(57)【要約】  本発明は、ホスト細胞のmTORに関する酵素の調節因子を用いて、ウイルス感染を治療又は防止する方法及び組成物を提供する。また、本発明は、ホスト細胞のmTORに関する酵素の調節因子及び小胞体ストレス応答(unfolded protein response)の調節因子を使用して、ウイルス感染を治療又は防止する方法及び組成物にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類におけるウイルス感染を治療又は防止する方法であり、治療有効量の、mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤である化合物、又はそのプロドラッグ、又はそれらの薬剤若しくはプロドラッグの医薬として許容される塩若しくはエステルを、これを必要とする哺乳類の対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記化合物が、式I
【化１】
2013500265.tif 000025
［式中、
R1は、6-10員アリール；C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12ヘテロ脂肪族(heteroaliphatic); C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-4のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール;並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-2のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環;からなる群から選択される任意で置換された基であり、
それぞれの場合に、R2は、独立して、ハロゲン、-NR2、-OR、-SR、又はC1-12アシル; 6-10-員アリール; C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12ヘテロ脂肪族; C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-4のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール；並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-2のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環；からなる群から選択される任意で置換された基であり；jは1〜4の整数であり；
R3及びR4は、独立して、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロゲン、又は任意で置換されたC1-6脂肪族であり、但しR3及びR4は一緒に環を形成せず；そして各Rは独立して、水素、C1-12アシル; 6-10-員アリール; C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環;並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有するC1-12ヘテロ脂肪族;からなる群から選択される任意で置換された基であり；又は
同一の窒素原子上の2つのRが、その窒素と一緒に、窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環を形成する]
の化合物である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、式II：
【化２】
2013500265.tif 000026
［式中、
X5、X6及びX8の1つ又は2つがNであり、それ以外はCHであり；
R7は、ハロ、ORO1、SRS1、NRN1RN2、NRN7aC(=O)Rα、NRN7bSO2RS2a、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、ここで、R01及びRS1は、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN1及びRN2は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN1及びRN2は、それらが結合する窒素と一緒になって3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；RC1は、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC1-7アルキル基、又はNRN8RN9から選択され、ここでRN8及びRN9は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN8及びRN9は、それらが結合する窒素と一緒になって3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；RS2aは、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN7a及びRN7bは、H及びC1-4アルキル基から選択され；
RN3及びRN4は、それらが結合する窒素と一緒になって、3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Rzは、H、ハロ、ORO2、SRS2b、NRN5RN6、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、及び任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、ここでR02及びRS2bは、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN5及びRN6は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN5及びRN6は、それらが結合する窒素と一緒になって、3〜8個の環原子を有するヘテロ環を形成する］
の化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
式III又は式IV：
【化３】
2013500265.tif 000027
［式中、
nは、1〜5の整数であり；zは1〜2の整数であり；
R1、R3、及びR4は、独立して、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールであり；
R2及びR6は、独立して、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、-OR5、-NH2、-SO2、-COOH、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールであり；かつ
R5は、独立して、水素、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールである］
の化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
式IIの化合物がKu-0063794である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
式IIIの化合物がPP30である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
式IVの化合物がPP242である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物がmTORC1の阻害剤である、請求項２〜４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物がmTORC2の阻害剤である、請求項２〜４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルス感染がヘルペスウイルスによるものである、請求項２〜４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルス感染が、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトヘルペスウイルス6変異体A、ヒトヘルペスウイルス6変異体B、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8、及びケルコピテキン(cercopithecine)ヘルペスウイルス1からなる群から選択されるヘルペスウイルスによるものである、請求項２〜４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
更に、小胞体ストレス応答(unfolded protein response)の阻害剤を哺乳類の対象に投与する工程を含む、請求項２〜４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記小胞体ストレス応答の阻害剤が、4-フェニルブチレートである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記小胞体ストレス応答の阻害剤が、タウロウルソデオキシコール酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルス感染を治療又は防止するための医薬組成物であり、(i)化合物、若しくはそのプロドラッグ、又は当該化合物若しくはプロドラッグの医薬として許容される塩；及び(ii)医薬として許容される担体を含有し、ここで当該化合物が、mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤である、治療有効量の組成物を含有する、前記組成物。
【請求項１６】
前記化合物が、式I
【化４】
2013500265.tif 000028
［式中、
R1は、6-10員アリール；C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12ヘテロ脂肪族(heteroaliphatic); C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-4のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール;並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-2のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環;からなる群から選択される任意で置換された基であり、
それぞれの場合に、R2は、独立して、ハロゲン、-NR2、-OR、-SR、又はC1-12アシル; 6-10-員アリール; C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12ヘテロ脂肪族; C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-4のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール；並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-2のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環；からなる群から選択される任意で置換された基であり；jは1〜4の整数であり；
R3及びR4は、独立して、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロゲン、又は任意で置換されたC1-6脂肪族であり、但しR3及びR4は一緒に環を形成せず；そして各Rは独立して、水素、C1-12アシル; 6-10-員アリール; C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環;並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有するC1-12ヘテロ脂肪族;からなる群から選択される任意で置換された基であり；又は
同一の窒素原子上の2つのRが、その窒素と一緒に、窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環を形成する]
の化合物である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記化合物が、式II：
【化５】
2013500265.tif 000029
［式中、
X5、X6及びX8の1つ又は2つがNであり、それ以外はCHであり；
R7は、ハロ、ORO1、SRS1、NRN1RN2、NRN7aC(=O)Rα、NRN7bSO2RS2a、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、ここで、R01及びRS1は、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN1及びRN2は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN1及びRN2は、それらが結合する窒素と一緒になって3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；RC1は、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC1-7アルキル基、又はNRN8RN9から選択され、ここでRN8及びRN9は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN8及びRN9は、それらが結合する窒素と一緒になって3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；RS2aは、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN7a及びRN7bは、H及びC1-4アルキル基から選択され；
RN3及びRN4は、それらが結合する窒素と一緒になって、3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Rzは、H、ハロ、ORO2、SRS2b、NRN5RN6、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、及び任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、ここでR02及びRS2bは、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN5及びRN6は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN5及びRN6は、それらが結合する窒素と一緒になって、3〜8個の環原子を有するヘテロ環を形成する］
の化合物である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記化合物が、式III又は式IV：
【化６】
2013500265.tif 000030
［式中、
nは、1〜5の整数であり；zは1〜2の整数であり；
R1、R3、及びR4は、独立して、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールであり；
R2及びR6は、独立して、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、-OR5、-NH2、-SO2、-COOH、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールであり；かつ
R5は、独立して、水素、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールである］
の化合物である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
式IIの化合物がKu-0063794である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
式IIIの化合物がPP30である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
式IVの化合物がPP242である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記化合物がmTORC1の阻害剤である、請求項１６〜１８のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記化合物がmTORC2の阻害剤である、請求項１６〜１８のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ウイルス感染がヘルペスウイルスによるものである、請求項１６〜１８のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記ウイルス感染が、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトヘルペスウイルス6変異体A、ヒトヘルペスウイルス6変異体B、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8、及びケルコピテキン(cercopithecine)ヘルペスウイルス1からなる群から選択されるヘルペスウイルスによるものである、請求項１６〜１８のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
更に、哺乳類の対象への投与において、小胞体ストレス応答(unfolded protein response)の阻害剤と併用される、請求項１６〜１８のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記小胞体ストレス応答の阻害剤が、4-フェニルブチレートである、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記小胞体ストレス応答の阻害剤が、タウロウルソデオキシコール酸である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該化合物若しくはそのプロドラッグの医薬として許容される塩の使用であり、当該化合物が、mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤である、ウイルス感染を治療又は防止するための医薬の製造における、前記使用。
【請求項３０】
前記化合物が、式I
【化７】
2013500265.tif 000031
［式中、
R1は、6-10員アリール；C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12ヘテロ脂肪族(heteroaliphatic); C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-4のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール;並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-2のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環;からなる群から選択される任意で置換された基であり、
それぞれの場合に、R2は、独立して、ハロゲン、-NR2、-OR、-SR、又はC1-12アシル; 6-10-員アリール; C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12ヘテロ脂肪族; C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-4のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール；並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-2のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環；からなる群から選択される任意で置換された基であり；jは1〜4の整数であり；
R3及びR4は、独立して、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロゲン、又は任意で置換されたC1-6脂肪族であり、但しR3及びR4は一緒に環を形成せず；そして各Rは独立して、水素、C1-12アシル; 6-10-員アリール; C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環;並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有するC1-12ヘテロ脂肪族;からなる群から選択される任意で置換された基であり；又は
同一の窒素原子上の2つのRが、その窒素と一緒に、窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環を形成する]
の化合物である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記化合物が、式II：
【化８】
2013500265.tif 000032
［式中、
X5、X6及びX8の1つ又は2つがNであり、それ以外はCHであり；
R7は、ハロ、ORO1、SRS1、NRN1RN2、NRN7aC(=O)Rα、NRN7bSO2RS2a、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、ここで、R01及びRS1は、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN1及びRN2は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN1及びRN2は、それらが結合する窒素と一緒になって3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；RC1は、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC1-7アルキル基、又はNRN8RN9から選択され、ここでRN8及びRN9は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN8及びRN9は、それらが結合する窒素と一緒になって3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；RS2aは、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN7a及びRN7bは、H及びC1-4アルキル基から選択され；
RN3及びRN4は、それらが結合する窒素と一緒になって、3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Rzは、H、ハロ、ORO2、SRS2b、NRN5RN6、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、及び任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、ここでR02及びRS2bは、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN5及びRN6は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN5及びRN6は、それらが結合する窒素と一緒になって、3〜8個の環原子を有するヘテロ環を形成する］
の化合物である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
前記化合物が、式III又は式IV：
【化９】
2013500265.tif 000033
［式中、
nは、1〜5の整数であり；zは1〜2の整数であり；
R1、R3、及びR4は、独立して、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールであり；
R2及びR6は、独立して、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、-OR5、-NH2、-SO2、-COOH、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールであり；かつ
R5は、独立して、水素、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールである］
の化合物である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３３】
式IIの化合物がKu-0063794である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
式IIIの化合物がPP30である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３５】
式IVの化合物がPP242である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３６】
前記化合物がmTORC1の阻害剤である、請求項３０〜３２のいずれか1項に記載の使用。
【請求項３７】
前記化合物がmTORC2の阻害剤である、請求項３０〜３２のいずれか1項に記載の使用。
【請求項３８】
前記ウイルス感染がヘルペスウイルスによるものである、請求項３０〜３２のいずれか1項に記載の使用。
【請求項３９】
前記ウイルス感染が、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトヘルペスウイルス6変異体A、ヒトヘルペスウイルス6変異体B、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8、及びケルコピテキン(cercopithecine)ヘルペスウイルス1からなる群から選択されるヘルペスウイルスによるものである、請求項３０〜３２のいずれか1項に記載の使用。
【請求項４０】
更に、小胞体ストレス応答(unfolded protein response)の阻害剤を哺乳類の対象に投与する工程を含む、請求項３０〜３２のいずれか1項に記載の使用。
【請求項４１】
前記小胞体ストレス応答の阻害剤が、4-フェニルブチレートである、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
前記小胞体ストレス応答の阻害剤が、タウロウルソデオキシコール酸である、請求項４０に記載の使用。
【請求項４３】
哺乳類におけるウイルス感染を治療又は予防するために使用される、mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤である、化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該化合物若しくはそのプロドラッグの医薬として許容される塩。
【請求項４４】
前記化合物が、式I
【化１０】
2013500265.tif 000034
［式中、
R1は、6-10員アリール；C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12ヘテロ脂肪族(heteroaliphatic); C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-4のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール;並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-2のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環;からなる群から選択される任意で置換された基であり、
それぞれの場合に、R2は、独立して、ハロゲン、-NR2、-OR、-SR、又はC1-12アシル; 6-10-員アリール; C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12ヘテロ脂肪族; C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-4のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール；並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-2のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環；からなる群から選択される任意で置換された基であり；jは1〜4の整数であり；
R3及びR4は、独立して、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロゲン、又は任意で置換されたC1-6脂肪族であり、但しR3及びR4は一緒に環を形成せず；そして各Rは独立して、水素、C1-12アシル; 6-10-員アリール; C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環;並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有するC1-12ヘテロ脂肪族;からなる群から選択される任意で置換された基であり；又は
同一の窒素原子上の2つのRが、その窒素と一緒に、窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環を形成する]
の化合物である、請求項４３に記載の化合物。
【請求項４５】
前記化合物が、式II：
【化１１】
2013500265.tif 000035
［式中、
X5、X6及びX8の1つ又は2つがNであり、それ以外はCHであり；
R7は、ハロ、ORO1、SRS1、NRN1RN2、NRN7aC(=O)Rα、NRN7bSO2RS2a、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、ここで、R01及びRS1は、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN1及びRN2は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN1及びRN2は、それらが結合する窒素と一緒になって3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；RC1は、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC1-7アルキル基、又はNRN8RN9から選択され、ここでRN8及びRN9は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN8及びRN9は、それらが結合する窒素と一緒になって3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；RS2aは、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN7a及びRN7bは、H及びC1-4アルキル基から選択され；
RN3及びRN4は、それらが結合する窒素と一緒になって、3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Rzは、H、ハロ、ORO2、SRS2b、NRN5RN6、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、及び任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、ここでR02及びRS2bは、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN5及びRN6は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN5及びRN6は、それらが結合する窒素と一緒になって、3〜8個の環原子を有するヘテロ環を形成する］
の化合物である、請求項４３に記載の化合物。
【請求項４６】
前記化合物が、式III又は式IV：
【化１２】
2013500265.tif 000036
［式中、
nは、1〜5の整数であり；zは1〜2の整数であり；
R1、R3、及びR4は、独立して、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールであり；
R2及びR6は、独立して、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、-OR5、-NH2、-SO2、-COOH、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールであり；かつ
R5は、独立して、水素、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールである］
の化合物である、請求項４３に記載の化合物。
【請求項４７】
式IIの化合物がKu-0063794である、請求項４５に記載の化合物。
【請求項４８】
式IIIの化合物がPP30である、請求項４６に記載の化合物。
【請求項４９】
式IVの化合物がPP242である、請求項４６に記載の化合物。
【請求項５０】
前記化合物がmTORC1の阻害剤である、請求項４４〜４６のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項５１】
前記化合物がmTORC2の阻害剤である、請求項４４〜４６のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項５２】
前記ウイルス感染がヘルペスウイルスによるものである、請求項４４〜４６のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項５３】
前記ウイルス感染が、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトヘルペスウイルス6変異体A、ヒトヘルペスウイルス6変異体B、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8、及びケルコピテキン(cercopithecine)ヘルペスウイルス1からなる群から選択されるヘルペスウイルスによるものである、請求項４４〜４６のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項５４】
更に、哺乳類の対象への投与において、小胞体ストレス応答(unfolded protein response)の阻害剤と併用される、請求項４４〜４６のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項５５】
前記小胞体ストレス応答の阻害剤が、4-フェニルブチレートである、請求項５４に記載の化合物。
【請求項５６】
前記小胞体ストレス応答の阻害剤が、タウロウルソデオキシコール酸である、請求項５４に記載の化合物。
【請求項５７】
mTORの阻害剤である、第一の化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該第一の化合物若しくはそのプロドラッグの医薬として許容される塩、及び、小胞体ストレス応答の阻害剤である、第二の化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該第二の化合物若しくはそのプロドラッグの医薬として許容される塩の、ウイルス感染を治療又は防止するための医薬の製造における使用。
【請求項５８】
前記小胞体ストレス応答の阻害剤が4-フェニルブチレートである、請求項６１に記載の使用。
【請求項５９】
前記小胞体ストレス応答の阻害剤がタウロウルソデオキシコール酸である、請求項６１に記載の使用。
【請求項６０】
哺乳類におけるヘルペスウイルス感染を治療又は防止する方法であり、処置を必要とする哺乳類の対象に、治療有効量の、化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該化合物若しくはそのプロドラッグの医薬として許容される塩を投与する工程を含み、当該化合物が、小胞体ストレス応答の阻害剤である、前記方法。
【請求項６１】
前記化合物が化学シャペロンである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記化合物が4-フェニルブチレートである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記化合物がタウロウルソデオキシコール酸である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記ウイルス感染が、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトヘルペスウイルス6変異体A、ヒトヘルペスウイルス6変異体B、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8、及びケルコピテキン(cercopithecine)ヘルペスウイルス1からなる群から選択されるヘルペスウイルスによるものである、請求項６０〜６３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６５】
哺乳類におけるヘルペスウイルス感染を治療又は防止するための医薬組成物であり、(i)化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該化合物若しくはプロドラッグの医薬として許容される塩；及び(ii)医薬として許容される塩を含有し、当該化合物が、小胞体ストレス応答の阻害剤である、前記医薬組成物。
【請求項６６】
前記化合物が化学シャペロンである、請求項６５に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
前記化合物が4-フェニルブチレートである、請求項６５に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
前記化合物がタウロウルソデオキシコール酸である、請求項６５に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記ウイルス感染が、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトヘルペスウイルス6変異体A、ヒトヘルペスウイルス6変異体B、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8、及びケルコピテキン(cercopithecine)ヘルペスウイルス1からなる群から選択されるヘルペスウイルスによるものである、請求項６５〜６８のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
ヘルペスウイルス感染を治療又は防止するため医薬の製造における、化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該化合物若しくはプロドラッグの医薬として許容される塩の使用であり、当該化合物が、小胞体ストレス応答の阻害剤である、前記使用。
【請求項７１】
前記化合物が化学シャペロンである、請求項７０に記載の使用。
【請求項７２】
前記化合物が4-フェニルブチレートである、請求項７０に記載の使用。
【請求項７３】
前記化合物がタウロウルソデオキシコール酸である、請求項７０に記載の使用。
【請求項７４】
前記ウイルス感染が、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトヘルペスウイルス6変異体A、ヒトヘルペスウイルス6変異体B、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8、及びケルコピテキン(cercopithecine)ヘルペスウイルス1からなる群から選択されるヘルペスウイルスによるものである、請求項７０〜７３のいずれか1項に記載の使用。
【請求項７５】
哺乳類におけるヘルペスウイルス感染を治療又は防止するのに使用される、小胞体ストレス応答の阻害剤である、化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該化合物若しくはプロドラッグの医薬として許容される塩。
【請求項７６】
前記化合物が化学シャペロンである、請求項７５に記載の化合物。
【請求項７７】
前記化合物が4-フェニルブチレートである、請求項７５に記載の化合物。
【請求項７８】
前記化合物がタウロウルソデオキシコール酸である、請求項７５に記載の化合物。
【請求項７９】
