(57)【要約】本発明は、少なくとも標的核酸をサンプルから精製するための方法に関し、該方法は、少なくとも、ａ）サンプルを、少なくとも１種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、ｂ）標的核酸を固相に結合するステップと、ｃ）標的核酸を固相から溶出するステップと、ｄ）溶出された標的核酸を、少なくとも１種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、ｅ）標的核酸を再び固相に結合するステップと、ｆ）必要に応じて、結合した標的核酸を固相から溶出するステップとを含む。驚くべきことに、第２のタンパク質消化ステップを、標的核酸が結合しそして固相から溶出された後、該核酸が固相に再結合する前に行うことは、単離された核酸中に残っているタンパク質汚染物を低減させるのに、非常に効率的であることが見出された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の標的核酸をサンプルから精製するための方法であって、少なくとも、
ａ）該サンプルを、少なくとも１種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、
ｂ）該標的核酸を固相に結合するステップと、
ｃ）該標的核酸を該固相から溶出するステップと、
ｄ）溶出された該標的核酸を、少なくとも１種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、
ｅ）該標的核酸を再び固相に結合するステップと、
ｆ）必要に応じて、結合した該標的核酸を該固相から溶出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ステップａ）および／またはステップｄ）での前記インキュベーションが、
ａ）加熱、
ｂ）揺動、
ｃ）塩の存在、
ｄ）カオトロピック剤の存在、
ｅ）６から９の間のｐＨ値、および／または
ｆ）少なくとも３分間のインキュベーション時間
の１つまたは複数を含む条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種のタンパク質分解化合物がタンパク質分解酵素である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）および／またはステップｅ）での結合が、
ａ）結合が、少なくとも１種のカオトロピック剤の存在下で行われ、
ｂ）結合が、アルコールの存在下で行われ、
ｃ）結合が、界面活性剤の存在下で行われ、
ｄ）結合が、タンパク質と前記固相との結合を促進させる条件下で行われ、そして／または
ｅ）結合が、低分子核酸、特に低分子ＲＮＡ種の結合を促進させる条件下で行われる
という特徴の１つまたは複数を有する条件下で行われる、請求項１から３の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）および／またはステップｅ）での結合が、
ａ）１０％ｖ／ｖから９０％ｖ／ｖ、１５％ｖ／ｖから９０％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖから８０％ｖ／ｖ、３０％ｖ／ｖから８０％ｖ／ｖ、４０％ｖ／ｖから８０％ｖ／ｖ、４０％ｖ／ｖから７０％、４０％ｖ／ｖから６５％からなる群から選択されるアルコール濃度が使用され、
ｂ）０．０５Ｍから飽和限界まで、０．１Ｍから４Ｍ、および１Ｍから４Ｍからなる群から選択される、１種もしくは複数のカオトロピック剤の濃度が使用され、そして／または
ｃ）少なくとも３０％ｖ／ｖのアルコール濃度、および少なくとも１種のカオトロピック剤が、低分子ＲＮＡを含めたＲＮＡを前記固相に結合するために使用される
という特徴の１つまたは複数を有する結合条件下で行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１つまたは複数の洗浄ステップが、ステップｂ）とｃ）の間、および／またはステップｅ）の後に行われる、請求項１から５の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
【請求項７】
洗浄に使用される溶液が、少なくとも１種のカオトロピック剤、少なくとも１種のアルコール、少なくとも１種の界面活性剤、および／または少なくとも１種の緩衝成分を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが、少なくとも１種の非標的核酸および少なくとも１種の標的核酸を含み、好ましくは該非標的核酸がＤＮＡであり、該標的核酸がＲＮＡである、請求項１から７の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
【請求項９】
非標的核酸を除去するための中間ステップが、ステップａ）の後およびステップｂ）の前に行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
酵素処理が、残りの非標的核酸を分解するためにステップｄ）の前に行われる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルを核酸安定化組成物と混合し、該安定化組成物が、
ａ）一般式
Ｙ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｘ−
（式中、Ｙは窒素またはリン、好ましくは窒素を表し、
Ｒ１Ｒ２Ｒ３およびＲ４は独立して、分岐状または非分岐状のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２０アリール基、および／またはＣ６〜Ｃ２６アラルキル基を表し、
Ｘ−は、無機または有機の一塩基酸または多塩基酸の陰イオンを表す）
の陽イオン化合物と、
ｂ）少なくとも１種のプロトン供与体と
を含む、請求項１から１０の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも、
ａ）カオトロピック剤の存在下、前記サンプルを少なくとも４０℃に加熱することによって、該サンプルを、少なくとも１種のタンパク質分解酵素と共にインキュベートするステップと、
−ＤＮＡを第１の固相に結合することによって、該ＤＮＡの少なくとも一部を除去し、該第１の固相に結合した該ＤＮＡを、前記ＲＮＡを含む残りの該サンプルから分離するステップと、
ｂ）該ＲＮＡを第２の固相に結合するステップであって、少なくとも１種のカオトロピック剤および濃度≧３０％ｖ／ｖのアルコールがこの結合ステップｂ）中に使用されるステップと、
−該第２の固相に結合した該ＲＮＡを洗浄するための、少なくとも１つの洗浄ステップを行うステップと、
ｃ）該第２の固相から該ＲＮＡを溶出するステップと、
ｄ）カオトロピック剤の存在下、該サンプルを少なくとも４０℃に加熱することによって、溶出された該ＲＮＡを、少なくとも１種のタンパク質分解酵素と共にインキュベートするステップと、
ｅ）該ＲＮＡを再び固相に結合するステップであって、少なくとも１種のカオトロピック剤および濃度≧３０％ｖ／ｖのアルコールがこの結合ステップｅ）中に使用されるステップと、
−該固相に結合した該ＲＮＡを洗浄するための、少なくとも１つの洗浄ステップを行うステップと、
ｆ）必要に応じて、結合した前記標的核酸を該固相から溶出するステップと
を含む、少なくともＲＮＡおよびＤＮＡを含むサンプルからＲＮＡを精製するための、請求項１から１１の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
【請求項１３】
低分子ＲＮＡを含む全ＲＮＡが標的核酸として単離され、単離された該核酸の９５％の純度が１．８から２．２の間となる、請求項１から１２の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが、体液、血液、血液産物、組織、および骨髄から選択される生物学的サンプルである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
核酸を結合することが可能な前記固相が、シリカ、磁性シリカ粒子、珪藻土、ガラス、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム、ボロシリケート、ニトロセルロース、ヒドロキシアパタイト（ヒドロキシルアパタイトとも呼ばれる）、金属酸化物、ポリマー支持体、膜、および磁性粒子を含みまたはそれらからなる固相からなる群から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明に至る研究は、贈与計画（ｇｒａｎｔ  ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）番号  ２２２９１６の下、欧州共同体の第７次研究枠組み計画（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ’ｓ  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ）（ＦＰ７／２００７−２０１３）からの資金を受け取った。
【０００２】
本発明は、少なくとも標的核酸、好ましくはＲＮＡを、サンプルから高純度で単離するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
標的核酸をサンプルから単離する場合、標的核酸を高純度で得ることが望ましい。したがって、特にタンパク質、および後に続く標的核酸の使用を潜在的に妨げるその他の化合物などの汚染物質は、精製プロセス中に除去されると考えられる。さらに精製方法は、単離されることになる標的核酸が精製プロセス中に分解しないことを、確実にすべきである。
【０００４】
核酸を単離するためのいくつかの方法が、従来技術で公知である。サンプルに含まれるタンパク質を除去するには、サンプルの溶解中に、タンパク質分解酵素を使用してタンパク質を分解することが一般的である。ＤＮＡを精製する場合、ＤＮＡは、通常、溶解緩衝液中に適切なキレート化剤を使用してＤＮａｓｅの活性に必要な補因子を不活化することにより、溶解中にＤＮａｓｅによる分解から保護する。ＲＮＡの単離は、ＲＮＡｓｅが非常に多量に遍在しており、広い温度範囲で活性であり、通常はそれらの活性に補因子を必要としないので、特に難しい。このように、溶解中のＲＮＡｓｅの特異的な不活化は、不可能である。したがってＲＮＡｓｅを不活化し分解するために、例えばフェノールおよび／またはカオトロピック剤などの強力な変性溶解試薬を使用することによって溶解を行うことが、一般的である。
