(57)【要約】  本明細書では、ヒトエンドシアリン遺伝子を発現する齧歯動物が提供される。好適な実施形態において、齧歯動物はマウスである。好適には、ヒトエンドシアリン遺伝子は、天然又は内因性のエンドシアリン遺伝子座中に組み込まれている。より好適には、宿主齧歯動物は内因性エンドシアリン遺伝子産物が欠損している。ヒトエンドシアリン遺伝子は好適には、親又は野生型の齧歯動物における天然のエンドシアリン遺伝子産物のものと同様の発生及び疾患応答パターンで発現される。この特徴により、これらの齧歯動物は、治療用途のためのエンドシアリン生物学に正又は負の影響を与える試験薬剤の効果を試験するのに有用となる。天然エンドシアリン遺伝子産物を欠失しているヒトエンドシアリンを発現する齧歯動物（ＨＵＥ齧歯動物）の使用が、エンドシアリン経路に正又は負に影響を与えることができ、また、ヒト治療として有用であり得るこれらの薬剤を識別するためのスクリーニング手段としても役立ち得る薬剤を開発するための戦略として提案される。
2013543379.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が配列番号３を含む、請求項１に記載のトランスジェニック齧歯動物。
【請求項３】
前記ヒトエンドシアリンが配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２のいずれか一項に記載のトランスジェニック齧歯動物。
【請求項４】
前記齧歯動物がマウスである、請求項１から３までのいずれか一項に記載のトランスジェニック齧歯動物。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列が前記齧歯動物の内因性エンドシアリン遺伝子座内に位置する、請求項１から４までのいずれか一項に記載のトランスジェニック齧歯動物。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列の組込みに起因して、前記齧歯動物の内因性エンドシアリン遺伝子が破壊され、それにより機能しない、請求項１から５までのいずれか一項に記載のトランスジェニック齧歯動物。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が前記齧歯動物の内因性遺伝子発現調節配列の制御下にある、請求項１から６までのいずれか一項に記載のトランスジェニック齧歯動物。
【請求項８】
レポーター遺伝子又は選択可能なマーカーを更に含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載のトランスジェニック齧歯動物。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか一項に記載のトランスジェニック齧歯動物から単離された細胞。
【請求項１０】
正常組織、悪性組織、炎症組織又は罹患した眼から単離される、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
ヒトエンドシアリンについてのターゲティング薬剤を識別するために試験薬理作用剤をスクリーニングする方法であって、
ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物に試験薬理作用剤を投与する工程と、
前記齧歯動物におけるヒトエンドシアリン活性を測定する工程と、
前記ヒトエンドシアリン活性を対照と比較する工程と
を含み、前記対照と比較したヒトエンドシアリン活性の増加又は減少がエンドシアリンについてのターゲティング薬剤の指標となる、上記方法。
【請求項１２】
ヒトエンドシアリンについてのターゲティング薬剤を識別するために試験薬理作用剤をスクリーニングする方法であって、
ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物の細胞と試験薬理作用剤とを接触させる工程と、
前記細胞におけるヒトエンドシアリン活性を測定する工程と、
前記ヒトエンドシアリン活性を対照と比較する工程と
を含み、前記対照と比較したヒトエンドシアリン活性の増加又は減少がエンドシアリンについてのターゲティング薬剤の指標となる、上記方法。
【請求項１３】
ヒトエンドシアリンについての薬剤を検証する方法であって、
ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物に薬剤を投与する工程と、
前記齧歯動物におけるヒトエンドシアリン活性を測定する工程と、
前記ヒトエンドシアリン活性を対照と比較する工程と
を含み、前記対照と比較したヒトエンドシアリン活性の増加又は減少により、エンドシアリンについての薬剤が検証される、上記方法。
【請求項１４】
ヒトエンドシアリンについての薬剤を検証する方法であって、
ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物の細胞と薬剤とを接触させる工程と、
前記細胞におけるヒトエンドシアリン活性を測定する工程と、
前記ヒトエンドシアリン活性を対照と比較する工程と
を含み、前記対照と比較したヒトエンドシアリン活性の増加又は減少により、エンドシアリンについての薬剤が検証される、上記方法。
【請求項１５】
疾患を抑制できる試験薬剤をスクリーニングする方法であって、
ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれており、前記疾患を示しているトランスジェニック齧歯動物に試験薬剤を投与する工程と、
前記トランスジェニック齧歯動物における前記疾患の存在を測定する工程と、
前記トランスジェニック齧歯動物における前記疾患の存在を対照と比較する工程と
を含み、前記対照と比較した前記疾患の減少が前記疾患を抑制できる薬剤の指標となる、上記方法。
【請求項１６】
疾患を抑制できる試験薬剤をスクリーニングする方法であって、
ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれており、前記疾患を示しているトランスジェニック齧歯動物の細胞と試験薬剤とを接触させる工程と、
前記細胞における前記疾患の存在を測定する工程と、
前記細胞における前記疾患の存在を対照と比較する工程と、
を含み、前記対照と比較した前記疾患の減少が前記疾患を抑制できる薬剤の指標となる、上記方法。
【請求項１７】
疾患を抑制できる薬剤を検証する方法であって、
ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれており、前記疾患を示しているトランスジェニック齧歯動物に薬剤を投与する工程と、
前記トランスジェニック齧歯動物における前記疾患の存在を測定する工程と、
前記トランスジェニック齧歯動物における前記疾患の存在を対照と比較する工程と、
を含み、前記対照と比較した前記疾患の減少により、前記疾患を抑制できる薬剤が検証される、上記方法。
【請求項１８】
疾患を抑制できる薬剤を検証する方法であって、
ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれており、前記疾患を示しているトランスジェニック齧歯動物の細胞と薬剤とを接触させる工程と、
前記細胞における前記疾患の存在を測定する工程と、
前記細胞における前記疾患の存在を対照と比較する工程と、
を含み、前記対照と比較した前記疾患の減少により、前記疾患を抑制できる薬剤が検証される、上記方法。
【請求項１９】
前記薬剤が抗体又はその抗原結合断片である、請求項１１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記薬剤がヒトエンドシアリン活性を刺激できる、請求項１１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記薬剤がヒトエンドシアリン活性を抑制できる、請求項１１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬剤がエンドシアリン結合タンパク質である、請求項１１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記エンドシアリン結合タンパク質がヒトエンドシアリン活性を刺激できる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記エンドシアリン結合タンパク質がヒトエンドシアリン活性を抑制できる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記薬剤がヒトエンドシアリンｍＲＮＡに相補的に結合できる核酸である、請求項１１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記薬剤が小化学分子である、請求項１１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記疾患が癌である、請求項１５から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患が炎症性疾患、眼疾患又は低下した創傷治癒である、請求項１５から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記トランスジェニック齧歯動物に腫瘍が移植される、請求項１５又は１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記トランスジェニック齧歯動物が転移癌を有する、請求項１５又は１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１０年９月２９日に出願された米国特許出願第６１／３８７，８９８号の利益を主張し、その出願は参照として本明細書にその全体が組み込まれる。
【０００２】
ヒトエンドシアリンを含有するトランスジェニック齧歯動物並びにそれらの開発及び使用に関する技術が本明細書に提供される。齧歯動物並びに誘導された器官、細胞及び生体液は、例えば発生並びに正常及び病態におけるエンドシアリン経路の解明、また治療的有用性についてのエンドシアリン発現／機能を遮断又は刺激できるエンドシアリン特異的化合物の開発に有用である。齧歯動物は、ヒトエンドシアリン機能（単数又は複数）を正若しくは負に調節できる薬剤を開発するために、発生、恒常性又は疾患の間、エンドシアリン機能を調節できる経路及び遺伝子素を決定するために使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
血管形成は新生血管の形成に関与する調節されたプロセスである。それは、正常な成長、胚発生、創傷治癒、及び他の生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす（Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０７（６８０１）：２４２−８）。更に、デノボ血管形成は、新たな「胚様（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｌｉｋｅ）」血管の形成（本明細書において新血管形成と称される）が構造及び機能に関して正常な血管系とは異なるように見える、癌を含むいくつかの病態に関与する（Ｈａｎａｈａｎ及びＷｅｉｎｂｅｒｇ、（２０００）Ｃｅｌｌ  １００（１）：５７−７０；Ｐｅｔｅｒｓら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：２６１−２６２）。これらの血管は、内皮細胞、周皮細胞及び線維芽細胞などの細胞を含むことが見出されている。多くのｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により、新生血管疾患を治療するための胚型、腫瘍関連内皮の血管形成を選択的に阻害できる新規の抗血管形成化合物を開発する能力を示す血管形成の種々のモデル系を使用して決定した場合、正常な血管系と疾患に関連した血管系との間の生物学的差異が実証されている（Ｄｈａｎａｂａｌら（２００５）ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  ５：１１５−１３０）。新生血管疾患は、癌、眼科適応症、炎症及び感染症を含む（Ｃｏｎｅｊｏ−Ｇａｒｃｉａら（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０５：６７９−６８１、Ｄａｓら（２００３）Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２２：７２１−７４８、Ｐａｌｅｏｌｏｇら（１９９９）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２：２９５−３０７、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ−Ｂｅｒｋａら（２００４）Ｃｕｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１０：３３３１−３３４８）。加えて、改善された血管形成が疾患の結果を好転できる疾患が存在する（Ｇａｌｉａｎｏら（２００４）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１６４：１９３５−１９４７、Ｗａｎｇら（２００４）Ｓｔｒｏｋｅ  ３５：１７３２−１７３７）。治療についてのこれらの機会を考慮して、疾患に関連した新血管形成、血管成長及び／又は抑制を特異的に阻害又は刺激できる潜在的な標的、並びに機能についての集中した調査が継続されている。このような標的を識別するための試みにおいて、腫瘍間質の細胞表面抗原を識別し、また新生血管内皮及び内皮関連細胞において発現される特異的タンパク質又はＲＮＡを単離する戦略が計画されている（Ｒｅｔｔｉｇら（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９（２２）：１０８３２−６；Ｓｔ．Ｃｒｏｉｘら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９：１１９７−１２０２）。これらの戦略は、周皮細胞及びエンドシアリン、ＣＤ２４８又は腫瘍内皮マーカー−１（ＴＥＭ１）と呼ばれている他の腫瘍間質細胞において特異的に発現しているように見える細胞表面タンパク質を識別している。エンドシアリンに結合できる抗体を利用する試験により、内皮細胞培養物においてこの抗原を発現する細胞のサブセット及び患者の正常組織における細胞のサブセットが識別されている。悪性組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）試験により、悪性組織における多数の新生血管関連細胞においてエンドシアリンの十分な発現が明らかにされている。限定されないが、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞��又はＨＭＶＥＣ（新生児皮膚微小血管内皮細胞）及び主要なヒト周皮細胞などの胚様内皮培養物由来の細胞系におけるエンドシアリンの発現が観察されている。エンドシアリン発現細胞は形態学において線維芽細胞様（fibroblastic-like）のように見える。最近の研究により、エンドシアリンが腫瘍血管系に関連した周皮細胞において少なくとも発現されることが見出された（Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚら（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：１−８）。
