(57)【要約】本発明は、式Iの化合物およびそれらの塩、ならびに該化合物を用いた組成物および方法を提供する。該化合物はC型肝炎ウイルス(HCV)に対する活性を有し、HCVに感染した患者の治療に有用でありうる。2013530232.tif 000017
2013530232.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I:
【化１】
2013530232.tif 000014
［式中、
R1は、フェニルまたはピリジニルであって、それらはハロ、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキルオキシ、およびアルコキシアルキルオキシからなる群から選択される0〜3個の置換基で置換されており、また、1個のCON(R9)(R10)置換基で置換されており;
R2は、水素、ハロ、またはアルキルであり;
R3は、CONHCH3であり;
R4は、X-Ar1でパラ置換されているフェニルであり;
R5およびR6は、独立して、水素、アルキル、ハロ、N(R7)(R8)、またはアルキルスルホニルであり;
R7およびR8は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルキルスルホニル、またはアルキルスルホニルアルキルであるか;あるいは、
N(R7)(R8)は、一緒になって、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、またはピペラジニルであって、それらはアルキル、ヒドロキシアルキル、もしくはヒドロキシから選択される0〜2個の置換基で置換されており;
R9は、水素であり;
R10は、
【化２】
2013530232.tif 000015
であり;
R11およびR12は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、またはアルコキシアルキルであるか;あるいは、
R11およびR12は、一緒になって、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、またはヘキシレンであり;
Xは、-O-または-NH-であり;
Ar1は、フェニルまたはパラハロフェニルであり;そして、
Ar2は、フェニル、ピリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、オキサジアチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラジニル、またはピリミジニルであって、それらはハロ、アルキル、もしくはジアルキルアミノから選択される0〜3個の置換基で置換されている］
の化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項２】
R1が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシ、およびヒドロキシアルキルオキシからなる群から選択される0〜3個の置換基で置換されたフェニルであって、また、それは1個のCON(R9)(R10)置換基で置換されており;
R2が、水素またはFであり;
R3が、CONHCH3であり;
R4が、X-Ar1でパラ置換されているフェニルであり;
R5およびR6が、水素であり;
R11およびR12が、独立して、メチルであるか、あるいは、R11およびR12が、一緒になって、エチレンまたはプロピレンであり;
Xが、-O-であり;
Ar1が、パラフルオロフェニルであり;そして、
Ar2が、フェニル、ピリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、オキサジアチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラジニル、またはピリミジニルであって、それらはハロもしくはアルキルから選択される0〜3個の置換基で置換されている、
請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項３】
R1が、アルキルおよびアルコキシからなる群から選択される0〜2個の置換基で置換されたフェニルであって、また、それは1個のCON(R9)(R10)置換基で置換されており;R2がFであり;R3がCONHCH3であり;R4がX-Ar1でパラ置換されているフェニルであり;R5およびR6が水素であり;R11およびR12が一緒になってエチレンであり;Xが-O-であり;Ar1がパラフルオロフェニルであり;そして、Ar2がピリミジニルである、請求項２に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項４】
式:
【化３】
2013530232.tif 000016
である、請求項３に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物もしくはその医薬的に許容される塩および医薬的に許容される担体を含有する組成物。
【請求項６】
治療上有効な量の請求項１に記載の化合物を患者に投与することを含む、C型肝炎感染症を処置するための方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、2010年6月30日に出願された米国仮特許出願第61/359,881号の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
（発明の背景）
本発明は概して、C型肝炎ウイルス(HCV)に対する活性を有し、HCVに感染した者の処置に有用である、式Iの新規化合物およびその塩に関する。本発明はまた、これら化合物を用いた組成物および方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
C型肝炎ウイルス(HCV)は主要なヒト病原体であり、世界中で推定1億7千万人が感染しており-これはヒト免疫不全ウイルス１型による感染数のおよそ5倍である。これらHCV感染者のかなりの割合が、肝硬変および肝細胞癌を含む重篤な進行性肝疾患を発症する(非特許文献１)。
【０００４】
HCVはプラス鎖RNAウイルスである。5'非翻訳領域における推定アミノ酸配列および広範な類似性の比較に基づいて、HCVはフラビウイルス科の独立した属として分類されている。フラビウイルス科の全てのメンバーは、単一の連続したオープンリーディングフレームの翻訳を介して全ての公知のウイルス-特異的タンパク質をコードするプラス鎖RNAゲノムを含有するエンベロープに包まれたビリオンを有する。
【０００５】
HCVゲノム全体にわたって、ヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列内に、かなりの多様性が見いだされる。少なくとも6つの主要な遺伝子型がキャラクタライズされており、50を超えるサブタイプが記載されている。HCVの主要な遺伝子型は世界的な分布において異なっており、病原性および治療法における遺伝子型の影響の可能性についての多くの研究にもかかわらず、HCVの遺伝的多様性の臨床的意義は依然として捉えにくい。
【０００６】
一本鎖HCV RNAゲノムは約9500ヌクレオチド長であり、約3000のアミノ酸である単一の大きなポリタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレーム(ORF)を有する。感染細胞において、このポリタンパク質は、細胞プロテアーゼおよびウイルスプロテアーゼにより複数の部位で切断され、構造タンパク質および非構造(NS)タンパク質を生じる。HCVの場合、成熟非構造タンパク質(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、およびNS5B)の生成は、2つのウイルスプロテアーゼによりもたらされる。1つめのものはメタロプロテアーゼであり、NS2-NS3接合部を切断すると考えられており;2つめは、NS3のN-末端領域内に含まれるセリンプロテアーゼ(本明細書においてNS3プロテアーゼとも称される)であり、NS3の下流、すなわちNS3-NS4A切断部位においてシスで、残りのNS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NS5B部位についてトランスでの両方における以降の切断の全てを仲介する。該NS4Aタンパク質は複数の機能を果たすと思われ、NS3プロテアーゼの補助因子として作用し、NS3および他のウイルスのレプリカーゼ成分の膜局在をおそらく補助している。NS3タンパク質とNS4Aとの複合体形成は、イベントの進行、全ての部位におけるタンパク質分解効率の増強に必要であると思われる。該NS3タンパク質はまた、ヌクレオシドトリホスファターゼおよびRNAヘリカーゼ活性を示す。NS5B(HCVポリメラーゼとも言う)は、HCVの複製に関与するRNA-依存性RNAポリメラーゼである。HCV NS5Bタンパク質は非特許文献２および３に記載されている。
