(57)【要約】  対応するアリールケトンのエナンチオ選択的酵素的還元及びその結果生じるアルコールのカルバメート化を含む、カルバミン酸（Ｒ）−1−アリール−２−テトラゾリル−エチルエステルの製造方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（２）で表されるアリールケトンをエナンチオ選択的酵素的還元に付し、一般式（３）で表される（Ｒ）−立体配置のアルコール化合物を生成せしめ、そして、該アルコールをカルバメート化することを含む、一般式（１）で表されるカルバミン酸アリール−２−テトラゾリルエチルエステルの製造方法：
【化１】
2013507911.tif 000014
［式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、ハロゲン、ペルフルオロアルキル、炭素数１〜８のアルキル、炭素数１〜８のチオアルコキシ及び炭素数１〜８のアルコキシよりなる群から選択され；そして
Ａ１及びＡ２の一方はＣＨであり、他方はＮである］
【請求項２】
上記エナンチオ選択的酵素的還元を、上記一般式（１）の化合物、アミノ酸配列の配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４と少なくとも６０％相同性を有する酸化還元酵素、還元工程中に酸化され且つ続いて再生される補因子（cofactor)としてのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨ［ここで、Ｒｘはｘが１〜１０の整数の炭素を表し、Ｒｙはｙがｘの値の２倍に２を加えたものに等しい整数の水素を表す］で表される第２級アルコールを含む補基質（cosubstrate）、及び適切な緩衝液を含む反応混合物内で行う請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸化還元酵素が、それぞれ核酸配列の配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７若しくは配列番号：８、または配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７若しくは配列番号：８にハイブリダイズ（hybridize）する核酸配列によりコード化される請求項３に記載の方法。
【請求項４】
酸化還元酵素が、カンジダ・マグノリア（Candida magnolia)、カンジダ・バクチニ（Candida vaccinii）またはアナウサギ（Oryctolagus cuniculus）から単離することができる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
酸化還元酵素が、完全に精製された状態または部分精製された状態で反応混合物に存在するか、または上記酸化還元酵素を発現した微生物細胞に存在する請求項２に記載の方法。
【請求項６】
酸化還元酵素が、それを発現した微生物細胞に存在し、上記微生物細胞は天然状態、透過可能な状態または溶解された状態で存在する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
微生物細胞が、形質転換された大腸菌（Escherichia coli）細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酸化された補因子（cofactor）の再生が上記補基質の酸化から生じる請求項２に記載の方法。
【請求項９】
上記補基質が、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−ヘプタノール及び２−オクタノールよりなる群から選択される第２級アルコールである請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
上記酸化還元酵素が、一般式（２）のアリールケトンの還元及び補基質の酸化の両方に作用する請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
カルバメート化工程が、一般式（３）の（Ｒ）−立体配置のアルコール化合物を無機シアネート及び有機酸と反応させることにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
カルバメート化工程が、一般式（３）の（Ｒ）−立体配置のアルコール化合物とクロロスルホン酸イソシアネート、トリクロロアセチルイソシアネート及びトリメチルシリルイソシアネートよりなる群から選択されるイソシアネート化合物との間の反応により生じる生成物を加水分解することにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
カルバメート化工程が、一般式（３）の（Ｒ）−立体配置のアルコール化合物と１,１−カルボジイミダゾール、カルバモイルハライド、ジスクシニルカルボネート、ホスゲン、トリホスゲンまたはクロロホルメートを含むカルボニル化合物との間の反応により生じる生成物にアンモニアを導入することにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
エナンチオ選択的酵素的還元工程及びカルバメート化工程の少なくとも一つの工程後に結晶化工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
結晶化工程が、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、１，４−ジオキサン、炭素数１〜４の低級アルコール及びこれらの混合物から選択される溶解剤を反応生成物に加え；そして、水、炭素数１〜４の低級アルコール、ジエチルエーテル、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン及びこれらの混合物よりなる群から選択される沈殿剤を加えることを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
下記一般式（４）のアリールケトンと下記一般式（５）のテトラゾールとの間の置換反応により一般式（２）のアリールケトンを製造する工程を更に含む請求項１に記載の方法：
【化２】
2013507911.tif 000015
［式中、Ｒ１及びＲ２は請求項１で定義したとおりであり；