【０００４】
１９９２年、Ｒｅｔｔｉｇらは、種々の癌種内の血管において抗原を認識するモノクローナル抗体を記載している（Ｒｅｔｔｉｇら（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９（２２）：１０８３２−６）。これらのうちの１つはＦＢ５と指定され、そのＦＢ５は神経芽細胞腫細胞系ＬＡ１−５ｓの表面上で約１００ｋＤａのタンパク質を認識する。ＦＢ５は、エンドシアリンに結合するマウスＩｇＧ１抗体であり、腫瘍血管系と関連する細胞及び種々の異なる癌種と関連する間質細胞を認識することが示されている。構造的評価によると、エンドシアリンは、５つの球状細胞外ドメイン（Ｃ型レクチンドメイン、Ｓｕｓｈｉ／ｃｃｐ／ｓｃｒパターンと３つのＥＧＦ反復とに対する類似性を有する１つのドメインを含む）を含むＣ型レクチン様タンパク質として分類されている。このタンパク質はまた、ムチン様領域、膜貫通セグメント、及び短い細胞質尾部を含む。このタンパク質は糖タンパク質のようでもある。炭水化物分析によると、エンドシアリンコアタンパク質には、シアロムチン様分子に対する類似性を有するシアリル化されたＯ−結合オリゴ糖を多数有することを示している。
【０００５】
米国特許第５，３４２，７５７号は約１００ｋＤａタンパク質（エンドシアリン）に結合する抗体を記載している。この抗体はＦＢ５と命名された。その後の研究によると、マウスＦＢ５の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトＩｇＧ１骨格に連結させて、悪性組織及びＨＭＶＥＣ培養物中の細胞のサブセット内で血管にも結合できるヒト化抗体を作製した。
【０００６】
米国特許第７，６１５，３７２号は、エンドシアリンに結合し、免疫エフェクター活性を誘導でき、内在化できる抗体を記載している。
【０００７】
血管新生は多数の病態と関連している。癌において、血管新生は腫瘍に血液及び栄養素を供給するのに重要であると考えられている。網膜症及び黄斑変性症などの非腫瘍疾患において、無制限な血管新生により失明を招く（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ−Ｂｅｒｋａ、（２００４）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．１０（２７）：３３３１−４８、Ｄａｓ及びＭｃＧｕｉｒｅ、（２００３）Ｐｒｏｇ  Ｒｅｔｉｎ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２２（６）：７２１−４８）。更に、一部の報告によると、炎症疾患における血管新生の役割が識別されている（Ｐａｌｅｏｌｏｇ及びＭｉｏｔｌａ、（１９９８）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２（４）：２９５−３０７）。これらの胚様内皮及び前駆細胞をより良く定義する方法、並びに上述の病態に関連したこれらの内皮細胞と関連した細胞を研究する方法により、これらの疾患を治療する新規薬物の開発を導くことになるであろう。反対に、血管新生は創傷治癒と関連する（Ｇａｌｉａｎｏら（２００４）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１６４（６）：１９３５−４７）。これらの複雑なプロセスの多くはｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験することが困難であるので、ヒトエンドシアリンタンパク質に影響を与え得る薬剤の効果を試験できるｉｎ  ｖｉｖｏモデルにより、ヒトにおけるこの経路の役割を理解するための開発、改良及び検証が可能となり、癌、炎症性疾患を治療する化合物並びに外傷、熱傷及び感染に関連する創傷治療を高めることができる化合物を含む治療有益性のために使用できる薬剤の識別を導く可能性があるであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ｉｎ  ｖｉｖｏモデルは複雑な多細胞プロセスを研究するのに重要である。ヒトと他の種のエンドシアリン遺伝子産物との間の相同性の程度は異なり、齧歯動物種では８０％未満の相同性を共有する（Ｏｐａｖｓｋｙら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１年１０月１９日、２７６（４２）：３８７９５−８０７、Ｃａｒｓｏｎ−Ｗａｌｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１年９月１５日、６１（１８）：６６４９−５５）。したがって、ヒトエンドシアリン遺伝子産物を発現する動物モデルは、血管形成及び新生血管疾患におけるその生物学的役割並びに炎症、眼科疾患（ｏｐｔｈａｍａｌｏｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、創傷治癒及び動物発生などの他の生物学的プロセスを試験するためにヒトエンドシアリンｍＲＮＡ又はタンパク質に結合できる薬剤を識別し、開発するのに有益であろう。ヒトエンドシアリンを発現する動物モデルの使用はこれまで記載されていなかった。更に、ヒト遺伝子が天然の齧歯動物ゲノム内の齧歯動物ホモログと置き換えられ、ヒト遺伝子発現が内因性齧歯動物と同様に作用する、ヒトエンドシアリンを発現する齧歯動物の開発により、正常組織及び種々の病態並びにｉｎ  ｖｉｖｏでヒト遺伝子産物に結合できる薬剤の開発におけるヒトエンドシアリン生物学の研究においてこれらの動物についての重要な使用が提供される。
【０００９】
本明細書では、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列（例えば配列番号３及び４）を発現する齧歯動物が提供される。好適な実施形態において、齧歯動物はマウスである。マウスエンドシアリンのヌクレオチド及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１及び２に示される。好適には、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列は天然又は内因性エンドシアリン遺伝子座中に組み込まれている。より好適には、内因性エンドシアリン遺伝子産物は、機能的に破壊されているか又はトランスジェニック齧歯動物において実質的に減少するか若しくは欠損している。好適には、トランスジェニック齧歯動物は、齧歯動物の内因性遺伝子発現調節配列の制御下にあるヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列を含有する構築物はまた、レポーター遺伝子又は選択可能なマーカー（例えば陽性選択マーカー及び／又は陰性選択マーカー）も含有する。ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列は好適には、親又は野生型齧歯動物における天然エンドシアリン遺伝子産物のものと同様の発生及び疾患応答パターンで発現される。この特徴により、これらの齧歯動物は、治療用途のためのエンドシアリン生物学に正又は負に影響を与える試験薬剤の効果を試験するのに有用となる。天然エンドシアリン遺伝子産物を欠失しているヒトエンドシアリンを発現する齧歯動物（ＨＵＥ齧歯動物）の使用が、エンドシアリン経路に正又は負に影響を与えることができ、また、ヒト治療として有用であり得るこれらの薬剤を識別するためのスクリーニング手段としても役立ち得る薬剤を開発するための戦略として提案される。
【００１０】
ヒトエンドシアリン配列が、種々の生理学的プロセスの間、齧歯動物エンドシアリン配列と同様に発現される、内因性エンドシアリン遺伝子座からヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列を発現する齧歯動物が提供される。
【００１１】
ヒトエンドシアリンを発現するトランスジェニック齧歯動物の子孫が提供される。
【００１２】
ヒトエンドシアリンを発現するトランスジェニック齧歯動物から単離された細胞が提供される。これらの細胞は、正常組織、悪性組織、炎症組織又は罹患した眼から単離できる。
【００１３】
また、ヒトエンドシアリンの生物学的性質を研究し、主要な内皮細胞及び周皮細胞集団、悪性組織又は正常組織並びに他の疾患に関連するエンドシアリン生物学に影響を与えることができる薬剤を開発するために、ＨＵＥ齧歯動物と称される、ヒトエンドシアリンを発現する齧歯動物を使用する方法も提供される。
【００１４】
一部の実施形態において、本発明のマウスはマウス第１９染色体の近位領域におけるマウスエンドシアリン遺伝子座内にノックインされているヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列を有する。
【００１５】
一部の実施形態において、マウスはＣ５７ＢＬ／６系を含み、ヒトエンドシアリンの研究はこれらのマウス又は当業者に公知の方法により一般に行われるようにヒトエンドシアリン遺伝子座が他のマウス系と交配されるマウスで実施され得る。
【００１６】
ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物の器官、組織又は細胞におけるヒトエンドシアリンの発現レベルを測定する工程を含む、正常な発生におけるヒトエンドシアリンの役割を試験する方法が提供される。好適な実施形態において、ヒトエンドシアリンの発現レベルは、齧歯動物の特定の発生段階において測定する。
【００１７】
また、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物の器官、組織又は細胞におけるヒトエンドシアリンの発現を位置決定する工程を含む、正常な発生におけるヒトエンドシアリン機能の役割を試験する方法も提供される。好適な実施形態において、ヌクレオチド配列はレポーター遺伝子又は選択可能なマーカーを含む。
【００１８】
ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれており、疾患表現型を示しているトランスジェニック齧歯動物の細胞におけるヒトエンドシアリンの発現レベルを測定する工程を含む、疾患表現型を支持又は予防する際のヒトエンドシアリンの役割を試験する方法が提供される。好適な実施形態において表現型は癌である。一部の好適な実施形態において、表現型は炎症性疾患である。更に好適な実施形態において、表現型は眼疾患である。なお更に好適な実施形態において、表現型は低下した創傷治癒である。
【００１９】
ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物に腫瘍を移植する工程と、齧歯動物の細胞におけるヒトエンドシアリンの発現レベルを測定する工程とを含む、異形成表現型を支持又は予防する際のヒトエンドシアリンの役割を試験する方法が提供される。
【００２０】
また、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物に腫瘍を移植する工程と、齧歯動物の細胞におけるヒトエンドシアリンの発現を位置決定する工程とを含む、異形成表現型を支持又は予防する際のヒトエンドシアリンの役割を試験する方法も提供される。好適な実施形態において、ヌクレオチド配列はレポーター遺伝子又は選択可能なマーカーを含む。
【００２１】
ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物及び免疫不全齧歯動物の子孫に腫瘍を移植する工程と、子孫の細胞におけるヒトエンドシアリンの発現レベルを測定する工程とを含む、異形成表現型を支持又は予防する際のヒトエンドシアリンの役割を試験する方法が提供される。好適な実施形態において、ヌクレオチド配列はレポーター遺伝子又は選択可能なマーカーを含む。
【００２２】
