(57)【要約】本発明は野生型ＰＦ４タンパク質の配列と比較した場合に、６７番目の位置に置換を有する、例えばＬ６７Ｈ置換を有するＰＦ４ムテインに関する。そのようなＰＦ４ムテインは野生型ＰＦ４タンパク質と比較して、向上した抗血管新生活性及び低減したプロテオグリカンへの親和性を示す。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、抗血管新生活性を示し、かつ、配列番号２の６７番目の位置に置換を含み、そして前記ポリペプチドが：
ｉ）配列番号４、５又は６のいずれかの６０番目から６７番目のアミノ酸と同一の配列を含み；又は
ii）配列番号２の６６番目の位置のリシンからグルタミン酸への置換及び配列番号２の６７番目の位置のロイシンからヒスチジンへの置換の両方を含まない、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２の６７番目の位置のロイシンが、ヒスチジン、リシン及びアルギニンからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２の６７番目の位置にロイシンからヒスチジンへの置換を含む、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
１つ又は２つのアミノ酸置換の存在によってのみ配列番号２又は３とは配列が異なる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号４、５、６、７又は８のいずれかの配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載したポリペプチドの、少なくとも６つの連続したアミノ酸の断片を含むポリペプチドであって、前記断片が、配列番号２の６６番目及び６７番目の位置を含み、かつ、前記ポリペプチドが、抗血管新生活性を示す、ポリペプチド。
【請求項７】
前記断片が、配列番号２の５８番目から６７番目までの位置を含む、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２の野生型ＰＦ４タンパク質と比較して、前記ポリペプチドが向上した抗血管新生活性及び低減したヘパリン及び／又はヘパリン硫酸への親和性を示す、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
血管新生をインビボで阻害するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
癌、眼の新生血管障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染、血管疾患、皮膚疾患、肺疾患、腸疾患、生殖系疾患、骨及び／又は関節疾患、糖尿病、肥満及び肝硬変からなる群より選択される疾患の治療における使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記疾患が癌である、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記疾患が眼の新生血管障害である、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードしている核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド及び／又は請求項１３に記載の核酸を含む医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法であって、
ａ）請求項１４に記載の宿主細胞を提供する工程；
ｂ）前記ポリペプチドの生産に好適な条件下において前記宿主細胞を培養する工程；及び、場合により、
ｃ）前記ポリペプチドを精製する工程、及び場合により、
ｄ）前記ポリペプチドを医薬組成物に処方する工程、
を含む製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型ＰＦ４タンパク質の配列と比較して、６７番目の位置に置換を含む、例えばＬ６７Ｈ置換を含むＰＦ４ムテインに関する。そのようなＰＦ４ムテインは野生型ＰＦ４タンパク質と比較して、向上した抗血管新生活性及び低減したプロテオグリカンへの親和性を示す。
【０００２】
血管新生、すなわち新しい血管の発生は、生理学的な状態（例えば胚発生、創傷治癒、などの最中）及び病的な状態（例えば癌）の両方で起こる、複雑な生物学的過程である（例えばBikfalvi and Bicknell, 2002 Trends Pharmacol Sci. 23:576-82を参照のこと）。血管新生は、血管新生促進因子と血管新生抑制因子との間の実質的なバランスによって制御される。血管新生を促進する因子として知られているものとしては、線維芽細胞成長因子、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）及びアンギオポエチンのファミリーが挙げられる。
【０００３】
腫瘍の成長には血管新生が必要であり、かつ拡散性の分子がこの過程を制御すると考えられることから、多くの抗癌研究プロジェクトにおいて、血管新生を阻害することが可能な分子が研究対象とされてきた（例えば、Auguste et al. 2005 Crit Rev Oncol Hematol. 54:53-61を参照のこと）。血管新生抑制分子には、アバスタチン（avastatin）のような抗体、小さい化学分子、及び内生因子、とりわけ血小板第４因子（ＰＦ４）が含まれる。
【０００４】
当面の間、癌又は眼疾患における血管新生の阻害は主に、最初に血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を阻害することに基づく。臨床試験及び臨床におけるＶＥＧＦアンタゴニストの現行の使用により、数多くの副作用及び治療への抵抗性が示されてきた。そのため、改善された特性を有する、新規抗血管新生分子の獲得が必要とされている。
【０００５】
ＣＸＣ−ケモカインファミリーは、主に化学誘引及び様々な免疫炎症性反応における特定の白血球の活性化に関与する炎症促進性のサイトカインを含む。血管新生促進性ケモカイン及び血管新生抑制性ケモカインの両方を含むことから、ＣＸＣケモカインファミリーは独特なものである。血小板第４因子（ＰＦ４又はＣＸＣＬ４）は、血管新生の制御因子として最初に記載されたケモカインである（Maione et al. 1990 Science. 247:77-9、及び国際公開第８５／０４３９７号）。
【０００６】
