(57)【要約】  本発明は、イソフラボンの一種であるダイゼインおよびダイジンを用いてＮＦ−κＢ遺伝子発現を阻害することによりＮＦーκＢの合成を阻害する方法を開示する。構造（１）を有する無毒の栄養補助食品イソフラボンであるダイゼイン、および構造（２）を有する７−Ｏ−ε−グルコピラノシル・ダイゼインは、ＮＦ−κＢ遺伝子発現を阻害することによりＮＦーκＢの合成を阻止する新規なＮＦ−κＢ阻害剤であり、全く毒作用はない。構造（１）のダイゼインおよび構造（２）のダイジンはいずれも、インスリン刺激によるグルコース取り込み時におけるＮＦ−κＢの阻害を排除することにより、パルミテート誘発による骨格筋細胞におけるＮＦ−κＢの過剰発現を改善する。ダイゼインは、前立腺がんおよび乳がん細胞におけるＮＦ−κＢの発現を阻害し、その結果これらのガン細胞の死亡率が増加する。構造（２）のダイジンは、構造（１）のダイゼインをしのぐ非常に優れた生体利用性を有する。構造（１）のダイゼインは、マウスに経口投与した場合、ＵＧＴ１の触媒作用によるグルクロン酸抱合プロセスによって消化管から排出されるため、吸収されない。構造（２）のダイジンはグルコシル化されたダイゼインであり、ＵＧＴ１介在による分解から保護され、加水分解されてダイゼインになり、それは血液中に吸収されて４時間以上血液中に留まるため、様々な組織や臓器に分配されことが期待される。構造（１）のダイゼインおよび構造（２）のダイジンは、パルミテート刺激によるＮＦ−κＢ合成の増大を大幅に低減する。ダイゼインは、パルミテート刺激によるＮＦ−κＢ／ＤＮＡ複合体の形成を阻害する。また、ダイゼインおよびダイジンはいずれもＮＦーκＢの発現を阻害し、その結果ＮＦ−κＢとＤＮＡとの結合を減少させることになる。構造（１）のダイゼインは、クロマトグラフィーによりダイズの葉から得た。ダイゼインおよびダイジンは、天然のものでも合成されたものでも生物活性は同じである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする脊椎動物に対し、治療有効量の、ダイズ属（genus Glycine）に属するダイズ植物体（soyabean plant）から得られるイソフラボン、および薬剤として許容される前記イソフラボンの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を投与することを含む、ＮＦーκＢ遺伝子発現を阻害する方法。
【請求項２】
選ばれる前記イソフラボンは、ダイズから抽出されたダイゼインおよびダイジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
使用される細胞株は、ＰＣ−３前立腺がん細胞株およびＭＣＦ−７乳がん細胞株からなる群より選ばれた、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＦ−κＢの阻害は、乳がん、前立腺がん、および糖尿病からなる群より選ばれる疾病の治療に用いられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記使用されるダイゼインの有効量はおよそ３〜５μｇ／ｍｌである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
治療を必要とする対象者に対し、３〜５μｇ／ｍｌの範囲でダイゼインおよびダイジンからなる群より選ばれるイソフラボンを経口投与することを含む、ヒトの前立腺がん、乳がん、および糖尿病を治療する方法。
【請求項７】
ＮＦ−κＢ遺伝子発現の阻害剤としてのダイゼインおよびダイジンの使用。
【請求項８】
ヒトの前立腺がん、乳がん、および糖尿病の治療へのダイゼインおよびダイジンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイズ（学名「ダイズ（Glycine max）」）由来の植物性イソフラボンの一種であるダイゼインおよびダイジンを用いてＮＦ−κＢ遺伝子発現を阻害することにより、ＮＦ−κＢの合成を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＦ−κＢは、糖尿病およびがんを含む炎症性疾患において重要な役割を果たす周知の転写因子である。ＮＦ−κＢは、２つのポリペプチド鎖、すなわちｐ５０およびｐ６５を有する不活性ヘテロ二量体として細胞内に留まる。これら２つの二量体の核局在化シグナルドメインは、κＢ阻害剤（ＩκＢ）として公知の別のタンパク質によりブロックされた状態にある。ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）によるＩκＢのリン酸化は、ＩκＢのプロテアソーム分解を引き起こし、それは活性化されたＮＦ−κＢを核内へと移行させ、そこでＮＦ−κＢはＤＮＡと結合して特異遺伝子のプロモーターを活性化する。
【０００３】
ＮＦ−κＢは多くの遺伝子発現を制御し、その多くは、糖尿病、がん、関節炎、およびアルツハイマー病と関係している。よって、強力なＮＦ−κＢ阻害剤への需要は高い。市販のＮＦ−κＢ阻害剤もいくつかあるが、そのほとんどは毒性が高いので治療目的には使えない。しかし、これらはすべて活性化阻害剤であり、すなわち、いずれもがＩκＢκまたはＩＫＫのリン酸化を阻害するものである。
【０００４】
マグノリア・オフィシナリスから得られたマグノロールおよびホノキオールは、ＮＦ−κＢの活性化を阻害し、ＮＦ−κＢ誘発による遺伝子産物の発現を下方制御する（エー・ケー・ツェー（Tse, A.K.）、シー・ケー・ワン（Wan, C.K.）、ジー・ワイ・ズー（Zhu, G.Y.）、 エックス・エル・シェン（Shen, X.L.）、エッチ・ワイ・チャン（Cheung, H.Y.）、エム・ヤン（Yang, M.）、およびダブル・エフ・フォン（Fong, W.F.）、２００７年、「マグノロール  サプレシズ  エヌエフカッパビー  アクティベーション  アンド  カッパビー  レギュレーテッド  ジーン  エクスプレッション  スルー  インヒビション  オブ  アイカッパビー  キナーゼ  アクティベーション（Magnolol suppresses NF-kappaB activation and NF-kappaB regulated gene expression through inhibition of IkappaB kinase activation）」、モレキュラー・イミュノロジー（Mol. Immunol）、第４４巻、２６４７〜２６５８ページ）。
【０００５】
公知の強力なＮＦ−κＢ活性化阻害剤であるクルクミンは広く知られている。アセチルサリチラートも、ＩＫＫκを阻害することによりＮＦ−κＢを阻害する。また、ＭＧ１３２のように、ＩκＢκ分解を阻害してＮＦ−κＢを細胞質基質に制限するプロテアソーム系阻害剤もいくつかある。ジチオカルバメートは公知のＩＫＫ阻害剤である（アール・シュレック（Shreck, R.）、ビー・マイヤー（Meier, B.）、ディー・エヌ・マネル（Mannel, D.N.）、ダブル・ドロージュ（Droge, W.）、およびピー・エー・ボーヤール（Baeuerle, P.A.）、１９９２年、「ジチオカルバメート  アズ  ポーテント  インヒビターズ  オブ  ヌクリア  ファクター  カッパビー  アクチベーション  イン  インタクト  セルズ（Dithiocarbamate as potent inhibitors of nuclear factor kappa B activation in intact cells）」、ジェイ・イー・エム（JEM）、第１７５巻、１１８１〜１１９４ページ）。ＳＮ−５０、パルテノリド、およびＰＤＴＣもまた、強力なＮＦ−κＢ活性化阻害剤として一般に用いられている。毒作用のない阻害剤を見つけ出すための研究が今も続いている。
【発明の概要】
【０００６】
ここで我々は、ＮＦ−κＢ経路を効果的にブロックする、天然源から単離される新規な分子を見つけ出した。この分子は、新たなターゲットにおいてＮＦ−κＢの遺伝子転写を阻害するが、毒作用はなかった。
【０００７】
多くのＮＦ−κＢ阻害剤が知られており、それらはＮＦ−κＢの活性化を阻害する。我々は、ＮＦ−κＢ遺伝子発現を阻害することによりＮＦ−κＢの合成を阻止するＮＦ−κＢ阻害剤を発明した。ダイゼインは、分子量２５４の無毒のイソフラボンであり、通常、ダイズ、マメ科植物、およびエンドウマメといった数多くの栄養補助食品中に存在する。ダイゼインはＮＦ−κＢ遺伝子発現を阻害し、結果としてタンパク質の発現を阻害するため、糖尿病やがんといった様々な重篤な疾患の治療に利用することができる。
【０００８】