また、ヒトエンドシアリンについてのターゲティング薬剤を識別するために試験薬理作用剤をスクリーニングする方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物に試験薬理作用剤を投与する工程と、齧歯動物におけるヒトエンドシアリン活性を測定する工程と、該ヒトエンドシアリン活性を対照と比較する工程とを含む、上記方法も提供される。対照と比較したヒトエンドシアリン活性の増加又は減少はエンドシアリンについてのターゲティング薬剤の指標となり得る。また、ヒトエンドシアリンについての薬剤を検証する方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物に薬剤を投与する工程と、齧歯動物におけるヒトエンドシアリン活性を測定する工程と、該ヒトエンドシアリン活性を対照と比較する工程とを含む、上記方法も提供される。対照と比較したヒトエンドシアリン活性の増加又は減少により、エンドシアリンについての薬剤を検証できる。本明細書に記載されている方法の好適な実施形態において、ターゲティング薬剤は抗体又はその抗原結合断片である。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。一部の好適な実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリン活性を刺激できる。更に好適な実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリン活性を抑制できる。なお更に好適な実施形態において、ターゲティング薬剤はエンドシアリン結合タンパク質である。一部の実施形態において、結合タンパク質はヒトエンドシアリン活性を刺激できる。一部の実施形態において、結合タンパク質はヒトエンドシアリン活性を抑制できる。一部の実施形態において、結合タンパク質はヒトエンドシアリン活性を刺激するか又は抑制する薬剤に結合する。一部の好適な実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンｍＲＮＡに相補的に結合できる核酸である。一部の好適な実施形態において、薬剤は小化学分子である。一部の実施形態において、試験薬剤は検出可能な標識に結合する。例示的な検出可能な標識には、限定されないが、化学発光化合物（例えばアクリジニウムエステル化合物）、リン光化合物、蛍光化合物、放射性標識、ビオチン又は酵素が含まれる。
【００２３】
更に、ヒトエンドシアリンについてのターゲティング薬剤を識別するために試験薬理作用剤をスクリーニングする方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物の細胞と試験薬理作用剤とを接触させる工程と、細胞におけるヒトエンドシアリン活性を測定する工程と、該ヒトエンドシアリン活性を対照と比較する工程とを含む、上記方法が提供される。対照と比較したヒトエンドシアリン活性の増加又は減少はエンドシアリンについてのターゲティング薬剤の指標となり得る。また、ヒトエンドシアリンについての薬剤を検証する方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物の細胞と薬剤とを接触させる工程と、細胞におけるヒトエンドシアリン活性を測定する工程と、該ヒトエンドシアリン活性を対照と比較する工程とを含む、上記方法も提供される。対照と比較したヒトエンドシアリン活性の増加又は減少により、エンドシアリンについての薬剤を検証できる。本明細書に記載されている方法の好適な実施形態において、ターゲティング薬剤は抗体又はその抗原結合断片である。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。一部の好適な実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリン活性を刺激できる。更に好適な実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリン活性を抑制できる。なお更に好適な実施形態において、ターゲティング薬剤はエンドシアリン結合タンパク質である。一部の実施形態において、結合タンパク質はヒトエンドシアリン活性を刺激できる。一部の実施形態において、結合タンパク質はヒトエンドシアリン活性を抑制できる。一部の好適な実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンｍＲＮＡに相補的に結合できる核酸である。一部の好適な実施形態において、薬剤は小化学分子である。一部の実施形態において、試験薬剤は検出可能な標識に結合する。例示的な検出可能な標識には、限定されないが、化学発光化合物（例えばアクリジニウムエステル化合物）、リン光化合物、蛍光化合物、放射性標識、ビオチン又は酵素が含まれる。
【００２４】
ヒトエンドシアリンについてのターゲティング薬剤を識別するために試験薬理作用剤をスクリーニングする方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物に試験薬理作用剤を投与する工程と、齧歯動物のエンドシアリン発現細胞においてヒトＰＤＧＦレセプター経路活性を測定する工程と、ヒトＰＤＧＦレセプター経路活性を対照と比較する工程とを含む、上記方法が提供される。一部の好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリン発現細胞においてＰＤＧＦレセプター経路を刺激する。一部の好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリン発現細胞においてＰＤＧＦレセプター経路を抑制する。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。
【００２５】
ヒトエンドシアリンについてのターゲティング薬剤を識別するために試験薬理作用剤をスクリーニングする方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物の細胞と試験薬理作用剤とを接触させる工程と、細胞におけるヒトＰＤＧＦレセプター経路活性を測定する工程と、ヒトＰＤＧＦレセプター経路活性を対照と比較する工程とを含む、上記方法が提供される。一部の好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリン発現細胞においてＰＤＧＦレセプター経路を刺激する。一部の好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリン発現細胞においてＰＤＧＦレセプター経路を抑制する。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。
【００２６】
また、疾患を抑制できる試験薬剤をスクリーニングする方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれており、疾患を示しているトランスジェニック齧歯動物に試験薬剤を投与する工程と、トランスジェニック齧歯動物における疾患の存在を測定する工程と、トランスジェニック齧歯動物における疾患の存在を対照と比較する工程とを含む、上記方法も提供される。対照と比較した疾患の減少は疾患を抑制できる薬剤の指標となり得る。また、疾患を抑制できる薬剤を検証する方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれており、疾患を示しているトランスジェニック齧歯動物に薬剤を投与する工程と、トランスジェニック齧歯動物における疾患の存在を測定する工程と、トランスジェニック齧歯動物における疾患の存在を対照と比較する工程とを含む、上記方法も提供される。対照と比較した疾患の減少により、薬剤が疾患を抑制できることが検証できる。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。好適な実施形態において、疾患は癌である。他の好適な実施形態において、疾患は炎症性疾患である。更に好適な実施形態において、疾患は眼疾患である。なお更に好適な実施形態において、疾患は低下した創傷治癒である。
【００２７】
更に、疾患を抑制できる試験薬剤をスクリーニングする方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれており、疾患を示しているトランスジェニック齧歯動物の細胞と試験薬剤とを接触させる工程と、細胞における疾患の存在を測定する工程と、細胞における疾患の存在を対照と比較する工程とを含む、上記方法が提供される。対照と比較した疾患の減少は疾患を抑制できる薬剤の指標となり得る。また、疾患を抑制できる薬剤を検証する方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物の、疾患を示している細胞と薬剤とを接触させる工程と、細胞における疾患の存在を測定する工程と、細胞における疾患の存在を対照と比較する工程とを含む、上記方法も提供される。対照と比較した疾患の減少により、薬剤が疾患を抑制できることを検証できる。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。好適な実施形態において、疾患は癌である。他の好適な実施形態において、疾患は炎症性疾患である。更に好適な実施形態において、疾患は眼疾患である。なお更に好適な実施形態において、疾患は低下した創傷治癒である。また、任意選択にトランスジェニック齧歯動物に移植され得る腫瘍も提供される。また、任意選択に転移癌を有するトランスジェニック齧歯動物も提供される。
【００２８】
腫瘍成長を抑制できる試験薬剤をスクリーニングする方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物に腫瘍を移植する工程と、トランスジェニック齧歯動物に試験薬剤を投与する工程と、トランスジェニック齧歯動物における腫瘍成長を測定する工程と、トランスジェニック齧歯動物における腫瘍成長を対照と比較する工程とを含む、上記方法が提供される。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。
【００２９】
腫瘍成長を抑制できる試験薬剤をスクリーニングする方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物及び免疫不全齧歯動物の子孫に腫瘍を移植する工程と、トランスジェニック齧歯動物に試験薬剤を投与する工程と、トランスジェニック齧歯動物における腫瘍成長を測定する工程と、トランスジェニック齧歯動物における腫瘍成長を対照と比較する工程とを含む、上記方法が提供される。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。
【００３０】
また、腫瘍成長を抑制できる試験薬剤をスクリーニングする方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物に腫瘍を移植する工程と、トランスジェニック齧歯動物に試験薬剤を投与する工程と、トランスジェニック齧歯動物において腫瘍細胞を位置決定する工程と、トランスジェニック齧歯動物における腫瘍細胞の位置決定を対照と比較する工程とを含む、上記方法も提供される。好適な実施形態において、ヌクレオチド配列はレポーター遺伝子を含む。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。
【００３１】
腫瘍成長を抑制できる試験薬剤をスクリーニングする方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物及び免疫不全齧歯動物の子孫に腫瘍を移植する工程と、トランスジェニック子孫齧歯動物に試験薬剤を投与する工程と、トランスジェニック子孫齧歯動物において腫瘍細胞を位置決定する工程と、トランスジェニック子孫齧歯動物における腫瘍細胞の位置決定を対照と比較する工程とを含む、上記方法が提供される。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。
【００３２】
また、疾患を治療する際の薬剤、例えば上記のスクリーニング方法のいずれかにより識別された薬剤の最適用量を決定する方法であって、異なる用量でトランスジェニック齧歯動物に薬剤を投与する工程と、トランスジェニック齧歯動物における疾患の存在を測定する工程と、トランスジェニック齧歯動物における疾患を抑制する薬剤の用量を決定する工程とを含む、上記方法も提供する。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。
【００３３】
疾患を治療する際の抗エンドシアリン抗体又はその抗原結合断片の最適用量を決定する方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物に抗体又はその抗原結合断片を異なる用量で投与する工程と、トランスジェニック齧歯動物における疾患の存在を測定する工程と、トランスジェニック齧歯動物における疾患を抑制する薬剤の用量を決定する工程とを含む、上記方法が提供される。好適な実施形態において、疾患は癌、炎症性疾患、眼疾患又は低下した創傷治癒である。
【００３４】
齧歯動物エンドシアリン遺伝子座に内在しているゲノム領域間にクローニングされたヒトエンドシアリンオープンリーディングフレームを含むベクターが提供される。
【００３５】
また、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物から単離された細胞も提供される。好適な実施形態において、細胞は正常組織から単離される。他の好適な実施形態において、細胞は悪性組織から単離される。更に好適な実施形態において、細胞は炎症組織から単離される。なお更に好適な実施形態において、細胞は罹患した眼から単離される。
【００３６】
ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物から単離された細胞を用いて遺伝子発現をスクリーニングする方法であって、細胞における発現プロファイルを測定する工程を含む上記方法が提供される。一部の実施形態において、遺伝子発現は試験薬剤の投与前、投与と同時及び／又は投与後に測定される。好適な実施形態において、発現プロファイルは細胞の単離直後に測定される。一部の好適な実施形態において、発現プロファイルは刺激剤又は栄養素の存在下で細胞を培養した後に測定される。更に好適な実施形態において、発現プロファイルは試験薬剤での治療後に測定される。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。一部の好適な実施形態において、細胞はＲＮＡプロファイルについて分析される。更に好適な実施形態において、細胞はｃＤＮＡプロファイルについて分析される。なお更に好適な実施形態において、細胞はタンパク質プロファイルについて分析される。