【０００５】
サンプルの溶解およびタンパク質の分解後、核酸が精製される。標的核酸を高純度で単離するために、核酸は、通常は固相に結合し、タンパク質およびその他の不純物を除去するために数回洗浄され、次いで核酸が溶出される。
【０００６】
しかし、核酸を単離するのに現在利用可能な方法は、単離された核酸が特にタンパク質汚染物をしばしば含むので、実現された純度のグレードに関してしばしば最適ではない。単離された核酸におけるタンパク質汚染は、単離された核酸の意図される下流用途において、問題を引き起こす可能性がある。例えば、増幅反応、ｃＤＮＡ合成、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応、および標識反応は、タンパク質汚染物によってかなり妨害される可能性がある。したがって、タンパク質汚染は避けるべきである。
【０００７】
しかし、タンパク質が共精製されることは、核酸調製では非常に一般的である。これは、非常に大量のタンパク質を含むサンプル（例えば、血液、血漿、痰、唾液、または便など）から核酸を単離するとき、およびタンパク質含量がサンプルごとに変化する場合、特に言えることである。例えば血液または血液産物を処理する場合、サンプル中のタンパク質含量は、ドナーごとに変化する可能性があり、同じドナーから異なる時点で採取したサンプル内でも変化する可能性がある。単離された標的核酸中のタンパク質汚染物質が問題を引き起こす、核酸単離手順のさらなる重要な例は、例えば標的核酸と固相との最適な結合を確実にして核酸を高収量で単離するために、強力な結合条件が使用され、または例えば、特異的核酸が（共）精製され、厳しく、したがって強力な結合条件下で固相にのみ結合すると考えられる、核酸単離手順である。それぞれの精製方法に関する例は、マイクロＲＮＡなどの低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を含む全ＲＮＡの単離である。これらの目的で、例えば低分子ＲＮＡを含むＲＮＡを結合するための高濃度のアルコールおよび塩など、強力な結合条件が、標的核酸と固相とを効率的に結合するのに必要である。そのような強力な結合条件下では、やはりタンパク質が固相に効率的に結合し、したがってタンパク質汚染は、たとえタンパク質分解ステップが溶解中に行われるとしても、およびたとえいくつかの洗浄ステップが、ＲＮＡが固相に結合した後に行われるとしても、単離されたＲＮＡにおいて常に存在する。使用される強力な結合条件により、タンパク質汚染は、単離された標的核酸において常に見出される。上記の問題は、大量のサンプル容積（ｖｏｌｕｍｉｎａ）（例えば、２．５ｍｌの全血）を処理する場合、さらに悪化する。
【０００８】
したがって、単離された核酸におけるタンパク質汚染を低減させるために、洗浄条件が最適化されまたはプロテイナーゼＫなどのタンパク質分解酵素が洗浄緩衝液に添加され、または残りのタンパク質汚染物が、タンパク質分解酵素を使用することによって固相に結合したままで消化されるという方法が、従来技術で開発された。しかし、これらの方法が既存のプロトコルに改善をもたらすとしても、改善と、標的核酸を高純度で得ることは、依然求められている。
【０００９】
さらに、自動化プロセス（例えば、多くのサンプルが同時に処理される）で精製された核酸の使用を可能にするために、たとえタンパク質汚染物の結合を促進させる強力な結合条件を使用するとしても、および例えば血液または血液産物の場合にそうであるようにたとえタンパク質含量がサンプルごとに変化する可能性があるサンプルタイプを処理するとしても、許容される純度の所与の範囲内にある許容される純度のグレードを備えた核酸を提供する核酸単離手順を提供することが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって本発明の目的は、単離された標的核酸の純度を高くし、特にタンパク質汚染をより低くする、サンプルから少なくとも１種の標的核酸を精製するための信頼性ある方法を提供することである。
【００１１】
さらに本発明の目的は、タンパク質と固相との結合も促進させる核酸結合条件を使用する場合、ならびに／または多量のおよび様々に変化もする量のタンパク質を含む、例えば血液もしくは血液産物などのサンプルから標的核酸を単離する場合、単離された標的核酸の純度を高くし、特にタンパク質汚染をより低くする、サンプルから少なくとも１種の標的核酸を精製するための信頼性ある方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
本発明は、単離された核酸におけるタンパク質汚染が著しく低減されることにより、単離された標的核酸に高純度をもたらす、少なくとも１種の標的核酸をサンプルから精製するための方法を提供する。
【００１３】
本発明の一態様によれば、少なくとも１種の標的核酸をサンプルから精製するための方法が提供され、前記方法は、少なくとも、
ａ）サンプルを、少なくとも１種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、
ｂ）標的核酸を固相に結合するステップと、
ｃ）標的核酸を固相から溶出するステップと、
ｄ）溶出された標的核酸を、少なくとも１種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、
ｅ）標的核酸を再び固相に結合するステップと、
ｆ）必要に応じて必要に応じて、結合した標的核酸を固相から溶出するステップと
を含む。
【００１４】
タンパク質汚染は、単離された標的核酸中で著しく低減されるので、標的核酸の溶出後に第２のタンパク質分解ステップが行われる方法によって標的核酸が高純度で得られることが、本発明者らにより見出された。前記第２のタンパク質分解ステップを行った後、標的核酸は固相に再び結合し、それによって高純度で単離される。
【００１５】
核酸の溶出後にそのような第２のタンパク質分解ステップを行うことによって、第２のタンパク質消化ステップが核酸単離手順の異なる段階で行われる方法に比べ、または洗浄条件を変化させることによりタンパク質汚染を低減させようとする方法に比べ、タンパク質汚染の低減が改善されることが見出された。有利には、本発明による方法は、たとえタンパク質汚染物と固相との結合も促進させる標的核酸と固相との結合のために強力な結合条件が使用されるとしても、ならびに／またはたとえ多量のおよび／もしくは様々な量のタンパク質を含むサンプルを処理するとしても、所与の純度範囲内の高純度で標的核酸を単離することを可能にする。したがって本発明による方法では、使用者は、標的核酸を固相に結合するのに最適な（例えば、強力な）結合条件を使用することが可能になり、それによって標的核酸の収量が増加する。さらに、本発明による方法は、強力な結合条件を使用した場合に固相にのみ効率的に結合する、標的核酸の精製を可能にする（例えば、低分子ＲＮＡ種など）。そのような強力な結合条件を使用する場合に標的核酸と共に共精製されることが避けられないタンパク質汚染物は、本発明の方法の第２のタンパク質分解ステップｄ）により効率的に除去され、それによって標的核酸が高純度で提供される。
【００１６】
本発明の好ましい態様によれば、少なくともＲＮＡおよびＤＮＡを含むサンプルからＲＮＡを精製するための方法が提供され、前記方法は、少なくとも、
ａ）カオトロピック剤の存在下、サンプルを少なくとも４０℃に加熱することによって、サンプルを、少なくとも１種のタンパク質分解酵素と共にインキュベートするステップと、
−ＤＮＡを第１の固相に結合することによって、ＤＮＡの少なくとも一部を除去し、前記第１の固相に結合したＤＮＡを、ＲＮＡを含む残りのサンプルから分離するステップと、
ｂ）ＲＮＡを第２の固相に結合するステップであって、少なくとも１種のカオトロピック剤および濃度≧３０％ｖ／ｖのアルコールがこの結合ステップｂ）中に使用されるステップと、
−前記第２の固相に結合したＲＮＡを洗浄するための、少なくとも１つの洗浄ステップを行うステップと、
ｃ）前記第２の固相からＲＮＡを溶出するステップと、
ｄ）カオトロピック剤の存在下、サンプルを少なくとも４０℃に加熱することによって、溶出されたＲＮＡを、少なくとも１種のタンパク質分解酵素と共にインキュベートするステップと、
ｅ）ＲＮＡを再び固相に結合するステップであって、少なくとも１種のカオトロピック剤および濃度≧３０％ｖ／ｖのアルコールがこの結合ステップｅ）中に使用されるステップと、
−固相に結合したＲＮＡを洗浄するための、少なくとも１つの洗浄ステップを行うステップと、
ｆ）必要に応じて、結合した標的核酸を固相から溶出するステップと
を含む。
【００１７】
標的核酸が固相に既に１回結合し固相から溶出した後、標的核酸を固相に再結合する前に、第２のタンパク質分解ステップが行われる本発明による方法は、サンプルからＲＮＡを単離するのに、特にｍｉＲＮＡなどの低分子ＲＮＡを含むＲＮＡを単離するのに、特に有用である。ＲＮＡを固相に結合するために、アルコールおよびカオトロピック剤が使用される。上記序論で概要を述べたように、結合の間、より高い濃度のアルコールおよびカオトロピック剤の使用は、溶解サンプル中に残っているタンパク質およびタンパク質分解産物も第１のタンパク質分解ステップ後に固相に結合し、したがってＲＮＡと共精製されるという効果を有する。本発明による方法は、単離されたＲＮＡ中のこれら残りのタンパク質汚染物を、著しく低減させることが可能になる。これは、たとえ血液または血液産物などの難しいサンプルからＲＮＡを精製する場合であっても、強力な結合条件を使用する。したがって本発明による方法は、従来技術よりも優れた重要な利点をもたらす。
【００１８】
本出願のその他の目的、特徴、利点、および態様は、以下の記述および添付される特許請求の範囲から当業者にとって明らかとなる。しかし、以下の記述、添付される特許請求の範囲、および特定の実施例は、本出願の好ましい実施形態を示すが、単なる例示として示されることを理解すべきである。開示される本発明の精神および範囲内にある様々な変更および修正は、以下を読むことによって当業者にとって容易に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】図１．１は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡプロトコルにより、ＲＮＡに、高く信頼性ある純度が１．８から２．０の範囲内で安定してかつ一貫して与えられることを示す。
