(57)【要約】【課題】癌ワクチンに係り、具体的には、腫瘍組織に由来するナノベシクルを含む癌治療用薬学的組成物、及び前記腫瘍組織由来ナノベシクルを用いて癌を治療する方法などを提供すること。          【解決手段】本発明に係る腫瘍組織由来ナノベシクル抗原は、細胞外ベシクルと類似した属性を有し、高い収率を示し、且つ多様な変形が可能であるから 、癌治療ワクチンの開発に非常に有用であると期待される。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍組織由来ナノベシクルを含む、癌治療用薬学的組成物。  
【請求項２】
前記腫瘍組織が、熱ショックタンパク質を発現するように形質転換された組織である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が免疫アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の組成物。 
【請求項４】
前記免疫アジュバントがｐｏｌｙＩ：Ｃである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ナノベシクルの膜が前記腫瘍組織の膜以外の成分をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記膜以外の成分がシクロデキストリンまたはポリエチレングリコールである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ナノベシクルの膜成分が化学的変形したものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記化学的変形がチオール基またはアミン基を用いた化学的方法による変形である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
腫瘍組織由来ナノベシクルを含む薬学組成物を個体に投与する段階を含む、癌治療方法。
【請求項１０】
前記腫瘍組織が、熱ショックタンパク質を発現するように形質転換された組織である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が免疫アジュバントをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫アジュバントがｐｏｌｙＩ：Ｃである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ナノベシクルの膜が前記腫瘍組織の膜以外の成分をさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記膜以外の成分がシクロデキストリンまたはポリエチレングリコールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ナノベシクルの膜成分が化学的変形したものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記化学的変形がチオール基またはアミン基を用いた化学的方法による変形である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍組織由来ナノベシクルの製造方法であって、下記の段階を含む方法： 
（ａ）腫瘍組織から細胞を分離する段階、
（ｂ）前記腫瘍組織細胞を含む懸濁液を押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、エレクトロポレーション、機械的分解及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いてナノベシクルを製造する段階、
（ｃ）前記懸濁液から製造されたナノベシクルを分離する段階、及び
（ｄ）前記分離されたナノベシクルを含む懸濁液に免疫アジュバントを添加して培養する段階。
【請求項１８】
腫瘍組織由来ナノベシクルの製造方法であって、下記の段階を含む方法：
（ａ）腫瘍組織から細胞を分離する段階、
（ｂ）前記腫瘍組織細胞を含む懸濁液に免疫アジュバントを添加して前記腫瘍組織細胞に免疫アジュバントをロードさせる段階、及び
（ｃ）前記腫瘍組織細胞を含む懸濁液を押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、エレクトロポレーション、機械的分解及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いてナノベシクルを製造する段階。
【請求項１９】
腫瘍組織由来ナノベシクル抗原を含む癌ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌ワクチンに係り、具体的には、腫瘍組織に由来するナノベシクルを含む癌治療用薬学的組成物、及び前記腫瘍組織由来ナノベシクルを用いて癌を治療する方法などに関する。          
【背景技術】
【０００２】
癌は、人体の基本単位である細胞の変形により、細胞の分化又は増殖に異常が発生し或いは細胞が死滅せずに無制限増殖することにより生成され、血液又はリンパ管への浸潤によって癌細胞の移動が可能であり、肺や肝などの臓器に転移する。現在まで知られている癌の種類は、約１００余種であり、代表的には肺癌、大腸癌、胃癌、肝癌などが挙げられる。高齢化時代を迎えて、全世界的に癌の発病率は毎年増えているが、未だ癌の完璧な治療は不可能な実情であって、新しい癌治療方法の開発が至急である。現代医学における癌治療技法は、手術、抗癌剤、放射線治療などの３大療法に焦点を合わせているが、これらの治療は、正常細胞に対する深刻な副作用により２次癌の発生及び転移を誘導するおそれがあり、患者の免疫力低下及び細胞代謝の異常をもたらすという限界がある。よって、既存の癌治療の問題点を克服するために、患者の免疫システムを用いた癌治療剤の開発が脚光を浴びており、特に最も注目されている分野の一つが癌ワクチンの開発である。
【０００３】
