(57)【要約】    細胞培養において増殖させたオルトミクソウイルスを不活性化し、および／または混入している外来性物質を不活性化する方法であって、少なくとも以下のステップ：  （ａ）オルトミクソウイルスを含有する液体をアルキル化剤で処理するステップ、および  （ｂ）オルトミクソウイルスを含有する液体にＵＶ光を照射するステップを含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養において増殖させたオルトミクソウイルスを不活性化し、および／または混入している外来性物質を不活性化する方法であって、少なくとも以下のステップ：
（ａ）オルトミクソウイルスを含有する液体をアルキル化剤で処理するステップ、および
（ｂ）オルトミクソウイルスを含有する液体にＵＶ光を照射するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）および（ｂ）を任意の順で連続して行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）がステップ（ｂ）に先行する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）がステップ（ａ）に先行する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）および（ｂ）を同時に行う、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アルキル化剤がβ−プロピオラクトンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
β−プロピオラクトンが０．０１％〜０．１％、または０．０３％〜０．８％、または０．０５％の濃度で使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＵＶ線量が５０〜５００Ｊ／ｍ２、もしくは１００〜４００Ｊ／ｍ２の範囲にあるか、または２００Ｊ／ｍ２であるか、または１００Ｊ／ｍ２である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのウイルス精製ステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルス精製ステップが清澄化、限外ろ過、核酸分解、超遠心およびクロマトグラフィーからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスが清澄化によって精製される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）および（ｂ）が清澄化後に行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスがショ糖勾配超遠心によって精製される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）および（ｂ）がショ糖勾配超遠心後に行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）がステップ（ｂ）の前に行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
スプリットステップをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００がスプリット剤として使用される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
スプリットステップがステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の後に行われる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
オルトミクソウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞が哺乳動物細胞またはトリ細胞である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物細胞がＭＤＣＫ細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
トリ細胞がＥＢ６６（登録商標）細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
外来性物質が外来性ウイルスである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
外来性ウイルスがマウス白血病ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ仮性狂犬病ウイルス、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
外来性物質がマウス白血病ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ仮性狂犬病ウイルスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法によって得られるウイルス。
【請求項２７】
請求項２６に従って得られたウイルスを好適な医薬担体と混合して含む、免疫原性組成物。
【請求項２８】
医療に使用するための請求項２７に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
オルトミクソウイルスに関連する感染の予防または治療に使用するための、請求項２７または２８に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
少なくとも、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法によって得られるウイルスを製薬上許容可能な担体と混合するステップを含む、ワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦支援研究に関する記載
本発明の態様は、保健社会福祉省からの、契約番号ＨＨＳＯ１００２００６０００１１Ｃによる米国政府支援によってなされた；米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【０００２】
技術分野
本発明は、ウイルス、特に、細胞培養によって産生されたウイルスを不活性化する方法に関する。本発明の方法は簡単で実行容易である。特に、それは任意のウイルス精製過程中に適切に挿入することができる。
【背景技術】
【０００３】
ウイルスによって引き起こされる非常に多くの疾患のため、ウイルス学は集中的に研究されている分野である。ウイルスタンパク質を単離し精製するため、ワクチンを製造するため、分析ツールを作製するため、または実験室研究のためのウイルスを提供するために、ウイルスを効率的に産生する必要性が常にある。
【０００４】
最近、従来の卵由来産生系の代替として、細胞培養に基づく技術が開発されている。
【０００５】
細胞培養系は、ワクチン製造の好適な代替法として現れ、特により簡単で、柔軟で、一貫性があるため、ワクチン製造能力をスケールアップする可能性を改善し、それ故、必要であれば、特に、世界的流行の脅威またはテロ攻撃の場合に、大量のウイルスを得ることが可能となる。
【０００６】
産生方法に関わらず、ウイルスは、特に、ワクチン接種に使用されることが意図されるならば、安全である必要があり、従って感染性は低減または除去される必要がある。このことは、ウイルスが弱毒化されることを必要とし得る。あるいは、このことは、ウイルスが精製され不活性化されることを必要とし得る。ウイルスの感染性を可能な限り不可逆的に低減する必要があるが、免疫原性は維持されるべきである。ワクチンは外来性物質を含まないことも重要であるが、ウイルスを産生するための宿主、例えば卵または細胞培養には培養中にウイルスが混入している場合がある。様々な不活性化剤、例えば界面活性剤、または化学物質、例えばホルムアルデヒドおよびβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）が当技術分野で公知である。しかし、該剤の使用に関して以下の問題が伴い得る：（ｉ）かなりの残存する感染性が報告されることが多いことから、非常に多くの場合、これらの剤の使用は、処理対象のウイルス懸濁液を完全に不活性化しない；（ｉｉ）界面活性剤はウイルス免疫原性に重要であり得るウイルスタンパク質の構造に悪影響を有する場合があり、界面活性剤によって誘導されるその変性は、最終的に、免疫原性喪失によるワクチン有効性の低下をもたらすため、界面活性剤は注意して使用しなければならない；（ｉｉｉ）化学物質、例えばＢＰＬおよびホルムアルデヒドは、有害製品であり、扱う人に健康リスクを与えることが多いため、注意深く扱う必要があり、かつ扱うための特殊な装置を必要とする；（ｉｖ）ホルムアルデヒド、特に、ウイルスを不活性化する標準的方法は、ウイルスを不活性化するために１〜数日の長いインキュベーション時間を通常必要とし、ことのことは、タンパク質を凝集させる原因となることも知られており、この凝集は、ウイルス精製に必要な続くステップに悪影響を及ぼし得る；（ｉｖ）界面活性剤及び化学物質は、使用後にウイルス懸濁液から除去される必要があり、それ故、ウイルス精製過程を複雑にする。オルトミクソウイルスを不活性化するこれらの技術の実施は、依然として存在するかなりの残存感染性をさらにもたらし得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳ  ２００６／２７００１７  Ａ１
【特許文献２】ＷＯ  ２００９／０２９６９５  Ａ１
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１９，ｐ．２９０−２９４（１９７０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、残存する感染性はワクチンの安全性にとって許容できないため、実施が簡単で、かつ完全なウイルス不活性化を達成することができる、別のウイルス不活性化法を提供するニーズが依然としてあり、その方法は、目的のウイルスを含む液体に混入し得る、可能性のある外来性物質、例えばウイルスを不活性化するのにも有用であるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明の方法は、上述の欠点を克服するウイルスを不活性化する方法を提供する。特に、本発明の方法は、ウイルス抗原性を維持しながら、高レベルのウイルス不活性化を達成することを可能にする。
【００１１】
本発明の第一の態様において、少なくとも以下のステップ：
（ａ）オルトミクソウイルスを含有する液体をアルキル化剤で処理するステップ、および
（ｂ）オルトミクソウイルスを含有する液体にＵＶ光を照射するステップ
を含む、細胞培養において増殖させたオルトミクソウイルスを不活性化し、および／または混入している外来性物質を不活性化する方法を提供する。
【００１２】
第二の態様において、本発明の方法によって得られるウイルスを提供する。
【００１３】
第三の態様において、本発明によって得られるウイルスを好適な医薬担体と混合して含む免疫原性組成物を提供する。
【００１４】
第四の態様において、医療において使用するための本発明の免疫原性組成物を提供する。特に、オルトミクソウイルスに関連する感染の予防または治療に使用するための本発明の免疫原性組成物を提供する。
【００１５】
第五の態様において、少なくとも、本発明によって得られるウイルスを製薬上許容可能な担体と混合するステップを含む、ワクチンの製造方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、小規模および大規模の両方のウイルス産生に適用することができるウイルスを不活性化する改善された方法に関する。本発明の方法は、特に、卵に由来するウイルスおよび細胞培養に由来するウイルスに適用できる。本方法は、少なくとも２種の異なる不活性化剤を用いた、少なくとも１つの不活性化ステップの実施を含む。より具体的には、本発明の方法は、ウイルスを不活性化するために、物理的処理、例えばＵＶ照射、および化学的処理、特に、例えばＢＰＬを用いた、アルキル化ステップを伴う処理の組み合わせに基づく。場合により、該方法は、界面活性剤に基づくスプリット（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）ステップをさらに含む。
【００１７】
本発明者らは、物理的処理と化学的処理を組み合わせる、本願で特許請求されている不活性化手段の特定の組み合わせが、より完全なウイルス不活性化、すなわち先行技術の処理に伴い得る残存する感染性の除去を達成することを可能にすることを見出した。本発明者らは、驚くべきことに、この組み合わせが、完全なウイルス不活性化を提供することに加えて、産生されたウイルスタンパク質の完全性にも抗原性にも影響を与えないことを観察した。得られたウイルスは、さらに精製されるか否かを問わず、免疫原性組成物、例えばワクチン組成物における使用に適する。
