(57)【要約】  本発明は一般に、ペプチドおよびタンパク質合成のプロセスおよび方法に関する。本発明は、そうしたプロセスおよび方法で使用するための特定の化合物にも関する。本明細書では、Ｃ末端三級Ｎ，Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−アミド（ＢＭＥＡ）を有するペプチドに、弱酸性のｐＨでＮ−から−Ｓへのアシル転移を施して、システイニルペプチドでの直接ライゲーションのために捕獲できる過渡的なチオエステルを生成させることが示される。これらのＣ末端ＢＭＥＡペプチドは、標準的なＦｍｏｃ固相合成プロトコルで容易に調製され、したがってネイティブケミカルライゲーションのためのチオエステル成分への非常に好都合なアクセスをもたらす。【選択図】図７
2013533254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
請求項１４もしくは１５に記載の化合物または請求項１１に記載の樹脂を含有するペプチド合成の方法。
【請求項２】
Ｃ末端三級Ｎ，Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−アミド基；Ｎ−（２−メルカプトエチル）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−アミド基またはＮ，Ｎ−ビス（３−メルカプトプロピル）−アミドを含むペプチドを製造するためのプロセスであって、請求項１１に記載のジアルキルアミン樹脂を提供するステップを含むプロセス。
【請求項３】
請求項１に記載の方法または請求項２に記載のプロセスであって、前記方法またはプロセスは、ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）をそれぞれ含む方法またはプロセス。
【請求項４】
請求項３に記載の方法またはプロセスであって、前記方法またはプロセスがそれぞれ、（ｉ）ライゲーション生成物をチオエステルに転換し、チオエステルとｃｙｓ−ペプチドとのＮＣＬを実施すること；または（ii）ライゲーション生成物をインサイチュでｃｙｓ−ペプチドと直接反応させることをさらに含み、１つ以上のさらなるライゲーションステップが任意に付随していてもよい方法またはプロセス。
【請求項５】
先行する請求項のいずれか一項に記載の方法またはプロセスであって、前記プロセスがチオール付加体の付加を含み、前記チオール付加体が、アルキルチオール、ベンジルメルカプタン、ＭＥＳＮａおよびメチルメルカプトアセテートからなる群から任意に選択される方法またはプロセス。
【請求項６】
先行する請求項のいずれか一項に記載の方法またはプロセスであって、前記方法またはプロセスはＦｍｏｃ固相ペプチド合成を含む方法またはプロセス。
【請求項７】
先行する請求項のいずれか一項に記載の方法またはプロセスであって、前記方法またはプロセスはポリペプチドまたはタンパク質を合成することを含む方法またはプロセス。
【請求項８】
先行する請求項のいずれか一項に記載のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を合成する方法またはプロセスであって、前記方法またはプロセスは、
（ｉ）ライゲーション結合部の１つ以上で、１つ以上のシステイン残基を他のアミノ酸残基に転換させること、および／またはペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を折り畳みさせること；および／または、
（ii）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を精製および取得すること
を含む方法またはプロセス。
【請求項９】
以下の反応スキームに示されるチオエステルペプチド合成の方法。
【化１】
2013533254.tif 000023
（ここで、独立に、ｎ＝２または３であり、ｍ＝２または３であり、ＲＣＯはアミノアシルまたはペプチジル基である、またはＲは、水素、酸素、硫黄、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ハロ、カルボキシル、ハロアルキル、ハロアルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、チオアルコキシ、アルケニルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ニトロ、アミノ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロヘテロシクリル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミン、アルキニルアミノ、アシル、アルケノイル、アルキノイル、アシルアミノ、ジアシルアミノ、アシルオキシ、アルキルスルホニルオキシ、ヘテロシクロキシ、ヘテロシクロアミノ、ハロヘテロシクロアルキル、アルキルスルフェニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アシルチオ、リン含有基、例えばホスホニルおよびホスフィニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、シアノ、シアネート、イソシアネート、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アルキル）および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（アルキル）2から独立に選択される１種以上の基であり、Ｒ’ＳＨはチオール含有化合物である）
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記チオール含有化合物が、３−メルカプトプロピオン酸またはベンジルメルカプタンまたはメチルメルカプトアセテートまたはＭＥＳＮａである方法。
【請求項１１】
以下の式（ｉ）または（ii）を有するジアルキルアミン樹脂。
【化２】
2013533254.tif 000024
（式中、
【化３】
2013533254.tif 000025
（すなわち、式中の円形体）は樹脂または固体支持体を表し、
ｎ＝独立に２、３であり、ｍ＝独立に２、３であり、
Ｒ1はＨ、Ｆｍｏｃであり、
Ｒ2は、Ｈまたは保護基、例えばＴｒｔ（トリチルまたはトリフェニルメチル）であり、
「リンカー」は、Ｆｍｏｃケミストリーに適合する任意のリンカーであり、ベンジル誘導体またはＴｒｔを含む）
【化４】
2013533254.tif 000026
（式中、ｎ＝２、３であり、ｍ＝２、３であり、
Ｒ1＝Ｈ，Ｆｍｏｃであり、
Ｒ2＝Ｔｒｔであり、
【化５】
2013533254.tif 000027
（すなわち、式中の円形体）は樹脂または固体支持体を表す）
【請求項１２】
請求項１１に記載のジアルキルアミン樹脂を製造するためのプロセスであって、ジアルキルアミン、ＨＳ（ＣＨ2）mＮＨ（ＣＨ2）nＳＨをトリチル樹脂にローディングすることを含む、または以下のステップ、すなわち、
（ｉ）下記式（Ａ）をｏ−ＮＯ2ＰｈＳＯ2−Ｃｌ、ＤＩＥＡ、およびＣＨ2Ｃｌ2−ＤＭＦと反応させて式（Ｂ）を得るステップと、
【化６】
2013533254.tif 000028
【化７】
2013533254.tif 000029
（ii）式（Ｂ）をアルキル化し、スルホニル基をチオール除去して式（Ｃ）を得るステップとを含むプロセス。
【化８】
2013533254.tif 000030
【請求項１３】
請求項１２に記載のプロセスであって、前記プロセスは、Ｆｍｏｃ  ＳＳＰＳ、続く切断により式（Ｄ）を得るステップをさらに含むプロセス。
【化９】
2013533254.tif 000031
（式中、ｎ＝２または３であり、ｍ＝２または３であり；ＲＣＯはアミノアシルもしくはペプチジル基である、またはＲは、水素、酸素、硫黄、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ハロ、カルボキシル、ハロアルキル、ハロアルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、チオアルコキシ、アルケニルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ニトロ、アミノ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロヘテロシクリル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミン、アルキニルアミノ、アシル、アルケノイル、アルキノイル、アシルアミノ、ジアシルアミノ、アシルオキシ、アルキルスルホニルオキシ、ヘテロシクロキシ、ヘテロシクロアミノ、ハロヘテロシクロアルキル、アルキルスルフェニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アシルチオ、リン含有基、例えばホスホニルおよびホスフィニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、シアノ、シアネート、イソシアネート、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アルキル）および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（アルキル）2から独立に選択される１種以上の基である）
【請求項１４】
以下の構造式を有するカルボキシアミド化合物。
【化１０】
2013533254.tif 000032
（式中、独立に、ｎ＝２または３であり、ｍ＝２または３であり、
ＲＣＯはアミノアシルもしくはペプチジル基である、またはＲは、水素、酸素、硫黄、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ハロ、カルボキシル、ハロアルキル、ハロアルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、チオアルコキシ、アルケニルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ニトロ、アミノ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロヘテロシクリル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミン、アルキニルアミノ、アシル、アルケノイル、アルキノイル、アシルアミノ、ジアシルアミノ、アシルオキシ、アルキルスルホニルオキシ、ヘテロシクロキシ、ヘテロシクロアミノ、ハロヘテロシクロアルキル、アルキルスルフェニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アシルチオ、リン含有基、例えばホスホニルおよびホスフィニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、シアノ、シアネート、イソシアネート、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アルキル）および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（アルキル）2から独立に選択される１種以上の基である）
【請求項１５】
以下の構造式を有する化合物。
【化１１】
2013533254.tif 000033
（式中、独立に、ｎ＝２または３であり、ｍ＝２または３であり、
ＲＣＯはアミノアシルもしくはペプチジル基である、またはＲは、水素、酸素、硫黄、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ハロ、カルボキシル、ハロアルキル、ハロアルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、チオアルコキシ、アルケニルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ニトロ、アミノ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロヘテロシクリル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミン、アルキニルアミノ、アシル、アルケノイル、アルキノイル、アシルアミノ、ジアシルアミノ、アシルオキシ、アルキルスルホニルオキシ、ヘテロシクロキシ、ヘテロシクロアミノ、ハロヘテロシクロアルキル、アルキルスルフェニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アシルチオ、リン含有基、例えばホスホニルおよびホスフィニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、シアノ、シアネート、イソシアネート、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アルキル）および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（アルキル）2から独立に選択される１種以上の基である）
【請求項１６】
請求項９に記載の方法、請求項１１に記載の樹脂、請求項１３に記載のプロセスまたは請求項１４もしくは１５に記載の化合物であって、（ｉ）ｎおよびｍの両方が２である；（ii）ｎ＝２かつｍ＝３である；またはｎ＝３かつｍ＝２である方法、樹脂、プロセスまたは化合物。
【請求項１７】
先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、プロセス、樹脂または化合物であって、ＢＭＥＡ部分の代わりに、システインがメルカプトエチルアミンを置きかえているＢＭＥＡ変形体を使用する方法、プロセス、樹脂または化合物。
【請求項１８】
ネイティブケミカルライゲーションのためのチオール付加体としてのメチルメルカプトアセテートの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、ペプチドおよびタンパク質合成のプロセスおよび方法に関する。本発明は、そうしたプロセスおよび方法で使用するための特定の化合物にも関する。本明細書で、Ｃ末端三級Ｎ，Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−アミド（ＢＭＥＡ）を有するペプチドは、弱酸性のｐＨでＮ−から−Ｓへのアシル転移を施されて、システイニルペプチドでの直接的なライゲーションのために捕獲できる過渡的なチオエステルを生成させることが示される。これらのＣ末端ＢＭＥＡペプチドは標準的なＦｍｏｃ固相合成プロトコルで容易に調製されるものであり、したがって、ネイティブケミカルライゲーション（native chemical ligation）のためのチオエステル成分への非常に好都合なアクセスを与える。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドＣα−チオエステルは、特にネイティブケミカルライゲーション2を含むいくつかのタンパク質合成ストラテジー1のための主要な構成要素として益々用いられてきている。大成功をおさめているネイティブケミカルライゲーションスキームは、ペプチドチオエステルを、Ｎ末端システイン残基を含む他のペプチドとライゲーションさせるために使用する。これは近年、これらの重要化合物を調製するための新規で好都合な方法の開発において著しく興味を刺激している3。従来から、チオエステルペプチドはＢｏｃ固相合成法で調製されており、それによってペプチド鎖は、チオエステルリンカー上に直接構築される1a、4。この方法は非常に効果的であるが、最後の切断ステップで非常に有害な強酸、例えばＨＦを必要とすることは、多くの研究室に思いとどまらせる要素をもたらしている。チオエステルリンカーでのペプチドチオエステルの直接的Ｆｍｏｃ−固相合成は、改変されたＦｍｏｃ−脱保護プロトコルを用いても可能であるが、その使用は比較的小さいペプチドに限定されており、Ｃ末端アミノ酸残基のラセミ化は重要な問題である5。その合成が標準的なＦｍｏｃケミストリーに適合する非チオエステル前駆体から間接的にチオエステルペプチドを得る代替のストラテジーを開発するために相当な努力がなされている6〜8。例えば、Ｋｅｎｎｅｒのセーフティ−キャッチスルホンアミド6a、b、c、アシル尿素6dおよびピログルタミルイミド6eに基づく特定の活性化アミド系が開発されている。他の系は、Ｎ→Ｓアシル転移を用いてチオエステルを生成するものであり9、10、これはある意味で、機構的にタンパク質スプライシングを想起させるものである11。これらの系の多くは、チオエステルを生成する遊離チオール化合物とのチオエステル交換反応が付随する、アミドからチオエステルへの転換の触媒作用をするように酸性条件を必要とする。Ａｉｍｏｔｏのグループは、ジケトピペラジン生成によって、プロリルエステルの分子内アミノリシスを介してＣｙｓの過渡的に曝露されたα−アミンを捕捉するようにそれが促進されることから、中性または弱酸性ｐＨでのアミドからチオエステルへの転換を媒介するための自己活性化Ｃ末端Ｃｙｓ−Ｐｒｏエステル（ＣＰＥ）の使用を報告している10a。第一のアミノ酸をＣＰＥリンカーにロードする不都合さおよびＣ末端での比較的反応性のグリコールエステルの必要性にも関わらず、この方法はその巧妙な設計をアピールしている。
