(57)【要約】  本発明は、抗ＶＥＧＦＲ−３モノクローナル抗体、前記抗体を含む医薬組成物および疾患の治療における前記抗体の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のＬＣＤＲ１、配列番号２のＬＣＤＲ２、配列番号３のＬＣＤＲ３、配列番号６のＨＣＤＲ１、配列番号７のＨＣＤＲ２および配列番号８のＨＣＤＲ３を含むヒトＶＥＧＦＲ−３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
配列番号５の軽鎖可変領域および配列番号１０の重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
配列番号１５の軽鎖および配列番号１６の重鎖を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
配列番号１５の２つの軽鎖および配列番号１６の２つの重鎖を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
ａ）前記抗体のヒトＶＥＧＦＲ−３への結合が、ヒトＶＥＧＦＲ−３のＰｒｏ−２１９をＬｅｕに単独変異させることによって少なくとも９０％減少する：および
ｂ）前記抗体のヒトＶＥＧＦＲ−３への結合が、ヒトＶＥＧＦＲ−３のＶａｌ−１７５をＡｌａに単独変異させることによって少なくとも５０％減少する、
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
前記抗体のヒトＶＥＧＦＲ−３への結合が、ヒトＶＥＧＦＲ−３のＬｅｕ−２２１をＶａｌに単独変異させることによって少なくとも５０％減少する、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７】
配列番号２０の変異マウスＶＥＧＦＲ−３および配列番号２１の変異マウスＶＥＧＦＲ−３にも結合し、配列番号２０の変異マウスＶＥＧＦＲ−３への結合が、野生型マウスＶＥＧＦＲ−３（配列番号１９）への結合と比較した場合、５０倍を上回って増加し、配列番号２１の変異マウスＶＥＧＦＲ−３への結合が、野生型マウスＶＥＧＦＲ−３への結合と比較した場合、１０倍を上回って増加する、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
前記抗体が、２０℃で、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００バイオセンサーにて表面プラズモン共鳴によって測定した場合、ヒトＶＥＧＦＲ−３に対して５．６×１０−１１Ｍから１×１０−９Ｍの間のＫｄを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
前記抗体が、１．３ｎＭから２ｎＭの間のＩＣ５０で、ヒトＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣ（配列番号２２）のヒトＶＥＧＦＲ−３への結合を抑制する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
前記抗体が、５ｎＭ〜１０ｎＭのＩＣ５０で、ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣによって刺激される分裂促進反応を抑制する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、場合によって、少なくとも１つの他の治療成分を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
薬剤として使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
卵巣癌、ヒト赤白血病、頭頸部癌、乳癌、腎細胞癌、膵癌、肺癌、大腸癌およびリンパ節転移の治療に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１５】
治療における同時使用、別々の使用または逐次使用のための、シスプラチン、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチンおよびドセタキセルから選択されるさらなる抗癌剤と組み合わせた、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮増殖因子受容体３（ＶＥＧＦＲ−３）に特異的に結合する抗体を対象とし、特に、抗ＶＥＧＦＲ−３抗体のアミノ酸配列および核酸配列、医薬組成物、およびＶＥＧＦＲ−３によって媒介される病状を治療する方法における前記抗体の使用を本明細書に提供する。
【背景技術】
【０００２】
内皮細胞特異的な増殖因子および受容体は、主に、内皮細胞増殖の刺激、分化、ならびに特定の細胞機能に関与していると考えられている。増殖因子の広く研究されている１つのファミリーには、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。
【０００３】
ＶＥＧＦＲ−３は、健常な成人組織においてその発現が、主に、リンパ管内皮に限定されている、唯一の受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。新生ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦＲ−３に特異的に結合する。これらのタンパク質のＮ末端領域およびＣ−末端領域のタンパク質切断により、ＶＥＧＦＲ−３に対する親和性が増加した成熟ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣおよびＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣが遊離する。これらのリガンドは、ＶＥＧＦＲ−３のシグナル伝達を活性化し、リンパ脈管新生（すなわち、前から存在するリンパ管からの新しいリンパ管の形成）を開始する。
【０００４】
ＶＥＧＦＲ−３に対するリガンドの発現パターンは、それらが、正常な血管系の発達および維持だけでなく、腫瘍の血管新生およびリンパ脈管新生にも関与することを示唆する。さらに、ＶＥＧＦＲ−３発現は、腫瘍内の毛細血管上で検出されている。したがって、ＶＥＧＦＲ−３へのＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄの結合を抑制するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、腫瘍の血管新生を抑制する可能性を有する。
【０００５】
さらに、ＶＥＧＦＲ−３活性の阻害は、ＶＥＧＦ−Ｃによって増強される腫瘍リンパ脈管新生を抑制することが示されている。多くの種類の癌において、転移の第１部位はリンパ節なので、ＶＥＧＦＲ−３の阻害は、腫瘍転移を抑制する可能性を有する。
【０００６】
Ｐｅｒｓａｕｄ,ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１７：２７４５−５６（２００４）は、ヒト抗ＶＥＧＦＲ−３モノクローナル抗体の特定の性質について記載しているが、任意のかかる抗体の配列も、かかる抗体が結合することができるエピトープの配列も開示していない。したがって、ＶＥＧＦＲ−３内の新規のエピトープに結合し、リガンド結合および受容体活性化を阻害することができる高親和性抗ＶＥＧＦＲ−３抗体に対するニーズが依然としてある。さらに、顕著な負の副作用がなく、様々な腫瘍型に対して抗腫瘍効果を示すことができる抗ＶＥＧＦＲ−３抗体に対するニーズが依然としてある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ−３に結合する抗体またはその抗原結合部分を提供し、その際：
ａ）前記抗体のヒトＶＥＧＦＲ−３への結合が、ヒトＶＥＧＦＲ−３のＰｒｏ−２１９をＬｅｕに単独変異させることによって少なくとも９０％減少する；かつ
ｂ）前記抗体のヒトＶＥＧＦＲ−３への結合が、ヒトＶＥＧＦＲ−３のＶａｌ−１７５をＡｌａに単独変異させることによって少なくとも５０％減少する。
【０００８】
好ましくは、アルカリホスファターゼとの融合タンパク質として、ヒトＶＥＧＦＲ−３もしくは変異ＶＥＧＦＲ−３の可溶性細胞外ドメインを発現させ、その後、アルカリホスファターゼ化学発光アッセイを用いて、本抗体に結合することができる各融合タンパク質の量を測定することによって、本抗体とヒトＶＥＧＦＲ−３もしくは変異ＶＥＧＦＲ−３との間の結合レベル、または本抗体の抗原結合断片とヒトＶＥＧＦＲ−３もしくは変異ＶＥＧＦＲ−３との間の結合レベルをアッセイする。
【０００９】
本発明は、さらに、薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤と共に、本発明の抗体またはその抗原結合部分を含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤と共に、本発明の抗体またはその抗原結合部分を含み、場合によって、少なくとも１つの他の治療成分を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、薬剤として使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合部分も提供する。
【００１２】
本発明は、さらに、卵巣癌、ヒト赤白血病、頭頸部癌、乳癌、腎細胞癌、膵癌、肺癌、大腸(colon)癌およびリンパ節転移の治療もしくは予防に使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００１３】
本発明は、さらに、かかる治療を必要としている哺乳類に、本発明の有効量の抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、哺乳類の卵巣癌、ヒト赤白血病、頭頸部癌、乳癌、腎細胞癌、膵癌、肺癌、大腸癌およびリンパ節転移からなる群から選択される癌を治療する方法を提供する。
【００１４】
本発明は、さらに、卵巣癌、ヒト赤白血病、頭頸部癌、乳癌、腎細胞癌、膵癌、肺癌、大腸癌およびリンパ節転移からなる群から選択される癌の治療のための薬剤の製造における抗体またはその抗原結合部分の使用を提供する。
【００１５】
本発明は、治療における同時使用、別々の使用、または逐次使用のための、シスプラチン、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチンおよびドセタキセルから選択されるさらなる抗癌剤と組み合わせた本発明の抗体またはその抗原結合部分も提供する。
【００１６】
本発明は、さらに、それを必要としている患者に、本発明の抗体またはその抗原結合部分と、シスプラチン、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチンおよびドセタキセルから選択されるさらなる抗癌剤の治療効果のある組み合わせを投与することを含む、哺乳類の卵巣癌、ヒト赤白血病、頭頸部癌、乳癌、腎細胞癌、膵癌、肺癌、大腸癌およびリンパ節転移からなる群から選択される癌を治療する方法を提供する。
【００１７】
本発明の抗体は、哺乳類のＶＥＧＦＲ−３の第２の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインに結合する。ヒトＶＥＧＦＲ−３のこの第２のＩｇ様ドメインは、この全長受容体の残基１３８〜２２６に対応する。Ｐａｊｕｓｏｌａ,ｅｔ.ａｌ.,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.５２：５７３８−５７４３（１９９２）を参照されたい。
