(57)【要約】  本発明は、黒色腫についての新規のバイオマーカー及び治療標的としてのニューロピリン−２の使用に関する。ニューロピリン−２の存在は、黒色腫に罹患している又は黒色腫を発症するリスクがある個体を診断し検出するためのバイオマーカーとして用いられ得る。循環している黒色腫細胞を捕捉するのにニューロピリン−２を用いる方法もまた記載される。本発明はさらに、黒色腫を罹患している又は黒色腫を発症するリスクがある個体をニューロピリン−２の活性を阻害する作用物質で処置する方法に関する。
2013507641.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における黒色腫を検出又は診断する方法であって、
ａ．前記対象から生物試料を取得すること、
ｂ．前記試料中のｉ）ニューロピリン−２を発現している細胞、ii）可溶性のニューロピリン−２、又はiii）可溶性のニューロピリン−２断片の存在を検出すること、及び
ｃ．前記ニューロピリン−２の発現を黒色腫の存在と関連付け、それによって対象における黒色腫を検出又は診断すること
を含む方法。
【請求項２】
黒色腫を発症するリスクがある対象を識別する方法であって、
ａ．前記対象から生物試料を取得すること、
ｂ．前記試料中のｉ）ニューロピリン−２を発現している細胞、ii）可溶性のニューロピリン−２、又はiii）可溶性のニューロピリン−２断片の存在を検出すること、及び
ｃ．前記ニューロピリン−２の発現を黒色腫を発症するリスクと関連付け、それによって黒色腫を発症するリスクがある対象を識別すること
を含む方法。
【請求項３】
対象における黒色腫の再発を予測する方法であって、
ａ．前記対象から生物試料を取得すること、
ｂ．前記試料中のｉ）ニューロピリン−２を発現している細胞、ii）可溶性のニューロピリン−２、又はiii）可溶性のニューロピリン−２断片の存在を検出すること、及び
ｃ．前記ニューロピリン−２の発現を黒色腫再発のリスクと関連付け、それによって対象における黒色腫の再発を予測すること
を含む方法。
【請求項４】
生物試料が組織、組織ホモジネート、組織薄片、細胞、剖検試料、病理試料、生検試料又は体液である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
体液が血液、血漿、血清、尿、浸出液又は髄液である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
検出がイムノアッセイ、アフィニティーカラム分離、磁気選別又はＦＡＣＳを行うことを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
検出が、生物試料をニューロピリン−２又はニューロピリン−２の結合相手であるタンパク質を発現している細胞を選択的に検出する作用物質と接触させることを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
作用物質が、ニューロピリン−２に特異的に結合する抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
抗体が標識化されている、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質がＶＥＧＦ、ＶＥＧＦの断片、ＰＬＥＸＩＮ、ＰＬＥＸＩＮの断片、セマフォリン又はセマフォリンの断片である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質が標識化されている、請求項７又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
標識が、蛍光標識、別のレポーターイオンと結合する部分、磁性粒子、重イオン、金粒子又は量子ドットである、請求項１１又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象における黒色腫細胞をインビボで識別する方法であって、
ａ．前記対象に、ニューロピリン−２を選択的に検出する標識化された作用物質の診断上有効な量を投与すること、及び
ｂ．前記標識化された作用物質を検出すること
を含む方法。
【請求項１６】
作用物質が、ニューロピリン−２に特異的に結合する抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
標識が、蛍光標識、別のレポーターイオンと結合する部分、磁性粒子、重イオン、金粒子又は量子ドットである、請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ニューロピリン−２を発現していると識別された対象に黒色腫に対する処置を与えることをさらに含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
対象における黒色腫を診断又は検出するためのキットであって、ｉ）ニューロピリン−２を発現している細胞、ii）可溶性のニューロピリン−２、又はiii）可溶性のニューロピリン−２断片の存在を検出する作用物質を少なくとも１つ含むキット。
【請求項２２】
黒色腫を発症するリスクがある対象を識別するためのキットであって、ｉ）ニューロピリン−２を発現している細胞、ii）可溶性のニューロピリン−２、又はiii）可溶性のニューロピリン−２断片の存在を検出する作用物質を少なくとも１つ含むキット。
【請求項２３】
対象における黒色腫の再発を予測するためのキットであって、ｉ）ニューロピリン−２を発現している細胞、ii）可溶性のニューロピリン−２、又はiii）可溶性のニューロピリン−２断片の存在を検出する作用物質を少なくとも１つ含むキット。
【請求項２４】
作用物質が、ニューロピリン−２又は可溶性のニューロピリン−２断片に特異的に結合する抗体である、請求項２１〜２３のいずれかに記載のキット。
【請求項２５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
作用物質が、ニューロピリン−２の結合相手であるタンパク質である、請求項２１〜２３のいずれかに記載のキット。
【請求項２８】
タンパク質がＶＥＧＦ、ＶＥＧＦの断片、ＰＬＥＸＩＮ、ＰＬＥＸＩＮの断片、セマフォリン又はセマフォリンの断片である、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
作用物質が標識化されている、請求項２１〜２８のいずれかに記載のキット。
【請求項３０】
標識が、蛍光標識、別のレポーターイオンと結合する部分、磁性粒子、重イオン、金粒子又は量子ドットである、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
作用物質を収容するための容器をさらに含む、請求項２１〜３０のいずれかに記載のキット。
【請求項３２】
対象から生物試料を得るための説明書をさらに含む、請求項２１〜３０のいずれかに記載のキット。
【請求項３３】
細胞試料から標的黒色腫細胞を少なくとも１つ選択的に単離する方法であって、
ａ．標的黒色腫細胞を少なくとも１つ含む細胞試料を準備すること、及び
ｂ．前記細胞試料と、ニューロピリン−２を発現している細胞を選択的に検出する作用物質とを、前記標的黒色腫細胞（複数可）が前記作用物質に結合して、結合した黒色腫細胞（複数可）が得られるのに有効な条件下で接触させること
を含む方法。
【請求項３４】
結合した黒色腫細胞（複数可）を水性媒体で洗浄することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
標的黒色腫細胞（複数可）の存在を検出することをさらに含む、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
単離された標的黒色腫細胞（複数可）をインビトロアッセイにおいて用いることをさらに含む、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
作用物質が、ニューロピリン−２に特異的に結合する抗体である、請求項３３〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
作用物質が標識化されている、請求項３３〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
標識が、蛍光標識、別のレポーターイオンと結合する部分、磁性粒子、重イオン、金粒子又は量子ドットである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
黒色腫について対象を処置する方法であって、
ａ．黒色腫に罹患している又は黒色腫を発症するリスクがある対象を識別すること、及び
ｂ．前記対象に黒色腫細胞の増殖を阻害する作用物質を投与することであって、前記作用物質がニューロピリン−２介在性の細胞増殖を阻害するものであること
を含む方法。
【請求項４３】
作用物質が、ニューロピリン−２に選択的に結合する分子である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
作用物質が、ニューロピリン−２に特異的に結合する抗体である、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年１０月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／２５１，１２３号明細書及び２００９年１１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／２５７，０７４号明細書の出願日の利益を主張し、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、黒色腫腫瘍細胞の検出における新規のバイオマーカーとしての、さらには黒色腫の処置における新規の治療標的としての、細胞表面受容体であるニューロピリン−２の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
黒色腫の罹患率は米国内の全てのがんのうち最大級の割合で増加していて、その現在の生涯リスクは５８人に１人である。米国では２００８年に６０，０００人を超える患者が黒色腫と診断され、８，０００人より多い患者の死亡を伴うことが予想される。現在、後期疾患に対して有効な全身性治療はなく、進行型黒色腫を有する患者についての平均寿命の期待値は６〜９ヶ月である。黒色腫の診断は、良性病変と悪性病変の間に過剰診断及び過小診断の両方につながり得る組織学的な重なりがあることから、難しいものであり得る。加えて、現在の臨床的判断基準を用いて特定の患者について予後を決定することは、不正確である可能性がある。最も有用な原発性皮膚黒色腫の予後指標はBreslowの深達度及び潰瘍の有無である。しかしながら、厚い黒色腫を有する多くの患者は転移がない一方で、薄い腫瘍を有する他の患者はその疾患により早期に死亡する。今までの多数の調査にも関わらず、現在、どの黒色腫が垂直成長及び転移へと進行するかを正確に識別する適当な方法はない。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】制御されたヘテロタイプ細胞の共培養法は細胞間コミュニケーション表現型の分析を可能にすることを示す図である。図１Ａはヘテロタイプ細胞を共培養する３つの方法を示す。間隙界面法（Ｉ）において、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ及びＧＦＰ−１２０５Ｌｕ転移性黒色腫細胞は正確に規定された間隙により隔てられたコロニーの中で共培養される。ランダム混合法（II）において、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ及びＧＦＰ−１２０５Ｌｕ転移性黒色腫細胞は混ぜ合わされ、異種性の細胞集団として培養される。マイクロパターニング法（III）において、正確に規定された大きさ及び形のＲＦＰ−ＨＵＶＥＣコロニーはＧＦＰ−１２０５Ｌｕ細胞により囲まれる。図１Ｂは間隙界面法を用いて共培養された細胞の６時間時（上段パネル）及び４８時間時（下段パネル）の表現型を示す。図１Ｃはランダム混合法を用いて共培養された細胞の６時間時（上段パネル）及び４８時間時（下段パネル）の表現型を示す。図１Ｄはマイクロパターニング法を用いて共培養された細胞の６時間時（上段パネル）及び４８時間時（下段パネル）の表現型を示す。図１ＥはＥＧＭ−２培地中で４８時間、単独培養されたＲＦＰ−ＨＵＶＥＣを示す。図１ＦはＨＵＶＥＣからの条件培地（ＣＭ，conditioned medium）中で４８時間、単独培養されたＲＦＰ−ＨＵＶＥＣを示す。図１Ｇは１２０５Ｌｕ細胞と４８時間共培養されたＲＦＰ−ＨＵＶＥＣを示す。図１ＨはＧＦＰ−１２０５Ｌｕ細胞と４８時間共培養されたＲＦＰ−ＨＵＶＥＣを示す。
【図２】黒色腫−内皮細胞間相互作用の包括的な遺伝子発現プロファイリングは細胞性コミュニケーションのメディエーターとしてのＮＲＰ２を同定することを示す図である。図２Ａは黒色腫−内皮細胞間コミュニケーションに関与する遺伝子を同定するためのスクリーニングの略図である。ランダム混合法を用いて、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ及びＧＦＰ−１２０５Ｌｕ転移性黒色腫細胞の集団は共培養系中に播種され、４８時間インキュベートされた。細胞はＦＡＣＳによりソートされ、ＲＮＡが単離されて汎ゲノムヒトGeneChipにハイブリダイズされた。共培養により変化した発現プロファイルはＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ及びＧＦＰ−１２０５Ｌｕ細胞のホモタイプ培養における発現プロファイルに対して比較され、黒色腫−内皮細胞間コミュニケーションに関連した遺伝子が同定された。図２Ｂはホモタイプ細胞培養又はその後のＲＦＰ−ＨＵＶＥＣとのヘテロタイプ共培養において生育されたＧＦＰ−１２０５Ｌｕ細胞におけるＮＲＰ２発現についてのウエスタンブロット結果を示す。図２Ｃはヒト黒色腫転移におけるＮＲＰ２についての免疫組織化学染色結果を低倍率で示す。図２Ｄ及び２Ｅはヒト黒色腫転移におけるＮＲＰ２についての免疫組織化学染色結果を高倍率で示す。矢印は腫瘍−転移性ニッチ界面の境界を指す。図２Ｆは図２Ｅにおいて描写された黒色腫細胞についてのＭｅｌａｎ−Ａ染色を示し、連続的な腫瘍切片におけるＮＲＰ２とＭｅｌａｎ−Ａ染色との相関を実証している。
【図３】ＮＲＰ２に対する中和抗体は転移性黒色腫細胞の増殖を遮断することを示す図である。図３Ａ〜３Ｃは、１０μｇ／ｍｌ（図３Ａ）、５μｇ／ｍｌ（図３Ｂ）又は２．５μｇ／ｍｌ（図３Ｃ）の正常ウサギＩｇＧ（白丸）又はウサギポリクローナルＮＲＰ２抗体（黒丸）存在下でのＧＦＰ−１２０５Ｌｕ転移性黒色腫細胞についての増殖アッセイを示す。図３Ｄは１０μｇ／ｍｌのＮＲＰ２中和抗体で４８時間処理した後のＧＦＰ−１２０５Ｌｕ細胞におけるＢｒｄＵ取り込みの定量を対照抗体での処理と比較して示す。エラーバーは標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図３Ｅは１０μｇ／ｍｌの正常マウスＩｇＧ又はマウスモノクローナルＮＲＰ２抗体（ｓｃ−２０２５）存在下でのＧＦＰ−１２０５Ｌｕ転移性黒色腫細胞を使用した増殖アッセイについての結果を示す。図３Ｆ〜Ｈは１０μｇ／ｍｌの正常ウサギＩｇＧ（図３Ｆ）、ウサギポリクローナルＮＲＰ２抗体（図３Ｇ）又はＤＮａｓｅ陽性対照（図３Ｈ）で処理された１２０５Ｌｕ黒色腫細胞を使用したＴＵＮＥＬアッセイについての結果を示す。図３Ｉ及び３Ｊは正常ウサギＩｇＧ（図３Ｉ）又はＮＲＰ２中和抗体（図３Ｊ）で４８時間処理した後のＧＦＰ−１２０５Ｌｕ細胞の表現型を示す。図３Ｋは１０μｇ／ｍｌの正常ウサギＩｇＧ又はウサギポリクローナルＮＲＰ２抗体の存在下、マイトマイシンＣ添加及び無添加での１２０５Ｌｕ黒色腫細胞に対して行われたスクラッチアッセイの結果を示す。
