(57)【要約】ＩＧＦ−１及びＥｒｂＢ細胞内シグナル経路の両方を特異的に標的とする二重特異的結合剤を開示する。例えば、リンカーにより接続されている抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体及び抗ＥｒｂＢ３抗体を含む二重特異的結合剤を、本明細書に記述する。これらの二重特異的剤は、ＩＧＦ−１及びＥｒｂＢシグナル経路の両方によるシグナル伝達をアンタゴナイズすることが可能であり、その増殖が両経路のシグナル伝達活性を要する腫瘍細胞の増殖を、阻害するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＦ−１Ｒ標的部分、リンカー部分、及びＥｒｂＢ３標的部分を含む二重特異的結合剤タンパク質であって、該ＩＧＦ−１Ｒ標的部分が、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合し、該ＥｒｂＢ３標的部分が、ＥｒｂＢ３と特異的に結合し、該標的部分が各々、該リンカー部分に連結されている、前記二重特異的結合剤タンパク質。
【請求項２】
標的部分の各々が、リンカー部分にペプチド結合により共有結合で連結されて、単一のポリペプチドを形成しており、該リンカー部分が、２〜５、６〜１０、１１〜２５、２６〜５０、５１〜１００、１０１〜２５０、２５１〜５００、又は５０１〜１０００個のアミノ酸の長さである、請求項１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項３】
リンカー部分が、化学的に及び生物学的に不活性である、請求項１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項４】
リンカー部分が、１つ又は複数のタンパク質ドメインで構成されている、請求項１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項５】
リンカー部分が、Ｆｃγ受容体、新生児型Ｆｃ受容体、腫瘍壊死因子ファミリー受容体を含む１つ又は複数の受容体、ヒト免疫グロブリン、又はヒト血清アルブミンと結合する、請求項１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項６】
リンカー部分が、ヒト血清アルブミンである、請求項４に記載の二重特異的結合剤。
【請求項７】
リンカー部分が、免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片である、請求項４に記載の二重特異的結合剤。
【請求項８】
リンカー部分が、腫瘍壊死因子相同ドメイン、又は腫瘍壊死因子相同ドメインの断片である、請求項４に記載の二重特異的結合剤。
【請求項９】
リンカー部分が、単量体を形成する、請求項１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項１０】
リンカー部分が、ホモ二量体又はヘテロ二量体を形成する、請求項１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項１１】
リンカー部分が、ホモ三量体又はヘテロ三量体を形成する、請求項１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項１２】
リンカー部分が、グリコシル化又は無グリコシル化されている、請求項１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項１３】
リンカー部分が、突然変異型のヒト血清アルブミンである、請求項６に記載の二重特異的結合剤。
【請求項１４】
リンカーが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプのヒト免疫グロブリンのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含有している、請求項７に記載の二重特異的結合剤。
【請求項１５】
リンカー部分が、ヒトＴＲＡＩＬ、ヒトＬＩＧＨＴ、ヒトＣＤ４０Ｌ、ヒトＴＮＦα、ヒトＣＤ９５、ヒトＢＡＦＦ、ヒトＴＷＥＡＫ、ヒトＯＸ４０、又はヒトＴＮＦβの断片であり、該断片が、構成的に又は誘導可能に二量体化又は三量体化することが可能である、請求項８に記載の二重特異的結合剤。
【請求項１６】
ＥｒｂＢ３標的部分が、リンカー部分のアミノ末端に連結されており、ＩＧＦ−１Ｒ標的部分が、該リンカー部分のカルボキシ末端に連結されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異的結合剤。
【請求項１７】
ＩＧＦ−１Ｒ標的部分が、リンカー部分のアミノ末端に連結されており、ＥｒｂＢ３標的部分が、該リンカー部分のカルボキシ末端に連結されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異的結合剤。
【請求項１８】
ＩＧＦ−１Ｒ標的部分が、１つ又は複数の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異的結合剤。
【請求項１９】
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、単鎖抗体である、請求項１８に記載の二重特異的結合剤。
【請求項２０】
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、単一ドメイン抗体である、請求項１８に記載の二重特異的結合剤。
【請求項２１】
ＥｒｂＢ３標的部分が、１つ又は複数の抗ＥｒｂＢ３抗体を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異的結合剤。
【請求項２２】
抗ＥｒｂＢ３抗体が、単鎖抗体である、請求項２１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項２３】
抗ＥｒｂＢ３抗体が、単一ドメイン抗体である、請求項２１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項２４】
リンカー部分が、増強された溶解性を有するように糖鎖操作されている、請求項１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項２５】
リンカー部分が、増強された安定性を有するように操作されている、請求項１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項２６】
リンカー部分が、血清中半減期の延長を提供するように操作されている、請求項１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項２７】
リンカー部分が、低減された不均質性を有するように操作されている、請求項１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項２８】
ＩＧＦ−１Ｒ標的部分及びＥｒｂＢ３標的部分のいずれか又は両方が、増強された安定性を有するように操作されている、請求項１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項２９】
ＩＧＦ−１Ｒ標的部分及びＥｒｂＢ３標的部分のいずれか又は両方が、低減された不均質性を有するように操作されている、請求項１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項３０】
ＩＧＦ−１Ｒ標的部分及びＥｒｂＢ３標的部分のいずれか又は両方が、発現の増強のために操作されている、請求項１に記載の二重特異的結合剤。
【請求項３１】
ＩＧＦ−１Ｒ標的部分が、２つの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を含み、ＥｒｂＢ３標的部分が、１つの抗ＥｒｂＢ３抗体を含む、請求項１８に記載の二重特異的結合剤。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の二重特異的結合剤をコードする核酸分子。
【請求項３３】
発現ベクターのプロモーターに機能的に連結された請求項３２に記載の核酸分子を含み、二重特異的結合剤を発現することが可能な宿主細胞。
【請求項３４】
二重特異的結合剤が発現される条件下で、請求項３３に記載の宿主細胞を培養することを含む、二重特異的結合剤を作製する方法。
【請求項３５】
腫瘍細胞を、該腫瘍細胞の増殖が阻害されるように、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の二重特異的結合剤と接触させることを含む、ＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項３６】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の二重特異的結合剤を、腫瘍細胞増殖を低減するのに有効な量で患者に投与することを含む、腫瘍を治療する方法であって、
該腫瘍が、該患者に存在しており、かつＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３を両方とも発現する腫瘍細胞を含む、
前記方法。
【請求項３７】
腫瘍が、肺癌、肉腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、膵臓癌、卵巣癌、又は乳癌の腫瘍である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
肺癌腫瘍が、非小細胞肺癌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
肉腫が、ユーイング肉腫である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
乳癌が、タモキシフェン抵抗性エストロゲン受容体陽性乳癌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
肺癌が、ゲフィチニブ抵抗性肺癌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
乳癌が、トラスツズマブ抵抗性転移性乳癌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
第２の抗がん剤を患者に投与すること、又は第２の抗がん治療理学療法を患者に施すことを更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
化学療法剤である第２の抗がん剤を投与することを更に含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
電離放射線である第２の抗がん治療理学療法を施すことを更に含む、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
腫瘍細胞は、細胞の増殖を刺激する増殖因子及びサイトカインの受容体を発現し、更にそのような受容体に対する抗体は、増殖因子及びサイトカインにより媒介される細胞増殖の刺激を阻止して腫瘍細胞増殖を阻害するのに有効であり得ることが確立されている。がん細胞上の受容体を標的とする市販の治療用抗体には、例えば、ＨＥＲ２受容体（ＥｒｂＢ２としても知られている）を標的とする、乳癌治療用のトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、並びに上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１又はＥｒｂＢ１としても知られている）を標的とする、結腸直腸癌及び頭頸部癌治療用のセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））が含まれる。
【０００２】
単一の治療用モノクローナル抗体のみを含む治療剤を投与するこの手法（別の治療用抗体を投与しない状態で投与された場合、本明細書では単独療法と呼ぶ）は、がん治療にそれなりの成功を示しているが、そのような治療の失敗又は初期阻害後の腫瘍増殖の再発に結び付く場合がある多数の要因が存在する。例えば、ある腫瘍は、細胞増殖に関して複数の増殖因子媒介性シグナル伝達経路に依存しており、従って、単一の経路を標的とすることは、腫瘍細胞増殖に著しい効果を及ぼすには不十分であることが判明する場合がある。或いは、１つの経路が唯一の又は支配的な増殖刺激経路である場合でさえ、ある腫瘍細胞は、元の経路が抗体により阻止されると、増殖刺激の別のシグナル経路を活性化させることが可能である（治療に対する先天的抵抗性）。また更に、幾つかの腫瘍は、抗体単独療法に初期応答性を示すが、別のシグナル経路の使用に切り替わることにより、後に治療に対して抵抗性を発生させる（治療に対する獲得抵抗性）。
【０００３】
従って、抗体単独療法の制限を克服し、他の利点を提供する、がん治療の更なる治療手法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
概要
腫瘍細胞により増殖の活性化に使用される２つのシグナル経路である、インスリン増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）経路、及びＥｒｂＢ経路、特にＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３としても知られている）経路を標的とする二重特異的結合剤（ＢＢＡ）が、本明細書で提供される。ＢＢＡは、中間にあるリンカー部分（モジュール）を介して共有結合で一緒に連結されている、ＩＧＦ−１Ｒを標的とする結合部分（モジュール）及びＥｒｂＢ３を標的とする結合部分（モジュール）を含む。本明細書に記載のように、これらのＢＢＡは、ＩＧＦ−１経路又はＥｒｂＢ３経路のいずれかのみを標的とする単一の結合剤の使用よりも、腫瘍細胞の増殖を阻害するのにより効果的であることが示された。
【０００５】
従って、１つの態様では、ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）と特異的に結合する第１の結合部分、及びＥｒｂＢ３と特異的に結合する第２の結合部分を含み、第１及び第２の結合部分が、リンカー部分により共有結合で連結されている、ＢＢＡが提供される。１つの実施形態では、連結部分は、そのような連結部分の１つの分子が他の連結部分分子と多量体を形成しないという点で単量体である。この単量体部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されている配列を有する、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含んでいてもよい。別の実施形態では、単量体連結部分は、３４位にセリン及び５０３位にグルタミンを有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されている配列を有する突然変異型のヒト血清アルブミンである。別の実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されている単量体リンカー部分は、化学的に及び生物学的に不活性である（リンカーが、生物学的結合機能又は触媒機能を有していないという点で）。別の実施形態では、連結部分は、構成的に又は誘導可能に二量体化することが可能である（本明細書では、二量体と呼ぶ）。この二量体のリンカーは、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０〜２９に示されているヒト免疫グロブリンの断片を含む。別の実施形態では、連結部分は、構成的に又は誘導可能に三量体化することが可能である（本明細書では、三量体と呼ぶ）。この三量体連結部分は、腫瘍壊死因子相同ドメイン又は腫瘍壊死因子相同ドメインの断片を含んでいてもよい。構成的三量体リンカーの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されている。誘導可能な三量体リンカーの一例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されている。
【０００６】
リンカー部分のグリコシル化状態は、真核生物発現宿主中でＮ結合グリコシル化を起こすアミノ酸モチーフの導入により操作することができる。１つの実施形態では、連結部分は、１８０位にアスパラギン、１８１位にセリン、及び１８２位にトレオニンを含有しており（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されている）、グリコシル化されている。別の実施形態では、連結部分は、１８０位にアスパラギンからグルタミンへの突然変異を含有しており（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されている）、無グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）されている。別の実施形態では、連結部分は、第２のＮ結合グリコシル化モチーフ（７８位のアスパラギン、７９位のグルタミン、及び８０位のトレオニン）を含有するように操作されていた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されているこの連結部分は、過剰グルコシル化されている。糖鎖操作された連結部分の更なる例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７〜２９に示されている。
【０００７】
そのような糖鎖操作の更なる方法は、米国特許出願公開第２００６／０２６９５４３号及びその中の参考文献に記載されている。
【０００８】
１つの実施形態では、第１の結合部分は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等の抗ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子操作抗体断片である。例示的な抗ＩＧＦ−１Ｒ単鎖抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されている。
【０００９】
別の実施形態では、第１の結合部分は、Ｆａｂ等の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体断片である。Ｆａｂ断片は、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）のヘテロ二量体で構成される。抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ断片の例示的なＨＣ及びＬＣ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されている。
【００１０】
別の実施形態では、第１の結合部分は、ＶＨドメイン等の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体断片である。例示的な抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＶＨドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されている。
【００１１】
別の実施形態では、第１の結合部分は、ＶＬドメイン等の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体断片である。例示的な抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＶＬドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されている。
【００１２】
１つの実施形態では、第１の結合部分は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等の抗ＥｒｂＢ３遺伝子操作抗体断片である。例示的な抗ＥｒｂＢ３単鎖抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されている。
【００１３】
別の実施形態では、第１の結合部分は、Ｆａｂ等の抗ＥｒｂＢ３抗体断片である。Ｆａｂ断片は、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）のヘテロ二量体で構成される。抗ＥｒｂＢ３  Ｆａｂの例示的なＨＣ及びＬＣ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されている。
【００１４】
別の実施形態では、第１の結合部分は、ＶＨドメイン等の抗ＥｒｂＢ３抗体断片である。例示的な抗ＥｒｂＢ３  ＶＨドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されている。
【００１５】
別の実施形態では、第１の結合部分は、ＶＬドメイン等の抗ＥｒｂＢ３抗体断片である。例示的な抗ＥｒｂＢ３  ＶＬドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されている。
【００１６】
別の実施形態では、第２の結合部分は、抗ＥｒｂＢ３抗体、例えば単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。例示的な抗ＥｒｂＢ３単鎖抗体は、ＡＢ２−３  ｓｃＦｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されている配列を含む）、ＡＢ２−６  ｓｃＦｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されている配列を含む）、及びＡＢ２−２１  ｓｃＦｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されている配列を含む）である。１つの実施形態では、第１の結合部分は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等の抗ＥｒｂＢ３遺伝子操作抗体断片である。例示的な抗ＥｒｂＢ３単鎖抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されている。
【００１７】
別の実施形態では、第１の結合部分は、Ｆａｂ等の抗ＥｒｂＢ３抗体断片である。Ｆａｂ断片は、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）のヘテロ二量体で構成される。抗ＥｒｂＢ３  Ｆａｂ断片の例示的なＨＣ及びＬＣ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されている。
【００１８】
別の実施形態では、第１の結合部分は、ＶＨドメイン等の抗ＥｒｂＢ３抗体断片である。例示的な抗ＥｒｂＢ３  ＶＨドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されている。
【００１９】
別の実施形態では、第１の結合部分は、ＶＬドメイン等の抗ＥｒｂＢ３抗体断片である。例示的な抗ＥｒｂＢ３  ＶＬドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されている。
【００２０】
別の実施形態は、突然変異ＨＳＡリンカーのＮ末端に連結されたＡＢ５−７  ｓｃＦｖ及び突然変異ＨＳＡリンカーのＣ末端に連結されたＡＢ２−３  ｓｃＦｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９によりコードされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）、突然変異ＨＳＡリンカーのＮ末端に連結されたＡＢ５−７  ｓｃＦｖ及び突然変異ＨＳＡリンカーのＣ末端に連結されたＡＢ２−６  ｓｃＦｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００によりコードされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）、突然変異ＨＳＡリンカーのＮ末端に連結されたＡＢ５−７  ｓｃＦｖ及び突然変異ＨＳＡリンカーのＣ末端に結合されたＡＢ２−２１  ｓｃＦｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８によりコードされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）、突然変異ＨＳＡリンカーのＮ末端に連結されたＡＢ２−３  ｓｃＦｖ及び突然変異ＨＳＡリンカーのＣ末端に連結されたＡＢ５−７  ｓｃＦｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５によりコードされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）、突然変異ＨＳＡリンカーのＮ末端に連結されたＡＢ２−６  ｓｃＦｖ及び突然変異ＨＳＡリンカーのＣ末端に連結されたＡＢ５−７  ｓｃＦｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６にコードされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）、並びに突然変異ＨＳＡリンカーのＮ末端に連結されたＡＢ２−２１  ｓｃＦｖ及び突然変異ＨＳＡリンカーのＣ末端に連結されたＡＢ５−７  ｓｃＦｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７によりコードされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）を含む。
【００２１】