【００１８】
「哺乳類／ヒト／マウスのＶＥＧＦＲ−３の第２のＩｇ様ドメイン（およびその変異）という用語は、そのドメインの天然の（例えば、正常な状態下でそのドメインを発現する細胞から精製された）形態、ならびに、例えば、天然もしくは合成の点変異体またはその切断バージョンによってコードされる組み換えバージョンを包含することを意図する。
【００１９】
本発明の抗体は、ヒトＶＥＧＦＲ−３の第２のＩｇ様ドメイン中のエピトープに結合し、その際、Ｐ２１９はそのエピトープの優勢成分であり、Ｖ１７５はそのエピトープの従属成分であり、Ｌ２２１はそのエピトープのマイナー成分である。（これらの残基の番号は、上記のＰａｊｕｓｏｌａ，ｅｔ．ａｌ．およびＥＭＢＬデータベースの登録番号Ｘ６８２０３に報告されている全長のヒトＶＥＧＦＲ−３と一致する。）この発見は、一つには、ヒトＶＥＧＦＲ−３に変異Ｖ１７５ＡもしくはＰ２１９ＬまたはＬ２２１Ｖが含まれると（すなわち、オルソロガスなマウスＶＥＧＦＲ−３残基に置換すると）、本発明の抗体の変異ヒトＶＥＧＦＲ−３への結合が消失するかまたは顕著に減少するという観察に基づく。
【００２０】
さらに、ヒトＶＥＧＦＲ−３中のエピトープに結合する本発明の抗体（その中で、Ｐ２１９はそのエピトープの優勢成分であり、Ｖ１７５はそのエピトープの従属成分であり、Ｌ２２１はそのエピトープのマイナー成分である）は、リガンドＶＥＧＦ−ＣのＶＥＧＦＲ−３への結合を阻害するので、この受容体の活性を中和することができる。したがって、本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ−３に対する新規中和抗体の産生を可能にする、ヒトＶＥＧＦＲ−３上の新規中和エピトープを提供し、これは、ヒトＶＥＧＦ−Ｃのこの受容体への結合を阻害することができる。したがって、本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ−３のエピトープを提供し、その中で、Ｐ２１９はそのエピトープの優勢成分であり、Ｖ１７５はそのエピトープの従属成分であり、Ｌ２２１はそのエピトープのマイナー成分である。
【００２１】
本発明は、アミノ酸残基Ｐ２１９およびＶ１７５を含むヒトＶＥＧＦＲ−３のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合部分も提供する。好ましくは、本発明は、アミノ酸Ｐ２１９、Ｖ１７５およびＬ２２１を含むヒトＶＥＧＦＲ−３のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合部分も提供する。かかるエピトープには、本発明の抗体（例えば、抗体１）が結合し、そのために、本発明は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖を有する抗体と同じヒトＶＥＧＦＲ−３のエピトープと反応する抗体またはその抗原結合部分も提供する。本発明の特定の抗体と同じヒトＶＥＧＦＲ−３のエピトープと反応する抗体（例えば、抗体１）は、ヒトＶＥＧＦＲ−３に結合するために競合し、したがって、本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ−３へ結合するために、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖を有する抗体と競合する抗体またはその抗原結合部分も提供する。
【００２２】
好ましくは、本発明の抗体は、（変異Ｌ２１９Ｐを含む）配列番号２０に示す配列を有する変異マウスＶＥＧＦＲ−３および（変異Ａ１７５Ｖを含む）配列番号２１に示す配列を有する変異マウスＶＥＧＦＲ−３にも結合し、その際、配列番号２０に示す配列を有する変異マウスＶＥＧＦＲ−３への結合は、野生型マウスＶＥＧＦＲ−３（配列番号１９）への結合と比較した場合、５０倍を上回って増加し、配列番号２１に示す配列を有する変異マウスＶＥＧＦＲ−３への結合は、野生型マウスＶＥＧＦＲ−３への結合と比較した場合、１０倍を上回って増加する。
【００２３】
好ましくは、アルカリホスファターゼとの融合タンパク質として、野生型マウスＶＥＧＦＲ−３もしくは変異マウスＶＥＧＦＲ−３の可溶性細胞外ドメインを発現させ、その後、アルカリホスファターゼ化学発光アッセイを用いて、本抗体に結合することができる各融合タンパク質の量を測定することによって、本抗体と野生型マウスＶＥＧＦＲ−３もしくは変異マウスＶＥＧＦＲ−３との間の結合レベル、または本抗体の抗原結合断片と野生型マウスＶＥＧＦＲ−３もしくは変異マウスＶＥＧＦＲ−３との間の結合レベルをアッセイする。
【００２４】
好ましくは、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＶＥＧＦＲ−３に対して高親和性を有する。例えば、本抗体またはその抗原結合部分は、２０℃で、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００バイオセンサーにて表面プラズモン共鳴によって測定した場合、ヒトＶＥＧＦＲ−３に対して５．６×１０−１１Ｍから１×１０−９Ｍの間のＫｄを有する。さらに、好ましくは、本抗体またはその抗原結合部分は、２０℃で、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００バイオセンサーにて表面プラズモン共鳴によって測定した場合、ヒトＶＥＧＦＲ−３に対して５．６×１０−１１Ｍから１×１０−１０Ｍの間のＫｄを有する。
【００２５】
好ましくは、本発明は、１．３ｎＭから２ｎＭの間のＩＣ５０で、ヒトＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣのヒトＶＥＧＦＲ−３への結合を抑制する抗ＶＥＧＦＲ−３抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２６】
好ましくは、本発明は、５ｎＭから１０ｎＭの間のＩＣ５０で、ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣによって刺激される分裂促進反応を抑制する抗ＶＥＧＦＲ−３抗体またはその抗原結合部分を提供する。より好ましくは、本抗体またはその抗原結合部分は、実施例５に記載のアッセイにおいて、５ｎＭ〜８ｎＭ、最も好ましくは、５ｎＭから６ｎＭの間のＩＣ５０でＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣによって刺激される分裂促進反応を抑制する。
【００２７】
好ましくは、本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ−３に結合し、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体またはその抗原結合部分を提供し、その際、このＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、このＨＣＶＲは、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号２のポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号３のポリペプチドを含み、ＨＣＤＲ１は配列番号６のポリペプチドを含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号７のポリペプチドを含み、ＨＣＤＲ３は配列番号８のポリペプチドを含む。
【００２８】
さらに好ましくは、本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ−３に結合し、配列番号５のＬＣＶＲポリペプチドおよび配列番号１０のＨＣＶＲポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２９】
さらに好ましくは、本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ−３に結合し、配列番号１５のポリペプチドを含む軽鎖および配列番号１６のポリペプチドを含む重鎖を含む抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３０】
さらにより好ましくは、本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ−３に結合し、配列番号１５のポリペプチドを含む２つの軽鎖および配列番号１６のポリペプチドを含む２つの重鎖を含む抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３１】
好ましくは、本発明は、ヒトＶＥＧＦＲ−３に結合するために、本発明の抗体と競合する抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３２】
好ましくは、本発明は、ヒト抗体である抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３３】
好ましくは、本発明は、ヒト改変抗体である抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３４】
定義
本明細書で使用する「抗体」という用語は、完全ヒト抗体またはヒト改変抗体、ならびにそれらの消化断片、それらの特定の部分および変異体であってもよいモノクローナル抗体を指すことを意図し、これには、ヒトＶＥＧＦＲ−３の第２のＩｇ様ドメインに結合する能力を保持する一本鎖抗体およびそれらの断片を含む抗体またはその特定の断片もしくは部分の構造および／または機能を模倣する、抗体の部分である抗体模倣薬が含まれる。例えば、本発明が包含するヒトＶＥＧＦＲ−３の第２のＩｇ様ドメインに特異的に結合することができる抗体断片には、（例えば、パパイン消化による）Ｆａｂ断片、（例えば、プラスミン消化による）Ｆａｃｂ断片、（例えば、ペプシン消化による）Ｆ（ａｂ’）２断片およびジスルフィド安定化可変断片（ｄｓＦｖ）または分子生物学技術によって生成される一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が含まれる。抗体断片は、例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−３の第２のＩｇ様ドメインに結合する能力を保持するドメイン除去抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）およびトリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）を含むことも意図する。
【００３５】
