(57)【要約】  本発明は、ビタミンＤ結合タンパク質に結合したビタミンＤ化合物を解離させるための試薬組成物、こうして得たこの試薬組成物および試薬混合物の使用によりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させてビタミンＤ化合物を検出するためのインビトロ方法に関する。使用する試薬は、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質を含有する。本発明はまた、ビタミンＤ化合物を解離させるための開示した試薬組成物の使用、および一般的な検出試薬のほかにビタミンＤ化合物を解離させるための試薬組成物を含むビタミンＤ化合物検出キットに関する。【選択図】図５
2013529304.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるためのインビトロ方法であって、
ａ）被験試料を調製し、そして
ｂ）工程（ａ）からの試料を
ｉ）０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質を含有する試薬、
ｉｉ）還元剤、および
ｉｉｉ）アルカリ化剤
と混合し、これによりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させる
ことを含む方法。
【請求項２】
工程（ｉ）による試薬が、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるのに適した条件下で水溶液に可溶性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉ）による試薬が、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩を含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｉ）による試薬が、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質を含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質が、環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのそれぞれのヒドロキシル化もしくはハロゲン化誘導体である、請求項１、２および４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
試料が液体試料である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
試料が血液、血清または血漿である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロ方法であって、
ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法に従ってビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させ、そして
ｂ）工程（ａ）で解離したビタミンＤ化合物を測定する
工程を含む方法。
【請求項９】
ビタミンＤ化合物が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、およびＣ３−エピ  ２５−ヒドロキシビタミンＤからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ビタミンＤ化合物２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／または２５−ヒドロキシビタミンＤ３を測定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質からなる群から選択される物質、および還元剤を含有する、試薬組成物。
【請求項１２】
還元剤が、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、Ｎ−メチルマレイミド、エルマン試薬および１，２−ジチオラン−３−カルボン酸からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の試薬組成物。
【請求項１３】
還元剤が、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌおよびジチオトレイトール（ＤＴＴ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の試薬組成物。
【請求項１４】
還元剤が２ｍＭ〜３０ｍＭの濃度を有する、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の試薬組成物。
【請求項１５】
被験試料、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の試薬組成物、およびアルカリ化剤を含む、試薬混合物。
【請求項１６】
アルカリ化剤が、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２およびＬｉＯＨからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の試薬混合物。
【請求項１７】
ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の試薬組成物およびアルカリ化剤の使用。
【請求項１８】
ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるためのキットであって、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の試薬組成物を含むキット。
【請求項１９】
ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から検出するためのキットであって、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の試薬組成物およびアルカリ化剤を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンＤ結合タンパク質に結合したビタミンＤ化合物を解離させるための試薬組成物、こうして得たこの試薬組成物および試薬混合物の使用によりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させてビタミンＤ化合物を検出するためのインビトロ方法に関する。本発明はまた、ビタミンＤ化合物を解離させるための開示した試薬組成物の使用、および一般的な検出試薬のほかにビタミンＤ化合物を解離させるための試薬組成物を含むビタミンＤ化合物検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＤの適切な供給は、用語“ビタミン(vitamin)”が既に示唆するように生命維持に必要(vital)である。ビタミンＤの欠乏は、くる病または骨粗鬆症など重篤な疾患を生じる。前世紀初頭にはまだビタミンＤは単一物質であると考えられていたが、この数十年でビタミンＤ系はビタミンＤ代謝産物の複雑な多岐にわたるネットワークに変貌した。今日では、４０を超える種々のビタミンＤ代謝産物が知られている(Zerwekh, J.E., Ann. Clin. Biochem. 41(2004) 272-281)。
【０００３】
ヒトは皮膚上でＤ３ビタミン類またはカルシフェロール類を太陽光線からの紫外線の作用により形成できるにすぎない。血中でビタミンＤ３はいわゆるビタミンＤ結合タンパク質に結合し、肝臓へ輸送され、そこで２５−ヒドロキシル化により２５−ヒドロキシビタミンＤ３に変換される。今日では、既に述べた２つの臓器である皮膚と肝臓のほかに多数の他の組織がビタミンＤ代謝に関与することが知られている(Schmidt-Gayk, H. et al. (eds.), “Calcium regulating hormones, vitaminD代謝産物s and cyclic AMP”, Springer Verlag, Heidelberg(1990) pp. 24-47)。２５−ヒドロキシビタミンＤ、より具体的には２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３は、それらの量に関して人類における中心的なビタミンＤ貯蔵形態である。必要なとき、これらの前駆物質を腎臓で変換して、生物活性１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、いわゆるＤホルモンを形成することができる。この生物活性ビタミンＤは特に腸からのカルシウム取込み、骨無機質化を調節し、それは多数の他の代謝経路、たとえばインスリン系などに影響を及ぼす。
【０００４】
ビタミンＤ（ビタミンＤ２およびビタミンＤ３）の濃度は食物摂取または太陽光線被曝に応じて大幅に変動するので、患者のビタミンＤ状態を調べる際にビタミンＤレベル自体の測定はほとんど有益性がない。さらに、ビタミンＤは循環中で比較的短い生物学的半減期（２４時間）をもち、したがってそれはこの理由でも患者のビタミンＤ状態を調べるのに適したパラメーターではない。同じことが生理活性形態のビタミンＤ（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ）にもあてはまる。これらの生物活性形態も、２５−ヒドロキシビタミンＤと比較して相対的に少量かつ変動性の高い濃度で生じる。これらすべての理由で、特に２５−ヒドロキシビタミンＤの定量は患者の総ビタミンＤ状態を全体的に分析するための適切な手段である。
【０００５】
２５−ヒドロキシビタミンＤなどのビタミンＤ代謝産物は、高い親和性でビタミンＤ結合タンパク質に結合し、アルブミンおよびある種のリポタンパク質にも限られた範囲で結合する。ビタミンＤ代謝産物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるのに適した方法は、普通の状況ではビタミンＤ代謝産物を他のいずれかのタンパク質から解離させるためにも十分に適するであろう。
【０００６】
ビタミンＤ結合タンパク質への２５−ヒドロキシビタミンＤまたは他のビタミンＤ化合物の結合は、ビタミンＤ化合物の測定を著しく複雑にする。既知の方法はすべて、分析すべきビタミンＤ化合物をそれがビタミンＤ結合タンパク質と共に形成する複合体から解離または脱離させることを必要とする。以下において、簡略化のためにこれをビタミンＤ結合タンパク質からのビタミンＤ化合物の解離と呼ぶ；ただし、もちろんそれはビタミンＤ結合タンパク質単独からではなくビタミンＤ化合物とビタミンＤ結合タンパク質の複合体からしか解離させることができない。
【０００７】
ビタミンＤ結合タンパク質は酸性ｐＨではアンフォールディングするが、ｐＨを中性条件に戻すと適正にリフォールディングして被分析体を再結合する傾向が高い。したがって、まずビタミンＤ化合物を解離させ、次いで分析すべきビタミンＤ化合物からビタミンＤ結合タンパク質を分離することがしばしば必要である。
【０００８】
２５−ヒドロキシビタミンＤの臨床上の重要性が高いため、２５−ヒドロキシビタミンＤを多少とも信頼性をもって測定できる多数の方法が文献から知られている。
たとえば、Haddad, J.G. et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992-995、およびEisman, J.A. et al, Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて血液試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ濃度を測定することが記載されている。
【０００９】