【００３７】
エンドシアリン発現細胞の成長及び／又は分化を阻害する試験薬剤をスクリーニングする方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物から単離された細胞に試験薬剤を投与する工程と、細胞の成長及び／又は分化を測定する工程と、該成長及び／又は分化を対照の未処理の細胞と比較する工程とを含み、該細胞の成長及び／又は分化のレベルが対照の未処理の細胞の成長及び／又は分化のレベルより低い場合、試験薬剤は該細胞の成長及び／又は分化を阻害する、上記方法が提供される。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。
【００３８】
また、エンドシアリン発現細胞の成長及び／又は分化を刺激する試験薬剤をスクリーニングする方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物から単離された細胞に試験薬剤を投与する工程と、細胞の成長及び／又は分化を測定する工程と、該成長及び／又は分化を対照の未処理の細胞と比較する工程とを含み、細胞の成長及び／又は分化のレベルが対照の未処理の細胞の成長及び／又は分化のレベルより高い場合、試験薬剤は該細胞の成長及び／又は分化を刺激する、上記方法も提供される。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。
【００３９】
エンドシアリン発現細胞の正常な生物活性を阻害する試験薬剤をスクリーニングする方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物から単離された細胞に試験薬剤を投与する工程と、細胞の生物活性を測定する工程と、該生物活性を対照の未処理の細胞と比較する工程とを含み、細胞の生物活性のレベルが対照の未処理の細胞の生物のレベルより低い場合、試験薬剤は該細胞の生物活性を阻害する、上記方法が提供される。一部の実施形態において、細胞の生物活性は、コラーゲンＣｏｌ  Ｉ、Ｃｏｌ  ＩＶ又はフィブロネクチンとのエンドシアリンの結合を含む。一部の実施形態において、細胞の生物活性は細胞外マトリクスとの細胞接着を含む。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。
【００４０】
上記の方法の好適な実施形態において、薬剤は抗体である。更に好適な実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。一部の好適な実施形態において、抗体はポリクローナル抗体である。一部の好適な実施形態において、抗体は、抗体の抗原結合断片である。更に好適な実施形態において、抗体はヒトエンドシアリンと結合できる１〜６個のＣＤＲを含有する。
【００４１】
上記の方法の好適な実施形態において、薬剤はタンパク質である。更に好適な実施形態において、タンパク質は完全長タンパク質である。一部の好適な実施形態において、タンパク質はペプチドである。一部の好適な実施形態において、タンパク質は模倣剤である。
【００４２】
上記の方法の好適な実施形態において、薬剤は化学物質である。更に好適な実施形態において、化学物質はエンドシアリン遺伝子発現を刺激する。一部の好適な実施形態において、化学物質はエンドシアリン遺伝子発現を抑制する。一部の好適な実施形態において、化学物質はエンドシアリンタンパク質機能を抑制する。更に好適な実施形態において、化学物質はエンドシアリンタンパク質機能を刺激する。
【００４３】
上記の３つの方法の好適な実施形態において、薬剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。更に好適な実施形態において、薬剤はＲＮＡｉ分子である。
【００４４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトエンドシアリン発現細胞を検出するための薬剤を試験する方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物に薬剤を投与する工程と、薬剤によるトランスジェニック齧歯動物におけるヒトエンドシアリン発現細胞の検出レベルを測定する工程と、薬剤によるトランスジェニック齧歯動物におけるヒトエンドシアリン発現細胞の検出レベルを、対照によるトランスジェニック齧歯動物におけるヒトエンドシアリン発現細胞の検出レベルと比較する工程とを含む、上記方法が提供される。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。
【００４５】
ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞においてヒトエンドシアリン発現を調節する薬剤を試験する方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物の細胞におけるヒトエンドシアリンの発現を測定する工程と、トランスジェニック齧歯動物に薬剤を投与する工程と、薬剤の投与後にトランスジェニック齧歯動物の細胞におけるヒトエンドシアリンの発現を測定する工程と、薬剤の投与後のトランスジェニック齧歯動物の細胞におけるヒトエンドシアリンの発現レベルを、薬剤の投与前のトランスジェニック齧歯動物の細胞におけるヒトエンドシアリンの発現レベルと比較する工程とを含む、上記方法が提供される。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。
【００４６】
また、腫瘍成長を阻害する試験薬剤をスクリーニングする方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物に腫瘍を移植する工程と、トランスジェニック齧歯動物に試験薬剤又は対照薬剤を投与する工程と、トランスジェニック齧歯動物における腫瘍成長を測定する工程と、試験薬剤を用いて投与したトランスジェニック齧歯動物における腫瘍成長を、対照薬剤を用いて投与したトランスジェニック齧歯動物における腫瘍成長と比較する工程とを含み、試験薬剤を用いて投与されたトランスジェニック齧歯動物における腫瘍成長が、対照薬剤を用いて投与されたトランスジェニック齧歯動物における腫瘍成長と比較して減少する場合、試験薬剤は腫瘍成長を阻害する薬剤として選択される、上記方法も提供される。好適な実施形態において、腫瘍はトランスジェニック齧歯動物に対して同系である。一部の好適な実施形態において、腫瘍はトランスジェニック齧歯動物に対して同種又は異種である。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。
【００４７】
また、腫瘍転移を阻害する試験薬剤をスクリーニングする方法であって、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列がゲノム中に組み込まれているトランスジェニック齧歯動物内に腫瘍細胞を導入する工程と、トランスジェニック齧歯動物に試験薬剤又は対照薬剤を投与する工程と、トランスジェニック齧歯動物における腫瘍転移を測定する工程と、試験薬剤を用いて投与したトランスジェニック齧歯動物における腫瘍転移を、対照薬剤を用いて投与したトランスジェニック齧歯動物における腫瘍転移と比較する工程とを含み、試験薬剤を用いて投与したトランスジェニック齧歯動物における腫瘍転移が対照薬剤を用いて投与したトランスジェニック齧歯動物における腫瘍転移と比較して減少する場合、試験薬剤は腫瘍転移を阻害する薬剤として選択される、上記方法も提供される。好適な実施形態において、腫瘍転移は、肺ｍｅｔモデルを利用する肺ｍｅｔ細胞の生物発光をｉｎ  ｖｉｖｏで定量することにより測定される。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤はエンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。
【００４８】
本発明はまた、これらの齧歯動物内でのヒトエンドシアリンの発現及び／又はタンパク質機能に正又は負の影響を与えることができる薬剤を識別するために本明細書に記載されている齧歯動物を使用する方法も提供する。
【００４９】
本発明は更に、これらの齧歯動物内での所与のヒトエンドシアリン生物活性を刺激又は抑制するためにそれらの曝露を最大化するための薬剤の使用を最適化するためにＨＵＥ齧歯動物を使用する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ヒトエンドシアリンを発現するＨＵＥマウス及びヒトエンドシアリンターゲティングベクターの生成の開発スキームを例示する。ヒトエンドシアリンオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号３）を含有する２２７４ｂｐ断片を、マウスエンドシアリン遺伝子（配列番号１）を含有する断片にクローニングし、次いでマウスエンドシアリン遺伝子機能を破壊する。この断片をマウス胚幹細胞内に導入し、ネオマイシン選択を使用して組込みのために選択した。選択したクローンをスクリーニングしてマウスエンドシアリン遺伝子座内に構築物を組み込んだものを識別した。マウス内因性エンドシアリン座内にターゲティング構築物を含有するクローンを増殖させ、マウス胚盤胞内に導入し、偽妊娠のレシピエントマウス内に移植した。マウスの尾クリッピングを使用してＰＣＲによりターゲティング構築物についてマウスの子をスクリーニングした。次いでそれらの陽性を成長させ、Ｃ５７ＢＬ／６系のマウスに戻し交配した。次いでヘテロ接合体を再び交配してＨＵＥ、ホモ接合性マウスエンドシアリンゼロ／ヒトエンドシアリン機能的マウスを生成した。
【００５１】
【図２】ＨＵＥマウス内のヒトエンドシアリンの発現を示す。ヒト周皮細胞及び肺組織においてヒトエンドシアリンの発現をＨＵＥマウスから誘導した。ＨＵＥマウス又は親野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、未処置のマウス又は肺転移癌を有するマウスによる癌試験から得られたマウス由来の肺組織について採取した。ヒト末梢血から周皮細胞を得た。細胞又は組織からタンパク質を抽出し、抗ヒトエンドシアリン抗体（ＭＯＲＡｂ−００４）又は対照抗体（−００９）を使用して、標準的なＩＰ法を使用してタンパク質を免疫沈降（ＩＰ）した。次いでＩＰ分取物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流し、ヒトエンドシアリンを認識できるウサギＲｂｔ−ＴＥＭ−１−５５−２抗体を使用してウェスタンブロットをした。示したように、ＨＵＥマウスは、陰性であった対照親マウスと対照的にヒトエンドシアリンタンパク質について陽性であった。
【００５２】
【図３】皮下腫瘍モデルにおいてヒトエンドシアリン薬剤の活性を試験する際のマウスの有用性を示す。分析的マウスを使用して、ＳＣモデルにおいてエンドシアリン機能に影響を与え得る薬剤を識別した。皮下に移植した腫瘍細胞を有するようにＨＵＥマウスを生成した。腫瘍が成長し始めると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで結合し、ヒトエンドシアリン活性を抑制できる５０ｍｇ／ｋｇの抗体を用いてマウスを５日間処置した（Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚら（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ１０４：１７９６５−１７９７０）。次いでマウスをスクリーニングし、１７日間腫瘍を測定した。示したように、対照（ＣＴ）ヒトＩｇＧではなく、抗ヒトエンドシアリン抗体で処置したＨＵＥマウスは、野生型Ｃ５７（ｗｔＣ５７）マウスと比較して低い腫瘍成長を有した。
【００５３】
【図４】肺転移癌モデルにおいてヒトエンドシアリン薬剤の活性を試験する際のＨＵＥマウスの有用性を示す。分析的マウスを使用して、肺ｍｅｔモデルにおいてエンドシアリン機能に影響を与え得る薬剤を識別した。ルシフェラーゼ遺伝子を形質導入したＬｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）細胞をＨＵＥにｉ．ｖ．で注射した。腫瘍細胞移植の前日に開始して、移植後の３、５、７及び１０日目に５０ｍｇ／ｋｇのＦＢ５若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで結合でき、ヒトエンドシアリン活性を抑制できるＭＯＲＡｂ−００４（Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚら（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ１０４：１７９６５−１７９７０）又はＰＢＳ対照を用いてマウスを一日おきに５日間処置した。肺における転移性疾患の大きさを、１４日まで一週間に３回、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物発光画像法により定量した。いずれかの抗ヒトエンドシアリン抗体を用いて処置したマウスは、ビヒクルで処置したマウスと比較して低い転移性疾患を示した。ＭＡｂ  ｔｘ＝抗体処置レジメンを赤色の矢印で示す。＊＝Ｐ＜０．０５。
【００５４】
