(57)【要約】  本発明は、３−アミノアダマンタン−１−カルボン酸を組み込んだペプチドに関する。これらのペプチドは、神経原性および神経栄養特性を驚くほど十分に保有するものとして開示される。これらの薬理的作用は中枢神経（ＣＮＳ）における神経作用の回復または維持するために有利に利用することができる。特に、アルツハイマ―症、パーキンソン症、ハンチントン症、筋萎縮性側索硬化症のような神経変性症の治療および予防、並びに外傷性脳損傷の後遺症または脳虚血症の治療に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で示される化合物であって、
【化１】
2013530975.tif 000008
（１）式中、
Ｒ1は、Ｌ体またはＤ体において、それぞれ１から１０００個、好ましくは１から１００個、より好ましくは１から１０個のα−、β−、γ―およびδ―アミノ酸を含む直鎖もしくは環状鎖を表し、
Ｒ2は、
Ｌ体またはＤ体において、それぞれ１から１０００個、好ましくは１から１００個、より好ましくは１から１０個のα−、β−、γ―およびδ―アミノ酸を含む直鎖もしくは環状鎖を表し、特に１，２，３，４または５個のアミノ酸鎖であることが好ましく、
あるいは、
Ｈ、ＮＨ2、任意のハロゲン、（以下に限定されるものではないが）メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、へキシル、へプチル、オクチルを含む１から２５個の炭素原子を持ったアルキル基またはシクロアルキル基、例えばフェ二ルまたはナフチルのような６から１０個の炭素原子を持った任意の芳香族炭化水素、例えばオキザゾルー２−イル、オキザゾルー４−イル、１−イミダゾルイル、２−イミダゾルイル、４−イミダゾルイル，１−ピロルイル、２−ピロルイル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、１−ピぺリジル、２−ピぺリジル、３−ピぺリジル、４−ピぺリジルのような任意のヘテロ環（即ち任意の５−または６−からなるヘテロ単環基）を表し、
Ｒ3は、
Ｈ、メトキシ、１から２５個の炭素原子を持った任意のアルキル基またはシクロアルキル基を表し、
Ｒ4およびＲ5は、
相互に独立して、Ｈ、ＮＨ２、任意のロゲン、（以下に限定されるものではないが）メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ペンチル、へキシル、へプチル、オクチルを含む１から２５個の炭素原子を有する任意のアルキル基またはシクロアルキル基、例えばフェニルまたはナフチルのような６から１０個の炭素原子を有する任意の芳香族炭化水素、例えばオキザゾルー２−イル、オキザゾルー４−イル、１−イミダゾルイル、２−イミダゾルイル、４−イミダゾルイル，１−ピロルイル、２−ピロルイル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、１−ピぺリジル、２−ピぺリジル、３−ピぺリジル、４−ピぺリジルのような任意のヘテロ環（即ち、任意の５−または６−からなるヘテロ単環基）を表す、
式（１）で示される化合物。
【請求項２】
ｎは、１，２または３を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ペプチド鎖Ｒ1とＲ2は、互いに結合し、その結果、１個以上の３−アミノアダマンタン−１−カルボン酸ならびに１から１００個、好ましくは１から１０個、より好ましくは２から５個のα−、β−、γ―およびδ―アミノ酸をそのＬ体またはＤ体中にそれぞれ含む環状ペプチドを得る、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ペプチド鎖Ｒ1とＲ2は、互いに結合し、その結果得られる環状ペプチドは、アミノ酸の数が４から１０個である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ1およびＲ2は相互に結合せず、その結果、１個以上の３―アミノアダマンタン−１−カルボン酸ならびに１から１００個、好ましくは１から１０個、より好ましくは２から５個のα−、β−、γ―およびδ―アミノ酸をそのＬ体またはＤ体中にそれぞれ含む直鎖ペプチドを得る、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ1は上で定義したアミノ酸の直鎖または環状鎖を表し、Ｒ2はアミノ基（ＮＨ2）を表す、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ1は１、２、３、４または５個のアミノ酸を有するアミノ酸鎖を表し、Ｒ2はＮＨ2を表す、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
中枢神経系の異常を治療するための薬剤の製造に際しての、請求項１から７のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項９】
アルツハイマ―症、パーキンソン症、ハンチントン症、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷の後遺症または脳虚血症を治療するための薬剤の製造に際しての、請求項８に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、神経原性および神経栄養特性を驚くほど十分に保有するものとして開示される３−アミノアダマンタン−１−カルボン酸組み込みペプチドに関する。これらの薬理的作用は中枢神経（ＣＮＳ）における神経作用の回復または維持のために、特にアルツハイマ―症、パーキンソン症、ハンチントン症、筋萎縮性側索硬化症のような神経変性症の治療および予防、並びに外傷性脳損傷の後遺症または脳虚血症の治療に使用される化合物として有利に利用することができる。
