(57)【要約】本発明は、少なくとも１つのＴＬＲアゴニストと製剤化したサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現する新生（腫瘍）細胞を含んでいる免疫原性組成物及び免疫応答を誘発又は増強するためにこの組成物を使用する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え免疫刺激サイトカインを発現する１つ又はそれ以上の増殖不全遺伝子組み換え新生（腫瘍）細胞を含み、そして少なくとも１つのトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含んでなる、免疫原性組成物。
【請求項２】
サイトカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
細胞が同等量の少なくとも１つのＴＬＲアゴニスト及びＧＭ−ＣＳＦを含んでいる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
ＴＬＲアゴニストが、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７又はＴＬＲ８、ＴＬＲ９アゴニストである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
組成物がＴＬＲ４アゴニスト及びＴＬＲ７／８アゴニストを含んでいる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ＴＬＲ４アゴニストがＬＰＳ、ＬＰＳ断片、又は合成グルコピラノシルリピドＡ類縁体であり、そしてＴＬＲ７／８アナログがＲ８４８である、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
細胞が放射線照射によって増殖不全にされる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
新生（腫瘍）細胞が、白血病、慢性骨髄性白血病、前立腺癌、頭頸部、扁平上皮癌、舌癌、喉頭癌、扁桃腺癌、下咽頭癌、上咽頭癌、乳癌、結腸癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌、膠芽細胞腫及び脳腫瘍よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
組成物が、少なくとも１×１０５細胞当り約１ｎｇのＴＬＲ４アゴニスト〜１×１０５細胞当り１０ｎｇのＴＬＲ４アゴニストを含んでいる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
組成物が、少なくとも５×１０５細胞当り約３〜５ｎｇを含んでいる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
細胞が、リポフェクタミン又はその他のリポソームベクターと結合しているＴＬＲアゴニストを含んでいる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
細胞が、ＬＰＳ／リポソームミセルを含んでいる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
１つ又はそれ以上の腫瘍抗原を発現する細胞をさらに含んでなる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
細胞が、自家又は同種異系である、請求項１〜１３の何れか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
ワクチンが、薬学的に許容される賦形剤中に組み換え免疫刺激サイトカインを発現する有効量の増殖不全性腫瘍細胞を含み、そして有効量の外因性トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含んでなる、対象の腫瘍形成を改善するワクチン。
【請求項１６】
細胞が、ＣＮ−ＣＳＦを発現するように遺伝子組み換えされている、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
組成物がＴＬＲ４アゴニスト及びＴＬＲ７／８アゴニストを含む、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１８】
ＴＬＲ４アゴニストがＬＰＳ、ＬＰＳ断片、又は合成グルコピラノシルリピドＡ類縁体であり、そしてＴＬＲ７／８アナログがＲ８４８である、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
細胞が、ＬＰＳ／リポソームミセルを含んでいる、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項２０】
１つ又はそれ以上の腫瘍抗原を発現する細胞をさらに含んでいる、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項２１】
細胞が、自家又は同種異系である、請求項１２〜２０の何れか一項に記載のワクチン。
【請求項２２】
方法が、組み換え免疫刺激サイトカインを発現する１つ又はそれ以上の増殖不全性腫瘍細胞を含み、そして外因性トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む、有効量の免疫原性組成物を対象に、当該対象において腫瘍細胞抗原に特異的な免疫応答を誘発するのに十分な量を投与することを含んでなる、腫瘍を有しているか又は腫瘍を発症する傾向にある対象において腫瘍細胞抗原に特異的な免疫応答を誘発する方法。
【請求項２３】
方法が、対象に請求項１〜２１の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量を当該対象において腫瘍細胞抗原に特異的な免疫応答を誘発するのに十分な量で投与して、それによって対象を治療することを含んでなる、腫瘍を有しているか又は腫瘍を発症する傾向にある対象の腫瘍形成を治療又は予防する方法。
【請求項２４】
方法が、対象に請求項１〜２１の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量を投与して、それによって対象における腫瘍の進展又は転移を治療又は予防することを含んでなる、腫瘍を有している対象における腫瘍の進展又は転移を治療又は予防する方法。
【請求項２５】
方法が、対象に請求項１〜２１の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量を投与して、それによって対象における確立された腫瘍を治療するか又は腫瘍形成を予防する、対象における確立された腫瘍を治療するか又は腫瘍形成を予防する方法。
【請求項２６】
方法が、対象に請求項１〜２１の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量を投与して、それによって対象における微小転移巣又は残存疾患を治療することを含んでなる、微小転移巣又は残存疾患を有する対象における微小転移巣又は残存疾患を治療する方法。
【請求項２７】
方法が、対象に請求項１〜２１の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンを投与することを含んでなる、対象に免疫を与える方法。
【請求項２８】
腫瘍細胞が癌細胞株由来であるか又は腫瘍由来である、請求項１４〜２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
癌細胞株又は腫瘍が、白血病、慢性骨髄性白血病、前立腺癌、頭頸部、扁平上皮癌、舌癌、喉頭癌、扁桃腺癌、下咽頭癌、上咽頭癌、乳癌、結腸癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌、膠芽細胞腫及び脳腫瘍よりなる群から選ばれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
免疫原性組成物を全身的又は局所的に投与する、請求項１４〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
免疫原性組成物を筋肉内注射、静脈内注射、腫瘍内注射、又は腹腔内注射で投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
１つ又はそれ以上の化学療法剤の有効量を対象に投与することをさらに含んでなる、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項３３】
１つ又はそれ以上の化学療法剤が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、オーリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、セマドチン、クロランブシル、シクロホスファミド、３’−４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、ドセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、ドラスタチン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシウレア及びヒドロキシウレアタキサン、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ＭＤＶ３１００、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、タキサン類、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、ＲＰＲ１０９８８１、リン酸エストラムスチン、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、及びビンフルニンよりなる群から選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項３４】
方法が、ＧＶＡＸの単独使用に比べて、樹状細胞の活性化増強し、そして／或いはＡＨ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はｐ１５Ｅ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の数を減少する、請求項１２〜３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
方法が、ＧＶＡＸの単独使用に比べて、腫瘍細胞増殖、腫瘍生育、又は対象の生存を減少又は安定化する、請求項１２〜３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする発現ベクター及び少なくとも１つのＴＬＲアゴニストを含んでなる、増殖不全性腫瘍細胞。
【請求項３７】
細胞が、白血病、慢性骨髄性白血病、前立腺癌、頭頸部、扁平上皮癌、舌癌、喉頭癌、扁桃腺癌、下咽頭癌、上咽頭癌、乳癌、結腸癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌、膠芽細胞腫及び脳腫瘍又はこれらの細胞株に由来している、請求項３４に記載の腫瘍細胞。
【請求項３８】
細胞が、ＴＬＲ４及びＴＬＲ７／８アゴニストを含んでいる、請求項３４に記載の腫瘍細胞。
【請求項３９】
ＴＬＲアゴニストがリポソームベクターと結合している、請求項３４に記載の腫瘍細胞。
【請求項４０】
請求項１〜２１の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量及び薬学的に許容される賦形剤を含んでなる、腫瘍を治療するための医薬組成物。
【請求項４１】
キットが、請求項１〜２１の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量、及びキットを請求項２２〜３３の何れか一項に記載の方法で用いるための説明書を含んでなる、腫瘍を治療するためのキット。
【請求項４２】
方法が、対象に請求項１〜２１の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量を投与して、それによって対象の子宮頸癌を治療又は予防することを含んでなる、対象の子宮頸癌を治療又は予防する方法。
【請求項４３】
方法が、対象に請求項１〜２１の何れか一項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量を投与して、それによって対象の多型性ＴＬＲ欠損症を治療することを含んでなる、対象の多型性ＴＬＲ欠損症を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／３２８，４７１号の優先権を主張し、この内容の全ては参照により本明細書に取り込まれている。
【０００２】
（連邦支援研究のもとでなされた発明に対する権利の宣言）
本研究は国立衛生研究所（National Instituteｓ of Health）の助成金番号（Grant No）：ＮＩＨ Ｋ２３−ＤＥ０１８４６４−０２による助成金によって支援された。政府は本発明においてある特定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
ＧＭ−Ｃ ＳＦを分泌するように遺伝子操作された致死的に放射線照射された腫瘍細胞ワクチン（ＧＶＡＸ）は、メラノーマ、腎細胞、前立腺、及び非小細胞肺、膵臓、更に頭頸部扁平上皮癌の多種モデルにおいて有望な効果を示したが、複数の免疫学的チェックポイント障害により、単独療法としてのＧＶＡＸは進行性疾患に対して臨床的に有効であるか疑わしい。ＧＶＡＸは最近、ホルモン抵抗性前立腺癌についての第三相試験において不確かな効果が見出された。腫瘍による免疫回避の重要なメカニズムを打破できないことが、腫瘍特異的宿主免疫応答を最初に刺激するように設計された過去の免疫治療戦略の主な限界であった。抗腫瘍免疫応答を減少させる多くの確定したメカニズムのうちで、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来サプレッサー細胞、及び寛容化樹状細胞（ＤＣs）が免疫治療の成功を阻害する負の調節因子であると仮定されていた。これら免疫回避チェックポイント経路のいくつかの下流にある一つの結論は免疫系の求心性経路における活性化免疫提示細胞の数が少ないことである。腫瘍細胞による免疫回避の重要なメカニズムを打破できる改善された腫瘍細胞ワクチンが望まれている。
【発明の概要】
【０００４】
以下に記載するように、本発明は概して、少なくとも１つのＴＬＲアゴニストと製剤化したサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現する新生（腫瘍）細胞を含んでいる免疫原性組成物、及び免疫応答を誘発又は増強するためにこの組成物を使用する方法を特徴としている。
【０００５】
一態様では、本発明は概して、一つ又はそれ以上の、組み替え免疫刺激サイトカインを発現する増殖不全性の遺伝子組み換え新生（腫瘍）細胞及び少なくとも一つのトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含有している免疫原性組成物を特徴としている。
【０００６】
別の態様では、本発明は概して、対象における新生物（腫瘍）を改善するワクチンを特徴としており、ワクチンは有効量の組み替え免疫刺激サイトカインを発現する増殖不全性の腫瘍細胞及び有効量の外因性トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを薬学的に許容される賦形剤中に含有している。
【０００７】
さらに別の態様では、本発明は概して、腫瘍を有しているか又は腫瘍を進展させる傾向にある対象における腫瘍細胞抗原特異的免疫応答を誘発する方法を特徴としており、方法は組み替え免疫刺激サイトカインを発現する増殖不全性の腫瘍細胞の一つ又はそれ以上を含有し、そして外因性トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを対象における腫瘍細胞抗原特異的免疫応答を誘発するのに十分な量で含有している免疫原性組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は概して、ＧＭ−ＣＳＦをコードする発現ベクターを含有している増殖不全性腫瘍細胞及び少なくとも一つのＴＬＲアゴニストを特徴としている。
【０００９】
さらに別の態様では、本発明は概して、腫瘍を有しているか又は腫瘍を進展させる傾向にある対象における腫瘍を治療又は予防する方法を特徴としており、方法は本明細書に記載の免疫原性組成物又はワクチンの有効量を対象における腫瘍細胞抗原特的免疫応答を誘発するのに十分な量で対象に投与して、それによって対象を治療することを含んでいる。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は概して、腫瘍を有している対象における腫瘍進展又は腫瘍転移を治療又は予防する方法を特徴としており、方法は本明細書に記載されている免疫原性組成物又はワクチンの何れかの有効量を対象に投与し、それによって対象における腫瘍進展又は腫瘍転移を治療又は予防することを含んでいる。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明は概して、対象における確立された腫瘍を治療するか又は腫瘍の形成を予防する方法を特徴としており、方法は本明細書に記載されている免疫原性組成物又はワクチンの何れかの有効量を対象に投与し、それによって対象における確立された腫瘍を治療するか又は腫瘍形成を予防することを含んでいる。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は概して、微小転移巣又は残存疾患を有している対象における微小転移巣又は残存疾患を治療する方法を特徴としており、方法は本明細書に記載されている免疫原性組成物又はワクチンの何れかの有効量を対象に投与し、それによって対象における微小転移巣又は残存疾患を治療することを含んでいる。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明は概して、対象に免疫を与える方法を特徴としており、方法は本明細書に記載されている免疫原性組成物又はワクチンの何れかを対象に投与することを含んでいる。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は概して、本明細書に記載されている免疫原性組成物又はワクチンの有効量及び薬学的に許容される賦形剤を含んでいる腫瘍の治療のための医薬組成物を特徴としている。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は概して、腫瘍を治療するためのキットを特徴としており、キットは本明細書に記載されている免疫原性組成物又はワクチンの有効量、及び本明細書に記載されている方法の何れかでキットを使用するための説明書を含んでいる。
【００１６】
さらに別の態様では、本発明は概して、対象における子宮頸癌を治療する方法を特徴としており、方法は本明細書に記載されている免疫原性組成物又はワクチンの有効量を対象に投与して、それによって対象の子宮頸癌を治療することを含んでいる。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明は概して、対象における多型ＴＬＲ欠損症を治療する方法を特徴としており、方法は本明細書に記載されている免疫原性組成物又はワクチンの有効量を対象に投与して、それによって対象の多型ＴＬＲ欠損症を治療することを含んでいる。
【００１８】
上記態様の何れか又は本明細書に記述されている本発明のその他の態様の何れかの多様な実施態様では、サイトカインは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。
