(57)【要約】  本開示は、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体の組み合わせを使用して、Ｂ細胞リンパ腫を治療する方法を提供する。このような方法は、単一抗体療法に比べて、長期の抗腫瘍活性および／または投与量の低減を含む、治療上の利点を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ細胞リンパ腫を治療する方法であって、抗ＣＤ１９抗体と抗ＣＤ２０抗体とを含んでなる併用療法を、それを必要とする患者に投与するステップを含み、前記併用療法が、同等の投与計画で単独投与された前記抗ＣＤ１９抗体または前記抗ＣＤ２０抗体のいずれよりもより長い持続期間にわたり抗腫瘍活性を提供する、方法。
【請求項２】
前記Ｂ細胞リンパ腫が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記併用療法が相乗的治療効果を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体が同時投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体が逐次投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗腫瘍活性が腫瘍増殖の阻害である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗腫瘍活性が悪性Ｂ細胞の枯渇である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記併用療法が、同等の投与計画で単独投与された前記抗ＣＤ１９抗体または前記抗ＣＤ２０抗体のいずれよりも少なくとも１ヶ月間長い抗腫瘍活性をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記併用療法が、同等の投与計画で単独投与された前記抗ＣＤ１９抗体または前記抗ＣＤ２０抗体のいずれよりも少なくとも６ヶ月間長い抗腫瘍活性をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記併用療法が少なくとも６ヶ月間の抗腫瘍活性をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者中の腫瘍体積が、前記併用療法による６ヶ月間の治療期間中に１０％未満増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗ＣＤ１９抗体が、生体外での測定で、改善された抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ＣＤ１９抗体が脱フコシル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗ＣＤ１９抗体がヒトまたはヒト化抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗ＣＤ１９抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含んでなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖ＣＤＲ３を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗ＣＤ１９抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメインを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗ＣＤ１９抗体が、配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗ＣＤ１９抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメインと、配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインとを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗ＣＤ２０抗体がリツキシマブである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
Ｂ細胞リンパ腫を治療する方法であって、抗ＣＤ１９抗体と抗ＣＤ２０抗体を含んでなる併用療法を、それを必要とする患者に投与するステップを含み、ある投与量の前記併用療法が、前記併用療法投与量より少なくとも２倍高い投与量の前記抗ＣＤ１９抗体よりも高い抗腫瘍活性を有する、方法。
【請求項２１】
前記Ｂ細胞リンパ腫が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記併用療法が相乗的治療効果を提供する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体が同時投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体が逐次投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗腫瘍活性が腫瘍増殖の阻害である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗腫瘍活性が悪性Ｂ細胞の枯渇である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗ＣＤ１９抗体が、生体外での測定で、改善された抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗ＣＤ１９抗体が脱フコシル化されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗ＣＤ１９抗体がヒトまたはヒト化抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗ＣＤ１９抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含んでなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖ＣＤＲ３を含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗ＣＤ１９抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメインを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗ＣＤ１９抗体が、配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗ＣＤ１９抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるＶＨドメインと、配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるＶＬドメインとを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗ＣＤ２０抗体がリツキシマブである、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含むヒト白血病およびリンパ腫の大部分は、Ｂ細胞起源である。
【背景技術】
【０００２】
近年、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）でＢ細胞拘束性表面抗原を標的化することによる、Ｂ細胞枯渇に基づく治療的アプローチへの注目が高まっている。特に抗ＣＤ２０  ｍＡｂであるリツキシマブは、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療をもたらす上で、有望なことが示されている。（Ｒｏｂａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００７；３３：７１０−７２８）リツキシマブの活性は、マクロファージやＮＫ細胞などのエフェクター細胞表面への活性化Ｆｃγ受容体の結合によって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介するｍＡｂの能力に大きく左右される。（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，２００７；１２：８９８−９１０）補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）やアポトーシスの直接誘導などのその他の機構もまた役割を果たすこともあるが、ＡＤＣＣは、それによってリツキシマブが生体内で悪性ならびに正常Ｂ細胞の排除を媒介する、主要な機序であるように見える。（Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６；６：３９４−４０３）リツキシマブと化学療法の組み合わせは、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）およびＣＬＬがある患者に顕著な改善をもたらし、長期にわたる寛解をもたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしこの治療法は、全ての患者集団にわたって効果的でない。したがって新しい改善された治療選択肢に対する、大きな必要性が依然として残る。
【０００４】
ヒトの分化抗原群（ＣＤ）抗原１９は、重鎖転位時から、初期プレＢ細胞によって発現される、Ｂ細胞特異的表面抗原である。ＣＤ１９は、膜貫通受容体の免疫グロブリンドメイン含有スーパーファミリーに属する。ＣＤ１９発現が下方制御されている場合、ＣＤ１９は、それらの系統全体を通じて、Ｂ細胞上で、プロＢ細胞から形質細胞段階まで発現される。（Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８３；１３１：２４４−２５０）Ｂ細胞特異的タンパク質、およびＢ細胞受容体（ＢＣＲ）複合体構成要素として、ＣＤ１９は、Ｂ細胞活性化と体液性免疫の閾値を調節する、Ｂ細胞シグナル伝達の正の調節因子である。（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１９９５；９２：１１５５８−６２；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；１５８：４６６２−９）ＣＤ１９は、プロＢ細胞段階前には、造血幹細胞上またはＢ細胞上で発現されない。（Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８３；１３１：２４４−２５０；Ｌｏｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９８７；７０：１３１６−１３２４）。
【０００５】
重要なことに、ＣＤ１９の発現は、Ｂ細胞の悪性形質転換に続いて維持され、ＣＤ１９は、ＡＬＬ、ＣＬＬ、およびＮＨＬを含む大部分のＢ細胞悪性腫瘍上で発現される。（Ｕｃｋｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９８８；７１：１３−２９；Ｄ’Ａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０００；６４：２７５−２８１；Ｇｉｎａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ，１９９８；５１：３６４−３６９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９８４；６３：１４２４−１４３３）Ｂ細胞悪性腫瘍上におけるＣＤ１９の広汎性で比較的安定した発現は、この抗原をｍＡｂベースの治療法の魅力的な標的にする。
【０００６】
したがってＢ細胞悪性腫瘍の治療のために、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体の双方の利点を利用する、併用療法に対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書で提供されるのは、抗ＣＤ１９抗体と抗ＣＤ２０抗体を含んでなる併用療法を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、Ｂ細胞リンパ腫を治療する方法である。このような併用療法は、同等の投与計画で単独投与される、前記抗ＣＤ１９抗体または前記抗ＣＤ２０抗体のいずれよりも、長い持続期間にわたって抗腫瘍活性をもたらす。
【０００８】