【化１】
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【０００３】
ペプチドチオエステル合成のための新規で好都合な方法を開発するための我々の努力において、我々はＮ→Ｓアシル転移反応に特に注意を払った。機構的には、Ｎ→Ｓアシル転移をもたらすために、チオール担持Ｎ−置換基がカルボニル酸素に対向している構造中に平面アミド結合が存在しなければならないことが確認されている。これは、正規のＸａａ−Ｃｙｓペプチド結合において、エネルギー的に好ましくない２°アミドのｃｉｓ異性体を必要とする（スキーム１）。また、反応平衡をチオエステル生成の方へ推進するために、新規に曝露されたアミンのための捕捉メカニズム、例えばプロトン化がなければならない。タンパク質スプライシングにおいて、ｔｒａｎｓ−ｃｉｓアミド異性化は、チオエステル化のための一般的酸塩基触媒としても働くインテインによって触媒作用されると思われる11。Ｎα−Ｃｙｓアルキル化、例えばメチル化またはエチル化は、Ｘａａ−Ｃｙｓアミド結合のｔｒａｎｓ−ｃｉｓ異性化を容易にすることも公知であり、次いで酸性条件を用いるとＮ→Ｓアシル基移動を促進することになる9d。これらの論拠は、スキーム２に示すように、ＮＣＬ用のチオエステルを得るための新規なＮ→Ｓアシル転移系を提案するに至らしめた。この反応系は、ペプチドＣ末端三級アミド１、すなわちＮ，Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−アミドまたはＢＭＥＡの使用に基づくものである。２つのβ−メルカプトエチル（ＨＳ−Ｅｔ）Ｎ置換で、このアミドは、分子内チオリシス反応のために正確に位置した１つのＨＳ−Ｅｔ基を常にもつことになる。チオエステル化生成物２中の第二アミンの比較的強い塩基性度はプロトン化による捕捉を容易にすることになり、これは、Ｎ→Ｓアシル転移反応平衡を有用な程度にＮＣＬ操作可能なｐＨへシフトさせる可能性がある。次いでネイティブケミカルライゲーションでのカップリングチオエステル化は、反応全体を最終的に前進させるように誘導することになる（スキーム２）。
【化２】
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【発明の概要】
【０００４】
ペプチドチオエステルは、タンパク質合成のための必須の構成要素である。我々が開発した技術は、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成で調製するのに好都合であり、またシステイニル−ペプチドを用いてＮＣＬにおいて使用するのに比較的効率的でもあるペプチドチオエステルへの容易なアクセスを提供する。
【０００５】
我々の設計は、Ｃ末端三級アミド、すなわちその窒素が２つのβ−メルカプトエチルまたはＨＳ−ｅｔ基で置換されているＮ，Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−アミドまたはＢＭＥＡをもとにしている。
【０００６】
そうした２つのＨＳ−ＥｔＮ−置換の存在は、このアミドが、分子内チオリシス反応（すなわち、Ｎ→Ｓアシル転移）をいつでも受けられてそれ自体がチオエステルに転換されるようにしている。生成したら、チオエステル生成物を、システイニルペプチドを用いたＮＣＬ用に直接使用して、ライゲーションの形成をもたらすことができる。その一方、他のチオエステル前駆体は、チオエステル交換とチオ−チオエステル交換の両方が一段で起こるようにすることはできず、ＮＣＬを進める前にチオエステルを生成させる追加的な段階を必要とする。
【０００７】
我々は、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成プロトコルを用いてペプチド鎖をその上に容易に構築できる、ＢＭＥＡリンカー誘導樹脂を調製するための直接的方法も考案した。選択されたＢＭＥＡペプチドのパネルを用いたモデル試験は我々の仮説を立証しており、ＮＣＬのためのこれらのペプチドの範囲ならびにタンパク質合成（例えば、ヒストンＨ３合成）におけるその有用性を実証した。
【０００８】
本発明の上記および他の側面（aspect）は、以下のより詳細な本発明の説明および本明細書の例の部から明らかであろう。
【０００９】
ＢＭＥＡ／ＢＭＥＡ部分について様々な参照が本明細書でなされるが、本発明はそうした部分に限定されることはなく、したがって、本明細書でのＢＭＥＡ／ＢＭＥＡ部分への参照は、文脈で別段の表示のない限り、変更すべきところは変更して（mutatis mutandis）、本明細書で教示されるようなＢＭＥＡ／ＢＭＥＡ部分の変形体（variant）に適用されることを理解すべきである。この関連において、我々は、ＢＭＥＡの変形体が、１つのＮ−置換が２−メルカプトエチルであり、１つが３−メルカプトプロピルであるものにおいて機能することを実証した（例４を参照されたい）。さらに、本明細書でのＢＭＥＡ／ＢＭＥＡ部分に関連する教示は、ＢＭＥＡのメルカプトエチルアミンの代わりにシステインを用いることによって改変されてもよい。したがって、本明細書でのＢＭＥＡ／ＢＭＥＡ部分に関連する教示は上記および他の変形体にまで及ぶことになる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＬＫＳＦＧ−（ＮＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2のＨＰＬＣおよびＭＳ分析。パネルＡ：ＨＰＬＣプロフィール；パネルＢ：ＥＳＩ−ＭＳ。
【図２】ｐＨ４（上部パネル）およびｐＨ５（下部パネル）でのＣＬＫＦＡを用いたＬＫＳＦＧ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2のライゲーション。反応状況を、２時間、４時間、８時間および２４時間で解析的ＲＰ−ＨＰＬＣによりチェックした（図１４）。ＨＰＬＣ条件はすべて同じとした：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜４０％の緩衝液Ｂ。緩衝液Ａ：Ｈ2Ｏ中の０．０４５％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：Ｈ2Ｏ中の９０％アセトニトリル。ピーク１はＣＬＫＦＡであり、ピーク２はＬＫＳＦＧ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2ジチオールペプチドであり、ピーク３はライゲーション生成物である。副反応は検出されなかった。
【図３】ＭＥＳＮＡの存在下、ｐＨ５でのＬＫＳＦＧ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2とＣＬＫＦＡのライゲーション。反応状況は、２時間、４時間、８時間および２４時間で解析的ＲＰ−ＨＰＬＣによりチェックした。ＨＰＬＣ条件：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜４０％の緩衝液Ｂ。緩衝液Ａ：Ｈ2Ｏ中の０．０４５％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：Ｈ2Ｏ中の９０％アセトニトリル。ピーク１はＣＬＫＦＡであり、ピーク２はＢＭＥＡペプチドＬＫＳＦＧ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2であり、ピーク３はライゲーション生成物である。
【図４】ライゲーション条件：ｐＨ５、２％ＭＥＳＮＡ、低出力マイクロ波照射。反応状況は、１時間、２時間、４時間および６時間で解析的ＲＰ−ＨＰＬＣによりチェックした。ＨＰＬＣ条件はすべて同じとした：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜４０％の緩衝液Ｂ。緩衝液Ａ：Ｈ2Ｏ中の０．０４５％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：Ｈ2Ｏ中の９０％アセトニトリル。ピーク１はＣＬＫＦＡであり、ピーク２はＬＫＳＦＧ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2ジチオールペプチドであり、ピーク３はライゲーション生成物であり、ピーク４はＬＫＳＦＧ−ＭＥＳＮである。
【図５Ａ】Ｈ３（１−１３）−ＢＭＥＡとＨ３（１４−１３５）／Ｋ１４ＣのライゲーションのＨＰＬＣおよびＭＯＬＤＩ−ＭＳ分析。
【図５Ｂ】Ｈ３（１−１３）／Ｋ４ｍｅ−ＢＭＥＡとＨ３（１４−１３５）／Ｋ１４ＣのライゲーションのＨＰＬＣおよびＭＯＬＤＩ−ＭＳ分析。
【図６】異なるＨ３タンパク質から形成されたヒストンオクタマーの１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析。レーン１、すべて発現されたヒストンタンパク質でのヒストンオクタマー；レーン２、合成野生型Ｈ３で；レーン３、合成Ｈ３Ｋ４ｍｅで。
【図７】我々の新規なＮ末端からＣ末端への逐次的ケミカルライゲーションアプローチを例示する図である。逐次的ライゲーションは、チオエステル媒介ネイティブケミカルライゲーションとペプチジルＮ，Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−アミド媒介ライゲーションの組合せで実施した。このアプローチはユビキチンの化学合成に首尾よく適用された。したがって、タンパク質合成におけるアプローチの潜在的有用性が実証された。
【図８】ペプチド１、Ｈ−ＡＤＫＲＡＨＨＮＡＬＥＲＫＲＲＤＨＡ−ＳＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ2のＣ１８解析的ＨＰＬＣプロフィール（Ａ）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（Ｂ）。ＨＰＬＣ勾配：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜４０％の緩衝液Ｂ。［Ｍ＋Ｈ］+実験値：２２６８．３１、同位体ＭＷ計算値：２２６７．１７Ｄａ。
【図９】ペプチド２、Ｈ−ＣＤＳＦＨＳＬＲＤＳＹ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2のＣ１８解析的ＨＰＬＣプロフィール（Ａ）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（Ｂ）。ＨＰＬＣ勾配：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜４０％の緩衝液Ｂ。［Ｍ＋Ｈ］+実験値：１４４８．９９、同位体ＭＷ計算値：１４４７．５７Ｄａ。
【図１０】ペプチド３、Ｈ−ＣＬＫＰＬＨＥＫＤＳＥＳ（P）ＧＧＧＫＤ−ＮＨ2のＣ１８解析的ＨＰＬＣプロフィール（Ａ）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（Ｂ）。ＨＰＬＣ勾配：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜４０％の緩衝液Ｂ。［Ｍ＋Ｈ］+実験値：１８７８．０１；同位体ＭＷ計算値：１８７６．８３ｄａ。
【図１１】ペプチド４、Ｕｂｉ  Ｈ−ＬＫ27−ＳＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ2のＣ１８解析的ＨＰＬＣプロフィール（上部）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（下部）。ＨＰＬＣ条件：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜８０％の緩衝液Ｂ。［Ｍ＋Ｈ］+実験値：３１０３．１３６５；同位体ＭＷ計算値：３１０２．６９Ｄａ。
【図１２】Ａ）およびＢ）：修正ストラテジーを用いて合成した粗製ペプチド５、ｕｂｉ  Ｈ−Ｃ28−Ｆ45−ＢＭＥＡのＣ１８解析的ＨＰＬＣプロフィール（Ａ）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（Ｂ）。図Ａで星印を付けたピークは、５ならびにそのＢＭＥＡ酸化型（ジスルフィド型）を含む所望生成物である。図Ｂ中の長方形で強調されているピークはマトリックスピークである。質量２２４５．０３１５および２２４８．０９８１でのピークは、それぞれ５が酸化された形態および還元された形態である。ピーク２３０３．１１９１および２３６０．１６５０はそれぞれ１個のｔ−ブチルおよび２個のｔ−ブチル基の付加によるＳ−アルキル化生成物である。Ｃ）およびＤ：精製された５のＣ１８解析的ＨＰＬＣプロフィール（Ｃ）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（Ｄ）。ＨＰＬＣ勾配：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜８０％の緩衝液Ｂ。［Ｍ＋Ｈ］+実験値：２２４５．１０（酸化されている）および２２４８．１０（還元されている）。酸化型の同位体ＭＷ計算値は２２４４．１２Ｄａであり、還元型は２２４６．１４Ｄａである。
【図１３】ペプチド６、Ｕｂｉ  Ｈ−Ｃ46−Ｇ76−ＯＨのＣ１８解析的ＨＰＬＣプロフィール（上部）およびＥＳＩ−ＭＳスペクトル（下部）。ＨＰＬＣ勾配：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜８０％の緩衝液Ｂ。ＭＷ実験値：３５００．９、ＭＷ計算値：３５００．９４Ｄａ。
【図１４】モデルペプチドでのＮからＣへの逐次的ライゲーションストラテジーの試験。Ａ）：ペプチド１と２のライゲーション反応のＣ１８解析的ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣ条件：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜４０％の緩衝液Ｂ。ピークａ：ペプチド１；ピークｂ：ペプチド２；ピークｃ：１および２のライゲーション生成物、Ｈ−ＡＤＫＲＡＨＨＮＡＬＥＲＫＲＲＤＨＡＣＤＳＦＨＳＬＲＤＳＹ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2またはＨ−ＡＹ29−ＢＭＥＡ。Ｂ）：Ｈ−ＡＹ29−ＢＭＥＡのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ。［Ｍ＋Ｈ］+実験値：３６１０．９３、ＭＷ計算値：３６０９．７１。Ｃ）：Ｈ−ＡＹ29−ＢＭＥＡとペプチド３のライゲーション反応のＣ１８解析的ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣ条件：５０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜５０％の緩衝液Ｂ。ピークａ：ペプチド３；ピークｂ：Ｈ−ＡＹ29−ＢＭＥＡ；ピークｃ：Ｈ−ＡＹ29−ＭＥＳ；ピークｄ：ライゲーション生成物、Ｈ−ＡＤＫＲＡＨＨＮＡＬＥＲＫＲＲＤＨＡ  ＣＤＳＦＨＳＬＲＤＳＹＣＬＫＰＬＨＥＫＤＳＥＳ（P）ＧＧＧＫＤ−ＮＨ2またはＨ−ＡＤ46−ＮＨ2。Ｄ）：Ｈ−ＡＤ46−ＮＨ2のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ。［Ｍ＋Ｈ］+実験値：５３５１．２０、ＭＷ計算値：５３４９．５０。
【図１５】ＮからＣへの逐次的ライゲーションを用いたユビキチンの合成。Ａ）：ペプチド４および５のライゲーション反応のＣ１８解析的ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣ条件：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜８０％の緩衝液Ｂ。ピークａ：ペプチド４；ピークｂ：ペプチド５；ピークｃ：４および５のライゲーション生成物、Ｈ−ＬＦ45−ＢＭＥＡ；ピークｄ：４の自己環化および加水分解生成物。Ｂ）：Ｈ−ＬＦ45−ＢＭＥＡの生のままとデコンボルーションによる（raw and deconvoluted）ＥＳＩ−ＭＳ。ＭＷ実験値：５２４６．９、ＭＷ計算値：５２４７．１６。Ｃ）：Ｈ−ＬＦ45−ＢＭＥＡとチオール付加体（thiol additive）としてメチルメルカプトアセテートを有するペプチド６のライゲーション反応のＣ１８解析的ＨＰＬＣ分析。ＨＰＬＣ条件：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜８０％の緩衝液Ｂ。ピークａ：ペプチド６；ピークｂ：Ｈ−ＬＦ45−ＢＭＥＡ；ピークｃ：ライゲーション生成物；ピークｄ：Ｈ−ＬＦ45−ＳＣＨ2ＣＯＯＭｅ。Ｄ）：全長ユビキチンの生のままとデコンボルーションによるＥＳＩ  ＭＳ。ＭＷ実験値：８６１２．６、ＭＷ計算値：８６１０．８。