Maioneら（1991 Cancer Res. 51:2077-8）はＰＦ４のＰＦ４−２４１突然変異体について記載している。この突然変異体は、野生型ＰＦ４タンパク質に比較して４つの置換、すなわちＫ６１Ｑ、Ｋ６２Ｅ、Ｋ６５Ｑ及びＫ６６Ｅ突然変異を含む。この突然変異体の活性はヘパリンとの結合から独立しているため、低い毒性及び改善されたバイオアベイラビリティを示す可能性がある。しかしながら、その抗血管新生活性は、野生型ＰＦ４タンパク質の抗血管新生活性と同等である。
【０００７】
国際公開第２００６／０２９４８７号では、ＰＦ４ｖａｒ１と命名された、ＰＦ４の天然に生じる変異体が開示されている。この変異体は野生型ＰＦ４タンパク質と比較して３つの置換、すなわちＰ５８Ｌ、Ｋ６６Ｅ及びＬ６７Ｈ突然変異を含む。ＰＦ４ｖａｒ１変異体は、野生型ＰＦ４タンパク質の抗血管新生活性と比較して、高い抗血管新生活性を有する。国際公開第２００６／０２９４８７号では、Ｐ５８Ｌ、Ｋ６６Ｅ及びＬ６７Ｈの３つの変異があることが、ＰＦ４ｖａｒ１変異体の高い抗血管新生活性に重要であることが示唆されている。
【０００８】
高い血管新生活性及びプロテオグリカンへの低い親和性を有するＰＦ４の突然変異体の獲得が必要とされている。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
おどろくべきことに、野生型ＰＦ４タンパク質と比較して高い抗血管新生活性及びプロテオグリカンへの低い親和性の両方を付与するためには、Ｌ６７Ｈ変異が十分であることが見いだされた。
【００１０】
さらに具体的には、発明者らは、野生型ＰＦ４タンパク質の配列と比較して、１つから５つのＣ末端配列のアミノ酸が変異した、ＰＦ４ムテインを得た。Ｌ６７Ｈ突然変異を含む（単独で又はその他の突然変異との組み合わせで含む）全てのムテインがインビトロで十分に高い抗血管新生活性を示すことを見いだした。抗血管新生活性のこの向上は、プロテオグリカンへの結合親和性の低下と同時に起こり、このことがＰＦ４ムテインを新生血管へ十分に供給することに寄与している。
【００１１】
本発明のＰＦ４ムテイン及びその断片
そのため本発明は、抗血管新生活性を示し、かつ、配列番号２と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７又は９８％同一の配列を含むポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは配列番号２の６７番目の位置に置換を含み、かつ、前記ポリペプチドは：
ｉ）配列番号４、５若しくは６の６０番目から６７番目まで又は５８番目から６７番目までのアミノ酸と同一の配列を含み；及び／又は
ii）配列番号２の６６番目の位置におけるリシンからグルタミン酸への置換、及び配列番号２の６７番目の位置におけるロイシンからヒスチジンへの置換の両方を含まないものである。
【００１２】
そのようなポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４単一点突然変異により、配列番号２の野生型ＰＦ４ポリペプチドから誘導することが可能である。
【００１３】
配列番号４、５又は６の５８番目から６７番目までのアミノ酸に同一な前記配列は好ましくは、配列番号２の５８番目から６７番目までのアミノ酸に対応する位置に配置される。例えば、前記ポリペプチドが配列番号２と比較していずれの欠損又は挿入をも含まない場合には前記配列は本発明のポリペプチドの５８番目から６７番目までの位置に配置されるが、前記ポリペプチドが例えば配列番号２の１番目の位置を欠損している場合には、本発明のポリペプチドの５７番目から６６番目までの位置に配置される。
【００１４】
「抗血管新生活性」とは、血管の成長を部分的に又は全体的に阻害する能力を意味する。化合物が抗血管新生活性を示すかどうかを決定する方法は当該分野において周知であり、例えば、実施例１に記載した、ウシ大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞を用いたアッセイが含まれる。このアッセイでは、ＢＡＥ細胞を組換えＦＧＦ２で刺激し、そして細胞の生存／増殖を測定する。
【００１５】
本発明はまた、配列番号２と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７又は９８％同一の配列を含むポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは配列番号２の６７番目の位置に置換を含み（例えばＬ６７Ｈ）、かつ、前記ポリペプチドは配列番号２の５８番目の位置から６７番目の位置にわたる領域中に、最大で２つの単一点突然変異を含む（例えばＫ６６Ｅ及びＬ６７Ｈ）。
【００１６】
上記ポリペプチドは今後、「本発明のＰＦ４ムテイン」と称される。
【００１７】
「ＰＦ４」とは、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン４、オンコスタチン−Ａ及びイロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）の名前でもまた知られている血小板第４因子を意味する。野生型ＰＦ４タンパク質の配列を配列番号１（完全長タンパク質）及び配列番号２（成熟タンパク質）として示す。ＰＦ４−２４１突然変異体の配列（成熟タンパク質）を配列番号３に示す。
【００１８】
本発明のＰＦ４ムテインは全て、配列番号２の６７番目の位置に置換を含む。配列番号２の６７番目の位置のロイシンが好ましくは、ヒスチジンの物理化学的特性に類似の特性を有するアミノ酸、例えば、ヒスチジン、リシン及びアルギニンからなる群より選択される、塩基性側鎖をもつアミノ酸で置換される。その結果、６７番目の位置のロイシンが好ましくは、塩基性側鎖をもつアミノ酸で置換される。もっとも好ましくは、前記置換は、配列番号２の６７番目の位置のロイシンのヒスチジンへの置換である。
【００１９】
本発明のＰＦ４ムテインはその他の単一点突然変異をさらに含んでいてもよく、この単一突然変異はアミノ酸の置換、挿入、又は欠損であってもよい。その他の単一点突然変異は好ましくは置換であり、これは保存的であっても保存的ではなくてもよい。その他の単一点突然変異は配列番号２に示す野生型ＰＦ４タンパク質のアレルの変異又は天然に生じない突然変異のいずれかに相当するものであってもよい。
【００２０】
「保存的置換」とは、以下の表に示す置換のうちの１つを意味する。
【表１】
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【００２１】
