(57)【要約】  本発明は、細胞の遊走を阻害するオリゴヌクレオチドに関する。本発明はまた、原発腫瘍または侵襲もしくは転移性腫瘍の予防または治療用薬剤を製造するための、ＴＳＰ１タンパク質の発現を阻害するか、またはＴＳＰ１の発現を制御するかもしくはＴＳＰ１の活性を媒介するタンパク質を阻害する少なくとも１種のタンパク質発現阻害剤、あるいは、少なくとも１種のタンパク質活性の阻害剤であって、当該阻害剤は、ＴＳＰ１タンパク質の活性、特に細胞遊走の刺激の原因となる活性を阻害するか、またはＴＳ１の発現を制御するかもしくはその活性を媒介するタンパク質を阻害する、阻害剤の使用に関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発腫瘍または侵襲性もしくは転移性腫瘍の予防または治療用薬剤を製造するための使用であって、
- ＴＳＰ１タンパク質の発現、または
- ＴＳＰ１の発現を制御するか、もしくはＴＳＰ１の活性を媒介するタンパク質の発現
を阻害する少なくとも１種のタンパク質発現の阻害剤、
あるいは、
- ＴＳＰ１タンパク質の活性、特に細胞遊走の刺激の原因となる活性、または
- ＴＳＰ１の発現を制御するか、もしくはその活性を媒介するタンパク質の活性
を阻害する少なくとも１種のタンパク質活性の阻害剤
の使用。
【請求項２】
タンパク質発現の阻害剤が、ＴＳＰ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ６、ＴＲＰＭ８、ＣＤ３６、またはＢ３インテグリンを含む群から選択されるタンパク質の発現を阻害する請求項１に記載の使用。
【請求項３】
タンパク質発現の阻害剤が、
- ２つのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）を含み、ハイブリッドを形成する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、
前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）は
- 前記オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と相補的であるか、
- または、前記オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と４０％未満のミスマッチを示すかのいずれかであり、且つ、
前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、
- 上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列に相補的であるか、
- または、上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列との４０％未満のミスマッチを示すかのいずれかである、
二本鎖オリゴヌクレオチドであるか、
- あるいは、上記で定義したそれぞれのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）の２つの相補的フラグメントを含む、上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチド（ａ）および（ｂ）のフラグメント（但し、当該フラグメントは、上記で定義したタンパク質の１つの発現を阻害する性質を保持している）であるか、あるいは、
- ２つのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）を含み、ハイブリッドを形成する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、各オリゴヌクレオチド配列はその３'または５'末端のいずれかにおいて、ハイブリッドを越えて延長する一本鎖末端を形成する１〜５個の不対ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）のハイブリッドの内側部は、
- オリゴヌクレオチド配列（ｂ）に相補的であるか、
- または、前記オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と４０％未満のミスマッチを示すかのいずれかであり、且つ、
前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、
- 上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列に相補的であるか、
- または、上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列と４０％未満ミスマッチを示すかのいずれかである、
二本鎖オリゴヌクレオチドであるか、
- あるいは、上記で定義したそれぞれのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）の２つの相補的フラグメントを含む、上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチド（ａ）および（ｂ）のフラグメント（但し、当該フラグメントは、上記で定義したタンパク質の１つの発現を阻害する性質を保持している）である、
請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
原発腫瘍または侵襲性もしくは転移性腫瘍の予防または治療の目的で、同時に、別個に、または経時的に使用する組み合わせ製品の製造のための、
- 少なくとも、請求項１〜３において上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチドと、
- 少なくとも抗血管新生剤と
を含むか、またはこれらからなる製品の使用、
あるいは、
原発腫瘍または侵襲性もしくは転移性腫瘍の予防または治療の目的で、同時に、別個に、または経時的に使用する組み合わせ製品の製造のための、
- 少なくとも、請求項１〜３において上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチドと、
- 少なくとも抗腫瘍剤と
を含むか、またはこれらからなる製品の使用、
あるいは、
原発腫瘍または侵襲性もしくは転移性腫瘍の予防または治療の目的で、同時に、別個に、または経時的に使用する組み合わせ製品の製造のための、
- 少なくとも、請求項１〜３において上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチドと、
- 少なくとも抗血管新生剤と、
- 少なくとも抗腫瘍剤と
を含むか、またはこれらからなる製品の使用。
【請求項５】
前記薬剤が、放射線療法または化学療法などの抗腫瘍治療と組み合わせられる請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
原発腫瘍または侵襲性もしくは転移性腫瘍が、固形腫瘍またはリンパ増殖性腫瘍であり、前記固形腫瘍は、前立腺腫瘍、肝腫瘍、肝細胞腺腫、限局性結節性過形成、神経膠腫などの脳腫瘍、乳癌、腎腫瘍、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胸膜肺芽腫、カルチノイド腫瘍などの肺腫瘍、骨腫、骨軟骨腫、動脈瘤性骨嚢胞、および線維性異形成などの骨腫瘍、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫、胃癌、大腸腫瘍、小腸腫瘍、食道腫瘍、膵臓腫瘍、肉腫、子宮頸癌、胆嚢腫瘍、メラノーマであり、前記リンパ球増殖性腫瘍は、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
活性物質として、
- ＴＳＰ１タンパク質の発現、または
- ＴＳＰ１の発現を制御するか、もしくはＴＳＰ１の活性を媒介するタンパク質の発現
を阻害する少なくとも１種のタンパク質発現の阻害剤、あるいは、
- ＴＳＰ１タンパク質の活性、特に細胞遊走の刺激の原因となる活性、または
- ＴＳＰ１の発現を制御するか、もしくはその活性を媒介するタンパク質の活性
を阻害する少なくとも１種のタンパク質活性の阻害剤
を、薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項８】
タンパク質発現の阻害剤が、ＴＳＰ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ６、ＴＲＰＭ８、ＣＤ３６、またはＢ３インテグリンを含む群から選択されるタンパク質の発現を阻害する請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
タンパク質発現の阻害剤が、二本鎖オリゴヌクレオチドまたは一本鎖オリゴヌクレオチドである請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
タンパク質発現の阻害剤が、
- ２つのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）を含み、ハイブリッドを形成する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、
前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）は
- 前記オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と相補的であるか、
- または、前記オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と４０％未満のミスマッチを示すかのいずれかであり、且つ、
前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、
- 上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列に相補的であるか、
- または、上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列との４０％未満のミスマッチを示すかのいずれかである、
二本鎖オリゴヌクレオチドであるか、
- あるいは、上記で定義したそれぞれのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）の２つの相補的フラグメントを含む、上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチド（ａ）および（ｂ）のフラグメント（但し、当該フラグメントは、上記で定義したタンパク質の１つの発現を阻害する性質を保持している）であるか、あるいは、
- ２つのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）を含み、ハイブリッドを形成する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、各オリゴヌクレオチド配列はその３'または５'末端のいずれかにおいて、ハイブリッドを越えて延長する一本鎖末端を形成する１〜５個の不対ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）のハイブリッドの内側部は、
- オリゴヌクレオチド配列（ｂ）に相補的であるか、
- または、前記オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と４０％未満のミスマッチを示すかのいずれかであり、且つ、
前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、
- 上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列に相補的であるか、
- または、上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列と４０％未満ミスマッチを示すかのいずれかである、
二本鎖オリゴヌクレオチドであるか、
- あるいは、上記で定義したそれぞれのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）の２つの相補的フラグメントを含む、上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチド（ａ）および（ｂ）のフラグメント（但し、当該フラグメントは、上記で定義したタンパク質の１つの発現を阻害する性質を保持している）である、
請求項７〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記標的配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列が、１５〜２５個のヌクレオチドを含む請求項７〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、２つの前記オリゴヌクレオチド配列のそれぞれの３'末端において、ハイブリッドを越えて延長する１〜５個のヌクレオチド、好ましくは２〜３個のヌクレオチドを含み、特にハイブリッドを越えて延長するヌクレオチドはデオキシチミジンである請求項７〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記標的配列が、配列番号４１（ＴＳＰ１）または配列番号４２（ＴＲＰＶ３）で表される請求項７〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、以下の構成の対:
（配列番号１および配列番号２）;（配列番号３および配列番号４）;（配列番号５および配列番号６）;（配列番号７および配列番号８）;（配列番号９および配列番号１０）;（配列番号１１および配列番号１２）;（配列番号１３および配列番号１４）;（配列番号１５および配列番号１６）;（配列番号１７および配列番号１８）;（配列番号１９および配列番号２０）；（配列番号２１および配列番号２２）；（配列番号２３および配列番号２４）;（配列番号２５および配列番号２６）;（配列番号２７および配列番号２８）；（配列番号２９および配列番号３０）；（配列番号３１および配列番号３２）；（配列番号３３および配列番号３４）；（配列番号３５および配列番号３６）；（配列番号３７および配列番号３８）；（配列番号３９および配列番号４０）（配列表参照）