【図４】規定された初期形状、細胞数及び大きさのＨＵＶＥＣコロニー内における集団性細胞運動の分析は、細胞性パターニングの促進におけるＮＲＰ２の不可欠な役割を示唆することを示す図である。図４Ａは黒色腫細胞非存在下での円形のＨＵＶＥＣ単独コロニーのＴ＝０、５及び４０時間での拡大を示す。図４ＢはＮＲＰ２中和抗体存在下での単層ＧＦＰ−１２０５Ｌｕ細胞により囲まれた円形ＨＵＶＥＣコロニーのＴ＝０、５及び４０時間での拡大を示す。図４Ｃ〜４Ｅは規定された形状、細胞数及び大きさのＨＵＶＥＣコロニーからの集団性細胞運動の定量的分析の結果を、島状ＨＵＶＥＣ単独（図４Ｃ）、島状ＨＵＶＥＣと黒色腫との共培養（図４Ｄ）及びＮＲＰ２中和抗体で処理された島状ＨＵＶＥＣと黒色腫との共培養（図４Ｅ）について示す。３つの独立した共培養実験が各条件について行われた。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。
【図５】黒色腫におけるＮＲＰ２受容体及びリガンドの発現分析の図である。図５ＡはGenechipデータを用いた変化する進行ステージからの黒色腫細胞株におけるＮＲＰ２、関連したリガンド及び受容体の定量的発現プロファイルを示す。図５Ｂは定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた変化する進行ステージからの黒色腫細胞株におけるＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３の発現を示す。図５Ｃは変化する進行ステージからの黒色腫細胞株におけるＮＲＰ２発現のウエスタンブロット結果を示す。
【図６】異なる腫瘍細胞タイプとの細胞間コミュニケーションは種々の程度のＨＵＶＥＣパターニングを誘導することを示す図である。図６Ａ〜６Ｃは、４８時間の共培養の後に異なる腫瘍細胞株と共培養され（上段パネル）、ＨＵＶＥＣネットワーク形成の形態分析を用いて評価された（下段パネル）、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ単独（図６Ａ）、ＨＣＴ−１１６結腸がん細胞と共培養されたＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ（図６Ｂ）及びＧＦＰ−１２０５Ｌｕ黒色腫細胞と共培養されたＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ（図６Ｃ）についての、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣのパターニング結果を示す。図６Ｄは様々な腫瘍細胞株との共培養により誘導されたＨＵＶＥＣパターニングの形態分析の定量をＨＵＶＥＣ単独の場合と比較して示す。図６Ｅは、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣとのヘテロタイプ共培養において生育された様々な腫瘍細胞株におけるＮＲＰ２発現のウエスタンブロット分析についての結果を示す。用いられた腫瘍細胞株は神経膠芽腫、Ｕ８７ＭＧ、黒色腫、ＧＦＰ−１２０５Ｌｕ、乳がん、Ｈｓ５７８Ｔ、非小細胞肺癌、Ｈ４６０、前立腺がん、ＰＣ−３、膵臓がん、Ｐａｎｃ３．０１４、結腸がん、ＨＣＴ−１１６、卵巣がん、及びＥＳ−２であった。
【図７】正常なヒト組織におけるＮＲＰ２についての代表的な染色の図である。図７Ａは正常な腎臓におけるＮＲＰ２についての染色を示す。図７Ｂは横紋筋におけるＮＲＰ２についての染色を示す。図７Ｃは精巣におけるＮＲＰ２についての染色を示す。
【図８】非メラニン細胞系腫瘍におけるＮＲＰ２についての代表的な染色の図である。図８Ａは結腸腺癌におけるＮＲＰ２についての染色を示す。図８Ｂは腎細胞癌におけるＮＲＰ２についての染色を示す。図８Ｃは乳管癌におけるＮＲＰ２についての染色を示す。図８Ｄは非メラニン細胞系腫瘍組織（ＭＦＨ−悪性線維性組織球腫；ＮＳＣＬ  ｓｑｃｃ−非小細胞肺がん、扁平細胞；ＲＣＣ−腎細胞癌；ＴＣＣ−移行上皮癌／膀胱）の定量化された染色を実証する箱ひげ図を示す。
【図９】メラニン細胞系腫瘍におけるＮＲＰ２についての代表的な染色の図である。図９Ａは転移性メラニン欠乏性類上皮黒色腫におけるＮＲＰ２についての染色を示す。図９Ｂは悪性黒色腫におけるＮＲＰ２についての染色を示す。図９Ｃは転移性メラニン欠乏性紡錘細胞悪性黒色腫におけるＮＲＰ２についての染色を示す。図９Ｄは色素性類上皮黒色腫におけるＮＲＰ２についての染色を示す。図９Ｅは紡錘細胞結節性黒色腫におけるＮＲＰ２についての染色を示す。図９Ｆは線維形成性悪性黒色腫におけるＮＲＰ２についての染色を示す。図９Ｇはメラニン細胞系腫瘍組織の定量化された染色を実証する箱ひげ図を示す。
【図１０】ＮＲＰ２についての定量化された組織染色の図である。図１０はメラニン細胞系腫瘍（緑）及び非メラニン細胞系腫瘍（ピンク）におけるＮＲＰ２についての定量化された組織染色をグラフで描写したものである。報告された値はＮＲＰ２について陽性の腫瘍及び黒色腫における平均染色パーセントである。黒色腫腫瘍の結果は緑で示され、非メラニン細胞系腫瘍の結果はピンクで示される。
【図１１】ＮＲＰ２は基底上のケラチノサイトにおいて発現されるが、良性母斑においては発現されないことを示す図である。図１１Ａ〜１１Ｄは良性母斑におけるＮＲＰ２染色の低倍率（１０×）画像である。表皮における基底上のＮＲＰ２の発現（赤色）が正常なメラニン細胞の染色を伴わないことに注目されたい。図１１Ｅ〜１１ＦはＮＲＰ２で染色された良性母斑のより高倍率（２０×）の像である。図１１ＦはＮＲＰ２で染色された良性母斑の高倍率像（４０×）である。
【図１２】ＮＲＰ２発現は転移性黒色腫細胞に限定されることを示す図である。図１２Ａ及び１２Ｃはリンパ節内のＭｅｌａｎ−Ａで染色された転移性黒色腫細胞についての低倍率（図１２Ａ）及び高倍率（図１２Ｃ）画像である。図１２Ｂ及び１２Ｄはリンパ節内のＮＲＰ２で染色された転移性黒色腫細胞についての低倍率（図１２Ｂ）及び高倍率（図１２Ｄ）画像である。矢印はＭｅｌａｎ−Ａ及びＮＲＰ２による腫瘍組織染色の一致を指す。
【図１３】ＮＲＰ２は分泌タンパク質として発現されることを示す図である。図１３Ａは、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ、ＧＦＰ−１２０５Ｌｕ黒色腫細胞及びＨＵＶＥＣ−１２０５Ｌｕ共培養からの条件培地におけるＮＲＰ２発現のＩＰ−ウエスタン分析についての結果を示す。Ｈ４６０（ＮＲＰ１＋／ＮＲＰ２−）肺がん細胞はＮＲＰ２についての陰性対照として包含された。図１３Ｂは、モック並びにＮＲＰ２をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ、ＧＦＰ−１２０５Ｌｕ黒色腫細胞、ＨＵＶＥＣ−１２０５Ｌｕ共培養及びＨ４６０（ＮＲＰ１＋／ＮＲＰ２−）肺がん細胞から回収された条件培地からのＮＲＰ２発現のＩＰ−ウエスタン分析の結果を示す。
【図１４】ＮＲＰ２のＥＬＩＳＡの図である。図１４はSanta Cruz（登録商標）社（Santa Cruz，ＣＡ）からのＣ−９及びＨ−３００抗体を用いて組換え型ヒトＮＲＰ２に対して行われたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図１５】インビボＮＲＰ２イメージングの図である。図１５Ａは注射から４時間後に撮影されたインビボイメージング結果である。図１５Ｂは注射から７２時間後に撮影されたインビボイメージング結果である。図１５Ｃは注射から１２０時間後に撮影されたインビボイメージング結果である。
【図１６】ＮＲＰ２のＦＡＣＳを用いた黒色腫細胞の検出を示す図である。図１６Ａは細胞外染色により標識されて識別された垂直成長期の黒色腫細胞株についてのＦＡＣＳ結果を示す。図１６Ｂは細胞内染色により標識されて識別された垂直成長期の黒色腫細胞株についてのＦＡＣＳ結果を示す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、黒色腫腫瘍細胞を検出して処置する方法を対象とする。ニューロピリン−２（ＮＲＰ２）は細胞表面受容体であり、本発明者らは、ＮＲＰ２が黒色腫細胞の増殖の決定的なメディエーターであることを実証した。したがって、ＮＲＰ２は黒色腫を処置するための新規の治療標的である。本発明者らはまた、ＮＲＰ２がｉ）黒色腫腫瘍細胞上に、ii）黒色腫患者の血清中に可溶性タンパク質として存在することを実証した。したがって、ＮＲＰ２は黒色腫腫瘍細胞の検出のための新規のバイオマーカーである。
【０００６】
したがって、本発明のいくつかの実施形態において、黒色腫に罹患している又は黒色腫を発症するリスクがある対象を処置するのに、ＮＲＰ２介在性の細胞増殖を阻害する作用物質を用いることが望ましい。いくつかの実施形態において、作用物質はＮＲＰ２に選択的に結合する分子である。いくつかの実施形態において、作用物質はＮＲＰ２に特異的に結合する抗体である。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。いくつかの実施形態において、作用物質はＮＲＰ２に選択的に結合するタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質はＶＥＧＦ又はＶＥＧＦの断片である。他の実施形態において、タンパク質はＰＬＥＸＩＮ又はＰＬＥＸＩＮの断片である。他の実施形態において、タンパク質はセマフォリン又はセマフォリンの断片である。いくつかの実施形態において、作用物質は、当該技術分野で周知である従来の検出方法（複数可）を用いて検出される。いくつかの実施形態において、作用物質は標識されている。標識は蛍光成分、レポーターイオンと結合する部分、磁性粒子、重イオン、金粒子、量子ドット又は当該技術分野で周知の任意の従来の標識であり得る。
【０００７】
本発明の１つの態様は、ｉ）対象における黒色腫を検出又は診断するための、ii）黒色腫を発症するリスクがある対象を識別するための、及び／又はiii）対象における黒色腫の再発を予測するためのバイオマーカーとしてＮＲＰ２を用いることである。実施形態において、試料は対象から取得され、バイオマーカーは当該技術分野で周知である従来の検出方法（複数可）を用いて検出される。いくつかの実施形態において、生物試料は組織、組織ホモジネート、組織薄片、細胞、剖検試料、病理試料、生検試料又は体液である。いくつかの実施形態において、試料は血液、血漿、血清、尿、浸出液又は髄液である。実施形態において、上記の発明は、生物試料中のｉ）ＮＲＰ２を発現している細胞、ii）可溶性のＮＲＰ２、又はiii）可溶性のＮＲＰ２断片の存在を識別することをさらに含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、生物試料を、ＮＲＰ２を発現している細胞を選択的に検出する作用物質と接触させることにより識別される。いくつかの実施形態において、作用物質はＮＲＰ２に選択的に結合する分子である。いくつかの実施形態において、作用物質はＮＲＰ２に特異的に結合する抗体である。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。いくつかの実施形態において、作用物質はＮＲＰ２に選択的に結合するタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質はＶＥＧＦ又はＶＥＧＦの断片である。他の実施形態において、タンパク質はＰＬＥＸＩＮ又はＰＬＥＸＩＮの断片である。他の実施形態において、タンパク質はセマフォリン又はセマフォリンの断片である。実施形態において、作用物質は当該技術分野で周知である従来の検出方法（複数可）を用いて検出される。いくつかの実施形態において、バイオマーカーはイムノアッセイ、フローサイトメトリー、アフィニティーカラム分離又は磁気選別により識別される。いくつかの実施形態において、バイオマーカーはＥＬＩＳＡ又は免疫組織化学検査により識別される。他の実施形態において、バイオマーカーは蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ，fluorescent-activated cell sorting）により識別される。実施形態において、作用物質は標識されている。標識は蛍光成分、レポーターイオンと結合する部分、磁性粒子、重イオン、金粒子、量子ドット又は当該技術分野で周知の任意の従来の標識であり得る。
【０００９】
本発明の別の態様は、ＮＲＰ２黒色腫細胞の存在をインビボで識別することである。実施形態において、対象に、ＮＲＰ２を選択的に検出する作用物質の診断上有効な量を投与する。いくつかの実施形態において、作用物質はＮＲＰ２に選択的に結合する分子である。いくつかの実施形態において、作用物質はＮＲＰ２に特異的に結合する抗体である。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。実施形態において、作用物質は、当該技術分野で周知である従来の検出方法（複数可）を用いて検出される。いくつかの実施形態において、作用物質は標識されている。標識は蛍光成分；レポーターイオンと結合する部分；磁性粒子；重イオン；金粒子；量子ドット；フッ素、ヨウ素、臭素及びアスタチンを包含する放射性同位体；又は当該技術分野で周知の任意の従来の標識であり得る。
【００１０】