本発明のクエリーアミノ酸配列と少なくとも、例えば、９５％「同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、クエリーアミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり最大５アミノ酸までの変異を対象ポリペプチド配列が含み得るという点を除いて、対象ポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列と同一であることを意図する。言い換えると、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列中の最大５％（１００当たり５）までのアミノ酸残基に、挿入、欠失、又は別のアミノ酸による置換を加えてもよい。
【００２２】
２つ以上の配列の同一性及び相同性を比較するための方法は当該分野において周知である。例えば２つの配列間の同一性のパーセンテージを決定するためには、それらの全長を考慮して、２つの配列に最適なアライメント（ギャップを含む）を見いだすためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを用いた「ｎｅｅｄｌｅ」プログラムを用いることができる。ｎｅｅｄｌｅプログラムは例えば、ワールドワイドウェブサイトのｅｂｉ．ａｃ．ｕｋから利用可能である。
【００２３】
好ましい実施形態において本発明のＰＦ４ムテインは、１つの単一アミノ酸置換、すなわち配列番号２の６７番目の位置の置換（例えばロイシンからヒスチジンへの置換）を有することにより、配列番号２（野生型ＰＦ４タンパク質）又は配列番号３（ＰＦ４−２４１）の配列とは異なる。そのような本発明のＰＦ４ムテインの例としては、配列番号４又は６を含む又は配列番号４又は６からなるポリペプチドが挙げられる。当業者には明らかなようにこの実施形態は、１つの単一アミノ酸置換を含むことのみにより、配列番号２（野生型ＰＦ４タンパク質）又は配列番号３（ＰＦ４−２４１タンパク質）の配列とは異なるＰＦ４ムテインを包含することを目的とする。
【００２４】
別の好ましい実施形態において本発明のＰＦ４ムテインは、さらなる単一アミノ酸置換、すなわち、配列番号２の６７番目の位置の置換（例えばロイシンのヒスチジンへの置換）と少なくとも１つのさらなる単一アミノ酸置換を有することにより、配列番号２又は３の配列とは異なる。
【００２５】
さらなる単一アミノ酸置換は例えば、
ｉ）配列番号２の５６番目の位置の置換、例えば塩基性側鎖を有するアミノ酸への置換、好ましくはグルタミンからアルギニンへの置換；及び／又は
ii）配列番号２の５８番目の位置の置換置換、例えばプロリンからロイシンへの置換；及び／又は
iii）配列番号２の６１番目の位置の置換、例えばリシンからグルタミンへの置換；及び／又は
iv）配列番号２の６２番目の位置の置換、例えばリシンからグルタミン酸への置換；及び／又は
ｖ）配列番号２の６５番目の位置の置換、例えばリシンからグルタミンへの置換；及び／又は
vi）配列番号２の６６番目の位置の置換、例えばリシンからグルタミン酸置換、
からなる群より選択することができる。
【００２６】
６７番目の位置の置換に加えて、本発明のＰＦ４ムテインは上述の単一アミノ酸置換の任意の組み合わせ、例えばｉ＋ii、ｉ＋iii、ｉ＋iv、ｉ＋ｖ、ｉ＋vi、ii＋iii、ii＋iv、ii＋ｖ、ii＋vi、iii＋iv、iii＋ｖ、iii＋vi、iv＋ｖ、iv＋vi、ｖ＋vi、ｉ＋ii＋iii、ｉ＋ii＋iv、ｉ＋ii＋ｖ、ｉ＋ii＋vi、ii＋iii＋iv、ii＋iii＋ｖ、ii＋iii＋vi、iii＋iv＋ｖ、iii＋iv＋vi、iv＋ｖ＋vi、ｉ＋ii＋iii＋iv、ｉ＋ii＋iii＋ｖ、ｉ＋ii＋iii＋vi、ii＋iii＋iv＋ｖ、ii＋iii＋iv＋vi、iii＋iv＋ｖ＋vi、ｉ＋ii＋iii＋iv＋ｖ、ｉ＋ii＋iii＋iv＋vi、ii＋iii＋iv＋ｖ＋vi又はｉ＋ii＋iii＋iv＋ｖ＋viを含んでもよい。さらなる単一アミノ酸置換が配列番号２の６６番目の位置におけるグルタミン酸置換を含む場合、６７番目の位置の置換は好ましくは、ロイシンからヒスチジンへの置換ではないものである。
【００２７】
その上さらに別の好ましい実施形態において本発明のＰＦ４ムテインは、２つの単一アミノ酸置換を有することから、配列番号２（野生型ＰＦ４タンパク質）又は配列番号３（ＰＦ４−２４１タンパク質）の配列とは異なる。２つのアミノ酸置換を有することにより配列番号２又は３の配列とは異なる本発明のＰＦ４ムテインの例としては、配列番号５、７又は８を含む又は配列番号５、７又は８からなるポリペプチドが挙げられる。当業者には明らかなように、この実施形態は、２つの単一アミノ酸置換を有することのみにより配列番号２（野生型ＰＦ４タンパク質）又は配列番号３（ＰＦ４−２４１タンパク質）の配列とは異なるＰＦ４ムテインを包含することを目的とする。
【００２８】
本発明のＰＦ４ムテインはこの配列に加えて、配列番号２に少なくとも８０％同一の配列をさらに含んでいてもよい。例えば本発明のＰＦ４ムテインはシグナルペプチドを含む場合がある。シグナルペプチドはＰＦ４の天然のシグナルペプチド（すなわち配列番号１の１番目から３１番目のアミノ酸）であってもよく、又は、例えば特定の宿主細胞中での発現に好適な異種シグナルペプチドであってもよい。あるいは加えて、本発明のＰＦ４ムテインは、ムテインと検出マーカー又は細胞毒性薬のような分子とを結合させるのに好適なリンカー配列を含んでもよい。
【００２９】
本発明はまた、本発明のＰＦ４ムテインの少なくとも６つの連続したアミノ酸の断片を含み又はこれらからなり、かつ、抗血管新生活性を示すポリペプチドに関する。この断片は好ましくは、配列番号２の６６番目及び６７番目の位置を含む。最も好ましくは、この断片は、配列番号２の６０番目から６７番目まで、又は５８番目から６７番目までの位置を含む。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「配列番号２の５８番目から６７番目までの位置を含む断片」、又は「配列番号２の６６番目及び６７番目の位置を含む断片」とは、本発明のＰＦ４ムテインに保存されている断片を意味し、前記断片はＰＦ４のこれらの位置のアミノ酸を含む領域を含む。これらの断片は、配列番号２に示す野生型ＰＦ４タンパク質の対応する断片に比較して、少なくとも１つの単一点置換（すなわち配列番号２の６７番目の位置におけるロイシンからヒスチジンへの置換）を含む。
【００３１】
そのような断片は、少なくとも６、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０又は６５の連続した、本発明のＰＦ４ムテインのアミノ酸を含むか又はこれらからなる。
【００３２】