癌ワクチンとは、癌への抵抗性を強くするために、患者の免疫メカニズムの活性化によって癌に対する強力な免疫反応を誘発することに基づく。このようなワクチン治療は、副作用が少ないうえ、手術により完全には除去されなかった癌或いは転移した見えない癌も患者の免疫システムが自ら治療することができるという利点がある。大部分の癌が自己細胞の変形により生成されることからみて、成功的な癌ワクチンの開発のためには、患者の免疫システムが癌を攻撃対象として認識するように適切な癌抗原の選択が重要である。癌抗原は、一般に、既存の抗原をペプチド或いはタンパク質として使用し、或いは癌細胞を放射線照射して使用する。このような癌抗原は、免疫反応を増進させるためにアジュバント(adjuvant)と複合的に使用し、或いは樹枝状細胞に搭載して使用することができる。ところが、既存のペプチドまたはタンパク質抗原を使う場合、製造が容易であるものの、患者によって抗原が異なることを見逃して免疫トレランス(tolerance)を起こすおそれがある。癌は、かなり異種の(heterogeneous)性格を持っており、癌特異抗原という定義が不明であり、患者によって発病原因と免疫反応の調節が異なるため、画一的な治療は大きな成功を収めることができない。よって、手術から得た腫瘍組織を患者に使用すると、多様な患者特異的癌抗原を得ることができる。ところが、癌細胞自体を使用する場合には、細胞自体を注入するので、癌発病の危険と自己免疫反応などの副作用をもたらすことなどが発生しうる。よって、腫瘍を用いて、効用性が高くかつ安全性問題がない画期的な癌抗原ワクチンの開発が求められている。
【０００４】
癌治療ワクチンの抗原として、ナノサイズのベシクルを用いることができる。ナノサイズのベシクル抗原は、樹枝状細胞などの抗原提示細胞によってよく認識及び捕食され、リンパ循環が容易であって免疫反応をよく誘導することができる。代表的なナノサイズのベシクルとしては、細胞生長の際に細胞外へ自然に分泌される細胞外ベシクル（エキソソーム(exosome)、微小胞(microvesicle)など）を挙げることができる。細胞外ベシクルは、数十ｎｍ〜数百ｎｍのサイズ及び二重脂質膜の構造を有し、タンパク質と、例えば脂質や遺伝子物質などの生物学的活性を有する物質から構成されているから、多様な生理的／病理的機能を行う。特に、癌細胞に由来する細胞外ベシクルの場合、多様な癌抗原を持っており、体積に対する表面積の割合が高くて癌抗原の局部濃度が高いため、受容体型の抗原に比べて高い免疫誘導活性を持つ。また、無細胞(cell-free)ワクチンという利点のため、臨床応用の許可を受け難い既存の腫瘍細胞ワクチンに比べて副作用が著しく少ないだろうと期待される。
【０００５】
ところが、自然に分泌される細胞外ベシクルを得るためには癌患者から直接癌細胞を分離して細胞株(cell line)を確立しなければならず、分泌量が少なくて大量確保が難しいうえ、分離及び精製が難しくて多くの費用及び時間を必要とするという欠点があるから、実際臨床応用に否定的な要因になるであろう。よって、癌腫瘍由来細胞外ベシクルを代替するナノサイズのベシクル抗原の開発が求められる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、抗癌免疫活性と免疫耐性破壊のためにナノサイズベシクル形態の癌抗原を開発することにある。癌細胞から自然に分泌される細胞外ベシクルの場合、ナノサイズを有し、多様な抗原タンパク質を持っており、癌ワクチンとして有用であるものの、大量の分離及び製造が難しいという欠点がある。よって、本発明は、従来の細胞外ベシクルの利点を有しながら高い収率(yield)を示す、腫瘍組織に由来するナノサイズのナノベシクル(nanovesicle、ＮＶ)を含有する癌治療用薬学的組成物、これを用いて癌を治療する方法、及び前記腫瘍組織由来ナノベシクルを製造する方法などを提供しようとする。
【０００７】
ところが、本発明が解決しようとする技術的課題は掲げた課題に制限されず、掲げていない他の課題は以降の記載から当業者に明らかに理解できるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のある観点は、腫瘍組織由来ナノベシクルを含む薬学的組成物を提供する。前記本発明の一具現例によれば、前記腫瘍組織は患者自己腫瘍に由来する癌組織であってもよい。他の具現例によれば、前記腫瘍組織は、熱ショックタンパク質を発現するように形質転換された組織であってもよいが、これに限定されない。前記本発明の別の具現例によれば、前記組成物はナノベシクルに免疫アジュバントをさらに含んでもよく、前記免疫アジュバントはｐｏｌｙＩ：Ｃ であってもよい。前記本発明の別の具現例によれば、前記ナノベシクルは膜に前記腫瘍組織の膜以外の成分をさらに含んでもよく、前記膜以外の成分はシクロデキストリンまたはポリエチレングリコールであってもよい。前記本発明の別の具現例によれば、前記ナノベシクルは膜成分が化学的変形したものであってもよく、前記化学的変形はチオール基またはアミン基を用いた変形であってもよい。
【０００９】
本発明の他の観点は、腫瘍組織由来ナノベシクルを含む組成物を個体に投与する段階を含む癌治療方法を提供する。前記腫瘍組織、前記組成物及び前記ナノベシクルは前述したとおりである。
【００１０】
本発明の別の観点は、腫瘍組織由来ナノベシクル抗原を含む癌ワクチンを提供する。
【００１１】
本発明の別の観点は、腫瘍組織由来ナノベシクルの製造方法を提供する。前記本発明の一具現例において、前記製造方法は、腫瘍組織から細胞を分離する段階と、前記腫瘍組織細胞を含む懸濁液を押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、エレクトロポレーション、機械的分解及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いてナノベシクルを製造する段階と、前記懸濁液から製造されたナノベシクルを分離する段階と、前記分離されたナノベシクルを含む懸濁液に免疫アジュバントを添加して培養する段階とを含んでもよい。
【００１２】
前記本発明の一具現例において、前記製造方法は、腫瘍組織から細胞を分離する段階と、前記腫瘍組織細胞を含む懸濁液に免疫アジュバントを添加して前記腫瘍組織細胞に免疫アジュバントをロードさせる段階と、前記腫瘍組織細胞を含む懸濁液を押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、エレクトロポレーション、機械的分解及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いてナノベシクルを製造する段階とを含んでもよい。