抗ＣＤ１９および／または抗ＣＤ２０抗体の低減用量を利用して、Ｂ細胞リンパ腫を治療する方法もまた提供される。特にこのような方法は、抗ＣＤ１９抗体と抗ＣＤ２０抗体を含んでなる併用療法を、それを必要とする患者に投与するステップを含んでなり、ある投与量の前記併用療法は、併用療法投与量より少なくとも２倍高い投与量の前記抗ＣＤ１９抗体よりも高い抗腫瘍活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｂ細胞白血病およびリンパ腫細胞系に対する、脱フコシル化抗ＣＤ１９  ｍＡｂ  １６Ｃ４（１６Ｃ４−ａｆｕｃ）および抗ＣＤ２０  ｍＡｂリツキシマブのＡＤＣＣ活性を示す。４つの細胞系を用いた生体外ＡＤＣＣアッセイからの結果が示され、これは１５種の白血病およびリンパ腫系統のパネルにわたり観察された、活性プロファイルを代表する。フコシル化ＣＤ１９  ｍＡｂ  １６Ｃ４を比較のために含めた。Ｋａｒｐａｓ−１１０６Ｐ細胞に対して試験した場合に、１６Ｃ４−ａｆｕｃおよびリツキシマブのＡＤＣＣ活性は同等であり（図１Ａ）；細胞系Ｆａｒａｇｅ、Ｒａｊｉ、およびＭｅＣ２でも同様の結果が得られた。ＪＶＭ２（図１Ｂ）は、生体外で、それに対してリツキシマブが１６Ｃ４−ａｆｕｃよりも効果的である細胞系を代表し；細胞系Ｇｒａｎｔａ−５１９、ＤＢ、およびＪＶＭ−１３でも同様の結果が得られた。Ｏｃｉ−ＬＹ１９（図１Ｃ）およびＤａｕｄｉ（図１Ｄ）は、それに対して１６Ｃ４−ａｆｕｃがリツキシマブよりも効果的である細胞系を代表し；Ｔｏｌｅｄｏ、Ｋａｒｐａｓ−４２２、Ｎａｌｍ−６、ＲＬ、およびＮａｍａｌｗａ細胞でも同様の結果が得られた。試験された全ての細胞系で、１６Ｃ４−ａｆｕｃは、１６Ｃ４のフコシル化バージョンよりも強力であった。示される結果は、三連サンプルの平均＋／−標準偏差である。図１Ｆ〜Ｈは、１６Ｃ４−ａｆｕｃおよびリツキシマブについて測定された、観察された最大死滅細胞％に対して（ＣＤ１９、図１Ｆ；ＣＤ２０、図１Ｇ）、およびＥＣ５０値に対して（ＣＤ１９、図１Ｈ；ＣＤ２０、図１Ｉ）プロットされた、ＣＤ１９およびＣＤ２０の相対的発現を示す（ＭＦＩとして表される；実施例２の表Ｉを参照されたい）。それに対してＥＣ５０が測定され得なかった細胞系／ｍＡｂの組み合わせは、排除された（実施例２の表Ｉもまた参照されたい）。この多様な細胞系パネルにわたり、ＥＣ５０または最大細胞死滅と抗原発現との有意な相関は判定され得なかった。
【図２】図２は、生体外で、患者由来慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞が、１６Ｃ４−ａｆｕｃ媒介ＡＤＣＣに対してどの程度に感受性であるかを示す。図２Ａでは、患者ＣＬＬ細胞は、ＣＤ１９およびＣＤ２０の変わりやすい細胞表面発現を示す。ＣＬＬ細胞上のＣＤ１９およびＣＤ２０抗原性部位数は、材料と方法で下述するようにして測定された。図２Ｂ−Ｃでは、ＦＡＣＳベースのアッセイを使用した、患者由来ＣＬＬ細胞を用いた、１６Ｃ４−ａｆｕｃおよびリツキシマブの生体外ＡＤＣＣアッセイからの結果が示される。ＫＣ１３３３  ＮＫ細胞は、２．５：１のＥ：Ｔ比で、エフェクター細胞として使用される。示される結果は、全部で６つの試験されたサンプルの内の３つの代表的患者サンプルである。試験された全てのサンプルで、患者ＰＢＭＣサンプルからＣＬＬ  Ｂ細胞を枯渇させる上で、１６Ｃ４−ａｆｕｃはリツキシマブよりも効果的であった。全てのＡＤＣＣアッセイは三連で実施し、平均値（＋／−標準偏差）が提示される。試験された全ての６つのＣＬＬ患者サンプルに対する、１６Ｃ４−ａｆｕｃ（図２Ｅ）およびリツキシマブ（図２Ｆ）の抗原発現と生体外ＡＤＣＣ活性との関係性が示される。ＣＤ１９およびＣＤ２０の抗原性部位数は、１６Ｃ４とリツキシマブのそれぞれによって達成された最大細胞死滅百分率と対比してプロットされる。
【図３】患者由来急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞が、１６Ｃ４−ａｆｕｃ媒介ＡＤＣＣに対して感受性であることを示す。図３Ａは、患者のＡＬＬ細胞に対するＣＤ１９およびＣＤ２０の発現を示す。ＣＤ１９およびＣＤ２０に対する抗原性部位数は、３つの個々のＡＬＬサンプルから測定された。比較のために、４人のドナーからの正常ヒト末梢血Ｂ細胞上の抗原性部位数が示される。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、および３Ｅに示されるように、１６Ｃ４−ａｆｕｃは、主要ＡＬＬ細胞に対して強力な生体外ＡＤＣＣ活性を有する。４人の患者からのサンプルに対するＦＡＣＳベースのアッセイからの結果が示される。ＫＣ１３３３  ＮＫ細胞は、２．５：１のＥ：Ｔ比で、エフェクター細胞として使用され；リツキシマブを比較のために含めた。全ての測定は三連で実施し、平均値（＋／−標準偏差）で提示される。
【図４】図４は、１６Ｃ４−ａｆｕｃによって阻害される腫瘍増殖が、Ｆｃ媒介エフェクター機能に依存すること示す。Ｄａｕｄｉ（図４Ａ）およびＲａｊｉ（図４Ｂ）ＳＣＩＤ−リンパ腫異種移植モデルにおける、１６Ｃ４−ａｆｕｃおよびエフェクターレスＦｃ変異ｍＡｂ  １６Ｃ４−ＴＭによる生体内腫瘍増殖阻害が示される。ＳＣＩＤマウスに、０日目にリンパ腫細胞を皮下接種した。７日目から開始して、動物に、ｍＡｂ（２．５ｍｇ／ｋｇ）または等容積ビヒクル（ＰＢＳ）を週３回投与した。ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂ  Ｒ３４７をアイソタイプ対照として使用した。
【図５】１６Ｃ４−ａｆｕｃによるＳＣＩＤマウス中のリンパ腫増殖の阻害が、用量依存性であることを示す。一連のｍＡｂ濃度および投与回数によるＲａｊｉ細胞異種移植片の処置は、アイソタイプ対照処置動物と比較して、有意な腫瘍増殖阻害を引き起こした。用量範囲は、０．３、１、３、および１０ｍｇ／ｋｇの１６Ｃ４−ａｆｕｃを含んだ。投与計画のバリエーションは、１、３、および５用量を含んだ。１回目の用量を細胞移植の５日後に投与した。図５Ａでは、週２回投与された５用量の１６Ｃ４−ａｆｕｃが、３用量の毎週投与よりも強力な抗腫瘍活性をもたらした（図５Ｂ）。３ｍｇ／ｋｇによる処置は、１０ｍｇ／ｋｇによる処置と同等の有効性を達成した。
【図６】図６は、ＣＤ１９  ｍＡｂ  １６Ｃ４−ａｆｕｃが、複数のＳＣＩＤリンパ腫モデルにおいて活性であることを示す。図６Ａは、３つの皮下リンパ腫異種移植モデルにおける、１６Ｃ４−ａｆｕｃおよびリツキシマブによる腫瘍増殖阻害を示す。Ｎａｍａｌｗａ（図６Ａ）、Ｄａｕｄｉ（図６Ｂ）、およびＴｏｌｅｄｏ（図６Ｃ）Ｂリンパ腫細胞系における結果が示される。ＳＣＩＤマウスに０日目に腫瘍細胞を皮下移植し、次に５日目から開始して、合計５用量（３ｍｇ／ｋｇ）の１６Ｃ４−ａｆｕｃ、アイソタイプ対照、ビヒクル、またはリツキシマブを週２回腹腔内注射した。図６Ｄおよび６Ｅでは、ＣＤ１９  ｍＡｂ  １６Ｃ４−ａｆｕｃは、播腫性疾患マウスモデルにおいて活性である。２つの全身性疾患モデルにおける、１６Ｃ４−ａｆｕｃおよびリツキシマブの抗腫瘍活性の比較を示す。示される結果は、Ｎａｍａｌｗａ（図６Ａ）およびＤａｕｄｉ（図６Ｂ）細胞を注射されたマウスの結果である。１６Ｃ４−ａｆｕｃ、リツキシマブ、またはアイソタイプ対照（３ｍｇ／ｋｇ）の週２回の腹腔内注射を細胞注射の７日後に開始して、５用量まで継続した。播種性腫瘍モデルでは、生存期間または麻痺までの期間を評価項目として使用した。
【図７】図７は、１６Ｃ４−ａｆｕｃおよびリツキシマブの組み合わせによる、ＳＣＩＤリンパ腫モデルにおける腫瘍増殖の長期抑制効果を示す。ＳＣＩＤリンパ腫モデルでは、１６Ｃ４−ａｆｕｃと同一スケジュールに従って同一濃度で、リツキシマブが投与された（週２回の３ｍｇ／ｋｇで、合計５用量）。Ｒａｊｉ（図７Ａ）、Ｄａｕｄｉ（図．７Ｂ）、Ｏｃｉ−ＬＹ１９（図７Ｃ）、およびＲａｍｏｓ（図７Ｄ）異種移植モデルからの結果が示される。１６Ｃ４−ａｆｕｃとリツキシマブの組み合わせは、ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉモデルに対して、腫瘍増殖の長期抑制をもたらした。リツキシマブに対する応答が不良であったＯｃｉ−ＬＹ１９モデル、および１６Ｃ４−ａｆｕｃに対する応答が不良であったＲａｍｏｓモデルでは、より低い効果が観察された。
【図８】ｈｕＣＤ１９／ＣＤ２０遺伝子導入マウスにおいて、単独でまたはリツキシマブと組み合わせて投与された、１６Ｃ４−ａｆｕｃの薬物動態学および薬物動力学を示す。４種の別個の投与が考察された。１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１ｍｇ／ｋｇ）＋対照；１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋対照；１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１ｍｇ／ｋｇ）＋リツキシマブ；１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋リツキシマブ；より高用量の１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）は、単独または組み合わせで投与されるかどうかに関わらず、より低用量の１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１ｍｇ／ｋｇ）よりも、血中により長時間維持された。
【図９】併用療法、リツキシマブ単独、または１６Ｃ４−ａｆｕｃ単独のいずれかの投与に続く、Ｂ細胞枯渇実験の結果を示す。結果は、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）の併用療法の最大用量が、最長持続期間にわたって血液および脾臓からの最大Ｂ細胞枯渇百分率をもたらすことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
Ａ．抗ＣＤ１９と抗ＣＤ２０抗体による併用療法
本明細書で提供されるのは、抗ＣＤ１９抗体と抗ＣＤ２０抗体の組み合わせを投与するステップを含む、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療する方法である。併用療法は、単一抗体療法（例えば抗ＣＤ１９または抗ＣＤ２０のいずれかの単独投与）と比較して、長期抗腫瘍有効性および／または低投与量での効果的な治療を提供する。抗ＣＤ１９抗体と抗ＣＤ２０抗体の組み合わせを、それを必要とする対象（例えば細胞悪性病変を患っている対象）に投与することによって、対象において腫瘍増殖阻害を長期化する方法もまた提供される。
【００１１】
本明細書の用法では「治療する」または「治療」は、対象に対するまたは対象からの単離組織または細胞系に対する抗ＣＤ２０抗体またはその抗原結合性断片の投与と組み合わされた、対象に対する抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合性断片の投与、または対象からの単離組織または細胞系に対する抗ＣＤ１９抗体またはその断片の投与を指し、対象は、疾患、疾患症状、または疾患素因を有し、目的は、疾患、疾患症状、または疾患素因を治癒し、回復させ、緩和する、軽減し、変化させ、矯正し、向上させ、改善し、または影響を及ぼすことである。「治療する」または「治療」はまた、単一医薬組成物の一部として、または代案としてはそれぞれ抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合断片）または抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）のいずれかを含んでなる個々の医薬組成物の一部として、対象に、または対象からの単離組織または細胞系に、これらの抗体またはその抗原結合性断片の組み合わせを投与し得ることも意図し、対象は、疾患、疾患症状、または疾患素因を有し、目的は、疾患、疾患症状、または疾患素因を治癒し、回復させ、緩和する、軽減し、変化させ、矯正し、向上させ、改善し、または影響を及ぼすことである。
【００１２】
複数パラメータが、例えば抗腫瘍活性などの治療有効性を示し得る。これらとしては、腫瘤サイズの低下；腫瘍の転移侵襲性の低下；腫瘍増殖速度の低下；悪液質および腹水生成などの腫瘍関連続発症の重症度または発生率の低下；病的骨折、自己免疫溶血性貧血、前リンパ球性形質転換、リヒター症候群などの腫瘍関連合併症の低減および／または予防；化学療法およびその他の治療に対する腫瘍の感作；患者生存率の上昇；腫瘍浸潤性リンパ球増大および腫瘍血管新生低下などの改善された予後の観察された臨床的相関の増大などが挙げられるが、これに限定されるものではない。したがっていくつかの実施形態では、これらの２種類の抗体の組み合わせの投与は、治療を受ける患者（例えば被験者）に、これらのパラメータの１つまたは複数の改善をもたらす。別の実施形態では、患者における改善は、いくつかのパラメータに関して相乗的であるが、その他に関しては相加的である。
【００１３】
特定の実施形態では、ＣＤ１９およびＣＤ２０抗体併用療法の効果は、相加的であってもよい。別の実施形態では、ＣＤ１９およびＣＤ２０抗体併用療法の効果は、相乗的であってもよい。「相乗作用」という用語は、それぞれの活性薬剤の個々の効果の合計を上回る、２つ以上の活性作用物質の組み合わされた効果を記述するのに使用される。したがって２つ以上の作用物質の組み合わされた効果が、例えば腫瘍増殖などの活性または過程の「相乗的阻害」をもたらす場合、活性または過程の阻害が、それぞれの活性薬剤の阻害効果の合計を上回ることが意図される。「相乗的治療効果」という用語は、２つ以上の治療法の組み合わせによって観察される治療効果を指し、（いくつかのパラメータのいずれかによって測定される）治療効果が、それぞれの個々の治療法で観察される個々の治療効果の合計を上回る。本明細書の目的では、相乗効果は、同等の投与計画または体制で投与されるＣＤ１９抗体とＣＤ２０抗体の組み合わせを用いた場合に観察される影響が、（１）そのＣＤ１９抗体またはＣＤ２０抗体が単独で（または個々に）用いられた場合に達成される影響を上回り、（２）そのＣＤ１９抗体とＣＤ２０抗体の加算された（相加的）効果の合計を超えることを意味する。本明細書の用法では、同等の投与計画とは、少なくとも２つの異なる処置の結果を評価しまたは比較するために使用される投与計画または体制を指し、したがって比較される処置間で同一になるようにデザインされ、すなわち患者には、同様にして（例えば日、投与間隔、抗体剤濃度）、異なる抗体または併用療法が投与される。投与計画の変数は、治療されるＢ細胞悪性病変および治療の選択次第で、当業者によって決定される。このような相乗作用または相乗効果は、当業者に知られている多様な手段によって判定され得る。例えばＣＤ１９抗体とＣＤ２０抗体の相乗的効果は、腫瘍細胞数または腫瘍サイズの低下を調べる生体外または生体内アッセイ形式を使用して、または腫瘍増殖阻害または腫瘍細胞枯渇によって、観察し得る。同様に、個々の構成要素の相乗的有効量は、各構成要素の一連の濃度を試験することで判定されてもよい。