ＮＦ−κＢは、デビッド・ボルティモアにより発見された転写因子である（アール・セン（Sen, R.）およびディー・ボルチモア（Baltimore, D）、１９８６年、「インデューシビリティ  オブ  カッパ  イミュノグロブリン  エンハンサーバインディング  プロテイン  ＮＦ−κＢ  バイ  ア  ポストトランスレーショナル  メカニズム（Inducibility of κ immunoglobulin enhancer-binding protein NF-kB by a post translational mechanism）」、セル（Cell）、第４７巻、９２１〜９２８ページ）、および（エッチ・シン（Singh, H.）、アール・セン（Sen, R.）、ディー・ボルチモア（Baltimore, D.）、およびピー・エー・シャープ（Sharp, P.A.）、１９８６年、「ア  ヌクリア  ファクター  ザット  バインズ  トゥ  ア  コンサーブド  シーケンス  モチーフ  イン  トランスクリプショナル  コントロール  エレメンツ  オブ  イミュノグロブリン  ジーンズ（A nuclear factor that binds to a conserved sequence motif in transcriptional control elements of immunoglobulin genes）」、ネイチャー（Nature）、第３１９巻、１５４〜１５８ページ）。ＮＦ−κＢは、ガンおよび糖尿病に関連した数多くの遺伝子発現を制御するため、現在集中的に研究が行われている。この転写因子は、大半の炎症性遺伝子の転写も制御する。従って、がんや糖尿病が人間の健康に大きな脅威を及ぼす限り、ＮＦ−κＢを阻害する分子を捜し出すことは非常に重要である。
【０００９】
我々は以前、骨格筋細胞における脂質誘発によるＮＦ−κＢ過剰発現がインスリン抵抗性と関係していることを報告している（ピー・バルマ（Barma, P.）、エス・バッタチャルヤ（Bhattacharya, S.）、エー・バッタチャルヤ（Bhattacharya, A.）、アール・クンドゥ（Kundu, R.）、エス・ダスグプタ（Dasgupta, S.）、エー・ビスワス（Biswas, A.）、エス・バッタチャルヤ（Bhattacharya, S.）、エス・エス・ロイ（Roy, S.S.）、およびエス・バッタチャルヤ（Bhattacharya, S.）、２００９年、「リピッド  インデュースド  オーバーエクスプレッション  オブ  エヌエフカッパビー  イン  スケルタル  マッスル  セルズ  イズ  リンクド  トゥ  インスリン  レジスタンス（Lipid induced overexpression of NF-κΒ in skeletal muscle cells is linked to insulin resistance）」、バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochim. Biophys. Acta.）、第１７９２巻、１９０〜２００ページ）。ダイゼインは、骨格筋細胞におけるパルミテート誘発によるＮＦ−κＢの過剰発現を改善する。
【００１０】
薬剤候補としてのイソフラボンの問題は、イソフラボンが腸や肝臓内でグルクロン酸抱合され、尿や便とともに体外へ排泄されてしまう点である。ダイゼインの生体利用性には大きな制限があるため、ダイゼインを薬剤として作用させるには、その吸収が現実の問題となる。ダイゼインを経口投与しても血清における可用性に結びつかないのは、消化管細胞から放出されたＵＧＴ１酵素の存在によってグルクロン酸抱合プロセスが起こり、それによってダイゼインが消化管から排出されるからである（ケー・ホソダ（Hosoda, K.）、ティー・フルタ（Furuta, T.）、エー・ヨコカワ（Yokokawa, A.）、ケー・オグラ（Ogura, K.）、エー・ヒラツカ（Hiratsuka, A.）、およびケー・イシイ（Ishii, K.）、２００８年、「プラズマ  プロファイリング  オブ  インタクト  イソフラボン  メタボライツ  バイ  ハイパフォーマンス  リキッドクロマトグラフィー  アンド  マススペクトロメトリック  アイデンティフィケーション  オブ  フラボン  グリコサイズ  ダイジン  アンド  ジェニスティン  イン  ヒューマン  プラズマ  アフター  アドミニストレーション  オブ  キナコ（Plasma profiling of intact isoflavone metabolites by high-performance liquid chromatography and mass spectrometric identification of flavone glycosides daidzin and genistin in human plasma after administration of kinako）」、ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Drug Metabolism and Disposition）、第３６巻、１４８５〜１４９５ページ）。
【００１１】
我々も同様の問題に直面した。体外の細胞株においては、ダイゼインは、ＮＦ−κＢ転写を効果的に阻止することができたが、消化管を通じたダイゼインの吸収が問題となるため、ターゲット組織に対するＮＦ−κＢ合成を阻害するためのダイゼインの作用は、ＮＦ−κＢが関与する疾患の治療には効果がないであろう。
【００１２】
この問題を解決するために、グルコシル化されたダイジンを用いれば、ＵＧＴ１介在による分解から保護できるのではと考えた。この仮説を確かめるために、相当量のイソフラボングリコシド（配糖体）を含むダイズの葉からダイジンを精製した。マウスにダイジン溶液を経口投与し、何回かに分けて血清を採取してそれらの血清についてタンパク質を沈殿させ、上澄み液を凍結乾燥させてダイジンの吸収を観察した。興味深いことに、血清中から検出できたのは、非グリコシド化合物であるダイゼインであった。このことから、ダイジンが加水分解されてダイゼインになり、４時間以上血液中に留まっていたことがわかる。
【００１３】
また、肝臓や骨格筋からもダイゼインを見つけた。ダイゼインは、ＮＦ−κＢのタンパク質および遺伝子の発現を減少させると同時に、ＮＦ−κＢ制御された遺伝子も阻害する。フェチュインＡ（κ２ヘーレマンス・シュミット糖タンパク質（Ａｈｓｇ））は、インスリン受容体チロシンキナーゼのリン酸化の内因性阻害剤であり、インスリン刺激された下流シグナルを抑止する（ピー・アウバーガー（Auberger, P.）、エル・ファルケロ（Falquerho, L.）、ジェイ・オー・コントレレス（Contreres, J.O.）、ジー・ペイジ（Pages, G.）、ジー・ルカム（Le Cam, G.）、ビー・ロッシ（Rossi, B.）、およびエー・ルカム（Le Cam, A.）、１９８９年、「キャラクタライゼーション  オブ  ア  ナチュラル  インヒビター  オブ  ザ  インスリン  レセプター  ティロシンキナーゼ：シーディーエヌエー  クローニング  ピュリフィケーション  アンド  アンティマイトジェニック  アクティビティ（Characterization of a natural inhibitor of the insulin receptor tyrosine kinase: cDNA cloning, purification, and anti-mitogenic activity）」、セル（Cell）、第５８巻、６３１〜６４０ページ、と、ジー・ロース（Rauth, G.）、オー・ポシュケ（Poschke, O.）、イー・フィンク（Fink, E.）、エム・ユーリッツ（Eulitz, M.）、エス・チップマー（Tippmer, S.）、エム・ケレラー（Kellerer, M.）、エッチ・ユー・ハリング（Haring, H.U.）、ピー・ノーラティル（Nawratil, P.）、エム・ハースマン（Haasemann, M.）、およびダブル・ヤーネンドゥシャン（Jahnen-Dechent, W.）、１９９２年、「ザ  ヌクレオチド  アンド  パーシャル  アミノ  アシッド  シーケンセズ  オブ  ラット  フェチュイン：アイデンティファイ  ウィズ  ザ  ナチュラル  ティロシンキナーゼ  インヒビター  オブ  ザ  ラット  インスリン  レセプター（The nucleotide and partial amino acid sequences of rat fetuin: Identity with the natural tyrosine kinase inhibitor of the rat insulin receptor）」、ヨーロピアン・ジャーナル・オフ・バイオケミストリー（Eur. J. Biochem）、第２０４巻、５２３〜５２９ページ）。
【００１４】
フェチュインＡはまず肝臓で合成され、血清に分泌される。フェチュインＡ遺伝子は、パルミテート処理されたラットの初代肝細胞で過剰発現する。我々は、このフェチュインＡの過剰発現にはＮＦ−κＢが介在していることを見出した。ＮＦ−κＢのｓｉＲＮＡは、パルミテート誘発によるフェチュインＡの過剰発現を阻害する一方、肝細胞におけるＮＦーκＢの強制発現においては、パルミテート不在下でフェチュインＡの発現を誘発する。ダイゼインはＮＦ−κＢ合成を下方制御するので、フェチュインＡのタンパク質および遺伝子の発現も阻害する。ＮＦ−κＢおよびフェチュインＡはいずれもインスリン抵抗性および２型糖尿病に関係しているため、ダイゼインによるＮＦ−κＢ転写の阻害は、インスリン作用の改善に役立つ。ダイゼインは、パルミテートによって下方制御される、インスリン刺激によるＧｌｕｔ−４の原形質膜への移動を助けるので、インスリン刺激によるグルコースの取り込みを増加させる。