別の実施態様では、細胞は少なくとも一つのＴＬＲアゴニストとＧＭ−ＣＳＦの同等の量を含有している。
さらなる実施態様では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８又はＴＬＲ９アゴニストである。
さらに別の実施態様では、免疫原性組成物はＴＬＲ４アゴニスト及びＴＬＲ７／８アゴニストを含有している。
別の実施態様では、ＴＬＲ４アゴニストはＬＰＳ、ＬＰＳ断片、又は合成グルコピラノシルリピドＡ類縁体であり、そしてＴＬＲ７／８類縁体はＲ８４８である。
別の実施態様では、細胞は放射線照射によって増殖不全にされている。
ある特定の実施態様では、腫瘍細胞は白血病、慢性骨髄性白血病、前立腺癌、頭頸部、扁平上皮癌、舌癌、喉頭癌、へんとう腺癌、下咽頭癌、鼻咽頭癌、乳癌、大腸癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌、神経膠芽腫及び脳腫瘍よりなる群から選ばれる。
別の実施態様では、組成物は１×１０５細胞当り少なくとも約１ｎｇのＴＬＲ４アゴニスト〜１×１０５細胞当り１０ｎｇのＴＬＲ４アゴニストを含んでいる。
さらなる実施態様では、組成物は５×１０５細胞当り少なくとも約３〜５ｎｇのＴＬＲ４アゴニストを含んでいる。
別の実施態様では、細胞はリポフェクタミン又は別のリポソーム性ベクターに関連したＴＬＲアゴニストを含んでいる、
さらなる実施態様では、細胞はＬＰＳ／リポソームミセルを含んでいる。
別の実施態様では、免疫原性組成物は一つ又はそれ以上の腫瘍抗原を発現する細胞を含んでいる。
さらなる実施態様では、免疫原性組成物は自己又は同種異系の細胞を含んでいる。
【００１９】
上記態様の何れか又は本明細書に記述されている本発明のその他の態様の何れかの多様な実施態様では、腫瘍細胞は癌細胞株に由来しているか又は腫瘍に由来している。
別の実施態様では、癌細胞株又は腫瘍は、白血病、慢性骨髄性白血病、前立腺癌、頭頸部、扁平上皮癌、舌癌、喉頭癌、へんとう腺癌、下咽頭癌、鼻咽頭癌、乳癌、大腸癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌、神経膠芽腫及び脳腫瘍よりなる群から選ばれる。
別の実施態様では、免疫原性組成物は、全身的に又は局所的に投与される。
さらなる実施態様では、免疫原性組成物は、筋肉内注射、静脈内注射、腫瘍内注射、又は腫瘍周辺注射によって投与される。
さらなる実施態様では、方法は１つ又はそれ以上の化学療法剤の有効量を対象に投与することを含んでいる。
ある特定の実施態様では、１つ又はそれ以上の化学療法剤は、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンバスチン、オーリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、セマドチン（cemadotin）、クロランブシル、シクロホスファミド、３’−４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール（docetaxol）、ドセタキセル（doxetaxel）、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、ドラスタチン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシウレア及びヒドロキシウレアタキサン、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ＭＤＶ３１００、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、タキサン類、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、ＲＰＲ１０９８８１、リン酸エストラムスチン、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、及びビンフルニンから選ばれる。
さらなる実施態様では、方法は樹状細胞の活性化を増強し、そして／又はＧＶＡＸ単独の使用に比べてＡＨ１特異的細胞毒性Ｔ細胞又はｐ１５Ｅ特異的細胞毒性Ｔ細胞の数を増やす。
ある特定の実施態様では、方法は、ＧＶＡＸ単独使用と比べて腫瘍細胞の増殖、腫瘍生育、又は対象の生存を減少又は安定化する。
さらなる実施態様では、細胞は白血病、慢性骨髄性白血病、前立腺癌、頭頸部、扁平上皮癌、舌癌、喉頭癌、へんとう腺癌、下咽頭癌、鼻咽頭癌、乳癌、大腸癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌、神経膠芽腫及び脳腫瘍又はそれらの細胞株に由来している。
さらなる実施態様では、細胞はＴＬＲ４及びＴＬＲ７／８アゴニストを含有している。
他の実施態様では、ＴＬＲアゴニストはリポソーム性ベクターと関連している。
【００２０】
（定義）
「サイトカイン」とは、局所的に作用して個体の免疫応答を調節するホルモンを意味する。
【００２１】
「遺伝子組み換え腫瘍細胞」とは、導入遺伝子を発現するように遺伝子組み換えされていて、癌治療の一部として患者に投与される細胞又は細胞集団を意味する。本発明の免疫原性組成物又はワクチンは治療を受けている患者に対して「自己」又は「同種異系」の腫瘍（例えば、癌）細胞、又は患者から採取した癌細胞と混合されている「バイスタンダー細胞」を含んでいる。一般に、遺伝子組み換え細胞は患者を苦しめているような癌細胞と同じ一般型である。例えば、メラノーマを患っている患者には通常、メラノーマ由来の遺伝子組み換え細胞を投与する。ＧＭ−ＣＳＦ発現遺伝子組み換え癌細胞ワクチンを本明細書では「ＧＶＡＸ」と称する。サイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝子組み換えされていて、その後癌の治療のために患者に再投与する自己又は同種異系癌細胞は、それぞれが参照により明確に本明細書に組み込まれている、米国特許第５，６３７，４８３号、同第５，９０４，９２０号、同第６，２７７，３６８号及び同第６，３５０，４４５号に、更に米国特許公開第２０１０／０１５０９４６号にも記載されている。膵臓癌の治療のためのＧＭ−ＣＳＦ発現遺伝子組み換え癌細胞又は「サイトカイン−発現細胞ワクチン」の形態は米国特許第６，０３３，６７４号及び同第５，９８５，２９０号に記載されていて、両者は参照により明確に本明細書に組み込まれている。一般的な免疫調節サイトカイン発現バイスタンダー細胞株は、参照により明確に本明細書に組み込まれている、米国特許第６，４６４，９７３号に記載されている。
【００２２】
「顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ポリペプチド」とは、免疫調節活性を有していて、ＧｅｎＢａｎｋ 受入れ番号ＡＡＡ５２１２２．１と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するサイトカイン又はその断片を意味する。
【００２３】
典型的なＧＭ−ＣＳＦ配列（ＮＧＢＩＡＡＡ５２１２２．１）を以下に提供する。
1 mwlqsllllg tvacsisapa rspspstqpw ehvnaiqear rllnlsrdta aemnetvevi
61 semfdlqept clqtrlelyk qglrgsltkl kgpltmmash ykqhcpptpe tscatqiitf
121 esfkenlkdf llvipfdcwe pvqe
ＧＭ−ＣＳＦは顆粒球及びマクロファージ系の造血細胞の生育を誘発することが示されている。またこれは、免疫系の主要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、樹状細胞の抗原プロセッシング及び提示機能も活性化する。免疫原性組成物は、一実施態様では、ワクチンの細胞における発現調節エレメントに操作可能に結合しているＧＭ−ＣＳＦコード配列を含んでいる。
【００２４】
「ＧＭ−ＣＳＦ核酸分子」とは、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００２５】
ＧＭ−ＣＳＦ核酸分子はネズミ又はヒトのＧＭ−ＣＳＦをコードできて、ゲノムＤＮＡ（その全てが参照により本明細書に明確に取り込まれている、米国特許公開第２００６／００５７１２７号公報を参照されたい）又はｃＤＮＡ（その全てが参照により本明細書に明確に取り込まれている、米国特許公開第２００６／００５７１２７号公報を参照されたい）の形態であり得る。一実施態様では、ＧＭ−ＣＳＦコード配列は、その全てが参照により本明細書に明確に取り込まれている、米国特許公開第２００６／００５７１２７号公報に記載されているアミノ酸配列をコードする。ＧＭ−ＣＳＦコード配列のその他の例は、ＧｅｎＢａｎｋ 受入れ番号；ＡＦ３７３８６８、ＡＣ０３４２２８、ＡＣ０３４２１６、Ｍ１０６６３及びＮＭ０００７５８に見られる。
【００２６】
典型的なＧＭ−ＣＳＦコード配列（ＡＦ３７３８６８）を以下に提供する。
1 gcagtctgtt tcctaccaga ctgggagcct caagggccaa atgtgagggc cagtgggagg
61 gtcccgttta cctccccaga acaggtcctg gtgtggattg gaaagacttg ttgactgact
121 gtctgagcta tgacaactca tttctaggag gaaagtgacc ttctctccca gatgggtcat
181 acaggctctc tgcctccctg gccatcagct gaaccactat ctatggctcc cttccctgcc
241 ctccagcctc cagggtgcta tccaacacat gtgatatcta catgtagtat ccatgtcctc
301 atctctcccc cgagagctcc ctggaaagag ctgagccaag gccttgcaaa aaaggtggag
361 aaagggccag ggcctggaca tttcatgttc ccaccccagc ctggccacta ggagtgttct
421 acgcaggctc agatggatgg ggctggcctc acagtggggt ctggaggact aaggtttggt
481 ttctctatgc aaggtcagaa aaactcccac agtacaggga aactggccag ggctgcagac
541 tcagaccaca gtgctaaagc catgaactcc acctgctctc tgaaggctcg ccaacctgag
601 tccagcagaa tgttctcgct tgtgtccaac cccactggtt taggctgaat cagcctctag
661 ggcccagagg cactgcacct ggagtaggga gcttctccag tatcagagtc accttcagag
721 gcctggagcc tttcataaag caggtaagag gactcaatag atgcatctgc atggaaaaca
781 tcctcccctc taccaggcac ctgtatgtac aaccaatcac agcagcacac atacacccag
841 aaatgggcac gtgtgggccc acaccccttt agctatgaaa cccaggcatg gggcagcttg
901 agccagatac cttgtgcaaa cacaaactcg tgctgtcttc tctgaactcc attgtgaaaa
961 tcaaacactt gtcagcccct caagagcctt tagatttcct acttccacac ttccacagaa
1021 aggcctctgg agttggggga tgctggggtt atgtaggaaa ttaagcctgg agggccttgc
1081 tggggaagcc attgtccctg tacctgagat ggatgcagcc acagccctgg agccagcctg
1141 aagctcctgg tgtcttctgg gggctacata taggagtgta gtccgaacct cagaggggca
1201 aacctgctct gcagagggaa tcaaggttca cataaccaga gaggggagtc actcaggaag
1261 gtggctccag agccaagagt cagactctgg gtcccgactt gacccagcca caccccctct
1321 gaagcttgct gagagtggct gcagtctcgc tgctggatgt gcacatggtg gtcattccct
1381 ctgctcacag gggcaggggt ccccccttac tggactgagg ttgccccctg ctccaggtcc
1441 tgggtgggag cccatgtgaa ctgtcagtgg ggcaggtctg tgagagctcc cctcacactc
1501 aagtctctca cagtggccag agaagaggaa ggctggagtc agaatgaggc accagggcgg
1561 gcatagcctg cccaaaggcc cctgggatta caggcaggat ggggagccct atctaagtgt
1621 ctcccacgcc ccaccccagc cattccaggc caggaagtcc aaactgtgcc cctcagaggg
1681 agggggcagc ctcaggccca ttcagactgc ccagggaggg ctggagagcc ctcaggaagg
1741 cgggtgggtg ggctgtcggt tcttggaaag gttcattaat gaaaaccccc aagcctgacc
1801 acctagggaa aaggctcacc gttcccatgt gtggctgata agggccagga gattccacag
1861 ttcaggtagt tcccccgcct ccctggcatt ttgtggtcac cattaatcat ttcctctgtg
1921 tatttaagag ctcttttgcc agtgagccca gtacacagag agaaaggcta aagttctctg
1981 gaggatgtgg ctgcagagcc tgctgctctt gggcactgtg gcctgcagca tctctgcacc
2041 cgcccgctcg cccagcccca gcacgcagcc ctgggagcat gtgaatgcca tccaggaggc
2101 ccggcgtctc ctgaacctga gtagagacac tgctgctgag atggtaagtg agagaatgtg
2161 ggcctgtgcc taggccaccc agctggcccc tgactggcca cgcctgtcag cttgataaca
2221 tgacattttc cttttctaca gaatgaaaca gtagaagtca tctcagaaat gtttgacctc
2281 caggtaagat gcttctctct gacatagctt tccagaagcc cctgccctgg ggtggaggtg
2341 gggactccat tttagatggc accacacagg gttgtccact ttctctccag tcagctggct
2401 gcaggaggag ggggtagcaa ctgggtgctc aagaggctgc tggccgtgcc cctatggcag
2461 tcacatgagc tcctttatca gctgagcggc catgggcaga cctagcattc aatggccagg
2521 agtcaccagg ggacaggtgg taaagtgggg gtcacttcat gagacaggag ctgtgggttt
2581 ggggcgctca ctgtgccccg agaccaagtc ctgttgagac agtgctgact acagagaggc
2641 acagaggggt ttcaggaaca acccttgccc acccagcagg tccaggtgag gccccacccc
2701 cctctccctg aatgatgggg tgagagtcac ctccttccct aaggctgggc tcctctccag
2761 gtgccgctga gggtggcctg ggcggggcag tgagaagggc aggttcgtgc ctgccatgga
2821 cagggcaggg tctatgactg gacccagcct gtgcccctcc caagccctac tcctgggggc
2881 tgggggcagc agcaaaaagg agtggtggag agttcttgta ccactgtggg cacttggcca
2941 ctgctcaccg acgaacgaca ttttccacag gagccgacct gcctacagac ccgcctggag
3001 ctgtacaagc agggcctgcg gggcagcctc accaagctca agggcccctt gaccatgatg
3061 gccagccact acaagcagca ctgccctcca accccggtga gtgcctacgg cagggcctcc
3121 agcaggaatg tcttaatcta gggggtgggg tcgacatggg gagagatcta tggctgtggc
3181 tgttcaggac cccagggggt ttctgtgcca acagttatgt aatgattagc cctccagaga
3241 ggaggcagac agcccatttc atcccaagga gtcagagcca cagagcgctg aagcccacag
3301 tgctccccag caggagctgc tcctatcctg gtcattattg tcattatggt taatgaggtc
3361 agaggtgagg gcaaacccaa ggaaacttgg ggcctgccca aggcccagag gaagtgccca
3421 ggcccaagtg ccaccttctg gcaggacttt cctctggccc cacatggggt gcttgaattg
3481 cagaggatca aggaagggag gctacttgga atggacaagg acctcaggca ctccttcctg
3541 cgggaaggga gcaaagtttg tggccttgac tccactcctt ctgggtgccc agagacgacc
3601 tcagcccagc tgccctgctc tgccctggga ccaaaaaggc aggcgtttga ctgcccagaa
3661 ggccaacctc aggctggcac ttaagtcagg cccttgactc tggctgccac tggcagagct
3721 atgcactcct tggggaacac gtgggtggca gcagcgtcac ctgacccagg tcagtgggtg
3781 tgtcctggag tgggcctcct ggcctctgag ttctaagagg cagtagagaa acatgctggt
3841 gcttccttcc cccacgttac ccacttgcct ggactcaagt gttttttatt tttctttttt
3901 taaaggaaac ttcctgtgca acccagatta tcacctttga aagtttcaaa gagaacctga
3961 aggactttct gcttgtcatc ccctttgact gctgggagcc agtccaggag tgagaccggc
4021 cagatgaggc tggccaagcc ggggagctgc tctctcatga aacaagagct agaaactcag
4081 gatggtcatc ttggagggac caaggggtgg gccacagcca tggtgggagt ggcctggacc