【図１６】酸性およびマイクロ波条件下でのＢＭＥＡ部分とＭＥＳＮａの交換による、ｕｂｉ  Ｈ−ＬＦ45−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2のｕｂｉ  Ｈ−ＬＦ45−ＭＥＳへの転換。Ａ）：反応を６ｈおよび１０ｈで、Ｃ１８解析的ＨＰＬＣでモニターした。ピークａ：Ｈ−ＬＦ45−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2；ピークｂ：少量の加水分解生成物、Ｈ−ＬＦ45−ＯＨを含むＨ−ＬＦ45−ＭＥＳ。ＨＰＬＣ勾配：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜８０％の緩衝液Ｂ。Ｂ）：ピークｂの生のままとデコンボルーションによるＥＳＩ−ＭＳ。種Ａ：Ｈ−ＬＦ45−ＭＥＳ、ＭＷ実験値５２５１．８、計算値５２５２．０９；種Ｂ：Ｕｂｉ  Ｌ1−Ｆ45−ＯＨ。ＭＷ実験値５１２６．８、計算値５１２７．９１。
【図１７】単離されたｕｂｉ  Ｌ1−Ｆ45−ＭＥＳとｕｂｉ  Ｃ４６−Ｇ−７６−ＯＨとのライゲーションをモニターしたＣ１８解析的ＨＰＬＣ。ピークａ：ｕｂｉ  Ｃ４６−Ｇ−７６−ＯＨ；ピークｂ：Ｕｂｉ  Ｌ1−Ｆ45−ＭＥＳ（少量のＵｂｉ  Ｌ1−Ｆ45−ＯＨを含む）；ピークｃ：ライゲーション生成物、Ｕｂｉ  Ｌ１−Ｇ７６−ＯＧ  Ａ２８Ｃ、Ａ４６Ｃ；ピークｄ：Ｕｂｉ  Ｌ1−Ｆ45−ＯＨ。ＨＰＬＣ勾配：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜８０％の緩衝液Ｂ。
【図１８】Ｕｂｉ  Ｈ−Ｌ1−Ｆ45−ＢＭＥＡとチオール付加体としてＭＥＳＮａを有するペプチド６のインサイチュでのライゲーションをモニターしたＣ１８解析的ＨＰＬＣ。ライゲーションをそれぞれ０ｈ、６．５ｈおよび１０ｈで分析した。ピークａ：Ｈ−Ｌ1−Ｆ45−ＢＭＥＡ；ピークｂ：６；ピークｃ：ライゲーション生成物；ピークｄ：Ｈ−Ｌ1−Ｆ45−ＢＭＥＡおよびＨ−Ｌ1−Ｆ45−ＯＨ。ＨＰＬＣ勾配：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜８０％の緩衝液Ｂ。
【図１９】フリーラジカル媒介脱硫による、合成されたユビキチン中のＣｙｓ２８およびＣｙｓ４６のＡｌａへの転換。Ａ）．精製されたユビキチンＣｙｓ２８Ｃｙｓ４６のＣ１８解析的ＨＰＬＣ。Ｂ）．８時間後の脱硫のＣ１８解析的ＨＰＬＣ分析。Ｃ）．精製された脱硫生成物のＣ１８解析的ＨＰＬＣ。Ｄ）．脱硫生成物の生のままとデコンボルーションによるＥＳＩ  ＭＳ。ＭＷ実験値８５４６．８、計算値８５４６．７０。
【図２０】再折り畳みされた合成モノユビキチンおよびその組み換え対応物の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル。
【図２１】ＮＣＬとＢＭＥＡ媒介ライゲーションの組合せを用いたＮからＣへの逐次的ライゲーション。好ましくは、Ｒはアルキルまたはアリール基である。最も一般的な場合、ＳＲ部分は、ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ2、ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ、ベンジルメルカプタン、ＭＥＳＮａ、メチルメルカプトアセテートまたは他のチオール化合物からくる。
【図２２】ペプチドＨ−ＬＫＳＦＧ−（ＮＣＨ2ＣＨ2ＳＨ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）の特性評価。（Ａ）Ｈ−ＬＫＳＦＧ−（ＮＣＨ2ＣＨ2ＳＨ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）のＣ１８解析的ＨＰＬＣプロフィール。ＨＰＬＣ条件：４５ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜４５％の緩衝液Ｂ。ピーク１はペプチドＬＫＳＦＧ−（ＮＣＨ2ＣＨ2ＳＨ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）であり、ピーク２および３はチオエステル型のペプチドＬＫＳＦＧ−（ＮＣＨ2ＣＨ2ＳＨ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）である。（Ｂ）ＥＳＩ−ＭＳで測定したこのペプチドの質量スペクトル。［Ｍ＋Ｈ］+実験値：６８４．８２、ＭＷ計算値：６８３．９。
【図２３】ペプチドＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2の特性評価。（Ａ）ＬＫＳＦＧ−（ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2のＣ１８解析的ＨＰＬＣプロフィール。ＨＰＬＣ条件：４５ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜４５％の緩衝液Ｂ。（Ｂ）ＥＳＩ−ＭＳで測定したこのペプチドの質量スペクトル。［Ｍ＋Ｈ］+実験値：６９８．０４、ＭＷ計算値：６９７．１。
【図２４】ライゲーション反応の解析的ＨＰＬＣ分析。条件は、異なるジチオールペプチド、Ａ：Ｈ−ＬＫＳＦＧ−ＢＭＥＡ、Ｂ：Ｈ−ＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）、Ｃ：Ｈ−ＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2を除いてすべて同じである。ＨＰＬＣ条件はすべて同じとした：４０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜４０％の緩衝液Ｂ。ピーク１はペプチドＨ−ＣＬＫＦＡ−ＮＨ2であり、ピーク２はジチオールペプチドであり、ピーク３はライゲーション生成物である。
【定義】
【００１１】
以下は、本発明の説明を理解する上で役立ついくつかの定義である。これらは一般的な定義として意図したものであり、本発明の範囲をこれらの用語だけに限定すべきものでは全くないが、以下の説明のより良好な理解のために提示するものである。
【００１２】
文脈で別段の必要がない限り、またはそれとは反対の記述が具体的になされていない限り、本明細書で単数の整数、ステップまたは要素として言及される本発明の整数、ステップまたは要素は明らかに、言及された整数、ステップまたは要素の単数形と複数形の両方を包含する。
【００１３】
当業者は、本明細書で説明する本発明が、具体的に記述されたもの以外の変更形態および改変形態を受け入れる余地があることを理解されよう。本発明がそうしたすべての変更形態および改変形態を含むことを理解すべきである。本発明はまた、本明細書において個別的にまたは集合的に参照される、または示されるステップ、特徴、組成物および化合物、ならびに前記ステップまたは特徴のあらゆる組合せまたは任意の２つ以上のすべても含む。
【００１４】
本明細書の関連で、本明細書で提供するさらなる定義を前提として、「アミノ酸」という用語は、少なくとも１個の一級、二級、三級または四級アミノ基と少なくとも１個の酸基を有すると定義され、その酸基は、カルボン酸、スルホン酸またはホスホン酸もしくはその混合物であってもよい。アミノ基は酸基に関して「アルファ」、「ベータ」、「ガンマ」…「オメガ」であってもよい。「アミノ酸」の主鎖は、ハロゲン、ヒドロキシ、グアニド、複素環基から選択される１種以上の基で置換されていてよい。「アミノ酸」という用語は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパルテート、グルタミン、リシン、アルギニンおよびヒスチジン、タウリン、ベタイン、Ｎ−メチルアラニン等もその範囲内に包含する。（Ｌ）および（Ｄ）の形態のアミノ酸は本発明の範囲内に含まれる。
【００１５】
本明細書で用いられる際、「Ｆｍｏｃ」は、固相ペプチド合成において使用するための保護基９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル、ならびに、そこでアミノ酸モノマーのＮ末端を脱保護されるアミノ酸鎖に付加される前にＦｍｏｃ保護基で保護する固相ペプチド合成の方法を意味する。
【００１６】
本明細書で用いられる際、置換基Ｒ2は保護基であり；Ｆｍｏｃプロセスで使用するのに適している前提で、任意の保護基を使用することができる。一態様では、Ｒ2はトリフェニルメチル（Ｔｒｔ）基である。他の態様では、Ｒ2は、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−ブチル）、２−ピリジン−スルフェニル、メチル−スルフェニルまたはアセトアミドメチルからなる群から選択される。
【００１７】
リンカーは、Ｆｍｏｃプロセスで使用するのに適した任意のリンカーであってよい。一態様では、そのリンカーはＲ2基と同じ置換基であってよい。一態様では、リンカーは、ベンジル基もしくは誘導体、フェニル基もしくは誘導体またはペプチジル基もしくは誘導体であってもよい。一態様では、リンカーはトリフェニルメチル（Ｔｒｔ）基である。
【００１８】
「樹脂」という用語は、固相ペプチド合成で使用するのに適した任意の樹脂を含むと広範に解釈されるべきである。例えば、樹脂という用語はペプチド合成に適した任意のポリマー樹脂を含み、例えばその樹脂は、ポリスチレン樹脂、例えば１〜２％のジビニルベンゼンで架橋させたスチレン；ポリアクリルアミド樹脂、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリスチレン樹脂（ＰＥＧ−ＰＳ）、ＰＥＧＡ（ポリエチレングリコールジメチルアクリルアミドコポリマー）樹脂である、またはこの樹脂は、ポリスチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリスチレンもしくはＰＥＧＡ（ポリエチレングリコールジメチルアクリルアミドコポリマー）をベースとしている。一態様では、その樹脂は、ペプチド合成に適したガラスビーズ、セルロース繊維または複合体である。
【００１９】
「アミノアシル」という用語は、所要のＲ−ＣＯ基または所要のＲ−ＣＯ基を有するその誘導体を形成する任意のアミノ酸基を含むと広範に解釈されるべきである。
【００２０】
本明細書の関連で用いられる「タンパク質」という用語は、文脈で別段の表示のない限り、「ポリペプチド」という用語と同義語として使用することができる。「タンパク質」という用語は、ペプチド結合以外の結合（例えば、ジスルフィド結合）で連結され得る２つ以上のポリペプチド複合体を含むことができる。
【００２１】
「ペプチジル」という用語は、そのＣ末端アミノ酸が所要のＲ−ＣＯ基または所要のＲ−ＣＯ基を有するその誘導体を形成する任意のペプチドを含むと広範に解釈されるべきである。ペプチドは、２〜１５個のアミノ酸または２〜３０個のアミノ酸からなる短いペプチド鎖であってもよい。本明細書で用いるペプチドの定義は、オリゴペプチドおよびポリペプチドも含む。本質的に、任意の長さのペプチド鎖がこの定義に含まれる（例えば、５、１０、１５、２０、２５または３０個のアミノ酸より大きいペプチドを含む）。ただし、本発明で使用するのに適しているという前提である。
【００２２】
一態様では、本明細書で用いる式（Ｉ）は、チオエステルを生じさせるための分子内チオリシス反応の生成物も含むことができる。
【化３】
2013533254.tif 000005
【００２３】
式（Ｉ）は、チオエステルへ転換させるためのいかなる先行ステップも必要とすることなく、ネイティブケミカルライゲーション反応で使用するのに適している。
【００２４】
式（Ｉ）の分子内チオリシス反応のチオエステル生成物を以下に示す。
【化４】
2013533254.tif 000006
【００２５】
一態様では、置換基「Ｒ−ＣＯ」は、アミノアシルもしくはペプチジル基または所要のＲ−ＣＯ基を有するその誘導体である。置換基「Ｒ」は、水素、酸素、硫黄、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ハロ、カルボキシル、ハロアルキル、ハロアルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、チオアルコキシ、アルケニルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ニトロ、アミノ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロヘテロシクリル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミン、アルキニルアミノ、アシル、アルケノイル、アルキノイル、アシルアミノ、ジアシルアミノ、アシルオキシ、アルキルスルホニルオキシ、ヘテロシクロキシ（heterocycloxy）、ヘテロシクロアミノ、ハロヘテロシクロアルキル、アルキルスルフェニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アシルチオ、リン含有基、例えばホスホニルおよびホスフィニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、シアノ、シアネート、イソシアネート、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アルキル）ならびに−Ｃ（Ｏ）Ｎ（アルキル）2から独立に選択される１種以上の基を指していてもよい。
【００２６】
本明細書で用いる「ヒドロキシル」という用語は、官能基−ＯＨを指す。
【００２７】
本明細書で用いる「アルコキシ」という用語は、直鎖または分枝アルキルオキシ基を指す。その例には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどが含まれる。
【００２８】
「チオール」という用語は−ＳＨを意味する。
【００２９】
「チオエーテル」という用語は、酸素が硫黄で置きかえられているエーテル基を指す。チオエーテル基には、これらに限定されないが、−アルキレン−Ｓ−アルキル、−アルキレン−Ｓ−アリール、−アルキレン−Ｓ−アリールアルキル、−アルキレン−Ｓ−アルキルアリール、−アリール−Ｓ−アルキル、−アリール−Ｓ−アリール、−アリール−Ｓ−アルキルアリール、−アリール−Ｓ−アリールアルキル、−アリールアルキル−Ｓ−アルキル、−アリールアルキル−Ｓ−アリール、−アリールアルキル−Ｓ−アルキルアリール、−アリールアルキル−Ｓ−アリールアルキル、−アルキルアリール−Ｓ−アルキル、−アルキルアリール−Ｓ−アリール、−アルキルアリール−Ｓ−アルキルアリールおよび−アルキルアリール−Ｓ−アリールアルキルが含まれる。チオエーテル基は、上述したような置換基で任意に置換されていてもよい。
【００３０】
本明細書の関連で用いるような「チオール付加体」という用語は、広範に解釈されるべきであり、これはチオエステル生成の触媒作用をするチオール（−ＳＨ−）を有する化合物を含む。
【００３１】
本明細書で用いる「求核試薬」という用語は、反応性電子対を有し、電子を供与することによって化学反応に参画する化学的部分を指す、すなわち、求核試薬は電子供与体化合物である。求核試薬は、ハロゲン、窒素、硫黄または酸素求核試薬であってよい。求核試薬の例には、とりわけ、フルオリド、シアニド、アイオダイド、クロリド、ブロミド、アセテート、エノラート、第一アミン、第二アミン、アミノ、アルコキシド、チオール、アルキルスルフィド（例えばメルカプタン）、ヒドロキシド、アジドおよびヒドラジンが含まれる。
【００３２】
本明細書で用いる「アミノ」という用語は、形態−ＮＲaまたは−ＮＲaＲbの基を指す。ここで、ＲaおよびＲbは、これらに限定されないが、水素、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシおよび任意に置換されたアリール基を含む基から独立に選択される。例えば、本明細書で用いる「アミノ」という用語は、式（Ｉ）の化合物のＲ2および／またはＲ3位にある−ＮＨ基、または式（Ｉ）の化合物のＴ位にある任意に置換された脂肪族基中の−ＮＨＣＨ3基を指すのに用いられていてもよい。
