(57)【要約】  本発明は、標的化部分として1個以上のD-アミノ酸を有する短いポリペプチド(例えば、長さ19アミノ酸未満)およびより長いポリペプチド(例えば、長さ19アミノ酸以上)に関する。これらのポリペプチドは、薬剤(例えば、治療剤または輸送ベクター)にコンジュゲートさせた場合、BBBを通過して、または特定の細胞型に該薬剤を輸送することができる。特に、短いポリペプチドは、1個以上のD-アミノ酸を含んでもよい。従って、これらの化合物は、神経疾患または特定の細胞型、器官、もしくは組織と関連する疾患の治療において特に有用である。【選択図】  図１
2013530993.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)
(式中、
X3はAsnまたはGlnであり；
X4はAsnまたはGlnであり；および
X5はPhe、TyrまたはTrpである)
を含む精製されたポリペプチド、またはその製薬上許容し得る塩であって、
前記ポリペプチドが長さ50アミノ酸未満であり；
前記ポリペプチドが必要に応じて、式Iaに記載のアミノ酸の1個以上のD-異性体を含み；および
前記ポリペプチドが表2に記載のペプチドではない、
前記精製されたポリペプチド、またはその製薬上許容し得る塩。
【請求項２】
アミノ酸配列Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)
(式中、
X3はAsnまたはGlnであり；
X4はAsnまたはGlnであり；および
X5はPhe、Tyr、またはTrpである)
を含む精製されたポリペプチド、またはその製薬上許容し得る塩であって、
前記ポリペプチドが長さ19アミノ酸未満であり、および
前記ポリペプチドが必要に応じて式Iaに記載のアミノ酸の1個以上のD-異性体を含む、
前記精製されたポリペプチド、またはその製薬上許容し得る塩。
【請求項３】
前記アミノ酸配列がZ1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2(式Ib)
(式中、
X3はAsnまたはGlnであり；
X4はAsnまたはGlnであり；
X5はPhe、TyrまたはTrpであり；
Z1は存在しないか、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、またはCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり; および
Z2は存在しないか、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr、またはThr-Glu-Glu-Tyr-Cysである)
であり；ならびに
前記ポリペプチドが必要に応じて、式Ib、Z1またはZ2に記載のアミノ酸の1個以上のD-異性体を含む、
請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列がLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lysである、請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列がLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyrである、請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸配列がX1-X2-Asn-Asn-X5-X6(式IIa)
(式中、
X1はLysまたはD-Lysであり；
X2はArgまたはD-Argであり；
X5はPheまたはD-Pheであり；および
X6はLysまたはD-Lysであり；ならびに
X1、X2、X5、またはX6の少なくとも1個はD-アミノ酸である)
である、請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記アミノ酸配列がX1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7(式IIb)
(式中、
X1はLysまたはD-Lysであり；
X2はArgまたはD-Argであり；
X5はPheまたはD-Pheであり；
X6はLysまたはD-Lysであり；および
X7はTyrまたはD-Tyrであり；ならびに
X1、X2、X5、X6、またはX7の少なくとも1個はD-アミノ酸である)
である、請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記アミノ酸配列がZ1-X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2(式IIc)
(式中、
X1はLysまたはD-Lysであり；
X2はArgまたはD-Argであり；
X5はPheまたはD-Pheであり；
X6はLysまたはD-Lysであり；
X7はTyrまたはD-Tyrであり；
Z1は存在しないか、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、またはCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり；および
Z2は存在しないか、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr、またはThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり；
X1、X2、X5、X6またはX7の少なくとも1個がD-アミノ酸である）
であり；ならびに
前記ポリペプチドが必要に応じてZ1またはZ2に記載のアミノ酸の1個以上のD-異性体を含む、
請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが長さ15アミノ酸未満である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが長さ10アミノ酸未満である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr (3D-An2); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1a); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1b); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P1c); D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys (P1d); Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P2); Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P3); Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P4); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5b); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P5c); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Tyr-Cys (P6b); およびD-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-D-Tyr-Cys (P6c)；またはその断片からなる群より選択される、請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr (3D-An2); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1a); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1b); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P1c); D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys (P1d); Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P2); Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P3); Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P4); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P5); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5b); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P5c); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Tyr-Cys (P6b); およびD-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-D-Tyr-Cys (P6c)；またはその断片からなる群より選択される1つ以上の配列に関連するアミノ酸の0〜5個の置換、欠失、または付加を有する配列を含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; およびLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys、またはその断片からなる群より選択される、請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr (3D-An2); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1a); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (Plb); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P1c); D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys (P1d)；またはその断片である、請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記断片が、P1、P1a、P1b、P1c、もしくはP1dのN末端から1〜7個のアミノ酸の欠失；P1、P1a、P1b、P1c、もしくはP1dのC末端から1〜5個のアミノ酸の欠失；またはP1、P1a、P1b、P1c、もしくはP1dのN末端から1〜7個のアミノ酸およびP1、P1a、P1b、P1c、もしくはP1dのC末端から1〜5個のアミノ酸の欠失を有する、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
C末端がアミド化された、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが血液脳関門を通過して効率的に輸送される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドがAngiopep-2よりも効率的に血液脳関門を通過して輸送される、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチドからなる標的化部分および治療用ペプチド剤を含み、前記標的化部分が前記治療用ペプチド剤に連結されている、治療用ポリペプチド。
【請求項２０】
前記標的化部分が共有結合により前記治療剤に連結される、請求項１９に記載の治療用ポリペプチド。
【請求項２１】
前記共有結合がペプチド結合である、請求項２０に記載の治療用ポリペプチド。
【請求項２２】
前記治療用ポリペプチドが融合タンパク質である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の治療用ポリペプチド。
【請求項２３】
前記治療用ペプチド剤が、ニューロテンシンまたはニューロテンシン類似体、ニューロテンシン受容体アゴニスト、神経栄養因子または神経栄養因子類似体、GLP-1アゴニスト、およびレプチンまたはレプチン類似体からなる群より選択される、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の治療用ポリペプチド。
【請求項２４】
前記治療用ペプチド剤が前記ニューロテンシン類似体であり、前記ニューロテンシン類似体がニューロテンシン(6-13)、ニューロテンシン(8-13)、Lys(7)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(7-13)、p-Glu(1)-ニューロテンシン、p-Glu(1)-ニューロテンシン-OH、D-Lys(6)-ニューロテンシン(6-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Lys(6)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(9)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Arg(9)-ニューロテンシン(6-13)、D-Pro(10)ニューロテンシン(6-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Trp(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Phe(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Trp(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(9)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(8)-D-Arg(9)-ニューロテンシン(8-13)、D-Pro(10)ニューロテンシン(8-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Trp(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Phe(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(8)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(8-13)、およびD-Arg(8)-D-Trp(11)-ニューロテンシン(8-13)、またはそのアセチル化形態からなる群より選択される、請求項２３に記載の治療用ポリペプチド。
【請求項２５】
前記治療用ペプチド剤が前記神経栄養因子または前記神経栄養因子類似体であり、前記神経栄養因子または前記神経栄養因子類似体が、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、GDNF類似体、脳由来神経栄養因子(BDNF)およびBDNF類似体からなる群より選択される、請求項２３に記載の治療用ポリペプチド。
【請求項２６】
式A-X-B
(式中、
Aは請求項１〜１８のいずれか１項に記載の標的化部分であり；
Xはリンカーであり；および
Bは治療剤または輸送ベクターである)
を有するコンジュゲート。
【請求項２７】
前記Xがペプチド結合である、請求項２６に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
前記Xが少なくとも1個のアミノ酸であり；ならびにAおよびBがそれぞれペプチド結合によりXに共有結合される、請求項２６に記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
前記Xがエステルリンカーである、請求項２６に記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
前記Xが式-NH-(CH2)n-C(O)O-(式中、nは2〜10の整数である)を有する、請求項２６に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
前記Xが式：
【化１】
2013530993.tif 000050
(式中、nは2〜15の整数であり；YはA上のチオールであり、ZはB上の一級アミンであるか、またはYはB上のチオールであり、ZはA上の一級アミンである)
を有する、請求項２６に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
Bが前記治療剤であり、前記治療剤が抗癌剤、治療用核酸剤、小分子薬剤、標識、または治療用ペプチド剤からなる群より選択される、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
前記治療剤が前記抗癌剤である、請求項３２に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
前記抗癌剤がパクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、ドキソルビシン、またはその類似体である、請求項３３に記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
前記治療剤が前記治療用核酸剤である、請求項３２に記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
前記治療用核酸剤がRNAi剤である、請求項３５に記載のコンジュゲート。
【請求項３７】
前記RNAi剤がsiRNAである、請求項３６に記載のコンジュゲート。
【請求項３８】
前記治療剤が前記治療用ペプチド剤である、請求項３２に記載のコンジュゲート。
【請求項３９】
前記コンジュゲートが融合タンパク質である、請求項３８に記載のコンジュゲート。
【請求項４０】
前記治療用ペプチド剤がニューロテンシンまたはニューロテンシン類似体、ニューロテンシン受容体アゴニスト、神経栄養因子または神経栄養因子類似体、GLP-1アゴニスト、およびレプチンまたはレプチン類似体からなる群より選択される、請求項３８〜３９のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項４１】
前記治療用ペプチド剤が前記ニューロテンシン類似体であり、前記ニューロテンシン類似体がニューロテンシン(6-13)、ニューロテンシン(8-13)、Lys(7)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(7-13)、p-Glu(1)-ニューロテンシン、p-Glu(1)-ニューロテンシン-OH、D-Lys(6)-ニューロテンシン(6-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Lys(6)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(9)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Arg(9)-ニューロテンシン(6-13)、D-Pro(10)ニューロテンシン(6-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Trp(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Phe(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Trp(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(9)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(8)-D-Arg(9)-ニューロテンシン(8-13)、D-Pro(10)ニューロテンシン(8-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Trp(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Phe(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(8)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(8-13)、およびD-Arg(8)-D-Trp(11)-ニューロテンシン(8-13)、またはそのアセチル化形態からなる群より選択される、請求項４０に記載のコンジュゲート。
【請求項４２】
前記治療用ペプチド剤が前記神経栄養因子または前記神経栄養因子類似体であり、前記神経栄養因子または前記神経栄養因子類似体がグリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、GDNF類似体、脳由来神経栄養因子(BDNF)およびBDNF類似体からなる群より選択される、請求項４１に記載のコンジュゲート。
【請求項４３】
Bが前記輸送ベクターであり、前記輸送ベクターが脂質ベクター、ポリプレックス、デンドリマー、またはナノ粒子からなる群より選択される、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項４４】
前記輸送ベクターが治療剤に結合されたか、または治療剤を含む、請求項４３に記載のコンジュゲート。
【請求項４５】
前記治療剤が抗癌剤、治療用核酸剤、小分子薬剤、標識、または治療用ペプチド剤からなる群より選択される、請求項４４に記載のコンジュゲート。
【請求項４６】
請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の治療用ポリペプチドまたは請求項２６〜４５のいずれか１項に記載のコンジュゲートを含む組成物。
【請求項４７】
製薬上許容し得る担体をさらに含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
癌を有する被験体に、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の治療用ポリペプチドまたは請求項２６〜４５のいずれか１項に記載のコンジュゲートを、前記癌を治療するのに十分な量で投与することを含む、癌を有する被験体を治療するか、または予防的に治療する方法。
【請求項４９】
前記癌が脳の癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記脳の癌が、神経膠腫、混合性神経膠腫、多形成グリア芽細胞腫、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、乏突起膠腫、上衣腫、乏突起星細胞腫、髄芽腫、網膜芽腫、神経芽腫、胚細胞腫、および奇形腫からなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の治療用ポリペプチドまたは請求項２６〜４５のいずれか１項に記載のコンジュゲートを、体温を低下させるのに十分な量で投与することを含む、被験体における体温を低下させる方法。
【請求項５２】
前記被験体が脳卒中、心臓発作、脳虚血、心虚血、神経損傷に罹患しているか、もしくは罹患したか、または神経保護を必要とするか、もしくは悪性低体温にある、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記治療用ポリペプチドまたは前記コンジュゲートが、ニューロテンシン(6-13)、ニューロテンシン(8-13)、Lys(7)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(7-13)、p-Glu(1)-ニューロテンシン、p-Glu(1)-ニューロテンシン-OH、D-Lys(6)-ニューロテンシン(6-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Lys(6)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(9)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Arg(9)-ニューロテンシン(6-13)、D-Pro(10)ニューロテンシン(6-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Trp(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Phe(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Trp(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(9)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(8)-D-Arg(9)-ニューロテンシン(8-13)、D-Pro(10)ニューロテンシン(8-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Trp(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Phe(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(8)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(8-13)、およびD-Arg(8)-D-Trp(11)-ニューロテンシン(8-13)、またはそのアセチル化形態からなる群より選択されるニューロテンシン類似体を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の治療用ポリペプチドまたは請求項２６〜４５のいずれか１項に記載のコンジュゲートを、高血圧を治療するのに十分な量で投与することを含む、被験体における高血圧を治療するか、または高血圧を予防的に治療する方法。
【請求項５５】
前記治療用ポリペプチドまたは前記コンジュゲートが、ニューロテンシン(6-13)、ニューロテンシン(8-13)、Lys(7)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(7-13)、p-Glu(1)-ニューロテンシン、p-Glu(1)-ニューロテンシン-OH、D-Lys(6)-ニューロテンシン(6-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Lys(6)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(9)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Arg(9)-ニューロテンシン(6-13)、D-Pro(10)ニューロテンシン(6-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Trp(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Phe(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Trp(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(9)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(8)-D-Arg(9)-ニューロテンシン(8-13)、D-Pro(10)ニューロテンシン(8-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Trp(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Phe(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(8)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(8-13)、およびD-Arg(8)-D-Trp(11)-ニューロテンシン(8-13)、またはそのアセチル化形態からなる群より選択されるニューロテンシン類似体を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の治療用ポリペプチドまたは請求項２６〜４５のいずれか１項に記載のコンジュゲートを、疼痛を治療するのに十分な量で投与することを含む、被験体における疼痛を治療するか、または疼痛を予防的に治療するか、または疼痛に対する感受性を低下させる方法。
【請求項５７】
前記疼痛が、急性疼痛、末梢もしくは中枢神経障害疼痛、炎症性疼痛、片頭痛関連疼痛、頭痛関連疼痛、過敏性腸症候群関連疼痛、線維筋痛関連疼痛、関節炎疼痛、骨格痛、関節痛、胃腸痛、筋肉痛、狭心痛、顔面痛、骨盤痛、跛行、術後疼痛、外傷後疼痛、緊張型頭痛、産科痛、婦人科痛、または化学療法誘導性疼痛である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の治療用ポリペプチドまたは請求項２６〜４５のいずれか１項に記載のコンジュゲートを、精神障害を治療するのに十分な量で投与することを含む、精神障害を有する被験体を治療する方法。
【請求項５９】
被験体に、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の治療用ポリペプチドまたは請求項２６〜４５のいずれか１項に記載のコンジュゲートを、薬物中毒または薬物乱用を治療するのに十分な量で投与することを含む、被験体における薬物中毒または薬物乱用を治療する方法。
【請求項６０】
請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の治療用ポリペプチドまたは請求項２６〜４５のいずれか１項に記載のコンジュゲートを、代謝障害を治療するのに十分な量で投与することを含む、代謝障害を有する被験体を治療する方法。
【請求項６１】
被験体に、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の治療用ポリペプチドまたは請求項２６〜４５のいずれか１項に記載のコンジュゲートを、神経障害を治療または予防するのに十分な量で投与することを含む、被験体における神経障害を治療するか、または神経障害を予防的に治療する方法。
【請求項６２】
前記治療用ペプチド剤が生物分子に特異的に結合するポリペプチドである、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の治療用ポリペプチド。
【請求項６３】
生物分子に特異的に結合する前記ポリペプチドが、免疫グロブリンまたは前記生物分子に特異的に結合する能力を保持するその断片である、請求項６２に記載の治療用ポリペプチド。
【請求項６４】
免疫グロブリンが四量体抗体または一本鎖抗体である、請求項６３に記載の治療用ポリペプチド。
【請求項６５】
請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の治療用ポリペプチドを含む組成物。
【請求項６６】
製薬上許容し得る担体をさらに含む、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
前記治療用ペプチド剤が生物分子に特異的に結合するポリペプチドである、請求項３２または請求項４５に記載のコンジュゲート。
【請求項６８】
生物分子に特異的に結合する前記ポリペプチドが、免疫グロブリンまたは前記生物分子に特異的に結合する能力を保持するその断片である、請求項６７に記載のコンジュゲート。
【請求項６９】
免疫グロブリンが四量体抗体または一本鎖抗体である、請求項６８に記載のコンジュゲート。
【請求項７０】
請求項６７〜６９のいずれか１項に記載のコンジュゲートを含む組成物。
【請求項７１】
製薬上許容し得る担体をさらに含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
治療を必要とする被験体に、請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の治療用ポリペプチドまたは請求項６７〜６９のいずれか１項に記載のコンジュゲートを、前記被験体を治療するのに十分な量で投与することを含む、治療を必要とする被験体を治療するか、または予防的に治療する方法。
【請求項７３】
前記被験体が癌を有するか、または癌を発症する高い危険性を有する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記癌が脳の癌である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記脳の癌が、神経膠腫、混合性神経膠腫、多形成グリア芽細胞腫、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、乏突起膠腫、上衣腫、乏突起星細胞腫、髄芽腫、網膜芽腫、神経芽腫、胚細胞腫、および奇形腫からなる群より選択される、請求項７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、部分的には、標的化部分として有用な短いポリペプチドに関する。本発明はまた、治療剤または輸送ベクターに連結された標的化部分を含むコンジュゲートおよびその使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
脳は、2つの障壁系：血液脳関門(BBB)および血液脳脊髄液関門(BCSFB)の存在によって潜在的に毒性の物質に対して保護されている。BBBは、その表面積がBCSFBの約5000倍大きいため、血清リガンドの取込みのための主要な経路であると考えられる。BBBを構成する脳の内皮は、中枢神経系(CNS)の多くの障害に対する潜在的な薬剤の使用のための主要な障害物である。原則として、小さい親油性分子のみがBBBを通過する、すなわち、循環する全身の血液から脳に通過することができる。しかし、CNS障害を治療するための動物試験において有望な結果を示すより大きいサイズまたはより高い疎水性を有する多くの薬剤は、BBBを通過しないことが多い。かくして、ペプチドおよびタンパク質治療剤は一般に、これらの薬剤に対する脳の毛細血管内皮壁のごくわずかな透過性のため、血液から脳への輸送から排除される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
脳疾患の治療は、さもなければ有効な治療剤がBBBを通過することができないことによって減じられることが多い。かくして、脳に薬剤を輸送するための新しい戦略が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らはここで、増強された効率で血液脳関門(BBB)を通過するか、または特定の細胞型(例えば、肝臓、眼、肺、腎臓、脾臓、筋肉、もしくは卵巣)に進入することができる短いポリペプチド(例えば、長さ19アミノ酸未満)を開発した。本発明者らはまた、1個以上のD-アミノ酸(例えば、3D-An2またはその断片)を有する短い(例えば、長さ6〜18アミノ酸)およびより長い(例えば、長さ19アミノ酸以上)ポリペプチドの両方を開発した。これらのポリペプチドは、標的化部分として役立つことができる。これらの標的化部分を1つ以上の薬剤または輸送ベクターと連結する(例えば、コンジュゲートさせる)場合、BBBを通過するか、または特定の細胞型への輸送効率も同様に増強される。従って、本発明は、必要に応じて1つ以上の薬剤(例えば、1つ以上の治療剤)または輸送ベクター(例えば、ナノ粒子もしくはリポソーム)にコンジュゲートされた標的化部分、ならびに疾患の治療および診断におけるそのような化合物の使用を特徴とする。
【０００５】
第一の態様において、本発明は、アミノ酸配列Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)(式中、X3はAsnもしくはGlnであり；X4はAsnもしくはGlnであり；およびX5はPhe、Tyr、もしくはTrpである)などの精製ポリペプチド、またはその製薬上許容し得る塩であって、該ポリペプチドが長さ200アミノ酸未満(例えば、150、100、75、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、12、10、11、8もしくは7アミノ酸未満、またはこれらの数の間の任意の範囲)であり；前記ポリペプチドが必要に応じて、式Iaに記載のアミノ酸の1つ以上のD-異性体(例えば、Lys、Arg、X3、X4、X5またはLysのD-異性体)を含み；および該ポリペプチドが表2に記載のペプチドではない、前記精製ポリペプチド、またはその製薬上許容し得る塩を特徴とする。
【０００６】
第二の態様において、本発明は、アミノ酸配列Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)(式中、X3はAsnもしくはGlnであり；X4はAsnもしくはGlnであり；およびX5はPhe、Tyr、もしくはTrpである)などの精製ポリペプチド、またはその製薬上許容し得る塩であって、該ポリペプチドが長さ19アミノ酸未満(例えば、18、17、16、15、14、12、10、11、8もしくは7アミノ酸未満、またはこれらの数の間の任意の範囲)であり；および前記ポリペプチドが必要に応じて、式Iaに記載のアミノ酸の1つ以上のD-異性体(例えば、Lys、Arg、X3、X4、X5またはLysのD-異性体)を含む、前記精製ポリペプチド、またはその製薬上許容し得る塩を特徴とする。
【０００７】
上記ポリペプチドのいずれかにおいて、1、2、3、4もしくは5アミノ酸(例えば、1〜3アミノ酸)の付加または欠失を、アミノ酸配列Lys-Arg-X3-X4-X5-Lysから作製することができる。
【０００８】
第一および第二の態様のいくつかの実施形態においては、前記アミノ酸配列は、Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2(式Ib)(式中、X3はAsnもしくはGlnであり；X4はAsnもしくはGlnであり；X5はPhe、Tyr、もしくはTrpであり；Z1は存在しないか、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、もしくはCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり；およびZ2は存在しないか、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-TyrもしくはThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり；ならびに前記ポリペプチドは必要に応じて、式Ib、Z1またはZ2に記載のアミノ酸の1つ以上のD-異性体を含む)である。
【０００９】
第一および第二の態様の他の実施形態においては、前記ポリペプチドは、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端、またはその両方に1個以上のさらなるシステイン残基を有する。他の実施形態においては、前記ポリペプチドは、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端、またはその両方に1個以上のさらなるチロシン残基を有する。さらに他の実施形態においては、前記ポリペプチドは、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端、またはその両方にアミノ酸配列Tyr-Cysおよび/またはCys-Tyrを有する。
【００１０】
第一および第二の態様の特定の実施形態においては、前記アミノ酸配列はLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lysである。他の実施形態においては、前記アミノ酸配列はLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyrである。さらに他の実施形態においては、前記アミノ酸配列はLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cysである。
【００１１】
第一および第二の態様の特定の実施形態においては、前記アミノ酸配列はX1-X2-Asn-Asn-X5-X6(式IIa)(式中、X1はLysもしくはD-Lysであり；X2はArgもしくはD-Argであり；X5はPheもしくはD-Pheであり；およびX6はLysもしくはD-Lysであり；ならびにX1、X2、X5、またはX6の少なくとも1個(たとえば、少なくとも2個、3個または4個)はD-アミノ酸である)である。
【００１２】
第一および第二の態様の他の実施形態においては、前記アミノ酸配列はX1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7(式IIb)(式中、X1はLysもしくはD-Lysであり；X2はArgもしくはD-Argであり；X5はPheもしくはD-Pheであり；X6はLysもしくはD-Lysであり；およびX7はTyrもしくはD-Tyrであり；ならびにX1、X2、X5、X6またはX7の少なくとも1個(例えば、少なくとも2個、3個、4個、または5個)はD-アミノ酸である)である。
【００１３】