【０００２】
本発明はペプチドを利用する新しい概念を提供するものであり、特にそれらのペプチドは、栄養因子の機能部分またはサブシーケンス(部分列)が類似するものである。それらの栄養因子には、例えば、脳由来の栄養因子（ＢＤＮＦ）、繊維状栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィンー３、グリア細胞株由来の栄養因子（ＧＤＮＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、あるいは親油性の３−アミノアダマンタン―１−カルボン酸と結合するその他の栄養因子などがあり、結果として生じる化合物の効能及び代謝安定性を向上させる。一方ペプチドの類似部分または上記した栄養因子により得られる結果については文献中に報じられているが、構成要素としてアダマンタンベースのアミノ酸、特に３−アミノアダマンタンー１−カルボン酸を組み込んペプチドが改善された薬理的側面を持った栄養因子の小分子相似物であるとして報告されていない。これら３−アミノアダマンタン―１−カルボン酸で修正された新規のペプチドは、神経原性および神経栄養性を有しシナプス可塑性を高める。この種類の化合物の代表的な実施例の調製、およびそれらの神経原性および神経栄養特性について記載されている。本発明（実施例３および４）で提供される、２種またはそれ以上の３−アミノアダマンタンカルボン酸が構成要素として組み込まれている神経栄養性ペプチドを例とする環状べプチドは、新規の構造モチーフを提供する。
【０００３】
［先行技術］
医療用用途に使用することができる３−アミノアダマンタン―１−カルボン酸を組み込んだ幾つかのペプチドが文献中に報じられている。
【０００４】
しかし以前には、これらのペプチドの神経原性または神経栄養特性についての報告は開示されていなかった。
アミノ酸構成要素として３−アミノアダマンタン―１−カルボン酸を組み込んだ小ペプチドがマズ―ル（Ｍａｚｕｒ）によって開示されている（ＵＳ１９７９−９９７６５Ａ（１９７９））。これらのペプチドはアダマンタン―１−カルボン酸基のメチルエステルを用いた液相化学および混合された無水物活性化のそれぞれを経て合成される。これらのペプチドは鎮痛薬としてスクリーンされる。シュライナーら（Ｓｃｈｒｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ）（ＷＯ  ２００６０１０３６２  Ａ１；Ｌ．ワンカ（Ｌ．Ｗａｎｋａ）、Ｃ．カブレレ(Ｃ．Ｃａｂｒｅｌｅ)、Ｍ．バネジュウ（Ｍ．Vａｎｅｊｅｗｓ）、Ｐ．Ｒ．シュライナー（Ｐ．Ｒ.Ｓｃｈｒｅｉｎｅｒ）「有機化学のヨーロッパジャーナル（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）」２００７年、１４７４；Ｃ．Ｅ．ミューラー(Ｃ．Ｅ  Ｍｕｌｌｅｒ)、Ｌ．ワンカ（Ｌ．Ｗａｎｋａ）、Ｋ．ジュウエル（Ｋ．Jｅｗｅｌｌ）、Ｐ．Ｒ．シュライナー（Ｐ．Ｒ.Ｓｃｈｒｅｉｎｅｒ）「アンゲヴァンテ・ケミー（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．）  国際版、英語」、２００８年、４７、６１８０；Ｃ．Ｅ．ミューラー（Ｃ．Ｒ.Ｍｕｌｌｅｒ）、Ｄ.ツエル(Ｄ．Zｅｌｌ)、Ｐ．Ｒ．シュライナー(Ｐ．Ｒ.Ｓｃｈｒｅｉｎｅｒ)  「化学・ヨーロッパジャーナル（Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．）」２００９年、１５．９６４７）は、Ｆｍｏｃ／ＯｔＢｕ方法論を用いるようなペプチドの液相並びに固相合成について詳細に記述している。３−アミノアダマンタン―１−カルボン酸を組み込んだペプチドの文献には医化学における幾つかの応用、特にＧＡＢＡトランスポータの遮断薬および抗インフルエンザＡ化合物として、および立体選択的合成における触媒としてそれぞれ記載されている。３−アミノアダマンタン―１−カルボン酸を組み込んだエンケファリン由来のペプチドの細胞阻害効果について、ホルバットら（Ｓ．ホルバット（Ｓ．Ｈｏｒｖａｔ）、Ｋ. ムリナルクーマジェスキ（Ｋ．Ｍｌｉｎａｒｃ−Ｍａｊｅｒｓｋｉ）、Ｌ．グラバスーオブロヴァク(Ｌ．Ｇｌａｖａｓ−Ｏｂｒｏｖａｃ）、Ａ．ジェーカス（Ａ．Ｊａｋａｓ）、Ｊ．ヴェルコビック（Ｊ．Ｖｅｌｋｏｖｉｃ）、Ｓ．マルツィ（Ｓ．Ｍａｒｃｚｉ）、Ｇ．クラゴル（Ｇ．Ｋｒａｇｏｌ）、Ｍ．ロシック(Ｍ．Ｒｏｓｃｉｃ）、Ｍ．マコビック(Ｍ．Ｍａｔｋｏｖｉｃ）、Ａ．ミロスティクースルブ（Ａ．Ｍｉｌｏｓｔｉｃ−Ｓｒｂ）「生物有機＆医薬品化学（Ｊ．Ｍｅｄ.Ｃｈｅｍ）」 ２００６年、４９、３１３６；ＷＯ２００６０９７７７４Ａ１、２００６年）により記載されている。抗腫瘍剤としてのこれらのペプチドの利用が提案されている。
【０００５】
同様に、文献中には神経栄養特性を示すペプチドが開示されている。ヒューゲスら（Ｈｕｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ）は細胞培養における神経原性特性を示す脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）に由来するペプチドについて報じている（Ｐ．Ｄ.オラリー（Ｐ．Ｄ．Ｏ'Ｌｅａｒｙ）、Ｒ．Ａ．ヒューゲス（Ｒ．Ａ．Ｈｕｇｈｅｓ）「神経化学ジャーナル（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．）」１９９８年、７０、１７１２；Ｐ．Ｄ．オラリー（Ｐ．Ｄ．Ｏ'Ｌｅａｒｙ）、Ｒ．Ａ．ヒューゲス（Ｒ．Ａ．Ｈｕｇｈｅｓ）「生物化学ジャーナル (Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」２００３年、２７８、２５７３８；Ｊ．