(57)【要約】【課題】５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオールを含むニューロン保護薬を提供する。【解決手段】  ニューロン保護薬は、５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオールを含む。５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオールは、グルタミン酸により誘導される小脳顆粒ニューロン、皮質ニューロン及び脊髄運動ニューロンの興奮性毒損傷を抑制することができ、ニューロンの生存率が向上させることができ、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を低減することができ、最小有効濃度が１μＭである。また、ＹＣ−６は、低酸素による大脳皮質ニューロンの損傷を抑制することができ、最小有効濃度が２．５μＭである。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロン保護薬を製造するための５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオールの使用。
【請求項２】
前記ニューロン保護薬は、脳虚血の治療薬であることを特徴とする、請求項１に記載のニューロン保護薬を製造するための５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオールの使用。
【請求項３】
前記ニューロン保護薬は、脊髄虚血の治療薬であることを特徴とする、請求項１に記載のニューロン保護薬を製造するための５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオールの使用。
【請求項４】
前記ニューロン保護薬は、低酸素によるニューロン損傷の治療薬であることを特徴とする、請求項１に記載のニューロン保護薬を製造するための５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオールの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオール化合物（以下ＹＣ−６という）を新たな医薬品としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性虚血性脳卒中の治療法には、主に血栓溶解療法及び神経保護療法がある。上記神経保護療法とは、急性虚血性脳卒中の治療過程中において、虚血による脳組織の病理学的反応及び生化学的反応を抑制し、虚血カスケード反応の各段階を阻害し、ニューロンの寿命を延長する医薬品又は対策である。
【０００３】
現在、急性虚血性脳卒中の治療として、神経保護療法が注目されている。多くの神経保護剤は、まだ臨床開発試験中のものである。その作用メカニズムは、虚血による各種の有害な病理的過程の発生を遮断することによって、虚血による脳組織の損傷を防止又は抑制し、脳組織の損害を減少し、脳組織の機能の回復を促進することにある。神経保護剤は、脳梗塞の面積を減少することができ、出血を誘発せず、血栓溶解療法或いは抗凝固治療による出血性合併症がなく、使用時に詳しい病因の診断が不要なので、早期治療を可能にする。このため、神経保護剤は、望ましい治療效果を有するため、大きい将来性を有する。
【０００４】
しかしながら、今まで、高安全性で有効な神経保護剤に関する報告はない。現在、臨床試験中の、臨床実用価値のある医学医薬品としては、カルシウムチャンネル遮断薬（ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒ，ＣＣＢ）、カルシウムチャンネル調整剤、グルタミン酸放出抑制剤、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体作動薬、フリーラジカル捕捉剤、抗細胞間接着分子抗体等が挙げられている。
【０００５】