抗体には、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）である４つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子が含まれる。それぞれの重鎖は、（本明細書でＨＣＶＲと省略する）重鎖可変領域および重鎖定常領域で構成される。この重鎖定常領域には、３つのドメインのＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３が含まれる。それぞれの軽鎖は、（本明細書でＬＣＶＲと省略する）軽鎖可変領域および軽鎖定常領域で構成される。全ての脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と名付けられた、２つのはっきりと異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。本明細書で使用するＬＣＶＲ発現は、カッパ種の軽鎖（Ｖκ）由来の可変領域およびラムダ種の軽鎖（Ｖλ）由来の可変領域の両方を含むことを意図する。軽鎖定常領域は、１つのドメインのＣＬで構成される。ＨＣＶＲ領域およびＬＣＶＲ領域には、より保存されている、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられた領域が散在しており、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた配列超可変領域が含まれる。それぞれのＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、以下の順番でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成されている：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。本発明では、ＬＣＶＲ ＣＤＲを、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と省略し、ＨＣＶＲ ＣＤＲを、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と省略する。
【００３６】
抗体を、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てることができる。インタクトな抗体には、５つの主要なクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがある。これらのうちのいくつかは、さらに、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２のサブクラス（アイソタイプ）に分けられ得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ（α）、デルタ（Δ）、エプシロン（ε）、ガンマ（γ）、およびミュー（μ）と呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元立体構造はよく知られている。本発明には、前述のクラスまたはサブクラス（アイソタイプ）のいずれかに分類される抗体が含まれる。
【００３７】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体集団から得られた抗体を指し、例えば、その集団を含む個々の抗体は、存在し得る天然変異または少数の翻訳後変化の可能性を除けば、実質的に同一である。モノクローナル抗体は、（決定基またはエピトープとも知られる）単一抗原部位に対して高度に特異的に作られ、これらは、本明細書に記載のとおり、哺乳類ＶＥＧＦＲ−３の第２のＩｇ様ドメインに含まれる。さらに、主として、様々な決定基に対して作られた様々な抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、その抗原上の単一決定基に対して作られる。モディファイヤー「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られるような抗体の特徴を示し、任意の特定法による抗体産生を必要とすると解釈されるべきではない。
【００３８】
本明細書で使用する「ヒト抗体」とは、（Ｋａｂａｔ,ｅｔ ａｌ.,（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ,Ｕ.Ｓ.Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ,ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ.９１−３２４２に記載の）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域および定常領域を有する抗体を指す。本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上に接合されている抗体を含むことを意図しない。
【００３９】
本明細書で開示する抗体１のアミノ酸配列に対する変更は、特に、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性における改善に関連して、本発明の範囲内に含まれる。これに関連して、本明細書で使用する「ヒト改変抗体」という用語は、抗体１に類似した機能的性質（例えば、Ｐ２１９およびＶ１７５を含むエピトープでヒトＶＥＧＦＲ−３に結合する能力）を有し、抗体１に由来する実質的にヒトまたは完全にヒトのＣＤＲであるフレームワーク領域を有するさらなる抗体を指す。本発明の文脈における実質的にヒトのフレームワークは、抗体１のフレームワーク領域と少なくとも８０％の配列同一性を有するフレームワークである。好ましくは、かかる実質的にヒトのフレームワークは、抗体１のフレームワーク領域と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％の配列同一性を有する。ヒトの生殖系列配列は、ＷＯ２００７／０４４４１１に記載されている。例えば、生殖系列の軽鎖フレームワークは、Ａｌ１、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０、Ａ２７、Ａ３０、ＬＩ、Ｌ１Ｉ、Ｌ１２、Ｌ２、Ｌ５、Ｌ１５、Ｌ６、Ｌ８、Ｏ１２、Ｏ２、およびＯ８からなる群から選択され得、生殖系列の重鎖フレームワークは、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−７２、ＶＨＩ−４６、ＶＨ３−９、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−３１、ＶＨ Ｉ−１８、ＶＨ Ｉ−６９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、およびＶＨ５−５Ｉからなる群から選択され得る。
【００４０】
抗体１由来のヒト改変抗体には、抗体１の配列内の残基について欠失および／または挿入および／または置換が含まれてもよい。しかし、最終コンストラクトは、抗体１の所望の機能特性（例えば、Ｐ２１９およびＶ１７５を含むエピトープでヒトＶＥＧＦＲ−３に結合する能力）を保有しなければならない。
【００４１】
抗体１に類似した機能的性質を有するヒト改変抗体は、いくつかの異なるアプローチを用いて産生することができ、それぞれのアプローチは、鋳型または親抗体として、抗体１（すなわち、配列番号５および配列番号１０にそれぞれ示されるＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを有する抗体）から始めて、さらなる抗体を作製する。第１のアプローチにおいて、抗体１のＣＤＲを、抗体１のフレームワーク領域と高い配列同一性を有する異なるヒトフレームワークに接合する。新しいフレームワークの配列同一性は、一般的に、抗体１の対応するフレームワークと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一である。この接合は、抗体１と比較して、結合親和性の低下をもたらし得る。この場合、このフレームワークは、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ.,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ８８,２８６９（１９９１）によって発表されている特定基準に基づいて、特定の位置で抗体１のフレームワークに復帰変異させることができる。復帰変異を考慮する残基の同定は、以下のとおりに実行してもよい。アミノ酸が以下のカテゴリーのいずれかの分類に入る時、用いられているヒト生殖系列配列のフレームワーク（アクセプターフレームワーク）アミノ酸を、抗体１のフレームワーク由来のフレームワーク（ドナーフレームワーク）アミノ酸と置換する：
（ａ）アクセプターフレームワークのヒトフレームワーク領域内のアミノ酸は、その位置でヒトフレームワークとは異なるが、抗体１の対応するアミノ酸は、その位置でヒトフレームワークに特有である；
（ｂ）アミノ酸の位置が、これらのＣＤＲのうちの１つに直接隣接している；
（ｃ）フレームワークアミノ酸の任意の側鎖原子が、３次元免疫グロブリンモデル内のＣＤＲアミノ酸の（中心から中心で）約５〜６オングストロームの任意の原子内にある。
【００４２】
アクセプターフレームワークのヒトフレームワーク領域内のアミノ酸および抗体１のフレームワーク内の対応するアミノ酸のそれぞれが、その位置でヒトフレームワークとは異なる場合、かかるアミノ酸を、その位置でヒトフレームワークに特有のアミノ酸と置換してもよい。これらの復帰変異基準は、抗体１の活性の回復を可能にする。
【００４３】
第２のアプローチにおいて、抗体１の機能的性質（例えば、Ｐ２１９およびＶ１７５を含むエピトープでヒトＶＥＧＦＲ−３に結合する能力）を保有する抗体１由来のヒト改変抗体を、（アミノ酸コードの縮重を避けるために無作為法または偏った方法のいずれか一方で）抗体１のＣＤＲを変異させることによって産生することができるが、抗体１のフレームワーク領域を保有する。好ましくは、抗体１由来のヒト改変抗体のＣＤＲのアミノ酸配列における変異（欠失、挿入および／または置換）は、抗体１のＣＤＲ配列と比較した場合、ヒト改変抗体のＣＤＲ配列において最大３個の変異、より好ましくは、２個の変異または最も好ましくは、単一変異に限定される。２個以上の変異が存在する場合、これらの変異は、様々な異なる方法でＣＤＲ配列の全域に分散していてもよい。例えば、これらの変異の全てが、単一ＣＤＲ配列（例えば、ＬＣＤＲ１）中に存在していてもよく、それぞれの変異が、異なるＣＤＲ配列中に存在していてもよく、または２個の変異が１つのＣＤＲ配列中に見出され、第３の変異が別のＣＤＲ配列に見出されてもよい。これにより、ヒト改変抗体のコンビナトリアルライブラリーが作製され、その際、これらのＣＤＲ配列は、上記に記載の１つまたは複数の位置で変異しているが、抗体１のフレームワーク領域を保有している。このライブラリーは、抗体１と比較した場合、類似のまたは改善された機能的性質を有するさらなる変異体を求めてスクリーニングすることができる。
【００４４】
抗体１に由来する（かつ、抗体１の機能的性質、例えば、Ｐ２１９およびＶ１７５を含むエピトープでヒトＶＥＧＦＲ−３に結合する能力を保有する）ヒト改変抗体を産生するさらなるアプローチは、上記の２つのアプローチを組み合わせて、フレームワークおよびＣＤＲの両方を変化させる。言い換えると、抗体１のＣＤＲを異なるフレームワークに接合させた後、特定のフレームワーク残基を、これらのＣＤＲ内で変化させることに加えて、復帰変異させてもよい。この方法の一般的原理については、Ｗｕ ｅｔ ａｌ.（１９９９）,Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.２９４：１５１−１６２に記載されている。
【００４５】
アミノ酸変化は、糖鎖付加部位の数または位置の変化などの、ヒト改変抗体の翻訳後プロセスを変えることもできる。
【００４６】