Ｘはハライド及びスルホネートから選択される離脱基である］
【請求項１７】
アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、１，４−ジオキサン、炭素数１〜４の低級アルコール及びこれらの混合物から選択される溶解剤を置換反応により得られる生成物に加え；そして水、炭素数１〜４の低級アルコール、ジエチルエーテル、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン及びこれらの混合物から選択される沈殿剤を加えることを含む結晶化工程を更に含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
下記一般式（２）で表されるアリールケトンのエナンチオ選択的酵素的還元を介して下記一般式３で表されるアルコール化合物を製造する方法であって、
上記還元は、上記一般式（２）の化合物、アミノ酸配列の配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４と少なくとも６０％相同性を有する酸化還元酵素、還元工程中に酸化され且つ続いて再生される補因子（cofactor)としてのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨ［ここで、Ｒｘはｘが１〜１０の整数の炭素を表し、Ｒｙはｙがｘの値の２倍に２を加えたものに等しい整数の水素を表す］で表される第２級アルコールを含む補基質（cosubstrate）、及び適切な緩衝液を含む反応混合物内で行われる方法：
【化３】
2013507911.tif 000016
［式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、ハロゲン、ペルフルオロアルキル、炭素数１〜８のアルキル、炭素数１〜８のチオアルコキシ、及び炭素数１〜８のアルコキシよりなる群から選択され；
Ａ１及びＡ２の一方はＣＨであり、他方はＮである］
【請求項１９】
酸化還元酵素が、それぞれ核酸配列の配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７若しくは配列番号：８、または配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７若しくは配列番号：８にハイブリダイズする核酸配列によりコード化される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
酸化還元酵素が、カンジダ・マグノリア（Candida magnolia)、カンジダ・バクチニ（Candida vaccinii）またはアナウサギ（Oryctolagus cuniculus）から単離することができる請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルバミン酸（Ｒ）−1−アリール−２−テトラゾリル−エチルエステルの製造方法に関する。より詳しくは、本発明は、アリールケトンのエナンチオ選択的酵素的還元（enantioselective enzymatic reduction）を含むカルバミン酸（Ｒ）−1−アリール−２−テトラゾリル−エチルエステルの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１に開示されている通り、カルバミン酸（Ｒ）−1−アリール−２−テトラゾリル−エチルエステル（以下、「カルバメート化合物」と称する）は、抗痙攣（anticonvulsant）効果により、中枢神経系の障害、特に不安、鬱病、痙攣、てんかん、偏頭痛、躁鬱、薬物乱用、喫煙，注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ)、肥満、睡眠障害、神経障害性の痛み、脳卒中、認知障害、神経退化、麻痺による筋痙攣などの治療に有用である。
【０００３】
上記カルバメート化合物は、そのテトラゾール部分におけるＮの位置によって、テトラゾール−１−イル（以下、「１Ｎテトラゾール」と称する)及びテトラゾール−２−イル（以下、「２Ｎテトラゾール」と称する）の２種類の位置異性体に分けられる。カルバメート化合物を製造するためのテトラゾールの導入は、上記２種類の位置異性体が１：１の混合物で生成し、薬物学的に用いるためには、個々に単離する必要がある。
【０００４】
上記のカルバメート化合物はキラリティーを有し、医薬品として用いるために高い光学純度と化学的純度が求められる。
【０００５】
この観点から、上記特許文献１では、純粋な鏡像立体異性体である、（Ｒ）−アリール-オキシランを出発物質として用い、適切な塩基と溶媒の存在下にテトラゾールによる開環反応を介してアルコール中間体に転換した後、該アルコール中間体にカルバモイル基を導入している。また、かくして製造される１Ｎと２Ｎ位置異性体を単離及び精製するために、アルコール中間体またはカルバメートの形成後に、カラムクロマトグラフィー法が設けられる。
【０００６】
上記製造での使用のため、（Ｒ）−２−アリール−オキシランは、置換された（Ｒ）−マンデル酸誘導体などの光学活性物質から様々な経路を通して合成されるか、α−ハロアリールケトンの不斉還元−環形成反応またはラセミ体２−アリール−オキシラン混合物のその個々の鏡像異性体への分離により得られる。そのため、（Ｒ）−２−アリール−オキシランは高価の化合物である。
【０００７】
さらに、上記（Ｒ）−２−アリール−オキシランとテトラゾールとの開環反応は、テトラゾールの低い求核性のために比較的高い温度で行われる。しかし、テトラゾール類は１１０〜１２０℃で自発的に分解し始めるため、上記の開環反応は暴走反応の高い危険性を内包している。
【０００８】
反応の選択性において、（Ｒ）−２−アリール−オキシラン及びテトラゾールには、それぞれ２個の反応部位が存在するため、これらの間の開環反応によりベンジル位置または末端位置において１Ｎ−又は２Ｎ−テトラゾールの置換がなされ、合計で４種の位置異性体の混合物が生成する。したがって、個々の位置異性体は生成収率が低く単離精製が困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０２５８７１８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の一態様は、新規な（Ｒ）−1−アリール−２−テトラゾリル−エチルエステルの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記態様を達成するために、本発明は、一般式（２）で表されるアリールケトンをエナンチオ選択的酵素的還元に付し、そして、下記一般式（３）で表される（Ｒ）−立体配置のアルコール化合物をカルバメート化することを含む、一般式（１）で表されるカルバミン酸（Ｒ）−1−アリール−２−テトラゾリルエチルエステルの製造方法が提供される：
