(57)【要約】（ａ）細胞接着性基質でコートされた内壁を有する容器中で接着性骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取する工程と、（ｂ）前記接着性基質上で前記骨髄細胞をインキュベートして、前記基質に接着性骨髄幹細胞の層を接着する工程と、（ｃ）前記基質から任意の非接着性細胞を洗浄する工程と、（ｄ）前記骨髄幹細胞層を採取する工程と、を含む、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法。細胞治療のために採取された骨髄細胞の単離キットおよびその使用についも開示される。
2013507931.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）細胞接着性基質でコートされた内壁を有する容器中で接着性骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取する工程と、
（ｂ）前記接着性基質上で前記骨髄細胞をインキュベートして、前記基質に接着性骨髄幹細胞の層を接着する工程と、
（ｃ）前記基質から任意の非接着性細胞を洗浄する工程と、
（ｄ）前記骨髄幹細胞層を採取する工程と、
を含む、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法。
【請求項２】
前記生物サンプルが赤血球を含み、前記生物サンプルを採取する工程が、
被験者から赤血球および骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取する工程と、骨髄幹細胞をインキュベートする前に、生物サンプルから赤血球を分離する工程と、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、自己のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物サンプルが、臍帯血または骨髄穿刺液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞接着性基質が、細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、または多糖でコートされたポリマー基質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリマーが、前記細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、または多糖でコーティングする前にコロナ放電されたものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞接着性表面コーティングが、１またはそれ以上の基底膜タンパク質のコーティングを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記基底膜タンパク質が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、およびフィブリノーゲンからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記基質が、ゼラチンでコートされた、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞接着性表面コーティングが、１または２以上のヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびアガロースからなる群から選択される多糖のコーティングを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質が、ポリ−Ｌ−リシンまたはポリ−Ｄ−リシンでコートされた、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記赤血球が、前記サンプルを成長培地で混合し、前記混合物を前記赤血球の分離に有効な量の血漿増量剤で希釈することで分離される、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、ｅｘ  ｖｉｖｏで１０成長培地と約１：１で混合される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
成長培地と混合された前記サンプルが、前記容器から分離された第１の細胞採取バッグ中の前記血漿増量剤と混合される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞接着性基質が、細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、および多糖からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、前記容器中の成長培地と混合される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、前記基質上で、約２時間〜約５日の間インキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記非接着性細胞が、前記基質を前記成長培地に交換することで洗浄される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記交換が、２回以上行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記骨髄幹細胞が、細胞分離液中で前記接着性細胞層をインキュベートすることで採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
薬学的に許容される食塩水中で前記採取された骨髄幹細胞を懸濁する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記採取された骨髄幹細胞の細胞表現型、生存、および無菌性の少なくとも１つを検査する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
骨髄幹細胞を前記幹細胞によって再生が誘導される組織に投与することを含み、この際、前記改善が、請求項１に記載の方法により採取される接着性骨髄細胞の投与を含む、再生療法。
【請求項２４】
（ａ）所定量の血漿増量剤を含む第１の細胞採取バッグと、
（ｂ）細胞接着性表面層でコートされた内壁および所定量の成長培地を含む第２の細胞収集バッグと、
（ｃ）前記第１のバッグを前記第２のバッグに輸送するための無菌性接続手段と、
を含む、幹細胞単離キット。
【請求項２５】
少なくとも１つの所定量の成長培地を有する容器をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記容器中の前記成長培地が、ＲＰＭＩ−１６４０を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
細胞分離液の容器をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２８】
骨髄穿刺液を採取するための吸引手段をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２９】
前記採取バッグの内壁が、前記細胞接着性表面層でコートされる前にコロナ放電処理された、請求項２４に記載のキット。
【請求項３０】
前記細胞接着性表面層が、細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、または多糖を含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項３１】
前記細胞接着性表面が、１または２以上の基底膜タンパク質のコーティングを含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記基底膜タンパク質が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、およびフィブリノーゲンからなる群から選択される、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記細胞接着性層が、１または２以上のヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびアガロースからなる群から選択される多糖のコーティングを含む、請求クオ３０に記載のキット。
【請求項３４】
前記細胞接着性表面層が、ポリ−Ｌ−リシンを含む、請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２００９年１０月１６日に出願された、米国仮特許出願第６１／２５２，３８９号の優先権を主張するものであり、その全体の内容が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、新規な幹細胞誘導性骨髄の単離方法、前記新規な単離に有用なキット、および前記新規な単離方法で採取された骨髄細胞の細胞療法のための使用。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞は、強力な増殖能、無限の自己再生能、および多能性を有することから、幹細胞の研究は、薬物毒性学とともに、分子学、細胞学、および臨床生物学の研究において重要な研究領域になっている。中枢神経系の外側の前駆細胞、特に骨髄細胞が、in vivoでニューロンまたは神経膠のいずれかを発生する能力を有しうるという証拠が提出されている。Toma et al , Nat. Cell Biol. 3:778-783 (2001); Mezey, E. et al , Science 290: 1779-1782 (2000); Brazleton, T. R. et al, Science 290: 1775-1779 (2000); and Eglitis, M. A. et al , Proc Natl. Acad. Sci. 94:4080-4085 (1997).
