(57)【要約】  本発明は、野生型と比べて組み換えによって改変され、かつ自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む細胞であって、該自己蛍光タンパク質の発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する、細胞に関する。本発明はまた、特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞を特定する方法、野生型と比べて組み換えによって改変されていて、かつ特定の代謝産物の最適化された生産を示す細胞を製造する方法、該方法によって得られる細胞、代謝産物の製造方法、および混合物の調製方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型と比べて遺伝的に改変され、かつ自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む細胞であって、ここで該自己蛍光タンパク質の発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する、細胞。
【請求項２】
自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現の制御が、転写レベルで特定の代謝産物の細胞内濃度に応じて達成される、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列が異種プロモーターの制御下にあり、該異種プロモーターが、野生型細胞での発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する遺伝子の発現を野生型の細胞において制御するものである、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現の制御が翻訳レベルで特定の代謝産物の細胞内濃度に応じて達成される、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列が、転写レベルまたは翻訳レベルで自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現を調節するリボスイッチの機能をmRNAレベルで果たすDNA配列に機能的に結合している、請求項２または４に記載の細胞。
【請求項６】
細胞がコリネバクテリウムまたはエシェリキア属の細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
代謝産物が、アミノ酸、ヌクレオチド、脂肪酸および炭水化物からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
代謝産物がアミノ酸である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
アミノ酸がL-リシンである、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
プロモーターがlysEプロモーターであり、かつ遺伝子がlysE遺伝子である、請求項２および６〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
自己蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質(GFP)またはこのタンパク質の変異体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
細胞懸濁液中で特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞を特定するための方法であって、以下の方法ステップ:
(i)  請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞懸濁液を提供するステップ;
(ii)  細胞を遺伝的に改変して、細胞が特定の代謝産物の細胞内濃度において異なる細胞懸濁液を得るステップ;
(iii)  細胞内蛍光活性の検出によってこの特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞懸濁液中の個別の細胞を特定するステップ
を含む、方法。
【請求項１３】
方法ステップ(ii)の遺伝的改変を非標的化突然変異誘発によって行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
以下の方法ステップ:
(iv)  特定された細胞を細胞懸濁液から分離するステップ
をさらに含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
フローサイトメトリーによって分離を行う、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
特定の代謝産物の生産が最適化されている、野生型と比べて遺伝的に改変された細胞を製造するための方法であって、以下の方法ステップ:
(I)  請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞懸濁液を提供するステップ;
(II)  細胞を遺伝的に改変して、細胞が特定の代謝産物の細胞内濃度において異なる細胞懸濁液を得るステップ;
(III)  細胞内蛍光活性の検出によって特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞懸濁液中の個別の細胞を特定するステップ;
(IV)  特定された細胞を細胞懸濁液から分離するステップ;
(V)  特定の代謝産物の細胞内濃度の増加の原因となる、特定されかつ分離された細胞中の遺伝的に改変された遺伝子G1〜Gnまたは突然変異M1〜Mmを特定するステップ;
(VI)  野生型と比べて遺伝的に改変され、特定の代謝産物の生産が最適化されている細胞であってそのゲノムが遺伝子G1〜Gnの少なくとも1つおよび/または突然変異M1〜Mmの少なくとも1つを含む細胞を、製造するステップ
を含む、方法。
【請求項１７】
方法ステップ(II)の遺伝的改変を非標的化突然変異誘発によって行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の方法によって得られる細胞。
【請求項１９】
代謝産物の製造方法であって、以下の方法ステップ:
(a)  請求項１６または１７に記載の方法によって、特定の代謝産物の生産が最適化されている、野生型と比べて遺伝的に改変された細胞を、作製するステップ;
(b)  栄養素を含む培養培地中で、細胞が栄養素から特定の代謝産物を生産する条件下で細胞を培養するステップ
を含む、方法。
【請求項２０】
代謝産物が、アミノ酸、ヌクレオチド、脂肪酸および炭水化物からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
代謝産物がアミノ酸である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
アミノ酸がL-リシンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
混合物の調製方法であって、以下の方法ステップ:
(A)  請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法によって代謝産物を製造するステップ;
(B)  代謝産物を、該代謝産物とは異なる混合物成分と混合するステップ
を含む、方法。
【請求項２４】
代謝産物がL-リシンであり、かつ混合物が食品または医薬組成物である、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型と比べて遺伝的に改変されている細胞、特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞を特定するための方法、特定の代謝産物の生産が最適化されている、野生型と比べて遺伝的に改変されている細胞の製造のための方法、該方法によって得られる細胞、代謝産物の製造方法、および混合物の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物学的に製造される代謝産物は多大な経済的関心を引いている。例えば、L-リシン、L-スレオニン、L-メチオニンおよびL-トリプトファンなどのアミノ酸は飼料添加物として使用され、L-グルタミン酸は香辛料添加物として使用され、L-イソロイシンおよびL-チロシンは医薬品産業で使用され、L-アルギニンおよびL-イソロイシンは医薬として使用され、また、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸およびL-フェニルアラニンはファインケミカルの合成の出発物質として使用される。産業的観点から重要な代謝産物の別の例はオキソグルタル酸であり、オキソグルタル酸は栄養補助食品として使用されるか、または成長ホルモンおよびインスリンの放出を促進するアルギニンα-ケトグルタル酸の前駆体として使用される。
【０００３】
そのような代謝産物の製造のための好ましい方法は、微生物を用いる生物工学的製造である。アミノ酸の製造では、特に、生物活性および光学活性型の特定の代謝産物をこの様式で直接得ることができ、およびさらに単純でかつ安価な原材料を用いることもできる。用いられる微生物は、例えばCorynebacterium glutamicum、その関連種ssp. flavumおよびssp. lactofermentum (Liebl et al., Int. J System Bacteriol. 1991, 41: 255 to 260)またはEscherichia coliおよび関連細菌である。
【０００４】
微生物学的経路による上記代謝産物の製造では、特定の代謝産物の生合成の調節が、微生物が自身の必要量を超えてそれを生産し、培地中に分泌するように従来法により突然変異によって改変される。例えば、WO-A-2005/059139は、遺伝的に改変されたCorynebacterium glutamicum株を用いるL-リシンの製造を開示する。該製造では、ペントースリン酸代謝経路による代謝を向上させることによってL-リシン生産の増加が達成される。WO-A-97/23597では、微生物中のアミノ酸、例えばL-リシンの生産の増加は、細胞から前記アミノ酸を流出させる輸出担体の活性を増加させることによって達成される。
【０００５】
そのような過剰生産体は、該代謝産物を特に大量に生産する突然変異体の検索によって従来法により得られる。この検索は「スクリーニング」と称される。スクリーニングでは、通常、慣用の化学的または物理的変異誘発物質(例えばMNNGまたはUV)を用いて出発株でランダム突然変異(非標的化突然変異誘発)を誘発し、慣用の微生物学的方法を使用して突然変異体を選択する。代謝産物過剰生産体を提供するための別の可能性は、標的遺伝子の過剰発現または欠失によって、または競合する合成経路を無効化することによって特定の合成経路を増強することを含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、ここでの問題は、非標的化突然変異誘発の場合、特に細胞の収集物中、いずれの細胞で、目的の代謝産物の細胞内合成の増加を生じさせる突然変異が生じているかを検出することが困難であることである。これに必要とされるスクリーニング方法は、非常に時間がかかり、かつ費用がかかる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、特定の代謝産物を過剰生産する遺伝的に改変された細胞の検出に関して、先行技術に起因する不都合を克服する目的に基づくものであった。
【０００８】
特に、本発明は、突然変異後に、特定の代謝産物の過剰生産を生じさせる突然変異体を単純な方法で特定でき、かつ場合により残りの細胞から分離することができる遺伝的改変細胞を提供する目的に基づくものであった。
【０００９】
本発明の基礎となる別の目的は、特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞の特定のための方法を提供することからなるものであった。該方法は、特に単純でかつ安価な様式で、多数の細胞中または多数の細胞からの、例えば細胞懸濁液中または細胞懸濁液からのそのような細胞の特定および場合により標的化された分離を可能にする。
【００１０】
本発明はまた、上記スクリーニング方法によってこの代謝産物の過剰生産に好都合であると特定されている遺伝子または突然変異が、標的化された様式で導入されるか、または標的化突然変異によって作製される、特定の代謝産物の生産が最適化されている細胞を提供する目的に基づくものであった。
【００１１】
野生型と比べて遺伝的に改変され、かつ自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む細胞であって、自己蛍光タンパク質の発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する細胞は、上記目的の達成に貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の細胞の第1の実施形態の自己蛍光タンパク質(afp)の遺伝子配列がプロモーター(lysEプロモーター)の制御下にある構築物の候補を示す。
【図２】図２は、実施例1で作製されたベクターpJC1lysGE'eYFPを示す(lysE'eYFP、LysE'eYFP融合タンパク質のコード配列; lysG、調節因子タンパク質LysGのコード配列; kanR、カナマイシン媒介耐性のコード配列; repA: 複製開始点; BamHI: 制限酵素BamHIの認識配列および切断部位)。