【図１−２】図１．２は、改訂されたＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡプロトコルにおいて、平均純度も１．８より下であることを示す。
【図２−１】図２．１は、第２のプロテイナーゼＫ消化がＲＮＡの純度に及ぼす影響を示す。
【図２−２】図２．２は、第２のプロテイナーゼＫ消化がＲＮＡの純度に及ぼす影響を示す。
【図３】図３は、追加のプロテイナーゼＫ消化が全収量に及ぼす影響を示す。
【図４】図４は、ｈａｓ−ｍｉＲ  １６の発現を決定することにより、得られたＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡの収量を分析するために行われた、ＲＴ−ＰＣＲのＣＴ値を示す。
【図５−１】図５．１．１は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット、ｍｉＲＮＡを単離するための改訂版（ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡ）、および本発明の方法による純度の比較を示す。
【図５−２】図５．１．２は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット、ｍｉＲＮＡを単離するための改訂版（ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡ）、および本発明の方法による純度の比較を示す。
【図５−３】図５．２．１は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット、ｍｉＲＮＡを単離するための改訂版（ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡ）、および本発明の方法による純度の比較を示す。
【図５−４】図５．２．２は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット、ｍｉＲＮＡを単離するための改訂版（ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡ）、および本発明の方法による純度の比較を示す。
【図５−５】図５．３．１は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット、ｍｉＲＮＡを単離するための改訂版（ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡ）、および本発明の方法による純度の比較を示す。
【図５−６】図５．３．２は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット、ｍｉＲＮＡを単離するための改訂版（ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡ）、および本発明の方法による純度の比較を示す。
【図５−７】図５．４．１は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット、ｍｉＲＮＡを単離するための改訂版（ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡ）、および本発明の方法による純度の比較を示す。
【図５−８】図５．４．２は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット、ｍｉＲＮＡを単離するための改訂版（ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡ）、および本発明の方法による純度の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
驚くべきことに、第２のタンパク質分解ステップを、標的核酸が固相に結合しそして固相から溶出された後、該核酸が固相に再結合する前に行うことは、単離された核酸におけるタンパク質汚染を低減させるのに、非常に効率的であることが見出された。
【００２１】
したがって、本発明の第１の態様によれば、少なくとも１種の標的核酸をサンプルから精製するための方法が提供され、前記方法は、少なくとも、
ａ）サンプルを、少なくとも１種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、
ｂ）標的核酸を固相に結合するステップと、
ｃ）標的核酸を固相から溶出するステップと、
ｄ）溶出された標的核酸を、少なくとも１種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、
ｅ）標的核酸を再び固相に結合するステップと、
ｆ）必要に応じて、結合した標的核酸を固相から溶出するステップと
を含む。
【００２２】
本発明による方法の個々のステップについて、以下に詳細に説明する。
【００２３】
ステップａ）では、標的核酸を含むサンプルを、少なくとも１種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートする。それによって、サンプルに含まれるタンパク質は分解する。通常、ステップａ）は、サンプルの溶解中に、または、溶解を必要とするサンプルが処理される場合には、サンプルの初期溶解が行われた後に、行われることになる。
【００２４】
ステップｂ）では、標的核酸を固相に結合する。標的核酸をそこに結合するのに適切な固相および条件は、従来技術において公知であり、以下でもさらに詳細に記載する。好ましくは、標的核酸を高い収量で精製するために、標的核酸と固相との強力な結合を可能にする結合条件が使用される。上記にて論じられたように、そのような強力な結合条件を使用する場合、通常はやはりタンパク質が、妨害量で固相に結合する。標的核酸は通常、固相に結合したままで、残りのサンプルおよび溶解産物からそれぞれ分離される。これは例えば、吸引、遠心分離によって残りのサンプルを除去すること、または結合した標的核酸を含む固相を残りのサンプルから除去することなどによる、従来技術で公知の任意の手段により実現することができる。
【００２５】
ステップｃ）では、標的核酸が、固相から溶出され、それによって溶出液中に得られる。上記にて論じたように、特に強力な結合条件が使用される場合、タンパク質汚染物も、通常、ステップｂ）で固相に結合し、それによってステップｃ）で溶出もされる。
【００２６】
ステップｄ）は、本発明の方法の本質的なステップを定める。ステップｄ）によれば、溶出された標的核酸は、少なくとも１種のタンパク質分解化合物と共に再びインキュベートされる。それによって、標的核酸と共精製され共に溶出された残りのタンパク質汚染物は、効率的に分解され、それによって不活化される。
【００２７】
本発明の方法のステップｅ）によれば、標的核酸はその後固相に再び結合する。標的核酸は通常、固相に結合したままで、ステップｅ）で残りのサンプルから分離される。やはりこれは、例えば吸引、遠心分離によって残りのサンプルを除去すること、または結合した標的核酸を含む固相を残りのサンプルから除去することなどによる、従来技術で公知の任意の手段によって実現することができる。ステップｅ）で使用される固相は、ステップｂ）で使用された固相と同一にすることができまたはその固相と同じタイプの固相であってもよいが、異なる固相を使用することも本発明の範囲内である。特に自動化された方法での取扱いを容易にするために、ステップｅ）で使用される固相は、ステップｂ）で使用された固相と同一であることが好ましい。この場合、ステップｂ）で使用された固相は、ステップｃ）およびｄ）中は存在したままである。次いで標的核酸を、ステップｅ）で再び前記固相に結合する。標的核酸を再び固相に結合するための適切な結合条件は、当技術分野で公知であり、やはり以下に詳細に記述する。ステップｅ）における標的核酸と固相とのこの再結合は、標的核酸が高い収量で得られることを確実にし、さらに、ステップｄ）で分解したタンパク質汚染物はもはや結合ステップｅ）で固相に効率的に結合できないので、単離された標的核酸は著しく少ないタンパク質汚染物を含むという効果を有する。それによって、タンパク質汚染物の量が低減される。このように、本発明による方法は、少なくとも標的核酸を高い収量でかつ高い純度で精製することを可能にする。
【００２８】
任意選択のステップｆ）では、標的核酸は、望む場合は固相から溶出される。あるいは、少なくとも１種の標的核酸は、標的核酸をそれぞれ使用する意図される下流用途に応じて、固相に結合したままで処理されてもよい。溶出ステップを行うことが望まれる場合、溶出は、例えば水、溶出緩衝液などの古典的な溶出溶液で、特にＴｒｉｓなどの生物学的緩衝液で行うことができ、好ましくは、意図される下流用途を妨げない溶出溶液が使用される。しかし、例えば加熱などのその他の溶出手段によって、ステップｃ）および／またはｅ）で固相から核酸を放出すること、したがって溶出することも、本発明の範囲内にある。
【００２９】
本発明による方法には、いくつかの利点がある。上記で説明したように、使用される結合条件と、核酸単離手順によって得られる標的核酸の収量と、単離された標的核酸中のタンパク質汚染物の量との間には、強力な相関がある。標的核酸を固相に結合するのに、最適ではない結合条件が使用される場合、そのような最適ではない結合条件下ではタンパク質が固相に効率的に結合できずかつ単離される核酸はより高い純度で得られるので、タンパク質汚染はそれほど問題を引き起こさない。しかし、許容される純度で標的核酸を提供するそのような最適ではない結合条件の使用には、標的核酸の収量が低下し、さらに強力な結合条件下でのみ結合する標的核酸（例えば、低分子ＲＮＡ種など）は全く単離されずまたは許容される収量で単離されないという欠点がある。しかし、標的核酸をより効率的に結合するために、より強力な結合条件を使用し、それによって単離された標的核酸の収量が増加しかつ／または低分子核酸を追加として単離する場合、タンパク質は、より強力な結合条件を使用したときに固相に強力に結合するので、単離された標的核酸中のタンパク質汚染物の量も増加する。したがって、従来技術で公知の方法を使用した場合、当業者は、特に多量のおよび／または様々な量のタンパク質を含む難しいサンプルを処理する場合、収量と純度との間で選択をしなければならなかった。望ましくないタンパク質汚染物の結合も促進させる結合条件を、標的核酸を固相に結合するのに使用する場合であっても（特に、高濃度のアルコールおよびカオトロピック剤が、標的核酸を結合するのに、例えば低分子ＲＮＡを含むＲＮＡを結合し単離するために使用される場合）、本発明による方法は特に、血液、血液産物、血清、および／または血漿などの、多量のおよびさらには様々な量のタンパク質を含む難しいサンプルからの標的核酸の高い収量および高い純度での単離を可能にするので、前記方法は上記ジレンマを解決する。
