(57)【要約】  本発明は、内側多孔質コア及び外側シェルを有するシェルビーズを含む媒体でイオン交換クロマトグラフィーを実施する方法に関し、内側コアがｐＨにより電荷が変化するリガンドを備えており、シェルが荷電イオン交換リガンドを備えており、この方法は以下の工程、すなわち、ａ）第１のｐＨで試料分子をシェルリガンドに吸着させる工程、ｂ）コアリガンドと同一の符号／種類を有する電荷を増大させることができ、同時に内側コアリガンドからイオンを放出させることにより、シェルリガンドから試料分子を置換する、すなわち溶出を起こさせるイオン強度の増大を引き起こす緩衝物質の添加によって第２のｐＨで内側コアリガンドの放電を生じさせ工程を含む。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内側多孔質コア及び外側シェルを有するシェルビーズを含む媒体でイオン交換クロマトグラフィーを実施する方法であって、内側コアはｐＨによりその電荷か変化するリガンドを備えており、シェルは荷電イオン交換リガンドを備えており、以下の工程、すなわち、ａ）第１のｐＨでシェルリガンドに試料分子を吸着させる工程、ｂ）コアリガンドと同一の符号／種類を有するその電荷を増大させることができ、同時に内側コアリガンドからイオンを放出させることにより、シェルリガンドから試料分子を置換する、すなわち溶出を起こさせるイオン強度の増大を生じさせる緩衝物質の添加によって第２のｐＨで内側コアリガンドの放電を起こさせる工程を含んでなる方法。
【請求項２】
シェルリガンドが、強イオン交換リガンド、例えば−Ｎ（ＣＨ3）3+並びにあらゆる種類の第四アンモニウムリガンド、非芳香族及び芳香族−ＳＯ3-リガンドである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
官能化コアのｐＨ単位当たりの電荷変化が＞３０μｍｏｌ／ｐＨｍＬゲルである、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
シェルリガンド及びコアリガンドが、同一又は異なる電荷を有しており、カルボン酸イオン（−ＣＯＯ-）、ホスホン酸イオン又はリン酸イオン（それぞれ、−ＰＯ32-、−Ｐ（ＯＨ）Ｏ2-、及び−ＯＰ（ＯＨ）Ｏ2-、−ＯＰＯ32-）、スルホン酸イオン又は硫酸イオン（それぞれ、−ＳＯ3-及び−ＯＳＯ3-）、−アリール−Ｏ-（フェノラート／アリーロラート）のようなあらゆる種類の陽イオンリガンド、又は正に荷電したいろいろな窒素、例えば第一アンモニウム、第二アンモニウム、第三アンモニウム、第四アンモニウム及びアミジニウムのようなあらゆる種類の陰イオンリガンドから選択される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
コアの多孔質が、試料分子がコア内に浸入するのを防ぐ、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
コアの多孔質が、試料分子がコア内に浸入するのを許容する、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
シェルビーズが３〜４００μｍの直径を有する、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
外側シェルが０．５〜１００μｍの厚さである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
方法をカラム形式で実施し、溶出工程で流れの方向を反対にする、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
上記請求項のいずれかで使用されるクロマトグラフィー媒体であって、内側多孔質コア及び外側シェルを有するシェルビーズを含んでなり、内側コアがｐＨにより電荷が変化するリガンドを備えており、シェルが荷電イオン交換リガンドを備えている、クロマトグラフィー媒体。
【請求項１１】
細胞及び／又はその一部、ウイルス及び／又はその一部、タンパク質、複合タンパク質、融合タンパク質、ペプチド、核酸、両性高分子、両性粒子、薬物、薬物断片のような生物及び合成起源の試料分子のイオン交換クロマトグラフィーのための、請求項１０記載のクロマトグラフィー媒体の使用。
【請求項１２】