多くの化合物において、神経活性ステロイドは、神経保護に幅広い効果を有するため、ますます注目されている。これらの神経活性ステロイドは、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ，  ＣＮＳ）疾患の進行と関連し、ニューロン損傷と死亡及び多種の中枢神経系疾患に対して、優れた調整作用を有する。２０世紀８０年代に、科学者は、神経組織に対して活性を有する天然又は人工合成のステロイドホルモンを、神経活性ステロイド（ｎｅｕｒｏａｃｔｉｖｅ  ｓｔｅｒｏｉｄｓ，ＮＡＳ）と命名している。現在、これらのステロイド・ホルモンは、補充療法として臨床に応用されている。エストロゲンは、既知の神経保護作用が最強のＮＡＳの一つである。閉経期の女性の場合、卵巣からエストロゲンが分泌されていないため、β−アミロイドタンパク質（ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ａβ）が堆積され、アルツハイマー病（ＡＩｚｈｅｉｍｅｒ  ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）が誘発される。エストロゲンを投与することによって、大脳のＡβレベルを顕著に降下させることができる。エストロゲンは、ＡＤの治療に応用され、優れた臨床效果が得られる。また、アロプレグネノロンが、体外培養の海馬ニューロンの低酸素又はグルタミン酸により誘導される不可逆の神経毒性損傷を保護することができることが、報告されている。しかしながら、５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオール（ＹＣ−６）は、本発明者が神経ステロイドの研究において、発見された神経保護作用を有する化合物である。ＹＣ−６の薬理作用に関する報告がされておらず、ＹＣ−６が神経組織に対して活性がある、又は、神経保護作用があるに関する報告はない。ＹＣ−６の化学式は下記の化１のとおりである。
【０００６】
【化１】
2013529657.tif 000002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述の問題に鑑みてなされたものであり、ニューロン保護薬の製造のための５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオールの使用を提供することを目的とする。これによって、本発明は、ニューロン疾患の治療に新たな医薬品を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ニューロン保護薬の製造のための５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオールの使用である。５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオール（以下、ＹＣ−６と略称する）は、グルタミン酸により誘導される小脳顆粒ニューロン、皮質ニューロン及び脊髄運動ニューロンの興奮性毒損傷を抑制することができ、ニューロンの生存率を向上させることができ、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を低減することができ、且つ用量依存的な関係が示されており、最小有効濃度が１μＭである。また、ＹＣ−６は、低酸素による大脳皮質ニューロンの損傷を抑制することができる。なお、ＹＣ−６の効果と使用量とは、依存的な関係を有する。最小有効濃度が２．５μＭである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の一実施形態によるニューロン保護薬の製造のための５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオールの使用の特性図である。
【図２】本発明の一実施形態によるニューロン保護薬の製造のための５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオールの使用の特性図である。
【図３】本発明の一実施形態によるニューロン保護薬の製造のための５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオールの使用の特性図である。
【図４】本発明の一実施形態によるニューロン保護薬の製造のための５α−アンドロスタン−３β，５，６β−トリオールの使用の特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明による一実施形態を図面に基づいて説明する。
（一実施形態）