成体骨髄間質細胞は、多能性間葉間質細胞（ＭＳＣ）、外膜細網細胞、血管周皮細胞、および骨芽細胞を含む希有な不均一細胞である (Jones, E. & McGonagle, D. Rheumatology (Oxford) 47, 126-31 (2008); Prockop, D. J. Mol. Ther. 17, 939-46 (2009))。これらの細胞は、自己再生能があり、複合胚性生殖層のための遺伝子転写をすることができる(Labat, M. L. et al, Biomed. Pharmacother. 54, 146-62 (2000); Woodbury, D. et al, J. N euros ci. Res. 69, 908-17 (2002))。in vitroと同様に、in vivoの研究においても、成体骨髄間質細胞と筋肉細胞、脂肪細胞、心筋細胞、神経外胚葉細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞等との差異が確認された。近年、好適な培養条件下において、成体骨髄間質細胞は、薬物毒性学の研究および試験用の幹細胞の非限定的な起源として使用される、成体骨髄間質細胞の高い可能性を示す肝細胞様細胞とも異なりうることが示された。Snykers. S. et al, Methods in Molecular Biology (2006)。
【０００４】
しかしながら、主として２つの理由により、幹細胞の同定および単離が試みられている。第１に、幹細胞は希有である。骨髄において、例えば、血液産生は、数百万の骨髄細胞にたった１つの細胞でしか行われない。Vogel, G. Science, 287, 1418-1419 (2000)。第２に、幹細胞に特有の分子マーカーを同定するのは困難である。特に、原始幹細胞は休止状態中に存在し、そのため分子マーカーをほとんど発現しない。Gage, F. H. Science, 287, 1433-1488 (2000)。
【０００５】
骨髄幹細胞を同定するいくつかの方法が、近年報告されている。例えば、骨髄に存在する幹細胞能およびアルデヒド脱水素酵素活性等の機能特性に基づく、マウス造血幹細胞の単離に密度勾配遠心分離法が用いられる。本方法に必須な要素は、通常の洗浄に代えて、向流洗浄を行うことによって小さなサイズの細胞から骨髄全体を分離することである。Juopperi, T. A. et al., Exp Hematol. 2007 Feb; 35(2):335-41。近年、新規な骨髄由来肝幹細胞（ＢＤＬＳＣ）の単離方法が報告された。前記方法は、骨髄細胞から直接ＢＤＬＳＣを精製するための培養システムの選択として、胆汁うっ滞性血清の使用を含む。Cai, Y. F. et al. World J. Gastroenterol 2009; 15(13): 1630-1635。前記結果は、ＢＤＬＳＣが精製および継代されうることを示す。本明細書中に引用されたすべての文献は、その全体の内容が本明細書に組み込まれる。
【０００６】
限られた成功が報告されているが、骨髄幹細胞の単離がいまだ試みられている。そのため、新規な骨髄幹細胞を単離する方法の開発が、急速な幹細胞研究および発展、特に、細胞療法への適用のために、よりいっそう必要とされている。
米国特許第６７３３４３３号明細書には、血液分離方法、特に、造血幹細胞の濃縮が開示されている。米国特許出願公開第５８７９３１８号明細書には、同様に、臍帯血の単離および処理をするための方法および閉鎖システムが開示されている。そして、米国特許第７２７９３３１号明細書には、同様に、臍帯断片から臍帯複合間葉幹細胞の単離方法が開示されている。しかしながら、前記３つの方法は、同一の血管またはバッグ中で接着性骨髄または臍帯血細胞の分離を可能にするものではない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、新規な骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供することにより、上述の要望を実現する。本発明は、また、幹細胞の単離、および細胞療法において採取される骨髄細胞の使用に有用な新規なキットを含む。
【０００８】
第１の態様において、本開示は、同じ血管内で骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供し、前記方法は、
（ａ）細胞接着性基質でコートされた内壁を有する容器中で接着性骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取する工程と、
（ｂ）前記接着性基質上で前記骨髄細胞をインキュベートして、前記基質に接着性骨髄幹細胞の層を接着する工程と、
（ｃ）前記接着性基質から任意の非接着性細胞を洗浄する工程と、
（ｄ）前記接着性骨髄幹細胞層を含む細胞層を採取する工程と、
を含む。
【０００９】
第２の態様において、本開示は、骨髄幹細胞を前記幹細胞によって再生が誘導される組織に投与することにより、再生療法を提供し、この際、前記改善は、上記の第１の態様に記載の方法により採取される接着性骨髄細胞を投与する。
【００１０】
第３の態様において、本開示は、以下の要素：