【００１４】
本明細書の用法では「組み合わせ」という用語は、その最も広い意味で使用され、対象が少なくとも２種の薬剤投与計画で治療されることを意味する。したがって「組み合わせ抗体療法」または「併用療法」は、対象が少なくとも２種の抗体投与計画で、より具体的には、少なくとも１つの抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）と組み合わされた、少なくとも１つの抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）で、治療されることを意味することが意図されるが、これらの抗体の組み合わせの有益な効果が達成されれば、異なる抗体の投与計画のタイミングは多様であり得る。抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）と組み合わされた、抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）による治療は、同時に（例えば一斉にまたは併行して）、または異なる時点で（例えば連続してまたは逐次に）、またはその組み合わせであり得る。本開示の目的で、同時に（例えば一斉に）投与するとは、同一製剤中で、または別個の製剤中で、抗体を一緒に投与することを指し、投与間隔は数分間から数時間であってもよいが、１日を越えない。本明細書の用法では、異なる時間の（例えば逐次）投与とは、間隔が数時間から数日間、数週間および数ヶ月にさえ至る、併用療法の抗体の投与を指す。
【００１５】
したがって特定の実施形態では、治療を受ける対象において、双方の物質の組み合わせの治療効果が生じさえすれば、組み合わせ抗体治療を受ける対象に、同時に（例えば一斉に）または異なる時点で（例えばいずれかの順で逐次に、同日に、または異なる日に）、双方の抗体が投与され得る。いくつかの実施形態では、抗体の組み合わせは、同時に１回投与で与えられるが、その他の投与は、いずれかの順で逐次に、同日に、または異なる日に投与することを含む。逐次投与は、対象が１回目のモノクローナル抗体投与に応答するかどうかに関わらず実施されてもよい。２種の抗体が同時に投与される場合、それらはそれぞれ抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）または抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）のいずれかを含んでなる別個の医薬組成物として投与し得て、またはこれらの抗体の双方を含んでなる単一医薬組成物として投与し得る。
【００１６】
本開示の方法は、Ｂ細胞疾患治療のために、それを必要とする対象に陽性治療反応をもたらす、併用療法を使用するステップを含んでなる。抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体を使用した併用療法に関する陽性治療反応は、これらの抗体またはその断片の抗腫瘍活性と結びついた疾患の改善、および／または疾患に付随する症状の改善を意味することが意図される。すなわち抗増殖効果、腫瘍のさらなる増殖の予防、腫瘍サイズ低下、がん細胞数低下、および／または新生物Ｂ細胞によって媒介される１つまたは複数の症状の低減が観察され得る。したがって例えば疾患の改善は、完全寛解として特徴付けられてもよい。「完全寛解」は、任意の過去の異常な放射線学的検査、骨髄、および脳脊髄液（ＣＳＦ）が正常化された、臨床的に検出可能な疾患の不在が意図される。このような応答は、本開示の方法に従った治療に続いて、少なくとも１ヶ月間持続しなくてはならない。代案としては、疾患の改善は、部分寛解として分類されてもよい。「部分寛解」は、新しい病変の不在下における、少なくとも１ヶ月間持続する、全ての測定可能腫瘍量（例えば対象中に存在する腫瘍細胞数）の少なくとも約５０％の低下が意図される。このような寛解は、測定可能な腫瘍のみに当てはまる。
【００１７】
腫瘍寛解は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線検査造影、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）分析、例えばルシフェラーゼ造影などの生物発光イメージング、骨スキャン造影、および骨髄吸引（ＢＭＡ）を含む腫瘍生検試料採取などのスクリーニング技術を使用して、腫瘍形態（例えば全体的腫瘍量、腫瘍サイズなど）の変化について評価し得る。これらの陽性治療的応答に加えて、治療を受ける対象が、疾患に付随する症状の改善の有益な効果を経験してもよい。したがってＢ細胞腫瘍では、対象は、例えば寝汗、発熱、体重減少、および／または蕁麻疹などのいわゆるＢ症状の低減を経験してもよい。
【００１８】
本明細書で開示される併用療法は、治療的有効用量で投与される。「治療的有効用量」、「治療的有効量」、または「有効量」という用語は、一定量の抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）と組み合わせて投与された場合に、新生物Ｂ細胞を含んでなるがんがある対象の治療に陽性治療反応をもたらす、抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）の量であることが意図される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）または抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）のいずれかの治療的有効用量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲である。治療方法は、方法の実施に有用な治療的有効用量の抗体組み合わせの単回投与、または治療的有効用量の抗体組み合わせの複数回投与を含んでなってもよいと認識される。
【００１９】
特定の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体と抗ＣＤ２０抗体による併用療法は、抗ＣＤ１９抗体単独または抗ＣＤ２０抗体単独のいずれかを伴う治療と比較して、長期の抗腫瘍活性を提供する。特定の実施形態では、併用療法は、抗ＣＤ１９抗体単独または抗ＣＤ２０抗体単独のいずれかによって得られる得る抗腫瘍活性よりも、少なくとも１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１年間、または２年間にわたり、より長く持続する抗腫瘍活性を提供してもよい。抗腫瘍活性の相対的持続期間は、試験集団の統計学的分析に基づいて決定されてもよい。例えば試験集団において、抗ＣＤ１９抗体が平均６週間にわたる特定レベルの抗腫瘍活性を呈示し、抗ＣＤ２０抗体が平均８週間にわたる特定レベルの抗腫瘍活性を呈示して、併用療法が試験集団において、単一抗体療法で見られるものと少なくとも同一レベルの抗腫瘍活性を少なくとも平均１２週間呈示する場合、組み合わせは、単独投与された抗体療法のいずれよりも少なくとも４週間長い抗腫瘍活性を呈示する。抗腫瘍活性の持続期間は、治療法が開始された日から、治療法が、（例えば腫瘍体積増大を阻止する能力、Ｂ細胞を枯渇させる能力などによる測定で）所望のレベルの抗腫瘍活性をもはや提供しない時点までとして測定されてもよい。
【００２０】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗腫瘍活性とは、１％、２％、５％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％または３０％を超える腫瘍サイズ増大を阻止する能力を指す。本明細書の用法では、腫瘍サイズとは、直径測定または推定腫瘍体積測定を指す。例えば併用療法が、６ヶ月間にわたり、一次元または二次元測定で、腫瘍が１０％を超えて増大するのを阻止し得る場合、それは６ヶ月間にわたり抗腫瘍活性を呈示する。（例えば末梢リンパ節中に存在する腫瘍などの）リンパ腫瘍のこれらの寸法測定は、直径測定または推定腫瘍体積測定を提供する上述の装置を使用して、身体スキャンによって得られる。（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００４  ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ（Ｐｏｓｔ−Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｖｏｌ２２，Ｎｏ  １４Ｓ（Ｊｕｌｙ  １５  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），２００４：６６０６））。したがって本明細書で開示される併用療法は、直径測定または推定腫瘍体積測定増大のいずれかが欠如している場合に、抗腫瘍活性を呈示する。別の実施形態では、抗腫瘍活性は、腫瘍サイズの実際の低下、または一定期間にわたる腫瘍の固定サイズ維持に反映されてもよい。別の実施形態では、抗腫瘍活性は、例えば直径測定または推定腫瘍体積測定などの治療前の腫瘍サイズと比較して、１％、２％、５％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％または３０％を超える腫瘍増殖の阻害によって判定されてもよい。
【００２１】
特定の実施形態では、抗腫瘍活性は、所定の治療法で得られるＢ細胞枯渇レベルを測定することによって判定されてもよい。悪性Ｂ細胞を含む循環Ｂ細胞は、フローサイトメトリーまたは上述のおよび当該技術分野で周知のその他の細胞計数装置によって最も容易に測定され、循環Ｂ細胞の計数が得られる。さらに循環Ｂ細胞数を提供する任意の方法を使用して、併用療法による治療後のＢ細胞枯渇を判定し得ることが検討される。循環Ｂ細胞枯渇は、組織Ｂ細胞枯渇の代理マーカーであることが良く知られている。したがってこのようなＢ細胞枯渇は、循環Ｂ細胞および組織Ｂ細胞の双方を含み、そのあるものは悪性であることもある。特定の実施形態では、抗腫瘍活性は、治療前のＢ細胞レベルと比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＢ細胞枯渇レベルによって判定されてもよい。例えば治療法が、少なくとも６ヶ月間にわたりＢ細胞枯渇レベルを９０％に維持できる場合、治療法は、６ヶ月間にわたり抗腫瘍活性を呈示する。
【００２２】
臨床有効性を予測する一方法は、例えばマウスがんモデルにおける抗ＣＤ２０抗体と抗ＣＤ１９抗体の組み合わせの使用など、適切なモデルにおけるこれらの抗体による併用療法の効果の測定である。これらのモデルとしては、ＮａｍａｌｗａおよびＤａｕｄｉとして知られている、ヒトバーキットリンパ腫細胞系を使用したものなどのヌードマウス異種移植腫瘍モデルが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗腫瘍活性は、Ｄａｕｄｉヒトリンパ腫細胞系を使用して、ヌードマウス異種移植腫瘍段階モデル中でアッセイされる。段階モデルでは、腫瘍が測定可能サイズに達して初めて抗体投与が開始されるので、ヌードマウス異種移植腫瘍段階モデル細胞系は、所与の抗体の治療効果を識別する上で、概して非段階モデルよりも効果的である。非段階モデルでは、抗体投与は、概して腫瘍接種の約１日以内で触診可能腫瘍が存在する前に開始される。段階モデルにおいて抗腫瘍活性増大を呈示する抗体の能力は、抗体が治療的に有効であることの強力な示唆である。
【００２３】
別の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体と抗ＣＤ２０抗体の組み合わせは、低減された用量で治療抗体を使用して、腫瘍増殖を抑制し、またはＢ細胞悪性腫瘍がある患者を治療する方法を提供する。特に本明細書で提供される実施例は、併用療法（例えば抗ＣＤ１９抗体と抗ＣＤ２０抗体の組み合わせ）の総用量が、併用療法の総用量を超える抗ＣＤ１９抗体用量よりも効果的であることを示す。したがって本明細書で開示される方法は、単一抗体療法の有効性を高め、それによってより低い投与量で、効果的な治療ができるようにし、高い投与量の抗体療法に付随する望ましくない副作用を潜在的に回避する。特定の実施形態では、併用療法は、同一抗腫瘍活性を与えるのに必要とされる抗ＣＤ１９抗体または抗ＣＤ２０抗体のいずれかの用量の少なくとも２分の１、３分の１、４分の１または５分の１の総用量で、同一のまたはそれを超える抗腫瘍効果を提供する（例えば単回投与に応えた抗腫瘍活性と同程度、または同等の投与計画を使用した規定期間にわたる抗腫瘍活性と同程度）。したがって抗腫瘍活性をもたらす抗ＣＤ１９抗体の任意の所与の投与量について、併用療法は、抗ＣＤ１９抗体の投与量よりも低い濃度でより大きな抗腫瘍活性をもたらす。より低い濃度は、ＣＤ１９抗体濃度の半分であってもよく、またはＣＤ１９抗体濃度の半分未満であってもよい。
【００２４】
特定の実施形態では、本明細書に記載される併用療法は、様々な投与手段によって達成されてもよい。例えば抗ＣＤ１９抗体および抗ＣＤ２０抗体は、別々に調合されて患者に投与されてもよい。代案としては、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体は、単一製剤中に組み合わせて調合されてもよい。抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体が別個の製剤中にある場合、抗体は、同一または異なる投与スケジュールで投与されてもよい。例えば２つの抗体は同一頻度で同時投与されてもよく（例えば双方の抗体が毎週１回同時投与される）、それらは別個の時点であるが同一投与頻度で投与されてもよく（例えば双方の抗体は毎週１回異なる時点で投与される）、またはそれらは頻度が異なるスケジュールを使用して投与されてもよい（例えば１つの抗体は毎週１回投与され別の抗体は隔週投与される）など。例示的な実施形態では、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体は組み合わせて調合され、同一投与計画で投与される。
