(57)【要約】  本発明は、Ｃ型肝炎に感染した被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性、又は自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性を判定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。本方法はＩＬ−２８Ａ遺伝子座、ＩＬ−２８Ｂ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における患者の遺伝子型の検出に基づく。【選択図】図２
2013500713.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を判定する方法であって、前記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの有無を判定することを含む、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を判定する方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの多型マーカーの存在が、前記被験体のＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性が増大していることの指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの多型マーカーが、第１９染色体上の約８０ｋｂからなる領域内に位置する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの多型マーカーが、配列番号１〜配列番号３４を含む群から選択される配列から本質的になる核酸セグメント中に位置する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの多型マーカーがｒｓ１１８７９００５、ｒｓ１２９７５７９９、ｒｓ１１０８３５１９、ｒｓ９５５１５５、ｒｓ１２９７２９９１、ｒｓ１２９８０２７５、ｒｓ８１０５７９０、ｒｓ１１８８１２２２、ｒｓ１０８５３７２７、ｒｓ８１０９８８６、ｒｓ８１１３００７、ｒｓ８０９９９１７、ｒｓ７２４８６６８、ｒｓ１６９７３２８５、ｒｓ１０８５３７２８、ｒｓ４８０３２２３、ｒｓ１２９８０６０２、ｒｓ４８０３２２４、ｒｓ６６４８９３、ｒｓ５７６８３２、ｒｓ１１６７１０８７、ｒｓ２５１９１０、ｒｓ７３５９９５３、ｒｓ７３５９９５０、ｒｓ２０９９３３１、ｒｓ１１６６５８１８、ｒｓ５７０８８０、ｒｓ５０３３５５、ｒｓ３０４６１、ｒｓ１９４０１４、ｒｓ２５１９０３、ｒｓ１２９７９１７５、ｒｓ３９５８７、ｒｓ３０４８０を含む群から選択される少なくとも１つのＳＮＰと関連する多型性部位である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの多型マーカーが、請求項５に記載の群から選択される少なくとも１つのＳＮＰと完全な又は強い連鎖不均衡にある多型性部位である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの多型マーカーが、請求項５に記載の群から選択される少なくとも２つのＳＮＰの組み合わせである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの多型マーカーがｒｓ８０９９９１７のＧ／Ｔ、ｒｓ８０９９９１７のＧ／Ｇ、ｒｓ５７６８３２のＣ／Ｇ、ｒｓ５７６８３２のＣ／Ｃ、ｒｓ１２９８０２７５のＧ／Ａ又はｒｓ１２９８０２７５のＧ／Ｇを含む群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃ型肝炎治療がインターフェロンによる治療である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記インターフェロンによる治療がＩＦＮα、ＩＦＮλ又は任意のペグインターフェロンを含む群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記インターフェロンによる治療が、リバビリン若しくは任意のタンパク分解酵素阻害剤、若しくは任意の他の抗ウイルス剤、又はそれらの任意の組み合わせと併用されたものである、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記慢性Ｃ型肝炎がＨＣＶのウイルス遺伝子型１、２、３又は４によって引き起こされたものである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験体の生体サンプルから単離した核酸サンプルにおいてＨＣＶウイルス遺伝子型を判定することを更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験体がＨＩＶに同時感染している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｃ型肝炎に感染した被験体における非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性を判定する方法であって、前記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの有無を判定することを含む、Ｃ型肝炎に感染した被験体における非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性を判定する方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの多型マーカーの存在が、前記被験体の非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性が増大していることの指標となる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの多型マーカーが、第１９染色体上の約８０ｋｂからなる領域内に位置する、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの多型マーカーが、配列番号１〜配列番号３４を含む群から選択される配列から本質的になる核酸セグメント中に位置する、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの多型マーカーがｒｓ１１８７９００５、ｒｓ１２９７５７９９、ｒｓ１１０８３５１９、ｒｓ９５５１５５、ｒｓ１２９７２９９１、ｒｓ１２９８０２７５、ｒｓ８１０５７９０、ｒｓ１１８８１２２２、ｒｓ１０８５３７２７、ｒｓ８１０９８８６、ｒｓ８１１３００７、ｒｓ８０９９９１７、ｒｓ７２４８６６８、ｒｓ１６９７３２８５、ｒｓ１０８５３７２８、ｒｓ４８０３２２３、ｒｓ１２９８０６０２、ｒｓ４８０３２２４、ｒｓ６６４８９３、ｒｓ５７６８３２、ｒｓ１１６７１０８７、ｒｓ２５１９１０、ｒｓ７３５９９５３、ｒｓ７３５９９５０、ｒｓ２０９９３３１、ｒｓ１１６６５８１８、ｒｓ５７０８８０、ｒｓ５０３３５５、ｒｓ３０４６１、ｒｓ１９４０１４、ｒｓ２５１９０３、ｒｓ１２９７９１７５、ｒｓ３９５８７、ｒｓ３０４８０を含む群から選択される少なくとも１つのＳＮＰと関連する多型性部位である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの多型マーカーが、請求項１９に記載の群から選択される少なくとも１つのＳＮＰと完全な又は強い連鎖不均衡にある多型性部位である、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記多型マーカーが、請求項１９に記載の群から選択される少なくとも２つのＳＮＰの組み合わせである、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記多型マーカーがｒｓ８０９９９１７のＧ／Ｔ、ｒｓ８０９９９１７のＧ／Ｇ、ｒｓ５７６８３２のＣ／Ｇ、ｒｓ５７６８３２のＣ／Ｃ、ｒｓ１２９８０２７５のＧ／Ａ又はｒｓ１２９８０２７５のＧ／Ｇを含む群から選択される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記慢性Ｃ型肝炎がＨＣＶのウイルス遺伝子型１、２、３又は４によって引き起こされたものである、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプルにおいてＨＣＶウイルス遺伝子型を判定することを更に含む、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験体がＨＩＶに同時感染している、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
慢性Ｃ型肝炎の患者を治療する方法であって、
ｉ）前記患者の多型マーカーの少なくとも１つが、該患者から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプルにおいて、ＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座内に存在するか否かを判定することと、ここで、前記患者の多型マーカーの少なくとも１つがｒｓ１１８７９００５、ｒｓ１２９７５７９９、ｒｓ１１０８３５１９、ｒｓ９５５１５５、ｒｓ１２９７２９９１、ｒｓ１２９８０２７５、ｒｓ８１０５７９０、ｒｓ１１８８１２２２、ｒｓ１０８５３７２７、ｒｓ８１０９８８６、ｒｓ８１１３００７、ｒｓ８０９９９１７、ｒｓ７２４８６６８、ｒｓ１６９７３２８５、ｒｓ１０８５３７２８、ｒｓ４８０３２２３、ｒｓ１２９８０６０２、ｒｓ４８０３２２４、ｒｓ６６４８９３、ｒｓ５７６８３２、ｒｓ１１６７１０８７、ｒｓ２５１９１０、ｒｓ７３５９９５３、ｒｓ７３５９９５０、ｒｓ２０９９３３１、ｒｓ１１６６５８１８、ｒｓ５７０８８０、ｒｓ５０３３５５、ｒｓ３０４６１、ｒｓ１９４０１４、ｒｓ２５１９０３、ｒｓ１２９７９１７５、ｒｓ３９５８７、ｒｓ３０４８０を含む群から選択される、
ｉｉ）前記患者の多型マーカーの少なくとも１つが、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性の増大と関連するか否かに基づいて前記患者を治療することと、
を含む、慢性Ｃ型肝炎の患者を治療する方法。
【請求項２７】
前記Ｃ型肝炎治療がインターフェロンによる治療である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記インターフェロンによる治療がＩＦＮα、ＩＦＮλ又は任意のペグインターフェロンを含む群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記インターフェロンによる治療が、リバビリン若しくは任意のタンパク分解酵素阻害剤、若しくは任意の他の抗ウイルス剤、又はそれらの任意の組み合わせと併用されたものである、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
慢性Ｃ型肝炎の患者を治療する方法であって、
ｉ）前記患者の多型マーカーの少なくとも１つが、該患者から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプルにおいて、ＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座内に存在するか否かを判定することと、ここで、前記患者の多型マーカーの少なくとも１つがｒｓ１１８７９００５、ｒｓ１２９７５７９９、ｒｓ１１０８３５１９、ｒｓ９５５１５５、ｒｓ１２９７２９９１、ｒｓ１２９８０２７５、ｒｓ８１０５７９０、ｒｓ１１８８１２２２、ｒｓ１０８５３７２７、ｒｓ８１０９８８６、ｒｓ８１１３００７、ｒｓ８０９９９１７、ｒｓ７２４８６６８、ｒｓ１６９７３２８５、ｒｓ１０８５３７２８、ｒｓ４８０３２２３、ｒｓ１２９８０６０２、ｒｓ４８０３２２４、ｒｓ６６４８９３、ｒｓ５７６８３２、ｒｓ１１６７１０８７、ｒｓ２５１９１０、ｒｓ７３５９９５３、ｒｓ７３５９９５０、ｒｓ２０９９３３１、ｒｓ１１６６５８１８、ｒｓ５７０８８０、ｒｓ５０３３５５、ｒｓ３０４６１、ｒｓ１９４０１４、ｒｓ２５１９０３、ｒｓ１２９７９１７５、ｒｓ３９５８７、ｒｓ３０４８０を含む群から選択される、
ｉｉ）前記患者から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプルにおいて、ＨＣＶウイルス遺伝子型を判定することと、
ｉｉｉ）前記患者の多型マーカーの少なくとも１つ及びＨＣＶウイルス遺伝子型が、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性の増大と関連するか否かに基づいて前記患者を治療することと、
を含む、慢性Ｃ型肝炎の患者を治療する方法。
【請求項３１】
前記Ｃ型肝炎治療がインターフェロンによる治療である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記インターフェロンによる治療がＩＦＮα、ＩＦＮλ又は任意のペグインターフェロンを含む群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記インターフェロンによる治療が、リバビリン若しくは任意のタンパク分解酵素阻害剤、若しくは任意の他の抗ウイルス剤、又はそれらの任意の組み合わせと併用されたものである、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記患者がＨＩＶに同時感染している、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を評価する方法であって、
ｉ）前記被験体において、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性を有する被験体を、該被験体の生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの有無を判定することによって区別することと、ここで、前記少なくとも１つの多型マーカーの存在が、前記被験体のＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性が増大していることの指標となる、
ｉｉ）Ｃ型肝炎治療計画を確立することと、
を含む、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を評価する方法。
【請求項３６】
前記Ｃ型肝炎治療がインターフェロンによる治療である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記インターフェロンによる治療がＩＦＮα、ＩＦＮλ又は任意のペグインターフェロンを含む群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記インターフェロンによる治療が、リバビリン若しくは任意のタンパク分解酵素阻害剤、若しくは任意の他の抗ウイルス剤、又はそれらの任意の組み合わせと併用されたものである、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記被験体がＨＩＶに同時感染している、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を評価する方法であって、
ｉ）前記被験体において、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性を有する被験体を、
前記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの有無であって、該少なくとも１つの多型マーカーの存在が、前記被験体のＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性が増大していることの指標となる、少なくとも１つの多型マーカーの有無、及び
