(57)【要約】本発明は、５型ホスホジエステラーゼ阻害剤としての式（Ｉ）の化合物およびそのクエン酸塩、それらの調製方法、ならびに式（Ｉ）の化合物およびそのクエン酸塩を含む医薬組成物を開示する。本発明の実験結果は、式（Ｉ）の化合物およびそのクエン酸塩は５型ホスホジエステラーゼの活性を阻害することができ、勃起不全の処置、血小板凝集の阻害および血栓症の処置、肺高血圧の軽減および心血管疾患の処置、喘息の処置および糖尿病性胃不全麻痺の処置のために使用することができるということを明らかにする。【化１】2013529651.tif 000007【選択図】なし
2013529651.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉによって表される化合物または薬学において許容できるその塩：
【化１】
2013529651.tif 000005
であって、式Ｉによって表される化合物の化合物名は、５−［２−エトキシフェニル−５−（３，４，５−トリメチルピペラジニル）−スルホニル］−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトンである、化合物または薬学において許容できるその塩。
【請求項２】
式ＩＩによって表される化合物、５−［２−エトキシフェニル−５−（３，４，５−トリメチルピペラジニル）−スルホニル］−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトンクエン酸塩。
【化２】
2013529651.tif 000006
【請求項３】
式Ｉによって表される化合物を調製する方法であって、
（１）テトラヒドロフランを２，６−ルペタジンおよびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートに加え、室温で反応させ、次いでテトラヒドロフランを最後まで濃縮して、３，５−ジメチル−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ピペラジンを得る工程と、
（２）テトラヒドロフラン、炭酸カリウム、およびヨウ化メチルをこの順に工程（１）の３，５−ジメチル−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ピペラジンに加え、室温で一晩反応させ、次いで濾過し、濃縮し、水およびジクロロメタンを残渣に加え、ジクロロメタンで洗浄し、有機層を合わせ、飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、残渣のカラムクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１：２０）を行って、３，４，５−トリメチル−１−ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルピペラジジンを得る工程と、
（３）工程（２）の３，４，５−トリメチル−１−ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルピペラジジンをジオキサンに溶解させ、冷却し、飽和塩化水素酸ジオキサン溶液を一滴ずつゆっくり加え、室温で撹拌し、次いで減圧下で溶媒を蒸発させると、１，２，６−トリメチルピペラジンを得る工程と、
（４）５−（２−エトキシフェニル）−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトンをクロロスルホン酸へと滴下し、反応溶液を２５℃以下の温度に保ち、室温で反応させ、次いでこの反応溶液を砕氷の中へと注ぎ込み、室温で機械的に撹拌し、温度を２５℃以下に保ち、次いで濾過し、乾燥して、５−（２−エトキシフェニル−５−クロロスルホニル）−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトンを得る工程と、
（５）工程（４）の５−（２−エトキシフェニル）−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトン、工程（３）の１，２，６−トリメチルピペラジン、およびトリエチルアミンをテトラヒドロフランに加え、室温で一晩撹拌し、次いで溶媒を蒸発させ、水および塩化メチレンを残渣に加え、分離し、塩化メチレン層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和ブライン溶液でこの順に洗浄し、次いで乾燥し、濃縮し、残渣から、エタノールで再結晶して式Ｉの化合物を得る工程と
を含む方法。
【請求項４】
式ＩＩによって表される化合物を調製する方法であって、
無水メタノールを式Ｉの化合物に加え、撹拌して還流するまで加熱し、溶解して澄んだ後にクエン酸を加え、還流によって反応が終了すると、室温まで冷却し、濾過し、メタノールで洗浄し、乾燥し、式ＩＩの化合物を得る工程
を含む方法。
【請求項５】
５型ホスホジエステラーゼ阻害剤の調製における、請求項１に記載の化合物または薬学において許容できるその塩の使用。
【請求項６】
５型ホスホジエステラーゼ阻害剤の調製における、請求項２に記載の５−［２−エトキシフェニル−５−（３，４，５−トリメチルピペラジニル）−スルホニル］−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトンクエン酸塩の使用。