【００１８】
特許請求されている方法は、以下の利点の１つまたはそれ以上を有する：（ｉ）ウイルスが凝集しているか否かを問わず、細胞残屑内に捕捉されるか否かを問わず、コンフォメーションまたは環境条件がウイルス不活性化ステップに最適であるか否かを問わず、処理に対するウイルス接近可能性を最適化する；（ｉｉ）１つだけの不活性化ステップを行う場合にウイルス画分が不活性化を免れ得るリスクを低減させ、それにより、より完全なウイルスの不活性化を達成する；（ｉｉｉ）ウイルスが特定の処理に対して示し得る耐性に関連する不完全不活性化のリスクを低減させる（この耐性がウイルスの性質に関係があるか、または処理の実験／環境条件に関係があるかを問わず）。例えば、ウイルス懸濁液中のウイルスのある画分だけを所定濃度の化学物質によって不活性化し得るが、安全性の理由または免疫原性の理由から、特に、不活性化剤の濃度をさらに増加させることが不可能であり得る場合、このことが当てはまり得る。特許請求されている方法のさらなる利点は、不活性化が化学物質を使用することのみによって行われる状況と比べて、ＵＶ照射を行うことが、例えば、使用される化学物質の量の低下を可能とし得る；（ｉｖ）先行技術の処理、特に、ホルムアルデヒドに基づく処理と比べて、産生されるウイルスを不活性化するのに要する時間を短縮する。
【００１９】
ウイルスに対して不活性化効果を有することが知られているいずれの化学物質も、例えばアルキル化剤（例えばＢＰＬ）を、本発明の方法に使用することができる。ＢＰＬは、不活性化能に加えて、核酸、例えばＤＮＡを分解する利点を提示するため、特に好適である。このさらなる能力は、特許請求されている細胞培養において産生されるウイルスがワクチンに含まれる予定であるならば、特に重要である。実際、安全性の理由から、ウイルスを増殖させるために使用される宿主細胞に由来する残存ＤＮＡ含量は、可能な限り低く維持し、そのサイズは可能な限り小さくなければならない。ＢＰＬは、様々な生物学的分子と反応するモノアルキル化剤であり、特に、ウイルスゲノムの核酸塩基を修飾し複製を阻害する。それは、非毒性生成物β−ヒドロキシプロピオン酸と乳酸の異性体に完全に加水分解されるため、３７℃で２時間加熱することにより素早く不活性化することができる。一実施形態では、本発明のウイルスを不活性化する方法は、少なくとも、ウイルスを含有する液体をＢＰで処理する１つのステップ（ＢＰＬ処理）およびウイルスを含有する液体にＵＶ光を照射する１つのステップ（ＵＶ照射）を含む。ＢＰＬ処理およびＵＶ照射は、任意の順で連続して行ってよい。例えば、ＢＰＬ処理はＵＶ照射に先行してよく、またはＢＰＬ処理はＵＶ照射に続いてもよい。あるいは、本発明の特別な実施形態では、ＢＰＬ処理およびＵＶ照射ステップは同時に行ってよい。この後者の実施形態は、追加のステップを省くことによって過程を単純化し短縮するというさらなる利点を提示する。また、ＢＰＬとＵＶ照射は、他の精製ステップによって分離してよく、またはＢＰＬ処理の直後にＵＶ処理が続き、もしくはＵＶ処理の直後にＢＰＬ処理が続き、間にさらなる精製ステップがないという点で、連続的様式で行ってよい。
【００２０】
用語「ウイルスを含有する液体」、例えばオルトミクソウイルスを含有する液体、および「ウイルスを含む液体」は同義であり、精製状態に関わらず、ウイルスを含む液体調製物であると理解されたい。液体は全く精製されていなくてよい。例えば、液体は、細胞にウイルスを感染させ、ウイルスが複製し、培地に放出された後に回収された細胞培養上清であってよい。あるいは、液体は、部分的に精製されていてもよい。例えば、ウイルスを含有する液体は、ＢＰＬ処理およびＵＶ照射による不活性化に供される前に、ろ過または遠心によって、予め清澄化されていてもよい。
【００２１】
ウイルス不活性化は、１％未満のＢＰＬを用いて達成し得る。好適には、ＢＰＬは、０．０１％〜０．１％、特に、０．０３％〜０．８％、好適には０．０５％の濃度で使用される。ＢＰＬは、適切に緩衝液に添加され、溶液のｐＨは６〜１０に維持される。ＢＰＬ活性はｐＨに特に感受性であることが知られているため、緩衝液のｐＨは６〜９、好適には７〜８、より好適には７．４〜８に維持される。一実施形態では、ＢＰＬは、本発明の方法において、リン酸６６ｍＭ−クエン酸１２５ｍＭ  ｐＨ７．４緩衝液に添加される。ＢＰＬは、４℃〜室温の範囲の温度で活性である。本発明の方法の一実施形態では、ＢＰＬのインキュベーション温度は４℃である。別の実施形態では、ＢＰＬのインキュベーション温度は室温である。本発明の意味では、室温は約２０℃〜約２４℃に含まれる温度と理解されたい。インキュベーション時間は、１時間〜数日でさまざまであり得る。一実施形態では、ＢＰＬは一晩添加される。本発明の意味では、一晩インキュベーションは、少なくとも８時間、場合により１２〜１６時間のインキュベーション時間を意味する。特別な実施形態では、ＢＰＬは０．０５％の濃度で４℃において一晩添加される。別の特別な実施形態では、ＢＰＬは０．０５％の濃度で室温において一晩添加される。ＢＰＬが添加され、室温で適切な時間置かれた後、ＢＰＬで処理したウイルス懸濁液は、４℃で数日間、例えば３日間保存してよく、その後、必要であれば、さらにウイルス懸濁液を精製する。
【００２２】
好適なＵＶ照射は、Ｃ型光、すなわち１００〜２８０、好適には２００〜２７０ｎｍ、より好適には、処理されるウイルスの核酸による最大吸収領域である２５４ｎｍの波長を有する光により生じる。ＵＶ不活性化の際、ＵＶ波長照射の励起エネルギーは、プリンおよびピリミジン塩基の共有結合を破壊し、標的ウイルス、そして外来性物質および細菌バイオバーデン（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）に損傷を引き起こす。ＵＶ線量またはフルエンシー（ｆｌｕｅｎｃｙ）は、特に、５０〜５００Ｊ／ｍ２の範囲であってよい。本発明は、ウイルス不活性化を引き起こすいずれのＵＶ線量も想定する。本発明の方法の一実施形態では、ＵＶフルエンシーは２００ジュール／ｍ２である。別の実施形態では、ＵＶフルエンシーは１００ジュール／ｍ２である。さらなる実施形態では、ＵＶフルエンシーは６０ジュール／ｍ２である。ＵＶ照射のための利用可能な市販のデバイスは、少量〜非常に大量までの液体を扱うことを可能にする。例示のためだけに、以下のデバイスを挙げ得る：ＵＶＩＶＡＴＥＣＴＭ（Ｂａｙｅｒ社より）。
【００２３】
不活性化される必要があるウイルスの量およびタイプに従って、ウイルス不活性化のための最適条件を達成するために、ＢＰＬ条件およびＵＶフルエンシーが決定される。当業者は、ウイルス不活性化を評価するための当技術分野で公知のいずれのアッセイを使用してもよく、例えば、５０％の細胞に感染することができるウイルスの量を表示する組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を測定してもよい。このアッセイでは、細胞培養を、感染しているかまたは感染していないかとしてスコアし、ウイルス感染性の尺度としてウイルス力価の決定を可能にする。試験対象の感染性サンプルの一連の連続希釈を行い、各希釈物の一部を使用して適切な感染可能な細胞に接種する。ウイルスが、感染性であるならば複製できるように、数日間細胞をインキュベートした後、ウイルスの存在は、当業者に公知の２つの読み取り法、細胞における細胞変性作用（ＣＰＥ）の分析および／または培養上清について行うニワトリ赤血球細胞を用いた赤血球凝集アッセイによって検出してよい。次いで、ウイルス力価がＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ，Ｌ．Ｊ．およびＭｕｅｎｃｈ，Ｈ．，１９３８，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｙｇｉｅｎｅ  ２７：４９３−４９７）に従って計算される。抗原性および免疫原性を維持しようとするならば、当業者は、ウイルスタンパク質コンフォメーション、すなわち構造を変化させないようにウイルス不活性化条件を適合化させる。不活性化試験と並行して、当技術分野で公知の技術によって、ウイルスの完全性、またはその特定のタンパク質の完全性をモニターする。例として挙げ得る技術は、任意のタンパク質検出技術、例えば特定の抗体を用いたウエスタンブロット解析、または閾値アッセイである。インフルエンザウイルスの特定の場合、免疫原性であることがわかっているタンパク質ＨＡの含量を、当業者によく知られた技術である、ＳＲＤ（一元放射免疫拡散アッセイ）アッセイによって特異的にモニターすることができる（Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．：Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ：ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．５（１９７７）２３７−２４７；Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９（１９８１）３１７−３３０）。ＳＲＤアッセイは、抗体／抗原複合体の形成に基づくため、該アッセイは、インフルエンザウイルス懸濁液由来のＨＡレベルを評価する場合、その懸濁液の不活性化処理がウイルス抗原性に悪影響を与える���分析することを可能にする。
【００２４】
目的のウイルスを不活性化することに加えて、本発明の不活性化法は、目的のウイルスを含有する液体に混入し得る、可能性のある外来性物質を不活性化することも可能にする。特に、これらの物質は、オルトミクソウイルスを産生する宿主に存在している場合があり、または、精製中任意のステップでウイルスを含有する液体に混入している場合がある。例えばワクチン接種の分野における規制当局は、より厳しくなりつつあり、ワクチンを数多くの可能性のある混入ウイルスに対して試験することを課す。そのようなウイルスの例として、ＰＰＶ（ブタパルボウイルス）、ＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス）、ＰＲＶ（ブタ仮性狂犬病ウイルス）およびＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）が挙げられる。パルボウイルスは、多くの動物種に感染する小さな非エンベロープＤＮＡウイルスである。それらは、特に、化学的処理に対して極めて耐性である。本発明の方法は、広範囲の外来性ウイルス、例えば、以下に限定されるものではないが、ＭｕＬＶ、ＰＲＶ、ＨＡＶおよびＰＰＶを不活性化することを可能にする。特に、本発明の方法は、細胞培養において産生されたオルトミクソウイルスから、混入しているＭｕＬＶ、ＰＲＶ、ＨＡＶおよびＰＰＶの少なくとも１つ、またはそれらの任意の組み合わせを不活性化するために使用される。特別な実施形態では、本発明の方法は、それらの全てを不活性化するために使用される。外来性物質の除去は、混入ウイルスに関する場合、ウイルスクリアランスと称されることが多い。従って、本発明の意味では、「ウイルスクリアランス」は、目的のウイルスの懸濁液に混入し得る外来性ウイルスを除去する能力と理解されたい。ウイルスクリアランスは、所定のウイルスの存在の検出を可能にするいずれかの好適な方法によってモニターし評価することができる。例えば、評価は直接的であってよく、すなわち内因性ウイルスの存在は、混入物として存在するならば、例えば目的の混入ウイルスのゲノムに特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって、試験対象のウイルス懸濁液から直接検出してよい。しかし、感度の理由から、混入ウイルスはあったとしても非常に低レベルでのみ存在すると予想されるため、例えば外因性ウイルスの添加に基づく間接的評価を使用することがより好適であり得る。その場合、不活性化されるウイルス懸濁液に、目的の外来性ウイルス、すなわちウイルスクリアランスを決定する必要がある既知量の外来性ウイルスを混合する。この混合は、不活性化およびおそらく精製の前に基準として機能するのに十分な量のウイルスを有するように、いずれかのウイルス不活性化ステップを行う前に行う。次いで、目的の不活性化ステップ、例えば本発明の不活性化法を、混合されたウイルス懸濁液に対して行う。混合に使用される外来性ウイルスの感染性を評価し、それにより、不活性化法の有効性を評価することができるように、混合されたウイルス懸濁液に不活性化法を行う前と後にウイルス力価を測定する。精製ステップは不活性化ステップを伴ってもよく、従って、それらの組み合わせを、目的の外来性ウイルスの感染性について評価してもよい。
【００２５】
本発明に従って調製されるウイルスは、例えばウイルスタンパク質の精製、分析アッセイ、宿主細胞の感染、診断目的または治療もしくは予防用途、例えばワクチン接種および臨床投与をはじめとするいずれの目的にも使用することができる。特に、本発明によって得られるウイルスは、免疫原性組成物における、例えばワクチンにおける使用に適する。
【００２６】
本発明の特別な実施形態では、オルトミクソウイルス、特にインフルエンザウイルスを不活性化する方法について特許請求する。