【００１２】
【化１】
2013507911.tif 000002
【００１３】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、ハロゲン、ペルフルオロアルキル、炭素数１〜８のアルキル、炭素数１〜８のチオアルコキシ及び炭素数１〜８のアルコキシよりなる群から選択され；そして
Ａ１及びＡ２の一方はＣＨであり、他方はＮである］
【発明の効果】
【００１４】
本発明の一態様によると、光学純度及び化学的純度が高いカルバメート化合物を経済的
に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の別の態様は、下記一般式（２）で表されるアリールケトンのエナンチオ選択的酵素的還元を介して、下記一般式（３）で表されるアルコール化合物を製造する新規な方法が提供する：
【００１６】
【化２】
2013507911.tif 000003
【００１７】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、ハロゲン、ペルフルオロアルキル、炭素数１〜８のアルキル、炭素数１〜８のチオアルコキシ及び炭素数１〜８のアルコキシよりなる群から選択され；そして
Ａ１及びＡ２の一方はＣＨであり、他方はＮである］
【００１８】
上記還元は、上記一般式（２）の化合物、アミノ酸配列の配列番号：１、配列番号：２，配列番号：３または配列番号：４と少なくとも６０％相同性を有する酸化還元酵素、還元工程中に酸化され且つ続いて再生される補因子（cofactor)としてのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨ［ここで、Ｒｘはｘが１〜１０の整数の炭素を表し、Ｒｙはｙがｘの値の２倍に２を加えたものに等しい整数の水素を表す）で表される第２級アルコールを含む補基質（cosubstrate）、及び適切な緩衝液を含む反応混合物内で行われる。
【００１９】
本発明の実施形態に従えば、下記一般式（２）で表されるアリールケトンのエナンチオ選択的酵素的還元及び下記一般式（３）で表されるアルコール化合物のカルバメート化を含む方法は、下記一般式（１）で表されるカルバミン酸（Ｒ）−1−アリール−２−テトラゾリル−エチルエステルの製造のために提供される。
【００２０】
【化３】
2013507911.tif 000004
【００２１】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、ハロゲン、ペルフルオロアルキル、炭素数１〜８のアルキル、炭素数１〜８のチオアルコキシ及び炭素数１〜８のアルコキシよりなる群から選択され；そして
Ａ１及びＡ２の一方はＣＨであり、他方はＮである］
【００２２】
本発明の上記製造方法において、出発物質として用いられる一般式（２）で表されるアリールケトンは、例えば、下記一般式（４）のアリールケトンと下記一般式（５）のテトラゾールとの置換反応で合成することができる。
【００２３】
【化４】
2013507911.tif 000005
【００２４】
［式中、Ｒ１及びＲ２は上記定義のとおりであり；
Ｘはハライドまたはスルホネートのような離脱基である］
【００２５】
一般式（４）及び（５）で表される化合物は商業的に入手可能な安価な化合物であるので、これらの化合物からの一般式（２）のアリールケトンの合成は経済的に有利である。さらに、上記置換反応は、（Ｒ）−２−アリール−オキシランとテトラゾールと間の開環反応と比べて、比較的温和な反応条件で行うことができる。本発明に係る方法は、したがって、潜在的に爆発性のテトラゾールを使用するが、工程安全性が確保され、不要なベンジル位置における位置異性体が生成せず、製造収率が高く、精製が容易である。
【００２６】
テトラゾールとの置換反応によって合成することができる一般式（２）で表されるアリールケトンは、下記一般式（２ａ）で表される１Ｎアリールケトン及び下記一般式（２ｂ）で表される２Ｎアリールケトンを含む位置異性体の混合物で存在することができ、それらは商業的に利用可能な結晶化により単離精製することができる。
【００２７】
【化５】
2013507911.tif 000006
【００２８】
本発明において有用な結晶化は、上記置換反応の生成物、即ち、位置異性体の混合物に溶解剤を加え、ついで沈殿剤を加えることを含むことができる。上記結晶化は、場合により、沈殿後、沈澱物をろ過し、ろ液を濃縮し、沈殿剤を更に加えることを更に含んでいてもよい。
【００２９】
上記溶解剤の非制限的な例は、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、１，４−ジオキサン及び炭素数１〜４の低級アルコール、ならびにこれらの混合溶媒を含む。上記溶解剤は、上記位置異性体の混合物の重量（ｇ）に基づいて、０〜２０ｍＬ（ｖ／ｗ）の量で使用することができる。本明細書で、溶解剤が０ｍＬ（ｖ／ｗ）の量で添加することは、上記ろ液を希釈することなく、後続の添加剤を直ちに加えることを意味する。
【００３０】
上記沈殿剤の例は、水、Ｃ１〜Ｃ４低級アルコール、ジエチルエーテル、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン及びこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。上記沈殿剤は上記位置異性体の混合物の重量（ｇ）に基づいて、０〜４０ｍＬ（ｖ／ｗ）の量でゆっくり加えることができる。本明細書で、沈殿剤が０ｍＬ（ｖ／ｗ）の量で加えることは、沈澱剤を加えることなく、放置または冷却して沈澱物を生じさせることを意味する。
【００３１】
沈殿剤の添加によって得られる結晶をろ過することにより、一般式（２ａ）の１Ｎアリールケトンが高純度の結晶として生成する。
【００３２】