本発明の別の態様は、試料から黒色腫細胞を単離する方法に関する。本方法は、試料を準備すること、及び試料をニューロピリン−２を発現している細胞を選択的に結びつける作用物質と接触させることを伴う。実施形態において、試料は対象から取得される。試料は細胞を含有する任意の体液であることが可能で、血液を包含する。いくつかの実施形態において、作用物質はＮＲＰ２に特異的に結合する抗体である。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。いくつかの実施形態において、作用物質はＮＲＰ２に選択的に結合するタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質はＶＥＧＦ又はＶＥＧＦの断片である。他の実施形態において、タンパク質はＰＬＥＸＩＮ又はＰＬＥＸＩＮの断片である。他の実施形態において、タンパク質はセマフォリン又はセマフォリンの断片である。実施形態において、作用物質は、当該技術分野で周知である従来の検出方法（複数可）を用いて検出される。いくつかの実施形態において、作用物質は標識されている。標識は、蛍光成分、レポーターイオンと結合する部分、磁性粒子、重イオン、金粒子、量子ドット又は当該技術分野で周知の任意の従来の標識であり得る。実施形態において、本方法は、単離された細胞（複数可）を水性媒体で洗浄することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、単離された細胞（複数可）の分子解析を行うことをさらに含む。分子解析としては、単離された細胞（複数可）の遺伝分析を包含する、当該技術分野で周知の任意の従来の分子アッセイが挙げられる。実施形態において、分子解析の結果は患者の処置方針を導くのに用いられる。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、ｉ）対象における黒色腫を検出するための、ii）黒色腫を発症するリスクがある対象を識別するための、又はiii）対象における黒色腫の再発を予測するためのキットである。実施形態において、キットは、ｉ）ＮＲＰ２を発現している細胞、ii）可溶性のＮＲＰ２又はiii）可溶性のＮＲＰ２断片の存在を検出する作用物質を含有する。いくつかの実施形態において、作用物質は、ＮＲＰ２又は可溶性のＮＲＰ２断片に特異的に結合する抗体である。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。いくつかの実施形態において、作用物質はＮＲＰ２に選択的に結合するタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質はＶＥＧＦ又はＶＥＧＦの断片である。他の実施形態において、タンパク質はＰＬＥＸＩＮ又はＰＬＥＸＩＮの断片である。他の実施形態において、タンパク質はセマフォリン又はセマフォリンの断片である。実施形態において、作用物質は、当該技術分野で周知である従来の検出方法（複数可）を用いて検出される。いくつかの実施形態において、作用物質は標識されている。標識は蛍光成分、レポーターイオンと結合する部分、磁性粒子、重イオン、金粒子、量子ドット又は当該技術分野で周知の任意の従来の標識であり得る。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の理解を容易にするため、いくつかの用語及び語句が下に定義される。
【００１３】
本明細書で用いられる単数形「a」、「an」及び「the」は文脈が明瞭に他を指示するものでない限り複数形を包含する。それ故に、例えば「タンパク質（a protein）」への言及は、２以上のタンパク質への言及を包含する。
【００１４】
本明細書で用いられる「ニューロピリン−２」及び「ＮＲＰ２」は、膜貫通型糖タンパク質の完全長、異性体及び断片を包含する。また定義内に包含されるのが、自然に又は介入により、例えばジスルフィド結合形成、糖鎖付加、脂質付加、アセチル化、リン酸化若しくは標識成分との抱合などの任意の他の操作若しくは修飾により修飾されたニューロピリン−２である。さらに定義内に包含されるのが、例えば１又は２以上のアミノ酸アナログ（例えば非天然アミノ酸などを包含する）や、同様に従来のものであって当該技術分野で周知の他の修飾を含有するニューロピリン−２である。
【００１５】
本明細書で用いられる「黒色腫」としては、悪性メラニン細胞の成長、原発性黒色腫、転移性黒色腫、メラニン細胞若しくはメラニン細胞関連母斑細胞のいずれかに由来する黒色腫、黒色癌、黒色上皮腫、黒色肉腫、表皮内黒色腫、表層進展性黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端黒子型黒色腫、侵襲性黒色腫又は家族性異型母斑黒色腫（ＦＡＭ−Ｍ，familial atypical mole and melanoma）症候群が挙げられるが、これらに限定されるものではない。哺乳類におけるかかる黒色腫は染色体異常、退行性の成長及び発達障害、分裂促進剤、紫外線（ＵＶ）、ウイルス感染症、遺伝子の不適切な組織発現、遺伝子発現の変化又は発癌物質によりもたらされる可能性がある。前述の黒色腫は本出願に記載される方法により診断され、査定され、又は処置されることが可能である。
【００１６】
「準備される」試料はアッセイを行う人間（又は機械）により取得されることが可能であり、又は別のものにより取得されて、アッセイを実施する人間（又は機械）に移送されることが可能である。
【００１７】
対象からの「試料」（例として被検試料）は、心不全を持つ対象における、レベルが上昇した本発明のタンパク質マーカーを含有することが予想される可能性がある試料が意味される。多くの適した試料のタイプが当業者にとって明らかであろう。いくつかの実施形態において、試料は全血、血漿又は血清（凝固因子が除去された血漿）などの血液試料である。例えば、末梢、動脈又は静脈の血漿又は血清が用いられ得る。いくつかの実施形態において、試料は尿、汗、又は髄液などの別の体液であり、これらの中にはタンパク質が血流から時折移される。例えば尿の場合、タンパク質は分解されやすく、そのため本発明のタンパク質の診断断片がスクリーニングされ得る。いくつかの実施形態において、試料は哺乳類組織の組織薄片、組織ホモジネート又は初代培養を包含する組織；細胞、剖検試料、病理試料、生検試料である。試料を取得し、それらを分析用（例として、タンパク質量の検出用）に調製する方法は、従来のものであって当該技術分野で周知である。
【００１８】
本明細書で用いられる「対象」は、黒色腫を持つ又は黒色腫を発症するリスクがある任意の動物を包含する。適した対象（患者）としては、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット又はブタなど）、農耕動物、競技動物（例としてイヌ又はウマ）、家畜動物及び愛玩動物（ウマ、イヌ又はネコなど）が挙げられる。非ヒト霊長類及びヒト患者は包含される。加えて、これらの症状を見せていない対象もまた、本発明の方法により評価され得る。
【００１９】
「リスクがある」は正常な対象と比較して又は対照群と比較してリスク増加があること、例として患者集団を意味することが意図される。それ故に、特定のマーカーを保有する対象は特異の疾患又は障害についてのリスク増加を持ち、さらなる検査を必要とするものと識別される可能性がある。「リスク増加」又は「リスク上昇」は確率、例として対象が障害を持つ確率における任意の統計的に有意な増加を意味する。
【００２０】
本明細書の実施例に提示されるデータの多くは完全長型のＮＲＰ２に関するものだが、このタンパク質のいろいろな型が黒色腫を持つ対象又は対象における黒色腫を発症するリスクを指し示すことができることは当業者に明らかであろう。例えば、タンパク質はインタクトな完全長のＮＲＰ−２であることができる。加えて、タンパク質は分解型及び／又は断片化型のＮＲＰ２であってもよい。かかる場合において、研究者は１又は２以上の断片又は分解産物のレベルを決定することが可能である。その上、ＮＲＰ２が自然にプロセッシング（例としてアセチル化、メチル化、リン酸化などの翻訳後修飾）を起こしたときは、これらの型のタンパク質のうち任意のものが本発明に包含される。したがって、「ニューロピリン−２」又は「ＮＲＰ２」は完全長のＮＲＰ２、ＮＲＰ２の断片及び翻訳後修飾型のＮＲＰ２をいう。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ベースライン値と比較した値（又は値の組合せ）の増加（例として統計的に有意な増加）の点からアッセイの結果を表現するのが望ましい。
【００２２】
本明細書で用いられる値の「有意な」増加は、適切であって当該技術分野で周知の統計的方法を用いて決定される再現性のある又は統計的に有意な差をいうことが可能であり、不規則変動のために５パーセントより低い変化の確率値を一般に伴う。適した統計的検定は当業者に明らかであろう。適したベースライン値と比較した本発明のタンパク質の量の有意な上昇は、その時、被験対象が黒色腫を持つ又は黒色腫を発症するリスクがあることを指し示している。対象が健常対照又は自身のベースライン（より早い時点で得られた）のレベルを有意に超えるレベルのマーカータンパク質を持つなら、対象は「おそらく」黒色腫を持つ又は黒色腫を発症するリスクがある。レベル増加の程度は確率の％に相関する。一般的に、本発明のマーカー量の上昇の存在は対象が黒色腫を持つことの強い徴候である。
【００２３】
本明細書で用いられる「ベースライン値」は、黒色腫を持たない「正常な」健常対象からの同等の試料（例として被験組織と同じタイプの組織からの試料）におけるタンパク質のレベル（量）を一般にいう。必要なら、正常な対象からの同じ組織のプール又は集団が用いられることが可能で、ベースライン値は測定値の平均（average）又は平均（mean）であり得る。適したベースライン値は過度の実験なくして当業者に決定され得る。適したベースライン値は値から編集されるデータベースにおいて利用可能であってもよく、並びに／又は発表されたデータに基づいて若しくは患者組織の後ろ向き研究及び本発明の方法を実行する当業者に明らかであろう他の情報に基づいて決定されてもよい。適したベースライン値は適切な信頼区間を提供する統計的ツールを用いて、標準値から外れた測定レベルが診断の観点から異常であり、黒色腫を予想するものとして受け取られ得るように選択されてもよい。
【００２４】
患者試料をベースライン対照の情報源として用いることは、臨床又は研究の状況において一般に実用的でない。したがって、いろいろな参照値のうち任意のものを用いることが可能で、それら参照値は同一又は同様の発現レベルが黒色腫を持たない対象において見い出される。
【００２５】
アッセイが行われる時にベースライン又は正常レベルは各アッセイについて確立される必要はなく、むしろベースライン又は正常レベルは、本明細書に記載の方法のうち任意のものを用いて確立されるベースラインレベルなどの所定のタンパク質又はタンパク質のパネルについて予め決定されたベースラインレベルに関する保存情報形態を参照することにより確立され得ることが当業者により理解されるであろう。かかる保存情報形態としては、例えば「正常レベル」（陰性対照）若しくは陽性対照に関する集団若しくは個体データについての参照チャート、リスト若しくは電子ファイル；以前の評価からのデータを記録している患者についてのカルテ；受信者動作特性（ＲＯＣ，receiver-operator characteristic）曲線；又は患者を診断するのに有用なベースラインレベルに関する任意の他のデータ源が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、タンパク質の組合せにおけるタンパク質の量は、ベースライン値と比較して、例としてNeter, Kutner, Nachtsteim, Wasserman (1996) Applied Linear Statistical Models, 4th edition, page 295におけるIrwinに記載されるような直線回帰スコアとして表現される。
【００２６】
処置の進行がモニターされているいくつかの実施形態において、ベースライン値は処置が施される前に同じ対象から得られたより早期の測定値に基づくことが可能である。
【００２７】
タンパク質の量は任意の適した方法を用いて測定され得る。いくつかの方法は所望のタンパク質に特異的な抗体、結合リガンド又は質量分析タグ付きペプチドの使用を伴う。本発明のアッセイにおける使用に適した抗体は市販されており、又は日常的に調製され得る。所望のタンパク質についてのアッセイにおいて抗体を調製して使用する方法は従来のものであり、例としてImmunochemical Protocols, Manson ed. (Humana Press 1992)におけるGreen et al., Production of Polyclonal Antisera；Current Protocols in Immunology, sections 2.4.1 and 2.5.1-2.6.7 (1992)におけるColigan et al.；Kohler & Milstein, Nature 256:495-7(1975)；及びHarlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, page 726 (Cold Spring Harbor Laboratory Pub. 1988)に記載される。
【００２８】
インビトロで免疫された又は標的抗原に対する抗体を生産する免疫された個体から単離された不死化ヒトＢリンパ球が生成され得る。例としてCole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss ed., p. 77 (1985)；Boemer et al., J Immunol, 147 (1):86-95 (1991)；及び米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照されたい。またヒト抗体は、例えばVaughan et al., Na. Biotech, 14:309-314 (1996)、Sheets et al., Proc Natl Acad Sci, 95:6157-6162 (1998)、Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381、及びMarks et al., J Mol Biol, 222:581 (1991)に記載されるように、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択され得る。抗体ファージライブラリーの生成及び使用のための技術はまた、米国特許第５，９６９，１０８号明細書、第６，１７２，１９７号明細書、第５，８８５，７９３号明細書、第６，５２１，４０４号明細書；第６，５４４，７３１号明細書；第６，５５５，３１３号明細書；第６，５８２，９１５号明細書；第６，５９３，０８１号明細書；第６，３００，０６４号明細書；第６，６５３，０６８号明細書；第６，７０６，４８４号明細書；及び第７，２６４，９６３号明細書；並びにRothe et al., J Mol Bio, J Mol Biol 376:1182-1200 (2007)に記載される。鎖シャフリング（Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)）などの親和性成熟ストラテジーは当該技術分野で知られており、高親和性のヒト抗体を生成するのに利用されることができる。
【００２９】
ヒト化抗体はまた、免疫処置に対して内因性の免疫グロブリン生産の非存在下でヒト抗体の完全レパートリーを生産する能力があるヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいて作成され得る。このアプローチは米国特許第５，５４５，８０７号明細書；第５，５４５，８０６号明細書；第５，５６９，８２５号明細書；第５，６２５，１２６号明細書；第５，６３３，４２５号明細書；及び第５，６６１，０１６号明細書に記載される。
【００３０】
いろいろな抗体のうち任意のものが本発明の方法において用いられ得る。かかる抗体としては、例としてポリクローナル、モノクローナル（ｍＡｂｓ）、組換え型、ヒト化又は部分的ヒト化、単鎖、Ｆａｂ及びそれらの断片が挙げられる。抗体は任意のアイソタイプ、例としてＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａなどの様々なＩｇＧアイソタイプに属するものであることが可能であり、ヤギ、ウサギ、マウス、ニワトリなどを包含する、抗体を生産する任意の動物種からのものであることが可能である。タンパク質に「特異的な」又はタンパク質を「特異的に結びつける」抗体という用語は、抗体がタンパク質中の規定されたアミノ酸配列又はエピトープを認識することを意味する。ポリペプチドに「特異的な」、ポリペプチドを「特異的に認識する」又は「特異的に結びつける」抗体は、ポリペプチドに選択的に結合し、抗体への結合が意図されない他のポリペプチドに一般的に結合しない抗体をいう。かかる特異性を達成するのに必要とされるパラメーターは、当該技術分野における従来法を用いて日常的に決定され得る。タンパク質をそれに特異的な抗体に結びつけるのに有効な条件は、従来のものであって当該技術分野で周知である。