4141 tgccctgggc cacactgacc ctgatacagg catggcagaa gaatgggaat attttatact
4201 gacagaaatc agtaatattt atatatttat atttttaaaa tatttattta tttatttatt
4261 taagttcata ttccatattt attcaagatg ttttaccgta ataattatta ttaaaaatat
4321 gcttctactt gtccagtgtt ctagtttgtt tttaaccatg agcaaatgcc agtggtgcct
4381 gccttcccat gaggcagggg agggaggaaa cggggaggtg gagagggggc gggggcctcc
4441 caggcgttgg gcactatcca agggccaaca ctgtcagagc agaggggagg tgagagccgg
4501 gcataggtgc ggaattctgc acacctggac gggcttcccg ggatgctcca gggctcccac
4561 cccagagaat ggctctcaag ttcacctgga agtccaagtg accagcccag ggaactctta
4621 tcccagagaa gggcaccacc cttcctgggg aggcctgggg gttggctggt cactggctga
4681 acaggcccac tctggcatca ggcaaaacac ctgccctgta gaggccttgg cccctgtgcc
4741 ccacgccctg cccctcacac tctgagattt aaccattccg aaagtaaaca gcaaaataga
4801 ctaactgttc aggggaaaag aaaccaaacc acaggggtca cagtgcagcg tatttaccaa
4861 acttgcccca aaatgggtga tcttaatctc tgagagtcag aatgtaaggt cataatttgt
4921 tggtacatgg ctgtagtgcc gcatgtttct gaattggttt ttatttttac atgaaatttt
4981 gaatctaatc aggcactttc ccctaaaact catggcctgc aggctaaaaa caaagtaggc
5041 ctcctccttc tccttacttt gacagctggg ctcaaggcct tgttcctgaa cctgttccct
5101 catctccctc caggactatg aggaagtgga tgtgccccaa gtcttaggcg ggcagcaggg
5161 ccagcttctc cttgacaggt gggcctaagg aagctggctt gtggcagctt tagcccctgc
5221 ctggcactgt ctgcagtcat gcgcccacca cccctcttgc ttcctctact tcagtcagca
5281 cctgcagaca gcgccaggcc tggccagaga cccactccat gctcatgcag aaagaccgtg
5341 acttcaggtg tgattacaaa taagaagtca gggtgaacgc tcaggatgaa gcctgagtgt
5401 cagcacaggc aagaatccat gaagtgtgct gtggttgttg aaaatgcatg aaaatcacat
5461 cttgcccagc gataaggtcc tctctgtctt ccgcgtaagc cagtgatgac tgataagagg
5521 tttagcattt ccttagcctc acatatatag gtacccctct ccacagaaat gctgccaagc
5581 ccagggctcg gaccagcttg gagtcacctt caagtaatac catgcacctg tacgtgctcc
5641 tggctcatgt gctctggggg tcagaaagcc attcttccca atgaaagtag ccacgatatc
5701 tccccacgaa aagtacacag cagtctgtgc tgacattcag aaagaactct cggctgacaa
5761 taacacacac aagataagtc tgggtctcca tcaaacgtta ttttgctctt agtgcccctt
5821 tgtgctcctg accaatttct ctggcttccg gggtcccttc aataggcccc agaaaaccag
5881 tgaggtaaga aacagctgcc ccgggacctt tcataccaca tttgaacagg gagagagaga
5941 tctcaccagt cagtgcccag ggaagagata acaacaaggg atagtggagt ga
【００２７】
「トール様受容体アゴニスト」とは、多数のＴＬＲ受容体ファミリーを活性化する物質を意味する。
【００２８】
「グルコピラノシルリピドＡ」又は「グリコピラノシルリピドＡ」又は「グリコピラノシルリピドアジュバント」又は「ＧＬＡ」は、新規な、臨床段階の、ヒトのトール様受容体−４（ＴＬＲ−４）アゴニストであって、その全てが本明細書に取り込まれている、米国特許出願第１１／８６２，１２２号及び米国特許出願公開第２００８／０１３１４６６号公報に記載されている。
【００２９】
「リポソーム性ベクター」とは、リポソームの形成によって物質を細胞に送達するために用いることのできる何れかの組成物を意味し、その限定されない例はリポフェクタミンである。
【００３０】
「Ｒ８４８」とは、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８ ＭｙＤ８８依存性シグナル経路を経由して免疫細胞を活性化するＴＬＲアゴニストである、分子量３１４．１７のイミダゾキノリン化合物を意味する。Ｒ８４８は式：Ｃ１７Ｈ２２Ｎ４Ｏ２：及び次の構造を有している。
【００３１】
【化１】
2013529192.tif 000003
【００３２】
「ＴＥＧＶＡＸ」とは、ＴＬＲアゴニストで更に製剤化されたＧＶＡＸを意味する。
【００３３】
「トール様受容体（ＴＬＲ）」とは、微生物産物を感知し、そして／又は適応免疫応答を開始する、タンパク質のトール様受容体ファミリーのメンバー又はその断片を意味する。
【００３４】
「トール様受容体４（ＴＬＲ４）」とは、ＮＰ＿６１２５６４と少なくとも８５％の配列同一性を有し、及び免疫調節活性を有しているポリペプチド又はその断片を意味する。
【００３５】
ヒト−トール様受容体４前駆体ＮＰ＿６１２５６４の配列を以下に提供する。
1 mmsasrlagt lipamaflsc vrpeswepcv evvpnityqc melnfykipd nlpfstknld
61 lsfnplrhlg sysffsfpel qvldlsrcei qtiedgayqs lshlstlilt gnpiqslalg
121 afsglsslqk lvavetnlas lenfpighlk tlkelnvahn liqsfklpey fsnltnlehl
181 dlssnkiqsi yctdlrvlhq mpllnlsldl slnpmnfiqp gafkeirlhk ltlrnnfdsl
241 nvmktciqgl aglevhrlvl gefrnegnle kfdksalegl cnltieefrl ayldyylddi
301 idlfncltnv ssfslvsvti ervkdfsynf gwqhlelvnc kfgqfptlkl kslkrltfts
361 nkggnafsev dlpslefldl srnglsfkgc csqsdfgtts lkyldlsfng vitmssnflg
421 leqlehldfq hsnlkqmsef svflslrnli yldishthtr vafngifngl sslevlkmag
481 nsfqenflpd iftelrnltf ldlsqcqleq lsptafnsls slqvlnmshn nffsldtfpy
541 kclnslqvld yslnhimtsk kqelqhfpss laflnltqnd factcehqsf lqwikdqrql
601 lvevermeca tpsdkqgmpv lslnitcqmn ktiigvsvls vlvvsvvavl vykfyfhlml
661 lagcikygrg eniydafviy ssqdedwvrn elvknleegv ppfqlclhyr dfipgvaiaa
721 niihegfhks rkvivvvsqh fiqsrwcife yeiaqtwqfl ssragiifiv lqkvektllr
781 qqvelyrlls rntyleweds vlgrhifwrr lrkalldgks wnpegtvgtg cnwqeatsi
【００３６】
「改善する」とは、疾患の進展又は進行を減少する、抑える、弱める、軽減する、止める、又は安定化することを意味する。
【００３７】
「類縁体」とは、同一ではないが、類似した機能又は構造特性を有している分子を意味する。例えば、ポリペプチド類縁体は対応する天然由来のポリペプチドの生物活性を保持しているが、天然由来のポリペプチドと比べて類縁体の機能を増大するある特定の生化学的修飾を有している。このような生化学的修飾は、例えばリガンド結合を変えずに、類縁体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、又は半減期を増大することができる。類縁体は非天然アミノ酸を包含する。
【００３８】
本開示において、「含む」、「含んでいる」、「含有している」及び「有している」等は、米国特許法がこれらのものに帰している意味を有していて、「包含する」、「包含している」等の意味であってもよい；「本質的に〜から成っている」又は「本質的に〜から成る」等は米国特許法で帰されている意味を有していて、この用語には制約がなく、列挙されているものの基本的な又は新規な特性が列挙されているもの以外の存在によって変えられない限り、列挙されているもの以外の存在を許容するが、先行技術の態様は除外される。
【００３９】
「疾患」とは、細胞、組織、又は臓器の正常な機能を傷害するか又は妨げる病気又は障害を意味する。
【００４０】
「有効量」とは、腫瘍細胞に対する又は腫瘍抗原に特異的な免疫応答を誘発又は増強するのに、腫瘍の生育を減少又は安定化するのに、対象の生存率を高めるのに、或いは治療していない患者に比べて疾患の症状を改善するのに十分な量を意味する。疾患の治療のための本発明の実施に用いられる活性化合物（複数を含む）の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重、及び一般的な健康状態によって変化する。最終的には、主治医又は獣医師が適切な量及び投与計画を決定するだろう。このような量を「有効」量と言う。
【００４１】
「断片」とは、ポリペプチド又は核酸分子の一部分を意味する。この部分は、参照する核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を含んでいることが好ましい。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００個のヌクレオチド又はアミノ酸を含むことができる。一実施態様では、ＴＬＲ４アゴニストの断片は、対象における免疫応答を強めるのに十分なＬＰＳ又はその他ののＴＬＲ４アゴニストの少なくとも約１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００又は７００個のアミノ酸を含むことができる。
【００４２】
「ハイブリダイゼーション」は、水素結合を意味し、これは相補ヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック型、フーグスティーン型又は逆フーグスティーン型水素結合であってよい。例えば、アデニンとチミンは水素結合の形成によって対になる相補的ヌクレオチド塩基である。
【００４３】
「単離された」とは、天然状態で見られるように通常はそれに付随している成分を様々な程度で含んでいない物質を意味する。「単離する」は、元の供給源又は環境からのある程度の分離を意味する。
【００４４】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する有機体の天然のゲノムにおいて、遺伝子の側面にある遺伝子がない、核酸（例えば、ＤＮＡ）を意味する。従ってこの用語は、例えば、ベクターに；自己複製プラスミド又はウィルスに、或いは原核動物又は真核動物のゲノムＤＮＡに取り込まれているか又は他の配列から独立している別の分子（例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって生産されたｃＤＮＡ、ゲノム又はｃＤＮＡ断片）として存在する組み換えＤＮＡを包含する。また、この用語はＤＮＡ分子から転写したＲＮＡ分子を、更に追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えＤＮＡも包含する。
【００４５】
「単離されたポリペプチド」とは、天然に付随している成分から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。典型的に、ポリペプチドは、それと天然に結びついているタンパク質及び天然の有機分子を少なくとも６０重量％含んでいない場合に、単離されている。好ましくは、調製物は重量で、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然供給源から抽出によって、このようなポリペプチドをコードする組み換え核酸の発現によって；又はタンパク質の化学合成によって得ることができる。純度は、適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析によって測定できる。
【００４６】
「微小転移巣」とは、そこにおいて二次腫瘍を臨床的に検出するためには余りにも微小である転移の形態を意味する。
【００４７】
「微小残存疾患」とは、治療中又は治療後に患者に残存している少数の癌細胞を意味する。
【００４８】
「新生物（腫瘍）（neoplasia）」とは、細胞又は組織の病的な増殖それに続く他の組織又は臓器への移動又は侵入を特徴とする疾患を意味する。新生物の生育は一般に制御されずそして進行性であって、正常細胞の増殖を引き起こさないか、或いはその停止を引き起こす条件下で生じる。新生物は多種の細胞型、組織、又は臓器に影響を及ぼし得て、これに限定されないが、膀胱、骨、脳、胸、軟骨、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、気管、尿路生殖管、尿管、尿道、子宮、及び膣よりなる群から選ばれる臓器、又はそれらの組織又は細胞型を包含する。新生物は、肉腫、癌腫、又は形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）のような癌を包含する。
【００４９】
周囲の組織に侵入するか又は血流又はリンパ管に入る腫瘍細胞は、元の腫瘍から離れて、二次性腫瘍、又は転移を形成する。転移した腫瘍は治療がより困難で、しばしば予後が不良である。腫瘍の重症度（すなわち、腫瘍のサイズ及び侵襲性）によって、段階ナンバーＩ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、又はＩＶ期を割り当てる。第Ｉ期の腫瘍は進行が最少で、最良の予後を有している。第ＩＩ期の腫瘍は一般により大きい癌を伴っていて、やや悪い予後に関わっている。第ＩＩＩ及びＩＶ期の腫瘍はその原発の位置を超えて広がっていて、最も悪い予後を有している。
【００５０】
本明細書で用いられている、「物質を得ること」にあるような「得ること」は、物質を合成すること、購入すること、又は別の方法で入手することを包含している。
【００５１】
本明細書で用いられている、「組み換え型」は、ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを発現する細胞を用いて産生されたポリペプチドの参照を包含している。細胞は適切に単離された核酸配列を導入することによって遺伝子操作されているので、この細胞は組み換え型のポリペプチドを産生する。この用語は、異種核酸の導入により又は本来の細胞を形成しないように本来の核酸を変更することによって改変されているか、或いは細胞がそのように改変した細胞に由来している、細胞、核酸、又はベクターの参照も包含している。従って、例えば、組み換え細胞は細胞の本来の形態（非組み換え型）には見出せない遺伝子を発現するか、本来の形態に見出せる遺伝子の突然変異体を発現するか、或いは他には異常に発現したか、低発現したか又は全く発現しなかった本来の遺伝子を発現する。
【００５２】
「減少する」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％の負の変更を意味する。
【００５３】
「参照」とは、標準の又はコントロールの条件を意味する。
【００５４】
「参照配列」は、配列比較の基準として用いられる規定配列である。参照配列は、特定化された配列の一部又は全部；例えば、全長ｃＤＮＡ又は遺伝子配列のセグメント、或いは完全なｃＤＮＡ又は遺伝子配列；であってよい。ポリペプチドに関しては、参照ポリペプチド配列の長さは一般に、少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、そしてさらにより好ましくは少なくとも約３５アミノ酸、約５０アミノ酸、又は約１００アミノ酸であろう。核酸に関しては、参照核酸配列の長さは一般に、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、又は約３００ヌクレオチド或いはその辺の又はその間の数であろう。
【００５５】
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識して結合するが、サンプル、例えば、本発明のポリペプチドを天然に含んでいる、生体サンプル中のその他の分子を実質的に認識せず結合しない化合物又は抗体を意味する。
【００５６】
本発明の方法で有用な核酸分子は本発明のポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子の何れも包含する。このような核酸分子は内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、一般的に実質的な同一性を示すだろう。内因性配列と「実質的な同一性」を有しているポリヌクレオチドは、一般に、二重螺旋核酸分子の少なくとも１つの螺旋とハイブリダイズすることが可能である。本発明の方法で有用な核酸分子は本発明のポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子の何れも包含する。このような核酸分子は内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、一般的に実質的な同一性を示すだろう。内因性配列と「実質的な同一性」を有しているポリヌクレオチドは、一般に、二重螺旋核酸分子の少なくとも１つの螺旋とハイブリダイズすることが可能である。「ハイブリダイズ」とは、相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載されている遺伝子）又はその部分の間に、多様なストリンジェントな条件下で、二重螺旋分子を形成する対合を意味する。（例えば、Wahl, G.M. and S.L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507 を参照されたい）。