【０００７】
現在、最も有効なHCVの治療法は、α-インターフェロンとリバビリンの組み合わせを用いており、40％の患者において持続的効果をもたらしている(非特許文献４)。最近の臨床結果により、ペグα-インターフェロンが単独療法としては未修飾のα-インターフェロンよりも優れていることが示されている(非特許文献５)。しかしながら、ペグα-インターフェロンとリバビリンの組み合わせを含む実験的な治療レジメンでも、かなりの割合の患者において、ウイルス量の持続的な減少が認められない。従って、HCV感染症の処置に対する有効な治療薬の開発が明確にかつ切実に必要とされている。
【０００８】
HCV-796（HCV NS5B阻害剤）は、患者におけるHCV RNAレベルを低下させる能力を示した。ウイルスRNAレベルは一時的に減少した後、該化合物を単剤として用いた処置の場合は投与の間にリバウンドしたが、インターフェロンおよびリバビリンの一種である標準的な治療と組み合わせた場合はより確実にレベルが低下した。この化合物の開発は、該組み合わせレジメンの長期投与の間に見られた肝毒性のため、中断していた。特許文献１および対応する特許文献２にHCV-796クラスの化合物が記載されている。 他の化合物が開示されている（例えば、特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第7,265,152号
【特許文献２】PCT特許出願 WO2004/041201
【特許文献３】WO2009/101022
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Lauer, G. M.; Walker, B. D. N. Engl. J. Med. 2001, 345, 41-52
【非特許文献２】“Structural Analysis of the Hepatitis C Virus RNA Polymerase in Complex with Ribonucleotides (Bressanelli; S. et al., Journal of Virology 2002, 3482-3492
【非特許文献３】Defrancesco and Rice, Clinics in Liver Disease 2003, 7, 211-242
【非特許文献４】Poynard, T. et al. Lancet 1998, 352, 1426-1432
【非特許文献５】Zeuzem, S. et al. N. Engl. J. Med. 2000, 343, 1666-1672
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は技術的利点をもたらし、例えば、該化合物は新規であり、C型肝炎に対して有効である。また、該化合物は、例えば、それらの作用メカニズム、結合、阻害効果、標的選択性、溶解性、安全性プロファイルまたは生物学的利用能のうちの１つ以上に関して、医薬用途における利点をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の詳細）
本発明の一態様は、式I:
【化１】
2013530232.tif 000003
［式中、
R1は、フェニルまたはピリジニルであって、それらはハロ、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキルオキシ、およびアルコキシアルキルオキシからなる群から選択される0〜3個の置換基で置換されており、また、1個のCON(R9)(R10)置換基で置換されており;
R2は、水素、ハロ、またはアルキルであり;
R3は、CONHCH3であり;
R4は、X-Ar1でパラ置換されているフェニルであり;
R5およびR6は、独立して、水素、アルキル、ハロ、N(R7)(R8)、またはアルキルスルホニルであり;
R7およびR8は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルキルスルホニル、またはアルキルスルホニルアルキルであるいか;あるいは、
N(R7)(R8)は一緒になって、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、またはピペラジニルであって、それらはアルキル、ヒドロキシアルキル、もしくはヒドロキシから選択される0-2個の置換基で置換されており;
R9は、水素であり;
R10は、
【化２】
2013530232.tif 000004
であり;
R11およびR12は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、またはアルコキシアルキルであるか;あるいは、
R11およびR12は、一緒になって、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、またはヘキシレンであり;
Xは、-O-または-NH-であり;
Ar1は、フェニルまたはパラハロフェニルであり;そして、
Ar2は、フェニル、ピリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、オキサジルアチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラジニル、またはピリミジニルであって、それらはハロ、アルキル、もしくはジアルキルアミノから選択される0〜3個の置換基で置換されている］
の化合物またはその医薬的に許容される塩である。
【００１３】
本発明の別の態様は、
R1が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシ、およびヒドロキシアルキルオキシからなる群から選択される0〜3個の置換基で置換されたフェニルであって、また、それは1個のCON(R9)(R10)置換基で置換されており;
R2が、水素またはFであり;
R3が、CONHCH3であり;
R4が、X-Ar1でパラ置換されているフェニルであり;
R5およびR6が、水素であり;
R11およびR12が、独立して、メチルであるか、あるいは、R11およびR12が、一緒になって、エチレンまたはプロピレンであり;
Xが、-O-であり;
Ar1が、パラフルオロフェニルであり;そして、
Ar2が、フェニル、ピリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、オキサジアチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラジニル、またはピリミジニルであって、それらはハロもしくはアルキルから選択される0〜3個の置換基で置換されている、
式Iの化合物またはその医薬的に許容される塩である。
【００１４】
本発明の別の態様は、R1が1個のCON(R9)(R10)、1個のメチル置換基、および1個のメトキシ置換基で置換されたフェニルであり;R2がフルオロであり;R4がX-Ar2でパラ置換されているフェニルであり;R5およびR6が水素であり;R10が
【化３】
2013530232.tif 000005
であり;R12およびR13が、一緒になって、エチレンであり;そして、Ar2がピリミジニルである、式Iの化合物またはその医薬的に許容される塩である。
【００１５】
本発明の別の態様は、R1が、1個のCON(R9)(R10)置換基で置換され、また、0〜2個のハロ、アルキル、もしくはアルコキシ置換基で置換されたフェニルである、式Iの化合物である。
【００１６】
本発明の別の態様は、R10が
【化４】
2013530232.tif 000006
であり、そして、R12およびR13がエチレンまたはプロピレンである、式Iの化合物である。
【００１７】
本発明の別の態様は、R10が
【化５】
2013530232.tif 000007
であり、そして、R12およびR13がエチレンである、式Iの化合物である。
【００１８】
本発明の別の態様は、R10が
【化６】
2013530232.tif 000008
であり、そして、R12およびR13のうちの少なくとも1つが水素でない、式Iの化合物である。
【００１９】
本発明の別の態様は、R4がフェニルまたはモノフルオロフェニルである、式Iの化合物である。
【００２０】
本発明の別の態様は、Ar1がフェニルである、式Iの化合物である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、X、Ar1、もしくはAr2を含むいずれの変数のいずれの範囲は、いずれの他の変数の範囲と独立して用いることができる。
【００２２】