置換変異体は、抗体１の超可変領域の１つまたは複数の残基を置換することによって産生することができる。置換変異体を産生するためのかかる１つの方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟として知られる。超可変領域のいくつかの部位（例えば、６〜７個の部位）を変異させ、それぞれの部位で全ての可能なアミノ酸置換を起こす。このように産生した抗体変異体は、それぞれの粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として、線状ファージ粒子から１価の形式（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｆａｓｈｉｏｎ）でディスプレイされる。次いで、ファージディスプレイ変異体を、本明細書に開示するそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【００４７】
本明細書に開示するアッセイを用いて、抗体１由来のヒト改変抗体をスクリーニングし、本明細書に開示するインビトロ機能およびインビボ機能を有するそれらの抗体を同定することができる。
【００４８】
本発明の抗体は、単離抗体であってもよい。単離抗体は、実質的に、他の細胞物質および／または化学物質を含まない。
【００４９】
本明細書で使用する「エピトープ」という用語は、免疫反応を誘発し、かかる反応によって生成された特異的抗体へ結合することを可能にする抗原表面の特定分子領域を指す。エピトープは、直鎖状のエピトープであってもよく（すわなち、単一の短いひと配列内に含まれる全ての近接アミノ酸残基で構成されていてもよい）、または立体構造的エピトープであってもよい（すなわち、抗原の直鎖状配列の異なる部分内に存在するが、抗原がその適切な２次構造および３次構造を推測するとすぐに、抗体結合部位を形成するためにまとまるアミノ酸残基で構成されていてもよい）。一般には、エピトープは、少数（例えば、２〜５個）の重要なアミノ酸残基で構成され、（例えば、異なるアミノ酸残基への変異によって）これらの残基を破壊すると、抗原とエピトープ間の結合を顕著に減少させるか、または完全に消失させる。
【００５０】
本明細書に開示する分子と「競合する」抗体またはその抗原結合断片は、本発明の分子が結合する部位（複数可）と同一かまたは重複する部位（複数可）でヒトＶＥＧＦＲ−３と結合するものである。例えば、競合するヒト改変抗体またはその抗原結合断片は、例えば、抗体競合アッセイによって同定することができる。例えば、精製したまたは部分精製したヒトＶＥＧＦＲ−３の試料を、固体支持体に結合させる。次いで、本発明の抗体および試験モノクローナル抗体または抗原結合断片を、試験抗体または本発明の抗体のいずれかを標識して加える。この標識抗体および非標識抗体が、ＶＥＧＦＲ−３上の別々のおよび分離した部位に結合する場合には、疑わしい競合抗体が存在していようといまいと、この標識抗体は、同じレベルで結合する。しかし、相互作用部位が同一または重複している場合には、この非標識抗体が競合し、抗原に結合した標識抗体の量は低下する。この非標識抗体が過剰に存在する場合、非標識抗体が結合する。本発明の目的では、競合するヒト改変抗体またはその抗原結合断片は、本発明の抗体の結合を約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％減少させるものである。かかる競合アッセイを行うための手順の詳細は、当業で周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ,Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,ｐａｇｅｓ ５６７−５６９,ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３１４−２の中で見つけることができる。かかるアッセイは、精製抗体を用いることによって、定量的に行うことができる。１つの抗体をそれ自体に対して滴定することによって、標準曲線を作製する。すなわち、同じ抗体を、標識および競合者の両方のために使用する。プレートへの標識分子の結合を抑制する非標識の競合モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の能力を滴定する。結果をプロットし、望ましい程度の結合抑制を達成するのに必要な濃度を比較する。
【００５１】
ヒトＶＥＧＦＲ−３は２つの形態で存在し、これらは、長さが異なるｍＲＮＡ転写によって産生される。より長い転写物は、より短い転写物によってコードされるタンパク質と比較した場合に、Ｃ末端に６５個の余分なアミノ酸残基を含むタンパク質をコードし、主形態であるより長いタンパク質が組織中に検出される。これらの２つの変異体のＮ末端細胞外ドメインは同一である。「ヒトＶＥＧＦＲ−３」という用語は、特に記載しない限り、選択的ｍＲＮＡ転写物由来の野生型ヒトＶＥＧＦＲ−３の両方の変異体（すなわち、配列番号１７および配列番号１８）を指す。
【００５２】
抗体１のＬＣＶＲ領域の核酸配列および対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４および配列番号５と命名する。
【００５３】
抗体１のＨＣＶＲ領域の核酸配列および対応するアミノ酸配列を、本明細書でそれぞれ配列番号９および配列番号１０と命名する。
【００５４】
抗体１の軽鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を、本明細書でそれぞれ配列番号１１および配列番号１２と命名する。配列番号１２のアミノ酸残基１〜１９は、様々な哺乳類宿主細胞株からの軽鎖の発現および抽出に有用な分泌配列を構成するが、成熟抗体には存在しない。抗体１の成熟軽鎖のアミノ酸配列を、本明細書で配列番号１５と命名する。
【００５５】
抗体１の重鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１３および配列番号１４と命名する。軽鎖の配列の場合のように、配列番号１４のアミノ酸残基１〜１９は、様々な哺乳類宿主細胞株からの重鎖の発現および抽出に有用な分泌配列を構成するが、成熟抗体には存在しない。抗体１の成熟重鎖のアミノ酸配列を、本明細書で配列番号１６と命名する。
【００５６】
抗体の特異性を、親和性および／または結合活性に基づいて決定することができる。抗原の抗体との平衡解離定数（Ｋｄ）によって表される親和性は、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合強度を測定する。結合活性は、抗体とその抗原との間の結合強度の尺度である。結合活性は、エピトープと抗体上のその抗原結合部位との間の親和性、および特定のエピトープの抗原結合部位の数を表す抗体の結合価の両方に関連する。Ｋｄの値が低ければ低いほど、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合強度は強くなる。
【００５７】
本発明は、本発明の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド（例えば、抗体１−配列番号１３）、または本発明の抗体（例えば、抗体１）のＶＨ領域もしくはその一部のいずれか１つ、または任意の変異体を含むＶＨ  ＣＤＲのいずれか１つを構成するポリヌクレオチドも提供する。本発明は、本発明の抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド（例えば、抗体１−配列番号１１）、または本発明の抗体（例えば、抗体１）のＶＬ領域もしくはその一部のいずれか１つ、または任意の変異体を含むＶＨ  ＣＤＲのいずれか１つを構成するポリヌクレオチドも提供する。
【００５８】
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターも含む。体表的なベクターには、細胞、例えば、哺乳類細胞などの原核生物宿主もしくは真核生物宿主において複製が可能であるプラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルスおよびファージの核酸または他の核酸分子が含まれる。典型的な発現ベクターには、本発明の核酸分子の発現調節に有用な転写および翻訳のターミネーター、開始配列、ならびにプロモーターが含まれる。これらのベクターは、独立的なターミネーター配列、真核生物および原核生物の両方においてベクターの複製を可能にする配列を含む遺伝子発現カセット、すわなち、原核細胞系および真核細胞系の両方のシャトルベクターおよび選択マーカーも含んでもよい。一般的には、これらのベクターは、アンピシリンまたはネオマイシンなどの抗生物質に対する抵抗性付与などの、形質転換宿主の選択のための表現型形質を提供するマーカーを含む。
【００５９】
適切なプロモーターには、構成的プロモーターおよび誘導プロモーターが含まれる。代表的な発現制御配列／プロモーターには、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ラムダファージの主要なオペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、酵母の解糖プロモーター、例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酵母の酸ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母のα接合因子のプロモーター、ヒトサイトメガロウイスル由来のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ならびにポリオーマウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、およびサルウイルス由来のプロモーター、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターおよび後期プロモーターが含まれる。
【００６０】
本発明には、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞などの非ヒト宿主も含まれる。「宿主」とは、非ヒトの多細胞生物を意味し、「宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターが導入される細胞もしくは細胞集団を指す。本発明の宿主細胞は、植物、動物、脊椎動物、哺乳類、げっ歯類、マウス、霊長類、またはヒトの細胞もしくは細胞株などの真核細胞もしくは真核細胞株であってもよい。適切な真核細胞には、酵母および他の真菌、昆虫細胞、植物細胞、ヒト細胞、ならびにハイブリドーマ株、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞およびＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞を含む動物細胞が含まれる。「宿主細胞集団」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを導入し、発現させることができる培養細胞群を意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはベクターからの発現を支持する任意の宿主細胞を対象とする。
【００６１】
本発明の宿主は、原核生物であってもよい。適切な原核生物宿主には、例えば、大腸菌ＳＧ−９３６、大腸菌ＨＢ １０１、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌Ｘ１７７６、大腸菌Ｘ２２８２、大腸菌ＤＨＩ、および大腸菌ＭＲＣ１などの大腸菌、シュードモナス、枯草菌などのバチルス、ならびにストレプトマイセスが含まれる。
【００６２】