【図３】図３は、実施例1で得られたATCC 13032 pJC1lysGE'eYFP株(上)およびDM1800 pJC1lysGE'eYFP株(下)の共焦点顕微鏡像を示す。下画像の白色バーは長さ10μmに相当する。各場合について、3μlの細胞懸濁液をスライドに載せ、1 %アガロースの薄層によって固定した。固定された懸濁液を波長514 nmおよび照射時間700 msの光で励起させた。505 nm〜550 nmの範囲の広帯域フィルターを使用してZeiss AxioImager M1でeYFPの蛍光発光測定を行った。
【図４】図４は、リボスイッチ要素に基づいて実施例2で作製された遺伝子配列の配列を示し、該配列は、リボスイッチ要素および、このリボスイッチ要素に機能的に連結されかつ自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む(太字: アプタマー; イタリック体: ターミネーター配列; 下線: EYFP)。
【図５】図５はベクターpJC1lrp-brnF'eYFPを示す。
【図６】図６は、内部L-メチオニン濃度と、実施例3で得られたATCC13032pJC1lrp-brnF'-eYFP培養物の蛍光出力シグナルとの相関を示す。
【図７】図７は、実施例4(c)での出発株ATCC13032pSenLysTK-Cの突然変異体によるリシンの形成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書中で使用される用語「代謝産物」とは、かなり全般的に、生化学的代謝経路の中間代謝物を意味すると理解されるものとし、本発明では、アミノ酸(amine acids)またはアミノ酸誘導体、例えばL-イソロイシン、L-ロイシン、L-バリン、L-リシン、L-アルギニン、L-シトルリン、L-ヒスチジン、L-メチオニン、L-システイン、L-トリプトファン、L-グリシンまたはO-アセチル-L-セリン、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体、例えばキサンチン、GTPまたはサイクリックジグアノシン一リン酸、脂肪酸または脂肪酸誘導体、例えばアシル補酵素Aチオエステル、糖または糖誘導体、例えばグルコース、ラムノース、リブロースビス-リン酸、ベータ-D-ガラクトシドまたはD-グルコサミン6-リン酸、ケト酸、例えばオキソグルタル酸、抗生物質、例えばチエナマイシン、アビラマイシン、ノカルジシンまたはテトラサイクリン、ビタミンまたはビタミン誘導体、例えばビオチンまたはチアミンピロリン酸、またはプリンアルカロイド、例えばテオフィリンを意味すると理解されるものとする。上記代謝産物の「誘導体」とは、特に、対応する化合物のアミン、リン酸化合物またはエステルを意味すると理解される。非常に特に好ましい代謝産物は、アミノ酸、特に、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-バリン、L-リシン、L-アルギニン、L-シトルリン、L-ヒスチジン、L-メチオニン、L-システイン、L-トリプトファン、O-アセチル-L-セリンからなる群から選択されるアミノ酸、特に好ましくは、L-リシン、L-アルギニン、L-シトルリンおよびL-ヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸である。本発明で最も好ましい代謝産物はL-リシンである。
【００１４】
細胞の「野生型」とは、好ましくは、そのゲノムが、進化によって天然に形成されたような状態で存在する細胞を意味すると理解される。該用語は、細胞全体および個別の遺伝子の両者に関して使用される。したがって、特に、遺伝子配列が、組み換え法を用いて人間により少なくとも部分的に改変されている細胞または遺伝子は、用語「野生型」に該当しない。
【００１５】
本発明で特に好ましい細胞は、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、バシラス(Bacillus)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、カンジダ(Candida)、ピキア(Pichia)、クルイベロミセス(Kluveromyces)、サッカロミセス(Saccharomyces)、エシェリキア(Escherichia)、ザイモモナス(Zymomonas)、ヤロウイア(Yarrowia)、メチロバクテリウム(Methylobacterium)、ラルストニア(Ralstonia)およびクロストリジウム(Clostridium)属の細胞であり、Brevibacterium flavum、Brevibacterium lactofermentum、Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae、Kluveromyces lactis、Candida blankii、Candida rugosa、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium efficiens、Zymonomas mobilis、Yarrowia lipolytica、Methylobacterium extorquens、Ralstonia eutrophaおよびPichia pastorisが特に好ましい。本発明で最も好ましい細胞は、コリネバクテリウムおよびエシェリキア属の細胞であり、Corynebacterium glutamicumおよびEscherichia coliは特に好ましい菌株である。
【００１６】
特に代謝産物がL-リシンである場合、遺伝的に改変されている細胞は、特にCorynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Corynebacterium melassecola ATCC17965、Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869およびBrevibacterium divaricatum ATCC14020、ならびに、L-アミノ酸を生産する、それらから作製された突然変異体および株、例えば、L-リシン産生株Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709、Brevibacterium flavum FERM-P 1708、Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712、Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463、Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464およびCorynebacterium glutamicum DSM 5715または、例えば、L-メチオニン産生株Corynebacterium glutamicum ATCC21608からなる群から選択される細胞から誘導することができる。挙げることができる好適なEscherichia coli株の例はEscherichia coli AJ11442 (JP 56-18596およびUS 4,346,170を参照のこと)、Escherichia coli VL611株およびEscherichia coli WC196株(WO-A-96/17930を参照のこと)である。
【００１７】
野生型と比べて遺伝的に改変されている本発明の細胞は、それらが、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含み、この自己蛍光タンパク質の発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する点を特徴とする。
【００１８】
自己蛍光タンパク質をコードする、当業者に公知のすべての遺伝子配列が、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列として使用可能である。Aequora属の蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)、および異なる波長帯の蛍光を発するその変異体(例えば黄色蛍光タンパク質、YFP; 青色蛍光タンパク質、BFP; シアン蛍光タンパク質、CFP)、または蛍光が増強されているその変異体(増強型GFPすなわちEGFP、またはEYFP、EBFPもしくはECFP)をコードする遺伝子配列が特に好ましい。さらに、他の自己蛍光タンパク質、例えば、BD Biosciences, Franklin Lakes, USAより公知のようなDsRed、HcRed、AsRed、AmCyan、ZsGreen、AcGFP、ZsYellowをコードする遺伝子配列を本発明に従って使用することもできる。
【００１９】
自己蛍光タンパク質の発現が、特定の代謝産物の細胞内濃度に依存し、したがってこの代謝産物濃度に応じて細胞により制御されうるという特徴は、本発明にしたがって種々の様式および方法で実現することができる。
【００２０】
本発明の細胞の第1の特定の実施形態では、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現の制御を転写レベルで特定の代謝産物の細胞内濃度に応じて達成する。特定の代謝産物の細胞内濃度に応じて、リボソームで翻訳されて自己蛍光タンパク質を形成することができる多い又は少ないmRNAが結果的に形成される。
【００２１】
本発明の細胞のこの第1の特定の実施形態に関連して、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列が、野生型細胞でのその発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する遺伝子の発現を該細胞の野生型において制御する異種プロモーターの制御下にあることによって、翻訳レベルでの発現の制御を達成することができる。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列は、そのようなプロモーターから誘導されたプロモーターの制御下にあってもよい。
【００２２】
表現「異種プロモーターの制御下」とは、該プロモーターが、天然の様式では、特に該プロモーター配列の単離元であって場合によっては該プロモーター配列がプロモーター効率をさらに高めるように遺伝的に改変されている野生型細胞において、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現を調節しないことを示す。この関連で、表現「そのようなプロモーターから誘導された」とは、遺伝的改変細胞に含まれかつ自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現を調節するプロモーターが、野生型細胞と同一核酸配列で含まれなければならないプロモーターである必要がないことを意味する。むしろ、プロモーター効率を高める目的で、このプロモーター配列は、例えば、個々の塩基の挿入、欠失または交換によって、例えば個々の核酸配列のパリンドローム化によって改変されていてよい。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現を調節するプロモーターはまた、必ずしも、遺伝的改変細胞自身のゲノムに含まれるプロモーターである必要はなく、また、遺伝的改変細胞自身のゲノムに含まれるプロモーターから誘導される必要はない。それにもかかわらず、プロモーターが、遺伝的改変細胞自身のゲノムに含まれるプロモーターであるか、または遺伝的改変細胞自身のゲノムに含まれるプロモーターから誘導されるが、特定の代謝産物の細胞内濃度に発現が依存する遺伝子の発現を制御するものである場合には、全体的に好都合であることが判明しうる。
【００２３】
本発明の細胞のこの実施形態では、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列はプロモーターの制御下にある。この関連で用語「プロモーターの制御下」とは、好ましくは、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列がプロモーターに機能的に連結されていることを意味すると理解されるものとする。プロモーターおよび自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列は、これらの2つの配列および場合により別の調節要素、例えばターミネーターが、各調節要素が核酸配列のトランスジェニック発現においてその機能を果たすことができるように連続的に配置されている場合に、機能的に連結されている。このために、化学的意味での直接連結が絶対的に必要なわけではない。遺伝的制御配列、例えばエンハンサー配列は、さらに離れた位置から、または他のDNA分子からさえ、標的配列に対してその機能を発揮することもできる。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列がプロモーター配列の後ろに(すなわち3'末端で)、2つの配列が互いに共有結合によって結合するように位置する配置が好ましい。好ましくは、この関連で、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列とプロモーター配列との間の距離は200塩基対未満であり、特に好ましくは100塩基対未満であり、非常に特に好ましくは50塩基対未満である。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列およびプロモーターを、これらの2つの遺伝子配列の間に相同遺伝子(すなわち、野生型細胞でのその発現が該プロモーターによって調節される遺伝子)の部分配列が依然として存在するように、互いに機能的に連結することも可能である。そのようなDNA構築物の発現では、自己蛍光タンパク質と相同遺伝子の対応する部分配列によってコードされるアミノ酸配列との融合タンパク質が得られる。自己蛍光タンパク質の機能的能力が、すなわち、特定の波長の光で励起された場合に蛍光を発するその特性が著しく損なわれない限り、そのような相同遺伝子の部分配列の長さは重要ではない。
【００２４】