前記ウイルス感染が、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトヘルペスウイルス6変異体A、ヒトヘルペスウイルス6変異体B、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8、及びケルコピテキン(cercopithecine)ヘルペスウイルス1からなる群から選択されるヘルペスウイルスによるものである、請求項７５〜７８のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項８０】
ウイルス感染を治療又は防止するための化合物を同定する方法であり、mTORのラパマイシン耐性機能を阻害する化合物を選択する工程を含み、当該mTORのラパマイシン耐性機能が、ウイルスに感染させた試験細胞をmTORのラパマイシン耐性機能を阻害する薬剤で処理することにより引き起こされる、ウイルス複製の制御として同定されたものであり、当該処理された試験細胞におけるウイルスの複製が、未処理の試験細胞におけるウイルスの複製と比較して減少していることにより、ウイルス複製の制御として、mTORのラパマイシン耐性機能が同定される、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスト細胞のmTORに関する酵素の調節因子を用いて、ウイルス感染を治療又は防止する方法を提供する。また、本発明は、ホスト細胞のmTORに関する酵素の調節因子及び小胞体ストレス応答(unfolded protein response)の調節因子を使用して、ウイルス感染を治療又は防止する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
政府の関与の表示
本発明は、国立衛生研究所により表彰されたGrant No. CA85786の下、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
哺乳類におけるラパマイシンの標的(mTOR)は、転写制御機能を有するセリン/スレオニンキナーゼである。mTORには、mTOR複合体1(mTORCl)及びmTOR複合体2(mT0RC2)と称される2つの複合体が存在する。mTOR触媒サブユニットに加え、mTORC1は、Raptor、mLST8及びPRAS40のタンパク質を更に含む。mTORC2は、mTOR及びmLST8を含むが、更に、制御タンパク質のRictor、mSIN1及びPROTORも含む。更に、mTORC1及びmTORC2は、それらの活性を阻害する、DEPTORと相互作用する。
【０００４】
ラパマイシンは、臓器移植において拒絶反応を防止するのに使用される、免疫抑制剤である。ラパマイシン及びその類似体は、FKBP-12タンパク質に結合して、mTORのFKBP-ラパマイシン結合(FKB)ドメインとの複合体の形成を媒介することにより、mTORを阻害する。この相互作用は、mTORC1のS6Kリン酸化等の幾つかの機能を阻害する。しかしながら、mTORC1には、4EBP(eIF4E結合タンパク質)のリン酸化等、ラパマイシンに耐性の他の機能が存在する。更に、FKBP-ラパマイシン複合体は、mTORC2と相互作用しないので、mTORC2の機能は、ラパマイシンにより阻害されない。
【０００５】
より安全に、効果的に、かつ確実に、HIVから風邪に至るウイルス感染を治療するための薬剤の、医療上の需要は到底満たされていない。ヒトサイトメガロウイルス(現行の薬剤は毒性が顕著で効率が低い)、当該需要は、単純ヘルペスウイルス(現行の薬剤は有効であるが救済が不完全である(incomplete relief))、インフルエンザA(現行の薬剤に耐性のウイルスが蔓延している)、及びC型肝炎ウイルス(病害対策が不完全であるため多くの患者が死亡している)等を治療するためのより良い薬剤の一般的需要を含む。更に、当該需要は、広範囲のウイルスに作用し、原因となる病原体の同定を要さずに臨床的に使用できる薬剤の一般的需要も含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第一の側面において、本発明は、哺乳類におけるウイルス感染を治療又は防止する方法に関し、当該方法は、治療有効量の、mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤である化合物、又はそのプロドラッグ、又はそれらの薬剤若しくはプロドラッグの医薬として許容される塩若しくはエステルを、これを必要とする哺乳類の対象に投与する工程を含む。
【０００７】
他の側面において、本発明は、ウイルス感染を治療又は防止するための医薬組成物に関し、当該組成物は、(i)化合物、若しくはそのプロドラッグ、又は当該化合物若しくはプロドラッグの医薬として許容される塩；及び(ii)医薬として許容される担体を含有し、ここで当該化合物が、mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤である、治療有効量の組成物を含有する。
【０００８】
他の側面において、本発明は、化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該化合物若しくはそのプロドラッグの医薬として許容される塩の使用であり、当該化合物が、mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤である、ウイルス感染を治療又は防止するための医薬の製造における、前記使用に関する。
【０００９】
他の態様において、本発明は、哺乳類におけるウイルス感染を治療又は予防するために使用される、mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤である、化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該化合物若しくはそのプロドラッグの医薬として許容される塩に関する。
【００１０】
一つの態様において、前記mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤は、式I：
【化１】
2013500265.tif 000002
［式中、
R1は、6-10員アリール；C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12ヘテロ脂肪族(heteroaliphatic); C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-4のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール;並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-2のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環;からなる群から選択される任意で置換された基であり、
それぞれの場合に、R2は、独立して、ハロゲン、-NR2、-OR、-SR、又はC1-12アシル; 6-10-員アリール; C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12ヘテロ脂肪族; C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-4のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール；並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-2のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環；からなる群から選択される任意で置換された基であり；jは1〜4の整数であり；
R3及びR4は、独立して、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロゲン、又は任意で置換されたC1-6脂肪族であり、但しR3及びR4は一緒に環を形成せず；そして各Rは独立して、水素、C1-12アシル; 6-10-員アリール; C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環;並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有するC1-12ヘテロ脂肪族;からなる群から選択される任意で置換された基であり；又は
同一の窒素原子上の2つのRが、その窒素と一緒に、窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環を形成する]
の化合物である。
【００１１】
一つの態様において、前記式Iの化合物は、Torin 1である。
【００１２】
一つの態様において、式Iの化合物は、mTORの特異的な阻害剤である。一つの態様において、式Iの化合物は、mTORC1の阻害剤である。他の態様において、式Iの化合物は、mTORC2の阻害剤である。
【００１３】
一つの態様において、前記mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤は、式II：
【化２】
2013500265.tif 000003
［式中、
X5、X6及びX8の1つ又は2つがNであり、それ以外はCHであり；
R7は、ハロ、ORO1、SRS1、NRN1RN2、NRN7aC(=O)Rα、NRN7bSO2RS2a、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、ここで、R01及びRS1は、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN1及びRN2は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN1及びRN2は、それらが結合する窒素と一緒になって3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；RC1は、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC1-7アルキル基、又はNRN8RN9から選択され、ここでRN8及びRN9は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN8及びRN9は、それらが結合する窒素と一緒になって3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；RS2aは、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN7a及びRN7bは、H及びC1-4アルキル基から選択され；
RN3及びRN4は、それらが結合する窒素と一緒になって、3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Rzは、H、ハロ、ORO2、SRS2b、NRN5RN6、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、及び任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、ここでR02及びRS2bは、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN5及びRN6は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN5及びRN6は、それらが結合する窒素と一緒になって、3〜8個の環原子を有するヘテロ環を形成する］
の化合物である。
【００１４】
一つの態様において、式IIの化合物は、Ku-0063794である。
【００１５】
一つの態様において、式IIの化合物は、mTORの特異的な阻害剤である。一つの態様において、式IIの化合物は、mTORC1の阻害剤である。一つの態様において、式IIの化合物は、mTORC2の阻害剤である。
【００１６】
一つの態様において、前記mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤は、式III又は式IV：
【化３】
2013500265.tif 000004
［式中、
nは、1〜5の整数であり；zは1〜2の整数であり；
R1、R3、及びR4は、独立して、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールであり；
R2及びR6は、独立して、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、-OR5、-NH2、-SO2、-COOH、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールであり；かつ
R5は、独立して、水素、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールである］
の化合物である。
【００１７】
一つの態様において、式IIIの化合物は、PP30である。一つの態様において、式IVの化合物は、PP242である。
【００１８】
一つの態様において、式III又はIVの化合物は、mTORの特異的な阻害剤である。一つの態様において、式III又はIVの化合物は、mTORC1の阻害剤である。一つの態様において、式III又はIVの化合物は、mTORC2の阻害剤である。
【００１９】
一つの態様において、前記ウイルス感染は、ヘルペスウイルスによるものである。一つの態様において、前記ウイルス感染は、単純ヘルペスウイルス1型(HSV)及び2型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)、エプスタインバーウイルス(EBV)、ヒトヘルペスウイルス6(変異体A及びB)、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8(カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、KSHV)、並びにケルコピテキン(cercopithecine)ヘルペスウイルス1(Bウイルス)からなる群から選択されるウイルスによるものである。一つの態様において、前記ウイルス感染は、ヒトサイトメガロウイルス及びヒト単純ヘルペスウイルス1型から選択される。
【００２０】
一つの態様において、本発明は、更に、小胞体ストレス応答の阻害剤を、哺乳類の対象に投与する工程を含む。一つの態様において、当該小胞体ストレス応答の阻害剤は、4-フェニルブチレートである。一つの態様において、当該小胞体ストレス応答は、タウロウルソデオキシコール酸である。
【００２１】
一つの態様において、本発明は、mTORの阻害剤である、第一の化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該第一の化合物若しくはそのプロドラッグの医薬として許容される塩、及び、小胞体ストレス応答の阻害剤である、第二の化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該第二の化合物若しくはそのプロドラッグの医薬として許容される塩の、ウイルス感染を治療又は防止するための医薬の製造における使用に関する。
【００２２】
一つの態様において、本発明は、哺乳類におけるヘルペスウイルス感染を治療又は防止する方法であり、処置を必要とする哺乳類の対象に、治療有効量の、化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該化合物若しくはそのプロドラッグの医薬として許容される塩を投与する工程を含み、当該化合物が、小胞体ストレス応答の阻害剤である、前記方法に関する。一つの態様において、前記化合物は、化学シャペロンである。一つの態様において、前記化合物は、4-フェニルブチレートである。一つの態様において、前記化合物は、タウロウルソデオキシコール酸である。一つの態様において、前記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス1型(HSV)及び2型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)、エプスタインバーウイルス(EBV)、ヒトヘルペスウイルス6(変異体A及びB)、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8(カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、KSHV)、並びにケルコピテキン(cercopithecine)ヘルペスウイルス1(Bウイルス)からなる群から選択される。
【００２３】
一つの態様において、本発明は、哺乳類におけるヘルペスウイルス感染を治療又は防止するための医薬組成物であり、(i)化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該化合物若しくはプロドラッグの医薬として許容される塩；及び(ii)医薬として許容される塩を含有し、当該化合物が、小胞体ストレス応答の阻害剤である、前記医薬組成物に関する。一つの態様において、前記化合物は、化学シャペロンである。一つの態様において、前記化合物は、4-フェニルブチレートである。一つの態様において、前記化合物は、タウロウルソデオキシコール酸である。一つの態様において、前記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス1型(HSV)及び2型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)、エプスタインバーウイルス(EBV)、ヒトヘルペスウイルス6(変異体A及びB)、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8(カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、KSHV)、並びにケルコピテキン(cercopithecine)ヘルペスウイルス1(Bウイルス)からなる群から選択される。
【００２４】
他の態様において、本発明は、ヘルペスウイルス感染を治療又は防止するため医薬の製造における、化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該化合物若しくはプロドラッグの医薬として許容される塩の使用であり、当該化合物が、小胞体ストレス応答の阻害剤である、前記使用に関する。一つの態様において、前記化合物は、化学シャペロンである。一つの態様において、前記化合物は、4-フェニルブチレートである。一つの態様において、前記化合物は、タウロウルソデオキシコール酸である。一つの態様において、前記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス1型(HSV)及び2型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)、エプスタインバーウイルス(EBV)、ヒトヘルペスウイルス6(変異体A及びB)、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8(カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、KSHV)、並びにケルコピテキン(cercopithecine)ヘルペスウイルス1(Bウイルス)からなる群から選択される。
【００２５】
他の態様において、哺乳類におけるヘルペスウイルス感染を治療又は防止するのに使用される、小胞体ストレス応答の阻害剤である、化合物若しくはそのプロドラッグ、又は当該化合物若しくはプロドラッグの医薬として許容される塩に関する。一つの態様において、前記化合物は、化学シャペロンである。一つの態様において、前記化合物は、4-フェニルブチレートである。一つの態様において、前記化合物は、タウロウルソデオキシコール酸である。一つの態様において、前記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス1型(HSV)及び2型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)、エプスタインバーウイルス(EBV)、ヒトヘルペスウイルス6(変異体A及びB)、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8(カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、KSHV)、並びにケルコピテキン(cercopithecine)ヘルペスウイルス1(Bウイルス)からなる群から選択される。
【００２６】
一つの態様において、本発明は、ウイルス感染を治療又は防止するための化合物を同定する方法であり、当該方法は、mTORのラパマイシン耐性機能を阻害する化合物を選択する工程を含む。
【００２７】
一つの態様において、本発明は、ウイルス感染を治療又は防止するための化合物を同定する方法に関し、当該方法は、mTORのラパマイシン耐性機能を阻害する化合物を選択する工程を含み、当該化合物は、ウイルスに感染させた試験細胞をmTORのラパマイシン耐性機能を阻害する薬剤で処理した場合ウイルス複製を制御する因子として同定されたものであり、当該処理された試験細胞におけるウイルスの複製が、未処理の試験細胞におけるウイルスの複製と比較して減少していることにより、mTOR阻害剤がウイルス複製の制御因子として同定される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】HCMVの複製は、Torin 1により阻害される。血清飢餓コンフルエントヒト線維芽細胞に、0.05 PFU/cellの多重度で、HCRVを感染させた。無細胞ウイルスは、TCID50アッセイにより定量し、エラーバーは、2つの独立した実験をそれぞれ2回行った結果の平均の標準誤差を表す。(A)Torin 1は、ラパマイシンよりも強力にHCMVの複製を阻害する。ウイルスの吸収直後に、細胞を、ビヒクル単独(N)(黒棒)(ジメチルスルホキシド[DMSO])、ラパマイシン(T)(灰色棒)(20μM)、又はTorin 1(T)(白棒)(250nM)で処理した。上澄を一日おきに回収し、適切な成分を含有する新鮮な培地に差し替え、表示された日の、上澄中のウイルス数をアッセイした。(B)HCMVの複製の阻害は用量依存的であり、細胞毒性によるものではない。感染した線維芽細胞を、様々な用量のTorin 1で処理した。薬剤を加えた培地を一日おきに差し替え、上澄中のウイルス数を、感染後8日目にアッセイした(黒棒)。8日の時点で、2番目の培養細胞のセットを2回洗浄し、薬剤を含まない無血清培地を各ウェルに添加し、更に8日経過後(感染後16日)に、ウイルス数をアッセイした（白色棒)。(C)Torin 1は、無感染ヒト線維芽細胞に対し毒性を有しない。Torin 1(250nM)で処理した線維芽細胞の生存率を、トリパンブルー排除アッセイにより、10日のタイムコースでモニタリングした。
【００２９】
【図２】Torin 1は、HCMVのヒト線維芽細胞への挿入に影響しない。血清飢餓コンフルエント線維芽細胞に、多重度3 PFU/cellで、HCMVを感染させた。(A)Torin 1は、ウイルスDNAの挿入をブロックしない。無血清コンフルエント線維芽細胞を、感染前(Pre)、又は吸収の直後1hpi(Post)、Torin 1(T)(250nM)で２４時間前処理した。対照の培養細胞には、Torin 1を溶解させていたビヒクルを添加した(NT)。2hpiで細胞を回収し、細胞に付着していたウイルスDNAを、リアルタイムPCRにより定量した。エラーバーは、2つの独立した試験を2回行い、その平均の標準誤差を表す。(B)Torin 1は、HCMV IE1タンパク質の蓄積を変化させない。IE1のレベルは、IE1特異的モノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットアッセイにより、6hpiの時点で決定された。画像は、2つの独立した試験の結果を表す。(C)Torin 1は、感染細胞のパーセンテージを変化させない。薬剤を添加した場合と不添加の場合における、ウイルスゲノム中に存在するGFPマーカー遺伝子の発現を、感染後24時間時点でモニタリングした。
【００３０】
【図３】Torin 1は、前初期タンパク質(immediate- early protein)及び初期タンパク質(early protein)の蓄積に殆ど影響しないが、HCMV DNA及び後期タンパク質の蓄積を阻害する。(A)ラパマイシン耐性mTOR活性は、全てではないが一部のHCMVタンパク質の蓄積を必要とする。血清飢餓コンフルエントヒト線維芽細胞に、多重度3 PFU/cellでHCMVを感染させ、続いて吸収直後に、ビヒクル(N) (DMSO)、ラパマイシン(R) (20 nM)、又はTorin 1 (T) (250 nM)でインキュベーションした。細胞は表示されている時間で回収され、ウエスタンブロットにより、表示されるタンパク質の蓄積が測定された。(B)Torin 1は、HCMV DNAの蓄積を阻害する。血清飢餓コンフルエントヒト線維芽細胞に、多重度0.05PFU/cellでHCMVを感染させ、上記(A)と同様に、ビヒクル、ラパマイシン又はTorin 1でインキュベーションした。表示されている時間にDNAを単離し、ウイルスDNAを、qPCRにより定量した。各試料ごとに同量のDNAを解析に付し、結果を、試料あたりのアクチンDNAのレベルで補正した。(C)ウイルス後期転写単位UL99は、Torin 1処理により阻害される。ヒト線維芽細胞を、多重度3 PFU/cellでHCMVを感染させ、上記(A)と同様に、ビヒクル、ラパマイシン又はTorin 1でインキュベーションした。表示されている時間に、UL99のRNAをqPCRにより定量し、そしてその結果を、各試料中のアクチンRNAの量で補正した。
【００３１】
【図４】ラパマイシン耐性mTOR活性は、HCMV感染時の4EBP1リン酸化及びeIF4F複合体の統合を必要とする。血清飢餓コンフルエントヒト線維芽細胞に多重度3 PFU/cellでHCMVを感染させた。1hpiの時点で、細胞を、薬剤を溶解させていたビヒクル(N) (DMSO)、ラパマイシン(R) (20 nM)、又はTorin 1 (T) (250 nM)で処理した。(A)48hpiの時点で、mTORC1の標的のリン酸化状態を、リン酸化された標的(4EBP1-PT37/46及びrpS6-PS235/6)に対する、及び全タンパク質に対する抗体を使用するウエスタンブロットにより評価した。チューブリンをローディング対照とした。(B)細胞を表示されている時点で回収した点を除き、(A)と同じである。(C及びD)モック感染(M)又はHCMV感染(WT)を多重度3 PFU/cellで行い、培養細胞を、表示されている時点で回収した。各試料から同量のタンパク質を取り、m7GTP-Sepharoseでインキュベーションし、そして単離されたタンパク質複合体を、eIF4F複合体及び4EBP1に対する表示されている抗体を使用して、ウエスタンブロットにより解析した。全ての場合において、記載の結果は、2つ以上の独立した実験の代表である。lysは、ライゼートを意味する。
【００３２】
【図５】Torin 1により、マウスサイトメガロウイルス(MCMV)の複製が阻害される。(A)Torin 1はMCMVの子孫形成を阻害するが、ラパマイシンは阻害しない。マウス胚線維芽細胞(MEF)に多重度0.05 PFU/cellでMCMVを感染させ、そしてビヒクル(黒棒) (DMSO)、ラパマイシン(灰色棒) (20 nM)、又はTorin 1 (白棒) (250 nM)で処理した。薬物を含有する新鮮な無血清培地を、一日おきに添加した。表示されている時間に、無細胞上澄を回収し、そして上澄中のウイルス数をTCID50法により定量した。エラーバーは、2つの独立した実験を2回行った平均の標準誤差を表す。(B)MEFに多重度3PFU/cellでMCMVを感染させ、上記(A)と同じくビヒクル(N)、ラパマイシン(R)、若しくはTorin 1(T)で処理し、又はLY294002 (LY) (20 μM)で処理した。48hpiの時点での、表示されているmTORC1の標的のリン酸化状態を、リン酸化標的(4EBP1-PT37/46及びrpS6-PS235/6)に対する、及び全タンパク質に対する抗体を使用する、ウエスタンブロットアッセイにより解析した。記載の結果は、3つの独立した実験の代表である。
【００３３】
【図６】mTORC2及びその標的のAktは、ラパマイシン耐性mTOR活性に関与しない。(A)MCMVの増殖は、RictorヌルMEF中のTrin1により阻害される。コンフルエント血清飢餓細胞に、多重度0.05 PFU/cellでMCMVを感染させ、1hpiの時点で、ビヒクル(黒棒)(DMSO)、ラパマイシン(灰色棒)(20 nM)又はTorinl(白棒)(250 nM)を添加した。感染の6日後、無細胞の上澄中のMCMVの数を、TCID50法により判定した。(B)Torin 1は、RictorヌルMEF中の4EBP1のリン酸化を阻害する。MEFには、多重度3 PFU/cellで、モック(M)又はMCMV(WT)を感染させ、そして上記(A)と同様に、ビヒクル(N)、ラパマイシン(R)又はTorin 1(T)で処理した。48hpiで、mTORC1の標的のリン酸化状態を、表示されているタンパク質に特異的な抗体を使用するウエスタンブロットにより評価した。(C)RictorヌルMEFの遺伝型を確認する。野生型及びRictorヌルMEFから全DNAを単離し、PCRを使用して遺伝型を確認した。(D)Akt1ヌルMEF及びAkt2ヌルMEFを使用した点を除き、(A)と同様の試験を行った。(E)Akt1ヌルMEF及びAkt2ヌルMEFを使用した点を除き、(B)と同様の試験を行った。B及びEにおいて、エラーバーは、それぞれ2回行われる独立した2つ以上の実験の平均の標準誤差を表す。C及びEにおいて、チューブリンをローディング対照としてアッセイした。(F)Akt1ヌル、及びAkt2ヌルMEFにおいて、Aktは発現していない。野生型及び突然変異MEFから採取したタンパク質を、Aktに特異的な抗体を使用したウエスタンブロットにより解析した。
【００３４】
【図７】mTORC1の標的の4EBP1の欠失は、Torin 1の存在下でのMCMVの複製を救済する。(A)4EBP1ヌルMEFにおいて、MCMVの増殖は、Torin 1により阻害されない。コンフルエント血清飢餓細胞に、多重度0.05 PFU/cellでMCMVを感染させ、1hpiの時点で、ビヒクル(黒棒)(DMSO)、ラパマイシン(灰色棒)(20 nM)又はTorinl(白棒)(250 nM)を添加した。感染の6日後、無細胞の上澄中のMCMVの数を、TCID50法により判定した。エラーバーは、それぞれ2回行われる独立した3つの実験の平均の標準誤差を表す。(B)Torin 1は、4EBP1ヌルMEF中のcap結合複合体からeIF4G又はeIF4Aを排除しない。細胞には、多重度3 PFU/cellでMCMV(WT)を感染させ、そして上記(A)と同様に、ビヒクル(N)、ラパマイシン(R)又はTorin 1(T)で処理した。48hpiで、mTORC1の標的のリン酸化状態を、表示されているタンパク質に特異的な抗体を使用するウエスタンブロットにより評価した。48hpiの時点で、細胞のライゼートから回収した同量のタンパク質を、m7G-Sepharoseと共にインキュベーションした。Cap類似体に結合するeIF4F複合体のコンポーネントの存在は、ウエスタンブロットにより判定された。当該結果は、2つの独立した実験の代表である。
【００３５】
【図８】ラパマイシン耐性mTOR活性は、代表的なα及びγヘルペスウイルスによるに必須である。(A)コンフルエント血清飢餓MEFに、多重度0.05 PFU/cellで、HSV-1又はγHV68を感染させた。無細胞上澄中のウイルス数は、72hpiでHSV-I(左)について、並びに感染後6日でγHC68(右)について、TCID50法により判定した。黒棒は、ビヒクルで処理した試料(N)(DMSO)を表し、灰色棒は、ラパマイシンで処理した試料(R) (20 nM)を表し、そして白棒は、Torin 1で処理した試料(T) (250 nM)を表す。エラーバーは、独立した2つ以上の実験の平均の標準誤差を表す。(B) コンフルエント血清飢餓MEFの単層に、多重度3PFU/cellで、HSV-1又はγHV68を感染させた。8hpiで感染細胞のライゼートを回収し、同量のタンパク質を、ウエスタンブロットにより解析した。(C)WT又は4EBP1ヌルMEFに、多重度0.05 PFU/cellで、HSV-Iを感染させた。72hpiで上澄中に存在する無細胞ウイルスの数をTCID50法により定量した。エラーバーは、独立した2つ以上の実験の平均の標準誤差を表す。
【００３６】
【図９】mTORキナーゼを指向するsiRNAによるヒト線維芽細胞の処理で引き起こされるHCMVの阻害を表す。MRC5線維芽細胞(ATCC#CCL-171)の継代23〜24番を、96ウェルプラスチック組織培養ディッシュに、10%FBS(GIBCO)を添加したDMEM(Sigma- Aldrich product #D5756, St. Louis, MO)中、7500 cells/wellの密度で播種した。細胞を〜70%コンフルエントになるまで増殖させた後、Oligofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して、説明書に従い、GFP mRNA (非特異的)、ウイルスIE2 mRNA又はmTORキナーゼを標的とするsiRNAを、1nmolトランスフェクションした。IE2 siRNA配列: 5'-AAACGCAUCUCCGAGUUGGAC-3' (配列番号:1); GFP siRNA配列: 5'-GCAAGCUGACCCUGAAGUUC AU-3' (配列番号:2); mTORキナーゼ(FRAP 1_2) siRNA配列: 5'- G AGUUAC AGUC GGGC AU AU-3' (配列番号:3)。全てのsiRNAは、Sigma- Aldrichから取得した。感染の4時間後、培地に、最終濃度が10%となるようにFBSを添加した。感染の28時間後、培地の上澄を除去し、濃度0.1 pfu/cellのHCMV株AD169を含む100μlのDMEM/10%FBSに置き換えた。感染は96時間行われ、96時間目に、培地の上澄を回収し、そして96ウェルフォーマットの90%コンフルエントMRC細胞の新鮮なプレートへの感染に使用された。当該レポータープレートへの感染の24時間後、試料を-20℃の氷冷メタノールで15分間固定し、続いて、感染価を定量するために、免疫蛍光染色を行った。結果は、「ロバストZスコア(robust Z score)」で表される。このスコアは、siRNA処理がない場合にもたらされる感染価の平均値の標準偏差に対応する。故に、mTORキナーゼ特異的siRNAは2標準偏差を越える高度に顕著な効率で、感染性HCMVの収率を低下させたことになる。
【００３７】
【図１０】4-PBAは、用量依存的に、HCMVの複製を阻害する。ヒト線維芽細胞に、多重度0.1 pfu/cellでHCMV株AD 169を感染させ、そして10%ウシ胎児血清及び表示されている量の薬物を含有する培地中で維持した。薬物を含有する培地は、1日おきに交換した。細胞から離れた及び細胞と接したウイルスは、感染後8日で回収され、TCID50法により力価測定を行った。データは、2つの試料の力価のログ平均を表す。
【００３８】
【図１１】4-PBAは、非感染又は感染コンフルエントヒト線維芽細胞に対して毒性ではない。(A)表示されている濃度の4-PBAを含有する培地中で、線維芽細胞を8日間維持した。タイムコースの期間中、一日置きに培地を交換した。処理期間の最後に、トリパンブルー排除アッセイにより細胞の生存率を測定した。データ点は、2つのウェルの平均を表す。(B)線維芽細胞に、多重度0.1 pfu/cellでHCMVを感染させた。表示されている濃度の4-PBAを含有する新鮮な培地を、1日置きに細胞に与えた。感染の8日後、細胞を培地で1回洗浄し、そして薬剤を含まない培地を加えた。更に8日後(感染の16日後)、上澄中の無細胞ウイルスを、TCID50法により定量した。データ点は、2つのウェルの平均を表す。
【００３９】
【図１２】4-PBAは、mTOR阻害剤と協調して、用量依存的に、HCMV複製に干渉する。ヒト線維芽細胞に、多重度0.1 pfu/cellで、HCMV株AD 169を感染させ、そして10%ウシ胎児血清及び表示されている量の薬物を含有する培地中で維持した。薬物は、以下の濃度で使用された：4-PBA, 1 mM; Torin 1, 250 nM; ラパマイシン, 20 nM。薬物を含有する培地は、1日おきに交換した。細胞から離れた及び細胞と接したウイルスは、感染後0、4、8及び12日で回収され、TCID50法により力価測定を行った。データは、2つの試料の力価のログ平均を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
詳細な説明
ウイルスの複製は、宿主細胞の代謝ネットワークに由来する、エネルギー及び巨大分子前駆体を必要とする。代謝流束をプロファイリングするための統合的アプローチを使用して、発明者らは、ウイルス感染に応答して、特定の代謝物の濃度及びフラックスが変化することを見出した。当該プロファイリング手法は、PCT/US2008/006959に記載されており、当該文献は、その全文を参照により本書に組み込む。このアプローチを使用して、様々な代謝経路における特定の酵素、特に鍵となる「スイッチ」とみなされる酵素が、ウイルスの複製を妨げ、正常な代謝流束のプロフィールを修復するための介入の標的；即ち代謝流束を方向転換するための標的として有用であり、ゆえに、抗ウイルス治療の標的とみなされることが見出された。加えて、代謝経路における「不可逆」反応又は関与段階(committed step)を触媒する酵素は、抗ウイルス治療の酵素標的として、有利に使用出来る。
【００４１】
下記に、本発明に係る抗ウイルス化合物及び標的酵素、新規抗ウイルス化合物を同定及び特定するスクリーニングアッセイ、並びにウイルス感染を治療及び防止する抗ウイルス治療剤としてのそれらの使用を、より詳細に記載する。本発明に係る化合物として、mTOR活性の阻害剤及び小胞体ストレス応答の阻害剤が挙げられ、それらは単独で、又は組み合わせて、ウイルス感染の治療又は防止に使用出来る。
【００４２】
１．mTORの調節因子
一つの態様において、本発明は、哺乳類におけるウイルス感染を治療又は防止する方法を提供し、当該方法は、治療有効量の化合物、又はその相対物（relative)、類似体若しくは誘導体を、それを必要とする対象に投与する工程を含み、当該化合物は、mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤である。mTORの阻害剤は、mTORC1、mT0RC2又はmTORC1及びmT0RC2の両方を阻害することが出来る。
【００４３】
ラパマイシン及びその類似体は、FKBP-12タンパク質に結合し、mTORのFKBP-ラパマイシン結合(FKB)ドメインとの複合体の形成を仲介する。この相互作用は、S6Kのリン酸化等の、mTORC1の特定の機能を阻害する。しかしながら、mTORC1には、4EPB(eIF4E結合タンパク質)のリン酸化等、ラパマイシンに耐性の他の機能が存在する。加えて、前記FKBP-ラパマイシン複合体はmTORC2と相互作用しないので、mTORC2の機能はラパマイシンによる阻害に耐性である。故に、mTORのラパマイシン耐性の機能は、mTORCl及び/又はmT0RC2のいずれにも存在する。
【００４４】
1.1  小分子阻害剤
mTORのラパマイシン耐性機能を阻害する化合物として、mTORキナーゼドメイン阻害剤が挙げられる。そのような化合物は、選択的に、mTORキナーゼドメインのATP結合部位に結合出来る。mTORキナーゼ阻害剤は、例えばIC50値等の測定結果を比較した場合、表1の1つ以上のキナーゼよりも、mTORの阻害に関して、>2、>5、>10、>20、>50、又は>100倍の選択性を示して、mTORを選択出来る。好ましい態様において、当該mTORキナーゼ阻害剤の選択性は、PBKと比較して、>2、>5、>10、>20、>50、又は>100倍である。
【００４５】
本発明に係る化合物として、小分子が挙げられる。本明細書中で使用されるとき、「化学剤」及び「小分子」という用語は区別されずに用いられ、いずれの用語も、分子量が最大で約4000原子質量単位(Dalton)、好ましくは最大で約2000Dalton、そしてより好ましくは、最大で約1000Daltonの物質を指す。他に特段の言及が無い限り、本明細書中で使用されるとき、「小分子」という用語は、化学剤のみを指し、生物剤を指さない。本明細書中で使用されるとき、「生物剤」は、分子量が約2000原子質量単位(Dalton)以上の、タンパク質、ポリペプチド及び核酸を含む分子である。本発明に係る化合物として、塩、エステル及びそれらの化合物の医薬として許容される形態が挙げられる。
【００４６】
その全文を参照により本書に組み込むWO2010/044885には、mTORの小分子調節因子が記載されている。この文献には、式I:
【化４】
2013500265.tif 000005
［式中、
