(57)【要約】  本発明は、植物への農薬の特異的送達に関する。より詳しくは、本発明は、生きている無傷植物上の結合部位に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含むターゲティング剤および農薬または農薬の組み合わせから本質的になる組成物に関する。本発明はさらに、生きている無傷植物上の前記結合部位に特異的に結合する結合ドメインに関する。より詳しくは、本発明は、４つのフレームワーク領域および３つの相補性決定領域またはそれらの任意の適切なフラグメントを含むアミノ酸配列を含む、植物に対して担体を結合または保持することが可能である結合ドメインに関する。好ましい一実施形態において、本発明は、毛状体、気孔、クチクラ、皮目、棘、針、根毛またはロウ層に特異的に結合する結合ドメインに関する。本発明はさらに、前記結合ドメインを含むターゲティング剤を使用して、植物に農薬を送達するための方法、植物上への農薬の堆積を改善するための方法に関し、植物上に前記農薬を保持するための方法、ならびに同剤を使用して生物ストレスもしくは非生物ストレスから植物を保護する方法または植物成長を調節する方法に関する。また本発明は、特異的ターゲティング農薬担体の製造方法に関する。
2013529066.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きている無傷植物上の少なくとも１つの結合部位に結合することが可能である結合ドメイン。
【請求項２】
自然免疫系または適応免疫系に由来する、請求項１に記載の結合ドメイン。
【請求項３】
４つのフレームワーク領域および３つの相補性決定領域またはそれらの任意の適切なフラグメントを含むアミノ酸配列に含まれる、植物上の少なくとも１つの結合部位に結合することが可能である結合ドメイン。
【請求項４】
植物に対して担体を結合することが可能である、請求項１から３のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項５】
植物に対して担体を保持することが可能である、請求項１から３のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項６】
植物の特定部位に結合する、請求項１から５のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項７】
植物の前記部位が葉、茎、根、果実、球果、花、球根および塊茎からなる群から選択される、請求項６に記載の結合ドメイン。
【請求項８】
植物上の特定構造に結合する、請求項１から７のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項９】
前記特定構造が毛状体、気孔、皮目、棘、針、根毛、クチクラまたはロウ層からなる群から選択される、請求項８に記載の結合ドメイン。
【請求項１０】
前記植物に農薬製剤の形で結合する、請求項１から９のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項１１】
アラビアゴムに結合する、請求項１から１０のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項１２】
レクチン、レクチン様ドメイン、エクステンシンまたはエクステンシン様ドメインに結合する、請求項１から１１のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項１３】
ラクダ科動物抗体に由来する、請求項１から１２のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項１４】
ＶＨＨ配列に含まれる、請求項１３に記載の結合ドメイン。
【請求項１５】
前記ＶＨＨが２つの安定化ジスルフィド架橋を有する、請求項１４に記載の結合ドメイン。
【請求項１６】
前記ＶＨＨが配列番号１−配列番号４２からなる群から選択される配列を含む、請求項１５に記載の結合ドメイン。
【請求項１７】
植物および／または植物部位に対して農薬を保持することが可能である、請求項１から１６のいずれかに記載の少なくとも１つの結合ドメインを含むターゲティング剤。
【請求項１８】
前記農薬が担体上に結合されているまたは担体中に含まれている、請求項１７に記載のターゲティング剤。
【請求項１９】
請求項１から１６のいずれかに記載の少なくとも１つの結合ドメインを含み、前記結合ドメインが植物上の特定構造に結合する、請求項１７または１８に記載のターゲティング剤。
【請求項２０】
前記特定構造が毛状体、気孔、皮目、棘、針、根毛、クチクラおよびロウ層からなる群から選択される、請求項１９に記載のターゲティング剤。
【請求項２１】
請求項１から１６のいずれかに記載の少なくとも１つの結合ドメインを含み、前記結合ドメインがアラビアゴムに結合する、請求項１７から２０のいずれかに記載のターゲティング剤。
【請求項２２】
請求項１から１６のいずれかに記載の少なくとも１つの結合ドメインを含み、前記結合ドメインがレクチン、レクチン様ドメイン、エクステンシンまたはエクステンシン様ドメインに結合する、請求項１７から２１のいずれかに記載のターゲティング剤。
【請求項２３】
請求項１から１６のいずれかに記載の少なくとも１つの結合ドメインを含み、前記結合ドメインがラクダ科動物抗体に由来する、請求項１７から２２のいずれかに記載のターゲティング剤。
【請求項２４】
請求項１から１６のいずれかに記載の少なくとも１つの結合ドメインを含み、前記結合ドメインがＶＨＨ配列に含まれる、請求項２３に記載のターゲティング剤。
【請求項２５】
前記ＶＨＨが２つの安定化ジスルフィド架橋を有する、請求項２４に記載のターゲティング剤。
【請求項２６】
前記ＶＨＨが配列番号１−配列番号４２からなる群から選択される配列を含む、請求項２５に記載のターゲティング剤。
【請求項２７】
植物および／または植物部位に農薬または農薬の組み合わせを送達および保持するための、請求項１７から２６のいずれかに記載のターゲティング剤の使用。
【請求項２８】
前記農薬または農薬の組み合わせが除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺線虫剤、殺生物剤、肥料、毒性緩和剤、微量栄養素または植物成長調整剤からなる群から選択される、請求項２７に記載のターゲティング剤の使用。
【請求項２９】
前記農薬または農薬の組み合わせが担体上に結合されているまたは担体中に含まれている、請求項２８に記載のターゲティング剤の使用。
【請求項３０】
前記担体が微小担体である、請求項２９に記載のターゲティング剤の使用。
【請求項３１】
前記微小担体が、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノカプセル、ナノスフェア、ポリマー粒子、人工的に木質化したセルロースから製造された粒子、複合ゲル粒子、弱イオン性樹脂粒子、微生物細胞またはそれらの断片からなる群から選択される、請求項３０に記載のターゲティング剤の使用。
【請求項３２】
請求項２９から３１のいずれかに記載のターゲティング剤の使用であって、前記ターゲティング剤が、担体の外表面の官能基によって前記担体にカップリングされている、ターゲティング剤の使用。
【請求項３３】
請求項３２に記載のターゲティング剤の使用であって、前記ターゲティング剤が共有結合によって前記官能基にカップリングされている、ターゲティング剤の使用。
【請求項３４】
（ａ）請求項１７から２６のいずれかに記載の少なくとも１つのターゲティング剤および（ｂ）農薬または農薬の組み合わせを含む組成物。
【請求項３５】
（ａ）請求項３に記載の４つのフレームワーク領域および３つの相補性決定領域またはそれらの任意の適切なフラグメントを含むアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つの結合ドメインを含む少なくとも１つのターゲティング剤および（ｂ）農薬または農薬の組み合わせを含む組成物。
【請求項３６】
前記農薬または農薬の組み合わせが担体上に結合されているまたは担体の中に含まれている、請求項３４または３５に記載の組成物。
【請求項３７】
（ａ）請求項１７から２６のいずれかに記載の少なくとも１つのターゲティング剤および（ｂ）担体を含む組成物。
【請求項３８】
（ａ）請求項１７から２６のいずれかに記載の少なくとも１つのターゲティング剤であって、４つのフレームワーク領域および３つの相補性決定領域またはそれらの任意の適切なフラグメントを含む少なくとも１つの結合ドメインを含む、前記ターゲティング剤および（ｂ）担体を含む組成物。
【請求項３９】
前記ターゲティング剤が前記担体にカップリングされている、請求項３７または３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ターゲティング剤が前記担体に共有結合でカップリングされている、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記担体が少なくとも１つの農薬にカップリングされており、および／または少なくとも１つの農薬を含む、請求項３７から４０のいずれかに記載の組成物。
【請求項４２】
前記農薬が除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺線虫剤、殺生物剤、肥料、毒性緩和剤、微量栄養素または植物成長調整化合物からなる群から選択される、請求項３６または４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記担体が、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ポリマー粒子、人工的に木質化したセルロースから製造された粒子、複合ゲル微粒子、弱イオン性樹脂粒子、微生物細胞またはそれらの断片からなる群から選択される、請求項３６から４２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４４】
植物に請求項３４から４３のいずれかに記載の組成物を少なくとも１回施用することを含む、植物に農薬または農薬の組み合わせを送達する方法。
【請求項４５】
農薬または農薬の組み合わせの用量が、いかなるターゲティング剤も含まない比較可能な組成物に含まれている同一の農薬または農薬の組み合わせの効果的用量と比べて低減される、請求項４４に記載の農薬または農薬の組み合わせを送達する方法。
【請求項４６】
植物を保護する方法および／または植物もしくは植物部位の生存能力、成長もしくは収量を調節する方法および／または植物もしくは植物部位における遺伝子発現を調節する方法であって、前記植物に請求項３４から４３のいずれかに記載の組成物を少なくとも１回施用することを含む、方法。
【請求項４７】
農薬または農薬の組み合わせの用量が、いかなるターゲティング剤も含まない比較可能な組成物に含まれている同一の農薬または農薬の組み合わせの効果的用量と比べて低減される、請求項４６に記載の植物を保護する方法および／または植物もしくは植物部位の生存能力、成長または収量を調節する方法および／または植物もしくは植物部位における遺伝子発現を調節する方法。
【請求項４８】
特異的ターゲティング農薬担体の製造方法であって、（ａ）担体中にまたは担体上に（担体に）農薬または農薬の組み合わせを充填することおよび（ｂ）前記担体に請求項１７から２６のいずれかに記載のターゲティング剤を付着させることを含む、方法。
【請求項４９】
請求項１７から２６のいずれかに記載のターゲティング剤を担体に付着させる方法であって、（ａ）連結剤を担体と反応させることおよび（ｂ）前記連結剤と前記ターゲティング剤を反応させることを含む、方法。
【請求項５０】
請求項４８の方法によって得られるまたは得ることが可能である、特異的ターゲティング農薬担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物への農薬の特異的送達に関する。より詳しくは、本発明は、生きている無傷植物上の結合部位に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含むターゲティング剤および農薬または農薬の組み合わせから本質的になる組成物に関する。本発明はさらに、生きている無傷植物上の前記結合部位に特異的に結合する結合ドメインに関する。より詳しくは、本発明は、４つのフレームワーク領域および３つの相補性決定領域またはそれらの任意の適切なフラグメントを含むアミノ酸配列を含む、植物に対して担体を結合または保持することが可能である結合ドメインに関する。好ましい一実施形態においては、本発明は、毛状体、気孔、クチクラ、皮目、棘、針、根毛またはロウ層に特異的に結合する結合ドメインに関する。本発明はさらに、前記結合ドメインを含むターゲティング剤を使用して、植物に農薬を送達するための方法、植物上への農薬の堆積を改善するための方法に関し、植物上に前記農薬を保持するための方法、ならびに同剤を使用して生物ストレスもしくは非生物ストレスから植物を保護する方法または植物成長を調節する方法に関する。また本発明は、特異的ターゲティング農薬担体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
長年、園芸家および農耕者は、雑草防除、植物保護および植物成長制御用の化学物質を圃場に噴霧することにより施用してきた。植物上に、例えば葉面上に施用する必要がある組成物に関し、ほとんどの量が植物表面には吸着しておらず、滴り落ちることにより失われまたは雨によって洗い流されるので、組成物がその生物学的活性を及ぼし得る植物部位に対して組成物の一部しか結合および保持されない。化学物質の効果低減をもたらすことの他に、噴霧中に植物から滴り落ちることによる化学物質の土壌への消失、または降雨による流出によって地下水の汚染、環境被害、生物多様性損失ならびにヒトおよび動物の健康上への影響が生じる可能性がある。
【０００３】
何人かの研究者達は、葉に張り付いて一定期間にわたってそれらの内容物を放出する徐放性粒子を植物に施用することによりこの問題を解決しようとした。ＵＳ６１８０１４１には、植物保護活性成分を送達するために使用可能な複合ゲル微粒子が記載されている。ＷＯ２００５１０２０４５には、少なくとも１つの植物活性化合物および真菌細胞またはその断片を含むカプセル化アジュバントを含んでなる組成物が記載されている。ＵＳ２００７０２８０９８１には、表面が親油性粘着付与剤でコーティングされていて、それにより担体粒剤が植物、野草および雑草の表面に接着する担体粒剤が記載されている。
【０００４】
農薬の送達を目的としたこれらの微粒子は、どちらかといえば非特異的な微弱相互作用、例えば親油性相互作用などによって微粒子が植物に固着することを特徴とする。これは通常の噴霧に比べて利点を有している可能性があるが、こうした送達方法の効果は限定されており、粒子は葉面上に最適には分配されず、または化合物の放出が完了する前に自然に変化し得る気候条件下で洗い流される恐れがある。微粒子を特異的に分配し効率的に保持するために、その内容物が完全に送達されるまで担体が植物に固着することを保証することができる、強固に結合する特異的分子が必要とされている。
【０００５】
セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）は、分子種をセルロースに付着させるのに有用な薬剤として記載されている（ＵＳ５７３８９８４およびＵＳ６１２４１１７）。実際、綿は９０％のセルロースから構成されているので、ＷＯ９８００５００にＣＢＤと酵素の間の直接融合体がＣＢＤのアフィニティーを利用して綿織物への結合に用いられたことが開示されているように、ＣＢＤｓは綿織物に対するいわゆる「効果薬剤」の送達に有用であることが判明した。カプセル化効果薬剤の送達に類似の多機能性融合タンパク質を使用することはＷＯ０３０３１４７７に特許請求されており、そこでは、前記多機能性融合タンパク質が、第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインのいずれかが微粒子に結合し得る、炭水化物結合ドメインである第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインからなることが特許請求されている。ＷＯ０３０３１４７７には、ＣＢＤおよび微粒子に結合している抗ＲＲ６抗体フラグメントからなる二機能性融合タンパク質を使用し、その複合体が綿糸または切断した野草に対して堆積することが例示されている。しかし、カプセル化効果薬剤の送達にこうした多機能性融合タンパク質を使用すると、深刻な多くの欠点を被る。第１に、セルロースは植物細胞壁の主成分であり、植物物質全体の約３３％がセルロースからなるが、生きている無傷植物において、セルロースは、植物細胞壁を覆っている不浸透性バリアのクチンおよびロウによって形成されている植物クチクラにより外部環境から保護されており、ＣＢＤによる結合に対してセルロースの接触可能性は不十分である。第２に、カプセル化効果薬剤の植物への効果的送達では、第１の結合ドメインの植物への結合と第２の結合ドメインの微粒子への結合が同時に必要である。両結合事象が発生する可能性は、結合ドメインおよびそれらのターゲット分子のモル濃度と結合複合体のモル濃度の間の微妙な平衡によって決まるので、十分な多機能性融合タンパク質がこうした同時結合を可能にするように溶液中に存在することはあり得ない。さらに、結合事象の平衡は、温度およびｐＨなどの環境パラメーターにより大きく影響を受ける。これに関し、それらの最適条件は、それぞれの結合ドメインで大幅に異なる可能性がある。したがって、こうした多機能性融合タンパク質の２つの結合ドメインのこうした同時結合が、カプセル化効果薬剤を植物に保持する十分に強固な結合をもたらす見込みはほとんどない。第３に、ＣＢＤの結合はある程度までセルロースに特異的であるが、全ての植物がセルロースを含有しているので、ＣＢＤが植物に結合するはずである多機能性融合タンパク質の使用は一般的結合方法と考えられ、したがって、粘着付与剤または固着剤を使用する非特異的固着と同類である。結合ドメインの特異的結合がある植物種への結合と別の植物種への結合とを識別することができるターゲット方法は、価値を相当に高める。ＷＯ０３０３１４７７はまた、さらに例証することなく、炭水化物または多糖類に別の結合剤を使用して、生きている生物に対して微粒子を堆積させる融合タンパク質を得ることができることを示唆している。しかし、ＣＢＤｓ以外の結合ドメインも生きている無傷植物に結合する結合ドメインも、ＷＯ０３０３１４７７には開示されていなかった。
【０００６】
特定のターゲットに対する特異性および高アフィニティーについて十分に知られている分子は抗体である。抗体は様々な広範囲のターゲットに対して生成することが可能であり、植物細胞壁の構造および力学を研究するために生成された抗体が特定の植物成分、主に植物細胞壁の成分に特異的に結合することが既に記載されている（Ｐｅｎｅｌｌら、１９８９；Ｊｏｎｅｓら、１９９７；Ｗｉｌｌａｔｓら、１９９８；ＷｉｌｌａｔｓおよびＫｎｏｘ、１９９９；Ｗｉｌｌａｔｓら、２００１）。しかし、前記抗体が生成されたいずれの植物細胞壁成分も、外部環境から抗体に直接接触可能であるかどうかについては不明である。さらに、抗体は、適応免疫系の成分としてのそれらの特性そのものによって、抗体は生理的条件下（綿密に調整されたｐＨ、温度および血液の通常浸透圧範囲を包含する）でそれらのターゲットに結合するというように解釈される。農薬のターゲット送達に抗体を使用することを万一考慮したならば、前記抗体は、農薬製剤の形で生きている無傷植物上のそれらのターゲットに結合することができるはずだけでなく（この場合、物理化学的特性は生理学的条件から実質的に外れる）、抗体はまた、植物に対して担体を保持するのに十分な強さで結合できるはずである。先に記載した植物結合抗体はどれも、これらの２つの重要な特性のいずれについても論証していなかった。
【０００７】
ラクダ科動物重鎖抗体（ＶＨＨ）の可変ドメインは、小型の１５ｋＤａ単鎖タンパク質として特に興味が持たれるタイプの抗体フラグメントであり、それらのターゲットに対する高アフィニティーを示すことから、選択することができる。また小型の単鎖分子としてのそれらの性質によって、ＶＨＨは製造するのが簡単で、従来の抗体を上回る安定特性を有する。しかし、これまでのところ、植物に結合するＶＨＨは記載されていない。さらに、共有結合で固体樹脂粒子に連結されているＶＨＨが、溶液から抗原を捕らえることができるという意味での機能性を維持することが明らかになっているが（ＷＯ０１４４３０１）、ＶＨＨのそのターゲットに対するアフィニティーが固体植物表面に対して担体を保持するのに十分であることは明らかにはなってはおらず、予想することもできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６１８０１４１号明細書
【特許文献２】国際公開第２００５／１０２０４５号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／０２８０９８１号明細書
【特許文献４】米国特許第５７３８９８４号明細書
【特許文献５】米国特許第６１２４１１７号明細書
【特許文献６】国際公開第９８／００５００号
【特許文献７】国際公開第２００３／０３１４７７号
【特許文献８】国際公開第２００１／０４４３０１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐｅｎｅｌｌら、１９８９
【非特許文献２】Ｊｏｎｅｓら、１９９７
【非特許文献３】Ｗｉｌｌａｔｓら、１９９８
【非特許文献４】ＷｉｌｌａｔｓおよびＫｎｏｘ、１９９９
【非特許文献５】Ｗｉｌｌａｔｓら、２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