【００２７】
本発明の別の態様では、特許請求している方法は、以下に限定されるものではないが、アデノウイルス、ヘパドナウイルス（ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルスおよびレトロウイルスをはじめとする他のウイルス、特に細胞に感染し、それらを複製のために使用することができるいずれのウイルスにも適用される。特に、本発明の方法は、エンベロープウイルス、例えばミクソウイルスに適する。
【００２８】
それ故、ウイルスまたはウイルス抗原は、オルトミクソウイルス、例えばインフルエンザウイルスに由来してよい。オルトミクソウイルス抗原は、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１）、膜タンパク質（Ｍ２）、１種またはそれ以上の転写酵素（ＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡ）をはじめとする、１種またはそれ以上のウイルスタンパク質から選択してよい。特に好適な抗原としては、インフルエンザサブタイプの抗原特異性を決定する２つの表面糖タンパク質であるＨＡおよびＮＡが挙げられる。
【００２９】
インフルエンザウイルスは、ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタ（例えばスワイン）インフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルスからなる群より選択される。インフルエンザウイルスは、より特定的には、Ａ型、Ｂ型およびＣ型株から、好ましくはＡ型およびＢ型株から選択される。
【００３０】
インフルエンザウイルスまたはその抗原は、大流行間期の（毎年のまたは季節性の）インフルエンザ株に由来してよい。あるいは、インフルエンザウイルスまたはその抗原は、世界的流行の発生を引き起こす可能性のある株（すなわち現在広まっている株の赤血球凝集素と比べて新な赤血球凝集素を有するインフルエンザ株、またはトリ被験体で病原性でありヒト集団に水平に伝染する可能性を有するインフルエンザ株、またはヒトに病原性であるインフルエンザ株）に由来してよい。特定の季節に応じて、およびワクチンに含まれる抗原の性質に応じて、インフルエンザウイルスまたはその抗原は、以下の赤血球凝集素サブタイプ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６の１種またはそれ以上に由来してよい。好ましくは、インフルエンザウイルスまたはその抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９サブタイプに由来する。
【００３１】
本発明の方法に使用される細胞は、原則として、細胞培養において培養することができ、ウイルス複製を支援することができる細胞の任意の所望の細胞タイプであり得る。それらは、接着して増殖する細胞または懸濁液中で増殖する細胞の両方であり得る。それらは、初代細胞または継続的細胞株のいずれかであり得る。遺伝的に安定な細胞株が好ましい。
【００３２】
哺乳動物細胞、例えばヒト、ハムスター、ウシ、サルまたはイヌ細胞が特に好適である。
【００３３】
多くの哺乳動物細胞株が当技術分野で公知であり、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＥＫ細胞、ヒト胎児腎臓細胞（２９３細胞）、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、およびＭＤＣＫ細胞を含む。
【００３４】
好適なサル細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞株におけるような腎臓細胞などのアフリカミドリザル細胞である。好適なイヌ細胞は、例えばＭＤＣＫ細胞株におけるような腎臓細胞である。
【００３５】
インフルエンザウイルスを増殖させるために好適な哺乳動物細胞株としては、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞が挙げられる。これらの細胞株は全て、例えばアメリカン・タイプ・セル・カルチャー（ＡＴＣＣ）コレクションから広く入手可能である。
【００３６】
具体的な一実施形態では、本発明の方法はＭＤＣＫ細胞を使用する。元のＭＤＣＫ細胞株は、ＡＴＣＣからＣＣＬ−３４として入手可能であるが、この細胞株の派生株、例えば懸濁液中での増殖に適合したＭＤＣＫ細胞（ＷＯ１９９７／３７０００）を使用してもよい。
【００３７】
あるいは、本発明に使用される細胞株は、トリ起源、例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラまたはキジに由来してもよい。トリ細胞株は、胚、幼鳥および成鳥をはじめとする様々な発達段階に由来してよい。特に、細胞株は、胚細胞、例えば胚性線維芽細胞、生殖細胞、または個々の器官、例えば神経、脳、網膜、腎臓、肝臓、心臓、筋肉、または胚外組織および胚を保護する膜に由来してよい。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を使用してよい。トリ細胞株の例としては、トリ胚性幹細胞（ＷＯ０１／８５９３８）およびアヒル網膜細胞（ＷＯ０５／０４２７２８）が挙げられる。特に、アヒル胚性幹細胞に由来するＥＢ６６（登録商標）細胞株が、本発明において想定される（ＷＯ２００８／１２９０５８）。他の好適なトリ胚性幹細胞としては、ニワトリ胚性幹細胞に由来するＥＢｘ細胞株、ＥＢ４５、ＥＢ１４およびＥＢ１４−０７４（ＷＯ２００６／１０８８４６）が挙げられる。このＥＢｘ細胞株は、その確立が天然に起こり、遺伝的、化学的またはウイルスによる改変を必要としなかった遺伝的に安定な細胞株であるという利点を提示する。これらのトリ細胞は、インフルエンザウイルスを増殖させるのに特に好適である。
【００３８】
特定の実施形態では、本発明の方法はＥＢ６６（登録商標）細胞を使用する。
【００３９】
細胞培養条件（温度、細胞密度、ｐＨ値など）は、用いる細胞の適合性によって非常に広い範囲にわたり変更でき、特定のウイルス増殖条件の詳細の要求に適合させることができる。細胞培養は当技術分野において広く記載されているため、適切な培養条件を決定することは当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｅｒｓｏｎ，編（１９７３）、およびＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第４版（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ  ０−４７１−３４８８９−９）を参照）。
【００４０】
具体的な一実施形態では、本発明に記載される方法に使用される宿主細胞は、血清不含および／またはタンパク質不含培地中で培養される。「血清不含培地」（ＳＦＭ）は、細胞生存および細胞増殖を可能にする血清添加を必要としない、すぐに使える細胞培養培地を意味する。この培地は、必ずしも化学的に規定されなくてもよく、様々な由来、例えば植物由来の加水分解物を含有し得る。このような血清不含培地は、ウイルス、マイコプラズマまたは未知の感染性物質の混入を排除することができるという利点を提示する。「タンパク質不含」は、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除しながら細胞の増殖が起こる培養を意味すると理解されるが、場合により、トリプシンまたはウイルス増殖に必要であり得る他のプロテアーゼなどのタンパク質を含むことができる。このような培養中で増殖する細胞は、元来、それ自体タンパク質を含有する。
【００４１】
血清不含培地は、ＶＰ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｆ  １１６８１−０２０）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒｅｆ  １２３０９−０１９）、またはＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＨＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）など、数多くの供給元から市販されている。
【００４２】
細胞は、様々な様式で、例えば、懸濁液中で、または微小担体上での増殖をはじめとして表面に接着して、あるいはそれらの組み合わせで増殖させることができる。培養は、ディッシュ、フラスコ、ローラーボトル中で、またはバッチ、フェドバッチ、半連続的もしくは連続的系、例えばかん流系を用いたバイオリアクター中で行うことができる。典型的には、細胞は、マスターまたはワーキング細胞バンクバイアルから、様々なサイズのフラスコまたはローラーボトルを経由して、そして最終的にはバイオリアクターまでスケールアップされる。一実施形態では、本発明の方法において用いられる細胞は、撹拌バイオリアクター中の血清不含培地中の微小担体ビーズ上で培養され、培養培地はかん流によって提供される。
【００４３】
別の実施形態では、細胞、特にＥＢ６６（登録商標）細胞は、バッチ様式にて懸濁液中で培養される。
【００４４】
ウイルスの感染前に、約３７℃、より好適には３６．５℃で、６．７〜７．８、好適には約６．８〜７．５、より好適には約７．２のｐＨで細胞を培養する。
【００４５】
本発明の方法では、細胞培養に基づくウイルスの産生は、一般に、培養した細胞に、産生されるウイルス株を接種するステップ、および感染した細胞を所望の期間培養し、ウイルスを複製させるステップを含む。
【００４６】
細胞によって産生されるウイルスを大量に産生するために、細胞が高密度に達したら、細胞に所望のウイルス株を接種することが好ましい。通常、接種は、細胞密度が少なくとも約１．５×１０６細胞／ｍｌ、好適には約３×１０６細胞／ｍｌ、より好適には約５×１０６細胞／ｍｌ、さらにより好適には７×１０６細胞／ｍｌ、またはさらにより高い場合に行う。最も多いウイルス産生を得るために最適な細胞密度は、ウイルス増殖のために使用される細胞タイプによって変化し得る。
【００４７】
接種は、約１０−１〜１０−７、好適には約１０−２〜１０−６、より好適には約１０−５のＭＯＩ（感染多重度）で行うことができる。
【００４８】
ウイルス感染のための温度およびｐＨ条件を変化させてよい。温度は、ウイルスタイプによって３２℃〜３９℃の範囲であってよい。インフルエンザウイルス産生のために、細胞培養感染は産生される株によって変化し得る。インフルエンザウイルス感染は、３２℃〜３５℃、好適には３３℃の温度で適切に行われる。一実施形態では、ウイルス感染は３３℃で行われる。別の実施形態では、ウイルス感染は３５℃で行われる。プロテアーゼ、典型的にはトリプシンを、ウイルス複製を可能にするために、ウイルス株に応じて細胞培養に添加してよい。プロテアーゼは、培養中任意の適切な段階で添加することができる。トリプシンは、好ましくは非動物由来であり、つまりプロテアーゼは動物源から精製されたものではない。それは、好適には、微生物、例えば細菌、酵母または植物において組み換えによって産生される。組み換えトリプシンの好適な例は、トウモロコシで産生される組み換えトリプシン、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｐｒｏｄｉｇｅｎ，１０１  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｂｌｖｄ，Ｓｕｉｔｅ  １００  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘａｓ  ７７８４５．製造者コード：ＴＲＹ）、または真菌で発現されるトリプシン様酵素であるＴｒｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である（ＷＯ２００４／０２０６１２）。
【００４９】
感染すると、細胞は、受動的溶解とも称される宿主細胞の自発的溶解によって、新たに形成されたウイルス粒子を培養培地に放出し得る。従って、一実施形態では、細胞に基づくウイルスの回収物を、細胞培養培地または上清を回収することによって、ウイルス接種後の任意の時に提供し得る。特定の実施形態では、細胞培養培地は、かん流によって回収される。この回収方法は、細胞に由来するウイルスをウイルス接種後の異なる時点で回収し、必要であれば、異なる回収物をプールすることが望ましい場合に、特に適する。
【００５０】
あるいは、ウイルス感染後、細胞に基づくウイルスを、宿主細胞を溶解する外的因子を用いることによって回収してよく、これは能動的溶解とも称される。しかし、前のものとは異なり、能動的に細胞を溶解することがすぐに細胞培養を終了させるため、このような回収方法は、細胞に基づくウイルスの回収物を一度の時点で回収することを要する。
【００５１】
