(57)【要約】  本発明は、癌細胞の増殖の減少又は遮断に関連する、ＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させることにより癌を処置する方法に関する。本発明はまた、癌治療用の薬物の製造におけるＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる薬剤の使用にも関する。前記薬剤は、化合物の中でもペプチド又はタンパク質であり得る。本発明はさらに、ＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させ、それによってペプチドの抗腫瘍効果を増加させるための、配列ＨＡＲＩＫＰＴＦＲＲＬＫＷＫＫＹＫＧＫＦＷからのペプチドの最適化に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞でのＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させることにより、前記細胞の増殖を減少させる、又は遮断することを特徴とする癌の治療方法。
【請求項２】
癌細胞でのＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる薬剤と癌細胞を接触させるか、又は癌細胞でのＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる薬剤を含む組成物をヒトに投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
癌細胞でのＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる薬剤が、配列番号３として識別されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
炎症及び転移を伴う腫瘍の発育を阻害することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
炎症及び転移を伴う腫瘍が、結腸、直腸、食道、肺、前立腺、胸、膵臓、又は肝臓に位置する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
癌細胞でのＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる薬剤が、核局在化配列（ＮＬＳ）を含有するＣＯＭＭＤ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する哺乳動物細胞発現ベクターを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
癌治療用の医薬の製造におけるＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる薬剤の使用。
【請求項８】
ＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる薬剤が、タンパク質、合成ペプチド、核酸、又は遺伝子治療用のベクターである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
合成ペプチドが、配列番号３として識別されるアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
遺伝子治療ベクターが、ＮＬＳを有するＣＯＭＭＤ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む哺乳動物細胞発現ベクターである、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
癌細胞でのＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる１種又は複数の薬剤、及び薬学的に許容される添加剤又はビヒクルを含む、癌治療のための医薬品組成物。
【請求項１２】
癌細胞でのＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる薬剤が、配列番号３として識別されるアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
癌細胞でのＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる薬剤が、ＮＬＳを有するＣＯＭＭＤ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む哺乳動物細胞発現ベクターである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
ＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる１種又は複数の薬剤、及び癌の標準的化学療法に特定の１種又は複数の薬物を含む、癌処置のための医薬品の組み合わせ。
【請求項１５】
ＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる薬剤が、配列番号３として識別されるアミノ酸配列を有するペプチドを含み、標準的化学療法に特定の薬物がシスプラチン及び５−ＦＵから選択される、請求項１４に記載の医薬品の組み合わせ。
【請求項１６】
組み合わせの一部となる薬剤及び薬物が、同じ処置の過程で、同時に、別々に、又は連続して投与される、請求項１４に記載の医薬品の組み合わせ。
【請求項１７】
細胞でのＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させることを特徴とする、慢性炎症を伴う癌を防ぐための方法。
【請求項１８】
細胞でのＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化の増加が、配列番号３として識別されるアミノ酸配列を有するペプチド又は前記ペプチドを含む組成物をそれを必要とする個体に投与することによって実現される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
患者の試料中のＣＯＭＭＤ１の核局在化の有無を判定することにより、ＣＯＭＭＤ１を予後マーカーとして使用することを特徴とする、癌患者の予後を判定する方法。
【請求項２０】
配列番号３として識別されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、ＣＯＭＭドメインへの結合能を有するペプチド。
【請求項２１】