【００２５】
Ｂ．抗ＣＤ１９抗体
本明細書に記載される併用療法は、抗ＣＤ１９抗体を含んでなる。「ＣＤ１９」または「ＣＤ１９抗原」という用語は、例えばＨＤ２３７またはＢ４抗体によって同定される約９０ｋＤａの抗原を指す。（Ｋｉｅｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩＩ，１２：１１１９（１９８７））。ＣＤ１９は、幹細胞段階から、プレＢ細胞、（未感作Ｂ細胞、抗原刺激Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、血漿細胞、およびＢリンパ球を含む）Ｂ細胞、および濾胞樹枝状細胞を含むが、これに限定されるものではない、血漿細胞への最終分化まで、Ｂ系統細胞の分化全体を通じて細胞上に見られる。ＣＤ１９はまた、ヒト胎児組織のＢ細胞上に見られる。好ましい実施形態では、本明細書で開示される抗体によって標的とされるＣＤ１９抗原は、ヒトＣＤ１９抗原である。
【００２６】
本明細書に記載される方法および組成物に従って、任意の適切な抗ＣＤ１９抗体を使用してもよい。適切な抗ＣＤ１９抗体としては、例えば既知の抗ＣＤ１９抗体、市販の抗ＣＤ１９抗体、または当該技術分野で周知の方法を使用して開発された抗ＣＤ１９抗体が挙げられる。
【００２７】
本明細書の用法では、免疫グロブリンとしてもまた知られている「抗体」および「抗体群」という用語は、（完全長モノクローナル抗体を含む）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合断片から形成される多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物学的活性を呈示する抗体断片（例えば抗原結合部分）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、および（例えば本明細書で開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、細胞内抗体、および上のいずれかのエピトープ結合断片を包含する。特に抗体としては、免疫グロブリン分子と、例えば少なくとも１つの抗原結合部位を含有する分子などの免疫グロブリン分子の免疫学的活性断片が挙げられる。
【００２８】
本開示のＣＤ１９抗体は、モノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ１９抗体であってもよい。本開示の組成物および方法で使用される抗ＣＤ１９抗体は、裸の抗体、免疫複合体または融合タンパク質であり得る。特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、循環Ｂ細胞を枯渇させるのに十分な量で、ヒト抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞媒介性細胞障害（ＣＤＣ）、および／またはアポトーシスを媒介してもよい。例示的な実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、親抗体と比較して、改善されたＡＤＣＣ活性を有するように改変された抗ＣＤ１９抗体である。改善されたＡＤＣＣ活性を有する抗体変種を作り出す方法については、さらに下述される。特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、改善されたＡＤＣＣ活性を有する脱フコシル化抗体である。
【００２９】
特定の実施形態では、本開示の組成物および方法で使用される抗ＣＤ１９抗体は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体であってもよく、具体的にはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ヒトアイソタイプであるＩｇＧアイソタイプ、またはヒト集団に見られる任意のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４対立遺伝子を有する。ヒトＩｇＧクラス抗体は、血清中の長い半減期および様々なエフェクター機能を媒介する能力などの機能特性を有する（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １（１９９５））。ヒトＩｇＧクラス抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の４つのサブクラスにさらに分類される。これまでにＩｇＧクラス抗体のエフェクター機能としてのＡＤＣＣおよびＣＤＣに関する多数の研究がなされており、ヒトＩｇＧクラスの抗体中では、ＩｇＧ１サブクラスが、ヒトにおいて最大のＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を有することが報告されている。（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７））。
【００３０】
特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、ＨＤ３７（ＩｇＧ１、κ）（ＤＡＫＯ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆ．）、ＢＵ１２（Ｃａｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４８（１０）：２９８３−７（１９９２））、４Ｇ７（ＩｇＧ１）（Ｍｅｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，３（４）：３０５−２０（１９８４  Ｗｉｎｔｅｒ））、Ｊ４．１１９（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｂ４３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＪ２５Ｃ１（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＦＭＣ６３（ＩｇＧ２ａ）（Ｚｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６９（ＰＴ６）：４１１−２２（１９９１）；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３４：１１５７−１１６５（１９９７）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，４１：５３−６０（１９９５））、８９Ｂ（Ｂ４）（ＩｇＧ１）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，Ｆｌａ．；Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２４４−２５０（１９８３））、および／またはＨＤ２３７（ＩｇＧ２ｂ）（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ，１９８９；およびＰｅｚｚｕｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８（９）：２７９３−２７９９（１９８７））を含むが、これに限定されるものではない、既知の抗ＣＤ１９抗体である。別の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、米国特許公開第２００８／０１３８３３６号明細書および米国特許公開第２００９／０１４２３４９号明細書、および米国特許第７，４６２，３５２号明細書および米国特許第７，１０９，３０４号明細書に記載される抗ＣＤ１９抗体のいずれかである。例示的な実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、米国特許公開第２００８／０１３８３３６号明細書に記載され、また下述される１６Ｃ４抗体、またはその抗原結合断片である。
【００３１】
特定の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、上述のような既知の抗ＣＤ１９抗体の（例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトアイソタイプへの）アイソタイプスイッチ変種である。
【００３２】
特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、ヒトＣＤ１９に免疫特異的に結合してもよく、当業者に知られている方法（例えばＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ）（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した評価で、３０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、２０００ｐＭ未満、１５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、７５０ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、７５ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を有してもよい。特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、ヒトＣＤ１９抗原と免疫特異的に結合してもよく、当業者に知られている方法（例えばＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ）を使用した評価で、２５〜３４００ｐＭ、２５〜３０００ｐＭ、２５〜２５００ｐＭ、２５〜２０００ｐＭ、２５〜１５００ｐＭ、２５〜１０００ｐＭ、２５〜７５０ｐＭ、２５〜５００ｐＭ、２５〜２５０ｐＭ、２５〜１００ｐＭ、２５〜７５ｐＭ、２５〜５０ｐＭの解離定数（Ｋｄ）を有してもよい。特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、ヒトＣＤ１９と免疫特異的に結合してもよく、当業者に知られている方法（例えばＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ）を使用した評価で、５００ｐＭ、１００ｐＭ、７５ｐＭまたは５０ｐＭの解離定数（Ｋｄ）を有してもよい。
【００３３】
特定の実施形態では、本開示の組成物および方法で使用される抗ＣＤ１９抗体は、それで治療されるヒトにおいてＢ細胞を減少させまたは枯渇させることができてもよい。Ｂ細胞枯渇は、循環Ｂ細胞における枯渇、または、骨髄、脾臓、胃腸管関連リンパ組織、および／またはリンパ節などであるが、これに限定されるものではない特定組織における枯渇であり得る。一実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、循環Ｂ細胞、血液Ｂ細胞、脾臓Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞性Ｂ細胞、腹膜Ｂ細胞、および／または骨髄Ｂ細胞を枯渇させてもよい。一実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、前駆Ｂ細胞、初期プロＢ細胞、後期プロＢ細胞、大型プレＢ細胞、小型プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、抗原刺激Ｂ細胞、および／または血漿細胞の枯渇を達成してもよい。このような枯渇は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）、および／またはＣＤ１９とその意図されるリガンドとの相互作用のブロック、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｂ細胞の増殖阻害および／またはＢ細胞死の誘導（例えばアポトーシスによる）などの様々な機構により達成されてもよい。Ｂ細胞「枯渇」とは、循環Ｂ細胞のおよび／または特定組織中のＢ細胞の少なくとも約２５％、４０％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の低下を意味する。特定の実施形態では、循環および／または特定組織から、実質的に全ての検出可能なＢ細胞が枯渇される。
【００３４】
特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体によるＢ細胞枯渇は、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１５日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、または少なくとも３０日間持続してもよい。別の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体によるＢ細胞枯渇は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、または少なくとも１０週間持続してもよい。さらなる実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体によるＢ細胞枯渇は、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間または少なくとも１２ヶ月間持続してもよい。
【００３５】