能動的細胞溶解に用いることができる方法は公知である。この点において有用な方法は、例えば、凍結融解、固体せん断（ｓｏｌｉｄ  ｓｈｅａｒ）、高張および／または低張溶解、液体せん断（ｌｉｑｕｉｄ  ｓｈｅａｒ）、高圧押し出し（ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）、界面活性剤溶解、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００５２】
一実施形態では、細胞に基づくウイルスの回収物は、細胞培養培地または上清を回収すること、接種した細胞を溶解すること、または両者によって、ウイルス接種後の任意の時に提供し得る。
【００５３】
回収前に、細胞感染は２〜１０日間続いてよい。具体的な一実施形態では、接種後３、４および５日の培養上清を回収し、さらなる下流処理（ウイルス単離）のためにプールする。異なる実施形態では、細胞培養上清を接種後５日に回収する。細胞によって産生されたウイルスを回収するための最適な時は、通常、感染ピークの決定に基づく。例えば、ＣＰＥ（細胞変性作用）を、ウイルス接種後に宿主細胞に生じる形態的変化、例えば細胞円形化、方向喪失（ｄｉｓｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）、膨張または収縮、死、表面からの分離をモニターすることによって測定する。また、特定のウイルス抗原の検出を、タンパク質検出の標準的技術、例えばウエスタンブロット解析によってモニターしてもよい。次いで、所望の検出レベルが達成された場合、回収物を回収することができる。インフルエンザウイルスの特定の場合、ＨＡの含量を、細胞にウイルスを接種した後任意の時に、当業者によく知られた技術であるＳＲＤアッセイによってモニターしてよい（Ｗｏｏｄ，ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ．５，２３７−２４７）。さらに、ＳＲＤアッセイは、最適なウイルス収量を得るために要する最適な細胞密度を決定するために使用してもよい。
【００５４】
本発明の内容では、細胞培養相は、ウイルス回収ステップに先行する任意のステップを含むものと理解すべきであり、ウイルス精製相は、該回収ステップに続く任意のステップを含むものと理解すべきである。例えば、細胞培養に基づくウイルスのウイルス精製相は、いくつかの様々なろ過、濃縮および／または他の分離ステップ、例えば限外ろ過、超遠心（勾配超遠心を含む）、クロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー）および吸着ステップを様々な組み合わせで含んでよい。本発明のウイルスを不活性化する方法は、任意の適切なステップで、化学的不活性化およびＵＶ照射ステップを実施することによって、任意のウイルス精製過程を適切に伴ってよい。
【００５５】
一実施形態では、本発明の不活性化法は、遠心によるかもしくはろ過によるかを問わない清澄化、限外ろ過／透析ろ過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、核酸分解、超遠心、特にショ糖勾配超遠心およびクロマトグラフィー、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのさらなるステップを含む。
【００５６】
ＢＰＬ処理およびＵＶ照射の組み合わせは、任意の順で、上記ステップのいずれかの後に適切に行ってもよい。例えば、ＢＰＬ処理は、ウイルス精製過程の初期に、特に、ウイルスを含有する細胞培養培地を回収することによって得られたウイルス回収物の清澄化後に、行ってよい。この処理の直後にＵＶ照射が続いてよい。あるいは、ＢＰＬ処理およびＵＶ照射は、他の精製ステップによって分離してもよい。ウイルス不活性化の第一ステップを過程における初期に、すなわち清澄化した回収物に対して行うことは、特に、作業する人に関する限り安全性の利点を提供する。実際、精製される必要がある液体に由来するウイルスが過程における初期に不活性化され、それ故、非感染性である場合、作業する人は可能性のあるウイルス感染から保護される。しかし、このような不活性化のための初期段階は、また、大量の容量を扱わなければならないという欠点をも提供する。従って、不活性化されるウイルス懸濁液の大量の容量のため、不活性化ステップ、特にＢＰＬステップに伴うコストはかなり大きいものであり得る。従って、本発明者らは、また、精製過程の後期に、例えば清澄化した回収物の限外ろ過および濃縮後、ならびに／またはショ糖勾配超遠心ステップ後にウイルスを不活性化することが、良い不活性化結果を依然としてもたらすかどうかについても試験した。本発明者らは、精製されたウイルス懸濁液に対してＢＰＬおよびＵＶ不活性化ステップを行うことが、ウイルス精製前に不活性化を行う場合と少なくとも同程度の、場合によりより良い不活性化結果をもたらすことを観察した。
【００５７】
一実施形態では、オルトミクソウイルスを含有する細胞培養培地は、特に哺乳動物ＭＤＣＫ細胞またはトリＥＢ６６（登録商標）細胞で産生されたインフルエンザウイルスは、連続的に、ろ過または遠心によって清澄化され、ＢＰＬ処理によって不活性化され、限外ろ過によって濃縮され、そしてＵＶ照射を受ける。
【００５８】
あるいは、清澄化されたウイルス回収物が、例えば限外ろ過によって濃縮された後、ＢＰＬ処理を行ってもよい。ウイルス回収物を濃縮することは、第一に、より少ない量のＢＰＬを使用することを可能にし、上記のように、コスト面の利点を提示するだけでなく、作業者がより少ない量のＢＰＬを扱うことも可能にする。ＵＶ照射は、ＢＰＬ処理直後に、または後に、該ＢＰＬ処理後に行われるさらなる精製ステップ後に行ってもよい。
【００５９】
不活性化後、得られたウイルスはさらに精製してよい。従って、遠心および／またはろ過による清澄化、ＢＰＬ処理による不活性化、限外ろ過による濃縮およびＵＶ照射に連続的に供された、インフルエンザウイルスを含有する細胞培養培地を、さらにショ糖勾配超遠心に供してもよい。
【００６０】
あるいは、本発明の不活性化ステップは、精製過程の後期に行ってもよい。例えば、ウイルス回収物は、遠心によって予め清澄化され、微小ろ過によって清澄化され、限外ろ過および濃縮に供され、そしてショ糖勾配超遠心に供される。次いで、ショ糖勾配超遠心から回収されたウイルスを含有する画分全てを不活性化に供する。一実施形態では、まず５０〜２００Ｊ／ｍ２の範囲のＵＶ照射を画分に対して行い、次いで照射された回収ウイルス画分にＢＰＬ、特にＢＰＬ０．０５％を添加する。ＢＰＬは、一晩、特に１２〜１６時間室温で置いてよい。別の実施形態では、まずＢＰＬ、特にＢＰＬ０．０５％を回収されたウイルス画分に直接添加し、室温にて少なくとも一晩置く。翌日、ＢＰＬで処理されたウイルス懸濁液をＵＶ照射、例えばＵＶ１００Ｊ／ｍ２に供してよい。回収されたウイルス画分中に存在する残存ショ糖は、ウイルスに対する公知の安定化効果のため、ウイルスを不活性化する際にＢＰＬの有効性に影響を与え得るが、本発明者らは、驚くべきことに、不活性化されるウイルスを含有する液体中に残存するショ糖は、たとえあったとしても、ＢＰＬによって生じる不活性化効果に影響しないことを観察した。従って、ＢＰＬ処理およびＵＶ照射の組み合わせに基づく本発明の不活性化法は、不活性化ステップを、ショ糖勾配超遠心ステップ直後をはじめとする、ウイルスの産生および精製の異なる段階において実施することができる点で、広く応用性がある。
【００６１】
本発明のウイルスを不活性化する方法は、また、ウイルスを産生した宿主に由来する残存混入ＤＮＡを分解するさらなるステップを伴ってもよい。例えば、ヌクレアーゼ、例えば限定されるものではないがＢｅｎｚｏｎａｓｅＴＭを用いるＤＮＡ分解ステップを、化学的不活性化およびＵＶ照射の組み合わせに加えて実施してもよい。
【００６２】
本発明の方法は、可能性としてのスプリットステップをさらに想定する。例えば、精製ステップ、例えばショ糖勾配超遠心を、ウイルススプリットステップと組み合わせることが可能であり得る。特に、スプリット剤をショ糖勾配に添加してよい。この実施形態は、単一作業内でウイルスを精製しスプリットすることを可能とするため、本発明の方法のステップの総数を最小限にすることが望ましい場合に特に好適である。従って、特定の実施形態では、少なくとも１回のショ糖勾配超遠心を行う場合、ショ糖勾配はスプリット剤をさらに含む。
【００６３】
あるいは、本発明の方法のウイルススプリットステップはバッチで行われる。
【００６４】
ウイルス、例えばインフルエンザウイルスをスプリットする方法は、当技術分野で周知である（ＷＯ０２／２８４２２）。ウイルスのスプリットは、スプリット剤の破壊濃度で、感染性（野生型もしくは弱毒型）または非感染性（不活性化）を問わない全ウイルスを破壊または断片化することによって行われる。スプリット剤は、一般に、脂質膜を分解し溶解することができる物質を含む。従来、スプリットインフルエンザウイルスは、リン酸トリ−ｎ−ブチル、またはＴｗｅｅｎＴＭと組み合わせたジエチルエーテル（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリットとして知られる）などの溶剤／界面活性剤処理を使用して産生され、この過程は依然として一部の製造設備で使用されている。現在用いられている他のスプリット剤としては、界面活性剤またはタンパク質分解酵素または胆汁塩、例えばデオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。スプリット剤として使用することができる界面活性剤としては、陽イオン性界面活性剤、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、他のイオン性界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、タウロデオキシコール酸塩、または非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎＴＭもしくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、または任意の２種もしくはそれ以上の界面活性剤の組み合わせが挙げられる。
【００６５】
一実施形態では、スプリット剤はデオキシコール酸塩である。別の実施形態では、スプリット剤はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、好適には、０．５％〜３％、特に１％〜２％の範囲の濃度で使用される。さらなる実施形態では、本発明の方法はスプリット剤としてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびラウリル硫酸ナトリウムの組み合わせを使用する。特別な実施形態では、任意の順のＢＰＬ処理およびＵＶ照射後、ウイルスを含有する液体、例えばインフルエンザウイルスを含有する液体は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、特にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ２％を用いてバッチでスプリットされる。
【００６６】
スプリット過程はバッチの、連続的なまたは半連続的な過程として行ってよい。バッチで行う場合、スプリットウイルスは、界面活性剤を除去するためのさらなる精製ステップ、例えばクロマトグラフィーステップを必要とし得る。
【００６７】
一実施形態では、ウイルス回収物は、遠心および／またはろ過によって清澄化され、場合により限外ろ過によって濃縮され、ショ糖勾配超遠心ステップによって精製され、任意の順のＢＰＬ処理およびＵＶ照射ステップによって連続的に不活性化され、そして不活性化されたウイルス液は界面活性剤、好適にはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加することによってバッチでスプリットされる。
【００６８】
ワクチンをはじめとする本発明の免疫原性組成物は、場合により、ワクチンに慣用的な添加物、特に組成物を受容する患者において誘発される免疫応答を増強する物質、すなわちいわゆるアジュバントを含有することができる。
【００６９】
一実施形態では、免疫原性組成物は、本発明によって得られるウイルスまたはそのウイルス抗原を好適な医薬担体と混合して含む。特別な実施形態では、それらはさらにアジュバントを含む。
【００７０】
アジュバント組成物は、代謝可能な油および乳化剤を含む水中油型乳剤を含んでよい。任意の水中油型組成物がヒト投与に適したものであるために、乳剤系の油相は代謝可能な油を含まなければならない。代謝可能な油という用語の意味は当技術分野で周知である。代謝可能とは、「代謝によって変換されることができる」と定義することができる（Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，第２５版（１９７４））。油は、受容者に毒性ではなく、代謝によって変換されることができる、植物油、魚油、動物油または合成油であってよい。木の実、種子、および穀粒は、植物油の一般的な原料である。合成油も本発明の一部であり、市販の油、例えばＮＥＯＢＥＥ（登録商標）およびその他のものを含み得る。
【００７１】