本発明には、本発明の抗体をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを発現する宿主細胞を培養すること、ならびに培地からこの抗体を回収することを伴う、本発明の抗体の産生法も含まれる。
【００６３】
本発明の抗体は、様々な経路によって投与される、ヒト医薬の薬剤として用いることができる。最も好ましくは、本発明の抗体を含む医薬組成物は、非経口投与用である。かかる医薬組成物は、当業で周知の方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ,１９ｔｈ ｅｄ.（１９９５）,Ａ.Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ.,Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ.参照）によって調製することができ、本明細書に開示する抗体、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む。
【００６４】
本発明の抗体の生理活性に関して本明細書で使用する「阻害する」または「中和する」という用語は、本明細書の実施例４または５で測定するヒトＶＥＧＦＲ−３生理活性を含むが、これに限定されないヒトＶＥＧＦＲ−３の生理活性を実質的に拮抗する、予防する、阻止する、抑制する、遅くする、破壊する、除去する、停止させる、減少させる、または逆転させる能力を意味する。
【００６５】
本明細書で使用する「治療する」および「治療」という用語は、目的が、疾患または障害と関連する、望まれない生理的変化を阻止するかまたはその速度を落とす（和らげる）ことである治療的処理を指す。有益なまたは所望の臨床結果には、検出可能であろうとなかろうと、症状の緩和、疾患もしくは障害の程度の減少、疾患もしくは障害の安定化（すなわち、その疾患もしくは障害は悪化しない）、疾患もしくは障害の進行の遅延または緩徐化、疾患もしくは障害の寛解または緩和、ならびにその疾患もしくは障害の（部分的または全体的な）緩解が含まれる。「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存時間と比較して、生存が延長することも意味し得る。治療を必要としているものには、すでに疾患もしくは障害を患っているもの、ならびに疾患もしくは障害を有する傾向にあるものが含まれる。
【００６６】
本発明の組成物は、「治療有効量」の本発明の抗体を含んでもよい。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するのに必要な投与量および期間で有効な量を指す。治療有効量の抗体は、個人の疾患状態、年齢、性、および体重などの因子、ならびにその個人において、抗体または抗体部分が所望の反応を誘発する能力に応じて変化し得る。治療有効量は、治療に有益な作用が、抗体もしくは抗体部分の任意の毒性作用または有害作用よりも上回る量でもある。
【００６７】
治療法は、単独でもしくは他の治療との組み合わせのいずれかで、事前に抗癌治療を受けていない患者における最初の治療として「第一」の治療であってもよく、または単独でもしくは他の治療との組み合わせのいずれかで、一度、事前に抗癌治療法を受けている患者における治療として「第二」の治療であってもよく、または単独でもしくは他の治療との組み合わせのいずれかで、「第三」の治療、「第四」の治療などであってもよい。
【００６８】
治療法は、部分的に成功しているが、特定の治療に対して不耐性である治療を事前に行っている患者に対しても与えられ得る。治療法は、補助療法として、すなわち、現在検出可能ではない疾患を患う患者における、または腫瘍の外科的除去後の癌の再発を防ぐために与えられてもよい。
【００６９】
本発明が治療する癌には、（肺、胸、または前立腺から転移した腫瘍を含む）リンパ系を経由して転移した原発腫瘍および続発性腫瘍もしくは転移性腫瘍が含まれる。
【００７０】
治療され得る癌には、血管新生化していない腫瘍、または実質的にはまだ血管新生化していない腫瘍、ならびに血管新生化した腫瘍が含まれる。これらの癌は、（白血病およびリンパ腫などの）非固形腫瘍を含んでもよく、固形腫瘍であってもよい。
【００７１】
本発明の抗体で治療されるべき癌の種類には、卵巣癌、ヒト赤白血病、頭頸部癌、乳癌、腎細胞癌、膵癌、肺癌および大腸癌が含まれる。さらに、リンパ脈管新生の促進におけるＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＥＧＦＲ−３経路の役割、ならびに、ほとんどの種類の癌について、転移の第１部位がリンパ節であることを考慮すると、ＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＥＧＦＲ−３経路の遮断が、例えば、乳癌、膵癌、胃癌または結腸直腸(colorectal)癌からのリンパ節転移を抑制すると期待される（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ.,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.,６６（５）,２６５０−２６５７（２００６））。
【００７２】
本抗体を、単独（単剤療法）で、または１つまたは複数の治療効果のある薬剤もしくは治療と組み合わせて（併用療法で）投与してもよい。他の治療効果のある薬剤を、本抗体と結合させてもよく、本抗体と同じ組成物に組み込んでもよく、または、別々の組成物として投与してもよい。他の治療効果のある薬剤または治療を、本抗体の投与前、投与中および／または投与後に投与してもよい。他の治療効果のある薬剤を、本抗体の治療効果を増大させるために、または本抗体の負の副作用を減少させるために投与してもよい。
【００７３】
本明細書に記載の治療法を用いて、サルおよびヒトなどの霊長類、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、ウサギ、ならびにラットおよびマウスなどのげっ歯類を含む任意の適切な哺乳類を治療することができる。一実施形態において、治療される哺乳類はヒトである。
【００７４】
以下の実施例を参照することによって、抗体１が、エピトープの優勢成分としてＰ２１９を、エピトープの従属成分としてＶ１７５を、エピトープの少数成分としてＬ２２１を含むヒトＶＥＧＦＲ−３上のエピトープに結合することが理解されるであろう。さらに、抗体２（マウスＶＥＧＦＲ−３に対して作られた参照ラットモノクローナル抗体）が、残基Ｌ２１９およびＶ２２１を含むマウスＶＥＧＦＲ−３上のエピトープに結合することが理解され得る。さらに、これらの実施例は、抗体１が、ヒトＶＥＧＦＲ−３に対して高い親和性（５６ｐＭ）を有し、リガンドＶＥＧＦ−ＣのＶＥＧＦＲ−３への結合を阻止することができ、ＶＥＧＦ−Ｃに刺激される分裂促進反応を阻止することができ、かつ卵巣癌およびＨＥＬのインビボ異種移植モデルに有効であることも示す。最後に、抗体２が、頭頸部癌、乳癌、肺癌、ＲＣＣ、膵癌および大腸癌の異種移植モデルに有効であることも理解され得る。
【００７５】
実施例１
本発明の抗体は、当業で周知の様々な適切な方法を用いて作製し、精製してもよい。例えば、ＨＥＫ ２９３ ＥＢＮＡまたはＣＨＯなどの適切な宿主細胞を、最適に定めた重鎖に対する軽鎖のベクター比または軽鎖（例えば、抗体１については配列番号１２）および重鎖（例えば、抗体１については配列番号１４）の両方をコードする単一ベクター系を用いて、抗体を分泌する発現系で一過的にまたは安定にトランスフェクトする。抗体が分泌された浄化培地を、多くの一般的な技術のいずれかを用いて精製する。例えば、この培地を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合性のある緩衝液で平衡化したプロテインＡまたはプロテインＧのセファロースＦＦカラムに都合よくアプライしてもよい。カラムを洗浄し、非特異的な結合成分を除去する。例えば、結合抗体を、（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．８から０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２．５などの）ｐＨ勾配によって溶出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどによって抗体画分を検出し、次いで、プールする。使用目的に応じで、場合によって、さらなる精製を行う。一般的な技術を用いて、本抗体を濃縮し、かつ／または無菌濾過してもよい。可溶性凝集物および多量体は、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む一般的な技術によって効果的に除去してもよい。これらのクロマトグラフィーステップ後の本抗体の純度は、９９％を上回る。生成物を、すぐに−７０℃で凍結してもよく、または凍結乾燥してもよい。抗体１の（Ｋａｂａｔ法を用いて決定した）ＣＤＲおよび可変領域のアミノ酸配列を以下に示す。
【００７６】
表１．軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列
【表１】
2013538813.tif 000002
【００７７】
表２．重鎖ＣＤＲアミノ酸配列
【表２】
2013538813.tif 000003
【００７８】
表３．ＬＣＶＲ、ＨＣＶＲ、軽鎖および重鎖のアミノ酸配列
【表３】
2013538813.tif 000004
【００７９】
実施例２
以下の実施例において、抗体１および抗体２が結合するＶＥＧＦＲ−３受容体上のエピトープの解明をもたらす実験について記載する。
【００８０】
ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣならびにマウスおよびヒトのｓＲ３−ＡＰの生成
組み換え成熟ヒトＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣを、Ｐｙｔｏｗｓｋｉ,ｅｔ ａｌ.（２００５）Ｊ.Ｎａｔｌ.Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ.９７（１）：１４−２１に記載のとおりに産生する。ヒトおよびマウスのＶＥＧＦＲ−３（ｓＲ３）の全長（すなわち、Ｉｇドメイン１〜７）可溶性細胞外領域を、ヒトアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）をコードするｃＤＮＡに融合し、融合タンパク質ｓＲ３−ＡＰを産生する（Ｐｅｒｓａｕｄ ｅｔ ａｌ.（２００４）Ｊ.Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１７：２７４５−５６；Ｐｙｔｏｗｓｋｉ,ｅｔ ａｌ.（２００５）Ｊ.Ｎａｔｌ.Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ.９７（１）：１４−２１）。
【００８１】
マウス−ヒトキメラｓＲ３−ＡＰおよびｓＲ３−ＡＰの部位特異的変異体の生成
ｓＲ３−ＡＰの３つのＮ末端免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメインのキメラのマウス−ヒトコンストラクトおよびヒト−マウスコンストラクトを、重複ＰＣＲ技術（Ｈｏ,ｅｔ ａｌ.（１９８９）,Ｇｅｎｅ ７７：５１−５９）を用いて調製し、ＡＰ発現ベクターにクローニングする（上記のＰｅｒｓａｕｄ,ｅｔ ａｌ.；上記のＰｙｔｏｗｓｋｉ,ｅｔ ａｌ.）。ｓＲ３−ＡＰコンストラクトの部位特異的変異誘発を、メーカーの取扱説明書にしたがって、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて行う。所望の置換の存在を、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、変異領域全域のｃＤＮＡの両方の鎖の配列解析により確認する。