【００１５】
様々な種類のがんにおいてＮＦ−κＢ活性が高められたことを示すいくつかのレポートに基づき、ガン細胞においてダイゼインがＮＦ−κＢ遺伝子発現を阻害できるかどうか調べた。その結果、ＰＣ−３（前立腺ガン細胞株）およびＭＣＦ−７（乳がん細胞株）細胞においてダイゼインがＮＦ−κＢ遺伝子発現を有意に阻害することがわかった。従って、ダイゼインは、汎用性のあるＮＦ−κＢ転写阻害剤であると考えることができる。
【００１６】
（発明の目的）
本調査の主な目的は、植物性分子ダイゼインおよびダイジンを用いてＮＦ−κＢ遺伝子発現を阻害することにより、ＮＦ−κＢの合成を阻害する方法を提供することである。
【００１７】
本調査のもう１つの目的は、ＮＦ−κＢ転写を阻害してそれによってＮＦ−κＢ遺伝子発現を抑止するであろう治療活性化合物であって、それによって糖尿病やがんといった重篤な疾患の治療法について別の選択肢を提供することになるだろう治療活性化合物を提供することである。
【００１８】
（発明の要旨）
そこで、本発明は、ＮＦーκＢ遺伝子発現を阻害する方法であって、治療を必要とする脊椎動物に対し、治療有効量の、ダイズ属（genus Glycine）に属するダイズ植物体（soyabean plant）から得られるイソフラボン、および薬剤として許容されるイソフラボンの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を投与することを含む、方法を提供する。
【００１９】
本発明の一実施形態は、ＮＦーκＢ遺伝子発現を阻害する方法であって、治療を必要とする脊椎動物に対し、治療有効量の、ダイズ属（genus Glycine）に属するダイズ植物体（soyabean plant）から得られるイソフラボン、および薬剤として許容されるイソフラボンの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を投与することを含む、方法である。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、選ばれるイソフラボンは、ダイズから抽出されたダイゼインおよびダイジンである。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、使用される細胞株は、ＰＣ−３前立腺がん細胞株およびＭＣＦ−７乳がん細胞株からなる群より選ばれたものである。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、前記ＮＦ−κＢ阻害は、乳がん、前立腺がん、および糖尿病からなる群より選ばれる疾病の治療に用いられる。
【００２３】
本発明の別の実施形態において、前記使用されるダイゼインの有効量は３〜５μｇ／ｍｌである。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、ヒトの前立腺がん、乳がん、および糖尿病を治療する方法であって、治療を必要とする対象者に対し、３〜５μｇ／ｍｌの範囲でダイゼインおよびダイジンからなる群より選ばれるイソフラボンを経口投与することを含む、方法である。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、ＮＦ−κＢ遺伝子発現の阻害剤としてのダイゼインおよびダイジンの使用である。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、ヒトの前立腺がん、乳がん、および糖尿病の治療へのダイゼインおよびダイジンの使用である。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、実施例を参照して実質的にここに記載するような、ＮＦーκＢ遺伝子発現を阻害するための方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、ダイゼインの基準ＨＰＬＣピークを示す。
【図２】図２は、ダイジンの基準ＨＰＬＣピークを示す。
【図３】図３は、ダイジンの経口投与によりダイゼイン（Ｄｎ）の生体利用性が向上することを示す。（Ａ）血清中においてＤｎの生体利用性の時間依存的上昇が観察され、（Ｂ）１２０分後、肝臓において相当量が検出された。
【図４】図４は、パルミテートによるＮＦ−κＢの過剰発現を示す。インスリン（１００ｎｍｏｌｅ）存在下で骨格筋細胞を０．７５ｍＭのパルミテートと共にインキュベートし、インスリン刺激による［3Ｈ］２−デオキシグルコース取り込み量が測定された（図４Ａ）。Ｌ６筋管にＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４プラスミドをトランスフェクトした後、パルミテートと共に、またはパルミテート＋ダイゼインと共に、インキュベートした。インキュベーション終了３０分前にインスリンを加えた。共焦点顕微鏡により、Ｇｌｕｔ４の移行が観察された（図４Ｂ）。パルミテートと共にインキュベートされた筋管に対して、抗ｐＮＦ−κＢ  ｐ６５、ＮＦ−κＢ  ｐ６５、ｐＮＦ−κＢ  ｐ５０およびＮＦ−κＢ  ｐ５０抗体を用いてウェスタンブロットが行われた。βアクチンが添加対照（loadong control）として用いられた（図４Ｃ）。時間および用量依存的にＮＦ−κＢタンパク質レベルを求めるためウェスタンブロットが行われた（図４ＤおよびＥ）。５回別個に実験を行って、その平均値±標準誤差を算出した。添加対照およびパルミテートと比較して、(*p<0.001、#p<.01)。
【図５】図５は、ダイゼイン（Ｄｎ）およびダイジン（Ｄｉｎ）がいずれもＮＦ−κＢのタンパク質および遺伝子の発現を阻害することを示す。ダイゼイン存在下または不在下で、骨格筋細胞をパルミテートと共にインキュベートした。ＮＦ−κＢ  ｐ６５およびＮＦ−κＢ  ｐ５０タンパク質レベルの変化が、ＮＦ−κＢ  ｐ６５またはＮＦ−κＢ  ｐ５０抗体を用いた免疫ブロット法により求められた。βアクチンが添加対照（loading control）として用いられた（図５Ａ）。骨格筋細胞を、インスリン、パルミテート、もしくはパルミテート＋ダイゼインと共に、またはこれらのいずれも使用せずに（Ｃ対照）、４時間インキュベートした。インキュベーション終了時に、ＲＮＡが抽出され、続いてＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲが行われた（図５Ｂ）。Ｌ６筋管をパルミテート、およびパルミテート＋ダイジンと共に４時間インキュベートした。抗ＮＦ−κＢ特異抗体もしくはＮＦ−κＢ特異プライマーを用いてウェスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲが行われた（図５Ｃ）。
【図６】図６は、ＮＦ−κＢ  ｐ６５タンパク質の精製を示す。対照およびパルミテートと共に６時間インキュベートしたＬ６骨格筋細胞溶解物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。６５ｋＤａ領域における明瞭かつ連続したバンドは、ＮＦ−κＢ  ｐ６５タンパク質の過剰発現を示している。Ｌ６骨格筋細胞をパルミテートと共にインキュベートし、遠心分離後の細胞溶解物をセファデックスＧ−７５カラムに添加した。パルミテートインキュベーションによるＮＦ−κＢタンパク質の発現を確認するため、対照を並行して処理した。対照およびパルミテート処理した細胞溶解物から別々に採取した（Ａ１、Ａ２、Ａ３といった）画分を、抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５抗体で免疫ブロットした。レーンＡ１およびＡ２は、ＮＦ−κＢの免疫反応バンドを示している。ゲル濾過クロマトグラフィーからプールした画分を凍結乾燥し、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ免疫親和性カラムに添加した。Ｐ１（非結合のタンパク質）およびＰ２（２ＭのＫＩによる溶出後の結合画分）のピークを収集した。ウェスタンブロット分析によると、Ｐ２がＮＦ−κＢの免疫反応バンドを示している。
【図７】ＮＦ−κＢ  ｐ６５タンパク質をＬ６骨格筋細胞に送達し、その取り込みを免疫蛍光法により検出した。ＮＰＴによりトランスダクトされた細胞をダイゼインと共にインキュベートし、［3Ｈ］２−デオキシグルコース取り込み量が求められた（図７Ａ）。対照およびＮＦ−κＢ  ｐ６５によりトランスダクトされた細胞（ＮＰＴ）を、抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５抗体を用いてウェスタンブロット分析にかけた（図７Ｂ）。Ｃ）ＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４構造を骨格筋細胞にトランスフェクトし、インスリン（Ｉ）、Ｉ＋ＮＦ−κＢ  ｐ６５タンパク質、もしくはＩ＋ＮＦ−κＢ  ｐ６５タンパク質＋ダイゼインと共に、または何も用いずに（Ｃ対照）インキュベートした。インキュベーション終了時に、レーザー走査共焦点顕微鏡を用いてＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４の局在化が検出された（図７Ｃ）。値は、３回別個に行った実験の平均値±標準誤差を表しており、*p<0.01 (I vs I + NPT)。