特に好適な代謝可能な油はスクアレンである。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、サメ肝油に大量に、そしてオリーブ油、小麦胚種油、ぬか油、および酵母に少量見られる不飽和油であり、本発明での使用に特に好ましい油である。スクアレンはコレステロールの生合成における中間体であるという事実を理由として代謝可能な油である（Ｍｅｒｃｋ  ｉｎｄｅｘ，第１０版，エントリー番号８６１９）。本発明のさらなる実施形態では、代謝可能な油は、組成物の全量の０．５％〜１０％（ｖ／ｖ）の量で免疫原性組成物中に存在する。
【００７２】
水中油型乳剤は乳化剤をさらに含む。乳化剤は好適にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンであってよい。さらに該乳化剤は、好適には、ワクチンまたは免疫原性組成物中に組成物の全量の０．１２５〜４％（ｖ／ｖ）存在する。
【００７３】
本発明の水中油型乳剤は、場合によりトコール（ｔｏｃｏｌ）を含む。トコールは当技術分野で周知であり、ＥＰ０３８２２７１に記載されている。好適には、トコールはα−トコフェロールまたはその誘導体、例えばα−トコフェロールスクシネート（ビタミンＥスクシネートとしても知られる）であってよい。該トコールは、好適には、免疫原性組成物の全量の０．２５％〜１０％（ｖ／ｖ）の量でアジュバント組成物中に存在する。
【００７４】
水中油型乳剤の製造方法は当業者に周知である。一般に、その方法は、油相（場合によりトコールを含む）を界面活性剤、例えばＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０ＴＭ溶液と混合し、続いてホモジナイザーを使ってホモジナイズすることを含み、混合物をシリンジ針に２回通過させることを含む方法が、少量の液体をホモジナイズするのに適していることは、当業者に明らかであろう。同様に、当業者は、マイクロフルイダイザー（Ｍ１１０Ｓマイクロフルイディクス装置、６ｂａｒの最大入力圧力で２分間に最大５０回の通過（約８５０ｂａｒの出力圧力））中の乳化過程を、より少量またはより大量の乳剤を製造するために適合させることができる。適合化は、必要とする直径の油滴を有する調製物が得られるまで生成された乳剤を測定することを含む、通常の実験によって達成することができる。
【００７５】
水中油型乳剤では、油と乳化剤は水性担体中にある。水性担体は、例えばリン酸緩衝生理食塩水であってよい。
【００７６】
特に、本発明の水中油型乳剤系は、サブミクロン範囲の小さな油滴サイズを有する。好適には、液滴サイズは直径１２０〜７５０ｎｍの範囲にあり、より特定的には１２０〜６００ｎｍのサイズである。さらにより特定的には、水中油型乳剤は、強度により少なくとも７０％が直径５００ｎｍ未満であり、より特定的には強度により少なくとも８０％が直径３００ｎｍ未満であり、さらに特定的には強度により少なくとも９０％が直径１２０〜２００ｎｍの範囲にある油滴を含有する。
【００７７】
油滴サイズ、すなわち直径は、本発明では強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）によって与えられる。油滴サイズの直径を強度によって測定するいくつかの方法がある。強度は定寸装置の使用によって、好適には動的光散乱、例えばＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ４０００または好適にはＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ３０００ＨＳによって測定される。詳細な手順は実施例ＩＩ．２に与えられる。最初の可能性は動的光散乱（ＰＣＳ−光子相関分光法）によってｚ平均直径ＺＡＤを測定することである；この方法はさらに多分散指数（ＰＤＩ）を与え、ＺＡＤおよびＰＤＩの両者はキュムラントアルゴリズムを用いて計算される。これらの値は粒子屈折率の知識を必要としない。第二の方法は、別のアルゴリズム、コンチン（Ｃｏｎｔｉｎ）、またはＮＮＬＳ、または自動的「Ｍａｌｖｅｒｎ」のもの（定寸装置によって提供されるデフォルトアルゴリズム）によって、全粒子サイズ分布を測定することによって油滴の直径を計算することである。大抵の場合、複合組成物の粒子屈折率は未知であるため、強度分布のみが考慮され、必要であればこの分布に由来する強度平均が考慮される。
【００７８】
アジュバント組成物はＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４アゴニストをさらに含んでよい。「ＴＬＲ４アゴニスト」によって、直接のリガンドとして、または間接的に内因性もしくは外因性リガンドの生成を介して、ＴＬＲ４シグナル伝達経路を介したシグナル伝達応答を引き起こすことができる成分が意味される（Ｓａｂｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ，ＪＩ  ２００３  ｐ１６３０−５）。ＴＬＲ４はリピドＡ誘導体、特にモノホスホリルリピドＡまたはより特定的には３脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）であってよい。
【００７９】
３Ｄ−ＭＰＬは商標ＭＰＬ（登録商標）としてＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ北米から入手可能であり、ＩＦＮ−ｇ（Ｔｈ１）表現型を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を主に促進する。それはＧＢ  ２  ２２０  ２１１  Ａに開示される方法によって製造することができる。化学的には、それは３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡと３，４，５または６アシル化鎖との混合物である。特に、本発明のアジュバント組成物中では、小粒子３Ｄ−ＭＰＬが使用される。小粒子３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍフィルターを通して滅菌ろ過され得る粒子サイズを有する。そのような調製物は国際特許出願第ＷＯ９４／２１２９２号に記載される。リピドＡの合成誘導体は公知であり、ＴＬＲ４アゴニストであると考えられており、限定されるものではないが、以下を含む：
ＯＭ１７４  （２−デオキシ−６−ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ］−４−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルリン酸二水素）、（ＷＯ９５／１４０２６）
ＯＭ２９４  ＤＰ  （３Ｓ，９Ｒ）−３−−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１，１０−ビス（リン酸二水素）（ＷＯ９９／６４３０１およびＷＯ００／０４６２）
ＯＭ１９７  ＭＰ−Ａｃ  ＤＰ  （３Ｓ−，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１−リン酸二水素１０−（６−アミノヘキサン酸）（ＷＯ０１／４６１２７）
【００８０】
使用され得る他のＴＬＲ４リガンドは、アルキルグルコサミニドホスフェート類（ＡＧＰ）、例えばＷＯ９８５０３９９もしくはＵＳ６３０３３４７（ＡＧＰの製造方法も開示されている）に開示されているもの、またはＵＳ６７６４８４０に開示されているような製薬上許容可能なＡＧＰの塩である。一部のＡＧＰはＴＬＲ４アゴニストであり、一部はＴＬＲ４アンタゴニストである。両者はアジュバントとして有用であると考えられる。加えて、さらに好適なＴＬＲ４アゴニストがＵＳ２００３／０１５３５３２およびＵＳ２２０５／０１６４９８８に開示されている。
【００８１】
本発明はインフルエンザウイルス免疫原性組成物、例えばワクチンを製造するのに特に適する。インフルエンザウイルスの様々な形態が現在入手可能である。それらは一般に生ウイルスまたは不活性化ウイルスのいずれかに基づく。不活性化されたワクチンは全ビリオン、スプリットビリオンまたは精製された表面抗原（ＨＡを含む）に基づいてよい。インフルエンザ抗原は、また、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ、核酸不含ウイルス様リポソーム粒子）の形態で提示することもできる。
【００８２】
ワクチンに使用されるインフルエンザウイルス株はシーズン毎に変化する。現在の流行間期には、ワクチンは典型的には２種のＡ型インフルエンザ株および１種のＢ型インフルエンザ株を含む。３価ワクチンが典型的であるが、より高価数、例えば４価も本発明で想定される。本発明は、また、流行株由来のＨＡ（すなわちワクチン受容者および一般ヒト集団に免疫がない株）を使用してもよく、および流行株に対するインフルエンザワクチンは１価であってよく、または流行株が補充された通常の３価ワクチンに基づいてもよい。
【００８３】
本発明の組成物は、Ａ型インフルエンザウイルスおよび／またはＢ型インフルエンザウイルスをはじめとする、１種またはそれ以上のインフルエンザウイルス株に由来する抗原を含んでよい。特に、２種のＡ型インフルエンザウイルス株および１種のＢ型インフルエンザウイルス株に由来する抗原を含む３価ワクチンが本発明によって想定される。
【００８４】
本発明の組成物は、１価組成物、すなわち１株タイプのみ、すなわち季節性株のみまたは流行株のみを含むものに限定されない。本発明は、また、季節性株および／または流行株の組み合わせを含む多価組成物を包含する。特に、３種の季節性株および１種の流行株を含む、アジュバント添加されていてよい、４価組成物が本発明の範囲内にある。本発明の範囲内にある他の組成物は、２種のＡ型株および１種のＢ型株、例えばＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＢ型株を含む３価組成物、ならびに異なる系統の２種のＡ型株および２種のＢ型株、例えばＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ／ＶｉｃｔｏｒｉａおよびＢ／Ｙａｍａｇａｔａを含む４価組成物である。
【００８５】
ＨＡは、現在の不活性化インフルエンザワクチンにおいて主要な免疫原であり、ワクチン用量は、ＳＲＤによって典型的に測定されるＨＡレベルを基準に標準化される。既存のワクチンは、典型的には、株あたり約１５μｇのＨＡを含有するが、例えば子供には、または流行状況では、またはアジュバントを使用する場合には、より低用量を使用することができる。部分用量、例えば半分（すなわち株あたり７．５μｇＨＡ）または４分の１が使用されており、より高用量、特に３×または９×用量が使用されている。従って、本発明の免疫原性組成物は、インフルエンザ株あたり０．１〜１５０μｇのＨＡ、特に０．１〜５０μｇ、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ等を含んでよい。特定の用量としては、株あたり約１５、約１０、約７．５、および約５μｇが挙げられる。
【００８６】
ＨＡは、現在の不活性化インフルエンザワクチンにおいて主要な免疫原であり、ワクチン用量は、ＳＲＤによって典型的に測定されるＨＡレベルを基準に標準化される。既存のワクチンは、典型的には、株あたり約１５μｇのＨＡを含有するが、例えば子供には、または流行状況では、またはアジュバントを使用する場合には、より低用量を使用することができる。部分用量、例えば半分（すなわち株あたり７．５μｇＨＡ）または４分の１が使用されており、より高用量、特に３×または９×用量が使用されている。従って、本発明の免疫原性組成物は、インフルエンザ株あたり０．１〜１５０μｇのＨＡ、特に０．１〜５０μｇ、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ等を含んでよい。特定の用量としては、株あたり約１５、約１０、約７．５、約５μｇ、株あたり約３．８μｇおよび株あたり約１．９μｇが挙げられる。
【００８７】
特定の株についてインフルエンザウイルスが精製されたら、他の株由来のウイルスと組み合わせて、例えば上記のような３価ワクチンを作製してよい。各株を別個に処理し、１価のバルクを混合して最終的な多価混合物を与えることが、ウイルスを混合しＤＮＡを分解して多価混合物から精製するより、好適である。
【００８８】
以下の非限定的な実施例を参照することにより本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００８９】
ＭＤＣＫ細胞で産生されたインフルエンザウイルスの、ＢＰＬによって誘導される不活性化（ＮＣＰ１２４−ニューカレドニアＡ株、ＮＣＰ１２７−ニューカレドニアＡ株、ＪＰ１２５−江蘇Ｂ株、ＪＰ１２８−江蘇Ｂ株、ＮＣＰ１３４−ニューカレドニアＡ株、およびＪＰ１２９−江蘇Ｂ株）
ＭＤＣＫ接着細胞を３６．５℃にてかん流培養様式で微小担体上で増殖させた。増殖相の後、適切な細胞密度に達したら（４．５×１０６細胞／ｍｌ〜７．５×１０６細胞／ｍｌ）、かん流様式で細胞に様々なインフルエンザウイルス株を接種し（１×１０−５の感染多重度）、温度を３３℃に変化させた。数日後ウイルスをかん流によって回収した。かん流回収物をプールし、全ウイルス回収物を以下のようにした。
