(57)【要約】  本発明のある態様は、小分子自食作用阻害剤、ならびに癌および急性膵炎の治療および予防のためのそれらの使用に関する。本明細書に開示されるように、自食作用の小分子阻害剤は、公知の生物活性ライブラリーにおいて画像ベース選別から特定された。この自食作用阻害剤は、自食作用を開始するために必要とされるタイプＩＩＩ  Ｐ１３キナーゼ錯体の分解を促進することによって機能することが分かった。医薬化学研究により、改善された効力および選択性を持った小分子自食作用阻害剤がもたらされた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎが０、１、２、３または４であり；
Ｙが−Ｃ（Ｒ１）＝または−Ｎ＝であり；
Ｒが−Ｈ、低級アルキル、−ＣＨ３、低級フルオロアルキル、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、−ＣＦ３、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、または低級アルキニルであり；
Ｒ１が独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−Ｃ（＝Ｏ）（低級アルキル）、−ＣＮ、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（低級フルオロアルキル）、−Ｓ（＝Ｏ）（低級アルキル）、−Ｓ（＝Ｏ）２（低級アルキル）および−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（低級アルキル）からなる群からそれぞれ選択され；
Ｒ２およびＲ３が独立して、−Ｈ、低級アルキル、低級フルオロアルキル、低級アルキニルおよびヒドロキシアルキルからなる群から選択され；
Ｘが−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（低級アルキル）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；
Ｚがフェニル、ピリジル、ビニル、モルフィニル、フェナンスロリニル、ナフチル、フリルまたはベンゾ［ｄ］チアゾリルであり；そして−ＣＨ３、低級アルキル、フルオロアルキル、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、低級フルオロアルコキシ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、低級アルコキシ、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＦ３、および３，４−メチレンジオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されている、
式Ｉ：
【化１】
2013500255.tif 000017
で表されることを特徴とする化合物またはそれの、製薬上許容される塩、生物学的に活性な代謝産物、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、エナンチオマーもしくは立体異性体；
ただし、前記化合物は、
【化２】
2013500255.tif 000018
（式中、ＪはＣｌ、ＯＣＨＦ２、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＦ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）２、Ｏ（ＣＨ２）３ＣＨ３、またはＯ（シクロペンチル）である）
ではない。
【請求項２】
Ｙが−Ｃ（Ｒ１）＝であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｎが存在し、Ｙが−Ｎ＝であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒが−Ｈであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
少なくとも１つのＲ１が−ＮＨ２、−Ｃｌ、−ＮＯ２、−Ｉ、または−ＯＭｅであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
少なくとも１つのＲ１が−ＮＨ２、−Ｃｌ、−ＮＯ２、−Ｉ、または−ＯＭｅであり；少なくとも２つのＲ１が−Ｈであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ２が−ＣＨ３であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ２が−Ｈであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ３が−ＣＨ３であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ３が−Ｈであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｘが−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（低級アルキル）−または−ＣＨ２−であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｘが−Ｎ（Ｈ）−または−Ｎ（低級アルキル）−であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｘが−Ｎ（Ｈ）−であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｚが、−ＣＨ３、低級アルキル、フルオロアルキル、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、低級フルオロアルコキシ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、低級アルコキシ、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＦ３、および３，４−メチレンジオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されたフェニルであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
ｎが０、１、または２であり；
Ｙが−Ｃ（Ｒ１）＝または−Ｎ＝であり；
Ｒが−Ｈ、低級アルキル、−ＣＨ３、低級フルオロアルキル、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、または−ＣＦ３であり；
Ｒ１が独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは−ＮＯ２からなる群からそれぞれ選択され；
Ｒ２およびＲ３が独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３または−ＣＨ（ＣＨ３）２からなる群から選択され；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ８が独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉからなる群から選択され；
Ｒ６およびＲ７が独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、またはＩからなる群から選択されるか；またはＲ６およびＲ７が一緒になって−ＯＣＨ２Ｏ−である、
【化３】
2013500255.tif 000019
で表されることを特徴とする化合物またはそれの、製薬上許容される塩、生物学的に活性な代謝産物、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、エナンチオマーもしくは立体異性体；
ただし、前記化合物は
【化４】
2013500255.tif 000020
ではない。
【請求項１６】
Ｙが−Ｃ（Ｒ１）＝であることを特徴とする請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｙが−Ｎ＝であることを特徴とする請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
ｎが存在し、Ｒが−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２または−ＣＦ３であることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
ＲがＨであることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒが−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２または−ＣＦ３であることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ１が−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉであることを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ１が−ＣＨ３であることを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ１が−ＮＯ２であることを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ２が−Ｈであることを特徴とする請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ２が−ＣＨ３であることを特徴とする請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ３が−Ｈであることを特徴とする請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ３が−ＣＨ３であることを特徴とする請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ４が−Ｈであることを特徴とする請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ４が−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＨ３または−ＯＣＨ３であることを特徴とする請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｒ５が−Ｈであることを特徴とする請求項１５〜２９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｒ５が−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＨ３または−ＣＦ３であることを特徴とする請求項１５〜２９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｒ６が−Ｈであることを特徴とする請求項１５〜３１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｒ６が−Ｆ、−Ｃｌまたは−Ｂｒであることを特徴とする請求項１５〜３１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｒ６が−ＣＨ３または−ＣＦ３であることを特徴とする請求項１５〜３１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｒ６が−ＯＣＨ３または−ＯＣＦ３であることを特徴とする請求項１５〜３１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ６およびＲ７が一緒になって−ＯＣＨ２Ｏ−であることを特徴とする請求項１５〜３１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３７】
Ｒ７が−Ｈであることを特徴とする請求項１５〜３６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３８】
Ｒ８が−Ｈであることを特徴とする請求項１５〜３７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３９】
【化５−１】
2013500255.tif 000021
【化５−２】
2013500255.tif 000022
【化５−３】
2013500255.tif 000023
【化５−４】
2013500255.tif 000024
からなる群から選択されることを特徴とする化合物、またはそれの製薬上許容される塩。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれか一項に記載の化合物、またはそれの、製薬上許容される塩、生物学的に活性な代謝産物、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、エナンチオマーもしくは立体異性体と；製薬上許容される希釈剤または担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項４１】
請求項１〜３９のいずれか一項に記載の、治療効果のある量の１つ以上の化合物、または請求項４０に記載の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含むことを特徴とする、癌、膵炎、神経変性、炎症性疾病、感染病、または細胞内病原体によって引き起こされた感染の治療方法。
【請求項４２】
癌を治療するためであることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記癌が、白血病、非小細胞肺癌、大腸癌、中枢神経系癌、メラノーマ、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、および乳癌からなる群から選択されることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
膵炎を治療するためであることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
神経変性を治療するためであることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
血管性認知症、初老期認知症、ダウン症候群における神経変性、およびＨＩＶ関連認知症からなる群から選択される神経変性状態を治療するためであることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
神経変性を治療するためであり；そして前記神経変性状態を有する前記対象において認知を高めるかまたは認知低下を阻害することを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
細胞内病原体によって引き起こされた感染を治療するためであることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記感染が細菌またはウィルスによって引き起こされることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも１つの追加の治療薬を投与する工程をさらに含むことを特徴とする請求項４１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも１つの追加の治療薬が請求項１〜３９のいずれか一項に記載の前記１つ以上の化合物、または請求項４０に記載の医薬組成物と同時に投与されることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記少なくとも１つの追加の治療薬が請求項１〜３９のいずれか一項に記載の前記１つ以上の化合物、または請求項４０に記載の医薬組成物と順次投与されることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記少なくとも１つの追加の治療薬が抗血管新生薬であることを特徴とする請求項５１または請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗血管新生薬が、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、カルボキシアミドトリアゾール、ＴＮＰ−４７０、ＣＭ１０１、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、血小板因子−４、スラミン、ＳＵ５４１６、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦＲ拮抗薬、ヘパリンと一緒の血管新生抑制ステロイド、軟骨由来血管新生阻害因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、アンギオスタチン、エンドスタチン、２−メトキシエストラジオール、テコガラン、トロンボスポンジン、プロラクチン、αＶβ３阻害剤およびリノミドからなる群から選択されることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記少なくとも１つの追加の治療薬が、解糖依存性癌を解糖できない細胞に変換する抗癌化合物であることを特徴とする請求項５１または請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
解糖依存性癌を解糖できない細胞に変換する前記抗癌化合物が、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、カルマスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、ミトキサントロン、プレドニゾン、デキサメタゾン、タモキシフェン、フルベストラント、アナストロゾール、レトロゾール、酢酸メゲストロール、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、ｇｌｅｅｖａｃ、イレッサ、タルセバ、ハーセプチン、アバスチン、Ｌ−アスパラギナーゼおよびトレチノインからなる群から選択されることを特徴とする請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
脱ユビキチン化プロテアーゼ錯体を請求項１〜３９のいずれか一項に記載の１つ以上の化合物と接触させる工程を含むことを特徴とする脱ユビキチン化プロテアーゼ錯体の不活性化方法であって、前記脱ユビキチン化プロテアーゼ錯体がＵＳＰ３、ＵＳＰ１０、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ１６およびＵＳＰ１８を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１０年１月２０日出願の米国仮特許出願第６１／２９６，７３５号明細書および２００９年７月２１日出願の米国仮特許出願第６１／２２７，１６４号明細書に対する優先権を主張するものであり；それらの両方の内容はそれらの全体を参照することにより本明細書に援用される。
【政府支援】
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって授与されたＰＯ１  ＡＧ０２７９１６、Ｒ３７  ＡＧ０１２８５９およびＤＰ１  ＯＤ０００５８０の下での政府支援で行われた。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、自食作用の強力な小分子阻害剤、およびそれの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｖｐｓ３４（液胞タンパク質仕分け３４）、タイプＩＩＩ  ＰｔｄＩｎｓ３キナーゼ（ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ）は、酵母における液胞加水分解酵素仕分けの調整剤として最初に特定された（非特許文献１）。Ｖｐｓ３４は、ホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）のイノシトール環のＤ−３位を特異的にホスホリル化してＰｔｄＩｎｓ３Ｐを生成する（非特許文献２）。ＰｔｄＩｎｓ３Ｐは、エンドソームからリソソームへの輸送、逆行エンドソームからＧｏｌｇｉへのトラフィック、多小胞体形成および自食作用を含む、多重の重要な細胞内膜トラフィッキング経路の制御に関与している（非特許文献３；非特許文献４）。ＰｔｄＩｎｓ３Ｐは、自食作用、細胞内小器官および大きいタンパク質錯体のターンオーバーに関与する進化的に保存される異化作用機構の開始のために必要とされる。
【０００５】
Ｖｐｓ３４は、酵母における２つの錯体：自食作用に関与する錯体Ｉ（Ｖｐｓ３４、Ｖｐｓ１５、Ｖｐｓ３０／Ａｔｇ６、およびＡｔｇ１４）、ならびに液胞タンパク質仕分け経路における錯体ＩＩ（Ｖｐｓ３４、Ｖｐｓ１５、Ｖｐｓ３０／Ａｔｇ６、およびＶｐｓ３８）中に存在する（上に引用された、非特許文献４）。哺乳類細胞では、Ｖｐｓ３４は、酵母においてそれらの同族の錯体と類似に機能する可能性がある、少なくとも２つのタンパク質錯体、Ｖｐｓ３４錯体ＩおよびＶｐｓ３４錯体ＩＩにおいて見いだされる。２つの哺乳類Ｖｐｓ３４錯体は、それぞれ、酵母Ｖｐｓ３４、Ｖｐｓ３０／Ａｔｇ６およびＶｐｓ１５と同族である、Ｖｐｓ３４、ベクリン１（Ｂｅｃｌｉｎ１）およびｐ１５０のコア成分を共有している。さらに、錯体ＩはＡｔｇ１４Ｌ、飢餓中に分離膜／ファゴホアに限局され、そして自食胞形成に必須である、酵母Ａｔｇ１４Ｌの哺乳類相同分子種を含有し；一方、錯体ＩＩは、主として後期エンドソームに限局される、ＵＶＲＡＧ、酵母におけるＶｐｓ３８と同族体を含有する（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。興味深いことに、Ｖｐｓ３４錯体の異なる成分の安定性は、一成分のノックダウンが錯体中のその他のもののレベルを多くの場合に下げるので互いに共依存性である（上に引用された、非特許文献５）。しかし、依然として、多重小胞トラフィッキング経路を調整するのに重要な役割を果たす可能性があるＶｐｓ３４錯体の安定性を調整する機構に関してほんのわずかなことしかわかっていない。
【０００６】
自食作用は、リソソーム依存様式で細胞内構成要素のターンオーバーを仲介する異化プロセスである（非特許文献９）。自食作用は、自食胞と呼ばれる、二重膜小胞を形成することによって、大きいタンパク質錯体および欠陥がある細胞小器官を含む、細胞質の取込み部まで広がる、分離膜の形成により開始される。自食胞の中身は、リソソームとのその融合後にリソソームの加水分解酵素によって分解されてオートリソソームを形成する。自食作用は、遊離アミノ酸、脂肪酸およびヌクレオチドなどの自食分解の産物が栄養素制限条件下に生き延びるために構成要素またはエネルギー源として細胞によって使用され得るので、飢餓状態を生き延びるための戦略として単細胞真核生物において幅広く研究されてきた（非特許文献９；および非特許文献１０）。
【０００７】
自食作用のコア分子機構は、酵母から哺乳類へと進化的に保存された一群のＡＴＧ遺伝子によってエンコードされたタンパク質産物によって制御される。自食小胞の核形成は、ＰｔｄＩｎｓ３Ｐ、自食胞の形成を仲介するのに順次機能する、２つのユビキチン様分子、Ａｔｇ１２およびＬＣ３（Ａｔｇ８の同族体）だけでなく、ベクリン１（酵母Ａｔｇ６の哺乳類同族体）およびＶｐｓ３４を含むタイプＩＩＩ  ＰＩ３キナーゼ錯体の産物を必要とする。第１のユビキチン化様反応において、Ａｔｇ１２はＡｔｇ５に接合し、自食胞の核形成を決定するのに重要な役割を果たす、大きい多量体タンパク質錯体を形成する。第２の反応において、ＬＣ３はホスファチジル−エタノールアミンに接合し、自食胞の伸びおよび閉鎖にとって重要な膜輸送をもたらす（非特許文献１１；および非特許文献１０）。
【０００８】
後生動物においては、自食作用は、正常に動作しない、老化したまたは損傷したタンパク質および細胞小器官のターンオーバーを仲介することによって細胞恒常性に関与する本質的な細胞内異化機構として機能する（非特許文献１０）。自食作用のダウンレギュレーションは、異常な折り畳み構造のタンパク質の蓄積を増やすことによって神経変性に関与する（非特許文献１２；および非特許文献１３）。自食作用はまた、ＤＮＡ損傷、細胞内病原体によるＥＲストレスおよび浸潤を含む、栄養素飢餓を越えて細胞ストレスの多くの形態への応答において活性化され得、先天性免疫および獲得免疫の両方（非特許文献１４）に、ならびに腫瘍抑制（非特許文献１５）に関与することが示されたきた。哺乳類細胞における自食作用を調整する機構の研究は始められたばかりである。
【０００９】
自食作用は、細胞恒常性を調整するのに重要な役割を果たし、かつ、細胞生存、成長、分化およびホスト防御応答に関与する。自食作用の異常調整は、癌、神経変性、炎症性疾病および感染病を含む多数のヒト疾病にかかわっている。自食作用に関する最新知識のほとんどは、自食作用「Ａｔｇ」遺伝子の特定へと至った酵母における見事な遺伝学研究に由来したものである。近年の研究は、酵母から哺乳類へのコア自食作用遺伝子の進化的保存を実証してきたが；哺乳類自食作用の機構および調整は、依然としてほとんどわかっていない複雑性の著しい増加を示してきた。
【００１０】
自食作用は癌の進行および治療において複雑な役割を果たすことが提案されてきた。自食作用の活性化は、代謝的ストレス下に腫瘍細胞生存を助長し、そして腫瘍成長に有利に働く壊死細胞死およびその後の炎症を防止することによって腫瘍抑制機構として機能する可能性がある（非特許文献１６）。他方で、自食作用の阻害は、癌のマルチプルラインにおけるベクリン１ヘテロ接合性の頻度の増加を説明し得る未知の機構を通じたゲノム不安定性（非特許文献１７；および非特許文献１８）、ならびに悪性上皮卵巣癌における自食作用関連タンパク質の発現の減少（非特許文献１９）を引き起こす可能性がある。このように、自食作用の長期的抑制は腫瘍形成を刺激する可能性がある。
【００１１】
抗癌治療における自食作用の提案された役割は、腫瘍形成中のものと反対である。いったん腫瘍が形成されると、自食作用の急性阻害は、放射線増感および化学増感を促進することによって治療目標にとって有益である可能性がある（非特許文献２０）。癌治療の動物モデルにおいて、重要な自食作用遺伝子ＡＴＧ５に抗するｓｈＲＮＡを使ってか抗マラリア薬物クロロキンを使ってかのどちらかの治療誘発自食作用の阻害は、活性化ｐ５３かアルキル化化学治療かのどちらかが腫瘍細胞死を推進するために用いらされた、Ｍｙｃ駆動腫瘍の細胞死および腫瘍退縮を高めた（非特許文献２１）。クロロキンは、大きい自食小胞の用量依存性蓄積を引き起こし、アルキル化治療誘発細胞死をＡＴＧ５のノックダウンと類似の程度まで高める。別の例において、ＴＲＡＩＬに対する抵抗は、阻害のために、ベクリン１またはＶｐｓ３４などの、自食プロセスの特異的な成分を標的とするという一般的アプローチによって逆転されることが分かった（非特許文献２２）。慢性の骨髄性白血病（ＣＭＬ）の場合に、クロロキンによる自食作用の阻害は、イマチニブによって誘発される、ＣＭＬ細胞株、Ｋ５６２の死を著しく高めた。さらに、イマチニブ抵抗性細胞株、ＢａＦ３／Ｔ３１５ＩおよびＢａＦ３／Ｅ２５５Ｋは、イマチニブおよびクロロキンでの共治療によって死亡するように誘導することができる。こうして、自食作用の阻害は、腫瘍細胞をイマチニブ誘発細胞死に対して敏感にする。自食作用のブロックはＣＭＬの治療のための新しい戦略であると提案されてきた（非特許文献２３）。これらの研究は、自食作用がＤＮＡ損傷治療に対する耐性を促進し得ることを提案している。クロロキンはリソソームのブロッカーであるので、自食作用プロセスの異なるステップを標的とする特異的な阻害剤がまた、細胞ベースのアッセイおよび動物モデルにおいて化学療法の効果を高めるのに同じ効果を有するかどうかを見ることは興味深いであろう。
【００１２】