【００５７】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されている何れか一つのアミノ酸配列）又は核酸配列（例えば、本明細書に記載されている何れか１つの核酸配列）と少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチド又は核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列は、比較に用いた配列とアミノ酸レベル又は核酸で少なくとも６０％、より好ましくは８０％又は８５％、そしてさらに好ましくは９０％、９５％又は９９％まで同一である。
【００５８】
配列同一性は典型的に、配列分析ソフトウェア（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP, or PILEUP/PRETTYBOX programs）を用いて測定する。このようなソフトウェアは、多種の置換、削除、及び／又はその他の修正についての相同性の程度を割り当てて同一又は類似配列をマッチさせる。同類置換は一般的に、以下のグループ内の置換を包含する；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を確認するための典型的なアプローチでは、ｅ−３とｅ−１００の間の確率スコアが近縁関係にある配列を示唆する、ＢＬＡＳＴプログラムを用いてもよい。
【００５９】
「対象」とは、これに限定されないが、ヒト或いはウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、又はネコのような非ヒト哺乳動物を包含する哺乳動物を意味する。
【００６０】
本明細書で用いられているような「腫瘍（ｔｕｍｏｒ）」は、悪性又は良性に関わらない全ての腫瘍細胞の生育および増殖、並びに全ての前癌状態及び癌性細胞及び組織を示す。
【００６１】
本明細書で提供される範囲は、範囲内の全ての値に対する省略であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０よりなる群からの何れかの数、数の組合わせ、又は部分範囲を包含していると理解される。
【００６２】
本明細書で用いられているような、用語「治療する」、「治療すること」、「治療」等は、疾患及び／又はそれに付随する症状を減少すること又は改善することを示す。当然のことながら、不可能ではないが、疾患又は病気を治療することは、疾患、病気又はそれに付随する症状を完全に消失させることを必要としていない。
【００６３】
具体的に述べているか内容から明らかでない限り、本明細書で用いられている用語、「又は」は包括的であると理解される。具体的に述べているか内容から明らかである以外は、本明細書で用いられている用語、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は単数又は複数であると理解される。
【００６４】
具体的に述べているか内容から明らかでない限り、本明細書で用いられている用語、「約」は当該技術分野における通常の許容の範囲内として、例えば、平均値の２標準偏差内と理解される。約は、述べられた値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内であると理解される。内容から明確でない限り、本明細書に提供されている全ての数値は用語「約」によって修飾されている。
【００６５】
本明細書にある可変基の定義の何れかにおける化学基の列挙の記述は、単一の基又は列挙された基の組合わせとしてのその可変基の定義を包含する。本明細書にある可変基又は態様についての実施態様の記述は、単一の実施態様の何れか、又は他の何れかの実施態様若しくはその一部との組合わせとしての実施態様を包含する。
【００６６】
本明細書に提供されている組成物又は方法の何れも、本明細書に提供されているその他の組成物及び方法の何れかの１つ又はそれ以上と組合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、ＴＬＲ４アゴニストのＧＶＡＸ内への送達を示す。図１は、ＴＬＲ４アゴニストのＧＶＡＸ内への送達を示す一式のＦＡＣＳグラフである。ＧＶＡＸワクチン細胞内へのＬＰＳの吸収効率を最適化するために、リポフェクタミンとＬＰＳ−ＢＯＤＩＰＹフルオロフォア複合体の濃度を示したように変化させた。フローサイトメリー分析の前に細胞を５回洗浄した。ＬＰＳは、最終洗浄でＬＡＬアッセイを用いると０．１２５ＥＵ／ｍｌ未満になって検出不可能であった。最適吸収は６時間培養で、１×１０５細胞当り４０μｇ／ｍｌのリポフェクタミン及び２５μｇ／ｍｌのＬＰＳであった。これらの条件を細胞当りに基づくＬＰＳの定量に用いた。
【図２】図２Ａは、２Ｂ、及び２Ｃは、ＴＥＧＶＡＸがインビボで抗腫瘍応答を誘発できることを示している。Ｂ１６を接種したＣ５７ＢＬ／６（図２Ａ）、ＳＣＣＦＶＩＩ／ＳＦを接種したＣ３Ｈ（図２Ｂ）、及びＣＴ２６を接種したＢａｌｂ／ｃ（図２Ｃ）マウスは、概して腫瘍注入の３〜５日後に腫瘍周辺を適切なＰＢＳ、ＧＶＡＸ、又はＴＥＧＶＡＸで処置した。検討した全マウスモデル中でＴＥＧＶＡＸ群におけるインビボでの腫瘍進展がＧＶＡＸ群におけるそれより統計的に遅かった。Ｂ１６及びＳＣＦＶＩＩ／ＳＦモデルに関しては、ＧＶＡＸ処置群とＰＢＳ処置群の間に差はなかった。ＣＴ２６モデルにおいて、ＴＥＧＶＡＸ群の４０〜６０％のマウスが１８日目までにそれらの触診可能な腫瘍の検出不可能なレベルまでの退行を経験した。２９３Ｔ細胞に製剤化された等モルのＬＰＳもコントロールの処置マウスと比べて生育速度に差がなかった。腫瘍の退行を示したマウスをＣＴ２６腫瘍（２×１０６）を再投与しても、腫瘍生育は分からなかった。３つのマウスモデル全てにおける減少した腫瘍生育速度は、ＧＶＡＸ群のそれと比べたＴＥＧＶＡＸ群におけるマウスの増大した生存率と相関していた。
【図３】図３は、ＴＥＧＶＡＸに注目される改善されたインビボ抗腫瘍応答はＭｙＤ８８に依存していることを示す。Ｂ１６モデルを用いて、腫瘍接種の３〜５日後に腫瘍内にワクチン処置を行ったＭｙＤ８８ヌルマウスを用いてインビボ腫瘍生育速度試験を実施した。ＴＥＧＶＡＸ処置群における抗腫瘍応答はＭｙＤ８８ヌルマウスにおいては無効になる。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、ＴＥＧＶＡＸ処置がリンパ球及び抗原提示細胞の腫瘍内微小環境への浸潤を増大することを示す。図４Ａは、コントロール、ＧＶＡＸ、又はＴＥＧＶＡＸで処置したＣＴ２６細胞におけるＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ８６＋、及びＣＤ４５＋細胞の免疫組織化学的染色の顕微鏡写真一式である。最初の２つのパネルにおいて、黄色の細胞はＣＤ４又はＣＤ８のＣＤ４５との共に局在化した染色を示している。３番目のパネルはＣＤ８６複合体単独染色を示している。これらの細胞は、４０倍の倍率で、無作為に選んだ１０視野内で公式に定量した。図４Ｂは、免疫組織化学で得られた定量データのグラフ表示である。ＧＶＡＸ又はＴＥＧＶＡＸの何れかで処置した腫瘍において、定量したＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８６及びＣＤ４５細胞のそれぞれにおいて、２群の間に統計的な差があった（Ｐ＜０．０１）。
【図５】図５は、ＴＥＧＶＡＸ処置が流入領域リンパ節（ＤＬＮ）内の活性化樹状細胞（ＤＣ）を増大することを示している。ＣＴ２６腫瘍担持Ｂａｌｂ／ｃマウスは腫瘍注入の３日後に腫瘍周辺をＰＢＳ（示していない）、ＧＶＡＸ、又はＴＥＧＶＡＸで処置した。処置の５〜７日後にＤＣをＤＬＮから単離した。Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ＋細胞をゲートして、ＣＤ８６、ＭＨＣＣＩＩ、及びＣＤ８０染色を示したように分析した。ＴＥＧＶＡＸは、ＧＶＡＸ処置群と比べて、ＤＬＮ内のＣＤ８６＋ＭＨＣＩＩ＋の数を、更にＣＤ８０＋ＭＨＣＩＩ＋ＤＣの数も増大した。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、ＴＥＧＶＡＸ処置が、腫瘍特異性ＣＤ８＋Ｔ−細胞の数を増大することを示している。ＣＴ２６保持Ｂａｌｂ／ｃマウスを３日目に腫瘍周辺をＰＢＳ、ＧＶＡＸ、又はＴＥＧＶＡＸで処置して、５日後に脾臓及びリンパ節からＣＤ８＋細胞を単離して精製した。ＡＰＣ及びＡＨ１ペプチドとして４Ｔ１細胞を用いてＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施して、ＩＦＮレベルを測定した。図６Ａは、ＡＨ１特異的ＩＦＮ生産Ｔ細胞の数は脾臓及び流入領域ＬＮの両方においてＧＶＡＸ群と比べてＴＥＧＶＡＸ群において統計的に多かった（Ｐ＜０．０１）ことのグラフである。図６Ｂは、ＡＨ１特異的ＣＴＬ殺生のグラフである。ＴＥＧＶＡＸ処置及び未処置ＣＴ２６腫瘍担持マウスにおけるＡＨ１特異的ＣＴＬの殺生パーセントを測定するためにインビボＣＴＬアッセイを用いた。−ｇａｌＣＦＳＥ標識ロー及びＡＨ１ＣＦＳＥ標識ハイ細胞を、未処置腫瘍担持群、又はＴＥＧＶＡＸ処置腫瘍担持群に共に注入した。平均特異的腫瘍溶解率は未置群と比べてＴＥＧＶＡＸ群で高かった（Ｐ＜０．０７）。
【図７】図７は、製剤化せずに等量のＬＰＳと別々に注入したＧＶＡＸは抗腫瘍応答を誘発しないことを示している。Ｂ１６担持マウスは腫瘍周辺をＧＶＡＸ、ＬＰＳの何れか、又はリポソーム製剤にしていないＬＰＳとＧＶＡＸの混合物の何れかで処置した。図２で用いたような等モル量のＬＰＳをこれらの実験で腫瘍周辺に注入した。
【図８】図８は、ＴＥＧＶＡＸが全身性の抗腫瘍応答も誘発できることを示している。Ｂ１６腫瘍モデルを用い、腫瘍周辺をＴＥＧＶＡＸで、又は腫瘍接種部位の対側肢内への注入の何れかでマウスを処置した。両方のＴＥＧＶＡＸ群が同様なインビボ生育速度を示した。
【図９】図９は、ＧＶＡＸ、Ｒ８４８、及びＧＬＡの併用がメラノーマ腫瘍細胞の生育を阻害したことを示すグラフである。ＧＶＡＸ及びその各種ＴＬＲアゴニストとの製剤をＢ１６腫瘍接種の３日後に注入した。腫瘍はワクチン処置の時点では触診可能ではなかった。腫瘍の相対生育速度を各群について追跡した。ＧＶＡＸ、ＧＬＡ、及びＲ８４８で処置したＢ１６腫瘍に関しては、腫瘍生育が、最初は他の群より遅く、そしてこれらのマウスの幾匹かにおいて、これらの腫瘍が退行したことが注目された。
【図１０】図１０は、ＴＬＲアゴニストで増強したＧＶＡＸが、確立されたＢ１６腫瘍の生育速度を低減したことを示すグラフである。Ｂ１６腫瘍細胞を足蹠内に注射して、腫瘍が触診可能になったら、図に示したようなワクチン製剤でマウスを処置した。ワクチンは対側肢に注射した。
【図１１】図１１は、ＧＶＡＸ／ＧＬＡ／Ｒ８４８で処置したマウスが最も多くの数のｐ１５Ｅ特異的Ｔ細胞を有していたこと、及びこの結果がインビボ腫瘍生育速度と相関していたことを示すＥＬＩＳＰＯＴアッセイ及びインビボＣＴＬアッセイの結果を示している幾つかの図を提供する。ワクチン製剤で処置したマウスを処置の１〜２週間後に摘出して、その脾臓を腫瘍特異的Ｔ細胞について分析した。
【図１２】図１２は、ＧＶＡＸ／ＧＬＡ／Ｒ８４８で処置したマウスが活性化樹状細胞を有意に増強したことを示す２枚の図を提供する。
【図１３】図１３は、ＧＶＡＸ／ＧＬＡ／Ｒ８４８で処置したマウスが統計的に有意な数のＩｌ−１２を発現するＣＤ１１ｃ＋細胞を有していたことを示すＦＡＣＳ分析を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本発明は少なくとも１つのＴＬＲアゴニストと製剤化したサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現する腫瘍細胞含んでいる組成物及び免疫応答を誘発又は増強するためにこの組成物を用いる方法を提供する。
【００６９】
本発明は、少なくとも部分的に、腫瘍細胞に基づいたワクチンにＴＬＲアゴニストを添加すると、腫瘍組織に存在している宿主免疫応答回避メカニズムを打破することによりワクチンの有効性が増強したという発見に基づいている。特に、以下に更に詳細に報告するように、同系のＧＭ−ＣＳＦを分泌する全細胞腫瘍ワクチン（ＧＶＡＸ）とＴＬＲ４アゴニストを用いてＴＥＧＶＡＸ（ＴＬＲで増強したＧＶＡＸ）を作成した。このワクチンの有効性を、免疫原性が弱いＢ１６マウスメラノーマモデルを含む、３つの異なる治療マウスモデルで試験した。免疫組織化学、フローサイトメトリー分析、ＥＬＩＳＰＯＴ、及びインビボＧＴＬ分析を、腫瘍組織に対する先天性及び適合性免疫応答の両方を評価するために用いた。ＴＥＧＶＡＸの腫瘍内及び全身投与は、ＧＶＡＸ単独に比べて増大したインビボでの抗腫瘍応答をもたらした。ＴＥＧＶＡＸの改善された抗腫瘍効果は、ＴＬＲシグナル伝達低下ＭｙＤ８８−／−マウスには存在していなかった。Ｂａｌｂ／ｃマウスのＣＴ２６マウスモデルにおいて、４０〜６０％のマウスが移植された腫瘍の退行を示した。ＣＴ２６腫瘍細胞を再投与すると、これらのマウスは腫瘍に対して免役されていることが証明された。ＴＥＧＶＡＸで処置した腫瘍は、腫瘍組織に増大した湿潤しているＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を、更に増大した数のＣＤ８６＋細胞も示した。ＴＥＧＶＡＸで処置したマウス由来流入領域リンパ節は、ＧＶＡＸ処置群及び偽処置群と比べて増大した数の活性化ＣＤ８６＋ＭＨＣＩＩ＋及びＣＤ８０＋ＭＨＣＩＩ＋樹状細胞を有していた。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ更にはインビボＣＴＬアッセイはＴＥＧＶＡＸで処置したマウスにおいて、ＡＨ１腫瘍抗原に特異的な増大した数のＣＴＬを示した。細胞に基づいたワクチンはＴＬＲアゴニストを用いてインビボでの改善された抗腫瘍応答を有するように製剤化できる。
【００７０】
（ＴＬＲアゴニストは抗腫瘍免疫応答を増強する）
不偏腫瘍抗原の供給源としての腫瘍細胞ワクチンの使用は多数の臨床試験で安全性が示されてきた。しかしながら、この手法の臨床効果には、抗腫瘍細胞毒性応答に向かうＴ細胞応答を歪め得る活性化抗原提示細胞の弱い上方制御による、限度がある。感染との関連において、ＴＬＲアゴニストは樹状細胞を活性化して免疫原性にすることが示されているが、ＴＬＲ４シグナル伝達の欠乏が耐性を導き得る（１４）。Blander and Medzhitov は貪食された微生物抗原がＬＰＳの存在下でより効果的に提示されることを示した（１７）。抗原含有ファゴリソソームにおいて、ＴＬＲ４シグナル伝達なしで、ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ複合体がＤＣの細胞表面に非効率的に存在している。これらの研究から推測されることは、局在性ＴＬＲ４刺激が併用ワクチンの一部として投与されたときに抗腫瘍応答を増強するということである。
【００７１】
何れかのＴＬＲアゴニストの使用に対する一つの懸念はその毒性である。なぜなら、ＴＬＲ４に対する生理的なリガンドは、敗血症に応答可能な巨大分子である、ＬＰＳである。ＬＰＳのＴＬＲ４アゴニスト活性はＬＰＳのリピドＡ成分を分離していて、非毒性リピドＡ形態の多くの形態が癌患者に導入されている（１８）。他のものは、癌患者に敗血症及びアナフィラキシーの徴候なしで、ＬＰＳを発熱性用量以上で皮内に用いている（１９）。その他の懸念は、腫瘍細胞上で発現されるＴＬＲ４受容体が発癌を促進するかもしれないということである（２０）。
【００７２】
免疫調節サイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現する遺伝子組み換え腫瘍細胞を含んでいる、ＧＶＡＸワクチンは最近、メラノーマ、乳癌、膵臓癌、及び大腸癌についての臨床試験の段階にある。本明細書で報告されたように、ＴＬＲ刺激作用をＧＶＡＸと局所的に組合わせることはＧＶＡＸワクチンの免疫原性を有意に増強することができる。前発がん性のＴＬＲ４刺激を最小化し、全身性ＴＬＲ４刺激を最小化するために、ＬＰＳ及びその他のＴＬＲアゴニストがＧＶＡＸ細胞中で製剤化されて、この新規な併用ワクチンが幾つかのマウスモデルで抗腫瘍効果を示した。
【００７３】
従って、本発明は腫瘍細胞に基づいたワクチンを含有しているＴＬＲアゴニストを含む治療用組成物、及び腫瘍細胞（例えば、乳癌及びメラノーマ細胞）の侵襲を阻害し、減少し、或いは取り除くために或いは腫瘍又はその症状を治療するためにこのような細胞に基づいたワクチンを用いる方法を提供する。
【００７４】
ある特定の実施態様では、本発明は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を分泌するように遺伝子組み換えされた患者特異的癌細胞を含み、更にトール様受容体アゴニストを含むように製剤化された自己癌細胞ワクチンを提供する。ＧＭ−ＣＳＦは白血球生成の刺激に対する幾つかの特異性を有している、多種の造血前駆細胞の増殖及び分化を調節して、治療誘発性好中球減少症を回復できる。この物質は抗原提示を促進し、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を上方調節し、そしてインターロイキン−２介在リンホカイン活性キラー細胞の機能を増大して宿主の抗腫瘍免疫を増大することもできる。ＴＬＲアゴニストはアジュバントとして作用してワクチンの効果を増大する。ＴＬＲアゴニストと共に製剤化した腫瘍細胞に基づいたワクチンは、活性化局所領域樹状細胞の数を増大し、更に腫瘍特異的ＣＴＬ応答も増大する。安全性については、ワクチン化の前に細胞を放射線照射する。
【００７５】
（免疫原性組成物）
癌ワクチンを含む、本発明の免疫原性組成物は特定のタイプの癌治療のための治療法及び予防法として有用である。有利には、これらのワクチンを、標的特異的腫瘍抗原を対象の腫瘍上に発現するようにワクチンを作成して、特定個人の癌を治療するように調整することができる。本発明のワクチンは通常、不活性化腫瘍細胞又はＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝子操作されている癌抗原を発現する細胞を含有し、この細胞は更にＴＬＲ４アゴニスト又はその断片を含んでいる。本発明の細胞は、リポフェクタミン又はその他のリポソーム媒体、例えば、油／水エマルション親油性分子、非細胞毒性の、受動的吸収でこれらの親油性分子を可溶化するもの、と組合わせたＴＬＲ４アゴニストを細胞と接触させることによってＴＬＲ４アゴニストを取り込むように誘導される。理論と結びつけるつもりはないが、ＴＬＲアゴニスト又はその生物活性断片を、ＴＬＲアゴニスト含有ミセルを形成するのに十分な条件下でリポソームと接触させる。このミセルはＧＭ−ＣＳＦ発現腫瘍細胞によって非特異的に吸収されてこのＴＬＲアゴニスト製剤化細胞ワクチンを対象の免疫系を刺激するために用いることができる。
【００７６】
免疫系は腫瘍を標的とする免疫応答性細胞を産生してこの刺激に応答する。特定の実施態様では、本発明の癌ワクチンは望ましく、微小転移巣又は残存疾患のような、検出不可能な腫瘍細胞を標的にしており、それによって腫瘍の再発を阻止する。病気の発症を阻止する他の病気用のワクチンとは違って、癌ワクチンは通常、対象が腫瘍を有していると確認された後に投与される。
【００７７】
腫瘍細胞ワクチンは、本明細書に記載されているようにして作成される、本発明の細胞組成物を用いて産生される。細胞は増殖不全にされ、対象に注入されて、そこで腫瘍は細胞抗原の免疫応答刺激を起動する。望ましくは、免疫系は致死的な放射線照射された細胞上に表示された１つ又はそれ以上の抗原を運搬する癌細胞の小集団を標的にする。
【００７８】
（組み換えポリペプチド発現）
本発明は組み換えＧＭ−ＣＳＦポリペプチドを発現するように遺伝子を組み換えた細胞を提供する。本発明のＧＭ−ＣＳＦポリペプチドは、実質的に科学界で公知の何れかの方法を用いて産生される。一般に、組み換えポリペプチドは、適切な発現媒体内にＧＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸分子又はその断片の全て又は一部を有している適切な宿主細胞（例えば、癌又は腫瘍細胞株由来の細胞）の形質転換によって産生される。このような核酸分子は、腫瘍を有する対象由来の細胞へ又は腫瘍細胞株へインビトロで送達することができる。核酸分子は、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質又はその断片の治療有効レベルを産生できるように細胞が受け取れる形態で対象の細胞に送達されなくてはならない。