【００３３】
「脂肪族の」という用語は、直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基を指す。
【００３４】
「アルキル」という用語は、その意味の中に、１〜１０個の炭素原子、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の炭素原子を有する一価（「アルキル」）および二価（「アルキレン」）の直鎖または分枝鎖飽和脂肪族基を含む。例えば、アルキルという用語には、これらに限定されないが、メチル、エチル、１−プロピル、イソプロピル、１−ブチル、２−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、アミル、１，２−ジメチルプロピル、１，１−ジメチルプロピル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、４−メチルペンチル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、１，２，２−トリメチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、２−エチルペンチル、３−エチルペンチル、ヘプチル、１−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、３，３−ジメチルペンチル、４，４−ジメチルペンチル、１，２−ジメチルペンチル、１，３−ジメチルペンチル、１，４−ジメチルペンチル、１，２，３−トリメチルブチル、１，１，２−トリメチルブチル、１，１，３−トリメチルブチル、５−メチルヘプチル、１−メチルヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどが含まれる。
【００３５】
「低級アルキル」という用語は、１、２、３、４、５もしくは６個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状飽和炭化水素鎖を指す。この用語は、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどの基で例示される。
【００３６】
「アルケニル」という用語は、その意味の中に、２〜１０個の炭素原子、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素原子を有し、適切な場合アルキル鎖中のどこかにＥ、Ｚ、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓのいずれかの立体構造で少なくとも１個の二重結合を有する、一価（「アルケニル」）および二価（「アルケニレン」）の直鎖または分枝鎖不飽和脂肪族炭化水素基を含む。アルケニル基の例には、これらに限定されないが、エテニル、ビニル、アリル、１−メチルビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１，３−ペンタジエニル、２，４−ペンタジエニル、１，４−ペンタジエニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、２−メチルペンテニル、１−ヘプテニル、２−ヘプテニル、３−ヘプテニル、１−オクテニル、１−ノネニル、１−デセニルなどが含まれる。
【００３７】
「低級アルケニル」という用語は、２、３、４、５もしくは６個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状飽和炭化水素鎖を指す。
【００３８】
本明細書で用いる「アルキニル」という用語は、その意味の中に、２〜１０個の炭素原子を有し、炭素鎖中のいずれかに少なくとも１個の三重結合を有する一価（「アルキニル」）および二価（「アルキニレン」）の直鎖または分枝鎖不飽和脂肪族炭化水素基を含む。アルキニル基の例には、これらに限定されないが、エチニル、１−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−メチル−２−ブチニル、３−メチル−１−ブチニル、１−ペンチニル、１−ヘキシニル、１−メチルペンチニル、１−ヘプチニル、２−ヘプチニル、１−オクチニル、２−オクチニル、１−ノニル、１−デシニルなどが含まれる。
【００３９】
「低級アルキニル」という用語は、２、３、４、５もしくは６個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状飽和炭化水素鎖を指す。
【００４０】
本明細書で用いる「ヘテロ原子」または変形体、例えば「ヘテロ−」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）および硫黄（Ｓ）を指す。
【００４１】
本明細書で用いる「アリール」または変形体、例えば「芳香族基」または「アリーレン」という用語は、６〜１０個の炭素原子を有する芳香族炭化水素の単一、多核、共役および縮合残基を指す。アリール基の例には、これらに限定されないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチルなどが含まれる。
【００４２】
本明細書で用いる「ヘテロアリール」および変形体、例えば「ヘテロ芳香族基」または「ヘテロアリーレン」という用語は、その意味の中に、１〜６個の原子がＯ、Ｎ、ＮＨおよびＳから選択されるヘテロ原子である５〜２０個の原子を有する単一、多核、共役および縮合芳香族部分を含む。そうした基の例には、ピリジル、２，２’−ビピリジル、フェナントロリニル、キノリニル、チオフェニル、インドイル（ｉｎｄｏｙｌ）、フラニルおよびピロリル部分などが含まれる。
【００４３】
本明細書で用いる「シクロアルキル」という用語は、環状の飽和脂肪族基を指し、これはその意味の中に、３〜１０個の炭素原子、例えば３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の炭素原子を有する一価（「シクロアルキル」）および二価（「シクロアルキレン」）の飽和、単環式、二環式、多環式または縮合多環式炭化水素ラジカルを含む。シクロアルキル基には、これらに限定されないが、シクロプロピル、２−メチルシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、２−メチルシクロペンチル、３−メチルシクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれる。
【００４４】
本明細書で用いる「シクロアルケニル」という用語は、環状の不飽和脂肪族基を指し、これはその意味の中に、３〜１０個の炭素原子を有し、適切な場合アルキル鎖中のどこかにＥ、Ｚ、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓのいずれかの立体構造で少なくとも１個の二重結合を有する、一価（「シクロアルケニル」）および二価（「シクロアルケニレン」）の単環式、二環式、多環式または縮合多環式炭化水素ラジカルを含む。シクロアルケニル基の例には、これらに限定されないが、シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどが含まれる。
【００４５】
本明細書で用いる「ヘテロシクロアルキル」という用語は、その意味の中に、その１〜５個の環原子がＯ、Ｎ、ＮＨまたはＳから選択されるヘテロ原子である３〜１０個の環原子を有する一価（「ヘテロシクロアルキル」）および二価（「ヘテロシクロアルキレン」）の飽和、単環式、二環式、多環式または縮合炭化水素ラジカルを含む。その例には、ピロリジニル、ピペリジニル、キヌクリジニル、アゼチジニル、モルホリニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニルなどが含まれる。
【００４６】
本明細書で用いる「ヘテロシクロアルケニル」という用語は、その意味の中に、その１〜５個の環原子がＯ、Ｎ、ＮＨまたはＳから選択されるヘテロ原子である３〜１０個の環原子および少なくとも１つの二重結合を有する一価（「ヘテロシクロアルケニル」）および二価（「ヘテロシクロアルケニレン」）の飽和、単環式、二環式、多環式または縮合多環式炭化水素ラジカルを含む。
【００４７】
本明細書で用いる「ハライド」または変形体、例えば「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、フロリド、クロリド、ブロミドおよびアイオダイドを指す。
【発明の詳細な説明】
【００４８】
本発明の第１の側面は、以下の構造式を有するカルボキシアミド化合物を提供する。
【化５】
2013533254.tif 000007
【００４９】
｛式中、独立にｎ＝２または３であり、ｍ＝２または３であり、
ＲＣＯはアミノアシルもしくはペプチジル基である、またはＲは、水素、酸素、硫黄、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ハロ、カルボキシル、ハロアルキル、ハロアルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、チオアルコキシ、アルケニルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ニトロ、アミノ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロヘテロシクリル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミン、アルキニルアミノ、アシル、アルケノイル、アルキノイル、アシルアミノ、ジアシルアミノ、アシルオキシ、アルキルスルホニルオキシ、ヘテロシクロキシ、ヘテロシクロアミノ、ハロヘテロシクロアルキル、アルキルスルフェニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アシルチオ、リン含有基、例えばホスホニルおよびホスフィニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、シアノ、シアネート、イソシアネート、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アルキル）ならびに−Ｃ（Ｏ）Ｎ（アルキル）2から独立に選択される１種以上の基である｝
一態様では、ｎおよびｍの両方は２である。さらなる態様では、ｎ＝２であり、ｍ＝３である。さらなる態様では、ｎ＝３であり、ｍ＝２である。さらなる態様では、ｎおよびｍの両方は３である。
【００５０】
一態様では、Ｒ−ＣＯ−はアミノアシルまたはペプチジル基である。
【００５１】
本明細書で論じるように、本発明の化合物は、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成を用いて有利に調製することができる。したがって、本発明は、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成により本発明の化合物を合成するステップを提供する。
【００５２】
本発明の第２の側面では、以下の式を有するジアルキルアミン樹脂を提供する：
【化６】
2013533254.tif 000008
【００５３】
（式中：
【化７】
2013533254.tif 000009
【００５４】
（すなわち、式中の円形体）は樹脂または固体支持体を表し、
ｎ＝独立に２、３であり；ｍ＝独立に２、３であり、
Ｒ1はＨ、Ｆｍｏｃであり、
Ｒ2はＨまたは保護基、例えばＴｒｔ（トリチルまたはトリフェニルメチル）であり；
「リンカー」は、Ｆｍｏｃケミストリーに適合する任意のリンカーであり、ベンジル誘導体またはＴｒｔを含む）
一態様では、ｎとｍはどちらも２である。さらなる態様では、ｎ＝２であり、ｍ＝３である。さらなる態様では、ｎ＝３であり、ｍ＝２である。さらなる態様では、ｎとｍはどちらも３である。
【００５５】
本発明の第３の側面では、以下の式を有するジアルキルアミン樹脂を提供する。：
【化８】
2013533254.tif 000010
【００５６】
（式中、ｎ＝２、３であり、ｍ＝２、３であり、
Ｒ1＝Ｈ、Ｆｍｏｃであり、
Ｒ2＝Ｔｒｔであり、
【化９】
2013533254.tif 000011
【００５７】
（すなわち、式中の円形体）は樹脂または固体支持体を表す）
一態様では、ｎおよびｍの両方は２である。さらなる態様では、ｎ＝２であり、ｍ＝３である。さらなる態様では、ｎ＝３であり、ｍ＝２である。さらなる態様では、ｎおよびｍの両方は３である。
【００５８】
本発明の第４の側面では、以下の構造式を有する化合物を提供する。
【化１０】
2013533254.tif 000012
【００５９】
｛式中、独立に、ｎ＝２または３であり、ｍ＝２または３であり、
ＲＣＯはアミノアシルもしくはペプチジル基である、またはＲは、水素、酸素、硫黄、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ハロ、カルボキシル、ハロアルキル、ハロアルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、チオアルコキシ、アルケニルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ニトロ、アミノ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロヘテロシクリル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミン、アルキニルアミノ、アシル、アルケノイル、アルキノイル、アシルアミノ、ジアシルアミノ、アシルオキシ、アルキルスルホニルオキシ、ヘテロシクロキシ、ヘテロシクロアミノ、ハロヘテロシクロアルキル、アルキルスルフェニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アシルチオ、リン含有基、例えばホスホニルおよびホスフィニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、シアノ、シアネート、イソシアネート、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アルキル）ならびに−Ｃ（Ｏ）Ｎ（アルキル）2から独立に選択される１種以上の基である｝
本発明の一態様では、本明細書で説明するジアルキルアミン樹脂は、少なくとも１種の本明細書で説明するようなアミノ酸、アミノアシル基またはペプチジル基をさらに含む。
【００６０】
本発明の化合物または樹脂は、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の合成方法において有用性が見出されると予想される。したがって、本発明の第５の側面は、本明細書で説明するような化合物または本明細書で説明するような樹脂を含むペプチド合成方法を提供する。同様に、本発明の第６の側面では、本明細書で説明するような化合物または本明細書で説明するような樹脂を含むタンパク質合成方法を提供する。
【００６１】
一態様では、第５または第６の側面の方法は、ＮＣＬにおける本明細書で説明するような化合物または樹脂の使用を含む。本発明の化合物または樹脂はＮＣＬにおいて直接使用することができ、したがって少なくとも一部の態様では、その化合物および樹脂をそのように用いることができる。
【００６２】
一態様では、本発明の第５または第６の側面の方法は、少なくとも３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０または８０個のアミノ酸長のペプチドの合成を含む。
【００６３】
本発明の第５または第６の側面の方法は、それぞれペプチドまたはタンパク質を精製および取得するステップをさらに含んでいてもよい。
【００６４】
本発明の第７の側面では、以下のステップ、すなわち：
（ｉ）以下の式（Ａ）をｏ−ＮＯ2ＰｈＳＯ2−Ｃｌ、ＤＩＥＡおよびＣＨ2Ｃｌ2−ＤＭＦと反応させて式（Ｂ）
【化１１】
2013533254.tif 000013
【００６５】
を得るステップと、
（ii）式（Ｂ）をアルキル化し、スルホニル基をチオール除去して式（Ｃ）
【化１２】
2013533254.tif 000014
【００６６】
を得るステップと
を含む、本明細書で説明するようなジアルキルアミン樹脂を製造するためのプロセスを提供する。
【００６７】
ジアルキルアミン樹脂は、ジアルキルアミン、ＨＳ（ＣＨ2）mＮＨ（ＣＨ2）nＳＨをトリチル樹脂に直接ロードすることによって製造することもできる。
【００６８】