【図８】ＮＦ−κＢ核局在化の増加がダイゼインによって阻害されている。Ｌ６筋管をパルミテートまたはパルミテート＋ダイゼインと共にインキュベートした。蛍光顕微鏡を使って免疫蛍光による検討が行われた。
【図９】図９は、ＮＦ−κＢの過剰発現と活性化との関係を示す。パルミテート、パルミテート＋ダイゼイン、もしくはＳＮ５０と共に、またはこれらいずれも使用せずに（対照）４時間インキュベートしたＬ６骨格筋細胞から核抽出物（ＮＥ）を作製した後、ＥＭＳＡを行った。野生型および変異型ＤＮＡ配列の両方を使って、ＮＦ−κＢ結合の特異性が判定された（図９Ａ）。パルミテート（Ｐ）もしくはパルミテート＋ダイゼイン存在下、またはこれらのいずれも使用せずに（Ｃ）インキュベートした骨格筋細胞において、抗ｐＩＫＫおよび抗ｐＩκＢα抗体をプローブとして用いて、ＩＫＫおよびＩκＢのパルミテート誘発リン酸化レベルを判定した。ＩＫＫおよびＩκＢαタンパク質に対する免疫ブロットを添加対照として用いた。
【図１０】ＮＦ−κＢ発現のパルミテート刺激が、ダイゼイン（Ｄｎ）によって阻害されている。ＮＦ−κＢシス型レポーター遺伝子プラスミドによりトランスフェクトされたＬ６筋管を、パルミテート（Ｐ）と共に、およびパルミテート＋Ｄｎと共にインキュベートした。インキュベーションの５時間後にルシフェラーゼ活性が確認された。パルミテートとのインキュベーションの前に、Ｄｎと共に細胞を１時間プレインキュベートした（図１０Ａ）。３回別個に行った実験の平均値±標準誤差を計算した。パルミテートと共に（Ｐ）、パルミテートなしで（Ｃ）、およびパルミテート＋Ｄｎと共にインキュベートした筋管を、抗ＮＦ−κＢ特異抗体を用いてＦＡＣＳ分析にかけた（図１０Ｂ）。
【図１１】ＮＦ−κＢ介在によるフェチュインＡの発現がダイゼイン（Ｄｎ）によって阻害されている。肝細胞を、パルミテートなしで（Ｃｔｌ）または０．７５ｍＭパルミテートと共に（Ｐ）４時間インキュベートした。パルミテートとのインキュベーションの前に、Ｄｎと共に細胞を１時間プレインキュベートした。ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトされた細胞をダイゼインと共にインキュベートした。細胞を溶解して、抗フェチュインＡ抗体を用いて免疫ブロットした。内部対照としてβアクチンを用いた。上記インキュベーション物から抽出したＲＮＡに対して、フェチュインＡ特異プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲを行った。内部対照としてｇａｐｄｈを用いた。３回別個に行った実験の平均値±標準誤差が計算された。
【図１２】ダイゼインは、前立腺がんおよび乳がんに対する予防効果を有する。ＰＣ−３およびＭＣＦ−７細胞を濃度５μｇ／ｍｌのダイゼインと共にインキュベートした。細胞死亡率を顕微鏡で確認した。上記インキュベーション物から抽出したＲＮＡに対して、ＮＦ−κＢ特異プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。内部対照としてｇａｐｄｈを用いた。３回別個に行った実験の平均値±標準誤差が計算された(図１２ＡおよびＢ)。
【図１３】図１３は、ＭＣＦ−７およびＰＣ−３細胞におけるＮＦ−κＢ  ｐ６５の発現と活性化との関係を示す。ＭＣＦ−７およびＰ−３細胞は、Ｄｎなしで（Ｃｏｎ）もしくはＤｎ（５μｇ／ｍｌ）で処理、または、ＮＦ−κＢ  ｐ６５  ｓｉＲＮＡ（ｐ６５ＫＯ）もしくはスクランブルｓｉＲＮＡ（モック）によりトランスフェクトされた。対照細胞は溶媒としてＤＭＳＯを含有していた。これら細胞から抽出した全ＲＮＡに対して、ＮＦ−κＢ  ｐ６５遺伝子特異プライマーを用いて定量ＰＣＲを行った。κＢ内部対照としてｇａｐｄｈを用いた。ＭＣＦ−７およびＰ−３細胞は、ＤｎなしでもしくはＤｎと共にインキュベート、または、ＮＦ−κ  Ｂｐ６５  ｓｉＲＮＡ（ｐ６５ＫＯ）もしくはスクランブルｓｉＲＮＡ（モック）によりトランスフェクトされ、その後、［3Ｈ］−ロイシンもしくは［γ32ｐ］−ＡＴＰとインキュベートされた。細胞溶解物からＮＦ−κＢ  ｐ６５またはｐＮＦ−κＢ  ｐ６５をプルダウンし、放射標識したロイシンまたはリン酸塩のＮＦ−κＢ  ｐ６５またはｐＮＦ−κＢ  ｐ６５への取り込み量（％）を、液体シンチレーションカウンターを用いた放射線計測により求めた。ここに示した図は、５回別個におこなわれた実験の代表例のひとつである。示されたデータは平均値±標準誤差であり、*p<0.01 vs Con、#p<0.001 vs Con。
【図１４】ダイゼインおよびダイジンは細胞生存性を阻害する。用量依存的な方法でダイゼインおよびダイジンを用いて、用量依存的な方法でＭＴＴアッセイを行った。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
ダイゼインは、構造１を有する無毒の栄養補助食品イソフラボンであり、ＮＦ−κＢ遺伝子発現を阻害することによりＮＦ−κＢの合成を阻止する新規なＮＦ−κＢ阻害剤である。構造１のダイゼインは、ＮＦ−κＢの遺伝子転写を阻害するが、毒作用はない。構造２を有するグルコピラノシル・ダイゼインであるダイジンも、ＮＦ−κＢ遺伝子発現を阻害することによりＮＦ−κＢの合成を阻止するＮＦ−κＢ阻害剤であり、毒作用はない。
【００３０】
構造１のダイゼインも構造２のダイジンも、骨格筋細胞におけるパルミテート誘発によるＮＦ−κＢの過剰発現を改善する。構造１のダイゼインおよび構造２のダイジンは、パルミテートによって下方制御される、インスリン刺激によるＧｌｕｔ−４の原形質膜への移動を助けるため、インスリン刺激によるグルコースの取り込みを増加させる。構造１のダイゼインも構造２のダイジンも、ＰＣ―３(前立腺ガン細胞株)およびＭＣＦ−７(乳がん細胞株)の阻害剤であり、新規なＮＦ−κＢ転写阻害剤である。
【００３１】
構造２のダイジンは、ダイゼインをしのぐ非常に優れた生体利用性を有する。ダイゼインは栄養補助食品の中に存在し、ダイズ、マメ科植物、およびエンドウマメに含まれているが、生体利用性の問題がある。構造１のダイゼインは、マウスに経口投与しても吸収されない。これは、構造１のダイゼインが、消化管細胞から放出されたＵＧＴ１酵素の存在によるグルクロン酸抱合プロセスによって消化管から排出されるからである。構造２のダイジンは、グルコシル化されたダイゼインであり、ＵＧＴ１介在による分解から保護され、加水分解されてダイゼインになり、吸収されて４時間以上血液中に留まるため、様々な組織や臓器に分配されることが期待される。
【００３２】
構造１のダイゼインと構造２のダイジンは、パルミテート刺激により増加するＮＦ−κＢ合成を大幅に低減する。ダイゼインは、パルミテート刺激によるＮＦ−κＢ・ＤＮＡ複合体の形成を阻害する。
【００３３】
よって、構造１のダイゼインおよび構造２のダイジンは、ＰＣー３および乳がんにおけるＮＦ−κＢ遺伝子発現を阻害することによって、前立腺がんおよび乳がんに対して予防効果を発揮する。これら２つの化合物は、ＮＦ−κＢ転写を阻害することによって治療上活性となるため、糖尿病、関節炎およびアルツハイマー病といった重篤な疾患の治療に有益である。
【００３４】
構造１のダイゼインおよび構造２のダイジンは、クロマトグラフィーによりダイズの葉から得た。ダイゼインおよびダイジンは、天然のものでも市販／合成されたものでも生物活性は同じである。
【実施例】
【００３５】
例として以下の実施例を示すが、本発明の範囲を制限するものではない。
【００３６】
（実施例１）
ダイズの葉からダイジンを抽出および精製した。イソフラボンの一種であるダイジンを、溶媒分画、すなわち、ダイヤイオンＨＰ−２０およびＭ−ボンダパックＣ−１８を用いた逆相カラムクロマトグラフィーによって、ダイズ（Glycine max）の葉から単離および精製した。その構造を、1Ｈ  ＮＭＲ、13Ｃ  ＮＭＲおよびＱ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認した。新鮮葉１００ｇからなる植物材料をグラインダー付きミキサーで粉砕し、２００ｍｌのエタノール／水混合液（７０／３０（体積比））に一晩浸漬した。濾過により抽出物を得、その植物性材料を再び未使用のエタノール性溶液である２００ｍｌのエタノール／水混合液（７０／３０（体積比））に一晩浸漬した。このプロセスを３回繰り返す。混合抽出物を、減圧下、５０℃未満で濃縮した。そして、濃縮された抽出物を、ヘキサン抽出（１００ｍｌ×３）により脱脂した。次に、脱脂された水層を、クロロホルム、続いて酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下、５０℃未満で蒸留した。次に、得られたゴム状の物質を、酢酸エチル、メタノール（５０％）／酢酸エチル、メタノール、および水（４５％）／メタノールを用いて、シリカゲルカラムによるクロマトグラフにかけた。水（４５％）／メタノールによる溶出で得られた画分が、それぞれダイゼインとダイジンであることがわかった。
【００３７】