R1は、6-10員アリール；C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12ヘテロ脂肪族(heteroaliphatic); C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-4のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール;並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-2のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環;からなる群から選択される任意で置換された基であり、
それぞれの場合に、R2は、独立して、ハロゲン、-NR2、-OR、-SR、又はC1-12アシル; 6-10-員アリール; C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12ヘテロ脂肪族; C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-4のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール；並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1-2のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環；からなる群から選択される任意で置換された基であり；jは1〜4の整数であり；
R3及びR4は、独立して、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロゲン、又は任意で置換されたC1-6脂肪族であり、但しR3及びR4は一緒に環を形成せず；そして各Rは独立して、水素、C1-12アシル; 6-10-員アリール; C7-15アリールアルキル; C6-15ヘテロアリールアルキル; C1-12脂肪族;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5-10-員ヘテロアリール;窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環;並びに窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有するC1-12ヘテロ脂肪族;からなる群から選択される任意で置換された基であり；又は
同一の窒素原子上の2つのRが、その窒素と一緒に、窒素、酸素及び硫黄からなる群から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4-7-員ヘテロ環を形成する]
のピリジノンキノリンが記載されている。
【００４７】
mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤として、以下のものが挙げられる。
【化５】
2013500265.tif 000006
【化６】
2013500265.tif 000007
【化７】
2013500265.tif 000008
【化８】
2013500265.tif 000009
【化９】
2013500265.tif 000010
【化１０】
2013500265.tif 000011
【化１１】
2013500265.tif 000012
【化１２】
2013500265.tif 000013
【化１３】
2013500265.tif 000014
【化１４】
2013500265.tif 000015
【化１５】
2013500265.tif 000016
【００４８】
Torin 1は、IC50が約2-10 nMの、mTORC1及びmTORC2のATP-競合的阻害剤である、ピリジノンキノリン化合物である。Torin 1は、ヘルペスウイルスに対する活性を有する抗ウイルス剤として、本明細書中で例示されている。
【００４９】
その全文を参照により本書に組み込むUS 2009/0099174には、mTORの選択的阻害剤が記載されている。この文献には、式II:
【化１６】
2013500265.tif 000017
［式中、
X5、X6及びX8の1つ又は2つがNであり、それ以外はCHであり；
R7は、ハロ、ORO1、SRS1、NRN1RN2、NRN7aC(=O)Rα、NRN7bSO2RS2a、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、ここで、R01及びRS1は、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN1及びRN2は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN1及びRN2は、それらが結合する窒素と一緒になって3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；RC1は、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC1-7アルキル基、又はNRN8RN9から選択され、ここでRN8及びRN9は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN8及びRN9は、それらが結合する窒素と一緒になって3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；RS2aは、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN7a及びRN7bは、H及びC1-4アルキル基から選択され；
RN3及びRN4は、それらが結合する窒素と一緒になって、3〜8個の環原子を含むヘテロ環を形成し；
Rzは、H、ハロ、ORO2、SRS2b、NRN5RN6、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、及び任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、ここでR02及びRS2bは、H、任意で置換されたC5-20アリール基、任意で置換されたC5-20ヘテロアリール基、又は任意で置換されたC1-7アルキル基から選択され；RN5及びRN6は、独立して、H、任意で置換されたC1-7アルキル基、任意で置換されたC5-20アリール基から選択され、又はRN5及びRN6は、それらが結合する窒素と一緒になって、3〜8個の環原子を有するヘテロ環を形成する］
の化合物が記載されている。
【００５０】
化合物Ku-00637934は、IC50が約10 nMの、mTORの選択的阻害剤であって(Garcia-Martinez et al. Biochem. J. 421:29-42)、以下の化学構造：
【化１７】
2013500265.tif 000018
を有する。Ku-0063794は、10 nMのIC50でmTORを阻害し、PI3キナーゼに関して選択的である(P110αアイソフォームのIC50が10μM)。
【００５１】
その全文を参照により本書に組み込むWO2010/006072には、式III又は式IV：
【化１８】
2013500265.tif 000019
［式中、
nは、1〜5の整数であり；zは1〜2の整数であり；
R1、R3、及びR4は、独立して、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、-OH、-NH2、-SO2、-COOH、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールであり；
R2及びR6は、独立して、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、-OR5、-NH2、-SO2、-COOH、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールであり；かつ
R5は、独立して、水素、置換された、若しくは置換されていないアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロアルキル、置換された、若しくは置換されていないシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換された、若しくは置換されていないアリール、又は置換された、若しくは置換されていないヘテロアリールである］
のmTORの選択的阻害剤が記載されている。
【００５２】
化合物PP30は、式IIIの化合物の一つであって、以下の化学構造：
【化１９】
2013500265.tif 000020
を有する。PP30は、80 nMのIC50でmTORを阻害し、PI3キナーゼに関して選択的である(P110αアイソフォームのIC50が3M)。
【００５３】
化合物PP242は、式IVの化合物の一つであって、以下の化学構造：
【化２０】
2013500265.tif 000021
を有する。PP２４２は、8 nMのIC50でmTORを阻害し、PI3キナーゼに関して選択的である(P110αアイソフォームのIC50が2M)。
【００５４】
上記化合物に加え、本発明において使用出来る選択的mTOR阻害剤として、KU-BMCL-200908069-1; KU-BMCL-200908069-5 (IC50 21 nmol; PBKに対する選択性>500倍); WAY-600 (IC50 9 nmol; PBKαに対する選択性>100倍及びPBKγに対する選択性>500倍); WYE-687 (IC50 7 nmol; PBKαに対する選択性>100倍及びPBKγに対する選択性>500倍); WYE354 (IC50 5 nmol; PBKαに対する選択性>500倍及びPBKγに対する選択性>500倍); Wyeth-BMCL-200910075-9b (IC50 0.7 nmol;PBKに対する選択性>1000倍); Wyeth-BMCL-200910096-27 (IC50 0.6 nmol; PBKαに対する選択性>200倍); INKl 28 (Intellikine, Inc.) (IC50 1 nmol; PBKに対する選択性>100倍); XL388 (Exelixis) (IC50がmTORClに対して9.8 nmol及びmTORC2に対して166 nM; 140個のタンパク質キナーゼのパネルに対する選択性>100倍(IC50 >3μM)); AZD8055 (Astra Zeneca) (IC50 0.13 nmol; plOOαに対する選択性>10,000倍);並びにOSI-027 (OSI pharmaceuticals)が挙げられる。他のATP競合的特異的mTOR阻害剤として、WYE-125132 (IC50 0.19 nmol; PBKsに対する選択性>5,000倍)が挙げられる。本発明に使用される他のmTOR阻害剤として、WO2006/090167、WO2006/090169、WO2007/060404、WO2007/080382、WO2007/060404、及びWO2008/023161に開示されているものが挙げられる。
【００５５】
本明細書中で使用されるとき、「医薬として許容される塩」という用語は、医薬として許容される、無毒性の、無機酸及び塩基並びに有機酸及び塩基を含む、酸又は塩基から調製される塩を指す。前記化合物の医薬として許容される塩基付加塩として適切なものとして、限定されないが、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛等から作られる金属塩、又はリシン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（N-メチルグルカミン)及びプロカイン等の有機塩が挙げられる。適切な無毒性の酸として、限定されないが、酢酸、アルギン酸、アントラニル酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、蟻酸、フマル酸、フロン酸、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グリコール酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、硫酸、酒石酸、及びp-トルエンスルホン酸が挙げられる。具体的な無毒性の酸として、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、及びメタンスルホン酸が挙げられる。具体的な塩の例として、塩酸塩およびメシル酸塩(mesylate)が挙げられる。他にも当該技術分野で周知の塩が挙げられ、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th eds., Mack Publishing, Easton PA (1990) or Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th eds., Mack Publishing, Easton PA (1995)を参照されたい。
【００５６】
本明細書中で使用され、他に特段の言及がないとき、「水和物」という用語は、共有結合でない分子間力により結合した、化学量論的、又は非化学量論的量の水を更に含有する、化合物、又はその塩を意味する。
【００５７】
本明細書中で使用され、他に特段の言及がないとき、「溶媒和物」という用語は、共有結合でない分子間力により結合した、化学量論的、又は非化学量論的量の溶媒を更に含有する、化合物、又はその塩を意味する。
【００５８】
本明細書中で使用され、他に特段の言及がないとき、「プロドラッグ」という用語は、加水分解し、酸化し、又は他の生物学的条件下での反応(インビトロ又はインビボ)により、化合物を提供する、化合物の誘導体を意味する。プロドラッグの例として、限定されないが、生体加水分解性(biohydrolyzable)アミド、生体加水分解性エステル、生体加水分解性カルバミン酸塩、生体加水分解性炭酸塩、生体加水分解性ウレイド、及び生体加水分解性リン酸塩類似体等の、生体加水分解性部分を含む化合物の誘導体及び代謝物が挙げられる。幾つかの態様において、カルボキシル官能基を有する化合物のプロドラッグは、カルボン酸の低級アルキルエステルである。当該カルボン酸エステルは、当該分子中に存在する任意のカルボン酸部分をエステル化することにより容易に形成される。プロドラッグは、典型的には、周知の方法を使用して調製出来、例えばBurger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery 6th ed. (Donald J. Abraham ed., 2001, Wiley) and Design及びApplication of Prodrugs (H. Bundgaard ed., 1985, Harwood Academic Publishers Gmfh)に記載されている方法を使用出来る。
【００５９】
本明細書中で使用され、他に特段の言及がないとき、「立体異性体」又は「立体異性体的に純粋」という用語は、ある化合物の立体異性体が、有機分子又は無機分子であって、その化合物の他の立体異性体を実質的に含まないことを意味する。例えば、1つのキラル中心を有する立体異性体的に純粋な化合物は、その化合物の他方の鏡像異性体を実質的に含まない。2つのキラル中心を有する立体異性体的に純粋な化合物は、その化合物の他のジアステレオ異性体を実質的に含まない。典型的な立体異性体的に純粋な化合物は、その化合物の一つの立体異性体を80重量%超、及びその化合物の他の立体異性体を20重量%未満含み、その化合物の一つの立体異性体を90重量%超、及びその化合物の他の立体異性体を10重量%未満含み、その化合物の一つの立体異性体を95重量%超、及びその化合物の他の立体異性体を5重量%未満含み、又はその化合物の一つの立体異性体を97重量%超、及びその化合物の他の立体異性体を3重量%未満含む。前記化合物はキラル中心を有している場合があり、ラセミ化合物(racemate)、個別の鏡像異性体、又はジアステレオ異性体、及びそれらの混合物として存在出来る。それらの異性体形態は、混合物も含め、本明細書中に開示される態様の中に包含される。
【００６０】
様々な化合物が1つ以上のキラル中心を含み、そして鏡像異性体のキラル混合物、ジアステレオ異性体の混合物、又は鏡像異性体的に、又は光学的に純粋な化合物として存在出来る。そのような家具汚物の立体異性体的に純粋な形態は、それらの混合物の使用と同じく、本明細書中に開示される態様に包含される。例えば、特定の化合物の鏡像異性体を等量、又は不等量含有する混合物が、本明細書中に開示される方法及び組成物に使用されてもよい。これらの異性体は、キラルカラム又はキラル分割剤等の標準的な技術を使用して、非対象的に合成され、又は分割されてもよい。例えば、Jacques, J., et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley-Interscience, New York, 1981); Wilen, S. H., et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E. L., Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962);及びWilen, S. H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN, 1972)を参照されたい。
【００６１】
有機又は無機分子の化合物が、E及びZ異性体、又はそれらの混合物、並びにシス及びトランス異性体、又はそれらの混合物を含み得ることも留意すべきである。特定の態様において、化合物は、E又はZ異性体のいずれかとして単離される。化合物は、E及びZ異性体の混合物である。
【００６２】
本発明において、mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤、又はこれに関連する化合物若しくは類似体又はそれらのプロドラッグが、増殖及び/又は蔓延がmTOR機能の維持に依存するウイルスの感染を治療又は防止するために使用される。一つの態様において、mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤、又はこれに関連する化合物若しくは類似体又はそれらのプロドラッグは、ヘルペスウイルスの感染を治療又は防止するために使用される。ヘルペスウイルス(Herpesviridae)は、二本鎖DNAゲノムを有するウイルスのファミリーである。例えば、本明細書中で例示するように、ナノモラー濃度のTorin 1は、α-ヘルペスウイルスである単純ヘルペスウイルス-1(HSV-I)；β-ヘルペスウイルスであるヒトサイトメガロウイルス(HCMV)；及びγ-ヘルペスウイルスであるγ-ヘルペスウイルス68の複製を阻害する。
【００６３】
本明細書中で使用されるとき、対象に治療剤を投与する際の「有効量」とは、（i）ウイルス感染またはそれに関連した症状の重症度を低減または回復する、（ii）ウイルス感染またはそれに関連した症状の持続時間を短縮する、（iii）ウイルス感染またはそれに関連した症状の進行を阻止する、（iv）ウイルス感染またはそれに関連した症状を回帰させる、（v）ウイルス感染またはそれに関連した症状の進展または発症を阻止する、（vi）ウイルス感染またはそれに関連した症状の再発を阻止する、（vii）1つの細胞から別の細胞、または1つの組織から別の組織へのウイルスの蔓延を低減または阻止する、（ix）1人の対象から別の対象へのウイルスの蔓延を阻止または低減する、（x）ウイルス感染に関連した器官の不全を低減する、（xi）対象の入院を減少させる、（xii）入院期間を短縮させる、（xiii）ウイルス感染した対象の生存率を増加させる、（xiv）ウイルス感染を除去する、および／または（xv）別の治療の予防効果または療法効果を高めるか改善する、の1つ、2つ、3つ、4つ、又はそれ以上を達成するのに充分な治療剤の量を指す。
【００６４】
本明細書中で使用されるとき、「有効量」という用語は、細胞培養に関連した生成物において使用する化合物という文脈で、細胞培養におけるウイルスの力価を減少させるか、または細胞培養におけるウイルスの複製を阻止するために十分な化合物の量を意味する。
【００６５】
哺乳類におけるウイルス感染を治療又は防止するのに使用されるmTOR阻害剤の好ましい用量は、<100mg/kg、<50mg/kg、<20mg/kg、<10mg/kg、<5mg/kg、<2mg/kg、<1mg/kg、<0.5mg/kg、<0.2mg/kg、<0.1mg/kg、<0.05mg/kg、<0.02mg/kg、又は<0.01mg/kgである。哺乳類におけるウイルス感染を治療又は防止するのに使用されるmTOR阻害剤の好ましい用量は、全血清濃度で、<100μM、<50μM、<20μM、<10μM、<5μM、<1μM、<500nM、or<250nMである。
【００６６】
また、本発明は、抗ウイルス活性を有することが望ましい細胞培養に関連する生成物における、mTOR阻害剤の使用を提供する。一つの態様において、mTOR阻害剤は、細胞培養培地に添加される。細胞培養培地に使用されるmTOR阻害剤として、対象の治療において強すぎる毒性が認められない化合物が挙げられる。
【００６７】
1.2  RNAi分子
本発明において、RNA干渉は、感染性ウイルスの収率を低下させるために、細胞内の標的酵素の発現を低下させるのに使用される。例えば、siRNA分子は、mTORキナーゼを標的とし、又はmTORC1及びmTORC2の複合体の他の成分等のmTORキナーゼと相互作用するタンパク質を標的とするように設計することにより、ラパマイシン耐性mTOR活性を阻止出来る。mTOR siRNAは、様々な酵素の標的を阻害するように設計された。幾つかの態様において、化合物は、標的タンパク質の発現レベルを低下させることが出来るRNA干渉(RNAi)分子である。RNAi分子として、限定されないが、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、及び配列特異的なRNAiを仲介出来る任意の分子が挙げられる。
【００６８】
RNA干渉（RNAi）は、標的mRNAに対する相同配列を持つ二本鎖RNA（dsRNA）により引き起こされる配列特異的転写後遺伝子抑制機序である。RNAiは、転写後遺伝子抑制またはPTGSとも呼ばれる。例えば、『Couzin, 2002, Science 298:2296-2297』、『McManus et al., 2002, Nat. Rev. Genet. 3, 737-747』、『Hannon, G. J., 2002, Nature 418, 244-251』、『Paddison et al., 2002, Cancer Cell 2, 17-23』を参照。dsRNAは、RNaseIII-type酵素と呼ばれるダイサーによる切断のために認識され、標的とされる。ダイサー酵素は、RNAを、完全に対のリボヌクレオチドの19のヌクレオチドと、それぞれのストランドの3'端にある約2、3の不対のヌクレオチドから構成されるsiRNAまたは低分子干渉RNA（siRNA）と呼ばれる約21〜23ヌクレオチドの短い二本鎖に「切断」する。これらの短い二本鎖は、RISCと呼ばれる多タンパク質複合体に関連し、またこの複合体をsiRNAと類似した配列を持つmRNA転写物に配向する。その結果、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に存在するヌクレアーゼにより、標的のmRNA転写物が切断・分解され、それによって遺伝子生成物の発現がなくなる。
【００６９】
文献の多数の報告書が、siRNAの特異性を主張し、siRNA配列とのほぼ完全な同一性の要件が示唆されている（『Elbashir et al., 2001. EMBO J. 20:6877-6888』、『Tuschl et al., 1999, Genes Dev. 13:3191-3197』、『Hutvagner et al., Sciencexpress 297:2056-2060』）。ある1つの報告書では、完全な配列の相補性がsiRNA-標的化された転写物の切断に必要であるが、一方で部分的な相補性は、microRNAに倣って転写物の劣化なしに翻訳抑圧につながることが示唆されている（『Hutvagner et al., Sciencexpress 297:2056-2060』）。
【００７０】
miRNAは、ゲノムから発現される調節RNAで、前駆物質の幹ループ（低分子ヘアピン）構造（長さおよそ80ヌクレオチド）から処理されて、標的mRNAの3' UTRにある相補配列に結合（またはハイブリッド形成）される一本鎖の核酸（長さおよそ22ヌクレオチド）が生成される（『Lee et al., 1993, Cell 75:843-854』、『Reinhart et al., 2000, Nature 403:901-906』、『Lee et al., 2001, Science 294:862-864』、『Lau et al., 2001, Science 294:858-862』、『Hutvagner et al., 2001, Science 293:834-838』）。miRNAは、部分的な相補性のみをもって転写物の配列に結合し（『Zeng et al., 2002, Molec. Cell 9:1327-1333』）、定常状態のRNAレベルに影響を及ぼすことなく翻訳を抑圧する（『Lee et al., 1993, Cell 75:843-854』、『Wightman et al., 1993, Cell 75:855-862』）。miRNAおよびsiRNAのどちらも、ダイサーにより処理され、RNA誘導サイレンシング複合体の成分に関連する（『Hutvagner et al., 2001, Science 293:834-838』、『Grishok et al., 2001, Cell 106: 23-34』、『Ketting et al., 2001, Genes Dev. 15:2654-2659』、『Williams et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6889-6894』、『Hammond et al., 2001, Science 293:1146-1150』、『Mourlatos et al., 2002, Genes Dev. 16:720-728』）。
【００７１】
低分子ヘアピン型RNA（shRNA）は、オーバーハングのある二本鎖RNA（例えば、siRNAおよびmiRNA）への処理にあたり、RNAiの媒介を行うのに十分な長さを持つ、二本鎖構造を形成するためにハイブリッド形成された、またはハイブリッド形成の能力を持つ少なくとも2個の相補的な部分で構成される一本鎖のRNA分子である。shRNAには、二本鎖構造を形成するための相補的な部分のハイブリッド形成にあたり、ループ構造を形成する少なくとも1つの非相補的な部分も含まれる。shRNAは、miRNAおよびsiRNAの先駆物質としての役目を果たす。
【００７２】
普通、shRNAをコードする配列は、ベクターにクローン化され、ベクターが細胞に導入され、細胞転写の仕組みにより転写される（『Chen et al., 2003, Biochem Biophys Res Commun 311:398-404』）。次に、例えば、RNAポリメラーゼIII（Pol III）により、ベクター内にあるPol III-typeプロモーターに反応してshRNAが転写できる（『Yuan et al., 2006, Mol Biol Rep 33:33-41』および『Scherer et al., 2004, Mol Ther 10:597-603』）。発現されたshRNAは、次に、細胞質に運び出され、ここで、ダイサーなどのタンパク質によりsiRNAに処理され、これが次にRNAiのトリガーとなる（『Amarzguioui et al., 2005, FEBS Letter 579:5974-5981』）。最適なRNAポリメラーゼIII転写のために、新しく開始されたRNAの5′端でプリンが必要であることがこれまでに報告されている。より詳細な考察については、『Zecherle et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16:5801-5810』、『Fruscoloni et al., 1995, Nucleic Acids Res, 23:2914-2918』、および『Mattaj et al., 1988, Cell, 55:435-442』に記載されている。shRNAの中核的配列は、細胞に安定して発現でき、インビトロおよびインビボのどちらでも、例えば、動物内など、細胞内での長期的な遺伝子サイレンシングが可能となる（『McCaffrey et al., 2002, Nature 418:38-39』、『Xia et al., 2002, Nat. Biotech. 20:1006-1010』、『Lewis et al., 2002, Nat. Genetics 32:107-108』、『Rubinson et al., 2003, Nat. Genetics 33:401-406』、および『Tiscornia et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:1844-1848』を参照）。
【００７３】
Martinez他は、発がん性変異を選択的に標的化するために、RNA干渉を利用できることを報告している（『Martinez et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14849-14854』）。この報告書では、点突然変異を含むR248W突然変異体の領域であるp53を標的とするsiRNAは、突然変異体p53の発現のサイレンシングをするが、野生型p53ではそうではないことが示された。
【００７４】
Wilda他は、M-BCR/ABL融合mRNAを標的としたsiRNAは、白血病性細胞でのM-BCR/ABL mRNAおよびM-BCR/ABL腫瘍性タンパク質を枯渇させるために使用できることを報告している（『Wilda et al.、2002、Oncogene 21:5716-5724』）。
【００７５】
米国特許第6,506,559号では、細胞における標的遺伝子の発現を阻止するためのRNA干渉プロセスが開示されている。このプロセスは、標的遺伝子の配列と同一な二本鎖領域に配列を持つ部分的または完全に二本鎖のRNAを、細胞に、または細胞外の環境に導入することから構成される。
【００７６】
米国出願公開番号第US 2002/0086356号では、長さ21〜23ヌクレオチド（nt）のRNAセグメントを使用した、ショウジョウバエインビトロ系でのRNA干渉が開示されている。この特許出願公報では、これらの21〜23 ntの断片を精製して、ショウジョウバエ抽出物に戻したとき、長鎖dsRNAの非存在下、配列特異的RNA干渉が媒介されることが教示されている。また、この特許出願公報では、同一または類似した性質の化学的に合成したオリゴヌクレオチドも、哺乳類の細胞での劣化に特異的なmRNAの標的化に使用できることも教示している。
【００７７】
国際特許出願公開第WO 2002/44321号では、長さ19〜23 ntの二本鎖RNA（dsRNA）により、ショウジョウバエインビトロ系で配列特異的転写後遺伝子抑制が誘発されることが開示されている。PCT公報では、長鎖dsRNAまたはオーバーハングした3'端を持つ化学的に合成したsiRNA二重鎖からRNase III様の処理反応により生成された低分子干渉RNA（siRNA）が、可溶化液中で効率的な標的RNA切断を媒介すること、また切断部位は、案内となるsiRNAの長さにあたる領域の中心付近に位置することが教示されている。
【００７８】
米国出願公開番号第US 2002/016216号では、標的遺伝子のヌクレオチド配列に対する厳密な条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列で構成される二本鎖RNA（dsRNA）を、標的遺伝子の発現を弱めるのに十分な量を細胞内に導入することで、培養した細胞中で標的遺伝子の発現を弱める方法が開示されている。
【００７９】
国際特許出願公開第WO 2003/006477号では、細胞内で発現されたとき、細胞により処理され、細胞自体のRNA干渉（RNAi）経路を用いて、標的の遺伝子を選択的にサイレンシングする（特定のmRNAを切断することで）標的の低分子干渉RNA（siRNA）を生成する、人工RNA先駆物質が開示されている。このPCT公報では、これらの人工RNA先駆物質をコードする核酸分子を、適切な制御配列を持つインビボの細胞内に導入することにより、人工RNA先駆物質の発現が時間的および空間的のどちらでも選択的に、すなわち、特定の時点で、および／または特定の組織、器官、または細胞で制御できることが教示されている。
【００８０】
国際特許出願公開第WO 02/44321号では、長さ19〜23 ntの二本鎖RNA（dsRNA）により、ショウジョウバエインビトロ系で配列特異的転写後遺伝子抑制が誘発されることが開示されている。このPCT公報では、siRNA二重鎖は、長鎖dsRNAからRNase III様の処理反応により、または可溶化液中で効率的な標的RNA切断を媒介するオーバーハングした3′端を持つ化学的に合成したsiRNA二重鎖により生成ができ、ここで切断部位は、案内となるsiRNAの長さにあたる領域の中心付近に位置することが教示されている。また、このPCT公報では、dsRNA処理の方向によって、センスまたはアンチセンスが同一の標的RNAが生成されたsiRNA複合体により切断可能であるかどうかが決定される証拠も提供されている。長さの効果、二次的な構造、糖骨格およびsiRNAのRNA干渉に対する配列特異性の系統的分析が、siRNA設計を支援するために開示されている。さらに、効力のサイレンシングは、19塩基対標的配列の5′および3′領域のGC含量と相関することが示されている。GC含量の多い5′およびGC含量の少ない3′を持つ配列を標的としたsiRNAが、最も機能性が高いことが分かった。より詳細な考察については、『Elbashir et al., 2001, EMBO J. 20:6877-6888』および『Aza-Blanc et al., 2003, Mol. Cell 12:627-637』に記載があり、それぞれの全文を参照により本書に組み込む。
【００８１】
本発明は、mTORを標的とし、又はmTORC1及び/若しくはmTORC2の他の成分を標的とすることにより、下記のようにウイルスの複製を阻害する、siRNAを提供する。感染性HCMVの収率を低下させるための、5'- GAGUUAC AGUCGGGC AUAU-3'の配列を有するsiRNAの使用を、本明細書中で例示する。
【００８２】
さらに、siRNA設計アルゴリズムがPCT公報WO 2005/018534 A2およびWO 2005/042708 A2に開示されており、それぞれの全文を参照により本書に組み込む。特に、国際特許出願公開第WO 2005/018534 A2号には、その標的遺伝子に対する部分的配列相同性を持つsiRNAを使用した遺伝子サイレンシングのための方法および組成が開示されている。この出願では、遺伝子を標的とした異なるsiRNAへの共通の反応および／または差異的な反応を識別する方法が提供されている。またこの出願では、siRNAにある2つの鎖の相対活量を評価する方法が提供されている。さらにこの出願では、siRNAを疾患の治療のための治療薬として使用する方法が提供されている。国際特許出願公開第WO 2005/042708 A2号では、位置特異的スコア行列アプローチを使用して、転写物でsiRNA標的モチーフを識別するための方法が提供されている。また、位置特異的スコア行列アプローチを使用して、siRNAの標的外遺伝子を識別する方法が提供されている。この出願ではさらに、サイレンシング効力および特異性が改善され、また模範的なsiRNAのライブラリのあるsiRNAを設計する方法が提供されている。
【００８３】
本書に記載した方法でsiRNAを標的としうる標的酵素mRNA内の潜在的な配列を識別するために、設計ソフトウェアを使用できる。例えば、http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html（「Ambion siRNA Target Finder Software」）を参照。例えば、当該技術（GenBank受入番号NM_004958）で知られているmTORのヌクレオチド配列を、Ambion siRNA Target Finder Software（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）に入力すると、ソフトウェアにより、mTOR発現を下方制御することによりmTOR活性を抑制するためのアッセイで使用しうる潜在的なmTOR標的配列および対応するsiRNA配列が識別される。この方法を使用して、mTORを抑制するためのACC1標的配列（5’〜3’）および対応するセンス鎖およびアンチセンス鎖siRNA配列（5’〜3’）の非限定的な例が特定されており、これを下記に記載する。
【００８４】
一定の実施態様において、化合物は標的酵素(例えばmTOR、mTORと相互作用するタンパク質、又はmTORの活性を調節するタンパク質等)の発現を抑制するのに効果的なsiRNAで、ここで、siRNAは、標的酵素mRNAのセンス配列から構成される第一の鎖および標的酵素のセンス配列の補体から構成される第二の鎖から構成され、またここで、第一および第二の鎖は、長さ約21〜23のヌクレオチドである。一部の実施態様において、siRNAは、それぞれ長さ約17、18、19、または20のヌクレオチドである標的酵素mRNAのセンス配列および補体配列から構成される第一および第二の鎖で構成される。
【００８５】
RNAi分子（例えば、siRNA、shRNA、miRNA）は、部分的または完全に二本鎖にすることも、また鎖当たり、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、および少なくとも50以上のヌクレオチドの断片を含むこともできる。RNAi分子（例えば、siRNA、shRNA、miRNA）は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、または少なくとも4のヌクレオチドの3′オーバーハングで構成することもできる。RNAi分子（例えば、siRNA、shRNA、miRNA）は、標的遺伝子発現を抑制する能力が維持される限り、使用者の希望する任意の長さとすることができる。
【００８６】
RNAi分子は、当業者に周知の任意の数の技術を使用して獲得することができる。一般に、RNAi分子の製造は、化学的合成的な方法により、または組み換え核酸技術により実行できる。dsRNAを調製する方法については、例えば、『Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 56), John Wiley & Sons, New York (2001)』、『Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.sup.rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (2001)』に記載があり、本書に記載した方法に採用することができる。例えば、RNAは、PCR生成物から転写した後、ゲル精製をすることができる。当該技術で知られているPCRテンプレートからのRNAのインビトロ転写の標準的な手順。例えば、dsRNAは、PCRテンプレートおよびAmbion T7 MEGASCRIPT、またはその他の類似したキット（テキサス州オースティン）を用いて合成でき、その後でRNAをLiClで沈殿させ、および緩衝液中に再懸濁させることができる。
【００８７】
細胞中のRNAi活性を検定するために、当業者に周知の任意の数の技術を採用することができる。例えば、RNAi分子を細胞に導入した上で、標的酵素の発現レベルを、当該技術で知られているアッセイ、例えば、ELISAおよび免疫ブロット法を使用して検定できる。また、標的酵素のmRNA転写物レベルは、当該技術で周知の方法、例えば、ノーザン分析アッセイおよび定量的リアルタイムPCRを使用して検定できる。さらに、標的酵素の活性は、当該技術で周知の方法および／または本書のセクション5.3に記載した方法で検定しうる。特定の実施態様において、RNAi分子により、標的酵素のタンパク質発現レベルが、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%低下する。一実施態様において、RNAi分子により、標的酵素のmRNA転写物レベルが、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95％低下する。特定の実施態様において、RNAi分子により、標的酵素の酵素活性が、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95％低下する。
【００８８】
2. 小胞体ストレス応答の阻害剤
一つの態様において、本発明は、哺乳類の対象におけるウイルス感染を治療又は防止する方法を提供し、当該方法は、小胞体ストレス応答(UPR)を阻害する治療有効量の化合物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。一つの態様において、当該阻害剤は、ウイルス感染を治療又は予防するために、mTOR阻害剤と組み合わせられる。
【００８９】