生きている無傷植物に特異的に強固に結合することが可能であり、植物に対して農薬または前記農薬を含有する担体を保持することが可能である結合ドメインを利用して、農薬が、生きている無傷植物上のその作用部位上または付近に送達または堆積される、農薬の特異的送達方法については、依然として未だ対処されていないニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、結合ドメイン、より詳しくは４つのフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＫａｂａｔによるＦＲおよびＣＤＲの定義）を含むアミノ酸配列を含んでなる結合ドメインを単離した。それにより、前記結合ドメインは生きている無傷植物上の結合部位に結合することが可能であり、驚いたことに、その際、前記植物に対して農薬または農薬含有担体を保持することが可能である。好ましくは、前記結合ドメインは、変動し得る温度、ｐＨ、塩濃度、水のアベイラビリティまたは湿度などの厳しい条件下で、安定性を維持し、これらの結合能力を保持する。より好ましくは、前記結合ドメインは、農薬製剤の形で安定性を維持し、これらの結合能力を保持する。４つのＦＲおよび３つのＣＤＲを、好ましくはＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順で含む結合ドメインは当業者に公知であり、Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉら（２００９）の限定されない実施例として記載されている。好ましくは、前記結合ドメインはラクダ科動物抗体に由来し、好ましくは軽鎖を有していない重鎖ラクダ科動物抗体に由来し、例えば重鎖ラクダ科動物抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）である。これらの結合ドメインを含むターゲティング剤は、植物または植物部位上の結合部位に農薬を特異的に保持することが可能であり、植物に（好ましくは生きている無傷植物に）農薬を送達および保持し、それにより、こうしたターゲティング剤に含まれている結合ドメインが植物上の結合部位に特異的に結合し、そこで農薬がそれらの活性を及ぼすことができるように使用することができる。少なくとも１つのターゲティング剤および好ましくは担体上に結合しているまたは担体中に含まれている農薬を含む農薬組成物は、その全体的な効果を維持しながら、こうした組成物中に含まれている、農薬の用量を低減した使用および／または農薬の施用頻度の軽減を可能にするのに適し得る。さらに、本発明による組成物に含まれている場合、農薬はより長期間にわたってその活性を及ぼし、最終的には損失される農薬を少なくし、環境の汚染を軽減することができる。また、本発明による組成物で農薬を施用することによって、農薬の活性に、そうでなければ存在しない特異性を導入することができる。
【００１２】
本発明の第１態様は、生きている無傷植物上の少なくとも１つの結合部位に結合することが可能である結合ドメインである。
【００１３】
本明細書で「生きている無傷植物」とは、成長する植物、土壌中、水中または人工基質中で成長する植物か、圃場で、温室で、畑で、庭で、鉢でまたは水耕栽培系で成長する植物を意味する。生きている無傷植物は、好ましくは、自然界におけるこうした植物に通常存在するすべての植物部位（根、茎、枝、葉、針、棘、花、種子…）を含むが、一部の植物部位（例えば花）は、植物のライフサイクルの一定期間中は存在しないこともある。生きている無傷植物は、植物から取り除かれた植物部位、例えば、植物からカットおよび分離された葉および花などは除外する。しかし、生きている無傷植物が、天候（例えば、限定するものではないが風、雨もしくは雹）による損傷、動物（植物の上で餌を食べる動物もしくは植物を踏みつける動物）による損傷、植物害虫（例えば、限定するものではないが昆虫、線虫および真菌）による損傷、または農作業（例えば、限定するものではないが剪定、果実の収穫もしくは花の採取）が原因の損傷といった、日常の自然的な現象によって損傷した植物を包含することは明白であるはずである。植物としては、裸子植物および被子植物、単子葉植物および双子葉植物、樹木、果樹、圃場作物および野菜作物および観賞用の種が挙げられる。限定されない例として、前記植物は、スギ、イトヒバ、モミ、セイヨウバクシン、カラマツ、マツ、アメリカスギ、トウヒ、イチイ、イチョウ、アブラヤシ、ゴムノキ、カシ、ブナ、トウモロコシ、ワタ、ダイズ、コムギ、イネ、オオムギ、ライムギ、モロコシ、キビ、ナタネ、マメ、エンドウ、ピーナッツ、ヒマワリ、ジャガイモ、トマト、サトウキビ、テンサイ、キャッサバ、タバコ、バナナ、リンゴ、オレンジ、レモン、オリーブ、パイナップル、アボカド、ブドウ、レタス、キャベツ、ニンジン、ナス、ピーマン、メロン、バラ、ユリ、キク、イネ科植物様の雑草、または葉の広い雑草であってもよい。
【００１４】
本明細書において「結合部位」とは、分子構造または化合物、例えば、タンパク質、（ポリ）ペプチド、（ポリ）サッカライド、糖タンパク質、リポタンパク質、脂肪酸、脂質もしくは核酸またはこうした分子構造もしくは化合物中の特定の領域またはこうした分子構造もしくは化合物の特定の構造、またはこうした分子構造もしくは化合物の組み合わせもしくは複合体を意味する。好ましくは、前記結合部位は少なくとも１つの抗原を含む。本明細書において「抗原」とは、動物において免疫応答を誘発することができる分子を意味する。好ましくは、前記結合部位は、毛状体、気孔、皮目、棘、針、根毛、クチクラまたはロウ層などの植物構造に含まれる。さらにより好ましくは、前記結合部位は、毛状体、気孔またはクチクラなどの植物構造に含まれる。前記結合部位は１つの特定の植物構造に特有であってもよく、または複数の植物構造中により一般的に含まれていてもよい。好ましくは、前記結合部位は、植物の特定部位、例えば、葉、茎、根、果実、球果、花、球根または塊茎などの上に存在する。さらにより好ましくは、前記結合部位は植物のこうした特定部位の表面に存在するが、このことは、結合部位が、例えば、葉表面、茎表面、根表面、果実表面、球果表面、花表面、球根表面または塊茎表面に存在することを意味する。前記結合部位は１つの特定の植物部位に特有であってもよく、または複数の植物部位により一般的に存在していてもよい。
【００１５】
本明細書において「結合ドメイン」とは、特異的分子間相互作用を使用してターゲット分子に結合することが可能であるタンパク性（タンパク質、タンパク質様またはタンパク質含有）分子の全部または一部を意味する。結合ドメインは天然分子（例えば、フィブロネクチン）であってもよく、天然分子に由来（例えば、自然免疫系もしくは適応免疫系の成分に由来）していてもよく、または完全に人工的に設計されていてもよい。結合ドメインは免疫グロブリンに基づいていてもよく、またはタンパク質中に存在するドメイン（限定するものではないが、微生物タンパク質、プロテアーゼ阻害剤、毒素、フィブロネクチン、リポカリン、単鎖逆平行多段コイルタンパク質もしくは反復モチーフタンパク質を包含する）に基づいていてもよい。こうした結合ドメインの限定されない例としては、炭水化物結合ドメイン（ＣＢＤ）（Ｂｌａｋｅら、２００６）、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら、１９９４）、ラクダ科動物重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、新規抗原レセプターの可変ドメイン（ＶＮＡＲ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）（Ｎｙｇｒｅｎら、２００８）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ）（ＷＯ２０１００６６７４０）、設計したアンキリン反復ドメイン（ＤＡＲＰｉｎｓ）（Ｓｔｕｍｐｐら、２００８）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）（Ｓｋｅｒｒａら、２００８）、ノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎｓ）（Ｋｏｌｍａｒら、２００８）および設計したＣＨ２ドメイン（ｎａｎｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｄｉｍｉｔｒｏｖ、２００９）がある。好ましくは、前記結合ドメインは単一ポリペプチド鎖からなり、翻訳後に改変されない。より好ましくは、前記結合ドメインはＣＢＤではない。さらにより好ましくは、前記結合ドメインは自然免疫系または適応免疫系に由来し、好ましくは自然免疫系または適応免疫系のタンパク質に由来する。一層より好ましくは、前記結合ドメインは免疫グロブリンに由来する。最も好ましくは、前記結合ドメインは４つのフレームワーク領域および３つの相補性決定領域またはそれらの任意の適切なフラグメント（これは次いで少なくとも１つの相補性決定領域を形成する少なくともいくつかのアミノ酸残基を通常含有する。）を含む。好ましくは、結合ドメインは、高収率で、好ましくは微生物の組換え発現系で産生するのが容易であり、その後に単離および／または精製するのに都合がよい。また好ましくは、結合ドメインは保存中および利用中に安定しているが、このことは、結合ドメインの保全性が保存条件下および／または利用条件下（昇温、凍結融解サイクル、ｐＨまたはイオン強度における変化、ＵＶ照射、有害化学物質の存在などを挙げることができる。）で維持されることを意味する。より好ましくは、前記結合ドメインは農薬製剤の形で安定している。本明細書における「農薬製剤」は、農薬使用のための組成物を意味し、さらなる定義として、少なくとも１つの活性物質を、最適な分散化、微粒化、堆積、葉湿潤、分散、保持および／または農薬の取り込みを促進する１つまたは複数の添加剤と一緒に場合により含む組成物である。こうした添加剤の限定されない例としては、希釈剤、溶媒、アジュバント、界面活性剤、湿潤剤、展着剤、油、固着剤、増粘剤、浸透剤、緩衝剤、酸性化剤、沈降防止剤、不凍剤、フォトプロテクター、消泡剤、殺生物剤および／または流動調節剤である。最も好ましくは、前記結合ドメインは、２年間周囲温度で保存した場合または２週間５４℃で保存した場合に農薬製剤の形で安定性を維持する。好ましくは、前記結合ドメインは、ＤＡＲＰｉｎｓ、ノッチン、アルファボディおよびＶＨＨからなる群から選択される。より好ましくは、前記結合ドメインはアルファボディおよびＶＨＨからなる群から選択される。最も好ましくは、前記結合ドメインはＶＨＨである。
【００１６】
結合部位または結合部位に含まれている抗原への結合ドメインの結合は高アフィニティーで生じる。解離定数が、結合ドメインとそのターゲット分子の間のアフィニティーの説明に一般に用いられる。好ましくは、結合ドメインと結合部位に含まれているターゲット分子の間の結合の解離定数は１０−５Ｍ未満であり、より好ましくは解離定数は１０−６Ｍ未満であり、さらにより好ましくは解離定数は１０−７Ｍ未満であり、最も好ましくは解離定数は１０−８Ｍ未満である。好ましくは、結合ドメインの結合部位への結合は特異的であるが、このことは、ターゲット分子が結合部位に存在する場合にのみ結合ドメインが結合部位に結合すること、およびターゲット分子が存在しない結合部位に結合ドメインは結合しないまたはかなり低いアフィニティーで結合することを意味する。結合ドメインの結合特異性は、実施例２に記載しているように、ＥＬＩＳＡなどの方法により分析することができる。前記方法では、結合ドメインのそのターゲット分子への結合が結合ドメインの無関係分子への結合と比較され、また結合ドメインの反応容器への非特異的固着と比較される。また特異性は、結合ドメインのそのターゲット分子に対するアフィニティー対無関係分子に対するアフィニティーの差として表すことができる。好ましくは、結合ドメインのそのターゲット分子に対するアフィニティーと無関連分子に対するそのアフィニティーの比は１０より大きく、さらに好ましくは前記比は２０より大きく、最も好ましくは前記比は１００よりも大きい。結合ドメインの結合は１つの特定の植物構造に特異的であってもよいが、このことは、こうした植物構造に含まれている結合部位が別の植物構造に存在しないこと、または非常に低い頻度で存在することを意味する。または、結合部位が複数の植物構造に存在する場合、複数の植物構造への結合がより一般的であり得る。結合ドメインの結合は１つの特定の植物部位に特異的であってもよいが、このことは、こうした植物部位中または植物部位上に存在する結合部位、場合によってはこうした植物部位の植物構造に含まれている結合部位が、別の植物部位に存在しないこと、または非常に低い頻度で存在することを意味する。または、結合部位が複数の植物部位に存在する場合、複数の植物部位への結合がより一般的であり得る。結合ドメインの結合は１つの特定の植物種に特異的であってもよいが、このことは、こうした植物種中または植物種上に存在する結合部位が別の植物種に存在しないこと、または非常に低い頻度で存在することを意味する。または、結合部位が複数の植物種に存在する場合、複数の植物種への結合がより一般的であり得る。結合ドメインの結合は１つの特定の植物属に特異的であってもよいが、このことは、こうした植物属中または植物属上に存在する結合部位が別の植物属に存在しないこと、または非常に低い頻度で存在することを意味する。または、結合部位が複数の植物属に存在する場合、複数の植物属への結合がより一般的であり得る。結合ドメインの結合は植物の１つの特定の成長段階に特異的であってもよいが、このことは、特定の成長段階にあるこうした植物中または植物上に存在する結合部位が別の成長段階にある植物に存在しないこと、または非常に低い頻度で存在することを意味する。または、結合部位が複数の植物成長段階に存在する場合、複数の植物成長段階への結合がより一般的であり得る。結合ドメインの結合特異性に関する全てのタイプは、下記に説明するように、それらの特定の使用を有していてもよい。
【００１７】
好ましくは、結合ドメインの結合部位への結合は、過酷条件下（例えば、低温または高温、低ｐＨまたは高ｐＨ、低イオン強度または高イオン強度、ＵＶ照射、水の低アベイラビリティ、変性化学物質の存在など）においても依然として機能性である。好ましい一実施形態においては、前記の過酷条件は４から９のｐＨ領域、より好ましくは３から１０のｐＨ領域、さらにより好ましくは２から１０のｐＨ領域、最も好ましくは１から１１のｐＨ領域により定義される。別の好ましい実施形態においては、前記の過酷条件は、４−５０℃の温度範囲、より好ましくは０−５５℃の温度範囲、さらにより好ましくは０−６０℃の温度範囲により定義される。別の好ましい実施形態においては、前記の過酷条件は、上記で定義したような農薬製剤の存在により定義される。
【００１８】
好ましくは、結合ドメインの結合部位への結合は、担体を前記結合部位に結合する、より好ましくは保持するのに十分に強固であり、担体のサイズおよび結合ドメインのアフィニティーに応じて、１つまたは複数の結合ドメインは１つまたは複数の結合部位に結合し、（１つまたは複数の）結合部位に対する結合ドメインの生じたアビディティーが担体の植物に対する強固な結合、好ましくは担体の植物に対する強固な保持を保証するように協力することが可能である。本明細書において「担体」とは、活性物質が担体中にまたは担体上に（担体に）適切に組み込まれ、包含され、固定化され、吸着され、吸収され、結合され、カプセル化され、包埋され、付着されまたは含まれることが可能な任意の固体担体、半固体担体または液体担体を意味する。こうした担体の限定されない例としては、ナノカプセル、マイクロカプセル、ナノスフェア、ミクロスフェア、ナノ粒子、微粒子、リポソーム、ベシクル、ビーズ、ゲル、弱イオン性樹脂粒子、リポソーム、渦巻状の送達ビヒクル、小顆粒、粒剤、ナノチューブ、バッキーボール、油中水滴型エマルションの一部である水滴、水中油滴型エマルションの一部である油滴、コルク、木材または他の植物由来物質などの有機物質（例えば、種子殻、木材チップ、パルプ、球体、ビーズ、シートまたは他の適切な形態のもの）、紙または厚紙、無機物質、例えばタルク、クレイ、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナ、シリケートおよびゼオライト、またはさらには微生物細胞（例えば酵母細胞）または（本明細書にさらに記載されているような）適切なそれらの画分または断片が挙げられる。本明細書において「保持する」とは、その結合部位もしくはそれらの結合部位に対する１つの単一結合ドメインもしくは２つ以上の結合ドメインの組み合わせのアフィニティーまたはアビディティーによって生じる結合力が、担体の重力、もしあれば噴霧した農薬溶液の流動または雫によって発生した力およびタルク、ならびにもしあれば１つまたは複数の外部要因によって生じた剪断力から課せられた力およびタルクにより強いられた組み合わさった力およびタルクよりも大きいことを意味する。好ましい実施形態においては、前記外部要因は雨、潅水、雪、雹または風である。非特異的結合に対する特異的結合による担体結合の特別な利点の１つは、特異的結合が担体に付加された外部剪断力に対して耐性が高いという点である（Ｃｏｚｅｎｓ−Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９０）。
【００１９】
好ましくは、本発明による結合ドメインは、生きている無傷植物の１つもしくは複数の特定部位中もしくは上に存在する、結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する。好ましくは、生きている無傷植物の前記部位は、葉、茎、根、果実、球果、花、球根または塊茎からなる群から選択される。さらに好ましくは、生きている無傷植物の前記部位は葉、茎または根からなる群から選択される。好ましくは、本発明による結合ドメインは、生きている無傷植物の表面上の結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する。本明細書において「表面」とは、生きている無傷植物上に、または生きている無傷植物の１つまたは複数の部位（しかし、組織学的な植物調製物は除く。）上に生じる全ての表面であってよい。好ましくは、生きている無傷植物の前記表面は、葉表面、茎表面、根表面、果実表面、球果表面、花表面、球根表面または塊茎表面からなる群から選択される、生きている無傷植物の部位の表面である。さらにより好ましくは、生きている無傷植物の前記表面は、根表面、茎表面および葉表面からなる群から選択される、生きている無傷植物の部位の表面である。
【００２０】
好ましくは、本発明による結合ドメインは、生きている無傷植物の特定構造中もしくは構造上のまたは生きている無傷植物の特定部位の特定構造中もしくは構造上の、さらに好ましくは、植物内への栄養素、農薬もしくは他の化学物質の輸送に関与しているもしくは関与に影響をしている、および／または植物防御に関与しているもしくは関与に影響している特定構造中または構造上の結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する。好ましくは、前記の特定構造は、毛状体、気孔、皮目、棘、針、根毛、クチクラおよびロウ層からなる群から選択され、さらにより好ましくは、前記の特定構造は毛状体、気孔およびクチクラからなる群から選択される。好ましい一実施形態においては、前記結合ドメインは、植物毛状体中または上の結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合している。植物毛状体は当業者に公知であり、限定されるものではないが、腺毛および葉毛が挙げられる。植物毛状体は植物防御において活性であるが（Ｌａｉら、２０００）、特に非腺毛も感染に対するターゲット候補として言及されている（Ｃａｌｏら、２００６）。腺毛を包含する毛状体はまた、植物クチクラを通過して極性化合物を植物内に輸送することに関係している（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、２００５）。このことから、自然防御を増強することまたは攻撃部位に農薬を集中させることまたは（極性）農薬を植物内に改善送達することによる農薬送達にとって、毛状体が理想的なターゲットとなる。別の好ましい実施形態においては、前記結合ドメインは、気孔中または気孔上の結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する。気孔は、ＣＯ２を植物内へ拡散させ、水分損失を最小限にさせるために不可欠である。気孔はまた、病原菌、特に微生物にとって主たる侵入部位として利用されている（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄら、２００７）。本明細書において「微生物」とは、細菌、ウイルス、真菌類などを意味する。さらに、気孔は、特異的シグナル経路を介して植物防御に直接関与し、微生物感染時に植物に気孔を閉じさせる（Ｍｅｌｏｔｔｏら、２００６）。さらに別の好ましい実施形態においては、前記結合ドメインは、根毛中または根毛上の結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する。根毛は植物への微生物付着および植物のコロニー形成にとって重要であることが知られており（Ｇａｇｅ、２００４；Ｌａｕｓら、２００５）、したがって農薬送達の重要なターゲットである。別の好ましい実施形態においては、前記結合ドメインは、植物クチクラ中またはクチクラ上の結合部位またはこうした結合部位に含まれる抗原に結合する。植物クチクラは植物への微生物付着および植物のコロニー形成にとって重要であること、さらに植物内への親油性農薬の送達および堆積に重要な役割を果たすこと（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、２００５）が知られており、したがって農薬の送達および堆積の重要なターゲットである。
【００２１】
好ましい一実施形態においては、本発明による結合ドメインは、アラビアゴムに結合する。別の好ましい実施形態においては、前記結合ドメインは、レクチン、レクチン様ドメイン、エクステンシンまたはエクステンシン様ドメインに結合し、より好ましくは、前記結合ドメインはジャガイモレクチンに結合する。好ましくは、前記結合ドメインは、４つのフレームワーク領域および３つの相補性決定領域またはそれらの任意の適切なフラグメント（これは次いで少なくとも１つの相補性決定領域を形成する少なくともいくつかのアミノ酸残基を通常含有する。）を含む。より好ましくは、前記結合ドメインは重鎖ラクダ科動物抗体に由来しており、さらにより好ましくは、前記結合ドメインはＶＨＨ配列を含む。重鎖ラクダ科動物抗体およびＶＨＨ誘導配列は当業者に公知である。ラクダ科動物抗体は、数ある中でＷＯ９４０４６７８およびＷＯ２００７１１８６７０（これらは参照により本明細書に組み込む。）に記載されている。さらに一層より好ましくは、前記ＶＨＨは２つのジスルフィド架橋を含む。大部分のＶＨＨ分子は１つのジスルフィド架橋のみを有する。さらなるジスルフィド架橋が存在すると、抗体ドメインに余剰の安定性が付与されるが、これは過酷条件下で安定性が求められる結合ドメインにとって有利な特性である。最も好ましくは、前記ＶＨＨは、配列番号１−配列番号４２（３Ａ２、３Ｂ４、３Ｂ７、３Ｄ１０、３Ｄ２、３Ｄ８、３Ｅ６、３Ｆ５、３Ｆ７、３Ｆ９、３Ｇ２、３Ｇ４、３Ｈ１０、３Ｈ８、４Ａ１、５Ｂ５、５Ｂ６、５Ｃ４、５Ｃ５、５Ｄ４、５Ｅ５、５Ｆ５、５Ｇ２、５Ｇ５、５Ｈ５、７Ａ２、７Ｃ２、７Ｄ２、７Ｅ１＿１、７Ｆ１、８Ｂ１０、８Ｂ１２、９Ａ１、９Ｂ５、９Ｃ４、９Ｄ５、９Ｅ１、９Ｅ４、９Ｆ４、９Ｈ１、９Ｈ２および１２Ｈ４）からなる群から選択される配列、またはそれらの任意の適切なフラグメント（これは次いで少なくとも１つの相補性決定領域を形成する少なくともいくつかのアミノ酸残基を通常含有する。）またはそれらの相同体を含み、好ましくはそれらからなる。本明細書における相同体とは、ＢＬＡＳＴｐアラインメントで測定した場合に、それぞれのまたは任意のフレームワーク領域およびそれぞれのまたは任意の相補性決定領域が、参照配列中の対応領域と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、より好ましくは９０％の同一性、さらにより好ましくは９５％の同一性を示す配列である（すなわち、ＦＲ１＿相同配列対ＦＲ１＿参照配列、ＣＤＲ１＿相同配列対ＣＤＲ１＿参照配列、ＦＲ２＿相同配列対ＦＲ２＿参照配列、ＣＤＲ２＿相同配列対ＣＤＲ２＿参照配列、ＦＲ３＿相同配列対ＦＲ３＿参照配列、ＣＤＲ３＿相同配列対ＣＤＲ３＿参照配列およびＦＲ４＿相同配列対ＦＲ４＿参照配列）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７；ＫａｂａｔによるＦＲおよびＣＤＲの定義）。