これら２つの画分を、水（４５％）／メタノールで溶出するＣ１８  ＲＰカラムによるフラッシュクロマトグラフィーによりさらに精製して、純粋なダイゼインおよびダイジンを得た。単離された化合物を、Ｌｕｎａ−Ｃ１８（２）カラムを用いて、ＨＰＬＣ（ウォーターズ社製ＨＰＬＣ装置）によりさらに確認した。メタノール（４５％）／水（体積比）を溶媒系として使用し、流速１ｍｌ／分で３５分間行った。１０マイクロリットルの試料を注入して、２３２ｎｍの紫外線でＩクロマトグラムを記録した。その際、ダイゼインはクロマトグラム上の保持時間５．６分に現れ、ダイジンはクロマトグラム上の保持時間８．７６分に現れた。そして、それぞれの構造を、ＩＲ、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ  ＮＭＲおよび質量スペクトルで確認した。
【００３８】
（実施例２）
生体利用性
ダイゼインおよびダイジンの溶液をマウスに経口投与して、１５分、３０分、６０分、１２０分および２４０分後に血液を採取し、血清分離することにより、ダイゼインおよびダイジンの生体利用性をテストした。最初に、標準および認証ダイゼインとダイジンを用いて、血液中のダイゼインおよびダイジンのＨＰＬＣ評価用に検量線を較正した。その後、認証ダイゼインを標準として用いて、ダイズの種からダイゼインを精製した。ゾーバックス社製Ｃ１８４５カラムを用いて、ウォーターズ社製ＨＰＬＣ装置でダイゼインの分析を行った。Ｈ2ＰＯ4（０．１％）／水（Ａ）およびＨ2ＰＯ4（０．１％）／アセトニトリル（Ｂ）を溶媒系として使用し（Ｂを２０％〜８０％勾配で２５分間、Ｂを８０％から２０％勾配で５分間）、流速１ｍｌ／分とした。クロマトグラムはすべて、２３２ｎｍの紫外線で記録した。ダイゼイン、ダイジンおよび代表的な血清試料のＨＰＬＣクロマトグラムを、図１、図２および図３にそれぞれ示した。ダイゼインのピークは、クロマトグラム上の保持時間５．６分に現れる。ダイジンのピークは、クロマトグラム上の保持時間８．７６分に現れる。血清試料は、保持時間８分あたりにピークを示さない。しかし、投与１５分後に採取した血清は、保持時間５．２２７分にピークを示した。これは、血液中にダイジンはなく、イソフラボングリコシドであるダイジンの加水分解生成物であるダイゼインが血清中に存在することを明確に示唆している。４時間後に採取した血清試料において、ダイジンの加水分解生成物が観察された。これは、血清中において相当な保持時間である４時間以上もの間、体のそれぞれの組織や臓器が、循環系の供給源からダイゼインを利用可能であることを示している。
【００３９】
ダイゼインの生体利用性
フラボン化合物は、ＵＧＴグループ酵素のグルクロン酸抱合により腸管から速やかに排出されるため、その生体利用性には問題がある（アール・キング（King R.）、１９９８年、アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Am. J. Clin. Nutr.）、第６８巻、１４９６Ｓ〜１４９９Ｓページ）。そのため、ダイゼインについて、その生体利用性を調べた。ダイゼインには、天然の入手可能な形態として、グルコシル化されたもの（ダイジン）とアグリコン（ダイゼイン）の２つがあり、両者を比較した場合により活性度の高いダイゼインを実験で使用した。しかし、腸管からのダイゼインの吸収率はダイジンより低かった。我々は、グルコシル化されたものを経口投与すると、血清および肝臓においてダイゼイン（Ｄｎ）として検出することができることを見出した。これは、腸管内で糖鎖が切断されることによって、腸管内でのグルクロン酸抱合から保護されるからだと考えられる。このことは、以前のレポートにおいても実証されていた（アール・キング（King R.）およびディー・ビー・バーシル（Bursill, D.B.）、１９９８年、アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Am. J. Clin. Nutr.）、第６７巻、８６２〜８７２ページ）。したがって、生体研究においても将来の治療用としても、Ｄｎの生体利用性が問題になることはないだろう。
【００４０】
（実施例３）
インスリン抵抗性におけるＮＦ−κＢの役割について数多くのレポートがあるが、その詳細なメカニズムはよくわかっていない。最近の証明によると、脂質誘発によるＮＦ−κＢ活性の亢進が、インスリン抵抗性や２型糖尿病において重要な役割を果たしていることが示されている。κＢキナーゼ阻害剤（ＩＫＫ）の活性化により、ＮＦ−κＢの阻害剤であるＩκＢがリン酸化される。ＩκＢは、リン酸化されるとプロテアソーム分解され、その結果ＮＦ−κＢが放出されて、ＮＦ−κＢが核内へと移行する。ＮＦ−κＢ活性化の阻害はインスリン抵抗性を改善するものの、ＩκＢおよびＮＦ−κＢの過剰な活性がインスリン抵抗性とリンクしていることは以前から示されていた（ディー・カイ（Cai, D.）、エム・ユアン（Yuan, M.）、ディー・エフ・フランツ（Frantz, D.F.）、ピー・エー・メレンデス（Melendez, P.A.）、エル・ハンセン（Hansen, L.）、ジェイ・リー（Lee, J.）、およびエス・イー・シュールソン（Shoelson, S.E.）、２００５年、「ローカル  アンド  システマティック  インスリン  レジスタンス  リザルティング  フロム  ヘパティク  アクティベーション  オブ  アイケーケーベータ  アンド  エヌエフカッパビー（Local and systemic insulin resistance resulting from hepatic activation of IKK-β and NF-κB）」、ネイチャー・メディスン（Nat. Med.）、第１１巻、１８３〜１９０ページ）。
【００４１】
以前、我々は、パルミテートによるＮＦ−κＢの過剰発現がインスリン抵抗性と関係していることを報告した（バルマ他（Barma et al）、２００９年）。ＮＦ−κＢは、糖尿病を制御するだけでなく、がん、関節炎およびアルツハイマー病といった炎症性の疾患の大半とも関連している転写因子である。したがって、強力なＮＦ−κＢ阻害剤を見つけ出す必要がある。我々は、ダイズの葉から、ダイジンとして知られるイソフラボングリコシドを単離した。腸管細胞において、ダイジンは加水分解されてダイゼインを形成する。我々は、ダイジンおよびダイゼインのいずれもがＮＦ−κＢの遺伝子転写およびタンパク質合成を効果的に阻害することができることを見出した。
【００４２】
ダイズイソフラボンであるダイゼインとゲニステインについては、現在臨床研究において調査が進められている。ゲニステインは、免疫機能、脳機能およびＤＮＡ修復に対して悪影響を及ぼす可能性があるとの懸念があることが報告されている（ディー・ジェイ・キム（Kim, D.J.）、エス・エッチ・ソク（Seok, S.H.）、エム・ダブル・ボク（Baek, M.W.）、エッチ・ワイ・リー（Lee, H.Y.）、ワイ・アール・ナ（Na, Y.R.）、エス・エッチ・パク（Park, S.H.）、エッチ・ケー・リー（Lee, H.K.）、（エヌ・ケー・ドゥッタ（Dutta, N.K.）、ケー・カワカミ（Kawakami, K.）およびジェイ・エッチ・パク（Park, J.H.）、２００９年、「デベロプメンタル  トクシティ  アンド  ブレイン  アロマテーズ  インダクション  バイ  ハイ  ジェニステイン  コンセントレーションズ  イン  ゼブラフィッシュ  エンブリオズ（Developmental toxicity and brain aromatase induction by high genistein concentrations in zebrafish embryos）」、トクシコロジー・メカニズムズ・アンド・メソッズ（Toxicology Mechanisms and Methods）、第１９巻、２５１〜２５６ページ）。ダイゼインはこうした副作用とは無縁であり、より効果的である。ダイゼインは、栄養補助食品に含まれており、ダイズ、マメ科植物およびエンドウマメにも含まれているが、生体利用性の問題がある。ダイジンを使うことにより、この問題を回避することができるであろう。
【００４３】
（実施例４）
ＮＦ−κＢ発現の阻害をモニターするため、L６骨格筋細胞株を使ってアッセイを行ったところ、インスリン活性がＮＦ−κＢによって阻害された。ＮＦ−κＢがインスリン活性を阻害することはよく知られている。L６筋管または骨格筋細胞をパルミテートと共に、パルミテートなしに、またはパルミテート＋ダイゼインと共にインキュベートした。細胞のインキュベーションが終了する前に、これらインキュベーション物に１００ｎＭのインスリンと［3Ｈ２−ＤＯＧ］を加えた。パルミテートによってインスリン刺激によるグルコース取り込みが大幅に減少した一方で、ダイゼインとの共インキュベーションによりパルミテートの逆作用が著しく減少した（図４Ａ）。Ｌ６筋管にＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４プラスミドをトランスフェクトした後、パルミテートと共に、またはパルミテート＋ダイゼインと共にインキュベートした。インキュベーション終了３０分前にインスリンを加えた（図４Ｂ)。パルミテートによって、ＮＦ−κＢ  ｐ６５およびＮＦ−κＢ  ｐ５０のいずれのタンパク質レベルも大幅に上昇した（図４Ｃ）。パルミテート誘発によるＮＦ−κＢの遺伝子およびタンパク質発現の増加は、濃度および時間依存的であった（図４Ｄ、Ｅ）。