図１は、ＹＣ−６が、グルタミン酸により誘導される、小脳顆粒ニューロン、脊髄運動ニューロン、および大脳皮質ニューロンの興奮性損傷に対する保護作用を示す特性図である。ここで、Ａは小脳顆粒ニューロンに対する保護作用を示す図であり、Ｂは脊髄運動ニューロンに対する保護作用を示す図であり、Ｃは大脳皮質ニューロンに対する保護作用を示す図である。また、ＤはＬＤＨ放出率を示す図であり、Ｅはニューロンの生存率を示す図である。＊および＊＊は、小脳顆粒ニューロンのＹＣ−６群とグルタミン酸（Ｇｌｕ）群とを比較するとき、著しい差異が存在することを示す（＊Ｐ  ＜  ０．０５，＊＊  Ｐ  ＜  ０．０１）。＃および＃＃は、脊髄運動ニューロンのＹＣ−６群とグルタミン酸（Ｇｌｕ）群とを比較するとき、著しい差異が存在することを示す（＃Ｐ  ＜  ０．０５，＃＃Ｐ  ＜  ０．０１）。＄および＄＄は、大脳皮質ニューロンのＹＣ−６群とグルタミン酸（Ｇｌｕ）群とを比較するとき、著しい差異が存在することを示す（＄Ｐ  ＜  ０．０５，＄＄Ｐ  ＜  ０．０１）。
【００１１】
図２は、ＹＣ−６が、低酸素により誘導される皮質ニューロン損傷を保護する作用を示す図である。ここで、Ａは位相差顕微鏡による観察結果を示す図であり、Ｂはニューロン生存率を示す図である。また、ＣはＬＤＨ放出値を示す図である。＃＃は、低酸素群とＣｏｎｔｒｏｌ群とを比較するとき、著しい差異が存在することを示す（Ｐ  ＜  ０．０１）。＊および＊＊は、ＹＣ−６群と低酸素群とを比較するとき、著しい差異が存在することを示す（＊Ｐ  ＜  ０．０５，＊＊  Ｐ＜  ０．０１）。
【００１２】
図３は、ＹＣ−６が、腹部大動脈閉塞によるウサギ脊髄虚血モデルに対する神経保護作用を示す図である。ここで、Ａは神経機能評価値を示す図であり、Ｂは組織病理切片を示す図であり、Ｃは正常な脊髄運動ニューロンの数を示す図である。
図４は、ＹＣ−６は局所ラット大脳虚血モデルに対する神経保護作用図である。ここで、Ａは神経機能評価値であり、Ｂは大脳梗塞切片図であり、Ｃは大脳梗塞面積比較図である。
【００１３】
本実施形態のＹＣ−６の神経保護作用を確認するために、（１）局所大脳虚血モデル及び（２）腹部大動脈を遮断することにより作成される脊髓損傷モデルを用い、ＹＣ−６のラット大脳虚血及びウサギ脊髄虚血によるニューロン損傷に対する保護作用を検討する。
【００１４】
ＹＣ−６群は、ラット脳虚血の３０分間前に、尾静脈注射により、ＹＣ−６が  １ｍｇ．Ｋｇ-1投与される。ＹＣ−６群の神経機能評価値は、処理されていない対照群の神経機能評価値より著しく高い。ＹＣ−６群の脳梗塞面積は、処理されていない対照群の脳梗塞面積より著しく低い。以上の結果より、ＹＣ−６は、脳ニューロン損傷に対する優れた保護作用を有することが明らかである。
【００１５】
脊髄虚血の３０分間前に、注射によりＹＣ−６を２  ｍｇ．Ｋｇ-1投与する。ＹＣ−６群の神経機能評価値は、処理されていない対照群の神経機能評価値により著しく高い。ＹＣ−６群には、麻痺動物がいない。一方で、対照群の動物は、全て麻痺する。組織病理学的結果としては、ＹＣ−６群の正常脊髓前角運動ニューロンの数量が、対照群の正常脊髓前角運動ニューロンの数量よりも著しく多かい。以上の結果より、ＹＣ−６は、脊髓ニューロン損傷に対する優れた保護作用を有することが明らかである。
【００１６】
よって、ＹＣ−６は、脳虚血、脊髄虚血及び低酸素によるニューロン損傷に対する保護作用を有する。これまで、ＹＣ−６が神経組織に対する活性又は神経保護作用を有するという報告はない。
【００１７】
（ニューロンの培養）
（１）ラット小脳顆粒ニューロン
生後７〜８日齢のラット（体重約１５〜２０ｇ）の脳膜および血管が除去された小脳は、０．２５ｇ／Ｌの膵酵素により消化処理された後、０．０５ｇ／ＬのＤＮａｓｅ  Ｉの分散液により処理される。得られた単細胞懸濁液は遠心分離され、分離された細胞は１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び２５ｍＭのＫＣＬを含むＢＭＥ培地で希釈される。希釈された細胞は、ポリリジンコートの培養容器で培養される。２４時間後に、１０μＭのＡｒａ−Ｃを添加することで非神経細胞の生長と増殖を抑制し、小脳顆粒ニューロンの純度を９５％以上にする。培養時、葡萄糖を添加し、細胞代謝の必要なエネルギーを補充する。小脳顆粒ニューロンは、培養８日目から試験に用いられる。
【００１８】
（２）ラット脊髄運動ニューロン
妊娠１５日目のＳＤラットの胎児脊髓を分離する。髄膜と血管が除去された胎児脊髓組織は、０．１２５％の膵酵素により消化処理された後、遠心分離される。運動ニューロンの濃度が最も高い中間層を取り、遠心分離により、細胞残屑を除去する。得られた脊髄運動ニューロンに対して、張り付き易さで分離を行い（１時間貼りつく）、速度が最も遅い脊髄運動ニューロンを取って培養する。２４ｈ経ってから、シタラビンを添加し、３日目に全部の培地をＬ−１５無血清培地に交換する。以降、２〜３日おきに半分のＬ−１５無血清培地を交換する。脊髄運動ニューロンは、培養（Ｌ−１５無血清培地使用）３〜５日目から試験に用いられる。
