(57)【要約】  本発明は、糖またはその他の炭素源から得られるピルベートを、レブリン酸、レブリン酸エステル、バレロラクトン、およびこれらの誘導体などの有用なＣ５材料へ転換するための方法を提供する。
2013538060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ５ケト酸もしくはエステル、またはＣ５ヒドロキシ酸もしくはエステル、またはこれらの環状誘導体である化合物を産生するための方法であって、アルドール付加によってピルベートをＣ５中間体へ転換するステップと、化学工程または酵素工程またはこれらの組み合わせによって前記Ｃ５中間体を前記化合物へ転換するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記ピルベートが、１つまたは複数のＣ６糖を含む炭素源から産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｃ６糖が、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、タロース、ガラクトース、フルクトース、プシコース、ソルボースおよびタガトースのうちの１つまたは複数である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ピルベートが、１つまたは複数のＣ５糖を含む炭素源から産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｃ５糖が、キシロース、アラビノース、リボース、リキソース、キシルロースおよびリブロースのうちの１つまたは複数である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記炭素源が、グリセロール、脂肪酸、およびアミノ酸のうちの１つまたは複数を含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ピルベートが、バイオマス、デンプン、セルロースおよび／またはリグノセルロース原料のうちの１つまたは複数を含む原料の発酵から産生される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記リグノセルロース原料が、トウモロコシ、木、都市廃棄物、ならびにパルプおよび製紙工場スラッジのうちの１つまたは複数を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ピルベートが、少なくともある程度、微生物系における解糖系によって産生される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ピルベートへのアルドール付加が、真核生物、原核生物、または古細菌発酵宿主において生じる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記発酵宿主が、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ピキア種、シュードモナス種、バチルス種、クリソスポリウム種、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ピルベートまたはアルドール付加産物が発酵宿主から回収され、無細胞系において、Ｃ５ケト酸もしくはエステル、またはＣ５ヒドロキシ酸もしくはエステル、またはこれらの環状誘導体である化合物へ転換される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アルドール付加産物が、還元、酸化、脱水、基の転移、加水分解およびラクトン化から選択される１つまたは複数の酵素工程によって無細胞系で前記化合物へ転換される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｃ５中間体が４−ヒドロキシ２−オキソ−ペンタン酸である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｃ５中間体が、アセチルアルデヒドのアルドール付加によってピルベートから産生される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記４−ヒドロキシ２−オキソ−ペンタン酸が２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸へ還元される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記４−ヒドロキシ２−オキソ−ペンタン酸が２，４−ジオキソ−ペンタン酸へ酸化される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸が２−ヒドロキシ４−オキソペンタン酸へ酸化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記２，４−ジオキソ−ペンタン酸が２−ヒドロキシ４−オキソペンタン酸へ還元される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記２−ヒドロキシ４−オキソペンタン酸が、デヒドラターゼ反応によって４−オキソ−２−ペンテン酸へ転換される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記４−オキソ−２−ペンテン酸がレブリン酸へ還元される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記レブリン酸が４−ヒドロキシペンタン酸へ還元される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記４−ヒドロキシペンタン酸が４−バレロラクトンへ環化される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸が、酸化的脱水によって４−オキソ−２−ペンテン酸へ転換される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記４−オキソ−２−ペンテン酸がレブリン酸へ還元される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記レブリン酸が４−ヒドロキシペンタン酸へ還元される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記４−ヒドロキシペンタン酸が４−バレロラクトンへ環化される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記４−ヒドロキシ２−オキソ−ペンタン酸が２−オキソ４−バレロラクトンへ環化され、場合により、４−バレロラクトンへ転換される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの中間体の酸基が補酵素Ａチオエステルへ転換される、請求項１４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
さらに、前記補酵素Ａチオエステルからエステルへの転換を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アセチルアルデヒドが、微生物宿主におけるピルベートの脱炭酸によって調製される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３２】
前記アルドール付加がＩ型アルドラーゼによって生じる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記アルドラーゼが、大腸菌ＨＫＰアルドラーゼ、またはその相同体もしくは突然変異体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記アルドール付加がＩＩ型アルドラーゼによって生じる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記アルドラーゼが、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｐｕｔｉｄａ）ＨｐａＩアルドラーゼ、またはその相同体もしくは突然変異体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アルドラーゼが、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  Ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）ＢｐｈＩアルドラーゼ、またはその相同体もしくは突然変異体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記アルドラーゼが宿主発酵生物中で発現される、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記化合物がレブリン酸またはそのエステルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記レブリン酸が１，４ペンタンジオールまたはジフェノール酸へ転換され、これは場合により、重合され得るか、あるいは他のポリマー構成要素と共重合され得る、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記レブリン酸またはそのエステルがメチルテトラヒドロフランまたはδ−アミノレブリン酸へ転換され、これは場合により、除草剤組成物中に組み込まれ得る、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記レブリン酸またはエステルが、場合により他の高分子構成要素とのコポリマーとして、さらに重合される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記レブリン酸またはそのエステルが、燃料添加剤として、またはプラスチックおよび他のポリマーの製造のためのモノマー／コポリマーとして使用されるケタールへ転換される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記化合物がラクトンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ラクトンが４−バレロラクトンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記４−バレロラクトンが、吉草酸もしくは吉草酸エステル、異性体ブテン、ブタジエン、または少なくとも５個の炭素のアルケンのうちの１つまたは複数へ転換される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記吉草酸、吉草酸エステルまたはアルケンがさらに、化学的または生物学的にアルカンへ還元される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ラクトンがアンゲリカラクトンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記ラクトンが２−オキソ−バレロラクトンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記ラクトンが２−ヒドロキシ−バレロラクトンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記ラクトンが５−ヒドロキシ−５−メチルジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記ラクトンが５−ヒドロキシ−５−メチルフラン−２（５Ｈ）−オンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