【図５】抗エンドシアリンで処置した腫瘍対対照で処置した腫瘍における微小血管密度の減少を実証するマイクロ−ＣＴ分析を示す。ＰＢＳで処置した腫瘍対照において、腫瘍体積は２０３９ｍｍ３であるのに対して、ＭＯＲＡｂ−００４で処置した腫瘍の腫瘍体積は６３７ｍｍ３である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本明細書中で参照されているＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列に対する受託番号を含む、参考研究、特許、特許出願書類、及び科学文献は、当業者の知識を確立するものであり、各々が具体的且つ個別に参照として組み込まれていることを示すのと同程度まで、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。本明細書に引用されている参照と本明細書の特定の教示の間に不一致があった場合、本明細書の特定の教示を優先して解決されるものとする。同様に、当業者に理解される単語又は表現の定義と、本明細書で具体的に教示されている単語又は表現の定義との間に不一致があった場合、本明細書の単語又は表現を優先して解決されるものとする。
【００５６】
当業者に公知の組換えＤＮＡ技術に関する一般的原理を示した標準的な参照研究には、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、２Ｄ  ＥＤ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｋａｕｆｍａｎら、Ｅｄｓ．、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（１９９５）、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｅｄ．、ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）が含まれる。
【００５７】
本明細書において、内因性エンドシアリン遺伝子が機能しない、ヒトエンドシアリンを発現する齧歯動物、好適にはマウスを生成する方法が提供される。ＨＵＥ齧歯動物と称されるヒトエンドシアリン齧歯動物が、動物モデルにおけるヒトエンドシアリンの機能を試験するため、及びヒトエンドシアリン生物学的機能に影響を与え得る薬剤を開発するために使用され得る。この方法は、正常なエンドシアリン生理に対する薬剤の効果、又はエンドシアリン経路に関与する疾患モデルにおける薬剤の効果を試験するために使用され得る。
【００５８】
作用のいかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、ヒトエンドシアリン陽性細胞（ＨＥＰＣ）は、癌、炎症及び眼科疾患などの新血管形成及び新生血管疾患に関連する血管の形成に関与する細胞についての前駆体であると考えられる。したがって、ＨＵＥ齧歯動物は、新生血管関連疾患におけるエンドシアリンの役割を試験するためにヒトエンドシアリンタンパク質又はｍＲＮＡに結合できる薬剤の効果を試験するのに有用であり得る。よって、ＨＵＥ齧歯動物は、癌及び非悪性病理などの新生血管疾患を治療するためのヒトエンドシアリンターゲティング薬剤を識別し、開発するための理想的な動物モデルとして役立つ。反対に、ＨＵＥ齧歯動物は、創傷治癒を促進するためのヒトエンドシアリンターゲティング薬剤を識別するための理想的な動物として役立つ。ＨＵＥ齧歯動物はまた、ヒトエンドシアリンｍＲＮＡ又は抗体、エンドシアリン結合タンパク質、ワクチン、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド及び／又は阻害マイクロＲＮＡを含む核酸ベースの薬剤、並びにウイルスベースの遺伝子治療剤を含むタンパク質に結合できる活性薬理作用剤をスクリーニングするのに有用である。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「薬剤」又は「ターゲティング薬剤」という用語は、限定されないが、小化学物質、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アゴニスト、天然リガンド、抗体、抗体の抗原結合断片、エンドシアリン結合タンパク質、ワクチン及びエンドシアリン発現全細胞ワクチンを含む、ヒトエンドシアリンの活性を阻害又は刺激するために使用できる任意の分子を指す。「ターゲティング薬剤」又は「薬剤」という用語は、ヒトエンドシアリンの活性を刺激又は阻害する分子に結合するヒトエンドシアリンに結合する任意の分子を含む。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「エンドシアリン陽性細胞」（ＥＰＣ）又は「エンドシアリン発現細胞」という用語は、エンドシアリンを発現する細胞を指す。一部の場合、ＥＰＣは、このような細胞のエンドシアリン又はエンドシアリン発現子孫に結合できる抗体又は結合タンパク質を使用して、一次組織又は内皮細胞から、例えば本明細書に記載しているＨＵＥ齧歯動物から単離される。ＥＰＣは血管を形成する能力を有し得る。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「成長の阻害」という用語は、培養物中の細胞数の約５％、好適には１０％、より好適には２０％、より好適には３０％、より好適には４０％、より好適には５０％、より好適には６０％、より好適には７０％、より好適には８０％、より好適には９０％、最も好適には１００％の減少を意味する。細胞成長のｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害は当該技術分野において公知のアッセイにより測定できる。例えば、「成長の阻害」は、試験薬剤と接触したＨＵＥ齧歯動物における腫瘍成長が、試験薬剤の非存在下での腫瘍成長と比較して低下する場合を指すために使用され得る。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「成長の刺激」という用語は、培養物中の細胞数の約５％、好適には１０％、より好適には２０％、より好適には３０％、より好適には４０％、より好適には５０％、より好適には６０％、より好適には７０％、より好適には８０％、より好適には９０％、最も好適には１００％の増加を意味する。細胞成長のｉｎ  ｖｉｖｏでの刺激は当該技術分野において公知のアッセイにより測定できる。例えば、「成長の刺激」は、試験薬剤と接触したＨＵＥ齧歯動物における腫瘍成長が、試験薬剤の非存在下での腫瘍成長と比較して増加する場合を指すために使用され得る。
【００６３】
「分析」という用語は、ＨＵＥ齧歯動物由来のＲＮＡ、タンパク質又は細胞プロファイルを分析することを指す。分析は、限定されないが、マイクロアレイ、ｃＤＮＡライブラリー、ＳＡＧＥ、減算、又はタンパク質アレイなどの差次的発現法などの当業者により使用される任意の方法を使用して実施できる。
【００６４】
「生物学的効果」という用語は状態の阻害又は刺激を指す。生物学的効果は、異常状態の症状の１つ又は複数をある程度まで軽減する。異常状態の治療に関して、生物学的効果は以下のうちの１つ又は複数を指してもよい：（ａ）細胞の増殖、成長及び／又は分化の増加又は減少、（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の成長の阻害（すなわち、遅延又は停止）、（ｃ）細胞死の促進、（ｄ）変性の阻害、（ｅ）異常状態に関連した症状のうちの１つ又は複数のある程度の軽減、並びに（ｆ）細胞集団の機能の増強。本明細書に記載している薬理作用剤及びその誘導体は、単独で、又は本発明の組成物のコンジュゲート若しくは追加成分と併せて生物学的効果をもたらす。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「約」という用語は、許容可能な範囲内の示した値の近似値を指す。好適にはその範囲は示した値の＋／−５％である。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「正常組織」という用語は、哺乳動物の胚、胎児又は成体源由来の非疾患組織を指す。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「疾患組織」という用語は、異形成である哺乳動物の胚、胎児又は成体源由来の組織を指す。組織は、限定されないが、悪性源、眼疾患、又は感染及び／若しくは炎症を有する組織からの疾患に由来してもよい。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「エンドシアリンリガンド」という用語は、細胞表面エンドシアリンに結合できる任意のタンパク質又は生化学物質を指す。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「ターゲティング構築物」又は「ターゲティングベクター」という用語は、センス方向においてクローニングされたヒトエンドシアリンオープンリーディングフレームを含有する組換えＤＮＡ断片を有するベクターを指す。本明細書に記載されている方法によれば、ヒトエンドシアリンをコードするヌクレオチド配列は、天然の齧歯動物エンドシアリン遺伝子を含有するゲノム断片内に組み込まれ、好適には齧歯動物エンドシアリン遺伝子を機能的に破壊する。一部の実施形態において、ターゲティングベクターは、組換え細胞のスクリーニングを容易にするために選択マーカー（例えばネオマイシン選択マーカー）を含有してもよい。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「分析的マウス」又は「分析的齧歯動物」という用語は、細胞表面上のエンドシアリン発現を認識できるか、又は腫瘍成長若しくは転移を阻害できる抗体、その抗原結合断片又は結合タンパク質などの薬剤、すなわち細胞中のヒトエンドシアリンメッセージに結合できるアンチセンスデオキシヌクレオチド又は阻害ＲＮＡなどの薬剤を識別するために使用され得るＨＵＥマウス又は齧歯動物を指し、それらの薬剤は、疾患に関連するエンドシアリン経路に影響を与える能力について試験でき、治療用途又は診断のための薬剤の使用を発見し、最適化し、及び／又は検証するために潜在的に使用できる。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「機能的に破壊されている」という用語は、遺伝子が、遺伝子の正常機能を妨げる、例えば対象産物の遺伝子の発現を妨げる、又は対象産物の正常量の遺伝子の発現を妨げる変異を有することを指す。機能的破壊を引き起こす変異は、内因性遺伝子内にコードされている内因性遺伝子産物のアミノ酸配列を変化させる挿入、欠失又は点変異であってもよい。機能的破壊を引き起こす変異はまた、内因性遺伝子の導入遺伝子との置換（すなわち、「ノックイン」）であってもよい。
【００７２】
「実質的に減少した又は欠損している」という用語は、本質的に検出できない量の正常な内因性遺伝子産物が動物細胞中で産生されることを意味することを意図する。この種の変異はまた、当該技術分野において「ヌル変異」とも称され、このようなヌル変異を保有する動物はまた、「ノックアウト動物」とも称される。この種の変異はまた、内因性遺伝子が導入遺伝子と置換される場合、「ノックイン」と称されてもよい。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「トランスジェニック齧歯動物」という用語は、導入遺伝子を含有する細胞を有する齧歯動物を指し、ここで、該導入遺伝子は、出生前、例えば胚形成期において齧歯動物又は齧歯動物の祖先内に導入された。「導入遺伝子」は、細胞のゲノム中に組み込まれるＤＮＡであり、該細胞からトランスジェニック齧歯動物が発生し、該細胞は成熟動物のゲノム内に残り、それにより、トランスジェニック齧歯動物の１つ又は複数の細胞種類又は組織のコードされた遺伝子産物の発現を指示する。トランスジェニック齧歯動物の種類は、内因性遺伝子が導入遺伝子と置換されている「ノックイン」である。
【００７４】
ヒトエンドシアリンを発現する齧歯動物
ヒトエンドシアリン齧歯動物は、齧歯動物の内因性エンドシアリン遺伝子座からヒトエンドシアリン遺伝子を発現するように操作された齧歯動物である。ＨＵＥ齧歯動物の内因性エンドシアリン遺伝子は好適には、機能的に破壊されているか又は実質的に減少するか若しくは欠損している。したがって、ＨＵＥ齧歯動物は、発生及び／又は疾患に関連する生物学的経路を抑制又は促進する際にヒトエンドシアリンに対して直接効果を有し得る薬剤をスクリーニング、開発及び研究するために使用できる。これらの齧歯動物は、齧歯動物エンドシアリンをコードする遺伝子の機能領域内へのヒト遺伝子の導入によって齧歯動物エンドシアリンが機能的に破壊されているか又は実質的に減少するか若しくは欠損しているという事実を考慮してヒトエンドシアリンの機能を試験するために固有のモデルを提供する。この特徴は、病態又は発生プロセスを支持できる可能性がある齧歯動物エンドシアリンが存在する場合に起こり得るあらゆる可能な冗長性を回避する。ヒトエンドシアリン遺伝子及びインタクトな齧歯動物エンドシアリン遺伝子を含有する従来のトランスジェニックマウスは、病態を支持する際のヒトエンドシアリン遺伝子機能の抑制又は活性化についての薬剤の薬理学的活性を解明するためにヒトエンドシアリンに結合できる薬剤を明確に識別する能力を減少し得る。
【００７５】
好適な実施形態において、齧歯動物はマウスである。本発明の好適なマウスは、種々のマウス系が疾患モデルのために使用されるものである。これらの系には、限定されないが、ＤＢＡ２、Ｃ５７ＢＬ／６及びＳＪ１２３株が含まれる。マウスは内因性マウスエンドシアリンを欠失した状態であるが、機能的ヒトエンドシアリン遺伝子産物を有する。
【００７６】
本明細書に記載されている好適なトランスジェニック齧歯動物は、天然対立遺伝子を有する導入遺伝子の相同的組換えをもたらす隣接配列が隣接したヒトエンドシアリンをコードする配列を含む導入遺伝子を用いてエンドシアリンをコードする標的天然又は内因性対立遺伝子の相同的組換えにより作製され、ここで、ヒトエンドシアリンの発現は天然対立遺伝子の天然遺伝子発現調節配列の制御下にある。好適な実施形態において、天然エンドシアリン対立遺伝子の少なくとも一部は、ヒトエンドシアリン配列と置換される。
