(57)【要約】本発明は、フラジェリンなどのトール様受容体作動物質の供給と組み合わせて、トール様受容体５（ＴＬＲ−５）などのトール様受容体を供給して、自然（シス効果）と獲得（トランス効果）の両方の免疫応答に関与する細胞を動員する、シス及びイントランス効果を生起し、がん細胞及び病原体に感染した細胞をＮＦ−κＢアポトーシス経路を介して特異的に死滅させる、がん又は感染症の処置のために使用される方法及び薬剤を対象とする。
2013506437.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の核酸及び第２の核酸を含むベクターであって、該第１の核酸がトール様受容体をコードし、該第２の核酸がトール様受容体作動物質をコードする、ベクター。
【請求項２】
前記トール様受容体作動物質がフラジェリンである、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
前記ベクターがほ乳動物発現ベクターである、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
前記ベクターがアデノウイルス、レンチウイルス又はリポソームから発現される、請求項３に記載のベクター。
【請求項６】
前記第１の核酸が分泌型のトール様受容体である、請求項１に記載のベクター。
【請求項７】
前記フラジェリンが分泌型のフラジェリンである、請求項２に記載のベクター。
【請求項８】
前記分泌型のフラジェリンが、図５に示されるＴＬＲ５活性に重要であり得るフラジェリンの１３種類の保存されたアミノ酸を含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
前記トール様受容体がＴＬＲ−５である、請求項１に記載のベクター。
【請求項１０】
前記第１の核酸が図７に示す配列を含み、前記第２の核酸が図９に示す配列を含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項１１】
ほ乳動物におけるがんを処置する方法であって、がんの処置を必要とするほ乳動物に請求項１に記載のベクターを含む薬剤を投与する工程を含む、方法。
【請求項１２】
前記がんが腫瘍である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍が、前立腺、乳房、結腸、食道、胃、肺、すい臓、腎臓、甲状腺、卵巣、咽頭又は頚部からなる群に由来する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍が肉腫、黒色腫、白血病及びリンパ腫からなる群に由来する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤が前記ほ乳動物の前記腫瘍からトランスで（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤が前記ほ乳動物の腫瘍に直接投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤が免疫賦活薬と組み合わせて投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫賦活薬が、成長ホルモン、プロラクチン及びビタミンＤからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記成長ホルモンがソマトトロピンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記薬剤がサイトカインと組み合わせて投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記サイトカインが幹細胞因子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ほ乳動物における感染症を処置する方法であって、感染症の処置を必要とするほ乳動物に請求項１に記載のベクターを含む薬剤を投与する工程を含む、方法。
【請求項２３】
前記感染症がウイルス、細菌、寄生原虫及び真菌からなる群から選択される生物体によるものである、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん及び感染症を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トール様受容体は、細菌及びウイルス病原体の最も一般的なパターンの認識を担う。その活性化は、自然免疫応答とそれに続く獲得免疫応答を誘発する。抗原が存在する部位に対する免疫系の受容体細胞は、有効な免疫応答における重要なステップである。そのため、免疫化は、異なるタイプのアジュバントの使用を含む。腫瘍の大多数は腫瘍特異抗原を発現するが、それらは、幾つかの機序によって免疫認識を逃れることができる。最近、リガンドと作動物質の細菌フラジェリンによるＴＬＲ５の活性化が、機能性ＴＬＲ５を発現する腫瘍に対して抗腫瘍効果を誘導することがマウスモデルで実証された。これは、がん免疫療法に対してＴＬＲ５作動物質を考慮する一般的な機会をもたらした。この考えを実行に移す上で２つの主要な障壁かある。第１に、機能性ＴＬＲ５を発現する腫瘍の発生率が極めて低く、この手法の適用がほんの少数の腫瘍に限られる。第２に、ＴＬＲ５作動物質の全身投与は、機能的受容体を有するすべての細胞におけるＴＲＬ５シグナル伝達を活性化して、応答が集中せず、腫瘍特異的でない。したがって、全身作用を最小にし、したがって感染細胞又は腫瘍に特異的に自然免疫応答を誘発することができる、感染又は腫瘍細胞におけるＴＬＲ受容体シグナル伝達のオートクリン活性化機序又は方法が当該技術分野で必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、第１及び第２の核酸を含むベクターであって、第１の核酸がトール様受容体をコードし、第２の核酸がトール様受容体作動物質をコードする、ベクターを対象とすることができる。第１の核酸は、分泌型のトール様受容体をコードすることができる。第２の核酸は、分泌型のフラジェリンとすることができる。トール様受容体作動物質は、フラジェリンとすることができる。ベクターは、ほ乳動物の発現ベクターとすることができる。ベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス又はリポソームから発現することができる。分泌型のフラジェリンはＣＢＬＢ５０２Ｓとすることができる。トール様受容体はＴＬＲ−５とすることができる。
【０００４】
本発明は、ほ乳動物におけるがんを処置する方法であって、それを必要とするほ乳動物に第１及び第２の核酸を含むベクターを含む薬剤を投与することを含む、方法を対象とすることができる。第１の核酸はトール様受容体をコードし、第２の核酸はトール様受容体作動物質をコードする。がんは腫瘍であり得る。腫瘍は、前立腺、乳房、結腸、食道、胃、肺、すい臓、腎臓、甲状腺、卵巣、咽頭又は頚部からなる群に由来し得る。腫瘍は、肉腫、黒色腫、白血病及びリンパ腫からなる群に由来し得る。薬剤は、ほ乳動物の腫瘍からトランスで（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）、または外部から投与することができる。薬剤は、ほ乳動物の腫瘍に直接投与することができる。薬剤は、免疫賦活薬と組み合わせて投与することができる。免疫賦活薬は、成長ホルモン、プロラクチン及びビタミンＤからなる群から選択することができる。成長ホルモンはソマトトロピンとすることができる。薬剤は、サイトカインと組み合わせて投与することができる。サイトカインは幹細胞因子とすることができる。
【０００５】
本発明は、ほ乳動物における感染症を処置する方法であって、それを必要とするほ乳動物に第１及び第２の核酸を含むベクターを含む薬剤の薬剤を投与することを含む、方法も対象とする。第１の核酸はトール様受容体をコードし、第２の核酸はトール様受容体作動物質をコードする。がんは腫瘍であり得る。感染症は、ウイルス、細菌、寄生原虫及び真菌からなる群に由来し得る。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、ＴＬＲ５、ＣＢＬＢ５０２Ｓ及びその組合せ（ＴＬＲ５＋ＣＢＬＢ５０２Ｓ）を発現するアデノウイルスベクターの模式図である。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、ＴＬＲ５、ＣＢＬＢ５０２Ｓ及びその組合せ（ＴＬＲ５＋ＣＢＬＢ５０２Ｓ）を発現するアデノウイルスベクターの模式図である。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、ＴＬＲ５、ＣＢＬＢ５０２Ｓ及びその組合せ（ＴＬＲ５＋ＣＢＬＢ５０２Ｓ）を発現するアデノウイルスベクターの模式図である。
【図２】図２は、マウスにおいて（ＴＬＲ５のない）対照ベクター又はＴＬＲ５を発現するベクターを導入した腫瘍細胞（Ａ５４９）における数日間の腫瘍体積の比の結果を示す。マウスは、ＣＢＬＢ５０２又はＰＢＳで３日間処理される。
【図３】図３は、ＣＢＬＢ５０２Ｓとトール様受容体を同時発現するベクターを含むアデノウイルスの注射による腫瘍増殖の抑制を示す。アデノウイルスは、同系マウスのＣＴ２６結腸癌腫瘍に注射され、アデノウイルスベクター構築物のインシス及びイントランス効果を試験する。
【図４】図４は、細菌フラジェリンのドメイン構造を示す。Ｆ４１のＣａ骨格トレース、疎水性コア分布及び構造情報。ドメインＤ１、Ｄ２ａ、Ｄ２ｂ及びＤ３を定義する４個の異なる疎水性コア。すべての疎水性側鎖原子は、Ｃａ骨格で示される。側鎖原子は色分けされている：Ａｌａ、黄色；Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＶａｌ、オレンジ色；Ｐｈｅ及びＴｙｒ、紫（炭素原子）及び赤（酸素原子）。ｃ、フラジェリンのアミノ酸配列における種々の構造的特徴の位置及び領域。上から下に、青色のＦ４１断片；褐色の３個のｂ薄層折り畳み；黄色のａヘリックス、緑色のｂ構造、及び紫色のｂ折り返しを含む二次構造分布；青色の５０残基ごとの目盛り（ｔｉｃ  ｍａｒｃ）；ドメインＤ０、Ｄ１、Ｄ２及びＤ３；青緑色のプロトエレメント内の軸方向のサブユニット接触領域；赤色の良好に保存されたアミノ酸配列及び紫色の可変領域；異なるスーパーコイルのエレメントを生成するＦ４１中の点変異を示す。最下部の文字は、変異エレメント：Ｌ（Ｄ１０７Ｅ、Ｒ１２４Ａ、Ｒ１２４Ｓ、Ｇ４２６Ａ）、Ｌタイプ直鎖；Ｒ（Ａ４４９Ｖ）、Ｒタイプ直鎖；Ｃ（Ｄ３１３Ｙ、Ａ４１４Ｖ、Ａ４２７Ｖ、Ｎ４３３Ｄ）、ｃｕｒｌｙ３３の形態を示す。