ＣＯＭＭＤファミリーメンバーが疾患の進行に関与する、疾患を処置するための請求項２０に記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学の分野に関し、特に抗癌剤を開発するための新たな治療標的の開示による癌治療に関する。これらの薬物は選択性及び効能が高いため、癌患者の現在の治療の改善に貢献する。癌細胞の核にタンパク質ＣＯＭＭＤ１が発現及び蓄積させることによって癌を処置する方法を記載する。ＨＡＲＩＫＰＴＦＲＲＬＫＷＫＹＫＧＫＦＷペプチドの一次構造に導入された化学修飾により、このペプチドのインビトロ及びインビボにおけるタンパク質ＣＯＭＭＤ１の核局在化及び抗腫瘍活性が増加する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療の大きな進歩にも関わらず、腫瘍細胞による既存の抗癌剤に対する抵抗性が発達するため、新規の作用機序を有する新たな抗癌剤の開発に大きな関心がある。ペプチドは、重要な生物学的機能の媒介物質としての役割、さらに特に魅力的な治療薬とするその独特の固有特性のため、今なお新たな治療薬として大きな関心が寄せられている。ペプチドは、低毒性と高特異性に関連した高い生物活動を示す。これらの特徴から生じる利点として、所望の標的に結合する高特異性により、有害な薬物間相互作用を最小限にすることや、組織の蓄積が減少し、中間代謝産物による合併症の危険性が低減されることが報告されている（Ｖｌｉｅｇｈｅら、２０１０、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ、１５：４０〜５６）。現在、癌の発育に重要な生体機能を有する特定の標的タンパク質に結合する選択性のあるペプチド及び／又は低分子を使用する抗癌治療がある。最初のシナリオでは、これらの治療は、特定のタンパク質機能を阻害し、癌細胞のアポトーシスを引き起こすことを目的とすることができ、例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）の阻害剤（Ｓｕｂｂａｒａｏら、２００４、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１０１：２２７〜２５７）、チロシンキナーゼ阻害剤（Ｇａｒｒｉｄｏら、２００７、Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｃｈｉｌ、１０：１３２７〜１３３２）がある。ほとんどの状況では、これらのタンパク質は、正常組織と比較すると、悪性プロセスにおいて異常であると考えられる。
【０００３】
第２のシナリオでは、薬物は、正常組織と比較して悪性プロセスにおいて異常である場合もあれば、異常でない場合もあるタンパク質標的に結合し、この場合、悪性のプロセスで活性化されるシグナル経路は影響を受ける。例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）複製の阻害剤、微小管集合の阻害剤、及びＮＦｋＢ転写因子の阻害剤がある。
【０００４】
最初のシナリオがある造血器悪性腫瘍では非常に有効であるが、これらの治療のほとんどは、固形腫瘍の複雑性のために有効性に限界がある。これとは対照に、第２のシナリオでは、腫瘍の薬物類の中で最も有効で毒性の高いいくつかの制癌剤が含まれる。このため、より選択的で有効となる新薬を捜索し、それによって毒性を最小限にすることが、進歩には必要である。この点で、新たな治療標的を同定し、癌の発育におけるそれらの役割を理解することが、薬物耐性の新たなメカニズムを明らかにし、より高い活性を保持し、既存の薬物と組み合わせることができる新薬の設計を容易にする助けとなり、それによって、毒性を低減し、癌患者の生活の質を高める。これまでＭＵＲＲ１（ｖａｎ  ｄｅ  Ｓｌｕｉｓら、２００２、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１：１６５〜１７３）として知られるＣＯＭＭＤ１タンパク質は、頭字語ＣＯＭＭＤ（銅代謝遺伝子ＭＵＲＲ１ドメイン（Ｃｏｐｐｅｒ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｇｅｎｅ  ＭＵＲＲ１  Ｄｏｍａｉｎ）、略称ＣＯＭＭＤ）で知られる、タンパク質の新たなファミリーに属する。ファミリータンパク質のうち１０のメンバーは、多細胞生物に高度に保存され、普遍的に発現されているが、そのメンバーのほとんどの生物学的機能は知られていない。このファミリーの重要な特性は、保存され特有のＣＯＭＭドメイン（銅代謝Ｍｕｒｒ１ドメイン（Ｃｏｐｐｅｒ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｍｕｒｒ１  Ｄｏｍａｉｎ））の存在であり、このドメインは、Ｃ末端領域のアミノ酸残基１１０〜１９０を含んでいる（Ｂｕｒｓｔｅｉｎら、２００５、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８０：２２２２２〜２２２３２）。ＣＯＭＭＤ１は、銅代謝の制御（Ｔａｏら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８：４１５９３〜４１５９６）、ナトリウムの細胞内輸送の調節（Ｂｉａｓｉｏら、２００４、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７９：５４２９〜５４３４）、ＮＦｋＢ転写因子の阻害（Ｍａｉｎｅら、２００７、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２６：４３６〜４４７）、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）−１αによって調節される遺伝子の発現の阻害（ｖａｎ  ｄｅ  Ｓｌｕｉｓら、２００７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２７：４１４２〜４１５６）などの多様な生物学的プロセスに関与してきた。
【０００５】
ＣＯＭＭＤ１は、ＮＦｋＢ転写因子からのＲｅｌＡ（ｐ６５）サブユニット、ＨＩＦ−１α因子からの触媒αサブユニット及び上皮性ナトリウムチャネルのΔＥＮａＣと物理的相互作用を示す。全ての場合において、この相互作用によって、ユビキチン化及びプロテアソーム分解経路に関わるメカニズムを介してこれらの「クライアント（ｃｌｉｅｎｔ）」タンパク質の分解が導かれる。ＣＯＭＭドメインは、ＣＯＭＭＤ１のタンパク質「クライアント」だけでなくファミリーメンバー間の相互作用の両方における、タンパク質間相互作用に関与することが示されている。ＣＯＭＭＤ１のＮ末端領域の三次元構造は提案されているが、ＣＯＭＭドメインの３次構造はまだ分かっていない（Ｓｏｍｍｅｒｈａｌｔｅｒら、２００７、  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３６５：７１５〜７２１）。
