(57)【要約】  本発明は、細胞、組織、器官および生物レベルでの、新規なＳＬＣ４１Ａ１機能を同定する方法に関する。部分的に、それは、（ｂ）ＳＬＣ４１Ａ１関連Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体活性またはその細胞もしくは組織特異的な発現をモジュレートする、（ａ）ＳＬＣ４１Ａ１ポリペプチドに結合する分子を同定することにおいて有用な方法に関連している。したがって、本発明は、ＳＬＣ４１Ａ１変異ライブラリー、ＳＬＣ４１Ａ１特異的抗体、それらの産出および発見ならびに誘導性コンディショナルＳＬＣ４１Ａ１ノックアウトマウスモデルおよび誘導性コンディショナルノックアウトＳＬＣ４１Ａ１細胞系を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＬＣ４１Ａ１変異形の同定または産生のための変異ライブラリーであって、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質ＳＬＣ４１Ａ１が、細胞Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体であり、
ｉ）配列番号１の変異を有するタンパク質であって、配列番号１のアミノ酸の１つが、位置２１（Ｓ＞Ｎ）、２５（Ｓ＞Ｑ）、７３（Ｓ＞Ｎ）、７６（Ｓ＞Ｎ）、８０（Ｓ＞Ｎ）、８９（Ｓ＞Ｎ）、９７（Ｓ＞Ｎ）、１５８（Ｓ＞Ｎ）、３０９（Ｓ＞Ｎ）、３９４（Ｓ＞Ｎ）、４０８（Ｓ＞Ｑ）、８１（Ｔ＞Ｑ）、１６８（Ｔ＞Ｑ）、５０９（Ｔ＞Ｑ）もしくは２７８（Ｙ＞Ｎ）で置換されているタンパク質（１５の変異タンパク質）および配列番号１の変異を有する少なくとも１つのタンパク質であって、複数のこれらの置換が存在するタンパク質
または
ｉｉ）配列番号１の膜貫通ドメインの変異およびＮ−、Ｃ−末端変異体を有するタンパク質であって、配列番号１のアミノ酸２−３０、３１−６０、６１−９０、２−６０、２−９０もしくは５０４−５１３が、欠失しているタンパク質（６の変異タンパク質）
ならびに
膜通過ドメインにおいて配列番号１の変異を有するタンパク質であって、アミノ酸９６−２０５、２２５−２７９、２８６−３３７、３４８−４２７もしくは４３９−５０３が、欠失しているタンパク質（５の変異タンパク質）
および配列番号１の膜通過ドメインにおいて変異を有するタンパク質であって、アミノ酸９９−１５０、１８０−２４１、２５６−３０６、３１７−３６８、４０８−４５９もしくは４３７−５０３が、欠失しているタンパク質（６の変異タンパク質）
または
ｉｉｉ）配列番号１のロイシンジッパー（ＬＺ）変異体を有するタンパク質であって、アミノ酸４８２−５０３が、欠失しており、ならびに位置４８２（Ｌ＞Ｖ）、４８９（Ｌ＞Ｖ）、４９４（Ｌ＞Ｖ）、４９６（Ｌ＞Ｖ）、５０１（Ｌ＞Ｖ）もしくは５０３（Ｌ＞Ｖ）におけるＬＺドメインにおけるアミノ酸が、置換されているタンパク質（７の変異タンパク質）
または
ｉｖ）配列番号１の外部ループ（ＥＬ）変異体を有するタンパク質であって、アミノ酸１２８−１７９、２４７−２５４、３１０−３１５、３６９−４０５もしくは４６８−４７８が、欠失しているタンパク質（５の変異タンパク質）
を含む変異ライブラリー。
【請求項２】
トランスジェニック誘導性コンディショナルノックアウト非ヒト哺乳類であって、ゲノムが、対応するタンパク質ＳＬＣ４１Ａ１が細胞Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体であるＳＣＬ４１Ａ１遺伝子の誘導性コンディショナルノックアウトを可能にする構築物において、２つのｌｏｘＰ  ＤＮＡ配列エレメントによって隣接された配列番号４のＳＣＬ４１Ａ１遺伝子を含む構築物、を含むことを特徴とし、ならびにＣｒｅリコンビナーゼまたはリガンド依存性Ｃｒｅリコンビナーゼを発現することを特徴とする、トランスジェニック誘導性コンディショナルノックアウト非ヒト哺乳類。
【請求項３】
ゲノム中に、請求項１に記載の変異ライブラリーから選択される配列番号１の変異ヒトＳＬＣ４１Ａ１配列を有する哺乳類ベクターをさらに有する、請求項２に記載のトランスジェニック誘導性コンディショナルノックアウト非ヒト哺乳類由来の細胞。
【請求項４】
対応するタンパク質ＳＬＣ４１Ａ１が細胞Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体である、誘導性のコンディショナルにノックアウトされたＳＣＬ４１Ａ１遺伝子を有するトランスジェニック細胞系であって、ゲノム中に、請求項１に記載の変異ライブラリーから選択される配列番号１の変異ヒトＳＬＣ４１Ａ１配列を有する哺乳類ベクターを有する、トランスジェニック細胞系。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
マグネシウムイオンＭｇ２＋は、細胞、器官および生物レベルで多数の生理学的プロセスに本質的に関与する重大なエレメントである［Ｋｏｌｉｓｅｋら、２００７］。したがって、生物学的に活性のある遊離の細胞内Ｍｇ２＋濃度（［Ｍｇ２＋］ｉ）は、０．５から１．２ｍＭのその最適レベルに調整されなければならない。このプロセスにおいて、Ｍｇ２＋の膜貫通放出が、決定的に関与することが示された（Ｓｃｈｗｅｉｇｅｌら、２００６）。今までのところ、外向きに方向づけられたＭｇ−ＡＴＰアーゼの存在に関する証拠はない、しかしながら、機能的研究によって、２つの主要な流出系、すなわち陰イオン依存性機構［ＯｄｂｌｏｍおよびＨａｎｄｙ、１９９９］および推定上のＮａ＋／Ｍｇ２＋交換体［Ｓｃｈｗｅｉｇｅｌら、２００６、２００９］が、提案された。ニワトリおよびシチメンチョウ赤血球におけるその最初の報告（Ｇｕｎｔｈｅｒら、１９８４）後、細胞内Ｍｇ２＋のＮａ＋依存性流出は、心室筋細胞、血管平滑筋細胞、肝細胞、胸腺細胞、ニューロン、腎臓および胃腸上皮細胞を含めた調べられた細胞の大部分において作動することが示された（Ｋｏｌｉｓｅｋら、２００７；Ｓｃｈｗｅｉｇｅｌら、２００６）。Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体も、Ｍｇ２＋を吸収および再吸収する腸および腎臓上皮の側底膜を通過してのＭｇ２＋の放出（Ｑｕａｍｍｅ、１９８９）に関する候補機構であり、身体Ｍｇ２＋ホメオスタシス（バランス）の制御に関してそれを重要にする。ヒト疾患の成長している集積の発病へのその関与によって実証されるように（Ｋｉｍｕｒａ、２００７）、Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体の高い偏在性は、その機能的重要性を証明する。対向輸送体の妨害または調節不全は、少し例を挙げれば、原発性高血圧症、虚血性心疾患、子癇、糖尿病および嚢胞性線維症に関与するように見える（Ｋｉｓｔｅｒｓら、１９９９；Ｖｏｒｍａｎｎら、１９９２；Ｋｉｍｕｒａ、２００７；ＫｕｍｅｄａおよびＩｎａｂａ、２００７）。
【０００２】
Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体のコード遺伝子を同定するおよび／またはタンパク質構造を解析するために、今まで使用されたすべての手法、例えば高（＞１００ｍＭ）−Ｍｇ２＋耐性細胞系の確立（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００５）は、失敗した。Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体のタンパク質構造のみが、その作動および調節の様相の詳細な研究および特異的な阻害剤またはアゴニストの開発を可能にすることになる。
【０００３】
ここ数年、真核細胞Ｍｇ２＋ホメオスタシスの調節に関与するタンパク質をコードするいくつかの候補遺伝子が、特徴づけられた（［Ｓｐｏｎｄｅｒら、２０１０］において要約されている）。それらのわずかのみが、Ｍｇ２＋輸送プロセスに直接的および特異的に関与することが明白に示された。最も特徴づけられたのは、哺乳類細胞の主なＭｇ２＋流入経路であると考えられるＭｅｌａｓｔａｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰｏｔｅｎｔｉａｌファミリーのＴＲＰＭ６およびＴＲＰＭ７チャネルならびにミトコンドリア基質中へのＭｇ２＋流入を媒介するミトコンドリアチャネルＭＲＳ２（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＲＮＡ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇメンバー２）である［Ｓｃｈｍｉｔｚ、２００３；Ｋｏｌｉｓｅｋ、２００３、Ｓｃｈｌｉｎｇｍａｎｎら、２００２］。差次的遺伝子発現手法（ＧｏｙｔａｉｎおよびＱｕａｍｍｅ、２００５ａ−ｄ、Ｇｏｙｔａｉｎら、２００７）によって発見された、他の推定上のＭｇ２＋輸送体は、ＭａｇＴ１（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１）、ＡＣＤＰ２（Ａｎｃｉｅｎｔ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；サブタイプ２）、タンパク質ＮＩＰＡ１（Ｎｏｎｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  ｉｎ  Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ／Ａｎｇｅｌｍａｎ）、ＳＬＣ４１Ａ１およびＳＬＣ４１Ａ２（Ｓｏｌｕｔｅ  Ｃａｒｒｉｅｒファミリー４１；サブファミリーＡ；メンバー１および２）である。
【０００４】