プロモーターおよび自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列に加えて、この特定の実施形態では、本発明の細胞は、調節因子をコードする遺伝子配列を含むこともでき、ここで該調節因子は、好ましくは代謝産物およびプロモーターと任意の様式で相互作用し、かつこの様式でRNAポリメラーゼに対するプロモーター配列の結合親和性に影響するタンパク質である。この関連で、調節因子とプロモーター配列との間の相互作用は代謝産物の存在に依存する。一般に、代謝産物は特定の、調節因子の機能的領域に結合し、かつこの様式で調節因子のコンフォメーションを変化させる影響を有し、該変化は調節因子とプロモーター配列との間の相互作用に対して影響を及ぼす。この関連で、調節因子は原則としてアクチベーターまたはリプレッサーであってよい。
【００２５】
本発明では、プロモーター候補は、原則として、その発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する遺伝子の発現を機能的連結を介して通常制御するすべてのプロモーターである。非常に特に好ましくは、プロモーターは、その発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存し、かつ代謝産物の化学反応または細胞からの代謝産物の流出によって代謝産物の細胞内濃度の減少を可能にするタンパク質をコードする遺伝子の発現を通常制御するプロモーターである。したがって、このタンパク質は、代謝産物から該代謝産物と異なる代謝生成物への反応を触媒する酵素、または細胞からの代謝産物の流出を触媒する能動的もしくは受動的輸送体である。
【００２６】
プロモーターは、さらに、代謝産物の存在下で特定のアクチベーターと相互作用し、かつこの様式で自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現を生じさせるプロモーターであるか、またはリプレッサーによって阻害されるプロモーターであってよく、該リプレッサーは特定の代謝産物との相互作用によってプロモーターから拡散し、その結果、阻害が排除されて、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現が達成される。
【００２７】
この第1の特定の実施形態の本発明の細胞の好適な例を以下にさらに詳細に説明する。しかし、本発明は、本発明の細胞の第1の特定の実施形態に該当する以下の例に限定されないことがこの時点で強調されるべきである。
【００２８】
第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、bkdプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Pseudomonas putida細胞であってよい(Pseudomonas putidaのBkdR調節因子に関しては、例えば、J. Bact., 181 (1999), pages 2,889-2,894, J. Bact., 187 (2005), page 664を参照のこと)。ここでL-イソロイシン、L-ロイシン、L-バリンまたはD-ロイシンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、bkdプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、BkdR調節因子(分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ調節タンパク質)をコードする遺伝子配列をさらに含む。BkdR調節因子によって調節されるbkdプロモーターのDNA配列は配列番号１に再現され、BkdR調節因子自身の配列は配列番号２に再現される。
【００２９】
第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、ackAプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Bacillus subtilis細胞であってよい(CodYリプレッサーに関しては、Mol. Mic. 62 (2006), page 811を参照のこと)。ここでまた、L-イソロイシン、L-ロイシンおよびL-バリンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、ackAプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、CodYリプレッサーをコードする遺伝子配列をさらに含む。CodYアクチベーターによって調節されるackAプロモーターのDNA配列は配列番号３に再現され、CodYアクチベーター自身の配列は配列番号４に再現される。
【００３０】
第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、mdeAプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Pseudomonas putida細胞であってもよい(MdeR調節因子に関しては、J. Bacteriol., 179 (1997), page 3,956を参照のこと)。ここでL-メチオニンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、mdeAプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、MdeR調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。MdeR調節因子によって調節されるmdeAプロモーターのDNA配列は配列番号５に再現され、MdeR調節因子自身の配列は配列番号６に再現される。
【００３１】
第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、brnFプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Corynebacterium glutamicum細胞であってよい(Corynebacterium glutamicumのLrp調節因子に関しては、J. Bact., 184 (14) (2002), pages 3,947-3,956を参照のこと)。ここで、L-イソロイシン、L-ロイシンおよびL-バリンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、brnFプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、Lrp調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。Lrp調節因子によって調節されるbrnFプロモーターのDNA配列は配列番号７に再現され、Lrp調節因子自身の配列は配列番号８に再現される。
【００３２】
第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、cysPプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Escherichia coli細胞であってよい(Escherichia coliのCysB調節因子に関しては、Mol. Mic., 53 (2004), page 791を参照のこと)。ここでO-アセチル-L-セリンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、cysPプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、CysB調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。CysB調節因子によって調節されるcysPプロモーターのDNA配列は配列番号９に再現され、Lrp調節因子自身の配列は配列番号１０に再現される。
【００３３】
第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、cadBプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Escherichia coli細胞であってもよい(Escherichia coliのCadC調節因子に関しては、Mol. Mic. 51 (2004), pages 1,401-1,412を参照のこと)。ここでカダベリンまたはプトレシンなどのジアミンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、cadBプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、CadC調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。CadC調節因子によって調節されるcadBプロモーターのDNA配列は配列番号１１に再現され、CadC調節因子自身の配列は配列番号１２に再現される。
【００３４】
第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、metY、metK、hom、cysK、cysIまたはsuuDプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Corynebacterium glutamicum細胞であってよい(Corynebacterium glutamicumのMcbR調節因子およびこれによって調節されるプロモーター配列に関しては、Mol. Mic. 56 (2005), pages 871-887を参照のこと)。ここでS-アデノシルホモシステインの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、metY、metK、hom、cysK、cysIまたはsuuDプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、McbR調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。McB調節因子によって調節されるmetYプロモーターのDNA配列は配列番号１３に再現され、MecR調節因子自身の配列は配列番号１４に再現される。
【００３５】
第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、argOプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Escherichia coli細胞であってもよい。ここでL-リシンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、argOプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、ArgP調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。ArgO調節因子によって調節されるargOプロモーターのDNA配列は配列番号１５に再現され、ArgP調節因子自身の配列は配列番号１６に再現される。
【００３６】
第1の実施形態の特に好ましい構成の遺伝的改変細胞は、さらに、lysEプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Corynebacterium glutamicum細胞であってよい(lysEプロモーターおよびその調節因子LysGに関しては、Microbiology, 147 (2001), page 1,765を参照のこと)。ここで、L-リシン、L-アルギニン、L-ヒスチジンおよびL-シトルリンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、lysEプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、LysG調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。LysG調節因子によって調節されるlysEプロモーターのDNA配列は配列番号１７に再現され、LysG調節因子自身の配列は配列番号１８に再現される。
【００３７】
Corynebacterium glutamicumでは、lysE遺伝子は、有機分子およびカチオンの流出に関与する12の公知の輸送体スーパーファミリーの1つと、分子レベルでも構造レベルでも類似性を有さない二次担体をコードする。新規機能およびまれな構造に基づいて、LysEは新規輸送体ファミリーの第1のメンバーとして特定されている。ゲノムシークエンシングの関連で、以来、このファミリーに多数のタンパク質を割り当てることが可能になっているが、今のところ、依然として大部分が未知の機能のタンパク質である。LysEが属するLysEファミリーは、RhtBファミリーおよびCadDファミリーとともに、LysEスーパーファミリーを形成する。該スーパーファミリーには、これまでにトータルで22メンバーが割り当てられている。LysEファミリーのうち、Corynebacterium glutamicum由来のリシン排出体はこれまでに唯一の機能的に特徴付けられたメンバーである。遺伝子レベルで、lysEは調節因子LysG (L-リシン排出を支配する)によって調節される。LysGはLTTRファミリーの細菌性調節タンパク質(LysR型転写制御因子)と高い類似性を有する。この関連で、L-リシンは、LysGによって媒介されるlysEの転写の誘導物質として作用する。L-リシンに加えて、2つの塩基性アミノ酸L-アルギニンおよびL-ヒスチジン、ならびにL-シトルリンも、LysGによって媒介されるlysE発現の誘導物質である。
【００３８】