ウイルスにコードされる糖タンパク質の合成を含む、ウイルスタンパク質の合成は、感染の進行を劇的に増大させる。糖タンパク質の合成が、細胞がこれらのタンパク質を適切に折り畳み、輸送する許容量を越えると、その細胞は、小胞体ストレス応答、又はUPRと称される、ストレス応答を誘導する。UPRが細胞のストレスを解消する機構は、複数の側面を有する。それらは、シャペロンタンパク質の発現の増大、細胞ストレスを解消するタンパク質の発現の増大、及びタンパク質合成の速度の低下を含む。総合すると、これらのUPRイベントは、細胞のホメオスタシスの維持の役割を果たす。ストレスが存在して、UPRが存在しない場合、細胞は、細胞死に至る一連のイベントを誘導する。故に、一つの態様において、本発明の化合物は、化学シャペロンとして働き、UPRを阻害する。そのような化学シャペロンの一例として、4-フェニルブチレート(4-PBA)が挙げられる。他の化学シャペロンとして、タウロウロデオキシコール酸(TUDCA)、トリメチルアミントリオキシド(TMO)及びベタインが挙げられる。
【００９０】
哺乳類におけるウイルス感染を治療又は防止するのに使用されるUPRの阻害剤の好ましい用量は、<100mg/kg、<50mg/kg、<20mg/kg、<10mg/kg、<5mg/kg、<2mg/kg、<1mg/kg、<0.5mg/kg、<0.2mg/kg、<0.1mg/kg、<0.05mg/kg、<0.02mg/kg、又は<0.01mg/kgである。哺乳類におけるウイルス感染を治療又は防止するのに使用されるUPRの阻害剤の好ましい用量は、全血清濃度で、<100μM、<50μM、<20μM、<10μM、<5μM、<1μM、<500nM、又は<250nMである。
【００９１】
また、抗ウイルス活性を有するのが望ましい細胞培養に関連する生成物における、UPRの阻害剤の使用を提供する。一つの態様において、UPRの阻害剤は、細胞培養培地に添加される。細胞培養培地に使用されるUPRの阻害剤として、対象の治療において強すぎる毒性が認められない化合物が挙げられる。
【００９２】
3.mTOR阻害剤と小胞体ストレス応答阻害剤の組合せ
一つの態様において、本発明は、治療有効量の、mTORの阻害剤である、第一の化合物又はその相対物、類似物、若しくは誘導体、及び小胞体ストレス応答の阻害剤である、第二の化合物又はその相対物、類似物、若しくは誘導体の組合せを、それを必要とする対象に投与する工程を含む、哺乳類におけるウイルス感染を治療又は防止する方法を提供する。一つの態様において、UPRの阻害剤との組合せに使用されるmTOR阻害剤は、mTORの特異的阻害剤である。他の態様において、mTOR阻害剤は、XL765、PI-103、PF-4691502、LY294002、及びLOR-220等の、他のタンパク質キナーゼに対する顕著かつ特異的な活性が低いものである。他の態様において、mTORの阻害剤は、mTORのラパマイシン耐性機能、mTORのラパマイシン感受性機能、又はそれらの両方を阻害する。
【００９３】
よって、セクション1に記載されたmTOR阻害剤に加えて、UPRの阻害剤と組み合わせて使用出来るmTOR阻害剤として、ラパマイシン及びそのアナログ(ラパログ)、例えば：ノルラパマイシン、エベロリムス(everolimus)、テムシロリムス(temsirolimus)(CCI-779)、リダフォロリムス(ridaforolimus)(AP23573)、ゾタロリムス(zotarolimus)、デオキソラパマイシン、デスメチルラパマイシン、デスメトキシラパマイシン、AP22594、28-エピ-ラパマイシン、24,30-テトラヒドロ-ラパマイシン、リダフォロリムス(AP23573)、トランス-3-アザ-ビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2-カルボン酸ラパマイシン、ABT-578、SDZRAD、AP20840、AP23464、AP23675、AP23841、AP24170、TAFA93、40-O-(2-ヒドロキシエチル)-ラパマイシン、32-デオキソラパマイシン、16-ペント-2-イニロキシ-32-デオキソラパマイシン、16-ペント-2-イニロキシ-32(S又はR)-ジヒドロ-ラパマイシン、16-ペント-2-イニロキシ-32(S又はR)-ジヒドロ-40-O-(2-ヒドロキシエチル)-ラパマイシン、40-[3-ヒドロキシ-2-(ヒドロキシ-メチル)-2-メチルプロパノエート]-ラパマイシン(CC1779)、40-エピ-(テトラゾリル)-ラパマイシン(ABT578)、TAFA-93、ビオリムス(biolimus)-7、ビオリムス-9、ビオリムスA9及びそれらの組合せ等が挙げられる。
【００９４】
本明細書中で使用されるとき、対象に2つ以上の治療剤を投与する文脈における、「組合せ」という用語は、2つ以上の治療剤(例えば2つ以上の予防剤及び/又は治療剤)の使用を意味する。用語「組合せ」の使用は、治療剤がウイルス感染した患者に投与される順番を限定しない。第一の治療剤(例えば第一の予防剤又は治療剤)が、ウイルス感染した患者に投与されるのは、第二の治療剤の投与の前(例えば5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、又は12週前)、同時、又は後(5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、又は12週後)であってもよい。
【００９５】
mTORの阻害剤を特定するスクリーニング試験法
mTORのラパマイシン耐性機能の阻害剤であると知られている化合物は、当該技術で知られているかおよび／または下に記載したアッセイ（例えば、セクション5.4以降を参照）を使用して、抗ウイルス活動のスクリーニングを直接行うことができる。随意ではあるが、当業者に周知のアッセイおよび／または下記を使用して、こうした阻害剤の誘導体または同属種、またはその他任意の化合物を、mTOR機能の調節の能力について検定することができる。これらのmTOR昨日を調節することが分かっている化合物は、抗ウイルス活動についてさらに検定することができる。
【００９６】
別の方法として、化合物は抗ウイルス活動について直接的に検定できる。抗ウイルス活性を示すそれらの化合物、または抗ウイルス性があるが、許容できない特異性または毒性を持つことが知られているそれらの化合物を、mTOR阻害活性に対してスクリーニングすることができる。酵素標的を調節する抗ウイルス化合物は、活性プロファイルが改善されるように最適化することができる。
【００９７】
mTORキナーゼ活性に関する化合物を試験するアッセイは、当該技術分野で公知である(例えば、Yu et al. Cancer Res. (2009) 69:6232-6240; Thoreen et al, J. Biological Chemistry (2009) 284:8023-8032; Reichling et al. J. Biomol Screen. (2008) 13:238-244を参照されたい)。
【００９８】
mTORキナーゼ活性を阻害する化合物の選択性を判定するため、前記化合物は、表1に列挙されている1つ以上のキナーゼ等の一連のキナーゼのキナーゼ活性の阻害について試験され得る。
【表１】
2013500265.tif 000022
タンパク質キナーゼ、例えばセリン/スレオニンキナーゼ、及び脂質キナーゼ、例えばPI3K等の阻害を試験する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Zask et al. J. Med. Chem. (2008) 51 :1319-1323; Yu et al. Cancer Res. (2009) 69:6232-6240; Thoreen et al., J. Biological Chemistry (2009) 284:8023-8032を参照されたい)。
【００９９】
例えば、脂質キナーゼアッセイは、Thoreen et al., J. Biological Chemistry (2009) 284:8023-8032に記載されている。反応は、様々な量の阻害剤、並びに、10 μM ATP、2 mM DTT及びキナーゼに特異的な緩衝剤及び基質が用いられ、三回実施される。P110α/p85α、p110β/p85α及びp110γには、50 μM PIP2:PS脂質キナーゼ基質が使用出来る。P110δ/p85αには、100 μM PIP2:PS脂質キナーゼ基質が使用出来る。PI3K-C2α及びPI3K-C2βには、100 μM PI脂質キナーゼ基質が使用出来る。hVPS34には、100 μM PLPS脂質キナーゼ基質が使用出来る。P110δ/p58α、p110β/p85α、p110δ/p85α、PI3K-C2α、及びPI3K-C2β用の緩衝剤は、50 mM Hepes pH 7.5、3 mM MgCl2、1 mM EGTA、100 mM NaCl、及び0.03% CHAPSである。hVPS34用の緩衝剤は、50 mM Hepes pH 7.3、0.1% CHAPS、1 mM EGTA、及び5 mM MnCl2である。p110α/p85α、p110β/p85α、p110δ/p58α、p1lOγ、PI3K-C2α、PI3K-C2β、及びhVPS34の酵素濃度は、それぞれ0.12、4.5、0.79、3.5、6.3、42、及び2.8 nMである。室温で1時間置いた後、12 nM Alexa Fluor647（登録商標)ADP Tracer、6 nM AdaptaTM Eu-抗-ADP抗体、20 mM Tris pH 7.5、0.01% NP-40、及び30 mM EDTAを含有する、5μLの検出混合物を添加する。30分後、プレートを、Tecan InfiniTE(登録商標)F500又はBMG PHERAstarプレートリーダーで読取ることが出来る。に適した装置の設定は、340nmでの励起後665及び615nmでの放出測定、時間差100μs、及び積分時間200μsとする。一次放出率(raw emission ratio)(665nmでの放出÷615nmでの放出)の値を、ヌクレオチド(ATP:ADP)標準曲線を使用して、生産物の形成率(ATPの生産%)に変換する。化合物の濃度対生産物形成率のプロットから、IC50値を計算する。
【０１００】
mTORのラパマイシン耐性機能に関連する任意の宿主細胞酵素は、抗ウイルス治療のための潜在的標的として意図されている。さらに、細胞の転写活性の調節に直接的または間接的に役割を持つ、その他の宿主細胞酵素は、抗ウイルス治療のための潜在的標的として意図される。
【０１０１】
本発明の一部の実施態様において、化合物により、酵素の活性が増加する（例えば、mTORの負の調節因子である酵素は、潜在的な抗ウイルス性の化合物によりその活性を増加させうる）。特定の実施態様において、化合物により、酵素の活性が、少なくともおよそ10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90％増加する。一部の実施態様において、化合物により、酵素の活性が低下する。特定の実施態様において、化合物により、酵素の活性が、少なくともおよそ10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または100%低下する。一定の実施態様において、化合物により、単一の酵素が排他的に調節される。一部の実施態様において、化合物により、1つの酵素が他に比べて大きな度合いで調節されるかもしれないが、複数の酵素が調節される。本書に記載した標準的な酵素活性アッセイを使用して、化合物の活性を特性づけできる。一実施態様において、化合物は特定の酵素の不可逆的な阻害または活性化を示す。一部の実施態様において、化合物は酵素を可逆的に抑制または活性化する。一部の実施態様において、化合物は酵素の動態を変化させる。
【０１０２】
一実施態様において、例えば、試験化合物および宿主標的酵素の間の相互作用の評価には、（i）試験化合物の酵素に対する結合の評価、（ii）酵素の生物活性の評価、（iii）試験化合物の存在下および不在下での酵素の酵素活性（例えば、キナーゼ活性）の評価のうち、1つ以上が含まれる。インビトロでの接触には、試験化合物、酵素、任意の必要な補助因子（例えば、ビオチン）またはエネルギー源（例えば、ATP、または放射標識したATP）、基質（例えば、アセチル-CoA、糖、ポリペプチド、ヌクレオシド、または標識の有無によらずその他任意の代謝生成物）が含まれる反応混合物の形成、および基質の生成物への変換の評価が含まれうる。生成物の形成の評価には、例えば、炭素またはリン酸塩（例えば、化学的に、または標識、例えば、放射標識を使用して）の移動の検出、反応生成物の検出、第一の反応に依存した二次的な反応の検出、または基質の物理的性質（例えば、分子量、電荷、またはpIの変化）の検出などが含まれうる。
【０１０３】
スクリーニング試験法に使用するための標的酵素は、天然原料、例えば、細胞、脂肪細胞（例えば、脂肪組織）から構成される組織または器官、肝臓、等から精製できる。別の方法として、標的酵素は、任意の数の異なる組み換えDNA発現系で発現でき、また大量に獲得でき、生物活性について検定できる。組み換えバクテリアの細胞（例えば、大腸菌の発現について、細胞は、任意の数の適切な培養液（例えばLB）中で成長し、および組み換えポリペプチドの発現は、IPTGを培養液に加えることで、または培養を高い温度に切り換えることで誘発される。さらにバクテリアを2時間〜24時間の間で培養した後、細胞は遠心分離で回収され、洗浄して残留した培養液が除去される。次に、バクテリアの細胞を、例えば細胞破砕機内での分裂により溶解させ、遠心分離して、高密度の封入体および細胞膜を可溶性の細胞成分から分離する。この遠心分離は、蔗糖などの糖類を緩衝液に取り込み、および選択的な速度で遠心分離することで、高密度の封入体が選択的に濃縮される条件下で実施できる。組み換えポリペプチドが封入内で発現される場合、これらは、いくつかあるうちどれかの溶液中で洗浄し、汚染する宿主タンパク質の一部を除去した後、βメルカプトエタノールまたはDTT（ジチオスレイトール）などの還元剤の存在下で、高濃度の尿素（例えば、8 M）または塩酸グアニジンなどのカオトロピック剤が含まれる溶液に可溶化することができる。この段階で、ポリペプチドがリフォールディングプロセスを起こして、天然のポリペプチドとより厳密に類似した高次構造となるために適切な条件下で、ポリペプチドを数時間培養することが有益となりうる。こうした条件には、一般に、低ポリペプチド（濃度が500 mg/ml未満）、低レベルの還元剤、2 M未満の濃度の尿素、また時には、タンパク質分子内でのジスルフィド結合の交換を促進する還元型および酸化型のグルタチオンの混合物などの試薬の存在が含まれる。リフォールディングプロセスは、例えば、SDS-PAGEにより、または天然の分子に特異的な抗体を用いて監視することができる。リフォールディングに続き、ポリペプチドは、イオン交換樹脂、ゲル透過樹脂などいくつかあるうちどれかの担体上で、または各種のアフィニティーカラム上で、クロマトグラフィーにより、さらに精製してリフォールディングする混合物から分離できる。宿主細胞を発現したポリペプチド、またはその断片の分離および精製は、限定はされないものの、調製用クロマトグラフィーおよび単クローン性または多クローン性の抗体が関与する免疫学的分離を含む従来の手段により実施できる。これらのポリペプチドは、組み換えDNA技術によるなどを含め多様な方法で生成して、本発明の目的で化合物をスクリーニングするために有用な純粋で生物学的に活性の標的酵素の大規模製造が可能となる。別の方法として、スクリーニングの対象となる標的酵素は、細胞ライゼート中またはその他の溶液または混合物中で、部分的に精製または検定しうる。
【０１０４】
基質および生成物のレベルは、インビトロの系内、例えば、生化学的抽出物内、例えば、タンパク質の抽出物内で評価できる。例えば、抽出物には、可溶性のすべてのタンパク質またはタンパク質の部分集合（例えば、70%または50%のアンモニウム硫酸塩切片）、標的酵素を含む部分集合として定義されたタンパク質の有用な部分集合が含まれうる。試験化合物の効果は、例えば、試験化合物を含む反応で、かつ試験化合物を含まない並行した制御反応で、基質および生成物のレベルを時間経過の開始時点で測定し、そのレベルを予定時間（例えば、0.5時間、1時間、または2時間）経過後と比較することで評価できる。これは、インビトロでの基質と生成物の比率に対する試験化合物の影響を判断する1つの方法である。反応率は、それぞれの培養についての反応時間に対して取り込んだ放射能またはその他の標識の線形回帰分析により入手できる。KMおよびVmaxの値は、初期速度の非線形回帰分析により、標準的なアンリ-ミヒャエリス-メンテン方程式に従い決定できる。kcatは、Vmax値を、例えば、比色タンパク質測定（例えば、Bio-RADタンパク質試験法、ブラッドフォード法、ローリー法）により導き出された酵素の反応濃度で割ることで入手できる。一実施態様において、化合物は標的酵素を不可逆的に不活性化する。別の実施態様において、化合物は標的酵素を可逆的に抑制する。一部の実施態様において、化合物は拮抗阻害により標的酵素を可逆的に抑制する。一部の実施態様において、化合物は非拮抗阻害により標的酵素を可逆的に抑制する。一部の実施態様において、化合物は不拮抗阻害により標的酵素を可逆的に抑制する。さらなる実施態様において、化合物は混合型阻害により標的酵素を抑制する。化合物による阻害の機序は、当業者に周知の標準的なアッセイにより決定できる。
【０１０５】
位相分割系を利用した酵素活性の定量的測定の方法が、米国特許第6,994,956号に記載されており、この全文を参照により本書に組み込む。特に、放射標識した基質およびその反応の生成物は、水相および非混合性のシンチレーション流体を含む有機相に差別的に分離され、放射標識を含む有機可溶部分を生成物分子に取り込む（信号試験法の利得）、または放射標識を含む有機可溶部分を基質分子から欠失させる（信号試験法の欠失）のいずれかにより酵素活性が評価される。シンチレーションは、放射性核種が有機の閃光体（scintillant）を含む相であるときにのみ検出される。こうした方法は、標的酵素の活性を抑制する化合物の能力の試験に採用できる。
【０１０６】
細胞アッセイを採用することもできる。模範的な細胞試験法には、試験化合物を培養細胞（例えば、哺乳類の培養細胞、例えば、ヒト培養細胞）に接触させ、次に、例えば、本書に記載した任意の方法、例えば逆相HPLC、LC-MS、又はLC-MS/MS等を使用して細胞内での基質および生成物のレベルを評価する方法が含まれる。
【０１０７】
基質および生成物のレベルは、例えば、NMR、HPLC（例えば、『Bak, M. I., and Ingwall, J. S. (1994) J. Clin. Invest. 93, 40-49』を参照）、質量分析法、薄層クロマトグラフィー、または放射標識した成分（例えば、キナーゼ試験法用に放射標識したATP）の使用により評価できる。例えば、31P NMRを使用してATPおよびAMPのレベルを評価できる。一実施において、細胞および／または組織を、10mm NMR試料チューブ内に配置し、89 cmの穴付の9.4-Tesla超電導磁石内に位置する1H/31P二重同調プローブに挿入することができる。希望に応じて、細胞は、スキャンに指標を付けるために、明確なピークのある物質と接触させることができる。6つの31P NMRスペクトル（それぞれ104の自由誘導減衰を平均した信号により得られる）は、GE-400 Ω NMR分光計（Bruker Instruments、米国カリフォルニア州フリーモント）を用いて、フリップ角60°、パルス15ミリ秒、遅延2.14秒、掃引幅6,000 Hz、およびデータ点2048個を使用して収集することができる。スペクトルは、20-Hz指数乗算および0次および1次位相修正を使用して分析される。共振ピーク領域は、NMR1ソフトウェア（New Methods Research Inc.、米国ニューヨーク州シラキュース）を使用して、ローレンツ型線形により、当てはめることができる。完全緩和スペクトル（再循環時間：15秒）および部分的飽和スペクトル（再循環時間：2.14秒）のピーク領域を比較することで、ピークについて飽和の補正因子を計算できる。ピーク領域は、細胞および／または組織の重さまたは数に対して基準化し、任意の面積単位で表現できる。例えば、ATPおよびAMPのレベルなど評価の別の方法には、抽出物を形成するための試料内での細胞の溶解、および逆相HPLCによる抽出物の分離（260 nmで吸光度を監視）が含まれる。
【０１０８】
別のタイプのインビトロでの試験法では、第一の酵素経路構成要素と第二の酵素経路構成要素との間の相互作用を調節する試験化合物の能力を評価する。このタイプの試験法は、標識化した構成要素の第二の経路構成要素に対する結合が、複合体において標識化した化合物を検出することで決定できるように、例えば、成分の1つを放射性同位元素または酵素ラベルと結合させることで達成できる。酵素経路構成要素は、125I、35S、14C、または3H、および放射放出の直接計数により、またはシンチレーション計数により検出される放射性同位元素直接的または間接的に標識化できる。別の方法として、構成要素は、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、またはルシフェラーゼ、および適切な基質の生成物への変換の決定により検出される酵素ラベルにより酵素的に標識化できる。拮抗アッセイを使用して、試験化合物と標的との間の物理的相互作用を評価することができる。
【０１０９】
可溶性および／または膜結合型の単離したタンパク質（例えば、酵素経路構成要素およびその受容体またはその生物学的に活性のタンパク質）を本発明の無細胞アッセイで使用できる。酵素の膜結合型を使用するとき、可溶化剤を利用することが望ましい。こうした可溶化剤の例には、n-オクチルグルコシド、n-ドデシルグルコシド、n-ドデシルマルトシド、オクタノイル-N-メチルグルクアミド、デカノイル-N-メチルグルクアミド、トリトンX-100、トリトンX-114、テシット、イソトリデシルポリ(エチレングリコールエーテル)n、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンミニオ]-1-プロパンスルホナート（CHAPS）、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンミニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホナート（CHAPSO）、またはN-ドデシル-N、N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホナートなどの非イオン性洗浄剤が含まれる。別の例において、酵素経路構成要素（例えば、AMPKの場合にGLUT-4）は、薄膜（例えば、リポソームまたはその他の小胞）内に存在できる。
【０１１０】
無細胞アッセイには、標的酵素および試験化合物が相互作用および結合して、除去および／または検出ができる複合体を形成するために十分な条件下、および時間での、この2つの成分の反応混合物の調製が関与する。一つの態様において、前記標的酵素は、1つ以上、そして通常数百又は数千個の試験化合物を含有する溶液と混合される。いずれかの結合した試験化合物を含む前記標的酵素は、例えばサイズ排除クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等により、結合していない(即ち遊離状態)試験化合物から分離される。前記標的と結合した試験化合物は、有機溶媒中で酵素を変性させる等により、標的酵素から分離され、そしてそれらの化合物は、LC-MS/MS等の適切な解析手段により同定される。
【０１１１】
2つの分子（例えば、標的酵素および試験化合物）の間の相互作用は、例えば、少なくとも1つの分子が例えば蛍光的に標識化されている蛍光性試験法を使用して検出して、試験化合物と標的酵素との間の相互作用を評価することもできる。こうした試験法の一例には、蛍光性エネルギー移動（蛍光共鳴エネルギー移動のFETまたはFRET）が含まれる（例えば、『Lakowicz et al.』、米国特許第5,631,169号、『Stavrianopoulos, et al.』、米国特許第4,868,103号を参照）。第一の「ドナー」分子のフルオロフォア標識は、その放出された蛍光エネルギーが、第二の「アクセプター」分子の蛍光標識により吸収され、吸収されたエネルギーにより今度はこれが蛍光を発することができるように選択される。別の方法として、タンパク質性の「ドナー」分子は、単にトリプトファン残基の自然の蛍光エネルギーを利用することもできる。ラベルは、「アクセプター」分子の標識を「ドナー」の標識から区別しうるように、異なる光の波長を発するものが選択される。ラベル間でのエネルギー移動の効率は、分子を隔てる距離に関連するため、分子間の空間的関係が評価できる。結合が分子間で発生する場合には、この試験法での「アクセプター」分子標識の蛍光放出は、最大値とすべきである。FET結合事象は、当該技術でよく知られた標準的な蛍光定量的検出手段（例えば、蛍光分光計の使用）によって都合よく測定できる。
【０１１２】
蛍光性試験法の別の例は、蛍光偏光（FP）である。FPでは、1つの構成要素のみを標識化する必要がある。結合相互作用は、標識化した構成要素の分子サイズの変化により検出される。サイズの変化により、溶液中の構成要素の反転率が変化し、FPの変化として検出される。例えば、『Nasir et al. (1999) Comb Chem HTS 2:177-190』、『Jameson et al. (1995) Methods Enzymol 246:283』、『Anal Biochem. 255:257 (1998)』を参照。蛍光偏光は、マルチウェルプレートで監視できる。例えば、『Parker et al. (2000) Journal of Biomolecular Screening 5 :77-88』、および『Shoeman, et al.. (1999) 38, 16802-16809』を参照。
【０１１３】
別の実施態様において、目標の分子を結合する標的酵素の能力の判断は、リアルタイムの生体分子相互作用分析（BIA）を用いて達成できる（例えば、『Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345』および『Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705』を参照）。「表面プラズモン共鳴」または「BIA」は、どの反応体（例えば、BIAcore）も標識化することなく、生物特異性相互作用をリアルタイムで検出する。結合表面での質量の変化（結合事象を表示）は、表面付近での光の屈折率の変化（表面プラズモン共鳴（SPR）の光学的現象）をもたらし、結果的に、生体分子間のリアルタイムの反応の指標として使用できる検出可能な信号が発生する。
【０１１４】
一実施態様において、標的酵素は、固相に固定される。固相上に固定された標的酵素／試験化合物の複合体は、反応、例えば、結合反応の終わりに検出できる。例えば、標的酵素は、固体の表面に固定させることができ、また試験化合物（これは固定されない）は、本書で考察した検出可能ラベルにより直接的または間接的に標識化できる。
【０１１５】
一方または両方のタンパク質について非複合型からの複合型の分離を促すために、また、試験法を自動化するための便宜を図るために、標的酵素または抗標的酵素抗体のいずれかを固定することが望ましいともいえる。標的酵素への試験化合物の結合、または化合物候補の存在下や不在下での標的酵素の第二の構成要素との相互作用は、反応物質を含むために適切な任意の容器内で達成できる。こうした容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心チューブが含まれる。一実施態様において、一方または両方のタンパク質が基質に結合できるようにするドメインを追加する融合タンパク質を提供できる。例えば、グルタチオン-S-転移酵素／標的酵素融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical、米国ミズーリ州セントルイス）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸収させ、次にこれを試験化合物または試験化合物と非吸収性の標的酵素のどれかと混合し、その混合物を複合体の生成を助長する条件下（例えば、塩およびpHについて生理学的条件）で培養することができる。培養の後、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄し、未結合の成分があれば除去し、ビーズの場合には基質を固定化し、および複合体を直接的または間接的に、例えば上記のとおりに決定する。別の方法として、複合体は、基質から解離することができ、また標的酵素の結合または活性のレベルは、標準技術を使用して決定される。
【０１１６】
標的酵素または試験化合物のいずれかを基質に固定化するその他の技術には、ビオチンおよびストレプトアビジンの接合の使用が含まれる。ビオチン化した標的酵素または試験化合物は、当該技術で知られている技術（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemical、イリノイ州ロックフォード）を用いて、ビオチン-NHS(N-ヒドロキシ-スクシニミド)から準備でき、ストレプトアビジン-被覆した96ウェルプレートのウェル（Pierce Chemical）に固定化される。
【０１１７】
この試験法を実施するために、固定化されていない構成要素が、固定させた構成要素を含む被覆した表面に追加される。反応が完了した後、形成された任意の複合体が固体表面上に固定されたまま残るような条件下で、未反応の成分が除去される（例えば、洗浄による）。固体表面上に固定化した複合体の検出は、多数の方法で達成できる。それ以前に固定化されていなかった構成要素が前標識されている場合、表面に固定化された標識が検出されると、複合体が形成されたことを示す。それ以前に固定化されていなかった構成要素が前標識されていない場合には、間接的な標識を使用して、表面に固定させた複合体の検出をすることができ、これには例えば、固定化した構成要素に特異的な標識化した抗体を使用するなどがある（この抗体が今度は、例えば、標識化されたアンチ-Ig抗体などによって直接的に標識化または間接的に標識化することができる）。
【０１１８】
一実施態様において、この試験法は、抗体の標的酵素との反応性を利用して実施されるが、標的酵素の試験化合物および／または基質との結合を干渉することはない。こうした抗体によって、プレートのウェルに誘導体化でき、ウェルに捕捉された標的酵素が抗体の結合により開放される。こうした複合体を検出する方法には、GST-固定化した複合体について上記に記載したものに加え、抗体の標的酵素との反応性を使用した複合体の免疫検出、および標的酵素に関連した酵素活性の検出に依存した酵素結合アッセイが含まれる。
【０１１９】
別の方法として、無細胞アッセイを液相で実施できる。こうした試験法において、反応生成物が、多数の標準技術のどれかにより、未反応の成分から分離されるが、この技術には、限定されないものの、分画遠心法（例えば、『Rivas, G., and Minton, A. P., (1993) Trends Biochem Sci 18:284-7』を参照）、クロマトグラフィー（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）、電気泳動法（例えば、『Ausubel, F. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: New York』を参照）、および免疫沈降（例えば、『Ausubel, F. et al., eds. (1999) Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley: New York』を参照）がある。こうした樹脂およびクロマトグラフ技術は、当業者に知られている（例えば、『Heegaard, N. H., (1998) J Mol Recognit 11:141-8』、『Hage, D. S., and Tweed, S. A. (1997) J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 699:499-525』を参照）。さらに、蛍光性エネルギー移動も、複合体を溶液からそれ以上精製することなく結合を検出するために、本書に記載のとおり、好都合に利用される。
【０１２０】
1つの望ましい実施態様において、試験法には、標的酵素またはその生物学的に活性な部分を標的酵素と結合する既知の化合物と接触させて、試験法の混合物を形成する手順、試験法の混合物を試験化合物と接触させる手順、および標的酵素と相互作用する試験化合物の能力を決定する手順が含まれ、ここで、標的酵素と相互作用する試験化合物の能力を決定する手順には、試験化合物を標的酵素に優先的に結合するか、または標的酵素の活性を調製する能力を、既知の化合物と比較して決定する手順が含まれる（例えば、拮抗実験法）。別の実施態様において、試験化合物の標的酵素に結合しその活性を調節する能力が、そうした標的酵素の既知の活性化剤または阻害剤と比較される。
【０１２１】
本発明の標的酵素は、1つ以上の細胞またはタンパク質など細胞外の高分子とインビボで相互に作用することができるが、これらは宿主細胞にとって異質であるか、宿主細胞に内在し、また組み換え型として発現されていても、またそうでなくてもよい。この考察の目的で、こうした細胞および細胞外の高分子は、本書では「結合パートナー」と呼ぶ。こうした相互作用を妨害する化合物は、標的酵素の活性の調節において有用でありうる。こうした化合物には、限定されないものの抗体、ペプチド、および小分子などの分子が含まれうる。別の一実施態様において、本発明は、こうした標的酵素の下流エフェクターの活性を調節することによって試験化合物の標的酵素の活性を調節する能力を決定する方法を提供する。例えば、該当する標的に対するエフェクター分子の活性、また該当する標的に対するエフェクターの結合は、前述のとおりに決定できる。
【０１２２】
標的酵素およびその細胞または細胞外の結合パートナーの間の相互作用に干渉する化合物を特定するために、標的酵素および結合パートナーを含む反応混合物は、2つの生成物が複合体を形成できるような条件下およびそれに十分な時間で調製される。抑制化合物を試験するために、反応混合物は、試験化合物の存在下および不在下で提供される。試験化合物は、最初から反応混合物に含めることも、標的およびその細胞または細胞外の結合パートナーを追加した後で追加することもできる。制御反応混合物は、試験化合物なしで、またはプラシーボとともに培養される。その後、標的生成物と細胞または細胞外の結合パートナー間での何らかの複合体の生成について検出される。試験化合物を含む反応混合物においてではなく、制御反応における複合体の生成は、化合物が標的生成物および相互作用的な結合パートナーの相互作用に干渉することを示す。さらに、試験化合物および正常な標的酵素を含む反応混合物内での複合体生成も、試験化合物および突然変異体の標的酵素を含む反応混合物内での複合体生成と比較することができる。この比較は、正常な標的酵素ではなく突然変異体の相互作用を妨害する化合物の識別が望ましいケースでは重要なものとなりうる。
【０１２３】
本書に記載したアッセイは、不均一または均一な型で実施できる。不均一なアッセイには、標的酵素または結合パートナー、基質、または試験化合物のいずれかを固相に固着し、反応終了時に固相に固定した複合体を検出する手順が関与する。均一なアッセイでは、反応全体は、液相中で実施される。どちらのアプローチでも、反応物質を加える順序は、試験の対象の化合物についての異なる情報を得るために変化させることができる。例えば、標的酵素と結合パートナーまたは基質との間の相互作用に（例えば、拮抗により）干渉する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を実施することにより識別できる。別の方法として、前もって形成した複合体を妨害する試験化合物、例えば、複合体から成分の1つを置き換える高めの結合定数を持つ化合物は、複合体が形成された後に試験化合物を反応混合物に加えることにより検査することができる。様々な型について、以下に簡単に説明する。
【０１２４】
不均一なアッセイ系において、標的酵素または相互作用的な細胞または細胞外の結合パートナーまたは基質のいずれかが固体表面（例えば、マイクロタイタープレート）に固定される一方、固定させていない種は、直接的または間接的に標識化される。固定させた種は、非共有結合または共有結合により固定化できる。別の方法として、固定化する種に特異的な固定化した抗体を、固体表面に種を固着するために使用できる。
【０１２５】
この試験法を実施するために、固定化した種のパートナーは、試験化合物を用いて、または用いずに被覆した表面にさらされる。反応が完了した後、未反応の成分が除去され（例えば洗浄による）、形成された複合体は固体表面上に固定されたまま残る。固定化されなかった種が前標識されている場合、表面に固定化された標識が検出されると、複合体が形成されたことを示す。固定化されなかった種が前標識されていない場合には、間接的な標識を使用して、表面に固定させた複合体を検出することができ、これには例えば、固定化した種に特異的な標識化した抗体を使用するなどがある（この抗体が今度は、例えば、標識化された抗Ig抗体などで直接的に標識化または間接的に標識化することができる）。反応成分を加える順序に応じて、複合体の生成を抑制するか、またはあらかじめ形成された複合体を妨害する試験化合物が検出できる。
【０１２６】
別の方法として、反応は、液相中で、試験化合物、未反応の成分から分離した反応生成物、および検出された複合体の存在下または不在下で実施でき、例えば、溶液中に形成された任意の複合体を固着させるための、結合成分の1つに特異的な固定化した抗体、および固定させた複合体を検出するための、他のパートナーに特異的な標識化された抗体を使用するなどである。繰り返しになるが、反応物質を液相に加える順序に応じて、複合体を抑制するか、またはあらかじめ形成した複合体を妨害する試験化合物を識別できる。
【０１２７】
別の発明の一実施態様において、均質なアッセイを使用できる。例えば、標的酵素および相互作用的な細胞または細胞外の結合パートナー生成物または基質から成るあらかじめ形成された複合体は、標的酵素またはその結合パートナーまたは基質のいずれかが標識化されているが、複合体の生成のために標識により生成される信号は消滅した状態で調製される（例えば、イムノアッセイにこのアプローチを利用した米国特許第4,109,496号を参照）。あらかじめ形成された複合体からの種の1つと競合し、それを置き換える試験物質を加えることにより、上記背景の信号が生成されることになる。このように、標的酵素結合パートナーまたは基質接触面を妨害する試験化合物が識別される。
【０１２８】
またさらに別の一面で、標的酵素は、two-hybrid試験法またはthree-hybrid試験法（例えば、米国特許第5,283,317号、『Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232』、『Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054』、『Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924』、『Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696』、およびBrent、国際特許出願公開第WO94/10300）で、標的酵素に結合するか、または相互に作用し（「標的酵素結合タンパク質」または「標的酵素-bp」）、標的酵素経路活性に関与する他のタンパク質を識別するために「おとりのタンパク質」として使用できる。こうした標的酵素-bpは、例えば、標的酵素経路の下流要素として、標的酵素または標的酵素標的の活性化剤または阻害剤とすることができる。
【０１２９】
別の実施態様において、標的酵素の遺伝子発現の修飾因子が識別される。例えば、細胞または無細胞の混合物を化合物候補と接触させ、標的酵素mRNAまたはタンパク質の発現を化合物候補の不在下での標的酵素mRNAまたはタンパク質の発現レベルに対して評価する。標的酵素構成要素mRNAまたはタンパク質の発現が、化合物候補の存在下においてその不在下よりも大きいとき、その化合物候補は、標的酵素mRNAまたはタンパク質の発現の刺激物質として識別される。逆に、標的酵素mRNAまたはタンパク質の発現が、化合物候補の存在下においてその不在下よりも小さい（統計的に有意なだけ小さい）とき、化合物候補は、標的酵素mRNAまたはタンパク質の発現の阻害剤として識別される。標的酵素mRNAまたはタンパク質の発現レベルは、標的酵素mRNAまたはタンパク質を検出する方法により決定でき、例えば、これには、Westerns、Northerns、PCR、質量分析、2-Dゲル電気泳動などがあるが、これらはすべて当業者には周知のものである。
4.1  化合物
【０１３０】
関心のある化合物を、mTORの活性を調節する能力について試験することができる。別の方法として、こうした化合物がmTOR調節活性を持つものとして特定されたら、本明細書中で説明するとおり、その抗ウイルス活性についてさらに試験することができる。別の方法として、化合物は、抗ウイルス活性についてスクリーニングすることができ、また本書で説明したmTORスクリーニングアッセイを使用して任意に特性づけができる。
【０１３１】
加えて、mTOR調節活性を有するものとして同定された化合物は、更に、選択性について試験することが出来る。
【０１３２】