第一および第二の態様のいくつかの実施形態においては、前記アミノ酸配列はZ1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2(式IIc)(式中、X3はAsnもしくはGlnであり；X4はAsnもしくはGlnであり；X5はPhe、Tyr、もしくはTrpであり；Z1は存在しないか、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-GlyもしくはCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり；およびZ2は存在しないか、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr、もしくはThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり；X1、X2、X5、X6またはX7の少なくとも1個はD-アミノ酸であり；ならびに前記ポリペプチドは必要に応じて、Z1またはZ2に記載のアミノ酸の1つ以上のD-異性体を含む)である。
【００１４】
上記態様のいずれかのさらなる実施形態においては、前記ポリペプチドは長さ15アミノ酸未満である(例えば、長さ10アミノ酸未満)。
【００１５】
上記態様のいずれかの他の実施形態においては、前記ポリペプチドは、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr (3D-An2); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1a); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (Plb); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (Plc); D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys (P1d); Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P2); Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P3); Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P4); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5b); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P5c); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Tyr-Cys (P6b); およびD-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-D-Tyr-Cys (P6c)；またはその断片である。
【００１６】
上記態様のいずれかのさらに他の実施形態においては、前記ポリペプチドは、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr (3D-An2); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P 1); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1a); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (Plb); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (Plc); D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys (P1d); Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P2); Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P3); Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P4); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P5b); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys (P5c); Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Tyr-Cys (P6a); D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Tyr-Cys (P6b); およびD-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-D-Tyr-Cys (P6c)；またはその断片から選択される1つ以上の配列と比較して、0〜5個(例えば、0〜4個、0〜3個、0〜2個、0〜1個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、2〜5個、2〜4個、2〜3個、3〜5個、3〜4個、または4〜5個)のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有する配列を含む。
【００１７】
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態においては、前記ポリペプチドは、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu; もしくはLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys、またはその断片である。
【００１８】
さらに他の実施形態においては、前記ポリペプチドは、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr (3D-An2);Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys (P1a);Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(Plb); Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-DTyr-Cys (P1c); D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys (P1d)またはその断片(例えば、P1、P1a、P1b、P1c、もしくはP1dのN末端からの1〜7個のアミノ酸の欠失；P1、P1a、P1b、P1c、もしくはP1dのC末端からの1〜5個のアミノ酸の欠失；またはP1、P1a、P1b、P1c、もしくはP1dのN末端からの1〜7個のアミノ酸の欠失およびP1、P1a、P1b、P1c、もしくはP1dのC末端からの1〜5個のアミノ酸の欠失)である。
【００１９】
上記態様のいずれかにおいて、前記ポリペプチドはアミド化されたC末端を有してもよい。他の実施形態においては、前記ポリペプチドは血液脳関門を通過して効率的に輸送される(例えば、前記ポリペプチドはAngiopep-2よりも効率的に血液脳関門を通過して輸送される)。
【００２０】
第三の態様において、本発明は、上記態様のいずれかに記載のポリペプチドおよび治療剤からなる標的化部分であって、治療剤に連結された前記標的化部分を含む治療用ポリペプチドを特徴とする。特定の実施形態においては、標的化部分は、共有結合(例えば、ペプチド結合)によって治療剤に連結される。他の実施形態においては、治療用ポリペプチドは融合タンパク質である。特定の実施形態においては、治療用ポリペプチドは1つ以上の治療用ペプチド剤を含む。
【００２１】
標的化部分は、治療用ペプチド剤に関して異種であってよい。
【００２２】
第三の態様の特定の実施形態においては、治療用ペプチド剤は、ニューロテンシンもしくはニューロテンシン類似体(例えば、ニューロテンシン(6-13)、ニューロテンシン(8-13)、Lys(7)-D-Yyr(11)-ニューロテンシン(7-13)、p-Glu(1)-ニューロテンシン、p-Glu(1)-ニューロテンシン-OH、D-Lys(6)-ニューロテンシン(6-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Lys(6)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(9)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Arg(9)-ニューロテンシン(6-13)、D-Pro(10)ニューロテンシン(6-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Trp(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Phe(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Trp(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(9)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(8)-D-Arg(9)-ニューロテンシン(8-13)、D-Pro(10)ニューロテンシン(8-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Trp(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Phe(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(8)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(8-13)、およびD-Arg(8)-D-Trp(11)-ニューロテンシン(8-13)、もしくはそのアセチル化形態、もしくは本明細書に記載のいずれか、例えば、アセチル-Lys(7)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(7-13))、ニューロテンシン受容体アゴニスト、神経栄養因子もしくは神経栄養因子類似体(例えば、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)もしくはGDNF類似体、または脳由来神経栄養因子(BDNF)もしくはBDNF類似体)、GLP-1アゴニスト、またはレプチンもしくはレプチン類似体である。
【００２３】
第三の態様の他の実施形態においては、治療用ペプチド剤は、免疫グロブリンなどの生物分子に特異的に結合するポリペプチド、または生物分子に特異的に結合する能力を保持するその断片である。例えば、免疫グロブリンは四量体(テトラマー)抗体または一本鎖抗体であってよい。
【００２４】
第四の態様において、本発明は、式A-X-B(式中、Aは上記ポリペプチドのいずれかの標的化部分であり；Xはリンカーであり；およびBは治療剤または輸送ベクターである)を有するコンジュゲートを特徴とする。特定の実施形態においては、コンジュゲートは式A-(X-B)nまたはA-X-(B)n(式中、nは1以上の整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10)である)を有する。特定の実施形態においては、nは2以上の整数(例えば、3、4、5、6、7、8、9または10)である。いくつかの実施形態においては、nは1〜10の整数(例えば、1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、2〜4、3〜9、3〜8、3〜7、3〜6、3〜5、または3〜4)である。
【００２５】
第四の態様のいくつかの実施形態においては、Xはペプチド結合である。他の実施形態においては、Xは少なくとも1個のアミノ酸であり；AおよびBはペプチド結合によってXに互いに共有結合する。特定の実施形態においては、Xはエステルリンカーである。いくつかの実施形態においては、Xは式-NH-(CH2)n-C(O)O-(式中、nは2〜10の整数(例えば、nは2〜5、2〜6、2〜7、2〜8、2〜9、2〜10、3〜5、3〜6、3〜7、3〜8、3〜9、3〜10、4〜5、4〜6、4〜7、4〜8、4〜9、4〜10、5〜6、5〜7、5〜8、5〜9、および5〜10の整数である、例えば、アミノヘキサン酸(Ahx)については、nは5である)を有する。特定の実施形態においては、Xは式：
【化１】
2013530993.tif 000003
【００２６】
(式中、nは2〜15の整数(例えば、nは3、6もしくは11である)であり；およびYはA上のチオールであり、ZはB上の一級アミンであるか、またはYはB上のチオールであり、ZはA上の一級アミンである)
を有する。
【００２７】
第四の態様の特定の実施形態においては、Bは治療剤、例えば、抗癌剤(例えば、パクリタキセル(Taxol(登録商標)もしくはパクリタキセル誘導体、例えば、ドセタキセル(Taxotere(登録商標))；エトポシド；ドキソルビシン；もしくはその類似体)、治療用核酸剤(例えば、RNAi剤、例えば、siRNA、dsRNA、miRNA、shRNAもしくはptgsRNA)、小分子薬剤(例えば、抗生物質、抗増殖剤、もしくは増殖因子阻害剤)、標識(例えば、アイソトープ、放射性画像化標識、蛍光標識、もしくはリポーター分子)、または治療用ペプチド剤である。特定の実施形態においては、コンジュゲートは1つ以上のBまたは治療剤を有する。特定の実施形態においては、治療剤は治療用ペプチド剤であり、コンジュゲートは融合タンパク質である。さらに他の実施形態においては、治療用ペプチド剤は、ニューロテンシンもしくはニューロテンシン類似体(例えば、ニューロテンシン(6-13)、ニューロテンシン(8-13)、Lys(7)-D-Yyr(11)-ニューロテンシン(7-13)、p-Glu(1)-ニューロテンシン、p-Glu(1)-ニューロテンシン-OH、D-Lys(6)-ニューロテンシン(6-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Lys(6)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(9)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Arg(9)-ニューロテンシン(6-13)、D-Pro(10)ニューロテンシン(6-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Trp(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Phe(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Trp(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(9)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(8)-D-Arg(9)-ニューロテンシン(8-13)、D-Pro(10)ニューロテンシン(8-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Trp(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Phe(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(8)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(8-13)、およびD-Arg(8)-D-Trp(11)-ニューロテンシン(8-13)、もしくはそのアセチル化形態、もしくは本明細書に記載のいずれか、例えば、アセチル-Lys(7)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(7-13))、神経栄養因子もしくは神経栄養因子類似体(例えば、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)もしくはGDNF類似体、および脳由来神経栄養因子(BDNF)もしくはBDNF類似体)、GLP-1アゴニスト、ならびにレプチンもしくはレプチン類似体から選択される。
【００２８】
第四の態様の特定の実施形態においては、Bは輸送ベクター、例えば、脂質ベクター(例えば、リポソーム、ミセル、もしくはリポプレックス)、ポリプレックス、デンドリマー、またはナノ粒子(例えば、ポリマーナノ粒子、固形脂質ナノ粒子、もしくはナノメートルサイズのミセル)である。他の実施形態においては、輸送ベクターは、治療剤(例えば、抗癌剤、治療用核酸剤、小分子薬剤、標識、および治療用ペプチド剤)に結合されるか、またはそれを含む。
【００２９】
第四の態様の他の実施形態においては、治療用ペプチド剤は、免疫グロブリンなどの生物分子に特異的に結合するポリペプチドまたは生物分子に特異的に結合する能力を保持するその断片である。例えば、免疫グロブリンは、四量体抗体または一本鎖抗体であってよい。
【００３０】
第五の態様において、本発明は、任意の治療用ポリペプチドまたは上記の任意のコンジュゲートを含む組成物を特徴とする。いくつかの実施形態においては、組成物は製薬上許容し得る担体をさらに含む。
【００３１】
第六の態様において、本発明は、癌を有する被験体などの治療を必要とする被験体(例えば、ヒト)を治療する(例えば、予防的に)方法を特徴とする。この方法は、被験体に有効量の本発明の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲート(例えば、治療用ペプチド剤として、免疫グロブリンもしくは生物分子に特異的に結合するその断片を含むポリペプチドまたはコンジュゲート)を投与する工程を含んでもよい。癌としては脳の癌(例えば、神経膠腫、混合性神経膠腫、多形成グリア芽細胞腫、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、乏突起膠腫、上衣腫、乏突起星細胞腫、髄芽腫、網膜芽腫、神経芽腫、胚細胞腫、および奇形腫)が挙げられる。被験体は、癌を有すると診断されたか、または癌を発症する高い危険にあると決定されたものであってよい。
【００３２】
特定の実施形態においては、本発明は、被験体における癌の治療または予防的治療における使用のための本明細書に記載の任意の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲートを特徴とする。他の実施形態においては、本発明は、被験体における癌を治療する(例えば、予防的に)ための薬剤の製造における本明細書に記載の任意の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲートの使用を特徴とする。癌としては、脳の癌(例えば、神経膠腫、混合性神経膠腫、多形成グリア芽細胞腫、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、乏突起膠腫、上衣腫、乏突起星細胞腫、髄芽腫、網膜芽腫、神経芽腫、胚細胞腫、および奇形腫)が挙げられる。
【００３３】
第七の態様において、本発明は、体温を低下させるのに十分な量の本発明の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲートを投与することによる被験体の体温を低下させる方法を特徴とする。被験体は、脳卒中、心臓発作、脳虚血、心虚血、神経損傷に罹患しているか、もしくは罹患したか、または神経保護を必要とするか、もしくは悪性低体温にあってよい。
【００３４】
特定の実施形態においては、本発明は、被験体の体温を低下させるのに使用するための本明細書に記載の任意の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲートを特徴とする。他の実施形態においては、本発明は、被験体の体温を低下させるための医薬の製造における本明細書に記載の任意の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲートの使用を特徴とする。被験体は、脳卒中、心臓発作、脳虚血、心虚血、神経損傷に罹患しているか、もしくは罹患したか、または神経保護を必要とするか、もしくは悪性低体温にあってよい。
【００３５】
第八の態様において、本発明は、有効量の本発明の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲートを被験体に投与することによる被験体における高血圧を治療する(例えば、予防的に)方法を特徴とする。
【００３６】
特定の実施形態においては、本発明は、被験体における高血圧の治療または予防的治療における使用のための本明細書に記載の任意の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲートを特徴とする。他の実施形態においては、本発明は、被験体における高血圧を治療する(例えば、予防的に)ための医薬の製造における本明細書に記載の任意の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲートの使用を特徴とする。
【００３７】
第九の態様において、本発明は、疼痛を治療するのに十分な量の本発明の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲートを投与することによる被験体における疼痛を治療する(例えば、予防的に)か、または疼痛に対する感受性を低下させる方法を特徴とする。疼痛は、急性疼痛、末梢もしくは中枢神経障害疼痛、炎症性疼痛、片頭痛関連疼痛、頭痛関連疼痛、過敏性腸症候群関連疼痛、線維筋痛関連疼痛、関節炎疼痛、骨格痛、関節痛、胃腸痛、筋肉痛、狭心痛、顔面痛、骨盤痛、跛行、術後疼痛、外傷後疼痛、緊張型頭痛、産科痛、婦人科痛、または化学療法誘導性疼痛であってよい。
【００３８】
特定の実施形態においては、本発明は、被験体における疼痛の治療もしくは予防的治療における使用のため、または疼痛に対する感受性を低下させるのに使用するための本明細書に記載の任意の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲートを特徴とする。他の実施形態においては、本発明は、被験体における疼痛を治療する(例えば、予防的に)か、または疼痛に対する感受性を低下させるための医薬の製造における本明細書に記載の任意の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲートの使用を特徴とする。疼痛は、急性疼痛、末梢もしくは中枢神経障害疼痛、炎症性疼痛、片頭痛関連疼痛、頭痛関連疼痛、過敏性腸症候群関連疼痛、線維筋痛関連疼痛、関節炎疼痛、骨格痛、関節痛、胃腸痛、筋肉痛、狭心痛、顔面痛、骨盤痛、跛行、術後疼痛、外傷後疼痛、緊張型頭痛、産科痛、婦人科痛、または化学療法誘導性疼痛であってよい。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は、障害を治療するのに十分な量の本発明の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲートを投与することによって、障害を有する被験体を治療する(例えば、予防的に)ことを特徴とする。これらの障害としては、被験体における精神障害(例えば、統合失調症もしくは本明細書に記載の任意の他の精神障害)、薬物依存もしくは薬物乱用(例えば、アンフェタミン、メタンフェタミン、3,4-メチレンジオキシ-メタンフェタミン、ニコチン、コカイン、メチルフェニダート、もしくはアレコリンの依存もしくは乱用)、代謝障害(例えば、糖尿病(例えば、I型もしくはII型)、肥満、肥満の結果としての糖尿病、高血糖、脂質異常症、高トリグリセリド血症、X症候群、インスリン耐性、耐糖能異常(IGT)、糖尿病性脂質異常症、高脂血症、心血管疾患、もしくは高血圧)、または神経障害(例えば、神経変性疾患；中枢神経系(CNS)、末梢神経系、もしくは自律神経系の症状；または本明細書に記載の任意の神経障害)が挙げられる。
【００４０】
特定の実施形態においては、本発明は、被験体における障害の治療または予防的治療における使用のための本明細書に記載の任意の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲートを特徴とする。他の実施形態においては、本発明は、被験体における障害を治療する(例えば、予防的に)ための医薬の製造における本明細書に記載の任意の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲートの使用を特徴とする。これらの障害としては、被験体における精神障害(例えば、統合失調症もしくは本明細書に記載の任意の他の精神障害)、薬物依存もしくは薬物乱用(例えば、アンフェタミン、メタンフェタミン、3,4-メチレンジオキシ-メタンフェタミン、ニコチン、コカイン、メチルフェニダート、もしくはアレコリンの依存もしくは乱用)、代謝障害(例えば、糖尿病(例えば、I型もしくはII型)、肥満、肥満の結果としての糖尿病、高血糖、脂質異常症、高トリグリセリド血症、X症候群、インスリン耐性、耐糖能異常(IGT)、糖尿病性脂質異常症、高脂血症、心血管疾患、もしくは高血圧)、または神経障害(例えば、神経変性疾患；中枢神経系(CNS)、末梢神経系、もしくは自律神経系の症状；または本明細書に記載の任意の神経障害)が挙げられる。
【００４１】
上記方法または使用のいずれかにおいて、被験体はヒトであってよい。
【００４２】
本発明の治療方法または使用においては、コンジュゲートまたは治療用ポリペプチドを、非コンジュゲート化治療剤または輸送ベクター(例えば、治療剤に結合されれか、またはそれを含む)の推奨用量と比較して低い(例えば、95%、75%、60%、50%、40%、30%、25%、10%、5%または1%未満)等価用量で投与することができる。他の実施形態においては、コンジュゲートまたは治療用ポリペプチドを、非コンジュゲート化薬剤について推奨される用量よりも高い(1.5x、2x、2.5x、3.0x、5x、8x、10x、15x、20x、25x)等価用量で投与する。
【００４３】
本発明の標的化部分、コンジュゲート、または治療用ポリペプチドは、特定の細胞型、器官、もしくは組織(例えば、肝臓、眼、肺、腎臓、脾臓、筋肉もしくは卵巣の細胞型、器官、もしくは組織のいずれか1、2、3、4、もしくは5つ)に効率的に輸送され得るか、または哺乳動物のBBBを通過することができる。本発明によれば、標的化部分は、例えば、被験体の肝臓(肝臓組織)、眼(眼組織)、肺(肺組織)、腎臓(腎臓組織)、脾臓(脾臓組織)、筋肉(筋肉組織)、および卵巣(卵巣組織)などの組織における治療剤の蓄積を促進することができる。従って、標的化部分、コンジュゲート、または治療用ポリペプチドを用いて、これらの組織と関連する疾患(例えば、本明細書に記載の任意のものなどの癌；細菌感染もしくはウイルス感染などの感染；または炎症症状)を治療することができる。標的化部分は、50アミノ酸未満の任意の長さ、例えば、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、12、10、11、8、もしくは7アミノ酸未満、またはこれらの数の間の任意の長さであってよい。特定の実施形態においては、標的化部分は、19アミノ酸未満の任意の長さ、例えば、18、17、16、15、14、12、10、11、8、もしくは7アミノ酸未満、またはこれらの数の間の任意の範囲であってよい。特定の実施形態においては、標的化部分は、長さ6〜19アミノ酸である。標的化部分は、組換え遺伝子技術または化学的合成により製造することができる。標的化部分、コンジュゲート、または治療用ポリペプチドはまた、本明細書に記載の任意のペプチドまたはポリペプチドと実質的に類似する(例えば、少なくとも35%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、85%、90%、95%または99%同一である)ペプチドを含んでもよい。
【００４４】
上記態様のいずれかにおいて、治療用ポリペプチド、コンジュゲート、または標的化部分は、Angiopep-2(配列番号97)の1個以上の位置1、2、3、4、8、10、11、13、14、15、16、17、18、および19について1個以上のD-アミノ酸置換を有するAngiopep-2(An2)よりも短いポリペプチドを含む。さらなる実施形態においては、治療用ポリペプチド、コンジュゲート、または標的化部分は、50アミノ酸未満、例えば、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、12、10、11、8、もしくは7アミノ酸未満の任意の長さ(例えば、19アミノ酸未満、例えば、18、17、16、15、14、12、10、11、8、もしくは7アミノ酸未満、もしくはこれらの数の間の任意の範囲の任意の長さ)を有する。特定の実施形態においては、治療用ポリペプチド、コンジュゲート、または標的化部分は、長さ6〜19アミノ酸である。
【００４５】
上記態様のいずれかにおいて、治療用ポリペプチド、コンジュゲート、または標的化部分は、血液脳関門を通過して効率的に輸送される(例えば、治療用ポリペプチド、コンジュゲート、または標的化部分は、Angiopep-2または治療用ペプチド剤、他の任意の治療剤、もしくは輸送ベクターにコンジュゲートされたAngiopep-2よりも効率的に血液脳関門を通過して輸送される)。
【００４６】
上記態様のいずれかの特定の実施形態においては、本明細書に記載の標的化部分、コンジュゲート、または治療用ポリペプチドは改変される(例えば、本明細書に記載のように)。標的化部分、コンジュゲート、または治療用ポリペプチドを、アミド化、アセチル化、またはその両方を行うことができる。そのような改変は、標的化部分のアミノ末端またはカルボキシ末端にあってよい。標的化部分、コンジュゲート、または治療用ポリペプチドはまた、本明細書に記載のペプチドのいずれかのペプチド模倣物質(例えば、本明細書に記載のもの)を含んでもよい。標的化部分、コンジュゲート、または治療用ポリペプチドはまた、本明細書に記載の配列の一つと比較して、アミノ酸の1個以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個)の置換、欠失、または付加を含んでもよい。特に、1、2、3、4または5アミノ酸(例えば、1〜3アミノ酸)のこれらの置換、欠失、または付加を、アミノ酸配列Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)、Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2(式Ib)、X1-X2-Asn-Asn-X5-X6(式IIa)、X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7(式IIb)、またはZ1-X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2(式IIc)(式中、それぞれの式についてX1〜X7、Z1およびZ2は本明細書に記載の通りである)から作製することができる。他の改変としては、翻訳後プロセッシングまたはユビキチン化、PEG化、アセチル化、アシル化、環化、アミド化、酸化、硫酸化、システインの形成、もしくは1種以上の治療剤の共有結合などの化学的改変が挙げられる。特に、環化は好ましい改変であってよい。
【００４７】
上記態様のいずれかの特定の実施形態においては、本明細書に記載の標的化部分、コンジュゲート、または治療用ポリペプチドは、マルチマー(例えば、ダイマー、トリマー、もしくはより高い次数のマルチマー、または本明細書に記載のもの)である。標的化部分は、マルチマー標的化部分(例えば、本明細書に記載のもの)であってよい。コンジュゲートはマルチマー標的化部分を含んでもよく、1つ以上の治療剤または1つ以上の輸送ベクター(例えば、本明細書に記載のもの)を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、マルチマー標的化部分およびコンジュゲートは、ポリペプチドのための任意の改変または本明細書に記載のさらなるコンジュゲーションを含む(例えば、翻訳後プロセッシングまたはユビキチン化、PEG化、アセチル化、アシル化、環化、アミド化、酸化、硫酸化、システインの形成、もしくは1種以上の治療剤の共有結合などの化学的改変)。
【００４８】
上記態様のいずれかの特定の実施形態においては、リンカーは一価または多価(例えば、ホモ二官能性、ヘテロ多官能性、二官能性、または三官能性薬剤)であってよい。他の実施形態においては、リンカーは可撓性アーム(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14もしくは15炭素原子；または(PEG)n(式中、nは1〜20である)などのポリエチレングリコールスペーサー))を含んでもよい。
【００４９】
(定義)
「コンジュゲート」とは、標的化部分と、標的化部分に連結された治療剤または輸送ベクター(例えば、本明細書に記載の任意のもの)とを有する化合物を意味する。
【００５０】
「血液脳関門を通過して輸送される」標的化部分とは、対照物質、またはコンジュゲートの場合、非コンジュゲート化薬剤と比較してより高い(例えば、25%、50%、100%、200%、500%、1,000%、5,000%、または10,000%)程度でBBBを通過することができる標的化部分を意味する。BBBを通過する能力を、当業界で公知の任意の方法(例えば、BBBのin vitroモデルまたは米国特許第7,557,182号に記載のin situ脳かん流)を用いて決定することができる。
【００５１】
「特定の細胞型に効率的に輸送される」標的化部分、コンジュゲート、または治療用ポリペプチドとは、標的化部分、コンジュゲート、または治療用ポリペプチドが、対照物質、またはコンジュゲートの場合、非コンジュゲート化薬剤と比較して少なくとも10%(例えば、25%、50%、100%、200%、500%、1,000%、5,000%、または10,000%)高い程度でその細胞型に蓄積することができる(例えば、細胞への輸送の増加、細胞からの流出の減少、またはその組合せに起因する)ことを意味する。そのような活性は、参照により本明細書に組み入れられるものとする国際特許出願公開第WO 2007/009229号で詳細に説明されている。
【００５２】
「等価用量」とは、非コンジュゲート化分子と比較して、本発明のコンジュゲート中の薬剤の同じモル量を達成するのに必要とされる本発明のコンジュゲートの量を意味する。
【００５３】
「断片」とは、完全長アミノ酸または核酸配列(例えば、本明細書に記載の任意の配列)の一部を意味する。断片は、完全長配列の少なくとも4、5、6、8、10、11、12、14、15、16、17、18、20、25、30、35、40、45、または50個のアミノ酸または核酸を含んでもよい。断片は、完全長タンパク質の生物学的活性の少なくとも1つを保持してもよい。
【００５４】
治療剤または輸送ベクターに「連結された」標的化部分とは、標的化部分と、治療剤または輸送ベクターとの共有的または非共有的相互作用を意味する。非共有的相互作用としては、限定されるものではないが、水素結合、荷電した基の間のイオン相互作用、静電結合、van der Waals相互作用、非極性基の間の疎水性相互作用、疎油性相互作用、およびLogPに基づく引力が挙げられる。
【００５５】
「マルチマー標的化部分」とは、標的化部分が同じか、または異なってもよい2個以上の標的化部分を含むポリペプチドを意味する。
【００５６】
「RNAi剤」とは、RNA干渉経路により遺伝子サイレンシング効果を発揮する任意の薬剤または化合物を意味する。RNAi剤としては、配列特異的RNAiを媒介することができる任意の核酸分子、例えば、短い干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(miRNA)、短いヘアピンRNA(shRNA)、短い干渉オリゴヌクレオチド、短い干渉核酸、短い干渉改変オリゴヌクレオチド、化学的に改変されたsiRNA、および転写後遺伝子サイレンシングRNA(ptgsRNA)が挙げられる。
【００５７】
「実質的に同一である」とは、参照アミノ酸または核酸配列と比較して少なくとも、または約35%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、85%、90%、95%またはさらには99%の同一性を有するポリペプチドまたは核酸を意味する。ポリペプチドについては、比較配列の長さは一般に、少なくとも4(例えば、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50または100)アミノ酸である。元のポリペプチドのアミノ酸と同一であるか、または類似するアミノ酸の配列間にギャップが認められてもよいことが本明細書で理解されるべきである。ギャップは、1個のアミノ酸も含まない、元のポリペプチドと同一でもなく、または類似もしない1個以上のアミノ酸を含んでもよい。同一性%は、例えば、デフォルトギャップ重量を用いる、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中のGAP、BESTFIT、またはFASTAアルゴリズムを用いて決定することができる。
【００５８】
「被験体」とは、ヒトまたは非ヒト動物(例えば、哺乳動物)を意味する。
【００５９】
「標的化部分」とは、BBBを通過して、または特定の細胞型に輸送することができるポリペプチド、ポリペプチド誘導体、またはペプチド模倣物質を意味する。
【００６０】
「治療剤」とは、疾患もしくは症状の治療もしくは予防的治療、または疾患もしくは症状の診断において用いることができる薬剤を意味する。
【００６１】
「治療用核酸剤」とは、RNAまたはDNAに基づく治療剤を意味する。
【００６２】
「治療用ペプチド剤」とは、タンパク質またはペプチドに基づく治療剤を意味する。
【００６３】
「治療用ポリペプチド」とは、標的化部分と、標的化部分に連結された治療用ペプチド剤とを有するコンジュゲートを意味する。
【００６４】
「輸送ベクター」とは、治療剤に結合するか、またはそれを含有することができる任意の化合物または組成物(例えば、脂質、炭水化物、ポリマー、もしくは界面活性剤)を意味する。輸送ベクターは、薬剤、例えば、小分子薬剤または治療用ペプチド剤を輸送することができる。輸送ベクターの例としては、脂質ミセル、リポソーム、リポプレックス、デンドリマー、およびナノ粒子が挙げられる。
【００６５】
被験体における疾患、障害または症状を「治療すること」とは、コンジュゲートまたは治療用ポリペプチドを被験体に投与することによって、疾患、障害または症状の少なくとも一つの兆候または症候を低下させることを意味する。
【００６６】
被験体における疾患、障害または症状を「予防的に治療すること」とは、疾患の症候または複数の症候の出現の前に被験体にコンジュゲートまたは治療用ポリペプチドを投与することによって疾患、障害または症状の発生頻度または重篤度を低下させる(例えば、防止する)ことを意味する。
【００６７】
アミノ酸残基の記載は、別途特定しない限り、天然のL-アミノ酸を指す。
【００６８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】Angiopep-2(An2)、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P1)、およびLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P5)に関するマウスにおけるin situでの脳かん流を示すグラフである。
【図２】対照マウス(ビヒクル)、ANG2002(NT-An2、20 mg/kg、静脈内)を受けるマウス、P5-NT(16 mg/kg、静脈内)を受けるマウス、およびP6-NT(14 mg/kg、静脈内)を受けるマウスにおける足舐め応答のマウスにおけるホットプレート試験における待ち時間(反応時間)を示すグラフである。
【図３】対照(ビヒクル)、ANG2002(NT-An2、20 mg/kg、静脈内)、P5-NT(16 mg/kg、静脈内)およびP6-NT(14 mg/kg、静脈内)の投与時のマウスにおける体温の効果を示すグラフである。
【図４】Angiopep-2およびANGP6a(P6a)のペプシンおよびトリプシン切断部位を示す図である。
【図５】ヒト結腸腺癌(HT29)細胞を用いる[3H]ニューロテンシンの競合結合アッセイを示すグラフである。
【図６】ANG2002、P6-NT、およびP6a-NTに関するマウスにおけるin situでの脳かん流を示すグラフである。
【図７】対照(PBS)、AN2-NT(An2にコンジュゲートされたニューロテンシン、20 mg/kg、4.683μmol/kg、静脈内)、P5-NT(4.683μmol/kg、静脈内)およびP5a-NT(4.683μmol/kg、静脈内)の投与時のマウスにおける体温の効果を示すグラフである。
【図８】対照(PBS)、AN2-NT(An2にコンジュゲートされたニューロテンシン、20 mg/kg、4.683μmol/kg、静脈内)、P6-NT(4.683μmol/kg、静脈内)およびP6a-NT(4.683μmol/kg、静脈内)の投与時のマウスにおける体温の効果を示すグラフである。
【図９】An2-NT、P6a-NT(6-13)(ANGP6a-NT(6-13))、P6b-NT(6-13, D-Arg8)(ANGP6b-NT(6-13, D-Arg8))およびP6b-NT(6-13, D-Arg8, D-Tyr11)(ANGP6b-NT(6-13, D-Arg8, D-Tyr11))のペプシンおよびトリプシン切断部位を示す。