【請求項７】
有効成分としての請求項１に記載の化合物または薬学において許容できるその塩と、一般的な薬物担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項８】
有効成分としての請求項２に記載の５−［２−エトキシフェニル−５−（３，４，５−トリメチルピペラジニル）−スルホニル］−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトンクエン酸塩と、一般的な薬物担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５型ホスホジエステラーゼを阻害するための化合物、その塩、その調製方法および当該化合物またはその塩を含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）および環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）は細胞における重要な二次メッセンジャーであり、細胞中のｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのレベルは、細胞の種々の機能を制御するために重要である。細胞においてｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのレベルを制御することに関与する酵素としては、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）、グアニル酸シクラーゼ（ＧＣ）およびホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）が挙げられる。これらの酵素のバランスのとれた協調によって、細胞中のｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのレベルが正常範囲内に維持される。いくつかの病状（例えば、高血圧、狭心症など）では、細胞中のｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのレベルが急激に低下することが認められる。細胞中のｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのレベルを上昇させるために、１）ＡＣおよびＧＣを活性化すること、ならびに２）ＰＤＥを阻害すること、という２つの選択肢を実行することができ、第２の選択肢がより良好な結果をもたらす。近年は、ＰＤＥ阻害剤を研究および開発するという高い熱意があり、アイソザイム選択的なＰＤＥ阻害剤の臨床応用は、画期的な進歩を遂げた。現在、ｃＤＮＡ分子クローンの実験結果から、少なくとも１０種のＰＤＥ遺伝子ファミリーが哺乳動物に存在するということが判明した。各ＰＤＥ遺伝子ファミリーについて、スプライスバリアントに起因して複数のＰＤＥアイソザイム亜型が存在し、その中で、５型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ５）ファミリーはｃＧＭＰを選択的に加水分解することができ、かつ個体の器官に広く分布している。
【０００３】
ＰＤＥ５阻害剤は、以下の薬理学的機能および臨床応用を有する。
【０００４】
（１）血小板凝集の阻害および抗血栓：理想的な抗血栓薬は、虚血部位がさらに虚血になるのを回避するために、血管平滑筋の弛緩なしに血小板凝集を阻害するはずである。ＰＤＥ３およびＰＤＥ５の阻害剤はともに、血小板凝集を阻害する機能を有する。しかしながら、ＰＤＥ５阻害剤は血管平滑筋の弛緩が低いということを踏まえると、ＰＤＥ５阻害剤は、動脈の血栓性疾患を処置することにおいて実質的な長所を有する。典型的なＰＤＥ５阻害剤であるジピリダモールは、良好な抗血栓効果を有する。
【０００５】
（２）肺高血圧の軽減および抗心血管疾患：肺血管抵抗の異常は、心血管疾患を引き起こす重要な要因であることが多い。動物モデル実験において、選択的なＰＤＥ５阻害剤であるザプリナストは、一酸化窒素の有効時間および強度を実質的に高めることができ、そしてより低い肺高血圧に対して比較的強い効果を有する。臨床的には、ザプリナストは、狭心症、高血圧および心筋梗塞を処置するために使用される。最新の報告では、ＰＤＥ５阻害剤であるＥ−４０１０は、モノクロタリンによって誘導された高血圧を有するラットの生存率を上昇させることができる。
【０００６】
（３）抗喘息：動物モデルとしてブタを使用する実験は、ＰＤＥ５阻害剤であるＳＲ−２６５５７９は、ヒスタミンによって誘導される気管支拡張症に対して治療効果を有するということを示す、ということが報告されている。
【０００７】
（４）糖尿病性胃不全麻痺の処置：糖尿病を抱えるラットに対し、ＰＤＥ５阻害剤であるクエン酸シルデナフィルは、胃排出遅延を逆転させることができ、そして糖尿病によって併発した消化器系の自律神経ニューロパチーに対して特定の治療効果および改善効果を有するということが報告されている。
【０００８】