第1の特定の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、fadEまたはfadBAプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Escherichia coli細胞であってよい(Escherichia coliのFadR調節因子に関しては、例えば、Mol. Biol., 29 (4) (2002), pages 937-943を参照のこと)。ここでアシル補酵素Aの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、fadEまたはfadBAプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、FadR調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。FadR調節因子によって調節されるfadEプロモーターのDNA配列は配列番号１９に再現され、LysG調節因子自身の配列は配列番号２０に再現される。
【００３９】
第1の特定の実施形態の遺伝的改変細胞は、fadMプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Bacillus subtilis細胞であってもよい(Bacillus subtilisのFabR調節因子に関しては、例えば、J. Bacteriol., 191 (2009), pages 6,320-6,328を参照のこと)。ここでまた、アシル補酵素Aの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、fadMプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、FabR調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。FabR調節因子によって調節されるfadMプロモーターのDNA配列は配列番号２１に再現され、FabR調節因子自身の配列は配列番号２２に再現される。
【００４０】
第1の特定の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、rhaSR、rhaBADまたはrhaTプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Escherichia coli細胞であってよい(Escherichia coliのRhaRおよびRhaS調節因子に関しては、例えば、J. Bacteriol., 189 (1) (2007), 269-271を参照のこと)。ここでラムノースの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、rhaSR、rhaBADまたはrhaTプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、RhaRまたはRhaS調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。RhaR調節因子によって調節されるrhaSRプロモーターのDNA配列は配列番号２３に再現され、rhaBADプロモーターの配列は配列番号２４に再現され、RhaR調節因子の配列は配列番号２５に再現され、RhaS調節因子の配列は配列番号２６に再現される。
【００４１】
第3の構成の遺伝的改変細胞は、hetC、nrrAまたはdevBプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変されたアナベナ属種(Anabaena sp.)の細胞であってもよい(アナベナ属種のNtcA調節因子に関しては、例えば、J. Bacteriol., 190 (18) (2008), pages 6,126-6,133を参照のこと)。ここでオキソグルタル酸の細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、hetC、nrrAまたはdevBプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、NtcA調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。NtcA調節因子によって調節されるhetCプロモーターのDNA配列は配列番号２７に再現され、nrrAプロモーターの配列は配列番号２８に再現され、devBプロモーターの配列は配列番号２９に再現され、NtcA調節因子の配列は配列番号３０に再現される。
【００４２】
第1の特定の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、cbbLS-2またはcbbLS-1プロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的に改変されたマイコバクテリウム属種(Mycobacterium sp.)の細胞であってよい(マイコバクテリウム属種のCbbR調節因子に関しては、例えば、Mol. Micr. 47 (2009), page 297を参照のこと)。ここでリブロースビス-リン酸の細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、cbbLS-2またはcbbLS-1プロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、CbbR調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。CbbR調節因子のDNA配列は配列番号３１に再現される。
【００４３】
第1の特定の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、pcbABプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Streptomyces cattleya細胞であってよい(Streptomyces cattleyaのThnU調節因子に関しては、例えば、Mol. Micr., 69 (2008), page 633を参照のこと)。ここでチエナマイシンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、pcbAプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、ThnU調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。ThnU調節因子によって調節されるpcbABプロモーターのDNA配列は配列番号３２に再現され、ThnU調節因子自身の配列は配列番号３３に再現される。
【００４４】
第1の特定の実施形態の遺伝的改変細胞は、aviRaプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Streptomyces viridochromogenes細胞であってもよい(Streptomyces viridochromogenesのAviC1またはAviC2調節因子に関しては、例えば、J. Antibiotics, 62 (2009), page 461を参照のこと)。ここでアビラマイシンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、aviRaプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、AviC1および/またはAviC2調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。AviC1またはAviC2調節因子によって調節されるaviRaプロモーターのDNA配列は配列番号３４に再現され、AviC1またはAviC2調節因子自身の配列は配列番号３５に再現される。
【００４５】
第1の特定の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、nocFプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Nocardia uniformis細胞であってよい(Nocardia uniformisのNocR調節因子に関しては、例えば、J. Bacteriol., 191 (2009), page 1,066を参照のこと)。ここでノカルジシンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、nocFプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、NocR調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。NocR調節因子によって調節されるnocFプロモーターのDNA配列は配列番号３６に再現され、NocR調節因子自身の配列は配列番号３７に再現される。
【００４６】
原則的に、上記プロモーターおよび、自己蛍光タンパク質をコードしかつこのプロモーターの制御下にある核酸を含む第1の特定の実施形態の本発明の細胞を作製するための種々の可能性が存在する。
【００４７】
第1の可能性は、例えば、ゲノムが上記プロモーターの1つおよび好ましくは対応する調節因子をコードする遺伝子配列をすでに含む細胞から出発し、次いで自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を、この遺伝子配列が該プロモーターの制御下にあるように細胞のゲノムに導入することからなる。適切であれば、プロモーター自身の核酸配列を、プロモーター効率を高める目的で、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列をゲノムに組み込む前またはその後に、1個以上のヌクレオチド交換、ヌクレオチド欠失またはヌクレオチド挿入によって改変することができる。
【００４８】
第2の可能性は、例えば、プロモーター配列および、自己蛍光タンパク質をコードしかつ該プロモーターのコンロール下にある遺伝子配列を含む1種以上の核酸構築物を細胞に導入することからなり、ここで、プロモーター効率を高める目的で、1個以上のヌクレオチド交換、ヌクレオチド欠失またはヌクレオチド挿入によってプロモーター自身の核酸配列を改変することも可能である。核酸構築物の挿入は、染色体上または染色体外で、例えば染色体外複製ベクター上で行うことができる。好適なベクターは、特定の菌株中で複製するベクターである。多数の公知のプラスミドベクター、例えばpZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554)、pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991))またはpHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991))は、潜在プラスミドpHM1519、pBL1またはpGA1に基づく。他のプラスミドベクター、例えばpCG4 (US 4,489,160)、またはpNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990))、またはpAG1 (US 5,158,891)に基づくプラスミドベクターを同様に使用することができる。しかし、このリストは本発明に関して限定的ではない。
【００４９】
プロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある遺伝子配列を含む遺伝子構築物を作製するための説明はおよびそのような構築物を細胞の染色体に導入するかまたはこの遺伝子構築物を含む染色体外複製ベクターを細胞に導入するための説明は、例えば、Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987))、Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994))、Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))、Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991))、EP-A-0 472 869、US 4,601,893、Schwarzer and Puehler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)、Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))、LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))、WO-A-96/15246、Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)、JP-A-10-229891、Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))および公知の遺伝学および分子生物学の教科書から当業者に十分に公知である。
【００５０】
本発明の細胞の第2の特定の実施形態では、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現の制御は、いわゆる「リボスイッチ(riboswitch)」を用いて、特定の代謝産物の細胞内濃度に応じて達成され、転写レベルおよび翻訳レベルの両レベルでそのような「リボスイッチ」を用いて発現を調節することが可能である。「リボスイッチ」とは、mRNAのみからなる調節要素を意味すると理解される。それらはセンサーとしておよび同時に調節要素として作用する。リボスイッチの概要は、例えば、Vitrechak et al., Trends in Genetics, 20 (1) (2004), pages 44-50に見出すことができる。リボスイッチを用いる遺伝子発現の調節に関するさらなる詳細は、the Faculty of Biochemistry, Chemistry and Pharmacy of the Johann Wolfgang Goethe University in Frankfurt am Mainに提出されたJonas Noeskeによる学術論文(2007)表題"Strukturelle Untersuchungen an Metabolit-bindenden Riboswitch-RNAs mittels NMR"に見出すこともできる。