【００７９】
形質導入ウィルス（例えば、レトロウィルス、アデノウィルス、及びアデノ随伴ウィルス）ベクターは、とりわけそれらの効率的な感染性及び安定な融合及び発現によって、遺伝子送達のために用いることができる（例えば、Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649, 1997; Naldini et al., Science 272:263-267, 1996; and Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997 を参照されたい）。例えば、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質、変異体、又はそれらの断片をコードするポリヌクレオチドをレトロウィルスベクターにクローン化して、その内因性プロモーターから、レトロウィルスの長い末端反復から、又は目的の標的細胞型に特異的なプロモーターから発現を生じさせることができる。使用できるその他のウィルスベクターは、例えば、ワクシニアウィルス、ウシパピローマウィルス、又はエプシュタインバールウィルスのような、ヘルペスウィルスを包含する（例えば、Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244:1275-1281, 1989; Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988; Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991; Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987; Anderson, Science 226:401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Miller et al., Biotechnology 7:980-990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993; 及び Johnson, Chest 107:77S-83S, 1995  のベクターも参照されたい）。レトロウィルスベクターは特に十分に開発されていて、臨床の場で用いられている（Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323:370, 1990; Anderson et al., U.S. Pat. No. 5,399,346）。最も好ましくは、ウィルスベクターは、ＴＬＲ４アゴニストの細胞への送達の前、それと同時に、又はそれに続いて、ＧＭ−ＣＳＦポリヌクレオチドを本発明の細胞へ投与するために用いられる。
【００８０】
ウィルスによらない手法も、ＧＭ−ＣＳＦをコードするベクターを腫瘍を有する患者由来又は腫瘍細胞株由来細胞へ導入するために用いることができる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸分子は、リポフェクチン（Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983）、アシアロオロソムコイド−ポリリジン共役（Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989）の存在下に核酸分子を投与して、又は手術条件下で微量注入して（Wolff et al., Science 247:1465, 1990）細胞内へ導入することができる。核酸をリポソーム及びプロタミンと組合せて投与することが好ましい。ＧＭ−ＣＳＦコードベクターによるトランスフェクションと同時に、その前に、又はそれに続いて、細胞をＴＬＲアゴニストと組合わせてリポフェクタミンで処理することができる。
【００８１】
インビトロでトランスフェクションを実施する方法は、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法、及び原形質融合の使用を包含する。リポソームもＤＮＡを細胞内へ送達するために潜在的に有益である。
【００８２】
本発明の方法で用いるためのｃＤＮＡ発現は、何れかの適切なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、又はメタロチオネインプロモーター）から指令され、何れかの適切な哺乳類調節エレメントによって調節されてもよい。例えば、必要により、特定の細胞型において優先的に遺伝子発現を指令することが知られているエンハンサーを核酸の発現を指令するために用いることができる。用いられるエンハンサーは、これに限定されないが、組織−又は細胞−特異的エンハンサーとして特徴付けられているものを包含できる。あるいは、遺伝子ゲノムを治療構築物として用いる場合は、調節を同種の調節配列又は、必要により、上記のプロモーター又は調節エレメントの何れかを包含する、異種起源由来の調節配列を介して行うことができる。
【００８３】
本発明に含まれるその他の治療手段は、組み換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質、変異体、又はそれらの断片を分泌している細胞のような、組み換え治療薬を、可能性のある又は実際の疾患発症組織の部位に直接（例えば、腫瘍内、腫瘍周辺）又は全身的に（例えば、従来の組み換えタンパク質投与技術によって）、投与することを包含する。ＧＭ−ＣＳＦタンパク質を発現している投与される細胞の用量は、個々の患者の大きさ及び健康状態を包含する多数の要因によって決まる。何れかの特定の対象については、特定の投薬計画は時間をかけて、個人のニーズ及びこの組成物を投与している人間又は投与を監督している人間の専門的な判断に従って調節されなければならない。
【００８４】
（自己細胞）
サイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦを発現してＴＬＲ４抗原を含んでいる、自己遺伝子組み換え細胞の使用は、それぞれの患者の腫瘍が、他の患者から見出される形態学的に類似した、ＭＨＣ適合腫瘍細胞とは異なる独特な一連の腫瘍抗原を発現するので、利益をもたらす。例えば、Kawakami et al., J. Immunol., 148, 638-643 (1992); Darrow et al., J. Immunol., 142, 3329-3335 (1989);及び Hom et al., J. Immunother., 10, 153-164 (1991)を参照されたい。対照的に、ＭＨＣ適合腫瘍細胞は、患者が遺伝子組み換えされた腫瘍細胞産生のために腫瘍サンプルを得る手術を受ける必要がないという利益をもたらす。
【００８５】
一実施態様では、腫瘍を有する患者を治療する方法は、対象から腫瘍細胞を得ること；細胞をＧＭ−ＣＳＦをコードする発現ベクターと接触させること；細胞に食菌することをもたらすか又はＴＬＲアゴニストを吸収する条件下で細胞をＴＬＲアゴニストと接触させること；細胞を増殖不全にすること（例えば、細胞に放射線を照射することにより）；及び細胞を細胞を得た対象に投与することを含んでいる。組成物を哺乳類対象に皮内に、皮下に又は腫瘍内に投与することが好ましい。
【００８６】
ある場合は、単一自己腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦだけを、或いは１つ又はそれ以上の腫瘍関連抗原と共にＧＭ−ＣＳＦを発現するかもしれない。別の場合は、ＧＭ−ＣＳＦ及び１つ又はそれ以上の腫瘍関連抗原が異なった自己腫瘍細胞によって発現されるかもしれない。
【００８７】
本発明の一態様では、自己腫瘍細胞は、それらの発現に必要なプロモータ及び発現／制御配列に動作可能なように結合している、ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸配列を含んでいるベクターを導入することによって遺伝子的に組み換えられる。
別の態様では、同一の自己腫瘍細胞又は第二自己腫瘍細胞は、それらの発現に必要なプロモータ及び発現／制御配列に動作可能なように結合している、１つ又はそれ以上の腫瘍関連抗原をコードする核酸配列を含んでいるベクターを導入することによって遺伝子的に組み換えられる。１つ又はそれ以上の腫瘍関連抗原をコードする核酸配列を、同一又は異なったベクターを用いて同一又は異なった自己腫瘍細胞内に導入することができる。１つ又はそれ以上の腫瘍関連抗原をコードする核酸配列は、プロモーターに動作可能なように結合している選択可能マーカー配列を更に含んでいても含んでいなくてもよい。望ましくは、自己腫瘍細胞は高レベルのＧＭ−ＣＳＦ及び／又は１つ又はそれ以上の前立腺腫瘍関連抗原を発現する。
【００８８】
（同種異系細胞）
一実施態様では、ＴＬＲ４アゴニストを含んでいる（例えば、ＴＬＲアゴニストをリポソーム賦形剤と共に含んでいる）遺伝子組み換え同種異系細胞は腫瘍免疫原性を増強できる。本明細書で用いられている「腫瘍細胞株」は最初は腫瘍又はその他の腫瘍細胞に由来していた細胞を含んでいる。このような細胞は一般に、培養で無限の生育を示す。
一態様では、対象の免疫応答を増強する方法は：（ａ）腫瘍細胞株を得ること；（ｂ）細胞が増大したレベルのサイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦを産生できるように細胞株を遺伝子組み換えすること；（ｃ）細胞を、細胞がアゴニストを吸収するような条件下で、ＴＬＲアゴニストと接触させること；（ｄ）組み換え腫瘍細胞株が増殖不全になるようにすること；及び（ｄ）腫瘍細胞株を腫瘍細胞株を得たのと同じ型の腫瘍細胞を有するかそれを発症する可能性がある対象に投与することを包含している。
ある実施態様では、投与された細胞は同種異系であって、対象に対してＭＨＣ適合性であるか又は適合性ではない。このような同種異系の株は、前もって製造できる、特性化される、公知の量のＴＬＲ４アゴニストを含有していて及び同等量のサイトカインを生産するバイアルに等分できて、そして対象に投与するためによく特性化された細胞が得られるように、保存（即ち、凍結）されるという利点をもたらす。遺伝子組み換え細胞を産生する方法は、例えば、参照により本明細書に明確に取り込まれている、国際公開第ＷＯ ００／７２８６号公報に記載されている。
【００８９】
同種異系細胞株組成物を患者に導入するために何れの投与経路も用いることができ、組成物を皮内、皮下又は腫瘍内投与することが好ましい。
【００９０】
（投与）
サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するように遺伝子組み換えされてＴＬＲアゴニストを含む腫瘍細胞は投与前に低温保存できる。このような細胞は増殖が不可能（「増殖不全」）になるように処理されことが好ましい。このような細胞は、増殖不全にされるが、最終的な細胞死以前にＧＭ−ＣＳＦの産生を未だ可能にするような放射線照射によって増殖不全にされることが最も好ましい。一実施態様では、本発明の細胞は、患者に投与する前に、約５０〜約２００ラド／分、又は約１２０〜約１４０ラド／分の用量で照射される。細胞がさらに増殖するのを実質的に１００％阻害するのに十分な総用量で細胞を放射線照射することが好ましい。約１０，０００〜２０，０００ラド、適切には、約１５，０００ラドの総用量で細胞を放射線照射することが望ましい。
【００９１】
一般に治療過程において、ＴＬＲアゴニストを含んでいるサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）発現細胞の１回以上の投与を対象に送達する。特定の治療過程に依存して、多様な時間間隔で反復される治療での一時点で複数回注入を行うことができる。例えば、初期又は「プライミング」治療に１回又はそれ以上の「ブースター」治療を続けることができる。このような「プライミング」及び「ブースター」治療は通常、同じ投与経路で及び／又はほぼ同じ部位に送達される。複数回用量を投与する場合は、最初の免疫化用量はその後の免疫化用量より高くてよい。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ及び腫瘍抗原生産細胞の５×１０７〜８個の最初の用量に１０７〜８個〜３×１０７〜９個の数回のブースター用量を続けることができる。
【００９２】
ＴＬＲアゴニストを含んでいる遺伝子組み換え細胞の単回注入は一般に、少なくとも約１０５〜１０９細胞の間、例えば、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、５×１０７、×１０８、×１０９細胞である。サイトカイン及び腫瘍抗原産生細胞の数は、所定の細胞性免疫治療組成物によって産生されるサイトカイン及び／又は腫瘍抗原のレベルに従い、調節できる。好ましい実施態様では、組み換え細胞は筋肉内又は静脈内の何れかで注入される。
【００９３】
ある実施態様では、細胞性免疫治療のサイトカイン産生細胞は、１００万細胞当り、２４時間で少なくとも１、５、１０、２０、７５、１００、２００、３００、４００、５００ｎｇのＧＭ−ＣＳＦを産生できる用量で投与される。
ある実施態様では、本発明の免疫原性組成物は１００万細胞当り、２４時間で少なくとも５００ｎｇの特定腫瘍抗原を産生できる用量で投与される。最適な細胞用量及び比率の決定は、本明細書に提示されている開示を考慮すると、日常的確認事項であって、通常の技術を有する実施医の技術範囲内である。
【００９４】
本発明の細胞は、細胞を作成するために用いた追加成分の大部分を除去するために処理される。特に、ウシ胎仔血清、ウシ血清成分、又は培地中のその他の生物補填物質を除去する。
一実施態様では、細胞を、例えば反復弱遠心分離によって、適切な薬理学的に適合する賦形剤中で洗浄する。適合性賦形剤は、多種の細胞培養培地、等張食塩水、生理的適合性緩衝液、例えば、リン酸又はヘペス、と共に又は無しで、及びブドウ糖のような栄養素、生理学的に適合するイオン又はアミノ酸、特にその他の免疫原性成分が欠けているものを包含する。インビボで投与するための組成物は、更に薬学的に許容される、適切な担体又は希釈剤を含むことができる。例えばアルブミン及び血漿分画のような担体、及び不活性な増量剤を用いることができる。このような組成物を製造する方法は当該技術分野で記載されている。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 19th edition, Genarro, A. Ed. (1995) を参照されたい。
【００９５】
医薬剤形において、本明細書に記載されている免疫原性組成物は単独で、又は当該技術分野で公知であるような他の薬学的に活性な化合物と適切に関連させて、更には併用しても用いることができる。
【００９６】
（医薬治療）
本発明は、腫瘍の治療に有用な腫瘍細胞に基づいたワクチン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦを発現してＴＬＲ４アゴニスト又はその断片を含んでいる増殖不全腫瘍細胞）を包含する。
ある特定の実施態様では、本発明の免疫原性組成物は新生物又は腫瘍に特異的な抗原に対する免疫応答を誘発又は増強するために有用である。本明細書で用いられるような表現「増強された免疫応答」は、特異的な免疫活性化の検出可能な増大が検出可能である（例えば、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞応答の増大）ことを意味する。増強した免疫応答の例は、本発明のサイトカイン発現細胞性ワクチンの投与前には低レベルで検出された抗原に結合する抗体の量の増大である。別の例は、増大した細胞免疫応答である。細胞免疫応答は、Ｔ細胞を包含して、インビトロで（例えば、クロム放出アッセイで測定することにより）又はインビボで観察できる。増強した免疫応答は、一般に、免疫細胞の特異的集団の増大とともに起こる。
【００９７】
別の実施態様では、本発明の免疫原性組成物は腫瘍細胞の生育を阻害するために有用である。語句「腫瘍の生育を阻害すること」は、腫瘍量、腫瘍体積、腫瘍細胞の量又は腫瘍の生育速度の測定可能な減少を示す。腫瘍量の測定可能な減少は当業者に公知の多くの方法で検出できる。アクセス可能な腫瘍の直接測定、腫瘍細胞（例えば、血中に存在する）の算出、腫瘍抗原（例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、アルファーフェトプロフェン（ＡＦＰ））の測定及び多くの可視化技術（例えば、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン及びＸ線）を包含する。腫瘍生育速度の減少は一般に、癌を有する対象のより長い生存期間と相関している。
更に別の態様では、本発明の細胞に基づいたワクチンは、腫瘍の生育及び／又は腫瘍細胞の周辺組織へ侵入するか或いはまた転移する傾向を予防又は減少するために有用である。治療用途に関しては、例えば、本明細書に開示されているワクチンは、生理食塩水のような薬学的に許容される緩衝液中で製剤化して、全身的に又は局所的に投与することができる。好ましい投与経路は、例えば、腫瘍内、腫瘍周辺、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、又は皮内注射を包含し、これらは免疫応答を誘発又は増強するのに十分なものである。ヒト患者又はその他の動物の治療は、生理的に許容される担体中の、本明細書で確認した治療薬の治療有効量を用いて実施できる。適切な担体及びそれらの製剤化は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin に記載されている。投与する治療薬剤の量は、投与の方法、患者の年齢及び体重によって、並びに腫瘍の臨床的症状によって変化する。場合によっては化合物の特異性が増大するためにより低い量を必要とするが、一般に、量は腫瘍に関連している他の疾患の治療に用いられている他の薬剤に用いられている量の範囲内であるだろう。
【００９８】
（医薬組成物の製剤化）
腫瘍治療のための細胞に基づくワクチンの投与は、他の成分と組合わせて、腫瘍を改善し、減少し、又は安定化するのに有効なワクチンの濃度をもたらす適切な方法の何れかによることができる。ワクチンは何れかの適切な量で、何れかの適切な担体物質中に含まれてよく、一般に組成物の総重量の１〜９５重量％の量で存在する。細胞に基づくワクチンは非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、又は腹腔内）投与経路に適している剤形で提供されてもよい。好ましい投与方法は筋肉内、腫瘍内、又は静脈内注入である。医薬組成物は従来の医薬実務に従って製剤化できる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 及び Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York を参照されたい）。
【００９９】
（非経口用組成物）
細胞に基づくワクチンを含んでいる医薬組成物は、従来の、非毒性の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含有している、剤形、製剤中で、又は適切な送達デバイス或いは移植を介して、注射、輸液又は移植（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内等）によって非経口投与できる。このような組成物の製剤及び調製物は医薬製剤分野の当業者に周知である。製剤は、前記のRemington: The Science and Practice of Pharmacy に見ることができる。
