、１２〜２４時間の範囲の期間撹拌すること；
ｉｘ．工程（ｖｉｉｉ）で得られた溶液を、１０〜２０℃の温度範囲で、２〜５時間の期間激しくかき混ぜること；
ｘ．クロロホルムで析出物をろ過し、洗浄してセンサーを得ること；
ｘｉ．単離した（ｉ）ＧＹＥ培地中のサッカロミセス属種、（ｉｉ）ニュートリエントブロス中のバチルス属種、および（ｉｉｉ）キングＢ培地中のシュードモナス属種を、３０〜４０℃の温度範囲で、６〜３６時間の期間培養すること；
ｘｉｉ．０．１〜０．１５ｍＭの範囲の濃度を有する工程（ｘ）で得られたセンサー１００μｌと共に、工程（ｘｉ）で得られた各培養種１００μｌを、２８〜３８℃の温度範囲で、５〜２０分の範囲の期間インキュベーションすること；
ｘｉｉｉ．単純顕微鏡下で観察するために、センサーで試料を染色すること；
ｘｉｖ．異なる色強度によりグラム陽性菌とグラム陰性菌とを区別すること；
ｘｖ．寒天培地プレート上に線画して工程（ｘｉ）から（ｘｉｖ）までの試験微生物のコロニーを増殖させること。
【０１０９】
［化合物Ｌ（スキーム１、式２）の合成］
１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）（２４７ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌｅ）を、２５０ｍＬ丸底ＲＢフラスコ中で無水テトラヒドロフラン（４０ｍＬ）に溶解した。テトラヒドロフラン（１０〜１５ｍＬ）中の４−（４−ジメチルアミノ−フェニルアゾ）−ベンゼンスルホニルクロリド（４００ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌｅ）とトリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ）（１ｍＬ）との溶液を、氷冷状態の上記溶液に加えた。次いで、得られた混合物を２５℃〜３０℃で１０時間撹拌し、次いで、１時間さらに還流した。このようにして得られたオレンジ色の析出物をテトラヒドロフランでろ過し洗浄した。最後に、固体残渣（Ｌ）を乾燥させた；収率：７５％。
化合物Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の合成
Ｌ（２００ｍｇ；０．４１ｍｍｏｌｅ）の溶液を、１００ｍＬ一首フラスコ中でメタノール２５ｍＬに溶解した。これに、硝酸亜鉛水溶液１．０ｍＬ（１４８．６９ｍｇのＺｎＮＯ3．６Ｈ2Ｏに相当、１．２モル当量）を加えた。得られた溶液を、２５℃〜３０℃で２４時間撹拌した。反応混合物を４℃の冷蔵庫に５時間保存し、紫色の析出物が現われた。これをグーチろ過器（３番）を用いてろ過により採取し、ＣＨＣｌ3で数回洗浄した；収率：６５％。
【０１１０】
［生物試料調製］
染色研究で使用した微生物は、ＣＳＭＣＲＩの庭園の土（２１．７５８７３２５Ｎ ７２．１４４３８９７Ｅ）から取ったシュードモナス属種（ＭＴＣＣ ５５５０）、アラビア海（ベラワル海岸、２０．９５９７３Ｎ ７０．２７９３２Ｅ）から取ったバチルス属種（ＭＴＣＣ ５５４９）、凝乳から取ったサッカロミセス属種（ＭＴＣＣ ５５４８）である。
【０１１１】
サッカロミセス属種の分離株はＧＹＥ（グルコース酵母抽出物寒天）培地で、バチルス属種のものはニュートリエントブロスで、およびシュードモナス属種のものはキングＢ培地で、２４時間３７℃で培養した。これを１００μｌ取り、３０〜４０℃で、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（１．１６×１０-4Ｍ）溶液１００μｌと共にインキュベーションした。試料は、ｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸緩衝液中の２％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドで、一晩室温２５〜３０℃で固定した。次いで、試料を、室温２５〜３０℃で１時間０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。同じ緩衝液中で２％（ｗ／ｖ）四酸化オスミウム（ＯｓＯ4）中で後固定を行い、２０分間０．１Ｍリン酸緩衝液で一回洗浄した。次いで、勾配を付けた水−エタノール系で水を除去した；２５％エタノール１５分、５０％エタノール１５分、７５％エタノール３０分、９０％エタノール６０分、無水アルコール３０分。顕微鏡観察前に、試料を緩衝液中ですすぎ、スパッタコーター（ポーラロンＳＣ７６２０）中で金でコーティングした。材料を加速電圧１５ｋＶで走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）ＬＥＯ １４３０ ＶＰ中で検査した。
【０１１２】
ブランク、ならびに染色真核生物（酵母）、グラム陽性およびグラム陰性細胞のＳＥＭ画像（図１１）を記録して、染色の際の細胞の外面の形態変化を示した（最大濃度のＡＴＰは、細胞膜周辺腔中のミトコンドリアを介して放出され、次いで細胞表面に分泌されるので）。いくつかのＡＴＰ結合カセットタンパク質（例えば、周辺質タンパク質（ＰＥＰ）、哺乳類ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ））も、形質膜に蓄積することが報告されている。［（ａ）Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｃｏｘ，Ｍ．Ｍ．；「Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，２００３第三版，ＷｏｒｔｈＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ．ＮＹ；Ｂｅｒｇｅｙ，（ｂ）Ｊｏｈｎ，Ｄ．Ｈ．；Ｎｏｅｌ，Ｇ．Ｈ．；Ｐｅｔｅｒ，Ｒ．Ｋ．；「Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ，Ｈ．Ａ．Ｓ．Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」，１９９４，第九版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ］。染料を有する酵母細胞の画像（染色された細胞表面は粗いことが分かった）とは対照的に、染料が無い酵母細胞のＳＥＭ画像は、なめらかであると認められた。これは、細胞に接着している異物、すなわち、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の存在を示した。染料Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）が結合した際の細胞表面の変化も、染色剤の非存在下および存在下での、グラム陰性およびグラム陽性菌について記録したＳＥＭ画像から明らかであった（図１１Ｃ〜１１Ｆ）。試料表面のＳＥＭ画像中のコントラストの違いはまた、試料表面の不均一な化学的性質の表れである。グラム陽性菌と比べたグラム陰性菌の比較的明るい細胞表面は、細胞外表面上により高い負電荷が蓄積していることを示す。この所見は、細胞外ＡＴＰ放出がグラム陰性菌でより高く、ポーリンと呼ばれるタンパク質を有するより多孔性の表面であることを記載している過去の報告とよく相関している［（ａ）Ｗｅｘｌｅｒ，Ｈ．Ｍ．「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ」．１９９７，２５，Ｓ２８４．（ｂ）Ｉｖａｎｏｖａ，Ｅ．Ｐ．；Ａｌｅｘｅｅｖａ，Ｙ．Ｖ．；Ｐｈａｍ，Ｄ．Ｋ．；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｗ．Ｄ．；「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，２００６，９，３７．（ｃ）Ｗｅｒｎｅｒ，Ｔ．Ｐ．；Ａｍｒｈｅｉｎ，Ｎ．；Ｆｒｅｉｍｏｓｅｒ，Ｆ．Ｍ．「ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，２００７，７：５１ ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２２２９−７−５１．］。
【０１１３】
［染色剤としてＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）を用いた酵母および細菌（グラム陽性とグラム陰性）細胞の染色、ならびに光学顕微鏡を用いた染色した細胞培養の観察。］
サッカロミセス属種の分離株はＧＹＥ（グルコース酵母抽出物寒天）培地で、バチルス属種のものはニュートリエントブロスで、およびシュードモナス属種のものはキングＢ培地で、２４時間３７℃で培養した。これを１００μｌ取り、［Ｌ．Ｚｎ］＝１．１６×１０-4Ｍ溶液（ｐＨ７．２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）１００μｌと共に室温でインキュベーションした。試料を、ｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸緩衝液中の２％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドで２５〜３５℃で一晩固定した。次いで、試料を、２５〜３５℃で１時間０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。同じ緩衝液中で２％（ｗ／ｖ）四酸化オスミウム（ＯｓＯ4）中で後固定を行い、２０分間０．１Ｍリン酸緩衝液で一回洗浄した。次いで、勾配を付けた水−エタノール系で水を除去した；２５％エタノール１５分、５０％エタノール１５分、７５％エタノール３０分、９０％エタノール６０分、無水アルコール３０分。顕微鏡観察前に、試料を緩衝液中ですすぎ、スパッタコーター（ポーラロンＳＣ７６２０）中で金でコーティングした。材料を加速電圧１５ｋＶで走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）ＬＥＯ １４３０ ＶＰ中で検査した。
【０１１４】
［Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の溶解性の向上は、水溶液である（スキーム２）］
水におけるＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の溶解性は限定的である（０．０４４８ｇＬ-1）。しかしながら、これは、α−シクロデキストリン（α−ＣＤ）の存在下で向上させることができる。Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）２．３ｍｇを再蒸留水５ｍＬに溶解し、２５〜３５℃で１時間撹拌した。次いで、溶液をろ過し、ろ液中の溶解固形物の濃度を方程式Ｏ．Ｄfiltrate／εLZn（Ｏ．Ｄfiltrateは、ろ液の光学濃度であり、εLZnは、Ｌ．Ｚｎのモル吸光係数である）（数値は、別の実験により前もって求めた）に基づいて求め、０．０４４８ｇＬ-1であると分かった。同様の実験をα−ＣＤの存在下で繰り返した。この場合、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）を２．９１３ｍｇ含む再蒸留水５ｍＬに、α−ＣＤを１４．２ｍｇ溶解し、この溶液を２５℃で１時間撹拌し；懸濁固形物がほとんどない溶液が得られた。これをＧ−４グーチろ過器を用いてろ過した。ろ液を採取し、ろ液の光学濃度（Ｏ．Ｄ）を４５８ｎｍでモニタリングした。包接錯体（擬ロタキサン形態）の完全な形成を考慮して、公知のεLZn.α-CD値および４５８ｎｍでのＯ．Ｄ．に基づいて濃度を求めた。計算により、０．３４ｇｌ-1のＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）が、得られた溶液中に存在することが示された。したがって、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）基準で、〜７．５倍の溶解性の増加が達成され、これは、水溶液中のα−ＣＤの非存在下および存在下でのＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の飽和溶液の可視的な色の違いでも明らかである（図８）。擬ロタキサン形態の水溶液中のＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）は、スキーム２でＬ．Ｚｎ．ＣＤとして示されている。