ゼノパス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞、遺伝的な異種系において過剰発現した際、Ｑｕａｍｍｅのグループ［ＧｏｙｔａｉｎおよびＱｕａｍｍｅ、２００５ａ−ｄ；Ｇｏｙｔａｉｎら、２００７］は、マウス（ｍ）ＳＬＣ４１Ａ１、ｍＳＬＣ４１Ａ２、ｍＡＣＤＰ２およびｍＭａｇＴ１を、すべてイオンの流入を媒介するＭｇ２＋チャネルであるとして特徴づけた。しかしながら、ＭａｇＴ１を除外すると、輸送は、Ｍｇ２＋に非常に特異的ではなく、ヒト由来の細胞ｈＳＬＣ４１Ａ２［Ｓａｈｎｉら、２００７］、ｈＭａｇＴ１［ＺｈｏｕおよびＣｌａｐｈａｍ、２００９］およびｈＳＬＣ４１Ａ１（Ｋｏｌｉｓｅｋら、２００８）において過剰発現した場合、すべてＭｇ２＋誘起電流を誘導することに失敗した。さらに、ＨＥＫ２９３細胞におけるｈＳＬＣ４１Ａ１のｔｅｔ誘導過剰発現を使用することによって、細胞質膜に局在化しており、イオンの流出を媒介するＭｇ２＋担体としてのヒトＳＬＣ４１Ａ１に関する有力な証拠が発見された［Ｋｏｌｉｓｅｋら、２００８］。ＳＬＣ４１Ａ１は、Ｓｍｉｔｈら（１９９５）によって報告された細菌のＭｇ２＋輸送系ＭｇｔＥの膜貫通ドメインにおける特異的な領域に部分的な配列相同性［Ｗａｂａｋｋｅｎら、２００３］を有することが示された。ＭｇｔＥタンパク質が、相補性アッセイによって発見されたことおよびそれらが、ポンプ（ＭｇｔＡ、ＭｇｔＢ）またはチャネル（ＣｏｒＡ）として作動する細菌のＭｇ２＋輸送体の他の群との相同性を示さないことに注目することは興味深い。ヒト［Ｗａｂｂａｋｅｎら、２００３］およびマウス［ＧｏｙｔａｉｎおよびＱｕａｍｍｅ、２００５ｃ］ＳＬＣ４１Ａ１転写物は、心臓、脳、腎臓、肝臓、筋肉、精巣、甲状腺、リンパ球において非常に豊富であり、結腸および小腸を含めた大部分の他の組織においてより低い程度で非常に豊富であることが発見された。ＭｇｔＥの機能もＳＬＣ４１Ａ１の機能も、完全には特徴づけられていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｏｌｉｓｅｋら、２００７
【非特許文献２】Ｓｃｈｗｅｉｇｅｌら、２００６
【非特許文献３】ＯｄｂｌｏｍおよびＨａｎｄｙ、１９９９
【非特許文献４】Ｓｃｈｗｅｉｇｅｌら、２００６、２００９
【非特許文献５】Ｇｕｎｔｈｅｒら、１９８４
【非特許文献６】Ｑｕａｍｍｅ、１９８９
【非特許文献７】Ｋｉｍｕｒａ、２００７
【非特許文献８】Ｋｉｓｔｅｒｓら、１９９９
【非特許文献９】Ｖｏｒｍａｎｎら、１９９２
【非特許文献１０】ＫｕｍｅｄａおよびＩｎａｂａ、２００７
【非特許文献１１】Ｗａｔａｎａｂｅら、２００５
【非特許文献１２】Ｓｐｏｎｄｅｒら、２０１０
【非特許文献１３】Ｓｃｈｍｉｔｚ、２００３
【非特許文献１４】Ｋｏｌｉｓｅｋ、２００３
【非特許文献１５】Ｓｃｈｌｉｎｇｍａｎｎら、２００２
【非特許文献１６】ＧｏｙｔａｉｎおよびＱｕａｍｍｅ、２００５ａ−ｄ
【非特許文献１７】Ｇｏｙｔａｉｎら、２００７
【非特許文献１８】Ｓａｈｎｉら、２００７
【非特許文献１９】ＺｈｏｕおよびＣｌａｐｈａｍ、２００９
【非特許文献２０】Ｋｏｌｉｓｅｋら、２００８
【非特許文献２１】Ｓｍｉｔｈら（１９９５）
【非特許文献２２】Ｗａｂｂａｋｅｎら、２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体のコード遺伝子の同定およびタンパク質構造の保護であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
目的は、タンパク質ＳＬＣ４１Ａ１が、細胞Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体であるという知見によって解決された。タンパク質ＳＬＣ４１Ａ１が、Ｍｇ２＋放出を媒介することが立証され、その作動の様式が明らかになった。以下において、呼称配列番号１は、タンパク質ＳＬＣ４１Ａ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿７７６２５３）に関して使用され、呼称配列番号２は、根底にあるＳＬＣ４１Ａ１のｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿１７３８５４）に関して使用される。ｃＤＮＡ配列は、配列番号３において表される。配列番号４は、マウス（ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、完全なｃｄｓ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＣ１１６２８０．１、ＣＤＳ：８０２＞２３４０）由来のＳＬＣ４１Ａ１を表し、配列番号５は、関連するタンパク質配列（ムス・ムスクルス、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿７７６２９０．１）である。
【０００８】
本発明は、細胞、組織、器官および生物レベルでの、新規なＳＬＣ４１Ａ１機能を同定する方法に関する。部分的に、それは、（ｂ）ＳＬＣ４１Ａ１関連Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体活性またはその細胞もしくは組織特異的な発現をモジュレートする、（ａ）ＳＬＣ４１Ａ１ポリペプチドに結合する分子を同定することにおいて有用な方法に関連している。
【０００９】
したがって、本発明は、ＳＬＣ４１Ａ１変異ライブラリー、ＳＬＣ４１Ａ１特異的抗体およびそれらの産出ならびに誘導性コンディショナルノックアウトマウスモデルおよびコンディショナル誘導性ノックアウト細胞系を含む。
【００１０】
ＳＬＣ４１Ａ１変異ライブラリーは、配列番号１のアミノ酸配列の以下の変異クラスターｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの少なくとも１つを含む（括弧内に示されたものは、配列番号３のｃＤＮＡのトリプレット変化である。）：
【００１１】
ｉ）１つの変異ライブラリーは、配列番号１の部位特異的変異体であって、単一アミノ酸（ａａ）が、それぞれ、位置：２１Ｓ、２５Ｓ、７３Ｓ、７６Ｓ、８０Ｓ、８９Ｓ、９７Ｓ、１５８Ｓ、３０９Ｓ、３９４Ｓ、４０８Ｓ、８１Ｔ、１６８Ｔ、５０９Ｔおよび２７８Ｙにおいて置換されている変異体を含む。
【００１２】
言い換えれば、単一ａａセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）またはチロシン（Ｙ）は、配列番号１の以下の位置の１つで別のａａによって置き換えられている：
それぞれ、２１Ｓ＞Ｎ（ＴＣＴ＞ＡＡＴ）、２５Ｓ＞Ｑ（ＴＣＡ＞ＣＡＡ）、７３Ｓ＞Ｎ（ＡＧＣ＞ＡＡＣ）、７６Ｓ＞Ｎ（ＡＧＴ＞ＡＡＴ）、８０Ｓ＞Ｎ（ＡＧＣ＞ＡＡＣ）、８９Ｓ＞Ｎ（ＴＣＣ＞ＡＡＣ）、９７Ｓ＞Ｎ（ＴＣＣ＞ＡＡＣ）、１５８Ｓ＞Ｎ（ＴＣＣ＞ＡＡＣ）、３０９Ｓ＞Ｎ（ＡＧＴ＞ＡＡＴ）、３９４Ｓ＞Ｎ（ＡＧＴ＞ＡＡＴ）および４０８Ｓ＞Ｑ（ＴＣＡ＞ＣＡＡ）、８１Ｔ＞Ｑ（ＡＣＡ＞ＣＡＡ）、１６８Ｔ＞Ｑ（ＡＣＡ＞ＣＡＡ）、５０９Ｔ＞Ｑ（ＡＣＧ＞ＣＡＧ）および２７８Ｙ＞Ｎ（ＴＡＣ＞ＡＡＣ）。これらの変異の組合せ、すなわち、配列番号１の少なくとも１つの変異であって、複数（２−１５）のこれらの置換が存在する変異も含まれる。好ましくは、２−５個のａａが置き換えられており、最も好ましくは、２または３個のａａが置き換えられている。言い換えれば、クラスターｉ）の変異ライブラリーは、配列番号１の単一のａａ変異を有する１５個のペプチドおよび少なくとも１つの変異であって、複数（２−１５）のこれらの置換が存在する変異からなる。
【００１３】
ｉｉ）別の変異ライブラリーは、配列番号１の膜貫通ドメイン（ＴＭ）の変異およびＮ−、Ｃ−末端変異体を含む：
配列番号１に基づいて、アミノ酸配列のそれぞれの欠失（Δ）が、
ａ）Ｎ−末端およびＣ−末端隣接領域：それぞれ、Δａａ２−３０、Δａａ３１−６０、Δａａ６１−９０およびΔａａ２−６０、Δａａ２−９０、Δａａ５０４−５１３（６個の変異タンパク質）
ならびに
ｂ）確実性が高いＴＭ１０モデル（ＴＭＰ）の配列番号１の膜通過ドメイン：それぞれ、Δａａ９６−２０５（ＴＭ１＋ＴＭ２）；Δａａ２２５−２７９（Ｔ３＋Ｔ４）；Δａａ２８６−３３７（ＴＭ５＋ＴＭ６）；Δａａ３４８−４２７（ＴＭ７＋ＴＭ８）およびΔａａ４３９−５０３（ＴＭ９＋ＴＭ１０）（５個の変異タンパク質）
ならびに
ｃ）確実性がより低いＴＭ１１モデル（ＳＯＳＵＩ）の膜通過ドメイン：それぞれ、Δａａ９９−１５０（ＴＭ１＋ＴＭ２）；Δａａ１８０−２４１（Ｔ３＋ＴＭ４）；Δａａ２５６−３０６（ＴＭ５＋ＴＭ６）；Δａａ３１７−３６８（ＴＭ７＋Ｔ８）；Δａａ４０８−４５９（ＴＭ９＋ＴＭ１０）およびΔａａ４３７−５０３（ＴＭ１０＋ＴＭ１１）（６個の変異タンパク質）
において存在した。
全体として、クラスターｉｉ）は、１７個の変異タンパク質を含む。
【００１４】
ｉｉｉ）別の変異ライブラリーは、配列番号１のロイシンジッパー（ＬＺ）変異体を含む：
これらのＳＬＣ４１Ａ１変異体は、配列番号１に対してそれぞれ
ａ）Δａａ４８２−５０３の欠失ならびに
ｂ）それぞれ、位置４８２Ｌ＞Ｖ（ＴＴＧ＞ＧＴＧ）、４８９Ｌ＞Ｖ（ＣＴＴ＞ＧＴＴ）、４９４Ｌ＞Ｖ（ＣＴＡ＞ＧＴＡ）、４９６Ｌ＞Ｖ（ＣＴＣ＞ＧＴＣ）、５０１Ｌ＞Ｖ（ＣＴＣ＞ＧＴＣ）および５０３Ｌ＞Ｖ（ＣＴＣ＞ＧＴＣ）（７個の変異タンパク質）におけるＬＺドメインにおけるａａ置換
を含む。
【００１５】
ｉｖ）別の変異ライブラリーは、配列番号１の外部ループ（ＥＬ）変異体を含む：
これらのＳＬＣ４１Ａ１変異体は、配列番号１に対してそれぞれ、ＥＬにおけるアミノ酸配列の欠失（Δ）を含む：それぞれ、Δａａ１２８−１７９、Δａａ２４７−２５４、Δａａ３１０−３１５、Δａａ３６９−４０５およびΔａａ４６８−４７８（５個の変異タンパク質）。
【００１６】
クラスターｉ）において記載された変異は、修飾されたリン酸化パターン、したがって、担体の損なわれたまたは改変された機能を示すＳＬＣ４１Ａ１変異形の同定に有用であると考えられる。
【００１７】
膜通過ドメイン（クラスターｉｉ）における変異およびＥＬ変異（クラスターｉｖ）は、インビボでのＳＬＣ４１Ａ１のＭｇ２＋／Ｎａ＋交換（流出）機能を維持するために必要な最低限の配列配置およびＭｇ２＋結合モチーフ／Ｍｇ２＋結合部位の同定に有用であると考えられる。したがって、それらは、より活性があるＳＬＣ４１Ａ１変異形またはＳＬＣ４１Ａ１担体の損なわれた機能を有するＳＬＣ４１Ａ１変異形を産み出すのに役立つことになる。