カラム、マイクロタイター又はバッチ形式における請求項１１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なイオン交換媒体及びその使用に関する。より厳密には、本発明は、シェルビーズを含む媒体でイオン交換クロマトグラフィーを実施する方法に関する。この媒体は、電荷がｐＨにより変化するリガンドをコア内に含み、かつ試料分子と結合することができるイオン交換リガンドを外側シェル内に含む。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジーにおいて、今日までに提案されているクロマトグラフィー法は標的とのいろいろなモードの相互作用に基づいている。例えば、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、官能基は反対の電荷を有する交換可能な対イオンを伴う永久的に結合したイオン性の基である。
【０００３】
生体分子のイオン交換クロマトグラフィーのために通常使用されるクロマトグラフィー媒体は、ビーズ内に均一に分配された適切な荷電リガンドで置換されている。吸着された生体分子の溶出のための塩勾配及び／又はｐＨ勾配を達成するためには、異なる溶離剤と共に２つのポンプを使用することによって勾配を得る。最初に、非置換性の移動相ポンプがクロマトグラフィー媒体を通る流れの（全部ではないとしても）殆どを送り込み、置換性の移動相ポンプは非常に少ない（さらにはゼロの）流れを送る。次に、各々のポンプの流量を連続的又は間欠的に変更して吸着された化合物の溶出に適した勾配を得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／１５５６６８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
吸着された試料分子の溶出のための塩勾配及び／又はｐＨ勾配の生成のために慣用の２つのポンプ構成を使用するよりも簡単なイオン交換クロマトグラフィーを実施する方法が多くの場合に望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、吸着された試料分子の溶出のための塩勾配及び／又はｐＨ勾配の生成のために２つのポンプ構成に依存しないイオン交換クロマトグラフィーを実施する新しい原理を提供する。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、内側多孔質コアと外側シェルを有するシェルビーズを含む媒体上でイオン交換クロマトグラフィーを実施する方法を提供し、ここで内側コアはｐＨと共にその電荷が変化するリガンドを備え、シェルは荷電イオン交換リガンドを備えており、この方法は、ａ）第１のｐＨで試料分子をシェルリガンドに吸着させ、ｂ）コアリガンドと同じ符号／種類を有する電荷を増大させることができ、同時に内側コアリガンドからイオンを放出させることによりシェルリガンドから試料分子を置換させる、すなわち溶出させるイオン強度の増大を起こさせる緩衝物質の添加によって、第２のｐＨで内側コアリガンドの放電を起こさせる工程を含む。
【０００８】
コアリガンド、例えばアミン−リガンドと同じ種類（同じ種類の電荷を有する）である限りいかなる種類の緩衝物質でも、例えばアミン緩衝剤を使用し得る。これは、ｐＨが増大すると、次式に従ってイオン強度を増大させる。
【０００９】
Ｍ−Ｎ+Ｈ（Ｒ1）2Ｘ-＋ＮＲ’3→Ｍ−Ｎ（Ｒ1）2＋ＮＨＲ’3＋Ｘ-
Ｍ＝ビーズマトリックス。
【００１０】
好ましくは、外側シェルリガンドは、強イオン交換リガンド、例えば−+Ｎ（ＣＨ3）3並びにあらゆる種類の第四アンモニウムリガンド、非芳香族及び芳香族−ＳＯ3-リガンドである。
【００１１】
好ましい実施形態では、官能化コアのｐＨ単位当たりの電荷変化は＞３０μｍｏｌ／ｐＨｍＬゲルである。
【００１２】
本発明の方法によると、シェルリガンドとコアリガンドは同一又は異なる電荷を有し得、任意の種類の陽イオンリガンド、例えばカルボン酸イオン（−ＣＯＯ-）、ホスホン酸イオン又はリン酸イオン（それぞれ、−ＰＯ32-、−Ｐ（ＯＨ）Ｏ2-、及び−ＯＰ（ＯＨ）Ｏ2-、−ＯＰＯ32-）、スルホン酸イオン又は硫酸イオン（それぞれ、−ＳＯ3-及び−ＯＳＯ3-）、−アリール−Ｏ-（フェノラート／アリーロラート）、又は任意の種類の陰イオンリガンド、例えば正に荷電したいろいろな窒素、例えば第一アンモニウム、第二アンモニウム、第三アンモニウム、第四アンモニウム及びアミジニウムから選択される。
【００１３】
上記請求項の１以上の方法において、コアの多孔質により、試料分子がコア内に浸入するのが防がれるか又は可能になる。