【００８２】
可溶性ＶＥＧＦＲ−３タンパク質の発現：
野生型ｓＲ３−ＡＰおよび変異ｓＲ３−ＡＰの細胞外領域をコードするｃＤＮＡを、化学的に定義した、タンパク質を含まないＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、番号１２３３８０２６）で懸濁培養したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、番号Ｒ７９００７）にトランスフェクトする。場合によって、選択したｓＲ３−ＡＰを、前述（Ｚｈｕ,ｅｔ ａｌ.,（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.５８：３２０９−１４）のとおりに、抗ＡＰ抗体親和性クロマトグラフィーを用いて、または本明細書に記載の固定化したｍＡｂ抗体１およびｍＡｂ抗体２を用いる親和性クロマトグラフィーによって精製する。
【００８３】
馴化培地（ＣＭ）におけるｓＲ３タンパク質の標準化；
ＣＭを、Ｔｒｏｐｉｘ ＴＲ７１７１ルミノメーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社,Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ,ＣＡ）を用いるＧｒｅａｔ ＥｓｃＡＰｅ（商標）ＳＥＡＰ化学発光キット２．０（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社,Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ,ＣＡ）を用いてＡＰ活性についてアッセイする。このＣＭを、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ−ＢＳＡ）中のそれらのＡＰ活性に比例して希釈し、再試験をして、ＡＰ活性測定およびウエスタンブロットによる標準化を検証する。
【００８４】
ｓＲ３−ＡＰ結合アッセイ：
標準化したＣＭの百（１００）μｌを、ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣまたは試験抗体のいずれか一方でコーティングした９６ウェルマイクロリットルプレートに移す（２００ｎｇ／ウェル）。２時間のインキュベーション後、これらのプレートを５回洗浄し、結合したｓＲ３−ＡＰを化学発光によって検出する。
【００８５】
抗体１およびマウスＶＥＧＦＲ−３に対する参照ラットモノクローナル抗体（「抗体２」と命名）の結合特異性を、マウスおよびヒトのＶＥＧＦＲ−３の固定化した細胞外部分（Ｉｇドメイン１〜７）を用いてＥＬＩＳＡによって試験する。抗体１および抗体２は、それぞれ強く、用量依存的にヒトおよびマウスのＶＥＧＦＲ−３に結合する。ヒト抗体の抗体１は、１０ｎＭを超える濃度で、マウスＶＥＧＦＲ−３とわずかではあるが再現性のある交差反応を示す。対照的に、抗体２は、ヒトＶＥＧＦＲ−３への全ての検出可能な結合を示すことができない。
【００８６】
抗体１および抗体２のエピトープは、ＶＥＧＦＲ−３の第２の免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメイン内に完全に含まれる：
ＶＥＧＦ受容体ファミリーの全３メンバーのリガンド結合部位は、細胞外ドメインの３つのＮ末端Ｉｇドメイン内に含まれる。抗体１および抗体２の種特異性を利用して、その最初の３つのＩｇドメインがこれらの抗体のエピトープを含むことを確かめる。マウスおよびヒトのＩｇドメイン１〜３をコードするＤＮＡ配列を、以下のＶＥＧＦＲ−３細胞外ドメインコンストラクトを形成するために様々な組み合わせで交換する：ｉ）野生型ヒト；ｉｉ）野生型マウス；ｉｉｉ）キメラ１（ヒトＩｇ１−ヒトＩｇ２−マウスＩｇ３）；キメラ２（ヒトＩｇ１−マウスＩｇ２−マウスＩｇ３）；（ｉｖ）キメラ３（マウスＩｇ１−ヒトＩｇ２−マウスＩｇ３）および（ｖ）キメラ４（ヒトＩｇ１−マウスＩｇ２−ヒトＩｇ３）。これらのコンストラクトを、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）との融合タンパク質として発現させる（上記のＰｅｒｓａｕｄ,ｅｔ ａｌ.）。コードタンパク質を、一過的にトランスフェクトした細胞の馴化培地（ＣＭ）から単離し、タンパク質濃度およびＡＰ活性を等しくするために標準化する。マウスおよびヒトのｓＲ３−ＡＰは、同様の親和性でヒトＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣに結合する。したがって、正しいタンパク質フォールディングがキメラ受容体に保存されていると判定するための手段として、様々なｓＲ３−ＡＰキメラのヒトＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣに結合する能力を試験する。抗体１および抗体２のキメラタンパク質１〜４に結合する能力は、抗体１および抗体２のエピトープが、それぞれ、ヒトおよびマウスのＶＥＧＦＲ−３の第２のＩｇドメイン（Ｉｇ２）内に完全に含まれていることを示す。例えば、抗体１は、Ｉｇドメイン２にマウスＶＥＧＦＲ−３配列を含むキメラ２またはキメラ４には結合しない。
【００８７】
抗体１および抗体２のエピトープを構成するＶＥＧＦＲ−３のアミノ酸の同定：
ヒトタンパク質とマウスタンパク質との間で異なるＶＥＧＦＲ−３の第２のＩｇドメインのアミノ酸配列内の十二（１２）個の位置を同定する。ヒトおよびマウスのタンパク質内の残基と共に、これらの位置を表４に示す。
【００８８】
表４
【表４】
2013538813.tif 000005
【００８９】
部位特異的変異誘発を用いて、ヒトおよびマウスの配列内の種特異的アミノ酸のそれぞれを、反対の種の対応するオルソログに個々に変化させる。次いで、それぞれの変異体タンパク質を、第１、第２および第３のＩｇドメインをコードするｓＲ３−ＡＰタンパク質との関連で発現させる。エピトープマッピングを、２つの相補的アプローチによって行う。第１のアプローチでは、マウスオルソログまたはヒトオルソログへの個々のアミノ酸置換により、ヒト特異的抗体１およびマウス特異的抗体２が、それらのそれぞれのヒトｓＲ３−ＡＰおよびマウスｓＲ３−ＡＰへの結合を失うことを測定する。第２のアプローチでは、マウスオルソログまたはヒトオルソログへの個々のアミノ酸置換によって、抗体１および抗体２が、反対の種のｓＲ３−ＡＰへの結合を獲得することを測定する。上記の変異が、第１のアプローチでの結合の喪失および第２のアプローチでの結合の獲得をもたらす場合、残基は、抗体のエピトープの一部を構成するための有力候補として考えられる。全変異体タンパク質に関して、ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣへの結合を並行して測定し、タンパク質構造の全体的な変化について調べる。
【００９０】
結合実験を３つ組で行い、３回の別々の実験の平均値および標準偏差として結果を計算する。ヒトｓＲ３−ＡＰのＩｇ２ドメイン中の、調べた１２個の置換のうち、たった１個（Ｖ１８４Ｌ）が、ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣおよび抗体１の両方への結合を完全に失う。したがって、この変化は、ヒトｓＲ３−ＡＰの全体構造を妨げるものと考えられる。置換Ｖ１７５Ａは、ＶＥＧＦ−Ｃおよび抗体１の両方への結合を約５０％失う。置換Ｐ２１９Ｌは、ＶＥＧＦ−Ｃへの結合を約７５％失い、抗体１への結合をほぼ完全に（約９５％）失う。Ｌ２２１のＶへの変化は、ヒトｓＲ３−ＡＰのＶＥＧＦ−Ｃへの結合に影響を与えないが、抗体１への結合を約５５％減少させる。残りの置換は、ＶＥＧＦ−Ｃまたは抗体１のいずれか一方への結合を実質的に失わない。
【００９１】
マウスｓＲ３−ＡＰにおけるマウスからヒトへの個々の変異を、ヒト特異的抗体１への結合の増加について調べる場合、置換Ａ１７５Ｖ（約１２倍）およびＬ２１９Ｐ（約６０倍）について、野生型マウスｓＲ３−ＡＰへの結合を上回る顕著な増加が観察される。他の置換はどれも、バックグラウンドを上回る結合の顕著な増加をもたらさない。
【００９２】
したがって、抗体１のエピトープを含むようにアミノ酸を考慮するための基準を設定し、その際、ヒトｓＲ３−ＡＰにおけるヒトからマウスへのオルソログ置換は、抗体１への結合を顕著に減少させるが、ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣへの結合を減少させる（しかし、消滅はさせない）か、または影響を受けないままにする。さらに、抗体１のエピトープを含むためのアミノ酸については、マウスｓＲ３−ＡＰにおけるマウスからヒトへのオルソログ置換が、抗体１への結合を顕著にもたらす。抗体１について、これらの基準は、ヒトｓＲ３−ＡＰのＶ１７５およびＰ２１９によって満たされる。ヒトｓＲ３−ＡＰにおけるマウスオルソログへの置換が、ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣおよび抗体１の両方への結合を消滅させるが、マウスｓＲ３−ＡＰにおけるこの位置でのヒトオルソログへの対応する置換は、抗体１への結合をもたらさないので、Ｖ１８４を排除する。ヒトｓＲ３−ＡＰにおけるロイシン２２１から対応するマウスバリンへの変化は、抗体１への結合を５５％減少させる。しかし、マウスｓＲ３−ＡＰにおけるこの位置でのヒトオルソログへの対応する置換は、抗体１への結合をもたらさない。それゆえに、Ｌ２２１は、抗体１のエピトープにわずかに寄与することができるが、上記で設定した全ての基準を満たさない。
【００９３】
位置２２１での残基の役割をさらに研究するために、ヒトｓＲ３−ＡＰにおけるＰ２１９ＬおよびＬ２２１Ｖの変異を、単一コンストラクト中で組み合わせる。ヒトｓＲ３−ＡＰへの結合を５％保持する単一Ｐ２１９Ｌ変異体と比較して、２重変異体の抗体１への結合は、本質的に消滅する。
【００９４】
まとめると、これらの結果は、ヒトＶＥＧＦＲ−３上の抗体１のエピトープの優勢成分としてＰ２１９を、従属成分としてＶ１７５を特定し、Ｌ２２１は、このエピトープのマイナー成分でもある可能性を上げる。
【００９５】
次いで、同様の方法を用いて、マウスＶＥＧＦＲ−３のＩｇドメイン２の残基が、抗体２のエピトープを構成することについて試験を行う。再び、結合実験を３つ組で行い、３回の別々の実験の平均値および標準偏差として結果を計算する。マウスアミノ酸を対応するヒトアミノ酸に変化させる１２個の個々の置換のうち４個の置換（Ｈ１７７Ｗ、Ｐ１９４Ｓ、Ｒ１９９ＨおよびＮ２１４Ｄ）は、マウスｓＲ３−ＡＰのＶＥＧＦ−Ｃおよび抗体２の両方への結合を顕著に減少させる。興味深いことに、位置２１９および２２１での変異（Ｌ２１９ＰおよびＶ２２１Ｌ）は、抗体２への結合を減少させるが、ＶＥＧＦ−Ｃへの結合を減少させない。ヒトＶＥＧＦＲ−３における、位置２１９および２２１でのヒトからマウスへの対応する変異（Ｐ２１９ＬおよびＬ２２１Ｖ）は、抗体２の野生型ヒト配列への結合よりも、それぞれ約５５倍および約１０倍上回るレベルで、抗体２のヒトｓＲ３−ＡＰへの結合を可能にする。位置２１９および２２１にヒトオルソログアミノ酸を含むマウス変異体タンパク質のＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣへの結合は、わずかに上昇するかまたは影響されないが、これらの変異体タンパク質の抗体２への結合は、消滅する（２１９）かまたは約８５％減少する（２２１）ことも示される。