から選択される請求項７〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記活性物質が、０．０５〜５０ｍｇ／ｋｇ、特に０.１〜２０ｍｇ/ｋｇの範囲の用量で投与用に処方される請求項７〜１４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１６】
同時に、別個に、または経時的に使用する組み合わせ製品としての
- 少なくとも、請求項１〜３において上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチドと、
- 少なくとも抗血管新生剤と
を含むか、またはこれらからなる製品、
あるいは
同時に、別個に、または経時的に使用する組み合わせ製品としての
- 少なくとも、請求項１〜３において上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチドと、
- 少なくとも抗腫瘍剤と
を含むか、またはこれらからなる製品、
あるいは
同時に、別個に、または経時的に使用する組み合わせ製品としての
- 少なくとも、請求項１〜３において上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチドと、
- 少なくとも抗血管新生剤と、
- 少なくとも抗腫瘍剤と
を含むか、またはこれらからなる製品
を活性物質として含む医薬組成物。
【請求項１７】
前記抗血管新生剤が、シレンジタイド、バンデタニブ、レナリドマイド、サリドマイド、三酸化ヒ素、ベバシズマブ、抗ＶＥＧＦＲ−１、抗ＶＥＧＦＲ−２、抗ＰＤＧＦＲ、抗ＦＭＳ−ＦＬＴ−３、抗ＴＫ１を含む群から選択される請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記抗腫瘍剤が、ベンダムスチン、テモゾロミド、メクロレタミン、シクロホスファミド、カルムスチン、シスプラチン、ブスルファン、チオテパ、またはダカルバジンのようなアルキル化剤；ペントスタチン、メトトレキサート、ペメトレキセド、フロクスウリジン、フルオロウラシル、シタラビン、メルカプトプリンまたはチオグアニンのような代謝拮抗剤；ルビテカン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン塩酸、またはオキサリプラチンのような細胞障害性抗生物質；ビノレルビン、ＢＭＳ １８４４７６、ビンクリスチン硫酸塩、ビンブラスチン、ドセタキセルタキソールのような植物誘導体を含む群から選択される請求項１６または１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
以下の配列：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０
から選択されるオリゴヌクレオチド配列。
【請求項２０】
以下の構成の対:
（配列番号１および配列番号２）;（配列番号３および配列番号４）;（配列番号５および配列番号６）;（配列番号７および配列番号８）;（配列番号９および配列番号１０）;（配列番号１１および配列番号１２）;（配列番号１３および配列番号１４）;（配列番号１５および配列番号１６）;（配列番号１７および配列番号１８）;（配列番号１９および配列番号２０）；（配列番号２１および配列番号２２）；（配列番号２３および配列番号２４）;（配列番号２５および配列番号２６）;（配列番号２７および配列番号２８）；（配列番号２９および配列番号３０）；（配列番号３１および配列番号３２）；（配列番号３３および配列番号３４）；（配列番号３５および配列番号３６）；（配列番号３７および配列番号３８）；（配列番号３９および配列番号４０）
から選択される二本鎖オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の遊走、侵襲または転移を阻害するオリゴヌクレオチドに関する。
特に、本発明は、腫瘍のようなヒトの病態の予防または治療用薬剤を製造するための二本鎖オリゴヌクレオチドの使用に関する。
また特に、本発明は、その産生物が病理学的状態の発症または持続に関与する遺伝子の発現を阻害することを目的とする。
本発明はまた、その産生物が病理学的状態の発症または持続に関与する遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ１）は、いくつかのインテグリンとスカベンジャー受容体ＣＤ３６とを含む多数のリガンドおよび受容体に結合する、いくつかのドメイン（Ｃａｒｌｓｏｎら、２００８）から構成される大きな４５０ｋＤａの三量体カルシウム結合分子である。ＴＳＰ１は、初めてその特性が明らかにされた抗血管新生分子であり（Ｇｏｏｄら、１９９０）、内皮細胞のインビトロでの遊走を阻害し、そのアポトーシスを誘導する（Ｊｉｍｅｎｅｚら、２０００）。ＴＳＰ１の発現は、原発性乳癌の腫瘍およびアンドロゲン依存性前立腺腫瘍を含む多くの腫瘍で阻害され（Ｒｅｎら、２００６;ＺｈａｎｇおよびＬａｗｌｅｒ、２００７）、ＴＳＰ１の発現と血管密度（ＭＶＤ）との間に逆相関が存在する（Ｃｏｌｏｍｂｅｌら、２００５;Ｆｏｎｔａｎａら、２００５ｂ）。乳癌の転移（Ｆｏｎｔａｎａら、２００５ａ）およびホルモン除去に不応性となった侵襲性または転移性前立腺腫瘍の両者において、ＴＳＰ１の発現が高く、減少したＭＶＤとは関連がないことがこれまでに報告されてきた（Ｃｏｌｏｍｂｅｌら２００５）。しかし、腫瘍の進展におけるＴＳＰ１の機能的関与は立証されていない。
【０００３】
ＴＳＰ１のタイプＩＩＩの反復（ｒｅｐｅａｔｓ）に結合し、そのフォールディングおよび性質を変化させるカルシウム（Ａｄａｍｓ、２００４;Ｃａｒｌｓｏｎら、２００８）が癌細胞の増殖、分化およびアポトーシスを調節することは、今日では明確に立証されている（Ａｂｅｅｌｅら、２００２; Ｌｅｈｅｎ'Ｋｙｉら、２００７;。Ｔｈｅｂａｕｌｔら、２００６）。確かに、細胞遊走の間に観察された周期的な形態学的変化および接着性の変化は、原形質膜のチャネル上にあるチャネルを通るＣａ2+の流入に応じて、反復して起こる[Ｃａ2+]iの変化を伴っている。遊走する細胞におけるこれらのチャネルの分子的性質は、転移性癌細胞に対してよりそうであるが、まだほとんど不明である。
【０００４】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、細胞内への二本鎖ＲＮＡの導入により、配列に依存する形で、遺伝子発現を阻害する転写後遺伝子抑制のメカニズムである。ＲＮＡｉは、哺乳動物、ショウジョウバエ、線虫、菌類および植物などの多くの生物で観察され、ＲＮＡｉは、特に合成ｓｉＲＮＡの導入によって、哺乳動物細胞内で引き起こされ得る（ＣａｒｔｈｅｗおよびＳｏｎｔｈｅｉｍｅｒ、２００９）。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的の一つは、原発腫瘍の発生、または腫瘍侵襲もしくは転移を促進する分子の阻害剤を提供することである。
本発明の別の目的は、上記分子の活性を制御あるいは媒介する分子の阻害剤を提供することである。
本発明の別の目的は、前記阻害剤を含む医薬組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、原発腫瘍および侵襲性または転移性腫瘍の進行の両方を阻害するのに有効な医薬組成物を提供することである。
【０００６】
本発明は、ＴＳＰ１発現が低酸素環境からの腫瘍細胞の遊走を刺激するため、したがって、それを阻害することで抗腫瘍効果が得られるという予想外の実験結果に依拠している。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
したがって、一般的な実施形態では、本発明は、原発腫瘍または侵襲性もしくは転移性腫瘍の予防または治療用薬剤を製造するための使用であって、
- ＴＳＰ１タンパク質の発現、または
- ＴＳＰ１の発現を制御するか、もしくはＴＳＰ１の活性を媒介するタンパク質の発現
を阻害する少なくとも１種のタンパク質発現の阻害剤、
あるいは、
- ＴＳＰ１タンパク質の活性、特に細胞遊走の刺激の原因となる活性、または
- ＴＳＰ１の発現を制御するか、もしくはその活性を媒介するタンパク質の活性
を阻害する少なくとも１種のタンパク質活性の阻害剤
の使用に関連する。
【０００８】
腫瘍は、増殖するのに十分な血液の供給に依存する。したがって、当業者にとって血管新生の阻害は、腫瘍の進展を抑制する方法である。この目標を達成するために、多くの抗血管新生化合物が過去に開発されてきた。その反対に、ＴＳＰ１のような血管新生の阻害剤を阻害することは、血管密度を増やすことになり、従って腫瘍の進展を促進すると予期される。これまで、腫瘍進展を阻害するためにＴＳＰ１タンパク質の発現または活性を阻害することは当業者にとって受け入れることが出来なかった。
【０００９】
本発明者らは、本明細書において、腫瘍のＴＳＰ１の抑制が確かに血管密度を増大させるが、ＴＳＰ１阻害の結果、強力な抗腫瘍効果が生じることを実証したのである。
【００１０】
腫瘍が拡大するにつれて、腫瘍では低酸素領域がしばしば発生する。低酸素状態は、血管新生の強力なトリガーである血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような血管新生因子の産生を刺激する。新しい血管は、腫瘍に灌注し、酸素を補給して低酸素状態を軽減する。低酸素状態が軽減するにつれて、ＶＥＧＦ産生はもはや刺激されず、フィードバック機構が働く。
【００１１】
そのようなフィードバック機構は、腫瘍におけるＴＳＰ１産生を制御するように起こらない：本発明者らは、低酸素状態が、血管新生を阻害するＴＳＰ１を誘導し、従って低酸素状態を強めることを、ここに示した。
本発明者らはまたここで、ＴＳＰ１は第二番目のメカニズムによって誘導され得、細胞質カルシウム濃度を増加させる樟脳またはタプシガルギンのような薬理学的分子がＴＳＰ１分泌および/または産生を誘導することを実証した。カルシウム濃度のこのような増加は、カルシウムチャネルの調節の緩和により引き起こされ得る。本発明者らは、一過性受容体電位（ＴＲＰ）ファミリーのいくつかのカルシウムチャネルがＴＳＰ１発現を調節していることを実証している。注目すべきは、これらのチャネルのいくつかは、癌細胞においてアップレギュレートされることが示されたことである（Ｐｒｅｖａｒｓｋａｙａら、２００７）。
【００１２】
低酸素状態または細胞内カルシウム濃度の変化によるＴＳＰ１の誘導は、独立して発生しうる二つのプロセスである。しかし、ＴＲＰチャネルの少なくとも一つであるＴＲＰＶ３が低酸素状態によってアップレギュレートされていることを本発明者らが示すように、これらのプロセスの間で幾らかのクロストークが発生し得る。さらに、本発明者らは、低酸素状態が細胞内カルシウム濃度の上昇を誘導することを示す。
【００１３】
重要なことに、前立腺の腫瘍において、ＴＳＰ１のサイレンシングが強く腫瘍の進展を阻害したので、ＴＳＰ１が、インビトロでの細胞遊走およびインビボでの腫瘍進展の主要な刺激剤であることも、本発明者らは実証した。
【００１４】
タンパク質発現の阻害剤とは、当該タンパク質をコードする遺伝子の転写あるいは当該タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を抑制する、オリゴヌクレオチドまたはペプチド、またはタンパク質、または他の任意の種類の有機もしくは無機分子などの生物学的分子を指す。
ＴＳＰ１の発現を制御するタンパク質とは、ＴＳＰ１遺伝子の転写またはＴＳＰ１遺伝子転写物の翻訳を制御するタンパク質を意味する。例えば、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ６、ＴＲＰＭ８のような一過性受容体電位（ＴＲＰ）ファミリーのいくつかの非電圧依存性のカチオンチャネルが本発明で考慮されている。
【００１５】
ＴＳＰ１の活性を媒介するタンパク質とは、ＴＳＰ１タンパク質の生物学的活性を媒介することができるＴＳＰ１タンパク質の受容体などのタンパク質を指す。例えば、受容体であるＣＤ３６およびＢ３インテグリンが、本発明で考慮されている。
タンパク質活性の阻害剤とは、インビボまたはインビトロ試験で該タンパク質の生物学的活性を阻害する、オリゴヌクレオチド、またはペプチド、またはタンパク質、または他の任意の種類の有機もしくは無機分子などの生物学的分子を指す。
【００１６】
細胞遊走の刺激とは、処置群における遊走している細胞の割合が対照群のそれに比べて、統計的に高い状態を指す。
細胞遊走能力は、改良ボイデンチャンバー（Ｂｏｙｄｅｎ Ｃｈａｍｂｅｒ）を用いてインビトロで測定することができる。ボイデンチャンバーは、透過性膜で区切られた二つのコンパートメントで構成されている。細胞は上部チャンバーに、化学走化性因子は下部チャンバー内に配置する。膜を通過して遊走する細胞を計数する。
詳細な遊走アッセイは、実施例の部に記載されている。
【００１７】
原発腫瘍とは、腫瘍の進行が開始し、癌塊を生ずるよう進行した解剖学的部位で増殖する腫瘍を指す。
侵襲性腫瘍とは、前立腺被膜などの初期の腫瘍の限界を限定する膜を突破した癌を指す。この癌は、それが最初に発生した組織の外に広がり、近辺の健常な組織中に増殖する。「侵襲性」は、前記癌がすでに前立腺外に広がっていることを意味するものではない。「侵襲」は浸潤と同じ意味を持つ。
転移性腫瘍とは、その元の部位から１つまたはそれ以上の他の身体部位に転移した癌を指す。
【００１８】
別の実施形態において、タンパク質発現の阻害剤は、ＴＳＰ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ６、ＴＲＰＭ８、ＣＤ３６、またはＢ３インテグリンを含む群から選択されるタンパク質の発現を阻害する。
ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ６、ＴＲＰＭ８は、一過性受容体電位（ＴＲＰ）ファミリーの非電圧依存性のカチオンチャネルに属している。これらのタンパク質はＴＳＰ１タンパク質の発現を制御する。
ＣＤ３６およびＢ３インテグリンはＴＳＰ１の受容体である。ＴＳＰ１は、多くの受容体と結合することが知られている（Ｒｏｂｅｒｔｓ、２００８）。これらの受容体はＴＳＰ１タンパク質の活性を媒介することができる。