【図１０】NT、P5a-NT1、P5b-NT1、P5c-NT1、およびP6a-NT1に関するマウスにおけるin situでの脳かん流を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
本発明者らはここで、増強された効率で血液脳関門(BBB)を通過することができるか、または特定の細胞型(例えば、肝臓、眼、肺、脾臓、腎臓、筋肉もしくは卵巣)に進入することができる短いポリペプチド(例えば、6〜18アミノ酸長)を開発した。本発明者らはまた、1個以上のD-アミノ酸(例えば、3D-An2)を有する短い(例えば、6〜18アミノ酸長)およびより長い(例えば、19アミノ酸長以上)ポリペプチドの両方を開発した。これらのポリペプチドは、BBBを通過して、または特定の細胞型に薬剤を輸送し、標的化部分として働くことができる。いくつかの場合、標的化部分は、19アミノ酸長以上であるより長い形態の同じポリペプチドよりも、より効率的に、および本明細書に記載のような特定の場合、さらにより効率的に、BBBを通過するか、または特定の細胞型に進入することができる。輸送におけるこの増加した効率は、非コンジュゲート化薬剤またはより長い形態のポリペプチドにコンジュゲートされた薬剤と比較して、より低用量のコンジュゲートを可能にすることができる。他の場合、薬剤をその標的組織により効率的に指向させることにより、より高い標的化効率は副作用を低下させることができるため、本発明の化合物を非コンジュゲート化薬剤またはより長い形態のポリペプチドにコンジュゲートされた薬剤よりも高用量で投与することができる。そのような標的化部分を含む化合物および疾患の治療におけるその使用を、以下で詳細に説明する。
【００７１】
(標的化部分)
本発明は、標的化部分として用いられる短いポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドは、コンセンサス配列(例えば、Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys)およびその保存的置換を含み、19アミノ酸長未満(すなわち、18アミノ酸およびより短い)である。
【００７２】
本発明のコンジュゲートおよび治療用ポリペプチドは、本明細書に記載の任意の標的化部分、またはその断片もしくは類似体を特徴とし得る。特定の実施形態においては、標的化部分は、本明細書に記載のポリペプチドに対して少なくとも35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、またはさらには100%の同一性を有してもよい。標的化部分は、本明細書に記載の配列の一つと比較して、1個以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個)の置換を有してもよい。標的化部分は、本明細書に記載の配列の一つと比較して、アミノ酸の1個以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個)の付加および欠失を有してもよい。他の改変は、以下により詳細に説明される。
【００７３】
本発明の標的化部分は、
Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)
(式中、
X3はAsnまたはGlnであり；
X4はAsnまたはGlnであり；および
X5はPhe、Tyr、またはTrpである)
のコンセンサス配列を含む。
【００７４】
本発明の標的化部分はまた、
Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2(式Ib)
(式中、
X3はAsnまたはGlnであり；
X4はAsnまたはGlnであり；
X5はPhe、Tyr、またはTrpであり；
Z1は存在しないか、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、またはCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり；および
Z2は存在しないか、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-TyrまたはThr-Glu-Glu-Tyr-Cysである)
のコンセンサス配列を含んでもよい。
【００７５】
式(Ia)および(Ib)のコンセンサス配列は、アミノ酸配列Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lysおよび保存的置換を含む。アミノ酸およびペプチドの保存的置換および誘導体は当業界でよく知られており、任意の有用な方法により(例えば、置換マトリックスまたは本明細書に記載の任意の他の方法を用いることにより)決定することができる。標的化部分の誘導体は、以下の基またはこれらの基のサブセット：Ser、ThrおよびCys；Leu、IleおよびVal；GluおよびAsp；LysおよびArg；Phe、TyrおよびTrp(例えば、PheおよびTyr)；ならびにGln、Asn、Glu、AspおよびHis(例えば、GlnおよびAsn)から選択される1個以上の保存的置換を含有する標的化部分を含む。保存的置換はまた、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)アルゴリズム、BLOSUM置換マトリックス(例えば、BLOSUM 62マトリックス)およびPAM置換マトリックス(例えば、PAM 250マトリックス)などの他の方法により決定することもできる。
【００７６】
コンセンサス配列はまた、式(Ia)または(Ib)の1個以上のアミノ酸残基が対応するD-異性体で置換された1個以上のD-アミノ酸置換を有するものも含む。D-アミノ酸置換は、消化酵素(例えば、ペプシンおよび/またはトリプシン)による切断に対する増加した耐性を有するペプチドを提供することができる。例えば、ペプシンまたはトリプシンによる可能な切断部位を有する式(Ia)または(Ib)中の1個以上のアミノ酸を、そのアミノ酸のD-異性体で置換することができる。ペプシンおよびトリプシンによる式(Ia)または(Ib)中の切断部位の例としては、Lysのための位置1；Argのための位置2；Phe、TyrまたはTrpであるX5のための位置5；およびLysのための位置6に対してN末端またはC末端である結合が挙げられる。従って、本発明のポリペプチドはまた、式(Ia)または(Ib)の位置1、2、5および/または6のアミノ酸について1個以上のD-異性体を有するものを含む。
【００７７】
本発明の他の標的化部分は、
X1-X2-Asn-Asn-X5-X6(式IIa)
(式中、
X1はLysまたはD-Lysであり；
X2はArgまたはD-Argであり；
X5はPheまたはD-Pheであり；および
X6はLysまたはD-Lysであり；ならびに
X1、X2、X5、またはX6の少なくとも1個はD-アミノ酸である)
のコンセンサス配列を含む。
【００７８】
本発明のさらに他の標的化部分は、
X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7(式IIb)
(式中、
X1はLysまたはD-Lysであり；
X2はArgまたはD-Argであり；
X5はPheまたはD-Pheであり；
X6はLysまたはD-Lysであり；
X7はTyrまたはD-Tyrであり；および
X1、X2、X5、X6またはX7の少なくとも1個はD-アミノ酸である)
のコンセンサス配列を含む。
【００７９】
本発明のさらに他の標的化部分はまた、
Z1-X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2(式IIc)
(式中、
X1はLysまたはD-Lysであり；
X2はArgまたはD-Argであり；
X5はPheまたはD-Pheであり；
X6はLysまたはD-Lysであり；
X7はTyrまたはD-Tyrであり；および
Z1は存在しないか、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、またはCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり；および
Z2は存在しないか、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-TyrまたはThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり；
X1、X2、X5、X6またはX7の少なくとも1個はD-アミノ酸であり；ならびに
前記ポリペプチドは必要に応じて、Z1またはZ2に記載のアミノ酸の1個以上のD-異性体を含む)
のコンセンサス配列を含む。
【００８０】
これらのコンセンサス配列はまた、保存的置換を含む。アミノ酸およびペプチドの保存的置換および誘導体は当業界でよく知られており、任意の有用な方法により(例えば、置換マトリックスまたは本明細書に記載の任意の他の方法を用いることにより)決定することができる。標的化部分の誘導体は、以下の基またはこれらの基のサブセット：Ser、ThrおよびCys；Leu、IleおよびVal；GluおよびAsp；LysおよびArg；Phe、TyrおよびTrp(例えば、PheおよびTyr)；ならびにGln、Asn、Glu、AspおよびHis(例えば、GlnおよびAsn)から選択される1個以上の保存的置換を含有する標的化部分を含む。保存的置換はまた、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)アルゴリズム、BLOSUM置換マトリックス(例えば、BLOSUM 62マトリックス)およびPAM置換マトリックス(例えば、PAM 250マトリックス)などの他の方法により決定することもできる。
【００８１】
本発明の標的化部分は、Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)(式中、X3〜X5は上記で定義された通りである)のコンセンサス配列；X1-X2-Asn-Asn-X5-X6およびX1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7(それぞれ式IIaおよびIIb)(式中、X1、X2、X5、X6およびX7は上記で定義された通りである)のコンセンサス配列；または本明細書に記載の3D-An2のより長いポリペプチドに対するアミノ酸の付加および欠失を含む。欠失または付加は、Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys、X1-X2-Asn-Asn-X5-X6、X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7、Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys、D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys、もしくはD-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-D-Tyrのコンセンサス配列、またはより長い配列3D-An2の任意の一部を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、1、2、3、4または5アミノ酸の欠失または付加を、標的化部分のコンセンサス配列から行うことができる。特定の実施形態においては、欠失または付加は1〜3アミノ酸であってよい。
【００８２】
所望の生物学的活性(例えば、BBBを通過する能力またはアゴニスト活性)を有意に破壊しない任意の有用な置換、付加および欠失を行うことができる。改変は、コンセンサス配列または元のポリペプチドの生物学的活性を低下させる(例えば、少なくとも5%、10%、20%、25%、35%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、もしくは95%)、効果を有さない、または増加させる(例えば、少なくとも5%、10%、25%、50%、100%、200%、500%、もしくは1000%)ことができる。
【００８３】
特に、D-アミノ酸の置換または付加を、標的化部分内で行うことができる。そのような置換または付加は、切断部位のより多くのアミノ酸のうちの1個をそのD-異性体で置換することができる、酵素による切断に対して増加した耐性を有するペプチドを提供することができる。酵素の例としては、ペプシン、トリプシン、Arg-Cプロテイナーゼ、Asp-Nエンドペプチダーゼ、キモトリプシン、グルタミルエンドペプチダーゼ、LysCリジルエンドペプチダーゼ、LysNペプチジル-Lysメタロエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼK、およびサーモリシンが挙げられる；ならびにこれらの酵素のための切断部位の例は本明細書に記載される。
【００８４】
さらに、置換、付加および欠失は、電荷(例えば、正電荷もしくは負電荷)、親水性、疎水性、in vivoでの安定性、バイオアベイラビリティ、毒性、免疫学的活性、免疫学的同一性、およびコンジュゲーション特性などのコンセンサス配列またはポリペプチドの特徴を有してもよく、またはそれを最適化することができる。例えば、正電荷は、塩基性/正に荷電していない(一般的な側鎖特性に基づいて以下に記載される)またはあまり正に荷電していない(例えば、pKaにより決定される)1個以上のアミノ酸(例えば、1〜3個のアミノ酸)を欠失させることにより促進することができる。別の例では、正電荷を、塩基性/正に荷電した、またはより正に荷電した(例えば、pKaにより決定される)1個以上のアミノ酸(例えば、1〜3個のアミノ酸)を挿入することにより促進することができる。
【００８５】
in vivoでの安定性を、任意の有用な方法で最適化することができる。例えば、1種以上の消化酵素の存在下での安定性を、天然のL-アミノ酸をそのD-異性体に置換することにより改善することができる。消化酵素の例としては、ペプシンおよびトリプシンが挙げられる。切断部位のためのサブサイト命名法を用いれば、S1-S1'は、ペプチドSn---S4-S3-S2-S1-S1'-S2'-S3'-S4’---Smの切断部位を示す。ペプシンによる切断は一般に、Phe、Tyr、Trp、またはLeuが位置S1もしくはS1'にある場合；またはProが位置S3もしくはS4にある場合に起こる。トリプシンによる切断は一般に、ArgもしくはLysが位置S1にある場合；Proが位置S1'にあり、Lysが位置S1にあり、Trpが位置S2にある場合；Proが位置S1'にあり、Argが位置S1にあり、Metが位置S2にある場合；またはProが位置S1'にあり、Gluが位置S2にある場合に起こる。他の切断部位の例としては、Arg-Cプロテイナーゼ(例えば、位置S1のArg)、Asp-Nエンドペプチダーゼ(例えば、位置S1'のAspもしくはGln)、キモトリプシン(例えば、高い特異性での切断のためには位置S1のTrp、TyrもしくはPhe；低い特異性での切断のためには位置S1のLeu、MetもしくはHis)、グルタミルエンドペプチダーゼ(例えば、位置S1のGlu)、LysCリジルエンドペプチダーゼ(例えば、位置S1のLys)、LysNペプチジル-Lysメタロエンドペプチダーゼ(例えば、位置S1'のLys)、プロテイナーゼK(例えば、脂肪族または位置S1のAla、Glu、Phe、Ile、Leu、Thr、Val、TrpもしくはTyrなどのアミノ酸残基)、およびサーモリシン(例えば、嵩高いか、または位置S1'のIle、Leu、Val、Ala、Met、もしくはPheなどのアミノ酸残基)による切断のためのものが挙げられる。
【００８６】
ExPASyプロテオミクスサーバー上で利用可能なPeptideCutterなどの切断部位を決定するための予測モデルも利用可能である。ペプシンによる切断のためのAngiopep-2(配列番号97)中の位置1、2、3、4、14、18、および19に対するC末端ならびにトリプシンによる切断のためのAngiopep-2(配列番号97)中の位置8、10、11および15に対するC末端などの、標的化部分のための切断部位の例を図4に示す。Angiopep-2(配列番号97)中の切断部位の他の例としては、Arg-Cプロテイナーゼによる切断のための位置8および11；Asp-Nエンドペプチダーゼによる切断のための位置16および17；キモトリプシンによる切断のための位置2、3、4、14および19；グルタミルエンドペプチダーゼによる切断のための位置17および18；LysCリジルエンドペプチダーゼによる切断のための位置10および15；LysNペプチジル-Lysメタロエンドペプチダーゼによる切断のための位置9および14；プロテイナーゼKによる切断のための位置1、2、3、4、14、16および19；ならびにサーモリシンによる切断のための位置1、2および13に対するC末端が挙げられる。従って、本発明の標的化部分はまた、Angiopep-2(配列番号97)中の位置1、2、3、4、8、10、11、13、14、15、16、17、18および19の1個以上について1個以上のD-アミノ酸置換を有するAngiopep-2(An2)よりも短いポリペプチドを含む。
【００８７】
機能または免疫学的同一性における実質的な改変は、(a)例えば、シートもしくはらせんコンフォメーションとしての置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造；(b)標的部位としての分子の電荷もしくは疎水性；または(c)側鎖の嵩を維持することに対するその効果が有意に異なる置換、付加および欠失を選択することにより達成される。天然の残基は、共通の側鎖特性に基づいて複数の群に分けられる：
(1)疎水性：ノルロイシン、メチオニン(Met)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、ヒスチジン(His)、トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)、およびフェニルアラニン(Phe)；
(2)中性疎水性：システイン(Cys)、セリン(Ser)、およびトレオニン(Thr)；
(3)酸性/負荷電：アスパラギン酸(Asp)およびグルタミン酸(Glu)；
(4)塩基性：アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln）、ヒスチジン(His)、リジン(Lys)およびアルギニン(Arg)；
(5)鎖の向きに影響する残基：グリシン(Gly)およびプロリン(Pro)；
(6)芳香族：トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(Phe)およびヒスチジン(His)；
(7)極性：Ser、Thr、Asn、Gln；
(8)塩基性の正荷電：Arg、Lys、His；ならびに
(9)荷電：Asp、Glu、Arg、Lys、His。
【００８８】
他のアミノ酸置換を、表1に列挙する。
【表１】
2013530993.tif 000004
【００８９】
一般に、標的化部分は、上記のようなアミノ酸配列Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)およびZ1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2(式Ib)を含み、必要に応じて、対応するD-異性体への1個以上の置換を有し、50アミノ酸長より少ない。さらに、標的化部分は、表2に記載のペプチドではない。
【表２】
2013530993.tif 000005
【００９０】
2013530993.tif 000006
【００９１】
2013530993.tif 000007
【００９２】
2013530993.tif 000008
【００９３】
本発明の標的化部分はまた、アミノ酸配列：
2013530993.tif 000009
【００９４】
を有するAngiopep-2(An2)または3D-An2よりも短いポリペプチドを含む。
【００９５】
他の実施形態においては、標的化部分は、アミノ酸配列：
2013530993.tif 000010
【００９６】
を有するAn2-Cysよりも短い。
【００９７】
標的化部分の例としては、
2013530993.tif 000011
【００９８】
が挙げられる。
【００９９】
本発明の標的化部分は、P1、P1a、P1b、P1c、P1d、P2、P3、P4、P5、P5a、P5b、P5c、P6、P6a、P6b、およびP6cの配列のアミノ酸の付加および欠失を含む。欠失または付加は、これらの配列の任意の一部を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、1、2、3、4または5個のアミノ酸の欠失または付加を、標的化部分のこれらの配列から行うことができる。特定の実施形態においては、欠失または付加は、1〜3アミノ酸であってよい。
【０１００】
本発明はまた、これらの標的化部分の断片(例えば、機能的断片)も特徴とする。特定の実施形態においては、断片は特定の細胞型(例えば、肝臓、眼、肺、腎臓、脾臓、筋肉もしくは卵巣)に効率的に輸送されるか、もしくは蓄積され得るか、またはBBBを通過して効率的に輸送される。ポリペプチドのトランケーションは、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端、またはその組合せから1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個以上のアミノ酸であってもよい。他の断片としては、ポリペプチドの内部部分が欠失された配列が挙げられる。ポリペプチドの欠失は、標的化部分の内部部分から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個以上のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態においては、欠失は標的化部分のコンセンサス配列から1、2、3、4または5個のアミノ酸であってよい。
【０１０１】
(標的化部分の同定)
さらなる標的化部分を、本明細書に記載のアッセイまたは方法の一つを用いることにより同定することができる。例えば、候補ポリペプチドを従来のペプチド合成により製造し、パクリタキセルとコンジュゲートさせ、実験動物に投与することができる。例えば、腫瘍細胞を注入され、コンジュゲートで治療されていない(例えば、非コンジュゲート化薬剤で治療された)対照と比較してコンジュゲートで治療された動物の生存を増加させるその能力に基づいて、生物学的に活性なコンジュゲートを同定することができる。例えば、生物学的に活性なポリペプチドは、in situ脳かん流アッセイにおいて脳実質中のその位置に基づいて同定することができる。
【０１０２】
他の組織中での蓄積を決定するためのアッセイを同様に実施することができる。標識されたポリペプチドのコンジュゲートを動物に投与して、様々な器官における蓄積を測定することができる。例えば、検出可能な標識(例えば、Cy5.5などの近赤外線蛍光分光分析標識)にコンジュゲートされた候補ポリペプチドは、in vivoでの生の可視化を可能にする。そのようなポリペプチドを動物に投与し、器官におけるポリペプチドの存在を検出し、かくして、所望の器官におけるポリペプチドの蓄積の速度および量を決定することができる。他の実施形態においては、ポリペプチドを放射性アイソトープ(例えば、125I)で標識することができる。次いで、ポリペプチドを動物に投与する。一定期間の後、動物を犠牲にし、器官を抽出する。次いで、各器官中の放射性アイソトープの量を、当業界で公知の任意の手段を用いて測定することができる。標識された対照ポリペプチドの量に対する、特定の器官中の標識された候補ポリペプチドの量を比較することにより、候補ポリペプチドが特定の組織に接近し、蓄積する能力を確認することができる。好適な陰性対照としては、特定の細胞型に効率的に輸送されないことが知られる任意のペプチドまたはポリペプチド(例えば、BBBを通過しないAngiopepと関連するペプチドまたは任意の他のペプチド)が挙げられる。
【０１０３】
(コンジュゲート)
標的化部分を治療剤または輸送ベクターに連結して、コンジュゲートを形成させることができる。コンジュゲート中、直接的に(例えば、ジスルフィドもしくはペプチド結合などの共有結合)または間接的に(例えば、本明細書に記載のものなどのリンカーを介する)化学的結合によって標的化部分を連結する。輸送ベクターを有するコンジュゲート中、治療剤はBBBを通過する輸送後に、例えば、輸送ベクターと薬剤との化学的結合の酵素的切断または破壊により遊離し得る。次いで、遊離した薬剤は、ベクターの非存在下でその意図される能力で機能することができる。リンカー、治療剤および輸送ベクターの例は以下に記載される。
【０１０４】
(治療用ポリペプチド)
コンジュゲートがペプチド結合またはアミノ酸もしくはペプチドリンカーを介して標的化部分に連結された治療用ペプチド剤を含む場合、得られるコンジュゲートは治療用ポリペプチド(例えば、融合タンパク質)である。薬剤が治療用ペプチド剤である実施形態においては、薬剤は共有結合によってポリペプチドに連結することができる。共有結合は、ペプチド結合(例えば、融合タンパク質として合成的または組換え的に産生される)であってよい。治療用ペプチド剤の例は以下に記載される。
【０１０５】
(輸送ベクターへの標的化部分の連結)
輸送ベクターを含むコンジュゲートを形成させるために、少なくとも2つの一般的な手法を用いることができる。第1の手法においては、薬剤(例えば、本明細書に記載の任意のもの)を含有する輸送ベクターを形成させる。次いで、本明細書に記載の標的化部分を輸送ベクターにコンジュゲートさせる。第2の手法においては、輸送ベクターを形成する分子(例えば、本明細書に記載の任意のもの)への標的化部分のコンジュゲーションを最初に実施し、次いで、コンジュゲートされた分子を用いて輸送ベクターを形成させる。いずれの手法においても、標的化部分はテザー分子を介してコンジュゲートさせることができる。
【０１０６】
輸送ベクターを含むコンジュゲートを、段階的プロセスにおいて形成させることができる。例えば、輸送ベクター分子を最初にリンカーに結合し、輸送ベクター分子を含有する輸送ベクターを形成させる。次いで、輸送ベクターを標的化部分と共にインキュベートして、リンカーとの共有結合を形成させる。特定の例においては、脂質分子をリンカーに結合し、得られる化合物を用いてリポソームを形成させる。次いで、リポソームを、標的化部分を含有する溶液と共にインキュベートして、標的化部分をリンカーの遠位末端に結合させる。
【０１０７】
別の例においては、輸送ベクターを、活性化された基を有するリンカーに共有結合させ、標的化部分を第2のリンカーに共有結合させた後、改変された輸送ベクターおよび改変された標的化部分を一緒に反応させて、第1のリンカーと第2のリンカーとの間に共有結合を形成させる。例えば、輸送ベクターのアミノ基は、リンカーのN-ヒドロキシスクシンイミジル基をスクシンイミジル4-ホルミルベンゾエートに置換することにより共有結合を形成する。この改変された輸送ベクターは、リンカー上に末端カルボニル基を有する。次いで、標的化部分のアミノ基は、リンカーのN-ヒドロキシスクシンイミジル基をスクシンイミジル4-ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾンに置換することにより共有結合を形成する。この改変された標的化部分は、リンカー上に末端ヒドラジン基を有する。最後に、改変された輸送ベクターおよび改変された標的化部分を組合せて、改変された標的化部分のヒドラジン基と、輸送ベクターの末端カルボニル基との間で共有結合を形成させる。
【０１０８】
別の例では、ポリオキシエチレン-(p-ニトロフェニルカルボナート)-ホスホエタノールアミンを、siRNA分子を含有する脂質ミセルの形成に用いる。簡単に述べると、この例では、ポリオキシエチレン-ビス(p-ニトロフェニルカルボナート)((pNP)2-PEG)を、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE)などのリポソームまたはミセルを形成することができる脂質にコンジュゲートさせて、pNP-PEG-PEの産生を得る。同様に、この分子を標的化部分(例えば、本明細書に記載の任意のもの)にコンジュゲートさせて、ペプチド-PEG-PEコンジュゲートを形成させる。次いで、このコンジュゲートを、リポソームの外側面上にポリペプチド分子を結合させるためのアンカーとして役立つPEG部分を含むリポソームの形成に用いることができる。例えば、Zhangら、J.Control.Release 112: 229-239(2006)を参照されたい。
【０１０９】
また、標的化部分をリポソームに、その形成の後にコンジュゲートさせることによって、脂質ベクターの産生を達成することもできる。この手順の一例においては、分子を封入するのに好適であり、十分なin vivoでの安定性を有する脂質の混合物を提供し、いくらかの脂質を、リンカー(例えば、本明細書に記載の任意のリンカー)を含有するテザー(PEGなど)に結合させる。混合物を乾燥させ、所望のポリヌクレオチドを含む水性溶液中で再構成させ、リポソームを形成することができる条件にかける(例えば、超音波または押出)。次いで、本明細書に記載の標的化部分を、テザー上のリンカーにコンジュゲートさせる。この方法の一つの特定例においては、93%の1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホコリン(POPC)、3%のジドデシルジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、3%のジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)-EPG2000および1%のDSPE-PEG2000-マレイミドの混合物を提供する。次いで、この混合物をクロロホルム中で調製し、窒素下で蒸発させた後、所望のポリヌクレオチドが添加されたTrisバッファー中に溶解する。次いで、400 nmから50 nmに低下した孔径を有する一連のポリカルボナートフィルターに混合物を通過させて、80〜100 nmのリポソームを生成させる。このリポソームをヌクレアーゼまたはプロテアーゼと混合して、未封入の治療剤を除去する。治療剤がDNA分子である場合、DNAエンドヌクレアーゼIおよびエキソヌクレアーゼIIを用いることができる。次いで、本明細書に記載の輸送ベクターを、リンカー(例えば、マレイミドまたは本明細書に記載の任意のリンカー)を含むDSPE-PEG2000にコンジュゲートさせることができる。次いで、治療剤を含み、本明細書に記載の標的化部分にコンジュゲートされたこれらの脂質ベクターを被験体に投与して、BBBを通過して、または特定の組織に治療剤を送達することができる。この手法のさらなる例は、Boado, Pharm. Res. 24: 1722-1787(2007); Pardridge, Pharm. Res. 24:1733-1744(2007);およびZhangら、Clin. Canc. Res. 10:3667-3677, 2004に記載されている。
【０１１０】
あるいは、コンジュゲートを、リンカーを用いずに形成させる。むしろ、0の長さのカップリング剤を用いて、さらなる原子を導入することなく、輸送ベクターまたは標的化部分内の官能基を活性化する。0の長さのカップリング剤の例としては、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびエチルクロロギ酸が挙げられる。
【０１１１】
(リンカー)
標的化部分を治療剤もしくは輸送ベクターに直接的に(例えば、ペプチド結合などの共有結合を介して)結合させるか、またはリンカーを介して結合させることができる。リンカーとしては、化学的連結剤(例えば、切断可能なリンカー)およびペプチドが挙げられる。以下に記載のリンカーのいずれかを、本発明の化合物において用いることができる。
【０１１２】
(化学的連結剤)
いくつかの実施形態においては、リンカーは化学的連結剤である。スルフヒドリル基、アミノ基(アミン)、または任意の好適な反応基を介して、標的化部分をコンジュゲートさせることができる。ホモ多官能性およびヘテロ多官能性架橋剤(二官能性および三官能性剤などのコンジュゲーション剤)が、多くの商業的起源から入手可能である。架橋に利用可能な部位は、標的化部分および本明細書に記載の治療剤または輸送ベクター上に見出すことができる。架橋剤は、可撓性アーム、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15個の炭素原子を含んでもよい。可撓性アームは、(PEG)n(式中、nは1〜20の整数である)などのポリエチレングリコールスペーサー、または-NH-(CH2)n-C(O)O-(式中、nは2〜10の整数である(例えば、nが5である場合))などのアミノ酸であってよい。
【０１１３】
架橋剤の例としては、BS3([ビス(スルホスクシンイミジル)スベラート]; BS3は接近可能な一級アミンを標的とするホモ二官能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステルである)、NHS/EDC(N-ヒドロキシスクシンイミドおよび1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド；NHS/EDCは一級アミン基とカルボキシル基とのコンジュゲーションを可能にする)、スルホ-EMCS([N-ε-マレイミドカプロン酸]ヒドラジド；スルホ-EMCSはスルフヒドリルおよびアミノ基に対して反応するヘテロ二官能性反応基(マレイミドおよびNHS-エステル)である)、ヒドラジド(多くのタンパク質は露出した炭水化物を含み、ヒドラジドはカルボキシル基を一級アミンに連結するための有用な試薬である)、SATA(N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート；SATAはアミンに対して反応し、保護されたスルフヒドリル基を付加する)、ならびにBMOE(ビス-マレイミドエタン)が挙げられる。
【０１１４】
共有結合を形成させるために、化学反応基として、ヒドロキシル部分がペプチドを改変するのに必要とされるレベルで生理的に許容し得る様々な活性カルボキシル基(例えば、エステル)を用いることができる。特定の薬剤としては、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、N-ヒドロキシ-スルホスクシンイミド(スルホ-NHS)、マレイミド-ベンゾイル-スクシンイミド(MBS)、γ-マレイミド-ブチリルオキシスクシンイミドエステル(GMBS)、マレイミドプロピオン酸(MPA)、マレイミドヘキサン酸(MHA)、およびマレイミドウンデカン酸(MUA)が挙げられる。
【０１１５】
一級アミンは、NHSエステルのための主要な標的である。タンパク質のN末端上に存在する接近可能なα-アミン基およびリジンのε-アミンはNHSエステルと反応する。かくして、本発明の化合物は、ペプチドのN末端アミノまたはリジンのε-アミンにコンジュゲートしたNHSエステルを有するリンカーを含んでもよい。NHSエステルコンジュゲーション反応が一級アミンと反応してN-ヒドロキシスクシンイミドを遊離する場合にアミド結合が形成される。反応基を含むこれらのスクシンイミドを、本明細書ではスクシンイミジル基と呼ぶ。本発明の特定の実施形態においては、タンパク質上の官能基はチオール基であり、化学反応基はγ-マレイミド-ブトリルアミド(GMBAまたはMPA)などのマレイミド含有基である。そのようなマレイミド含有基を、本明細書ではマレイド基と呼ぶ。
【０１１６】
マレイミド基は、反応混合物のpHが6.5〜7.4である場合に、ペプチド上のスルフヒドリル基に対して最も選択的である。pH 7.0では、マレイミド基とスルフヒドリル(例えば、血清アルブミンなどのタンパク質上のチオール基)との反応速度は、アミンとの反応速度より1000倍速い。かくして、マレイミド基とスルフヒドリルとの安定なチオエーテル結合を形成することができる。従って、本発明の化合物は、標的化部分または薬剤のスルフヒドリル基にコンジュゲートされたマレイミド基を有するリンカーを含んでもよい。
【０１１７】
アミン間リンカーとしては、NHSエステルおよびイミドエステルが挙げられる。NHSエステルの例は、DSG(ジスクシンイミジルグルタレート)、DSS(ジスクシンイミジルスベラート)、BS3(ビス[スルホスクシンイミジル]スベラート)、TSAT(トリス-スクシンイミジルアミノトリアセテート)、BS(PEG)n(式中、nは1〜20である)(例えば、BS(PEG)5およびBS(PEG)9)などのポリエチレングリコールスペーサーを含むビス-スクシンイミドエステル活性化化合物の変異体、DSP(ジチオビス[スクシンイミジルプロピオナート])、DTSSP(3,3'-ジチオビス[スルホスクシンイミジルプロピオナート])、DST(ジスクシンイミジルタルタレート)、BSOCOES(ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン)、EGS(エチレングリコールビス[スクシンイミジルスクシネート])、ならびにスルホ-EGS(エチレングリコールビス[スルホスクシンイミジルスクシネート])である。イミドエステルとしては、DMA(ジメチルアジピミダート・2HCl)、DMP(ジメチルピメリミダート・2HCl)、DMS(ジメチルスベリミダート・2HCl)およびDTBP(ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオンイミダート・2HCl)が挙げられる。他のアミン間リンカーとしては、DFDNB(1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)およびTHPP(β-[トリス(ヒドロキシメチル)ホスフィノ]プロピオン酸(ベタイン))が挙げられる。
【０１１８】
リンカーは、スルフヒドリル間リンカーであってよい。そのようなリンカーとしては、マレイミドおよびピリジルジチオールが挙げられる。マレイミドの例としては、BMOE(ビス-マレイミドエタン)、BMB(1,4-ビスマレイミドブタン)、BMH(ビスマレイミドヘキサン)、TMEA(トリス[2-マレイミドエチル]アミン)、BM(PEG)2 1,8-ビス-マレイミドジエチレングリコール)またはBM(PEG)n(式中、nは1〜20(例えば、2もしくは3)である)、BMDB(1,4-ビスマレイミジル-2,3-ジヒドロキシブタン)、およびDTME(ジチオ-ビスマレイミドエタン)が挙げられる。ピリジルジチオールの例としては、DPDPB(1,4-ジ-[3'-(2'-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ブタン)が挙げられる。他のスルフヒドリルリンカーとしては、HBVS(1,6-ヘキサン-ビス-ビニルスルホン)が挙げられる。
【０１１９】
リンカーは、アミン-スルフヒドリル間リンカーであってもよく、NHSエステル/マレイミド化合物が挙げられる。そのようなアミン-スルフヒドリル間リンカーは、エステルリンカー(例えば、エステル基を含有する本明細書に記載の任意のリンカー)を含んでもよい。これらの化合物の例は、AMAS(N-(α-マレイミドアセトキシ)スクシンイミドエステル)、BMPS(N-[β-マレイミドプロピルオキシ]スクシンイミドエステル)、GMBS(N-[γ-マレイミドブチリルオキシ]スクシンイミドエステル)、スルホ-GMBS(N-[γ-マレイミドブチリルオキシ]スルホスクシンイミドエステル)、MBS(m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)、スルホ-MBS(m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル)、SMCC(スクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート)、スルホ-SMCC(スルホスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート)、EMCS([N-ε-マレイミドカプロイルオキシ]スクシンイミドエステル)、スルホ-EMCS([N-ε-マレイミドカプロイルオキシ]スルホスクシンイミドエステル)、SMPB(スクシンイミジル4-[p-マレイミドフェニル]ブチラート)、スルホ-SMPB(スルホスクシンイミジル4-[p-マレイミドフェニル]ブチラート)、SMPH(スクシンイミジル-6-[β-マレイミドプロピオンアミド]ヘキサノエート)、LC-SMCC(スクシンイミジル-4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシ-[6-アミドカプロエート])、スルホ-KMUS(N-[κ-マレイミドウンデカノイルオキシ]スルホスクシンイミドエステル)、SM(PEG)n(スクシンイミジル-([N-マレイミドプロピオンアミド-ポリエチレングリコール)エステル)(式中、nは1〜30(例えば、2、4、6、8、12、もしくは24)である)、SPDP(N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオナート)、LC-SPDP(スクシンイミジル6-(3-[2-ピリジルジチオ]-プロピオンアミド)ヘキサノエート)、スルホ-LC-SPDP(スルホスクシンイミジル6-(3'-[2-ピリジルジチオ]-プロピオンアミド)ヘキサノエート)、SMPT(4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-[2-ピリジルジチオ]トルエン)、スルホ-LC-SMPT(4-スルホスクシンイミジル-6-[α-メチル-α-[2-ピリジルジチオ]トルアミド]ヘキサノエート)、SIA(N-スクシンイミジルヨードアセテート)、SBAP(スクシンイミジル3-[ブロモアセタミド]プロピオナート)、SIAB(N-スクシンイミジル[4-ヨードアセチル]アミノベンゾエート)、およびスルホ-SIAB(N-スルホスクシンイミジル[4-ヨードアセチル]アミノベンゾエート)である。