【図５】図５は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａフラジェリンドメイン、その断片、及びＴＬＲ５とのその相互作用の模式図である。黒い棒は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ’及びＢ’を含む断片の構築に使用されるフラジェリン遺伝子の領域を表す。
【図６】図６は、フラジェリン誘導体を示す。（右側に列挙された）選択されたフラジェリン誘導体のドメイン構造及び近似境界（アミノ酸配位）。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄｕｂｌｉｎのＦｌｉＣフラジェリンは、５０５個のアミノ酸（ａａ）内にコードされる。
【図７−１】図７は、以下のフラジェリン改変体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号７〜８）、ＡＢ’（配列番号９〜１０）、ＢＡ’（配列番号１１〜１２）、ＢＢ’（配列番号１３〜１４）、ＣＡ’（配列番号１５〜１６）、ＣＢ’（配列番号１７〜１８）、Ａ（配列番号１９〜２０）、Ｂ（配列番号２１〜２２）、Ｃ（配列番号２３〜２４）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号２５〜２６）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号２７〜２８）、ＡＡ’ｎ１〜１７０（配列番号２９〜３０）、ＡＡ’ｎ１〜１６３（配列番号３３〜３４）、ＡＡ’ｎ５４〜１７０（配列番号３１〜３２）、ＡＡ’ｎ５４〜１６３（配列番号３３５〜３６）、ＡＢ’ｎ１〜１７０（配列番号３７〜３８）、ＡＢ’ｎ１〜１６３（配列番号３９〜４０）、ＡＡ’ｎ１〜１２９（配列番号４１〜４２）、ＡＡ’ｎ５４〜１２９（配列番号４３〜４４）、ＡＢ’ｎ１〜１２９（配列番号４５〜４６）、ＡＢ’ｎ５４〜１２９（配列番号４７〜４８）、ＡＡ’ｎ１〜１００（配列番号４９〜５０）、ＡＢ’ｎ１〜１００（配列番号５１〜５２）、ＡＡ’ｎ１〜７０（配列番号５３〜５４）及びＡＢ’ｎ１〜７０（配列番号５５〜５６）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列はイタリック体で示される（リーダーはＭｅｔを含み、ＭｅｔはＦｌｉＣのアミノ酸１でもある）。Ｎ末端定常領域には下線が引かれている。アミノ酸リンカー配列はボールド体である。Ｃ末端定常領域には下線が引かれている。ＧＳＴは、存在する場合、強調表示される。
【図７−２】図７は、以下のフラジェリン改変体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号７〜８）、ＡＢ’（配列番号９〜１０）、ＢＡ’（配列番号１１〜１２）、ＢＢ’（配列番号１３〜１４）、ＣＡ’（配列番号１５〜１６）、ＣＢ’（配列番号１７〜１８）、Ａ（配列番号１９〜２０）、Ｂ（配列番号２１〜２２）、Ｃ（配列番号２３〜２４）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号２５〜２６）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号２７〜２８）、ＡＡ’ｎ１〜１７０（配列番号２９〜３０）、ＡＡ’ｎ１〜１６３（配列番号３３〜３４）、ＡＡ’ｎ５４〜１７０（配列番号３１〜３２）、ＡＡ’ｎ５４〜１６３（配列番号３３５〜３６）、ＡＢ’ｎ１〜１７０（配列番号３７〜３８）、ＡＢ’ｎ１〜１６３（配列番号３９〜４０）、ＡＡ’ｎ１〜１２９（配列番号４１〜４２）、ＡＡ’ｎ５４〜１２９（配列番号４３〜４４）、ＡＢ’ｎ１〜１２９（配列番号４５〜４６）、ＡＢ’ｎ５４〜１２９（配列番号４７〜４８）、ＡＡ’ｎ１〜１００（配列番号４９〜５０）、ＡＢ’ｎ１〜１００（配列番号５１〜５２）、ＡＡ’ｎ１〜７０（配列番号５３〜５４）及びＡＢ’ｎ１〜７０（配列番号５５〜５６）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列はイタリック体で示される（リーダーはＭｅｔを含み、ＭｅｔはＦｌｉＣのアミノ酸１でもある）。Ｎ末端定常領域には下線が引かれている。アミノ酸リンカー配列はボールド体である。Ｃ末端定常領域には下線が引かれている。ＧＳＴは、存在する場合、強調表示される。
【図７−３】図７は、以下のフラジェリン改変体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号７〜８）、ＡＢ’（配列番号９〜１０）、ＢＡ’（配列番号１１〜１２）、ＢＢ’（配列番号１３〜１４）、ＣＡ’（配列番号１５〜１６）、ＣＢ’（配列番号１７〜１８）、Ａ（配列番号１９〜２０）、Ｂ（配列番号２１〜２２）、Ｃ（配列番号２３〜２４）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号２５〜２６）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号２７〜２８）、ＡＡ’ｎ１〜１７０（配列番号２９〜３０）、ＡＡ’ｎ１〜１６３（配列番号３３〜３４）、ＡＡ’ｎ５４〜１７０（配列番号３１〜３２）、ＡＡ’ｎ５４〜１６３（配列番号３３５〜３６）、ＡＢ’ｎ１〜１７０（配列番号３７〜３８）、ＡＢ’ｎ１〜１６３（配列番号３９〜４０）、ＡＡ’ｎ１〜１２９（配列番号４１〜４２）、ＡＡ’ｎ５４〜１２９（配列番号４３〜４４）、ＡＢ’ｎ１〜１２９（配列番号４５〜４６）、ＡＢ’ｎ５４〜１２９（配列番号４７〜４８）、ＡＡ’ｎ１〜１００（配列番号４９〜５０）、ＡＢ’ｎ１〜１００（配列番号５１〜５２）、ＡＡ’ｎ１〜７０（配列番号５３〜５４）及びＡＢ’ｎ１〜７０（配列番号５５〜５６）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列はイタリック体で示される（リーダーはＭｅｔを含み、ＭｅｔはＦｌｉＣのアミノ酸１でもある）。Ｎ末端定常領域には下線が引かれている。アミノ酸リンカー配列はボールド体である。Ｃ末端定常領域には下線が引かれている。ＧＳＴは、存在する場合、強調表示される。
【図７−４】図７は、以下のフラジェリン改変体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号７〜８）、ＡＢ’（配列番号９〜１０）、ＢＡ’（配列番号１１〜１２）、ＢＢ’（配列番号１３〜１４）、ＣＡ’（配列番号１５〜１６）、ＣＢ’（配列番号１７〜１８）、Ａ（配列番号１９〜２０）、Ｂ（配列番号２１〜２２）、Ｃ（配列番号２３〜２４）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号２５〜２６）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号２７〜２８）、ＡＡ’ｎ１〜１７０（配列番号２９〜３０）、ＡＡ’ｎ１〜１６３（配列番号３３〜３４）、ＡＡ’ｎ５４〜１７０（配列番号３１〜３２）、ＡＡ’ｎ５４〜１６３（配列番号３３５〜３６）、ＡＢ’ｎ１〜１７０（配列番号３７〜３８）、ＡＢ’ｎ１〜１６３（配列番号３９〜４０）、ＡＡ’ｎ１〜１２９（配列番号４１〜４２）、ＡＡ’ｎ５４〜１２９（配列番号４３〜４４）、ＡＢ’ｎ１〜１２９（配列番号４５〜４６）、ＡＢ’ｎ５４〜１２９（配列番号４７〜４８）、ＡＡ’ｎ１〜１００（配列番号４９〜５０）、ＡＢ’ｎ１〜１００（配列番号５１〜５２）、ＡＡ’ｎ１〜７０（配列番号５３〜５４）及びＡＢ’ｎ１〜７０（配列番号５５〜５６）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列はイタリック体で示される（リーダーはＭｅｔを含み、ＭｅｔはＦｌｉＣのアミノ酸１でもある）。Ｎ末端定常領域には下線が引かれている。アミノ酸リンカー配列はボールド体である。Ｃ末端定常領域には下線が引かれている。ＧＳＴは、存在する場合、強調表示される。
【図７−５】図７は、以下のフラジェリン改変体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号７〜８）、ＡＢ’（配列番号９〜１０）、ＢＡ’（配列番号１１〜１２）、ＢＢ’（配列番号１３〜１４）、ＣＡ’（配列番号１５〜１６）、ＣＢ’（配列番号１７〜１８）、Ａ（配列番号１９〜２０）、Ｂ（配列番号２１〜２２）、Ｃ（配列番号２３〜２４）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号２５〜２６）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号２７〜２８）、ＡＡ’ｎ１〜１７０（配列番号２９〜３０）、ＡＡ’ｎ１〜１６３（配列番号３３〜３４）、ＡＡ’ｎ５４〜１７０（配列番号３１〜３２）、ＡＡ’ｎ５４〜１６３（配列番号３３５〜３６）、ＡＢ’ｎ１〜１７０（配列番号３７〜３８）、ＡＢ’ｎ１〜１６３（配列番号３９〜４０）、ＡＡ’ｎ１〜１２９（配列番号４１〜４２）、ＡＡ’ｎ５４〜１２９（配列番号４３〜４４）、ＡＢ’ｎ１〜１２９（配列番号４５〜４６）、ＡＢ’ｎ５４〜１２９（配列番号４７〜４８）、ＡＡ’ｎ１〜１００（配列番号４９〜５０）、ＡＢ’ｎ１〜１００（配列番号５１〜５２）、ＡＡ’ｎ１〜７０（配列番号５３〜５４）及びＡＢ’ｎ１〜７０（配列番号５５〜５６）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列はイタリック体で示される（リーダーはＭｅｔを含み、ＭｅｔはＦｌｉＣのアミノ酸１でもある）。Ｎ末端定常領域には下線が引かれている。アミノ酸リンカー配列はボールド体である。Ｃ末端定常領域には下線が引かれている。ＧＳＴは、存在する場合、強調表示される。