【００３１】
「検出可能な成分」又は「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、放射性又は化学的手段により検出可能な組成をいう。例えば有用な標識としては３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例としてＥＬＩＳＡにおいて通常用いられるようなもの）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、抗血清若しくはモノクローナル抗体が利用可能なハプテン及びタンパク質、又は標的に相補的な配列を有する核酸分子が挙げられる。検出可能な成分は放射性、発色性又は蛍光性シグナルなどの測定可能なシグナルをしばしば生成し、これらシグナルは試料中の結合した検出可能な成分の量を定量するのに用いられ得る。シグナルの定量化は、例としてシンチレーション測定、デンシトメトリー、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ又はインタクトな又はその後に消化されたペプチド（１又は２以上のペプチドが査定され得る）の質量分析による直接分析により達成される。当業者は所望の化合物を標識する技術及び検出手段に精通している。かかる技術及び方法は従来のものであって当該技術分野で周知である。
【００３２】
本発明の実施形態において、本発明のタンパク質に特異的な抗体は表面上に固定化され（例としてマイクロアレイなどのアレイ上の反応要素であるか、又はＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ，surface plasmon resonance）に基づく技術に用いられる表面などの別の表面上にある）、試料中のタンパク質はその抗体に特異的に結合する能力によって検出される。あるいは、試料中のタンパク質が表面上に固定化され、その抗体に特異的に結合する能力によって検出されることが可能である。特異的な結合に有効な条件を包含する、表面を調製して分析を行う方法は、従来のものであって当該技術分野で周知である。
【００３３】
適したイムノアッセイの多くのタイプのなかには、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、ＦＡＣＳ分析、免疫蛍光、免疫組織化学染色、ウエスタンブロット（イムノブロット）、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ，fluorescence-activated cell sorting）、タンパク質Ａイムノアッセイなどの技術を用いた競合及び非競合アッセイ系がある。本発明の方法において用いられるアッセイは比色読み取り、蛍光読み取り、質量分析、目視検査などに基づき得る。アッセイは例として懸濁ビーズ、又は抗体若しくは細胞試料若しくは血液試料がガラススライド若しくはチップなどの表面に付着したアレイを使用して実施され得る。
【００３４】
本発明の実施形態において、組織試料は当該技術分野で周知である従来の免疫組織化学的アッセイ（複数可）において、組織中に存在するタンパク質について適した抗体で染色される。
【００３５】
一般的に、本明細書に言及される分子生物学的方法は当該技術分野で周知のものであり、例としてSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, current edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NYに記載される。
【００３６】
「診断の」は病理状態の存在又は性質を識別することを意味し、特異の疾患又は障害を発症するリスクがある患者を識別することを包含する。診断方法はその感度及び特異度において異なる。診断アッセイの「感度」は、検査で陽性となる病気にかかった個体のパーセンテージ（「真陽性」のパーセント）である。アッセイにより検出されない病気にかかった個体は「偽陰性」である。病気にかかっておらずアッセイにおいて陰性となる対象は「真陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異度」は１から偽陽性率を引いたものであり、ここで「偽陽性」率は検査で陽性となる疾患を有さない個体の比率として定義される。特定の診断方法は状態の確定診断を与えることはできないが、本方法が診断を援助する陽性徴候を提供すれば十分である。
【００３７】
本発明の検出（診断）方法は多くの使用に適応され得る。例えば本方法は黒色腫の進行を追うのに用いられ得る。本発明の実施形態において、検出は処置が施される前（又はほぼ同時に）及び後の両方で実施され、本方法は処置の有効性をモニターするのに用いられる。前臨床及び臨床試験において評価され得る対象についての特定の投薬計画又は薬若しくは他の治療法の有効性を決定することが可能なように、対象はこの方法でモニターされ得る。処置方法が成功であるなら、本発明のタンパク質マーカーのレベルは減少することが予想される。
【００３８】
本明細書で用いられる「処置される」は、有効量の薬又は他の抗黒色腫手法が対象に施されることを意味する。作用物質の「有効」量は、対象において検出可能な応答（例として治療的応答に属するもの）を引き起こす量をいう。
【００３９】
本発明の１つの態様は、ＮＲＰ２に選択的に結合する作用物質を用いて黒色腫細胞を単離する方法である。実施形態において、本発明は試料から希少な細胞を単離するのに利用される。いくつかの実施形態において、希少な細胞は末梢血からの循環している黒色腫細胞である。一般的に、希少な細胞の単離に使用するためのデバイスは当該技術分野で周知であり、例としてVeridex LLC社によるCellsearch（登録商標）Systemがある。当業者は試料から単一細胞を単離するのに用いられ得る実験条件及び系を認識するであろう。
【００４０】
試料から生物細胞を単離する方法に加えて、本発明のいくつかの実施形態は、単離された細胞が追加の情報を与えるのに用いられることができる方法を提供する。実施形態において、本発明の方法を用いて単離された細胞は、追加のインビトロアッセイを用いてさらにアッセイされ得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法を用いて単離された細胞は計数される。細胞を計数する従来法はいくつかの実施形態において用いられることが可能で、例えば、例として目視検査といった光学的計数、自動計数、顕微鏡検査に基づく検出；ＦＡＣＳ；及び例としてコールターカウンターといった電気的検出を包含するものである。細胞の計数は、疾患の診断、疾患の進行のモニタリング及び処置の効力のモニタリング又は決定に有用であり得る。
【００４１】
実施形態において、本発明の方法を用いて単離された細胞はフローサイトメトリー又は他の分析プラットフォームによる免疫細胞化学的分析に供される。かかる分析は診断を容易にし、臨床医に重要な情報を与える。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法を用いて単離された細胞は溶解されることが可能で、細胞又はその一部についての１又は２以上の特性が測定され得る。溶解された細胞において測定され得る生物学的特性の限定されない例としては、ｍＲＮＡ発現、タンパク質発現及びＤＮＡ定量が挙げられる。加えて、いくつかの実施形態において、細胞のＤＮＡはシーケンスされることが可能であり、又はある配列特性（例として多型及び染色体異常）が例としてＦＩＳＨ又はＰＣＲといった従来技術を用いて識別され得る。いくつかの実施形態において、細胞はデバイスに結合したまま溶解される。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法により単離された細胞は溶解されずにアッセイされる。非溶解細胞をアッセイする方法の限定されない例としては、細胞外又は細胞内染色を用いること；様々な培地中での形態又は生育特性を観察すること；及び細胞の表面上のバイオマーカーを識別することが挙げられる。さらなる実施形態において、単離された細胞はその後のインビトロアッセイにおける使用の前に、単離された細胞の濃縮集団を取得するために培養される。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態において、単離された細胞から取得され得る情報としては、特定のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡ配列の識別又は列挙；細胞表面マーカーの識別又は列挙；及び特定の腫瘍のタイプ若しくは存在を指し示しているタンパク質又は他の細胞内容物の識別又は列挙が挙げられる。実施形態において、単離された細胞は原発組織、疾患のステージ若しくは重篤度、又は特定の処置への感受性を決定するために分析されてもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は黒色腫腫瘍を根絶するための内科、放射線又は外科処置の後に残存する循環中の黒色腫細胞を査定するのに用いられる。さらなる実施形態において、本発明の方法及びデバイスは疾患の発生、再発及び／又は進行の指標としての循環中の黒色腫細胞の存在及び数について患者を査定するために何年にもわたって定期的に行われる。
【００４６】
本発明の別の態様は対象が黒色腫に罹患している又は黒色腫を発症するリスクがあるかを検出するためのキットであり、本発明のタンパク質の量を検出するための１又は２以上の作用物質を含む。キットはまた、タンパク質の量の検出、測定及び／又は定量に適した追加の作用物質を包含することができ、標準曲線作成のための従来の分析物を包含する。他の使用のなかで、本発明のキットは実験用途に用いられ得る。当業者は本発明の方法を実施するのに適したキットの構成成分を認識するであろう。
【００４７】
抗体に基づく方法がタンパク質レベルを測定するのに用いられることが予定されるなら、キット中の作用物質はタンパク質に特異的な抗体を包むことが可能である。いくつかの実施形態において、抗体は例として化学発光、酵素、蛍光又は放射性成分といった検出可能なマーカーで標識される。いくつかの実施形態において、キットは抗体への標識された結合相手（複数可）を包含する。タンパク質検出のための抗体に基づくキットは従来のものであって当該技術分野で周知である。当業者は抗体を用いてバイオマーカー（複数可）を検出するのに適したキットの構成成分を認識するであろう。
【００４８】
いくつかの実施形態において、キットはＮＲＰ２の結合相手であるタンパク質を含有する。ＮＲＰ２の結合相手は例として化学発光、酵素、蛍光又は放射性成分といった検出可能なマーカーで標識され得る。キットはまたＮＲＰ２を選択的に結びつけるタンパク質への標識された結合相手（複数可）を包含することが可能である。かかるキットは当該技術分野で周知であり、当業者はＮＲＰ２の結合相手を結合剤として用いてバイオマーカー（複数可）を検出するのに適したキットの構成成分を認識するであろう。
【００４９】
実施形態において、本発明のキットは本方法を行うための説明書を含むことができる。任意選択で、キットは、哺乳類の対象から試料（例として体液）を得て、キットを用いて黒色腫に罹患している又は黒色腫を発症するリスクがある哺乳類の対象を識別するための説明書を包含することが可能である。いくつかの実施形態において、本発明のキットは適したバッファー、容器又は包装資材を含有する。キットの試薬は試薬が安定である容器の中に、例として凍結乾燥された形又は安定化された液体としてあることができる。試薬はまた例として単一の対象についてアッセイを行うための１回使い切りの形であってもよい。
【００５０】
本発明の実施形態は次の限定されない例への参照によりさらに定義されることが可能であるが、この例はＮＲＰ２を黒色腫についての新規のバイオマーカー及び治療標的として識別し性質決定するのに利用される方法論を記載するものである。材料及び方法の両者への多くの修飾が本開示の範囲から逸脱することなく実践されることができるのは当業者に明らかであろう。
【００５１】
［実施例］
ニューロピリン−２は黒色腫腫瘍細胞の新規のバイオマーカーとして同定された。本明細書に記載される例及び実施形態は説明の目的のみのためのものであって、これらを考慮した様々な修飾又は変更は当業者に示唆されるであろうし本出願の趣旨及び範囲内に含まれるものであることが理解される。
【実施例１】
【００５２】
黒色腫−内皮細胞間コミュニケーションはインビトロで観察される
腫瘍細胞の近隣の内皮細胞との相互作用は腫瘍の生存及び転移にとって決定的である。黒色腫はその発生の比較的早いステージで転移する能力のために悪名高い。この攻撃的な挙動は少なくとも部分的に、腫瘍細胞とそれらを囲む間質との間の相互作用に依存する。インビボでの転移の間に生じる腫瘍−間質細胞間の相互作用のモデルとなる長期間のヘテロタイプ細胞共培養系を用いて、血管新生及び軸索誘導に関与する細胞表面受容体であるニューロピリン−２（ＮＲＰ２）は、黒色腫と内皮細胞との相互作用の間に黒色腫細胞において高度にアップレギュレートされる遺伝子として同定されている。
【００５３】
３つの別々の黒色腫及び内皮細胞のインビトロ二次元共培養系が黒色腫−内皮細胞間コミュニケーションの分子決定要因を同定するのに利用された（図１Ａ）。これらの系は共培養の制御度を増加させるように、構成細胞株を区別するのが容易なように設計された。これらの研究で用いられる細胞株としては、安定的に組み込まれた緑色蛍光タンパク質を保有する転移性黒色腫細胞株１２０５Ｌｕ（ＧＦＰ−１２０５Ｌｕ）及び赤色蛍光タンパク質を安定的にトランスフェクトされたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ）が挙げられる。
【００５４】
第一の系（間隙規定法）において、隔てられた黒色腫及び内皮細胞の隣接コロニーは最初にコロニーが１５０〜２００ｐｍ隔てられるような方法でインキュベートされた（図１Ａ、左）。１．５×１０５個のＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）は２４ウェルプレート内のプラスチック製クローニングシリンダー（内径１０ｍｍ）内部でＥＧＭ−２中に接種された。３×１０５個のＧＦＰ−１２０５Ｌｕ細胞はクローニングリングの外側に播種された。４時間のインキュベーションで細胞をプレートに接着させた後、クローニングリングは除去され、ヘテロタイプ細胞集団の間に１５０〜２００ｐｍの間隙が残された。細胞はＰＢＳで洗浄され、新たなＥＧＭ−２がウェルに添加された。細胞は次いで２４時間移動を許容され、その後にウェルの写真が撮影された。４８時間後、ヘテロタイプ細胞は相互作用して自己組織化細胞性ネットワークを界面に生み出した。
【００５５】