本発明の一態様では、ジアルキルアミン樹脂を製造するためのプロセスは、Ｆｍｏｃ  ＳＳＰＳのステップ、続く切断によって式（Ｄ）を得るステップをさらに含む：
【化１３】
2013533254.tif 000015
【００６９】
（式中、ｎ＝２または３であり、ｍ＝２または３であり；ＲＣＯはアミノアシルもしくはペプチジル基である、またはＲは、水素、酸素、硫黄、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ハロ、カルボキシル、ハロアルキル、ハロアルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、チオアルコキシ、アルケニルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ニトロ、アミノ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロヘテロシクリル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミン、アルキニルアミノ、アシル、アルケノイル、アルキノイル、アシルアミノ、ジアシルアミノ、アシルオキシ、アルキルスルホニルオキシ、ヘテロシクロキシ、ヘテロシクロアミノ、ハロヘテロシクロアルキル、アルキルスルフェニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アシルチオ、リン含有基、例えばホスホニルおよびホスフィニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、シアノ、シアネート、イソシアネート、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アルキル）および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（アルキル）2から独立に選択される１種以上の基である）
一態様では、ｎおよびｍの両方は２である。さらなる態様では、ｎ＝２であり、ｍ＝３である。さらなる態様では、ｎ＝３であり、ｍ＝２である。さらなる態様では、ｎおよびｍの両方は３である。
【００７０】
本発明の第８の側面では、Ｃ末端三級Ｎ，Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−アミド基；Ｎ−（２−メルカプトエチル）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−アミド基またはＮ，Ｎ−ビス（３−メルカプトプロピル）−アミドを含むペプチドを製造するためのプロセスであって、本明細書で説明するようなジアルキルアミン樹脂を提供するステップを含むプロセスを提供する。さらなる態様では、このプロセスは、Ｃ末端三級Ｎ，Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−アミド基；Ｎ−（２−メルカプトエチル）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−アミド基またはＮ，Ｎ−ビス（３−メルカプトプロピル）−アミド基を含むペプチドを精製および取得するステップをさらに含む。
【００７１】
本明細書で説明する本発明の一態様では、ペプチドを製造するためのこのプロセスはＦｍｏｃ固相ペプチド合成を含む。したがって、本発明の第５、第６および第８の側面はＦｍｏｃ固相ペプチド合成を含んでいてもよい。
【００７２】
そのプロセスが本明細書で説明するペプチドを製造するためであり、そのプロセスがＦｍｏｃ固相ペプチド合成を含み、そのプロセスが本明細書で説明するようなジアルキルアミン樹脂を提供するステップを含む本発明の態様では、Ｒ2はＴｒｔである。
【００７３】
さらなる態様では、本明細書で説明するようなペプチドまたはタンパク質を製造するためのプロセス（例えば、本発明の第５、第６および第８の側面による）は、ネイティブケミカルライゲーションを含む。本明細書で論じるように、チオエステル転換に先行するステップを何ら必要とすることなく、ＮＣＬを好都合に実施することができる。
【００７４】
一態様では、ネイティブケミカルライゲーションのｐＨは３〜７、例えばｐＨは４〜６である。さらなる態様では、ネイティブケミカルライゲーションの反応温度は２０℃〜５０℃、例えば２５℃〜５０℃または３０℃〜４５℃である。
【００７５】
本発明の化合物または樹脂はＮＣＬにおいて直接使用することができ、したがって少なくとも一部の態様では、化合物および樹脂をそのように使用することができる。
【００７６】
本発明の第５、第６および第８の側面の一態様では、その方法は少なくとも２つのライゲーションステップを含む。ライゲーションの方法はＮＣＬを含み、ＢＭＥＡ部分を用いる場合、ＢＭＥＡ媒介ライゲーションを含む（当業者は、ｎおよびｍの少なくとも１つまたはその両方が３である場合、同等のライゲーション法を用いてもよいことを理解されよう）。好ましくは、ライゲーションのためのｐＨは３〜７、例えばｐＨは４〜６である。
【００７７】
一態様では、ライゲーションステップの少なくとも１つはＮＣＬである（例えば、少なくとも第１のライゲーションステップ）。
【００７８】
ライゲーションの第２のステップについての選択肢は：（ｉ）ライゲーション生成物をチオエステルに転換させるステップ、ならびにチオエステルとＣ末端ｃｙｓ−ペプチドとのＮＣＬを実施するステップ；および（ii）ライゲーション生成物を、ｃｙｓ−ペプチドとインサイチュで直接反応させるステップを含む。任意に、１つ以上のさらなるライゲーションステップが付随してもよい。
【００７９】
一態様では、本発明の第５、第６および第８の側面は、ネイティブケミカルライゲーションとペプチジルＮ，Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−アミド媒介ライゲーションとの組合せによる、ＮからＣへの逐次的ライゲーションを含む。
【００８０】
本発明の第５、第６および第８の側面の一態様では、この方法は、図２１に示すようなスキームによるＮからＣへの逐次的ライゲーションを含む。
【００８１】
本発明のさらなる側面は、本発明の第５、第６、第８または第９の側面の方法によって得られるペプチド（ポリペプチドおよびタンパク質を含む）を含む。本発明にしたがって製造されるペプチドまたはタンパク質には、１つ以上の処理および／または精製のステップを任意に施してもよい。例えば、ライゲーション結合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の１つ以上（および任意にすべて）での１つ以上の（および任意にすべての）システイン残基を、他のアミノ酸残基に転換させてもよい。フリーラジカル媒介脱硫を、そうしたプロセスにおいて用いてもよい。他の処理ステップは、例えばその天然状態（ｎａｔｉｖｅ  ｓｔａｔｅ）へのペプチドまたはタンパク質の折り畳みを含んでいてもよい。これは、例えば透析で実施してもよい。処理および／または精製ステップは任意の順序で行ってもよい。一部の態様では、精製が１つ以上の処理ステップの後に続く。一部の態様では、１つ以上の処理ステップが精製の後に続く。
【００８２】
本明細書で説明するペプチドの製造のためのプロセスまたはペプチド合成の方法の一態様では、このプロセスは、チオール付加体の付加をさらに含む。ここで、チオール付加体は、アルキルチオール、ベンジルメルカプタン、ＭＥＳＮａ、メチルメルカプトアセテートまたは他のチオール化合物である。
【００８３】
本明細書で説明するペプチドの製造のためのプロセスまたはペプチド合成の方法のさらなる態様では、その方法またはプロセスは、マイクロ波照射の使用を含む。
【００８４】
本明細書で説明するペプチドの製造のためのプロセスまたはペプチド合成の方法のさらなる態様では、Ｃ末端アミノ酸は、ＡＬＡ、ＡＲＧ、ＡＳＮ、ＡＳＰ、ＣＹＳ、ＧＬＵ、ＧＬＮ、ＧＬＹ、ＨＩＳ、ＬＥＵ、ＬＹＳ、ＭＥＴ、ＰＨＥ、ＰＲＯ、ＳＥＲ、ＴＲＹもしくはＴＹＲである、またはＲＣＯ基はＡＬＡ、ＡＲＧ、ＡＳＮ、ＡＳＰ、ＣＹＳ、ＧＬＵ、ＧＬＮ、ＧＬＹ、ＨＩＳ、ＬＥＵ、ＬＹＳ、ＭＥＴ、ＰＨＥ、ＰＲＯ、ＳＥＲ、ＴＲＹもしくはＴＹＲのアミノアシル基である。例えば、Ｃ末端アミノ酸またはＲＣＯ基は、アミノ酸ＧＬＹ、ＡＬＡ、ＳＥＲ、ＰＨＥ、ＬＥＵ、ＭＥＴ、ＡＳＮ、ＴＹＲ、ＴＲＰもしくはＬＹＳまたはそのアミノアシル基である。
【００８５】
本発明の第９の側面では、例えば以下の反応スキームで示すような、酸性溶液（Ｈ＋）での本明細書で説明するような化合物とチオール含有化合物（Ｒ’ＳＨ）と０の交換反応を含むチオエステルペプチド合成方法を提供する：
【化１４】
2013533254.tif 000016
【００８６】
（式中、独立に、ｎ＝２または３であり、ｍ＝２または３であり、ＲＣＯはアミノアシルもしくはペプチジル基である、またはＲは、水素、酸素、硫黄、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ハロ、カルボキシル、ハロアルキル、ハロアルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、チオアルコキシ、アルケニルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ニトロ、アミノ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロヘテロシクリル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミン、アルキニルアミノ、アシル、アルケノイル、アルキノイル、アシルアミノ、ジアシルアミノ、アシルオキシ、アルキルスルホニルオキシ、ヘテロシクロキシ、ヘテロシクロアミノ、ハロヘテロシクロアルキル、アルキルスルフェニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アシルチオ、リン含有基、例えばホスホニルおよびホスフィニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、シアノ、シアネート、イソシアネート、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アルキル）および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（アルキル）2から独立に選択される１種以上の基である）
一態様では、ｎおよびｍの両方は２である。さらなる態様では、ｎ＝２であり、ｍ＝３である。さらなる態様では、ｎ＝３であり、ｍ＝２である。さらなる態様では、ｎおよびｍの両方は３である。
【００８７】
一態様では、チオール含有化合物は、３−メルカプトプロピオン酸、ベンジルメルカプタン、メチルメルカプトアセテートまたはＭＥＳＮａである。
【００８８】
本発明のチオエステルペプチドは、ＮＣＬのため、または他の用途のために使用することができる。
【００８９】
上述したように、ＢＭＥＡ／ＢＭＥＡ部分について様々な参照が本明細書でなされるが、本発明はそうした部分に限定されることはなく、したがって、本明細書でのＢＭＥＡ／ＢＭＥＡ部分への参照は、文脈で別段の表示のない限り、変更すべきところは変更して、本明細書で教示されるようなＢＭＥＡ／ＢＭＥＡ部分の変形体に適用される。この関連において、我々は、メルカプトエチルアミンを置きかえるためにシステインを使用する新規なＢＭＥＡ変形体を設計した。そのカルボキシル基を、変形体をリンクアミド樹脂または他の樹脂のタイプに付加させるために使用することができる：
【化１５】
2013533254.tif 000017
【００９０】
したがって、本発明の上述の側面において、システインをメルカプトエチルアミンに置きかえたＢＭＥＡ変形体を、ＢＭＥＡ部分の代わりに使用していてもよい。
【００９１】
本発明の第１０の側面は、ネイティブケミカルライゲーションのためのチオール付加体としてのメチルメルカプトアセテートの使用を含む。
【００９２】
本発明は、その範囲内に、すべてのジアステレオマー異性体、ラセミ化合物および鏡像異性体を含む、本明細書で開示する化合物のすべての異性体を包含する。したがって、式（Ｉ）の化合物およびその誘導体は、それぞれの場合において必要に応じて、例えばその化合物のＥ、Ｚ、ｃｉｓ、ｔｒａｎｓ、（Ｒ）、（Ｓ）、（Ｌ）、（Ｄ）、（＋）および／または（−）の形態を含むものと理解すべきである。
【００９３】
別段の指定のない限り、「含む（comprising）」および「含む（comprise）」という用語ならびにその文法的変形体は、「開放形（open）」または「包含形（inclusive）」の言語を表し、したがってこれらは、言及された要素を含むが、また言及されていない追加的な要素の包含も許容するものとする。
【００９４】
本発明の非限定的な例を、具体的な例を参照することによってより詳細にさらに説明するが、これらの例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでは全くない。
【００９５】
［例］
例１
結果および考察
ペプチドＮ，Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−アミドの合成。スキーム２に示すようなＣ末端ＢＭＥＡペプチド１を合成するため、我々は、直接的反応ステップ（スキーム３）で調製したビス（２−メルカプトエチル）アミン誘導トリチル樹脂５を設計した。したがって、（２−アミノエチル）スルファニル−トリチル樹脂３を、ｏ−ニトロベンゼンスルホニルクロリドと反応してスルホンアミド樹脂４を得た。光延反応によりスルホンアミドをＴｒｔ−ＳＣＨ2ＣＨ2ＯＨでアルキル化し、続いてスルホニル基をチオール除去して、最後にジアルキルアミン樹脂５を得た。これはＦｍｏｃ  ＳＰＰＳで使用する準備ができている。
【化１６】
2013533254.tif 000018
【００９６】
スキーム３．Ｃ末端Ｎ，Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−アミド（ＢＭＥＡ）ペプチドの合成。（ａ）ｏ−ＮＯ2ＰｈＳＯ2−Ｃｌ、ＤＩＥＡ、ＣＨ2Ｃｌ2−ＤＭＦ；（ｂ）Ｔｒｔ−ＳＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、Ｐｈ3Ｐ、ＤＥＡＤ、ＴＨＦ−ＣＨ2Ｃｌ2；（ｃ）ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、ＤＢＵ、ＤＭＦ。
【００９７】
第１のＦｍｏｃ−アミノ酸の樹脂５へのローディングを、最小のラセミ化リスクで、立体的に障害のある２°アミンに効果的であることが公知のＤＩＣ／ＨＯＡｔ、カップリングプロトコルを用いて実行した。続くペプチド鎖の構築を、標準的なＳＰＰＳ手順を用いて実施した。その不活性な性質のため、三級アミド結合は、Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳの間完全に安定である。
【００９８】
Ｃ−ｔｅｒ  Ｇｌｙ  ＢＭＥＡペプチドを用いたモデル試験。我々のＢＭＥＡ媒介ライゲーション法を試験するため、最初に、Ｃ末端残基−ＬＫＳＦＧとしてＧｌｙを有する小さいＢＭＥＡペプチドを調製した。ＨＰＬＣ分析から、粗生成物は優れた品質のものであった（図１）。興味深いことにＨＰＬＣプロフィールから、約１：５の比で２つのピークが見られた。小さいピークは、ＢＭＥＡ部分に遊離アミンを有しており、より親水性であると予測され、ＨＰＬＣにおいてより早期に溶出するチオエステル形態のようであり、大きいピークはアミドの形態であった。第１または第２のピークを分離しＨＰＬＣで再分析すると、同じ２つのピークパターンが現れた。これは、チオエステル形態とアミド形態とがＨＰＬＣ緩衝液（ｐＨ約２）中ですばやく交換されていることを示唆している。Ｎ−Ｓアシル転移が、これらの比較的酸性の条件下で、このＢＭＥＡペプチドで容易に起こり得ることを明らかに示しているため、この結果は非常に勇気づけられるものであった。実際、このペプチドを、Ｈ2Ｏ中の２０％メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）で処理した場合、室温で８ｈ後に８５％を超える収率でＭＰＡチオエステルが得られた。Ｎ−アルキルシステイン法での従来の試験で、室温で２日間反応させた後、ＭＰＡとのチオール交換により約２０％のチオエステル生成物が得られた。これらの結果は、アミド窒素上での２つのＨＳ−Ｅｔ基の存在が、Ｎ−アルキルシステイン系と比較して、ＢＭＥＡのチオエステル化能を著しく増大させていることを示している。
【００９９】