【００１４】
好ましくは、シェルビーズは３〜４００μｍの直径を有しており、外側シェルは０．５〜１００μｍの厚さである。例えば、直径１００μｍのシェルビーズの場合外側シェルは０．５〜１０μｍである。直径３００μｍのシェルビーズの場合外側シェルは０．５〜３０μｍである。
【００１５】
代わりの実施形態では、この方法をカラム形式で実施する場合、溶出工程で流れの方向を反対にする、すなわちカラムをひっくり返す。これによって、イオン強度の増強のための充分な時間が得られ、試料分子がクロマトグラフィー床を通る輸送距離が短くなり、その結果シャープなピークが得られる。
【００１６】
第２の態様では、本発明は、上記方法に使用するクロマトグラフィー媒体に関し、この媒体は内側多孔質コアと外側シェルを有するシェルビーズを含んでおり、内側コアはｐＨによりその電荷が変化するリガンドを備えており、シェルは荷電イオン交換リガンドを備えている。
【００１７】
第３の態様では、本発明は、細胞及び／又はその一部、ウイルス及び／又はその一部、タンパク質、複合タンパク質、融合タンパク質、ペプチド、核酸、両性高分子、両性粒子、薬物、薬物断片のような生物及び合成起源の試料分子のイオン交換クロマトグラフィーのための、上記クロマトグラフィー媒体の使用に関する。
【００１８】
この使用はカラム、マイクロタイター又はバッチ形式であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、コアリガンドを有する陽イオン交換媒体のビーズ設計を示し、コアリガンドの電荷及び関連の対イオンと結合する能力はｐＨのシフトにより変化することができる。
【図２】図２は、５０％のプロトタイプＨＦＡ  ５５  Ｃｏｒｅ  ＰＥＩ  Ｓｈｅｌｌ−Ｓ（弱陰イオン性リガンド）と５０％のＳ−シェル（強陽イオン性）プロトタイプを充填したカラムによるリボヌクレアーゼＡの分離を示す（詳細については実験欄参照）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、プロトン化可能でありかつ脱プロトン化可能な官能基（弱イオン交換リガンド）で官能化コアを有する「シェルビーズ」を使用することを提案するが、ここで前記官能基は（緩衝）化合物でｐＨを変化させることによってその電荷を低減する又は放電することができ、前記化合物はこの過程で次にその電荷を増大し、同時に周囲の溶液（移動相）におけるイオン強度を変化させ、荷電された好ましい強イオン交換リガンドに吸着されたタンパク質の溶出を達成する。試料吸着のためのイオン交換リガンドは外側の薄いシェルに結合しているのが好ましく、コアリガンドは弱イオン交換リガンドであって用途に適したｐＨ範囲で電荷変化が可能であるｐＫａを有しており、コアリガンドはシェルリガンドに対して同一の電荷でも又は反対に荷電されることもできる。コアリガンドは、その化学構造に応じて、短いｐＨ間隔で比較的鋭いｐＨ切替によって電荷を変化させるか又は広いｐＨ間隔で遅く緩やかに電荷を変化させるように選択することができる。後者のタイプのリガンドはクロマトグラフィーカラム内にｐＨ及び塩勾配を生成するのに使用し得る。同時係属中のスエーデン国特許出願第１０５０１５７−５号に記載の等電点電気泳動媒体と比較して、十分に多量の塩イオンを放出するために、本発明のコア内のリガンド密度は数倍高い。コアの多孔質は、試料置換基の結合を回避するために、タンパク質／ペプチドを排除するように調節することができる。さらにまた、移動相は、コアリガンドを放電させ、同時に同じ符号をもつ電荷を獲得し、従ってコアリガンドから対イオンを放出させることができる「標準の」緩衝化学種の単純な混合物を使用することができる。当然、ビーズ内及び回りのイオン強度を増大するために１つのポンプ（溶離剤を混合する装置ではない）が必要なだけである。この種の媒体の主要な応用分野はタンパク質及びペプチドの大規模な精製である。また、この種のビーズは分析用途にも適切である。
【実施例】
【００２１】
以下、図面及び実験部に関連して本発明を説明する。
【００２２】
実験
以下の実施例は例示の目的のみで記載するものであり、後記特許請求の範囲に記載の本発明を制限するものと解してはならない。
【００２３】
全般
マトリックスの体積とは沈降した床体積をいい、グラムで表したマトリックスの重量とは吸引乾燥重量をいう（膨潤したビーズからボイド水を除去したもの）。反応の攪拌にはモーター駆動攪拌機を使用する。官能性の分析及びビーズのアリル化の程度、又はアミン含量の程度の決定には慣用法を使用した。