【００２２】
本発明の第２の態様は、植物および／または植物部位に対して農薬を保持することが可能であるターゲティング剤である。
【００２３】
本明細書において「ターゲティング剤」とは、少なくとも１つの結合ドメインを含む、好ましくはポリペプチド骨格を有する分子構造である。その最もシンプルな形のターゲティング剤は、ただ１つの単一結合ドメインからなる。しかし、ターゲティング剤は、さらに定義されているように、複数の結合ドメインを含むことが可能であり、１価であっても多価であってもよく、単一特異的または多重特異的であってもよい。１つの単一結合ドメインまたは多重結合ドメインとは別に、ターゲティング剤は、結合ドメインに化学的にカップリングされ得る、またはＮ末端もしくはＣ末端にまたはさらには内部に融合され得る他の成分をさらに含むことができる。前記の他の成分としては、限定されないが、標識化アミノ酸（例えば、蛍光性標識化もしくは放射能標識化）または検出可能なアミノ酸（例えば、抗体により検出可能）を包含する１つまたは複数のアミノ酸、１つまたは複数の単糖類、１つまたは複数の少糖類、１つまたは複数の多糖類、１つまたは複数の脂質、１つまたは複数の脂肪酸、１つまたは複数の小分子、または前述の任意の組み合わせが挙げられる。好ましい一実施形態において、前記の他の成分は、前記ターゲティング剤でスペーサーまたはリンカーとして機能する。
【００２４】
本明細書において「農薬」とは、農薬産業（農業、園芸、花卉園芸および家庭用およびガーデン用を包含する）で使用することが可能であるが、また非作物関連の使用を目的とした製品、例えば有害昆虫および有害げっ歯類を防除するための公衆衛生／害虫防除作業者の使用、家庭での使用、例えば植物または植物部位、作物、球根、塊茎、果実を（例えば有害な生物、病気または害虫から）保護するため；植物の成長を調節する、好ましくは促進または増強するため；および／または収穫される植物、作物または植物部位（例えばその果実、花、種子など）の収量を高めるための家庭用殺菌剤および殺虫剤および薬剤でも使用可能である、すべての活性物質または活性成分を意味する。こうした物質の例は当業者には明らかであり、例えば、殺虫剤（例えば、家庭使用の殺虫剤を含む接触性殺虫剤または浸透性殺虫剤）、除草剤（例えば、家庭使用の除草剤を含む接触性除草剤または浸透性除草剤）、殺菌剤（例えば、家庭使用の殺菌剤を含む接触性殺菌剤または浸透性殺菌剤）、殺線虫剤（例えば、家庭使用の殺線虫剤を含む接触性殺線虫剤または浸透性殺線虫剤）および他の農薬または殺生物剤（例えば、殺昆虫剤または殺カタツムリ剤）として活性のある化合物；ならびに肥料；植物ホルモンなどの成長調節剤；微量栄養素、毒性緩和剤、フェロモン；忌避剤；昆虫餌；および／または調節するため（すなわち、増加、減少、阻害、増強および／または誘発）に使用される活性成分、ターゲット植物（例えば保護しようとする植物または防除しようとする植物）中のまたはターゲット植物による遺伝子発現（および／または他の生物学的もしくは生化学的方法）、例えば核酸（例えば、ＲＮＡｉ技術の文献において使用されるような、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ）およびこの目的においてそれ自体は公知である他の因子、タンパク質、化学物質などを挙げることができる。こうした農薬の例は当業者には明らかである。例えば、限定されるものではないが、グリホサート、パラコート、メトラクロール、アセトクロール、メソトリオン、２，４−Ｄ，アトラジン、グルホシネート、スルホサート、フェノキサプロップ、ペンジメタリン、ピクロラム、トリフルラリン、ブロモキシニル、クロジナホップ、フルロキシピル、ニコスルフロン、ベンスルフロン、イマゼタピル、ジカンバ、イミダクロプリド、チアメトキサム、フィプロニル、クロルピリホス、デルタメトリン、ラムダ−シハロトリン、エンドスルファン、メタアミドフォス、カルボフラン、クロチアニジン、シペルメトリン、アバメクチン、ジフルフェニカン、スピノサド、インドキサカルブ、ビフェントリン、テフルトリン、アゾキシストロビン、チアメトキサム、テブコナゾール、マンコゼブ、シアゾファミド、フルアジナム、ピラクロストロビン、エポキシコナゾール、クロロタロニル、銅殺菌剤、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、ジフェノコナゾール、カルベンダジム、プロピコナゾール、チオファナート、硫黄、ボスカリドおよび他の公知の農薬またはそれらの任意の適切な組み合わせが挙げられる。他の適切な農薬は本明細書の開示に基づいて当業者には明らかであり、例えば市販の農薬であってもよく、例えば、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＭｃＤｏｕｇａｌｌ、  ＡｇｒｉＳｅｒｖｉｃｅ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００７  Ｖ４．０、  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  −  ２００６  Ｍａｒｋｅｔ，  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｉｎｄｅｘ  ｐｐ．  １０−２０に記載されているそれぞれの化合物が挙げられる。前記農薬は、様々な形態で得ることができる。例えば、限定されるものではないが、結晶として、微結晶として、ナノ結晶として、共結晶として、散剤として、粒剤として、粉剤として、錠剤として、ゲル剤として、可溶性濃縮物として、エマルションとして、乳剤として、懸濁液として、懸濁液濃縮物として、サスポエマルションとして、分散剤として、分散剤濃縮物として、マイクロカプセル懸濁液として、または当業者には明らかな農薬製剤の他の形態またはタイプが挙げられる。農薬は、直ぐに使用可能な活性物質または活性成分を含むだけでなく、外部因子により活性化され得る不活性形態の前駆体も含まれる。限定されない例として、前駆体は、虫害時の植物創傷によって生じるｐＨ変化により、真菌の攻撃によって生じる酵素作用により、または温度変化もしくは湿度変化により活性化することができる。
【００２５】
本明細書において「植物部位」とは、生きている無傷植物の部位かどうか生きている無傷植物から単離もしくは分離されたかどうかにかかわらずすべての植物部位を意味し、死んでいる植物原料でさえもみなすことができる。好ましくは、前記植物部位は、葉、茎、根、果実、球果、花、球根および塊茎からなる群から選択される。より好ましくは、前記植物部位は、葉、茎および根からなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記植物は生きている無傷植物であり、および／または前記植物部位は生きている無傷植物の植物部位である。
【００２６】
植物または植物部位に対して農薬を保持することが可能であるために、１つの単一ターゲティング剤または複数のターゲティング剤を、共有結合によって、水素結合によって、双極子相互作用によって、弱ファン−デル−ワールス力によってまたは前述の任意の組み合わせによって、農薬と融合させるまたは農薬に付着させる。本明細書において「付着させる」とは、カップリングさせること、接続させること、固定させること、混合させることまたは被覆することを意味する。
【００２７】
好ましい一実施形態においては、前記農薬は、上記で定義されているように担体上に結合されているまたは担体中に含まれており、それによりターゲティング剤が担体または農薬のいずれかにカップリングされている。好ましくは、結合ドメインは担体にカップリングされている。本明細書において「カップリングされている」とは、農薬または農薬を含有する担体をターゲティング剤により保持することが可能である任意のカップリングであり得る。結合は共有結合および非共有結合であってもよい。好ましくは、前記カップリングは共有結合である。結合ドメインおよび／またはターゲティング剤が担体の外表面に存在する任意のタイプの官能基にどのようにカップリングすることができるかについては、当業者には明らかである。本明細書において「官能基」とは、タンパク質が共有結合で結合することができるすべての化学基を意味し、例えば、限定されるものではないが、カルボキシル基、アミン基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基またはアルキン基が挙げられる。限定されない例として、担体の外表面上のカルボキシル基と結合ドメインおよび／またはターゲティング剤のアミン基との間のカルボジイミド結合の形成によるカップリングを適用することができる。結合ドメインおよび／またはターゲティング剤は、連結剤の有無に関わらず、担体にカップリングすることができる。微生物細胞またはファージの場合、本発明によるターゲティング剤は、微生物細胞またはファージゲノムによりコード化されていてもよいが、一方、農薬は、融合タンパク質としてまたは化学的連結により、微生物細胞またはファージ中に含有されるまたは微生物細胞もしくはファージにカップリングされている。本明細書において「連結剤」とは、当業者に公知のすべての連結剤であってもよく、好ましくは、連結剤は、担体に結合されているターゲティング剤の可撓性を高めて、ターゲティング剤に含まれている結合ドメインを植物上の結合部位へ結合するのを促進する。こうした連結剤の例は、ＷＯ００２４８８４およびＷＯ０１４０３１０で確認することができる。
【００２８】
好ましくは、前記担体は微小担体である。本明細書において「微小担体」は、粒子の直径が５００μｍ未満、好ましくは２５０μｍ未満、さらにより好ましくは１００μｍ未満、最も好ましくは５０μｍ未満である微粒子担体である。農薬送達用の微小担体は当業者に公知であり、例えば、限定するものではないが、ナノカプセル、マイクロカプセル、ナノスフェア、ミクロスフェア、弱イオン性樹脂粒子、ポリマー粒子、複合ゲル粒子、人工的に木質化したセルロースから製造された粒子、リポソーム、ベシクルおよび渦巻状送達ビヒクルが挙げられる。また、１つもしくは複数の農薬が微生物細胞（例えば酵母細胞）もしくはファージの上もしくは内部に存在することが可能であり（例えば、１つもしくは複数の農薬は、こうした細胞内に（もしくは細胞に）装填することができる、または前記微生物細胞中に産生／発現された生物製剤であるため）、または１種もしくは複数の農薬が細胞断片（例えば細胞壁もしくは細胞膜の断片）、細胞画分もしくは他の細胞残屑（例えば、１種もしくは複数の農薬がその内部へ（またはそれに）装填、産生または発現された微生物細胞の分画もしくは溶融により得られたもの）と結びついている（例えば、それに結合しているまたはその中に包埋されている）ことが可能であり、したがって、前記微生物細胞またはファージが微小担体として使用されることが可能である。本明細書においては、微小担体、微粒子、ミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、ナノカプセルおよびナノスフェアは同義で使用することができる。こうした微小担体は、数ある中でＵＳ６１８０１４１、ＷＯ２００４００４４５３、ＷＯ２００５１０２０４５およびＵＳ７４９４５２６（これらは参照により本明細書に組み込む）に既に記載されている。好ましくは、前記微小担体は天然ポリマーからなる微粒子である。微小担体の特性は、農薬の持続放出、農薬の遅延放出、または農薬の即時放出を可能とするようなものであってよく、微小担体のすべてのタイプはそれらの特定の使用を有する。微小担体は共有結合に好適な架橋可能な残基を自然的に含んでいてもよく、または微小担体は当技術分野で公知の方法に適した架橋可能な基を導入するために誘導体化することができる。こうした誘導体化は、微小担体の製造前に、すなわち、前記製造法で使用される原料のレベルで行うことができる、または微小担体の製造法中に行うことができる、または微小担体の製造後に行うことができる。特定の一実施形態においては、微小担体上の官能基は、上記で定義したようなターゲティング剤にその順番で結合される、連結剤またはスペーサーに結合されていてもよい。
【００２９】
別の好ましい実施形態においては、ターゲティング剤に含まれている１つまたは複数の結合ドメインは、植物（好ましくは生きている無傷植物）の１つまたは複数の特定部位中または上に存在する、結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する。好ましくは、植物の（さらに好ましくは生きている無傷植物の）前記部位は、葉、茎、根、果実、球果、花、球根または塊茎からなる群から選択される。さらに好ましくは、植物の（好ましくは生きている無傷植物の）前記部位は、葉、茎または根からなる群から選択される。さらに好ましくは、ターゲティング剤に含まれている１つまたは複数の結合ドメインは、植物（好ましくは生きている無傷植物）の表面の結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する。好ましくは、植物（好ましくは生きている無傷植物）の前記表面は、葉表面、茎表面、根表面、果実表面、球果表面、花表面、球根表面または塊茎表面からなる群から選択される、植物（好ましくは生きている無傷植物）の部位の表面である。さらにより好ましくは、植物（好ましくは生きている無傷植物）の前記表面は、根表面、茎表面および葉表面からなる群から選択される植物（好ましくは生きている無傷植物）の部位の表面である。
【００３０】
別の好ましい実施形態においては、ターゲティング剤に含まれている１つまたは複数の結合ドメインは、植物、好ましくは生きている無傷植物の特定構造中もしくは特定構造上または植物、好ましくは生きている無傷植物の特定部位の特定構造中もしくは特定構造上の、さらに好ましくは植物内への栄養素、農薬もしくは他の化学物質の輸送に関与しているもしくは関与することに影響している特定構造中もしくは特定構造上の、および／または植物防御に関与しているもしくは関与することに影響している特定構造中もしくは特定構造上の結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する。好ましくは、前記特定構造は、毛状体、気孔、皮目、棘、針、根毛、クチクラおよびロウ層からなる群から選択され、さらにより好ましくは、前記特定構造は、毛状体、気孔およびクチクラからなる群から選択される。好ましい一実施形態においては、ターゲティング剤に含まれている前記の１つまたは複数の結合ドメインは、植物毛状体中または毛状体上の結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する。別の好ましい実施形態においては、ターゲティング剤に含まれている前記の１つまたは複数の結合ドメインは、気孔中または気孔上の結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する。さらに別の好ましい実施形態においては、ターゲティング剤に含まれている前記の１つまたは複数の結合ドメインは、植物クチクラ中またはクチクラ上の結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する。
【００３１】
また別の好ましい実施形態においては、本発明によるおよびターゲティング剤に含まれている１つまたは複数の結合ドメインは、アラビアゴムに結合する。別の好ましい実施形態においては、ターゲティング剤に含まれている１つまたは複数の前記結合ドメインは、レクチン、レクチン様ドメイン、エクステンシンまたはエクステンシン様ドメインに結合し、さらにより好ましくは、前記結合ドメインはジャガイモレクチンに結合する。好ましくは、ターゲティング剤に含まれている１つまたは複数の前記結合ドメインは、４つのフレームワーク領域および３つの相補性決定領域またはそれらの任意の適切なフラグメント（これは次いで少なくとも１つの相補性決定領域を形成する少なくともいくつかのアミノ酸残基を通常含有する。）を含み、より好ましくは、ターゲティング剤に含まれている１つまたは複数の前記結合ドメインは、重鎖ラクダ科動物抗体に由来し、さらにより好ましくは、ターゲティング剤に含まれている１つまたは複数の前記結合ドメインはＶＨＨ配列を含む。さらに一層より好ましくは、前記ＶＨＨは２つのジスルフィド架橋を含む。最も好ましくは、前記ＶＨＨは、配列番号１−配列番号４２（３Ａ２、３Ｂ４、３Ｂ７、３Ｄ１０、３Ｄ２、３Ｄ８、３Ｅ６、３Ｆ５、３Ｆ７、３Ｆ９、３Ｇ２、３Ｇ４、３Ｈ１０、３Ｈ８、４Ａ１、５Ｂ５、５Ｂ６、５Ｃ４、５Ｃ５、５Ｄ４、５Ｅ５、５Ｆ５、５Ｇ２、５Ｇ５、５Ｈ５、７Ａ２、７Ｃ２、７Ｄ２、７Ｅ１＿１、７Ｆ１、８Ｂ１０、８Ｂ１２、９Ａ１、９Ｂ５、９Ｃ４、９Ｄ５、９Ｅ１、９Ｅ４、９Ｆ４、９Ｈ１、９Ｈ２および１２Ｈ４）からなる群から選択される配列またはそれらの任意の適切なフラグメント（これは次いで少なくとも１つの相補性決定領域を形成する少なくともいくつかのアミノ酸残基を通常含有する。）もしくはそれらの相同体を含み、好ましくはそれらからなる。
【００３２】
本発明の第３の態様は、植物または植物部位に農薬または農薬の組み合わせを送達し保持するための、本発明によるターゲティング剤の使用である。
【００３３】
生きている無傷植物の部位か生きている無傷植物およびさらには死んでいる植物原料から単離もしくは分離されたかにかかわらず、すべての植物部位は、本発明によるターゲティング剤を使用して、農薬または農薬の組み合わせを送達し保持するためのターゲットとして見なすことができる。好ましくは、前記植物部位は、葉、茎、根、果実、球果、花、球根および塊茎からなる群から選択される。より好ましくは、前記植物部位は葉、茎および根からなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記植物は生きている無傷植物であり、および／または前記植物部位は生きている無傷植物の植物部位である。前記送達は、農薬または農薬の組み合わせの施用に適切なまたは望まれるすべての手動式方法または機械式方法を使用して行われる。例えば、限定されるものではないが、噴霧法、ブラッシング法、粉衣法、ドリッピング法、コーティング法、浸漬法、広域散布法、小滴、ミストまたはエアロゾルとしての施用法が挙げられる。限定されない例として、本発明によるターゲティング剤は、圃場栽培された作物の葉に農薬または農薬の組み合わせを送達し保持するために使用することが可能であり、ハイドロカルチャーによって繁殖させた作物の根に農薬または農薬の組み合わせを送達し保持するために使用することが可能であり、ポストハーベスト処理として収穫された植物部位（例えば果実、花または種子）に農薬または農薬の組み合わせを送達し保持するために使用することが可能であり、耕作地を準備する際に土壌中に存在する、生きている植物原料または死んでいる植物原料に農薬または農薬の組み合わせを送達し保持するために使用することが可能であり、これは無耕作の農作業との組み合わせにおいて特に有用であり、または根圏全体にわたって農薬を分散させ持続的に保持させることが達成されるよう根圏付近に置かれている基質に農薬を送達し保持するために使用することが可能である。本発明の特に有利な態様の１つは、ターゲティング剤と農薬または農薬の組み合わせの組み合わせを適切に選択することにより、様々な異なる使用に対する同様の活性物質を製剤化することができる。異なる使用とは、例えば、異なる植物種または植物部位における使用、異なる環境条件（土壌の種類、雨量および他の天候条件、またはさらなる異なる季節上の条件）に対する使用、および異なる最終使用に対して（例えば、圃場において、温室において、庭において、水耕栽培系において、場合により環境依存性の急速放出、遅延放出または持続放出の使用に対して、家庭使用に対して、害虫防除作業者による使用に対して）である。このため、農薬を送達し保持するためのターゲティング剤の使用によって、環境上認められ得る、立証済みの効果を持つ活性剤農薬物質または農薬製剤から開始し、所望のまたは意図する最終使用に適合する様々な改善された植物保護製品または薬剤または他の農薬製品を提供することができる。限定されない例として、広域スペクトル除草剤は、植物種特異的結合ドメインを含むターゲティング剤を使用して薬剤を送達することにより、植物種特異的であるものを作製することができる。一方、広域スペクトル特異性を有する結合ドメインを含むターゲティング剤を使用して同一除草剤を送達することで、その所望する作用を及ぼすのに必要とされる除草剤の量を減らすのに役立つ可能性がある。さらに、農薬の好ましくない的外れの活性（例えば、益虫に対する活性）は、ターゲット作物またはターゲット作物の特定部位に高度に特異的である結合ドメインを含むターゲティング剤を使用してその農薬を送達することにより回避することができる。
【００３４】
好ましくは、前記農薬または農薬の組み合わせは、除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺線虫剤、殺生物剤、肥料、毒性緩和剤、微量栄養素および植物成長調節化合物からなる群から選択される。
【００３５】
好ましくは、農薬または農薬の組み合わせを送達および保持する前記方法によって、前記農薬または農薬の組み合わせの植物または植物部位に対する堆積の改善がなされる。本明細書において「堆積の改善」とは、植物もしくは植物部位に結合されている農薬もしくは農薬の組み合わせの量が増加すること、および／または農薬もしくは農薬の組み合わせの分散が、いかなるターゲティング剤も使用しないで施用した同一の農薬もしくは農薬の組み合わせと比較した場合、ターゲティング剤に含まれている結合ドメインの特異性の機能に関してより等しくもしくはより集中されて植物もしくは植物部位一面に分配されることを意味する。
【００３６】