２５−ヒドロキシビタミンＤを測定するための他の方法は、特にビタミンＤ結合タンパク質、たとえば乳汁中に存在するものの使用に基づく。たとえば、Holick, M.F. and Ray, R. (US 5,981,779)およびDeLuca et al. (EP 0 583 945)には、ヒドロキシビタミンＤおよびジヒドロキシビタミンＤについてのビタミンＤアッセイ法が記載されており、それはこれらの物質をビタミンＤ結合タンパク質に結合させることに基づき、その際、これらの物質の濃度を競合試験法により測定している。しかし、この方法の前提条件は、測定すべきビタミンＤ代謝産物をまず元の血液または血清試料から単離しなければならず、たとえばクロマトグラフィーによって精製しなければならないことである。
【００１０】
Armbruster, F.P. et al. (WO 99/67211)は、ビタミンＤ測定のために血清または血漿試料をエタノール沈殿によって調製すべきであると教示している。この方法では、タンパク質沈殿を遠心により除去すると、エタノール上清が可溶性ビタミンＤ代謝産物を含有する。これらを競合結合アッセイ法で測定することができる。
【００１１】
あるいは、EP 0 753 743には、過ヨウ素酸塩を用いて血液または血漿試料からタンパク質を分離できると教示されている。この場合、ビタミンＤ化合物は過ヨウ素酸塩で処理した試料からの、タンパク質を含まない上清中において測定される。ある市販の検査法では、血清または血漿試料の抽出のためにアセトニトリルを推奨している（たとえば、ＤｉａＳｏｒｉｎからのラジオイムノアッセイにおいて、または“Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ”ＣｏｍｐａｎｙからのビタミンＤ検査法において）。
【００１２】
近年、多数の異なる解離試薬が提唱され、それらは原則としてビタミンＤ化合物を試料中に存在するいかなる結合タンパク質からも解離するのに適切なはずである。しかし、この解離または脱離を比較的緩和な条件下で実施して、これにより解離試薬で処理した試料を結合検査に直接使用できるようにしなければならない（たとえば、WO 02/57797およびUS 2004/0132104を参照）。近年の多大な努力にもかかわらず、ビタミンＤを測定するために利用できるすべての方法が、手間のかかる試料調製、標準化の低さ、検査法間の一致の低さ、または添加したビタミンＤの回収不良などの欠点をもつ（これについては特に前掲のZerwekh, J.E.を参照)。
【００１３】
US 7,087,395では、金属水酸化物ならびにシクロデキストリンおよびその誘導体ならびにサリチル酸金属塩がビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるために用いられ、その結果、ビタミンＤ結合タンパク質または他の血清タンパク質は不可逆的に変性する。変性後の試料中の脂質およびタンパク質にビタミンＤ化合物が非特異的に付着するのを阻止するために、界面活性剤、たとえばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００またはＴｗｅｅｎ−２０が用いられている。
【００１４】
ビタミンＤ化合物の検査法を自動化するのは特に困難である。自動化には、綱渡りを果たすというきわめて困難な問題を解決する必要がある：一方では適切な解離試薬によってビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させる必要があり、他方では試料をその後に直接分析できるように条件を選択しなければならない。この後続の直接分析の前提条件は、一方では内在性のビタミンＤ結合タンパク質がこの分析中にビタミンＤ化合物に結合せず、またはもはや有意なほどには結合せず、したがってこの分析を妨害しないこと、他方では用いた解離試薬が抗体またはビタミンＤ結合タンパク質など検出試薬の結合を妨害しないことである。さらに、ビタミンＤ結合タンパク質の種々の対立遺伝子がヒト集団に存在し、それらが生化学的に異なる挙動をすることが知られている。ビタミンＤ化合物の解離および測定は、多様な対立遺伝子／表現型について同等でなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】US 5,981,779
【特許文献２】EP 0 583 945
【特許文献３】WO 99/67211
【特許文献４】EP 0 753 743
【特許文献５】WO 02/57797
【特許文献６】US 2004/0132104
【特許文献７】US 7,087,395
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Zerwekh, J.E., Ann. Clin. Biochem. 41(2004) 272-281
【非特許文献２】Schmidt-Gayk, H. et al. (eds.), “Calcium regulating hormones, vitamin D metabolites and cyclic AMP”, Springer Verlag, Heidelberg(1990) pp. 24-47
【非特許文献３】Haddad, J.G. et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992-995
【非特許文献４】Eisman, J.A. et al, Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって本発明の目的は、試料中のビタミンＤ化合物、特にヒドロキシビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための、先行技術の問題を少なくとも部分的に克服できる試薬組成物を開発することであった。ビタミンＤ化合物を解離させるのに適した試薬組成物、ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロ方法、その試薬組成物の使用、およびこの試薬組成物を用いてビタミンＤ化合物を測定するためのキットが以下に記載され、特許請求の範囲に包含される。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるためのインビトロ方法であって、ａ）被験試料を調製し、そしてｂ）工程（ａ）からの試料をｉ）０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質を含有する試薬、ｉｉ）還元剤、およびｉｉｉ）アルカリ化剤と混合し、これによりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させる工程を含む方法に関する。
【００１９】
他の態様において本発明は、ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロ方法であって、ａ）被験試料を調製し、ｂ）工程（ａ）からの試料をｉ）０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質を含有する試薬、ｉｉ）還元剤、およびｉｉｉ）アルカリ化剤と混合し、これによりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させ、そしてｃ）工程（ｂ）で解離したビタミンＤ化合物を測定する工程を含む方法に関する。
【００２０】
他の態様において本発明は、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質、および還元剤を含む、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための試薬組成物に関する。
【００２１】
他の態様において本発明は、被験試料、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための試薬組成物、すなわち０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質および還元剤、ならびにアルカリ化剤を含む、試薬混合物に関する。
【００２２】
他の態様において本発明は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるためのキットであって、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質および還元剤を含む試薬組成物を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、前処理工程における試薬混合物のｐＨ変化を示す。このアッセイは実施例１．５に概説したように実施された。試薬組成物（Ａ）は種々の濃度の炭酸エチレン（ＥＣ）を含有する：０．００Ｍ（●）、０．１０Ｍ（◆）、０．３０Ｍ（□）、０．５０Ｍ（▲）、０．７５Ｍ（○）、１．００Ｍ（■）、１．５０Ｍ（◇）ＥＣ。Ｘ軸は時間（分）、Ｙ軸はｐＨを示す。
【図２】図２は、実施例１．５の記載に従った、種々の濃度の炭酸エチレン（ＥＣ）を含有する試薬組成物（Ａ）を用いたビタミンＤアッセイの検量曲線を示す：１．５０Ｍ（●）、１．００Ｍ（□）、０．７５Ｍ（◆）、０．５０Ｍ（○）、０．３０Ｍ（▲）および０．１０Ｍ（◇）ＥＣ。Ｘ軸は濃度をｎｇ／ｍｌで示し、Ｙ軸は常法によりＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｍｐａｎｙからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて測定したカウントを示す。
【図３】図３は、実施例１．５の記載に従った、種々の濃度の還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する試薬組成物（Ａ）を用いたビタミンＤアッセイの検量曲線を示す：１．０ｍＭ（□）、２．０ｍＭ（●）、４．０ｍＭ（◆）、６．７ｍＭ（○）、１０．０ｍＭ（▲）、１５．０ｍＭ（◇）。Ｘ軸は濃度をｎｇ／ｍｌで示し、Ｙ軸は常法によりＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｍｐａｎｙからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて測定したカウントを示す。
【図４ａ】図４ａは、ビタミンＤアッセイ（実施例１）および液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＴＭＳ）の方法の比較を示す；２５−ヒドロキシビタミンＤをＬＣ−ＴＭＳおよび実施例１．５のビタミンＤアッセイにより測定し、その際、０．５Ｍ炭酸エチレン（ＥＣ）を含む試薬組成物（Ａ）をインキュベーションに用いた。多数の血清試料についての結果（ｎｇ／ｍｌ）を、Ｘ軸にＬＣ−ＴＭＳについて、Ｙ軸に実施例１．５のビタミンＤアッセイについてプロットする。  （- - -）  ｙ＝ｘ  （━━━）  線形回帰    ビタミンＤアッセイ＝２．０１１６＋０．９０３６＊ｘ、ピアソンのｒ＝０．９５０９。
【図４ｂ】図４ｂは、ビタミンＤアッセイ（実施例１）およびＬＣ−ＴＭＳの方法の比較を示す；２５−ヒドロキシビタミンＤをＬＣ−ＴＭＳおよび実施例１．５のビタミンＤアッセイにより測定し、その際、炭酸エチレン（ＥＣ）を含まない試薬組成物（Ａ）をインキュベーションに用いた。多数の血清試料についての結果（ｎｇ／ｍｌ）を、Ｘ軸にＬＣ−ＴＭＳについて、Ｙ軸に実施例１．５のビタミンＤアッセイについてプロットする。  （- - -）  ｙ＝ｘ  （━━━）  線形回帰    ビタミンＤアッセイ＝０．７４９６＋０．７３３８＊ｘ、ピアソンのｒ＝０．７９１４。
【図５】図５は、実施例２に記載したように、０．５Ｍ炭酸エチレン（◆）、０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３（○）、０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（▲）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（◇）、および対照（□）を含有する試薬組成物（Ａ）を用いたビタミンＤアッセイの検量曲線を示す。Ｘ軸は濃度をｎｇ／ｍｌで示し、Ｙ軸は常法によりＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｍｐａｎｙからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて測定したカウントを示す。