さらに、自食作用はまた急性膵炎によって誘発される細胞損傷を仲介するのに重要な役割を果たすことが示されてきた。それ自体の時期尚早に活性化される消化プロテアーゼによる膵臓の自己消化が急性膵炎の開始における重要な事象であると考えられる。自食作用関連（Ａｔｇ）遺伝子Ａｔｇ５を膵臓腺房細胞において欠く条件付きノックアウトマウスは、セルレインによって誘発される急性膵炎の有意に減少した重症度を示してきた（非特許文献２４）。したがって自食作用は、トリプシンへのトリプシノーゲンの活性化によって膵臓腺房細胞において有害な影響を与える。自食作用の阻害剤は、急性膵炎のための重要な新しい治療法を提供する可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｈｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｅｍｒ，１９９０
【非特許文献２】Ｓｃｈｕ，Ｐ．Ｖ．，Ｔａｋｅｇａｗａ，Ｋ．，Ｆｒｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｔａｃｋ，Ｊ．Ｈ．，Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｅｍｒ，Ｓ．Ｄ．（１９９３）Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｙｅａｓｔ  ＶＰＳ３４  ｇｅｎｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｒｔｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０，８８−９１
【非特許文献３】Ｈｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｅｍｒ，Ｓ．Ｄ．（１９９０）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＶＰＳ３４，ａ  ｇｅｎｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｖａｃｕｏｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｖａｃｕｏｌｅ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０，６７４２−６７５４
【非特許文献４】Ｋｉｈａｒａ，Ａ．，Ｎｏｄａ，Ｔ．，Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｏｈｓｕｍｉ，Ｙ．（２００１）．Ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｖｐｓ３４  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｙ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５２，５１９−５３０
【非特許文献５】Ｉｔａｋｕｒａ，Ｅ．，Ｋｉｓｈｉ，Ｃ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｎ．（２００８）．Ｂｅｃｌｉｎ  １  ｆｏｒｍｓ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ａｔｇ１４  ａｎｄ  ＵＶＲＡＧ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １９，５３６０−５３７２
【非特許文献６】Ｌｉａｎｇ，Ｃ．，Ｆｅｎｇ，Ｐ．，Ｋｕ，Ｂ．，Ｄｏｔａｎ，Ｉ．，Ｃａｎａａｎｉ，Ｄ．，Ｏｈ，Ｂ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｊｕｎｇ，Ｊ．Ｕ．（２００６）．Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｕｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｂｅｃｌｉｎ１−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＵＶＲＡＧ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８，６８８−６９９
【非特許文献７】Ｍａｔｓｕｎａｇａ，Ｋ．，Ｓａｉｔｏｈ，Ｔ．，Ｔａｂａｔａ，Ｋ．，Ｏｍｏｒｉ，Ｈ．，Ｓａｔｏｈ，Ｔ．，Ｋｕｒｏｔｏｒｉ，Ｎ．，Ｍａｅｊｉｍａ，Ｉ．，Ｓｈｉｒａｈａｍａ−Ｎｏｄａ，Ｋ．，Ｉｃｈｉｍｕｒａ，Ｔ．，Ｉｓｏｂｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｔｗｏ  Ｂｅｃｌｉｎ  １−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｔｇ１４Ｌ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｃｏｎ，ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｔａｇｅｓ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１，３８５−３９６
【非特許文献８】Ｚｈｏｎｇ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｑ．Ｊ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｙａｎ，Ｙ．，Ｂａｃｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ．，Ｈｅｉｎｔｚ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｙｕｅ，Ｚ．（２００９）．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  Ａｔｇ１４Ｌ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｃｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｂｅｃｌｉｎ  １−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−３−ｋｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１（４），４６８−４７６
【非特許文献９】Ｌｅｖｉｎｅ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｋｌｉｏｎｓｋｙ，Ｄ．Ｊ．（２００４）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｙ  ｓｅｌｆ−ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ６，４６３−４７７
【非特許文献１０】Ｌｅｖｉｎｅ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．（２００８）．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ  １３２，２７−４２
【非特許文献１１】Ｆｕｊｉｔａ，Ｎ．，Ｉｔｏｈ，Ｔ．，Ｏｍｏｒｉ，Ｈ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．，Ｎｏｄａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ，Ｔ．（２００８）．Ｔｈｅ  Ａｔｇ１６Ｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ  ｔｈｅ  Ｓｉｔｅ  ｏｆ  ＬＣ３  Ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １９，２０９２−２１００
【非特許文献１２】Ｈａｒａ，Ｔ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｍ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．，Ｎａｋａｈａｒａ，Ｙ．，Ｓｕｚｕｋｉ−Ｍｉｇｉｓｈｉｍａ，Ｒ．，Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｍ．，Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｋ．，Ｓａｉｔｏ，Ｉ．，Ｏｋａｎｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｓａｌ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｕｓｅｓ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４１，８８５−８８９
【非特許文献１３】Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｍ．，Ｗａｇｕｒｉ，Ｓ．，Ｃｈｉｂａ，Ｔ．，Ｍｕｒａｔａ，Ｓ．，Ｉｗａｔａ，Ｊ．，Ｔａｎｉｄａ，Ｉ．，Ｕｅｎｏ，Ｔ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｍ．，Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｋｏｍｉｎａｍｉ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃａｕｓｅｓ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４１，８８０−８８４
【非特許文献１４】Ｓｃｈｍｉｄ，Ｄ．，Ｄｅｎｇｊｅｌ，Ｊ．，Ｓｃｈｏｏｒ，Ｏ．，Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｍｕｎｚ，Ｃ．（２００６）．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８４，１９４−２０２
【非特許文献１５】Ｌｉａｎｇ，Ｘ．Ｈ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｓ．，Ｓｅａｍａｎ，Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｋ．，Ｋｅｍｐｋｅｓ，Ｂ．，Ｈｉｂｓｈｏｏｓｈ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，Ｂ．（１９９９）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｂｅｃｌｉｎ  １．Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，６７２−６７６
【非特許文献１６】Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．（２００８）．Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｕｎｒａｖｅｌｅｄ：Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ４，３９９−４０１
【非特許文献１７】Ｑｕ，Ｘ．，Ｙｕ，Ｊ．，Ｂｈａｇａｔ，Ｇ．，Ｆｕｒｕｙａ，Ｎ．，Ｈｉｂｓｈｏｏｓｈ，Ｈ．，Ｔｒｏｘｅｌ，Ａ．，Ｒｏｓｅｎ，Ｊ．，Ｅｓｋｅｌｉｎｅｎ，Ｅ．Ｌ．，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｎ．，Ｏｈｓｕｍｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｃｌｉｎ  １  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｇｅｎｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１２，１８０９−１８２０
【非特許文献１８】Ｙｕｅ，Ｚ．，Ｊｉｎ，Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｃ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｈｅｉｎｔｚ，Ｎ．（２００３）．Ｂｅｃｌｉｎ  １，ａｎ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｇｅｎｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｉｓ  ａ  ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，１５０７７−１５０８
【非特許文献１９】Ｓｈｅｎ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｄ．Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．Ｌ．，Ｄｅｎｇ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｚｈｕ，Ｘ．Ｆ．（２００８）．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ４，１０６７−８
【非特許文献２０】Ａｍａｒａｖａｄｉ，Ｒ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．（２００７）．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３，７２７１−７２７９
【非特許文献２１】Ａｍａｒａｖａｄｉ，Ｒ．Ｋ．，Ｙｕ，Ｄ．，Ｌｕｍ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｕｉ，Ｔ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｏｒｏｕ，Ｍ．Ａ．，Ｅｖａｎ，Ｇ．Ｉ．，Ｔｈｏｍａｓ−Ｔｉｋｈｏｎｅｎｋｏ，Ａ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．（２００７）．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅｒａｐｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｙｃ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７，３２６−３３６
【非特許文献２２】Ｈｏｕ，Ｗ．，Ｈａｎ，Ｊ．，Ｌｕ，Ｃ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ  Ｒａｂｉｎｏｗｉｃｈ，Ｈ．（２００８）．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ＴＲＡＩＬ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ４，９４０−９４３
【非特許文献２３】Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｙ．，Ｔｅｒｕｉ，Ｙ．，Ｔａｎｉｙａｍａ，Ａ．，Ｋｕｎｉｙｏｓｈｉ，Ｒ．，Ｔａｋｉｚａｗａ，Ｔ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｓ．，Ｏｚａｗａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｈａｔａｋｅ，Ｋ．（２００８）．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ａｒｅ  ｎｅｘｔ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ９９，２２００−８
【非特許文献２４】Ｏｈｍｕｒａｙａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ．（２００８）．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｔｈｅｏｒｙ  ｆｏｒ  ｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ４，１０６０−１０６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
さらに、小分子阻害剤は、哺乳類細胞における細胞機構を探究する上で重要なツールである。しかし、自食作用の唯一利用可能な小分子阻害剤は、約１０ｍＭの作用濃度を有し、高度に非特異的である３−メチルアデニン（３−ＭＡ）である。それ故、哺乳類細胞における自食作用の研究を容易にするために使用することができる高度に特異的な小分子ツールを開発することが緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は一部分において、自食作用の阻害剤である化合物、そのような化合物を含む組成物、ならびにそのような化合物および組成物の使用方法に関する。
【００１６】
本発明の一態様は、
ｎが０、１、２、３または４であり；
Ｙが−Ｃ（Ｒ１）＝または−Ｎ＝であり；
Ｒが−Ｈ、低級アルキル、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、または低級アルキニルであり；
Ｒ１が独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−Ｃ（＝Ｏ）（低級アルキル）、−ＣＮ、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（低級フルオロアルキル）、−Ｓ（＝Ｏ）（低級アルキル）、−Ｓ（＝Ｏ）２（低級アルキル）および−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（低級アルキル）からなる群からそれぞれ選択され；
Ｒ２およびＲ３が独立して、−Ｈ、低級アルキル、低級フルオロアルキル、低級アルキニルおよび低級ヒドロキシアルキルからなる群から選択され；
Ｘが−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（低級アルキル）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；
Ｚがフェニル、ピリジル、ビニル、モルフィニル、フェナンスロリニル、ナフチル、フリルまたはベンゾ［ｄ］チアゾリルであり；そして−ＣＨ３、低級アルキル、フルオロアルキル、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、低級フルオロアルコキシ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、低級アルコキシ、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＦ３、および３，４−メチレンジオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されている、
式Ｉ：
【化１】
2013500255.tif 000002
【００１７】
の化合物、またはそれの製薬上許容される塩、生物学的に活性な代謝産物、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、エナンチオマーもしくは立体異性体に関する。
【００１８】
本発明の別の態様は、単独でまたは別の治療薬と組み合わせて、式Ｉの化合物、またはそれの製薬上許容される塩、生物学的に活性な代謝産物、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、エナンチオマーもしくは立体異性体と、１つ以上の製薬上許容される担体とを含む医薬組成物に関する。本発明のそのような医薬組成物は、典型的には、癌または膵炎に関連する状態および疾患の治療もしくは予防のための治療法の一環として、本発明の方法に従って投与することができる。
【００１９】
本発明の別の態様は、治療効果のある量の、本発明の１つ以上の化合物または医薬組成物を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、癌、膵炎または細胞内病原体によって引き起こされる疾病の治療または予防方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】画像ベース選別による自食作用の小分子阻害剤の特定に関する。ＭＢＣＱの構造。
【図１Ｂ】画像ベース選別による自食作用の小分子阻害剤の特定に関する。１細胞当たりのＬＣ３−ＧＦＰスポット数（ａ）、１細胞当たりのスポットサイズ（ｂ）、１細胞当たりのスポット強度（ｃ）の定量的分析。データは、対照ビヒクル処理細胞の％として表される。Ｈ４−ＬＣ３細胞は、９６ウェル−プレートに播種され、ビヒクル対照（１％ＤＭＳＯ）、１０μＭのＭＢＣＱありまたはなしの０．２μＭラパマイシンで指示時間培養され、４％パラホルムアルデヒドで固定され、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、３μｇ／ｍｌ）で染色された。各化合物処理について１０００細胞の画像が２０×対物レンズのＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＨＣＳ  ４．０  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）によって解析された。
【図２】飢餓によって誘発される自食作用のＭＢＣＱ阻害に関する結果を図示する。ＨＣＳを用い、対照の％として表される、１細胞当たりのＬＣ３−ＧＦＰスポット数（ａ）、１細胞当たりのスポットサイズ（ｂ）および１細胞当たりのスポット強度（ｃ）の定量的測定値。３−ＭＡ（１０ｍＭ）またはウォルトマンニン（０．１μＭ）が陽性対照として使用された。
【図３】自食作用へのＭＢＣＱの影響の電子顕微鏡分析を図示する。Ｈ４細胞が０．１％ＤＭＳＯ（ビークル）、ラパマイシン（０．２μＭ）、ＭＢＣＱ（１０μＭ）、またはＭＢＣＱおよびラパマイシンで４時間処理された。細胞が処理され、ＥＭによって画像形成された。
【図４Ａ】ＭＢＣＱ誘発体の創出アプローチを図示する。
【図４Ｂ】ＭＢＣＱ誘発体の創出アプローチを図示する。
【図５Ａ】ＭＢＣＱの活性誘導体がＭＥＦ細胞においてＬＣＳＩＩのレベルを下げることを示すことに関連する結果を図示する。ＭＥＦ細胞がＤＭＳＯ（１‰）、ラパマイシン（０．２μＭ）単独、もしくはＭＢＣＱ（１０μＭ）、Ｃ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）またはＣ７１（１０μＭ）と共に４時間処理された。細胞溶解物が抗ＬＣ３抗体を使用するウェスタンブロッティングのために集められた。
【図５Ｂ】ＭＢＣＱの活性誘導体がＭＥＦ細胞においてＬＣＳＩＩのレベルを下げることを示すことに関連する結果を図示する。ＭＥＦ細胞へのＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）の自食作用阻害効果の電子顕微鏡法確認。ＭＥＦ細胞がビヒクル対照（１‰ＤＭＳＯ）、およびその他の示された化合物で４時間処理された。ラパマイシン（０．２μＭ）およびＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）。次に、細胞がグルタルアルデヒドで固定され、ＥＭアッセイ用のサンプルが調製された。バー、１：１１，０００。矢印は二重および多重膜オートファゴソミック小胞を示す。Ｎ：核。
【図６Ａ】ＭＢＣＱがＨ４細胞成長にほとんど影響を及ぼさないことを示す結果を図示する。Ｈ４細胞が５日間ＭＢＣＱ（５μＭ）で処理され、トリパンブルーの存在下での細胞数計数のために毎日採取された。
【図６Ｂ】ＭＢＣＱがＨ４細胞成長にほとんど影響を及ぼさないことを示す結果を図示する。Ｈ４細胞が２４時間および４８時間ＭＢＣＱ（５μＭ）で処理され、次に細胞が７０％エタノールで固定され、ヨウ化プロピジウム（４０μｇ／ｍＬ）で染色され、ＲＮａｓｅ（２００μｇ／ｍＬ）溶液で３０分間培養された。細胞サイクルプロフィールおよび可能なアポトーシス細胞死がフローサイトメーターによって分析された。
【図７Ａ】ＭＢＣＱおよびＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）がエトポシドによって誘発されるｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ細胞の細胞死を部分的に阻害することを示す結果を図示する。Ｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ細胞がエトポシド（８μＭ）の存在または不在下にＭＢＣＱ（１０μＭ）、または３−ＭＡ（１０ｍＭ）で８時間または２４時間処理された。画像によって実証されるような細胞生存。
【図７Ｂ】ＭＢＣＱおよびＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）がエトポシドによって誘発されるｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ細胞の細胞死を部分的に阻害することを示す結果を図示する。Ｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ細胞がエトポシド（８μＭ）の存在または不在下にＭＢＣＱ（１０μＭ）、または３−ＭＡ（１０ｍＭ）で８時間または２４時間処理された。ＭＴＴアッセイによって実証されるような細胞生存。
【図７Ｃ】ＭＢＣＱおよびＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）がエトポシドによって誘発されるｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ細胞の細胞死を部分的に阻害することを示す結果を図示する。Ｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ細胞がエトポシド（８μＭ）の存在または不在下にＭＢＣＱ（１０μＭ）、または３−ＭＡ（１０ｍＭ）で８時間または２４時間処理された。細胞が抗ＬＣ３抗体を使用するウェスタンブロッティングのために集められた。α−チューブリンが対照として使用された。
【図７Ｄ】ＭＢＣＱおよびＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）がエトポシドによって誘発されるｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ細胞の細胞死を部分的に阻害することを示す結果を図示する。Ｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ細胞がエトポシド（８μＭ）の存在または不在下に、ｓｐａｕｔｉｎ（１０μＭ）、または示された濃度で８時間または指示時間処理された。画像によって実証されるような細胞生存。
【図７Ｅ】ＭＢＣＱおよびＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）がエトポシドによって誘発されるｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ細胞の細胞死を部分的に阻害することを示す結果を図示する。Ｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ細胞がエトポシド（８μＭ）の存在または不在下に、ｓｐａｕｔｉｎ（１０μＭ）、または示された濃度で８時間または指示時間処理された。ＭＴＴアッセイによって実証されるような細胞生存。
【図７Ｆ】ＭＢＣＱおよびＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）がエトポシドによって誘発されるｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ細胞の細胞死を部分的に阻害することを示す結果を図示する。Ｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ細胞がエトポシド（８μＭ）の存在または不在下に、ｓｐａｕｔｉｎ（１０μＭ）、または示された濃度で８時間または指示時間処理された。細胞が抗ＬＣ３抗体を使用するウェスタンブロッティングのために集められた。α−チューブリンが対照として使用された。
【図８Ａ】ＭＢＣＱおよびＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）によりＦＹＶＥ−ＲＦＰスポットが減るが、ＦＹＶＥ−ＲＦＰのタンパク質レベルにはまったく影響を及ぼさないことを示す結果を図示する。Ｈ４−ＦＹＶＥ細胞がＤＭＳＯ（０．１％）、ＭＢＣＱ（１０μＭ）またはＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）で指定時間処理された。画像が蛍光顕微鏡法によって解析され、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、３μｇ／ｍＬ）で染色された後にＨＣＳによって定量された。各化合物処理について１０００細胞の画像が２０×対物レンズのＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＨＣＳ  ４．０  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）によって解析された。
【図８Ｂ】ＭＢＣＱおよびＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）によりＦＹＶＥ−ＲＦＰスポットが減るが、ＦＹＶＥ−ＲＦＰのタンパク質レベルにはまったく影響を及ぼさないことを示す結果を図示する。Ｈ４−ＦＹＶＥ細胞がＤＭＳＯ（０．１％）、ＭＢＣＱ（１０μＭ）またはＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）で指定時間処理された。Ｈ４−ＦＹＶＥ細胞がＤＭＳＯ（０．１％）、ＲＡＰＡ（０．２μＭ）単独、ＲＡＰＡ（０．２μＭ）ありまたはなしのＭＢＣＱ（１０μＭ）またはＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）で８時間処理された。細胞溶解物が抗ＲＦＰおよび負荷対照としての抗チューブリンを使用するウェスタンブロッティングのために集められた。
【図９Ａ】ＭＢＣＱおよびＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）がＰｔｄＩｎｓ３Ｐの細胞レベルを選択的に下げることを示す結果を図示する。ＭＥＦ細胞がＤＭＳＯ（０．１％）、ＲＡＰＡ（０．２μＭ）単独、ＲＡＰＡ（０．２μＭ）ありまたはなしのＭＢＣＱ（１０μＭ）で３時間処理された。細胞ＰｔｄＩｎｓ種が抽出され、フッ化ビニリデン膜上へ塗布された。ＰｔｄＩｎｓ３ＰのレベルがＧＳＴ−ＰＸドメイン・タンパク質および抗ＧＳＴ抗体を使用して検出された。
【図９Ｂ】ＭＢＣＱおよびＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）がＰｔｄＩｎｓ３Ｐの細胞レベルを選択的に下げることを示す結果を図示する。ＭＥＦ細胞がＤＭＳＯ（０．１％）、ＲＡＰＡ（０．２μＭ）単独、ＲＡＰＡ（０．２μＭ）ありまたはなしのＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）で３時間処理された。細胞ＰｔｄＩｎｓ種が抽出され、フッ化ビニリデン膜上へ塗布された。ＰｔｄＩｎｓ３ＰのレベルがＧＳＴ−ＰＸドメイン・タンパク質および抗ＧＳＴ抗体を使用して検出された。
【図１０Ａ】Ｃ４３（ＳＰＡＵＴＩＮ）およびその活性誘導体がベクリン１／Ｖｐｓ３４／ｐ１５０錯体の分解を選択的に促進することを示す結果を図示する。Ｃ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）はＶｐｓ３４酵素活性の直接阻害剤ではない。２９３Ｔからの抗ＨＡを使用して免疫沈降された外因性ＨＡ−Ｖｐｓ３４錯体が、指定濃度のＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）およびウォルトマンニン（１０μＭ）の不在または存在下での３２Ｐ−ＡＴＰの存在下にＰｔｄＩｎｓで室温にて１０分間培養された。この産物が薄層クロマトグラフィーおよびオートラジオグラフィーによって分析された。レーン１において、反応緩衝液がＶｐｓ３４／ベクリン−１錯体の代わりに陰性対照として使用された。
【図１０Ｂ】Ｃ４３（ＳＰＡＵＴＩＮ）およびその活性誘導体がベクリン１／Ｖｐｓ３４／ｐ１５０錯体の分解を選択的に促進することを示す結果を図示する。ＭＢＣＱ、Ｃ２９およびＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）の処理は外因性Ｖｐｓ３４およびベクリン１のレベルを下げた。２９３Ｔ細胞がＨＡ−Ｖｐｓ３４およびｆｌａｇ−ベクリン１発現ベクターでトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞が、示された化合物で１２時間処理された。細胞溶解物が抗ＨＡ、抗ｆｌａｇまたは抗チューブリンを使用するウェスタンブロッティングによって分析された。
【図１０Ｃ】Ｃ４３（ＳＰＡＵＴＩＮ）およびその活性誘導体がベクリン１／Ｖｐｓ３４／ｐ１５０錯体の分解を選択的に促進することを示す結果を図示する。ＭＢＣＱおよびＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）はＧＦＰ−Ｐ１５０タンパク質のレベルを下げる。２９３Ｔ細胞がＧＦＰ−Ｐ１５０ベクターでトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞がＭＢＣＱ（１０μＭ）、Ｃ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）で追加の４時間処理された。細胞溶解物が抗ＧＦＰまたは抗チューブリンを使用するウェスタンブロッティングによって分析された。
【図１０Ｄ】Ｃ４３（ＳＰＡＵＴＩＮ）およびその活性誘導体がベクリン１／Ｖｐｓ３４／ｐ１５０錯体の分解を選択的に促進することを示す結果を図示する。ＭＢＣＱおよびＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）はｍｙｃ−Ａｔｇ１４タンパク質のレベルを下げる。２９３Ｔ細胞がｍｙｃ−Ａｔｇ１４ベクターでトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞がＭＢＣＱ（１０μＭ）、Ｃ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）で追加の４時間処理された。細胞溶解物が抗ｍｙｃまたは抗チューブリンを使用するウェスタンブロッティングによって分析された。
【図１０Ｅ】Ｃ４３（ＳＰＡＵＴＩＮ）およびその活性誘導体がベクリン１／Ｖｐｓ３４／ｐ１５０錯体の分解を選択的に促進することを示す結果を図示する。Ｈ４細胞がＣ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）または３−ＭＡ（１０ｍＭ）ありまたはなしのラパマイシン（０．２μＭ）で４時間処理され、ＤＭＳＯ（１‰）が陰性対照として使用された。細胞溶解物が採取され、抗ベクリン１、抗Ａｔｇ１４、抗Ｖｐｓ３４および抗ＵＶＲＡＧを使用するウェスタンブロッティングによって分析された。抗α−チューブリンが負荷対照として使用された。
【図１０Ｆ】Ｃ４３（ＳＰＡＵＴＩＮ）およびその活性誘導体がベクリン１／Ｖｐｓ３４／ｐ１５０錯体の分解を選択的に促進することを示す結果を図示する。２９３Ｔ細胞がタンパク質合成を阻害するためのＣＨＸの存在下にＭＢＣＱまたはｓｐａｕｔｉｎで指示時間処理され、細胞溶解物が抗ベクリン１を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。ＣＨＸ（５μＭ）、ＭＢＣＱ（１０μＭ）、Ｃ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）。
【図１０Ｇ】Ｃ４３（ＳＰＡＵＴＩＮ）およびその活性誘導体がベクリン１／Ｖｐｓ３４／ｐ１５０錯体の分解を選択的に促進することを示す結果を図示する。Ｈ４細胞がｓｐａｕｔｉｎ（１０μＭ）または３−ＭＡ（１０ｍＭ）ありまたはなしのラパマイシン（０．２μＭ）で４時間処理され、ＤＭＳＯ（１‰）が陰性対照として使用された。細胞溶解物が採取され、抗ベクリン１および抗ＬＣ３を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。抗α−チューブリンが負荷対照として使用された。
【図１０Ｈ】Ｃ４３（ＳＰＡＵＴＩＮ）およびその活性誘導体がベクリン１／Ｖｐｓ３４／ｐ１５０錯体の分解を選択的に促進することを示す結果を図示する。２９３Ｔ細胞が、示されたベクターでトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞がＭＢＣＱ（１０μＭ）、Ｃ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）またはラパマイシン（０．２μＭ）で追加の４時間処理された。細胞溶解物が、示された抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。
【図１０Ｉ】Ｃ４３（ＳＰＡＵＴＩＮ）およびその活性誘導体がベクリン１／Ｖｐｓ３４／ｐ１５０錯体の分解を選択的に促進することを示す結果を図示する。２９３Ｔ細胞が、示されたベクターでトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞がＭＢＣＱ（１０μＭ）、Ｃ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）またはラパマイシン（０．２μＭ）で追加の４時間処理された。細胞溶解物が、示された抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。
【図１０Ｊ】Ｃ４３（ＳＰＡＵＴＩＮ）およびその活性誘導体がベクリン１／Ｖｐｓ３４／ｐ１５０錯体の分解を選択的に促進することを示す結果を図示する。２９３Ｔ細胞が、示されたベクターでトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞がＭＢＣＱ（１０μＭ）、Ｃ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）またはラパマイシン（０．２μＭ）で追加の４時間処理された。細胞溶解物が、示された抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。
【図１０Ｋ】Ｃ４３（ＳＰＡＵＴＩＮ）およびその活性誘導体がベクリン１／Ｖｐｓ３４／ｐ１５０錯体の分解を選択的に促進することを示す結果を図示する。２９３Ｔ細胞が、示されたベクターでトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞がＭＢＣＱ（１０μＭ）、Ｃ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）またはラパマイシン（０．２μＭ）で追加の４時間処理された。細胞溶解物が、示された抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。
【図１０Ｌ】Ｃ４３（ＳＰＡＵＴＩＮ）およびその活性誘導体がベクリン１／Ｖｐｓ３４／ｐ１５０錯体の分解を選択的に促進することを示す結果を図示する。２９３Ｔ細胞が、示されたベクターでトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞がＭＢＣＱ（１０μＭ）、Ｃ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）またはラパマイシン（０．２μＭ）で追加の４時間処理された。細胞溶解物が、示された抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。
【図１０Ｍ】Ｃ４３（ＳＰＡＵＴＩＮ）およびその活性誘導体がベクリン１／Ｖｐｓ３４／ｐ１５０錯体の分解を選択的に促進することを示す結果を図示する。２９３Ｔ細胞が、示されたベクターでトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞がＭＢＣＱ（１０μＭ）、Ｃ４３（ｓｐａｕｔｉｎ）（１０μＭ）またはラパマイシン（０．２μＭ）で追加の４時間処理された。細胞溶解物が、示された抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。
【図１１Ａ】選択された癌細胞株がグルコースを含まない条件下にＭＢＣＱおよびその活性誘導体に対して敏感であることを示す結果を図示する。ＢＴ５４９細胞が正常ＤＭＥＭ中で、示された濃度のＣ４３で２４時間処理された。
【図１１Ｂ】選択された癌細胞株がグルコースを含まない条件下にＭＢＣＱおよびその活性誘導体に対して敏感であることを示す結果を図示する。血清を含まない条件下で、示された濃度のＣ４３で２４時間処理された。
【図１１Ｃ】選択された癌細胞株がグルコースを含まない条件下にＭＢＣＱおよびその活性誘導体に対して敏感であることを示す結果を図示する。細胞生存度がＭＴＴによってアッセイされるかまたは抗ＬＣ３でのウェスタンブロッティングアッセイ用に採取された。
【図１１Ｄ】選択された癌細胞株がグルコースを含まない条件下にＭＢＣＱおよびその活性誘導体に対して敏感であることを示す結果を図示する。ＭＣＦ−７細胞がＤＭＳＯ（１‰）、グルコースありのＤＭＥＭ中で、Ｃ４３（１０μＭ）で１２時間処理された。
【図１１Ｅ】選択された癌細胞株がグルコースを含まない条件下にＭＢＣＱおよびその活性誘導体に対して敏感であることを示す結果を図示する。ＭＣＦ−７細胞がＤＭＳＯ（１‰）、グルコースなしのＤＭＥＭ中で、Ｃ４３（１０μＭ）で１２時間処理された。
【図１１Ｆ】選択された癌細胞株がグルコースを含まない条件下にＭＢＣＱおよびその活性誘導体に対して敏感であることを示す結果を図示する。細胞生存度がＭＴＴまたは画像によってアッセイされた。
【図１１Ｇ】選択された癌細胞株がグルコースを含まない条件下にＭＢＣＱおよびその活性誘導体に対して敏感であることを示す結果を図示する。細胞溶解物が抗ＬＣ３を使用するウェスタンブロッティングによって分析され、α−チューブリンが負荷対照として使用された。
【図１１Ｈ】選択された癌細胞株がグルコースを含まない条件下にＭＢＣＱおよびその活性誘導体に対して敏感であることを示す結果を図示する。Ｂｃａｐ−３７細胞が正常ＤＭＥＭ中で、示された濃度のＣ４３で２４時間処理された。
【図１１Ｉ】選択された癌細胞株がグルコースを含まない条件下にＭＢＣＱおよびその活性誘導体に対して敏感であることを示す結果を図示する。Ｂｃａｐ−３７細胞が血清を含まない条件下で、示された濃度のＣ４３で２４時間処理された。
【図１１Ｊ】選択された癌細胞株がグルコースを含まない条件下にＭＢＣＱおよびその活性誘導体に対して敏感であることを示す結果を図示する。細胞生存度がＭＴＴまたは画像によってアッセイされた。
【図１１Ｋ】選択された癌細胞株がグルコースを含まない条件下にＭＢＣＱおよびその活性誘導体に対して敏感であることを示す結果を図示する。Ｃ４３で処理されたＢｃａｐ−３７の細胞サイクルプロフィール。Ｂｃａｐ−３７細胞がＤＭＳＯ（０．１％）（上図）、Ｃ４３（１０μＭ）（下図）で１２時間処理された。この細胞が次に７０％エタノールで固定され、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、４０μｇ／ｍＬ）で染色され、暗黒中、ＲＮａｓｅ酵素（２００μｇ／ｍＬ）溶液で３０分間処理された。細胞サイクルプロフィールおよび可能なアポトーシス死がフローサイトメーターによって統計的に分析された。
【図１１Ｌ】選択された癌細胞株がグルコースを含まない条件下にＭＢＣＱおよびその活性誘導体に対して敏感であることを示す結果を図示する。そして細胞溶解物がＣ４３で指示時間処理され、抗ＰＡＲＰを使用するウェスタンブロッティングによって分析され、α−チューブリンが負荷対照として使用された。
【図１１Ｍ】選択された癌細胞株がグルコースを含まない条件下にＭＢＣＱおよびその活性誘導体に対して敏感であることを示す結果を図示する。そして細胞溶解物がＣ４３で指示時間処理され、抗ＬＣ３を使用するウェスタンブロッティングによって分析され、α−チューブリンが負荷対照として使用された。
【図１２Ａ】ｓｐａｕｔｉｎが非癌細胞においてアポトーシスを誘発しないことを示す実験の結果を図示する。ＭＤＣＫ細胞がＤＭＳＯ（１‰）およびグルコースありまたはなしのＤＭＥＭ中の示された濃度でのｓｐａｕｔｉｎで２４時間処理された。画像によって実証されるような細胞生存。
【図１２Ｂ】ｓｐａｕｔｉｎが非癌細胞においてアポトーシスを誘発しないことを示す実験の結果を図示する。ＭＤＣＫ細胞がＤＭＳＯ（１‰）およびグルコースありまたはなしのＤＭＥＭ中の示された濃度でのｓｐａｕｔｉｎで２４時間処理された。ＭＴＴアッセイによって実証されるような細胞生存。
【図１２Ｃ】ｓｐａｕｔｉｎが非癌細胞においてアポトーシスを誘発しないことを示す実験の結果を図示する。Ｈｓ５７８Ｂｓｔ細胞がＤＭＳＯ（１‰）およびグルコースありまたはなしのＤＭＥＭ中の示された濃度としてのＣ４３で２４時間処理された。画像によって実証されるような細胞生存。
【図１２Ｄ】ｓｐａｕｔｉｎが非癌細胞においてアポトーシスを誘発しないことを示す実験の結果を図示する。Ｃ〜Ｄ、Ｈｓ５７８Ｂｓｔ細胞がＤＭＳＯ（１‰）およびグルコースありまたはなしのＤＭＥＭ中の示された濃度としてのＣ４３で２４時間処理された。ＭＴＴアッセイによって実証されるような細胞生存。
【図１３】ＭＢＣＱおよび誘導体の生体内での効果を示す結果を図示する。（Ａ）マウスが陽性対照としてのラパマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ）単独を、またはＣ４３もしくはＭＢＣＱ（４０ｍｇ／ｋｇ）を４時間の間１時間毎に腹腔内注射され、次に５時間目に犠牲にされた。肝臓における自食作用レベルが抗ＬＣ３抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。（Ｂ）Ｃ４３はセルレインによって誘発される自食作用のレベルを下げる。ラットがセルレイン（５０μｇ／ｋｇ）単独をまたはＣ４３（４０ｍｇ／ｋｇ）を４時間の間１時間毎に腹腔内注射された。ラットは最後の注射の１時間後に犠牲にされ、膵臓が抗ＬＣ３および抗チューブリン（対照としての）を使用するウェスタンブロッティング分析のために単離された。
【図１４−１】自食作用を阻害することができるＭＢＣＱ誘導体を図示する。ＥＣ５０を計算するために、Ｈ４−ＬＣ３細胞が９６ウェル−プレートに播種され、異なる濃度の化合物の存在下に２４時間培養され、次にポリホルメート（ｐｏｌｙｆｏｒｍａｔｅ）で固定され、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、３μｇ／ｍｌ）で染色された。画像データが、ＤＡＰＩ標識核およびＧＦＰ−ＬＣ３、自食作用のためのマーカーについて２０×対物レンズのＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＨＣＳ  ４．０  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）で集められた。Ｓｐｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏ−Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎが、最適化後の画像を取得し、そして解析するために用いられた。各化合物処理について１０００細胞の画像が１フィールド当たりの平均細胞数、蛍光スポット数、１細胞当たりのエリアおよび強度を得るために解析された。ＤＭＳＯおよびラパマイシンが、それぞれ、陰性対照または陽性対照として使用された。ＬＣ３−ＧＦＰの変化の百分率がＤＭＳＯ処理サンプルの百分率で割ることによって計算された。各処理は平均およびＳＤのために３通り行われた。画像はまた、目視検査用の従来型蛍光顕微鏡を用いて解析された。実験は３回繰り返された。
【図１４−２】図１４−１の続き。
【図１４−３】図１４−２の続き。
【図１４−４】図１４−３の続き。
【図１４−５】図１４−４の続き。
【図１４−６】図１４−５の続き。
【図１５−１】自食作用を阻害する能力が低下した、またはまったくしないＭＢＣＱ誘導体を図示する。ＥＣ５０を計算するために、Ｈ４−ＬＣ３細胞が９６ウェル−プレートに播種され、異なる濃度の化合物の存在下に２４時間培養され、次にポリホルメートで固定され、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、３μｇ／ｍｌ）で染色された。画像データが、ＤＡＰＩ標識核およびＧＦＰ−ＬＣ３、自食作用のためのマーカーについて２０×対物レンズのＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＨＣＳ  ４．０  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）で集められた。Ｓｐｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏ−Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎが、最適化後の画像を取得し、そして解析するために用いられた。各化合物処理について１０００細胞の画像が、１フィールド当たりの平均細胞数、蛍光スポット数、１細胞当たりのエリアおよび強度を得るために分析された。ＤＭＳＯおよびラパマイシンが、それぞれ、陰性対照または陽性対照として使用された。ＬＣ３−ＧＦＰの変化の百分率がＤＭＳＯ処理サンプルの百分率で割ることによって計算された。各処理は平均およびＳＤのために３通り行われた。画像はまた、目視検査用の従来型蛍光顕微鏡を用いて解析された。実験は３回繰り返された。
【図１５−２】図１５−１の続き。
【図１５−３】図１５−２の続き。
【図１５−４】図１５−３の続き。
【図１５−５】図１５−４の続き。
【図１５−６】図１５−５の続き。
【図１６】ｓｐａｕｔｉｎがプロテアソーム経路によるベクリン１の分解を促進することを示す実験の結果を図示する。２９３Ｔ細胞がＧＦＰ−ベクリン１でトランスフェクトされ、そしてトランスフェクションの２４時間後に、細胞が、示された化合物で追加の２４時間処理された。ＤＭＳＯ（１‰）、ＭＢＣＱ（１０μＭ）、ｓｐａｕｔｉｎ（１０μＭ）、ＮＨ４Ｃｌ（１０ｍＭ）、ＭＧ１３２（５μＭ）。細胞溶解物が抗ＧＦＰを使用するウェスタンブロッティングによって分析された。
【図１６】ｓｐａｕｔｉｎがプロテアソーム経路によるベクリン１の分解を促進することを示す実験の結果を図示する。２９３Ｔ細胞がＧＦＰ−ベクリン１およびＨＡ−Ｕｂ発現ベクターでトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞がＭＧ１３２またはｓｐａｕｔｉｎで２４時間処理された。細胞溶解物が抗ＧＦＰ抗体で免疫沈降され、免疫錯体が抗ＨＡ抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。
【図１７】選択された自食作用タンパク質の安定性へのＵＳＰ３、ＵＳＰ１０、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ１６およびＵＳＰ１８のｓｉＲＮＡノックダウンの影響を実証する実験の結果を図示する。Ｈ４細胞が、示されたｓｉＲＮＡｓで７２時間トランスフェクトされ、ラパマイシン（０．２μＭ）またはｓｐａｕｔｉｎ（１０μＭ）で４時間処理され、非標的ｓｉＲＮＡ（Ｎ．Ｔ．ｓｉＲＮＡ）が陰性対照として使用された。細胞溶解物が採取され、（Ｌｅｆｔ）：示されたタンパク質に対して特異的な抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。抗α−チューブリンが負荷対照として使用された。
【図１８】ＵＳＰタンパク質の安定性へのＵＳＰ３、ＵＳＰ１０、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ１６およびＵＳＰ１８のｓｉＲＮＡノックダウンの影響を実証する実験の結果を図示する。Ｈ４細胞が、示されたｓｉＲＮＡｓで７２時間トランスフェクトされるか、ラパマイシン（０．２μＭ）またはｓｐａｕｔｉｎ（１０μＭ）で４時間処理され、非標的ｓｉＲＮＡ（Ｎ．Ｔ．ｓｉＲＮＡ）が陰性対照として使用された。細胞溶解物が採取され、（Ｌｅｆｔ）：示されたタンパク質に対して特異的な抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。抗α−チューブリンが負荷対照として使用された。
【図１９】ｓｉＲＮＡノックダウンのＰ５３の安定性へのＵＳＰ３、ＵＳＰ１０、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ１６、ＵＳＰ１８およびベクリン１の影響を実証する実験の結果を図示する。Ｈ４細胞が、示されたｓｉＲＮＡｓ（各ＵＳＰについて３つ）でトランスフェクトされ、ラパマイシン（０．２μＭ）で４時間処理され、ＤＭＳＯ（１％）が陰性対照として使用された。細胞溶解物が採取され、抗ｐ５３抗体またはその他の示された抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。抗α−チューブリンが負荷対照として使用された。
【図２０】ＧＦＰ−ＵＳＰ１０およびＭｙｃ−ＵＳＰ１３が実際に相互作用し得たことならびにこの相互作用がｓｐａｕｔｉｎ処理細胞において阻害されたことを実証する実験の結果を図示する。２９３Ｔ細胞がＧＦＰ−ＵＳＰ１０（レーン１〜４）、Ｍｙｃ−ＵＳＰ１３（レーン２〜４）、ＭＧ１３２（レーン３〜４）および／またはｓｐａｕｔｉｎ（レーン４）でトランスフェクトされた。溶解物が抗ＧＦＰ抗体で免疫沈降され、免疫錯体が、示された抗体を使ったウェスタンブロットによって分析された。
【図２１】ｆｌａｇ−ＵＳＰ１０およびＧＦＰ−ベクリン１が実際に相互作用し得たことならびにこの相互作用がｓｐａｕｔｉｎ処理細胞において阻害されたことを実証する実験の結果を図示する。２９３Ｔ細胞がＧＦＰ−ベクリン１（レーン１）、ＧＦＰ−ベクリン１およびＦｌａｇ−ＵＳＰ１０（レーン２〜４）プラスミドで１２時間でトランスフェクトされ、ｓｐａｕｔｉｎ（１０μＭ）ありまたはなしのＭＧ１３２（１０μＭ）で４時間培養され、細胞溶解物が抗ＧＦＰ抗体で免疫沈降され、免疫錯体が抗Ｆｌａｇ抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。
【図２２】ｆｌａｇ−ＵＳＰ１０およびＧＦＰ−ベクリン１が実際に相互作用し得たことならびにこの相互作用がｓｐａｕｔｉｎ処理細胞においてはほとんど達成されなかったことを実証する実験の結果を図示する。２９３Ｔ細胞がＧＦＰ−ベクリン１（レーン１）、ＧＦＰ−ベクリン１およびＭｙｃ−ＵＳＰ１３（レーン２〜４）プラスミドで１２時間でトランスフェクトされ、ｓｐａｕｔｉｎ（１０μＭ）ありまたはなしのＭＧ１３２（１０μＭ）で４時間培養され、細胞溶解物が抗ＧＦＰ抗体で免疫沈降され、免疫錯体が抗Ｍｙｃ抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析された。
【図２３】Ａ９の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図示する。
【図２４】Ａ３０の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図示する。
【図２５】Ａ３６の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
自食作用、細胞異化プロセスは、リサイクリングのために細胞内構成要素のリソソーム依存性ターンオーバーを仲介することによって代謝ストレス条件下に細胞生存を促進するのに重要な役割を果たす。自食作用の阻害は、可能な新規癌治療として提案されてきた。
【００２２】