第二の系（ランダム混合法）において、細胞は５０／５０の比で予め混合され、このランダムに混合された状態で播種されて、その後に４８時間相互作用するのを許された（図１Ａ、中央）。ＧＦＰ−１２０５Ｌｕ及びＲＦＰ−ＨＵＶＥＣは９５％のコンフルエンス度で１：１の比でＥＧＭ−２培養培地中に播種された。細胞は４８時間インキュベートされ、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ，fluorescence activated cell sorting）を用いて純粋な集団へとソートされた。個々の細胞タイプの対照培養は同一の条件下で生育（bgfregrown）された。共培養及び対照の細胞はＰＢＳで２回洗浄され、トリプシン処理により回収された。回収された細胞はＦＡＣＳ用に氷冷ＥＧＭ−２中に再懸濁された。
【００５６】
第三の系（マイクロパターニング法）はステンシルに基づく技術を利用する。内皮細胞は事前に規定された大きさの円形又は三角形の形状をしたコロニーへとパターン形成され、黒色腫細胞が次いで残った周囲の空間内に播種された（図１Ａ、右）。具体的には、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣはOstuni et al（Ostuni E, Kane R, Chen CS, Ingber DE, Whitesides GM (2000) Patterning Mammalian Cells Using Elastomeric Membranes. 16(20): 7811）により報告された技術と同様のマイクロステンシル技術を用いて二次元コロニーへと微小パターン形成された。高アスペクト比ネガ型フォトレジストであるＳＵ−８はシリコン上へ光パターン形成された。これは１００ｐｍ高さのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）膜をスピンキャストするための鋳型として用いられた。エラストマー膜はコラーゲンコーティングされたガラス基板表面上に平らに置かれ、次いでＨＵＶＥＣ細胞を含有する培養培地に曝露された。細胞はＰＤＭＳステンシルとガラス基板の両方に接着した。膜を剥がすと、ＨＵＶＥＣはマイクロステンシルにより保護されていない領域内に残った。
【００５７】
円形及び三角形の形状をした各々のコロニーにおける細胞の数は正確に制御された（１ｍｍ径の円形コロニーについて８８＋／−１４個の細胞、１ｍｍ辺の三角形のコロニーについて７２＋／−２０個の細胞）。共インキュベーションの間及び後に黒色腫と内皮細胞とを区別するため、安定的に組み込まれた緑色蛍光タンパク質を保有する転移性黒色腫細胞株１２０５Ｌｕ（ＧＦＰ−１２０５Ｌｕ）及び赤色蛍光タンパク質を安定的にトランスフェクトされたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ）が用いられた。利用される３つの異なる共培養技術はヘテロタイプ細胞間の界面の性質及び範囲の点で主に異なる。界面は、第一の方法においては最初は存在しないものの出現してきて、第二の方法においては非常に広範囲だが制御が不十分であり、第三の方法においては良好に規定されて制御されるが非常に広範囲ではない。これらの異なって規定される界面は、空間的な関係を調整した結果として優先的に生じる可能性があるヘテロタイプ細胞の相互作用の範囲を利用者が変えることを可能とする。
【００５８】
個々のＨＵＶＥＣ細胞の位置における変化は経時的に手作業で追跡され、座標はMathematica（バージョン６）において実行される特注ソフトウェアパッケージを用いて記録された。速度ベクトルの空間的相関係数は既に記載された（Haga H, Irahara C, Kobayashi R, Nakagaki T, Kawabata K (2005) Collective movement of epithelial cells on a collagen gel substrate. Biophys J 88(3): 2250-2256）ように全ての細胞ペアについて細胞間距離ｒ（我々の分析においては２００μＭを超えない）の関数として計算された。
【００５９】
【数１】
2013507641.tif 000003
【００６０】
式中ｖは細胞ｉの位置ｒでの速度ベクトルを意味し、１時間間隔で撮影された２つの画像における細胞位置間の差から計算される。細胞ペアの運動が高度に相関する場合、Ｃ（ｒ）の値は１に近づき得る。Ｃ（ｒ）の値が低いことは指向性運動における相関が低いことを指し示す。
【００６１】
間隙規定法において、腫瘍−内皮細胞間の界面として発達した目を引く内皮細胞ネットワークが徐々に出現し、細胞は進行的に入り混ざった（図１Ｂ、下）。注目すべきことに、これらの構造は内皮細胞で構成される腫瘍細胞を取り囲んだ連続的なループを包含し、腫瘍実質において見られるもの（Asaishi K, Endrich B, Gotz A, Messmer K (1981) Quantitative analysis of microvascular structure and function in the amelanotic melanoma A-Mel-3. Cancer Res 41(5): 1898-1904、Endrich B, Hammersen F, Gotz A, Messmer K (1982) Microcirculatory blood flow, capillary morphology and local oxygen pressure of the hamster amelanotic melanoma A-Mel-3. J Natl Cancer Inst 68(3): 475-485）と類似した形状及び型に属していた。この内皮細胞の構造化集合体は、単独で培養された内皮細胞で観察されたランダム集合体（図１Ｆ）と異なった。
【００６２】
ランダム混合法を用いた黒色腫及び内皮細胞のランダム共培養の評価は、共培養の６時間時には極小のＨＵＶＥＣネットワーク形成を示したが（図１Ｃ、上）、共培養の４８時間時には明白な細胞ネットワーク形成を示した（図１Ｃ、下）。内皮細胞がループ状及び枝状構造の中に徐々に蓄積することにより形成されたネットワークは黒色腫細胞のバックグラウンドに対して明確に区別可能であり、間隙規定法を用いて観察されるものと同様の細胞ネットワーク形態を有した。
【００６３】
最後にマイクロパターニング法においては、４８時間の共培養の間、内皮細胞は集団性運動の「流れ」の中で予めパターン形成された島状構造から出て周囲の大規模な黒色腫細胞コロニーへと動いて、最初の枝状ネットワークを形成することが見い出された（図１Ｄ）。それ故に３つ全ての細胞共培養法は、ヘテロタイプ細胞コロニー間の界面で広範囲に及ぶ内皮細胞の枝状及びループ状ネットワークへの再組織化を結果としてもたらした。
【００６４】
基本培地単独又はＨＵＶＥＣ条件培地のいずれかにおける４８時間のＨＵＶＥＣのインキュベーションは、ＨＵＶＥＣパターニングをインビトロで引き起こすことができなかった（図１Ｅ及び１Ｆ）。一方、黒色腫細胞の条件培地又は共培養の条件培地のいずれかを使用してインキュベートされたＨＵＶＥＣにおいては、間隙規定及びランダム混合共培養法を用いてインキュベーション４８時間時に見い出されたものと同様のネットワークへと細胞が再組織化されたが（図１Ｇ及び１Ｈ）、このことは黒色腫−ＨＵＶＥＣ間コミュニケーションが少なくとも部分的に１又は２以上の腫瘍分泌性可溶性因子（複数可）により仲介されることを示唆する。
【実施例２】
【００６５】
黒色腫−内皮細胞間コミュニケーションの間の差次的な遺伝子発現
用いられる共培養法のなかで、ランダム混合法は同様の相対的なヘテロタイプ細胞の数及び広範囲に及ぶヘテロタイプ細胞間の界面のために共培養に加わる細胞のゲノム組成変化における大規模評価にとりわけ有利であり、おそらく大半の細胞が細胞間、内皮−黒色腫間の細胞間コミュニケーションに参加するようになるであろう。したがって、ランダム混合法を用いて、その後に細胞タイプ特異的な蛍光標識の色に基づいてヘテロタイプ細胞をソーティングすることで、ソートされた細胞の遺伝子発現プロファイルが試験された。
【００６６】
黒色腫−ＨＵＶＥＣ間コミュニケーションを支配する分子経路を定義するため、単独又は混合で４８時間培養されたＧＦＰ−１２０５Ｌｕ及びＲＦＰ−ＨＵＶＥＣの遺伝子発現プロファイリングが行われた（図２Ａ）。マイクロアレイ解析は既に記載された（Ryu B, Kim DS, Deluca AM, Alani RM (2007) Comprehensive expression profiling of tumor cell lines identifies molecular signatures of melanoma progression. PLoS One 2(7): e594）ように行われた。４つのGeneChip（ＧＦＰ−１２０５Ｌｕ単独、ＧＦＰ−１２０５Ｌｕ共培養、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ単独、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ共培養）からの発現レベルを含有するスプレッドシートはMicrosoft Excelにおいて生成された。チップからのシグナルはRMAExpressを用いて正規化された。各細胞タイプについて共培養試料と対照試料との間の発現比を生成するために２つの新たなスプレッドシートが作り出された。Affymetrixソフトウェアにより存在する（「Ｐ」）とタグ付けされた遺伝子のみが評価を考慮された。２以上のカットオフシグナル比は共培養された細胞においてアップレギュレートされたとみなされ、０．５以下のシグナルはダウンレギュレートされたとみなされた。Spotfire（Tibco社製，Somerville，ＭＡ）は、遺伝子オントロジー（ＧＯ，Gene Ontology）分類を使用した所望の遺伝子のアノテーションを包含するマイクロアレイデータのさらなる解析のために用いられた。変化した全ての遺伝子のなかで、所望の特異的遺伝子に関連した分類及び最も一般的な分類の両方が査定された。共培養されたＧＦＰ−１２０５Ｌｕにおいて単一培養に対して変化した遺伝子に関連した選択されたＧＯ分類で、０．０５より小さいｐ値を有するものが表１に示される。全ての試料はAffymetrix社からの市販アレイにおいて、Affymetrix GeneChipヒトU133Plus 2.0アレイを用いてAffymetrix社のウェブサイトに記載されるように分析された。JHMI Microarray Core Facilityは現行のＭＩＡＭＥガイドラインによる全ての手法に従う。マイクロアレイデータはシリーズレコードＧＳＥ８６９９の下で遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ，Gene Expression Omnibus）リポジトリに供された。
【００６７】
【表１】
2013507641.tif 000004
【００６８】
【表２】
2013507641.tif 000005
【００６９】
共培養系に関連した遺伝子発現の特徴的性質の解析は、内皮細胞の発現プロファイルに対する腫瘍細胞の特異的な影響を実証し、その逆も同様に実証した。最初の解析は黒色腫細胞における発現プロファイルの差に焦点が置かれた。ＨＵＶＥＣとの共培養の後にＧＦＰ−１２０５Ｌｕ細胞において単独で生育された黒色腫細胞に対してアップレギュレートされた遺伝子についての遺伝子オントロジー生物学的分類の評価は、細胞接着、細胞運動、細胞外マトリックス組織化及び血管新生、すなわち腫瘍の進行及び転移にしばしば関連した特徴的性質を制御する遺伝子における変化を実証した（表１）。以前の調査は黒色腫細胞自身の細胞自律的な血管新生特性に様々に起因するものであった進行型黒色腫の血管原性表現型について述べているが（Hendrix MJ, Senor EA, Hess AR, Seftor RE (2003) Vasculogenic mimicry and tumour-cell plasticity: lessons from melanoma Nat Rev Cancer 3(6): 411-421、Velazquez OC, Herlyn M (2003) The vascular phenotype of melanoma metastasis. Clin Exp Metastasis 20(3): 229-235、Dome B, Hendrix MJ, Paku S, Tovari J, Timar J (2007) Alternative vascularization mechanisms in cancer: Pathology and therapeutic implications. Am J Pathol 170(1): 1-15、Hess AR, Margaryan NV, Seftor EA, Hendrix MJ (2007) Deciphering the signaling events that promote melanoma tumor cell vasculogenic mimicry and their link to embryonic vasculogenesis. role of the Eph receptors. Dev Dyn 236(12): 3283-3296）、現在の研究は、黒色腫細胞が近隣の内皮細胞により今度は内皮細胞に影響を及ぼすことが可能な因子及びその機能的な脈管構造を形成する傾向を作り出すように誘導され得ることによれば、より複雑な像を示唆する。
【００７０】
共培養条件下で黒色腫細胞においてアップレギュレートされた上位３０個の遺伝子のなかには、腫瘍血管新生及び黒色腫転移に既に関連した遺伝子であるチモシンβ４（Clark EA, Golub TR, Lander ES, Hynes RO (2000) Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature 406(6795): 532-535、Ridley A (2000) Molecular switches in metastasis. Nature 406(6795): 466-467、Cha HJ, Jeong MJ, Kleinman HK (2003) Role of thymosin beta4 in tumor metastasis and angiogenesis. J Natl Cancer Inst 95(22): 1674-1680）、及び内皮細胞の接着に関与する遺伝子であるマルチメリン１（Adam F, Zheng S, Joshi N, Kelton DS, Sandhu A et al. (2005) Analyses of cellular multimerin 1 receptors: in vitro evidence of binding mediated by alphallbbeta3 and alphavbeta3. Thromb Haemost 94(5): 1004-1011）があった。加えて、高度にアップレギュレートされた遺伝子についてのより精密な試験は、それら遺伝子の多くが新規血管床の迅速で頑強な形成を確保するのに責任を持つ可能性がある分泌性構成成分をコードすることを示唆する。とりわけ、Ｉ型及びIV型のコラーゲンは両黒色腫細胞自身の運動（注目すべきことに、関係するインテグリンαＶもまた共培養後に黒色腫細胞において過剰発現される）と、同様に内皮細胞の付着及び運動の亢進を確保することに影響することが可能であり、細胞コミュニケーションの推定上の間接的手段として働く（Yin Z, Noren D, Wang CJ, Hang R, Levchenko A (2008) Analysis of pairwise cell interactions using an integrated dielectrophoretic-microfluidic system. Mol Syst Biol 4: 232）。フォンウィルブランド因子及びその関係したタンパク質であるマルチメリンは凝固の調節を通じて血管新生を容易にする可能性がある（Nash GF, Walsh DC, KakkarAK (2001) The role of the coagulation system in tumour angiogenesis. Lancet Oncol 2(10): 608-613）。サイトカインＣＸ３ＣＬ１の過剰発現は、皮膚由来の内皮細胞を包含するいくつかの細胞タイプの化学誘引にかかわっている（Crola Da Silva C, Lamerant-Fayel N, Paprocka M, Mitterrand M, Gosset D et al. (2009) Selective human endothelial cell activation by chemokines as a guide to cell homing. Immunology 126(3): 394-404）。また注目すべきことに、ＮＲＰ２は分泌型で存在して内皮細胞の表面上でＶＥＧＦシグナル伝達に影響することが可能であり、それ故に細胞増殖及び運動を調節する細胞シグナル伝達を直接的に調整する。これらの結果は、黒色腫細胞が続いて起こる両細胞タイプの挙動に影響を及ぼす可能性がある複数の可溶性因子を生産するよう内皮細胞により誘導され得ることを示唆する。