他方、ろ過工程後に得られるろ液は濃縮し、沈殿剤対溶解剤の比率を高め、一般式（２ｂ）の２Ｎアリールケトンを高純度で得ることができる。ろ液の濃縮比は当業者によって適切に決定することができる。例えば、濃縮は溶媒が完全に除去されるまで行い、次に上述したような溶解剤と沈殿剤を加える。
【００３３】
上記結晶化は、カラムクロマトグラフィー方法と異なり、何ら困難なく商業的に利用することができる。
【００３４】
上記エナンチオ選択的酵素的還元は、一般式（２）のアリールケトンの下記一般式（３）で表される（Ｒ）−立体配置を有するアルコール化合物への転換を可能にする。
【００３５】
【化６】
2013507911.tif 000007
【００３６】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、ハロゲン、ペルフルオロアルキル、炭素数１〜８のアルキル、炭素数１〜８のチオアルコキシ及び炭素数１〜８のアルコキシよりなる群から選択され；そして
Ａ１及びＡ２の一方はＣＨであり、他方はＮである］
【００３７】
上記エナンチオ選択的酵素的還元は、反応混合物に懸濁されているか、または通常の方法で固定化された酸化還元酵素により行うことができる。上記酵素は、完全に精製された状態、部分的に精製された状態、またはそれらが発現された微生物細胞の状態で利用することができる。上記細胞それ自体は、天然（native）状態、透過可能な（permeabilized）状態または溶解された（lysed）状態であってもよい。細胞の状態で酵素を使用することが、コスト面で大幅な節約を示すので、当業界によって本発明の工程の実施のために好まれる。最も好ましくは、酵素がＥ．ｃｏｌｉで発現され、天然細胞の懸濁液として使用される。
【００３８】
一般式（２）のアリールケトン化合物の酵素的還元工程は、上記一般式（２）を含む化合物、酸化還元酵素、補因子としてのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、補基質及び適切な緩衝液を含む反応混合物中で行うことができ、ここで、酸化還元酵素は、アミノ酸の少なくとも６０％がアミノ酸配列の配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４の一つと同じであるアミノ酸配列を含む。
【００３９】
アミノ酸配列の配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４の一つを含むポリペプチド、またはアミノ酸配列の配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４の一つと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも９０％同じであるアミノ酸配列を含み且つ酸化還元酵素活性を保持するポリペプチドは、高い転換率及びエナンチオ選択的に一般式（２）の化合物を一般式（３）（Ｒ−立体配置）の化合物に還元するために使用することができる。エナンチオ選択的酵素的還元で生成するＲ−アルコールの鏡像体過剰率（enantiomeric excess）は、少なくとも約８９％、好ましくは少なくとも約９５％及び最も好ましくは少なくとも約９９％である。
【００４０】
エナンチオ選択的酵素的還元に有用な酸化還元酵素ポリペプチドを生産する有機体は、野生株（wild strain）または変種であってもよく、好ましくはカンジダ・マグノリア（C
andida magnolia）、カンジダ・バクチニ（Candida vaccinii)、及びアナウサギ（Oryctolagus cuniculus)から選択される。カンジダ属（genus）の酵母が、本方法で利用される酸化還元酵素を生産するために好ましい。ポリペプチドの誘導体は、上述した配列番号等と少なくとも６０パーセントの相同性を有し且つ酸化還元酵素活性を保持するものである。当業者は配列相同性を正確に判定するために利用可能なシステム及び技術が存在していることを知っている。
【００４１】
配列番号：１を含むポリペプチドは、例えば、ブダペスト条約の条件下にDeutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, 38124に受託番号ＤＳＭＺ  ２２１６７として寄託された有機体アナウサギ、特にラビットＤＳＭＺ  ２２１６７として得ることができるＤＮＡ配列の配列番号：５、またはそこにハイブリダイズ（hybridize）する核酸配列によりコード化することができる。配列番号：２を含むポリペプチドは、例えば、有機体カンジダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）ＤＳＭＺ  ２２０５２から得ることができるＤＮＡ配列の配列番号：６、またはそこにハイブリダイズする核酸配列によりコード化することができる。
【００４２】
配列番号：３を含むポリペプチドは、例えば、有機体カンジダ・バクチニ（Candida vaccinii）ＣＢＳ７３１８から得ることができるＤＮＡ配列の配列番号：７、またはそこにハイブリダイズする核酸配列によりコード化することができる。配列番号：４を含むポリペプチドは、例えば、有機体カンジダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）ＣＢＳ６３９６から得ることができるＤＮＡ配列の配列番号：８、またはそこにハイブリダイズする核酸配列によりコード化することができる。
【００４３】
上述したポリペプチド配列の一つを有する酸化還元酵素は、当業者に知らされた通常のプロセスによって利用可能な量で得られる。アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、適切なベクターにクローニングし、その後、上記配列をコードする遺伝子を発現できる宿主有機体に導入される。このようなペプチドを発現できるように形質転換できる微生物は、当業界によく知られている。好ましい微生物は大腸菌である。上述したように、形質転換されたＥ.ｃｏｌｉによって発現される酸化還元酵素は、本方法で利用するために、Ｅ.ｃｏｌｉ細胞から抽出し、部分的にまたは完全に精製するか、天然、透過可能なまたは溶解された状態の細胞自体で利用することができる。エナンチオ選択的酵素的還元の好ましい具体例は、天然状態の細胞懸濁液を利用することである。これらの形態のどれでも、遊離または固定された状態で利用することができる。