【００３０】
したがって本発明による方法は、難しいサンプルからでも標的核酸の高い収量および高い純度での単離を可能にするので、従来技術よりも優れたかなりの改善をもたらす。実施例で実証されるように、単離された標的核酸の純度は、本発明の方法により改善される。
【００３１】
一実施形態によれば、タンパク質の効率的な分解は、ステップａ）および／またはステップｄ）における少なくとも１種のタンパク質分解化合物とのインキュベーション中に促進される。好ましくは、ステップａ）および／またはステップｄ）におけるインキュベーションは、加熱下で行われる。好ましくは、ステップａ）のサンプル、それぞれステップｄ）の標的核酸含有溶出液は、インキュベーション中に少なくとも３５℃の温度、少なくとも４０℃、または少なくとも５０℃に加熱され、好ましくは少なくとも５５℃の温度に加熱される。タンパク質分解酵素が、より高い温度でそれらの最適なそれぞれ最も高い活性を示すタンパク質分解化合物として使用される場合、インキュベーション中にそれぞれ、より高い温度を使用することが特に好ましい。
【００３２】
さらに、ステップａ）および／またはステップｄ）中のインキュベーションは、ステップａ）のサンプル、それぞれステップｄ）の標的核酸含有溶出液を揺動しながら行われることが好ましい。揺動の非限定的な例には、振盪、撹拌、混合、または振動が含まれる。ある態様では、揺動（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）には振盪が含まれる。振盪は、一、二、または三次元の振盪にすることができる。様々な振盪デバイスまたは揺動デバイスを使用することができる。非限定的な例には、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、ＴｕｒｂｏＭｉｘ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｖｏｒｔｅｘ  Ａｄａｐｔｅｒ（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅホルダーボルテックスアダプター（Ｔｒｏｅｍｎｅｒ）、およびＭｉｃｒｏｔｕｂｅフォームラックボルテックスアタッチメント（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）が含まれる。揺動は、例えばミキサー内で、少なくとも５０ｒｐｍで、少なくとも１００ｒｐｍで、少なくとも２００ｒｐｍで、または少なくとも５００ｒｐｍで行うことができる。好ましくは、加熱および揺動は、サーモミキサーまたは同時加熱および揺動を可能にする同等の装置を使用することによって同時に行われる。これらの条件は、タンパク質分解酵素をタンパク質分解化合物として使用する場合に特に好ましい。
【００３３】
少なくとも１種のタンパク質分解酵素をタンパク質分解化合物として使用する場合、前記酵素が効率的に作用しかつ触媒活性になることを確実にするインキュベーション条件が、使用される。条件は、使用されるタンパク質分解酵素に依存し、公知であり、それぞれ当業者により決定可能である。好ましくは、ステップａ）および／またはｄ）でのインキュベーションは、タンパク質分解酵素の活性を促進させかつ／または維持する塩および／またはイオンの存在下で行われる。適切な塩には、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、もしくはＣａＣｌ２、またはカオトロピック塩などのカオトロピック剤が含まれるが、これらに限定するものではない。
【００３４】
ステップａ）および／またはステップｄ）でのインキュベーションは、好ましくはカオトロピック剤の存在下で行われる。これは、ＲＮＡが標的核酸として単離される場合に特に好ましい。任意のカオトロピック剤は、例えば、限定するものではないが一次構造を無傷のままにしながらタンパク質または核酸の二次、三次、または四次構造を変化させることによって、タンパク質または核酸に障害を引き起こす目的で使用することができる。ステップａ）および／またはステップｄ）で少なくとも１種のタンパク質分解化合物と共にインキュベーションする間に使用することができる好ましいカオトロピック剤には、塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、および尿素などが含まれるが、これらに限定するものではない。
【００３５】
ステップａ）および／またはステップｄ）での少なくとも１種のタンパク質分解化合物とのインキュベーションは、通常、標的核酸の分解に至らないｐＨ値で行われる。さらに、タンパク質分解酵素をタンパク質分解化合物として使用する場合、タンパク質分解酵素が活性であるｐＨ値が使用されるべきである。好ましくは、ステップａ）および／またはステップｄ）での少なくとも１種のタンパク質分解化合物とのインキュベーションは、４．３から９、６から８の間のｐＨで行われ、好ましくは中性ｐＨ値で行われる。
【００３６】
タンパク質の効率的な分解を確実にするために、ステップａ）のサンプル、それぞれステップｄ）の標的核酸含有溶出液は、効率的なタンパク質分解を確実にするために、少なくとも３分間にわたり、好ましくは少なくとも５分間にわたりインキュベートすべきである。好ましい実施形態によれば、インキュベーションは、ステップａ）で少なくとも５分間、およびステップｄ）で少なくとも１０分間行われる。
【００３７】
好ましい実施形態によれば、ステップａ）およびステップｄ）でのインキュベーションは、加熱、揺動の下、カオトロピック剤の存在下、６から８のｐＨで、好ましくは中性ｐＨで、少なくとも３分間、好ましくは少なくとも５分間のインキュベーション時間で行われる。
【００３８】
好ましい実施形態によれば、タンパク質分解化合物はタンパク質分解酵素である。タンパク質分解酵素は、例えばタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドにおけるペプチド結合の切断を触媒する酵素を指す。例示的なタンパク質分解酵素には、プロテイナーゼおよびプロテアーゼ、特にズブチリシン、ズブチラーゼ、およびアルカリセリンプロテアーゼなどが含まれるが、これらに限定するものではない。ズブチラーゼは、セリンプロテアーゼのファミリーであり、即ち活性部位にセリン残基を有する酵素である。ズブチリシンは、広範な基質特異性を有する細菌性セリンプロテアーゼである。ズブチリシンは、尿素および塩酸グアニジなどのカオトロピック剤や、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの陰イオン界面活性剤による、変性に対して比較的耐性がある。例示的なズブチリシンには、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、ズブチリシン、ズブチリシンＡ、およびＱＩＡＧＥＮ  Ｐｒｏｔｅａｓｅなどが含まれるが、これらに限定するものではない。ズブチラーゼ、ズブチリシン、プロテイナーゼＫ、およびその他のプロテアーゼの考察は、とりわけＧｅｎｏｖら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４５巻：３９１〜４００頁、１９９５年に見出すことができる。好ましくは、タンパク質分解酵素はプロテイナーゼＫである。プロテイナーゼＫなどのタンパク質分解酵素の使用には、タンパク質分解酵素それ自体もインキュベーション中に消化されるという利点がある。タンパク質分解酵素を使用するインキュベーションは、タンパク質分解酵素が活性である条件下で行われる。
【００３９】
非限定的な態様では、タンパク質分解酵素は、インキュベーションステップａ）および／またはｄ）において、約０．００１ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で使用される。その他の実施形態では、その範囲は、約０．０１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌの間、または約０．２ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌの間にすることができる。
【００４０】
一実施形態によれば、１種または複数の追加の添加剤が、インキュベーションステップａ）および／またはｄ）中に存在する。例えば、サンプルの溶解、タンパク質の分解を支援し、かつ／または標的核酸をインキュベーション混合物中に保存する添加剤を、添加することができる。非限定的な例には、キレート化剤、界面活性剤、緩衝剤、アルカリ化剤、ヌクレアーゼ阻害剤、およびβ−メルカプトエタノールが含まれるが、これらに限定するものではない。
【００４１】
一実施形態によれば、ステップａ）および／またはステップｄ）でのインキュベーションは、少なくとも１種のヌクレアーゼ阻害剤の存在下で行われる。好ましくは、ＲＮＡを単離する場合にＲＮａｓｅ阻害剤を使用し、ＤＮＡを単離する場合にＤＮａｓｅ阻害剤を使用する。そのようなヌクレアーゼ阻害剤の組合せを使用することも、本発明の範囲内にある。適切なヌクレアーゼ阻害剤は、従来技術で公知であり、したがって詳細に記述する必要はない。
【００４２】
一実施形態によれば、ステップｂ）および／またはステップｅ）における結合は、カオトロピック剤の存在下および／またはアルコールの存在下で行われる。
【００４３】
ステップｂ）および／またはステップｅ）での結合中に使用されるカオトロピック剤の濃度は、０．０５Ｍから飽和限界までの範囲内にあってよい。好ましい濃度範囲は、使用されるカオトロピック剤に応じて、０．１Ｍから７Ｍ、１Ｍから７Ｍ、１．５Ｍから６Ｍ、および２Ｍから４Ｍの範囲内にある。適切なカオトロピック剤には、塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、および尿素などが含まれるがこれらに限定するものではなく、特に好ましいのは過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムである。
【００４４】