【０１１５】
［リガンドＬ（スキーム１、式２）の特性決定］
化合物Ｌの単離収率（収率は出発化合物に基づいて計算した）；７５％。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，Ｊ（Ｈｚ），δ（ｐｐｍ））：７．９８−７．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈe）７．９−７．８７（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈc，Ｈd），７．０６（３Ｈ，ｂ，−ＮＨmacrocycle），６．７７−６．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈb），３．１５（１６Ｈ，ｂｒ，Ｈf,h,i,j,k,m,n,o），３．１１（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．０３（４Ｈ，ｂｒ，Ｈg,l)．Ｅｓ−Ｍｓ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ；４８８．３０（Ｍ+＋Ｈ+）．元素分析データ：計算値Ｃ：５９．１１，Ｈ：７．６５，Ｎ：２０．１１，測定値Ｃ：５９．１，Ｈ：７．５，Ｎ：２０．２。
【０１１６】
［Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の特性決定］
化合物Ｌ．Ｚｎの単離収率（収率は出発化合物に基づいて計算した）；６５％。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ7，ＴＭＳ，δ（ｐｐｍ））：７．９２−７．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈe），７．８８−７．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９，Ａｒ−Ｈc），７．８１−７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈd），６．９２−６．９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５，Ａｒ−Ｈb），３．１３（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．９２−２．９１（８Ｈ，ｂｒ，Ｈf,g,n,o），２．７５−２．７４（１２Ｈ，ｂｒ，Ｈh,i,j,k,l,m），．ＥＳ−ｍｓ（ポジティブモード、ｍ／ｚ）：６７６．００（Ｍ+）．元素分析：計算値Ｃ：４２．５７，Ｈ：５．５１，Ｎ：１８．６２；測定値Ｃ：４２．８８，Ｈ：５．５６，Ｎ：１８．２２．分析データは、この分子の推定構造とよく一致している。
【０１１７】
［Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）とα−ＣＤとの包接錯体形成のための安定度定数の評価］
事前のスペクトル研究は、過剰のα−ＣＤ（０〜２．３ｍＭ）水溶液をＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の８．３μＭ溶液に加えると、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（４６３ｎｍ）の吸収極大が、より短い波長（４５８ｎｍ）にシフトする傾向があることを示す。α−ＣＤ中のトランス−１，２−ビス−（４−ピリジル）エチレン、４，４’−アゾピリジン（ＡＺＰ）、およびのいくつかの関連するビピリジン／ビフェニル分子を加えた際のホスト−ゲストタイプの包接錯体の形成は、数名の研究者によって報告されている（Ｓｈｕｋｌａ，Ａ．Ｄ．；Ｂａｊａｊ，Ｈ．Ｃ．；Ｄａｓ，Ａ．「Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．」２００１，４０，４４６．；Ｓｈｕｋｌａ，Ａ．Ｄ．；Ｂａｊａｊ，Ｈ．Ｃ．，Ｄａｓ，Ａ．「Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ」，２００２，１１４，４３１．；Ｂｅｅｒ，Ａ．Ｊ．；Ｍａｃａｒｔｎｅｙ，Ｄ．Ｈ．「Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」２０００，３９，１４１０．；Ｍａｃａｒｔｎｅｙ，Ｄ．Ｈ．；Ｗａｄｄｌｉｎｇ，Ｃ．Ａ．；「Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」１９９４，３３，５９１２．；Ｐｈｉｌｉｐ，Ｄ．；Ｓｔｏｄｄａｒｔ，Ｊ．Ｆ．「Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．」１９９６，３５，１１５４．）。ＣＤキャビティーにおけるこれら化合物への包接がＨＯＭＯ−ＬＵＭＯエネルギーギャップに影響を及ぼし、これにより吸収スペクトルバンドが影響される（エネルギー準位の摂動は、大きなものであるとは報告されていないが）ことも報告されている。したがって、本研究では、観察された５ｎｍのシフトは、包接現象および擬ロタキサン錯体の形成に起因する可能性がある。系統的分光光度滴定をした際、吸収極大が５ｎｍシフトすることが分かり、２つの同時等吸収点が観察された。この分光光度滴定に基づいた会合定数を求めると、会合定数値が２５５（±１５）Ｍ-1であることが示された。
【０１１８】
ＵＶ−ｖｉｓ滴定からの結合定数の算出に使用した一般式は次のとおりである：
Ｌ．Ｚｎ＋ＣＤ＝Ｌ．Ｚｎ．ＣＤ
Ｌの吸収極大はλLであり、この波長での吸光係数およびＯＤは、それぞれεLおよびＡLである。
【０１１９】
Ｌ．Ｚｎ．ＣＤの吸収極大はλL.Zn.CDであり、この波長での吸光係数およびＯＤは、それぞれεL.Zn.CDおよびＡL.Zn.CDである。
【０１２０】
したがって、所与の濃度のレセプター分子（［Ｌ］）およびα−シクロデキストリン（［ＣＤ］）について
［Ｌ．Ｚｎ．ＣＤ］＝［｛ＡL.Zn.CD−Ａ0｝／εL.Zn.CD］  （１）
式中、Ａ0は、外部からＣＤを加える前のλL.Zn.CDでのＯＤ値である。
【０１２１】
ＡL.Zn.CDは、１００モル当量のＣＤを加えた後のλL.Zn.CDにて記録した。
【０１２２】
したがって、λL.Zn.CD＝ＡL.Zn.CD／［Ｌ．Ｚｎ］free  （２）
（レセプター分子はすべてＣＤに結合し、ＣＤはこの波長では全く吸収しないと仮定すれば）
したがって、一旦［Ｌ．Ｚｎ．ＣＤ］を求めることができれば、式１および３を用いて、錯形成していないレセプター分子［Ｌ．Ｚｎ］の濃度を計算することができる。
【０１２３】
［Ｌ．Ｚｎ］free＝［Ｌ．Ｚｎ］initial−［Ｌ．Ｚｎ．ＣＤ］  （３）
および、［ＣＤ］free＝［ＣＤ］initial−［Ｌ．Ｚｎ．ＣＤ］  （４）
Ｋが、ＣＤの所与の濃度での包接錯体Ｌ．Ｚｎ．ＣＤの形成定数である場合、
結合定数、Ｋ＝［Ｌ．Ｚｎ．ＣＤ］／｛［Ｌ．Ｚｎ］free［ＣＤ］free｝  （５）
したがって、大過剰のα−ＣＤ（１２５倍）の存在下では、擬ロタキサン形態、つまり、Ｌ．Ｚｎ．α−ＣＤ（スキーム２）は、水溶液中で支配的な形態として存在すると考えられる（図８）。
【０１２４】
Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）として示される化合物の、ＡＴＰおよび他のアニオンとのカップリングに起因する電子スペクトル変化を測定する実験を行った。
【０１２５】
様々な重要なアニオン（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＰＰｉ、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ42-、ＣＨ3ＣＯ2-、Ｉ-、Ｂｒ-、Ｃｌ-、およびＦ-など）に対するＺｎ−錯体（Ｌ．Ｚｎ）（スキーム１、式１Ａ）の結合挙動を調べるために、次の実験を行った。
【０１２６】
ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＰＰｉ、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4-、ＣＨ3ＣＯ2-、Ｉ-、Ｂｒ-、Ｃｌ-、およびＦ-のナトリウム塩の溶液（〜２１ｍＭ）を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）におけるそれぞれの塩を用いて調製し、使用まで保存した。さらに、化合物Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の溶液（４４．３５μＭ）を、再蒸留され脱イオン化された水を用いて調製し、保存した。これら保存溶液を、溶液を調製した日に実験に使用した。
【０１２７】
プローブ保存液（前もって調製し保存した４４．３５μＭの化合物（Ｌ．Ｚｎ）（本発明のスキーム１、式１Ａ）の溶液）の最終濃度が８．８７μＭになるようにプローブ保存液１ｍＬを１０ｍＬ試験管に入れた後に試験液を使用した。これに、ＡＴＰおよび他のアニオン（ＣＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＰＰｉ、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ42-、ＣＨ3ＣＯ2-、Ｉ-、Ｂｒ-、Ｃｌ-、およびＦ-）の前もって調製し保存した溶液それぞれ４ｍＬを、溶液それぞれのアリコートが（１７ｍＭ）になるように試験管に加えた。次いで、得られた溶液を、適宜ベースライン補正した後に、複光束分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−３１０１ ＰＣ）を用いてＵＶ−ｖｉｓスペクトル測定に使用し、この結果を図１に示す。
【０１２８】
図１に示すように、本発明の化合物（Ｌ．Ｚｎ）（スキーム１、式１Ａ）の吸収スペクトルでは、ＡＴＰがｐＨ７．２にて加えられると、明確な新しい吸収スペクトルバンドが５０３ｎｍに現れた。したがって、ＡＴＰ（〜１９２０当量）の溶液をＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の溶液に加えると、４０ｎｍの赤方偏移が観察された。ＣＴＰのこの偏移ははるかに少なく、９ｎｍの赤方偏移が観察されたのみである。対照的に、２０００当量の他のアニオンが加えられると、変化は観察されなかった。したがって、本発明の化合物（Ｌ．Ｚｎ）（スキーム１、式１Ａ）は、ＡＴＰと優先的にカップリングすることが分かる。
【０１２９】
水性培地中のＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（８．８７μＭ）の溶液を、過剰量の〜５００μＭの様々なリン酸アニオン（Ｈ2ＰＯ4-、ＰＰｉ、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、およびＣＴＰなど）で処理した。それぞれのアニオンを加えると、ＡＴＰの存在下でのみ著しい色の変化が観察された。ＡＤＰおよびＣＴＰの場合は、色の変化がわずかに観察された。したがって、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）は、様々なリン酸アニオンのうちでＡＴＰに選択的に結合することができ、ＡＴＰの結合に伴う色の変化は、肉眼で検出することができる（図２）。
【０１３０】
［ＡＴＰの濃度に応じた化合物（Ｌ．Ｚｎ）（スキーム１、式１Ａ）に対するＵｖ−ｖｉｓスペクトル滴定実験。］
Ｚｎ（ＩＩ）−化合物（Ｌ．Ｚｎ）（スキーム１、式１Ａ）とＡＴＰとの結合特性を調べるために、次の実験を行った。
【０１３１】
ＡＴＰ（２１．６ｍＭ）の溶液を、１０ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて調製した。さらに、化合物（Ｌ．Ｚｎ）（スキーム１、式１Ａ、実施例１で得られた）の溶液（４７．３μＭ）を、再蒸留し脱イオン化した水を用いて調製した。これら保存溶液を、溶液を調製した日に実験に使用した。
