(57)【要約】  機能性多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］生合成経路を含む油性酵母であるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のトランスジェニック株におけるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ［「Ｇ６ＰＤＨ」］および６−ホスホグルコノラクトナーゼ［「６ＰＧＬ」］をコードする遺伝子の協調的に調節された過剰発現は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞におけるＰＵＦＡ生成の増加および総脂質含量の増加をもたらした。これは、トランスジェニック微生物内の、還元的生合成反応にとって重要な還元当量であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸［「ＮＡＤＰＨ」］の還元型の細胞アベイラビリティを増加させることにより達成される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック微生物であって：
（ａ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｂ）６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｃ）目的の非天然生産物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と；
を含み、
目的の非天然生産物の生合成が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を必要とする少なくとも１つの酵素反応を含み；
（ａ）および（ｂ）の協調的に調節された過剰発現が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加をもたらし；そして
（ｃ）を含み、（ａ）および（ｂ）を欠いているか、または協調的調節様式で（ａ）および（ｂ）を過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生産されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の量および目的生産物の量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加により、トランスジェニック微生物における（ｃ）の発現によって生産される目的生産物の量が増加している；上記トランスジェニック微生物。
【請求項２】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子および６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子の協調的に調節された過剰発現が：
（ａ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を、第１のプロモーターに作動可能に連結させ、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を、第２のプロモーターに作動可能に連結させる手段であって、ここで第１のプロモーターが、第２のプロモーターと比較すると、同等または減少した活性を有する、該手段；
（ｂ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を、多コピーで発現させ、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を、多コピーで発現させる手段であって、ここでグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子のコピー数が、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子のコピー数と比較すると、同等であるかまたは減少する、該手段；
（ｃ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子の酵素活性を、マルチザイムとして６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子の酵素活性に連結させる手段；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に記載された手段の任意の組合せ；
からなる群から選択される手段によって達成される、請求項１に記載のトランスジェニック微生物。
【請求項３】
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の遺伝子に加えて、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が発現する、請求項１に記載のトランスジェニック微生物。
【請求項４】
目的の非天然生産物が、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステルからなる群から選択される、請求項１に記載のトランスジェニック微生物。
【請求項５】
目的の非天然生産物が、オメガ−３脂肪酸およびオメガ−６脂肪酸からなる群から選択され；そして（ｃ）の少なくとも１つの異種遺伝子が、デルタ−１２デサチュラーゼ、デルタ−６デサチュラーゼ、デルタ−８デサチュラーゼ、デルタ−５デサチュラーゼ、デルタ−１７デサチュラーゼ、デルタ−１５デサチュラーゼ、デルタ−９デサチュラーゼ、デルタ−４デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼおよびデルタ−９エロンガーゼからなる群から選択される、請求項４に記載のトランスジェニック微生物。
【請求項６】
微生物が、藻類、酵母、ユーグレナ類、ストラメノパイル、卵菌類および菌類からなる群から選択される、請求項１に記載のトランスジェニック微生物。
【請求項７】
酵母が、油性酵母である、請求項６に記載のトランスジェニック微生物。
【請求項８】
トランスジェニック油性酵母であって：
（ａ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｂ）６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｃ）目的の非天然生産物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子であって、目的の生産物が、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸、少なくとも１つのキノン由来化合物、少なくとも１つのカロテノイドおよび少なくとも１つのステロールからなる群から選択される、該異種遺伝子と；
を含み、
（ａ）および（ｂ）の協調的に調節された過剰発現が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加をもたらし；そして
（ｃ）を含み、（ａ）および（ｂ）を欠いているか、または協調的調節様式で（ａ）および（ｂ）を過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック油性酵母により生産されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の量および目的生産物の量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加により、トランスジェニック油性酵母における（ｃ）の発現によって生産される目的生産物の量が増加している；トランスジェニック油性酵母。
【請求項９】
油性酵母が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項８に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸が、リノール酸、ガンマ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、オメガ−６ドコサペンタエン酸、アルファ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、オメガ−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される、請求項８または９に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項１１】
（ｃ）を含み、（ａ）および（ｂ）を欠いているか、または協調的調節様式で（ａ）および（ｂ）を過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック油性酵母により生産される総脂質含量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量および少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸量に加えて、総脂質含量が増加している、請求項１０に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項１２】
少なくとも１つのカロテノイドが、アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプソルブリン、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、β−カロテン、β、ψ−カロテン、δ−カロテン、ε−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、γ−カロテン、ψ−カロテン、４−ケト−γ−カロテン、ζ−カロテン、α−クリプトキサンチン、デオキシフレキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、ジデヒドロリコペン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β−イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコペン、ミクソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、フィトフルエン、ロドピン、ロドピングルコシド、４−ケト−ルビキサンチン、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、トルレン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセテート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、ゼアキサンチン、ＣＣ３０カロテノイドおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項１３】
少なくとも１つのキノン由来化合物が、ユビキノン、ビタミンＫ化合物およびビタミンＥ化合物ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項１４】
少なくとも１つのステロール化合物が、スクアレン、ラノステロール、チモステロール、エルゴステロール、７−デヒドロコレステロール（プロビタミンＤ３）およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載のトランスジェニック油性酵母。
【請求項１５】
目的の非天然生産物の生産のための方法であって：
（ａ）トランスジェニック微生物を備えるステップであって：
（ｉ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｉｉ）６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｉｉｉ）目的の非天然生産物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と；
を含み、
（ｉ）および（ｉｉ）が協調的調節様式で過剰発現され、（ｉ）および（ｉｉ）を欠いているか、または協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生産されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の生産が増加している、該ステップと；
（ｂ）発酵性炭素源の存在下でステップ（ａ）のトランスジェニック微生物を増殖させ、それによって、目的の非天然生産物の生産を（ｉｉｉ）の発現によりもたらすステップと；
（ｃ）場合によって、目的の非天然生産物を回収するステップと；
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１０年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／３１９４７３号明細書の利益を主張するものであり、その内容全体を参照によって本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
本発明はバイオテクノロジーの分野に入る。より具体的には、本発明は、ペントースリン酸経路遺伝子（例えばグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ［「Ｇ６ＰＤ」］および６−ホスホグルコノラクトナーゼ［「６ＰＧＬ」］）の協調的に調節された過剰発現に基づいて、トランスジェニック微生物における、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型［「ＮＡＤＰＨ」］の細胞アベイラビリティを操作するための有用な方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
補因子ペアＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋は、主として、同化代謝の間の種々の酸化還元反応において還元当量の供与体および／または受容体としてそれが使用される結果として、すべての生物にとって不可欠なものである。例えば、ＮＡＤＰＨは、アミノ酸、ビタミン、芳香族化合物、ポリオール、ポリアミン、ヒドロキシエステル、イソプレノイド、フラボノイドならびに多価不飽和脂肪酸（例えばオメガ−３脂肪酸およびオメガ−６脂肪酸）を含めた脂肪酸の生成にとって重要である。対照的に、補因子ペアＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋は細胞内の異化作用に使用される。
【０００４】
細胞内の還元的生合成反応のための大量のＮＡＤＰＨ還元当量は、ペントースリン酸経路［または「ＰＰ経路」］を介して生成する。ＰＰ経路は、ヌクレオチドおよび核酸を構築するための基質（すなわちグリセリンアルデヒド−３−リン酸、フルクトース−６−リン酸）へのリボース−５−リン酸の変換を担う非酸化段階、ならびに酸化段階を含む。酸化段階内の正味の反応は次の化学方程式で示される：グルコース−６−リン酸＋２ＮＡＤＰ＋＋Ｈ２Ｏ→リブロース−５−リン酸＋２ＮＡＤＰＨ＋２Ｈ＋＋ＣＯ２。
【０００５】
組換え操作された生物における多くの産業上有用な化合物の生成は、細胞のＮＡＤＰＨ要求性を高めることが多い。したがって、ＮＡＤＰＨの利用を最適化することは、目的の化合物の生成を最大にする有用な手段である。実際、いくつかの研究により、組換え生物内のＮＡＤＰＨ量が増加すると、設計された生成物量が増加することが実証されてきた。しかしながら、数多くの手段がこの目的を達成するために利用されてきた。
【０００６】
細胞ＮＡＤＰＨを増加させるアプローチの１つは、ＮＡＤＨを必要とする。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）においてＬ−スレオニン、Ｌ−リジンおよびＬ−フェニルアラニンの生成を増加させるための方法を記載している特許文献１を参照されたい。この方法では、細胞によるニコチンアミドジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（すなわち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐｎｔＡおよびｐｎｔＢ遺伝子によりコードされる）の発現が改変され、その結果、ＮＡＤＨから生成するＮＡＤＰＨが増加する。同様に、特許文献２は、ＮＡＤＨ＋ＮＡＤＰ＋⇔ＮＡＤ＋＋ＮＡＤＰＨとして示される可逆反応を触媒する酵素である可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（すなわちｕｄｈＡ）で宿主細胞を形質転換することにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＮＡＤＰＨレベルを少なくとも約５０％増加させる方法を記載している。
【０００７】
細胞ＮＡＤＰＨを増加させる代替手段が、特許文献３に記載されており、この明細書では、ＮＡＤＰＨ酸化活性の１つもしくは複数が制限されており、かつ／またはＮＡＤＰ＋の還元を優位にさせる１つまたは複数の酵素活性を有する微生物株が教示されている。これは、キニーネオキシドレダクターゼまたは可溶性トランスヒドロゲナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子の欠失により達成することができる。ホスホグルコースイソメラーゼもしくはホスホフルクトキナーゼの欠失および／またはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、膜結合型トランスヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、リンゴ酸シンターゼ、イソシトレートリアーゼもしくはイソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼの過剰発現を含むさらなる改変も場合によっては提案されている。
【０００８】
これまでの方法では、グルコース−６−リン酸［「Ｇ−６−Ｐ」］のリブロース−５−リン酸への還元に伴う、ＮＡＤＰ＋からのＮＡＤＰＨの生成を担うＰＰ経路の酸化段階内の遺伝子を直接操作していない。表１および図１で以下に記載のとおり、ＰＰ経路の酸化分岐には連続した３つの反応が含まれる。
【０００９】
【表１】
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【００１０】
ＮＡＤＰＨの生成を増加させる手段として、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ［「Ｇ６ＰＤＨ」］の過剰発現を試みることは、容易に理解できることであるが、これは致死的でもある。具体的には、この酵素反応の生成物、すなわちデルタ−６−ホスホグルコノラクトンが細胞にとって有毒となり得る。例えば、非特許文献１は、６ＰＧＬをコードするｄｅｖＢ／ＳＯＬホモログが不活性化されたシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）突然変異株の作製を記載している。この突然変異体の増殖が、炭素源としてマンニトールを使用すると野生型の速度のわずか９％になり、炭素源としてグルコン酸を使用すると野生型の速度の５０％になるため、６−ホスホグルコン酸の濃度が増加すると細胞にとって有毒になるという仮説が導かれた。「この代謝経路を通るバランスのとれたフラックスを維持するためには、細胞内の６ＰＧＬおよびＧ６ＰＤＨの活性量を同程度にすべきことは必須と思われる」と述べられている。数種の生物では、６ＰＧＬおよびＧ６ＰＤＨのホモログが、一緒に位置している染色体上で重複しており、極めて厳密な転写制御および発現の協調的調節の可能性がさらに示唆されている。６ＰＧＬおよびＧ６ＰＤＨを介する効率的な代謝フラックスの必要性に対する１つの解答は、単一のタンパク質内に両方の酵素活性を併せもつ動物の中に見出せるように思われる。
【００１１】
６ＰＧＬおよびＧ６ＰＤＨの調節に対するさらなる洞察が、非特許文献２のＮＭＲ分光分析によって得られた。この研究により、６−ホスホグルコノラクトンのデルタ型［「δ−６−Ｐ−Ｇ−Ｌ」］がＧ−６−Ｐ酸化の唯一の生成物であり、その後に６−ホスホグルコノラクトンのガンマ型（［「γ−６−ＰＧ−Ｌ」］が分子内転位により生成するが、δ−６−Ｐ−Ｇ−Ｌのみが６ＰＧＬに加水分解され、一方、γ−６−ＰＧ−Ｌはさらなる変換を受けることができない「デッドエンド」になることが示された。この観察に基づいて、Ｍｉｃｌｅｔらは、６ＰＧＬ活性がデルタ型の加水分解を加速し、それ故、ガンマ型への変換が防止されて、細胞内在性求核分子との反応を介して毒性を示しかつＰＰ経路の機能を妨害する可能性のあるδ−６−Ｐ−Ｇ−Ｌの蓄積が６ＰＧＬにより抑制されると結論した。
【００１２】
Ｇ６ＰＤＨの過剰発現に関する上記の問題にもかかわらず、非特許文献３は、異種発現タンパク質のグルコニル付加生成物の形成を抑制する手段として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における６ＰＧＬの過剰発現に成功したと報告している。具体的には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において発現された６ＰＧＬをコードするシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）遺伝子が、異種１８ｋＤａタンパク質のバイオマス収率および比生産性をそれぞれ５０％および６０％増加させることが見出された。ＰＰ経路の酸化分岐を通る前駆体およびＮＡＤＰＨの高いフラックスが代謝フラックス解析により示されるとおり、高レベルの６ＰＧＬ発現により、前駆体の余分な要求およびエネルギー必要量をこの株が満たし、プラスミドＤＮＡの複製および異種遺伝子の発現が可能になったと結論された。
【００１３】
同様に、非特許文献４は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種ＨＸ−３０８において、オメガ−３多価不飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］の生合成の間にＮＡＤＰＨの適切な供給が確実になされることが重要であると認識した。しかしながら、そこで利用された溶液には、発酵工程の迅速な脂質蓄積段階の間、醗酵システムに添加されたリンゴ酸が含まれており、リンゴ酸のピルビン酸への変換と同時のＮＡＤＰ＋のＮＡＤＰＨへの還元が可能になっていた。この改変が、細胞ＮＡＤＰＨの欠乏を防止し、生物内に蓄積される総脂質の１５％の増加および総脂肪酸の最終ＤＨＡ含量の３５％から６０％への増加を可能にした。
【００１４】
目的の異種非天然生成物を生成させるために組換え操作されたトランスジェニック微生物における補因子ＮＡＤＰＨの細胞アベイラビリティを増加させることができる手段として、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ［「Ｇ６ＰＤ」］および６−ホスホグルコノラクトナーゼ［「６ＰＧＬ」］の両方を過剰発現させる手段を本明細書に開示する。目的の異種生成物がその生合成ためにＮＡＤＰＨ補因子を必要とする場合、細胞ＮＡＤＰＨを最適化すると、目的の生成物の生成が増加することになる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第５，８３０，７１６号明細書
【特許文献２】米国特許第７，３２６，５５７号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７−００８７４０３Ａ１号明細書
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｈａｇｅｒ，Ｐ．Ｗ．ら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８２（１４）：３９３４−３９４１（２０００））
【非特許文献２】Ｍｉｃｌｅｔ，Ｅ．ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（３７）：３４８４０−３４８４６（２００１））
【非特許文献３】Ａｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら（ＡＥＭ，７４（４）：９５０−９５８（２００８））
【非特許文献４】Ｒｅｎ，Ｌ．−Ｊ．ら（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔ．Ｅｎｇ．，３２：８３７−８４３（２００９））
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
第１の実施形態では、本発明は、トランスジェニック微生物であって、
（ａ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と、
（ｂ）６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と、
（ｃ）目的の非天然生成物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と
を含み、