自食作用の小分子調整剤のための画像ベース選別において、自食作用阻害剤、ＭＢＣＱが特定された。ＭＢＣＱの広範な医薬化学変性は、Ｃ４３などの、新規誘導体を特定した。Ｃ４３は細胞ベースのアッセイにおいて約０．８μＭのＩＣ５０で自食作用を阻害することが開示される。本明細書においてある場合にはＣ４３は「ｓｐａｕｔｉｎ」（特異的で強力な自食作用阻害剤）と言われる。約３０ｎＭのＩＣ５０のＣ４３の誘導体もまた製造された。
【００２３】
さらに、ＭＢＣＱおよびｓｐａｕｔｉｎはＶｐｓ３４錯体（たとえば、その産物、ＰｔｄＩｎｓ３Ｐが自食作用の開始のために必要とされる、ベクリン１／Ｖｐｓ３４／ｐ１５０を含むタイプＩＩＩ  ＰｔｄＩｎｓ３キナーゼ錯体）の分解を促進し得ることが本明細書において開示される。Ｖｐｓ３４錯体のユビキチン化および分解はＵＳＰ３、ＵＳＰ１０、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ１６およびＵＳＰ１８を含む脱ユビキチン化プロテアーゼ錯体によって調整されることがさらに開示される。ｓｐａｕｔｉｎが自食作用を阻害する機構は、哺乳類細胞におけるＶｐｓ３４錯体のターンオーバーを調整することに関与するＵＳＰ１０およびＵＳＰ１３を含む脱ユビキチン化プロテアーゼ錯体の崩壊であると本明細書において提案される。
【００２４】
さらに、ｓｐａｕｔｉｎは概して非細胞毒性であるが飢餓条件下に癌細胞の小集団のアポトーシスを誘発することが本明細書において開示される。さらに、ｓｐａｕｔｉｎは膵炎の動物モデルにおいて生体内で自食作用を阻害することが本明細書において開示される。
【００２５】
定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いられる特定の用語がここに集められる。本明細書において定義され、使用されるような、すべての定義は、辞書の定義、参照により援用される公文書における定義、および／または定義される用語の普通の意味に優先する。
【００２６】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、この冠詞の文法上の対象の１つをまたは２つ以上を（すなわち、少なくとも１つを）意味するために本明細書において使用される。例として、「an element（要素）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００２７】
語句「および／または」は、本明細書においておよび特許請求の範囲においてここで使用される場合、そのように等位接続される要素、すなわち、ある場合には接続的に存在し、別の場合には離接的に存在する要素の「どちらかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」を使ってリストアップされる複数の要素は、同じように、すなわち、要素の「１つ以上」がそのように等位接続されていると解釈されるべきである。具体的に特定されるそれらの要素に関係しているか関係していないかを問わず、「および／または」節によって具体的に特定される要素以外のその他の要素が任意選択的に存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの制約がない言語と連結して使用されるとき、一実施形態においては、Ａのみ（Ｂ以外の要素を任意選択的に含んで）を；別の実施形態においては、Ｂのみ（Ａ以外の要素を任意選択的に含んで）を；さらに別の実施形態においては、ＡおよびＢの両方（その他の要素を任意選択的に含んで）などを意味することができる。
【００２８】
本明細書においておよび特許請求の範囲においてここで使用される場合、「または」は、上に定義されたような「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。たとえば、リストにおいて項目を分離するとき、「または」または「および／または」は包括的である、すなわち、多数の要素またはリストの要素、および、任意選択的に、追加のリストアップされていない項目の、少なくとも１つの包含であるが、それらの２つ以上をまた包むと解釈されるものとする。「の１つだけ」もしくは「の厳密に１つ」、または特許請求の範囲において使用されるとき、「からなる」などの、それとは反対が明確に示された用語だけが、多数の要素またはリストの要素の厳密に１つの要素の包含を意味するであろう。一般に、用語「または」は本明細書において使用される場合、「どちらか」、「の１つ」、「のただ１つ」または「の厳密に１つ」などの、排他性の用語に先行されるとき、排他的な別の可能性（すなわち、「１つまたはその他、しかし両方ではない」）を示唆すると解釈されるにすぎないものとする。「から本質的になる」は、特許請求の範囲において使用されるとき、特許法の分野において使用されるようなその普通の意味を有するものとする。
【００２９】
本明細書においておよび特許請求の範囲において使用される場合、語句「少なくとも１つ」は、１つ以上の要素のリストに関連して、要素のリストにおける要素の任意の１つ以上から選択されるが、要素のリスト内に具体的にリストアップされたそれぞれの要素の少なくとも１つおよびあらゆる要素を必ずしも含まず、そして要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを排除しない少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきである。この定義はまた、具体的に特定されるそれらの要素に関係しているか関係していないかを問わず、語句「少なくとも１つ」が言及する要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が任意選択的に存在してもよいことを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」または、同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態においては、Ｂがまったく存在せずに（およびＢ以外の要素を任意選択的に含んで）、２つ以上を任意選択的に含む、少なくとも１つのＡを；別の実施形態においては、Ａがまったく存在せずに（およびＡ以外の要素を任意選択的に含んで）、２つ以上を任意選択的に含む、少なくとも１つのＢを；さらに別の実施形態においては、２つ以上を任意選択的に含む、少なくとも１つのＡ、および２つ以上を任意選択的に含む（および他の要素を任意選択的に含んで）、少なくとも１つのＢなどを意味することができる。
【００３０】
それとは逆であると明らかに示されない限り、２つ以上の工程または行為を含む本明細書で特許請求されるあらゆる方法において、この方法の工程または行為の順番が、この方法の工程または行為が列挙される順番に必ずしも限定されないことがまた理解されるべきである。
【００３１】
上の本明細書においてだけでなく、特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「持っている（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」などのすべての移行句は、制約がないこと、すなわち、それらを含むが、それらに限定されないことを意味することが理解されるべきである。移行句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」だけは、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２１１１．０３に明記されているように、それぞれ、制限されたまたは半制限された移行句であるものとする。
【００３２】
各表現、たとえば、アルキル、ｍ、ｎなどの定義は、それが任意の構造において２回以上現れるとき、同じ構造における他の場所でのその定義とは無関係であることを意図される。
【００３３】
「置換」または「で置換された」が言外に含まれたものを含むこと、ただしそのような置換が、置換される原子および置換基の許される原子価に一致していること、そしてこの置換が安定な化合物、たとえば、転位、環化、脱離、またはその他の反応によってなどの変形を自発的に経ない化合物、をもたらすことが理解されるであろう。
【００３４】
用語「置換（された）」はまた、有機化合物のすべての許容される置換基を含むと考えられる。広い見方において、許容される置換基としては、有機化合物の非環式および環式の、分枝および非分枝の、炭素環式および複素環式の、芳香族および非芳香族の置換基が挙げられる。例示的な置換基としては、たとえば、下で本明細書に記載されるものが挙げられる。許容される置換基は、適切な有機化合物について１つ以上であっても同じまたは異なるものであってもよい。本発明の目的のためには、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基および／またはヘテロ原子の原子価を満たす本明細書に記載される有機化合物のあらゆる許容される置換基を有してもよい。本発明は、有機化合物の許容される置換基によっていかなる方法によっても制限されることを意図されない。「１つ以上の」置換基が示されるとき、たとえば、１、２、３、４または５つの置換基があってもよい。
【００３５】
用語「低級」は、以下にリストアップされる基のいずれかに添えられる場合、それらの基が７個未満の炭素（すなわち、６個以下の炭素）を含有することを示す。たとえば「低級アルキル」は１〜６個の炭素を含有するアルキル基を意味する。
【００３６】
本発明の目的のために、化学元素は、元素の周期表、ＣＡＳバージョン、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、６７ｔｈ  Ｅｄ、１９８６−８７、裏表紙に従って特定される。
【００３７】
用語「アルキル」は、１〜２０個、１〜１５個、または１〜１０個の炭素原子を含有する脂肪族または脂環式炭化水素を意味する。アルキルの代表例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、第二ブチル、イソブチル、第三ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシルｌ、２−メチルシクロペンチル、および１−シクロヘキシルエチルが挙げられるが、それらに限定されない。用語「フルオロアルキル」は、１個以上の水素がフッ素で置き換えられているアルキルを意味する。
【００３８】
用語「アルコキシ」は、酸素を経て親部分に結合したアルキル基を意味する。用語「フルオロアルコキシ」は、酸素を経て親部分に結合したフルオロアルキル基を意味する。
【００３９】
選択される自食作用阻害剤
本発明の一態様は、
ｎが０、１、２、３または４であり；
Ｙが−Ｃ（Ｒ１）＝または−Ｎ＝であり；
Ｒが−Ｈ、低級アルキル、−ＣＨ３、低級フルオロアルキル、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、−ＣＦ３、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、または低級アルキニルであり；
Ｒ１が独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−Ｃ（＝Ｏ）（低級アルキル）、−ＣＮ、−Ｏ（低級アルキル）、−Ｏ（低級フルオロアルキル）、−Ｓ（＝Ｏ）（低級アルキル）、−Ｓ（＝Ｏ）２（低級アルキル）および−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（低級アルキル）からなる群からそれぞれ選択され；
Ｒ２およびＲ３が独立して、−Ｈ、低級アルキル、低級フルオロアルキル、低級アルキニルおよびヒドロキシアルキルからなる群から選択され；
Ｘが−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（低級アルキル）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；
Ｚがフェニル、ピリジル、ビニル、モルフィニル、フェナンスロリニル、ナフチル、フリルまたはベンゾ［ｄ］チアゾリルであり；そして−ＣＨ３、低級アルキル、フルオロアルキル、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、低級フルオロアルコキシ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、低級アルコキシ、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＦ３、および３，４−メチレンジオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されている、
式Ｉ：
【化２】
2013500255.tif 000003
【００４０】
で表される化合物、またはそれの製薬上許容される塩、生物学的に活性な代謝産物、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、エナンチオマーもしくは立体異性体に関する。
【００４１】
ある実施形態においては、本発明は、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関するが、ただしこの化合物は、
【化３】
2013500255.tif 000004
【００４２】
（式中、ＪはＣｌ、ＯＣＨＦ２、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＦ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、ＯＣＨ（ＣＨ３）２、Ｏ（ＣＨ２）３ＣＨ３、またはＯ（シクロペンチル）である）
ではない。
【００４３】
ある実施形態においては、本発明は、ｎが０である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、ｎが１である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、ｎが２である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、ｎが３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、ｎが４である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００４４】
ある実施形態においては、本発明は、Ｙが−Ｃ（Ｒ１）＝である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００４５】
ある実施形態においては、本発明は、Ｙが−Ｃ（Ｈ）＝である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００４６】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒが−Ｎ＝である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００４７】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒが−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００４８】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒが低級アルキルまたは低級フルオロアルキルである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００４９】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒが−ＣＨ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００５０】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒが−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２または−ＣＦ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、１つのＲ１だけが−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、２つのＲ１だけが−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、３つのＲ１だけが−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００５１】
ある実施形態においては、本発明は、少なくとも１つのＲ１が−ＮＨ２、−Ｃｌ、−ＮＯ２、−Ｉ、または−ＯＭｅである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、少なくとも１つのＲ１が−ＮＨ２、−Ｃｌ、−ＮＯ２、−Ｉ、または−ＯＭｅであり；少なくとも２つのＲ１が−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００５２】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒ２が−ＣＨ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ２が−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ２がヒドロキシアルキルである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００５３】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒ３が−ＣＨ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ３が−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ３がヒドロキシアルキルである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００５４】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒ２が−ＣＨ３であり；Ｒ３がＨである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ２が−Ｈであり；Ｒ３が−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００５５】
ある実施形態においては、本発明は、Ｘが−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（低級アルキル）−または−ＣＨ２−である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｘが−Ｎ（Ｈ）−または−Ｎ（低級アルキル）−である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｘが−Ｎ（Ｈ）−である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００５６】
ある実施形態においては、本発明は、ｎが０または１であり；Ｘが−Ｎ（Ｈ）−であり；Ｒ２が−Ｈであり；Ｒ３が−Ｈであり；Ｒが−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００５７】
ある実施形態においては、本発明は、Ｚが、−ＣＨ３、低級アルキル、フルオロアルキル、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、低級フルオロアルコキシ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、低級アルコキシ、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＦ３、および３，４−メチレンジオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換された４−ピリジルである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００５８】
ある実施形態においては、本発明は、Ｚが、−ＣＨ３、低級アルキル、フルオロアルキル、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、低級フルオロアルコキシ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、低級アルコキシ、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＦ３、および３，４−メチレンジオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されたモルフィニルである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００５９】
ある実施形態においては、本発明は、Ｚが、−ＣＨ３、低級アルキル、フルオロアルキル、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、低級フルオロアルコキシ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、低級アルコキシ、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＦ３、および３，４−メチレンジオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換された２−フリルである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００６０】
ある実施形態においては、本発明は、Ｚが、−ＣＨ３、低級アルキル、フルオロアルキル、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、低級フルオロアルコキシ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、低級アルコキシ、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＦ３、および３，４−メチレンジオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換された１−ナフチルまたは２−ナフチルである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００６１】
ある実施形態においては、本発明は、Ｚが、−ＣＨ３、低級アルキル、フルオロアルキル、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、低級フルオロアルコキシ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、低級アルコキシ、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＦ３、および３，４−メチレンジオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されたベンゾ［ｄ］チアゾール−５−イルまたはベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イルである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｚが、−ＣＨ３、低級アルキル、フルオロアルキル、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、低級フルオロアルコキシ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、低級アルコキシ、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＦ３、および３，４−メチレンジオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されたフェニルである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００６２】
ある実施形態においては、本発明は、ｎが０または１であり；Ｚが、−ＣＨ３、低級アルキル、フルオロアルキル、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、低級フルオロアルコキシ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、低級アルコキシ、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＦ３、および３，４−メチレンジオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されたフェニルである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００６３】
ある実施形態においては、本発明は、ｎが０または１であり；Ｘが−Ｎ（Ｈ）−であり；Ｚが、−ＣＨ３、低級アルキル、フルオロアルキル、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、低級フルオロアルコキシ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、低級アルコキシ、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＦ３、および３，４−メチレンジオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されたフェニルである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００６４】
ある実施形態においては、本発明は、ｎが０または１であり；Ｘが−Ｎ（Ｈ）−であり；Ｒ２が−Ｈであり；Ｒ３が−Ｈであり；Ｚが、−ＣＨ３、低級アルキル、フルオロアルキル、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、低級フルオロアルコキシ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、低級アルコキシ、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＦ３、および３，４−メチレンジオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されたフェニルである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００６５】
ある実施形態においては、本発明は、ｎが０または１であり；Ｘが−Ｎ（Ｈ）−であり；Ｒ２が−Ｈであり；Ｒ３が−Ｈであり；Ｒが−Ｈであり；Ｚが、−ＣＨ３、低級アルキル、フルオロアルキル、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、低級フルオロアルコキシ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、低級アルコキシ、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）２、−ＣＦ３、および３，４−メチレンジオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されたフェニルである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００６６】
本発明の一態様は、
ｎが０、１、２、３または４であり；
Ｙが−Ｃ（Ｒ１）＝または−Ｎ＝であり；
Ｒが−Ｈ、低級アルキル、−ＣＨ３、低級フルオロアルキル、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、または−ＣＦ３であり；