一実施態様において、高速大量処理スクリーニング法を使用して、多数の潜在的な治療用化合物（潜在的な修飾因子またはリガンド化合物）を含む、コンビナトリアルケミカルライブラリまたはペプチドライブラリ（例えば、公に利用できるライブラリ）が提供される。こうした「コンビナトリアルケミカルライブラリ」または「リガンドライブラリ」が次に、本明細書に記載したとおり、1つ以上のアッセイでスクリーニングされ、望ましい特性的な活性(例えばmTOR活性の阻害)を示すライブラリ構成要素（特定の化学物質種またはサブクラス）が特定される。こうして、特定された化合物は、従来的な「リード化合物」としての役目を果たすか、または潜在的または実際の治療薬としてそれ自体を使用することができる。
【０１３３】
コンビナトリアルケミカルライブラリは、化学合成または生物学的合成のいずれかにより、試薬などの多数の化学物質「基本要素」を組み合わせることにより生成された多様な化学物質を集めたものである。例えば、ポリペプチドライブラリなどの線形コンビナトリアルケミカルライブラリは、化学物質基本要素（アミノ酸）の組を所定の化合物の長さについて考えられるすべての方法で組み合わせることにより形成されたものである（すなわち、ポリペプチド化合物内のアミノ酸の数）。数百万の化学物質を、化学物質基本要素のこうしたコンビナトリアル混合によって合成できる。
【０１３４】
コンビナトリアルケミカルライブラリ準備およびスクリーニングについては、当業者にはよく知られている。こうしたコンビナトリアルケミカルライブラリには、限定されないものの、ペプチドライブラリが含まれる（例えば、米国特許第5,010,175号、『Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991)』および『Houghton et al., Nature 354:84-88 (1991)』を参照）。化学物質の多様性ライブラリを生成するためにその他の化学反応も使用できる。こうした化学反応には、限定されないものの、ペプトイド（例えば、PCT公報第WO 91/19735号）、コードされたペプチド（例えば、PCT公報第WO 93/20242号）、無作為なバイオ-オリゴマー（例えば、PCT公報第WO 92/00091号）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（『Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)』）、ビニローグ性ポリペプチド（『Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)』）、ブドウ糖足場材料を持つ非ペプチド性ペプチド模倣分子（『Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)』）、小規模化合物ライブラリの類似した有機合成（『Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)』）、オリゴカルバミン酸塩（『Cho et al., Science 261:1303 (1993)』）、および／またはホスホン酸ペプチジル（『Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)』）、核酸ライブラリ（Ausubel、BergerおよびSambrook（すべて上記）を参照）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば、米国特許第5,539,083号を参照）、抗体ライブラリ（例えば、『Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996)』およびPCT/US96/10287を参照）、炭水化物ライブラリ（例えば、『Liang et al., Science, 274:1520-1522 (1996)』および国際特許出願公開第WO 1997/000271号を参照）、低分子有機分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン、『Baum C&EN, January 18, page 33 (1993)』、イソプレノイド、米国特許第5,569,588号、チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号、ピロリジン、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号、モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号、ベンゾジアゼピン、米国特許第5,288,514号、およびこれに類するものを参照）が含まれる。分子ライブラリ合成のその他の例については、当該技術に、例えば、『DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909』、『Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422』、『Zuckermann et al. (1994) . J. Med. Chem. 37:2678』、『Cho et al. (1993) Science 261:1303』、『Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059』、『Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061』、および『Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233』に記載がある。
【０１３５】
一部の模範的なライブラリは、特定のリード化合物からの変異体の生成に使用される。1つの方法には、コンビナトリアルライブラリの生成が含まれ、ここでリード化合物の1つ以上の官能基が、例えば、誘導体化により変化する。こうして、コンビナトリアルライブラリには、共通の構造的特徴（例えば、足場（scaffold）や骨格(framework）を持つクラスの化合物が含まれうる。コンビナトリアルライブラリの準備用の装置は市販されている（例えば、357 MPS、390 MPS、Advanced Chem Tech、ケンタッキー州ルイビル、Symphony、Rainin、マサチューセッツ州ウォーバーン、433A Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ、9050 Plus、Millipore、マサチューセッツ州ベッドフォードを参照）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリはそれ自体が市販されている（例えば、ComGenex、ニュージャージー州プリンストン、Asinex、ロシア、モスクワ、Tripos, Inc.、ミズーリ州セントルイス、ChemStar, Ltd、ロシア、モスクワ、3D Pharmaceuticals、ペンシルバニア州エクストン、Martek Biosciences、メリーランド州コロンビア等を参照）。試験化合物は、生物学的ライブラリ、ペプチドライブラリ（ペプチドの機能性を持つ分子のライブラリであるが、酵素による劣化に対する抵抗性があるにもかかわらず生物活性を維持する新規の非ペプチドバックボーンを持つライブラリ、例えば、『Zuckermann, R. N. et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678-85』）を参照、空間的にアドレス可能な並列の固相または溶液の位相ライブラリ、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法、「1ビーズ1化合物」ライブラリ法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリ法から得ることもできる。生物学的ライブラリには、核酸ライブラリおよびタンパク質ライブラリが含まれる。一部の核酸ライブラリは、多様なセットのタンパク質（例えば、天然および人工のタンパク質）をコードし、その他は、例えば核酸アプタマーまたはリボザイムなどの機能的RNAおよびDNA分子を提供する。ペプトイドライブラリは、ペプチドライブラリに類似した構造が含まれるように作成できる。（『Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145』も参照）。タンパク質ライブラリは、発現ライブラリまたはディスプレイライブラリ（例えば、ファージディスプレイライブラリ）により生成することもできる。化合物のライブラリは、溶液中（例えば、『Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421』）、またはビーズ（『Lam (1991) Nature 354:82-84』）、チップ（『Fodor (1993) Nature 364:555-556』）、バクテリア（Ladner、米国特許第5,223,409号）、胞子（Ladner 米国特許第5,223,409号）、プラスミド（『Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869』）またはファージ（『Scot and Smith (1990) Science 249:386-390』、『Devlin (1990) Science 249:404-406』、『Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382』、『Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310』、Ladner上掲）上で提示することもできる。酵素は、コンビナトリアルケミカルライブラリまたはその他何らかの適切な出所から選択可能な化合物を特定するためにスクリーニングできる（『Hogan, Jr., Nat. Biotechnology 15:328, 1997』）。
【０１３６】
本明細書にある任意のアッセイ、例えば、インビトロでのアッセイまたはインビボでのアッセイは、個別に、例えば、試験化合物のみとともに、または適切な対照群とともに実施できる。例えば、試験化合物のない並列アッセイ、またはその他の反応成分のない、例えば、標的のないものや基質のないものなど、その他の並列アッセイである。別の方法として、アッセイの結果を基準、例えば、基準値、例えば、評価の前に文献から入手できるもの、およびその他などと比較することが可能である。適切な相関および当該技術で既知の統計的方法を使用して、評価結果を評価できる。
【０１３７】
化合物が望ましい効果を持つことが判明したら、製造量の化合物を合成することができ、例えば、少なくとも50 mg、500 mg、5 g、または500 gの化合物が製造される。宿主細胞を貫通できる化合物が、本発明の実施において望ましいものの、化合物は、またはその溶解性を維持するために、または宿主細胞への侵入を助けるために、可溶化剤と組み合わせたり、別の化合物（単一または複数）と組み合わせて投与（例えば、脂質との混合物により）することができる。化合物は、例えば、対象への投与のために製剤化でき、また対象のために投与することもできる。
【０１３８】
5. 化合物の抗ウイルス活性の特定
5.1  ウイルス
本発明は、ウイルス感染の防止、管理および／または治療に使用される化合物を提供する。任意のウイルスに対する化合物の抗ウイルス活性は、本明細書下記に記載した技術を使用して試験できる。
【０１３９】
一つの態様において、前記ウイルスは、ヘルペスウイルス(Herpesviridae)である。ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス(HSV)1型及び2型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス(EBV)、ヒトヘルペスウイルス6(変異体A及びB)、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8(カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、KSHV)、及びケルコピテキン(cercopithecine)ヘルペスウイルス1(Bウイルス)が挙げられる。Bウイルスは、ヒトに感染する場合もあるサルのウイルスである。ヒトヘルペスウイルスを、表2に示す。
【表２】
2013500265.tif 000023
【０１４０】
特定の実施態様において、ウイルスはヒトに感染する。その他の実施態様において、ウイルスはヒト以外の動物に感染する。特定の実施態様において、ウイルスは、ブタ、家禽、その他の家畜、またはペットに感染する。
【０１４１】
[00739]ウイルスの任意のタイプ、サブタイプまたは株に対して、化合物の抗ウイルス活性を評価できる。例えば、自然発生的な株、変異体または突然変異体、突然変異誘発ウイルス、リアソータントおよび／または遺伝子組み換えウイルスに対して、化合物の抗ウイルス活性を評価できる。
【０１４２】
一部の実施態様において、ウイルスは、細胞培養または対象において、4時間以下、6時間以下、8時間以下、12時間以下、16時間以下、または24時間以下以内にピーク力価を達成する。その他の実施態様において、ウイルスは、細胞培養または対象において、48時間以下、72時間以下、または1週間以下以内にピーク力価を達成する。その他の実施態様において、ウイルスは、1週間よりも後にピーク力価を達成する。これらの実施態様に従い、ウイルス力価は感染した組織内または血清中で測定することができる。
【０１４３】
一部の実施態様において、ウイルスは、細胞培養内で104 pfu/ml以上、5×104u/ml以上、105 pfu/ml以上、5×105 pfu/ml以上、106 pfu/ml以上、5×106 pfu/ml以上、107 pfu/ml以上、5×107 pfu/ml以上、108 pfu/ml以上、5×108 pfu/ml以上、109 pfu/ml以上、5×109 pfu/ml以上、または1010 pfu/ml以上のウイルス力価を達成する。一定の実施態様において、ウイルスは、細胞培養内で104 pfu/ml以上、5×104 pfu/ml以上、105 pfu/ml以上、5×105 pfu/ml以上、106 pfu/ml以上、5×106 pfu/ml以上、107 pfu/ml以上、5×107 pfu/ml以上、108 pfu/ml以上、5×108 pfu/ml以上、109 pfu/ml以上、5×109 pfu/ml以上、または1010 pfu/ml以上のウイルス力価を、4時間、6時間、8時間、12時間、16時間、または24時間以下以内に達成する。その他の実施態様において、ウイルスは、細胞培養内で104 pfu/ml以上、5×104 pfu/ml以上、105 pfu/ml以上、5×105 pfu/ml以上、106 pfu/ml以上、5×106 pfu/ml以上、107 pfu/ml以上、5×107 pfu/ml以上、108 pfu/ml以上、5×108 pfu/ml以上、109 pfu/ml以上、5×109 pfu/ml以上、または1010 pfu/ml以上のウイルス力価を、48時間、72時間、または1週間以内に達成する。
【０１４４】
一部の実施態様において、ウイルスは、対象において、1 pfu/ml以上、10 pfu/ml以上、5×101 pfu/ml以上、102 pfu/ml以上、5×102 pfu/ml以上、103 pfu/ml以上、2.5×103 pfu/ml以上、5×103 pfu/ml以上、104 pfu/ml以上、2.5×104 pfu/ml以上、5×104 pfu/ml以上、または105 pfu/ml以上のウイルス収率を達成する。一定の実施態様において、ウイルスは、対象において、1 pfu/ml以上、10 pfu/ml以上、5×101 pfu/ml以上、102 pfu/ml以上、5×102 pfu/ml以上、103 pfu/ml以上、2.5×103 pfu/ml以上、5×103 pfu/ml以上、104 pfu/ml以上、2.5×104 pfu/ml以上、5×104 pfu/ml以上、または105 pfu/ml以上のウイルス収率を、4時間、6時間、8時間、12時間、16時間、24時間、または48時間以内に達成する。一定の実施態様において、ウイルスは、対象において、1 pfu/ml以上、10 pfu/ml以上、101 pfu/ml以上、5×101 pfu/ml以上、102 pfu/ml以上、5×102 pfu/ml以上、103 pfu/ml以上、2.5×103 pfu/ml以上、5×103 pfu/ml以上、104 pfu/ml以上、2.5×104 pfu/ml以上、5×104 pfu/ml以上、または105 pfu/ml以上のウイルス収率を、48時間、72時間、または1週間以内に達成する。これらの実施態様に従い、ウイルス収率は感染した組織内または血清中で測定することができる。特定の実施態様において、対象は免疫適格性である。別の実施態様において、対象は免疫無防備状態または免疫抑制性である。
【０１４５】
一部の実施態様において、ウイルスは、対象において、1 pfu以上、10 pfu以上、5×101pfu以上、10２pfu以上、5×10２pfu以上、10３pfu以上、2.5×103pfu以上、5×103 pfu以上、104 pfu以上、2.5×104 pfu以上、5×104 pfu以上、または105 pfu以上のウイルス収率を達成する。一定の実施態様において、ウイルスは、対象において、1 pfu以上、10 pfu以上、5×101 pfu以上、102 pfu以上、5×102 pfu以上、103 pfu以上、2.5×103 pfu以上、5×103 pfu以上、104 pfu以上、2.5×104 pfu以上、5×104 pfu以上、または105 pfu以上のウイルス収率を、4時間、6時間、8時間、12時間、16時間、24時間、または48時間以内に達成する。一定の実施態様において、ウイルスは、対象において、1 pfu以上、10 pfu以上、101 pfu以上、5×101 pfu以上、102 pfu以上、5×102 pfu以上、103 pfu以上、2.5×103 pfu以上、5×103 pfu以上、104 pfu以上、2.5×104 pfu以上、5×104 pfu以上、または105 pfu以上のウイルス収率を、48時間、72時間、または1週間以内に達成する。これらの実施態様に従い、ウイルス収率は感染した組織内または血清中で測定することができる。特定の実施態様において、対象は免疫適格性である。別の実施態様において、対象は免疫無防備状態または免疫抑制性である。
【０１４６】
一部の実施態様において、ウイルスは、対象において、感染単位数1以上、感染単位数10以上、感染単位数5×101以上、感染単位数102以上、感染単位数5×102以上、感染単位数103以上、感染単位数2.5×103以上、感染単位数5×103以上、感染単位数104以上、感染単位数2.5×104以上、感染単位数5×104以上、または感染単位数105以上のウイルス収率を達成する。一定の実施態様において、ウイルスは、対象において、感染単位数1以上、感染単位数10以上、感染単位数5×101以上、感染単位数102以上、感染単位数5×102以上、感染単位数103以上、感染単位数2.5×103以上、感染単位数5×103以上、感染単位数104以上、感染単位数2.5×104以上、感染単位数5×104以上、または感染単位数105以上のウイルス収率を、4時間、6時間、8時間、12時間、16時間、24時間、または48時間以内に達成する。一定の実施態様において、ウイルスは、対象において、感染単位数1以上、感染単位数10以上、感染単位数101以上、感染単位数5×101以上、感染単位数102以上、感染単位数5×102以上、感染単位数103以上、感染単位数2.5×103以上、感染単位数5×103以上、感染単位数104以上、感染単位数2.5×104以上、感染単位数5×104以上、または感染単位数105以上のウイルス収率を、48時間、72時間、または1週間以内に達成する。これらの実施態様に従い、ウイルス収率は感染した組織内または血清中で測定することができる。特定の実施態様において、対象は免疫適格性である。別の実施態様において、対象は免疫無防備状態または免疫抑制性である。特定の実施態様において、ウイルスは、感染単位数104未満の収率を達成する。その他の実施態様において、ウイルスは、感染単位数105以上の収率を達成する。
【０１４７】
一部の実施態様において、ウイルスは、対象において、1ml当たりの感染単位数1以上、1ml当たりの感染単位数10以上、1ml当たりの感染単位数5×101以上、1ml当たりの感染単位数102以上、1ml当たりの感染単位数5×102以上、1ml当たりの感染単位数103以上、1ml当たりの感染単位数2.5×103以上、1ml当たりの感染単位数5×103以上、1ml当たりの感染単位数104以上、1ml当たりの感染単位数2.5×104以上、1ml当たりの感染単位数5×104以上、または1ml当たりの感染単位数105以上のウイルス力価を達成する。一定の実施態様において、ウイルスは、対象において、1ml当たりの感染単位数10以上、1ml当たりの感染単位数5×101以上、1ml当たりの感染単位数102以上、1ml当たりの感染単位数5×102以上、1ml当たりの感染単位数103以上、1ml当たりの感染単位数2.5×103以上、1ml当たりの感染単位数5×103以上、1ml当たりの感染単位数104以上、1ml当たりの感染単位数2.5×104以上、1ml当たりの感染単位数5×104以上、または1ml当たりの感染単位数105以上のウイルス力価を4時間、6時間、8時間、12時間、16時間、24時間、または48時間以内に達成する。一定の実施態様において、ウイルスは、対象において、1ml当たりの感染単位数1以上、1ml当たりの感染単位数10以上、1ml当たりの感染単位数5×101以上、1ml当たりの感染単位数102以上、1ml当たりの感染単位数5×102以上、1ml当たりの感染単位数103以上、1ml当たりの感染単位数2.5×103以上、1ml当たりの感染単位数5×103以上、1ml当たりの感染単位数104以上、1ml当たりの感染単位数2.5×104以上、1ml当たりの感染単位数5×104以上、または1ml当たりの感染単位数105以上のウイルス力価を48時間、72時間、または1週間以内に達成する。これらの実施態様に従い、ウイルス力価は感染した組織内または血清中で測定することができる。特定の実施態様において、対象は免疫適格性である。別の実施態様において、対象は免疫無防備状態または免疫抑制性である。特定の実施態様において、ウイルスは、1 ml当たりの感染単位数104未満の力価を達成する。一部の実施態様において、ウイルスは、1ml当たりの感染単位数105以上の力価を達成する。
【０１４８】
一部の実施態様において、ウイルスは細胞に感染し、細胞1個当たり101以上、2.5×101以上、5×101以上、7.5×101以上、102以上、2.5×102以上、5×102以上、7.5×102以上、103以上、2.5×103以上、5×103以上、7.5×103以上、104以上、2.5×104以上、5×104以上、7.5×104以上、または105以上のウイルス粒子を生成する。一定の実施態様において、ウイルスは細胞に感染し、細胞1個当たり10以上、101以上、2.5×101以上、5×101以上、7.5×101以上、102以上、2.5×102以上、5×102以上、7.5×102以上、103以上、2.5×103以上、5×103以上、7.5×103以上、104以上、2.5×104以上、5×104以上、7.5×104以上、または105以上のウイルス粒子を4時間、6時間、8時間、12時間、16時間、または24時間以内に生成する。その他の実施態様において、ウイルスは細胞に感染し、細胞1個当たり10以上、101以上、2.5×101以上、5×101以上、7.5×101以上、102以上、2.5×102以上、5×102以上、7.5×102以上、103以上、2.5×103以上、5×103以上、7.5×103以上、104以上、2.5×104以上、5×104以上、7.5×104以上、または105以上のウイルス粒子を48時間、72時間、または1週間以内に生成する。
【０１４９】
その他の実施態様において、ウイルスは、少なくとも約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、または15日間潜伏する。別の実施態様において、ウイルスは、少なくとも約1週間、または2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、または10週間潜伏する。さらなる実施態様において、ウイルスは、少なくとも約1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、7カ月、8カ月、9カ月、10カ月、または11カ月間潜伏する。さらに、別の実施態様において、ウイルスは、少なくとも約1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、または15年間潜伏する。一部の実施態様において、ウイルスは15年よりも長く潜伏する。
【０１５０】
５．２  抗ウイルス活性を検出するためのインビトロでのアッセイ
化合物の抗ウイルス活性は、本明細書に記載したか、または当業者に周知の他の様々なインビトロでのアッセイで評価することができる。こうしたウイルスに対する抗ウイルス活性を持つ化合物について検定しうるウイルスの非限定的な例については、本明細書中に掲載している。特定の実施態様において、化合物は、そのウイルス複製を抑制する能力にみあった活性プロファイルを示し、一方で真核細胞、好ましくは哺乳類の細胞に関して低い毒性を維持する。例えば、ウイルスの複製に対する化合物の効果は、様々な希釈度の化合物の存在下または不在下で、異なる希釈度のウイルスで感染させる手順、および例えば、ウイルス複製、ウイルスゲノム複製および／またはウイルスタンパク質の合成に対する化合物の効果を評価する手順により決定しうる。別の方法として、ウイルスの複製に対する化合物の効果は、細胞を様々な希釈度の化合物またはプラシーボと接触させる手順、細胞を異なる希釈度のウイルスで感染させる手順、および例えば、ウイルス複製、ウイルスゲノム複製、および／またはウイルスタンパク質の合成に対する化合物の効果を評価する手順により決定しうる。ウイルス複製の変化は、例えば、粥腫の生成により評価しうる。ウイルスタンパク質の生成は、例えば、ELISA、ウエスタンブロット、免疫蛍光染色またはフローサイトメトリー分析により評価しうる。ウイルス核酸の生成は、例えば、RT-PCR、PCR、ノーザン分析、またはサザンブロットにより評価しうる。
【０１５１】
一定の実施態様において、化合物は、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知の他のアッセイで、負の対照群（例えば、PBS、DMSO）に対してウイルスの複製をおよそ10%、好ましくは15%、25%、30%、45%、50%、60%、75%、95%以上減少させる。一部の実施態様において、化合物は、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知の他のアッセイで、負の対照（例えば、PBS、DMSO）に対してウイルスの複製を約少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、75倍、100倍、500倍、または1000倍減少させる。その他の実施態様において、化合物は、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知の他のアッセイで、負の対照群（例えば、PBS、DMSO）に対してウイルスの複製を約少なくとも1.5〜3倍、2〜4倍、3〜5倍、4〜8倍、6〜9倍、8〜10倍、2〜10倍、5〜20倍、10〜40倍、10〜50倍、25〜50倍、50〜100倍、75〜100倍、100〜500倍、500〜1000倍、または10〜1000倍減少させる。その他の実施態様において、化合物は、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知の他のアッセイで、負の対照（例えば、PBS、DMSO）に対してウイルスの複製を約1 log、1.5 log、2 log、2.5 log、3 log、3.5 log、4 log、4.5 log、5 log以上減少させる。これらの実施態様に従い、こうした化合物は、本明細書中に記載したアッセイで、安全性および効力についてさらに評価することができる。
【０１５２】
一定の実施態様において、化合物は、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知の他のアッセイで、負の対照群（例えば、PBS、DMSO）に対してウイルス性ゲノムの複製をおよそ10%、好ましくは15%、25%、30%、45%、50%、60%、75%、95%以上減少させる。一部の実施態様において、化合物は、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知の他のアッセイで、負の対照（例えば、PBS、DMSO）に対してウイルス性ゲノムの複製を約少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、75倍、100倍、500倍、または1000倍減少させる。その他の実施態様において、化合物は、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知の他のアッセイで、負の対照（例えば、PBS、DMSO）に対してウイルス性ゲノムの複製を約少なくとも1.5〜3倍、2〜4倍、3〜5倍、4〜8倍、6〜9倍、8〜10倍、2〜10倍、5〜20倍、10〜40倍、10〜50倍、25〜50倍、50〜100倍、75〜100倍、100〜500倍、500〜1000倍、または10〜1000倍減少させる。その他の実施態様において、化合物は、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知の他のアッセイで、負の対照群（例えば、PBS、DMSO）に対してウイルス性ゲノムの複製を約1 log、1.5 log、2 log、2.5 log、3 log、3.5 log、4 log、4.5 log、5 log以上減少させる。これらの実施態様に従い、こうした化合物は、本明細書中に記載したアッセイで、安全性および効力についてさらに評価することができる。
【０１５３】
一定の実施態様において、化合物は、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知の他のアッセイで、負の対照群（例えば、PBS、DMSO）に対してウイルスタンパク質の合成をおよそ10%、好ましくは15%、25%、30%、45%、50%、60%、75%、95%以上減少させる。一部の実施態様において、化合物は、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知の他のアッセイで、負の対照群（例えば、PBS、DMSO）に対してウイルスタンパク質の合成をおよそ少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、75倍、100倍、500倍、または1000倍減少させる。その他の実施態様において、化合物は、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知の他のアッセイで、負の対照群（例えば、PBS、DMSO）に対してウイルスタンパク質の合成をおよそ少なくとも1.5〜3倍、2〜4倍、3〜5倍、4〜8倍、6〜9倍、8〜10倍、2〜10倍、5〜20倍、10〜40倍、10〜50倍、25〜50倍、50〜100倍、75〜100倍、100〜500倍、500〜1000倍、または10〜1000倍減少させる。その他の実施態様において、化合物は、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知の他のアッセイで、負の対照群（例えば、PBS、DMSO）に対してウイルスタンパク質の合成をおよそ1 log、1.5 log、2 log、2.5 log、3 log、3.5 log、4 log、4.5 log、5 log以上減少させる。これらの実施態様に従い、こうした化合物は、本明細書中に記載したアッセイで、安全性および効力についてさらに評価することができる。
【０１５４】
一部の実施態様において、化合物により、ウイルス複製1ラウンド当たり約1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、25倍以上、30倍以上、35倍以上、40倍以上、45倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、または100倍以上のウイルス収率の低減がもたらされる。一定の実施態様において、化合物により、ウイルス複製1ラウンド当たり約2倍以上のウイルス収率の低減がもたらされる。特定の実施態様において、化合物により、ウイルス複製1ラウンド当たり約10倍以上のウイルス収率の低減がもたらされる。
【０１５５】
インビトロでの抗ウイルスアッセイは、初代細胞および樹立株細胞を含めた任意の真核細胞を使用して実施できる。選択した細胞または株細胞は、所定のウイルスにより感染の影響を受けやすいべきである。それぞれのウイルスについて標準的なインビトロでの抗ウイルスアッセイ（例えば、ウイルス細胞変性効果アッセイ、ニュートラルレッド摂取アッセイ、ウイルス収率アッセイ、プラーク減少アッセイに使用可能な哺乳類株細胞の非限定的な例を、表3に掲載する。
【表３】
2013500265.tif 000024
【０１５６】
以下のセクション5. 2.1〜5.2.7は、それぞれのウイルスに対する化合物の抗ウイルス活性を特性づけるために使用できる抗ウイルスアッセイの非限定的な例を記載したものである。当業者であれば、セクション5.2.1〜5.2.7に記載した方法を、例えば、表3に記載したものなどの細胞系およびウイルス病原体を変化させることによるなど、その他のウイルスに対して適応させる方法が分かる。
【０１５７】
5.2.1  ウイルス細胞変性効果(CPE)アッセイ
CPEは、培養した細胞が大抵のウイルスによって感染すると経験する形態学的な変化である。これらの形態学的な変化は、固定も染色もされていない細胞で顕微鏡によって簡単に観察できる。CPEの形態には、ウイルスに応じて変化があるが、限定されないものの、細胞の円形化、感染細胞の細胞核および／または細胞質内の封入体の外観、および合胞体の生成、または多核細胞（多数の核を含む大規模な細胞質の集団）などが含まれる。アデノウイルス感染では、アデノウイルスカプシドの結晶性アレイ（crystalline arrays）が、細胞核に蓄積され、封入体が形成される。
【０１５８】
CPEアッセイによって、化合物の抗ウイルス効果の手段が提供されうる。こうしたアッセイの非限定的な例の1つにおいて、化合物は、（例えば、1000、500、100、50、10、1 μg/ml）に連続的に希釈され、96ウェル式プレートのうち、細胞単層（好ましくは、80〜100%集密の哺乳類の細胞）を含む3つのウェルに追加される。5分以内に、ウイルスを加えてプレートを密封し、37°Cで、近似最大値のウイルスのCPEを誘発するために必要な標準時間だけ培養する（例えば、ウイルスおよび感染多重度（multiplicity of infection）にも依るがおよそ48〜120時間）。CPEは、各試験において化合物と並行して既知の正の対照薬物が評価された後で、顕微鏡によって読み取られる。データは、50%有効濃度または近似的なウイルス-抑制性濃度、50%エンドポイント（EC50）および細胞-抑制性濃度、50%エンドポイント（IC50）として表現される。一般的な選択性指標（「SI」）は、IC50をEC50で割ったものとして計算される。これらの値は、例えば、M.N. Prichard、K.R. Asaltine、およびC. Shipman, Jr.（ミシガン大学、ミシガン州アンアーバー）によるコンピュータソフトウェアプログラムMacSynergy IIなど、当該技術で既知の任意の方法を使用して計算できる。
【０１５９】
一実施態様において、化合物は、3、または4、または5、または6、または7、または8、または9、または10、または11、または12、または13、または14、または15、または20、または21、または22、または23、または24、または25、または30、または35、または40、または45、または50、または60、または70、または80、または90、または100、または200、または300、または400、または500、1,000、または10,000よりも大きいSIを持つ。一部の実施態様において、化合物は、10よりも大きいSIを持つ。特定の実施態様において、10よりも大きいSIを持つ化合物が、さらに本明細書に記載したかまたは当該技術で既知のインビトロおよびインビボでのその他のアッセイで評価され、安全性および効力が特性づけられる。
【０１６０】
5.2.2  ニュートラルレッド(NR)染料摂取アッセイ
NR染料摂取アッセイを、CPE阻害アッセイを検証するために使用することができる。こうしたアッセイの非限定的な一例において、CPE阻害アッセイに使用されるものと同一の96ウェル式マイクロプレートを使用できる。ニュートラルレッドを媒体に加えると、ウイルスによる損傷を受けていない細胞が、より大きな量の染料を取り込む。生存可能な細胞を示す摂取のパーセント値を、マイクロプレートオートリーダー上で、バックグラウンドを除去するための差異のある405および540 nmの二波長で読み取る。（『McManus et al.、Appl. Environment. Microbiol. 31:35-38、1976』を参照）。EC50は、感染細胞があり化合物と接触した試料について決定され、またIC50は、化合物と接触した非感染性の細胞のある試料について決定される。
【０１６１】
5.2.3  ウイルス収率アッセイ
溶解させた細胞およびCPE阻害アッセイでのものなど、感染細胞からの上澄をウイルス収率（初代感染語のウイルス粒子の生成）のアッセイに使用できる。非限定的な一例において、これらの上澄は、連続的に希釈され、単層の影響を受けやすい細胞（例えば、ベロ細胞）上に追加される。これらの細胞内でのCPEの発生は、上澄内の感染性ウイルスの存在を示すものである。ウイルス収率を1 log10抑制する試験化合物の濃度である90%有効濃度（EC90）が、当該技術で既知の計算方法を使用したこれらのデータから決定される。一実施態様において、化合物のEC90は、負の対照試料のEC90よりも少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、または50倍少ない。
【０１６２】
5.2.4  プラーク減少アッセイ
こうしたアッセイの非限定的な一例において、ウイルスは、様々な濃度に希釈され、3通りに作成された単層の標的の哺乳類細胞を含むそれぞれのウェルに加えられる。次にプレートを培養し、対照試料の効果的な感染を達成するための時間だけ培養する（例えば、15分ごとに振盪して1時間）。培養期間の後、同量の1%アガロースを、2×の濃度で準備した同量のそれぞれの化合物希釈物に加える。一定の実施態様において、0.03 μg/ml〜100 μg/mlの間の最終的な化合物濃度が、0.5%の最終アガロースオーバーレイ濃度で検査できる。薬物アガロースの混合物を、2 mlの容積のそれぞれのウェルに注ぎ、およびプレートを3日間培養し、その後、細胞をニュートラルレッド1.5%溶液で染色する。4〜6時間の培養期間の終わりに、ニュートラルレッド溶液を吸引し、実体顕微鏡を使用してプラークを計数する。別の方法として、最終アガロース濃度0.4%を使用しうる。その他の実施態様において、プレートは3日よりも長く培養され、適切な場合に4日目および8日目に追加的なオーバーレイが注がれる。別の実施態様において、オーバーレイ媒体は、半流動性ではなく液体である。
【０１６３】
5.2.5  ウイルス力価アッセイ
この非限定的な例において、単層の標的の哺乳類の細胞株を、異なる量（例えば、3プラーク形成単位（pfu）または5 pfuの多重度）のウイルス（例えば、HCMVまたはHSV）で感染させ、その後、様々な希釈度の化合物（例えば、0.1 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml、または10 μg/ml）の存在下または不在下で培養する。感染した細胞は、感染後48時間または72時間に収穫し、適切な標的株細胞（例えば、ベロ細胞、MRC5 細胞）上で、当該技術で既知の標準プラークアッセイで力価を測定する。一定の実施態様において、化合物の存在下で感染細胞を培養することで、化合物の不在下での感染細胞の培養に比較して、感染性ウイルスの収量が少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、500倍、または1000倍減少する。特定の実施態様において、化合物の存在下で感染細胞を培養することで、化合物の不在下での感染細胞の培養に比較して、PFU/mlが少なくとも10倍減少する。
【０１６４】
一定の実施態様において、化合物の存在下で感染細胞を培養することで、化合物の不在下での感染細胞の培養に比較して、感染性ウイルスの収量が少なくとも0.5 log10、1 log10、1.5 log10、2 log10、2.5 log10、3 log10、3.5 log10、4 log10、4.5 log10、5 log10、5.5 log10、6 log10、6.5 log10、7 log10、7.5 log10、8 log10、8.5 log10、または9 log10だけ減少する。特定の実施態様において、化合物の存在下で感染細胞を培養することで、化合物の不在下での感染細胞の培養に比較して、感染性ウイルスの収量が少なくとも1 log10または2 log10だけ減少する。別の特定の実施態様において、化合物の存在下で感染細胞を培養することで、化合物の不在下での感染細胞の培養に比較して、感染性ウイルスの収量が少なくとも2 log10だけ減少する。