（５）勃起不全の処置：ＰＤＥ５は陰茎の海綿体に広く分布しているので、ＰＤＥ５阻害剤は、陰茎の海綿体の中のｃＧＭＰレベルを上昇させることができる。一連の生理的反応および生化学反応の際に、血管平滑筋は弛緩し、陰茎は勃起する。プロスタグランジンＥ１とは異なり、ＰＤＥ５阻害剤は、病理的な勃起を引き起こさず、その機能には、いまだ性的刺激を必要とするであろう。
【０００９】
ＰＤＥ５阻害剤の上記の薬理学的機能を考慮して、本出願人らは、化学的な分子修飾方法を用いてシルデナフィルの化学構造を修飾し、新しい化合物およびそれらのクエン酸塩、すなわち、５−［２−エトキシフェニル−５−（３，４，５−トリメチルピペラジニル）−スルホニル］−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトンおよびそのクエン酸塩（ＺＴＨ）を生成する。ＺＴＨは、ＰＤＥ５酵素の活性を効果的に阻害することができるということが認められる。これにより、本発明が成し遂げられた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の第１の目的は、５型ホスホジエステラーゼの活性を阻害することができる新しい化合物およびその塩、例えばクエン酸塩を提供することである。本発明の第２の目的は、新しい化合物およびそのクエン酸塩を調製するための方法を提供することである。本発明の第３の目的は、この新しい化合物またはその塩、例えばクエン酸塩を含有する医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、式Ｉによって表される化合物、および式ＩＩによって表されるその薬学的クエン酸塩：
【化１】
2013529651.tif 000003
を提供する。
【００１２】
式Ｉによって表される化合物の化合物名は、５−［２−エトキシフェニル−５−（３，４，５−トリメチルピペラジニル）−スルホニル］−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトンである。その構造を示すために核磁気共鳴技術が使用され、質量スペクトルは分子量を計算する。
【００１３】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）  δ８．１８０−８．１８５（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ），７．８８０−７．９０８（ｄｄ，Ｊ１＝２．４Ｈｚ，Ｊ２＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３５６−７．３７９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），４．２８４−４．３３７（ｑ，Ｊ＝１４Ｈｚ，２Ｈ），４．２３４（ｓ，３Ｈ），３．５７５−３．６０３（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，２Ｈ），２．８６５−２．９０２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．３７７（ｂｒ，２Ｈ），２．２６１（ｓ，３Ｈ），２．１１２−２．１６８（ｔ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，２Ｈ），１．７９５−１．８５１（ｍ，２Ｈ），１．４６５−１．５００（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．０９０−１．１０５（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，６Ｈ），０．９７８−１．０１５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）。ＭＳ  ５０３［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００１４】
式ＩＩのクエン酸塩は、式Ｉの化合物とクエン酸との反応から得られる。式ＩＩによって表されるクエン酸塩の化合物名は、５−［２−エトキシフェニル−５−（３，４，５−トリメチルピペラジニル）−スルホニル］−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトンクエン酸塩である。核磁気共鳴を用いて分析を行う：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ８．１６４−８．１７０（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９１４−７．９４２（ｄｄ，Ｊ１＝２．４Ｈｚ，Ｊ２＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３６３−７．３８５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２７６−４．３２９（ｑ，Ｊ＝１４Ｈｚ，２Ｈ），４．２３１（ｓ，３Ｈ），３．７４６−３．７７６（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，２Ｈ），２．９８６（ｂｒ，２Ｈ），２．８５８−２．