【００４４】
還元反応は、その中に懸濁された酵素を含有する細胞を有する単相システムで行うことができる。また、上記反応は、米国特許出願公開２００９／００１７５１０号明細書及び米国特許７，３７１，９０３に説明された通りに、２相の水性／有機溶媒システムで行うことができる。上記反応は通常のバッチ反応、または連続工程（continous process）として行うことができる。商業的適用のためのエナンチオ選択的酵素的還元の顕著な長所の一つは連続操作が可能であることである。
【００４５】
反応混合物は、好ましくは添加された反応物１ｋｇ当りの約３５ｇ〜３５０ｇの細胞を含む。懸濁液は、反応混合物の水性部分であり、また、緩衝液、例えば、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、ホスフェート、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌまたはグリシン緩衝液を含む。緩衝液は、更に、酵素の安定化のために、イオン、例えば、マグネシウムイオンの供給源を含んでいてもよい。酵素を安定化するために、緩衝液に存在しうる追加の添加剤は、グリセロール、ソルビトールなどのポリオール、１,４−ＤＬ−ジチオトレイトール、グルタチオン、システインなどの硫黄化合物、アミノ酸及びペプチド、またはＤＭＳＯのような洗剤を含むことができる。酵素のための好ましい安定剤は、ポリオール、特にグリセロールであり、これは細胞懸濁液重量に対して約１０重量％〜８０重量％、好ましくは約５０重
量％で存在することができる。
【００４６】
エナンチオ選択的酵素的還元工程は、反応混合物が、補因子または補酵素の再生性のために補基質を用いて、アリールケトン基質の還元のための水素を提供する共役基質原理（coupled substrate principle）を用いて、有利に行うことができる。補因子は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）が好ましく、これらはそれぞれ還元状態、即ち、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨで利用される。補因子は、反応混合物で約０．０１ｍＭ〜５ｍＭ、好ましくは０．０５ｍＭ〜０.５ｍＭの濃度で存在する。反応において、補基質は酸化されることによって、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ補因子を再生する機能を果たす。補基質は、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨで表される第２級アルコールであり、ここでＲｘはｘが１〜１０の整数の炭素を表し、Ｒｙはｙがｘの値の２倍に２を加えたものに等しい整数の水素を表す。適切な補基質の例は、２−プロパノール、２−ブタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−ペンタノール、２−ヘプタノール、２−オクタノールなどを含む。好ましい補基質の例は、２−ブタノールである。補基質は、反応混合物で約１０体積％〜８０体積％、好ましくは約４０体積％〜６０体積％、最も好ましくは約５０体積％で存在する。
【００４７】
アリールケトンの還元中に生成される酸化された補因子は、酸化還元酵素により触媒となりうる、補基質の酸化により再生される。したがって、本発明の特別な経済的利点は、酸化還元酵素が一般式（１）のアリールケトンの還元及び補基質の酸化に影響を与えるので、補因子再生に追加の酵素を必要としないことである。また、アリールケトンの還元速度を増進させるために、さらに別の酵素を反応混合物に加えて、補因子を再生することも本発明の範囲内にある。
【００４８】
さらに別の実施形態において、補因子の再生に関与しない有機溶媒を反応混合物及び水性有機２相システム（aqueous organic 2-phase system）で行われる還元工程に添加することができる。このような溶媒の非制限的な例は、ジエチルエーテル、第３級ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸エチル、ブチルアセテート、ヘプタン、ヘキサンまたはシクロヘキサンを含む。このような溶媒は、反応混合物の体積に基づいて、約１体積％〜５０体積％で存在することができる。
【００４９】
反応混合物でアリールケトン基質の量は、好ましくは約０．１重量％を超えて、約５０重量％まで増加することができ、好ましい濃度は約５〜３０重量％である。基質の量は、本発明の製造方法が精製された状態の基質または不純物の様々な含量及び形態を含む原料生成物（raw product）で行うことができるため、基質の純度に依存する。全ての成分を添加した後、反応混合物のｐＨは５〜１０の範囲であり、好ましくは７〜９であり、最適のｐＨは約８である。本発明に係る酵素的還元は、約１０〜４５℃、好ましくは約２０〜４０℃、最も好ましくは約２５〜３５℃の温度で行われる。
【００５０】
エナンチオ選択的還元方法は、一般式（３）のアルコールを高収率及び高いエナンチオ選択的に提供に加えて、費用節減を可能にして親環境的である。従って、高い光学純度の（Ｒ）−立体配置を有するアルコール化合物は、約１２〜９６時間、好ましくは約２４〜４８時間内に、上述した反応条件下に酵素の存在下で得ることができる。培養中、混合物のｐＨは、これを周期的に測定し、それぞれナトリウムカーボネート及びナトリウムヒドロオキシドのような通常の酸性または塩基性試薬を添加して上記範囲に維持する。エナンチオ選択的酵素的還元の効率は、総回転数（total turnover number）（ＴＴＮ）で示すことができ、これは最初に加えられた補因子１モル当たり生成された一般式（２）のキラルアルコールのモル数である。エナンチオ選択的酵素的還元のＴＴＮは、約１０２〜１０５、好ましくは１０３以上である。
【００５１】
上記エナンチオ選択的酵素的還元により得られるアルコール化合物は、一般式（３ａ）のアルコール１Ｎ及び一般式（３ｂ）のアルコール２Ｎの位置異性体の混合物として存在することができ、それは結晶化により高純度を有する個々の位置異性体に単離精製することができる：
【００５２】
【化７】
2013507911.tif 000008
【００５３】