前記ラクトンが、アルファ’−アンゲリカラクトンまたはアルファ−アンゲリカラクトンへ酸化される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記ラクトンがプロトアネモニンへ酸化される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記４−バレロラクトンがホルムアルデヒドと反応されて、メチレンメチルブチロラクトンを生じる、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記ラクトンが、場合により他の高分子構成要素とのコポリマーとして、さらに重合される、請求項５〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
請求項４１または５５の方法を含む、高分子材料またはポリマー含有産物の製造方法。
【請求項５７】
前記高分子材料がナイロン、ゴム、ポリアクリレートまたはプラスチックである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項４０または４２に記載の方法を含む、除草剤または燃料添加剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１０年８月３０日に出願され、参照によって本明細書に援用される米国仮特許出願第６１／３７８，１９９号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
レブリン酸、または４−オキソペンタン酸は、式ＣＨ３Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈを有する有機化合物である。これは、ケト酸である。レブリン酸は通常、化学的に、例えば、スクロースを濃塩酸と共に加熱することによって調製される。プロセスはグルコースの仲介によって進行し、フルクトースへ、そして次にヒドロキシメチルフルフラールへ異性化される。
【０００３】
レブリン酸は、ナイロン様ポリマー、合成ゴム、およびプラスチックに対する潜在的な前駆体である。レブリン酸は、例えば医薬品の合成における多用途の合成中間体であり、そしてメチルテトラヒドロフラン、バレロラクトン、およびレブリン酸エチルなどの他の化学商品の工業生産における前駆体である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
特定の態様および実施形態では、本発明は、糖またはその他の炭素源から得られるピルベートを、レブリン酸などの有用なＣ５材料へ転換するための化学的経路を提供する。例示的なＣ５化合物は、図１および２に示される。糖を炭素源として使用する場合、この経路の鍵は、Ｃ６糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトースなどであるが、これらに限定されない）および／またはＣ５糖（例えば、キシロース、アラビノースなどであるが、これらに限定されない）をピルベートへ転換し、続いて化学的または生化学的なアルドール付加、酸化、還元、脱水および環化反応により、ピルベートを１つまたはいくつかの有用なＣ５化合物へ転換することである。脂肪酸およびグリセロールなど（限定はされない）の別の炭素源と共に使用される場合、炭素源はまずピルベートへ転換され、続いて以下の一般式：Ｃ５Ｃ４（Ｘ）Ｃ３Ｃ２（Ｙ）Ｃ１（＝Ｏ）（Ｚ）を有する線状Ｃ５ケト酸もしくはエステルまたはこれらの環化誘導体を含む、１つまたはいくつかの有用なＣ５化合物へ転換される。上記式中、Ｘはヒドロキシルまたはケトン酸素のいずれかであり、Ｙは水素、ヒドロキシルまたはケトン酸素のいずれかであり、Ｃ３およびＣ２炭素間の結合は単結合または二重結合（例えば、飽和または不飽和）のいずれかであり、そしてＺはエステル、チオエステルまたはカルボン酸官能基のいずれかを作るようにアルコキシ、スルフィドまたはフェノキシ基である。いくつかの実施形態では、Ｃ５化合物はＣ５Ｃ４（Ｏ１）Ｃ３Ｃ２（Ｙ）Ｃ１（＝Ｏ）（Ｏ１）であり、式中、指標「Ｏ１」は、環状エステル、またはラクトンが形成されるように同じ酸素原子を指し、Ｙは水素またはヒドロキシルまたはケトン酸素のいずれかである。全ての他の原子価または結合は、上記でそうでないと示されない限り、水素原子であると考えられる。
【０００５】
１つの態様では、本発明は、Ｃ５ケト酸もしくはエステル、またはＣ５ヒドロキシ酸もしくはエステル、またはこれらの環状誘導体である化合物を製造するための方法を提供する。この方法は、アルドール付加によってピルベートをＣ５中間体へ転換するステップと、化学工程もしくは酵素工程またはこれらの組み合わせによってＣ５中間体を前記化合物へ転換するステップとを含む。特定の実施形態では、Ｃ５化合物は、上記のような一般式Ｃ５Ｃ４（Ｘ）Ｃ３Ｃ２（Ｙ）Ｃ１（＝Ｏ）（Ｚ）またはＣ５Ｃ４（Ｏ１）Ｃ３Ｃ２（Ｙ）Ｃ１（＝Ｏ）（Ｏ１）を有する。特定の実施形態では、化合物は、微生物宿主のための炭素源として適切な５−炭素および／または６−炭素糖または原料から調製される。これらの実施形態では、本方法は、糖または原料からのピルベートの形成（例えば、微生物宿主によって）と、ピルベートへのアセチルアルデヒドのアルドール付加（例えば、微生物宿主または無細胞系において）とを含み、これにより、所望のＣ５化合物を調製するための中間体として、５−炭素ケト酸が調製される。アルドール付加のためのアセチルアルデヒドは、微生物宿主中でピルベートの脱炭酸によって調製することができる。アルドール付加産物はさらに、１つまたは複数の還元、酸化、脱水、基の転移、加水分解および／またはラクトン化反応を受けて（例えば、それぞれ独立して、微生物宿主または無細胞系において）、所望のＣ５産物が調製される。
【０００６】
このような産物は、商業的に有用な化学薬品および燃料を調製するための構成要素として使用することができる。例えば、２−オキソ−バレロラクトン（図２の化合物Ｌ７）、２−ヒドロキシ−バレロラクトン（図２の化合物Ｌ６）、アンゲリカラクトン（図２の化合物Ｌ２、Ｌ３およびＬ１０）および４−バレロラクトン（γ−バレロラクトン、図２の化合物Ｌ１）などのラクトンは、溶媒として使用することができる。アンゲリカラクトンおよび４−バレロラクトンは、化学的にメチレンメチルブチロラクトン（ＭｅＭＢＬ）へ転換することもできる（この転換を触媒するための方法については、例えば、国際公開第２００６／０１５０２３号パンフレット、国際公開第２００６／０１５０２４号パンフレットを参照）。メチレンメチルブチロラクトンをモノマーまたはコポリマーとして使用して、エレクトロニクスおよび自動車用途において広く使用されるポリメチルアクリレート（ＰＭＭＡ）ポリマーの熱耐性を増大させる、あるいはポリマー全体を製造する（Ｐｏｌｙ（ＭｅＭＢＬ）など、例えば国際公開第２００５／０２８５２９号パンフレットを参照）ことができる。さらに、Ｂｏｚｅｌｌ  Ｊ．，「Ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｒｉｄｇｅ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９：５２２−５２３（２０１０）において概説されるように、４−バレロラクトンは、化学触媒作用を用いて、吉草酸そしてさらに吉草酸エステルへ、ならびに異性体ブテン、ブタジエンおよび他のアルケン（８個以上の炭素を有するアルケンを含む）へ転換され得る。レブリン酸（図１の化合物Ｐ１）は１，４ペンタンジオールおよびジフェノール酸へ転換され得るが、これらはいずれもポリマーを製造するために使用することができる。δ−アミノレブリン酸（レブリン酸からの誘導体）は、年間３００ポンドを超える推定市場を有する除草剤である。さらにまた、レブリン酸は、ピロリドン（国際公開第２００４／０８５０４８号パンフレット）、ピロリジノン（国際公開第２０１０／０６５８３３号パンフレット、国際公開第２００４／０８５３９０号パンフレット、国際公開第２００４／０８５３４９号パンフレット、国際公開第２００４／０８４６３３号パンフレット）、アンゲリカラクトン（国際公開第２００５／０９７７２３号パンフレット）、４−バレロラクトンおよび２−メチル−ＴＨＦへ転換させることができ、これらは最終産物であるか、あるいは、アニオン液（国際公開第２０１０／０６５８３３号パンフレット）、バイオ燃料および燃料添加剤などの種々の有用性を有する他の化合物へさらに変換され得る。レブリン酸はさらに、電池（例えば、特開０９１９０８２０号公報）、インク（米国特許第５，７６９，９２９号明細書）、コーティング（特開０６２８００４１号公報）、防食コーティング（欧州特許第４９６５５５号明細書）のための材料として使用することができる。レブリン酸エステル（Ｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ｅｓｔｅｒまたはｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ  ｅｓｔｅｒ、図１の化合物Ｐ９）は、それ自体が、そしてケタールに変換された後に、ポリマー構成要素であり（米国特許出願公開第２００８／０２４２７��１号明細書）、燃料添加剤として使用することもできる（参照によってその全体が本明細書に援用される米国特許第７，１５３，９９６号明細書に記載される）。さらに、レブリン酸エステルは、パーソナルケア製品（例えば、特開０５３２００２３号公報）、界面活性剤および潤滑剤（欧州特許第８８２７４５号明細書）、吸収剤（国際公開第１９９８／９８４３６８４号パンフレットを参照）において使用することができる。この段落で引用される全ての参考文献は、参照によって本明細書に援用される。
【０００７】
レブリン酸、レブリン酸エステル、および図２に記載されるラクトンの一部はいずれも、薬剤活性成分の製造および薬学的用途でも使用することができ、そのうちのいくつかは、Ｂｏｚｅｌｌ  Ｊ．，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ａｓ  ａ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」，Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ２８：２２７−２３９（２０００）に記載されている。例えば、国際公開第１９９５／０２２５２４号パンフレットには、抗癌剤として使用される新規のインドール誘導体の合成のためのレブリン酸メチルエステルの使用が報告されている。レブリン酸および４−ヒドロキシ−ペンタン酸は、多彩な潜在的用途を有するキラル試薬として使用することができる（例えば、Ｍｅｙｅｒｓら、「Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｌｋｙｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｒｉｇｉｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｅｍｏｔｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｎ  ｐ−ｆａｃｉａｌ  ａｄｄｉｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｌａｃｔａｍ  ｅｎｏｌａｔｅｓ．Ｓｔｅｒｅｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ」，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：７４２９−７４３８（１９９８年）を参照）。本発明によって製造されるＣ５の薬学的用途には、細菌中のクオラムセンシング分子機構をそこで妨害することによる、ブチロラクトンおよびバレロラクトン誘導体の抗生物質および抗バイオフィルム剤としての使用が含まれ得る（例えば、欧州特許第１７１６１３１号明細書および国際公開第２００６／１１７１１３号パンフレットを参照）。さらなる使用は、生物学的に活性なプロトアネモニン（図２の化合物Ｌ４）から得られる。最後に、レブリン酸およびエステルは、食品、フレーバーおよび香料（欧州特許第１５３３３６４号明細書）ならびに多数の消費者製品の添加剤に使用されている。例えば、レブリン酸は、タバコの添加剤として使用される（国際公開第２０１０／０５１０７６号パンフレット）。この段落中の全ての参考文献は参照によって本明細書に援用される。