【０００６】
細胞内のＣＯＭＭＤ１基底発現は、ＣＯＭＭドメインに位置する一連のロイシン残基を介したユビキチン化及びプロテアソーム分解によって制御される（Ｍａｉｎｅら、２００９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、４１７：６０１〜６０９）。近年、ＣＯＭＭＤ１は、そのＣＯＭＭドメインにも位置する核外移行シグナル（ＮＥＳ）を介した細胞質核間輸送の構成的メカニズムを有することが報告されている。ロイシン配列の破壊及び／又はプロテアソーム分解を阻害する薬剤によって、細胞内のＣＯＭＭＤ１の発現が増加することが報告されている。さらに、ＣＯＭＭＤ１中のＮＥＳ配列の破壊によって、ＮＦｋＢ及びＨＩＦ−１α因子の転写活性の抑制が増す（Ｍｕｌｌｅｒら、２００９、Ｔｒａｆｆｉｃ、１０：５１４〜５２７）。
【０００７】
癌細胞は、タンパク質ＸＩＡＰ（Ｘ連鎖アポトーシス阻害剤）及び分泌性クラステリン（ｓＣＬＵ））などの様々なタンパク質を過剰発現する。双方のタンパク質は、ＣＯＭＭＤ１の分解を促し、ＮＦｋＢの活性化及び腫瘍細胞の生存を促進する。ＭＧ１３２（Ｓｈｉｒｌｅｙら、２００５、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ、７：１１０４〜１１１１；Ｚｈｏｕら、２００９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２１：３３３〜３３９）などのプロテアソーム阻害剤は、ユビキチン化及びプロテアソーム分解のメカニズムを阻害することにより抗腫瘍効果を示すことが報告されている。ＸＩＡＰに結合する化合物は、カスパーゼ−３及びカスパーゼ−９の活性化に対するこのタンパク質の阻害効果を遮断することでアポトーシスを誘導する（Ｖｏｇｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００９、６９：２４２５〜２４３４）。Ｉ−ｋＢとして知られているＮＦｋＢ因子の細胞質阻害剤を安定化させることにより、ｓＣＬＵの機能を阻害するよう設計された干渉リボ核酸（ＲＮＡｉ）が、抗腫瘍効果を有することが提唱されている（Ｚｏｕｂｅｉｄｉら、２０１０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８：１９〜３０）。
【０００８】
国際特許出願ＷＯ０７／０９５８６７では、発明の本質はＬＡＬＦタンパク質（リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）抗リポ多糖因子）の３２〜５１領域に由来するペプチドに関し、アミノ酸置換により、ＬＰＳ結合能の解離を確実にし、抗腫瘍活性及び免疫調節活性を増加させた。これらのペプチドのうちの１つはＬ２と称するペプチドである。さらに、別の発明（国際出願ＰＣＴ／ＣＵ２００８／０００００６）では、上記ペプチドの細胞透過能が明らかにされている。しかしながら、かかる発明において、かかるペプチドの作用機序が開示も提唱もされていない。
【０００９】
現在、癌を処置する治療法（化学療法、放射線療法、免疫療法など）がいくつかあり、それらの多くは臨床試験中である。しかしながら、これらの治療法には、低選択性、毒性及び薬物耐性の発達などに関連する欠点が今もなおある。この領域で考慮すべき別の重要な側面は、薬物効能の診断及び／又は予測に有用なバイオマーカーの選択である。したがって、癌の治療及び／又は診断に有用な新たな分子を研究し発見する必要性、及び低毒でより選択性があり有効な薬物の設計が依然として残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、タンパク質ＣＯＭＭＤ１の核局在化を増加させて癌を処置する方法を記載することにより上記の問題を解決する。この増加によって、癌細胞の増殖が減少する、又は遮断される。
【００１１】
本発明で初めて、Ｌ２ペプチド（配列ＨＡＲＩＫＰＴＦＲＲＬＫＷＫＫＹＫＧＫＦＷ、配列番号１）とＣＯＭＭＤ１が細胞内で相互作用し、ＣＯＭＭＤ１の核局在化が癌細胞死に関係していることが明らかにされる。したがって、本発明は、ＣＯＭＭＤ１の核局在化及び蓄積を促進する抗腫瘍活性を有する化合物の同定においてタンパク質ＣＯＭＭＤ１の使用を提供する。
【００１２】
本発明で提供されるデータでは、Ｌ２ペプチドが特にアミノ酸１１０〜１９０の間の領域でＣＯＭＭＤ１と相互作用することが示されている。さらに、Ｌ２ペプチドによってＣＯＭＭＤ１の核内蓄積がもたらされる。その上、核局在化配列（ＮＬＳ）を保持するＣＯＭＭＤ１タンパク質の発現は細胞死を誘導するには十分であることが本発明で初めて報告されている。したがって、本発明は、癌処置での治療標的としてのＣＯＭＭＤ１の使用を実証する。
【００１３】
さらに、癌細胞の核におけるタンパク質ＣＯＭＭＤ１の蓄積を促し、ペプチドの抗腫瘍効果を増加させるように、Ｌ２ペプチド（配列番号１）からペプチドＬ５５２（配列番号３）に最適化した。ＣＯＭＭＤ１の核局在化を促進するように改良された本発明において報告されるペプチドＬ５５２（配列番号３）は次の配列を有する：
2013530162.tif 000002
【００１４】
この最適化は、特定位置（上記配列中に太字の小文字で表される）で天然アミノ酸を非天然アミノ酸（Ｄ−アミノ酸）に置き換え、アセチル化（上記配列中にＡｃ−として示す）によってＮ末端を保護する化学修飾に基づく。これらの修飾をＬ２ペプチド（配列番号１）に実施し、それによってＬ５５２ペプチド（配列番号３）を生じさせることで、元のＬ２ペプチドに対して、細胞の核にタンパク質ＣＯＭＭＤ１が最も多く蓄積し、Ｌ５５２ペプチドの抗腫瘍活性が増加することを確実にする。したがって、Ｌ５５２ペプチドは、ＣＯＭＭＤ１と相互作用することにより、ＣＯＭＭＤ１の核局在化を促進し癌細胞の増殖を阻害する新たなクラスの分子である。
【００１５】