目的の非天然生成物の生合成が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を必要とする少なくとも１つの酵素反応を含み、
（ａ）および（ｂ）の協調的に調節された過剰発現が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加をもたらし、
（ｃ）を含み、かつ（ａ）および（ｂ）を欠いているかまたは協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生成されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の量および目的生成物の量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加により、トランスジェニック微生物における（ｃ）の発現によって生成される目的生成物の量が増加している、トランスジェニック微生物に関する。
【００１８】
さらに、Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子および６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子の協調的に調節された過剰発現が、
（ａ）Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子が、第１のプロモーターに作動可能に連結し、６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子が、第２のプロモーターに作動可能に連結し、第１のプロモーターの活性が、第２のプロモーターと比較すると、同等または減少していること、
（ｂ）Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子が、多重コピーで発現し、６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子が、多重コピーで発現し、Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子のコピー数が、６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子のコピー数と比較すると、同等または減少していること、
（ｃ）Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子の酵素活性が、マルチザイム（ｍｕｌｔｉｚｙｍｅ）として６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子の酵素活性に連結していること、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に述べられた手段の任意の組合せ、
からなる群から選択される手段によって達成される。
【００１９】
第２の実施形態では、本発明は、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の遺伝子に加えて発現する、上記トランスジェニック微生物に関する。
【００２０】
第３の実施形態では、本発明は、目的の非天然生成物が、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステルからなる群から選択される上記トランスジェニック微生物に関する。
【００２１】
第４の実施形態では、本発明は、
（ａ）目的の非天然生成物が、オメガ−３脂肪酸およびオメガ−６脂肪酸からなる群から選択され、かつ
（ｂ）（ｃ）の少なくとも１つの異種遺伝子が、デルタ−１２デサチュラーゼ、デルタ−６デサチュラーゼ、デルタ−８デサチュラーゼ、デルタ−５デサチュラーゼ、デルタ−１７デサチュラーゼ、デルタ−１５デサチュラーゼ、デルタ−９デサチュラーゼ、デルタ−４デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼおよびデルタ−９エロンガーゼからなる群から選択される、上記トランスジェニック微生物に関する。
【００２２】
第５の実施形態では、本発明は、前記トランスジェニック微生物が、藻類、酵母、ユーグレナ類、ストラメノパイル、卵菌類および菌類からなる群から選択されるトランスジェニック微生物に関する。より具体的には、好ましいトランスジェニック微生物は油性酵母である。
【００２３】
第６の実施形態では、本発明は、トランスジェニック油性酵母であって、
（ａ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と、
（ｂ）６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と、
（ｃ）目的の非天然生成物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子であって、目的の生成物が、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸、少なくとも１つのキノン誘導体化合物、少なくとも１つのカロテノイドおよび少なくとも１つのステロールからなる群から選択される異種遺伝子と
を含み、
（ａ）および（ｂ）の協調的に調節された過剰発現が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加をもたらし、
（ｃ）を含み、かつ（ａ）および（ｂ）を欠いているかまたは協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック油性酵母により生成されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の量および目的生成物の量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加により、トランスジェニック油性酵母における（ｃ）の発現によって生成される目的生成物の量が増加している、トランスジェニック油性酵母に関する。
【００２４】
より具体的には、本発明のトランスジェニック油性酵母はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。
【００２５】
第７の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸が、リノール酸、ガンマ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、オメガ−６ドコサペンタエン酸、アルファ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、オメガ−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される、上記トランスジェニック油性酵母に関する。
【００２６】
第８の実施形態では、本発明は、（ｃ）を含み、かつ（ａ）および（ｂ）を欠いているかまたは協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック油性酵母により生成される総脂質含量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量および少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸量に加えて、総脂質含量が増加している、上記トランスジェニック油性酵母に関する。
【００２７】
第９の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのカロテノイドが、アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、キャプソルブリン（ｃａｐｓｏｒｕｂｒｉｎ）、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、β−カロテン、β，ψ−カロテン、δ−カロテン、ε−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、γ−カロテン、ψ−カロテン、４−ケト−γ−カロテン、ζ−カロテン、α−クリプトキサンチン、デオキシフレキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、ジデヒドロリコペン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β−イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコペン、ミクソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、フィトフルエン、ロドピン、ロドピングルコシド、４−ケト−ルビキサンチン、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、トルレン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセテート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、ゼアキサンチン、Ｃ３０カロテノイド、およびそれらの組合せからなる群から選択される、上記トランスジェニック油性酵母に関する。
【００２８】
第１０の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのキノン誘導体化合物が、ユビキノン、ビタミンＫ化合物およびビタミンＥ化合物、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、上記トランスジェニック油性酵母に関する。
【００２９】
第１１の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのステロール化合物が、スクアレン、ラノステロール、チモステロール、エルゴステロール、７−デヒドロコレステロール（プロビタミンＤ３）およびそれらの組合せからなる群から選択される、トランスジェニック油性酵母に関する。
【００３０】
第１２の実施形態では、本発明は、目的の非天然生成物の生成のための方法であって、
（ａ）トランスジェニック微生物を提供するステップであって、
（ｉ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と、
（ｉｉ）６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と、
（ｉｉｉ）目的の非天然生成物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と
を含み、
（ｉ）および（ｉｉ）が協調的調節様式で過剰発現され、（ｉ）および（ｉｉ）を欠いているかまたは協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生成されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の生成が増加している、ステップと、
（ｂ）発酵性炭素源の存在下でステップ（ａ）のトランスジェニック微生物を増殖させ、それによって、目的の非天然生成物を（ｉｉｉ）の発現により生成させるステップと、
（ｃ）場合によって、目的の非天然生成物を回収するステップと
を含む方法に関する。
【００３１】
生物学的寄託
以下の生物学的材料は、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託されており、以下の名称、登録番号および寄託日を有する。
【００３２】
【表２】
2013530679.tif 000004
【００３３】
上に記載された生物学的材料は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅの条項下で寄託された。記載の寄託物は指定の国際寄託機関に少なくとも３０年間維持され、それを開示する特許の交付時に一般に利用可能となる。寄託物の利用可能性は、政府行為により交付された特許権の適用外で、本発明を実施するためのライセンスを構成しない。
【００３４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｕは、米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１号明細書に記載の方法論に従って、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１２８から誘導した。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ペントースリン酸経路の酸化段階の間に起こる生化学反応を示す図である。
【図２Ａ】ｐＺＷＦ−ＭＯＤ１のプラスミドマップを示す図である。
【図２Ｂ】ｐＺＵＦ−ＭＯＤ１のプラスミドマップを示す図である。
【図３Ａ】ｐＺＫＬＹ−ＰＰ２のプラスミドマップを示す図である。
【図３Ｂ】ｐＺＫＬＹ−６ＰＧＬのプラスミドマップを示す図である。
【図４】ｐＧＰＭ−Ｇ６ＰＤのプラスミドマップを示す図である。
【００３６】
本発明は、本出願の一部を形成する、以下の詳細な説明および添付の配列記載から、より十分に理解することができる。
【００３７】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１−１．８２５（「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ」）に準拠し、Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＰＯ）Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＴ．２５（１９９８）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（Ｒｕｌｅｓ  ５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）ならびにＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  ＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓのＳｅｃｔｉｏｎ  ２０８およびＡｎｎｅｘ  Ｃ）に合致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。
【００３８】
配列番号：１〜２５は、表２に記載された、遺伝子をコードするＯＲＦもしくはタンパク質（もしくはその一部）またはプラスミドである。
【００３９】
【表３】
2013530679.tif 000005
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本明細書で引用されたすべての特許文献および非特許文献の開示は、それらの内容全体を参照によって本明細書に組み込むものとする。
【００４１】
本開示では、以下の略語を使用する。
「翻訳領域」は「ＯＲＦ」と略す。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は「ＰＣＲ」と略す。
「米国培養細胞系統保存機関」は「ＡＴＣＣ」と略す。
「ペントースリン酸経路」は「ＰＰ経路」と略す。
「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸」は、「ＮＡＤＰ＋」またはその還元型では「ＮＡＤＰＨ」と略す。
「グルコース−６−リン酸」は「Ｇ−６−Ｐ」と略す。
「グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ」は「Ｇ６ＰＤＨ」と略す。
「６−ホスホグルコノラクトナーゼ」は「６ＰＧＬ」と略す。
「６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ」は「６ＰＧＤＨ」と略す。
「多価不飽和脂肪酸」は「ＰＵＦＡ」と略す。
「トリアシルグリセロール」は「ＴＡＧ」と略す。
「総脂肪酸」は「ＴＦＡ」と略す。
「脂肪酸メチルエステル」は「ＦＡＭＥ」と略す。
「乾燥細胞重量」は「ＤＣＷ」と略す。
【００４２】
本明細書で使用する用語「発明」または「本発明」は、限定することを意図するものではなく、特許請求の範囲に定義されたかまたは本明細書に記載された任意の発明に一般に適用するものである。
【００４３】
用語「ペントースリン酸経路」［「ＰＰ経路」］、「ホスホグルコン酸経路」および「ヘキソース一リン酸側路」は、２つの別個の段階で起こるサイトゾル過程を指す。非酸化段階は、ヌクレオチドおよび核酸を構築するための基質へのリボース−５−リン酸の変換を担っている。次の化学反応：グルコース−６−リン酸＋２ＮＡＤＰ＋＋Ｈ２Ｏ→リブロース−５−リン酸＋２ＮＡＤＰＨ＋２Ｈ＋＋ＣＯ２で要約することができる酸化段階は、細胞内の還元的生合成反応のためのＮＡＤＰＨ還元当量を生成する役目をする。より具体的には、表１および図１に前述したとおり、酸化段階で起こる反応は、脱水素、加水分解および酸化的脱炭酸を含む。
【００４４】
「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸」［「ＮＡＤＰ＋」］およびその還元型ＮＡＤＰＨは、ＣＡＳ登録番号５３−５９−８を有する補因子ペアである。ＮＡＤＰ＋は、還元剤としてＮＡＤＰＨを必要とする同化反応に使用される。動物では、ＰＰ経路の酸化段階は、細胞ＮＡＤＰＨの主要な供給源であり、必要なＮＡＤＰＨの約６０％を生成する。ＮＡＤＰＨは、シトクロムＰ４５０による水酸化（例えば芳香族化合物、ステロイド、アルコールの水酸化）ならびに種々の生合成反応（例えば脂肪酸鎖伸長ならびに脂質、コレステロールおよびイソプレノイドの合成）に還元当量を提供する。加えて、ＮＡＤＰＨは、活性酸素種の毒性に対する防御に関与する酸化還元のための還元当量を提供する。
【００４５】
用語「グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ」［「Ｇ６ＰＤ」］は、脱水素を介してグルコース−６−リン酸［「Ｇ−６−Ｐ」］の６−ホスホグルコノラクトンへの変換を触媒する酵素［Ｅ．Ｃ．１．１．１．４９］を指す。
【００４６】
用語「６−ホスホグルコノラクトン」は、ＣＡＳ登録番号２６４１−８１−８を有する化合物を指す。これらのホスホグルコノラクトンは分子内変換を通してデルタ型またはガンマ型のいずれかになる。
【００４７】
用語「６−ホスホグルコノラクトナーゼ」［「６ＰＧＬ」］は、加水分解によりデルタ−６−ホスホグルコノラクトンの６−ホスホグルコン酸への変換を触媒する酵素を指す［Ｅ．Ｃ．３．１．１．３１］。
【００４８】
用語「６−ホスホグルコン酸」は、ＣＡＳ登録番号９２１−６２−０を有する化合物を指す。
【００４９】
用語「６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ」［「６ＰＧＤＨ」］は、酸化的脱炭酸を介して、ＮＡＤＰＨおよび二酸化炭素と共に、６−ホスホグルコン酸のリブロース−５−リン酸への変換を触媒する酵素を指す［Ｅ．Ｃ．１．１．１．４４］。
【００５０】
用語「Ｇ６ＰＤおよび６ＰＧＬの協調的に調節された過剰発現」は、ほぼ同量のＧ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬの活性が、ＰＰ経路を通るバランスのとれたフラックスを維持するために、細胞内で共発現するか、またはＧ６ＰＤＨ活性が６ＰＧＬ活性より少ないように共発現することを意味する。これにより、６ＰＧＬ活性が６−ホスホグルコノラクトンのデルタ型［「δ−６−ＰＧ−Ｌ」］の加水分解を加速し、それ故、ガンマ型［「γ−６−ＰＧ−Ｌ」］への変換が防止されて、高濃度のδ−６−Ｐ−Ｇ−Ｌの蓄積が防止されることが保証される。
【００５１】
用語「多重コピーでの発現」は、遺伝子コピー数が２以上であることを意味する。
【００５２】
用語「マルチザイム」または「融合タンパク質」は、少なくとも２つの独立して分離可能な酵素活性を有し、第１の酵素活性が第２の酵素活性に連結していることが好ましい単一ポリペプチドを指す（米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書）。少なくとも２つの独立して分離可能な酵素活性間の「連結」または「結合」は、最小で１つのポリペプチド結合から構成されるが、プロリンもしくはグリシンなどの１つのアミノ酸残基または少なくとも１つのプロリンまたはグリシンのアミノ酸残基を含むポリペプチドから構成されることもある。さらに、米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書は、その明細書中の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群から選択されるいくつかの好ましいリンカーについて記載している。
【００５３】
用語「目的の非天然生成物」は、野生型微生物内で天然には生成されない任意の生成物を指す。典型的には、目的の生成物である異種タンパク質の発現を可能にするために、宿主微生物へ適切な異種遺伝子を導入する組換え手段によって、目的の非天然生成物は生成される。本明細書における本発明の目的のためには、目的の非天然生成物の生合成は、還元当量としてＮＡＤＰＨを利用する少なくとも１つの酵素反応を必要とする。好ましい目的の非天然生成物の非限定例としては、これらに限定されないが、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステルが挙げられる。
【００５４】
用語「目的の非天然生成物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子」は、それが導入される宿主微生物とは異なる起源に由来する遺伝子を指す。異種遺伝子は、宿主微生物における目的の非天然生成物の生成を促進する。一部の場合では、中間段階または経路中間体をまったく経ずに、所望する目的の生成物への基質の直接変換を触媒する単一の異種遺伝子のみが、目的の生成物の生成を可能にするために必要となり得る。あるいは、所望する目的の非天然生成物を生成するための一連の反応が起こるように、新しい生合成経路をコードする一連の遺伝子を微生物へ導入することが望ましい場合もある。
【００５５】
用語「油性」は、エネルギー源をオイルの形態で貯蔵する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，Ｉｎ：Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０）。一般に、油性微生物の細胞オイル含量はシグモイド曲線に従い、脂質濃度は、後期対数増殖期または初期定常増殖期に最大に達するまで増加し、次いで、後期定常期および死滅期の間に徐々に減少する（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：４１９−２５（１９９１））。油性微生物が乾燥細胞重量の約２５％を超えてオイルを蓄積することはまれではない。
【００５６】
用語「油性酵母」は、オイルを生成することができる酵母と分類される微生物を指す。油性酵母の例としては、決してこれらに限定されるものではないが、次の属、すなわちヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。
【００５７】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」および「単離核酸断片」は、本明細書において互換的に使用する。これらの用語はヌクレオチド配列等を包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然または改変のヌクレオチド塩基を場合によっては含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーとすることができる。ＤＮＡポリマーの形態にあるポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはそれらの混合物の１つまたは複数のセグメントから構成することができる。ヌクレオチド（通常、５’−一リン酸形態で見出される）は、次の一文字名により表す。アデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対応）に対しては「Ａ」、シチジル酸またはデオキシシチジル酸に対しては「Ｃ」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸に対しては「Ｇ」、ウリジル酸に対して「Ｕ」、デオキシチミジル酸に対しては「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）に対しては「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対しては「Ｙ」、ＧまたはＴに対しては「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴに対しては「Ｈ」、イノシンに対しては「Ｉ」、任意のヌクレオチドに対しては「Ｎ」である。
【００５８】