【０００８】
本発明の特定の実施形態では、本方法は、ピルベートを４−バレロラクトンへ転換することを含む。別の実施形態では、本方法は、ピルベートをレブリン酸へ転換することを含む。別の実施形態では、本方法は、ピルベートを、レブリン酸エチルおよびレブリン酸プロピルなど（限定はされない）のレブリン酸エステル（レブリネート）へ転換することを含む。本発明の別の代替の実施形態では、本方法は、ピルベートをアンゲリカラクトン、アルファ−およびアルファ’−アンゲリカラクトンへ転換することを含む。さらに他の実施形態では、本方法は、ピルベートを２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸またはその環化形態の２−ヒドロキシ−４−バレロラクトンへ転換することを含む。さらに別の実施形態では、本方法は、ピルベートを２−オキソ−４−ヒドロキシ−ペンタン酸またはその環化形態の２−オキソ−４−バレロラクトンへ転換することを含む。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ピキア種、シュードモナス種、バチルス種、クリソスポリウム種、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を含むがこれらに限定されない真核生物、原核生物または古細菌発酵宿主において単一の代謝経路に組み込まれた多数の酵素工程を含む。これらおよび他の実施形態では、本方法は、無細胞系において実行される１つまたは複数の酵素工程、または化学触媒作用工程、またはこれらの組み合わせを含み、経路内の種々の中間体は、場合により、プロセスを完了するため必要に応じて発酵ブロスから分離および／または精製される。
【００１０】
本発明の特定の実施形態の利点は、中央代謝に基づいていることである。例えば、真核生物、原核生物および古細菌のＣ５およびＣ６代謝はいずれも解糖系を使用して、ピルベートを産生することができる。ピルベートは、中央代謝の最も重要な中間体の１つであり、解糖系に加えて、脂質代謝およびアミノ酸代謝から得ることができる。本発明の方法はピルベートを摂取して、２分子のピルベートをレブリン酸および４−バレロラクトンなどの１つのＣ５分子へ転換する。Ｃ６糖の場合、炭素収率は最大８０％になり得る。Ｃ５糖の場合、炭素収率は理論的には１００％に達し得る。本方法は、改変サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）およびピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）など（限定はされない）のＣ５およびＣ６を同時に発酵させることができる微生物株を使用すると、レブリン酸、４−バレロラクトンまたは図１および図２に示されるＣ５化合物のいずれかへの糖の直接発酵が可能になる。この達成可能な高収率は、レブリン酸またはガンマ−バレロラクトンを得るための代替の熱化学的方法（通常４０％以下のモル収率を生じる）と比較したときに、明白な産業的利点を示す。
【００１１】
本発明の一実施形態では、本方法は、糖の流れを、図１および２に記載されるＣ５化合物のうちの１つまたはいくつかへ転換する。別の実施形態では、プロセスの原料としてデンプンが使用される。別の実施形態では、本方法は、リグノセルロース原料（トウモロコシ茎葉、木材チップ、都市廃棄物、パルプおよび製紙工場スラッジを含むが、これらに限定されない）を、図１および２に記載されるＣ５化合物のうちの少なくとも１つへ転換する。
【００１２】
本発明の一実施形態では、本方法は、好ましくは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＣａｒｇｉｌｌのＣＢ１株（国際公開第２００７／１０６５２４号パンフレットに記載）、シュードモナス、クリソスポリウムおよび大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）など（限定はされない）の、Ｃ６糖の取込みおよび発酵の効率が高い発酵株において、Ｃ６糖を図１および２に記載されるＣ５化合物のうちの１つまたはいくつかへ転換する。本発明の別の実施形態では、本方法は、好ましくは、改変サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）など（限定はされない）の、Ｃ５糖の取込みおよび発酵の効率が高い発酵株において、Ｃ５糖を図１および２に記載されるＣ５化合物の１つまたはいくつかへ転換する。本発明の実施形態では、本方法は、好ましくは、Ｃ５およびＣ６糖の両方の取込みおよび発酵の効率が高い発酵株（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））において、Ｃ５およびＣ６糖を同時にＣ５化合物へ転換する。本発明の別の実施形態では、発酵株は、フランなど（限定はされない）のバイオマス加水分解物抑制剤と、低ｐＨまたは高有機酸価の培地とに対する高レベルの耐性を示す。
【００１３】
特定の実施形態では、原料は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、タロース、ガラクトース、フルクトース、プシコース、ソルボース、およびタガトースから選択される１つまたは複数のＣ６糖を含む。これらまたは他の実施形態では、原料は、キシロース、アラビノース、リボース、リキソース、キシルロース、およびリブロースから選択される１つまたは複数のＣ５糖を含む。
【００１４】
Ｃ５およびＣ６糖を４−ヒドロキシ−ペンタン酸または４−バレロラクトンへ転換するために本発明の方法が使用される場合、経路は、レドックス（還元−酸化）バランスが取られるように設計される：解糖系の中で２還元当量（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの形成）が生じてピルベートがもたらされ（１つのグルコース分子が２つのピルベート分子へ）、ピルベートから４−ヒドロキシ−ペンタン酸または４−バレロラクトン（γ−バレロラクトン）への下流プロセスによって、２還元当量が消費される（ＮＡＤ（Ｐ）の形成）。これらの２つの分子の産生のためにこの経路のレドックスバランスが取られているという事実は、発酵プロセスの場合に最適化された転換をもたらし、不均衡を相殺するために発酵宿主をさらに操作する必要性を低減または除去するであろう。他の化合物または構成要素の全て（図１）へ糖を直接的に発酵させるためには、発酵宿主は、経路のバランスを取るための別の副反応、あるいは経路のバランスを取るために適したレドックス当量の外部供給源に依存するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】レブリン酸（図１の化合物Ｐ１）、ならびに本明細書に記載されるプロセスの経路および種々の実施形態の異なる段階で産生され得る有用な誘導体（図１の化合物Ｐ１〜Ｐ１６）の分子式を示す。
【図２】本方法の種々の実施形態に従う経路の異なるステップで産生され得る種々のＣ５ラクトン（化合物Ｌ１〜Ｌ１０）の分子式を示す。
【図３】ピルベートを図１または図２のＣ５化合物のいずれかへ転換する生化学的プロセスの概略図を提供し、特定のステップが強調されている。いくつかの可能性のある化学中間体および副経路はここでは示されていない。異なる経路の可能性のより完全な描写については図５を参照されたい。
【図４】本発明の特定の実施形態に従う生化学的経路およびプロセスの概略図を提供し、酸化／還元ステップ（図３のステップ３および４に相当）の順序が反対にされている。図３と同様に、いくつかの可能性のある化学中間体および副経路はここでは示されていない。異なる経路の可能性のより完全な描写については図６を参照されたい。
【図５】図３の生化学的経路／プロセスの概略図を提供し、ステップ４およびステップ５は崩壊されて、酸化的デヒドラターゼを用いる１つのステップになる。
【図６】ピルベートを図１または２のＣ５化合物または構成要素のいずれかへ転換する生化学的経路／プロセスの詳細図を提供する。図３、４、および５に示される化学工程に加えて、中心経路からの中間体の環化反応から得ることができる異なる環状中間体と、環状ラクトン中間体から種々のＣ５化合物または構成要素へ至る化学変換とが示される。さらに、中心経路において中間体から得ることができる異なるＣｏＡ中間体も表される。経路はレブリニル−ＣｏＡを産生するために使用することができ、レブリニル−ＣｏＡから、レブリン酸および４−バレロラクトン、あるいはレブリネートおよび／または図１の４−オキソ−ペンタン酸エステル（化合物Ｐ９）などの他のペンタン酸エステルを容易に得ることができる。
【図７】チオエステラーゼまたはトランスフェラーゼのいずれかの作用によってレブリニル−ＣｏＡ中間体からレブリン酸エステル（レブリネート）およびレブリン酸を産生する原理を示す。側鎖Ｒは、メチル、エチル、プロピル、アリール、フェニル、ナフチルおよび他の芳香族基、ならびに酸素および窒素置換基（例えば、ケトン、第１級、第２級および第３級アルコール、第１級、第２級および第３級アミンなど）を有するアルキル基など（限定はされない）の任意の官能基であり得る。
【図８】２つのエン酸レダクターゼ酵素（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＡ６４５２２およびＡＡＤ１６１０６、図８で６００１および６００２と標識化）を基質４−オキソ−２−ペンテン酸（アセチルアクリル酸としても知られている、図１の化合物Ｐ２を参照）および対照としての基質シクロヘキセノンと反応させたときに得られる動力学的トレースを示す。「６００１  ａｃｅｔｏ」および「６００２  ａｃｅｔｏ」と標識化された曲線は、１００ｕＭのＮＡＤＰＨおよび基質４−オキソ−２−ペンテン酸の存在下におけるタンパク質の活性を示す。「６００１  ｃｙｃｌｏ」および「６００２  ｃｙｃｌｏ」と標識化された曲線は、１００ｕＭのＮＡＤＰＨおよび基質シクロヘキセノンの存在下におけるタンパク質の活性を示す。ＮＡＤＰＨから酸化形態ＮＡＤＰ＋への転換を判断する３４０ｎｍにおける吸収の低下がモニターされる。この曲線は、両方のタンパク質による基質４−オキソ−２−ペンテン酸からレブリン酸（図１の化合物Ｐ１）への転換を示す。対照曲線（「６００１  ｂｕｆｆｅｒ」および「６００２  ｂｕｆｆｅｒ」および「ｂｕｆｆｅｒ  ｃｙｃｌｏ」および「ｂｕｆｆｅｒ  ａｃｅｔｏ」と標識化）は、緩衝液中に基質だけ、または緩衝液中にタンパク質だけの場合の吸光度の低下を示す。これらの条件下では有意な活性は検出されない。全ての曲線は、リン酸カリウム緩衝液１００ｍＭ、ｐＨ７．０および室温（２５℃）において得られる。初期ＮＡＤＰＨ濃度は１００ｕＭであり、４−オキソ−２−ペンテン酸の初期濃度は１００ｍＭであり、シクロヘキセノンの初期濃度は５０ｍＭである。タンパク質濃度は様々である。
【図９】シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｐｕｔｉｄａ）からのＩＩ型アルドラーゼ酵素、ＨｐａＩアルドラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＤＡ６３５１８）の、基質アセトアルデヒドおよびピルベートに対する活性を実証する。アッセイ条件は以下の通りであった：タンパク質を大腸菌から発現させてＮｉ精製し、１００ｍＭのＭｎＣｌ２が補充されたＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）中、１００ｍｇ／ｍｌ初期濃度でアセトアルデヒドおよびピルベートの混合物と反応させた。タンパク質および基質を室温で３０分間インキュベートした後、ＨＣｌによりクエンチングし、ＥＰＩＣ極性カラムを用いるＨＰＬＣにかけた。図９は得られたＨＰＬＣトレースを示し、基質および産物に相当するピークは黒い矢印で図中に示される。産物４−ヒドロキシ、２−オキソペンタン酸の化学的同一性は、ＬＣ／ＭＳ（データは示さず）によって確認した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