（ａ）所定量の血漿増量剤を含む第１の細胞採取バッグと、
（ｂ）細胞接着性表面層でコートされた内壁および所定量の成長培地を含む第２の細胞収集バッグと、
（ｃ）前記第１のバッグを前記第２のバッグに輸送するための無菌性接続手段と、
を含む、幹細胞単離キット提供する。
【００１１】
本明細書で開示される第２の細胞採取バッグは、外来処置であらかじめ形成されうる簡易な方法における再生療法のための自己（患者自身）の成体骨髄間質細胞を使用するための新規な治療戦略を示す。実施例で示されるように、本発明者は、脊髄損傷（ＳＣＩ）において、髄膜注射による自己細胞療法のための骨髄を選択するために、接着性能が利用できる。直接髄膜注射は、ニューロンまたは星状細胞への分化を誘導するために十分な幹細胞を脳および脊髄に提供することができる。
【００１２】
他の態様において、開示された実施形態は、生物療法の使用についてのアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）の要件を満たすように設計される。本戦略は広範に適応があり、神経変性、外傷、および臓器不全疾患を含むヒトの病気の再生および修復のすべての要素を含みうる。そのため、本明細書で開示される幹細胞−バッグ治療戦略を用いた利点は、とりわけ、（１）患者自身の細胞を使用することから安全である；（２）免疫抑制または免疫調整を必要とすることなく耐容性がありうる；（３）脊髄損傷（ＳＣＩ）の治療に成果を挙げているように、効果的である；（４）局所注射であり低侵襲である；（５）成体幹細胞が実質的に全ての組織において多様な再生能を発揮することから、適応が広い；（６）同一目的において、胎生幹細胞を使用する場合よりも倫理的に許容される；（７）ＦＤＡの現在のGood Manufacture Practice (GMP)に適合し、臨床における準備または臨床試験に好適である：ことを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明に係る幹細胞単離方法を具体化したデバイスの側断面図である。
【図２】図２は、図１の実施形態の操作時における側断面図である。
【図３】図３は、本発明に係る幹細胞単離方法を具体化した別のデバイスの側断面図である。
【図４】図４は、図３の実施形態の操作時における側断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
好ましい実施形態の説明
本発明は、成体骨髄幹細胞は類似の表面表現型を示すが、異なる潜在性を有する幹細胞を分離できる組織培養のためのポリマー基質への選択的な接着性を有するとの発見に基づくものである。
【００１５】
第１の態様において、本開示は、生物サンプルから骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。
【００１６】
第１の態様の第１の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。前記方法は、
（ａ）細胞接着性基質でコートされた内壁を有する容器中で接着性骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取する工程と、
（ｂ）前記接着性基質上で前記骨髄細胞をインキュベートして、前記基質に骨髄幹細胞の層を接着する工程と、
（ｃ）前記接着性基質から任意の非接着性細胞を洗浄する工程と、
（ｄ）前記接着性骨髄幹細胞層を採取する工程と、
を含む。
【００１７】
第１の態様の第２の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、前記生物サンプルが赤血球を含み、第１の実施形態における前記生物サンプルを採取する工程が、被験者から赤血球および骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取する工程と、骨髄幹細胞をインキュベートする前に、生物サンプルから赤血球を分離する工程と、をさらに含む。
【００１８】
第１の態様の第３の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第１の実施形態に記載の工程を含み、前記サンプルが、自己のものである。
【００１９】
第１の態様の第４の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第１の実施形態に記載の工程を含み、前記生物サンプルが、臍帯血または骨髄穿刺液を含む。
【００２０】
第１の態様の第５の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第１の実施形態に記載の工程を含み、前記細胞接着性基質が、細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、または多糖でコートされたポリマー基質である。
【００２１】
第１の態様の第６の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第４の実施形態に記載の工程を含み、前記ポリマー基質が、前記細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、または多糖でコーティングする前にコロナ放電されたものである