８９５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７９２（ｓ，２Ｈ），２．７３９（ｓ，２Ｈ），２．５９０（ｓ，３Ｈ），２．４０６−２．４６４（ｔ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，２Ｈ），１．７８４−１．８３９（ｍ，２Ｈ），１．４４８−１．４８３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２５３−１．２６９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ），０．９７２−１．００９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）。
【００１５】
式Ｉの化合物は、主に、出発物質としてのｃｉｓ−２，６−ルペタジンおよび５−（２−エトキシフェニル）−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトンを用いて得られ、多段階の反応によって合成される。合成経路は以下のとおりである。
【化２】
2013529651.tif 000004
【００１６】
テトラヒドロフランを２，６−ルペタジンおよびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートに加え、室温で反応させ、次いでテトラヒドロフランを最後まで濃縮すると、３，５−ジメチル−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ピペラジン（ＺＴＨ−１）が得られる。核磁気共鳴および質量スペクトルで分析すると、以下のとおりである：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ３．８−４．１（ｂｒ，２Ｈ），２．７５−２．８０（ｍ，２Ｈ），２．２−２．５（ｂｒ，２Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ），１．０５２−１．０６７（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ  ２１５［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００１７】
テトラヒドロフラン、炭酸カリウム、およびヨウ化メチルをこの順にＺＴＨ−１に加え、室温で一晩反応させ、次いで濾過し、濃縮し、水およびジクロロメタンを残渣に加え、ジクロロメタンで洗浄し、有機層を合わせ、飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、残渣のカラムクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１：２０）を行うと、３，４，５−トリメチル−１−ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルピペラジジン（ＺＴＨ−２）が得られる。核磁気共鳴および質量スペクトルで分析すると、以下のとおりである：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ），δ４．５０５−４．５３３（ｍ，２Η），４．１１０−４．１３４（ｍ，２Η），２．９４３（ｓ，３Η），２．７７９（ｂｒ，２Η），２．１９６（ｓ，９Η），１．７８２−１．７９７（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ  ２２９［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００１８】
ＺＴＨ−２をジオキサンに溶解させ、冷却し、飽和塩化水素酸ジオキサン溶液を一滴ずつゆっくり加え、室温で撹拌し、次いで減圧下で溶媒を蒸発させると、１，２，６−トリメチルピペラジン（ＺＴＨ−３）が得られる。核磁気共鳴および質量スペクトルで分析すると、以下のとおりである：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）  δ４．５０５−４．５３３（ｍ，２Ｈ），３．７２２（ｂｒ，２Ｈ），３．６１１−３．６４４（ｍ，２Ｈ），３．３１０−３．４２３（ｍ，２Ｈ），２．９３７（ｓ，３Ｈ），１．４９３−１．５０６（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ  １２９［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００１９】