Ｂ細胞悪性腫瘍は、特定のＢ細胞サブセットの病的拡大によって特徴付けられ、例えば前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病は、プロＢ細胞／プレＢ細胞発達段階に相当するＢ細胞の異常な拡大によって特徴付けられる。悪性Ｂ細胞は、ＣＤ１９などの正常Ｂ細胞マーカーの細胞表面発現を維持する。したがって抗ＣＤ１９抗体は、ヒト対象中で悪性Ｂ細胞を枯渇させてもよい。特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、ヒト対象中で、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％の悪性Ｂ細胞の枯渇を達成してもよい。
【００３６】
エフェクター機能の操作
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、例えばＢ細胞悪性腫瘍を治療する上で抗体の有効性を高めるように、エフェクター機能に関して改変される。例示的なエフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害、またはＡＤＣＣであり、その中では細胞媒介性反応である非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合抗体を認識し、引き続いて標的細胞の溶解を引き起こす。細胞傷害性細胞、またはエフェクター細胞は、１つまたは複数のＦｃＲを発現する白血球であってもよい。作動体細胞は、マウス中で、少なくともＦｃγＲＩ、ＦＣγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよび／またはＦｃγＲＩＶを発現する。ＡＤＣＣを媒介するいくつかのヒト白血球としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞および好中球が挙げられる。これらの細胞の内、ＡＤＣＣを仲介する主要細胞は、ＦｃγＲＩＩＩを発現するＮＫ細胞である。単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよび／またはＦｃγＲＩＶを発現する。造血性細胞上のＦｃＲ発現については、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７−９２（１９９１）で要約されている。
【００３７】
抗体のエフェクター機能を高める一方法は、改変グリコフォーム生成による。改変グリコフォームは、例えば、改変または変種発現株の使用によって、例えばＤＩ  Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）などの１つまたは複数の酵素の同時発現によって、様々な生物中または様々な生物からの細胞系中におけるＦｃ領域を含んでなる分子の発現によって、またはＦｃ領域を含んでなる分子の発現後の炭水化物の修飾によって、当業者に知られている任意の方法によって作成されてもよい。改変グリコフォームを作り出す方法は、当該技術分野で公知であり、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１７Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７８：３４６６−３４７３）米国特許第６，６０２，６８４号明細書；米国特許出願第１０／２７７，３７０号明細書；米国特許出願第１０／１１３，９２９号明細書；ＰＣＴ国際公開第００／６１７３９Ａ１号パンフレット；ＰＣＴ国際公開第０１／２９２２４６Ａ１号パンフレット；ＰＣＴ国際公開第０２／３１１１４０Ａ１号パンフレット；ＰＣＴ国際公開第０２／３０９５４Ａ１号パンフレット；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば国際公開第０００６１７３９号パンフレット；ユーラシア特許第０１２２９１２５号明細書；米国特許第２００３０１１５６１４号明細書；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＪＭＢ，３３６：１２３９−４９を参照されたい。Ｆｃ領域中に存在するグリコシル化部位（例えばＩｇＧのアスパラギン２９７）の除去をもたらす、１つまたは複数のアミノ酸置換もまた実施し得る。さらに脱グリコシル化抗体は、必要なグリコシル化機構を欠いている細菌細胞中で作られてもよい。
【００３８】
フコシル残基量が低下している低フコシル化抗体、または二分ＧｌｃＮＡｃ構造が増大されている抗体などの、改変されたタイプのグリコシル化を有する抗体もまた、作成し得る。このような改変グリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増大させることが実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば改変グリコシル化機構がある宿主細胞中における抗体の発現によって達成され得る。改変グリコシル化機構がある細胞については、当該技術分野で記述され、宿主細胞として使用し得て、その中で本開示の組換え抗体を発現させて、それによって改変グリコシル化抗体を生成する。例えばそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１、ならびに米国特許第６，９４６，２９２号明細書；欧州特許第１，１７６，１９５号明細書；ＰＣＴ国際公開第０３／０３５８３５号パンフレット；ＰＣＴ国際公開第９９／５４３４２号パンフレットを参照されたい。
【００３９】
一実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、改善された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する、変種Ｆｃ領域を含んでなる。一実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、Ａｓｎ２９７に連結する複合体Ｎ−グリコシド結合糖鎖を有するＦｃ領域を含んでなり、その中でフコースは還元末端でＮ−アセチルグルコサミンに結合せず、前記Ｆｃ領域は改善された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。
【００４０】
特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、Ｆｃ変種を含んでなり、前記変種Ｆｃドメインは、同等の非変種Ｆｃドメインよりも、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍、または少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも６０倍、または少なくとも７０倍、または少なくとも８０倍、または少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも２００倍高い、Ｆｃγ受容体ＩＩＢに対する親和性を有する。
【００４１】
別の実施形態では、エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域にシステイン残基を導入し、それによってこの領域中に鎖間ジスルフィド結合を形成できるようにして改変されてもよい。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力および／または増大された補体媒介細胞死滅および／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有してもよい。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照されたい。抗腫瘍活性が改善されたホモ二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるように、ヘテロ二機能性架橋剤を使用して調製されてもよい。二重Ｆｃ領域を有し、それによって改善された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有してもよい抗体もまた、設計され得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照されたい。
【００４２】
エフェクター機能を変化させるように、抗体のＦｃ領域を操作するその他の方法は、当該技術分野で公知である（例えばＦｃ領域を変化させ、ＦＣγＲＩＩＡとの結合親和力と比較して、ＦｃγＲＩＩＢとの結合親和力を高めることを記載する、どちらもＫｏｅｎｉｇらに付与された米国特許公開第２００４０１８５０４５号明細書およびＰＣＴ国際公開第２００４／０１６７５０号パンフレット；Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．に付与されたＰＣＴ国際公開第９９／５８５７２号パンフレット、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．に付与されたＰＣＴ国際公開第９９／５１６４２号パンフレット、およびＤｅｏ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第６，３９５，２７２号明細書もまた参照されたい；  その開示の内容全体を本明細書に援用する）。Ｆｃ領域を修飾して、ＦｃγＲＩＩＢへの結合親和力を低下させる方法はまた、当該技術分野で公知である（例えばその開示の内容全体を本明細書に援用する、どちらもＲａｖｅｔｃｈらに付与された米国特許公開第２００１００３６４５９号明細書およびＰＣＴ国際公開第０１／７９２９９号パンフレット）。野生型Ｆｃ領域と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡとの結合親和性が強化されている変種Ｆｃ領域を有する修飾抗体についてもまた、記述されている（例えばその開示の内容全体を本明細書に援用する、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．に付与されたＰＣＴ国際公開第２００４／０６３３５１号パンフレット）。
【００４３】
本開示で組成物および方法で使用される抗ＣＤ１９抗体が、ＡＤＣＣを仲介できるかどうかを判定するのに、当該技術分野で公知の生体外アッセイを使用し得る。例示的なアッセイは、米国特許第５，５００，３６２号明細書または米国特許第５，８２１，３３７号明細書に記載される。特にこのようなアッセイで有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代案としては、またはそれに加えて、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばＣｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９５：６５２−６５６（１９９８））で開示される動物モデルなどの生体内で評価されてもよい。アッセイはまた、例えばＣｙｔｏＴｏｘ９６（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）などの市販のキットを使用して実施してもよい。
【００４４】
例示的な抗ＣＤ１９抗体
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、抗ＣＤ１９抗体１６Ｃ４（例えば米国特許公開第２００８／０１３８３３６号明細書を参照されたい）、またはその抗原結合断片を利用する。１６Ｃ４は、強力なＡＤＣＣエフェクター機能を有することが示されているＣＤ１９  ｍＡｂである。１６Ｃ４は、ＨＢ１２ｂ  ｍＡｂのヒト化および親和性最適化によって開発された、ＣＤ１９  ｍＡｂ抗ＣＤ１９−２の脱フコシル化形態である。（Ｋａｎｓａｓ  ＧＳおよびＴｅｄｄｅｒＴＦ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９１；１４７：４０９４−４１０２；Ｙａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，２００５；１０２（４２）：１５１７８−１５１８３；Ｈｅｒｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，２０１０，３３５（１）：２１３−２２２）。
【００４５】
特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ３を含んでなる、重鎖を含んでなる。別の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ３を含んでなる、重鎖を含んでなる。特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる可変領域を含んでなる、重鎖を含んでなる。別の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる可変領域を含んでなる、重鎖を含んでなる。
【００４６】
特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ３を含んでなる、軽鎖を含んでなる。別の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、配列番号６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ３を含んでなる、軽鎖を含んでなる。特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含んでなる可変領域を含んでなる、軽鎖を含んでなる。別の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる可変領域を含んでなる、軽鎖を含んでなる。
【００４７】
特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、配列番２号のアミノ酸配列を含んでなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含んでなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖ＣＤＲ３を含んでなる。