【００４４】
（実施例５）
ウェスタンブロット法により細胞内のＮＦ−κＢ含有量を測定したところ、パルミテート刺激されたＮＦ−κＢが、ダイゼインにより大幅に減少したことがわかった（図５Ａ）。半定量ＲＴ−ＰＣＲおよび定量リアルタイムＰＣＲ分析によると、パルミテートでインキュベートしたＬ６筋管ではＮＦ−κＢ遺伝子発現が大幅に増加したが、その増加がダイゼインによって防止されたことがわかった（図５Ｂ）。これらの結果は、ダイゼインがＮＦ−κＢ遺伝子発現を阻害することを示唆している。すなわち、ダイゼインは、ＮＦ−κＢの遺伝子転写を阻害することによって、パルミテートに起因するＮＦ−κＢタンパク質の過剰発現の阻害を成し遂げる。ダイゼインのフラボングリコシドであるダイジンも、パルミテート誘発によるＮＦ−κＢの遺伝子発現およびタンパク質合成を低減した（図２Ｃ）。
【００４５】
（実施例６）
Ｌ６筋管を、パルミテートと共に、またはパルミテートなしでインキュベートし、超音波処理により溶解した後、遠心分離した。上澄み液を採取して、セファデックスＧ７５カラムに添加した。これら細胞からの溶出プロファイルから、パルミテート処理したもの（Ａ２）は、対照（Ａ１）と比較してＮＦ−κＢ  ｐ６５タンパク質が増加したことがわかった。これらインキュベーション物からの溶出画分を、抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５抗体による免疫親和性クロマトグラフィーにかけて、さらに精製した。免疫親和性クロマトグラフィーからの溶出画分（Ｐ２）は、ウェスタンブロット分析において、抗ＮＦ−κＢ抗体との交差反応性を示している（図６）。我々は、パルミテート誘発によるＮＦ−κＢ合成の増加が、ダイゼインによって防止されることを見出した。
【００４６】
（実施例７）
精製したＮＦ−κＢ  ｐ６５タンパク質をＬ６骨格筋細胞にトランスダクトした後、その細胞をインスリンおよび［3Ｈ］−２ＤＯＧと共にインキュベートして、細胞への過剰なＮＦ−κＢ  ｐ６５タンパク質の侵入がインスリン活性に影響を及ぼすかどうか観察した。ＮＦ−κＢ  ｐ６５タンパク質がトランスダクトされた細胞において、グルコースの取り込み量が減少したが、ダイゼインにより減少が防止された（図７Ａ）。ウェスタンブロット分析により、ＮＦ−κＢ  ｐ６５タンパク質のトランスダクションによる細胞内のＮＦ−Ｂ  ｐ６５の増加レベルを確認した（図７Ｂ）。ＮＦ−κＢ  ｐ６５タンパク質を、ＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４によりトランスフェクトされた骨格筋細胞１バッチ分にトランスダクトした後、インスリンとインキュベートした。インキュベーションが終わると、カバーガラス上の細胞をパラホルムアルデヒド（３．５％）に定着させた。レーザー走査共焦点顕微鏡でカバーガラスを観察して、ＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４の移行を調べた。インスリンとの反応によるＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４の原形質膜への移行は、ＮＦ−κＢ  ｐ６５をトランスダクトした細胞内では抑止されていたが、その抑止はダイゼインによって防止された（図７Ｃ）。
【００４７】
（実施例８）
パルミテートの活性化は、ＮＦ−κＢの核局在化の増加につながる。ＦＩＴＣ結合抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５抗体を使った免疫蛍光研究により、骨格筋細胞内のＮＦ−κＢの推移を観察した。細胞質においても核領域においても、パルミテートにより亢進されたＮＦ−κＢレベルがダイゼインによって阻害された（図８）。
【００４８】
（実施例９）
パルミテート誘発によるＮＦ−κＢの核内への移行の増加は、ＮＦ−κＢとＤＮＡとの結合の増大と符合する。ＥＭＳＡを行って、このことを調べた。ＮＦ−κＢとＤＮＡとの複合体の形成はパルミテートにより刺激されたが、ダイゼインとＳＮ−５０はこのタンパク質とＤＮＡとの複合体の形成を低減させた（図９Ａ）。パルミテートは、ＮＦ−κＢとそのκＢエンハンサー因子との結合を誘発し、ＮＦ−κＢ自身の遺伝子発現を制御する（バルマ他（Barma et al）、２００９年）一方、ダイゼインはこの結合を阻害するため、ＮＦ−κＢの遺伝子発現を不活性化する。このことは、ＮＦ−κＢが自動制御ループを有しており、それによりＮＦ−κＢ自身の遺伝子発現をコントロールすることを示唆している。パルミテート誘発によるＩＫＫおよびＩκＢκのリン酸化はダイゼインによる影響を受けない。すなわちこれは、ダイゼインがＮＦ−κＢ活性化経路に影響を及ぼさないことを示唆している（図９Ｂ）。
【００４９】
（実施例１０）
ダイゼインは、パルミテート誘発によるＮＦ−κＢプロモーターの活性を阻害する。パルミテートなしで（対照）、パルミテートと、およびパルミテート＋ダイゼインと共に細胞をインキュベートした。パルミテートとのインキュベーションによりＮＦ−κＢプロモーターの活性は著しく増大したが、ダイゼインはパルミテートの刺激効果を軽減した（図１０Ａ）。また、ＦＡＣＳ分析をおこなって、対照細胞およびパルミテート処理した細胞におけるＮＦ−κＢタンパク質レベルを観察した。フローサイトメトリー分析により、パルミテートとの反応によるＮＦ−κＢの増加レベルがダイゼインにより著しく阻害されたことがわかった（図１０Ｂ）。
【００５０】
（実施例１１）
ＮＦ−κＢは、多くの炎症遺伝子の転写を制御する。ＮＦ−κＢは、インスリン受容体チロシンキナーゼの阻害剤であるフェチュインＡの転写を制御する。初代肝細胞をパルミテートなしで、またはパルミテートと、もしくはパルミテート＋ダイゼインと共にインキュベートした。パルミテートは、フェチュインＡ遺伝子の発現を著しく誘発した。ＮＦ−κＢ  ｓｉＲＮＡまたはダイゼインの添加は、ＮＦ−κＢの発現を阻害することによってフェチュインＡの合成を阻害する（図１１）。ダイゼインは、ＮＦ−κＢ遺伝子発現を防止することにより、ＮＦ−κＢの下流シグナル伝達を調節する。
【００５１】
（実施例１２）
ダイゼインは、前立腺がんおよび乳がんに対しても予防効果がある。濃度５μｇ／ｍｌのダイゼインは、ＰＣ−３アンドロゲン非依存性前立腺がん細胞株（図１２Ａ）およびＭＣＦ−７乳がん細胞株（図１２Ｂ）におけるＮＦ−κＢ遺伝子発現を低減する。
【００５２】
方法
本願請求項の理解のため、ＮＦ−κＢ遺伝子転写の阻害におけるダイゼイン（Ｄｎ）の役割に関連した結果を得るために利用した手法の詳細について説明する。ＮＦ−κＢのリン酸化体である活性ＮＦ−κＢの、当該イソフラボンによる阻害に関するレポートはいくつかあるが、ＮＦ−κＢの遺伝子およびタンパク質合成の阻害についてのレポートはこれまで全くない。本願の新規性はそこにある。
【００５３】
１．試薬
組織培養材料はすべて、ギブコＢＲＬ・ライフテクノロジーズ社（米国、ゲイサーズバーグ）から入手した。［3Ｈ］−ロイシン（比活性度１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、ＧＥヘルスケア（香港、九龍）から入手した。［γ32ｐ］−ＡＴＰ（比活性度６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、ＢＲＩＴ社（インド）から調達した。ＮＦ−κＢ  ｐ６５、ｐＮＦ−κＢ  ｐ６５、ｐΙΚΚα／β、ｐΙκＢαおよびβ−アクチン用の一次抗体は、サンタクルス・バイオテクノロジー社（米国カリフォルニア州）から購入した。対照およびＮＦ−κＢ  ｐ６５（ｈ）ｓｉＲＮＡも、サンタクルス・バイオテクノロジー社（米国カリフォルニア州）から購入した。フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヒツジ抗ウサギ抗体およびアルカリホスファターゼ結合二次抗体は、シグマ・ケミカル社（米国、ミズーリ州セントルイス）から購入した。その他化学薬品および試薬は、シグマ・ケミカル社（米国、ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【００５４】
２．細胞株および細胞培養
乳がん細胞株ＭＣＦ−７、前立腺がん細胞株ＰＣ−３、およびＬー６骨格筋細胞株は、米国ジョージタウン大学のパルタ・ピー・バネルジー博士（Dr. Partha P. Banerjee）から贈呈された（ＡＴＣＣ寄託番号ＭＣＦ−７、ＨＴＢ−２２、ＰＣ−３、ＣＲＬ−１４３５、Ｌ６−ＣＲＬ−１４５８）。これらの細胞を、３７℃の加湿した９５％Ｏ2／５％ＣＯ2雰囲気において、アール塩および非必須アミノ酸を含み、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を加えたＤＭＥＭ培地で培養した。
【００５５】
３．細胞培養処理