特定の態様および実施形態では、本発明は、糖またはその他の炭素源から得られるピルベートを、レブリン酸などの有用なＣ５材料へ転換するための化学的経路を提供する。概念的に、本発明の方法は、少なくとも２段階、いくつかの実施形態では、４〜８段階、例えば７〜８段階（図３に示される中心の８つのステップを参照）に構築される経路を提供し、経路に沿って得られる中間体の最大４つの付加的な環化ステップを有する。多数の段階の中間体を補酵素Ａ（ＣｏＡ）部分に付着させると、経路は、レブリニル−ＣｏＡなどのＣｏＡ中間体を導くことができる（図６を参照）。さらに、４つの任意選択的なステップは、経路中の重要な中間体の環化変異体を導くことができる（再度図６を参照）。
【００１７】
種々の実施形態によると、第１のステップは、糖（バイオマスなどに由来）をピルベートへ転換する解糖系であるか、あるいは糖からピルベートへの任意の化学的変換である。第２のステップは、２分子のピルベートを１分子の４−ヒドロキシ２−オキソ−ペンタン酸およびＣＯ２へ転換する。任意選択的な環化ステップは、対応するラクトンの２−オキソ−４−バレロラクトンを生じる。任意選択的なＣｏＡ付着ステップは、４−ヒドロキシ−２−オキソペンタノイル−ＣｏＡをもたらすことができる。第３のステップは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸を２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸へ、あるいは４−ヒドロキシ−２−オキソペンタノイル−ＣｏＡを２，４−ジヒドロキシ−ペンタノイル−ＣｏＡへ、あるいは２−オキソ−４−バレロラクトンを２−ヒドロキシ−４−バレロラクトンへ還元する。任意選択的な環化ステップは、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸または２，４−ジヒドロキシ−ペンタノイル−ＣｏＡのいずれかから、対応するラクトンの２−ヒドロキシ−４−バレロラクトンを生じる。任意選択的なＣｏＡ付着ステップは、２，４−ジヒドロキシペンタン酸から、２，４−ジヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡをもたらす。第４のステップは、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸を２−ヒドロキシ−４−オキソ−ペンタン酸へ、あるいは２，４−ジヒドロキシ−ペンタノイル−ＣｏＡを２−ヒドロキシ−４−オキソ−ペンタノイル−ＣｏＡへ酸化する。任意選択的なＣｏＡ付着ステップは、２−ヒドロキシ−４−オキソ−ペンタン酸を２−ヒドロキシ−４−オキソペンタノイル−ＣｏＡへ転換する。第５のステップは、２−ヒドロキシ−４−オキソ−ペンタン酸を４−オキソ−２−ペンテン酸へ、あるいは２−ヒドロキシ−４−オキソ−ペンタノイル−ＣｏＡを４−オキソ−２−ペンテノイル−ＣｏＡへ脱水する。任意選択的なＣｏＡ付着ステップは、４−オキソ−２−ペンテン酸を４−オキソ−２−ペンテノイル−ＣｏＡへ転換する。任意選択的なステップは、４−オキソ−２−ペンテン酸を４−ヒドロキシ−２−ペンテン酸へ、あるいは４−オキソ−２−ペンテン酸を４−ヒドロキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡへさらに還元し、これらはいずれも、場合により環化されてアンゲリカラクトンを生じ得る。別の任意選択的なＣｏＡ付着ステップは、４−ヒドロキシ−２−ペンテン酸から４−ヒドロキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡをもたらし、これもやはり場合により環化されてアンゲリカラクトンを生じ得る。本発明の代替の実施形態は、第４および第５のステップを単一のステップに「崩壊させる（ｃｏｌｌａｐｓｅ）」。第６のステップは、上記と同様の方法で、４−オキソ−２−ペンテン酸の還元によってレブリン酸（４−ヒドロキシ−ペンタン酸）を生成する。任意選択的なステップは、補酵素Ａ（ＣｏＡ）をレブリン酸に付着させ、レブリニル−ＣｏＡが得られる。次に、レブリニル−ＣｏＡは、適切なアルコールと反応するトランスフェラーゼの使用により、様々なレブリン酸エステルへ変換され得る。いくつかの実施形態では、第７のステップはレブリン酸をさらに還元して、４−ヒドロキシ−ペンタン酸を生じる。第８のステップは４−ヒドロキシ−ペンタン酸を環化して、４−バレロラクトンを生成する。
【００１８】
特定の実施形態では、ステップ４および５は、単一の変換である酸化的脱水において実行することができる。本発明の別の実施形態では、ステップ３および４は、２−ヒドロキシ−４−オキソ−ペンタン酸がまず２，４−ジオキソ−ペンタン酸へ酸化され、さらに２−オキソ−４−ヒドロキシ−ペンタン酸へ還元されるように順序が反対にされ、図３の経路は図４に表される経路になる。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、ステップ３、５および６（図３）は、それぞれのラクトンＬ１、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９およびＬ１０において直接実行され、この場合、図６に記載される環化ステップのいずれか１つにおいて，ピルベートおよびアセトアルデヒドから最初に産生される直鎖中間体からの分枝が生じる。本発明のこの実施形態を用いて、ラクトンを直接得るか、あるいは加水分解の後に、化合物Ｐ１〜Ｐ１６（レブリン酸を含む）のいずれかを取り戻すことができる。
【００２０】
本発明のさらに別の態様では、ステップ２、３、４、５および６（図３）は、ＣｏＡ中間体において実行され、この場合、図６の段落に記載されるＣｏＡ付着ステップのいずれか１つにおいて、ピルベートおよびアセトアルデヒドから最初に産生される直鎖中間体からの分枝が生じる。本発明のこの実施形態を用いて、チオエステラーゼの使用により化合物Ｐ１〜Ｐ１６（レブリン酸を含む）のいずれかを得ることができる。レブリン酸エステル（Ｐ９）は、トランスフェラーゼの使用によって、レブリニル−ＣｏＡおよび適切なアルコールから得ることができる。
【００２１】
ステップ１：糖からピルベートへの転換
糖からピルベートへの転換は、十分に研究された代謝経路である解糖系の一部である。解糖系では、多数の酵素の作用の結果、グルコースなどのＣ６糖の各分子が、２分子のピルベート、２分子のＡＴＰ、および２つのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ分子の形態の２還元当量へ転換される。
【００２２】
本発明の一実施形態では、ピルベートは発酵生物の解糖系から得られ、続いて、発酵宿主の下流経路で使用される。代替の実施形態では、ピルベートは発酵ブロスから分離され、続いて下流経路に従って処理される。
【００２３】
ステップ２：ピルベートから４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸への転換
４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸は、アセトアルデヒド（アルデヒド）のピルベート（αケト酸）へのアルドール付加によって生成することができる。付加は、１当量のアセトアルデヒドを１当量のピルベートと反応させる。アセチルアデヒドは、種々の方法で得ることができる。例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼは、ピルベートからアセトアルデヒドへの非酸化的脱炭酸を触媒する。従って、多数の真核生物または原核生物源（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｃｙｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））からのピルビン酸デカルボキシラーゼを使用することができる。本発明の好ましい実施形態では、アセチルアデヒドは、酵素ピルビン酸デカルボキシラーゼを用いてピルベートから生成される。
【００２４】
ピルベートとアセトアルデヒドとの間のアルドール付加を触媒することが示されている多数のアルドラーゼが単離されている。Ｉ型アルドラーゼの４−ヒドロキシ−２−ケト−ペンタン酸アルドラーゼ（ＨＫＰアルドラーゼ）は、Ｓｃｈｉｆｆ塩基リジンを用いるアルドラーゼであり、正および逆反応を触媒する。本発明の一実施形態では、ピルベートとアセトアルデヒドとの間のアルドール付加は、Ｐｏｌｌａｒｄ，ＪＲら，「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｋｅｔｏ−ｐｅｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ａｌｄｏｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅ．Ｃｏｌｉ」，Ａｐｐｌ．Ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６４（１０）：４０９３−４０９４（１９９８年）に記載される大腸菌からのＨＫＰアルドラーゼ、またはその相同体、またはその突然変異体（これらの突然変異体は、場合により、コンピュータによる設計、定向進化技術もしくは合理的な変異誘発、またはこれらの組み合わせを用いるタンパク質工学により得られる）によって触媒される。コンピュータによる設計技術は、米国特許出願公開第２００９−０１９１６０７号明細書および国際公開第２０１０／０７７４７０号パンフレットに開示されており、これらは参照によってその全体が本明細書に援用される。
【００２５】
少なくとも２つのＩＩ型アルドラーゼがピルベートとアセトアルデヒドとの間の付加を触媒することが知られており、２つ（ＢｐｈＩおよびＨｐａＩ）は、Ｗａｎｇ  Ｗら，「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｍｅｔａｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｋｉｎｅｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９：３７７４−３７８２（２０１０年）においてある程度詳細に特徴付けられている。これらの酵素は金属補助因子（ＺｎまたはＭｎのいずれかが一般的である）を用いる。ＢｐｈＩおよびＨｐａＩは、検出可能な配列類似性を共有しない。ＢｐｈＩは立体選択的であり、４Ｓ付加物をもたらすが、ＨｐａＩは、その非常に開放性の活性部位のために、ラセミ混合物（４Ｒおよび４Ｓ付加物）を生じる。ＢｐｈＩは、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼのＢｐｈＪにアロステリックに結合され、単離されて発現されると活性および安定ではない。しかしながら、ＨｐａＩは大腸菌において自然に発現可能であり、活性を示す。本発明の代替の実施形態では、ピルベートとアセトアルデヒドとの間のアルドール付加は、ＨｐａＩもしくはＢｐｈＩ、またはこれらの突然変異体（これらの突然変異体は、場合により、コンピュータによる設計、定向進化技術もしくは合理的な変異誘発、または３つの組み合わせを用いるタンパク質工学により得られる）によって触媒される。
【００２６】