Ｍ．フレッチャー(Ｊ．Ｍ．Ｆｌｅｔｃｈｅｒ）、Ｒ．Ａ．ヒューゲス（Ｒ．Ａ．Ｈｕｇｈｅｓ)  「ペプチド科学ジャーナル (Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．)」２００６年、１２，５１５；Ｊ．Ｍ．フレッチャー（Ｊ．Ｍ．Ｆｌｅｔｃｈｅｒ）、Ｃ．Ｊ．モルトン（Ｃ．Ｊ．Ｍｏｒｔｏｎ）、Ｒ．Ａ．ツァー（Ｒ．Ａ．Ｚｗａｒ）、Ｓ．Ｓ．ムーレイ（Ｓ．Ｓ．Ｍｕｒｒａｙ）、Ｐ．Ｄ．オラリー（Ｐ．Ｄ．Ｏ'Ｌｅａｒｙ）、Ｒ．Ａ．ヒューゲス（Ｒ．Ａ．Ｈｕｇｈｅｓ）「生物化学ジャーナル（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」２００８年  ２８３、３３３７５；Ｊ．Ｍ．フレッチャー（Ｊ．Ｍ．Ｆｌｅｔｃｈｅｒ）、Ｒ．Ａ．ヒューゲス（Ｒ．Ａ．Ｈｕｇｈｅｓ)  「生物有機＆医薬品化学 (Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．)」２００９年、１７、２６９５）。他の栄養因子に由来する神経刺激性ペプチドおよび神経原性ペプチドについてもまた以前から報じられている（例えばＨ．Ｈ．チェン(Ｈ．Ｈ．Ｃｈｅｎ）、Ｙ．Ｃ．タン（Ｙ．Ｃ．Ｔｕｎｇ）、Ｂ．リー（Ｂ．Ｌｉ）、Ｋ．イクバル（Ｋ．Ｉｑｂａｌ）、Ｉ．グランキーーイクバル（Ｉ．Ｇｕｒｕｎｄｋｅ−ｉｑｂａｌ）「老化の神経生物学（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ）」２００７年、２８、１１４８；Ｙ．マツオカ(Ｙ．Ｍａｔｕｏｋａ）、Ｙ．ジャーキン（Ｙ．Ｊｏｕｒｏｕｋｈｉｎ）、Ａ．Ｊ．グレイ（Ａ．Ｊ．Ｇｒａｙ）、Ｌ．マー（Ｌ．Ｍａ）、Ｃ．ヒラターフカエ（Ｃ．Ｈｉｒａｔａ−Ｆｕｋａｅ）、Ｈ．Ｆ．リー（Ｈ．Ｆ．Ｌｉ）、Ｌ．ファン（Ｌ．Ｆｅｎｇ）、Ｌ．ルカニュ（Ｌ．Ｌｅｃａｎｕ）、Ｂ．Ｒ．ウォカー（Ｂ．Ｒ．Ｗａｌｋｅｒ）、Ｅ．プラネル（Ｅ．Ｐｌａｎｅｌ）、Ｏ．アランシオ（Ｏ．Ａｒａｎｃｉｏ）、Ｉ．ゴゼス（Ｉ．Ｇｏｚｅｓ）、Ｐ．Ｓ．アイシン(Ｐ．Ｓ．Ａｉｓｅｎ)「薬理学及び実験治療学ジャーナル（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ）」  ２００８年、３２５、１４６参照）。
【０００６】
本発明は構成要素として３−アミノアダマンタン―１−カルボン酸を組み込んだ神経栄養特性を示す一連のペプチドおよび環状ペプチド（スキーム１）を提供する。
【０００７】
【化１】
2013530975.tif 000002
スキーム１    γ―アミノアダマンタンー１−カルボン酸を組み込んだペプチドの構造
これらのペプチドは、Ｒ1およびＲ2として相互に独立して、成長因子または神経性ペプチド由来のペプチドフラグメント、および薬力学的および薬物動力学（例えば細胞分布、蛋白質分解の劣化に対する安定性、血液脳関門を通した透過率など）に影響を持つアミノ酸残基、非天然のα−、β−、γ―およびδ―アミノ酸、好ましくは３−アダマンタン―１−カルボン酸、またはこれらのオリゴペプチドを含むことができる。
【０００８】
ｎは１から１００の間、好ましくは１から１０の間、より好ましくは１から５の間の任意の数であり、特にｎ＝１、２または３を持った化合物であることが好ましい。
Ｒ1は、Ｌ体またはＤ体において、それぞれ１から１０００個、好ましくは１から１００個、より好ましくは１から１０個のα−、β−、γ―およびδ―アミノ酸を含む直鎖もしくは環状鎖を表す。特に１、２、３、４または５個のアミノ酸の鎖であることが好ましい。
【０００９】
Ｒ2は、
１．Ｌ体またはＤ体において、それぞれ１から１０００個、好ましくは１から１００個、より好ましくは１から１０個のα−、β−、γ―およびδ―アミノ酸を含む直鎖もしくは環状鎖を表し、特に１，２，３，４または５個のアミノ酸の鎖であることが好ましい。
【００１０】
あるいは、
２．Ｈ、ＮＨ2、任意のハロゲン、（以下に限定されるものではないが）メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、へキシル、へプチル、オクチルを含む１から２５個の炭素原子を持ったアルキル基またはシクロアルキル基、例えばフェ二ルまたはナフチルのような６から１０個の炭素原子を持った任意の芳香族炭化水素、例えばオキザゾルー２−イル、オキザゾルー４−イル、１−イミダゾルイル、２−イミダゾルイル、４−イミダゾルイル，１−ピロルイル、２−ピロルイル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、１−ピぺリジル、２−ピぺリジル、３−ピぺリジル、４−ピぺリジルのような任意のヘテロ環（即ち任意の５−または６−からなるヘテロ単環基）を表す。
【００１１】
一実施例では、ペプチド鎖Ｒ1およびＲ2は相互に結合し、その結果、１個以上の３―アミノアダマンタン−１−カルボン酸ならびに１から１００個、好ましくは１から１０個、より好ましくは２から５個のα−、β−、γ―およびδ―アミノ酸をそのＬ体またはＤ体中にそれぞれ含む環状ペプチドが得られる。特に全数が４から１０個のアミノ酸を有するシクロペプチドが好ましい。
【００１２】
他の実施例では、Ｒ1およびＲ2は相互に結合せず、その結果、１個以上の３―アミノアダマンタン−１−カルボン酸ならびに１から１００個、好ましくは１から１０個、より好ましくは２から５個のα−、β−、γ―およびδ―アミノ酸をそのＬ体またはＤ体中にそれぞれ含む線状ペプチドが得られる。特に全数が４から１０個のアミノ酸を有するシクロペプチドであることが好ましい。
【００１３】
最も好ましい実施例では、Ｒ1は上で定義したようなアミノ酸の直鎖または環状鎖を示し、Ｒ2はアミノ基（ＮＨ2）を示す。最も好ましくは、Ｒ1は１、２、３、４または５個のアミノ酸を有するアミノ酸鎖を示し、Ｒ2はＮＨ2を示す。