【００９０】
ａ）以下の公称孔隙率：５μｍ−０．５μｍ−０．２μｍを有する３種の異なるデプスフィルター（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒ）から構成されるろ過列（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｔｒａｉｎ）上で清澄化した。実験ＮＣＰ１２７では、ウイルス回収物にＴｗｅｅｎ８０を最終濃度０．０２％で清澄化前に添加した。
【００９１】
ｂ）次いで、清澄化した回収物を、７５０ｋＤ中空繊維膜を用いた限外ろ過によって１０倍（ＮＣＰ１２４）、２０倍（ＪＰ１２８）、または３０倍（ＮＣＰ１２７、ＪＰ１２５、ＮＣＰ１３４およびＪＰ１２９）に濃縮し、約２リットルの最終容量を得て、１２５ｍＭクエン酸および０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する５容のＰＢＳに対して、および４容の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１μＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に対して透析ろ過した。
【００９２】
ｃ）保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を限外ろ過系から取り出し、水浴中で３７℃に温めた。ＢｅｎｚｏｎａｓｅＴＭ（Ｍｅｒｃｋ）を最終濃度１００ユニット／ｍｌ（ＮＣＰ１２４）、２００ユニット／ｍｌ（ＪＰ１２５、ＮＣＰ１３４およびＪＰ１２９）または１３５ユニット／ｍｌ（ＮＣＰ１２７およびＪＰ１２８）で保持液に添加することによってＤＮＡ分解を行い、混合物を３７℃にて１時間インキュベートした。
【００９３】
ｄ）実験ＪＰ１２８およびＪＰ１２９においてのみ、ＢｅｎｚｏｎａｓｅＴＭ処理した保持液を１０００ｂａｒで高圧ホモジナイゼーションによってホモジナイズした。
【００９４】
ｅ）次いで、限外ろ過保持液（ホモジナイズされているか否かを問わず）を、ウイルスおよび混入物がそれぞれの密度に到達するまで勾配中に移動する、ショ糖勾配（０〜５５％）超遠心に供した。勾配上に全保持液をロードした後、６０分のバンディング（ｂａｎｄｉｎｇ）時間で、大部分のウイルスが勾配内のそれぞれの密度に到達することができた。ウイルス粒子は数画分内に濃縮された。生成物画分は１２５ｍＭクエン酸およびショ糖を含有するＰＢＳ  ｐＨ７．４中である。精製された全ビリオン（Ｗｈｏｌｅ  ｖｉｒｉｏｎ）を約２６〜５１％の範囲にあるショ糖割合からプールした。この範囲はＳＤＳ−ＰＡＧＥの、および抗ＨＡおよび抗ＭＤＣＫ抗体を用いるウエスタンブロット解析のプロファイルに基づいて決定されている。全ビリオンをプールした画分を４℃〜８℃の範囲の温度で保存した。
【００９５】
ｆ）ウイルスをさらに精製するために、第二ショ糖勾配（５〜５５％）超遠心を行い、同時にウイルスをスプリット（ｓｐｌｉｔ）する。２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００−０．５ｍＭ  α−トコフェリル水素スクシネート（ＮＣＰ１２７、ＪＰ１２５、ＪＰ１２８、ＮＣＰ１３４およびＪＰ１２９）または１．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００−１％ラウロイルサルコシンナトリウム−０．５ｍＭ  α−トコフェリル水素スクシネート（ＮＣＰ１２４）をショ糖層に添加し、界面活性剤ミセル障壁を形成させた。この界面活性剤障壁に進入する全ウイルス（Ｗｈｏｌｅ  ｖｉｒｕｓ）はスプリットされた。ウイルス膜タンパク質赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含有するウイルス断片は、ミセル密度に移動した。残存するビリオン、宿主細胞タンパク質混入物の一部およびＤＮＡは、ウイルスタンパク質がプールされないより高いショ糖濃度画分に移動した。約１３〜５５％ショ糖の範囲の画分に存在するウイルスタンパク質をプールした。この範囲はＳＤＳ−ＰＡＧＥの、および抗ＨＡおよび抗ＭＤＣＫ抗体を用いるウエスタンブロット解析のプロファイルに基づいて決定されている。ウイルスタンパク質を含有する画分プールはＰＢＳ  ｐＨ７．４中であった。次いで、このプールを総タンパク質含量についてアッセイし、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０−０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００−α−トコフェリル水素スクシネート０．１ｍＭを含有するＰＢＳ  ｐＨ７．４で２５０μｇタンパク質／ｍｌに希釈した。
【００９６】
ＢＰＬを用いたウイルス不活性化の少なくとも１つのステップを、上記過程中に、以下のように行った：
−実験ＮＣＰ１２４では、ステップａ）の清澄化後に、ＢＰＬを様々な濃度：０．０２、０．０４、０．０５、０．０６および０．１％で添加し、４℃で一晩インキュベートした。
【００９７】
−実験ＪＰ１２５では、ステップｄ）の第一ショ糖勾配超遠心後に、回収しプールした全ビリオンを含有する画分にＢＰＬを０．１％の濃度で添加し、４℃で一晩インキュベートした。
【００９８】
−実験ＮＣＰ１２７では、ステップｂ）で得られた保持液をステップｃ）でＢｅｎｚｏｎａｓｅＴＭとインキュベートした後に、ＢＰＬを様々な濃度：０．０２、０．０４、０．０５、０．０６、０．０８および０．１％で添加し、４℃で一晩インキュベートした。  −実験ＪＰ１２８では、様々な濃度：０．０５、０．０４、０．０３、０．０２および０．１％を使用したことを除いて、ＪＰ１２５と同じ条件でＢＰＬを添加した。
【００９９】
−実験ＪＰ１２９では、使用した濃度が：０．０３、０．０４および０．０５％であったことを除いて、ＮＣＰ１２７と同じ条件でＢＰＬを添加した。
【０１００】
−実験ＮＣＰ１３４では、使用した濃度が０．０５％および０．１％であったことを除いて、ＮＣＰ１２７と同じ条件でＢＰＬを添加し、インキュベーションは室温（ＲＴ）で一晩であった。
【０１０１】
ウイルス不活性化を、ＴＣＩＤ５０アッセイ（組織培養感染量）によってウイルス力価を測定することによって評価した。ＢＰＬ不活性化の有効性を評価するために、一晩インキュベーションの終わりに、各実験における各ＢＰＬ条件からサンプルを回収し、感染性を試験した。試験対象のサンプルの一連の連続希釈を行う。各希釈の５０μｌをＭＤＣＫ細胞を含有する９６ウェルマイクロプレートに１０箇所反復して（ｉｎ  １０  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）接種し、８個の希釈を各試験対象サンプルについて接種する。次いで、ウイルスがもし感染性なら細胞内で複製することができるように、プレートを３５℃で５〜７日間インキュベートする。細胞内の感染性ウイルスの存在は、顕微鏡によって細胞上の細胞変性作用（ＣＰＥ）をモニターすることによって検出される。感染性ウイルスの懸濁液を細胞の感受性を実証するための陽性対照として使用し、非接種培養物を陰性対照として使用する。ＣＰＥが検出されるウェルの数を、感染した細胞として各希釈についてスコアし、ウイルス力価をＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ，Ｌ．Ｊ．およびＭｕｅｎｃｈ，Ｈ．，１９３８，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｙｇｉｅｎｅ  ２７：４９３−４９７）に従って計算する。得られた結果を表１に表し、ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表す。ＢＰＬを添加しなかった対照（０）は、何らかの精製ステップを経る前の、表示されたウイルス回収物から回収されたサンプル中で評価される力価に相当する。
【表１】
2013529897.tif 000002
【０１０２】
結果−結論
表１は、ＢＰＬが、ウイルス液に添加された場合、ＢＰＬを添加しなかった対照と比較して、ウイルスを不活性化するのに有効であることを示す。使用した大部分のＢＰＬ濃度は、アッセイの定量の限界と同じまたはそれ未満のウイルス力価をもたらし、ＢＰＬを添加しなかった対照と比較して、約８  ｌｏｇのウイルス力価低減の達成を可能にする。ＢＰＬの不活性化効果はインキュベーション温度（４℃またはＲＴ）に関わらず観察される。いくつかの実験では、一部のウイルス力価が約４〜約８の範囲であり、ウイルス力価低減が２〜６  ｌｏｇであり、残存する感染性が観察された。
【実施例２】
【０１０３】
ＭＤＣＫ細胞で産生されたインフルエンザウイルスの、ＵＶによって誘導される不活性化（ＪＰ１２８−江蘇Ｂ株）
ＪＰ１２８の実験細胞培養条件は実施例１に記載されたとおりであった。ウイルス回収物を実施例１のステップａ）に記載されるように清澄化した。清澄化後、ウイルスの清澄化された回収物を様々な線量のＵＶ：２００、３００、および４００に供した。ＵＶ照射を、ＵＶ−Ｃ２５４ｎｍ低圧水銀ランプを含むＢａｙｅｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ＳｅｒｖｉｃｅｓのＵＶｉｖａｔｅｃＴＭ  Ｌａｂデバイスを用いて製造業者の推奨に従って行った。ＵＶ線量またはフルエンシーは、ランプ強度の、および２５４ｎｍで測定される照射対象サンプルの光学密度（ＯＤ）の関数である。２５４ｎｍにおけるＯＤの値を、所望のフルエンシーの値と同様に、該フルエンシーを達成するのに必要な流速を計算するために、Ｂａｙｅｒによって提供されるＭａｓｔｅｒ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎシートに挿入する。表２は、実験ＪＰ１２８でＵＶｉｖａｔｅｃＴＭ  Ｌａｂデバイスを用いたＵＶ照射に使用されるパラメーターを示す。
【表２】
2013529897.tif 000003
【０１０４】
サンプルを様々なＵＶ線量照射に供した後、ウイルス不活性化を、実施例１に記載されるように、ＴＣＩＤ５０アッセイによってウイルス力価を測定することによって評価した。ウイルス液の初期力価を得るために、清澄化された回収物、すなわち照射前（フルエンシー０）について、および照射後のウイルス液の残存力価を得るために、ＵＶ照射後に、測定を行った。ＵＶ不活性化効果は、上記初期力価から上記残存力価を減算することにある、ＬＶＲ（Ｌｏｇウイルス低減）の計算によって表される。結果を表３に表示する。ＵＶ処理がウイルス抗原性に影響を及ぼすか評価するために、各ＵＶ処理後、ＳＲＤによってＨＡ濃度も測定した。
【表３】
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【０１０５】
結果−結論
表３は、ＳＲＤによって測定されるＨＡが、試験したＵＶ線量のいずれによっても影響を受けなかったことを示す。５．４  ｌｏｇのウイルス力価の低減が２００Ｊ／ｍ２の低フルエンシーについて観察された。試験したＵＶ線量のいずれも定量アッセイと同じまたはそれ未満のウイルス力価をもたらさなかったが、このことは、ＵＶ照射後に残存感染性が持続することを示唆する。
【０１０６】
−ＨＡ含量を測定するために用いられるＳＲＤ法
ガラスプレート（１２．４−１０ｃｍ）を、ＮＩＢＳＣによって推奨される濃度の抗インフルエンザＨＡ血清を含有するアガロースゲルで被覆した。ゲルが固化した後、７２個のサンプルウェル（３ｍｍ直径）をアガロースに開けた。標準およびサンプルについて１０μｌの適切な希釈物をウェルにロードした。プレートを湿式チャンバー内で室温（２０〜２５℃）にて２４時間インキュベートした。その後、プレートをＮａＣｌ溶液に一晩浸し、蒸留水中で短く洗浄した。次いで、ゲルを圧縮乾燥した。完全に乾燥したら、プレートをクマシーブリリアントブルー溶液で１０分間染色し、明らかに明確な染色領域が見えるようになるまで、メタノールおよび酢酸の混合液中で２回脱染した。プレートを乾燥した後、抗原ウェルを取り囲む染色領域の直径を直角に２方向で測定した。代わりに、表面を測定する装置を使用することができる。表面に対する抗原希釈物の用量−応答曲線を構築し、結果を標準的傾斜比アッセイ法（Ｆｉｎｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．（１９５２）．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓａｙ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｑｕｏｔｅｄ  ｉｎ：Ｗｏｏｄ，ＪＭ，ｅｔ  ａｌ（１９７７）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ．５，２３７−２４７）に従って計算した。
【実施例３】
【０１０７】
ＭＤＣＫ細胞で産生されたインフルエンザウイルスの、ＢＰＬおよびＵＶの組み合わせによって誘導される不活性化（ＭＡＰ１４０−マレーシアＢ株、ＷｉＰ１４４−ウィスコンシンＡ株およびＳＯＰ１３８−ソロモンＡ株）