好ましい一実施形態において、前記農薬または農薬の組み合わせは、先に定義したように、担体、好ましくは微小担体上に結合しているまたは担体中に含まれている。これは、例えば、揮発性のまたは環境要因（例えば水分の存在もしくはＵＶ照射）によって速やかに分解され得る農薬または農薬の組み合わせにおいて、または農薬もしくは農薬の組み合わせの取扱者に相当な毒性危険をもたらす農薬または農薬の組み合わせにおいて、特に有利となり得る。特定の一実施形態において、担体上の官能基は、上記で定義したように、ターゲティング剤にその順番で結合されている、連結剤またはスペーサーに結合されていてもよい。
【００３７】
本発明の第４の態様は、少なくとも（ｉ）本発明による少なくとも１つの結合ドメインを含む１つのターゲティング剤および（ｉｉ）農薬または農薬の組み合わせを含んでなる組成物である。
【００３８】
前記組成物に含まれている１つまたは複数のターゲティング剤は、「単一特異的」ターゲティング剤または「多重特異的」ターゲティング剤であってもよい。「単一特異的」ターゲティング剤とは、いずれかの単一結合ドメインを含むターゲティング剤、またはそれぞれが同一結合部位にもしくは部位中に存在しまたは前記結合部位を形成する同一抗原に対して向かう、２つ以上の異なる結合ドメインを含むターゲティング剤を意味する。このため、単一特異的ターゲティング剤は、単一結合ドメインまたは多重結合ドメインのいずれかを介して単一結合部位に結合することができる。「多重特異的」ターゲティング剤とは、結合部位にもしくは結合部位中に存在しまたは前記結合部位を形成する異なる抗原に対してそれぞれ向かう、２つ以上の結合ドメインを含むターゲティング剤を意味する。このため、「二特異的」ターゲティング剤は、結合部位にもしくは結合部位中に存在しまたは前記結合部位を形成する、２つの異なる結合部位もしくは抗原に結合することが可能である。「三特異的」ターゲティング剤は、結合部位にもしくは結合部位中に存在しまたは前記結合部位を形成する、３つの異なる抗原に結合することが可能である。「多重特異的」ターゲティング剤についても同様である。また、本明細書に記載されているターゲティング剤に関して、「１価（の）」という用語は、ターゲティング剤が単一結合ドメインを含むことを表すために使用し、「２価（の）」という用語は、ターゲティング剤が合計２つの単一結合ドメインを含むことを表すために使用し、「３価（の）」という用語は、ターゲティング剤が合計３つの単一結合ドメインを含むことを表すために使用し、「多価（の）」ターゲティング剤についても同様である。したがって、一態様においては、本発明の上記組成物は２つ以上の同一でありまたは異なるターゲティング剤を含み、これにより、同一のターゲティング剤については、それぞれが同一結合部位にまたは結合部位中に存在する同一でありまたは異なる抗原に結合する、２つ以上のターゲティング剤を意味するが、異なるターゲティング剤については、少なくとも１つが同一結合部位にもしくは結合部位中にまたは異なる結合部位中に存在する異なる抗原に結合する、２つ以上のターゲティング剤を意味する。
【００３９】
好ましくは、前記組成物に含まれている１つまたは複数のターゲティング剤は、植物（好ましくは生きている無傷植物）の１つまたは複数の特定部位中または部位上に存在する、結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する、少なくとも１つの結合ドメインを含む。好ましくは、植物（より好ましくは生きている無傷植物）の前記部位は、葉、茎、根、果実、球果、花、球根または塊茎からなる群から選択される。より好ましくは、生きている無傷植物の前記部位は葉、茎または根からなる群から選択される。より好ましくは、前記組成物に含まれている１つまたは複数のターゲティング剤は、生きている無傷植物の表面の結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する、少なくとも１つの結合ドメインを含む。好ましくは、生きている無傷植物の前記表面は、葉表面、茎表面、根表面、果実表面、球果表面、花表面、球根表面または塊茎表面からなる群から選択される、生きている無傷植物の部位の表面である。さらにより好ましくは、生きている無傷植物の前記表面は、根表面、茎表面および葉表面からなる群から選択される、生きている無傷植物の部位の表面である。
【００４０】
好ましくは、前記組成物に含まれている（１つまたは複数の）ターゲティング剤は、植物（好ましくは生きている無傷植物）の特定構造中もしくは構造上の、または植物（好ましくは生きている無傷植物）の特定部位の特定構造中もしくは構造上の、より好ましくは、植物内への栄養素、農薬もしくは他の化学物質の輸送に関与しているもしくは関与することに影響を及ぼしている、および／または植物防御に関与しているもしくは関与することに影響を及ぼしている特定構造中または構造上の結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する、少なくとも１つの結合ドメインを含む。好ましくは、前記の特定構造は、毛状体、気孔、皮目、棘、針、根毛、クチクラおよびロウ層からなる群から選択され、さらにより好ましくは前記の特定構造は毛状体、気孔およびクチクラからなる群から選択される。好ましい一実施形態においては、前記組成物に含まれている（１つまたは複数の）ターゲティング剤は、植物毛状体中または毛状体上の結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する、少なくとも１つの結合ドメインを含む。別の好ましい実施形態においては、前記組成物に含まれている（１つまたは複数の）ターゲティング剤は、気孔中または気孔上の結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する、少なくとも１つの結合ドメインを含む。さらに別の好ましい実施形態においては、前記組成物に含まれている（１つまたは複数の）ターゲティング剤は、植物クチクラ中またはクチクラ上の結合部位またはこうした結合部位に含まれている抗原に結合する、少なくとも１つの結合ドメインを含む。
【００４１】
さらに別の好ましい実施形態においては、前記組成物に含まれている（１つまたは複数の）ターゲティング剤は、アラビアゴムに結合する、少なくとも１つの結合ドメインを含む。別の好ましい実施形態においては、前記組成物に含まれている（１つまたは複数の）ターゲティング剤は、レクチン、レクチン様ドメイン、エクステンシンまたはエクステンシン様ドメインに結合する、少なくとも１つの結合ドメインを含む。より好ましくは、前記結合ドメインはジャガイモレクチンに結合している。好ましくは、前記組成物に含まれている（１つまたは複数の）ターゲティング剤は、４つのフレームワーク領域および３つの相補性決定領域またはそれらの任意の適切なフラグメント（これは次いで、少なくとも１つの相補性決定領域を形成する少なくともいくつかのアミノ酸残基を通常含有する。）を含む、少なくとも１つの結合ドメインを含む。より好ましくは、ターゲティング剤に含まれている１つまたは複数の前記結合ドメインは重鎖ラクダ科動物抗体に由来し、さらにより好ましくは、ターゲティング剤に含まれている１つまたは複数の前記結合ドメインはＶＨＨ配列を含む。さらに一層より好ましくは、前記ＶＨＨは２つのジスルフィド架橋を含む。最も好ましくは、前記ＶＨＨは、好ましくは、配列番号１−配列番号４２（３Ａ２、３Ｂ４、３Ｂ７、３Ｄ１０、３Ｄ２、３Ｄ８、３Ｅ６、３Ｆ５、３Ｆ７、３Ｆ９、３Ｇ２、３Ｇ４、３Ｈ１０、３Ｈ８、４Ａ１、５Ｂ５、５Ｂ６、５Ｃ４、５Ｃ５、５Ｄ４、５Ｅ５、５Ｆ５、５Ｇ２、５Ｇ５、５Ｈ５、７Ａ２、７Ｃ２、７Ｄ２、７Ｅ１＿１、７Ｆ１、８Ｂ１０、８Ｂ１２、９Ａ１、９Ｂ５、９Ｃ４、９Ｄ５、９Ｅ１、９Ｅ４、９Ｆ４、９Ｈ１、９Ｈ２および１２Ｈ４）またはそれらの任意の適切なフラグメント（これは次いで少なくとも１つの相補性決定領域を形成する少なくともいくつかのアミノ酸残基を通常含有する。）またはそれらの相同体からなる群から選択され、好ましくはそれらからなる。
【００４２】
本発明による組成物において、前記農薬または農薬の組み合わせは、除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺線虫剤、殺生物剤、肥料、毒性緩和剤、微量栄養素または植物成長調節化合物からなる群から好ましくは選択される。
【００４３】
本発明による組成物において、農薬または農薬の組み合わせは、液体、半固体または固体形態であってもよく、例えば、エアロゾル、フロワブル粉末、水和剤、湿潤性粒剤、乳剤、懸濁液濃縮物、マイクロエマルション、カプセル懸濁液、乾燥マイクロカプセル、錠剤もしくはゲルとして維持することが可能であり、または保存もしくは植物への施用に適切な液体媒体（例えば、水もしくは別の適切な水性媒体、有機媒体もしくは油状媒体）の中に懸濁、分散、乳化もしくは導入することが可能である。場合により、組成物は、本発明による組成物での使用に好適な１つまたは複数のさらなる成分、例えば、限定されるものではないが、希釈剤、溶媒、アジュバント、界面活性剤、湿潤剤、展着剤、油、固着剤、増粘剤、浸透剤、緩衝剤、酸性化剤、沈降防止剤、不凍剤、フォトプロテクター、消泡剤、殺生物剤および／または流動調節剤などをさらに含む。
【００４４】
好ましい一実施形態においては、農薬または農薬の組み合わせは、担体上に結合しているまたは担体中に含まれる。農薬の組み合わせの場合、それぞれの個別の農薬は、個別の担体上に結合させることが可能であり、または個別の担体中に含ませることが可能である。または農薬の適切な組み合わせは、１つの担体上に一緒に結合され得るまたは１つの担体中に一緒に含まれ得る。担体使用の代わりとして、農薬または農薬の組み合わせは、適切なコーティングまたは（外部）層を施されて提供される（小型）粒子の形態で提供することもできる。ターゲティング剤は前記のコーティングもしくは（外部）層にカップリングし、もしくは結合することが可能であり、それらは粒子を安定化し、物理的保全性または安定性を改善する役目を果たし得る。別の代替案として、農薬または農薬の組み合わせは、添加剤または結合剤と適切に混合させることができる。ターゲティング剤は添加剤または結合剤にカップリングし、もしくは結合させることが可能であり、粒子を安定化し、物理的保全性または安定性を改善する役目をさらに果たし得る。こうしたコーティング粒子または複合粒子は、好ましくは、スラリー、湿潤ケーキまたはフリーフロワブル粉末、錠剤、カプセルまたは液体濃縮物（例えば、エマルション、懸濁液または分散液）の形態である。
【００４５】
好ましい一実施形態においては、本発明による組成物は農薬使用のためのものである。本明細書において「農薬使用」とは、圃場栽培作物（例えば農業）での使用に適切であるおよび／または使用を意図している上記で定義したような農薬の使用（例えば、農薬、成長調節剤、栄養素／肥料、忌避剤、枯葉剤など）を包含するだけでなく、温室栽培作物（例えば園芸／花卉園芸）または水耕栽培系での使用、および非作物使用に適切であるおよび／または使用を意図している上記で定義したような農薬の使用、例えば個人の庭での使用、家庭での使用（例えば、家庭で使用するための除草剤もしくは殺虫剤）、または害虫防除作業者による使用（例えば雑草防除など）を意味する、上記で定義したような農薬の使用（例えば、農薬、成長調節剤、栄養素／肥料、忌避剤、枯葉剤など）も包含する。
【００４６】
本明細書に記載されている教示に基づき、また例えば、送達しようとする（１つまたは複数の）農薬に基づき、（１つまたは複数の）農薬を送達しようとする植物に対する部位に基づき、および本発明の組成物（および／またはその中に含まれている農薬）の意図する農薬作用に基づき、当業者は、本発明の組成物中に存在させることができる／存在させなければならない特異的結合ドメイン／ターゲティング剤（ならびに組成物の他の成分、例えば担体、農薬および農薬形態／製剤）を適切に選択し、所望のまたは意図する農薬作用を達成することができる。よって、有利には、本明細書の開示に基づいて、所望のまたは意図する農薬の作用を達成するために、当業者が結合ドメイン／ターゲティング剤、農薬、担体、組成物のさらなる成分および組成物の農薬形態／製剤の適切な組み合わせを適切に選択することを本発明は可能にする。この点に関し、現在検討している本発明において、一部のこうした組み合わせが他よりもより効果的および／またはより好ましいことが予測されるけれども、意図した／所望の農薬作用がほぼ同程度に得られ得る多数のこうした組み合わせが恐らくあるということに留意されたい。またこれにより、当業者は、使用しようとする組み合わせを選択する場合、他の（二次）因子、例えば、保護しようとする特定作物、高有病率の圃場、土壌、天候および／または他の環境条件、組成物が好ましく施用される方法、組成物が施用される環境（圃場、温室など）、所望の持続性および／または特定の施用に関する農薬組成物の選択に影響を及ぼし得る他の要因を考慮に入れることができる。
【００４７】
例えば、限定されるものではないが、本発明の組成物が植物の１つまたは複数の特定部位に結合することを目的とする場合、ターゲティング剤（すなわち、その中に存在する１つまたは複数の結合ドメイン）は、好ましくは植物の前記部位の中／上に（すなわち十分な量で）存在する（本明細書で定義したような）１つまたは複数の結合部位に向けられる（これはまた、すなわち、植物の１つまたは複数の他の部位に比べて、植物の意図する／所望の部位に優先的に結合することができる本発明の結合ドメイン／ターゲティング剤／組成物が提供されるように、こうした結合部位が、植物の他の部位よりも多量に／高い程度に植物の前記部位の中／上に存在することができる）；こうした結合ドメイン／ターゲティング剤を含む本発明の組成物（すなわち、組成物が植物の所望部位に存在する結合部位に向けられるというようなもの、好ましくは、植物の所望部位にこれらが優先的に結合することができるようなもの）は、本発明の一部の特定の（しかし限定されない）態様を形成する。例えば、限定されるものではないが、
−植物の葉に結合させるための本発明の組成物について、結合ドメインおよび／またはターゲティング剤は、植物（の葉）の次に記す１つまたは複数の結合部位に対して誘導することができる：クチン、表皮のロウ、アラビノガラクタン−タンパク質または脂質伝達タンパク質；
−植物の根に結合させるための本発明の組成物について、結合ドメインおよび／またはターゲティング剤は、植物（の根）の次に記す１つまたは複数の結合部位に対して誘導することができる：エクステンシンまたはペクチン；
−植物の茎に結合させるための本発明の組成物について、結合ドメインおよび／またはターゲティング剤は、植物（の茎）の次に記す１つまたは複数の結合部位に対して向けられる：リグニン、エクステンシンまたは排出物；
また本発明のこうしたそれぞれの組成物は、本発明の特定の（しかし限定されない）態様を形成する。
【００４８】
本発明の第５の態様は、少なくとも（ｉ）本発明による少なくとも１つの結合ドメインを含む１つのターゲティング剤および（ｉｉ）担体を含む組成物である。
【００４９】
前記組成物に含まれている（１つまたは複数の）ターゲティング剤は、単一特異的ターゲティング剤または多重特異的ターゲティング剤であってもよく、１価ターゲティング剤または多価ターゲティング剤であってもよい。したがって、一態様において、本発明の上記組成物は２つ以上の同一でありまたは異なるターゲティング剤を含み、これにより、同一のターゲティング剤については、それぞれが同一結合部位にまたは結合部位中に存在する同一でありまたは異なる抗原に結合する、２つ以上のターゲティング剤を意味するが、異なるターゲティング剤については、少なくとも１つが同一結合部位にもしくは結合部位中にまたは異なる結合部位中に存在する異なる抗原に結合する、２つ以上のターゲティング剤を意味する。
【００５０】
好ましい（しかし限定されない）特定の一実施形態においては、担体は、噴霧法、ブラッシング法、ドリッピング法、浸漬法、コーティング法、広域散布法、小滴、ミストまたはエアロゾルとしての施用法などの任意の適切なまたは所望の手動方法または機械方法を使用して、本発明の組成物が意図した作用部位に適切に施用されることを可能にするようなものであり、および／または本発明の組成物が意図した作用部位に適切に施用することができるように製剤化されることを可能にするようなものである。こうした方法の例、こうした方法で使用するに好適である本発明の組成物の例、および本発明のこうした組成物を製造し製剤化する方法の例は、本明細書の開示に基づき当業者には明らかである。好ましくは、担体は、１つまたは複数の活性物質が、例えばナノカプセル、マイクロカプセル、ナノスフェア、ミクロスフェア、リポソームまたはベシクルなどの担体内へ混和、カプセル化または封入され得るようなものである。さらにより好ましくは、担体は、こうした混和、カプセル化、包埋または封入時に、こうして得られた複合体が適切な液体媒体（例えば水または別の適切な水性媒体、有機媒体もしくは油性媒体）中へ懸濁、分散、乳化または導入されるので、本発明の組成物が適切に保存されるまたは（必要に応じさらに希釈後）意図した作用部位に施用される安定性を有する本発明の（濃縮）液状組成物を提供することができるようなものである。さらにより好ましくは、担体は、本発明の組成物が、場合により（通常好ましくは）最終使用前に最終使用者によって適切に希釈、分散、懸濁、乳化することができる、または適切に再構成することができる適切な液体濃縮物、乾燥粉末、錠剤、カプセル、スラリーまたは「湿潤ケーキ」として、最終使用前に輸送および／または保存することができるようなものである（そのような濃縮物は、本発明のさらなる態様を形成する。）。この目的に好適な担体、好ましくは微小担体（および活性成分をその中に吸収、カプセル化、包埋等する方法）は本明細書の開示に基づいて当業者には明らかであり、および／または市販により入手可能であり得る。いくつかの（しかし限定されない）例としては、活性成分が適切なマトリクス材に包埋または吸収されている固体ミクロスフェアもしくは半固体ミクロスフェアまたは顆粒剤、または活性成分を含有するコア部を囲むシェル物質を含むマイクロカプセル（すなわち、マイクロカプセル内へのカプセル化）が挙げられる。
【００５１】
好ましくは、担体は、例えば、数分、数時間、数日または数週間にわたって、即時放出、遅延放出、漸次放出、刺激放出または持続放出の特性を有するようなものである。また、担体は、（例えば、高温もしくは低温、高ｐＨもしくは低ｐＨ、日光、高湿度もしくは低湿度または他の環境要因または条件に対する長期間の暴露により）時間とともに（例えば、数分、数時間、数日または数週間にわたって）破壊または徐々に分解する物質（例えばポリマー）、特定の外部要因（例えば、高温もしくは低温、高ｐＨもしくは低ｐＨ、高湿度もしくは低湿度または他の環境要因または条件）がきっかけとなった場合に破壊または分解し、それによりマイクロカプセルから活性剤を放出する物質（例えばポリマー）から製造されていてもよい。また担体は、好ましくは、本発明の組成物が目的の作用部位に施用される場合に、すなわち、所望の期間（例えば、本発明の組成物を２回施用する間の時間）中に農薬の所望の作用を提供するのに十分な速度で、農薬が担体から放出されるようなものである。
【００５２】
特定の一実施形態においては、担体（好ましくは微小担体）は、ポリマー物質、例えば、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、メラミン、尿素／ホルムアルデヒド、アクリルポリマー、ナイロン、酢酸ビニルもしくはシロキサンポリマーまたは−場合により（通常好ましくは）農薬目的において−生分解性高分子（例えば、寒天、ゼラチン、アルギン酸塩、ガム、ペクチン、ポリアルコール、例えばセチルアルコール、油性物質、例えば水素化パーム油または大豆油、デンプン、ロウなど）からなっていてもよい。あるいは、これは通常はあまり好ましくないが、非生物分解性物質、例えばポリアクリル酸メチル、ポリエーテルスルフォン、金属酸化物、カーボン構造などを使用することができる。
【００５３】
好ましくは、前記担体は、ナノカプセル、ナノスフェア、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ポリマー粒子、人工的に木質化されたセルロースから製造した粒子、複合ゲル粒子、弱性イオン樹脂粒子、微生物細胞またはそれらの断片からなる群から選択される。より好ましくは、前記担体は、マイクロカプセル、ミクロスフェアまたはポリマー粒子からなる群から選択される。最も好ましくは、前記担体はマイクロカプセルである。
【００５４】
好ましい一実施形態においては、前記組成物に含まれている（１つまたは複数の）ターゲティング剤は、４つのフレームワーク領域および３つの相補性決定領域またはそれらの任意の適切なフラグメント（これは次いで少なくとも１つの相補性決定領域を形成する少なくともいくつかのアミノ酸残基を通常含有する。）を含む、少なくとも１つの結合ドメインを含む。より好ましくは、ターゲティング剤に含まれている１つまたは複数の前記結合ドメインは重鎖ラクダ科動物抗体に由来しており、さらにより好ましくは、ターゲティング剤に含まれている１つまたは複数の前記結合ドメインはＶＨＨ配列を含む。さらに一層より好ましくは、前記ＶＨＨは２つのジスルフィド架橋を含む。最も好ましくは、前記ＶＨＨは配列番号１−配列番号４２（３Ａ２、３Ｂ４、３Ｂ７、３Ｄ１０、３Ｄ２、３Ｄ８、３Ｅ６、３Ｆ５、３Ｆ７、３Ｆ９、３Ｇ２、３Ｇ４、３Ｈ１０、３Ｈ８、４Ａ１、５Ｂ５、５Ｂ６、５Ｃ４、５Ｃ５、５Ｄ４、５Ｅ５、５Ｆ５、５Ｇ２、５Ｇ５、５Ｈ５、７Ａ２、７Ｃ２、７Ｄ２、７Ｅ１＿１、７Ｆ１、８Ｂ１０、８Ｂ１２、９Ａ１、９Ｂ５、９Ｃ４、９Ｄ５、９Ｅ１、９Ｅ４、９Ｆ４、９Ｈ１、９Ｈ２および１２Ｈ４）またはそれらの任意の適切なフラグメント（これは次いで少なくとも１つの相補性決定領域を形成する少なくともいくつかのアミノ酸残基を通常含有する。）またはそれらの相同体からなる群から選択される配列を含み、好ましくはそれらからなる。
【００５５】
別の好ましい実施形態において、本発明による組成物に含まれているターゲティング剤および担体は、互いにカップリングされている。好ましくは、前記の１つの単一ターゲティング剤または多重ターゲティング剤は、アフィニティー結合または共有結合により前記担体にカップリングされている。より好ましくは、前記の１つの単一ターゲティング剤または多重ターゲティング剤は、共有結合によって担体にカップリングされている。好ましくは、前記の１つの単一ターゲティング剤または多重ターゲティング剤は、担体の外表面に存在する官能基の使用によって担体にカップリングされており、好ましくは共有結合でカップリングされている。好ましくは、前記の（１つまたは複数の）ターゲティング剤に含まれている結合ドメインは、担体にカップリングされており、好ましくは共有結合でカップリングされている。あるいは、前記の１つの単一ターゲティング剤または多重ターゲティング剤は、ターゲティング剤に含まれている結合ドメインではない成分を介して担体にカップリングされており、好ましくは共有結合でカップリングされている。
【００５６】