【図７−６】図７は、以下のフラジェリン改変体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号７〜８）、ＡＢ’（配列番号９〜１０）、ＢＡ’（配列番号１１〜１２）、ＢＢ’（配列番号１３〜１４）、ＣＡ’（配列番号１５〜１６）、ＣＢ’（配列番号１７〜１８）、Ａ（配列番号１９〜２０）、Ｂ（配列番号２１〜２２）、Ｃ（配列番号２３〜２４）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号２５〜２６）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号２７〜２８）、ＡＡ’ｎ１〜１７０（配列番号２９〜３０）、ＡＡ’ｎ１〜１６３（配列番号３３〜３４）、ＡＡ’ｎ５４〜１７０（配列番号３１〜３２）、ＡＡ’ｎ５４〜１６３（配列番号３３５〜３６）、ＡＢ’ｎ１〜１７０（配列番号３７〜３８）、ＡＢ’ｎ１〜１６３（配列番号３９〜４０）、ＡＡ’ｎ１〜１２９（配列番号４１〜４２）、ＡＡ’ｎ５４〜１２９（配列番号４３〜４４）、ＡＢ’ｎ１〜１２９（配列番号４５〜４６）、ＡＢ’ｎ５４〜１２９（配列番号４７〜４８）、ＡＡ’ｎ１〜１００（配列番号４９〜５０）、ＡＢ’ｎ１〜１００（配列番号５１〜５２）、ＡＡ’ｎ１〜７０（配列番号５３〜５４）及びＡＢ’ｎ１〜７０（配列番号５５〜５６）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列はイタリック体で示される（リーダーはＭｅｔを含み、ＭｅｔはＦｌｉＣのアミノ酸１でもある）。Ｎ末端定常領域には下線が引かれている。アミノ酸リンカー配列はボールド体である。Ｃ末端定常領域には下線が引かれている。ＧＳＴは、存在する場合、強調表示される。
【図７−７】図７は、以下のフラジェリン改変体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号７〜８）、ＡＢ’（配列番号９〜１０）、ＢＡ’（配列番号１１〜１２）、ＢＢ’（配列番号１３〜１４）、ＣＡ’（配列番号１５〜１６）、ＣＢ’（配列番号１７〜１８）、Ａ（配列番号１９〜２０）、Ｂ（配列番号２１〜２２）、Ｃ（配列番号２３〜２４）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号２５〜２６）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号２７〜２８）、ＡＡ’ｎ１〜１７０（配列番号２９〜３０）、ＡＡ’ｎ１〜１６３（配列番号３３〜３４）、ＡＡ’ｎ５４〜１７０（配列番号３１〜３２）、ＡＡ’ｎ５４〜１６３（配列番号３３５〜３６）、ＡＢ’ｎ１〜１７０（配列番号３７〜３８）、ＡＢ’ｎ１〜１６３（配列番号３９〜４０）、ＡＡ’ｎ１〜１２９（配列番号４１〜４２）、ＡＡ’ｎ５４〜１２９（配列番号４３〜４４）、ＡＢ’ｎ１〜１２９（配列番号４５〜４６）、ＡＢ’ｎ５４〜１２９（配列番号４７〜４８）、ＡＡ’ｎ１〜１００（配列番号４９〜５０）、ＡＢ’ｎ１〜１００（配列番号５１〜５２）、ＡＡ’ｎ１〜７０（配列番号５３〜５４）及びＡＢ’ｎ１〜７０（配列番号５５〜５６）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列はイタリック体で示される（リーダーはＭｅｔを含み、ＭｅｔはＦｌｉＣのアミノ酸１でもある）。Ｎ末端定常領域には下線が引かれている。アミノ酸リンカー配列はボールド体である。Ｃ末端定常領域には下線が引かれている。ＧＳＴは、存在する場合、強調表示される。
【図７−８】図７は、以下のフラジェリン改変体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号７〜８）、ＡＢ’（配列番号９〜１０）、ＢＡ’（配列番号１１〜１２）、ＢＢ’（配列番号１３〜１４）、ＣＡ’（配列番号１５〜１６）、ＣＢ’（配列番号１７〜１８）、Ａ（配列番号１９〜２０）、Ｂ（配列番号２１〜２２）、Ｃ（配列番号２３〜２４）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号２５〜２６）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号２７〜２８）、ＡＡ’ｎ１〜１７０（配列番号２９〜３０）、ＡＡ’ｎ１〜１６３（配列番号３３〜３４）、ＡＡ’ｎ５４〜１７０（配列番号３１〜３２）、ＡＡ’ｎ５４〜１６３（配列番号３３５〜３６）、ＡＢ’ｎ１〜１７０（配列番号３７〜３８）、ＡＢ’ｎ１〜１６３（配列番号３９〜４０）、ＡＡ’ｎ１〜１２９（配列番号４１〜４２）、ＡＡ’ｎ５４〜１２９（配列番号４３〜４４）、ＡＢ’ｎ１〜１２９（配列番号４５〜４６）、ＡＢ’ｎ５４〜１２９（配列番号４７〜４８）、ＡＡ’ｎ１〜１００（配列番号４９〜５０）、ＡＢ’ｎ１〜１００（配列番号５１〜５２）、ＡＡ’ｎ１〜７０（配列番号５３〜５４）及びＡＢ’ｎ１〜７０（配列番号５５〜５６）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列はイタリック体で示される（リーダーはＭｅｔを含み、ＭｅｔはＦｌｉＣのアミノ酸１でもある）。Ｎ末端定常領域には下線が引かれている。アミノ酸リンカー配列はボールド体である。Ｃ末端定常領域には下線が引かれている。ＧＳＴは、存在する場合、強調表示される。
【図７−９】図７は、以下のフラジェリン改変体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号７〜８）、ＡＢ’（配列番号９〜１０）、ＢＡ’（配列番号１１〜１２）、ＢＢ’（配列番号１３〜１４）、ＣＡ’（配列番号１５〜１６）、ＣＢ’（配列番号１７〜１８）、Ａ（配列番号１９〜２０）、Ｂ（配列番号２１〜２２）、Ｃ（配列番号２３〜２４）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号２５〜２６）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号２７〜２８）、ＡＡ’ｎ１〜１７０（配列番号２９〜３０）、ＡＡ’ｎ１〜１６３（配列番号３３〜３４）、ＡＡ’ｎ５４〜１７０（配列番号３１〜３２）、ＡＡ’ｎ５４〜１６３（配列番号３３５〜３６）、ＡＢ’ｎ１〜１７０（配列番号３７〜３８）、ＡＢ’ｎ１〜１６３（配列番号３９〜４０）、ＡＡ’ｎ１〜１２９（配列番号４１〜４２）、ＡＡ’ｎ５４〜１２９（配列番号４３〜４４）、ＡＢ’ｎ１〜１２９（配列番号４５〜４６）、ＡＢ’ｎ５４〜１２９（配列番号４７〜４８）、ＡＡ’ｎ１〜１００（配列番号４９〜５０）、ＡＢ’ｎ１〜１００（配列番号５１〜５２）、ＡＡ’ｎ１〜７０（配列番号５３〜５４）及びＡＢ’ｎ１〜７０（配列番号５５〜５６）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列はイタリック体で示される（リーダーはＭｅｔを含み、ＭｅｔはＦｌｉＣのアミノ酸１でもある）。Ｎ末端定常領域には下線が引かれている。アミノ酸リンカー配列はボールド体である。Ｃ末端定常領域には下線が引かれている。ＧＳＴは、存在する場合、強調表示される。
【図７−１０】図７は、以下のフラジェリン改変体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号７〜８）、ＡＢ’（配列番号９〜１０）、ＢＡ’（配列番号１１〜１２）、ＢＢ’（配列番号１３〜１４）、ＣＡ’（配列番号１５〜１６）、ＣＢ’（配列番号１７〜１８）、Ａ（配列番号１９〜２０）、Ｂ（配列番号２１〜２２）、Ｃ（配列番号２３〜２４）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号２５〜２６）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号２７〜２８）、ＡＡ’ｎ１〜１７０（配列番号２９〜３０）、ＡＡ’ｎ１〜１６３（配列番号３３〜３４）、ＡＡ’ｎ５４〜１７０（配列番号３１〜３２）、ＡＡ’ｎ５４〜１６３（配列番号３３５〜３６）、ＡＢ’ｎ１〜１７０（配列番号３７〜３８）、ＡＢ’ｎ１〜１６３（配列番号３９〜４０）、ＡＡ’ｎ１〜１２９（配列番号４１〜４２）、ＡＡ’ｎ５４〜１２９（配列番号４３〜４４）、ＡＢ’ｎ１〜１２９（配列番号４５〜４６）、ＡＢ’ｎ５４〜１２９（配列番号４７〜４８）、ＡＡ’ｎ１〜１００（配列番号４９〜５０）、ＡＢ’ｎ１〜１００（配列番号５１〜５２）、ＡＡ’ｎ１〜７０（配列番号５３〜５４）及びＡＢ’ｎ１〜７０（配列番号５５〜５６）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列はイタリック体で示される（リーダーはＭｅｔを含み、ＭｅｔはＦｌｉＣのアミノ酸１でもある）。Ｎ末端定常領域には下線が引かれている。アミノ酸リンカー配列はボールド体である。Ｃ末端定常領域には下線が引かれている。ＧＳＴは、存在する場合、強調表示される。