一本鎖形態の核酸断片が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で別の核酸断片にアニールすることができる場合、核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ分子などの別の核酸断片に「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は周知であり、参照によって本明細書に組み込むＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）の特に第１１章および表１１．１に例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似した断片（遠縁の生物からの相同配列など）から高度に類似した断片（機能性酵素を再現する、近縁の生物からの遺伝子など）までスクリーニングするように調整することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の１セットは、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温で１５分間に始まり、次いで２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃で３０分間を反復し、さらに０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃で３０分間を２回反復する一連の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件のより好ましいセットは、より高温を使用するが、その洗浄は、最後の２回の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、３０分間洗浄の温度を６０℃に上昇させることを除いて上記のものと同じである。高度にストリンジェントな条件の別の好ましいセットは、最後の２回に０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件のさらなるセットとして、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーションおよび２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が挙げられる。
【００５９】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能となるけれども、ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補的配列を含有することが必要となる。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当技術分野で周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、それらの配列を有する核酸ハイブリッドの熱融解点［「Ｔｍ」または「Ｔｍ」］の値は高くなる。Ｔｍの高さに対応する、核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順序で低下する。長さが１００超のヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔｍの計算式が誘導されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、９．５０−９．５１を参照のこと）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、１１．７−１１．８を参照のこと）。一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、最も好ましくは、その長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、当業者ならば、温度および洗浄液塩濃度は、プローブの長さなどの要因に応じて必要なときに調整することができることを認識されよう。
【００６０】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」とは、当業者による配列のマニュアル評価またはＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ［「ＢＬＡＳＴ」］（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用する、コンピュータによる自動配列比較および同定のいずれかによって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む部分である。一般に、１０以上の連続したアミノ酸配列または３０以上のヌクレオチド配列が、既知のタンパク質または遺伝子に相同なものとしてポリペプチド配列または核酸配列を推定的に同定するために必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０の連続したヌクレオチドを含む、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、微生物コロニーまたはバクテリオファージプラークのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど、遺伝子同定（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離の配列依存的方法に使用することができる。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲの増幅プライマーとして使用することができる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、その配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するのに十分な配列を含む。本明細書に報告された配列の利益を受ける当業者は、本明細書に記載の方法論に基づいて、当業者に周知の目的のために本開示の配列の全部または実質的な部分を今や使用することができる。
【００６１】
用語「相補的」は、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を記載するために使用する。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
【００６２】
用語「相同性」および「相同」は互換的に使用する。これらは、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現の媒介または特定の表現型の生成に対する遺伝子断片の能力に影響を及ぼさない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の未改変断片に比較して、得られる核酸断片の機能特性が実質的に変化しない、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入などの核酸断片の改変を指す。
【００６３】
さらに、当業者は、相同な核酸配列はまた、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃などの中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書に例示した配列またはその配列と機能的に同等である、本明細書に開示のヌクレオチド配列の任意の部分とハイブリダイズする能力によっても定義されることを認識する。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似した断片をスクリーニングするように調整することができる。
【００６４】
用語「選択的にハイブリダイズする」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非標的核酸配列へのハイブリダイゼーションよりも顕著に検出できる程度（例えばバックグラウンドの少なくとも２倍）に、指定の核酸標的配列に核酸配列がハイブリダイズすることおよび非標的核酸が実質的に除外されることへの言及を含む。選択的にハイブリダイズする配列は、典型的には、互いに少なくとも約８０％の配列同一性または９０％の配列同一性、最大１００％の配列同一性（すなわち、完全に相補的）を有する。
【００６５】
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブがその標的配列に選択的にハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況では異なることになる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同プロービング）。あるいは、ストリンジェンシー条件は、低度の類似性を検出するように、配列中のミスマッチを幾分許容するように調整することができる（非相同プロービング）。一般に、プローブの長さは、約１０００ヌクレオチド未満、場合によっては５００ヌクレオチド未満である。
【００６６】
典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３において、約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０を超えるヌクレオチド）については少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成することができる。代表的な低ストリンジェンシー条件は、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）緩衝液を用いた３７℃でのハイブリダイゼーションおよび１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）による５０〜５５℃での洗浄を含む。代表的な中程度ストリンジェンシー条件は、４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳを用いた３７℃でのハイブリダイゼーションおよび０．５×〜１×ＳＳＣによる５５〜６０℃での洗浄を含む。代表的な高ストリンジェンシー条件は、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳを用いた３７℃でのハイブリダイゼーションおよび０．１×ＳＳＣによる６０〜６５℃での洗浄を含む。
【００６７】
特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の働きによるものであり、重要な要因は最終洗浄液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：２６７−２８４（１９８４）の式、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから近似することができ、式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセント、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセント、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする（規定のイオン強度およびｐＨの下で）温度である。Ｔｍは、１％のミスマッチ当たり約１℃低下するので、Ｔｍ、すなわちハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件を、所望の同一性を有する配列にハイブリダイズするように調整することができる。例えば、≧９０％超の同一性を有する配列を探す場合、Ｔｍを１０℃低下させることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける、特定の配列とその相補配列とのＴｍよりも約５℃低いように選択する。しかしながら、厳密にストリンジェントな条件では、Ｔｍよりも１、２、３または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、中程度にストリンジェントな条件では、Ｔｍよりも６、７、８、９または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、低ストリンジェンシー条件では、Ｔｍよりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の組成物ならびに所望のＴｍを使用すると、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の溶液のストリンジェンシーにおける変更を当然記述できることを当業者ならば理解されよう。所望のミスマッチ程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらす場合、より高い温度を使用できるようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸ハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）に見出される。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件は、少なくとも１０、３０、６０、９０、１２０または２４０分間適用することができる。
【００６８】
用語「パーセント同一性」は、配列の比較により決定される、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を指す。「パーセント同一性」は、場合によっては、比較配列間のマッチのパーセントにより決定されるポリペプチド配列間またはポリヌクレオチド配列間の配列関連度も意味する。「パーセント同一性」および「パーセント類似性」は、これらに限定されないが、１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載のものを含む、公知の方法によって容易に計算することができる。
【００６９】
パーセント同一性を決定する好ましい方法は、試験配列間に最良のマッチを与えるように設計されている。パーセント同一性およびパーセント類似性を決定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムの中に成文化されている。配列アラインメントおよびパーセント同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して実施することができる。配列の多重アライメントは、「アライメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」および「アライメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）に記載）を含む数種類のアルゴリズムを包含し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）（バージョン８．０．２）プログラムの中にある「アライメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施する。いずれかのＣｌｕｓｔａｌプログラムを使用して配列アライメントをした後、プログラム中の「配列距離」表を見ることにより、「パーセント同一性」を得ることができる。
【００７０】
「アライメントのＢＬＡＳＴＮ法」は、デフォルトパラメーターを使用してヌクレオチド配列を比較するための国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）［「ＮＣＢＩ」］により提供されるアルゴリズムであり、一方、「アライメントのＢＬＡＳＴＰ法」は、デフォルトパラメーターを使用して、タンパク質配列を比較するためのＮＣＢＩにより提供されるアルゴリズムである。
【００７１】
同一または類似の機能または活性を有する他種由来のポリペプチドを同定する際に、多くのレベルの配列同一性が有用であることは、当業者は十分理解している。適切な核酸断片、すなわち本明細書に記載の方法および宿主細胞において単離した、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に報告したアミノ酸配列に対して少なくとも約７０〜８５％同一のポリペプチドをコードし、一方、より好ましい核酸断片は、少なくとも約８５〜９５％同一のアミノ酸配列をコードする。好ましい範囲は上記のとおりであるが、パーセント同一性の有用な例としては、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５０％〜１００％間の任意の整数パーセントが挙げられる。さらに、この単離したヌクレオチド断片のいずれの全長相補物もまたは部分的相補物も目的のものである。
【００７２】
適切な核酸断片は、上記の相同性を有するだけでなく、典型的には少なくとも５０アミノ酸、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００７３】
用語「コドン縮重」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ヌクレオチド配列の変異を許容する遺伝暗号における性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞が示す「コドンバイアス」について十分承知している。したがって、宿主細胞における発現の改善を目的として遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように遺伝子を設計することが好ましい。
【００７４】
「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を使用して、化学的に合成されるオリゴヌクレオチドビルディングブロックから組み立てることができる。これらのオリゴヌクレオチドビルディングブロックをアニールし、次いで連結して遺伝子セグメントを形成した後、酵素的に組み立てて全遺伝子を構築する。したがって、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のための遺伝子を構築することができる。当業者は、宿主が好むコドンの方向へコドン使用をバイアスすると、遺伝子発現が成功する可能性が高まることを認識している。好ましいコドンは、配列情報が利用可能である、宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づいて決定することができる。例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用プロフィールは米国特許第７，１２５，６７２号明細書に提供されている。
【００７５】
「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、コード領域のみを指すことも、またはコード配列の前（５’非コード配列）およびコード配列の後（３’非コード配列）に調節配列を含むこともある。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する、天然に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然では一緒に見出されることがない制御配列およびコード配列を含む、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列を含むことも、または同じ供給源に由来するが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含むこともある。「内在性遺伝子」は、生物ゲノム内のその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、遺伝子移入により宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新たな位置に導入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によりゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」は、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計された、そのコドン使用頻度を有する遺伝子である。
【００７６】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列（例えば、転写開始部位と翻訳開始コドンの間）、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を挙げることができる。
【００７７】
「プロモーター」は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来することも、または天然に見出される様々なプロモーターに由来した様々なエレメントから構成されていることも、または合成ＤＮＡセグメントまで含むこともある。異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境もしくは生理学的条件に応答して、異なるプロモーターが遺伝子の発現を指示し得ることを当業者は理解している。ほぼ常に大部分の細胞型で遺伝子の発現を誘導するプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全には画定されていないので、様々な長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター作用を示す可能性があることもまた認識されている。
【００７８】
用語「３’非コード配列」および「転写ターミネーター」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができるポリアデニル化認識配列およびその他の調節配列をコードする配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことにより特徴づけられる。３’領域は、転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすことができる。
【００７９】
「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼが触媒するＤＮＡ配列の転写により生じる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、その転写物は転写一次産物と呼ばれ、または転写一次産物の転写後プロセシングから生じたＲＮＡ配列である場合は、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンがなく、かつ細胞がタンパク質に翻訳することができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補的で、それに由来する二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、その故細胞がタンパク質に翻訳することができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的転写一次産物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的で、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書；国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。
【００８０】
用語「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方の機能に影響を及ぼすように、単一核酸断片上で核酸配列が結合していることを指す。例えば、プロモーターがそのコード配列の発現に影響を及ぶすことができる場合、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。すなわち、そのコード配列はプロモーターの転写制御下にある。コード配列は、センスまたはアンチセンスの方向で調節配列に作動可能に連結することができる。
【００８１】
用語「組換え体」は、例えば化学合成により、または遺伝子工学技術を用いる核酸の単離セグメントの操作により、さもなければ別々の２つの配列を人為的に組合せたものを指す。
【００８２】
本明細書で使用する用語「発現」は、核酸断片に由来したセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともある。したがって、本明細書で使用する用語「発現」は、機能性最終生成物（例えばｍＲＮＡまたはタンパク質［前駆体または成熟のいずれか］）の生成を指す。
【００８３】
「形質転換」は、遺伝学的に安定な遺伝をもたらす、宿主生物への核酸分子の移入を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドである場合も、または宿主生物のゲノムへ組み込まれる場合もある。
【００８４】