【実施例３】
【００７１】
ＮＲＰ２は黒色腫−内皮細胞間コミュニケーションの間にアップレギュレートされ、転移性黒色腫において発現される
ＮＲＰは神経系及び血管系の発達を調整する膜貫通型糖タンパク質である（Bielenberg DR, Pettaway CA, Takashima S, Klagsbrun M (2006) Neuropilins in neoplasms: expression, regulation, and function Exp Cell Res 312(5): 584-593、Favier B, Alam A, Barron P, Bonnin J, Laboudie P et al. (2006) Neuropilin-2 interacts with VEGFR-2 and VEGFR-3 and promotes human endothelial cell survival and migration. Blood 108(4): 1243-1250、Staton CA, Kumar I, Reed MW, Brown NJ (2007) Neuropilins in physiological and pathological angiogenesis. J Pathol 212(3): 237-248）。ＮＲＰは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ，vascular endothelial growth factor）受容体及びプレキシンと相互作用する共受容体として機能し、別個の機能を有する２つの既知のリガンド、軸索誘導に関与するクラス３セマフォリン及び血管新生を促進することが知られるＶＥＧＦファミリーメンバーを結びつける。ＮＲＰ２の機能を遮断することは、近年、リンパ管内皮細胞運動及び腫瘍に関連したリンパ脈管新生に対する作用を通じて腫瘍転移を阻害することが示されている（Caunt M, Mak J, Liang WC, Stawicki S, Pan Q et al. (2008) Blocking neuropilin-2 function inhibits tumor cell metastasis. Cancer Cell 13(4): 331-342）。ＮＲＰはまた、いろいろながんにおいて発現されることから、腫瘍形成にもかかわっている（Bielenberg DR, Pettaway CA, Takashima S, Klagsbrun M (2006) Neuropilins in neoplasms: expression, regulation, and function Exp Cell Res 312(5): 584-593、Klagsbrun M, Takashima S, Mamluk R (2002) The role of neuropilin in vascular and tumor biology. Adv Exp Med Biol 515: 33-48、Bielenberg DR, Hida Y, Shimizu A, Kaipainen A, Kreuter M et al. (2004) Semaphorin 3F, a chemorepulsant for endothelial cells, induces a poorly vascularized, encapsulated, nonmetastatic tumor phenotype. J Clin Invest 114(9): 1260-1271、Chen C, Li M, Chai H, Yang H, Fisher WE et al. (2005) Roles of neuropilins in neuronal development, angiogenesis, and cancers. World J Surg 29(3): 271-275、Chabbert-de Ponnat I, Buffard V, Leroy K, Bagot M, Bensussan A et al. (2006) Antiproliferative effect of semaphorin 3F on human melanoma cell lines. J Invest Dermatol 126(10): 2343-2345、Ellis LM (2006) The role of neuropilins in cancer. Mol Cancer Ther 5(5): 1099-1107、Guttmann-Raviv N, Kessler 0, Shraga-Heled N, Lange T, Herzog Y et al. (2006) The neuropilins and their role in tumorigenesis and tumor progression. Cancer Lett 231(1): 1-11、Bielenberg DR, Klagsbrun M (2007) Targeting endothelial and tumor cells with semaphorins. Cancer Metastasis Rev 26(3-4): 421-431）。加えてＮＲＰ２は、近年、黒色腫転移及び血管新生に不可欠なプロセスをインビボで調節することが示されているが（Cohen T, Herzog Y Brodzky A, Greenson JK, Eldar S, Gluzman-Poltorak Z, Neufeld, G Resnick MB. Neuropilin-2 is a novel marker expressed in pancreatic islet cells and endocrine pancreatic tumours. The Journal of pathology 2002; 198:77-82）、これら調節のメカニズムは明確でない。したがって、共培養条件への表現型細胞応答の調節におけるＮＲＰ２の潜在的な役割が上記の様々な方法を用いて評価された。
【００７２】
ＮＲＰ２タンパク質の発現は、ｓｃ−５５４２抗体（Santa Cruz社製）を標準的条件下で用いたイムノブロット法により、共培養の間に黒色腫細胞において評価された。試料はアクリルアミドゲル上で泳動され、Immobilon-P膜上にトランスファーされた。膜は次いでSanta Cruz（登録商標）社（Santa Cruz，カリフォルニア）から市販されているＮＲＰ２抗体を使用して調べられた。イムノブロット法の結果は共培養された黒色腫細胞におけるＮＲＰ２の発現増加を確認する（図２Ｂ）。
【００７３】
原発性ヒト黒色腫組織におけるＮＲＰ２発現の試験は、評価された転移性黒色腫の５／５において腫瘍実質内でのＮＲＰ２の特異的な高レベル発現を実証した（図２Ｃ〜Ｅ）。その上、かかる染色はメラニン細胞マーカーのＭｅｌａｎ−Ａによる腫瘍染色（図２Ｆ）と一致した。したがって、ＮＲＰ２は転移性黒色腫においてインビボで発現される。
【実施例４】
【００７４】
ＮＲＰ２は黒色腫細胞の増殖を仲介する
ＮＲＰ２は細胞増殖及び／又は運動を調節することが知られるＶＥＧＦ及びセマフォリンのシグナル伝達と相互作用することが可能なことから、黒色腫−内皮共培養におけるＮＲＰ２過剰発現の機能的意義がＮＲＰ２中和抗体を用いて調査された（Nasarre P, Constantin B, Rouhaud L, Harnois T, Raymond G et al. (2003) Semaphorin SEMA3F and VEGF have opposing effects on cell attachment and spreading. Neoplasia 5(1): 83-92、Nasarre P, Kusy S, Constantin B, Castellani V, Drabkin HAet al. (2005) Semaphorin SEMA3F has a repulsing activity on breast cancer cells and inhibits E-cadherin-mediated cell adhesion. Neoplasia 7(2): 180-189）。研究において評価された抗体はＮＲＰ２のアミノ酸５６０〜８５８位に対して生成されたものであり、したがってセマフォリン及びＶＥＧＦリガンドの両者の結合を遮断するであろう。
【００７５】
ＸＴＴアッセイ
細胞は平底９６ウェルプレート中に３，０００個の細胞／ウェルで播種された。ウサギポリクローナルＮＲＰ２抗体（ｓｃ−５５４２，Santa Cruz社製）及び正常ウサギＩｇＧ（ｓｃ−２０２７，Santa Cruz社製）、又はマウスモノクローナルＮＲＰ２抗体（ｓｃ−１３１１７，Santa Cruz社製）及び正常マウスＩｇＧ（ｓｃ−２０２５，Santa Cruz社製）は終濃度１０ｐｇ／ｍｌで機能研究のために用いられた。ＸＴＴ試薬（Cell Proliferation Kit II，Roche Applied Science社製）は２４時間ごとに８日間、ウェルのサブセットに添加され、色の変化が分光光度計によりモニターされた。細胞数は標準曲線から外挿された。細胞は抗体の存在下で播種され、培地が交換され、抗体は２、４及び６日目に再び新しくされた。ＢｒｄＵ取り込みはBrdU Labeling and Detection Kit I（Roche Applied Science社製）を用いて、製造業者の説明書に従って測定された。
【００７６】
興味深いことに、共培養の非存在下においてさえＮＲＰ２中和抗体（Ｈ−３００、ｓｃ−５５４２）は黒色腫細胞の増殖をインビトロで激しく減少させたが（図３Ａ）、このことはＮＲＰ２が黒色腫細胞の増殖の決定的なメディエーターであることを示唆する。別のＮＲＰ２中和抗体（Ｃ−９、ｓｃ−１３１１７）を使用した研究もまた増殖抑制性の役割を確認し（図３Ｅ）、ＢｒｄＵ取り込みアッセイは抗体処理後４８時間時での有意な増殖阻害を実証した（図３Ｄ）。増殖阻害は抗体の量が減少すると抑制作用が小さくなったことから滴定可能であった（図３Ａ〜Ｃ）。
【００７７】
ＴＵＮＥＬアッセイ
細胞は平底９６ウェルプレート中に３，０００個の細胞／ウェルで播種された。ウサギポリクローナルＮＲＰ２抗体（ｓｃ−５５４２，Santa Cruz社製）及び正常ウサギＩｇＧ（ｓｃ−２０２７，Santa Cruz社製）、又はマウスモノクローナルＮＲＰ２抗体（ｓｃ−１３１１７，Santa Cruz社製）及び正常マウスＩｇＧ（ｓｃ−２０２５，Santa Cruz社製）は終濃度１０ｐｇ／ｍｌで機能研究のために用いられた。ＴＵＮＥＬアッセイの場合、細胞は抗体の存在下で播種され、ＴＵＮＥＬ染色は４８時間の抗体処理の後又はトランスフェクション後４８時間で行われた。ＴＵＮＥＬ染色はIn situ Cell Death Detection Kit（TMR Red，Roche Applied Science社製）を用いて行われた。
【００７８】
ＴＵＮＥＬ染色による細胞のアポトーシスの評価は黒色腫の細胞死に著しい増加がないことを実証した（図３Ｆ〜Ｈ）。加えて、腫瘍細胞形態は中和抗体での処理の後に顕著には変化しなかった（図３Ｉ及び３Ｊ）。
【００７９】
スクラッチアッセイ
細胞は平底９６ウェルプレート中に３，０００個の細胞／ウェルで播種された。ウサギポリクローナルＮＲＰ２抗体（ｓｃ−５５４２，Santa Cruz社製）及び正常ウサギＩｇＧ（ｓｃ−２０２７，Santa Cruz社製）、又はマウスモノクローナルＮＲＰ２抗体（ｓｃ−１３１１７，Santa Cruz社製）及び正常マウスＩｇＧ（ｓｃ−２０２５，Santa Cruz社製）は終濃度１０ｐｇ／ｍｌで機能研究のために用いられた。スクラッチアッセイの場合、ＧＦＰ−１２０５Ｌｕ細胞は１００％コンフルエンスで２４ウェルプレート中に播種された。２００ｐｌピペットチップが細胞単層中に線を引っかくのに用いられ、細胞はＰＢＳ中で３回洗浄された。マイトマイシンＣは終濃度０ｐＭ又は３ｐＭで１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中に添加された。ＤＡＰＩ染色は核を可視化するのに用いられた。全ての実験は３連で行われた。全ての実験についての顕微鏡写真はNikon社製のEclipse顕微鏡を使用して撮影され、MetaMorphソフトウェア（Molecular Devices社製）を用いて分析された。
【００８０】
増殖が考慮された場合、ＮＲＰ２の抗体中和はスクラッチアッセイにおいて細胞運動を顕著には変化させなかった（図３Ｋ）。これらの結果は、ホモタイプ細胞培養において黒色腫細胞により発現されたＮＲＰ２はおそらくＶＥＧＦによるオートクラインシグナル伝達を容易にすることにより細胞増殖を特異的に支持することを示唆する（非特許文献３５）。
【００８１】
ＸＸＴ、ＴＵＮＥＬ及びスクラッチアッセイの結果は、純粋培養又は共培養環境中での黒色腫細胞増殖の調節におけるＶＥＧＦの潜在的な決定的役割を支持する。
【実施例５】
【００８２】
ＮＲＰ２は黒色腫共培養においてＨＵＶＥＣの集団性運動を促進する
ＮＲＰ２が全ての共培養法で観察された枝状及びループ状ネットワークへの細胞再組織化を伴う方向性を持った集団性内皮細胞運動をも制御することが可能かを調査するために、ＨＵＶＥＣ細胞運動の高度時間分解微速度撮影イメージングが用いられた。この目的のためには、最も制御された細胞共培養の方法であるマイクロパターニング法が、初期条件すなわち内皮細胞コロニーの形状及びその大きさの高い再現性度のためにとりわけ都合が良かった。
【００８３】