特定の実施形態においてそのような断片は、少なくとも６、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０又は６５の連続した、配列番号４、５、６、７又は８のいずれか１つのアミノ酸を含む又はこれらからなる。
【００３３】
別の特定の実施形態においてそのような断片は、配列番号４、５又は６の、６０番目から６７番目まで、又は５８番目から６７番目までのアミノ酸と同一な配列を含む。
【００３４】
断片は例えば、配列番号２の１７番目の位置から７０番目の位置までにわたる断片をからなる、ＰＦ４の短いイソ型に相当するものであってもよい。
【００３５】
断片はまた、ペプチド、すなわち５０アミノ酸未満のポリペプチドに相当するものであってもよい。
【００３６】
本発明のそのようなペプチドは例えば、配列番号２の６７番目の位置に少なくとも１つの置換（例えばロイシンからヒスチジンへの置換）を挿入することにより、Ragonaら(2009 Biochem Biophys Res Commun. 382:26-9)、Bennyら(2005 Clin Cancer Res. 11:768-76)、Bikfalvi(2004 Semin Thromb Hemost. 30:379-85)、Giussaniら(2003 Cancer Res. 63:2499-505)、Hagedornら(2002 Cancer Res. 62:6884-90)、Hagedornら(2001 FASEB J. 15:550-2) 又は Jouanら(1999 Blood. 94:984-93)に記載されているペプチドから誘導することができる。
【００３７】
本発明のペプチドはまた、国際公開第０２／０６３００号に記載されているペプチドのうちの１つからも誘導することができる。それらは例えば、配列番号２の４７番目の位置から７０番目の位置にわたる断片を含む又はそれらからなっていてもよい。好ましい実施形態においてペプチドは、配列番号２の４７番目の位置から７０番目までの位置にわたる断片にインフレームで融合させた、配列番号２の１７番目の位置から３４番目の位置にわたる断片を含む又はそれらからなる。配列番号９のペプチドがそのような本発明のペプチドの一例である。
【００３８】
本発明のペプチドは任意に、それらの安定性及び／又はそれらのバイオディスポニビリティ（ｂｉｏｄｉｓｐｏｎｉｂｉｌｉｔｙ）を向上させる化学修飾を含んでいてもよい。そのような化学修飾は、インビボでの酵素分解に対する保護、及び／又は膜のバリアを貫通する能力が向上し、その結果、その半減期及び維持が増大し、又はその生物学的活性が向上したペプチドの獲得を目的としている。当該分野において既知の任意の化学修飾を本発明に用いることができる。そのような化学修飾には、
例えばＮ末端アシル化（好ましくはアセチル化）又は脱アミノ化のような、ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端修飾、又はＣ末端カルボキシル基をアミド又はアルコール基にする修飾；
２つのアミノ酸の間のアミド結合の修飾：２つのアミノ酸を結合しているアミド結合の窒素原子又はアルファ炭素のアシル化（好ましくはアセチル化）又はアルキル化（好ましくはメチル化）；
例えば２つのアミノ酸を結合しているアミド結合のアルファ炭素のアシル化（好ましくはアセチル化）又はアルキル化（好ましくはメチル化）のような、アルファ炭素の修飾；
例えば１つ以上の天然に生じるアミノ酸（Ｌ鏡像異性体）を相当するＤ−鏡像異性体に置換するようなキラル変化；
アミノ酸の鎖の反転と共に（Ｃ末端からＮ末端）、１つ以上の天然に生じるアミノ酸（Ｌ−鏡像異性体）が相当するＤ−鏡像異性体に置換されるレトロ反転；
１つ以上のアルファ炭素が窒素原子に置換されるアザペプチド；及び／又は
１つ以上のアミノ酸のアミノ基がα炭素よりもβ炭素に結合しているベータペプチド；
が含まれるがこれらには限定されない。
【００３９】
本発明のＰＦ４ムテインの少なくとも６つの連続したアミノ酸の断片を含み、かつ、抗血管新生活性を示すポリペプチドは、本発明のＰＦ４ムテインに保存される断片に加えて、さらに配列を含む場合がある。例えばそれらは、シグナルペプチド、リンカー配列又は第二の、本発明のＰＦ４ムテインの少なくとも６つの連続したアミノ酸の断片を含んでいてもよい。
【００４０】
特定の実施形態において、本発明のＰＦ４ムテインの少なくとも６つの連続したアミノ酸の断片を含み、かつ、抗血管新生活性を示すポリペプチドは、連続していない少なくとも２つの、本発明のＰＦ４ムテインの少なくとも６つの連続したアミノ酸、の断片から成る。
【００４１】
本発明のＰＦ４ムテイン及びその断片は、好ましくは、野生型ＰＦ４タンパク質と比較して高い抗血管新生活性を示す。
【００４２】
本発明のＰＦ４ムテイン及びその断片はまた好ましくは、野生型ＰＦ４タンパク質と比較して、ヘパリン及び／又はヘパリン硫酸への低い親和性を示す。化合物のヘパリン及び／又はヘパリン硫酸塩への親和性を決定する方法は当該分野において周知である。親和性は例えば、実施例１に記載したように、ＢＩＡｃｏｒｅの装置を備えた表面プラズモン共鳴により決定することができる。
【００４３】
好ましい実施形態において本発明のＰＦ４ムテイン及びその断片は、
ｉ）それらのヘパリンへの親和定数が少なくとも４、８又は１０３μＭである；及び／又は
ii）それらのヘパラン硫酸塩への親和定数が少なくとも１０２、３．１０２又は１０３μＭである；及び／又は
iii）ＦＧＦ−２で刺激したＢＡＥを用いた増殖アッセイにより決定したそれらのＩＣ５０が、１６０、９０又は４２ng／mlよりも低いものである、
のうちの少なくとも１つの特徴を示す。
【００４４】
本発明のＰＦ４ムテインは例えば、（ｉ）及び（ii）；（ｉ）及び（iii）；（ii）及び（iii）；又は（ｉ）、（ii）及び（iii）の特徴を示す場合がある。
【００４５】
ＰＦ４ムテイン及びその断片の治療における使用
本発明のＰＦ４ムテイン及びその断片は抗血管新生活性を示す。そのためこれらは、インビトロ及びインビボの両方において、血管新生の阻害に有用なものである。
【００４６】
血管新生の阻害が望まれる疾患は、当業者には周知である（例えば、Carmeliet 2005 Nature. 438:932-6を参照のこと）。疾患は例えば、Carmeliet（2005 Nature. 438:932-6）の添付の表１に挙げられた疾患のいずれか１つに相当するものであってもよい。
【００４７】