「トランスジェニック細胞」または「トランスジェニック生物」は、形質転換手順により核酸断片を含有する細胞または生物を指す。トランスジェニック細胞またはトランスジェニック生物はまた、「組換え」、「形質転換」または「形質転換体」細胞または生物と呼ばれる。
【００８５】
用語「プラスミド」および「ベクター」は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態をとる染色体外エレメントを指す。このようなエレメントは、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたは任意の供給源に由来する一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡの線状もしくは環状のヌクレオチド配列とすることができ、そこでは、いくつかのヌクレオチド配列が連結または組換えされて、細胞に発現カセットを導入することができるユニークな構築物になっている。
【００８６】
用語「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、かつ外来宿主においてその遺伝子の発現を増強させることができるエレメントを、外来遺伝子に加えて有するＤＮＡの断片を指す。一般に、発現カセットは、選択された遺伝子のコード配列ならびに選択された遺伝子生成物の発現に必要とされる、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列を含むことになる。したがって、発現カセットは、典型的には、１）プロモーター配列、２）コード配列、すなわち翻訳領域［「ＯＲＦ」］、および３）３’非翻訳領域、すなわち真核生物では通常ポリアデニル化部位を含有するターミネーターから構成される。発現カセットは、通常、クローニングおよび形質転換を容易にするためにベクター内に含まれる。それぞれの宿主に対して適正な調節配列を使用する限り、様々な発現カセットを、細菌、酵母、植物および哺乳類の細胞を含む様々な生物に形質転換することができる。
【００８７】
用語「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」および「コンストラクト」は、本明細書において互換的に使用する。組換えコンストラクトは、例えば天然に一緒に見出すことはない調節配列およびコード配列などの核酸断片の人為的な組合せを含む。例えば、組換えコンストラクトは、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列を含むことも、または同じ供給源に由来するが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含むこともある。このようなコンストラクトは、それ自体で使用することも、またはベクターと共に使用することもできる。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者には周知のように、宿主細胞を形質転換するために使用する方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本明細書に記載の任意の単離核酸断片を含む宿主細胞の形質転換、選択および増殖を成功裡に行うためにベクター上に存在しなければならない遺伝エレメントを十分承知している。当業者はまた、独立した異なる形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２４１１−２４１８（１９８５）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１８：７８−８６（１９８９））、したがって、所望の発現レベルおよびパターンを示す株または系統を得るためには多数の事象をスクリーニングしなければならないことも認識している。
【００８８】
用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の解析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものでも、または独立に開発されたものでもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、これらに限定されないが、１）ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））、３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、４）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、および５）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられる。本記載内では、配列分析ソフトウェアを解析に使用する場合は常に、特に指示がない限り、分析結果は、参照プログラムの「デフォルト値」に基づくものである。本明細書で使用する「デフォルト値」は、ソフトウェアを最初に初期化したときに、初めにロードされる値またはパラメーターの任意のセットを意味する。
【００８９】
本明細書で使用する標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニングの手法は、当技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（これ以降「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）、Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）により記載されている。
【００９０】
ペントースリン酸経路の酸化分岐は、上述のとおり、３つの酵素、すなわちグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ［「Ｇ６ＰＤＨ」］、６−ホスホグルコノラクトナーゼ［「６ＰＧＬ」］および６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ［「６ＰＧＤＨ］」を含む。しかしながら、Ｇ６ＰＤＨはＰＰ経路の律速酵素であり、ＮＡＤＰ＋によりアロステリック的に促進される（その結果、低濃度のＮＡＤＰ＋は解糖系にＧ−６−Ｐを振り向けるが、高濃度のＮＡＤＰ＋はＰＰ経路にＧ−６−Ｐを振り向ける）。
【００９１】
ＰＰ経路の酵素、特にＧ６ＰＤＨは詳細に研究されている。これは、Ｇ６ＰＤＨ欠損が、世界中で４億を超える人々に存在し、アフリカ、地中海およびアジアの系統の人々が最大の有病率を示す世界で最も一般的なヒト酵素欠損症である結果である。具体的には、Ｇ６ＰＤＨ欠損は、いくつかの原因、最も一般的には感染または特定の医薬品または化学物質への曝露に呼応した、異常に低レベルのＧ６ＰＤＨおよび非免疫性溶血性貧血を特徴とするＸ連鎖劣性遺伝病である。１９９８年の時点で、いずれも完全に不活性というわけではないが、欠陥のあるＧ６ＰＤ遺伝子によりコードされた、ほぼ１００種の異なる形態のＧ６ＰＤ酵素分子が知られていた−−−このことはＧ６ＰＤがヒトにおいて不可欠であることを示唆する。
【００９２】
部分的および全体的なゲノム配列が利用可能であるため、Ｇ６ＰＤＨ、６ＰＧＬおよび６ＰＧＤＨをコードする数多くの遺伝子配列が公的に利用可能である。例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＧ６ＰＤＨ、６ＰＧＬおよび６ＰＧＤＨのタンパク質に対して高い相同性を有するＧ６ＰＤＨ、６ＰＧＬおよび６ＰＧＤＨの配列を、それぞれ表３、４および５に示す。当技術分野で周知のとおり、これらの配列から、配列分析ソフトウェアを使用して、同種または他種のＧ６ＰＤＨ、６ＰＧＬおよび／または６ＰＧＤＨのホモログをそれぞれ容易に探索することができる。一般に、このようなコンピュータソフトウェアは、種々の置換、欠失およびその他の改変に対して相同性の程度を割り当てることにより、類似配列をマッチさせる。表３、表４または表５の任意のＧ６ＰＤＨ、６ＰＧＬおよび／または６ＰＧＤＨのタンパク質を核酸またはタンパク質の配列データベースに対して比較し、それによって好ましい生物内の類似の公知配列を同定するために、低複雑性フィルター（ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｆｉｌｔｅｒ）および以下のパラメーター：期待値（Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）＝１０およびマトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ  ６２を用いるＢＬＡＴＰアライメント法（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））などのソフトウェアアルゴリズムを使用することはよく知られている。
【００９３】
公知配列のデータベースの中を検索するためのソフトウェアアルゴリズムの使用は、表３、表４および表５にそれぞれ記載されている配列など、Ｇ６ＰＤＨ、６ＰＧＬおよび／または６ＰＧＤＨの公的に利用可能な配列に対して比較的低いパーセント同一性を有するホモログの単離に特に適している。Ｇ６ＰＤＨ、６ＰＧＬおよび／または６ＰＧＤＨの公的に利用可能な配列に対して少なくとも約７０％〜８５％同一であるＧ６ＰＤＨ、６ＰＧＬおよび／または６ＰＧＤＨのホモログの単離は比較的容易であると予測できる。さらに、少なくとも約８５％〜９０％同一であるそれらの配列は、単離に特に適しており、少なくとも約９０％〜９５％同一である配列は、最も容易に単離されよう。
【００９４】
一部のＧ６ＰＤＨホモログは、Ｇ６ＰＤＨ酵素にユニークなモチーフの使用によっても単離されている。例えば、Ｇ６ＰＤＨがＮＡＤＰ＋結合モチーフを有することは周知である（Ｌｅｖｙ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３２６：１４５−１５１（１９９６））。「保存ドメイン」のこれらの領域は、特定の位置に高度に保存された１組のアミノ酸に対応し、Ｇ６ＰＤＨタンパク質の構造、安定性または活性にとって不可欠なＧ６ＰＤＨタンパク質の領域を表している可能性が高い。モチーフは、タンパク質ホモログファミリーのアライメントされた配列が高度に保存されていることにより同定される。ユニークな「サイン」としてのモチーフにより、新しく決定された配列を有するタンパク質が以前に同定されたタンパク質ファミリーに属するものか否かを決定することができる。これらのモチーフは、新規Ｇ６ＰＤＨ遺伝子を迅速に同定するための診断ツールとして有用である。
【００９５】
あるいは、Ｇ６ＰＤＨ、６ＰＧＬおよび／または６ＰＧＤＨの公的に利用可能な配列またはそれらのモチーフをホモログ同定用のハイブリダイゼーション試薬とすることができる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本構成要素としては、プローブ、目的の遺伝子または遺伝子断片を含有すると推測される試料および特定のハイブリダイゼーション法が挙げられる。プローブは、典型的には、検出すべき核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出すべき核酸配列にハイブリダイズ可能である。プローブ長は５塩基から数万塩基まで変動し得るが、典型的には、約１５塩基〜約３０塩基のプローブ長が適している。プローブ分子の一部のみが、検出すべき核酸配列に相補的である必要がある。さらに、プローブと標的配列の間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイズした領域にある塩基の特定の分画が適切な相補的塩基と対を形成しない結果となりながらも、ハイブリダイゼーションは相補性が不完全な分子間で起こる。
【００９６】
ハイブリダイゼーション法は周知である。典型的には、プローブおよび試料を、核酸ハイブリダイゼーションが可能となる条件下で混合しなければならない。これには、適切な濃度および温度の条件下で、無機塩または有機塩の存在においてプローブと試料を接触させるステップが含まれる。プローブと試料核酸の間のあらゆる可能なハイブリダイゼーションが起こるのに十分長い時間、プローブと試料核酸を接触させていなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度により、ハイブリダイゼーションが起こるのに必要な時間が決定される。プローブまたは標的の濃度が高いほど、必要とするハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短縮される。場合によっては、塩酸グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウムまたはトリフルオロ酢酸セシウムなどのカオトロピック剤を添加してもよい。所望により、ハイブリダイゼーション混合物に、ホルムアミドを典型的には３０〜５０％（ｖ／ｖ）［「容積単位」］で添加することができる。
【００９７】
種々のハイブリダイゼーション溶液を使用することができる。典型的には、これらの溶液は、約２０〜６０容積％、好ましくは３０容積％の極性有機溶媒を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液では、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨは約６〜９の範囲））、約０．０５〜０．２％の界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、または０．５〜２０ｍＭの間のＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）および血清アルブミンを使用する。さらに、典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識キャリア核酸、子ウシ胸腺ＤＮＡもしくはサケ精子ＤＮＡなどの断片化核ＤＮＡまたは酵母ＲＮＡ、および場合によっては、約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌ［「重量／容積」］のグリシンが含まれる。極性の水溶性剤または膨潤剤（例えばポリエチレングリコール）、アニオン性ポリマー（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレート）およびアニオン性糖ポリマー（硫酸デキストランなど）を含む容積排除剤（ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）などの他の添加物を含めてもよい。
【００９８】
核酸ハイブリダイゼーションは様々なアッセイ形式に適応可能である。最も適したものの１つはサンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適応可能となる。サンドイッチ型アッセイの主要構成要素は固体担体である。固体担体は、非標識で配列の一部に相補的である固定化核酸プローブを吸着または共有結合させている。
【００９９】
本明細書または公開文献に記載されているＧ６ＰＤＨ、６ＰＧＬおよび／もしくは６ＰＧＤＨの任意の核酸断片または同定された任意のホモログを使用して、同種または他種からホモログタンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。配列依存プロトコールを使用するホモログ遺伝子の単離は当技術分野で周知である。配列依存プロトコールの例としては、これらに限定されないが、１）核酸ハイブリダイゼーション法、２）ポリメラーゼ連鎖反応［「ＰＣＲ」］（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）、リガーゼ連鎖反応［「ＬＣＲ」］（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１０７４（１９８５））または鎖置換増幅［「ＳＤＡ」］（Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２））などの核酸増幅技術の種々の使用により例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法、ならびに３）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニングの方法が挙げられる。
【０１００】
例えばＧ６ＰＤＨ、６ＰＧＬおよび／または６ＰＧＤＨの公的に利用可能な遺伝子またはそれらのモチーフに類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、それらの公的に利用可能な核酸断片の全部または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用し、周知の方法によって所望の任意の生物からのライブラリーをスクリーニングすることにより直接単離することができよう。公的に利用可能な核酸配列に基づいた特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野で公知の方法により設計および合成することができる（上記Ｍａｎｉａｔｉｓ）。さらに、配列全体を直接使用して、ランダムプライマーＤＮＡ標識化、ニックトランスレーション法もしくは末端標識化手法などの当業者に公知の方法によるＤＮＡプローブ合成または利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写システムを使用するＲＮＡプローブ合成を行うことができる。さらに、特定のプライマーを設計および使用して、公的に利用可能な配列またはそれらのモチーフの一部または全長を増幅することができる。得られた増幅産物は、増幅反応の間に直接標識するか、または増幅反応の後に標識して、適切なストリンジェンシー条件下で全長ＤＮＡ断片を単離するためのプローブとして使用することができる。
【０１０１】
まさに議論した周知の方法のいずれかに基づいて、選択した好ましい任意の生物において、Ｇ６ＰＤＨ、６ＰＧＬおよび／または６ＰＧＤＨの遺伝子ホモログを同定および／または単離することが可能であろう。
【０１０２】
複雑な分子がより小さな単位から合成される、細胞内の大部分の同化過程は、アデノシン三リン酸［「ＡＴＰ」］またはＮＡＤＰＨのいずれかによりエネルギーを供給される。ＮＡＤＰＨに関しては、ＰＰ経路の酸化段階が細胞におけるＮＡＤＰＨの主要な供給源であり、必要なＮＡＤＰＨの約６０％が生成される。したがって、Ｇ６ＰＤＨ、６ＰＧＬおよび６ＰＧＤＨにより触媒される反応は、細胞ＮＡＤＰＨを生成するそれらの能力のために細胞の代謝において重要な役割を果たす。次いで、この分子は数多くの同化経路に還元当量を提供する。
【０１０３】
本発明は、ＮＡＤＰＨの細胞内アベイラビリティを増加させ、それによって、この補因子をその生合成経路において必要とする非天然生成物の生成を増加させることに関する。より具体的には、目的の非天然生成物を生成するための方法であって、
（ａ）トランスジェニック微生物を提供するステップであって、
（ｉ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ［「Ｇ６ＰＤＨ」］をコードする少なくとも１つの遺伝子と、
（ｉｉ）６−ホスホグルコノラクトナーゼ［「６ＰＧＬ」］をコードする少なくとも１つの遺伝子と、
（ｉｉｉ）目的の非天然生成物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と
を含み、
目的の非天然生成物の生合成が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸［「ＮＡＤＰＨ」］を必要とする少なくとも１つの酵素反応を含み、
（ｉ）および（ｉｉ）が協調的調節様式で過剰発現され、
（ｉ）および（ｉｉ）を欠いているかまたは協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生成されるＮＡＤＰＨ量と比較すると、ＮＡＤＰＨ量の生成が増加している、ステップと、
（ｂ）発酵性炭素源の存在下でステップ（ａ）のトランスジェニック微生物を増殖させ、それによって、目的の非天然生成物を（ｉｉｉ）の発現により生成させるステップと、
（ｃ）場合によって、目的の非天然生成物を回収するステップと
を含む方法を本明細書に記載する。
【０１０４】
より具体的には、Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子および６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子を、協調的調節様式で過剰発現させるが、これは、
（ａ）第２のプロモーターに比較すると、第１のプロモーターの活性が同等または低下している［すなわち、第１のプロモーターと第２のプロモーターが互いに同じかまたは異なっている］、Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子の第１のプロモーターへの作動可能な連結および６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子の第２のプロモーターへの作動可能な連結、
（ｂ）Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子のコピー数が、６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子のコピー数と比較すると、同等または減少している、Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子の多重コピーでの発現および６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子の多重コピーでの発現、
（ｃ）マルチザイムの作製による、Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子の酵素活性の６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子の酵素活性への連結、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に述べられた手段の任意の組合せ、
からなる群から選択される手段によって達成することができる。
【０１０５】
少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性反応を含む生合成ルートが過剰発現すると、ＮＡＤＰ＋レベルが劇的に増加し、そのため、Ｇ６ＰＤＨが刺激されてＮＡＤＰＨがさらに生成することになる。
【０１０６】
上記の方法に関する一部の実施形態では、６ＰＧＤＨをさらに発現させることにより、ＮＡＤＰＨの細胞アベイラビリティのさらなる増加を得ることができる。
【０１０７】
少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性反応を有する目的の非天然生成物はいずれも、本発明のトランスジェニック微生物および／または方法を使用して生成することができる。ＮＡＤＰＨ依存性反応を有する非天然生成物の例としては、これらに限定されないが、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、キノイン（ｑｕｉｎｏｉｎｅ）、スチルベン、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステルが挙げられる。
【０１０８】
より具体的には、脂質合成では、ＮＡＤＰＨは脂肪酸生合成に必要である。例えば具体的には、多価不飽和脂肪酸であるリノール酸［「ＬＡ」、１８：２  ω−６］の１分子の合成には、次の反応：９アセチルＣｏＡ＋８ＡＴＰ＋１６ＮＡＤＰＨ＋２ＮＡＤＨ→ＬＡ＋８ＡＤＰ＋１６ＮＡＤＰ＋＋２ＮＡＤで示されるとおり、少なくとも１６分子のＮＡＤＰＨが必要である。したがって、脂質合成はＮＡＤＰＨの細胞アベイラビリティに依存する。用語「脂肪酸」は、より長鎖およびより短鎖の酸が両方とも知られているが、鎖長が約Ｃ１２〜Ｃ２２の範囲にある長鎖脂肪酸（アルカン酸）を指す。主な鎖長はＣ１６からＣ２２の間である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」の単純な表記法で表し、ここで、Ｘは、特定の脂肪酸における炭素［「Ｃ」］原子の総数、Ｙは二重結合の数である。
【０１０９】
「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］および「オメガ−６脂肪酸」［「ｎ−６」］対「オメガ−３脂肪酸」［「ｎ−３」］の間の差異に関するさらなる詳細は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，２３８，４８２号明細書に提供されている。米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表３には、オメガ−３およびオメガ−６ＰＵＦＡとそれらの前駆体の化学名および一般名、ならびに一般に使用される略語について詳細にまとめられている。
【０１１０】