ＨＣＶウイルス遺伝子型であって、遺伝子型１又は４の存在が、前記被験体のＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性が増大していることの指標となる、ＨＣＶウイルス遺伝子型
を判定することによって区別することと、
ｉｉ）Ｃ型肝炎治療計画を確立すること
とを含む、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を評価する方法。
【請求項４１】
前記Ｃ型肝炎治療がインターフェロンによる治療である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記インターフェロンによる治療がＩＦＮα、ＩＦＮλ又は任意のペグインターフェロンを含む群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記インターフェロンによる治療が、リバビリン若しくは任意のタンパク分解酵素阻害剤、若しくは任意の他の抗ウイルス剤、又はそれらの任意の組み合わせと併用されたものである、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記被験体がＨＩＶに同時感染している、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
慢性Ｃ型肝炎を患う被験体において、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性を請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って判定するためのキットであって、
ｉ）前記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの有無を選択的に検出するための試薬と、
ｉｉ）使用説明書
とを含む、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体において、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性を請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って判定するためのキット。
【請求項４６】
Ｃ型肝炎に感染した被験体において、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法に従って非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性を判定するためのキットであって、
ｉ）前記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの有無を選択的に検出するための試薬と、
ｉｉ）使用説明書と、
を含む、Ｃ型肝炎に感染した被験体において、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法に従って非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性を判定するためのキット。
【請求項４７】
前記試薬が前記ウイルス遺伝子型の検出を対象とする別のプライマー、プライマーセット又はプライマーアレイを更に含む、請求項４５又は４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記被験体がＨＩＶに同時感染している、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎に感染した被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性、又は自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性を判定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、世界人口の約３％である２億人を超える人々に慢性的に感染している一本鎖ＲＮＡウイルスである［１〜４］。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による急性感染は、広範な先天免疫応答及び適応免疫応答を誘導し、２０％〜５０％の人々においてＨＣＶの永続的な抑制を達成する［５］。ウイルス除去の失敗は慢性Ｃ型肝炎につながる。慢性感染は、主に肝硬変及び肝細胞癌に進行することに起因する著しい罹患率及び死亡率と関連している［６］。現在の標準的なペグインターフェロン及びリバビリン療法（ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ）は、慢性的に感染した個体の３０％〜８０％で持続性奏効率（sustained response rate）をもたらしている［７〜９］。
【０００３】
宿主の遺伝的要因が、慢性Ｃ型肝炎感染の自然経過及び療法に対する応答の両方に影響を与えることを示唆する証拠が増えている［１０〜１３］。単一のＨＣＶ株で汚染された免疫グロブリン製剤から同様の条件下で感染した２つの妊婦コホートでは、半数で感染が自発的に除去され、半数が慢性Ｃ型肝炎に進行した［１４、１５］。慢性的に感染した患者のうち、ＨＣＶ−ＲＮＡレベルが同様であり、遺伝子型が同一の症例間であっても治療に対する応答は異なっている［６、７、９］。奏効率は民族性及び性別に強く関連する［１６］。以前の報告から、ＨＣＶ感染の転帰に対するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）［１０、１３］、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）［１７］、サイトカイン（特許文献１）、ケモカイン及びインターロイキン、並びにインターフェロン活性化遺伝子［１８〜２２］の影響が明らかとなっている。
【０００４】
以前の研究では、ＨＣＶ感染における遺伝子の潜在的役割の先験的な知識に基づく候補遺伝子アプローチが用いられていた。しかしながら、以前のデータからは自発的除去又は治療に対する応答の正確な予測は可能ではない［１３］。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第００／０８２１５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のアプローチにもかかわらず、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体における抗Ｃ型肝炎療法非応答性に対する感受性、又はＣ型肝炎ウイルスに急性感染した被験体における自発的若しくは非自発的なＣ型肝炎除去に対する感受性を判定する、効果的な予測方法を開発することの非常に大きな必要性が依然として存在する。
【０００７】
これまで、この問題を克服する効率的な方法又は戦略は開発されていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的は、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を判定する方法であって、上記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの有無を判定することを含む、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を判定する方法を提供することにより達成される。
【０００９】
本発明の更なる目的は、Ｃ型肝炎に感染した被験体における非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性を判定する方法であって、上記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの有無を判定することを含む、Ｃ型肝炎に感染した被験体における非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性を判定する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、慢性Ｃ型肝炎の患者を治療する方法であって、
ｉ）上記患者の多型マーカーの少なくとも１つが、該患者から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプルにおいて、ＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座内に存在するか否かを判定することと、ここで、上記患者の多型マーカーの少なくとも１つはｒｓ１１８７９００５、ｒｓ１２９７５７９９、ｒｓ１１０８３５１９、ｒｓ９５５１５５、ｒｓ１２９７２９９１、ｒｓ１２９８０２７５、ｒｓ８１０５７９０、ｒｓ１１８８１２２２、ｒｓ１０８５３７２７、ｒｓ８１０９８８６、ｒｓ８１１３００７、ｒｓ８０９９９１７、ｒｓ７２４８６６８、ｒｓ１６９７３２８５、ｒｓ１０８５３７２８、ｒｓ４８０３２２３、ｒｓ１２９８０６０２、ｒｓ４８０３２２４、ｒｓ６６４８９３、ｒｓ５７６８３２、ｒｓ１１６７１０８７、ｒｓ２５１９１０、ｒｓ７３５９９５３、ｒｓ７３５９９５０、ｒｓ２０９９３３１、ｒｓ１１６６５８１８、ｒｓ５７０８８０、ｒｓ５０３３５５、ｒｓ３０４６１、ｒｓ１９４０１４、ｒｓ２５１９０３、ｒｓ１２９７９１７５、ｒｓ３９５８７、ｒｓ３０４８０を含む群から選択される、
ｉｉ）上記患者の多型マーカーの少なくとも１つが、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性の増大と関連するか否かに基づいて上記患者を治療することと、
を含む、慢性Ｃ型肝炎の患者を治療する方法を提供することである。
【００１１】
また本発明の更なる目的は、慢性Ｃ型肝炎の患者を治療する方法であって、
ｉ）上記患者の多型マーカーの少なくとも１つが、該患者から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプルにおいて、ＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座内に存在するか否かを判定することと、ここで、上記患者の多型マーカーの少なくとも１つがｒｓ１１８７９００５、ｒｓ１２９７５７９９、ｒｓ１１０８３５１９、ｒｓ９５５１５５、ｒｓ１２９７２９９１、ｒｓ１２９８０２７５、ｒｓ８１０５７９０、ｒｓ１１８８１２２２、ｒｓ１０８５３７２７、ｒｓ８１０９８８６、ｒｓ８１１３００７、ｒｓ８０９９９１７、ｒｓ７２４８６６８、ｒｓ１６９７３２８５、ｒｓ１０８５３７２８、ｒｓ４８０３２２３、ｒｓ１２９８０６０２、ｒｓ４８０３２２４、ｒｓ６６４８９３、ｒｓ５７６８３２、ｒｓ１１６７１０８７、ｒｓ２５１９１０、ｒｓ７３５９９５３、ｒｓ７３５９９５０、ｒｓ２０９９３３１、ｒｓ１１６６５８１８、ｒｓ５７０８８０、ｒｓ５０３３５５、ｒｓ３０４６１、ｒｓ１９４０１４、ｒｓ２５１９０３、ｒｓ１２９７９１７５、ｒｓ３９５８７、ｒｓ３０４８０を含む群から選択される、
ｉｉ）上記患者から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプルにおいて、ＨＣＶウイルス遺伝子型を判定することと、
ｉｉｉ）上記患者の多型マーカーの少なくとも１つ及びＨＣＶウイルス遺伝子型が、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性の増大と関連するか否かに基づいて上記患者を治療することと、
を含む、慢性Ｃ型肝炎の患者を治療する方法である。
【００１２】
本発明は、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を評価する方法であって、
ｉ）上記被験体において、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性を有する被験体を、該被験体の生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの有無を判定することによって区別することと、ここで、上記少なくとも１つの多型マーカーの存在が、上記被験体のＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性が増大していることの指標となる、
ｉｉ）Ｃ型肝炎治療計画を確立することと、
を含む、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を評価する方法も提供する。
【００１３】
本発明は、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を評価する方法であって、
ｉ）上記被験体において、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性を有する被験体を、
上記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの有無であって、該少なくとも１つの多型マーカーの存在が、上記被験体のＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性が増大していることの指標となる、少なくとも１つの多型マーカーの有無、及び
ＨＣＶウイルス遺伝子型であって、遺伝子型１又は４の存在が、上記被験体のＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性が増大していることの指標となる、ＨＣＶウイルス遺伝子型
を判定することによって区別することと、
ｉｉ）Ｃ型肝炎治療計画を確立することと、
を含む、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を評価する方法にも関する。
【００１４】
本発明は、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体において、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性を本発明に従って判定するためのキットであって、
ｉ）上記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの有無を選択的に検出するための試薬と、
ｉｉ）使用説明書と、
を含む、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体において、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性を本発明に従って判定するためのキットにも関する。
【００１５】
Ｃ型肝炎に感染した被験体において、本発明に従って非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性を判定するためのキットであって、
ｉ）上記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの有無を選択的に検出するための試薬と、
ｉｉ）使用説明書と、
を含む、Ｃ型肝炎に感染した被験体において、本発明に従って非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性を判定するためのキットも本発明で提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】マンハッタンプロットを示す図である。推定した（imputated）２．５Ｍ全ての一塩基多型（ＳＮＰ）についてのＰ値が（−ｌｏｇ１０スケールで）示される。