他に特別の定めのない限り、これらの用語は以下の意味を有する。「アルキル」は、1〜6個の炭素から成る直鎖もしくは分枝鎖アルキル基を意味する。「アルケニル」は、少なくとも1個の二重結合を有する、2〜6個の炭素から成る直鎖または分枝鎖アルキル基を意味する。「シクロアルキル」は、3〜7個の炭素から成る単環系を意味する。「ヒドロキシアルキル」、「アルコキシ」、および置換されたアルキル部分を有する他の用語は、アルキル部分についての1〜6個の炭素原子から成る直鎖および分枝鎖異性体を含む。「ハロ」は、ハロで定義された置換基においてモノハロ置換からペルハロ置換された全てのハロゲン化異性体、例えば、「ハロアルキル」および「ハロアルコキシ」、「ハロフェニル」、「ハロフェノキシ」を含む。「アリール」は、炭素環およびヘテロ環芳香族置換基を含む。括弧（Parenthetic）および複数の括弧（multiparenthetic）でくくられた用語は、当業者に対して結合関係を明確にすることを目的としている。例えば、((R)アルキル)のような用語は、置換基Rでさらに置換されたアルキル置換基を意味する。多環系(例えば二環式環系)上の可変部位で結合するように化学描画により図示される置換基は、それらが付加するように描かれる環に結合することが意図される。例えば、式IVの置換基R1およびR2は、式IVのチオフェン環ではなくベンゼン環に結合することが意図されている。
【００２３】
エチレンは、エタンジイルもしくは-CH2CH2-を意味し;プロピレンは、プロパンジイルもしくは-CH2CH2CH2-を意味し;ブチレンは、ブタンジイルもしくは-CH2CH2CH2CH2-を意味し;ペンチレンは、ペンタンジイルもしくは-CH2CH2CH2CH2CH2-を意味する。
【００２４】
本発明には、該化合物の医薬的に許容される塩形態の全てが含まれる。医薬的に許容される塩は、対イオンが化合物の生理活性または毒性に有意に寄与せず、したがって薬理学的同等物として機能するものである。これらの塩は、市販の試薬を用いた一般的な有機化学技術に従って製造することができる。いくつかのアニオン塩形態としては、酢酸塩、アシストレート、ベシル酸塩、臭化物塩、カンシル酸塩、塩化物塩、クエン酸塩、フマル酸塩、グルコウロン酸塩（glucouronate）、臭化水素塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、ヨウ化物塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシレート、およびキシノホエート（xinofoate）が挙げられる。いくつかのカチオン塩形態としては、アンモニウム塩、アルミニウム塩、ベンザチン塩、ビスマス塩、カルシウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、リチウム塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、4-フェニルシクロヘキシルアミン塩、ピペラジン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、トロメタミン塩、および亜鉛塩が挙げられる。
【００２５】
いくつかの本発明の化合物は、不斉炭素原子を有している。本発明には、エナンチオマーおよびジアステレオマー並びに立体異性体の混合（例えばラセミ体）を含む、全ての立体異性体が含まれる。いくつかの立体異性体は、当分野で公知の方法を用いて製造することができる。該化合物の立体異性体の混合物および関連する中間体は、当分野で公知の方法に従って、個々の異性体に分離することができる。以下のスキームおよび表中の分子構造の描写における楔またはハッシュ（hash）の使用は、相対的な立体化学を示すことのみを意図しており、絶対的な立体化学帰属を暗示するものとして解釈すべきでない。
【００２６】
本発明は、本発明の化合物に出現する原子の全ての同位体を含むことを意図する。同位体には、原子番号が同一であるが質量数が異なる原子が含まれる。一般的な例として、限定されることなく、水素の同位体にはジュウテリウムおよびトリチウムが含まれる。炭素の同位体としては13Cおよび14Cが挙げられる。同位体で標識された本発明の化合物は一般に、当業者に公知の通常の技法によってか、または本明細書に記載されたものと類似した方法によって、他で用いられる非標識試薬の代わりに適切な同位体-標識試薬を用いて、製造することができる。そのような化合物は、例えば、生物活性の決定における標準物質および試薬として、様々な使用可能性を有しうる。安定な同位体の場合、そのような化合物は、生物学的、薬理学的、または薬物動態学的特性を都合よく修飾する能力を有しうる。
【００２７】
（生物学的方法）
該化合物は、以下のHCV RdRpアッセイにおいて決定されるように、HCV NS5Bに対する活性を示した。
【００２８】
HCV NS5B RdRpクローニング、発現、および精製
HCVのNS5Bタンパク質、遺伝子型1bをコードするcDNAをpET21a発現ベクターにクローニングした。該タンパク質を18個のアミノ酸のC-末端切断で発現させ、溶解性を増強した。大腸菌コンピテント細胞株BL21(DE3)を、該タンパク質の発現に用いた。培養物が600 nmで吸光度2.0になるまで、37℃で〜4時間培養した。該培養物を20℃まで冷却し、1 mM IPTGで誘導した。新鮮なアンピシリンを最終濃度50 μg/mlまで添加し、該細胞を終夜20℃で増殖させた。
【００２９】
細胞ペレット(3L)を溶解させて精製し、15〜24 mgの精製NS5Bを得た。該溶解バッファーは、20 mM Tris-HCl, pH 7.4、500 mM NaCl、0.5％トリトンX-100、1 mM DTT、1mM EDTA、20％グリセロール、0.5 mg/ml リゾチーム、10 mM MgCl2、15 μg/ml デオキシリボヌクレアーゼI、およびComplete TM protease inhibitor tablets (Roche)から成る。該溶解バッファーの添加後、凍結させた細胞ペレットを、組織ホモジナイザーを用いて再懸濁した。サンプルの粘稠性を減少させるために、溶解物のアリコートを、Branson超音波処理器に接続したマイクロチップを用いて氷上で超音波処理した。超音波処理した溶解物を4℃で30分間、100,000 x gで遠心分離し、0.2 μm フィルターユニット(Corning)を通して濾過した。
【００３０】
該タンパク質を、2つの連続したクロマトグラフィー工程:Heparin sepharose CL-6BおよびpolyU sepharose 4Bを用いて精製した。該クロマトグラフィーバッファーは溶解バッファーと同じであるが、リゾチーム、デオキシリボヌクレアーゼI、MgCl2またはプロテアーゼインヒビターを含まず、バッファーのNaCl濃度はカラムへのタンパク質の充填要件に従って調節した。各カラムをNaClグラジエントで溶出した（カラムの種類に依存して5〜50のカラム容積の長さで変化させた）。最終クロマトグラフィー工程の後、得られた酵素の純度はSDS-PAGE分析に基づき＞90％であった。該酵素をアリコートにして-80℃で保存した。
【００３１】
標準的HCV NS5B RdRp酵素アッセイ
HCV RdRp 遺伝子型1bアッセイを、96ウェルプレート(Costar 3912)において、最終量60 mlで行った。アッセイバッファーは、20 mM Hepes, pH 7.5、2.5 mM KCl、2.5 mM MgCl2、1 mM DTT、1.6 U RNAseインヒビター(Promega N2515)、0.1 mg/ml BSA(Promega R3961)、および2％グリセロールから成る。全ての化合物をDMSO中に連続的に希釈(3倍)し、アッセイにおけるDMSOの最終濃度が2％であるように、水でさらに希釈した。HCV RdRp 遺伝子型1b酵素は最終濃度28 nMで用いた。ポリA鋳型は6 nMで用い、ビオチン標識オリゴ-dT12プライマーは180 nM最終濃度で用いた。鋳型は商業的に入手した(Amersham 27-4110)。ビオチン標識プライマーはSigma Genosysにより調製された。3H-UTPは0.6 μCi(0.29 μM 総UTP)で用いた。酵素の添加により反応を開始し、30℃で60分間インキュベートし、SPAビーズ(4 μg/μL, Amersham RPNQ 0007)を含有する50 mM EDTAを25 μL添加することにより停止させた。室温で＞1時間インキュベートした後、プレートをPackard Top Count NXTで測定した。
【００３２】
修飾HCV NS5B RdRp酵素アッセイ