【００１８】
ＬＺドメインは、二量体化において、したがって、担体としてのその正常な機能に必須である、ＳＬＣ４１Ａ１の複合体形成能に関して重大であることが知られている（Ｋｏｌｉｓｅｋら、２００８）。ＬＺドメイン（クラスターｉｉｉ）における変異は、変化した輸送および調節特徴ならびに／または作用の様式を有するＳＬＣ４１Ａ１変異形の産生において役立つと考えられている。
【００１９】
これらの配列のそれぞれは、本発明の部分である。好ましくは、それらは、変異クラスターｉ）からｉｖ）の１つの少なくともすべての配列を含む変異ライブラリーにおいて組み合わされる。最も好ましい実施形態は、４つすべての変異クラスターｉ）からｉｖ）を組み合わせる変異ライブラリーである。
【００２０】
変異クラスターｉ、ｉｉおよびｉｖの期待される成果は、細胞の細胞質膜におけるＳＬＣ４１Ａ１方向の最終的な確認でもある。Ｋｏｌｉｓｅｋら（２００８）によって示されるように、１０個のＴＭおよび細胞内に向けられた、Ｎ−末端とＣ−末端との両方を含む予測されたモデルが、最も可能性が高い。
【００２１】
それぞれの変異ＳＬＣ４１Ａ１挿入断片（クラスターｉ、ｉｉ、ｉｉｉおよび／またはｉｖからの）は、クローニングベクターｐＵＣ１９中にクローニングされ、選択されたクローンは、適切な挿入方向に関して制御され、検証目的のために配列決定される。構築されたライブラリーは、どちらも以下でより詳細に記載されることになる、それぞれの哺乳類発現ベクター中にサブクローニングされ、誘導性コンディショナルＳＬＣ４１Ａ１ノックアウト細胞系における機能的スクリーニングに使用されるまたはトランスジェニックコンディショナルノックアウト動物の細胞中にサブクローニングされる。
【００２２】
さらに、本発明は、一態様において、細胞Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体に対する特異的な抗体の産生および同定のための、１つまたは複数のアミノ酸が、置換、欠失または付加されており、アミノ酸レベルでの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは９８％の配列番号１との同一性を有する、アミノ酸配列配列番号１からなるタンパク質またはそのタンパク質断片の使用に関連している。
【００２３】
以下で、「少なくとも９０％の同一性」という用語は、これが、タンパク質またはＤＮＡが関係しているかどうかに関わらず、好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは９８％の同一性を含むことを常に意味する。
【００２４】
細胞Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体に対する抗体を同定する関連する方法は、
−１つまたは複数のアミノ酸が、置換、欠失または付加されており、アミノ酸レベルでの少なくとも９０％の配列番号１との同一性を有する、配列番号１を有するタンパク質またはそのタンパク質断片を、一次抗体とタンパク質またはタンパク質断片との複合体形成を可能にする条件下で一次抗体と接触させるステップおよび
−複合体を検出するステップ
を含む。
【００２５】
複合体は、好ましくは、二次抗体によって検出される。好ましい実施形態において、一次および／または二次抗体は、放射性標識、蛍光標識、酵素標識またはビオチン標識の群から選択される標識を含む。
【００２６】
本発明の別の態様は、Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体に対する抗体を同定するためのキットであって、１つまたは複数のアミノ酸が、置換、欠失または付加されており、アミノ酸レベルでの少なくとも９０％の配列番号１との同一性を有する、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのタンパク質断片を含むキットに関連している。
【００２７】
さらに、本発明は、Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を産み出すおよび作製するためにこのタンパク質を使用する方法における、１つまたは複数のアミノ酸が、置換、欠失または付加されており、アミノ酸レベルでの少なくとも９０％の配列番号１との同一性を有する、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのタンパク質断片の使用に関連している。
【００２８】
Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体に選択的に結合するいくつかの抗体が、提供された。本発明の特別な実施形態は、それぞれが、以下のエピトープ
【００２９】
【化１】
2013543486.tif 000003
の１つを特異的に認識する、７つの抗体に関連している。
これらの抗体は、存在、非存在およびまたは量の検出にならびに１つまたは複数のアミノ酸が、置換、欠失または付加されており、アミノ酸レベルでの少なくとも９０％の配列番号１との同一性を有する、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのタンパク質断片を有する、細胞Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体との相互作用に使用することができる。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルとすることができるが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００３０】
本発明の別の態様は、細胞Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体と安定なまたは一過性のタンパク質複合体を形成することができる特異的なタンパク質結合パートナーの同定のための、１つまたは複数のアミノ酸が、置換、欠失または付加されており、アミノ酸レベルでの少なくとも９０％の配列番号１との同一性を有する、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのタンパク質断片の使用に関連している。
【００３１】
Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体に関する特異的なタンパク質複合体パートナーを同定する関連する方法は、
−１つまたは複数のアミノ酸が、置換、欠失または付加されており、アミノ酸レベルでの少なくとも９０％の配列番号１との同一性を有する、アミノ酸配列配列番号１のタンパク質またはその断片を含有する細胞を、候補物質とこのタンパク質または断片との相互作用を可能にする条件下で、候補物質と接触させるステップ、
−遊離もしくは総細胞内Ｍｇ２＋濃度または細胞外Ｍｇ２＋濃度を決定するステップおよび
−決定されたＭｇ２＋濃度を、候補物質の非存在下での、遊離もしくは総細胞内Ｍｇ２＋濃度または細胞外Ｍｇ２＋濃度と比較するステップ
を含む。
【００３２】
本発明の別の態様は、Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体と安定なまたは一過性のタンパク質複合体を形成する特異的なタンパク質結合パートナーを同定するためのキットであって、１つまたは複数のアミノ酸が、置換、欠失または付加されており、アミノ酸レベルでの少なくとも９０％の配列番号１との同一性を有する、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのタンパク質断片を含むキットに関連している。
【００３３】
特に、以下に一覧表にした物質は、１つまたは複数のアミノ酸が、置換、欠失または付加されており、アミノ酸レベルでの少なくとも９０％の配列番号１との同一性を有する、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのタンパク質断片と同一である、Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体に関するタンパク質複合体パートナーとして適していると分かっている：
３−ベータ−ヒドロキシステロイド−デルタ（８），デルタ（７）−イソメラーゼ（ＯＳ＝ホモ・サピエンス（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ１５１２５）；３−ベータ−ヒドロキシステロイド−デルタ（８），デルタ（７）−イソメラーゼ  