より具体的には本発明は、癌、眼の新生血管障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染、血管疾患、皮膚疾患、肺疾患、腸疾患、生殖系疾患、骨及び／又は関節疾患、糖尿病、肥満及び肝硬変からなる群より選択される疾患の治療における、本発明のＰＦ４ムテイン及びその断片の使用を指向する。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「癌」とは、任意の型の悪性（すなわち良性ではない）腫瘍を指す。腫瘍は好ましくは、固形の悪性腫瘍に相当し、例えば癌腫、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、中皮腫並びに神経芽細胞腫、膠芽腫及び網膜芽細胞腫のような芽細胞腫が含まれる。あるいは癌は、リンパ腫又は白血病のような血液癌である場合もある。癌は例えば、肺、直腸結腸、膵臓、胃、喉頭、鼻咽頭、甲状腺、膀胱、陰茎、前立腺、精巣、尿道、乳、子宮頸、子宮内膜、卵巣、膣、外陰、肝臓、腎臓又は網膜癌に相当するものであってもよい。最も好ましい実施形態において癌は転移性の癌である。
【００４９】
本明細書を通して使用する場合、用語「眼の新生血管障害」とは、硝子体過形成遺残症候群、糖尿病性網膜症（例えば増殖糖尿病性網膜症）、未熟網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、黄斑変性、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜新生血管、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血及び糖尿病性網膜浮腫のような障害を指す。
【００５０】
本明細書を通して使用する場合、用語「炎症性疾患」とは、炎症によって引き起こされる、又は炎症をもたらす疾患を指す。炎症は、罹患した血管及び隣接した組織で、損傷又は物理的、化学的、又は生物学的な薬剤による異常な刺激に反応して起こる、動的で複雑な細胞学的及び化学的応答からなる病的過程である。炎症性疾患は好ましくは、慢性炎症性疾患に相当する。
【００５１】
本明細書を通して使用する場合、「自己免疫疾患」とは、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、バセドウ病及び真性糖尿病を含むがこれらには限定されない。
【００５２】
本明細書を通して使用する場合、用語「感染」とは、ウイルス感染（例えばＡＩＤＳ）及び細菌感染を含むがこれらには限定されない。
【００５３】
本明細書を通して使用する場合、用語「糖尿病」は、Ｉ型及びII型両方の糖尿病を含む。
【００５４】
「血管疾患」とは、血管奇形、ディジョージ症候群、ＨＨＴ、海綿状血管腫、アテローム性動脈硬化及び移植後血管病変のような疾患を意味する。
【００５５】
「皮膚疾患」とは、乾癬、疣贅、アレルギー性皮膚炎、ケロイド瘢痕、化膿性肉芽腫、水疱性疾患及びカポジ肉腫のような疾患を意味する。
【００５６】
「肺疾患」とは、喘息、原発性肺高血圧症及び鼻茸のような疾患を意味する。
【００５７】
「腸疾患」とは、炎症性大腸炎、歯周病、腹水及び腹膜癒着のような疾患を意味する。
【００５８】
「生殖系疾患」とは、子宮内膜症、子宮出血、卵巣嚢胞及び卵巣過刺激のような疾患を意味する。
【００５９】
「骨及び／又は関節疾患」とは、関節炎、滑膜炎、骨髄炎及び骨棘形成のような疾患を意味する。
【００６０】
本発明はさらに、有効量の本明細書において記載したポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含む、血管新生を阻害する方法、及び／又は癌、眼の新生血管障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染、血管疾患、皮膚疾患、肺疾患、腸疾患、生殖系疾患、骨及び／又は関節疾患、糖尿病、肥満及び肝硬変からなる群より選択される疾患を治療又は予防する方法を指向する。前記患者は、好ましくは、癌、眼の新生血管障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染、血管疾患、皮膚疾患、肺疾患、腸疾患、生殖系疾患、骨及び／又は関節疾患、糖尿病、肥満及び肝硬変からなる群より選択される疾患を発症している、又はそれらを発症するリスクのある患者である。
【００６１】
「有効量」とは、ポリペプチドの濃度を、治療対象となる疾患を予防する、治療する、又はその進行を遅らせることが可能な濃度にするために十分な量を意味する。当業者は、そのような濃度を慣習的に決定することができる。実際に投与される化合物の量は、一般的には、治療対象となる状態、選択された投与経路、実際に投与する化合物、年齢、体重、及び個々の患者の反応、患者の症状の重篤度などを含む関連する状況を考慮して、医師により決定されるだろう。用量は投与されるポリペプチドの安定性によって多様になり得ることもまた、当業者には明かだろう。
【００６２】
「治療する」とは、治療上での使用を意味し、「予防する」とは、予防的な使用を意味する。
【００６３】
本発明の範囲内で治療を受ける患者は、好ましくはヒト患者である。しかしながら、その他の哺乳類を治療するための、本発明のＰＦ４ムテイン及びその断片の獣医学的使用についてもまた、本発明では検討する。
【００６４】
本発明は、本発明のＰＦ４ムテインをコードしている核酸若しくはその断片、又はそのような核酸を含むベクターの、血管新生を阻害するための使用にもまた関する。
【００６５】
核酸、宿主細胞及び組換えＰＦ４ムテイン及びその断片の製造方法
本発明の一態様は、本発明のＰＦ４ムテインをコードしている核酸又はその断片に関する。ＰＦ４ムテイン又はその断片は、上の段落において記載したポリペプチドのいずれか１つに相当するものであってもよい。
【００６６】
当業者はそのような核酸を、例えば実施例１に記載したように、野生型ＰＦ４をコードしているｃＤＮＡをクローニングし、部位特異的突然変異生成によって突然変異を導入することにより、容易に得ることができる。
【００６７】
核酸を例えば、発現ベクターのようなベクター中に含ませてもよい。そのような発現ベクター中では、本発明の核酸は、コードされたポリペプチドの発現を可能にする、シグナル（例えばプロモーター、ターミネーター、及び／又はエンハンサー）の制御下におかれる。ベクターは、複数のクローニング部位、選択マーカー、検出マーカーなどをさらに含んでいてもよい。
【００６８】
任意にベクター中に挿入される核酸を、次に、宿主細胞に導入してもよい。従って、本発明は、本発明の核酸を含む宿主細胞に関する。
【００６９】