【０１００】
非経口で使用する組成物は、単位剤形（例えば、単回用量アンプル）で、又は数回用量を含有しているアンプルで提供することができ、及びその中に適切な防腐剤を添加してもよい（以下を参照されたい）。組成物は溶液、懸濁液、乳濁液、輸液用具、又は移植用の送達デバイスの形態であってよく、或いは使用前に水又はその他の適切な賦形剤で再構築する乾燥粉末として存在していてもよい。腫瘍を減少又は改善する活性薬剤と離して、組成物は非経口投与で許容される担体及び／又は賦形剤を含有することができる。活性な治療薬(複数も)を放出制御のために、微小球、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソーム等に取り込むことができる。更に組成物は、懸濁、溶解、安定化、ｐＨ調節剤、張力調節剤、及び／又は懸濁化剤を含有することができる。
【０１０１】
上で示したように、本発明の医薬組成物は、無菌注射に適している形態であってよい。このような組成物を調製するために、適切な治療薬（複数を含む）を非経口投与で許容される液体賦形剤に溶解又は懸濁する。とりわけ、使用できる許容可能な賦形剤及び溶媒は、水、適量の塩酸、水酸化ナトリウム又は適切なバッファーを添加して適切なｐＨに調節した水、１，３−ブタンジオール、リンゲル溶液、及び等張の食塩溶液並びにブドウ糖溶液である。水性製剤は１つ又はそれ以上の防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、エチル又はｎ−プロピル）も含有することができる。１つの化合物が水に難溶か殆ど溶けない場合は、溶解増強剤又は溶解剤を添加してもよい、或いは溶媒が１０〜６０ｗ／ｗ％のプロピレングリコール等を含んでもよい。
【０１０２】
（併用治療）
任意に、本発明の癌ワクチンに基づく治療剤を他の何れかの化学療法剤と併用して投与することができる：このような方法は当業者にとって公知であってRemington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin に記載されている。特に、本発明の免疫原性組成物を、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、オーリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、セマドチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビン−カロイコブラスチン（3',4'-didehydro-4'-deoxy-8'-norvin- caleukoblastine）、ドセタキソール（docetaxol）、ドセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、ドラスタチン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシ尿素及びヒドロキシ尿素タキサン類、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ＭＤＶ３１００、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、タキサン、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、ＲＰＲ１０９８８１
リン酸エストラムスチン、タモキシフェン、タソネムリン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、及びビンフルニンの１つ又はそれ以上の何れかと併用して投与することができる。
【０１０３】
本発明の併用療法では、治療成分を同時に、又は互いに１、３、５、７、１４、２１又は２８日以内に、腫瘍の生育を阻害するのに十分な量を投与する。癌のタイプ及びその進展段階に応じて、併用療法は、癌を治療する、癌の拡散を遅らせる、癌の生育を遅らせる、原発腫瘍から身体の他の部分へ拡散しうる癌細胞を殺すか止める、癌に起因する症状を軽減する、又は最初の場所で癌を阻止するために用いることができる。併用療法は、痛み及び不快感を引き起こす癌細胞を除去して、人々がより快適に暮らすことの手助けもする。
【０１０４】
本発明の併用投与は、それぞれの化合物を単独で投与することに比べて同様な効果及びより低い毒性をもたらしつつ、それぞれの化合物のより低い用量の投与を可能にする。あるいは、このような併用は腫瘍の治療において同様なあるいは減少した毒性を持って改善された効果をもたらす。
【０１０５】
（キット）
本発明は、腫瘍を治療又は予防するためのキットを提供する。
一実施態様では、キットは単位剤形内に腫瘍細胞に基づくワクチンの有効量を含有している治療又は予防組成物を包含している。
ある実施態様では、キットは治療又は予防細胞組成物を含有する滅菌容器を含んでいて；このような容器は箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、又は当該技術分野で公知のその他の適切な容器形態であってよい。このような容器はプラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属泊、又は医薬品を保持するのに適している材料で作ることができる。
【０１０６】
必要に応じて、本発明の腫瘍細胞に基づくワクチンは、癌（例えば、メラノーマ、乳癌）を有しているか、又は癌が進展する危険性のある対象にワクチンを投与するための説明書と共に提供される。説明書は通常、腫瘍を治療又は予防するための組成物の使用についての情報を含んでいる。別の実施態様では、説明書は以下のものの少なくとも１つを含んでいる：治療薬の説明；虚血又はその症状を治療又は予防するための投与計画及び投与；事前注意；警告；適応症；禁忌；過量投与情報；副作用；動物薬理；臨床研究；及び／又は参考文献。説明書は容器（存在するとき）に直接、又は容器に貼付したラベルとして、或いは容器内に又は容器と共に供給される別個のシート、パンフレット、カード、又はホルダーとして印刷できる。
【０１０７】
本発明の実施には、別段の指示がないかぎり、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生物化学及び免疫学の従来技術を使用するが、これらは十分に当業者の理解の範囲内である。このような技術は、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook, 1989); “Oligonucleotide Synthesis”(Gait, 1984);“Animal Cell Culture”(Freshney, 1987);“Methods in Enzymology”“Handbook of Experimental Immunology”(Weir, 1996);“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller and Calos, 1987;“Current Protocols in Molecular Biology”(Ausbel, 1987);“PCR: The Polymerase Chain Reaction”,(MUllis, 1994);“Current Protocols in Immunology”(Coligan, 1991) のような文献に十分に説明されている。これらの技術は本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの製造に適用でき、このようにして本発明を作成し実施する際に考慮できる。特定の実施態様のために特に有用な技術は以下のセクションで検討される。 
【０１０８】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、及び治療方法をどのように作成して用いるかについての完全な開示及び記載を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが彼らの発明と見なしているものの範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【０１０９】
実施例１：ＴＬＲアゴニストで増強した（Enhanced）ＧＶＡＸ（ＴＥＧＶＡＸ）の製剤化。
局所領域に固有の免疫細胞活性化を増強し、更にトール様受容体４（ＴＬＲ４）刺激の全身毒性を最小化して腫瘍細胞に対するＴＬＲ４刺激を最小化するために、リポ多糖類（ＬＰＳ）をＧＶＡＸ（ＴＥＧＶＡＸ−ＴＬＲ４強化ＧＶＡＸ）内に製剤化した。致死的放射線照射の前に、ＧＶＡＸ細胞内へのＬＰＳの吸収を最適化するために市販のリポソームベクター−リポフェクタミン−を用いた。吸収の程度を定量するために、ＬＰＳ−ジピロメテンボロンジフルオライド（ＢＯＤＩＰＹ）フルオロフォアを用いてＬＰＳ−ＢＯＤＩＰＹで製剤化する細胞の９８％を有するように最適化する各種条件を試験した（図１）。細胞当り吸収されたＬＰＳの総量を定量するために、リムルスアメボサイトライゼート（Limulus Amebocyte Lysate：ＬＡＬ）アッセイ（Cambrex）を用いて、ＬＰＳ製剤を最適化したリポフェクタミン方法によって、５×１０５細胞内に４．７３±０．２ｎｇのＬＰＳが吸収されたことを明らかにした。それぞれのインビボマウス腫瘍実験に対して、ＴＥＧＶＡＸ製剤中のＬＰＳとＧＭ−ＣＳＦの同等量を保証するために、ＴＥＧＶＡＸのアリコートをＬＡＬアッセイ更にはＧＭ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて試験した。典型的な分泌されたＧＭ−ＣＳＦは５０〜２００ｎｇ／ｍｌ／１０６細胞／日の範囲であった。
【０１１０】
実施例２：ＴＥＧＶＡＸはインビボで複数のマウス癌モデルにおいて抗腫瘍応答を誘発する。
ＴＥＧＶＡＸの効果を最初にＢ１６メラノーママウスモデルで試験し、そこでは治療モデルに腫瘍を移植した３〜５日後にＴＥＧＶＡＸを腫瘍内に送達した。腫瘍内注射の理論的根拠の一部は、腫瘍と流入領域リンパ節の間を循環している局所領域の抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）を標的としていたことを保証することであった。アネルギー性で耐性の腫瘍特異的Ｔ細胞は早ければＢ１６注入の３日後に現れるのでこれらの時点を選択した。図２に示したように、ＴＥＧＶＡＸはＧＶＡＸ処置と比べるとＢ１６腫瘍の生育速度を減少させた。これらの生育速度の統計的に有意な差を生存曲線の差に置き換えた（図２）。しかしながら、ＴＥＧＶＡＸで処置した全てのＣ５７Ｂ１／６マウスは最終的に注射部位に大きい腫瘍を発症した。５×１０５細胞当り４．７３ｎｇのＬＰＳが測定されたことを考量して、コントロール実験を実施して、ＴＥＧＶＡＸ処置群と等モル量のＬＰＳを腫瘍周辺に注入した。ここで、これらのマウスは、ＧＶＡＸ又はＰＢＳで処置した腫瘍担持マウスと生育速度又は生存率に差を有していなかった（図７）。リポソーム製剤なしでＧＶＡＸを注射した等モルのＬＰＳは、ＰＢＳコントロール群と比べて抗腫瘍応答を明らかにせず、ＬＰＳの細胞内製剤がその抗腫瘍応答に対して重要であることを示唆した（図７）。ＴＥＧＶＡＸも全身性抗腫瘍応答を誘発した（図８）。Ｂ１６メラノーマモデルを用い、マウスは腫瘍周辺又は腫瘍接種部位の対側肢の何れかをＴＥＧＶＡＸで処置して、両処置群が同様なインビボ腫瘍生育速度を示した（図８）。
【０１１１】
ＴＥＧＶＡＸが別のマウス腫瘍モデルにおいても抗腫瘍応答を明らかにできるか否かを試験するために、野生型ＴＬＲ４Ｒを有する同系Ｃ３Ｈ／ＨｅＯＵＪマウスの横腹にＳＣＣＦＶＩＩ／ＳＦ細胞を皮下注射した（図２）。腫瘍が触診可能になった時点で、腫瘍をマウスＳＣＣＦＶＩＩ／ＳＦ扁平上皮癌細胞から調製したＴＥＧＶＡＸ又はＧＶＡＸの何れかで処置した。Ｂ１６モデルを用いるＴＥＧＶＡＸ実験と同様に、ＴＥＧＶＡＸは有意な抗腫瘍応答を示した。今度も、ＴＥＧＶＡＸで処置した全てのマウスが最終的に安楽死を必要とした巨大な腫瘍を発症した。ＳＣＣＦＶＩＩ／ＳＦマウスモデルにおける口腔腫瘍の舌及び口腔底部の測定が本来不正確であるので、同所注射は実施しなかった。
【０１１２】
最後に、ＣＴ２６大腸癌モデルでＴＥＧＶＡＸも試験して、これも抗腫瘍応答を示し、ここでは移植した腫瘍の生育速度がＧＶＡＸ単独で処置したＣＴ２６腫瘍より統計的に遅かった（図２）。ＣＴ２６に対して、ＴＥＧＶＡＸで処置したマウスの４０〜６０％が実際に腫瘍の退行を有していた。ＣＴ２６細胞を生存したマウスから採取して腫瘍を再移植すると、どの腫瘍も生育せず、完全な免疫治療の治癒を明らかにした。ＣＴ２６モデルに対して、ＴＥＧＶＡＸと等モル量の致死的に放射線照射したＨＥＫ２９３細胞で製剤化したＬＰＳも試験した。同一の腫瘍抗原及びＧＭＣＳＦのセットがない細胞に基づくワクチン内に製剤化したＬＰＳはＣＴ２６モデルにおいて抗腫瘍応答を引き起こさなかった。
【０１１３】
実施例３：ＴＥＧＶＡＸへの抗腫瘍応答はＭｙＤ８８依存性である。
上記のインビボ抗腫瘍効果が実際にＴＬＲ４シグナル伝達の導入に起因していたことを確認するために、Ｂ１６腫瘍をＭｙＤ８８−／−遺伝子型を有するＣ５７Ｂ１／６マウスに接種した。次いで、腫瘍をＴＥＧＶＡＸ又はＧＶＡＸで処置した。図３は、ＧＶＡＸ細胞内に構築されたＴＬＲ４アゴニストの添加による増強された抗腫瘍応答が、実際に、ＴＬＲ４刺激に続発することを示している。ＧＶＡＸ群で先に言及された僅かな差は、最終的にＰＢＳ処置群の生育曲線と重なった（図７）。ＭｙＤ８８はＴＬＲ４シグナル伝達の必須細胞内メディエーターであって、ＭｙＤ８８欠損マウスにおいてＴＬＲ４シグナル伝達の非存在が、野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスで一貫して認められた増強したインビボ抗腫瘍応答をもはや明らかにしなかった。
【０１１４】
実施例４：ＴＥＧＶＡＸは腫瘍微小環境においてＴ細胞浸潤及びＡＰＣの増強を誘発する。
ＴＥＧＶＡＸ処置によるインビボ抗腫瘍応答の潜在的なメカニズムを検討するために、処置後に腫瘍組織を摘出してリンパ球浸潤を分析した。図４に示したように、ＴＥＧＶＡＸで処置した腫瘍は、コントロール処置及びＧＶＡＸ処置腫瘍と比べて、ＣＤ４及びＣＤ８浸潤を定量的に増大していた。さらに、ＴＬＲ４アゴニストが局所に常在しているＡＰＣを成熟するように刺激すると仮定して、ＣＤ８６に対する抗体で免疫染色を行って、ＴＥＧＶＡＸで処置した腫瘍微小環境において定量的に増強したＣＤ８６＋細胞が観察された。マクロファージが腫瘍組織内で増大しているか否かも試験したが、処置群の間でＦ４＋マクロファージの湿潤に有意な差は見出されなかった。
【０１１５】
実施例５：局所的流入領域リンパ節における樹状細胞活性化の増強。
図４の免疫染色データはＴＬＲ４アゴニストを製剤化した細胞ワクチンは活性化した局所領域の樹状細胞の数を増大できるという仮説と一致していた。ＤＣはエフェクター細胞が免疫寛容性になるか或いは細胞毒性の何れになるかを決定できる重要な一次抗原処理細胞である。理論に縛られるつもりはないが、ＧＶＡＸに吸収されたＬＰＳは、細胞残屑及び腫瘍抗原とのミセルのように浸潤ＤＣ内に取り込まれると思われる。従って、ＴＥＧＶＡＸ処置によって増大した数の活性化した局所領域のＤＣ集団が存在すると思われる。この仮説を試験するために、ＰＢＳ、ＧＶＡＸ、又はＴＥＧＶＡＸの何れかで処置した腫瘍担持マウス由来の流入領域リンパ節から樹状細胞を精製して、Ｂ２２０及びＣＤ１１ｃを用いて従来型のＤＣ集団をゲートした。これらのゲートした細胞由来ＤＣ活性化マーカーＣＤ８６、ＣＤ８０及びＭＨＣＩＩの多様性染色が、ＧＶＡＸ処置群又はコントロール処置群と比べてＴＥＧＶＡＸ処置群由来の樹状細胞がより多くの活性化ＤＣの集団を有していることを示す（図５）。
【０１１６】
実施例６：腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞はＴＥＧＶＡＸで処置したマウス中で増大する。
ＳＣＣＦＶＩＩ／ＳＦ及びＢ１６モデルと組合せてＣＴ２６モデルを検討する１つの理論的根拠は、ＡＨ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞の定量のための試薬の利用可能性であった。局所領域樹状細胞を活性化するＴＥＧＶＡＸのインビボ抗腫瘍応答が腫瘍特異的細胞傷害性エフェクター細胞の下流集団を増大するかを試験するために、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。免疫原性ＭＨＣクラスＩＬｄ制限ＡＨ１ペプチドを用いて、流入領域リンパ節及び脾臓由来のＴ細胞を採取して、ＡＨ１ペプチド（ＡＰＣでパルスしたＣＴ２６に対する免疫優性ペプチド）の存在下で、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってＩＦＮ産生細胞傷害性Ｔ細胞をスクリーニングした。図６Ａに示したように、ＴＥＧＶＡＸによる処置の５日後に最小量のＡＨ１特異的Ｔ細胞が検出されたに対して、８日目までに、ＴＥＧＶＡＸ群の、流入領域リンパ節及び脾臓の両方に統計的に有意なＡＨ１特異的Ｔ細胞が存在した。インビボ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイも、未置群と比べてＴＥＧＶＡＸ処置群においてＡＨ１ペプチドに対する増強された細胞傷害性Ｔ細胞プライミングも明らかにした（図６Ｂ）。Ｂ１６モデル由来のｐ１５Ｅ特異的Ｔ細胞を用いるインビボＣＴＬアッセイもＴＥＧＶＡＸ群に増強されたｐ１５Ｅ特異的Ｔ細胞を明らかにした。
【０１１７】
実施例７：ＧＶＡＸと組合わせたＴＬＲ４アゴニストは、腫瘍細胞の生育を減少してＡＨ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞の数を増大した。
上で報告したように、ＴＥＧＶＡＸは３つの異なったマウスモデルにおいてインビボ腫瘍応答を改善した。Ｂ１６メラノーマモデル、ＣＴ２６大腸癌モデル、そしてＳＣＣＶＩＩ舌扁平上皮癌モデルにおいて、確立された腫瘍に腫瘍内注入したＴＥＧＶＡＸがＧＶＡＸ単独と比べて腫瘍の生育を減少した。腫瘍接種後のＴＥＧＶＡＸを用いる全身処置もインビボでＢ１６の生育速度を減少させた。抗腫瘍応答を誘発する免疫学的メカニズムを試験するために、ＣＴ２６マウスモデルを抗腫瘍細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を検討するために用いた。十分に特性化されているＥＬＩＳＰＯＴアッセイ及びインビボＣＴＬアッセイを用いると、ＴＥＧＶＡＸで処置したマウスは処置の８日後までに増大した数のＡＨ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を示した。これらの実験で、前臨床モデルにおいてＴＬＲ４アゴニストをＧＶＡＸと併用することにより、腫瘍生育の速度が減少した。
【０１１８】
実施例８：ＧＶＡＸ並びにＴＬＲ７及びＴＬＲ８アゴニスト（Ｒ８４８）と組合わせた合成ＴＬＲ４アゴニスト−グリコピラノシル リピドＡ類縁体（ＧＬＡ）−はメラノーマ細胞の生育を有意に減少した。
腫瘍微小環境内のＴＬＲシグナル伝達の１つ以上のタイプが抗腫瘍応答を改善できるか否かを確認するために、ＴＬＲ４アゴニストの別の形態である、ＧＬＡ（合成グリコピラノシル リピドＡ類縁体）をＧＶＡＸと共に用いた。ＧＶＡＸに構築したＧＬＡをＲ８４８、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８とも組合わせた。Ｂ１６メラノーママウスを用いてインビボ腫瘍処置実験を実施した。Ｂ１６メラノーマモデルを用いると、ＧＶＡＸ、ＧＬＡ、及びＲ８４８の組み合わせは野生型マウスにおける悪性Ｂ１６腫瘍の生育を阻止した（図９）。
【０１１９】