ＯＳ＝ラッタス・ノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ９ＪＪ４６）；ＡＴＰ合成酵素サブユニットａ（ＯＳ＝クリセツラス・グリセウス（Ｃｒｉｃｅｔｕｉｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ１４４１３）；ＡＴＰ合成酵素サブユニットａ（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ００８４６）；ＡＴＰ合成酵素サブユニットａ（ＯＳ＝パン・トログロデュテス（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ９Ｔ９Ｗ０）；ＡＴＰ合成酵素サブユニットａ（ＯＳ＝タキグロスス・アキュレアトゥスアキュレアトゥス（Ｔａｃｈｙｇｌｏｓｓｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ８Ｗ９Ｇ８）；Ｂ細胞受容体付随タンパク質３１（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ５１５７２）；最初期応答３相互作用タンパク質１（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ３−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ９Ｙ５Ｕ９）；ケラチノサイト付随タンパク質２（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ８Ｎ６Ｌ１）；クニッツ型プロテアーゼ阻害剤２（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｏ４３２９１）；ペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼＢ（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ２３２８４）；プロバブルなエルゴステロール生合成タンパク質２８（Ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２８）（ＯＳ＝ポンゴ・アベリイ（Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ）、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ５Ｒ５８９）；タンパク質ジスルフィド−イソメラーゼＡ６（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ１５０８４）；タンパク質ＹＩＰＦ６（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ９６ＥＣ８）；推定上の特徴づけられていないタンパク質ＣＸｏｒｆ６２（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ８Ｎ２Ａ０）；シグナルペプチダーゼ複合体サブユニット１（ＯＳ＝ポンゴ・アベリイ、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ５ＲＦ９６）；ストレス付随小胞体タンパク質１（ＯＳ＝ラッタス・ノルベギクス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ９Ｒ２Ｃ１）；トランスロコン付随タンパク質サブユニットガンマ（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ９ＵＮＬ２）；膜貫通タンパク質１４７（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ９ＢＶＫ８）；膜貫通タンパク質１４Ａ（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ９Ｙ６Ｇ１）；特徴づけられていないタンパク質Ｃ１０ｏｒｆ３５（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ９６Ｄ０５）；特徴づけられていないタンパク質Ｃ４ｏｒｆ３（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ８ＷＶＸ３）；ＵＰＦ０４１４膜貫通タンパク質Ｃ２０ｏ���ｆ３０（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ９６Ａ５７）；ＵＰＦ０４８０タンパク質Ｃ１５ｏｒｆ２４相同体（ＯＳ＝マカカ・ファスシクラリス（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ４Ｒ５Ｖ２）；およびＵＰＦ０４８０タンパク質Ｃ１５ｏｒｆ２４（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ９ＮＰＡ０）。
【００３４】
これらの中で好ましい分子は、３−ベータ−ヒドロキシステロイド−デルタ（８），デルタ（７）−イソメラーゼ（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ１５１２５）；Ｂ細胞受容体付随タンパク質３１（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ５１５７２）；ペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼ（ＯＳ＝ホモ・サピエンス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ２３２８４）およびＵＰＦ０４８０タンパク質Ｃ１５ｏｒｆ２４（ＯＳ＝マカカ・ファスシクラリス、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ４Ｒ５Ｖ２）である。
【００３５】
これらのＳＬＣ４１Ａ１複合体形成パートナーは、当技術分野でよく知られているスプリット−ユビキチン法によって、スクリーニングされ、表１において詳細に一覧表にされている。ユビキチンに基づくスプリットタンパク質センサー（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｐｌｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｎｓｏｒ）（ＵＳＰＳ）は、時間の関数として、タンパク質−タンパク質相互作用を、生細胞におけるこれらの相互作用の自然のままの部位で検出およびモニターすることを可能にする方法である。この方法に関する詳細は、ＪｏｈｎｓｓｏｎおよびＶａｒｓｈａｖｓｋｙ、１９９４において見出すことができる。
【００３６】
スクリーニングされた分子が、表１において示された一覧表においてより頻繁に出現するほど、ＳＬＣ４１Ａ１に関する結合パートナーであるそれらの能力が高い、すなわちより多くのクローンがＳＬＣ４１Ａ１との相互作用を明らかにした。表を短縮するために、複数の記載は削除され、出現（Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）の頻度のみが、数として示されている。表２において一覧表にされたシングルトンは、最も弱いパートナーである。それらは、最も強いものから最も弱いものへ体系化されている。
【００３７】
【表１】
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2013543486.tif 000005
【００３８】
別のシングルトンは、以下で表２において一覧表にされている。
【００３９】
【表２】
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2013543486.tif 000007
2013543486.tif 000008
【００４０】
したがって、本発明の別の態様は、Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体に関するタンパク質複合体パートナーとしての、したがって、その機能を調節または修飾する前記分子の使用に関連している。さらに、これらの特異的なタンパク質結合パートナーは、特に以下（表４）に言及された疾患の治療のための、治療上の適用における使用を目的とする。
【００４１】
上記の表１および２において、下線が引かれた名称は、ＤＵＡＬ膜ＳＵ−ＹＴＨスクリーン（ＤＵＡＬｍｅｍｂｒａｎｅ  ＳＵ−ＹＴＨ  ｓｃｒｅｅｎ）の大部分において発見された、高度に結合したタンパク質を示す。高度に結合したタンパク質は、シャペロン、ストレス誘導小胞体タンパク質（ｅｎｄｏｐｌａｓｍａｔｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、トランスロコン機構の構成成分ならびに膜タンパク質選別および輸送に関与するタンパク質を含む。
【００４２】
最も顕著な候補結合パートナーは、デルタ（８）−ステロールからそれらの対応するデルタ（７）−異性体への転換を触媒する酵素である、３−ベータ−ヒドロキシステロイド−デルタ（８），デルタ（７）−イソメラーゼである。スクリーニングにおいて、３−ベータ−ヒドロキシステロイド−デルタ（８），デルタ（７）−イソメラーゼが、ＳＬＣ４１Ａ１と相互作用する、２４のクローンが同定された。３−ベータ−ヒドロキシステロイド−デルタ（８），デルタ（７）−イソメラーゼにおける欠損は、Ｃｏｎｒａｄｉ−Ｈｕｎｅｒｍａｎｎ−Ｈａｐｐｌｅ症候群としても知られている、点状軟骨異形成症の原因である（Ｄｅｒｒｙら、１９９９）。同定された他の候補結合パートナーに関しては、ＳＬＣ４１Ａ１と３−ベータ−ヒドロキシステロイド−デルタ（８），デルタ（７）−イソメラーゼとの間の相互作用の性質は、知られていない。その同定は、哺乳類における妨害されたコレステロール代謝とマグネシウム不足との間のつながりを理解するのに役立つことになる。
【００４３】
１０のクローンは、ＳＬＣ４１とＢ細胞受容体付随タンパク質３１との間の相互作用を明らかにした。小胞体からＧｏｌｇｉへの膜タンパク質の順輸送における役割を果たすことが推定されている。それは、ＣＡＳＰ８媒介アポトーシスにも関与し得る。
【００４４】
３番目に強いＳＬＣ４１Ａ１結合候補は、ペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼおよびＵＰＦ０４８０タンパク質Ｃ１５ｏｒｆ２４であった。
【００４５】
１のみより多いクローンにおいて発見された、同定されたＳＬＣ４１Ａ１結合パートナーの残りは、不十分に特徴づけられたまたは特徴づけられていない膜貫通タンパク質、細胞増殖シグナルへの細胞応答の媒介に関与するタンパク質（最初期応答３相互作用タンパク質；ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および小胞体に位置するプロバブルなエルゴステロール生合成タンパク質２８、膜貫通タンパク質１４７およびｎｉｃａｌｉｎ−ｎｏｍｏ複合体のＡＰＨ−１−類似コア構成成分によって単に表される。１つの興味深い候補は、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤２である。機能的でない場合、このタンパク質は、先天性分泌性ナトリウム下痢３型（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｔｙｐｅ  ３）（ＤＩＡＲ３）または先天性ナトリウム下痢（ＣＳＤ）と名付けられた、乳児期のまれな、遺伝性の下痢を引き起こす。