ＭＤＣＫ接着細胞を３６．５℃にてかん流培養様式で微小担体上で増殖させた。増殖相の後、適切な細胞密度に達したら（６×１０６細胞／ｍｌ超）、かん流様式で細胞にインフルエンザウイルス（１×１０−５の感染多重度）を接種し、温度を３３℃に変化させた。接種後５日にウイルスをかん流によって回収した。かん流回収物を実施例１のステップａ）に記載されるように清澄化した。清澄化後、ウイルス回収物をＵＶおよびＢＰＬを組み合わせた以下の不活性化処理に供した：２種の異なるＵＶ線量を試験し（２００および５００Ｊ／ｍ２）、２種のＢＰＬ濃度（０．０５％および０．１％）と全ての組み合わせで組み合わせた。
【０１０８】
ＵＶ照射を、実施例２に記載されるように、同じＵＶｉｖａｔｅｃＴＭ  Ｌａｂデバイスを用いて同じ製造業者の推奨に従って行った。ＢＰＬを４℃で一晩添加した。ＵＶおよびＢＰＬ処理は続けて行い、ＵＶ照射をＢＰＬとのインキュベーション前に行った。
【０１０９】
各不活性化処理後、以下の表に示すように、ウイルス力価を実施例１に記載されるようにＴＣＩＤ５０アッセイによって測定した。ＨＡの抗原性を、表示されるステップ後に、実施例２に記載されるようにＳＲＤアッセイによってその含量を測定することによってモニターした。結果を表４（ＳＯＰ１３８）、表５（ＭＡＰ１４０）および表６（ＷｉＰ１４４）に表示する。ＨＡ結果は、開始材料中に存在する、すなわち清澄化前のウイルス回収物中に存在する総ＨＡ量を表す対照値１００％（ＨＡの列）と、または表示されるステップを行う前に存在する総ＨＡ量（ＨＡ回復ステップの列）と、比較した割合の形式で表示される。
【表４】
2013529897.tif 000005
【０１１０】
【表５】
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【０１１１】
【表６】
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【０１１２】
結果−結論
試験した３種のインフルエンザ株について、ウイルス力価低減がＵＶ処理後に観察された。定量の限界と同じまたはそれ未満のウイルス力価を達成するように、ＢＰＬ作用によってこのウイルス低減は達成された。ＵＶおよびＢＰＬの組み合わせ処理後、ＨＡ抗原活性に大きな影響は観察されなかった。従って、物理的処理、例えばＵＶ照射、および化学的処理の組み合わせが、精製過程と並行したインフルエンザウイルス不活性化を確実なものとし、各ステップの個別の実施と比較して、より完全なウイルス不活性化の達成を可能にする。
【実施例４】
【０１１３】
ＥＢ６６（登録商標）細胞で産生されたインフルエンザウイルスの、ＢＰＬによって誘導される不活性化
４．１  ＥＢ６６（登録商標）細胞をバッチ様式にて懸濁液中で増殖させた。それらにＨ５Ｎ１を接種し、数日後、細胞培養培地を回収することによってウイルスを回収した。ウイルス回収物を、以下の公称孔隙度：５μｍ−０．５μｍ−０．２μｍを有する３種の異なるデプスフィルターから構成される一連のろ過列を使用することによって（ＥＢ６６＿２６、ＥＢ６６＿２８、ＥＢ６６＿３３およびＥＢ６６＿４２）、または４５００ｇでの遠心および０．２μｍろ過の連続的組み合わせによって（ＥＢ６６＿２９およびＥＢ６６＿３０）清澄化した。清澄化後、清澄化されたウイルス回収物を、７５０ｋＤ中空繊維フィルターを用いた限外ろ過によって１０倍に濃縮し、クエン酸１２５ｍＭを含有するＰＢＳの溶液を用いて透析ろ過した。
【０１１４】
ＢＰＬ０．０５％を室温にて一晩、限外ろ過ステップの前に添加するか（ＥＢ６６＿２６、ＥＢ６６＿２８、ＥＢ６６＿２９、ＥＢ６６＿３０およびＥＢ６６＿３１）、または限外ろ過後に、すなわち限外ろ過後に得られた保持液にＢＰＬを添加した（ＥＢ６６＿４２およびＥＢ６６＿３３）。力価を、実施例１に記載されるようにＴＣＩＤ５０アッセイによって測定した。不活性化される前のウイルス調製物の初期力価を得るために、清澄化された回収物（表７）または限外ろ過保持液（表８）について、および不活性化後のウイルス液の残存力価を得るために、ＢＰＬ処理後に、測定を行った。ＢＰＬ不活性化効果は、上記初期力価から上記残存力価を減算することにある、ＬＶＲ（Ｌｏｇウイルス低減）の計算によって表される。結果を表７および表８に表示し、それぞれ限外ろ過ステップ前または限外ろ過ステップ後に行った場合のＢＰＬの不活性化効果を表示する。ウイルス力価をｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表す。最終列は５つの異なる実験に基づく平均ＬＶＲを表示する。また、ＨＡの含量を実施例２に記載されるようにＳＲＤによって測定した。ＨＡ結果は、ＢＰＬを添加する前に存在する、すなわち清澄化された回収物中に存在する総ＨＡ量を表す対照値１００％と比較した割合の形式で表示される。
【表７】
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【０１１５】
【表８】
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【０１１６】
結果−結論
表７は、ウイルス清澄化回収物のＢＰＬによる処理が、ＢＰＬを添加しなかった対照と比較して、ウイルスを不活性化するのに有効であったことを示す。ＢＰＬ０．０５％は、アッセイの定量の限界と同じまたはそれ未満のウイルス力価をもたらし、ＢＰＬを添加しなかった対照と比較して、約５．８  ｌｏｇのＬＶＲの達成を可能にした。表８は、限外ろ過によって濃縮された後におけるウイルス清澄化回収物のＢＰＬ０．０５％による処理が、一方では、アッセイの定量の限界と同じまたはそれ未満の力価（ＥＢ６６＿４２を参照）、および他方では、定量の限界を超える力価（得られた力価が定量の限界を超えるため、感染性ウイルスの残存レベルを示すＥＢ６６＿３３を参照）を与えることを示し、それぞれ≧５．９および４．６のＬＶＲを示す。
【０１１７】
４．２  別の実験では、ＥＢ６６（登録商標）細胞にＨ５Ｎ１を接種し、数日後、細胞培養培地を回収することによってウイルスを回収した。ウイルス回収物を、８５００ｒｐｍでの遠心および０．４５μｍろ過の連続的組み合わせによって清澄化した（ＥＢ６６＿６５および６９）。次いで、清澄化されたウイルス回収物を、限外ろ過によって約１０倍に濃縮し、ＰＢＳの溶液（ＥＢ６６＿６９）またはクエン酸１２５ｍＭを含有するＰＢＳ  ｐＨ７．４の溶液を用いて透析ろ過した。次いで、限外ろ過保持液を実施例１に記載されるようにショ糖勾配（０〜５５％）超遠心に供した。次いで、全ビリオンをプールした画分に直接ＢＰＬ０．０５％を添加した。力価を、実施例１に記載されるようにＴＣＩＤ５０アッセイによって測定した。不活性化される前のウイルス液の初期力価を得るために、ＢＰＬを添加する前に、および不活性化後のウイルス調製物の残存力価を得るために、ＢＰＬ処理後に、測定を行った。ＢＰＬ不活性化効果はＬＶＲの計算によって表される。結果を表９に表示する。
【表９】
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【０１１８】
結果−結論
表９は、６  ｌｏｇを超えるＬＶＲの達成を可能にするため、ＢＰＬ０．０５％がウイルスを不活性化するのに有効であることを示す。これらの結果は、ショ糖勾配超遠心ステップ直後にＢＰＬ処理を行うことが、良い不活性化結果を提供することを示し、残存ショ糖がＢＰＬの不活性化効果に悪影響を与えないことを示唆する。これらのＢＰＬ条件で達成されるＬＶＲは表７および８で得られるものより若干高い。
【実施例５】
【０１１９】
ＥＢ６６（登録商標）細胞で産生されたインフルエンザウイルスの、ＵＶによって誘導される不活性化
ＥＢ６６（登録商標）細胞を培養し、実施例４に記載されるようにＨ５Ｎ１を感染させた。ウイルス回収物を連続的な４５００ｇでの遠心および０．２μｍフィルターのろ過によって清澄化した。次いで、ウイルス清澄化回収物を実施例４に記載されるように限外ろ過によって濃縮した。これらの実験ではＢＰＬを添加しなかった。
【０１２０】
限外ろ過後、保持液を、実施例２に記載されるように、同じＵＶｉｖａｔｅｃＴＭ  Ｌａｂデバイスを用いて同じ製造業者の推奨に従って、ある線量範囲のＵＶ照射（１００Ｊ／ｍ２、１５０Ｊ／ｍ２および２００Ｊ／ｍ２）に供した。照射後、ウイルス力価を、実施例１に記載されるようにＴＣＩＤ５０アッセイによって測定した。ウイルス液の初期力価を得るために、限外ろ過保持液から回収されたサンプルにおいてＵＶ照射前に、および不活性化後のウイルス液の残存力価を得るために、ＵＶ照射後に、測定を行った。ＵＶ不活性化効果は、上記初期力価から上記残存力価を減算することにある、ＬＶＲ（ｌｏｇウイルス低減）の計算によって表される。結果を表１０に表示する。ウイルス力価をｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表す。
【表１０】
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【０１２１】
結果−結論
表１０は、ウイルス力価がアッセイの定量の限界と同じまたはそれ未満であっため、１００〜２００Ｊ／ｍ２の範囲のＵＶ線量がＥＢ６６（登録商標）細胞で産生されたインフルエンザウイルスを不活性化するのに有効であったことを示す。
【実施例６】
【０１２２】
ＥＢ６６（登録商標）細胞で産生されたインフルエンザウイルスの、ＢＰＬおよびＵＶによって誘導される不活性化
６．１  ＥＢ６６（登録商標）細胞を培養し、実施例４に記載されるようにＨ５Ｎ１を感染させた。ウイルス回収物を連続的な１０５００ｒｐｍでの遠心および０．４５μｍフィルターの微小ろ過によって清澄化した。
【０１２３】
清澄化された回収物を、（ｉ）ＢＰＬ０．０１％処理、（ｉｉ）ＵＶ２０Ｊ／ｍ２照射、または（ｉｉｉ）ＢＰＬ０．０１％処理およびＵＶ６０Ｊ／ｍ２照射に供した。ＢＰＬ０．０１％を室温で一晩置いた。ＵＶ照射は、実施例２に記載されるように、同じＵＶｉｖａｔｅｃＴＭ  Ｌａｂデバイスを用いて同じ製造業者の推奨に従って行った。条件（ｉｉｉ）では、清澄化された回収物をまず室温にて一晩ＢＰＬ０．０１％で処理し、次いで翌日、６０Ｊ／ｍ２のＵＶ線量を照射した。ウイルス液の初期力価を得るために、ＢＰＬを添加する前またはＵＶ照射前に、および不活性化後のウイルス液の残存力価を得るために、ＢＰＬ処理および／またはＵＶ照射後に、ウイルス力価を実施例１に記載されるようにＴＣＩＤ５０アッセイによって測定した。ＢＰＬおよび／またはＵＶ不活性化効果は、上記初期力価から上記残存力価を減算することにある、ＬＶＲ（ｌｏｇウイルス低減）の計算によって表される。結果を表１１に表示する。ウイルス力価をｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表す。
【表１１】
2013529897.tif 000012
【０１２４】
結果−結論
表１１は、残存する感染性が測定されたため（ＬＶＲは２．１  ｌｏｇ）、０．０１％濃度のＢＰＬがインフルエンザウイルスを含有する清澄化回収物を部分的に不活性化することを示すが、表９は、得られた力価がアッセイの定量の限界と同じまたはそれ未満であったため、ＢＰＬ０．０５％がより完全なウイルス不活性化の達成を可能にした結果を提供した。しかし、最適より低いＢＰＬ０．０１％濃度をＵＶ６０Ｊ／ｍ２照射ステップと組み合わせると、得られた力価はアッセイの定量の限界と同じまたはそれ未満であり、このことは、物理的処理、例えばＵＶ、および化学的処理、例えばＢＰＬの組み合わせが精製過程と並行したインフルエンザウイルス不活性化を確実なものとし、効果のために使用する必要があるＢＰＬの量を制限しながら、より完全なウイルス不活性化の達成を可能にすることを示唆する。
【０１２５】
６．２  別の実験では、ＥＢ６６（登録商標）細胞を培養し、実施例４に記載されるようにＨ５Ｎ１を感染させた。ウイルス回収物を回収し、実施例４に記載されるように清澄化した。ＢＰＬ０．０５％を清澄化されたウイルス回収物に室温にて一晩添加した。次いで、ＢＰＬによって処理されたウイルス回収物を７５０ｋＤ中空繊維フィルターを用いた限外ろ過によって１０倍に濃縮し、クエン酸１２５ｍＭを含有するＰＢＳの溶液を用いて透析ろ過した。濃縮後、ＢＰＬによって処理されたウイルス回収物に２００Ｊ／ｍ２ＵＶ線量を照射した。ウイルス力価を、ウイルス液の初期力価を得るために、表示される清澄化回収物から回収されたサンプルにおいてＢＰＬを添加する前に、および不活性化後のウイルス調製物の残存力価を得るために、ＢＰＬ添加後およびＵＶ照射後に、測定した。ＢＰＬおよびＢＰＬ／ＵＶの不活性化効果は、上記初期力価から上記残存力価を減算することにある、ＬＶＲ（Ｌｏｇウイルス低減）の計算によって表される。結果を表１３に表示する。ウイルス力価をｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表す。
【表１２】
2013529897.tif 000013
【０１２６】
結果−結論