【００５１】
リボスイッチは、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列が、mRNAレベルで代謝産物に結合可能なDNA配列に機能的に結合している、この第2の特定の実施形態の本発明の細胞中で使用することができ、DNAに沿ったさらなる転写またはリボソームでの翻訳は代謝産物とmRNAとの結合に応じて影響を受ける。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現は、この様式で転写レベルまたは翻訳レベルでリボスイッチによって調節される。リボスイッチ要素を有する本発明の細胞では、いかなるタンパク質因子の関与もなしに代謝産物がmRNAの5'-UTR中の構造領域に直接結合し、RNA二次構造の変化を誘発する。5'-UTR中のこのコンフォメーション変化は、自己蛍光タンパク質をコードするそれに続く遺伝子の発現のモジュレーションを導く。この関連で、遺伝子調節作用は、転写もしくは翻訳、または、適切であれば、RNAプロセシングにも影響することによって達成することができる。リボスイッチの代謝産物結合領域(アプタマードメイン)はモジュール式の独立したRNAドメインである。リボスイッチの残りの部分(発現プラットフォーム)は、通常、アプタマードメインの下流にある。代謝産物がアプタマードメインに結合しているか否かに応じて、発現プラットフォームはアプタマードメインの領域との塩基対形成に入ることができる。ほとんどの場合、発現プラットフォームとアプタマードメインとの間のこれらの塩基対形成は代謝産物未結合状態で生じ、遺伝子発現の活性化を生じさせる。逆に、これらの塩基対形成はリガンド結合状態で阻害され、それにより、通常、遺伝子発現の阻害が生じる。調節メカニズムが転写または翻訳に影響を有するかどうかは、代謝産物結合または代謝産物未結合状態で発現プラットフォームがとる二次構造に依存する。発現プラットフォームは、転写ターミネーターおよび転写アンチターミネーターを形成できる配列をしばしば含むが、2種の二次構造は互いに排他的である。よく存在する別のモチーフは、代謝産物結合状態に応じて、SD配列(Shine-Dalgarno配列)を一本鎖型に変換するか、またはマスクする二次構造である。SD配列が二次構造の形成によってマスクされると、リボソームはSD配列を認識できない。転写の早期中断または翻訳の開始は、この様式でリボスイッチによって調節することができる。
【００５２】
挙げることができる、転写レベルまたは翻訳レベルで自己蛍光タンパク質の発現の制御を可能にする好適なリボスイッチ要素の例は、例えば、Bacillus subtilis由来のリシンリボスイッチ(Grundy et al., 2009によって報告されている)、Bacillus subtilis由来のグリシンリボスイッチ(Mandal et al., Science 306 (2004), pages 275-279によって報告されている)、Bacillus subtilis由来のアデニンリボスイッチ(Mandal and Breaker, Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (2004), pages 29-35によって報告されている)またはBacillus anthracis由来のTPPタンデムリボスイッチ(Welz and Breaker, RNA 13 (2007), pages 573-582によって報告されている)である。これらの天然に存在するリボスイッチ要素に加えて、合成リボスイッチ要素、例えば、テオフィリンリボスイッチ(Jenison et al., Science 263 (1994), pages 1,425-1,429またはDesai and Gellivan, J. Am. Chem. Soc. 126 (2004), pages 1.3247-54によって報告されている)、ビオチンリボスイッチ(Wilson et al., Biochemistry 37 (1998), pages 14,410-14,419によって報告されている)またはTetリボスイッチ(Berens et al., Bioorg. Med. Chem. 9 (2001), pages 2,549-2,556によって報告されている)を使用することもできる。
【００５３】
細胞懸濁液中で特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞を特定するための方法であって、以下の方法ステップ:
(i)  野生型と比べて遺伝的に改変されていて、かつ自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む上記本発明の細胞を含み、ここで自己蛍光タンパク質の発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する、細胞懸濁液、を提供するステップ;
(ii)  細胞を遺伝的に改変して、細胞が特定の代謝産物の細胞内濃度において異なる細胞懸濁液を得るステップ;
(iii)  細胞内蛍光活性の検出によってこの特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞懸濁液中の個別の細胞を特定するステップ
を含む方法もまた、上記目的の達成に貢献する。
【００５４】
本発明の方法のステップ(i)では、まず、栄養培地および多数の上記遺伝的改変細胞を含む細胞懸濁液を提供する。
【００５５】
本発明の方法のステップ(ii)では、細胞懸濁液中の1個以上の細胞を遺伝的に改変して、細胞が特定の代謝産物の細胞内濃度において異なる細胞懸濁液を得る。
【００５６】
細胞懸濁液の遺伝的改変は標的化または非標的化突然変異誘発によって行うことができ、非標的化突然変異誘発が特に好ましい。
【００５７】
標的化突然変異誘発では、制御された様式で細胞の特定の遺伝子において突然変異を生じさせる。突然変異の候補は、トランジション、トランスバージョン、挿入および欠失である。酵素活性に対するアミノ酸交換の影響に応じて、「ミスセンス突然変異」または「ナンセンス突然変異」と称される。遺伝子中の少なくとも1個の塩基対の挿入または欠失は「フレームシフト突然変異」を生じさせ、その結果、誤ったアミノ酸が組み入れられるか、または翻訳が早期中断される。いくつかのコドンの欠失は、典型的に、酵素活性の完全喪失を生じさせる。そのような突然変異を作製するための説明は先行技術に属し、公知の遺伝学および分子生物学の教科書、例えばKnippers ("Molekulare Genetik", 6th edition, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, Germany, 1995)による教科書、Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990)による教科書またはHagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer-Verlag, Stuttgart, 1986)による教科書に見出せる。
【００５８】
これらの標的化突然変異誘発法に関する詳細、特に有用な参考文献は、例えば、DE-A-102 24 088中に見出せる。
【００５９】
しかし、本発明では、方法ステップ(ii)の遺伝的改変が非標的化突然変異誘発によって行われれば、特に好ましい。そのような非標的化突然変異誘発の例は、例えばN-メチル-N-ニトロ-N-ニトロソグアニジンなどの化学物質での細胞の処理または紫外光での細胞の照射である。突然変異を誘発するためのそのような方法は概して公知であり、とりわけ、Miller ("A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992))またはthe American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)のハンドブック"Manual of Methods for General Bacteriology"に見出せる。
【００６０】
方法ステップ(ii)での細胞の遺伝的改変によって、細胞中で生じている突然変異の性質に応じて、特定の細胞で、例えば酵素活性の増加もしくは減少、特定の酵素の発現の増加もしくは減少、特定の輸送タンパク質の活性の増加もしくは減少、特定の輸送タンパク質の発現の増加もしくは減少、調節タンパク質中の突然変異、構造タンパク質中の突然変異、またはRNA調節要素中の突然変異の結果として、プロモーターを介する対応する調節タンパク質との相互作用によってまたはリボスイッチ要素との相互作用によって自己蛍光タンパク質の発現に影響を及ぼす該代謝産物の細胞内濃度の増加が存在しうる。突然変異の結果、特定の代謝産物の濃度が増加している細胞は、したがって、この細胞で自己蛍光タンパク質が形成される点で識別される。自己蛍光タンパク質の遺伝子は細胞内代謝産物濃度の増加のレポーター遺伝子として働く。
【００６１】
本発明の方法の方法ステップ(iii)では、したがって、この特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞懸濁液中の個々の細胞を細胞内蛍光活性の検出によって特定する。このために、細胞懸濁液を、自己蛍光タンパク質を励起させて発光させる周波数の電磁放射線に曝露する。
【００６２】
本発明の方法の特定の構成では、方法ステップ(iii)での細胞の特定後、好ましくはその直後に、さらなる方法ステップ(iv)を行う。該ステップでは、特定された細胞を細胞懸濁液から分離する。この分離は、好ましくは、フローサイトメトリー(FACS = 蛍光励起セルソーティング)を用いて、非常に特に好ましくは高性能フローサイトメトリー(HAT-FACS = ハイスループット蛍光励起セルソーティング)を用いて行う。フローサイトメトリーによる細胞懸濁液の分析に関する詳細は、例えば、Sack U, Tarnok A, Rothe G (eds.): Zellulaere Diagnostik. Grundlagen, Methoden und klinische Anwendungen der Durchflusszytometrie, Basel, Karger, 2007, pages 27 - 70に見出せる。
【００６３】
したがって、本発明の方法を用いて、標的化または非標的化突然変異が細胞中で生じている細胞懸濁液中で、突然変異によって特定の代謝産物の細胞内濃度の増加を生じている細胞を、細胞の生存性に影響することなく、標的化された様式で単離することが可能である。
【００６４】
野生型と比べて遺伝的に改変され、特定の代謝産物の生産が最適化されている細胞の製造方法であって、以下の方法ステップ:
(I)  野生型と比べて遺伝的に改変されていて、かつ自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む上記本発明の細胞を含み、ここで自己蛍光タンパク質の発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する、細胞懸濁液を提供するステップ;
(II)  細胞を遺伝的に改変して、細胞が特定の代謝産物の細胞内濃度において異なる細胞懸濁液を得るステップ;
(III)  細胞内蛍光活性の検出によって特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞懸濁液中の個別の細胞を特定するステップ;
(IV)  特定された細胞を細胞懸濁液から分離するステップ;
(V)  特定の代謝産物の細胞内濃度の増加の原因となる、特定されかつ分離された細胞中の遺伝的に改変された遺伝子G1〜Gnまたは突然変異M1〜Mmを特定するステップ;
(VI)  野生型と比べて遺伝的に改変され、特定の代謝産物の生産が最適化されている細胞であって、そのゲノムが遺伝子G1〜Gnの少なくとも1つおよび/または突然変異M1〜Mmの少なくとも1つを含む細胞を、製造するステップ
を含む方法も、上記目的を達成するために貢献する。
【００６５】
方法ステップ(I)〜(IV)では、まず、特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞を突然変異誘発によって作製し、細胞懸濁液から分離する。ここで上記方法ステップ(i)〜(iv)を参照することができる。
【００６６】
方法ステップ(V)では、特定されかつ分離された細胞において、特定の代謝産物の細胞内濃度の増加の原因となる遺伝的に改変された遺伝子G1〜Gnまたは突然変異M1〜Mmを、当業者に公知の遺伝学的方法によって特定し、数値nおよびmは、それぞれ、特定されかつ分離された細胞中で観察される改変遺伝子の数および観察される突然変異の数に依存する。好ましくは、この関連での手順は、特定の代謝産物の形成を刺激することが知られている細胞中の遺伝子の配列またはプロモーター配列が最初に分析されるように行われる。代謝産物がL-リシンの場合、これらは、例えば、遺伝子lysC、hom、zwf、mqo、leuC、gndまたはpykである。これらの遺伝子のいずれにも突然変異が認識されなければ、特定されかつ分離された細胞のゲノム全体を分析して、適切な場合には、さらなる改変遺伝子Giまたはさらなる突然変異Miを特定する。細胞中の特定の代謝産物の細胞内濃度の増加を生じさせる好都合な改変遺伝子配列Giまたは好都合な突然変異Miをこの様式で特定することができる。
【００６７】