【００４６】
シングルトンの中で興味深い結合パートナーは、プロバブルな低親和性銅取り込みタンパク質２（ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｌｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｐｐｅｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）、ミトコンドリア担体相同体２（知られていない溶質の輸送体）、カルシウム放出活性化カルシウムチャネルタンパク質１、亜鉛輸送体ＺＩＰ１３および小胞体に位置する糖輸送体（Ｕｎｉｐｒｏｔ）でありそうな、溶質担体ファミリー３５メンバーＢ１である。
【００４７】
ＳＬＣ４１Ａ１関連Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体活性を増加または減少させ、したがってモジュレーターと呼ばれる、さらなる物質は、表３において示されている。これらの物質は、ＳＬＣ４１Ａ１分子の構造上の構成成分との直接的な相互作用によってまたはＳＬＣ４１Ａ１タンパク質の修飾をもたらす細胞シグナルカスケードの誘導によってＳＬＣ４１Ａ１関連Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体活性をモジュレートする。したがって、これらのモジュレーターのいくつかは、ホルモンまたは細胞シグナルカスケードのエレメントである。翻訳後修飾、したがってＳＬＣ４１Ａ１関連Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体活性の調節／モジュレーションに関する主要な部位は、以下であった：
−糖鎖付加側：アミノ酸残基Ｎ−４７５
−ｃＡＭＰ依存性ＰＫリン酸化側：Ｓ−１５７、Ｓ−３０８、Ｓ−３９３、Ｔ−５０８
−ＰＫ  Ｃリン酸化側：Ｔ−８０、Ｔ−１６７、Ｔ−３８７、Ｓ−４０７
−残基Ｓ−３１７でのカゼインキナーゼＩＩモチーフ
−Ｇ−１４３でのミリストイル化配列
【００４８】
【表３】
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【００４９】
特に、イミプラミン、キニジン、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）類似体、βアドレナリンおよびα１アドレナリンアゴニスト、ならびにホルモンアンギオテンシンＩＩおよびインスリンは、強いモジュレート効果を示した。細胞外Ｎａ＋のＮ−メチル−Ｄ−グルタミン（ＮＭＤＧ）との置き換えまたは非特異的なＮａ＋／Ｍｇ２＋交換体阻害剤イミプラミンおよびキニジンの適用は、ＳＬＣ４１Ａ１媒介流出を強力に減少させることが実証された。また、ＳＬＣ４１Ａ１媒介Ｍｇ２＋流出は、ｄｂ−環状アデノシン一リン酸（ｄｂ−ｃＡＭＰ）、アドレナリン受容体アゴニストおよびホルモンアンギオテンシンＩＩによって刺激されることが発見された。対照的に、阻害効果は、インスリンの適用後に観察された。
【００５０】
細胞代謝、生存能および増殖に対するＮａ＋／Ｍｇ２＋交換体活性の重要性を考慮して、我々は、ＳＬＣ４１Ａ１が、これらのプロセスを遮断または刺激する分子を設計および／または同定するための理想的な標的を表すと考える。
したがって、上記のモジュレーター（表３）、特にイミプラミン、キニジン、ＤＩＤＳ、リドカイン、ニフェジピン、ベンザミル、ＫＢ−Ｒ７９４３、ＳＥＡ０４００、アミロリド、グルココルチコイドに関する受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト、アルドステロン、アンギオテンシンＩＩ、インスリン、グルカゴン、ＰＧＥ２およびカテコールアミン（βアドレナリンおよび／またはα１アドレナリン作用薬）、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ類似体、タウリン、ゲニステイン、カルホスチンＣ、ホルボール１２，１３−ジブチレート、Ｌ−ＮＭＡ、ＮＯＲ１、ＯＤＱ、ホルスコリン、インドメタシン、アラキドン酸、スペルミン、スペルミジン、ＰｈＴＸ−３４３、アグマチン、強心ステロイド（例えばウワバイン、ロスタフロキシン、ブファリン、オレアンドリン、マリノブファゲニン、ＵＮＢＳ−１４５０）ならびにマイトジェン（例えばボンベシン、ＥＧＦ）、より好ましくはイミプラミン、キニジン、ｃＡＭＰおよびその類似体、アドレナリンアゴニストならびにアンギオテンシンＩＩおよびインスリンの効果を模倣する分子を使用して、Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体発現細胞の機能、代謝、増殖および成長をモジュレートことができる。上記に挙げたモジュレーターは、治療薬としての使用も目的とする。
【００５１】
上記の抗体、タンパク質結合パートナーおよび上記に挙げたモジュレーターもしくはその類似体またはこれらのモジュレーターのアゴニストもしくはアンタゴニストとして働く薬剤は、患者のＮａ＋／Ｍｇ２＋交換体発現細胞を通しての増加したまたは減少したＭｇ２＋流出によって特徴づけられる状態を有する患者を治療するのに有用であると考えられる。妨害されたまたは調節不全にされたＮａ＋／Ｍｇ２＋交換体活性のかかる状態は、心血管障害、代謝および内分泌機能異常、神経疾患、癌、子癇前症、子癇、胎児発育遅延ならびに早期分娩などの様々な疾患複合において報告されてきた。
【００５２】
本発明が焦点をおいた、これらの疾患複合の中で特別な疾患は、表４において一覧表にされている。本発明が好ましくは焦点をおいた疾患は、高血圧症、虚血性心疾患、心筋梗塞、糖尿病に関連する心血管機能障害、子癇前症、子癇、糖尿病（ＩＩ型）、非インスリン依存性糖尿病、嚢胞性線維症、パーキソン病、脳卒中、前立腺癌および攻撃的行動または高いストレス感受性である。これらの疾患は、表４において印をつけられている（太字）。
【００５３】
【表４】
2013543486.tif 000013
【００５４】
表４において、疾患が、それらの病因が、Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体発現細胞を通しての増加したまたは減少したＭｇ２＋流出に関連しているという本証拠に従って上から下へ一覧表にされている。証拠の有力さは、最後の列における星印によって示されている。心血管疾患は、それらがＮａ＋／Ｍｇ２＋交換体に関連しているという最も有力な証拠を有する。したがって、心血管疾患の治療は、本発明に関して、すなわち上記で概要を述べた抗体、特別なタンパク質結合パートナーに関してまたは上記で概要を述べた特異的なモジュレーターに関して最も関連がある適用である。
【００５５】
配列番号３のヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）は、これらの疾患の遺伝子治療に、すなわち心血管疾患、代謝または内分泌機能異常、神経疾患、癌、子癇前症、子癇、胎児発達遅延および早期分娩の群からの疾患の治療に、好ましくは高血圧症、虚血性心疾患、心筋梗塞、糖尿病に関連する心機能不全、子癇前症、子癇、糖尿病（Ｉ型）、非インスリン依存性糖尿病、嚢胞性線維症（ｍｕｋｏｖｉｓｚｉｄｏｓｅ）、嚢胞性線維症（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）（ＩＩ型）、パーキソン病（ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキソン病（ｍｏｒｂｕｓ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）、脳卒中、前立腺癌および攻撃的行動または高いストレス感受性の治療に特別に役立つ。同じことが、１つまたは複数のヌクレオチドが、置き換え、欠失または付加されており、さらにヌクレオチドレベルでの少なくとも９０％の同一性を有する、配列番号３の断片にあてはまる。
【００５６】
本発明の別の態様は、ＳＣＬ４１Ａ１遺伝子が、誘導性のコンディショナルにノック可能（ノックアウト）であることを特徴とする、すなわちそれは、時間（例えば、発達の胚、若年または成体段階で）または組織特異的に（特定の器官または細胞型）、ノックアウトされることができる、ＳＬＣ４１Ａ１の機能的ノックアウトにつながる誘導性コンディショナルシステムを有する、非ヒト哺乳類、好ましくマウス、すなわち遺伝的に改変されたコンディショナルノックアウト非ヒト哺乳類に基づくモデルである。以下において、マウスが参照される、なぜならこれは、本発明による好ましい非ヒト哺乳類であるからである。
【００５７】
マウスモデルは、ＳＬＣ４１Ａ１の遺伝子配列（配列番号３、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿１７３８５４）に基づいて開発された。
【００５８】
ＳＬＣ４１Ａ１誘導性コンディショナルＫＯマウスを、１２９胚幹細胞を使用して、相同組み換えによって開発した。次いで、このマウス系統を、マウスＳＬＣ４１Ａ１の組織特異的または時間依存性の標的にされた不活性化の産出のために、Ｃｒｅリコンビナーゼ（ＣＲ）またはリガンド依存性Ｃｒｅリコンビナーゼ（ＬＣＲ）発現マウスと交雑させた。
【００５９】