さらに別の好ましい実施形態において、前記担体は、上記に定義したように、少なくとも１つの農薬にカップリングされており、および／または少なくとも１つの農薬を含む。好ましくは、前記農薬は、除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺線虫剤、殺生物剤、肥料、微量栄養素、毒性緩和剤または植物成長調節化合物からなる群から選択される。この好ましい実施形態において、前記組成物は農薬の使用向けである。
【００５７】
担体に結合、カップリングもしくは付着している、または担体と会合している１つまたは複数のターゲティング剤を含む担体は、保存に適している（濃縮）溶液、懸濁液、分散液またはエマルションを提供するように、適切な液体媒体（例えば、水または別の水性媒体、有機性媒体もしくは油状媒体）中に溶解、乳化、懸濁もしくは分散または包含されていてもよい。
【００５８】
例えば、本発明の組成物が農薬使用を目的とする場合、本発明の組成物は、噴霧に好適である液体、半固体または固体形態、例えば溶液、エマルション、懸濁液、分散液、エアロゾル、フロアブル粉末または他の適切な形態であってもよい。特に、このような農薬使用のための本発明の組成物は、１つまたは複数の農薬が適切にカプセル化、封入、包埋、混入または包含されている、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノカプセル、ナノスフェア、リポソームまたはベシクルなど；および前記結合部位にもしくは結合部位中に存在する１つもしくは複数の抗原に結合するための１つもしくは複数の結合ドメインをそれぞれ含む、または植物もしくは植物部位（例えば、植物の葉、茎、花、果実、球根または塊茎）上の前記の１つまたは複数の結合部位を形成する、１つまたは複数のターゲティング剤を含んでいてもよい。
【００５９】
本発明の第６の態様は、植物に本発明による組成物を少なくとも１回施用することを含む、植物に農薬または農薬の組み合わせを送達する方法である。
【００６０】
本明細書において「１回施用」とは、植物または植物部位の単一処理を意味する。この方法によれば、本発明による組成物は、そのものとして植物もしくは植物部位に施用される、または前記組成物は、植物への施用前に、まず適切な溶液中に溶解、懸濁および／または希釈される。植物への施用は、農薬または農薬の組み合わせを施用するためのすべての適切または所望の手動式方法または機械式方法、例えば、限定されるものではないが、噴霧法、ブラッシング法、粉衣法、ドリッピング法、浸漬法、コーティング法、広域散布法、小滴、ミストまたはエアロゾルとしての施用法を使用して行われる。このような植物または植物部位への施用の際、組成物は、組成物に含まれている（１つまたは複数の）ターゲティング剤の部位を形成する１つまたは複数の結合ドメインを介して、好ましくはターゲティングされた様式で、結合部位でまたは結合部位に（または前記結合部位にもしくは結合部位中に存在するまたは前記結合部位を形成する１つまたは複数の抗原に）結合することができる。その結果、農薬は、所望する農薬作用を提供することができるような方法で（例えば、担体の分解または担体の壁を通過する受動輸送により）担体から放出される。本発明による組成物を使用して、農薬または農薬の組み合わせを植物に送達する特別の利点は、植物または植物部位への農薬または農薬の組み合わせの（前に定義したような）堆積の改善がもたらされ得ること、および／または外部要因（例えば、雨、潅水、雪、雹または風）による損失に対する農薬または農薬の組み合わせの耐性が強化され得ることである。
【００６１】
好ましい一実施形態においては、本発明による組成物を使用して植物に農薬または農薬の組み合わせを送達することによって、農薬または農薬の組み合わせの耐雨性が改善される。本明細書において「耐雨性が改善される」とは、降雨前後に計算された農薬または農薬の組み合わせの損失割合が、いかなるターゲティング剤も含まない比較可能な組成物に含まれている同一の農薬または農薬の組み合わせと比べて、本発明による組成物中で農薬または農薬の組み合わせが施用される場合に小さいことを意味する。本明細書において「比較可能な組成物」とは、本発明による組成物に使用されているターゲティング剤が含まれないことを除いて、その組成物が本発明による組成物と同一であることを意味する。
【００６２】
好ましい実施形態において、本発明による組成物に含まれている前記農薬または農薬の組み合わせの適切な用量が植物または植物部位に施用される。本明細書において「適切な用量」とは、前記組成物に含まれている農薬の活性物質の効果的用量を意味する。
【００６３】
好ましくは、前記方法は、いかなるターゲティング剤も含まない、上記で定義したような比較可能な組成物に含まれている同一の農薬または農薬の組み合わせの施用と比べて、農薬または農薬の組み合わせの用量を有効に軽減して植物へ施用し、前記農薬または前記農薬の組み合わせの場合と同様の有効作用を得ることを含む。前記の有効な軽減は、本発明によるターゲティング剤を使用して、前記農薬を植物に向けることにより得られる。あるいは、前記方法は、本発明によるターゲティング剤が存在しない農薬のカプセル化組成物の同一用量の施用頻度と比較して、施用頻度が有効に軽減される適切な用量を施用し、前記農薬の場合と同様の有効作用を得ることを含む。さらにより好ましくは、前記方法は、本発明によるターゲティング剤が存在しない農薬のカプセル化組成物の適切な用量および施用頻度と比較して、適切な用量ならびに施用頻度が両方とも有効に軽減される施用をし、前記農薬の場合と同様の有効作用を得ることを含む。
【００６４】
本発明の第７の態様は、本発明による組成物を少なくとも１回施用することを含む、外部ストレス（生物ストレスもしくは非生物ストレス）から植物を保護する方法、および／または植物もしくは植物部位の生存能力、成長もしくは収量を調節する方法、および／または植物もしくは植物部位における遺伝子発現を調節し、植物成分（例えばタンパク質、油、炭水化物、代謝物質など）の（レベルの）変化をもたらす方法である。必要に応じて、前記組成物は適切な溶液に溶解、懸濁および／または希釈される。本明細書において「植物を保護する」とは、任意のストレスから植物を保護することであるが、前記ストレスは生物ストレス、例えば、限定されるものではないが、雑草、昆虫、げっ歯類、線虫、ダニ、真菌、ウイルスまたは細菌が原因のストレスであってもよく、非生物ストレス、例えば、限定されるものではないが、乾燥ストレス、塩ストレス、温度ストレスまたは酸化ストレスであってもよい。
【００６５】
好ましくは、前記方法は、いかなるターゲティング剤も含まない、上記で定義したような比較可能な組成物に含まれている同一の農薬または農薬の組み合わせの施用と比べて、農薬または農薬の組み合わせの用量を有効に軽減して植物へ施用し、前記農薬または前記農薬の組み合わせの場合と同様の有効作用を得ることを含む。前記の有効な軽減は、本発明によるターゲティング剤を使用して、前記農薬を植物に向けることにより得られる。あるいは、前記方法は、本発明によるターゲティング剤が存在しない農薬のカプセル化組成物の同一用量の施用頻度と比較して、施用頻度が有効に軽減される適切な用量を施用し、前記農薬の場合と同様の有効作用を得ることを含む。さらにより好ましくは、前記方法は、本発明によるターゲティング剤が存在しないカプセル化農薬の適切な用量および施用頻度と比較して、適切な用量ならびに施用頻度が両方とも有効に軽減される施用をし、前記農薬の場合と同様の有効作用を得ることを含む。
【００６６】
本発明の第８の態様は、（ａ）担体中にまたは担体上に（担体に）農薬を充填することおよび（ｂ）前記担体に本発明による少なくとも１つのターゲティング剤を付着させることを含む、特異的ターゲティング農薬担体の製造方法である。
【００６７】
本明細書において「充填する」とは、組込み、包含、固定化、吸着、吸収、結合、カプセル化、包埋、付着、混合、固定または含むことを意味する。担体中にまたは担体上に（担体に）上記で定義したような農薬を充填する方法は当業者には公知であり、例えば、限定されるものではないが、ドリップキャスティング、押出造粒、流動床造粒、同時押出、噴霧乾燥、噴霧冷却、微粒化、添加または縮合重合、界面重合、ｉｎ  ｓｉｔｕ重合、コアセルベーション、噴霧カプセル化、冷却溶解分散、溶媒蒸発、相分離、溶媒抽出、ゾルゲル重合、高剪断混合または低剪断混合、流動床コーティング、パンコーティング、融解、受動的吸収もしくは能動的吸収もしくは吸着が挙げられる。好ましい（しかし限定されない）一実施形態において、農薬は適切なマイクロカプセル化技術、例えば、界面重合、ｉｎ  ｓｉｔｕ重合、コアセルベーション、噴霧カプセル化、冷却溶解分散、溶媒蒸発、相分離、溶媒抽出またはゾルゲル重合などを使用して、微小担体に充填される。このような微小担体の製造に好適な物質の好ましい（しかし限定されない）例は、アルギン酸塩、寒天、ゼラチン、ペクチン、ガム、硬化油、デンプン、ロウ、多価アルコール、ポリ尿素、ポリウレタン、ポリアミド、メラミン、尿素／ホルムアルデヒド、ナイロンおよび他の（場合によりおよび通常好まれる生物分解性または不活性）ポリマーなどの物質である。より好ましくは、少なくとも１つの官能基は、微小担体の外表面に存在する。
【００６８】
本発明による少なくとも１つのターゲティング剤は、共有結合によって、水素結合によって、双極子相互作用によって、弱ファン−デル−ワールス力によって、または前述のいずれかの組み合わせによって担体に結合されている。ターゲティング剤の担体への付着は、担体中にもしくは担体上に（担体に）農薬を充填しながら実施することが可能であり、担体中にもしくは担体上に（担体に）農薬を充填した後に実施することが可能であり、または農薬を含有する担体が、施用に適した溶液に溶解される時にだけ行うことができる。前記ターゲティング剤を担体に付着させるための好適なプロセスは、当業者には自明である。好ましい一実施形態において、ターゲティング剤および担体は相互にカップリングされている。好ましくは、前記の（１つまたは複数の）ターゲティング剤は、アフィニティー結合または共有結合により前記担体にカップリングされている。より好ましくは、前記の（１つまたは複数の）ターゲティング剤は共有結合により担体にカップリングされている。好ましくは、前記の（１つまたは複数の）ターゲティング剤は、担体の外表面に存在する官能基を使用することにより担体にカップリングされており、好ましくは共有結合でカップリングされている。好ましくは、前記の（１つまたは複数の）ターゲティング剤に含まれている結合ドメインは、担体にカップリングされており、好ましくは共有結合でカップリングされている。あるいは、前記の（１つまたは複数の）ターゲティング剤は、ターゲティング剤に含まれている結合ドメインではない成分を介して担体にカップリングされており、好ましくは共有結合でカップリングされている。好ましい一実施形態において、前記の（１つまたは複数の）ターゲティング剤を担体に付着させる前記プロセスは、（ａ）連結剤を担体と反応させることおよび（ｂ）少なくとも１つのターゲティング剤を前記連結剤と反応させることを含む。
【００６９】
本発明の第９の態様は、（ａ）連結剤を担体と反応させることおよび（ｂ）前記ターゲティング剤を前記連結剤と反応させることを含む、本発明によるターゲティング剤を担体に付着させるプロセスである。本明細書において「反応させる」とは、連結剤を、担体および／またはターゲティング剤への連結剤の結合を可能にする条件に置くことを意味する。
【００７０】
本発明の第１０の態様は、上記の方法によって得られた、特異的ターゲティング農薬担体である。本明細書において「特異的ターゲティング」とは、担体に付着されている、好ましくはカップリングされている、最も好ましくは共有結合で結合されている、本発明による少なくとも１つのターゲティング剤を介して、担体が植物上または植物部位上の結合部位に特異的に結合することができることを意味する。
【００７１】
本発明の最後の態様は、結合部位もしくは前記結合部位に含まれている抗原への特異的結合に関与するアミノ酸配列を単離するための本発明による任意の結合ドメインの使用、および前記アミノ酸配列に基づいた人工結合ドメインを構築するための本発明による任意の結合ドメインの使用である。実際、本発明による結合ドメインにおいて、フレームワーク領域および相補性決定領域は公知であり、同一結合部位または前記結合部位に含まれている抗原に結合する結合ドメインの誘導体を研究することにより、結合部位または前記結合部位に含まれている抗原への結合に関与する不可欠なアミノ酸を推定することができる。この知見を用いて、最小結合ドメインを構築し、それらの誘導体を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１−１】葉表面に結合する結合ドメイン（ＶＨＨ）を示す図である。図１Ａ：天然ジャガイモの葉表面に結合しているＰＢＳ中のＶＨＨ３Ｅ６  ５μｇ／ｍｌを示す図である。Ａｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしている抗ヒスチジン抗体により検出。ＶＨＨ  ３Ｅ６は葉表面、気孔、腺毛および葉毛に結合している。図１Ｂ：天然ジャガイモの葉表面へ結合しているＰＢＳ中のＶＨＨ３Ｅ６  ５μｇ／ｍｌを示す図である。Ａｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしている抗ヒスチジン抗体により検出。Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡システムにより画像化。ＶＨＨ  ３Ｅ６は葉表面、気孔、腺毛および葉毛に結合している。図１Ｃ：天然ジャガイモの葉表面に結合しているＰＢＳ中のＶＨＨ５Ｄ４  ５μｇ／ｍｌを示す図である。Ａｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしている抗ヒスチジン抗体により検出。ＶＨＨ  ５Ｄ４は葉表面、気孔、腺毛および葉毛に結合している。図１Ｄ：ジャガイモ葉片の縁の損傷植物組織に結合しているＰＢＳ中のＣＢＭ３ａ  ５μｇ／ｍｌを示す図である。Ａｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしている抗ヒスチジン抗体による検出。ＣＢＭ３ａは葉表面、気孔、腺毛または葉毛には結合していないが、葉をパンチングすることによる試料の調製によって露出されているジャガイモ葉片の縁の損傷植物組織にのみ結合している。図１Ｅ：天然ジャガイモの葉表面上に一次抗体がないこと（ＰＢＳのみ）を示す図である。Ａｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしている抗ヒスチジン抗体と培養。
【図１−２】葉表面に結合する結合ドメイン（ＶＨＨ）を示す図である。図１Ｆ：天然イヌホオズキの葉表面に結合しているＰＢＳ中のＶＨＨ３Ｅ６  ５μｇ／ｍｌを示す図である。Ａｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしている抗ヒスチジン抗体により検出。ＶＨＨ  ３Ｅ６は葉表面、腺毛および葉毛に結合している。図１Ｇ：野草の葉表面に結合しているＰＢＳ中のＶＨＨ３Ｅ６  ５μｇ／ｍｌを示す図である。Ａｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしている抗ヒスチジン抗体により検出。ＶＨＨ  ３Ｅ６は、葉表面と葉をパンチングすることによる試料の調製によって露出されているジャガイモ葉片の縁の損傷植物組織に結合している。
【図２】結合ドメイン（ＶＨＨ）の生きている無傷植物への結合を示す図である。図２Ａ：生きている無傷植物に結合しているＰＢＳ中のＶＨＨ３Ｅ６  ５μｇ／ｍｌを示す図である。ジャガイモの鉢植え植物に付いている葉をＶＨＨ  ３Ｅ６の溶液中に浸漬した。葉をサンプリングした。Ａｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしている抗ヒスチジン抗体により検出。ＶＨＨ  ３Ｅ６は葉表面、気孔、腺毛および葉毛に結合している。図２Ｂ：生きている無傷植物に結合しているＰＢＳ中のＶＨＨ３Ｅ６  ５μｇ／ｍｌを示す図である。ジャガイモの鉢植え植物に付いている葉をＶＨＨ  ３Ｅ６の溶液中に浸漬した。葉をサンプリングした。Ａｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしている抗ヒスチジン抗体により検出。標識化されている葉全体の一部。ＶＨＨ  ３Ｅ６は葉表面、気孔、腺毛および葉毛に結合している。
【図３】結合ドメインのマイクロカプセルへのカップリングを示す図である。図３Ａ：１工程のＥＤＣカップリング化学法によってカップリングされたＶＨＨ  ３Ｅ６を含むマイクロカプセルを示す図である。カップリングされたマイクロカプセルは、Ａｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしている抗ヒスチジン抗体で標識化した。Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡システムで画像化。ＶＨＨ  ３Ｅ６は、１工程のカップリング化学法によりマイクロカプセル表面にカップリングされている。図３Ｂ：２工程のＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学法によってカップリングされたＶＨＨ  ３Ｅ６を含むマイクロカプセルを示す図である。カップリングされたマイクロカプセルは、Ａｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしている抗ヒスチジン抗体で標識化した。Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡システムで画像化。ＶＨＨ  ３Ｅ６は２工程のＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学法によってマイクロカプセル表面にカップリングされている。図３Ｃ：共有結合によるカップリングなしでＶＨＨ  ３Ｅ６とインキュベートしたマイクロカプセルを示す図である。受動的に吸着されたＶＨＨは、Ａｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしている抗ヒスチジン抗体で標識化した。Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡システムで画像化。ＶＨＨ  ３Ｅ６の小さな画分がマイクロカプセル表面に受動的に吸着される。図３Ｄ：ＶＨＨとはインキュベートしていないがＡｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしている抗ヒスチジン抗体とのみインキュベートしたマイクロカプセルを用いたコントロール条件を示す図である。Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡システムで画像化。ＶＨＨ  ３Ｅ６の小さな画分がマイクロカプセル表面に受動的に吸着される。
【図４】マイクロカプセルの葉表面への結合および保持を示す図である。蛍光性トレーサー分子を含有するマイクロカプセルを用いた天然ジャガイモ葉片に対する葉片結合アッセイ。特異的植物結合ＶＨＨとカップリングしているマイクロカプセル、無関連のコントロールＶＨＨとカップリングしているマイクロカプセル、またはブランクのマイクロカプセルの結合および保持を比較する。ブランクのマイクロカプセルと比較して、９倍以上特異的ＶＨＨとカップリングしているマイクロカプセルがジャガイモ葉片上に結合しており、保持されている。
【図５】ターゲティング剤とカップリングしているマイクロカプセルを使用する用量の軽減を示す図である。蛍光性トレーサー分子を含有するマイクロカプセルを用いた天然ジャガイモ葉片に対する葉片結合アッセイである。異なる濃度において、特異的植物結合ＶＨＨとカップリングしているマイクロカプセル、無関連コントロールのＶＨＨとカップリングしているマイクロカプセル、またはブランクのマイクロカプセルの結合および保持を比較する。ブランクのマイクロカプセルに比べて、最大で８倍以上の特異的ＶＨＨとカップリングしているマイクロカプセルがジャガイモ葉片上に結合しており、保持されている。
【実施例】
【００７３】
実施例１：
ＶＨＨの作製および選択
アラビアゴム、ジャガイモ葉ホモジネートまたはコムギ葉ホモジネートを使用するラマの免疫化
アラビアゴムの溶液は、アラビアゴムノキのアラビアゴム５ｇ（Ｓｉｇｍａ）を秤量し、５０ｍｌの水に溶解させることにより調製した。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて、全タンパク質濃度を測定した。アリコートを調製し、−８０℃で保存し、免疫化に使用した。ジャガイモ植物（ソラナム・チューベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）の品種Ｄｅｓｉｒｅｅ）のホモゲナイズされた葉またはコムギ植物（トリチクム・アエスチブム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）の品種Ｂｏｌｄｕｓ）のホモゲナイズされた葉は、液体窒素中で葉を凍結させ、細粉が得られるまで乳鉢および乳棒を用いて前記の葉をホモゲナイズすることにより調製した。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて、全タンパク質濃度を測定した。アリコートを調製し、−８０℃で保存し、懸濁液を免疫化に使用した。
【００７４】
ラマは、標準方法に従って、毎週の間隔で、アラビアゴム、ジャガイモ葉ホモジネートまたはコムギ葉ホモジネートの筋肉注射６回で免疫化した。２頭のラマ、「４０４３３４」および「Ｌａｈａｉａｎａ」をアラビアゴムで免疫化した。３頭のラマ、「４０７９２８」「Ｃｈｉｌｅａｎ  Ａｕｔｕｍｎ」および「Ｎｉａｇａｒａ」をホモジネートしたジャガイモ葉で免疫化し、別の２頭のラマ、「３３７３３」および「Ｏｒｇａｎｚａ」をホモジネートしたコムギ葉で免疫化した。ラマ「４０４３３４」、「４０７９２８」および「３３７３３」はアジュバントＬＱ（Ｇｅｒｂｕ）を用いて免疫化し、ラマ「Ｌａｈａｉａｎａ」、「Ｃｈｉｌｅａｎ  Ａｕｔｕｍｎ」、「Ｎｉａｇａｒａ」および「Ｏｒｇａｎｚａ」はフロインド不完全アジュバント（ＦＩＡ）を用いて免疫化した。ラマ「４０４３３４」の免疫処置用量は、０、７、１４、２１、２８、３５日目の各日について３５０μｇであり、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を４０日目に採取した。ラマ「４０７９２８」および「３３７３３」の免疫処置用量は、０、７、１４、２１、２８および３６日目の各日に１ｍｇであり、ＰＢＬを４０日目に採取した。４０日目のＰＢＬ採取の時、ラマ「４０４３３４」「４０７９２８」および「３３７３３」の血清を採取した。ラマ「Ｌａｈａｉａｎａ」、「Ｃｈｉｌｅａｎ  Ａｕｔｕｍｎ」、「Ｎｉａｇａｒａ」および「Ｏｒｇａｎｚａ」の免疫処置用量は０日に１００μｇ、７、１４、２１、２８および３５日目に５０μｇであった。０日および２５日目に、また３８日目のＰＢＬ採取時に、ラマ「Ｌａｈａｉａｎａ」、「Ｃｈｉｌｅａｎ  Ａｕｔｕｍｎ」、「Ｎｉａｇａｒａ」および「Ｏｒｇａｎｚａ」の血清を採取した。