また、ビーズ上固相均一アッセイ（on-bead solid phase homogeneous assay）を、NS5B阻害剤を評価するために用いた(WangY-K, Rigat  K, Roberts S, and Gao M (2006) Anal Biochem, 359: 106-111)。該アッセイは、上記の標準的なアッセイを改変したものであり、96-ウェルもしくは384-ウェル型で用いた。ビオチン標識オリゴdT12プライマーを、プライマーおよびビーズをバッファー中で混合して、室温で3時間インキュベートすることによって、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズ(SPAビーズ(GE, RPNQ0007)もしくはimaging bead(GE, RPNQ0261)上に結合させた。未結合のプライマーを遠心分離して除去した。プライマー-結合ビーズを、3x反応バッファー(40 mM Hepes バッファー, pH 7.5、7.5 mM MgCl2、7.5 mM KCl、dTプライマー結合ビーズ、ポリA鋳型、3H-UTP、およびRNAse阻害剤(Promega N2515)）中に再懸濁させた。化合物をDMSO中で1:3に連続希釈し、アッセイプレート中に等分した。等量の(96-ウェルアッセイに対しては20 μL、および384-ウェルアッセイに対しては10 μL)の水、3X反応混合物、および20 mM Hepesバッファー, pH 7.5、0.1 mg/ml BSA中の酵素を、アッセイプレート上の希釈した化合物に加えた。96-ウェルアッセイにおける成分の最終濃度:0.36 nM 鋳型、15 nM プライマー、0.43 μM(1 μCi) 3H-UTP、0.08 U/μL RNAse阻害剤、7 nM NS5B酵素、0.033 mg mL BSA、および2 μg/μLビーズ、20 mM Hepesバッファー, pH 7.5、2.5 mM MgCl2、2.5 mM KCl、2％DMSO。384-ウェルアッセイにおける成分の最終濃度: 0.2 nM 鋳型、15 nM プライマー、0.29 μM 3H-UTP(0.3 μCi)、0.08 U/μL RNAse阻害剤、7 nM NS5B酵素、0.033 mg/mL BSA、および0.33 μg/μLビーズ、20 mM Hepesバッファー, pH 7.5、2.5 mM MgCl2、2.5 mM KCl、2％DMSO。
【００３３】
反応を、30℃で4時間行い、50 mM EDTA(10 μL)を加えることによって停止させた。少なくとも15分間インキュベートした後、プレートを、Packard NXT TopcountもしくはAmersham LEADseeker multimodality imaging systemにおいて測定した。
【００３４】
化合物のIC50値を、7つの異なる[I]を用いて決定した。IC50値を、式y=A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))を用いて、阻害から算出した。
【００３５】
細胞株
化合物を評価するために用いた細胞株は、ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する遺伝子型1aもしくは1bのHCVレプリコンを恒常的に発現するヒト幹細胞由来細胞株(Huh-7)から成る。これらの細胞を、10％FBS、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1.0 mg/mL G418を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で維持した。
【００３６】
HCVレプリコンルシフェラーゼアッセイ
化合物の有効性を評価するために、HCVレプリコン細胞を、96-ウェルプレートにおいて、DMEM（10％FBS含有）中に、104/ウェルの細胞密度で播種した。37℃で終夜インキュベートした後、化合物をDMSO中に連続希釈し、該細胞プレートに加えた。別法として、用量設定した化合物を無菌の384-ウェル組織-培養処理プレート（tissue-culture treated plate）に移し、該プレートに50 μLの細胞を、4％ FCSを含有するDMEM中(最終DMSO濃度 0.5％)中に、2.4 x 103 細胞/ウェルの密度で播種した。37℃で3日間インキュベートした後、細胞を、EnduRen基質(Promega cat #E6485)を用いて製造者の指示書に従って、ウミシイタケルシフェラーゼ活性について分析した。簡単に述べると、該EnduRen基質をDMEMに希釈し、次いでプレートに、7.5 μMの最終濃度まで添加した。該プレートを、37℃で少なくとも1時間インキュベートした後、TopCount NXT マイクロプレートシンチレーション・ルミネッセンスカウンター(Packard)もしくはViewlux Imager (PerkinElmer)において、発光プログラム（luminescence program）を用いて、測定した。50％有効濃度(EC50)を、指数形式の半数影響方程式（median effect equation）を用いて算出した（ここで、EC50=100-[(δFinh/δFcon)x100]）。
【００３７】
化合物の細胞毒性を評価するために、Cell Titer-Blue(Promega)をEnduRen-含有プレートに加え、37℃で少なくとも4時間インキュベートした。各ウェルからの蛍光シグナルを、Cytoflour 400(PE Biosystems)もしくはViewlux Imagerを用いて測定した。全てのCC50値を、半数影響方程式を用いて算出した。
【００３８】
化合物の代表的なデータを表1に報告する。
表1
【表１】
2013530232.tif 000009
【００３９】
（医薬組成物および処置方法）
該化合物は、HCV NS5Bに対する活性を示し、HCVおよびHCV感染症の処置に有用であり得る。従って、本発明の別の態様は、化合物もしくはその医薬的に許容される塩、および医薬的に許容される担体を含有する組成物である。
【００４０】
本発明の別の態様は、抗HCV活性を有する化合物をさらに含有する組成物である。
【００４１】
本発明の別の態様は、抗HCV活性を有する化合物がインターフェロンである組成物である。本発明の別の態様は、該インターフェロンがインターフェロンα2B、ペグインターフェロンα、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンα2A、またはリンパ芽球様インターフェロンタウから選択される。
【００４２】
本発明の別の態様は、抗HCV活性を有する化合物がシクロスポリンである、組成物である。本発明の別の態様は、シクロスポリンがシクロスポリンAである。
【００４３】
本発明の別の態様は、抗HCV活性を有する化合物が、インターロイキン2、インターロイキン6、インターロイキン12、1型ヘルパーＴ細胞応答の発生を増強する化合物、干渉RNA、アンチセンスRNA、イミキモド（Imiqimod）、リバビリン、イノシン5'-一リン酸脱水素酵素阻害剤、アマンタジン、およびリマンタジンからなる群から選択される組成物である。
【００４４】
本発明の別の態様は、抗HCV活性を有する化合物が、HCV感染症の処置のために、HCVメタロプロテアーゼ、HCVセリンプロテアーゼ、HCVポリメラーゼ、HCVヘリカーゼ、HCV NS4Bタンパク質、HCVエントリー、HCVアセンブリ、HCVイグレス、HCV NS5Aタンパク質、IMPDH、またはヌクレオシドアナログから選択される標的の機能を阻害するのに有効である、組成物である。
【００４５】
本発明の別の態様は、化合物もしくはその医薬的に許容される塩、医薬的に許容される担体、インターフェロンおよびリバビリンを含有する組成物である。
【００４６】
本発明の別の態様は、HCVレプリコンに化合物もしくはその医薬的に許容される塩を接触させることを含む、HCVレプリコンの機能を阻害する方法である。
【００４７】
本発明の別の態様は、HCV NS5Bタンパク質に化合物もしくはその医薬的に許容される塩を接触させることを含む、HCV NS5Bタンパク質の機能を阻害する方法である。
【００４８】
本発明の別の態様は、患者に治療上有効な量の化合物もしくはその医薬的に許容される塩を投与することを含む、患者においてHCV感染症を処置する方法である。別の実施態様において、該化合物はHCVレプリコンの機能を阻害するのに有効である。別の実施態様において、該化合物はHCV NS5Bタンパク質の機能を阻害するのに有効である。
【００４９】
本発明の別の態様は、患者に治療上有効な量の化合物またはその医薬的に許容される塩を、抗HCV活性を有する別の化合物とともに(前、後、もしくは同時に)投与することを含む、患者においてHCV感染症を処置する方法である。
【００５０】