本発明の別の目的は、癌治療用の薬物の製造におけるタンパク質ＣＯＭＭＤ１の核局在化を増加させる薬剤の使用である。ＣＯＭＭＤ１の核内蓄積を促進する薬剤又は化合物には、例えば、タンパク質（抗体を含む）、突然変異タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、核酸、及び有機小分子が含まれる。これらの化合物は、天然源から単離しても、合成若しくは組み換えの技術、又はそれらを任意の組み合わせによって調製してもよい。特定の実施形態では、タンパク質ＣＯＭＭＤ１の核局在化を増加させる薬剤はＬ５５２ペプチド（配列番号３）である。本発明の状況では、ＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加又は増強することと、細胞の核にＣＯＭＭＤ１を蓄積することは、同じ意味を有する。別の特定の実施形態では、ＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる薬剤は、ＮＬＳを導入したタンパク質ＣＯＭＭＤ１をコードするＤＮＡ配列を含む、哺乳動物細胞での発現ベクターとして、核酸タイプであり得る。このタイプのベクターは遺伝子治療として使用することができる。
【００１６】
また、ＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる薬剤を含む、癌処置のための医薬品組成物も本発明の一部である。本発明の一実施形態において、医薬品組成物は、ＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる有効量の薬剤（その阻害濃度５０（ＩＣ５０）によって決定）及び添加剤又は薬学的に許容されるビヒクルを含む。組成物は非経口的又は局所的な経路によって投与され得る。
【００１７】
ＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる薬剤を含む医薬品組成物の投与は、ＣＯＭＭＤ１の核局在化を促進する有効量の薬剤を投与して腫瘍細胞の成長を低下させる、又は遮断することを含む、ヒトの固形腫瘍を処置する、又は防ぐ方法を構成する。
【００１８】
本発明の一実施形態では、ＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる薬剤は、白血病、特に骨髄性白血病の患者に投与して癌細胞の増殖を遮断することができる。この薬剤は、細菌性リポ多糖体（ＬＰＳ）などの炎症性刺激の存在下でさえ有効であり得る。
【００１９】
本発明では、Ｌ５５２ペプチドは標準的化学療法と組み合わせて使用することにより相乗効果が生まれ、シスプラチン及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの細胞増殖抑制剤の投与量を低減することができることが示されている。したがって、ＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる１種又は複数の薬剤、及び癌の化学療法に特定の１種又は複数の薬物を含む、癌処置のための医薬品の組み合わせも本発明の目的である。本発明の実施形態では、かかる薬剤はＬ５５２ペプチドであり、標準的化学療法の特定薬物はシスプラチン及び５−ＦＵから選択される。この医薬品の組み合わせにおいて、含まれる薬剤及び薬物は、処置中に同時に、別々に又は連続して投与することができる。
【００２０】
一方、近年のデータは、炎症が腫瘍の進行の重要な要素であるという概念を進展させた。今日、炎症性微小環境は、Ｈａｎａｈａｎ及びＷｅｉｎｂｅｒｇｓによって記載される、癌の最も重要な６つの特徴に位置づけられる腫瘍の特性として分類されている（Ｐｅｒｗｅｚら、２００７、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１２１：２３７３〜２３８０）。
【００２１】
本発明で提供されるデータは、Ｌ５５２ペプチドが炎症性刺激の存在下で癌細胞の成長を遮断するのに有効であることを示している。同様に、癌細胞に一過性にトランスフェクトされたＧＦＰ−ＮＣＯＭＭＤ１タンパク質（核局在化配列（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を保持する）は、Ｌ５５２ペプチドと同等の効果を提供する。より具体的には、ＬＰＳ及びＴＮＦ（腫瘍壊死因子α（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒα））などの炎症性刺激の存在下で、Ｌ５５２ペプチドが癌細胞死を促すことが結果によって実証されている。同様に、ＬＰＳ注入によってマウスが炎症性刺激を受けた結腸腫瘍のマウスモデルにおいてペプチドの有効性が実験データによって実証されている。
【００２２】
このため、本発明はまた、Ｌ５５２ペプチドをそれを必要とするヒトに投与することを含む、炎症及び転移を伴う腫瘍の発育を阻害する方法も提供する。炎症及び転移を伴う腫瘍として、例えば、結腸直腸、食道、肺、前立腺、胸、膵臓及び肝臓の癌が分かっている。
【００２３】
また、Ｌ５５２ペプチドの投与を予防的に使用して、クローン病、潰瘍性大腸炎、膵臓炎、硬変などの慢性炎症を伴う癌の発育を防ぐこともできる。したがって、Ｌ５５２ペプチド又は前記ペプチドを含む組成物をそれを必要とするヒトに投与することを特徴とする、慢性炎症を伴う癌を防ぐ方法も本発明の目的である。
【００２４】
ＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化を増加させる薬剤としてＬ５５２ペプチドを含む組成物の次に投与量及び処置計画に関して、当業者は処置（予防的又は治療的）の投与量及びスケジュールを容易に決定することができる。有効量は、個々の組成物の相対的効力により変化する可能性があり、ペプチドの分子量及びインビトロＩＣ５０又は動物試験のＩＣ５０に基づいて計算することができる。例えば、化合物の分子量（化学構造）及び有効な実験的投与量（ＩＣ５０）を考慮し、投与量（ｍｇ／ｋｇ）を常法に従って計算することができる。一般に、投与量は０．２〜４ｍｇ／ｋｇの重量である。ペプチド又はペプチドを含む組成物は、週に１回若しくは数回、又は数か月に１回若しくは数回投与することができる。
【００２５】
本発明はまた、試料中のＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化の有無を判定することにより、癌患者用の新たな予後マーカーとしてのＣＯＭＭＤ１の使用にも関する。
【００２６】
同様に、Ｌ５５２ペプチドは、ＣＯＭＭタンパク質が疾患の進行の一因となるか関与する疾患を処置する活性薬剤を提供する。例えば、ＣＯＭＭＤファミリーからのどのメンバーの量が増加又は減少しても、及び／又はその活性が増加又は減少しても、疾患が生じる可能性がある。ＣＯＭＭＤタンパク質のＣ末端のアミノ酸残基１１０〜１９０の間に含まれるＣＯＭＭドメインにＬ５５２ペプチドが結合する能力によって、治療活性が維持される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ｌ２ペプチドとＣＯＭＭＤ１の間の物理的相互作用を示す図である。これは酵母ツーハイブリッド法によって行われた。ネガティブコントロールとして、空ベクター（ｐＧＢＫＴ７）で形質転換された酵母株ＡＨ１０９とＹ１８７株で形質転換されたＣＯＭＭＤ１の断片との接合物を使用した。相互作用を確認するために、Ｌ２配列を保有するベクターで形質転換されたＡＨ１０９株とＹ１８７株に形質転換された各ＣＯＭＭＤ１断片とを接合した。ポジティブコントロールとして、ＧＡＬ４転写因子を保持するＰＣＬ１接合物を使用した。なお、ＣＯＭＭＤ１遺伝子の全配列を保有するプラスミドと、ＣＯＭＭＤ１タンパク質のアミノ酸１１０〜１９０を含有する構成物とで相互作用が生じる。