【００１９】
別の実施形態において、タンパク質発現の阻害剤は、ＴＳＰ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＣＤ３６またはＢ３インテグリンを含む群から選択されるタンパク質の発現をインビトロおよびインビボで阻害する。
インビボ試験はヒト、マウスおよびラットを含む生きている動物に関する。本発明においては、タンパク質発現のインビボ阻害は、ヌードマウスに異種移植された腫瘍組織の増殖および体積で測定することができる。タンパク質発現の阻害剤またはタンパク質活性の阻害剤の注射後の腫瘍組織の体積の減少は、当該タンパク質発現のインビボでの阻害を意味する。
インビトロ試験とは、タンパク質発現の阻害を測定するために、例えば培養下にある細胞の使用、またはリアルタイムＲＴ−ＰＣＴ等を指す。
【００２０】
別の実施形態において、タンパク質発現の阻害剤は、ＴＳＰ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３を含む群から選択されるタンパク質のインビボ発現を阻害する。
別の実施形態において、タンパク質発現の阻害剤は、二本鎖オリゴヌクレオチドまたは一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００２１】
「オリゴヌクレオチド」という言葉は、２〜１００、特に、５〜５０、および好ましくは１３〜２５ヌクレオチドのポリヌクレオチド、特に１９、２０、２１オリゴヌクレオチドであって、リボヌクレオチド型、デオキシリボヌクレオチド型またはそれらの混合物を意味する。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡを指すことがある。一本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の発現を阻害するために使用されるマイクロＲＮＡまたは任意のアンチセンス一本鎖のオリゴヌクレオチドを指すことがある。
二本鎖オリゴヌクレオチドはその標的ｍＲＮＡを繰り返し切断するので、二本鎖オリゴヌクレオチドの使用は、リボザイムまたは一本鎖アンチセンスデオキシヌクレオチドのような他の従前のアンチＲＮＡの方策よりも効率的である。
さらに、二本鎖オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドよりも安定している。
【００２２】
別の実施形態において、該タンパク質発現の阻害剤は、
- ２つのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）を含み、ハイブリッドを形成する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、
前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）は
- 前記オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と相補的であるか、
- または、前記オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と４０％未満のミスマッチを示すかのいずれかであり、且つ、
前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、
- 上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列に相補的であるか、
- または、上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列との４０％未満のミスマッチを示すかのいずれかである、
二本鎖オリゴヌクレオチドであるか、
- あるいは、上記で定義したそれぞれのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）の２つの相補的フラグメントを含む、上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチド（ａ）および（ｂ）のフラグメント（但し、当該フラグメントは、上記で定義したタンパク質の１つの発現を阻害する性質を保持している）である。
【００２３】
該オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と相補的であることが好ましいが、オリゴヌクレオチド配列（ｂ）について１〜８個のミスマッチ、特に５個、より詳しくは３個のミスマッチ、さらにより詳しくは１個のミスマッチを含むことができる。
該オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、標的配列と相補的であることが好ましいが、標的配列について１〜８個のミスマッチ、特に５個、より詳しくは３個のミスマッチ、さらにより詳しくは１個のミスマッチを含むことができる。この適用は、標的配列の長さが２１ヌクレオチドの場合に特有である。
【００２４】
別の実施形態において、該タンパク質発現の阻害剤は、
- ２つのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）を含み、ハイブリッドを形成する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、各オリゴヌクレオチド配列はその３'または５'末端のいずれかにおいて、ハイブリッドを越えて延長する一本鎖末端を形成する１〜５個の不対ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）のハイブリッドの内側部は、
- オリゴヌクレオチド配列（ｂ）に相補的であるか、
- または、前記オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と４０％未満のミスマッチを示すかのいずれかであり、且つ、
前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、
- 上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列に相補的であるか、
- または、上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列と４０％未満ミスマッチを示すかのいずれかである、
二本鎖オリゴヌクレオチドであるか、
- あるいは、上記で定義したそれぞれのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）の２つの相補的フラグメントを含む、上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチド（ａ）および（ｂ）のフラグメント（但し、当該フラグメントは、上記で定義したタンパク質の１つの発現を阻害する性質を保持している）である。
【００２５】
該オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と相補的であることが好ましいが、オリゴヌクレオチド配列（ｂ）について１〜８個のミスマッチ、特に５個、より詳しくは３個のミスマッチ、さらにより詳しくは１個のミスマッチを含むことができる。
該オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、標的配列と相補的であることが好ましいが、標的配列と１〜８個のミスマッチ、特に５個、より詳しくは３個のミスマッチ、さらにより詳しくは１個のミスマッチを含むことができる。この適用は、標的配列の長さが２１ヌクレオチドの場合に特有である。
【００２６】
有利な実施形態では、標的配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列は、１５〜２５ヌクレオチドを含む。
標的配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列はアンチセンス鎖であり、前記第一配列に相補的な第二オリゴヌクレオチド配列はセンス鎖である。
本発明のオリゴヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチドの種類は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはその両者である。
【００２７】
本発明のオリゴヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチドは、天然ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）、または化学的に修飾されたヌクレオチド、またはそれらの混合物であって、特に反応性基、または連結剤を含む化学的に修飾されたヌクレオチドであって、５−メチルシチジン、キサントシン（ｘａｎｔｈｉｎｏｓｉｎｅ）、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、リボチミジン、７−メチルグアノシン、またはロックド核酸(ＬＮＡ）などである。
好ましくは、また、アンチセンス鎖で設計された標的配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列は、天然のリボヌクレオチドおよびセンス鎖を実質的に含み、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの両方を含むことができる。
【００２８】
上記の定義は、更に説明する医薬組成物およびオリゴヌクレオチドの配列にも適用する。
【００２９】
有利な実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、２つの前記オリゴヌクレオチド配列のそれぞれの３'末端において、ハイブリッドを越えて延長する１〜５個のヌクレオチド、好ましくは２〜３個のヌクレオチドを含む。
さらに有利な実施形態では、ハイブリッドを越えて延長するヌクレオチドはデオキシチミジンである。
【００３０】
特定の実施形態において、配列番号４１（ＴＳＰ１）で表される標的配列の発現は、本発明に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドによって阻害される。
別の特定の実施形態では、配列番号４２（ＴＲＰＶ３）で表される標的配列の発現は、本発明に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドによって阻害される。
別の特定の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、以下の構成の対のいずれかから選択される：
（配列番号１および配列番号２）；（配列番号３および配列番号４）;（配列番号５および配列番号６）；（配列番号７および配列番号８）、（配列番号９および配列番号１０）；（配列番号１１および配列番号１２）；（配列番号１３および配列番号１４）；（配列番号１５および配列番号１６）；（配列番号１７および配列番号１８）；（配列番号１９および配列番号２０）；（配列番号２１および配列番号２２）；（配列番号２３および配列番号２４）；（配列番号２５および配列番号 ２６）；（配列番号２７および配列番号２８）；（配列番号２９および配列番号３０）；（配列番号３１および配列番号３２）；（配列番号３３および配列番号３４）；（配列番号３５および配列番号３６）；（配列番号３７および配列番号３８）；（配列番号３９および配列番号４０）。
【００３１】
表１は、本発明で用いられる二本鎖オリゴヌクレオチド配列のリストを示す。それぞれの対応する二本鎖オリゴヌクレオチド配列によってヒトにおいて標的とした遺伝子は、表の最初の欄に記載されている。 ＴＳＰ１、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＭ８に対しては４つの異なる対が示され、ＣＤ３６、インテグリンＢ３、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ６に対しては２つが示されている。
【００３２】
【表１】
2013500709.tif 000002
【００３３】
オリゴヌクレオチド配列番号１〜２０は、それぞれ２つの前記オリゴヌクレオチド配列の３'末端にて、ハイブリッドを越えて延長する２つのデオキシチミジンを含む。本発明の有利な実施形態によれば、表１において、オリゴヌクレオチド配列番号 ２１〜４０は、ハイブリッドを越えて延長するヌクレオチドを含まず、第一オリゴヌクレオチド配列（アンチセンス鎖）および第二オリゴヌクレオチド配列（センス鎖）は長さが同一である。
【００３４】
ヒトでのＴＳＰ１発現は、ＴＳＰ１ ｍＲＮＡを標的とする以下の４つの異なった二本鎖オリゴヌクレオチドのいずれか１つを使用して阻害できる。
− 表１でＴＳＰ１ａと記された、ＴＳＰ１ ｍＲＮＡ部分を標的とする、配列番号１および配列番号２からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
− または、表１でＴＳＰ１ａと記された、ＴＳＰ１ ｍＲＮＡ部分を標的とする、配列番号２１および配列番号２２からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
− または、表１でＴＳＰ１ｂと記された、ＴＳＰ１ ｍＲＮＡ部分を標的とする、配列番号３および配列番号４からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
− または、表１でＴＳＰ１ｂと記された、ＴＳＰ１ ｍＲＮＡ部分を標的とする、配列番号２３および配列番号２４からなる二本鎖オリゴヌクレオチド。
【００３５】
表１でＴＳＰ１ａと記された配列は、数種の哺乳動物の間で、特にヒトとマウスとの間で完全に保存されているので、配列番号１および配列番号２からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、または配列番号２１および配列番号２２からなる二本鎖オリゴヌクレオチドは、ヒトだけでなく他の哺乳動物におけるＴＳＰ１発現を阻害するために使用することができる。
【００３６】
ヒトでのＴＲＰＶ３発現は、ＴＲＰＶ３ ｍＲＮＡを標的とする以下の４つの異なった二本鎖オリゴヌクレオチドのいずれか１つを使用して阻害できる。