【００１３】
前記本発明の他の具現例において、前記方法は、前記ナノベシクルが含まれた懸濁液から前記免疫アジュバントを含むナノベシクルを分離する段階をさらに含んでもよい。
【００１４】
前記本発明の別の具現例において、前記分離段階は、密度勾配、超遠心分離、濾過、透析及び自由流動電気泳動法よりなる群から選ばれた方法を用いて行われてもよいが、これに限定されない。
【発明の効果】
【００１５】
従来、自然に分泌される細胞外ベシクルが効果的な抗癌作用を起こすから癌ワクチンの開発に利用できると報告されたことがあるが、患者細胞の体外培養必要性、分離・製造の難しさ、及び低い収率によって臨床応用に限られてきた。本発明に係る腫瘍組織由来ナノベシクルは、細胞外ベシクルとほぼ同様の属性を有しながら高い収率を示すうえ、多様な変形が可能な抗原であって、癌治療ワクチンの開発に非常に有用であると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】超音波分解を用いて分離した黒色腫由来ナノベシクルを透過電子顕微鏡方法によって確認した結果である。
【図２】超音波分解を用いて分離した黒色腫由来ナノベシクルのサイズを動的光散乱粒度分析器で測定した結果である。
【図３】超音波分解を用いて分離したナノベシクル内に癌抗原としてのチロシナーゼ(tyrosinase)が濃縮されており、核タンパク質としてのヒストン(hystone)は少ないことを示すウェスタンブロットの結果である。
【図４】超音波分解を用いて分離した大腸癌由来ナノベシクルを透過電子顕微鏡方法によって確認した結果である。
【図５】押出を用いて分離した黒色腫由来ナノベシクルを透過電子顕微鏡方法によって確認した結果である。
【図６】骨髄由来樹枝状細胞にＤｉＩ蛍光標識ナノベシクルを処理したときに樹枝状細胞がナノベシクルを認識及び捕食することを示すＦＡＣＳの結果である。
【図７】樹枝状細胞に多様な濃度の黒色腫由来ナノベシクルを処理したときにＩＬ−１２ｐ７０サイトカインが濃度依存的に増加することを示すＥＬＩＳＡの結果である。
【図８】黒色腫由来ナノベシクルとアジュバントを癌治療ワクチンとして注入したときにマウスの癌成長阻害効能があることを示す癌組織のサイズに対するグラフである。
【図９】癌転移モデルにおいて黒色腫由来ナノベシクルとアジュバントを癌治療ワクチンとして注入したときにマウスの癌転移が減少したことを示すマウスの摘出肺のイメージである。
【図１０】マウスの肺における黒色腫コロニーの数を計算して表として示す。
【図１１】マウスの摘出肺のＨ＆Ｅ染色結果である。
【図１２】樹枝状細胞に大腸癌由来ナノベシクルを処理したときにＩＬ−１２ｐ７０サイトカインが増加することを示すＥＬＩＳＡの結果である。
【図１３】大腸癌由来ナノベシクルとアジュバントを癌治療ワクチンとして注入したときにマウスの癌成長阻害効能があることを示す癌組織サイズに対するグラフである。
【図１４】アジュバントｐｏｌｙＩ：Ｃをロードして製造した黒色癌由来ナノベシクルを透過電子顕微鏡方法で確認した結果である。
【図１５】アジュバントをロードして製造した黒色癌由来を癌治療ワクチンとして注入したときにマウスの癌成長阻害効能があることを示す癌組織サイズに対するグラフである。
【図１６】熱ストレスを加えると、熱ショックタンパク質が増加したナノベシクルが製造可能であることを示すウェスタンブロットの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者は、抗癌免疫活性と免疫耐性破壊の効果を有するうえ、大量の分離・製造が可能で、高い収率を有するナノサイズのナノベシクルを開発するために努力した結果、本発明を完成するに至った。
【００１８】
癌細胞から自然に分泌される細胞外ベシクルの場合、ナノサイズを有し、多様な抗原タンパク質を持っているから、癌のワクチンとして有用であるものの、大量の分離・製造が難しいという欠点がある。
【００１９】
すなわち、本発明者は、癌ワクチンの開発において体外培養なしで大量生産が可能なナノサイズのベシクル開発、ナノベシクルの変形による抗癌効能増進、及び製造されたナノベシクルの抗癌効果検証を行うことにより、より効果的なベシクル形態の癌抗原ワクチンの開発のために鋭意努力した結果、本発明に至ることになった。
【００２０】
具体的に、本発明者は、従来の細胞外ベシクルの利点を有するとともに高い収率(yield)を有する、腫瘍由来ナノサイズのナノベシクル（nanovesicle、ＮＶ）の開発方法を模索した結果、自己腫瘍癌細胞に由来する膜タンパク質の抗原を濃縮した後、超音波分解(sonication)法または押出(extrusion)を介して１００〜２００ｎｍのナノベシクル抗原を見出した。このような方法によって得たナノベシクルは、自然に分泌される細胞外ベシクルと形状、サイズ、密度などにおいて類似した属性を持っている。また、前記ナノベシクルにアジュバント(adjuvant)を注入し或いは熱タンパク質(heat-shock protein)増加などの変形(modification)によって抗癌効能を増進させることができる。
【００２１】
したがって、本発明は、腫瘍組織に由来するナノベシクルを含む癌治療用薬学的組成物を提供する。また、本発明は、腫瘍組織に由来するナノベシクル抗原を含む癌ワクチンを提供する。本発明において、腫瘍は、自己腫瘍に由来する癌組織であってもよいが、これに限定されない。
【００２２】
本発明の一具現例で使用した癌種類は、黒色腫や大腸癌以外にも、多数の癌種類に由来するナノベシクルを含んでもよい。
【００２３】
本発明で製造したナノベシクルは、５０〜２５０ｎｍのベシクル形態であり、由来細胞の細胞膜脂質と細胞膜タンパク質抗原などを持っている。
【００２４】
前記細胞外ベシクルの構成成分分析に使用されるタンパク質は、ウェスタンブロット(Western Blotting)などによって確認できるが、これに限定されない。
【００２５】
本発明において、ナノベシクルに結合した抗原タンパク質は、チロシナーゼなどであってもよいが、これに限定されない。
【００２６】