我々は次に、個別的なチオール−交換反応およびそのチオエステル生成物精製ステップを省き、ＢＭＥＡペプチドを直接ＮＣＬに使用できるかどうかを試験しようとした。これは理想的なことであり、我々の本研究の焦点でもある。反応のための最適のｐＨ範囲を見出すために、我々は最初に、チオール付加体としてベンジルメルカプタン（１％）を用いて、異なるｐＨでＬＫＳＦＧ−（ＮＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2（５ｍＭ）とＣＬＫＦＡ（１５ｍＭ）のライゲーションを実施した。反応温度は３７℃であった。我々は、反応をｐＨ４、５および６で実施した場合、ライゲーションの割合はおおよそ同じであり、２４ｈ後に、ＢＭＥＡペプチドの約７５％が消費されてライゲーション生成物を生成することを見出した。しかし、ｐＨ６で副生成物の若干の増加が見られた（データは示されていない）。ｐＨをさらに７および８に上昇させると、相当な副反応が検出され、同時に反応収率が低下した。ＨＰＬＣでそれほどの量のＢＭＥＡチオエステルまたはベンジルチオエステルが認められなかったので、Ｎ−から−Ｓへのアシル転移が律速段階速度であるようであり、これは、それが生成されるやいなやこれらのチオエステルがシステイニルペプチドＣＬＫＦＡと急速に反応したことを示唆している。
【０１００】
次いで我々はｐＨ５を選択して、異なる温度でライゲーション反応を実施した。我々は、室温では反応はより遅く、２４ｈで約５０％のＢＭＥＡペプチドの消費割合であることを見出した。他方、反応を４２℃で実施した場合、８ｈで５０％消費を観察した。２４ｈ反応させた後、すべてのＢＭＥＡペプチドは反応した。
【０１０１】
我々は、ＭＥＳＮＡ（ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＳＯ3Ｎａ）がライゲーション反応のためのより良いチオール付加体であることも見出した。図３から分かるように、反応を３７℃、ｐＨ５で実施した場合、２％（ｗ／ｖ）ＭＥＳＮＡの存在下で８ｈ後、収率は８０％以上であった。
【０１０２】
図４から分かるように、我々は、マイクロ波照射が反応を大幅に加速できることも見出した。基本的に、正確に４ｈの反応で９０％を超える収率が得られた。
【０１０３】
他のモデル試験−ＢＭＥＡペプチドの反応範囲。上記データは、Ｃ末端ＢＭＥＡを有するペプチドを、インサイチュでシステイニルペプチドでライゲーションされ得るチオエステルへ容易に転換できることを明らかに示している。このＢＭＥＡ系の範囲を検討するために、次いで我々は、異なるＣ末端アミノ酸残基、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＰｈｅおよびＶａｌをそれぞれ有する他の４つの小さいＢＭＥＡペプチドを合成した（表１）。次いでこれらのペプチドを、マイクロ波照射下、ＣＬＫＦＡでライゲーションするのに使用した。結果を表１にまとめた。
【表１】
2013533254.tif 000019
【０１０４】
表１から、以下の結論を引き出すことができる。Ｃ末端Ａｌａ、ＳｅｒまたはＰｈｅを有するＢＭＥＡペプチドの反応効率は、立体障害に起因してＧｌｙのそれより低いが、すべての反応は１０ｈ後には殆んど完了していた。６ｈ後でわずか５％の生成物しか生成していないので、Ｃ−ｔｅｒ  Ｖａｌは反応に非常に不利なようである。以前に、Ｃ−ｔｅｒ  Ｖａｌチオエステルはネイティブケミカルライゲーションを行うことができることが文献で実証されているので、ＢＭＥＡペプチドＬＫＳＦＶの低反応性は、Ｎ−から−Ｓへのアシル転移反応を施すことが困難であることに起因するはずである。それにもかかわらず、これらの結果は、立体的に非常に障害のあるβ−分枝アミノ酸、例えばＶａｌを除いて、ＢＭＥＡペプチドのライゲーションが、Ｃ末端位で大部分のアミノ酸を許容できることを示している。これは、ネイティブケミカルライゲーションのための三級アミドＢＭＥＡ系の広範な応用範囲を実証している。
【０１０５】
ヒストンＨ３タンパク質の合成。上記モデル試験でＢＭＥＡペプチドをＮＣＬに直接使用できることが確認されたので、次いで我々はこの方法のタンパク質合成への適用を進めた。Ｈ３のＮ末端ペプチドおよびそのＣ末端球状ドメインのライゲーションによるヒストンＨ３タンパク質の半合成を実証した。Ｈ３のＮ末端１３残基配列に対応する２つのペプチド、Ｈ３（１−１３）およびＨ３（１−１３）／Ｋ４ｍｅをＣ末端ＢＭＥＡアミドとして合成し、Ｎ−ｔｅｒ  Ｃｙｓ、Ｈ３（１４−１３５）Ｋ１４Ｃを有するＨ３球状ドメインを、大腸菌（E. coli）における過剰発現により組み換え技術によって調製した。ライゲーション反応を、６Ｍ  Ｇｄｎ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＴＣＥＰ、２％（ｗ／ｖ）ＭＥＳＮＡおよび２％（ｗ／ｖ）チオフェノールナトリウム塩を含む緩衝液（ｐＨ６）中で実施した。凍結乾燥したＨ３（１４−１３５）／Ｋ１４Ｃを、２ｍＭの最終濃度でこのライゲーション緩衝液に溶解し、３当量のＨ３（１−１３）−ＢＭＥＡおよびＨ３（１−１３）／Ｋ４ｍｅ−ＢＭＥＡとそれぞれ反応させた。反応物を３７℃で２４〜４８時間インキュベートした。ライゲーション反応をＣ８解析的ＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。ライゲーション反応のＨＰＬＣ分析および質量スペクトルデータを図５に示した。
【０１０６】
ＨＰＬＣ条件：２５ｍｉｎで緩衝液Ａ中に０％〜５０％の緩衝液Ｂ。緩衝液Ａ、続いて２０ｍｉｎで緩衝液Ａ中に５０％〜６０％緩衝液Ｂ。緩衝液Ａ：Ｈ2Ｏ中の０．３％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：Ｈ2Ｏ中の０．３％ＴＦＡおよび９０％アセトニトリル。１はライゲーション生成物であり、２は非ライゲーション（ｕｎｌｉｇａｔｅｄ）Ｈ３（１４−１３５）／Ｋ１４Ｃである。
【０１０７】
図５Ａおよび図５Ｂから、２４時間後、７０％超のＨ３（１４−１３５）／Ｋ１４ＣがＨ３（１−１３）またはＨ３（１−１３）／Ｋ４ｍｅとライゲーションされていることが分かる。これらの結果は、ＢＭＥＡ法を合成巨大タンパク質、例えばヒストンにも適用できることを示している。合成されたＨ３タンパク質は、他の３つのヒストンタンパク質、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ２Ｂとヒストンオクタマーを形成するその能力において十分に機能的であった。図６から分かるように、発現野生型Ｈ３、合成野生型Ｈ３およびＫ４ｍｅ改変での合成Ｈ３の間でオクタマー形成の効率において有意差はなかった。また、オクタマー複合体は２Ｍ  ＮａＣｌ溶液中で安定であった。
【０１０８】
結論
Ｃ末端ＢＭＥＡペプチドの設計は、Ｎ−から−Ｓへのアシル転移のエネルギー障壁を克服して対応するＣ末端チオエステルの形成を容易にすることが示された。過渡的に形成されるとはいえ、チオエステルは、システイニルペプチドライゲーションパートナーとの直接反応のためのその捕獲を可能にするのに十分な長さの寿命を有している。この反応系は広範なＣ末端アミノ酸残基に適用可能であり、その幅広い有用性を指し示している。ヒストンＨ３タンパク質の合成の首尾よい実証は、合成タンパク質化学におけるＢＭＥＡ法の実用的価値を立証するものであり、化学生物学およびタンパク質薬物の発見におけるツールキットへの重要な追加であることを示している。さらに、非常に使用し易いので、本発明の重要な利点はその簡単さである。これはまたより効率的でもあり、ＢＭＥＡペプチドをネイティブケミカルライゲーションで直接使用するのを可能にしている。
【０１０９】
材料および方法
アミノ酸、カップリング試薬およびトリチル樹脂はＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）およびＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。すべての化学試薬は市場の供給業者から購入した。
【０１１０】
Ｔｒｔ−ＳＣＨ2ＣＨ2ＯＨの合成。０．１当量ＢＦ3．Ｅｔ2Ｏを滴下しながら、ＤＣＭ中の１当量Ｔｒｔ−ＣｌをＤＣＭ中の１当量２−メルカプトエタノールに添加した。反応物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を水でクエンチし、ＤＣＭで２回抽出した。ＤＣＭ抽出物を一緒にし、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で脱水し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。
【化１７】
2013533254.tif 000020
【０１１１】
５当量の２−ニトロベンゼン−１−スルホニルクロリドおよび５当量のＤＩＥＡをＤＣＭ／ＤＭＦに溶解し、反応容器中の１当量のＮＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｓ−Ｔｒｔ−樹脂に加えた。樹脂混合物を室温で２時間振とうさせ、続いてＤＭＦ（３×）およびＤＣＭ（３×）で洗浄した。
【化１８】
2013533254.tif 000021
【０１１２】
５当量のトリフェニルホスフィンおよび５当量のＤＥＡＤを無水ＴＨＦに溶解し、次いで無水ＤＣＭ中の５当量のＴｒｔＳＣＨ2ＣＨ2ＯＨを加えた。全溶液を、２−ニトロベンゼン−１スルホニル−ＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｓ−Ｔｒｔ樹脂を入れた反応容器に加えた。樹脂混合物を室温で３時間振とうさせ、続いて無水ＤＣＭ（３×）で洗浄した。この工程をもう２回繰り返した。
【０１１３】
ＴｒｔＳＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｓ−Ｔｒｔ−樹脂。１０当量のＤＢｕと２０当量の２−メルカプトエタノールをＤＭＦ中で混合し、上記反応容器に加えた。容器を室温で終夜振とうさせ、続いてＤＭＦ（３×）およびＤＣＭ（３×）で洗浄した。
【０１１４】
Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳによるＢＭＥＡペプチドの合成
第１のアミノ酸残基の付加
４当量のＨＯＡＴ、４当量のＤＩＣおよび４当量のＦｍｏｃアミノ酸（それぞれＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ）を無水ＤＣＭ／ＤＭＦに溶解し、反応容器に加えた。樹脂混合物を室温で２時間振とうさせ、続いてＤＭＦ（３×）およびＤＣＭ（３×）で洗浄した。
【０１１５】
ペプチド伸長を、標準的なＦｍｏｃ  ＳＰＰＳプロトコルを用いて実施した。ペプチドを、２％（ｖ／ｖ）Ｈ2Ｏ、１．５％（ｖ／ｖ）Ｔｉｓ、１．５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールおよび９５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡにより室温で１ｈｒかけて樹脂から切断し、続いてエチルエーテルによる沈澱にかけた。次いで粗製ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
【０１１６】
ヒストンＨ３合成。
【０１１７】
プラスミドｐＥＴ−３ｄ−Ｈ３（１４−１３５）／Ｋ１４Ｃ過剰発現系の構築。アフリカツメガエル（Xenopus laevis）ヒストンＨ３遺伝子を含むプラスミドｐＥＴ−３ｄを標的遺伝子の供給源とした。最初に、野生型アフリカツメガエルヒストンＨ３遺伝子を、順方向プライマー５’−ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  −３’および逆方向プライマー  ５’−ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  −３’を用いた部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により、Ｃｙｓ１１０〜Ａｌａで変異させた。用いた条件は、９５℃で３０ｓ、９５℃で３０ｓを１８サイクル、５５℃で１ｍｉｎおよび６８℃で６ｍｉｎのサイクルであった。変異遺伝子を、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＣａＣｌ2コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換し、増幅させた。野生型とここで称する増幅プラスミドｐＥＴ−３ｄ−Ｈ３／Ｃ１１０Ａをプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、ｐＥＴ−３ａ−Ｈ３／Ｃ１１０Ａをもとにして第２の変異を実行してアミノ酸残基１−１３を取り除いた。第２の変異のための順方向および逆方向プライマーはそれぞれ：５’−ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  −３’および５’−ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＧＣＧ  ＧＧＧ  ＡＧＣ  ＧＣＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＴＡＴ  ＡＴＣ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＡＡＧ  −３’であった。変異誘発条件は第１の変異と同じであった。変異遺伝子を、ＣａＣｌ2コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換させた。
【０１１８】
組み換えヒストンＨ３（１４−１３５）／Ｋ１４Ｃの過剰発現および精製。細胞を、１Ｌ中に１６ｇバクトトリプトン、１０ｇイースト抽出物、１０ｇ  ＮａＣｌ、１００ｍｇアンピシリ、２５ｍｇクロラムフェニコールを含む２×ＴＹ培地中で成長させた。細胞のＯＤ600nmが０．６〜０．８に達した後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を加えて０．５ｍＭの最終濃度にし、培養物をさらに２ｈインキュベートした。培養された細胞を、６０００ｒｐｍ、室温で１０ｍｉｎ遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、ＪＡ−１０ローター）にかけて収穫した。細胞を洗浄用緩衝液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、−２０℃で貯蔵した。
【０１１９】
細胞懸濁液を水浴中、３７℃で解かした。細胞溶解物に、マイクロフルイダー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｅｒ）で剪断をかけた。粗製細胞抽出物を２０，０００×ｇ、４℃で３０ｍｉｎ遠心分離にかけた（ＨＥＲＭＬＥ、Ｚ３６ＨＫ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ペレットを、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む洗浄用緩衝液中で２回再懸濁し遠心分離にかけて洗浄して、細胞残屑および不純物を除去した。洗浄用緩衝液で再度洗浄して洗剤を除去した。次いで残留ペレットを、室温で１時間洗浄用緩衝液中の６Ｍ  Ｇｄｎ−ＨＣｌに溶解した。遠心分離ですべての不溶性物質を除去した後、上澄みを、緩衝液Ａ（０．０５％ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ）中に０％〜５０％の緩衝液Ｂ（９０％ＡＣＮ／０．０５％ＴＦＡ）の勾配で２５ｍｉｎ、次いで８０％の勾配で４０ｍｉｎ、１０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＣ１８ｐｒｅｐ  ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製されたタンパク質を凍結乾燥し、分子量をＭＡＬＤＩ−ＭＳで測定した。
【０１２０】
組み換えヒストンタンパク質（野生型）の発現および精製。アフリカツメガエルヒストンＨ２Ａ、Ｈ２ＢおよびＨ４遺伝子を含むプラスミドｐＥＴ−３ａならびにＨ３遺伝子を含むｐＥＴ−３ｄをＤｒ．Ｃ．Ａ．Ｄａｖｅｙのラボから入手した。プラスミドを、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ  ＣａＣｌ2−コンピテント細胞中に形質転換させた。細胞を、１Ｌ中に１６ｇバクトトリプトン、１０ｇイースト抽出物、１０ｇ  ＮａＣｌ、１００ｍｇアンピシリ、２５ｍｇクロラムフェニコールを含む２×ＴＹ培地中で成長させた。０．５ｍＭ  ＩＰＴＧによる誘導はＯＤ600nm＝０．６〜０．８であった。誘導は３７℃で３ｈであった。細胞を、６０００×ｇ、室温で１０ｍｉｎ遠心分離にかけて収穫した。細胞ペレットを洗浄用緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、−２０℃で貯蔵した。ヒストンタンパク質を、切断したヒストンＨ３（１４−１３５）／Ｋ１４Ｃと同じ仕方で抽出し精製した（節８．２を参照されたい）。