Ｒ１が独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは−ＮＯ２からなる群からそれぞれ選択され；
Ｒ２およびＲ３が独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３または−ＣＨ（ＣＨ３）２からなる群から選択され；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ８が独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉからなる群から選択され；
Ｒ６およびＲ７が独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒもしくは−Ｉからなる群から選択されるか；またはＲ６およびＲ７が一緒になって−ＯＣＨ２Ｏ−である
式ＩＩ：
【化４】
2013500255.tif 000005
【００６７】
で表される化合物、またはそれの製薬上許容される塩、生物学的に活性な代謝産物、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、エナンチオマーもしくは立体異性体に関する。
【００６８】
ある実施形態においては、本発明は、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する、ただしこの化合物は、
【化５】
2013500255.tif 000006
【００６９】
ではない。
【００７０】
ある実施形態においては、本発明は、ｎが０である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、ｎが１である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、ｎが２である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、ｎが３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、ｎが４である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００７１】
ある実施形態においては、本発明は、Ｙが−Ｃ（Ｒ１）＝である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００７２】
ある実施形態においては、本発明は、Ｙが−Ｃ（Ｈ）＝である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００７３】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒが−Ｎ＝である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００７４】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒが−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００７５】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒが低級アルキルまたは低級フルオロアルキルである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００７６】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒが−ＣＨ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００７７】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒが−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２または−ＣＦ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００７８】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒ１が−Ｆである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ１が−Ｃｌである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ１が−Ｂｒである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ１が−Ｉである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ１が−ＮＯ２である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ１が−ＣＨ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００７９】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒ２が−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ２が−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３または−ＣＨ（ＣＨ３）２である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ２が−ＣＨ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００８０】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒ３が−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ３が−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３または−ＣＨ（ＣＨ３）２である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ３が−ＣＨ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００８１】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒ４が−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ４が−Ｆである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ４が−Ｃｌである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ４が−ＣＨ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ４が−ＯＣＨ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００８２】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒ５が−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ５が−Ｆである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ５が−Ｃｌである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ５が−ＣＨ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ５が−ＯＣＨ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００８３】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒ６が−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ６が−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ６が−Ｆである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ６が−Ｃｌである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ６が−Ｂｒである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ６が−ＣＨ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ６が−ＣＦ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ６が−ＯＣＨ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ６が−ＯＣＦ３である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００８４】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒ６およびＲ７が一緒になって−ＯＣＨ２Ｏ−である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００８５】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒ７が−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、Ｒ７が−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００８６】
ある実施形態においては、本発明は、Ｒ８が−Ｈである、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００８７】
本発明の一態様は、
【化６−１】
2013500255.tif 000007
【化６−２】
2013500255.tif 000008
【化６−３】
2013500255.tif 000009
【化６−４】
2013500255.tif 000010
【００８８】
からなる群から選択される、化合物、またはそれの製薬上許容される塩、生物学的に活性な代謝産物、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、エナンチオマーもしくは立体異性体に関する。
【００８９】
本発明の一態様は、
【化７】
2013500255.tif 000011
【００９０】
またはそれの製薬上許容される塩、生物学的に活性な代謝産物、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、エナンチオマーもしくは立体異性体に関する。
【００９１】
ある実施形態においては、本発明は、化合物が自食作用阻害剤であり；そして自食作用阻害剤のＥＣ５０が約１００ｎＭ未満である、前述の化合物および付随する定義のいずれかに関する。
【００９２】
ある実施形態においては、本発明は、約１０μＭ未満のＩＣ５０で自食作用を阻害する、前述の化合物のいずれか１つに関する。ある実施形態においては、本発明は、約５μＭ未満のＩＣ５０で自食作用を阻害する、前述の化合物のいずれか１つに関する。ある実施形態においては、本発明は、約１μＭ未満のＩＣ５０で自食作用を阻害する、前述の化合物のいずれか１つに関する。ある実施形態においては、本発明は、約７５０ｎＭ未満のＩＣ５０で自食作用を阻害する、前述の化合物のいずれか１つに関する。ある実施形態においては、本発明は、約５００ｎＭ未満のＩＣ５０で自食作用を阻害する、前述の化合物のいずれか１つに関する。ある実施形態においては、本発明は、約２５０ｎＭ未満のＩＣ５０で自食作用を阻害する、前述の化合物のいずれか１つに関する。ある実施形態においては、本発明は、約１００ｎＭ未満のＩＣ５０で自食作用を阻害する、前述の化合物のいずれか１つに関する。
【００９３】
ある実施形態においては、本発明は、自食作用の阻害剤であり；そしてＰＤＥ５を阻害しない、前述の化合物のいずれか１つに関する。
【００９４】
ある実施形態においては、本発明は、自食作用およびＰＤＥ５の両方を阻害し；約０．００１μＭ〜約１０μＭの自食作用ＩＣ５０を有し；そしてＰＤＥ５  ＩＣ５０対自食作用ＩＣ５０の比が約１０〜約５０である、前述の化合物のいずれか１つに関する。ある実施形態においては、本発明は、自食作用およびＰＤＥ５の両方を阻害し；約０．００１μＭ〜約１０μＭの自食作用ＩＣ５０を有し；そしてＰＤＥ５  ＩＣ５０対自食作用ＩＣ５０の比が約５０〜約１００である、前述の化合物のいずれか１つに関する。ある実施形態においては、本発明は、自食作用およびＰＤＥ５の両方を阻害し；約０．００１μＭ〜約１０μＭの自食作用ＩＣ５０を有し；そしてＰＤＥ５  ＩＣ５０対自食作用ＩＣ５０の比が約１００〜約１，０００である、前述の化合物のいずれか１つに関する。
【００９５】
酸性置換基を有する本発明のある化合物は、製薬上許容される塩基との塩として存在してもよい。本発明はそのような塩を包含する。そのような塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リジン塩およびアルギニン塩が挙げられる。これらの塩は、当業者に公知の方法によって製造されてもよい。
【００９６】
本発明のある化合物およびそれらの塩は、２つ以上の結晶形で存在してもよく、本発明は、各結晶形およびそれの混合物を包含する。
【００９７】
本発明のある化合物およびそれらの塩はまた、溶媒和物、たとえば水和物の形態で存在してもよく、本発明は、各溶媒和物およびそれの混合物を包含する。
【００９８】
本発明のある化合物は、１つ以上のキラル中心を含有し、異なる光学活性形で存在してもよい。本発明の化合物が１つのキラル中心を含有するとき、化合物は２つのエナンチオマー形態で存在し、本発明は、両方のエナンチオマーおよびラセミ混合物などのエナンチオマーの混合物を包含する。エナンチオマーは、当業者に公知の方法によって、たとえば、たとえば結晶化によって分離することができるジアステレオマー塩の形成；たとえば結晶化、気−液もしくは液体クロマトグラフィーによって分離することができるジアステレオマー誘導体もしくは錯体の形成；１つのエナンチオマーとエナンチオマー特異的試薬との選択的反応、たとえば酵素的エステル化；またはキラル環境における、たとえばキラル担体たとえばキラル配位子が結合したシリカ上でのもしくはキラル溶媒の存在下での、気−液もしくは液体クロマトグラフィーによって分割されてもよい。所望のエナンチオマーが、上記の分離手順の１つによって別の化学物質へ変換される場合、所望のエナンチオマー形態を遊離させるためにさらなる工程が用いられることは十分理解されるであろう。あるいは、特定のエナンチオマーが、光学活性の試薬、基質、触媒もしくは溶媒を使用する不斉合成により、または不斉転換によって１エナンチオマーを他のものへ変換することにより合成されてもよい。
【００９９】
本発明の化合物が２つ以上のキラル中心を含有するとき、それはジアステレオマー形態で存在する可能性がある。ジアステレオマー化合物は、当業者に公知の方法、たとえばクロマトグラフィーまたは結晶化によって分離されてもよく、個々のエナンチオマーは上記の通り分離されてもよい。本発明は、本発明の化合物の各ジアステレオマーおよびそれらの混合物を包含する。
【０１００】
本発明のある化合物は、異なる互変異性型でまたは異なる幾何異性体として存在する可能性があり、本発明は、本発明の化合物の各互変異性体および／または幾何異性体ならびにそれらの混合物を包含する。
【０１０１】
本発明のある化合物は、分離可能であり得る異なる安定な立体配座形態で存在する可能性がある。たとえば立体障害または環歪みのための、不斉単結合周りの制限された回転によるねじれ不斉は、異なる配座異性体の分離を可能にし得る。本発明は、本発明の化合物の各配座異性体およびそれらの混合物を包含する。
【０１０２】
本発明のある化合物は双性イオン形態で存在する可能性があり、本発明は、本発明の化合物の各双性イオン形態およびそれらの混合物を包含する。
【０１０３】
本明細書において使用される場合、用語「プロドラッグ」は、ある生理学的化学的プロセスによって親薬物に生体内で変換される試剤を意味する（たとえば、プロドラッグは、生理学的ｐＨにされるとすぐに所望の薬物形態に変換される）。プロドラッグは、ある状況において、それらが親薬物より投与するのが容易であり得るので多くの場合に有用である。それらは、たとえば、経口投与によって生物学的に利用可能であり得るが、親薬物はそうではない。プロドラッグはまた、親薬物よりも薬理学的な組成物に改善された溶解性を有する可能性がある。限定なしに、プロドラッグの例は、水溶解性が有益ではない細胞膜を横切っての送達を容易にするエステル（「プロドラッグ」）としてそれが投与されるが、次に、水溶解性が有益である細胞内に入るとすぐにそれが代謝加水分解されてカルボン酸になる本発明の化合物であろう。プロドラッグは多くの有用な特性を有する。たとえば、プロドラッグは、究極的な薬物より水溶性であり、それによって薬物の静脈内投与を容易にする可能性がある。プロドラッグはまた、究極的な薬物より高いレベルの生物学的利用可能性を有する可能性がある。投与後に、プロドラッグは、血液または組織において酵素的にまたは化学的に開裂されて究極的な薬物を送達する。
【０１０４】
例示的なプロドラッグは、アミンの遊離水素が（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイルオキシメチル、１−（（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイルオキシ）エチル、１−メチル−１−（（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイルオキシ）エチル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニルオキシメチル、Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニルアミノメチル、スクシノイル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノイル、α−アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルカノイル、アリールアクチル（ａｒｙｌａｃｔｙｌ）およびα−アミノアシル、またはα−アミノアシル−α−アミノアシル（ここで、前記α−アミノアシル部分は独立して、タンパク質中に見いだされる天然起源のＬ−アミノ酸のいずれかである）、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）２またはグリコシル（炭水化物のヘミアセタールのヒドロキシルの脱離から生じるラジカル）に置き換えられている本発明の化合物のアミンを放出する。
【０１０５】
医薬組成物
本発明の１つ以上の化合物は、本明細書に記載されるような疾病もしくは病気を治療するもしくは改善するためにそれらだけでか、またはそれらが投与量で生物学的に好適な担体もしくは賦形剤と混合されている医薬組成物で、ヒト患者に投与することができる。これらの化合物の混合物はまた、単純混合物としてかまたは好適な調合医薬組成物で患者に投与することができる。たとえば、本発明の一態様は、治療効果のある用量の式ＩもしくはＩＩの化合物、またはそれの製薬上許容される塩、生物学的に活性な代謝産物、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、エナンチオマーもしくは立体異性体と、製薬上許容される希釈剤または担体とを含む医薬組成物に関する。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、治療効果のある用量は、本明細書に記載されるような疾病または病気の予防または減衰をもたらすのに十分な１種または複数種の化合物の量を意味する。本出願の化合物の調合および投与技法は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，最新版などの、当業者に周知の参考文献に見いだすことができる。
【０１０７】
投与の好適なルートとしては、たとえば、経口、点眼、直腸、経粘膜、局所、または腸内投与；くも膜下、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼球内注射だけでなく、筋肉内、皮下、脊髄内注射を含む、非経口投与が挙げられてもよい。
【０１０８】
あるいは、たとえば、多くの場合デポーまたは持続放出調合物で、浮腫性部位への化合物の直接注射によって、全身様式よりもむしろ局所様式で化合物を投与してもよい。
【０１０９】
さらに、標的薬物送達システムで、たとえば、内皮細胞特異的抗体で被覆されたリポソームにおいて薬物を投与してもよい。
【０１１０】
本発明の医薬組成物は、それ自体公知である方法で、たとえば、従来型混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作製、粉末化、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥方法を用いて製造されてもよい。
【０１１１】
本発明に従って使用するための医薬組成物はしたがって、賦形剤と薬剤的に使用することができる製剤への活性化合物の処理を容易にする助剤とを含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用する従来法で調合されてもよい。適切な調合物は、選択される投与のルートに依存する。
【０１１２】
注射のためには、本発明の試剤は、水溶液において、好ましくはハンクス（Ｈａｎｋｓ）液、リンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ）液、または生理食塩緩衝液などの生理学的に相溶性の緩衝液において調合されてもよい。経粘膜投与のためには、透過されるべきバリアに適切な浸透剤が調合物中に使用される。そのような浸透剤は当該技術分野において一般に公知である。
【０１１３】
経口投与のために、化合物は、当該技術分野において周知の製薬上許容される担体と活性化合物を組み合わせることによって容易に調合することができる。そのような担体は、本発明の化合物が、治療されるべき患者による経口摂取のための、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして調合されることを可能にする。経口使用のための医薬製剤は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせ、生じた混合物を任意選択的にすり潰し、必要ならば、好適な助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工することによって得ることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、サッカロース、マニトール、またはソルビトールを含む、糖類などの充填剤；たとえば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース製剤、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。必要ならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの、崩壊剤が添加されてもよい。
【０１１４】
糖衣錠コアは好適なコーティングが付いている。この目的のために、アラビヤゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに好適な有機溶剤もしくは溶剤混合物を任意選択的に含有してもよい、高濃度の糖類溶液が使用されてもよい。染料または顔料が、同定のためにまたは活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために錠剤または糖衣錠コーティングに添加されてもよい。
【０１１５】
経口で使用することができる医薬製剤としては、ゼラチンとグリセロールもしくはソルビトールなどの可塑剤とでできたソフトな、密封カプセルだけでなく、ゼラチンでできた押し込み式カプセルが挙げられる。押し込み式カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどのバインダー、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑剤ならびに、任意選択的に、安定剤との混合剤中に活性原料を含有することができる。ソフトカプセルにおいて、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの、好適な液体に溶解されてもまたは懸濁されてもよい。さらに、安定剤が添加されてもよい。経口投与のためのすべての調合物は、そのような投与に好適な投与量にあるべきである。
【０１１６】
口腔投与のためには、組成物は、従来法で調合された錠剤またはトローチ剤の形態をとってもよい。
【０１１７】
吸入による投与のためには、本発明に従って使用するための化合物は、好適な噴射剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の好適なガスを使って、加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー・プレゼンテーションの形態で便利に送達される。加圧エアゾールの場合には投与量単位は、計量供給量を送達するためのバルブを提供することによって測定されてもよい。たとえば、吸入具または吸入器において使用するためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末ミックスとラクトースもしくはデンプンなどの好適な粉末基剤とを含有して調合されてもよい。
【０１１８】
化合物は、注射、たとえば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与のために調合することができる。注射用の調合物は、添加された保存剤入りの、単位投与量形態で、たとえば、アンプルでまたは多用量容器で提供されてもよい。組成物は、油状もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとってもよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの調合剤を含有してもよい。
【０１１９】
非経口投与のための医薬調合物としては、水溶性形態での活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液が適切な油状注射懸濁液として調製されてもよい。好適な親油性溶剤またはビヒクルとしては、ごま油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの、合成脂肪酸エステル、またはリボソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘度を高める物質を含有してもよい。任意選択的に、懸濁液はまた、好適な安定剤または高濃度溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を上げる試剤を含有してもよい。
【０１２０】
あるいは、活性原料は、使用前に、好適なビヒクル、たとえば、滅菌したピロゲンを含まない水で構成するための粉末形態にあってもよい。
【０１２１】
化合物はまた、たとえば、ココアバターまたはその他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を含有する、坐薬または保持浣腸などの直腸組成物に調合されてもよい。
【０１２２】