しかしながら、ＰＵＦＡ例の一部として、これらに限定されないが、リノール酸［「ＬＡ」、１８：２  ω−６］、ガンマ−リノレン酸［「ＧＬＡ」、１８：３  ω−６］、エイコサジエン酸［「ＥＤＡ」、２０：２  ω−６］、ジホモ−ガンマ−リノレン酸［「ＧＬＡ」、２０：３  ω−６］、アラキドン酸［「ＡＲＡ」、２０：４  ω−６］、ドコサテトラエン酸［「ＤＴＡ」、２２：４  ω−６］、ドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−６」、２２：５  ω−６］、アルファ−リノレン酸［「ＡＬＡ」、１８：３  ω−３］、ステアリドン酸［「ＳＴＡ」、１８：４  ω−３］、エイコサトリエン酸［「ＥＴＡ」、２０：３  ω−３］、エイコサテトラエン酸［「ＥＴｒＡ」、２０：４  ω−３］、エイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」、２０：５  ω−３］、ドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−３」、２２：５  ω−３］およびドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」、２２：６  ω−３］が挙げられる。
【０１１１】
ＮＡＤＰＨが必要となるＰＵＦＡ生合成のさらなる例として、グルコースからのＥＰＡ生合成を次の化学方程式：
グルコース＋２ＡＤＰ＋４ＮＡＤ→２アセチルＣｏＡ＋２ＡＴＰ＋４ＮＡＤＨ＋２ＣＯ２（式１）
１０アセチルＣｏＡ＋９ＡＴＰ＋１８ＮＡＤＰＨ＋５ＮＡＤＨ→ＥＰＡ＋９ＡＤＰ＋１８ＮＡＤＰ＋＋５ＮＡＤ（式２）
によって示すことができる。
【０１１２】
コレステロール合成では、還元反応にＮＡＤＰＨが必要なため、１モルのコレステロール合成に複数モルのＮＡＤＰＨが必要となる。したがって、ステロール生合成はＮＡＤＰＨの細胞アベイラビリティに依存する。ステロール化合物の例としては、スクアレン、ラノステロール、チモステロール、エルゴステロール、７−デヒドロコレステロール（プロビタミンＤ３）およびそれらの組合せが挙げられる。
【０１１３】
同様に、イソプレノイド生合成では、還元反応の電子供与体としてＮＡＤＰＨが必要となる。例えば、イソプレンの前駆体であるメバロン酸へのＨＭＧ−ＣｏＡの変換に２モルのＮＡＤＰＨが必要となる。また、他のイソプレノイドへのイソプレンのさらなる変換には、還元／不飽和化ステップでＮＡＤＰＨがさらに必要となる。用語「イソプレノイド化合物」は、イソプレン（２−メチルブタ−１，３−ジエン；ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ＝ＣＨ２）から形式的に誘導される化合物、すなわちその骨格が分子内に反復して存在することが全般的に認められる化合物を指す。これらの化合物は、イソペンテニルピロリン酸で始まるイソプレノイド経路を介して生合成的に生成するもので、イソプレン単位のヘッドトゥーテール縮合により形成し、長さが例えば５、１０、１５、２０、３０、または４０炭素であり得る分子がもたらされる。したがって、例えばテルペン、テルペノイド、カロテノイド、キノン誘導体化合物、ドリコールおよびスクアレンがイソプレノイド化合物として挙げられるが、これらの化合物すべてについてその生合成は、ＮＡＤＰＨの細胞アベイラビリティに依存する。
【０１１４】
本明細書で使用する用語「カロテノイド」は、イソプレンから形式的に誘導される共役ポリエン炭素骨格を有する炭化水素のクラスを指す。このクラスの分子は、トリテルペン［「Ｃ３０ジアポカルテノイド」（ｄｉａｐｏｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ）］およびテトラテルペン［「Ｃ４０カロテノイド」］ならびにそれらの酸素化誘導体から構成され、典型的には、これらの分子は強い光吸収特性を有し、長さがＣ２００を超える場合もある。長さが、例えばＣ３５、Ｃ５０、Ｃ６０、Ｃ７０およびＣ８０である他の「カロテノイド化合物」が知られている。用語「カロテノイド」には、カロテンおよびキサントフィルの両方が含まれ得る。「カロテン」は、炭化水素カロテノイド（例えばフィトエン、β−カロテンおよびリコペン）を指す。対照的に、用語「キサントフィル」は、１つまたは複数の酸素原子を、ヒドロキシ−、メトキシ−、オキソ−、エポキシ−、カルボキシ−またはアルデヒドの官能基形態で含有するＣ４０カロテノイドを指す。キサントフィルはカロテンより極性であり、この特性により、脂肪および脂質へのその溶解性が劇的に低下する。したがって、カロテノイドの適切な例として、アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン（すなわち３，３’−ジヒドロキシ−β、β−カロテン−４，４’−ジオン）、カンタキサンチン（すなわちβ，β−カロテン−４，４’−ジオン）、カプソルブリン（ｃａｐｓｏｒｕｂｒｉｎ）、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、β，ψ−カロテン、δ−カロテン、ε−カロテン、β−カロテンケト−γ−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、γ−カロテン、ψ−カロテン、ζ−カロテン、ゼアキサンチン、アドニルビン、テトラヒドロキシ−β、β’−カロテン−４，４’−ジオン、テトラヒドロキシ−β、β’−カロテン−４−オン、カロキサンチン、エリスロキサンチン、ノストキサンチン、フレキシキサンチン、３−ヒドロキシ−γ−カロテン、３−ヒドロキシ−４−ケト−γ−カロテン、バクテリオルビキサンチン（ｂａｃｔｅｒｉｏｒｕｂｉｘａｎｔｈｉｎ）、バクテリオルビキサンチナール（ｂａｃｔｅｒｉｏｒｕｂｉｘａｎｔｈｉｎａｌ）、ルテイン、４−ケト−γ−カロテン、α−クリプトキサンチン、デオキシフレキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、ジデヒドロリコペン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β−イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコペン、ミクソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、フィトフルエン、ロドピン、ロドピングルコシド、４−ケト−ルビキサンチン、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、トルレン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセテート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシドおよびそれらの組合せが挙げられる。
【０１１５】
用語「少なくとも１つのキノン誘導体化合物」は、酸化還元活性のあるキノン環構造を有する化合物を指し、ＣｏＱ系列（すなわち、Ｑ６、Ｑ７、Ｑ８、Ｑ９およびＱ１０）のキノン、ビタミンＫ化合物、ビタミンＥ化合物およびそれらの組合せを含む。例えば、補酵素Ｑ１０［「ＣｏＱ１０」］という用語は、ユビキノン１０としても知られる２，３−ジメトキシ−ジメチル−６−デカプレニル−１，４−ベンゾキノン（ＣＡＳ登録番号３０３−９８−０）を指す。ＣｏＱ１０のベンゾキノン部分はチロシンから合成されるが、イソプレン側鎖はメバロン酸経路を介してアセチルＣｏＡから合成される。したがって、ＣｏＱ１０などのＣｏＱの生合成はＮＡＤＰＨを必要とする。「ビタミンＫ化合物」には、例えばメナキノンまたはフィロキノンが含まれるが、一方「ビタミンＥ化合物」には、例えばトコフェロール、トコトリエノールまたはα−トコフェロールが含まれる。
【０１１６】
リスベラトロール生合成では、芳香族前駆体チロシンの生成のためにＮＡＤＰＨが必要となる。したがって、リスベラトロール［「３，４’，５−トリヒドロキシスチルベン」］生合成はＮＡＤＰＨの細胞アベイラビリティに依存する。
【０１１７】
当業者ならば、少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性反応を有する、他の目的生成物の例を容易に考え出すことができよう。本例は、限定することを意図するものではなく、代替生成物もまた考えられることは明白である。
【０１１８】
目的の非天然生成物を生成するように操作することができる任意の微生物を本発明の実施に使用することができる。そのような微生物の例としては、これらに限定されないが、種々の細菌、藻類、酵母、ユーグレナ類、ストラメノパイル、卵菌類および菌類が挙げられる。これらの微生物は、本明細書に記載のＧ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬの協調的に調節された過剰発現に先だって、目的の非天然生成物の生合成を可能にする少なくとも１つの異種遺伝子を含むことを特徴とする。あるいは、まずＧ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬの過剰発現を協調的に調節し、次いで少なくとも１つの異種遺伝子を導入して、結果として目的の非天然生成物の生合成を可能にするように微生物を操作できること、または同じ最終結果を達成するためにこれらの形質転換を同時に実施できることを理解されたい。
【０１１９】
時として、目的の生成物が親油性の場合には、油性生物が好まれることがある。油性生物は、オイルの合成および蓄積が天然に可能であり、通常、乾燥細胞重量の約２５％超をオイルとして蓄積することができる。種々の藻類、コケ、菌類、酵母、ストラメノパイルおよび植物が本来油性として分類される。油性酵母がより好ましく、油性酵母として典型的に同定される属としては、これらに限定されないが、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。より具体的には、例示のオイル合成酵母として、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｎａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｏｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．  ｇｒａｍｉｎｉｓ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカとして分類された）が挙げられる。最も好ましい油性酵母はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、ＡＴＣＣ＃７６９８２、ＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４および／またはＬＧＡＭ  Ｓ（７）１（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．，ａｎｄ  Ａｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，８２（１）：４３−９（２００２））として指定されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株が最も好ましい。代替実施形態では、非油性生物、例えばサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母は、油性になるように遺伝子改変することができる（国際公開第２００６／１０２３４２号パンフレット）。
【０１２０】
したがって、例えば、デサチュラーゼ（すなわち、デルタ−１２デサチュラーゼ、デルタ−６デサチュラーゼ、デルタ−８デサチュラーゼ、デルタ−５デサチュラーゼ、デルタ−１７デサチュラーゼ、デルタ−１５デサチュラーゼ、デルタ−９デサチュラーゼ、デルタ−４デサチュラーゼ）遺伝子およびエロンガーゼ（すなわち、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼおよびデルタ−９エロンガーゼ）遺伝子の適切な組合せを導入することにより、数多くの微生物が長鎖ＰＵＦＡを生成するように遺伝子操作されてきた。例えば、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｄｙｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｉｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９：２２４−２３０（２００２）；Ｄｏｍｅｒｇｕｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６９：４１０５−４１１３（２００２）；米国特許第６，１３６，５７４号明細書；米国特許出願公開第２００６−００５１８４７−Ａ１号明細書）、海洋シアノバクテリウム・シネココッカス（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）種（Ｙｕ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ，３５（１０）：１０６１−１０６４（２００６））、メチロトローフ酵母ピチア・パストリス（Ｋａｊｉｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，５４（３）：３３５−５２（２００４））およびコケのニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）（Ｋａｅｗｓｕｗａｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１０１（１１）：４０８１−４０８８（２０１０））に関する研究を参照されたい。
【０１２１】
さらに、それらの内容全体が参照によって本明細書に組込まれる以下の参考文献：米国特許第７，２３８，４８２号明細書；米国特許第７，４６５，５６４号明細書；米国特許第７，５８８，９３１号明細書；米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書；米国特許第７，５５０，２８６号明細書；米国特許第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書；米国特許第２０１０−０３１７−０７２Ａ１号明細書に記載のとおり、ＰＵＦＡ生成のために、油性酵母株であるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の操作に向けて莫大な努力がなされてきた。
【０１２２】
ＰＵＦＡ生合成のために操作された上記の組換え生物のそれぞれにおいて、Ｇ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬの協調的に調節された過剰発現により、ＮＡＤＰＨ量の増加がもたらされ、それによって、生成されるＰＵＦＡ量の増加が可能になる（協調的調節様式ではＧ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬを過剰発現していない、同様に操作された組換え生物と比較して）と予測されよう。
【０１２３】
微生物が油性酵母であり、目的の非天然生成物がＰＵＦＡである一部の実施形態では、Ｇ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬの協調的に調節された過剰発現が、総脂質含量の増加も（ＰＵＦＡ生成の増加に加えて）もたらす。
【０１２４】
代替実施形態では、目的の代替非天然生成物を生成する様々な目的のために微生物を操作することができる。例えば、野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、補酵素Ｑ９およびエルゴステロールを天然に生成することができるが、天然ではカロテン生成性ではなく、リスベラトロールを通常生成しない。国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットおよび国際公開第２００９／１２６８９０号パンフレットは、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼをコードするｃｒｔＥ、フィトエンシンターゼをコードするｃｒｔＢ、フィトエンデサチュラーゼをコードするｃｒｔＩ、リコペンシクラーゼをコードするｃｒｔＹ、カロテノイドヒドロキシラーゼをコードするｃｒｔＺおよび／またはカロテノイドケトラーゼをコードするｃｒｔＷなどのカロテノイド生合成経路遺伝子の導入によるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における一連のカロテノイドの生成について記載している。
【０１２５】
米国特許出願公開第２００９／０１４２３２２−Ａ１号明細書および国際公開第２００７／１２０４２３号パンフレットは、補酵素Ｑ１０を生成するデカプレニルピロリン酸シンターゼをコードするｄｄｓＡ、ビタミンＫ化合物を生成するためのＭｅｎＦ、ＭｅｎＤ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＥ、ＭｅｎＢ、ＭｅｎＡ、ＵｂｉＥおよび／またはＭｅｎＧのポリペプチドをコードする遺伝子およびビタミンＥ化合物を生成するためのｔｙｒＡ、ｐｄｓｌ（ｈｐｐｄ）、ＶＴＥｌ、ＨＰＴ１（ＶＴＥ２）、ＶＴＥ３、ＶＴＥ４および／またはＧＧＨのポリペプチドをコードする遺伝子などの異種キノン生合成経路遺伝子の導入によるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における種々のキノン誘導体化合物の生成について記載している。国際公開第２００８／１３０３７２号パンフレットは、スクアレンシンターゼをコードするＥＲＧ９／ＳＱＳ１およびスクアレンエポキシダーゼをコードするＥＲＧｌの導入によるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるステロールの生成について記載している。また、国際公開第２００６／１２５０００号パンフレットは、リスベラトロールシンターゼをコードする遺伝子の導入によるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるリスベラトロールの生成について記載している。
【０１２６】
非天然生成物の生成のために操作された組換え生物のそれぞれにおいて、協調的調節様式ではＧ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬを過剰発現していない、同様に操作された組換え生物と比較して、Ｇ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬの協調的に調節された過剰発現により、ＮＡＤＰＨ量の増加がもたらされ、それによって、非天然生成物（すなわち、ＰＵＦＡ、カロテノイド、キノン誘導体化合物、ビタミンＫ化合物、ビタミンＥ化合物、ステロイド、リスベラトロール）の量の増加が可能になると予測されよう。
【０１２７】
当業者は、目的の様々な非天然生成物を生成するように操作された他のトランスジェニック微生物についても十分承知しており、非天然生成物の生成をもたらす生合成反応の少なくとも１つがＮＡＤＰＨ依存的である場合には、これらはいずれも本明細書に開示の使用に適している。
【０１２８】
別の態様では、本発明は、トランスジェニック微生物であって、
（ａ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ［「Ｇ６ＰＤＨ」］をコードする少なくとも１つの遺伝子と、
（ｂ）６−ホスホグルコノラクトナーゼ［「６ＰＧＬ」］をコードする少なくとも１つの遺伝子と、
（ｃ）目的の非天然生成物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と
を含み、
目的の非天然生成物の生合成が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸［「ＮＡＤＰＨ」］を必要とする少なくとも１つの酵素反応を含み、
（ｃ）を含み、（ａ）および（ｂ）を欠いているかまたは協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生成されたＮＡＤＰＨ量および目的生成物量と比較すると、
（ａ）および（ｂ）の協調的に調節された過剰発現が、ＮＡＤＰＨ量の増加をもたらし、
ＮＡＤＰＨ量の増加が、トランスジェニック微生物における（ｃ）の発現により生成される目的生成物量の増加をもたらす、トランスジェニック微生物に関する。
【０１２９】
好ましい実施形態では、Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子および６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子の協調的に調節された過剰発現が、
（ａ）Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子が、第１のプロモーターに作動可能に連結し、６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子が、第２のプロモーターに作動可能に連結し、第１のプロモーターの活性が、第２のプロモーターと比較すると、同等または減少していること、
（ｂ）Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子が、多重コピーで発現し、かつ６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子が、多重コピーで発現し、Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子のコピー数が、６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子のコピー数と比較すると、同等または減少していること、
（ｃ）Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子の酵素活性が、マルチザイムとして６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子の酵素活性に連結していること、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に述べられた手段の任意の組合せ、
からなる群から選択される手段によって達成される。
【０１３０】
一部の実施形態では、トランスジェニック微生物は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の遺伝子に加えて、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子も発現する。
【０１３１】
ＰＰ経路遺伝子をコードする少なくとも１つの翻訳領域［「ＯＲＦ」］を含む組換えコンストラクトを作製し、目的の非天然生成物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む宿主微生物に導入することが必要である。当業者は、１）ＤＮＡ分子、プラスミドなどの高分子の構築、操作および単離のための特定の条件および手順、２）組換えＤＮＡ断片および組換え発現コンストラクトの生成、および３）クローンのスクリーニングおよび単離を記載する標準資料教材について承知している。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｍａｌｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９５）；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅｓ，ｖ．１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９８）；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ，ｖ．２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：ＮＹ（１９９８）；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｌａｒｋ，ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：ＮＹ（１９９７）を参照されたい。
【０１３２】
一般に、コンストラクトに含まれる配列の選択は、所望の発現生成物、宿主細胞の性質および非形質転換細胞に対して形質転換細胞を分離する提案手段に依存する。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞の形質転換、選択および増殖を成功裡に行うためにプラスミドベクター上に存在しなければならない遺伝エレメントについて承知している。しかしながら、典型的には、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子、選択可能マーカー、および自律複製または染色体組込みを可能にする配列の転写および翻訳を指示する配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の領域５’（すなわちプロモーター）、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’（すなわちターミネーター）を含む。両方の制御領域が、形質転換された宿主細胞の遺伝子に由来する場合が最も好ましい。