【図２】図２Ａは、ＳＷ９４８細胞における免疫沈降（プルダウン）によるＬ２ペプチドとＣＯＭＭＤ１との相互作用の検証を示す図である。この実験では、１００μｇの全タンパク質（ＴＰ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で得られた組み換えＣＯＭＭＤ１タンパク質（ＣＯＭＭＤ１ｒ）、及び分子量標準（ＭＷ）が示されている。図２Ｂは、Ｌ２ペプチドで処理されたＳＷ９４８細胞におけるＣＯＭＭＤ１細胞内局在化：未処理細胞（ＮＴ）における、核（Ｎ）内、細胞質（Ｃ）内のＣＯＭＭＤ１発現を示す図である。βアクチンは細胞質画分コントロールとして、ヒトリボ核タンパク質（ｈｕｍａｎ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ｈｎＲＰＮ）は核画分のコントロールとして示す。
【図３】図３Ａは、Ｌ５５２最適化ペプチドによるＣＯＭＭＤ１の高度な核内蓄積を示す図である。βアクチン及びｈｎＲＮＰタンパク質を、サイトゾル画分及び核画分のコントロールとしてそれぞれ使用した。図３Ｂは、免疫沈降実験（プルダウン）における、様々な腫瘍細胞系でのＬ５５２ペプチドとＣＯＭＭＤ１タンパク質の相互作用を示す。Ｃｕｌｌｉｎ７（ＣＵＬ７）タンパク質との相互作用は検出されなかった。βアクチンの存在は複数の細胞系の全タンパク質抽出物で示されている。
【図４】様々な組織に由来する腫瘍細胞、及びＬφ（末梢血から単離されたヒトリンパ球）でのペプチドの抗増殖効果を示す図である。
【図５】ＴＣ−１腫瘍モデルでのＬ５５２ペプチドの抗腫瘍効果を示す図である。図５Ａは、腫瘍成長の阻害の曲線を示す図である。図５Ｂは、様々な実験群の累積生存率を示す図である。
【図６】核局在化配列（ＮＬＳ）を保有するＣＯＭＭＤ１タンパク質の発現は細胞死を誘導するには十分であることを示す図である。ネガティブコントロールとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、並びに遺伝構成物ＧＦＰ−ＣＯＭＭＤ１及びＧＦＰ−Ｎ−ＣＯＭＭＤ１が一過性にトランスフェクトされた非生存細胞の割合を示す。
【図７】図７Ａは、ＧＦＰ−Ｎ−ＣＯＭＭＤ１がトランスフェクトされたＨＴ−２９結腸癌細胞での５−ＦＵに対する化学感受性を示す図である。ＩＣ５０値を示す。図７Ｂは、ＬＰＳ及びＴＮＦ−αを加えることによる炎症性環境のＩＣ５０に対する影響を示す図である。
【図８】様々な炎症性刺激の存在下で癌細胞の増殖に対するＬ５５２ペプチドの効果を示す図である。図８Ａは、ヒト骨髄性白血病細胞（ＴＨＰ−１）をＬＰＳ及びＴＮＦ−αで処理した場合の図である。図８Ｂは、マウス結腸癌（ＣＴ−２６）をＬＰＳ及びＴＮＦ−αで処理した場合の図である。ＩＣ５０の値を示す。
【図９】ＬＰＳ注入によって炎症性刺激にさらされたＢＡＬＢ／ｃマウスの結腸癌モデルにおけるＬ５５２ペプチドの抗腫瘍効果を示す図である。図９Ａは、様々な実験群の累積生存率を示す図である。図９Ｂは、各実験群の平均腫瘍体積を示す図である。
【実施例】
【００２８】
（例１）Ｌ２ペプチドとＣＯＭＭＤ１の間の物理的相互作用
抗腫瘍性Ｌ２ペプチドとタンパク質の相互作用を同定するために、ツーハイブリッド酵母システムを使用した。ペプチドに対応する配列をクローニングするために、Ｌ２ペプチド配列（ＨＡＲＩＫＰＴＦＲＲＬＫＷＫＹＫＧＫＦＷ）に対応するようにオリゴヌクレオチドを以下のように設計した：
【化１】
2013530162.tif 000003
【００２９】
ｐＧＢＫＴ７  ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩベクターでこれらの配列をクローニングするため、これらの部位に相補的な配列をオリゴヌクレオチドの末端に付加した。Ｌ２ペプチド配列を保有するｐＧＢＫＬ２−１組み換えプラスミドは制限酵素分析と配列決定によって確認した。プラスミドを酢酸リチウム法によってＡＨ１０９酵母株に形質転換し、ＳＤ−Ｔｒｐ培地で成長させた。それは、ＳＤ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓプレート上で成長させると自己活性化し得ないことが確認された。相互作用のスクリーニングには、Ｙ１８７株に形質転換されたヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを使用した。二倍体形成及び相互作用の選択については、ｐＧＢＫＬ２−１プラスミドを含有する５×１０８個のＡＨ１０９細胞を、ヒト肝臓ＤＮＡライブラリーを含有する５×１０８個のＹ１８７細胞と共に固形培地ＹＰＤＡで４時間３０℃で成長させた。１０ｍｌの滅菌水をＹＰＤＡプレートの表面に加え、細胞をスパチュラで注意深く懸濁させ、１５枚のＳＤ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｄｅ最少培地プレートに移して７日間３０℃で成長させた。７４個の得られたコロニーを、９６ディープウェルプレートの液体ＳＤ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕに移した。液体培地で成長を観察した後、酵母ＤＮＡの精製を行った。精製し、−２０℃で保存した個々のＤＮＡをＤＨ１０Ｂ大腸菌株に形質転換した。個々のクローンをそれぞれＹ１８７酵母株に形質転換し、ｐＧＢＫＴ７及びｐＧＢＫＬ２−１プラスミドで形質転換されたＡＨ１０９株との接合によって相互作用を確認した。陽性クローンのＤＮＡを配列決定した。ブラスト（Ｂｌａｓｔ）プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、  ２１５：４０３〜４１０）を用いた配列解析によって、クローンのうちの１つ（Ｌ２−２１）がＣＯＭＭＤ１タンパク質のアミノ酸６〜１９０をコードする遺伝子の配列に相当し、このクローンがＬ−２ペプチド配列を含有するプラスミドと相互作用可能であることが明らかになった。この相互作用に関与するＣＯＭＭＤ１タンパク質領域を特異的に同定するために、ｐＧＢＫＬ２−１プラスミドに欠失を行い、クローンｐＧＢＫＬ２（６〜１１０）、ｐＧＢＫＬ２（６〜７０）、ｐＧＢＫＬ２（７１〜１９０）、ｐＧＢＫＬ２（１１０〜１９０）を生成した。図１に示されるように、相互作用は、ＣＯＭＭＤファミリーについて記載のタンパク質相互作用に関与するＣＯＭＭドメインを含有するプラスミドｐＧＢＫＬ２（１１０〜１９０）のみに保存されている。この結果は、Ｌ２ペプチドがアミノ酸１１０〜１９０の領域に特異的に結合していることを示している。