本発明は、ナノベシクル抗原の免疫反応を増進させるためにナノベシクルに免疫アジュバントをさらに含むことができ、前記免疫アジュバントは、Ｔｏｌｌ様受容体３のリガンドであるｐｏｌｙＩ：Ｃであってもよいが、これに制限されず、全てのＴｏｌｌ様受容体のリガンドと多様なアジュバントを含むことができる。
【００２７】
本発明において、ナノベシクルとアジュバントとを結合させ、アジュバントがロードされたナノベシクルを獲得することができるが、これに限定されず、免疫反応増進と抗癌効果増進のための多様な物質の結合が含まれ得る。
【００２８】
本発明において、ナノベシクルに熱ストレスを加えて熱ショックタンパク質９０の発現を増加させることができるが、これに制限されない。
【００２９】
本発明において、前記ナノベシクルの膜が前記腫瘍組織の膜以外の成分をさらに含むことができ、前記ナノベシクルの膜以外の成分はシクロデキストリンまたはポリエチレングリコールを含むことができるが、これに限定されない。また、本発明においてチオール基またはアミン基を用いた化学的方法によって膜成分を変形させることができるが、これに限定されない。
【００３０】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。前記薬学的に許容される担体は、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物性オイル、及びイソプロピルミリステートなどを含むことができ、これに限定されない。
【００３１】
また、本発明は、前記腫瘍組織由来ナノベシクルを含む組成物を個体に投与する段階を含む癌治療方法を提供する。本発明において、「個体」とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒト、または非ヒトの霊長類、マウス(mouse)、ラット(rat)、イヌ、猫、馬、牛などの哺乳類を意味する。また、本発明において、「薬剤学的有効量」の範囲が患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄率、及び疾患の重症度などによって様々に調節できるのは、当業者には明らかである。
【００３２】
本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の度合い、薬物形態、投与経路、及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択できる。ところが、好ましくは、本発明の組成物を１日０．００１〜１００ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは０．０１〜３０ｍｇ／体重ｋｇで投与する。投与は１日１回行ってもよく、多数回に分けて行ってもよい。本発明の薬学的組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路で投与できる。投与方法には制限がなく、例えば、経口、直腸、又は静脈、筋肉、皮下、子宮内頚膜及び脳室内(intracerbroventricular)注射によって投与できる。
【００３３】
また、本発明は、腫瘍組織由来ナノベシクルの製造方法を提供する。本発明の一具現例において、ナノベシクルへのアジュバントの注入や熱タンパク質(heat-shock protein)増加などの変形(modification)によって抗癌効果を増加させることができる。
【００３４】
本発明において、癌治療ワクチンに用いられるナノベシクル抗原は、癌組織から獲得した膜タンパク質を超音波粉砕または押出方法でベシクル形態を製造することができるが、これに限定されない。以下、本発明の腫瘍組織由来ナノベシクルの製造方法について詳細に考察する。
【００３５】
本発明の一具現例によれば、腫瘍組織由来ナノベシクルの製造方法は、（ａ）腫瘍組織から細胞を分離する段階と、（ｂ）前記腫瘍組織細胞を含む懸濁液を押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、エレクトロポレーション、機械的分解及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いてナノベシクルを製造する段階と、（ｃ）前記懸濁液から製造されたナノベシクルを分離する段階と、（ｄ）前記分離されたナノベシクルを含む懸濁液に免疫アジュバントを添加して培養する段階とを含むことができる。
【００３６】
また、本発明の他の具現例によれば、（ａ）腫瘍組織から細胞を分離する段階と、（ｂ）前記腫瘍組織細胞を含む懸濁液に免疫アジュバントを添加して前記腫瘍組織細胞に免疫アジュバントをロードさせる段階と、（ｃ）前記腫瘍組織細胞を含む懸濁液を押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、エレクトロポレーション、機械的分解及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いてナノベシクルを製造する段階とを含むことができる。
【００３７】
本発明の別の具現例によれば、前記ナノベシクルが含まれた懸濁液から、前記免疫アジュバントを含むナノベシクルを分離する段階をさらに含むことができ、前記分離段階は、密度勾配、超遠心分離、濾過、透析及び自由流動電気泳動法よりなる群から選ばれた方法を用いて行われうる。
【００３８】
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。ところが、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【実施例】
【００３９】
実施例１．超音波分解を用いた黒色腫由来ナノベシクルの製造及び特性