【図７−１１】図７は、以下のフラジェリン改変体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号７〜８）、ＡＢ’（配列番号９〜１０）、ＢＡ’（配列番号１１〜１２）、ＢＢ’（配列番号１３〜１４）、ＣＡ’（配列番号１５〜１６）、ＣＢ’（配列番号１７〜１８）、Ａ（配列番号１９〜２０）、Ｂ（配列番号２１〜２２）、Ｃ（配列番号２３〜２４）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号２５〜２６）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号２７〜２８）、ＡＡ’ｎ１〜１７０（配列番号２９〜３０）、ＡＡ’ｎ１〜１６３（配列番号３３〜３４）、ＡＡ’ｎ５４〜１７０（配列番号３１〜３２）、ＡＡ’ｎ５４〜１６３（配列番号３３５〜３６）、ＡＢ’ｎ１〜１７０（配列番号３７〜３８）、ＡＢ’ｎ１〜１６３（配列番号３９〜４０）、ＡＡ’ｎ１〜１２９（配列番号４１〜４２）、ＡＡ’ｎ５４〜１２９（配列番号４３〜４４）、ＡＢ’ｎ１〜１２９（配列番号４５〜４６）、ＡＢ’ｎ５４〜１２９（配列番号４７〜４８）、ＡＡ’ｎ１〜１００（配列番号４９〜５０）、ＡＢ’ｎ１〜１００（配列番号５１〜５２）、ＡＡ’ｎ１〜７０（配列番号５３〜５４）及びＡＢ’ｎ１〜７０（配列番号５５〜５６）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列はイタリック体で示される（リーダーはＭｅｔを含み、ＭｅｔはＦｌｉＣのアミノ酸１でもある）。Ｎ末端定常領域には下線が引かれている。アミノ酸リンカー配列はボールド体である。Ｃ末端定常領域には下線が引かれている。ＧＳＴは、存在する場合、強調表示される。
【図８】図８は、２１種の細菌由来の保存されたアミノ（図８Ａ）及びカルボキシ（図８Ｂ）末端のアミノ酸配列の比較を示す。ＴＬＲ５活性に重要な１３種類の保存されたアミノ酸は、陰影を付けて示される。アミノ酸配列は、ＴｒＥＭＢＬ（最初の文字＝Ｑ）又はＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（最初の文字＝Ｐ）の受託番号によって識別される。
【図９】図９は、ヒトトール様受容体５タンパク質の核酸及びアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明者らは、フラジェリンなどのトール様受容体作動物質と組み合わせたトール様受容体５（ＴＬＲ−５）などのトール様受容体の供給が、自然（シス効果）と獲得（トランス効果）の両方の免疫応答に関与する細胞を補充するシス及びイントランス効果をもたらして、がん細胞及び病原体感染細胞をＮＦ−κＢアポトーシス経路を介して特異的に死滅させるという驚くべき発見をした。理論に拘泥するものではないが、本発明において実施される概念は、（ｉ）腫瘍における既存のＴＬＲ発現に対するＴＬＲによって媒介される免疫化戦略の依存を、ＴＬＲの発現を駆動する構築物を腫瘍に導入することによって克服すること、及び（ｉｉ）ＴＬＲ作動物質の局所的プールを作製することによって腫瘍に対する免疫応答を導くことであった。例えば、ＴＬＲを含む製剤は、発現を誘導し、同時にＴＬＲを活性化して、腸壁を通した多量の細菌侵入の状況を模倣した宿主免疫系に腫瘍細胞を曝露させる。
【０００８】
ＴＬＲ５などのＴＬＲとフラジェリンなどのＴＬＲ作動物質を供給して、自然と獲得の両方の免疫系を相互作用させ、活性化することによって、この方法は、前立腺、乳房、結腸、食道、胃、肺、すい臓、腎臓、甲状腺、卵巣、咽頭又は頚部のがんに由来する腫瘍の処置、並びに肉腫、黒色腫、白血病及びリンパ腫の処置に使用することができる。この方法の適用例はがんの処置に限定されず、この方法は、ウイルス、細菌、寄生原虫及び真菌に由来する感染症の処置に使用することもできる。
【０００９】
ＴＬＲとＴＬＲ作動物質を供給することの変形としては、ＴＬＲ受容体と、同じ易感染性ほ乳動物細胞においてＴＬＲ活性を活性化する分泌型フラジェリンとを同時発現するベクターが挙げられる。本発明の方法は、ほ乳動物細胞中のＴＬＲ受容体と細胞にトランスで投与されるＴＬＲ作動物質とを発現するベクター構築物を含むこともできる。例えば、アデノウイルスベクターは、ほ乳動物細胞によるその効果的な合成及び分泌を達成するのにフラジェリンの改変を必要とし得る。
【００１０】
１．定義
本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を記述する目的のためにすぎず、限定的であることを意図するものではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特段の明示がない限り、複数の指示対象を含む。
【００１１】
本明細書で数値範囲を列挙する場合、その間にある各数値も同じ精度で明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲では６と９に加えて数７と８も企図され、範囲６．０〜７．０では、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０も明示的に企図される。
【００１２】
「投与する」は、薬剤又は薬剤の単回投与又は複数回投与を意味し得る。
【００１３】
ペプチド又はポリペプチドに関連した「類似体」は、１種類以上の非標準アミノ酸、又は従来のアミノ酸セットとは別の構造変化を含む、ペプチド又はポリペプチドを意味し得る。
【００１４】
「抗体」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ並びに単鎖抗体、二特異性抗体、二重特異性抗体、二機能性抗体及びその誘導体を含めて、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ若しくはＩｇＥクラス、又は断片、又はその誘導体の抗体を意味し得る。抗体は、所望のエピトープ又はそれに由来する配列に対して十分な結合特異性を示すモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体又はその混合物とすることができる。抗体はキメラ抗体とすることもできる。抗体は、当該技術分野で公知の１種類以上の化学、ペプチド又はポリペプチド成分の付加によって誘導体化することができる。抗体は、化学成分と複合化することができる。
【００１５】
「誘導体」は、一次構造（アミノ酸及びアミノ酸類似体）を除いて異なるペプチド又はポリペプチドを意味し得る。誘導体は、翻訳後修飾の一形態であるグリコシル化によって異なり得る。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、異種の系における発現に帰因するグリコシル化パターンを示し得る。少なくとも１つの生物活性が保持される場合、これらのペプチド又はポリペプチドは本発明による誘導体である。別の誘導体としては、共有結合的に修飾されたＮ又はＣ末端を有する融合ペプチド又は融合ポリペプチド、ＰＥＧ化ペプチド又はポリペプチド、脂質部分と結合したペプチド又はポリペプチド、アルキル化ペプチド又はポリペプチド、アミノ酸側鎖官能基を介して別のペプチド、ポリペプチド又は化学物質と結合したペプチド又はポリペプチド、及び当該技術分野において知られている別の改変が挙げられる。
【００１６】
「断片」は、基準ペプチド又はポリペプチドの一部を意味し得る。
【００１７】
「ホモログ」は、共通の進化の祖先を持つペプチド又はポリペプチドを意味し得る。
【００１８】
「リーダー配列」は、対象ペプチド又はポリペプチドが、細胞膜からの細胞外分泌の目的で真核細胞の小胞体及びゴルジ複合体を経由して適切に移動することができるように、対象ペプチド又はポリペプチドに関連し、翻訳される任意のペプチド配列をコードする核酸であり得る。リーダーペプチド配列は、アルカリホスファターゼに由来することができる。リーダー配列は、
【００１９】
【化１】
2013506437.tif 000003
を含むＤＮＡ配列を有することができる。
【００２０】
「リポソーム」は、細胞膜と同じ材料でできた小さい泡（小胞）を意味し得る。リポソームは、薬物で満たされ、がん及び他の疾患の薬物を送達するのに使用される。リポソームにはベクターを充填することができる。リポソーム膜は、頭部グループと尾部グループを有する分子であるリン脂質でできていてもよい。リポソームの頭部は、水に誘引され得る。尾部は、長い炭化水素鎖でできており、水によってはじかれる。尾部は、水によってはじかれ、整列して、水から離れた表面を形成することができる。原形質膜の脂質は、主に、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンのようなリン脂質とすることができる。リポソームは、（卵のホスファチジルエタノールアミンのような）混合脂質鎖を有する天然由来のリン脂質で構成することができ、又はＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）のような純粋な界面活性剤成分で構成することができる。
【００２１】
「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結配列を意味することができ、天然、合成、又は天然と合成の変形若しくは組合せとすることができる。
【００２２】
「実質的に同一」とは、第１及び第２のアミノ酸配列が、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００個のアミノ酸の領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であることを意味し得る。
【００２３】
「処置すること」、「処置」又は「処置する」は各々、症状又は障害の症候、臨床徴候、又は根底にある病理を、一時的又は恒久的に、軽減、抑制、抑止、除去若しくは防止する、又はその出現を遅延させることを意味し得る。症状又は障害の防止は、発症前に本発明の薬剤を対象に投与することを含む。症状又は障害の抑制は、症状又は障害の誘発後かつその臨床的出現前に本発明の薬剤を対象に投与することを含む。症状又は障害の抑止は、臨床的発症後に本発明の薬剤を対象に投与することを含む。
【００２４】