【００３０】
（例２）免疫沈降実験（プルダウン）及びペプチドＬ５５２で処理した癌細胞でのＣＯＭＭＤ１の核局在化の判定
試験を２つのブロックに分割した：
（Ａ）固相法を用いて合成された合成Ｌ２ペプチド（配列番号１）をビオチン化し、ストレプトアビジンセファロース樹脂に付着した「ベイト（ｂａｉｔ）」として用いた。ＳＷ９４８（ヒト結腸癌由来の細胞系）からの全抽出タンパク質を「プレイ（ｐｒｅｙ）」として用いた。これらの実験は「プルダウン」として知られている。全抽出タンパク質を、抽出緩衝液（０．５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセリン、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、及びプロテアーゼ阻害剤）を用いて、２×１０７個の細胞から得た。ビオチン化ペプチド（３００μｇ）を、５０μＬのストレプトアビジンセファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に１時間培養し、リン酸緩衝生理食塩水（１倍ＰＢＳ）＋１ｍＭ  ＤＴＴで洗浄した。次に、５００μＬの全タンパク質を、ビオチン化ペプチドを含有する５０μＬの樹脂と共に室温で５時間培養した。続いて、この樹脂を１倍ＰＢＳ及び１ｍＭ  ＤＴＴで十分洗浄した。樹脂に付着して残ったタンパク質はペプチドと相互作用するものであり、２５μＬの電気泳動緩衝液（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ６．９、０．１Ｍ  ＤＴＴ、２０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０％グリセリン、及び０．０１％ブロモフェノールブルー）に懸濁させる。目的のタンパク質を検出するために、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７．５％）を行い、続いてウェスタンブロットによる免疫検出を行った。ＣＯＭＭＤ１タンパク質を検出するために、ＣＯＭＭＤ１タンパク質に対するモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、ｃｌｏｎｅ２Ａ１２）を使用した。全タンパク質抽出物（１００μｇ）、及び大腸菌で得られた組み換えＣＯＭＭＤ１タンパク質をポジティブコントロールとして採用した。図２Ａで表された結果は、全タンパク質抽出物と比較した場合、Ｌ２ペプチドがプルダウン実験でＣＯＭＭＤ１タンパク質を濃縮させることを表している。これは、Ｌ２とＣＯＭＭＤ１の間の相互作用を示している。
【００３１】
（Ｂ）ＳＷ９４８細胞（３×１０６個の細胞）は、Ｌ２ペプチド（５０μＭ）と共に、３７℃及び５％ＣＯ２で５時間培養した。続いて、細胞質タンパク質及び核タンパク質を報告されるように得た（Ｖａｎｃｕｒｏｖａら、２００１、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７６：１９７４６〜１９７５２）。ＣＯＭＭＤ１の検出は、抗ＣＯＭＭＤ１抗体を用いてウェスタンブロットによって行った。図２Ｂは、Ｌ２ペプチドで処理したＳＷ９４８細胞でのＣＯＭＭＤ１核局在化を表している。βアクチンは細胞質画分のコントロールとして、ヒトリボ核タンパク質（ｈｕｍａｎ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ｈｎＲＮＰ）は核画分のコントロールとして使用した。
【００３２】
（例３）ＣＯＭＭＤ１を核内蓄積するためのＬ５５２ペプチドの最適化
ペプチドＬ２とＣＯＭＭＤ１が物理的相互作用を有し、このことがＣＯＭＭＤ１の核局在化と相関することを考慮し、ＣＯＭＭＤ１の核内蓄積を高めることを目的として、複数のペプチドをＬ２（配列番号１）から設計した。固相法を用いて本発明のペプチドを合成した。粗ペプチドを３０％酢酸溶液で抽出し、凍結乾燥し、その後逆相クロマトグラフィＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。精製されたペプチドの分子量は質量分析によって確認した。得られた調製物は、非抗原性で、非発熱性であり、動物及びヒトへの投与に薬学的に許容される。表１に示すように、配列がＨＡＲＩＫＰＴＦＲＲＬＫＷＫＹＫＧＫＦＷ（配列番号１）である本来のＬ２ペプチドの特定位置にＤ−アミノ酸を導入する置換をいくつかの点に行った。１つの事例では、Ｎ末端をアセチル化でブロックした。
【表１】
2013530162.tif 000004
【００３３】
本実験の目的は、細胞の核にＣＯＭＭＤ１を蓄積する能力の高いペプチドを同定することであった。ＳＷ９４８細胞（３×１０６個の細胞）を、Ｌ２、Ｌ５５１、Ｌ５５２、Ｌ５５３及びＬ５５４ペプチド（５０μＭ）と共に、３７℃及び５％ＣＯ２で５時間培養した。続いて、例２に記載するように、細胞質タンパク質及び核タンパク質を単離した。ＣＯＭＭＤ１の検出は、抗ＣＯＭＭＤ１抗体を使用してウェスタンブロットによって行った。図３Ａは、上記のペプチドで処理したＳＷ９４８細胞でのＣＯＭＭＤ１核局在化を表している。結果によって、Ｌ５５２ペプチドが癌細胞の核に最も多くのＣＯＭＭＤ１の蓄積を誘導することが示されている。さらに、種々の腫瘍株における免疫ブロット実験（プルダウン）によってＬ５５２ペプチドとＣＯＭＭＤ１の間の相互作用が実証されている（図３）。これらの結果は、Ｌ５５２とＣＯＭＭＤ１の間の相互作用を確証している。また、この相互作用はＣＯＭＭＤ１の核内蓄積の促進と関係している。
【００３４】
（例４）種々の腫瘍系におけるペプチドＬ５５２の抗増殖効果の増加を例示する
このアッセイでは、ヒト由来のＨ−８２（小細胞肺癌）、Ｈ−１２５（非小細胞肺癌）、ＭＣＦ−７（乳腺癌）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（乳腺癌、受容体陽性上皮成長因子）、ＬＳ１７４Ｔ（結腸直腸腺癌）、及びＨＴ−２９（化学療法に抵抗性の結腸直腸腺癌）の腫瘍細胞を、ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）１ｍｌ当たり１×１０４個の細胞の密度で、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。２４時間後、９μＭから３００μＭの間の投与量範囲でペプチドを培地に加えた。５％ＣＯ２の存在下で４８時間培養し、その後、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）で明らかにした（Ｇｒａｙ  ＭＪら、２００８、Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、１００：１０９〜２０）。