− 表１でＴＲＰＶ３ａと記された、ＴＲＰＶ３ ｍＲＮＡ部分を標的とする、配列番号５および配列番号６からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
− または、表１でＴＲＰＶ３ａと記された、ＴＲＰＶ３ ｍＲＮＡ部分を標的とする、配列番号２５および配列番号２６からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
− または、表１でＴＲＰＶ３ｂと記された、ＴＲＰＶ３ ｍＲＮＡ部分を標的とする、配列番号７および配列番号８からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、
− または、表１でＴＲＰＶ３ｂと記された、ＴＲＰＶ３ ｍＲＮＡ部分を標的とする、配列番号２７および配列番号２８からなる二本鎖オリゴヌクレオチド。
【００３７】
表１でＴＲＰＶ３ｂと記された配列は、数種の哺乳動物の間で、特にヒトとマウスとの間で完全に保存されているので、配列番号７および配列番号８からなる二本鎖オリゴヌクレオチド、または配列番号２７および配列番号２８からなる二本鎖オリゴヌクレオチドは、ヒトだけでなく他の哺乳動物におけるＴＲＰＶ３発現を阻害するために使用することができる。
【００３８】
今日まで公知のいかなる哺乳動物のｍＲＮＡも認識しない二本鎖オリゴヌクレオチドを、いくつかのインビトロおよびインビボの実験でコントロールとして使用する。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、以下の配列の対からなる。
鎖１：５'−ＧＡＵＡＧＣＡＡＵＧＡＣＧＡＡＵＧＣＧＵＡｄＴｄＴ−３'
鎖２：５'−ＵＡＣＧＣＡＵＵＣＧＵＣＡＵＵＧＣＵＡＵＣｄＴｄＴ−３'
【００３９】
留意すべき点は、他のコントロールを置換することができ、ビヒクル（ＰＢＳ）のインビボ注射もコントロールとして使用される。
【００４０】
有利な実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、以下の構成の対から選択される：（配列番号１および配列番号２）;（配列番号３および配列番号４）;（配列番号５および配列番号６）;（配列番号７および配列番号８）;（配列番号１３および配列番号１４）;（配列番号１５および配列番号１６）;（配列番号１７および配列番号１８）;（配列番号２１および配列番号２２）;（配列番号２３および配列番号２４）;（配列番号２５および配列番号２６）;（配列番号２７および配列番号２８）;（配列番号３３および配列番号３４）;（配列番号３５および配列番号３６）;（配列番号３７および配列番号３８）。
【００４１】
さらに有利な実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、以下の構成の対から選択される：（配列番号１および配列番号２）;（配列番号３および配列番号４）;（配列番号５および配列番号６）;（配列番号７および配列番号８）;（配列番号１７および配列番号１８）;（配列番号２１および配列番号２２）;（配列番号２３および配列番号２４）;（配列番号２５および配列番号２６）;（配列番号２７および配列番号２８）;（配列番号３７および配列番号３８）。
【００４２】
ヒトの所定のｍＲＮＡを阻害する治療薬としてオリゴヌクレオチドを開発するには、二本鎖オリゴヌクレオチドが、ヒトとマウスとの間で完全に保存された配列を標的とすることが特に有利である。この性質によって、ヒトへの投与以前の前臨床モデルにおけるオリゴヌクレオチドの有効性および毒性の評価が可能になる。特に有利な実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、以下の構成の対から選択される：（配列番号１および配列番号２）;（配列番号７および配列番号８）;（配列番号２１および配列番号２２）;（配列番号２７および配列番号２８）。
【００４３】
別の実施形態において、本発明は、原発腫瘍または侵襲性もしくは転移性腫瘍の予防または治療の目的で、同時に、別個に、または経時的に使用する組み合わせ製品の製造のための、
− 少なくとも、上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチドと、
− 少なくとも抗血管新生剤と
を含むか、またはこれらからなる製品の使用に関する。
【００４４】
別の実施形態において、本発明は、原発腫瘍または侵襲性もしくは転移性腫瘍の予防または治療の目的で、同時に、別個に、または経時的に使用する組み合わせ製品の製造のための、
− 少なくとも、上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチドと、
− 少なくとも抗腫瘍剤と
を含むか、またはこれらからなる製品の使用に関する。
【００４５】
別の実施形態において、本発明は、原発腫瘍または侵襲性もしくは転移性腫瘍の予防または治療の目的で、同時に、別個に、または経時的に使用する組み合わせ製品の製造のための、
− 少なくとも、上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチドと、
− 少なくとも抗血管新生剤と、
− 少なくとも抗腫瘍剤と
を含むか、またはこれらからなる製品の使用に関する。
【００４６】
有利な実施形態において、前記薬剤は、放射線療法または化学療法などの抗腫瘍治療と組み合わせられる。
【００４７】
有利な実施形態において、抗血管新生阻害剤は、シレンジタイド、バンデタニブ、レナリドマイド、サリドマイド、三酸化ヒ素、ベバシズマブ、抗ＶＥＧＦＲ−１、抗ＶＥＧＦＲ−２、抗ＰＤＧＦＲ、抗ＦＭＳ−ＦＬＴ−３、および抗ＴＫ１を含む群から選択される。
有利な実施形態において、抗腫瘍剤は、ベンダムスチン、テモゾロミド、メクロレタミン、シクロホスファミド、カルムスチン、シスプラチン、ブスルファン、チオテパ、またはダカルバジン（Ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）のようなアルキル化剤；ペントスタチン、メトトレキサート、ペメトレキセド、フロクスウリジン、フルオロウラシル、シタラビン（Ｃｙｔａｒａｉｎｅ）、メルカプトプリンまたはチオグアニン（Ｔｈｉｇｕａｎｉｎｅ）のような代謝拮抗剤；ルビテカン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン塩酸、またはオキサリプラチンのような細胞障害性抗生物質；ビノレルビン、ＢＭＳ １８４４７６、ビンクリスチン硫酸塩、ビンブラスチン、ドセタキセルタキソールのような植物誘導体から選択される。
【００４８】
別の有利な実施形態では、原発腫瘍または侵襲性もしくは転移性腫瘍は、固形腫瘍またはリンパ増殖性腫瘍である。
さらに有利な実施形態では、固形腫瘍は、前立腺腫瘍、肝腫瘍、肝細胞腺腫、限局性結節性過形成、神経膠腫などの脳腫瘍、乳癌、腎腫瘍、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胸膜肺芽腫、カルチノイド腫瘍などの肺腫瘍、骨腫、骨軟骨腫、動脈瘤性骨嚢胞、および線維性異形成などの骨の腫瘍、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫、胃癌、大腸腫瘍、小腸腫瘍、食道腫瘍、膵臓腫瘍、肉腫、子宮頸癌、胆嚢腫瘍、メラノーマである。
別のより有利な実施形態では、リンパ球増殖性腫瘍は、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である。
【００４９】
本発明に準拠して、タンパク質活性の阻害剤は、ＴＳＰ１タンパク質に対する抗体、あるいはＴＳＰ１の発現を制御するか、または活性を媒介するタンパク質であり得る。例えば、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ６、ＴＲＰＭ８、ＣＤ３６、Ｂ３インテグリンなどである。
【００５０】
別の態様において、本発明は、医薬組成物に関する。
一般的な実施形態において、該医薬組成物は、活性物質として、
- ＴＳＰ１タンパク質の発現、または
- ＴＳＰ１の発現を制御するか、もしくはＴＳＰ１の活性を媒介するタンパク質の発現
を阻害する少なくとも１種のタンパク質発現の阻害剤、あるいは、
- ＴＳＰ１タンパク質の活性、特に細胞遊走の刺激の原因となる活性、または
- ＴＳＰ１の発現を制御するか、もしくはその活性を媒介するタンパク質の活性
を阻害する少なくとも１種のタンパク質活性の阻害剤
を、薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて含む。
【００５１】
有利な実施形態において、前記タンパク質発現の阻害剤は、ＴＳＰ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ６、ＴＲＰＭ８、ＣＤ３６、またはＢ３インテグリンを含む群から選択されるタンパク質の発現を阻害する。
さらに有利な実施形態において、前記タンパク質発現の阻害剤は、ＴＳＰ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＣＤ３６、またはＢ３インテグリンを含む群から選択されるタンパク質の発現を阻害する。
特に有利な実施形態において、タンパク質発現の阻害剤は、ＴＳＰ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３を含む群から選択されるタンパク質の発現を阻害する。
【００５２】
別の有利な実施形態において、タンパク質発現阻害剤は、二本鎖オリゴヌクレオチドまたは一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００５３】
別の実施形態において、本発明の医薬組成物におけるタンパク質発現の阻害剤は、
- ２つのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）を含み、ハイブリッドを形成する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、
前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）は
- 前記オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と相補的であるか、
- または、前記オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と４０％未満のミスマッチを示すかのいずれかであり、且つ、
前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、
- 上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列に相補的であるか、
- または、上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列との４０％未満のミスマッチを示すかのいずれかである、
二本鎖オリゴヌクレオチドであるか、
- あるいは、上記で定義したそれぞれのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）の２つの相補的フラグメントを含む、上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチド（ａ）および（ｂ）のフラグメント（但し、当該フラグメントは、上記で定義したタンパク質の１つの発現を阻害する性質を保持している）である。
【００５４】
当該オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と相補的であることが好ましいが、オリゴヌクレオチド配列（ｂ）について１〜８個のミスマッチ、特に５個、より詳しくは３個のミスマッチ、さらにより詳しくは１個のミスマッチを含むことができる。
該オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、標的配列と相補的であることが好ましいが、標的配列について１〜８個のミスマッチ、特に５個、より詳しくは３個のミスマッチ、さらにより詳しくは１個のミスマッチを含むことができる。この適用は、標的配列の長さが２１ヌクレオチドの場合に特有である。
【００５５】
別の実施形態において、本発明の医薬組成物におけるタンパク質発現の阻害剤は、
- ２つのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）を含み、ハイブリッドを形成する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、各オリゴヌクレオチド配列はその３'または５'末端のいずれかにおいて、ハイブリッドを越えて延長する一本鎖末端を形成する１〜５個の不対ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）のハイブリッドの内側部は、
- オリゴヌクレオチド配列（ｂ）に相補的であるか、
- または、前記オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と４０％未満のミスマッチを示すかのいずれかであり、且つ、
前記オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、
- 上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列に相補的であるか、
- または、上記で定義した、発現を阻害すべきタンパク質の１つをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ分子に属する標的配列と４０％未満ミスマッチを示すかのいずれかである、
二本鎖オリゴヌクレオチドであるか、
- あるいは、上記で定義したそれぞれのオリゴヌクレオチド配列（ａ）および（ｂ）の２つの相補的フラグメントを含む、上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチド（ａ）および（ｂ）のフラグメント（但し、当該フラグメントは、上記で定義したタンパク質の１つの発現を阻害する性質を保持している）である。
【００５６】