第１の態様の第７の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第４の実施形態に記載の工程を含み、前記細胞接着性表面コーティングが、１またはそれ以上の基底膜タンパク質のコーティングである。
【００２２】
第１の態様の第８の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第６の実施形態に記載の工程を含み、前記基底膜タンパク質が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、およびフィブリノーゲンから選択される。
【００２３】
第１の態様の第９の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第４の実施形態に記載の工程を含み、前記基質が、ゼラチンでコートされる。
【００２４】
第１の態様の第１０の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第４の実施形態に記載の工程を含み、前記細胞接着性表面コーティングが、１または２以上のヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびアガロースから選択される多糖のコーティングである。
【００２５】
第１の態様の第１１の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第４の実施形態に記載の工程を含み、前記基質が、ポリ−Ｌ−リシンまたはポリ−Ｄ−リシンでコートされる。
【００２６】
第１の態様の第１２の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第１の実施形態に記載の工程を含み、前記赤血球が、前記サンプルを成長培地で混合し、前記混合物を前記赤血球の分離に有効な量の血漿増量剤で希釈することで分離される。
【００２７】
第１の態様の第１３の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第１１の実施形態に記載の工程を含み、前記サンプルが、ｅｘ  ｖｉｖｏで１０成長培地と約１：１で混合される。
【００２８】
第１の態様の第１４の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第１１の実施形態に記載の工程を含み、成長培地と混合された前記サンプルが、第１の細胞採取バッグ中の前記血漿増量剤とさらに混合される。
【００２９】
第１の態様の第１５の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第１の実施形態に記載の工程を含み、前記細胞を細胞接着性基質に接触させる工程が、前記細胞を第２の細胞採取バッグに輸送することを含み、前記内壁表面が、細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、または多糖でコートされる。
【００３０】
第１の態様の第１６の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第１４の実施形態に記載の工程を含み、前記細胞が、第２のバッグ中の成長培地と混合される。
【００３１】
第１の態様の第１７の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第１の実施形態に記載の工程を含み、前記細胞が、前記基質上で、約２時間〜約５日の間インキュベートされる。より具体的な実施形態において、前記細胞は、約３時間〜約７２時間の間インキュベートされる。
【００３２】
第１の態様の第１８の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第１の実施形態に記載の工程を含み、非接着性細胞が、前記基質を前記成長培地に交換することで洗浄される。
【００３３】
第１の態様の第１９の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第１７の実施形態に記載の工程を含み、前記交換が、２回以上行われる。
【００３４】
第１の態様の第２０の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第１の実施形態に記載の工程を含み、前記骨髄幹細胞が、細胞分離液中で前記接着性細胞層をインキュベートすることで採取される。
【００３５】
第１の態様の第２１の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第１の実施形態に記載の工程を含み、薬学的に許容される食塩水中で前記採取された骨髄幹細胞を懸濁する工程をさらに含む。
【００３６】
第１の態様の第２２の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第１の実施形態に記載の工程を含み、前記採取された骨髄幹細胞の細胞表現型、生存、および無菌性の少なくとも１つを検査する工程をさらに含む。