拡張として、任意の適切なピルビン酸アルドラーゼおよびアルデヒドのケトンへのアルドール付加を触媒する他の同様のアルドラーゼ（例えば、ＫＤＰＧアルドラーゼ）は、考えられる限り、アセトアルデヒドのピルベートへのアルドール付加を触媒するように再設計され得る。再設計は、ピルベートおよびアセトアルデヒドの両方に対する所望の基質特異性を達成するステップと、ラセミ体またはエナンチオピュアな付加物（（Ｒ）４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸および（Ｓ）４−ヒドロキシ−３−オキソ−ペンタン酸）のいずれかを生成するように所望の立体選択性を調節するステップと、本発明が実施される工業条件で所望の触媒活性を得るために酵素を安定化（例えば、熱安定化またはより高い有機価（ｏｒｇａｎｉｃ  ｔｉｔｅｒ）中での安定化）するステップと、そして／あるいは、本発明が実施される工業条件（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の代謝経路において）との関連で酵素の発現可能性および溶解度を改善するステップとを含むことができるが、これらに限定されない。本発明の別の実施形態では、ピルベートとアセトアルデヒドとの間のアルドール付加は、ピルビン酸アルドラーゼ、またはその任意の相同体および突然変異体（これらの突然変異体は、場合により、コンピュータによる設計、定向進化技術もしくは合理的な変異誘発、または３つの組み合わせを用いるタンパク質工学により得られる）によって触媒される。
【００２７】
最後に、Ｚａｎｇｈｅｌｌｉｎｉ，Ａら，「Ｎｅｗ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ａｎｄ  ａｎ  ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｄｅｓｉｇｎ」，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５：２７８５−２７９４（２００６年）に記載されるものなどの新規の酵素設計技術を用いて、天然に存在するかもしれないし存在しないかもしれない基質のための新しいアルドラーゼ酵素を設計することが可能である。参照によってその全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９−０１９１６０７号明細書に記載されるように、最大７０のこのようなアルドラーゼが新規に設計されている。この方法論を基質ピルベートおよびアセトアルデヒドに適用すると、所望の活性を有するアルドラーゼをもたらすことができる。本発明の別の実施形態では、ピルベートとアセトアルデヒドとの間のアルドール付加は新規に設計されたアルドラーゼによって触媒される。
【００２８】
ステップ２’：４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸から２−オキソ−４−バレロラクトンへの環化
４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸は、２−ヒドロキシ−４−バレロラクトン（図１の化合物Ｌ７）へ環化される。酸性〜中性の溶液中では、熱力学的平衡はラクトンへの環化の方向にある。ラクトンへの環化は、化学触媒作用または生化学触媒作用のいずれかの使用によって動力学的に増強され得る。ラクトン化のための均一および不均一触媒には、強酸条件（例えば、硫酸）、金属触媒（例えば、パラジウム、ルビジウム）が含まれる。例えば、Ｍａｒｔｉｎ  ＣＨら，「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ４−ｖａｌｅｒｏｌａｃｔｏｎｅ  ｆｒｏｍ  ｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０」，Ａｐｐｌ．ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７６（２）：４１７−４２４で実証されるように、生化学触媒作用は、正方向のラクトン化反応（低〜中性ｐＨ／高有機溶媒価）を支持する条件下で、リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼおよびラクトナーゼの作用によって得ることができる。
【００２９】
本発明の一実施形態では、２−オキソ−４−バレロラクトンは、発酵ブロスまたは無細胞溶液から４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸を分離した後、触媒の存在下で４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸から生じる。本発明の別の実施形態では、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸から２−オキソ−４−バレロラクトンへのラクトン化は、リパーゼもしくはエステラーゼもしくはプロテアーゼもしくはラクトナーゼ、またはこれらの突然変異体（これらの突然変異体は場合により、コンピュータによる設計、定向進化技術、合理的な変異誘発、または３つの組み合わせを用いるタンパク質工学により得られる）によって直接触媒される。
【００３０】
ステップ３：４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸から２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸への還元
様々な種類の天然デヒドロゲナーゼの中で、コンピュータでのおよび／または実験的なスクリーニングにより、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸および２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸を許容する基質特異性を有するデヒドロゲナーゼを選択することができる。さらに、コンピュータによる設計、定向進化技術もしくは合理的な変異誘発、または３つの組み合わせを用いて、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸および２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸に対する現存のデヒドロゲナーゼの基質特異性を変更または増大することができる。適切なデヒドロゲナーゼの出発点の例には、Ｌ−およびＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈまたはヘム依存性、真核生物または細菌に由来）、リンゴ酸、アスパラギン酸およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性、真核生物または細菌由来）、ならびにアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性アルキルまたはフェニルアルコールデヒドロゲナーゼ）が含まれる。このようなデヒドロゲナーゼの例は、実施例セクションに記載されている。
【００３１】
本発明の一実施形態では、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸は、均一または不均一な化学触媒作用を用いて選択的に２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸に還元される。２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸は、このステップを完了するために、発酵または無細胞溶液から分離／精製されてもよいし、されなくてもよい。好ましくは、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸は、溶液または発酵ブロスから分離された後、続いて前記還元を受ける。
【００３２】
本発明の一実施形態では、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸の２位におけるケトンの還元を触媒するためにＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性デヒドロゲナーゼが使用される。別の実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸に対して高度の基質特異性を有して、そして２位のケトンに対して非常に位置選択的に、ケトンを還元する。本発明の一実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは立体選択的ではなく、４Ｒおよび４Ｓエナンチオマーの両方を受容することができる。本発明の別の実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸の４Ｒまたは４Ｓエナンチオマー形態のいずれかを選択的に還元する。
【００３３】
本発明の別の実施形態では、好ましくは、高度の基質および位置選択性を有するＦＡＤ依存性デヒドロゲナーゼが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性デヒドロゲナーゼの代わりに使用される。本発明の一実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは立体選択的ではなく、４Ｒおよび４Ｓエナンチオマーの両方を受容することができる。本発明の別の実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸の４Ｒまたは４Ｓエナンチオマー形態のいずれかを選択的に還元する。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、好ましくは、高度の基質および位置選択性を有するＦＭＮ依存性デヒドロゲナーゼが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性デヒドロゲナーゼの代わりに使用される。本発明の一実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは立体選択的ではなく、４Ｒおよび４Ｓエナンチオマーの両方を受容することができる。本発明の別の実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸の４Ｒまたは４Ｓエナンチオマー形態のいずれかを選択的に還元する。
【００３５】
本発明のさらに別の実施形態では、好ましくは、高度の基質および位置選択性を有するフェリシトクロム依存性デヒドロゲナーゼが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性デヒドロゲナーゼの代わりに使用される。本発明の一実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは立体選択的ではなく、４Ｒおよび４Ｓエナンチオマーの両方を受容することができる。本発明の別の実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸の４Ｒまたは４Ｓエナンチオマー形態のいずれかを選択的に還元する。
【００３６】
本発明のさらに別の実施形態では、好ましくは、高度の基質および位置選択性を有するキノン依存性デヒドロゲナーゼが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性デヒドロゲナーゼの代わりに使用される。本発明の一実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは立体選択的ではなく、４Ｒおよび４Ｓエナンチオマーの両方を受容することができる。本発明の別の実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸の４Ｒまたは４Ｓエナンチオマー形態のいずれかを選択的に還元する。
【００３７】
ステップ３’：２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸から２−ヒドロキシ４−バレロラクトンへの環化
２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸は、２−ヒドロキシ−４−バレロラクトン（図１の化合物Ｌ６）へ環化される。酸性〜中性の溶液中では、熱力学的平衡は４−バレロラクトンへの環化の方向にある。熱力学的平衡ならびに化学および生化学触媒作用について、上記と同じ所見が保持される。