【００２４】
架橋アガロースゲル（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＦＡ  ５５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から出発して本発明の分離マトリックスを調製する１つの方法を以下に例示する。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＦＡ  ５５のビーズ直径は約９０μｍである。
【００２５】
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＦＡ  ５５−ＨＦＡ  ５５  Ｃｏｒｅ−ＰＥＩ  Ｓｈｅｌｌ−ＳＯ3-に基づく、内部ｐＨ及びイオン強度勾配溶出によるアイソクラチックイオン交換クロマトグラフィー用のシェル媒体の調製
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＦＡ  ５５のアリル活性化
ガラスフィルター上でＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＦＡ  ５５を蒸留水で洗浄した。このゲル、すなわち８００ｍＬの水を切ったゲルを三つ首丸底フラスコに入れた。ＮａＯＨ（８００ｍＬ、５０％溶液）を加え、機械的攪拌を開始し、スラリーを水浴上で５０℃に加熱した。およそ１時間後、１６８ｍＬのアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）を加えた。その後、スラリーを激しく攪拌しながら一晩放置した。約２０時間後スラリーをガラスフィルターに移し、蒸留水（×５）、エタノール（×２）及び蒸留水（×５）で洗浄した。
【００２６】
次に滴定によりアリル含量を測定した。２３０μｍｏｌ／ｍＬ。
【００２７】
シェルの活性化（部分臭素化）
アリル化ゲル１００ｍＬを秤量してフラスコに入れ、１０００ｍＬの蒸留水を加えた。０．３５４ｍＬの臭素を１００ｍＬの蒸留水に溶解させ、この溶液をアリル化ゲルスラリーに加えた。臭素のこの量は約５μｍのシェルの厚さに相当する。この臭素溶液を激しく攪拌しながら５回に分けて等量ずつアリルゲルスラリーに加えた。およそ１０分後ゲルをガラスフィルター上で蒸留水にで洗浄した。
【００２８】
陽イオン交換基のシェルカップリング（Ｓ−シェルプロトタイプ）
１００ｍＬの部分的に臭素化ゲル（上記参照）をフラスコに移し、２５ｍＬの蒸留水に溶解させた１２．５ｇの亜硫酸ナトリウムと混合した。攪拌しながら、５０％のＮａＯＨを加えてｐＨ１２とした後、５０℃で２０ｈ攪拌した。次にゲルをガラスフィルター上で蒸留水にで洗浄した。
【００２９】
イオン交換能は２５μｍｏｌ／ｍＬと評価された。
【００３０】
ビーズのコア内のＰＥＩ（ポリエチレンイミン）のカップリング
２５ｍＬの「Ｓ−シェルゲル」（上記参照）をビーカー内でオーバーヘッド攪拌しながら蒸留水（２５ｍＬ）及び０．５ｇの酢酸ナトリウムと混合した。スラリーに濃い橙／黄色が残るまで臭素を加えた。２分間の攪拌後、ギ酸ナトリウムをスラリーが完全に変色するまで加えた。次にゲルをガラスフィルター上で蒸留水にで洗浄した。
【００３１】
２５ｍＬの水を切ったコア臭素化ゲルをビーカーに移し、１０ｍＬの水及び１０ｇのポリエチレンイミン（７５００００ｇ／ｍｏｌ）と混合した。次に混合物を２０℃で２０ｈ攪拌した後、ガラスフィルター上で蒸留水にで洗浄した。ゲルのＰＥＩで官能化コアのイオン交換能は１５０μｍｏｌ／ｍＬゲル床と評価された。
【００３２】
ＨＦＡ  ５５  Ｃｏｒｅ  ＰＥＩ  Ｓｈｅｌｌ−Ｓのクロマトグラフィー評価
シェル媒体プロトタイプ（ＨＦＡ  ５５  Ｃｏｒｅ  ＰＥＩ  Ｓｈｅｌｌ−Ｓ）の挙動を試験するために、カラムに、Ｓ−シェルプロトタイプ（上記参照）とＨＦＡ  ５５  Ｃｏｒｅ  ＰＥＩ  Ｓｈｅｌｌ−Ｓの混合物を充填した。５０％のプロトタイプＨＦＡ  ５５  Ｃｏｒｅ  ＰＥＩ  Ｓｈｅｌｌ−Ｓの使用は、媒体（ＨＦＡ  ５５  Ｃｏｒｅ  ＰＥＩ  Ｓｈｅｌｌ−Ｓ）がｐＨ勾配及びイオン強度工程／勾配を生成する効率を証明するための単なる一例である。
【００３３】
実験