【図６】図６は、実施例３に記載したように、下記のものを含有する試薬組成物（Ａ）を用いたビタミンＤアッセイの検量曲線を示す：  ◆：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  ＥＣ、または  ▲：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、または  □：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ；Ｘ軸は濃度をｎｇ／ｍｌで示し、Ｙ軸は常法によりＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｍｐａｎｙからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて測定したカウントを示す。
【図７】図７は、実施例４に記載したように、下記のものを含有する試薬組成物（Ａ）を用いたビタミンＤアッセイの検量曲線を示す：  ○：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  ＥＣ（実施例１．５を参照）、または  ◆：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ炭酸ジメチル；Ｘ軸は濃度をｎｇ／ｍｌで示し、Ｙ軸は常法によりＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｍｐａｎｙからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて測定したカウントを示す。
【図８】図８は、実施例５に記載したように、下記のものを含有する試薬組成物（Ａ）を用いたビタミンＤアッセイの検量曲線を示す：  ◆：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  ＥＣ（実施例１．５を参照）、または  ○：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３、または  ▲：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ＋  ０．５Ｍエチレングリコール、または  □：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ；Ｘ軸は濃度をｎｇ／ｍｌで示し、Ｙ軸は常法によりＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｍｐａｎｙからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて測定したカウントを示す。
【図９】図９は、実施例４に記載したように、下記のものを含有する試薬組成物（Ａ）を用いたビタミンＤアッセイの検量曲線を示す：  ◆：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  ＥＣ（実施例１．５を参照）、または  ○：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  １，２炭酸グリセロール；Ｘ軸は濃度をｎｇ／ｍｌで示し、Ｙ軸は常法によりＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｍｐａｎｙからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて測定したカウントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるためのインビトロ方法であって、ａ）被験試料を調製し、そしてｂ）工程（ａ）からの試料をｉ）０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質を含有する試薬、ｉｉ）還元剤、およびｉｉｉ）アルカリ化剤と混合し、これによりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させる工程を含む方法に関する。
【００２５】
本明細書中で用いる下記の用語はそれぞれ、このセクションに関連する意味をもつ。
冠詞“ａ”および“ａｎ”は、本明細書中で１または１より多い（すなわち、少なくとも１）その冠詞をもつ目的語を表わすために用いられる。
【００２６】
“１以上”という表現は、１〜５０、好ましくは１〜２０、同様に好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または１５を表わす。
別に記載しない限り、“ビタミンＤ化合物”は、下記の構造式ＩおよびＩＩに従ったビタミンＤ２主鎖またはビタミンＤ３主鎖を含むすべての天然化合物を含むと解釈すべきである。
【００２７】
【化１】
2013529304.tif 000003
【００２８】
【化２】
2013529304.tif 000004
【００２９】
構造式ＩおよびＩＩにおいて、ビタミンＤの位置はステロイド命名法に従って記載される。２５−ヒドロキシビタミンＤは構造式ＩおよびＩＩの位置２５においてヒドロキシル化されたビタミンＤ代謝産物、すなわち２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３を表わす。他の既知のヒドロキシビタミンＤ化合物は、たとえば１，２５−ジヒドロキシビタミンＤおよび２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤの形態である。
【００３０】
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、構造式ＩおよびＩＩの位置２５のほかに位置１におけるヒドロキシル化をもつ活性形態のビタミンＤ（いわゆるＤホルモン）を表わす。
他の周知のＤ化合物は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３およびＣ３−エピ  ２５−ヒドロキシビタミンＤである。
【００３１】
意外にも、本発明に開示するインビトロ法で、炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質の存在により、アルカリ性条件下でビタミンＤ化合物がビタミンＤ結合タンパク質から解離することを本発明者らは見出した。
【００３２】
本発明による“炭酸水素イオン(hydrogen carbonate ion)”(bicarbonate ion)は、実験式ＨＣＯ３−および分子質量６１．０１ダルトンをもつ陰イオンである。
本発明による“炭酸水素塩”は、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、炭酸水素カリウム（ＫＨＣＯ３）、炭酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）、炭酸水素カルシウム（Ｃａ（ＨＣＯ３）２）および炭酸水素マグネシウム（Ｍｇ（ＨＣＯ３）２）からなる群から選択される化合物である。
【００３３】
本発明による“加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質”は、炭酸エステルまたはピロカーボネートからなる群から選択される化合物である。
本発明による“炭酸エステル”は、カルボニル基に２つのアルコキシ基が隣接したものである。これらの炭酸エステルの一般式はＲ１Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ２である。環式炭酸エステル（たとえば炭酸エチレン）または非環式炭酸エステル（たとえば、炭酸ジメチル）、およびそのヒドロキシル化またはハロゲン化誘導体を使用できる。
【００３４】
好ましくは、前記方法の工程ｉ）による炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質は、それぞれ０．１Ｍ〜１．５Ｍ、または０．２Ｍ〜１．０Ｍ、または少なくとも０．１、０．２、０．３もしくは０．４Ｍ、または多くとも２．０、１．７、１．５、１．３、１．０もしくは０．７５Ｍの濃度をもつ。
【００３５】
ある態様において本発明は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるためのインビトロ方法であって、ａ）被験試料を調製し、そしてｂ）工程（ａ）からの試料をｉ）０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩を含有する試薬、ｉｉ）還元剤、およびｉｉｉ）アルカリ化剤と混合し、これによりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させる工程を含む方法に関する。
【００３６】
好ましくは、前記方法の工程ｉ）による炭酸水素塩は、それぞれ０．１Ｍ〜１．５Ｍ、または０．２Ｍ〜１．０Ｍ、または少なくとも０．１、０．２、０．３もしくは０．４Ｍ、または多くとも２．０、１．７、１．５、１．３、１．０もしくは０．７５Ｍの濃度をもつ。
【００３７】
好ましい態様において、炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸水素カルシウムおよび炭酸水素マグネシウムからなる群から選択される。さらに好ましい態様において、炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムおよび炭酸水素アンモニウムからなる群から選択される。さらに好ましくは、炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウムからなる群から選択される。
【００３８】
ある態様において本発明は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるためのインビトロ方法であって、ａ）被験試料を調製し、そしてｂ）工程（ａ）からの試料をｉ）０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質を含有する試薬、ｉｉ）還元剤、およびｉｉｉ）アルカリ化剤と混合し、これによりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させる工程を含む方法に関する。
【００３９】
好ましくは、前記方法の工程ｉ）による、加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質は、それぞれ０．１Ｍ〜１．５Ｍ、または０．２Ｍ〜１．０Ｍ、または少なくとも０．１、０．２、０．３もしくは０．４Ｍ、または多くとも２．０、１．７、１．５、１．３、１．０もしくは０．７５Ｍの濃度をもつ。
【００４０】
好ましい態様において、加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質は、環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのそれぞれのヒドロキシル化もしくはハロゲン化誘導体である。好ましい態様において、加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質は、環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのそれぞれのハロゲン化誘導体である。他の好ましい態様において、環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのハロゲン化誘導体は、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、炭酸プロピレン、炭酸ビニレン、炭酸トリメチレン、二炭酸エリトリトール、１，２−炭酸グリセロール、４−クロロ−１，３−ジオキソラン−２−オン、４，５−ジクロロ−１，３−ジオキソラン−２−オン、２，５−ジオキサヘキサンジ酸ジメチルエステル、ピロカーボネート、炭酸１，２  ブチレン、炭酸シス  ２，３  ブチレンおよび炭酸トランス  ２，３  ブチレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのハロゲン化誘導体は、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、炭酸プロピレン、炭酸ビニレン、炭酸トリメチレン、二炭酸エリトリトール、１，２−炭酸グリセロール、４−クロロ−１，３−ジオキソラン−２−オンおよび４，５−ジクロロ−１，３−ジオキソラン−２−オンからなる群から選択される。