【０１２０】
特定の実施形態においては、リンカーは、式：
【化２】
2013530993.tif 000012
【０１２１】
(式中、nは2〜15の整数であり(例えば、nは3、6もしくは11である)；およびYはA上のチオールであり、ZはB上の一級アミンであるか、またはYはB上のチオールであり、ZはA上の一級アミンである)
を有する。
【０１２２】
他の実施形態においては、リンカーはアミノ-非選択間リンカーである。そのようなリンカーの例としては、NHSエステル/アリールアジドおよびNHSエステル/ジアジリンリンカーが挙げられる。NHSエステル/アリールアジドリンカーとしては、NHS-ASA(N-ヒドロキシスクシンイミジル-4-アジドサリチル酸)、ANB-NOS(N-5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド)、スルホ-HSAB(N-ヒドロキシスルホスクシンイミジル-4-アジドベンゾエート)、スルホ-NHS-LC-ASA(スルホスクシンイミジル[4-アジドサリチルアミド]ヘキサノエート)、SANPAH(N-スクシンイミジル-6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート)、スルホ-SANPAH(N-スルホスクシンイミジル-6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート)、スルホ-SFAD(スルホスクシンイミジル-(ペルフルオロアジドベンズアミド)-エチル-1,3'-ジチオプロピオナート)、スルホ-SAND(スルホスクシンイミジル-2-(m-アジド-o-ニトロベンズアミド)-エチル-1,3'-プロピオナート)、およびスルホ-SAED(スルホスクシンイミジル2-[7-アミノ-4-メチルクマリン-3-アセタミド]エチル-1,3'ジチオプロピオナート)が挙げられる。NHSエステル/ジアジリンリンカーとしては、SDA(スクシンイミジル4,4'-アジペンタノエート)、LC-SDA(スクシンイミジル6-(4,4'-アジペンタナミド)ヘキサノエート)、SDAD(スクシンイミジル2-([4,4'-アジペンタナミド]エチル)-1,3'-ジチオプロピオナート)、スルホ-SDA(スルホスクシンイミジル4,4'-アジペンタノエート)、スルホ-LC-SDA(スルホスクシンイミジル6-(4,4'-アジペンタナミド)ヘキサノエート)、およびスルホ-SDAD(スルホスクシンイミジル2-([4,4'-アジペンタナミド]エチル)-1,3'-ジチオプロピオナート)が挙げられる。
【０１２３】
アミン-カルボキシル間リンカーの例としては、カルボジイミド化合物(例えば、DCC(N,N-ジシクロヘキシルカルボジミド)およびEDC(1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド))が挙げられる。スルフヒドリル-非選択間リンカーの例としては、ピリジルジチオール/アリールアジド化合物(例えば、APDP ((N-[4-(p-アジドサリチルアミド)ブチル]-3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオン-アミド))が挙げられる。スルフヒドリル-炭水化物間リンカーの例としては、マレイミド/ヒドラジド化合物(例えば、BMPH (N-[β-マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド)、EMCH ([N-ε-マレイミドカプロン酸]ヒドラジド)、MPBH 4-(4-N-マレイミドフェニル)酪酸ヒドラジド)、およびKMUH (N-[κ-マレイミドウンデカン酸]ヒドラジド))ならびにピリジルジチオール/ヒドラジド化合物(例えば、PDPH (3-(2-ピリジルジチオ)プロピオニルヒドラジド))が挙げられる。炭水化物-非選択間リンカーの例としては、ヒドラジド/アリールアジド化合物(例えば、ABH (p-アジドベンゾイルヒドラジド))が挙げられる。ヒドロキシル-スルフヒドリルリンカーの例としては、イソシアネート/マレイミド化合物(例えば、(N-[p-マレイミドフェニル]イソシアネート))が挙げられる。アミン-DNA間リンカーの例としては、NHSエステル/プソラレン化合物(例えば、SPB (スクシンイミジル-[4-(プソラレン-8-イルオキシ)]-ブチラート))が挙げられる。
【０１２４】
式Y=C=N-Q-A-C(O)-Z(式中、Qはホモ芳香環系またはヘテロ芳香環系であり；Aは単結合または非置換もしくは置換二価C1-30架橋基であり、YはOまたはSであり；ならびにZはCl、Br、I、N3、N-スクシンイミジルオキシ、イミダゾリル、1-ベンゾトリアゾリルオキシ、OAr(式中、Arは電子欠損活性化アリール基である)またはOC(O)R(式中、Rは-A-Q-N=C=YもしくはC4-20三級アルキルである)である)を有するリンカーも、米国特許第4,680,338号に記載されている。
【０１２５】
リンカーはまた、米国特許第5,306,809号にも記載されており、式：
【化３】
2013530993.tif 000013
【０１２６】
(式中、R1はH、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C6-12アリールもしくはアラルキルまたは二価有機化合物-O-、-S-、もしくは
【化４】
2013530993.tif 000014
【０１２７】
(式中、R'はC1-6アルキル、連結部分である)
とカップリングしたこれらのものであり；R2はH、C1-12アルキル、C6-12アリール、またはC6-12アラルキルであり、R3は
【化５】
2013530993.tif 000015
【０１２８】
または隣接する窒素の孤立電子対を非局在化させることができる別の化学構造であり、およびR4はR3を標的化部分または薬剤に連結させることができるペンダント反応基である)
を有するリンカーを記載している。
【０１２９】
リンカーは、多価または一価であってよい。一価リンカーは、共有結合を形成するのに利用可能なただ一つの活性化基を有する。しかしながら、一価リンカーは、本明細書に記載のように、カップリング剤を用いることにより化学的に改変して、第2の活性化基を形成することができる1個以上の官能基を含んでもよい。例えば、リンカーの末端ヒドロキシル基を、任意数のカップリング剤により活性化することができる。カップリング剤の例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド、エチルクロロギ酸、ジシクロヘキシルカルボジイミド、およびトリフルオロメタンスルホニルクロリドが挙げられる。例えば、米国特許第5,395,619号および第6,316,024号を参照されたい。
【０１３０】
多価リンカー(例えば、多官能性リンカー)は、2個以上の活性化基を有する。リンカー中の活性化基は、ホモ多価リンカーと同じであってもよく、またはヘテロ多価リンカーと異なってもよい。ヘテロ多価リンカーは、ポリペプチドおよび輸送ベクターを異なる官能基にコンジュゲートさせることができる。ヘテロ多価リンカーとしては、ポリオキシエチレン-ビス(p-ニトロフェニルカルボナート)、mal-PEG-DSPE、ジイソシアネート、スクシンイミジル4-ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾンが挙げられる。
【０１３１】
2個の活性化基を有するホモ多価リンカーの例としては、ジスクシンイミジルグルタレート、ジスクシンイミジルスベラート、ビス(スルホスクシンイミジル)スベラート、ビス(NHS)PEG5、ビス(NHS)PEG9、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)、3,3'-ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオナート)、ジスクシンイミジルタルタレート、ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン、エチレングリコールビス[スクシンイミジルスクシネート])、エチレングリコールビス[スルホスクシンイミジルスクシネート])、ジメチルアジピミダート、ジメチルピメリミダート、ジメチルスベリミダート、ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオンイミダート、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン、ビス-マレイミドエタン、1,4-ビスマレイミドブタン、ビスマレイミドヘキサン、1,8-ビス-マレイミドジエチレングリコール、1,11-ビス-マレイミド-トリエチレングリコール、1,4-ジ-[3'-(2'-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ブタン、1,6-ヘキサン-ビス-ビニルスルホン、およびビス-[b-(4-アジドサリチルアミド)エチル]ジスルフィドが挙げられる。
【０１３２】
3個の活性化基を有するホモ多価リンカーの例としては、トリス-スクシンイミジルアミノトリアセテート、β-[トリス(ヒドロキシメチル)ホスフィノ]プロピオン酸、およびトリス[2-マレイミドエチル]アミンが挙げられる。
【０１３３】
ヘテロ多価リンカーの例としては、マレイミド活性化基およびスクシンイミド活性化基を含むもの、例えば、N-[α-マレイミドアセトキシ]スクシンイミドエステル、N-[β-マレイミドプロピルオキシ]-スクシンイミドエステル、N-[γ-マレイミドブチリルオキシ]スクシンイミドエステル、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート、N-[ε-マレイミドカプロイルオキシ]スクシンイミドエステル、およびスクシンイミジル 4-[p-マレイミドフェニル]ブチレート、例えば、N-スルホスクシンイミジル誘導体; PEGスペーサー分子を含むもの、例えば、スクシンイミジル-([N-マレイミドプロピオンアミド]-(エチレングリコール)x)エステル(式中、xは2〜24である)；ピリジルジチオ活性化基およびスクシンイミド活性化基を含むもの、例えば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート、スクシンイミジル 6-(3-[2-ピリジルジチオ]-プロピオンアミド)ヘキサノエート、4-スクシンイミジルオキシカルボニル-メチル-a-[2-ピリジルジチオ]トルエン、および4-スルホスクシンイミジル-6-メチル-a-(2-ピリジルジチオ)トルアミド]ヘキサノエート)；ハロアセチル活性化基およびスクシンイミド活性化基を有するもの、例えば、N-スクシンイミジルヨードアセテートおよびN-スクシンイミジル[4-ヨードアセチル]アミノベンゾエート；アリールアジド活性化基およびスクシンイミド活性化基を含むもの、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミジル-4-アジドサリチル酸、スルホスクシンイミジル[4-アジドサリチルアミド]-ヘキサノエート、およびN-スクシンイミジル-6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート；ジアジリン活性化基およびスクシンイミド活性化基を含むもの、例えば、スクシンイミジル 4,4'-アジペンタノエートおよびスクシンイミジル 6-(4,4'-アジペンタナミド)ヘキサノエート; N-[4-(p-アジドサリチルアミド)ブチル]-3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド; N-[β-マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド; N-(6-マレイミドカプロン酸)ヒドラジド; 4-(4-N-マレイミドフェニル)酪酸ヒドラジドヒドロクロリド; (N-[κ-マレイミドウンデカン酸]-ヒドラジド); 3-(2-ピリジルジチオ)プロピオニルヒドラジド; p-アジドベンゾイルヒドラジド; およびN-[p-マレイミドフェニル]イソシアネートが挙げられる。
【０１３４】
他の実施形態においては、リンカーは、三官能性、四官能性またはそれ以上の連結剤である。三官能性リンカーの例としては、TMEA、THPP、TSAT、LC-TSAT(トリス-スクシンイミジル(6-アミノカプロイル)アミノトリアセテート)、トリス-スクシンイミジル-1,3,5-ベンゼントリカルボキシレート、MDSI(マレイミド-3,5-ジスクシンイミジルイソフタレート)、SDMB(スクシンイミジル-3,5-ジマレイミドフェニルベンゾエート、Mal-4(テトラキス-(3-マレイミドプロピル)ペンタエリスリトール、NHS-4(テトラキス-(N-スクシンイミジルカルボキシプロピル)ペンタエリスリトール))が挙げられる。
【０１３５】
TMEAは、構造：
【化６】
2013530993.tif 000016
【０１３６】
を有する。TMEAは、そのマレイミド基を介して、スルフヒドリル基(例えば、システインアミノ酸側鎖を介する)と反応することができる。
【０１３７】
THPPは、構造：
【化７】
2013530993.tif 000017
【０１３８】
を有する。THPPのヒドロキシル基およびカルボキシ基は、一級または二級アミンと反応することができる。
【０１３９】
(アミノ酸およびペプチドリンカー)
他の実施形態においては、リンカーは、少なくとも1個のアミノ酸(例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、40または50アミノ酸のペプチド)を含む。特定の実施形態においては、リンカーは、1個のアミノ酸(例えば、Cysなどの任意の天然アミノ酸)である。他の実施形態においては、米国特許第7,271,149号に記載のような、配列番号[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(式中、nは1、2、3、5、6または6である)を有するペプチドなどのグリシンリッチペプチドが用いられる。他の実施形態においては、米国特許第5,525,491号に記載のような、セリンリッチペプチドリンカーが用いられる。セリンリッチペプチドリンカーとしては、式[X-X-X-X-Gly]y(式中、Xの最大2個はThrであり、残りのXはSerであり、yは1〜5である(例えば、Ser-Ser-Ser-Ser-Gly(式中、yは1より大きい)))のものである。いくつかの場合、リンカーは1個のアミノ酸(例えば、GlyまたはCysなどの任意のアミノ酸)である。
【０１４０】
アミノ酸リンカーは、可撓性(例えば、可撓性もしくは剛性)について選択するか、または電荷に基づいて(例えば、陽性、陰性、もしくは中性)選択することができる。可撓性リンカーは、典型的には、Gly残基を有するもの(例えば、[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(式中、nは1、2、3、4、5または6である))を含む。他のリンカーとしては、剛性リンカー(例えば、PAPAPおよび(PT)nP(式中、nは2、3、4、5、6または7である))およびα-へリックスリンカー(例えば、A(EAAAK)nA(式中、nは1、2、3、4または5である))が挙げられる。
【０１４１】
好適なリンカーの例は、コハク酸、Lys、GluおよびAsp、またはGly-Lysなどのジペプチドである。リンカーがコハク酸である場合、その一方のカルボキシル基はアミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成し、その他方のカルボキシル基は例えば、ペプチドまたは置換基のアミノ基とアミド結合を形成してもよい。リンカーがLys、GluまたはAspである場合、そのカルボキシル基はアミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成し、そのアミノ基は例えば、置換基のカルボキシル基とアミド結合を形成してもよい。Lysをリンカーとして用いる場合、さらなるリンカーを、Lysのε-アミノ基と置換基との間に挿入することができる。一つの特定の実施形態においては、さらなるリンカーはコハク酸であり、Lysのε-アミノ基と、および置換基に存在するアミノ基とアミド結合を形成することができる。一実施形態においては、さらなるリンカーは、GluまたはAsp(例えば、Lysのε-アミノ基とアミド結合を、および置換基に存在するカルボキシル基と別のアミド結合を形成する)である、すなわち、置換基はNε-アシル化リジン残基である。
【０１４２】
他の実施形態においては、ペプチドリンカーは分枝状ポリペプチドである。分枝状ペプチドリンカーの例は、米国特許第6,759,509号に記載されている。そのようなリンカーは、式：
【化８】
2013530993.tif 000018
【０１４３】
(式中、Aはチオールアクセプターであり；Wは架橋部分であり；cは0〜1の整数であり；aは2〜12の整数であり；QはO、NH、またはN-低級アルキルであり；pは0または1の整数であり；dは0または1の整数であり；Eは多価原子であり；それぞれのbは1〜10の整数であり；それぞれのXは式：
-CO-Y-Zm-Gn
(式中、YはL型の2個のアミノ酸残基であり；Zは1または2個のアミノ酸残基であり；mは0もしくは1の整数であり；Gは自壊的スペーサーであり；およびnは0もしくは1の整数であるが、但し、nが0である場合、-Y-ZmはAla-Leu-Ala-LeuもしくはGly-Phe-Leu-Glyである)
のものであるか、またはそれぞれのXは式：
【化９】
2013530993.tif 000019
【０１４４】
(式中、それぞれのX1は式-CO-Y-Zm-Gmのものであり；ならびに式中、Y、Z、Q、E、G、m、d、p、a、bおよびnは上記で定義された通りである)
のものであるか、またはそれぞれのX1は式：
【化１０】
2013530993.tif 000020
【０１４５】
(式中、それぞれのX2は、式-CO-Y-Zm-Gmのものであり；ならびに式中、Y、Z、Q、E、G、m、d、p、a、bおよびnは上記で定義された通りである)
のものであるか、またはそれぞれのX2は式：
【化１１】
2013530993.tif 000021
【０１４６】
(式中、それぞれのX3は、式-CO-Y-Zm-Gmのものであり；ならびに式中、Y、Z、Q、E、G、m、d、p、a、bおよびnは上記で定義された通りである)
のものであるか、またはそれぞれのX3は式：
【化１２】
2013530993.tif 000022
【０１４７】
(式中、それぞれのX4は式-CO-Y-Zm-Gmのものであり；ならびに式中、Y、Z、Q、E、G、m、d、p、a、bおよびnは上記で定義された通りである)
のものである)
のものが挙げられる。
【０１４８】
分枝状リンカーは、中間体自壊的スペーサー部分(G)を用いてもよく、薬剤またはペプチドベクターと、分枝状ペプチドリンカーとを一緒に共有的に連結する。自壊的スペーサーは、2個の化学部分を一緒に共有的に連結し、酵素的切断により三部分分子から前記分離した化学部分の1つを遊離することができる二官能性化学部分(例えば、本明細書に記載の任意の好適なリンカー)であってよい。特定の実施形態においては、Gは薬剤またはペプチドベクターと、ペプチドリンカーとを分離し、一緒に共有的に連結する自壊的スペーサーであり、このスペーサーは、T部分(以下の式で用いられる通り、「T」は薬剤もしくはペプチドベクターに既に含まれる求核原子である)を介してペプチドベクターまたは薬剤に連結され、
【化１３】
2013530993.tif 000023
【０１４９】
(式中、TはO、NもしくはSである)；
-HN-R1-COT(式中、TはO、NもしくはSであり、R1はC1-5アルキルである)；
【化１４】
2013530993.tif 000024
【０１５０】
(式中、TはO、NもしくはSであり、R2はHもしくはC1-5アルキルである)；
【化１５】
2013530993.tif 000025
【０１５１】
(式中、TはO、NもしくはSである)；または
【化１６】
2013530993.tif 000026
【０１５２】
(式中、TはO、NもしくはSである)
により表される。好ましいGとしては、PABC(p-アミノベンジル-カルバモイル)、GABA(γ-アミノ酪酸)、α,α-ジメチルGABA、およびβ,β-ジメチルGABAが挙げられる。
【０１５３】
分枝状リンカー中、チオールアクセプター「A」は、ペプチドベクターまたは薬剤に由来する硫黄原子によってペプチドベクターまたは薬剤に連結される。チオールアクセプターは、例えば、α-置換アセチル基であってよい。そのような基は、式：
【化１７】
2013530993.tif 000027
【０１５４】
(式中、YはCl、Br、I、メシラート、トシラートなど脱離基である)
を有する。チオールアクセプターがα-置換アセチル基である場合、リガンドへの結合後のチオール付加物は、結合-S-CH2-を形成する。好ましくは、チオールアクセプターはマイケル付加アクセプターである。本発明の代表的なマイケル付加アクセプターは、式：
【化１８】
2013530993.tif 000028
【０１５５】
を有する。リガンドのチオール基を連結した後、マイケル付加アクセプターは、マイケル付加付加物、例えば、
【化１９】
2013530993.tif 000029
【０１５６】
(式中、Lは薬剤またはペプチドベクターである)
になる。
【０１５７】
架橋基「W」は、安定な三部分分子中に2個の分離した化学部分を一緒に共有的に連結することができる二官能性化学部分である。架橋基の例は、S. S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking. CRC Press, Florida, (1991); ならびにG. E. MeansおよびR. E. Feeney, Bioconjugate Chemistry, vol. 1 , pp.2-12, (1990)に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み入れられるものとする。Wは、ケト部分にチオールアクセプターを共有的に連結することができる。例示的な架橋基は、式-(CH2)f-(Z)g-(CH2)h-(式中、fは0〜10であり；hは0〜10であり；gは0または1であるが、但し、gが0である場合、f+hは1〜10であり；ZはS、O、NH、SO2、フェニル、ナフチル、ポリエチレングリコール、3〜10個の炭素原子を含有するシクロ脂肪族炭化水素環、または3〜6個の炭素原子およびO、NもしくはSから選択される1もしくは2個のヘテロ原子を含有するヘテロ芳香族炭化水素環である)を有する。好ましいシクロ脂肪族部分としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる。好ましいヘテロ芳香族部分としては、ピリジル、ポリエチレングリコール(1〜20個の反復単位)、フラニル、ピラニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、オキサジニル、ピロリル、チアゾリル、モルホリニルなどが挙げられる。架橋基においては、gが0である場合、f+hは2〜6(例えば、2などの2〜4)の整数であるのが好ましい。gが1である場合、fは0、1または2である；およびhは0、1または2であるのが好ましい。チオールアクセプターにカップリングした好ましい架橋基は、Pierce Catalog, pp. E-12、E-13、E-14、E-15、E-16、およびE-17 (1992)に示される。
【０１５８】
(リンカーに対する改変)
本明細書に記載の任意のリンカー(例えば、化学的連結剤またはアミノ酸リンカー)を改変することができる。例えば、リンカーはスペーサー分子を含んでもよい。リンカー内のスペーサー分子は、任意の好適な分子であってよい。スペーサー分子の例としては、脂肪族炭素基(例えば、C2〜C20アルキル基)、切断可能なヘテロ原子炭素基(例えば、ジチオ基を含むC2〜C20アルキル基)、および親水性ポリマー基が挙げられる。親水性ポリマー基の例としては、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミド、および親水性ペプチド配列が挙げられる。
【０１５９】
一例においては、親水性ポリマーは、PEG、例えば、500〜10,000 Da(例えば、1,000〜5,000 Da、例えば、2,000 Da)の分子量を有するPEG鎖である。PEGのメトキシまたはエトキシ捕捉類似体を用いることもできる。これらのものは、120〜20,000 Daの範囲の大きさで市販されている。リポソーム中での使用のための脂質-テザーコンジュゲートの調製は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,395,619号に記載されている。他のスペーサー分子としては、ポリヌクレオチド(例えば、DNAまたはRNA)、多糖類、例えば、デキストランまたはキサンタン、セルロース誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロース)、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリメチルアクリル酸、およびポリ(NIPAM)が挙げられる。カップリング剤でPEGを活性化するための合成反応スキームは、米国特許第5,631,018号、第5,527,528号および第5,395,619号に記載されている。PEGスペーサー分子を含むリンカーのための合成反応スキームは、米国特許第6,828,401号および第7,217,845号に記載されている。
【０１６０】
PEGは、例えば、当業界で公知の任意の手段により本発明のポリペプチドにコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態においては、PEG分子をリンカーで誘導体化した後、タンパク質と反応させて、コンジュゲートを形成させる。好適なリンカーとしては、アルデヒド、トレシルもしくはトシルリンカー、ジクロロトリアジンもしくはクロロトリアジン、エポキシド、カルボキシレート、例えば、スクシンイミジルスクシネート、カルボナート、例えば、p-ニトロフェニルカルボナート、ベンゾトリアゾリルカルボナート、2,3,5-トリクロロフェニルカルボナート、およびPEG-スクシンイミジルカルボナート、または反応性チオール、例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ビニルスルホン、およびヨードアセタミドが挙げられる。コンジュゲーションは、用いるリンカーに応じて、アミノ基(例えば、N-末端アミノ基もしくはリジン側鎖内のアミノ基)、またはチオールヒドロキシル、もしくはアミド基で行うことができる。例えば、Veroneseら、Drug Discov. Today 10: 1451-1458, 2005を参照されたい。
【０１６１】
(治療剤)
コンジュゲートは、任意の有用な治療剤を含んでもよい。以下に記載の治療剤のいずれかを本発明の化合物において用いることができる。特定の目的の薬剤としては、抗癌剤(例えば、パクリタキセルまたはパクリタキセル誘導体、例えば、ドセタキセル；エトポシド；ドキソルビシン；およびその類似体)、治療用核酸剤、および治療用ペプチド剤(例えば、ニューロテンシンおよびニューロテンシン受容体アゴニスト、GDNFおよびその類似体、BDNFおよびその類似体、GLP-1アゴニスト、レプチン、およびOB受容体アゴニスト)が挙げられる。
【０１６２】
(抗癌剤)
本発明に従えば、薬剤は抗癌剤であってよい。本発明により包含される抗癌剤としては、例えば、本発明の標的化部分へのそのコンジュゲーションを可能にする基を有する薬剤が挙げられる。特定の抗癌剤としては、パクリタキセル(Taxol(登録商標))、パクリタキセル誘導体(例えば、ドセタキセル(Taxotere(登録商標)))、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、シクロホスファミド、メルファラン、およびクロラムブシル；その誘導体(もしくは類似体)；その製薬上許容し得る塩；またはその組合せからなる群より選択されるものが挙げられる。特定の実施形態においては、抗癌剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、もしくはドキソルビシン；その製薬上許容し得る塩；またはその誘導体である。
【０１６３】
本明細書で用いられる「パクリタキセル誘導体」とは、パクリタキセルと少なくとも70%(例えば、75%、80%、85%、90%、95%、99%以上)同程度に有効である生物学的活性を有する分裂阻害化合物を指す。生物学的活性の例としては、ウサギ抗血清などを用いる競合的ELISAアッセイ；チューブリン分解アッセイ；および/または細胞傷害性アッセイにより決定される1つ以上のIC50値；ならびにCmax、AUCおよび/またはCminなどの1つ以上の薬物動態パラメータが上げられる。
【０１６４】
パクリタキセル誘導体の例としては、本明細書に記載のように、ドセタキセルおよびその類似体が挙げられる。特定の実施形態においては、抗癌剤はパクリタキセルまたはパクリタキセル類似体またはパクリタキセル誘導体である。パクリタキセルは、式：
【化２０】
2013530993.tif 000030
【０１６５】
を有する。
【０１６６】
パクリタキセルの構造類似体または誘導体は、米国特許第6,911,549号に記載されており、式：
【化２１】
2013530993.tif 000031
【０１６７】
(式中、R1は-CH3；-C6H5、または1、2もしくは3個のC1〜C4アルキル、C1〜C3アルコキシ、ハロ、C1〜C3 アルキルチオ、トリフルオロメチル、C2〜C6ジアルキルアミノ、ヒドロキシル、もしくはニトロで置換されたフェニル; および2-フリル、2-チエニル、1-ナフチル、2-ナフチルまたは3,4-メチレンジオキシフェニルからなる群より選択され; R2は-H、-NHC(0)H、-NHC(0)C1〜C10アルキル(好ましくは、-NHC(0)C4〜C6アルキル)、-NHC(0)フェニル、1、2、もしくは3個のC1〜C4アルキル、C1〜C3アルコキシ、ハロ、C1〜C3アルキルチオ、トリフルオロメチル、C2〜C6ジアルキルアミノ、ヒドロキシもしくはニトロで置換された-NHC(0)フェニル、-NHC(0)C(CH3)=CHCH3、-NHC(0)OC(CH3)3、-NHC(0)OCH2フェニル、-NH2、-NHS02-4-メチルフェニル、-NHC(0)(CH2)3COOH、-NHC(O)-4-(S03H)フェニル、-OH、-NHC(O)-1-アダマンチル、-NHC(0)0-3-テトラヒドロフラニル、-NHC(0)0-4-テトラヒドロピラニル、-NHC(0)CH2C(CH3)3、-NHC(0)C(CH3)3、-NHC(0)OC1〜C10アルキル、-NHC(0)NHC1〜C10アルキル、-NHC(0)NHPh、1、2、もしくは3個のC1〜C4アルキル、C1〜C3アルコキシ、ハロ、C1〜C3アルキルチオ、トリフルオロメチル、C2〜C6ジアルキルアミノ、もしくはニトロで置換された-NHC(0)NHPh、-NHC(0)C3〜C8シクロアルキル、-NHC(0)C(CH2CH3)2CH3、-NHC(0)C(CH3)2CH2Cl、-NHC(0)C(CH3)2CH2CH3、フタルイミド、-NHC(0)-1-フェニル-1-シクロペンチル、-NHC(0)-1-メチル-l-シクロヘキシル、-NHC(S)NHC(CH3)3、-NHC(0)NHCC(CH3)3、または-NHC(0)NHPhからなる群より選択され; R3は-H、-NHC(0)フェニル、または-NHC(0)0C(CH3)3からなる群より選択されるが、但し全体として、R2およびR3の一方は、-Hであるが、R2およびR3は両方とも-Hではなく; R4は-Hまたは-OH、-OAc(-OC(0)CH3)、-0C(0)0CH2C(Cl)3、-OCOCH2CH2NH3+HCOO-、-NHC(0)フェニル、-NHC(0)OC(CH3)3、-OCOCH2CH2COOHおよびその製薬上許容し得る塩、-OCO(CH2)3COOHおよびその製薬上許容し得る塩、ならびに-OC(0)-Z-C(0)-R'[式中、Zはエチレン(-CH2CH2-)、プロピレン(-CH2CH2CH2-)、-CH=CH-、1,2-シクロヘキサン、もしくは1,2-フェニレンであり、R'は-OH、-OH塩基、-NR'2R'3、-OR'3、-SR'3、-OCH2C(0)NR'4R'5(式中、R'2は-Hもしくは-CH3であり、R'3は-(CH2)nNR'6R'7もしくは(CH2)nN+R'6R'7R'8X-(式中、nは1〜3である)であり、R'4は-Hもしくは-C1〜C4アルキルであり、R'5は-H、-C1〜C4アルキル、ベンジル、ヒドロキシエチル、-CH2C02H、もしくはジメチルアミノエチルであり、R'6およびR'7は-CH3、-CH2CH3、ベンジルであるか、またはR'6およびR'7はNR'6R'7の窒素と一緒になってピロリジノ、ピペリジノ、モルホリノ、もしくはN-メチルピペリジノ基を形成し; R'8は-CH3、-CH2CH3もしくはベンジルであり、X-はハロゲン化物であり、塩基はNH3、(HOC2H4)3N、N(CH3)3、CH3N(C2H4)2NH、NH2(CH2)6NH2、N-メチルグルカミン、NaOH、もしくはKOHである]、-OC(0)(CH2)nNR2R3 [式中、nは1〜3であり、R2は-Hもしくは-C1〜C3アルキルであり、R3は-Hもしくは-C1〜C3アルキルである]、-OC(0)CH(R'')NH2 [式中、R''は-H、-CH3、-CH2 CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2フェニル、-(CH2)4NH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2からなる群より選択される]、アミノ酸プロリンの残基、-OC(0)CH=CH2、-C(0)CH2CH2C(0)NHCH2CH2S03-Y+、-OC(0)CH2CH2C(0)NHCH2CH2CH2S03-Y+(式中、Y+はNa+もしくはN+(Bu)4である)、-OC(0)CH2CH2C(0)OCH2CH20Hからなる群より選択され; R5は-Hもしくは-OHであるが、但し全体として、R5が-OHである場合、R4は-Hであり、さらに但し、R5が-Hである場合、R4は-Hではなく; R7がα-R71:β-R72(式中、R71およびR72の一方は-Hであり、R71およびR72の他方は-X(式中、Xはハ��である)である)である場合、R6は-H:-Hであり、R8は-CH3であり; R7がα-H:β-R74(式中、R74およびR8は一緒になって、シクロプロピル環を形成する)である場合、R6は-H:-Hであり；R10は-Hまたは-C(0)CH3である); および化合物が酸性または塩基性官能基を含む場合、その製薬上許容し得る塩により記載することができる。
【０１６８】
パクリタキセル(Taxol(登録商標))誘導体(または類似体)の例示的な実施形態としては、内容全体が参照により本明細書に組み入れられる2005年6月28日に発行された米国特許第6,911,549号に開示、言及された誘導体が挙げられる。特定のパクリタキセル誘導体としては、ドセタキセル(Taxotere(登録商標))、((アジドフェニル)ウレイド)タキソイド、(2α,5α,7β,9α,10β,13α)-5,10,13,20-テトラアセトキシタキサ-11-エン-2,7,9-トリオール、(2α,5α,9α,10β)-2,9,10-トリアセトキシ-5-((β-D-グルコピラノシル)オキシ)-3,1-シクロタキサ-11-エン-13-オン、1β-ヒドロキシバッカチンI、1,7-ジヒドロキシタキシニン、l-アセチ-5,7,10-デアセチル-バッカチンI、1-デヒドロキシバッカチンVI、1-ヒドロキシ-2-デアセトキシ-5-デシナモイル-タキシニンj、1-ヒドロキシ-7,9-ジデアセチルバッカチンI、1-ヒドロキシバッカチンI、10-アセチル-4-デアセチルタキソテール、10-デアセトキシパクリタキセル、10-デアセチルバッカチンIIIジメチルスルホキシドジソルベート、10-デアセチル-10-(3-アミノベンゾイル)パクリタキセル、10-デアセチル-10-(7-(ジエチルアミノ)クマリン-3-カルボニル)パクリタキセル、10-デアセチル-9-ジヒドロタキソール、10-デアセチルバッカチンIII、10-デアセチルパクリタキセル、10-デアセチルタキシニン、10-デアセチルタキソール、10-デオキシ-10-C-モルホリノエチルドセタキセル、10-O-アセチル-2-O-(シクロヘキシルカルボニル)-2-デベンゾイルタキソテール、10-O-sec-アミノエチルドセタキセル、11-デスメチルラウリマリド、13-デオキソ-13-アセチルオキシ-7,9-ジアセチル-1,2-ジデオキシタキシン、13-デオキシバッカチンIII、14-ヒドロキシ-10-デアセチル-2-O-デベンゾイルバッカチンIII、14-ヒドロキシ-10-デアセチルバッカチンIII、14β-ベンゾイルオキシ-13-デアセチルバッカチンIV、14β-ベンゾイルオキシ-2-デアセチルバッカチンVI、14β-ベンゾイルオキシバッカチンIV、19-ヒドロキシバッカチンIII、2',2''-メチレンドセタキセル、2',2''-メチレンパクリタキセル、2'-(バリル-ロイシル-リジル-PABC)パクリタキセル、2'-アセチルタキソール、2'-0-アセチル-7-0-(N-(4'-フルオレセインカルボニル)アラニル)タキソール、2,10,13-トリアセトキシ-タキサ-4(20),11-ジエン-5,7,9-トリオール、2,20-0-ジアセチルタキスマイロールN,2-(4-アジドベンゾイル)タキソール、2-デアセトキシタキシニンJ、2-デベンゾイル-2-m-メトキシベンゾイル-7-トリエチルシリル-13-オキソ-14-ヒドロキシバッカチンIII 1,14-カルボナート、2-0-(シクロヘキシルカルボニル)-2-デベンゾイルバッカチンIII 13-0-(N-(シクロヘキシルカルボニル)-3-シクロヘキシルイソセリナート)、2α,7β,9α,10β,13α-ペンタアセトキシルタキサ-4(20),11-ジエン-5-オール、2α,5α,7β,9α,13α-ペンタヒドロキシ-10β-アセトキシタキサ-4(20),11-ジエン、2α,7β,9α,10β、13-ペンタアセトキシ-11β-ヒドロキシ-5α-(3'-N,N-ジメチルアミノ-3'-フェニル)-プロピオニルオキシタキサ-4(20),12-ジエン、2α,7β-ジアセトキシ-5α,10β,13β-トリヒドロキシ-2(3-20)アベオタキサ-4(20),11-ジエン-9-オン、2α,9α-ジヒドロキシ-10β,13α-ジアセトキシ-5α-(3'-メチルアミノ-3'-フェニル)-プロピオニルオキシタキサ-4(20),11-ジエン、2α-ヒドロキシ-7β,9α,10β、13α-テトラアセトキシ-5α-(2'-ヒドロキシ-3'-N,N-ジメチルアミノ-3'-フェニル)-プロピオニルオキシタキサ-4(20),11-ジエン、3'-(4-アジドベンズアミド)タキソール、3'-N-(4-ベンゾイルジヒドロシナモイル)-3'-N-デベンゾイルパクリタキセル、3'-N-m-アミノベンズアミド-3'-デベンズアミドパクリタキセル、3'-p-ヒドロキシパクリタキセル、3,11-シクロタキシニンNN-2、4-デアセチルタキソール、5,13-ジアセトキシ-タキサ-4(20),11-ジエン-9,10-ジオール、5-O-ベンゾイル化タキシニンK、5-0-フェニルプロピオニルオキシタキシニンA、5α,13α-ジアセトキシ-10β-シナモイルオキシ-4(20),11-タキサジエン-9α-オール、6,3'-p-ジヒドロキシパクリタキセル、6-α-ヒドロキシ-7-デオキシ-10-デアセチルバッカチン-III、6-フルオロ-10-アセチルドセタキセル、6-ヒドロキシタキソール、7,13-ジアセトキシ-5-シナミルオキシ-2(3-20)-アベオ-タキサ-4(20),11-ジエン-2,10-ジオール、7,9-ジデアセチルバッカチンVI、7-(5'-ビオチニルアミドプロパノイル)パクリタキセル、7-アセチルタキソール、7-デオキシ-10-デアセチルバッカチン-III、7-デオキシ-9-ジヒドロパクリタキセル、7-エピパクリタキセル、7-メチルチオメチルパクリタキセル、7-0-(4-ベンゾイルジヒドロシナモイル)パクリタキセル、7-0-(N-(4'-フルオレセインカルボニル)アラニル)タキソール、7-キシロシル-10-デアセチルタキソール、8,9-シングル-エポキシブレビホリン、9-ジヒドロバッカチンIII、9-ジヒドロタキソール、9α-ヒドロキシ-2α,10β,13α-トリアセトキシ-5α-(3'-N,N-ジメチルアミノ-3'-フェニル)-プロピオニルオキシタキサ-4(20),11-ジエン、バッカチンIII、バッカチンIII 13-0-(N-ベンゾイル-3-シクロヘキシルイソセリナート)、BAY59、ベンゾイルタキソール、BMS 181339、BMS 185660、BMS 188797、ブレビホリオール、ブチタキセル、セファロマニン、ダンタクスシンA、ダンタクスシンB、ダンタクスシンC、ダンタクスシンD、ジブロモ-10-デアセチルセファロマニン、DJ927、Flutax 2、グルタリルパクリタキセル 6-アミノヘキサノールグルクロニド、IDN 5109、IDN 5111、IDN 5127、IDN 5390、イソラウリマリド、ラウリマリド、MST 997、N-(パクリタキセル-2'-0-(2-アミノ)フェニルプロピオナート)-0-(β-グルクロニル)カルバメート、N-(パクリタキセル-2'-0-3,3-ジメチルブタノエート)-0-(β-グルクロニル)カルバメート、N-デベンゾイル-N-(3-(ジメチルアミノ)ベンゾイル)パクリタキセル、ノナタキセル、オクトレオチドコンジュゲートパクリタキセル、パクリタキセル、パクリタキセル-トランスフェリン、PNU 166945、ポリ(エチレングリコール)-コンジュゲートパクリタキセル-2'-グリシナート、ポリグルタミン酸-パクリタキセル、プレタックス、プロタキセル、RPR 109881A、SB T-101187、SB T-1102、SB T-1213、SB T-1214、SB T-1250、SB T-12843、タスマトロールE、タスマトロールF、タスマトロールG、タキサ-4(20),11(12)-ジエン-5-イルアセテート、タキサ-4(20),11(12)-ジエン-5-オール、タキサン、タクスキニンN、タクスクルチン、タキセゾピジンM、タキセゾピジンN、タキシン、タキシニン、タキシニンA、タキシニンM、タキシニンNN-1、タキシニンNN-7、タキソールC-7-キシロース、タキソール-シアリルコンジュゲート、タクスマイロールA、タクスマイロールB、タクスマイロールG、タクスマイロールH、タクスマイロールI、タクスマイロールK、タクスマイロールM、タクスマイロールN、タクスマイロールO、タクスマイロールU、タクスマイロールV、タクスマイロールW、タクスマイロール-X、タクスマイロール-Y、タクスマイロール-Z、タクスシン、タクススピナナンA、タクススピナナンB、タクススピンC、タクススピンD、タクススピンF、タクスユナニンC、タクスユナニンS、タクスユナニンT、タクスユナニンU、タクスユナニンV、tRA-96023、およびワリホリオールが挙げられる。他のパクリタキセル類似体としては、1-デオキシパクリタキセル、10-デアセトキシ-7-デオキシパクリタキセル、10-O-デアセチルパクリタキセル 10-モノスクシニルエステル、10-スクシニルパクリタキセル、12b-アセチルオキシ-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-ドデカヒドロ-4,11-ジヒドロキシ-12-(2,5-ジメトキシベンジルオキシ)-4a,8、13,13-テトラメチル-5-オキソ-7,11-メタノ-1H-シクロデカ(3,4)ベンズ(l,2-b)オキセタ-9-イル 3-(tert-ブチルオキシカルボニル)アミノ-2-ヒドロキシ-5-メチル-4-ヘキサノエート、130-nmアルブミン結合パクリタキセル、2'-パクリタキセルメチル2-グルコピラノシルスクシネート、3'-(4-アジドフェニル)-3'-デフェニルパクリタキセル、4-フルオロパクリタキセル、6,6,8-トリメチル-4,4a,5,6,7,7a,8,9-オクタヒドロシクロペンタ(4,5)シクロヘプタ(l,2-c)-フラン-4,8-ジオール 4-(N-アセチル-3-フェニルイソセリナート)、6,6,8-トリメチル-4,4a,5,6,7,7a,8,9-オクタヒドロシクロペンタ(4,5)シクロヘプタ(1,2-c)-フラン-4,8-ジオール 4-(N-tert-ブトキシカルボニル-3-フェニルイソセリナート)、7-(3-メチル-3-ニトロソチオブチリル)パクリタキセル、7-デオキシパクリタキセル、7-スクシニルパクリタキセル、A-Z-CINN 310、AI-850、アルブミン結合パクリタキセル、AZ 10992,イソタキセル、MAC321、MBT-0206、NK105、Pacliex、パクリタキセルポリグルメックス、パクリタキセル-EC-1コンジュゲート、ポリラクトフェート、およびTXD 258が挙げられる。他のパクリタキセル類似体は、米国特許第4,814,470号、第4,857,653号、第4,942,184号、第4,924,011号、第4,924,012号、第4,960,790号; 第5,015,744号; 第5,157,049号; 第5,059,699号; 第5,136,060号; 第4,876,399号; および第5,227,400号に記載されている。