【００１４】
Ｒ3はＨ、メトキシ、１から２５個の炭素原子を持った任意のアルキル基またはシクロアルキル基である。さらにＲ4およびＲ5は、相互に独立して、Ｈ、ＮＨ2、任意のハロゲン、（以下に限定されるものではないが）メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、へキシル、へプチル、オクチルを含む１から２５個の炭素原子を有する任意のアルキル基またはシクロアルキル基、例えばフェニルまたはナフチルのような６から１０個の炭素原子を有する任意の芳香族炭化水素、例えばオキザゾルー２−イル、オキザゾルー４−イル、１−イミダゾルイル、２−イミダゾルイル、４−イミダゾルイル，１−ピロルイル、２−ピロルイル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、１−ピぺリジル、２−ピぺリジル、３−ピぺリジル、４−ピぺリジルのような任意のヘテロ環（即ち、任意の５−または６−からなるヘテロ単環基）であり得る。
【００１５】
ペプチドは、固相ペプチド合成法によって容易に合成されるが、溶液中での合成も可能である。
これらのペプチドの幾つかは、神経原性および神経栄養特性を示し、かつ細胞培養ならびにマウスのin vivoでシナプス可塑性を高める。以下に示す実施例は本発明を例示するものである。如何なる方法においてもこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１６】
課題
対象となる発明の課題は、以下に限定されるものではないが、パーキンソン症、アルツハイマ症、ハンチントン症、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患の治療、および外傷性脳挫傷の後遺症または脳虚血症などの治療のための新規の薬剤を製造するための、ａ）新種の化学物質、および、ｂ）公知の種類の化学物質、を予見することである。
【００１７】
解決策
意外にも、３−アミノアダマンタン−１−カルボン酸と、特にＬ体またはＤ体におけるプロテン遺伝子型α―アミノ酸、請求項１に記載の非天然アミノ酸、請求項２に記載の既知の物質などのアミノ酸を組み込んだぺプチドが、所望の特性を有することが見出された。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】AＧｌｙを組み込んだペプチドが認知度を改善することを示す。  ペプチド０２１と０２２は、体重（Ａ）、探索行動（Ｃ）または、泳ぎの速さ（Ｄ）に対する影響はなかったが、マウスの不安度レベルは減少した（Ｂ）。（Ｅ−Ｆ）ペプチド０２１は、新規の物体と見慣れた物体とを区別する能力を著しく改善した。*ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ−検定。（Ｇ）ペプチド０２１と０２２は水迷路の空間記憶課題の学習においてパーフォーマンスを高めた。**ｐ＜０．００１；２元配置分散分析法を使ったポストホックフィッシャーのＬＳＤ検定。（Ｈ）ペプチド０２１は、最初のプルーブトライアル（Probe Trial）ではパーフォーマンスは改善されたが、ペプチド０２１での治療はペプチドでのプリートメント（preatment）の終了時の１５日後（ＰＴ２）または３０日後（ＰＴ３）にはもはや効果はなかった。*ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ−検定。
【図２】ペプチド０２１が、ＤＧ内で神経発生を促進することを示す。  （Ａ）Ｂｒｄｕ（赤）およびＮｅｕＮ（緑）で二重標識した陽性細胞を示す代表図である。スケールバーは２０μｍを示す。（Ｂ）ＧＣＬ，ＳＧＺおよび総ＤＧ内でペプチド０２１治療した動物のＢｒｄｕ陽性細胞の数は著しく増加した。（Ｃ）ペプチド０２１の治療は、Ｂｒｄｕ/ＮｅｕＮの陽性細胞の数をＧＣＬおよび総ＤＧ内で著しく増加させた。*ｐ＜０．０５；２元配置分散分析法を使ったポストホックフィッシャーのＬＳＤ検定。
【図３】ペプチド０２１が、ＤＧ内でシナプス可塑性を促進することを示す。  ペプチド０２１は、ＤＧ内のシナプトフィシンの発現（Ａ）およびシナプシン１の発現（Ｂ）を著しく促進した。***ｐ＜０．００１；２元配置分散分析法を使ったポストホックフィッシャーのＬＳＤ検定。スケールバーは、１００μｍを示す。
【図４】ペプチド０２１を用いてＨｅｐＧ２細胞内で用量依存的にＬＩＦ誘起ＳＴＡＴ３リン酸化反応を阻害することを示す。  ＨｅｐＧ２細胞は、０．２５ｎＭ  ＬＩＦとともに異なる濃度のペプチド０２１で１５分間処理した。次に、Ｔｙｒ７０５（ｐＹ−ＳＴＡＴ３）でＳＴＡＴ３リン酸化反応がウエスタンブロット法で測定された。ｐＹ−ＳＴＡＴ３値は、ＳＴＡＴ３総発現量に対して正規化された。データは、０．２５ｎＭ  ＬＩＦのみ（１００％）で処理された細胞から％値で示されている。*ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
概要