【０１６５】
5.2.6  フローサイトメトリーアッセイ
化合物の存在下または不在下で培養した、感染した標的の細胞におけるウイルス抗原の発現を検出するために、フローサイトメトリーを利用できる（例えば、『McSharry et al., Clinical Microbiology Rev., 1994, 7:576-604』を参照）。フローサイトメトリーによって細胞表面上で検出可能なウイルスの抗原の非限定的な例には、限定されないものの、HSVのgB、gC、gC、およびgE、水痘帯状疱疹ウイルスのgpI、HCMVのgB、及びHHV-6のgp110/60が含まれる。その他の実施態様において、細胞内のウイルス抗原またはウイルス核酸は、当該技術で既知の技術により、フローサイトメトリーにより検出可能である。
【０１６６】
5.2.7  抗ウイルスアッセイのための遺伝子組換え株細胞
抗ウイルスアッセイで使用するための様々な株細胞は、ウイルス感染またはウイルス複製のためのより適切な宿主、またウイルス-感染細胞を迅速に検出するためにより都合の良い基質とするために遺伝子操作ができる（例えば、『Olivo, P.D., Clin. Microbiol. Rev., 1996, 9:321-334』を参照）。一部の面において、これらの株細胞は、転写、翻訳、プリゲノムキャプシド形成、逆転写、粒子集合および放出などの、ウイルス複製の任意の手順の遮断に対する化合物の抗ウイルス活性の試験に利用できる。それぞれのウイルスについて、抗ウイルスアッセイに使用するための遺伝子組み換え細胞の非限定的な例について、以下に説明する。
【０１６７】
EBVに対する化合物の抗ウイルス効果は、Daudi細胞内のウイルスカプシド抗原（VCA）生成レベルを、ELISAアッセイを使用して測定することで評価できる。化合物の様々な濃度について検査でき（例えば、50 mg/ml〜0.03 mg/ml）、また、未処理の細胞および化合物で処理した細胞から得られた結果が、EC50値の計算に使用される。毒性も無く良好なEBV VCA生成に対する活性を持つ化合物を選択して、EBV DNA合成を抑制する能力について試験する。
【０１６８】
HSVを用いたアッセイでは、HSV-1 UL39プロモーターの転写制御下で大腸菌lacZ遺伝子により安定的に形質転換させたBHKICP6LacZ株細胞を使用できる（『Stabell et al., 1992, Methods 38:195-204』を参照）。感染細胞は、当該技術で既知のβ-ガラクトシダーゼアッセイ、例えば、比色分析法を使用して検出される。
【０１６９】
化合物の安全性及び効力の特性付け
化合物の安全性および効力は、当業者に周知の技術を使用して評価できる。下記のセクション5.4および5.5では、化合物の安全性および効力を特性づけるための、細胞毒性試験および動物モデルアッセイについてそれぞれ、非限定的な例を提供している。一定の実施態様において、本明細書中に記載した細胞毒性試験は、本明細書中に記載したインビトロでの抗ウイルスアッセイの前に、同時に、又は後に実施される。
【０１７０】
一部の実施態様において、化合物は、非感染性の細胞およびウイルス感染した細胞の生存能力に差異的に影響する。ウイルス感染細胞および非感染性の細胞の生存能力に対する化合物の特異的効果は、本明細書中に記載した技術などの技術、または当業者にとって既知のその他の技術を使用して評価しうる。一定の実施態様において、化合物は、非感染性の細胞よりもウイルスに感染した細胞に対する毒性が高い。特定の実施態様において、化合物は、ウイルスに感染した細胞の生存能力に優先的に影響する。任意の特定の概念に拘束されることなく、未感染の細胞およびウイルス感染細胞の生存能力に対する化合物の差異的な効果は、差異的に発現または調節されるか、または未感染の細胞およびウイルス感染細胞において差異的な活性を持つ特定の酵素またはタンパク質を標的化した化合物の結果でありうる。例えば、感染した宿主細胞におけるウイルス感染および／またはウイルス複製は、酵素および／またはタンパク質の発現、調節、および／または活性により変化しうる。従って、一部の実施態様において、同一の酵素、タンパク質または代謝経路を標的とするその他の化合物が、抗ウイルス活性について検査される。その他の実施態様において、ウイルス感染した細胞の生存能力に差異的に影響する化合物の同属種が設計され、抗ウイルス活性について検査される。化合物の抗ウイルス活性を評価するために使用できる抗ウイルスアッセイの非限定的な例について、本明細書中に記載されている。
【０１７１】
5.4  細胞毒性試験
1つの望ましい実施態様において、細胞は、初代細胞および株細胞を含めた動物の細胞である。一部の実施態様において、細胞は、ヒト細胞である。一定の実施態様において、細胞毒性は、U937（ヒト単球株細胞）、初代末梢血単核細胞（PBMC）、Huh7（ヒト肝芽腫株細胞）、293T（ヒト胎児由来腎臓株細胞）、およびTHP-1（単球細胞）といった1つ以上の株細胞で評価される。化合物の細胞毒性の試験に使用可能なその他の株細胞の非限定的な例を、表3に掲載する。
【０１７２】
化合物への暴露の後で、細胞（感染または未感染）の生存能力または株細胞の評価するために、当該技術でよく知られた数多くのアッセイが使用でき、こうして、化合物の細胞毒性が決定される。例えば、細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン（BrdU）の取り込みの測定（例えば、『Hoshino et al., 1986, Int. J. Cancer 38, 369』、『Campana et al., 1988, J. Immunol. Meth. 107:79』を参照）により、（3H）チミジンの取り込みの測定（例えば、『Chen, J., 1996, Oncogene 13:1395-403』、『Jeoung, J., 1995, J. Biol. Chem. 270:18367 73』を参照）により、直接的な細胞計数により、またはがん原遺伝子（例えば、fos、myc）または細胞周期マーカー（Rb、cdc2、cyclin A、D1、D2、D3、E、等）など既知の遺伝子の転写、翻訳または活性の変化の検出により評価できる。こうしたタンパク質およびmRNAおよび活性のレベルは、当該技術でよく知られた任意の方法により決定できる。例えば、タンパク質は、ELISA、ウエスタンブロッティングまたは免疫沈降など、既知の免疫診断法により、市販の抗体を含めた、抗体を使用して定量化できる。mRNAは、例えば、ノーザン分析、RNaseプロテクション、またはポリメラーゼ連鎖反応を逆転写とともに使用するなど、当該技術で既知および日常的な方法を使用して、定量化できる。細胞の生存能力は、トリパンブルー染色または当該技術で既知のその他の細胞死または生存能力マーカーを使用して評価できる。特定の実施態様において、細胞のATPレベルが測定され、細胞の生存能力が決定される。
【０１７３】
特定の実施態様において、細胞の生存能力は、細胞内ATPレベルを測定するCellTiter-Gloアッセイキット（Promega）など、当該技術で標準的なアッセイを使用して、3日および7日の期間で測定される。細胞のATPの減少は、細胞障害効果を示すものである。別の特定の実施態様において、細胞の生存能力は、ニュートラルレッド摂取アッセイで測定できる。その他の実施態様において、形態学的な変化の目視観察には、拡張、粒度（granularity）、ギザギザの縁（ragged edges）のある細胞、薄膜様の外観、円形化、ウェル表面からの脱離、またはその他の変化（変更）が含まれうる。これらの変化は、観察された細胞毒性の度合いに従い、T（100%毒性）、PVH（部分的毒性-非常に重度-80%）、PH（部分的毒性-重度-60%）、P（部分的毒性-40%）、P（部分的に毒性-軽度-20%）、または0（無毒性-0%）が指定される。これらのデータの回帰分析により50%の細胞抑制性（細胞毒性）濃度（IC50）が決定される。
【０１７４】
化合物は、動物モデルにおけるインビボ毒性について試験できる。例えば、化合物の抗ウイルス活性を試験するために使用される、本明細書に記載したおよび／または当該技術で既知のその他の動物モデルを、これらの化合物のインビボ毒性を決定するために使用することもできる。例えば、動物には、化合物の多様な濃度で投与される。その後、動物は時間経過に伴って、組織損傷を示すことになりうる、死亡率、体重減少または体重増加の不成功、および／または血清マーカーレベルについて監視される（例えば、一般的な組織損傷の指標としてのクレアチンホスホキナーゼレベル、肝臓損傷の可能性の指標としてのグルタミン酸シュウ酸トランスアミラーゼまたはピルビン酸トランスアミラーゼのレベル）。これらのインビボでのアッセイは、投与量に加えて、様々な投与モードおよび／または療法の毒性の試験に適応させることもできる。
【０１７５】
本発明による化合物の毒性および／または効力は、細胞培養または実験動物における、例えば、LD50（母集団の50%に対して致命的な用量）およびED50（母集団の50%で治療的に効果的な用量）の決定についての標準的な製薬の手順により決定できる。毒性および療法効果の用量比が治療係数で、これはLD50/ED50の比として表現しうる。本発明に従い識別された化合物で、大きな治療指数を示すものが望ましい。本発明に従い識別された化合物で、毒性副作用を示すものを使用することもできるが、影響のある組織の部位へのこうした薬剤を標的とした送達系の設計には、非感染性の細胞への潜在的損傷を最小限に抑えるように、またそれにより副作用を低減するように、注意が必要である。
【０１７６】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、本発明に従い識別された化合物の多様な投薬をヒトで使用するための調剤のために使用できる。こうした薬剤の投薬は、循環濃度の範囲内が好ましく、これには、ED50値で低毒性か無毒性のものが含まれる。投薬は、採用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化しうる。本発明の方法で使用される任意の薬剤について、治療的に効果的な用量は、まずは細胞培養アッセイにより予想できる。用量は、動物モデルで循環する血漿濃縮の範囲を達成するために策定することができ、これには、細胞培養で決定されたIC50（すなわち、症状の最大半減阻害を達成する試験化合物の濃度）が含まれる。こうした情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用できる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定できる。投薬量の決定に関するそれ以外の情報については、本明細書中に記載する。
【０１７７】
5.5  動物モデル
化合物および組成物は、ヒトでの使用の前に、望ましい治療または予防の活性を得るために、インビボで評価するのが望ましい。例えば、インビボでのアッセイは、化合物および／または別の治療薬を投与することが好ましいかどうかを決定するために使用される。例えば、ウイルス感染を阻止するための化合物の使用を評価するために、動物がウイルスに感染する前に化合物を投与することができる。別の実施態様において、化合物は、動物に、動物がウイルスに感染するのと同時に投与できる。ウイルス感染を治療または管理するための化合物の使用を評価するために、一実施態様において、化合物は、動物のウイルス感染の後で投与される。別の実施態様において、化合物は、ウイルス感染を治療および／または管理するために、動物がウイルスに感染するのと同時に動物に投与される。特定の実施態様において、2回以上にわたり化合物が動物に投与される。
【０１７８】
化合物は、限定されないものの、ラット、マウス、ニワトリ、雌ウシ、サル、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、モルモット等を含めた動物モデル系で、ウイルスに対する抗ウイルス活性について試験することができる。発明の特定の実施態様において、化合物は、マウスモデル系で試験される。こうしたモデル系は、幅広く使用され、当業者によく知られている。
【０１７９】
動物をウイルスに感染させ、それと同時的または経時的に化合物またはプラシーボで処理する。動物（例えば、血清、尿、痰、精液、唾液、プラズマ、または組織の試料）から得られた試料は、当該技術でよく知られた方法、例えば、変化したウイルス複製（例えば、プラーク生成により決定されるもの）またはウイルスタンパク質の生成（例えば、ウエスタンブロット、ELISA、またはフローサイトメトリー分析により決定されるもの）またはウイルス核酸（例えば、室温-PCR、ノーザン分析またはサザンブロットにより決定されるもの）を測定する方法により、ウイルス複製を試験できる。組織試料におけるウイルスの定量化のために、組織試料をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で均質化し、浄化した均質物の希釈液を、37°Cで単層の細胞（例えば、Vero、CEFまたはMDCK細胞）に1時間吸収させる。その他のアッセイにおいて、病理組織検査は感染後に実施されるが、ウイルスが感染の標的として知られている器官の評価が好ましい。ウイルス特異的単クローン抗体を使用してウイルス免疫組織化学が実施される。下記の非限定的な模範的な動物モデルを、その他のウイルス系に適応させることができる。
【０１８０】
ウイルスの毒性に対する化合物の効果は、化合物の投与を受けた感染した対象におけるウイルスの力価、化合物の投与を受けた感染した対象の生存期間、化合物の投与を受けた感染した対象での免疫応答、化合物の投与を受けた感染した対象における症状の数、持続時間および／または重症度、および／または化合物の投与を受けた感染した対象における1つ以上の症状が発症する前の期間が評価されるインビボアッセイを使用して決定できる。当業者に周知の技術が、こうした効果を測定するために使用できる。
【０１８１】
5.5.1  単純ヘルペスウイルス(HSV)
インビボでの化合物の抗ウイルス活性を評価するために、単純ヘルペスウイルス1型または2型（HSV-1またはHSV-2）のマウスモデルを採用できる。BALB/cマウスは一般的に使用されるが、感受性のあるその他の適切なマウス系を使用できる。マウスは、適切な感染多重度（multiplicity of infection）のHSV（例えば、105 pfuのHSV-1菌株E-377または4×104 pfuのHSV-2菌株MS）を持つ様々な経路により培養した後、化合物およびプラシーボを投与する。腹腔内（i.p.）接種では、HSV-1は、腸、肝臓、および脾臓で複製し、CNSに伝播する。経鼻（i.n.）接種では、HSV-1は、上咽喉で複製し、CNSに伝播する。最適な投与量および治療法を決定するために、化合物をその他の治療と組み合わせて使用して、投与の任意の適切な投与経路（例えば、経口、局所的、全身性、経鼻）、頻度および用量を検査できる。
【０１８２】
HSV-2性病のマウスモデルにおいて、HSV-1またはHSV-2のある雌のスイスウェブスターマウスの膣内接種を実施し、および膣スワブを入手し、ウイルス複製に対する治療の効果を評価する（例えば、『Crute et al., Nature Medicine, 2002, 8:386-391』を参照）。例えば、プラークアッセイによるウイルス力価は、膣スワブから決定できる。皮膚の病変を研究するための、SKH-1マウス（免疫適格性の無毛マウスの菌株）を使用したHSV-1のマウスモデルも、当該技術で説明されている（例えば、『Crute et al., Nature Medicine, 2002, 8:386-391』および『Bolger et al., Antiviral Res., 1997, 35:157-165』を参照）。HSVのモルモットモデルについても説明があり、例えば、『Chen et al., Virol. J, 2004 Nov 23, 1:11』を参照のこと。統計的分析を実施して有意性を計算する（例えば、P値が0.05以下）。
【０１８３】
5.5.2  HCMV
HCMVは、一般には実験動物に感染しないため、マウスCMV（MCMV）感染のマウスモデルは、インビボでの化合物の抗ウイルス活性の評価に使用できる。例えば、BALB/cマウスMCMVマウスモデルを、感染したマウスに投与したときのインビボでの化合物の抗ウイルス活性を評価するために使用できる（例えば、『Kern et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2004, 48:4745-4753』を参照）。化合物で治療したまたは未治療の感染したマウスから単離した組織の均質物を、マウス胚線維芽細胞（MEF）を用いた標準プラークアッセイを使用して試験する。次に、統計的分析を実施して有意性を計算する（例えば、P値が0.05以下）。
【０１８４】
別の方法として、ヒトの組織（すなわち、網膜組織または胎児胸腺および肝臓組織）をSCIDマウスに移植して、その後、マウスを、好ましくは組織グラフトの部位でHCMVに感染させる（例えば、『Kern et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2004, 48:4745-4753』を参照）。接種に使用するHCMVのpfuは、実験およびウイルス菌株に応じて変化しうる。任意の適切な投与経路（例えば、経口、局所的、全身性、経鼻）、頻度および投与の用量を試験して、化合物を使用し、随意にその他の治療と組み合わせて、最適な投与量および治療法を決定できる。化合物で治療したかまたは未治療の感染したマウスから、様々な時点で単離した移植組織の均質物を、ヒト包皮線維芽細胞（HFF）を用いた標準プラークアッセイを使用して試験する。次に、統計的分析を実施して有意性を計算する（すなわち、P値が0.05以下）。
【０１８５】
抗ウイルス薬を研究するためのCMVのモルモットモデルについてもこれまでに記載があり、例えば、『Bourne et al., Antiviral Res., 2000, 47:103-109』、『Bravo et al., Antiviral Res., 2003, 60:41-49』、および『Bravo et al, J. Infectious Diseases, 2006, 193:591-597』を参照されたい。
【０１８６】
6.  医薬組成物
本明細書に記載したか、または参照により組み込んだ任意の化合物は、任意で、化合物を含有する組成物の形態であってもよい。
【０１８７】
本明細書で提供した一定の実施態様において、組成物（医薬組成物を含む）は、化合物および医薬として許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含有する。
【０１８８】
その他の実施態様において、本明細書で提供したものは、有効量の化合物および医薬として許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含有する医薬組成物である。医薬組成物は、獣医用および／またはヒトへの投与に適切である。
【０１８９】
本明細書で提供した医薬組成物は、対象に投与されるようにする任意の形態を取ることができ、前記対象は、動物であることが好ましく、これには、限定はされないものの、ヒト、哺乳動物、または雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等などヒト以外の動物、また、哺乳動物であることがさらに好ましく、およびヒトが最も好ましい。
【０１９０】
特定の実施態様において、またこの文脈において、「医薬として許容される担体、賦形剤または希釈剤」という用語は、連邦政府または州政府の規制当局により認可を受けたか、または米国薬局方（U.S. Pharmacopeia）または動物での、さらに具体的にはヒトでの使用にその他一般に認められている薬局方にリストされている担体、賦形剤または希釈剤を意味する。「担体」という用語は、それとともに治療が投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全および不完全））、賦形剤、または媒体を意味する。こうした薬剤学的担体は、水および油などの無菌の液体とすることができ、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油およびこれに類するものなど、石油、動物、植物を起源とするものや、合成的なものが含まれる。水は、医薬組成物が静脈内に投与されるとき、好ましい担体である。生理食塩水および水溶性のブドウ糖およびグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射用溶液用に採用できる。適切な薬剤学的担体の例については、E.W. Martinによる『Remington’s Pharmaceutical Sciences』に記載がある。
【０１９１】
一般的な組成物および剤形は、1つ以上の賦形剤を含有する。適切な賦形剤は、製薬学の当業者にとってよく知られており、また適切な賦形剤の非限定的な例には、デンプン、ブドウ糖、ラクトース、蔗糖、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ナトリウムステアリン酸塩、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールおよびこれに類するものが含まれる。特定の賦形剤が医薬組成物または剤形への組み込みにとって適切かどうかは、当該技術でよく知られている多様な要因に依存し、これには、限定はされないものの、剤形が患者に投与される方法およびその剤形に含まれる特定の有効成分などがある。望ましい場合、組成物または単一単位の剤形には、少量の湿潤剤または乳化剤、またはpH緩衝薬を含めることができる。
【０１９２】
ラクトースを含まない組成物は、当該技術でよく知られており、また例えば、米国薬局方（USP）SP (XXI)/NF (XVI）にリストされている賦形剤を含有しうる。一般に、ラクトースを含まない組成物は、医薬品としての適合性がありかつ医薬として許容される量の有効成分、結合剤／賦形剤、および潤滑剤を含有する。好ましいラクトースを含まない剤形は、化合物、微結晶性セルロース、アルファ化でんぷん、およびステアリン酸マグネシウムが挙げられる。
【０１９３】
さらに、本明細書で提供されているのは、水は一部の化合物の劣化を促進することがあるため、1つ以上の化合物を含有する無水の医薬組成物および剤形である。例えば、水（例えば、5%）を加えることは、製薬の技術では、有効期間や時間経過に伴う製剤の安全性などの特性を決定するために、長期的な保管をシミュレートする手段として広く受け入れられている。例えば、『Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 2d. Ed., Marcel Dekker, NY, NY, 1995, pp. 379 80』を参照のこと。事実上、水および熱によって、一部の化合物の分解が促進される。こうして、水分および／または湿気は、製剤の製造、取り扱い、包装、保管、出荷、および使用中に一般的に遭遇するものであるため、製剤形態に対する水の効果は、重要な意義を持つものとなりうる。
【０１９４】
本明細書で提供した無水の組成物および剤形は、無水または低水分を含む成分および低水分または低湿度の条件を使用して、調製できる。一級または二級アミンから構成されるラクトースおよび少なくとも1つの化合物を含有する組成物および剤形は、製造、包装、および／または保管中に水分および／または湿気とかなり接触することが予想される場合には、無水であることが好ましい。
【０１９５】
無水の組成物は、その無水の性質が維持されるように調製および保管されるべきである。従って、無水の組成物は、適切な処方キットに含めることができるよう、水への暴露を阻止することが知られている素材を使用して包装することが好ましい。適切な包装の例には、限定されないものの、密閉された箔、プラスチック、単位用量容器（例えば、バイアル）、ブリスター包装、およびストリップ包装が含まれる。
【０１９６】
さらに、本明細書で提供されているのは、化合物が分解する速度を低下させる1つ以上の薬剤を含有する組成物および剤形である。本明細書では「安定剤」と呼ぶこうした薬剤には、限定されないものの、アスコルビン酸、pH緩衝液、または塩緩衝液などの酸化防止剤がある。
【０１９７】
組成物および単一単位の剤形は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放性製剤およびこれに類する形態を取りうる。経口の製剤形態には、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、等の標準的担体が含まれうる。こうした組成物および剤形には、予防的または治療的に有効な量の化合物（好ましくは精製した形態）と、それとともに行う患者への適切な投与のための形態が提供されるように適切な量の担体が含まれる。製剤形態は、投与方法に適したものであるべきである。1つの望ましい実施態様において、組成物または単一単位の剤形は、無菌で、対象、好ましくは被験動物、より好ましくは哺乳類の被検体、および最も好ましくはヒト対象への投与に適した形態である。
【０１９８】
本明細書で提供した組成物は、意図される投与経路に適合するように調製される。投与経路の例には、限定されないものの、非経口的、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口的（例えば、吸入）、鼻腔内、経皮的（局所的）、経粘膜、滑液包内、眼科的および直腸投与が含まれる。特定の実施態様において、組成物は、日常的な手順に従い、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻腔内、眼科的または局所的投与に適応させた組成物として、調製される。1つの望ましい実施態様において、組成物は、日常的な手順に従い、ヒトに対する皮下投与用に調製される。一般に、静脈内投与のための組成物は、無菌で等張性の水溶性緩衝液に入れた溶液である。必要に応じて、組成物には、可溶化剤および注射の部位での苦痛を和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬も含まれうる。剤形の例には、限定されないものの、錠剤、カプレット、カプセル（弾性ゼラチン軟カプセルなど）、カシェー、トローチ、ロゼンジ（トローチ剤）、分散性顆粒剤、座薬、軟膏、パップ剤（パップ）、ペースト、粉末、ドレッシング（包帯）、クリーム、プラスター、溶液、パッチ、エアロゾル（例えば、スプレー式点鼻剤または吸入器）、ゲル、患者への経口または経粘膜の投与に適した液体剤形（懸濁液を含む）（例えば、水溶性のまたは非水溶性の液体懸濁液、水中油乳濁液、または油中水乳濁液）、溶液、および特効薬、患者への非経口的投与に適した液体剤形、および無菌の固体（例えば、患者への非経口的投与に適した液体剤形を提供するために再構成されうる結晶性または非晶質の固体）が含まれる。
【０１９９】
本発明の組成物、形状、および剤形タイプは、一般に、これらの用途に応じて変化する。
【０２００】
一般に、本明細書で提供した組成物の成分は、例えば、その量の活性薬剤を表示したアンプルまたはサッシェなどの密閉容器に入れた冷凍乾燥粉末または無水の濃縮物として、別個にまたは単位剤形に一緒に混入して供給される。組成物が注入により投与される場合には、無菌製薬グレードの水または生理食塩水の入った注入ビンで調剤しうる。組成物が注射により投与される場合、投与の前に成分を混合することができるよう、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供しうる。
【０２０１】
経口投与に適した本明細書で提供した医薬組成物は、限定されないものの、錠剤（例えば、咀嚼錠）、カプレット、カプセル、および液体（例えば、味付きシロップ）などの個々の剤形として提供しうる。こうした剤形には、所定の量の有効成分が含まれ、また当業者にとってよく知られた製薬学の方法により調製しうる。『Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton PA (1990)』を全般的に参照のこと。
【０２０２】
本明細書で提供されている典型的な経口投与形態は、伝統的な製薬の配合技術に従い、少なくとも1つの賦形剤と均質に混合した化合物を組み合わせることで調製される。賦形剤は、投与のために望ましい調製の形態に応じて、非常に多様な形態を取ることができる。例えば、経口液体またはエアロゾル剤形での使用に適した賦形剤には、限定されないものの、水、グリコール、油、アルコール類、香味剤、防腐剤、および着色剤が含まれる。固体の経口剤形（例えば、粉末、錠剤、カプセル、およびカプレット）での使用に適した賦形剤の例には、限定されないものの、デンプン、糖類、微結晶セルロース、希釈剤、顆粒薬、潤滑剤、結合剤、および崩壊剤が含まれる。
【０２０３】
投与のしやすさから、錠剤およびカプセルは、最も有利な単位経口剤形であり、この場合、固体賦形剤が採用される。希望に応じて、錠剤は、標準的な水性または非水系の技術により被覆することができる。こうした剤形は、製薬学の任意の方法により調製できる。一般に、医薬組成物および剤形は、有効成分を液体担体と均一かつ均質に混合する、固体担体を細粒にする、またはその両方を行った後、必要に応じて、生成物を希望の体裁に形作ることで調製される。
【０２０４】
例えば、錠剤は圧縮または成型により調製できる。圧縮錠剤は、粉末または顆粒などの自由に流動する形態の有効成分を適切な機械で圧縮することにより調製でき、これが任意に賦形剤と混合される。成型錠剤は、不活性の液体希釈剤で湿らせた粉末の化合物の混合物を適切な機械で成型することにより作成できる。
【０２０５】
本明細書で提供されている経口剤形で使用できる賦形剤の例には、限定されないものの、結合剤、賦形剤、錠剤分解物質、および潤滑剤が含まれる。医薬組成物および剤形での使用に適した結合剤には、限定されないものの、コーンスターチ、ポテトスターチ、またはその他のデンプン、ゼラチン、天然ゴムおよび合成ゴム（アカシアなど）、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、その他のアルギン酸塩、粉末トラガカント、グアールガム、セルロースおよびその誘導体（例えば、エチルセルロース、酢酸繊維素、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、アルファ化でんぷん、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、（例えば、2208番、2906番、2910番）、微結晶性セルロース、およびその混合物が含まれる。
【０２０６】
本明細書で提供されている医薬組成物および剤形での使用に適した賦形剤の例には、限定されないものの、タルク、炭酸カルシウム（例えば、顆粒または粉末）、微結晶性セルロース、粉末セルロース、デキストレート、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソルビトール、デンプン、アルファ化でんぷん、およびその混合物が含まれる。本明細書で提供されている医薬組成物中の結合剤または賦形剤は、一般的に医薬組成物または剤形の約50〜約99重量パーセントで存在する。
【０２０７】
微結晶性セルロースの適切な形態には、限定されないものの、AVICEL PH 101、AVICEL PH 103、AVICEL RC 581、AVICEL PH 105（FMC Corporation、American Viscose Division、Avicel Sales（ペンシルベニア州マーカスフック）より入手可能）として販売されている素材、およびその混合物が含まれる。特定の結合剤は、AVICEL RC 581として販売されている微結晶性セルロースおよびナトリウムカルボキシメチルセルロースの混合物である。適切な無水または低水分の賦形剤または添加物には、AVICEL PH 103TMおよびデンプン1500 LMが含まれる。
【０２０８】
錠剤分解物質は、水性の環境にさらされたときに分解する錠剤を提供するために、本明細書で提供した組成物に使用される。錠剤分解物質の含有量が多すぎる錠剤は、保管中に分解することがあり、一方、含有量が少なすぎる錠剤は、望ましい速度でまたは望ましい条件で分解しないことがある。従って、有効成分の放出を不利益に変化させるために多過ぎでも少な過ぎでもない十分な量の錠剤分解物質を、本明細書で提供されている固体の経口剤形を形成するために使用すべきである。使用する錠剤分解物質の量は、製剤タイプによって異なり、また、当業者には容易に認識できる。典型的な医薬組成物は、約0.5〜約15重量パーセントの錠剤分解物質を含有し、特に、約1〜約5重量パーセントの錠剤分解物質を含有する。
【０２０９】
本明細書で提供されている医薬組成物および剤形で使用できる錠剤分解物質には、限定されないものの、寒天、アルギン酸、炭酸カルシウム、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポラクリリンカリウム、グリコール酸デンプンナトリウム、バレイショデンプンまたはタピオカデンプン、アルファ化デンプン、その他のデンプン、粘土、その他のアルギン、その他のセルロース、ゴム、およびその混合物が含まれる。
【０２１０】
本明細書で提供されている医薬組成物および剤形で使用できる潤滑剤には、限定されないものの、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、軽油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール、その他のグリコール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、硬化植物油（例えば、ラッカセイ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、エチルラウレアート、寒天、およびその混合物が含まれる。それ以外の潤滑剤には、例えば、シロイドシリカゲル（AEROSIL 200、製造元W.R. Grace Co.、メリーランド州ボルチモア）、合成シリカの凝固エアロゾル（販売元Degussa Co.、テキサス州プレーノ）、CAB O SIL（焼成二酸化ケイ素製品、販売元Cabot Co.、マサチューセッツ州ボストン）、およびその混合物が含まれる。使用する場合には、潤滑剤は、一般に約1重量パーセント未満の量の医薬組成物または剤形が、組み込み先に使用される。
【０２１１】
化合物は、放出制御手段または当業者によく知られた送達装置により投与することができる。例には、限定されないものの、米国特許第3,845,770号、第3,916,899号、第3,536,809号、第3,598,123号、および第4,008,719号、第5,674,533号、第5,059,595号、第5,591,767号、第5,120,548号、第5,073,543号、第5,639,476号、第5,354,556号、および第5,733,566号に記載されたものが含まれ、それぞれを参照し本明細書に組み込む。こうした剤形は、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、その他の高分子マトリクス、ゲル、隔膜、浸透圧系、多層膜コーティング、微小粒子、リポソーム、細粒、またはその組み合わせを使用して異なる比率での希望の放出プロファイルを提供するために、1つ以上の有効成分の緩徐なまたは制御された放出を提供するために使用できる。当業者に周知の適切な徐放性製剤は、本明細書に記載されているものも含めて、発明の有効成分とともに使用するために、容易に選択できる。こうして、発明には、経口投与に適した単一単位剤形が含まれ、これには限定はされないものの、放出制御に適応させる錠剤、カプセル、ジェルキャップ、およびカプレットなどがある。
【０２１２】
すべての徐放性製薬製品は、制御しない対応物により達成されるものよりも薬物治療を改善するという共通の目的を持つ。理想的には、薬物療法における最適に設計された徐放性調製品の使用は、最小限の薬剤原料が、最小限の時間で、病状を治癒または管理するために採用されることで特性づけられる。徐放性製剤の利点には、薬物の長時間にわたる活性、投薬頻度の減少、および患者の服薬順守の増加が含まれる。さらに、徐放性製剤は、薬物の血液レベルなど、作用の発現またはその他の特性の時間に影響を及ぼすために使用できるため、副作用（例えば、有害な副作用）の発生に影響を与えることができる。
【０２１３】
ほとんどの徐放性製剤は、その治療的または予防的な効果のレベルを長時間にわたり維持するために、望ましい療法効果を即座に起こすある量の薬物（有効成分）を当初放出し、またその他の量の薬物を徐々にかつ連続的に放出するよう設計されている。薬物のこの体内での一定レベルを維持するためには、代謝されて体内から排出される薬物量を置き換える速度で剤形から放出される必要がある。有効成分の放出制御は、限定はされないものの、pH、温度、酵素、水、またはその他の生理学的条件または薬剤などを含めた、様々な条件により促すことができる。
【０２１４】
非経口的な剤形は、限定はされないものの、皮下、静脈内（大量瞬時投与を含む）、筋肉内、および動脈内を含めた様々な経路により、患者に投与できる。こうした投与は、一般的に患者の汚染物質に対する自然防御を迂回するため、非経口的剤形は、無菌であるか、または患者に投与する前に滅菌できることが好ましい。非経口的な剤形の例には、限定されないものの、注射用にすぐ使用できる溶液、注射用に医薬品として容認される溶媒にすぐに溶解または懸濁できる乾燥物、注射用にすぐに使用できる懸濁液、および乳濁液が含まれる。
【０２１５】
本明細書で提供されている非経口的な剤形を提供するために使用できる適切な媒体は、当業者によく知られている。例には、限定されないものの、注射USP用の水のほか、限定はされないものの、生理食塩液注射液、リンガー液、ブドウ糖注射、ブドウ糖および生理食塩液注射液、および乳酸リンゲル液といった水溶性溶媒、限定はされないものの、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールといった水混和性媒体、ならびに限定はされないものの、トウモロコシ油、綿実油、ラッカセイ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルといった非水溶性媒体が含まれる。
【０２１６】
本明細書で提供されている1つ以上の化合物の溶解性（溶解度）を増加させる薬剤を、本明細書で提供されている非経口的な剤形に組み込むこともできる。
【０２１７】
本明細書で提供されている経皮的、局所的、および経粘膜の剤形には、限定されないものの、眼科用溶液、噴霧剤、エアロゾル、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、溶液、乳濁液、懸濁液、または当業者に周知のその他の形態が含まれる。例えば、『Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th and 18th eds., Mack Publishing, Easton PA (1980 & 1990)』、および『Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th ed., Lea & Febiger, Philadelphia (1985)』を参照のこと。口腔内の粘膜組織の治療に適した剤形は、うがい薬または経口ゲル剤として調製できる。さらに、経皮的剤形には、「リザーバー型」または「マトリクス型」のパッチが含まれ、これが、皮膚に貼られ、望ましい量の有効成分の浸透が許容されるよう特定の期間だけ着用される。
【０２１８】
本明細書で提供されている経皮的、局所的、および経粘膜の剤形を提供するために使用できる適切な賦形剤（例えば、担体および希釈剤）およびその他の素材は、製薬技術の当業者によく知られており、また所定の医薬組成物または剤形が貼り付けられる特定の組織によっても異なる。その事実を念頭に置き、典型的な賦形剤には、限定されないものの、水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン1,3ジオール、ミリスチン酸イソプロピル、イソプロピル パルミチン酸塩、鉱油、およびローション、チンキ、クリーム、乳濁液、ゲルまたは軟膏を形成するためのその混合物が含まれ、これらは、無毒性でかつ医薬として許容されるものである。保湿剤または湿潤剤を、希望に応じて、医薬組成物および剤形に加えることもできる。それ以外のこうした成分の例は、当該技術でよく知られている。例えば、『Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th and 18th eds., Mack Publishing, Easton PA (1980 & 1990)』を参照のこと。
【０２１９】