【０１６９】
エトポシド誘導体(または類似体)の例としては、ポドフィロトキシン誘導体が挙げられる。エトポシドの他の誘導体としては、エトポシドホスフェート(ETOPOPHOS(登録商標))、エトポシド4'-ジメチルグリシン、エトポシドDMG、テニポシド、およびNK611、またはその任意の製薬上許容し得る塩(例えば、-OP(O)(ONa)2)が挙げられる。本発明における使用にとって好適なさらに他のポドフィロトキシン誘導体は、米国特許第4,567,253号；第4,609,644号；第4,900,814号；第4,958,010号；第5,489,698号；第5,536,847号；第5,571 ,914号；第6,051,721号；第6,107,284号；第6,475,486号；第6,610,299号；第6,878,746号；第6,894,075号；第7,087,641号；第7,176,236号；第7,241,595号；第7,342,114号；および第7,378,419号；ならびに米国特許出願公開第20030064482号、第20030162722号、第20040044058号、第20060148728号、および第20070249651号(それぞれ、参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【０１７０】
例示的なドキソルビシン(ヒドロキシダウノルビシンまたはAdriamycin(登録商標))誘導体(または類似体)としては、エピルビシン(Ellence(登録商標)またはPharmorubicin(登録商標))が挙げられる。他のドキソルビシン誘導体は、米国特許第4,098,884号、第4,301,277号、第4,314,054号、第4,464,529号、第4,585,859号、第4,672,057号、第4,684,629号、第4,826,964号、第5,200,513号、第5,304,687号、第5,594,158号、第5,625,043号、および第5,874,412号(それぞれ、参照により本明細書に組み入れられるものとする)に見出すことができる。
【０１７１】
(治療用核酸剤)
標的化部分は、発現ベクター(例えば、プラスミド)およびRNAi剤などの任意の治療用核酸剤にコンジュゲートすることができる。発現ベクターはポリペプチド(例えば、インターフェロン、治療用サイトカイン(例えば、IL-12)、もしくはFGF-2などの治療用ポリペプチド)をコードしてもよく、または治療用核酸(例えば、本明細書に記載のものなどのRNAi剤)をコードしてもよい。核酸は、任意の長さ、コンフォメーション、電荷、もしくは形状(すなわち、線状、コンカテマー、環状(例えば、プラスミド)、ニック環状、コイル状、スーパーコイル状、もしくは荷電)の二本鎖および一本鎖DNAおよびRNA分子などの、当業界で公知の任意の型を含む。さらに、核酸は、5'および3'末端改変を含んでもよく、これらの末端に平滑ヌクレオチドおよび突出ヌクレオチド、またはその組合せを含む。本発明の特定の実施形態においては、核酸は、標的化された遺伝子産物を沈黙化させることができるRNA干渉配列(例えば、siRNA、shRNA、miRNA、またはdsRNAヌクレオチド配列)であるか、またはそれをコードする。核酸は、例えば、DNA分子、RNA分子、またはその改変形態であってよい。
【０１７２】
RNAi標的の例としては、増殖因子(例えば、表皮増殖因子(EGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β))、増殖因子受容体、例えば、受容体チロシンキナーゼ、例えば、EGF受容体(EGFR)、例えば、Her2/neu(ErbB)、VEGF受容体(VEGFR)、血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)、サイトカイン、ケモカイン、キナーゼ、例えば、細胞質チロシンおよびセリン/トレオニンキナーゼ(例えば、焦点接着キナーゼ、サイクリン依存的キナーゼ、SRCキナーゼ、syk-ZAP70キナーゼ、BTKキナーゼ、RAFキナーゼ、MAPキナーゼ(例えば、ERK)、およびWntキナーゼ)、ホスファターゼ、調節的GTPase(例えば、Rasタンパク質)、転写因子(例えば、MYC)、ホルモンおよびホルモン受容体(例えば、エストロゲンおよびエストロゲン受容体)、抗アポトーシス分子(例えば、スルビビン、Bcl-2、Bcl-xL)、癌遺伝子(例えば、腫瘍抑制因子調節因子、例えば、mdm2)、酵素(例えば、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD-1)、α,β(BACE)、およびγセクレターゼ、α-L-イズロニダーゼ、イズロネートスルファターゼ、ヘパランN-スルファターゼ、α-N-アセチル-グルコサミニダーゼ、アセチル-Coα-グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ、N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ-A、セラミダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、アリールスルファターゼA、アスパルトアシラーゼ、フィタノイル-CoAヒドロキシラーゼ、ペロキシン-7、β-ヘキソサミニダーゼA、アスパルチル-グルコサミニダーゼ、フコシダーゼ、およびα-マンノシダーゼ、シアリダーゼ)、ならびに他のタンパク質(例えば、Huntingtin(Httタンパク質)、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、ソーティングネキシン(SNX6など)、α-シヌクレイン、LINGO-1、Nogo-AおよびNogo受容体1(NgR-1))、およびグリア線維性酸性タンパク質が挙げられる。表3は、例示的なRNAi標的と疾患との関係を例示するものである。
【０１７３】
EGFRを沈黙化させる例示的なRNAi配列は、配列番号117(GGAGCUGCCCAUGAGAAAU)および配列番号118(AUUUCUCAUGGGCAGCUCC)である。同様に、VEGFは、例えば、配列番号119(GGAGTACCCTGATGAGATC)に記載の配列を有するRNAi分子を用いて沈黙化させることができる。本発明の薬剤における使用のためのさらなるRNAi配列は、市販のものであるか(例えば、Dharmacon, Ambion)、または実務者は実行可能なRNAi配列の構築のためのいくつかの公共利用可能なソフトウェアツールの一つ(例えば、MIT/Whiteheadにより維持され、http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/で入手可能な、siRNA Selection Server)を用いることができる。疾患または症状の例、およびそのような疾患の治療において有用であり得るRNAi標的を、表3に示す。
【表３】
2013530993.tif 000032
【０１７４】
(小分子薬剤)
任意の小分子薬剤を標的化部分に連結することができる。小分子薬剤としては、抗癌剤、抗生物質、細胞傷害剤、アルキル化剤、抗新生物剤、代謝拮抗剤、抗増殖剤、チューブリン阻害剤、トポイソメラーゼIもしくはII阻害剤、ホルモンアゴニストもしくはアンタゴニスト、アポトーシス剤、免疫調節剤、および放射活性剤(例えば、アイソトープ)、または本明細書に記載の任意の薬剤が挙げられる。小分子薬剤の例としては、パクリタキセル(Taxol(登録商標))、パクリタキセル誘導体(例えば、ドセタキセル(Taxotere(登録商標))、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、メトトレキサート、カンプトテシン、ホモカンプトテシン、チオコルヒチン、コルヒチン、コンブレタスタチン、コンブレタスチンA-4、ポドフィロトキシン、リゾキシン、リゾキシン-d、ドリスタチン、CC1065、アンサミトシンp3、メイタンシノイド、およびその任意の製薬上許容し得る塩など、およびその組合せ、ならびにP-gp基質であってよい任意の薬剤が挙げられる。
【０１７５】
小分子薬剤の例としては、鎮痛剤および抗炎症剤(例えば、アロキシプリン、オーラノフィン、アザプロパゾン、ベノリレート、ジフルニサル、エトドラック、フェンブフェン、フェノプロフェンカルシム、フルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ナブメトン、ナプロキセン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダック)、抗生物質(例えば、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、マクロライド、キノロンおよびテトラサイクリン)、駆虫剤(例えば、アルベンダゾール、ベフェニウムヒドロキシナフトエート、カンベンダゾール、ジクロロフェン、イベルメクチン、メベンダゾール、オキサムニキン、オキシフェンダゾール、オキサンテルエンボナート、プラジカンテル、ピランテルエンボナート、チアベンダゾール)、抗不整脈剤(例えば、アミノダロン(例えば、HCl)、ジソピラミド、フレカイニド(例えば、アセテート)、キニジン(例えば、サルフェート))、抗細菌剤(例えば、ベネタミンペニシリン、シノキサシン、シプロフロキサシン(例えば、HCl)、クラリスロマイシン、クロファジミン、クロキサシリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、エチオナミド、イミペネム、ナリジクス酸、ニトロフラントイン、リファンピシン、スピラマイシン、スルファベンザミド、スルファドキシン、スルファメラジン、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファフラゾール、スルファメトキサゾール、スルファピリジン、テトラサイクリン、トリメトプリム)、抗凝固剤(例えば、ジクマロール、ジピリダモール、ニクマロン、フェニンジオン)、抗鬱剤(例えば、アモキサピン、マプロチリン(例えば、HCl)、ミアンセリン(例えば、HCl)、ノルトリプチリン(例えば、HCl)、トラゾドン(例えば、HCl)、トリミプラミン(例えば、マレイン酸塩))、抗糖尿病剤(例えば、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリクラジド、グリピジド、トラザミド、トルブタミド)、抗てんかん剤(例えば、ベクラミド、カルバマゼピン、クロナゼパム、エトトイン、メトイン、メトスクシミド、メチルフェノバルビトン、オキシカルバゼピン、パラメタジオン、フェナセミド、フェノバルビトン、フェニトイン、フェンスクシミド、プリミドン、スルチアム、バルプロ酸)、抗真菌剤(例えば、アンホテリシン、ブトコナゾール(例えば、硝酸塩)、クロトリマゾール、エコナゾール(例えば、硝酸塩)、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ナタマイシン、ナイスタチン、スルコナゾール(例えば、硝酸塩)、テルビナフィン(例えば、HCl)、テルコナゾール、チオコナゾール、ウンデセン酸)、抗痛風剤(例えば、アロプリノール、プロベネシド、スルフィン-ピラゾン)、抗高血圧剤(例えば、アムロジピン、ベニジピン、ダロジピン、ジリタゼム(例えば、HCl)、ジアゾキシド、フェロジピン、グアナベンズ(例えば、酢酸塩)、イスラジピン、ミノキシジル、ニカルジピン(例えば、HCl)、ニフェジピン、ニモジピン、フェノキシベンザミン(例えば、HCl)、プラゾシン(例えば、HCl)、レセルピン、テラゾシン(例えば、HCl))、抗マラリア剤(例えば、アモジアキン、ク��ロキン、クロルプログアニル(例えば、HCl)、ハロファントリン(例えば、HCl)、メフロキン(例えば、HCl)、プログアニル(例えば、HCl)、ピリメタミン、キニンサルフェート)、抗片頭痛剤(例えば、ジヒドロエルゴタミン(例えば、メシル酸塩)、エルゴタミン(例えば、酒石酸塩)、メチセルギド(例えば、マレイン酸塩)、ピゾチフェン(例えば、マレイン酸塩)、コハク酸スマトリプタン)、抗ムスカリン剤(例えば、アトロピン、ベンズヘキソール(例えば、HCl)、ビペリデン、エトプロパジン(例えば、HCl)、ヒヨスチアミン、メペンゾレート(例えば、ブロミド)、オキシフェンサイクリミン(例えば、HCl)、トロピカミド)、抗癌剤および免疫抑制剤(例えば、アミノグルテチミド、アムサクリン、アザチオプリン、ブスルファン、クロラムブシル、シクロスポリン、ダカルバジン、ドキソルビシン、エストラムスチン、エトポシド、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトザントロン、パクリタキセル、プロカルバジン(例えば、HCl)、タモキシフェン(例えば、クエン酸塩)、テストラクトン)、抗原虫剤(例えば、ベンズニダゾール、クリオキノール、デコキナート、ジヨードヒドロキシキノリン、フロ酸ジロキサニド、ジニトルミド、フルゾリドン、メトロニダゾール、ニモラゾール、ニトロフラゾン、オルニダゾール、チニダゾール)、抗甲状腺剤(例えば、カルビマゾール、プロピルチオウラシル)、抗不安剤、鎮静剤、催眠剤および神経弛緩剤(例えば、アルプラゾラム、アミロバルビトン、バルビトン、ベンタゼパム、ブロマゼパム、ブロムペリドール、ブロチゾラム、ブトバルビトン、カルブロマール、クロルジアゼポキシド、クロルメチアゾール、クロルプロマジン、クロバザム、クロチアゼパム、クロザピン、ジアゼパム、ドロペリドール、エチナメート、フルナニゾン、フルニトラゼパム、フルオプロマジン、フルペンチキソールデカノエート、フルフェナジンデカノエート、フルラゼパム、ハロペリドール、ロラゼパム、ロルメタゼパム、メダゼパム、メプロバメート、メタカロン、ミダゾラム、ニトラゼパム、オキサゼパム、ペントバルビトン、ペルフェナジンピモジド、プロクロルペラジン、スルピリド、テマゼパム、チオリダジン、トリアゾラム、ゾピクロン)、β遮断剤(例えば、アセブトロール、アルプレノロール、アテノロール、ラベタロール、メトプロロール、ナドロール、オキシプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール)、強心剤(例えば、アムリノン、ジギトキシン、ジゴキシン、エノキシモン、ラナトシドC、メジゴキシン)、コルチコステロイド(例えば、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデゾニド、コルチゾン(例えば、酢酸塩)、デソキシメタゾン、デキサメタゾン、フルドロコルチゾン(例えば、酢酸塩)、フルニゾリド、フルコルトロン、フルチカゾン(例えば、プロピオン酸塩)、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン)、利尿剤(例えば、アセタゾラミド、アミロリド、ベンドロフルアジド、ブメタニド、クロロチアジド、クロルタリドン、エタクリン酸、フルセミド、メトラゾン、スピロノラクトン、トリアムテレン)、抗パーキンソン病剤(例えば、ブロモクリプチン(例えば、メシル酸塩)、リ���リド(例えば、マレイン酸塩))、胃腸剤(例えば、ビサコジル、シメチジン、シサプリド、ジフェノキシレート(例えば、HCl)、ドンペリドン、ファモチジン、ロペラミド、メサラジン、ニザチジン、オメプラゾール、オンダンセトロン(例えば、HCl)、ラニチジン(例えば、HCl)、スルファサラジン)、ヒスタミンH受容体アンタゴニスト(例えば、アクリバスチン、アステミゾール、シナリジン、シクリジン、シプロヘプタジン(例えば、HCl)、ジメンヒドリナート、フルナリジン(例えば、HCl)、ロラタジン、メクロジン(例えば、HCl)、オキサトミド、テルフェナジン)、脂質調節剤(例えば、ベザフィブレート、クロフィブレート、フェノフィブレート、ゲンフィブロジル、プロブコール)、硝酸塩および他の抗狭心症剤(例えば、硝酸アミル、ニトログリセリン、二硝酸イソソルビド、一硝酸イソソルビド、四硝酸ペンタエリスリトール)、オピオイド鎮痛剤(例えば、コデイン、デキストロプロポキシフェン、ジアモルフィン、ジヒドロコデイン、メプタジノール、メタドン、モルフィン、ナルブフィン、ペンタゾシン)、性ホルモン(例えば、クロミフェン(例えば、クエン酸塩)、ダナゾール、エチニルエストラジオール、メドロキシプロゲステロン(例えば、酢酸塩)、メストラノール、メチルテストステロン、ノルエチステロン、ノルゲストレル、エストラジオール、コンジュゲート化エストロゲン、プロゲステロン、スタノゾロール、スチベストロール、テストステロン、チボロン)、ならびに覚醒剤(例えば、アンフェタミン、デキサンフェタミン、デクスフェンフルラミン、フェンフルラミン、マジンドール)が挙げられる。本発明はまた、これらの薬剤のいずれかの類似体(例えば、治療上有効な類似体)を含んでもよい。
【０１７６】
(標識)
標識を標的化部分に連結して、診断的および/または治療的処置を可能にすることができる。標識の例としては、アイソトープ、放射性画像化剤、マーカー、トレーサー、蛍光標識(例えば、ローダミン)、およびリポーター分子(例えば、ビオチン)などの検出可能な標識が挙げられる。
【０１７７】
好適であり得る放射線(検出可能な放射性標識)を放出する放射性画像化剤の例は、インジウム-111、テクニチウム-99、または低用量ヨウ素-131により例示される。本発明における使用のための検出可能な標識、またはマーカーは、放射性標識、蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、発光標識、発色標識、PETスキャナーのための陽電子放射アイソトープ、化学発光標識、または酵素標識であってよい。蛍光標識としては、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質(GFP)、フルオレセイン、およびローダミンが挙げられる。化学発光標識としては、限定されるものではないが、ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼが挙げられる。酵素標識としては、限定されるものではないが、ペルオキシダーゼおよびホスファターゼが挙げられる。ヒスタミンタグもまた検出可能な標識であってよい。例えば、コンジュゲートは、担体部分と抗体部分(抗体または抗体断片)を含んでもよく、さらに標識を含んでもよい。標識は、例えば、医療用アイソトープ、例えば、限定されるものではないが、テクネチウム-99、ヨウ素-123および-131、タリウム-201、ガリウム-67、フッ素-18、インジウム-111などであってよい。
【０１７８】
(治療用ペプチド剤)
治療用ペプチド剤としては、タンパク質またはペプチドに基づく広範囲の薬剤(例えば、任意の有用なペプチドもしくはタンパク質に基づく薬剤)が挙げられる。治療用ペプチド剤の例としては、限定されるものではないが、ペプチドまたはタンパク質に基づく薬剤(例えば、正の薬理学的モジュレータ(アゴニスト)または薬理学的阻害剤(アンタゴニスト))などが挙げられる。
【０１７９】
コンジュゲートは、標的化部分およびタンパク質から本質的になる治療用ポリペプチド(例えば、融合タンパク質)であってよい。治療用ペプチド剤の例としては、細胞毒素(例えば、モノメチルオーリスタチンE(MMAE)、細菌内毒素および外毒素、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、ブドウ球菌腸毒素、毒素ショック症候群毒素TSST-1、アデニル酸シクラーゼ毒素、シガ毒素、およびコレラ腸毒素)、抗血管新生化合物(例えば、エンドスタチン、ケモカイン、マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害剤(MMPI)、アナステリン、ビトロネクチン、抗トロンビン、チロシンキナーゼ阻害剤、およびVEGF阻害剤)、ホルモン(例えば、増殖ホルモン)、ならびにサイトカイン(例えば、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン、リンホカイン、およびケモカイン)が挙げられる。
【０１８０】
本発明のコンジュゲート中に含有させることができる他の治療用ペプチド剤は、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH、コルチコトロピン)、増殖ホルモンペプチド(例えば、ヒト胎盤ラクトゲン(hPL)、増殖ホルモン、およびプロラクチン(Prl))、メラノサイト刺激ホルモン(MSH)、オキシトシン、バソプレシン(ADH)、副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRF)、ゴナドトロピン放出ホルモン関連ペプチド(GAP)、増殖ホルモン放出因子(GRF)、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LH-RH)、オレキシン、プロラクチン放出ペプチド、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(THR)、カルシトニン(CT)、カルシトニン前駆体ペプチド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、副甲状腺ホルモン(PTH)、副甲状腺ホルモン関連タンパク質(PTHrP)、アミリン、グルカゴン、インスリンおよびインスリン様ペプチド、ニューロペプチドY、膵臓ポリペプチド(PP)、ペプチドYY、ソマトスタチン、コレシストキニン(CCK)、ガストリン放出ペプチド(GRP)、ガストリン、ガストリン阻害ペプチド、モチリン、セクレチン、血管作動性腸管ペプチド(VIP)、ナトリウム利尿ペプチド(例えば、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、B型ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、脳ナトリウム利尿ペプチド、およびC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP))、タキキニン(例えば、ニューロキニンA、ニューロキニンB、およびP物質)、P物質、アンギオテンシン(例えば、アンギオテンシンIおよびアンギオテンシンII)、レニン、エンドセリン(例えば、エンドセリン-1、エンドセリン-2、エンドセリン-3、サラホトキシン(ヘビ毒)およびサソリ毒)、サラホトキシンペプチド、オピオイドペプチド(例えば、カソモルフィンペプチド、デモルフィン、エンドルフィン、エンケファリン、サイモシン、胸腺液性因子(THF))、アドレノメデュリンペプチド(AM)、アラトスタチンペプチド、アミロイドβタンパク質断片(Aβ断片)、抗微生物ペプチド(例えば、ディフェンシン、セクロピン、ブホリン、およびマガイニン)、抗酸化ペプチド(例えば、ナチュラルキラー増強因子B(NKEF-B)、ボンベシン、骨Glaタンパク質ペプチド(例えば、オステロカルシン(骨Glaタンパク質、またはBGP)、CARTペプチド、細胞接着ペプチド、コルチスタチンペプチド、フィブロネクチン断片およびフィブリン関連ペプチド、FMRFペプチド、ガラニン、グアニリンおよびウログアニリン、ならびにインヒビンペプチドである。
【０１８１】
特に、治療用ペプチド剤は、ニューロテンシンもしくはニューロテンシン類似体、ニューロテンシン受容体アゴニスト、神経栄養因子もしくは神経栄養因子類似体(例えば、グリア細胞系由来神経栄養因子(GDNF)もしくはGDNF類似体または脳由来神経栄養因子(BDNF)もしくはBDNF類似体)、GLP-1アゴニスト、またはレプチンもしくはレプチン類似体である。これらの薬剤に関するさらなる詳細を以下に提供する。
【０１８２】
(ニューロテンシンまたはニューロテンシン類似体)
ニューロテンシン(NT)は、中枢神経系および胃腸管に見出される13アミノ酸のペプチドである。脳においては、NTはドーパミン受容体および他の神経伝達物質系と関連する。末梢性NTは、消化器系および心血管系の両方においてパラクラインおよびエンドクラインペプチドとして作用する。脳においてその生物学的効果を発揮するためには、NTはBBBを通過せず、全身投与後にペプチダーゼによって迅速に分解されるため、脳に直接注射または送達する必要がある。前臨床薬理試験は、その多くが脳へのNTの直接注射を含むが、NT受容体のアゴニストが、精神病、統合失調症、パーキンソン病、疼痛、および精神刺激剤の乱用などの神経精神症状の治療にとって臨床的に有用であることを強く示唆している。特に、様々な動物試験において、NTの脳室内注射は、痛覚抑制実験において低体温および鎮痛作用を誘導した。
【０１８３】
ペプチド治療剤は、ニューロテンシンまたはその類似体であってよい。ヒトニューロテンシンは、配列QLYENKPRRPYILを有する13アミノ酸のペプチドである。ニューロテンシン類似体の例としては、(VIP-ニューロテンシン)ハイブリッドアンタゴニスト、アセチルニューロテンシン(8-13)、JMV 1193、KK13ペプチド、ニューロメジンN、ニューロメジンN前駆体、ニューロテンシン(1-1O)、ニューロテンシン(1-11)、ニューロテンシン(1-13)、ニューロテンシン(1-6)、ニューロテンシン(1-8)、ニューロテンシン(4-13)、ニューロテンシン(6-13)、ニューロテンシン(8-13)、Asp(12)-ニューロテンシン(8-13)、Asp(13)-ニューロテンシン(8-13)、Cit(8)-ニューロテンシン(8-13)、Lys(8)-ニューロテンシン(8-13)、Cit(9)-ニューロテンシン(8-13)、Lys(9)-ニューロテンシン(8-13)、N-メチル-Arg(8)-Lys(9)-ネオ-Trp(11)-ネオ-Leu(12)-ニューロテンシン(8-13)、ニューロテンシン(9-13)、ニューロテンシン69L、Arg(9)-ニューロテンシン、アジドベンゾイル-Lys(6)-Trp(11)-ニューロテンシン、Gln(4)-ニューロテンシン、ヨード-Tyr(11)-ニューロテンシン、ヨード-Tyr(3)-ニューロテンシン、N-α-(フルオレセイニルチオカルバミル)グルタミル(1)-ニューロテンシン、Lys(7)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(7-13) (例えば、NT1もしくはKRRP(D-Y)IL)、p-Glu(1)-ニューロテンシンまたはp-Glu(1)-ニューロテンシン-OH (例えば、pELYENKPRRPYILもしくはpELYENKPRRPYIL-OH(式中、「pE」はL-ピログルタミン酸である))、Phe(11)-ニューロテンシン、Ser(7)-ニューロテンシン、Trp(11)-ニューロテンシン、Tyr(11)-ニューロテンシン、ラットNT77、PD 149163、プロニューロテンシン、ステアリル-Nle(17)-ニューロテンシン(6-11)VIP(7-28)、99mTc-NT-XI、TJN 950、および血管作動性腸管ペプチド-ニューロテンシンハイブリッドが挙げられる。
【０１８４】
他のニューロテンシン類似体としては、同じL-アミノ酸残基の対応するD-異性体への置換などの1個以上の置換を有する短縮ニューロテンシンペプチドが挙げられる。ニューロテンシン類似体の例としては、ニューロテンシン(6-13) (KPRRPYIL)またはニューロテンシン(7-13) (PRRPYIL)のもの、例えば、D-Lys(6)-ニューロテンシン(6-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Lys(6)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(9)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Arg(9)-ニューロテンシン(6-13)、D-Pro(10)ニューロテンシン(6-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Trp(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Phe(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(6-13)、D-Arg(8)-D-Trp(11)-ニューロテンシン(6-13)、およびLys(7)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(7-13) (例えば、NTlまたはKRRP(D-Y)IL); ならびにニューロテンシン(8-13)のもの、例えば、D-Arg(8)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(9)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(8)-D-Arg(9)ニューロテンシン(8-13)、D-Pro(10)ニューロテンシン(8-13)、D-Tyr(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Trp(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Phe(11)-ニューロテンシン(8-13)、D-Arg(8)-D-Tyr(11)-ニューロテンシン(8-13)、およびD-Arg(8)-D-Trp(11)-ニューロテンシン(8-13)、ならびに上記のいずれかのアセチル化された類似体が挙げられる。
【０１８５】
さらなるニューロテンシン類似体としては、ペプシンおよびトリプシンの1個以上の切断部位について1個以上のD-アミノ酸置換を有するものが挙げられる。ペプシンによる切断のための位置1、2、3、11、12、および13に対してC末端ならびにトリプシンによる切断のための位置8に対するC末端などのニューロテンシンのための切断部位の例を図9に示す。従って、本発明のニューロテンシン類似体はまた、ニューロテンシンの位置1、2、3、8、11、12、および13の1個以上について1個以上のD-アミノ酸置換を有するニューロテンシンよりも短いポリペプチドも含む。
【０１８６】
さらに他のニューロテンシン類似体としては、
NT64L [L-neo-Trp11]NT(8-13)、NT72D [D-Lys9,D-ネオ-Trp1l,tert-Leu12]NT(9-13)、NT64D [D-ネオ-Trp11]NT(8-13)、NT73L [D-Lys9,L-ネオ-Trp11]NT(9-13)、NT65L [L-ネオ-Trp11、tert-Leu12]NT(8-13)、NT73D [D-Lys9,D-ネオ-Trp11]NT(9-13)、NT65D [D-ネオ-Trp11、tert-Leu12]NT(8-13)、NT74L [DAB9,L-ネオ-Trp11,tert-Leu12]NT(9-13)、NT66L [D-Lys8、L-ネオ-Trp11、tert-Leu12]NT(8-13)、NT74D [DAB9,Pro,D-ネオ-Trp11,tert-Leu12]NT(9-13)、NT66D [D-Lys8、D-ネオ-Trp11、tert-Leu12]NT(8-13)、NT75L [DAB8 L-ネオ-Trp11]NT(8-13)、NT67L [D-Lys8、L-ネオ-Trp11]NT(8-13)、NT75D [DAB8、D-ネオ-Trp11]NT(8-13)、NT67D [D-Lys8、D-ネオ-Trp11]NT(8-13)、NT76L [D-Orn9,L-ネオ-Trp11]NT(8-13)、NT69L [N-メチル-Arg8,L-Lys9 L-ネオ-Trp11,tert-Leu12]NT(8-13)、NT76D [D-Orn9,D-ネオ-Trp11]NT(8-13)、NT69D [N-メチル-Arg8 L-Lys9,D-ネオ-Trp11,tert-Leu12]NT(8-13)、NT77L [D-Orn9,L-ネオ-Trp11,tert-Leu12]NT(8-13)、NT71L [N-メチル-Arg8,DAB9 L-ネオ-Trp11,tert-leu12]NT(8-13)、NT77D [D-Orn9,D-ネオ-Trp11,tert-Leu12]NT(8-13)、NT71D [N-メチル-Arg8,DAB9,D-ネオ-Trp11,tert-leu12]NT(8-13)、NT78L [N-メチル-Arg8,D-Orn9 L-ネオ-Trp11,tert-Leu12]NT(8-13)、NT72L [D-Lys9,L-ネオ-Trp11,tert-Leu12]NT(9-13)、およびNT78D [N-メチル-Arg8,D-Orn9,D-ネオ-Trp11,tert-Leu12]NT(8-13)(式中、ネオ-Trpは(2-アミノ-3-[1H-インドリル]プロパン酸)である)が挙げられる。他のニューロテンシン類似体としては、β-ラクトテンシン(NTR2選択的)、JMV-449、およびPD-149またはPD-163(NTR1選択的；ニューロテンシンの還元アミド結合8-13断片)が挙げられる。
【０１８７】
他のニューロテンシン類似体としては、改変アミノ酸を含むもの(例えば、本明細書に記載のもののいずれか)が挙げられる。ニューロテンシン類似体はまた、ニューロテンシン受容体アゴニストであってもよい。例えば、ニューロテンシン類似体は、少なくとも1つの他のNTR受容体または両方と比較して、NTR1、NTR2、またはNTR3に対して選択的であってよい(例えば、少なくとも2、5、10、50、100、500、1000、5000、10,000、50,000または100,000倍以上、NTR1、NTR2、またはNTR3の1つに結合するか、またはそれを活性化することができる)。
【０１８８】
(グリア細胞系由来神経栄養因子(GDNF)またはGDNF類似体)
GDNFはジスルフィド結合したホモダイマーとして分泌され、ドーパミン作動性ニューロン、プルキンエ細胞、運動ニューロン、および交感神経ニューロンの生存を支援することができる。これらの活性の1つ以上を有するGDNF類似体または断片を本発明において用いることができ、そのような類似体および断片の活性を当業界で公知の任意の手段を用いて試験することができる。
【０１８９】
ヒトGDNFは、211アミノ酸のタンパク質(アイソフォーム1)；185アミノ酸のタンパク質(アイソフォーム2)、および133アミノ酸のタンパク質として発現される。成熟GDNFは、アイソフォーム1のアミノ酸118〜211、アイソフォーム2のアミノ酸92〜185を含む134アミノ酸の配列である。アイソフォーム3は、アミノ酸40〜133に由来するトランスフォーミング増殖因子様ドメインを含む。他の形態のGDNFは、アイソフォーム1のアミノ酸78〜211を含む。
【０１９０】
特定の実施形態においては、GDNF類似体は、GDNFのスプライス変異体である。そのようなタンパク質は、PCT公開第WO 2009/053536号に記載されており、プレ-(α)プロ-GDNF、プレ-(β)プロ-GDNF、およびプレ-(γ)プロ-GDNFスプライス変異体、ならびにプレ-プロ領域を欠く変異体：(α)プロ-GDNF、(β)プロ-GDNF、およびプレ-(γ)プロ-GDNFが挙げられる。
【０１９１】
GDNF類似体はまた、GDNF前駆体タンパク質または生物学的に活性な変異体の断片も含む。GDNF類似体の例としては、Pro-Pro-Glu-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Arg-Ser-Leu-Gly-Arg-Arg; Phe-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Lys-Arg; FPLPA-アミド、PPEAPAEDRSL-アミド、LLEAPAEDHSL-アミド、SPDKQMAVLP、SPDKQAAALP、SPDKQTPIFS、ERNRQAAAANPENSRGK-アミド、ERNRQAAAASPENSRGK-アミド、およびERNRQSAATNVENSSKK-アミドが挙げられる。他のGDNF類似体は、米国特許出願公開第2009/0069230号および第2006/0258576号; ならびにPCT公開第WO 2008/069876号に記載されている。
【０１９２】
(脳由来神経栄養因子(BDNF)またはBDNF類似体)
BDNFは、神経成長因子ファミリーのタンパク質の糖タンパク質である。このタンパク質は、247アミノ酸のポリペプチド(アイソフォームA)、255アミノ酸のポリペプチド(アイソフォームB)、262アミノ酸のポリペプチド(アイソフォームC)、276アミノ酸のポリペプチド(アイソフォームD)、および329アミノ酸のポリペプチド(アイソフォームE)としてコードされる。成熟119アミノ酸糖タンパク質はより大きい前駆体からプロセッシングされて、神経細胞集団の生存を促進する神経栄養因子になる。成熟タンパク質は、アイソフォームAプレタンパク質のアミノ酸129〜247、アイソフォームBプレタンパク質のアミノ酸137〜255、アイソフォームCプレタンパク質のアミノ酸144〜162、アイソフォームDプレタンパク質のアミノ酸158〜276、またはアイソフォームEプレタンパク質のアミノ酸211(もしくは212)〜329を含む。BDNFはTrkB受容体および低親和性神経増殖因子受容体(LNGFRまたはp75)で作用する。BDNFは存在する神経細胞のニューロン生存を支援することができ、また、新しい神経細胞の増殖および分化を促進することもできる。本発明のBDNF断片または類似体は上記活性のいずれかを有してもよい。そのような類似体および断片の活性を、当業界で公知の任意の手段を用いて試験することができる。他のBDNF類似体は、米国特許第6,800,607号、米国特許出願公開第2004/0072291号およびPCT公開第WO 96/15146号に記載されている。
【０１９３】
(GLP-1アゴニスト)
本明細書に記載の標的化部分を、GLP-1アゴニストにコンジュゲートさせることができる。特定のGLP-1アゴニストとしては、GLP-1、エキセンジン-4、およびその類似体または断片が挙げられる。類似体の例を以下に記載する。
【０１９４】