さらなる方法ステップ(VI)では、野生型と比べて遺伝的に改変され、特定の代謝産物の生産が最適化されている細胞であって、そのゲノムが遺伝子G1〜Gnの少なくとも1つおよび/または突然変異M1〜Mmの少なくとも1つを含む細胞を製造することができる。このために、方法ステップ(V)で観察された1個以上の好都合な改変遺伝子Gおよび/または改変突然変異Mを、標的化された様式で細胞に導入する。特定の突然変異のこの標的化された導入は、例えば、「遺伝子置換」によって行うことができる。この方法では、突然変異、例えば欠失、挿入または塩基交換をin vitroで目的の遺伝子中で生じさせる。生じた対立遺伝子を、次いで、標的宿主に関して非複製性のベクターにクローニングし、これを形質転換またはコンジュゲーションによって標的宿主に導入する。組み込みを達成する第1の「クロスオーバー」イベントおよび標的遺伝子または標的配列中の切除を達成する好適な第2の「クロスオーバー」イベントによる相同組換え後、突然変異または対立遺伝子の取り込みが達成される。
【００６８】
上記方法によって得られた、特定の代謝産物の生産が最適化されている細胞も、上記目的の達成に貢献する。
【００６９】
代謝産物の製造方法であって、以下の方法ステップ:
(a)  上記方法によって、特定の代謝産物の生産が最適化されている、野生型と比べて遺伝的に改変された細胞を作製するステップ;
(b)  栄養素を含む培養培地中で、細胞が該栄養素から特定の代謝産物を生産する条件下で細胞を培養するステップ
を含む方法も、上記目的の達成に貢献する。
【００７０】
方法ステップ(a)で作製された特定の代謝産物の生産が最適化されている本発明の遺伝的改変細胞を、代謝産物の生産のために、バッチ法(バッチ培養)で、または流加法(フィード法(feed method))または反復流加法(反復フィード法)で連続的または不連続的に方法ステップ(b)で栄養培地中で培養することができる。GB-A-1009370に記載されるような半連続法も想定できる。公知の培養方法の概要は、Chmiel ("Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))による教科書またはStorhas ("Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)による教科書に記載されている。
【００７１】
使用される栄養培地は、好適な様式で特定の菌株の要求性を満たす必要がある。種々の微生物の培養培地の説明は、the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)のハンドブック"Manual of Methods for General Bacteriology"に含まれる。
【００７２】
栄養培地は、炭水化物、例えばグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油および脂肪、例えばダイズ油、ヒマワリ油、ラッカセイ油およびココナツ脂肪、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸、アルコール、例えばグリセロールおよびメタノール、炭化水素、例えばメタン、アミノ酸、例えばL-グルタミン酸もしくはL-バリン、または有機酸、例えば酢酸を炭素の供給源として含むことができる。これらの物質は個別にまたは混合物として使用することができる。
【００７３】
栄養培地は、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母抽出物、肉エキス、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、ダイズ粉および尿素、または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムを窒素の供給源として含むことができる。窒素の供給源は個別にまたは混合物として使用することができる。
【００７４】
栄養培地は、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩をリンの供給源として含むことができる。栄養培地は、さらに、金属塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含む必要があり、それは成長に必要である。最後に、上記物質に加えて、必須の成長物質、例えばアミノ酸およびビタミンを用いることができる。さらに、好適な前駆体を栄養培地に加えることができる。上記出発物質を1回のバッチの形式で培養物に加えるか、または好適な様式で培養の期間中に供給することができる。
【００７５】
塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水、または酸性化合物、例えばリン酸もしくは硫酸を好適な様式で用いて、培養物のpHを調節する。脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて、泡の発生を抑制することができる。例えば抗生物質などの選択作用を有する好適な物質を培地に加えて、プラスミドの安定性を維持することができる。酸素または酸素含有ガス混合物、例えば空気を培養物に導入して、好気条件を維持する。培養物の温度は、通常、20℃〜45℃であり、好ましくは25℃〜40℃である。
【００７６】
混合物の調製方法であって、以下の方法ステップ:
(A)  上記方法によって代謝産物を製造するステップ;
(B)  代謝産物を、該代謝産物と異なる混合物成分と混合するステップ
を含む方法も、上記目的の達成に貢献する。
【００７７】
代謝産物がアミノ酸、特にL-リシンである場合、混合物は、好ましくは食品、非常に特に好ましくは動物飼料、または医薬組成物である。
【００７８】
以下、図面および非限定的な実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。
【００７９】
（図面の簡単な説明は上述のとおり）
図１は、本発明の細胞の第1の実施形態の自己蛍光タンパク質(afp)の遺伝子配列がプロモーター(lysEプロモーター)の制御下にある構築物の候補を示す。変異体Aは、代謝産物依存的調節因子がその標的遺伝子(lysE)のすぐ隣にある初期状態を示し、該標的遺伝子は代謝産物濃度に従って調節因子によって調節される。変異体Bでは、最も単純な事例において、標的遺伝子が蛍光タンパク質(afp)によって置換される。変異体Cでは、標的遺伝子の最初のアミノ酸群と蛍光タンパク質との翻訳融合が生じている。変異体Dでは、標的遺伝子の最初のアミノ酸群を含むプロモーター領域から出発し、終止コドンによって終結し、リボソーム結合部位(RBS)および蛍光タンパク質のオープンリーディングフレームが続く、長い転写物が形成されるように、転写融合が生じている。変異体Eでは、標的遺伝子の最初のアミノ酸群を含むプロモーター領域から出発し、終止コドンによって終結し、リボソーム結合部位および公知でかつ十分に発現されるタンパク質、例えばE. coli由来のβ-ガラクトシダーゼ、LacZの開始部分が続き、それが次いで蛍光タンパク質と融合される、長い転写物が形成されるように、転写融合が生じている。
【００８０】
実施例
【実施例１】
【００８１】
自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列がlysEプロモーターの制御下にありかつ自己蛍光タンパク質の発現が細胞内L-リシン濃度に依存する細胞により例示する、第1の実施形態の本発明の細胞の作製。
【００８２】
(a)  ベクターpJC1lysGE'eYFPの構築
lysE'とレポーター遺伝子eyfp (配列番号４９; eYFPのタンパク質配列: 配列番号７２)との融合物の構築をオーバーラップエクステンションPCRによって達成した。様々に転写される調節因子LysGの遺伝子とともにlysEのコード配列を保持するpUC18-2.3-kb-lysGE-BamHI (Bellmann et al., 2001; Microbiology 1471765-74)、およびeyfpの増幅を可能にするpEKEx2-yfp-tetR (Frunzke et al., 2008; J Bacteriol. 190:5111-9)を鋳型として使用した。lysGE'eyfp断片を確立するために、まず、オリゴヌクレオチドの組み合わせplysGE_for (配列番号３８)およびplysGE_rev (配列番号３９)を用いてコード配列lysGE'およびlysGE'ns (1,010 bp)を増幅した。eyfpのコード配列の増幅には、2つのオリゴヌクレオチドの組み合わせpeYFP_rev (配列番号４０)およびpeYFP_fw2 (配列番号４１)を使用した。
【００８３】
plysGE_for     5'-CGCGGATCCCTAAGCCGCAATCCCTGATTG-3'
plysGE_rev      5'-TCCGATGGACAGTAAAAGACTGGCCCCCAAAGCAG-3'
peYFP_rev      5'-TGAGGATCCTTATTACTTGTCAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCC-3'
peYFP_fw2      5'-CTTTTACTGTCCATCGGAACTAGCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACC-3'。
【００８４】
1 %濃度アガロースゲルから増幅断片を精製した後、外側プライマーplysGE-forおよびpeYFP_revを用いる第2のPCR反応でこれらを鋳型として用いた。内側オリゴヌクレオチドプライマーplysGE_revおよびpeYFP_fw2から生成された17 bpの相補領域における鋳型断片のハイブリダイゼーションによって、重複伸長断片を確立することができた。この方法で形成された生成物lysGE'eyfpを制限酵素BamHIで消化し、反応バッチの精製後、同様にBamHIで開環されかつ脱リン酸化されたベクターpJC1とのライゲーション反応に用いた。ライゲーションバッチをE. coli DH5αMCRの形質転換に直接使用して、50μg/mlのカナマイシンを含むLBプレートで形質転換体の選択を行った。これらのプレートで生育し、したがってカナマイシン耐性であった20コロニーをコロニーPCRに用いた。それぞれについて上記のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてコロニーPCRを行い、断片lysGE'eyfpがベクターpJC1に挿入されたかどうかを確認した。アガロースゲルでのコロニーPCRの分析では、分析されたサンプル中でサイズ1,010 bpの予測されたPCR産物が示され、その後、ラージスケールでのプラスミド作製のためにコロニーを培養した。制限酵素BglII、XhoIおよびPvuIでの試験切断によって、挿入断片pJC1lysGE'eYFPの存在を実証することができた。挿入物の配列決定により、予測配列との100 %一致が示された。
【００８５】
(b)  pJC1lysGE'eYFPを用いるCorynebacterium glutamicumの形質転換
Tauch et al., 2002 (Curr Microbiol. 45(5) (2002), pages 362-7)によって記載されているようにして、C. glutamicum ATCC 13032株およびDM1800株のコンピテント細胞を調製した。ATCC 13032株は、リシンを分泌する野生型であるが、DM1800株は遺伝子特異的突然変異誘発によってリシン分泌体となった(Georgi et al. Metab Eng. 7 (2005), pages 291-301)。Tauch et al. (Curr Microbiol. 45(5) (2002), pages 362-7)によって記載されるようにして、pJC1lysGE'eYFPでのエレクトロポレーションによってこれらの細胞を形質転換した。25μg/mlのカナマイシンを含むBHISプレートで形質転換体の選択を行った。これらのプレートで生育し、したがってカナマイシン耐性であったコロニーを、プラスミド調製および酵素BglII、XhoIおよびPvuIでの試験切断によってベクターの存在に関して確認した。それぞれについて1つの正しいクローンをATCC 13032 pJC1lysGE'eYFPおよびDM1800 pJC1lysGE'eYFPと名付けた。
【００８６】
(c)  リシン特異的蛍光の検出
Zeiss AxioImager M1を用いる共焦点顕微鏡検査によって蛍光のin vivo発光を試験した。この目的で、ATCC 13032 pJC1lysGE'eYFP株およびDM1800 pJC1lysGE'eYFP株の3μlの細胞懸濁液をスライドに載せ、それに1 %濃度のアガロースの薄層を適用して固定した。固定された懸濁液を波長514 nmおよび照射時間700 msの光で励起させた。505 nm〜550 nmの範囲の広帯域フィルターを使用してeYFPの蛍光発光測定を行った。AxioVision 4.6ソフトウェアを用いて蛍光細胞をデジタル記録した。リシン形成株DM1800 pJC1lysGE'eYFPの場合にのみ蛍光の発光が生じ、リシンを形成しないATCC13032 pJC1lysGE'eYFP株は蛍光を発しないことが画像中に認められる。
【実施例２】
【００８７】
自己蛍光タンパク質の発現がアデニンリボスイッチ(ARS)によって下方制御され、かつ自己蛍光タンパク質の発現が細胞内アデニン濃度に依存する細胞により例示する、第2の実施形態の本発明の細胞の作製。
【００８８】
まず、Bacillus subtilisのゲノムDNAから出発し、プライマーARS_for (配列番号４２)およびARS_rev (配列番号４３)を用いてBacillus subtilis由来のアデニンリボスイッチ(ARS)(Mandai and Breaker, Nat Struct Mol Biol, 11 (2004), pages 29-35を参照のこと)を増幅した。第2のPCRでは、Qiagen MinElute Gel Extraction Kitを用いて精製されたARS増幅物から出発して、プライマーARS_for_BamHIおよびARS_rev_NdeIを使用して、5'末端BamHIおよび3'末端NdeI切断部位を有するARS増幅物を増幅し、これらの制限酵素で切断した。
【００８９】