そのような宿主細胞は、本発明の組換えムテイン又はその断片の製造に有用である。組換えタンパク質の製造に好適な宿主細胞は当該分野において周知であり、それらには例えば、細菌細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、酵母細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、真菌細胞（例えばＡ．ｎｉｇｅｒ）、植物細胞、昆虫細胞、並びに、ＣＨＯ細胞、マウス細胞及びヒト細胞（例えばＨＥＫ２９３及びＰＥＲ．Ｃ６）のような哺乳類細胞が含まれる。
【００７０】
従って本発明は、
ａ）本発明の宿主細胞を準備する工程；
ｂ）前記ポリペプチドの製造に好適な条件下で前記宿主細胞を培養する工程；及び、任意に、
ｃ）前記ポリペプチドを精製する工程、及び任意に、
ｄ）前記ポリペプチドを医薬組成物に処方する工程、
を含む、本発明のＰＦ４ムテイン又はその断片の製造方法を指向する。
【００７１】
あるいは、本発明のＰＦ４ムテイン又はその断片を化学合成によって製造することもできる。実際小さいペプチドの製造には、化学合成が特に適用される。
【００７２】
ＰＦ４ムテイン及び／又はその断片を含む医薬組成物
本発明のＰＦ４ムテイン又はその断片を医薬組成物として処方してもよい。従って本発明は、本発明のＰＦ４ムテイン又はその断片及び生理学的に許容可能な担体を含む医薬組成物について検討する。当業者は、既知のいずれの方法からも生理学的に許容可能な担体を調製することができる。
【００７３】
本発明のＰＦ４ムテイン又はその断片を含む医薬組成物には、目的を達成するのに有効な量のポリペプチド及び／又はペプチドを含む、全ての組成物が含まれる。加えて、医薬組成物は、活性化合物を薬学上使用可能な調製物として処理する工程を促進するための賦形剤及び左剤を含む、好適な薬学上許容可能な担体を含んでいてもよい。好適な薬学上許容可能な媒体は当該分野において周知であり、例えばこの分野における標準的な教科書である、Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Company, Easton, USA, 1985）に記載されている。ペプチドの投与方法、溶解度及び安定性に従って、薬学上許容可能な媒体を慣習的に選択することができる。例えば、静脈内投与用の製剤は、緩衝液、希釈剤及びその他の好適な添加剤をもまた含有する可能性のある、無菌的な水溶液を含み得る。薬物送達のための生体材料及びその他のポリマーの使用、並びに別の技術及び特定の投与方法を確認するためのモデルについては文献において開示されている。
【００７４】
目的を達成するための任意の手段により、本発明のＰＦ４ムテイン又はその断片を投与することができる。例えば、皮下、静脈内、皮内、筋内、腹腔内、脳内、鞘内、鼻腔内、経口、直腸、経皮的、口腔、局所、局部、吸入又は皮下の使用を含むがこれらには限定されない数多くの方法により、投与を行うことができる。
【００７５】
投与される用量は、個々のニーズ、望まれる効果、及び選択された投与経路により異なる。投与される用量は、性別、健康状態、及び受容者の体重、併用療法、併用療法を受ける場合には、治療の頻度、及び望まれる効果の特性、に依存して異なることを理解されたい。それぞれの治療に必要とされる総量を、複数回投与又は単回投与により投与することができる。
【００７６】
目的の送達経路によっては、化合物を、液体（例えば、溶液、懸濁液）、固体（例えば、丸薬、錠剤、座剤）又は半固体（例えば、クリーム、ゲル）の剤形に処方してもよい。
【００７７】
好ましい実施形態において組成物は、正確な投与を促すための単位容量形態で提供される。用語「単位容量形態」とは、ヒト対象及びその他の哺乳類への単回投与として好適な、物理的に別個の単位を指し、ここで各単位は、所望される治療効果をもたらすように算出された、予め決められた量の活性成分と、好適な医薬賦形剤とを含むものである。一般的に単位容量形態は、充填済みの、予め測定された、液体組成物のアンプル若しくはシリンジ、又は固体組成物の場合には、丸薬、錠剤、カプセルなどを含む。そのような組成物では、本発明の化合物は一般に少ない方の構成要素（約０．１〜約５０重量％又は好ましくは約１〜約４０重量％）であり、その他の部分は様々な媒体若しくは担体、及び所望の剤形に処方するのに有用な加工助剤である。
【００７８】
本発明のＰＦ４ムテイン又はその断片を、持続放出形態において又は持続放出性薬物送達システムにより投与することもできる。
【００７９】
「生理学的に許容可能な」という表現は、活性成分の生物学的活性の効果を干渉しない、かつ、投与される宿主にとって有毒でない任意の担体を包含することを意味する。例えば非経口投与用には、注入のための単位容量形態として上述した活性成分を、生理的食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンガー液のような媒体中に処方してもよい。
【００８０】
薬学上許容可能な担体に加えて、安定剤、賦形剤、緩衝剤及び保存剤のような少量の添加剤を本発明の組成物に加えることもできる。
【００８１】
本発明はまた、例えば遺伝子治療による治療における、本発明のＰＦ４ムテイン又はその断片をコードしている核酸を含む医薬組成物についても検討する。この例において核酸は、好ましくは、ベクターに挿入された状態で提供され、ここでペプチドをコードしている配列は、その発現を可能にする発現シグナル（例えばプロモーター、ターミネーター及び／又はエンハンサー）の制御下におかれる。ベクターは例えば、アデノウイルス又はレンチウイルスベクターのようなウイルスベクターに相当するものであってもよい。
【００８２】
本発明はさらに、本発明のＰＦ４ムテイン又はその断片を含む医薬組成物及び投与方法についての説明を含むキットを提供する。これらの説明においては、例えば、医学的適応、及び／又は投与経路、及び／又は用量、及び／又は治療する患者群を示すことができる。
【００８３】
学術論文若しくは要約、公開されている若しくは未公開の特許出願、交付済み特許又はいずれのその他の参考文献を含む本明細書で引用した全ての参考文献は、引用した参考文献中に示されている全てのデータ、表、図面及び文章を含め、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００８４】
「含む」「有する」「含有する」及び「からなる」という用語はそれぞれ個別の意味を有するが、これらは本明細書を通じて同じ意味で用いられ、他方の語に置き換えることもできる。
【００８５】
以下の実施例及び図面を考慮して、本発明はさらに評価されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、ケモカインＰＦ４のＧＡＧへの親和性を変化させるためには、ヒスチジン６７の変異が重要であることを示す。Ａ．２μMの異なるタンパク質を固定化したヘパリン及びへパラン硫酸上に注入したＢｉａｃｏｒｅ解析。Ｂ．ＰＦ４及び変異体のエクスビボでの拡散性。特異的抗ＰＦ４ＥＬＩＳＡにより、膜に結合したタンパク質の量を決定した。結果は、３つの複製を用いて行った、３回の独立した実験の、平均±標準偏差である。