【００３８】
本発明の一実施形態では、２−ヒドロキシ−４−バレロラクトンは、発酵ブロスまたは無細胞溶液から２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸を分離した後、触媒の存在下で２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸から生じる。本発明の別の実施形態では、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸から２−ヒドロキシ−４−バレロラクトンへのラクトン化は、リパーゼもしくはエステラーゼもしくはプロテアーゼもしくはラクトナーゼ、またはこれらの突然変異体（これらの突然変異体は、コンピュータによる設計、定向進化技術もしくは合理的な変異誘発、または３つの組み合わせを用いるタンパク質工学により得られる）によって直接触媒される。
【００３９】
ステップ４：２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸から４−オキソ−２−ヒドロキシ−ペンタン酸への酸化
本発明の一実施形態では、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸は、不均一または不均一な化学触媒作用を用いて、４−オキソ−２−ヒドロキシ−ペンタン酸へ選択的に酸化される。２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸は、このステップを完了するために、発酵または無細胞溶液から分離／精製されてもよいし、されなくてもよい。好ましくは、４−オキソ−２−ヒドロキシ−ペンタン酸は、溶液または発酵ブロスから分離された後、続いて前記酸化を受ける。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態では、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸の４位のヒドロキシルの酸化を触媒するために、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性デヒドロゲナーゼが使用される。好ましい実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、２，４−ジヒドロキシペンタン酸に対して高度の基質特異性を有して、そして４位のヒドロキシルに対して非常に位置選択的に、ヒドロキシルを酸化する。好ましくは、前記デヒドロゲナーゼは、２，４−ジヒドロキシペンタン酸の４つの異なるエナンチオマー（２Ｒ４Ｒ、２Ｒ４Ｓ、２Ｓ４Ｒ、２Ｓ４Ｓ）を受容する。代替の実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸の先の還元から得られる最も豊富なエナンチオマーがどちらであっても、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸の２Ｒ（２Ｒ４Ｒ、２Ｒ４Ｓ）または２Ｓ（２Ｓ４Ｒ、２Ｓ４Ｓ）エナンチオマーのいずれかを選択的に酸化している。このようなデヒドロゲナーゼの例は、実施例セクションに記載されている。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸の４位のヒドロキシルの酸化を触媒するために、ＦＡＤ依存性デヒドロゲナーゼが使用される。好ましい実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸に対して高度の基質特異性を有して、そして４位のヒドロキシルに対して非常に位置選択的に、ヒドロキシルを酸化する。好ましくは、前記デヒドロゲナーゼは、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸の４つの異なるエナンチオマー（２Ｒ４Ｒ、２Ｒ４Ｓ、２Ｓ４Ｒ、２Ｓ４Ｓ）を受容する。代替の実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸の還元から得られる最も豊富なエナンチオマーがどちらであっても、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸の２Ｒ（２Ｒ４Ｒ、２Ｒ４Ｓ）または２Ｓ（２Ｓ４Ｒ、２Ｓ４Ｓ）エナンチオマーのいずれかを選択的に酸化している。
【００４２】
本発明の別の実施形態では、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸の４位のヒドロキシルの酸化を触媒するために、ＦＭＮ依存性デヒドロゲナーゼが使用される。好ましい実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸に対して高度の基質特異性を有して、そして４位のヒドロキシルに対して非常に位置選択的に、ヒドロキシルを酸化する。好ましくは、前記デヒドロゲナーゼは、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸の４つの異なるエナンチオマー（２Ｒ４Ｒ、２Ｒ４Ｓ、２Ｓ４Ｒ、２Ｓ４Ｓ）を受容する。代替の実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸の還元から得られる最も豊富なエナンチオマーがどちらであっても、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸の２Ｒ（２Ｒ４Ｒ、２Ｒ４Ｓ）または２Ｓ（２Ｓ４Ｒ、２Ｓ４Ｓ）エナンチオマーのいずれかを選択的に酸化している。
【００４３】
本発明のさらに別の実施形態では、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸の４位のヒドロキシルの酸化を触媒するために、フェリシトクロム依存性デヒドロゲナーゼが使用される。好ましい実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸に対して高度の基質特異性を有して、そして４位のヒドロキシルに対して非常に位置選択的に、ヒドロキシルを酸化する。好ましくは、前記デヒドロゲナーゼは、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸の４つの異なるエナンチオマー（２Ｒ４Ｒ、２Ｒ４Ｓ、２Ｓ４Ｒ、２Ｓ４Ｓ）を受容する。代替の実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸の還元から得られる最も豊富なエナンチオマーがどちらであっても、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸の２Ｒ（２Ｒ４Ｒ、２Ｒ４Ｓ）または２Ｓ（２Ｓ４Ｒ、２Ｓ４Ｓ）エナンチオマーのいずれかを選択的に酸化している。
【００４４】
本発明のさらに別の実施形態では、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸の４位のヒドロキシルの酸化を触媒するために、キノン依存性デヒドロゲナーゼが使用される。好ましい実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、２，４−ジヒドロキシペンタン酸に対して高度の基質特異性を有して、そして４位のヒドロキシルに対して非常に位置選択的に、ヒドロキシルを酸化する。好ましくは、前記デヒドロゲナーゼは、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸の４つの異なるエナンチオマー（２Ｒ４Ｒ、２Ｒ４Ｓ、２Ｓ４Ｒ、２Ｓ４Ｓ）を受容する。代替の実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸の還元から得られる最も豊富なエナンチオマーがどちらであっても、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸の２Ｒ（２Ｒ４Ｒ、２Ｒ４Ｓ）または２Ｓ（２Ｓ４Ｒ、２Ｓ４Ｓ）エナンチオマーのいずれかを選択的に酸化している。
【００４５】
ステップ５：４−オキソ−２−ヒドロキシ−ペンタン酸から４−オキソ−２−ペンテン酸への脱水
古典的には、化学的な脱水は、１００℃よりも高い温度、濃縮酸（４．０Ｍの硫酸）および／または金属酸化物触媒（酸化亜鉛またはアルミニウム）などの均一または不均一な触媒作用のいずれかによって達成される。本発明の一実施形態では、還元および酸化ステップの後に得られる４−オキソ−２−ヒドロキシ−ペンタン酸は、均一または不均一触媒作用によって、４−オキソ−２−ペンテン酸へ化学的に脱水される。４−オキソ−２−ヒドロキシ−ペンタン酸は、このステップを完了するために、発酵または無細胞溶液から分離／精製されてもよいし、されなくてもよい。好ましくは、４−オキソ−２−ヒドロキシ−ペンタン酸は、溶液または発酵ブロスから分離された後、続いて前記脱水を受ける。
【００４６】
有機化合物の脱水は、あるいは、デヒドラターゼ酵素によって触媒され得る。数種類のデヒドラターゼが特徴付けられており、異なるメカニズム：ビタミンＢ１２依存性またはＳＡＭ依存性デヒドラターゼ（例えば、ジオールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼ）などにおけるラジカルに基づくメカニズム、鉄−硫黄含有デヒドラターゼ（例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、アコニターゼ）などのルイス酸メカニズム、および二酸デヒドラターゼ（例えば、酒石酸デヒドラターゼ）などのエノラートイオン中間体メカニズムに依存する。メカニズムは全て４−オキソ−２−ヒドロキシ−ペンタン酸の脱水に適用可能であるが、脱離されるヒドロキシルに対してβのカルボニルにおけるエノラートアニオンの形成はα−プロトンのｐＫａを低下させ、それにより一般酸／塩基群によって容易に引き抜きが可能になるので、エノラート中間体に依存するメカニズムが好まれる。付加的な一般酸／塩基群は、脱離する水分子をプロトン化する。例えば、Ｇｅｒｌｔら，「Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｏｌａｓｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｐｌａｙ  ｏｆ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３３：５９−７０（２００５年）に記載されるように、このメカニズムは、様々な種類の天然デヒドラターゼによって利用され、エノラーゼスーパーファミリーからのマグネシウム依存性デヒドラターゼ、例えば、酒石酸デヒドラターゼ、グルコン酸デヒドラターゼは、このメカニズムを高い基質特異性を有する構造的に様々な二酸の脱水のために使用する。フマラーゼ（フマル酸ヒドラターゼとしても知られている）は、エノラートに基づくマレートからフマレートへの可逆的な水和を触媒する。エノイルデヒドラターゼ（クロトナーゼとしても知られている）は、ＣｏＡチオエステルのエノラートアニオンを使用して、種々のＣｏＡ基質の可逆的な水和を触媒する（例えば、Ｈｏｌｄｅｎら，「Ｔｈｅ  Ｃｒｏｔｏｎａｓｅ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ｄｉｖｅｒｇｅｎｔｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｔｈａｔ  ｃａｔａｌｙｚｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ａｃｙｌ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｔｈｉｏｅｓｔｅｒｓ」，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：１４５−１５７（２００１年）を参照）。