プライマーEYFP_for_NdeI (配列番号４４)およびEYFP_rev_EcoRI (配列番号４５)を用いて、pEKEx2-EYFPに基づいてレポーター遺伝子eyfpを増幅し、酵素NdeIおよびEcoRIで制限切断し、Qiagen MinElute Gel Extraction Kitを用いて同様に精製した。
【００９０】
ARS_for:      5'-TCAACTGCTATCCCCCCTGTTA-3'
ARS_rev:      5'-AAACTCCTTTACTTAAATGTTTTGATAAATAAA-3'
EYFP_for_NdeI:      5'-TACATATGGTGAGCAAGGGCGA-3'
EYFP_rev_EcoRI:      5'-TAGAATTCTTATCTAGACTTGTACAGCTCG-3'。
【００９１】
2つの制限切断PCR産物を、あらかじめBamHIおよびEcoRIで制限切断されたベクターpEKEx2に一緒にライゲートし、したがって、IPTG誘導性プロモーターptacの制御下に置いた。次いでライゲーションバッチでE. coli XL1ブルーを形質転換した。
【００９２】
カナマイシン耐性形質転換体を構築物pEKEx2-ARS-EYFPの存在に関してコロニーPCRを用いて試験し(プライマーpEKEx2_for (配列番号４６)およびEYFP_rev (配列番号４７))、さらなる分析のためにプラスミドを精製した。
【００９３】
作製された構築物pEKEx2-ARS-EYFPの確認のために、これを制限酵素NdeIで切断し、バンドパターンに基づいて検査した。
【００９４】
図４に示されるアデニンセンサーの配列決定(配列番号４８)で、アデニン依存的リボスイッチ(ydhL)と自己蛍光タンパク質EYFPとの無傷の融合が確認された。
【００９５】
pEKEx2_for:      5'-CGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGC-3'
EYFP_rev:      5'-TAGAATTCTTATCTAGACTTGTACAGCTCG-3'。
【実施例３】
【００９６】
自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列がbrnFEプロモーターの制御下にありかつ自己蛍光タンパク質の発現が細胞内L-メチオニン濃度に依存する細胞によって例示される、第1の実施形態の本発明の細胞の作製。
【００９７】
(a)  ベクターpJC1lrp-brnF'eYFの構築
brnFとレポーター遺伝子eyfpとの融合物の構築のための手順は以下の通りであった。2つの別々の反応で、オリゴヌクレオチドペアlrp-fw-A-BamHI (配列番号５０) / lrp-brnF-rv-I-NdeI (配列番号５１)を用いて、最初にコードlrpおよびbrnF配列の最初の30ヌクレオチド(brnF')を遺伝子間領域(560 bp)とともに増幅し、またオリゴヌクレオチドペアeyfp-fw-H-NdeI (配列番号５２) / eyfp-rv-D-SalI (配列番号５３)を用いてeyfp (751 bp)を増幅した。C. glutamicum由来のゲノムDNAおよび、eyfpの増幅を可能にするベクターpEKEx2-yfp-tetR (Frunzke et al., 2008, J. Bacteriol. 190: 5111-5119)を鋳型として使用した。オリゴヌクレオチドfw-A-BamHIおよびlrp-brnF-rv-I-NdeIに5'末端BamHIおよびNdeI制限切断部位を追加し、オリゴヌクレオチドeyfp-fw-H-NdeIおよびeyfp-rv-D-SalIに5'末端NdeIおよびSalI制限切断部位を追加した。lrp-brnF'増幅物をBamHIおよびNdeIで制限切断し、かつeyfp増幅物をNdeIおよびSalIで制限切断した後、ライゲーションバッチ中でNdeI切断部位の遊離端を介してlrp-brnF'増幅物をeyfp増幅物と融合させ、同時に、BamHIおよびSalIによって同様に開環されたベクターpJC1中にクローニングした(図５)。ライゲーションバッチをE. coli DH5αの形質転換に直接使用した。50μg/mlのカナマイシンを含むLBプレートで形質転換体の選択を行った。これらのプレートで生育し、したがってカナマイシン耐性であったコロニーをコロニーPCRに用いた。断片lrp-brnF'eyfpがベクターpJC1に挿入されたかどうかを確認するために、ベクターpJC1中の「多重クローニング部位」の領域に隣接するオリゴヌクレオチドを用いてコロニーPCRを行った。アガロースゲルでのコロニーPCRの分析では、分析されたサンプル中でサイズ1,530 bpの予測されたPCR産物が示され、その後、ラージスケールでのプラスミド作製のためにコロニーを培養した。制限酵素BamHI、NdeIおよびSalIでの試験切断によって挿入断片の存在を実証した。挿入物の配列決定により、予測配列との100 %一致が示された。Tauch and Kirchner (Curr. Microbiol. (2002) 45:362- 367)の方法によってベクターpJC1lrp-brnF'eYFPでのコンピテントC. glutamicum細胞の形質転換を行い、C. glutamicum ATCC13032 pJC1lrp-brnF'eYFP株を得た。
【００９８】
lrp-fw-A-BamHI    5'-GCGCGGATCCTCACACCTGGGGGCGAGCTG-3'
lrp-brnF-rv-I-NdeI    5'-GCGCCATATGATATCTCCTTCTTAAAGTTCAGCTTGAATGAATCTCTTGCG-3'
eyfp-fw-H-NdeI    5'-GCGCCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3'
eyfp-rv-D-SalI    5'-GCGCGTCGACTTATCTAGACTTGTACAGCTCGTC-3'
Seq_pJC1_for1 (配列番号５４)    5'-CGATCCTGACGCAGATTTTT-3'
Seq_pJC1_rev1 (配列番号５５)    5'-CTCACCGGCTCCAGATTTAT-3'。
【００９９】
(b)  細胞内メチオニン濃度と蛍光出力との相関
さらに詳細な特徴づけのために、L-メチオニンに関するセンサーの感度および動的範囲を測定した。このために、ATCC13032 pJC1lrp-brnF'eYFPでペプチドを用いて種々のメチオニン内部濃度を確立した。この方法は、例えば、Troetschel et al., (J. Bacteriol. 2005, 187: 3786-3794)によって記載されている。以下のジペプチド: L-アラニル-L-メチオニン(Ala-Met)、L-メチオニル-L-メチオニン(Met-Met)、およびL-アラニル-L-アラニン(Ala-Ala)を用いた。種々のL-メチオニン濃度を達成するために、以下の混合比: 0.3 mM Ala-Met＋2.7 mM Ala-Ala、0.6 mM Ala-Met＋2.4 mM Ala-Ala、0.9 mM Ala-Met＋2.1 mM Ala-Ala、1.5 mM Ala-Met＋1.5 mM Ala-Ala、2.1 mM Ala-Met＋0.9 mM Ala-Ala、2.7 mM Ala-Met＋0.3 mM Ala-Ala、3 mM Ala-Met、3 mM Met-Metを使用し、それをCGXII培地に加えた(Keilhauer et al., 1993, J Bacteriol. 175:5595-603)。BioLectorシステム(m2p-labs GmbH, Forckenbeckstrasse 6, 52074 Aachen, Germany)においてマイクロタイタースケール(Flowerplate(登録商標) MTP-48-B)で0.6 mlの培地で培養を行った。ペプチドを加えた7分後、200μlの細胞懸濁液由来の細胞をシリコーン油での遠心分離によって培地から分離し、Klingenberg and Pfaff (Methods in Enzymology 1967; 10: 680-684)によって記載されているようにして不活性化した。サンプルの細胞質画分をEbbinghausen et al. (Arch. Microbiol. (1989), 151:238-244)によって記載されているようにして用意し、Lindroth and Mopper (Anal. Chem. (1979) 51, 1167-1174)によって記載されているようにして逆相HPLCを用いてアミノ酸濃度を定量した。種々のペプチド濃度を有するATCC13032 pJC1lrp-brnF'eYFPの培養物の蛍光をBioLectorシステム(m2p-labs GmbH, Forckenbeckstrasse 6, 52074 Aachen, Germany)でオンラインで検出した。内部L-メチオニン濃度と蛍光出力シグナルとの相関を図６に示す。センサープラスミドpJC1lrp-brnF'eYFPが約0.2〜25 mMの線形範囲でメチオニンの細胞内検出を可能にすることが認められる。メチオニンの蓄積は、低いmM範囲(< 1 mM)ですでに検出することができる。
【実施例４】
【０１００】
実施例4
リシン形成が増加している細胞の単離およびリシン形成を生じさせる新規突然変異の特定のための代謝産物センサーの使用。
【０１０１】
(a)  リシンセンサーpSenLysTK-Cを含む組換え野生型のCorynebacterium glutamicumの構築
ベクターpJC1はCremer et al. (Molecular and General Genetics, 1990, 220:478-480)によって記載されている。このベクターをBamHIおよびSalIで切断し、GATC (GATC Biotech AG, Jakob-Stadler-Platz 7, 78467 Konstanz)によって合成された1,765 kb断片BamHI-<-EYFP-lysE'-lysG->-SalI (配列番号５６)とライゲートした。
【０１０２】
得られたベクターpSenLysTKを制限酵素BamHIで消化し、GATC (GATC Biotech AG, Jakob-Stadler-Platz 7, 78467 Konstanz)によって合成された2,506 kb断片BamHI-T7ターミネーター-<-クリムゾン----lacIQ->-BamHI (配列番号５７)とライゲートした。
【０１０３】
得られたベクターをpSenLysTK-Cと称した。それは、転写融合物としてEYFPを含み、生存マーカーとしてタンパク質クリムゾン(crimson)を含む。Tauch et al. (Curr. Microbiol. 45 (2002), pages 362-7)によって記載されているようにして野生型のコンピテント細胞にセンサープラスミドpSenLysTK-Cを導入し、Corynebacterium glutamicum ATCC13032 pSenLysTK-C株を得た。
【０１０４】
(b)  Corynebacterium glutamicum ATCC13032 pSenLysTK-Cの突然変異誘発
得られたATCC13032 pSenLysTK-C株を「Difco Brain Heart Infusion」培地(Difco, Becton Dickinson BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA)中で30℃で一晩培養し、この培養物5 mlに、1 mlのジメチルスルホキシドに溶解された0.5 mgのN-メチル-N-ニトロソ-N'-ニトログアニジンの溶液0.1 mlを加えた。この培養物を30℃で15分振とうした。次いで細胞を4℃および2,500 gで遠心分離し、5 mlの0.9 % NaClに再懸濁した。遠心分離ステップおよび再懸濁を反復した。このように得られた細胞懸濁液に7.5 mlの80 %濃度グリセロールを加え、この突然変異細胞懸濁液のアリコートを-20℃で保存した。
【０１０５】
(c)  ハイスループットサイトメトリー(HT-FACS =「ハイスループット蛍光励起セルソーティング」) およびセルソーティング
(b)で得られた細胞懸濁液200μlを20 mlのCGXII-Kan25液体培地(Keilhauer et al., J. Bacteriol. 1993; 175(17):5595-603)に加え、培養物を30℃および180 rpmでインキュベートした。45分後、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドを終濃度0.1 mMで加えた。さらに2時間のインキュベーション後、光学特性の分析およびBecton Dickinson (Becton Dickinson BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA)のFACS Aria IIセルソーターでの細胞粒子のソーティングを行った。FACS設定の「前方散乱」および「側方散乱」の限界値は、「前方散乱」の場合は50 mV (NDフィルター1.0)および「側方散乱」の場合は550 mVの電子増幅で500であった。波長488 nmおよび、625 mVで530〜30の「パラメーターゲイン」(PMT)による検出によってEYFPの励起を達成した。波長633 nmおよび、700 mVで660〜20のPMTによる検出によってクリムゾンの励起を達成した。2百万のクリムゾン陽性細胞を20 mlのCGXII-Kan25中でソートし、培養物を180 rpmおよび30℃で22時間培養した。次いで再びイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドを終濃度0.1 mMで加えた。さらに2時間後、EYFPおよびクリムゾン蛍光に関して分析速度10,000粒子/秒で18,000,000細胞を分析し、580細胞を選別し、FACS Aria IIセルソーターを用いて自動的にBHIS-Kan25プレートに載せた。プレートを30℃で16時間インキュベートした。プレートに載せた580細胞のうち、270が生育した。これらをすべてマイクロタイタープレートの0.8 mlのCGXII-Kan25中に移し、400 rpmおよび30℃で48時間培養した。プレートをマイクロタイタープレートローターで4,000 x gで30分、4℃で遠心分離し、上清を水で1 : 100希釈し、HPLCを用いて分析した。185クローンをリシン形成体として特定した。さらに詳細な特徴づけのため、これらのクローンのうち40クローンの生成物形成に関する分析を振とうフラスコ中の50 mlのCGXII-Kan25中で再び行った。出発株ATCC13032 pSenLysTK-Cはリシンを分泌しないが、40の突然変異体は2〜35 mMの範囲の種々の量のリシンを形成する(図７)。