【００３７】
第２の態様において、本開示は、再生療法を提供する。この際、前記方法は、幹細胞を前記幹細胞によって再生が誘導される組織に投与することを含み、前記改善は、上記の本開示の第１の態様に記載のいずれかの形態に記載の方法により採取される幹細胞を投与する。
【００３８】
第３の態様において、本開示は、幹細胞単離キットを提供する。
【００３９】
第３の態様の第１の実施形態において、本開示は、
（ａ）所定量の血漿増量剤を含む第１の細胞採取バッグと、
（ｂ）細胞接着性表面層でコートされた内壁および所定量の成長培地を含む第２の細胞収集バッグと、
（ｃ）前記第１のバッグを前記第２のバッグに輸送するための無菌性接続手段と、
を含む、幹細胞単離キットを提供する。
【００４０】
第３の態様の第２の実施形態において、本開示は、上記第１の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記幹細胞単離キットは、少なくとも１つの所定量の成長培地を有する、赤血球および骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取するための容器をさらに含む。
【００４１】
第３の態様の第３の実施形態において、本開示は、上記第２の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記容器中の成長培地は、Ｘ−ｖｉｖｏである。
【００４２】
第３の態様の第４の実施形態において、本開示は、上記第１の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記幹細胞単離キットは、第２の容器のための１または２以上の置換の成長培地の容器をさらに含む。
【００４３】
第３の態様の第５の実施形態において、本開示は、上記第１の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記幹細胞単離キットは、細胞分離液の容器をさらに含む。
【００４４】
第３の態様の第６の実施形態において、本開示は、上記第１の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記幹細胞単離キットは、骨髄穿刺液を採取するための吸引手段をさらに含む。
【００４５】
第３の態様の第７の実施形態において、本開示は、上記第１の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記採取バッグの内壁が、前記細胞接着性表面層でコートされる前にコロナ放電処理される。
【００４６】
第３の態様の第８の実施形態において、本開示は、上記第１の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記細胞接着性表面層が、天然または合成細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、または多糖を含む。
【００４７】
第３の態様の第９の実施形態において、本開示は、上記第８の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記細胞接着性表面が、１または２以上の基底膜タンパク質を含む。
【００４８】
第３の態様の第１０の実施形態において、本開示は、上記第９の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記基底膜タンパク質が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、およびフィブリノーゲンからなる群から選択される。
【００４９】
第３の態様の第１１の実施形態において、本開示は、上記第８の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記細胞接着性層が、１または２以上のヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびアガロースから選択される多糖を含む。
【００５０】
第３の態様の第１２の実施形態において、本開示は、上記第８の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記細胞接着性表面層が、ポリ−Ｌ−リシンまたはポリ−Ｄ−リシンを含む。
【００５１】
さらに他の態様において、本発明は、任意の状態または疾患を治療するための、当該治療に応じた前駆幹細胞由来の骨髄の使用を包含する。
【００５２】
本発明は、例えば、哺乳類の骨髄、脂肪組織、または任意の好適な胎生組織等からの任意の組織再生幹細胞の単離および処理に使用されうる。前記幹細胞は、好ましくは非胎児の哺乳類の骨髄、最も好ましくはヒトから得られる。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態において、細胞塊が採取され、または好適な起源から得られうる。前記細胞塊は、その後、培養で成長し、さらに細胞塊が生成することによって、望ましい場所でさらに継代培養されうる。当該分離は、臨床上有効な量の幹細胞が生成するまで任意に好ましい回数で繰り返されうる。
【００５４】