【００７５】
ライブラリー構築  −  それぞれの免疫化ラマから、個別のＶＨＨライブラリーを作製した。ＲＮＡを末梢血リンパ球から単離した後、ランダム六量体プライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを用いメーカーの使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってｃＤＮＡ合成を行った。第１のＰＣＲは、ＶＨＨおよびＶＨを増幅するために、フォワードプライマーミックス［比が１：１のｃａｌｌ００１（５’−ｇｔｃｃｔｇｇｃｔｇｃｔｃｔｔｃｔａｃａａｇｇ−３’）およびｃａｌｌ００１ｂ（５’−ｃｃｔｇｇｃｔｇｃｔｃｔｔｃｔａｃａａｇｇｔｇ−３’）］とリバースプライマーｃａｌｌ００２（５’−ｇｇｔａｃｇｔｇｃｔｇｔｔｇａａｃｔｇｔｔｃｃ−３’）を使用して行った。ＶＨＨフラグメントを単離した後、第２のＰＣＲは、フォワードプライマーＡ６Ｅ（５’−ｇａｔｇｔｇｃａｇｃｔｇｃａｇｇａｇｔｃｔｇｇｒｇｇａｇｇ−３’）およびリバースプライマー３８（５’−ｇｇａｃｔａｇｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｇｇａｇａｃｇｇｔｇａｃｃｔｇｇｇｔ−３’）を使用して実施した。ＰＣＲフラグメントは、ＰｓｔＩおよびＥｃｏ９１Ｉ制限酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して消化し、ベクターｐＭＥＳ４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＱ９０７２４８．１）中のｐＩＩＩ遺伝子上流にライゲートした。ライゲーション産物は標準プロトコルに従ってエタノール沈澱させ、水中に再懸濁し、ＴＧ１細胞へエレクトロポレートした。ライブラリーサイズは１Ｅ＋０８−６Ｅ＋０８インディペンデントクローンの範囲であった。ライブラリーのランダムに選択したクローンについて単一コロニーＰＣＲを実施し、ライブラリーの挿入割合を評価した。免疫ラマ「Ｏｒｇａｎｚａ」からのライブラリーを除き（これは挿入割合が８０％であった）、すべてのライブラリーの挿入割合は≧９０％であった。ライブラリーには、ラマ「４０４３３４」「４０７９２８」「３３７３３」「Ｃｈｉｌｅａｎ  Ａｕｔｕｍｎ」、「Ｌａｈａｉａｎａ」「Ｎｉａｇａｒａ」および「Ｏｒｇａｎｚａ」に対し、それぞれ２５、２７、２８、２９、３０、３１、３２の番号を付けた。それぞれのライブラリーからのファージは、標準手順に従い、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを使用して作製した。
【００７６】
アラビアゴムの植物表皮抽出物または葉全体に対するファージ選択。
【００７７】
アラビアゴムの溶液は、５ｇのアラビアゴムを秤量し、５０ｍｌの水に溶解させることによって調製した。アリコートを調製し、使用するまで−２０℃で保存した。ジャガイモ植物のクチクラおよび接着表皮の抽出物は、ジャガイモ植物の茎から得た薄い細片から調製した。コムギ植物のクチクラおよび接着表皮の抽出物は、コムギの鞘葉から得た薄い細片から調製した。細胞壁グリカンおよび非セルロース多糖類の豊富な抽出物は、それぞれ、ＣＤＴＡおよびＮａＯＨを使用して（Ｍｏｌｌｅｒら、２００７）連続的に抽出した。細片を液体窒素で凍結させ、細粉が得られるまで乳鉢および乳棒で粉砕した。細胞壁グリカンの豊富な抽出物は、グラム当たり１０ｍｌの破砕物および４℃、３０分間の縦方向回転（ｈｅａｄ−ｏｖｅｒ−ｈｅａｄ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）を使用し、細粉を５０ｍＭのＣＤＴＡ  ｐＨ６．５中に再懸濁させることにより調製した。抽出物および不溶性物質は、フィルターと適合したシリンジを使用して分離した。抽出物は、マイクロ遠心分離機中、５分間２０，０００ｇで遠心分離を行うことによりさらに精製した。セルロースを含まない多糖類の豊富な抽出物は、グラム当たり１０ｍｌの不溶性物質および４℃、３０分間の縦方向回転を使用し、４Ｍ  ＮａＯＨおよび１％のＮａＢＨ４中のＣＤＴＡ抽出後に、不溶性物質から調製した。抽出物および不溶性物質は、フィルターと適合したシリンジを使用して分離した。抽出物は、マイクロ遠心分離機中、５分間２０，０００ｇで遠心分離を行うことによりさらに精製した。アラビアゴムに対する第１ラウンド選択は、０．１Ｍの炭酸塩緩衝液ｐＨ８．３中の１ｍｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌアラビアゴムでコーティングした９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，  Ｎｕｎｃ）のウェル中で実施した。コーティングは、４℃で一晩実施した。ウェルは、ＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ＰＢＳ中の５％スキムミルク（５％ＭＰＢＳ）でブロッキングした。ファージを２．５％ＭＰＢＳ中に懸濁し、約２Ｅ＋１１  ｃｆｕを各ウェルに使用した。２時間室温でウェルに結合させた後、ＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０およびＰＢＳで全面洗浄することによって、非結合ファージを除去した。結合ファージは、３０分間、ＰＢＳ中の０．１ｍｇ／ｍｌトリプシン（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で溶出させた。溶出ファージは、過剰のＡＥＢＳＦトリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を含有するポリプロピレン製９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に移した。ターゲットをコーティングしたウェルのファージ力価は、富化を評価するためにブランクのウェルのファージ力価と比較した。ファージは、標準手順に従って、新鮮なＴＧ１細胞を用いて増幅させた。
【００７８】
第２ラウンド選択は、ライブラリー２５および３０のウェルが１ｍｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌの代わりに１０μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌのアラビアゴムでコーティングされる以外は、第１ラウンドと同様に実施した。有意な富化は、第１ラウンド選択においてライブラリー２７、２８、２９、３１および３２では得られなかった。第２ランド選択においては、富化はライブラリー２８、３１および３２については＞１０００倍であり、ライブラリー２７および２９についてはそれぞれ２５倍および２５０倍であった。ライブラリー２５および３０についての富化は、第１ラウンド選択において、それぞれ５０倍および＞１０００倍であった。第２ラウンド選択においては、両ライブラリーについて富化は１０００倍であった。ジャガイモ表皮ＣＤＴＡ抽出物に対する選択はアラビアゴムに対する選択と同様に実施したが、第１ラウンド選択および第２ラウンド選択の両方とも、ウェルは１０倍および１０００倍希釈したジャガイモ表皮ＣＤＴＡ抽出物でコーティングした。第１ラウンド選択における富化は、ライブラリー２５、２７、２８、２９、３０、３１および３２についてそれぞれ１０、１Ｅ＋０３、２０、２０、＞１Ｅ＋０４、１５および５倍であり、第２ラウンド選択においてはすべてのライブラリーについて＞１００倍であった。コムギ表皮ＣＤＴＡ抽出物に対する選択は、ジャガイモ表皮ＣＤＴＡ抽出物に対する選択と同様に実施したが、第１ラウンド選択および第２ラウンド選択の両方とも、ウェルは２０倍および２０００倍希釈したコムギ表皮ＣＤＴＡ抽出物でコーティングした。第１ラウンド選択における富化は、ライブラリー２５、２７、２８、２９、３０、３１および３２について、それぞれ＞１０、＞１００、＞１０、１、＞１Ｅ＋０３、１０および５倍であった。第２ラウンド選択での富化は、ライブラリー２９については＞１０倍であり、ライブラリー２５、２７、２８、３０、３１および３２については＞１００倍であった。ジャガイモ葉に対する選択は、第１ラウンド選択における葉の粒子と第２ラウンド選択における葉全体を使用して、２回の連続する選択で実施した。ライブラリー２７、２８、２９、３０、３１および３２は、葉に対する選択で使用した。第１ラウンド選択用の葉の粒子は、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５ホモゲナイザーを使用して、ＰＢＳ中でジャガイモの葉を混合することによって調製した。この葉の粒子は、遠心分離によって懸濁液から回収した。本明細書で「ホモゲナイズした葉の可溶性分画」と呼ぶ上清は、推定によれば細胞内の成分が豊富であり、結合剤が細胞内エピトープへ競合するようにファージ選択中に溶液中で使用した。ライブラリーファージは、室温で３０分間、縦方向回転（ｈｅａｄ−ｏｖｅｒ−ｈｅａｄ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）を用いて、２％ＭＰＢＳ中のホモゲナイズした葉可溶性分画とプレインキュベートした。これらの混合物を葉の粒子に加え、室温で２時間、縦方向回転（ｈｅａｄ−ｏｖｅｒ−ｈｅａｄ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）でインキュベートした。結合ファージを含む葉の粒子を遠心分離により回収し、上清は廃棄した。結合ファージを含む葉の粒子は、ＰＢＳによる連続洗浄によって広く洗浄した。洗浄は、ＰＢＳ中に葉の粒子を再懸濁し、葉の粒子を沈降させ、上清を廃棄することにより実施した。ファージの溶出およびＴＧ１の感染は前述のように実施した。第２ラウンド選択については、無傷の葉全体を使用した。葉は、２％ＭＰＢＳ中ファージ溶液上に浮遊させ上下混合しながらインキュベートし、室温で２時間、ファージを結合させた。葉は、ＰＢＳを入れた新しいチューブに葉を移すことにより広範囲に洗浄した。結合ファージの溶出は水中１００ｍＭ  ＴＥＡで実施し、溶出ファージを含む溶液は、溶出ファージ容量の半分の１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を使用して中和した。ＴＧ１の感染は、前述のように実施した。
【００７９】
選択アウトプットからの単一コロニーの選抜  −  個々のクローンが、ライブラリー２５および３０を用いたアラビアゴムに対する第１ラウンド選択および第２ラウンド選択から選抜された。ライブラリー２７、２８、２９、３１および３２を用いたアラビアゴムに対する選択から、クローンが第２ラウンド選択後に選抜されたが、第１ラウンド選択での選抜はなかった。合計２０８個のクローンがアラビアゴム選択から選抜された。ジャガイモ表皮ＣＤＴＡ抽出物に対する選択から、合計３２１個のクローンが全ライブラリーからの第１ラウンドおよび第２ラウンドの両選択後に選抜された。コムギ表皮ＣＤＴＡ抽出物に対する選択から、合計１６２個のクローンが全ライブラリーからの第２ラウンド選択後に選抜された。ジャガイモ葉の選択から、合計１８４個のクローンが、ライブラリー２７、２８、２９、３０、３１および３２からの第２ラウンド選択後に選抜された。新鮮なＴＧ１細胞を連続希釈した溶出ファージに感染させ、ＬＢ寒天；２％グルコース；１００μｇ／ｍｌアンピシリン上で平板培養した。単一コロニーを、ウェル当たり１００μｌの２ｘＴＹ；１０％グリセロール；２％グルコース；１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する９６ウェルプレート中で選抜した。プレートを３７℃でインキュベートし、マスタープレートとして−８０℃で保存した。
【００８０】
実施例２：
ＶＨＨの特性決定
単一ポイント結合ＥＬＩＳＡ  −  単一ポイント結合ＥＬＩＳＡを使用して、アラビアゴムまたは植物抽出物に結合するクローンを同定した。ＥＬＩＳＡ用のＶＨＨ含有抽出物は、以下のように調製した。１ウェル当たり１００μｌの２ｘＴＹ、２％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む９６ウェルプレートはマスタープレートから接種し、３７℃で一晩増殖させた。１ウェル当たり２５μｌの一晩培養物を使用して、１ウェル当たり１ｍｌの２ｘＴＹ；０．１％グルコース；１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する新しい９６ウェルのディープウェルプレートへ接種した。３時間振盪培養器中で３７℃にて増殖させた後、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで加え、さらなる４時間のインキュベーション中に組換えＶＨＨを産生させた。細胞を３，０００ｇ、２０分間の遠心分離により沈降させ、−２０℃で一晩保存した。細胞ペレットを解凍し、短時間ボルテックスし、１ウェル当たり１２５μｌの室温ＰＢＳを加えた。細胞を１５分間室温でＥＬＩＳＡシェーカープラットフォームに再懸濁した。プレートを３，０００ｇで２０分間遠心分離にかけ、１ウェル当たり１００μｌのＶＨＨ含有抽出物をポリプロピレン製９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に移し、さらに使用するまで−２０℃で保存した。
【００８１】
アラビアゴム選択からのクローンの結合を、炭酸塩緩衝液ｐＨ８．３中１ｍｇ／ｍｌのアラビアゴムを１００μｌ／ウェルでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートで分析した。ジャガイモ表皮ＣＤＴＡ抽出物選択からのクローンの結合は、０．１Ｍ炭酸塩ｐＨ８．３中の３０倍希釈のジャガイモおよび３０倍のコムギ表皮ＣＤＴＡ抽出物の１ウェル当たり１００μｌでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを使用して、ジャガイモ表皮ＣＤＴＡ抽出物およびコムギ表皮ＣＤＴＡ抽出物に対して分析した。コムギ表皮ＣＤＴＡ抽出物選択からのクローンの結合は、０．１Ｍ炭酸塩ｐＨ８．３中の２０倍希釈コムギ表皮ＣＤＴＡ抽出物の１ウェル当たり１００μｌでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを使用して分析した。一晩４℃のコーティングと翌日１時間室温での継続コーティングを行った後、プレートをＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、１．５時間ＰＢＳ中の５％スキムミルクでブロッキングした。プレートを空にし、１ウェル当たり９０μｌの１％ＭＰＢＳを入れた。各クローンからのＶＨＨ含有抽出物１０μｌを（１つまたは複数の）抗原コーティングウェルおよびブランクウェルに添加した。ＶＨＨを室温で１時間結合させ、非結合のＶＨＨをＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄することにより除去した。結合ＶＨＨは、１％ＭＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０中の単クローンマウス抗ヒスチジン抗体（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）および１％ＭＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０中でアルカリフォスファターゼ（ＲａＭ／ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ）とコンジュゲートしているウサギ抗マウスＩｇＧ全分子抗体で連続してインキュベーションすることにより検出した。非結合抗体は、ＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄することにより除去した。プレートをＰＢＳでさらに２回洗浄し、１００μｌのｐＮＰＰ二ナトリウム六水和物基質（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加した。
【００８２】
４０５ｎｍでの吸光度を測定し、（１つまたは複数の）ターゲットコーティングウェルへのＶＨＨ結合とターゲット非コーティングウェルへのＶＨＨ結合の比を各クローンについて算出した。２３％のクローンが２を超える比を有しており、これらのクローンは、さらに詳しい特性決定のために第１の群として選抜された。比が１．１５−２の間で、すべてのクローンの１０％を含むクローンの第２の群は、後で再検討した。比が１．１５未満のクローンは、それ以上分析はしなかった。
【００８３】
葉全体選択からのクローンについて、適したＥＬＩＳＡを開発した。上下混合の浮遊葉片を、抗原を含むコーティングウェルの代わりに使用した。インキュベーションは、抽出物のＥＬＩＳＡと同様に行った。基質とインキュベーションした後、ピンセットを使用して葉片をウェルから取り出し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。得られた各クローンに関するシグナルを、一次抗体インキュベーションなしの葉片を入れたウェルから得たシグナルと比較し、それらの比を算出した。表皮抽出物選択から発見され特性決定された葉表面結合抗体を陽性コントロール抗体として使用した。比が１．５を超えるＶＨＨは、さらにシーケンシングにより分析した。
【００８４】
単一コロニーＰＣＲおよびシーケンシング  −  単一コロニーＰＣＲおよびシーケンシングは、以下のように、ＥＬＩＳＡ陽性クローンに対して実施した。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを入れたマスタープレートウェルからの培養物を、滅菌水で１０倍希釈した。これらの希釈クローンの５μｌを、フォワードプライマーＭＰ５７（５’−ｔｔａｔｇｃｔｔｃｃｇｇｃｔｃｇｔａｔｇ−３’）およびリバースプライマーＧＩＩＩ（５’−ｃｃａｃａｇａｃａｇｃｃｃｔｃａｔａｇ−３’）を使用するＰＣＲ用の鋳型として使用した。ＰＣＲ産物は、プライマーＭＰ５７（ＶＩＢ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｗｅｒｐ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシングにより配列決定した。
【００８５】
抗体産生および精製  −  ＶＨＨ抗体フラグメントは、標準方法に従って、Ｅ．ｃｏｌｉサプレッサー株ＴＧ１または非サプレッサー株ＷＫ６（Ｆｒｉｔｚら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、第１６巻、第１４号、１９８８）で産生した。簡潔に説明すると、コロニー画線培養を行い、単一コロニーの一晩培養物を２ｘＴＹ；２％グルコース；１００μｇ／ｍｌアンピシリン中に接種した。この一晩培養物を使用して、２ｘＴＹ；０．１％グルコース；１００μｇ／ｍｌアンピシリン中に新鮮培養物１：１００で接種した。３時間振盪培養器中で３７℃にて増殖させた後、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで加え、組換えＶＨＨ抗体フラグメントを４時間のさらなるインキュベーション中に産生した。細胞を沈降させ、元の培養物容量の１／５０のペリプラズム抽出緩衝液（５０ｍＭリン酸塩ｐＨ７；１Ｍ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁し、一晩４℃で縦方向回転（ｈｅａｄ−ｏｖｅｒ−ｈｅａｄ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）でインキュベートした。スフェロプラストを４℃で２０分間、３，０００ｇの遠心分離により沈降させた。上清を新しいチューブに移し、再度４℃で２０分間、３，０００ｇの遠心分離を行った。ヘキサヒスチジン標識ＶＨＨ抗体フラグメントを、メーカーの使用説明書に従い、抽出物容量の１／１５のＴＡＬＯＮ金属アフィニティー樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ペリプラズム抽出物から精製した。精製ＶＨＨ抗体フラグメントを濃縮し、メーカーの使用説明書に従い、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５ｋＤａ  ＭＷＣＯ装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を使用してＰＢＳに透析した。
【００８６】
ＥＬＩＳＡにおけるアラビアゴムに対するＶＨＨ結合  −  ＶＨＨ抗体フラグメントの力価測定は、５０ｍＭ炭酸塩ｐＨ９．６中の１００μｇ／ｍｌアラビアゴムをウェル当たり１００μｌでコーティングしたＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，  Ｎｕｎｃ）上で実施した。プレートを４℃で一晩コーティングし、コーティングは翌日室温で１時間継続した。プレートをＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、１時間、ＰＢＳ中の５％スキムミルクでブロッキングした。精製ＶＨＨ抗体フラグメントの４倍連続希釈液をポリプロピレン製９６ウェルプレート中の１％ＭＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０中で調製した。抗体濃度は、３μｇ／ｍｌから１２ｎｇ／ｍｌの範囲であった。抗体希釈液を、アラビアゴムをコーティングしたプレートに移し、室温で１時間、ＶＨＨ抗体フラグメントを結合させた。結合ＶＨＨは、１％ＭＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０中のモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）およびアルカリフォスファターゼとコンジュゲートしているウサギ抗マウスＩｇＧ全分子抗体（ＲａＭ／ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ）での連続したインキュベーションにより検出した。非結合抗体は、各抗体のインキュベーション後、ＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄することにより除去した。プレートをＰＢＳでさらに２回洗浄し、１００μｌのｐＮＰＰ二ナトリウム六水和物基質（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加した。４０５ｎｍの吸光度を測定し、抗体濃度の関数としてプロットした（表１参照）。