マウス（Ｃ５７／ＢＬ６種、雌）に黒色腫細胞（Ｂ１６ＢＬ６）を皮下注射した後、２〜３週間育てて癌組織のサイズが１．０〜１．５ｃｍになると、手術によって分離した。黒色腫組織を挽いて４５μｍのフィルターを用いて細胞に均質化(homogenization)させ、低張液(hypotonic solution)を入れて４℃で３０分間培養した。その後、ホモジナイザー(homogenizer)で１００回程度ストローク(stroke)を介して細胞を粉砕し、最終的に１５０ｍＭに塩(salt)濃度を調整してベシクルが形成されるようにした。細胞粉砕物は、５００×ｇで１０分間遠心分離(centrifugation)して核タンパク質及び粉砕されていない細胞を取り除いた後、上澄み液に水槽分解器(water bath sonicator)を用いて３０分間超音波分解を加えることにより、均一なナノサイズのベシクルが生成されるようにした。その後、１００００×ｇで２０分間遠心分離して細胞滓やミトコンドリアなどを取り除いた。上澄み液を集めた後、１０ｍＬに体積を調整して超遠心分離チューブに入れ、下に２．０Ｍのスクロース(sucrose)０．１ｍＬとその上の０．８Ｍのスクロース０．３５ｍＬを緩衝(cushion)として敷いて１００，０００×ｇで２時間超遠心分離(ultracentrifugation)した。スクロースに沈んだベシクルを３０％のＯｐｔｉｐｒｅｐ４．８ｍＬに合わせ、２０％のＯｐｔｉｐｒｅｐ３．０ｍＬと５％のＯｐｔｉｐｒｅｐ２．５ｍＬをのせて２００，０００×ｇで２時間超遠心分離した。最終的に５％のＯｐｔｉｐｒｅｐと２０％のＯｐｔｉｐｒｅｐとの間の層からナノベシクルを得た。図１は実施例１の方法で抽出した黒色腫由来ナノベシクルを透過電子顕微鏡で分析した結果である。図１に示すように、細胞外ベシクルは、脂質二重層からなっており、球状をしていることが分かる。
【００４０】
図２はナノベシクルを動的光散乱粒度分析器で分析した結果である。図２に示すように、ナノベシクルの平均サイズは１０１．６±２４．８ｎｍである。
【００４１】
図３は抽出されたナノベシクルタンパク質を１０μｇずつ準備した後、ウェスタンブロットを行った結果である。図３に示すように、対照群として、同量の癌細胞（ＷＣ）を共にゲルにロードした。黒色腫由来ナノベシクルの場合、細胞と比較して、膜抗原タンパク質としてのチロシナーゼは濃縮されているが、核タンパク質としてのヒストン(histone)は相対的に少なかった。
【００４２】
実施例２．超音波分解を用いた大腸癌由来ナノベシクルの製造及び特性
マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ種、雌）に大腸癌細胞（Ｃｏｌｏｎ２６）を皮下注射した後、２〜３週間育てて癌組織のサイズが１．０〜１．５ｃｍになると、手術によって分離した。実施例１と同様の方法で、大腸癌組織を挽いて細胞に均質化(homogenization)させ、低張液(hypotonic solution)を入れて４℃で３０分間培養した。その後、ホモジナイザー(homogenizer)で１００回程度ストローク(stroke)を介して細胞を粉砕し、最終的に１５０ｍＭに塩(salt)濃度を調整してベシクルが形成されるようにした。細胞粉砕物は、５００×ｇで１０分間遠心分離(certrifugation)して、核タンパク質及び粉砕されていない細胞を取り除いた後、上澄み液に水槽分解器(water bath sonicator)を用いて３０分間超音波分解を加えることにより、均一なナノサイズのベシクルが生成されるようにした。その後、１００００×ｇで２０分間遠心分離して細胞滓やミトコンドリアなどを取り除いた。上澄み液を集めた後、１０ｍＬに体積を調整して超遠心分離チューブに入れ、下に２．０Ｍのスクロース(sucrose)０．１ｍＬとその上の０．８Ｍのスクロース０．３５ｍＬを緩衝(cushion)として敷いて１００，０００×ｇで２時間超遠心分離した。スクロースに沈んだベシクルを３０％のＯｐｔｉｐｒｅｐ４．８ｍＬに合わせ、２０％のＯｐｔｉｐｒｅｐ３．０ｍＬと５％のＯｐｔｉｐｒｅｐ２．５ｍＬをのせて２００，０００×ｇで２時間超遠心分離(ultracentrifugation)した。最終的に５％のＯｐｔｉｐｒｅｐと２０％のＯｐｔｉｐｒｅｐとの間の層からナノベシクルを得た。図４は上述の方法で抽出したナノベシクルを透過電子顕微鏡で分析した結果である。
【００４３】
実施例３．押出を用いた黒色腫由来ナノベシクルの製造及び特性
マウス（Ｃ５７／ＢＬ６、雌）に黒色腫細胞（Ｂ１６ＢＬ６）を皮下注射した後、２〜３週間育てて癌組織のサイズが１．０〜１．５ｃｍになると、手術によって分離した。黒色腫組織を挽いて４５μｍのフィルターを用いて細胞に均質化(homogenization)させ、低張液(hypotonic solution)を入れて４℃で３０分間培養した。その後、ホモジナイザー(homogenizer)で１００回程度ストローク(stroke)を介して細胞を粉砕し、最終的に１５０ｍＭに塩(salt)濃度を調整してベシクルが生成されるようにした。細胞粉砕物は、５００×ｇで１０分間遠心分離(centrifugation)して核タンパク質及び粉砕されていない細胞を取り除いた後、上澄み液を孔径１μｍのメンブレインフィルター(membrane filter)を３回通過させた後、孔径０．４μｍのメンブレインフィルターを３回通過させた。その後、サンプルを集めた後、１０ｍＬに体積を調整して超遠心分離チューブに入れ、下に２．０Ｍのスクロース(sucrose)０．１ｍＬとその上の０．８Ｍのスクロース０．３５ｍＬを緩衝(cushion)として敷いて１００，０００×ｇで２時間超遠心分離(ultracentrifugation)した。スクロースに沈んだベシクルを３０％のＯｐｔｉｐｒｅｐ４．８ｍＬに合わせ、２０％のＯｐｔｉｐｒｅｐ３．０ｍＬと５％のＯｐｔｉｐｒｅｐ２．５ｍＬをのせて２００，０００×ｇで２時間超遠心分離した。最終的に５％のＯｐｔｉｐｒｅｐと２０％のＯｐｔｉｐｒｅｐとの間の層からナノベシクルを得た。図５は上述の方法で抽出したナノベシクルを透過電子顕微鏡で分析した結果である。
【００４４】
実施例４．黒色腫由来ナノベシクル処理の際に誘導される樹枝状細胞の免疫反応
マウス（Ｃ５７／ＢＬ６、雌）の大腿骨と脛骨から骨髄細胞を採取した。骨髄細胞に赤血球を溶解させた後、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩに栄養成分と２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを入れて１週間樹枝状細胞に分化させた。実施例１の方法で分離したナノベシクルを、脂質に付着できる黒色蛍光物質ＤｉＩで標識した後、樹枝状細胞と２４時間反応させ、ＦＡＣＳで捕食有無を確認した。
【００４５】