治療の対象となる特定の組織に応じて、それ以外の成分を、化合物による治療の前に、それと同時に、またはその後に使用することもできる。例えば、組織への有効成分の送達を支援するために浸透エンハンサーを使用することもできる。適切な透過促進剤には、限定されないものの、アセトン、様々なアルコール類（エタノール、オレイル、およびテトラヒドロフリルなど）、アルキルスルホキシド類（ジメチルスルホキシドなど）、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ポリエチレングリコール、ピロリドン（ポリビニルピロリドンなど）、コリドングレード（ポビドン、ポリビドン）、尿素、および様々な水溶性または不溶性の糖エステル（Tween 80（ポリソルビン酸80）およびSpan 60（ソルビタンモノステアラート）など）が含まれる。
【０２２０】
医薬組成物または剤形のpH、または医薬組成物または剤形を適用する組織のpHも、1つ以上の化合物の送達を改善するために調節することができる。同様に、溶剤の担体の極性、そのイオン強度、または緊張度を調節して、送達を改善することができる。ステアリン酸塩などの薬剤を、医薬組成物または剤形に加えて、送達を改善するために1つ以上の化合物の親水性または親油性を有利に変化させることもできる。これに関連して、ステアリン酸塩は、製剤形態のためのリピド媒体として、乳化剤または界面活性剤として、また送達を促進または浸透を促進する薬剤としての役割を果たさせることができる。化合物の異なる塩、水和物または溶媒和物を、結果的に生じる組成物の性質（特性）をさらに調節するために使用することができる。
【０２２１】
一定の特定の実施態様において、組成物は、経口剤、注射剤、または経皮剤である。特定の一実施態様において、組成物は、経口投与の形態である。別の特定の実施態様において、組成物は、注射剤の形態である。別の特定の実施態様において、組成物は経皮剤の形態である。
【０２２２】
7.  予防及び治療の方法
本発明により、ウイルス感染を予防、治療および／または管理する方法が提供され、前記方法は、1つ以上の化合物を、それを必要とする対象に投与する手順から構成される。特定の実施態様において、発明によりウイルス感染を予防、治療および／または管理する方法が提供され、前記方法は、予防的にまたは治療的に有効な量の1つ以上の化合物または化合物を含有する組成物の1用量を、それを必要とする対象に投与する手順を含む。化合物または化合物を含有する組成物は、ウイルス感染について、どの系統の治療にも使用しうる（例えば、第一選択、第二選択、第三選択、第四選択または第五選択の治療）。
【０２２３】
別の実施態様において、本発明は、ヒト対象において、それを必要とするヒト対象に、有効量の1つ以上の化合物または1つ以上の化合物を含有する組成物を投与することにより、ウイルス感染によって変化した代謝流束を反転または再配向する方法に関連する。例えば、ウイルス感染は、有益な結果（例えば、相乗効果、副作用の低減、治療指数の向上）を生み出す酵素阻害化合物の組み合わせを使用して治療ができる。
【０２２４】
特定の実施態様において、化合物が、前記ウイルス感染を阻止、治療、管理または改善するために投与される唯一の有効成分である。一定の一実施態様において、化合物を含有する組成物が唯一の有効成分である。
【０２２５】
本発明には、抗ウイルス療法が利用出来ない、ウイルス感染を予防、治療および／または管理する方法が含まれる。また本発明には、他の公知の治療に代わるものとしての、ウイルス感染を予防、治療および／または管理する方法が含まれる。
【０２２６】
また本発明は、ウイルス感染を予防、治療および／または管理する方法を提供するが、前記方法は、それを必要とする対象に1つ以上の化合物および1つ以上のその他の治療剤（例えば、予防薬または治療薬）を投与することを含む。特定の実施態様において、他の治療剤は、現時点で使用されているもの、使用されてきたもの、またはウイルス感染の予防、治療および／または管理に有用であることが知られているものである。こうした治療の非限定的な例については、本明細書中に掲載している。特定の実施態様において、1つ以上の化合物が、本明細書中に記載した1つ以上の治療との組み合わせで対象に投与される。別の実施態様において、1つ以上の化合物が、補助的治療剤、苦痛を軽減する薬剤、または抗ウイルス活性を持たないその他の治療剤との組み合わせで、対象に投与される。
【０２２７】
本発明の組合せ治療剤は、経時的または同時的に投与できる。一実施態様において、本発明の組合せ治療剤は、mTOR阻害剤である化合物、及びUPRを阻害する化合物を含有する。一実施態様において、本発明の組合せ治療剤は、mTORのラパマイシン耐性機能を阻害する化合物、及びUPRを阻害する化合物を含有する。一実施態様において、本発明の組合せ治療剤は、mTORのラパマイシン耐性機能を阻害する化合物、及び分子シャペロンである化合物を含有する。一実施態様において、本発明の組合せ治療剤は、化合物および同一の作用機序を持つ少なくとも1つのその他の治療剤を含有する。別の実施態様において、本発明の組合せ治療剤は、化合物および化合物とは異なる作用機序を持つ少なくとも1つのその他の治療剤を含有する。
【０２２８】
特定の実施態様において、本発明の組合せ治療剤は、化合物とともに機能して、相加効果または相乗効果を持つことにより、化合物の予防的および／または療法効果を改善する。別の実施態様において、本発明の組合せ治療剤は、各治療を単独で受けた場合に関連した副作用を低減する。
【０２２９】
組合せ治療剤の予防薬または治療薬は、同一の医薬組成物で対象に投与できる。別の方法として、組合せ治療剤の予防薬または治療薬は、別個の医薬組成物で、対象に同時的に投与できる。予防薬または治療薬は、同一または異なる投与経路で対象に投与しうる。
【０２３０】
7.1  患者母集団
本発明において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、ウイルス感染を受けた対象に投与される。その他の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、ウイルス感染にかかりやすいまたは敏感な対象に投与される。一部の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、ウイルス感染の発生があったか、またはそれが考えられる地域に住む対象に投与される。一部の実施態様において、ウイルス感染は、潜伏性のウイルス感染である。一実施態様において、化合物または組合せ治療剤が、ヒト乳児に投与される。一実施態様において、化合物または組合せ治療剤が、ヒト早産児ヒト乳児に投与される。その他の実施態様において、ウイルス感染は、活動性感染である。さらに、その他の実施態様において、ウイルス感染は、慢性ウイルス感染である。ウイルス感染のタイプの非限定的な例には、本明細書中に記載したものを原因とする感染が含まれる。
【０２３１】
特定の実施態様において、ウイルス感染は、エンベロープウイルス感染である。一部の実施態様において、エンベロープウイルスは、DNAウイルスである。その他の実施態様において、エンベロープウイルスは、RNAウイルスである。一部の実施態様において、エンベロープウイルスは二本鎖のDNAまたはRNAゲノムを持つ。その他の実施態様において、エンベロープウイルスは一本鎖のDNAまたはRNAゲノムを持つ。特定の実施態様において、ウイルスはヒトに感染する。
【０２３２】
一定の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、0〜6カ月、6〜12カ月、1〜5歳、5〜10歳、10〜15歳、15〜20歳、20〜25歳、25〜30歳、30〜35歳、35〜40歳、40〜45歳、45〜50歳、50〜55歳、55〜60歳、60〜65歳、65〜70歳、70〜75歳、75〜80歳、80〜85歳、85〜90歳、90〜95歳または95〜100歳である哺乳動物に投与される。一定の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、ウイルス感染の危険にさらされているヒトに投与される。一定の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、ウイルス感染したヒトに投与される。一定の実施態様において、患者は、0〜6カ月、6〜12カ月、1〜5歳、5〜10歳、5〜12歳、10〜15歳、15〜20歳、13〜19歳、20〜25歳、25〜30歳、20〜65歳、30〜35歳、35〜40歳、40〜45歳、45〜50歳、50〜55歳、55〜60歳、60〜65歳、65〜70歳、70〜75歳、75〜80歳、80〜85歳、85〜90歳、90〜95歳または95〜100歳のヒトである。一部の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、ヒト乳児に投与される。その他の実施態様において、化合物、または組合せ治療剤が、ヒト小児に投与される。その他の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、ヒト成人に投与される。さらに、その他の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、高齢者に投与される。
【０２３３】
一定の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、ペット、例えば、イヌまたはネコに投与される。一定の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、家畜または家畜、例えば、ブタ、雌ウシ、ウマ、ニワトリなどに投与される。一定の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、鳥、例えば、アヒルまたはニワトリに投与される。
【０２３４】
一定の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、免疫無防備状態や免疫抑制状態にあるか、または免疫無防備状態や免疫抑制状態になる危険性のある霊長類、好ましくはヒト、またはその他の哺乳動物（ブタ、雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコおよびげっ歯類など）に投与される。一定の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、免疫抑制薬治療を受けているか、その治療から回復中の対象に投与される。一定の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、がん、エイズ、その他のウイルス感染、または細菌感染を持つか、またはそれらに感染する危険性のある対象に投与される。一定の実施態様において、対象は、手術、化学療法および／または放射線療法を受けているか、それを受ける予定であるか、またはそれを受けた対象である。一定の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、嚢胞性線維症、肺線維症、または対象がウイルス感染しやすくなるその他の病気を持つ対象に投与される。一定の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、組織移植を行った組織移植予定の、またはその経験のある対象に投与される。一部の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、養護施設、グループホーム（すなわち、対象10人以上の施設）、または刑務所に住む対象に投与される。一部の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、学校（例えば、小学校、中学校、高校または大学）または託児所に通う対象に投与される。一部の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、医師または看護師などヘルスケア分野または病院で働く対象に投与される。一定の実施態様において、化合物、化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が、妊娠中または妊娠する予定の対象に投与される。
【０２３５】
一部の実施態様において、何らかの有害影響または化合物以外の治療に対する不耐性が現れる前に、患者に、化合物または化合物を含有する組成物、または組合せ治療剤が投与される。一部の実施態様において、化合物または1つ以上の化合物、または組合せ治療剤を含有する組成物が、難治性の患者に投与される。一定の一実施態様において、難治性の患者は、標準的な抗ウイルス療法に対して難治性の患者である。一定の実施態様において、ウイルス感染している患者は、感染が有意には根絶されていないとき、および／または症状が有意には軽減されていないとき、治療に対して難治性である。患者が難治性かどうかの決定は、感染症の治療の効果を評価するために当該技術で知られている任意の方法により、そうした状況において当該技術で容認されている「難治性」の意味を用いて、インビボまたはインビトロのいずれでも行うことができる。各種の実施態様において、ウイルス感染している患者は、ウイルス複製が減少しないかまたは増加したとき、難治性である。
【０２３６】
一部の実施態様において、化合物または1つ以上の化合物、または組合せ治療剤を含有する組成物が、こうした感染症を発症する危険性のある患者において、ウイルス感染の発症または再発を阻止するために、患者に投与される。一部の実施態様において、化合物または1つ以上の化合物、または組合せ治療剤を含有する組成物が、従来的な治療に対する有害な反応に影響を受けやすい患者に投与される。
【０２３７】
一部の実施態様において、1つ以上の化合物または1つ以上の化合物、または組合せ治療剤を含有する組成物が、化合物以外の治療に対して難治性であることが判明しており、それらの治療をもはや受けていない患者に投与される。一定の実施態様において、本発明の方法に従い管理または治療を受けている患者は、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、またはその他の生物療法／免疫療法による治療を既に受けている患者である。これらの患者のなかには、難治性の患者、従来的な治療には若すぎる患者、および従来の治療による管理または治療にもかかわらず、ウイルス感染を併発している患者がいる。
【０２３８】
一部の実施態様において、1つ以上の化合物または1つ以上の化合物、または組合せ治療剤を含有する組成物を投与する対象は、化合物や組成物または組合せ治療剤の投与前には、治療を受けていない。その他の実施態様において、1つ以上の化合物または1つ以上の化合物、または組合せ治療剤を含有する組成物が、1つ以上の化合物または1つ以上の化合物、または組合せ治療剤を含有する組成物の投与の前に治療を受けたことのある対象に投与される。一部の実施態様において、化合物または化合物を含有する組成物の投与を受ける対象は、以前の治療に対して難治性であったか、または以前の治療に対して有害副作用を経験したか、または対象に対する容認できない毒性レベルが理由で以前の治療が中断されたものである。
【０２３９】
7.2  投与方法
患者に投与するとき、化合物は、医薬品として容認される溶媒を含有する任意の組成物の構成要素として投与することが好ましい。組成物は、経口的に、またはその他の任意の好都合な経路により、例えば、注入または大量瞬時投与により、上皮または粘膜皮膚層による吸収（例えば、口腔粘膜、直腸、および腸管粘膜）により投与でき、また他の生物活性のある薬剤とともに投与することもできる。投与は、全身的でも局所的でもよい。様々な送達系が知られており、例えば、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセル、カプセルへの封入があり、化合物およびその医薬として許容される塩を投与するため使用できる。
【０２４０】
投与の方法には、限定されないものの、非経口的な、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮的、直腸、吸入、または局所的、特に耳、鼻、眼、または皮膚が含まれる。投与方法は、医師の裁量に任せられている。ほとんどの場合に、投与によって、化合物が血流に放出されることになる。
【０２４１】
特定の実施態様において、化合物を局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、限定はされないが、局所的な注入、局所投与、例えば、創傷包帯とともに、注射により、カテーテルの手段により、坐薬の手段により、または植え込み錠の手段により達成することができるが、前記植え込み錠は、多穴性、非多孔、または膜（シアラスティック膜など）、または繊維を含めたゼラチン質材料のものである。それらの場合に、投与によって、化合物は、実質的に血流に放出されることなく、局所的な組織に選択的に集中し得る。
【０２４２】
一定の実施態様において、脳室内、くも膜下腔内および硬膜外注射を含めた何らかの適切な経路により、化合物を中枢神経系に導入することが望ましい場合がある。脳室内注射は、脳室内カテーテルにより、例えば、オンマヤリザーバーなどのリザーバーに取り付けて、促進することもできる。
【０２４３】
肺投与も採用することができ、例えば、吸入器または噴霧器の使用により、またエアロゾル剤による製剤形態で、または過フッ化炭化水素または合成肺胞界面活性物質内の灌流による。一定の実施態様において、化合物は、トリグリセリドなどの従来的な結合剤および媒体とともに、坐薬として調製される。
【０２４４】
皮膚徴候を伴うウイルス感染については、化合物は局所的に管理できる。同様に、眼の症候を伴うウイルス感染については、化合物は眼から投与できる。
【０２４５】
別の実施態様において、化合物は、小胞、特にリポソームに入れて送達される（『Langer, 1990, Science 249:1527 1533』、『Treat et al.（Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Bacterial infection）』、『Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353 365 (1989)』、『Lopez Berestein, ibid., pp. 317 327』を参照、同書を全般的に参照）。
【０２４６】
別の実施態様において、化合物は放出制御系に入れて送達される（例えば、『Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115 138 (1984)』を参照）。放出制御系の例については、『Langer, 1990, Science 249:1527 1533』によるレビューに考察があり、それを使用しうる。一実施態様において、ポンプを使用することもできる（『Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201』、『Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507』、『Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574』を参照）。別の実施態様において、高分子材料を使用することができる（『Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)』、『Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)』、『Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61』を参照、また『Levy et al., 1985, Science 228:190』、『During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351』、『Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105』も参照）。特定の実施態様において、化合物を含有する放出制御系は、予防、治療および／または管理の対象となるウイルスに感染した組織のすぐそばに配置される。この実施態様に従い、放出制御系が感染のごく近くにあることで、全身的に投与する場合に、化合物の用量の一部分のみを必要としうる。
【０２４７】
一定の実施態様において、化合物がそれに対する抗ウイルス活性を持つ、ウイルス感染の自然な経路により投与することが望ましい場合がある。例えば、発明の化合物を、ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）による気道の感染を治療または阻止するために、何らかの適切な経路で肺に投与することが望ましい場合がある。肺投与は、例えば、吸入器または噴霧器の使用により、また噴霧剤としての使用するためのエアロゾル剤による製剤形態を採用することもできる。
【０２４８】
7.3  化合物との組合せに使用される薬剤
ウイルス感染の予防、治療および／または管理のために、化合物との組み合わせに使用できる治療薬または予防薬には、限定されないものの、小分子、合成薬物、ペプチド（環状ペプチドを含む）、ポリペプチド、タンパク質、核酸（例えば、DNAおよびRNAヌクレオチドで、これには限定はされないものの、アンチセンスヌクレオチド配列、三重らせん体、RNAi、および生物学的に活性のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む）、抗体、合成的または天然の無機分子、模倣薬剤、および合成的または天然の有機分子が含まれる。こうした薬剤の特定の例には、限定されないものの、免疫調整薬（例えば、インターフェロン）、抗炎症薬（例えば、副腎コルチコイド、副腎皮質ステロイド（例えば、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、プレドニソロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン）、糖質コルチコイド、ステロイド、および非ステロイド系抗炎症性薬物（例えば、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク、およびCOX-2阻害剤））、鎮痛剤、ロイコトリエン拮抗薬（例えば、モンテルカスト、メチルキサンチン、ザフィルルカスト、およびジロートン）、β2-作動薬（例えば、アルブテロール、ビテロール、フェノテロール、イソエタリー、メタプロテレノール、ピルブテロール、サルブタモール、テルブタリンホルモテロール、サルメテロール、およびサルブタモールテルブタリン）、抗コリン作用薬（例えば、臭化イプラトロピウムおよびオキシトロピウム臭化物）、スルファサラジン、ペニシラミン、ダプソン、抗ヒスタミン薬、抗マラリア剤（例えば、ヒドロキシクロロキン）、抗ウイルス薬（例えば、ヌクレオシド類似体（例えば、ジドブジン、アシクロビル、ガングシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、およびリバビリン）、フォスカーネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、およびAZT）ならびに抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧称アクチノマイシン）、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（AMC））が含まれる。
【０２４９】
ウイルス感染の予防、管理、および／または治療に有用であることが知られているか、または使用されてきたか、または現在使用されている、あるいは発明に従って化合物と組み合わせて使用できる任意の治療については、本明細書に記載している。ウイルス感染の予防、治療および／または管理に使用されてきたか、または現在使用されている治療（例えば、予防薬または治療薬）に関する情報については、例えば、『Gilman et al., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, 2001』、『The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Berkow, M.D. et al. (eds.), 17th Ed., Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, Rahway, NJ, 1999』、『Cecil Textbook of Medicine, 20th Ed., Bennett and Plum (eds.), W.B. Saunders, Philadelphia, 1996』および『Physicians' Desk Reference (61st ed. 1007)』を参照。
【０２５０】
7.3.1  抗ウイルス剤
化合物との組み合わせに使用できる抗ウイルス剤には、限定されないものの、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、および融合阻害剤が含まれる。一実施態様において、抗ウイルス剤は、アマンタジン、オセルタミビルリン酸塩、リマンタジン、およびザナミビルからなる群から選択される。別の実施態様において、抗ウイルス剤は、デラビルジン、エファビレンツ、およびネビラピンからなる群から選択した非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬である。別の実施態様において、抗ウイルス剤は、アバカビル、ジダノシン、エムトリシタビン、エムトリシタビン、ラミブジン、スタブジン、テノホビルDF、ザルシタビン、およびジドブジンからなる群から選択したヌクレオシド逆転写酵素阻害剤である。別の実施態様において、抗ウイルス剤は、アンプレナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、リトナビル、およびサキナビルからなる群から選択したプロテアーゼ阻害剤である。別の実施態様において、抗ウイルス剤は、エンフビルチドなどの融合阻害剤である。
【０２５１】
それ以外に組み合わせ化合物に使用するための抗ウイルス剤の非限定的な例には、リファンピシン、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、AZT、ddI、ddC、3TC、d4T）、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬（例えば、デラビルジン、エファビレンツ、ネビラピン）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、アプレナビル、インジナビル、リトナビル、およびサキナビル）、イドクスウリジン、シドホビル、アシクロビル、ガンシクロビル、ザナミビル、アマンタジン、およびパリビズマブが含まれる。その他の抗ウイルス剤の例には、限定されないものの、エースマンナン、アシクロビル、アシクロビルナトリウム、アデホビル、アロブジン、アルビルセプトスドトックス、塩酸アマンタジン（SYMMETRELTM）、アリルドン、アリルドン、アテビルジンメシラート、アブリジン、シドホビル、シパムフィリン、シタラビン塩酸塩、メシル酸デラビルジン、デスシクロビル、ジダノシン、ジソキサリル、エドクスジン、エンビラデン、エンビロキシム、ファムシクロビル、塩酸ファモチン、フィアシタビン、フィアルリジン、ホサリラート、フォスカメットナトリウム、ホスホネットナトリウム、ガンシクロビル、ガンシクロビルナトリウム、イドクスウリジン、ケトキサール、ラミブジン、ロブカビル、メモチン塩酸塩、メチサゾン、ネビラピン、オセルタミビルリン酸塩（TAMIFLUTM）、ペンシクロビル、ピロダビル、リバビリン、リマンタジン塩酸塩（FLUMADINETM）、メシル酸サキナビル、ソマンタジン塩酸塩、ソリブジン、スタトロン、スタブジン、チロロン塩酸塩、トリフルリジン、塩酸バラシクロビル、ビダラビン、ビダラビンリン酸塩、ビダラビンリン酸ナトリウム、ビロキシム、ザルシタビン、ザナミビル（RELENZATM）、ジドブジン、およびジンビロキシムが含まれる。
【０２５２】
7.3.2  抗細菌剤
化合物との組み合わせに使用できる抗細菌剤（抗生物質を含む）には、限定されないものの、アミノグリコシド系抗生物質、糖ペプチド、アンフェニコール抗生物質、アンサマイシン系抗生物質、セファロスポリン、セファマイシンオキサゾリジノン、ペニシリン、キノロン、ストレプトグラミン（streptogamins）、テトラサイクリン、およびその類似体が含まれる。一部の実施態様において、抗生物質は、細菌感染を阻止および／または治療するための化合物と組み合わせて投与される。
【０２５３】
特定の実施態様において、化合物は、限定はされないものの、ストレプトマイシン、ネオマイシン、エリスロマイシン、カルボマイシン、およびスピラマイシンを含むその他のタンパク質合成阻害薬と組み合わせて使用される。
【０２５４】
一実施態様において、抗菌性の薬剤は、アンピシリン、アモキシシリン、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ペニシリンG、ストレプトマイシン、スルファニルアミド、およびバンコマイシンからなる群から選択される。別の実施態様において、抗菌性の薬剤は、アジトロマイシン、セフォニシド、セフォテタン、セファロチン、セファマイシン、クロルテトラサイクリン、クラリトロマイシン、クリンダマイシン、サイクロセリン、ダルホプリスチン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、リネゾリド、ムピロシン、オキシテトラサイクリン、キヌプリスチン、リファンピン、スペクチノマイシン、およびトリメトプリムからなる群から選択される。
【０２５５】
化合物との組み合わせに使用される抗細菌剤のそれ以外の非限定的な例には、アミノグリコシド系抗生物質（例えば、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ネオマイシン、ネオマイシン、ウンデシレン酸塩、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、およびスペクチノマイシン）、アンフェニコール抗生物質（例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、およびチアンフェニコール）、アンサマイシン系抗生物質（例えば、リファミドおよびリファンピン）、カルバセフェム（例えば、ロラカルベフ）、カルバペネム（例えば、ビアペネムおよびイミペネム）、セファロスポリン（例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、およびセフピロム）、セファマイシン（例えば、セフブペラゾン、セフメタゾール、およびセフミノクス）、葉酸類似体（例えば、トリメトプリム）、糖ペプチド（例えば、バンコマイシン）、リンコサミド（例えば、クリンダマイシン、およびリンコマイシン）、マクロライド（例えば、アジトロマイシン、カルボマイシン、クラリスロマイシン、ジリトロマイシン、エリスロマイシン、およびエリスロマイシンアシストラート）、モノバクタム（例えば、アズトレオナム、カルモナム、およびチゲモナム）、ニトロフラン（例えば、フラルタドン、および塩化フラゾリウム）、オキサセフェム（例えば、フロモキセフ、およびモキサラクタム）、オキサゾリジノン（例えば、リネゾリド）、ペニシリン（例えば、アムジノシリン、アムジノシリン・ピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ペナムシリン、ペネタマートヨウ化水素酸塩、ペニシリンoベネタミン、ペニシリン0、ペニシリンV、ペニシリンVベンザチン、ペニシリンVヒドラバミン、ペニメピサイクリン、およびフェンシヒシリンカリウム）、キノロンおよびその類似体（例えば、シノキサシン、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、フルメキン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、およびモキシシリト）、ストレプトグラミン（例えば、キヌプリスチンおよびダルホプリスチン）、スルホンアミド（例えば、アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルファミド、ノプリルスルファミド、フタリルスルファセタミド、スルファクリソイジン、およびスルファシチン）、スルホン類（例えば、ジアチモスルホン、グルコスルホンナトリウム、およびソラスルホン）、およびテトラサイクリン（例えば、アピシクリン、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、およびデメクロサイクリン）が含まれる。それ以外の例には、サイクロセリン、ムピロシン、チュベリンアンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンデュラシジン、エンビオマイシン、および2,4ジアミノピリミジン（例えば、ブロジモプリム）が含まれる。
【０２５６】
7.4  投与の用量と頻度
ウイルス感染の予防、治療および／または管理において有効な化合物の量、または化合物を含有する組成物の量は、標準的な臨床技術により決定できる。インビトロでまたはインビボでのアッセイを、最適な投薬範囲を特定する助けとして任意に採用できる。採用する正確な用量は、例えば、投与経路、発明のタイプ、および感染の重症度にも依存し、また開業医およびそれぞれの患者または対象の状況の判断に従い決定されるべきである。
【０２５７】
一部の実施態様において、化合物の投薬は、動物実験で決定された最大無毒性量（NOAEL）からの推定により決定される。この推定投薬量は、ヒトの臨床試験についての最大推奨初回投与量の決定において有用である。例えば、NOAELは、ヒト相当用量（HED）を決定するために推定できる。一般に、HEDは、体表面積（すなわち、mg/m2）に対して規準化した用量をもとに、ヒト以外の動物の用量から推定される。特定の実施態様において、NOAELは、マウス、ハムスター、ラット、ケナガイタチ、モルモット、ウサギ、イヌ、霊長類、霊長類（サル、マモセット、リスザル、ヒヒ）、マイクロまたはミニブタで決定される。ヒト相当用量を決定するためのNOAELおよびその推定法の使用に関する考察については、『Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers, U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evalutaion and Research (CDER)（米国保健福祉省食品医薬品局医薬品評価センター）, Pharmacology and Toxicology, July 2005）』を参照のこと。一実施態様において、化合物またはその組成物は、NOAELのヒト相当用量（HED）よりも低い用量で、1週間、2週間、3週間、1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、6カ月、9カ月、1年、2年、3年、4年以上の期間にわたり投与される。
【０２５８】
一定の実施態様において、ヒト対象のための投薬方法は、動物モデルの研究から、10%の動物が死ぬ致死量（LD10）を用いて推定できる。一般に、第I相治験の初回投与量は、臨床前試験に基づく。臨床前試験における薬物の標準的な毒性の測定手段は、治療のために死んだ動物の割合である。動物実験でのLD10と、ヒト初回投与量の推定の基礎として、体表面積について修正されたヒトでの最大耐用量（MTD）との相関は、十分に当該技術の範囲内である。一部の実施態様において、1つの動物モデルについての投与量の相互関係は、例えば、『Freireich et al., Cancer Chemother. Rep., 1966, 50:219-244』に記載のある換算係数（体表面積平方メートル当たりのミリグラム数による）を使用して、別の動物での使用に変換できる。体表面積は、患者の身長および体重からおおよそ決定できる。例えば、『Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, N. Y., 1970, 537』を参照のこと。一定の実施態様において、体表面積の調整には、例えば、表面積、体重、代謝、組織分布、吸収速度、および排泄率などの宿主の要因が含まれる。さらに、投与経路、賦形剤の用途、および標的とする特定の病気またはウイルスも、考慮する要因である。一実施態様において、標準的な控えめな初回投与量は、マウスのLD10の約1/10であるが、その他の種（すなわち、イヌ）がその化合物に対して感応性がより高い場合には、これよりもさらに低くなりうる。その他の実施態様において、標準的な控えめな初回投与量は、マウスのLD10の約1/100、1/95、1/90、1/85、1/80、1/75、1/70、1/65、1/60、1/55、1/50、1/45、1/40、1/35、1/30、1/25、1/20、1/15、2/10、3/10、4/10、または5/10である。その他の実施態様において、ヒトにおける化合物の初回投与量は、動物モデルの研究から推定した用量よりも低い。別の実施態様において、ヒトにおける化合物の初回投与量は、動物モデルの研究から推定した用量よりも高い。比較的低いレベルで活性の組成物の用量を開始すること、また最小限の毒性で希望の効果を達成するために、必要に応じて、投薬を増加または減少することは、十分に当該技術の範囲内である。
【０２５９】
化合物または組成物の模範的な用量には、対象または試料の体重1キログラム当たりのミリグラムまたはマイクログラムの量が含まれる（例えば、1 kg当たり約1マイクログラム〜1 kg当たり約500ミリグラム、1 kg当たり約5ミリグラム〜1 kg当たり約100ミリグラム、または1 kg当たり約1マイクログラム〜1 kg当たり約50ミリグラム）。特定の実施態様において、1日量は、少なくとも50 mg、75 mg、100 mg、150 mg、250 mg、500 mg、750 mg、または少なくとも1 gである。
【０２６０】
一実施態様において、投薬は、0.01〜5000 mM、1〜300 mM、10〜100 mMおよび10 mM〜1 Mの濃度である。別の実施態様において、投薬は、少なくとも5 μM、少なくとも10 μM、少なくとも50 μM、少なくとも100 μM、少なくとも500 μM、少なくとも1 mM、少なくとも5 mM、少なくとも10 mM、少なくとも50 mM、少なくとも100 mM、または少なくとも500 mMの濃度である。特定の実施態様において、投薬は、患者の体重に対して0.25 μg/kg以上、好ましくは0.5 μg/kg以上、1 μg/kg以上、2 μg/kg以上、3 μg/kg以上、4 μg/kg以上、5 μg/kg以上、6 μg/kg以上、7 μg/kg以上、8 μg/kg以上、9 μg/kg以上、または10 μg/kg以上、25 μg/kg以上、好ましくは50 μg/kg以上、100 μg/kg以上、250 μg/kg以上、500 μg/kg以上、1 mg/kg以上、5 mg/kg以上、6 mg/kg以上、7 mg/kg以上、8 mg/kg以上、9 mg/kg以上、または10 mg/kg以上である。
【０２６１】
一実施態様において、前記投薬は、0.01〜5000 mM、1〜300 mM、10〜100 mM及び10 mM〜1 Mの濃度である。別の実施態様において、前記投薬は、少なくとも5 μM、少なくとも10 μM、少なくとも50 μM、少なくとも100 μM、少なくとも500 μM、少なくとも1 mM、少なくとも5 mM、少なくとも10 mM、少なくとも50 mM、少なくとも100 mM、又は少なくとも500 mMの濃度である。特定の実施態様において、投薬は、患者の体重に対して0.25 μg/kg以上、好ましくは0.5 μg/kg以上、1 μg/kg以上、2 μg/kg以上、3 μg/kg以上、4 μg/kg以上、5 μg/kg以上、6 μg/kg以上、7 μg/kg以上、8 μg/kg以上、9 μg/kg以上、または10 μg/kg以上、25 μg/kg以上、好ましくは50 μg/kg以上、100 μg/kg以上、250 μg/kg以上、500 μg/kg以上、1 mg/kg以上、5 mg/kg以上、6 mg/kg以上、7 mg/kg以上、8 mg/kg以上、9 mg/kg以上、または10 mg/kg以上である。
【０２６２】
別の実施態様において、投薬は、5 mg、好ましくは10 mg、50 mg、100 mg、150 mg、200 mg、250 mg、300 mg、350 mg、400 mg、500 mg、550 mg、600 mg、650 mg、700 mg、750 mg、800 mg以上の単位用量である。別の実施態様において、投薬は、約5 mg〜約100 mg、約100 mg〜約200 μg、約150 mg〜約300 mg、約150 mg〜約400 mg、250 μg〜約500 mg、約500 mg〜約800 mg、約500 mg〜約1000 mg、または約5 mg〜約1000 mgの範囲の単位用量である。
【０２６３】
一定の実施態様において、経口投与に適した投薬範囲は、体重1キログラム、1日当たりの化合物約0.001ミリグラム〜約500ミリグラムである。発明の特定の実施態様において、経口用量は、体重1キログラム、1日当たり約0.01ミリグラム〜約100ミリグラム、約0.1ミリグラム〜約75ミリグラムまたは約0.5ミリグラム〜5ミリグラムである。本明細書に記載した投薬量は、投与される総量を意味し、つまり、2種以上の化合物が投与される場合には、一部の実施態様において、投与量は、投与された総量に一致する。特定の実施態様において、経口組成物には、本発明の化合物が約10重量%〜約95重量％含まれる。
【０２６４】