本発明の別の態様は、抗HCV活性を有する他の化合物がインターフェロンである、該方法である。
【００５１】
本発明の別の態様は、該インターフェロンがインターフェロンα2B、ペグインターフェロンα、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンα2A、またはリンパ芽球様インターフェロンタウから選択される、該方法である。
【００５２】
本発明の別の態様は、抗HCV活性を有する他の化合物がシクロスポリンである、該方法である。
【００５３】
本発明の別の態様は、該シクロスポリンがシクロスポリンAである、該方法である。
【００５４】
本発明の別の態様は、抗HCV活性を有する他の化合物がインターロイキン2、インターロイキン6、インターロイキン12、1型ヘルパーＴ細胞応答の発生を増強する化合物、干渉RNA、アンチセンスRNA、イミキモド、リバビリン、イノシン5'-一リン酸脱水素酵素阻害剤、アマンタジン、またはリマンタジンから選択される、該方法である。
【００５５】
本発明の別の態様は、抗HCV活性を有する他の化合物が、HCV感染症の処置のために、HCVメタロプロテアーゼ、HCVセリンプロテアーゼ、HCVポリメラーゼ、HCVヘリカーゼ、HCV NS4Bタンパク質、HCVエントリー、HCVアセンブリ、HCVイグレス、HCV NS5Aタンパク質、IMPDH、およびヌクレオシドアナログからなる群から選択される標的の機能を阻害するのに有効である、該方法である。
【００５６】
本発明の別の態様は、抗HCV活性を有する他の化合物がHCV NS5Bタンパク質以外のHCVの生活環における標的の機能を阻害するのに有効である、該方法である。
【００５７】
「治療上有効な」とは、肝炎およびHCV感染症の分野の医師には明らかであるように、有意義な患者利益をもたらすのに必要な薬剤の量を意味する。
【００５８】
「患者」とは、肝炎およびHCV感染症の分野の医師には明らかであるように、HCVウイルスに感染しており、療法に適した人を意味する。
【００５９】
「処置」、「療法」、「レジメン」、「HCV感染症」および関連する用語は、肝炎およびHCV感染症の分野の医師には明らかであるように、用いられる。
【００６０】
本発明の化合物は、通常、治療上有効な量の化合物もしくはその医薬的に許容される塩および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物として提供され、通常の賦形剤を含んでもよい。医薬的に許容される担体は、許容される安全性プロファイルを有する通常の公知の担体である。組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、トローチ剤（losenge）、および散剤、ならびに液体懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤（elixer）、および液剤を含む、全ての一般的な固形および液状形態を包含する。組成物は一般的な製剤技術を用いて製造され、通常の賦形剤(例えば結合剤および湿潤剤)およびベヒクル(例えば水およびアルコール)が組成物に一般的に用いられる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 17th edition, 1985を参照。
【００６１】
固体組成物は通常、用量単位で製剤化され、用量当たり約1〜1000 mgの活性成分を提供する組成物が好ましい。投与量のいくつかの例は、1 mg、10 mg、100 mg、250 mg、500 mg、および1000 mgである。通常、他の薬剤は、臨床的に用いられる種類の薬剤と同様の単位範囲で存在しうる。典型的には、これは0.25〜1000 mg/単位である。
【００６２】
液体組成物は通常、用量単位内である。通常、液体組成物は1〜100 mg/mLの単位用量内であろう。投与量のいくつかの例は、1 mg/mL、10 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL、および100 mg/mLである。通常、他の薬剤は、臨床的に用いられる種類の薬剤と同様の単位範囲で存在しうる。典型的には、これは1〜100 mg/mLである。
【００６３】
本発明は全ての一般的な投与様式を包含し;経口および非経口方法が好ましい。通常、投与レジメンは臨床的に用いられる他の薬剤と同様でありうる。典型的には、１日用量は、1日あたり1〜100 mg/kg体重であろう。通常、経口ではより多くの化合物が必要とされ、非経口ではあまり必要とされない。しかしながら、具体的な投与レジメンは正確な医学的判断を用いて医師により決定されるであろう。
【００６４】
本発明はまた、該化合物を組み合わせ療法で投与する方法も包含する。すなわち、該化合物を、肝炎およびHCV感染症の処置において有用な他の薬剤と同時だが別個に用いることができる。これらの組み合わせ方法において、該化合物は通常、体重1kg当たり1〜100 mg/日の１日用量で、他の薬剤と同時に投与され得る。他の薬剤は通常、治療に用いられる量で投与され得る。しかしながら、具体的な投与レジメンは正確な医学的判断を用いて医師により決定されるであろう。
【００６５】
表2に、組成物および方法に適切な化合物のいくつかの例を記載する。
表2
【表２】
2013530232.tif 000010
【表３】
2013530232.tif 000011
【表４】
2013530232.tif 000012
【実施例】
【００６６】
（合成方法）
該化合物は、以下に記載の方法を含む、当分野で公知の方法により製造されうる。いくつかの試薬および中間体が当分野において公知である。他の試薬および中間体は、市販の物質を用いて、当分野で公知の方法により製造することができる。化合物の合成を説明するために用いられる変数(例えば、番号付けされた「R」置換基)は、該化合物の製造方法を説明することのみを意図しており、特許請求の範囲または本明細書の他の項において用いられる変数と混同されない。以下の方法は、例示目的であって、本発明の範囲を制限することを意図しない。スキームにおいて用いられる略語は一般に、当分野で用いられる慣習に従う。
【００６７】
スキームにおいて用いられる略語は一般に、当分野で用いられる慣習に従う。明細書および実施例において用いられる化学的略語は以下の通り定義する:「NaHMDS」はナトリウムビス（トリメチルシリル)アミド;「DMF」はN,N-ジメチルホルムアミド;「MeOH」はメタノール;「NBS」はN-ブロモスクシンイミド;「Ar」はアリール;「TFA」はトリフルオロ酢酸;「LAH」は水素化リチウムアルミニウム;「BOC」、「DMSO」はジメチルスルホキシド;「h」は時間;「rt」は室温または保持時間(状況により決定される);「min」は分;「EtOAc」は酢酸エチル;「THF」はテトラヒドロフラン;「EDTA」はエチレンジアミン四酢酸;「Et2O」はジエチルエーテル;「DMAP」は4-ジメチルアミノピリジン;「DCE」は1,2-ジクロロエタン;「ACN」はアセトニトリル;「DME」は1,2-ジメトキシエタン;「HOBt」は1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物;「DIEA」はジイソプロピルエチルアミン、「Nf」はCF3(CF2)3SO2-;および、「TMOF」はオルトギ酸トリメチル。
【００６８】
エチル 2-(4-ブロモフェニル)-5-ヒドロキシベンゾフラン-3-カルボキシレートを、以下のスキームに従って製造した。
【化７】
2013530232.tif 000013
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.50 (s, 1H), 7.91 (m, 2H), 7.74 (m, 2H), 7.50 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.86 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 1H), 4.32 (q, J =  7.1 Hz, 2H), 1.32 (t, J = 7.1 Hz, 3H). HPLC メソッド: SUNFIRE C18 (4.6X150)mm, 3.5ミクロン; バッファー : 0.05％TFA／水 pH 2.5; 移動相A : バッファー:MeCN(95:5); 移動相B : MeCN:バッファー(95:5);流速 : 1ml/分; 時間: 0; B％: 10; 時間: 12; B％: 100; 時間: 15; B％: 100; 時間: 18; B％: 10; 時間: 23; B％: 10; 波長: 254 nm, 保持時間 分: 12.856; 波長: 220 nm, 保持時間 分: 12.856.