５−（２−エトキシフェニル）−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトンをクロロスルホン酸へと滴下し、反応溶液を２５℃以下に保ち、室温で反応させ、次いでこの反応溶液を砕氷の中へと注ぎ込み、室温で機械的に撹拌し、温度を２５℃以下に保ち、次いで濾過し、乾燥すると、５−（２−エトキシフェニル−５−クロロスルホニル）−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトン（ＺＴＨ−４）が得られる。核磁気共鳴および質量スペクトルで分析すると、以下のとおりである：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  ７．８７１−７．８７６（ｓ，１Η），７．７００−７．７２７（ｄｄ，Ｊ１＝２Ｈｚ，Ｊ２＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．０９８−７．１１９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１２５−４．１６１（ｍ，５Ｈ），２．７７８−２．８１６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．７００−１．７５６（ｍ，２Ｈ），１．３０３−１．３３７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．９１９−０．９５６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ）。ＭＳ  ４１１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００２０】
ＺＴＨ−４、ＺＴＨ−３、およびトリエチルアミンをテトラヒドロフランに加え、室温で一晩撹拌し、次いで溶媒を蒸発させ、水および塩化メチレンを残渣に加え、分離し、この塩化メチレン層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和ブライン溶液でこの順に洗浄し、次いで乾燥し、濃縮し、残渣から、エタノールで再結晶して式Ｉの化合物（ＺＴＨ−５）を得る。
【００２１】
無水メタノールをＺＴＨ−５に加え、撹拌して還流するまで加熱し、溶解して澄んだ後にクエン酸を加え、還流によって反応が終了すると、室温まで冷却し、濾過し、メタノールで洗浄し、乾燥すると、式ＩＩの化合物（ＺＴＨ）が得られる。
【００２２】
ＺＴＨ−５、ＺＴＨ−５塩（ＺＴＨなど）は、ピラゾロピリミジンケトン化合物であり、それらの化学構造はｃＧＭＰの化学構造に類似しており、それらは、ｃＧＭＰと競合してＰＤＥ５の触媒ドメインに結合することができ、そのため、ＰＤＥ５によるｃＧＭＰへの分解を阻害し、ｃＧＭＰの濃度を高め、ｃＧＭＰの濃度が正常範囲内に留まることを確実にする。ＺＴＨ−５、ＺＴＨ−５塩（ＺＴＨなど）は、５型ホスホジエステラーゼの活性を効果的に阻害することができ、従って、５型ホスホジエステラーゼ阻害剤として、または５型ホスホジエステラーゼ抑制剤の有効成分として使用することができる。ＺＴＨ−５、ＺＴＨ−５塩（ＺＴＨなど）は、勃起不全の処置、血小板凝集の阻害および抗血栓、肺高血圧の軽減および抗心血管疾患、抗喘息および糖尿病性胃不全麻痺の処置のための新しい世代の薬物として開発される可能性を有する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（１）ＺＴＨ−５の調製
（５−［２−エトキシフェニル−５−（３，４，５−トリメチルピペラジニル）−スルホニル］−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトン）：
【００２４】
１．  ３，５−ジメチル−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ピペラジン（ＺＴＨ−１）の調製： 
２，６−ルペタジン（１１．４ｇ、１００ｍｍｏｌ、１当量）およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（２１．８ｇ、１００ｍｍｏｌ、１当量）を２５０ｍｌのフラスコに加え、次いで１００ｍｌのテトラヒドロフランを加え、室温で４時間反応させ、テトラヒドロフランを濃縮し尽くし（すなわち、最後までテトラヒドロフランを濃縮し）、２１．４ｇの橙色の油状物質ＺＴＨ−１を得る。収率は１００％である。
【００２５】
２．  ３，４，５−トリメチル−１−ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルピペラジジン（ＺＴＨ−２）の調製：
ＺＴＨ−１（１０．７ｇ、５０ｍｍｏｌ、１当量）を２５０ｍｌのフラスコに加え、１００ｍｌのテトラヒドロフラン、炭酸カリウム（１０．３５ｇ、７５ｍｍｏｌ、１．５当量）およびヨウ化メチル（８．５２ｇ、６０ｍｍｏｌ、１．２当量）をこの順に加え、室温で一晩反応させ、濾過し、濃縮し、１００ｍｌの水および１００ｍｌのジクロロメタンを残渣に加え、ジクロロメタンで洗浄し（５０ｍｌ×２回）、有機層を合わせ、飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、残渣のカラムクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１：２０）を行うと、５．７ｇの橙色の油状物質ＺＴＨ−２が得られる。収率は５０％である。
【００２６】
３．  １，２，６−トリメチルピペラジン（ＺＴＨ−３）の調製：
ＺＴＨ−２（１１．４ｇ、５０ｍｍｏｌ、１当量）を１００ｍｌのジオキサンに溶解させ、０℃に冷却し、飽和塩化水素酸ジオキサン溶液（４Ｍ、２５ｍｌ、２当量）を一滴ずつゆっくり加え、室温で２時間撹拌し、減圧下で溶媒を蒸発させると、白色固体の粗生成物ＺＴＨ−３が得られ、これを、精製せずに次の工程のために直接使用する。