【０１３２】
Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（［Ｌ．Ｚｎ］＝４７．３μＭ）の保存液１．０ｍＬを、Ｌ．Ｚｎ溶液の最終濃度が９．４６μＭになるように試験管に入れた。これに、様々な量のＡＴＰ（０．１〜４ｍＬの保存ＡＴＰ溶液（２１．６ｍＭ）を加えた。次いで、得られた溶液を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて、得られるアリコートの全容積を５ｍＬに維持して希釈し、これを複光束分光計およびクォーツ分光測光用セル（３．５ｍＬ容量）を用いた分光光度測定に使用した。全スペクトル変化は、適宜ベースライン補正した後に、複光束分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−３１０１ ＰＣ）を用いて測定した。この滴定中の実験すべてでスリット幅は０．２ｎｍで変更せずにおき、その結果を図３に示す。
【０１３３】
図３に示すように、様々なＡＴＰとの化合物Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の吸収滴定スペクトルである。本発明によれば、化合物の最終濃度がｐＨ７．２で９．４６μＭであると、ＡＴＰの添加量は、０当量から１８２６モル当量まで増加し、したがって、錯体Ｌ．Ｚｎ−ＡＴＰ（スキーム１、式１Ｂ）の形成による新しいスペクトルバンドが、５０３ｎｍの波長で観察された。したがって、本発明の錯体（Ｌ．Ｚｎ−ＡＴＰ）（スキーム１、式１Ｂ）の形成の結合定数は、当該化合物およびＡＴＰの分光光度滴定実験によると９７８±１５Ｍ-1（２５℃）であったことが分かる。
【０１３４】
ＵＶ−ｖｉｓ滴定からの結合定数の計算に使用した一般式は次のとおりである。
【０１３５】
Ｌ．Ｚｎ＋Ａ-＝Ｌ．Ｚｎ−Ａ-
Ｌ．Ｚｎの吸収極大はλLであり、この波長での吸光係数およびＯＤは、それぞれεLおよびＡLである。
【０１３６】
Ｌ．Ｚｎ−Ａ-の吸収極大はλL.Zn-A-であり、この波長での吸光係数およびＯＤは、それぞれεL.Zn-A-およびＡL.Zn-A-である。
【０１３７】
したがって、所与の濃度のレセプター分子（［Ｌ．Ｚｎ］）およびアニオン（［Ａ-］）について、
［Ｌ．Ｚｎ−Ａ-］＝［｛ＡLZn-A-−Ａ0｝／εL.Zn-A-］  （６）
式中、Ａ0は、外部からＡ-を加える前のλL.Zn-A-でのＯＤ値である。
【０１３８】
ＡL.Zn-A-は、１００モル当量のＡ-を加えた後のλL.Zn-A-にて記録した。
【０１３９】
したがって、εL.Zn-A-＝ＡL.Zn-A-／［Ｌ．Ｚｎ］free  （７）
（レセプター分子はすべてＡ-に結合し、Ａ-単独ではこの波長では吸収しないと仮定すれば）
したがって、一旦［Ｌ．Ｚｎ−Ａ-］を求めることができれば、式６および７を用いて、錯形成していないレセプター分子［Ｌ．Ｚｎ］の濃度を計算することができる。
【０１４０】
［Ｌ．Ｚｎ］free＝［Ｌ．Ｚｎ］initial−［Ｌ．Ｚｎ−Ａ-］  （８）
および、［Ａ-］free＝［Ａ-］initial−［Ｌ．Ｚｎ−Ａ-］  （９）
Ｋが、Ａ-の所与の濃度での包接錯体Ｌ．Ｚｎ−Ａ-の形成定数である場合、
結合定数、Ｋ＝［Ｌ．Ｚｎ−Ａ-］／｛［Ｌ．Ｚｎ］free［Ａ-］free｝  （１０）
Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（［Ｌ．Ｚｎ］＝８．９５μＭ）の保存液１．０ｍＬを、Ｌ．Ｚｎ溶液の最終濃度が１．７９μＭになるように試験管に入れ、これに、様々な量のＣＴＰ（０．１〜４ｍＬの保存ＣＴＰ溶液（１２．７１ｍＭ）を加えた。次いで、得られた溶液を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）（ｐＨ７．２）を加えて、得られるアリコートの全容積を５ｍＬに維持して希釈し、これをクォーツ分光測光用セル（３．５ｍＬ容量）による分光光度測定に使用した。全スペクトル変化は、適宜ベースライン補正した後に、分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−３１０１ ＰＣ）を用いて測定した。この滴定中の実験すべてでスリット幅は０．２ｎｍで変更せずにおき、その結果を図４に示す。
【０１４１】
図４に示すように、様々なＣＴＰとの化合物Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の吸収滴定スペクトルである。本発明によれば、化合物の最終濃度がｐＨ７．２で１．７９μＭであると、ＣＴＰの添加量は、０当量から５６８１当量まで増加し、したがって、錯体Ｌ．Ｚｎ−ＣＴＰの形成による新しいスペクトルバンドが、４７７ｎｍの波長で観察された。したがって、本発明の錯体（Ｌ．Ｚｎ−ＣＴＰ）の形成の結合定数は、当該化合物およびＣＴＰの分光光度滴定実験によると２２０（±１５）Ｍ-1（２５℃）であったことが分かる。
【０１４２】
Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（［Ｌ．Ｚｎ］＝４４．３μＭ）の保存液１ｍＬを、Ｌ．Ｚｎ溶液の最終濃度が８．８６μＭになるように試験管に入れた。これに、様々な量のＡＤＰ（０．１〜４ｍＬの保存ＡＤＰ溶液（８．１９ｍＭ）を加えた。次いで、得られた溶液を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて、得られるアリコートの全容積を５ｍＬに維持して希釈し、これをクォーツ分光測光用セル（３．５ｍＬ容量）のマッチドペアを用いた分光光度測定に使用した。全スペクトル変化は、適宜ベースライン補正した後に、複光束分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−３１０１ ＰＣ）を用いて測定した。この滴定中の実験すべてでスリット幅は０．２ｎｍで変更せずにおき、その結果を図５に示す。
【０１４３】
図５に示すように、様々なＡＤＰとの化合物Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の吸収滴定スペクトルである。本発明によれば、化合物の最終濃度がｐＨ７．２で８．８６μＭであると、ＡＤＰの添加量は、０から９２４モル当量まで徐々に増加し、したがって、錯体Ｌ．Ｚｎ−ＡＤＰの形成による新しいスペクトルバンドが、４７１ｎｍの波長で観察された。したがって、本発明の錯体（Ｌ．Ｚｎ−ＡＤＰ）の形成の結合定数は、当該化合物およびＡＤＰの分光光度滴定実験によると１４２（±１５）Ｍ-1（２５℃）であったことが分かる。
【０１４４】
ＡＴＰおよびＣＴＰの31Ｐ ＮＭＲスペクトル（図６Ａおよび図６Ｂ）をＢｒｕｋｅｒ ５００ＭＨｚ（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩ−ＤＰＸ ５００ＭＨｚ）ＦＴ ＮＭＲに記録した。Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）とのＡＴＰの結合も31Ｐ ＮＭＲ分光法により確認した（図６Ａ）。Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）に結合したＡＴＰのα、β、およびγ−Ｐ−原子の31Ｐシグナルのアップフィールドシフト（それぞれ０．０７ｐｐｍ、０．０９ｐｐｍ、および０．０５ｐｐｍ）が観察された。ほぼ同様のシフトが、他の研究者により過去に報告されている（Ｏｊｉｄａ，Ａ．；Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｋ．；Ｍｉｔｏ−ｏｋａ，Ｙ．；Ｈａｍａｃｈｉ，Ｉ．「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．」２００２，４３，６１９３）。α、β、およびγ−Ｐ原子の31Ｐ ＮＭＲシグナルは、それぞれのリン酸単位を介したＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）のＺｎ−原子への結合を示す。この所見により我々は、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）がＡＴＰの存在下でヘプタ配位錯体を形成することができるとの結論に至る。このタイプのヘプタ配位Ｚｎ錯体の例は、文献［（ａ）Ｌｉｎｄｌｏｙ，Ｌ．Ｆ．；Ｂｕｓｃｈ，Ｄ．Ｈ．「Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」１９７４，１３，２４９４．（ｂ）Ｗｅｓｔｅｒ，Ｄ．；Ｐａｌｅｎｉｋ，Ｇ．Ｊ．「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１９７４，９５，６５０５．］にある。
【０１４５】
ＣＴＰに対して同様の実験を繰り返すと、31Ｐシグナルの非常に僅かなシフトが観察された（図６Ｂ）。Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）に結合したＣＴＰのα、β、およびγ−Ｐ−原子の31Ｐシグナルのアップフィールドシフト（それぞれ０．０ｐｐｍ、０．０３ｐｐｍ、および０．０１ｐｐｍ）が観察された。ＡＤＰおよびＡＭＰを用いて同じ実験を行った場合には、そのようなシフトは観察されなかった。したがって、31Ｐ ＮＭＲスペクトルのデータも、観察された結合親和性の傾向（ＡＴＰ＞＞ＣＴＰ＞ＡＤＰ＞＞ＡＭＰ）を裏付ける。恐らく、ＡＴＰとＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）との向上した静電的相互作用が、Ｌ．Ｚｎ−ＡＴＰにおける効率的なＬ．Ｚｎ−Ｏ（リン酸）結合に非常に重要である。したがって、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の観察された結合選択性ＡＴＰ＞＞ＣＴＰ＞ＡＤＰ＞＞ＡＭＰは、リン酸種のアニオン電荷数の差に起因し得る。
【０１４６】
ＡＴＰの非存在下および存在下での錯体Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の質量分析を、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）技術を用いて行った。
【０１４７】
本発明の化合物（Ｌ．Ｚｎ、スキーム１、式１Ａ）とＡＴＰとの錯体が形成されたかどうかを判断するために、文献（Ｋｗｏｎ，Ｊ．Ｙ．；Ｊａｎｇ．Ｙ．Ｊ．；Ｌｅｅ，Ｙ．Ｊ．；Ｋｉｍ，Ｋ．Ｍ．；Ｓｅｏ Ｍ．Ｓ．；Ｎａｍ，Ｗ．；Ｙｏｏｎ，Ｊ．「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」２００５，１２７，１０１０７）を参照してエレクトロスプレーイオン化質量分析を行った。
【０１４８】
化合物Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ；７．２μＭ）および９００μＭのＡＴＰ（１２５モル当量）をメスフラスコに入れ、ＨＰＬＣグレードの水５ｍＬに溶解して、混合液を形成した。次に、この混合液を、ポジティブモードのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）技術を用いて質量分析した。その結果、ピークは、ｍ／ｚ＝１０８２周辺で得られ、図７に示す（使用機器：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ（登録商標）ＡｄｖａｎｔａｇｅＭＡＸ四重極イオントラップ機器、サンホセ、カリフォルニア州，米国）（図７）。
【０１４９】
Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の水溶液にＡＴＰのジナトリウム塩の水溶液を加えると、新たな錯体Ｌ．Ｚｎ−ＡＴＰ（スキーム１、式１Ｂ）が形成された。この溶液を、ＥＳＩ−質量スペクトルの記録に使用し、スペクトルを図７に示す。図７に示すピークは、［Ｃ34Ｈ49Ｎ12Ｐ3ＳＯ15ＮａＺｎ＋Ｈ+］＝［Ｌ．Ｚｎ（ＮＯ3）2−２（ＮＯ3-）］＋［Ｃ10Ｈ12Ｎ5Ｏ13Ｐ3Ｎａ2−Ｎａ+］＋Ｈ+の［Ｃ24Ｈ37Ｎ7Ｐ3ＳＯ2Ｚｎ］に対応する質量を示す。これは、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）とＡＴＰとの１：１錯体の形成を支持していることが明らかである。したがって、質量スペクトル分析は、提案する錯体Ｌ．Ｚｎ−ＡＴＰの形成を裏付けている。