【００４８】
特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる軽鎖ＣＤＲ３を含んでなる。
【００４９】
特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる可変領域を含んでなる重鎖、および配列番号５のアミノ酸配列を含んでなる可変領域を含んでなる軽鎖を含んでなる。別の実施形態では、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる可変領域を含んでなる重鎖、および配列番号５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる可変領域を含んでなる軽鎖を含んでなる。
【００５０】
本開示は、ヒトＣＤ１９に結合する抗体１６Ｃ４の誘導体である抗体を包含する。例えば、アミノ酸置換を生じさせるのに慣例的に使用される、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発を含む、当業者に知られている標準的な技術を使用して、抗体をコードするヌクレオチド配列中に、変異（例えば付加、欠失、および／または置換）を導入し得る。一実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＫ  ＣＤＲ誘導体は、１６Ｃ４抗ＣＤ１９抗体の元のＶＨおよび／またはＶＫ  ＣＤＲと比較して、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、２個未満のアミノ酸置換、または１個のアミノ酸置換を含んでもよい。別の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＫ  ＣＤＲ誘導体は、１つまたは複数の予測された非必須アミノ酸残基（例えば抗体が特異的にヒトＣＤ１９に結合するのに重要でないアミノ酸残基）で生じた保存的アミノ酸置換を有してもよい。変異はまた、飽和変異誘発などによって、ＶＨおよび／またはＶＫ  ＣＤＲコード配列の全部または一部に沿って無作為に導入し得て、結果として生じた変異体を生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定し得る。変異誘発に続いて、コードされた抗体を発現させ得て、体活性を測定し得る。２つのアミノ酸配列の％同一性は、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を含むが、これに限定されるものではない、当業者に知られている任意の方法によって判定され得る。
【００５１】
Ｃ．抗ＣＤ２０抗体
本明細書に記載される併用療法は、抗ＣＤ２０抗体をさらに含んでなる。ＣＤ２０抗原（ヒトＢリンパ球拘束性分化抗原、Ｂｐ３５とも称される）は、プレＢおよび成熟Ｂリンパ球上に位置する、分子量およそ３５ｋＤの疎水性膜貫通タンパク質である（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（１９）：１１２８２−１１２８７（１９８９）；Ｅｉｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯＪ．７（３）：７１１−７１７（１９８８）；Ｃｌａｒｋ  ａｎｄ  Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ａｄｖ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．５２：８１−１４９（１９８９）；およびＶａｌｅｎｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（１９）：１１２８２−１１２８７（１９８９））。ＣＤ２０は初期プレＢ細胞の発達中に発現されて、形質細胞分化まで残留し；それはヒト幹細胞、リンパ始原細胞または正常血漿細胞上には見られない。ＣＤ２０は、正常Ｂ細胞、ならびに例えばＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）中の細胞などの悪性Ｂ細胞の双方の上に存在し、ＣＤ２０は９０％を超えるＮＨＬ上で発現される。（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ６３（６）：１４２４−１４３３（１９８４））。ＣＤ２０は、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常血漿細胞またはその他の正常組織上には見られない（Ｔｅｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５（２）：９７３−９７９（１９８５））。ＣＤ２０Ｇは、細胞周期開始および分化の活性化過程の初期段階を調節し（Ｔｅｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、前出）、任意選択でカルシウムイオンチャネルとして機能する。（Ｔｅｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４Ｄ：１９５（１９９０））。
【００５２】
本明細書に記載される方法および組成物に従って、任意の適切な抗ＣＤ２０抗体を使用してもよい。適切な抗ＣＤ２０抗体としては、例えば既知の抗ＣＤ２０抗体、市販の抗ＣＤ２０抗体、または当該技術分野で周知の方法を使用して開発された抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。
【００５３】
本開示のＣＤ２０抗体は、モノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ２０抗体であってもよい。本開示の組成物および方法で使用される抗ＣＤ２０抗体は、裸の抗体、免疫複合体または融合タンパク質であり得る。特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２０抗体は、循環Ｂ細胞を枯渇させるのに十分な量で、ヒト抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞媒介性細胞障害（ＣＤＣ）、および／またはアポトーシスを媒介してもよい。例示的な実施形態では、本開示の抗ＣＤ２０抗体は、親抗体と比較して、改善されたＡＤＣＣ活性を有するように改変された抗ＣＤ２０抗体である。改善されたＡＤＣＣ活性を有する抗体変種を作り出す方法については、上に記述される。特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ２０抗体は、改善されたＡＤＣＣ活性を有する脱フコシル化抗体である。
【００５４】
特定の実施形態では、本開示の組成物および方法で使用される抗ＣＤ２０抗体は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体であってもよく、具体的にはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ヒトアイソタイプであるＩｇＧアイソタイプ、またはヒト集団に見られる任意のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４対立遺伝子を有する。
【００５５】
ＣＤ２０抗原に結合する抗体の例としては、以下が挙げられる。現在は「リツキシマブ」（「リツキサン（商標）」）と称される「Ｃ２Ｂ８」；「Ｙ２Ｂ８」または「イブリツモマブチウキセタン」（ＺＥＶＡＬＩＮ（商標））と称されるイットリウム［９０］標識Ｂ８マウス抗体（参照によって本明細書に明示的に援用する、米国特許第５，７３６，１３７号明細書）；任意選択的に１３１Ｉで標識され、「１３１Ｉ−Ｂ１」抗体（ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ、ＢＥＸＸＡＲ（商標））を生じる、「トシツモマブ」（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）とも称される、マウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」（参照によって本明細書に明示的に援用する、米国特許第５，５９５，７２１号明細書）；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」（Ｐｒｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ６９（２）：５８４−５９１（１９８７））、および「フレームワークパッチ」またはヒト化１Ｆ５を含むその変種（Ｌｅｕｎｇ，Ｓ．に付与された国際公開第０３／００２６０７号パンフレット）；ＡＴＣＣ寄託ＨＢ−９６４５０；マウス２Ｈ７およびキメラ２Ｈ７抗体（参照によって本明細書に明示的に援用する、米国特許第５，６７７，１８０号明細書）；ヒト化２Ｈ７；ｈｕＭａｘ−ＣＤ２０（Ｇｅｎｍａｂ，Ｄｅｎｍａｒｋ）；ＡＭＥ−１３３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）；Ａ２０抗体またはキメラまたはヒト化Ａ２０抗体などのその変種（それぞれｃＡ２０、ｈＡ２０）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓの米国特許第２００３／０２１９４３３号明細書）；およびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐから入手できるモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８−２、９３−１Ｂ３、Ｂ−ＣＩまたはＮＵ−Ｂ２（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩＩ（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ｅｄ．，ｐ．４４０，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７））。例示的実施形態では、本開示の方法および組成物は、抗ＣＤ１９抗体、またはその断片と組み合わせて、リツキシマブ、またはその抗原結合断片が利用される。
【００５６】
リツキシマブ（リツキサン（商標））は、１９９８年４月７日にＡｎｄｅｒｓｏｎらに付与された米国特許第５，７３６，１３７号明細書では、「Ｃ２Ｂ８」と称されている抗体である。リツキサン（商標）は、再発性または難治性低悪性度または濾胞性ＣＤ２０−陽性のＢ細胞非ホジキンリンパ腫がある患者の治療に特効がある。生体外作用機序の研究は、リツキサン（商標）がヒト補体に結合し、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を通じて、リンパ系Ｂ細胞を溶解することを実証している（Ｒｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ８３（２）：４３５−４４５（１９９４））。さらに、それは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のアッセイにおいて、顕著な活性を有する。より最近では、リツキサン（商標）は、トリチウム化チミジン組み込みアッセイにおいて抗増殖性効果を有し、アポトーシスを直接誘発することが示されている。（Ｍａｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ８８（１０）：６３７ａ（１９９６））。生体内前臨床試験は、リツキサン（商標）が、恐らくは補体および細胞媒介性のプロセスを通じて、カニクイザルの末梢血、リンパ節、および骨髄からＢ細胞を枯渇させることを示した。（Ｒｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ８３（２）：４３５−４４５（１９９４））。リツキシマブは、１９９７年１１月に米国において、毎週４回の３７５ｍｇ／ｍ２の用量で、再発性または難治性低悪性度または濾胞性ＣＤ２０＋Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）がある患者の治療のために認可された。
【００５７】
本明細書において「リツキシマブ」または「リツキサン（商標）」という用語は、ＣＤ２０抗原に対する遺伝子改変キメラマウス／ヒトモノクローナル抗体を指し、参照によって本明細書に明示的に援用する米国特許第号５，７３６，１３７明細書では「Ｃ２Ｂ８」と称される。軽鎖可変領域および重鎖可変領域またはリツキシマブの完全な核酸およびアミノ酸配列は、米国特許第５，７３６，１３７号明細書で開示される。具体的には、リツキシマブの軽鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列が、米国特許第５，７３６，１３７号明細書の図４および配列番号６で開示される。リツキシマブの重鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列は、米国特許第５，７３６，１３７号明細書の図５および配列番号９で開示される。米国特許第５，７３６，１３７号明細書の配列番号６および９、および図４および５の核酸およびアミノ酸配列は、参照によって本明細書に明示的に援用する。リツキシマブは、米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）に受入番号６９１１９の下に寄託された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞中に存在するベクターＤＮＡを含んでなるＣＨＯ細胞トランスフェクトーマによって生成されてもよい。リツキシマブはまた、ＡＴＣＣに受入番号ＨＢ１１３８８の下に寄託された、ハイブリドーマ２Ｂ８によって生成されてもよい。
【００５８】
Ｄ．Ｂ細胞悪性腫瘍