上記結晶化は、上記還元から生成される位置異性体の混合物に溶解剤を加え、沈殿剤を加え、そして、場合により、沈澱物をろ過し、ろ液を濃縮し、追加の沈殿剤を更に含むことができる。
【００５４】
上記結晶化に有用な溶解剤の例は、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、１，４−ジオキサン、炭素数１〜４の低級アルコール、及びこれらの混合物を含むが、それらに制限されない。上記溶解剤は上記位置異性体混合物の重量（ｇ）に基づいて、０〜２０ｍＬ（ｖ／ｗ）の量で加えることができる。
【００５５】
上記沈殿剤の非制限的な例は、水、炭素数１〜４の低級アルコール、ジエチルエーテル、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン及びこれらの混合物を含む。上記沈殿剤は上記位置異性体混合物の重量（ｇ）に基づいて、０〜４０ｍＬ（ｖ／ｗ）の量でゆっくり加えることができる。
【００５６】
沈殿剤の添加後、ろ過により１Ｎアルコール（３ａ）を高純度の沈澱物として得ることができる。
【００５７】
また、ろ液を濃縮し、溶解剤対沈殿剤の比率を高めることによって、２Ｎアルコール（３ｂ）が非常に高い純度の結晶形態で得ることができる。
【００５８】
これら結晶化工程は、一般式（２）のアリールケトンの位置異性体が既に単離精製されている場合には、省略することができる。
【００５９】
一般式（３）の（Ｒ）−立体配置を有するアルコール化合物へのカルバモイル基の導入により、一般式（１）で表される（Ｒ）−立体配置を有するカルバメートが得られる：
【００６０】
【化８】
2013507911.tif 000009
【００６１】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、ハロゲン、ペルフルオロアルキル、炭素数１〜８のアルキル、炭素数１〜８のチオアルコキシ及び炭素数１〜８のアルコキシよりなる群から選択され；そして
Ａ１及びＡ２の一方はＣＨであり、他方はＮである］
【００６２】
上記カルバメート化工程において、例えば、無機シアネート−有機酸、イソシアネート−水またはカルボニル化合物−アンモニアを、カルバモイル基を導入するために使用することができる。
【００６３】
上記無機シアネート−有機酸を用いるカルバメート化のために、一般式（３）の（Ｒ）−立体配置を有するアルコール化合物を有機溶媒、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルムまたはこれらの混合物中に溶解し、１〜４当量のナトリウムシアネートのような無機シアネートと有機酸、例えば、メタンスルホン酸または酢酸と混合した後、約−１０℃〜約７０℃で反応させる。
【００６４】
イソシアネート−水を使用する場合については、一般式（３）の（Ｒ）−立体配置を有するアルコールの有機溶媒、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルムまたはこれらの混合溶媒の溶液に、１〜４当量のイソシアネート、例えば、クロロスルホン酸イソシアネート、トリクロロアセチルイソシアネート、トリメチルシリルイソシアネートを加え、約−５０℃〜４０℃で反応させる。次に、精製することなく、加水分解を誘導するために１〜２０当量の水を加える。
【００６５】
上記カルボニル化合物−アンモニアの使用については、一般式（３）の（Ｒ）−立体配置を有するアルコール化合物の有機溶媒、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルムまたはこれらの混合溶媒中の溶液に、１〜４当量のカルボニル化合物、例えば、１，１’−カルボニルジイミダゾール、カルバモイルクロリド、ジスクシニルカルボネート、ホスゲン、トリホスゲンまたはクロロホルメートを加え、約−１０℃〜７０℃で反応させた後、精製することなく、１〜１０当量のアンモニアを加える。
【００６６】
上記カルバメート化後、かくして得られる一般式（１）のカルバメート化合物は、以下に記述する結晶化により更に高い光学的と化学的純度に精製することができる。結晶化は、カルバメート化の生成物に溶解剤を加え、次いで沈殿剤を加え、そして場合により、沈澱をろ過し、追加の沈殿剤を添加することを含む。製薬学的用途のために、カルバメート化生成物を最終的に精製するが、本方法のより早い段階で結晶化行ってもよい。
【００６７】
上記溶解剤の非制限的な例は、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、１，４−ジオキサン及び炭素数１〜４の低級アルコール及びこれらの混合物を含む。上記溶解剤は上記反応生成物の重量（ｇ）に基づいて、０〜２０ｍＬ（ｖ／ｗ）の量で加えることができる。
【００６８】
上記沈殿剤の非制限的な例は、水、炭素数１〜４の低級アルコール、ジエチルエーテル、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン及びこれらの混合物を含む。上記沈殿剤は上記反応生成物の重量（ｇ）に基づいて、０〜４０ｍＬ（ｖ／ｗ）の量でゆっくり加えることができる。
【００６９】
エナンチオ選択的酵素的還元を含む、本発明の方法により、光学的純度の高いカルバメート化合物を提供することができる。また、本発明の方法は、温和な反応条件で行われるので、工程安定性を確保することができる。さらに、エナンチオ選択的酵素的還元の前後またはカルバメート化の後に、大規模生産に適用可能な結晶化工程を遂行することによって、化学的純度が更に高いカルバメート化合物が生じる。本発明によって製造された上記カルバメート化合物は、痙攣のような中枢神経系（ＣＮＳ）障害の治療に極めて有用である。
【００７０】
以下に記載する実施例により本発明をよりよく理解することができるが、これらは本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００７１】
製造例１：１−（２−クロロフェニル）−２−（１，２，３，４−テトラゾール−１−イル）エタン−１−オンの製造