「改変体」は、アミノ酸の挿入、欠失又は保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持する、ペプチド又はポリペプチドを意味し得る。「生物活性」の代表例としては、トール様受容体に結合する能力、及び特異抗体によって結合される能力が挙げられる。改変体は、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味することもできる。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を性質（例えば、荷電領域の親水性、程度及び分布）の類似した異なるアミノ酸で置換することは、当該技術分野では典型的には軽微な変化を含むと認識される。これらの軽微な変化は、当該技術分野において理解されるように、部分的には、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することによって確認することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシー指数は、その疎水性及び電荷の考察に基づく。ハイドロパシー指数の類似したアミノ酸は、置換してもタンパク質機能を保持できることが当該技術分野で知られている。一態様においては、±２のハイドロパシー指数を有するアミノ酸を置換する。アミノ酸の親水性も、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換を明らかにするのに使用することができる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を考慮すると、該ペプチドの最大局所平均親水性を計算することができる。最大局所平均親水性は、抗原性及び免疫原性と良く相関することが報告された有用な尺度である。米国特許第４，５５４，１０１号を参照によりその全体を本明細書に援用する。親水性値の類似したアミノ酸の置換は、当該技術分野において理解されるように、生物活性、例えば免疫原性を保持したペプチドを生成することができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を使用して実施することができる。アミノ酸の疎水性指数と親水性値の両方は、該アミノ酸の特定の側鎖による影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能に適合したアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ及び他の諸性質によって示されるように、アミノ酸、特に該アミノ酸の側鎖の相対的類似度に依存すると理解される。
【００２５】
「ベクター」は、複製開始点を含む核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、酵母又はほ乳動物人工染色体とすることができる。ベクターは、ＲＮＡ又はＤＮＡベクターとすることができる。ベクターは、自己複製染色体外ベクター、又は宿主ゲノムに組み込まれたベクターとすることができる。
【００２６】
２．トール様受容体
パターン認識受容体（ＰＲＲ）の一タイプであり得るトール様受容体（ＴＬＲ）を本明細書に記載する。ＴＬＲは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と総称される、グラム陽性、グラム陰性菌、真菌及びウイルスを含めた病原体に由来する保存された分子生成物であるが宿主分子とは識別可能である分子を認識することができる。ＴＬＲは、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）と総称される、損傷した又は瀕死の細胞から放出される内因性分子を認識することもできる。ＰＡＭＰ又はＤＡＭＰは、以下に更に記述されるＴＬＲ作動物質とすることができる。ＴＬＲは、シグナルを伝達するために細胞質内でアダプター分子を補充する断片、改変体、類似体、ホモログ又は誘導体とすることができる。ＴＬＲは、ヒト、又はアカゲザル、マウス、ラットなどの他のほ乳動物種に由来することができる。ＴＬＲは、シグナルを伝達するために細胞質内でアダプター分子を補充するＴＬＲと少なくとも３０〜９９％同一とすることができる。
【００２７】
ＴＬＲは、大部分のほ乳動物種に存在すると推定される１０から１５タイプのＴＬＲの一つとすることができる。ＴＬＲは、ヒトとマウスにおいて一緒に同定された（単にＴＬＲ１からＴＬＲ１３と命名された）１３種類のＴＬＲの一つとすることができ、又は別のほ乳動物種に存在する同等の形態とすることができる。ＴＬＲは、ヒトにおいて同定された１１メンバー（ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１１）の一つとすることができる。
【００２８】
ＴＬＲは、異なるタイプの免疫細胞によって発現することができ、細胞表面上又は細胞質中に位置することができる。ＴＬＲは、がん細胞上で発現され得る。ＴＬＲは、消化器系の正常な上皮細胞、皮膚の正常な角化細胞、肺胞及び気管支上皮細胞、並びに雌の生殖管の上皮細胞によって発現され得る。器官に沿って並ぶこれらの細胞は、微生物侵入に対する最前線の防御であり得る。上皮細胞で発現されるＴＬＲは、増殖及びアポトーシスの調節に極めて重要な役割を果たすことができる。
【００２９】
ＴＬＲを発現するがん細胞は、以下の表から選択することができる。
【００３０】
表１  ヒトがん細胞におけるＴＬＲ発現
【００３１】
【表１】
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がん細胞上で発現されるＴＬＲは、ＮＦ−κＢカスケードを上方制御し、発がん及びがん細胞増殖の一因になる抗アポトーシス性タンパク質を産生し得る。
【００３２】
ＴＬＲの４種類のアダプター分子がシグナル伝達に関与することが知られている。これらのタンパク質は、骨髄分化因子８８（ＭｙＤ８８）、（Ｍａｌとも称される）Ｔｉｒａｐ、Ｔｒｉｆ及びＴｒａｍとして知られる。アダプターは、シグナルを増幅するある種のプロテインキナーゼ（ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ４、ＴＢＫ１及びＩＫＫｉ）を含めて、細胞内の別の分子を活性化し、最終的に、炎症反応を調整する遺伝子を誘導又は抑制する。病原体認識中のＴＬＲシグナル伝達経路は、ＭｙＤ８８、活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦ−κＢ）、及び分裂促進因子関連タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）によって媒介される細胞外及び細胞内経路を介して、免疫反応を誘発することができる。全体として、数千の遺伝子がＴＬＲシグナル伝達によって活性化される。まとめると、ＴＬＲは、遺伝子調節の最も多面的な、それでいて緻密に調節されたゲートウェイの一つを構成する。
【００３３】
ＴＬＲはインターロイキン−１受容体と一緒に、「インターロイキン−１受容体／トール様受容体スーパーファミリー」として知られる受容体スーパーファミリーを形成する。このファミリーのすべてのメンバーは共通していわゆるＴＩＲ（Ｔｏｌｌ−ＩＬ−１受容体）ドメインを有する。ＴＩＲドメインの３つのサブグループが存在し得る。サブグループＩ  ＴＩＲドメインを含むタンパク質は、マクロファージ、単球及び樹状細胞によって産生されるインターロイキンの受容体であり、すべてが細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを有する。サブグループＩＩ  ＴＩＲドメインを含むタンパク質は、古典的なＴＬＲであり、微生物起源の分子に直接又は間接的に結合する。ＴＩＲドメインを含むタンパク質の第３のサブグループ（ＩＩＩ）は、すべてサイトゾルであるアダプタータンパク質からなり、サブグループ１及び２のタンパク質からのシグナル伝達を媒介する。ＴＬＲは、サブグループＩ  ＴＩＲドメイン、サブグループＩＩ  ＴＩＲドメイン又はサブグループＩＩＩ  ＴＩＲドメインを保持する断片、改変体、類似体、ホモログ又は誘導体とすることができる。
【００３４】
ＴＬＲは、二量体として機能することができる。例えば、大部分のＴＬＲはホモ二量体として機能するように見えるが、ＴＬＲ２は、ＴＬＲ１又はＴＬＲ６とヘテロ二量体を形成し、各二量体は異なるリガンド特異性を有する。ＴＬＲは、ＭＤ−２を必要とするＴＬＲ４によるＬＰＳの認識の場合など、完全なリガンド感受性については別の補助受容体にも依存し得る。ＣＤ１４及びＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）は、ＭＤ−２に対するＬＰＳの提示を促進することが知られている。
【００３５】
ａ．ＴＬＲ１
ＴＬＲは、グラム陽性菌に特異的にＰＡＭＰを認識するＴＬＲ１とすることができる。ＴＬＲ１は、ＣＤ２８１とも称される。
【００３６】
ｂ．ＴＬＲ５
ＴＬＲは、トール様受容体５とすることができる。ＴＬＲ−５によってコードされるタンパク質は、病原体認識及び自然免疫の活性化において基礎的な役割を果たすことができる。ＴＬＲ−５は、感染病原体上で発現されるＰＡＭＰを認識することができ、有効な免疫の発生に必要なサイトカインの産生を媒介することができる。ＴＬＲ−５は、細菌鞭毛の主成分である細菌フラジェリン及びビルレンス因子を認識することができる。ＴＬＲの活性化は、核因子ＮＦ−κＢを動員し、腫瘍壊死因子アルファの産生を刺激することができる。
【００３７】
３．トール様受容体作動物質
本明細書ではＴＬＲ作動物質も記載する。ＴＬＲ作動物質は、病原体に由来する保存された分子産物であり得るＰＡＭＰとすることができる。病原体は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌又はウイルスとすることができる。ＴＬＲ作動物質は、損傷した又は瀕死の細胞から放出される内因性分子であり得る、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）リガンドとすることができる。ＤＡＭＰ又はＰＡＭＰは、ＴＬＲシグナルを介して免疫応答を惹起することができ、シグナルを伝達するために、細胞質内でアダプター分子を補充する。ＴＬＲ作動物質は、以下の表２のリガンドであり得るＴＬＲの作動物質とすることができる。
【００３８】
表２  ＴＬＲ及びリガンド
【００３９】
【表２】