他の実施形態は、Ｎ末端でリンカー部分に融合され、次いでリンカー部分がＣ末端の抗ＩＧＦ−１Ｒ部分に融合されている抗ＥｒｂＢ３部分を含む。そのような分子は、下記に示されている式Ａ−Ｌ−Ｂと一致していてもよく、下記の表１１に示されている部分の特定の組み合わせを有していてもよい。これら部分は、介在配列なしで連続的に融合されている。同時発現部分は、存在する場合、個別のポリペプチド鎖として同じ細胞中で発現される。これらポリペプチド鎖の折り畳みは、ＥＬＩトポロジーの二重特異的分子をもたらす。
【００２２】
他の実施形態は、Ｎ末端でリンカー部分に融合され、次いでリンカー部分がＣ末端の抗ＥｒｂＢ３部分に融合されている抗ＩＧＦ−１Ｒ部分を含む。そのような分子は、下記に示されている式Ａ−Ｌ−Ｂと一致していてもよく、下記の表１２に示されている部分の特定の組み合わせを有していてもよい。これら部分は、介在配列なしで連続的に融合されている。同時発現部分は、存在する場合、個別のポリペプチド鎖として同じ細胞中で発現される。これらポリペプチド鎖の折り畳みは、ＩＬＥトポロジーの二重特異的分子をもたらす。
【００２３】
Ｃ末端リジン変異は、バイオ医薬品抗体及び抗体様分子で一般的に観察される。Ｃ末端リジンは、カルボキシペプチダーゼＢ等の塩基性カルボキシペプチダーゼにより切断することができる。このプロセシングは、生産プロセスに感受性であることが知られており、不完全な切断は、バイオ医薬品製品の不均質性の増加をもたらす場合がある。
【００２４】
１つの実施形態では、Ｃ末端の抗ＩＧＦ−１Ｒ部分は、Ｃ末端リジンを除去することにより均質になるように操作されている。例示的な均質性抗ＩＧＦ−１Ｒ部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されている。
【００２５】
別の実施形態では、Ｃ末端の抗ＥｒｂＢ３部分は、Ｃ末端リジンを除去することにより均質になるように操作されている。例示的な均質性抗ＥｒｂＢ３部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２に示されている。
【００２６】
安定性の増強及び発現の増加を示すｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、及びＦａｂ等の抗体断片を操作するための方法は、米国特許出願公開第２００６／０１２７８９３号、米国特許出願公開第２００９／００４８１２２号、及びそれらの中の参考文献に記載されている。
【００２７】
１つの実施形態では、抗ＥｒｂＢ３部分は、安定性を増強するためにそのような方法により操作されている。例示的な安定化された抗ＥｒｂＢ３部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されている。
【００２８】
別の実施形態では、抗ＩＧＦ−１Ｒ部分は、安定性を増強するためにそのような方法により操作されている。例示的な安定化された抗ＩＧＦ−１Ｒ部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されている。
【００２９】
別の実施形態では、抗ＩＧＦ−１Ｒ部分は、発現を増加させるためにそのような方法により操作されている。例示的な発現最適化抗ＩＧＦ−１Ｒ部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されている。
【００３０】
複数の親和性相互作用（典型的には単一標的に対して）に起因する結合強度の増加におけるアビディティーは、抗体及び抗体様分子の生物学的機能を向上させることができる。
【００３１】
ある実施形態では、ＢＢＡに含まれている結合モジュールは両方とも、単一の親和性相互作用のみが可能であり、つまりそれらは、ＩＧＦ−１Ｒとの単一の親和性相互作用及びＥｒｂＢ３に対する単一の親和性相互作用が可能である。これらの特徴を有する例示的なＢＢＡは、実施例５に記載のように、アミノ酸が介在しないＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の遺伝子融合により構築することができる。
【００３２】
他の実施形態では、ＢＢＡの結合モジュールの１つ又は複数は、複数の親和性相互作用が可能であり、アビディティー結合特性をもたらす。そのような結合モジュールは、少数価（ｏｌｉｇｏｖａｌｅｎｔ）であり、同一標的との２、３、４、又は５つ以上の別個の親和性相互作用が可能であり、本明細書では「タンデム」モジュールと呼ぶ。
【００３３】
従って、あるより高い親和性（アビディティー）実施形態では、ＢＢＡは、ＩＧＦ−１Ｒに対する２つの親和性相互作用及びＥｒｂＢ３に対する２つの親和性相互作用が可能である。これらの特徴を有する例示的なＢＢＡは、実施例５に記載のように、配列を介在させずにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を遺伝子融合し、同一の細胞中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９と共に同時発現させることにより構築することができる。
【００３４】
ある更により高い親和性（アビディティー）実施形態では、ＢＢＡは、ＩＧＦ−１Ｒに対する３つの親和性相互作用及びＥｒｂＢ３に対する３つの親和性相互作用が可能である。これらの特徴を有する例示的なＢＢＡは、実施例５に記載のように、配列が介在しないＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の遺伝子融合により構築することができる。
【００３５】
他の実施形態では、ＢＢＡは、ＩＧＦ−１Ｒとの単一の親和性相互作用のみ及びＥｒｂＢ３に対する２つの親和性相互作用が可能である。これらの特徴を有する例示的なＢＢＡは、実施例５に記載のように、配列が介在しないＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０の遺伝子融合により構築することができる。
【００３６】
ＩＧＦ−１Ｒ標的部分、リンカー部分、及びＥｒｂＢ３標的部分を含み、ＩＧＦ−１Ｒ標的部分が、特異的にＩＧＦ−１Ｒと結合し、ＥｒｂＢ３標的部分が、特異的にＥｒｂＢ３と結合し、標的部分が各々、リンカー部分に連結されている、二重特異的結合剤タンパク質も提供される。１つの実施形態では、標的部分の各々は、ペプチド結合によりリンカー部分に共有結合で連結されて、単一のポリペプチドを形成し、リンカー部分は、長さが２〜５、６〜１０、１１〜２５、２６〜５０、５１〜１００、１０１〜２５０、２５１〜５００、又は５０１〜１０００個のアミノ酸である。
【００３７】
種々の形態のリンカー部分が企図される。１つの実施形態では、リンカー部分は、化学的に及び生物学的に不活性である。別の実施形態では、リンカー部分は、１つ又は複数のタンパク質ドメインで構成されている。別の実施形態では、リンカー部分は、例えば、Ｆｃγ受容体、新生児型Ｆｃ受容体、腫瘍壊死因子ファミリー受容体を含む１つ又は複数の受容体、ヒト免疫グロブリン、又はヒト血清アルブミンと結合する。別の実施形態では、リンカー部分は、ヒト血清アルブミンである。別の実施形態では、リンカー部分は、免疫グロブリン、又は免疫グロブリン断片である。別の実施形態では、リンカー部分は、腫瘍壊死因子相同ドメイン、又は腫瘍壊死因子相同ドメインの断片である。別の実施形態では、リンカー部分は、単量体を形成する。別の実施形態では、リンカー部分は、ホモ二量体又はヘテロ二量体を形成する。別の実施形態では、リンカー部分は、ホモ三量体又はヘテロ三量体を形成する。別の実施形態では、リンカー部分は、グリコシル化されているか、又は無グリコシル化（非グリコシル化）されている。別の実施形態では、リンカー部分は、突然変異型のヒト血清アルブミンである。別の実施形態では、リンカーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプのヒト免疫グロブリンのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含有している。別の実施形態では、リンカー部分は、ヒトＴＲＡＩＬ、ヒトＬＩＧＨＴ、ヒトＣＤ４０Ｌ、ヒトＴＮＦα、ヒトＣＤ９５、ヒトＢＡＦＦ、ヒトＴＷＥＡＫ、ヒトＯＸ４０、又はヒトＴＮＦβの断片であり、断片は、構成的に又は誘導可能に二量体化又は三量体化することが可能である。別の実施形態では、リンカー部分は、増強された溶解性を有するように糖鎖操作されている。別の実施形態では、リンカー部分は、増強された安定性を有するように糖鎖操作されている。別の実施形態では、リンカー部分は、血清中半減期の延長を提供するように操作されている。別の実施形態では、リンカー部分は、低減された不均質性を有するように操作されている。
【００３８】
特定の実施形態では、ＥｒｂＢ３標的部分は、リンカー部分のアミノ末端に連結されており、ＩＧＦ−１Ｒ標的部分は、リンカー部分のカルボキシ末端に連結されている。
【００３９】
別の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ標的部分は、リンカー部分のアミノ末端に連結されており、ＥｒｂＢ３標的部分は、リンカー部分のカルボキシ末端に連結されている。
【００４０】
更なる実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ標的部分は、１つ又は複数の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（例えば、単鎖抗体又は単一ドメイン抗体）を含む。特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ標的部分は、２つの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を含み、ＥｒｂＢ３標的部分は、１つの抗ＥｒｂＢ３抗体を含む。
【００４１】
別の実施形態では、ＥｒｂＢ３標的部分は、１つ又は複数の抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、単鎖抗体又は単一ドメイン抗体）を含む。
【００４２】
本明細書で提供される標的部分は、安定性が増強され、不均質性が低減され、発現が増強されるように操作することができる。例えば、１つの実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ標的部分及びＥｒｂＢ３標的部分のいずれか又は両方は、安定性が増強されるように操作されている。別の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ標的部分及びＥｒｂＢ３標的部分のいずれか又は両方は、不均質性が低減されるように操作されている。また更なる実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ標的部分及びＥｒｂＢ３標的部分のいずれか又は両方は、発現が増強されるように操作されている。
【００４３】
本発明の別の態様は、核酸分子、例えば、プロモーターに機能的に連結された本明細書に記載の二重特異的結合剤をコードする配列を含む発現ベクター、及びそのような発現ベクターを含む宿主細胞、並びにＢＢＡが発現されるようにそのような宿主細胞を培養することを含むＢＢＡを発現する方法に関する。
【００４４】
本明細書に記載のＢＢＡの１つ又は複数を含むキット、並びにがんを治療するためにそのような剤を使用するための説明書も包含される。
【００４５】
別の態様では、腫瘍細胞の増殖が阻害されるように、腫瘍細胞を本明細書に記載のＢＢＡと接触させることを含む、ＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法が提供される。また、患者のＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３発現腫瘍を治療する方法が提供され、該方法は、腫瘍の増殖が阻害されるように、本明細書に記載のＢＢＡを患者に投与することを含む。ＢＢＡで治療される（例えば、本明細書で開示された治療法により）腫瘍の例には、肺癌、肉腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、膵臓癌、及び乳癌が含まれる。種々の実施形態では、肺癌は、非小細胞肺癌又はゲフィチニブ抵抗性肺癌であり、肉腫は、ユーイング肉腫であり、又は乳癌は、タモキシフェン抵抗性エストロゲン受容体陽性乳癌若しくはトラスツズマブ抵抗性転移性乳癌である。提供される腫瘍治療法は、患者に、化学療法剤等の第２の抗がん剤を投与すること、又は電離放射線等の抗がん治療理学療法を施すことを更に含むことができる。
【００４６】
二重特異的結合剤を作製する方法、並びに腫瘍細胞の増殖が阻害されるように、本明細書に記載の二重特異的結合剤のいずれかと腫瘍細胞とを接触させることにより、ＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法が更に提供される。
【００４７】
患者の腫瘍（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３を両方とも発現する腫瘍細胞を含む腫瘍）を治療する方法も提供され、該方法は、本明細書に記載の二重特異的結合剤のいずれか１つを、腫瘍細胞増殖を低減するのに有効な量で患者に投与することを含む。１つの実施形態では、腫瘍は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌又はゲフィチニブ抵抗性肺癌）、肉腫（例えば、ユーイング肉腫）、結腸直腸癌、頭頸部癌、膵臓癌、卵巣癌、又は乳癌の腫瘍（例えば、タモキシフェン抵抗性エストロゲン受容体陽性乳癌又はトラスツズマブ抵抗性転移性乳癌）である。別の実施形態では、本方法は、ＢＢＡによる治療と組み合わせて、第２の抗がん剤（例えば、化学療法薬剤）を患者に投与すること、又は第２の抗がん治療理学療法（例えば、電離放射線）を患者に施すことを更に含む。
【００４８】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】図１Ａは、ＢＢＡ  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−３Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＢＢＡ  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−３Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）を示す図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＢＢＡ  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−３Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）を示す図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＢＢＡ  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−３Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）を示す図である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＢＢＡ  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−３Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＢＢＡ  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−６Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＢＢＡ  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−６Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）を示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＢＢＡ  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−６Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）を示す図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＢＢＡ  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−６Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）を示す図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＢＢＡ  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−６Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＢＢＡ  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−２１Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＢＢＡ  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−２１Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＢＢＡ  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−２１Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）を示す図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＢＢＡ  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−２１Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）を示す図である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＢＢＡ  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−２１Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＢＢＡ  ＡＢ２−３Ｎ／ＡＢ５−７Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＢＢＡ  ＡＢ２−３Ｎ／ＡＢ５−７Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）を示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＢＢＡ  ＡＢ２−３Ｎ／ＡＢ５−７Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）を示す図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＢＢＡ  ＡＢ２−３Ｎ／ＡＢ５−７Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）を示す図である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＢＢＡ  ＡＢ２−３Ｎ／ＡＢ５−７Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＢＢＡ  ＡＢ２−６Ｎ／ＡＢ５−７Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＢＢＡ  ＡＢ２−６Ｎ／ＡＢ５−７Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）を示す図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＢＢＡ  ＡＢ２−６Ｎ／ＡＢ５−７Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）を示す図である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＢＢＡ  ＡＢ２−６Ｎ／ＡＢ５−７Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）を示す図である。
【図５Ｅ】図５Ｅは、ＢＢＡ  ＡＢ２−６Ｎ／ＡＢ５−７Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＢＢＡ  ＡＢ２−２１Ｎ／ＡＢ５−７Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＢＢＡ  ＡＢ２−２１Ｎ／ＡＢ５−７Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）を示す図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＢＢＡ  ＡＢ２−２１Ｎ／ＡＢ５−７Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）を示す図である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＢＢＡ  ＡＢ２−２１Ｎ／ＡＢ５−７Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）を示す図である。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＢＢＡ  ＡＢ２−２１Ｎ／ＡＢ５−７Ｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）及びヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）を示す図である。
【図７】図７Ａ〜Ｃは、抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ単独又は抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧ単独の効果と比較した、ＡＤＲｒ（図７Ａ）、ＭＣＦ７（図７Ｂ）、及びＡ５４９（図７Ｃ）細胞の腫瘍球状体増殖に対するＢＢＡ、ＡＢ２−２１Ｎ／ＡＢ５−７Ｃ及びＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−２１Ｃの阻害効果を示す棒グラフである。
【図８】図８Ａ〜Ｃは、抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ単独又は抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧ単独の効果と比較した、ＡＤＲｒ（図８Ａ）、ＭＣＦ７（図８Ｂ）、及びＡ５４９（図８Ｃ）細胞の腫瘍球状体増殖に対するＢＢＡ、ＡＢ２−２１Ｎ／ＡＢ５−７Ｃ及びＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−２１Ｃの阻害効果を示す棒グラフである。
【図９】単量体ＢＢＡ  ＩＬＥ−６（９４％単量体）ＭＷ１２０ｋＤａをＥＬＩ−７二量体ＢＢＡ（９４％単量体）ＭＷ１９５ｋＤａと比較したグラフを示す図である。
【図１０】異なるロットのＩＬＥ−６二量体ＢＢＡ（ＭＷ１９５ｋＤａ）のＳＤＳ  ｐａｇｅを示す図である。
【図１１】異なるロットのＥＬＩ−１単量体ＢＢＡ（ＭＷ１２０ｋＤａ）のＳＤＳ  ｐａｇｅを示す図である。
【図１２Ａ】ＡＤＲｒ細胞に対する結合を示す図である。
【図１２Ｂ】ＭＣ７細胞に対する結合を示す図である。
【図１３】三価型とＨＳＡ二重特異的型との比較を示す図である。
【図１４Ａ】ＩＬＥ−７及びＥＬＩ−７によるｐＩＧＦ−１Ｒ阻害を示す図である。
【図１４Ｂ】ＩＬＥ−７及びＥＬＩ−７によるｐＥｒｂＢ３阻害を示す図である。
【図１４Ｃ】ＩＬＥ−７及びＥＬＩ−７によるｐＡＫＴ阻害を示す図である。
【図１５】ＤＵ１４５（ＣＴＧ）におけるＥＬＩ−７の効果を示す図である。
【図１６】２Ｄ培養でのＥＬＩ−７によるＢＸＰＣ３増殖の阻害を示す図である。
【図１７】三価の二重特異体（ＩＬＥ−７及びＩＬＥ−９）と対照ＩｇＧ  Ａｂ＃６との比較を示す図である。
【図１８】ＤＵ１４５球状体増殖に対する三価の二重特異的抗体ＩＬＥ−７の効果を示す図である。
【図１９】ＢｘＰＣ−３腫瘍増殖曲線を示す図である。
【図２０】４１日目のＢｘＰＣ−３最終腫瘍体積を示す図である。
【図２１Ａ】ＤＵ１４５腫瘍増殖曲線を示す図である。
【図２１Ｂ】３６日目のＤＵ１４５腫瘍体積を示す図である。
【図２２】ＩＬＥ−２及びＩＬＥ−３によるＨＲＧ誘導性ｐＥＲｂＢ３を示す図である。
【図２３Ａ】ＨＲＧに刺激されたｐＥＲｂＢ３を示す図である。
【図２３Ｂ】ＨＲＧ誘導性ｐＡｋｔを示す図である。
【図２４】ＢＢＡ  ＩＬＥ−７は、１０−１１Ｍ  ＩＬＥ−７でのｐＥｒｂＢ３レベルと比較して、１０−７ＭでｐＥｒｂＢ３を完全に阻害した一方で、ＢＢＡ  ＩＬＥ−３は、１０−１１Ｍ  ＩＬＥ−３でのｐＥｒｂＢ３レベルと比較して、１０−７ＭでのｐＥｒｂＢ３の阻害は５０％以下であったことを示す図である。
【図２５】ＩＬＥ−７は、１０−１１Ｍ  ＩＬＥ−７でのｐＡｋｔレベルと比較して、１０−７Ｍで５０％を超えてｐＡＫＴを阻害した一方で、ＩＬＥ−３は、１０−１１Ｍ  ＩＬＥ−３でのｐＡｋｔレベルと比較して、１０−７ＭでのｐＡｋｔの阻害は２０％以下であったことを示す図である。
【図２６】ＢＢＡが、広範囲のＥｒｂＢ３及びＩＧＦ−１Ｒ受容体レベルにわたってシグナル伝達を阻害することを示す図である。
【００５０】
配列表の簡単な説明