【００４１】
さらに好ましくは、環式もしくは非環式の炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、１，２−炭酸グリセロール、炭酸プロピレンおよび炭酸ビニレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、環式もしくは非環式の炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、１，２−炭酸グリセロールおよび炭酸プロピレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、環式もしくは非環式の炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチルおよび１，２−炭酸グリセロールからなる群から選択される。
【００４２】
ある態様において、前記方法の工程ｉ）による環式もしくは非環式の炭酸エステルは０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度をもつ。好ましくは、環式もしくは非環式の炭酸エステルは、それぞれ０．１Ｍ〜１．５Ｍ、または０．２Ｍ〜１．０Ｍ、または少なくとも０．１、０．２、０．３もしくは０．４Ｍ、または多くとも２．０、１．７、１．５、１．３、１．０もしくは０．７５Ｍの濃度をもつ。
【００４３】
ある態様において、本発明による方法の工程ｉ）の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質を含有する試薬は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるのに適した条件下で水溶液中に少なくとも２Ｍまで溶解できる。他の態様において、本発明による方法の工程ｉ）の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質を含有する試薬は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるのに適した条件下で水溶液中に少なくとも１．５Ｍまで溶解でき、またはより好ましくは少なくとも１．０Ｍまで溶解できる。本発明による方法の工程ｉ）の試薬を得るために、炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質を水に可溶化する方法は当業者に既知である。炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質は、２５℃の水に可溶性でなければならない。水溶液中に可溶化した炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質は、沈降または結晶化することなく４℃で保存できなければならない。
【００４４】
炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質それぞれと、アルカリ化剤とのモル比は、好ましくは１：３〜３：１、より好ましくは１：２〜２：１、より好ましくは１：１．５〜１．５：１である。
【００４５】
アルカリ化剤と炭酸水素塩および/または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質とのモル比が反応性イオンＯＨ−またはＨＣＯ３−の濃度に基づいて計算されることも、当業者に自明である。
【００４６】
少なくとも２種類の異なる炭酸水素塩および／または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる異なる物質それぞれの混合物を本発明による方法に使用できることは、当業者に分かる。炭酸水素塩および／または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質の混合物と、アルカリ化剤とのモル比は、好ましくは１：３〜３：１、より好ましくは１：２〜２：１、より好ましくは１：１．５〜１．５：１である。
【００４７】
この理論に拘束されるのは望まないが、試薬組成物中に炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質が存在するとｐＨシフトが誘発される可能性は十分にある。試薬組成物中の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質の濃度が低いほど、前処理反応に際しての試薬混合物のｐＨ低下がより遅くなる。試薬組成物中の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質の濃度が高いほど、前処理反応に際しての試薬混合物のｐＨ低下がより速やかになる。アルカリ性緩衝条件下での炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質と還元剤との協奏作用のため、ビタミンＤ結合タンパク質の不可逆的な変性が達成され、これによりその後のビタミンＤ化合物の検出が容易になるとも思われる。
【００４８】
ある態様において、前記方法による工程ｉｉ）の還元剤は、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、Ｎ−メチルマレイミド、エルマン試薬(Ellman's Reagent)および１，２−ジチオラン−３−カルボン酸からなる群から選択される。
【００４９】
他の態様において、前記方法による工程ｉｉ）の還元剤は、工程ｉｉ）の還元剤がチオール基を含むことを特徴とする。
他の態様において、前記方法による工程ｉｉ）の還元剤は、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌおよびジチオトレイトール（ＤＴＴ）からなる群から選択される。
【００５０】
前記方法による工程ｉｉ）の還元剤は、ある態様において２ｍＭから３０ｍＭまで、他の態様において３ｍＭから２０ｍＭまで、他の態様において３．５ｍＭから１５ｍＭまで、他の態様において４ｍＭから１０ｍＭまでの濃度をもつ。
【００５１】
“アルカリ化剤”は、アルカリ水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物（すなわち水溶液中）であってもよい。アルカリ化剤は、アルカリ水酸化物および／またはアルカリ土類金属水酸化物の混合物、すなわちＮａＯＨとＫＯＨ、ＮａＯＨとＬｉＯＨ、ＮａＯＨとＣａ（ＯＨ２）、ＫＯＨとＣａ（ＯＨ）２、ＫＯＨとＬｉＯＨ、ならびに他の組合わせも含むことができる。
【００５２】
“アルカリ水酸化物”は、アルカリ金属陽イオンとヒドロキシド陰イオン（ＯＨ−）から構成される一群の化学物質である。アルカリ水酸化物は、たとえばＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＲｂＯＨおよびＣｓＯＨである。“アルカリ金属”は、周期表の１族（ＩＵＰＡＣ方式）を形成する一連の元素である：リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、ルビジウム（Ｒｂ）、セシウム（Ｃｓ）、およびフランシウム（Ｆｒ）。
【００５３】
“アルカリ土類金属水酸化物”は、アルカリ土類金属陽イオンと２つのヒドロキシド陰イオン（ＯＨ−）から構成される一群の化学物質である。“アルカリ土類金属”は、周期表の２族（ＩＵＰＡＣ方式）（ＩＩＡ族）を構成する：ベリリウム（Ｂｅ）、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、バリウム（Ｂａ）およびラジウム（Ｒａ）。
【００５４】
ある態様において、前記方法による工程ｉｉｉ）のアルカリ化剤は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２およびＬｉＯＨからなる群から選択される。
他の態様において、前記方法による工程ｉｉｉ）のアルカリ化剤は、それぞれ０．１Ｍ〜２．０Ｍ、または０．１Ｍ〜１．５Ｍ、または０．２Ｍ〜１．７５Ｍ、または０．２Ｍ〜１．０Ｍ、または少なくとも０．１、０．２、０．３もしくは０．４Ｍ、または多くとも２．０、１．７、１．５、１．３、１．０もしくは０．７５Ｍの濃度をもつ。
【００５５】
他の態様において、前記方法による工程ｉｉｉ）のアルカリ化剤は、ＮａＯＨおよびＫＯＨからなる群から選択される。
他の態様において、本発明による方法に用いるアルカリ化剤は、試料  ＋  試薬ｉ）  ＋  還元剤ｉｉ）  ＋  アルカリ化剤ｉｉｉ）の混合物中において、それぞれ０．１Ｍ〜０．６Ｍ、または０．２Ｍ〜０．５Ｍ、または少なくとも０．１もしくは０．２Ｍ、または多くとも０．６もしくは０．５Ｍの最終濃度をもつ。
【００５６】
前記方法の他の態様において、工程ｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）それぞれの３種類の試薬と被験試料との混合比は、好ましくは１：３〜３：１である。
ある態様において、前記方法による工程ａ）の試料、工程ｉ）の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質を含む試薬  ＋  工程ｉｉ）の還元剤  ＋  工程ｉｉｉ）のアルカリ化剤は、いかなるピペッティング順序で添加してもよい。混合した時点で本発明の方法による工程ｂ）は他の態様において少なくとも１０、１２、１５または２０秒間、９．５〜１４のｐＨをもつことを特徴とするものであってもよく、さらに好ましくは工程ｂ）は混合した時点で少なくとも１０、１２、１５または２０秒間、１０．５〜１４のｐＨをもつ。
【００５７】
前記方法のある態様において、工程ａ）の被験試料を、工程ｂ）で、工程ｉ）の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質を含む試薬、工程ｉｉ）の還元剤、工程ｉｉｉ）のアルカリ化剤と混合し、インキュベートする。インキュベーション工程ｂ）は必要な長さであってよい。インキュベーション時間は、たとえば１５秒から２４時間までである。ある態様において、本発明方法による工程ｂ）の混合物を１〜６０分間インキュベートし、これによりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させる。
【００５８】
前記方法による工程ｂ）の成分の濃度は、被験試料と共にインキュベートする際に、特定したｐＨ範囲、ならびに炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質、還元剤、およびアルカリ化剤のそれぞれの目的濃度が、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるのに適切になるように、当業者が容易に選択できる。
【００５９】
アルカリ性条件により、被験試料中に存在するビタミンＤ結合タンパク質が変性してビタミンＤが解離する。アルカリ化剤の濃度は、前処理反応において“試薬混合物”（＝被験試料＋本発明による試薬組成物＋アルカリ化剤）のｐＨを少なくともｐＨ１０．０、好ましくは少なくともｐＨ１０．５、好ましくは少なくとも１１．０にまで高めるのに十分でなければならない。試薬混合物のｐＨは、被験試料＋本発明による試薬組成物＋アルカリ化剤を混合した時点で測定しなければならないことは、当業者に自明である。炭酸水素塩および／または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質が加水分解されるため、試薬混合物においてｐＨは低下するであろう（図１および実施例１．５を参照）。