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ＴＬＲ作動物質は、ＴＬＲに結合してＮＦ−κＢ活性の活性化などのＴＬＲ媒介性活性を誘導するＰＡＭＰ又はＤＡＭＰの断片、改変体、類似体、相同性又は誘導体とすることができる。ＴＬＲ作動物質の断片、改変体、類似体、ホモログ又は誘導体は、ＴＬＲ作動物質のアミノ酸と少なくとも３０〜９９％同一とすることができ、ＴＬＲ媒介性活性を誘導することができる。
【００４０】
ＴＬＲ作動物質は、ＴＬＲ−５などのＴＬＲを標的にすることができる。ＴＬＲ作動物質は、ＴＬＲ−５の作動物質とすることができ、ＴＬＲ−５活性を刺激することができる。ＴＬＲ作動物質は、抗ＴＬＲ５抗体又は別の小分子とすることができる。ＴＬＲ作動物質はフラジェリンとすることができる。
【００４１】
フラジェリンは、フラジェリン又はフラジェリン関連ポリペプチドとすることもできる。フラジェリンは、種々のグラム陽性及びグラム陰性菌種を含めて、任意の起源とすることができる。フラジェリンは、その内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２００３／００００４４４２９号に開示されたフラジェリンポリペプチドを含めて、ただしそれだけに限定されない任意のグラム陽性又はグラム陰性菌種に由来するフラジェリンポリペプチドとすることができる。例えば、フラジェリンは、米国特許出願公開第２００３／００４４４２９号の図７に示された細菌種由来のアミノ酸配列を有することができる。Ｕ．Ｓ．２００３／００４４４２９の図７に列挙されたフラジェリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースを含めた情報源で公的に利用可能である。フラジェリンは、米国特許出願公開第２００３／００００４４４２９号の図２５に示されたＢＬＡＳＴの結果に列挙された受託番号に対応するフラジェリンペプチド又はその改変体とすることもできる。フラジェリンは、その内容全体を本明細書に援用する米国特許出願公開第２００９／００１１９８２号に開示されたフラジェリンポリペプチドとすることもできる。フラジェリンは、本明細書の図６及び７に開示されたフラジェリンポリペプチドのいずれか一つとすることができる。
【００４２】
フラジェリンは、ＴＬＲ５に結合してＮＦ−κＢ活性の活性化などのＴＬＲ５媒介性活性を誘導するフラジェリンの断片、改変体、類似体、相同性又は誘導体とすることができる。フラジェリンの断片、改変体、類似体、ホモログ又は誘導体は、ＴＬＲ５に結合してＴＬＲ５媒介性活性を誘導するフラジェリンのアミノ酸と少なくとも３０〜９９％同一とすることができる。
【００４３】
フラジェリンは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの一種に由来することができ、その代表例は（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８４９７２によってコードされる）Ｓ．ｄｕｂｌｉｎである。フラジェリン関連ポリペプチドは、ＴＬＲ５に結合してＮＦ−ｋＢ活性の活性化などのＴＬＲ５媒介性活性を誘導するＭ８４９７２の断片、改変体、類似体、ホモログ若しくは誘導体又はその組合せとすることができる。フラジェリンの断片、改変体、類似体、ホモログ又は誘導体は、フラジェリンのドメイン構造及びＴＬＲ５によって認識される保存された構造に基づく合理的設計によって得ることができる。
【００４４】
フラジェリンは、図５に示す１３種類の保存されたアミノ酸（位置８９、９０、９１、９５、９８、１０１、１１５、４２２、４２３、４２６、４３１、４３６及び４５２）のうち少なくとも１０、１１、１２又は１３種類を含むことができる。フラジェリンは、Ｍ８４９７２のアミノ酸１  １７４及び４１８  ５０５と少なくとも３０〜９９％同一とすることができる。その内容全体を本明細書に援用する米国特許出願公開第２００９／００１１９８２号の図２６は、Ｍ８４９７２と比較した、公知のＴＬＲ−５刺激活性を有するフラジェリンのアミノ及びカルボキシ末端の一致率を示す。
【００４５】
フラジェリンは、細菌鞭毛の主成分であり得る。フラジェリンは３個のドメインで構成され得る（図４）。ドメイン１（Ｄ１）とドメイン２（Ｄ２）は不連続であり得、アミノ末端とカルボキシ末端の残基がヘアピン構造の形成によって並列するときに形成され得る。Ｄ１及びＤ２ドメインを含むアミノ及びカルボキシ末端が最も保存され得る。一方、中間の超可変領域（Ｄ３）は大きく変わり得る。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉヒンジによって分離されたアミノＤ１及びＤ２とカルボキシルＤ１及びＤ２（ＮＤ１−２／ＥＣＨ／ＣＤ２）を含む組換えタンパク質を使用した試験によれば、Ｄ１及びＤ２はＥＣＨエレメントに結合すると生理活性になり得る。このキメラは、２つの腸管上皮細胞系において、ＩｋＢａの分解、ＮＦ−ｋＢの活性化、及びＮＯとＩＬ−８の産生を誘発し得るが、ヒンジ単独では誘発しない。非保存Ｄ３ドメインは、鞭毛繊維の表面に存在することができ、主要な抗原エピトープを含み得る。フラジェリンの強力な炎症誘発活性は、高度に保存されたＮ及びＣ  Ｄ１及びＤ２領域に存在し得る（図４参照）。
【００４６】
フラジェリンは、トール様受容体５（ＴＬＲ５）に結合することによってＮＦ−ｋＢ活性を誘導することができる。ＴＬＲは、フラジェリンに特有な保存構造を認識することができる。保存構造は、アミノ酸含有量の変化をある程度許容した残基の大きいグループで構成され得る。その内容を参照により本明細書に援用するＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１２４７−５３（２００３）は、ＴＬＲ５によって認識される保存構造の一部であるフラジェリン中の１３種類の保存されたアミノ酸を特定した。ＴＬＲ５活性に重要であり得るフラジェリンの１３種類の保存されたアミノ酸を図５に示す。
【００４７】
少なくとも幾らかのＴＬＲ５刺激活性を保持するフラジェリンの多数の欠失変異体が作製された。フラジェリンは、かかる欠失変異体とすることができ、本明細書の実施例に開示する欠失変異体とすることができる。フラジェリンは、アミノ酸１８５〜３０６若しくは４４４〜４９２を欠損したＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ１３６８９から、又はアミノ酸１７９〜４１５を欠損したＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８４９７３から翻訳された配列、又はその改変体を含むことができる。
【００４８】
フラジェリンは、トランスポゾンの挿入及び変化を可変Ｄ３ドメインに含むことができる。Ｄ３ドメインは、ヒンジ又はリンカーポリペプチドで部分的又は全体的に置換して、Ｄ１及びＤ２ドメインを適切に折り畳み、その改変体がＴＬＲ５活性を刺激するようにすることができる。改変体のヒンジエレメントは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭｕｋＢタンパク質中に見いだすことができ、配列番号３及び４の配列又はその改変体を有することができる。
【００４９】
上述したフラジェリンは、更にリーダー配列を含むことができる。リーダー配列を更に含むフラジェリンはＣＢＬＢ５０２Ｓとすることができる。
【００５０】
４．薬剤
本発明は、治療有効量のＴＬＲ及びＴＬＲ作動物質を含む薬剤にも関する。薬剤は、ＴＬＲをＴＬＲ作動物質とは別に送達することができる。薬剤はベクターとすることができる。ベクターは、ＴＬＲをコードする第１の核酸、及びＴＬＲ作動物質を含む第２の核酸を含むことができる。ベクターは、ほ乳動物細胞に形質導入を生じさせることができる。ベクターは、強力なプロモーターを使用してＴＬＲ及び／又はＴＬＲ作動物質のバイシストロニック性発現を可能にすることができる。ベクターは、強力なプロモーターによって制御することができる、ＴＬＲをコードする遺伝子のみを含むことができる。ベクターは、ウイルス又はリポソーム関連ベクター系によってほ乳動物細胞に送達することができる。ウイルスベクター系は、アデノウイルス又はサイトメガロウイルスとすることができる。
【００５１】
薬剤は、ベクターを収容するリポソームとすることができる。リポソームは、ほ乳動物細胞に形質導入を生じさせることができ、発現のためにベクターを送達することができる。
【００５２】
薬剤は、発現を誘導し、同時にＴＬＲを活性化して、腸壁を通した多量の侵入の状況を模倣した宿主免疫系に腫瘍又は感染細胞を曝露させる、製剤とすることができる。薬剤は、ＴＬＲ作動物質と組み合わせてＴＬＲを発現する製剤とすることができ、筋肉内などの投与のために溶液で系統的に送達することができる。薬剤は、アデノウイルス又はサイトメガロウイルスベクター系などの同じベクターから発現することができるＴＬＲ作動物質と組み合わせてＴＬＲを発現する製剤とすることができる。薬剤は、ほ乳動物細胞の細胞表面に機能的作動物質を輸送することができるナノ粒子の形で発現されるＴＬＲ作動物質と組み合わせてＴＬＲを発現する製剤とすることができる。
【００５３】
薬剤は、当該技術分野で周知である方法を使用して製造することができる上記製剤を含む薬剤とすることができる。薬剤は、共薬剤（ｃｏａｇｅｎｔ）を含むこともできる。
【００５４】
ベクターは、ＴＬＲ５をコードする第１の核酸、及びフラジェリンを含む第２の核酸を含むことができる。ベクターは、強力なプロモーターを使用して、ＴＬＲ５及び／又はフラジェリンを発現することができる。発現ベクターは、さらに、ＴＬＲ若しくはＴＬＲ５及び／又はフラジェリンをコードする遺伝子の上流にクローン化されたリーダー配列を含むことができる。発現ベクターは、ｐＣＤ５１５に基づくベクター系とすることができる。発現ベクターは、図１Ａに記載のｐＣＤ５１５−ＣＭＶ−ｈＴＬＲ５−ＥＦ１−５０２とすることができる。発現ベクターは、図１Ｂに記載のｐＣＤ５１５−ＣＭＶ−ｈＴＬＲ５とすることができる。発現ベクターは、図１Ｃに記載のｐＣＤ５１５−ＣＭＶ−Ｓｓｅａｐ−５０２とすることができる。
【００５５】