【００８７】
【表１】
2013529066.tif 000003
【００８８】
ＥＬＩＳＡにおけるジャガイモレクチンへのＶＨＨ結合
ＰＢＳ中の１００μｇ／ｍｌジャガイモレクチン（Ｓｉｇｍａ）を１ウェル当たり１００μｌでコーティングしたＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，  Ｎｕｎｃ）を４℃で一晩コーティングし、コーティングを翌日室温で１時間継続した。プレートをＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、１時間ＰＢＳ中の５％スキムミルクでブロッキングした。ジャガイモレクチンをコーティングしたプレートにＶＨＨ（３μｇ／ｍｌ）を移し、ＶＨＨ抗体フラグメントを室温で１時間結合させた。結合ＶＨＨは、１％ＭＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０中のモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）およびアルカリフォスファターゼとコンジュゲートしているウサギ抗マウスＩｇＧ全分子抗体（ＲａＭ／ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ）での連続したインキュベーションにより検出した。非結合抗体は、各抗体のインキュベーション後、ＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄することにより除去した。プレートをＰＢＳでさらに２回洗浄し、１００μｌのｐＮＰＰ二ナトリウム六水和物基質（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加し、４０５ｎｍでの吸光度を測定した（表２参照）。
【００８９】
【表２】
2013529066.tif 000004
【００９０】
実施例３：
植物表面への結合ドメインの結合
葉片へのＶＨＨ結合  −  ジャガイモ（品種Ｄｅｓｉｒｅｅ）、イヌホオズキ、雑草、コムギまたはツツジの非固定葉片へのＶＨＨ結合を調査した。比較に関し、ジャガイモ（品種Ｄｅｓｉｒｅｅ）の非固定葉片へのＣＢＭ３ａの結合を並行して分析した。葉片は、５ｍｍのベルト穴パンチャーの道具を用いて新鮮なジャガイモ葉をパンチングすることによって調製した。葉片は、５％のＭＰＢＳまたはＰＢＳをウェル当たり２００μｌ含有する９６ウェルプレートのウェルに直ちに入れ、３０分間インキュベートした。葉片を、２％ＭＰＢＳまたはＰＢＳ中それぞれ５μｇ／ｍｌのＶＨＨ抗体フラグメント、５μｇ／ｍｌのＣＢＭ３ａを含有する溶液に移し、６０−９０分間インキュベートした。非結合のＶＨＨタンパク質またはＣＢＭ３ａタンパク質は、２％のＭＰＢＳまたはＰＢＳで３回洗浄することにより除去した。結合ＶＨＨまたは結合ＣＢＭ３ａタンパク質は、１時間、１％ＭＰＢＳ中のＡｌｅｘａ−４８８蛍光色素（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）と直接結合しているモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体と培養することにより検出した。非結合抗体は、ＰＢＳで３回洗浄することにより除去した。葉片をスライドガラスに置き、カバーグラスでカバーし、顕微鏡検査によって、またはマクロズーム顕微鏡システム（Ｎｉｋｏｎ）もしくはＳＰ５共焦点顕微鏡システム（Ｌｅｉｃａ）で分析した。実施例（限定されるものではない）によって、ＶＨＨ抗体フラグメント（例えば３Ｅ６、５Ｄ４）は、ジャガイモ葉の葉表面の毛状体、気孔およびクチクラに明らかに結合していることが判明した（図１Ａ−Ｃ）。明確な対照において、ＣＢＭ３ａに関し、ジャガイモ葉の表面での結合は検出されず、ジャガイモ葉片の切り口の損傷組織への微弱結合のみが確認された（図１Ｄ）。また本発明の一部のＶＨＨ（例えば３Ｅ６）はイヌホオズキの葉または雑草の葉の表面にも特異的に結合することが示され、それぞれ図１Ｆおよび１Ｇに示された通りである。コムギまたはツツジの葉表面へ有意な結合は認められなかった。
【００９１】
生きている無傷植物へのＶＨＨ結合  −  生きている無傷植物へのＶＨＨの結合は、ジャガイモ鉢植え植物（品種Ｄｅｓｉｒｅｅ）に対して調査した。生きている無傷植物の複葉を、ＰＢＳ中のヘキサヒスチジン標識化ＶＨＨの溶液またはコントロール条件についてはＰＢＳ単独の溶液中に浸漬し、植物に付着している複葉を放置した。ＶＨＨを１時間結合させた。次に、植物にまだ付着している複葉を、エルレンマイヤーフラスコに入れたＰＢＳで５回洗浄した。様々な葉および葉柄切片がサンプリングされた。結合ＶＨＨは、１時間ＰＢＳ中のＡｌｅｘａ−４８８蛍光色素（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）と直接コンジュゲートしているモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体とインキュベーションすることにより検出した。非結合抗ヒスチジン抗体は、ＰＢＳで５回洗浄することにより除去した。葉全体、葉片または葉柄切片は、結合ＶＨＨについて顕微鏡観察により分析した。ＶＨＨは、図２に示したように、葉構造（例えば毛状体および気孔）、葉表面および葉柄切片に結合することが分かった。無関係のコントロールＶＨＨでは結合は認められなかった。このことは、本発明のＶＨＨが生きている無傷植物に特異的に結合することができることを証明している。
【００９２】
水中でのＶＨＨ結合  −  水中の葉表面へのＶＨＨの結合を、ジャガイモ植物（品種Ｄｅｓｉｒｅｅ）の葉からカットした葉片に対して調べた。葉片は、超純水で３回洗浄した。ヘキサヒスチジン標識ＶＨＨを超純水で希釈し、葉片に加え、１時間結合させた。ＶＨＨのストック溶液はＰＢＳに溶解していたが、ここで使用した希釈（５μｇ／ｍｌについては２００倍または５００ｎｇ／ｍｌについては２０００倍）によってストックからの有効なＰＢＳ希釈が得られ、これは水中での結合を示すのに十分に希釈されているものと考えられる。１時間ＶＨＨを結合させた後、葉片を超純水で５回洗浄した。結合ＶＨＨは、１時間、ＰＢＳ中のＡｌｅｘａ−４８８蛍光色素（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）と直接コンジュゲートしているモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体とインキュベーションすることにより検出した。非結合抗ヒスチジン抗体はＰＢＳで５回洗浄することにより除去した。葉片は、結合ＶＨＨについて顕微鏡観察で分析した。ＰＢＳ中のＶＨＨの結合を、コントロール条件として前記で記載されているようにして分析した。Ａｌｅｘａ−４８８蛍光色素とコンジュゲートしている抗ヒスチジン抗体との結合ＶＨＨの検出、非結合の抗ヒスチジン抗体の洗浄および顕微鏡観察による結合ＶＨＨの分析は、水中におけるＶＨＨ結合実験に関して記載したように実施した。ＶＨＨは、水中で葉構造（例えば毛状体および気孔）ならびに葉表面に結合することが分かった。無関係のコントロールＶＨＨとの結合は認められなかった。確認された水中の結合は、ＰＢＳ中で実施した並行実験で確認されたものと類似していた。本発明のＶＨＨは、水中で葉構造物および葉表面に結合することができる。
【００９３】
ＶＨＨ結合動態  −  恐らく結合が施用後に直ちに達成されることが必要とされる、温室または圃場で施用する場合の結合剤としてのＶＨＨの適用可能性をさらに検討するために、葉浸漬ＶＨＨ結合実験を行い、検出可能な結合を達成するためのＶＨＨの最短インキュベーション時間を試験した。直径８ｍｍのジャガイモ葉片（品種Ｄｅｓｉｒｅｅ）をパンチングする道具を使用して切断し、ＰＢＳで３回洗浄した。ヘキサヒスチジン標識ＶＨＨの５μｇ／ｍｌ前希釈液をＰＢＳで調製し、様々な時間で葉片とインキュベートした。インキュベーションの時間は、１０秒、３０秒、１分、５分、２０分または１時間であった。非結合ＶＨＨは、ＰＢＳで５回洗浄することにより除去した。結合ＶＨＨは、１時間、ＰＢＳ中のＡｌｅｘａ−４８８蛍光色素（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）と直接コンジュゲートしているモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体とインキュベーションすることにより検出した。非結合抗ヒスチジン抗体は、ＰＢＳで５回洗浄することにより除去した。葉片は、結合ＶＨＨについて顕微鏡観察で分析した。特異的結合は、特異的ＶＨＨでは、インキュベーション時間１０秒−ＶＨＨインキュベーション１時間の各試料について観察した。無関係のコントロールＶＨＨでは、結合は認められなかった。本発明のＶＨＨは、施用後１０秒以内に、葉構造（例えば毛状体および気孔）ならびに葉表面への検出可能な結合を示す。
【００９４】
様々なｐＨにおけるＶＨＨ結合  −  抗体がそれらのターゲットに自然に結合する生理学的条件から著しく外れるｐＨ値での結合が恐らく生じる可能性がある、温室または圃場で施用する結合剤としてのＶＨＨの適用可能性を検討するため、葉浸漬ＶＨＨ結合実験をｐＨの異なる一連の溶液で行った。以下の溶液を調製した：５０ｍＭのグリシンｐＨ２．０、５０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．０、５０ｍｍの炭酸ナトリウムｐＨ９．６および１０ｍＭの水酸化ナトリウムｐＨ１１．０。直径８ｍｍのジャガイモ葉片（品種Ｄｅｓｉｒｅｅ）をパンチングする道具を使用して切断した。葉片は、まず、異なるｐＨの溶液で３回洗浄することによって異なるｐＨに平衡化した。ヘキサヒスチジン標識ＶＨＨを、異なるｐＨの溶液で５μｇ／ｍｌに希釈し、対応する平衡化した葉片に加え、１時間ＶＨＨを結合させた。ＶＨＨとインキュベーションした後、対応する異なるｐＨの溶液で葉片を３回洗浄した。その後、全部をＰＢＳで２回洗浄し、葉片をＰＢＳに平衡化した。結合ＶＨＨは、１時間、ＰＢＳ中のＡｌｅｘａ−４８８蛍光色素（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）と直接コンジュゲートしているモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体とインキュベーションすることにより検出した。非結合抗ヒスチジン抗体は、ＰＢＳで５回洗浄することにより除去した。葉片は、結合ＶＨＨについて顕微鏡観察で分析した。本発明の一部のＶＨＨ（例えばＶＨＨ  ３Ｅ６）は、ｐＨ２からｐＨ１１の試験した全ての範囲にわたって、葉片への検出可能な結合を示した。
【００９５】
様々な温度におけるＶＨＨ結合  −  結合が様々な温度で、時には極端な温度で恐らく生じる可能性がある、温室または圃場で施用する結合剤としてのＶＨＨの適用可能性を検討するため、様々な温度における葉浸漬ＶＨＨ結合実験を使用した。使用した温度は４℃、室温、３７℃、５５℃または７０℃であった。直径８ｍｍのジャガイモ葉片（品種Ｄｅｓｉｒｅｅ）をパンチングする道具を使用して切断した。葉片は、異なる温度のＰＢＳで３回洗浄することによって異なる温度に平衡化した。ヘキサヒスチジン標識ＶＨＨを、異なる温度のＰＢＳで５μｇ／ｍｌに希釈し、対応する平衡化した葉片に加え、異なる温度で１時間ＶＨＨを結合させた。ＶＨＨとインキュベーションした後、葉片を室温のＰＢＳで５回洗浄した。結合ＶＨＨは、室温で１時間、ＰＢＳ中のＡｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしているモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）とインキュベーションすることにより検出した。非結合抗ヒスチジン抗体は、室温のＰＢＳで５回洗浄することにより除去した。葉片は、結合ＶＨＨについて顕微鏡観察で分析した。本発明の一部のＶＨＨ（例えばＶＨＨ  ３Ｅ６）は、４℃から５５℃の温度範囲にわたって、葉片への検出可能な結合を示した。葉片は１時間７０℃のＰＢＳ中に浸漬した場合に著しく損傷するが、ＶＨＨの結合が依然として検出されたことに注意されたい。
【００９６】
実施例４：
微粒子へのターゲティング剤のカップリング
２価ＶＨＨの構築、産生および精製  −  ２価ＶＨＨ構築物は、ｐＡＳＦ２２ベクター内へ２種のＶＨＨ配列を縦並びでクローニングし、２種のＶＨＨの間における２種のＶＨＨの９グリシン−セリンリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ）との融合を作製することにより、細菌中で産生させた。ｐＡＳＦ２２は、インハウスで製造したｐＭＥＳ誘導体である。使用した標識は、Ｃ末端ｃ−Ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ）およびヘキサヒスチジン（ＨＨＨＨＨＨ）であった。トリプルアラニンリンカー（ＡＡＡ）はＶＨＨのＣ末端とｃ−Ｍｙｃ標識の間に置かれ、グリシンアラニンアラニン（ＧＡＡ）リンカーはｃ−Ｍｙｃ標識のＣ末端とヘキサヒスチジン標識の間に使用した。使用した２価ＶＨＨの完全Ｃ末端配列：ＡＡＡ−ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ−ＧＡＡ−ＨＨＨＨＨＨ。新鮮な一晩培養物は、コロニー画線培養から開始し、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した２ｘＴＹ培地への接種により調製した。この一晩培養物を使用して、０．１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した２ｘＴＹ培地中に新鮮培養物を１：１００で接種した。３時間振盪培養器中で３７℃にて増殖させた後、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加し、組換え２価ＶＨＨを４時間のさらなるインキュベーション中に調製した。細胞を沈降させ、元の培養物容量の１／５０のＰＢＳに再懸濁させ、４℃で３０分間、縦方向回転でインキュベートした。スフェロプラストは、４℃で２０分間、３，０００ｇの遠心分離を行うことによりを沈降させた。上清を新しいチューブに移し、再度４℃で２０分間、３，０００ｇの遠心分離を行った。上清を回収し、塩化ナトリウム濃度を５００ｍＭに調整し、イミダゾール濃度を２０ｍＭに調整した。ヘキサヒスチジン標識２価ＶＨＨは、標準方法に従って、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステム（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ  Ｃｒｕｄｅ  ５  ｍｌ  ＩＭＡＣカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｒｅｐ
ｇｒａｄｅゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して抽出物から精製した。
【００９７】
微粒子へのＶＨＨのカップリング  −  最初に、微粒子に共有結合しているＶＨＨがそれらのターゲットに結合し、微粒子ターゲティングのための抗原含有表面に十分な接着強度を提供することができるかどうかについて試験した。微粒子をアラビアゴム特異的ＶＨＨ抗体フラグメントとカップリングさせ、アラビアゴムでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートへの結合を調べた。
【００９８】
様々なタイプの微粒子を調製した。精製ＶＨＨ抗体フラグメントを、（ｉ）ビーズのＥＤＣ活性化とその後のＶＨＨ抗体フラグメントのカップリングの２工程カップリング化学法を使用して、直径２．８μｍの常磁性体ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）Ｍ−２７０カルボン酸（Ｄｙｎａｌ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にカップリングさせ、（ｉｉ）１工程のカップリング化学法を使用して、直径２μｍのＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ蛍光性ミクロスフェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にカップリングさせた。両方とも製造者の説明書に従った。
【００９９】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０カルボン酸へのカップリングについて簡潔に説明すると：ＶＨＨを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５ｋＤａスピンフィルター装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を使用して５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．０に透析した。ビーズは１０ｍＭのＮａＯＨによる連続２回洗浄、および水による３回洗浄により調製し、室温で３０分間、０．１ＭのＥＤＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）で活性化した。ＥＤＣ活性化ビーズは、氷冷水および氷冷５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．０による速やかな連続洗浄により洗浄した。ビーズは最終洗浄で分配した。１００μｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．０中のＶＨＨ抗体フラグメント６０μｇを３ｍｇのビーズに加え、室温で３０分間インキュベートした。カップリング後に上清を回収した。非結合画分のタンパク質Ａ２８０を測定することによって、カップリングＶＨＨおよび非カップリングＶＨＨの量を算出した。９５％を超えるＶＨＨ抗体フラグメントがビーズにカップリングされた。ビーズを５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．４でブロッキングし、ＰＢＳ／０．１％−Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、４℃で保存した。ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ蛍光性ミクロスフェアへのカップリングについて簡潔に説明すると：ＶＨＨを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５ｋＤａスピンフィルター装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を使用して、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．０に透析した。０．８μｍ  ＰＥＳフィルター装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を使用し、その手順により、溶液からビーズを単離させた。ビーズを超純水で洗浄し、超純水中に再懸濁させて調製した。２００μｇのＶＨＨを含有するＶＨＨ抗体フラグメント１００μｌを１００μｌのビーズに加えた。ビーズとＶＨＨのそれぞれの混合物に０．８ｍｇのＥＤＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、ｐＨを０．１ＭのＮａＯＨで６．５に調整した。カップリングは室温で２時間実施した。グリシンを１００ｍＭの最終濃度まで加え、室温で３０分間インキュベートして反応をクエンチした。非結合画分のタンパク質Ａ２８０を測定することにより、カップリングＶＨＨおよび非カップリングＨＨの量を算出した。１４％−３３％の様々なＶＨＨ抗体フラグメントがビーズにカップリングされた。ビーズを５０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．４；０．９％ＮａＣｌ（５０ｍＭ  ＰＢＳ）で２回洗浄し、５０ｍＭ  ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、２ｍＭアジ化ナトリウム中で保存した。
【０１００】