当該オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、オリゴヌクレオチド配列（ｂ）と相補的であることが好ましいが、オリゴヌクレオチド配列（ｂ）について１〜８個のミスマッチ、特に５個、より詳しくは３個のミスマッチ、さらにより詳しくは１個のミスマッチを含むことができる。
該オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、標的配列と相補的であることが好ましいが、標的配列について１〜８個のミスマッチ、特に５個、より詳しくは３個のミスマッチ、さらにより詳しくは１個のミスマッチを含むことができる。この適用は、標的配列の長さが２１ヌクレオチドの場合に特有である。
【００５７】
本発明の医薬組成物においては、標的配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列は、１５〜２５ヌクレオチドを含む。
有利な実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、２つの前記オリゴヌクレオチド配列のそれぞれの３'末端において、ハイブリッドを越えて延長する１〜５個のヌクレオチド、好ましくは２〜３個のヌクレオチドを含む。
ハイブリッドを越えて延長するヌクレオチドは、標的配列に相補的であるか、またはそうでなくてもよい。
ハイブリッドを越えて延長するヌクレオチドは、いかなる天然ヌクレオチドであってもよい。
さらに有利な実施形態では、ハイブリッドを越えて延長するヌクレオチドはデオキシチミジンである。
【００５８】
特定の実施形態において、配列番号４１（ＴＳＰ１）で表される標的配列の発現は、本発明に記載されている二本鎖オリゴヌクレオチドによって阻害される。
別の特定の実施形態では、配列番号４３（ＴＲＰＶ３）で表される標的配列の発現は本発明に記載されて二本鎖オリゴヌクレオチドによって阻害される。
【００５９】
別の特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、活性物質として、以下の構成の対から選択される二本鎖オリゴヌクレオチドを含む:
（配列番号１および配列番号２）;（配列番号３および配列番号４）;（配列番号５および配列番号６）;（配列番号７および配列番号８）;（配列番号９および配列番号１０）;（配列番号１１および配列番号１２）;（配列番号１３および配列番号１４）;（配列番号１５および配列番号１６）;（配列番号１７および配列番号１８）;（配列番号１９および配列番号２０）；（配列番号２１および配列番号２２）；（配列番号２３および配列番号２４）;（配列番号２５および配列番号２６）;（配列番号２７および配列番号２８）；（配列番号２９および配列番号３０）；（配列番号３１および配列番号 ：３２）；（配列番号３３および配列番号３４）；（配列番号３５および配列番号３６）；（配列番号３７および配列番号３８）；（配列番号：３９および配列番号４０）。
【００６０】
有利な実施形態において；本発明の医薬組成物は、活性物質として、以下の構成の対から選択される二本鎖オリゴヌクレオチドを含む：
（配列番号１および配列番号２）;（配列番号３および配列番号４）;（配列番号５および配列番号６）;（配列番号７および配列番号８）；（配列番号１３および配列番号１４）; （配列番号１５および配列番号１６）；（配列番号１７および配列番号１８）；（配列番号２１および配列番号２２）；（配列番号２３および配列番号２４）；（配列番号２５および配列番号２６）；（配列番号２７および配列番号２８）；（配列番号３３および配列番号３４）；（配列番号３５および配列番号３６；（配列番号３７および配列番号３８）。
【００６１】
さらに有利な実施形態において、本発明の医薬組成物は、活性物質として、以下の構成の対から選択される二本鎖オリゴヌクレオチドを含む：
（配列番号１および配列番号２）;（配列番号３および配列番号４）;（配列番号５および配列番号６）;（配列番号７および配列番号８）；（配列番号１７および配列番号１８）；（配列番号２１および配列番号２２）；（配列番号２３および配列番号２４）；（配列番号２５および配列番号２６）；（配列番号２７および配列番号２８）；（配列番号３７および配列番号３８）。
【００６２】
特に有利な実施形態において、本発明の医薬組成物は、活性物質として、以下の構成の対から選ばれる二本鎖オリゴヌクレオチドを含む：
（配列番号１および配列番号２）;（配列番号７および配列番号８）；（配列番号２１および配列番号２２）；（配列番号２７および配列番号２８）。
【００６３】
有利な実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは、生理食塩水である。
別の有利な実施形態において、本発明の医薬組成物に使用される二本鎖オリゴヌクレオチドは、コレステロール、または前記二本鎖オリゴヌクレオチドを細胞内に浸透可能にする物質と結合される。
別のさらに有利な実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドを細胞内に浸透可能にする物質は、例えば、リポソーム、脂質ベース薬剤、ナノ粒子、磁性球体、ポリエチレンイミン誘導体である。
【００６４】
有利な実施形態において、前記活性物質は、０．０５〜５０ｍｇ／ｋｇ、特に０．１〜２０ ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与するように処方される。
二本鎖オリゴヌクレオチドを含む活性物質は、適用方法または活性物質の形態に応じて、変更しても十分な用量で投与用に処方され得る。
有利な実施形態において、活性物質は、以下の投与法の一つのために処方される：静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内点滴注入、舌下、直腸内、腫瘍に直接注射、局所または経口。
本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞にトランスフェクションし、該細胞を次いで組織に注入するか、または、例えば、局所、全身、エアロゾル経路で直接組織に注入することができる。
【００６５】
有利な実施形態において、医薬組成物は、
同時に、別個に、または経時的に使用する組み合わせ製品としての
− 少なくとも、上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチドと、
− 少なくとも抗血管新生剤と
を含むか、またはこれらからなる製品を活性物質として含む。
【００６６】
有利な実施形態において、医薬組成物は、
同時に、別個に、または経時的に使用する組み合わせ製品としての
− 少なくとも、上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチドと、
− 少なくとも抗腫瘍剤と
を含むか、またはこれらからなる製品を活性物質として含む。
【００６７】
有利な実施形態において、医薬組成物は、
同時に、別個に、または経時的に使用する組み合わせ製品としての
− 少なくとも、上記で定義した二本鎖オリゴヌクレオチドと、
− 少なくとも抗血管新生剤と、
− 少なくとも抗腫瘍剤と
を含むか、またはこれらからなる製品を活性物質として含む。
【００６８】
本発明の医薬組成物の前記抗血管新生阻害剤は，シレンジタイド、バンデタニブ、レナリドマイド、サリドマイド、三酸化ヒ素、ベバシズマブ、抗ＶＥＧＦＲ−１、抗ＶＥＧＦＲ−２、抗ＰＤＧＦＲ、抗ＦＭＳ−ＦＬＴ−３、および抗ＴＫ１を含む群から選択できる。
本発明の医薬組成物の前記抗腫瘍剤は、ベンダムスチン、テモゾロミド、メクロレタミン、シクロホスファミド、カルムスチン、シスプラチン、ブスルファン、チオテパ、またはダカルバジン（Ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）のようなアルキル化剤；ペントスタチン、メトトレキサート、ペメトレキセド、フロクスウリジン、フルオロウラシル、シタラビン（Ｃｙｔａｒａｉｎｅ）、メルカプトプリンまたはチオグアニン（Ｔｈｉｇｕａｎｉｎｅ）のような抗代謝剤；ルビテカン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン塩酸、またはオキサリプラチンのような細胞障害性抗生物質；ビノレルビン、ＢＭＳ １８４４７６、ビンクリスチン硫酸塩、ビンブラスチン、ドセタキセルタキソールのような植物誘導体を含む群から選択できる。
【００６９】
別の実施形態において、本発明は、以下の配列から選択されるオリゴヌクレオチド配列に関する：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４ 、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０。
【００７０】
これらの配列はすべて、それ自体新規である。
【００７１】
別の実施形態において、本発明は、以下の構成の対から選択される二本鎖オリゴヌクレオチドに関する:（配列番号１および配列番号２）;（配列番号３および配列番号４）;（配列番号５および配列番号６）;（配列番号７および配列番号８）;（配列番号９および配列番号１０）; （配列番号１１および配列番号１２）;（配列番号１３および配列番号１４）;（配列番号１５および配列番号１６）;（配列番号１７および配列番号１８）;（配列番号１９および配列番号２０）；（配列番号２１および配列番号２２）；（配列番号２３および配列番号２４）;（配列番号２５および配列番号２６）;（配列番号２７および配列番号２８）；（配列番号２９および配列番号３０）；（配列番号３１および配列番号 ：３２）；（配列番号３３および配列番号３４）；（配列番号３５および配列番号３６）；（配列番号３７および配列番号３８）；（配列番号 ：３９および配列番号４０）。
【００７２】
有利な実施形態において；本発明は、以下の構成の対から選択される二本鎖オリゴヌクレオチドに関する：（配列番号１および配列番号２）;（配列番号３および配列番号４）;（配列番号５および配列番号６）;（配列番号７および配列番号８）；（配列番号１３および配列番号１４）; （配列番号１５および配列番号１６）；（配列番号１７および配列番号１８）；（配列番号２１および配列番号２２）；（配列番号２３および配列番号２４）；（配列番号２５および配列番号２６）；（配列番号２７および配列番号２８）；（配列番号３３および配列番号３４）；（配列番号３５および配列番号３６）；（配列番号３７および配列番号３８）。
【００７３】
有利な実施形態において；本発明は、以下の構成の対から選択される二本鎖オリゴヌクレオチドに関する：（配列番号１および配列番号２）;（配列番号３および配列番号４）;（配列番号５および配列番号６）;（配列番号７および配列番号８）；（配列番号１７および配列番号１８）；（配列番号２１および配列番号２２）；（配列番号２３および配列番号２４）；（配列番号２５および配列番号２６）；（配列番号２７および配列番号２８）；（配列番号３７および配列番号３８）。
【００７４】
特に有利な実施形態において、本発明は、以下の構成の対から選択される二本鎖オリゴヌクレオチドに関する：（配列番号１および配列番号２）;（配列番号７および配列番号８）；（配列番号２１および配列番号２２）；（配列番号２７および配列番号２８）。
【００７５】
これらの二本鎖オリゴヌクレオチドはすべて、それ自体新規である。
【００７６】
本発明は、以下の図および実施例によって説明されるが、これらは決して本発明の範囲の限界ではない。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１−１】図１Ａは、アンドロゲン依存性（ＬＮＣａＰ）、去勢抵抗性（Ｃ４−２および２２ＲＶ１）、またはアンドロゲン非依存性（ＰＣ３）の前立腺腫瘍細胞におけるＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルを表す。結果（平均±ＳＥＭ、ｎ> ３）はシクロフィリンＡのｍＲＮＡレベルに正規化し、任意の単位（ＬＮＣａＰを１に設定）で表す。  図１Ｂは、アンドロゲン依存性（ＬＮＣａＰ）、去勢抵抗性（Ｃ４−２および２２ＲＶ１）、またはアンドロゲン非依存性（ＰＣ３）の前立腺腫瘍細胞における、対応するＴＳＰ１タンパク質レベルを表す。ローディングコントロールとしてチューブリンを使用した。  図１Ｃは、ＴＳＰ１ ｍＲＮＡを標的にした二つの異なるｓｉＲＮＡをトランスフェクションして４８時間後のＣ４−２細胞におけるＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルを表す。同じ細胞におけるシクロフィリンＡのｍＲＮＡのレベルに正規化した結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭであって、任意の単位で表される。  図１Ｄは、ＴＳＰ１ａ−またはＴＳＰ１ｂ−ｓｉＲＮＡをトランスフェクションして４８時間後のＣ４−２細胞における、間接免疫蛍光法により可視化したＴＳＰ１発現を表す。  図１Ｅは、ＴＳＰ１ａ−またはＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後のＣ４−２細胞の代謝活性を表す。  図１Ｆは、ＴＳＰ１ａ−またはＴＳＰ１ｂ−ｓｉＲＮＡをＣ４−２細胞にトランスフェクションして４８時間後に測定したカスパーゼ３および７の酵素活性を表す。結果は、コントロールまたはＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞との間に統計的に違いはない。  図１Ｇは、表示したｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたＣ４−２（黒バー）またはＰＣ３細胞（灰色のバー）の新鮮な培養培地への遊走能力を表す。トランスフェクションの２日後、細胞を、ボイデンチャンバーの上部に播種し、新鮮培地に向かって遊走した細胞数を、１８時間後に計数した。結果は、コントロール条件で遊走する細胞と比較した、細胞の遊走の割合として表す（平均±ＳＥＭ、ｎ=３）。実験を３回繰り返し、同様の結果を得た。  図１Ｈは、ＬＮＣａＰ細胞またはＣ４−２細胞からの条件培地に向うＬＮＣａＰ細胞の遊走能力を表す。ＬＮＣａＰ細胞（黒色バー）またはＣ４−２細胞（灰色のバー）を、ボイデンチャンバーの下部にて培養（ｐｌａｔｅ）した。２日後、ＬＮＣａＰ細胞を上室に播種し、遊走細胞の数を１８時間後に計数した。結果は、Ｇのように表す。  図１Ｉは、ドキシサイクリンの存在下（ｄｏｘ +）または不在下（ｄｏｘ −）で２日間培養したＪＴ８細胞の細胞ホモジネートおよび条件培地における、ウエスタンブロット法で測定したＴＳＰ１の発現を表す。ＪＴ８細胞は、ＴＳＰ１をコードするｔｅｔ抑制性プラスミドで安定にトランスフェクションされた線維肉腫細胞である。