薬剤は、発現を誘導し、同時にＴＬＲを活性化して、腸壁を通した多量の侵入の状況を模倣した宿主免疫系に腫瘍又は感染細胞を曝露させる、製剤とすることができる。製剤は、ベクターを収容するウイルス発現系の形とすることができる。製剤は、
筋肉内などの投与のために溶液で系統的に送達されるＴＬＲ作動物質、
ＴＬＲと同じアデノウイルスベクターから発現されるＴＬＲ作動物質、又は
ＣＢＬＢ５０２に由来し得るフラジェリンなどの機能性ＴＬＲ作動物質をその表面に有するナノ粒子の形で発現されるＴＬＲ作動物質と組み合わせた、アデノウイルス発現機能性ヒトＴＬＲ５とすることができる。ナノ粒子は、バクテリオファージＴ７に基づくことができ、又はその生物活性を保持するように全体的に形成することができる。ナノ処方は、用量依存的にＮＦ−κＢ応答性レポーターを活性化することができ、有効な免疫化手法のためにエンドサイトーシスによって細胞内に取り込むことができる（Ｍｏｂｉａｎ  ＡＰ−Ａ）。
【００５６】
ａ．投与
本明細書に記載の方法を使用した薬剤の投与は、経口、非経口、舌下、経皮、経直腸、経粘膜、局所、吸入、口腔投与又はその組合せとすることができる。非経口投与としては、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、髄腔内及び関節内が挙げられるが、それだけに限定されない。獣医学用途の場合、薬剤は、正常な獣医学診療に従って適切に許容される処方として投与することができる。獣医師は、特定の動物に最も適切な投与計画及び投与経路を容易に決定することができる。薬剤は、ヒト患者、ネコ、イヌ、大型動物又はトリに投与することができる。
【００５７】
薬剤は、別の処置と同時に又は規則正しく投与することができる。本明細書では「同時の」又は「同時に」という用語は、薬剤と別の処置が、互いに４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、更により好ましくは６時間以内、最も好ましくは３時間以下で投与されることを意味する。本明細書では「規則正しく」という用語は、他方の処置とは異なるときに、繰り返し投与に対してある頻度で、薬剤を投与することを意味する。
【００５８】
薬剤は、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０ｈｒ、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分及び１分を含めて、別の処置の前に任意の時点で投与することができる。薬剤は、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０ｈｒ、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分及び１分を含めて、薬剤の第２の処置の前に任意の時点で投与することができる。
【００５９】
薬剤は、約１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、３８時間、４０時間、４２時間、４４時間、４６時間、４８時間、５０時間、５２時間、５４時間、５６時間、５８時間、６０時間、６２時間、６４時間、６６時間、６８時間、７０時間、７２時間、７４時間、７６時間、７８時間、８０時間、８２時間、８４時間、８６時間、８８時間、９０時間、９２時間、９４時間、９６時間、９８時間、１００時間、１０２時間、１０４時間、１０６時間、１０８時間、１１０時間、１１２時間、１１４時間、１１６時間、１１８時間及び１２０時間を含めて、別の処置の後に任意の時点で投与することができる。薬剤は、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０ｈｒ、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分及び１分を含めて、薬剤の第２の処置の後に任意の時点で投与することができる。
【００６０】
ｂ．処方
方法は、薬剤の投与を含むことができる。本明細書に記載の薬剤は、従来の様式で処方された錠剤又はロゼンジの形とすることができる。例えば、経口投与用錠剤及びカプセル剤は、従来の賦形剤を含むことができ、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤及び湿潤剤とすることができる。結合剤としては、シロップ、アラビアゴム（ａｃｃａｓｉａ）、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、デンプン粘漿剤及びポリビニルピロリドンが挙げられるが、それだけに限定されない。充填剤は、ラクトース、糖、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム及びソルビトールとすることができる。潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール及びシリカが挙げられるが、それだけに限定されない。崩壊剤は、ジャガイモデンプン及びナトリウムデンプングリコラートとすることができる。湿潤剤はラウリル硫酸ナトリウムとすることができる。錠剤は、当該技術分野で周知である方法によって被覆することができる。
【００６１】
本明細書に記載の薬剤は、水性又は油性懸濁液剤、溶液剤、乳濁液剤、シロップ剤、エリキシル剤などの液剤とすることもできる。薬剤は、使用前に水又は他の適切な媒体で構成するための乾燥品として処方することもできる。かかる液体調製物は、懸濁化剤、乳化剤、非水性媒体、防腐剤などの添加剤を含むことができる。懸濁化剤は、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル及び水素化食用脂とすることができる。乳化剤は、レシチン、ソルビタンモノオレアート及びアラビアゴムとすることができる。非水性媒体は、食用油、アーモンド油、分画ヤシ油、油性エステル、プロピレングリコール及びエチルアルコールとすることができる。防腐剤は、メチル又はプロピルｐ−ヒドロキシベンゾアート及びソルビン酸とすることができる。
【００６２】
本明細書に記載の薬剤は、カカオ脂、グリセリドなどの坐剤基剤を含むことができる坐剤として処方することもできる。本明細書に記載の薬剤は、吸入用に処方することもでき、乾燥粉末として投与することができる、又はジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタンなどの噴霧剤を使用してエアロゾルの形で投与することができる、溶液、懸濁液、乳濁液などの形とすることができる。本明細書に記載の薬剤は、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ペースト剤、薬用硬膏剤、貼付剤、膜剤などの水性又は非水性媒体を含む経皮製剤として処方することもできる。
【００６３】
本明細書に記載の薬剤は、注射、腫瘍内注射、持続注入などの非経口投与用に処方することもできる。注射用製剤は、油性又は水性媒体中の懸濁液、溶液又は乳濁液の形とすることができ、懸濁化剤、安定化剤及び分散剤を含めて、ただしそれだけに限定されない処方薬剤を含むことができる。薬剤は、発熱物質を含まない滅菌水を含めて、ただしそれだけに限定されない適切な媒体で戻すための散剤として提供することもできる。
【００６４】
本明細書に記載の薬剤は、デポ製剤として処方することもでき、移植又は筋肉内注射によって投与することができる。薬剤は、適切なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容される油中の乳濁液として）、イオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶性の誘導体として（例えば、やや難溶性の塩として）、処方することができる。
【００６５】
ｃ．投与量
方法は、治療有効量の薬剤をそれを必要とする患者に投与することを含むことができる。療法に使用するのに必要な治療有効量は、処置する症状の性質、ＴＬＲ活性を活性化するのに要求される時間、及び患者の年齢／症状に応じて変わる。しかし、一般には、成人の処置に使用される用量は、典型的には０．００１ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。この用量は、約１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ／日とすることができる。所望の用量は、好都合には、単回投与で投与することができ、又は例えば１日に２、３、４回又はそれ以上、適切な間隔で投与する複数回投与として投与することができる。複数回投与が望ましい、又は必要である場合がある。
【００６６】
投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、２７５ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、３２５ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、３７５ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４２５ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、４７５ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、５２５ｍｇ／ｋｇ、５５０ｍｇ／ｋｇ、５７５ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、６２５ｍｇ／ｋｇ、６５０ｍｇ／ｋｇ、６７５ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、７２５ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、７７５ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、８２５ｍｇ／ｋｇ、８５０ｍｇ／ｋｇ、８７５ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、９２５ｍｇ／ｋｇ、９５０ｍｇ／ｋｇ、９７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇなどの任意の投与量とすることができる。