アセトニトリル（２０００ｍＬ）中の２−ブロモ−２'−クロロアセトフェノン（２２８．３ｇ、０．９７８ｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１６１．６ｇ、１．１７０ｍｏｌ）の懸濁液に、３５ｗ／ｗ％１H-テトラゾールジメチルホルムアミド溶液（２１５．１ｇ、１．０８０ｍｏｌ）を室温で加えた。反応物を４５℃で２時間撹拌し、減圧蒸留して約１５００ｍＬの溶媒を除去した。濃縮液を酢酸エチル（２０００ｍＬ）で希釈し、１０％食塩水（３回×２０００ｍＬ）で洗浄した。分離された有機層を減圧蒸留し、２１６．４ｇの油状の固体残渣を得た。固体残渣の酢酸エチル（４３２ｍＬ）に、ヘプタン（６００ｍＬ）をゆっくり加えた。生成した結晶を室温でろ過し洗浄して、９０．１ｇ（０．４０５ｍｏｌ）の１−（２−クロロフェニル）−２−（１，２，３，４−テトラゾール−１−イル）エタン−１−オン（以下、‘１Ｎケトン’と称する）を得た。
1H-NMR（CDCl3)d8.87（s,1H),d7.77（d,1H),d7.39-7.62（m,3H),d5.98（s,2H)
【００７２】
製造例２：１−（２−クロロフェニル）−２−（１，２，３，４−テトラゾール−２−イル)エタン−１−オンの製造
上記製造例１のろ過後、ろ液を濃縮し、イソプロパノール（１００ｍＬ）に溶かし、それにヘプタン（４００ｍＬ）をゆっくり加えて結晶化を完結させた。ろ過し５℃で洗浄して、９４．７ｇ（０．４２５ｍｏｌ）の１−（２−クロロフェニル）−２−（１，２，３，４−テトラゾール−２−イル)エタン−１−オン（以下、「２Ｎケトン」と称する）を得た。
1H-NMR（CDCl3)d8.62（s,1H),d7.72（d,1H),d7.35-7.55（m,3H),d6.17（s,2H)
【００７３】
製造例３：種々の酸化還元酵素に介したエナンチオ選択的酵素的還元による（Ｒ）−立体配置のアルコール化合物の製造
下記４つの溶液を以下のようにして製造した。
【００７４】
酵素溶液１
大腸菌ＳｔａｒＢＬ２１（Ｄｅ３）コンピテント（competent）細胞（nvitrogen）を、酸化還元酵素配列番号１をコードする発現構成体（expression construct）ｐＥＴ２１−ＭＩＸで形質転換した。上記生じた発現構成体で形質転換された大腸菌群を、５５０ｎｍで測定時、光学密度が０．５になるまで、それぞれ５０μg／ｍＬのアンピシリンまたは４０μｇ／ｍＬのカナマイシンが添加された２００ｍＬのＬＢ培地（１％トリップトン、０．５％酵母及び１％塩化ナトリウム）で培養した。所望の組換えタンパク質の発現は、イソプロピルチオガラクトサイド（ＩＰＴＧ)を０．１ｍＭ濃度で加えることにより誘導した。２５℃及び１６時間、２２０ｒｐｍで誘導後、細胞を採取し、−２０℃に凍結した。酵素溶液の調製において、３０ｇの細胞を１５０ｍＬのトリエタノールアミン緩衝液（ＴＥＡ  １００ｎＭ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、ｐＨ８)で再懸濁し、高圧ホモジナイザー（homogenizer)で均質化した。結果酵素溶液を１５０ｍＬグリセロールと混合し、−２０℃で保管した。
【００７５】
酵素溶液２
ＲＢ７９１細胞（E.coli genetic stock, Yale, USA）を、酸化還元酵素配列番号２をコードする発現構成体ｐＥＴ−ＭＩＸで形質転換した。上記生成した発現構成体で形質転換された大腸菌群を、５５０ｎｍで測定時、光学密度が０．５になるまで、それぞれ５０μｇ／ｍＬのアンピシリンまたは４０μｇ／ｍＬのカナマイシンが添加された２００ｍＬのＬＢ培地（１％トリップトン、０．５％酵母及び１％塩化ナトリウム)で培養した。所望の組換えタンパク質の発現は、イソプロピルチオガラクトサイド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭ濃度で加えることにより誘導した。２５℃及び１６時間、２２０ｒｐｍで誘導後、細胞を採取し、−２０℃に凍結した。酵素溶液の調製において、３０ｇの細胞を１５０ｍＬのトリエタノールアミン緩衝液（ＴＥＡ  １００ｎＭ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、ｐＨ８)で再懸濁し、高圧ホモジナイザー（homogenizer)で均質化した。結果酵素溶液を１５０ｍＬグリセロールと混合し、−２０℃で保管した。
【００７６】
酵素溶液３
酵素溶液３は、酸化還元酵素配列番号１をコードするｐＥＴ２１−ＭＩＸ発現構成体の代わりに酸化還元酵素配列番号３をコードするｐＥＴ２１−ＭＩＸ発現構成体を使用した以外は、酵素溶液１と同様の方法で製造された。
【００７７】
酵素溶液４
酵素溶液４は、酸化還元酵素配列番号２をコードするｐＥＴ２１−ＭＩＸ発現構成体の代わりに酸化還元酵素配列番号４をコードするｐＥＴ２１−ＭＩＸ発現構成体を使用した以外は、酵素溶液２と同様の方法で製造された。
【００７８】
それぞれの酵素溶液１〜４に含まれる異なる酸化還元酵素を、１−（２−クロロフェニル）−２−（１，２，３，４−テトラゾール−１−イル）エタン−１−オン（１Ｎケトン）及び１−（２−クロロフェニル）−２−（１，２，３，４−テトラゾール−２−イル)エタン−１−オン（２Ｎケトン）をそれぞれ、相応する１−（２−クロロフェニル）−２−（１，２，３，４−テトラゾール−１−イル）エタン−１−オル（以下、「１Ｎアルコール」と称する）及び１−（２−クロロフェニル）−２−（１，２，３，４−テトラゾール−２−イル)エタン−１−オル（以下、「２Ｎアルコール」と称する）に転換するため
に下記のとおり試験した。
【００７９】
反応バッチＡ
１６０μＬ  緩衝液（ＴＥＡ  １００ｎＭ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、ｐＨ８）
１００μＬ  ＮＡＤＰＨ（４０ｍｇ／ｍＬ）
４０μＬ  ２−プロパノール
５０μＬ  酵素溶液１
２ｍｇ  １Ｎケトンまたは２Ｎケトン
【００８０】
反応バッチＢ
１６０μＬ  緩衝液（ＴＥＡ  １００ｎＭ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、ｐＨ８）
１００μＬ  ＮＡＤＰＨ（４０ｍｇ／ｍＬ）
４０μＬ  ２−プロパノール
５０μＬ  酵素溶液２
２ｍｇ  １Ｎケトンまたは２Ｎケトン
【００８１】
反応バッチＣ
３５０μＬ  緩衝液（ＴＥＡ  １００ｎＭ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、ｐＨ８）
０．０５ｍｇ  ＮＡＤＰ
５０μＬ  酵素溶液３
１０ｍｇ  １Ｎケトンまたは２Ｎケトン
２５０μＬ  ４−メチル−２−ペンタノール