すべてのペプチドはＦｍｏｃ法に続く固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）によって合成される。前記したように３−（９−フロウレニルメトキシカルボニル）アミノアダマンタンー１−カルボン酸（Ｆｍｏｃ−AＧｌｙ）が合成される。使用するＦｍｏｃ−α―アミノ酸、活性化剤および他の化学薬品は、ノバビオケム（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）社から購入し、供給された状態で使用した。使用する溶媒は、ペプチド合成用グレードのものである。自動化ＳＰＰＳは、プロテインテクノロジー  ＰＳ３自動化ペプチド合成装置を使用して、リンク  アミド  ＡＭ  樹脂（２００−４００メッシュ  ノバビオケム社製）によって行われた。ローディング（２Ｘ４０分）ならびに鎖伸長（２Ｘ２０分）は、Ｆｍｏｃ−アミノ酸、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３テトラメチルアミ二ウム  ６フルオロリン酸（ＨＢＴＵ）、１ヒドロキシベンゾトリアゾ―ル水化物（ＨＯＢｔ）および過剰のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエスラミン（ＤＩＰＥＡ）のそれぞれの（樹脂置換による）２Ｘ４当量を用いたダブルカップリングを経てＤＭＦ内で行われた。アセチル化は、１０当量の無水酢酸とＤＩＰＥＡを用いてＤＭＦ内で２０分間樹脂をローディングして行われた。アダマンタン化は、アダマンタン−１−カルボン酸（アクロス・オーガ二クス）を用いて鎖伸長ステップで上記したようなＨＢＴＵ/ＨＯＢt活性によるダブルカップリング手法で行われた。一時的なＦｍｏｃ保護基の除去は、２０％のピぺリジンを用いてＤＭＦ内で２ｘ２０分間行うか、あるいは２０％のピぺリジンと１％のＤＢＵを用いてＤＭＦ内で３ｘ３分間行う。樹脂は、鎖伸長とＦｍｏｃ開裂ステップの後、ＤＭＦで６ｘ３０秒間洗浄する。ペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と水とトリイソプロピルシラン（９５：２．５：２．５）を３時間かけて樹脂から開裂し、氷温のジエチル・エーテルを添加して沈殿させる。ペプチドは遠心分離法により採集する。粗沈殿物は、新たな氷温のジエチル・エーテルに再び浮遊させ、さらに２回遠心分離して得る。水と酢酸（２：１）で溶解し、ジエチル・エーテルとヘキサン（１：１）で抽出後、粗ペプチドの水溶液は凍結乾燥される。ぺプチドは、３．５mＬ/分の流速で溶媒Ａ(Ａ:水/０．１％ＴＦＡ、Ｂ:アセトニトリル/０．１％ＴＦＡ)中に溶媒Ｂの濃度勾配をつけてレステック社製のＲＰ１８カラム（２１．２×２５０ｍｍ、５μｍ、３００Å）を用いてセミ分取用逆相ＨＰＬＣで精製する。生産物断片（プロダクトフラクション）は１mL/分の流速で溶媒A中に溶媒Bのリニア濃度勾配をつけて分析用ＨＰＬＣでレステック社製のＣ８カラム(４．６ｘ１５０ｍｍ)を用いて分析される。分析用およびセミ分取用のＨＰＬＣは、可変波長検出器を用いて２１５ｎｍでモニターする。分析用ＨＰＬＣで分析されたような純度９５%以上のペプチドを含む生産物断片は、貯留され凍結乾燥されて本発明の研究に使用される。プロトンＮＭＲは、ブルカー社製の４００ＭＨzスペクトロメータまたはバリアン社製の６００ＭＨz機器で記録される。プロトン化学シフトは、内部のテトラメチルシラン(ＴＭＳ、δ０．０ppm)または残留溶媒のピークを基準としてppm(δ)で報告される。
【００２０】
データは以下のように報告される：化学シフト(マルチプリシティ[シングレット（ｓ）、ダブレット（ｄ）、トリプレット（ｔ）、カルテット(q)、マルチプレット（ｍ）]、カップリング定数[Hz]、インテグレーション］。スペクトルは２５℃で得られる。ＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、フィニガンＬＣＱデュオ質量分析計で記録される。
【００２１】
以下の全てのペプチド合成は、異なる添加剤、化学量、溶媒、結合回数、および様々な温度を用いて実施することが可能である。更に、マイクロ波によるペプチド合成も可能である。よって以下の実施例および上記の一般的な手順は、適切な合成条件を推定するものにすぎず、それぞれの化合物の合成は以下に示すプロトコルのみに限定されるものではない。
【００２２】
実施例
実施例１：Ac-Asp-Gly-Gly-Leu-AGly-NH2 (ペプチド021)
【００２３】
【化２】
2013530975.tif 000003
分取用ＨＰＬＣ:溶媒Ａ中において溶媒Ｂを８０分間で１５−４５%とする。プロダクトフラクションを４０−４３分間で溶出する。分析用ＨＰＬＣ: 溶媒Ａ中において溶媒Ｂを２０分間で１０−６０%とする。保持時間は９．５分。
【００２４】
1H-NMR（プロトン核磁気共鳴法） (600 MHz, [D6]DMSO):  δ = 0.83 (d, J = 6.5 Hz, 3 H, Leu-Hδ); 0.87 (d, J = 6.6 Hz, 3 H, Leu-Hδ); 1.36−1.47 (m, 2 H, Leu-Hβ); 1.49−1.59 (m, 3 H, Leu-Hγおよびアダマンタン-CH2); 1.62−1.71 (m, 4 H, 2×アダマンタン-CH2); 1.79−1.90 (m, 4 H, 2×アダマンタン-CH2); 1.86 (s, 3 H, アセチル-CH3); 1.92 (br. s, 2 H, アダマンタン-CH2); 2.06−2.12 (m, 2 H, 2×アダマンタン-CH); 2.70 (dd, J = 16.6および5.4 Hz, 1 H, Asp-Hβ); 3.66−3.75 (m, 5 H, 4×Gly-Hαおよび Asp-Hβ); 4.21−4.27 (m, 1 H, Leu-Hα); 4.51−4.57 (m, 1 H, Asp-Hα); 6.71 (s, 1 H, CONH2); 6.98 (s, 1 H, CONH2); 7.36 (br. s, 1 H, AGly-NH); 7.69 (d, J = 8.4 Hz, 1 H, Leu-NH); 7.99 (t, J = 5.9 Hz, 1 H, Gly-NH); 8.20 (t, J = 5.7 Hz, 1 H, Gly-NH); 8.24 (t, J = 7.6 Hz, 1 H, Asp-NH); 12.32 (br. s, 1 H, Asp-CO2H).  MS (ESI)（エレクトロスプレーイオン化質量分析法）: m/z = 579.4 [M + H]+ (計算値（calcd.）579.3). 