静脈内（i.v.）投与の適切な投薬範囲は、体重1キログラム1日当たり約0.01ミリグラム〜約100ミリグラム、体重1キログラム1日当たり約0.1ミリグラム〜約35ミリグラム、および体重1キログラム1日当たり約1ミリグラム〜約10ミリグラムである。一部の実施態様において、鼻腔内投与の適切な投薬範囲は、体重1キログラム、1日当たり約0.01 pg/kg〜約1 mg/kgである。座薬には、体重1キログラム、1日当たり一般的に約0.01ミリグラム〜約50ミリグラムの発明の化合物が含まれ、約0.5重量%〜約10重量%の範囲の有効成分を含有する。
【０２６５】
皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、硬膜外、舌下の、脳内、膣内、経皮的な投与または吸入による投与について推奨される投与量は、体重1キログラム、1日当たり約0.001ミリグラム〜約500ミリグラムの範囲である。局所的投与について適切な用量には、投与の領域によっても異なるが、約0.001ミリグラム〜約50ミリグラムの範囲の用量が含まれる。効果的な用量は、インビトロでまたは動物モデルでの試験系から得られた用量-反応曲線から推定することもできる。こうした動物モデルおよび系は、当該技術でよく知られている。
【０２６６】
別の実施態様において、対象には、用量1回分以上の予防的または治療的に有効な量の化合物または組成物が投与され、ここで、予防的または治療的に有効な量は、毎回の用量で同じではない。別の実施態様において、対象には、用量1回分以上の予防的にまたは治療的に有効な量の化合物または組成物が投与され、ここで、前記対象に投与される予防的または治療的に有効な量の用量は、例えば、0.01 μg/kg、0.02 μg/kg、0.04 μg/kg、0.05 μg/kg、0.06 μg/kg、0.08 μg/kg、0.1 μg/kg、0.2 μg/kg、0.25 μg/kg、0.5 μg/kg、0.75 μg/kg、1 μg/kg、1.5 μg/kg、2 μg/kg、4 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、15 μg/kg、20 μg/kg、25 μg/kg、30 μg/kg、35 μg/kg、40 μg/kg、45 μg/kg、または50 μg/kgにより、治療の進行に伴い増加する。別の実施態様において、対象には、用量1回分以上の予防的にまたは治療的に有効な量の化合物または組成物が投与され、ここで、用量は、例えば、0.01 μg/kg、0.02 μg/kg、0.04 μg/kg、0.05 μg/kg、0.06 μg/kg、0.08 μg/kg、0.1 μg/kg、0.2 μg/kg、0.25 μg/kg、0.5 μg/kg、0.75 μg/kg、1 μg/kg、1.5 μg/kg、2 μg/kg、4 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、15 μg/kg、20 μg/kg、25 μg/kg、30 μg/kg、35 μg/kg、40 μg/kg、45 μg/kg、または50 μg/kgにより、治療の進行に伴い減少する。
【０２６７】
一定の実施態様において、対象には、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知のその他のアッセイを使用して決定された負の対照に対して、ウイルスゲノム複製を少なくとも20%〜25%、好ましくは少なくとも25%〜30%、少なくとも30%〜35%、少なくとも35%〜40%、少なくとも40%〜45%、少なくとも45%〜50%、少なくとも50%〜55%、少なくとも55%〜60%、少なくとも60%〜65%、少なくとも65%〜70%、少なくとも70%〜75%、少なくとも75%〜80%、または最高少なくとも85%抑制するかまたは低減するために効果的な量の化合物または組成物が投与される。その他の実施態様において、対象には、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知のその他のアッセイを使用して決定された負の対照に対して、ウイルスゲノム複製を少なくとも20%〜25%、好ましくは少なくとも25%〜30%、少なくとも30%〜35%、少なくとも35%〜40%、少なくとも40%〜45%、少なくとも45%〜50%、少なくとも50%〜55%、少なくとも55%〜60%、少なくとも60%〜65%、少なくとも65%〜70%、少なくとも70%〜75%、少なくとも75%〜80%、または最高少なくとも85%抑制するかまたは低減するために効果的な量の化合物または組成物が投与される。一定の実施態様において、対象には、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知のその他のアッセイを使用して決定された負の対照に対して、ウイルスゲノム複製を少なくとも1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、8倍、10倍、15倍、20倍、または2〜5倍、2〜10倍、5〜10倍、または5〜20倍抑制するかまたは低減するために効果的な量の化合物または組成物が投与される。
【０２６８】
一定の実施態様において、対象には、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知のその他のアッセイを使用して決定された負の対照に対して、ウイルスのタンパク質合成を少なくとも20%〜25%、好ましくは少なくとも25%〜30%、少なくとも30%〜35%、少なくとも35%〜40%、少なくとも40%〜45%、少なくとも45%〜50%、少なくとも50%〜55%、少なくとも55%〜60%、少なくとも60%〜65%、少なくとも65%〜70%、少なくとも70%〜75%、少なくとも75%〜80%、または最高少なくとも85%抑制するかまたは低減するために効果的な量の化合物または組成物が投与される。その他の実施態様において、対象には、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知のその他のアッセイを使用して決定された負の対照に対して、ウイルスのタンパク質合成を少なくとも20%〜25%、好ましくは少なくとも25%〜30%、少なくとも30%〜35%、少なくとも35%〜40%、少なくとも40%〜45%、少なくとも45%〜50%、少なくとも50%〜55%、少なくとも55%〜60%、少なくとも60%〜65%、少なくとも65%〜70%、少なくとも70%〜75%、少なくとも75%〜80%、または最高少なくとも85%抑制するかまたは低減するために効果的な量の化合物または組成物が投与される。一定の実施態様において、対象には、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知のその他のアッセイを使用して決定された負の対照に対して、ウイルスのタンパク質合成を少なくとも1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、8倍、10倍、15倍、20倍、または2〜5倍、2〜10倍、5〜10倍、または5〜20倍抑制するかまたは低減するために効果的な量の化合物または組成物が投与される。
【０２６９】
一定の実施態様において、対象には、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知のその他のアッセイを使用して決定された負の対照に対して、ウイルス感染を少なくとも20%〜25%、好ましくは少なくとも25%〜30%、少なくとも30%〜35%、少なくとも35%〜40%、少なくとも40%〜45%、少なくとも45%〜50%、少なくとも50%〜55%、少なくとも55%〜60%、少なくとも60%〜65%、少なくとも65%〜70%、少なくとも70%〜75%、少なくとも75%〜80%、または最高少なくとも85%抑制するかまたは低減するために効果的な量の化合物または組成物が投与される。一部の実施態様において、対象には、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知のその他のアッセイを使用して決定された負の対照に対して、ウイルス感染を少なくとも1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、8倍、10倍、15倍、20倍、または2〜5倍、2〜10倍、5〜10倍、または5〜20倍抑制するかまたは低減するために効果的な量の化合物または組成物が投与される。
【０２７０】
一定の実施態様において、対象には、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知のその他のアッセイを使用して決定された負の対照に対して、ウイルス複製を少なくとも20%〜25%、好ましくは少なくとも25%〜30%、少なくとも30%〜35%、少なくとも35%〜40%、少なくとも40%〜45%、少なくとも45%〜50%、少なくとも50%〜55%、少なくとも55%〜60%、少なくとも60%〜65%、少なくとも65%〜70%、少なくとも70%〜75%、少なくとも75%〜80%、または最高少なくとも85%抑制するかまたは低減するために効果的な量の化合物または組成物が投与される。一部の実施態様において、対象には、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知のその他のアッセイを使用して決定された負の対照に対して、ウイルス複製を少なくとも1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、8倍、10倍、15倍、20倍、または2〜5倍、2〜10倍、5〜10倍、または5〜20倍抑制するかまたは低減するために効果的な量の化合物または組成物が投与される。その他の実施態様において、対象には、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知のその他のアッセイを使用して決定された負の対照に対して、ウイルス複製を1 log、1.5 log、2 log、2.5 log、3 log、3.5 log、4 log、5 log以上抑制するかまたは低減するために効果的な量の化合物または組成物が投与される。
【０２７１】
一定の実施態様において、対象には、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知のその他のアッセイを使用して決定された負の対照に対して、他の個人に伝播させるウイルスの能力を少なくとも20%〜25%、好ましくは少なくとも25%〜30%、少なくとも30%〜35%、少なくとも35%〜40%、少なくとも40%〜45%、少なくとも45%〜50%、少なくとも50%〜55%、少なくとも55%〜60%、少なくとも60%〜65%、少なくとも65%〜70%、少なくとも70%〜75%、少なくとも75%〜80%、または最高少なくとも85%抑制するかまたは低減するために効果的な量の化合物または組成物が投与される。その他の実施態様において、対象には、本明細書に記載したアッセイまたは当業者に周知のその他のアッセイを使用して決定された負の対照に対して、対象内の他の細胞、組織または器官に蔓延させるウイルスの能力を少なくとも20%〜25%、好ましくは少なくとも25%〜30%、少なくとも30%〜35%、少なくとも35%〜40%、少なくとも40%〜45%、少なくとも45%〜50%、少なくとも50%〜55%、少なくとも55%〜60%、少なくとも60%〜65%、少なくとも65%〜70%、少なくとも70%〜75%、少なくとも75%〜80%、または最高少なくとも85%抑制するまたは低減するために効果的な量の化合物または組成物が投与される。
【０２７２】
一定の実施態様において、化合物または組成物の用量が、対象に毎日、1日おきに、2日に1回、3日目ごと、毎週1回、毎週2回、毎週3回、または2週間に1回投与される。その他の実施態様において、2、3または4用量の化合物または組成物が、対象に毎日、2日に1回、3日目ごと、毎週1回または2週間に1回投与される。一部の実施態様において、用量1回分の化合物または組成物が、2日間、3日間、5日間、7日間、14日間、または21日間投与される。一定の実施態様において、化合物または組成物の用量が、1カ月間、1.5カ月間、2カ月間、2.5カ月間、3カ月間、4カ月間、5カ月間、6カ月間以上投与される。
【０２７３】
ウイルス感染の予防、治療および／または管理について使用されてきたか、現在使用されている予防薬または治療薬の投与量は、臨床医が利用できる参考資料、例えば『Physicians’ Desk Reference（処方医薬品情報事典）（61st ed. 2007）』を使用して決定できる。好ましくは、感染を阻止、処置および／または管理するために、使用されてきたか、現在使用されている量よりも低い投与量が、1つ以上の化合物または組成物と組み合わせて利用される。
【０２７４】
ウイルス感染の予防、治療または管理以外の用途に認可されてきた化合物について、安全な用量の範囲は、例えば、『Physician’s Desk Reference (61st ed. 2007)』など、臨床医が利用できる参考資料を使用して容易に決定できる。
【０２７５】
上述の投与スケジュールは、例証目的でのみ提供されているもので、および限定的であるとは考慮されるべきではない。当業者であれば、本発明の範囲内であることを容易に理解する。
【０２７６】
本明細書中に開示される発明を、その原理の範囲中で変化させることが、当業者によりなされ得ることを、理解され、及び予想されたい。また、そのような変更は、本発明の範囲内に包含されるべきことが意図される。
【０２７７】
本願の全体にわたり、様々な文献を挿入して参照している。これらの文献の開示内容の全体を、本願に参照により援用することにより、本発明に関連する先行技術の言及事項をより完全に記載している。下記実施例は、本発明を更に例証するものであるが、いかなる場合も、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０２７８】
実施例１-Torin 1は、HCMVの生産を阻害する
【０２７９】
mTOR阻害剤であるTorin 1の、HCMV複製に対する効果を判定するために、線維芽細胞を血清飢餓により増殖停止させ、HCMVを感染させ、そしてTorin 1又はラパマイシンで処理し、そして、ウイルス複製複数回分の期間、増殖をモニタリングした。
【０２８０】
初代ヒト包皮線維芽細胞を、10%正常ウシ血清を含有するDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)中で培養し、6〜14代で使用した。ウイルスの多段階増殖解析を、以下のように行った。ヒト線維芽細胞をコンフルエントにプレーティングし、下記感染前48時間血清飢餓に置いた。細胞に、多重度0.05 PFU/cellで、HCMVを感染させた。6ウェルプレート中で、細胞を、300μlの培地中のウイルスと共に、15分毎に揺らして1時間インキュベーションした。吸収が行われた後、前記接種材料を除去し、そして新鮮な無血清培地に置き換えた。無細胞上澄中に存在するウイルスの量を、初代ヒト線維芽細胞に対する、50%組織培養感染用量(TCID50)法により、定量した。
【０２８１】
図1Aに記載されているように、ラパマイシン処理は、中程度にHCMV複製を阻害し、10日時点で約8倍の効果に達した。対照的に、Torin 1は、HCMVの収率を、10日時点で約160倍低下させた。Torin 1は、試験した範囲内の全ての濃度で、HCMVの子孫の生産の阻害に効果的で、50%阻害濃度(IC50)は、約60nMであった(感染後8日)(図1B)。この用量は、Torin 1がmTORC1及びmTORC2のキナーゼ活性を阻害するIC50の2〜10nMに劣らない(47)。
【０２８２】
過去の報告では、Torin 1は実質的に細胞の増殖を阻害するが、500nMまでの濃度では細胞を死滅させないことが示されている。発明者らは、トリパンブルー排除アッセイを使用して、250nMのTorin 1の、増殖停止線維芽細胞の生存率に対する影響を試験した。Torin 1処理後10日を超えて、95%以上の細胞生存状態を維持しており、Torin 1処理は、これらの細胞生存率に影響しなかった(図1C)。
【０２８３】
前記ウイルスの増殖の阻害が細胞毒性によるものではないことを確認するために、発明者らは、薬物放出試験を実施した。感染細胞を一定の範囲のTorin 1で8日間処理し、その後、細胞をTorin 1を含有しない培地中で維持した。8日後、上澄中のウイルスを、TCID50法により定量した(感染後16日)(図1B)。薬剤の除去後、HCMVの複製は、最初に1mMの薬剤を与えた培養細胞で部分的に回復し、250nMの薬物を与えた細胞で実質的に回復し、そして100nMのTorin 1を与えた細胞において、完全に回復した。8日間のTorin 1処理の後薬剤を除去することでウイルス収率が100倍超増大したことは、更に、250nM未満の薬物で処理した細胞が生存状態を維持していたことを実証する。
【０２８４】
これらの結果は、Torin 1が、HCMV複製の強力な阻害剤であることを実証する。mTORキナーゼに対するTorin 1の選択性及びそのラパマイシン耐性mTORC1活性を阻害する効果を実証する従来の研究から得たデータに基づき、このmTORC1活性は、HCMVの溶解性複製において重要であることが推察される。
【０２８５】
実施例２：Torin 1は、ウイルスDNA及び後期ウイルスタンパク質の蓄積を阻害する
【０２８６】
Torin 1によるウイルスの生活環の阻害の性質を判定するために、発明者らは、250nMの用量の薬物の、HCMVの侵入に対する影響を最初に試験した。細胞を、感染前に、又はウイルスの吸収の直後に、Torin 1で24時間処理した。
【０２８７】
感染細胞内のウイルスDNA及び転写産物の蓄積が判定された。HCMV感染の過程でのウイルスDNAの蓄積は、上記のように、定量PCR(qPCR)によりモニタリングされた(Terhune, et al. (2007) J. Virol. 81:3109-3123)。
【０２８８】
概説すると、まず、初代ヒト線維芽細胞に、多重度0.05 PFU/cellで、BADinGFPを感染させた。細胞のペレットを、400 mM NaCl、10 mM Tris (pH 7.5)、及び10 mM EDTAを含有する溶液500μlに再懸濁した。表示されている時間で、細胞をスクレーピングにより培地中に回収し、解析まで凍結細胞ペレットとして保存した。400 mM NaCl、10 mM Tris (pH 7.5)、及び10 mM EDTAを含有する溶液500μlに、細胞ペレットを再懸濁した。プロテイナーゼK(20μg)を、20%SDS溶液4μlと一緒に添加した。ライゼートを、フェノールクロロホルムで抽出した。RNase A(20μl)を添加し、当該ライゼートを、37℃で1時間インキュベーションした。ライゼートを、フェノール-クロロホルムで、続いてクロロホルムで抽出した。100%エタノール1mlを添加し、14000xgで30分間遠心分離して、DNAを沈殿させた。DNAを70%エタノールで1回洗浄した後、10mM Tris(pH 7.5)50μl中で再懸濁した。例えば、各試料において、DNAを、NanoDrop分光光度計(Thermo Scientific)を用いて定量した。500ナノグラムのDNAを、12.5 μl 2x SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems)及び2μMの各プライマーの混合物に添加し、全体積を25μlとした。ローディングの量が等しいことの追加対照として、各試料のウイルスDNAの量を、各試料中の細胞内グリセルアルデヒド-3-リン酸塩脱水素酵素(GAPDH)遺伝子の量で補正した。
【０２８９】
Torin 1で感染24時間前に処理した、又はウイルス吸収の1時間後に当該薬剤で処理したヒト線維芽細胞について、タンパク質のウエスタンブロット解析を実施した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤(完全EDTA不含；Roche)を含有する、放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)緩衝剤(50 mM Tris-HCl [pH 7.4]、1% NP-40、0.25% デオキシコール酸ナトリウム、150 mM NaCl、1 mM EDTA)に溶解させた。各ライゼート中のタンパク質濃度は、Bradfordアッセイにより判定された。試料あたり30μgのタンパク質を解析した。細胞ライゼート中のタンパク質は、SDS含有10%ポリアクリルアミドゲルで分離された。タンパク質は、セミドライ転写装置を使用して、タンパク質メンブレン上に転写された。0.1%Tween 20(PBS-T)及び5%脱脂粉乳を含有する燐酸緩衝生理食塩水でメンブレンを1時間インキュベーションした後、一次抗体とインキュベーションした。1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBS-Tで抗IE-1モノクローナル抗体(56)又は抗チューブリン抗体(Sigma)を希釈し、前記メンブレンと1時間質オンでインキュベーションした。PBS-Tで更に洗浄した後、ブロットを、1%BSAを含有するPBS-Tで5000倍に希釈した、ヤギ抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼを結合した二次抗体とインキュベーションした。その後メンブレンを再びPBS-Tで洗浄し、タンパク質を、ECL試薬(Amersham)を使用して、化学発光により可視化した。
【０２９０】
感染の2時間後(2hpi)の時点で、細胞に結合したウイルスDNAのレベルは、実験条件中の薬物に影響されなかった(図2A)。HCMV前初期IE1タンパク質の発現をこれらの条件下で試験したとき、Torin 1で処理した、及び処理していない細胞の間で、6hpiの時点で、細胞にコードされるチューブリンに相対的な、IE1の量に、顕著な差は無かった(図2B)。更に、薬剤処理は、24hpiの時点で、ウイルスゲノムに由来して発現するGFPマーカータンパク質を発現する細胞のパーセンテージを変化させなかった。同様に、これらの結果は、ウイルスの結合及び侵入、並びに前初期タンパク質の発現等、HCMVの生活環の初期段階は、Torin 1の影響を受けないことを実証する。
【０２９１】
実施例３：Torin 1とラパマイシンの、ウイルスタンパク質の蓄積に対する影響の比較
【０２９２】
6〜96hpiでの動的クラス(kinetic class)の代表的なウイルスタンパク質IE1、pUL44、及びpUL99の蓄積に及ぼす効果について、上記と同様のウエスタンブロットにより、Torin 1とラパマイシンを比較した(図3A)。pUL99に対する抗体は、既に記載されている(Silva, et al. J. Virol. (2003) 77: 10594-10605)。加えて、HCMV DNAの蓄積は、上記と同様の方法を使用して、感染後にモニタリングされた。
【０２９３】
感染後のUL99の転写レベルは、上記と同様の手段で判定された(Depto, et al. (1992) J. Virol. 66:3241-3246)。概説すると、まず、表示されている時間に、Trizol(Invitrogen)抽出により、全RNAを回収した。DNaseで処理したRNA (0.5 μg)を、ランダムヘキサマープライマーを使用して、TaqMan逆転写試薬キット(Applied Bioscience)で、逆転写した。SYBR green master mix (Applied Biosciences)と、UL99に特異的なプライマー(5'-GTGTCCCATTCCCGACTCG-3' (配列番号:4)及び5'-TTCACAACGTCCACCCACC-3'(配列番号:5))に、cDNAを2マイクロリットル添加した。同じ試料中のアクチンのレベルを、5'-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTC-S' (配列番号:6)及び5'-CGGACTCGTCATACTCCT GCTT-3' (配列番号:7)のプライマーを使用して測定した。各試料における閾値サイクルを、アクチン遺伝子がUL21.5遺伝子座に挿入された組換えHCMV BACの連続希釈からなる標準曲線と比較することにより、UL99及びアクチン転写産物のコピー数を決定した。全ての実験の標準曲線のR値は、0.98を超えていた。
【０２９４】
ラパマイシンは、前初期タンパク質IE1及び初期タンパク質pUL44の蓄積に殆ど影響せず、また後期タンパク質pUL99のレベルを中程度に低下させた(図3A)。Torin 1は、IE1及びpUL44の蓄積の阻害は限定的であったが、pUL99の蓄積量の低下は劇的であった。pUL99の発現はウイルスDNAの複製の阻害に依存するので、発明者らは、Torin 1がウイルスDNA蓄積を阻害するか否かを試験した(図3B)。ウイルスDNAの蓄積は、ラパマイシン又はTorin 1で処理した線維芽細胞の定量リアルタイムPCRにより測定された。ラパマイシンはウイルスDNAの蓄積を中程度に阻害し、これは、HCMVの子孫の生産に対するラパマイシンの効果と一致する。対照的に、Torin 1は、96hpiの時点で、ウイルスDNAの蓄積を150倍抑制した。この知見は、ウイルス後期タンパク質の阻害が、ウイルスの後期RNAの転写を低下させることにより、ウイルスDNAの蓄積を阻害することを示唆する。この仮説を検証するために、発明者らは、Torin 1およびラパマイシンの存在下で、UL99のmRNAの発現のレベルを測定した。ラパマイシン及びTorin 1のいずれもUL99mRNAのレベルを低下させ、Torin 1の効率はラパマイシンを上回っていた(図3C)。Torin 1で処理した細胞のUL99 mRNAのレベルの低下の程度は、観察されたウイルスDNAの蓄積の阻害の程度と一致していた。UL99タンパク質の低下レベルは、UL99 mRNAレベルの低下よりも著しい場合があり、mTOR活性が、後期タンパク質の合成に特異的に関与する可能性が高い。しかしながら、後期転写に対する影響に関するこれらの結果の解釈は、DNA蓄積に対する薬物の効果により混乱させられる。即ち、これらの結果は、ラパマイシン非感受性mTOR活性が、充分なHCMV DNAの蓄積に必要であるが、ウイルス前初期及び初期タンパク質の発現にとって重要でないことを示している。
【０２９５】
実施例4：Torin 1はHCMV感染細胞内で4EBP1のリン酸化を阻害する
【０２９６】
HCMV感染の過程でのmTORC1標的のリン酸化に対するTorin 1の効果が調査された。HCMVの感染はmTORC1活性を誘導するが、mTORC1標的のリン酸化の感受性は、mTORC1阻害剤のラパマイシンに特異的であった。P70S6キナーゼ、続いてrpS6のmTORC1によるリン酸化は、HCMV感染の過程でラパマイシンにより阻害され、他のmTORC1の標的である4EBP1のリン酸化は、ラパマイシンに耐性である。このmTOR標的に対する異なった効果は、感染の過程で、mTOR以外のキナーゼが4EBP1のリン酸化に関与していることを示唆し得る。この可能性を検証するために、HCMVを感染させた線維芽細胞をラパマイシン及びTorin 1で処理し、4EBP1及びrpS6のリン酸化状態を測定した。いずれの薬剤も、HCMV感染で通常認められるrpS6のリン酸化の誘導を顕著に阻害したが、Torin 1のみ、実質的に、4EBP1のリン酸化を阻害していた(図4A)。これは、Torin 1の存在下で、リン酸化形態に特異的な抗体を用いてリン酸化4EBP1-PT37/46を検出出来なかったこと、及び全4EBP1の移動度の変化の両方から証明された。全4EBP1、rpS6、及びチューブリンのレベルはモニタリングされて、タンパク質回収の対照に用いられた。この薬剤ごとに異なる効果は、感染期間を通して観察された(図4B)。これらの結果は、HCMV感染の過程での4EBP1のラパマイシン耐性のリン酸化は、他のキナーゼの作用よりもむしろTorin 1感受性のmTOR活性に依存していることを実証する。
【０２９７】
4EBP1のリン酸化状態は、キャップ(cap)依存的タンパク質翻訳を制御する。リン酸化されていない4EBP1はeIF4Eと結合して、eIF4E複合体の形成を阻害するが、4EBP1のリン酸化は、eIF4Eとの相互作用を阻害する。Torin 1が4EBP1のリン酸化を顕著に阻害する能力は、発明者らにTorin 1で処理された細胞中のeIF4E複合体のレベルを試験させた。HCMVの感染は、4EBP1の、m7G キャップの類似体であるm7GTP-Sepharoseとの複合体との結合の低下を引き起こし(図4C)、これは既に開示されている情報と一致していた(Walsh, et al. (2005) J. Virol. 79:8057-8064)。
【０２９８】
ラパマイシン処理は、前記キャップアナログと4EPB1との結合の量を増大させず、これは、感染の過程で4EBP1のリン酸化を阻害するラパマイシンの機能と一致していた。対照的に、Torin 1処理は、感染期間を通じて、4EBP1とm7GTP-Sepharoseの結合の実質的増大を引き起こした。HCMV感染自体はキャップ類似体とeIFeEとの結合率を変化させず、これをローディング対照とした。加えて、cap類似体にロードされた各試料中のタンパク質の量が等しいことを確認するために、細胞ライゼート中のチューブリンの量を試験した。m7GTPSepharoseと結合した4EBP1のレベルの増大は、Torin 1処理後のeIF4G及びeIF4Aとキャップ類似体との結合の低下と一致していた(図4D)。eIF4G及びeIF4Aの結合に対するラパマイシンの効果は、最低限であった。eIF4Eレベルは薬剤の影響を受けず、ローディング対照とされた。これらの結果は、ラパマイシン耐性mTORによる4EBP1のリン酸化が、HCMV感染の過程でのeIF4F複合体の統合の維持に必須であることを示唆する。
【０２９９】
実施例5：Torin 1は4EBP1ヌル細胞においてMCMV複製を阻害しない
【０３００】
mTORシグナル経路中のタンパク質の機能的役割の同定は、個別のmTOR構成要素を欠いたノックアウトマウスを作製することにより促進されてきた。例えば、必須mTORC2構成要素であるRictorを欠いたマウス胚線維芽細胞(MEF)を利用して、mTORC2の、Aktの完全な活性化に関与するキナーゼ複合体としての明確な同定がもたらされた。発明者らは、マウスサイトメガロウイルス(MCMV)及びmTORシグナル経路の構成要素を欠いたMEF株を利用して、ラパマイシン耐性リン酸化イベントに対するmTORC2の潜在的な貢献を評価した。MCMVがHCMVと同様に振舞い、mTORシグナリングイベントの解析の適切なモデルであることを確認するために、発明者らは、MEFにおけるMCMVの増殖及びmTOR依存的リン酸化イベントに対する、Torin 1及びラパマイシンの効果を判定した。HCMVと同様に、ラパマイシンはそうではないが、Torin 1は、MCMV複製を阻害した(図5A)。特に、ラパマイシンはHCMVの収率を中程度に低下させた(図1A)が、MCMVに対しては阻害作用を有しなかった。また、HCMVで観察されたように(図4A)、rpS6のリン酸化の増大が測定されたことから、MCMVの感染は、mTORC1活性を誘導していたことが分かった。RpS6のリン酸化はラパマイシン、Torin 1、及びLY294002、、クラス1ホスファチジルイノシトール3-キナーゼの阻害剤及びmTORにより完全に阻害されたが、4EBP1のリン酸化は、Torin 1及びLY294002により阻害されたが、ラパマイシンではされなかった(図5B)。全rpS6タンパク質がアッセイされ、ローディング対照とされた。HCMVと同様、MCMVはmTORシグナリング経路を誘導し、また4EBP1のリン酸化を誘導するラパマイシン耐性mTOR活性に依存していた。
【０３０１】
MCMVは、HCMVと同様に、mTORシグナリングイベントを誘導することが判明した後、mTORの作用の様々なエフェクターを欠いたMEFに対するTorin 1及びラパマイシン処理の効果の特徴付けをおこなった。発明者らは、第一に、MCMVの複製におけるmTORC2の要求性を調査した。RictorヌルMEFはウイルスの増殖を支持し(無処理)(図6A)、これは、mTORC2が、充分なMCMV複製に必須でないことを示す。更に、Torin 1は、これらの細胞において、MCMV複製(図6A)及び4EBP1リン酸化(図6A)を効果的に阻害し、これは、mTORC2が、MCMV感染細胞において、Torin 1の標的でないことを示唆する。最後に、これらの細胞は、PCRにより、無傷の遺伝子座を欠くことが確認された(図6C)。また、発明者らは、mTORC2の標的の一つであるAktキナーゼの潜在的な役割を評価するために、Aktl/Akt2ヌルMEFを利用した。これらの細胞はTorin感受性のMCMV複製を支持し(図6D)、Torin 1は、Aktの非存在下で4EBP1のリン酸化を阻害したことにより(図6E)、MCMV感染細胞において、このキナーゼがTorin 1の標的である可能性は排除された。また、これらの細胞は、ウエスタンブロットアッセイにより、Aktの欠損が確認された(図6F)。Torin 1によるHCMVの阻害は4EBP1の脱リン酸化と対応しており(図3及び4)、これは、このリン酸化イベントが重要なTorin 1の標的である可能性を示唆する。従って、発明者らは4EBP1ヌルMEF(48)におけるMCMVの複製を阻害するTorin 1の能力を試験した。正常のMEFの場合と同様にMCMVは良好に複製し、これは、4EBP1が、サイトメガロウイルスの複製に必須でないことを示唆する(4EBP1-/-、無処理)(図7A)。対照細胞と同様、ラパマイシンは、4EBP1ヌル細胞において、MCMV複製に対する影響は最小限であった。重要なことに、Torin 1は、4EBP1を欠いた細胞で、MCMV複製を阻害することは出来ない(図7A)。4EBP1は、mTORC1によるリン酸化で不活性化されない限り、eIF4F複合体の組み立てを阻害する機能を有する。Torin 1処理は対照細胞におけるeIF4F複合体の形成を阻害したが、そのような効果は、4EBP1ヌル細胞では認められなかった(図7B)。最後に、MEFのフェノタイプを確認するウエスタンブロットアッセイにより、これらの細胞のライゼート中に、4EBP1は検出されなかった。発明者らは、4EBP1が、サイトメガロウイルス感染の過程でTorin 1に対する感受性を提供する標的であると結論付け、ラパマイシン耐性mTORC1は、ウイルスの生活環において、キャップ依存的翻訳の維持に必須であると推測する。
【０３０２】
実施例6：3つのヘルペスウイルスサブファミリーのメンバーの全てがTorin 1により阻害される
【０３０３】
MEFに、アルファヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)、及びガンマヘルペスウイルスのマウスガンマヘルペスウイルス68(γHV68)を感染させた(図8A)。これらのウイルスは、サイトメガロウイルスとして、同一の薬物感受性を呈した。ラパマイシンはHSV-I及びγHV68複製の防止に有効でなかったが、Torin 1は、複数回のウイルス複製期間を通じて、両方のウイルスを阻害した。加えて、ラパマイシンはそうではないが、Torin 1は、HSV-I感染の過程で4EBP1のリン酸化を阻害し(図8B)、そしてTorin 1は、4EBP1を欠いた細胞においてHSV-Iの生産を阻害しなかった(図8C)。発明者らは、ラパマイシン耐性mTOR活性は、複数種のヘルペスウイルスの複製にとって必須であると結論付けた。
【０３０４】
実施例7：mTORキナーゼを指向するsiRNAでの線維芽細胞の処理によるHCMV収量の阻害
【０３０５】
継代23〜24番のMRC5線維芽細胞(ATCC # CCL-171)を96ウェルプラスチック組織培養ディッシュ(TRP#92696, Switzerland)中に、10%FBS(GIBCO)を添加したDMEM (Sigma- Aldrich product #D5756, St. Louis, MO)中、7500 cells/wellの密度で播種した。細胞を〜70%コンフルエントまで増殖させた後、Oligofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して、説明書に従い、GFP mRNA (非特異的)、ウイルスIE2 mRNA又はmTORキナーゼを標的とするsiRNAを、1nmolトランスフェクションした。IE2 siRNA配列: 5'-AAACGCAUCUCCGAGUUGGAC-3' (配列番号:1); GFP siRNA配列: 5'-GCAAGCUGACCCUGAAGUUC AU-3' (配列番号:2); mTORキナーゼ(FRAP 1_2) siRNA配列: 5'- G AGUUAC AGUC GGGC AU AU-3' (配列番号:3)。全てのsiRNAは、Sigma- Aldrichから取得した。感染の4時間後、培地に、最終濃度が10%となるようにFBSを添加した。感染の28時間後、培地の上澄を除去し、濃度0.1 pfu/cellのHCMV株AD169を含む100μlのDMEM/10%FBSに置き換えた。感染は96時間行われ、96時間目に、培地の上澄を回収し、そして96ウェルフォーマットの90%コンフルエントMRC細胞の新鮮なプレートへの感染に使用された。当該レポータープレートへの感染の24時間後、試料を-20℃の氷冷メタノールで15分間固定し、続いて、感染価を定量するために、免疫蛍光染色を行った。図9の結果は、「ロバストZスコア(robust Z score)」で表される。このスコアは、siRNA処理がない場合にもたらされる感染価の平均値の標準偏差に対応する。故に、mTORキナーゼ特異的siRNAは2標準偏差を越える高度に顕著な効率で、感染性HCMVの収率を低下させたことになる。
【０３０６】
実施例8：小胞体ストレス応答の阻害剤での線維芽細胞の処理によるHCMV収量の阻害
【０３０７】
HCMVが、高レベルのウイルス糖タンパク質の発現に拘らず細胞のホメオスタシスを維持するためにUPRが起こることを実際に必要とするという仮説を調査するため、HCMV感染ヒト線維芽細胞(HFF)をUPRの阻害剤である、化学シャペロンの4-フェニルブチレート(4-PBA)で処理した。4-PBAでの処理は、ウイルス複製を用量依存的に効率的に阻害した(図10)。
【０３０８】
4-PBAが細胞に毒性であって細胞生存率の低下により間接的にHCMVを阻害している可能性を排除するため、2つの実験を実施した（図11)。第一の実験(図11A)において、異なる濃度の薬物で8日間処理したコンフルエントヒト線維芽細胞に対し、細胞生存率を測定するアッセイを実施した(図11A)。試験した最大の薬物用量であっても、トリパンブルー排除アッセイにおいて、細胞生存率に対する影響は認められなかった。第二の実験において、前記薬物は、両面的であることが示された(図11B)。感染細胞は様々な濃度の薬物の存在下で8日間維持され、そしてそれらの飼料は、ウイルスの収率を判定するのに利用された。上記実験(図10)と同様に、前記薬物は、用量依存的に、ウイルスの生産を阻害した。そして、前記薬物は除去され、ウイルスの用量が8日後に判定された。試験された全ての用量において、ウイルスは回復し、正常な収率をもたらした。細胞は正常なウイルス収率を維持することが出来たことから、前記薬物が8日間の処理の過程で細胞にダメージを与えなかったことが示唆される。
【０３０９】
このことは、HCMVが、感染性の子孫の正常な収率を生じるのに、UPRを必要とすることを実証する。重要なことに、このデータは、UPRを阻害する薬物が、抗HCMV治療剤として振舞うことも示す。多くのウイルスにおいて感染の過程で高レベルのウイルス性糖タンパク質が発現することから、UPRを阻害する薬物は、他のヘルペスウイルス及び他のウイルスに対しても抗ウイルス作用を有することが予想される。この類の薬物として、4-PBAやタウロウルソデオキシコール酸 (TUDCA)が挙げられる。4-PBAは、現在、新生児の尿素サイクルの機能不全の治療に臨床的に使用される。本研究に使用されるものと同様の血清濃度は、4-PBAで処置された患者において測定されている。このことは、4-PBAは、免疫系の機能が不完全な個体に対して安全かつ十分に耐えられるものであるから、サイトメガロウイルスが感染した患者についても同様であり、HCMV複製を阻害するレベルの4-PBAの用量は、インビボで達成出来ることを示す。
【０３１０】
実施例９：mTOR阻害剤及び小胞体ストレス応答の阻害剤で処理した線維芽細胞におけるHCMV収量の阻害
【０３１１】
Torin 1は、4-PBAと組み合わせると、いずれかの薬物単独の場合よりも強力にHCMVを阻害し、また、4-PBAをラパマイシンと組み合わせた場合も、いずれかの薬物単独の場合よりも強力にHCMVを阻害した(図12)。ヒト線維芽細胞に、多重度0.1 pfu/cellで、HCMV株AD 169を感染させ、そして10%ウシ胎児血清を含有し、かつラパマイシン又はTorin 1を単独で、及び4-PBAと組み合わせて含有する培地中で維持した。薬物は、以下の濃度で使用された：4-PBA, 1 mM; Torin 1, 250 nM; ラパマイシン, 20 nM。薬物を含有する培地は、1日おきに交換した。細胞から離れた及び細胞と接したウイルスは、感染後0、4、8及び12日で回収され、TCID50法により力価測定を行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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