ＬＣＲは、Ｃｒｅとステロイド受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）との間の融合タンパク質である。ＬＢＤは、それが、その天然リガンドに応答せず、合成リガンドに結合するように変異されている。合成薬物４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）に特異的に応答するが、β−エストラジオールには応答しない、タモキシフェン活性化ＣｒｅＥＲＴリコンビナーゼ（修飾されたパックマン（ｐａｃｍａｎ））、Ｃｒｅと変異エストロゲン受容体（ＥＲ）ＬＢＤとの融合物は、例となり得る。ＯＨＴの非存在下で、リコンビナーゼは、細胞質に位置づけられる。ＯＨＴのＬＢＤへの結合は、それが、そのｌｏｘＰ基質を組み換えることができる、核中へのリコンビナーゼのトランスロケーションをもたらす（Ｆｅｉｌ  Ｒ．、２００７）。ＬＣＲ系は、時間依存性の設定を有する実験においてだけでなく、組織特異性への要求を有する実験においても、誘導性コンディショナルＫＯマウスの産出のために広く使用されている。組織特異的にＣｒｅＥＲＴ２リコンビナーゼを発現するマウス系統は、以下に一覧表にされ、新規に開発されたコンディショナルＫＯ  ＳＬＣ４１Ａ１マウスは、特異的な実験の必要性に依存して、入手可能なＣｒｅＥＲＴ２マウス系統の１つで繁殖させることができる。
【００６０】
特異的な組織においてＣｒｅＥＲＴ２リコンビナーゼを発現するマウス系統の例：
骨（骨芽細胞Ｃｏｌ１ａ１−ＣｒｅＥＲＴ２  ｔｇ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  １  α１鎖および象牙芽細胞）
内皮（Ｔｉｅ２−ＣｒｅＥＲＴ２  ｔｇ  Ｔｉｅ２受容体チロシンキナーゼ）
上皮：
腸上皮Ｖｉｌ−ＣｒｅＥＲＴ２  ｔｇ  Ｖｉｌｌｉｎ  ｅｌ
内部上皮器官Ｋ１８−ＣｒｅＥＲＴ２  ｔｇケラチン１８
腎上皮ＫｓｐＣａｄ−ＣｒｅＥＲＴ２  ｔｇ腎臓特異的カドヘリンＬａｎｔｉｎｇａ−ｖａｎ
脂肪組織（脂肪細胞）ａＰ２−ＣｒｅＥＲＴ２  ｔｇ脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質
肝臓（肝細胞）ＳＡ−ＣｒｅＥＲＴ２  ｋｉ血清アルブミン
神経系：
星状細胞ＧＦＡＰ−ＣｒｅＥＲＴ２  ｔｇグリア線維酸性タンパク質
ＧＬＡＳＴ−ＣｒｅＥＲＴ２  ｋｉ星状細胞特異的グルタミン酸輸送体
神経幹細胞Ｎｅｓ−ＣｒｅＥＲＴ２  ｔｇネスチン
シュワン細胞およびＰＬＰ−ＣｒｅＥＲＴ２  ｔｇプロテオリピドタンパク質
乏突起膠細胞
コネキシン３２に融合したシュワン細胞Ｐ０Ｃｘ−ＣｒｅＥＲＴ２  ｔｇ  Ｐ０
皮膚：
ケラチノサイトＫ５−ＣｒｅＥＲＴ２  ｔｇケラチン５
Ｋ１４−ＣｒｅＥＲＴ２  ｔｇケラチン１４
メラニン細胞Ｔｙｒ−ＣｒｅＥＲＴ２  ｔｇチロシナーゼ
Ｔｙｒ−ＣｒｅＥＲＴ２  ｔｇチロシナーゼ
広範なＲｏｓａ２６−ＣｒｅＥＲＴ２  ｋｉ  Ｒｏｓａ２６（Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  Ｒｏｓａ２６−ＣｒｅＥＲＴ２  ｋｉ  Ｒｏｓａ２６）
筋肉：
骨格筋ＨＡＳ−ＣｒｅＥＲＴ２  ｔｇ（ＰＡＣ）骨格筋αアクチン
平滑筋ＳＭ−ＣｒｅＥＲＴ２  ｋｉ  ＳＭ２２α
【００６１】
トランスジェニックコンディショナルノックアウトマウスは、ゲノムが、ＳＣＬ４１Ａ１のコンディショナルノックアウトを可能にする構築物を含むことを特徴とする。「構築物」という用語は、動物のゲノム中に外因的に挿入されたポリヌクレオチドを表す。動物は、ノックアウト遺伝子に関してヘテロ接合性またはホモ接合性とすることができるが、好ましくはホモ接合性である（−／−）。構築物は、２つのｌｏｘＰ  ＤＮＡ配列エレメント（ｌｏｘＰ部位）によって隣接された、すなわちそれらが、好ましくはＳＣＬ４１Ａ１遺伝子の３’および５’に位置している、配列番号４（マウス遺伝子）のＳＣＬ４１Ａ１遺伝子を含む。
【００６２】
様々な組織から単離された細胞は、ＳＣＬ４１Ａ１の機能のさらなる調査を可能にする。したがって、本発明の別の態様は、トランスジェニック誘導性コンディショナルノックアウト細胞または細胞系である。細胞は、トランスジェニック誘導性コンディショナルノックアウト非ヒト哺乳類から採取することができるまたは別々の細胞系に由来することができる。
【００６３】
トランスジェニック動物由来の細胞が関係している場合、これらの動物の心臓（心筋細胞）由来、脈管構造（例えば大動脈）由来、肝臓（肝細胞）由来または脳もしくはＣＮＳ／小膠細胞由来の初代細胞培養物（プライモカルチャー（ｐｒｉｍｏｃｕｌｔｕｒｅ））を使用することが好ましい。
【００６４】
他の起源の細胞または細胞系が関係している場合、誘導性のコンディショナルにノックアウトされたＳＬＣ４１Ａ１遺伝子を有する安定なヒト細胞系、より好ましくは安定なヒト胚腎細胞系（ＡＣＣ−３０５／ＤＳＭＺ）、誘導性のコンディショナルにノックアウトされたＳＬＣ４１Ａ１遺伝子を有するＨＥＫ２９３（ｈＳＬＣ４１Ａ１−／−）または安定なヒトＢ細胞前駆体白血病細胞系（ＡＣＣ−１２８／ＤＳＭＺ）、ＮＡＬＭ−６（ｈＳＬＣ４１Ａ１−／−）を使用することが好ましい。細胞系は、Ｓｈｉｂａｈａｒａ  Ｋｅｉ−ｉｃｈｉらによって報告された技法に従って産み出されることになる。
誘導性のコンディショナルにノックアウトされたＳＬＣ４１Ａ１細胞または細胞系を産み出すために、ヒトＳＬＣ４１Ａ１の変異型を含む哺乳類のベクターは、安定なヒト細胞系のこれらのプライモカルチャーされた細胞中または安定なヒト細胞系の細胞中に導入または電気穿孔され、それらのゲノムにおいて変異ヒトＳＬＣ４１Ａ１を有する哺乳類ベクターを有する細胞をもたらす。ヒトＳＬＣ４１Ａ１の変異型は、変異ライブラリーに関して上記のとおりである、すなわちこれらの変異配列のそれぞれは、ベクターにおいて存在することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】投入培地のＭｇ２＋濃度に依存した、Ｍｇ２＋流出を示す図である。Ａ：Ｍｇ２＋を含まない、Ｎａ＋含有培地での−ｔｅｔおよび＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞の再懸濁後の［Ｍｇ２＋］ｉ変化の代表的な最初の記録。測定前に、細胞は、それらを高（１０ｍＭ）−Ｍｇ２＋溶液において２０分間インキュベートすることによってＭｇ２＋を投入された。
【図１Ｂ】投入培地のＭｇ２＋濃度に依存した、Ｍｇ２＋流出を示す図である。Ｂ：０、２、５または１０ｍＭ  Ｍｇ２＋を含有する溶液において前もって投入された−ｔｅｔおよび＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞に関する平均［Ｍｇ２＋］ｉ変化の大きさ。Ｎ＝各Ｍｇ２＋濃度に関する１０の単一の実験；＊Ｐ＜０．０１；＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２Ａ】ＳＬＣ４１Ａ１依存性Ｍｇ２＋流出に及ぼすＮＭＤＧによる細胞外Ｎａ＋の完全な置換の効果を示す図である。Ａ：Ｍｇ２＋を含まない、Ｎａ＋含有培地でのまたはＭｇ２＋およびＮａ＋を含まない培地での−ｔｅｔおよび＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞の再懸濁後の［Ｍｇ２＋］ｉ変化の代表的な最初の記録。測定前に、細胞は、それらを高（１０ｍＭ）−Ｍｇ２＋溶液において２０分間インキュベートすることによってＭｇ２＋を投入された。
【図２Ｂ】ＳＬＣ４１Ａ１依存性Ｍｇ２＋流出に及ぼすＮＭＤＧによる細胞外Ｎａ＋の完全な置換の効果を示す図である。Ｂ：Ｍｇ２＋を全く含まない培地における２０分間のインキュベーションの前および後の−ｔｅｔおよび＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞の［Ｍｇ２＋］ｉに及ぼすＮａ＋置換の効果。Ｎ＝条件当たり９の単一の実験；＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２Ｃ】ＳＬＣ４１Ａ１依存性Ｍｇ２＋流出に及ぼすＮＭＤＧによる細胞外Ｎａ＋の完全な置換の効果を示す図である。Ｃ：［Ｍｇ２＋］ｉの減少として測定されたＳＬＣ４１Ａ１依存性Ｍｇ２＋放出に及ぼすＮａ＋置換の効果。Ｎ＝９；Ｐ＜０．００１。Ｍｇ２＋
【図３Ａ】ＳＬＣ４１Ａ１依存性Ｍｇ＋流出に及ぼすイミプラミンおよびキニジンの効果を示す図である。Ａ：イミプラミン（２５０μΜ）を有するまたは有さない、Ｍｇ２＋を含まない、Ｎａ＋含有培地での＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞の再懸濁後の［Ｍｇ２＋］ｉ変化の代表的な最初の記録。測定前に、細胞は、それらを高（１０ｍＭ）−Ｍｇ２＋溶液において２０分間インキュベートすることによってＭｇ２＋を投入された。
【図３Ｂ】ＳＬＣ４１Ａ１依存性Ｍｇ＋流出に及ぼすイミプラミンおよびキニジンの効果を示す図である。Ｂ：条件当たり８の単一の測定から得られた結果の概要。＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３Ｃ】ＳＬＣ４１Ａ１依存性Ｍｇ＋流出に及ぼすイミプラミンおよびキニジンの効果を示す図である。Ｃ：Ｍｇ２＋を含まない、Ｎａ＋含有培地での＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞の再懸濁後に観察されたＭｇ２＋］ｉ変化に及ぼすキニジン（１００μΜ）の効果の概要。測定前に、細胞は、それらを高（１０ｍＭ）−Ｍｇ２＋溶液において２０分間インキュベートすることによってＭｇ２＋を投入された。Ｎ＝条件当たり３の単一の測定。
【図４】＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞における［Ｍｇ２＋］ｉ減少に及ぼすｄＢ−ｃＡＭＰの効果を示す図である。ｄＢ−ｃＡＭＰ（１００μΜ）を有さないおよび有する観察された減少した［Ｍｇ２＋］ｉが、示されている。棒は、６（０ｍＭ−投入）から１０（２ｍＭおよび１０ｍＭ−投入）までの単一の測定の平均値±ＳＥを表す。
【図５】ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞の増殖に及ぼすイミプラミン（２５０μΜ）およびｄＢ−ｃＡＭＰ（１００μＭ）の効果を示す最初のトレースである。それぞれの薬剤は、播種後２４時間で添加される。細胞指数の増加または減少は、それぞれ、より高いまたはより低い増殖速度を反映する。赤の曲線：対照；青の曲線：イミプラミン；緑の曲線＝ｄＢ−ｃＡＭＰ。