腫瘍細胞はＲＦＰ−ＨＵＶＥＣと４８時間インキュベートされ、落射蛍光顕微鏡検査を用いて写真が撮影された。ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣの画像についての閾値はOtsuの方法（Matlabの「graythresh」機能）を用いて決定された。閾値を超えた画素はＨＵＶＥＣに相当し、閾値を下回った画素はバックグラウンド（すなわち共培養されたがん細胞により覆われた領域）に相当した。ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ画像は直径１００ピクセルの円を用いて形態的に閉じられ、次いでネットワーク形成の計量が閾値を下回った画素の画分としてコンピューター処理された。この方法は、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣにより覆われなかった少なくとも直径１００ピクセルの大きな領域からなる共培養領域の画分を決定した。ＨＵＶＥＣが共培養中でランダムに分散するときなどのネットワーク形成の非存在下においては、ＨＵＶＥＣにより被覆される大領域はほとんど又は全くないと予想され、ネットワーク形成計量はゼロに近いと予想される。ＨＵＶＥＣ細胞が凝集してパターンを形成するときなどのネットワーク形成の存在下においては、ＨＵＶＥＣにより覆われない多くの大領域が出現し、ネットワーク形成計量は正であると予想されるであろう。
【００８４】
内皮細胞の集団性運動は様々な細胞ペアについての細胞速度の相関Ｃ（ｒ）を細胞間距離（ｒ）の関数として推定することにより（（Haga H, Irahara C, Kobayashi R, Nakagaki T, Kawabata K (2005) Collective movement of epithelial cells on a collagen gel substrate. Biophys J 88(3): 2250-2256）に記載）、対照（ＨＵＶＥＣコロニー単独）及び共培養実験について早い時点（５時間）及び遅い時点（４０時間）で定量された（図４）。低密度の純粋なＨＵＶＥＣコロニーについてＣ（ｒ）は０と予想されるが、高密度なコロニーについては一般に共培養の非存在下であってもより一層高値であることに注目されたい。これは部分的に、コロニー中心から離れて利用可能な空間へと至る測定距離（＜２００ｐｍ）についての細胞運動の相関のためである。
【００８５】
黒色腫細胞は早い時点では方向性を持ったＨＵＶＥＣ運動を顕著に亢進したが、遅い時点では亢進しなかった。著しいことに、ＮＲＰ２中和抗体は黒色腫細胞によるこの早期の亢進作用を完全に消滅させたが（図４Ｂ、Ｅ）、このことはＮＲＰ２が細胞性ネットワーク形成の初期ステージの間の内皮細胞組織化を仲介するのに決定的な役割を果たすことを示唆する。その上、ＮＲＰ２中和抗体の作用は比較的大きい細胞間距離（＞１２０ｐｍ）で最も明白であった。これらの知見は、共培養の間の内皮細胞運動に対するＮＲＰ２の作用がおそらく長期のものであり、接触に基づく細胞間相互作用よりむしろ拡散に基づくプロセスを通じて細胞挙動に影響を及ぼす可能性があることを、条件培地を使用した実験の結果と一致して示唆する。これらの結果はさらに、ヘテロタイプ共培養において観察された分岐パターン（図１Ｂ〜Ｄ）が少なくとも部分的に初期の（最初の５時間にわたる）細胞運動の方向性及び速度におけるＮＲＰ２依存的相関に依存する可能性があることを暗に意味する。ＮＲＰ２、おそらくその分泌型は内皮細胞の動員において黒色腫細胞を助ける可能性があり、このことは、この動員が機能的な新しい脈管構造を結果としてもたらし、それ故に黒色腫の生存を亢進してかつ転移ルートを提供することを確保する。黒色腫増殖及び腫瘍転移におけるＮＲＰ２の機能に関するインビボ（Caunt M, Mak J, Liang WC, Stawicki S, Pan Q et al. (2008) Blocking neuropilin-2 function inhibits tumor cell metastasis. Cancer Cell 13(4): 331-342）及びインビトロの証拠を考えると、ＮＲＰ２は黒色腫−内皮細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターであり、黒色腫を処置することにおいて価値のある治療標的である。
【実施例６】
【００８６】
ＮＲＰ２受容体及びリガンドは黒色腫において発現される
黒色腫細胞株のパネルにおけるＮＲＰ２リガンド及び共受容体の発現は、黒色腫におけるＮＲＰ２の機能に関連した経路を定義するために評価された。以前の変化する悪性進行ステージからの黒色腫細胞株の遺伝子発現研究は、黒色腫進行に関連した分子の特徴的性質を与えた（Ryu B, Kim DS, Deluca AM, Alani RM (2007) Comprehensive expression profiling of tumor cell lines identifies molecular signatures of melanoma progression. PLoS One 2(7): e594）。これらのデータはＮＲＰ２、そのホモログであるＮＲＰ１並びにその結合相手であるＶＥＧＦＲ１、プレキシンＡ４Ａ、プレキシンＡ３、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＳｅｍａ３Ｆの発現を調査するためにマイニングされた。ＮＲＰ２発現は黒色腫の全てのステージにおいて検出され、放射生育期のものの３つのうち２つにおいてより低い発現が認められた（図５Ａ）。ＶＥＧＦ−Ａの発現は早期ステージの黒色腫で後期ステージに対して上昇した一方（図５Ａ）、プレキシン、Ｓｅｍａ３Ｆ及びＶＥＧＦ−Ｃの低レベル発現が評価された全ての黒色腫細胞株において見られ、Ｎｒｐ１発現は実質的に欠けていた（図５Ａ）。
【００８７】
ヒト黒色腫細胞株及びＲＦＰ−ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３の相対的発現レベルは、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）解析により決定された。次のプライマーオリゴヌクレオチドが用いられた。
ＶＥＧＦＲ１フォワード（5'-GCACCTTGGTIGTGGCTGAC-3'）
ＶＥＧＦＲ１リバース（5'-GAGCAAGGATGAAGGCACTC-3'）
ＶＥＧＦＲ２フォワード（5'-CATCACATCCACTGGTATTGG-3'）
ＶＥＧＦＲ２リバース（5'-GCCAAGCTTGTACCATGTGAG-3'）
ＶＥＧＦＲ３フォワード（5'-CCCACGCAGACATCAAGACG-3'）
ＶＥＧＦＲ３リバース（5'-TGCAGAACTCCACGATCACC-3'）
ＧＡＰＤＨフォワード（5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'）
ＧＡＰＤＨリバース（5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'）
【００８８】
ＲＮＡはRNeasy Mini Kit（Invitrogen社製）を用いて抽出された。各試料について３ｐｇのＲＮＡがSuperScript First-Strand Synthesis System（Invitrogen社製）を製造業者の説明書に従って用いることで、ｃＤＮＡ合成のために用いられた。ｑＲＴ−ＰＣＲは１反応あたり総容量２０ｐＬ、各々１ｐＬのｃＤＮＡ、１０ｐＬのSYBR Green PCR master mix（Applied Biosystems社製）、１ｐＬの１０ｐＭフォワードプライマー及び１ｐＬの１０ｐＭリバースプライマーを含有して実施された。ＤＮＡは５０℃で２分間、９５℃で１０分間、その後に９５℃で２５秒間、６０℃で３１秒間及び７２℃で１分間を４０サイクルというパラメーターを用いて増幅された。ＶＥＧＦ受容体遺伝子発現はＧＡＰＤＨに対する参照プライマーを用いて正規化された。黒色腫細胞株についての未処理の定量データは、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ受容体遺伝子発現に対して較正された。
【００８９】
試験された全ての細胞株は高レベルのＶＥＧＦＲ１を発現し、種々の低レベルでＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３発現を有した（図５Ｂ）。ＮＲＰ２タンパク質の発現もまた垂直成長期の黒色腫において最も高レベルであって、早期（放射）生育期の黒色腫の３つのうち２つにおいて検出可能なタンパク質はほとんどなかった（図５Ｃ）。これらの結果は、最も注目すべきことにＶＥＧＦ受容体を包含する天然の結合相手を通じて、ＮＲＰ２がその作用を発揮することが可能であることを示唆した。
【実施例７】
【００９０】
腫瘍細胞と内皮細胞との間のパターニング相互作用は腫瘍タイプによって変わる
間隙界面共培養法を用いて、様々な腫瘍細胞のＨＵＶＥＣパターニングを促進する能力が評価された（図６）。パターニングはＨＵＶＥＣ細胞のネットワークにより形成された円形領域を自動画像解析システムを用いて定量することにより査定された（図６Ａ〜Ｃ、下）。興味深いことに、様々な腫瘍細胞株による幅広いＨＵＶＥＣパターン誘導が観察され、これには卵巣がん細胞、結腸がん細胞及び膵臓がん細胞により誘導された軽度から中等度のパターニング、並びに非小細胞肺がん、前立腺がん、乳がん、神経膠芽腫及び黒色腫の細胞により誘導された最も強いパターニングがあった（図６Ｄ、上）。腫瘍細胞のＮＲＰ２の発現とパターニングとの間に厳密な相関はなかったが（図６Ｄ）、パターニングに関連した腫瘍細胞株の上位５つのうち３つは顕著なレベルのＮＲＰ２を発現した。
【００９１】
これらの研究は、黒色腫及び神経膠芽腫の細胞を包含するいくつかのがん細胞タイプが高レベルのＮＲＰ２発現を持つことが可能であり、これが今度は内皮細胞とのコミュニケーションに影響して内皮細胞のパターニングを促進する可能性があることを示唆する。ＮＲＰ２が神経細胞及び内皮細胞の運命の界面で機能すること、並びに黒色腫細胞がこの共受容体を通じて内皮細胞とのコミュニケーションへのかかる強い応答を引き起こすことは目を引く。黒色腫の起源細胞は神経堤由来のメラニン細胞であるため、関連した脈管構造を有するこれら腫瘍細胞についての強いコミュニケーションネットワークは神経細胞と内皮細胞との間の相互作用に共通した特徴を持つ。実際に、黒色腫についての発生の早期ステージで転移する目を引く能力は、その神経堤運動に関連した発生合図の遺伝記憶に関係する可能性がある。この神経−内皮細胞の界面で機能する細胞性受容体であるニューロピリンはおそらく細胞間コミュニケーションの決定的なメディエーターとなるものであって、早い時期に決定的な発生上の役割を果たすが、腫瘍の血管新生及び転移を促進する発生合図を再現する可能性もある。それ故に、ＮＲＰ２は黒色腫細胞の増殖及び黒色腫−内皮細胞間コミュニケーションのメディエーターであり、この疾患における決定的な治療標的である。
【実施例８】
【００９２】
皮膚性黒色腫及び良性母斑におけるＮＲＰ２の発現
免疫組織化学的分析において評価された組織はDepartment of Pathology of Memorial Sloan-Kettering Cancer Centerのアーカイブに由来し、適切なプロトコールの下で回収されたホルマリン固定、パラフィン包埋された保管材料から確立された検体マイクロアレイであった。用いられた組織検体は患者の臨床データに関するアノテーションは包含されない故に、転帰測定のために選択されなかった。色素性及び非色素性、紡錘及び類上皮、同様に線維形成性の黒色腫の混合物が黒色腫組織マイクロアレイ（ＴＭＡ，melanoma tissue microarray）に包含された。これらの組織学的パラメーターはメラニン細胞分化抗原の発現と既に相関していた。良性母斑はJohns Hopkins Department of PathologyアーカイブからＩＲＢに許可されたプロトコールの下で取得された。免疫組織化学検査はEnVision System HRP（DakoCytomation社製）を用いて行われた。スライドは脱パラフィン処理され、段階的なアルコール系列を用いて再水和された。クエン酸バッファー（ｐＨ６．０、１０ｍＭ）が抗原回復のために用いられた。キャピラリーギャップ法を用いて、切片はＮＲＰ２に対するウサギポリクローナル抗体（ＳＣ−５５４２，Santa Cruz Biotechnology社製）と共に一晩インキュベートされた。１：５０の希釈が最適な染色結果を与えることが見い出された。３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ，3-amino-9-ethyl carbazole）が色素原として用いられ、切片はヘマトキシリンで対比染色された。
【００９３】
大半の評価用の症例は利用可能な同一検体からの組織切片が３つあったが、組織切片が１つ又は２つしかない症例もあった。各組織切片は分析のために２つの病理学的判読がなされた。１の症例について２以上の切片が利用可能で病理学的判読が一致しなかった場合、その症例を代表するために判読の平均が取られた。各腫瘍タイプについての各症例の最終的な結果は次いで病理医の評価により平均されて、各腫瘍タイプの平均染色パーセンテージ及び強度が決定された。各症例について全切片を平均することにより、１つの切片しか有さない別の症例より重きを置かれた複数の切片を有する症例はなく、複数の切片を有する症例は症例全体を通じてＮＲＰ２染色のより的確な代表であった。
【００９４】
分析のために用いられた組織は正常組織、様々なタイプの非メラニン細胞系腫瘍及び様々な皮膚性黒色腫であった。ＴＭＡスライドはBacus Labs Inc.社製のSlide Scanner（BLISS，Bacus laboratories社製、ロンバード、ＩＬ．）を用いてスキャンされてデジタル化された。画像は評価のためＴＭＡＪデータベースにアップロードされた。研究されていた組織の代表的試料とみなされなかった組織は分析から除かれた。スライドは定性的に試験され、組織染色が推定されて、組織の２０％未満、２０〜６０％、６０％超に存在するという３つに類別された。ＮＲＰ２染色の強度はまた０〜３にスコア化され、０はＮＲＰ２染色がなく、３は最も高い強度であった。染色の範囲及び強度は記録され、ＮＲＰ２について強く陽性であった対照試料と比較された。
【００９５】
特注オープンソース画像解析ソフトウェアパッケージであるＦＲＩＤＡ（FRamework for Image Dataset Analysis）は、組織マイクロアレイスライドのスキャンから生成された画像を包含するＲＧＢカラー画像データセットの解析及び画像解析のために用いられた。赤い染色及びヘマトキシリン単独（核は赤く染色されない）についての色相、彩度及び明度（ＨＳＢ，Hue saturation and brightness）の区分範囲は組織マイクロアレイ画像セットから定義された。「全組織」、「ＮＲＰ２染色陽性の組織」、「染色された核」及び「残りの組織」についての特異的な色画素定義を用いて、Ｊａｖａソフトウェアプログラムは選択された色画素を有する画像を分析して陽性の染色を定量した。本研究において、組織領域全体が「組織領域」と定義され、染色された核は標識された「核」と定義され、特異的なＮＲＰ２染色の色が陽性のマスクは「ＮＲＰ２領域」と定義された。予備検査研究によると核は染色されると予想されず、かつ核は腫瘍細胞において非常に大きいものであり得ることから、ＮＲＰ２についての染色が予想された残りの組織領域は「組織領域」の中にあって「核」の中にない組織として再定義され、続いて「細胞質」と標識された。核のない全組織領域を再定義することにより、ＮＲＰ２についての可能性のある全染色領域に基づくより的確な計算が確立された。染色のパーセンテージはＦＲＩＤＡプログラムにより「ＮＲＰ２領域」／「細胞質」（核のない全組織領域）として計算された。ＦＲＩＤＡコンピューター解析の結果は病理医評価と共にＲバージョン２．６統計ソフトウェアプログラムを用いて解析された。不等分散を有するWelchの２標本ｔ検定はメラニン細胞系腫瘍と非メラニン細胞系腫瘍との間のＦＲＩＤＡ  ＮＲＰ２染色の差を統計的に評価するのに用いられた。