図６は樹枝状細胞がナノベシクルを捕食することをＦＡＣＳ結果で表わしたものであり、括弧内の数字はＭＦＩ(mean fluorescence intensity)値を示す。分化された樹枝状細胞を１×１０５となるように２４ウェルプレートに接種した後、ナノベシクルを０、０．１、１．０、２．０、１０．０μｇ／ｍＬで処理して２４時間培養した。培養液を集めて４℃で５００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を収集した後、さらに３０００×ｇで２０分間遠心分離し、上澄み液を収集した。分離された上澄み液に入っているサイトカインの量をＥＬＩＳＡ(enzyme linked immunosorbant assay)法によって測定した。
【００４６】
図７はサイトカインの量を示す結果であって、ナノベシクルの量に比例して、Ｔヘルパータイプ１のサイトカインであるＩＬ−１２ｐ７０が増加することを示す。これは黒色腫由来ナノベシクルが樹枝状細胞などの抗原提示細胞と作用して抗癌効果を誘発することができることを意味する。
【００４７】
実施例５．黒色腫由来ナノベシクルの癌成長阻害効能
マウス（Ｃ５７／ＢＬ６、雌）に５×１０５の黒色腫細胞（Ｂ１６ＢＬ６）を皮下注射して癌の生成が測定できるように１週間育てた。その後、実施例１の方法で分離した黒色腫由来ナノベシクル１０μｇを単独で、或いはアジュバントとしてのｐｏｌｙＩ：Ｃ５０μｇと組み合わせて１週間隔で３回腹腔注射した。癌組織のサイズは週２〜３回ずつ測定した。癌組織の体積は最も長い長さ（ｌ）とこれに垂直な長さ（ｓ）を測定してｖ＝ｌｓ２／２の式で計算した。
【００４８】
図８は黒色腫由来ナノベシクルとアジュバントを癌治療ワクチンとして注入したときにマウスの癌成長阻害効能があることを示す癌組織のサイズに対するグラフである。図８に示すように、ナノベシクルとアジュバントを共にワクチンとして与えた場合、癌の成長を有意に減少させ、Ｔ／Ｃ比［Ｔ／Ｃ比＝ (median tumor volume of treated group)／(median tumor volume of control group)×１００の値が基準４２％以下の場合に効果が良いと判定］の値を分析した場合も、３４％と効能が良かった。特に癌細胞（ＷＣ）自体を抗原として用いた場合に比べて癌の成長抑制に卓越した効果を示して、腫瘍由来ナノベシクルを用いた癌治療ワクチンの有効性を立証した。
【００４９】
実施例６．黒色腫由来ナノベシクルの癌転移阻害効能
マウス（Ｃ５７／ＢＬ６、雌）に１×１０５の黒色腫細胞（Ｂ１６ＢＬ６）を血管注射してマウスの肺に癌が生成されるようにした。４日後、実施例１の方法で分離した黒色腫由来ナノベシクル１０μｇを単独で、或いはアジュバントとしてのｐｏｌｙＩ：Ｃ５０μｇと組み合わせて４日間隔で３回腹腔注射した。１４日目にマウスを安楽死させ、肺を摘出した。
【００５０】
図９は癌転移モデルにおいて黒色腫由来ナノベシクルとアジュバントを癌治療ワクチンとして注入したときにマウスの癌転移が減少したことを示すマウスの摘出肺のイメージであって、肉眼で見られる黒いコロニーが黒色腫である。
【００５１】
生成された黒色腫の数を計算して図１０に示した。図１０に示すように、ナノベシクルとアジュバントを共に与えた場合に、その数が有意に減少したことが分かる。
【００５２】
また、摘出した肺を切片にして細胞の核をヘマトキシリン(hematoxylin)で染色し（青色）、細胞質をエオシン(eosin)で染色する（赤色）Ｈ＆Ｅ(Hematoxylin-Eosin)法で染色した。図１１は肺のＨ＆Ｅ染色結果であって、ナノベシクルとアジュバントを共に与えた場合にのみ黒色腫（矢印）の生成が減少したことを示す。このような結果は腫瘍由来ナノベシクルを癌抗原としてワクチンに使用すると、転移した癌の数を有意に減らすことができるという有効性を立証した。
【００５３】
実施例７．大腸癌由来ナノベシクル処理の際に誘導される樹枝状細胞の免疫反応
マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ、雌）の大腿骨と脛骨から骨髄細胞を採取した。骨髄細胞に赤血球を溶解させた後、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩに栄養成分と２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを入れて１週間樹枝状細胞に分化させた。分化した樹枝状細胞を１×１０５となるように２４ウェルプレートに接種した後、実施例２の方法で分離した大腸癌由来ナノベシクルを１０．０μｇ／ｍＬで処理して２４時間培養した。培養液を集めて４℃で５００×ｇにて１０分間遠心分離し、上澄み液を収集した後、さらに３０００×ｇで２０分間遠心分離して上澄み液を収集した。分離された上澄み液に入っているサイトカインの量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。
【００５４】
図１２はサイトカインの量を示す結果であって、ナノベシクルの量に比例してＴヘルパータイプ１のサイトカインであるＩＬ−１２ｐ７０が増加することを示す。これは大腸癌由来ナノベシクルが樹枝状細胞などの抗原提示細胞と作用して抗癌効果を誘発することができることを意味する。
【００５５】
実施例８．大腸癌由来ナノベシクルの癌成長阻害効能
マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ、雌）に５×１０５の大腸癌細胞（Ｃｏｌｏｎ２６）を皮下注射して癌の生成が測定できるように１週間育てた。その後、実施例２の方法で分離した大腸癌由来ナノベシクル１０μｇを単独で、或いはアジュバントとしてのｐｏｌｙＩ：Ｃ５０μｇと組み合わせて１週間隔で３回腹腔注射した。癌組織のサイズは週２〜３回ずつ測定した。癌組織の体積は最も長い長さ（ｌ）とこれに垂直な長さ（ｓ）を測定してｖ＝ｌｓ２／２の式で計算した。
【００５６】
図１３は大腸癌由来ナノベシクルとアジュバントを癌治療ワクチンとして注入したときにマウスの癌成長阻害効能があることを示す癌組織のサイズに対するグラフである。図１３に示すように、ナノベシクルとアジュバントを共にワクチンとして与えた場合、癌の成長を有意に減少させ、Ｔ／Ｃ比の値を分析した場合も、２７％と効能が良かった。これは腫瘍由来ナノベシクルが黒色腫だけでなく大腸癌など他の種類の癌の抗原としても卓越した効果を示すことができることを意味する。