【図６】−ｔｅｔおよび＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞におけるＳＬＣ４１Ａ１依存性Ｍｇ２＋流出に及ぼすインスリンの効果を示す図である。インスリン（２００μＵ／ｍｌおよび４００μＵ／ｍｌ）を有さないまたは有する、Ｍｇ２＋を含まない、Ｎａ＋含有培地での−ｔｅｔおよび＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞の再懸濁後の［Ｍｇ２＋］ｉ変化が、示されている。測定前に、細胞は、それらを高（１０ｍＭ）−Ｍｇ２＋溶液において２０分間インキュベートすることによってＭｇ２＋を投入された。Ｎ＝条件当たり３の単一の測定。
【００６６】
以下で、本発明は、例を用いてより詳細に概説される。
【実施例】
【００６７】
材料および方法：
ＨＥＫ２９３−（ＦＬＡＧ−ＳＬＣ４１Ａ１）細胞系；成長培地および培養条件
テトラサイクリン−（ｔｅｔ）−誘導性ＨＥＫ２９３−（ＦＬＡＧ−ＳＬＣ４１Ａ１）細胞系の調製（クローニングプロトコール）および培養条件は、Ｋｏｌｉｓｅｋら［２００８］によってこれまでに報告された。
【００６８】
ウエスタンブロット分析
非誘導（−ｔｅｔ）および誘導（＋ｔｅｔ、１５−１８ｈ）ＨＥＫ２９３−（ＦＬＡＧ−ＳＬＣ４１Ａ１）細胞（１０７細胞ｍｌ−１）は、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）およびプロテアーゼ阻害剤（Ｐｅｒｂｉｏ−ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有するＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）において４℃で３０分間溶解された。総溶解物タンパク質は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解され、フッ化ポリビニリデン膜へ転写され、ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合した抗ＦＬＡＧ抗体またはＧＡＭ  ＨＲＰ連結抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）にコンジュゲートしたアクチンに対する抗体（ＡｂＣａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）で免疫装飾（ｉｍｍｕｎｏｄｅｃｏｒａｔｅ）された。同じ試料は、Ｍ２抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）またはアイソタイプ対照によって免疫沈降され、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解され、フッ化ポリビニリデン膜へ転写された。膜は、Ｍ２抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）およびＧＡＭ−＿−ＨＲＰ（ＳＢＡ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で免疫ブロットされた。膜は、増強された化学発光（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（ＥＣＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって展開された。
【００６９】
ｍａｇ−ｆｕｒａ２  ＦＦ−蛍光分析法による、＋ｔｅｔおよび−ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞における遊離の細胞内Ｍｇ２＋の決定
非誘導（−ｔｅｔ）および誘導（＋ｔｅｔ）ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞は、氷冷の、二価を全く含まないＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）で２回すすがれ、Ｈｙｔａｓｅ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用によって分離され、遠心分離され、１０ｍｍｏｌ．ｌ−１  ＨＥＰＥＳおよび１．３６ｍｍｏｌ．ｌ−１  Ｌ−グルタミン（ＣＭＦ−ＨＢＳ＋）で補われた、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を全く含まないＨａｎｋバランス溶液（ＣＭＦ−ＨＢＳ、ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｉｄｅｎｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において２回洗浄され、最後に同じ溶液に再懸濁された。７．５μｍｏｌ．ｌ−１  ｍａｇ−ｆｕｒａ２ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ  ＵＳＡ）での細胞の投入は、投入促進物Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）の存在下で３７℃で３０分間行われた。ＣＭＦ−ＨＢＳ＋において洗浄された後、細胞は、３７℃でさらに３０分間インキュベートされて、蛍光プローブの完全なエステル分解を可能にし、ＣＭＦ−ＨＢＳ＋において２回洗浄されて、細胞外ｍａｇ−ｆｕｒａ２を除去し、Ｍｇ２＋流出容量の測定前にＭｇ２＋が投入されるまで、１０ｍｍｏｌ．ｌ−１  ＨＥＰＥＳ、５ｍｍｏｌ．ｌ−１グルコースおよび０．４ｍｍｏｌ．ｌ−１  Ｍｇ２＋で補われたＣＭＦ−ＨＢＳにおいて保管された。後者は、２０分間にわたって細胞内Ｍｇ２＋濃度（［Ｍｇ２＋］ｉ）減少として決定された。流出実験の直前に、−ｔｅｔおよび＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）は、０、２、５または１０ｍｍｏｌ．ｌ−１  Ｍｇを含有するＣＭＦ−ＨＢＳ＋における２０分間のインキュベーションによってＭｇを投入された。１０ｍｍｏｌ．ｌ−１の細胞外Ｍｇ２＋濃度（［Ｍｇ２＋］ｅ）は、すべてのさらなる実験に関して選択された。投入後、残っている細胞外Ｍｇ２＋は、細胞をＣＭＦ−ＨＢＳ＋において２回洗浄することによって除去され、細胞をＣＭＦ−ＨＢＳ＋に再懸濁した後、測定が開始された。変動する細胞外［Ｎａ＋］の影響を決定するために、測定溶液は、１４５ｍＭ  Ｎａ＋を含有するＣＭＦ−ＨＢＳ＋を、適切な体積のＮａ＋およびＭｇ２＋を全く含まないＰＢＳで希釈することによって調製された。Ｍｇ２＋流出に及ぼすＨＣＯ３−の効果を調査するために、Ｍｇ投入および測定中に、Ｈａｎｋ（０．３５ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３）またはＥａｒｌ（２．２ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３）塩を有する１０ｍｍｏｌ．ｌ−１  ＨＥＰＥＳおよび１．３６ｍｍｏｌ．ｌ−１  Ｌ−グルタミン（ＣＭＦ−Ｍ１９９＋）で完成されたＣａ２＋およびＭｇ２＋を全く含まない培地１９９が、使用された。安定なｐＨ値を確実にするために、高ＨＣＯ３−培地は、９５％空気−５％ＣＯ２で前もって平衡化された。
【００７０】
測定は、撹拌下で、２ｍｌの細胞懸濁液（１０％のサイトクリット（ｃｙｔｏｃｒｉｔ）を有するＣＭＦ−ＨＢＳ＋またはＣＭＦ−Ｍ１９９＋）を含有する３ｍｌキュベットにおいて３７℃で行われた。［Ｍｇ２＋］ｉは、蛍光が、３４０および３８０ｎｍでの励起ならびに５１５ｎｍでの発光で２０ｍｓの間隔で測定されることを可能にするファストフィルターアクセサリー（ｆａｓｔ  ｆｉｌｔｅｒ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）を使用することによって、蛍光光度計（ＬＳ５０−Ｂ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ  ＵＳＡ）において、プローブ投入細胞の蛍光を測定することによって決定された。［Ｍｇ２＋］ｉ値は、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら（１９８１）の式に従って、ソフトウェアＦＬ  ＷｉｎＬａｂバージョン４．０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用することによって、３４０／３８０ｎｍ比から計算された。ｍａｇ−ｆｕｒａ２／Ｍｇ２＋複合体に関する１．５ｍｍｏｌ．ｌ−１の解離定数が、計算に使用された；最小（Ｒｍｉｎ）および最大（Ｒｍａｘ）比が、ジギトニンを使用することによって、各実験の終わりに決定された。Ｒｍａｘは、Ｃａ２＋の非存在下での２５ｍｍｏｌ．ｌ−１  ＭｇＣｌ２の添加によって見出され、他方、Ｒｍｉｎは、５０ｍｍｏｌ．ｌ−１  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２の添加によって得られ、すべてのＭｇ２＋を溶液から除去した。データ評価のために、各１０秒データセットは、測定の始め、次いで常に５０秒後に平均された。最終［Ｍｇ２＋］ｉは、測定の最後１０秒の平均［Ｍｇ２＋］ｉとして決定された。したがって、任意の所与の［Ｍｇ２＋］ｉの計算に関して、５００のデータポイントが使用された。言明されない場合、データは、平均値±標準誤差（ＳＥ）として提示されている。
【００７１】
【表５】
2013543486.tif 000014
【００７２】
【表６】
2013543486.tif 000015
【００７３】
結果
−ｔｅｔおよび＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞の［Ｍｇ２＋］ｉ