【００１９】
（３）ラット皮質ニューロン
生後１日齢のラットの脳膜および血管が除去された皮質は、０．２５  ｇ／Ｌ  の膵酵素により消化処理された後、０．０５ｇ／ＬのＤＮａｓｅ  Ｉ  の分散液により処理される。得られた単細胞懸濁液は遠心分離され、分離された細胞は５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳと２％のＢ２７を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地で希釈される。希釈された細胞は、ポリリジンコートの培養容器で培養される。２４時間後に、１０μＭのＡｒａ−Ｃを添加することで非神経細胞の生長と増殖を抑制する。その後、毎週２〜３回、半分の培地を交換する。皮質ニューロンは、培養１０日目から試験に用いられる。
【００２０】
（実施例１）
（初代培養ニューロン細胞に対するＹＣ−６の保護作用）
（１）  グルタミン酸により誘導される小脳顆粒ニューロン興奮性損傷に対するＹＣ−６の保護作用
８日間培養された小脳顆粒ニューロンは、それぞれ正常対照群、グルタミン酸群、ＭＫ８０１＋グルタミン酸群、ＹＣ−６＋グルタミン酸群に分けられる。正常対照群に対しては、何らの処理も行わない。グルタミン酸群は、２００μＭのグルタミン酸が添加される。そのほかの群は、ＭＫ８０１（１０μＭ）及び異なる濃度のＹＣ−６があらかじめ添加され、３７℃にて３０分間インキュベートされた後、グルタミン酸が添加される。２４ｈ後に、位相差顕微鏡で神経細胞の形態を観察する。ＦＤＡで神経細胞を染色し、倒立蛍光顕微鏡で観察し、細胞計数を行い、ニューロンの生存率を計算する。各群の乳酸脱水素酵素の活性を測定する。
生存率＝各群の生細胞数／対照群の生細胞数×１００％。
【００２１】
結果、図１−Ａ、Ｄ、Ｅに示すように、グルタミン酸群と比較する場合、ＹＣ−６＋グルタミン酸群およびＭＫ８０１＋グルタミン酸群では、大部分の小脳顆粒ニューロンの細胞体及び細胞突起の完全が維持され、細胞生存率が高く、ＬＤＨの放出値が低く、著しい差を有する。また、ＹＣ−６の効果は、濃度を依存している。また、上記濃度範囲内に、ＹＣ−６は、正常神経細胞の生存率に影響がないことが明らかである。
【００２２】
（２）グルタミン酸により誘導される脊髄運動ニューロンの興奮性損傷に対するＹＣ−６の保護作用
５日間培養された脊髄運動ニューロンは、それぞれ正常対照群、グルタミン酸群、ＭＫ８０１＋グルタミン酸群、およびＹＣ−６＋グルタミン酸群に分けられる。正常対照群に対しては、何らの処理も行わない。グルタミン酸群は、２００μＭのグルタミン酸が添加される。そのほかの群は、ＭＫ８０１（１０μＭ）及び異なる濃度のＹＣ−６があらかじめ添加され、３７℃にて３０分間インキュベートされた後、グルタミン酸が添加される。２４ｈ後に、位相差顕微鏡で神経細胞の形態を観察する。ＦＤＡで神経細胞を染色し、倒立蛍光顕微鏡で観察し、細胞計数を行い、ニューロンの生存率を計算する。各群の乳酸脱水素酵素の活性を測定する。
生存率＝各群の生細胞数／対照群の生細胞数×１００％。
【００２３】
倒立位相差顕微鏡下で観察した結果、対照群では、生存している脊髄運動ニューロンの数が多く、細胞体が、飽満であり、三角形や多角形を呈し、立体感およびハレーションを有し、分岐および細胞突起を有する。グルタミン酸群では、生存されている脊髄運動ニューロンの数が少なく、細胞突起が形成され、細胞の損傷が著しい。一方、ＹＣ−６＋グルタミン酸群及びＭＫ８０１＋グルタミン酸群では、脊髄運動ニューロンの数が明らかに増加しており、細胞突起が多かったが、少ない死細胞が観察される。図１−Ｂ，Ｄ，Ｅを示すように、対照群と比較する場合、他の群では何れも脊髄運動ニューロンの生存率が低い。また、グルタミン酸群とする場合、ＹＣ−６＋グルタミン酸群の生存率が著しく高い。また、ＹＣ−６の効果は、濃度を依存している。上記濃度範囲内に、ＹＣ−６は、正常神経細胞の生存率に影響がないことが明らかである。
【００２４】
（３）グルタミン酸により誘導される皮質ニューロンの興奮性損傷に対するＹＣ−６の保護作用
１０日間培養された皮質ニューロンは、それぞれ正常対照群、グルタミン酸群、ＭＫ８０１＋グルタミン酸群、およびＹＣ−６＋グルタミン酸群に分けられる。正常対照群に対しては、何らの処理も行わない。グルタミン酸群は、２００μＭのグルタミン酸は添加される。そのほかの群は、溶剤、ＭＫ８０１（１０μＭ）及び異なる濃度のＹＣ−６があらかじめ添加され、３７℃にて３０分間インキュベートされた後、グルタミン酸が添加される。２４ｈ後に、位相差顕微鏡で神経細胞の形態を観察する。ＦＤＡで神経細胞を染色し、倒立蛍光顕微鏡で観察し、細胞計数を行い、ニューロンの生存率を計算する。各群の乳酸脱水素酵素の活性を測定する。