【００２７】
４．  ５−（２−エトキシフェニル−５−クロロスルホニル）−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトン（ＺＴＨ−４）の調製：
−１０℃の温度で、５−（２−エトキシフェニル）−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトン（５０ｇ、１６０ｍｍｏ）を１００ｍｌのクロロスルホン酸に加え、滴下の間、この反応溶液を２５℃以下の温度に保ち、滴下が終了すると、室温で３時間反応させ、反応液を砕氷へと注ぎ込み、機械的に撹拌し、２５℃以下の温度を保ち、次いで室温で１時間撹拌し、濾過し、乾燥すると、５０ｇの白色固体ＺＴＨ−４が得られる。収率は７５．９％である。
【００２８】
５．  ５−［２−エトキシフェニル−５−（３，４，５−トリメチルピペラジニル）−スルホニル］−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトン（ＺＴＨ−５）の調製：
ＺＴＨ−４（３６ｇ、１０ｍｍｏｌ、１当量）、ＺＴＨ−３（１７．６ｇ、１０ｍｍｏｌ、１当量）、およびトリエチルアミン（６０．６ｇ、６０ｍｍｏｌ、６当量）を５００ｍｌのテトラヒドロフランに加え、室温で一晩撹拌し、溶媒を蒸発させ、２００ｍｌの水および２００ｍｌの塩化メチレンを加え、分離し、塩化メチレン層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和ブライン溶液でこの順に洗浄し、次いで乾燥し、濃縮し、１０倍量のエタノールを用いて再結晶することにより残渣から、３２ｇの白色結晶のＺＴＨ−５を得て、次いで別の５０倍量のエタノールを用いて再結晶することにより１６．５ｇの白色結晶ＺＴＨ−５が得られる。収率は３７％である。
【００２９】
（２）ＺＴＨ（５−［２−エトキシフェニル−５−（３，４，５−トリメチルピペラジニル）−スルホニル］−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−ケトンクエン酸塩）の調製：
５００ｍｌの反応容器（瓶）の中に、１５ｇの化合物ＺＴＨ−５、２７０ｍｌの無水メタノールを加え、撹拌して還流するまで加熱し、溶解して澄んだ後に１２．５ｇのクエン酸を加え、還流しながら約１．５時間反応させ、室温まで冷却し、濾過し、メタノールで洗浄し（３回×５ｍｌ）、乾燥すると、１５ｇの白色固体のＺＴＨが得られる。
【００３０】
上記の（１）および（２）は調製の実施形態であり、下記の（３）は実験の実施形態である。
【００３１】
（３）ＰＤＥ５に対するＺＴＨの阻害効果に関する検討
１．  ｃＧＭＰに対して作用するＰＤＥ５に対する、ＺＴＨの阻害効果：
実験方法：
酵素結合免疫系を使用して、ｃＧＭＰを分解するＰＤＥ５に対する、異なる濃度のＺＴＨのインビトロ阻害効果を検出する。Ａｍｅｒｓｈａｍ（会社）製のｃＧＭＰ生体内変換酵素結合免疫測定システムキット（ＥＬＩＳＡキット）（ｃＧＭＰ  ｂｉｏｔｒａｃｋ  ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｏａｓｓｙ  ｓｙｓｔｅｍ、ＥＩＡとも呼ばれる）の操作手順に従って、ｃＧＭＰの濃度を検出する。クエン酸シルデナフィルを陽性対照として使用する。
【００３２】
試薬の調製：
異なる薬物濃度を有するＺＴＨおよびクエン酸シルデナフィルの調製：
特定量のＺＴＨをそれぞれ秤量してｄｄｈ２Ｏに懸濁させ、ＤＭＳＯ（薬物：ＤＭＳＯ＝１ｍｏｌ：１Ｌ）を加えてＺＴＨを１００μｌの試料穴において溶解させ、最終濃度を１０−４ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−５ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−６ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−７ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−８ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−９ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−１０ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−１１ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−１２ｍｏｌ・Ｌ−１とする。
【００３３】
比較対象のクエン酸シルデナフィルも、上で論じたのと同様にして調製する。
【００３４】
ＰＤＥ５作業溶液の調製：
対応する体積のＥＩＡバッファー溶液で希釈された特定量のＰＤＥ５を吸い上げ、最終濃度を１ｕ／μｌとし、これを、後の使用のために−８０℃という低温で保存する。
【００３５】
ｃＧＭＰの調製：
対応する体積のＥＩＡバッファー溶液に溶解させた特定量のｃＧＭＰ（ｃＧＭＰ、Ｎａ）をそれぞれ秤量し、最終ｃＧＭＰの濃度を３２００ｆｍｏｌ／５０μｌとし、これを、後の使用のために−２０℃という低温で保存する。