クロマトグラフィーの性能に関して、シェル媒体（上記参照）の混合物をＨＲ  ５／２０カラムに充填し、緩衝溶液（５０ｍＭギ酸、ｐＨ２．７）で平衡化した後カラム中に試料を注入した（１００μＬのリボヌクレアーゼＡ、１０ｍｇ／ｍＬ）。流量を０．２５ｍＬ／ｍｉｎに調節し、緩衝液Ｂ（３００ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ９．７）を流すことによってタンパク質（リボヌクレアーゼＡ）を「アイソクラチックに」溶出した。
【００３４】
試料
試料は５０ｍＭのギ酸（ｐＨ２．７）に溶解させたリボヌクレアーゼＡであり、濃度は１０．０ｍｇ／ｍｌに調節した。試料体積は１００μＬであった。
【００３５】
機器
ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅ  １０
ソフトウエア：Ｕｎｉｃｏｒｎ
カラム：ＨＲ  ５／２０。
【００３６】
結果及び考察
タンパク質製造の重大な簡易化をもたらす下流のクロマトグラフィーの足場（ｐｌａｔｆｏｒｍ）を改良するためには、分離媒体のクロマトグラフィー性能を維持又は増大することが極めて重要である。本発明においては、アイソクラチック条件下でのカラム内で内部ｐＨ変化又はｐＨ勾配及び重ね合わせたイオン強度ステップ／勾配を生成することができるイオン交換ビーズを提案する。分離のためのリガンドはシェルに結合され、溶出過程で使用されるリガンドはコアに結合されている。コアリガンドの電荷は、先の平衡化ｐＨと比べて異なるｐＨに調節された溶離剤／緩衝剤により切り替えることにより、ｐＨ勾配及びイオン強度変化を生じさせることができる。加えて、コアの多孔質はタンパク質／ペプチドを排除するように調節することができる。この種類のビーズの設計を、陽イオン交換クロマトグラフィーについて図１に示す。
【００３７】
図１では、少なくとも緩やかな電荷シフト及びｐＨ３〜１０のｐＨ勾配を生成することを可能にする放電可能なＩＥＸコアリガンド（他の放電可能なＩＥＸリガンドも当然使用することができる）としてＰＥＩ（ポリエチレンイミン）が提案されている。この種のビーズのコアリガンドは、平衡化及び吸着緩衝剤又はより高い濃度の緩衝物質を有する別の平衡化緩衝剤の対イオンで平衡化され予備的に飽和される。この緩衝剤は、コアリガンドが荷電されるｐＨ（すなわち酸性の緩衝剤を用いる陰イオン交換リガンドの場合、ｐＨ例えば３）に調節され、その後リガンドは例えば１０に調節されたトリエタノールアミン緩衝剤で溶出される。溶出工程で使用される移動相中の荷電した緩衝剤成分は、その低い濃度のため、自身では、結合した（この例の場合正に荷電している）試料生体分子を−ＳＯ3-基から置換／溶出することができない。ＰＥＩリガンド中の窒素を高いｐＨのトリエタノールアミン緩衝剤で滴定すると、その結果、そのリガンドの電荷が減少し、ｐＨが増大したときにＰＥＩリガンドから対イオンが放出される。この放出されたイオンは次に、滴定過程で増大した電荷を獲得した緩衝剤化合物に対して対イオンとして働く。このようにして、ビーズ内又は回りの移動相中に増大したイオン強度が生じる。アミンが十分にはプロトン化されないか又は全くプロトン化されないｐＨに調節されたアミン緩衝溶液によるＰＥＩリガンドの遅い滴定によって、ｐＨ勾配に加えて内部に生じるイオン強度勾配を得ることが可能である。このイオン強度の増大はビーズのコア内に高いＰＥＩ密度を使用することによって強化することができる。
【００３８】
この種の媒体をタンパク質の分離に使用することができることを立証するために、カラムに５０％のプロトタイプＨＦＡ  ５５  Ｃｏｒｅ  ＰＥＩ  Ｓｈｅｌｌ−Ｓと５０％のＳ−シェルプロトタイプ（上記参照）を充填した。図２によると、ｐＨ勾配が得られ、また導電率にステップが観察される。リボヌクレアーゼＡはシャープなピークできれいに溶出される。この結果は、この種のビーズ設計（図１）をタンパク質の精製に使用することができるということを明らかに示している。ビーズの性能はシェルの厚さ、コア内の緩衝リガンドの種類及びシェル内のリガンドを調節することによって最適化することができる。
【００３９】
有利なことに、カラム内の流れの方向は溶出のために変えられる。これにより、イオン強度の増強に充分な時間が可能になり、クロマトグラフィー床を通る試料分子のより短い輸送距離が達成され、結果としてシャープなピークが得られる。
【図１】
2013530406.tif 000003
【図２】
2013530406.tif 000004
【国際調査報告】
2013530406.tif 000005
2013530406.tif 000006
2013530406.tif 000007
2013530406.tif 000008