【０１３３】
所望の宿主細胞における異種遺伝子またはその一部の発現を促進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは数多くあり、よく知られている。これらの制御領域は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、イントロン配列、３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲ領域、ならびにタンパク質および／またはＲＮＡ安定化エレメントを含むことができる。このようなエレメントはそれらの強度および特異性において異なっていてもよい。実際、選択された宿主細胞におけるこれらの遺伝子の発現を指示できる任意のプロモーター、すなわち天然、合成またはキメラのいずれのプロモーターも適している。宿主細胞における発現は、誘導様式または構成的様式で起こすことができる。誘導発現は、目的の遺伝子に作動可能に連結された調節可能プロモーターの活性を誘導することにより起こる。構成的発現は、目的の遺伝子に作動可能に連結された構成的プロモーターの使用により起こる。当業者は、当業者に周知の手段を使用して、第２のプロモーターに比較して第１のプロモーターの活性強度を容易に識別することができよう。
【０１３４】
宿主微生物が例えば酵母である場合、酵母細胞で機能する転写および翻訳の領域が、具体的には宿主種から得られる。例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で使用する好ましい転写開始制御領域については、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００９−００９−３５４３−Ａ１号明細書を参照されたい。構成的転写または誘導転写のいずれが望ましいか、目的のＯＲＦを発現する際のプロモーターの効率、構築の容易さ等に応じて任意の数の調節配列を使用することができる。
【０１３５】
転写終結コドン、すなわち「終結領域」をコードする３’非コード配列は、組換えコンストラクトに備えられていなければならず、開始領域が得られた遺伝子の３’領域に由来してもまたは異なる遺伝子に由来してもよい。多数の終結領域が公知であり、それらが由来した属および種と同じでも異なっていても使用される場合には、様々な宿主において申し分なく機能する。終結領域は、何らかの特定の性質のためではなく便宜上で選択されることが多い。終結領域はまた、好ましい宿主にとって天然の種々の遺伝子に由来してもよい。
【０１３６】
酵母で使用するための具体的に有用な終結領域は、酵母遺伝子、具体的にはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）またはクリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。γ−インターフェロンおよびα−２インターフェロンをコードする哺乳類遺伝子の３’−領域も酵母において機能することが知られている。当業者は、入手可能な情報を利用して、転写ターミネーターとして機能する３’−領域配列を設計し合成することができるので、３’−領域は合成することも可能である。終結領域は不必要な場合もあるが、極めて好ましいものである。
【０１３７】
ベクターは、上記の調節エレメントに加えて、選択可能マーカーおよび／またはスコラブル（ｓｃｏｒａｂｌｅ）マーカーを含むことができる。マーカー遺伝子は抗生物質抵抗性遺伝子であることが好ましく、その結果、抗生物質により細胞を処置すると、非形質転換細胞は増殖阻害を受けるかまたは死滅し、形質転換細胞は阻害を受けずに増殖する。酵母形質転換体の選択については、カナマイシン、ヒグロマイシンおよびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性を有する、酵母において機能する任意のマーカーが有用であり、またウラシル、リジン、ヒスチジンまたはロイシンの欠損培地上で増殖する能力は特に有用である。
【０１３８】
クローニングベクターに遺伝子を挿入するのみでは、所望の速度、濃度、量等でのその発現は保証されない。高い発現速度の必要性に応じて、多くの特殊化した発現ベクターが、転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質の安定性および局在、酸素制限ならびに宿主細胞からの分泌を制御する、いくつかの異なる遺伝エレメントを操作することにより作製されている。操作される特徴の一部として、関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、クローン化された遺伝子のコピー数、遺伝子がプラスミドに保持されるか宿主細胞ゲノムに組み込まれるか、合成される外来タンパク質の最終的な細胞局在、宿主生物におけるタンパク質の翻訳および正確なフォールディングの効率、宿主細胞内のクローン化された遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の固有の安定性、ならびに宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近い頻度でのクローン化された遺伝子内のコドン使用が挙げられる。これらのそれぞれは、ＰＰ経路遺伝子の発現をさらに最適化するために、本明細書に記載の方法および宿主細胞において使用することができる。
【０１３９】
具体的には、協調的に調節された過剰発現には、本発明では、Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子および６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子を必要とする。これを達成できる方法の１つは、Ｇ６ＰＤＨをコードする遺伝子を第１のプロモーターに作動可能に連結し、６ＰＧＬをコードする遺伝子を第２のプロモーターに作動可能に連結し、第１のプロモーターの活性が、第２のプロモーターと比較すると、同等または減少していることを保証することによるものである。一部の場合には、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは同じである。これにより、細胞における６ＰＧＬおよびＧ６ＰＤＨの活性量を同様にすることができ、その結果ＰＰ経路を通るバランスのとれたフラックスが維持される。
【０１４０】
当業者ならば承知しているように、種々のプロモーターの活性を比較するために様々な方法が利用可能である。このタイプの比較は、各プロモーターの強度を容易に判定するのに有用である。こうして、レポーター遺伝子（すなわちβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子）の発現に基づいてプロモーター活性を間接的に定量することが有用となる可能性があり、そこでは各発現コンストラクトのＧＵＳ活性を組織化学的および／または蛍光定量的アッセイによって測定することができる（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ５：３８７−４０５（１９８７））。代替実施形態では、より定量的な手段を使用して、プロモーター活性を定量することが時として有用となり得る。適切な方法の１つは、リアルタイムＰＣＲの使用である（リアルタイムＰＣＲの適用についての一般的総説に関しては、Ｇｉｎｚｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，３０：５０３−５１２（２００２）を参照されたい）。リアルタイムＰＣＲは、蛍光レポーターの検出および定量に基づいている。このシグナルは反応におけるＰＣＲ生成物の量に正比例して増加する。各サイクルで蛍光発光量を記録することにより、ＰＣＲ生成物量の最初の顕著な増加が標的テンプレートの初期量に相関する対数期の間のＰＣＲ反応をモニターすることが可能である。アンプリコンを定量的に検出するために、（１）蛍光プローブの使用、または（２）ＤＮＡ結合剤（例えばＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ  Ｉ、臭化エチジウム）の使用の２つの一般方法がある。相対的な遺伝子発現比較については、内部基準（例えば、染色体にコードされた１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子）として内在性の対照を使用することが必要であり、それによって、各リアルタイムＰＣＲ反応に加えられた総ＤＮＡ量の差を標準化することが可能になる。リアルタイムＰＣＲのための特定の方法については当技術分野で詳細に文書化されている。例えば、リアルタイムＰＣＲ特集号（Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５（４）：３８３−４８１（２００１））を参照されたい。
【０１４１】
リアルタイムＰＣＲ反応に続いて、蛍光強度の記録を使用して、１）絶対標準法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）などの既知量の標準を使用する）、２）相対標準法（既知量の標的核酸を各ランのアッセイデザインに含む）、または３）遺伝子発現の相対的な定量のための比較ＣＴ法（ΔΔＣＴ）（標的配列の相対量を選ばれたリファレンス値のいずれかと比較し、その結果をリファレンス値に対するものとして示す）によりテンプレート量を定量する。比較ＣＴ法では、標的とノーマライザーのＣＴ値間の差、すなわち、ΔＣＴ＝ＣＴ（標的）−ＣＴ（ノーマライザー）を最初に決定する必要がある。この値を定量すべき試料それぞれについて計算し、各比較がなされるリファレンスとして１つの試料を選択しなければならない。比較ΔΔＣＴ計算には、各試料のΔＣＴとベースラインのΔＣＴの間の差を見出すステップと、次いで、これらの値を式２−ΔΔＣＴにより絶対値に変換するステップとが含まれる。
【０１４２】
本明細書における本発明を限定するものとは考えられないが、国際公開第２００６／２００６／０５２８７０号パンフレットは、比較条件下で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における７つの異なるプロモーター活性を直接比較する手段の例を提供している。
【０１４３】
プロモーター、ＰＰ経路ＯＲＦおよびターミネーターを含む少なくとも１つのキメラ遺伝子を含む組換えコンストラクトを作製した後、そのコンストラクトを、宿主微生物において自律複製可能なプラスミドベクターに配置するか、または宿主微生物ゲノムに直接組み込む。発現カセットの組込みは、宿主ゲノム内でランダムに起こすことができるか、または宿主遺伝子座との組換えを目的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同領域を含有するコンストラクトを使用することにより標的を設定することができる。コンストラクトの標的を内在性遺伝子座にする場合、転写および翻訳の制御領域の全部または一部を内在性遺伝子座から得ることができる。
【０１４４】
２つ以上の遺伝子が別々の複製ベクターから発現する場合、ベクターの選択手段はそれぞれ異なっていてもよく、各ベクターは、安定な発現を維持しかつコンストラクト間のエレメントの再集合を防止するために他のコンストラクトとの相同性を有するべきではない。すべての導入遺伝子が、所望の生成物の合成を実現するのに必要なレベルで発現するように、導入コンストラクトの制御領域、選択手段および増殖方法を実験的に決定することにより賢明に選択することができる。
【０１４５】
目的遺伝子を含むコンストラクトは、任意の標準手法により宿主細胞に導入することができる。これらの手法には、酢酸リチウム形質転換（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７（１９９１））などの形質転換、プロトプラスト融合、遺伝子銃衝撃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｉｍｐａｃｔ）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、真空濾過、または目的遺伝子を宿主細胞に導入する他の任意の方法）が含まれる。
【０１４６】
便宜上、例えば発現カセット中のＤＮＡ配列を取り込む任意の方法により操作された宿主微生物を、本明細書では、「形質転換」または「組換え体」と呼ぶ。形質転換宿主は、発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有し、遺伝子がゲノムに組み込まれ、増幅されるか否か、または複数のコピー数を有する染色体外エレメント上に存在するか否かに応じて、２つ以上有することがある。
【０１４７】
Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子および６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子の協調的に調節された過剰発現を達成するための代替手段が、遺伝子が多重コピーで発現する場合に存在する。具体的には、Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子のコピー数が、６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子のコピー数に比較して同等または減少している場合に、細胞における６ＰＧＬおよびＧ６ＰＤＨの活性量を同様にすることができ、その結果ＰＰ経路を通るバランスのとれたフラックスが維持される。
【０１４８】
あるいは、当業者は、Ｇ６ＰＤＨをコードする少なくとも１つの遺伝子および６ＰＧＬをコードする少なくとも１つの遺伝子の協調的に調節された過剰発現を、両酵素を含むマルチザイムを作製することによっても保証することができる。国際公開第２００８／１２４０４８号パンフレットは、少なくとも２つの独立して分離可能な酵素活性を、「マルチザイム」または「融合タンパク質」として単一ポリペプチドの中に連結する手段を教示している。それぞれが独立して分離可能な酵素活性を有する２つ以上のポリペプチド間の適切な結合または連結もまた、そのパンフレットに含まれており、したがって、Ｇ６ＰＤＨ−６ＰＧＬマルチザイムの作製は容易であろう。このアプローチはまた、細胞における６ＰＧＬおよびＧ６ＰＤＨの活性量を同様にして、ＰＰ経路を通るバランスのとれたフラックスを維持することを保証するのに適していよう。
【０１４９】
形質転換宿主微生物は、導入コンストラクト上に含有されるマーカーに対する選択により同定することができる。あるいは、多くの形質転換手法が多くのＤＮＡ分子を宿主細胞に導入するので、別個のマーカーコンストラクトを所望のコンストラクトと同時形質転換することができる。
【０１５０】
典型的には、形質転換宿主は、選択培地上で増殖する能力に対して選択され、選択培地は、抗生物質が組み込まれている場合も、または栄養素もしくは増殖因子など非形質転換宿主の増殖に必要な要素が欠損している場合もある。導入マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性を与える場合も、または必須な増殖因子または酵素をコードしている場合もあり、そのため、形質転換宿主で発現すると、選択培地上での増殖が可能になる。発現したマーカータンパク質を直接的または間接的に検出することができると、形質転換宿主の選択も可能になる。マーカータンパク質は、単独でまたは別のタンパク質との融合物として発現させることができる。マーカータンパク質またはタグを発現する細胞は、例えば視覚的にまたは抗体を使用する蛍光標識細胞ソーティングまたはパニングなどの手法により選択することができる。
【０１５１】
選択された宿主または発現コンストラクトにかかわらず、独立した異なる形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらすので（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２４１１−２４１８（１９８５）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１８：７８−８６（１９８９））、所望の発現レベル、調節およびパターンを示す株または系統を得るためには複数の形質転換体をスクリーニングしなければならない。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン解析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノザン解析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１−２）：１３３−１４５（１９９３））およびタンパク質発現のウェスタン解析および／もしくはＥｌｉｓａ解析、または表現型解析により達成することができる。あるいは、Ｇ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬの発現レベルが操作されているトランスジェニック微生物で生成される目的の非天然生成物の量を単に定量し、この量を、Ｇ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬの発現レベルが操作されていないトランスジェニック微生物で生成される目的の非天然生成物の量と比較すれば、細胞における目的の非天然生成物の量の増加が観察されるか否かに基づいて、Ｇ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬの協調的に調節された過剰発現が達成されているか否かを容易に判定することができよう。特定のアッセイでは、目的の生成物を合成して判定することになる。
【０１５２】
トランスジェニック微生物は、目的の少なくとも１つの非天然生成物の生成を最適化する条件下で増殖させる。一般に、培地条件は、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素対窒素比、様々なミネラルイオンの量、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス生産段階の期間、オイル蓄積段階の期間、ならびに細胞収集の時期および方法を改変することにより最適化することができる。例えば、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、酵母抽出物−ペプトン−デキストロースブロス［「ＹＰＤ」］などの複合培地、合成最少培地、または増殖に必要な成分が欠損し、所望の発現カセットの選択を引き出す合成最少培地（例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））の中で一般に増殖させる。
【０１５３】
本明細書に記載の方法およびトランスジェニック生物のための発酵培地は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許出願公開第２００９−０３２５２６５−Ａ１号明細書の教示のとおり、適切な炭素源を含有しなければならない。適切な炭素源は、多種多様な糖（例えばグルコース）を包含し、フルクトース、グリセロールおよび／または脂肪酸が好ましい。グルコース、スクロース、転化スクロース、フルクトースおよび／または１０〜２２の間の炭素を含有する脂肪酸が最も好ましい。例えば、発酵性炭素源は、グルコースを転化スクロースおよび／またはフルクトースと組み合わせて使用する場合に、転化スクロース（すなわち、スクロースの加水分解から生じる等量のフルクトースおよびグルコースを含む混合物）、グルコース、フルクトースおよびこれらの組合せからなる群から選択することができる。
【０１５４】
窒素は、無機（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機（例えば尿素またはグルタミン酸）の供給源から補充することができる。適切な炭素源および窒素源に加えて、発酵培地はまた、油性宿主の増殖および目的の非天然生成物の生成に必要な酵素経路の促進に適する、当業者に公知の適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液、ビタミンおよびその他の成分を含有しなければならない。好ましい増殖培地は、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）などの一般の商業的調製培地である。他の合成（ｄｅｆｉｎｅｄ）増殖培地または合成（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）増殖培地も使用することができ、形質転換宿主細胞の増殖に適した培地は、微生物学または発酵科学の当業者には公知である。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的には、約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、その中では初期増殖条件の範囲としてｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で行うことができ、その中では微好気条件が好ましい。
【０１５５】
当業者はまた、生成しようとする目的の特定生成物に応じた、トランスジェニック微生物を培養する適切な手段に精通していよう。例えば、代謝期は増殖と脂肪の合成／保存との間で「バランス」を取らなければならないため、油性酵母細胞における高レベルのＰＵＦＡの蓄積には、典型的には、二段階工程が必要である。したがって、最も好ましくは、二段階発酵工程が油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））におけるＰＵＦＡの生成に必要である。このアプローチは米国特許第７，２３８，４８２号明細書に記載されており、種々の適切な発酵工程設計（すなわちバッチ、フェドバッチおよび連続）および増殖中の検討がある。
【実施例】
【０１５６】
本発明を以下の実施例の中でさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示す一方、例示としてのみ示されることを理解されたい。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正をなして、様々な使用および条件にそれを適合させることができる。
【０１５７】
特に指示がない限り、参照された米国特許および特許出願はすべて、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
一般的方法
実施例で使用する標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニングの手法は、当技術分野で周知であり、１）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；２）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ，ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；および３）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）に記載されている。
【０１５９】
微生物培養の維持および増殖に適した材料および方法は、当技術分野で周知である。以下の実施例における使用に適した手法は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４））；またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）の記載に見出すことができる。微生物細胞の増殖および維持に使用されるすべての試薬、制限酵素および材料は、特に指示がない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ），ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ），Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ），ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ），またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的には、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ［「ＬＢ」］プレート上で３７℃にて増殖させた。
【０１６０】
特に指示がない限り、ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００を含有）、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ（最終濃度）、２００μＭの各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、１０ｐｍｏｌｅの各プライマー、１μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および１μｌ容量中の２０〜１００ｎｇのテンプレートＤＮＡを含む５０μｌの全容積で行なった。増幅は以下のように実施した。９５℃で１分間の最初の変性、次いで９５℃で３０秒間の変性を３０サイクル、５５℃で１分間のアニーリング、および７２℃で１分間の伸長。７２℃で１０分間の最終伸長サイクルを実施した後、４℃で反応を停止した。