【図２】感染集団における遺伝子型の分布を示す図である。（Ａ）Ｇ対立遺伝子を含有する遺伝子型は、慢性感染を有する個体と比較して、自発的ＨＣＶ除去を示す個体において減少した。（Ｂ）スイスＣ型肝炎コホート研究（ＳＣＣＳ）において、以下の３つの患者群にわたってＧ対立遺伝子の頻度が増加した：自発的ウイルス除去を示す患者＜治療後に除去を示す患者（すなわち治療に対する応答者）＜治療に非応答性の患者。
【図３】ＩＬ２８Ｂハプロタイプブロックにおける自発的除去及び治療非応答性の両方に対して適合した関連性パターンを示す、種々のＳＮＰのＰ値のグラフ表示である。（Ａ）ハプロタイプブロック。最も強い遺伝的関連性はＩＬ２８Ｂ遺伝子に最も近いハプロタイプブロックに位置する。（Ｂ）ＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及びＩＬ−２９遺伝子座におけるＨＣＶとのＳＮＰの遺伝的関連性。ＩＬ２８Ｂ遺伝子座及びＩＬ２８Ａ遺伝子座の近くに位置するＳＮＰの強い関連性は、自発的Ｃ型肝炎除去及びインターフェロンによる療法への非応答性の両方のエンドポイントで存在した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を判定する方法であって、上記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの有無を判定することを含む、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を判定する方法に関する。
【００１８】
本発明は、Ｃ型肝炎に感染した被験体における非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性を判定する方法であって、上記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの有無を判定することを含む、Ｃ型肝炎に感染した被験体における非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性を判定する方法にも関する。
【００１９】
本明細書中に記載されるものと同様又は等価の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を下記に記載する。本明細書中で言及される全ての公報、特許出願、特許及び他の参照文献は、その全体が参照により援用される。本明細書中で論考される公報及び出願は、本願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提示される。本明細書中のいかなる内容も、本発明が先行発明に基づいて、かかる公報に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈されてはならない。加えて、材料、方法及び実施例は例示のみを目的とし、限定を意図するものではない。
【００２０】
別段の規定がない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本明細書の主題が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で使用される場合、以下の定義は本発明の理解を容易にするために与えられる。
【００２１】
「含む」という用語は、１つ又は複数の特徴又は成分を含む、すなわちその存在を許容するという意味で一般に使用される。
【００２２】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、文脈上そうではないと明らかに指示されない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は複数の指示対象（references）を含む。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「持続性ウイルス応答」は、治療終了後２４週間を超える検出不可能なウイルス血症であると定義された。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「少なくとも１つ」は「１つ又は複数」を意味する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「被験体」又は「患者」という用語は、当該技術分野でよく認識されており、本明細書中では同義で使用され、哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ラット、マウス、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、最も好ましくはヒトを指す。幾つかの実施形態では、被験体はＣ型肝炎治療の必要性がある被験体である。しかしながら、他の実施形態では、被験体は正常被験体であり得る。
【００２６】
「被験体」又は「患者」という用語は、特定の年齢又は性別を表すものではない。このため、男性であるか又は女性であるかを問わず、成人、幼児及び新生児の被験体を包含することが意図される。
【００２７】
代替的には、上記被験体又は患者は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、好ましくはＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２に同時感染している。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「感受性」という用語は、被験体の尤度、又はＣ型肝炎治療に反応性を示さない素因、又は非自発的Ｃ型肝炎除去に対する被験体の素因を指す。
【００２９】
「対立遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、細胞、個体又は集団内の遺伝子配列又は遺伝子配列（遺伝子等）内の単一ヌクレオチド位置の或る特定の形態を指し、この特定の形態は、遺伝子の配列内の少なくとも１つ、しばしば２つ以上の可変部（variant sites）の配列内の同じ遺伝子の他の形態とは異なる。この配列は遺伝子内にあっても、又は遺伝子内になくてもよい。異なる対立遺伝子間で異なるこれらの可変部での配列は、「分散（variances）」、「多型」又は「突然変異」と称される。常染色体に特異的な染色体位置又は「遺伝子座」の各々において、個体は一方が片方の親から、もう一方がもう片方の親から（例えば一方が母親から、もう一方が父親から）受け継がれた２つの対立遺伝子を有する。
【００３０】
「多型」は、本明細書中で使用される場合、集団内で２つ以上の遺伝的に決定された選択的配列又は対立遺伝子が発生することを指す。「多型マーカー」又は部位とは、多様性が生じる遺伝子座である。好ましいマーカーは、各々が選択された集団内の好ましくは１％を超える、より好ましくは１０％又は２０％を超える頻度で発生する、少なくとも２つの対立遺伝子を有する。多型は１つ又は複数の塩基の変化、挿入、反復又は欠失を含み得る。多型座は一塩基対の大きさしかない場合もある。多型マーカーとしては、制限断片長多型、繰り返し配列数多型（variable number of tandem repeats）（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純配列反復、コピー数多型（copy number variations）（ＣＮＶ）、及びＡｌｕ等の挿入因子が挙げられる。最初に同定された対立遺伝子形態を任意に参照形態として指定し、他の対立遺伝子形態を選択的対立遺伝子又は変異型対立遺伝子として指定する。選択された集団内で最も頻繁に発生する対立遺伝子形態は、野生型形態と称される場合もある。２対立遺伝子多型は２つの形態を有する。３対立遺伝子多型は３つの形態を有する。２つの核酸間の多型は自然に発生しても、又は化学物質、酵素若しくは他の作用因子への曝露若しくは接触、又は核酸に損傷を引き起こす作用因子、例えば紫外線放射、突然変異原又は発癌性物質への曝露によって引き起こされるものであってもよい。特定の種類の多型（一塩基多型又はＳＮＰと呼ばれる）は、個人のＤＮＡ配列内で発生し得る小さな遺伝的変化又は変異である。遺伝子コードは、４つのヌクレオチド「文字」であるＡ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）及びＧ（グアニン）によって指定される。単一のヌクレオチド（例えばＡ）が、他の３つのヌクレオチド文字（Ｃ、Ｇ又はＴ）の１つで置換される場合にＳＮＰ変異が発生する。
【００３１】
「Ｃ型肝炎ウイルス」又は「ＨＣＶ」という用語は、病原株がＣ型肝炎（非Ａ非Ｂ型肝炎としても知られる）を引き起こすＲＮＡウイルス種を定義するために本明細書中で使用される。ＨＣＶ分離株の遺伝的差異に基づいて、Ｃ型肝炎ウイルス種は６つの遺伝子型（１〜６）に分類され、各々の遺伝子型内に幾つかの亜型がある。亜型は更にそれらの遺伝的多様性に基づいて準種に分けられる。ＨＣＶ遺伝子型の優位性及び分布は世界的に異なる。例えば、北アメリカでは遺伝子型１ａが優勢であり、その後に１ｂ、２ａ、２ｂ及び３ａが続く。ヨーロッパでは、遺伝子型１ｂが優勢であり、その後に２ａ、２ｂ、２ｃ及び３ａが続く。遺伝子型４及び５は、ほぼ例外なくアフリカで見られる。ウイルス遺伝子型は、インターフェロンによる療法に対する潜在的応答及びかかる療法の所要期間を決定するうえで臨床的に重要である。遺伝子型１及び遺伝子型４は概して、インターフェロンによる治療に対する応答性が他の遺伝子型（２、３、５及び６）よりも低い。遺伝子型５及び６が集団内でまれであることに留意されたい。
【００３２】
「Ｃ型肝炎」は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）によって引き起こされる、肝臓に影響を及ぼす感染性疾患である。感染は多くの場合無症候性であるが、慢性Ｃ型肝炎感染は確立されると、肝臓の瘢痕（線維症）及び一般に何年もたってから現れる進行性瘢痕（肝硬変）に進行する可能性がある。一部の症例では、肝硬変の人々は続いて肝不全、又は肝臓がんを含む他の肝硬変の合併症を発症する。
【００３３】
「慢性Ｃ型肝炎」は、６ヶ月を超えて持続するＣ型肝炎ウイルスによる感染として定義される。臨床的には、慢性Ｃ型肝炎は無症候性である（症状を伴わない）ことが多く、大抵は偶然に発見される。慢性Ｃ型肝炎の自然経過は人によって大幅に異なる。ＨＣＶに感染したほとんどの人々は、肝臓生検で炎症の兆候を有し、肝臓瘢痕（線維症）の進行速度は個体間で有意な変動を示す。このウイルスに対する試験が利用可能である時間が限られていたため、経時的なリスクの正確な推定は確立することが困難である。
【００３４】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が同定されてすぐに、このウイルスに対する抗体を有する人々における多数の横断的研究によって、「自発的Ｃ型肝炎除去」を示すことが見てとれる人々がいる一方で、ウイルス血症の状態を保持している人々もいることが実証された。それ以降、多くの研究者が自発的ウイルス除去の確率、経時変化及び予測因子を含むＣ型肝炎感染の原因を明らかにしようと試みてきた。除去率の推定値は１０％〜５０％の範囲にわたっており、除去の持続時間は一部の症例においては３年もの間であることが分かった。権威ある臨床総説では一般に、除去率が１０％〜１５％と低いことが述べられている。
【００３５】
「非自発的Ｃ型肝炎除去」は、本明細書中で被験体が自発的除去を示さず、感染が慢性Ｃ型肝炎へ進展し得る状況を指す。明確にするために、この用語は治療によって誘導される除去を指すものではない。
【００３６】
「ＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座」は概して、ヒトにおいては、３つのサイトカイン遺伝子、すなわちＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２８Ａ及びＩＬ２９（ＩＦＮλファミリーに属する）をコードする第１９染色体の長腕内の８０ｋｂ領域に位置するゲノムＤＮＡ領域を指す。これら３つの遺伝子は幾つかのエキソン、ＩＬ−２８（ＩＦＮλ１とも称される）については５つ、ＩＬ−２８Ａ（ＩＦＮλ２）及びＩＬ−２８Ｂ（ＩＦＮλ３）については６つのエキソンを有する。これらは２０ｋＤａの分泌モノマータンパク質をコードする。ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２８Ａ及びＩＬ２９サイトカインが、ＩＦＮαに耐性を有するか、又は耐性を有するようになるＨＣＶ感染患者の治療のためのＩＦＮαの興味深い代替物となり得ることが最近報告された（［３８］）。
【００３７】
慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を判定する本発明による方法の場合、少なくとも１つの多型マーカーの存在は、上記被験体のＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性が増大していることの指標となる。
【００３８】
一方、本発明に従うＣ型肝炎に感染した被験体において非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性を判定する方法の場合、少なくとも１つの多型マーカーの存在は、上記被験体の非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性が増大していることの指標となる。
【００３９】
上記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座に適用することのできる、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の有無を解析するための多数の方法が利用可能である。多型又は突然変異を検出するアッセイは、直接シークエンシングアッセイ、断片多型アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ及びコンピューターベースのデータ解析を含むが、これらに限定されない幾つかのカテゴリーに分けられる。これらのアッセイの多様な変更を行うためのプロトコル及び市販のキット又はサービスが利用可能である。幾つかの実施形態では、アッセイは組み合わせて又は混合的に行われる（例えば、幾つかのアッセイからの異なる試薬又は技術を組み合わせて１つのアッセイを生み出す）。以下のアッセイが本発明において有用であり、ＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座内に見られる様々なＳＮＰの検出と関連付けながら説明する。
【００４０】
本発明の一態様では、ＳＮＰは直接シーケンス法を用いて検出される。これらのアッセイでは、ＤＮＡサンプルを初めに任意の好適な方法を用いて被験体から単離する。幾つかの実施形態では、対象の領域を好適なベクターにクローニングし、宿主細胞（例えば細菌）中で増殖させることによって増幅する。他の実施形態では、対象の領域内のＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅する。
【００４１】
増幅後、対象の領域（例えばＳＮＰを含有する領域）内のＤＮＡを、放射性マーカーヌクレオチドを用いた手動シークエンシング、又は自動シークエンシングを含むが、これらに限定されない任意の好適な方法を用いてシークエンシングする。シークエンシングの結果は任意の好適な方法を用いて表示される。配列を検査し、所与のＳＮＰの有無を判定する。
【００４２】