【００５７】
実施例９．アジュバントがロードされたナノベシクルの製造
マウスから腫瘍組織を得た後、挽いて４５μｍのフィルターを用いて細胞に均質化(homogenization)させ、低張液(hypotonic solution)を入れて４℃で３０分間培養した。この過程でアジュバントとしてのｐｏｌｙＩ：Ｃを１ｍｇ／ｍＬで入れて１０分間さらに培養した後、ホモジナイザーで１００回程度ストロークを介して細胞を粉砕し、最終的に１５０ｍＭに塩濃度を調整してアジュバントがベシクルの形態に結合するようにした。アジュバントを持つ細胞粉砕物は、５００×ｇで１０分間遠心分離(centrifugation)して核タンパク質及び粉砕されていない細胞を取り除いた後、上澄み液を孔径１μｍのメンブレインフィルターを３回通過させた後、孔径０．４μｍのメンブレインフィルター(membrane filter)を３回通過させた。その後、サンプルを集めた後、１０ｍＬに体積を調整して超遠心分離チューブに入れ、下に２．０Ｍのスクロース(sucrose)０．１ｍＬとその上の０．８Ｍのスクロース０．３５ｍＬを緩衝(cushion)として敷いて１００，０００×ｇで２時間超遠心分離した。スクロースに沈んだベシクルを３０％のＯｐｔｉｐｒｅｐ４．８ｍＬに合わせ、２０％のＯｐｔｉｐｒｅｐ３．０ｍＬと５％のＯｐｔｉｐｒｅｐ２．５ｍＬをのせて２００，０００×ｇで２時間超遠心分離(ultracentrifugation)した。最終的に５％のＯｐｔｉｐｒｅｐと２０％のＯｐｔｉｐｒｅｐとの間の層から、アジュバントがロードされたナノベシクルを得た。
【００５８】
図１４は上述の方法で黒色腫から抽出したナノベシクルを透過電子顕微鏡で分析した結果であって、ｄｓＲＮＡとしてのｐｏｌｙＩ：Ｃが結合していることが分かる。
【００５９】
実施例１０．アジュバントがロードされたナノベシクルの癌成長阻害効能
マウス（Ｃ５７／ＢＬ６、雌）に５×１０５の黒色腫細胞（Ｂ１６ＢＬ６）を皮下注射して癌の生成が測定できるように１週間育てた。その後、実施例９の方法で分離したｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントがロードされた黒色腫由来ナノベシクル１０μｇを、１週間隔で３回腹腔注射した。癌組織のサイズは週２〜３回ずつ測定した。癌組織の体積は最も長い長さ（ｌ）とこれに垂直な長さ（ｓ）を測定してｖ＝ｌｓ２／２の式で計算した。
【００６０】
図１５に示すように、アジュバントが結合した１０μｇのナノベシクル［ＮＶ（ＰｏｌｙＩ：Ｃ）］が、ナノベシクル１０μｇとアジュバント５０μｇを別々に使用する場合、［ＮＶ＋ＰｏｌｙＩ：Ｃ］グループより抗癌効果が高かった。アジュバントがロードされたナノベシクルワクチンの場合、Ｔ／Ｃ比の値を分析した場合も３３％と効能が高かった。これはナノベシクルにアジュバントをロードする場合、アジュバントの拡散を減らして局所作用濃度を高め、特にｐｏｌｙＩ：Ｃアジュバントと作用するＴｏｌｌ様受容体３(toll-like receptor 3)は免疫細胞のエンドソーム(endosome)に存在してナノベシクルを介しての伝達が容易だからであることを解明した重要な研究結果である。
【００６１】
実施例１１．熱ショックタンパク質(heat-shock protein)が増加したナノベシクルの製造
マウスから腫瘍組織を得た後、１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培養液に入れ、４２℃で１時間３０分間熱ストレスを加えた。その後、癌組織を挽いて４５μｍのフィルターを用いて細胞に均質化(homogenization)させ、低張液(hypotonic solution)を入れて４℃で３０分間培養した後、ホモジナイザー(homogenizer)で１００回程度ストローク(stroke)を介して細胞を粉砕し、最終的に１５０ｍＭに塩(salt)濃度を調整してアジュバントがベシクルの形態に結合するようにした。細胞粉砕物は、５００×ｇで１０分間遠心分離(centrifugation)して核タンパク質及び粉砕されていない細胞を取り除いた後、上澄み液に水槽分解器(water bath sonicator)を用いて３０分間超音波分解を加えることにより、均一なナノサイズのベシクルが生成されるようにした。その後、１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して細胞滓やミトコンドリアなどを取り除いた。上澄み液を集めた後、１０ｍＬに体積を調整して超遠心分離チューブに入れ、下に２．０Ｍのスクロース(sucrose)０．１ｍＬとその上の０．８Ｍのスクロース０．３５ｍＬを緩衝(cushion)として敷いて１００，０００×ｇで２時間超遠心分離(ultracentrifugation)した。スクロースに沈んだベシクルを３０％のＯｐｔｉｐｒｅｐ４．８ｍＬに合わせ、２０％のＯｐｔｉｐｒｅｐ３．０ｍＬと５％のＯｐｔｉｐｒｅｐ２．５ｍＬをのせて２００，０００×ｇで２時間超遠心分離した。最終的に５％のＯｐｔｉｐｒｅｐと２０％のＯｐｔｉｐｒｅｐとの間の層からナノベシクルを得た。
【００６２】
図１６は上述の方法で黒色腫から抽出したナノベシクルをウェスタンブロットで分析した結果であって、４２℃の熱ストレスを加える場合、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）の発現が増加した。特にナノベシクルの場合、癌細胞に比べて熱ショックタンパク質が１．８倍さらに増加することを示した。熱タンパク質が増加したナノベシクルを癌患者に使用すると、危険信号を知らせることにより免疫反応を増進させ且つ抗癌効果を高めるものと期待する。 
【００６３】