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：安定化ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：安定化均質性ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：安定化発現最適化ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：安定化均質性発現最適化ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：ＶＨ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：安定化均質性ＶＨ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：Ｆａｂ  ＨＣ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：安定化均質性Ｆａｂ  ＨＣ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０：Ｆａｂ  ＬＣ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：安定化Ｆａｂ  ＬＣ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２：ＶＬ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３：安定化ＶＬ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４：ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−５アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５：均質性ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−５アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６：Ｆａｂ  ＨＣ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−５アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７：Ｆａｂ  ＬＣ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−５アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８：単量体均質性ヒトアルブミン様リンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９：ヒトアルブミン配列に「Ｃ３４Ｓ及びＮ５０３Ｑ」置換を有する単量体均質性ヒトアルブミン様リンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０：二量体ＣＬカッパ様リンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１：二量体ＣＬラムダ様リンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２：二量体ＩｇＧ２様リンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３：二量体ＩｇＧ２様短鎖リンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４：二量体グリコシル化ＩｇＧ１様リンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５：二量体無グリコシル化ＩｇＧ１様リンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６：二量体過剰グリコシル化ＩｇＧ１様リンカー
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７：二量体グリコシル化ＩｇＧ４様リンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８：二量体無グリコシル化ＩｇＧ４様リンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９：二量体過剰グリコシル化ＩｇＧ４様リンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０：三量体ＴＲＡＩＬ様リンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１：三量体ＬＩＧＨＴ様リンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２：化学的に及び生物学的に不活性なリンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３：ｓｃＦｖ  ＥｒｂＢ３モジュール２−３アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４：安定化ｓｃＦｖ  ＥｒｂＢ３モジュール２−３アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５：ＶＨ  ＥｒｂＢ３モジュール２−３アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６：安定化ＶＨ  ＥｒｂＢ３モジュール２−３アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７：Ｆａｂ  ＨＣ  ＥｒｂＢ３モジュール２−３アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８：安定化Ｆａｂ  ＨＣ  ＥｒｂＢ３モジュール２−３アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９：Ｆａｂ  ＬＣ  ＥｒｂＢ３モジュール２−３アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０：安定化Ｆａｂ  ＬＣ  ＥｒｂＢ３モジュール２−３アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１：ＶＬ  ＥｒｂＢ３モジュール２−３アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２：安定化ＶＬ  ＥｒｂＢ３モジュール２−３アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３：ｓｃＦｖ  ＥｒｂＢ３モジュール２−６アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４：ｓｃＦｖ  ＥｒｂＢ３モジュール２−２１アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５：均質性ｓｃＦｖ  ＥｒｂＢ３モジュール２−２１アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６：ｓｃＦｖ  ＥｒｂＢ３モジュールＥ３Ｂアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７：ｓｃＦｖ安定化及び最適化ＥｒｂＢ３モジュールＥ３Ｂｃ８アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８：タンデムＥｒｂＢ３モジュールＡアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９：タンデムＥｒｂＢ３モジュールＢアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０：タンデムＥｒｂＢ３モジュールＣアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１：二量体ＩｇＧ２様Ｆｃリンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２：二量体ＩｇＧ２様短鎖Ｆｃリンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３：二量体グリコシル化ＩｇＧ１様Ｆｃリンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４：二量体無グリコシル化ＩｇＧ１様Ｆｃリンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５：二量体グリコシル化ＩｇＧ４様Ｆｃリンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６：二量体無グリコシル化ＩｇＧ４様Ｆｃリンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７：鎖全長ＥｒｂＢ３モジュール２−３アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８：鎖全長ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９：ＶＨ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−６アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０：安定化ＶＨ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−６アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１：Ｆａｂ  ＨＣ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−６アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２：安定化Ｆａｂ  ＨＣ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−６アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３：ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−６アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４：安定化ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−６アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５：安定化均質性ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−６アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６：Ｆａｂ  ＬＣ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−６アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７：ＶＬ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−６アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８：安定化ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−５アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９：均質性安定化ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−５アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０：ＶＨ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−５アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１：安定化ＶＨ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−５アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２：安定化Ｆａｂ  ＨＣ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−５アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３：ｓｃＦｖ  ＥｒｂＢ３モジュール２−１４アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４：安定化ｓｃＦｖ  ＥｒｂＢ３モジュール２−１４アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５：ＶＨ  ＥｒｂＢ３モジュール２−１４アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６：安定化ＶＨ  ＥｒｂＢ３モジュール２−１４アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７：Ｆａｂ  ＨＣ  ＥｒｂＢ３モジュール２−１４アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８：安定化Ｆａｂ  ＨＣ  ＥｒｂＢ３モジュール２−１４アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９：Ｆａｂ  ＬＣ  ＥｒｂＢ３モジュール２−１４アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０：ＶＬ  ＥｒｂＢ３モジュール２−１４アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１：安定化ｓｃＦｖ  ＥｒｂＢ３モジュール２−２１アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２：安定化均質性ｓｃＦｖ  ＥｒｂＢ３モジュール２−２１アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３：ＶＨ  ＥｒｂＢ３モジュール２−２１アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４：安定化ＶＨ  ＥｒｂＢ３モジュール２−２１アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５：ＶＬ  ＥｒｂＢ３モジュール２−２１アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６：Ｆａｂ  ＬＣ  ＥｒｂＢ３モジュール２−２１アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７：Ｆａｂ  ＨＣ  ＥｒｂＢ３モジュール２−２１アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８：安定化Ｆａｂ  ＨＣ  ＥｒｂＢ３モジュール２−２１アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９：ＶＨ  ＥｒｂＢ３モジュールＥ３Ｂアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０：ＶＬ  ＥｒｂＢ３モジュールＥ３Ｂアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１：Ｆａｂ  ＬＣ  ＥｒｂＢ３モジュールＥ３Ｂアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２：Ｆａｂ  ＨＣ  ＥｒｂＢ３モジュールＥ３Ｂアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−３Ｃアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−６Ｃアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−２１Ｃアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６  ＡＢ２−３Ｎ／ＡＢ５−７Ｃアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７  ＡＢ２−６Ｎ／ＡＢ５−７Ｃアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８  ＡＢ２−２１Ｎ／ＡＢ５−７Ｃアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−３Ｃヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００  ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−６Ｃヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１  ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２：安定化ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３：安定化均質性ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４：安定化発現最適化ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５：安定化均質性発現最適化ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６：ＶＨ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７：安定化均質性ＶＨ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８：ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−２１Ｃヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９：安定化均質性Ｆａｂ  ＨＣ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０：Ｆａｂ  ＬＣ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１：安定化Ｆａｂ  ＬＣ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２：ＶＬ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３：安定化ＶＬ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４：ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−５ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５  ＡＢ２−３Ｎ／ＡＢ５−７Ｃヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６  ＡＢ２−６Ｎ／ＡＢ５−７Ｃヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７  ＡＢ２−２１Ｎ／ＡＢ５−７Ｃヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８：単量体均質性ヒトアルブミン様リンカーヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９：ヒトアルブミン配列に「Ｃ３４Ｓ及びＮ５０３Ｑ」置換を有する単量体均質性ヒトアルブミン様リンカーヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０：二量体ＣＬカッパ様リンカーヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１：二量体ＣＬラムダ様リンカーヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２：二量体ＩｇＧ２様リンカーヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３：二量体ＩｇＧ２様短鎖リンカーヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４：二量体無グリコシル化ＩｇＧ１様リンカーヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５：二量体過剰グリコシル化ＩｇＧ１様リンカーヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６：三量体ＴＲＡＩＬ様リンカーヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７：三量体ＬＩＧＨＴ様リンカーヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８：ｓｃＦｖ  ＥｒｂＢ３モジュール２−３ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９：安定化ｓｃＦｖ  ＥｒｂＢ３モジュール２−３ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０：ＶＨ  ＥｒｂＢ３モジュール２−３ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１：Ｆａｂ  ＬＣ  ＥｒｂＢ３モジュール２−３ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２：ＶＬ  ＥｒｂＢ３モジュール２−３ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３：ｓｃＦｖ  ＥｒｂＢ３モジュール２−６ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４：ｓｃＦｖ  ＥｒｂＢ３モジュールＥ３Ｂヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５：ｓｃＦｖ安定化親和性成熟ＥｒｂＢ３モジュールＥ３Ｂｃ８ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６：タンデムＥｒｂＢ３モジュールＡヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７：タンデムＥｒｂＢ３モジュールＢヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８：タンデムＥｒｂＢ３モジュールＣヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９：鎖全長ＥｒｂＢ３モジュール２−３ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０：鎖全長ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−７ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１：ｓｃＦｖ  ＩＧＦ−１Ｒモジュール５−６ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２：ｓｃＦｖ  ＥｒｂＢ３モジュール２−１４ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３：（単量体）ヒト血清アルブミンリンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４：（単量体）ヒト血清アルブミンリンカーヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５：Ｃ３４Ｓ及びＮ５０３Ｑ置換を有する（単量体）ヒト血清アルブミンリンカーアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６：「Ｃ３４Ｓ及びＮ５０３Ｑ」置換をコードする（単量体）ヒト血清アルブミンリンカーヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７：対照ｓｈＲＮＡ配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８：ＩＧＦ−１Ｒ標的化ｓｈＲＮＡ配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９：ＥｒｂＢ３標的化ｓｈＲＮＡ配列（ｍｏｄ１）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０：ＥｒｂＢ３標的化ｓｈＲＮＡ配列（ｍｏｄ２）
【発明を実施するための形態】
【００５１】
詳細な説明
Ｉ．定義