【０１６１】
一般的な分子クローニングは標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）に従って実施した。ＤＮＡ配列は、ベクターおよび挿入断片に特異的なプライマーの組合せを使用する染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書；欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用して、ＡＢＩの自動シークエンサー上に生成した。配列編集をＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）で実施した。すべての配列は、両方向で少なくとも２倍のカバレッジを示す。本明細書において特に指示がない限り、遺伝子配列の比較はＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して行った。略語の意味は以下のとおりである。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０１６２】
発現カセットの命名法
発現カセットの構造は「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」の単純な表記法により表され、ここでＸはプロモーター断片を記述し、Ｙは遺伝子断片を記述し、Ｚはターミネーター断片を記述し、これらはすべて互いに作動可能に連結されている。
【０１６３】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株は米国培養細胞系統保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、下記の処方に従った数種の培地中で２８〜３０℃にて定期的に増殖させた。
高グルコース培地［「ＨＧＭ」］（１リットル当たり）：８０グルコース、２．５８ｇのＫＨ２ＰＯ４および５．３６ｇのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５（調整の必要なし）。
合成デキストロース培地［「ＳＤ」］（１リットル当たり）：６．７ｇの硫酸アンモニウム含有、アミノ酸非含有Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅおよび２０ｇのグルコース。
発酵培地［「ＦＭ」］（１リットル当たり）：６．７０ｇ／ｌの硫酸アンモニウム含有、アミノ酸非含有Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、６．００ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．００ｇのＫ２ＨＰＯ４、１．５０ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１．５ｍｇ／Ｌのチアミン−ＨＣｌ、２０ｇのグルコースおよび５．００ｇの酵母抽出物（ＢＢＬ）。
【０１６４】
参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載のように、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換を実施した。
【０１６５】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｕ株の生成
Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介して総脂質に比較してＥＰＡを生成するＹ４３０５Ｕ株は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第２００８−０２５４１９１号明細書の一般的方法に記載のように生成した。手短かに言えば、Ｙ４３０５Ｕ株は、Ｙ２２２４株（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子の自律突然変異からの５−フルオロオロチン酸［「ＦＯＡ」］抵抗性変異体）、Ｙ４００１株（１７％のＥＤＡ生成、Ｌｅｕ−表現型）、Ｙ４００１Ｕ１株（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−）、Ｙ４０３６株（１８％のＤＧＬＡ生成、Ｌｅｕ−表現型）、Ｙ４０３６Ｕ株（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−）、Ｙ４０７０株（１２％のＡＲＡ生成、Ｕｒａ−表現型）、Ｙ４０８６株（１４％のＥＰＡ生成）、Ｙ４０８６Ｕ１株（Ｕｒａ３−）、Ｙ４１２８株（３７％のＥＰＡ生成、２００７年８月２３日に米国培養細胞系統保存機関に寄託、名称ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８６１４）、Ｙ４１２８Ｕ３株（Ｕｒａ−）、Ｙ４２１７株（４２％のＥＰＡ生成）、Ｙ４２１７Ｕ２株（Ｕｒａ−）、Ｙ４２５９株（４６．５％のＥＰＡ生成）、Ｙ４２５９Ｕ２株（Ｕｒａ−）、Ｙ４３０５株（総ＴＦＡに対して５３．２％のＥＰＡ生成）の構築を通して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２から誘導した。
【０１６６】
Ｙ４３０５株の完全な脂質プロフィールは以下のとおりであった。１６：０（２．８％）、１６：１（０．７％）、１８：０（１．３％）、１８：１（４．９％）、１８：２（１７．６％）、ＡＬＡ（２．３％）、ＥＤＡ（３．４％）、ＤＧＬＡ（２．０％）、ＡＲＡ（０．６％）、ＥＴＡ（１．７％）およびＥＰＡ（５３．２％）。総脂質％乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］は２７．５であった。
【０１６７】
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較したＹ４３０５株の最終遺伝子型は、ＳＣＰ２−（ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ）、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ−、Ｐｅｘ１０−、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、未知の１−、未知の３−、未知の８−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（３コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ：：ＯＣＴ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：ＡＣＯ、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯであった（ここで、ＦｍＤ１２は、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＦｍＤ１２Ｓは、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）に由来する、コドン最適化Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＭＥ３Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に由来するコドン最適化Ｃ１６／１８エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）のΔ９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅＳは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；Ｅ３８９Ｄ９ｅＳは、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ８Ｍは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］に由来する合成突然変異体Δ８デサチュラーゼ［米国特許第７，７０９，２３９号明細書］であり；ＥｇＤ５は、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）のΔ５デサチュラーゼ［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］であり；ＥｇＤ５Ｓは、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化Δ５デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］であり；ＲＤ５Ｓは、ペリディニウム（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）種ＣＣＭＰ６２６に由来するコドン最適化Δ５デサチュラーゼ［米国特許第７，６９５，９５０号明細書］であり；ＰａＤ１７は、ピチウム・アファニデルマツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）のΔ１７デサチュラーゼ［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり；ＰａＤ１７Ｓは、ピチウム・アファニデルマツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）に由来するコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり；ＹｌＣＰＴ１はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のジアシルグリセロールコリンホスホトランスフラーゼ遺伝子［国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット］である）。
【０１６８】
続いて、Ｙ４３０５株のＵｒａ３遺伝子を破壊して（米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１号明細書の一般的方法に記載のように）、Ｕｒａ３突然変異遺伝子をＹ４３０５株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。形質転換体の選択およびＦＡＭＥの分析の後に、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で増殖させた場合、形質転換体＃１、＃６および＃７がそれぞれ総脂質の３７．６％、３７．３％および３６．５％のＥＰＡを生成することが明らかとなった。これら３株を、それぞれＹ４３０５Ｕ１株、Ｙ４３０５Ｕ２株およびＹ４３０５Ｕ３株と命名し、まとめてＹ４３０５Ｕ株とした。
【０１６９】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸分析のために、細胞を遠心分離により集め、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．＆  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１−９１７（１９５９））に記載のように脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］をナトリウムメトキシドによる脂質抽出物のエステル転移反応により調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｉ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６（１９９０））、次いで、３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）のＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。オーブン温度は、３．５℃／分で１７０℃（２５分間保持）から１８５℃であった。
【０１７０】
直接の塩基エステル転移反応のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を採取し、蒸留水で１回洗浄し、真空下、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃで５〜１０分間乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１％のものを１００μｌ）を試料に添加し、次いで試料を２０分間攪拌振盪した。１Ｍ  ＮａＣｌを３滴およびヘキサンを４００μｌ添加した後、試料を攪拌回転した。上層を取り出し、上記のようにＧＣにより分析した。
【０１７１】
Ｇ６ＰＤＨ、６ＰＧＬおよび６ＰＧＤＨをコードするヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）遺伝子
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ［「Ｇ６ＰＤＨ」］をコードするヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子は、配列番号１として本明細書に示されており、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５０４２７５に対応する。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＯＲＦ  ＹＡＬＩ０Ｅ２２６４９ｐとしてそこにアノテートされている１４９７ｂｐ配列は、「ｕｎｉｐｒｏｔ｜Ｐ１１４１２サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＮＬ２４１ｃ  ＺＷＦ１グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼに類似」している。
【０１７２】
さらに、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｇ６ＰＤＨをコードする４９８アミノ酸のタンパク質配列（配列番号２）を使用して、国立バイオテクノロジー情報センター［「ＮＣＢＩ」］ＢＬＡＳＴＰ  ２．２．２２＋（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７２：５１０１−５１０９（２００５））検索を、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（すべての非重複性のＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ「［ＰＤＢ」］タンパク質配列データベース、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ［「ＰＩＲ」］タンパク質配列データベースおよびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ［「ＰＲＦ」］タンパク質配列データベースを含み、全ゲノムショットガン［「ＷＧＳ」］プロジェクトからの環境試料を除く）内の類似性を有する配列を同定するために行った。
【０１７３】
配列番号２が最大類似性を有する配列をまとめたＢＬＡＳＴＰ比較の結果を、％同一性、％類似性および期待値に従って報告する。「％同一性」は、２つのタンパク質間で同一のアミノ酸のパーセントとして定義される。「％類似性」は、２つのタンパク質間で同一または保存のアミノ酸のパーセントとして定義される。「期待値」は、このサイズのデータベース検索においてまったく偶然に期待されるマッチの数を特定し、所与のスコアを用いてマッチの統計的有意性を評価する。
【０１７４】
多くのタンパク質が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｇ６ＰＤＨ（配列番号２）と有意な類似性を共有するとして同定された。タンパク質を「グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ」と具体的に同定したアノテーションを有するヒットの要約の一部を表３に示すが、これは本明細書の開示を限定するものと見なすべきではない。表３のタンパク質は、配列番号２に対して２ｅ−１３２より大きいｅ−値を有していた。
【０１７５】
【表４】
2013530679.tif 000006
【０１７６】
【表５】
2013530679.tif 000007
【０１７７】
【表６】
2013530679.tif 000008
【０１７８】
【表７】
2013530679.tif 000009
【０１７９】
【表８】
2013530679.tif 000010
【０１８０】
Ｇ６ＰＤＨは、探索されたすべての生物および細胞型で見出され、かなりの配列保存が観察されることに留意されたい。Ｇ６ＰＤＨをコードするサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＺＷＦ１遺伝子を最初に単離して特徴づけしたＮｏｇａｅ，Ｉ．およびＭ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（Ｇｅｎｅ，９６：１６１−１６９（１９９０））は、コードされたタンパク質が、ショウジョウバエ、ヒトおよびラットの酵素からのＧ６ＰＤＨ配列に対して約６０％の類似性があることを認めた。
【０１８１】
６−ホスホグルコノラクトナーゼ［「６ＰＧＬ」］をコードするヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子は、配列番号３として本明細書に示されており、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５０３８３０に対応する。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＯＲＦ  ＹＡＬＩ０Ｅ１１６７１ｐとしてそこにアノテートされている７４７ｂｐ配列は、「ｕｎｉｐｒｏｔ｜Ｐ３８８５８サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＨＲ１６３ｗ  ＳＯＬ３の可能性のある６−ホスホグルコノラクトナーゼに類似」している。
【０１８２】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）６ＰＧＬ（配列番号４）をコードする２４８アミノ酸のタンパク質配列を、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｇ６ＰＤＨタンパク質について上記した方法と同様に、「ｎｒ」データベースに対するＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＰ  ２．２．２２＋検索のクエリーとして使用した。多くのタンパク質が、配列番号４と有意な類似性を共有するとして同定された。タンパク質を「６−ホスホグルコノラクトナーゼ」と具体的に同定したアノテーションを有するヒットの要約の一部を表４に示すが、これは本明細書の開示を限定するものと見なすべきではない。表４のタンパク質は、配列番号４に対して１ｅ−４０より大きいｅ−値を有していた。
【０１８３】
【表９】
2013530679.tif 000011
【０１８４】
【表１０】
2013530679.tif 000012
【０１８５】
【表１１】
2013530679.tif 000013
【０１８６】
同様に、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ［「６ＰＧＤＨ」］をコードするヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子は、配列番号５として本明細書に示されており、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５００９３８に対応する。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＯＲＦ  ＹＡＬＩ０Ｂ１５５９８ｐとしてそこにアノテートされている１４７０ｂｐ配列は、「ｕｎｉｐｒｏｔ｜Ｐ３８７２０サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＨＲ１８３ｗ  ＧＮＤ１  ６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼに高度に類似して」いる。
【０１８７】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）６ＰＧＤＨ（配列番号６）をコードする４８９アミノ酸のタンパク質配列を、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｇ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬのタンパク質について上記した方法と同様に、「ｎｒ」データベースに対するＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＰ  ２．２．２２＋検索のクエリーとして使用した。多くのタンパク質が、配列番号６と有意な類似性を共有するとして同定された。タンパク質を「６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ」と具体的に同定したアノテーションを有するヒットの要約の一部を表５に示すが、これは本明細書の開示を限定するものと見なすべきではない。表５のタンパク質は、配列番号６に対して０．０より大きいｅ−値を有していた。
【０１８８】
【表１２】
2013530679.tif 000014
【０１８９】
【表１３】
2013530679.tif 000015
【０１９０】
【表１４】
2013530679.tif 000016
【０１９１】
【表１５】
2013530679.tif 000017
【０１９２】
実施例１
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２１０７Ｕ株におけるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）の過剰発現
本実施例では、強力な天然ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）プロモーターの制御下で、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ［「Ｇ６ＰＤＨ」］をコードするヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）遺伝子の過剰発現を可能にするプラスミドｐＺＷＦ−ＭＯＤ１（図２Ａ；配列番号７）の構築について記載する。
【０１９３】
過剰発現プラスミドを用いて、ＰＵＦＡを生成するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２１０７Ｕ株の形質転換を行い、細胞増殖および脂質合成に対する過剰発現の効果を判定し、比較した。具体的には、Ｇ６ＰＤＨの過剰発現は細胞増殖の低下をもたらした。
【０１９４】
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｇ６ＰＤＨを含むプラスミドｐＺＷＦ−ＭＯＤ１の構築
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｇ６ＰＤＨ  ＯＲＦは、５’−末端（配列番号１０のヌクレオチド８５〜５２４）近傍にイントロンを含有していた。Ｇ６ＰＤＨをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１として示す。
【０１９５】
プライマーＹＺＷＦ−Ｆ１（配列番号８）およびＹＺＷＦ−Ｒ（配列番号９）を、Ｇ６ＰＤＨをコードするヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）遺伝子のコード領域を増幅するために設計した。プライマーＹＺＷＦ−Ｆ１は、翻訳開始「ＡＴＧ」コドンの後に挿入された６つの塩基「ＧＧＡＴＣＣ」（ＢａｍＨＩ部位の形成）を含有している。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方を２つの別個のＰＣＲ増幅（一般的方法）においてテンプレートとして使用し、４４０ｂｐイントロン（配列番号１２）含有および非含有Ｇ６ＰＤＨコード領域を得た。
【０１９６】
増幅ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＺＵＦ−ＭＯＤ１（配列番号１３；図２Ｂ）にライゲートした。プラスミドｐＺＵＦ−ＭＯＤ１は、以前に、米国特許第７，１９２，７６２号明細書の実施例５に記載されている。図２Ｂの「ＭＣＲ−Ｓｔｕｆｆｅｒ」断片は、ｐＤＮＲ−ＬＩＢ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）の一部から増幅された２５３ｂｐ「ｓｔｕｆｆｅｒ」ＤＮＡ断片に相当する。この断片を、強力なヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＦＢＡＩＮプロモーター（米国特許第７，２０２，３５６号明細書；配列番号１４）に作動可能に連結した。