【図２Ａ】図２は、ケモカインＰＦ４の生物学的活性を変化させるためには、ヒスチジン６７の変異が重要であることを示す。異なる濃度の組換えタンパク質を、ＦＧＦ−２で刺激したウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を用いた増殖アッセイに加えた。結果は、３つの複製を用いて行った、３回の独立した実験の、平均±標準偏差である。
【図２Ｂ】図２は、ケモカインＰＦ４の生物学的活性を変化させるためには、ヒスチジン６７の変異が重要であることを示す。異なる濃度の組換えタンパク質を、ＦＧＦ−２で刺激したウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を用いた増殖アッセイに加えた。結果は、３つの複製を用いて行った、３回の独立した実験の、平均±標準偏差である。
【００８７】
配列の簡単な説明
配列番号１は、完全長野生型ＰＦ４タンパク質の配列を示す。
配列番号２は、成熟野生型ＰＦ４タンパク質の配列を示す。
配列番号３は、ＰＦ４−２４１変異体の配列を示す。
配列番号４は、Ｌ６７Ｈ変異を含むＰＦ４ムテインの配列を示す。
配列番号５は、Ｐ５８Ｌ変異及びＬ６７Ｈ変異を含むＰＦ４ムテインの配列を示す。
配列番号６は、Ｌ６７Ｈ変異を含むＰＦ４−２４１変異体の配列を示す。
配列番号７は、Ｑ５６Ｒ変異及びＬ６７Ｈ変異を含むＰＦ４ムテインの配列を示す。
配列番号８は、Ｑ５６Ｒ変異及びＬ６７Ｈ変異を含むＰＦ４−２４１変異体の配列を示す。
配列番号９は、Ｑ５６Ｒ変異及びＬ６７Ｈ変異を含む本発明のペプチドの配列を示す。
【００８８】
実施例
実施例１：材料及び方法
１．１．細胞培養
抗生物質、１％グルタミン、及び１０％ウシ胎仔血清又は１０％ウシ血清を含むＤＭＥＭ（Invitrogen、Cergy Pontoise、France）培地中でＢＡＥ細胞を生育させ、３７℃、１０％  ＣＯ２条件下で維持した。
【００８９】
１．２．プラスミド
２回の連続した工程により、ｐＣＤＮＡ−ＰＦ４から、ヒトＰＦ４／ＣＸＣＬ４ｃＤＮＡのコード領域をクローニングした。最初に、ＰＦ４に結合するプライマーを用いてより長いＰＦ４ｃＤＮＡ断片を増幅した。
【００９０】
単位複製配列（３０６bp）をｐＳＣ−Ａベクター（Stratagene）にクローニングした。再構成したプラスミドをＤＮＡシークエンシングにより確認した。この構築物を、成熟ＰＦ４タンパク質のコード領域を増幅するための鋳型として用いた。精製したＰＣＲ産物をＢａｍＨ１及びＸｈｏ１制限酵素で消化し、そして、ｐＧＥＸ−ＰＦ４発現ベクターを生成するために、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−２（Amersham Biosciences）に挿入した。最後に、自動ＤＮＡシークエンシング解析により、選択したクローンのヌクレオチド配列を確認した。
【００９１】
１．３．ｐＧＥＸ−ＰＦ４変異体発現ベクター組み換え体の構築
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  II  ＸＬキット（Stratagen）を用いた部位特異的突然変異生成に、ｐＧＥＸ−ＰＦ４発現ベクターをＤＮＡ鋳型として用いた。最終的に、既に記載されているように（Lasagni et al. 2007 Blood. 2007 109:4127-34 ; Bastide et al. 2008 Nucleic Acids Res. 36:2434-45）、ＤＮＡシークエンシング解析により、ｐＧＥＸ−ＰＦ４変異体クローンのスクリーニングを行った。
【００９２】
１．４．組み換え体ＰＦ４及び変異体のＥ．ｃｏｌｉ内での生産
上述した異なるｃＤＮＡを含む、ｐＧＥＸ−６Ｐ−２（ＧＳＴ融合発現ベクター、Amersham）組換えベクターを用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を、１００μg／mlのアンピシリンを加えた１００mlのＬＢ培地中で生育させた。ＯＤ６００  nmが０．３〜０．５に達した後、培地を揺すりながら０．５mmol／Ｌのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（Euromedex）を添加することにより、融合タンパク質の発現を誘導した。２２０rpm、２５℃で、培地を一晩生育させた。ＩＰＴＧで誘導した試験培養及び空のｐＧＥＸ−６Ｐ−２ベクターを含むＩＰＴＧで誘導した対照培養を、５０００回転／分、１５分、４℃での遠心分離により回収した。ＰＢＳ  １Ｘ（１０mM  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８mM  ＫＨ２ＰＯ４、１４０mM  ＮａＣｌ、２．７mM  ＫＣｌ、ｐＨ７．３、Lonza）、１mg／mlリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を含む１０倍量の溶解緩衝液に、沈殿物を再懸濁した。液体窒素での凍結とその後の氷浴中での超音波処理（６、３０秒の超音波処理工程）による凍結／融解で細胞を溶解した。ＤＮＡを完全に断片化するために、５ｇ／mlのＤＮａｓｅＩ（Sigma）を加え、氷上で１５分間撹拌した。１２０００回転／分、３０分、４℃での遠心分離により細胞残渣を除去し、上清を回収した。
【００９３】
１．５．ＧＳＴ−ＰＦ４及び変異体組換えタンパク質を精製するためのアフィニティクロマトグラフィー工程
可溶性ＧＳＴ−ＰＦ４（又は別の変異体）組換えタンパク質を含む上清を、ＰＢＳ  ＩＸを用いて流速１ml／分、室温で予め平衡化しておいたＧＳＴｒａｐ  ＨＰアフィニティカラム（５ml；Amersham Biosciences）にロードした。ＯＤ  ２８０nmでの吸収が基準に戻るまで、結合させた材料をＰＢＳ  ＩＸを用いて洗浄した。基準値で安定したら、カラムの１０倍量の溶出緩衝液（ＰＢＳ  ＩＸ、２０mM  還元グルタチオン、pH８．０）を用い、流速１ml／分で、結合したＧＳＴ−ＰＦ４組換えタンパク質を溶出した。ＧＳＴ−ＰＦ４組換えタンパク質を含む溶出画分をプールした。クマシーブルー（Biorad）で染色したＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル及びウェスタンブロット解析を用いて精製段階及びアフィニティクロマトグラフィーのプロファイルを解析した。
【００９４】