【００７７】
ＨＵＥ齧歯動物は、ヒトエンドシアリンを発現し、内因性エンドシアリン遺伝子産物を欠失するように操作される。一部の好適な実施形態において、全エンドシアリンオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするヒト相補的ｃＤＮＡは、齧歯動物エンドシアリン遺伝子座を含有する齧歯動物ゲノム断片内にクローニングされる。ターゲティング構築物は、構築物を取り込む細胞の選択に役立つように選択可能なマーカー（例えばネオマイシン耐性遺伝子）を含有してもよい。次いで得られた構築物を線形化し、齧歯動物胚幹細胞（ＥＳＣ）系内に導入し、遺伝子ノックアウト又はトランスジェニック胚幹（ＥＳ）細胞を生成する当業者に公知の標準的な方法を使用することにより構築物を齧歯動物エンドシアリン遺伝子座中に組み込むためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりスクリーニングする。ターゲティング構築物が内因性齧歯動物エンドシアリン遺伝子座内に組み込まれていることが見出されるクローンを増殖させ、サザンブロットにより更に検証する。クローンを齧歯動物胚盤胞内に注入するために使用し、得られた齧歯動物の子を、ターゲティング構築物を含有するこれらの齧歯動物を識別するために尾クリッピングから抽出したＤＮＡを使用するゲノムＰＣＲ又はサザンブロッティングを含む、当業者に公知の方法を使用してスクリーニングする。次いでこれらのキメラ齧歯動物を成長させ、非トランスジェニック齧歯動物と交配させて、ヘテロ接合体並びに最終的にゼロの齧歯動物エンドシアリン及び機能的ヒトエンドシアリン発現を含有するホモ接合体齧歯動物を生成する。
【００７８】
また、単離した遺伝的ノックイン細胞も提供される。一部の実施形態において、単離したノックイン細胞は、上記のノックイン齧歯動物から得た遺伝的ノックイン一次細胞である。一部の実施形態において、単離したノックイン細胞は、上記のノックイン齧歯動物から得た遺伝的ノックイン一次細胞と遺伝的に同一であるか、クローンであるか、又は好適には子孫である。
【００７９】
抗体、結合タンパク質、核酸薬剤
本発明の抗体及び結合タンパク質は、ＨＵＥ齧歯動物内又はそれらに由来する細胞表面上でエンドシアリンに特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体及びタンパク質は正常組織内でヒトエンドシアリンを発現する細胞に結合する。他の実施形態において、抗体及びタンパク質は疾患組織内の細胞に結合する。更に他の実施形態において、抗体及びタンパク質はＨＵＥ齧歯動物由来の一次培養物中の細胞に結合する。一部の実施形態において、抗体又は結合タンパク質は、ヒトエンドシアリンを阻害若しくは刺激する分子又は検出可能な標識に結合する。
【００８０】
本発明の方法における使用に適切な好適な抗体又はその抗原結合断片及びタンパク質には、例えば、組織又は培養物から細胞を単離できる、全ヒト抗体、ヒト抗体ホモログ、ヒト化抗体ホモログ、キメラ抗体ホモログ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ｖ）抗体断片、一本鎖抗体及び抗体重鎖若しくは軽鎖の単量体若しくは二量体、エンドシアリンリガンド又はそれらの混合物が含まれる。
【００８１】
抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型（同様にそれらのサブタイプ）を含む任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリンを含んでもよい。免疫グロブリンの軽鎖はカッパ又はラムダであってもよい。
【００８２】
抗体の抗体結合断片は、抗原結合特異性、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ｖ）断片、重鎖単量体又は二量体、軽鎖単量体又は二量体、一本の重鎖及び一本の軽鎖を含む二量体などを保有するインタクトな抗体の部分を含む。よって、抗原結合断片及び上記の抗体由来の全長二量体又は三量体ポリペプチドはそれ自体で有用である。
【００８３】
抗体、抗原結合断片、又はエンドシアリン結合タンパク質は、単独で、又はコンジュゲートとして使用されてもよい。抗体及び結合タンパク質のコンジュゲーションは文献において周知である。
【００８４】
抗体及びその抗原結合断片は、例えば、共有結合により抗体がそのエピトープに結合することを防がないように、任意の種類の分子の抗体への共有結合により修飾される誘導体を含む。適切な誘導体の例には、限定されないが、グリコシル化抗体及び断片、アセチル化抗体及び断片、ペグ化抗体及び断片、リン酸化抗体及び断片、並びにアミド化抗体及び断片が含まれる。本発明の抗体及びその誘導体は、それ自体、公知の保護／遮断基、タンパク質分解的切断、細胞リガンド又は他のタンパク質との連結などにより誘導体化されてもよい。更に、本発明の抗体及びその誘導体は１つ又は複数の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
【００８５】
哺乳動物細胞宿主の末梢血由来のものなどのポリクローナル抗体もまた、使用されてもよい。そのような細胞は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトエンドシアリンに結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞を形成するために骨髄腫細胞と融合されてもよい。
【００８６】
作用のいかなる特定の理論にも束縛されることを望まずに、抗体又はその抗原結合断片は、抗体又はその抗原結合断片の細胞外エピトープとの結合に起因してＨＵＥ齧歯動物内でエンドシアリン発現組織及び細胞と結合するのに特に有用であると考えられる。これにより、抗体の解離（Ｋｄ）の減少が導かれる。これは、組織又は組織培養物から単離するための細胞をターゲティングするのに特に良好な特徴である。
【００８７】
ヒトエンドシアリンに結合する抗体を記載している米国特許公開第２００８−０２４８０３４号は本明細書に参照として組み込まれる。一部の実施形態において、薬剤はヒトエンドシアリンに結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適な実施形態において、薬剤は、エンドシアリンに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。好適には、抗体又は抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。最も好適には、薬剤は、それぞれ配列番号５、６及び７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖並びにそれぞれ配列番号８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を含むヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。一実施形態において、薬剤はＭＯＲＡｂ−００４（Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）である。
【化１】
2013543379.tif 000003
【００８８】
本発明の核酸薬剤は、ヒトエンドシアリンのｉｎ  ｖｉｖｏでの発現を阻害又は抑制するために静脈内、筋肉内、噴霧、局所又は経口経路により投与され得るものである。核酸には、アンチセンスデオキシヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ並びにそれらの誘導体が含まれる。しかしながら、使用を限定することを望まずに、ｉｎ  ｖｉｖｏで作用する核酸薬剤の開発はｉｎ  ｖｉｔｒｏベースのシステムを使用して明らかにされていない。したがって、核酸薬剤をスクリーニングするためのＨＵＥ齧歯動物の使用により、潜在的な薬理学的用途についての薬剤の開発が可能となる。核酸薬剤は、単独で、又はコンジュゲートとして使用されてもよい。核酸のコンジュゲーションは文献において周知である。
【００８９】
核酸スクリーニングは陽性の正常又は疾患組織においてヒトエンドシアリン発現を抑制する際の薬剤の効果を含み、分析は、曝露されたＨＵＥ齧歯動物由来の定常状態ｍＲＮＡ、タンパク質及び／又はエンドシアリン発現細胞を測定することで行われる。
【００９０】
本発明の分析的齧歯動物は、限定されないが、癌、炎症又は眼科疾患などの病態を示すように準備される齧歯動物を含み、ヒトエンドシアリン薬剤がそれらの病態を変化させることについて試験できる。反対に、分析的齧歯動物は、限定されないが、創傷治癒などの欠損した又は最適以下のエンドシアリン活性が存在するモデルにおいて使用でき、ヒトエンドシアリン活性により欠損した生物学的プロセスを刺激できるものを識別するために薬剤をスクリーニングできる。
【００９１】
本発明はまた、疾患の存在又は非存在をスクリーニングするための診断プローブとして使用できる薬剤を識別するためにＨＵＥ齧歯動物の使用を包含する。診断プローブは、限定されないが、ヒトエンドシアリン遺伝子産物に対するモノクローナル抗体、結合タンパク質及び標識した相補的核酸を含む、当業者により使用される分子的実態を含む。
【００９２】
ＨＵＥ齧歯動物を用いてヒトエンドシアリン結合薬剤をスクリーニングする方法
抗体又は結合タンパク質特異性についてのスクリーニング
ＨＵＥ齧歯動物又はそれら由来の細胞、組織又は流体内でヒトエンドシアリンを発現する細胞又は組織に特異的に結合する抗体、抗原結合断片又はエンドシアリン結合タンパク質についてのスクリーニングは、当該技術分野において公知の免疫学的検定技術、例えばエンドシアリンを発現する組織又は細胞における免疫組織化学（ＩＨＣ）又は免疫細胞化学（ＩＣＣ）を使用して成し遂げることができる。反対に、抗体、抗原結合断片又はエンドシアリン結合タンパク質は、検出可能な標識（例えば放射性同位体、発色蛍光色素、化学発光化合物、リン光化合物、ビオチン又は酵素）で標識されてもよく、例えばＨＵＥ齧歯動物又はその組織内のｉｎ  ｖｉｖｏでの画像化においてエンドシアリン発現細胞の検出に使用されてもよい。分析的マウスから識別された陽性の結合抗体又は結合タンパク質は、ＨＵＥ齧歯動物の組織由来のヒトエンドシアリン発現細胞に結合できる薬剤を識別するために細胞ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいて反応性について更にスクリーニングできる。ヒトエンドシアリンに反応性のある抗体又は結合タンパク質を産生するクローンが更なる増殖及び発生のために選択される。
【００９３】
本発明の抗体、その誘導体及び結合タンパク質は、１×１０−２未満の解離定数（Ｋｄ）を含む結合親和性を有する。一部の実施形態において、Ｋｄは１×１０−３未満である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−４未満である。一部の実施形態において、Ｋｄは１×１０−５未満である。更に他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−６未満である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−７未満である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−８未満である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−９未満である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−１０未満である。更に他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−１１未満である。一部の実施形態において、Ｋｄは１×１０−１２未満である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−１３未満である。他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−１４未満である。更に他の実施形態において、Ｋｄは１×１０−１５未満である。
【００９４】
活性薬剤についてスクリーニングするためにＨＵＥ齧歯動物を利用する方法
本発明の方法は疾患及び非疾患状態における使用に適切である。
【００９５】
本発明は、正常組織と比較して疾患組織におけるヒトエンドシアリンの高い発現により特徴付けられる異形成障害を示すＨＵＥ齧歯動物における薬剤のスクリーニングに適切である。抗ヒトエンドシアリン活性について試験され得る悪性組織には、限定されないが、卵巣腫瘍、腎腫瘍、大腸腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍、卵管腫瘍、子宮腫瘍、及び脳腫瘍が含まれる。限定されないが、関節炎組織又は炎症を起こした気道由来の組織を含む、炎症の影響を受けている組織も試験されてもよい。マウスにおける抗エンドシアリン活性について、眼組織も試験されてもよい。反対に、向上したエンドシアリン活性から恩恵を受け得る病態が、エンドシアリン生物活性を向上させる活性薬剤についてスクリーニングするために使用されてもよい。それらは、エンドシアリンリガンドアゴニストとして作用する薬剤及びその内因性活性（単数又は複数）を向上させるためにエンドシアリンタンパク質構造を修飾する薬剤であってもよい。最近、エンドシアリン経路が、新血管形成に関連する生物活性を促進するために血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプター経路によりクロストークすることが実証されている（Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚ，Ｂ．ら（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：１−８）。ＰＤＧＦレセプター経路の活性を促進できるエンドシアリン結合薬剤は、創傷治癒及び他の関連障害に対して利益を与えることができる。