生存率＝各群の生細胞数／対照群の生細胞数×  １００％。
【００２５】
結果として、図１−Ｃ，Ｄ，Ｅを示すように、グルタミン酸群と比較する場合、ＹＣ−６＋グルタミン酸群およびＭＫ８０１＋グルタミン酸群では、大部分の皮質ニューロンの細胞体及び細胞突起の完全が維持され、細胞生存率が高く、ＬＤＨの放出値が低く、著しい差を有する。また、ＹＣ−６の効果は、濃度を依存している。また、上記濃度範囲内に、ＹＣ−６は、正常神経細胞の生存率に影響がないことが明らかである。
【００２６】
（４）低酸素により誘導される皮質ニューロン興奮性損傷に対するＹＣ−６の保護作用
１０日間培養された初代皮質ニューロンは、それぞれ正常対照群、低酸素群、ＭＫ８０１＋低酸素群、ＹＣ−６＋低酸素群に分けられる。各群に、三つの補助ウェルを設置する。正常対照群は、ＣＯ2インキュベーターで正常インキュベートされる。低酸素群は、低酸素環境下に置かれる（酸素濃度は１％である）。ＭＫ８０１＋低酸素群およびＹＣ−６＋低酸素群に対しては、低酸素環境下（酸素濃度は１％である）に置かれる３０分間前に、ＭＫ８０１（１０μＭ）及び異なる濃度のＹＣ−６で前処理を行う。１２時間後に、位相差顕微鏡により観察し、写真を撮る。
【００２７】
９６ウェルマイクロプレートに対して、上記のように群分け及び処理を行う。その後、ＭＴＴ貯蔵液２００  μＬを添加し、４時間作用させ、生存の細胞中に青紫色の結晶体を形成させる。各ウェル内の液体を除去し、１５０μＬのＤＭＳＯを添加し、青紫色の結晶体を溶解させる。半時間後、結晶体が完全に溶解した後、マイクロプレートリーダーにより５７０ｎｍの波長でＯＤ値を測定する。損傷群および対照群に対しては、各時間点で５０μＬの培養液をそれぞれ取り、キットの説明書に基づいて、各ウェル内の培養液のＬＤＨ含有量を測定する。各群の測定データは、ｍｅａｎ±ＳＤで示す。複数サンプルの平均値間の分散分析及び多重比較するｔ−ｔｅｓｔを用いて統計処理を行う。参考文献は［１］および［２］である。
［１］  Ｂｒｅｗｅｒ  Ｇ．Ｊ．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｌｄｕｔ  ｒａｔ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｍｅｔｈ．  １９９７，  ７１：  １４３−１５５．
［２］  Ｌｅｅ  Ｍ．Ｍ．，  Ｈｓｅｉｈ  Ｍ．Ｔ．  Ｍａｇｎｏｌｏｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  １９９８，  ９：  ３４５１−３４５６．
【００２８】
結果、ラットの皮質ニューロンは、１０日間培養された後、細胞体がテーパ状または多極形を呈し、細胞体の境界が鮮明となり、屈折性が高くなり、ニューロン細胞の突起が網に織りなし、細胞核が明晰となる。低酸素により処理された皮質ニューロンは、完全性が破壊され、屈折性が低くなり、シナプスが裂けかつ消失し、細胞質顆粒が変性し、一部の細胞体が腫れて消失する細胞体もある。ＭＫ８０１前処理群およびＹＣ−６前処理群は、正常対照群と比較する場合、皮質ニューロンの形態差がほとんどない。ＹＣ−６のニューロン保護作用とＹＣ−６の濃度とは、依存的な関係を有する（図２  Ａ）。ＭＴＴ法の結果により、低酸素処理はニューロンの生存率を著しく低下させたが（Ｐ  ＜  ０．０５）、低酸素により損害されたニューロンの生存率の向上は、ＹＣ−６の濃度に依存している（図２  Ｂ）。ＬＤＨ放出結果は、ＭＴＴ法と一致である。ＹＣ−６前処理群では、低酸素によるニューロン損傷の低下が濃度に依存している（図２−Ｃ、Ｐ  ＜  ０．０５）。
【００２９】
（実施例２）
（腹部大動脈閉塞によるウサギ脊髄虚血モデルに対するＹＣ−６の神経保護作用）
４０匹の雄性ニュージーランドホワイトウサギは、４群に分けられる（ｎ  ＝１０）。Ｃｏｎｔｒｏｌ群は、ウサギ脊髄虚血モデルに作成される。ＹＣ−６群は、脊髄虚血が発生する３０分間前に、耳翼辺縁静脈注射により２ｍｇ．Ｋｇ-1のステロイドＹＣ−６が投与される。Ｖｅｈｉｃｌｅ群は、脊髄虚血が発生する３０分間前に、同様に、同等容量のヒドロキシプロピルシクロデキストリン（１ｍｌ・Ｋｇ-1）が注射される。Ｓｈａｍ群は、腹部大動脈のみ暴露され、腹部大動脈が遮断されない。