本発明の一態様では、ＳＮＰはＰＣＲベースのアッセイを用いて検出される。幾つかの実施形態では、ＰＣＲアッセイは、対象の反復多型を含有する断片を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー（「プライマー」）の使用を含む。標的ポリヌクレオチド配列の増幅は当業者に既知の任意の方法によって行うことができる。例えば［４１］及び［４２］を参照されたい。増幅方法としては、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、鎖置換増幅（［４３］、［４４］）、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを用いた鎖置換増幅（米国特許第５，００１，０５０号）、転写ベースの増幅［４５］、自律的配列複製（「３ＳＲ」）（［４６］、［４７］）、Ｑβレプリカーゼ系（［４８］、［４９］）、核酸配列ベースの増幅（「ＮＡＳＢＡ」）（［５０］）、修復連鎖反応（repair chain reaction）（「ＲＣＲ」）（［５０］、上掲）及びブーメランＤＮＡ増幅（すなわち「ＢＤＡ」）（［５０］）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＣＲは標的ポリヌクレオチド配列を増幅する好ましい方法である。
【００４３】
ＰＣＲは当業者に既知の技法に従って行うことができる。ＰＣＲは一般に、初めに核酸サンプルを（例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で）増幅プライマー対で処理することを含む。プライマー対の一方のプライマーは標的ポリヌクレオチド配列の一方の鎖とハイブリダイズする。プライマー対の第２のプライマーは標的ポリヌクレオチド配列の他方の相補鎖とハイブリダイズする。プライマーは、各々の核酸鎖に相補的な各々のプライマーの伸長産物が合成される条件下で、それらの標的ポリヌクレオチド配列鎖とハイブリダイズする。各々のプライマーから合成された伸長産物は、その相補体から分離されると、他のプライマーの伸長産物の合成の鋳型となることができる。プライマー伸長後、サンプルを変性条件で処理して、プライマー伸長産物をそれらの鋳型から分離する。これらの工程を所望の程度の増幅が得られるまで周期的に繰り返す。
【００４４】
増幅した標的ポリヌクレオチドを、本明細書の他の部分に記載される検出アッセイの１つに使用して、増幅した標的ポリヌクレオチド配列内に存在するＧＴ反復多型を同定することができる。
【００４５】
本発明の一態様では、ＳＮＰは断片長多型アッセイを用いて検出される。断片長多型アッセイでは、一連の位置でのＤＮＡの切断に基づく独自のＤＮＡバンドパターンが、酵素（例えば制限エンドヌクレアーゼ）を用いて生成される。多型を含有するサンプルに由来するＤＮＡ断片は、野生型とは異なるバンドパターンを有する。
【００４６】
本発明の一態様では、当該技術分野で既知のマイクロサテライト多型判定の方法である、断片サイジング解析をBeckman CoulterのＣＥＱ  ８０００遺伝子解析システムを用いて行う。
【００４７】
本発明の一態様では、ＳＮＰは制限断片長多型アッセイ（ＲＰＬＰ）を用いて検出される。対象の領域を初めにＰＣＲを用いて単離する。次いで、所与の多型について独自の長さの断片を与えることが知られる制限酵素でＰＣＲ産物を切断する。制限酵素によって消化されたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、エチジウムブロマイド染色によって可視化し、対照（野生型）と比較する。
【００４８】
一態様では、多型はＣＬＥＡＶＡＳＥ断片長多型アッセイを用いて検出される（ＣＦＬＰ、Third Wave Technologies, Madison, Wis.、例えば米国特許第５，８８８，７８０号を参照されたい）。このアッセイは、ＤＮＡの一本鎖が自ら折り畳まれる場合、ＤＮＡ分子の正確な配列に対して個体差が大きい高次構造をとるという観察に基づくものである。これらの二次構造は、一本鎖領域が二本鎖ＤＮＡヘアピンと並列するような、ＤＮＡの部分的に二重の領域を伴う。ＣＬＥＡＶＡＳＥ  Ｉ酵素は、これらの一本鎖領域と二本鎖領域との間の接合部を認識して切断する構造特異的な耐熱性ヌクレアーゼである。
【００４９】
対象の領域を初めに、例えばＰＣＲを用いて単離する。次いで、ＤＮＡ鎖を加熱することによって分離する。次に、反応を冷却して鎖内二次構造を形成させる。次いで、ＰＣＲ産物をＣＬＥＡＶＡＳＥ  Ｉ酵素で処理して、所与の多型に独自の一連の断片を生成させる。ＣＬＥＡＶＡＳＥ酵素で処理したＰＣＲ産物を分離し、（例えばアガロースゲル電気泳動によって）検出し、（例えばエチジウムブロマイド染色によって）可視化し、対照（野生型）と比較する。
【００５０】
本発明の他の態様では、ＳＮＰはハイブリダイゼーションアッセイによって検出される。ハイブリダイゼーションアッセイでは、所与の多型又は突然変異の有無は、サンプルに由来するＤＮＡの相補ＤＮＡ分子（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）とハイブリダイズする能力に基づいて判定される。ハイブリダイゼーション及び検出の様々な技術を用いる様々なハイブリダイゼーションアッセイが利用可能である。アッセイの選択についての説明は下記に提示する。
【００５１】
好ましい態様では、ハイブリダイズした核酸は、サンプル核酸に結合した１つ又は複数の標識を検出することによって検出される。標識は当業者に既知の任意の多数の手段によって取り込ませることができる。一実施形態では、標識はサンプル核酸の調製における増幅工程中に同時に取り込ませる。このため、例えば標識されたプライマー又は標識されたヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、標識された増幅産物が得られる。別の実施形態では、標識されたヌクレオチド（例えばフルオレセインで標識されたＵＴＰ及び／又はＣＴＰ）を用いた転写増幅によって、標識が転写された核酸内に取り込まれる。
【００５２】
代替的には、標識は元の核酸サンプル（例えばｍＲＮＡ、ｐｏｌｙＡ  ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等）又は増幅が完了した後の増幅産物に直接付加することができる。標識を核酸に結合させる手段は当業者に既知であり、例えばニックトランスレーション、又は核酸をキナーゼ処理し、続いてサンプル核酸と標識（例えば蛍光体）とを連結する核酸リンカーを結合（ライゲーション）することによる（例えば標識されたＲＮＡでの）末端標識が挙げられる。別の実施形態では、標識は末端デオキシトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いて断片の末端に付加される。
【００５３】
本発明に使用するのに好適な検出可能な標識としては、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段又は化学的手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。本発明において有用な標識としては、標識されたストレプトアビジン複合体による染色のためのビオチン、抗ビオチン抗体、電磁ビーズ（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えばフルオレセイン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、放射標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３２Ｐ）、リン光標識、酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びＥＬＩＳＡに一般に使用されるもの）、及びコロイド金又は色ガラス又はプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズ等の比色標識（calorimetric labels）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
かかる標識を検出する手段は当業者に既知である。このため、例えば放射標識は写真フィルム又はシンチレーションカウンターを用いて検出することができ、蛍光マーカーは放射光を検出する光検出器を用いて検出することができる。酵素標識は通常、酵素に基質を供給し、基質に対する酵素の作用によって生じる反応産物を検出することによって検出され、比色標識は着色した標識を単に可視化することによって検出される。
【００５５】
標識はハイブリダイゼーション前又はハイブリダイゼーション後に標的核酸（複数も可）に付加することができる。いわゆる「直接標識」は、ハイブリダイゼーション前に標的核酸に直接結合するか、又は取り込ませる検出可能な標識である。一方、いわゆる「間接標識」はハイブリダイゼーション後にハイブリッド二本鎖に連結される。多くの場合、間接標識はハイブリダイゼーション前に標的核酸に結合した結合部に結合させる。このため、例えば標的核酸をハイブリダイゼーション前にビオチン化させてもよい。ハイブリダイゼーション後、アビジンと複合体形成した蛍光体がビオチンを有するハイブリッド二本鎖に結合し、容易に検出される標識が得られる。核酸を標識し、標識されたハイブリダイズ核酸を検出する方法の詳細な総括については、Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization with Nucleic Acid Probes（その全体が全ての目的のために参照により本明細書中に援用される）を参照されたい。
【００５６】
一態様では、対象の配列（例えばＳＮＰ等の多型）とのプローブのハイブリダイゼーションは、結合したプローブを可視化することによって直接検出される（例えばノーザンアッセイ又はサザンアッセイ、例えば、Ausabel et al. （Eds.）, 1991, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYを参照されたい）。これらのアッセイでは、ゲノムＤＮＡ（サザン）又はゲノムＲＮＡ（ノーザン）を被験体から単離する。次いで、ほとんどゲノム内で切断することがなく、アッセイされる任意のマーカーの近くで切断しない一連の制限酵素でＤＮＡ又はＲＮＡを切断する。次いで、ＤＮＡ又はＲＮＡを分離し（例えばアガロースゲル電気泳動）、メンブレンに転写する。（例えば放射性ヌクレオチドを取り込ませることによって）標識された、検出される突然変異に特異的なプローブ（単数又は複数）を低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー又は高ストリンジェンシーの条件下でメンブレンと接触させる。結合していないプローブを除去し、標識されたプローブを可視化することによって結合の存在を検出する。
【００５７】
本発明の一態様では、ＳＮＰはＤＮＡチップハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出される。このアッセイでは、一連のオリゴヌクレオチドプローブを固体支持体に固定させる。オリゴヌクレオチドプローブは所与の一塩基多型に独自であるように設計されている。対象のＤＮＡサンプルをＤＮＡ「チップ」と接触させ、ハイブリダイゼーションを検出する。
【００５８】
幾つかの実施形態では、ＤＮＡチップアッセイはＧｅｎｅＣｈｉｐ（Affymetrix, Santa Clara, Calif、例えば米国特許第６，０４５，９９６号を参照されたい）アッセイである。ＧｅｎｅＣｈｉｐ技術では、「チップ」に固定した小型の高密度オリゴヌクレオチドプローブアレイを使用する。プローブアレイは、固相化学合成と半導体産業において利用されるフォトリソグラフィー製造技法とを組み合わせた、Affymetrixの光指向性（light-directed）化学合成プロセスによって作製される。一連のフォトリソグラフィーマスクを使用してチップ曝露部位を画定し、続いて特異的化学合成工程を行うことで、プロセスによってアレイ内の所定の位置に各々のプローブを有する高密度オリゴヌクレオチドアレイが構築される。複数のプローブアレイを大きなガラスウエハ上に同時に合成する。次いで、ウエハをダイシングし、個々のプローブアレイを、それらを環境から保護し、ハイブリダイゼーションのためのチャンバーとなる射出成形プラスチックカートリッジ内にパッケージングする。
【００５９】
解析対象の核酸を被験体から得られた生体サンプルから単離し、ＰＣＲによって増幅し、蛍光レポーター基で標識する。次いで、流体工学ステーション（fluidics station）を用いて、標識されたＤＮＡをアレイとともにインキュベートする。次いで、アレイをスキャナに挿入し、ハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションデータは、プローブアレイに結合した標的内に既に取り込まれた蛍光レポーター基の発する光として収集する。標的と完全に一致するプローブは概して、ミスマッチを有するプローブよりも強いシグナルを生じる。アレイ上の各々のプローブの配列及び位置は既知であるため、相補性によってプローブアレイにアプライした標的核酸の同一性を判定することができる。
【００６０】
別の態様では、電気的に捕捉されたプローブを含有するＤＮＡマイクロチップ（Nanogen，San Diego，Calif.）を利用する（例えば米国特許第６，０６８，８１８号を参照されたい）。マイクロエレクトロニクスの使用のために、Nanogenの技術によって、その半導体マイクロチップ上での指定の試験部位への、また指定の試験部位からの帯電分子の能動的移動及び濃縮が可能となる。所与の多型又は突然変異に独自のＤＮＡ捕捉プローブがマイクロチップ上の特異的部位に電気的に配置されるか、又は「アドレスされる」。ＤＮＡは強い負電荷を有するため、正電荷の領域に電気的に移動させることができる。
【００６１】
初めに、マイクロチップ上の試験部位又は試験部位の列を、正電荷によって電気的に活性化する。次に、ＤＮＡプローブを含有する溶液をマイクロチップ上に導入する。負に帯電したプローブは正に帯電した部位へと急速に移動し、そこで濃縮され、マイクロチップ上の部位に化学結合する。次いで、マイクロチップを洗浄し、特異的に結合したＤＮＡプローブのアレイが完全になるまで、異なるＤＮＡプローブの別の溶液を添加する。
【００６２】
次いで、いずれのＤＮＡ捕捉プローブが試験サンプル中の相補ＤＮＡ（例えば、ＰＣＲ増幅した対象の遺伝子）とハイブリダイズするかを判定することによって、標的ＤＮＡ分子の存在について試験サンプルを解析する。標的分子をマイクロチップ上の１つ又は複数の試験部位に移動させ、濃縮するために電子電荷も使用される。各々の試験部位でのサンプルＤＮＡの電気的濃縮は、相補的な捕捉プローブとのサンプルＤＮＡの迅速なハイブリダイゼーションを促進する（ハイブリダイゼーションは数分以内に起こり得る）。任意の結合していない又は非特異的に結合したＤＮＡを各々の部位から除去するために、部位の極性又は電荷を負に逆転させて、それにより任意の結合していない又は非特異的に結合したＤＮＡを捕捉されたプローブから溶液中へと戻す。レーザーベースの蛍光スキャナを使用して結合を検出する。
【００６３】
さらに別の態様では、表面張力差による平面（チップ）上での流体の分離に基づくアレイ技術（ProtoGene，Palo Alto，Calif.）が利用される（例えば米国特許第６，００１，３１１号を参照されたい）。Protogeneの技術は、化学コーティングによって与えられる表面張力差によって流体を平面上で分離することができるという事実に基づいている。そのように分離すると、試薬のインクジェットプリントによってオリゴヌクレオチドプローブがチップ上で直接合成される。表面張力によって画定されたその反応部位を有するアレイを、４つの圧電ノズル（piezoelectric nozzles）セット（各々が４つの標準的なＤＮＡ塩基の各々に対応する）の下のＸ／Ｙトランスレーションステージ上に搭載する。トランスレーションステージをアレイの各々の列に沿って移動させ、適切な試薬を反応部位の各々に供給する。例えば、アミダイトＡをこの合成工程等の間にアミダイトＡが結合する部位のみに供給する。一般的な試薬及び洗浄液は表面全体に充満させることによって供給し、続いてスピニングにより除去する。