前に記載された調合物に加えて、化合物はまた、デポー製剤として調合されてもよい。そのような長時間効果のある調合物は、移植によって（たとえば皮下でもしくは筋肉内でまたは筋肉内注射によって）投与されてもよい。このように、たとえば、化合物は、好適なポリマー材料もしくは疎水性材料（たとえば許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を使って、または溶けにくい誘導体として、たとえば、溶けにくい塩として調合されてもよい。
【０１２３】
あるいは、疎水性医薬化合物のためのその他の送達システムが用いられてもよい。リポソームおよびエマルジョンは、疎水性薬物のための送達ビヒクルまたは担体の周知の例である。ジメチルスルホキシドなどのある有機溶剤がまた、通常より大きい毒性という代償を払ってであるが、用いられてもよい。さらに、化合物は、治療薬を含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの、持続放出システムを用いて送達されてもよい。様々な持続放出材料が確立されており、当業者によく知られている。持続放出カプセルは、それらの化学的性質に依存して、２、３週間から１００日超まで化合物を放出することができる。治療用薬剤の化学的性質および生物学的安定性に依存して、タンパク質安定化のための追加の戦略が用いられてもよい。
【０１２４】
医薬組成物はまた、好適な固相もしくはゲル相担体または賦形剤を含んでもよい。そのような担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１２５】
本発明の化合物の多くは、製薬上相溶性の対イオンとの塩（すなわち、製薬上許容される塩）として提供されてもよい。「製薬上許容される塩」は、受容者への投与時に、直接にか間接にかのどちらかで、本発明の化合物または化合物のプロドラッグを提供することできるあらゆる非毒性塩を意味する。「製薬上許容される対イオン」は、受容者への投与時に塩から放出されるときに毒性でない塩のイオン性部分である。製薬上相溶性の塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含むが、それらに限定されない、多くの酸を使って形成することができる。塩は、相当する遊離塩基形態より水性もしくはその他のプロトン性溶剤に可溶性である傾向がある。
【０１２６】
製薬上許容される塩を形成するために一般に用いられる酸としては、パラ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、ビ酒石酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ベシル酸、フマル酸、グルコン酸、グルクロン酸、ギ酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、乳酸、シュウ酸、パラ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸および酢酸などの有機酸だけでなく、二硫化水素、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸およびリン酸などの無機酸、ならびに関連無機酸および有機酸が挙げられる。そのような製薬上許容される塩としてはしたがって、硫酸塩、ピロ硫酸塩、硫酸水素塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−二酸塩、ヘキシン−１，６−二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ベータ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩および同様な塩が挙げられる。好ましい製薬上許容される酸付加塩としては、塩酸および臭化水素酸などの鉱酸で形成されるもの、そしてとりわけマレイン酸などの有機酸で形成されるものが挙げられる。
【０１２７】
酸性官能基と製薬上許容される塩を形成するための好適な塩基としては、ナトリウム、カリウム、およびリチウムなどのアルカリ金属の水酸化物；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物；アルミニウムおよび亜鉛などの、その他の金属の水酸化物；アンモニア、および非置換もしくはヒドロキシ置換モノ−、ジ−、またはトリアルキルアミンなどの、有機アミン；ジシクロヘキシルアミン；トリブチルアミン；ピリジン；Ｎ−メチル、Ｎ−エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン；モノ−、ビス−、もしくはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−第三ブチルアミン、もしくはトリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミンなどの、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−Ｎ−（ヒドロキシアルキル）−アミン、またはトリ−（２−ヒドロキシエチル）アミンなどの、モノ−、ビス−、もしくはトリス−（２−ヒドロキシ−低級アルキルアミン）；Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン；ならびにアルギニン、リジンなどのアミノ酸などが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１２８】
本発明において使用するのに好適な医薬組成物としては、活性原料がその意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物が挙げられる。より具体的には、治療効果のある量は、治療中の対象の現存する症状の進行を防ぐためにまたは症状を軽減するために有効な量を意味する。有効量の決定は十分に当業者の能力内にある。
【０１２９】
選択される使用方法
本発明の一態様は、対象における自食作用活性が変えられ、そして治療または予防が達成されるように本発明の化合物を対象に投与する工程を含む、自食作用の阻害が有益である対象における自食作用の阻害方法を提供する。ある実施形態においては、対象はヒトである。
【０１３０】
用語「治療すること」は本明細書において使用される場合、病気の予防もしくは病気の管理、および／または病気の治療を提供するという目的のための、本明細書に記載される１つ以上の化合物の対象への投与および／または塗布を包含する。本開示の目的のための「治療」は、治療を提供してもよいが、提供しなければならないわけではなく；むしろ、「治療」は病気の管理の形態にあってもよい。本明細書に記載される化合物が、癌を含む、望まれていない増殖型細胞を治療するために使用されるとき、「治療」は、正常細胞への最小限の破壊影響で、望ましくない増殖型細胞の部分的または全面的破壊を含む。細胞レベルでの、癌細胞を含む、望まれていない急速増殖型細胞の治療の所望の機構はアポトーシスである。
【０１３１】
用語「予防すること」は本明細書において使用される場合、臨床的に明らかな望まれていない細胞増殖の開始を防ぐもしくは遅くすることか、危険にさらされた個体における望まれていない急速な細胞増殖の前臨床的に明らかな段階の開始を防ぐもしくは遅くすることかのどちらかを含む。悪性細胞の転移の防止もしくは鈍化または悪性細胞の進行を阻むかもしくは逆転させることもまたこの定義によって包含されることが意図される。これには、前癌状態および癌を進行させるという危険にされされているものの予防的治療が含まれる。血管形成またはステント手順を受けた対象における再狭窄の防止または鈍化もまたこの定義によって包含される。
【０１３２】
治療の目的のための用語「対象」には、自食作用の阻害が有益であろう、疾患ありと診断された、疾患の症状を有する、または疾患を進行させるという危険にさらされているあらゆるヒトまたは動物対象が含まれる。予防の方法のためには対象はあらゆるヒトまたは動物対象である。予防の目的上、例示するために、対象は、癌などの、望まれていない急速な細胞増殖によって特徴付けられる疾患にかかる危険にさらされているかまたは疾患に遺伝学的にかかりやすいヒト対象であってもよい。対象は、発癌物質への暴露のために、望まれていない急速な細胞増殖によって特徴付けられる疾患に遺伝学的にかかりやすいために危険にさらされているなどであってもよい。ヒト治療のために有用であることに加えて、本明細書に記載される化合物はまた、イヌ、ネコ、馬、乳牛、ヒツジ、および豚などの、しかしそれらに限定されない、ペットおよび家畜を含む、哺乳類の獣医治療のためにも有用である。
【０１３３】
本発明の一態様は、治療効果のある量の式ＩもしくはＩＩの１つ以上の化合物、またはそれの製薬上許容される塩、生物学的に活性な代謝産物、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、エナンチオマーもしくは立体異性体を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、癌の治療または予防方法に関する。
【０１３４】
自食作用の抑制は、放射線増感および化学増感を促進することによる新しい抗癌治療であると提案されてきた。癌治療の動物モデルにおいて、重要な自食作用遺伝子ＡＴＧ５に抗するｓｈＲＮＡを使ってか抗マラリア薬物クロロキンを使ってかのどちらかでの治療誘発自食作用の阻害は、活性化ｐ５３かアルキル化化学療法かのどちらかが腫瘍細胞を駆動するために使用されたＭｙｃ−駆動腫瘍の細胞死および腫瘍退縮を高めた（Ａｍａｒａｖａｄｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅｒａｐｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｙｃ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，２００７．１１７（２）：３２６−３６ページ）。クロロキンは、大きい自食小胞の用量依存性蓄積を引き起こし、アルキル化治療誘発細胞死をＡＴＧ５のノックダウンと類似の程度まで高める。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の場合には、クロロキンは、イマチニブによって誘発される、ＣＭＬ細胞株、Ｋ５６２の死を著しく高めた。さらに、イマチニブ抵抗性細胞株、ＢａＦ３／Ｔ３１５ＩおよびＢａＦ３／Ｅ２５５Ｋは、イマチニブおよびクロロキンでの共治療によって死に誘導することができる。これらの研究は、自食作用の阻害が従来の化学療法を助長する可能性があることを示唆する。
【０１３５】
米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の癌のアルファベット順リストには、急性リンパ芽球性白血病、成人；急性リンパ芽球性白血病、幼児期；急性骨髄白血病、成人；副腎皮質癌腫；副腎皮質癌腫、幼児期；エイズ関連リンパ腫；エイズ関連悪性腫瘍；肛門癌；星状細胞腫、幼児期小脳の；星状細胞腫、幼児期脳の；胆管癌、肝外の；膀胱癌；膀胱癌、幼児期；骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫、幼児期；脳腫瘍、成人；脳腫瘍、脳幹神経膠腫、幼児期；脳腫瘍、小脳星状細胞腫、幼児期；脳腫瘍、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、幼児期；脳腫瘍、上衣腫、幼児期；脳腫瘍、髄芽腫、幼児期；脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍、幼児期；脳腫瘍、視経路および視床下部神経膠腫、幼児期；脳腫瘍、幼児期（その他）；乳癌；乳癌および妊娠；乳癌、幼児期；乳癌、男性；気管支腺腫／カルチノイド、幼児期；カルチノイド腫瘍、幼児期；カルチノイド腫瘍、胃腸の；癌腫、副腎皮質の；癌腫、膵島細胞；原発不明の癌腫；中枢神経系リンパ腫；小脳星状細胞腫、幼児期；脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、幼児期；頸部癌；幼児期癌；慢性リンパ球白血病；慢性骨髄性白血病；慢性脊髄増殖性疾患；腱鞘の明細胞肉腫；大腸癌；結腸直腸癌、幼児期；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；子宮内膜癌；上衣腫、幼児期；上皮癌、卵巣の；食道癌；食道癌、幼児期；ユーイング腫瘍；頭蓋外胚細胞腫瘍、幼児期；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；眼癌、眼球内メラノーマ；眼癌、網膜芽細胞腫；胆嚢癌；胃（胃袋）癌；胃（胃袋）癌、幼児期；胃腸カルチノイド腫瘍；胚細胞腫瘍、頭蓋外の、幼児期；胚細胞腫瘍、性腺外の；胚細胞腫瘍、卵巣の；妊娠性絨毛腫瘍；神経膠腫、幼児期脳幹；神経膠腫、幼児期視経路および視床下部；毛様細胞白血病；頭頚部癌；肝細胞（肝臓）癌、成人（原発性の）；肝細胞（肝臓）癌、幼児期（原発性の）；ホジキンリンパ腫、成人；ホジキンリンパ腫、幼児期；妊娠中のホジキンリンパ腫；下咽頭癌；視床下部および視経路神経膠腫、幼児期；眼球内メラノーマ；膵島細胞癌腫（内分泌膵臓）；カポジ肉腫；腎臓癌；咽頭癌；咽頭癌、幼児期；白血病、急性リンパ芽球性の、成人；白血病、急性リンパ芽球性の、幼児期；白血病、急性骨髄の、成人；白血病、急性骨髄の、幼児期；白血病、慢性リンパ球の；白血病、慢性骨髄性の；白血病、毛様細胞；唇および口腔癌；肝臓癌、成人（原発性の）；肝臓癌、幼児期（原発性の）；肺癌、非小細胞；肺癌、小細胞；リンパ芽球性白血病、成人急性の；リンパ芽球性白血病、幼児期急性の；リンパ球白血病、慢性の；リンパ腫、エイズ関連の；リンパ腫、中枢神経系（原発性の）；リンパ腫、皮膚Ｔ細胞；リンパ腫、ホジキンの、成人；リンパ腫、ホジキンの、幼児期；リンパ腫、妊娠中のホジキンの；リンパ腫、非ホジキンの、成人；リンパ腫、非ホジキンの、幼児期；リンパ腫、妊娠中の非ホジキンの；リンパ腫、一次中枢神経系；マクログロブリン血症、ヴァルデンストレームの；男性乳癌；悪性中皮腫、成人；悪性中皮腫、幼児期；悪性胸腺腫；髄芽腫、幼児期；メラノーマ；メラノーマ、眼球内の；メルケル細胞癌腫；中皮腫、悪性の；原発不明の転移性頚部偏平上皮癌；多発性内分泌腫瘍症候群��幼児期；骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄性白血病、慢性の；骨髄白血病、幼児期急性の；骨髄腫、多発性の；脊髄増殖性疾患、慢性の；鼻腔および副鼻腔癌；上咽頭癌；上咽頭癌、幼児期；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫、成人；非ホジキンリンパ腫、幼児期；妊娠中の非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺癌；口腔癌、幼児期；口腔および唇癌；口腔咽頭癌；骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫；卵巣癌、幼児期；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；膵臓癌、幼児期；膵臓癌、膵島細胞；副鼻腔および鼻腔癌；副甲状腺癌；陰茎癌；褐色細胞腫；松果腺およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、幼児期；下垂体腫瘍；形質細胞新生物／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；妊娠および乳癌；妊娠およびホジキンリンパ腫；妊娠および非ホジキンリンパ腫；一次中枢神経系リンパ腫；原発性肝臓癌、成人；原発性肝臓癌、幼児期；前立腺癌；直腸癌；腎臓細胞（腎臓）癌；腎臓細胞癌、幼児期；腎臓骨盤および尿管、移行細胞癌；網膜芽細胞腫；黄紋筋肉腫、幼児期；唾液腺癌；唾液腺癌、幼児期；肉腫、ユーイング腫瘍；カポシ肉腫；骨の肉腫（骨肉腫）／悪性線維性組織球腫；肉腫、黄紋筋肉腫、幼児期；肉腫、軟組織、成人；肉腫、軟組織、幼児期；セザリー症候群；皮膚癌；皮膚癌、幼児期；皮膚癌（メラノーマ）；皮膚癌腫、メルケル細胞；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉腫、成人；軟組織肉腫、幼児期；原発不明の偏平頸部癌、転移性の；胃袋（胃の）癌；胃袋（胃の）癌、幼児期；テント上原始神経外胚葉腫瘍、幼児期；Ｔ細胞リンパ腫、皮膚の；睾丸癌；胸腺腫、幼児期；胸腺腫、悪性の；甲状腺癌；甲状腺癌、幼児期；腎臓骨盤および尿管の移行細胞癌；絨毛腫瘍、妊娠の；原発部位不明癌、幼児期；幼児期の異常癌；尿管および腎臓骨盤、移行細胞癌；尿道癌；子宮肉腫；膣癌；視経路および視床下部神経膠腫、幼児期；外陰癌；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；ならびに腎芽細胞腫瘍が含まれる。本発明の方法は、そのようなタイプの癌を治療するために有用である可能性がある。
【０１３６】
本発明の別の態様は、治療効果のある量の式ＩもしくはＩＩの１つ以上の化合物、またはそれらの製薬上許容される塩、生物学的に活性な代謝産物、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、エナンチオマーもしくは立体異性体を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、急性膵炎の治療または予防方法に関する。
【０１３７】
膵炎は、最終的に器官それ自体の破壊につながる消化酵素の放出によって仲介される膵臓の炎症である。膵炎は、多くの合併症のある深刻な致命的病気であり得る。重症例においては、出血、心臓、肺および腎臓への組織損傷、ならびに感染症が起こる可能性がある。急性膵炎の約８０，０００の症例が米国において毎年発生し；それらの約２０パーセントが深刻である。膵炎のための公知の治療はない。膵炎を管理するための現行アプローチは、それが自然に消散するのを待つことと、それが発生した場合心臓、肺および腎臓合併症の治療とを含む。
【０１３８】
自食作用は、急性膵炎によって誘発される細胞損傷を仲介するのに重要な役割を果たすことを示してきた。早期に活性化された膵臓自体の消化プロテアーゼによる膵臓の自己消化が急性膵炎の開始にとって重要であると考えられる。リソソーム加水分解酵素は膵臓トリプシノーゲン活性化に重要な役割を果たすことが知られているが、どこでそしてどのようにしてトリプシノーゲンがこれらのリソソーム酵素と接触するかは、はっきりしないままである。近年、自食作用は、膵炎の動物モデルにおいて膵臓消化酵素の放出に重要な役割を果たすことが提案されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｃｉｎａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２００８．１８１（７）：１０６５−７２ページ；およびＯｈｍｕｒａｙａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｋ．Ｙａｍａｍｕｒａ，Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｔｈｅｏｒｙ  ｆｏｒ  ｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，２００８．４（８）：１０６０−２ページ）。重要な自食作用遺伝子Ａｔｇ５にとって欠陥がある、Ａｔｇ５−／−マウスにおいて、セルレインによって誘発される急性膵炎の重症度は、有意に低下したレベルのトリプシノーゲン活性化で大きく低下する。したがって、自食作用の活性化は、トリプシンへのトリプシノーゲンの活性化を仲介することによって膵臓腺房細胞において有害な影響を及ぼす可能性がある。自食作用の阻害は、急性膵炎においてトリプシノーゲン活性化をブロックするためのまたとない機会を提供する可能性がある。自食作用阻害剤の開発は、急性膵炎用のピカ新の阻害剤を提供する可能性がある。
【０１３９】
本発明の別の態様は、治療効果のある量の式ＩもしくはＩＩの１つ以上の化合物、またはそれらの製薬上許容される塩、生物学的に活性な代謝産物、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、エナンチオマーもしくは立体異性体を、それを必要としている対象に投与する工程を含む、細胞内病原体によって引き起こされる疾病の治療または予防方法に関する。たとえば、Ｃｈｅｎらに付与される米国特許出願公開第２００９／０１１１７９９号明細書（その全体を参照により本明細書によって援用される）を参照されたい。
【０１４０】
近年の研究は、増殖するために自食胞を使用するウィルスおよび原生動物だけでなく、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、赤痢菌種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの、細菌を含む細胞内病原体からの細胞防御における自食作用の役割を確証してきた。自食作用の遂行は、養分状態、成長因子／サイトカイン、および低酸素症状態などの主として生理学的因子によって左右される上流信号変換システムによって調整される。自食作用の薬理学的な誘発は、先天性免疫のこのエフェクターが細胞内病原体から防御するための引き金になるかまたは防御するために増幅されるであろう治療戦略である。
【０１４１】
本発明の別の態様は、脱ユビキチン化プロテアーゼ錯体を式ＩまたはＩＩの１つ以上の化合物と接触させる工程を含む脱ユビキチン化プロテアーゼ錯体の不活性化方法であって、この脱ユビキチン化プロテアーゼ錯体がＵＳＰ３およびＵＳＰ１０を含む方法に関する。そのような方法は、脱ユビキチン化プロテアーゼ錯体の活性によって引き起こされるかまたはこの活性によって高められるあらゆる状態を改善するために用いることができる。
【０１４２】
併用療法
本発明の一態様においては、本発明の化合物、またはそれの製薬上許容される塩は、単独でかまたは別の治療薬と組み合わせて癌および膵炎などの疾病を治療するために使用することができる。本発明の化合物は単独でかまたは追加の試剤、たとえば、治療薬と組み合わせて使用することができ、前記追加の試剤はその意図される目的のために熟練者によって選択されることが理解されるべきである。たとえば、追加の試剤は、本発明の化合物によって治療中の疾病または状態を治療するために有用であると当該技術分野において認められている治療薬であることができる。追加の試剤はまた、治療組成物に有益な特質を与える試剤、たとえば、組成物の粘度に影響を及ぼす試剤であることができる。
【０１４３】
本発明によって考えられる併用療法は、たとえば、別個の医薬調合物での本発明の化合物、またはそれの製薬上許容される塩と、追加の試剤との投与だけでなく、単一医薬調合物での本発明の化合物、またはそれの製薬上許容される塩と、追加の試剤との投与を含む。言い換えれば、共投与は、両試剤の併用の有益な効果を提供するように対象への少なくとも２つの試剤の投与を意味するものとする。たとえば、試剤は、同時にまたはある時間にわたって順次投与されてもよい。
【０１４４】
本発明内に含められる併用は、それらの意図される目的のために有用なそれらの併用であることがさらに理解されるべきである。下に記述される試剤は、目的上例示的であり、限定されることを意図されない。本発明の一部である、併用は、本発明の化合物と下のリストから選択される少なくとも１つの追加の試剤とであることができる。併用が、形成される組成物がその意図される機能を果たすことができるようなものである場合、併用はまた、２つ以上の追加の試剤、たとえば、２つもしくは３つの追加の試剤を含むことができる。
【０１４５】
たとえば、本発明の一態様は、癌の治療のために抗血管新生阻害剤と組み合わせての小分子自食作用阻害剤（たとえば式ＩまたはＩＩのもの）の使用に関する。抗血管新生阻害剤は、腫瘍生存および成長を支援するために必要とされる腫瘍における血管の成長を抑えることによって腫瘍成長を阻害すると期待されることが知られている。たとえば、血管新生抑制剤エンドスタチンおよび関連化学薬品は、血管の構築を抑え、腫瘍成長を低下させる。抗血管新生薬物の数百の臨床試験が現在進行中である。患者での試験において、抗血管新生治療は、比較的少ない副作用で腫瘍成長を抑えることができる。しかし、抗血管新生治療が単独で患者生存を延ばすのに不十分ではない可能性があり；従来の化学療法との併用はそれ故有益である可能性がある。特に、自食作用阻害剤は、単独でかまたは抗血管新生治療と組み合わせて機能する新しい選択肢を提供する可能性がある。
【０１４６】
エンドスタチンは、ベクリン１およびベータ−カテニン・レベルを調節することによって内皮細胞において自食作用を誘発することが示されている（Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｂｅｃｌｉｎ  １  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２００９）。本明細書において開示されるように、自食作用の阻害は飢餓条件下に癌細胞の小集団を選択的に殺すことが分かった。それ故、抗血管新生治療は追加の代謝ストレスを誘発して、普通は細胞毒性がない、自食作用阻害剤に対して癌細胞を敏感にする可能性があることが提案される。したがって、抗血管新生治療と抗自食作用治療との併用は、正常細胞への細胞毒性なしの癌の治療のための新たな選択肢を提供する可能性がある（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，２００７．３（５）：５１２−５ページ）。
【０１４７】
本発明の化合物と併用することができる抗血管新生剤の非限定的な例としては、たとえば、次のものが挙げられる：ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、カルボキシアミドトリアゾール、ＴＮＰ−４７０、ＣＭ１０１、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、血小板因子−４、スラミン、ＳＵ５４１６、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦＲ拮抗薬、ヘパリンと一緒の血管新生抑制ステロイド、軟骨由来血管新生阻害因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、アンギオスタチン、エンドスタチン、２−メトキシエストラジオール、テコガラン、トロンボスポンジン、プロラクチン、αＶβ３阻害剤およびリノミド。
【０１４８】
さらに、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらに付与される米国特許出願公開第２００８／０２６９２５９号明細書（その全体を参照により本明細書によって援用される）に記載されているように、自食作用阻害剤は、解糖依存性癌を解糖できない細胞に変換する１つ以上の抗癌化合物と１つ以上の自食作用阻害剤とを組み合わせることによって、解糖依存性癌を有すると特定された対象を治療するために使用することができる。解糖依存性癌を解糖できない細胞に変換する抗癌化合物の例：アルキル化剤；ニトロソウレア；抗腫瘍抗生物質；コルチコステロイドホルモン；抗エストロゲン；アロマターゼ阻害剤；プロゲスチン；抗アンドロゲン；ＬＨＲＨアゴニスト；キナーゼ阻害剤；ならびに抗体療法；たとえば、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、カルマスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、ミトキサントロン、プレドニゾン、デキサメタゾン、タモキシフェン、フルベストラント、アナストロゾール、レトロゾール、酢酸メゲストロール、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、ｇｌｅｅｖａｃ、イレッサ、タルセバ、ハーセプチン、アバスチン、Ｌ−アスパラギナーゼおよびトレチノイン。
【０１４９】
投与量
本明細書において使用される場合、「治療効果のある量」または「治療効果のある用量」は、病気の進行を完全にまたは部分的に阻害するかまたは病気の１つ以上の症状を少なくとも部分的に軽減する、本発明の化合物または２つ以上のそのような化合物の組み合わせの量である。治療効果のある量はまた予防的に有効である量であることができる。治療効果のある量は、患者のサイズおよび性、治療されるべき病気、病気の重症度および求められる結果に依存するであろう。所与の患者について、治療効果のある量は、当業者に公知の方法によって決定することができる。