【００６０】
本明細書中で用いる用語“試料”は、インビトロ評価の目的のために個体から得られる生体試料を表わす。本発明の方法において、被験試料は、ある態様では液体試料である。試料は、本発明の他の態様においてはいずれかの体液を含むことができる。他の態様において、被験試料は血液、血清または血漿であり、血清または血漿が最も好ましい。他の態様において、液体試料を濾紙またはメンブレン上で乾燥させる。ある態様において、本発明に用いる試料は、個体から得られた試料のうちの一定部分を表わす。
【００６１】
本発明は、他の態様において、ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロ方法であって、（ａ）ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させ、そして（ｂ）工程（ａ）で解離したビタミンＤ化合物を測定する工程を含む方法を含む。
【００６２】
他の態様において本発明は、ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロ方法であって、（ａ）目的とする試料中のビタミンＤ結合タンパク質に結合しているビタミンＤ化合物を解離させ、そして（ｂ）工程（ａ）で解離したビタミンＤ化合物を測定する工程を含む方法を含む。
【００６３】
他の態様において本発明は、ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロ方法であって、ａ）被験試料を調製し、ｂ）工程（ａ）からの試料をｉ）０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質を含有する試薬、ｉｉ）還元剤、およびｉｉｉ）アルカリ化剤と混合し、これによりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させ、そしてｃ）工程（ｂ）で解離したビタミンＤ化合物を測定する工程を含む方法に関する。
【００６４】
他の態様において本発明は、ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロ方法であって、測定するビタミンＤ化合物が２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、およびＣ３−エピ  ２５−ヒドロキシビタミンＤを含む群から選択される方法を含む。
【００６５】
他の態様において本発明は、ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロ方法であって、測定するビタミンＤ化合物が２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を含む群から選択される方法を含む。
【００６６】
他の態様において本発明は、ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロ方法であって、ビタミンＤ化合物２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／または２５−ヒドロキシビタミンＤ３を測定する方法を含む。
【００６７】
試薬組成物：
１態様において本発明は、被験試料中のビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。
【００６８】
１態様において本発明は、被験試料中のビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、０．１Ｍ〜１．５Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。
【００６９】
他の態様において本発明は、被験試料中のビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、０．２Ｍ〜１．０Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。
【００７０】
他の態様において本発明は、被験試料中のビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、少なくとも０．１、０．２、０．３もしくは０．４Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。
【００７１】
他の態様において本発明は、被験試料中のビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、多くとも２．０、１．７、１．５、１．３、１．０もしくは０．７５Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。
【００７２】
他の態様において本発明は、被験試料中のビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。好ましくは、試薬組成物はそれぞれ０．１Ｍ〜１．５Ｍ、または０．２Ｍ〜１．０Ｍ、または少なくとも０．１、０．２、０．３もしくは０．４Ｍ、または多くとも２．０、１．７、１．５、１．３、１．０もしくは０．７５Ｍの濃度の炭酸水素塩、および還元剤を含有する。他の好ましい態様において、試薬組成物中の炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸水素カルシウムおよび炭酸水素マグネシウムからなる群から選択される。さらに好ましくは、試薬組成物中の炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムおよび炭酸水素アンモニウムからなる群から選択される。さらに好ましくは、試薬組成物中の炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウムおよび／または炭酸水素カリウムである。
【００７３】
他の態様において本発明は、被験試料中のビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。好ましくは、試薬組成物はそれぞれ０．１Ｍ〜１．５Ｍ、または０．２Ｍ〜１．０Ｍ、または少なくとも０．１、０．２、０．３もしくは０．４Ｍ、または多くとも２．０、１．７、１．５、１．３、１．０もしくは０．７５Ｍの濃度の加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質、および還元剤を含有する。
【００７４】
他の態様において本発明は、被験試料中のビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのそれぞれのヒドロキシル化もしくはハロゲン化誘導体、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。好ましくは、試薬組成物はそれぞれ０．１Ｍ〜１．５Ｍ、または０．２Ｍ〜１．０Ｍ、または少なくとも０．１、０．２、０．３もしくは０．４Ｍ、または多くとも２．０、１．７、１．５、１．３、１．０もしくは０．７５Ｍの濃度の環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのそれぞれのヒドロキシル化もしくはハロゲン化誘導体、および還元剤を含有する。
【００７５】
他の態様において本発明は、被験試料中のビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのそれぞれのハロゲン化誘導体、および還元剤を含有する、試薬組成物に関する。好ましくは、試薬組成物はそれぞれ０．１Ｍ〜１．５Ｍ、または０．２Ｍ〜１．０Ｍ、または少なくとも０．１、０．２、０．３もしくは０．４Ｍ、または多くとも２．０、１．７、１．５、１．３、１．０もしくは０．７５Ｍの濃度の環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのそれぞれのハロゲン化誘導体、および還元剤を含有する。他の好ましい態様において、試薬組成物中の環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのハロゲン化誘導体は、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、炭酸プロピレン、炭酸ビニレン、炭酸トリメチレン、二炭酸エリトリトール、１，２−炭酸グリセロール、４−クロロ−１，３−ジオキソラン−２−オン、４，５−ジクロロ−１，３−ジオキソラン−２−オン、２，５−ジオキサヘキサンジ酸ジメチルエステル、ピロカーボネート、炭酸１，２  ブチレン、炭酸シス  ２，３  ブチレンおよび炭酸トランス  ２，３  ブチレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、試薬組成物中の環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのハロゲン化誘導体は、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、炭酸プロピレン、炭酸ビニレン、炭酸トリメチレン、二炭酸エリトリトール、１，２−炭酸グリセロール、４−クロロ−１，３−ジオキソラン−２−オン、および４，５−ジクロロ−１，３−ジオキソラン−２−オンからなる群から選択される。さらに好ましくは、試薬組成物中の環式もしくは非環式の炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、１，２−炭酸グリセロール、炭酸プロピレンおよび炭酸ビニレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、試薬組成物中の環式もしくは非環式の炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、１，２−炭酸グリセロールおよび炭酸プロピレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、試薬組成物中の環式もしくは非環式の炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチルおよび１，２−炭酸グリセロールからなる群から選択される。
【００７６】
本発明は、他の態様において、還元剤が２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、Ｎ−メチルマレイミド、エルマン試薬および１，２−ジチオラン−３−カルボン酸からなる群から選択されることを特徴とする試薬組成物に関する。
【００７７】
他の態様において本発明は、還元剤がチオール基を含むことを特徴とする試薬組成物に関する。
他の態様において本発明は、還元剤が２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌおよびジチオトレイトール（ＤＴＴ）からなる群から選択されることを特徴とする試薬組成物に関する。
【００７８】
還元剤の濃度は、本発明のある態様において２ｍＭから３０ｍＭまで、他の態様において３ｍＭから２０ｍＭまで、他の態様において３．５ｍＭから１５ｍＭまで、他の態様において４ｍＭから１０ｍＭまでである。
【００７９】
還元剤の能力が官能基、すなわち還元基の存在に依存することは当業者に既知である。したがって、適切な濃度の還元剤をそれの活性還元基の数を考慮に入れて選択することは当業者に知られている。
【００８０】
ビタミンＤ結合タンパク質をコードする遺伝子は、ヒト集団において種々の対立遺伝子の形態でみられる。これらの対立遺伝子がコードするポリペプチドは生化学的に異なること、すなわちそれらが異なる表現型を生じることは知られている。これらの生化学的相異はビタミンＤ化合物の結合および解離にも影響を及ぼす。本発明による試薬組成物は、ビタミンＤ結合タンパク質の表現型とは独立してビタミンＤ化合物を解離させるのに適している。したがって、本発明の好ましい態様は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための、本発明による試薬組成物の使用である。