Ｍａｇ−Ｆｕｒａ２投入−ｔｅｔおよび＋ｔｅｔ（１５ｈｒ）ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞の基本［Ｍｇ２＋］ｉは、Ｍｇを全く含まないがＮａを含有する培地において同じ溶液における２０分間のプレインキュベーション後に測定された（表７）。−ｔｅｔ細胞（０．２６±０．０５ｍＭ）と比較して、テトラサイクリン誘導ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞は、６２％低い［Ｍｇ２＋］ｉ（０．１０±０．０２ｍＭ）を有した。我々の以前の結果［Ｋｏｌｉｓｅｋら、２００８］と一致して、これらのデータは、ＳＬＣ４１Ａ１を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞の増加した流出容量を指し示している。これを試験するために、Ｍｇが異なるように投入された−ｔｅｔおよび＋ｔｅｔ細胞の流出容量が、決定された。
【００７４】
Ｍｇが異なるように投入された−ｔｅｔおよび＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞における［Ｍｇ２＋］ｉ変化
［Ｍｇ２＋］ｉは、Ｍｇ２＋流出活性に影響することがよく知られているので、実験は、Ｍｇ含有溶液における実際の測定前にすべての調製および保管手順（プローブ投入を除いて）を行うことによって、ＳＬＣ４１Ａ１関連Ｍｇ２＋遊離を支持するように設計された。加えて、流出実験の直前に、−ｔｅｔおよび＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞は、２、５または１０ｍｍｏｌ．ｌ−１  Ｍｇを含有する培地における２０分間のインキュベーションによってＭｇを異なるように投入された。その後、Ｍｇ２＋流出容量は、Ｍｇを全く含まない培地において２０分間にわたって測定された［Ｍｇ２＋］ｉ減少として決定された。表６において、測定期間の始めおよび終わりに決定された［Ｍｇ２＋］ｉ値は、すべての条件に関して示されている。−ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞は、０．２５±０．０２ｍＭの安定な［Ｍｇ２＋］ｉを有し、Ｍｇ投入またはＭｇを全く含まない培地におけるインキュベーション後に、増加または減少は観察されなかったことを理解することができる。対照的に、増加する細胞外Ｍｇ２＋濃度でのプレインキュベーションは、＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞における約３から４倍の［Ｍｇ２＋］ｉの上昇を誘導した（表７）。Ｍｇ２＋を全く含まない培地に再懸濁された場合、これらの細胞は、細胞からのＭｇ２＋遊離を反映する連続的な［Ｍｇ２＋］ｉ減少（図１Ａ）を示す。投入条件（２、５または１０ｍＭ  細胞外Ｍｇ）に依存して、このＭｇ２＋流出は、それぞれの開始レベルと比較して、終点［Ｍｇ２＋］ｉの４８％、５３％および６５％の減少をもたらす（表７）。−ｔｅｔおよび＋ｔｅｔ（１５ｈｒ）ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞に関する結果は、図１Ｂにおいて要約されている。非誘導−ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞と比較して、５または１０ｍＭ  Ｍｇ２＋を前もって投入された＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞が、Ｍｇを含まない培地に再懸濁された場合、有意なＭｇ２＋放出が起こった。測定期間中の［Ｍｇ２＋］ｉ減少は、それぞれ、２、５および１０ｍＭのＭｇを前もって投入した後、２０分当たり１３３±３３、２２４±５１および２５７±４４μｍｏｌ．ｌ−１に達した（図１Ｂ）。
【００７５】
【表７】
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【００７６】
現在まで、仮定されたＮａ＋または陰イオン依存性Ｍｇ２＋流出系は、分子レベルで同定されていない。したがって、次のステップは、ＳＬＣ４１Ａ１関連Ｍｇ２＋放出の輸送特徴を定義するための実験の実行であった。
【００７７】
ｈＳＬＣ４１Ａ１からのＭｇ２＋流出は、細胞外Ｎａ＋に依存し、非特異的なＮａ＋／Ｍｇ２＋交換体阻害剤イミプラミンおよびキニジンによって阻害される。
第１に、Ｍｇ２＋放出に及ぼす細胞外［Ｎａ＋］の効果は、Ｍｇ投入（１０ｍＭ）−ｔｅｔおよび＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞で試験された。後者は、１４５ｍＭ  Ｎａ＋を含有するＭｇを全く含まない培地にまたは同じであるが有機非浸透性陽イオンＮＭＤＧによってすべてのＮａ＋が等浸透圧的に置き換えられた培地に懸濁され、［Ｍｇ２＋］ｉは、２０分間にわたって測定された（図２Ａ）。−ｔｅｔ対照細胞において、０．４５±０．０３ｍＭの安定な［Ｍｇ２＋］ｉが、決定された。対照的に、Ｎａ含有培地においてインキュベートされた＋ｔｅｔ細胞の［Ｍｇ２＋］ｉは、０．７４±０．０７から０．２９±０．０４ｍＭまで減少し、ＳＬＣ４１Ａ１関連Ｍｇ２＋放出（図２Ｂ）を実証した。このＭｇ２＋流出は、細胞外Ｎａ＋に明らかに依存していた（図２）。それは、１４５−Ｎａ＋培地における３５８±６９μΜ／２０ｍｉｎから０−Ｎａ＋ＮＭＤＧ培地における５５±２６μΜ／２０ｍｉｎまで減少し（図２Ｃ）、８２±５％の減少を反映した。これらの結果は、ＳＬＣ４１Ａ１関連Ｍｇ２＋流出のＮａ依存性機構を、明らかに指し示している。
【００７８】
したがって、我々は、Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体の知られている非特異的阻害剤の適用が、ＳＬＣ４１Ａ１媒介Ｍｇ２＋流出の変化をもたらすかどうかを次に評価した。Ｍｇ２＋投入（２０ｍｉｎ、１０ｍＭ）＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞は、それぞれ、２５０μΜイミプラミン（図３Ａ）または１００μΜキニジン（図３Ｃ）を有するまたは有さない、１４５ｍＭの［Ｎａ＋］ｅを有するＭｇ２＋を全く含まない培地においてインキュベートされ、［Ｍｇ２＋］ｉは、２０分間測定された。分子の漏れやすさ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）を補正するために、対照測定が、−ｔｅｔ細胞で行われた。図３Ａにおいて示されるように、イミプラミンの適用は、ＳＬＣ４１Ａ１関連Ｍｇ２＋流出を少なくした。データは、図３Ｂにおいて要約され、図３Ｂは、阻害剤適用が、Ｍｇ２＋流出を、６４±９％に相当する、３４１±３５から１２９±３２μＭ／２０ｍｉｎまで減少させたことを示している。図３Ｃは、ＳＬＣ４１Ａ１媒介Ｍｇ２＋流出に及ぼす１００μΜキニジンの阻害効果の要約を示している。それは、３８±７％の減少に相当する、３２７±７１μΜ／２０ｍｉｎから１７６±０．５μΜ／２０ｍｉｎまで減少した。
【００７９】
ｈＳＬＣ４１Ａ１媒介Ｍｇ２＋流出は、ｄＢ−ｃＡＭＰおよびアンギオテンシンＩＩによって刺激されるが、インスリンによって阻害される。
投入条件、したがって、細胞内Ｍｇ２＋状態に依存して、ｄＢ−ｃＡＭＰの適用は、ＳＬＣ４１Ａ１関連Ｍｇ２＋流出を１７％減少させる（１０ｍＭ−Ｍｇ２＋溶液における投入）またはそれを、それぞれ、１３％および３６％増加させる（２ｍＭ−および０ｍＭ−Ｍｇ２＋投入溶液における投入）（図４）。興味深いことに、成長しているＳＬＣ４１Ａ１過剰発現細胞へのｄＢ−ｃＡＭＰの適用は、それらの増殖の刺激につながった（図５）。対照的に、Ｎａ＋／Ｍｇ２＋交換体阻害剤イミプラミンは、対照と比較して、かかる細胞の増殖を減少させた（図５）。
さらに、アンギオテンシンＩＩは、ＳＬＣ４１Ａ１関連Ｍｇ２＋流出を１９、５％刺激した。
【００８０】
図６において示されるように、インスリンは、ＳＬＣ４１Ａ１媒介Ｍｇ２＋流出を、それぞれ、３８％（２００μＵ７ｍｌ）および６８％（４００μＵ／ｍｌ）減少させた。
【００８１】
Ｃａ２＋チャネル阻害剤ベラパミルは、ｈＳＬＣ４１Ａ１媒介Ｍｇ２＋流出に及ぼす効果を有さない。
心筋細胞において、ベラパミルは、知られていない機構によってＮａ＋依存性Ｍｇ２＋流出を果たすことが示された（Ｈａｎｄｙら、１９９６）。したがって、我々は、＋ｔｅｔ  ＨＥＫ２９３−（ＳＬＣ４１Ａ１）細胞からのＭｇ２＋流出に及ぼすこのＬ型Ｃａ２＋チャネル阻害剤の効果を試験した。我々は、それぞれ、１００μΜおよび２００μΜベラパミルの比較的高濃度を使用したが、我々は、ＳＬＣ４１Ａ１媒介Ｍｇ２＋放出に及ぼす阻害剤の効果を発見しなかった。観察された［Ｍｇ２＋］ｉ減少は、対照条件下で３４４±４１μΜ／２０ｍｉｎに達し、１００μＭまたは２００μΜのベラパミルの適用後３８６±４５μＭ／２０ｍｉｎまたは３２６±５８μΜ／２０ｍｉｎに達した。
【００８２】
参考文献
【表８】
2013543486.tif 000017
2013543486.tif 000018
2013543486.tif 000019
【図１Ａ】
2013543486.tif 000020
【図１Ｂ】
2013543486.tif 000021
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2013543486.tif 000023
【図２Ｃ】
2013543486.tif 000024
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2013543486.tif 000026
【図３Ｃ】
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【図４】
2013543486.tif 000028
【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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