用語「ＢＢＡ」は、本明細書で使用される場合、２つの異なる結合部分及び従って２つの異なる結合部位（２つの異なる抗体結合部位等）を有する人工ハイブリッド分子を指す。２つの異なる結合部分は、「共有結合で連結」されており、それらは、２つの異なる結合部分を接続する、ＢＢＡの別個の構造成分を指す「リンカー部分」を介して、化学的に一緒に結合されていることを意味する。
【００５２】
「ＩＧＦ−１Ｒ」は、ヒトインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１、以前はソマトメジンＣとして知られていた）の受容体を指す。ＩＧＦ１−Ｒは、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）にも結合し、それにより活性化される。ＩＧＦ１−Ｒは、受容体チロシンキナーゼであり、それは、細胞内での１つ又は複数のタンパク質の１つ又は複数の特定のチロシンへのリン酸分子（複数可）の付加を触媒することにより、シグナルを細胞内に伝達することを意味する。ＩＧＦ１−Ｒによるチロシンリン酸化は、自己触媒機能を含み、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２によるＩＧＦＲ−１活性化は、ＩＧＦ１−Ｒの自己リン酸化をもたらす。ヒトＩＧＦ−１Ｒ前駆体のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００８６６に提供されている。
【００５３】
「ＥｒｂＢ３」及び「ＨＥＲ３」は、米国特許第５，４８０，９６８号に記載のヒトＥｒｂＢ３タンパク質を指す。ヒトＥｒｂＢ３タンパク質配列は、米国特許第５，４８０，９６８号の図４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されており、最初の１９個のアミノ酸は、成熟タンパク質から切断されるリーダー配列に相当する。ＥｒｂＢ３は、チロシンキナーゼ基質であり、ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーであり、それらの他のメンバーには、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／Ｎｅｕ）、及びＥｒｂＢ４が含まれる。ＥｒｂＢ３それ自体は、チロシンキナーゼ活性を欠如しており、ＥｒｂＢ３は、別のＥｒｂＢファミリー受容体と一緒になったヘテロ二量体形態でのみ作用すると考えられる。ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、及びＥｒｂＢ４は全て、受容体チロシンキナーゼであり、ヘテロ二量体ＥｒｂＢ３の活性化は、ＥｒｂＢ３のチロシンリン酸化をもたらす。ＥｒｂＢファミリーのリガンドには、ヘレグリン（ＨＲＧ）、ベータセルリン（ＢＴＣ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦα）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、エピゲン（ｅｐｉｇｅｎ）（ＥＰＧ）、及びエピレギュリン（ＥＰＲ）が含まれる。
【００５４】
用語「単量体リンカー」は、本明細書で使用される場合、単量体のＢＢＡの形成をもたらす、二重特異的結合剤（ＢＢＡ）に使用されるリンカー部分を指す。即ち、完全なＢＢＡは、リンカー部分により共有結合で一緒に連結された２つの異なる結合部分（１つはＩＧＦ−１Ｒに特異的であり、他方はＥｒｂＢ３に特異的である）で構成される単一分子（単量体）からなる。典型的には、単量体リンカーは、例えばヒト血清アルブミン等の、単量体として存在するタンパク質に由来する。
【００５５】
用語「二量体リンカー」は、本明細書で使用される場合、二量体ＢＢＡの形成をもたらす、ＢＢＡに使用されるリンカー部分を指す。即ち、完全なＢＢＡは、２つの分子（二量体）又はサブユニットからなり、ＢＢＡの各サブユニットは、リンカー部分により共有結合で一緒に連結された少なくとも１つの、典型的には２つの異なる結合部分（１つはＩＧＦ−１Ｒに特異的であり、他方はＥｒｂＢ３に特異的である）で構成される。典型的には、二量体リンカーは、これらのリンカーが二量化して（例えば、ジスルフィド架橋により）二量体ＢＢＡを生成するように、例えば免疫グロブリン分子等の、二量体として存在するタンパク質に由来する。
【００５６】
用語「三量体リンカー」は、本明細書で使用される場合、三量体のＢＢＡの形成をもたらす、ＢＢＡに使用されるリンカー部分を指す。即ち、完全なＢＢＡは、３つの分子（三量体）又はサブユニットで構成されており、ＢＢＡの各サブユニットは、リンカー部分により共有結合で一緒に連結された２つの異なる結合部分（１つはＩＧＦ−１Ｒに特異的であり、他方はＥｒｂＢ３に特異的である）で構成される。典型的には、三量体リンカーは、これらのリンカーが三量体化して（例えば、ジスルフィド架橋により）三量体ＢＢＡを生成するように、例えばＴＲＡＩＬ又はＬＩＧＨＴ等の、三量体として存在するタンパク質に由来する。
【００５７】
用語「化学的に及び生物学的に不活性のリンカー」は、本明細書で使用される場合、リンカー部分それ自体が、例えば対象に投与された際にいかなる化学的又は生物学的活性も示さない、ＢＢＡに使用されるリンカー部分を指す。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「グリコシル化」リンカー又は「グリコシル化」ＢＢＡは、その構造に糖部分を含むリンカー又はＢＢＡを指す。例えば、リンカー又はＢＢＡの配列内に１つ又は複数のグリコシル化部位が存在すると、リンカー又はＢＢＡの発現に際して「グリコシル化」リンカー又はＢＢＡがもたらされる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「無グリコシル化」リンカー又は「無グリコシル化」ＢＢＡは、その構造にいかなる糖部分も含まないリンカー又はＢＢＡを指す。例えば、リンカー又はＢＢＡの配列内にグリコシル化部位が一切欠如していると（天然に存在するか、又は全てのグリコシル化部位を意図的に除去することによる部位特異的突然変異誘発により生成されるかのいずれか）、リンカー又はＢＢＡの発現の際に「無グリコシル化」リンカー又はＢＢＡがもたらされる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「過剰グリコシル化」リンカー又は「過剰グリコシル化」ＢＢＡは、未修飾型のリンカー又はＢＢＡと比較して、その構造に多数の糖部分を含む修飾型のリンカー又はＢＢＡを指す。例えば、グリコシル化部位の数を増加させるためのリンカー又はＢＢＡの修飾（例えば、部位特異的突然変異誘発による）がリンカー又はＢＢＡの配列内に存在すると、リンカー又はＢＢＡの発現に際して「過剰グリコシル化」リンカー又はＢＢＡがもたらされる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「安定化された」配列（例えば、ＢＢＡに使用される結合部分の）は、それがタンパク質として発現された場合に、配列の安定性を増強するためにその元々の形態から修飾されている配列を指す。例えば、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体又は抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、ＶＨ及び／又はＶＬ配列）をコードするヌクレオチド配列は、ＢＢＡ内に発現された場合に、コードされた抗体の安定性を増強するために、１つ又は複数のコードされたアミノ酸位置が修飾（例えば、部位特異的突然変異誘発により）されていてもよい。それらの結合親和性／特異性を著しく変更せずに抗体等の結合部分の安定性を増強するアミノ酸修飾は、当技術分野で公知であり、標準的組換えＤＮＡ技術により、本明細書に記載のＢＢＡに使用される結合部分に組み込むことができる。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「最適化」配列（例えば、ＢＢＡに使用される結合部分の）は、タンパク質としての配列の発現を増強するためにその元々の形態から修飾されている配列を指す。例えば、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体又は抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、ＶＨ及び／又はＶＬ配列）のヌクレオチド配列は、コードされた抗体の発現を増強するために１つ又は複数のコドンが修飾（例えば、部位特異的突然変異誘発により）されていてもよい（当技術分野では、「コドン最適化」として知られている）。抗体等の、コードされた結合部分のタンパク質発現を増強するヌクレオチド（コドン）修飾は、当技術分野で公知であり、標準的組換えＤＮＡ技術により、本明細書に記載の結合部分に組み込むことができる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「安定化及び最適化」配列は、それがタンパク質として発現された場合に、配列の安定性を増強し、且つタンパク質としての配列の発現を増強するように、その元々の形態から修飾されている配列を指す。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「均質性」配列（例えば、ＢＢＡに使用される結合部分の）は、それがタンパク質として発現された場合に、配列の均質性を増強するためにその元々の形態から修飾された配列を指す。例えば、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体又は抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、ＶＨ及び／又はＶＬ配列）のヌクレオチド配列は、ＢＢＡ内に発現された場合に、コードされた抗体の均質性を増強するために、１つ又は複数のコードされたアミノ酸位置が修飾（例えば、部位特異的突然変異誘発により）されていてもよい。それらの結合親和性／特異性を著しく変更せずに抗体等の結合部分の均質性を増強するアミノ酸修飾は、当技術分野で公知であり、標準的組換えＤＮＡ技術により、本明細書に記載のＢＢＡに使用される結合部分に組み込むことができる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「ＩＧＦ−１Ｒシグナル経路」は、リガンドとＩＧＦ−１Ｒファミリー受容体との相互作用により開始されるシグナル伝達経路を包含することが意図されている。ＩＧＦ−１Ｒシグナル経路内の成分には、以下のものが含まれていてもよい：（ｉ）１つ又は複数のリガンド、それらの例にはＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２が含まれる；（ｉｉ）１つ又は複数の受容体、それらの例には、ＩＧＦ−１Ｒ及びインスリン受容体が含まれる；（ｉｉｉ）１つ又は複数のＩＧＦ結合タンパク質、及び（ｉｖ）細胞内キナーゼ及び基質、それらの例には、インスリン受容体基質２（ＩＲＳ２）、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＡＫＴ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）が含まれる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「ＥｒｂＢシグナル経路」は、リガンドとＥｒｂＢファミリーの受容体との相互作用により開始されるシグナル伝達経路を包含することが意図されている。ＥｒｂＢシグナル経路内の成分には、以下のものが含まれていてもよい：（ｉ）１つ又は複数のリガンド、それらの例には、ヘレグリン（ＨＲＧ）、ベータセルリン（ＢＴＣ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦα）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、エピゲン（ＥＰＧ）、及びエピレギュリン（ＥＰＲ）が含まれる；（ｉｉ）１つ又は複数の受容体、それらの例には、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、及びＥｒｂＢ４が含まれる；及び（ｉｉｉ）細胞内キナーゼ及び基質、それらの例には、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ホスファチジルイノシトールビスホスファート（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトールトリスホスファート（ＰＩＰ３）、ホスファターゼ及びテンシン相同体（ＰＴＥＮ）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼアイソザイム１（ＰＤＫ１）、ＡＫＴ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、タンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）、及びＳＲＣタンパク質チロシンキナーゼが含まれる。
【００６７】
本明細書中に使用される場合、用語「阻害」は、抗体又はＢＢＡにより媒介される生物学的活性の任意の再現性よく検出可能な減少を指す。幾つかの実施形態では、阻害は、生物学的活性の統計的に有意な減少を提供する。例えば、「阻害」は、生物学的活性の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の再現性のある減少を指すことができる。
【００６８】
従って、ａ）リガンド媒介性のＥｒｂＢ３リン酸化の阻害、及びｂ）ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２媒介性のＩＧＦ−１Ｒリン酸化の阻害は、それぞれａ）ＥｒｂＢファミリーリガンドにより誘導されるＥｒｂＢ３のリン酸化レベル、又はｂ）ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２により誘導されるＩＧＦ−１Ｒのリン酸化レベルを、各々、ＢＢＡで処理されていない対照細胞におけるリン酸化と比べて、再現性よく減少させるＢＢＡの能力により実証することができる。ＥｒｂＢ３及び／又はＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞は、天然細胞又は細胞株であってもよく、又はＥｒｂＢ３及び／又はＩＧＦ−１Ｒをコードする核酸を宿主細胞に導入することにより組換えにより産生されてもよい。１つの実施形態では、ＢＢＡは、ＥｒｂＢファミリーリガンド媒介性のＥｒｂＢ３リン酸化を、例えば、下記の実施例に記載のようにウエスタンブロッティングを行い、その後抗ホスホチロシン抗体でプローブすることにより決定して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％以上阻害する。別の実施形態では、ＢＢＡは、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２媒介性のＩＧＦ−１Ｒリン酸化を、例えば、下記の実施例に記載のようにウエスタンブロッティングを行い、その後抗ホスホチロシン抗体でプローブすることにより決定して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％以上阻害する。
【００６９】
本明細書では同義的に使用される用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、抗体全長及びその任意の抗原結合性断片又は単鎖を含む。典型的な抗体は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと略される）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと略される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域に更に細分化される。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ末端からカルボキシ末端に配置されている、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有している。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の最初の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【００７０】
抗体−抗原結合機能は、完全長抗体の抗原結合断片により行うことができることが示されている。そのような結合断片の例には、以下のものが含まれる：（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）２断片、ヒンジ領域のジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１のドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインで構成されるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片；（ｖｉ）ＶＨドメインからなる抗体断片；（ｖｉｉ）ＶＨ又はＶＬドメインからなる抗体断片；及び（ｖｉｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、又は（ｉｘ）随意に合成リンカーで結合されてもよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせ。
【００７１】
用語「単鎖抗体」又は「単鎖Ｆｖ」（ｓｃＦＶ）は、可変領域重鎖ドメイン及び可変領域軽鎖ドメインが両方とも、単一の直鎖状タンパク質内に含有されている抗体を指す。Ｆｖ断片のこれらの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、個別の遺伝子によりコードされており、天然抗体ではそれぞれ軽鎖及び重鎖に発現されるが、それらは、組換え法を使用して、ＶＬ及びＶＨ領域対が一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又は単鎖抗体として知られている）を形成する単一タンパク質鎖として作られることを可能にする合成リンカーにより結合されていてもよい。これら単鎖抗体は、当業者に公知の従来技術を使用して取得され、断片は、完全抗体と同じように有用性についてスクリーニングされる。単鎖抗体は、その用語が本明細書で使用されるような抗体の「抗原結合部分」でもあり、組換えＤＮＡ技術、又は完全免疫グロブリンの酵素的又は化学的切断により産生することができる。
【００７２】
用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得たか又は調製された抗体を指し、つまり、集団の各個々の抗体分子は、例えば少量で存在する場合がある様々なグリコシル化及び／又は天然突然変異を含む分子を除き、全ての他の分子と本質的に同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して向けられている。更に、単一の精製された抗原に対して調製された場合でさえ、典型的には、抗原の複数の別々の決定基（エピトープ）に対する多数の異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、典型的には、抗原の単一の決定因子に対して向けられている。モノクローナル抗体は、当分野で認識されている任意の技術を使用して調製することができる。モノクローナル抗体には、キメラ抗体、ヒト抗体、及びヒト化抗体が含まれており、モノクローナル抗体は、天然であってもよく又は組換えにより産生されてもよい。
【００７３】
抗体は、以下のもの等の組換え手段により調製、発現、生成、又は単離することができる：（ａ）免疫グロブリン遺伝子（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）のトランスジェニック若しくは染色体導入動物（例えば、マウス）又はそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）ファージディスプレイを使用して、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト抗体配列を含有する）から単離された抗体、及び（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段により調製、発現、生成、又は単離された抗体。そのような組換え抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有してもよい。しかしながら、ある実施形態では、そのような組換えヒト抗体を、インビトロ突然変異誘発にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系ＶＨ及びＶＬ配列に由来及び関連するが、インビボではヒト抗体生殖系レパートリー内に天然に存在しない場合がある配列である。
【００７４】
用語「キメラ免疫グロブリン」又は「キメラ抗体」は、その可変領域が第１の種に由来し、その定常領域が第２の種に由来する免疫グロブリン又は抗体を指す。キメラ免疫グロブリン又は抗体は、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから、例えば遺伝子操作により構築することができる。
【００７５】
用語「ヒト抗体」は、フレームワーク及びＣＤＲ領域が両方とも、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を示す。更に、ヒト抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発、又はインビボでの体細胞突然変異により導入された突然変異）を含んでいてもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含まない。
【００７６】
ヒト抗体は、少なくとも１つ又は複数のアミノ酸が、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基、例えば活性増強アミノ酸残基に置換されていてもよい。典型的には、ヒト抗体は、最大２０箇所の位置が、ヒト生殖系免疫グロブリン配列の一部ではないアミノ酸残基と置換されていてもよい。特定の実施形態では、これらの置換は、下記で詳述されているようにＣＤＲ領域内にある。
【００７７】
用語「ヒト化免疫グロブリン」又は「ヒト化抗体」は、少なくとも１つのヒト化免疫グロブリン又は抗体鎖（つまり、少なくとも１つのヒト化軽鎖又は重鎖）を含む免疫グロブリン又は抗体を指す。用語「ヒト化免疫グロブリン鎖」又は「ヒト化抗体鎖」（つまり、「ヒト化免疫グロブリン軽鎖」又は「ヒト化免疫グロブリン重鎖」）は、実質的にヒト免疫グロブリン又は抗体に由来する可変フレームワーク領域と、実質的に非ヒト免疫グロブリン又は抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは２つのＣＤＲ、より好ましくは３つのＣＤＲ）とを含み、更に、定常領域（例えば軽鎖の場合、少なくとも１つの定常領域又はその部分、及び例えば重鎖の場合、３つの定常領域）を含む可変領域を有する、免疫グロブリン又は抗体鎖（つまり、それぞれ軽鎖又は重鎖）を指す。用語「ヒト化可変領域」（例えば、「ヒト化軽鎖可変領域」又は「ヒト化重鎖可変領域」）は、実質的にヒト免疫グロブリン又は抗体に由来する可変フレームワーク領域と、実質的に非ヒト免疫グロブリン又は抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む可変領域を指す。
【００７８】
「単離されたＢＢＡ」は、本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他のＢＢＡが実質的に存在しないＢＢＡを指すことが意図されている。加えて、単離されたＢＢＡには、典型的には細胞性物質が実質的に存在しない。
【００７９】
「アイソタイプ」は、重鎖定常域遺伝子によりコードされる抗体クラスを指す。１つの実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体アイソタイプから選択されるアイソタイプである。幾つかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。他の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
【００８０】
「抗原」は、ＢＢＡ内の結合部分が結合する実体（例えば、タンパク質性実体又はペプチド）である。本明細書に開示されている種々の実施形態では、抗原は、ＥｒｂＢ３又はＩＧＦ−１Ｒである。特定の実施形態では、抗原は、ヒトＥｒｂＢ３又はヒトＩＧＦ−１Ｒである。
【００８１】
用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原の部位を指す。エピトープは、連続したアミノ酸、又はタンパク質の三次構造折り畳みにより近接される非連続アミノ酸のいずれから形成されていてもよい。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒と接触しても保持されるが、三次構造折り畳みにより形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒により処理されると失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間的立体構造中に、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的立体構造を決定する方法には、当技術分野の技術及び本明細書に記載の技術、例えば、Ｘ線結晶解析法及び２次元核磁気共鳴法が含まれる。
【００８２】