【０１５０】
電子スペクトル研究に関する記載について上記したように、本発明のＺｎ（ＩＩ）錯体Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）は、水溶液中の他のアニオンを認識せず、ＡＴＰに選択性を示す。ＡＴＰに結合すると、肉眼で検出可能なはっきりした色の変化を伴うより好ましい電荷移動遷移により、５０３ｎｍにＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の新たな吸収バンドが現われた。したがって、これにより我々はこの本発明のＺｎ（ＩＩ）−錯体（Ｌ．Ｚｎ、スキーム１、式１Ａ）を、光学顕微鏡のみを介して観察するための生細胞用の比色染色剤として使用する可能性を調査する機会を得た。
【０１５１】
真核微生物であるサッカロミセス・セレビシエ（S.cerevisiae）は、そのエネルギーをＡＴＰの形態で取り出し、その細胞の表面は、負電荷を持つＡＴＰイオンを有する。したがって、我々は、真核細胞を染色するためのレセプター分子Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）を使用することができた。酵母細胞を、レセプター分子Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（１．１６×１０-4Ｍ）に２０分間またはＬ．Ｚｎ−ＣＤ（スキーム２）（（［Ｌ．Ｚｎ］＝０．５×１０-3Ｍ［α−ＣＤ］＝２．９２×１０-3Ｍ）に２分間曝露し、次に、水混合液で洗浄し、次いで光学顕微鏡（ＡＸＩＯ ＩＭＡＧＥＲ−Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）下で観察した。
【０１５２】
事前のスペクトル研究は、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の吸収極大（４６３ｎｍ）は、α−ＣＤ（０〜２．３ｍＭ）の水溶液をＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の８．３μＭ溶液へ加えると、より短い波長（４５８ｎｍ）にシフトすることを示す。ＣＤキャビティーにおける包接がＨＯＭＯ−ＬＵＭＯエネルギーギャップに影響を及ぼすことが予想され、これにより吸収スペクトルバンドが影響される（エネルギー準位の摂動は、大きなものであるとは予想されていないが）。したがって、本研究では、観察された５ｎｍのシフトは、包接現象および擬ロタキサン錯体の形成に起因する可能性がある。系統的分光光度滴定をした際、吸収極大が５ｎｍシフトすることが分かり、２つの同時等吸収点が観察された。この分光光度滴定に基づいた会合定数を求めると、会合定数値が２５５（±１５）Ｍ-1であることが示された。したがって、大過剰のα−ＣＤ（１２５倍）の存在下では、擬ロタキサン形態、つまり、Ｌ．Ｚｎ．α−ＣＤ（スキーム２）は、水溶液中で支配的な形態として存在すると考えられる（図８）。
【０１５３】
通常の光学顕微鏡（ＡＸＩＯ ＩＭＡＧＥＲ-Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）下で観察した無色の酵母細胞の画像を図９Ａに示す。このように観察したＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（０．１１６ｍＭ）およびＬ．Ｚｎ．α−ＣＤ（スキーム２）（（［Ｌ．Ｚｎ］＝０．５ｍＭ、［α−ＣＤ］＝２．９２ｍＭ）で処理した細胞の画像を、図９Ｂおよび９Ｃ（同様の倍率で）にそれぞれ示す。図９Ａは、処理した細胞がＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）で染色されること、細胞の色はピンク色−紫色（図９Ａ（Ｂ））に変わったことを示した。酵母細胞の変色は、細胞表面の負電荷を持つリン酸基が、レセプター分子Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）に効果的に結合していることを示した。この染色は、水／エタノール（７０／３０、ｖ／ｖ）の混合物を用いた後洗浄の後でも安定していることが分かった。エタノールは、脱水剤および生物試料の良好な固定剤として作用することが知られている。当該細胞をＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）、Ｌ．Ｚｎ．α−ＣＤ（スキーム２）、または遊離Ｚｎ（ＩＩ）イオンの溶液で処理して対照実験を行うと；そのような色の変化は観察されなかった。これは、観察された染色についての妥当な理由として、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）への細胞表面のＡＴＰイオンの結合を裏付ける。細胞表面上のその場で産生されたＡＴＰイオンのＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）への結合は、観察された染色の妥当な理由と考えられた。さらに、吸収スペクトル（図１０Ａ）および光学顕微鏡画像（図１０Ｂ）は、染色された細胞が、過剰（５０モル当量）のクエン酸イオンをＡＴＰおよび染色された酵母細胞に加えると無色になることを示した。同じ所見が、酵母細胞とＬ．Ｚｎ／Ｌ．Ｚｎ．α−ＣＤ（スキーム２）との混合物で観察された（図１０Ｂ）。この所見は、酵母細胞中でその場で産生されたＡＴＰの可逆的結合に基づいて説明することができる。
【０１５４】
我々はまた、原核生物（グラム陽性およびグラム陰性菌細胞）の染色剤としてのＬ．Ｚｎ／Ｌ．Ｚｎ．α−ＣＤの使用可能性を調査した。図９Ｂ（Ａ）および９Ｃ（Ａ）は、光学顕微鏡下で観察した場合の２種類の細菌バチルス・メガテリウム（グラム陽性）およびシュードモナス・フルオレセンス（グラム陰性）の画像をそれぞれ示した。図９Ｂ（Ｂ）および９Ｃ（Ｂ）は、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（６６μＭ）の存在下で観察した場合の同じ細菌の画像を示した。これらの図は、Ｌ．Ｚｎの存在下で細菌の染色における色の明らかな変化を明確に示した。図９ｂ（Ｃ）および９ｃ（Ｃ）は、Ｌ．Ｚｎ．α−ＣＤ（［Ｌ．Ｚｎ］＝０．５ｍＭ、［α−ＣＤ］＝２．９２ｍＭ）の存在下で観察した場合の同じ細菌の画像を示した。同一の倍率で撮影した図９Ｂおよび９Ｃは、本発明の染料Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）がまた、グラム陽性およびグラム陰性菌を、染色した細胞の明らかに異なる色強度および形状によって区別できることを示した。予想されたように、グラム陽性菌の染色された細胞は、染色されたグラム陰性菌のものと比較して長く見えた。Ｌ．Ｚｎ．α−ＣＤ（スキーム２）による２種類の異なる細菌の染色強度の違いは、各細菌細胞の細胞生物学や、染色の際に関与する詳細な生化学のほか；それぞれの細菌の細胞構造および細胞壁組成の違いに深く言及することがより一層よく理解することができる。
【０１５５】
ブランク、ならびに染色真核生物（酵母）、グラム陽性およびグラム陰性細胞のＳＥＭ画像（図１１）は、染色の際の細胞の外面の形態変化を示した。染料を有する酵母細胞の画像（染色された細胞表面は粗いと認められた）とは対照的に、染料が無い酵母細胞のＳＥＭ画像は、なめらかであると認められた。これは、細胞に接着している異物、すなわち、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の存在を示した。染料Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）が結合した際の細胞表面の変化も、染色剤の非存在下および存在下での、グラム陰性およびグラム陽性菌について記録したＳＥＭ画像から明らかであった（図１１Ｃ〜１１Ｆ）。試料表面のＳＥＭ画像中のコントラストの違いはまた、試料表面の不均一な化学的性質の表れである。グラム陽性菌と比べたグラム陰性菌の比較的明るい細胞表面は、細胞外表面上により高い負電荷が蓄積していることを示す。
【０１５６】
影響を受けなかった細胞増殖および成長により、染色剤（Ｌ．ＺｎまたはＬ．Ｚｎ．α−ＣＤのいずれか）は毒性が無く、染色後に細胞を生存可能に維持したことが裏付けられた。したがって；Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）は、ＡＴＰなどの生物活性分子の効率的なその場での化学センサーとしてかつ好適な染色剤としても使用することができる。真核生物の酵母細胞（サッカロミセス・セレビシエ）ならびに原核生物の細菌細胞（グラム陽性（シュードモナス・フルオレセンス）およびグラム陰性（バチルス・メガテリウム））の、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の非存在下および存在下での、水性培地中における増殖プロファイルを図１２に示す。吸光度(λｍａｘ＝６００ｎｍにて)対時間（ｔ）の変化を３０時間まで（その後は増殖の大きな変化は観察されなかったので）プロットした。図１２ａ〜ｆは、代謝プロセスにおけるそれぞれの細胞の漸進的な増殖を伴う細胞増殖とＡＴＰ生成との良好な相関性を示した。これらの動態検査は、増殖の様々な局面をモニタリングするために行われ；ここで、バッチ培養としてのＡＴＰ濃度の増加は、誘導期から対数期そしてその後の定常期まで増え、最終的には増殖曲線の下落が観察された。図１２ａ、１２ｃ、および１２ｅは、それぞれ、経時的なサッカロミセス・セレビシエ、シュードモナス・フルオレセンス、およびバチルス・メガテリウムの実際の増殖曲線を示す。一方、図１２ｂ、１２ｄ、および１２ｆは、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）（Ｄ１）およびＬ．Ｚｎ．α−ＣＤ（スキーム２）（Ｄ２）の存在下での、サッカロミセス・セレビシエ、シュードモナス・フルオレセンス、およびバチルス・メガテリウムの経時的な細胞質中のＡＴＰの相対的な増加をそれぞれ示す。図１２は、同一の実験条件下の培養物中の実際の細胞増殖およびＡＴＰ濃度の増加がよく一致したことを示す。実際の細胞増殖およびＡＴＰ濃度で観察された相対的な減少（図１２）は、ＡＴＰを消費する異化プロセスが一定時間以降より重要になることを考慮すれば説明することができる。
【０１５７】
ＡＴＰやＡＤＰ／ＡＭＰ／ＰＰｉのいずれも、生物系の細胞内では高濃度で保存することはできない。細胞質中のそれらの相対的な濃度は、一般に、様々な生物学的プロセスによって狭い濃度限度に調節されている。実際には、細菌は、確実に細胞の要求が満足されるが超過しないように、代謝プロセスに調節機構を設けている。したがって、この調節の生理的な結果は同じであるが、グラム陽性およびグラム陰性菌における機構は全く異なる。しかしながら、動態検査は、染色剤としてＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）を用いると、代謝プロセスの際の細胞増殖およびＡＴＰの放出は相関し得ることを示した。グラム陰性菌の場合に観察された吸収変化の程度およびより急峻な傾斜は、グラム陽性菌と比較して、細胞増殖の際に放出されたＡＴＰへのＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）のより高い結合を示した。
【０１５８】
細胞の生存能力を、光学顕微鏡下で、Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）での染色の前後に観察した。細胞増殖、細胞分裂、ならびに細胞運動性は、染色した細胞懸濁液を、３時間まで凹面スライド中で調製した懸滴（hanging drop）として取った際に観察することができる（図１３）。
【０１５９】