【０１２１】
ヒストンオクタマーの生成および精製。４つのヒストンを等モル量（それぞれおおよそ１ｍｇ）で、変性（unfolding）緩衝液（７Ｍ  Ｇｄｎ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＤＴＴ）中に２ｍｇ／ｍＬの最終濃度で個別に溶解した。ヒストンタンパク質Ｈ３については２０ｍＭのＤＴＴを加えなければならなかった。３０ｍｉｎ変性した後、４つのタンパク質を一緒に混合した。混合溶液を、６００ｍＬの再折り畳みされた緩衝液（２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）に対して４℃で透析した。透析をそれぞれ少なくとも４ｈかけて、３回実施した。透析の間に生成した沈澱物質を、２０，０００ｇ、室温で１０ｍｉｎ遠心分離にかけて除去した。上澄みをＡｍｉｃｏｎ濃縮器（１０ｋＤａのＭＷカットオフ）で濃縮し、再折り畳みされた緩衝液で予め平衡化させた２６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００カラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。画分を集め、１８％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。精製されたオクタマー溶液を等容積のグリセロールと混合し、−２０℃で貯蔵した。
【０１２２】
例２
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）およびケミカルライゲーション法、特に注目すべきネイティブケミカルライゲーションの開発12によって、ペプチドおよびタンパク質化学合成に大変革がもたらされ、タンパク質の生化学的および生物物理学的研究が劇的に促進された。ケミカルライゲーション法を用いたタンパク質の全化学合成のためには、ＳＰＰＳで効率的に調製できるペプチドの長さの制約に起因して、２つの断片は通常、平均的なサイズのタンパク質の全長をカバーするのに十分ではない。したがって、複数の断片の逐次的または収束的縮合が必要である。
【０１２３】
逐次的合成に関しては、これをＣ末端からＮ末端へまたはその逆方向のいずれかで実施することができる。ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）を用いてＣからＮへタンパク質を合成する場合、望ましくないライゲーションを阻止するためにすべての内部チオエステル断片のＮ末端システイン残基を保護する必要がある。その保護ステップは、既存のアミノ酸側鎖に化学側鎖を付加する保護基、例えば一般に使用されるｔ−ブトキシカルボニル（Ｔ−Ｂｏｃ）の使用を含む。完全長のペプチドを合成した後、元のアミノ酸側鎖に復帰させるために、Ｔ−Ｂｏｃを取り外すことが必要となる。しかし、そうした脱保護ステップは、非常に有害な強酸（フッ化水素酸、塩酸等）を用いたＴ−Ｂｏｃの取り外しを伴うことになり、これは多くの研究所におけるＴ−Ｂｏｃの使用を妨げている。
【０１２４】
さらに、ライゲーションのそれぞれラウンド後の脱保護および精製ステップは余分な作業を持ち込むことになり、全体の収率を低下させる。ＣからＮへのライゲーションは直接的であるが、逆方向のライゲーションはより挑戦的なものである。ＮからＣへの逐次的ライゲーションが機能することを確認するためには、最初のライゲーションの間に中間Ｃｙｓ−ペプチドのＣ末端部が損なわれずに残留し、したがって次のライゲーションステップに使用可能であることが必要である。この原則にもとづき、２つ以上の直交するライゲーションケミストリーを用いることによって、多くのＮからＣへの逐次的ライゲーション法が開発された。ＮＣＬをＮからＣへの逐次的ライゲーションにおける単一のケミストリーとして用いた場合、逐次的ライゲーションは、異なる反応性を有する２つのチオエステル13またはチオエステル前駆体14のいずれかを用いることによって、速度論的に制御された。より直接的である速度論的制御によるライゲーションアプローチとは異なり、チオエステル前駆体アプローチは、ライゲーションのそれぞれラウンドの後に前駆体をチオエステルへ転換させる余分の操作を必要とする可能性がある。しかし、これらの操作はインサイチュで、ライゲーション反応で実施して精製ステップを回避することができる15。
【０１２５】
ペプチドおよびタンパク質を、効率的、直接的、かつ迅速な仕方で、高い生成物収率で合成する課題は残ったままである。最近のペプチドおよびタンパク質合成技術が必ずしも常に、ライゲーション後に損なわれていない生成物をもたらし、高収率のタンパク質を効率的に製造するまたは中位サイズから巨大サイズのタンパク質を好都合に合成するとは限らないことを考えれば、上記の欠点の１つ以上を克服するまたは少なくともそれを良くするタンパク質合成法の効率を改善する必要がある。
【０１２６】
ここに、我々は、ＮＣＬとペプチジルＮ，Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−アミド（ＢＭＥＡ）媒介ライゲーションの組合せによる新規なＮからＣへの逐次的ライゲーションアプローチを導入する。ペプチジルＢＭＥＡはチオエステル前駆体として働くことができることが分かっている。弱酸性条件（ｐＨ４〜６）下で、ペプチジルＢＭＥＡを：ｉ）ＢＭＥＡ部分をチオールと交換することによってチオエステルに転換し；ii）Ｃｙｓ−ペプチドとインサイチュでライゲーションさせることができる。アルカリ性条件下ではその間、これはそのアミド形態に留まり、ｃｙｓ−ペプチドとの反応性は低いままである。これらの観察をもとにして、ペプチドチオエステルをアルカリ性条件下でＣｙｓ−ペプチジルＢＭＥＡと反応すると、ＮＣＬが支配的となり、ＢＭＥＡ部分はライゲーション後も損なわれないままとなることがわかった。したがって、我々は、新規な３つのセグメントＮからＣへの逐次的ライゲーションストラテジーを提案する。図２１に示すように、第１のステップは、Ｎ末端チオエステルと中間Ｃｙｓ−ペプチジルＢＭＥＡセグメントとのＮＣＬ反応である。第２のステップは、ライゲーション生成物とＣ末端Ｃｙｓ−ペプチドとのＢＭＥＡ媒介ライゲーションである。
【０１２７】
我々の提案を試験するために、最初に３つの短いモデルペプチドを合成した。ペプチド２、中間Ｃｙｓ−ペプチジルＢＭＥＡセグメントを従来報告されているようにして合成した16。第１のライゲーションステップのため、１と２とを、正規のＮＣＬ条件下で互いに反応させた。１５ｍＭの１と５ｍＭの２を、６Ｍ  Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．２Ｍリン酸塩、５０ｍＭ  ＴＣＥＰ、２％ｖ／ｖチオフェノール（ｐＨ７．０）を含むライゲーション緩衝液に溶解した。ライゲーション反応はＨＰＬＣでモニターした。室温で４時間の後、反応は、わずかな副反応しか伴うことなく完了した。ライゲーション生成物を精製し、ペプチド３を用いた次のライゲーションステップにかけた。ライゲーションは、ＢＭＥＡ媒介ライゲーションに最適の条件下で実施した。５ｍＭのライゲーション生成物および１５ｍＭのペプチド３を、６Ｍ  Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＯＡｃ、５０ｍＭ  ＴＣＥＰ、０．２Ｍ  ＭＥＳＮａ（ｐＨ５．０）を含むライゲーション緩衝液に溶解した。ライゲーションは、マイクロ波照射下で１５時間以内に完了した。モデルペプチドでの試験によって、我々のＮからＣへの逐次的ライゲーションストラテジーが機能することが実証された。
【０１２８】
ペプチド１：Ｈ−ＡＤＫＲＡＨＨＮＡＬＥＲＫＲＲＤＨＡ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ2
ペプチド２：Ｈ−ＣＤＳＦＨＳＬＲＤＳＹ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2
ペプチド３：Ｈ−ＣＬＫＰＬＨＥＫＤＳＥＳ（P）ＧＧＧＫＤ−ＮＨ2
Ｓ（ｐ）：ホスホセリン
例３
我々のストラテジーを中位サイズのタンパク質、ユビキチンの合成に適用した。ユビキチンは、７６個のアミノ酸を有する高度に保存されたタンパク質であり、ユビキチン化と称されるプロセスにより、カルボキシレート末端を有する他のユビキチンまたは他のタンパク質のリシン側鎖と結合することができる。ユビキチンの化学合成は広く研究されている。以前に、Ｋｅｎｔのグループは、３つのセグメントとライゲーション結合部としてのＡｌａ２８ＣｙｓおよびＡｌａ４６ＣｙｓのＣからＮへの逐次的ライゲーションによりユビキチンを合成している17。最近、我々のグループも、ライゲーション結合部としてのＡｌａ２８ＣｙｓおよびＬｙｓ４８で、ＣからＮへの方向でユビキチン誘導体を合成した18。ユビキチンのＣからＮへの合成は広く研究されているが、ユビキチンのＮからＣへの合成は報告されていない。
【０１２９】
ＮからＣへの逐次的ライゲーションでユビキチンを合成するために、ＳＰＰＳを用いて３つのセグメントを合成した。中間Ｃｙｓ−ペプチジルＢＭＥＡセグメント５は逆のアプローチを用いて合成した。手短に言えば、２−クロロトリチルクロリド樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）中の３０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理してトリチルカルボカチオンを得た。樹脂の色は暗赤色になった。簡単に洗浄した後、ＤＣＭ中のＮ，Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−アミン・ＴＦＡ塩の溶液を樹脂と混合した。樹脂の色は直ちに標準的な黄色に変わった。これは、樹脂へのリンカーのローディングが完了したことを示している。アミノ酸のローディングは従来報告されているのと同じようにした16。新規なリンカー合成法は従来のアプローチと比べて、より速く、簡略化されたものであった16。
【０１３０】
ペプチド４：Ｈ−ＬＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ2
ペプチド５：Ｈ−ＣＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2
ペプチド６：Ｈ−ＣＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧ−ＯＨ
第１のＮＣＬステップのため、３．５ｍｇ（３．８ｍＭ）のＮ末端ペプチドチオエステル４および２．３ｍｇ（３．４ｍＭ）の中間セグメント５を、６Ｍ  Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．２Ｍリン酸塩、２０ｍＭ  ＴＣＥＰおよび０．２Ｍ  ＭＥＳＮａ（ｐＨ８．０）を含む３００μＬのライゲーション緩衝液に溶解した。図１５Ａに示すように、ライゲーションは室温で５時間以内に完了していた。ＢＭＥＡ部分から誘導された副反応は観察されなかった。さらに１．５時間インキュベートしても、ＨＰＬＣプロフィールにおいて変化は観察されなかった。これは、ライゲーション条件下でＢＭＥＡ部分が安定であることを示している。精製し凍結乾燥した後、２．５ｍｇのライゲーション生成物Ｈ−ＬＦ45−ＢＭＥＡを単離した。
【０１３１】
ライゲーションの第２のステップため、我々は２つの選択肢をもった（図２１）。ペプチジルＢＭＥＡをチオエステルに転換させ、単離されたチオエステルとＣ末端ｃｙｓ−ペプチドのＮＣＬを実施するか、あるいは、ペプチジルＢＭＥＡをｃｙｓ−ペプチドと直接反応させることのいずれかができる。第１の選択肢を用いると、ＢＭＥＡが中間ステップごとに、単離されたチオエステルへ転換された場合、このＮ−Ｃ逐次的ライゲーションは原理的には、無限のステップで実施することができることに留意されたい。
【０１３２】
我々は最初に、ライゲーションの第２のステップのために第１の選択肢を検討した。Ｈ−ＬＦ45−ＢＭＥＡをチオエステルに転換させるために、約３ｍｇのＨ−ＬＦ45−ＢＭＥＡを３００μＬ緩衝液（６Ｍ  Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＯＡｃ、０．２Ｍ  ＭＥＳＮａ、４０ｍＭ  ＴＣＥＰ（ｐＨ５．０）を含む）に溶解し、低出力マイクロ波を照射した。１０ｈ後、ＢＭＥＡの大部分は、少量の加水分解生成物を含むが、チオエステル形態に転換されていた（図１６）。ＨＰＬＣ精製後に１．５ｍｇのＨ−ＬＦ45−ＭＥＳを単離した。
【０１３３】
次に、ＮＣＬ条件下でＨ−ＬＦ45−ＭＥＳをペプチド６と反応させた。１．５ｍｇのＨ−ＬＦ45−ＭＥＳおよび１．５ｍｇの６を、２００μＬ  のＮＣＬ緩衝液（６Ｍ  Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．２Ｍリン酸塩、２０ｍＭ  ＴＣＥＰおよび０．２Ｍ  ＭＥＳＮａ、ｐＨ８．０）に溶解した。反応は６時間以内に完了した（図１７）。１．４ｍｇのライゲーション生成物を単離した。
【０１３４】
次いで、我々はインサイチュでのＨ−ＬＦ45−ＢＭＥＡと６のライゲーションを試験した。マイクロ波照射下、ｐＨ５．０で反応させた。まずＭＥＳＮａをチオール付加体として使用し、Ｈ−ＬＦ45−ＢＭＥＡに対する６の比をより小さくする（１．５〜２当量）と、ライゲーションの効率が低くなることが分かった。５時間照射した後、すべてのＨ−ＬＦ45−ＢＭＥＡをＨ−ＬＦ45−ＭＥＳに変換させた。チオエステルの３０％〜４０％だけが６と反応し、ライゲーション生成物を生成した。照射を続行しても収率を高めることはできなかった（データは示されていない）。大過剰（約３当量）の６を用いたとき、ライゲーション反応はより効率的であった。１０時間マイクロ波照射した後、Ｈ−ＬＦ45−ＭＥＳの７０％超がライゲーション生成物に転換された（図１８）。
【０１３５】
我々の観察にもとづいて、非常に長いペプチドセグメントが関係した場合、ＭＥＳＮａは、ＢＭＥＡ媒介ライゲーションのための良好なチオール付加体ではないようであることがわかった。芳香族チオールはＮＣＬのための効果的な添加剤であることは示されていたが、これらは我々の場合には適していないようである。その理由は：ｉ）これらが２２０ｎｍで強い吸収を有し、その保持時間が長いペプチドセグメントのそれと非常に近似しており；ii）これが酸性条件下で難溶性であるためである。これらの考察を考慮に入れて、我々は別のアルキルチオール、メチルメルカプトアセテートをチオール付加体として試験した。１ｍｇ（１．９ｍＭ）のＨ−ＬＦ45−ＢＭＥＡおよび１．４ｍｇ（４ｍＭ）の６を、１００μのＬ緩衝液（６Ｍ  Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＯＡｃ、２％ｖ／ｖメチルメルカプトアセテート、４０ｍＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ５．０）に溶解した。７時間マイクロ波照射した後、反応を完了した（図１５Ｃ）。殆んどすべてのＨ−ＬＦ45−ＢＭＥＡが消費され、ペプチド６とライゲーションされた。ＭＥＳＮａと比較すると、メチルメルカプトアセテートがチオール付加体として働いた場合、Ｈ−ＬＦ45−ＢＭＥＡと６のライゲーションはさらに効率的であった。
【０１３６】
ユビキチンのネイティブシーケンスを得るために、フリーラジカル媒介脱硫19を、我々のＮからＣへの逐次的ライゲーションアプローチで合成された完全長ユビキチンを用いて実施して、ライゲーション結合部で２つのシステイン残基をアラニンに転換させた。脱硫プロセスは解析的ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳでモニターした。脱硫は８時間以内に完了した（図１９）。最終生成物をＣ１８半分取ＨＰＬＣで精製した。次に、化学合成したユビキチンを透析で再折り畳みした。円偏光二色性（ＣＤ）を測定して、タンパク質がその天然状態へ再折り畳みされていることが確認された（図２０）。
【０１３７】