「特異的結合」、「特異的に結合する」「選択的結合」、及び「選択的に結合する」は、ＢＢＡの抗体又は結合部分が、特定の抗原又はエピトープに対する検出可能な親和性を示し、一般的には他の抗原及びエピトープとの著しい交差反応性を示さないことを意味する。「検出可能な」又は好ましい結合には、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９Ｍ−１、又は１０−１０Ｍ、又はそれより更に低いＫｄ値の解離定数（Ｋｄ）での結合が含まれる。１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満の値を有する解離定数が、より好ましい（より低い値の解離定数は、より高い結合親和性を示し、従って１０−７のＫｄは、１０−８のＫｄよりも低値の（より良好な）結合親和性を示すことに留意されたい）。本明細書に示されている値の中間にある値も本開示の範囲内にあり、好ましい結合親和性は、ある範囲の解離定数により、例えば１０−６〜１０−１０Ｍ、好ましくは１０−７〜１０−１０Ｍ、より好ましくは１０−８〜１０−１０Ｍ以下により示されていてもよい。「著しい交差反応性を示さない」結合部分は、それが交差反応しない実体（例えば、タンパク質性実体）に検出可能には結合しないであろう部分である。特異的又は選択的結合は、そのような結合を決定するための当技術分野で認識されている任意の手段により、例えばスキャッチャード分析及び／又は競合結合アッセイにより決定することができる。
【００８３】
解離定数（Ｋｄ）、及び従って結合親和性は、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、組換えＥｒｂＢ３を被検体として使用し、抗体をリガンドとして使用して、ＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で決定される）又は細胞結合アッセイを使用して便利に測定することができる。１つの実施形態では、ＢＢＡの結合部分は、抗原（ＥｒｂＢ３又はＩＧＦ−１Ｒのいずれか）に５０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）（つまり、５０ｎＭのＫｄにより示される結合親和性と少なくとも同じ程度に高い結合親和性）（例えば、４０ｎＭ、又は３０ｎＭ、又は２０ｎＭ、又は１０ｎＭ以下のＫｄ）で結合する。特定の実施形態では、ＢＢＡの結合部分は、抗原（ＥｒｂＢ３又はＩＧＦ−１Ｒのいずれか）に８ｎＭ以下のＫｄで結合する（例えば、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ、１．４ｎＭ、１．３ｎＭ、又は１ｎＭ以下）。他の実施形態では、結合部分は、およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、又は１０−１０Ｍ未満、又は更にそれ以下等の、およそ１０−７Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）で抗原（ＥｒｂＢ３又はＩＧＦ−１Ｒ）に結合し、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、つまり、所定の抗原以外の抗原、又は所定の抗原と緊密に関連した抗原）に対するその結合親和性よりも少なくとも２倍高い親和性（つまり、少なくとも２倍低いＫｄ値）で所定の抗原に結合する。
【００８４】
用語「ＩＣ５０」は、最大応答の５０％阻害を提供する、つまり応答を、最大応答と基線との中間レベルに低減するＢＢＡの濃度を指す。ＩＣ５０値は、例えば、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式に使用して、絶対的阻害定数（Ｋｉ）に変換することができる。
【００８５】
用語「核酸分子」は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図されている。核酸分子は、一本鎖であってもよく、又は二本鎖であってもよいが、典型的には二本鎖ＤＮＡである。
【００８６】
核酸分子は、細胞全体中に、細胞溶解産物中に、又は部分的に精製された形態若しくは実質的に純粋な形態で存在していてもよい。
【００８７】
用語「機能的に連結された」は、核酸配列が、別の核酸配列と機能的関係性を持つように配置されることを指す。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結されており、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的に連結されており、又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に機能的に連結されている。一般的に、「機能的に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合は、連続しており、且つリーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、ライゲーションにより、便利な制限部位で達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、従来の慣行に従って使用される。核酸は、別の核酸配列と機能的関係性を持つように配置される場合に「機能的に連結されている」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、コード配列の転写に影響及ぼすように連結されている場合、コード配列に機能的に結合されている。転写制御配列に関して、「機能的に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が、連続しており、２つのタンパク質コード領域を結合するのに必要な場合、連続し且つリーディングフレーム中にあることを意味する。
【００８８】
用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すことが意図されている。１つのタイプのベクターは、更なるＤＮＡセグメントがライゲーションされていてもよい円形二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）、更なるＤＮＡセグメントが、ＤＮＡセグメントによりコードされたタンパク質の発現を駆動することになるプロモーター（例えば、ウイルスプロモーター）に機能的に連結されるように、ウイルスゲノムにライゲーションされてもよい。あるベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律的複製が可能である（例えば、細菌複製開始点を有する細菌ベクター、及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムに組み込まれる場合があり、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、あるベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を指図することが可能である。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
【００８９】
用語「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、発現ベクターが導入されている細胞を指すことが意図されており、その細胞は、増殖が可能であり、好ましくはベクターによりコードされたタンパク質の発現が可能である。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されていることが理解されるべきである。突然変異又は環境的影響のいずれかにより、ある修飾が次世代に生じる場合があるため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書で使用される場合、依然として用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【００９０】
用語「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の治療的又は予防的処置を指す。「治療」の方法では、疾患若しくは障害の１つ若しくは複数の症状又は疾患若しくは障害の再発を予防、治癒、遅延、重症度を低減、若しくは軽減するために、又はそのような治療をしない場合に予想される生存を越えて患者の生存を延長するために、本明細書で開示されたＢＢＡを患者に投与することが使用され、例えば、患者は、ＥｒｂＢ３及び／又はＩＧＦ−１依存性シグナル伝達に関連する疾患又は障害を有するか、又はそのような疾患若しくは障害を有する素因がある。
【００９１】
用語「ＥｒｂＢ３及び／又はＩＧＦ−１Ｒ依存性シグナル伝達に関連する疾患又は障害」は、本明細書で使用される場合、ＥｒｂＢ３及び／又はＩＧＦ−１Ｒのレベル増加が見出され、及び／又はＥｒｂＢ３及び／若しくはＩＧＦ−１Ｒに関与する細胞カスケードの活性化が見出される疾患状態及び／又は疾患状態に伴う症状を含む。ＥｒｂＢ３は、ＥｒｂＢ３のレベル増加が見出される場合に、ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ２等の他のＥｒｂＢタンパク質とヘテロ二量体化する。一般的に、用語「ＥｒｂＢ３及び／又はＩＧＦ−１Ｒ依存性シグナル伝達に関連する疾患又は障害」は、ＥｒｂＢ３及び／又はＩＧＦ−１Ｒの関与を必要とする任意の障害、その症状の開始、進行、又は持続を指す。例示的なＥｒｂＢ３媒介性及び／又はＩＧＦ−１Ｒ媒介性障害には、これに限定されないが、例えばがんが含まれる。
【００９２】
用語「がん」及び「がん性」は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的な状態を指すか又は記述する。がんの例には、これらに限定されないが、カルシノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。そのようながんのより多くの特定の例には、扁平上皮癌、肺小細胞癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫及び神経線維腫症等の膠細胞腫瘍、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、メラノーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、及び種々のタイプの頭頸部癌が含まれる。特定の実施形態では、本明細書で開示された方法を使用して治療されるがんは、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、腎癌、胃腸／結腸癌、肺癌、及び前立腺癌から選択される。本明細書で開示された方法により治療するための他のがんは、下記の「ＢＢＡを使用する方法」の項に更に記述されている。
【００９３】
用語「有効量」は、本明細書で使用される場合、患者に投与した際に、本明細書に記載のような、ＥｒｂＢ３及び／又はＩＧＦ−１依存性シグナル伝達に関連する疾患又は障害の治療、予後、又は診断を達成するのに十分なＢＢＡの量を指す。治療上有効量は、治療されている患者及び疾患状態、患者の体重及び年齢、疾患状態の重症度、及び投与方法等に応じて変動することになり、当業者であれば容易に決定することができる。７０ｋｇの患者に投与する用量は、例えば、約１μｇ〜約５０００ｍｇ、約２μｇ〜約４５００ｍｇ、約３μｇ〜約４０００ｍｇ、約４μｇ〜約３，５００ｍｇ、約５μｇ〜約３０００ｍｇ、約６μｇ〜約２５００ｍｇ、約７μｇ〜約２０００ｍｇ、約μｇ〜約１９００ｍｇ、約９μｇ〜約１，８００ｍｇ、約１０μｇ〜約１，７００ｍｇ、約１５μｇ〜約１，６００ｍｇ、約２０μｇ〜約１，５７５ｍｇ、約３０μｇ〜約１，５５０ｍｇ、約４０μｇ〜約１，５００ｍｇ、約５０μｇ〜約１，４７５ｍｇ、約１００μｇ〜約１，４５０ｍｇ、約２００μｇ〜約１，４２５ｍｇ、約３００μｇ〜約１，０００ｍｇ、約４００μｇ〜約９７５ｍｇ、約５００μｇ〜約６５０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約６２５ｍｇ、約１ｍｇ〜約６００ｍｇ、約１．２５ｍｇ〜約５７５ｍｇ、約１．５ｍｇ〜約５５０ｍｇ、約２．０ｍｇ〜約５２５ｍｇ、約２．５ｍｇ〜約５００ｍｇ、約３．０ｍｇ〜約４７５ｍｇ、約３．５ｍｇ〜約４５０ｍｇ、約４．０ｍｇ〜約４２５ｍｇ、約４．５ｍｇ〜約４００ｍｇ、約５ｍｇ〜約３７５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約３５０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約３２５ｍｇ、約３０ｍｇ〜約３００ｍｇ、約４０ｍｇ〜約２７５ｍｇ、約５０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２２５ｍｇ、約９０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約８０ｍｇ〜約１７５ｍｇ、約７０ｍｇ〜約１５０ｍｇ、又は約６０ｍｇ〜約１２５ｍｇの抗体又はその抗原結合部分の範囲であってもよい。投与計画は、最適な治療応答を提供するために調節することができる。また、有効量は、抗体又はその抗原結合部分の任意の毒性又は有害効果（つまり、副作用）が最小限に抑えられるか、及び／又は有益な効果がそれを上回る量である。更なる投与計画は、下記の医薬組成物に関する項に更に記述されている。
【００９４】
用語「患者」は、予防的又は治療的処置のいずれかを受けているか又は受けることになるヒト対象を示す。例えば、本明細書で開示された方法及び組成物は、がんを有する患者を治療するために使用することができる。
【００９５】
用語「試料」は、患者に由来する組織、体液、又は細胞を指す。通常、組織又は細胞は、患者から取り出されることになるが、インビボ診断も企図される。固形腫瘍の場合、組織試料は、外科的に摘出された腫瘍から採取し、従来技術による検査用に調製することができる。リンパ腫及び白血病の場合、リンパ球、白血病細胞、又はリンパ組織を取得し、適切に調製することができる。特定の腫瘍の場合、尿、涙滴、血清、脳脊髄液、糞便、痰、細胞抽出液等を含む他の患者試料も有用であり得る。
【００９６】
用語「抗がん剤」及び「抗腫瘍剤」は、腫瘍、がん、及び悪性腫瘍等を治療するために使用される薬物を指す。薬物療法は、単独で、又は手術若しくは放射線療法等の他の治療と組み合わせて使用することができる。関与する器官の性質に応じて、幾つかのクラスの薬物をがん治療に使用することができる。例えば、乳癌は、一般的にエストロゲンにより刺激され、性ホルモンを不活性化する薬物で治療することができる。同様に、前立腺癌は、アンドロゲン（男性ホルモン）を不活性化する薬物で治療することができる。本明細書に開示のある方法において、本明細書に開示のＢＢＡと組み合わせて使用するための抗がん剤には、中でも付録Ａに列挙されたものが含まれるが、それらは限定的であると解釈されるべきでない。１つ又は複数の抗がん剤は、本明細書で開示されたＢＢＡの投与と同時に、又は投与前に、又は投与後のいずれで投与されてもよい。
【００９７】
用語「抗がん治療理学療法」は、がんの治療又はがん細胞の増殖阻害に有効な薬物又は他の形態の治療剤の投与以外の治療を指す。そのような抗がん理学療法の非限定的な例には、外科手術、及び熱又は電離放射線による治療が含まれる。
【００９８】
更なる定義が、本明細書の全体にわたって見出される場合がある。
【００９９】
ＩＩ．ｓｃＦｖ及びＢＢＡ並びにその調製
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に対応するアミノ酸配列を有するか又は含む単鎖抗体ｓｃＦｖ  ＡＢ２−２１、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対応するアミノ酸配列を有するか又は含む単鎖抗体ｓｃＦｖ  ＡＢ５−７が、本明細書で例として提供されている。
【０１００】
本明細書で提供されるＢＢＡは、以下の３つの機能的に別個の成分を含む：ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する第１の結合部分、ＥｒｂＢ３と特異的に結合する第２の結合部分、並びに第１及び第２の結合部分を、例えば共有結合で一緒に接続して単一分子を形成する連結部分。これらの成分の各々は、下記に更に記述されている。
【０１０１】
Ａ．ＩＧＦ−１Ｒ結合部分
ＢＢＡの１つの結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する。好ましくは、結合部分は抗体であるが（つまり、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体）、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する他の結合部分も、ＢＢＡでの使用に好適である。抗体は、例えば、完全長抗体、又はＦａｂ若しくはＦ（ａｂ）'２断片等の、その抗原結合性断片若しくは部分であってもよい。抗体は、例えば、ヒト又はヒト化抗体であってもよい（又はヒト若しくはヒト化可変領域を含む）。更に、抗体はキメラ抗体であってもよい。例示的なＩＧＦ−１Ｒ結合部分は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、例えば、ヒト単鎖抗体である。ＢＢＡで使用するのに好適な抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｓｃＦｖの一例は、ＡＢ５−７  ｓｃＦｖであり、そのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されている。或いは、ＣＰ−７５１，８７１（Ｐｆｉｚｅｒ社製）、ＩＭＣ−Ａ１２（Ｉｍｃｌｏｎｅ社製）、Ｒ１５０７（Ｇｅｎｍａｂ社製）、ＭＫ−０６４６（Ｍｅｒｃｋ社製）、ＡＭＧ４７９（Ａｍｇｅｎ社製）、及びＡＶＥ−１６４２（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ社製）等の当技術分野で公知の他の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ＢＢＡでの使用に適している場合がある。更に、ＢＢＡで使用される他の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、下記で更に詳述されている、抗体を作製及び選択するための標準的方法を使用して調製することができる。
【０１０２】
Ｂ．ＥｒｂＢ３結合部分
ＢＢＡの別の結合部分は、ＥｒｂＢ３と特異的に結合する。好ましくは、結合部分は抗体であるが（つまり、抗ＥｒｂＢ３抗体）、ＥｒｂＢ３と特異的に結合する他の結合部分も、ＢＢＡでの使用に好適である。抗体は、例えば、完全長抗体、又はＦａｂ若しくはＦ（ａｂ）'２断片等の、その抗原結合性断片若しくは部分であってもよい。抗体は、例えば、ヒト又はヒト化抗体であってもよい（又はヒト若しくはヒト化可変領域を含む）。更に、抗体はキメラ抗体であってもよい。ＥｒｂＢ３結合部分は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、例えば、ヒト単鎖抗体であってもよい。ＢＢＡで使用するに好適な抗ＥｒｂＢ３  ｓｃＦｖの例は、ＡＢ２−３  ｓｃＦｖ−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＡＢ２−６  ｓｃＦｖ−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、及びＡＢ２−２１  ｓｃＦｖ−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４である。或いは、Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社による国際公開公報第２００８／１００６２４号及びＭｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社に帰属する米国特許出願公開第２００９０２９１０８５号に記載されている抗体、１Ｂ４Ｃ３（Ｕ３  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ社製）、及びＵ３−１２８７（Ｕ３  Ｐｈａｒｍａ／Ａｍｇｅｎ社製）等の当技術分野で公知の他の抗ＥｒｂＢ３抗体を、ＢＢＡに使用することができる。更に、ＢＢＡで使用される他の抗ＥｒｂＢ３抗体は、下記で更に詳述されている、抗体を作製及び選択するための標準的方法を使用して調製することができる。
【０１０３】
ＢＢＡに使用することができる更なるモノクローナル抗体（つまり、抗ＩＧＦ−１Ｒ及び抗ＥｒｂＢ３抗体）は、様々な公知の技術を使用して生成することができる。特定の実施形態では、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【０１０４】
Ｃ．連結部分
ＢＢＡの連結部分は、典型的にはタンパク質性分子であるが、２つの結合部分を結合するための、当技術分野で公知の他の化学リンカーも、ＢＢＡでの使用に好適である。１つの実施形態では、連結部分は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含み、そのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４に示されている。別の実施形態では、連結部分は、３４位がセリンで置換され、５０３位がグルタミンで置換された突然変異型のヒト血清アルブミンを含む。これらの置換は、分子の血清中半減期を増強するためになされた。この突然変異型のＨＳＡ（ｍＨＳＡ）のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５に示されている。ｍＨＳＡのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６に示されている。この突然変異型のＨＳＡ、及びＢＢＡのリンカーとしてのその使用は、Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社によるＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４０２５９に更に記述されている。
【０１０５】
更なる実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３のリンカーは、Ｎ末端が４個のアミノ酸及びＣ末端が６個のアミノ酸で伸長されており（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４のリンカーは、Ｎ末端が１２個のヌクレオチド及びＣ末端が１８個のヌクレオチドで伸長されており（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５のリンカーは、Ｎ末端が４個のアミノ酸及びＣ末端が６個のアミノ酸で伸長されており（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６のリンカーは、Ｎ末端が１２個のヌクレオチド及びＣ末端が１８個のヌクレオチドで伸長されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９）。
【０１０６】
１つの実施形態では、第１の結合部分は、連結部分のアミノ末端（Ｎ末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）又はＮ末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ））に結合されており、第２の結合部分は、リンカー部分のカルボキシ末端（Ｃ末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）又はＣ末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ））に結合されている。別の実施形態では、第２の結合部分は、連結部分のアミノ末端（Ｎ末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）又はＮ末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ））に結合されており、第１の結合部分は、リンカー部分のカルボキシ末端（Ｃ末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）又はＣ末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ））に結合されている。
【０１０７】
突然変異ＨＳＡリンカーを含む例示的なＢＢＡは、ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−３Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）、ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−６Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）、ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−２１Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）、ＡＢ２−３Ｎ／ＡＢ５−７Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）、ＡＢ２−６Ｎ／ＡＢ５−７Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）、及びＡＢ２−２１Ｎ／ＡＢ５−７Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）である。そのような結合剤の結合活性、アンタゴニスト活性、及び腫瘍増殖阻害活性は、下記の実施例で更に詳述されている。好ましくは、実施例３及び４で実証されているように、ＢＢＡは、以下の機能的特性の１つ又は複数を示す：（ｉ）ＩＧＦ−１誘導性のＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する；（ｉｉ）ヘレグリン（ＨＲＧ）誘導性又はベータセルリン（ＢＴＣ）誘導性のＥｒｂＢ３リン酸化を阻害する；（ｉｉｉ）ＩＧＦ−１誘導性のＡＫＴリン酸化を阻害する；（ｉｖ）腫瘍細胞の増殖を阻害する；（ｖ）腫瘍球状体の増殖を阻害する。これら機能的特性の各々を評価するための方法は、下記の実施例３及び４に更に詳述されている。