【００４７】
本発明の一実施形態では、４−オキソ−２−ヒドロキシ−ペンタン酸から４−オキソ−２−ペンテン酸への脱水は、デヒドラターゼによって触媒される。本発明の好ましい実施形態では、前記デヒドラターゼはエノラート中間体を使用して、脱水を触媒する。好ましくは、前記デヒドラターゼは、エノラーゼスーパーファミリー、フマラーゼもしくはエノイル−ＣｏＡデヒドラターゼスーパーファミリーのメンバー、またはタンパク質工学によって得られるこれらの突然変異体である。本発明の好ましい実施形態では、前記デヒドラターゼは、４−オキソ−２−ヒドロキシ−ペンタン酸に対して高レベルの基質特異性を示す。本発明の別の好ましい実施形態では、前記デヒドラターゼは、４−オキソ−２−ヒドロキシ−ペンタン酸の２Ｒおよび２Ｓエナンチオマーを同等に脱水する。本発明の代替の実施形態では、前記デヒドラターゼは、４−オキソ−２−ヒドロキシ−ペンタン酸の２Ｒまたは２Ｓエナンチオマーのいずれかを選択的に脱水する。
【００４８】
ステップ４および５の代替案：
２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸から４−オキソ−２−ペンテン酸への２段階の転換の代わりに、酸化的脱水を用いて１段階の転換を達成することができる。酸化的脱水は、糖の代謝において一般的である。Ｉｓｈｉｙａｍａら，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ＦｌａＡ１  ｆｒｏｍ  ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｒｅｖｅａｌ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ  ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２８１（３４）：２４４８９−２４４９５（２００６年）にその構造の詳細が記載されている、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ反転４，６−デヒドラターゼなどのいわゆる４，６デヒドラターゼ酵素。本発明の一実施形態では、このような４，６−デヒドラターゼを使用して、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸から４−オキソ−２−ペンタン酸への酸化的脱水を触媒する。本発明の１つの態様では、前記４，６−デヒドラターゼはエナンチオ選択的であり、好ましくは、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸のエナンチオマーの１つ（２Ｒ４Ｒ、２Ｒ４Ｓ、２Ｓ４Ｒまたは２Ｓ４Ｓのいずれか）を脱水する。本発明の別の態様では、前記４，６−デヒドラターゼはエナンチオ選択的ではなく、２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸のエナンチオマーの２つ以上を同様の触媒効率で脱水する。本発明の好ましい実施形態では、４，６−デヒドラターゼは２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸において非常に活性であり、コンピュータによる設計、定向進化技術もしくは合理的な変異誘発、またはこれらの組み合わせを用いてタンパク質工学により天然４，６−デヒドラターゼから得られる。
【００４９】
ステップ６：４−オキソ−２−ペンテン酸から４−オキソ−ペンタン酸（レブリン酸）への還元
置換アルケンの二重結合は還元（水素化）されて、対応する飽和アルカンを得ることができる。Ｓｔｕｅｒｍｅｒら，「Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｂｉｏｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃ＝Ｃ  ｂｏｎｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｏａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｏｌｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆａｍｉｌｙ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．１１：２０３−２１３（２００７年）において概説されるように、置換アルケンは、化学触媒作用を用いて、あるいはエン酸レダクターゼなどの生体触媒を用いて通常は非対称的に還元することができる。エン酸レダクターゼは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびゼニゴケ属などの真核生物と、クロストリジウム属などの原核生物との両方から特徴付けられている。エン酸レダクターゼ酵素のファミリーは、酵素の代謝回転ごとに酸化するフラビン補因子（ＦＭＮ）に依存する。ニコチンアミド非依存性である１つの既知の場合を除いて、フラビン補因子は、次に、活性部位に同様に結合するニコチンアミド補因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかによって還元される。１回の代謝回転が完了すると、基質は還元されており、補因子ＮＡＤ（Ｐ）ＨはＮＡＤ（Ｐ）＋へ酸化されている。エン酸レダクターゼはその基質特異性に差がある。しかしながら、酵母およびクロストリジウムエン酸レダクターゼなどのいくつかのエン酸レダクターゼは広い基質特異性を有し、直鎖の置換アルケン（酸またはケトン官能基を有する）と、４−バレロラクトンなどの置換ラクトンとを適応させることができる。
【００５０】
本発明の一実施形態では、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸は、分離ブロスまたは無細胞溶液から分離され、不均一または不均一な触媒作用を用いて二重結合が選択的に還元される。
【００５１】
本発明の別の実施形態では、エン酸レダクターゼ酵素は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸をレブリン酸へ還元するために使用される。好ましい実施形態では、前記エン酸レダクターゼはＦＭＮＨ２およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ補因子の両方に依存し、前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ補因子は活性部位で使用されて、ＦＭＮＨ２を触媒作用前のその酸化還元状態へ再生する。本発明の好ましい実施形態では、前記エン酸レダクターゼは、発酵宿主においてクローン化および発現される。代替の実施形態では、前記エン酸レダクターゼは細胞外で使用されるか、あるいは適切な補因子再生システムにより無細胞系で使用される。別の代替の実施形態では、前記還元は、１つまたはいくつかのエン酸レダクターゼを発現する全細胞触媒によって触媒され、前記細胞は、経路の一部または全体が使用される発酵宿主細胞とは異なる。
【００５２】
ステップ７：４−オキソ−ペンタン酸（レブリン酸）から４−ヒドロキシ−ペンタン酸への還元
ステップ３（段落［００３７］〜［００４３］）と同様に、レブリン酸の４位のケトンの還元は、化学触媒作用手段またはデヒドロゲナーゼ生体触媒の使用のいずれかによって達成することができる。代謝経路との関連で、この最後の還元（および対応する１還元当量の酸化）は、Ｃ５および／またはＣ６糖からの経路全体のレドックスバランスを保証する。
【００５３】
本発明の一実施形態では、レブリン酸はブロスまたは無細胞溶液から分離され、４位のケトンは不均一または不均一な触媒作用を用いて選択的に還元されて、４−ヒドロキシ−ペンタン酸を生じる。
【００５４】
本発明の代替の実施形態では、ＮＡＤ（Ｐ）依存性デヒドロゲナーゼは、レブリン酸の４位のケトンから対応するヒドロキシルへの還元を触媒するために使用され、４−ヒドロキシ−ペンタン酸を生成する。好ましい実施形態では、レブリン酸に対して高度の基質特異性を有して、そして４位のケトンに対して非常に位置選択的に、前記デヒドロゲナーゼがケトンを還元する。好ましくは、前記デヒドロゲナーゼは、４−オキソ−２−ヒドロキシ−ペンタン酸の４位のヒドロキシルの酸化の場合と同じ酵素、またはその突然変異体（突然変異体は、コンピュータによる設計もしくは実験的変異誘発、または２つの組み合わせにより得られる）である。本発明の好ましい実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、４−ヒドロキシ−ペンタン酸のエナンチオマーの１つ（４Ｒまたは４Ｓ）を選択的に生成する。代替の実施形態では、前記デヒドロゲナーゼは、４−ヒドロキシ−ペンタン酸の４Ｒおよび４Ｓエナンチオマーのラセミ混合物を生成する。
【００５５】
ステップ８：４−ヒドロキシ−ペンタン酸から４−バレロラクトンへの環化
４−ヒドロキシ−ペンタン酸は、４−バレロラクトン（γ−バレロラクトンとしても知られている、図１の化合物Ｌ１）へ環化される。酸性溶液中で、熱力学的平衡は４−バレロラクトンへの環化の方向にある。熱力学的平衡ならびに化学および生化学触媒作用について、段落［００３５］と同じ所見が保持される。
【００５６】
本発明の一実施形態では、４−バレロラクトンは、発酵ブロスまたは無細胞溶液から４−ヒドロキシ−ペンタン酸を分離した後、触媒の存在下で４−ヒドロキシ−ペンタン酸から生じる。本発明の好ましい実施形態では、エナンチオピュアな４−ヒドロキシ−ペンタン酸（４Ｒまたは４Ｓエナンチオマーのいずれか）は、前記触媒によってエナンチオピュアな４−バレロラクトンへ転換される。代替の実施形態では、４−ヒドロキシ−ペンタン酸の２つのエナンチオマー（４Ｒおよび４Ｓ）のラセミ混合物は、前記触媒によって４−バレロラクトンのラセミ混合物へ転換される。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、４−ヒドロキシ−ペンタン酸から４−バレロラクトンへのラクトン化は、リパーゼもしくはエステラーゼもしくはプロテアーゼもしくはラクトナーゼ、またはこれらの突然変異体（これらの突然変異体は、コンピュータによる設計、定向進化技術もしくは合理的な変異誘発、または３つの組み合わせを用いるタンパク質工学により得られる）によって、細胞内または細胞の外側で直接触媒される。本発明の好ましい実施形態では、前記リパーゼまたはエステラーゼまたはプロテアーゼまたはラクトナーゼはエナンチオピュアな４−ヒドロキシ−ペンタン酸基質に作用して、エナンチオピュアな４−バレロラクトンを生成する。代替の実施形態では、前記リパーゼまたはエステラーゼまたはプロテアーゼまたはラクトナーゼは、４−ヒドロキシ−ペンタン酸の４Ｒおよび４Ｓエナンチオマーのラセミ混合物に作用して、４−バレロラクトンの４Ｒおよび４Ｓエナンチオマーのラセミ混合物を生成する。
【実施例】
【００５８】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素の例：
ピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素などのピルビン酸デカルボキシラーゼファミリーの酵素（ＥＣ番号ＥＣ４．１．１．１）は、経路の第１のステップであるピルベートからアセトアルデヒドへの転換を触媒するために使用することができる。以下の表１はこのような酵素の例を（その供給源の生物と共に）記載しており、これらは文献において研究および特徴付けされており、公共データベースＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）のその受入番号が記載される。Ｂｌａｓｔ、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＨＭＭＥＲ３など（限定はされない）のアライメントソフトウェアを用いて、アライメントｅ値＜０．１により、表１の配列（またはこれらの逆翻訳）から得られる相同酵素、例えばタンパク質およびＤＮＡ配列も使用することができる。