【００６９】
エチル 2-(4-ブロモフェニル)-4-フルオロ-5-ヒドロキシベンゾフラン-3-カルボキシレート
エチル 2-(4-ブロモフェニル)-5-ヒドロキシベンゾフラン-3-カルボキシレート(5g, 13.84mmol, 1.0当量)／アセトニトリル(300ml)の混合液に、室温で、selectfluor(6 g, 16.9mmol, 1.22当量)を少しずつ加え、該混合液を24時間撹拌した。反応の完了後、該溶媒を減圧下でエバポレートした。残渣を水で希釈し、EtOAc(100 ml x 3)で抽出した。抽出物を合わせて、飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。該粗生成物を、シリカゲル(60-120メッシュ)カラムによって、溶離液として10％ EtOAc/石油エーテルを用いて精製し、プレパラティブHPLCによってさらに精製した。 収量: 1.35g (25.8％). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.75 (s, 1H), 7.81-7.74 (m, 4H), 7.39 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.08 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 4.35-4.30 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.27 (t, J = 6.8 Hz, 3H). カラム: ZORBAX SB C18 (4.6X50mm,5μm); 移動相A : 10％MeOH-90％H2O-0.1％TFA; 移動相B : 90％MeOH-10％H2O-0.1％TFA; 流速: 1ML/分; 時間: 0; ％A: 100; ％B: 0; 時間: 2; ％A: 0; ％B: 100; 保持時間 分: 2.137, 波長: 220nm. 
プレパラティブHPLCメソッド
カラム : Symmetry C18(250x4.6)5μ; 移動相A: 0.05％TFA／水(15); 移動相B: MeOH(85) ; 流速: 1ml/分,; 保持時間: 9.33分.
【００７０】
4-フルオロ-2-(4-ブロモフェニル)-5-ヒドロキシベンゾフラン-3-カルボン酸
MeOH/THF（1:1の混合液）の中のエチル 4-フルオロ-2-(4-フルオロフェニル)-5-ヒドロキシベンゾフラン-3-カルボキシレート(0.75g, 1.97mmol, 1.0当量)の混合液に、室温で、1M NaOH水溶液(0.35g, 8.75mmol, 4.4当量)を加え、該混合液を60℃まで4時間加熱した。次いで、該混合液を室温まで冷却し、濃縮し、水で希釈し、1.5 N HClを用いて酸性化した。固形物を濾過し、水で洗浄し、減圧乾燥させた。 収量: 0.62 g (89.3％)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.38 (bs, 1H), 9.70 (s, 1H), 7.83-7.75 (m, 4H), 7.37(d, J = 8.0Hz, 1H), 7.07 (t, J = 8Hz, 1H). カラム: purospher@star RP-18 (4X55)mm, 3μm; 移動相A : 20mM NH4OAc／90％H2O, 10％MeCN; 移動相B : 20mM NH4OAc／10％H2O, 90％MeCN; 流速: 2.5ML/分; 時間: 0; ％A: 100; ％B: 0; 時間: 2; ％A: 0; ％B: 100; 保持時間 分: 1.23, 波長: 220nm.
【００７１】
4-フルオロ-2-(4-ブロモフェニル)-5-ヒドロキシ-N-メチルベンゾフラン-3-カルボキサミド
THF中の4-フルオロ-2-(4-ブロモフェニル)-5-ヒドロキシベンゾフラン-3-カルボン酸(0.62g, 1.77mmol, 1当量)、2M 溶液のメチルアミン／THF(5.4ml, 10.8mmol, 6.1当量)、HOBT(0.43g, 3.18mmol, 1.8当量)、EDCI.HCl(0.61g, 3.18mmol, 1.8当量)の混合液に、室温で、窒素雰囲気下において、ジイソプロピルエチルアミン(1.9ml, 10.9mmol, 6.2当量)を加えた。該澄明な反応混合液を、室温で終夜撹拌した。該反応混合液を濃縮し、水で希釈し、その後、固体沈殿物を濾過により集めた。該生成物を石油エーテルで洗浄し、減圧下で乾燥させた。 収量: 0.51g (79.7％). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.67 (s, 1H), 8.63 (t, J = 4.4Hz, 1H), 7.79-7.72 (m, 4H), 7.33 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.02(m, 1H), 2.81 (d, J = 4.4Hz, 3H). 
カラム: purospher@star RP-18 (4X55)mm, 3μm; 移動相A : 20mM NH4OAc／90％H2O, 10％MeCN; 移動相B : 20mM NH4OAc／10％H2O, 90％MeCN; 流速: 2.5ML/分; 時間: 0; ％A: 100; ％B: 0; 時間: 2; ％A: 0;％B: 100.; 保持時間 分: 1.704, 波長: 220nm.