【００９６】
エンドシアリン結合タンパク質並びに抗エンドシアリン抗体及びその抗原結合断片が、ＨＵＥ齧歯動物における薬理活性を試験するために使用されてもよい。それらの活性には、治療活性を最大化すること及び／又は毒性試験において薬剤の効果を試験することが含まれる。抗エンドシアリン抗体及び抗原結合断片が、抗エンドシアリン活性を最大化するための投薬効果及び薬物濃度を試験するために使用されてもよい。
【００９７】
本発明はまた、ＨＵＥ齧歯動物を使用して疾患を抑制できる薬剤をスクリーニングするのに適切である。これらの薬剤は、エンドシアリンタンパク質を調節する血管新生阻害分子を含んでもよい。この方法は、腫瘍を保有するＨＵＥ齧歯動物を試験分子と接触させる工程と、腫瘍成長の阻害を検出する工程とを含み、試験分子と接触したマウスにおける腫瘍成長が、試験分子と接触していないマウスにおける腫瘍成長と比較して低下する場合、該試験分子はエンドシアリンタンパク質又は活性を調節する血管新生阻害分子として識別される。
【００９８】
任意の適切な腫瘍が、抗血管新生分子を試験するモデルを提供するために任意の適切な様式で注入されてもよい。腫瘍の齧歯動物レシピエントは任意の適切な系であってもよい。腫瘍はトランスジェニック齧歯動物に対して同系、異系又は異種であってもよい。レシピエントは、       限定されないが、ｎｕ／ｎｕ、ｓｃｉｄ及びベージュマウスを含む、１つ又は複数の免疫関連機能において免疫応答性又は免疫不全性であってもよい。ＨＵＥ齧歯動物に、同系腫瘍細胞、例えばＢ１６黒色腫（ＡＴＣＣ）を接種できる。腫瘍成長に対する抗体又はその抗原結合断片投与の効果は、従来の方法を使用して原発性又は転移性腫瘍成長を定量することにより解明できる。
【００９９】
種々の異なる試験抗血管新生分子は本明細書に提供した方法を使用して識別できる。抗血管新生分子は多数の化学的分類を包含できる。特定の実施形態において、それらは、有機分子、好適には５０ダルトン超且つ約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物である。抗血管新生分子は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含んでもよく、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、好適には官能化学基のうちの少なくとも２つを含んでもよい。抗血管新生分子は、環状炭素構造若しくは複素環構造及び／又は上記の官能基の１つ又は複数と置換された芳香族若しくは多環芳香族構造を含んでもよい。抗血管新生分子はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジンなどの生体分子、それらの誘導体、構造的類似体又は組み合わせを含む。対象の試験抗血管新生分子はまた、抗体若しくは結合断片又はそれらの模倣物、例えばＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂなどのペプチド及びタンパク質薬剤を含んでもよい。
【０１００】
試験抗血管新生分子はまた、合成又は天然化合物のライブラリーを含む広範囲の源から得られ得る。例えば、多数の手段が、無作為化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、広範囲の有機化合物及び生体分子の無作為及び指向性合成に利用可能である。代替として、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるか又は容易に作製される。加えて、天然又は合成的に産生されたライブラリー及び化合物は、従来の化学、物理及び生化学手段により容易に修飾され、組み合わせライブラリーを作製するために使用されてもよい。公知の薬理作用剤が、構造的類似体を生成するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの指向性又は無作為化学修飾に供されてもよい。
【０１０１】
試験抗血管新生分子は、それが、腫瘍の成長を少なくとも２０％、しばしば３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％及び時々１００％、特異的に阻害できる場合、阻害剤として識別される。成長阻害は任意の簡便な測定方法を使用して定量できる。例えば、原発性腫瘍成長に関して、腫瘍体積を算出するために腫瘍塊の垂直測定が行われる。転移成長は必要に応じて顕微鏡分析又は巨視的分析により確認できる。腫瘍はトランスジェニック動物に対して同系、異系又は異種であってもよい。試験分子は、腫瘍接種の時点、霊長類の腫瘍成長の確立後、又は局所及び／若しくは遠隔転移の確立後に投与されてもよい。試験分子の単回又は複数回投与は、限定されないが、静脈内、腹腔内、腫瘍内、皮下及び皮内を含む、任意の簡便な投与様式を使用して与えられてもよい。
【０１０２】
以下の実施例は本発明を例示するために提供し、本発明の限定とみなされるべきではない。
【実施例】
【０１０３】
（例１）
ＨＵＥマウスを、ヒトエンドシアリンを発現し、内因性エンドシアリン遺伝子産物を欠失するように操作した。全エンドシアリンオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするヒト相補的ｃＤＮＡを、マウスエンドシアリン遺伝子座を含有するマウスゲノム断片内にクローニングした。図１は遺伝子座をクローニングするための戦略を提供する。ターゲティング構築物は、その構築物を組み込んだ細胞の選択に役立つようにネオマイシン耐性遺伝子を含有する。マウス第１９染色体配列（ｎ．ｔ．＃５，０３８，０７８〜５，１００，６４０）をアンサンブルデータベースから読み出し、参照として使用した。マウスＲＰ２３−４１０Ｏ１０ＢＡＣからＰＣＲにより５’ホモロジーアーム（５．０ｋｂ）及び３’ホモロジーアーム（２．８ｋｂ）を生成した。
【０１０４】
以下のプライマー及び条件を使用するＰＣＲによりターゲティングベクターのホモロジーアーム及びノックイン領域を作製した。
【化２】
2013543379.tif 000004
大文字はアームに属する配列を表す。小文字は後のクローニング工程に加えられる制限エンドヌクレアーゼ部位を表す。ＰＣＲサイクル条件は以下の通りであった：９４℃１５秒、５８℃１５秒、６８℃６分、２５サイクル。
【０１０５】
ノックイン領域はヒトＣＤ２４８  ｃＤＮＡプラスミドを含有した。これらの断片をＬｏｘＮｗＣＤ内でクローニングし、制限消化及びエンドシークエンシング（ｅｎｄ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により確認した。最終ベクターは標準的な分子クローニングにより得た。ホモロジーアーム及びノックインヒトＣＤ２４８断片とは別に、最終ベクターはまた、Ｎｅｏ発現カセット（ＥＳ細胞の陽性選択のため）及びＤＴＡ発現カセット（ＥＳ細胞の陰性選択のため）に隣接するｌｏｘＰ配列を含有する。最終ベクターは制限消化及びエンドシークエンシング分析の両方により確認した。ヒトエンドシアリンターゲティング配列は以下の通りである（配列番号１１）（イタリックでホモロジーアーム、太字でノックイン領域、ＬｏｘＰ部位は下線、確認した配列は強調／影付き）：
【化３−１】
2013543379.tif 000005
【化３−２】
2013543379.tif 000006
【化３−３】
2013543379.tif 000007
【化３−４】
2013543379.tif 000008
【化３−５】
2013543379.tif 000009
【０１０６】
エレクトロポレーション前に最終ベクターを線形化するためにＫｐｎＩを使用した。次いで得られた構築物を線形化し、マウス胚幹細胞（ＥＳＣ）系に導入し、遺伝子ノックアウト又はトランスジェニック胚幹（ＥＳ）細胞を生成する当業者に公知の標準的な方法を使用することにより構築物をマウスエンドシアリン遺伝子座に組み込むためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりスクリーニングした。ターゲティング構築物が内因性マウスエンドシアリン遺伝子座中に組み込まれていることを見出したクローンを増殖させ、サザンブロットにより更に確認した。マウス胚盤胞内に注入するためにクローンＡを使用し、ゲノムＰＣＲ又は尾クリッピングから抽出されたＤＮＡを使用するサザンブロッティングを含む、当業者に公知の方法を使用して、得られたマウスの子をスクリーニングして、ターゲティング構築物を含有するそれらのマウスを識別した。次いでそれらのキメラマウスを成長させ、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃ５７マウスとも称される）マウスと交配してヘテロ接合性及び最終的にゼロのマウスエンドシアリン及び機能的ヒトエンドシアリン発現を含有するホモ接合性マウスを生成した。図２はＨＵＥ（レーン１〜３）及び野生型Ｃ５７（レーン４）マウス由来のヒトエンドシアリンのタンパク質発現を示す。ＨＵＥマウスは、野生型対照Ｃ５７マウスを使用して決定した場合、マウスエンドシアリン遺伝子のものと同様のヒトエンドシアリン発現パターンを有することを確認した。
【０１０７】
（例２）
ヒトエンドシアリンに結合できる薬剤をスクリーニングするためのＨＵＥ分析的マウスの有用性を実証するために、２つの異なる癌モデルにおいてＨＵＥマウスを利用した。１つのモデル（ＳＣモデルと名付けた）は、ＨＵＥ及び野生型Ｃ５７対照マウスの脇腹内の皮下に埋め込まれる同系腫瘍を移植することを必要とし、その野生型Ｃ５７対照マウスはインタクトなマウスエンドシアリンを有し、ヒトエンドシアリンを発現しない。他方のモデル（肺Ｍｅｔモデル）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光画像法（Ｍｉｎ、Ｊら  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１０年３月１６日（３）：２８６−２９４）により腫瘍体積を測定するために使用できるルシフェラーゼを発現するように安定に形質導入される、Ｃ５７同系転移Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞を使用した。ＨＵＥ又はＣ５７対照マウス内に導入した場合、これらの細胞は、宿主動物の肺に転移できることが以前に示されている。その全体が参照として本明細書に組み込まれる、Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．２００３、２０（８）：７３３−４４（ＳＣＩＤマウスに移植し、処置に応答して生物発光画像法（ＢＬＩ）を使用して生物発光を測定されるルシフェラーゼを発現するように操作したヒト腫瘍細胞系）も参照のこと。
【０１０８】
ＳＣモデルにおいて、脇腹内への腫瘍細胞の首尾良い埋め込み後、マウスエンドシアリンを認識しないヒト化抗ヒトエンドシアリン（ＭＯＲＡｂ−００４）抗体又は対照抗体でマウスを処置し、１７日目に測定して腫瘍成長を抑制する能力を試験した。図３に示すように、抗ヒトエンドシアリン抗体で処置したＨＵＥマウスは対照ヒトＩｇＧで処置したマウスと比較して低下した腫瘍成長を示した。同じ実験において、抗ヒトエンドシアリン抗体ＭＯＲＡｂ−００４又は対照ヒトＩｇＧは、野生型Ｃ５７マウスに埋め込んだ腫瘍の成長低下を示さず、その活性としてＭＯＲＡｂ−００４の特異性がヒトエンドシアリンに制限され、マウスエンドシアリンに制限されないことが実証される。
【０１０９】
ＨＵＥ分析的マウスを使用する第２の例を肺Ｍｅｔモデルを利用して示す。癌細胞をＨＵＥマウスに導入した。ＦＢ５、ＭＯＲＡｂ−００４又はビヒクル（リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ））での処置を前日に開始し、３、５、７及び１０日継続した。肺における転移性疾患の程度を、ｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光画像法により１４日まで一週間に３回定量した。図４に示すように、いずれかの抗ヒトエンドシアリン抗体で処置したマウスは、ビヒクルで処置したマウスと比較して低下した転移性疾患を示した。
【０１１０】
まとめると、上記のデータにより、発見、開発及び検証のためにヒトエンドシアリンをターゲティングすることができる薬剤を識別するための分析的マウスとして利用した場合、ＨＵＥマウスの有用性が実証される。
【０１１１】
（例３）
例１に従って生成したＨＵＥマウスに、脇腹の皮下にＢ１６Ｆ１０Ｔ１細胞を注入した。腫瘍細胞移植の３日後に開始して継続的に動物に４０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００４又はＰＢＳの対照のみの５回の投与を与えた。処置後、腫瘍血管系を評価するために、Ｘ線マイクロ−ＣＴを使用した。マイクロ−ＣＴは全腫瘍における腫瘍血管系の全体的分析を提供するので、免疫組織化学などの一部の他のアプローチに固有の一部の制限を克服できる。
【０１１２】
移植の１７日後、安楽死させる１０分前に、腫瘍保有動物に５０μｌのヘパリンの腹腔内注射を与えた。胸腔を開口し、２０Ｇ針を使用して小さな切り目を心臓の左心房に入れ、ポリエチレンカニューレ（内径、０．５８ｍｍ、外径、０．９６ｍｍ）を左心室に通し、手動で所定の位置に固定した。１５〜２０ｍｌのＰＢＳを６ｍｌ  ｍｉｎ−１の速度で手動で灌流して血液を除去した。ＭＩＣＲＯＦＩＬ（Ｃａｒｖｅｒ、市販のクロム酸鉛ラテックス）を製造業者により推奨されるように調製した。次いで２ｍｌ  ｍｉｎ−１の速度で１０ｍｌのＭＩＣＲＯＦＩＬをマウスに手動で灌流した。注入したラテックス混合物を６０分間室温で重合させ、次いで対象の組織を解剖する前に動物を４〜８℃で一晩冷蔵した。解剖した腫瘍を１０％の中性緩衝ホルマリンに浸漬した。