本明細書に記載される抗ＣＤ１９抗体と抗ＣＤ２０抗体を含んでなる併用療法を使用して、Ｂ細胞悪性腫瘍を含むＢ細胞疾患を治療し得る。「Ｂ細胞悪性病変」という用語は、Ｂ細胞系統の細胞に由来する任意の悪性病変を含む。例示的なＢ細胞悪性腫瘍としては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。低悪性度／濾胞性ＮＨＬ、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度非切断小細胞性ＮＨＬを含む、Ｂ細胞サブタイプ非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；マントル細胞リンパ腫、および巨大腫瘤病変ＮＨＬ；バーキットリンパ腫；多発性骨髄腫；プレＢ急性リンパ芽球性白血病、およびその他の初期Ｂ細胞前駆体に由来する悪性腫瘍；一般的急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）；免疫グロブリン変異性ＣＬＬおよび免疫グロブリン非変異性ＣＬＬを含む慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；有毛細胞白血病；Ｎｕｌｌ急性リンパ芽球性白血病；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、および３型ＤＬＢＣＬを含む、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；プロリンパ球性白血病；軽鎖病；プラズマ細胞腫；骨硬化性骨髄腫；形質細胞白血病；意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）；くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）；無痛性多発性骨髄腫（ＩＭＭ）；古典的および結節性リンパ球優位型を含むホジキンリンパ腫；リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）；および胃粘膜関連リンパ系組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫を含む辺縁帯リンパ腫。
【００５９】
これらのがんの再発の治療もまた検討される。ＬＰＨＤは、照射または化学療法にも関わらず、頻繁に再発する傾向があるホジキン病の一種であり、ＣＤ２０陽性悪性細胞によって特徴付けられる。ＣＬＬは、白血病の４つの主要な種類の１つである。リンパ球と称される成熟Ｂ細胞のがんであるＣＬＬは、血液、骨髄およびリンパ組織中の細胞の進行性蓄積によって顕在化する。無痛性リンパ腫は、進行の遅い不治の疾患であり、患者の平均生存期間は、多数の寛解および再発期間に続いて６〜１０年である。
【００６０】
Ｂ細胞枯渇の所望のレベルは、疾患に左右される。Ｂ細胞悪性病変の治療では、本開示の抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体の標的である、Ｂ細胞枯渇を最大化するのが望ましいことがある。したがってＢ細胞新生物治療のためには、例えば腫瘍増殖（サイズ）、がん性細胞型の増殖、転移、特定のがんのその他の徴候および症状をモニターすることで、当該技術分野の医師によって評価され得る、疾患の進行を阻止するために、Ｂ細胞枯渇が少なくとも十分であることが望ましい。好ましくはＢ細胞枯渇は、少なくとも２ヶ月、より好ましくは３ヶ月、なおもより好ましくは４ヶ月、より好ましくは５ヶ月、なおもより好ましくは６ヶ月以上にわたり、疾患の進行を阻止するのに十分である。さらにより望ましい実施形態では、Ｂ細胞枯渇は、寛解期間を少なくとも６ヶ月、より好ましくは９ヶ月、より好ましくは１年、より好ましくは２年、より好ましくは３年、なおもより好ましくは５年以上増大するのに十分である。最も好ましい実施形態では、Ｂ細胞枯渇は疾患を治癒させるのに十分である。好ましい実施形態では、がん患者におけるＢ細胞枯渇は、治療前ベースラインレベルの少なくとも約７５％、より好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９９％および１００％にさえ至る。
【００６１】
本開示の組成物の投与後に、症状またはその他の適用可能基準に、治療前と比較して測定可能な改善があれば、本開示の方法によって、患者のＢ細胞新生物は緩和され、または成功裏に治療される。治療効果は、本開示の組成物の投与後３〜１０週間以内に明らかになってもよい。各疾患の適用可能基準は、該当技術分野の医師に良く知られている。例えば医師は、疾患の臨床的徴候、または疾患の血清学的マーカー、Ｂ細胞計数を含む完全血球算定、および血清免疫グロブリンレベルなどの血清学的徴候について、治療される患者をモニターし得る。患者は、以下の１つまたは複数に、観察可能なおよび／または測定可能な低下または不在を示してもよい。がん細胞数の低下またはがん細胞の不在；腫瘍サイズ低下；臓器へのがん細胞浸潤の阻害（例えばある程度遅延させ好ましくは停止させる）；腫瘍転移の阻害（例えばある程度遅延させ好ましくは停止させる）；腫瘍増殖のある程度の阻害；および／または特定のがんに付随する症状の１つまたは複数のある程度の軽減；罹患率および死亡率の低下、および生活の質の問題の改善。好ましくは本開示の組成物の投与後に、本開示の方法による治療前に測定された特定の症状または基準のベースラインからの改善は、少なくとも２０％、より好ましくは、２５〜３０％、なおもより好ましくは３０〜３５％、最も好ましくは４０％以上である。
【００６２】
新生物治療の有効性または成功の評価のパラメータは、当該分野の医師に知られている。概して当該分野の医師は、特定疾患の徴候および症状の低下を探す。パラメータとしては、疾患進行までの期間の中央値、寛解および安定期の時間が挙げられる。Ｂ細胞新生物では、測定可能な基準としては、例えば疾患進行までの期間、全体的および／または進行なし生存期間の増大が挙げられる。白血病の場合、骨髄生検を行って寛解程度を判定し得る。完全寛解は、治療に続いて３０日目に、白血病細胞が、患者の骨髄中に見られる全細胞の５パーセント未満を構成することと定義され得る。
【００６３】
以下の参考文献は、リンパ腫およびＣＬＬ、それらの診断、治療、および治療有効性を測定する標準医学的手技について記載する。Ｃａｎｅｌｌｏｓ  Ｇ  Ｐ，Ｌｉｓｔｅｒ，Ｔ  Ａ，Ｓｋｌａｒ  Ｊ  Ｌ：Ｔｈｅ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９８；ｖａｎ  Ｂｅｓｉｅｎ  Ｋ  ａｎｄ  Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ，Ｆ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ，Ｓｔａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｃｈａｐ．７０，ｐｐ１２９３−１３３８，ｉｎ：Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ  ｅｄ．Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２０００；およびＲａｉ，Ｋ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｌ，Ｄ：Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｃｈａｐ．７２，ｐｐ１３５０−１３６２，ｉｎ：Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ  ｅｄ．Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２０００。
【００６４】
Ｅ．医薬製剤
本発明の特定の態様は、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、またはその組み合わせ、および薬学的に許容可能な賦形剤を含んでなる、医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は薬剤として使用される。
【００６５】
特定の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、またはその組み合わせは、医薬（治療的）組成物として、薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定剤と共に調合されてもよく、当該技術分野で公知の多様な方法によって投与されてもよい。当業者には理解されるように、投与手段および／または様式は、所望の結果次第で変動する。「薬学的に許容できる担体」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉しない、１つまたは複数の無毒の材料を意味する。このような調製品は、塩、緩衝剤、保存料、適合性担体、および任意選択的にその他の治療薬を慣例的に含有してもよい。このような薬学的に許容可能な調製品はまた、ヒトへの投与に適する、適合性固形または液体増量剤、希釈剤または封入物質を慣例的に含有してもよい。本明細書に記載される製剤中で利用してもよい、その他の検討される担体、賦形剤、および／または添加剤、としては、例えば、着香剤、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、脂質、血清アルブミンやゼラチンやカゼインなどのタンパク質賦形剤、ナトリウムなどの塩形成対イオンが挙げられる。本明細書に記載される製剤で使用するのに適する、これらのおよび追加的な既知の医薬担体、賦形剤および／または添加剤は、当該技術分野で公知であり、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」，２１ｓｔｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２００５）、および「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」，６０ｔｈｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．（２００５）に収載される。当該技術分野で周知のように、または本明細書に記載されるように、投与様式、併用療法抗体の溶解度および／または安定性に適する、薬学的に許容可能な担体を慣例的に選択し得る。
【００６６】
本明細書に記載される製剤は、所望の投与に適したｗ／ｖがもたらされる濃度で、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、またはその組み合わせを含んでなる。特定の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体または抗ＣＤ２０抗体は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌ、および約２５ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤中に存在する。特定の実施形態では、製剤中の抗ＣＤ１９または抗ＣＤ２０抗体の濃度は、約０．１〜約１００重量％で変動してもよい。特定の実施形態では、抗ＣＤ１９または抗ＣＤ２０抗体の濃度は、０．００３〜１．０モルの範囲内である。
【００６７】
特定の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体または抗ＣＤ２０抗体は合わせて調合されて、それぞれの抗体は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌ、および約２５ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤中に存在する。特定の実施形態では、製剤中の各抗体の濃度は約０．１〜約１００重量％で変動してもよい。特定の実施形態では各抗体の濃度は、０．００３〜１．０モルの範囲内である。
【００６８】
特定の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、国際公開第２０１０１０２２７６号パンフレットの処方のいずれかに従って調合される。
【００６９】
一実施形態では、本開示の製剤は、実質的に内毒素および／または関連発熱性物質がない、発熱性物質を含まない製剤である。内毒素としては、微生物中に閉じ込められて、微生物が分解または死滅した場合にのみ放出される毒素が挙げられる。発熱性物質としてはまた、細菌およびその他の微生物の外膜からの発熱誘導熱安定性物質（糖タンパク質）が挙げられる。ヒトに投与した場合、これらの物質はどちらも、発熱、血圧低下、およびショックを引き起こし得る。可能な有害効果のために、少量の内毒素でさえも、静脈内投与される医薬品溶液から除去されなくてはならない。食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬剤用途について、１時間の１期間内のキログラム体重用量あたり５内毒素単位（ＥＵ）という上限を設定している（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６（１）：２２３（２０００））。特定の実施形態では、組成物中の内毒素および発熱性物質レベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、または５ＥＵ／ｍｇ未満、または１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【００７０】