【００３６】
実験：
ＰＤＥ５によるｃＧＭＰの分解効果：
ＰＤＥ５およびｃＧＭＰを混合し、試料穴１００μｌに３２００ｆｍｏｌのｃＧＭＰが含まれるようにし、３０℃で２０分反応させた後に、ＰＤＥ５による、ｃＧＭＰの分解効果を検出する。
【００３７】
ＰＤＥ５に対するＺＴＨの阻害効果：
ＺＴＨおよびクエン酸シルデナフィル陽性対照医薬をそれぞれｃＧＭＰと混合し、十分にブレンドし（ＤＭＳＯ  ｄｄｈ２Ｏ溶液を陰性対照として使用すると仮定する）、ＰＤＥ５  ３ｕを加え、３０℃で２０分間反応させる。試料穴１００μｌには３２００ｆｍｏｌ  ｃＧＭＰが含まれる。薬物濃度は、１０−４ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−５ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−６ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−７ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−８ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−９ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−１０ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−１１ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−１２ｍｏｌ・Ｌ−１、ｃＧＭＰを分解するＰＤＥ５に対する、異なる濃度のＺＴＨ、陽性対照医薬の阻害を検出する。上記の試験試料を、抗体でコーティングした試験穴に加え、次いで１００μｌの抗血清をそれぞれに加えて反応を停止し（これは、４℃で１５〜１８時間行う）、次いでｃＧＭＰペルオキシダーゼ接合体５０μｌを加えて反応を停止し（３時間行ってから洗浄する）、呈色のためにＴＭＢ  ２００μｌを加え、ＢＩＯＲＡＤ  ４５０  ＥＬＩＳＡ読み取り器を使用して６３０ｎｍの波長で読み取る。測定したｃＧＭＰ吸光度の値に基づき、ＥＩＡ吸光度の式［（標準または試料のＯＤ−ＮＳＢ  ＯＤ）×１００／（０  標準  ＯＤ−ＮＳＢ  ＯＤ）］を使用して％Ｂ／ＢＯを算出する。Ｓ曲線にフィッティングするための線形回帰およびＰＲＯＢＩＴ回帰関数を用いて、ＰＤＥ５に対するＺＴＨ、クエン酸シルデナフィル陽性対照医薬のＩＣ５０を算出する。
【００３８】
実験の結果：
ＰＤＥ５によるｃＧＭＰの分解：
ＰＤＥ５は、３０℃で２０分間ｃＧＭＰと反応し、そのときＰＤＥ５は、３２００ｆｍｏｌ  ｃＧＭＰを約１６００ｆｍｏｌまで分解することができる。
【００３９】
ｃＧＭＰを分解するＰＤＥ５に対するＺＴＨの阻害効果：
ｃＧＭＰを分解するＰＤＥ５に対する、異なる濃度（１０−４ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−５ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−６ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−７ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−８ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−９ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−１０ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−１１ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−１２ｍｏｌ・Ｌ−１）のＺＴＨ、対照医薬およびＤＭＳＯ  ｄｄＨ２Ｏ溶液の群の阻害効果を、それぞれ比較する。ＰＤＥ５がｃＧＭＰを分解することを阻害するＺＴＨの異なる濃度から得られた異なる吸光度（ＯＤ値）に基づき、％Ｂ／ＢＯを算出するためのＥＩＡ吸光度の式［（標準または試料  ＯＤ−ＮＳＢ  ＯＤ）×１００／（０  標準  ＯＤ−ＮＳＢ  ＯＤ）］を使用して、上記薬物のＩＣ５０値を算出する。線形回帰フィッティングを用い、データをＳ曲線にフィッティングすることができ（ｐ＜０．０５）、ＰＲＯＢＩＴ回帰関数を用いて、ＩＣ５０を算出する。ＺＴＨのＩＣ５０は２．１２×１０−９Ｍであり、クエン酸シルデナフィル陽性対照医薬は６．９５８×１０−９Ｍである。
【００４０】
２．  ｃＡＭＰに対するＰＤＥ５における、ＺＴＨの効果：
実験方法：
酵素結合免疫系を使用して、ｃＡＭＰに対するＰＤＥ５における、異なる濃度のＺＴＨのインビトロ効果を検出する。Ａｍｅｒｓｈａｍ製のｃＡＭＰ生体内変換酵素結合免疫測定システムキット（ＥＬＩＳＡキット）（ｃＡＭＰ  ｂｉｏｔｒａｃｋ  ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｏａｓｓｙ  ｓｙｓｔｅｍ、ＥＩＡとも呼ばれる）の操作手順に従って、ｃＡＭＰの濃度を検出する。クエン酸シルデナフィルを対照として使用する。