このように、標的核酸としてＲＮＡを単離する場合に特に好ましい一実施形態によれば、カオトロピック塩が、トリクロロアセテート、パークロレート、およびトリフルオロアセテートからなる群から選択されるカオトロピック陰イオンを含むカオトロピック剤として使用される。トリクロロアセテート、パークロレート、およびトリフルオロアセテートからなる群から選択される前記カオトロピック陰イオンは、少なくとも０．０５Ｍから飽和限界までの濃度での結合中に存在してもよい。一実施形態によれば、濃度は、０．０５Ｍから４Ｍの範囲内にある。一実施形態によれば、濃度は、０．０５Ｍから３Ｍの範囲内にあり、好ましくは０．０５Ｍから２Ｍの範囲内にある。非常に好ましい実施形態によれば、トリクロロアセテート、パークロレート、およびトリフルオロアセテートからなる群から選択される前記カオトロピック陰イオンの濃度は、０．１Ｍから１Ｍの範囲内にある。最も好ましくは、前記カオトロピック陰イオンの濃度は１Ｍ未満であり、０．１Ｍから０．９Ｍ、または０．１Ｍから０．８Ｍの範囲内にある。したがって、トリクロロアセテート、パークロレート、およびトリフルオロアセテートからなる群から選択されるカオトロピック陰イオンを含むカオトロピック塩は、好ましくは、本発明によるカオトロピック陰イオンに関して、特に塩が１価の陽イオンを含む場合に、上記の濃度での結合中に存在する。陽イオンとして、好ましくはナトリウムなどのアルカリ金属イオンを使用することができる。したがって一実施形態によれば、カオトロピック剤は、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムからなる群から選択される。これらのカオトロピック塩は、低分子ＲＮＡ種を含むＲＮＡの単離に、特に十分適切である。好ましくは、トリクロロ酢酸ナトリウムは、０．１Ｍから１Ｍ未満の濃度で、好ましくは０．１Ｍから０．７Ｍの濃度で結合組成物中に存在する。望む場合、例えば一般に使用されるグアニジニウム塩などのその他のカオトロピック塩も、トリクロロアセテート、パークロレート、およびトリフルオロアセテートからなる群から選択されるカオトロピック陰イオンを含むカオトロピック塩に加えて使用することができる。
【００４５】
アルコールとして、好ましくは１から５個の炭素原子を有する短鎖分岐または非分岐アルコールを使用することが好ましい。例は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールである。アルコールの混合物も使用することができる。アルコールは、好ましくはイソプロパノールおよびエタノールから選択され、特に十分適切なのは、標的核酸としてＲＮＡを単離する場合、イソプロパノールである。好ましくは、本発明による方法は、フェノールおよび／またはクロロホルムの使用を含まない。
【００４６】
アルコールは、ステップｂ）および／またはステップｅ）の結合混合物中に、１０％ｖ／ｖから９０％ｖ／ｖ、特に１５％ｖ／ｖから８０％ｖ／ｖ、２０％から８０％ｖ／ｖの濃度で含まれていてもよい。低分子ＲＮＡも含む標的核酸としてＲＮＡを単離する場合、結合の間に、そしてしたがって結合混合物において、アルコール濃度≧３０％ｖ／ｖ、好ましくは≧４０％ｖ／ｖから≦８０％ｖ／ｖを使用することが有益である。より高いアルコール濃度は結合を改善し、したがって短い核酸（通常、５００ｎｔ以下のサイズを有する）、特に低分子ＲＮＡ種の単離を改善する。最も好ましいのは、低分子ＲＮＡを含むＲＮＡの単離が意図される場合、結合中のアルコール濃度が≧４０％ｖ／ｖから≦８０％ｖ／ｖまたは≧４０％ｖ／ｖから≦６５％ｖ／ｖである。
【００４７】
必要に応じて、１種または複数の界面活性剤を、ステップｂ）および／またはステップｅ）で標的核酸を固相に結合するのに使用することができる。好ましくは、イオン性および／または非イオン性界面活性剤が界面活性剤として使用される。好ましくは、非イオン性界面活性剤は、少なくとも５％の濃度で使用される。前記界面活性剤は、例えば結合緩衝液と共に添加することができる。
【００４８】
さらに、生物学的緩衝液は、結合に使用することができる。生物学的緩衝液の非限定的な例には、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＲＩＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｏｐａｎｅなどが含まれるが、これらに限定するものでない。好ましくは、Ｔｒｉｓ緩衝液は、標的核酸を固相に結合するのに使用される。
【００４９】
したがって、本発明の方法の一実施形態によれば、標的核酸を固相に結合するために、そして、したがって適切な結合条件をステップｂ）および／またはステップｅ）の結合混合物において得るために、ステップａ）のサンプル（それぞれ、インキュベーションステップｄ）で処理された溶出標的核酸）を、ステップｂ）で（それぞれ、ステップｅ）において）、少なくとも１種のアルコールおよび少なくとも１種のカオトロピック剤および必要に応じて生物学的緩衝液、好ましくはＴｒｉｓを含む結合緩衝液に接触させて、標的核酸を固相に結合する。必要に応じて、結合緩衝液も、上記のような界面活性剤を含んでいてもよい。しかし、適切な結合組成物を形成するために、構成要素を別々に添加することもできる。好ましくは、結合緩衝液のｐＨは、８を含む範囲にある。一実施形態によれば、結合緩衝液のｐＨは、ｐＨ７．０から９の範囲内にあり、好ましくは７．５から８．５；最も好ましくは、結合緩衝液はｐＨ８を有する。
【００５０】
一実施形態によれば、標的核酸が固相に結合した状態で、１つまたは複数の洗浄ステップを、ステップｂ）とｃ）との間、および／またはステップｅ）の後に行う。この目的で、一般的な洗浄溶液を使用してもよい。一実施形態によれば、洗浄のために使用される溶液は、少なくとも１種のカオトロピック剤、少なくとも１種のアルコール、少なくとも１種の界面活性剤、および／または少なくとも１種の緩衝成分を含む。洗浄溶液中に使用することができるカオトロピック剤には、塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、およびヨウ化ナトリウムが含まれるが、これらに限定するものではない。さらに、トリクロロアセテート、パークロレート、およびトリフルオロアセテートからなる群から選択されるカオトロピック陰イオンを含むカオトロピック塩を使用することができる。それぞれのカオトロピック塩の例は、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムのようなアルカリ塩である。アルコールとして、好ましくは１から５個の炭素原子を有する短鎖分岐または非分岐アルコールを、洗浄のために、それぞれ洗浄溶液中に使用することができる。例は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールである。好ましくは、イソプロパノールおよび／またはエタノールが使用される。好ましくは、洗浄溶液は、少なくとも５０％のアルコールおよび少なくとも１Ｍのカオトロピック塩、好ましくは少なくとも２Ｍのカオトロピック塩を含む。さらに、洗浄溶液は、界面活性剤を含んでいてもよい。好ましくは、イオン性および／または非イオン性界面活性剤が界面活性剤として使用される。好ましくは、非イオン性界面活性剤は、少なくとも５％の濃度で使用される。本明細書に記述されるステップ以外の、追加の中間ステップを行うことも、本発明の範囲内にある。しかし、特定の実施形態によれば、本明細書に記述されるステップ以外の追加のステップは行わない。
【００５１】
上記の洗浄溶液の代わりにまたはそれに加えて使用することができる、さらなる適切な洗浄溶液には、アルコールおよび生物学的緩衝液が含まれる。適切なアルコールおよび生物学的緩衝液については既に記述されている。好ましくは、イソプロパノールまたはエタノール、最も好ましくはエタノールを、この第２の洗浄ステップで使用する。好ましくは、エタノールは、少なくとも７０％ｖ／ｖ、好ましくは少なくとも８０％ｖ／ｖの濃度で使用される。生物学的緩衝液は、好ましくは、ｐＨが約７から８のＴｒｉｓである。
【００５２】
単離された核酸の純度は、従来技術で公知の適切な方法により決定することができる。一実施形態によれば、純度は、分光光度分析により決定される。タンパク質汚染の程度を決定する１つの一般的な方法は、２６０：２８０の比の決定である。核酸は２６０ｎｍの光を吸収し（ａｄｓｏｒｂ）、タンパク質は２８０ｎｍの光を吸収する。純粋なＤＮＡの場合、Ａ２６０／２８０は約１．８であり、純粋なＲＮＡの場合、Ａ２６０／２８０は約２である。核酸は、タンパク質のそれに比べて２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでより高い吸光係数を有するので、２６０／２８０の比のごくわずかな差も、それが、様々なタンパク質含量を示すので重要である。２６０／２８０の比が低下するにつれ、分析された核酸サンプル中のタンパク質汚染物の量は高くなる。ＲＮＡに関し、単離されたＲＮＡの２６０／２８０の比が１．８から２．２、好ましくは１．９から２．１の範囲内にある場合、通常その純度に関しては許容される。しかし、特定のサンプルを処理する場合、核酸単離手順が特定の条件下でまたは時々この純度に到達可能であることが、単に重要なのではない。逆に言えば、異なるサンプルおよび様々な量のタンパク質を含むサンプル（血液または血液産物など）が処理される場合であっても、これらの純度に信頼性を持ってかつ連続して到達することが、重要なのである。本発明による方法はこれを実現するが、それは、たとえ強力な結合条件が使用される場合であっても、またはたとえ多量のおよび様々な量のタンパク質を含むサンプルが処理される場合であっても、所与の範囲内にある信頼性ある純度で、単離された標的核酸を連続して提供するからである。したがって本発明による方法は、異なるサンプルおよび様々な量のタンパク質を含むサンプル（血液または血液産物など）が処理される場合であっても、高い収量および信頼性ある純度での標的核酸の単離を可能にする。標的核酸としてＲＮＡを単離するための一実施形態によれば、精製されたＲＮＡの８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の２６０／２８０の比は、１．８から２．２、好ましくは１．８５から２．１の範囲内にある。このように、方法を１００回行った場合、９５のケースでそれぞれの純度が到達される。
【００５３】