【０１５０】
本発明の方法に使用される任意の化合物について、治療効果のある用量は、細胞アッセイから最初に推定することができる。たとえば、用量は、細胞アッセイにおいて測定されるようなＩＣ５０（すなわち、半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む血中濃度範囲を達成するよう細胞および動物モデルにおいて調合することができる。ある場合には、そのような測定は化合物への血漿タンパク質の結合影響を近似するので、３〜５％血清アルブミンの存在下にＩＣ５０を測定することが適切である。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。
【０１５１】
治療効果のある用量は、患者における症状の改善をもたらす化合物の量を意味する。そのような化合物の毒性および治療効果は、たとえば、最大耐量（ＭＴＤ）およびＥＤ５０（５０％最大反応のための有効用量）を測定するための細胞培養物または実験動物における標準薬剤学手順によって測定することができる。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、それは、ＭＴＤとＥＤ５０との比として表すことができる。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトで使用するためのある範囲の投与量を調合するのに用いることができる。そのような化合物の投与量は好ましくは、毒性がほとんどないかまったくなしでＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与ルートに依存してこの範囲内で変わってもよい。的確な調合、投与ルートおよび投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る（たとえば、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１  ｐ１における、Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５を参照されたい）。危機状態の治療においては、ＭＴＤに近づく緊急のボーラスまたは注入が急速な反応を得るために必要とされる可能性がある。
【０１５２】
投与量および間隔は、キナーゼ調節効果、または最小限の有効濃度（ＭＥＣ）を維持するのに十分である活性部分の血漿レベルを提供するために個々に調節されてもよい。ＭＥＣは各化合物について変わるであろうが、生体内データから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、投与の個々の特性およびルートに依存するであろう。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて血漿濃度を測定することができる。
【０１５３】
投与間隔はまた、ＭＥＣ値を用いて決定することができる。化合物は、症状の所望の改善が達成されるまで、１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、最も好ましくは５０〜９０％の時間にＭＥＣより上の血漿レベルを維持する投薬計画を用いて投与されるべきである。局所投与または選択的摂取の場合には、薬物の有効局所濃度は、血漿濃度に関連しなくてもよい。
【０１５４】
投与される組成物の量は、もちろん、治療中の対象に、対象の体重、苦痛の重症度、投与の方法および処方医師の判断に依存するであろう。
【０１５５】
キット
本発明の化合物および組成物（たとえば、式ＩまたはＩＩの化合物および組成物）は、必要ならば、キット（たとえば、パックまたはディスペンサー装置）で提供されてもよい。パックは、たとえば、ブリスター・パックなどの、金属またはプラスチック箔を含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置には、本明細書に記載されるあらゆる方法での化合物の使用についての使用説明書が添えられていてもよい。相溶性の医薬担体において調合された本発明の化合物を含む組成物がまた調製され、適切な容器に入れられ、指示病気の治療についてラベルを貼られてもよい。使用説明書がまた提供されてもよい。
【実施例】
【０１５６】
今大まかに記載されている本発明は、本発明のある態様および実施形態の例示目的のために挙げられるにすぎない、そして本発明を限定することを意図されない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。
【０１５７】
実施例１：自食作用の小分子阻害剤の単離
自食作用の機構を探究し、そしてそれを活性化することができる追加の小分子を特定するために、自食作用調整剤についてのハイスループット画像ベース選別を開発した。このシステムは、自食作用の誘発時の自食胞膜へのＧＦＰに結合した軽鎖３（ＬＣ３−ＧＦＰ）の局在化をうまく利用する（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｙｕ，Ｊ．，Ｐａｎ，Ｈ．，Ｈｕ，Ｐ．，Ｈａｏ，Ｙ．，Ｃａｉ，Ｗ．，Ｚｈｕ，Ｈ．，Ｙｕ，Ａ．Ｄ．，Ｘｉｅ，Ｘ．，Ｍａ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｍａｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４，１９０２３−１９０２８）。哺乳類ＬＣ３、酵母ＡＴＧ８のオーソログは、特異的に自食胞膜をマークすることが示されている（Ｋａｂｅｙａ，Ｙ．，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｎ．，Ｕｅｎｏ，Ｔ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．，Ｋｉｒｉｓａｋｏ，Ｔ．，Ｎｏｄａ，Ｔ．，Ｋｏｍｉｎａｍｉ，Ｅ．，Ｏｈｓｕｍｉ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ，Ｔ．（２０００）．ＬＣ３，ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  Ａｐｇ８ｐ，ｉｓ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｉｎ  ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １９，５７２０−５７２８；およびＭｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ，Ｔ．（２００７）．Ｈｏｗ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔ  ＬＣ３  ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ３，５４２−５４５）。１細胞当たりのＬＣ３−ＧＦＰ陽性自食胞の数は、正常成長条件下では非常に低いが、血清飢餓またはラパマイシンの添加時に急速に増加する。しかし、ＬＣ３−ＧＦＰの細胞レベルを上げる化合物が自食作用の分解活性を必ずしも上げることができるわけではない。代わりに、ＬＣ３−ＧＦＰの増加は、細胞死に関係するかまたはリソソーム欠陥の結果であり、こうして自食作用の閉塞に関係する可能性がある。
【０１５８】
４８０の公知の生物活性化合物の選別において、ＬＣ３−ＧＦＰベースのハイスループット画像選別を、細胞損傷を引き起こす結果としてかまたは下流リソソーム機能をブロックすることによってＬＣ３−ＧＦＰのレベルを非特異的に上げるものから自食症分解を特異的に誘発することができる化合物の特定を可能にする長期タンパク質分解についてのロースループットアッセイと結合させた。選別の結果は、自食作用を誘発し、そして明らかな細胞損傷を引き起こすことなく長期タンパク質分解を促進することができる、そのうちの７つがＦＤＡ認可薬物である、８つの化合物の特定につながった（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｙｕ，Ｊ．，Ｐａｎ，Ｈ．，Ｈｕ，Ｐ．，Ｈａｏ，Ｙ．，Ｃａｉ，Ｗ．，Ｚｈｕ，Ｈ．，Ｙｕ，Ａ．Ｄ．，Ｘｉｅ，Ｘ．，Ｍａ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｍａｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４，１９０２３−１９０２８）。
【０１５９】
この選別において、以前はＰＤＥ５阻害剤として知られた（ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｔ．Ｄ．，Ｄｕｎｋｅｒｌｅｙ，Ｈ．Ａ．，Ｍａｕｒｉｃｅ，Ｄ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｂ．Ｍ．（２００６）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ５  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｅｎｏｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３１７，１８８−１９５）、公知の生物活性化合物、ＭＢＣＱ（図１Ａ）が、自食作用阻害剤活性を有すると特定された。ラパマイシン（０．２μＭ）でのＬＣ３−ＧＦＰ−Ｈ４細胞の刺激は、予期される通りにＬＣ３−ＧＦＰのレベルの増加につながった。ＭＢＣＱの存在は、ラパマイシン刺激ＬＣ３−ＧＦＰだけでなく基本的レベルを両方とも阻害した。ＬＣ３−ＧＦＰドットの低下は、ラバマイシン単独のそれと比較してＭＢＣＱおよびラバマイシンの添加１時間後に明らかであった。ハイスループット顕微鏡法を用いるＬＣ３−ＧＦＰドットの定量的分析（図１Ｂ）。ＭＢＣＱの処理は、対照とまたはラバマイシン処理単独と比較してＬＣ３−ＧＦＰドットのスポット強度だけでなく数、スポットサイズをも低下させた。ＬＣ３−ＧＦＰの強度を、ラバマイシン単独のそれに対してラバマイシンおよびＭＢＣＱ両方一緒の存在下に両方とも測定し、ＭＢＣＱのＩＣ５０は、１０ｍＭのワーキング濃度を有する、一般に使用されるタイプＩＩＩ  ＰｔｄＩｎｓ３Ｐキナーゼ阻害剤、３−メチル−アデニン（３−ＭＡ）より約１０，０００倍強力である、０．７８８μＭであると測定された。
【０１６０】
ＭＢＣＱによる自食作用の阻害を確認するために、Ｈ４−ＬＣ３細胞、２９３Ｔ細胞およびマウス胎児線維芽細胞をＭＢＣＱで処理し、内因性ＬＣ３ＩＩのレベルをウェスタンブロットによって測定した。ＭＢＣＱの阻害活性と一致して、ＬＣ３ＩＩのレベルは、ラバマイシン単独のそれと比較してＭＢＣＱおよびラパマイシン共処理したＨ４−ＬＣ３、２９３ＴおよびＭＥＦ細胞において一貫して低下した。ＬＣ３−ＧＦＰ分析（図１Ｂ）と一致して、ＬＣ３ＩＩのレベルは、ラバマイシン単独のそれと比較して１時間のＭＢＣＱおよびラパマイシンでの処理後に有意により低かった。
【０１６１】
飢餓誘発自食作用へのＭＢＣＱの影響を測定するために、Ｈ４−ＬＣ３−ＧＦＰ細胞をＨａｎｋｓ緩衝液中で１時間培養し、それは、ＬＣ３−ＧＦＰドットのレベル（図２）の増加によって実証されるように自食作用を誘発するのに十分であった。ＭＢＣＱ（５μＭ）の存在下に、飢餓誘発自食作用は有意に低下する。ＬＣ３−ＧＦＰスポット数、スポットサイズおよびスポット強度の定量的測定は、飢餓誘発自食作用がＭＢＣＱ（５μＭ）または３−ＭＡ（１０ｍＭ）またはウォルトマンニン（０．１μＭ）の陽性対照によって阻害されることを裏付けた。
【０１６２】
ラパマイシンで処理された細胞の超微細構造をＭＢＣＱの存在または不在下に測定した。ＭＢＣＱ単独で４時間処理された細胞は、ビヒクル（１％ＤＭＳＯ）で処理された対照と形態学的に似ていることが分かった。ラパマイシンの処理は、特徴的な二重膜を持った大量の自食胞の形成につながった。そのような二重膜自食胞は、ラパマイシンおよびＭＢＣＱ一斉に処理された細胞においては目立って不在であった（図３）。
【０１６３】
実施例２：ＭＢＣＱの構造活性相関（ＳＡＲ）
ＭＢＣＱは４−ヘテロ原子置換キナゾリン化合物である。ＳＡＲの目的のために、ＭＢＣＱの構造を、図４Ａに示されるように３つの部分すなわち部分Ａ、ＢおよびＣ、に分割した。
【０１６４】
部分Ａにおいて、異なる置換基を６−位へ導入し：ハロゲン、電子不足基（たとえば、ニトロおよびメチルスルホニル基）、および電子に富む基（たとえばメトキシおよびアミノ基）；ハロゲンを７−位へ導入し；ハロゲンを６−および８−位の両方へ導入し；ならびにメチルまたはアミノ基を２−位へ導入した。
【０１６５】
部分Ｂについては、窒素を酸素または硫黄原子で置き換え；メチレン鎖を伸ばし；および分枝点（すなわち置換）をメチレン鎖に加えた。
【０１６６】
部分Ｃにおいて、４−ピリジル、モルホリニル、ならびに置換および非置換フェニルを含む、異なる芳香族サイクルの影響を研究した。置換フェニルの置換基としては、電子吸引性基（たとえば、ハロゲン、ニトロ、およびトリフルオロメチル基）、置換フェニル５）ならびに電子供与性基（たとえばアミノ、メトキシ基）の両方が挙げられる。
【０１６７】
ＭＢＣＱ構造上で上記の修正をした合計１９４種の化合物を合成し、自食作用を阻害することにおけるそれらの活性を分析した。
【０１６８】
ＳＡＲ結果は次の通りまとめることができる（また図４Ｂも参照されたい）：
（１）キナゾリンの６−位の置換基の性質は、活性にとって決定的に重要である。電子吸引性置換基（たとえばニトロまたはフッ素基）は活性を向上させる（たとえば図１６におけるＣ２９）。６−位に電子供与性置換基（たとえばアミノ基）を持った化合物は活性をまったく持たない（たとえば図１４におけるＣ７１）。６−位に置換基なしの化合物は穏やかな活性を有する。
【０１６９】
（２）７−および８−位の置換基は、活性に負の影響を及ぼす。たとえば、キナゾリンが７−または８−位にモノ置換されているとき、化合物は活性を失い（たとえばＣ８３）、６−および８−位の両方にクロロ基でビス−置換されている化合物と同じである（たとえばＣ１９、Ｃ２０）。
【０１７０】
（３）部分Ａ上の立体障害は活性を妨げる（たとえばＣ６８、Ｃ０１）。
【０１７１】
（４）部分Ｂにおけるヘテロ原子がＯまたはＳであるとき、活性はまったく検出されなかった（たとえばＣ１０１、Ｃ４５）。
【０１７２】
（５）化合物は、部分Ｃにおけるベンゼンがモルホリンまたはフランで置き換えられるときに活性を失う（たとえばＣ７８、Ｃ５４）。
【０１７３】
（６）部分Ｃにおいて４−ＣＦ３、４−ＮＯ２または４−ピリジンを持った化合物はまったく活性を示さない（たとえばＣ１５）。同時に３−、４−および５−位に置換基があるとき、活性はまったく検出されなかった（たとえばＣ１５）。
【０１７４】
（７）部分Ｂにおけるヘテロ原子が、１〜３個の炭素に連結された、窒素であるときに高活性は観察された（たとえばＣ１６、Ｃ５１およびＣ１３）。４個以上のメチレン単位が部分Ａと部分Ｃとを連結する鎖中にあるとき活性はまったく検出されなかった（たとえばＣ３０、Ｃ４９）。さらに、分枝鎖上の嵩高い置換基は活性なしにつながる（たとえばＣ８１、Ｃ８６およびＣ９４）。さらに、分枝鎖上の異なる光学的配置（ＲまたはＳ）で感知できるほどの効果は検出されなかった（たとえばＣ６９およびＣ８４、Ｃ７６およびＣ７７）。
【０１７５】
合成され、そしてそれらの自食作用阻害活性について分析されたＭＢＣＱ誘導体のうちで、４４種の化合物がＭＢＣＱのそれと類似のまたはそれより上の自食作用阻害活性を示した（図１６）。同時に、構造上ＭＢＣＱに似ているが自食作用阻害活性をまったく持たない、Ｃ７１およびＣ８２などの、多数の化合物が特定され、その後の実験において陰性対照として使用された（図１５）。
【０１７６】
自食作用への阻害活性を確認するために、マウス胎児線維芽（ＭＥＦ）細胞を、ラバマイシンの存在または不在下にＣ２９、Ｃ４３またはＣ７１で４時間処理し、自食作用のレベルをＬＣ３ウェスタンブロッティングによって測定した。Ｃ４３またはＣ２９の処理はラバマイシンによって誘発される自食作用を阻害したが、陰性対照Ｃ７１は阻害しなかった（図５Ａ）。
【０１７７】
自食作用へのＣ２９およびＣ４３の影響は、電子顕微鏡法によってさらに確認された。ラバマイシン処理ＭＥＦ細胞において、予期されるように多くの多重膜の小胞だけでなく多数の二重膜の自食小胞が観察された（図５Ｂ）。ラバマイシンおよびＣ２９またはＣ４３で処理された細胞においては、自食胞は、ビヒクル処理細胞におけるように概して存在しない（図５）。
【０１７８】
実施例３：ＭＢＣＱは自食作用を含む選択的細胞死モデルを阻害する
細胞活性へのＭＢＣＱの影響を特徴付けるために、細胞生存および細胞サイクルへのＭＢＣＱの影響を以下に概説されるように測定した。Ｈ４細胞をＭＢＣＱ（５μＭ）で５日間処理し、トリパンブルーの存在下での細胞数計数のために毎日採取した。図６Ａに示されるように、ＭＢＣＱの処理は、細胞増殖にまったく影響を及ぼさなかった。ＭＢＣＱ（５μＭ）で２４時間および４８時間処理されたＨ４細胞における細胞サイクルプロフィールおよび可能なアポトーシス細胞もまた測定した。図６Ｂに示されるように、ＭＢＣＱは細胞サイクル分布に検出できる影響をまったく及ぼさない。
【０１７９】
自食は多数のアポトーシス欠損細胞タイプにおける細胞死に関与すると提案されてきた。たとえば、ｂａｘ／ｂａｋ二重欠損マウス胎児線維芽細胞（ＤＫＯ  ｍｅｆ）は、アポトーシスに対して強い抵抗性がある（Ｗｅｉ，Ｍ．Ｃ．，Ｚｏｎｇ，Ｗ．Ｘ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｅ．Ｈ．，Ｌｉｎｄｓｔｅｎ，Ｔ．，Ｐａｎｏｕｔｓａｋｏｐｏｕｌｏｕ，Ｖ．，Ｒｏｓｓ，Ａ．Ｊ．，Ｒｏｔｈ，Ｋ．Ａ．，ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，Ｇ．Ｒ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｊ．（２００１）．Ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ＢＡＸ  ａｎｄ  ＢＡＫ：ａ  ｒｅｑｕｉｓｉｔｅ  ｇａｔｅｗａｙ  ｔｏ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２，７２７−７３０）。エトポシドによるｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ  ｍｅｆの刺激は、自食作用誘発によって一部分において細胞死を誘発すると示されてきた（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｓ．，Ｋａｎａｓｅｋｉ，Ｔ．，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｎ．，Ｍｉｚｕｔａ，Ｔ．，Ａｒａｋａｗａ−Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｙ．（２００４）．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｎｏｎ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６，１２２１−１２２８）。ＭＢＣＱがエトポシドによって誘発されるｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ細胞の細胞死を阻害する可能性があるかどうかを試験するために、Ｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ細胞を、陽性対照としてのＭＢＣＱ（１０μＭ）、または３−ＭＡ（１０ｍＭ）の存在下にエトポシドで８時間処理した。図７Ａに示されるように、ＭＢＣＱの存在は、ｂａｘ／ｂａｋ  ＤＫＯ  ＭＥＦ細胞の細胞死を有意に減少させた。さらに、ＭＢＣＱによる阻害と一致して、ＬＣ３ＩＩのレベルは、エトポシド処理細胞において上がったが、ＭＢＣＱの存在下では下がった（図７Ｂ）。
【０１８０】
実施例４：ＭＢＣＱはＰＩ３Ｐの細胞レベルを選択的に下げる
ＭＢＣＱはラパマイシンおよび飢餓によって誘発される自食作用を阻害するので、ＭＢＣＱがｍＴＯＲの活性に影響を及ぼすかどうかを先ず測定した。ウェスタンブロッティングアッセイは、ＭＢＣＱが対照またはラバマイシン処理細胞において、ｍＴＯＲおよびその標的、ｐ７０Ｓ６ＫおよびＳ６のホスホリル化にまったく影響を及ぼさないことを実証した。そしてまたＭＢＣＱは、ＧＳＫ−３α／β、ＡＫＴのホスホリル化にもいかなる影響も及ぼさない。ＡＫＴのホスホリル化はタイプＩ  ＰｔｄＩｎｓ３（ＰＩ３）キナーゼによって調整されるので、この結果はまた、ＭＢＣＱがタイプＩ  ＰＩＳキナーゼへまったく影響を及ぼさないことを示唆する。したがって、ＭＢＣＱはｍＴＯＲ経路またはタイプＩ  ＰＩ３キナーゼに対してまったく影響を及ぼさないと結論された。
【０１８１】
マーカーとしてＥＥＡ１の免疫染色を用いる早期エンドソーム、マーカーまたはリソトラッカーとしてｌａｍｐ２の免疫染色を用いるリソソーム、マーカーとしてＧａｌＴ−ＹＦＰを用いるトランス−ＧｏｌｇｉへのＭＢＣＱの影響を測定した。ＭＢＣＱの影響は、これらの実験のいずれにおいても検出されなかった。したがって、ＭＢＣＱは主要な細胞内小器官に影響を及ぼさないと結論された。
【０１８２】
さらに、ｐＥＧＦＰ−ＣＬ１、短寿命ペプチドとのＧＦＰ融合を用いるプロテアソーム分解経路へのＭＢＣＱの影響を測定した（Ｂｅｎｃｅ，Ｎ．Ｆ．，Ｓａｍｐａｔ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｋｏｐｉｔｏ，Ｒ．Ｒ．（２００１）．Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２，１５５２−１５５５）。ＭＢＣＱはｐＥＧＦＰ−ＣＬ１のレベルに影響を及ぼさず、ＭＢＣＱがプロテアソーム経路に一般的な影響を及ぼさないことを示唆することが分かった（データは示されていない）。さらに、ＭＢＣＱの処理は、ポリユビキチン化の一般的なレベルにまったく影響を及ぼさない。したがって、ＭＢＣＱはユビキチン−プロテアソーム分解経路に一般的な影響を及ぼさないと結論された。
【０１８３】
ＰｔｄＩｎｓ３Ｐ（ＰＩ３Ｐ）のレベルは自食作用を仲介するのに決定的に重要な役割を果たすことが知られている（Ｌｅｖｉｎｅ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｋｌｉｏｎｓｋｙ，Ｄ．Ｊ．（２００４）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｙ  ｓｅｌｆ−ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ６，４６３−４７７）。ＭＢＣＱがＰＩ３Ｐに影響を及ぼすかどうかを問うために、ＦＹＶＥ−ＲＦＰを発現するＨ４細胞を使用した。ＦＹＶＥはＰＩ３Ｐに特異的に結合し、ＰＩ３Ｐについての細胞レベル用のマーカーとして広く使用されている（Ｇａｕｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，Ａ．，Ｄ’Ａｒｒｉｇｏ，Ａ．，Ｂｒｅｍｎｅｓ，Ｂ．，Ｓｔｅｎｍａｒｋ，Ｈ．，およびＡａｓｌａｎｄ，Ｒ．（１９９８）．ＦＹＶＥ  ｆｉｎｇｅｒｓ  ｂｉｎｄ  ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９４、４３２−４３３）。興味深いことに、ＭＢＣＱの処理は、基礎Ｈ４細胞およびラバマイシン処理Ｈ４細胞の両方においてＦＹＶＥ−ＲＦＰスポットのレベルを急速におよび効果的に下げるが、ウェスタンブロッティングによって検出されるＦＹＶＥ−ＲＦＰのレベルは変化しなかった（図８）。
【０１８４】
ＰｔｄＩｎｓ３Ｐの細胞レベルへのＭＢＣＱの影響をさらに測定するために、脂質ドットブロットアッセイを用いた。細胞ＰｔｄＩｎｓ種を抽出し、ポリフッ化ビニリデン膜上へ塗布した。ＰｔｄＩｎｓ３Ｐのレベルは、ＧＳＴ−ＰＸドメイン・タンパク質および抗ＧＳＴ抗体を使用して検出された。図９に示されるように、ＭＢＣＱおよびＣ４３の処理は、基礎細胞およびラバマイシン処理細胞の両方中のＰｔｄＩｎｓ３Ｐの細胞レベルを選択的に下げた。総合すれば、ＭＢＣＱはＰｔｄＩｎｓ３Ｐのレベルを下げると結論された。
【０１８５】
実施例５：ＭＢＣＱおよびその活性誘導体はＶｐｓ３４錯体の分解を選択的に促進する
タイプＩＩＩ  ＰｔｄＩｎｓ３キナーゼ錯体、Ｖｐｓ３４／ベクリン１／ｐ１５０は、ＰｔｄＩｎｓ３Ｐを生成するためのＰｔｄＩｎｓのホスホリル化に関与するので、Ｖｐｓ３４錯体のキナーゼ活性へのＭＢＣＱ阻害活性を測定した。２９３Ｔ細胞をＨＡ−Ｖｐｓ３４／ＧＦＰ−ベクリン１でトランスフェクトした。抗ＨＡを使用して免疫沈降させたＶｐｓ３４錯体を、γ−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下にＰｔｄＩｎｓで培養した。ホスホリル化産物を薄層クロマトグラフィーおよび引き続くオートラジオグラフィーによって分析した。図１０Ａに示されるように、ＰｔｄＩｎｓホスホリル化は、ウォルトマンニンによって阻害されるが、ＭＢＣＱによって阻害されない。したがって、ＭＢＣＱはＶｐｓ３４酵素活性の直接阻害剤ではないと結論された。
【０１８６】
他方では、ｆｌａｇ−タグ付きベクリン１およびＨＡ−Ｖｐｓ３４のレベルは、Ｃ８２、不活性アナログのそれよりＭＢＣＱ、Ｃ２９またはＣ４３処理細胞においてかなり低いことが分かった（図１０Ｂ）。ＭＢＣＱ、Ｃ２９およびＣ４３の処理はまた、ＧＦＰ−ｐ１５０およびＡｔｇ１４Ｌのレベルを下げたが、Ｃ８２は下げなかった（図１０Ｃ〜Ｄ）。
【０１８７】
ＭＢＣＱおよびＣ４３は、Ｈ４細胞における（図１０Ｅ）および２９３Ｔ細胞における（図１０Ｆ）内因性ベクリン１、Ｖｐｓ３４およびＡｔｇ１４Ｌのレベルを下げ得るが、公知の自食作用阻害剤３−ＭＡは、Ｈ４細胞における内因性ベクリン１にまったく影響を及ぼさない（図１０Ｇ）ことがまた分かった。
【０１８８】
ＭＢＣＱおよびＣ４３が内因性ベクリン１に類似の影響を及ぼすかどうかを測定するために、２９３Ｔ細胞を、タンパク質合成を阻害するためのＣＨＸの存在下にＭＢＣＱまたはＣ４３で処理した。ベクリン１のレベルは、６時間の処理後にＣＨＸ単独でよりＭＢＣＱまたはＣ４３の存在下にとりわけ低かった（図１０Ｅ）。したがって、ＭＢＣＱおよびＣ４５の両方が内因性ベクリン１の分解を促進すると結論することができる。
【０１８９】
ＭＢＣＱおよびＣ４３がＶｓｐ３４錯体のレベルを下げる機構を探究するために、２９３Ｔ細胞を、リソソーム分解を阻害するためのプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２またはＮＨ４Ｃｌと共にＣ４３で処理した。ＭＧ１３２の存在はＧＦＰ−ベクリン１の減少を阻害したが、ＮＨ４Ｃｌは阻害しないことが分かった。この結果は、Ｃ４３の処理がプロテアソーム経路によってベクリン１の分解を促進することを示唆する。それ故、Ｃ４３は、Ｖｐｓ３４／ベクリン１／ｐ１５０／Ａｔｇ１４Ｌ／ＵＶＲＡＧを含むタイプＩＩＩ  ＰＩ３キナーゼ錯体の分解を選択的に促進することによって自食作用を阻害すると結論された。
【０１９０】
実施例６：ＭＢＣＱおよびその活性誘導体は飢餓誘発アポトーシスを高める
自食作用は細胞生存を支援するために代謝ストレス条件下に活性化されるので、化合物を、それらが飢餓条件下に細胞死を促進するかどうかを測定するために試験した。確かに、Ｃ４３は血清を含まない条件下にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図１１Ａ）およびグルコースを含まない条件下にＭＣＦ−７細胞（図１１Ｂ）の生存を低下させることが分かった。ウェスタンブロット分析は、Ｃ４３の処理が基礎条件およびグルコースを含まない条件の両方下にＭＣＦ−７細胞における自食作用を阻害することを裏付けた。
【０１９１】
さらに、Ｃ４３は、１０％ウシ血清の存在下に、Ｂｃａｐ−３７細胞、乳癌細胞株の増殖を阻害することが分かった（図１１Ｃ）。さらに、Ｍｃａｐ−３７細胞は、グルコースを含まない条件下にＣ４３に非常に敏感になった（図１１Ｄ）。対照およびグルコースを含まない条件下に培養されたＢｃａｐ−３７細胞のウェスタンブロット分析は、Ｃ４３の処理が基礎条件およびグルコースを含まない条件の両方下に自食作用を阻害することを裏付けた。