【００８１】
本発明による試薬組成物は、１態様において、ビタミンＤ結合タンパク質の表現型とは無関係に独立して被験試料中のビタミンＤ結合タンパク質からビタミンＤ化合物を解離させるために使用される。
【００８２】
ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させる目的のために、本発明による試薬組成物を被験試料、たとえば血清または血漿、およびアルカリ化剤と混合する。
試薬混合物：
本明細書中で以下において用いる用語“試薬混合物”は、被験試料、本発明による試薬組成物、およびアルカリ化剤を含む。
【００８３】
他の態様において試薬混合物は、アルカリ化剤がＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２およびＬｉＯＨからなる群から選択されることを特徴とする。
他の態様において試薬混合物は、用いるアルカリ化剤がそれぞれ０．１Ｍ〜２．０Ｍ、または０．１Ｍ〜１．５Ｍ、または０．２Ｍ〜１．７５Ｍ、または０．２Ｍ〜１．０Ｍ、または少なくとも０．１、０．２、０．３もしくは０．４Ｍ、または多くとも２．０、１．７、１．５、１．３、１．０もしくは０．７５Ｍの濃度をもつことを特徴とする。
【００８４】
他の態様において試薬混合物は、アルカリ化剤がＮａＯＨおよびＫＯＨからなる群から選択されることを特徴とする。
他の態様において、本発明による方法に用いるアルカリ化剤は、試薬混合物中においてそれぞれ０．１Ｍ〜０．６Ｍ、または０．２Ｍ〜０．５Ｍ、または少なくとも０．１もしくは０．２Ｍ、または多くとも０．６もしくは０．５Ｍの最終濃度をもつ。
【００８５】
試薬組成物およびアルカリ化剤と被験試料との混合比は、ある態様において好ましくは１：３〜３：１である。
被験試料、開示した試薬組成物およびアルカリ化剤をいずれかのピペッティング順序で添加して、試薬混合物を調製することができる。混合した時点で試薬混合物は他の態様においてそれが少なくとも１０、１２、１５または２０秒間、９．５〜１４のｐＨをもつことを特徴とし、さらに好ましくは試薬混合物は混合した時点で少なくとも１０、１２、１５または２０秒間、１０．５〜１４のｐＨをもつ。
【００８６】
被験試料を、本発明による試薬組成物およびアルカリ化剤と混合し、そしてインキュベートする。この工程を前処理工程とも呼ぶことができる。前処理工程は、必要な長さで実施できる。インキュベーション時間は、たとえば１５秒〜２４時間である。試薬混合物を１態様において１〜６０分間インキュベートして、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させる。試薬混合物を他の態様において４〜１０分間インキュベートして、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させる。
【００８７】
試薬混合物およびそれの成分の濃度は、被験試料と共にインキュベートする際に、特定したｐＨ範囲、ならびに炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質、還元剤、およびアルカリ化剤のそれぞれの目的濃度が、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるのに適切になるように、当業者が容易に選択できる。
【００８８】
試薬混合物は、ある態様において、本発明の試薬組成物について記載した炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質の、好ましい物質を同様に含む。
【００８９】
ビタミンＤ化合物の検出は、好ましくは２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、およびＣ３−エピ  ２５−ヒドロキシビタミンＤを含む群から選択される少なくとも１種類のビタミンＤ化合物が検出されるように実施される。
【００９０】
ビタミンＤ化合物の特異的検出において、前処理工程の後にさらにインキュベーション
工程を伴う。試薬混合物中に存在する還元剤の残りは、非特異的タンパク質、好ましくはたとえばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の添加により遮蔽することができる。この非特異的タンパク質は別個に添加してもよく、あるいは検出剤をも含む溶液に単純に含有させてもよい。還元剤の残留還元能を遮蔽することにより、ビタミンＤ化合物に対するタンパク質系の特異的結合剤を用いて支障なくビタミンＤ化合物を検出することができる。
【００９１】
当業者に認識されるように、特異的結合剤を含む溶液はｐＨ緩衝剤系を含有し、これによって、特異的結合剤を含有する溶液を試薬混合物に添加した後、ｐＨはビタミンＤ化合物が特異的結合剤へ結合するための前提条件のものであることが保証されるであろう。ビタミンＤ化合物への特異的結合が行なわれる限り、必ず必要な緩衝剤系も最終ｐＨも決定的ではない。ビタミンＤ結合タンパク質を特異的結合剤として用いる場合、このインキュベーション工程中のｐＨは好ましくはｐＨ６．０〜ｐＨ９．０に選択される。抗体をビタミンＤ化合物の特異的結合剤として用いる場合、このインキュベーション工程中のｐＨは好ましくはｐＨ５．５〜ｐＨ７．５であろう。
【００９２】
特異的結合剤を含む溶液は、好ましくは２０ｍＭ〜４００ｍＭの緩衝剤系を含有する。同様に好ましくは、緩衝剤は５０ｍＭ〜３５０ｍＭまたは１００ｍＭ〜３００ｍＭのモル濃度をもつ。
【００９３】
ビタミンＤ化合物を検出するためのインビトロ方法は、−本発明の開示に基づいて−多様な様式で実施できる。
原則として、１種類以上のビタミンＤ化合物に結合するすべてのタンパク質系結合パートナー、たとえば特異的に結合するポリペプチドを特異的結合剤として使用できる。特異的結合剤は抗体またはビタミンＤ結合タンパク質そのものであってもよい。
【００９４】
多くの市販検査システムがアビジンまたはストレプトアビジン（ＳＡ）でコートした固相、たとえばＳＡ−コートしたマイクロタイタープレートまたはＳＡ−コートしたラテックスの使用に基づく。
【００９５】
被分析体のビオチニル化誘導体を、検査操作の前または途中で、たとえばこのＳＡ固相に結合させる。ビタミンＤ化合物を検出する場合、被分析体のこのビオチニル化誘導体化合物は、たとえばビオチニル化２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／またはビオチニル化２５−ヒドロキシビタミンＤ３であってもよい。
【００９６】
本発明の１態様において、インビトロ検出方法を競合アッセイとして実施する。そのような競合検査法において、一定量で検査に添加したビタミンＤ化合物誘導体は、特異的結合剤の結合部位に対して、試料に由来する対応するビタミンＤ化合物と競合する。試料中に多量のビタミンＤ化合物が存在するほど、検出信号はより小さくなる。
【００９７】
１態様において、ビタミンＤ化合物の誘導体はビオチニル化ビタミンＤ化合物である。他の態様において、ビオチニル化ビタミンＤ化合物はビオチニル化２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／またはビオチニル化２５−ヒドロキシビタミンＤ３である。他の態様において、ビオチニル化ビタミンＤ化合物はビオチニル化２５−ヒドロキシビタミンＤ２である。
【００９８】
前記に述べたように、本発明に開示する検出方法に使用するのに好ましい特異的結合剤は、抗体およびビタミンＤ結合タンパク質である。ビタミンＤ結合タンパク質を競合アッセイ方式に用いると、それは結合について１種類以上の（ビオチニル化）ビタミンＤ化合物誘導体と競合するすべてのビタミンＤ化合物を統合的に測定するであろう。１態様において、ビタミンＤ結合タンパク質は検出可能に標識化、たとえばルテニウム化されるであろう。
【００９９】
使用：
１態様において本発明は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるために、試薬組成物をアルカリ化剤と一緒に使用することに関する。
【０１００】
他の態様において本発明は、被験試料中に存在すると予想されるビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるために、試薬組成物をアルカリ化剤と一緒に使用することに関する。
【０１０１】
他の態様において本発明は、ビタミンＤ化合物を検出する方法においてビタミンＤ化合物を解離させるために、試薬組成物をアルカリ化剤と一緒に使用することに関する。
他の態様において本発明は、ビタミンＤ化合物を検出する方法において被験試料中に存在すると予想されるビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるために、０．１Ｍ〜２．０Ｍの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質および２ｍＭ〜３０ｍＭの還元剤を含有する試薬組成物を、１Ｍ〜１．５Ｍのアルカリ化剤溶液と一緒に使用することに関する。
【０１０２】
試薬組成物の使用は、ある態様において、本発明の試薬組成物について記載した炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質の、好ましい物質を同様に含む。
【０１０３】
キット：
１態様において本発明は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるためのキットであって、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質および還元剤を含む試薬組成物を含むキットに関する。
【０１０４】
１態様において本発明は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から検出するためのキットであって、０．１Ｍ〜２．０Ｍの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質および還元剤を含む試薬組成物、ならびにアルカリ化剤を含むことを特徴とするキットに関する。
【０１０５】
他の態様において本発明は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から検出するためのキットであって、０．１Ｍ〜２．０Ｍの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質および２ｍＭ〜３０ｍＭの還元剤を含む試薬組成物、ならびにアルカリ化剤を含むことを特徴とするキットに関する。
【０１０６】
他の態様において本発明は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から検出するためのキットであって、検出成分のほかに、０．１Ｍ〜２．０Ｍの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質および２ｍＭ〜３０ｍＭの還元剤を含む試薬組成物、ならびにアルカリ化剤の１Ｍ〜１．５Ｍ溶液を含むことを特徴とするキットに関する。
【０１０７】
他の態様において本発明は、ビタミンＤ化合物を検出するためのキットであって、特異的結合剤を含む溶液のほかに、炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質および還元剤を含む試薬組成物、ならびにアルカリ化剤を含むキットに関する。
【０１０８】
他の態様において本発明は、ビタミンＤ化合物を検出するためのキットであって、特異的結合剤を含む溶液のほかに、０．１Ｍ〜２．０Ｍの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質および２ｍＭ〜３０ｍＭの還元剤を含む試薬組成物、ならびにアルカリ化剤の１Ｍ〜１．５Ｍ溶液を含むことを特徴とするキットに関する。
【０１０９】