本発明を実施するための好ましい実施形態は、ＦＤＡの現在のGood Manufacture Practice (GMP)に従って、ＢＭ前駆幹細胞を単離することである。
【００５５】
本発明によって単離された前記骨髄前駆幹細胞は、医学的研究に於ける用途だけでなく、臨床的および治療的用途におけるホストの可能性を有する。２つの考えられる治療メカニズムは、（１）それが有する移動能の利点を利用する、遺伝子産物の輸送手段としての細胞の使用、および（２）損傷した組織の修復のための細胞の使用、例えば、ニューロンの再生、これによる組織機能の修復または増進を含む。
【００５６】
本発明の方法により採取された前記細胞は、原理上、疾病もしくは疾患、または幹細胞の起源にかかわらず、任意の幹細胞治療に使用されうる。かような疾病または疾患の治療の例示される例としては、脊髄損傷（ＳＣＩ）の治療のための細胞治療戦略を含む。この際、低侵襲性の自己の最低限に処理された接着性ＢＭ由来細胞（ＡＢＭＣ）は髄膜注射により移植される。
【００５７】
成体幹細胞を使用する前記自己移植の利点は、特に制限されないが、胎児細胞の使用よりも優れた安全性プロファイルを含む。本明細書に開示された方法は、幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの特徴を保持することから、臓器移植の増大または置換のための組織治療の研究および開発を通じて、前記方法は、成体幹細胞の単離の治療的応用を促す可能性を有する。この技術は、ほとんどの組織の治療または置換のための３次元構造および組織の再生のための足場となる使用を与えうる。
【００５８】
定義
本明細書で使用される用語「基底膜」は、臓器の腔および表面に配置する上皮、または血管内表面に配置する内皮の基礎となる繊維の薄膜を意味する。
【００５９】
本明細書で使用される用語「基底膜タンパク質」は、基底膜の組織上に表現されるタンパク質を意味し、特に制限されないが、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、およびフィブリノーゲンを含む。
【００６０】
本明細書で使用される用語「生物サンプル」は、分化転換または補修能を有する細胞を含む成体または胎児哺乳類の体液を意味し、特に制限されないが、血清、胸膜液、脳脊髄液、羊水、胎盤組織および脂肪組織の吸引物、末梢血、臍帯血、骨髄の吸引物等の吸引物が挙げられる。
【００６１】
本明細書で使用される用語「バイオポリマー」は、合成ポリマーまたは生物が生成するポリマーを意味し、特に制限されないが、タンパク質、ポリペプチド、および多糖を含む。多糖の例としては、セルロース、でんぷん、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびアガロースを含む。
【００６２】
本明細書で使用される用語「骨髄吸引物」は、吸引によって髄腔から取り出された物質を意味し、特に制限されないが、ＢＭ吸引およびＢＭ生検を含む。
【００６３】
本明細書で使用される用語「細胞接着性表面層」は、細胞接着性を付与するように処理された表面を意味し、特に制限されないが、コロナ処理されたバッグまたはフラスコを含む。
【００６４】
本明細書で使用される用語「細胞分離液」は、前記表面への細胞の接着を防止するために用いられる物質を意味し、特に制限されないが、アキュターゼ（Accutase）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびトリプシンを含む。
【００６５】
本明細書で使用される用語「細胞表現型」は、分化の群または細胞表面に発現するＣＤマーカーを意味し、特に制限されないが、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、およびＣＤ２７１を含む。
【００６６】
本明細書で使用される用語「コロナ放電」は、ポリマー表面に細胞接着性を付与する周知の処理を意味し、特に制限されないが、接着性細胞を採取するためのコロナ処理されたバッグ、フラスコ、または血管を含む。
【００６７】
本明細書で使用される用語「状態または疾患」は、異常機能をもたらす病理学的な変化を意味し、特に制限されないが、組織損傷、組織変性、組織萎縮、または組織喪失を含む。
【００６８】
本明細書で使用される用語「成長培地」は、細胞の成長に必要な栄養を供給できる液体物質を意味し、特に制限されないが、Ｘ−ｖｉｖｏ、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ、ｃｃＭＥＭを含む。
【００６９】
本明細書で使用される用語「インキュベート」は、所定の期間、一定の温度で成分を混合することを意味する。
【００７０】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される」は、化合物、物質、組成物、および／または剤形を意味し、これらは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、もしくは他の問題、または合併症を起こすことなく、かつ、妥当なリスク・ベネフィット比に応じて、ヒトおよび動物の組織に接触して好適に使用される。
【００７１】