【００７２】
4-フルオロ-2-(4-ブロモフェニル)-5-イソプロポキシ-N-メチルベンゾフラン-3-カルボキサミド
密閉チューブ中のN-メチルピロリジノン中の4-フルオロ-2-(4-ブロモフェニル)-5-ヒドロキシ-N-メチルベンゾフラン-3-カルボキサミド(0.17g, 0.467mmol, 1当量)、2-ブロモプロパン(0.18ml, 1.46mmol, 3.1当量)、および炭酸セシウム(0.46g, 1.41mmol, 3当量)の混合液を、50℃で16時間加熱した。該反応混合液を室温まで冷却し、無機物（inorganic）を濾過により除去した。濾過物を水で希釈し、生成物をEtOAc中に抽出した。有機物を飽和食塩水で洗浄し、濾過し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。該粗生成物を、シリカゲル(60-120)カラムクロマトグラフィーにより、溶離液として0-20％EtOAc／石油エーテルを用いて精製した。 収量: 0.15g (79.4％). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.66 (d, J = 4.4Hz,1H), 7.78-7.73 (m, , 4H), 7.46 (d, J = 9.2Hz,1H), 7.26 (t, J = 8.4Hz, 1H), 4.53(m, 1H), 2.82 (d, J = 4.4Hz, 3H). 1.29 (d, J = 6.0Hz, 6H).  カラム: purospher@star RP-18 (4X55)mm, 3μm; 移動相A : 20mM NH4OAc／90％H2O, 10％MeCN; 移動相B : 20mM NH4OAc／10％H2O, 90％MeCN; 流速 : 2.5ML/分; 時間: 0; ％A: 100; ％B: 0; 時間: 1.8; ％A: 0; ％B: 100; 保持時間 分: 2.117, 波長: 220nm.
【００７３】
4-フルオロ-2-(4-(4-フルオロフェノキシ)フェニル)-5-イソプロポキシ-N-メチルベンゾフラン-3-カルボキサミド
密閉チューブ中においてトルエン中の4-フルオロ-2-(4-ブロモフェニル)-5-イソプロポキシ-N-メチルベンゾフラン-3-カルボキサミド(0.15g, 0.37mmol, 1 当量)、4-フルオロフェノール(0.225g, 2.0 mmol, 5.4当量)、Pd(OAc)2(5mg, 0.02mmol, 0.06当量)、X-phos(16mg, 0.037mmol, 0.1当量)およびK3PO4(0.2 g, 0.94 mmol, 2.5当量)の混合液を、N2ガスで5分間パージし、該反応混合液を50℃で16時間加熱した。該反応混合液を室温まで冷却し、無機物を濾過により除去した。濾過物を水で希釈し、EtOAcで抽出した。有機物を飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。該粗生成物を、シリカゲル(60-120)カラムクロマトグラフィーにより、溶離液として0-20％EtOAc／石油エーテルを用いて、精製した。 収量: 0.12g (75.0％). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.64 (d, J = 4.8Hz, 1H), 7.85 (d, J = 8.8Hz, 2H), 7.44 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.31-7.27 (m, 2H), 7.24-7.17 (m, 3H), 7.12 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 4.53 (m, 1H), 2.81 (d, J = 4.4Hz, 3H), 1.30 (d, J = 6Hz, 6H).
LCMS: (ES+) m/z = 438.2 (M+H)+; カラム: Xbridge phe (4.6X30mm- 3.5μm); 移動相A : 2％MeCN／98％H2O-10mM NH4COOH; 移動相B 98％MeCN／2％H2O-10mM NH4COOH; 流速: 1.8ML/分; 時間: 0; ％A: 100; ％B: 0; 時間: 1.5; ％A: 0; ％B: 100; 保持時間 分: 1.85, 波長: 220nm.
【００７４】
4-フルオロ-2-(4-(4-フルオロフェノキシ)フェニル)-5-ヒドロキシ-N-メチルベンゾ-フラン-3-カルボキサミド
4-フルオロ-2-(4-(4-フルオロフェノキシ)フェニル)-5-イソプロポキシ-N-メチルベンゾフラン-3-カルボキサミド(0.12g, 0.27mmol, 1当量)／CH2Cl2混合液に、BCl3(5ml, 5.0mmol, 18.5当量, 1M／トルエン)を加えた。該反応混合液を室温で3時間撹拌した後、該反応液をNaHCO3の飽和溶液でクエンチした。該混合液を水で希釈し、該生成物をCH2Cl2中に抽出した。有機物を飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。 収量: 0.1g (92.0％). 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.85(d, J = 2Hz, 2H), 7.83-7.05 (m, ,7H), 6.97 (d, J = 8.2Hz, 1H), 2.96 (d, J = 4Hz, 3H). LCMS: (ES-) m/z = 394.0 (M-H); カラム: Xbridge phe (4.6X30mm- 3.5μm); 移動相A : 2％MeCN／98％H2O-10mM NH4COOH; 移動相B 98％MeCN／2％H2O-10mM NH4COOH; 流速: 1.8ML/分; 時間: 0; ％A: 100; ％B: 0; 時間: 1.5; ％A: 0; ％B: 100; 保持時間 分: 1.667, 波長: 220nm.
【００７５】
4-フルオロ-2-(4-(4-フルオロフェノキシ)フェニル)-3-(メチルカルバモイル)ベンゾフラン-5-イル トリフルオロメタンスルホネート
4-フルオロ-2-(4-(4-フルオロフェノキシ)フェニル)-5-ヒドロキシ-N-メチルベンゾフラン-3-カルボキサミド(0.1g, 0.25mmol, 1.0当量)／CH2Cl2溶液に、室温で、N2下において、トリエチルアミン(0.1ml, 0.71mmol, 2.8当量)を加えた。該混合液を0℃まで冷却し、N-フェニル-ビス-(トリフルオロメタンスルホンアミド)(0.11g, 0.31mmol, 1.2当量)を加えた後、室温で3時間撹拌した。該反応混合液を減圧下で濃縮し、残渣を水で希釈した後、CH2Cl2で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。該粗生成物を、シリカゲル(60-120)カラムクロマトグラフィーにより、溶離液として0-10％EtOAc／石油エーテルを用いて精製して、目的の生成物をオフホワイト色の固形物として得た。 収量: 0.126g (94.7％). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.77 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 7.89-7.86 (m, 2H), 7.75-7.65 (m, 2H), 7.33-7.28 (m, 2H), 7.23-7.15 (m, 4H), 2.84 (d, J = 4.8Hz, 3H). LCMS: (ES+) m/z = 528.0 (M+H)+; カラム: Xbridge phe (4.6X30mm- 3μm); 移動相A : 2％MeCN／98％H2O-10mM NH4COOH; 移動相B 98％MeCN／2％H2O-10mM NH4COOH; 流速: 1.8ML/分; 時間: 0; ％A: 100; ％B: 0; 時間: 1.5; ％A: 0; ％B: 100; 保持時間 分: 1.89, 波長: 220nm.