【００６４】
対象の多型に独自のＤＮＡプローブをProtogeneの技術を用いてチップに固定する。次いで、チップをＰＣＲ増幅した対象の遺伝子と接触させる。ハイブリダイゼーションの後、結合していないＤＮＡを除去し、任意の好適な方法を用いて（例えば取り込まれた蛍光基の蛍光脱消光（de-quenching）によって）ハイブリダイゼーションを検出する。
【００６５】
さらに他の態様では、ＳＮＰの検出に「ビーズアレイ」が用いられる（Illumina，San Diego，Calif、例えば、国際公開第９９／６７６４１号及び国際公開第００／３９５８７号（各々が参照により本明細書中に援用される）を参照されたい）。Illuminaは光ファイバー束と、アレイに自己組織化するビーズとを組み合わせたビーズアレイ技術を使用している。各々の光ファイバー束は、束の直径に応じて数千から数百万という個々のファイバーを含有する。ビーズは所与の多型又は突然変異の検出に特異的なオリゴヌクレオチドでコーティングされている。ビーズのバッチを組み合わせて、アレイに特異的なプールを形成する。アッセイを行うために、ビーズアレイを、調製した被験体サンプル（例えばＤＮＡ）と接触させる。ハイブリダイゼーションの酵素検出のような任意の好適な方法を用いてハイブリダイゼーションを検出する。
【００６６】
本発明の幾つかの態様では、特異的構造の酵素的切断によってハイブリダイゼーションを検出するアッセイを用いてゲノムプロファイルを作成する（ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ、Third Wave Technologies、例えば米国特許第６，００１，５６７号を参照されたい）。ＩＮＶＡＤＥＲアッセイでは、重複オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによって形成された複合体を切断する構造特異的な酵素を用いて、特異的なＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列が検出される。高温及びプローブの１つを過剰にすることによって、温度サイクルを伴わず存在する各々の標的配列について複数のプローブを切断することが可能となる。次いで、これら切断されたプローブが第２の標識されたプローブの切断を誘導する。二次プローブオリゴヌクレオチドは、内部色素によって消光されるフルオレセインで５’末端標識することができる。切断されると、脱消光されたフルオレセインで標識された産物を標準的な蛍光プレートリーダーを用いて検出することができる。
【００６７】
ＩＮＶＡＤＥＲアッセイでは、非増幅ゲノムＤＮＡ内の特異的突然変異及び多型が検出される。単離したＤＮＡサンプルを初めに多型／突然変異又は野生型配列のいずれかに特異的なプローブと接触させ、ハイブリダイズさせる。次いで、第１のプローブに特異的であり、フルオレセイン標識を含有する二次プローブをハイブリダイズさせ、酵素を添加する。蛍光プレートリーダーを用いて結合を検出し、試験サンプルと既知の陽性対照及び陰性対照とのシグナルを比較する。
【００６８】
幾つかの態様では、結合したプローブのハイブリダイゼーションはＴａｑＭａｎアッセイを用いて検出される（PE Biosystems，Foster City，Calif、例えば米国特許第５，９６２，２３３号を参照されたい）。このアッセイはＰＣＲ反応中に行われる。ＴａｑＭａｎアッセイは、ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を利用するものである。所与の対立遺伝子又は突然変異に特異的なプローブがＰＣＲ反応に加えられる。このプローブは、５’−レポーター色素（例えば蛍光色素）及び３’−クエンチャー色素を有するオリゴヌクレオチドからなる。ＰＣＲ中にプローブがその標的に結合すると、ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤポリメラーゼの５’−３’核酸分解活性によって、レポーター色素とクエンチャー色素との間でプローブが切断される。クエンチャー色素からのレポーター色素の分離により蛍光の増加がもたらされる。ＰＣＲの各サイクルによってシグナルが蓄積し、蛍光光度計を用いてモニタリングすることができる。
【００６９】
幾つかの態様では、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステム（Sequenom，San Diego，Calif.）が多型を検出するために使用される（例えば米国特許第６，０４３，０３１号を参照されたい）。標準的な手順を用いてＤＮＡを血液サンプルから単離する。次に、対象の多型を含有する特異的ＤＮＡ領域をＰＣＲによって増幅する。次いで、増幅された断片の一方の鎖が固体表面に結合されるが、固定化されなかった鎖を標準的な変性及び洗浄によって除去する。残りの固定化された一本鎖は続いて、遺伝子型に特異的な診断用産物を生じる自動酵素反応の鋳型として働く。
【００７０】
次いで、非常に少量、通常は５ナノリットル〜１０ナノリットルの酵素産物を、ＳｐｅｃｔｒｏＲＥＡＤＥＲ質量解析計を用いた続く自動解析のためにＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰアレイに移す。各々のスポットに、分注された診断用産物とマトリックスを形成する光吸収結晶を予め投入する。ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型）質量解析を使用する。脱離として知られるプロセスにおいて、マトリックスにレーザービームからのパルスを当てる。レーザービームからのエネルギーがマトリックスに伝達されて、マトリックスが気化され、少量の診断用産物が飛行管内に放出される。続いて電界パルスを管に適用すると、診断用産物が帯電し、飛行管から検出器に向かって放たれる。電界パルスを適用してから診断用産物が検出器と衝突するまでの時間は、飛行時間と称される。これは、分子の質量が飛行時間と直接相関する（より小さい分子がより大きい分子よりも速く飛行する）ため、産物の分子量の非常に正確な尺度である。全アッセイは０．０００１秒未満で完了し、サンプルを反復的なデータ収集を含めて合計３秒間〜５秒間で解析することが可能となる。次いで、ＳｐｅｃｔｒｏＴＹＰＥＲソフトウェアによって、１つのサンプルにつき３秒という速度で遺伝子型が計算、記録、比較及び報告される。
【００７１】
通常、本発明の「核酸サンプル」は、全血、血清、精液、唾液、涙、尿、糞便物質、汗、口腔粘膜塗沫、皮膚、並びに筋肉、肝臓、脳組織、神経組織及び毛髪の生検材料等の被験体から得られた生体サンプルから単離される。核酸サンプルは遺伝子の一部、制御配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｒＲＮＡを含む）であってもよい。
【００７２】
ゲノムＤＮＡサンプルは通常、プローブと接触させる前に増幅させる。ゲノムＤＮＡは任意の生体サンプルから得ることができる。ＳＮＰを含有するゲノムＤＮＡの増幅は、サンプルを得た個体が多型性部位でホモ接合性である場合には単一種の核酸、又は個体がヘテロ接合性である場合には２つの種の核酸を生成する。
【００７３】
ＲＮＡサンプルは多くの場合増幅にも供される。この場合、通常は増幅の先に逆転写を行う。発現された全てのｍＲＮＡの増幅は、例えば［３９］及び［４０］（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されるように行うことができる。２倍体のサンプルからのＲＮＡサンプルの増幅は、サンプルを提供する個体が、発現されたＲＮＡ内で生じる多型性部位でヘテロ接合性である場合には２つの種の標的分子、又はＲＮＡ種が選択的スプライシングに供される場合おそらくはそれ以上の標的分子を生成し得る。増幅は一般に、当該技術分野で既知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて行うことができる。標的サンプル中の核酸は、増幅の過程で１つ又は複数の標識ヌクレオチドを増幅混合物に混入することによって標識することができる。標識は増幅後に（例えば末端標識によって）増幅産物に結合させることもできる。増幅産物は、増幅反応に使用される酵素及び基質に応じてＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。
【００７４】
個々の多型の遺伝子型は、少なくとも２つの対立遺伝子の集まり（sum）を含み、ホモ接合性（すなわち同一の対立遺伝子を含む）又はヘテロ接合性（すなわち異なる対立遺伝子を含む）であり得る。
【００７５】
本発明の幾つかの態様では、単離した本発明の核酸サンプルは従来の核酸合成を用いて、又は当該技術分野で既知の組み換え核酸法（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）及びAusubel et al.の方法（2001, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York）によって生成又は合成することができる。
【００７６】
驚くべきことに、本発明者らは、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの存在が、上記被験体のＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性が増大していることの指標となることを示した。
【００７７】
さらに驚くべきことに、本発明者らは、Ｃ型肝炎に感染した被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの存在が、上記被験体の非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性が増大していることの指標となることを示した。
【００７８】
好ましくは、本発明の少なくとも１つのＳＮＰは、ヒト第１９染色体上の約８０ｋｂからなる領域内に位置する。ハプロタイプブロックのマッピングによって、ＳＮＰ間の強い遺伝的関連性、並びにｉ）一方で、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体におけるＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性、及びｉｉ）他方で、非自発的Ｃ型肝炎除去に対する増大した感受性が示された（図３）。
【００７９】
より好ましくは、本発明の少なくとも１つのＳＮＰは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４を含む群から選択されたＳＮＰに隣接するＤＮＡ領域（表１に挙げられる）から本質的になる核酸セグメント中に位置する。
【００８０】
本発明は、上記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つ、すなわち上で定義されたように１つ又は複数の一塩基多型（ＳＮＰ）、すなわちその組み合わせの有無を判定することも企図する。
【００８１】
好ましくは、多型マーカーはｒｓ１１８７９００５、ｒｓ１２９７５７９９、ｒｓ１１０８３５１９、ｒｓ９５５１５５、ｒｓ１２９７２９９１、ｒｓ１２９８０２７５、ｒｓ８１０５７９０、ｒｓ１１８８１２２２、ｒｓ１０８５３７２７、ｒｓ８１０９８８６、ｒｓ８１１３００７、ｒｓ８０９９９１７、ｒｓ７２４８６６８、ｒｓ１６９７３２８５、ｒｓ１０８５３７２８、ｒｓ４８０３２２３、ｒｓ１２９８０６０２、ｒｓ４８０３２２４、ｒｓ６６４８９３、ｒｓ５７６８３２、ｒｓ１１６７１０８７、ｒｓ２５１９１０、ｒｓ７３５９９５３、ｒｓ７３５９９５０、ｒｓ２０９９３３１、ｒｓ１１６６５８１８、ｒｓ５７０８８０、ｒｓ５０３３５５、ｒｓ３０４６１、ｒｓ１９４０１４、ｒｓ２５１９０３、ｒｓ１２９７９１７５、ｒｓ３９５８７、ｒｓ３０４８０を含む群から選択される少なくとも１つのＳＮＰと関連する多型性部位である。最も好ましくは、ＳＮＰはｒｓ８０９９９１７のＧ／Ｔ、ｒｓ８０９９９１７のＧ／Ｇ、ｒｓ５７６８３２のＣ／Ｇ、ｒｓ５７６８３２のＣ／Ｃ、ｒｓ１２９８０２７５のＧ／Ａ又はｒｓ１２９８０２７５のＧ／Ｇを含む群から選択される。
【００８２】
さらに好ましくは、少なくとも１つの多型マーカーはｒｓ１１８７９００５、ｒｓ１２９７５７９９、ｒｓ１１０８３５１９、ｒｓ９５５１５５、ｒｓ１２９７２９９１、ｒｓ１２９８０２７５、ｒｓ８１０５７９０、ｒｓ１１８８１２２２、ｒｓ１０８５３７２７、ｒｓ８１０９８８６、ｒｓ８１１３００７、ｒｓ８０９９９１７、ｒｓ７２４８６６８、ｒｓ１６９７３２８５、ｒｓ１０８５３７２８、ｒｓ４８０３２２３、ｒｓ１２９８０６０２、ｒｓ４８０３２２４、ｒｓ６６４８９３、ｒｓ５７６８３２、ｒｓ１１６７１０８７、ｒｓ２５１９１０、ｒｓ７３５９９５３、ｒｓ７３５９９５０、ｒｓ２０９９３３１、ｒｓ１１６６５８１８、ｒｓ５７０８８０、ｒｓ５０３３５５、ｒｓ３０４６１、ｒｓ１９４０１４、ｒｓ２５１９０３、ｒｓ１２９７９１７５、ｒｓ３９５８７、ｒｓ３０４８０を含む群から選択される少なくとも１つのＳＮＰと完全な又は強い連鎖不均衡にある多型性部位である。
【００８３】
例えば、上記ｒｓ８０９９９１７対立遺伝子Ｇは１つの染色体（又は２つの対立遺伝子位置の一方）の上に存在する場合、ヘテロ接合性遺伝子型Ｇ／Ｔを与える。一方、２つの染色体（又は対立遺伝子位置）上に存在する場合、ホモ接合性遺伝子型Ｇ／Ｇを与える。
【００８４】
一態様では、本明細書中に記載される、ウイルス遺伝子型の判定に有用な核酸サンプル及び多型の判定に有用な核酸サンプルは、被験体から得られた同じ生体サンプルから単離される。次いで、生体サンプルを、一方で本発明の少なくとも１つの多型マーカーの有無を判定するのに有用な核酸サンプルの単離のため、他方でＨＣＶウイルス遺伝子型の判定のために調製する。
【００８５】
別の態様では、本明細書中に記載される、ウイルス遺伝子型の判定に有用な核酸サンプル及び多型の判定に有用な核酸サンプルは、被験体から得られた２つの異なる生体サンプルから単離される。この場合、次いで、第１の生体サンプルを本発明の少なくとも１つの多型マーカーの有無を判定するのに有用な核酸サンプルの単離のために調製し、第２の生体サンプルをＨＣＶウイルス遺伝子型の判定に有用な核酸サンプルの単離のために調製する。
【００８６】
これら２つの生体サンプルは性質が同じであっても（例えば２つの症例における全血）、又は異なっていてもよい（例えば全血及び肝臓生検材料）。
【００８７】
解析対象のＨＣＶ核酸（通常はＲＮＡ）を概して単離し、ｃＤＮＡに逆転写し、例えば国際公開第９６／１４８３９号及び国際公開第９７／０１６０３号に記載されるＰＣＲによって増幅する。当該技術分野で既知の任意の他の技法を適用することができる。
【００８８】