【０１０６】
(d)  lysC、hom、thrBおよびthrC中の突然変異の特定
40の突然変異体のさらなる特徴づけのため、Qiagen (Qiagen, Hilden, Germany)のDNeasyキットを用いてそれらの染色体DNAを単離した。遺伝子lysCをプライマーlysC-32F (配列番号５８)およびlysC-1938R (配列番号５９)を用いて増幅し、増幅物をEurofins MWG Operon (Anzingerstr. 7a, 85560 Ebersberg, Germany)によって配列決定した。
【０１０７】
lysC-32F      5'-GAACATCAGCGACAGGACAA-3'
lysC-1938R      5'-GGGAAGCAAAGAAACGAACA-3'。
【０１０８】
既知の突然変異T311I、T308I、A279T、A279VおよびA279Tを得た。さらに、新規突然変異H357Y (cac→tac)、T313I (acc→atc)、G277D (ggc→gac)およびG277S (ggc→agc)を得た。野生型のコードトリプレットとそれに続く、突然変異体の対応する突然変異型トリプレットをそれぞれについて括弧内に記載する。
【０１０９】
プライマーhom-289F (配列番号６０)およびthrB-2069R (配列番号６１)を用いて遺伝子homを増幅し、増幅物をEurofins MWG Operon (Anzingerstr. 7a, 85560 Ebersberg, Germany)によって配列決定した。
【０１１０】
hom-289F      5'-CCTCCCCGGGTTGATATTAG-3'
thrB-2069R      5'-GGCCAGCACGAATAGCTTTA-3'。
【０１１１】
新規突然変異A346V (gct→gtt)、V211F (gtc→ttc)、G241S (ggt→agt)、A328V (gct→gtt)、T233I (acc→atc)、および二重突然変異R158C (cgc→tgc) T351I (acc→atc)を得た。
【０１１２】
プライマーペアhom-1684F (配列番号６２)およびthrB-2951R (配列番号６３)を用いて突然変異体のthrBをさらに配列決定して、新規突然変異S102F (tcc→ttc)を得た。
【０１１３】
hom-1684F      5'-AGGAATCTCCCTGCGTACAA-3'
thrB-2951R      5'-CCGGATTCATCCAAGAAAGC-3'。
【０１１４】
プライマーペアthrC-22F (配列番号６４)およびthrC-2046R (配列番号６５)を用いて突然変異体のthrCをさらに配列決定して、新規突然変異A372V (gcc→gtc)を得た。
【０１１５】
thrC-22F      5'-GCCTTAAAACGCCACTCAAT-3'
thrC-2046R      5'-GGCCGTTGATCATTGTTCTT-3'。
【０１１６】
(e)  murEの突然変異の特定
lysC中の突然変異でも、hom、thrBまたはthrC中の突然変異でもない突然変異を含む突然変異体で突然変異をさらに特定するために、さらにmurEを配列決定した。プライマーmurE-34F (配列番号６６)およびmurE-1944R (配列番号６７)を用いて遺伝子murEを増幅し、増幅物をGATC (GATC Biotech AG, Jakob-Stadler-Platz 7, 78467 Konstanz)によって配列決定した。
【０１１７】
murE-34F      5'-AACTCCACGCTGGAGCTCAC-3'
murE-1944R      5'-AGAACGCGGAGTCCACG-3'。
【０１１８】
ヌクレオチド361でのCからTへのトランジション(ctc→ttc)を含み、それがMurEタンパク質(配列番号６８)において、タンパク質の121位のアミノ酸交換L121Fを生じさせる、murE遺伝子配列(配列番号６９)が決定された。
【０１１９】
(f)  野生型でのリシン形成に対するmurE突然変異の影響
プライマー7-39-L-F (配列番号７０)および7-39-R-R (配列番号７１)を用いて、実施例(e)で得られたC. glutamicum突然変異体M39の染色体DNAから1 kbの遺伝子murEを増幅し、新たに特定された突然変異を保持するmurE断片を得た。得られた増幅物をBamHIおよびSalIによって、C. glutamicumで複製できないベクターpK19mobsacB (Schaefer et al., Gene 1994; 145:69-73)中にクローニングし、それを相同組換えによって野生型ゲノムに導入した(Tauch et al., Curr. Microbiol. 45 (2002), pages 362-7; Schaefer et al., Gene 1994; 145:69-73)。次いで、得られたC. glutamicum Lys39株を50 mlのBHIS-Kan25中で30℃および130 rpmで12時間培養した。500μlのこの培養物を50 mlのCGXII-Kan25中に移し、再び30℃および130 rpmで24時間培養した。これから出発し、初期ODが0.5の50 mlのCGXII本培養物を接種し、この培養物を130 rpmおよび30℃で48時間培養した。培養上清を水で1 : 100に希釈し、表1に得られるL-リシン濃度をHPLCによって決定した。
【０１２０】
7-39-L-F      5'-TAGGATCCCGACAACATCCCACTGTCTG-3'
7-39-R-R      5'-AAGTCGACGTCTGCTTCTTGCCCAAGG-3'。
【表１】
2013529073.tif 000003
【０１２１】
配列
配列番号１
2013529073.tif 000004
【０１２２】
配列番号２
2013529073.tif 000005
【０１２３】
配列番号３
2013529073.tif 000006
【０１２４】
配列番号４
2013529073.tif 000007
【０１２５】
配列番号５
2013529073.tif 000008
【０１２６】
配列番号６
2013529073.tif 000009
【０１２７】
配列番号７
2013529073.tif 000010
【０１２８】
配列番号８
2013529073.tif 000011
【０１２９】
配列番号９
2013529073.tif 000012
【０１３０】
配列番号１０
2013529073.tif 000013
2013529073.tif 000014
【０１３１】
配列番号１１
2013529073.tif 000015
【０１３２】
配列番号１２
2013529073.tif 000016
2013529073.tif 000017
【０１３３】
配列番号１３
2013529073.tif 000018
【０１３４】
配列番号１４
2013529073.tif 000019
【０１３５】
配列番号１５
2013529073.tif 000020
【０１３６】
配列番号１６
2013529073.tif 000021
2013529073.tif 000022
【０１３７】
配列番号１７
2013529073.tif 000023
【０１３８】
配列番号１８
2013529073.tif 000024
【０１３９】
配列番号１９
2013529073.tif 000025
【０１４０】
配列番号２０
2013529073.tif 000026
2013529073.tif 000027
【０１４１】
配列番号２１
2013529073.tif 000028
【０１４２】
配列番号２２
2013529073.tif 000029
【０１４３】
配列番号２３
2013529073.tif 000030
【０１４４】
配列番号２４
2013529073.tif 000031
【０１４５】
配列番号２５
2013529073.tif 000032
2013529073.tif 000033
【０１４６】
配列番号２６
2013529073.tif 000034
【０１４７】
配列番号２７
2013529073.tif 000035
【０１４８】
配列番号２８
2013529073.tif 000036
【０１４９】
配列番号２９
2013529073.tif 000037
【０１５０】
配列番号３０
2013529073.tif 000038
【０１５１】
配列番号３１
2013529073.tif 000039
【０１５２】
配列番号３２
2013529073.tif 000040
【０１５３】
配列番号３３
2013529073.tif 000041
2013529073.tif 000042
【０１５４】
配列番号３４
2013529073.tif 000043
【０１５５】
配列番号３５
2013529073.tif 000044
【０１５６】
配列番号３６
2013529073.tif 000045
【０１５７】
配列番号３７
2013529073.tif 000046
2013529073.tif 000047
【０１５８】
配列番号３８
2013529073.tif 000048
【０１５９】
配列番号３９
2013529073.tif 000049
【０１６０】
配列番号４０
2013529073.tif 000050
【０１６１】
配列番号４１
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【０１６２】
配列番号４２
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【０１６３】
配列番号４３
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【０１６４】
配列番号４４
2013529073.tif 000054
【０１６５】
配列番号４５
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【０１６６】
配列番号４６
2013529073.tif 000056
【０１６７】
配列番号４７
2013529073.tif 000057
【０１６８】
配列番号４８
2013529073.tif 000058
【０１６９】
配列番号４９
2013529073.tif 000059
【０１７０】
配列番号５０
2013529073.tif 000060
【０１７１】
配列番号５１
2013529073.tif 000061
【０１７２】
配列番号５２
2013529073.tif 000062
【０１７３】
配列番号５３
2013529073.tif 000063
【０１７４】
配列番号５４
2013529073.tif 000064
【０１７５】
配列番号５５
2013529073.tif 000065
【０１７６】
配列番号５６
2013529073.tif 000066
2013529073.tif 000067
【０１７７】
配列番号５７
2013529073.tif 000068
2013529073.tif 000069
【０１７８】
配列番号５８
2013529073.tif 000070
【０１７９】
配列番号５９
2013529073.tif 000071
【０１８０】
配列番号６０
2013529073.tif 000072
【０１８１】
配列番号６１
2013529073.tif 000073
【０１８２】
配列番号６２
2013529073.tif 000074
【０１８３】
配列番号６３
2013529073.tif 000075
【０１８４】
配列番号６４
2013529073.tif 000076
【０１８５】
配列番号６５
2013529073.tif 000077
【０１８６】
配列番号６６
2013529073.tif 000078
【０１８７】
配列番号６７
2013529073.tif 000079
【０１８８】
配列番号６８
2013529073.tif 000080
2013529073.tif 000081
【０１８９】
配列番号６９
2013529073.tif 000082
【０１９０】
配列番号７０
2013529073.tif 000083
【０１９１】
配列番号７１
2013529073.tif 000084
【０１９２】
配列番号７２
2013529073.tif 000085
【図１】
2013529073.tif 000086
【図２】
2013529073.tif 000087
【図３】
2013529073.tif 000088
【図４】
2013529073.tif 000089
【図５】
2013529073.tif 000090
【図６】
2013529073.tif 000091
【図７】
2013529073.tif 000092
【配列表】
2013529073000001.app
【国際調査報告】
2013529073.tif 000093
2013529073.tif 000094
2013529073.tif 000095
2013529073.tif 000096
2013529073.tif 000097
2013529073.tif 000098
2013529073.tif 000099
2013529073.tif 000100
2013529073.tif 000101
2013529073.tif 000102