実施例２：1-AdCO-DGGLAG-NH2 (ペプチド022): 
【００２５】
【化３】
2013530975.tif 000004
分取用ＨＰＬＣ:溶媒Ａ中において溶媒Ｂを７９分間で１０−４３%、次に溶媒Ａ中において溶媒Ｂを１０分間で４３−６０%、次に溶媒Ａ中において溶媒Ｂを２０分間で６０％とする。プロダクトフラクションを８３−８６分間で溶出する。分析用ＨＰＬＣ: 溶媒Ａに溶媒Ｂを２０分間で１０−６０%とする。保持時間は１５．５分。
【００２６】
1H-NMR（プロトン核磁気共鳴法） (600 MHz, [D6]DMSO):  δ = 0.82 (d, J = 6.8 Hz, 3 H, Leu-Hδ); 0.87 (d, J = 6.8 Hz, 3 H, Leu-Hδ); 1.35−1.45 (m, 2 H, Leu-Hβ); 1.49−1.59 (m, 3 H, Leu-Hγ およびアダマンタン-CH2); 1.61−1.70 (m, 10 H, 5×アダマンタン-CH2); 1.75−1.80 (m, 6 H, 3×アダマンタン-CH2); 1.80−1.89 (m, 4 H, 2×アダマンタン-CH2); 1.92 (br. s, 2 H, アダマンタン-CH2); 1.94−1.98 (m, 3 H, 3×アダマンタン-CH); 2.04−2.11 (m, 2 H, 2×アダマンタン-CH); 2.56 (dd, J = 16.0および8.0 Hz, 1 H, Asp-Hβ); 2.74 (dd, J = 16.1および5.5 Hz, 1 H, Asp-Hβ); 3.66−3.75 (m, 4 H, 4×Gly-Hα); 4.21−4.27 (m, 1 H, Leu-Hα); 4.53−4.58 (m, 1 H, Asp-Hα); 6.71 (s, 1 H, CONH2 (d, J = 7.7 Hz, 1 H, Leu-NH); 7.71 (d, J = 8.5 Hz, 1 H, Asp-NH); 7.88 (t, J = 5.5 Hz, 1 H, Gly-NH); 8.03 (t, J = 5.9 Hz, 1 H, Gly-NH); 12.20 (br. s, 1 H, Asp-CO2H).  MS (ESI) （エレクトロスプレーイオン化質量分析法）: m/z = 699.4 [M + H]+ (計算値（calcd.） 699.4).
実施例３：シクロ-[L-Asp-D-Lys-AGly-L-Asp-D-Lys-AGly] (ペプチド140)
【００２７】
【化４】
2013530975.tif 000005
市販のワング樹脂（１００−２００メッシュ）はＦｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＤｍａｂで０．４０ｍｍｏｌ／ｇの置換レベルまでローディングされた。次に上記のアセチル化手順を用いて非機能化されたヒドロキシ基をエンドキャッピングする(２０分間ＤＭＦ中でＤＩＰＥＡおよび無水酢酸（１０当量）)。ダブルカップリング手法により上記のような線形前駆体ペプチド合成が行われる。最終Ｆｍｏｃ保護基が開裂した後、C末端Ｄｍａｂ保護基は、ＤＭＦ内で２％のヒドラジン水化物で振盪する（４ｘ５分）ことで開裂する。ＤＭＦで６回洗浄した後、ＰｙＢＯＰとＨＯＢｔ（５当量）およびＤＩＰＥＡ(１０当量)用いて（３ｘ１６時間）環状化が開始される。樹脂結合シクロペプチドを洗浄して乾燥した後、上記の線形ペプチドの実施例での手順と同様に、粗ペプチドの開裂とワークアップが行われる。
【００２８】
分取用ＨＰＬＣ:溶媒Ａ中において溶媒Ｂを１２０分間で１０−６０%とする。プロダクトフラクションを４５．４−４８．９分間で溶出する。分析用ＨＰＬＣ: 溶媒Ａ中において溶媒Ｂを２０分間で１０−６０%とする。保持時間は７．６分。
【００２９】
1H-NMR （プロトン核磁気共鳴法）(400 MHz, [D6]DMSO):  δ = 1.20−1.40 (m, 4 H, Lys-Hγ); 1.40−1.69 (m, 20 H, アダマンタン-CH およびアダマンタン-CH2); 1.69−1.80 (m, 4 H, Lys-Hδ); 1.89−2.03 (m, 2 H, Lys-Hβ); 2.03−2.12 (m, 4 H, アダマンタン-CH2); 2.12−2.27 (m, 4 H, アダマンタン-CH); 2.30−2.44 (m, 2 H, Lys-Hβ); 2.53−2.67 (m, 4 H, Asp-Hβ); 2.68−2.81 (m, 4 H, Lys-Hε); 3.82−3.92 (m, 2 H, Lys-Hα); 4.35 (q, J = 6.8 Hz, 2 H, Asp-Hα); 6.93 (s, 2 H, AGly-NH); 7.71 (br. s, 4 H, Lys-NH2(ε)); 7.80 (d, J = 6.0 Hz, 2 H, Asp-NH); 8.30 (d, 2 H, J = 8.0 Hz, Lys-NH); 12.30 (br. s, 2 H, Asp-CO2H).  MS (ESI)（エレクトロスプレーイオン化質量分析法）: m/z = 841.6 [M + H]+ (計算値（calcd.）841.5).
実施例４： シクロ-[Asp-Cit-AGly-Cit-Cit-AGly] (ペプチド144)
【００３０】
【化５】
2013530975.tif 000006
環状ペプチドは実施例３で記載されるのと同様の方法で調製される。
【００３１】
分取用ＨＰＬＣ:溶媒Ａ中において溶媒Ｂを９０分間で１０−４０%とする。プロダクトフラクションを５１．３−５２．３分間で溶出する。分析用ＨＰＬＣ: 溶媒Ａ中において溶媒Ｂを２０分間で１０−６０%とする。保持時間は７．３５分。
【００３２】
1H-NMR （プロトン核磁気共鳴法）(400 MHz, [D6]DMSO):  δ = 1.20−1.50 (m, 6 H, Cit-Hγ); 1.51−1.82 (m, 24 H, アダマンタン-CH2); 1.82−2.03 (m, 6 H, Cit-Hβ); 2.03−2.23 (m, 4 H, アダマンタン-CH); 2.36 (t, J = 11.0 Hz, 1 H, Cit-Hδ); 2.43−2.56 (m, 1 H, Asp-Hβ); 2.69 (dd, J1 = 10 Hz, J2 = 5 Hz, 1 H, Asp-Hβ); 2.92 (t, J = 6.5 Hz, 5 H, Cit-Hδ); 3.91 (q, J = 7.0 Hz, 1 H, Cit-Hα); 4.03 (q, J = 7.2 Hz, 1 H, Cit-Hα); 4.09 (q, J = 7.2 Hz, 1 H, Cit-Hα); 4.50 (q, J = 7.1 Hz, 1 H, Asp-Hα); 5.99 (br. s, 3 H, Cit-NH (ε); 7.16 (s, 2 H, AGly-NH); 7.28 (s, 1 H, Cit-NH); 7.30 (s, 1 H, Asp-NH); 7.34 (s, 2 H, Cit-NH); 7.64−7.74 (m, 6 H, Cit-NH2).  MS (ESI) （エレクトロスプレーイオン化質量分析法）: m/z = 941.7 [M + H]+ (計算値（calcd.） 941.5).