「連鎖不均衡」（ＬＤ）は、対立遺伝子又は遺伝マーカーの幾つかの組み合わせが、それらの頻度に基づく対立遺伝子からのハプロタイプのランダム形成から予想されるよりも程度の差はあるが頻繁に集団内で生じる状況を表す。１つの遺伝子座の特定の対立遺伝子が、同じ染色体上に第２の遺伝子座の特異的な対立遺伝子とともに（遺伝子座が集団内で独立して分離している場合に予想されるよりも頻繁に）見られる場合、この遺伝子座は不均衡にある。このＬＤの概念は、提案された不均衡の最初の尺度の１つ（Ｄで表される）によって公式化される。Ｄは他の大半のＬＤの尺度と同様に、２つの遺伝子座ハプロタイプの観察頻度と、対立遺伝子がランダムに分離する場合に示される予想頻度との間の差として不均衡を定量化する。２つの隣接した遺伝子座の標準的な表記Ａ及びＢを採用すると（各遺伝子座の２つの対立遺伝子はＡ、ａ及びＢ、ｂとなる）、対立遺伝子Ａ及びＢからなるハプロタイプの観察頻度はＰＡＢで表される。２つの遺伝子座での対立遺伝子の独立組み合わせを推測すると、予想ハプロタイプ頻度は、２つの対立遺伝子各々の対立遺伝子頻度の積、すなわちＰＡ×ＰＢ（ここで、ＰＡは第１の遺伝子座での対立遺伝子Ａの頻度であり、ＰＢは第２の遺伝子座での対立遺伝子Ｂの頻度である）として算出される。したがって、不均衡の最も単純な尺度はＤ＝ＰＡＢ−ＰＡ×ＰＢである。新たな突然変異が近くの遺伝子座で特定の対立遺伝子を有する染色体上で生じた場合、ＬＤが引き起こされ、組み換えによって次第に失われる。反復突然変異も隣接した遺伝子座の対立遺伝子間の関連性を減少させ得る。ＬＤのパターン形成における組み換えの重要性は「連鎖」という異名で知られている。集団におけるＬＤの程度は、時間（ｔ）及びマーカー間の組み換え距離（ｒ又は組み換え割合）の両方によって減少すると予想される。理論的には、ＬＤは式：Ｄｔ＝（１−ｒ）ｔＤ０（式中、Ｄ０は幾つかの始点での不均衡の程度であり、Ｄｔはｔ世代後の不均衡の程度である）に従って、時間及び距離とともに減衰する。
【００８９】
広範な統計法がＬＤの量を測定するために提案されているが、これらは状況に応じて異なる強度を有する。尺度ＤはＬＤの直感的概念であるが、その数値はＬＤの強度を測定し、そのレベルを比較するのにほとんど有用でない。これは対立遺伝子頻度に対するＤの依存性のためである。最も一般的な２つの尺度は、Ｄ’及びｒ２の絶対値である。
【００９０】
Ｄ’の絶対値は、２つの遺伝子座での対立遺伝子頻度を前提として、Ｄをその最大可能値で除算することによって求められる。Ｄ’＝１の場合は完全なＬＤとして知られる。Ｄ’＜１という値は完全な祖先のＬＤが崩壊したことを示す。Ｄ’＜１という値の大きさには明らかな解釈はない。Ｄ’の推定値は少数のサンプルにおいて強く誇張される。したがって、１に近い統計的に有意なＤ’の値は、最小の歴史的組み換えの有用な指標を与えるが、中間値を研究間のＬＤの強度の比較又はＬＤの程度の測定に使用すべきでない。
【００９１】
尺度ｒ２は幾つかの点でＤ’を補完するものである。ｒ２は、Ｄ２を２つの遺伝子座での対立遺伝子頻度の積で除算した値に等しい。Hill及びRobersonは、Ｅ［ｒ２］＝１／１＋４Ｎｃ（式中、ｃは２つのマーカー間の組み換え率（モルガン）であり、Ｎは有効な集団サイズである）であることを推論した。この等式は、ＬＤの２つの重要な特性を示している。第一に、予想ＬＤレベルは組み換えの関数である。２つの部位間の組み換えが多いほど、これら２つの部位が互いにより強くシャッフルされ、ＬＤが減少する。第二に、ＬＤはＮの関数であり、ＬＤが集団の特性であることが強調される。
【００９２】
本願においては、ＨａｐＭａｐ  Ｅｕｒｏｐｅａｎデータセット及び／又は本発明者らによって実験的に解析された集団において、強い連鎖不均衡が、上記ＳＮＰとの少なくとも０．６のｒ２及び／又は０．５のＤ’という相関を示す。
【００９３】
本発明によると、上記ｒｓ８０９９９１７対立遺伝子Ｇ又はｒｓ５７６８３２対立遺伝子Ｃが（１つ又は２つの事例において）存在する場合、これは慢性Ｃ型肝炎を患う被験体のＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性が増大していることの指標となる。１つの対立遺伝子の代わりにｒｓ８０９９９１７対立遺伝子Ｇ又はｒｓ５７６８３２対立遺伝子Ｃが２つの事例で存在することは、（それぞれ）Ｇ対立遺伝子又はＣ対立遺伝子を有しない場合と比較して、Ｃ型肝炎治療非応答性のリスクを更に増加させる。
【００９４】
同様に、上記ｒｓ８０９９９１７対立遺伝子Ｇ又はｒｓ５７６８３２対立遺伝子Ｃが（１つ又は２つの事例において）存在する場合、これはＣ型肝炎に感染した被験体の非自発的Ｃ型肝炎除去（又は慢性Ｃ型肝炎への進展）に対する感受性が増大していることの指標となる。１つの対立遺伝子の代わりにｒｓ８０９９９１７対立遺伝子Ｇ又はｒｓ５７６８３２対立遺伝子Ｃが２つの事例で存在することは、（それぞれ）Ｇ対立遺伝子又はＣ対立遺伝子を有しない場合と比較して、非自発的除去のリスクを更に増加させる。
【００９５】
一方、ｒｓ１２９８０２７５のリスク対立遺伝子Ｇを保有する患者は、他の患者よりも不応答者となる可能性が高い（ＯＲ＝１．９９、９５％ＣＩ＝１．５７〜２．５４、Ｐ＝１．７４Ｅ−８）。この関連性は、関連共変量（年齢、性別、ＨＣＶ遺伝子型、線維症重症度（severity status）及びＨＣＶウイルス負荷、調整したＰ＝４．６１Ｅ−０９）について調整した後も依然として有意であった。同様に、Ａ／Ｇ遺伝子型及びＧ／Ｇ遺伝子型を保有する患者は、Ａ／Ａ保有者よりも不応答者となる可能性が高かった（ＯＲ＝２．６５［９５％ＣＩ＝２．１８〜３．１８］、Ｐ＝２．６７Ｅ−７、Ａ／Ｇについて調整したＰ＝９．９０Ｅ−８、ＯＲ＝３．６８、［９５％ＣＩ＝２．７７〜４．８８］、Ｐ＝４．０５Ｅ−６、Ｇ／Ｇについて調整したＰ＝１．１３Ｅ−５、参照としてＡ／Ａを用いる）。
【００９６】
ＳＮＰの存在とＣ型肝炎治療非応答又は非自発的除去に対する感受性との間の関連性が、ＨＣＶに単一感染した個体及びＨＣＶ／ＨＩＶに同時感染した個体の両方において観察されることも見出された。
【００９７】
【表１】
2013500713.tif 000003
【００９８】
表１において角括弧内に記載のＳＮＰは、特別な順序なしに野生型対リスク（マイナー）対立遺伝子に関するものであり、したがってこの点において指示的又は限定的なものではない。
【００９９】
概して、Ｃ型肝炎治療はインターフェロンによる治療である。より好ましくは、インターフェロンによる治療はＩＦＮα、ＩＦＮλ又は任意のペグインターフェロンを含む群から選択される。通常、上記インターフェロンによる治療はリバビリンと併用される。代替的な組み合わせには、タンパク分解酵素阻害剤又は他の抗ウイルス剤が含まれ得る。
【０１００】
本発明にはさらに、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を評価する方法であって、
ｉ）上記被験体において、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性を有する被験体を、上記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの多型マーカーの有無であって、該少なくとも１つの多型マーカーの存在が、上記被験体のＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性が増大していることの指標となる、少なくとも１つの多型マーカーの有無を判定することによって区別することと、
ｉｉ）Ｃ型肝炎治療計画を確立すること
とを含む、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性を評価する方法が包含される。
【０１０１】
慢性Ｃ型肝炎を患う被験体における多型の判定によって、医師が該被験体に対する最良のＣ型肝炎治療計画（Ｃ型肝炎治療及び／又は他の抗ウイルス剤の性質、用量及び期間）を確立することが可能となる。例えば、上記の方法によって、少なくとも１つのＳＮＰが上記被験体から得られた核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座において存在することが明らかとなり、上記被験体のＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性が増大していることが示され、この被験体を最新の治療戦略（例えば、より高用量の現在利用可能な薬物、現在利用可能な薬物でのより長い治療期間及び／又は最新の薬物を用いた治療）に対する有力な候補であるとみなすことができる。
【０１０２】
さらに、本発明者らは、本発明のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座内に少なくとも１つのＳＮＰを、特にホモ接合性で保有するＨＣＶ遺伝子型１又は４に感染した被験体が、表４及び表５の両方に示されるように、治療によって誘導される除去（すなわち「治療に対する応答」又は「治療の成功」）の可能性が非常に低いことを示した。表４は感染集団における各々の遺伝子型（ＴＴ、ＧＴ及びＧＧ）の分布に関してより具体的なデータを与えるものであり、表５はリスク対立遺伝子の有無を検討するものである。単に、表４及び表５が様々な群におけるわずかに異なる数の患者に基づくものであることに留意されたい。例えば、表５は、遺伝子型１又は４に感染した患者のうち、治療の失敗が非保有者ではわずか３８％であるのに対し、感染したリスク対立遺伝子保有者の７２％で起こったことを示す（ＯＲ＝６．５４［９５％ＣＩ＝４．６５〜９．２０］、Ｐ＝３．７０Ｅ−８）。別の観点からは、治療の失敗が、両方のリスクパラメータが高い患者（すなわち、ウイルス遺伝子型１又は４に感染した患者、及びｒｓ８０９９９１７Ｇ対立遺伝子がＩＬ２８Ｂ遺伝子座内に存在する患者）では７２％であるのに対し、両方のリスクパラメータが低い患者（すなわち、ウイルス遺伝子型２又は３に感染した患者、及びｒｓ８０９９９１７Ｇ対立遺伝子がＩＬ２８Ｂ遺伝子座にない患者）のわずか１６％で起こったことに留意されたい（ＯＲ＝１８．８９［９５％ＣＩ＝１２．８７〜２７．７１］、Ｐ＝１．８４Ｅ−１４）。
【０１０３】
これらの結果から、ＨＣＶ遺伝子型２又は３に感染した被験体における、ＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座での遺伝的多様性と療法（例えばインターフェロンによる治療）に対する応答との関連性も示される（ＯＲ＝３．３２［９５％ＣＩ＝２．２１〜４．９９］、Ｐ＝３．２７Ｅ−３）。しかし、この関連性の強さはＨＣＶ遺伝子型１又は４に感染した被験体の場合よりも低い。これらの結果から、ウイルス遺伝子型及び宿主の多型の両方を知ることが治療に対する応答を予測するのに重要であることが実証される。
【０１０４】
したがって、本発明の別の態様は、ＨＣＶに感染した被験体のＣ型肝炎治療非応答性に対する感受性又は非自発的除去に対する感受性をより精密に評価するために、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体においてウイルス遺伝子型の判定と本明細書中に記載される多型の判定とを組み合わせることを含む。
【０１０５】
これらの組み合わせた判定は同時に行っても、又は行わなくてもよい。同時ではない場合、ウイルス遺伝子型を初めに評価して、所定の（determined）時間の後、本明細書中に記載される多型の判定を行う。本明細書中に記載される多型の判定を初めに行い、所定の時間の後、ウイルス遺伝子型を評価することも想定される。
【０１０６】
通常、ウイルス遺伝子型の判定と多型の判定との間（その逆も可能）の経過時間又は期間である所定の時間は、数秒間から数年間の間に含まれ得る。
【０１０７】
本発明にはさらに、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体において、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性を本発明に従って判定するためのキットであって、
ｉ）上記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の有無を選択的に検出するための試薬と、
ｉｉ）使用説明書
とを含む、慢性Ｃ型肝炎を患う被験体において、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性を本発明に従って判定するためのキットも包含される。
【０１０８】
本発明にはさらに、Ｃ型肝炎に感染した被験体において、本発明に従って非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性を判定するためのキットであって、
ｉ）上記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の有無を選択的に検出するための試薬と、
ｉｉ）使用説明書
とを含む、Ｃ型肝炎に感染した被験体において、本発明に従って非自発的Ｃ型肝炎除去に対する感受性を判定するためのキットが包含される。
【０１０９】
代替的には、キットに使用される試薬は、本明細書の他の部分に記載されるように、単離核酸、好ましくはプライマー、プライマーセット又はプライマーアレイを含む。プライマーを固体基質に固定してもよい。キットは対照の標的核酸及びプライマーを更に含み得る。当業者であれば、過度の実験を行うことなく、通常の要件に従ってプライマーを選択することが可能である。キットの単離核酸は分子標識又はタグも含み得る。
【０１１０】
通常、プライマー、プライマーセット又はプライマーアレイは、ＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座において少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の有無を検出することを対象とする。
【０１１１】
ＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座における少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の有無は、例えば表６中に開示されるプライマー（配列番号３５〜配列番号５８）から選択されるＰＣＲプライマー又はシークエンシングプライマーのセットを用いて判定することができるが、これに限らない。
【０１１２】
被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプルのＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の有無を検出することを対象とするプライマー、プライマーセット又はプライマーアレイに加えて、キットの試薬は例えば、被験体から得られた生体サンプルから単離したウイルス遺伝子型を別個に検出することを対象とする他のプライマー、プライマーセット又はプライマーアレイを含み得る。使用されるこれらのプライマーセット又はプライマーアレイは、一般に当該技術分野で既知であるか、又は通常の要件を知ることで容易に生成することができる。
【０１１３】
更なる実施形態では、本発明のキットは、本発明の方法を実施するのに必要とされる、、当該技術分野で既知のバッファー等の様々な試薬を含む。
【０１１４】
これらの試薬又はバッファーは例えば、被験体から得られた生体サンプルから核酸を抽出及び／又は精製するのに有用であり得る。
【０１１５】
キットは、本発明の方法を実施するのに必要とされる微小遠心管等の必要とされる全ての材料も含み得る。
【０１１６】
本発明はさらに、慢性Ｃ型肝炎の患者を治療する方法であって、
ｉ）ｒｓ１１８７９００５、ｒｓ１２９７５７９９、ｒｓ１１０８３５１９、ｒｓ９５５１５５、ｒｓ１２９７２９９１、ｒｓ１２９８０２７５、ｒｓ８１０５７９０、ｒｓ１１８８１２２２、ｒｓ１０８５３７２７、ｒｓ８１０９８８６、ｒｓ８１１３００７、ｒｓ８０９９９１７、ｒｓ７２４８６６８、ｒｓ１６９７３２８５、ｒｓ１０８５３７２８、ｒｓ４８０３２２３、ｒｓ１２９８０６０２、ｒｓ４８０３２２４、ｒｓ６６４８９３、ｒｓ５７６８３２、ｒｓ１１６７１０８７、ｒｓ２５１９１０、ｒｓ７３５９９５３、ｒｓ７３５９９５０、ｒｓ２０９９３３１、ｒｓ１１６６５８１８、ｒｓ５７０８８０、ｒｓ５０３３５５、ｒｓ３０４６１、ｒｓ１９４０１４、ｒｓ２５１９０３、ｒｓ１２９７９１７５、ｒｓ３９５８７、ｒｓ３０４８０を含む群から選択される、上記患者の多型マーカーの少なくとも１つが、該患者から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプルにおいて、ＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座内に存在するか否かを判定することと、