【００９６】
正常組織の分析
【００９７】
【表３】
2013507641.tif 000006
【００９８】
正常組織についてのＮＲＰ２染色の定性的な免疫組織化学的分析は表３に見い出される。ＮＲＰ２染色は肝臓、腎臓、卵管、膵臓、胎盤組織、精巣、前立腺、横紋筋細胞、検体特異的な乳管組織、表皮、脾臓及び子宮内膜組織において著しかった（図７）。全ての正常肝臓の試料は軽度なＮＲＰ−２陽性であり、散在的な肝細胞染色を有した。正常腎臓組織試料の大部分は糸球体内皮細胞、集合管及び集合尿細管の強いＮＲＰ２染色を示した。卵管の粘膜内層細胞は全ての検体において間欠的に陽性に染まった。胎盤検体は胎盤絨毛の合胞体栄養細胞の強度の間欠性ＮＲＰ２染色を示した。これらの同一検体はまた絨毛核内部の胎児毛細管の間欠性染色を示した。乳房組織はコア試料に基づいて乳管内皮細胞の選択的なＮＲＰ２染色を示した。横紋筋細胞は全ての利用可能な検体において中等度の散在的なＮＲＰ−２染色を示した。皮膚検体は表皮層の内部のみでＮＲＰ２について強く陽性に染まり、いくつかの検体は表皮基底細胞層のごくわずかの染色を備えていた。子宮内膜組織の間質細胞及び腺細胞は核の内部でＮＲＰ２について間欠的に陽性に染まり、細胞質のごくわずかの染色を有した。精巣は精細管の上皮内でＮＲＰ２について強く陽性に染まった。前立腺検体は前立腺内皮細胞において、主に泡沫状細胞質への薄い染色色相として、ＮＲＰ２について軽度に陽性に染まった。他の全ての組織はＮＲＰ２について陰性であった。
【００９９】
腫瘍及び黒色腫の分析
【０１００】
【表４】
2013507641.tif 000007
【０１０１】
ＮＲＰ２についての免疫組織化学染色はいろいろな腫瘍について評価された（表４、図８）。乳房の腫瘍はＮＲＰ２について検体特異的に染まり、２／５の乳小葉癌細胞の症例が軽度な陽性の染色を有し、３／５の乳管癌症例がＮＲＰ２陽性の染色を有したが、全ての切片にはわたらなかった。平滑筋肉腫検体もまたＮＲＰ２について症例特異的なように染まり、１つの検体は陰性の染色を有し、他の２つは陽性の染色を有した。腎細胞癌（明細胞）症例５例のうち４例はＮＲＰ２について陽性に染まり、大半の切片は強く陽性に染まった。結腸腺癌はＮＲＰ２について症例特異的に陽性に染まり、２／４の症例がＮＲＰ２について軽度な陽性の染色を有した。陽性に染まった結腸腺癌は散在的な核内及びクリプト細胞細胞質の染色があった。膀胱の移行上皮癌のＮＲＰ２についての染色もまた症例特異的であり、２／３の症例が軽度な陽性の染色を有した。粘液性卵巣、漿液性卵巣、肺腺癌、脂肪肉腫、紡錘細胞肉腫、非小細胞肺がん（扁平細胞癌）及び悪性線維性組織球腫の全ての症例はＮＲＰ２について陰性であった。
【０１０２】
いろいろな腫瘍のＦＲＩＤＡコンピューター解析（図８Ｄ）は全ての染色腫瘍組織の平均パーセンテージが１０．４％であったことを指し示した。腎細胞癌は最も平均染色パーセントが高く、４９．９％であった。この結果は驚くべきものではないが、それは正常腎組織は腎糸球体及び尿細管においてＮＲＰ２について強く陽性に染色されるためである。残りのＮＲＰ２陽性腫瘍のコンピューター解析は平均染色パーセンテージを乳管癌５．１％、乳小葉癌２．９％、結腸腺癌３．７％、平滑筋肉腫９．９％、移行上皮癌９．７％と計算した（表４、図８Ｄ、図１０）。これらの結果は下に論ずるように、評価された大部分の黒色腫よりも顕著に低いものである。
【０１０３】
【表５】
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【０１０４】
様々な原発性悪性黒色腫及び転移性黒色腫におけるＮＲＰ２についての免疫組織化学染色は表５に示される。色素性類上皮黒色腫は最も陽性のＮＲＰ２染色を実証し、全ての症例がＮＲＰ２についての陽性染色を有しており（８／８）、大半の検体は病理医の評価によって６０％超の中等度から強度の染色を有した（表５、図９）。メラニン欠乏性類上皮黒色腫の症例は全てＮＲＰ２について陽性に染まり（６／６）、大部分の染色が病理医の評価によって６０％超で、全て中等度から強度の染色を有した。紡錘細胞結節性黒色腫の全ての症例もまたＮＲＰ２について陽性に染まり（３／３）、その大半は中等度の強度を示し、その全ては病理医の評価によって２０％超の染色があった。全ての黒色腫症例のうち、線維形成性悪性黒色腫は最も軽度の染色があった。線維形成性悪性黒色腫の全ての症例は陽性であり（５／５）、その全ては病理医の評価によって２０％未満に染まった。その他の悪性黒色腫症例は１７／１８の検体においてＮＲＰ２陽性に染まった。これらの大多数は視野の２０％超が染まり、染色強度は軽度から強度まで変化した（図９）。
【０１０５】
ＮＲＰ２について染色されたいろいろな黒色腫についてのＦＲＩＤＡ解析は、分析された全ての組織についての平均が４６．９％であって（図９Ｇ）、分析されたその他の腫瘍から著しい増加があったことを示した（図１０）。線維形成性悪性黒色腫は最も低い染色パーセンテージであり、平均８．５％であった。紡錘細胞結節性黒色腫のコンピューター解析はＮＲＰ２について平均１３．９％が陽性と指し示した。類上皮タイプの黒色腫はＮＲＰ−２について最も多くの染色があり、色素性類上皮黒色腫の発現は平均４２．６％でメラニン欠乏性類上皮黒色腫は平均ＮＲＰ２陽性パーセンテージは４０．２％だった。他の黒色腫はコンピューター解析による平均ＮＲＰ２発現が４６．４％であった。
【０１０６】
転移性黒色腫もまたＮＲＰ２について分析された。転移性の悪性黒色腫症例は分析された５例全てにおいてＮＲＰ２陽性に染まった。全ての症例は病理医の評価によって６０％超に染まり、全てが中等度から強度の染色を有した。転移性メラニン欠乏性紡錘細胞黒色腫は８／９の検体においてＮＲＰ２陽性に染まり、染色強度は軽度から強度まで変化した。転移性メラニン欠乏性類上皮悪性黒色腫の症例については、全ての症例が陽性に染まり（８／８）、全ての切片が病理医の評価によって２０％超の染色を有し、染色の大部分が６０％超であった。これらの症例の大部分はＮＲＰ２について強度に染まった。
【０１０７】
転移性黒色腫のＦＲＩＤＡ解析は非転移性黒色腫についての解析と同様であった。転移性メラニン欠乏性紡錘細胞黒色腫はコンピューター解析による平均ＮＲＰ２染色パーセントが２２．２％であった。一方、転移性メラニン欠乏性類上皮細胞黒色腫及び他の転移性悪性黒色腫は、それぞれ６３．５％及び５０．６％とより高いパーセンテージであった（図１０）。
【０１０８】
メラニン細胞系及び非メラニン細胞系のＮＲＰ２発現についての、ＦＲＩＤＡ結果と比較した不等分散を有するＷｅｌｃｈの２標本ｔ検定がＲ統計ソフトウェアパッケージを用いて行われた。メラニン細胞系腫瘍は平均ＮＲＰ２染色パーセントが４０％であったのに対し、非メラニン細胞系腫瘍の平均はたった１０％であった。平均における差は３０％であり、染色パーセントにおける差についての９５％信頼区間は（２３．６、３５．５）であった。平均における差は統計的に有意であることが見い出された（ｐ＜０．０００１）。
【０１０９】
ＮＲＰ２についての良性母斑の染色もまた限定された数の組織検体において評価された。注目すべきことに、評価された全ての良性母斑はＮＲＰ２についての染色が陰性であったが、基底上のケラチノサイトはＮＲＰ２について陽性に染まった（図１１）。興味深いことに、正常なヒトメラニン細胞もまた表皮内部でのＮＲＰ２についての染色は陰性であった。
【０１１０】
ＮＲＰ２の発現が転移状況において見られる黒色腫細胞に限定されることを確認するため、腫瘍検体はＮＲＰ２及びＭｅｌａｎ−Ａについて評価された。転移性黒色腫においてＮＲＰ２の発現はＭｅｌａｎ−Ａの発現と一致したことから、これらの細胞におけるＮＲＰ２の特異的な発現が示唆される（図１２）。
【０１１１】
１７／１８の他の悪性黒色腫が病理医の評価によって平均して６０％超のＮＲＰ２陽性の染色を有し（コンピューター解析によって４６．４％）、それらは高強度である一方で、良性母斑はＮＲＰ２発現について完全に陰性であることから、我々の研究はＮＲＰ２が黒色腫についての有用なマーカーであり、悪性メラニン細胞系腫瘍に対して良性メラニン細胞系腫瘍の鑑別を援助する可能性があることを示唆する。加えて、良性及び悪性メラニン細胞系腫瘍におけるＮＲＰ２の差次的な発現を考えると、ＮＲＰ２は黒色腫において有用な予後バイオマーカーである可能性がある。ＮＲＰ２が分泌型で発現され得ることを考えると、この分泌タンパク質の検出もまた潜在性の転移性疾患を有する患者の識別のためのサロゲート黒色腫マーカーとして有用な可能性がある。
【実施例９】
【０１１２】
タンパク質ＮＲＰ２は分泌タンパク質として発現される
ＨＵＶＥＣパターニングは腫瘍に関連した分泌性可溶性因子に依存し、かつＮＲＰ２は分泌型及び細胞表面受容体としての両方で存在することができることから（Staton CA, Kumar I, Reed MW, Brown NJ (2007) Neuropilins in physiological and pathological angiogenesis. J Pathol 212(3): 237-248）、ＨＵＶＥＣ単独、ＧＦＰ−１２０５Ｌｕ細胞単独のいずれか、又はランダム混合法を用いて共培養された細胞に由来する条件培地におけるＮＲＰ２の発現が評価された（図１３Ａ）。ＨＵＶＥＣ単独により条件付けされた培地に対してＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ及びランダム混合法共培養系の両者により条件付けされた培地におけるＮＲＰ２の濃度の顕著な上昇が観察された。これらの結果は、ＮＲＰ２が少なくとも部分的に可溶性型で黒色腫細胞により生産され得、それ故にＮＲＰ２はパラクライン黒色腫−内皮細胞間コミュニケーションの潜在的に興味深い推定上のメディエーターであることを示唆する。
【０１１３】
これらの結果はモック及びＮＲＰ２がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ、ＧＦＰ−１２０５Ｌｕ黒色腫細胞、ＨＵＶＥＣ−１２０５Ｌｕ共培養及びＨ４６０（ＮＲＰ１＋／ＮＲＰ２−）肺がん細胞から回収された条件培地からのＮＲＰ２発現のＩＰ−ウエスタン分析により確認され、さらに支持された（図１３Ｂ）。
【実施例１０】
【０１１４】
ＥＬＩＳＡによる組換え型ヒトＮＲＰ２の検出
濃度を変化させた組換え型ヒトＮＲＰ２（R&D Systems社製，２２１５−Ｎ２）は９６ウェルプレート中に播種された。ウサギポリクローナルＮＲＰ２抗体（Santa Cruz（登録商標）社製，ｓｃ−５５４２）及びマウスモノクローナルＮＲＰ２抗体（Santa Cruz（登録商標）社製，ｓｃ−１３１１７）は濃度を変化させた組換え型ヒトＮＲＰ２を検出することができた（図１４）。したがって、ＥＬＩＳＡは患者血流中のＮＲＰ２レベルを検出するのに用いられることが可能であり、黒色腫患者のスクリーニングのための鋭敏なツールを提供するものである。
【実施例１１】
【０１１５】
インビボでの黒色腫イメージング
ＳＣＩＤマウスは１２０５Ｌｕ黒色腫細胞及びＨ４６０肺がん細胞を皮下注射された。ＮＲＰ２に対する抗体（Santa Cruz社製，ｓｃ−５５４２）、ポドプラニン（リンパ脈管構造を見るため）及びＣＤ３１（血管密度を見るため）は１２５Ｉで放射性標識された。抗体は静脈内注射され、注射から４時間後（図１５Ａ）、７２時間後（図１５Ｂ）及び１２０時間後（図１５Ｃ）にイメージングされた。
【実施例１２】
【０１１６】
ＦＡＣＳを用いた黒色腫細胞の検出
実験は、ＮＲＰ２発現がＮＲＰ２抗体標識（Santa Cruz社製，ｓｃ−５５４２）及びＦＡＣｓ分析を通じて黒色腫細胞上で検出され得るかを決定するために行われた。垂直成長期黒色腫細胞株の細胞外染色及びＦＡＣＳ分析は、標識され得る細胞のサブ集団を明らかにする（図１６Ａ）。ＮＲＰ２についての細胞内染色は、９９．８％を超える黒色腫細胞がＮＲＰ２の細胞外ＭＡＭドメインを標的とするＮＲＰ２特異的抗体を用いて標識され識別され得ることを実証する（図１６Ｂ）。これらの結果は、ＮＲＰ２発現についてのＦＡＣＳ分析が細胞試料中で黒色腫細胞を検出するのに十分な感度及び特異度を提供することを指し示す。
【０１１７】
本明細書で引用される全ての論文、特許、特許出願、インターネットサイト及び受託番号／データベース配列（ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の両者を包含する）は、全ての目的について本明細書に参照によりその全体が組み入れられ、その組み入れは個々の論文、特許、特許出願、インターネットサイト又は受託番号／データベース配列がそれぞれ参照によりそのように組み入れられることが具体的に個別に指し示されたのと同程度のものである。
【０１１８】
本明細書で参照される参考文献は便宜のために下に収載される。
【０１１９】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１Ｄ】
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【図１Ｅ−１Ｈ】
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【図２Ａ】
2013507641.tif 000012
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ−２Ｆ】
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【図３Ａ−３Ｅ】
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【図３Ｆ−３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図４Ｃ−４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図６Ｄ−６Ｅ】
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【図７Ａ−７Ｃ】
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【図８Ａ−８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ−９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１１Ｆ】
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【図１２Ａ−１２Ｄ】
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【図１３Ａ−１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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