【０１１３】
次いでＮｕｍｉｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより実施されるＸ線マイクロ−ＣＴシステムを用いて腫瘍を画像化し、画像分析ソフトウェアパッケージ（Ａｌｔａｖｉｅｗ、Ｎｕｍｉｒａ）を使用して分析した。その結果は図５に見られ得る。
【０１１４】
（参考文献）
Asahara T, et.al. Endothelial progenitor cells for postnatal vasculogenesis. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2004; 287:C572-C579.
Bagley, et.al. Human endothelial precursor cells express tumor endothelial marker 1/endosialin/CD248, Mol Cancer Ther 2008; 7(8) 2536-2546.
Bagley, et.al.Endosialin/TEM 1/CD248 is a pericyte marker of embryonic and tumor neovascularization. Microvasc Res., 2008; 1-9.
Brady, et.al. Human endosialin (tumor endothelial marker 1) is abundantly expressed in highly malignant and invasive brain tumors. J Neuropatholgy and Exp Neurology, 2004; 63(12) 1274-1283.
Buhring HJ, Seiffert M, Bock TA, Scheding S, Thiel A, Scheffold A, Kanz L,Brugger W. Expression of novel surface antigens on early hematopoietic cells. Ann N Y Acad Sci. 1999 Apr 30; 872:25-38; discussion 38-9.
Carson-Walter EB, Watkins DN, Nanda A, Vogelstein B, Kinzler KW, St Croix B. Cell surface tumor endothelial markers are conserved in mice and humans. Cancer Res. 2001 Sep 15; 61(18):6649-55.
Christian S, Ahorn H, Koehler A, Eisenhaber F, Rodi HP, Garin-Chesa P, Park JE, Rettig WJ, Lenter MC. Molecular cloning and characterization of endosialin, a C-type lectin-like cell surface receptor of tumor endothelium. J Biol Chem. 2001 Mar 9; 276(10):7408-14.
Conejo-Garcia JR, Buckanovich RJ, Benencia F, Courreges MC, Rubin SC, Carroll RG, Coukos G. Vascular Leukocytes Contribute to Tumor Vascularization. Blood.2005 Sep 9; 105:679-1.
Das A, et.al. Retinal and choroidal angiogenesis: pathophysiology and strategies for inhibition. Prog. Retin. Eye Res., 2003; 22(6):721-748.
Dhanabal, et.al.Anti-angiogenic therapy as a cancer treatment paradigm.Curr. Med. Chem. Anti-Canc. Agents 2005; 5:115-130.
Florell SR, et.al. Preservation of RNA for functional genomic studies: a multidisciplinary tumor bank protocol. Mod.Pathol. 2001; 14(2):116-128.
Galiano RD, et.al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. Am. J. Pathol. 2004; 164(6):1935-1947.
Kurosawa N, Kanemitsu Y, Matsui T, Shimada K, Ishihama H, Muramatsu T. Genomic analysis of a murine cell-surface sialomucin, MGC-24/CD164. Eur J Biochem. 1999 Oct 1;265(1):466-72.
Kyriakos RJ, et.al. The fate of antibodies bound to the surface of tumor cells in vitro. Cancer Res 1992; 52(4):835-842.
MacFadyen JR, et.al.Endosialin (TEM1, CD248) is a marker of stromal fibroblasts and is not selectively expressed on tumour endothelium. FEBS 2005; 579:2569-2575.
Marty, et al. Isolation and characterization of a scfv antibody specific for tumor endothelial marker 1 (tcm 1), a new reagent for targeted tumor therapy. Cancer Letters 2006; 235(2): 298-308.
Min J, Zaslavsky A, Fedele G, McLaughlin SK, Reczek EE, et.al. An oncogene-tumor suppressor cascade drives metastaticprostate cancer by coordinately activating Ras and NF-κB. Nat. Med. 16: 286-294, 2010.
Opavsky R, Haviernik P, Jurkovicova D, Garin MT, Copeland NG, Gilbert DJ, Jenkins NA, Bies J, Garfield S, Pastorekova S, Oue A, Wolff L. Molecular characterization of the mouse Tem1/endosialin gene regulated by cell density in vitro and expressed in normal tissues in vivo. J Biol Chem. 2001 Oct 19; 276(42):38795-807.
Paleolog, E.M., et al. Angiogenesis in arthritis: role in disease pathogenesis and as a potential therapeutic target. Angiogenesis 1999; 2:295-307.
Peters et al. Contribution of bone marrow-derived endothelial cells to human tumor vasculature.Nat. Med. 2005; 11:261-262.
Presta LG. Antibody engineering.Curr. Op. Struct. Biol. 1992; 2:593-596.
Queen C, et.al.A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1989; 86:10029-10033.
Rettig WJ, Garin-Chesa P, Healey JH, Su SL, Jaffe EA, Old LJ. Identification of endosialin, a cell surface glycoprotein of vascular endothelial cells in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Nov 15; 89(22):10832-6.
St Croix B, Rago C, Velculescu V, Traverso G, Romans KE, Montgomery E, Lal A, Riggins GJ, Lengauer C, Vogelstein B, Kinzler KW. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 2000 Aug 18; 289(5482):1121-2.
Tomkowicz B, Rybinski K, Foley B, Ebel W, Kline B, Routhier E, Sass P, Nicolaides NC, Grasso L, and Zhou Y. Expression of Human Endosialin (CD248) Promotes Cellular Adhesion to Fibronectin Through Direct Binding and Activation of b1 Integrins. Proc Natl Acad Sci. 2007 104:17965-970.
Tomkowicz B, Rybinski K, Sebeck D, Sass PM, Nicolaides NC, Grasso L, and Zhou Y. Endosialin/TEM-1/CD248 Regulates Pericyte Proliferation through PDGF Receptor Signaling.  Cancer Biol. Ther.2010 9:1-8.
Watt SM, Chan JY. CD164--a novel sialomucin on CD34+ cells. Leuk Lymphoma. 2000 Mar; 37(1-2):1-25.
Watt SM, Buhring HJ, Rappold I, Chan JY, Lee-Prudhoe J, Jones T, Zannettino AC, Simmons PJ, Doyonnas R, Sheer D, Butler LH. CD164, a novel sialomucin on CD34(+) and erythroid subsets, is located on human chromosome 6q21. Blood. 1998 Aug 1;92(3):849-66.
Wilkinson-Berka JL, et.al. Vasoactive factors and diabetic retinopathy: vascular endothelial growth factor, cycoloxygenase-2 and nitric oxide. Curr. Pharm. Des. 2004; 10(27):3331-3348.
Yancopoulos GD, et.al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature 2000; 407(6801):242-248.
Zannettino AC, Buhring HJ, Niutta S, Watt SM, Benton MA, Simmons PJ. The sialomucin CD164 (MGC-24v) is an adhesive glycoprotein expressed by human hematopoietic progenitors and bone marrow stromal cells that serves as a potent negative regulator of hematopoiesis. Blood. 1998 Oct 15;92(8):2609-12.
【０１１５】
本発明の配列
配列番号１  マウスエンドシアリン又はＴＥＭ１  ｃＤＮＡ（受託番号＿０５４０４２）
【化４】
2013543379.tif 000010
【０１１６】
配列番号２  マウスエンドシアリン又はＴＥＭ１タンパク質（受託番号＿０５４０４２）
【化５】
2013543379.tif 000011
【０１１７】
配列番号３  ヒトエンドシアリン又はＴＥＭ１  ｃＤＮＡ（受託番号＿０２０４０４）
【化６】
2013543379.tif 000012
【０１１８】
配列番号４  ヒトエンドシアリン又はＴＥＭ１タンパク質（受託番号＿０２０４０４）
【化７】
2013543379.tif 000013
【図１】
2013543379.tif 000014
【図２】
2013543379.tif 000015
【図３】
2013543379.tif 000016
【図４】
2013543379.tif 000017
【図５】
2013543379.tif 000018
【配列表】
2013543379000001.app
【国際調査報告】
2013543379.tif 000019
2013543379.tif 000020
2013543379.tif 000021
2013543379.tif 000022