【００３０】
ウサギ脊髄虚血モデルの制作方法は、文献［３，４］及び本発明者の前の研究［５］を参照する。
［３］  Ｃｅｌｉｋ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ２００２，  ９９：  ２２５８−２２６３．
［４］  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＳＨ，  Ｋｒａｉｍｅｒ  Ｊ．Ｍ．，  Ｇｒａｅｂｅｒ  Ｇ．Ｍ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｌｕｎａｒｉｚｉｎｅ  ｏｎ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ．  Ｓｔｒｏｋｅ，  １９９３，  ２４：  １５４７−１５５３．
［５］  Ｓａｎｇ  Ｈ．，  Ｃａｏ  Ｌ．，  Ｑｉｕ  Ｐ．，  Ｘｉｏｎｇ  Ｌ．，  Ｗａｎｇ  Ｒ．，  Ｙａｎ  Ｇ．  Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ  ｖｉａ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ．  Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，  ２００６，１０５：  ９５３−９６０．
【００３１】
虚血が発生する直前、虚血が発生した１０分後、及び、再潅流した２０分後に、各群間の生理学パラメーターをそれぞれ測定する。Ｔａｌｏｖ評価法［５］により、各群のウサギの機能について評価を行う。ここで、０分は後肢が全く麻痺した状態を表し、１分は後肢の関節運動が観察される状態を表し、２分は後肢が自由に運動できるが直立できない状態を表し、３分は直立できるが、歩くことができない状態を表し、４分は後肢の運動機能が完全に回復し、正常に歩くことができる状態を表す。
【００３２】
神経機能の評価が終了した後、麻酔された状態で、パラフィン包埋された腰部脊髄組織（Ｌ5−Ｌ7）を、切片し、ＨＥ染色する。特定観察者により、光学顕微鏡で、脊髓の病理学の変化を観察し、脊髓前角の正常な運動ニューロンを計数する。ここで、特定観察者とは、群分け状態を承知している観察者を言う。動物（個体）の脊髓前角の正常なニューロンの数は、３つの切片で数えられた数の平均値である。
【００３３】
結果、虚血が発生する直前、虚血が発生した１０後、及び再潅流２０分後に測定した各群間の生理学パラメーターは、著しく異なる（Ｐ＞０．０５）ことが明らかである。各群動物神経機能評価値の結果を、図３−Ａに示す。偽手術群のウサギの後肢の神経機能は、観察期間において完全に正常である（４分）。一方、Ｃｏｎｔｒｏｌ群及びＶｅｈｉｃｌｅ群では、直立できるウサギはいない。ＹＣ−６群では、７匹のウサギが直立できる（３分以上）。ＹＣ−６群及びＳｈａｍ群の神経機能評価値は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群及びＶｅｈｉｃｌｅ群の神経機能評価値より、正常である（Ｐ＜０．０５）。
【００３４】
図３−Ｂに示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ群及びＶｅｈｉｃｌｅ群では、正常な運動ニューロンが基本的に消失し、大量の空胞変性が生じ、腰部脊髄の損傷が厳重である。一方、ＹＣ−６群では、正常の運動ニューロンが確認され、腰部脊髄の損傷が大幅に軽減されている。図３−Ｃに示すように、ＹＣ−６群及びＳｈａｍ群では、脊髓前角の正常な神経細胞が著しく増えている（Ｐ＜０．０５）。
【００３５】
上述したように、ＹＣ−６は脊髄虚血に対して優れた保護作用を有する。
（実施例３）
（ラット局所脳虚血モデル（ＭＣＡＯ）に対するＹＣ−６の神経保護作用）
３０匹の雄性ＳＤラットは、ランダムに３群（ｎ＝１０）に分けられる。Ｃｏｎｔｒｏｌ群は、ラット局所脳虚血モデルに作成される。ＹＣ−６群は、脳虚血が発生する３０分間前に、尾静脈注射により１ｍｇ．Ｋｇ-1のＹＣ−６が投与される。Ｖｅｈｉｃｌｅ群は、脊髄虚血が発生する３０分間前に、同様に、同等容量のヒドロキシプロピルシクロデキストリン（２ｍｌ・Ｋｇ-1）が注射される。
【００３６】
ラットは、手術前１２時間から絶食させ、水を自由に摂取させる。塞栓糸法により中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルを作成する［６］。