【００５９】
【表１】
2013538060.tif 000003
【００６０】
４−ヒドロキシ−２−ケト−ペンタン酸の産生を触媒するアルドラーゼ酵素の例：
Ｂｌａｓｔ、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＨＭＭＥＲ３など（限定はされない）のアライメントソフトウェアを用いて、アライメントｅ値＜０．１により、以下の表の配列（またはこれらの逆翻訳）から得られる相同酵素、例えばタンパク質およびＤＮＡ配列も使用することができる。
【００６１】
【表２】
2013538060.tif 000004
【００６２】
【表３】
2013538060.tif 000005
【００６３】
【表４】
2013538060.tif 000006
【００６４】
ペンタン酸誘導体の４位のケトンを第２級アルコール（ヒドロキシル）へ還元する／ペンタン酸誘導体の４位の第２級アルコール（ヒドロキシル）をケトンへ酸化することができるデヒドロゲナーゼ酵素の例：
Ｂｌａｓｔ、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＨＭＭＥＲ３など（限定はされない）のアライメントソフトウェアを用いて、アライメントｅ値＜０．１により、以下の表の配列（またはこれらの逆翻訳）から得られる相同酵素、例えばタンパク質およびＤＮＡ配列も使用することができる。
【００６５】
様々な種類のデヒドロゲナーゼが、種々の程度の基質特異性により、第２級アルコール／ケトンを酸化／還元することができる。以下に記載されるデヒドロゲナーゼ配列は、３個以上の炭素のアルキル鎖の第２級アルコール／ケトン置換基において活性であることが文献で報告されたデヒドロゲナーゼのいくつかの例である。
【００６６】
【表５】
2013538060.tif 000007
【００６７】
２，４−ジオキソペンタン酸を４−オキソ−２−ヒドロキシ−ペンタン酸へ還元するためのデヒドロゲナーゼ酵素の例：
Ｂｌａｓｔ、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＨＭＭＥＲ３など（限定はされない）のアライメントソフトウェアを用いて、アライメントｅ値＜０．１により、以下の表の配列（またはこれらの逆翻訳）から得られる相同酵素、例えばタンパク質およびＤＮＡ配列も使用することができる。
【００６８】
広い基質特異性を有する乳酸デヒドロゲナーゼ酵素は、基質２，４−ジオキソペンタン酸を受容することが文献で実証された。以下の２つの配列は異なる立体選択性を有する。
【００６９】
【表６】
2013538060.tif 000008
【００７０】
４−オキソ−２−ヒドロキシ−ペンタン酸から４−オキソ−２−ペンテン酸への転換を触媒するデヒドラターゼ酵素の例：
Ｂｌａｓｔ、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＨＭＭＥＲ３など（限定はされない）のアライメントソフトウェアを用いて、アライメントｅ値＜０．１により、以下の表の配列（またはこれらの逆翻訳）から得られる相同酵素、例えばタンパク質およびＤＮＡ配列も使用することができる。
【００７１】
エノラートスーパーファミリーのデヒドラターゼ：
「エノラーゼ」酵素ファミリーと構造的に関連するこれらのデヒドラターゼ酵素は、酸官能基に対してαの水素の１つの引き抜きの後に形成されるエノラートイオンを安定化する。これらの酵素はエノラートアニオンの安定化に依存して脱水反応の活性化エネルギーを低下させるので、これらは、カルボン酸、ケトンまたはエステル官能基のいずれかによりβ脱離されるヒドロキシルを有する基質において活性であり得る。この種類のデヒドラターゼのいくつかの例は以下の表で提供される：
【００７２】
【表７】
2013538060.tif 000009
【００７３】
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、または「クロトナーゼ」ファミリーのデヒドラターゼ：
これらの酵素は、α，β不飽和チオ−エステルへの／からの水分子の可逆的な付加／脱離を触媒することができる（補酵素Ａ誘導体）。これらは、プロトンの引き抜きの後に形成されるエノラートアニオンの安定化に依存するので、酵素はα，β不飽和カルボン酸およびケトンの水和（および可逆的な脱水）を触媒することもできる。エノラーゼスーパーファミリーからのデヒドラターゼとは対照的に、これらの酵素はどの補因子も必要としない。
【００７４】
【表８】
2013538060.tif 000010
【００７５】
フマラーゼＣファミリーのデヒドラターゼ（フマラーゼＡおよびＢファミリーの酵素は鉄−硫黄クラスタを使用する）：
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼファミリーと同様に、これらの酵素はどの補因子も必要とせずにエノラートを安定化する。基質結合および遷移状態の安定化は、活性部位アミノ酸により達成される。
【００７６】
【表９】
2013538060.tif 000011
【００７７】
その他のデヒドラターゼ：
鉄−硫黄クラスタに依存するデヒドラターゼ酵素（例えば、ジヒドロキシ−ジオールデヒドラターゼ、フマラーゼＡおよびＣ）、またはビタミンＢ１２依存性およびＳＡＭ依存性デヒドラターゼ（例えば、グリセロールおよびプロパンジオールデヒドラターゼなど）などの、全ての他の既知のデヒドラターゼ（ＥＣ番号４．２．１．＊）も、４−オキソ−２−ヒドロキシペンタン酸から４−オキソ−２−ペンテン酸への脱水を触媒するために使用され得る。
【００７８】
２，４−ジヒドロキシ−ペンタン酸から４−オキソ−２−ペンテン酸への酸化的脱水／転換を触媒することができるオキシダーゼ／エピメラーゼ酵素の例
Ｂｌａｓｔ、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＨＭＭＥＲ３など（限定はされない）のアライメントソフトウェアを用いて、アライメントｅ値＜０．１により、以下の表の配列（またはこれらの逆翻訳）から得られる相同酵素、例えばタンパク質およびＤＮＡ配列も使用することができる。
【００７９】
【表１０】
2013538060.tif 000012
【００８０】
４−オキソ、２−ヒドロキソペンタン酸からレブリン酸への還元を触媒する酵素の例：
Ｂｌａｓｔ、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＨＭＭＥＲ３など（限定はされない）のアライメントソフトウェアを用いて、アライメントｅ値＜０．１により、以下の表の配列（またはこれらの逆翻訳）から得られる相同酵素、例えばタンパク質およびＤＮＡ配列も使用することができる。
【００８１】
エン酸レダクターゼと呼ばれる酵素ファミリー、あるいはより非公式には旧黄色酵素は、α，β不飽和チオエステル、カルボン酸およびケトンの可逆的な還元を触媒する、ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＦＭＮ依存性酵素である。これらは広い基質特異性を示し、以下の配列は、４−オキソ、３−ヒドロキシペンタン酸からレブリン酸への還元を触媒することが実験的に成功して（データを参照）証明されている。
【００８２】
【表１１】
2013538060.tif 000013
【００８３】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）からの酵素ＮＣＲの多点突然変異体も、基質としての４−オキソ、２−ヒドロキソペンタン酸に対する種々の触媒活性を示すことが実験的に示されている。これらの突然変異体は、配列ＡＡＤ１６１０６のアミノ酸番号付けにおけるＹ１７８Ａ、Ｐ２４２Ｑ、Ｄ３３８ＹおよびＦ３１５Ｙに対応する。
【００８４】
４−ヒドロキシ酸からその対応する環状エステル（ラクトン）へのラクトン化を触媒することができる酵素の例：
Ｂｌａｓｔ、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＨＭＭＥＲ３など（限定はされない）のアライメントソフトウェアを用いて、アライメントｅ値＜０．１により、以下の表の配列（またはこれらの逆翻訳）から得られる相同酵素、例えばタンパク質およびＤＮＡ配列も使用することができる。
【００８５】
４−ヒドロキシ酸からの１，４環状エステルの可逆的な形成を触媒するために使用することができる多種類のラクトナーゼ（例えば、ラクトノヒドロラーゼ）が知られている。特に、１．４ラクトナーゼ（ＥＣ３．１．１．２５）は４−ヒドロキシ酸に対していくらかの特異性を示し、従って、図３、４および５のステップ８の反応、ならびに図６の多数のラクトン化反応を触媒するために選択される配列である。特に、いくつかの１，４−ラクトナーゼは４−ヒドロキシペンタン酸と共にアッセイされ、ガンマ−バレロラクトンへのその可逆的な環化を触媒することが報告されている。以下の表は、この反応を触媒することが文献で報告されているいくつかのラクトナーゼ酵素を記載する。
【００８６】
【表１２】
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【００８７】
様々な種類の他の特徴付けられたラクトナーゼが４−ヒドロキシ酸の環化を触媒することができる。以下は、現存するラクトナーゼ（カルボキシエステラーゼのサブクラス）に相当するＥＣ番号を記載する表である。
【００８８】
【表１３】
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【００８９】
最後に、エステラーゼ、リパーゼおよびペプチダーゼ／アミダーゼは、適切な実験条件（非アルカリ性ｐＨ、そして通常は室温）下でラクトン化反応を触媒することが観察されている。例えば、リパーゼは、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５５２４号明細書においてラクトン化のために言及されており、アミダーゼ／ペプチダーゼは、国際公開第２００９／１４２４８９号パンフレットにおいて、ラクトンを合成するための使用に成功している（これらはいずれも参照によって本明細書に援用される）。
【００９０】
４−ヒドロキシ酸からその対応する環状エステル（ラクトン）へのラクトン化を触媒するための非生体触媒法の例：
ヒドロキシ酸の１，４−ラクトン化を触媒するために多数の非生体触媒法がある。例えば、このようなラクトン化は酸で触媒されることがよく知られており、従って、培地のｐＨを低下させる（生細胞の内側でも外側でも）と、ラクトン化反応の速度が増大する。さらに、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５５２４号明細書（参照によって本明細書に援用される）には、ｐＨ２．５〜７．０および室温などの合理的な条件下で、４−ヒドロキシ酸の酸官能基における官能基転移による活性化が、ラクトン形態を定量的に生じるために十分であることが報告されている。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５５２４号明細書には、（１）リン酸基による活性化（この場合は、４−ヒドロキシルブチリルホスファートの生成による）と、（２）補酵素Ａによる活性化（４−ヒドロキシルブチリル−ＣｏＡの生成による）とが記載されている。天然または改変されたキナーゼ酵素またはＣｏＡシンテターゼをそれぞれ用いる中間体４−ヒドロキシルペンタノイル−ホスファートまたは４−ヒドロキシルペンタノイル−ＣｏＡの合成、すなわち化学合成は、適切な条件下で同様の活性化および自発性ラクトン化を生じることが予測される。
【００９１】
本明細書で引用される全ての参考文献は、全ての目的のために参照によって本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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