ｉｉ）上記患者の多型マーカーの少なくとも１つが、Ｃ型肝炎治療非応答性に対する感受性の増大と関連するか否かに基づいて上記患者を治療すること
とを含む、慢性Ｃ型肝炎の患者を治療する方法を企図する。
【０１１７】
概して、Ｃ型肝炎治療はインターフェロンによる治療である。より好ましくは、インターフェロンによる治療はＩＦＮα、ＩＦＮλ又は任意のペグインターフェロンを含む群から選択される。通常、上記インターフェロンによる治療はリバビリンと併用される。代替的な組み合わせには、タンパク分解酵素阻害剤又は他の抗ウイルス剤が含まれ得る。
【０１１８】
本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス１若しくは２（ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はインフルエンザウイルスの治療への非応答性、又は自発的除去に対する感受性を、この（this or these）ウイルスの１つ又は複数に感染した被験体において判定する方法であって、上記被験体から得られた生体サンプルから単離した核酸サンプル中のＩＬ２８Ｂ／Ａ遺伝子座及び／又はＩＬ−２９遺伝子座における少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の有無を判定することを含む、方法も考慮する。
【０１１９】
本明細書中に記載される本発明に、具体的に記載した以外の変更及び修正の余地があることが当業者には理解される。本発明が、その精神と基本的な特徴から逸脱することなく、全てのかかる変更及び修正を包含することを理解されたい。本発明は、本明細書中で個々に又はまとめて言及された又は示された全ての工程、特徴、組成物及び化合物、並びに任意及び全ての組み合わせ、又は任意の２つ以上の上記工程又は特徴も含む。したがって、本開示は、示される全ての態様において非限定的であるとみなされ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に示されるが、本発明の意義及び均等範囲内に含まれる全ての変更がここに包含されることが意図される。
【０１２０】
様々な参照文献が本明細書全体にわたって引用されるが、それらは各々、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【０１２１】
以上の説明は、以下の実施例を参照してより完全に理解される。しかしながら、かかる実施例は本発明を実施する方法の一例であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１２２】
実施例１
患者及び方法
患者はスイスＣ型肝炎コホート研究（ＳＣＣＳ）及びスイスＨＩＶコホート研究（ＳＨＣＳ）の枠組みの中で参加し、８つのスイスの大病院及びそれらの地方の提携センターで２回の多施設研究を行った［２３］。遺伝子検査を含む書面によるインフォームドコンセントが参加に必須であり、研究は全ての地方倫理委員会によって承認された。人種的に多様な集団においてＣ型肝炎転帰の遺伝的予測因子は異なるため［１０、１３、２４、２５］、本発明者らは解析を白人に限定した。この研究では遺伝子型１、２、３及び４のみが表されることに注目すべきである。
【０１２３】
自発的Ｃ型肝炎除去
慢性ＨＣＶ感染は、ＨＣＶ血清反応陽性であり（ＥＬＩＳＡを用いて、免疫ブロット法によって確認される）、定量的アッセイによってＨＣＶ  ＲＮＡが検出可能であるとして定義されている。自発的Ｃ型肝炎除去は、ＨＣＶ血清反応陽性であり、抗ＨＣＶ療法の開始前にＨＣＶ  ＲＮＡが検出不可能であるとして定義されている。感染１年目のＨＣＶ  ＲＮＡレベルの変動（［２６］に掲載）を回避するために、本発明者らは、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルを初めに報告された陽性ＨＣＶ血清学的結果（serology）の少なくとも１年後に判定した。
【０１２４】
ジェノタイピング
ジェノタイピングは、スイスジュネーブの連邦科学研究能力センター（National Centre of Competence in Research）、「Frontiers in Genetics」でIlluminaのゲノムプラットフォームを用いて、IlluminaのＨｕｍａｎ１Ｍ−Ｄｕｏ  ＢｅａｄＣｈｉｐ、ＨｕｍａｎＨａｐ５５０又はＨｕｍａｎ６００Ｗ−Ｑｕａｄを使用することによって行った。遺伝子型コール（calling）はＢｅａｄｓｔｕｄｉｏソフトウェアのデフォルト設定を用いて行った。０．２未満のジェノタイピングスコアを有するコールは更なる解析から除外した。コールレート（call rate）が９０％未満のＳＮＰ及びコールレートが９５％未満の個体は除去した。コールレート＞９０％、マイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）＞１％、ハーディ・ワインベルグｐ値＞１０−７の測定されたＳＮＰに基づくＭＡＣＨを用いて推定を行った。得られた推定データにおいて、推定精度の低い（ｒ２−ｈａｔ＜０．３）ＳＮＰは無視した。集団の層別化及び関連性は［２８］に記載されるような祖先主成分（ancestry principal component）を用いて評価した。各々の遺伝的に関係がある／同一の個体の対（関連性＞０．２５）の一方を更なる解析から除外した。各々のジェノタイピングした個体の性別を臨床データに従って評価した。関連性解析はロジスティック回帰を用いて厳密な最尤法によって行った。最初の２つの祖先主成分値及びＢ型肝炎ウイルス感染状況（ＨＢｓ−Ａｇの有無として規定される）等の共変量をモデルに加えた。ファミリーワイズエラー率（family-wise error rate）を調整するためにボンフェローニ補正を使用した。一般に使用される５×１０−８という閾値を得るには１００万回の独立試験が想定された［Han et al 2009 Plos Genetics］。
【０１２５】
ＨＩＶ同時感染の影響
自発的ＨＣＶ除去に対するＨＩＶ同時感染の潜在的影響を考慮に入れるために、ＨＣＶに単一感染した個体及び同時感染した個体を初めに別個に解析し、続いて本発明者らはこの２つのコホートのゲノムワイドメタ解析を行った。各々のコホートから得られた関連性シグナルを逆分散重み付けによってメタ解析した。関連性解析はロジスティック回帰モデルを用いて厳密な最尤法によって行った。単変量解析において結果に影響を与える共変量（Ｐ＜０．１）を、最初の２つの祖先主成分とともにモデルに加えた。本発明者らは、潜在的に重要な因子を無視することのないよう、組み入れ基準として緩やかなｐ値カットオフを共分散に用いた。異なるジェノタイピングプラットフォームが使用されているという事実を考慮して（To account for）、本発明者らは、（慢性感染患者のうち）対立遺伝子頻度が任意の２つのプラットフォーム間で有意に異なる（カイ二乗検定、Ｐ＜１０−４）任意のＳＮＰを除外した。ゲノム対照をゲノムワイドｐ値に適用すると、（単一感染したコホートについては）λ＝１．０４、（同時感染したコホートについては）λ＝１．０２が得られた。
【０１２６】
これらの値によって非常に軽度の拡大が示唆され、モデルに最初の２つの祖先主成分を加えることで潜在的な集団層別化が十分に補正されることが確認された。ボンフェローニ補正を用いて複数の試験を調整し、５×１０−８を有意性閾値として使用した。
【０１２７】
実施例２
結果
１１４２人のＨＣＶ感染患者（単一感染した７２６人及びＨＩＶに同時感染した４１６人）が研究に参加したが、そのうち２４５人が自発的ウイルス除去を有し、８９７人が慢性感染を有していた（表３）。慢性感染患者のうち、４０４人をペグインターフェロンα・リバビリン併用療法に対する応答について評価可能であった。予想された通り、自発的除去と関連する因子には、より低い年齢（Ｐ＜０．００１）、女性（Ｐ＜０．００１）及び活動性Ｂ型肝炎（Ｐ＜０．００１）が含まれていた。治療に対する応答と関連する因子には、より低い年齢（Ｐ＝０．０５）、女性（０．０３）、ウイルス遺伝子型２又は３（Ｐ＜０．００１）、より低いウイルス負荷（Ｐ＜０．００１）及び限局性線維症（Ｐ＝０．０２）が含まれていた。
【０１２８】
ＳＮＰ  ｒｓ８０９９９１７は、明らかに自発的Ｃ型肝炎除去と関連する（図１）。遺伝子型Ｔ／Ｔ（祖先の対立遺伝子）、Ｇ／Ｔ（ヘテロ接合性）及びＧ／Ｇ（ホモ接合性）の頻度は、自発的除去を有する患者においてそれぞれ０．７９、０．２０及び０．０１であるのに対し、慢性感染を有する患者においてそれぞれ０．５７、０．３８及び０．０５であった（加法モードでＯＲ＝０．３８、９５％信頼区間［ＣＩ］＝０．２７〜０．５３、Ｐ＝２．８６Ｅ−０８、表４、図２Ａ）。ｒｓ８０９９９１７と自発的除去との関連性が、年齢、性別、活動性Ｂ型肝炎及びＨＣＶリスク群を考慮する多変量解析において依然として存在する（加法モードでＯＲ＝０．３８、９５％ＣＩ＝０．２８〜０．５３、Ｐ＝６．８１Ｅ−０９、表４）。
【０１２９】
ｒｓ８０９９９１７のＧ対立遺伝子も、ペグインターフェロンα・リバビリン併用療法に対する非応答性と関連していた（図２Ｂ）。遺伝子型Ｔ／Ｔ、Ｇ／Ｔ及びＧ／Ｇの頻度は、持続性ウイルス応答を有する患者においてそれぞれ０．６８、０．２９及び０．０３であったのに対し、不応答者においてはそれぞれ０．４３、０．５０及び０．０７であった（基本モードでＯＲ＝０．３６、９５％ＣＩ＝０．２３〜０．５３、Ｐ＝８．９６Ｅ−０７、加法モードでＯＲ＝０．３８、９５％ＣＩ＝０．２７〜０．５３、Ｐ＝２．８６Ｅ−０６、表４、図２Ｂ）。ｒｓ８０９９９１７と治療非応答性との関連性が、年齢、性別、ＨＣＶ  ＲＮＡ、ＨＣＶ遺伝子型、線維症段階及び糖尿病を考慮する多変量モデルにおいて依然として存在していた（加法モードでＯＲ＝０．２９、９５％ＣＩ＝０．１６〜０．５３、Ｐ＝６．９６Ｅ−０５）。全体としては、自発的除去を有する患者（０．０７）、持続性ウイルス応答を有する患者（０．１７）及び治療非応答性の患者（０．３２）にわたって、ｒｓ８０９９９１７のマイナー対立遺伝子頻度の漸進的増加が存在した。
【０１３０】
ｒｓ８０９９９１７  ＳＮＰは、（被験体がヒトの場合）３つのサイトカイン遺伝子、すなわちＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２８Ａ及びＩＬ２９をコードするヒト第１９染色体長腕の約８０ｋＢの領域内に位置していた（図３Ａ）。ハプロタイプブロックのマッピングによって、ｒｓ８０９９９１７がＩＬ−２８Ｂ遺伝子全体を含むハプロタイプブロックの一部であることが示された。種々のＳＮＰのＰ値のグラフ表示から、ＩＬ２８Ｂのハプロタイプブロックにおいて自発的除去及び治療応答性の両方について適合した関連性パターンが示された（図３Ｂ）。  
【０１３１】
ＨＣＶに単一感染した個体（ＯＲ＝２．４９、９５％ＣＩ＝１．６４〜３．７９、Ｐ＝１．９６×１０−５）及びＨＣＶ／ＨＩＶに同時感染した個体（ＯＲ＝２．１６、９５％ＣＩ＝１．４７〜３．１８、Ｐ＝８．２４×１０−５）において関連性が観察された。自発的除去の場合については、表４は単一感染した患者及び同時感染した患者の群内の様々な遺伝子型の分布及び関連した除去頻度を示す。
【０１３２】
実施例３
病原体の遺伝的リスク決定因子
本発明者らは、宿主及び病原体の遺伝的リスク決定因子の共同寄与（joint contribution）について更に評価した。ウイルス遺伝子型（ウイルス遺伝子型２又は３対ウイルス遺伝子型１又は４）及び宿主の多型（宿主のｒｓ８０９９９１７Ｇリスク対立遺伝子の保有者対非保有者、表５）に従って患者を４つの群に層別化した。治療の失敗は、両方のリスクパラメータが高い患者では７２％であるのに対し、両方のリスクパラメータが低い患者のわずか１６％で起こった（ＯＲ＝１８．８９［９５％ＣＩ＝１２．８７〜２７．７１］、Ｐ＝１．８４Ｅ−１４、表５）。遺伝子型１又は４に感染した患者のうち、治療の失敗が非保有者ではわずか３８％であるのに対し、感染したリスク対立遺伝子保有者の７２％で起こった（ＯＲ＝６．５４［９５％ＣＩ＝４．６５〜９．２０］、Ｐ＝３．７０Ｅ−８）。遺伝子型２又は３に感染した患者のうち、治療の失敗が非保有者では１６％であるのに対し、リスク対立遺伝子保有者の２５％で起こった（ＯＲ＝３．３２［９５％ＣＩ＝２．２１〜４．９９］、Ｐ＝３．２７Ｅ−３）。また、表４は、ウイルス遺伝子型１＆４又は２＆３に感染した患者それぞれの群における様々な遺伝子型（ＴＴ、ＴＧ、ＧＧ）の分布、及び対応する治療に対する応答又は非応答の頻度を示す。
【０１３３】
表２の注釈
表２に与えられるＳＮＰの野生型／リスク対立遺伝子が、表１において言及される対応する配列と比べて同じ鎖又は反対の鎖で読み取られ得ることに留意されたい。
【０１３４】
表３の注釈
１  ＳＣＣＳはスイスＣ型肝炎コホート研究を意味し、ＳＨＣＳはスイスＨＩＶコホート研究を意味する。３８人のＨＩＶに感染したＳＣＣＳ患者をＳＨＣＳ患者とともに解析した。
２  ＨＢｓ抗原が３５２人の単一感染した患者及び５６人の同時感染した患者において欠けていた
３  （除去エンドポイントについては）設定点及び（治療エンドポイントについては）治療前のＨＣＶ  ＲＮＡ
４  大量飲酒者とは、５年超にわたる１日４０ｇを超えるアルコールの摂取と定義した。
５  治療前の生検データが１２８人の患者において欠測であった。重篤な線維症及び炎症はＭＥＴＡＶＩＲスコア＞２であることによって定義した。
【０１３５】
表４の注釈
１  最も可能性の高いモデル
２  年齢、性別、ＨＢｓ  ＡＧ及びリスクタイプについて調整した
３  年齢、性別、ＨＣＶ  ＲＮＡ、ＨＣＶ遺伝子型、線維症段階及び糖尿病について調整した
４  年齢、性別、ＨＣＶ  ＲＮＡ、線維症段階及び糖尿病について調整した
【０１３６】
表５の注釈
１  線維症段階、性別、年齢、ベースラインＨＣＶウイルス負荷及び最初の２つの祖先主成分について調整した。
２  遺伝子型１又は４の患者を解析すると、治療の失敗が非保有者ではわずか３８％であるのに対し、リスク対立遺伝子保有者の７２％で起こった（ＯＲ＝６．５４［９５％ＣＩ＝４．６５〜９．２０］、Ｐ＝３．７０Ｅ−８）。
【０１３７】
【表２】
2013500713.tif 000004
【０１３８】
【表３】
2013500713.tif 000005
【０１３９】
【表４】
2013500713.tif 000006
【０１４０】
【表５】
2013500713.tif 000007
【０１４１】
【表６】
2013500713.tif 000008
【０１４２】
参考文献等：
(1) Seeff LB, Hollinger FB, Alter HJ, Wright EC, Cain CM, Buskell ZJ, et al. Long-term mortality and morbidity of transfusion-associated non-A, non-B, and type C hepatitis: A National Heart, Lung, and Blood Institute collaborative study. Hepatology 2001 Feb;33(2):455-463.
(2) Davila JA, Morgan RO, Shaib Y, McGlynn KA, El Serag HB. Hepatitis C infection and the increasing incidence of hepatocellular carcinoma: a population-based study. Gastroenterology 2004 Nov;127(5):1372-1380.
(3) Thomas DL, Astemborski J, Rai RM, Anania FA, Schaeffer M, Galai N, et al. The natural history of hepatitis C virus infection: host, viral, and environmental factors. JAMA 2000 Jul 26;284(4):450-456.