蛍光性トレーサーまたは活性成分を含有するマイクロカプセルへのターゲティング剤のカップリング  −  ポリ尿素マイクロカプセルは界面重合法により製造した。官能性ポリ尿素マイクロカプセルを生成する目的で、殺虫剤ラムダシハロスリンまたは蛍光性トレーサー分子Ｕｖｉｔｅｘ  ＯＢおよび表面露出のカルボン酸残基にリシンが組み込まれているシェルを含有するマイクロカプセルにＶＨＨをカップリングさせた。ラムダシハロスリンは、カプセル化の前に、３０％−６６％の濃度で安息香酸ベンジル中に溶解させた。あるいは、マイクロカプセルの蛍光可視化を容易にするために、安息香酸ベンジル中の１．５％Ｕｖｉｔｅｘのコアを使用した。トルエンジイソシアネート（ＴＤＩ）およびポリメチレンポリフェニレンイソシアネート（ＰＭＰＰＩ）を、異なる比および油相中濃度で油相に溶解させ、所望のシェル特性を得た。エマルションに対する撹拌速度は、液滴サイズ、したがってマイクロカプセル直径を調節するために変動させた。直径が約５μｍ、１０μｍまたは５０μｍのマイクロカプセルが良好に得られた。二官能性リシンおよび三官能性ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）を異なる比で使用し、および／またはカプセル化中に、一方ではマイクロカプセル表面上のカルボン酸の量を最大限にするように、一方ではカプセルシェルの十分な強度が得られるように、連続的に加えた。マイクロカプセルは製造後に水で洗浄し、水中のマイクロカプセル懸濁液として保存した。マイクロカプセルは、ＶＨＨのカップリング直前に、真空気密濾過フラスコおよびＰ  １．６濾過漏斗（Ｄｕｒａｎ）を使用し、１００ｍＭ  ＭＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で洗浄した。あるいは、０．４５μｍの使い捨て濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えたガラスフィルターホルダーまたは０．４５μｍ９６ウェルのディープウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した。マイクロカプセルへのＶＨＨのカップリングは、１工程方法を使用するカルボジイミド介在カップリング、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）なしの２工程方法またはＮＨＳを用いる２工程方法を使用して実施した。１工程カップリング方法と２工程カップリング方法の主たる違いは、１工程カップリング方法におけるＶＨＨの架橋の発生である。これら３つの方法のプロトコルはほとんど同じであり、以下のように異なる。１工程について、カップリングＶＨＨを洗浄したマイクロカプセルに加え、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、室温で２時間、カップリング反応させた。２工程カップリングについて、まず、洗浄マイクロカプセルをＮＨＳの存在下または非存在下でＥＤＣにより活性化した。過剰の未反応ＥＤＣ（およびＮＨＳ）を氷冷緩衝液で速やかに連続洗浄して除去し、ＶＨＨを加え、マイクロカプセルシェル上の活性化カルボン酸と反応させた。直径１０μｍのマイクロカプセルに関し、マイクロカプセル１ｍｇ当たり２−２０μｇのＶＨＨをカップリングさせた。別の直径を有するマイクロカプセルについて、量をそれに応じて計量した。ＶＨＨのカップリング後、マイクロカプセルをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中で保存した。ＶＨＨのカッ���リングの成功は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるカップリング効率の分析およびＡｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしている抗ヒスチジン抗体を使用する顕微鏡観察またはＳＰ５共焦点顕微鏡システム（Ｌｅｉｃａ）による結合ヘキサヒスチジン標識化ＶＨＨの分析を組み合わせて使用することにより調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、マルチマーの形成が予想通り、１工程のカップリング反応で確認された。ＶＨＨカップリングマイクロカプセルは、室温で１時間、抗ヒスチジン抗体で標識化した。非結合抗ヒスチジン抗体は、０．４５μｍ９６ウェルのディープウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＰＢＳで５回洗浄することにより除去した。カップリングＶＨＨを含むマイクロカプセル、ＥＤＣ無添加のＶＨＨでインキュベートしたマイクロカプセルおよびブランクのマイクロカプセルを比較した。マイクロカプセルの抗ヒスチジン標識は、図３に示すように、１工程または２工程のカップリング方法を使用してＶＨＨをカップリングさせたマイクロカプセルに対して最も強かった。また、一部のＶＨＨがマイクロカプセルに受動的に吸着されたことも認められた。ＶＨＨは、１工程または２工程のカップリング方法を使用し、様々なサイズのマイクロカプセルにカップリングさせることに成功した。
【０１０１】
実施例５：
抗原含有表面へのターゲティング剤カップリングマイクロ粒子の結合
ＶＨＨカップリングビーズまたはマイクロカプセルを用いた結合アッセイ  −  ＶＨＨカップリング微粒子の機能性を、５０ｍＭ炭酸塩ｐＨ９．６またはＰＢＳ中の１００μｇ／ｍｌアラビアゴムでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートで調べた。コーティングを一晩実施し、プレートをＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、１．５時間ＰＢＳ中の５％スキムミルクでブロッキングした。ＶＨＨカップリング常磁性体ビーズを５０倍希釈し、１時間、１％ＭＰＢＳＴ中のＡｌｅｘａ−４８８蛍光色素と直接コンジュゲートしているモノクローナルマウス抗ヒスチジン抗体（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）とインキュベートした。ＶＨＨコンジュゲート常磁性体ＤｙｎａｂｅａｄｓおよびＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ蛍光ビーズの２倍連続希釈液（５０−８００倍）を２％ＭＰＢＳ中で調製し、アラビアゴムをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。非結合ビーズは、ＰＢＳ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄することにより除去した。ＥＬＩＳＡプレートウェルの底を、結合ビーズについて顕微鏡観察により分析した。ビーズのカウント、分析した表面積の計算への顕微鏡カメラマスクの使用が、表３に示したように、ウェル当たりの結合ビーズ数の計算に用いられた。あるいは、微粒子は、マクロズーム顕微鏡システム（Ｎｉｋｏｎ）を利用して視覚化し、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ画像分析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してカウントした。１ウェル当たりの結合Ｆｌｕｏｓｐｈｅｒｅｓの数を表４に示す。
【０１０２】
【表３】
2013529066.tif 000005
【０１０３】
【表４】
2013529066.tif 000006
【０１０４】
ＥＬＩＳＡに類似のアッセイセットアップを使用し、抗原含有表面へのＶＨＨカップリングマイクロカプセルの相互作用を評価した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｕｎｃ）または高結合ハーフエリアマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ））をアラビアゴムまたはジャガイモレクチンでコーティングした。コーティングは、ＰＢＳ中の１００μｇ／ｍｌアラビアゴムまたはジャガイモレクチンで一晩実施した。コントロールウェルは、ブランクウェルまたは無関係の抗原でコーティングしたウェルを包含していた。プレートを０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、１−２時間、ＰＢＳ中の５％スキムミルクでブロッキングした。ＶＨＨカップリングラムダシハロスリン含有マイクロカプセルまたはＵｖｉｔｅｘ含有マイクロカプセルは、０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中の１％スキムミルクで適切な密度まで希釈した。マイクロカプセルを、抗原コーティングウェルまたはコントロールウェルに加え、１時間結合させた。非結合マイクロカプセルは０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで５回洗浄することにより除去した。ＥＬＩＳＡプレートウェルの底は、結合マイクロカプセルについて、マクロズーム顕微鏡システム（Ｎｉｋｏｎ）で分析した。マイクロカプセルは、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ画像分析ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用してカウントした。ＤＡＰＩフィルターを使用して、Ｕｖｉｔｅｘマイクロカプセルを視覚化した。白色ＬＥＤ照明および明視野画像をラムダシハロスリンマイクロカプセルに使用した。ラムダシハロスリン含有マイクロカプセルまたはＵｖｉｔｅｘ含有マイクロカプセルに関するコントロールは、ブランクのマイクロカプセルおよび無関係のＶＨＨがカップリングされたマイクロカプセルを包含していた。
【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
別の実験において、ラムダシハロスリンの量も分析により測定した。１００μｌ／ウェルのアセトンを、結合マイクロカプセルと共に洗浄ウェルに加え、内部標準として０．０５％リン酸トリフェニルを含有するヘキサン１０ｍｌを入れたガラスバイアルに移した。ラムダシハロスリンの量は、ＧＣ／ＭＳ−ＭＳ分析により検量溶液と比較して測定した。ラムダシハロスリンマイクロカプセルに対するコントロールは、ＶＨＨがカップリングされていなかったブランクのマイクロカプセルおよび無関係のＶＨＨがカップリングされたマイクロカプセルを包含していた。またコントロールは、アラビアゴムまたはジャガイモレクチンをコーティングしていなかったウェルも包含していた。ラムダシハロスリンマイクロカプセルを用いたＥＬＩＳＡ類似アッセイの結果により、本発明の一部のＶＨＨ（例えばＶＨＨ３Ｅ６）は抗原コーティング表面にマイクロカプセルを結合および保持することが可能であることが確認され、その結果、抗原でコーティングされたウェル中のラムダシハロスリンの量がブランクのマイクロカプセルと比較して２３倍に増加し、抗原でコーティングしていないブランクのウェルに対して２７倍の増加が測定された。
【０１０７】
マイクロカプセル結合アッセイの結果に基づき、ＶＨＨは、表面へマイクロカプセルを結合および保持することが可能であるまたは不可能であるというように分類することができる。本発明のＶＨＨの一部（例えばＶＨＨ３Ｅ６）は、マイクロカプセルにカップリングした場合、抗原コーティング表面に特異的に結合することが可能であることを示した。無関係の抗原を有する表面への有意な結合は認められなかった。さらに、この特異的結合は、洗浄工程中に起こる剪断力に対して結合力が明らかに耐えるので、抗原コーティング表面にマイクロカプセルを保持するのに十分な強度があった。その上、殺虫剤ラムダシハロスリンを含有するマイクロカプセルを用いた実施例で明らかなように、ＶＨＨは、関連活性成分を含有するマイクロカプセルを表面に結合および保持することが可能であるということである。
【０１０８】
次に、マイクロカプセルの表面への結合が、多価性ＶＨＨを含むターゲティング剤を使用することで改善される可能性があるかどうかについて調べた。同量の１価ＶＨＨ、２価ＶＨＨおよび無関係のＶＨＨを使用し、並行して一連のカップリングを実施した。実施例４に記載しているように、ＶＨＨおよび多価性ＶＨＨの成功したカップリングについて分析した。ＥＬＩＳＡ類似アッセイは、５μｇ／ウェルのジャガイモレクチンでコーティングした高結合ハーフエリアマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）を使用して実施した。コントロールウェルには、ブランクのウェルまたは無関係の抗原でコーティングしたウェルが含まれていた。プレートは、０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、１−２時間ＰＢＳ中の５％スキムミルクでブロッキングした。ＶＨＨカップリングＵｖｉｔｅｘ含有マイクロカプセルは、０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中の１％スキムミルクで適切な密度まで希釈された。５倍連続希釈系を調製し、表面へ結合させ、１価または２価のＶＨＨとカップリングしたマイクロカプセルのカップリングと比較した。マイクロカプセルを、抗原をコーティングしたウェルまたはコントロールウェルに加え、１時間結合させた。非結合マイクロカプセルは、０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで５回洗浄することにより除去した。ＥＬＩＳＡプレートウェルの底は、結合マイクロカプセルについて、マクロズーム顕微鏡システム（Ｎｉｋｏｎ）で分析した。マイクロカプセルは、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ画像分析ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用してカウントした。ＤＡＰＩフィルターを使用してＵｖｉｔｅｘマイクロカプセルを視覚化した。２価ＶＨＨは、マイクロカプセルにカップリングした場合に抗原コーティング表面へ特異的に結合することが可能であることを示し、複数のマイクロカプセルが、１価ＶＨＨを含むマイクロカプセルと比較して、２価ＶＨＨを使用して保持された。高密度のマイクロカプセルの施用により（ウェルの底表面を完全に覆うと計算される）、１価ＶＨＨを含む同量のマイクロカプセルと比較して、１７％を超えるカップリング２価ＶＨＨを含むマイクロカプセルがウェル中に保持されたことが分かった。また２５倍未満のマイクロカプセルを施用した場合、１価ＶＨＨを含むマイクロカプセルと比較して、２価ＶＨＨとカップリングしているマイクロカプセルについて、１６０％を超えるマイクロカプセルがウェル中に保持されたことが分かった。カップリング２価ＶＨＨを含むマイクロカプセルの表面積は、このマイクロカプセル密度で施用したブランクのマイクロカプセルの表面積より１５倍上回り、一方、１価ＶＨＨを含むマイクロカプセルの表面積は、このマイクロカプセル密度で施用したブランクのマイクロカプセルの表面積を６倍しか上回っていなかった。この違いは、１価ＶＨＨに比べて、２価ＶＨＨには付加的アビディティーに基づく結合力の増加があることによって説明することができる。また、これは、２価ＶＨＨを使用すると、マイクロカプセル上のカップリングされたターゲティング剤の可撓性およびスペーサー長、または両方の組み合わせが増加するということでもあり得る。
【０１０９】
【表６】
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【０１１０】
葉片結合アッセイを使用して、ＶＨＨカップリングマイクロカプセルとジャガイモ、雑草およびツツジの葉の相互作用を評価した。直径８ｍｍの葉片をジャガイモ鉢植え植物（品種Ｄｅｓｉｒｅｅ）の葉から、温室栽培のペレニアル・ライグラス（Ｌｏｌｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）の葉から、ツツジ鉢植え植物の葉からサンプリングした。葉片をＰＢＳで３回洗浄した。ラムダシハロスリンまたはＵｖｉｔｅｘを含有するマイクロカプセルは、０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中の１％スキムミルクで適切な密度まで希釈した。マイクロカプセルを葉片に加え、マイクロカプセルを沈降させ、１時間ターゲティング剤と結合させた。非結合マイクロカプセルは、０．０５％−Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３−５回洗浄することにより除去した。
【０１１１】
ラムダシハロスリンマイクロカプセルについて、残留分析を実施し、ジャガイモ葉片上のラムダシハロスリン量を測定した。洗浄した結合マイクロカプセル含む葉片をガラスバイアルに移し、マイクロカプセルをアセトンに溶解させた。試料は、内部標準として０．０５％リン酸トリフェニルを含有するヘキサンを添加することにより希釈した。ラムダシハロスリンの量は、ＧＣ／ＭＳ−ＭＳ分析により検量溶液と比較して測定した。ラムダシハロスリンマイクロカプセルに対するコントロールは、ＶＨＨがカップリングされなかったブランクのマイクロカプセル、および無関係のＶＨＨがカップリングされたマイクロカプセルを含んでいた。ラムダシハロスリンマイクロカプセルを用いる葉片結合アッセイの結果により、本発明のＶＨＨの一部は、葉表面へのマイクロカプセルの結合および保持を可能とすることが判明し、その結果、ＶＨＨがカップリングされなかったブランクのマイクロカプセルまたは無関係のＶＨＨがカップリングされたマイクロカプセルと比較して、葉片上のラムダシハロスリンの量がそれぞれ３．３倍および２．２倍増加した。
【０１１２】
Ｕｖｉｔｅｘマイクロカプセルを有する葉片を、結合マイクロカプセルについて、マクロズーム顕微鏡システム（Ｎｉｋｏｎ）で分析した。マイクロカプセルは、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ画像分析ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用してカウントした。ＤＡＰＩフィルターを使用してＵｖｉｔｅｘマイクロカプセルを視覚化した。Ｕｖｉｔｅｘマイクロカプセルに対するコントロールは、ＶＨＨがカップリングされなかったブランクのマイクロカプセルおよび無関係のＶＨＨがカップリングされたマイクロカプセルを含んでいた。Ｕｖｉｔｅｘマイクロカプセルを用いた葉片結合アッセイの結果によると、本発明の一部のＶＨＨ（例えばＶＨＨ  ３Ｅ６）は、葉表面にマイクロカプセルを特異的に結合および保持することが可能であることを示すことがわかった。
【０１１３】
ジャガイモ葉片における、ＶＨＨ  ３Ｅ６とカップリングしているマイクロカプセルの特異的結合は、図４で明らかなように、ブランクのマイクロカプセルと比較して９倍を超えるマイクロカプセルが葉表面に結合しており、無関係のＶＨＨとカップリングしているマイクロカプセルと比較して６倍を超えるマイクロカプセルが葉表面に結合されていた。雑草葉片における、ＶＨＨ  ３Ｅ６とカップリングしたマイクロカプセルの特異的結合は、ブランクのマイクロカプセルと比較して３倍を超えるマイクロカプセルが葉表面に結合しており、無関係のＶＨＨとカップリングしているマイクロカプセルと比較して２倍を超えるマイクロカプセルが葉表面に結合していた。ツツジ葉片上では、ＶＨＨ  ３Ｅ６とカップリングしているマイクロカプセルの特異的結合は認めることができなかったが、これは、実施例３で示した、ＶＨＨの植物種に関連した結合特異性に全く類似している。
【０１１４】
力価実験を実施し、特異的ＶＨＨを含むマイクロカプセルのどのくらいの希釈係数が、ＶＨＨがカップリングされなかったマイクロカプセルの同一処理後に同量のマイクロカプセルを得る施用に対応するのか調べた。マイクロカプセルの２倍連続希釈液を調製し、葉片結合をこれらの希釈系列に対しジャガイモ葉片上で分析した。用量実験から、図５で明らかなように、特異的なＶＨＨを含むマイクロカプセルの８倍低濃度が、非機能性マイクロカプセルと比較して、葉片に特異的に結合されている同量のマイクロカプセルをもたらすことが計算された。この実験から、本発明によるＶＨＨの１つを農薬含有微小担体にカップリングすることにより、農薬の適切用量の有効な軽減を達成することができることが明らかである。
【０１１５】
実施例６：
生きている無傷植物表面に対するターゲティング剤カップリングマイクロカプセルの堆積および保持
カップリングされたターゲティング剤を含む担体の堆積および保持に関する効果を、温室栽培したジャガイモ鉢植え植物（品種Ｄｅｓｉｒｅｅ）全体を用いた実験で調べた。特異的ＶＨＨとカップリングしているマイクロカプセル、無関係のコントロールＶＨＨとカップリングしているマイクロカプセルまたはブランクのマイクロカプセルを異なる植物から得た複数の複葉全体に施用した。合計で１５植物を異なる処理に使用した。マイクロカプセル懸濁液は、葉表面上に６．４％被覆率のマイクロカプセルが施用されるように算出した。複葉は、マイクロカプセル葉片結合アッセイ（上記参照）に関する方法と同様の方法でマイクロカプセル懸濁液に沈降させたが、変更したのはマイクロカプセルの沈降およびＶＨＨの結合をわずか１５分間にさせたことであった。植物は、マイクロカプセルの施用後、１時間、乾燥させた。それぞれの複葉のうちの各ペアの対の葉の１つをサンプリングし、それ以上いかなる処理を行うことなく分析した。マイクロカプセルにカップリングしている特異的ＶＨＨのマイクロカプセル堆積に対する効果は、異なる施用から得たこれらの葉を用いて分析することができる。サンプリングした葉のみを失った植物全体は、マイクロカプセルにカップリングしている特異的ＶＨＨの降雨事象後の保持に関する効果および堆積および保持を合わせた効果を調べるためにさらに処理した。４５秒に１Ｌ／ｍ２の微細液滴による降雨シミュレーション（ＳＳＣＯＴＦＶＳ２  ノズルタイプ）を使用し、保持効果を調べた。既にサンプリングした葉の反対の葉を降雨シミュレーション後にサンプリングした。Ｕｖｉｔｅｘマイクロカプセルを含む葉全体を、結合マイクロカプセルについてマクロズーム顕微鏡システム（Ｎｉｋｏｎ）で分析した。マイクロカプセルは、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ画像分析ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用してカウントした。ＤＡＰＩフィルターを使用してＵｖｉｔｅｘマイクロカプセルを視覚化した。降雨事象の前にサンプリングした葉から、特異的ターゲティング剤を含むマイクロカプセルに関し、ブランクのマイクロカプセルと比較して、既に２．７倍を超えるマイクロカプセルが堆積していることが算出された。無関係のコントロールターゲティング剤を有するマイクロカプセルを有する葉は、ブランクのマイクロカプセルと比較して０．８割合のマイクロカプセルしか含有していなかった。これは、特異的ＶＨＨが、植物に対するマイクロカプセルの堆積に対して有効作用を既に有していることを示す。特異的ＶＨＨを含むマイクロカプセルの平均で６９（±８）％が降雨事象後に保持されたが、無関係のコントロールＶＨＨがカップリングされているマイクロカプセルおよびブランクのマイクロカプセルについては、それぞれ、３５（±１７）％および３９（±４）％のマイクロカプセルしか保持されなかった。堆積効果および保持効果の組み合わせにより、特異的ＶＨＨを含むマイクロカプセルまたは無関係のコントロールＶＨＨを含むマイクロカプセルに関する植物全体の葉上のマイクロカプセル量は、ブランクのマイクロカプセルと比較して、それぞれ５倍および０．９倍であった。この実験から、特異的ＶＨＨは、生きている無傷植物全体に対する担体の��達および特異的結合を可能にする優れたターゲティング剤であることが明らかである。農薬または農薬の組み合わせを含有する担体にカップリングされている本発明のターゲティング剤の堆積の改善および保持の改善の結果として、植物表面に特異的に前記農薬を送達すること、それにより、植物表面に堆積した前記農薬の量の増加、または類似効果を維持しながら可能な施用量の軽減、または類似効果を維持しながら可能な施用頻度の軽減、または前記農薬の雨耐性の可能な改善、または前記農薬に対する特定の特異性の誘導、または前述の任意の組み合わせが大いに期待される。
【０１１６】
【表７】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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