【００３５】
最後に、プレートを４９２ｎｍの吸収度で読み取った。各点を二重反復で行い、少なくとも２回、実験を独立して行った。ＩＣ５０値は細胞増殖の各曲線から得た。結果を図４に示す。結果は、Ｎ末端のアセチル化、及び特定位置でのＤ−アミノ酸の置換によってＬ５５２ペプチドの抗増殖効果の増加が保証されることを示している。しかしながら、末梢血から単離されたヒトリンパ球では効果が見られなかった。この結果は、本発明の目的であるＬ５５２ペプチドが、正常細胞での毒性は増加させずに腫瘍細胞に選択的な細胞傷害効果を高めることを示している。報告された結果によって、Ｌ５５２ペプチドが、ＣＯＭＭＤ１タンパク質と相互作用し、核内の蓄積をさらに促進し、癌細胞に選択的な抗増殖効果を増加させるように最適化されたことが実証されている。
【００３６】
（例５）ＴＣ−１腫瘍のマウスモデルにおけるＬ５５２ペプチドの抗腫瘍効果
これらアッセイでは、８週齢から１０週齢の間のＣ５７ＢＬ／６雌（実験群当たりｎ＝１０頭）を使用した。このモデルでの腫瘍生着には、食塩水（ＰＢＳ）に懸濁された、悪性Ｃ５７ＢＬ／６からの肺上皮細胞に由来するＴＣ−１細胞を使用した。２００μＬの量の５×１０４個の細胞をマウスの右後肢に皮下接種した。腫瘍の体積が１００ｍｍ３に達すると、５回分の投与量のペプチド（Ｌ２、Ｌ５５２及びＬ５５１）を、２日間隔で右後肢に皮下投与した。この研究では、１回分の投与量が１ｋｇの重量当たり０．２ｍｇのペプチド（４μｇ／マウス）を評価した。目的のペプチドの抗腫瘍効果を測定するための評価パラメーターは、図５Ａ及び図５Ｂに示すように、動物の生存率及び腫瘍量であった。Ｌ５５２ペプチドは、Ｌ２ペプチド及びＬ５５１ペプチドと比較して、腫瘍の進行を阻害し、マウスの生存率を増加させる能力に関してより有効であった。これらの結果は、Ｌ５５２に導入された修飾がインビボの抗腫瘍効率を増加させたことを証明している。ログランク法によって統計分析を行い、群間の有意差を決定した。結果は、試験した他のペプチドと比較してＬ５５２ペプチドが動物の生存率を有意に増加（＊ｐ＜０．０５）させることが実証している。これらの結果は、特定位置のＤ−アミノ酸置換、及びアセチル化によるＮ末端のブロックがペプチドの抗腫瘍能を有意に増加させることを実証している。
【００３７】
（例６）核局在化配列を保有するＣＯＭＭＤ１タンパク質の発現は細胞死を誘導するには十分であることを例示する
細胞増殖の阻害に対するＣＯＭＭＤ１の核局在化の役割を確認するために、ＧＦＰに融合したＣＯＭＭＤ１を発現する組み換えプラスミドｐＧＦＰ−ＣＯＭＭＤ１、及びＰＫＫＫＲＫＶ核局在化ペプチド配列を含有するｐＧＦＰ−Ｎ−ＣＯＭＭＤ１を生成した。ｐＧＦＰ−ＣＯＭＭＤ１のクローニングについては、次のオリゴヌクレオチドを使用してポリメラーゼ連鎖反応を行った：
【化２】
2013530162.tif 000005
ＮＬＳが導入されたＣＯＭＭＤ１をコードする遺伝子の増幅には次のオリゴヌクレオチドを使用した：
【化３】
2013530162.tif 000006
【００３８】
組み換えクローンを制限及びＤＮＡ配列によって分析した。構築物及びｐＥＧＦＰコントロールは共に、二重反復で２４ウェルプレートにポリエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を使用して、ＨＴ−２９及びＨＥＫ２９３細胞系に一過性にトランスフェクトした（Ｂｏｕｓｓｉｆ，Ｏら、１９９５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、９２：７２９７〜７３０１）。７２時間後、ウェルのうちの１つを使用して、蛍光顕微鏡Ａｘｉｏｖｅｒｔ４０（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）及びＡＰｌａｎ  １０×対物レンズを使用して組み換えタンパク質の発現を評価した。アポトーシスを確認するために、残りのウェルから培地を取り出し、ＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍＬの濃度のアクリジンオレンジ／エチジウムブロマイド（ＡＯ／ＥＢ）の混合液で染色し（Ｒｉｂｌａｈ  Ｄら、２００５、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５：１２〜１５）、顕微鏡Ａｘｉｏｖｅｒｔ４０及びＡＰｌａｎ  ４０×対物レンズで観察した。このタイプの染色では、ＡＯが生細胞の膜を通過し、細胞の核及び細胞質をそれぞれ緑やオレンジに染色し、一方、ＢＥは膜の完全性が喪失した細胞のみを貫通し、ＤＮＡを赤色に染色する。ＢＥの蛍光はＡＯ蛍光より優勢である。
【００３９】
ＡＯ／ＥＢ染色によって、ＧＦＰ及びＧＦＰ−ＣＯＭＭＤ１がトランスフェクトされＡＯで染色された生存細胞が示される。ＧＦＰ−Ｎ−ＣＯＭＭＤ１がトランスフェクトされた細胞の場合のみ、細胞はＥＢによって染色された核で観察され、それらがアポトーシスの後期にあることを示している。図６は、１つの実験条件につき３つの独立したフィールドの、核が赤色に染色された細胞の割合を示すグラフである。グラフは値と標準偏差を表す。これらの結果によって、タンパク質ＣＯＭＭＤ１へのＮＬＳの導入が細胞のアポトーシスの誘導には十分であることが実証されている。これらの結果はまた、新たな治療標的としてのＣＯＭＭＤ１の有用性も実証している。
【００４０】
（例７）細胞系ＨＴ−２９における５−ＦＵ及び炎症性刺激に感受性のＣＯＭＭＤ１タンパク質の核局在化の効果を例示する
（Ａ）上記構築物が一過性にトランスフェクトされたＨＴ−２９細胞系を、ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）１ｍｌ当たり１×１０４個の細胞の密度で、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。２４時間後、細胞増殖抑制剤５−ＦＵを、１０倍階段希釈で０．０２５μＭから２５００μＭの間の投与量範囲で培地に加えた。５％ＣＯ２の存在下で４８時間培養し、最終的にＭＴＴで明らかにした。最後に、４９２ｎｍの吸収度でプレートを読み取った。各点を二重反復で行い、少なくとも２回、独立して実験を行った。ＩＣ５０値は細胞増殖の各曲線から得た。図７Ａで表された結果は、ＮＬＳを有するＣＯＭＭＤ１（ＧＦＰ−Ｎ−ＣＯＭＭＤ１）の発現が５−ＦＵに対する癌細胞の感受性を増加させることを示している。この例において、ＧＦＰ又はＧＦＰ−ＣＯＭＭＤ１を発現する細胞と比較して、ＧＦＰ−ＮＣＯＭＭＤ１を発現する細胞のＩＣ５０が減少することが示されている。これらの結果は、新たな治療標的としてのＣＯＭＭＤ１の有用性も実証している。さらに、ＣＯＭＭＤ１の核局在化が従来の細胞増殖抑制剤への化学感受性（ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を誘導することも示している。