ワクチン製剤を腫瘍接種の２〜４日後に注入した。一般的に、このような免疫原性腫瘍細胞が少ない場合は、ＧＶＡＸそれ自身はインビボのＢ１６の生育を阻止しない。これらのマウスにＢ１６メラノーマ細胞株を再注入すると、投与された腫瘍細胞は生育しなかった。ｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を定量するためにＥＬＩＳＰＯＴ及びインビボＣＴＬアッセイの両方を実施して、ＧＶＡＸ、ＧＬＡ、Ｒ８４８で処置したマウスがＧＶＡＸ単独で処置したマウスより有意によりｐ１５Ｅに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を有していた。
【０１２０】
実施例９：ＧＶＡＸ／ＧＬＡ／Ｒ８４８の組み合わせは樹状細胞の活性化を増強する。
器質性の腫瘍組織を治療するために、ＧＶＡＸ／ＧＬＡ／Ｒ８４８製剤を用いて触診可能なＢ１６腫瘍を処置した。腫瘍接種の７〜１０日後にワクチン製剤を触診可能な腫瘍組織から離れた部位に注入した。再び、ＴＬＲアゴニストで増強されたＧＶＡＸは腫瘍生育速度を減少した（図１０）。
【０１２１】
ＥＬＩＳＰＯＴ及びインビボＣＴＬアッセイを実施してそれぞれの群でｐ１５Ｅ特異的ＣＴＬのレベルを定量し、そしてその結果はＧＶＡＸ／ＧＬＡ／Ｒ８４８で処置したマウスがインビボ腫瘍生育速度に相関するｐ１５Ｅ特異的Ｔ細胞の最も多い数を有していたことを明らかにした（図１１）。
【０１２２】
ＧＶＡＸ／ＧＬＡ／Ｒ８４８製剤によるこれらの抗腫瘍応答を考慮して、ＴＬＲアゴニストで増強したワクチンが樹状細胞を刺激したと推測した。従って、各処置群由来の流入領域リンパ節及び脾臓を採取して、樹状細胞の活性化状態を試験した。ＣＤ１１ｃ＋及びＢ２２０＋細胞上でＣＤ８０及びＣＤ８６活性化マーカーを用いると、ＧＶＡＸ／ＧＬＡ／Ｒ８４８処置群は有意に増強された活性化樹状細胞を示した（図１２）。
【０１２３】
各処置群由来の腫瘍組織を、免疫組織化学を用いて分析した。ＧＶＡＸ／ＧＬＡ／Ｒ８４８で処置した腫瘍により多い数のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＣＤ８６＋細胞が見出された。最後に、各処置群でサイトカイン環境を試験してＴＬＲアゴニストで処置したマウスにおいてＩｌ−１２が上昇したか否かを確認した。ＣＤ１１ｃ陽性細胞を流入領域リンパ節及び脾臓の両方から採取して、Ｔ細胞レパートリーを抗腫瘍Ｔｈ１応答に向けさせる能力に関するＩｌ−１２サイトカインのレベルを試験した（図１３）。ＧＶＡＸ／ＧＬＡ／Ｒ８４８で処置したマウスが、Ｔ細胞環境をＴｈ１応答に向けさせる主要なサイトカインである、Ｉｌ−１２を発現するＣＤ１１ｃ＋細胞の統計的に有意な数を有していた。これは流入領域リンパ節及び脾臓の両方で著名であった。
【０１２４】
要約すると、これらの結果はＧＶＡＸ基盤を複数のＴＬＲアゴニストと共に用いる方法が固形腫瘍の治療における効果を増大したことを示した。ＧＶＡＸとＴＬＲ４及びＴＬＲ７／８アゴニストとの組合わせはインビボでの抗腫瘍応答を改善する。改善された抗腫瘍応答は活性化樹状細胞の増大した数、腫瘍特異的ＣＴＬの増大した数、流入領域リンパ節及び脾臓内にＩｌ−１２を分泌できるＣＤ１１ｃの増大した数と相関している。
【０１２５】
上記の結果は以下の方法及び材料を用いて得られた。
【０１２６】
（マウス腫瘍細胞株）
ＳＣＣＦＶＩＩ／ＳＦ頭頸部扁平上皮癌、Ｂ１６−Ｆ０メラノーマ、及びＧＭ−ＣＳＦを分泌するように形質導入されたＢ１６−Ｆ０細胞株を、１０％の加熱不活化したウシ胎仔血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を含有しているＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。ＣＴ２６結腸直腸癌細胞株を、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Sigma, St. Louis）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び２ｍＭのＬ−グルタミンを加えて、同様に培養した。ＧＭ−ＣＳＦで形質導入したバイスタンダーＢ７８ＨＩ細胞をＣＴ２６と同じであるが、ストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）由来のハイグロマイシンＢ（１ｇ／Ｌ）（Roche Applied Science, Indianapolis, IN）を加えた培地で培養した。全ての細胞を５％の加湿ＣＯ２中、３７℃で培養した。腫瘍接種の１０日前にワクチンを注射するワクチン接種モデルで試験したＧＶＡＸワクチン細胞株は３つのＧＣＡＸ株全てで腫瘍の生育を示さなかった。
【０１２７】
（マウス）
成熟（日齢＞５０日）雌性Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／Ｃ、及びＣ３Ｈ／ＨｅＯＵＪマウスをJackson Laboratory から購入して、the Johns Hopkins Animal Care and Use Committee に従って飼育した。Ｃ５７ＢＬ／６ＭｙＤ８８−／−マウスを Dr. Franck Housseau (Johns Hopkins University) から入手した。
【０１２８】
（ＴＥＧＶＡＸ製剤）
リポフェクトＡＭＩＮＥ試薬（１２０μｇ／ｍｌ）及びEscherichia coli ０２６：Ｂ６由来のＬＰＳ（１０〜２５μｇ／ｍｌ）を組合わせてリポソーム複合体にした。細胞をリポ多糖類（ＬＰＳ）製剤へ５×１０５細胞の密度で播種して２４時間後にリポソーム−ＬＰＳ複合体と６時間培養し、ＰＢＳで５回洗浄し、次いでマウスに注入した。細胞に組み込まれたＬＰＳを定量するために、製造会社の指示の通りにLimulus Amebocyte Lysate (LAL) アッセイ (Cambrex) を実施した。０〜３．０ＥＵ／ｍｌからのＬＰＳ（２３ＥＵ／ｎｇ）をスタンダードとして用いた。致死的放射線照射の前にＴＥＧＶＡＸを、生存細胞生育を保証するために培養した。アネキシン染色が製剤化後にアポトーシスの証拠がないことを立証した。
【０１２９】
（インビボワクチン処置アッセイ）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹内に５×１０４個のＢ１６−Ｆ０細胞を皮下注射した。移植の３〜５日後に１０６致死的放射線照射（１５０Ｇｙ）したＢ１６ＧＭ−ＣＳＦ（ＧＶＡＸ）、１０６致死的放射線照射（１５０Ｇｙ）したＬＰＳ製剤化ＧＶＡＸ（ＴＥＧＶＡＸ製剤）又はＬＰＳ吸収２９３細胞を腫瘍周辺に注入した。一部の場合には、腫瘍接種肢の対側肢にワクチンを注入した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＯＵＪマウス及びＢａｌｂ／ｃマウスを、それぞれ同様な方法で、ＳＣＦＶＩＩ／ＳＦ細胞及びＣＴ２６細胞と共に用いた。
【０１３０】
（免疫組織化学）
マウス由来の凍結ＣＴ２６腫瘍を１０μｍの厚さにカットして１％のＢＳＡで室温で３０分間ブロックした。４℃で１時間培養した抗マウスＣＤ４５（eBioscience）及び抗マウスＣＤ４−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＣＤ８−ＦＩＴＣ、ＣＤ８６−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen) を一次抗体として用いた。抗ＣＤ４５−Ｃｙ３（Invitrogen）を、幾つかの場合に二次抗体として用いた。ＤＡＰＩを１０分間対比染色として用いた。倍率４０倍の無作為に選択した１０の視野にある細胞の数を数えた。Nicon Eclipse F800 がこれらの実験に用いた顕微鏡で、Nicon DS-Qilmc がカメラで、そしてNIS-Element AR 3.0 がソフトウェアであった。腫瘍障害のあるＢＬ／６マウス由来の脾臓及び流入領域リンパ節をＧＶＡＸ及びＴＥＧＶＡＸ処置の５日後に摘出した。スライスした脾臓をＤＮＡｓｅＩ（Roche）及び市販の組織解離用の酵素混合物（LIBERASE BLENDZYME 2）（20,000 Mandl U/ml）（Roche）を含有している培地で酵素的に消化させた。ＤＣが豊富な集団を、ＣＤ３＋及びＣＤ１９＋を除去して得て、そしてＣＤ１１ｃ＋及びＢ２２０＋染色した。ＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０＋がゲートしたＤＣを、BD Biosciences からのＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＭＨＣＩＩ抗体を用いる多色ＦＡＣＳ分析で評価した。
【０１３１】
（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）プレート（MultiScreenHTS filter plate, Millipore）をマウスインターフェロン（ＩＦＮ）γ抗体（Ａｂ）（MabTech）で２４時間コーティングして、４Ｔ１乳癌細胞を１０μｇ／ｍｌのＡＨ１ペプチドで１晩パルスした。翌日、脾臓及びリンパ節をマウスから摘出した。１０６個のＣＤ８ａ＋細胞を、１０５個のパルスしていない４Ｔ１細胞と共培養するために、１０５個のパルスした４Ｔ１細胞と共培養するために、又は陽性コントロールのために１μＭのＰＭＡ及び１０ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンで刺激するために、３組を固定した。第３日目に、プレートをビオチニル化した抗マウスＩＦＮ−γ−Ａｂ（MabTech）と培養し、次いでＥＬＩＳＰＯＴ（ＢＤ）用のストレプタビジン−ＨＲＰと培養した。プレートをＥＬＩＳＰＯＴ（ＢＤ）用のＡＥＣ基質試薬セットを用いて展開させて、ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダー（Immunospot）を用いて分析した。
【０１３２】
（インビボＣＴＬアッセイ）
インビボ追跡用の市販試薬 CellTrace（登録商標）CFSE Cell Proliferation Kit （Molecular Probes）をＴＥＧＶＡＸで処置したか処置していないＣＴ２６腫瘍障害マウスにおけるＣＴＬの死滅パーセントを試験するために用いた。脾細胞をβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）又はＡＨ１ペプチドの何れかで１０μｇ／ｍｌ濃度で９０分間処理してパルスした。β−ｇａｌ集団をＣＦＳＥで低く標識（０．５μＭ）して、ＡＨ１集団をカルボキシフルオレセン二酢酸スクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識（５μＭ）した。１０分間培養した後、両方のＣＳＦＥ標識化細胞をマウスの３群に１０７細胞／マウス注入した。注入の２４時間後に脾細胞を採取して分析した。
【０１３３】
（統計解析）
２つの処置群間の統計的な有意差を見積もるために、対応のあるｔ検定を用いて両側ｐ値を計算した。統計的に有意なｐ値を以下のように標識した。＊＊ｐ＜０．０１及び＊ｐ＜０．０５。データはエクセルソフトウェアを用いて分析した。
【０１３４】
（その他の実施態様）
前述の説明から、本明細書に記載されている本発明を、様々な使用及び条件に適用するために、改変及び修正できることは明らかであろう。このような実施態様もまた以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【０１３５】
本明細書の可変部の定義の何れかにおける構成要素のリストの記述は、単一構成要素又はリストされている構成要素の組合わせ（又は小組合わせ）の何れかとしてのその可変部の定義を包含している。本明細書の実施態様の記述は、単一の実施態様の何れかとしての、又はその他の何れかの実施態様又はそれらの部分との組合わせてとしてのその実施態様を包含している。
【０１３６】
本明細書に述べられている全ての特許及び刊行物は、それぞれの独立した特許及び刊行物が参照により取り込まれることを具体的にそして個々に示しているのと同じ程度に、参照により本明細書に取り込まれている。
【図１】
2013529192.tif 000004
【図２】
2013529192.tif 000005
【図３】
2013529192.tif 000006
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2013529192.tif 000008
【図５】
2013529192.tif 000009
【図６】
2013529192.tif 000010
【図７】
2013529192.tif 000011
【図８】
2013529192.tif 000012
【図９】
2013529192.tif 000013
【図１０】
2013529192.tif 000014
【図１１−１】
2013529192.tif 000015
【図１１−２】
2013529192.tif 000016
【図１１−３】
2013529192.tif 000017
【図１２】
2013529192.tif 000018
【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月7日(2013.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３３】
１つ又はそれ以上の化学療法剤が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、オーリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド（配列番号１）、カケクチン、セマドチン、クロランブシル、シクロホスファミド、３’−４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、ドセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、ドラスタチン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシウレア及びヒドロキシウレアタキサン、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ＭＤＶ３１００、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、タキサン類、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、ＲＰＲ１０９８８１、リン酸エストラムスチン、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、及びビンフルニンよりなる群から選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
上記態様の何れか又は本明細書に記述されている本発明のその他の態様の何れかの多様な実施態様では、腫瘍細胞は癌細胞株に由来しているか又は腫瘍に由来している。
別の実施態様では、癌細胞株又は腫瘍は、白血病、慢性骨髄性白血病、前立腺癌、頭頸部、扁平上皮癌、舌癌、喉頭癌、へんとう腺癌、下咽頭癌、鼻咽頭癌、乳癌、大腸癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌、神経膠芽腫及び脳腫瘍よりなる群から選ばれる。
別の実施態様では、免疫原性組成物は、全身的に又は局所的に投与される。
さらなる実施態様では、免疫原性組成物は、筋肉内注射、静脈内注射、腫瘍内注射、又は腫瘍周辺注射によって投与される。
さらなる実施態様では、方法は１つ又はそれ以上の化学療法剤の有効量を対象に投与することを含んでいる。
ある特定の実施態様では、１つ又はそれ以上の化学療法剤は、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンバスチン、オーリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド（配列番号１）、カケクチン、セマドチン（cemadotin）、クロランブシル、シクロホスファミド、３’−４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール（docetaxol）、ドセタキセル（doxetaxel）、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、ドラスタチン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシウレア及びヒドロキシウレアタキサン、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ＭＤＶ３１００、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、タキサン類、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、ＲＰＲ１０９８８１、リン酸エストラムスチン、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、及びビンフルニンから選ばれる。
さらなる実施態様では、方法は樹状細胞の活性化を増強し、そして／又はＧＶＡＸ単独の使用に比べてＡＨ１特異的細胞毒性Ｔ細胞又はｐ１５Ｅ特異的細胞毒性Ｔ細胞の数を増やす。
ある特定の実施態様では、方法は、ＧＶＡＸ単独使用と比べて腫瘍細胞の増殖、腫瘍生育、又は対象の生存を減少又は安定化する。
さらなる実施態様では、細胞は白血病、慢性骨髄性白血病、前立腺癌、頭頸部、扁平上皮癌、舌癌、喉頭癌、へんとう腺癌、下咽頭癌、鼻咽頭癌、乳癌、大腸癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌、神経膠芽腫及び脳腫瘍又はそれらの細胞株に由来している。
さらなる実施態様では、細胞はＴＬＲ４及びＴＬＲ７／８アゴニストを含有している。
他の実施態様では、ＴＬＲアゴニストはリポソーム性ベクターと関連している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
典型的なＧＭ−ＣＳＦ配列（ＮＧＢＩＡＡＡ５２１２２．１）を以下に提供する。
1 mwlqsllllg tvacsisapa rspspstqpw ehvnaiqear rllnlsrdta aemnetvevi
61 semfdlqept clqtrlelyk qglrgsltkl kgpltmmash ykqhcpptpe tscatqiitf
121 esfkenlkdf llvipfdcwe pvqe
（配列番号２）
ＧＭ−ＣＳＦは顆粒球及びマクロファージ系の造血細胞の生育を誘発することが示されている。またこれは、免疫系の主要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、樹状細胞の抗原プロセッシング及び提示機能も活性化する。免疫原性組成物は、一実施態様では、ワクチンの細胞における発現調節エレメントに操作可能に結合しているＧＭ−ＣＳＦコード配列を含んでいる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
典型的なＧＭ−ＣＳＦコード配列（ＡＦ３７３８６８）を以下に提供する。
1 gcagtctgtt tcctaccaga ctgggagcct caagggccaa atgtgagggc cagtgggagg
61 gtcccgttta cctccccaga acaggtcctg gtgtggattg gaaagacttg ttgactgact
121 gtctgagcta tgacaactca tttctaggag gaaagtgacc ttctctccca gatgggtcat
181 acaggctctc tgcctccctg gccatcagct gaaccactat ctatggctcc cttccctgcc
241 ctccagcctc cagggtgcta tccaacacat gtgatatcta catgtagtat ccatgtcctc