本明細書で使用される用語「血漿増量剤」は、赤血球を含む成分を分離するために血中に添加される液体を意味し、特に制限されないが、ヒドロキシエチル澱粉、およびポリコハク酸ゼラチンを含む。
【００７２】
本明細書で使用される用語「前駆幹細胞」は、自己再生能および他の成熟または未成熟表現型に分化する能力を有する細胞を意味し、特に制限されないが、多能性間葉間質細胞（ＭＳＣ）、外膜細網細胞、血管周皮細胞、線維芽細胞、および偏平な骨芽細胞（bone lining cell）を含む。
【００７３】
本明細書で使用される用語「Ｘ−ｖｉｖｏ」は、ヒト臨床試験の使用に適した、化学的に定義される非動物起源の培地を意味し、特に制限されないが、Ｘ−ｖｉｖｏ１０、Ｘ−ｖｉｖｏ１５、およびＸ−ｖｉｖｏ２０を含む。
【００７４】
本明細書で使用される用語「治療する」または「治療」は、特に制限されないが、疾患の改善、疾患の合併症による重症化の緩和、疾患の兆候の防止、疾患の再発の防止、単なる疾患の悪化、好ましくない生体反応（例えば、炎症）の軽減の防止を含み、または最終的に成功しない場合であっても、任意の上記効果を得るための治療努力を含む。
【００７５】
前記システムの詳細な説明
図１は、つり金具２、バーコード標識領域を有し、任意の動物産物を含まない３つのバッグ１、３、および４の使い捨てのセットを示す。これらのバッグは、栓９、１１、１３、および１４を介してチューブのライン１０を有する幹細胞単離バッグ（幹バッグ）５と連結されている。前記幹バッグ５は、幹細胞との接着性を付与するためにコロナ処理１９され、ポリ−Ｌ−リシン（神経分化用）、ラミニン（上皮分化用）、フィブロネクチン（間葉分化用）等の表面接着性物質２０でプレコートされ、ヒト臨床試験に適するＸ−ｖｉｖｏ培地（Cambrex）２１を含む。バッグ１は、バッグ３中の抗凝固骨髄または生物液体サンプル１１とヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）７を一定の比率で混合し、最終ＨＥＳ濃度が１．２％とするために、階級がつけられている。前記サンプルバッグ３は、骨髄（ＢＭ）または生物液体サンプル２５を導入するための注入部１７、細菌をろ過する空気部１６、バッグ４中の沈降赤血球（ＲＢＣ）を除去するための栓１３、および血漿、または幹バッグ５からチューブ１８を介して採取される前記サンプルが遠心分離された血清を得るための栓１４を有し、その結果、接着性幹細胞の単離に動物血清の使用を回避している。バッグ３は、ＡＣＤ、ＣＰＤ、ＣＰＤＡ、ヘパリン、またはクエン酸ナトリウム等の抗凝固剤を有する。任意のバッグ６は、接着性幹細胞の庁期保存のために、ジメチルスルホキシド、グリセロール、エチレングリコール、またはポリエチレングリコール等の防腐剤２４を含み、チューブ２３により幹バッグに連結される。
【００７６】
図２は、つり金具２、バーコード標識領域を有し、任意の動物産物を含まない３つのバッグ１、３、および４の使い捨てのセットを示す。これらのバッグは、栓９、１１、１３、および１４を介してチューブのライン１０を有する幹細胞単離バッグ５と連結されている。前記幹バッグ５は、幹細胞２２との接着性を付与するためにコロナ処理１９され、ポリ−Ｌ−リシン（神経分化用）、ラミニン（上皮分化用）、フィブロネクチン（間葉分化用）等の表面接着性物質２０でプレコートされ、ヒト臨床試験に適する、接着細胞２２を単離するためのＸ−ｖｉｖｏ培地（Cambrex）２１を含む。バッグ１は、バッグ３中の抗凝固骨髄または生物液体サンプル１１とヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）７を一定の比率で混合し、最終ＨＥＳ濃度が１．２％とするために、階級がつけられている。前記サンプルバッグ３は、ＢＭまたは生物液体サンプル２５を導入するための注入部１７、細菌をろ過する空気部１６、バッグ４中の沈降ＲＢＣを除去するための栓１３、および血漿、または幹バッグ５からチューブ１８を介して採取される前記サンプルが遠心分離された血清を得るための栓１４を有し、その結果、接着性幹細胞の単離に動物血清の使用を回避している。バッグ３は、ＡＣＤ、ＣＰＤ、ＣＰＤＡ、ヘパリン、またはクエン酸ナトリウム等の抗凝固剤を有する。任意のバッグ６は、接着性幹細胞の庁期保存のために、ジメチルスルホキシド、グリセロール、エチレングリコール、またはポリエチレングリコール等の防腐剤２４を含み、チューブ２３により幹バッグに連結される。
【００７７】