１．６．細胞生死判別試験
ＢＡＥ細胞を、平底の９６−ウェルプレートに５ｘ１０３細胞／ウェルの密度で２４時間プレーティングした。一晩血清飢餓を行った後、細胞を３つに分け、異なる濃度の組換えタンパク質を加えて又は加えずに、１０ng／mlの組換えＦＧＦ２で４８時間処理した。細胞の生存能力をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Promega）を用いて、製造業者の説明に従って、４９０nmで測定した。
【００９５】
１．７．ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００バイオセンサー装置（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ）を用いてリアル−タイム結合実験を行い、レゾナンスユニット（ＲＵ）として数値化した（１０００RU＝１ngのタンパク質が１mm２のフローセル表面に結合する単位）（Ferjoux et al. 2003 Mol Biol Cell. 14:3911-28）。グリコアミノグリカン（ＧＡＧ）をビオチン化し、そしてストレプトアビジンを予め結合させておいたカルボキシルメチル化デキストランチップ上に固定化した（ｃｈｉｐ  ＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ）。ヘパリン（１４０RU）及びへパラン硫酸（１２０RU）をフローセル２及びフローセル３上に固定化し、フローセル１を非特異的相互作用対照として用いた。可溶性リガンドを流速３０μl／分で注入し、表面に曝露させ、６００ｓ（結合位相）とその後、この流れの間に解離が生じる３００ｓで測定した。センサーグラムは特異的相互作用（差次的反応）の代表的なものであり、フローセル２及び３で生じた結合から、フローセル１で生じた非特異的結合を推定した。結果を、レゾナンスユニット（RU）を秒単位での時間の関数として表す。固定化したＧＡＧ上に異なる濃度（１６〜２０００nM）のタンパク質を注入することにより、全ての組換えタンパク質の結合、解離、及び親和性定数（それぞれｋａ、ｋｄ、及びＫＤ）を決定するための動態解析を行った。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１ソフトウェアによる質量移動を伴う１：１  Ｌａｎｇｕｉｍｕｉｒ結合モデルを用いて重ねたセンサーグラムをフィッティングさせることにより、解析を行った。ＧＡＧと組換えタンパク質複合体との解離速度は、接触時間（４分から最大８分まで）には影響されなかった。
【００９６】
１．８．ＥＬＩＳＡ
市販のＰＦ４−ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を用いてＰＦ４及び変異体を測定した。ブランクとしてはＰＢＳを用いた。３つの複製を用いてアッセイを行い、そして結果をＳｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ４．０ソフトウェア（Molecular Devices）を用いて解析した。
【００９７】
実施例２：結果
以下のタンパク質を組換えタンパク質として、Ｅ．ｃｏｌｉ内で生産した。
野生型ＰＦ４タンパク質（「ＰＦ４」と称する、配列番号２）；
ＰＦ４Ｐ５８Ｌ変異体（「Ｌ」とする、配列番号２の５８番目の位置のプロリンがロイシンに置換されている）；
ＰＦ４Ｋ６６Ｅ変異体（「Ｅ」とする、配列番号２の６６番目の位置のリシンがグルタミン酸に置換されている）；
ＰＦ４Ｐ５８ＬＫ６６Ｅ変異体（「ＬＥ」とする、配列番号２の５８番目の位置のプロリンがロイシンに置換されていて、かつ、６６番目の位置のリシンがグルタミン酸に置換されている）；
ＰＦ４Ｐ５８ＬＬ６７Ｈムテイン（「ＬＨ」とする、配列番号２の５８番目の位置のプロリンがロイシンに置換されていて、かつ、６７番目の位置のロイシンがヒスチジンに置換されている）；
ＰＦ４Ｋ６６ＥＬ６７Ｈムテイン（「ＥＨ」とする、配列番号２の６６番目の位置のリシンがグルタミン酸に置換されていて、かつ、６７番目の位置のロイシンがヒスチジンに置換されている）；
ＰＦ４−２４１変異体（「２４１」とする、配列番号６）；及び
ＰＦ４−２４１Ｌ６７Ｈムテイン（「２４１＋Ｈ」と称する、配列番号６の６７番目の位置のロイシンがヒスチジンに置換されている）
【００９８】
クマシー染色及び抗ＰＦ４ウェスタンブロットにより、それぞれのタンパク質が正しく発現していることを確認した。
【００９９】
Ｂｉａｃｏｒｅを用いてそれぞれのタンパク質のヘパリン及びヘパリン硫酸への結合性を解析し、そしてＥＬＩＳＡによって拡散性を解析した。結果を図１に示す。Ｌ６７Ｈ変異を含むムテインが、Ｌ６７Ｈ変異を欠くタンパク質よりもよい拡散性を示すことを見いだした。Ｌ６７Ｈ変異に加えてＫ６１Ｑ、Ｋ６２Ｅ、Ｋ６５Ｑ及びＫ６６Ｅ変異がある場合、拡散性はさらに高くなった（２４１＋Ｈを参照のこと）。
【０１００】
Ｂｉａｃｏｒｅを用いた結合実験によって決定した、それぞれのタンパク質の固定化したヘパリン及びヘパラン硫酸に対する親和性定数を以下の表１に示す。Ｌ６７Ｈ変異がある場合、ムテインのヘパリンに対する親和性は３ログまでになり、ヘパラン硫酸への親和性は５ログまでになる。
【表２】
2013500029.tif 000004
【０１０１】
ＦＧＦ−２で刺激したウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を用いた増殖アッセイにより、それぞれのタンパク質の抗血管新生活性を試験した。用量−反応曲線を図２に示す。これらの曲線により、表２に示すようなそれぞれのタンパク質の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を算出することができる。モル単位（２８kDaの４量体形態としてのＭＷ）において計算した場合のＬ６７Ｈ変異体のＩＣ５０値は１nMであり、野生型ＰＦ４タンパク質のＩＣ５０値は８４nMである。
【表３】
2013500029.tif 000005
【０１０２】
結論として、ＰＦ４の生物学的活性を変化させるためにはＬ６７Ｈ変異が重要であることを見いだした。
【図１】
2013500029.tif 000006
【図２Ａ】
2013500029.tif 000007
【図２Ｂ】
2013500029.tif 000008
【配列表】
2013500029000001.app
【国際調査報告】
2013500029.tif 000009
2013500029.tif 000010
2013500029.tif 000011
2013500029.tif 000012
2013500029.tif 000013