「サンプル」という用語は、本明細書では広い意味で使用され、核酸を含有する様々な供給源を含むものとする。サンプルは、生物学的サンプルであってもよいが、この用語は、その他のもの、例えば核酸を含む人工サンプルも含む。例示的なサンプルには、全血；赤血球；白血球；バフィコート；頬スワブ、喉スワブ、膣スワブ、尿道スワブ、頚部スワブ、喉スワブ、直腸スワブ、病変スワブ、膿瘍（ａｂｃｅｓｓ）スワブ、および鼻咽頭スワブなどを含むがこれらに限定されないスワブ；尿；痰；唾液；精液；リンパ液；羊水；脳脊髄液；腹水；胸水；嚢胞からの液；滑液；硝子体液；房水；滑液包液；眼洗浄液；眼吸引液；血漿；血清；肺洗浄液；肺吸引液；肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓、細胞培養物を含むがこれらに限定されない組織、ならびに溶解産物、抽出物、または任意の細胞および微生物およびウイルスから得られた材料であって、サンプル上もしくはサンプル中に存在し得るものなどが含まれるが、これらに限定するものではない。核酸を含有する、臨床的または法医学的状況から得られた材料も、サンプルという用語の意図する意味に含まれる。さらに当業者なら、上述の例示的なサンプルのいずれかから得られた溶解産物、抽出物、もしくは材料、またはそれらの部分も、サンプルという用語の範囲内にあることを理解する。好ましくは、サンプルは、ヒト、動物、植物、細菌、または真菌由来の生物学的サンプルである。特に「サンプル」という用語は、タンパク質も含む核酸含有サンプルを指す。好ましくは、サンプルは、細胞、組織、細菌、ウイルス、ならびに体液、例えば血液、血液産物（バフィコート、血漿、および血清など）、尿、髄液、痰、便、ＣＳＦおよび精液、上皮スワブ、バイオプシー、骨髄サンプル、および組織サンプル、好ましくは肺および肝臓などの器官組織サンプルからなる群から選択される。好ましくは、サンプルは、全血と、バフィコート、血清、または血漿などの血液産物から選択される。
【００５４】
本明細書で使用される「核酸」という用語は、特に、典型的にはサブユニット間のホスホジエステル結合によって、しかし場合によってはホスホロチオエートおよびメチルホスホネートなどにより共有結合したリボヌクレオシドおよび／またはデオキシリボヌクレオシドを含む、ポリマーを指す。核酸には、ｇＤＮＡ；環状ＤＮＡ；循環ＤＮＡ；ｈｎＲＮＡ；ｍＲＮＡ；ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、およびｓｔＲＮＡ（一過性低分子ＲＮＡ）を含むがこれらに限定されない非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）；断片化核酸；ミトコンドリアまたは葉緑体などの細胞内小器官から得られる核酸；ならびに生物学的サンプル中に存在し得る微生物、寄生生物、またはＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスから得られる核酸が含まれるが、これらに限定するものではない。生物学的サンプルに添加されまたは「スパイク」されるヌクレオチド類似体を含んでいてもいなくてもよい合成核酸配列も、本発明の範囲内にある。低分子ＲＮＡまたは低分子ＲＮＡ種という用語は特に、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、または１００ｎｔ未満の長さを有するＲＮＡを指し、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、その他の短鎖干渉核酸、およびｓｎｏＲＮＡなどが含まれるが、これらに限定するものではない。
【００５５】
本発明による方法は、少なくとも標的核酸を精製するための方法に関する。本発明の方法により処理することができるサンプルの詳細な例から明らかにされるように、サンプルは、複数のタイプの核酸を含んでいてもよい。意図される用途に応じて、サンプルから全てのタイプの核酸を（例えば、後で共に標的核酸になり得るＤＮＡおよびＲＮＡ）、または特定の複数のタイプの核酸もしくは特定の１つのタイプの核酸（例えば、ＤＮＡではなくＲＮＡのみ、またはその逆）のみを単離することが望ましい場合がある。これら全ての変種は、本発明の範囲内にある。
【００５６】
このように、一実施形態によれば、サンプルは、少なくとも１種の非標的核酸および少なくとも１種の標的核酸を含む。
【００５７】
一実施形態によれば、本発明による方法は、非標的核酸の少なくとも一部を除去するステップｂ）の前に行われるステップａ）の後に、中間ステップを含む。好ましくは、非標的核酸は、適切な条件下で非標的核酸の少なくとも一部を固相に結合し、次いで固相に結合した非標的核酸を、標的核酸を含む残りのサンプルから分離することによって除去される。これは例えば、主に非標的核酸が固相に結合する条件下での適切な固相の添加によって、実現することができる。非標的核酸を標的核酸から選択的に除去するための適切な方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＥＰ  ０  ８８０  ５３７およびＷＯ  ９５／２１８４９に記載されている。
【００５８】
標的核酸としてＲＮＡ（のみ）を単離しようとする場合、非標的核酸は通常ＤＮＡである。
【００５９】
非標的核酸の量をさらに低減させるために、適切な酵素を使用して非標的核酸を分解するための中間ステップを、ステップｄ）の前、好ましくはステップｃ）の後に行うことができる。ＲＮＡが標的核酸として単離される一実施形態によれば、したがってＤＮａｓｅ処理はステップｄ）の前に行われる。前記ＤＮａｓｅ消化は任意のステップで行うことができるが、ＤＮａｓｅ処理はステップｃ）の後およびステップｄ）の前に行うことが好ましい。ＤＮａｓｅ消化を行うための条件は従来技術で周知であるので、その条件について本明細書でさらに記述する必要はない。ステップｄ）の前にＤＮａｓｅ消化を行うことには、第２のタンパク質分解ステップｄ）中にＤＮａｓｅも分解し、したがってＤＮａｓｅは、単離した標的核酸中に含有されるタンパク質汚染物の量に寄与せず、それぞれそれほど寄与しないという利点がある。基本的に同じことが、標的核酸としてＤＮＡを単離する場合、したがって非標的核酸としてＲＮＡを分解するのにＲＮａｓｅを使用する場合にも当てはまる。
【００６０】
固相として、サンプル中に存在するかまたはサンプルから放出される核酸を結合することが可能な任意の材料を使用することができ、その材料には、適切な条件下で核酸を結合することのできる様々な材料を含めることができる。本発明と併せて使用することができる例示的な固相には、シリカ粒子、二酸化ケイ素、珪藻土、ガラス、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム、およびボロシリケートを含むがこれらに限定されないシリカを含む化合物；ニトロセルロース；ジアゾ化紙；ヒドロキシアパタイト（ヒドロキシルアパタイトとも呼ばれる）；ナイロン；金属酸化物；ジルコニア；アルミナ；ポリマー支持体、ジエチルアミノエチル誘導体化支持体およびトリエチルアミノエチル誘導体化支持体、ならびに疎水性クロマトグラフィー樹脂（フェニルセファロースまたはオクチルセファロースなど）などが含まれるが、これらに限定するものではない。固相という用語は、その形態またはデザインに関していかなる限定も意味するものではない。このように、固相という用語は、多孔質または非多孔質；透過性または不透過性であり；膜、フィルター、シート、粒子、磁性粒子、ビーズ、ゲル、粉末、および繊維などを含むがこれらに限定されない適切な材料を包含する。一実施形態によれば、例えばシリカ固相などの固相の表面は修飾されず、例えば官能基で修飾されない。
【００６１】
好ましい実施形態によれば、シリカを含む固相が使用される。タンパク質汚染の問題は特に、シリカ粒子を固相として使用する場合に生じることが見出された。このように、本発明は特に、固相としてシリカ粒子を使用するときのタンパク質汚染の問題を解決する。ビーズの形態で使用することができ、好ましくは約０．０２から３０μｍ、より好ましくは０．０５から１５μｍ、最も好ましくは０．１から１０μｍの粒子サイズを有するシリカ粒子の使用が、特に好ましい。核酸結合キャリアの処理を容易にするには、好ましくは磁性シリカ粒子を使用する。磁性シリカ粒子は、例えばフェリ磁性、強磁性、常磁性、または超常磁性であってもよい。適切な磁性シリカ粒子は、例えばＷＯ  ０１／７１７３２、ＷＯ  ２００４／００３２３１、およびＷＯ  ２００３／００４１５０に記載されている。その他の磁性シリカ粒子も従来技術から公知であり、例えばＷＯ  ９８／３１８４０、ＷＯ  ９８／３１４６１、ＥＰ  １  ２６０  ５９５、ＷＯ  ９６／４１８１１、およびＥＰ  ０  ３４３  ９３４に記載されており、例えば磁性シリカガラス粒子も含まれる。
【００６２】
全血または血液産物などの生物学的サンプルからＲＮＡが単離される場合に特に好ましい一実施形態によれば、サンプル中に含有される核酸は、サンプルの現状、特に転写パターンを保存するために、好ましくは生物学的サンプルがその自然環境から採取された直後に安定化される。これは、医療および診断の分野で特に有益である。
【００６３】
したがって一実施形態によれば、サンプルは、前記サンプルから核酸を単離する前に前記サンプル中で核酸を安定化させるための、核酸貯蔵安定化組成物と混合する。一実施形態によれば、前記安定化組成物は、
ａ）一般式
Ｙ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｘ−
（式中、Ｙは窒素またはリン、好ましくは窒素を表し、
Ｒ１Ｒ２Ｒ３およびＲ４は独立して、分岐状または非分岐状のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２０アリール基、および／またはＣ６〜Ｃ２６アラルキル基を表し、
Ｘ−は、無機または有機の一塩基酸または多塩基酸の陰イオンを表す）
の陽イオン化合物と、
ｂ）少なくとも１種のプロトン供与体であって、プロトン供与体が好ましくは５０ｍＭを超えて飽和に至る濃度で組成物中に存在し、プロトン供与体が、好ましくは飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニルカルボン酸、飽和および／もしくは不飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸、脂肪族ヒドロキシルジカルボン酸および脂肪族ヒドロキシルトリカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸、アミノ酸、または無機酸、またはそれらの塩からなる群から、それ自体でまたは組み合わせて選択されるプロトン供与体と