Ｉｎ  ｖｉｖｏおよびＩｎ  ｖｉｔｒｏスクリーン
概要
Ｃ５７Ｂｌ６生育環境での飼育を終えた８−１０ヶ月の雌に対するペプチドの特性（立体学的および行動学的）を示すために、全ｉｎ  ｖｉｏ調査が実施された。時折発生する妊娠したマウスを調査対象から除外し、マウスを少なくとも３週間環境に順応させた。マウスは食物と水とに自由に近づける状態で１２：１２時間の明暗サイクル下でグループ収納（一檻あたり３匹）した。すべての措置は我が国の動物福祉委員会から認定されたプロトコルに従ってなされた。ペプチド治療に際して、マウス（１グループあたり８匹とした）は、１日当たり２５ｎｍｏｌで３５日間連続投与されたペプチド０２１およびペプチド０２２を含む貯蔵ペレットの長期連続放出による皮下埋植を受けた（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅriｃａ、サラソタ、フロリダ州）。対照グループ（８匹）については、ペレットはキャリアポリマーのみからなる。マウスは２．５％のアベルチン（Ａｖｅｒｔｉｎ）で（マウス０．２５ｇ当たり０．３８ｍｌ）によって麻酔をかけられた。無菌状態下でペレットは精密トロカール（套管針）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅriｃａ、サラソタ、フロリダ州）によって右肩の前外側面に沿って皮下内に埋め込まれる。麻酔から覚めた後にマウスはコロニー（群体中）に移される。移植と治療に関して何らの問題も見られなかった。ニューロン新生を精査するために、ペプチド治療の２日目から始めて１日に２回の割合で５日間、臭素化デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（シグマ社製、セントルイス、ミズリー州）を腹腔注射（投与ｋｇ当たり１００ｍｇ）した。
【００３３】
一般試験
マウスの生理状態および体調を、グルーミング、生理状態および抱擁反射の評価による処理を通して注意深く観察した。また体重についても記録した。
【００３４】
ワン・トライアル物体認識試験
ワン・トライアル物体認識の課題では、マウスは２つの異なる物体を見せられ、２つの物体のうちの１つについては、同じオープンフィールドで遭遇したという先の経験での記憶に基づいて、新規のものであるか見慣れたものであるかを認識するものである。見慣れた物体は新規に遭遇する物体よりもより早く探し当てるが、それは見慣れた物体の表象はなお記憶の中にあるからである。ワン・トライアル物体の認識課題は何らか挿話的な出来事（エピソード）の記憶を試験するものであるが、それは物体の記憶（何であるか）、物体の位置（何処にあるか）、およびどれに遭遇したかの背景（どれであるか）に限られる。しかしながら、挿話的な出来事の時間的な次元は、実験者には利用できないので、この理由のためにマウスを使ったこの課題は短期時限での記憶試験であると考えられている（エナシュール、２０１０）。これに用いられる試験は、先にサルゴリーニおよびその共同研究者（２００３）が記述した手順を採用して行われる。試験装置はクラシックなオープンフィールド(即ち、４０ｃｍの高さの壁を持った３０Ｘ３０ｃｍのＰＶＣ製の方形のアレーナ）である。オープンフィールドは黒い不透明のカーテンで実験者から隔離された部屋の一部に置かれる。オープンフィールドにはコンピュータに接続されたビデオカメラが設置されている。この課題では３つの物体が採用される。一般的な手順は次の３つの異なる段階からなる：習熟させる段階（１セッション、２０分）、サンプリングする段階および試験する段階。第１日目では、マウスは個別に習熟段階に従わされるが、その段階ではマウスは器具について習熟するために空のアレーナに導かれる。この習熟段階では（オープンフィールドでカバーされる距離内を測定することによって）歩行活動についての、また（最初の５分間においてマウスがアレーナの中心部において費やす時間を測定することによって）不安度についての基線レベルを記録することができる。第２日目においては、各マウスは、まずサンプリング段階に従わされるが（１セッション、１０分間）、サンプリング段階では２つの相等しい物体がアレーナの中心から対称の位置に置かれる。その後１５分経過させる間にマウスは自分の檻に戻り、試験段階を実行する（２セッション、１０分間）ためにアレーナ中に再度導入される。マウスはその後２つの物体を見せられる。１つは見慣れた物体（先にサンプリング段階におい提示された）および他の１つは前記サンプリング段階の間に置かれたと同じ場所に置かれた新しい物体である。データ収集は、ビデオトラッキングシステム（Ｓｍａｒｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１４ ｓｏｆｔｗａｒｅ、パンラボ／サンジェゴ  インストルメンツ社製）を用いてなされた。試験段階における物体認識（ＯD）は次のように示される。
【００３５】
【数１】
2013530975.tif 000007
水迷路における空間参照記憶課題
空間参照学習およびメモリは以前にモーリスら（１９８２）によって記載された手法から適合された手法を使用して水迷路において評価される。この試験では、マウスは固定された浸水エスケーププラットフォーム(避難台)を見つけるために環境の空間表象に基づいた空間ナビゲーション戦略を用いることが要求される。その処理手順は直径１８０ｃｍの環状タンク中で実施された。プールは白色の無毒塗料を施すことによって不透明化され水（２１±１）℃で満たされる。習得作業は北西象限におけるエスケーププラットホーム（直径１５ｃｍで水面から１ｃｍ下に浸されている）で始められ、各マウスにはプラットホームを見るために９０秒間が与えられた。もしマウスが９０秒間でプラットホームを見つけ出せない場合には、穏やかにマウスをプラットホームに誘導する。各試行が終了した後、マウスを２０秒間プラットホーム上に放置し、次いで乾燥させ、次の試行を行うまで元の籠に戻す。日に５回このような習得作業を４日間連続して行った。記憶するための試験、あるいはプルーブトライアル（ＰＴ）を２４時間後に行った。プルーブトライアルの間、マウスはエスケーププラットホームなしのタンク中で６０秒間泳ぐことが許される。最初のプルーブトライアルを行ってから、１５日後および３０日後に第２および第３のプルーブトライアルを行う。学習は、エスケーププラットホームに到達するまでの時間と距離で測定される。プルーブトライアルのために、タンクは４つの仮想象限とエスケーププラットホームが存在した小ゾーンに分けられる。記憶の測定は、消費時間あるいは他の３つの象限に対する目標象限への到達距離の比率を指数として計算された。水中迷路中のマウスの挙動は、天井に取り付けられたサムソン社製デジタルカメラ（ＳＤＣ  ４３０４）でモニターされ、ＳＭＡＲＴ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１４  ｓｏｆｔｗａｒｅ（パンラボ/サンジェゴ  インストルメント社製）によって追跡と時間測定がなされた。