我々は、金属中心がアニオン性分析物との結合にレセプター単位として作用する容易な２工程合成法に従って、新規なＺｎ（ＩＩ）に基づいた比色センサーＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）を合成した。当該センサーは、純粋な水性媒体中でＡＴＰに対して選択的であり、ＡＴＰに結合した後に著しい色の変化を示す。様々な生体細胞（真核および原核細胞）で産生されたＡＴＰへの結合を介したこの化合物の生細胞を染色する能力を試験した。この試薬は細胞を染色することが分かり、これは光学顕微鏡を介して目で見ることができ、かつ毒性がないことが分かった。この好適な染色剤により、細胞増殖動態に関する研究を行うことができる。
【０１６０】
本発明は、Ｚｎ（ＩＩ）に基づいた比色センサーＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の調製、および生細胞用の好適な染色剤としてのその使用方法を開発することに関連する。ここで、センサーの調製は、リガンドの合成および、亜鉛塩溶液とのその反応を伴う。金属中心は、アニオン性分析物との結合のレセプター単位として作用する。センサーは、水性媒体中でアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に選択的であり、ＡＴＰに結合後に著しい色の変化を示す。センサーは染色剤として機能し、細胞増殖動態に関する研究を行うことができる。従来技術は、Ｚｎ（ＩＩ）に基づいた比色センサーを生細胞用の好適な染色剤としてどのように使用することができるかについて開示も教示もしていない。本発明で初めて、酵母細胞（真核生物）およびグラム陽性／グラム陰性菌細胞（原核生物）が、染色された細胞の色強度に基づいて区別され得ることを報告する。さらに、センサーは毒性が無く、細胞の染色後であっても、水性媒体中で生体細胞の細胞増殖動態の評価およびモニタリングに使用することができる。
【０１６１】
本発明が有する進歩性は、次のとおりである。（ｉ）様々な生物学的リン酸の中でもＡＴＰに優先的に結合するＺｎ（ＩＩ）に基づいた比色センサーＬ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の調製、（ｉｉ）センサーは、水性媒体中でｐＨ７．２の生理学的条件下で生細胞の染色に活性がある；（ｉｉｉ）センサーは、生細胞に対して毒性がない、および（ｉｖ）α−シクロデキストリン中へのセンサーの包接が、生細胞の染色強度、およびその後の色強度に基づく分離を増進させる。
【０１６２】
本発明を通じて我々が解決した技術的課題は、呼吸過程で産生される様々な濃度のＡＴＰの認識を介した生体内での細胞増殖動態の評価に使用することができる生細胞用の好適な染色剤を開発することである。生理的条件での生細胞の染色に有用なセンサーに関する従来公知の方法で遭遇する大きな問題の１つは、センサーの毒性である。生細胞の死亡の原因となるので、使用する当該センサーの毒性によりインビボ細胞増殖動態の研究をすることができない。対照的に、本発明のＺｎに基づいた比色センサーは毒性が無く、生体細胞のインビボ細胞増殖動態の評価に有用であることが分かった。さらに、このセンサーのおかげで、代謝プロセスにおけるそれぞれの細胞の漸進的な増殖に伴う、細胞増殖とアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のその場での生成との相関性を確立することができる。
【０１６３】
［実施例］
下記の実施例は、例示するために記載したものであり、したがって本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【実施例１】
【０１６４】
容量が２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）２４７ｍｇ（１．２３ｍＭ濃度）を無水テトラヒドロフラン１００ｍＬ（１２．３ｍＭ濃度）に緩やかに撹拌しながら２５℃で溶解した。溶液を含むフラスコを５℃の温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン５ｍＬを１．０ｍＬ／分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン５０ｍＬ中に４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリドを４００ｍｇ含む溶液（２４．７６ｍＭ濃度）を、５０ｍＬ／時間、撹拌しながら５℃の温度で加えた。２５℃の温度に到達した後に混合物を６時間撹拌し、次いで３０分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物（リガンド）を、濃度が１５ｍＭになるように２５℃でメタノールに溶解した。これに、リガンドの０．５モル当量の硝酸亜鉛溶液を２５℃の温度で加え、１５時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により１５℃まで下げ、さらに３時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物（センサー）の析出物をクロロホルムで洗浄し、静置した。ＧＹＥ培地中のサッカロミセス属種１００μＬを、２５℃にて１０分間の期間、１．０×１０-4Ｍの濃度のセンサー１００μＬと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。
【０１６５】
化合物Ｌ（スキーム１、式２）の単離収率：収率；７５％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，Ｊ（Ｈｚ），δ（ｐｐｍ））：７．９８−７．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈe）７．９−７．８７（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈc，Ｈd）、７．０６（３Ｈ，ｂ，−ＮＨmacrocycle）、６．７７−６．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈb）、３．１５（１６Ｈ，ｂｒ，Ｈf,h,i,j,k,m,n,o）、３．１１（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2）、２．０３（４Ｈ，ｂｒ，Ｈg,l）．ＥＳ−ｍｓ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ；４８８．３０（Ｍ+＋Ｈ+）．元素分析データ：計算値Ｃ：５９．１１，Ｈ：７．６５，Ｎ：２０．１１，実測値Ｃ：５９．１，Ｈ：７．５，Ｎ：２０．２。
【０１６６】
化合物Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の単離収率：収率；６５％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ7，ＴＭＳ，δ（ｐｐｍ））：７．９２−７．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈe），７．８８−７．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９，Ａｒ−Ｈc），７．８１−７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈd），６．９２−６．９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５，Ａｒ−Ｈb），３．１３（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．９２−２．９１（８Ｈ，ｂｒ，Ｈf,g,n,o），２．７５−２．７４（１２Ｈ，ｂｒ，Ｈh,i,j,k,l,m），．ＥＳ−ｍｓ（ポジティブモード，ｍ／ｚ）：６７６．００（Ｍ+）．元素分析：計算値Ｃ：４２．５７，Ｈ：５．５１，Ｎ：１８．６２；実測値Ｃ：４２．８８，Ｈ：５．５６，Ｎ：１８．２２。
【実施例２】
【０１６７】
容量が２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）２４７ｍｇ（１．２３ｍＭ濃度）を無水テトラヒドロフラン１５４ｍＬ（８．０ｍＭ濃度）に緩やかに撹拌しながら２５℃で溶解した。溶液を含むフラスコを５℃の温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン５ｍＬを１．０ｍＬ／分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン５０ｍＬ中に４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリドを４００ｍｇ含む溶液（２４．７６ｍＭ濃度）を、５０ｍＬ／時間、撹拌しながら５℃の温度で加えた。２５℃の温度に到達した後に混合物を６時間撹拌し、次いで３０分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物（リガンド）を、濃度が１５ｍＭになるように２５℃でメタノールに溶解した。これに、リガンドの０．５モル当量の硝酸亜鉛溶液を２５℃の温度で加え、１５時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により１５℃まで下げ、さらに３時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物（Ｌ．Ｚｎ、（スキーム１、式１Ａ））の析出物（センサー）をクロロホルムで洗浄し、静置した。ＧＹＥ培地中のサッカロミセス属種１００μＬを、２５℃にて１０分間の期間、１．０×１０-4Ｍの濃度のセンサー１００μＬと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。
【０１６８】
化合物Ｌ（スキーム１、式２）の単離収率：収率；７０％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，Ｊ（Ｈｚ），δ（ｐｐｍ））：７．９８−７．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈe）７．９−７．８７（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈc，Ｈd），７．０６（３Ｈ，ｂ，−ＮＨmacrocycle），６．７７−６．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈb），３．１５（１６Ｈ，ｂｒ，Ｈf,h,i,j,k,m,n,o），３．１１（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．０３（４Ｈ，ｂｒ，Ｈg,l）．Ｅｓ−Ｍｓ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ；４８８．３０（Ｍ+＋Ｈ+）．元素分析データ：計算値Ｃ：５９．１１，Ｈ：７．６５，Ｎ：２０．１１，実測値Ｃ：５９．１，Ｈ：７．５，Ｎ：２０．２。
【０１６９】
化合物Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の単離収率：収率；６５％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ7，ＴＭＳ，δ（ｐｐｍ））：７．９２−７．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈe），７．８８−７．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９，Ａｒ−Ｈc），７．８１−７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈd），６．９２−６．９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５，Ａｒ−Ｈb），３．１３（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．９２−２．９１（８Ｈ，ｂｒ，Ｈf,g,n,o），２．７５−２．７４（１２Ｈ，ｂｒ，Ｈh,i,j,k,l,m），．ＥＳ−ｍｓ（ポジティブモード，ｍ／ｚ）：６７６．００（Ｍ+）．元素分析：計算値Ｃ：４２．５７，Ｈ：５．５１，Ｎ：１８．６２；実測値Ｃ：４２．８８，Ｈ：５．５６，Ｎ：１８．２２。