まとめると、我々は、ネイティブケミカルライゲーションとＢＭＥＡ媒介ライゲーションの組合せ使用（combinatal use）によって、タンパク質の化学合成を、Ｎ末端からＣ末端で実行することができることを実証した。ＢＭＥＡ媒介ライゲーションステップのために、我々は異なる選択肢、すなわち：ｉ）単離されたチオエステルでのライゲーションまたはインサイチュでの直接ライゲーション；ii）異なるチオール付加体も検討した。我々の手法は、小さいペプチドに役に立つだけでなく、長いペプチドセグメントが関係する場合でも効率的である。さらに、ペプチジルＢＭＥＡの合成のためのストラテジーも見直し、最適化した。新規なストラテジーは、簡単であり時間が節約され、より長いペプチドＢＭＥＡセグメントの合成に適している。これらの試みにより、我々は、新規に開発したＮからＣへの逐次的ライゲーションストラテジーがタンパク質合成において高い価値を有すると確信している。
【０１３８】
例２および３への支援情報
一般的方法
アミノ酸誘導体、カップリング試薬および樹脂は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）から購入した。他のすべての化学試薬はＡｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃおよびＡｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入した。すべての解析的ＨＰＬＣ分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８（５ｕｍ、４．６×２５０ｍｍ）逆相カラムを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステムを用いて、１．０ｍＬ／ｍｉｎの流量で実施した。検出は、ＵＶ−ＶＩＳ−検出器により２２０ｎｍで実施した。精製は、Ｓｈｉｍａｄｚｕシステムで半分取ＨＰＬＣカラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８、５ｕｍ、１０×２５０ｍｍ）を用いて、２．５ｍＬ／ｍｉｎの流量で実施した。すべての分析のための緩衝液系は、緩衝液Ａ−Ｈ2Ｏ（０．０４５％ＴＦＡを含む）および緩衝液Ｂ−Ｈ2Ｏ中の９０％アセトニトリル（０．０４５％ＴＦＡを含む）であった。ペプチドおよびタンパク質の質量は、ＥＳＩイオン源を備えたＴｈｅｒｍｏ  ＦＩＮＮＩＧＡＮ  ＬＣＱ  Ｄｅｃａ  ＸＰ  ＭＡＸまたは４８００  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦアナライザーを用いて、マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸で測定した。
【０１３９】
固相ペプチド合成：
チオエステルペプチドの合成
Ｈ−ＡＤＫＲＡＨＨＮＡＬＥＲＫＲＲＤＨＡ−ＳＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ2（ペプチド１）およびユビキチンＬ１−Ｋ２７−ＳＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ2（ペプチド４）を、標準的なｔ−Ｂｏｃケミストリーを用いて手作業で合成した。最初に、Ｔｒｔ−ＳＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨをＭＢＨＡ樹脂にカップリングさせた。トリチル基を、ＴＦＡ／ＴＩＳ／β−メルカプトエタノール／ＤＣＭ（５：２．５：２．５：９０）を含むカクテルで処理して取り外した。アミノ酸のカップリングのため、Ｂｏｃ−アミノ酸（４当量）およびベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）（４当量）をＤＣＭに溶解した。ＤＩＥＡ（１２当量）を溶液に加えた。２ｍｉｎ活性化させた後、混合物を樹脂と混合した。１．５ｈ反応させた。カップリング効率をＫａｉｓｅｒ試験でチェックした。Ｂｏｃ基を、ＤＣＭ中の３０％ＴＦＡで１０ｍｉｎ処理し、続いて１５ｍｉｎ処理して取り外した。使用した側鎖保護アミノ酸誘導体は、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｎ（Ｘａｎ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ（Ｘａｎ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨであった。配列アセンブリングを行った後、ペプチド１を、ＴＦＭＳＡ／ＴＦＡ／ｐ−クレゾール／メチルフェニルスルフィド（１：７：１：１）を含むカクテルで、１ｈで樹脂から切断した。ペプチド４を、ＨＦ／ｐ−クレゾール（９：１）で、０℃、１．５ｈで樹脂から切断した。粗製ペプチドを冷エーテルで沈澱させ、Ｃ１８半分取ＨＰＬＣで精製した。
【０１４０】
ペプチジルＢＭＥＡの合成
ペプチドＨ−ＣＤＳＦＨＳＬＲＤＳＹ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2（ペプチド２）を上述したようにして合成した。手短に言えば、システアミンを最初に２−クロロトリチルクロリド樹脂にロードした。アミノ基を２−ニトロベンゼンスルホニルクロリドで保護した。次いで光延反応を実施した。５当量のトリフェニルホスフィンおよび５当量のＤＥＡＤを無水ＴＨＦに溶解した後、無水ＤＣＭ中の５当量のＴｒｔＳＣＨ2ＣＨ2ＯＨを加えた。全溶液を樹脂に加えた。樹脂を室温で３×３ｈインキュベートした。次いで、２−ニトロベンゼンスルホニル基を、ＤＭＦ中の１０当量のＤＢＵおよび２０当量の２−メルカプトエタノールで終夜処理して取り外した。第１のアミノ酸に、無水ＤＣＭ／ＤＭＦ中の４当量のＤＩＣ、４当量のＨＯＡｔおよび４当量のＦｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨでロードした。残留アミノ酸のカップリングを、カップリング試薬としてＰｙＢＯＰを用いた標準的なＦｍｏｃケミストリーにより実施した。ユビキチンＨ−Ｃ２８−Ｆ４５−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2（ペプチド５）の合成のために、Ｎ，Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−アミンを２−クロロトリチルクロリド樹脂に直接ロードした。１ｇの樹脂（１．３ｍｍｏｌ／ｇ）をＤＣＭ中の３０％ＴＦＡで５ｍｉｎ処理し、無水ＤＣＭで３回洗浄した。樹脂は暗赤色または黒色に変わった。無水ＤＣＭ中の１．５ｍｍｏｌｅ  Ｎ，Ｎ−ビス（２−メルカプトエチル）−アミン・ＴＦＡ塩の溶液を樹脂と混合した。数分後、樹脂は標準的な黄色に変わった。これは、ローディングが完了したことを示している。樹脂をＤＣＭおよびＤＭＦで洗浄した。Ｅｌｌｍａｎ試験は陽性であった。これは未結合のチオール基の存在を示している。少量の未結合チオール基を、ＤＭＦ中の１００μＬのＳ−メチルメタンチオスルホネート（ＭＭＴＳ）および１００μＬのＤＩＥＡで、２０ｍｉｎで保護した。アミノ酸のカップリングはペプチド２の合成と同様にした。合成後、ペプチドを、９５％ＴＦＡ、１．５％ＥＤＴ、１．５％ＴＩＳおよび２％Ｈ2Ｏを含む混合物で、１ｈまたは３ｈ（Ａｒｇが存在する場合）で樹脂から切断した。粗製ペプチドを冷エーテルで沈澱させ、半分取ＨＰＬＣで精製した。
【０１４１】
Ｃ末端Ｃｙｓ−ペプチドの合成。
【０１４２】
標準的なＦｍｏｃケミストリーを用いてペプチドＨ−ＣＬＫＰＬＨＥＫＤＳＥＳ（P）ＧＧＧＫＤ−ＮＨ2（ペプチド３）およびユビキチンＨ−Ｃ４６−Ｇ７６−ＯＨ（ペプチド６）を合成した。ペプチド３の合成のためにリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（０．６５ｍｍｏｌ／ｇ）を使用した。まず、Ｆｍｏｃ基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで２ｍｉｎかけ、次いで２０ｍｉｎかけて取り外した。カップリング反応のため、４当量のＦｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ、４当量のＰｙＢＯＰおよび８当量のＤＩＥＡをＤＭＦに溶解した。２ｍｉｎ予備活性化した後、混合物を樹脂に加えた。カップリング反応を１．５〜２時間実施した。使用したＦｍｏｃアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨであった。Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ホスホリル）−ＯＨを、リン酸化セリンの導入のために使用した。ペプチド６はＷａｎｇ樹脂（０．４４ｍｍｏｌ／ｇ）を用いて合成した。Ｃ末端Ｇｌｙを、無水ＤＣＭ／ＤＭＦ中の８当量ＤＣＣ、０．８当量ＤＭＡＰ、８当量Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いて終夜かけてロードした。ローディングをさらに５ｈ反復し、次いで樹脂をＡｃ2Ｏで１ｈキャッピングした。Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンで取り外した。以下のアミノ酸を、ＤＭＦ中で予備活性化した４当量ＰｙＢＯＰ、４．当量アミノ酸、８当量ＤＩＥＡを用いてカップリングさせた。平均して、各カップリング反応は１．５ｈ続いた。カップリングはニンヒドリン試験でモニターした。使用したＮα−Ｆｍｏｃ保護アミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨであった。ＧｌｙをＡｓｐＧｌｙ結合部で、Ｆｍｏｃ−（Ｈｍｂ）Ｇｌｙ−ＯＨ（２当量ＰｙＢＯＰ、２当量アミノ酸、４当量ＤＩＥＡ）を用いてカップリングさせた。配列アセンブリングを行った後、樹脂をＤＭＦ中の２０％ピペリジンで２０ｍｉｎ処理してＦｍｏｃ基を取り外し、（Ｈｍｂ）Ｇｌｙ残基のＨｍｂ基のヒドロキシル基での可能性のあるアシル化部（ａｃｙｌａｔｉｏｎ）を加水分解した。次いで樹脂を、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ2Ｏ／ＥＤＴ（９２．５／２．５／２．５／２．５）で２．５ｈかけて切断した。粗製ペプチドを、冷エーテルで沈澱させ、Ｃ１８分取ＨＰＬＣで精製した。所望生成物をＣ１８解析的ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳで分析した。
【０１４３】
フリーラジカル媒介脱硫：
脱硫をＮ2下で実施した。すべての溶液を、使用直前にＮ2下で調製した。１．５ｍｇの硫黄含有ユビキチンを、６Ｍ  Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ６．５）を含む３００μＬ緩衝液に溶解した。５０μＬの１Ｍ  ＴＣＥＰ溶液（５Ｍ  ＮａＯＨで中和）を加えた。２５μＬの１０ｍＭグルタチオンを加えた。２０μＬの０．２Ｍ  ＶＡ−０４４を加えた。溶液を３７℃で５ｈ撹拌した。１０μＬの０．２Ｍ  ＶＡ−０４４を混合物に加え、溶液をさらに３ｈ連続的に撹拌した。脱硫反応物をＣ１８解析的ＨＰＬＣで分析した（図１９）。最終ジユビキチンをＣ１８半分取ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥した。１．１ｍｇの最終生成物を単離した。
【０１４４】
再折り畳みされたユビキチンの円偏光二色性（ＣＤ）測定：
ユビキチンの折り畳みのため、１．１ｍｇの脱硫ユビキチンを０．２ｍＬ緩衝液（６Ｍ  Ｇｄｎ・ＨＣｌ、１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、水に対して透析させた。再折り畳みした後、ユビキチンのＣＤを、ベースラインとして最終透析溶液を用いてＣｈｉｒａｓｃａｎ分光計で測定した。スキャンは１８０〜２６０ｎｍで実施し、光路長（ｐａｓｓｌｅｎｇｔｈ）は１ｍｍであった。
【０１４５】
例４
ＢＭＥＡペプチドの相同物
五員環中間体を用いて、ＢＭＥＡペプチドに、ＮからＳへのアシル転移を施すことができる。我々は、六員環中間体を用いて、同様の化合物にＮからＳへのアシル転移をやはり施すことができるかどうかを検討した。そこで我々は２つの系、ペプチドＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）およびペプチドＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2を設計した。
【０１４６】
１  ペプチドＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）およびＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2の合成
光延反応においてＴｒｔＳＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨを
【化１９】
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【０１４７】
に付加した以外はＢＭＥＡトリチル樹脂の場合と殆んど同じ仕方で、ＴｒｔＳＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＣＨ2ＣＨ2Ｓ−（２−クロロ）トリチル樹脂を調製した。スルホニル基を取り外した後、アミノ酸を、標準的なＦｍｏｃ  ＳＰＰＳで樹脂とカップリングさせた。ペプチドＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）のＥＳＩ−ＭＳおよび解析的ＲＰ−ＨＰＬＣスペクトルを以下の図２２に示した。興味深いことに、２つの小さいピークが観察された（図２２のピーク２およびピーク３）。これらは、ＮからＳへのアシル転移後の２つのチオエステルに対応する。一方はＬＫＳＦＧ−ＳＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨであり、他方はＬＫＳＦＧ−ＳＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＳＨである。
【０１４８】
同様にＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2も調製した。ペプチドＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2のＥＳＩ−ＭＳおよび解析的ＲＰ−ＨＰＬＣスペクトルを図２３に示した。
【０１４９】
２  ペプチドＣＬＫＦＡ−アミドでのそれぞれのペプチドＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）またはペプチドＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2のライゲーション
それぞれ５ｍＭのＬＫＳＦＧ−ＢＭＥＡ、ＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）またはペプチドＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2について同一ライゲーション条件、すなわち１５ｍＭ  ＣＬＫＦＡ、１００ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５、５０ｍＭ  ＴＣＥＰおよび１％（ｖ／ｖ）ベンジルメルカプタン、３７℃を用いた。反応状況はＨＰＬＣを用いて２ｈ、４ｈ、８ｈおよび２４ｈでモニターした（図２４を参照されたい）。
【０１５０】
ペプチドＨ−ＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）の反応速度は、同一条件下で、ＬＫＳＦＧ−ＢＭＥＡ（図２４Ａ＆Ｂ）の反応速度より若干速かった。副反応は検出されず、ライゲーション生成物の分子量はＥＳＩ−ＭＳで確認した。しかし、ペプチドＬＫＳＦＧ−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2の反応速度は、ＬＫＳＦＧ−ＢＭＥＡの反応速度よりずっと遅かったが（図２４Ａ＆Ｃ）、検出可能な副反応なくきれいに反応がなされた。ビス（２−メルカプトプロピル）アミドでなぜこれほど劇的な反応性の低下が見られたかについては完全には明らかでない。可能性のある１つの解釈は、硫黄がそのアミドから遠ざかっているのでアミドの活性が低下してきたということである。可能性のある別の理由は、六員環中間体が五員環系より生成しないようであるということである。
【０１５１】
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【図１】
2013533254.tif 000034
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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