【００４１】
（Ｂ）ＧＦＰ−ＮＣＯＭＭＤ１が一過性にトランスフェクトされたＨＴ−２９細胞系を、３０分間、種々の炎症性刺激、例えばＬＰＳ（４０μｇ／ｍＬ）及びＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）にさらした。続いて、例６に記載のようにＩＣ５０を評価した。結果を図７Ｂに示す。
【００４２】
（例８）炎症性刺激にさらした癌細胞の細胞増殖に対するＬ５５２ペプチドの効果を例示する
このアッセイでは、ヒト由来の急性骨髄性白血病の細胞（ＴＨＰ−１）及びマウス結腸癌の細胞（ＣＴ−２６）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）１ｍｌ当たり１×１０４個の細胞の密度で、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間、細胞を維持した。この後、ＬＰＳ（４０μｇ／ｍＬ）又はＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）を３０分かけて加えた。図８は、上記刺激の存在下又は非存在下におけるＴＨＰ−１細胞系及びＣＴ−２６細胞系のＩＣ５０値を表す。結果では、Ｌ５５２ペプチドが、種々の炎症性刺激の存在下で、ＴＨＰ−１癌細胞系及びＣＴ−２６癌細胞系で細胞増殖を阻害することが示されている。この結果によって、Ｌ５５２ペプチドが様々な抗炎症剤にさらされた癌細胞の増殖を遮断するのに有効であることが示されている。
【００４３】
（例９）ＬＰＳ注入によって炎症性刺激にさらされたＢＡＬＢ／ｃマウスの結腸癌モデルにおけるＬ５５２ペプチドの抗腫瘍効果を例示する
これらアッセイでは、８週齢から１０週齢の間のＣＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（実験群当たりｎ＝１０頭）を使用した。このモデルでの腫瘍生着には、ＢＡＬＢ／ｃの結腸癌から単離されたＣＴ−２６細胞を使用した。２００μＬの１倍ＰＢＳに懸濁した７×１０４個の細胞をマウスの腋窩に皮下接種した。１１日後、腹腔内投与で、ＰＢＳ中の１０μｇ  ＬＰＳ／マウス（血清型０５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ）を動物に注入した。腫瘍の体積が１００ｍｍ３に達すると、ある群は隔日に５回分の投与量のＬ５５２ペプチド（０．２ｍｇ／ｋｇ重量）を受け、ある群は５−ＦＵを２０ｍｇ／ｋｇの投与量で受けた。この実験で評価される目的のパラメーターは、動物の生存率及び腫瘍量の体積の増加であった。
【００４４】
図９に表された結果は、ＬＰＳの注入による炎症期が加えられた結腸癌のモデルにおけるＬ５５２ペプチドの効能を示す。（Ａ）結果では、ＬＰＳが加えられると、Ｌ５５２ペプチドは、５−ＦＵで処理された群と比較して動物の生存率（＊ｐ＜０．０５）を増加させるのにより有効であったことが示されている。ログランク法によって統計分析を行い、群間の有意差を決定した。（Ｂ）Ｌ５５２ペプチドは、腫瘍の進行を阻害する能力の点でより有効であった。この例で表された結果では、Ｌ５５２ペプチドが炎症を伴う癌の処置に有効であることが示されている。
【００４５】
（例１０）Ｌ５５２ペプチドと標準的化学療法の組み合わせの相乗効果を例示する
このアッセイでは、ＨＴ−２９及びＨ−１２５の腫瘍細胞を、ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）１ｍｌ当たり１×１０４個の細胞の密度で、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。２４時間後、９μＭから３００μＭの間の投与量範囲でペプチドを培地に加え、細胞増殖抑制薬を、各細胞系で報告されたＩＣ５０前後の１０倍階段希釈の投与量範囲で加えた。５％ＣＯ２の存在下で４８時間培養を行い、ＭＴＴで明らかにした。細胞増殖抑制剤とペプチドを組み合わせた処置の効果をＣａｌｃｕＳｙｎコンピュータ・ソフトウェアによって分析し、薬物の組み合わせを検討した（Ｔｉｎｇ−Ｃｈａｏ  Ｃｈｏｕ、２００６、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５８：６２１〜６８１）。表２に表されたデータは、ペプチドと細胞増殖抑制剤の組み合わせが細胞増殖抑制剤の量を低減することができることを示し、それは薬物減少率指数（ＲＩ）で示される値によって得られる。これらの結果によって、標準的化学療法と同時にペプチドを投与することで、少ない量の従来の薬物で有効な処置（影響を受けた細胞の割合が８９％から９４％の間）を提供できることが示されている。ＨＴ−２９細胞系では、５−ＦＵとＬ５５２ペプチドを組み合わせると、細胞増殖抑制剤が２０分の１に減少（ＲＩ）する。Ｈ−１２５細胞系でシスプラチンとＬ５５２ペプチドを組み合わせると、細胞増殖抑制剤が５分の１に減少する。これらの結果は、肺癌及び結腸癌では標準治療法と組み合わせてペプチドを投与することで、容易に細胞増殖抑制剤の投与量を減少させることができることを示している。このことによって、化学療法に伴う副作用を低減することができる。
【表２】
2013530162.tif 000007
【図１】
2013530162.tif 000008
【図７Ａ】
2013530162.tif 000009
【図７Ｂ】
2013530162.tif 000010
【図８Ａ】
2013530162.tif 000011
【図８Ｂ】
2013530162.tif 000012
【図２】
2013530162.tif 000013
【図３】
2013530162.tif 000014
【図４】
2013530162.tif 000015
【図５】
2013530162.tif 000016
【図６】
2013530162.tif 000017
【図９】
2013530162.tif 000018
【配列表】
2013530162000001.app
【国際調査報告】
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