【実施例３】
【０１７０】
容量が２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）２４７ｍｇ（１．２３ｍＭ濃度）を無水ジクロロメタン１００ｍＬ（１２．３ｍＭ濃度）に緩やかに撹拌しながら２５℃で溶解した。溶液を含むフラスコを５℃の温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン５ｍＬを１．０ｍＬ／分で加えた。別途調製した、無水ジクロロメタン５０ｍＬ中に４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリドを４００ｍｇ含む溶液（２４．７６ｍＭ濃度）を、５０ｍＬ／時間、撹拌しながら５℃の温度で加えた。２５℃の温度に到達した後に混合物を６時間撹拌し、次いで３０分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物（リガンド）を、濃度が１５ｍＭになるように２５℃でメタノールに溶解した。これに、リガンドの０．５モル当量の硝酸亜鉛溶液を２５℃の温度で加え、１５時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により１５℃まで下げ、さらに３時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物（Ｌ．Ｚｎ、（スキーム１、式１Ａ））の析出物（センサー）をクロロホルムで洗浄し、静置した。ＧＹＥ培地中のサッカロミセス属種１００μＬを、２５℃にて１０分間の期間、１．０×１０-4Ｍの濃度のセンサー１００μＬと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。
【０１７１】
化合物Ｌ（スキーム１、式２）の単離収率：収率；３０％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，Ｊ（Ｈｚ），δ（ｐｐｍ））：７．９８−７．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈe）７．９−７．８７（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈc，Ｈd），７．０６（３Ｈ，ｂ，−ＮＨmacrocycle)，６．７７−６．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈb），３．１５（１６Ｈ，ｂｒ，Ｈf,h,i,j,k,m,n,o），３．１１（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．０３（４Ｈ，ｂｒ，Ｈg,l）．Ｅｓ−Ｍｓ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ；４８８．３０（Ｍ+＋Ｈ+）．元素分析データ：計算値Ｃ：５９．１１，Ｈ：７．６５，Ｎ：２０．１１，実測値Ｃ：５９．１，Ｈ：７．５，Ｎ：２０．２。
【０１７２】
化合物Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の単離収率：収率；６５％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ7，ＴＭＳ，δ（ｐｐｍ））：７．９２−７．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈe），７．８８−７．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９，Ａｒ−Ｈc），７．８１−７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈd），６．９２−６．９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５，Ａｒ−Ｈb），３．１３（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．９２−２．９１（８Ｈ，ｂｒ，Ｈf,g,n,o），２．７５−２．７４（１２Ｈ，ｂｒ，Ｈh,i,j,k,l,m），．ＥＳ−ｍｓ（ポジティブモード，ｍ／ｚ）：６７６．００（Ｍ+）．元素分析：計算値Ｃ：４２．５７，Ｈ：５．５１，Ｎ：１８．６２；実測値Ｃ：４２．８８，Ｈ：５．５６，Ｎ：１８．２２。
【実施例４】
【０１７３】
容量が２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）２４７ｍｇ（１．２３ｍＭ濃度）を無水テトラヒドロフラン１００ｍＬ（１２．３ｍＭ濃度）に緩やかに撹拌しながら２５℃で溶解した。溶液を含むフラスコを５℃の温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン５ｍＬを１．０ｍＬ／分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン６２ｍＬ中に４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリドを４００ｍｇ含む溶液（２０ｍＭ濃度）を、５０ｍＬ／時間、撹拌しながら５℃の温度で加えた。２５℃の温度に到達した後に混合物を６時間撹拌し、次いで３０分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物（リガンド）を、濃度が１５ｍＭになるように２５℃でメタノールに溶解した。これに、リガンドの０．５モル当量の硝酸亜鉛溶液を２５℃の温度で加え、１５時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により１５℃まで下げ、さらに３時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物（Ｌ．Ｚｎ、（スキーム１、式１Ａ））の析出物（センサー）をクロロホルムで洗浄し、静置した。ＧＹＥ培地中のサッカロミセス属種１００μＬを、２５℃にて１０分間の期間、１．０×１０-4Ｍの濃度のセンサー１００μＬと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。
【０１７４】
化合物Ｌ（スキーム１、式２）の単離収率：収率６８％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，Ｊ（Ｈｚ），δ（ｐｐｍ））：７．９８−７．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈe）７．９−７．８７（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈc，Ｈd），７．０６（３Ｈ，ｂ，−ＮＨmacrocycle），６．７７−６．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈb），３．１５（１６Ｈ，ｂｒ，Ｈf,h,i,j,k,m,n,o），３．１１（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．０３（４Ｈ，ｂｒ，Ｈg,l）．Ｅｓ−Ｍｓ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ；４８８．３０（Ｍ+＋Ｈ+）．元素分析データ：計算値Ｃ：５９．１１，Ｈ：７．６５，Ｎ：２０．１１，実測値Ｃ：５９．１，Ｈ：７．５，Ｎ：２０．２。
【０１７５】
化合物Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の単離収率：収率６５％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ7，ＴＭＳ，δ（ｐｐｍ））：７．９２−７．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈe），７．８８−７．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９，Ａｒ−Ｈc），７．８１−７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈd），６．９２−６．９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５，Ａｒ−Ｈb），３．１３（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．９２−２．９１（８Ｈ，ｂｒ，Ｈf,g,n,o），２．７５−２．７４（１２Ｈ，ｂｒ，Ｈh,i,j,k,l,m），．ＥＳ−ｍｓ（ポジティブモード，ｍ／ｚ）：６７６．００（Ｍ+）．元素分析：計算値Ｃ：４２．５７，Ｈ：５．５１，Ｎ：１８．６２；実測値Ｃ：４２．８８，Ｈ：５．５６，Ｎ：１８．２２。
【実施例５】
【０１７６】
容量が２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）２４７ｍｇ（１．２３ｍＭ濃度）を無水テトラヒドロフラン１００ｍＬ（１２．３ｍＭ濃度）に緩やかに撹拌しながら２５℃で溶解した。溶液を含むフラスコを５℃の温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン５ｍＬを１．０ｍＬ／分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン６２ｍＬ中に４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリドを４００ｍｇ含む溶液（２０ｍＭ濃度）を、２５ｍＬ／時間、撹拌しながら５℃の温度で加えた。２５℃の温度に到達した後に混合物を６時間撹拌し、次いで３０分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物（リガンド）を、濃度が１５ｍＭになるように２５℃でメタノールに溶解した。これに、リガンドの０．３５モル当量の硝酸亜鉛溶液を２５℃の温度で加え、１５時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により１５℃まで下げ、そして、さらに３時間激しく撹拌した。所望の化合物（Ｌ．Ｚｎ、（スキーム１、式１Ａ））の析出物（センサー）をクロロホルムで洗浄し、静置した。ＧＹＥ培地中のサッカロミセス属種１００μＬを、２５℃にて１０分間の期間、１．０×１０-4Ｍの濃度のセンサー１００μＬと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。
【０１７７】
化合物Ｌ（スキーム１、式２）の単離収率：収率７５％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，Ｊ（Ｈｚ），δ（ｐｐｍ））：７．９８−７．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈe）７．９−７．８７（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈc，Ｈd），７．０６（３Ｈ，ｂ，−ＮＨmacrocycle），６．７７−６．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈb），３．１５（１６Ｈ，ｂｒ，Ｈf,h,i,j,k,m,n,o），３．１１（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．０３（４Ｈ，ｂｒ，Ｈg,l）．Ｅｓ−Ｍｓ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ；４８８．３０（Ｍ+＋Ｈ+）．元素分析データ：計算値Ｃ：５９．１１，Ｈ：７．６５，Ｎ：２０．１１，実測値Ｃ：５９．１，Ｈ：７．５，Ｎ：２０．２。
【０１７８】