【０１０８】
ＢＢＡをコードする核酸は、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して、例えば、第１の結合部分をコードする核酸分子及び第２の結合部分をコードする核酸を、リンカー部分をコードする核酸にインフレームでライゲーションすることにより調製することができる。ＢＢＡをコードする核酸分子を発現ベクターに導入し、その結果生じたＢＢＡ発現ベクターを、リンパ腫細胞等の宿主細胞に導入する（例えば、形質移入、形質導入、又は感染により）ことにより、本明細書で提供されるＢＢＡを発現する方法が、本明細書で更に提供される。その後、その結果生じたＢＢＡ宿主細胞を培養してＢＢＡを発現させ、それを宿主細胞又は宿主細胞が増殖されている培地から回収することができる。ＢＢＡの構築及び発現は、実施例１に更に記述されている。組換えにより発現されたＢＢＡは、下記の実施例２に記述されている手法等の、種々のクロマトグラフィー手法を使用して精製することができる。
【０１０９】
他の実施形態では、本明細書に記載のＢＢＡは、下記の式により表すことができる：
Ａ−Ｌ−Ｂ
式中、Ａ、Ｌ、及びＢの順序は、Ｎ末端からＣ末端であり、（ｉ）Ａは、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する結合部分であり、Ｌは、リンカー部分であり、Ｂは、ＥｒｂＢ３と特異的に結合する結合部分であるか、又は（ｉｉ）Ａは、ＥｒｂＢ３と特異的に結合する結合部分であり、Ｌは、リンカー部分であり、Ｂは、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する結合部分である。種々の実施形態では、リンカー部分「Ｌ」は、例えば、単量体リンカー、二量体リンカー、又は三量体リンカーであってもよい。種々の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒと特異的に結合する結合部分（「Ａ」又は「Ｂ」）は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、ＶＨ断片、ＶＬ断片、又は上記に詳述されている他の抗原結合性断片等の抗体又は抗体断片であってもよい。種々の実施形態では、タンデム結合部分は、１、２、又は３価の結合価を有する。種々の実施形態では、ＥｒｂＢ３と特異的に結合する結合部分（「Ａ」又は「Ｂ」）は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、ＶＨ断片、ＶＬ断片、又は上記に詳述されている他の抗原結合性断片等の抗体又は抗体断片であってもよい。別の実施形態では、リンカー部分「Ｌ」は、化学的に及び生物学的に不活性である。更に他の実施形態では、リンカー部分「Ｌ」又はＢＢＡ全体は、例えば、グリコシル化、無グリコシル化、又は過剰グリコシル化されていてもよい。更に他の実施形態では、「Ａ」、「Ｌ」、及び／又は「Ｂ」をコードする配列（複数可）は、安定化、最適化、安定化及び最適化、並びに／又は均質化されていてもよい。種々の実施形態では、リンカー部分は、例えば、ヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリン、ヒトＴＲＡＩＬ、ヒトＬＩＧＨＴ、ヒトＣＤ４０Ｌ、ヒトＴＮＦα、ヒトＣＤ９５、ヒトＢＡＦＦ、ヒトＴＷＥＡＫ、ヒトＯＸ４０、又はヒトＴＮＦβの断片であってもよい。
【０１１０】
従って、式Ａ−Ｌ−Ｂを含む実施形態の更なる非限定的な例は、下記の１４個の表（表Ａ〜Ｎ）に示されており、示されている配列は全て、アミノ酸配列である。示されている組み合わせのアミノ酸配列をコードする対応するヌクレオチド配列を組み合わせた構築物も企図され、そのような対応するヌクレオチド配列は、配列表に提供されている。下記の表Ａ〜Ｎの各々では、各列の個々の配列の各々により示されている各部分と、その表の他の列の各々に示されている任意の部分との、あらゆる可能なＡ−Ｌ−Ｂの組み合わせが、新規のＢＢＡとして企図される。
【０１１１】
（表Ａ）
2013507926.tif 000002
【０１１２】
（表Ｂ）
2013507926.tif 000003
【０１１３】
（表Ｃ）
2013507926.tif 000004
【０１１４】
（表Ｄ）
2013507926.tif 000005
【０１１５】
（表Ｅ）
2013507926.tif 000006
【０１１６】
（表Ｆ）
2013507926.tif 000007
【０１１７】
別の実施形態では、本発明は、Ａ＝抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体断片＋同時発現抗体パートナー（二重鎖抗体分子を形成する）、Ｌ＝単量体、二量体、又は三量体リンカー、及びＢ＝抗ＥｒｂＢ３  ｓｃＦｖ抗体のＢＢＡを提供する。下記の表Ｇ、Ｈ、及びＩのＡ、Ｌ、及びＢのあらゆる可能な組み合わせが企図されるが、但し「Ａ」部分の抗体対の場合、同じ抗体に由来する軽鎖及び重鎖対が維持される（例えば、下記の表Ｇ、Ｈ、及びＩに示されているように、抗体５−７に由来する断片は、抗体５−７パートナーと対になり、抗体５−６に由来する断片は、抗体５−６パートナーと対になる等）。
【０１１８】
（表Ｇ）
2013507926.tif 000008
【０１１９】
（表Ｈ）
2013507926.tif 000009
【０１２０】
（表Ｉ）
2013507926.tif 000010
【０１２１】
別の実施形態では、本発明は、Ａ＝抗ＥｒｂＢ３  ｓｃＦｖ抗体、Ｌ＝単量体、二量体、又は三量体リンカー、及びＢ＝抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体断片＋同時発現抗体パートナー（二重鎖抗体分子を形成する）のＢＢＡを提供する。下記の表ＪのＡ、Ｌ、及びＢのあらゆる可能な組み合わせが本発明により包含されることが意図されているが、但し「Ｂ」部分の抗体対の場合、同じ抗体に由来する軽鎖及び重鎖対が維持される（例えば、下記の表Ｊに示されているように、Ａｂ５−７に由来するＦａｂ  ＨＣは、Ａｂ５−７パートナーと対になり、Ａｂ５−６に由来するＦａｂ  ＨＣは、Ａｂ５−６パートナーと対になる等）。
【０１２２】
（表Ｊ）
2013507926.tif 000011
【０１２３】
別の好ましい実施形態では、本発明は、Ａ＝抗ＥｒｂＢ３抗体断片＋同時発現抗体パートナー（二重鎖抗体分子を形成する）、Ｌ＝単量体、二量体、又は三量体リンカー、及びＢ＝抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｓｃＦｖ抗体のＢＢＡを提供する。下記の表Ｋ及びＭのＡ、Ｌ、及びＢのあらゆる可能な組み合わせが本発明により包含されることが意図されているが、但し「Ａ」部分の抗体対の場合、同じ抗体に由来する軽鎖及び重鎖対が維持される（例えば、下記の表Ｋ及びＭに示されているように、抗体２−３に由来する断片は、抗体２−３パートナーと対になり、抗体２−１４に由来する断片は、抗体２−１４パートナーと対になる等）。
【０１２４】
（表Ｋ）
2013507926.tif 000012
【０１２５】
（表Ｍ）
2013507926.tif 000013
【０１２６】
別の実施形態では、本発明は、Ａ＝抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｓｃＦｖ抗体、Ｌ＝単量体、二量体、又は三量体リンカー、及びＢ＝抗ＥｒｂＢ３抗体断片＋同時発現抗体パートナー（二重鎖抗体分子を形成する）のＢＢＡを提供する。下記の表ＮのＡ、Ｌ、及びＢのあらゆる可能な組み合わせが本発明により包含されることが意図されているが、但し「Ｂ」部分の抗体対の場合、同じ抗体に由来する軽鎖及び重鎖対が維持される（例えば、下記の表Ｎに示されているように、Ａｂ２−３に由来するＦａｂ  ＨＣは、Ａｂ２−３パートナーと対になり、Ａｂ２−１４に由来するＦａｂ  ＨＣは、Ａｂ２−１４パートナーと対になる等）。
【０１２７】
（表Ｎ）
2013507926.tif 000014
【０１２８】
ＩＩＩ．医薬組成物
別の態様では、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された、本明細書で開示されたＢＢＡ又は単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）の１つ又は複数を含有する組成物、例えば医薬組成物が提供される。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、並びに等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または上皮投与（例えば、注射又は点滴による）に好適である。投与経路に応じて、ＢＢＡ又はｓｃＦｖは、タンパク質を不活化する場合がある酸の作用及び他の自然条件からＢＢＡを保護するための物質でコーティングされていてもよい。
【０１２９】
医薬組成物は、単独で、又は併用療法で、つまり他の剤と組み合わせて投与することができる。例えば、併用療法は、以下に記載の抗がん剤等の少なくとも１つの更なる治療剤と共に本開示のＢＢＡを含むことができる。医薬組成物は、放射線療法及び／又は外科手術等の、別の抗がん治療理学療法と併せて投与することもできる。
【０１３０】
本開示の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。当業者であれば理解するように、投与の経路及び／又は方法は、所望の結果に応じて様々であろう。
【０１３１】
ある投与経路により本明細書で提供された組成物を投与するためには、その不活性化を防止する物質でＢＢＡをコーティングすることが必要であるか、又はその不活性化を防止する物質と共にＢＢＡを同時投与する必要がある場合がある。例えば、適切な担体、例えばリポソーム又は希釈剤中のＢＢＡを、患者に投与してもよい。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水及び緩衝水溶液が含まれる。リポソームには、水中油中水型ＣＧＦ乳剤、並びに従来のリポソームが含まれる。
【０１３２】
薬学的に許容される担体には、無菌注射用溶液又は分散液の即時調製用の無菌水溶液又は分散液及び無菌粉末が含まれる。薬学的活性物質用のそのような媒体及び剤の使用は、当技術分野で公知である。あらゆる従来の媒体又は剤は、活性化合物と非適合性でない限り、本明細書で提供された医薬組成物におけるその使用が企図される。補完的な活性化合物（例えば、下記に開示されている抗がん剤）を、組成物に組み込むこともできる。
【０１３３】
治療用組成物は、典型的には、製造条件下及び保管条件下で無菌及び安定的でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に好適な他の規則的構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動度は、例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合は必要とされる粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、又は塩化ナトリウムを含むことは有用であろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含むことによりもたらすことができる。
【０１３４】
無菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、上記で列挙された成分の１つ又は組み合わせと共に適切な溶媒に組み込み、その後必要に応じて滅菌精密ろ過することにより調製することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒及び上記で列挙されたものからの必要とされる他の成分を含有する無菌媒体に組み込むことにより調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、調製方法には、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）が含まれ、それらは、活性成分と、以前に滅菌ろ過されたその溶液に由来する任意の更なる所望の成分との粉末を産出する。
【０１３５】
投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するために調節することができる。例えば、単一のボーラス又は点滴で投与してもよく、幾つかの分割用量を、ある時間にわたって投与してもよく、又は用量は、治療状況の緊急性により示されるのと比例して、低減又は増加されてもよい。例えば、本明細書で開示されたＢＢＡは、例えば静脈内若しくは皮下注射により週１回若しくは２回、又は例えば静脈内若しくは皮下注射により月１回若しくは２回で投与してもよい。
【０１３６】
好適な用量範囲及び投与計画の非限定的な例には、２〜５０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の週１回、又は週２回、又は３日毎に１回、又は２週毎に１回、又は月１回投与、及び１〜１００ｍｇ／ｋｇの週１回、又は週２回、又は３日毎に１回、又は２週毎に１回、又は月１回投与が含まれる。種々の実施形態では、ＢＢＡは、３．２ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、又は４０ｍｇ／ｋｇの用量で、週１回、又は週２回、又は３日毎１回、又は２週毎に１回、又は月１回のタイミングで投与される。好適な投与スケジュールには、３日毎に１回、５日毎に１回、７日毎に１回（つまり、週１回）、１０日毎１回、１４日毎に１回（つまり、２週毎に１回）、２１日毎に１回（つまり、３週毎に１回）、２８日毎に１回（つまり、４週毎に１回）、及び月１回が含まれる。
【０１３７】
投与の容易性及び用量の均一性のため、単位剤形の非経口組成物を製剤化することが、特に有利である。単位剤形は、本明細書で使用される場合、個々の患者治療用の単位用量に適合する物理的に個別の単位（例えば、バイアル又はアンプル中の）を指し、各単位は、必要とされる医薬担体と共に所望の治療効果を生じさせることが予測される所定量のＢＢＡを含有する。
【０１３８】
薬学的に許容される酸化防止剤の例には、以下のものが含まれる：（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び亜硫酸ナトリウム等の水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、及びアルファ−トコフェロール等の油溶性抗酸化剤；及び（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、及びリン酸等の金属キレート剤。
【０１３９】
語句「非経口投与」及び「非経口で投与される」は、本明細書で使用される場合、通常は注射による、腸内投与及び局所投与以外の投与方法を意味し、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、胸骨内の注射及び点滴が含まれる。
【０１４０】
医薬組成物に使用することができる好適な水性及び非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物、オリーブ油等の植物油、並びにオレイン酸エチル等の注射用有機エステルが含まれる。適切な流動度は、例えば、レシチン等のコーティング材料の使用により、分散液の場合は必要とされる粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１４１】
また、これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤等の更なる剤を含有していてもよい。
【０１４２】
微生物存在の予防は、上記の殺菌処理と、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、並びにフェノールソルビン酸等の含有との両方により保証することができる。糖及び塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含むことも望ましい場合がある。加えて、注射用医薬品形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅延させる剤の含有によりもたらすことができる。
【０１４３】
医薬品としてヒト及び動物に投与される場合、ＢＢＡは、薬学的に許容される担体と組み合わせて、例えば、０．００１〜９０％又は０．００５〜７０％又は０．０１〜３０％の活性成分を含有する医薬組成物として与えることができる。
【０１４４】
医薬組成物中の活性成分（例えば、ＢＢＡ）の実際の用量レベルは、特定の患者、組成物、及び投与方法で、患者に毒性を与えずに所望の治療応答を達成するのに効果的な量の活性成分を得るために、変動させることができる。選択される用量レベルは、使用される特定の組成物又はそのエステル、塩、若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用されている特定の化合物の排泄速度、治療期間、他の薬物、使用される特定のＢＢＡ（複数可）と組み合わせて使用される化合物及び／又は物質、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、及び以前の病歴、並びに医学分野で周知の類似要因を含む様々な薬物動態学的要因に依存するだろう。当技術分野で通常の技術を有する医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定及び処方することができる。例えば、医師は、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルから用量を開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増加させることができる。一般的に、好適な１日用量は、いかなる許容されない有害効果も引き起こさずに治療効果を再現性よくもたらすのに効果的な最も高い用量である活性成分の量であろう。そのような有効量は、一般的に上述の要因に依存するだろう。投与は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下であってもよい。必要に応じて、治療用組成物の有効１日用量は、その日のうちに適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、又は６つ以上の部分用量として、随意に単位剤形で投与されてもよい。
【０１４５】
治療用組成物は、当技術分野で公知の医療デバイスを用いて投与することができる。例えば、ある実施形態では、本明細書で提供された治療用組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号、又は第４，５９６，５５６号に開示されているデバイス等の無針皮下注射デバイスを用いて投与することができる。周知の移植片の例には、以下のものが含まれる：米国特許第４，４８７，６０３号、そこには、制御された速度で薬剤を放出するための埋込可能なマイクロ注入ポンプが開示されている；米国特許第４，４８６，１９４号、そこには、皮膚を通して薬剤を投与するために治療デバイスが開示されている；米国特許第４，４４７，２３３号、そこには、正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプが開示されている；米国特許第４，４４７，２２４号、そこには、連続薬物投与用の流量可変の埋込可能な注入装置が開示されている；米国特許第４，４３９，１９６号、そこには、多チャンバー区画を有する浸透圧薬物送達システムが開示されている；及び米国特許第４，４７５，１９６号、そこには、浸透圧薬物送達システムが開示されている。多くの他のそのような移植片及び送達システム等が、当業者に公知である。
【０１４６】
ＩＶ．ＢＢＡを使用する方法
また、様々なエクスビボ及びインビボ検出、診断、及び治療応用にＢＢＡを使用する方法が提供される。ＢＢＡは、ＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３と特異的に結合するため、これらの剤は、これらの受容体のいずれか又は両方の発現を検出するために、並びに免疫親和性技術によりタンパク質を精製するために使用することができる。更に、本明細書で開示されたＢＢＡは、様々ながんを含む、ＥｒｂＢ３及び／又はＩＧＦ−１Ｒ依存性シグナル伝達に関連する疾患又は障害を治療するために使用することができる。
【０１４７】
１つの実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法が提供され、該方法は、腫瘍細胞を、腫瘍細胞の増殖が阻害されるように、本明細書に記載のＢＢＡと接触させることを含む。
【０１４８】
別の実施形態では、本明細書で開示されたＢＢＡを、疾患又は障害を治療するのに有効な量で患者に投与することにより、ＥｒｂＢ３及び／又はＩＧＦ−１Ｒ依存性シグナル伝達に関連する疾患又は障害を治療するための方法が提供される。好適な疾患又は障害には、例えば、これらに限定されないが、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、腎癌、消化管癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、及び前立腺癌を含む様々ながんが含まれる。
【０１４９】
また更に、患者のＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３発現腫瘍を治療する方法が提供され、該方法は、腫瘍が治療されるように、本明細書に記載のＢＢＡを投与することを含む。好ましくは、腫瘍は、肺癌、肉腫、結腸直腸癌、頭頸部癌、膵臓癌、及び乳癌からなる群から選択される。１つの実施形態では、腫瘍は、非小細胞肺癌である肺癌である。別の実施形態では、腫瘍は、ユーイング肉腫である肉腫である。別の実施形態では、腫瘍は、タモキシフェン抵抗性エストロゲン受容体陽性乳癌である乳癌である。別の実施形態では、腫瘍は、ゲフィチニブ抵抗性肺癌である肺癌である。別の実施形態では、腫瘍は、トラスツズマブ抵抗性転移性乳癌である乳癌である。
【０１５０】
別の態様では、腫瘍を治療する方法は、ＢＢＡと組み合わせて第２の抗がん剤を投与することを更に含む。そのような組み合わせ及び治療方法において第２の抗がん剤として役目を果たすことができる好適な抗がん剤の例は、付録Ａに列挙されている。従って、例えば、付録Ａに列挙されているものから選択される第２の抗がん剤と一緒に、典型的には少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と一緒に、ＢＢＡ、例えば本明細書に記載のＢＢＡを含む新規の組成物が企図される。それに加えて又はその代わりに、腫瘍を治療する方法は、ＢＢＡと組み合わせて第２の抗がん治療理学療法を施すことを更に含む。そのような併用方法において「第２の抗がん治療理学療法」として役目を果たすことができる理学療法の非限定的な例には、外科手術及び電離放射線が含まれる。
【０１５１】
ある態様では、本明細書で開示されたＢＢＡは、患者に投与される。
【０１５２】
別の実施形態では、本明細書で開示されたＢＢＡを（例えば、エクスビボ又はインビボで）、対象に由来する細胞と接触させ、細胞上のＥｒｂＢ３及び／又はＩＧＦ−１Ｒに対する結合のレベルを測定することにより、ヒト対象のＥｒｂＢ３及び／又はＩＧＦ−１Ｒ依存性シグナル伝達に関連する疾患又は障害（例えば、がん）を診断するための方法が提供される。ＥｒｂＢ３及び／又はＩＧＦ−１Ｒに対する異常に高いレベルの結合は、対象が、ＥｒｂＢ３及び／又はＩＧＦ−１Ｒ依存性シグナル伝達に関連する疾患又は障害を有する可能性が高いことを示す。
【０１５３】
また、本明細書で開示されたＢＢＡを含むキットが提供される。キットは、キットの内容物の使用目的を示す表示を含んでいてもよく、随意に、ＥｒｂＢ３及び／又はＩＧＦ−１Ｒ依存性シグナル伝達に関連する疾患又は障害を治療又は診断する、例えば腫瘍を診断又は治療する際の、キットの使用説明書を含む。表示という用語は、キット上に又はキットと共に提供されているか、又は別様にキットに付随する任意の書面、広告、又は記録物を含む。
【実施例】
【０１５４】
以下の例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【０１５５】
材料及び方法
別様の記述がない限り、実施例の全体にわたって、以下の物質及び方法が使用される。一般的に、本開示の技術の実施には、別様の指定がない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば抗体技術）、薬理学、薬学の従来技術、及びポリペプチド調製における標準的技術が使用される。
【０１５６】
ヘレグリン
これら実施例及び図に使用される場合、ＨＲＧは、ヘレグリン１ベータ１、ＨＲＧ１−Ｂ、ＨＲＧ−β１、ニューレグリン１、ＮＲＧ１、ニューレグリン１ベータ１、ＮＲＧ１−ｂ１、及びＨＲＧ  ＥＣＤ等として様々に知られているヘレグリンのアイソフォームを指す。ＨＲＧは、市販されている、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製の３７７−ＨＢ−０５０／ＣＦである。
【０１５７】
ＩＧＦ−１