【０１９７】
ライゲーション混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０コンピテント細胞を形質転換した。何回かの試みにもかかわらず、増幅ｃＤＮＡ断片を含有するライゲーション混合物ではコロニーは得られなかった。コロニーは、増幅ゲノムＤＮＡ断片で容易に得られた。これらのコロニーに由来するＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットで精製し、プラスミドの同一性を制限酵素マッピングにより確認した。キメラＦＢＡＩＮ：：Ｇ６ＰＤＨ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含む得られたプラスミドを「ｐＺＷＦ−ＭＯＤ１」（図２Ａ；配列番号７）と命名した。
【０１９８】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２１０７Ｕ株におけるＧ６ＰＤＨ過剰発現の効果
Ｙ２１０７Ｕ１株およびＹ２１０７Ｕ２株をまとめて指し、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路の発現を介した２段階増殖の後に総脂質の約１６％のＥＰＡを生成するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２１０７Ｕ株は、参照によって本明細書に組込まれる米国特許第７，１９２，７６２号明細書の実施例４に記載のように生成した。手短かに言えば、Ｙ２１０７Ｕ株は、Ｍ４株（８％のＤＧＬＡ生成）、Ｙ２０４７株（１１％のＡＲＡ生成）、Ｙ２０４８株（１１％のＥＰＡ生成）、Ｙ２０６０株（１３％のＥＰＡ生成）、Ｙ２０７２株（１５％のＥＰＡ生成）、Ｙ２０７２Ｕ１株（１４％のＥＰＡ生成）およびＹ２０８９株（１８％のＥＰＡ生成）の構築を通して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２から誘導した。野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較したＹ２１０７Ｕ株の最終遺伝子型は、ＦＢＡＩＮ：：ＥＬ１Ｓ：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥＬ１Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＡＴ：：ＥＬ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＡＴ：：ＥＬ１Ｓ：：ＸＰＲ、ＴＥＦ：：ＥＬ２Ｓ：：ＸＰＲ、ＴＥＦ：：Δ６Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮ：：Δ６Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：Ｆ．Δ１２：：Ｌｉｐ２、ＴＥＦ：：Ｆ．Δ１２：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：Ｍ．Δ１２：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＭＡΔ５：：Ｐｅｘ２０、ＴＥＦ：：ＭＡΔ５：：Ｌｉｐ１、ＴＥＦ：：ＨΔ５Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＴＥＦ：：Ｉ．Δ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＡＴ：：Ｉ．Δ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＴＥＦ：：Δ１７Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：Δ１７Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：Δ１７Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＴＥＦ：：ｒＥＬＯ２Ｓ：：Ｐｅｘ２０（２コピー）であった。略語は下記のとおりである。ＥＬ１Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に由来するコドン最適化エロンガーゼ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＸ４６４７３１）であり；ＥＬ２Ｓは、スラウストキトリウム・オウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）に由来するコドン最適化エロンガーゼ遺伝子［米国特許第６，６７７，１４５号明細書］であり；Δ６Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に由来するコドン最適化Δ６デサチュラーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ４６５２８１）であり；Ｆ．Δ１２は、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）のΔ１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；Ｍ．Δ１２は、モルティエラ・イサベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）のΔ１２デサチュラーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ４１７２４５）であり；ＭＡΔ５は、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）のΔ５デサチュラーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０６７６５４）であり；ＨΔ５Ｓは、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）に由来するコドン最適化Δ５デサチュラーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３７５３４）であり；Ｉ．Δ５Ｓは、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃ��ｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）に由来するコドン最適化Δ５デサチュラーゼ遺伝子（国際公開第２００２／０８１６６８号パンフレット）であり；Δ１７Ｓは、Ｓ．ジクリナ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）に由来するコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，１２５，６７２号明細書］であり；ｒＥＬＯ２Ｓは、ラットに由来するコドン最適化ｒＥＬＯ２  Ｃ１６／１８エロンガーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０７１９８６）である。
【０１９９】
プラスミドｐＺＷＦ−ＭＯＤ１（配列番号７）および対照プラスミドｐＺＵＦ−ＭＯＤ１（配列番号１３）を使用して、Ｙ２１０７Ｕ株を形質転換した。形質転換体を、２５０ｒｐｍで３０℃にて２日間、２５ｍＬのＳＤ培地中で増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により集め、ＨＧＭ培地中に再懸濁した。２５０ｒｐｍで３０℃にて、さらに５日間、培養物を増殖させた。
【０２００】
乾燥細胞重量測定のために、各培養物の１０ｍＬを３７５０ｒｐｍで５分間遠心分離した。各細胞ペレットを水１０ｍＬ中に再懸濁し、再び遠心分離した。次いで、細胞ペレットを、あらかじめ秤量したアルミニウム皿に移して、８０℃で一晩乾燥させ、秤量して細胞培養物１０ｍＬの乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を決定した。
【０２０１】
脂質測定のために、細胞を遠心分離により集め、脂質を抽出して、ＦＡＭＥをエステル転移反応により調製し、次いで、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで（一般的方法に記載のように）分析した。
【０２０２】
キメラＦＢＡＩＮ：：ＭＣＲ−Ｓｔｕｆｆｅｒ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含む３つのｐＺＵＦ−ＭＯＤ１形質転換体およびキメラＦＢＡＩＮ：：Ｇ６ＰＤＨ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含む９つのｐＺＷＦ−ＭＯＤ１形質転換体について、ＤＣＷ、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］およびＴＦＡの重量パーセントとしてのＥＰＡ濃度「［ＥＰＡ％ＴＦＡ」］を、太字で強調したそれぞれの平均と共に、下記の表６に示す。
【０２０３】
より具体的には、本明細書の用語「総脂肪酸」［「ＴＦＡ」］は、例えばバイオマスまたはオイルのこともある所与の試料において、塩基エステル転移反応法（当技術分野で公知）により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導することができる、すべての細胞脂肪酸の合計を指す。したがって、総脂肪酸は、中性脂質分画（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール［「ＴＡＧ」］を含む）および遊離脂肪酸以外の極性脂質分画（ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの分画を含む）に由来する脂肪酸を含む。
【０２０４】
細胞の「総脂質含量」という用語は、ＤＣＷのパーセントとしてのＴＦＡの尺度であるが、ＤＣＷのパーセントとしてのＦＡＭＥの尺度［「ＦＡＭＥ％ＤＣＷ」］で総脂質含量を近似することができる。こうして、総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、例えばＤＣＷ１００ミリグラム当たりの総脂肪酸のミリグラムに等しい。
【０２０５】
総脂質中の脂肪酸濃度は、ＴＦＡの重量パーセント［「％ＴＦＡ」］、例えばＴＦＡ１００ミリグラム当たりの所与の脂肪酸のミリグラムとして本明細書では表現する。本明細書の開示に特に記載がない限り、総脂質に対する所与の脂肪酸のパーセントに言及する場合、％ＴＦＡとしての脂肪酸濃度に等しい（例えば、総脂質の％ＥＰＡは、ＥＰＡ％ＴＦＡに等しい）。
【０２０６】
一部の場合には、細胞の所与の脂肪酸含量を、乾燥細胞重量［「％ＤＣＷ」］の重量パーセントとして表現することが有用である。したがって、例えば、エイコサペンタエン酸％ＤＣＷは、次の式：［（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）*（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００によって決定されよう。しかしながら、乾燥細胞重量［「％ＤＣＷ」］の重量パーセントとしての細胞の所与の脂肪酸含量は、次の式：［（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）*（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）］／１００で近似することができる。
【０２０７】
【表１６】
2013530679.tif 000018
【０２０８】
上記の表６に示した結果より、ｐＺＷＦ−ＭＯＤ１を保持し、キメラＦＢＡＩＮ：：Ｇ６ＰＤＨ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を発現する細胞の平均ＤＣＷは、対照のわずか約半分であることが実証された。これにより、Ｇ６ＰＤＨを過剰発現する細胞の増殖は良好ではないことが示された。具体的には、一部のコロニーのＤＣＷが１０％未満であった。ＤＣＷが対照の５０％を超えるコロニーについては、対照の値と比較すると、総脂質およびＥＰＡの含量がわずかに増加していた。
【０２０９】
上記の結果および細胞が良好に増殖できなかった細胞表現型の観察に基づいて、極めて強力なプロモーター制御下でのＧ６ＰＤ単独の過剰発現は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の増殖を阻害する、許容できない量の６−ホスホグルコノラクトンをもたらすと結論した。
【０２１０】
実施例２
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ［「Ｇ６ＰＤＨ」］および６−ホスホグルコノラクトナーゼ［「６ＰＧＬ」］の協調的に調節された過剰発現のためのプラスミドｐＺＫＬＹ−ＰＰ２の構築
本実施例では、協調的調節様式で、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ［「Ｇ６ＰＤＨ」］および６−ホスホグルコノラクトナーゼ［「６ＰＧＬ」］をコードするヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）遺伝子を過剰発現させるためのプラスミドｐＺＫＬＹ−ＰＰ２（図３Ａ；配列番号１５）の構築について記載する。具体的には、弱い天然ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）プロモーターをＧ６ＰＤの発現を誘導するために選択し、一方強力な天然ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）プロモーターを６ＰＧＬに作動可能に連結した。この戦略は、６−ホスホグルコノラクトンの６−ホスホグルコン酸への迅速な変換を保証し、それによって毒性レベルの６−ホスホグルコノラクトンの蓄積を回避するように設計したものである。
【０２１１】
Ｇ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬの過剰発現のためのプラスミドｐＺＫＬＹ−ＰＰ２の構築
プラスミドｐＺＫＬＹ−ＰＰ２の構築には、最初に、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の６ＰＧＬおよびＧ６ＰＤＨ遺伝子を個々に増幅させ、個々それぞれの遺伝子を適切なヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）プロモーターにライゲートして、個々の発現カセットを作製する必要があった。次いで、協調的に調節された過剰発現のためのプラスミドｐＺＫＬＹ−ＰＰ２を２つの発現カセットから組み立てた。
【０２１２】
具体的には、ＰＣＲプライマーのＹＬ９６１（配列番号１６）およびＹＬ９６２（配列番号１７）を使用して、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡからヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）６ＰＧＬ遺伝子を増幅した（一般的方法）。プライマーＹＬ９６１は、翻訳開始「ＡＴＧ」コドンの後に挿入された３つの塩基「ＧＣＴ」を含有した。６ＰＧＬを含む７５２ｂｐのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＦＢＡプロモーター（米国特許第７，２０２，３５６号明細書；配列番号１８）を含む５３３ｂｐのＰｍｅＩ／ＮｃｏＩ断片を、ＰｍｅＩ／ＮｏｔＩで消化したｐＺＫＬＹプラスミド（配列番号２５）と一緒にライゲートして、ｐＺＫＬＹ−６ＰＧＬ（配列番号１９；図３Ｂ）を生成した。
【０２１３】
同様に、プライマーＹＬ９５９（配列番号２０）およびＹＬ９６０（配列番号２１）を使用して、ゲノムＤＮＡからヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｇ６ＰＤＨをＰＣＲにより増幅した（一般的方法）。プライマーＹＬ９５９は、第４のヌクレオチド「Ａ」が「Ｇ」に変化して、クローニング目的のためのＮｃｏＩ部位を生成するように、Ｇ６ＰＤＨコード領域内で１塩基対突然変異を誘起させた。したがって、Ｇ６ＰＤＨの増幅されたコード領域は、野生型酵素に対して変化したアミノ酸を含有し、第２アミノ酸の「Ｔｈｒ」が「Ａｌａ」に変化していた。このＰＣＲ生成物を、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶで消化して４９６ｂｐ断片を生成し、またはＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩで消化して１．４ｋＢ断片を生成した。次いで、Ｇ６ＰＤＨがヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＧＰＭプロモーター（米国特許第７，２５９，２５５号明細書；配列番号２４）に作動可能に連結するように、これら２つの断片をｐＤＭＷ２２４−Ｓ２（配列番号２２）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位に一緒にライゲートして、ｐＧＰＭ−Ｇ６ＰＤ（配列番号２３；図４）を生成した。
【０２１４】
次いで、ＧＰＭ：：Ｇ６ＰＤを含む２．８ｋＢ断片を、ＳｗａＩ／ＢｓｉＷＩ制限酵素を用いる消化によりｐＧＰＭ−Ｇ６ＰＤから切り取った。次いで、この単離した断片を、ｐＺＫＬＹ−６ＰＧＬ（配列番号１９；図３Ｂ）のＳｗａＩ／ＢｓｉＷＩ部位にクローニングして、ｐＺＫＬＹ−ＰＰ２を生成した。
【０２１５】
したがって、プラスミドｐＺＫＬＹ−ＰＰ２（図３Ａ）は以下の構成要素を含有した。
【０２１６】
【表１７】
2013530679.tif 000019
【０２１７】
実施例３
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｕ株におけるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ［「Ｇ６ＰＤＨ」］および６−ホスホグルコノラクトナーゼ［「６ＰＧＬ」］の協調的に調節された過剰発現は、総脂質の蓄積を増加させる。
本実施例では、プラスミドｐＺＫＬＹ−ＰＰ２による、ＰＵＦＡを生成するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｕ株の形質転換ならびに細胞増殖および脂質合成に対するＧ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬの協調的に調節された過剰発現の効果について記載する。具体的には、形質転換細胞において、Ｇ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬの協調的に調節された過剰発現は、ＤＣＷのパーセントとしての総脂質量の増加およびＴＦＡのパーセントとしてのＰＵＦＡ量の増加をもたらした。
【０２１８】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｕ株（一般的方法）をｐＺＫＬＹ−ＰＰ２（配列番号１５；実施例２）の８．５ｋＢのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片により、一般的方法に従い形質転換した。形質転換体をウラシルが欠損するＳＤ培地プレート上で選択した。３つのｐＺＫＬＹ−ＰＰ２形質転換体をＰＰ１２株、ＰＰ１３株およびＰＰ１４株と命名した。
【０２１９】
脂質分析のために、ｐＺＫＬＹ−ＰＰ２形質転換体およびＹ４３０５細胞（対照）を比較的油性の条件下で増殖させた。最初に、１２５ｍＬフラスコに入れたＳＤ培地２５ｍＬ中で、約０．１のＯＤ６００から出発して４８時間、各株の培養物を増殖させた。５０ｍＬ円錐管において、４３００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を収集した。上清を廃棄して細胞をＨＧＭ２５ｍＬ中に再懸濁し、新たな１２５ｍＬフラスコに移した。細胞を３０℃でさらに１２０時間、通気培養した。ＨＧＭ培養細胞（１ｍＬ）を１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して集め、総脂質を抽出して、エステル転移反応により脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を調製した後、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣ（一般的方法）で分析した。
【０２２０】
乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］、総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］、総脂肪酸の重量パーセントとして表現する所与の脂肪酸の濃度［「％ＴＦＡ］」および乾燥細胞重量のパーセントとしての所与の脂肪酸の含量［「％ＤＣＷ」］を以下の表８に示す。具体的には、脂肪酸は１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（リノール酸；ω−６）、エイコサテトラエン酸［「ＥＴＡ」；２０：４  ω−３］およびエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」；２０：５  ω−３］と同定された。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５ＵのｐＺＫＬＹ−ＰＰ２形質転換体（すなわちＰＰ１２、ＰＰ１３およびＰＰ１４）ならびにＹ４３０５対照株の三つ組み試料の平均脂肪酸組成は、灰色で強調し「平均」を付けて示した。
【０２２１】
【表１８】
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【０２２２】
表８の結果より、Ｙ４３０５Ｕにおける、ＰＰ経路酵素のＧ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬの過剰発現は、Ｙ４３０５対照株とパーセント比較すると、総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を約１２％増加させることが示された。さらに、ＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］およびＥＴＡ＋ＥＰＡ生産性［「ＥＴＡ＋ＥＰＡ％ＤＣＷ」］が形質転換株において約６〜７％増加した。「ＥＰＡ％ＴＦＡ」として測定されるＥＰＡタイターは、ＰＰ１２株、ＰＰ１３株およびＰＰ１４株において、わずかに減少した。
【０２２３】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５ＵのｐＺＫＬＹ−ＰＰ２形質転換体ＰＰ１２、ＰＰ１３およびＰＰ１４について、代替培地で増殖させた場合も評価した。各株を、１２５ｍＬフラスコに入れたＦＭ培地２５ｍＬ中において２５０ｒｐｍで３０℃にて４８時間増殖させた。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心分離機で３６００ｒｐｍにて各培養物５ｍＬを遠心分離した後、１２５ｍＬフラスコに入れたＨＧＭ培地２５ｍＬ中に細胞を再懸濁し、２５０ｒｐｍで３０℃にて５日間増殖させた。
【０２２４】
各培養物から遠心分離により細胞を収集して、総脂質を抽出し、エステル転移反応によりＦＡＭＥを調製した後、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。表８に記載のものと同様な数量化を使用して、表９に結果を示す。
【０２２５】
【表１９】
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【０２２６】
表９の結果より、Ｙ４３０５Ｕにおける、ＰＰ経路酵素のＧ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬの協調的に調節された過剰発現は、総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］、ＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ」］およびＥＴＡ＋ＥＰＡ生産性［「ＥＴＡ＋ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ」］ならびにＥＰＡタイター［「ＥＰＡ％ＴＦＡ」］を増加させた。この効果はＧ６ＰＤＨによりもたらされた細胞ＮＡＤＰＨアベイラビリティの増加に起因する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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