他の態様において本発明は、ビタミンＤ化合物を検出するためのキットであって、特異的結合剤を含む溶液のほかに、０．１Ｍ〜２．０Ｍの炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質ならびに２ｍＭ〜３０ｍＭの２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌおよびジチオトレイトール（ＤＴＴ）からなる群から選択される還元剤を含む試薬組成物、ならびにＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２およびＬｉＯＨからなる群から選択されるアルカリ化剤の１Ｍ〜１．５Ｍ溶液を含むことを特徴とするキットに関する。
【０１１０】
キットは、ある態様において、本発明の試薬組成物について記載した炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質の、好ましい物質を同様に含む。
【０１１１】
本発明による試薬組成物は、ビタミンＤ化合物の自動検査に使用するのに適切であることが証明された。本発明は好ましくは、特にビタミンＤ化合物の測定のための検査において、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための本発明による試薬組成物の使用に関する。
【０１１２】
ビタミンＤ化合物の検査は、好ましくは完全自動化される。この場合の完全自動化は、実験者は被験試料とビタミンＤ化合物の測定のための全成分を含有する試薬パックとを自動分析計に乗せるだけでよく、以後のすべての工程が分析計によって自動的に実施されることを意味する。完全自動検査は、Ｒｏｃｈｅ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）で実施するのが特に好ましい。
【０１１３】
本発明による試薬組成物は、他の態様において、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、およびＣ３−エピ  ２５−ヒドロキシビタミンＤからなる群から選択されるビタミンＤ化合物を検出するためのインビトロ方法に使用される。
【０１１４】
既に前記に述べたように、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３が診断に特に関連する形態のビタミンＤである。本発明によるインビトロ方法において、２５−ヒドロキシビタミンＤ２もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３または両方を２５−ヒドロキシビタミンＤ２または２５−ヒドロキシビタミンＤ３に対する特異的抗体で特異的に検出することも好ましい態様である。
【０１１５】
本発明を以下の実施例および図面によってさらに説明する。実際の保護範囲は本発明の特許請求の範囲から生じる。
【実施例】
【０１１６】
実施例１
２５−ヒドロキシビタミンＤの検出のためのアッセイ法
市販のアッセイ法を製造業者の指示に従って使用する。２５−ヒドロキシビタミンＤの測定を、文献の記載に従って、ＨＰＬＣ（２５（ＯＨ）ビタミンＤ３の検査、“Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ”  Ｃｏｍｐａｎｙ，ベンスハイム，注文Ｎｏ．ＫＣ  ３４００）により、またはＬＣ−ＭＳ／ＭＳ(Vogeser, M. et al, Clin. Chem. 50 (2004) 1415-1417)により実施する。
【０１１７】
新規検査法のための成分および全般的検査法を以下に記載する：
１．１  ヒドロキシビタミンＤ２−３−２’−シアノエチルエーテルの合成
２０．６ｍｇ（５０μｍｏｌ）の２５−ヒドロキシビタミンＤ２（Ｆｌｕｋａ  Ｎｏ．１７９３７）を、内部温度計付き２５ｍｌ三口丸底フラスコ内で１０ｍｌの乾燥アセトニトリルにアルゴン雰囲気下で溶解する。１．５ｍｌのｔｅｒｔ．−ブタノール／アセトニトリル（９：１）を溶液に添加し、氷浴内で６℃に冷却する。次いで８２０μｌのアクリロニトリル溶液（１．０ｍｌアセトニトリル中の８６μｌアクリロニトリル）を添加し、６℃で１５分間撹拌する。次いで２０５μｌの水素化カリウム溶液（２５ｍｇのＫＨ，０．５ｍｌのｔｅｒｔ．−ブタノール／アセトニトリル９：１中）を添加する。短時間の凝集が起きた後に透明な溶液が得られる。反応溶液を６℃でさらに４５分間、続いて４℃で６０分間、撹拌する。
【０１１８】
続いて、反応溶液を１０ｍｌのメチル−ｔｅｒｔ．−ブチルエーテルで希釈し、それぞれ１０ｍｌのＨ２Ｏで２回洗浄する。有機相を約１ｇの無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、Ｇ３ガラスフリットでろ過し、ロータリーエバポレーターで蒸発させる。それを高真空下で乾燥させると、約５５ｍｇの質量をもつ粘稠な透明残留物が生成する。
【０１１９】
１．２  ヒドロキシビタミンＤ２−３−３−アミノプロピルエーテルの合成
上記で得たニトリル全体を１５ｍｌのジエチルエーテルに溶解し、水素化リチウム７．５ｍｇのジエチルエーテル７．５ｍｌ中における懸濁液と、撹拌しながら混合する。反応混合物を室温で１時間撹拌する。その後、水素化アルミニウムリチウム３８．４のジエチルエーテル６．６ｍｌ中における懸濁液を添加する。その結果、混合物が強く混濁する。反応混合物を室温でさらに１時間撹拌し、次いで反応混合物を氷浴内で０〜５℃に冷却し、３５ｍｌの水を慎重に添加する。６．６ｍｌの１０Ｍ水酸化カリウム溶液の添加によりｐＨを強塩基性にする。
【０１２０】
それをそれぞれ６５ｍｌのメチル−ｔｅｒｔ．−ブチルエーテルで３回抽出する。有機相を合わせて、約５ｇの無水硫酸ナトリウムにより乾燥させ、濾過し、室温でロータリーエバポレーターにより蒸発させる。残留物をオイルポンプで一定質量になるまで乾燥させる。粗生成物を５ｍｌのＤＭＳＯおよび３．０ｍｌのアセトニトリルに溶解し、分取ＨＰＬＣにより精製する
溶離剤Ａ  ＝  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｈ２Ｏ  ＋  ０．１％トリフルオロ酢酸；
溶離剤Ｂ  ＝  ９５％アセトニトリル  ＋  ５％  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｈ２Ｏ  ＋  ０．１％  ＴＦＡ；
勾配：５０％  Ｂから１００％  Ｂまで１００分間で
流速：３０ｍｌ／分
温度：室温
カラム寸法：直径＝５．０ｃｍ；長さ＝２５ｃｍ
カラム材料：Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８／３００Å／１５〜２０μｍ
検出波長：２２６ｎｍ
分析用ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８／３００Å／５μｍ；４．６×２５０ｍｍ）によってその生成物含量が８５％より多い画分を丸底フラスコにプールし、凍結乾燥させる。１３．７ｍｇ（収率：５８％）が無色の凍結乾燥物として得られる。
【０１２１】
１．３  ヒドロキシビタミンＤ２−３−３’−Ｎ−（ヘミスベリル）アミノプロピル−エーテル−ビオチン−（ベータ−Ａｌａ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（イプシロン）コンジュゲート（＝  Ａｇ−Ｂｉ）の合成
１３．７ｍｇ（２５μｍｏｌ）のヒドロキシビタミンＤ２−３−３’−アミノプロピルエーテルを３．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、２８．７ｍｇ（３０μｍｏｌ）のビオチン−（ベータ−Ａｌａ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（ｅｐｉｓｏｎ）−ヘミ−スベレート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏ．１１８６６６５６）および１２．５μｌのトリエチルアミンを添加し、それを室温で一夜撹拌する。反応溶液を４．５ｍｌのＤＭＳＯで希釈し、０．４５μｍのマイクロフィルターにより濾過し、続いて分取ＨＰＬＣ（条件は実施例２．３ｂ）を参照）により精製する。分析用ＨＰＬＣによって８５％より多量の生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥させる。９．８（収率：３０％）の精製ビオチンコンジュゲートが得られる。
【０１２２】
１．４  ビタミンＤ結合タンパク質のルテニウム化およびゲル濾過クロマトグラフィーによる精製
ビタミンＤ結合タンパク質を１００ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）へ移し、タンパク質濃度を５〜１０ｍｇ／ｍｌに調整する。ルテニウム化試薬（ルテニウム（ＩＩ）トリス（ビピリジル）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）をＤＭＳＯに溶解し、抗体溶液に３対１のモル比で添加する。４５分間の反応時間後、１−リジンの添加により反応を停止し、ルテニウム化ビタミンＤ結合タンパク質（＝  ＤＢＰ−Ｒｕ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでのゲル濾過によって精製する。
【０１２３】
１．５  アッセイに際しての検査法
被験試料をＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｍｐａｎｙからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムにより測定する。
【０１２４】
被験試料を試薬組成物（Ａ）およびアルカリ化剤（Ｂ）と混合することにより、試薬混合物を調製する。
この例では、１５μｌの試料を１５μｌの試薬組成物（Ａ）および１０μｌのアルカリ化剤（Ｂ）と混合した試薬混合物を調製する。この試薬混合物を９分間インキュベートする。次の工程で７０μｌの検出試薬（溶液Ｃ）を試薬混合物に添加し、さらに９分間インキュベートする。最終工程で、ビオチニル化ｗａｌｌ抗原（溶液Ｄ）（６０μｌ）、および３０μｌのストレプトアビジン（ＳＡ）（３０μｌ）コートした磁性ポリスチレン粒子（懸濁液Ｅ）を添加する。さらに９分間のインキュベーション後、結合したルテニウム化ビタミンＤ結合タンパク質の量を常法により測定する（参照：図１、２、３、４ａ、４ｂ）。
【０１２５】
試薬組成物（Ａ）は下記のものを含有する：
１０ｍＭ  ＮａＯＨ
４ｍＭ  ＥＤＴＡ
６．７ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
０．５Ｍ  炭酸エチレン（ＥＣ）
ｐＨ  ５．５
アルカリ化剤（Ｂ）は下記のものを含有する：
１．３７５Ｍ  ＮａＯＨ
ルテニウム化ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ−Ｒｕ）を含む溶液Ｃは下記のものを含有する：
０．２Ｍ  ビス−トリス−プロパン（ｐＨ７．５）
２．５％  ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）
５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１％  マンニット
０．１％  オキシピリオン(oxypyrion)
０．１２μｇ／ｍＬ  ＤＢＰ−Ｒｕ
ビオチニル化ｗａｌｌ抗原を含む溶液Ｄは下記のものを含有する：
０．２Ｍ  ビス−トリス−プロパン（ｐＨ８．６）
０．５％  ｔｗｅｅｎ−２０溶液
０．１％  オキシピリオン
３０ｎｇ／ｍｌ  ビオチン
０．０１０８μｇ／ｍＬ  Ａｇ−Ｂｉ（実施例１．１から）
ＳＡ−コートしたラテックス粒子を含む懸濁液Ｅは下記のものを含有する：
０．７２ｍｇ／ｍｌ  ＳＡ−コートした磁性ポリスチレン粒子；４７０ｎｇ／ｍｌの結合容量をもつ。
【０１２６】
実施例２
炭酸エステルと金属塩、リン酸緩衝液および炭酸塩との比較
被験試料をＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｍｐａｎｙからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムにより測定する。全アッセイ操作は実施例１．５に示されている。