ウイルス清澄化回収物へのＢＰＬ添加および続くＵＶ照射は、このように組み合わされた処理がアッセイの定量の限界と同じまたはそれ未満であるウイルス力価をもたらすため、インフルエンザウイルスを不活性化するのに有効である。
【実施例７】
【０１２７】
ＥＢ６６（登録商標）細胞で産生されたインフルエンザウイルスの、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によって誘導される不活性化
ＥＢ６６（登録商標）細胞を培養し、実施例４に記載されるようにＨ５Ｎ１を感染させた。実施例４に記載されるように、ウイルス回収物を回収し、清澄化し、限外ろ過によって濃縮した。過程中、ＢＰＬを添加せず、ＵＶ照射も行わなかった。次いで、濃縮されたウイルス回収物を、ウイルスおよび混入物がそれぞれの密度に到達するまで勾配中に移動するショ糖勾配（０〜５５％）超遠心に供した。勾配上に全保持液をロードした後、６０分のバンディング時間で、大部分のウイルスが勾配内のそれぞれの密度に到達することができた。ウイルス粒子は数画分内に濃縮された。生成物画分は１２５ｍＭクエン酸およびショ糖を含有するＰＢＳ  ｐＨ７．４中であった。精製された全ビリオンを約３０〜４８％の範囲のショ糖の割合からプールした。この範囲は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの、および抗ＨＡおよび抗ＭＤＣＫ抗体を用いるウエスタンブロット解析のプロファイルに基づいて決定されている。次いで、全ウイルスをプールした画分を７５０ｋＤ中空繊維フィルターを用いた限外ろ過によって濃縮し、ＰＢＳの溶液を用いて透析ろ過した。
【０１２８】
ウイルスをスプリットするために、ショ糖勾配遠心後、回収しプールした全ウイルスを含有する画分に室温にてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ２％を添加した。ウイルス力価を、ウイルス液の初期力価を得るために、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加する前に、およびスプリット後のウイルス調製物の残存力価を得るために、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００添加後様々な時点（表１２に示す）に、測定した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不活性化効果は、上記初期力価から上記残存力価を減算することにある、ＬＶＲ（Ｌｏｇウイルス低減）の計算によって表される。結果を表１３に表示する。ウイルス力価をｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表す。
【表１３】
2013529897.tif 000014
【０１２９】
結果−結論
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ２％は、処理後３０分という短時間でインフルエンザウイルスを不活性化するのに有効である。３．２  ｌｏｇおよび３．８  ｌｏｇのＬＶＲが、それぞれ処理３０分後および２時間後に観察された。
【実施例８】
【０１３０】
ＥＢ６６細胞で産生されたインフルエンザウイルスのＢＰＬ、ＵＶおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によって誘導される不活性化の累積的効果
同じ過程中にＢＰＬ、ＵＶおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ステップを行う累積的効果を評価するために、個別ステップＢＰＬ、ＵＶおよびＴｒｉｔｏｎについてそれぞれ実施例４、５および７で得られたＬＶＲを合計した。結果を表１４に表示する。
【表１４】
2013529897.tif 000015
【０１３１】
結果−結論
同じ過程中の不活性化の３つの個別ステップの組み合わせ（ＢＰＬ；ＵＶおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）は、１５．２より高いＬＶＲをもたらす。
【実施例９】
【０１３２】
外来性ウイルスのＢＰＬおよびＵＶによって誘導される不活性化の累積的効果
特にワクチンに含ませるための、インフルエンザ産生のための動物細胞の使用は、ウイルス増殖および複製に適する条件下で細胞を培養することを伴う。従って、これらの条件はインフルエンザウイルス以外の病原体が細胞培養中で増殖し得る危険性を増大させ、それにより、最終ワクチン製品の外来性ウイルスの混入を引き起こす可能性がある。本発明の方法により得られたウイルス調製物を、４種のモデル外来性ウイルス：ブタ仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）およびＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に対して試験した。表示される不活性化ステップ（ＵＶまたはＢＰＬ）に進む前に、インフルエンザウイルス液に表示される外来性ウイルスを混合した。
【０１３３】
９．１  インフルエンザウイルスを実施例１に記載されるようにＭＤＣＫ細胞で産生した。ウイルス液にＭｕＬＶおよびＰＰＶを別個に混合した。ＢＰＬ０．０５％およびＢＰＬ０．１％を各混合インフルエンザウイルス調製物に室温にて一晩添加した。実施例１に記載されるように、力価をＴＣＩＤ５０アッセイによって測定した。不活性化される前のウイルス液の初期力価を得るために、ＢＰＬを添加する前に、および不活性化後のウイルス液の残存力価を得るために、ＢＰＬ処理後に、測定を行った。ＢＰＬ不活性化効果は、上記初期力価から上記残存力価を減算することにある、ＬＶＲ（Ｌｏｇウイルス低減）の計算によって表される。また独立に、ＭｕＬＶおよびＰＰＶを別個に混合したインフルエンザウイルス調製物に２００Ｊ／ｍ２ＵＶ線量を照射した。不活性化される前のウイルス調製物の初期力価を得るために、ＵＶ照射前に、および不活性化後のウイルス調製物の残存力価を得るために、ＵＶ照射後に、力価を測定した。ＢＰＬおよびＵＶ不活性化効果は、上記初期力価から上記残存力価を減算することにある、ＬＶＲ（Ｌｏｇウイルス低減）の計算によって表される。結果を表１５に表示する。ウイルス力価をｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表す。
【表１５】
2013529897.tif 000016
【０１３４】
結果−結論
ＢＰＬ処理は、試験した２種の濃度でＭｕＬＶおよびＰＰＶの両者に関してウイルス力価の低減をもたらした。また、ＵＶ処理は、ＭｕＬＶおよびＰＰＶの両者のウイルス力価の低減をもたらし、観察されたＬＶＲが８．２  ｌｏｇであったため、ＰＰＶに特に強い効果を有した。ＢＰＬおよびＵＶの組み合わせ処理は、細胞培養で産生されたインフルエンザウイルスの、もしあれば、外来性ウイルスの混入からの精製過程を、該ウイルスを不活性化することによって確実なものとする。
【０１３５】
９．２  実施例４に記載されるようにＥＢ６６（登録商標）細胞で産生されたインフルエンザウイルスに、ＰＰＶ、ＰＲＶ、ＨＡＶおよびＭｕＬＶを別個に混合した。混合後、各インフルエンザウイルス液を、表１６に示すように、ＢＰＬ０．０５％を室温にて一晩添加することによって、または２００Ｊ／ｍ２の線量をＵＶ照射することによって、不活性化した。ウイルス力価を、実施例１に記載されるようにＴＣＩＤ５０アッセイによって測定した。不活性化される前のウイルス液の初期力価を得るために、ＢＰＬを添加するか、またはＵＶを照射する前に、ならびに不活性化後のウイルス液の残存力価を得るために、ＢＰＬ処理後またはＵＶ照射後に、測定を行った。ＢＰＬおよびＵＶ不活性化効果は、上記初期力価から上記残存力価を減算することにある、ＬＶＲ（Ｌｏｇウイルス低減）の計算によって表される。結果を表１６および１７に表示する。ウイルス力価をｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表す。
【表１６】
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【０１３６】
【表１７】
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【０１３７】
結果−結論
ＢＰＬ処理は、全ての試験したウイルス、ＭｕＬＶ、ＰＰＶ、ＨＡＶおよびＰＲＶに関してウイルス力価の低減をもたらした。ＵＶ処理は、ＰＲＶ、ＰＰＶおよびＨＡＶのウイルス力価の低減をもたらし、観察されたＬＶＲが６．８  ｌｏｇであったため、ＰＰＶに特に強い効果を有した。従って、ＢＰＬおよびＵＶの組み合わせ処理は、細胞培養で産生されたインフルエンザウイルスの、もしあれば、外来性ウイルスの混入からの精製過程を、該ウイルスを不活性化することによって確実なものとする。
【手続補正書】
【提出日】平成25年1月7日(2013.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養において増殖させたオルトミクソウイルス、例えばインフルエンザウイルスを不活性化し、および／または混入している外来性物質を不活性化する方法であって、少なくとも以下のステップ：
（ａ）オルトミクソウイルスを含有する液体をアルキル化剤、例えばβ−プロピオラクトンで処理するステップ、および
（ｂ）オルトミクソウイルスを含有する液体にＵＶ光を照射するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）および（ｂ）を同時に行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
β−プロピオラクトンが０．０１％〜０．１％、または０．０３％〜０．８％、または０．０５％の濃度で使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＵＶ線量が５０〜５００Ｊ／ｍ２、もしくは１００〜４００Ｊ／ｍ２の範囲にあるか、または２００Ｊ／ｍ２であるか、または１００Ｊ／ｍ２である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのウイルス精製ステップをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ウイルス精製ステップが清澄化、限外ろ過、核酸分解、超遠心およびクロマトグラフィーからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ウイルスが清澄化によって精製される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）および（ｂ）が清澄化後に行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ウイルスがショ糖勾配超遠心によって精製される、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）および（ｂ）がショ糖勾配超遠心後に行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
スプリットステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００がスプリット剤として使用される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
スプリットステップがステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の後に行われる、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞が哺乳動物細胞、例えばＭＤＣＫ細胞、またはトリ細胞、例えばＥＢ６６（登録商標）細胞である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
外来性物質が外来性ウイルスである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
外来性ウイルスがマウス白血病ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ仮性狂犬病ウイルス、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
外来性物質がマウス白血病ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ仮性狂犬病ウイルスである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって得られたウイルスを好適な医薬担体と混合して含む、免疫原性組成物。
【請求項１９】
少なくとも、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって得られるウイルスを製薬上許容可能な担体と混合するステップを含む、ワクチンの製造方法。
【国際調査報告】
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