【００４１】
試薬の調製：
ｃＡＭＰの調製：
特定量のｃＡＭＰ（ｃＡＭＰ、Ｎａ）を秤量し、それぞれ対応する体積のＥＩＡバッファー溶液に溶解させる。ｃＡＭＰの最終濃度は、１６００ｆｍｏｌ／５０μｌである。この生成物を、後の使用のために−２０℃という低温で保存する。
【００４２】
ＺＴＨおよびクエン酸シルデナフィルの調製、およびＰＤＥ５作業溶液の調製は、上で論じたものと同じである。
【００４３】
実験：
ＰＤＥ５によるｃＡＭＰの分解効果：
ＰＤＥ５およびｃＡＭＰを混合し、試料穴１００μｌに１６００ｆｍｏｌのｃＡＭＰが含まれるようにする。３０℃で２０分間反応させた後に、ＰＤＥ５によるｃＡＭＰの分解効果を検出する。
【００４４】
ｃＡＭＰに対するＰＤＥ５における、ＺＴＨの効果：
ＺＴＨおよび陽性対照医薬をｃＡＭＰと混合し、十分にブレンドし（ＤＭＳＯ  ｄｄｈ２Ｏ溶液を陰性対照として使用すると仮定する）、ＰＤＥ５  ３ｕを加え、３０℃で２０分間反応させる。試料穴１００μｌには１６００ｆｍｏｌのｃＡＭＰが含まれる。薬物濃度は、１０−４ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−５ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−６ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−７ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−８ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−９ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−１０ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−１１ｍｏｌ・Ｌ−１、１０−１２ｍｏｌ・Ｌ−１であってよい。上記の試験試料を、抗体でコーティングした試験穴に加え、次いで１００μｌの抗血清をそれぞれに加えて反応を停止し（これは、４℃で２時間行う）、次いでｃＡＭＰペルオキシダーゼ接合体５０μｌを加えて反応を停止し（１時間行ってから洗浄する）、呈色のためにＴＭＢ  １５０μｌを加え、ＥＬＩＳＡ読み取り器を使用して６３０ｎｍの波長で読み取る。測定したｃＡＭＰ吸光度の値に基づき、ＥＩＡ吸光度の式［（標準または試料のＯＤ−ＮＳＢ  ＯＤ）×１００／（０  標準  ＯＤ−ＮＳＢ  ＯＤ）］を使用して％Ｂ／ＢＯを算出する。Ｓ曲線にフィッティングするための線形回帰およびＰＲＯＢＩＴ回帰関数を用いて、ＰＤＥ５に対するＺＴＨ、クエン酸シルデナフィル陽性対照医薬のＩＣ５０を算出する。
【００４５】
実験の結果：
ｃＡＭＰに対するＰＤＥ５の分解効果：
ＰＤＥ５はｃＡＭＰを分解しない。
【００４６】
ｃＡＭＰに対するＰＤＥ５におけるＺＴＨの効果：
ＺＴＨ群、対照医薬群、およびｄｄＨ２Ｏ医薬陰性対照群の間でＯＤ値に実質的な差はなく（ｐ＞０．０５）、Ｓ曲線にフィッティングできない（ｐ＞０．０５）。
【００４７】
結論：
ＺＴＨは、ピラゾロピリミジンケトン化合物であり、その化学構造はｃＧＭＰの化学構造に類似しており、ＺＴＨは、ｃＧＭＰと競合してＰＤＥ５の触媒ドメインに結合することができ、そのため、ＰＤＥ５がｃＧＭＰを分解するのを阻害し、ｃＧＭＰの濃度を高める。
【００４８】
ｃＧＭＰを分解するＰＤＥ５に対するＺＴＨの阻害効果を検討した中で、ＺＴＨのＩＣ５０は、２．１２×１０−９Ｍと算出され、陽性対照医薬は６．９５８×１０−９Ｍである。この結果は、ＰＤＥ５がｃＧＭＰを分解するのをＺＴＨが阻害できること、ＺＴＨが投与量に依存すること、およびＺＴＨが非常に良好なＰＤＥ５阻害剤であることを示す。ＰＤＥ５酵素に対するＺＴＨの阻害活性は、クエン酸シルデナフィルよりも著しく良好である。従って、ＺＴＨは、勃起不全の処置、血小板凝集の阻害および抗血栓、肺高血圧の軽減および抗心血管疾患、抗喘息および糖尿病性胃不全麻痺の処置のための新しい世代の薬物となる可能性を有する。
【００４９】
上記の実験の実施形態では、ＺＴＨの実験データのみが開示されているとはいえ、ＺＴＨはＺＴＨ−５のクエン酸塩であり、ＺＴＨ−５がＺＴＨと類似の構造を有する（すなわち、ＺＴＨ−５およびクエン酸塩以外のＺＴＨ−５の塩はＺＴＨと類似の構造を有し、共通のピラゾロピリミジンケトン構造を有する）ということを踏まえると、ＺＴＨ−５、クエン酸塩以外のＺＴＨ−５の塩は、ＰＤＥ５がｃＧＭＰを分解することを阻害する効果を有してＰＤＥ５阻害剤となり、勃起不全の処置、血小板凝集の阻害および抗血栓、肺高血圧の軽減および抗心血管疾患、抗喘息および糖尿病性胃不全麻痺の処置のための新しい世代の薬物となる可能性を有するということが、ＺＴＨの実験的効果から推測できる。
【国際調査報告】
2013529651.tif 000008
2013529651.tif 000009
2013529651.tif 000010
2013529651.tif 000011
2013529651.tif 000012
2013529651.tif 000013