前述した本発明の説明は例示のためのものに過ぎず、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の技術的思想又は必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理解することができる。よって、上述した実施例は全ての面で例示的なもので、限定的なものではないと理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明に係る腫瘍組織由来ナノベシクルは、細胞外ベシクルと類似した属性を有し、高い収率を示し、且つ多様な変形が可能な抗原であって、癌治療ワクチンの開発に非常に有用であるものと期待される。
【図２】
2013543519.tif 000003
【図６】
2013543519.tif 000004
【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
2013543519.tif 000015
【図１１】
2013543519.tif 000016
【図１４】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年4月19日(2013.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍組織由来ナノベシクルを含む、癌治療用薬学的組成物。  
【請求項２】
前記腫瘍組織が、熱ショックタンパク質を発現するように形質転換された組織である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が免疫アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の組成物。 
【請求項４】
前記免疫アジュバントがｐｏｌｙＩ：Ｃである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ナノベシクルの膜が前記腫瘍組織の膜以外の成分をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記膜以外の成分がシクロデキストリンまたはポリエチレングリコールである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ナノベシクルの膜成分が化学的変形したものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記化学的変形がチオール基またはアミン基を用いた化学的方法による変形である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
腫瘍組織由来ナノベシクルの製造方法であって、下記の段階を含む方法： 
（ａ）腫瘍組織から細胞を分離する段階、
（ｂ）前記腫瘍組織細胞を含む懸濁液を押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、エレクトロポレーション、機械的分解及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いてナノベシクルを製造する段階、
（ｃ）前記懸濁液から製造されたナノベシクルを分離する段階、及び
（ｄ）前記分離されたナノベシクルを含む懸濁液に免疫アジュバントを添加して培養する段階。
【請求項１０】
腫瘍組織由来ナノベシクルの製造方法であって、下記の段階を含む方法：
（ａ）腫瘍組織から細胞を分離する段階、
（ｂ）前記腫瘍組織細胞を含む懸濁液に免疫アジュバントを添加して前記腫瘍組織細胞に免疫アジュバントをロードさせる段階、及び
（ｃ）前記腫瘍組織細胞を含む懸濁液を押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、エレクトロポレーション、機械的分解及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いてナノベシクルを製造する段階。
【請求項１１】
腫瘍組織由来ナノベシクル抗原を含む癌ワクチン。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、癌ワクチンに係り、具体的には、腫瘍組織に由来するナノベシクルを含む癌治療用薬学的組成物などに関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、抗癌免疫活性と免疫耐性破壊のためにナノサイズベシクル形態の癌抗原を開発することにある。癌細胞から自然に分泌される細胞外ベシクルの場合、ナノサイズを有し、多様な抗原タンパク質を持っており、癌ワクチンとして有用であるものの、大量の分離及び製造が難しいという欠点がある。よって、本発明は、従来の細胞外ベシクルの利点を有しながら高い収率(yield)を示す、腫瘍組織に由来するナノサイズのナノベシクル(nanovesicle、ＮＶ)を含有する癌治療用薬学的組成物、及び前記腫瘍組織由来ナノベシクルを製造する方法などを提供しようとする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明において、腫瘍組織由来ナノベシクルを含む組成物は個体に投与する段階を含む癌治療方法に用いることができる。前記腫瘍組織、前記組成物及び前記ナノベシクルは前述したとおりである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
また、本発明において、前記腫瘍組織由来ナノベシクルを含む組成物は個体に投与する段階を含む癌治療方法に用いることができる。本発明において、「個体」とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒト、または非ヒトの霊長類、マウス(mouse)、ラット(rat)、イヌ、猫、馬、牛などの哺乳類を意味する。また、本発明において、「薬剤学的有効量」の範囲が患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄率、及び疾患の重症度などによって様々に調節できるのは、当業者には明らかである。
【国際調査報告】
2013543519.tif 000019
2013543519.tif 000020
2013543519.tif 000021
2013543519.tif 000022
2013543519.tif 000023
2013543519.tif 000024
2013543519.tif 000025
2013543519.tif 000026