【図１−２】図１Ｊは、ＴＳＰ１発現を抑制するようドキシサイクリンの存在下で培養したか、またはＴＳＰ１発現を誘導するようドキシサイクリンの非存在下で培養したＴＳＰ１誘導可能ＪＴ８細胞によって条件付けした培地に向かうＣ４−２細胞の遊走を表す。結果は、Ｇのように表す。  図１Ｋは、表示したｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたＣ４−２細胞の遊走能力を表す。トランスフェクションの２日後、細胞を、ボイデンチャンバーの上部にて培養し、新鮮培地に向かって遊走した細胞数を２日後に計数した。結果は図１Ｃのように表す。  図１Ｌは、ＣＤ３６に対するＴＳＰ１の結合を阻害する抗体の非存在下または存在下のＣ４−２で条件付けした培地に向けたＣ４−２の遊走能力を表す。Ｃ４−２細胞は、ボイデンチャンバーの下部にて培養した。２日後、Ｃ４−２細胞を、コントロール培地またはＴＳＰ１−抗体Ａｂ１（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国カリフォルニア州フリーモントからのＣｌｏｎｅＡ４．１）を１μｇ/ｍｌ含有する培地中で、上室にて培養した。ＴＳＰ１−Ａｂ１の抗体を上室に添加した場合には、それを下室にも同じ濃度で添加した。１８時間培養後、遊走細胞を計数した。
【図２】図２Ａは、ビヒクル（左）またはタプシガルギン（１μＭ）（右）で２時間処理したＣ４−２細胞におけるＴＳＰ１発現を表す。ＴＳＰ１発現は、間接免疫蛍光法で可視化されている。  図２Ｂは、ビヒクル（左）またはタプシガルギン（１μＭ）（右）で２時間処理したＣ４−２細胞による細胞培養培地中のＴＳＰ１分泌を表す。分泌されたＴＳＰ１は、細胞培養培地中でウエスタンブロッティングによって測定する。  図２Ｃは、表示した用量の樟脳で２時間処理したＣ４−２細胞におけるＴＳＰ１発現を表す。ＴＳＰ１発現は、間接免疫蛍光法で可視化されている。  図２Ｄは、表示した用量のビヒクルまたは樟脳で２時間処理したＣ４−２細胞による細胞培養培地中のＴＳＰ１分泌を表す。分泌されたＴＳＰ１は、細胞培養培地中でウエスタンブロッティングによって測定する。  図２Ｅは、表示した用量の樟脳による処理の６時間後のＣ４−２細胞におけるＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベル（平均±ＳＥＭ、ｎ = ３）を表す。ｍＲＮＡレベルは、シクロフィリンＡに正規化されている。  図２Ｆは、表示した前立腺腫瘍細胞株において測定されたＴＲＰＶ３（黒色バー）およびＴＲＰＭ８（灰色のバー）ｍＲＮＡレベルを示す。結果（平均±ＳＥＭ、ｎ> ３）をシクロフィリンＡのｍＲＮＡレベルに正規化し、任意の単位で表す。  図２Ｇは、表示した前立腺細胞株におけるＴＲＰＶ３タンパク質のウエスタンブロットによる検出を表す。ローディングコントロールとしてチューブリンを使用した。  図２Ｈは、ＴＲＰＶ３ａ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの４８時間後のＣ４−２細胞におけるＴＳＰ１およびＴＲＰＶ３の発現を表す。  図２Ｉは、表示したｓｉＲＮＡによってトランスフェクションされたＣ４−２細胞のＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルを表す。シクロフィリンＡのｍＲＮＡレベルに正規化した結果は、トランスフェクションの２日後に測定されている（平均±ＳＥＭ、ｎ> ３）。  図２Ｊは、表示したｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたＣ４−２の、新鮮培養培地へ向けた遊走能力を表す。トランスフェクションの２日後、細胞を上室に播種し、遊走した細胞数を１８時間後に計数した。結果は、コントロール条件で遊走する細胞と比較した、細胞の遊走の割合として表す（平均±ＳＥＭ、ｎ = ３）。実験を３回繰り返し、同様の結果を得た。
【図３】図３Ａは、Ｃ４−２細胞の増殖に対するＴＲＰＭ８およびＴＲＰＶ３のサイレンシングの効果を表す。Ｃ４−２細胞は、表示したｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。それらの細胞の増殖は、代謝アッセイで測定する（平均±ＳＥＭ、ｎ = ３、３回の別個の実験の代表値）。  図３Ｂは、Ｃ４−２（黒色バー）またはＰＣ３細胞（灰色バー）の遊走に対するＴＲＰＶ３サイレンシングの効果を表す。細胞をコントロール、または２つの異なるＴＲＰＶ３ ｓｉＲＮＡによりトランスフェクションし、図１Ｇのように遊走アッセイを行った。  図３Ｃは、ＣＯＮＴ−、ＴＲＰＣ４−、またはＴＲＰＣ６-ｓｉＲＮＡで２日前にトランスフェクションしたＣ４−２細胞の遊走能力を表す。  図３Ｄは、ＣＯＮＴ−またはＴＳＰ１-ｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、トランスフェクションの４８時間後のＣ４−２細胞の培養液中のＴＳＰ１のウエスタンブロット検出を表す。  図３Ｅは、Ｃ４−２細胞の遊走能力に対するＴＳＰ１の影響を表す。ボイデンチャンバーの下部にて培養したＣ４−２細胞を、コントロール−（Ｃと明記）またはＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡ（ＴＳＰ）のいずれかでトランスフェクションした。同じ日に、別の細胞バッチをコントロール−、ＴＳＰ１−、またはＴＲＰＶ３−ｓｉＲＮＡ（ＴＲＰ）でトランスフェクションした。三日後、これらの後者の細胞をトリプシン処理し、表示したようにボイデンチャンバーの上部に播種した。遊走を１８時間後に定量し、結果を、コントロール−条件で遊走する細胞（上部および下部にてコントロール−ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞）との割合で表した（平均±ＳＥＭ、ｎ = ３）。
【図４−１】図４Ａは、酸素正常状態で、または、低酸素状態を模倣するための塩化コバルト３００μＭの存在下で培養したＣ４−２細胞において測定したＴＲＰＶ３（薄灰色バー）およびＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベル（濃灰色バー）を表す。ｍＲＮＡレベルを定量し、シクロフィリンＡに正規化している。結果を、１に設定した酸素正常状態のｍＲＮＡレベルに対する、低酸素状態下のｍＲＮＡレベルの比として表現する。２つの別個の実験からの結果を表示する。  図４Ｂは、コントロール条件（ｃｏｎｔ）または３００μＭ ＣｏＣｌ2の存在下で３０分または４８時間培養したＣ４−２細胞の細胞内カルシウム濃度（平均±ＳＥＭ、条件ごとにｎ> １２０個の細胞）を表す。  図４Ｃは、２０％（酸素正常状態）または１％酸素（低酸素状態）中で、７２時間まで培養したＣ４−２細胞におけるＶＥＧＦおよびＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルを表す。薄灰色バーは、酸素正常状態でのＶＥＧＦを表し、濃灰色バーは、低酸素状態でのＶＥＧＦを表し、白色バーは、酸素正常状態でのＴＳＰ１を表し、黒色バーは、低酸素状態でのＴＳＰ１を表す。結果を、シクロフィリンＡのｍＲＮＡレベルに正規化し、Ｔ０を１に設定して任意の単位で表す。  図４Ｄは、ＥＬＩＳＡで測定し、総タンパク質含有量に正規化した、Ｃ４−２細胞ホモジネートにおけるＶＥＧＦおよびＴＳＰ１のタンパク質含有量を表す。薄灰色バーは、酸素正常状態でのＶＥＧＦを表し、濃灰色のバーは、Ｃのような色彩コードを表す。  図４Ｅは、ＥＬＩＳＡで測定し、細胞ホモジネート中の全タンパク質量に正規化した、Ｃ４−２細胞の培養培地中のＶＥＧＦおよびＴＳＰ１タンパク質含有量を表す。 色彩コードはＣに同じ。  図４Ｆは、酸素正常状態（Ｎ）または低酸素状態（Ｈ）で表示された期間培養した細胞のＣ４−２細胞ホモジネート中のＴＳＰ１、Ｈｉｆ１アルファおよびＴＲＰＶ３タンパク質含有量を表す。ローディングコントロールとしてチューブリンを使用した。
【図４−２】図４Ｇは、塩化コバルト中で表示された期間培養したＰＣ３細胞におけるシクロフィリンＡレベルに正規化した、ＶＥＧＦ（灰色）およびＴＳＰ１（黒）ｍＲＮＡレベルの誘導を、同一時点でのコントロール培地でのそれぞれのｍＲＮＡレベルと比較して、表す。  図４Ｈは、コントロール条件下（Ｎ）または低酸素状態を模倣するための３００μＭ ＣｏＣｌ2の存在下（Ｈ）で４８時間増殖したＰＣ３細胞におけるＴＳＰ１の免疫検出を表す。
【図５−１】図５Ａは、指数関数的に増殖しているＣ４−２腫瘍を有するマウスの腫瘍体積を表す。マウスは、毎日、ＰＢＳ（三角形）、コントロール−（黒色四角）、ＴＲＰＶ３−（薄灰色菱形）またはＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡ（濃灰色菱形）のｉ.ｐ.注射による処理をされた。すべてのｓｉＲＮＡはＰＢＳで（１２０μｇ/ｋｇ）希釈した。腫瘍体積はｃｍ3で表す（平均±ＳＥＭ、１群あたりマウス６匹）。  図５Ｂは、指数関数的に増殖しているＰＣ３腫瘍を有するマウスの腫瘍体積を表す。マウスは、毎日、コントロール−（黒色四角）、ＴＲＰＶ３−（薄灰色菱形）またはＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡ（濃灰色菱形）のｉ.ｐ.注射による処理をされた。すべてのｓｉＲＮＡはＰＢＳで（１２０μｇ/ｋｇ）希釈した。腫瘍体積はｃｍ3で表す（平均±ＳＥＭ、１群あたりマウス６匹）。  図５Ｃは、シクロフィリンＡに正規化し、任意の単位で表した、図５Ｂに示した実験の終了時に採取したＰＣ３腫瘍におけるＴＲＰＶ３およびＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルを表す。ＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルは、コントロール−ｓｉＲＮＡ（黒色四角）、ＴＲＰＶ３−ｓｉＲＮＡ（灰色菱形）またはＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡ（白丸）で処理したマウスからの同一腫瘍におけるＴＲＰＶ３ ｍＲＮＡレベルに対してプロットした。  図５Ｄは、シクロフィリンＡ ｍＲＮＡレベルに正規化した、図５Ａ（Ｃ４−２、菱形）および５Ｂ（ＰＣ３、三角）に示した実験の終了時に採取した腫瘍におけるＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルを表す。腫瘍は、コントロール−ｓｉＲＮＡ（黒記号）、またはＴＲＰＶ３−ｓｉＲＮＡ（薄灰色記号）もしくはＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡ（濃灰色記号）で処理した。  図５Ｅは、シクロフィリンＡ ｍＲＮＡレベルに正規化した、図４Ａ（Ｃ４−２、菱形）および４Ｂ（ＰＣ３、三角）に示した実験の終了時に採取した腫瘍におけるＴＲＰＶ３ ｍＲＮＡレベルを表す。腫瘍は、コントロール−ｓｉＲＮＡ（黒記号）、またはＴＲＰＶ３−ｓｉＲＮＡを（薄灰色記号）もしくはＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡ（濃灰色記号）で処理した。
【図５−２】図５Ｆは、図５Ａおよび図５Ｂに記載した実験の終了時に採取したＣ４−２（灰色バー）またはＰＣ３（黒色バー）腫瘍からの血管新生のホットスポットにおける微小血管密度（ＭＶＤ）の定量化を表す。  図５Ｇは、シクロフィリンＡ ｍＲＮＡレベルに正規化した、図４Ａ（Ｃ４−２、菱形）および４Ｂ（ＰＣ３、三角）に示した実験の終了時に採取した腫瘍におけるＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルを表す。腫瘍は、コントロール−ｓｉＲＮＡ（黒記号）、またはＴＲＰＶ３−ｓｉＲＮＡ（薄灰色記号）もしくはＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡ（濃灰色記号）で処理した。  図５Ｈは、ＰＢＳ（黒色バー）、あるいは、すべてＰＢＳで希釈した、ＴＬＲ３の既知のリガンド（濃灰色バー）である４０００μｇ/ｋｇのポリ（Ｉ：Ｃ）、またはＴＲＰＶ３ｂ−ｓｉＲＮＡ（薄灰色バー）もしくはＴＳＰ１ａ-ｓｉＲＮＡの（白色バー）のいずれかのｉ.ｐ.注射の５時間後に犠牲にしたヌードマウスにおける、表示した遺伝子のｍＲＮＡレベルを表す。シクロフィリンＡに正規化した、表示された遺伝子のｍＲＮＡレベルは、脾臓におけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。結果（平均値±ＳＥＭ、ｎ = ４）は任意の単位で表し、ＰＢＳコントロールの値を１に設定して正規化する。
【図６】図６Ａは、他のすべての処置以前に取得した、種々の臨床段階の凍結した根治的前立腺全摘除術のサンプル（ＰＴ２、ｐＴ３ａ、ｐＴ３ｂ/ｐＴ４）からの腫瘍周囲組織（Ｎ）および腫瘍組織（Ｔ）における、アクチンｍＲＮＡに正規化した、ＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルを表す。各ボックスプロットは、２５、５０（中央値）および７５パーセンタイルを示す、３本の水平線で構成されている。最高値および最低値は、エラーバーを使用して表示される。有意の場合にＰ値が表示されている。  図６Ｂは、手術後少なくとも３０ヶ月の間に腫瘍再発の証拠を示さなかった（ｎ = ８）または手術後にＰＳＡの再発（ｎ = １１）を経験した患者からのサンプルにおける、アクチンｍＲＮＡに正規化した、ＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルの比較を表す。
【実施例】
【００７８】
以下の実施例は、後述の実験手順に従って行われた。
【００７９】
試薬およびｓｉＲＮＡ