これら実施例及び図に使用される場合、ＩＧＦ−１は、インスリン増殖因子１を指す。組換えヒトＩＧＦ−１は、市販されている、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製の２９１−ＧＩ−０５０／ＣＦである。
【０１５８】
細胞株
下記の実験で使用されている細胞株は全て、示されるように、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州）又は米国国立癌研究所（ＮＣＩ）、例えばＤｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＤＣＴＤ）から取得することができる。
・ＭＣＦ７  −ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−２２
・Ｔ４７Ｄ  −ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−１３３
・ＯＶＣＡＲ８  −ＮＣＩ
・Ａ５４９  −ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ−１８５
・ＡＤＲｒ  −ＮＣＩ
・ＢｘＰＣ−３  −ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１６８７
・ＤＵ１４５  −ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−８１
【０１５９】
対照抗体
米国特許出願公開第２００９０２９１０８５号に記載のＡｂ＃６（ＭＭ−１２１）を、抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧ抗体対照として使用した。マウス抗ヒトＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体ｍＡｂ３９１（ＩｇＧ１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から市販されている、カタログ番号ＭＡＢ３９１）を、抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ抗体対照として使用する。
【０１６０】
実施例１：単量体ＢＢＡの調製及び発現
ＢＢＡは、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して、結合部分の各々をコードする核酸を、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）リンカーをコードするＤＮＡにライゲーションして構築することができる。より詳しくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５に示されるアミノ酸配列を有する突然変異型のＨＳＡリンカーをコードする核酸、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６に示されるヌクレオチド配列を使用する。
【０１６１】
一組の３つの異なる剤では、リンカーのＮ末端は、ＡＢ５−７  ｓｃＦｖ（抗ＩＧＦ−１Ｒ）をコードする核酸に機能的に連結されており、リンカーのＣ末端は、ＡＢ２−３、ＡＢ−２−６、又はＡＢ２−２１  ｓｃＦｖ（抗ＥｒｂＢ３）のいずれかをコードする核酸に機能的に連結されている。これら３つの剤は、本明細書では、ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−３Ｃ、及びＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−６Ｃ、及びＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−２１Ｃと呼ばれる（表１１及び１２）。
【０１６２】
別の一組の３つの異なる剤では、リンカーのＮ末端は、ＡＢ２−３、ＡＢ２−６、又はＡＢ２−２１  ｓｃＦｖ（抗ＥｒｂＢ３）のいずれかをコードする核酸に機能的に連結されており、リンカーのＣ末端は、ＡＢ５−７  ｓｃＦｖ（抗ＩＧＦ−１Ｒ）をコードする核酸に機能的に連結されている。これら３つの剤は、本明細書では、ＡＢ２−３Ｎ／ＡＢ５−７Ｃ、ＡＢ２−６Ｎ／ＡＢ５−７Ｃ、及びＡＢ２−２１Ｎ／ＡＢ５−７Ｃと呼ばれる（表１１及び１２）。
【０１６３】
ＨＳＡが融合されたＢＢＡをコードする核酸を、単一分子として発現プラスミドにクローニングする。例示的な発現ベクターは、ｐＭＰ  １０Ｋ（ＳＥＬＥＸＩＳ社製）であり、例示的な細胞株は、ＣＨＯ−ｋ１−Ｓ（ＳＥＬＥＸＩＳ社製）である。発現プラスミドを線形化し（例えばＰｖｕ１を用いて）、その後ＱＩＡＱＵＩＣＫ精製（ＱＩＡＧＥＮ社製）する。ＣＨＯ細胞への形質移入には、リポフェクタミンＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＯｐｔｉＭｅｍＩ（Ｇｉｂｃｏ社製）中で使用する。形質移入した細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＦ１２Ｈａｍｓ培地で、２日間は淘汰圧をかけずに、その後４日間は淘汰圧をかけて回復させ、その後無血清培地に交換して淘汰圧をかけた。ＨＳＡが融合されたＢＢＡには、ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を、ＨＴ補充剤（ＧＩＢＣＯ社製）と共に使用する。
【０１６４】
実施例２：単量体ＢＢＡの精製
プロテインＡ親和性、陽イオン交換、及び陰イオン交換の３つのクロマトグラフィーステップを使用して、ＢＢＡを精製する。各々は、製造業者の説明書に従って実施することができる。プロテインＡ親和性ステップは、最も重要なクロマトグラフィーステップであり、それは、プロテインＡが、回収した細胞培養液（ＨＣＣＦ）等の複雑な溶液中でＢＢＡと選択的に及び効率的に結合し、単一ステップで９９．５％を超える生成不純物を、高収率及びハイスループットで除去するためである。このステップは、著しいウイルス除去も提供する。ＧＥ社製のＭＡＢＳＥＬＥＣＴを、プロテインＡ親和性樹脂として使用する。必要に応じて、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーの代わりに、プロテインＧ親和性クロマトグラフィーを使用してもよい。第２のクロマトグラフィーステップには、ＧＥ社製のＳＰＦＦ（スルホプロピルファストフロー）、アガロース系樹脂を、陽イオン交換樹脂として使用する。このステップは、宿主細胞不純物、及びＢＢＡの多量体型（凝集体）の除去を更に支援する。第３の最終クロマトグラフィーステップでは、ＧＥ社製のＱＳＦＦ（第四級アミンセファロースファストフロー）、アガロース系陰イオン交換樹脂が、ＳＰＦＦ貯留に由来するあらゆる微量ウイルス、エンドトキシン、及び宿主細胞不純物を除去することにより、産物の最終ポリッシングを支援する。
【０１６５】
実施例３：単量体ＢＢＡの結合及びアンタゴニスト活性
Ａ．ＢＢＡの結合親和性
１×１０５個のＭＣＦ７細胞及び１×１０５個のＡＤＲｒ細胞を、室温で２時間２μＭのＢＢＡと共にインキュベートし、その後１２回の連続３倍希釈をする。その後、ヤギ抗ＨＳＡ−Ａｌｅｘａ６４７結合抗体を検出抗体として使用して、細胞を４５分間氷上でインキュベートする。ＭＣＦ７及びＡＤＲｒ細胞に対するＢＢＡの細胞結合解離定数（結合親和性の尺度）を、ＦＡＣＳ（蛍光励起細胞分取）により評価し、各ＢＢＡの見かけ上の解離定数を決定する。以下の結果が得られた。
【０１６６】
（表１）ＢＢＡの解離定数
2013507926.tif 000015
【０１６７】
Ｂ．ＢＢＡのアンタゴニスト活性
（ｉ）ｐＩＧＦ−１Ｒ形成の阻害
ＩＧＦ−１ＲをアンタゴナイズするＢＢＡの能力を決定するために、剤の存在下におけるＩＧＦ−１Ｒリン酸化の阻害を検査した。２．５×１０４個のＡＤＲｒ細胞を、１  ＭのＢＢＡ又は抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧのいずれかと共に２４時間プレインキュベートし、その後９回の連続３倍希釈をして１０データ点の曲線を生成する。細胞を、１３ｎＭのＩＧＦ−１で１０分間処理する。ホスホ−ＩＧＦ−１Ｒ（ｐＩＧＦ−１Ｒ）を産生するＩＧＦ−１誘導性のＩＧＦ−１Ｒリン酸化を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製；カタログ番号ＤＹＣ１７７０）により測定して、ｐＩＧＦ−１Ｒ形成を阻害する剤の能力を評価する。以下の結果が得られた。
【０１６８】
（表２）ＢＢＡによるｐＩＧＦ−１Ｒ形成の阻害
2013507926.tif 000016
【０１６９】
このように、同様のＩＣ５０が観察され、ＢＢＡは、抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ抗体と同様にＩＧＦ−１誘導性のＩＧＦ−１Ｒリン酸化をアンタゴナイズすることが可能であることが示された。
【０１７０】
（ｉｉ）ｐＥｒｂＢ３形成の阻害
ＥｒｂＢ３をアンタゴナイズするＢＢＡの能力を決定するために、剤の存在下におけるＥｒｂＢ３リン酸化の阻害を検査した。（２．５，×１０４個のＡＤＲｒ細胞を、１  ＭのＢＢＡ又は抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧのいずれかと共に２４時間プレインキュベートし、その後９回の連続３倍希釈をして１０データ点の曲線を生成する。細胞を、５ｎＭのヘレグリン（ＨＲＧ）で１５分間処理する。ＨＲＧ誘導性のＥｒｂＢ３リン酸化を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製；カタログ番号ＤＹＣ１７６９）により測定して、ｐＥｒｂＢ３形成を阻害する剤の能力を評価する。モノクローナルＩｇＧ２抗ＥｒｂＢ３抗体（ＡＢ＃６）を対照として使用した。以下の結果が得られた。
【０１７１】
（表３）ＢＢＡ（及び比較用ＩｇＧ）によるＨＲＧ誘導性ｐＥｒｂＢ３形成の阻害
2013507926.tif 000017
Ｋｉ値は、２つの独立した実験の平均である。
【０１７２】
１０〜２０倍のＫｉの違いが、ＢＢＡと抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧとの間で観察され、ＢＢＡは、抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧ抗体と同様に、ＨＲＧ誘導性のＥｒｂＢ３リン酸化をアンタゴナイズすることが可能ではないことが示された。
【０１７３】
別の一組の実験では、ベータセルリン（ＢＴＣ）誘導性のＥｒｂＢ３リン酸化を検査する。２×１０４個のＡＤＲｒ細胞を、１μＭのいずれかのＢＢＡと共に１時間プレインキュベートし、その後９回の連続３倍希釈をして１０データ点の曲線を生成するか、又は５００ｎＭの抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧと共に１時間プレインキュベートし、その後９回の連続３倍希釈をして１０データ点の曲線を生成する。細胞を、５０ｎＭのＢＴＣで５分間処理する。ＢＴＣ誘導性のＥｒｂＢ３リン酸化を、ｐＥｒｂＢ３  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製；カタログ番号ＤＹＣ１７６９Ｅ）を使用して測定し、ｐＥｒｂＢ３形成を阻害する剤の能力を評価する。以下の結果が得られた。
【０１７４】
（表４）ＢＢＡ（及び比較用ＩｇＧ）によるＢＴＣ誘導性ｐＥｒｂＢ３形成の阻害
2013507926.tif 000018
【０１７５】
結果は、ＢＴＣ刺激性ｐＥｒｂＢ３シグナルは、ＢＢＡにより完全に阻害することができることを実証した。
【０１７６】
（ｉｉｉ）ＩＧＦ−１誘導性ｐＡＫＴ形成の阻害
ＩＧＦ−１Ｒ経路に沿った細胞内シグナル伝達を阻害するＢＢＡの能力を決定するために、ｐＡＫＴ形成を阻害する剤の能力を試験する。１．５×１０５個のＭＣＦ７細胞を、１２ウェルプレート中でＢＢＡと共に１時間プレインキュベートし（１μＭの高用量から開始し、合計９回の３倍希釈をして１０データ点の曲線を生成する）、その後１３．５ｎＭのＩＧＦ−１と共に１５分間プレインキュベートする。ＩＧＦ−１誘導性のＡＫＴリン酸化を、以下の抗体を使用してＥＬＩＳＡにより測定する：抗ＡＫＴ、クローンＳＫＢ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号０５−５９１）；ビオチン化抗ホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３特異的；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、カタログ番号５１０２）。検出は、ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号ＤＹ９９８）による。以下の結果が得られた。
【０１７７】
（表５）ＢＢＡによるｐＡＫＴ形成の阻害
2013507926.tif 000019
Ｋｉ値は、２つの独立した実験の平均である。
【０１７８】
表５に示されている結果は、表１に示されている結果とあわせると、ＩＧＦ−１誘導性ｐＡＫＴの阻害レベルが、ＢＢＡの結合親和性と相関することを実証する。即ち、剤のより強固な結合は、ｐＡＫＴ形成の阻害の向上に結び付く。
【０１７９】
（ｉｖ）ＩＧＦ２誘導性ｐＩＧＦ−１Ｒ及びｐＡＫＴ形成の阻害
別の一組の実験では、ＩＧＦ２誘導性のｐＩＧＦ−ＩＲ及びｐＡＫＴを検査する。２．５×１０４個のＭＣＦ７細胞を、１μＭのいずれかのＢＢＡと共に１時間プレインキュベートし、その後９回の連続３倍希釈をして１０データ点の曲線を生成するか、又は５００ｎＭからの抗ＩＧＦ−ＩＲ  ＩｇＧ１  ｍＡｂ３９１と共に１時間プレインキュベートし、その後９回の連続３倍希釈をして１０データ点の曲線を生成する。細胞を、１３ｎＭのＩＧＦ２で１５分間処理する。ＩＧＦ２誘導性ｐＩＧＦ−ＩＲを、ｐＩＧＦ−ＩＲ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号ＤＹＣ１７７０）により測定して、ｐＩＧＦ−１Ｒ形成を阻害する剤の能力を評価する。ＩＧＦ２誘導性ｐＡＫＴを、Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ社が開発したＥＬＩＳＡアッセイにより測定して、ｐＡＫＴ形成を阻害する剤の能力を評価する。以下の結果が得られた。
【０１８０】
（表６）ＢＢＡによるＩＧＦ２誘導性ｐＩＧＦ−１Ｒ形成の阻害
2013507926.tif 000020
【０１８１】
（表７）ＢＢＡによるＩＧＦ２誘導性ｐＡＫＴ形成の阻害
2013507926.tif 000021
【０１８２】
実施例４：単量体ＢＢＡの抗腫瘍活性
Ａ．腫瘍細胞増殖アッセイ
細胞性ＡＴＰの存在量を測定するルミネセンスに基づくアッセイであるＣＴＧアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製；カタログ番号ＰＲ−Ｇ７５７２）を使用して、腫瘍細胞増殖に対する二重特異的剤の効果をインビトロで検査する。３つの細胞株を検査する：ＡＤＲｒ、ＢｘＰＣ−３、及びＭＣＦ７、それらは、以下のレベルのＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３を発現する。
【０１８３】
（表８）細胞株受容体発現
2013507926.tif 000022
【０１８４】
ＣＴＧアッセイを実施するための最適増殖条件を決定するために、細胞数、培地／増殖因子（ＩＧＦ−１、ＨＲＧ）、及び時点を、３つの細胞株について滴定する。これらの最適化実験により、ＡＤＲｒ細胞株は、増殖因子に対して最小限の応答を示し、ＢｘＰＣ−３細胞株は、ＩＧＦ−１に良好に応答し、ＭＣＦ７細胞株は、ＩＧＦ−１及びＨＲＧの両方に良好に応答したことが実証された。阻害剤アッセイを実施するために選択された増殖条件は、１０％血清又は１％血清＋１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１及び１３５ｎｇ／ｍｌのＨＲＧである。以下の細胞数をＣＴＧアッセイに使用する：ＡＤＲｒ及びＭＣＦ７  −１２５０細胞／ウエル（６日目）、５０００細胞／ウエル（３日目）；ＢｘＰＣ−３  −２５００細胞／ウエル（６日目）、７５００細胞／ウエル（３日目）。細胞を、以下の用量の阻害剤と共に３日間又は６日間インキュベートする：１μＭ、２５０ｎＭ、６２．５ｎＭ、又は１５．６２５ｎＭ。プレートを室温で２０分間平衡化し、その後ＣＴＧ試薬を室温で１０分間添加し、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）でプレートを測定する。
【０１８５】
ＣＴＧアッセイにおけるＢＢＡの効力は、下記に要約されており、（−）＝＜１０％阻害、（＋）＝＞１０％阻害、及び（＋＋）＞２０％阻害である。
【０１８６】
（表８Ａ）細胞増殖の阻害
2013507926.tif 000023
【０１８７】
結果は、二重特異的結合剤の全てが、試験した腫瘍細胞の少なくとも幾つかの増殖を阻害することが可能であることを示す。ＡＤＲｒ細胞株の場合、ＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−３Ｃ及びＡＢ５−７Ｎ／ＡＢ２−６Ｃは、抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ及び抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧの組み合わせと同様に、増殖を阻害することができた。ＢｘＰＣ−３細胞株の場合、ＡＢ２−６Ｎ／ＡＢ５−７Ｃは、抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ及び抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧの組み合わせと同様に、増殖を阻害することができた。ＭＣＦ７細胞株の場合、ＡＢ２−２１Ｎ／ＡＢ５−７Ｃ、ＡＢ２−３Ｎ／ＡＢ５−７Ｃ、及びＡＢ２−６Ｎ／ＡＢ５−７Ｃは、抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ及び抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧの組み合わせと同様に、増殖を阻害することができた。
【０１８８】
腫瘍球状体増殖アッセイ
インビトロでの腫瘍球状体の増殖に対するＢＢＡの効果を、インビボでの腫瘍増殖のモデルとして検査する。そのような形成の最適条件を含む、少量の基底膜抽出物マトリゲルを使用した腫瘍球状体の形成は、当技術分野に記述されている（例えば、Ｉｖａｓｃｕ，Ａ．及びＫｕｂｂｉｅｓ，Ｍ．（２００６年）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．１１巻：９２２〜９３２頁；Ｌｉｎ，Ｒ．Ｚ．及びＣｈａｎｇ，Ｈ．Ｙ．（２００８年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．３巻：１１７２〜１１８４頁を参照）。４つの細胞株：ＡＤＲｒ、ＭＣＦ７、Ａ５４９、及びＯｖｃａｒ８を検査する。細胞（１０％ウシ胎仔血清を有する培地２００μｌ当たり２０００個の細胞）を、９６ウエル低吸着プレートの各ウエルに添加する。２日目又は３日目に、球状体を撮影及び測定し、その後ＢＢＡで処理する。９日目又は１０日目に、球状体を再び撮影及び測定する。
【０１８９】
データ分析には、面積に基づく球状体増殖を、以下の式を使用して決定する：（９日目の面積−２日目の面積）／２日目の面積×１００。阻害パーセントを、（対照−試料）／対照×１００により決定する。
【０１９０】
一組の初期実験では、細胞を、０．５μＭ抗ＩＧＲ−１Ｒ  ＩｇＧ単独又は０．５μＭ抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧ単独のいずれかで処理して（単独療法）、ＩＧＦ−１及び／又はＨＲＧにより駆動される球状体増殖を特定する。結果は下記に要約されている。下記の表９及び１０では、（＋）＝＞１５％（しかし、＜３０％）阻害、（＋＋）＝＞３０％（しかし、＜５０％）阻害、（＋＋＋）＝＞５０％阻害、及び（−）＝＜１５％阻害である。
【０１９１】
（表９）ＩＧＦ−１及び／又はＨＲＧにより駆動される腫瘍細胞株球状体増殖
2013507926.tif 000024
【０１９２】
次に、腫瘍球状体増殖に対するＢＢＡ（０．５μＭ）の効果を決定する。
【０１９３】
（表１０）腫瘍球状体増殖に対するＢＢＡ及びＩｇＧ結合剤の効果
2013507926.tif 000025
【０１９４】
これらの結果は、ＢＢＡの全てが、検査した腫瘍球状体の少なくとも幾つかの増殖を阻害することが可能であることを実証する。
【０１９５】
また、腫瘍球状体増殖を阻害するＢＢＡの能力を、抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ単独療法、抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧ単独療法、及び抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ＋抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧ併用療法の効果と比較する。単独療法比較の結果は、図７Ａ〜Ｃに示されており、ＤＸ２−２１Ｎ／ＤＸ５−７Ｃ及びＤＸ５−７Ｎ／ＤＸ２−２１Ｃ  ＢＢＡが、Ａ５４９及びＭＣＦ７細胞株における抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ又は抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧ単独のいずれよりも大きな腫瘍球状体増殖の阻害パーセントを示し、ＡＤＲｒ細胞株の場合、単独療法とほぼ同等の阻害を示すことが実証されている。併用療法比較の結果は、図８Ａ〜Ｃに示されており、ＤＸ２−２１Ｎ／ＤＸ５−７Ｃ及びＤＸ５−７Ｎ／ＤＸ２−２１Ｃ  ＢＢＡは、ＡＤＲｒ及びＭＣＦ７細胞株で、抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ＋抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧ併用療法と同様に作用するが、Ａ５４９細胞株では、併用療法がより効果的だったことが実証される。
【０１９６】
実施例５：ＥｒｂＢ３及びＩＧＦ−１Ｒを標的とするＢＢＡの操作
実施例１〜４に記載の治療法を拡張するために、本発明者らは、ＥｒｂＢ３及びＩＧＦ−１Ｒを標的とする更なるＢＢＡの多様なサブセットを操作した。抗ＥｒｂＢ３−リンカー−抗ＩＧＦ−１Ｒ（ＥＬＩ）及び抗ＩＧＦ−１Ｒ−リンカー−抗ＥｒｂＢ３（ＩＬＥ）のＮ末端からＣ末端方向の融合分子の構築の例は、それぞれ表１１及び１２に示されている。表１１に示されている各々の例示的な分子の抗ＥｒｂＢ３部分、リンカー部分、及び抗ＩＧＦ−１Ｒ部分は、Ｎ末端からＣ末端に介在配列なしで一緒に連続して結合されている。同時発現部分は、存在する場合、個別のポリペプチド鎖として同じ細胞中で発現される。これらポリペプチド鎖の折り畳みは、ＥＬＩトポロジーの二重特異的分子をもたらす。
【０１９７】
（表１１）抗ＥｒｂＢ３−リンカー−抗ＩＧＦ−１Ｒトポロジー（ＥＬＩ）を有する融合分子
2013507926.tif 000026
【０１９８】
表１２に示されている各々の例示的な分子の抗ＩＧＦ−１Ｒ部分、リンカー部分、及び抗ＥｒｂＢ３部分は、Ｎ末端からＣ末端に介在配列なしで一緒に連続して結合されている。同時発現部分は、存在する場合、個別のポリペプチド鎖として同じ細胞中で発現される。これらポリペプチド鎖の折り畳みは、ＩＬＥトポロジーの二重特異的分子をもたらす。
【０１９９】
（表１２）抗ＩＧＦ−１Ｒ−リンカー−抗ＥｒｂＢ３トポロジー（ＩＬＥ）を有する融合分子
2013507926.tif 000027
【０２００】
要約すると、融合分子ＥＬＩ−１、ＥＬＩ−２、ＥＬＩ−３、ＥＬＩ−４、ＥＬＩ−５、ＥＬＩ−６、ＩＬＥ−１、ＩＬＥ−２、ＩＬＥ−３、ＩＬＥ−４、ＩＬＥ−５、ＩＬＥ−６、ＩＬＥ−７、ＩＬＥ−８、ＩＬＥ−９を、機能的単量体になるように設計した。融合分子ＥＬＩ−７、ＥＬＩ−８、ＥＬＩ−９、ＥＬＩ−１２、ＥＬＩ−１３、ＥＬＩ−１４、ＥＬＩ−１５、ＩＬＥ−１０、ＩＬＥ−１１、ＩＬＥ−１２、ＩＬＥ−１３、ＩＬＥ−１４、ＩＬＥ−１５、ＩＬＥ−１６を、機能的二量体になるように設計した。融合分子ＥＬＩ−１０及びＥＬＩ−１１を、機能的三量体になるように設計した。融合分子ＥＬＩ−１、ＥＬＩ−２、ＥＬＩ−３、ＥＬＩ−４、ＥＬＩ−５、ＥＬＩ−６、ＩＬＥ−１、ＩＬＥ−２、ＩＬＥ−３、ＩＬＥ−４、ＩＬＥ−５、ＩＬＥ−６、ＩＬＥ−７、ＩＬＥ−８、ＩＬＥ−９、ＥＬＩ−７、ＥＬＩ−８、ＥＬＩ−９、ＥＬＩ−１２、ＥＬＩ−１３、ＥＬＩ−１４、ＥＬＩ−１５、ＩＬＥ−１０、ＩＬＥ−１１、ＩＬＥ−１２、ＩＬＥ−１３、ＩＬＥ−１４、ＩＬＥ−１５、ＩＬＥ−１６を、新生児型Ｆｃ受容体による能動的再利用により体循環での半減期が増強されるように設計した（Ｇｈｅｔｉｅら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００年、１８巻、７３９〜７６６頁；Ｃｈａｕｄｈｕｒｙら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．、２００３年、１９７巻、３１５〜２２頁）。融合分子ＥＬＩ−１０及びＥＬＩ−１１を、流体力学半径の増加により体循環での半減期が増強されるように設計した（Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．、１９９６年、２７８巻、１００６〜１１頁）。複数の戦略を使用して、ＩＧＦ−１Ｒ標的部分、ＥｒｂＢ３標的部分、及びリンカー部分の薬物特性を向上させた。ＥＬＩ−１０、ＥＬＩ−１１、ＥＬＩ−１２、ＥＬＩ−１３、ＥＬＩ−１４、ＥＬＩ−１５、ＩＬＥ−１５、及びＩＬＥ−１６の標的部分の安定性及び発現レベルを、以前に報告された技術を応用することにより向上させた（Ｌａｎｇｅｄｉｊｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９８年、２８３巻、９５〜１１０頁；Ｎｉｅｂａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９９７年、１０巻、４３５〜４４４頁；Ｅｗｅｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、４２巻、１５１７〜１５２８頁；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９８年、２８１巻、９１７〜９２８頁；Ｗｏｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３０５巻、９８９〜１０１０頁）。ＥＬＩ−１０及びＥＬＩ−１１の標的部分の不均質性を、塩基性カルボキシペプチダーゼに対して抵抗性になるようにＣ末端を再操作することにより減少させた（Ｈａｒｒｉｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９９５年、２３巻、１２９〜１３４頁）。ＥＬＩ−１３及びＥＬＩ−１４のリンカー部分を、以前に記載のように、溶解性が増加させるか又は不均質性が低減されるように糖鎖操作した（Ｐｅｐｉｎｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、２０１０年、１９巻、９５４〜６６頁；Ｌｕｎｄら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９３年、３０巻、７４１〜８頁）。ＥＬＩ−１、ＥＬＩ−２、ＥＬＩ−３、ＥＬＩ−４、ＥＬＩ−５、ＥＬＩ−６、ＩＬＥ−１、ＩＬＥ−２、Ｉ���Ｅ−３、ＩＬＥ−４、ＩＬＥ−５、ＩＬＥ−６、ＩＬＥ−７、ＩＬＥ−８、及びＩＬＥ−９のリンカー部分の各々の均質性を増加させた。