GLP-1およびGLP-1類似体は、本発明のコンジュゲートおよび治療用ポリペプチド中で用いることができる。特定の実施形態においては、GLP-1類似体はトランケートされていてもよく、野生型配列の1個以上の置換を有してもよく(例えば、ヒト野生型配列)、または他の化学的改変を有してもよいペプチドである。GLP-1アゴニストはまた、例えば、米国特許第6,927,214号に記載のものなどの非ペプチド化合物であってもよい。特定の類似体としては、LY548806、CJC-1131、およびリラグルチドが挙げられる。
【０１９５】
GLP-1類似体は、トランケート形態のGLP-1であってよい。GLP-1ペプチドは、そのN末端、そのC末端、またはその組合せから、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、20個以上の残基によりトランケートすることができる。特定の実施形態においては、トランケートされたGLP-1類似体は、GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、もしくはGLP-1(7-37)ヒトペプチドまたはそのC末端アミド化形態である。
【０１９６】
GLP-1類似体は、位置8のアラニン以外のアミノ酸または位置22のグリシン以外のアミノ酸などの置換(例えば、[Glu22]GLP-1(7-37)OH、[Asp22]GLP-1(7-37)OH、[Arg22]GLP-1(7-37)OH、[Lys22]GLP-1(7-37)OH、[Cya22]GLP-1(7-37)OH、[Val8,Glu22]GLP-1(7-37)OH、[Val8,Asp22]GLP-1(7-37)OH、[Val8,Arg22]GLP-1(7-37)OH、[Val8,Lys22]GLP-1(7-37)OH、[Val8,Cya22]GLP-1(7-37)OH、[Gly8,Glu22]GLP-1(7-37)OH、[Gly8,Asp22]GLP-1(7-37)OH、[Gly8,Arg22]GLP-1(7-37)OH、[Gly8,Lys22]GLP-1(7-37)OH、[Gly8,Cya22]GLP-1(7-37)OH、[Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Arg22]GLP-1(7-36)NH2、[Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Cya22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8,Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8,Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8,Arg22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8,Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8,Cya22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8,Glu22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8,Asp22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8,Arg22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8,Lys22]GLP-1(7-36)NH2、[Gly8,Cya22]GLP-1(7-36)NH2、[Val8,Lys2 ]GLP-1(7-37)OH、[Val8,Ala27]GLP-1(7-37)OH、[Val8,Glu30]GLP-1(7-37)OH、[Gly8,Glu30]GLP-1(7-37)OH、[Val8,His35]GLP-1(7-37)OH、[Val8,His37]GLP-1(7-37)OH、[Val8,Glu22,Lys23]GLP-1(7-37)OH、[Val8,Glu22,Glu2]GLP-1(7-37)OH、[Val8,Glu22,Ala27]GLP-1(7-37)OH、[Val8,Gly34,Lys35]GLP-1(7-37)OH、[Val8,His37]GLP-1(7-37)OH、[Gly8,His37]GLP-1(7-37)OH); またはN-アシル化もしくはN-アルキル化アミノ酸による位置7での置換(例えば、[D-His7]GLP-1(7-37)、[Tyr7]GLP-1(7-37)、[N-アセチル-His7]GLP-1(7-37)、[N-イソプロピル-His7]GLP-1(7-37)、[D-Ala8]GLP-1(7-37)、[D-Glu9]GLP-1(7-37)、[Asp9]GLP-1(7-37)、[D-Asp9]GLP-1(7-37)、[D-Phe10]GLP-1(7-37)、[Ser22,Arg23,Arg24,Gln26]GLP-1(7-37)、および[Ser8,Gln9,Tyr16,Lys18,Asp21]GLP-1(7-37))を含んでもよい。他のGLP-1類似体は、米国特許第5,545,618号、第5,574,008号、第5,981,488号、第7,084,243号、第7,101,843号、および第7,238,670号に記載されている。
【０１９７】
エキセンジン-4およびエキセンジン-4類似体を、本発明のコンジュゲートおよび治療用ポリペプチドにおいて用いることもできる。本発明の化合物は、エキセンジン-4配列の断片を含んでもよい。エキセンジン-4は、配列：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2を有する。
【０１９８】
特定のエキセンジン-4類似体は、システイン置換(例えば、[Cys32]エキセンジン-4); リジン置換(例えば、[Lys39]エキセンジン-4); ロイシン置換(例えば、[Leu14,Phe25]エキセンジン-4アミド、[Leu14,Phe25]エキセンジン-4(1-28)アミド、および[Leul4,Ala22,Phe25]エキセンジン-4(l-28)アミド)を有するもの; またはエキセンジン断片(例えば、エキセンジン-4(1-30)、エキセンジン-4(1-30)アミド、エキセンジン-4(1-28)アミド、およびエキセンジン-4(1-31))を含む。他のエキセンジン類似体は、米国特許第7,157,555号、第7,220,721号、および第7,223,725号; ならびに米国特許出願公開第2007/0037747号に記載されている。
【０１９９】
(レプチンおよびレプチン類似体)
レプチンはアジポカインであり、かくして、アジポカインまたはその類似体を含んでもよい治療用ペプチド剤である。アジポカインとしては、アジポネクチン、レプチン、およびレジスチンが挙げられる。アジポネクチンは、ヒト、マウスおよびラットアジポネクチンを含む。レプチンとしては、レプチン(116-130)、レプチン(22-56)、レプチン(57-92)、レプチン(93-105)、LY396623、メトレレプチン、マウスレプチン類似体、PEG化レプチン、およびメチオニルヒトレプチンが挙げられる。レジスチンは、ヒト、マウス、およびラットレジスチンを含む。レプチンは、切断された配列(例えば、ヒト配列のアミノ酸22〜167)または完全長タンパク質であってよい。本発明において用いられるポリペプチドは、これらのペプチドもしくはタンパク質のいずれかであってよく、またはこれらのペプチドもしくはタンパク質のいずれかと実質的に同一であってもよい。
【０２００】
レプチン類似体は、OB受容体アゴニストであってもよい。特定の実施形態においては、OB受容体アゴニストは、視床下部に認められる主な受容体であるOB-Rb型または血液脳関門で認められ、レプチン輸送に関与するOB-Rのアゴニストである。
【０２０１】
(免疫グロブリンおよびその断片)
治療用ペプチド剤は、免疫グロブリン(「抗体」とも呼ばれ、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を包含することが当業界で理解されている)であってよい。認識されるヒト免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α(IgA1およびIgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含み、そのような遺伝子によりコードされる免疫グロブリンは本発明の組成物内で有用である。完全長免疫グロブリン「軽鎖」(約25 kDaおよび214アミノ酸)は、アミノ末端の可変領域遺伝子(約110アミノ酸)およびカルボキシ末端のκまたはλ定常領域によりコードされる。完全長免疫グロブリン重鎖(約50 kDaおよび446アミノ酸)は可変領域遺伝子(約116アミノ酸)および他の上記の定常領域遺伝子の一つ、例えば、γ(約330アミノ酸をコードする)により同様にコードされる。本発明の組成物中に有用に組み入れられる抗体または免疫グロブリンは、ヒトまたは非ヒト起源に由来するCDRを含んでもよい。免疫グロブリンのフレームワークは、ヒト、ヒト化、もしくはヒトにおける抗原性を低下させるために改変された非ヒト、例えば、マウスのフレームワーク、または合成フレームワーク、例えば、コンセンサス配列であってもよい。
【０２０２】
上述のように、生物分子に特異的に結合する免疫グロブリンの断片を、本発明の組成物に含有させることもでき、これらの断片はそれらが誘導された完全な免疫グロブリンにより結合された同じ生物分子に特異的または選択的に結合するため、本発明者らはこれらの断片を、抗体の「抗原結合部分」と呼ぶことができる。用語「断片」に包含される結合部分の例としては、(i)VLC、VHC、CLおよびCH1ドメインからなる一価断片であるFab断片；(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された2個のFab断片を含む二価断片であるF(ab')2断片；(iii)VHCおよびCH1ドメインからなるFd断片；(iv)抗体の単一アームのVLCおよびVHCドメインからなるFv断片；(v)VHCドメインからなるdAb断片(Wardら、Nature 341:544-546(1989))；ならびに(vi)例えば、可変領域の抗原結合部分に特異的に結合するのに十分なフレームワークを有する単離された相補性決定領域(CDR)が挙げられる。軽鎖可変領域の断片または抗原結合部分および重鎖可変領域の抗原結合部分、例えば、Fv断片の2個のドメイン、VLCおよびVHCを、組換え方法を用いて、VLCおよびVHC領域対が一価分子を形成する単一タンパク質鎖として作製することができる合成リンカーにより連結することができる(一本鎖Fv(scFv)として知られる；本明細書で用いられる用語「免疫グロブリン」により包含される；例えば、Birdら、Science 242: 423-426(1988)；およびHustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883(1988)を参照されたい)。免疫グロブリンおよびその断片を、当業者には公知の従来の技術を用いて取得することができ、その断片を無傷の抗体と同じ様式でその有用性についてスクリーニングすることができる。Fab断片は、パパインを用いる四量体抗体の切断から得ることができる；Fab'およびF(ab')2断片はペプシンを用いる切断によって生成させることができる。
【０２０３】
また、本発明の組成物において有用なものは、フレームワーク残基がヒト生殖細胞配列に対応し、CDRがV(D)J組換えおよび体細胞突然変異から得られるポリペプチドを含む、ヒト免疫グロブリンまたは抗体である。しかしながら、ヒト抗体はまた、ヒト生殖細胞免疫グロブリン核酸配列中ではコードされないアミノ酸残基(例えば、in vivoでの無作為または部位特異的突然変異誘発により導入された突然変異)を含んでもよい。ヒト可変遺伝子のin vivoでの体細胞突然変異はフレームワーク残基の突然変異をもたらすことが証明されている(Nat. Immunol. 2: 537(2001)を参照されたい)。そのような抗体は、フレームワーク突然変異にも拘らず、その起源は「ヒト」であると言われる。マウス抗体可変ドメインはまた、フレームワーク残基中に体細胞突然変異を含む(Sem. Immunol. 8:159(1996)を参照されたい)。免疫グロブリンはまた、ポリクローナルもしくはモノクローナルであってもよく、一、二または三特異的であってもよい。免疫グロブリンは親和性成熟されたものであってよく、組込まれる免疫グロブリンのいずれかは単離された(例えば、それらが産生される動物または細胞からある程度まで精製された)ものであってよい。一本鎖抗体、およびキメラ、ヒト化またはCDR移植抗体、ならびに異なる種から誘導される部分を含むキメラまたはCDR移植一本鎖抗体も、本発明により包含され、「免疫グロブリン」と呼ばれる。
【０２０４】
本発明の組成物中に組込まれる免疫グロブリンは、標識(例えば、マーカーもしくはリポーター配列として役立つか、またはそれが結合する抗体配列の精製を容易にするポリペプチド)を含んでもよい。好適な標識としては、FLAGタグ、ヒスチジンタグ、または酵素的に活性な、または蛍光タンパク質が挙げられる。あるいは、またはさらに、抗体は毒素を含んでもよい。
【０２０５】
(輸送ベクター)
コンジュゲートは、任意の治療剤(例えば、本明細書に記載のもの)に結合するか、またはそれを含む任意の有用な輸送ベクターを含んでもよい。本発明の輸送ベクターは、薬剤(例えば、本明細書に記載のものなどの治療剤)を輸送することができる任意の脂質、炭水化物、またはポリマーに基づく組成物を含んでもよい。輸送ベクターとしては、脂質ベクター(例えば、リポソーム、ミセル、およびポリプレックス)ならびにデンドリマーなどのポリマーに基づくベクターが挙げられる。他の輸送ベクターとしては、シリカ、脂質、炭水化物、または他の製薬上許容し得るポリマーを含んでもよいナノ粒子が挙げられる。輸送ベクターは、薬剤(例えば、本明細書に記載の任意のもの)の分解に対して保護することによって、これらの化合物の薬理学的半減期およびバイオアベイラビリティを増加させることができる。
【０２０６】
任意の生体適合性脂質または脂質ベクター(例えば、リポソーム、ミセル、およびリポプレックス)を形成することができる脂質の組合せを用いて、脂質ベクターを形成させることができる。脂質ベクター中への薬剤の封入は、損傷もしくは分解から薬剤を保護するか、または細胞へのその進入を容易にすることができる。脂質ベクターは、電荷相互作用(例えば、陽イオン性の脂質ベクターおよび陰イオン性の細胞膜)の結果として、細胞膜と相互作用し、融合し、かくして細胞質中へ薬剤を放出する。リポソームは1つ以上の脂質分子、ポリペプチド-脂質コンジュゲート、および脂質成分を含む二層ベシクルである。リポプレックスは、リポソームに全体的な正の電荷を付与する陽イオン性脂質分子と共に形成されたリポソームである。ミセルは、界面活性剤または脂質分子の単一層を含むベシクルである。
【０２０７】
(リポソーム)
特定の実施形態においては、脂質ベクターはリポソームである。典型的には、用いられる脂質は二層を形成することができ、陽イオン性である。好適な脂質分子のクラスとしては、リン脂質(例えば、ホスホチジルコリン)、脂肪酸、糖脂質、セラミド、グリセリド、およびコレステロール、またはその任意の組合せが挙げられる。あるいは、またはさらに、脂質ベクターは、中性脂質(例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE))を含んでもよい。脂質ベクターを形成することができる他の脂質は、当業界で公知であり、本明細書に記載されている。
【０２０８】
本明細書で用いられる「脂質分子」は、疎水性頭部と親水性尾部とを有する分子であり、リポソームを形成することができる。脂質分子は必要に応じて、親水性ポリマー基を含むように改変することができる。そのような脂質分子の例としては、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]および1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[カルボキシ(ポリエチレングリコール)-2000]が挙げられる。
【０２０９】
脂質分子の例としては、カルジオリピン(CL)、ホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスファチジルイノシトール(PI)、およびホスファチジルセリン(PS)などの天然脂質；スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴミエリン、セレブロシド、スルファチド、ガングリオシド、およびフィトスフィンゴシンなどのスフィンゴ脂質；1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDAB)、3-β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol)、N-[1-(2,3-ジテトラデシルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DORIE)、および1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)などの陽イオン脂質；1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DLPC)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、および1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホコリン(POPC)などのホスファチジルコリン；1,2-ジブチリル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DSPE)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、および1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(グルタリル)などのホスホエタノールアミン；1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-リン酸、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-リン酸、および1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸などのホスファチジン酸；ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DMPC)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール)および1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール)などのホスファチジルグリセロール；1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン、および1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリンなどのホスファチジルセリン；1',3'-ビス[1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ]-sn-グリセロールなどのカルジオリピン；ならびに1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-750]、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]、および1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[カルボキシ(ポリエチレングリコール)-2000]などのPEG-脂質コンジュゲートが挙げられる。
【０２１０】
市販の脂質組成物としては、Invitrogen Corp.からのLipofectamine(商標)2000およびLipofectin(登録商標)；Promega Corp.からのTransfectam(登録商標)およびTransfast(商標)；Sigma-Aldrich Co.からのNeuroPORTER(商標)およびEscort(商標)；RocheからのFuGENE(登録商標)；ならびにStrategeneからのLipoTAXI(登録商標)が挙げられる。公知の脂質組成物としては、Boado, Pharm. Res. 24:1772-1787(2007)に記載のような、Trojan Horse Lipsome技術が挙げられる。
【０２１１】
リポソームはまた、リポソームの形成または安定性を補助する他の成分を含んでもよい。成分の例としては、コレステロール、抗酸化剤(例えば、α-トコフェロール、β-ヒドロキシトルイジン)、界面活性剤、および塩が挙げられる。
【０２１２】
脂質分子を、リンカーを用いて、または用いずに、共有結合または非共有結合(例えば、イオン相互作用、捕捉もしくは物理的封入、水素結合、吸収、吸着、van der Waals力、もしくはその任意の組合せ)により標的化部分に結合させることができる。
【０２１３】
リポソームは、ポリペプチド-脂質コンジュゲートおよびリポソームの形成または安定性を補助する他の成分などの、脂質分子を含む任意の有用な組合せのものであってよい。当業者であれば、特定の薬剤の封入、リポソームの安定性、スケールアップ反応条件、または他の任意の関連する因子を支持する組合せを最適化する方法を知っている。組合せの例は、Boado, Pharm. Res. 24: 1772-1787(2007)に記載される。一例においては、リポソームは、標的化部分に共有連結された、93%のPOPC、3%のDDAB、3%のジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)-PEG2000、および1%のDSPE-PEG2000を含む。
【０２１４】
典型的には、リポソームの生成は、一般的な2段階プロセスを介して行う。第1のステップでは、脂質および脂質成分を揮発性有機溶媒または溶媒混合物中で混合して、脂質の均一な混合物を確保する。溶媒の例としては、クロロホルム、メタノール、シクロヘキサン、およびt-ブタノールが挙げられる。次いで、溶媒を除去して、フィルム、粉末、またはペレット中で乾燥脂質混合物を形成させる。溶媒を、窒素、回転式蒸発、噴霧乾燥、凍結乾燥、および減圧乾燥を用いるなど、任意の公知の分析技術を用いることにより除去することもできる。
【０２１５】
第2のステップでは、乾燥脂質混合物を水性溶液で水和して、リポソームを形成させる。薬剤を水性溶液に添加し、薬剤が封入されたリポソームの形成を得ることができる。あるいは、リポソームを第1の水性溶液を用いて最初に形成させた後、薬剤を含有する別の水性溶液に曝露する。薬剤の封入を、反復凍結解凍サイクル、超音波処理、または混合などの任意の公知の技術により促進することができる。この手法のさらなる例は、Boado, Pharm. Res. 24: 1772-1787(2007)に記載されている。あるいは、薬剤を疎水性部分(例えば、コレステロール)にカップリングさせて、親油性誘導体を生成させ、親油性誘導体を他の脂質分子と共に用いてリポソームを形成させる。
【０２１６】
第2のステップの間に、乾燥脂質混合物はポリペプチド-脂質コンジュゲートを含むか、または含まなくてもよい。このプロセスは、必要に応じて、特定の温度範囲が約40℃〜約70℃を含む場合、脂質分子の相転移温度を越えて水性溶液を加熱した後、それを乾燥脂質混合物に添加すること；特定の時間範囲が約30分〜約2時間を含む場合、乾燥脂質混合物と水性溶液との組合せをインキュベートすること；ボルテックス混合、振とう、撹拌、もしくはアジテーションなどにより、インキュベーション中に乾燥脂質混合物と水性溶液とを混合すること；0.9%塩水、5%デキストロース、および10%スクロースの溶液などの生理的浸透圧を確保するために水性溶液に非電解質を添加すること；押出もしくは超音波処理などにより大きい多重膜ベシクルを破壊すること；ならびに乾燥脂質混合物が脂質分子を含まなかった場合、予め形成されたリポソームをポリペプチド-脂質コンジュゲートと共にさらにインキュベートすることを含む、様々なさらなるステップを含んでもよい。当業者であれば、この水和ステップ中の特定の温度およびインキュベーション時間を同定し、リポソーム中への誘導体化された脂質分子の組込みを確保するか、または安定なリポソームを得ることができる。
【０２１７】
ポリペプチド-脂質コンジュゲートを、リポソームを形成するプロセスにおける任意の時点で添加することができる。一例では、ポリペプチド-脂質コンジュゲートを、乾燥脂質混合物の形成中に脂質および脂質成分に添加する。別の例では、ポリペプチド-脂質コンジュゲートを、脂質および脂質成分を含有する乾燥脂質混合物と共に予め形成されたリポソームに添加する。さらに別の例では、ミセルをポリペプチド-脂質コンジュゲートと共に形成させ、リポソームを脂質および脂質成分を含有する乾燥脂質混合物と共に形成させた後、ミセルとリポソームとを一緒にインキュベートする。水性溶液は、バッファー、塩、キレート剤、塩水、デキストロース、スクロースなどの、薬剤またはリポソームを安定化するためのさらなる成分を含んでもよい。
【０２１８】
この手順の一例では、脂質混合物から構成される乾燥フィルムを、薬剤を含有する水性溶液を用いて水和する。この混合物を最初に50℃に30分間加熱した後、室温まで冷却する。次に、混合物を、ポリペプチド-脂質コンジュゲートを含有する乾燥フィルム上に移す。次いで、混合物を37℃で2時間インキュベートして、薬剤を含有するリポソーム中にポリペプチド-脂質コンジュゲートを組込む。例えば、Zhangら、J. Control. Release 112: 229-239(2006)を参照されたい。
【０２１９】
(ポリプレックス)
ポリマーと薬剤との複合体は、ポリプレックスと呼ばれる。ポリプレックスは、典型的には、陽イオン性ポリマーからなり、その産生は陰イオン性薬剤(例えば、ポリヌクレオチド)とのイオン相互作用によって調節される。いくつかの場合、ポリプレックスは結合した薬剤を細胞質中に放出することができない。この目的のため、不活化アデノウイルスなどのエンドソーム溶解剤との同時トランスフェクション(エンドサイトーシスの間に作られるエンドソームを溶解するため)を行う必要がある。特定の場合、ポリエチレンイミンなどのポリマーは、キトサンおよびトリメチルキトサンと同様、エンドソーム破壊のそれ自身の方法を有する。ポリプレックスは、例えば、米国特許出願公開第2002/0009491号；第2003/0134420号；および第2004/0176282号に記載されている。
【０２２０】
ポリプレックスを、本明細書に記載の任意のポリマーおよびコポリマーと共に形成させることができ、非荷電または陰イオン性ポリマーを、陽イオン側鎖を含むようにさらに誘導体化することができる。陽イオン側鎖の例は、典型的には生理的条件下でプロトン化されるアミンである。ポリプレックスを形成させるのに用いることができるポリマーの例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアミドアミン、およびポリエチレンイミンなどのポリアミンが挙げられる。
【０２２１】
(デンドリマー)
デンドリマーは、球状の高度に分枝した大分子である。この粒子の表面は多くの方法で官能化することができ、得られる構築物の多くの特性はその表面によって決定される。特に、陽イオン性デンドリマー(すなわち、正の表面電荷を有するもの)を構築することができる。DNAまたはRNAなどの遺伝物質の存在下の場合、電荷相補性はポリヌクレオチドと陽イオン性デンドリマーとの一時的結合をもたらす。その目的地に到達した時、デンドリマー-ポリヌクレオチド複合体は、エンドサイトーシスを介して、またはトランスサイトーシスによってBBBを通過して細胞中に取り込まれる。デンドリマーは、例えば、米国特許第6,113,946号および第7,261,875号に記載されている。
【０２２２】
デンドリマーを、当業界で公知の任意のプロセスによって製造することができる。分岐的な方法の下では、デンドリマーのコアを最初に構築し、その後のステップはコアから外側に向かって構築して分枝した構造を形成する。収束的な方法の下では、くさび型のデンドリマー(またはデンドロン)を別々に構築し、その後のステップはデンドリマーの外側表面を作り上げる分子から内側に向かって構築する。異なるデンドロンを同じか、または異なるポリマー性モノマーと共に形成させることができる。次いで、デンドロンをコア分子または構造に共有結合させて、デンドリマーを形成させる。これらの方法のさらなる例は、Svensonら、Adv. Drug. Deliv. Rev. 57: 2106-2129(2005)に記載されている。
【０２２３】
ポリアミドアミン(PAMAM)デンドリマーについては、デンドリマーのコアは典型的には、アミノ基を含む。コア分子の例としては、アンモニア；ジアミン分子、例えば、エチレンジアミン、1,4-ジアミノブタン、1,6-ジアミノヘキサン、1,12-ジアミノドデカン、およびシスタミン；ならびにトリアミン分子、例えば、トリエタノールアミンが挙げられる。付加反応の第1ステップにおいては、ポリマー性モノマーを用いて、モノマーをコアのアミノ基と反応させて四分枝分子を形成させることにより、コアを構築する。ジアミン分子およびポリマー性モノマーとのその後の付加反応はさらに、デンドリマーを構築する。
【０２２４】
アミノ基と反応するポリマー性モノマーの例としては、PAMAMデンドリマーを形成するメタクリレート；およびポリ(プロピレンイミン)デンドリマーを形成するアクリロニトリルを含む。PAMAMデンドリマーおよびデンドリマーの合成反応の例は、米国特許第4,507,466号、第5,527,524号および第5,714,166号に記載されている。トリエタノールアミンコアと共に形成されるPAMAMデンドリマーの例は、Wuら、Chem. Comm. 3:313-315(2005)；およびZhouら、Chem. Comm. 22:2362-2364(2006)に記載されている。デンドリマーの合成は、分子内反応を防止するための活性化された基への保護基の付加；および保護基を除去するための脱保護ステップの追加などの追加のステップを含んでもよい。
【０２２５】
PAMAMデンドリマーに加えて、他の型のデンドリマーを用いることができる。リンデンドリマーについては、デンドリマーのコアはP=O基を含む。コア分子の例としては、シクロトリホスファゼン基およびチオホスホリル基が挙げられる。ポリマー性モノマーの例としては、フェノキシメチル(メチルヒドラゾノ)基が挙げられる。あるいは、デンドリマーはポリエステルコア構造を有する超分枝ポリマーである。そのようなデンドリマーの例としては、超分枝2,2-ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸ポリエステル-16-ヒドロキシルが挙げられる。
【０２２６】
デンドリマーの外側表面基は、アミドエタノール、アミドエチルエタノールアミン、アミノ、ヘキシルアミド、カルボキシレート、スクシナミジル、トリメトキシシリル、トリス(ヒドロキシメチル)アミドメタン、および3-カルボメトキシピロリジノン基などの様々な官能基を有してもよい。さらに、これらの官能基をカップリング剤でさらに処理して、活性化基(本明細書で定義されたもの)を形成させることができる。
【０２２７】
一つの特定の例においては、ポリアミドアミンデンドリマーを、親水性ポリマー基：α-マレイミジル-ω-N-ヒドロキシスクシンイミジルポリエチレングリコール(MW 3400)を含有する多価リンカーにコンジュゲートさせる。ポリアミドアミンデンドリマーの表面上のアミノ基を、リンカーの末端N-ヒドロキシスクシンイミジル活性化基と反応させる。次いで、誘導体化されたデンドリマーを、精製し、濾過し、塩水中に溶解する。次に、誘導体化デンドリマーの末端マレミジル基を、標的化部分のスルフヒドリル基と反応させる。ポリペプチドがスルフヒドリル基を含まない場合、ポリペプチド中に存在するアミノ基を、N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテートまたはN-スクシンイミジル-S-アセチルチオプロピオナートと反応させて、保護されたスルフヒドリル基を導入することができる。あるいは、ポリペプチドを、さらなるシステイン基を含むように合成することができる。薬剤および誘導体化デンドリマーを溶媒中でインキュベートし、混合物をボルテックスすることにより、薬剤を誘導体化デンドリマーと結合させる。これらの手法のさらなる例は、Keら、J. Pharm. Sci. 97: 2208-2216(2008)；Huangら、J. Gene Med. 11: 754-763(2009)；Huangら、Biomaterials 29: 238-246(2008)；およびLiuら、Biomaterials 30: 4195-4202に記載されている。
【０２２８】
別の特定の例においては、ポリアミドアミンデンドリマーを、脂肪族基：4-スルホスクシンイミジル-6-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルアミド]ヘキサノエートを含有する多価リンカーにコンジュゲートさせる。ポリアミドアミンデンドリマーの表面上のアミノ基を、リンカーの末端スルホスクシンイミジル活性化基と反応させる。次いで、誘導体化デンドリマーを精製し、塩水中に溶解する。次に、誘導体化デンドリマーの末端ピリジルジチオ基を、ポリペプチドのスルフヒドリル基と反応させる。薬剤および誘導体化デンドリマーを溶媒中でインキュベートし、混合物をボルテックスすることにより、薬剤を誘導体化デンドリマーと結合させる。これらの手法のさらなる例は、Kangら、Pharm. Res. 22: 2099-2106(2005)に記載されている。
【０２２９】
共有および非共有結合(例えば、イオン相互作用、捕捉もしくは物理的封入、水素結合、吸収、吸着、van der Waals力、またはその任意の組合せ)などの任意数の方法により、薬剤を誘導体化デンドリマーと結合させることができる。
【０２３０】
(ナノ粒子)
本発明における輸送ベクターとして、ナノ粒子を用いることができる。本明細書で用いられる「ナノ粒子」は、約1 nm〜約1000 nmの範囲の大きさのコロイド粒子、ポリマー粒子、または元素粒子である。ナノ粒子は、シリカ、炭水化物、脂質、またはポリマー分子から構成され得る。分子を、ナノ粒子マトリックス中に埋込むか、またはその表面上に吸着させることができる。一例では、ナノ粒子を、ポリ(ブチルシアノアクリレート)(PBCA)などの生分解性ポリマーから構成させることができる。元素ナノ粒子の例としては、炭素ナノ粒子および酸化鉄ナノ粒子が挙げられ、次いで、これをオレイン酸(OA)-Pluronicで被覆することができる。この手法においては、薬剤(例えば、疎水性または不水溶性薬剤)を、Jainら、Mol. Pharm. 2: 194-205(2005)に記載のように、ナノ粒子中にロードする。他のナノ粒子は、シリカから作られ、例えば、Burnsら、Nano Lett. 9:442-448(2009)に記載のものが挙げられる。
【０２３１】
ナノ粒子を、任意の有用なポリマーから形成させることができる。ポリマーの例としては、ポリ(ブチルシアノアクリレート)、ポリ(ラクチド)、ポリ(グリコリド)、ポリ-ε-カプロラクトン、ポリ(ブチレンスクシネート)、ポリ(エチレンスクシネート)、およびポリ(p-ジオキサノン)などの生分解性ポリマー；ポリ(エチレングリコール)；ポリ-2-ヒドロキシエチルメタクリレート(ポリ(HEMA))；ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)、ポリ(ラクチド)-ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ポリ(エチレングリコール)シアノアクリレート-コ-ヘキサデシルシアノアクリレート、およびポリ[HEMA-コ-メタクリル酸]などのコポリマー；フィブリノゲン、コラーゲン、ゼラチン、およびエラスチンなどのタンパク質；ならびにアミロペクチン、α-アミロース、およびキトサンなどの多糖類が挙げられる。
【０２３２】
ポリマーナノ粒子を、任意の有用なプロセスにより製造することができる。溶媒蒸発方法を用いて、ポリマーおよび薬剤を溶媒中に溶解して、ナノエマルジョンを形成させ、溶媒を蒸発させる。好適な溶媒系および界面活性剤を用いて、水中油または油中水ナノエマルジョンを得ることができる。この方法は、必要に応じて、濾過、遠心分離、超音波処理、または凍結乾燥を含んでもよい。ナノ沈降法を用いて、ポリマーおよび薬剤の溶液を第1の溶媒中で形成させる。次いで、前記溶液を、第1の溶媒と混和するが、ポリマーを可溶化しない第2の溶媒に添加する。相分離の間に、ナノ粒子を自発的に形成させる。エマルジョン重合法を用いて、モノマーを水性溶液中に分散させて、ミセルを形成させる。水性溶液中の開始剤ラジカル(例えば、ヒドロキシルイオン)は、モノマーの陰イオン性重合を開始する。エマルジョン重合法の別の変形においては、薬剤が陰イオン性重合を促進する開始剤ラジカルとして作用する。例えば、光増感剤である薬剤はシアノアクリレートモノマーの重合を開始することができる。さらなる方法としては、透析、イオンゲル化、界面重合、および細孔形成剤を用いる溶液流延法が挙げられる。
【０２３３】
溶媒蒸発法の例において、ポリマーは、Stellaら、J. Pharm. Sci. 89:1452-1464(2000)に記載のように合成された、親水性ポリマー基：ポリ(アミノポリ(エチレングリコール)シアノアクリレート-コ-ヘキサデシルシアノアクリレート)を含有するシアノアクリレートコポリマーである。ポリマーおよび薬剤を有機溶媒に添加し、水性溶液を添加することにより混合物を乳化する。次いで、減圧下で有機溶媒を蒸発させ、得られたナノ粒子を洗浄し、凍結乾燥させた。トランスフェリンである薬剤の特定例においては、トランスフェリンの炭水化物部分上の末端ヒドロキシル基を過ヨウ素酸ナトリウムで処理してアルデヒド基を形成させ、酸化したトランスフェリンをナノ粒子に添加する。この手法のさらなる例は、Liら、Int. J. Pharm. 259: 93-101(2003)；およびYuら、Int. J. Pharm. 288: 361-368(2005)に記載されている。
【０２３４】
エマルジョン重合法の例においては、モノマーを、酸性水性溶液に滴下しながら添加する。混合物を撹拌して重合を促進した後、中和する。次いで、ナノ粒子を濾過、遠心分離、超音波処理、および洗浄する。この方法の一つの特定の例においては、ブチルシアノアクリレートモノマーのモノマーが提供され、水性溶液はまた、希塩酸水溶液中のデキストランを含む。薬剤を導入するために、ポリ(ブチルシアノアクリレート)ナノ粒子を凍結乾燥させた後、塩水中に再懸濁する。一定の撹拌下でナノ粒子を含む塩水溶液に薬剤を添加する。あるいは、重合プロセス中に薬剤を添加する。ナノ粒子を、必要に応じて、ポリソルベート80などの界面活性剤で被覆する。この手法のさらなる例は、Kreuterら、Brain Res. 674:171-174(1995)；Kreuterら、Pharm. Res. 20:409-416(2003)；およびSteinigerら、Int. J. Cancer 109:759-767(2004)に記載されている。
【０２３５】
他のナノ粒子としては、固形脂質ナノ粒子(SLN)が挙げられる。SLN手法は、例えば、Kreuter, Ch.24, In V.P. Torchilin(編)、Nanoparticles as Drug Carriers pp.527-548, Imperial College Press, 2006に記載されている。固形脂質ナノ粒子のための脂質分子の例としては、ステアリン酸および改変ステアリン酸、例えば、ステアリン酸-PEG2000；大豆レシチン；ならびに乳化蝋が挙げられる。固形脂質ナノ粒子は、必要に応じて、界面活性剤、例えば、Epicuron(登録商標)200、ポロキサマー188(Pluronic(登録商標)F68)、Brij 72、Brij 78、ポリソルベート80(Tween80)；ならびに塩、例えば、タウロコレートナトリウムなどの他の成分を含んでもよい。リポソームについて考察されたいくつかの方法によって固形脂質ナノ粒子中に薬剤を導入することができ、そのような方法はさらに、高圧均質化、およびマイクロエマルジョンの分散を含んでもよい。
【０２３６】
一例においては、SLNはステアリン酸、Epicuron 2000(界面活性剤)、および薬剤(例えば、ドキソルビシン、トブラマイシン、イダルビシン、もしくはパクリタキセル、またはパクリタキセル誘導体などの抗癌剤)を搭載したタウロコレートナトリウムを含む。別の例においては、SLNはステアリン酸、大豆レシチン、およびポロキサマー188を含む。SLNはまた、ポリオキシル2-ステアリルエーテル(Brij 72)、または乳化蝋とポリオキシル20-ステアリルエーテル(Brij 78)との混合物から作製することもできる(例えば、Koziaraら、Pharm. Res. 20: 1772-1778, 2003を参照されたい)。固形脂質ナノ粒子を作製する一つの例においては、界面活性剤(例えば、Brij 78またはTween 80)を、水中の乳化蝋の混合物に50℃〜55℃で添加することにより、マイクロエマルジョンを形成させた。乳化蝋は、セトステアリルアルコールから調製され、ソルビタンの脂肪酸エステルのポリオキシエチレン誘導体を含有する固形蝋である。ナノ粒子を、撹拌しながら混合物を冷却することにより形成させる。水中の乳化蝋を含有する加熱された混合物に薬剤を添加することにより、薬剤を導入することができる。この手法のさらなる例は、Koziaraら、Pharm. Res. 20: 1772-1778(2003)に記載されている。
【０２３７】