樟脳およびタプシガルギンはシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ)から購入した。ＴＳＰ１抗体（Ａｂ１、Ａｂ−４，Ａｂ−１１）は、Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ, Ｆｒｅｍｏｎｔ， Ｃａ, ＵＳＡ )から、ＴＲＰＶ３抗体は、ＴＥＢＵ(Ｌｅ Ｐｅｒｒａｙ ｅｎ Ｙｖｅｌｉｎｅｓ, Ｆｒａｎｃｅ)から、チューブリン（Ｔｕｂｕｌｉｎ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ(Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ, Ｆｒａｎｃｅ)から購入した。Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒヤギ抗ウサギ４８８およびＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒヤギ抗マウス５６８は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓから購入した。ｓｉＲＮＡは、シグマアルドリッチ（ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）(Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ, Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。使用した配列は補足表１に示す。
【００８０】
細胞株
細胞株ＬＮＣａＰは、ヒトアンドロゲン依存性前立腺細胞株である。これは、アンドロゲン受容体を発現し、その増殖はアンドロゲンに依存する。
細胞株Ｃ４−２および２２ＲＶ１は、ヒト去勢抵抗性前立腺腫瘍細胞株である。これらは、アンドロゲン受容体を発現するが、これらの増殖はもはやアンドロゲンに依存しない。
細胞株ＰＣ３は、ヒトアンドロゲン非依存性前立腺細胞株である。ＰＣ３細胞はもはやアンドロゲン受容体を発現しない。
【００８１】
細胞培養およびトランスフェクトション
ＬＮＣａＰおよびＣ４−２細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＲＭＰＩ中で、ＰＣ−３細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で増殖させた。 ＨｉＰｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）を、この製造元の推奨に従って使用し、２４ウェルプレートの細胞を表示のｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）でトランスフェクションした。代謝活性アッセイ(ＷＳＴ１, Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ, Ｍｅｙｌａｎ Ｆｒａｎｃｅ)を使用して、細胞増殖を測定した。低酸素状態を模倣するために、３００μＭ塩化コバルトの存在下で細胞を４８時間培養した。低酸素状態の条件では、細胞は、低酸素インキュベーター（Ｂｉｎｄｅｒ ＧｍｂＨ, Ｔｕｔｔｌｉｇｅｎ, Ｆｒａｎｃｅ）内で、３７℃で、５％ＣＯ2、９４％Ｎ2、および１％Ｏ2で培養した。
【００８２】
遊走アッセイ
遊走能力を、改良ボイデンチャンバーを用いて測定した。細胞（４０,０００）を、８μｍのＰＥＴ膜（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ, Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ, Ｆｒａｎｃｅ）により下室から分離されている細胞培養チャンバー−インサートシステムの上部におけるＲＰＭＩ １％ＦＢＳ中に播種した。ＲＰＭＩ １０％ＦＢＳまたは条件培地を下部コンパートメントに加えた。１８時間後、上部コンパートメントの非遊走細胞を綿棒を使ってこそげ取った。膜の下側の細胞を、−２０℃にてメタノールで固定し、ヘキスト３３２５８(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ, Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ, Ｆｒａｎｃｅ)で染色した。その後、膜を摘出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ（ＤＡＫＯ）でガラス面に取り付けて、細胞を計数した。
【００８３】
リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ、ｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの解析
全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ, Ｆｒａｎｃｅ)を用いて単離した。ＲＮＡを、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ, Ｆｒａｎｃｅ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡを、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ, Ｆｒａｎｃｅ)を用いてリアルタイムＰＣＲにより定量した。ヒトシクロフィリンＡを内部対照として使用した。ＰＣＲプライマーの配列を補足表２に示す。
【００８４】
ＥＬＩＳＡ
細胞ホモジネートおよび上清中のＴＳＰ１およびＶＥＧＦタンパク質の含有量を、ＥＬＩＳＡ (Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ, Ｒ＆Ｄ, Ｌｉｌｌｅ, Ｆｒａｎｃｅ)で測定した。
【００８５】
カルシウムイメージング
蛍光イメージングは、１４２ｍＭ ＮａＣｌ、５.６ｍＭ ＫＣｌ、１ ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2、０.３４ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０.４４ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および５.６ｍＭ グルコースを含むハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中にて実施した。細胞質カルシウム濃度は、前述した通り（Ｍａｒｉｏｔら、２００２）、Ｆｕｒａ−２を添加した細胞（２μＭ）を用いて測定した。細胞内カルシウム濃度は、励起波長のそれぞれの蛍光強度の比（Ｆ３４０/Ｆ３８０）およびＧｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚの方程式（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、１９８５）から導いた。
【００８６】
動物、ｓｉＲＮＡの注入、および腫瘍形成アッセイ
動物を用いる研究は、ハウジングおよび世話、安楽死の方法、ならびに実験プロトコルを含めて、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ａｎｄｒe Ｌｗｏｆｆ ｉｎ Ｖｉｌｌｅjｕｉｆ, Ｆｒａｎｃｅ内地元の動物倫理委員会に準拠して実施した。腫瘍細胞（２×１０6細胞/マウス）を、５０％（ｖ：ｖ）マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ、Ｆｒａｎｃｅ）で６−８週齢の雄ヌードマウスに皮下注射し、毎日測定した。腫瘍が指数関数的に増殖した時、ＰＢＳで希釈したｓｉＲＮＡを、毎日ｉ．ｐ．注入した（１２０μｇ/ｋｇ）。腫瘍体積は、次式を用いて概算した：長さ×幅2×０.５。
【００８７】
被験者
前立腺組織サンプルは、Ｃｅｎｔｒｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ Ｌｙｏｎ Ｓｕｄ (Ｌｙｏｎ, Ｆｒａｎｃｅ)で根治的前立腺全摘除術を施行した１４人の患者およびＣｏｃｈｉｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ (Ｐａｒｉｓ, Ｆｒａｎｃｅ)の１２人から得た。各患者からは書面による同意を得た。前立腺の除去直後に、組織の小片は病理医により肉眼解剖され、瞬間凍結され、分析まで液体窒素中でｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ Ｌｙｏｎ Ｓｕｄ および ｔｈｅ ｇｒｏｕｐｅ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ Ｃｏｃｈｉｎ−Ｓａｉｎｔ Ｖｉｎｃｅｎｔ ｄｅ Ｐａｕｌの腫瘍バンクに保存した。凍結切片の組織学的解析は、ＲＮＡ抽出前に、同一病理学者により各サンプルに対して実施された。完全に癌腺から構成されたフラグメントを選択して「腫瘍」サンプルと命名し、癌組織が含まれていないものを選択して「腫瘍周辺組織」と命名した。
【００８８】
実施例１：ＴＳＰ１の発現は、ホルモン不応性癌の前立腺細胞で増加している
ＴＳＰ１プロモーターは, アンドロゲン依存性前立腺細胞株ＬＮＣａＰにおいてメチル化され（Ｌｉら、１９９９）、従って、ＴＳＰ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルは、これらの細胞で非常に低い（図１Ａおよび図１Ｂ）。興味深いことに、持続的なＴＳＰ１発現は、去勢後のマウス に再発するＬＮＣａＰ腫瘍から樹立されたＣ４−２細胞において見出された（Ｔｈａｌｍａｎｎら，１９９４）。ＴＳＰ１は、去勢抵抗性前立腺腫瘍細胞株Ｒ２２ＲＶ１（Ｓｒａｍｋｏｓｋｉ ら，１９９９）およびアンドロゲン非依存性細胞株ＰＣ３における、ｍＲＮＡ（図１Ａ）およびタンパク質（図１Ｂ）レベルでの発現も認められた。前立腺癌細胞におけるＴＳＰ１の機能を研究するために、最初のｓｉＲＮＡは、マウスとヒトとの配列に完全に保存された配列を標的とするように設計され（ＴＳＰ１ａ−ｓｉＲＮＡ）、二番目のｓｉＲＮＡは、特定的にヒトのｍＲＮＡを標的にするよう設計された（ＴＳＰ１ｂ−ｓｉＲＮＡ）。Ｃ４−２細胞では、この２種類のｓｉＲＮＡは、細胞増殖（図１Ｅ）またはアポトーシス（図１Ｆ）に影響せずに、ｍＲＮＡ発現（図１Ｃ）およびタンパク質レベル（図１Ｄ）で７０％以上ＴＳＰ１発現をサイレンスした。
【００８９】
実施例２：ＴＳＰ１は、前立腺腫瘍細胞の遊走を刺激する。
ボイデンチャンバーを使用して、前立腺腫瘍細胞の遊走に対するＴＳＰ１の可能性のある役割を研究した。ＴＳＰ１サイレンシングは、Ｃ４−２細胞の遊走を強く阻害した（図１Ｇ）。この効果は、ＰＣ３細胞の遊走もＴＳＰ１サイレンシング（図１Ｇ）によって強く影響されたため、アンドロゲン受容体の発現に依存しなかった。逆に、ＴＳＰ１を発現しないＬＮＣａＰ細胞の遊走が、細胞がＣ４−２細胞条件培地（図１Ｈ）に向かって遊走したときに、刺激された。前立腺腫瘍細胞の遊走についてのＴＳＰ１の役割をさらに立証するために、ＴＳＰ１の産生がテトラサイクリン抑制性プロモーターの制御下にある細胞株である、ＪＴ８を用いた（Ｆｉｌｌｅｕｒら、２００１）。ＪＴ８細胞の条件培地を、ＴＳＰ１発現を阻害するためにドキシサイクリンの存在下で、またはＴＳＰ１発現を誘導するためにその不存在下で調製した（図１Ｉ）。そして、これら二つの培地に向かうＣ４−２細胞の遊走を測定した。ＴＳＰ１の存在は、細胞が遊走する能力を強く増大させた（図１Ｊ）。
【００９０】
ＴＳＰ１の活性は、いくつかの種類の受容体、特にサブユニットβ１またはβ３を含むインテグリン、およびＣＤ３６レセプターによって媒介される。ＴＳＰ１のＣＤ３６との結合が、ＴＳＰ１の抗血管新生作用を媒介することが示されている。本発明においては、特定のｓｉＲＮＡはそれぞれＣＤ３６、β１およびβ３インテグリンを標的にするよう設計された。β１のサイレンシングは、Ｃ４−２細胞の遊走特性に影響を与えなかった（図１Ｋ）。対照的に、ＣＤ３６またはβ３をサイレンシングすると、ボイデンアッセイにおけるＣ４−２の遊走を強く減少させた（図１Ｋ）。さらに、ＴＳＰ１のＣＤ３６受容体との結合を阻害するＴＳＰ１抗体（ＴＳＰ１ Ａｂ１、クローンＡ４.１）はＣ４−２細胞の遊走を妨げ（図１Ｌ）、ＴＳＰ１のＣＤ３６との結合が、ＴＳＰ１の抗血管新生効果および遊走を誘導する能力を媒介することを実証している。
上記の結果は、ＴＳＰ１が、およびＰＣ３細胞において、ＬＮＣａＰ細胞におけるよりも、はるかに高いレベル（ｍＲＮＡおよびタンパク質）で発現されていることを示す。１０ｎＭのＴＳＰ１ａ−ｓｉＲＮＡまたはＴＳＰ１ｂ-ｓｉＲＮＡによるＣ４−２細胞のトランスフェクションは、細胞増殖に影響を与えずに（図１Ｅ）、ＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベル（図１Ｃ）およびタンパク質レベル（図１Ｄ）を著しく減少させる。
【００９１】
実施例３：ＴＳＰ１の発現および分泌は前立腺腫瘍細胞内のカルシウムによって調節されている。
ＴＳＰ１はカルシウム結合ドメインを含み、またカルシウムはＴＳＰ１のフォールディングに影響を及ぼす（Ａｄａｍｓ，２００４）。問題は、前立腺腫瘍細胞の細胞質内カルシウム濃度の増加が、ＴＳＰ１の発現および/または分泌を調節することができるかどうかである。この目的のために、ＳＥＲＣＡポンプの阻害剤であって、細胞内カルシウム濃度（Ｃａ+ + i）を増加させるタプシガルギンでＣ４−２細胞を処理した。タプシガルギンによる２時間の処理で、細胞質ゾルからＴＳＰ１が急速に消失し（図２Ａ）、培地中に分泌する結果になった（図２Ｂ）。カルシウムチャネルであるＴＲＰＶ２（Ｍｏｎｅｔら、２０１０）、ＴＲＰＶ６（Ｆｉｘｅｍｅｒら、２００３）、ＴＲＰＭ８（図２Ｊ）、およびＴＲＰＶ３（図２Ｆおよび２Ｇ）は、前立腺腫瘍細胞において発現されている。樟脳は、既知のＴＲＰＶ３チャネルのアゴニストであり（Ｍｏｑｒｉｃｈら、２００５；Ｖｏｇｔ−Ｅｉｓｅｌｅら、２００７）、同様にＴＳＰ１分泌を刺激した（図２Ｃおよび２Ｄ）。さらに、樟脳による６時間の処理は、用量に依存してＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルの増加を誘導した（図２Ｅ）。これらの結果から、カルシウムが前立腺腫瘍細胞におけるＴＳＰ１のｍＲＮＡレベルおよび分泌の両方を調節することが立証される。