【０２０１】
実施例６：ＥｒｂＢ３及びＩＧＦ−１Ｒを標的とするＢＢＡの調製、発現、及び精製
実施例５に記載の融合分子をコードする核酸を、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して、単一分子として発現プラスミドにクローニングした。使用した発現ベクターは、ｐＭＰ  １０Ｋ（ＳＥＬＥＸＩＳ社製）だった。発現プラスミドを線形化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して精製し、リポフェクタミンＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用してＣＨＯ細胞に同時形質移入した。形質移入した細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＦ１２Ｈａｍｓ培地で、２日間は淘汰圧をかけずに、その後４日間は淘汰圧をかけて回復させた。４日後、それらを、グルタミンを含有する無血清培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）に交換し、淘汰圧をかけた。一週後、細胞を発現について調べ、所望の容積にスケールアップした。融合分子は全て、３つのクロマトグラフィーステップ：プロテインＡ親和性、陽イオン交換、及び陰イオン交換の組み合わせを使用して精製した。各々は、製造業者の説明書に従って実施した。プロテインＡ親和性ステップを使用して、回収した細胞培養液（ＨＣＣＦ）から融合分子を選択的に及び効率的に結合させた。このステップでは、単一ステップで９５％を超える生成不純物が、高収率及びハイスループットで除去された。このステップの後、所望の分子形態の融合分子の割合は、６０〜９８パーセントの範囲であった。ＧＥ社製のＭＡＢＳＥＬＥＣＴを、プロテインＡ親和性樹脂として使用した。第２のクロマトグラフィーステップでは、ＧＥ社製のＳＰＦＦ（スルホプロピルファストフロー）、アガロース系樹脂を、陽イオン交換樹脂として使用した。このステップの後、所望の分子形態の融合分子の割合は、９０〜９９パーセントの範囲であった。ＧＥ社製のＱＳＦＦ（第四級アミンセファロースファストフロー）、アガロース系の陰イオン交換樹脂を、第３及び最終クロマトグラフィーステップで使用した。精製された物質を、リン酸緩衝生理食塩水に対して濃縮及び透析した。このステップの後、融合分子の最終収量は、２０ｍｇ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲だった。
【０２０２】
実施例７：ＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３経路を標的とする多様なＢＢＡの結合及び生物学的活性
Ａ）ＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢに対するＢＢＡの結合
１×１０５個のＭＣＦ７細胞及び１×１０５個のＡＤＲｒ細胞を、室温で２時間２μＭのＢＢＡと共にインキュベートし、その後１２回の連続３倍希釈をする。その後、ヤギ抗ＨＳＡ−Ａｌｅｘａ６４７結合抗体を検出抗体として使用して、細胞を４０分間氷上でインキュベートする。ＭＣＦ７及びＡＤＲｒ細胞に対するＢＢＡの細胞結合解離定数（結合親和性の尺度）を、ＦＡＣＳにより評価し、各ＢＢＡの見かけ上の解離定数を決定する。以下の結果が得られた（図１２ａ及び１２ｂも参照）。
【０２０３】
（表１３）
2013507926.tif 000028
【０２０４】
ＩｇＧ−二重特異体（つまり、ＥＬＩ−７、ＩＬＥ−１０、ＩＬＥ−１２）は、幾つかの場合、より低い濃度においてより強い結合性で両細胞タイプに結合し、各受容体に対する強力な結合及び結合能力を示した。ＩｇＧ−二重特異体は、同等のモノクローナル抗体成分に対して同様のＫｄを示した。
【０２０５】
２×１０６個のＢＸＰＣ３細胞を、０．５μＭのＢＢＡと共に室温で２時間インキュベートし、その後１１回の連続２．５倍希釈をする。その後、ヤギ抗ＨＳＡ−Ａｌｅｘａ６４７結合抗体を検出抗体として使用して、細胞を４５分間氷上でインキュベートする。ＢＸＰＣ３細胞に対するＢＢＡの細胞結合解離定数（結合親和性の尺度）を、ＦＡＣＳにより評価し、各ＢＢＡに対する見かけ上の解離定数を決定する。以下の結果が得られた。
【０２０６】
図１３は、３つの実験の代表的な結果を示す（下記で表にされている）。
【０２０７】
（表１４）
2013507926.tif 000029
【０２０８】
三価の二重特異体（ＩＬＥ−７、ＩＬＥ−９）は、対照二重特異体（ＩＬＥ−２、ＩＬＥ−３）よりも非常に強固に結合し、第２のＥｒｂＢ３結合部分を非重複エピトープに付加することにより、細胞に対する結合が著しく向上することが示される。
【０２０９】
Ｂ）ＢＢＡによるＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３及びＡｋｔのシグナル阻害
ＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３及び共通の下流成分（Ａｋｔ）をアンタゴナイズするＢＢＡの能力を決定するために、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化、ＥｒｂＢ３リン酸化、及びＡｋｔリン酸化の阻害を、剤の存在下で検査する。３．５×１０４個のＢＸＰＣ３細胞を、０．３μＭのＢＢＡと共に１時間プレインキュベートし、その後９回の連続３倍希釈をして１０データ点の曲線を生成する。細胞を、８０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１及び２０ｎｇ／ｍｌのヘレグリンで１５分間処理する。ホスホ−ＩＧＦ−１Ｒ（ｐＩＧＦ−１Ｒ）を産生するＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製；カタログ番号ＤＹＣ１７７０）により測定して、ｐＩＧＦ−１Ｒ形成を阻害する剤の能力を評価する。ＥｒｂＢ３のリン酸化を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製；カタログ番号ＤＹＣ１７６９）により測定して、ｐＥｒｂＢ３形成を阻害する剤の能力を評価する。ＡＫＴのリン酸化を、以下の抗体を使用してＥＬＩＳＡにより測定する：抗ＡＫＴ、クローンＳＫＢ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号０５−５９１）；ビオチン化抗ホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３特異的；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、カタログ番号５１０２）。図１４Ａ〜１４Ｃには、ＩＬＥ−７及びＥＬＩ−７の結果が示されており、結果は、下記の表にも要約されている。
【０２１０】
（表１５）
2013507926.tif 000030
【０２１１】
ＥＬＩ−７、ＩｇＧ連結ＢＢＡ及びＩＬＥ−７、三価ＨＳＡ連結ＢＢＡは、ＩＧＦ−１及びＨＲＧによる同時刺激でさえ、ｐＥｒｂＢ３、ｐＩＧＦ−１Ｒ、及びｐＡｋｔを阻害することができる。
【０２１２】
Ｃ）２次元培養中でのＢＢＡによる細胞増殖阻害
腫瘍細胞増殖に対する二重特異的剤の効果を、相対光量単位（ＲＬＵ）として示される細胞性ＡＴＰの存在量を測定するルミネセンスに基づくアッセイであるＣＴＧアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製；カタログ番号ＰＲ−Ｇ７５７２）を使用して、インビトロで検査する。１ウエル当たり５００細胞のＤＵ１４５細胞を、８０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１及び２０ｎｇ／ｍｌのヘレグリンと共に、２μＭから開始した３倍稀釈の阻害剤を含有する培地で６日間インキュベートした。ＩｇＧ二重特異的ＢＢＡ  ＥＬＩ−７は、ＤＵ１４５細胞の増殖を阻害した（ＥＬＩ−７の場合、Ｋｉ＝１２ｎＭ、図１５を参照）。ＩＧＦ−１Ｒ又はＥｒｂＢ３のみに対する阻害剤は、細胞増殖に効果を及ぼさなかった。
【０２１３】
１ウエル当たり２０００細胞のＢＸＰＣ３細胞を、１μＭから開始した３倍稀釈の阻害剤を含有する培地で６日間インキュベートした。ＩｇＧ二重特異的ＢＢＡ  ＥＬＩ−７は、ＢＸＰＣ３増殖を４６％阻害した（ｐ＜０．００１、スチューデントＴ検定）（図１６）。
【０２１４】
Ｄ）３次元培養中でのＢＢＡによる細胞増殖阻害
腫瘍細胞増殖に対するＢＢＡの効果を、相対光量単位（ＲＬＵ）として示される細胞性ＡＴＰの存在量を測定するルミネセンスに基づくアッセイであるＣＴＧアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製；カタログ番号ＰＲ−Ｇ７５７２）を使用して、インビトロで検査する。この場合、専用のナノ培養プレート（Ｓｃｉｖａｘ社製：カタログ番号ＮＣＰ−Ｌ−ＭＳ−９６）を使用して、３次元での細胞増殖を可能にする。１０，０００個のＢＸＰＣ３細胞を、１０％ＦＢＳを含有する培地で１０日間インキュベートする。３日目の終了時に、２μＭから開始した３倍稀釈液を使用して、阻害剤を種々のウエルに添加する。三価ＢＢＡ  ＩＬＥ−９及びＩＬＥ−７は、ＣＴＧで測定したところ、ＢＸＰＣ３細胞の増殖を、それぞれ４４％及び４８％阻害した（ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定）（図１７）。
【０２１５】
この場合、専用のナノ培養プレート（Ｓｃｉｖａｘ社製：カタログ番号ＮＣＰ−Ｌ−ＭＳ−９６）を使用して、３次元での細胞増殖を可能にする。１０，０００個のＤＵ１４５細胞を、１０％ＦＢＳを含有する培地で１０日間インキュベートした。３日目の終了時に、２μＭから開始した３倍稀釈液を使用して、阻害剤を種々のウエルに添加する。三価二重特異体、ＩＬＥ−７は、ＣＴＧで測定したところ、ＤＵ１４５細胞の増殖を２８％阻害する（ｐ＝０．０２、スチューデントｔ検定）（図１８）。
【０２１６】
Ｅ）がんのマウスモデルにおけるＢＢＡによる腫瘍増殖阻害
がんのマウスモデルにおける腫瘍増殖に対するＢＢＡの効果を、まず各ＢＢＡの薬物動態学的特性を計算することにより評価した。５００μｇの各ＨＳＡ連結ＢＢＡ又は６００μｇの各ＩｇＧ連結ＢＢＡを、各マウスの尾部静脈に注射し（１阻害剤及び１時点当たり４匹のマウス）、その後種々の時点で血液を採取した（マウスをまず犠牲にし、その後心穿刺により血液を採取した）。ＨＳＡ−リンカーを有するＢＢＡの時点は、０．５、４、８、２４、２８、７２、及び１２０時間である。ＩｇＧ−リンカーを有するＢＢＡの時点は、０．５、４、２４、７２、１２０、１６８、及び２４０時間である。ＨＳＡ−リンカーを有するＢＢＡの血中濃度を、ＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３結合を検出する自家製ＥＬＩＳＡキットを使用して測定する。詳しくは、プレートをＨｉｓタグ付ヒトＩＧＦ−１Ｒでコーティングし、ＢＢＡと共にインキュベートし、その後ヒトＥｒｂＢ３−Ｆｃキメラ及び抗Ｆｃ−ＨＲＰ検出試薬で検出する。ＩｇＧ−リンカーを有するＢＢＡの血中濃度を、製造業者の説明書に従って抗ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ  ｌａｂｓ社製、カタログ番号Ｅ８０−１０４）を使用して測定する。各ＢＢＡの薬物動態学的特性（半減期及びＣｍａｘ）を、１コンパートメントモデルを使用して計算する。以下の結果が得られた。
【０２１７】
（表１６）
2013507926.tif 000031
【０２１８】
薬物特異的半減期のシミュレーションは、以下の用量が、等しい曝露量（又はＩＬＥ−７の場合には、５０％相当の曝露量）をもたらすだろうという予測に結び付いた。
【０２１９】
（表１７）
2013507926.tif 000032
【０２２０】
その後、膵臓癌のマウスモデルにおける腫瘍増殖に対するＢＢＡの効果を、各マウス側腹の皮下空間に、５×１０６個のＢＸＰＣ３細胞（ＰＢＳ及び増殖因子が低減されたマトリゲルの１：１混合物に再懸濁されていた；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、カタログ番号３５４２３０）を注射することにより評価した。腫瘍を７〜１０日間成長させ（それらが、およそ１００〜２００ｍｍ３の体積に達するまで）、その後各マウスの腫瘍サイズを測定した（ｐｉ／６×長さ×幅２、幅は最小測定値）。その後、マウスをサイズで一致させ、その後無作為に治療群に割当てた。その後、ＢＢＡ、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、抗ＥｒｂＢ３抗体、又はＰＢＳ対照を、研究終了まで３日毎に注射した。図１９Ａ、１９Ｂ、及び２０は、ＩＬＥ−７及びＥＬＩ−７が両方とも、ＰＢＳ対照と比較して、ＢＸＰＣ３細胞の異種移植片腫瘍増殖を有意に阻害し、最終腫瘍体積は、ＰＢＳと比較して、ＩＬＥ−７で治療した腫瘍では８２％低く、ＥＬＩ−７で治療した腫瘍では７７％低いことを示す（ｐ値は、スチューデントＴ検定により決定した）。０日目は、投与の初日を指す。
【０２２１】
その後、前立腺癌のマウスモデルにおける腫瘍増殖に対するＢＢＡの効果を、各マウス側腹の皮下空間に、５×１０６個のＤＵ１４５細胞（ＰＢＳ及び増殖因子が低減されたマトリゲルの１：１混合物に再懸濁されていた；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、カタログ番号３５４２３０）を注射することにより評価した。腫瘍を７〜１０日間成長させ（それらが、およそ１００〜２００ｍｍ３の体積に達するまで）、その後各マウスの腫瘍サイズを測定した（ｐｉ／６×長さ×幅２、幅は最小測定値）。その後、マウスをサイズで一致させ、その後無作為に治療群に割当てた。その後、ＢＢＡ、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、抗ＥｒｂＢ３抗体、又はＰＢＳ対照を、研究終了まで３日毎に注射した。図２１Ａ及び２１Ｂは、ＢＢＡ  ＩＬＥ−７及びＥＬＩ−７が両方とも、ＤＵ１４５細胞の異種移植片腫瘍増殖を有意に阻害し、その一方でＩＧＦ−１Ｒ又はＥｒｂＢ３は阻害せず、最終腫瘍体積は、ＰＢＳ対照と比較して、ＩＬＥ−７で治療した腫瘍では５７％低く、ＥＬＩ−７で治療した腫瘍では５０％低いことを示す（ｐ値は、スチューデントＴ検定により決定した）。０日目は、投与の初日を指す。
【０２２２】
実施例８：ＢＢＡは、新規の作用機構を有しており、広範な受容体プロファイルにわたって効力を示す
Ａ）三価ＢＢＡ二重標的ＥｒｂＢ３は、新規の作用機構を有する
ａ．ＨＳＡ−二重特異体は、限定的なシグナル伝達阻害を示す
幾つかの場合で、本発明者らは、１つの抗ＥｒｂＢ３部分のみを使用するＢＢＡによるｐＥｒｂＢ３の限定的な阻害を観察した。例えば、５ｎＭのヘレグリンは、１５分以内でＡＤＲｒ細胞にｐＥｒｂＢ３を誘導するが、１時間のＩＬＥ−２又はＩＬＥ−３前処理による阻害は、不完全な阻害をもたらす（３倍希釈で１μＭが最高用量）。特に、ＩＬＥ−３は、低用量（＜１０ｎＭ）で最大達成可能阻害に達することができるが、６０％を超えて阻害することができない（図２２）。
【０２２３】
ｂ．混合ＥｒｂＢ３アンタゴニストの予測
競合アッセイにより、抗ＥｒｂＢ３部分、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４が、ＥｒｂＢ３の個別のドメイン、ドメイン３及び１にそれぞれ結合することが示された。従って、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４を使用する阻害剤が、同時にＥｒｂＢ３に結合する可能性がある。これは下記に示されており、そこでは、ＡＤＲｒ細胞が、５ｎＭのヘレグリンで１５分間刺激され、阻害剤が、培地中で１時間プレインキュベートされた。
【０２２４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３（ＩｇＧとして）及びＩＬＥ−３の組み合わせは、リン酸化ＥｒｂＢ３の完全阻害を達成することができ、抗ＥｒｂＢ３部分、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４が、補完的な作用機構を有することを示す（図２３ａ及び２３ｂ）。
【０２２５】
ｃ．三価二重特異型によるｐＥｒｂＢ３の完全阻害の実験的確認
ＩＬＥ−７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４で構成される）が、実際にリン酸化ＥｒｂＢ３を完全に阻害することができることを確認するために、２×１０４個のＡＤＲｒ細胞を、ＢＢＡで１時間前処理した後で（０．５ｎＭの開始濃度で、１０データ点３倍希釈）、５ｎＭのヘレグリンで１５分間処理した。ＩＬＥ−７はｐＥｒｂＢ３を完全に阻害したが、ＩＬＥ−３は阻害しなかった（図２４）。
【０２２６】
同様の実験で、３．５×１０４個のＢＸＰＣ３細胞を、ＢＢＡで１時間前処理した後で（０．５ｎＭの開始濃度で、１０データ点連続３倍希釈）、２０ｎｇ／ｍｌのヘレグリン及び８０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１で１５分間処理した。ＩＬＥ−７は、リン酸化Ａｋｔシグナル伝達を阻害したが、ＩＬＥ−３は、阻害できなかった（図２５）。
【０２２７】
Ｂ）ＢＢＡは、広範囲のＥｒｂＢ３及びＩＧＦ−１Ｒ受容体レベルにわたってシグナル伝達を阻害する
二量体ＢＢＡ（例えば、４つの結合部分、各標的に対して２つ、を有するＢＢＡ）が広範囲のＥｒｂＢ３及びＩＧＦ−１Ｒ受容体レベルにわたって下流シグナル伝達を阻害することができるかどうかを判断するために、以下の実験を実施した。
【０２２８】
ＢＸＰＣ３細胞受容体レベルは、ｐＬＫＯ．１  ＰＵＲＯベクター（Ｓｉｇｍａ社製）を使用して、ＢｘＰＣ−３細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ又はＥｒｂＢ３のｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウンにより変動させた。その後、ＥｒｂＢ３及びＩＧＦ−１Ｒレベルを、定量的ＦＡＣＳにより測定し、その結果生じた分布から、平均受容体レベルを計算した（相対的発現レベルは、表１．１を参照）。ＢＢＡの効力を決定するために、細胞を血清飢餓させ、３７℃にて１時間ＥＬＩ−７で前処理し、その後２０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ＋８０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１で１５分間刺激した。ｐＡＫＴのシグナル阻害を、ＥＬＩＳＡにより評価した。
【０２２９】
（表１８）４つのＢＸＰＣ３細胞株の相対的受容体レベル及びｐＡｋｔのＩＣ５０値
2013507926.tif 000033
【０２３０】
ＢＢＡ  ＥＬＩ−７は、それらのＩＣ５０値及び重複した信頼区間により示されるように、修飾された受容体レベルを有するＢＸＰＣ３細胞株にわたって同様の効力を示し（表１．１を参照）、それらが、広範な受容体プロファイルに対して幅広い活性を有することを示した（図２６）。
【０２３１】
等価物
当業者であれば、単なる日常的な実験作業を使用して、本明細書に記載の特定の実施形態の等価物を多く認識し、又は確認及び実施することができるだろう。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲により包含されることが意図されている。従属クレームで開示された実施形態のあらゆる組み合わせが、本開示の範囲内であることが企図される。
【０２３２】
参照による援用
本明細書に参照されている、ありとあらゆる米国及び外国特許及び係属特許出願及び公報の開示は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０２３３】
付録Ａ
抗がん剤
2013507926.tif 000034
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【０２３４】
（配列表）
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2013507926.tif 000084
2013507926.tif 000085
【図１Ａ】
2013507926.tif 000086
【図１Ｂ】
2013507926.tif 000087
【図１Ｃ】
2013507926.tif 000088
【図１Ｄ】
2013507926.tif 000089
【図１Ｅ】
2013507926.tif 000090
【図２Ａ】
2013507926.tif 000091
【図２Ｂ】
2013507926.tif 000092
【図２Ｃ】
2013507926.tif 000093
【図２Ｄ】
2013507926.tif 000094
【図２Ｅ】
2013507926.tif 000095
【図３Ａ】
2013507926.tif 000096
【図３Ｂ】
2013507926.tif 000097
【図３Ｃ】
2013507926.tif 000098
【図３Ｄ】
2013507926.tif 000099
【図３Ｅ】
2013507926.tif 000100
【図４Ａ】
2013507926.tif 000101
【図４Ｂ】
2013507926.tif 000102
【図４Ｃ】
2013507926.tif 000103
【図４Ｄ】
2013507926.tif 000104
【図４Ｅ】
2013507926.tif 000105
【図５Ａ】
2013507926.tif 000106
【図５Ｂ】
2013507926.tif 000107
【図５Ｃ】
2013507926.tif 000108
【図５Ｄ】
2013507926.tif 000109
【図５Ｅ】
2013507926.tif 000110
【図６Ａ】
2013507926.tif 000111
【図６Ｂ】
2013507926.tif 000112
【図６Ｃ】
2013507926.tif 000113
【図６Ｄ】
2013507926.tif 000114
【図６Ｅ】
2013507926.tif 000115
【図７】
2013507926.tif 000116
【図８】
2013507926.tif 000117
【図９】
2013507926.tif 000118
【図１０】
2013507926.tif 000119
【図１１】
2013507926.tif 000120
【図１２Ａ】
2013507926.tif 000121
【図１２Ｂ】
2013507926.tif 000122
【図１３】
2013507926.tif 000123
【図１４Ａ】
2013507926.tif 000124
【図１４Ｂ】
2013507926.tif 000125
【図１４Ｃ】
2013507926.tif 000126
【図１５】
2013507926.tif 000127
【図１６】
2013507926.tif 000128
【図１７】
2013507926.tif 000129
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2013507926.tif 000132
【図２１Ａ】
2013507926.tif 000133
【図２１Ｂ】
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【図２２】
2013507926.tif 000135
【図２３Ａ】
2013507926.tif 000136
【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年6月15日(2012.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013507926000001.app
【国際調査報告】
2013507926.tif 000182
2013507926.tif 000183
2013507926.tif 000184