［６］  Ｗａｎｇ  Ｑ．，  Ｐｅｎｇ  Ｙ．，  Ｃｈｅｎ  Ｓ．，  Ｇｏｕ  Ｘ．，  Ｈｕ  Ｂ．，  Ｄｕ  Ｊ．，  Ｌｕ  Ｙ．，  Ｘｉｏｎｇ  Ｌ．  Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｅｌｅｃｔｒｏａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒａｐｉｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｆｏｃａｌ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｓｔｒｏｋｅ，  ２００９，  ４０（６）：  ２１５７−２１６４．
遮断１２０分間後に、塞栓糸を取り出し、再灌流させる。レーザードップラー型血流計により局所脳血流を測定する。手術が終了した後、動物が覚醒した後、動物をメッシュケージに置く、飼料を自由に摂取させる。再灌流された７２ｈ後、群分けを承知していない観察者は、Ｌｏｎｇａ評価法［７］により神経機能を評価し、記録する。
［７］  Ｌｏｎｇａ  Ｅ．Ｚ．，  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｐ．Ｒ．，  Ｃａｒｌｓｏｎ  Ｓ．，  Ｃｕｍｍｉｎｓ  Ｒ．  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｍｉｄｄｌｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｒａｎｉｅｃｔｏｍｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｓｔｒｏｋｅ，  １９８９，  ２０（１）：  ８４−９１．
ここで、０級は機能障害がない状態を表し、１級は左側前肢が伸びることができない状態を表し、２級は左側に回転する状態を表し、３級は左側に傾斜する状態を表し、４級は自律神経活動がない同時に意識抑制状態となる状態を表し、５級は死亡した状態を表す。
【００３７】
神経機能評価が終了した後、ラットを断頭屠殺し、ラットの脳を取り出す。取り出された脳は、切片された後、ＴＴＣ溶液で３０分間染色され、パラホルムアルデヒド緩衝剤で固定される。２４ｈ後に、デジタルカメラにより写真を撮り、コンピューターに記録し、画像処理ソフトウェア（ＡＤＯＢＥ（登録商標），  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ  ８．  ０）で梗塞面積（ピンク部分は正常脳組織であり、白色部分は梗塞部分である）を計算する。脳水腫による梗塞面積の偏差を校正するために、反対側の正常面積を占める百分率で梗塞面積を示す。
梗塞面積百分率＝（反対側正常組織面積−同側正常組織面積）／反対側正常組織面積×１００％
【００３８】
神経行為学評価（ＮＢＳ）は、クラスカル・ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定を用いる。群間差異が存在する場合、マン・ホイットニイ（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ）のＵ検定及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの校正を行い、両群間の差異を比較する。梗塞面積及び生理学パラメーターは、平均値±標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＤ）で示す。統計処理について、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用い、複数群間の比較は、ＳＮＫ（Ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｓｔｕｄｅｎｇ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）を用いる。＊Ｐ＜０．０５は、統計学上著しく異なるということを意味する。
【００３９】
各群の動物の神経機能評価結果を、図５に示す。Ｃｏｎｔｒｏｌ群及びＶｅｈｉｃｌｅ群と比較する場合、ＹＣ−６群は、神経機能が著しく改善され、脳梗塞面積が著しく減少した（＊Ｐ＜０．０５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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