【０１２７】
実施例１．５と異なり、試薬組成物（Ａ）はそれぞれ０．５Ｍ炭酸エチレン（ＥＣ）、０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌまたは０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４を含有する。
【０１２８】
試薬組成物（Ａ）：
１０ｍＭ  ＮａＯＨ
４ｍＭ  ＥＤＴＡ
６．７ｍＭ  ＤＴＴ
０．５Ｍ  ＥＣ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＣｌまたはＮａＨ２ＰＯ４のいずれか。
【０１２９】
対照として、１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴを含有する試薬組成物（Ａ）を用いた。結果を図５に示す。アルカリ前処理（試薬混合物）に際して存在する炭酸エステル（０．５Ｍ  ＥＣ（◆））は、競合アッセイにおいて信号増強効果をもたらす。特に、ＥＣを含まない検査（□）と比較して信号動態が改善される。塩（０、５Ｍ  ＮａＣｌ、（◇））は効果を示さない。０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３の添加（○）または０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４の添加（▲）は信号に対するわずかな効果を示す。
【０１３０】
実施例３
炭酸エステルを含む／含まないアルカリ前処理
被験試料をＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｍｐａｎｙからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムにより測定する。アッセイ操作は実施例１．５に示されている。
【０１３１】
実施例１．５と異なり、下記のいずれかを含有する３種類の異なる試薬組成物を調製した：
◆：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  ＥＣ（実施例１．５を参照）または
▲：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴまたは
□：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ。
【０１３２】
試料  ＋  それぞれ◆（試薬組成物（Ａ）  ＋  アルカリ化剤（Ｂ）；実施例１．５に記載）、▲、または□のいずれか（＝試薬混合物）の４分間の前処理インキュベーションの後で溶液Ｃの添加前に、トリス−プロパンｐＨ６．３の添加により試薬混合物のｐＨをｐＨ９に調整した（図６）。アルカリ前処理（試薬混合物）に際して存在する炭酸エステルＥＣは、競合アッセイにおいて信号増強効果をもたらす。特に、ＥＣを含まない検査と比較して信号動態が改善される。
【０１３３】
実施例４
炭酸エチレン−対−炭酸ジメチル
被験試料をＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｍｐａｎｙからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムにより測定する。アッセイ操作は実施例１．５に示されている。
【０１３４】
実施例１．５と異なり、下記のいずれかを含有する２種類の異なる試薬組成物（Ａ）を調製した：
○：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  ＥＣ（１．５を参照）または
◆：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ炭酸ジメチル
炭酸エチレンまたは炭酸ジメチルの両方の炭酸エステルが、それぞれ同じアッセイ性能を示す（図７）。
【０１３５】
実施例５
炭酸エチレンの加水分解生成物の効果
被験試料をＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｍｐａｎｙからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムにより測定する。アッセイ操作は実施例１．５に示されている。
【０１３６】
実施例１．５と異なり、下記のいずれかを含有する５種類の異なる試薬組成物（Ａ）を調製した：
◆：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  ＥＣ（１．５を参照）または
○：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３または
▲：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ＋  ０．５Ｍエチレングリコール
□：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ
ＥＣのアルカリ加水分解生成物はエチレングリコールであり、これはアッセイに対して影響をもたない（▲）。炭酸水素塩（ＮａＨＣＯ３）も信号増強効果を示すが、炭酸エステルほど大きくはない（図８）。
【０１３７】
実施例６
炭酸エチレン−対−１，２  炭酸グリセロール
被験試料をＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｍｐａｎｙからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムにより測定する。アッセイ操作は実施例１．５に示されている。
【０１３８】
実施例１．５と異なり、下記のいずれかを含有する２種類の異なる試薬組成物（Ａ）を調製した：
◆：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  ＥＣ（１．５を参照）または
○：１０ｍＭ  ＮａＯＨ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  １，２  炭酸グリセロール
炭酸エチレンまたは１，２  炭酸グリセロールの両方の炭酸エステルが、それぞれ同じアッセイ性能を示す（図９）。
【図１】
2013529304.tif 000005
【図２】
2013529304.tif 000006
【図３】
2013529304.tif 000007
【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年12月14日(2012.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるためのインビトロ方法であって、
ａ）被験試料を調製し、そして
ｂ）工程（ａ）からの試料を
ｉ）０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩、または０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質を含有する試薬、
ｉｉ）還元剤、および
ｉｉｉ）アルカリ化剤
と混合し、これによりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させる
ことを含む方法。
【請求項２】
工程（ｉ）による試薬が、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるのに適した条件下で水溶液に可溶性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉ）による試薬が、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩を含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｉ）による試薬が、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質を含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質が、環式もしくは非環式の炭酸エステル、またはそのそれぞれのヒドロキシル化もしくはハロゲン化誘導体である、請求項１、２および４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
試料が液体試料である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
試料が血液、血清または血漿である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロ方法であって、
ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法に従ってビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させ、そして
ｂ）工程（ａ）で解離したビタミンＤ化合物を測定する
工程を含む方法。
【請求項９】
ビタミンＤ化合物が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、およびＣ３−エピ  ２５−ヒドロキシビタミンＤからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ビタミンＤ化合物２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／または２５−ヒドロキシビタミンＤ３を測定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための試薬組成物であって、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質、および還元剤を含有する、試薬組成物。
【請求項１２】
還元剤が、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、Ｎ−メチルマレイミド、エルマン試薬および１，２−ジチオラン−３−カルボン酸からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の試薬組成物。
【請求項１３】
還元剤が、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌおよびジチオトレイトール（ＤＴＴ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の試薬組成物。
【請求項１４】
還元剤が２ｍＭ〜３０ｍＭの濃度を有する、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の試薬組成物。
【請求項１５】
被験試料、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質からなる群から選択される物質、還元剤、およびＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２およびＬｉＯＨからなる群から選択されるアルカリ化剤を含む試薬混合物であり、
ここで前記試料は血液、血清または血漿である、前記試薬混合物。
【請求項１６】
ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から解離させるための、０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度の炭酸水素塩または加水分解に際して炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を放出できる物質からなる群から選択される物質、還元剤、およびＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２およびＬｉＯＨからなる群から選択されるアルカリ化剤を含む試薬組成物の使用。  
【国際調査報告】
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