化合物Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の単離収率：収率５０％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ7，ＴＭＳ，δ（ｐｐｍ））：７．９２−７．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈe），７．８８−７．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９，Ａｒ−Ｈc），７．８１−７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈd），６．９２−６．９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５，Ａｒ−Ｈb），３．１３（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．９２−２．９１（８Ｈ，ｂｒ，Ｈf,g,n,o），２．７５−２．７４（１２Ｈ，ｂｒ，Ｈh,i,j,k,l,m），．ＥＳ−ｍｓ（ポジティブモード，ｍ／ｚ）：６７６．００（Ｍ+）．元素分析：計算値Ｃ：４２．５７，Ｈ：５．５１，Ｎ：１８．６２；実測値Ｃ：４２．８８，Ｈ：５．５６，Ｎ：１８．２２。
【実施例６】
【０１７９】
容量が２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）２４７ｍｇ（１．２３ｍＭ濃度）を無水テトラヒドロフラン１００ｍＬ（１２．３ｍＭ濃度）に緩やかに撹拌しながら２５℃で溶解した。溶液を含むフラスコを５℃の温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン５ｍＬを１．０ｍＬ／分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン６２ｍＬ中に４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリドを４００ｍｇ含む溶液（２０ｍＭ濃度）を、２５ｍＬ／時間、撹拌しながら５℃の温度で加えた。２５℃の温度に到達した後に混合物を６時間撹拌し、次いで３０分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物（リガンド）を、濃度が１５ｍＭになるように２５℃でメタノールに溶解した。これに、リガンドの０．７５モル当量の硝酸亜鉛溶液を２５℃の温度で加え、１５時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により１５℃まで下げ、さらに３時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物（Ｌ．Ｚｎ、（スキーム１、式１Ａ））の析出物（センサー）をクロロホルムで洗浄し、静置した。ＧＹＥ培地中のサッカロミセス属種１００μＬを、２５℃にて１０分間の期間、１．０×１０-4Ｍの濃度のセンサー１００μＬと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。
【０１８０】
化合物Ｌ（スキーム１、式２）の単離収率：収率７５％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，Ｊ（Ｈｚ），δ（ｐｐｍ））：７．９８−７．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈe）７．９−７．８７（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈc，Ｈd），７．０６（３Ｈ，ｂ，−ＮＨmacrocycle），６．７７−６．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈb），３．１５（１６Ｈ，ｂｒ，Ｈf,h,i,j,k,m,n,o），３．１１（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．０３（４Ｈ，ｂｒ，Ｈg,l）．Ｅｓ−Ｍｓ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ；４８８．３０（Ｍ+＋Ｈ+）．元素分析データ：計算値Ｃ：５９．１１，Ｈ：７．６５，Ｎ：２０．１１，実測値Ｃ：５９．１，Ｈ：７．５，Ｎ：２０．２。
【０１８１】
化合物Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の単離収率：収率６３％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ7，ＴＭＳ，δ（ｐｐｍ））：７．９２−７．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈe），７．８８−７．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９，Ａｒ−Ｈc），７．８１−７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈd），６．９２−６．９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５，Ａｒ−Ｈb），３．１３（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．９２−２．９１（８Ｈ，ｂｒ，Ｈf,g,n,o），２．７５−２．７４（１２Ｈ，ｂｒ，Ｈh,i,j,k,l,m），．ＥＳ−ｍｓ（ポジティブモード，ｍ／ｚ）：６７６．００（Ｍ+）．元素分析：計算値Ｃ：４２．５７，Ｈ：５．５１，Ｎ：１８．６２；実測値Ｃ：４２．８８，Ｈ：５．５６，Ｎ：１８．２２。
【実施例７】
【０１８２】
容量が２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）２４７ｍｇ（１．２３ｍＭ濃度）を無水テトラヒドロフラン１００ｍＬ（１２．３ｍＭ濃度）に緩やかに撹拌しながら２５℃で溶解した。溶液を含むフラスコを５℃の温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン５ｍＬを１．０ｍＬ／分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン６２ｍＬ中に４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリドを４００ｍｇ含む溶液（２０ｍＭ濃度）を、２５ｍＬ／時間、撹拌しながら５℃の温度で加えた。２５℃の温度に到達した後に混合物を６時間撹拌し、次いで３０分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物（リガンド）を、濃度が１５ｍＭになるように２５℃でメタノールに溶解した。これに、リガンドの０．７５モル当量の硝酸亜鉛溶液を２５℃の温度で加え、１５時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により１５℃まで下げ、さらに３時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物（Ｌ．Ｚｎ、（スキーム１、式１Ａ））の析出物（センサー）をクロロホルムで洗浄し、静置した。ニュートリエントブロス培地中のバチルス属種１００μＬを、２５℃にて１０分間の期間、１．０×１０-4Ｍの濃度のセンサー１００μＬと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。
【０１８３】
化合物Ｌ（スキーム１、式２）の単離収率：収率７５％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，Ｊ（Ｈｚ），δ（ｐｐｍ））：７．９８−７．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈe）７．９−７．８７（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈc，Ｈd），７．０６（３Ｈ，ｂ，−ＮＨmacrocycle），６．７７−６．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈb），３．１５（１６Ｈ，ｂｒ，Ｈf,h,i,j,k,m,n,o），３．１１（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．０３（４Ｈ，ｂｒ，Ｈg,l）．Ｅｓ−Ｍｓ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ；４８８．３０（Ｍ+＋Ｈ+）．元素分析データ：計算値Ｃ：５９．１１，Ｈ：７．６５，Ｎ：２０．１１，実測値Ｃ：５９．１，Ｈ：７．５，Ｎ：２０．２。
【０１８４】
化合物Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の単離収率：収率；６５％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ7，ＴＭＳ，δ（ｐｐｍ））：７．９２−７．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈe），７．８８−７．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９，Ａｒ−Ｈc），７．８１−７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈd），６．９２−６．９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５，Ａｒ−Ｈb），３．１３（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．９２−２．９１（８Ｈ，ｂｒ，Ｈf,g,n,o），２．７５−２．７４（１２Ｈ，ｂｒ，Ｈh,i,j,k,l,m），．ＥＳ−ｍｓ（ポジティブモード，ｍ／ｚ）：６７６．００（Ｍ+）．元素分析：計算値．Ｃ：４２．５７，Ｈ：５．５１，Ｎ：１８．６２；実測値Ｃ：４２．８８，Ｈ：５．５６，Ｎ：１８．２２。
【実施例８】
【０１８５】
容量が２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）２４７ｍｇ（１．２３ｍＭ濃度）を無水テトラヒドロフラン１００ｍＬ（１２．３ｍＭ濃度）に緩やかに撹拌しながら２５℃で溶解した。溶液を含むフラスコを５℃の温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン５ｍＬを１．０ｍＬ／分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン６２ｍＬ中に４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリドを４００ｍｇ含む溶液（２０ｍＭ濃度）を、２５ｍＬ／時間、撹拌しながら５℃の温度で加えた。２５℃の温度に到達した後に混合物を６時間撹拌し、次いで３０分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物（リガンド）を、濃度が１５ｍＭになるように２５℃でメタノールに溶解した。これに、リガンドの０．７５モル当量の硝酸亜鉛溶液を２５℃の温度で加え、１５時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により１５℃まで下げ、さらに３時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物（Ｌ．Ｚｎ、（スキーム１、式１Ａ））の析出物（センサー）をクロロホルムで洗浄し、静置した。キングＢ培地中のシュードモナス属種１００μＬを、２５℃にて１０分間の期間、１．０×１０-4Ｍの濃度のセンサー１００μＬと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。
【０１８６】