ナノ粒子はまた、ナノメートルサイズのミセルを含んでもよい。ミセルは、本明細書に記載の任意のポリマーから形成させることができる。ミセルを形成させるためのポリマーの例としては、ブロックコポリマー、例えば、ポリ(エチレングリコール)およびポリ(ε-カプロラクトン)が挙げられる。一つの特定例においては、PEO-b-PCLブロックコポリマーを、マクロ開始剤としてα-メトキシ-ω-ヒドロキシ-ポリ(エチレングリコール)を用いることにより、ε-カプロラクトンの制御開環重合により合成する。ミセルを形成させるために、PEO-b-PCLブロックコポリマーを有機溶媒(例えば、テトラヒドロフラン)に溶解した後、脱イオン水を添加して、ミセル溶液を形成させる。有機溶媒を蒸発させて、ナノメートルサイズのミセルを得た。
【０２３８】
特定の実施形態においては、界面活性剤で被覆することにより、ナノ粒子の特性を変化させる。例えば、ポリソルベート界面活性剤、例えば、ポリソルベート20、40、60および80(Tween 80)；Epicuron(登録商標)200；ポロキサマー界面活性剤、例えば、188(Pluronic(登録商標)、ポロキサマー908および1508；ならびにBrij界面活性剤、例えば、Brij 72およびBrij 78などの任意の生体適合性界面活性剤を用いることができる。他の実施形態においては、界面活性剤を、PCT公開第WO 2008/085556号に記載のように、ナノ粒子に共有結合させる。そのような手法は、界面活性剤がナノ粒子に吸い付くのを防止することにより毒性を低下させることができる。必要に応じて、ナノ粒子を界面活性剤で被覆することができる。
【０２３９】
必要に応じて、親水性ポリマー基(例えば、ポリ(エチレングリコール)またはポリ(プロピレングリコール))を含むようにナノ粒子を改変することができる。ナノ粒子の表面を、親水性ポリマー基を共有結合させることにより改変することができる。あるいは、ポリ[メトキシポリ(エチレングリコール)シアノアクリレート-コ-ヘキサデシルシアノアクリレート]などの親水性ポリマー基を含むポリマーを用いることにより、ナノ粒子を形成させることができる。必要に応じて、ナノ粒子を架橋させてもよく、特に、タンパク質に基づくナノ粒子のために用いることができる。
【０２４０】
任意の有用な方法により治療剤をナノ粒子に導入することができる。ナノ粒子の形成時、その間、またはその後に薬剤をナノ粒子中に組込むことができる。一例においては、ナノ粒子の形成の前にポリマーまたはモノマーと共に薬剤を溶媒に添加する。別の例においては、吸着により予め形成されたナノ粒子中に薬剤を組込む。さらに別の例においては、薬剤をナノ粒子に共有結合させる。界面活性剤でナノ粒子をさらに被覆する任意選択のステップを用いてナノ粒子の表面に薬剤を物理的に吸着させることができる。界面活性剤の例としては、ポリソルベート80(Tween 80)が挙げられる。この手法のさらなる例は、Kreuter, Nanoparticular Carriers for Drug Delivery to the Brain, Chapter 24, in Torchilin (編), Nanoparticulates as Drug Carriers (2006), Imperial College Pressに記載されている。
【０２４１】
(炭水化物に基づく送達方法)
キトサンなどの炭水化物に基づくポリマーを、例えば、ミセルまたはナノ粒子の形成における輸送ベクターとして用いることができる。キトサンポリマーは両親媒性であり得るため、これらのポリマーは疎水性薬剤(例えば、本明細書に記載のもの)の送達において特に有用である。キトサンポリマーの例としては、四級アンモニウムパルミトイルグリコールキトサンが挙げられ、Quら、Biomacromolecules 7:3452-3459, 2006に記載のように合成することができる。
【０２４２】
(ハイブリッド方法)
いくつかのハイブリッド方法は2つ以上の技術を組合わせるものであり、被験体の細胞、組織、または器官に本発明のコンジュゲートを投与するのに有用であり得る。例えば、ビロソームは、リポソームと不活化ウイルスとを組合わせるものである。この組合せは、ウイルスまたはリポソーム法単独よりも呼吸上皮細胞中でのより効率的な遺伝子導入を有する。他の方法は、他のウイルスベクターを陽イオン脂質と混合すること、またはウイルスをハイブリダイズさせることを含む。
【０２４３】
(マルチマー標的化部分、コンジュゲート、および治療用ポリペプチド)
本発明の化合物はまた、マルチマー(例えば、ダイマーもしくはトリマー)型の本明細書に記載の標的化部分、コンジュゲート、および治療用ポリペプチドも包含する。直接的に(例えば、ジスルフィドもしくはペプチド結合などの共有結合)または間接的に(例えば、本明細書に記載のものなどのリンカーを介して)化学的結合により、標的化部分を連結する。マルチマー標的化部分、コンジュゲート、および治療用ポリペプチドの例を以下に記載する。本明細書に記載の任意のリンカーを、マルチマー標的化部分、コンジュゲート、および治療用ポリペプチド(例えば、多価リンカー)のために用いることができる。
【０２４４】
(マルチマー標的化部分)
特定の実施形態においては、マルチマー標的化部分は、式：
A1-X-A2
(式中、A1およびA2は各々独立に、標的化部分(例えば、本明細書に記載の任意の標的化部分)であり、Xはリンカーである)
を有するダイマーである。リンカーは、本明細書に記載の任意のリンカーであってよい。特定の実施形態においては、リンカーはマレイミド部分を含み、ペプチドベクター(例えば、N末端またはC末端システイン残基が付加されたペプチドベクター)中に存在するシステインに結合する。
【０２４５】
他の実施形態においては、マルチマー標的化部分は、
【化２２】
2013530993.tif 000033
【０２４６】
(式中、A1、A2、A3、AmおよびそれぞれのApは独立に、標的化部分(例えば、本明細書に記載の任意の標的化部分)であり；X、X1およびそれぞれのXpは独立に、2個の標的化部分を一緒に連結するリンカー(例えば、本明細書に記載の任意のリンカー)であり；nは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり；mはn+2であり；ならびにpは2〜n+1の整数である)
からなる群より選択される式を有するか、または含む。特定の実施形態においては、nは1であり、化合物は式：
【化２３】
2013530993.tif 000034
【０２４７】
を有する。
【０２４８】
より高い次数のマルチマー標的化部分は、式：
【化２４】
2013530993.tif 000035
【０２４９】
(式中、A1、A2、それぞれのAq、およびそれぞれのAsは独立に、標的化部分(例えば、本明細書に記載のもののいずれか)であり；A3は標的化部分であるか、または存在せず；X、それぞれのXq、それぞれのXrおよびそれぞれのXsは独立に、標的化部分を連結するリンカーであり；m、nおよびpはそれぞれ独立に、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり；qは4〜m+3の整数であり；rはm+4〜m+n+3の整数であり；ならびにsはm+n+4〜m+n+p+3の整数である)
により記載することもできる。
【０２５０】
いくつかの実施形態においては、マルチマー標的化部分は、ポリペプチドのための本明細書に記載の任意の改変またはさらなるコンジュゲーション(例えば、翻訳後プロセッシングまたはユビキチン化、PEG化、アセチル化、アシル化、環化、アミド化、酸化、硫黄化、システインの形成、もしくは1つ以上の治療剤の共有結合などの化学的改変による)を含む。
【０２５１】
(マルチマーコンジュゲート)
治療剤または輸送ベクターを、マルチマーコンジュゲートまたは治療用ポリペプチドを形成させるために連結された(例えば、共有結合による)1つ以上のマルチマー標的化部分に連結することができる。
【０２５２】
治療剤およびダイマー標的化部分を含む化合物を、分子の標的化部分を介して、または分子のリンカー部分を介してコンジュゲートさせることができる。薬剤が標的化部分に連結された(例えば、リンカーが化学的リンカーであるリンカー、ペプチド、またはペプチド結合などの共有結合を介して)本発明の化合物を、式：
【化２５】
2013530993.tif 000036
【０２５３】
(式中、A1およびA2は各々独立に、標的化部分(例えば、本明細書に記載の任意のもの)であり；XはA1とA2とを連結するリンカー(例えば、化学的リンカー、ペプチド、または共有結合)であり；B1は治療剤または輸送ベクターであり；ならびにY1はB1とA1とを連結するリンカーである)
により表すことができる。
【０２５４】
特定の実施形態においては、2つ以上(例えば、3、4、5、6、7、8、9もしくは10)の治療剤または輸送ベクターを、標的化部分の一方または両方に連結する。そのような化合物は、式：
【化２６】
2013530993.tif 000037
【０２５５】
(式中、A1、A2およびXは上記で定義された通りであり；mは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり；nは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり；pは1〜mの整数であり；qはm+1〜m+nの整数であり；それぞれのBpおよびそれぞれのBqは独立に、治療剤または輸送ベクター(例えば、本明細書に記載の任意のもの)であり；ならびにそれぞれのYpおよびそれぞれのYqは独立に、それぞれのBpまたはそれぞれのBqを、それぞれA1またはA2に連結するリンカーである)
により表すことができる。
【０２５６】
他の実施形態においては、治療剤または輸送ベクターを、ダイマーを形成する標的化部分を連結するリンカーを介してダイマーに連結する(例えば、本明細書に記載のものなどの共有結合または化学的リンカーを介して)。そのような化合物は、式：
【化２７】
2013530993.tif 000038
【０２５７】
(式中、A1およびA2は標的化部分(例えば、本明細書に記載の任意のもの)であり；Bは治療剤または輸送ベクターであり；ならびにXはA1、A2およびBを連結するリンカーである)
を有してもよい。
【０２５８】
他の実施形態においては、治療剤または輸送ベクターを、リンカーおよび標的化部分の両方に連結することができる。そのような化合物を、式：
【化２８】
2013530993.tif 000039
【０２５９】
(式中、A1およびA2は独立に、標的化部分であり；BZは薬剤であるか、または存在せず；mは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり；nは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり；pは1〜mの整数であり；qはm+1〜m+nの整数であり；それぞれのBpおよびBqは独立に、治療剤または輸送ベクター(例えば、本明細書に記載の任意のもの)であり；ならびにそれぞれのYpおよびYqは独立に、それぞれのBpまたはそれぞれのBqを、それぞれA1またはA2に連結するリンカーであり、以下の少なくとも一つ(例えば、少なくとも二つ)は真実である：(i)B1が存在する；(ii)mが少なくとも1である；および(iii)nが少なくとも1である)
により表すことができる。
【０２６０】
本発明の化合物はまた、トリマー標的化部分を含んでもよい。トリマー標的化部分を、標的化部分の一つを介して単一の薬剤に連結する場合、化合物は以下の式：
【化２９】
2013530993.tif 000040
【０２６１】
(式中、A1、A2およびA3は各々独立に、標的化部分(例えば、本明細書に記載の任意のもの)であり；X1およびX2はリンカーであり；B1は治療剤または輸送ベクターであり；ならびにY1はB1を標的化部分(例えば、A1、A2およびA3)またはリンカーX1に連結するリンカーである)
の一つを有してもよい。
【０２６２】
他の実施形態においては、トリマー標的化部分を、1または1より多い治療剤または輸送ベクターにコンジュゲートさせる。そのようなコンジュゲーションは、標的化部分を介するか、またはリンカーを介するものであってよい。そのような化合物は、以下の式：
【化３０】
2013530993.tif 000041
【０２６３】
(式中、A1、A2およびA3は標的化部分であり；n、mおよびjは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり；それぞれのBp、それぞれのBq、およびそれぞれのBrは独立に、治療剤または輸送ベクター(例えば、本明細書に記載の任意のもの)であり；BzおよびByは独立に、治療剤もしくは輸送ベクターであるか、または存在せず；存在する場合、X1はA1、A2およびBzを連結するリンカーであり；存在する場合、X2はA2、A3およびByを連結するリンカーである)
の一つを含んでもよい。特定の実施形態においては、n、mまたはjの少なくとも1つは少なくとも1であり、Bzは存在するか、またはByは存在する。他の実施形態においては、少なくとも2つ(例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25または30)のBp、Bq、Br、ByおよびBzが存在する。
【０２６４】
本発明の化合物はまた、より高い次数の標的化部分マルチマー(例えば、クアトロマー、ペントマーなど)を含んでもよい。そのようなマルチマーは、式：
【化３１】
2013530993.tif 000042
【０２６５】
(式中、A1、A2、それぞれのAq、それぞれのAr、およびそれぞれのAsは独立に、標的化部分であり；A3は標的化部分であるか、または存在せず；X、それぞれのXq、XrおよびXsは独立に、標的化部分を連結するリンカーであり；m、nおよびpは各々独立に、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり；qは4〜m+3の整数であり；rはm+4〜m+n+3の整数であり；ならびにsはm+n+4〜m+n+p+3の整数である)
により記載することができる。1つ以上の薬剤を、この式のリンカー(X、任意のXq、XrもしくはXs)または標的化部分(A1、A2、A3、それぞれのAq、それぞれのAr、およびそれぞれのAs)に連結して、より高い次数のマルチマーコンジュゲートを形成させることができる。
【０２６６】
(マルチマー治療用ポリペプチド)
マルチマー治療用ポリペプチドも本発明に包含される。一実施形態においては、マルチマー治療用ポリペプチドは、融合タンパク質の形態にある。融合タンパク質は、ペプチド結合により直接的に、またはペプチドリンカーを介して、2、3、4、5つ以上の標的化部分を含んでもよい。一例においては、融合タンパク質ダイマーは、式：
A1-X-A2
(式中、A1およびA2は独立に、標的化部分(例えば、本明細書に記載の任意のもの)であり、Xは(a)A1およびA2を連結するペプチド結合または(b)ペプチド結合によりA1およびA2に連結された1個以上のアミノ酸である)
により記載される。特定の実施形態においては、ペプチドリンカーは単一のアミノ酸(例えば、天然アミノ酸)、可撓性リンカー、剛性リンカー、またはα-へリックスリンカーである。本発明において用いることができるペプチドリンカーの例は、以下の「アミノ酸およびペプチドリンカー」の表題のセクションに記載される。特定の実施形態においては、A1およびA2は同じ標的化部分である。
【０２６７】
融合タンパク質マルチマーは、式：
A1-(Xn-Am)n
(式中、nは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10であるか、または少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10であり；mは2〜n+1の整数であり；A1およびそれぞれのAmは独立に、標的化部分(例えば、本明細書に記載の任意のもの)であり；ならびにそれぞれのXnは独立に、(a)A1およびA2を連結する標的化部分または(b)ペプチド結合により隣接する標的化部分(A1もしくはAn)に連結された1個以上のアミノ酸である)
により記載することができる。
【０２６８】
特定の実施形態においては、マルチマーを形成する標的化部分はそれぞれ、50、40、35、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、または6アミノ酸長未満であってよい。融合タンパク質は、1,000、500、250、150、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40または35アミノ酸長未満であってよい。
【０２６９】
(改変ポリペプチド)
本発明で用いられる標的化部分、治療用ペプチド剤、および治療用ポリペプチドは、改変アミノ酸配列を有してもよい。特定の実施形態においては、改変は、所望の生物学的活性(例えば、BBBを通過する能力またはアゴニスト活性)を有意に破壊しない。改変は、元のポリペプチドの生物学的活性を低下させる(例えば、少なくとも5%、10%、20%、25%、35%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、もしくは95%)、効果を有さない、または増加させる(例えば、少なくとも5%、10%、25%、50%、100%、200%、500%もしくは1000%)ことができる。改変ペプチドまたはポリペプチドは、in vivoでの安定性、バイオアベイラビリティ、毒性、免疫学的活性、免疫学的同一性、およびコンジュゲーション特性などのポリペプチドの特徴を有するか、または最適化することができる。
【０２７０】
改変としては、翻訳後プロセッシングなどの天然プロセス、または当業界で公知の化学的改変技術によるものが挙げられる。改変は、ポリペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ-またはカルボキシ-末端を含むポリペプチド中のどこでも行うことができる。同じ種類の改変が所与のポリペプチド中のいくつかの部位に同じか、または異なる程度で存在してもよく、ポリペプチドは2種以上の改変を含んでもよい。ポリペプチドはユビキチン化の結果として分枝していてもよく、それらは分枝を含むか、または含まない、環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝環状ポリペプチドは翻訳後天然プロセスの結果生じるか、または合成的に作製することができる。他の改変としては、PEG化、アセチル化、アシル化、アセトミドメチル(Acm)基の付加、ADP-リボシル化、アルキル化、アミド化、ビオチン化、カルバモイル化、カルボキシエチル化、エステル化、フィアビンへの共有結合、ヘム部分への共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、薬剤の共有結合、マーカーの共有結合(例えば、蛍光もしくは放射活性)、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、デメチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質溶解的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫黄化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介性付加ならびにユビキチン化が挙げられる。
【０２７１】
改変されたポリペプチドはまた、ポリペプチド配列中に、保存的または非保存的な(例えば、D-アミノ酸、デスアミノ酸)アミノ酸挿入、欠失、または置換を含んでもよい(例えば、そのような変化がポリペプチドの生物学的活性を実質的に変化させない場合)。特に、本発明のポリペプチドのいずれかのアミノまたはカルボキシ末端への1個以上のシステイン残基の付加は、例えば、ジスルフィド結合によるこれらのポリペプチドのコンジュゲーションを容易にすることができる。例えば、P1はN末端にシステイン残基を有する。アミノ酸置換は保存的(すなわち、ある残基が同じ一般型もしくは群の別の残基により置換される)または非保存的(すなわち、ある残基が別の型のアミノ酸により置換される)であってよい。さらに、非天然アミノ酸を、天然アミノ酸に置換することができる(すなわち、非天然保存的アミノ酸置換または非天然非保存的アミノ酸置換)。
【０２７２】
合成的に作製されたポリペプチドは、DNAによって天然ではコードされないアミノ酸の置換(例えば、非天然または異常アミノ酸)を含んでもよい。非天然アミノ酸の例としては、D-アミノ酸、システインの硫黄原子に結合したアセチルアミノメチル基を有するアミノ酸、PEG化されたアミノ酸、式NH2(CH2)nCOOH(式中、nは2〜6である)のωアミノ酸、中性非極性アミノ酸、例えば、サルコシン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、およびノルロイシンが挙げられる。フェニルグリシンは、Trp、Tyr、またはPheに置換してもよい；シトルリンおよびメチオニンスルホキシドは中性非極性であり、システイン酸は酸性であり、オルニチンは塩基性である。プロリンはヒドロキシプロリンで置換してもよく、コンフォメーションを付与する特性を保持する。
【０２７３】
類似体は置換的突然変異誘発によって作製することができ、元のポリペプチドの生物学的活性を保持する。「保存的置換」として同定された置換の例を表1に示す。そのような置換が望ましくない変化をもたらす場合、表1に「置換の例」と命名されたか、またはアミノ酸クラスを参照して本明細書にさらに記載された他の型の置換を導入し、生成物をスクリーニングする。
【０２７４】
(ポリペプチド誘導体およびペプチド模倣物質)
天然アミノ酸からなるポリペプチドに加えて、ペプチド模倣物質またはポリペプチド類似体も本発明により包含され、本発明の化合物において用いられる標的化部分またはペプチド/ポリペプチド剤を形成することができる。ポリペプチド類似体は、鋳型ポリペプチドのものと同様の特性を有する非ペプチド薬剤として製薬業界で一般的に用いられている。非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣剤」またはペプチド模倣物質と呼ばれる(Fauchereら、Infect. Immun. 54: 283-287(1986)およびEvansら、J. Med. Chem. 30:1229-1239(1987))。治療上有用なペプチドまたはポリペプチドと構造的に関連するペプチド模倣剤を用いて、等価な、または増強された治療効果または予防効果をもたらすことができる。一般に、ペプチド模倣物質は、天然の受容体結合ポリペプチドなどのパラダイムポリペプチド(すなわち、生物学的または薬理学的活性を有するポリペプチド)と構造的に類似するが、必要に応じて、当業界で周知の方法により、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(シスおよびトランス)、-CH2SO-、-CH(OH)CH2-、-COCH2-などの結合により置換された1個以上のペプチド結合を有する(Spatola, Peptide Backbone Modifications, Vega Data, 1:267, 1983；Spatolaら、Life Sci. 38:1243-1249, 1986；Hudsonら、Int. J. Pept. Res. 14:177-185, 1979；およびWeinstein, 1983, Chemistry and Biochemistry, of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein(編)、Marcel Dekker, New York）。そのようなポリペプチド模倣剤は、経済的生産、より高い化学的安定性、増強された薬理学的特性(例えば、半減期、吸収、効能、および効率)、低下した抗原性、その他などの、天然のポリペプチドと比較して有意な利点を有し得る。
【０２７５】
本明細書に記載の標的化部分はBBBを効率的に通過するか、または特定の細胞型(例えば、本明細書に記載のもの)を標的化することができるが、その有効性はプロテアーゼの存在によって低下し得る。同様に、本発明において用いられるペプチド/ポリペプチド薬剤の有効性も同様に低下し得る。血清プロテアーゼは、L-アミノ酸および切断のためのペプチド結合などの、特異的基質要件を有する。さらに、血清中のプロテアーゼ活性の最も顕著な成分であるエキソペプチダーゼは通常、ポリペプチドの最初のペプチド結合に対して作用し、遊離N末端を要する(Powellら、Pharm. Res. 10: 1268-1273(1993))。これを考慮すると、改変型のポリペプチドを用いることが有利であることが多い。改変されたポリペプチドは、元のL-アミノ酸ポリペプチドの構造的特徴を保持するが、プロテアーゼおよび/またはエキソペプチダーゼによる切断に対して容易に影響されないのが有利である。
【０２７６】
コンセンサス配列の1個以上のアミノ酸の、同じ型のD-アミノ酸(例えば、エナンチオマー；L-リジンの代わりにD-リジン)との全体的置換を用いて、より安定なポリペプチドを生成することができる。かくして、本明細書に記載のポリペプチド誘導体またはペプチド模倣物質は、全部L-、全部D-、またはD,L混合ポリペプチドであってよい。N末端またはC末端のD-アミノ酸の存在は、ペプチダーゼが基質としてD-アミノ酸を用いることができないため、ポリペプチドのin vivoでの安定性を増加させる(Powellら、Pharm. Res. 10: 1268-1273(1993))。逆Dポリペプチドは、L-アミノ酸を含有するポリペプチドに対して逆の配列に配置された、D-アミノ酸を含有するポリペプチドである。かくして、L-アミノ酸ポリペプチドのC末端残基は、D-アミノ酸ポリペプチドのN末端などになる。逆D-ポリペプチドはL-アミノ酸ポリペプチドと同じ三次元コンフォメーションおよび従って同じ活性を保持するが、in vitroおよびin vivoで酵素的分解に対してより安定であり、かくして、元のポリペプチドよりも高い治療効果を有する(BradyおよびDodson, Nature 368:692-693, 1994およびJamesonら、Nature 368: 744-746(1994))。逆D-ポリペプチドに加えて、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む拘束ポリペプチドを、当業界で周知の方法により作製することができる(Rizoら、Ann. Rev. Biochem. 61: 387-418(1992))。例えば、ジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基を付加し、それによって、環状ポリペプチドを得ることにより、拘束ポリペプチドを作製することができる。環状ポリペプチドは、遊離NまたはC末端を有さない。従って、それらはエキソペプチダーゼによるタンパク質分解を受けにくいが、それらは勿論、ポリペプチド末端で切断しないエンドペプチダーゼの影響は受ける。N末端もしくはC末端D-アミノ酸を有するポリペプチドおよび環状ポリペプチドのアミノ酸配列は通常、それぞれ、N末端もしくはC末端D-アミノ酸残基の存在、またはその環状構造について以外は、それらが対応するポリペプチドの配列と同一である。
【０２７７】
分子内ジスルフィド結合を含有する環状誘導体を、アミノおよびカルボキシ末端などの環化のために選択された位置に好適なS保護されたシステインまたはホモシステイン残基を組み入れながら、従来の固相合成により調製することができる(Sahら、J. Pharm. Pharmacol. 48:197(1996))。鎖集合の完了後、(1)S-S結合を形成する対応する2個の遊離SH官能基の結果として生じる支持体上での酸化を用いてS保護基を選択的に除去した後、支持体から生成物を従来通り除去すること、および好適な精製手順により、または(2)完全な側鎖脱保護と共に支持体からポリペプチドを除去した後、高度に希釈された水性溶液中で遊離SH官能基を酸化させることにより、環化を実施することができる。
【０２７８】
分子内アミド結合を含有する環状誘導体を、環化のために選択された位置に、好適なアミノおよびカルボキシル側鎖保護されたアミノ酸誘導体を組み入れながら、従来の固相合成により調製することができる。分子内-S-アルキル結合を含有する環状誘導体を、環化のために選択された位置に、好適なアミノ保護側鎖を有するアミノ酸残基、および好適なS保護されたシステインまたはホモシステイン残基を組み入れながら、従来の固相化学により調製することができる。
【０２７９】
ポリペプチドのN末端またはC末端残基に対して作用するペプチダーゼに対する耐性を付与するための別の有効な手法は、改変されたポリペプチドが最早ペプチダーゼの基質ではなくなるように、ポリペプチド末端に化学基を付加することである。一つのそのような化学的改変は、いずれか、または両方の末端でのポリペプチドのグリコシル化である。特定の化学的改変、特に、N末端グリコシル化は、ヒト血清中のポリペプチドの安定性を増加させることが示されている(Powellら、Pharm. Res. 10: 1268-1273 (1993))。血清安定性を増強する他の化学的改変としては、限定されるものではないが、アセチル基などの1〜12個の炭素の低級アルキルからなるN末端アルキル基の付加、および/またはC末端アミド基もしくは置換アミド基の付加が挙げられる。特に、本発明は、N末端アセチル基および/またはC末端アミド基を担持するポリペプチドからなる改変ポリペプチドを含む。
【０２８０】
また、誘導体がポリペプチドの所望の機能的活性を保持するという条件で、通常はポリペプチドの一部ではないさらなる化学的部分を含有する他の型のポリペプチド誘導体も本発明により含まれる。そのような誘導体の例としては、(1)アシル基がアルカノイル基(例えば、アセチル、ヘキサノイル、オクタノイル)、アロイル基(例えば、ベンゾイル)またはF-moc(フルオレニルメチル-O-CO-)などの遮断基であってよい、アミノ末端または別の遊離アミノ基のN-アシル誘導体；(2)カルボキシ末端または別の遊離カルボキシもしくはヒドロキシル基のエステル；(3)カルボキシ末端またはアンモニアもしくは好適なアミンとの反応により生成された別の遊離カルボキシル基のアミド；(4)リン酸化誘導体；(5)抗体または他の生物学的リガンドにコンジュゲートされた誘導体および他の型の誘導体が挙げられる。
【０２８１】
本明細書に記載のポリペプチドへのさらなるアミノ酸残基の付加の結果生じるより長いポリペプチド配列も、本発明に包含される。そのようなより長いポリペプチド配列は、上記のポリペプチドと同じ生物学的活性および特異性(例えば、細胞指向性)を有すると期待することができる。実質的な数のさらなるアミノ酸を有するポリペプチドは排除されないが、いくらかの長いポリペプチドは有効な配列を隠すことによって標的(例えば、LRPまたはLRP2などのLRP受容体ファミリーのメンバー)への結合を阻害する配置を取り得ると認識される。これらの誘導体は競合的アンタゴニストとして作用し得る。かくして、本発明は伸長部を有する本明細書に記載のポリペプチドまたはポリペプチドの誘導体を包含するが、伸長部はポリペプチドまたはその誘導体の細胞標的化活性を破壊しないのが望ましい。
【０２８２】
本発明に含まれる他の誘導体は、アラニン残基の短いストレッチまたはタンパク質分解のための推定部位(例えば、カテプシンによる、例えば、米国特許第5,126,249号および欧州特許第495 049号を参照されたい)などによって、直接的に、またはスペーサーを介して互いに共有連結された、本明細書に記載の2つの同じポリペプチド、または2つの異なるポリペプチドからなる二重ポリペプチドである。
【０２８３】
本発明はまた、そのアミノ末端もしくはカルボキシ末端、またはその両方で、異なるタンパク質のアミノ酸配列に連結された、本明細書に記載のポリペプチド、またはその断片を含有するキメラまたは融合タンパク質であるポリペプチド誘導体も包含する。そのようなキメラまたは融合タンパク質は、タンパク質をコードする核酸の組換え発現により製造することができる。例えば、キメラまたは融合タンパク質は、望ましくは等価な、またはより高い機能的活性を有するキメラまたは融合タンパク質をもたらす記載のポリペプチドの1つと共有された少なくとも7個のアミノ酸を含んでもよい。
【０２８４】
(ペプチド模倣物質を同定するためのアッセイ)
上記のように、本明細書に記載のポリペプチドの骨格形状および薬理作用団展示を再現するために作製された非ペプチド化合物(ペプチド模倣物質)は、より高い代謝安定性、より高い効能、より長い作用期間、およびより良好なバイオアベイラビリティの属性を有することが多い。
【０２８５】
ペプチド模倣化合物は、生物学的ライブラリー、空間的に近接可能な平行固相もしくは液相ライブラリー、デコンボリューションを要する合成ライブラリー方法、「1ビーズ1化合物」ライブラリー方法、およびアフィニティクロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法などの、当業界で公知のコンビナトリアルライブラリー方法におけるいくつかの手法のいずれかを用いて取得することができる。生物学的ライブラリー手法はペプチドライブラリーに限定されるが、他の4つの手法はペプチド、非ペプチドオリゴマー、または小分子ライブラリーの化合物にも適用可能である(Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145(1997))。分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当業界で、例えば、DeWittら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909(1993))；Erbら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422(1994)；Zuckermannら(J. Med. Chem. 37: 2678(1994))；Choら(Science 261:1303(1993))；Carellら(Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059(1994)および同書2061)；およびGallopら(Med. Chem. 37: 1233(1994))に見出すことができる。化合物のライブラリーを、溶液中(例えば、Houghten, Biotechniques 13: 412-421(1992))またはビーズ(Lam, Nature 354: 82-84(1991))、チップ(Fodor, Nature 364: 555-556(1993))、細菌もしくは胞子(米国特許第5,223,409号)、プラスミド(Cullら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869(1992))上またはファージ(ScottおよびSmith, Science 249: 386-390(1990))上に提示させるか、またはルシフェラーゼ、および酵素標識を好適な基質の生成物への変換の決定により検出することができる。
【０２８６】
本明細書に記載のポリペプチドが同定されたら、限定されるものではないが、示差的溶解度(例えば、沈降)、遠心分離、クロマトグラフィー(例えば、アフィニティ、イオン交換、およびサイズ排除)などの任意数の標準的な方法によるか、またはペプチド、ペプチド模倣物質、もしくはタンパク質の精製に用いられる任意の他の標準的な技術により、それを単離および精製することができる。同定された目的のポリペプチドの機能的特性を、当業界で公知の任意の機能的アッセイを用いて評価することができる。望ましくは、細胞内シグナリングにおける下流の受容体機能を評価するためのアッセイを用いる(例えば、細胞増殖)。
【０２８７】
例えば、本発明のペプチド模倣化合物を、以下の3段階プロセス：(1)本明細書に記載のポリペプチドを走査して、本明細書に記載の特定の細胞型を標的化するのに必要な二次構造の領域を同定すること；(2)コンフォメーションが拘束されたジペプチド代用物を用いて、主鎖形状を改良し、これらの代用物に対応する有機プラットフォームを提供すること；および(3)最良の有機プラットフォームを用いて天然ポリペプチドの所望の活性を模倣するように設計された候補のライブラリー中に有機薬理作用団を展示することを用いて取得することができる。より詳細には、3段階は以下の通りである。段階1においては、リード候補ポリペプチドを走査し、その構造を短縮して、その活性のための要件を同定する。元の一連のポリペプチド類似体を合成する。段階2においては、最良のポリペプチド類似体を、コンフォメーションが拘束されたジペプチド代用物を用いて精査する。インドリジジン-2-オン、インドリジジン-9-オンおよびキノリジジノンアミノ酸(それぞれ、I2aa、I9aaおよびQaa)を、最良のペプチド候補の主鎖形状を試験するためのプラットフォームとして用いる。これらの、および関連するプラットフォーム(Halabら、Biopolymers 55: 101-122(2000)およびHanessianら、Tetrahedron 53: 12789-12854(1997)に概説されている)を、ポリペプチドの特定の領域に導入して、薬理作用団を異なる向きに向けることができる。これらの類似体の生物学的評価は、活性のための形状要件を模倣する改善されたリードポリペプチドを同定する。段階3においては、最も活性の高いリードポリペプチドに由来するプラットフォームを用いて、天然ペプチドの活性を担う薬理作用団の有機代用物を展示する。薬理作用団および足場を、平行合成形式で組合わせる。ポリペプチドの誘導および上記の段階を、当業界で公知の方法を用いる他の手段によって達成することができる。
【０２８８】
本明細書に記載のポリペプチド、ポリペプチド誘導体、ペプチド模倣物質または他の小分子から決定される構造機能相関を用いて、類似するか、またはより良好な特性を有する類似分子構造を改良および調製することができる。従って、本発明の化合物はまた、本明細書に記載のポリペプチドの構造、極性、電荷特性および側鎖特性を共有する分子も含む。
【０２８９】
まとめると、本明細書の開示に基づいて、当業者であれば、薬剤を特定の細胞型(例えば、本明細書に記載のもの)に対して標的化するための化合物を同定するのに有用であるペプチドおよびペプチド模倣物質スクリーニングアッセイを開発することができる。本発明のアッセイを、低効率、高効率、または超高効率スクリーニング形式のために開発することができる。本発明のアッセイは、自動化の影響を受けやすいアッセイを含む。
【０２９０】
(疾患および症状)
本発明の化合物を用いて、様々な疾患および症状を治療することができる。本発明の化合物はBBBを通過するか、または特定の細胞型(例えば、肝臓、眼、肺、腎臓、脾臓、筋肉、または卵巣)に進入することができるため、神経変性疾患および癌などの神経障害の治療、ならびに特定の細胞型に関連する障害の治療を、本発明のコンジュゲートまたは治療用ポリペプチドを用いて増強することができる。
【０２９１】
(特定の標的細胞型および標的組織への送達)
本発明の化合物を用いて、治療剤または輸送ベクターを様々な器官および組織(例えば、肝臓、眼、肺、腎臓、脾臓、筋肉、または卵巣)に送達することができる。本発明によれば、標的化部分は、例えば、被験体の肝臓(肝臓組織)、眼(眼組織)、肺(肺組織)、腎臓(腎臓組織)、脾臓(脾臓組織)、筋肉(筋肉組織)、および卵巣(卵巣組織)などの組織中での治療剤の蓄積を促進することができる。従って、前記化合物を用いて、これらの組織と関連する疾患(例えば、本明細書に記載の任意のものなどの癌；細菌感染もしくはウイルス感染などの感染；または炎症症状)を治療することができる。
【０２９２】
肝臓疾患の例としては、アメーバ性肝膿瘍、肝硬変、播種性コクシジオイデス症、薬物性胆汁鬱滞、ヘモクロマトーシス、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、肝細胞癌、肝臓癌、アルコールに起因する肝臓疾患、原発性胆汁性肝硬変、化膿性肝膿瘍、ライ症候群、硬化性胆管炎、およびウィルソン病が挙げられる。アメーバ性肝膿瘍は、メトロニダゾールにコンジュゲートさせた治療部分の投与により治療することができる。B型肝炎は、例えば、インターフェロン-α、ラミブジン、アデフォビルジピボキシル、エンテカビル、または他の抗ウイルス剤にコンジュゲートさせた治療部分の投与により治療することができる。C型肝炎は、例えば、PEG化インターフェロンもしくはリバビリン、またはその組合せにコンジュゲートさせた治療部分の投与により治療することができる。肺疾患の例としては、小細胞癌(例えば、燕麦細胞癌)、混合型小細胞/大細胞癌、混合型小細胞癌、および転移性腫瘍などの肺癌が挙げられる。転移性腫瘍は、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肉腫、膀胱癌、神経芽腫、およびウィルムス腫瘍などの任意の組織の癌から生じ得る。脾臓疾患の例としては、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および特定のT細胞リンパ腫などの癌が挙げられる。
【０２９３】
本明細書に記載の標的化部分は、治療剤または輸送ベクターを特定の細胞型(例えば、本明細書に記載のもの)に標的化することができる。本発明のコンジュゲートは治療剤または輸送ベクターを特定の組織に輸送するため、コンジュゲートはより低い毒性(例えば、より少ない副作用)、より高い効果(例えば、取込みの増加もしくは組織もしくは細胞からの流出の減少に起因して薬剤が標的組織中で濃縮されるため、またはコンジュゲートされた場合、薬剤がより高い安定性を有するため)、またはその組合せをもたらすことができる。そのような活性は以下に、および参照により本明細書に組み入れられる国際公開第WO 2007/009229号に記載されている。従って、本発明はまた、コンジュゲートが、治療剤単独の用量よりも低い用量(例えば、5%、10%、15%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.9%低い)の治療剤を含む、本発明のコンジュゲートまたは本発明のコンジュゲートを含む組成物を被験体に投与することにより、疾患または症状(例えば、癌などの、標的組織と関連する任意の疾患もしくは症状)を有する被験体を治療する方法を特徴とする。