(4) Williams R. Global challenges in liver disease. Hepatology 2006 Sep;44(3):521-526.
(5) Thomas DL, Astemborski J, Rai RM, Anania FA, Schaeffer M, Galai N, et al. The natural history of hepatitis C virus infection: host, viral, and environmental factors. JAMA 2000 Jul 26;284(4):450-456.
(6) Lauer GM, Walker BD. Hepatitis C virus infection. N Engl J Med 2001 Jul 5;345(1):41-52.
(7) Manns MP, McHutchison JG, Gordon SC, Rustgi VK, Shiffman M, Reindollar R, et al. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomised trial. Lancet 2001 Sep 22;358(9286):958-965.
(8) Chung RT, Andersen J, Volberding P, Robbins GK, Liu T, Sherman KE, et al. Peginterferon Alfa-2a plus ribavirin versus interferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C in HIV-coinfected persons. N Engl J Med 2004 Jul 29;351(5):451-459.
(9) Fried MW, Shiffman ML, Reddy KR, Smith C, Marinos G, Goncales FL, Jr., et al. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection. N Engl J Med 2002 Sep 26;347(13):975-982.
(10) Asselah T, Bieche I, Paradis V, Bedossa P, Vidaud M, Marcellin P. Genetics, genomics, and proteomics: implications for the diagnosis and the treatment of chronic hepatitis C. Semin Liver Dis 2007 Feb;27(1):13-27.
(11) Massard J, Ratziu V, Thabut D, Moussalli J, Lebray P, Benhamou Y, et al. Natural history and predictors of disease severity in chronic hepatitis C. J Hepatol 2006;44(1 Suppl):S19-S24.
(12) Thio CL. Host genetic factors and antiviral immune responses to hepatitis C virus. Clin Liver Dis 2008 Aug;12(3):713-26, xi.
(13) Yee LJ. Host genetic determinants in hepatitis C virus infection. Genes Immun 2004 Jun;5(4):237-245.
(14) Kenny-Walsh E. Clinical outcomes after hepatitis C infection from contaminated anti-D immune globulin. Irish Hepatology Research Group. N Engl J Med 1999 Apr 22;340(16):1228-1233.
(15) Muller R. The natural history of hepatitis C: clinical experiences. J Hepatol 1996;24(2 Suppl):52-54.
(16) Kau A, Vermehren J, Sarrazin C. Treatment predictors of a sustained virologic response in hepatitis B and C. J Hepatol 2008 Oct;49(4):634-651.
(17) Grakoui A, Shoukry NH, Woollard DJ, Han JH, Hanson HL, Ghrayeb J, et al. HCV persistence and immune evasion in the absence of memory T cell help. Science 2003 Oct 24;302(5645):659-662.
(18) Knapp S, Yee LJ, Frodsham AJ, Hennig BJ, Hellier S, Zhang L, et al. Polymorphisms in interferon-induced genes and the outcome of hepatitis C virus infection: roles of MxA, OAS-1 and PKR. Genes Immun 2003 Sep;4(6):411-419.
(19) Knapp S, Hennig BJ, Frodsham AJ, Zhang L, Hellier S, Wright M, et al. Interleukin-10 promoter polymorphisms and the outcome of hepatitis C virus infection. Immunogenetics 2003 Sep;55(6):362-369.
(20) Wietzke-Braun P, Maouzi AB, Manhardt LB, Bickeboller H, Ramadori G, Mihm S. Interferon regulatory factor-1 promoter polymorphism and the outcome of hepatitis C virus infection. Eur J Gastroenterol Hepatol 2006 Sep;18(9):991-997.
(21) Yee LJ, Perez KA, Tang J, van Leeuwen DJ, Kaslow RA. Association of CTLA4 polymorphisms with sustained response to interferon and ribavirin therapy for chronic hepatitis C virus infection. J Infect Dis 2003 Apr 15;187(8):1264-1271.
(22) Goulding C, McManus R, Murphy A, MacDonald G, Barrett S, Crowe J, et al. The CCR5-delta32 mutation: impact on disease outcome in individuals with hepatitis C infection from a single source. Gut 2005 Aug;54(8):1157-1161.
(23) Prasad L, Spicher VM, Zwahlen M, Rickenbach M, Helbling B, Negro F. Cohort Profile: the Swiss Hepatitis C Cohort Study (SCCS). Int J Epidemiol 2007 Aug;36(4):731-737.
(24) Neumann-Haefelin C, Thimme R. Impact of the genetic restriction of virus-specific T-cell responses in hepatitis C virus infection. Genes Immun 2007 Apr;8(3):181-192.
(25) Singh R, Kaul R, Kaul A, Khan K. A comparative review of HLA associations with hepatitis B and C viral infections across global populations. World J Gastroenterol 2007 Mar 28;13(12):1770-1787.
(26) Hoofnagle JH. Course and outcome of hepatitis C. Hepatology 2002 Nov;36(5 Suppl 1):S21-S29.
(27) Thomas DL. Hepatitis C and human immunodeficiency virus infection. Hepatology 2002 Nov;36(5 Suppl 1):S201-S209.
(28) Novembre J, Johnson T, Bryc K, Kutalik Z, Boyko AR, Auton A, et al. Genes mirror geography within Europe. Nature 2008 Aug 31.
(2 9) Micallef JM, Kaldor JM, Dore GJ. Spontaneous viral clearance following acute hepatitis C infection: a systematic review of longitudinal studies. J Viral Hepat 2006 Jan;13(1):34-41.
(30) Martin-Carbonero L, Barreiro P, Jimenez-Galan G, Garcia-Berriguete R, Nunez M, Rios P, et al. Clearance of hepatitis C virus in HIV-infected patients with multiple chronic viral hepatitis. J Viral Hepat 2007 Jun;14(6):392-395.
(31) Wietzke-Braun P, Manhardt LB, Rosenberger A, Uy A, Ramadori G, Mihm S. Spontaneous elimination of hepatitis C virus infection: A retrospective study on demographic, clinical, and serological correlates. World J Gastroenterol 2007 Aug 21;13(31):4224-4229.
(32) Gale M, Jr., Foy EM. Evasion of intracellular host defence by hepatitis C virus. Nature 2005 Aug 18;436(7053):939-945.
(33) Sheppard P, Kindsvogel W, Xu W, Henderson K, Schlutsmeyer S, Whitmore TE, et al. IL-28, IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R. Nat Immunol 2003 Jan;4(1):63-68.
(34) Renauld JC. Class II cytokine receptors and their ligands: key antiviral and inflammatory modulators. Nat Rev Immunol 2003 Aug;3(8):667-676.
(35) Li M, Liu X, Zhou Y, Su SB. Interferon-lambdas: the modulators of antivirus, antitumor, and immune responses. J Leukoc Biol 2009 Jul;86(1):23-32.
(36) Kotenko SV, Gallagher G, Baurin VV, Lewis-Antes A, Shen M, Shah NK, et al. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nat Immunol 2003 Jan;4(1):69-77.
(37) Filippini P, Coppola N, Scolastico C, Rossi G, Onofrio M, Sagnelli E, et al. Does HIV infection favor the sexual transmission of hepatitis C? Sex Transm Dis 2001 Dec;28(12):725-729.
(38)Uz・G, Monneron D. IL-28 and IL-29: newcomers to the interferon family. Biochimie 2007 Jun-Jul;89(6-7):729-34.
(39)Innis MA et al.,1990. "Academic Press". PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications.
(40)Bustin SA 2000). "Journal of Molecular Endocrinology, 25". Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. pp. 169-193
(41)Kwoh et al. ,1990, Am. Biotechnol. Lab. 8:14-25.
(42)Hagen-Mann, et al., 1995 Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 103 : 150- 155.
(43)Walker et al., 1992 PNAS, 89:392-396.
(44)Walker et al., 1992 Nucleic Acids Res. 20: 1691-1696.
(45)Kwoh et al., 1989, PNAS 86:1173-1177.
(46)Guatelli et al., 1990, PNAS 87:1874-1878.
(47)Mueller et al., 1997, Histochem. Cell Biol. 108:431-437.
(48)Lizardi et al., 1988, BioTechnology 6:1 197-1202.
(49)Cahill et al., 1991, Clin. Chem. 37:1482-1485.
(50)Lewis, 1992, Gen. Eng. News 12 (9):1.
【図１】
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【図２】
2013500713.tif 000010
【図３】
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【国際調査報告】
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