【００７６】
メチル 5-(4-フルオロ-2-(4-(4-フルオロフェノキシ)フェニル)-3-(メチルカルバモイル)ベンゾフラン-5-イル)-2-メトキシ-4-メチルベンゾエート
トルエン/EtOH(4:1)中の4-フルオロ-2-(4-(4-フルオロフェノキシ)フェニル)-3-(メチルカルバモイル)ベンゾフラン-5-イル トリフルオロメタンスルホネート(0.11g, 0.208mmol, 1当量)、メチル 2-メトキシ-4-メチル-5-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ベンゾエート(0.075g, 0.245mmol, 1.18当量)の混合液に、1.0 M Na2CO3水溶液(0.09g, 0.849mmol, 4.0当量)を加え、該混合液をN2で10分間パージした。テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(0.022g, 0.019mmol, 0.09当量)を加え、再びN2で該反応混合液を10分間パージした。上記の反応混合液を100℃で終夜加熱した。トルエン層を分離し、水層をEtOAcで抽出した。有機層を合わせて、濃縮した。得られた生成物を、シリカゲル(60-120)カラムクロマトグラフィーにより、溶離液として40％EtOAc/ヘキサンを用いて、精製した。 収量: 94 mg (77.6％). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.67 (d, J = 4.4Hz, 1H),  7.89 (d, J = 8Hz, 2H), 7.60(d, J = 6.4Hz, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.32-7.26 (m, 3H), 7.21-7.14 (m, 3H), 7.14 (d, J = 6.8Hz, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 2.79 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.21(s, 3H).
LCMS: (ES+) m/z = 558.2 (M+H)+. カラム: Xbridge phe (4.6X30mm- 3.5μm); 移動相A : 2％MeCN／98％H2O-10mM NH4COOH; 移動相B 98％MeCN／2％H2O-10mM NH4COOH; 流速: 1.8ML/分; 時間: 0; ％A: 100; ％B: 0; 時間: 1.5; ％A: 0; ％B: 100; 保持時間 分: 1.868, 波長: 220nm.
【００７７】
5-(4-フルオロ-2-(4-フルオロフェノキシ)フェニル)-3-(メチルカルバモイル)ベンゾフラン-5-イル)-2-メトキシ-4-メチル安息香酸
MeOH/THF（1:1 混合液）中のメチル 5-(4-フルオロ-2-(4-(4-フルオロフェノキシ)フェニル)-3-(メチルカルバモイル)ベンゾフラン-5-イル)-2-メトキシ-4-メチルベンゾエート(0.09g, 0.16mmol, 1.0当量)の溶液に、周囲温度にて、1M NaOH(0.03g, 0.75mmol, 4.7当量)溶液を加え、その後、該混合液を60℃で3時間撹拌した。該反応混合液を濃縮し、水で希釈し、1.5 N HClで酸性化した。固形物を濾過し、石油エーテルで洗浄した。 収量 : 0.05 g (57.4％). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.50 (s, 1H), 8.66 (q, J = 4.8Hz, 1H), 7.90-7.86 (m, 2H), 7.58-7.08 (m, 10H), 3.87 (s, 3H), 2.79 (d, J = 4.8Hz, 3H), 2.21(s, 3H). LCMS: (ES+) m/z = 544.2 (M+H)+ ; カラム: Xbridge phe (4.6X30mm- 3.5μm); 移動相A : 2％MeCN／98％H2O-10mM NH4COOH; 移動相B 98％MeCN／2％H2O-10mM NH4COOH; 流速: 1.8ML/分; 時間: 0; ％A: 100; ％B: 0; 時間: 1.5; ％A: 0; ％B: 100; 保持時間 分: 1.529, 波長: 220nm.
【００７８】
4-フルオロ-2-(4-(4-フルオロフェノキシ)フェニル)-5-(4-メトキシ-2-メチル-5-(1-(ピリミジン-2-イル)シクロプロピルカルバモイル)フェニル)-N-メチルベンゾフラン-3-カルボキサミド
DMF中の5-(4-フルオロ-2-(4-フルオロフェノキシ)フェニル)-3-(メチルカルバモイル)ベンゾフラン-5-イル)-2-メトキシ-4-メチル安息香酸(0.04g, 0.073mmol, 1.0当量)、1-(ピリミジン-2-イル)シクロプロパンアミン HCl(0.020g, 0.116mmol, 1.6当量)の混合液に、0℃にて、トリエチルアミン(0.1ml, 0.717mmol, 9.8.当量)およびPy-BOP(0.06g, 0.115mmol, 1.58当量)を加えた。該反応混合液を室温で終夜撹拌した後、水で希釈し、0℃まで冷却した。析出した固形物を濾過し、水で洗浄し、減圧下で乾燥させた。該粗生成物をプレパラティブHPLCにより精製した。 収量: 0.020g (41.1％). 1H NMR (400MHz ,CD3OD) δ 8.66 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 7.91-7.88 (m, 3H), 7.50 (d, J = 8Hz, 1H), 7.27-7.20 (m, 2 H), 7.18 - 7.12 (m, 7 H),  4.09 (s, 3 H), 2.95 (s, 3 H), 2.30 (s, 3H), 1.80 (m 2 H), 1.52 (m, 2H). 19F NMR (376.57 MHz, CD3OD) δ -121.02, -122.94.  (19F 化学シフトは、CFCl3（0.0 ppm）を基準とした). LCMS: (ES+) m/z = 661.2 (M+H)+; カラム: Ascentis ExpressC8(2.1x50mm)-2.7μm; 移動相A : 2％MeCN／98％H2O-10mM NH4COOH; 移動相B 98％MeCN／2％H2O-10mM NH4COOH; 流速: 1ML/分; 時間: 0; ％A: 100; ％B: 0; 時間: 1.5; ％A: 0; ％B: 100; 保持時間 分: 2.04, 波長: 220nm. HPLC メソッド: SUNFIRE C18 (4.6X150)mm, 3.5ミクロン; バッファー : 0.05％TFA／水 pH 2.5; 移動相A : バッファー:MeCN(95:5); 移動相B : MeCN:バッファー(95:5); 流速 : 1ml/分; 時間: 0; B％: 10; 時間: 25; B％: 100; 波長: 254 nm, 保持時間 分: 20.793; 波長: 220 nm, 保持時間 分: 20.793. HPLC メソッド: XBridege フェニル (4.6X150) mm, 3.5ミクロン ; バッファー : 0.05％TFA／水 pH 2.5; 移動相A: 0.05％TFA／水:MeCN(95:5); 移動相B: 0.05％TFA／MeCN:水(95:5); 流速: 1ml/分; 時間: 0; B％: 10; 時間: 25; B％: 100; 波長: 254 nm, 保持時間 分: 18.878; 波長: 220 nm, 保持時間 分: 18.878. プレパラティブHPLCメソッド: カラム : XTerra C18(250x4.6)5μ); 移動相A: 20mM 酢酸アンモニウム／水 ; 移動相B: MeCN; 流速: 1ml/分, 時間: 0; B％: 60; 時間: 20; B％: 60; 時間: 22; B％: 100; 時間: 25; B％: 100; 保持時間: 11.962分.
【００７９】
本発明は前述の例示的な実施例に限定されず、そしてその本質的特性から逸脱することなく他の特定の形態において具体化することができることが当業者には明白であろう。従って該実施例は、あらゆる点で、制限するものではなく例示的なものとしてみなされ、そして、前述の実施例に対してよりはむしろ特許請求の範囲を参照すべきであり、従って、特許請求の範囲と同等の意味および範囲内となる全ての変更を包含すると意図することが望ましい。
【国際調査報告】
2013530232.tif 000018
2013530232.tif 000019