【００９６】
抗体２のエピトープを含むようにアミノ酸を考慮するために設定された基準は、マウスｓＲ３−ＡＰにおけるヒトオルソログ置換が、抗体２への結合を顕著に減少させるが、ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣへの結合を減少させる（しかし、消滅はさせない）かまたは影響を受けないままにする。さらに、抗体２のエピトープを含むためのアミノ酸については、ヒトｓＲ３−ＡＰにおけるヒトからマウスへのオルソログ置換が、抗体２への結合を顕著にもたらす。抗体２について、これらの基準は、マウスｓＲ３−ＡＰのＰ２１９およびＬ２２１によって満たされる。
【００９７】
このデータを表す別の方法は、ヒトｓＲ３−ＡＰ配列内のヒトからマウスへの個々のオルソログ変異のそれぞれによって構成される野生型マウスｓＲ３−ＡＰに、抗体２が結合する最大の割合を計算することである。これは、ヒトｓＲ３−ＡＰ配列内のＰ２１９ＬおよびＬ２２１Ｖの個々の置換が、それぞれ、野生型マウスｓＲ３−ＡＰで見られる抗体２への最大結合の約５％および約１％の再構成をもたらすことを示す。したがって、Ｌ２１９およびＶ２２１が、抗体２のエピトープの成分であると結論づけられる。
【００９８】
抗体１および抗体２が、それぞれ、ヒトＶＥＧＦＲ−３およびマウスＶＥＧＦＲ−３中の高度に類似したエピトープに結合し、いずれの場合にも、位置２１９の残基が重要な残基であることが分かり得る。以下の実施例のデータは、抗体１および抗体２の両方がそれらのそれぞれの抗原の活性を阻止し、インビボ異種移植モデルにおける腫瘍増殖を抑制することができる中和抗体であることを示す。かかるデータは、本明細書で同定したＶＥＧＦＲ−３のＩｇドメイン中の新規エピトープが、中和エピトープである重要で有利な特徴を提供することを示すためのさらなる証拠を提供する。したがって、前記エピトープへの抗体結合は、リガンド結合、ＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達を遮断し、インビボでの腫瘍増殖を抑制することができる。
【００９９】
実施例３：抗ＶＥＧＦＲ−３抗体に対する親和性（Ｋｄ）測定
抗体１の結合速度を、２０℃で、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００バイオセンサー（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）,Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ,ＮＹ）において表面プラズモン共鳴によって測定する。ヒトＶＥＧＦＲ−３の可溶性細胞外ドメイン（ｓＲ３−ＡＰ）を、センサーチップ上に固定化し、０．８から６．２５ｎＭの間の濃度で、抗体１をこのセンサーの表面に注入する。センサーグラムを、ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．２プログラムを用いて評価し、オン速度（ｋａ）およびオフ速度（ｋｄ）を決定する。解離定数（Ｋｄ）を、以下の式を用いて、ｋａ速度およびｋｄ速度から計算する：Ｋｄ＝ｋａ／ｋｄ。
【０１００】
ＢＩＡｃｏｒｅ動態解析により、抗体１の固定化ｓＲ３−ＡＰへの結合のＫｄは５６ｐＭである。したがって、抗体１は、ヒトＶＥＧＦＲ−３に対して極めて高い親和性を有し、その際、前記親和性は、ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣのｓＲ３−ＡＰの親和性よりもほぼ２０倍を上回る。
【０１０１】
実施例４：ＶＥＧＦＲ−３へのＶＥＧＦ−Ｃ結合の抗ＶＥＧＦＲ−３抗体による阻止
ヒトＶＥＧＦＲ−３へのＶＥＧＦ−Ｃ結合を阻止するＶＥＧＦＲ−３抗体の能力を測定するために、競合ＶＥＧＦ−Ｃブロッキングアッセイを利用する。抗体または可溶性ファージ粒子を、０．００１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの濃度でｓＲ３−ＡＰ５０ｎｇと混合し、室温で１時間インキュベートし、ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣ（２００ｎｇ／ウェル）でコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレートに移す。さらに２時間後、これらのプレートを５回洗浄し、ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ社）を加え、ＯＤ４０５ｎｍで、結合したｓＲ３−ＡＰ分子を定量化する。ＩＣ５０、すなわち、ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣへのｓＲ３−ＡＰ結合の５０％阻害に必要なＦａｂまたはＩｇＧの濃度を計算する。抗体１のＦａｂ型およびＩｇＧ型は、それぞれ、２ｎＭおよび１．３ｎＭのＩＣ５０で、固定化ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣへのｓＲ３−ＡＰ結合を強く阻止する。それに反して、ヒトＩＧＦ受容体を標的にし、同じファージライブラリーから得られる対照抗体は不活性である。
【０１０２】
実施例５：ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣに刺激される分裂促進反応の抗体１による抑制
ＶＥＧＦＲ−３によって媒介されるシグナル伝達を抑制する抗体１の能力を試験するために、ヒトＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインをヒトｃＦＭＳの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに融合したＶＥＧＦＲ−３のキメラ形態を発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞株を調製する。親細胞によるＶＥＧＦＲ−３の内因性発現は検出されず、細胞膜上のキメラ受容体の局在をＦＡＣＳ解析によって示す。ＶＥＧＦＲ−３−ＦＭＳ細胞（５×１０３細胞／ウェル）を、無血清培地２００ｍｌを含む９６ウェル組織培養プレート（Ｗａｌｌａｃ社,Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ,ＭＤ）に播種し、３７℃で７２時間インキュベートする。抗体を最高で２０ｎＭ加え、３７℃で１時間プレインキュベートし、その後、ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣを、最終濃度２０ｎｇ／ｍｌまで加える。インキュベーション１８時間後、トリチウム化チミジン０．２５ｍＣｉ（［３Ｈ］−ＴｄＲ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を各ウェルに加え、さらに４時間インキュベートする。これらの細胞を氷上に置き、血清含有培地で一度洗浄し、４℃で１０分間、１０％ＴＣＡとインキュベートし、２％ＳＤＳ２５ｍｌに可溶化する。取り込まれた放射活性をシンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ社,Ｍｏｄｅｌ １４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ）で測定する。ＶＥＧＦＲ−３−ｃＦＭＳを発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞による［３Ｈ］−ＴｄＲの取り込みを、ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣの添加によって少なくとも３倍刺激する。分裂促進反応を、ＩＣ５０値が５ｎＭの抗体１によって特異的に、用量依存的に阻止する
【０１０３】
実施例６：ヒト卵巣癌細胞株の皮下異種移植モデルにおける抗ＶＥＧＦＲ−３モノクローナル抗体
この実験において、抗ＶＥＧＦＲ−３モノクローナル抗体の抗体１および抗体２を、免疫不全ＳＣＩＤマウスにおいて、単独で、またはヒト卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−８（ＮＣＩ−６０,Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ,ＮＣＩ／ＮＩＨ）の異種移植と組み合わせて用いる。ＯＶＣＡＲ−８は、ヒトＶＥＧＦＲ−３を発現する数少ないヒト癌細胞株のうちの１つである。この実験の予想は、抗体２が、増殖する腫瘍のマウス間質における血管新生およびリンパ脈管新生を阻止するが、その腫瘍には影響を与えないことである。対照的に、抗体１は、ヒト癌細胞にのみ作用することが期待される。
【０１０４】
ＯＶＣＡＲ−８細胞を、７５匹のメス胸腺欠損マウスの左脇腹に１×１０７細胞／マウスでｓ．ｃ．注射する。腫瘍が約１８０ｍｍ３に達した時、細胞移植後１３日目に、これらのマウスを、以下の５つの治療群に無作為に分ける（ｎ＝１２）：ＵＳＰ生理食塩水対照、０．５ｍｌ／用量；４０ｍｇ／ｋｇのＲａｔ ＩｇＧ；４０ｍｇ／ｋｇの抗体１；４０ｍｇ／ｋｇの抗体２および４０ｍｇ／ｋｇの抗体１＋４０ｍｇ／ｋｇの抗体２。抗ＶＥＧＦＲ−３ｍＡｂおよび対照に、月曜−水曜−金曜スケジュールでｉ．ｐ．注射する。腫瘍測定を週に２回記録する。各治療群の相対腫瘍体積対生理食塩水対照群の相対腫瘍体積の比として、各治療群のＴ／Ｃ％を計算する。４１日目を経たＲＭ  ＡＮＯＶＡを用いて、治療群間の腫瘍増殖を比較する。
【０１０５】
抗体２は、７１％のＴ／Ｃ％で、ＯＶＣＡＲ−８腫瘍の増殖を有意に抑制する（Ｐ＝０．０２９９）。抗体１は、このモデルにおいて有効である傾向を有する（Ｔ／Ｃ％は７４％であった）が、腫瘍抑制の程度は、有意性に達しない（Ｐ＞０．０５）。これは、４１日目におけるこの群の広範な腫瘍体積（３３５−１５０４ｍｍ３）に起因し得、この群が統計的有意性に達するのを妨げ得る。
【０１０６】
抗体１および抗体２の組み合わせは、同時に、抗体２の腫瘍抑制効果を増強する（Ｔ／Ｃ％は４７％であり、組み合わせ効果は、いずれかの抗体単独の場合と比較して、有意性に達する（Ｐ≦０．０３５８））。
【０１０７】
抗体２は、ＯＶＣＡＲ−８腫瘍の増殖を有意に抑制するが、このモデルにおいて、抗体１は統計的有意性に達しないで有効であるように見える。しかし、２つのモノクローナル抗体の組み合わせは、抗体２の単剤療法と比較して、ＯＶＣＡＲ−８腫瘍増殖を有意に抑制するので、抗体１は、この実験において治療効果を示したと結論づけられる。したがって、本発明の抗体は、卵巣癌のインビボモデルにおいて抗腫瘍効果を示す。
【０１０８】
実施例７：ヒト赤白血病（ＨＥＬ）細胞の皮下異種移植モデルにおける抗ＶＥＧＦＲ−３ｍＡｂ抗体１
以下の実施例において、ヒト赤白血病（ＨＥＬ）細胞の皮下異種移植モデルにおける抗体１の顕著な抗腫瘍効果を測定する。
【０１０９】
１ケージあたり５〜６匹を収容したｎｕ／ｎｕマウス（メス、７〜８週齢）に、５×１０６ＨＥＬ細胞／マウスで皮下注射する。腫瘍が約４００ｍｍ３に達した時、マウスを、腫瘍容積によって以下の４つの治療群のうちの１つに無作為に分ける（ｎ＝１１／群）：
１）ＵＳＰ生理食塩水、１０ｍｌ／ｋｇ
２）抗体１、６０ｍｇ／ｋｇ（１日目に１５０ｍｇ／ｋｇの負荷用量）
３）抗体１、２０ｍｇ／ｋｇ（１日目に５０ｍｇ／ｋｇの負荷用量）