【００６７】
５．がんの処置方法
それを必要とするほ乳動物に薬剤を投与することによってがんを処置する方法を本明細書に記載する。この方法は、ＴＬＲの腫瘍内刺激を標的にし、それによって免疫応答を腫瘍に集中させて、腫瘍細胞をＴＬＲ作動物質応答状態に転化することによって、がんに対する免疫療法を提供する。この方法は、転移発生のリスクを低下させるために外科的除去前の原発腫瘍の処置、及び他の腫瘍小結節の処置に使用することができる。この方法は、腫瘍内注射を含むことができる。この方法は、外科的除去前に薬剤を原発腫瘍に注射して、転移発生のリスクを低下させる、さらに他の腫瘍小結節を処置するステップを含むことができる。この方法は、アデノウイルス腫瘍内注射を利用できる任意の腫瘍の処置に使用することができる。
【００６８】
（進行性及び転移性ぼうこうがんを含めた）ぼうこう癌、乳癌、（結腸直腸がんを含めた）結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、（小及び非小細胞肺がん並びに肺腺癌を含めた）肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、尿生殖路癌、リンパ系癌、直腸癌、喉頭癌、（すい外分泌癌を含めた）すい臓癌、食道癌、胃癌、胆嚢癌、頚部癌、甲状腺癌及び（へん平上皮癌を含めた）皮膚癌；白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫及びＢｕｒｋｅｔｔリンパ腫を含めたリンパ球系列の造血器腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病並びに前骨髄球性白血病を含めたミエロイド系列の造血器腫瘍；星細胞腫、神経芽細胞腫、神経こう腫及びシュワン腫を含めた中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫及び骨肉腫を含めた間充織起源の腫瘍；並びに黒色腫、色素性乾皮症、角化きょく細胞腫、精上皮腫、甲状腺ろ胞がん、奇形癌、及び胃腸管又は腹骨盤腔のがんを含めた他の腫瘍を含めて、種々のがんを本発明によって処置することができる。
【００６９】
この方法は、免疫賦活薬、サイトカイン又は化学療法の使用を含めた別のがん処置法と組み合わせることができる。免疫賦活薬は、成長ホルモン、プロラクチン又はビタミンＤとすることができる。
【００７０】
６．感染細胞の処置
薬剤による導入細胞の同時送達によって感染症を処置する方法を本明細書に記載する。この方法は、ウイルス、細菌、寄生原虫又は真菌感染症の処置に使用することができる。この方法は、細胞内注射を用いることによって任意の感染症の処置に使用することができ、全身作用を最小限にしつつ感染細胞のＴＬＲシグナル伝達のオートクリン活性化をもたらし、それによって感染細胞に特異的な自然免疫応答を誘発することができる。この方法は、ウイルス、細菌、寄生原虫又は真菌感染症を処置する別の療法と組み合わせることができる。
【００７１】
この方法は、薬剤の投与を含むことができる。この方法は、薬剤を含むワクチンの投与を含むことができ、最適な抗原を発現する構築物を含むことができる任意の他のワクチン接種と併用することができる。
【実施例】
【００７２】
（実施例１）
バイシストロニック性発現ＴＬＲ５／フラジェリンベクターの合成、及び腫瘍細胞の処理
トール様受容体５（ＴＬＲ−５）及びフラジェリンＣＢＬＢ５０２を発現するベクター構築物を作製した。ベクターｐＣＤ５１５をこれらの構築物の骨格として使用した。ヒトＴＬＲ−５のｃＤＮＡ配列、及びトール様受容体作動物質のＣＢＬＢ５０２をコードするＤＮＡを、アルカリホスファターゼから誘導されたリーダーペプチドと個々に融合させて、発現されるタンパク質を小胞体（ＥＲ）及びゴルジを経由して細胞外分泌されるように導くことができる。
【００７３】
ｐＣＤ５１５−ＣＭＶ−ｈＴＬＲ５−ＥＦ１−５０２ｓベクター構築物は、細胞表面で分泌型のＣＢＬＢ５０２フラジェリン（ＣＢＬＢ５０２Ｓ）及びトール様受容体５（ＴＬＲ５）を発現した。このアデノウイルスベクターは、その有効な合成及びほ乳動物細胞による分泌のために、ＣＢＬＢ５０２の改変を必要とした。アデノウイルス構築物は、アルカリホスファターゼから誘導されるリーダー核酸配列
【００７４】
【化２】
2013506437.tif 000006
を含み、切断型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａフラジェリン（ｆｌｉＣ）遺伝子の上流にクローン化された（分泌型のフラジェリン（すなわち、ＣＢＬＢ５０２Ｓ）のコード化については、Ｂｕｒｄｅｌｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：２２６−２３０（２００８）を参照されたい）。ＥＦ１（伸長因子１α）プロモーターは、ＣＢＬＢ５０２Ｓをコードするこのカセットの上流にクローン化された。ＴＬＲ５遺伝子は、ヒトに由来し、図９に示すアミノ酸配列を有する。ＣＭＶプロモーターは、ＴＬＲ５遺伝子の上流にクローン化された。この構築物は、ＴＬＲ５とＣＢＬＢ５０２Ｓを同時発現する。この構築物を図１Ａに示す。
【００７５】
ｐＣＤ５１５−ＣＭＶ−ｈＴＬＲ５発現ベクターは、ヒトＴＬＲ−５の形態を発現するように構築された（図９参照）。アデノウイルス構築物は、ｈＴＬＲ５カセットの上流にクローン化された強力なＣＭＶプロモーターを含む。この構築物を図１Ｂに示す。
【００７６】
ｐＣＤ５１５−ＣＭＶ−Ｓｓｅａｐ−５０２発現ベクターは、分泌型フラジェリンＣＢＬＢ５０２及びトール様を発現するように構築された。アデノウイルス構築物は、リーダー配列ＳＥＡＰ５０２フラジェリン（ｆｌｉＣ）遺伝子の上流にクローン化された強力なＣＭＶプロモーターを含む。この構築物を図１Ｃに示す。［クローニング情報を必要とする］。
【００７７】
（実施例２）
バイシストロニック性発現ＴＬＲ５／フラジェリンベクターの合成、及び腫瘍細胞の処理
どちらもＮＦ−ｋＢ応答性ＧＦＰを発現するがそのＴＬＲ５状態が異なる２種類のレポーターほ乳動物細胞系に、ベクター構築物ｐＣＤ５１５、ｐＣＤ５１５−ＣＭＶ−ｈＴＬＲ５−ＥＦ１−５０２ｓ、ｐＣＤ５１５−ＣＭＶ−ｈＴＬＲ５−５０２、ｐＣＤ５１５−ＣＭＶ−ｈＴＬＲ５及びｐＣＤ５１５−ＣＭＶ−Ｓｓｅａｐ−５０２を導入した（下記表３参照）。
【００７８】
表３  ＴＬＲ５シグナル伝達活性化因子としてのアデノウイルス構築物の活性
【００７９】
【表３】
2013506437.tif 000007
ＴＬＲ５とＴＬＲ５作動物質ＣＢＬＢ５０２Ｓを同時発現するベクターは、公知ＴＬＲのどれをも発現せずＴＬＲ５作動物質単独で活性化することができない２９３ヌル細胞において、ＮＦ−ｋＢレポーターの発現を誘導するのに十分であった。この実験は、ＴＬＲ５及びフラジェリンＣＢＬＢ５０２Ｓがトランス又はシスで作用してＴＬＲ５シグナル伝達を活性化することを実証するものである。
【００８０】
（実施例３）
（ｐＣＤ５１５−ＣＭＶ−ｈＴＬＲ５−ＥＦ１−５０２ｓ）を有するバイシストロン性アデノウイルスの抗腫瘍効果を試験するために、アデノウイルス懸濁液１０ｍｌ（１０１２〜１０１１  ＩＵ／ｍｌ）を、ＣＴ２６マウス結腸癌細胞から生ずるＢＡＬＢ／ｃマウスの２個の皮下増殖同系腫瘍の一つに、腫瘍が直径３〜５ｍｍに達したときに注射し、注射しなかった対照の腫瘍が実験終了の必要なサイズ限界に達するまで腫瘍サイズをモニターした。対照マウスに、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するアデノウイルスベクターを注射した（やはり、マウス１匹当たり２個の腫瘍のうち１個）。代表的実験の結果を図４に示す。（ｐＣＤ５１５−ＣＭＶ−ｈＴＬＲ５−ＥＦ１−５０２ｓ）を注射した腫瘍の成長はほぼ完全になくなり、同じ動物の注射しなかった腫瘍の成長も、ＲＦＰを発現するアデノウイルスを注射した対照動物の腫瘍に比べて低下した。この結果は、ｐＣＤ５１５−ＣＭＶ−ｈＴＬＲ５−ＥＦ１−５０２ｓの（ｉ）強力なインシス及び（ｉｉ）目に見えるイントランス効果を示し、自然（シス効果）と獲得（トランス効果）の両方の免疫応答の動員を示すものである。単独で注射した表１に示した他方の対照ウイルス（すなわち、ＡＤ５（対照）及びＡｄ５（ＴＬＲ５））はどれも腫瘍の成長抑制効果がなかった。
【００８１】
したがって、ＴＬＲ５の強制的な異所性発現は、本来はＴＬＲ５がない腫瘍細胞タイプをＴＬＲ５刺激に対して高度に応答性とし、腫瘍の免疫寛容を破壊し、自然免疫応答を強力に誘発して、獲得免疫応答とそれに続く全般的な抗腫瘍効果の効果的な発生を促進する。
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１Ａ】
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【図１Ｃ】
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【図３】
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【図５】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年6月5日(2012.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013506437000001.app
【国際調査報告】
2013506437.tif 000031
2013506437.tif 000032
2013506437.tif 000033
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