５０μＬ  補因子の再生のための酵素（サーモアネロビウム・ブロッキイ由来の酸化還元酵素）溶液
【００８２】
反応バッチＤ
３５０μＬ  緩衝液（ＴＥＡ  １００ｎＭ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、ｐＨ８）
０．０５ｍｇ  ＮＡＤＰ
５０μＬ  酵素溶液４
１０ｍｇ  １Ｎケトンまたは２Ｎケトン
２５０μＬ  ４−メチル−２−ペンタノール
５０μＬ  補因子の再生のための酵素（サーモアネロビウム・ブロッキイ由来の酸化還元酵素）溶液
【００８３】
各反応バッチＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを２４時間培養した後、遠心分離して、鏡像体過剰率（enantiomeric excess）及び転換率（conversion）を判定するために、ＨＰＬＣ分析容器に移した各反応バッチに、１ｍＬのアセトニトリルを加えた。表１に記載された生成物の転換率及びｅｅ−値は下記式を利用して求めた。
転換率（％）＝［（生成物の面積）／（反応物の面積＋生成物の面積）］×１００
ｅｅ−値（％）＝［（Ｒ−立体配置の面積−Ｓ−立体配置の面積）／（Ｒ−立体配置の面積＋Ｓ−立体配置の面積）］×１００
【００８４】
【表１】
2013507911.tif 000010
【００８５】
製造例４：酸化還元酵素配列番号：２を介した酵素的還元
１Ｎ／２ＮケトンをＲ−１Ｎ／Ｒ−２Ｎアルコールに転換するために、酸化還元酵素配列番号：２を含む３０μＬの酵素溶液２を、３００μＬの緩衝液（１００ｍＭ  ＴＥＡ、ｐＨ８、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール）、１００ｍｇの１Ｎケトン及び２Ｎケトンの混合物（１Ｎ：２Ｎ＝１４％：８６％）、０．０４ｍｇのＮＡＤＰ及び３００μＬの２−ブタノールの混合物に加えた。反応混合物を持続的に十分に混合しながら室温で培養した。４８時間後、９８％以上のケトンが下記の組成（Ｒ−２Ｎアルコール８０％；Ｓ−２Ｎアルコール０％；Ｒ−１Ｎアルコール２０％、Ｓ−１Ｎアルコール０％；１Ｎケトン０％；２Ｎケトン０％）のアルコール混合物に還元された。
【００８６】
一般的な処理（workup）及び酢酸エチル／ヘキサンでの再結晶化の後、光学的に純粋なアルコールを下記のとおり得た：
（Ｒ）−1−（２−クロロフェニル）−２−（１，２，３，４−テトラゾール−１−イル）エタン−１−オル（１Ｎアルコール)
1H-NMR（CDCl3)d8.74（s,1H),d7.21-7.63（m,4H),d5.57（m,1H),d4.90（d,1H),d4.50（d,1H),d3.18（d,1H)；
（Ｒ）−1−（２-クロロフェニル）−２−（１，２，３，４−テトラゾール−２−イル)エタン−１−オル（２Ｎアルコール)
1H-NMR（CDCl3)d8.55（s,1H),d7.28-7.66（m,4H),d5.73（m,1H),d4.98（d,1H),d4.83（d,1H),d3.38（br,1H).
【００８７】
カルバメートの製造
【００８８】
製造例５：カルバミン酸（Ｒ）−1−（２−クロロフェニル）−２−（テトラゾール−２−イル)エチルエステルの製造
酸化還元酵素配列番号：２を含む５０ｍＬの酵素溶液２を２５０ｍＬの緩衝液（１００ｍＭ  ＴＥＡ、ｐＨ８、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール）、５０ｇ（２２５ｍｍｏｌ）の１−（２−クロロフェニル）−２−（１，２，３，４−テトラゾール−２−イル)エタン−１−オン（２Ｎケトン）、４ｍｇのＮＡＤ、３００ｍＬの２−プロパノール及び１５０ｍＬのブチルアセテートの混合物に加えた。上記反応混合物を室温で撹拌した。４８時間後、９８％以上の２Ｎケトンは９９％ｅｅ値の相応する（Ｒ）−1−（２-クロロフェニル）−２−（１，２，３，４−テトラゾール−２−イル)エタン−１−オル（Ｒ−２Ｎアルコール）に還元された。上記生じた混合物に、５００ｍＬの酢酸エチルを加えた。分離後、形成された有機層を１０％食塩水（３回×５００ｍＬ)で）洗浄した。かくして形成された有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧蒸留して、５０
．４ｇ（２２４ｍｍｏｌ）の１−（２−クロロフェニル）−２−（１，２，３，４−テトラゾール−２−イル）エタン−１−オル（Ｒ−２Ｎアルコール、光学純度９９．９％）の油状残渣を得た。−１５℃に冷却後、３８g（２６７ｍｍｏｌ）のクロロスルホニルイソシアネートをゆっくり加え、−１０℃で２時間撹拌した。水をゆっくり加えた反応の終了を誘導した。上記最終溶液を約３００ｍＬの溶媒が除去されるまで減圧濃縮した。濃縮液を６００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、１０％塩水（３×５００ｍＬ）で洗浄した。有機層を減圧濃縮し、濃縮液をイソプロパノール（９０ｍＬ）に溶解した後、ヘプタン（１８０ｍＬ）をゆっくり加えて、結晶化を完了した。得られた沈澱をろ過し、洗浄して、５１．８ｇ（１９４ｍｍｏｌ）のカルバミン酸（Ｒ）−1−（２−クロロフェニル）−２-（テトラゾール−２−イル)エチルエステル（光学純度９９．９％）を得た。
1H-NMR(Acetone-d6) d8.74(s, 1H), d7.38-7.54(m, 4H), d6.59(m, 1H), d6.16(Br, 2H), d4.90(d, 1H), d5.09(m, 2H)
【００８９】
上述したとおり、本発明に従い、光学的及び化学的純度の高いカルバメート化合物を経済的に製造することができる。
【００９０】
本発明の好ましい形態を例示の目的のために開示したが、当業者は、添付の特許請求の範囲に開示された発明の範囲及び精神から逸脱することなく、種々の修正、追加及び代替が可能であることを認識するであろう。
【００９１】
配列目録フリーテキスト（Sequence Listing Free Text)
【００９２】
【表２】
2013507911.tif 000011
【００９３】
【表３】
2013507911.tif 000012
【００９４】
【表４】
2013507911.tif 000013
【配列表】
2013507911000001.app
【国際調査報告】
2013507911.tif 000017
2013507911.tif 000018