融合性細胞をトリプシン処理により継代培養し、続いて必須添加物を加えたＤＭＥＭ培地を含む６穴培養皿に幡種した。融合性ＭＣＦ−７細胞を３μｇ／ｍｌのダイゼイン（Ｄｎ）とインキュベートし、ＰＣ３細胞を５μｇ／ｍｌダイゼインとインキュベートした。ダイゼインをＤＭＳＯに溶かした。対照細胞は、培地において同量のＤＭＳＯで処理した。インキュベーション終了時に、細胞を溶解し、１００００ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を採取した。上澄み液のタンパク質濃度を、以下のローリー他（Lowry et al）の方法で求めた（オー・エッチ・ローリー（O.H. Lowry）、エヌ・ジェイ・ローズブロー（N.J. Rosebrough）、エー・イー・ファー（A.E. Farr）、アール・ジェイ・ランドール（R.J. Randall）、「プロテイン  メジャーメント  ウィズ  フォリン  フェノール  リエージェント（Protein measurement with Folin phenol reagent）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第１９３巻（１９５１年）、２６５〜２７５ページ）。リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社（米国、カリフォルニア州カールズバッド）を使って、同社の指示に従い、スクランブルｓｉＲＮＡおよびＮＦ−κＢ  ｐ６５  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。
【００５６】
４．ウェスタンブロット
我々の以前の記述に従って、ウェスタンブロットを行った（エス・ダスグプタ（S. Dasgupta）、エス・バッタチャルヤ（S. Bhattacharya）、エー・ビスワス（A. Biswas）、エス・エス・マジュムダール（S. S. Majumdar）、エス・ムコパディヤイ（S. Mukhopadhyay）、エス・レイ（S. Ray）、およびエス・バッタチャルヤ（S. Bhattacharya）、２０１０年、「エヌエフカッパビー  メディエイツ  リピッド・インデュースド  フェチュインエー  エクスプレッション  イン  ヘパトサイツ  ザット  インペアズ  アディポサイト  ファンクション  エフェクティング  インスリン  レジスタンス（NF-κΒ mediates lipid-induced fetuin-A expression in hepatocytes that impairs adipocyte function effecting insulin resistance）」、バイオケミカル・ジャーナル（Biochem. J.）、第４２９巻、４５１〜４６２ページ）。要約すると、対照または処理済み細胞溶解物からのタンパク質４０〜５０μｇを１０％または１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、セミドライ式トランスブロット装置（トランスブロット（登録商標）ＳＤセル、バイオ・ラッド社、米国）を用いて、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社、米国、ベッドフォード）に転写した。ＳＮＡＰ識別装置（ミリポア社、米国、ベッドフォード）を使って、まず希釈率１：１０００で様々な一次抗体と共に、続いて同じ希釈率でアルカリホスファターゼ結合二次抗体それぞれと共に膜をインキュベートした。５−ブロモー４−クロロー３−インドリルリン酸／ニトロブルー・テトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を使って現像することにより、タンパク質のバンドを検出した。
【００５７】
５．ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ
ＴＲＩ試薬を使って、その製造会社のプロトコルに従って、様々なインキュベーション物から全ＲＮＡを抽出した。第１ｃＤＮＡ鎖合成キット、リバートエイド（登録商標）（ファーメンタス・ライフサイエンス社、米国メリーランド州ハノーバー）を使ってＲＴ−ＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲ（アプライド・バイオシステムズ社、米国カリフォルニア州）により、相対遺伝子発現をさらに確認した。以下の反応条件で、遺伝子特異プライマーを使ってＰＣＲを行った。すなわち、初回活性化工程：９５℃で１５分、変性：９５℃で３０秒、アニーリング：５０℃〜５５℃で３０秒、最終伸長：７２℃、３０秒を４０サイクルとした。別反応でｇａｐｄｈを同時に増幅した。ＣT値は、対応するｇａｐｄｈ対照を使って補正した。使用したプライマーシーケンスは以下のとおりである。すなわち、ＮＦーκＢ  ｐ６５（順方向: 5'-ccatcagggcagatctcaaacc-3'、逆方向: 5'-gctgctgaaactctgagttgtc-3'、遺伝子バンク受入番号：NM_021975.3）、Ｂｃｌ−２（順方向: 5'-TGGGATGCCTTTGTGGAACT-3'、逆方向: 5'-GAGACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3'、遺伝子バンク受入番号：NM_000657.1）、サイクリンＤ１（順方向: 5'-GGATGCTGGAGGTCTGCGAGGAAC-3'、逆方向: 5'-GAGA-GGAAGCGTGTGAGGCGGTAG-3'、遺伝子バンク受入番号：NM_053056.2）。ｇａｐｄｈ（順方向: 5'-gccatcaacgaccccttc-3'、逆方向: 5'-agccccagccttctcca-3'、遺伝子バンク受入番号：J04038.1)。
【００５８】
６．ＮＦ−κＢ精製のためのゲル濾過および免疫親和性クロマトグラフィー
ＮＦ−κＢを多量に含んだ画分を調製するため、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したセファデックスＧ−７５（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社、スウェーデン、ウプサラ）カラム（２×５０ｃｍ）を使って、我々の研究室において以前作成した以下の記述に従い、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った（ディー・バス（D. Basu）、エス・バッタチャルヤ（S. Bhattacharya）、「ピュリフィケーション  オブ  トゥー  タイプス  オブ  ゴナドトロピン  レセプターズ  フロム  カープ  オバリアン  フォリクルズ：オーバーラッピング  レコグニション  バイ  トゥー  ディファレント  リガンズ（Purification of two types of gonadotropin receptors from carp ovarian follicles: overlapping recognition by two different ligands）」、ジェネラル・アンド・コンパラティブ・エンドクリノロジー（Gen. Comp. Endo）、第１２９巻（２００２年）、１５２〜１６２ページ）。流速１ｍｌ／分を維持し、骨格筋細胞溶解物を添加した直後に１．０ｍｌの画分を採取した。標準ゲル濾過分子量マーカー（シグマ・ケミカル社、米国、セントルイス）を作動させて溶出したタンパク質の分子量の概算を求めた。およそ６６ｋＤａの画分をプールし、凍結乾燥して体積を減らし、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。そこでＮＦ−κＢ  ｐ６５を同定するために、ゲルをウェスタンブロット分析用のＰＶＤＦ膜に転写した。免疫親和性クロマトグラフィーによりＣＮＢｒ活性セファロース４Ｂビーズを抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５抗体と結合させ、さらに精製を行った。我々の研究室において以前作成した以下の手順により、抗体の結合を行った。要約すると、セファロース４Ｂビーズに結合したＮＦ−κＢ  ｐ６５抗体を５ｍｌカラムに添加した。カップリング緩衝液（ｐＨ８．５）、続いて酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４．０）で洗浄することにより、非結合の抗体を除去した。ビーズ上に残った活性基をグリシン緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ８．０）でブロックした。サンプルをカラムに添加し、４℃で一晩おいた。非結合のタンパク質は１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し、リガンドに結合したＮＦ−κＢ  ｐ６５は、カオトロピック剤として２．０ＭのＫＩを含む溶出緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４）で溶出した。各溶出画分は１．０ｍｌであった。２８０ｎｍでの吸光度がベースラインに達するまで画分を採取し、プールし、透析によって緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４）を排除し、凍結乾燥した。ＮＦ−κＢ  ｐ６５の純度を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べたところ、抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５抗体と交差反応したタンパク質のバンドが一本現れた。