【０１９２】
Ｃ４３がＢｃａｐ−３７細胞の死を誘発する機構を探究するために、ＤＮＡ中身をＦＡＣＳによって解析した。グルコースを含まない条件下のＢｃａｐ−３７細胞の処理は、アポトーシスＤＮＡ崩壊と一致する、サブ二倍体ＤＮＡのピークを誘発することが分かった（図１１Ｅ）。さらに、ＰＡＲＰの開裂、カスパーゼ活性化の特徴もまた、グルコースを含まない条件下にＣ４３で６時間処理されたＢｃａｐ−３７細胞において検出された（図１１Ｆ）。別の乳癌細胞株、ＢＴ５４９もまた、Ｃ４３の処理に対して同様な反応を実証した。
【０１９３】
解析された上記の癌細胞株とは対照的に、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来する、ＭＤＣＫ細胞のグルコースを含まない条件下のｓｐａｕｔｉｎでの処理は、アポトーシスを誘発せず；１０μＭのｓｐａｕｔｉｎで４８時間処理されたときに約２５％成長抑制が観察されるにすぎなかった（図１２Ａおよび１２Ｂ）。腫瘍周辺の正常組織から樹立された、そして起源が筋上皮である、Ｈｓ５７８Ｂｓｔ細胞もまた、ｓｐａｕｔｉｎに敏感ではなかった（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。これらの結果は、癌細胞が増加した代謝圧力下にあり得る可能性と一致し、それ故非癌細胞より自食作用の阻害に敏感である。
【０１９４】
アポトーシス欠損条件下での自食作用の増加した活性化は細胞死を仲介することが示されてきた。この可能性を試験するために、Ｂａｘ−Ｂａｋ二重ノックアウト（ＤＫＯ）細胞を、ｓｐａｕｔｉｎの存在または不在下にＤＮＡ損傷応答によって誘発するためのエトポシドで試験し、Ｃ４３、ＭＢＣＱおよび３−ＭＡがＢａｘ−Ｂａｋ  ＤＫＯ細胞のエトポシド誘発死を阻害することが分かった。
【０１９５】
したがって、癌細胞の小集団は自食作用の阻害に選択的に敏感である可能性があると結論された。
【０１９６】
実施例７：生体内でのＭＢＣＱ誘導体の効果
生体内でのＭＢＣＱ誘導体の効果を試験することを始めるために、ラバマイシン注射マウスにおける自食作用を阻害するＭＢＣＱ誘導体の能力を研究した。マウスに陽性対照としてラバマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ）単独を、またはＣ４３もしくはＭＢＣＱ（４０ｍｇ／ｋｇ）を４時間毎時間腹腔内注射し、次に５時間目に犠牲にした。肝臓における自食作用レベルを次に、抗ＬＣ３抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析した。図１３Ａに示されるように、Ｃ４３もしくはＭＢＣＱの投与は、ＬＣ３ＩＩのレベルを有意に下げた。したがって、Ｃ４３およびＭＢＣＱは両方とも、自食作用を阻害するのに生体内で活性であると測定された。
【０１９７】
自食作用は膵炎における組織損傷に関与すると提案されてきたので、ＭＢＣＱ誘導体を、それらがセルレイン注射、膵炎の十分に確立された動物モデルによって誘発される組織損傷を減らすことができるかどうかを見るために試験した（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｄ．，Ｏｈｍｕｒａｙａ，Ｍ．，Ｈｉｒｏｔａ，Ｍ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．，Ｓｕｙａｍａ，Ｋ．，Ｉｄａ，Ｓ．，Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｙ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｅ．，Ｋｉｄｏ，Ｈ．，Ａｒａｋｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｃｉｎａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８１，１０６５−１０７２；およびＯｈｍｕｒａｙａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ．（２００８）．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｔｈｅｏｒｙ  ｆｏｒ  ｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ４，１０６０−１０６２）。ラットにセルレイン（５０ｎｇ／ｋｇ）単独をまたはＣ４３（４０ｍｇ／ｋｇ）を４時間毎時腹腔内注射した。ラットを最後の注射の１時間後に犠牲にし、膵臓をウェスタンブロッティング分析のために単離した。図１３Ｂに示されるように、セルレインの注射は報告されているように自食作用を誘発し；Ｃ４３の共注射はセルレイン注射に誘発される自食作用のレベルを有意に下げた。総合すれば、Ｃ４３は、セルレイン誘発膵炎において誘発される自食作用を減らすのに有効であると結論された。
【０１９８】
実施例８：化合物の製造
式ＩおよびＩＩの化合物の合成への１つの一般的なアプローチをスキームＩにおいて下に図示する。
【化８】
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【０１９９】
［１］工程１は、キナゾリン−４−ケトン（または８−アザ−キナゾリン−４−ケトン）の形成である。
【０２００】
１つのアプローチにおいては、アントラニル酸メチルエステル（または２−アミノニコチン酸メチル）をホルムアミドと１：１５〜２０のモル比で混合し、約１７０〜１９０℃で加熱する。反応が完了した後、混合物を冷却し、濾過し、洗浄し、乾燥させる。生じた粗生成物をさらに処理することなく次の反応に使用する。
【０２０１】
［２］工程２は、４−クロロキナゾリン（または８−アザ−４−クロロキナゾリン）の形成である。
【０２０２】
１つのアプローチにおいては、工程１からの粗生成物をオキシ塩化リンと１：８．７〜１０のモル比で混合し、次に約１００〜１１５℃で加熱する。反応が完了する、約１０〜１２時間後に、混合物を冷却し、過剰のオキシ塩化リンを回転蒸発によって除去する。ジクロロメタンなどの、有機溶媒を加えて固体を溶解させ、これにアンモニアの添加による約７〜８への生じた溶液のｐＨ調整が続く。生じた混合物をジクロロメタンで抽出し、乾燥させ、カラムクロマトグラフィーによって精製する。
【０２０３】
別のアプローチにおいては、工程１からの組成生物を、触媒量の無水ＤＭＦ（たとえば０．５〜１ｍＬ）と共に、塩化チオニルと１：１５〜２０のモル比で混合し、次に約８０〜９０℃で加熱する。反応が完了する、約１０〜１２時間後に、混合物を冷却し、過剰の塩化チオニルをロータリーエバポレーターによって除去する。ジクロロメタンなどの、有機溶媒を加えて固体を溶解させ、これにアンモニアの添加による約７〜８への生じた溶液のｐＨ調整が続く。生じた混合物をジクロロメタンで抽出し、乾燥させ、カラムクロマトグラフィーによって精製する。
【０２０４】
別のアプローチにおいては、工程１からの組成生物を塩化オキサリルとアルゴン下に混合し、無水ＤＭＦを滴加して、１：１．５：１．５工程１の生成物：塩化オキサリル：ＤＭＦのモル比の混合物を形成し、次に約８５〜９５℃に加熱する。約７〜１０時間後に、反応を飽和リン酸二ナトリウム水素でクエンチする。次に混合物を、ジクロロメタンなどの、有機溶媒で抽出し、カラムクロマトグラフィーによって精製する。
【０２０５】
［３］工程３は、Ｎ−置換−４−アミノ−キナゾリン（または８−アザ−Ｎ−置換−４−アミノ−キナゾリン）の形成である。
【０２０６】
アルゴン下に、工程２の生成物、ＨＸＣ（Ｒ２）（Ｒ３）（ＣＨ２）ｎＺ（本明細書において定義されるような）、およびトリエチルアミンを、テトラヒドロフランなどの、有機溶媒中、１：１．２５：１．６８のモル比で組み合わせ、約７５〜８０℃に加熱する。１２〜１８時間後に、有機溶媒を回転蒸発によって除去する。生じた粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製する。
【０２０７】
追加の例示のために、化合物Ａ９、Ａ３０およびＡ３６の合成を下により詳細に記載する。上に指摘されたように、追加の化合物は、任意選択的に置換された４−クロロキナゾリン（下に示される９−３などの）と結合するアミンを変えることによって製造することができる。
【０２０８】
Ａ９の製造
【化９】
2013500255.tif 000013
【０２０９】
ジエチルエーテル（５ｍＬ）中のＡｇＮＯ２（４４８．５ｍｇ、２．９２ミリモル）の懸濁液に化合物９−１（５００ｍｇ、２．６５ミリモル）をアルゴン下に氷−塩浴中で滴加した。混合物を室温に暖め、一晩撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を真空で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥＡ：ＰＥ、１：１００）によって精製して３つの化合物を得た。１Ｈ  ＮＭＲによってどれが所望の化合物９−２であるかを判断することは困難であった。
【０２１０】
ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（１ｍＬ／１ｍＬ）中に化合物９−２（１５０ｍｇ、０．９６７ミリモル、ＭＣ０４４９−４１−２）およびＫＯＨ（８１．４ｍｇ、１．４５１ミリモル）を含有する混合物を室温で２時間撹拌した。次にセレクトフルオル（５１４．０ｍｇ、１．４５１ミリモル）を一度に加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水（１０ｍＬ）に注ぎ込み、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ＰＥ）によって精製して化合物９−３を無色オイル（７０ｍｇ、収率：４２％）として得た。
【０２１１】
イソプロピルアルコール（５ｍＬ）中の化合物９−３（５０ｍｇ、０．２７ミリモル）および（４−クロロフェニル）メタンアミン（４７ｍｇ、０．３３ミリモル）の溶液にＥｔ３Ｎ（４６μＬ、０．３３ミリモル）を加えた。溶液を１５０℃で２０分間電子レンジにかけた。ＴＬＣは反応が完了していることを示した。混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製してＡ９を淡黄色固体（５２ｍｇ、収率：６７％、１Ｈ  ＮＭＲ、およびＬＣ−ＭＳによって確認）として得た。１Ｈ  ＮＭＲを図２３に示す。
【０２１２】
Ａ３０の製造
【化１０】
2013500255.tif 000014
【０２１３】
イソプロピルアルコール（４ｍＬ）中の化合物９−３（１０５ｍｇ、０．５７３ミリモル）、３０−９（９４ｍｇ、０．５７３ミリモル）およびＮＥｔ３（０．２２ｍＬ、１．６４ミリモル）を１５０℃で２０分間電子レンジにかけた。濃縮およびカラムクロマトグラフィーによる精製はＡ３０を黄色固体（８０ｍｇ、収率：４５％、１Ｈ  ＮＭＲによって確認）として与えた。１Ｈ  ＮＭＲを図２４に示す。
【０２１４】
Ａ３６の製造
【化１１】
2013500255.tif 000015
【０２１５】
ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）中の化合物３６−１（１．０ｇ、５．３ミリモル）およびＮａＣＮ（５２０ｍｇ、１０．６ミリモル）の溶液を３０℃で一晩撹拌した。ＴＬＣは反応が完了していることを示した。混合物を水（３０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機相を水（１０ｍＬ×５）およびＮａＨＣＯ３（飽和、２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製して３６−２を無色オイル（３６０ｍｇ、収率：５０％）として得た。
【０２１６】
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の化合物３６−２（３４６ｍｇ、２．５６ミリモル）の溶液にラネー（Ｒａｎｅｙ）Ｎｉを加えた。次に混合物を濃水性アンモニアでｐＨ＝１０に調整し、３０℃で一晩撹拌した。ＴＬＣは反応が完了していることを示した。混合物を、セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）を通して濾過し、濾液を濃縮して３６−３を黄色オイル（１２０ｍｇ、収率：３４％）として得た。
【０２１７】
イソプロピルアルコール（５ｍＬ）中の化合物９−３（５０ｍｇ、０．２７ミリモル）および３６−３（４６ｍｇ、０．３３ミリモル）の溶液にＥｔ３Ｎ（４６μＬ、０．３３ミリモル）を加えた。溶液を１５０℃で２０分間電子レンジにかけた。ＴＬＣは反応が完了していることを示した。濃縮およびフラッシュクロマトグラフィーによる精製はＡ３６を白色固体（４８．４ｍｇ、収率：６３％、ＤＭＳＯ中４００ＭＨｚでの１Ｈ  ＮＭＲ、およびＭＳによって確認）として得た。１Ｈ  ＮＭＲを図２５に示す。
【０２１８】
実施例９：ＰＤＥ５阻害活性からの自食作用阻害活性の分離
ＭＢＣＱ誘導体の構造活性相関（ＳＡＲ）を、自食作用の阻害におけるその活性がそのＰＤＥ５阻害活性から分離され得るかどうかを決定するために研究した。上に記載されたように、合成され、そしてそれらの自食作用阻害活性について分析されたＭＢＣＱ誘導体のうち、幾つかの化合物はＭＢＣＱのそれに類似のまたはそれより上の自食作用阻害活性を示し、その他のものは自食作用阻害活性をまったく持たず、したがって陰性対照として役立つことができる。
【０２１９】
１４のＭＢＣＱ誘導体を選択し、ＰＤＥ５へのそれらの活性について選別した（Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｙａｎ，Ｚ．，Ｙａｎｇ，Ｓ．，Ｃａｉ，Ｊ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｋｅ，Ｈ．（２００８）．Ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ−８Ａ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７，１２７６０−１２７６８）。それらのうち、Ｃ４３（６−フルオロ−Ｎ−（４−フルオロベンジル）キナゾリン−４−アミン）、ＭＢＣＱのそれに匹敵する０．８７μＭのＩＣ５０の有効な自食作用阻害剤が、ＰＤＥ５およびその他のＰＤＥに対してはるかに低下した阻害活性を有することが分かった。このように、ＭＢＣＱのＰＤＥ５阻害活性は、自食作用阻害活性のそれから化学的に分離することができる。
【表１】
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【０２２０】
この結論と一致して、ＭＹ−５４４５、ジピリダモール、ＩＢＭＸおよびシルデナフィルを含む、選別されたが、自食作用阻害剤として明るみに出ていない多数のその他の公知ＰＤＥ５阻害剤が生物活性ライブラリーに存在した。この結論をさらに確認するために、Ｈ４−ＬＣ３−ＧＦＰ細胞を、ＭＢＣＱを陽性対照として使用してラバマイシンと、ＭＹ−５４４５（３０μＭ）、ジピリダモール（８０μＭ）、ＩＢＭＸ（１００μＭ）またはシルデナフィル（１０μＭ）を含むその他のＰＤＥ５阻害剤とで処理した。ＰＤＥ５について２．５ｎＭのＥＣ５０を有する最も強力なＰＤＥ５阻害剤、シルデナフィル（Ｖｉａｇｒａ）を含む、試験されたＰＤＥ５阻害剤のどれもが、自食作用に関するいかなる活性も持たない。これらのデータから、ＭＢＣＱの自食作用阻害活性はそのＰＤＥ５阻害活性と関係がないと結論された。
【０２２１】
実施例１０：Ｖｐｓ３４錯体Ｉのための脱ユビキチン化プロテアーゼ錯体の同定
ユビキチン化は、プロテアソーム分解を仲介するのに本質的な重要な工程を表す。それ故実験は、ベクリン１のユビキチン化がＣ４３で処理された細胞において増加するかどうかを測定するために行った。図１６に図示されるように、Ｃ４３はベクリン１のユビキチン化を促進することが分かった。
【０２２２】
それ故、Ｃ４３は、Ｖｐｓ３４錯体Ｉのユビキチン化を負に調整するために普通は機能する脱ユビキチン化プロテアーゼ錯体（ＤＵＢ）を標的にすると仮説を立てた。これは、小分子が活性剤より阻害剤である可能性が高いという共通の所見に従っている。この仮説を直接試験するために、ＤｈａｒｍａｃｏｎライブラリーＳＭＡＲＴプールからヒト脱ユビキチン化酵素を標的にする１２７ｓｉＲＮＡのコレクションを、アッセイとしてＬＣ３−ＧＦＰ−Ｈ４細胞を使用してノックダウン時に自食作用の阻害につながるＤＵＢについて選別した。
【０２２３】
ｓｉＰＬＫ１をトランスフェクション効率の検証のために使用し、ｓｉＶｐｓ３４を陽性対照として含めた。トランスフェクションの７２時間後に、細胞を、ＤＭＳＯ、自食作用を誘発するためのラパマイシン（２００ｎＭ）、またはラパマイシン（２００ｎＭ）およびｓｐａｕｔｉｎ（１０μＭ）で、それぞれ正副２通り追加の８時間処理した。細胞をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（０．５μＭ）で対比染色し、３．８％ＰＦＡ中で固定した。蛍光画像をとり、ＣｅｌｌＷｏＲｘ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて定量した。
【０２２４】
選別は、ＵＳＰ１０、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ３、ＵＳＰ１６およびＵＳＰ１８を、ノックダウン時に、プレート中央から少なくとも１．５標準偏差だけラバマイシンの存在下だけでなく基礎条件下に自食作用のレベルの低下につながる５つの遺伝子として特定した。Ｈ４細胞におけるＶｐｓ３４錯体でのタンパク質発現レベルへのこれらの５つのＵＳＰのノックダウンの影響を解析した。５つのＵＳＰのいずれのノックダウンも内因性Ｖｐｓ３４、ベクリン１、Ａｔｇ１４ＬおよびＵＶＲＡＧのレベルを下げることが分かった（図１７）。さらに、５つのＵＳＰのいずれのノックダウンもまたその他の４つのＵＳＰのタンパク質レベルの低下につながった（図１８）。興味深いことに、Ｃ４３の処理もまたこれらの５つのＵＳＰのレベルを下げた（図１８）。ｓｐａｕｔｉｎの処理もまた、２９３Ｔ細胞およびＢｃａｐ−３７細胞におけるＵＳＰ１３およびＵＳＰ１０のレベルを下げることができたが、ＵＳＰ４４、非関連ＵＳＰのレベルにほとんど影響を及ぼさない。
【０２２５】
これらの結果は、ＵＳＰ３、ＵＳＰ１０、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ１６およびＵＳＰ１８の安定性が互いに共依存であることを示唆し、これは、それらが大きい錯体中に存在する場合に起こる可能性がある。この可能性を試験するために、ＧＦＰ−ＵＳＰ１０およびＭｙｃ−ＵＳＰ１３プラスミドを２９３Ｔ細胞へトランスフェクトし、ＧＦＰ−ＵＳＰ１０相互作用およびＭｙｃ−ＵＳＰ１３免疫沈降によって調べた。ＧＦＰ−ＵＳＰ１０およびＭｙｃ−ＵＳＰ１３は実際に相互作用し、そして重要なことには、この相互作用はｓｐａｕｔｉｎ処理細胞において阻害されることが分かった（図１９）。したがって、ｓｐａｕｔｉｎは、Ｖｐｓ３４錯体のユビキチン化状態を調整するためにこの脱ユビキチン化プロテアーゼ錯体を適切に標的にするのに必要とされる可能性があるＵＳＰ１０とＵＳＰ１３と相互作用を中断させると結論された。
【０２２６】
ＵＳＰ１０はｐ５３のＤＵＢとして知られているから、これらのＵＳＰをノックダウンすることのｐ５３への影響もまた研究した。５つのＵＳＰのどれかのノックダウンがｐ５３の減少につながり得ることが分かった（図２０）。これらのデータは、ＵＳＰ３、ＵＳＰ１０、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ１６およびＵＳＰ１８がすべてｐ５３の調整剤であることを示唆する。
【０２２７】
ＵＳＰ１０およびＵＳＰ１３がＶｐｓ３４錯体の脱ユビキチン化プロテアーゼであることをさらに確認するために、２９３Ｔ細胞におけるＦｌａｇ−ＵＳＰ１０／ＧＦＰ−ベクリン１とＭｙｃ−ＵＳＰ１３／ＧＦＰ−ベクリン１との相互作用を免疫沈降でアッセイした。Ｆｌａｇ−ＵＳＰ１０およびＭｙｃ−ＵＳＰ１３は両方ともＧＦＰ−ベクリン１と相互作用することができ；そして興味深いことに、ｓｐａｕｔｉｎの処理はＦｌａｇ−ＵＳＰ１０とＧＦＰ−ベクリン１との相互作用を損なう（図２１Ａ）が、Ｍｙｃ−ＵＳＰ１３とＧＦＰ−ベクリン１との相互作用を損なうことができない（図２１Ｂ）ことが分かった。この結果は、ｓｐａｕｔｉｎがＵＳＰ１０をまたはＵＳＰ１０の上流を標的にしてＵＳＰ１０とベクリン１との相互作用を中断させる可能性があることを示唆する。重要なことには、ベクリン１またはＶｐｓ３４のノックダウンはＵＳＰ１０および、ＵＳＰ１０の基質として知られるｐ５３の内因性レベルを下げ得ることもまた分かった（図２１Ｃ）。これは、Ｖｐｓ３４錯体が、ＵＳＰ１０およびＵＳＰ１３を含むその脱ユビキチン化プロテアーゼを安定化させることによって、それら自体のレベルを調整することができる可能性があることを示唆する。さらに、これは、ベクリン１の損失がその脱ユビキチン化プロテアーゼを阻害することによってｐ５３の減少につながる可能性があるので、なぜベクリン１が多くの種類の癌において頻繁に失われるかを説明するための機構を提供する可能性がある。
【０２２８】
参照による援用
本明細書に引用される米国特許および米国公開特許出願のすべては、参照により本明細書によって援用される。
【０２２９】
均等物
本発明の幾つかの実施形態が本明細書に記載され、例示されてきたが、当業者は、機能を果たすためのおよび／または本明細書に記載される結果および／または利点の１つ以上を得るための様々なその他の方法および／または構造を容易に想像するであろうし、そのような変形および／または修正のそれぞれは本発明の範囲内にあると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載されるすべてのパラメータ、寸法、材料、および構造が例示的であることを意図されること、ならびに実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構造が、本発明の教示が用いられる１つまたは複数の具体的な用途に依存することを容易に十分理解するであろう。当業者は、通常の実験を用いるだけで、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認めるか、または均等物を確認することができるであろう。それ故、前述の実施形態は例として提示されているにすぎないこと、および、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内で、本発明は、具体的に記載され、そして特許請求されるようなもの以外の別のやり方で実施されてもよいことが理解されるべきである。本発明は、本明細書に記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法を指向する。さらに、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法のあらゆる組み合わせは、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾していないならば、本発明の範囲内に含められる。
【図１Ａ】
2013500255.tif 000025
【図１Ｂ】
2013500255.tif 000026
【図２】
2013500255.tif 000027
【図４Ａ】
2013500255.tif 000028
【図４Ｂ】
2013500255.tif 000029
【図６Ａ】
2013500255.tif 000030
【図６Ｂ】
2013500255.tif 000031
【図７Ｂ】
2013500255.tif 000032
【図７Ｅ】
2013500255.tif 000033
【図８Ａ】
2013500255.tif 000034
【図１１Ａ】
2013500255.tif 000035
【図１１Ｂ】
2013500255.tif 000036
【図１１Ｄ】
2013500255.tif 000037
【図１１Ｅ】
2013500255.tif 000038
【図１１Ｈ】
2013500255.tif 000039
【図１１Ｉ】
2013500255.tif 000040
【図１１Ｋ】
2013500255.tif 000041
【図１２Ａ】
2013500255.tif 000042
【図１２Ｂ】
2013500255.tif 000043
【図１２Ｃ】
2013500255.tif 000044
【図１２Ｄ】
2013500255.tif 000045
【図１４−１】
2013500255.tif 000046
【図１４−２】
2013500255.tif 000047
【図１４−３】
2013500255.tif 000048
【図１４−４】
2013500255.tif 000049
【図１４−５】
2013500255.tif 000050
【図１４−６】
2013500255.tif 000051
【図１５−１】
2013500255.tif 000052
【図１５−２】
2013500255.tif 000053
【図１５−３】
2013500255.tif 000054
【図１５−４】
2013500255.tif 000055
【図１５−５】
2013500255.tif 000056
【図１５−６】
2013500255.tif 000057
【図２３】
2013500255.tif 000058
【図２４】
2013500255.tif 000059
【図２５】
2013500255.tif 000060
【図３】
2013500255.tif 000061
【図５Ａ】
2013500255.tif 000062
【図５Ｂ】
2013500255.tif 000063
【図７Ａ】
2013500255.tif 000064
【図７Ｃ】
2013500255.tif 000065
【図７Ｄ】
2013500255.tif 000066
【図７Ｆ】
2013500255.tif 000067
【図８Ｂ】
2013500255.tif 000068
【図９Ａ】
2013500255.tif 000069
【図９Ｂ】
2013500255.tif 000070
【図１０Ａ】
2013500255.tif 000071
【図１０Ｂ】
2013500255.tif 000072
【図１０Ｃ】
2013500255.tif 000073
【図１０Ｄ】
2013500255.tif 000074
【図１０Ｅ】
2013500255.tif 000075
【図１０Ｆ】
2013500255.tif 000076
【図１０Ｇ】
2013500255.tif 000077
【図１０Ｈ】
2013500255.tif 000078
【図１０Ｉ】
2013500255.tif 000079
【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
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【図１０Ｌ】
2013500255.tif 000082
【図１０Ｍ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｊ】
2013500255.tif 000087
【図１１Ｌ】
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【図１１Ｍ】
2013500255.tif 000089
【図１３】
2013500255.tif 000090
【図１６Ａ】
2013500255.tif 000091
【図１６Ｂ】
2013500255.tif 000092
【図１７】
2013500255.tif 000093
【図１８】
2013500255.tif 000094
【図１９】
2013500255.tif 000095
【図２０】
2013500255.tif 000096
【図２１】
2013500255.tif 000097
【図２２】
2013500255.tif 000098
【国際調査報告】
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