【０２９４】
(癌療法)
抗癌剤を含む本発明の化合物を用いて、任意の脳または中枢神経系の疾患(例えば、グリア芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、および乏突起膠腫などの脳の癌、神経膠腫、上衣腫、ならびに髄膜腫)を治療することができる。本発明の化合物(例えば、P1〜P6)を、肝臓、眼、肺、腎臓、脾臓、筋肉、または卵巣への輸送のために用いることができ、好適な治療剤と共に用いて、これらの組織と関連する疾患(例えば、肝細胞癌、肝臓癌、小細胞癌(例えば、燕麦細胞癌)、混合型小細胞/大細胞癌、混合型小細胞癌、およい転移性腫瘍などの癌)を治療することもできる。転移性腫瘍は、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肉腫、膀胱癌、神経芽腫、ウィルムス腫瘍、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および特定のT細胞リンパ腫などの任意の組織の癌から生じ得る。本発明の組成物を用いて治療することができる癌のさらなる例としては、肝細胞癌、乳癌、頭部および頸部の癌、例えば、様々なリンパ腫、例えば、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、アデノーマ、扁平上皮癌、喉頭癌、網膜の癌、食道の癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮癌、メラノーマ、結腸直腸癌、膀胱癌、前立腺癌、肺癌(非小細胞肺癌など)、膵臓癌、子宮頸癌、頭部および頸部の癌、皮膚癌、鼻咽頭癌、脂肪肉腫、上皮癌、腎細胞癌、胆嚢腺癌、耳下腺癌、子宮内膜癌、多剤耐性癌；ならびに増殖性疾患および症状、例えば、腫瘍血管形成と関連する血管新生、黄斑変性(例えば、滲出型/萎縮型AMD)、角膜血管新生、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、近視性変性ならびに他の増殖性疾患および症状、例えば、再狭窄および多発性嚢胞腎が挙げられる。BBBを通過して効率的に輸送されるベクターを用いて治療することができる脳の癌としては、神経膠腫、混合性神経膠腫、多形成グリア芽細胞腫、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、乏突起膠腫、上衣腫、乏突起星細胞腫、髄芽腫、網膜芽腫、神経芽腫、胚細胞腫、および奇形腫が挙げられる。
【０２９５】
(ニューロテンシンに基づく療法)
本発明の化合物を、ニューロテンシン活性が有益である任意の好適な治療適用において用いることができる。脳においては、NTはドーパミン受容体および他の神経伝達因子系と結合する。末梢のNTは消化器系および心血管系の両方に対してパラクラインおよびエンドクラインペプチドとして作用する。精神障害、代謝障害、および疼痛などの様々な治療適用がニューロテンシンについて提言されている。ニューロテンシンは統合失調症と関連する脳の領域における神経伝達を調節することが示されているため、ニューロテンシンおよびニューロテンシン受容体アゴニストは抗精神病剤として提唱されている。
【０２９６】
本明細書に記載のポリペプチドはBBBを通過して薬剤を輸送することができるので、本発明の化合物は神経変性疾患または中枢神経系(CNS)、末梢神経系、もしくは自律神経系(例えば、ニューロンが失われているか、もしくは退化している場合)の他の症状などの神経疾患の治療にとっても有用である。ニューロテンシンは抗精神病療法を提言され、かくして、統合失調症および双極性障害などの疾患の治療において有用であり得る。多くの神経変性疾患は運動失調(すなわち、非協調的筋肉運動)および/または記憶喪失を特徴とする。神経変性疾患としては、アレキサンダー病、アルパー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS；すなわち、ルー・ゲーリック病)、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病(シュピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病)、ウシ海綿状脳症(BSE)、カナバン病、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、HIV関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、マシャド・ジョセフ病(脊髄小脳失調症3型）、多発性硬化症、多系統萎縮症、ナルコレプシー、神経ボレリア症、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、レフサム病、シルダー病(すなわち、副腎白質ジストロフィー)、統合失調症、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、および脊髄癆が挙げられる。
【０２９７】
本発明の化合物を用いて、被験体の体温を低下させることができる。体温の低下は、脳卒中、脳虚血、心虚血、または脊髄損傷などの神経損傷に罹患しているか、または最近罹患した被験体において有益であることが示されているため、そのような治療は従ってこれらの症状の合併症を減少させるのに有用である。
【０２９８】
ニューロテンシンもまた鎮痛効果を有することが公知である。かくして、本発明の化合物を用いて被験体における疼痛を減少させることができる。被験体は急性疼痛(例えば、機械的疼痛、熱疼痛、冷疼痛、虚血疼痛、および化学物質誘導性疼痛からなる群より選択される)に罹患していてもよい。他の型の疼痛としては、末梢もしくは中枢神経疼痛、炎症性疼痛、片頭痛関連疼痛、頭痛関連疼痛、過敏性腸症候群関連疼痛、線維筋痛関連疼痛、関節炎痛、骨格痛、関節痛、胃腸痛、筋肉痛、狭心痛、顔面痛、骨盤痛、跛行、術後疼痛、外傷後疼痛、緊張型頭痛、産科痛、婦人科痛、または化学療法誘導性疼痛が挙げられる。
【０２９９】
ニューロテンシンを用いて、代謝障害を治療することができることの証拠がある；例えば、米国特許出願第2001/0046956号を参照されたい。かくして、本発明の化合物を用いて、そのような障害を治療することができる。代謝障害は、糖尿病(例えば、I型もしくはII型)、肥満、肥満の結果としての糖尿病、高血糖、脂質異常症、高トリグリセリド血症、X症候群、インスリン耐性、耐糖能異常(IGT)、糖尿病性脂質異常症、高脂血症、心血管疾患、または高血圧であってよい。被験体は過体重、肥満、または過食症であってよい。
【０３００】
ニューロテンシンはまた、特に精神刺激剤による被験体の薬物中毒を治療するか、または薬物乱用を減少させることができると提唱されている。かくして、本発明の化合物は、アンフェタミン、メタンフェタミン、3,4-メチレンジオキシメタンフェタミン、ニコチン、コカイン、メチルフェニダート、およびアレコリンなどの薬物の中毒または乱用を治療するのに有用であり得る。
【０３０１】
(GDNF/BNDFに基づく療法)
GDNFおよびBDNFに基づく化合物を用いて、ニューロン生存の増強(例えば、ニューロン死速度の低下)またはニューロン形成速度の増加が有益である任意の疾患または症状を治療することができる。そのような症状としては、神経変性障害、例えば、ポリグルタミン伸長障害(例えば、ハンチントン病(HD)、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、ケネディ病(球脊髄性筋萎縮症とも呼ばれる)、ならびに脊髄小脳失調症(例えば、1型、2型、3型(マシャド・ジョセフ病とも呼ばれる)、6型、7型および17型))、別のトリヌクレオチド反復伸長障害(例えば、脆弱性X症候群、脆弱性XE精神遅滞、フリードライヒ失調症、筋強直性ジストロフィー、脊髄小脳失調症8型および脊髄小脳失調症12型)、アレキサンダー病、アルパーズ病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病(シュピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病とも呼ばれる)、カナバン病、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、虚血性脳卒中、クラッベ病、レビー小体型認知症、多発性硬化症、多系統萎縮症、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、脊髄損傷、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、および脊髄癆からなる群より選択される障害が挙げられる。他の症状としては、損傷(例えば、脊髄損傷)、脳震盪、虚血性脳卒中、および出血性脳卒中が挙げられる。
【０３０２】
(GLP-1に基づく療法)
GLP-1アゴニストを含む本発明の化合物を、脳、または特定の組織におけるGLP-1アゴニスト活性が望ましい任意の治療適用において用いることができる。GLP-1アゴニスト活性は、インスリン分泌の刺激(すなわち、インクレチンホルモンとして作用する)およびグルカゴン分泌の阻害と関連し、それによって食後のグルコース変動の制限に寄与する。GLP-1アゴニストはまた、胃腸運動および分泌を阻害し、かくして、エンテロガストロンおよび「回腸ブレーキ」機構の一部として作用することもできる。GLP-1はまた、食欲および食物摂取の生理的調節因子であると考えられる。これらの作用のため、GLP-1およびGLP-1受容体アゴニストは、例えば、Kinzigら、J. Neurosci. 23:6163-6170(2003)に概説されるように、代謝障害の療法に用いることができる。そのような障害としては、肥満、高血糖、脂質異常症、高トリグリセリド血症、X症候群、インスリン耐性、IGT、糖尿病性脂質異常症、高脂血症、心血管疾患、および高血圧が挙げられる。
【０３０３】
GLP-1はまた、米国特許第5,846,937号に記載のように鎮静作用または抗不安作用などの神経作用も有する。かくして、GLP-1アゴニストは、不安、攻撃性、精神病、発作、パニック発作、ヒステリー、または睡眠障害の治療において用いることができる。GLP-1アゴニストはアミロイド-βペプチドおよびグルタミン誘導性アポトーシスに対してニューロンを保護することが示されているため(Perryら、Curr. Alzheimer Res. 2: 377-85 (2005))、GLP-1アゴニストを用いて、アルツハイマー病を治療することもできる。
【０３０４】
GLP-1アゴニストのための他の治療的使用としては、学習能力の改善、神経保護の増強、ならびに例えば、ニューロン新生の調節による中枢神経系の疾患もしくは障害、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ALS、脳卒中、ADD、および神経精神症候群の症候の軽減が挙げられる(米国特許第6,969,702号および米国特許出願第2002/0115605号)。GLP-1アゴニストを用いるニューロン新生の刺激は、例えば、Bertilssonら、J. Neurosci. Res. 86: 326-338 (2008)に記載されている。
【０３０５】
さらに他の治療的使用としては、肝臓幹細胞/前駆細胞の機能的膵臓細胞への変換(米国特許出願公開第2005/0053588号)；β細胞崩壊の防止(米国特許第7,259,233号および第6,569,832号)およびβ細胞増殖の刺激(米国特許出願公開第2003/0224983号)；肥満の治療(米国特許第7,211,557号)；食欲の抑制および満腹の誘導(米国特許出願公開第2003/0232754号)；過敏性腸症候群の治療(米国特許第6,348,447号)；心筋梗塞(米国特許第6,747,006号)および脳卒中(PCT公開第WO 00/16797号)と関連する罹患率および/または死亡率の低下；Q波心筋梗塞が存在しないことを特徴とする急性冠症候群の治療(米国特許第7,056,887号)；術後異化変化の減衰(米国特許第6,006,753号)；冬眠心筋または糖尿病性心筋症の治療(米国特許第6,894,024号)；ノルエピネフリンの血漿レベルの抑制(米国特許第6,894,024号)；尿中ナトリウム排出の増加、尿中カリウム濃度の低下(米国特許第6,703,359号)；毒性循環血液量過多と関連する症状または障害、例えば、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、および高血圧の治療(米国特許第6,703,359号)；変力反応の誘導および心筋収縮能の増加(米国特許第6,703,359号)；多嚢胞性卵巣症候群の治療(米国特許第7,105,489号)；呼吸困難の治療(米国特許出願公開第2004/0235726号)；非消化管経路を介する、すなわち、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、または他の注射もしくは輸液を介する栄養摂取の改善(米国特許第6,852,690号)；ネフロパシーの治療(米国特許出願公開第2004/0209803号)；例えば、異常左心室駆出率を伴う左心室収縮機能障害の治療(米国特許第7,192,922号)；例えば、下痢、術後ダンピング症候群および過敏性腸症候群などの胃腸障害の治療または予防のため、ならびに内視鏡手順における前投薬としての胃十二指腸運動の阻害(米国特許第6,579,851号)；重症多発性ニューロパシー(CIPN)および全身性炎症反応症候群(SIRS)の治療(米国特許出願公開第2003/0199445号)；トリグリセリドレベルの調節および脂質異常症の治療(米国特許出願公開第2003/0036504号および第2003/0143183号)；虚血後の血流の再かん流により引き起こされる器官組織損傷の治療(米国特許第6,284,725号)；冠動脈疾患危険因子(CHDRF)症候群の治療(米国特許第6,528,520号)；ならびにその他が挙げられる。
【０３０６】
(レプチンに基づく療法)
レプチンまたは関連する分子を含む本発明の化合物を用いて、代謝障害、神経疾患、ならびに他の適応症を治療することができる。
【０３０７】
特定の実施形態においては、本発明の化合物を用いて、代謝障害を治療する。そのような障害としては、糖尿病(I型またはII型)、肥満、高血糖、脂質異常症、高トリグリセリド血症、X症候群、インスリン耐性、IGT、糖尿病性脂質異常症、高脂血症、心血管疾患、および高血圧が挙げられる。レプチンは食物摂取を減少させ、かくして、体重を低下させ、食物摂取または体重の減少が有益である疾患を治療するのに用いることができる。
【０３０８】
(投与および用量)
本発明はまた、治療上有効量の本発明の治療用ポリペプチドまたはコンジュゲートを含む医薬組成物を特徴とする。組成物を様々な薬剤送達系における使用のために製剤化することができる。1種以上の生理学的許容し得る賦形剤または担体をまた、適切な製剤のために組成物中に含有させることができる。本発明における使用のための好適な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA、第17版、1985に見出される。薬剤送達のための方法に関する簡単な概説については、例えば、Langer (Science 249: 1527-1533, 1990)を参照されたい。
【０３０９】
医薬組成物は、経皮的手段などによる非経口、鼻内、局所、経口、もしくは局所投与を意図され、予防的および/または治療的処置を意図される。医薬組成物を、非経口的に(例えば、静脈内、筋肉内、もしくは皮下注射による)、または経口摂取によるか、または血管もしくは癌症状により罹患した領域での局所適用もしくは関節内注射により投与することができる。さらなる投与経路としては、血管内、動脈内、腫瘍内、腹腔内、脳室内、硬膜内、ならびに鼻内、眼内、強膜内、眼窩内、直腸、局所、またはエアロゾル吸入投与が挙げられる。デポー注射または浸食性埋込み物もしくは成分などの手段による持続放出投与も本発明に具体的に含まれる。かくして、本発明は、許容し得る担体、好ましくは、水性担体、例えば、水、緩衝化水、塩水、PBSなどに溶解または懸濁された上記薬剤を含む非経口投与のための組成物を提供する。前記組成物はpH調整剤および緩衝化剤、等張性調整剤、湿潤剤、洗剤などの、生理的条件に近づけるために必要とされる製薬上許容し得る補助物質を含んでもよい。本発明はまた、錠剤、カプセル剤などの製剤のための結合剤または充填剤などの不活性成分を含んでもよい経口送達のための組成物も提供する。さらに、本発明は、クリーム、軟膏などの製剤のための溶媒または乳化剤などの不活性成分を含んでもよい経口投与のための組成物を提供する。
【０３１０】
これらの組成物を、従来の滅菌技術により滅菌するか、または滅菌濾過することができる。得られる水性溶液をそのまま使用するために包装するか、または凍結乾燥してもよく、凍結乾燥調製物を投与前に滅菌水性担体と組合わせる。調製物のpHは、典型的には3〜11、より好ましくは5〜9または6〜8、および最も好ましくは7〜8、例えば、7〜7.5である。固体形態の得られる組成物を、錠剤またはカプセル剤の密閉包装中などの固定量の上記薬剤または複数の薬剤をそれぞれ含有する、複数の単回投与単位中に包装することができる。また、固体形態の組成物を、局所適用可能なクリームまたは軟膏のために設計された搾り出し可能なチューブ中などの可撓量のための容器中に包装することもできる。
【０３１１】
有効量を含有する組成物を、予防的または治療的処置のために投与することができる。予防的適用においては、組成物を、臨床的に決定された素因を有するか、または神経疾患もしくは神経変性疾患への罹患性が増加した被験体に投与することができる。本発明の組成物を、臨床疾患の開始を遅延させる、減少させる、または好ましくは防止するのに十分な量で被験体(例えば、ヒト)に投与することができる。治療適用においては、組成物を、疾患(例えば、神経症状または神経変性疾患)に既に罹患している被験体(例えば、ヒト)に、その症状およびその合併症の症候を治癒させるか、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与する。この目的を達成するのに十分な量は、「治療上有効量」と定義され、疾患または医学的症状と関連するいくつかの症候を実質的に改善するのに十分な化合物の量である。例えば、神経変性疾患(例えば、本明細書に記載のもの)の治療においては、疾患または症状の任意の症候を低下させ、防止する、遅延させる、抑制する、または停止させる薬剤または化合物は、治療上有効である。治療上有効量の薬剤または化合物は、疾患もしくは症状を治癒させるには必要とされないが、疾患もしくは症状の開始が遅延される、妨害される、もしくは防止されるか、または疾患もしくは症状の症候が改善されるか、または疾患もしくは症状の期間が変化するか、もしくは例えば、重篤でなくなるか、または個体において回復が加速されるような、疾患もしくは症状の治療を提供する。
【０３１２】
この使用にとって有効な量は、疾患または症状の重篤度ならびに被験体の体重および一般的な状態に依存してよいが、一般的には被験体あたり用量あたり約0.05μg〜約1000μg(例えば、0.5〜100μg)の範囲の等量の薬剤である。初回投与および追加投与のための好適なレジメンは、初回投与、次いで、1以上の時間、日、週、または月の間隔の反復用量のその後の投与を典型とする。本発明の組成物中に存在する薬剤の合計有効量を、単回用量として、ボーラスもしくは輸液として、比較的短期間にわたって哺乳動物に投与するか、または複数用量をより長期間(例えば、4〜6、8〜12、14〜16、もしくは18〜24時間毎、または2〜4日、1〜2週間毎、月に1回の投与)にわたって投与する分画治療プロトコールを用いて投与することができる。あるいは、血液中で治療上有効濃度を維持するのに十分な連続静脈内輸液が想定される。
【０３１３】
本発明の組成物内に存在し、哺乳動物(例えば、ヒト)に適用される本発明の方法において用いられる1つ以上の薬剤の治療上有効量を、当業者であれば哺乳動物の年齢、体重、および症状の個体差を考慮して決定することができる。本発明の特定の化合物はBBBを通過する増強された能力を示すため、本発明の化合物の用量は非コンジュゲート化薬剤の治療効果に必要とされる等価用量よりも低い(例えば、約90%、75%、50%、40%、30%、20%、15%、12%、10%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、または0.1%未満またはそれと等しい)ものであってよい。本発明の薬剤を、治療される被験体において望ましい結果(例えば、ニューロンの保存、新しいニューロン増殖)をもたらす量である有効量で被験体(例えば、ヒトなどの哺乳動物)に投与する。当業者であれば、治療上有効量を経験的に決定することもできる。
【０３１４】
被験体は、1週間あたりに1回以上(例えば、1週間あたり2、3、4、5、6または7回以上)、用量あたり、非コンジュゲート化薬剤と比較して約0.05〜1,000μgの等価用量、1週間あたり0.1〜2,500(例えば、2,000、1,500、1,000、500、100、10、1、0.5、または0.1)μgの用量の範囲の薬剤を受容することもできる。被験体はまた、2または3週間毎に1回、用量あたり0.1〜3,000μgの範囲の前記組成物の薬剤を受容することができる。
【０３１５】
有効量を含む本発明の組成物の単回または複数回投与を、治療する医師により選択される用量レベルおよびパターンで実行することができる。用量および投与スケジュールを、被験体における疾患または症状の重篤度に基づいて決定および調整し、医師または本明細書に記載の者により一般的に実施される方法に従う治療の過程を通してモニターすることができる。
【０３１６】
本発明の化合物を、治療もしくは療法の従来の方法と組合せて用いるか、または治療もしくは療法の従来の方法とは別々に用いることができる。
【０３１７】
本発明の化合物を他の薬剤との組合せ療法において投与する場合、それらを連続的に、または同時に個体に投与することができる。あるいは、本発明による医薬組成物は、本明細書に記載の製薬上許容し得る賦形剤と結合した本発明の化合物と、当業界で公知の別の治療剤または予防剤との組合せから構成されていてもよい。
【０３１８】
(さらなるコンジュゲーション)
本発明の組成物および方法において、コンジュゲートまたは治療用ポリペプチドを、治療剤、検出可能な標識、または本明細書に記載の任意の他の薬剤などの別の薬剤にさらに連結することができる。コンジュゲートは、疾患または症状の検出のための、放射性画像化剤、例えば、放射線を放出するものなどの検出可能な標識で標識することができる。他の実施形態においては、本発明の担体もしくはその機能的誘導体またはその混合物を、疾患もしくは症状を治療するための治療剤に連結するか、またはその混合物に連結するか、もしくはそれで標識することができる。治療用化合物にさらにコンジュゲートされた本発明のコンジュゲートを、BBBを通過するか、または治療が有益である他の細胞もしくは組織への薬剤の輸送を可能にする条件下で、個体に投与することによって、そのような治療を行うことができる。
【０３１９】
本明細書で用いられる治療剤は、細胞の殺傷を可能にする薬物、医薬、放射線を放出する薬剤、細胞毒素(例えば、化学療法剤)および/もしくはその生物学的に活性な断片、ならびに/またはその混合物であってよく、またはそれは治療される個体における疾患もしくは症状を治療する、治癒させる、軽減する、改善する、減少させるか、もしくは阻害する薬剤であってもよい。治療剤は合成産物または菌類、細菌もしくは他の微生物、例えば、マイコプラズマ、ウイルスなど、動物、例えば、爬虫類、または植物起源の産物であってもよい。治療剤および/またはその生物学的に活性な断片は、酵素的に活性な薬剤および/もしくはその断片であってよく、または重要な、および/もしくは必須の細胞経路を阻害もしくは遮断することにより、または重要な、および/もしくは必須の天然の細胞成分と競合することにより作用してもよい。
【０３２０】
本発明の化合物、コンジュゲートおよび組成物の共有改変は、本発明の範囲内に含まれる。当業界で周知の方法を用いる直接化学的合成により、化学的誘導体を都合良く調製することができる。そのような改変を、例えば、標的化されたアミノ酸残基と、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤とを反応させることにより、ポリペプチド、薬剤、またはコンジュゲート中に導入することができる。輸送ベクター誘導体は、例えば、BBBを通過し、別の薬剤と結合またはコンジュゲートされることによって、その薬剤をBBBを通過して輸送することができる。本発明のコンジュゲートを、限定されるものではないが、スルフヒドリル基、アミノ基(アミン)および/または炭水化物を介して、好適な検出可能な標識または治療剤に連結(すなわち、コンジュゲート)することができる。ホモ二官能性およびヘテロ二官能性架橋剤(コンジュゲーション剤)が多くの商業的起源から入手可能である。架橋に利用可能な領域は、本発明の担体上に見出すことができる。架橋剤は、例えば、短いアーム(2個未満の炭素鎖)、中サイズのアーム(2〜5個の炭素鎖)、または長いアーム(3〜6個の炭素鎖)などの可撓性アームを含んでもよい。架橋剤の例としては、BS3([ビス(スルホスクシンイミジル)スベラート]；BS3は接近可能な一級アミンを標的化するホモ二官能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステルである)、NHS/EDC(N-ヒドロキシスクシンイミドおよびN-エチル-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド；NHS/EDCは一級アミン基とカルボキシル基とのコンジュゲーションを可能にする)、スルホ-EMCS([N-ε-マレイミドカプロン酸]ヒドラジド；スルホ-EMCSはスルフヒドリルおよびアミノ基に対して反応するヘテロ二官能性反応基(マレイミドおよびNHS-エステル)である)、ヒドラジド(多くのタンパク質は露出した炭水化物を含み、ヒドラジドはカルボキシル基を一級アミンに連結するための有用な試薬である)、ならびにSATA(N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート；SATAはアミンに対して反応し、保護されたスルフヒドリル基を付加する)が挙げられる。
【０３２１】
(実施例)
【実施例１】
【０３２２】
(Angiopep-2-Cysのより短い類似体(P1〜P6)の合成)
SPPS(固相ペプチド合成)を、Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)アミノ末端保護を用いるProtein Technologies, Inc. Symphony(登録商標)ペプチド合成装置上で実行した。より短いAngiopepを、樹脂に対して5倍過剰のFmoc-アミノ酸(200 mM)を用いて100μmol規模で合成した。粗ペプチドを氷冷エーテルを用いて沈降させ、RP-HPLCクロマトグラフィー(Waters Delta Prep 4000)により精製した。アセトニトリルを回収した画分から蒸発させ、凍結乾燥したところ、純白色の固体(純度>95%)が得られた。ESI-TOF MS(Bruker Daltonics)により質量を確認した。表4はAngiopep-2-Cys(AN2-Cys)および様々なより短い類似体(P1〜P6)の配列を提供する。
【表４】
2013530993.tif 000043
【実施例２】
【０３２３】
(より短い類似体P1およびP5の輸送)
より短い類似体P1およびP5がBBBを通過することを確認するために、当業界で標準的な方法を用いてin situ脳かん流を実施した。初期輸送を時間の関数として測定した。結果は、P1およびP5の脳取込みが、Angiopep-2(An2)についてと類似するか、またはそれより高いことを示している(図1)。毛細管除去法(capillary depletion)も行って脳実質中に見出される類似体の量を定量した(図1)。An2およびP1と比較した場合、類似するか、またはより高いレベルのP5が脳実質中に見出された。さらに、これらの結果は、類似体が脳の毛細血管中に捕捉されないことを示している。全体として、本発明者らの結果は、新しいより短い類似体P1およびP5がBBBを効率的に通過することを証明している。
【実施例３】
【０３２４】
(P5およびP6のニューロテンシン誘導体の特性評価)
本発明者らは、より短い類似体が、構造：
【化３２】
2013530993.tif 000044
【０３２５】
を有するANG2002(EMCSリンカーを介してAngiopep-2にコンジュゲートさせた改変ニューロテンシン(NT))と比較して、マウスにおいて鎮痛または持続的低体温を誘導することができるかどうかを試験するための実験を行った。試験されたコンジュゲートは、配列KRNNFKTEEYC-pELYENKPRRPYILを有するP5-NTおよび配列KRNNFKYC-pELYENKPRRPYILを有するP6-NT(ここで、P5およびP6は両方とも、EMCSリンカーを介してNTのリジンにコンジュゲートされ、pEはピロ-L-グルタミン酸を表す)を含んでいた。
【０３２６】
鎮痛の誘導を決定するために、本発明者らは、対照マウスならびに等価用量のニューロテンシンのANG2002、P5-NTおよびP6-NTを受容するマウスにおける、ホットプレート足露出行動および足舐め行動との間の待ち時間を試験した。かくして、マウスはANG2002の静脈内20 mg/kgボーラス注射、P5-NTの静脈内16 mg/kgボーラス注射、またはP6-NTの静脈内14 mg/kgボーラス注射を受けた。試験したコンジュゲートは全て、注射の15分後に足舐め行動の待ち時間を増加させ、かくしてANG2002、P5-NTおよびP6-NTが鎮痛剤として作用することができることを示している(図2)。
【０３２７】
本発明者らは、より短い類似体がANG2002と比較してマウスにおいて持続的低体温を誘導することができるかどうかを試験するためのさらなる実験を行った。マウスは、ANG2002の静脈内20 mg/kgボーラス注射、P5-NTの静脈内16 mg/kgボーラス注射またはP6-NTの静脈内14 mg/kgボーラス注射を受けた。体温は注射後低下し続けた；かくして、ANG2002、P5-NTおよびP6-NTは低体温の誘導において同等な活性を有する(図3)。
【実施例４】
【０３２８】
(D-異性体を有するより短い類似体の経口製剤の例)
Angiopep-2およびより短いその類似体を有する経口製剤を作製することができる。ペプシンおよびトリプシンの切断部位を決定し、特定のアミノ酸をその対応するD-異性体で置換することにより、より短い類似体を調製した。図4は、Angiopep-2(すなわち、ペプシンについては位置1、2、3、4、14、18および19のC末端ならびにトリプシンについては位置8、10、11および15のC末端)およびP6a(すなわち、トリプシンについては位置6のC末端)の予測される切断部位を示す。
【０３２９】
経口製剤(1 mg/mLのAngiopepペプチド)の安定性を、胃液中に存在する酵素である1 mg/25 mLのペプシン(41倍希釈、pH = 1.4)の存在下、37℃で決定した。表5は、様々なAngiopepペプチドの分解の半減期(t1/2)を提供する。
【表５】
2013530993.tif 000045
【０３３０】
一般に、同じアミノ酸残基の全部のL-異性体を有する類似体と比較して、D-異性体を有する類似体について半減期は増加した。特に、D-アミノ酸置換(An2の位置10、11および14に相当する)を有する短縮された類似体は、18時間を超える半減期を有するポリペプチドおよびトリプシンのためのただ1個の切断部位を提供した(表5および図4中のP6aを参照されたい)。全体として、本発明者らの結果は、D-異性体を有する新しいより短い類似体は一般に、分解に対してより安定であることを証明している。
【実施例５】
【０３３１】
(D-異性体を有する類似体のニューロテンシン誘導体のin vitroでの特性評価)
本発明者らは、D-異性体を有するより短いコンジュゲートが、[3H]-ニューロテンシンを用いるヒト結腸腺癌(HT29)細胞アッセイにおいてニューロテンシン受容体に競合的に結合することができるかどうかを試験するための実験を行った。試験したコンジュゲートは、ANG2002、P5a-NT、P6-NTおよびP6a-NT(ここで、P5a、P6およびP6aの配列は表5に提供される)を含んでいた。これらのコンジュゲートに関して、「NT」はpELYENKPRRPYIL(式中、pEはピロ-L-グルタミン酸を表す)であり、P5a、P6、P6aはEMCSリンカーを介してNTのリジンにコンジュゲートされる。
【０３３２】
P5a-NTおよびP6a-NTは、表6に示されるように、3個のD-アミノ酸置換を含んでいた。結果は、P5a、P6、およびP6aがAngiopep-2(すなわち、ANG2002として)よりも強力であることを示唆する(図5および表6)。特に、3個のD-アミノ酸置換を有するP6a-NTは、同じ配列を有するが、L-アミノ酸残基のみを有するP6-NTと同等のIC50値を有していた。
【表６】
2013530993.tif 000046
【実施例６】
【０３３３】
(D-異性体を有するP6aのニューロテンシン誘導体の輸送)
D-異性体を有するより短いコンジュゲートがBBBを通過することを確認するために、当業界で標準的な方法を用いてin situ脳かん流を実施した。初期輸送を時間の関数として測定した。試験したコンジュゲートは、実施例3および5に記載のようにP6-NT、P6a-NTおよびANG2002を含んでいた。結果は、P6-NTおよびP6a-NTの脳取込みがANG2002のものと類似し、P6a-NTの脳取込みがP6-NTのものよりも高いことを示す(図6)。毛細管除去法も行って、脳実質中に見出される類似体の量を定量し、P6a-NTはP6-NTと比較して実質中の存在の増加を示した(図6)。さらに、本発明者らの結果は、D-アミノ酸残基を有する新しいより短いコンジュゲートP6a-NTは、D-アミノ酸残基を欠くコンジュゲートP6-NTよりも効率的にBBBを通過することを証明している。
【実施例７】
【０３３４】
(D-異性体を有するニューロテンシン誘導体による低体温の誘導)
本発明者らは、D-異性体を有するより短いコンジュゲートが、AN2-NT(図9に示されるように、Angiopep-2およびニューロテンシンを含む融合タンパク質)と比較して、マウスにおいて持続的低体温を誘導することができるかどうかを試験するための実験を行った。試験したコンジュゲートは、上記の表6に提供されたように、P5-NT、P5a-NT、P6-NTおよびP6a-NTを含んでいた。マウスは、AN2-NT、P5-NT、P5a-NT、P6-NTおよびP6a-NTの静脈内4.682μmol/kgボーラス注射(AN2-NTの20 mg/kgに等しい)を受けた。試験したコンジュゲートの注射後、体温は低下し続けた(図7および8)。特に、D-異性体を有するより短いコンジュゲートP5a-NTおよびP6a-NTはAN2-NTおよびD-異性体を欠くより短いペプチドと比較して、マウスにおいて体温に対する増加した効果を有していた。
【実施例８】
【０３３５】
(より短いNT1ニューロテンシン誘導体を有するコンジュゲートの合成)
コンジュゲートの長さを減少させるために、ニューロテンシンのさらに短縮された誘導体(NT1)も調製した。SPPS(固相ペプチド合成)を、Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)アミノ末端保護を用いるProtein Technologies, Inc. Symphony(登録商標)ペプチド合成装置上で実行した。ニューロテンシン類似体を含む、および含まないより短いAngiopepを、樹脂に対して5倍過剰のFmocアミノ酸(200 mM)を用いて100μmol規模で合成した。粗ペプチドを氷冷エーテルを用いて沈降させ、RP-HPLCクロマトグラフィー(Waters Delta Prep 4000)により精製した。回収された画分からアセトニトリルを蒸発させ、凍結乾燥したところ、純白色の固体(純度>95%)が得られた。ESI-TOF MS(Bruker Daltonics)により質量を確認した。表7は様々なより短い類似体(P5a〜P6c)およびニューロテンシン誘導体NT1：Ac-KRRP(D-Y)ILを有する対応するコンジュゲート(ここで、より短い類似体(P5a〜P6c)はEMCSリンカーを介してNT1のリジンにコンジュゲートされる)の配列を提供する。
【表７】
2013530993.tif 000047
【実施例９】
【０３３６】
(D-異性体を有するニューロテンシン(6-13)類似体のコンジュゲートの切断部位)
また、ペプシンおよびトリプシンの可能な切断部位を決定し、これらの切断部位のアミノ酸残基を、同じアミノ酸残基の1個以上のD-異性体で置換することにより、より短いコンジュゲートを設計した。図9は、酵素切断部位を決定するための予測モデルであるPeptideCutterにより決定されたAn2-NTおよびより短いコンジュゲートの切断部位の例を示し、表8は図9の配列のアラインメントを提供する。全体として、標的化部分中(すなわち、P6aまたはP6b配列中)およびニューロテンシン誘導部分中にD-アミノ酸置換を含有させることにより、切断部位の減少を予測した(図9)。
【表８】
2013530993.tif 000048
【実施例１０】
【０３３７】
(より短いNT1ニューロテンシン誘導体のコンジュゲートの輸送)
より短いAngiopep類似体およびより短いニューロテンシン誘導体の両方を有するコンジュゲートがBBBを通過することを確認するために、当業界で標準的な方法を用いてin situ脳かん流を行った。P5a-NT1、P5b-NT1、P5c-NT1およびP6a-NT1の初期輸送を、時間の関数として測定した。これらのペプチドの配列は実施例8に記載されている。結果は、これらのペプチドの脳取込みがニューロテンシン(NT)についてよりも高いことを示す(図10)。毛細管除去法も行って、脳実質中に見出される類似体の量を定量した(図10)。全体として、本発明者らの結果は、D-アミノ酸残基を有する新しいより短いコンジュゲートがBBBを通過することを証明している。
【実施例１１】
【０３３８】
(様々なニューロテンシン誘導体の活性の比較)
本発明者らは、より短いコンジュゲートが、ANG2002(上記の実施例3で示された)、AN2-Ahx-NT(アミノヘキサン酸(Ahx)リンカーを介して配列ELYENKPRRPYILを有するニューロテンシンにコンジュゲートされたAngiopep-2)およびAN2-NT(図9に示されるように、配列ELYENKPRRPYILを有するニューロテンシンに直接コンジュゲートされた(すなわち、リンカーなしに)Angiopep-2)と比較して、マウスにおいて持続的鎮痛、低体温、および/または低血圧を誘導することができるかどうかを試験するための実験を行った。試験したコンジュゲートは、P5-NT、P5a-NT、P6-NT、P6a-NT、P5a-NT1およびP6a-NT1(上記の実施例5および8に記載された)を含んでいた。
【０３３９】
表9は、これらの結果の概要を提供する。An2-Ahx-NTにより誘導された鎮痛、低体温、および低血圧はANG2002と類似し、リンカーの使用は活性を維持した。D-異性体を含むより短いペプチドP5a-NTおよびP6a-NTはマウスにおける体温に対する増加した効果を提供し、ANG2002と比較してその鎮痛特性を保持した。ニューロテンシン断片NT1を有する短いAngiopep(Ac-KRRP(D-Y)IL)は活性の低下をもたらしたが、標的化部分とNT1との間にリンカーを用いることにより、またはNT1配列をより長いNT配列で置換することにより、活性を保持することができる。
【表９】
2013530993.tif 000049
【０３４０】
(他の実施形態)
本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、および特許は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０３４１】
本発明の記載された方法および系の様々な改変および変更は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明を特定の望ましい実施形態に関連して説明してきたが、特許請求された本発明はそのような特定の実施形態に不当に制限されるべきではないことが理解されるべきである。実際、医学、薬理学の分野、または関連する分野におけう当業者にとって自明である本発明を実行するための記載の様式の様々な改変は、本発明の範囲内にあると意図される。
【図１】
2013530993.tif 000051
【図２】
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【図３】
2013530993.tif 000053
【図４】
2013530993.tif 000054
【図５】
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【図６】
2013530993.tif 000056
【図７】
2013530993.tif 000057
【図８】
2013530993.tif 000058
【図９】
2013530993.tif 000059
【図１０】
2013530993.tif 000060
【配列表】
2013530993000001.app
【国際調査報告】
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2013530993.tif 000062
2013530993.tif 000063
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