【００９２】
実施例４：前立腺腫瘍細胞におけるＴＲＰチャネルの発現およびＴＳＰ１の調節。
２つのＴＲＰチャネルである、ＴＲＰＭ８およびＴＲＰＶ３の発現を前立腺細胞株において分析した。ＴＲＰＭ８はＬＮＣａＰおよびＣ４−２細胞では発現したが、２２ＲＶ１では検出不能であり、ＰＣ３細胞においてのみ非常に低いレベルで発現した（図２Ｆ）。対照的に、ＴＲＰＶ３は、アンドロゲン非依存性ＰＣ３細胞を含む、これらの４つの前立腺細胞株のすべてにおいて発現した（図２Ｆ）。ＴＲＰＶ３ ｍＲＮＡは、その親のアンドロゲン依存性細胞株ＬＮＣａＰに比べて、去勢抵抗性細胞株Ｃ４−２においてアップレギュレートされた。しかし、発明の結果は、タンパク質レベルでは、ＴＲＰＶ３がＬＮＣａＰ細胞で強く発現されることを明確に示す（図２Ｇ）。そして、ＴＲＰチャネルの発現がＴＳＰ１発現を調節できるかどうかを分析した。ＴＲＰＶ３をサイレンスすると、ＴＳＰ１タンパク質発現が減少した（図２Ｈ）。ＴＲＰファミリーの少なくとも４種のチャンネル、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ６、およびＴＲＰＭ８は、これらのサイレンシングがＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルを減少させたので、ＴＳＰ１を刺激する（図２Ｉ）。対照的に、ＴＲＰＣ４およびＴＲＰＣ６はＴＳＰ１を抑制し、それらのサイレンシングは、Ｃ４−２細胞（図２Ｉ、２Ｊ）におけるそのｍＲＮＡレベルを増加させた。ＴＲＰＣ１、ＴＲＰＣ３、またはＯＲＡＩはＴＳＰ１発現に有意な影響を与えなかった（図２Ｉ）。
【００９３】
実施例５：ＴＲＰＶ３チャネルは前立腺癌細胞の遊走の制御に関与している
遊走についてのＴＲＰカルシウムチャネルの可能性のある役割を探求するため、ＴＲＰＶ３が前立腺癌細胞でよく発現することから、このチャネルに注目したが、チャネルのアンドロゲンへの依存度がどうあっても、また、ＴＲＰＭ８とは対照的に、ＴＲＰＶ３のサイレンシングが細胞増殖に影響を与えないためであって（図３Ａ）、これは、遊走アッセイの解釈を偏らせ得る表現型である。ＴＲＰＶ３のサイレンシングは、Ｃ４−２およびＰＣ３細胞における細胞遊走で大規模な阻害を引き起こした（図３Ｂ）。対照的に、ＴＲＰＣ４またはＴＲＰＣ６を標的にしたｓｉＲＮＡは、Ｃ４−２細胞の遊走を刺激した（図３Ｃ）。すべて纏めると、これらの結果は、遊走に関するＴＲＰチャネルの影響がＴＳＰ１によって媒介される可能性を示唆する。
【００９４】
実施例６：ＴＲＰＶ３の細胞遊走への影響はＴＳＰ１によって媒介される
細胞遊走におけるＴＳＰ１およびＴＲＰＶ３のそれぞれの役割をさらに調べるために、ボイデンチャンバーの下部にて培養したＣ４−２細胞を、コントロール−またはＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクションした。三日後、ＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞の条件培地中のＴＳＰ１濃度が著しく減少した（図３Ｄ）。我々は、その後、３日前にコントロール−、ＴＳＰ１−、またはＴＲＰＶ３-ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＣ４−２細胞をチャンバーの上部に加えた。コントロール条件（上部および下部チャンバー内においてコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞）に比して、２つのコンパートメントで同時にＴＳＰ１をサイレンシングすると、遊走を７０％減少させた（図３Ｅ）。興味深いことに、ＴＳＰ１を、上部または下部のいずれか一つのコンパートメントでサイレンシングさせると、遊走能力は部分的に減少しただけであって、遊走効果は分泌タンパク質によって媒介されていることを実証している（図３Ｅ）。
上部コンパートメントでＴＲＰＶ３をサイレンシングさせることで、ＴＳＰ１が枯渇した培地に向かって遊走するＣ４−２細胞の遊走は、大幅に抑制された。 しかし重要なのは、この阻害は、ＴＳＰ１がボイデンチャンバーの下部に存在していた時には、完全に失われたことである（図３Ｅ）。この結果は、細胞遊走のＴＲＰＶ３による刺激が分泌したＴＳＰ１によって媒介されていることを実証する。
【００９５】
実施例７：低酸素状態は、ＴＲＰＶ３およびＴＳＰ１の発現を誘導し、[Ｃａ+ +]iを増加させる
低酸素条件に対する抵抗は、進行腫瘍の一般的な特徴である。ＴＳＰ１およびＴＲＰＶ３ ｍＲＮＡレベル、ならびに細胞内カルシウム濃度を、低酸素条件下のＣ４−２細胞で分析した。Ｈｉｆ１ａおよびＨｉｆ２ａタンパク質の安定化を誘導し（Ｙｕａｎら、２００３）、また低酸素状態の効果を模倣する３００μＭ 塩化コバルトによる４８時間処理は、ＴＲＰＶ３およびＴＳＰ１の ｍＲＮＡレベルを強く誘導した（図４Ａ）。
細胞内カルシウム濃度は、コントロール条件または塩化コバルトの存在下で増殖させたＣ４−２細胞において測定した。３０分後に変化のなかった静止レベルは、塩化コバルトの存在下で４８時間培養した細胞では２倍以上増加した（図４Ｂ）。
【００９６】
ＴＳＰ１は、ヒト線維芽細胞および血管平滑筋細胞において低酸素状態によって誘導される(Ｄｉｓｔｌｅｒら, ２００７; Ｆａｖｉｅｒら, ２００５; Ｍａｙｕｋｏ Ｏｓａｄａ−Ｏｋａ, ２００８)。これは前立腺腫瘍細胞でもそうであるかどうかを分析するために、Ｃ４−２細胞を１％または２０％酸素中で増殖させ、ＶＥＧＦおよびＴＳＰ１の発現を、最大７２時間まで異なる時点で比較した。ＶＥＧＦおよびＴＳＰ１のｍＲＮＡの両方の時間依存的な増加が、低酸素状態下で、ｍＲＮＡ（図４Ｃ）およびタンパク質レベル（図４Ｄ）で観察された。低酸素状態への曝露の２時間後、直ちに、ＴＳＰ１タンパク質の分泌が誘導された（図４Ｅ）。ＴＲＰＶ３およびＨｉｆ１アルファタンパク質もまた、時間依存的に低酸素状態により誘導された（図４Ｆ）。同様に、低酸素状態の効果を模倣するＣｏＣｌ2へＰＣ３細胞を暴露させると、ｍＲＮＡ（図４Ｇ）とタンパク質レベル（図４Ｈ）でのＴＳＰ１発現が誘導された。
【００９７】
実施例８：ＴＲＰＶ３またはＴＳＰ１のインビボでのサイレンシングにより、去勢抵抗性またはアンドロゲン非依存性前立腺腫瘍の増殖が阻害される。
本発明のインビトロのデータは、細胞の増殖または生存に影響を与えることなく、Ｃ４−２またはＰＣ３細胞の遊走が、ＴＲＰＶ３またはＴＳＰの１サイレンシングによって強く損なわれることを立証するものである。インビボでのＴＳＰ１およびＴＲＰＶ３の役割を探求するために、Ｃ４−２細胞をヌードマウスに異種移植した。腫瘍が指数関数的に増殖しはじめた時に、マウスは、処置用に無作為化され、毎日、ＰＢＳのｉ．ｐ．注射、あるいはＰＢＳで希釈した１２０μｇ／ｋｇのコントロール−または、ＴＳＰ１−、もしくはＴＲＰＶ３−ｓｉＲＮＡのいずれかのｉ．ｐ．注射を受けた。ＴＳＰ１−またはＴＲＰＶ３−ｓｉＲＮＡで処理したマウスの腫瘍の増殖は著しく阻害された（図５Ａ）。同様に、ＴＲＰＶ３およびＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡは両方とも、異種移植したＰＣ３腫瘍の増殖を抑制した（図５Ｂ）。
【００９８】
図５Ｂに示した実験の終了時に採取したコントロールのＰＣ３腫瘍では、ＴＲＰＶ３とＴＳＰ１とのｍＲＮＡレベルの間で高い相関性（ｒ2＝０．８３）が見られた（図５Ｃ）。コントロールと比較して、ＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡによる処理は、ＰＣ３腫瘍におけるＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルを有意に減少させた（図５Ｃ）。注目すべきは、ＴＲＰＶ３をサイレンシングすると、ＴＲＰＶ３ ｍＲＮＡレベルの減少のみならずＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルを減少させた（図５Ｃ）。これらのデータは、インビトロのようにインビボでは、ＴＲＰＶ３はＴＳＰ１発現を調節することを確認している。
Ｃ４−２腫瘍では、ＴＲＰＶ３−またはＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡによる処理によって、対応する標的ｍＲＮＡレベルが、コントロールと比較して、有意に減少された（図５Ｄ、５Ｅ）。
【００９９】
実施例９：ＴＳＰ１は去勢抵抗性腫瘍において抗血管新生特性をなお発揮している
ＴＳＰ１−またはＴＲＰＶ３−ｉＲＮＡで処置したＣ４−２およびＰＣ３腫瘍は、より小さくなり高度に壊死していたが（図５Ｆ）、非壊死領域でのそれらの微小血管の血液の密度（ＭＶＤ）はコントロールよりも有意に高かったので、ＴＳＰ１は、ＣＲＣａＰおよびＡＩＣａＰ腫瘍において血管新生をなお抑制したことを示している。ＭＶＤの増加は、ＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡで処理した腫瘍におけるＶＥＧＦの発現低下と並行しており（図５Ｇ）、低酸素状態の低下を示している。この結果で、ＴＳＰ１は、Ｃ４−２およびＰＣ３腫瘍において抗血管新生特性をなお発揮していることが立証される。
【０１００】
実施例１０：インターフェロンまたは炎症性サイトカインの発現誘導の欠如。
インビボで観察された抗腫瘍効果は非特異的免疫応答に関連していなかったことを確認するために、マウスに、腹腔内経路で一回注射によりＴＳＰ１ａ−ｓｉＲＮＡもしくはＴＲＰＶ３ｂ−ｓｉＲＮＡ、または、ポジティブコントロールとして使用した、ＴＬＲ３の既知リガンドであるポリ（Ｉ：Ｃ）を投与した。すべての注射は、ＰＢＳで希釈したｓｉＲＮＡを４ｍｇ/ｋｇの用量で実施した。注射から５時間後、自然免疫応反応または炎症に関与するいくつかの遺伝子をコードするｍＲＮＡを、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＴで定量した。ポリ（Ｉ：Ｃ）による処置のみが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＩＬ６、ＩＬ１２ｂ、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、およびＩＰ１０の有意な増加を誘導するが、ＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡもＴＲＰＶ３−ｓｉＲＮＡも同一量の、腫瘍実験で使用されているより３３倍高い用量で、これらのＴＬＲおよびサイトカインを誘導しなかった（図５Ｈ）。これらの結果は、インビボでのＴＳＰ１−ｓｉＲＮＡまたはＴＲＰＶ３−ｓｉＲＮＡの注射によって観察された抗腫瘍効果は、自然免疫の刺激によって起こり得るものではないことを立証している。
【０１０１】
実施例１１：ＴＳＰ１発現は病理学的ステージおよび根治的前立腺切除後の癌の再発に関連する。
ＴＳＰ１ ｍＲＮＡ発現は、手術前に放射線療法および/またはホルモン除去の治療を受けていない、臨床的に限局性前立腺癌の患者からの２６個の冷凍された根治的前立腺全摘除術標本で検討した。腫瘍および腫瘍周辺組織を対として１８検体で分析した。平均ＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルは、腫瘍に比べて腫瘍周辺組織で有意に高かったので（表１）、ＴＳＰ１の発現は未治療のアンドロゲン依存性腫瘍において抑制されていることを確認した。
腫瘍または腫瘍周囲のＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルと、患者の年齢、グリーソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）スコアまたは手術前の血清ＰＳＡレベルとの間に有意な関連はなかった（表１）。腫瘍組織では、ＴＳＰ１のｍＲＮＡレベルは、局所進行前立腺癌（ｐＴ３）患者に比べて、限局性疾患（ｐＴ２）患者で有意に低かった（表１および図６Ａ）。腫瘍周辺組織においては、その差は統計的に有意ではなかったが、より高いステージの疾患の患者では、ＴＳＰ１のｍＲＮＡレベルがより高くなる傾向がある。
【０１０２】
この研究に含まれた２６人の患者のうち、１１人はＰＳＡ再発を経験したが、８人は、手術後少なくとも３０ヶ月間追跡調査したが、腫瘍の再発の証拠を示さなかった。根治的前立腺全摘除術時に腫瘍および腫瘍周辺組織で測定したＴＳＰ１ ｍＲＮＡレベルは、有意にＰＳＡ再発と関連していた（表１および図６Ｂ）。
【０１０３】
【表２】
2013500709.tif 000003
【０１０４】
【表３−１】
2013500709.tif 000004
【０１０５】
【表３−２】
2013500709.tif 000005
【０１０６】
【表３−３】
2013500709.tif 000006
【０１０７】
【表３−４】
2013500709.tif 000007
【０１０８】
【表３−５】
2013500709.tif 000008
【図１−１】
2013500709.tif 000009
【図１−２】
2013500709.tif 000010
【図２】
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【図３】
2013500709.tif 000012
【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
2013500709.tif 000015
【図５−２】
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【図６】
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【配列表】
2013500709000001.app
【国際調査報告】
2013500709.tif 000018
2013500709.tif 000019
2013500709.tif 000020
2013500709.tif 000021
2013500709.tif 000022
2013500709.tif 000023
2013500709.tif 000024