を含む。
【００６４】
好ましくは、Ｒ１は、１２、１４、または１６個の炭素原子を有する高級アルキル基を示し、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれメチル基を表す。
【００６５】
好ましくは、陰イオンＸ−は、ハロゲン化水素酸の陰イオンまたは一塩基性有機酸もしくは二塩基性有機酸の陰イオンを表し、最も好ましくは、陰イオンＸ−は、臭化物、塩化物、ホスフェート、スルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキサレート、マロネート、スクシネート、またはシトレートからなる群から選択される。
【００６６】
好ましくは、プロトン供与体は、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニルカルボン酸、飽和および／もしくは不飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸、アミノ酸、または無機酸、またはそれらの塩、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、脂肪族モノカルボン酸には、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、エチルメチル酢酸（２−メチル酪酸）、２，２−ジメチルプロピオン酸（ピバル酸）、ｎ−ヘキサン酸、ｎ−オクタン酸、ｎ−デカン酸、またはｎ−ドデカン酸（ラウリン酸）、またはそれらの混合物からなる群から選択されるＣ１〜Ｃ６アルキルカルボン酸が含まれる。好ましくは、脂肪族アルケニルカルボン酸は、アクリル酸（プロペン酸）、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸、またはビニル酢酸、またはそれらの混合物からなる群から選択される。好ましくは、飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸は、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、またはアジピン酸、またはそれらの混合物からなる群から選択される。脂肪族ジカルボン酸は、シュウ酸またはコハク酸またはそれらの混合物であることが、最も好ましい。好ましくは、脂肪族ヒドロキシ−ジカルボン酸および脂肪族ヒドロキシ−トリカルボン酸は、タルトロン酸、Ｄ−（＋）、Ｌ−（−）、もしくはＤＬリンゴ酸、（２Ｒ，３Ｒ）−（＋）−酒石酸、（２Ｓ，３Ｓ）−（−）−酒石酸、メソ酒石酸、およびクエン酸、またはそれらの混合物からなる群から選択される。不飽和ジカルボン酸は、マレイン酸および／もしくはフマル酸またはそれらの混合物であることが、最も好ましい。好ましくは、不飽和トリカルボン酸は、アコニット酸である。好ましくは、脂肪族ケトジカルボン酸は、メソキサル酸、またはオキサロ酢酸、またはそれらの混合物である。好ましくは、アミノ酸は、アミノ酢酸（グリシン）、α−アミノプロピオン酸（アラニン）、α−アミノ−イソ吉草酸（バリン）、α−アミノ−イソカプロン酸（ロイシン）、およびα−アミノ−β−メチル吉草酸（イソロイシン）、またはそれらの混合物からなる群から選択される。
【００６７】
好ましくは、安定化組成物は水性溶液中に存在する。好ましくは、陽イオン化合物は、０．０１重量パーセントから１５重量パーセントの範囲の濃度で含まれる。
【００６８】
適切な安定化溶液は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２７０，９５３号にも記載されている。
【００６９】
上記のように安定化する複合サンプルは、安定化溶液中の添加剤およびサンプルの高いタンパク質含量が原因で、核酸の単離が特に難しくなる。本発明の方法は、これらの困難を克服し、安定化サンプル、特に複合生物学的サンプルであって、全血ならびに、血液産物（バフィコート、血清、および／もしくは血漿など）の生物学的サンプル、または組織サンプル、特に器官組織サンプル、例えば肺もしくは肝臓から得られたサンプルから、それぞれ、望む場合は良好な収量および高純度で、低分子ＲＮＡを含むＲＮＡを単離することが可能になる。したがって本発明の方法は、医療分野、および特に診断の分野で特に有用である。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態によれば、少なくともＲＮＡおよびＤＮＡを含むサンプルからＲＮＡを精製するための方法が提供され、前記方法は、少なくとも以下のステップ：
ａ）カオトロピック剤の存在下、サンプルを少なくとも４０℃に加熱することによって、サンプルを、少なくとも１種のタンパク質分解酵素と共にインキュベートするステップと、
−ＤＮＡを第１の固相に結合することによって、ＤＮＡの少なくとも一部を除去し、前記第１の固相に結合したＤＮＡを、ＲＮＡを含む残りのサンプルから分離するステップと、
ｂ）ＲＮＡを第２の固相に結合するステップであって、少なくとも１種のカオトロピック剤および濃度≧３０％ｖ／ｖのアルコールがこの結合ステップｂ）中に使用されるステップと、
−前記第２の固相に結合したＲＮＡを洗浄するための、少なくとも１つの洗浄ステップを行うステップと、
ｃ）前記第２の固相からＲＮＡを溶出するステップと、
ｄ）カオトロピック剤の存在下、サンプルを少なくとも４０℃に加熱することによって、溶出されたＲＮＡを、少なくとも１種のタンパク質分解酵素と共にインキュベートするステップと、
ｅ）ＲＮＡを再び固相に結合するステップであって、少なくとも１種のカオトロピック剤および濃度≧３０％ｖ／ｖのアルコールがこの結合ステップｅ）中に使用されるステップと、
−固相に結合したＲＮＡを洗浄するための、少なくとも１つの洗浄ステップを行うステップと、
ｆ）必要に応じて、結合した標的核酸を固相から溶出するステップと
を含む。
【００７１】
上記のように本発明の方法は、結合を促進ししたがってタンパク質汚染物の共精製を促進する結合条件が使用される場合であっても、大量のタンパク質を含む複合サンプルから、ＲＮＡを高純度で、そして、したがって低いタンパク質汚染状態で単離するのに特に適切である。個々のステップを行うのに適切な条件は上記にて詳述され、ＲＮＡを単離するためのこの特定の実施形態にも当てはまる上記開示を参照されたい。本発明による方法のこの特定の実施形態は、血液および血液産物などのタンパク質を多量に含むサンプルから、ｍｉＲＮＡなどの低分子ＲＮＡを含むＲＮＡを単離するのに特に適切である。低分子ＲＮＡを含むＲＮＡを単離するための適切な結合条件は、上記にて詳述される。ここにも当てはまる上記開示を参照されたい。
【実施例】
【００７２】
１．ＲＮＡ単離プロトコル
全ＲＮＡを、安定化溶液を含むＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ中の、１２名の異なるドナーから得た全血（２．５ｍｌ）から、３つ組みで、単離した。適切な安定化溶液についても既に記述されている。安定化サンプルを含むＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）を、市販のキットＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）についての指示マニュアル、ｍｉＲＮＡなどの低分子ＲＮＡ種も単離するためのその改訂版、または本発明による方法に従ってさらに処理した。
【００７３】
安定化サンプルは、下記の通り処理した：
ａ）ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）
詳細なプロトコルは、該当するハンドブックに記載されている。したがって、それぞれのプロトコルについては、本明細書では手短にしか記述しない：
１．ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブを、１０分間、３０００〜５０００×ｇで、スイングアウトローターを使用して遠心分離した。
２．遠心分離後、上清をデカンテーションにより除去した。上清を廃棄し、ペレットを、ステップ３での再懸濁用に取っておいた。
３．チューブ当たり３００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＢＲ１を添加した。チューブを閉鎖し、ペレットをボルテックスによって完全に再懸濁した。マルチチューブボルテックスミキサーを、３０秒間全速で、再懸濁するために使用し、それぞれペレットが完全に再懸濁するまで行った。
４．クロージャーを除去し、廃棄した。
５．ロボットシステムＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＳＰを、さらなる処理に使用した。ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ単離のために必要とされる試薬カートリッジ、および消耗品を、「試薬および消耗品」の引出し（ｄｒａｗｅｒ）に投入した。さらに、必要とされる溶出ラックを、「溶出液」の引出しに投入した。
６．ステップ４からのサンプルを、適切なサンプルキャリアに配置し、「サンプル」の引出しに投入した。その後サンプルを、該当するプログラムでＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙにより処理した。手短に言うと、ロボットシステムＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙは、溶解緩衝液ＢＲ２、プロテイナーゼＫ、およびＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズを添加することによって、プローブを処理した。最初にＤＮＡをビーズに結合し、除去した。その後、さらなる磁性ビーズを、結合緩衝液ＱＳＢ１に加えて添加した。その後、複合体を、緩衝液ＱＳＢ１および緩衝液ＢＲ４で前洗浄した。
７．サンプルを、緩衝液ＢＲ５で先に溶出し、残りのＤＮＡを消化した。ＲＮＡは、緩衝液ＱＳＢ２を添加することにより再結合した。その後、さらなる洗浄ステップを行い、複合体を乾燥し、ＲＮＡを溶出した。
ｂ）ｍｉＲＮＡなどの低分子ＲＮＡを含むために改訂されたＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙプロトコル
ｍｉＲＮＡなどの低分子ＲＮＡも単離するための、改訂されたＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄプロトコルを、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙロボットシステムで行った。手短に言うと、下記のステップを行った：
１．ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブを１０分間、３，０００から６，０００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを、酢酸アンモニウムを含む緩衝液（３００μｌ）を添加しボルテックスによって再懸濁した。適切な緩衝液は、緩衝液ＢＲ１（ＱＩＡＧＥＮ）である。
２．さらなる溶解剤、好ましくはＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（４０μｌ）と、３Ｍ超のカオトロピック塩、好ましくはＧＩＴＣを含む溶解緩衝液（２３０μｌ）とを添加した。適切な緩衝液は緩衝液ＢＲ２（ＱＩＡＧＥＮ）である。その後、サンプルを１０分間、５６℃、１００ｒｐｍでインキュベートした。
３．ＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）を添加して、ＤＮＡをシリカ粒子に結合させて一緒に除去した。
４．ＲＮＡを結合するため、追加のＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズを添加し（６０μｌ）、８０％のイソプロパノール（またはエタノール）、それぞれ０．６Ｍの過塩素酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、またはトリクロロ酢酸ナトリウム、およびＴｒｉｓを含む、本発明による結合緩衝液１５００μｌを添加した。
５．２つの洗浄ステップを行った。第１の洗浄ステップは、イソプロパノール、ＧＴＣ、および界面活性剤を含む緩衝液を用いて行い、第２の洗浄ステップは、エタノールおよびＴｒｉｓを含む洗浄緩衝液を用いて行った。
６．その後、溶出緩衝液（例えば、ＢＲ５、ＱＩＡＧＥＮ）２５０μｌでＲＮＡを先に溶出し、ＤＮａｓｅ消化を行った（２２５μｌの緩衝液ＲＤＤ（ＱＩＡＧＥＮ）および２５μｌのＤＮａｓｅ  Ｉ原液（ＱＩＡＧＥＮ））。
７．ＲＮＡをビーズに再結合するため、同じ結合緩衝液（上記参照）１４００μｌを添加した。この第２の結合ステップは、低分子ＲＮＡの良好な収量を確実にする。
８．その後、４回の追加の洗浄ステップを行った。
９．全ＲＮＡを、適切な溶出緩衝液（ＢＲ５、ＱＩＡＧＥＮ）を使用することにより溶出した。水またはＴｒｉｓ緩衝液など、その他の一般的な溶出緩衝液も使用することができる。
ｃ）本発明による方法
本発明による方法も、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙロボットシステムで行った。方法は、ｂ）で記述された方法に該当するが、追加のプロテイナーゼＫ消化を、ＤＮａｓｅ消化後に行った。手短に言うと、下記のステップを行った：
１．ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブを、１０分間、３，０００から６，０００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを、酢酸アンモニウムを含む緩衝液（３００μｌ）を添加しボルテックスによって再懸濁した。適切な緩衝液は、緩衝液ＢＲ１（ＱＩＡＧＥＮ）である。
２．さらなる溶解剤、好ましくはＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（２０μｌ）と、３Ｍ超のカオトロピック塩、好ましくはＧＩＴＣを含む溶解緩衝液（２３０μｌ）とを添加した。適切な緩衝液は、緩衝液ＢＲ２（ＱＩＡＧＥＮ）である。その後、サンプルを１０分間、５６℃、１００ｒｐｍでインキュベートした。
３．ＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）を添加して、ＤＮＡをシリカ粒子に結合させて一緒に除去した。
４．ＲＮＡを結合するため、追加のＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズを添加し、８０％のイソプロパノール（またはエタノール）、それぞれ０．６Ｍの過塩素酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、またはトリクロロ酢酸ナトリウム、およびＴｒｉｓを含む、本発明による結合緩衝液１５００μｌを添加した。
５．２回の洗浄ステップを行った。第１の洗浄ステップは、イソプロパノール、ＧＴＣ、および界面活性剤を含む緩衝液を用いて行い、第２の洗浄ステップは、エタノールおよびＴｒｉｓを含む洗浄緩衝液を用いて行った。
６．その後ＲＮＡを、溶出緩衝液（例えば、ＢＲ５、ＱＩＡＧＥＮ）２５０μｌを用いて先に溶出し、ＤＮａｓｅ消化を行った（２２５μｌの緩衝液ＲＤＤ（ＱＩＡＧＥＮ）および２５μｌのＤＮａｓｅ  Ｉ原液（ＱＩＡＧＥＮ））。
７．次いで第２のプロテイナーゼＫ消化ステップを行った。この目的のため、２０μｌのプロテイナーゼＫと、３Ｍ超のカオトロピック塩、好ましくはＧＩＴＣを含む溶解緩衝液（２００μｌ）とを添加し（適切な緩衝液はＢＲ２、ＱＩＡＧＥＮである）、サンプルを５分間、５６℃、１００ｒｐｍでインキュベートした。
８．ＲＮＡをビーズに再結合するため、本発明による同じ結合緩衝液（上記参照）１４００μｌを添加した。この第２の結合ステップは、低分子ＲＮＡの良好な収量を確実にする。
９．その後、４回の追加の洗浄ステップを行った。この目的のため、洗浄緩衝液ＱＳＢ１、ＡＷ１、およびＢＲ４（全てＱＩＡＧＥＮ）を使用することができる。
９．全ＲＮＡを、適切な溶出緩衝液（ＢＲ５、ＱＩＡＧＥＮ）を使用することにより溶出した。水またはＴｒｉｓ緩衝液など、その他の一般的な溶出緩衝液も使用することができる。
２．結果
結果を、図１から７に示す。
【００７４】
図１．１は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡプロトコルにより、ＲＮＡに、高く信頼性ある純度が１．８から２．０の範囲内で安定してかつ一貫して与えられることを示す。ＲＮＡの全収量、特に単離された全ＲＮＡ中のｍｉＲＮＡなどの低分子ＲＮＡの収量が増加するよう設計された、改訂されたＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡプロトコルは、最適な純度を提供しないが、それは２６０／２８０の比が１．８よりもしばしば低く存在し、さらに高い変動を示したからである。図１．２に見られるように、平均純度も１．８より下である。
【００７５】
純度におけるこの低下は、この改訂されたＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）プロトコルが、強力な結合化学（強力なカオトロピック剤および高いアルコール濃度）を使用することに起因する。これらの結合条件は、全ＲＮＡの収量を増加させ、低分子ＲＮＡ種も結合し、したがって高効率で単離されるという有利な効果を有する。しかし、これらの強力な結合条件には、タンパク質汚染物もシリカ粒子に結合し、それによって純度が許容レベルよりも下に低下し、さらに、自動化プロセスでは特に許容できない変動を、得られた純度にもたらすという欠点がある。
【００７６】
図２．１および図２．２は、第２のプロテイナーゼＫ消化がＲＮＡの純度に及ぼす影響を示す。これらの図は、本発明による方法が、低分子ＲＮＡの結合を増加させるだけではなくタンパク質汚染物の結合も増加させるという結合化学を使用したにも関わらず（図１．１および１．２も参照）、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡプロトコルと同等の純度をもたらしたことを示す。ほとんどのサンプルの純度は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡプロトコルと同様に１．８から２．２の範囲内にあった。図２．２は、異なる方法によって得られた主な純度を示す。結果は、ＲＮＡを高い収量で提供しかつ低分子ＲＮＡ種も単離しながら優れた純度が連続して実現されたので、本発明によるプロトコルは従来の方法より優れた著しい改善を示したことを示す。
【００７７】
図３は、追加のプロテイナーゼＫ消化が全収量に及ぼす影響を示す。明らかなように、本発明によるプロトコル（プロトコル発明Ｉでは、再結合が２．５分間行われ、発明ＩＩでは、再結合が５分間行われた）は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡプロトコルに比べて著しく増加した収量でＲＮＡを提供した。このように、収量の増加に関する強力な結合化学の利点は、タンパク質汚染物に関する強力な結合化学の欠点を回避しながら維持された。
【００７８】
図４は、ｈａｓ−ｍｉＲ  １６の発現を決定することにより、得られたＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡの収量を分析するために行われた、ＲＴ−ＰＣＲのＣＴ値を示す。ＣＴ値が高くなるほど、単離されたＲＮＡ中のそれぞれのｍｉＲＮＡの含量は低くなる。明らかなように、本発明による方法は、良好な収量で、低分子ＲＮＡ種を含む全ＲＮＡを提供し、一方、それほど強力ではない結合化学を使用するＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡプロトコルは、高ＣＴ値から誘導することができるような高い収量で、低分子ＲＮＡ種を提供しなかった。これは、本発明による方法が、良好な純度を提供しながら、強力な結合化学により低分子核酸の単離も可能にすることを、実証する。
【００７９】
図５．１から５．４は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット、ｍｉＲＮＡを単離するための改訂版（ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡ）、および本発明の方法による純度の比較を示す。明らかなように、本発明による方法は、純度を著しく改善した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【国際調査報告】
2013533749.tif 000016
2013533749.tif 000017