図３は、つり金具２、バーコード標識領域を有し、任意の動物産物を含まない４つのバッグ１、３、４、および１９の使い捨てのセットを示す。これらのバッグは、栓９、１１、１３、および１４を介してチューブのライン１０を有する幹細胞単離バッグ５と連結されている。前記幹バッグ５は、幹細胞との接着性を付与するためにコロナ処理２１され、ポリ−Ｌ−リシン（神経分化用）、ラミニン（上皮分化用）、フィブロネクチン（間葉分化用）等の表面接着性物質２０でプレコートされ、ヒト臨床試験に適するＸ−ｖｉｖｏ培地（Cambrex）２２を含む。バッグ１は、バッグ３中の抗凝固骨髄または生物液体サンプル１１とヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）７を一定の比率で混合し、最終ＨＥＳ濃度が１．２％とするために、階級がつけられている。前記サンプルバッグ３は、ＢＭまたは生物液体サンプル２７を導入するための注入部１７、細菌をろ過する空気部１６、バッグ４中の沈降ＲＢＣを除去するための栓１３、および血漿、または血漿採取バッグ１９（幹バッグ５からチューブ２０を介して採取される）からチューブ１４を介して採取される前記サンプルが遠心分離された血清を得るための栓１４を有し、その結果、幹細胞の単離に動物血清の使用を回避し、さらなる細胞培養のための血漿または血清の保存を可能としている。バッグ３は、ＡＣＤ、ＣＰＤ、ＣＰＤＡ、ヘパリン、またはクエン酸ナトリウム等の抗凝固剤を有する。任意のバッグ６は、接着性幹細胞の庁期保存のために、ジメチルスルホキシド、グリセロール、エチレングリコール、またはポリエチレングリコール等の防腐剤２６を含み、チューブ２５により幹バッグに連結される。
【００７８】
図４は、つり金具２、バーコード標識領域を有し、任意の動物産物を含まない３つのバッグ１、３、４、および１９の使い捨てのセットを示す。これらのバッグは、栓９、１１、１３、および１４を介してチューブのライン１０を有する幹細胞単離バッグ５と連結されている。前記幹バッグ５は、幹細胞２５との接着性を付与するためにコロナ処理２２され、ポリ−Ｌ−リシン（神経分化用）、ラミニン（上皮分化用）、フィブロネクチン（間葉分化用）等の表面接着性物質２３でプレコートされ、接着性細胞２５を分離するためのヒト臨床試験に適するＸ−ｖｉｖｏ培地（Cambrex）２４を含む。バッグ１は、バッグ３中の抗凝固骨髄または生物液体サンプル１１とヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）７を一定の比率で混合し、最終ＨＥＳ濃度が１．２％とするために、階級がつけられている。前記サンプルバッグ３は、ＢＭまたは生物液体サンプル２８を導入するための注入部１７、細菌をろ過する空気部１６、バッグ４中の沈降ＲＢＣを除去するための栓１３、および血漿、または血漿採取バッグ１９（さらに幹細胞豊富な血漿を分離でき、幹バッグ５からチューブ２１を介して採取される）からチューブ１４を介して採取される前記サンプルが遠心分離された血清を得るための栓１４を有し、その結果、幹細胞の単離に動物血清の使用を回避し、さらなる細胞培養のための血漿または血清の保存を可能としている。バッグ３は、ＡＣＤ、ＣＰＤ、ＣＰＤＡ、ヘパリン、またはクエン酸ナトリウム等の抗凝固剤を有する。任意のバッグ６は、接着性幹細胞の庁期保存のために、ジメチルスルホキシド、グリセロール、エチレングリコール、またはポリエチレングリコール等の防腐剤２７を含み、チューブ２６により幹バッグに連結される。
【実施例】
【００７９】
実施例
本発明は、下記の非限定的な実施例により、より十分に説明される。これらの実施例の変更は、当該技術分野における当業者には明らかである。
【００８０】
脊髄損傷患者の腸骨稜の骨髄吸引物を用いて、ヒト接着性骨髄細胞（ＡＭＢＣ）を単離する。ポリ−Ｌ−リシンで内壁をコートされ、標準的なＸ−ｖｉｖｏ培地および患者の血清または血漿を含む血液採取バッグ中で細胞を採取する。前記細胞を３日間インキュベートし、培地の交換の洗浄工程を３回行うことによって、非接着性細胞を除去する。３７℃で５分間、アキュターゼ（Accutase）とともにインキュベーションすることで前記接着性細胞を引き上げる。単離されたＡＢＭＣを移植する前に、前記サンプルの細胞表現型、生存、および無菌性を検査する。驚くべきことに、前記バッグから分離された前記細胞が、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、およびＣＤ２７１に対して陽性であったが、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＣＤ１３の発現がなかったことが本発明により判明した。
【００８１】
前記幹細胞バッグは、脊髄損傷（ＳＣＩ）を治療するための細胞治療戦略において、細胞治療戦略における使用を目的として開発され、この際、前記低侵襲性の自己の最低限に処理されたＡＢＭＣは、髄膜注射により移植される。脊髄損傷は、腰椎穿刺を介した髄膜移植し、約１０４〜約１０７骨髄細胞／ｋｇ間の累積標的細胞を受け取り、
および標的線量が達成されるまで毎月前記工程が繰り返されることにより自己ＡＢＭＣ治療を用いて治療される。ＡＢＭＣは、食塩水１５０μL中に懸濁され、腰椎穿刺によりＣＳＦに注射される。好ましい実施形態に係る前述の実施例および説明は、例示として理解されるべきであり、特許請求の範囲によって定義された発明により定められるべきである。容易に評価されるように、多くの変更、および上述の特徴の組み合わせは、特許請求の範囲に記載された本発明を逸脱することなく、利用することができる。かような変更は、本発明の思想および記載から逸脱するものとはみなされず。すべての変形は、添付の特許請求の範囲の技術的思想に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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