４）抗体１、６ｍｇ／ｋｇ（１日目に１５ｍｇ／ｋｇの負荷用量）。
【０１１０】
抗体１をＵＳＰ生理食塩水で調製する。週に２回、投薬液剤１０ｍｌ／体重ｋｇでｉ．ｐ．投与する。第１の用量、負荷用量を１日目に投与し、続いて、本研究期間中、週に２回、維持量を投与する。腫瘍体積を週に２回測定する。本研究期間中、少なくとも週に２回、体重を記録する。各治療群の相対腫瘍体積対生理食塩水対照群の相対腫瘍体積の比として、１８日目の各治療群のＴ／Ｃ％を計算する（表５）。反復測定ＡＮＯＶＡにより、治療群の腫瘍増殖および体重変化を比較する。
【０１１１】
抗体１での治療は、ＨＥＬ腫瘍増殖を用量依存的に抑制し、６０ｍｇ／ｋｇの抗体１は有意に腫瘍増殖を抑制する（Ｐ＝０．００３１）。この研究における抗体１の治療では、体重に効果はない（表５）。したがって、本発明の抗体は、ＨＥＬのインビボモデルにおいて抗腫瘍効果を示すが、そのモデルにおいて有害な副作用は最小である。
【０１１２】
表５
【表５】
2013538813.tif 000006
【０１１３】
実施例８：ＣＡＬ２７扁平上皮癌の異種移植モデルにおける、シスプラチンと組み合わせた抗ＶＥＧＦＲ−３ｍＡｂ抗体２
頭頸部癌における抗ＶＥＧＦＲ−３抗体の活性について試験するために、ＣＡＬ２７異種移植モデルを用いる。１×１０７細胞／マウスのＣＡＬ２７細胞懸濁液を、６０匹のメス胸腺欠損マウスの左脇腹にｓ．ｃ．注射する。腫瘍が約１８０ｍｍ３に達した時、細胞移植後８日目に、これらのマウスを以下の４つの治療群に無作為に分ける（ｎ＝１２）：１）ＵＳＰ生理食塩水対照、０．５ｍｌ  ｉ.ｐ.、１週間に３日、２）４０ｍｇ／ｋｇの抗体２、１週間に３日、３）７ｍｇ／ｋｇのシスプラチン、ｑ７ｄ、４）４０ｍｇ／ｋｇの抗体２、１週間に３日＋７ｍｇ／ｋｇのシスプラチン、ｑ７ｄ。
【０１１４】
６１日目を経たＲＭ  ＡＮＯＶＡを用いて、治療群間の腫瘍増殖を比較する。カイ二乗検定を用いて、治療群間の腫瘍退縮の数における統計的有意性について試験する。
【０１１５】
抗体２またはシスプラチンを用いる単剤療法は、ＵＳＰ生理食塩水対照と比較して、ＣＡＬ２７腫瘍の増殖を有意に抑制する（Ｐ≦０．００７７）。抗体２およびシスプラチンのＴ／Ｃ％値は、それぞれ５５％および３９％である。抗体２およびシスプラチンの両方を用いる併用療法は、単剤療法と比較した場合、腫瘍増殖の有意な抑制をもたらす（Ｐ≦０．０３２２）。併用療法の効果は、分画産物法（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｍｅｔｈｏｄ）によって測定した場合、添加剤を上回る。したがって、ＶＥＧＦＲ−３のＩｇ２ドメイン中のエピトープへの抗ＶＥＧＦＲ−３抗体結合は、頭頸部癌のインビボモデルにおいて、単剤療法またはシスプラチンとの組み合わせのいずれか一方で抗腫瘍効果を示す。
【０１１６】
実施例９：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌の異種移植モデルにおける、５−フルオロウラシル／ロイコボリンと組み合わせた抗ＶＥＧＦＲ−３ｍＡｂ抗体２
乳癌における抗ＶＥＧＦＲ−３抗体の活性について試験するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルを用いる。ＮＩＨ ｎｕ／ｎｕ胸腺欠損マウス（メス、８週齢）に、０．４ｍｌ（１：１ ｗ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ）中６×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、乳腺脂肪体に皮下注射する。腫瘍が約３００ｍｍ３に達した時、マウスを腫瘍サイズによって以下の治療群に無作為に分ける（ｎ＝１２）：１）ＵＳＰ生理食塩水、１０μｌ／ｇ、１週間に３回、２）４０ｍｇ／ｋｇの抗体２、１週間に３回、３）１２５ｍｇ／ｋｇの５ＦＵ（５−フルオロウラシル）＋６２ｍｇ／ｋｇのＬＶ（ロイコボリン）、１週間に１回、４）４０ｍｇ／ｋｇの抗体２、１週間に３回＋それぞれ１２５ｍｇ／ｋｇおよび６２ｍｇ／ｋｇの５ＦＵ／ＬＶ、１週間に１回。全ての薬剤を治療の日に調製し、ｉ．ｐ．投与する。細胞毒性治療を、抗体治療の開始の１日前に開始する。
【０１１７】
生理食塩水対照群の腫瘍体積対治療マウスの腫瘍体積の比較は、抗体２または抗体２＋５ＦＵ／ＬＶ投与によって顕著な腫瘍増殖抑制を示す（表６参照）。抗体２＋５ＦＵ／ＬＶの組み合わせの効果は、単剤療法の効果以下であるが、その組み合わせでは抗腫瘍効果が増加する傾向がある。したがって、ＶＥＧＦＲ−３のＩｇ２ドメイン中のエピトープへの抗ＶＥＧＦＲ−３抗体結合は、（生理食塩水対照と比較して）乳癌のインビボモデルにおいて、単剤療法または５ＦＵ／ＬＶとの組み合わせのいずれか一方で抗腫瘍効果を示す。
【０１１８】
表６
【表６】
2013538813.tif 000007
１３４日を経たＲＭ ＡＮＯＶＡ
【０１１９】
実施例１０：ＮＣＩ−Ｈ２９２肺癌の異種移植モデルにおける、抗ＶＥＧＦＲ−３ｍＡｂ抗体２単独およびドセタキセルと組み合わせた抗ＶＥＧＦＲ−３ｍＡｂ抗体２
肺癌における抗ＶＥＧＦＲ−３抗体の活性について試験するために、ＮＣＩ−Ｈ２９２異種移植モデルを用いる。ｎｕ／ｎｕマウス（メス、８週齢）に、２×１０６ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞／マウスで皮下注射する。腫瘍が約３００ｍｍ３に達した時、マウスを腫瘍サイズによって以下の治療群に無作為に分ける（ｎ＝１５）：１）ＵＳＰ生理食塩水、１０μｌ／ｇ、１週間に３回、ｉ.ｐ.、２日目に開始、２）４０ｍｇ／ｋｇの抗体２、１週間に３回、ｉ.ｐ.、２日目に開始、３）１２ｍｇ／ｋｇのドセタキセル、ｑ７ｄ、１日目に開始、４）１２ｍｇ／ｋｇのドセタキセル、ｑ７ｄ、１日目に開始＋４０ｍｇ／ｋｇの抗体２、１週間に３回、２日目に開始。
【０１２０】
本研究期間中、腫瘍体積を週に約２回測定し、体重を週に少なくとも２回記録する。犠牲にするマウスを、ＣＯ２窒息によって安楽死させる。実験群の相対腫瘍体積対対照群の相対腫瘍体積の比として、各治療群のＴ／Ｃ％を計算する。腫瘍増殖および体重を、２６日目を経た反復測定ＡＮＯＶＡによって対照群と比較する。
【０１２１】
抗体２およびドセタキセルでの治療は、それぞれ７４％および４９％のＴ／Ｃ％値でＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍増殖を有意に抑制する。抗体２とドセタキセルの併用療法は、いずれかの単剤療法と比較して、２４％のＴ／Ｃ％で抗腫瘍効果を有意に増加させる。したがって、ＶＥＧＦＲ−３のＩｇ２ドメイン中のエピトープへの抗ＶＥＧＦＲ−３抗体結合は、肺癌のさらなるインビボモデルにおいて、単剤療法（ｐ≦０．０００１）またはドセタキセルとの組み合わせ（ｐ≦０．０００１）のいずれか一方で抗腫瘍効果を示す。
【０１２２】
実施例１１：皮下ＳＫ−ＲＣ−２９ヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）の異種移植モデルにおける抗ＶＥＧＦＲ−３ｍＡｂ抗体２
ＲＣＣにおける抗ＶＥＧＦＲ−３抗体の活性について試験するために、ＳＫ−ＲＣ−２９ヒト腎細胞癌の異種移植モデルを用いる。メスの胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウス（１群につきｎ＝１２）に、１匹のマウスあたり２×１０６ＳＫ−ＲＣ−２９ＲＣＣ細胞でｓ．ｃ．移植する。これらの細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜との１：１の混合物として注射する（Ｖｔ＝０．４ｍｌ）。腫瘍が約２００〜２５０ｍｍ３に達した時、マウスを群に無作為に分け、ｉ．ｐ．投与を開始し、対照群にはＵＳＰ生理食塩水（５００μｌ／注射）を投与し、抗体２の群には、第１用量として６０ｍｇ／ｋｇ、その後の全ての用量として４０ｍｇ／ｋｇを投与する。腫瘍体積測定を、４３日間、週に２回記録する。組織学的分析のために、４８日目（この研究の終わり）に、代表的な腫瘍試料（治療群あたりｎ＝４）を取得した。治療群間の抗腫瘍効果の有意性を決定するために、反復測定（ＲＭ）ＡＮＯＶＡを用いて、統計分析を行った。４７日目に測定した時、治療群のいずれにおいても、抗体毒性による体重損失は生じなかった。実際、抗体で治療したマウスの体重は、本研究の期間中、約５．５％増加した。
【０１２３】
抗腫瘍効果を評価し、Ｔ／Ｃ％値を計算するために、３２日目までに全治療群を対照マウスと比較する。抗体２のＴ／Ｃ％は６２％であり（ｐ＝０．０１２）、これは、皮下異種移植モデルにおいて、有害な副作用はほとんどない状態で腎細胞癌の増殖抑制を示す。
【０１２４】
実施例１２：ＢｘＰＣ−３膵癌の異種移植における抗ＶＥＧＦＲ−３ｍＡｂ抗体２
膵癌における抗ＶＥＧＦＲ−３抗体の活性について試験するために、ＢｘＰＣ−３膵癌異種移植モデルを用いる。メスの胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウス（ｎ＝３６）に、１：１でＭａｔｒｉｇｅｌに混合した２×１０６ＢｘＰＣ−３ヒト膵臓細胞／マウスをｓ．ｃ．注射する。腫瘍が約３５０ｍｍ３に達した時、これらの動物を以下の３つの治療群に分ける（ｎ＝１０）：１）ＵＳＰ生理食塩水、２）１０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ抗体２、３）４０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ抗体２。全治療において、０．１ｍｌ／体重１０ｇで、週に３回ｉ．ｐ．投与する。腫瘍体積測定を、６週間、週に２回記録する。
【０１２５】
抗体２での治療は、用量依存的に、ＢｘＰＣ−３腫瘍の増殖を抑制する。４０日目の本研究の終了の時点で、１０ｍｇ／ｋｇ用量群および４０ｍｇ／ｋｇ用量群のＴ／Ｃ値は、それぞれ、７５％（ｐ＝０．０４２）および５６％（ｐ＝０．００２）である。
【０１２６】
実施例１３：ＨＴ−２９大腸異種移植における、オキサリプラチンと組み合わせた抗ＶＥＧＦＲ−３ｍＡｂ抗体２
大腸癌における抗ＶＥＧＦＲ−３抗体の活性について試験するために、ＨＴ−２９大腸異種移植モデルを用いる。ＨＴ−２９細胞懸濁液を、６０匹のメスの胸腺欠損マウスの左脇腹に５×１０６／マウスでｓ．ｃ．注射する。腫瘍が約１８０ｍｍ３に達した時、細胞移植後８日目に、これらのマウスを以下の４つの治療群に無作為に分ける（ｎ＝１２）：１）ＵＳＰ生理食塩水対照、０．５ｍｌ  ｉ．ｐ．、週に３回、２）４０ｍｇ／ｋｇの抗体２、週に３回、３）１２ｍｇ／ｋｇのオキサリプラチン、ｑ７ｄ、４）４０ｍｇ／ｋｇの抗体２、週に３回＋１２ｍｇ／ｋｇのオキサリプラチン、ｑ７ｄ。
【０１２７】
腫瘍測定を、週に２回記録する。ＲＭ ＡＮＯＶＡを用いて、治療群間で腫瘍増殖を比較する。抗体２は、単独では、ＨＴ−２９腫瘍増殖を有意に抑制しない。本抗体は、８０％のＴ／Ｃ％で有効性の傾向を有する。抗体２およびオキサリプラチンの両方での併用療法は、対照またはいずれかの単剤療法（Ｐ≦０．０２８０）と比較して、４７％のＴ／Ｃ％でＨＴ−２９腫瘍増殖を有意に抑制する。したがって、ＶＥＧＦＲ−３のＩｇ２ドメイン中のエピトープへの抗ＶＥＧＦＲ−３抗体結合は、大腸癌のインビボモデルにおいて、オキサリプラチンと組み合わせて用いた時に抗腫瘍効果を示す。
【配列表】
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【国際調査報告】
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