化合物Ｌ（スキーム１、式２）の単離収率：収率７５％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，Ｊ（Ｈｚ），δ（ｐｐｍ））：７．９８−７．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈe）７．９−７．８７（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈc，Ｈd），７．０６（３Ｈ，ｂ，−ＮＨmacrocycle），６．７７−６．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈb），３．１５（１６Ｈ，ｂｒ，Ｈf,h,i,j,k,m,n,o），３．１１（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．０３（４Ｈ，ｂｒ，Ｈg,l）．Ｅｓ−Ｍｓ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ；４８８．３０（Ｍ+＋Ｈ+）．元素分析データ：計算値Ｃ：５９．１１，Ｈ：７．６５，Ｎ：２０．１１，実測値Ｃ：５９．１，Ｈ：７．５，Ｎ：２０．２。
【０１８７】
化合物Ｌ．Ｚｎ（スキーム１、式１Ａ）の単離収率：収率６５％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ7，ＴＭＳ，δ（ｐｐｍ））：７．９２−７．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈe），７．８８−７．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９，Ａｒ−Ｈc），７．８１−７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈd），６．９２−６．９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５，Ａｒ−Ｈb），３．１３（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．９２−２．９１（８Ｈ，ｂｒ，Ｈf,g,n,o），２．７５−２．７４（１２Ｈ，ｂｒ，Ｈh,i,j,k,l,m），．ＥＳ−ｍｓ（ポジティブモード，ｍ／ｚ）：６７６．００（Ｍ+）．元素分析：計算値Ｃ：４２．５７，Ｈ：５．５１，Ｎ：１８．６２；実測値Ｃ：４２．８８，Ｈ：５．５６，Ｎ：１８．２２。
【実施例９】
【０１８８】
容量が２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）２４７ｍｇ（１．２３ｍＭ濃度）を無水テトラヒドロフラン１００ｍＬ（１２．３ｍＭ濃度）に緩やかに撹拌しながら２５℃で溶解した。溶液を含むフラスコを５℃の温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン５ｍＬを１．０ｍＬ／分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン６２ｍＬ中に４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリドを４００ｍｇ含む溶液（２０ｍＭ濃度）を、２５ｍＬ／時間、撹拌しながら５℃の温度で加えた。２５℃の温度に到達した後に混合物を６時間撹拌し、次いで３０分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物（リガンド）を、濃度が１５ｍＭになるように２５℃でメタノールに溶解した。これに、リガンドの０．７５モル当量の硝酸亜鉛溶液を２５℃の温度で加え、１５時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により１５℃まで下げ、さらに３時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物（Ｌ．Ｚｎ、（スキーム１、式１Ａ））の析出物（センサー）をクロロホルムで洗浄し、静置した。キングＢ培地中のシュードモナス属種１００μＬを、２５℃にて１０分間の期間、１．２５×１０-4Ｍの濃度のセンサー１００μＬと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。
【０１８９】
化合物Ｌ（スキーム１、式２）の単離収率：収率７５％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，Ｊ（Ｈｚ），δ（ｐｐｍ））：７．９８−７．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈe）７．９−７．８７（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈc，Ｈd），７．０６（３Ｈ，ｂ，−ＮＨmacrocycle），６．７７−６．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈb），３．１５（１６Ｈ，ｂｒ，Ｈf,h,i,j,k,m,n,o），３．１１（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．０３（４Ｈ，ｂｒ，Ｈg,l）．Ｅｓ−Ｍｓ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ；４８８．３０（Ｍ+＋Ｈ+）．元素分析データ：計算値Ｃ：５９．１１，Ｈ：７．６５，Ｎ：２０．１１，実測値Ｃ：５９．１，Ｈ：７．５，Ｎ：２０．２。
【０１９０】
収率６５％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ7，ＴＭＳ，δ（ｐｐｍ））：７．９２−７．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈe），７．８８−７．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９，Ａｒ−Ｈc），７．８１−７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈd），６．９２−６．９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５，Ａｒ−Ｈb），３．１３（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．９２−２．９１（８Ｈ，ｂｒ，Ｈf,g,n,o），２．７５−２．７４（１２Ｈ，ｂｒ，Ｈh,i,j,k,l,m），．ＥＳ−ｍｓ（ポジティブモード，ｍ／ｚ）：６７６．００（Ｍ+）．元素分析：計算値Ｃ：４２．５７，Ｈ：５．５１，Ｎ：１８．６２；実測値Ｃ：４２．８８，Ｈ：５．５６，Ｎ：１８．２２。
【実施例１０】
【０１９１】
容量が２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）２４７ｍｇ（１．２３ｍＭ濃度）を無水テトラヒドロフラン１００ｍＬ（１２．３ｍＭ濃度）に緩やかに撹拌しながら２５℃で溶解した。溶液を含むフラスコを５℃の温度で氷中に維持した。これに、トリエチルアミン５ｍＬを１．０ｍＬ／分で加えた。別途調製した、テトラヒドロフラン６２ｍＬ中に４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリドを４００ｍｇ含む溶液（２０ｍＭ濃度）を、２５ｍＬ／時間、撹拌しながら５℃の温度で加えた。２５℃の温度に到達した後に混合物を６時間撹拌し、次いで３０分間還流させた。ろ過し洗浄した析出物（リガンド）を、濃度が１５ｍＭになるように２５℃でメタノールに溶解した。これに、リガンドの０．７５モル当量の硝酸亜鉛溶液を２５℃の温度で加え、１５時間の期間撹拌し続けた。得られた混合物の温度を凍結冷却により１５℃まで下げ、さらに３時間さらに激しく撹拌した。所望の化合物（Ｌ．Ｚｎ、（スキーム１、式１Ａ））の析出物（センサー）をクロロホルムで洗浄し、静置した。キングＢ培地中のシュードモナス属種１００μＬを、２５℃にて１０分間の期間、１．４５×１０-4Ｍの濃度のセンサー１００μＬと共に培養した。異なる色強度に基づいて、グラム陽性およびグラム陰性を区別し、寒天培地プレートに線画すると試験微生物のコロニーが増殖した。
【０１９２】
化合物Ｌ（スキーム１、式２）の単離収率：収率７５％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，Ｊ（Ｈｚ），δ（ｐｐｍ））：７．９８−７．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈe）７．９−７．８７（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈc，Ｈd），７．０６（３Ｈ，ｂ，−ＮＨmacrocycle），６．７７−６．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０，Ａｒ−Ｈb），３．１５（１６Ｈ，ｂｒ，Ｈf,h,i,j,k,m,n,o），３．１１（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．０３（４Ｈ，ｂｒ，Ｈg,l）．Ｅｓ−Ｍｓ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ；４８８．３０（Ｍ+＋Ｈ+）．元素分析データ：計算値Ｃ：５９．１１，Ｈ：７．６５，Ｎ：２０．１１，実測値Ｃ：５９．１，Ｈ：７．５，Ｎ：２０．２。
【０１９３】
収率６５％（収率は出発化合物に基づいて算出した）。1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ7，ＴＭＳ，δ（ｐｐｍ））：７．９２−７．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈe），７．８８−７．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９，Ａｒ−Ｈc），７．８１−７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５，Ａｒ−Ｈd），６．９２−６．９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５，Ａｒ−Ｈb），３．１３（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ3）2），２．９２−２．９１（８Ｈ，ｂｒ，Ｈf,g,n,o），２．７５−２．７４（１２Ｈ，ｂｒ，Ｈh,i,j,k,l,m），．ＥＳ−ｍｓ（ポジティブモード，ｍ／ｚ）：６７６．００（Ｍ+）．元素分析：計算値Ｃ：４２．５７，Ｈ：５．５１，Ｎ：１８．６２；実測値Ｃ：４２．８８，Ｈ：５．５６，Ｎ：１８．２２。
【０１９４】
［本発明の利点］
１．Ｚｎ（ＩＩ）に基づいた比色センサーは、他のヌクレオチドよりも、優先的にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）と結合する。
【０１９５】
２．センサーは、生細胞に毒性が無い。
【０１９６】
３．センサーは、好適な染色剤としてかつ細胞増殖動態研究用に使用することができる。
【０１９７】
４．α−シクロデキストリンの使用が、センサーの水に対する溶解性を向上させる。
【０１９８】
５．染色された微生物細胞は、光学顕微鏡を介して、ならび培養液中でセンサーと共に肉眼ではっきりと見ることができる。
【０１９９】
６．センサーは本質的に非親油性である。
【０２００】
７．染色方法は容易（単一の染色剤）であり、迅速であり、環境にやさしい。
【０２０１】
８．これは、一工程のみでグラム陽性菌とグラム陰性菌とを区別することができる特殊な染色剤である。
【０２０２】
【化４】
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【０２０３】
【化５】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図２】
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【国際調査報告】
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