【００５９】
７．電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）
ＮＦ−κＢ結合部位に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ(野生型: 5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'、 変異型: 5'-AGTTGAGGGAACTTTCCCAGGC-3', AGTTGAGGAAACTTTCCCAGGC-3')を用いて、がん細胞の様々なインキュベーション物質から作製した核抽出物を使って、ＥＭＳＡを行った。プローブは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ32ｐ］−ＡＴＰで末端標識した後、１０μｇの対照細胞、およびＤｎ処理したＭＣＦ−７およびＰＣ３細胞の核抽出物と共に、２０μｌの結合反応液中で４５分間インキュベートした。反応混合物を５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ホスフォイメージャー（ＧＥヘルスケア社、米国）で視覚化した。
【００６０】
８．［3Ｈ］−ロイシン取り込みについての検討
０．２％ウシ血清アルブミンを加えたクレブスリンガーリン酸（ＫＲＰ）緩衝液において、ＭＣＦ−７およびＰＣ３細胞をインキュベートした。ＮＦ−κＢ  ｐ６５タンパク質合成に対するＤｎの効果を判定するために、Ｄｎ存在下、Ｄｎ不在下で、１０μＣｉ／ｍｌの［3Ｈ］−ロイシンと共に細胞をインキュベートした。また、ＮＦ−κＢ  ｐ６５  ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡにより細胞をトランスフェクトした。インキュベーション終了時に、細胞を溶解し、抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５抗体でＮＦ−κＢ  ｐ６５をプルダウンした。放射線計測によるＮＦ−κＢ  ｐ６５への取り込み量を液体シンチレーションカウンター（パーキンエルマー社製Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ２８００ＴＲ）で測定した。
【００６１】
９．［γ32ｐ］−ＡＴＰ取り込みについての検討
ＭＣＦ−７およびＰＣ３細胞を、ダイゼイン（Ｄｎ）なしで、もしくはダイゼインと共にインキュベート、または８０μＭの［γ32ｐ］−ＡＴＰ存在下で、ＮＦ−κＢ  ｐ６５  ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡによりトランスフェクトした。インキュベーション終了時に、細胞溶解物を、抗ｐＮＦ−κＢ  ｐ６５抗体による免疫沈降にかけた。放射線計測によるｐＮＦ−κＢ  ｐ６５への取り込み量を液体シンチレーションカウンター（パーキンエルマー社製Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ２８００ＴＲ）で測定した。
【００６２】
（実施例１３）
ＭＣＦ−７およびＰＣ３細胞をＤｎ処理なし（Ｃｏｎ）もしくはＤｎ（それぞれ３μｇ／ｍｌと５μｇ／ｍｌ)で処理、またはＮＦ−κＢ  ｐ６５  ｓｉＲＮＡ（ｐ６５ＫＯ）もしくはスクランブルｓｉＲＮＡ（モック）によりトランスフェクトした。対照細胞は、溶媒としてＤＭＳＯを含んでいた。これら細胞から抽出した全ＲＮＡに対して、ＮＦ−κＢ  ｐ６５遺伝子特異プライマーを用いて定量ＰＣＲを行った。内部標準としてｇａｐｄｈを用いた。ＭＣＦ−７およびＰＣ３細胞をＤｎなしで、もしくはＤｎと共にインキュベート、またはＮＦ−κＢ  ｐ６５  ｓｉＲＮＡ（ｐ６５ＫＯ）もしくはスクランブルｓｉＲＮＡ（モック）でトランスフェクトした後、［3Ｈ］−ロイシンまたは［γ32ｐ］−ＡＴＰとのインキュベーションを行った。細胞溶解物からＮＦ−κＢ  ｐ６５またはｐＮＦ−κＢ  ｐ６５をプルダウンし、放射標識されたロイシンまたはリン酸塩のＮＦ−κＢ  ｐ６５またはｐＮＦ−κＢ  ｐ６５への取り込み量（％）を、液体シンチレーションカウンターによる放射線計測により求めた。５回別個に行った実験のうち代表例のひとつを図に示す。示されたデータは平均値±標準誤差であり、*p<0.01 vs Con、#p<0.001 vs Con。
【００６３】
以上の結果は、ｐ６５  ｓｉＲＮＡおよびフラボノ化合物であるダイゼイン（Ｄｎ）によるＮＦ−κＢ  ｐ６５遺伝子発現の抑制により、がん細胞において不活性型およびリン酸化型いずれのＮＦ−κＢも減少したことを示している。ＮＦ−κＢ抑制のためにｐ６５  ｓｉＲＮＡおよびＤｎを両方選択する理由は、ＮＦ−κＢ  ｐ６５  ｓｉＲＮＡはそのｍＲＮＡを特異的に阻害し、Ｄｎは、ＮＦ−κＢが結合してその遺伝子を発現させるプロモーターκＢセグメントを占有するからである。そこで、ＮＦ−κＢ依存型のがん細胞における不活性ＮＦ−κＢと活性ＮＦ−κＢとの平衡の重要性について検討するため、２つの方式でＮＦ−κＢ遺伝子抑制を行った。ＭＣＦ−７およびＰＣ３細胞におけるＮＦ−κＢ遺伝子発現が阻害されることにより、結果的にそのタンパク質の発現を低減することになり、このことはリン酸型ＮＦ−κＢの大幅な減少とも符合した。
【００６４】
このような発現の低減が、ＮＦ−κＢタンパク質合成の阻害と、その結果としてのリン酸化の抑制によるものなのかを調べるため、ＭＣＦ−７およびＰＣ３細胞を［3Ｈ］−ロイシンもしくは［γ32ｐ］−ＡＴＰと共にインキュベートした後、活性ＮＦ−κＢと不活性ＮＦ−κＢとをそれぞれの抗体と共に免疫沈降した。ＮＦ−κＢ  ｐ６５  ｓｉＲＮＡまたはＤｎによりＮＦ−κＢ遺伝子発現が抑制されたため、ＮＦ−κＢタンパク質合成が顕著に低減された。このことは、リン酸化ＮＦ−κＢの大幅な減少と一致しており、これら細胞における活性ＮＦ−κＢのプールが、そのデノボ合成に依存的であることを示している。
【００６５】
本発明の効果
１．これまでＮＦ−κＢ合成の阻害剤は報告されていない。ダイゼインは、ＮＦ−κＢ  ｐ６５の転写を阻止するので、ＮＦ−κＢ遺伝子発現の効果的な阻害剤であるということが判明したので、これが達成されたことに我々の研究調査の新規性がある。
２．ダイゼインは、ＮＦ−κＢ遺伝子発現を低減することによりその合成を阻害する。
３．ここ数年、肺がん、乳がん、膵臓がん、大腸がん、脳腫瘍といったがんにおいて、ＮＦ−κＢが過剰発現した状態にあるとのレポートがいくつかある。こういったがんにおいてＮＦ−κＢが強い発現を示すのは、これらのがんがＮＦ−κＢに依存的だからであると報告されている。このようなＮＦ−κＢの過剰発現には、これらがん細胞の生存性が必要である（サイトウ他（Saitoh et al）、２０１０年、カンサー（Cancer）、第７０巻、２６３〜２７０ページ、ユー他（Yu, et al）、２００３年、オンコロジー（Oncology）、第６５巻、３７〜４５ページ、ユー他（Yu et al）、２００４年、インターナショナル・ジャーナル・オブ・コロレクタル・ディジーズ（Int J Colorectal Dis）、第１９巻、１８〜２２ページ）。したがって、このようなＮＦ−κＢ依存型がん細胞においては、ＮＦ−κＢ発現の阻害剤が、がん細胞の成長および生存性にとって適切な処置となるであろう。ダイゼインは、我々のこれまでの研究を通じて知られた唯一のＮＦ−κＢ発現阻害剤であるため、上記の目的にかなうであろう。これこそまさにダイゼインの大きな利点である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月13日(2013.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする脊椎動物に対し、治療有効量であるおよそ３〜５μｇ／ｍｌの、ダイズ属（genus Glycine）に属するダイズ植物体（soyabean plant）から得られるイソフラボン、および薬剤として許容される前記イソフラボンの塩を投与することを含む、ＮＦ−κＢ遺伝子発現を阻害する方法。
【請求項２】
選ばれる前記イソフラボンは、ダイズから抽出されたダイゼインおよびダイジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
使用される細胞株は、ＰＣ−３前立腺がん細胞株およびＭＣＦ−７乳がん細胞株からなる群より選ばれた、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＦ−κＢの阻害は、乳がん、前立腺がん、および糖尿病からなる群より選ばれる疾病の治療に用いられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ＮＦ−κＢ遺伝子発現の阻害剤としてのダイゼインおよびダイジンの使用。
【国際調査報告】
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