【００３６】
免疫組織化学
行動実験の終わりにおいて、マウスに過量のペンタバルビトール（５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔を施し、０．１モルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を経心的に灌流されるように注いだ。灌流後、脳を頭蓋骨から取り出し、後刻行われる生物化学的解析のために直ちに脳左半球を凍結し、脳右半球を室温で少なくとも２４時間、０．１モルＰＢＳ内の４％パラフォルムアルデヒド中に浸漬固定した。組織を均衡させ切断を行うまで４℃の３０％蔗糖溶液中に貯蔵した。脳を海馬全体を通して４０μｍの凍結スライデイングミクロトームで矢状に分割し，分割片はさらに処理が行われるまで−２０℃でグリコール抗凍結液（エチレングリコール、グリセロールおよび０．１モルＰＢＳを３：３：４の割合で含む）中に貯蔵する。ＢｒｄＵおよびＮｅｕＮを２重標識するために、脳の分割片を３７℃の２モルのＨＣｌで３０分間前処理し、また０．１モルの硼酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）で１０分間中和する。組織の分割片はまず３０分間ブロッキング緩衝液（４％の健康な山羊の血清＋ＰＢＳ中０．１％のツイーン２０）で３０分間、さらにそれぞれ１：４００と１：１００の間で希釈されたＢｒｄＵ（ミリポア  コーポレーション社製，ビレリカ、マサチューセッツ州）およびＮｅｕＮ（ミリポア  コーポレーション社製）抗体の存在下で４℃で一晩の間培養される。シナプス前端末の整合性を測定するために、組織は、抗シナプトフィシン（１：２００、クローンＳＹ３８、ミリポア  コーポレーション社製）または抗シナプシン１（１：２００；ストレスゲンバイオテクノロジ  コーポレイション社製、ビクトリア、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）で標識する。脳分割片はそれぞれ４℃の一次抗体中で１晩培養される。アレクサ４８８および５９４（１：５００；インビトロジェン社製、カールスバッド、カリフォルニア州）は二次抗体として用いられる。すべての映像がニコン  エクリプス  ９０ｉおよびＤ−エクリプスＣ１顕微鏡(ニコン社製、日本)により得られた。
【００３７】
歯状回の神経発生は，歯状回（ＤＧ）内のＢｒｄＵ陽性細胞およびＢｒｄＵ／ＮｅｕＮの二重陽性細胞の数を数えることによって評価される。陽性細胞の数は、非バイアスの立体学 (ウエストら、１９９１)を用いＤＧを通しての４０μｍ矢状区分のシリーズにおいて測定される。半顆粒状帯域（ＳＧＺ）および顆粒状細胞層（ＧＣＬ）内の全てのＢｒｄＵ陽性細胞は、蛍光顕微鏡(ニコン  エクリプス  ９０ｉ、ニコン社製、日本)を用いて数えられる。二重標識された細胞は共焦点映像システム(Ｄ−エクリップス  Ｃ１、ニコン社製)によって評価される。非バイアスの立体学原理を採用するので、ＤＧの細胞数を評価するために光学分留法が用いられる。(ウエストら、１９９１)。各脳は誤差検出係数に基づき、少なくとも１００個の細胞が数えられた。ＤＧにおけるシナプトフィシンおよびシナプシン１の発現を定量分析するために、海馬を介した１連の４０μｍコロナセクション内の各１０セクションが分析される。ＧＣＬの全アウトラインが示された。次に最大投影画像が共焦点Ｚ−スタックに基づいて生成され、さらに抗体染色が、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪプログラム、バーンジョン１３２ｊ（ｈｔｔｐ；／／ｒｓｂ．ｉｎfｏ．ｎｉｈ．gｏｂ／ｉｊ／）を使って、平均光学密度を測定することで定量化された。
【００３８】
ＨｅｐＧ２細胞におけるＳＴＡＴ３のリン酸化の分析
ＬＩＦシグナリングを介してペプチド０２１の作用の分子メカニズムを探るために、８０％コンフルエントなＨｅｐＧ２の人の肝臓がん細胞（ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア州）は、異なる濃度のペプチド０２１および０．２５ｎｍのＬＩＦ（ケミコンインターナショナル社製、テメクラ、カリフォルニア州）とともに１５分間処理した。細胞は溶解され、次に抗リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｔｙr  ７０５）抗体および抗ＳＴＡＴ３抗体（セル  シグナリング  テクノロジー社製、デンバー、マサチュウセッツ州）を使って展開させたウエスタンブロット法にかけられた。
【００３９】
統計的解析
全ての統計的解析はＳＴＡＳＴＩＣＡ６．０（スタットソフト社製、タルサ、オクラホマ州）を用いて行われた。データは平均±ＳＥＭとして表示される。ポストホックフィッシャーのＬＳＤ検定によるＡＮＯＶＡが、スチューデントのｔ−検定により解析されたＳＴＡＴ３  リン酸化反応からのデータを除いて、解析データとして用いられる。ｐ<０．０５の差異は重要であると考えられている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2013530975.tif 000014
2013530975.tif 000015