301 atctctcccc cgagagctcc ctggaaagag ctgagccaag gccttgcaaa aaaggtggag
361 aaagggccag ggcctggaca tttcatgttc ccaccccagc ctggccacta ggagtgttct
421 acgcaggctc agatggatgg ggctggcctc acagtggggt ctggaggact aaggtttggt
481 ttctctatgc aaggtcagaa aaactcccac agtacaggga aactggccag ggctgcagac
541 tcagaccaca gtgctaaagc catgaactcc acctgctctc tgaaggctcg ccaacctgag
601 tccagcagaa tgttctcgct tgtgtccaac cccactggtt taggctgaat cagcctctag
661 ggcccagagg cactgcacct ggagtaggga gcttctccag tatcagagtc accttcagag
721 gcctggagcc tttcataaag caggtaagag gactcaatag atgcatctgc atggaaaaca
781 tcctcccctc taccaggcac ctgtatgtac aaccaatcac agcagcacac atacacccag
841 aaatgggcac gtgtgggccc acaccccttt agctatgaaa cccaggcatg gggcagcttg
901 agccagatac cttgtgcaaa cacaaactcg tgctgtcttc tctgaactcc attgtgaaaa
961 tcaaacactt gtcagcccct caagagcctt tagatttcct acttccacac ttccacagaa
1021 aggcctctgg agttggggga tgctggggtt atgtaggaaa ttaagcctgg agggccttgc
1081 tggggaagcc attgtccctg tacctgagat ggatgcagcc acagccctgg agccagcctg
1141 aagctcctgg tgtcttctgg gggctacata taggagtgta gtccgaacct cagaggggca
1201 aacctgctct gcagagggaa tcaaggttca cataaccaga gaggggagtc actcaggaag
1261 gtggctccag agccaagagt cagactctgg gtcccgactt gacccagcca caccccctct
1321 gaagcttgct gagagtggct gcagtctcgc tgctggatgt gcacatggtg gtcattccct
1381 ctgctcacag gggcaggggt ccccccttac tggactgagg ttgccccctg ctccaggtcc
1441 tgggtgggag cccatgtgaa ctgtcagtgg ggcaggtctg tgagagctcc cctcacactc
1501 aagtctctca cagtggccag agaagaggaa ggctggagtc agaatgaggc accagggcgg
1561 gcatagcctg cccaaaggcc cctgggatta caggcaggat ggggagccct atctaagtgt
1621 ctcccacgcc ccaccccagc cattccaggc caggaagtcc aaactgtgcc cctcagaggg
1681 agggggcagc ctcaggccca ttcagactgc ccagggaggg ctggagagcc ctcaggaagg
1741 cgggtgggtg ggctgtcggt tcttggaaag gttcattaat gaaaaccccc aagcctgacc
1801 acctagggaa aaggctcacc gttcccatgt gtggctgata agggccagga gattccacag
1861 ttcaggtagt tcccccgcct ccctggcatt ttgtggtcac cattaatcat ttcctctgtg
1921 tatttaagag ctcttttgcc agtgagccca gtacacagag agaaaggcta aagttctctg
1981 gaggatgtgg ctgcagagcc tgctgctctt gggcactgtg gcctgcagca tctctgcacc
2041 cgcccgctcg cccagcccca gcacgcagcc ctgggagcat gtgaatgcca tccaggaggc
2101 ccggcgtctc ctgaacctga gtagagacac tgctgctgag atggtaagtg agagaatgtg
2161 ggcctgtgcc taggccaccc agctggcccc tgactggcca cgcctgtcag cttgataaca
2221 tgacattttc cttttctaca gaatgaaaca gtagaagtca tctcagaaat gtttgacctc
2281 caggtaagat gcttctctct gacatagctt tccagaagcc cctgccctgg ggtggaggtg
2341 gggactccat tttagatggc accacacagg gttgtccact ttctctccag tcagctggct
2401 gcaggaggag ggggtagcaa ctgggtgctc aagaggctgc tggccgtgcc cctatggcag
2461 tcacatgagc tcctttatca gctgagcggc catgggcaga cctagcattc aatggccagg
2521 agtcaccagg ggacaggtgg taaagtgggg gtcacttcat gagacaggag ctgtgggttt
2581 ggggcgctca ctgtgccccg agaccaagtc ctgttgagac agtgctgact acagagaggc
2641 acagaggggt ttcaggaaca acccttgccc acccagcagg tccaggtgag gccccacccc
2701 cctctccctg aatgatgggg tgagagtcac ctccttccct aaggctgggc tcctctccag
2761 gtgccgctga gggtggcctg ggcggggcag tgagaagggc aggttcgtgc ctgccatgga
2821 cagggcaggg tctatgactg gacccagcct gtgcccctcc caagccctac tcctgggggc
2881 tgggggcagc agcaaaaagg agtggtggag agttcttgta ccactgtggg cacttggcca
2941 ctgctcaccg acgaacgaca ttttccacag gagccgacct gcctacagac ccgcctggag
3001 ctgtacaagc agggcctgcg gggcagcctc accaagctca agggcccctt gaccatgatg
3061 gccagccact acaagcagca ctgccctcca accccggtga gtgcctacgg cagggcctcc
3121 agcaggaatg tcttaatcta gggggtgggg tcgacatggg gagagatcta tggctgtggc
3181 tgttcaggac cccagggggt ttctgtgcca acagttatgt aatgattagc cctccagaga
3241 ggaggcagac agcccatttc atcccaagga gtcagagcca cagagcgctg aagcccacag
3301 tgctccccag caggagctgc tcctatcctg gtcattattg tcattatggt taatgaggtc
3361 agaggtgagg gcaaacccaa ggaaacttgg ggcctgccca aggcccagag gaagtgccca
3421 ggcccaagtg ccaccttctg gcaggacttt cctctggccc cacatggggt gcttgaattg
3481 cagaggatca aggaagggag gctacttgga atggacaagg acctcaggca ctccttcctg
3541 cgggaaggga gcaaagtttg tggccttgac tccactcctt ctgggtgccc agagacgacc
3601 tcagcccagc tgccctgctc tgccctggga ccaaaaaggc aggcgtttga ctgcccagaa
3661 ggccaacctc aggctggcac ttaagtcagg cccttgactc tggctgccac tggcagagct
3721 atgcactcct tggggaacac gtgggtggca gcagcgtcac ctgacccagg tcagtgggtg
3781 tgtcctggag tgggcctcct ggcctctgag ttctaagagg cagtagagaa acatgctggt
3841 gcttccttcc cccacgttac ccacttgcct ggactcaagt gttttttatt tttctttttt
3901 taaaggaaac ttcctgtgca acccagatta tcacctttga aagtttcaaa gagaacctga
3961 aggactttct gcttgtcatc ccctttgact gctgggagcc agtccaggag tgagaccggc
4021 cagatgaggc tggccaagcc ggggagctgc tctctcatga aacaagagct agaaactcag
4081 gatggtcatc ttggagggac caaggggtgg gccacagcca tggtgggagt ggcctggacc
4141 tgccctgggc cacactgacc ctgatacagg catggcagaa gaatgggaat attttatact
4201 gacagaaatc agtaatattt atatatttat atttttaaaa tatttattta tttatttatt
4261 taagttcata ttccatattt attcaagatg ttttaccgta ataattatta ttaaaaatat
4321 gcttctactt gtccagtgtt ctagtttgtt tttaaccatg agcaaatgcc agtggtgcct
4381 gccttcccat gaggcagggg agggaggaaa cggggaggtg gagagggggc gggggcctcc
4441 caggcgttgg gcactatcca agggccaaca ctgtcagagc agaggggagg tgagagccgg
4501 gcataggtgc ggaattctgc acacctggac gggcttcccg ggatgctcca gggctcccac
4561 cccagagaat ggctctcaag ttcacctgga agtccaagtg accagcccag ggaactctta
4621 tcccagagaa gggcaccacc cttcctgggg aggcctgggg gttggctggt cactggctga
4681 acaggcccac tctggcatca ggcaaaacac ctgccctgta gaggccttgg cccctgtgcc
4741 ccacgccctg cccctcacac tctgagattt aaccattccg aaagtaaaca gcaaaataga
4801 ctaactgttc aggggaaaag aaaccaaacc acaggggtca cagtgcagcg tatttaccaa
4861 acttgcccca aaatgggtga tcttaatctc tgagagtcag aatgtaaggt cataatttgt
4921 tggtacatgg ctgtagtgcc gcatgtttct gaattggttt ttatttttac atgaaatttt
4981 gaatctaatc aggcactttc ccctaaaact catggcctgc aggctaaaaa caaagtaggc
5041 ctcctccttc tccttacttt gacagctggg ctcaaggcct tgttcctgaa cctgttccct
5101 catctccctc caggactatg aggaagtgga tgtgccccaa gtcttaggcg ggcagcaggg
5161 ccagcttctc cttgacaggt gggcctaagg aagctggctt gtggcagctt tagcccctgc
5221 ctggcactgt ctgcagtcat gcgcccacca cccctcttgc ttcctctact tcagtcagca
5281 cctgcagaca gcgccaggcc tggccagaga cccactccat gctcatgcag aaagaccgtg
5341 acttcaggtg tgattacaaa taagaagtca gggtgaacgc tcaggatgaa gcctgagtgt
5401 cagcacaggc aagaatccat gaagtgtgct gtggttgttg aaaatgcatg aaaatcacat
5461 cttgcccagc gataaggtcc tctctgtctt ccgcgtaagc cagtgatgac tgataagagg
5521 tttagcattt ccttagcctc acatatatag gtacccctct ccacagaaat gctgccaagc
5581 ccagggctcg gaccagcttg gagtcacctt caagtaatac catgcacctg tacgtgctcc
5641 tggctcatgt gctctggggg tcagaaagcc attcttccca atgaaagtag ccacgatatc
5701 tccccacgaa aagtacacag cagtctgtgc tgacattcag aaagaactct cggctgacaa
5761 taacacacac aagataagtc tgggtctcca tcaaacgtta ttttgctctt agtgcccctt
5821 tgtgctcctg accaatttct ctggcttccg gggtcccttc aataggcccc agaaaaccag
5881 tgaggtaaga aacagctgcc ccgggacctt tcataccaca tttgaacagg gagagagaga
5941 tctcaccagt cagtgcccag ggaagagata acaacaaggg atagtggagt ga
（配列番号３）
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
ヒト−トール様受容体４前駆体ＮＰ＿６１２５６４の配列を以下に提供する。
1 mmsasrlagt lipamaflsc vrpeswepcv evvpnityqc melnfykipd nlpfstknld
61 lsfnplrhlg sysffsfpel qvldlsrcei qtiedgayqs lshlstlilt gnpiqslalg
121 afsglsslqk lvavetnlas lenfpighlk tlkelnvahn liqsfklpey fsnltnlehl
181 dlssnkiqsi yctdlrvlhq mpllnlsldl slnpmnfiqp gafkeirlhk ltlrnnfdsl
241 nvmktciqgl aglevhrlvl gefrnegnle kfdksalegl cnltieefrl ayldyylddi
301 idlfncltnv ssfslvsvti ervkdfsynf gwqhlelvnc kfgqfptlkl kslkrltfts
361 nkggnafsev dlpslefldl srnglsfkgc csqsdfgtts lkyldlsfng vitmssnflg
421 leqlehldfq hsnlkqmsef svflslrnli yldishthtr vafngifngl sslevlkmag
481 nsfqenflpd iftelrnltf ldlsqcqleq lsptafnsls slqvlnmshn nffsldtfpy
541 kclnslqvld yslnhimtsk kqelqhfpss laflnltqnd factcehqsf lqwikdqrql
601 lvevermeca tpsdkqgmpv lslnitcqmn ktiigvsvls vlvvsvvavl vykfyfhlml
661 lagcikygrg eniydafviy ssqdedwvrn elvknleegv ppfqlclhyr dfipgvaiaa
721 niihegfhks rkvivvvsqh fiqsrwcife yeiaqtwqfl ssragiifiv lqkvektllr
781 qqvelyrlls rntyleweds vlgrhifwrr lrkalldgks wnpegtvgtg cnwqeatsi
（配列番号４）
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
（併用治療）
任意に、本発明の癌ワクチンに基づく治療剤を他の何れかの化学療法剤と併用して投与することができる：このような方法は当業者にとって公知であってRemington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin に記載されている。特に、本発明の免疫原性組成物を、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、オーリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド（配列番号１）、カケクチン、セマドチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビン−カロイコブラスチン（3',4'-didehydro-4'-deoxy-8'-norvin- caleukoblastine）、ドセタキソール（docetaxol）、ドセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、ドラスタチン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシ尿素及びヒドロキシ尿素タキサン類、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ＭＤＶ３１００、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、タキサン、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、ＲＰＲ１０９８８１
リン酸エストラムスチン、タモキシフェン、タソネムリン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、及びビンフルニンの１つ又はそれ以上の何れかと併用して投与することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013529192000001.app
【国際調査報告】
2013529192.tif 000020
2013529192.tif 000021
2013529192.tif 000022
2013529192.tif 000023