生体内投与のために使用される場合、本開示の製剤は無菌でなくてはならない。本開示の製剤は、滅菌濾過、照射などを含む、様々な滅菌方法によって滅菌されてもよい。一実施形態では、製剤は、滅菌済み０．２２ミクロンフィルターによって濾過滅菌される。注射用無菌組成物は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」，２１ｓｔｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２００５）に記載されるような、従来の製薬慣行に従って調合し得る。
【００７１】
本開示の治療的組成物は、経口、経鼻、肺、（バッカルおよび舌下を含む）局所、直腸、膣および／または非経口投与などの特定投与経路のために配合し得る。「非経口投与」および「非経口的に投与する」という語句は、本明細書の用法では、経腸的および局所投与を除く、通常は注射による投与様式を指し、制限なしに、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内注射および輸液が挙げられる。本開示の処方は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤を含む、局所または経皮投与に適する。抗体は無菌、条件下で、薬学的に許容できる担体と共に、そして必要なこともある、任意の保存料、緩衝液、または噴霧剤と共に混合されてもよい。（米国特許第７，３７８，１１０号明細書；米国特許第７，２５８，８７３号明細書；米国特許第７，１３５，１８０号明細書；米国特許公開第２００４−００４２９７２号明細書；および米国特許公開第２００４−００４２９７１号明細書）。
【００７２】
製剤は、好都合には単位投与形態で提供されてもよく、薬学技術分野で公知の任意の方法で調製されてもよい。本開示の医薬組成物の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対する毒性なしに、特定の患者、組成物、および投与様式ついて、所望の治療反応を達成するのに効果的な活性成分の量（例えば「治療的有効量」など）を得るように、変動されてもよい。選択される投与量レベルは、用いられる本開示の特定組成物の活性、投与経路、投与時点、用いられる特定化合物の排出速度、治療期間、用いられる特定組成物と組み合わせて使用されるその他の薬剤、化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性別、重量、病状、総体的な健康、および以前の病歴などの医療技術分野で周知の要素を含む、多様な薬物動態学的要素に左右される。適切な投与量は、例えば、約０．１、１、１０、または５０ｍｇ／ｋｇ体重などの約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれを上回る範囲であってもよく、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重が好ましい。
【００７３】
特定の実施形態では、方法は、複数用量の抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）と組み合わされた、複数用量の抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）を投与するステップを含んでなる。方法は、抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）または抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）のいずれか、またはその双方を含んでなる医薬組成物の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０以上の治療的有効用量を投与するステップを含んでなってもよい。複数用量の医薬組成物投与の頻度および長さは、必要以上の実験なしに当業者によって容易に判定され得る。さらに治療的有効量の抗体組み合わせによる対象の治療は、単回治療を含み得て、または好ましくは一連の治療を含み得る。例えば、どちらも約１〜約１０週間、好ましくは約２〜約８週間、より好ましくは約３〜約７週間、なおもより好ましくは約４、５、または６週間にわたり、毎週１回、約１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内の用量で投与される、抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）と抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）の組み合わせで、被験者を治療し得る。治療は、再発を阻止するために毎年、または再発の徴候に際して、実施されてもよい。
【００７４】
治療のために使用される抗体またはその抗原結合性断片の有効投与量は、特定の治療過程にわたって、増大または低減してもよいこともまた理解される。投与量の変化は、本明細書に記載される診断アッセイ結果に起因して、それから明らかになってもよい。したがって一実施形態では、投与計画は、治療的有効量の抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）と組み合わされた、治療的有効量の抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）の投与を含み、組み合わせは、治療期間の１、８、１５、および２２日目に投与される。別の実施形態では、投与計画は、治療的有効量の抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）と組み合わされた、治療的有効量の抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）の投与を含み、組み合わせは、治療期間の週の１、２、３、４、５、６、および７日目に投与される。さらなる実施形態は、治療的有効量の抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）と組み合わされて、治療的有効量の抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）が投与され、組み合わせが、治療期間の週の１、３、５、および７日目に投与される投与計画；治療的有効量の抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）と組み合わされた、治療的有効量の抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）の投与を含み、抗体組み合わせが、治療期間の週の１および３日目に投与される、投与計画；および治療期間の任意の週の１日目における、抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）と組み合わされた治療的有効量の抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）の投与を含む好ましい投与計画を含む。治療期間は、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、または１年間から構成されてもよい。治療期間は引き続いてもよく、または１日間、１週間、２週間、１ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、または１年間互いに離れていてもよい。抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）と抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）の組み合わせを使用した治療は、治療がどこかの時点で抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）と抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）の組み合わせを含みさえすれば、同時のまたは併行した片方のまたは双方の抗体の投与を含んでなってもよい。併用療法の効果はまた、抗ＣＤ２０抗体および／または抗ＣＤ１９抗体治療のいずれかの投与タイミングを変動させることで、最適化し得る。抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合性断片と組み合わされた、抗ＣＤ２０抗体またはその抗原結合性断片による治療は、同時（併行）、連続的（逐次）、またはその組み合わせであってもよい。したがって組み合わせ抗体治療を受ける対象には、同時に（例えば一斉に）または異なる時点で（例えばいずれかの順で逐次に、同日に、または異なる日に）、抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）と抗ＣＤ１９（またはその抗原結合性断片）の双方が投与され得る。したがっていくつかの実施形態では、リツキシマブ（またはその抗原結合性断片）などの抗ＣＤ２０抗体は、１６Ｃ４（またはその抗原結合性断片）などの抗ＣＤ１９抗体と共に同時投与される。なおも別の実施形態では、リツキシマブ（またはその抗原結合性断片）などの抗ＣＤ２０抗体が最初に投与され、次に１６Ｃ４（またはその抗原結合性断片）などの抗ＣＤ１９抗体が投与される。なおも別の実施形態では、１６Ｃ４（またはその抗原結合性断片）などの抗ＣＤ１９抗体が最初に投与され、次にリツキシマブ（またはその抗原結合性断片）などの抗ＣＤ２０抗体が投与される。いくつかの実施形態では、リツキシマブと１６Ｃ４などの抗ＣＤ２０抗体と抗ＣＤ１９抗体の組み合わせは、１回の投与で同時に投与されるが、その他の投与としては、いずれかの順での同日、または異なる日の逐次投与が挙げられる。リツキシマブなどの抗ＣＤ２０抗体および１６Ｃ４などの抗ＣＤ１９抗体が同時投与される場合、それらは、それぞれ抗ＣＤ２０抗体（またはその抗原結合性断片）または抗ＣＤ１９抗体（またはその抗原結合性断片）のいずれかを含んでなる、別個の医薬組成物として投与され得て、またはこれらの抗がん剤の双方を含んでなる単回医薬組成物として投与され得る。
【実施例】
【００７５】
ここで本発明を一般的に記述し、それは、本開示の特定の実施形態および実施形態の単なる例証のみを目的とし、本発明の制限を意図しない、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
【００７６】
実施例１：抗ＣＤ１９  ｍＡｂ  １６Ｃ４−ａｆｕｃは、複数Ｂ白血病およびリンパ腫細胞系に対する強力な生体外ＡＤＣＣ活性を有する
１６Ｃ４−ａｆｕｃは、マウスＩｇＧ１  ｍＡｂ  ＨＢ１２Ｂのヒト化および親和性成熟によって作成された、ｍＡｂ  １６Ｃ４の脱フコシル化形態である。（Ｋａｎｓａｓ  ＧＳ  ａｎｄ  Ｔｅｄｄｅｒ  ＴＦ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９１；１４７：４０９４−４１０２；Ｙａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，２００５；１０２（４２）：１５１７８−１５１８３；Ｈｅｒｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，２０１０，３３５（１）：２１３−２２２）。フコシル化１６Ｃ４ｍＡｂと比較して、１６Ｃ４−ａｆｕｃは活性化ヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよびマウスＦｃγＲＩＶとの親和性が約９倍増大され、ＡＤＣＣエフェクター機能が改善されている。リツキシマブとは対照的に、１６Ｃ４はＣＤＣを媒介しない。（Ｈｅｒｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，２０１０，３３５（１）：２１３−２２２）
【００７７】
Ｂ白血病およびリンパ腫細胞系の大きなパネルにおいて、１６Ｃ４−ａｆｕｃのＡＤＣＣ活性をフコシル化前駆体であるｍＡｂ  １６Ｃ４の活性と比較した。陽性対照として、ＣＤ２０  ｍＡｂリツキシマブを全てのアッセイに含めた。試験された全ての細胞系で、１６Ｃ４−ａｆｕｃは、ＡＤＣＣの仲介について親ｍＡｂ抗ＣＤ１９  ｍＡｂよりも顕著に強力であった（図１Ａ−１Ｅ）。１５種の悪性Ｂ細胞系の全パネルに対する１６Ｃ４−ａｆｕｃの活性をリツキシマブの活性と比較すると、３つの異なる活性プロファイルが観察された。１つ目は、中量から高量のＣＤ１９を発現する（表Ｉ）Ｋａｒｐａｓ−１１０６Ｐ細胞（図１Ａ）によって例示される、それに対して１６Ｃ４−ａｆｕｃおよびリツキシマブがほぼ等効力であった細胞系；２つ目は、ＣＬＬ細胞系ＪＶＭ２（図１Ｂ）などの、それに対してリツキシマブが１６Ｃ４−ａｆｕｃよりも効果的であった細胞系；３つ目は、Ｏｃｉ−ＬＹ１９細胞（図１Ｃ）およびＤａｕｄｉ細胞（図１Ｄおよび表Ｉ）などの、それに対して１６Ｃ４−ａｆｕｃがリツキシマブよりも効果的であった細胞系。
【００７８】
細胞系はまた、ＣＤ１９およびＣＤ２０の相対的発現についても分析し、２つの抗原の表面レベルが、それぞれＣＤ１９およびＣＤ２０  ｍＡｂに対するそれらの生体外感度を決定するかどうかを判定した（表Ｉ）。図１Ｂでは、１６Ｃ４−ａｆｕｃおよびリツキシマブで観察されたＡＤＣＣ機能（最大細胞毒性百分率、図１ＥはＣＤ１９  ｍＡｂおよび図１ＦはＣＤ２０  ｍＡｂ；ＥＣ５０値、図１ＧはＣＤ１９  ｍＡｂおよび図１ＨはＣＤ２０  ｍＡｂ）が、ｍＡｂ  １６Ｃ４およびリツキシマブを検出の一次抗体とするフローサイトメトリーにより測定された、ＣＤ１９およびＣＤ２０の相対的表面発現に対してプロットされる。特定の細胞系では、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０  ｍＡｂに対する感度は、それらの相対的な抗原発現と一致するように見える。例えばＯｃｉ−ＬＹ１９細胞は、低濃度のＣＤ２０を有するがＣＤ１９を高度に発現し、１６Ｃ４処置にだけ応答する（表Ｉ）。逆はＧｒａｎｔａ−５１９細胞で観察され、それはＣＤ２０を高レベルで発現し、リツキシマブによって効率的に死滅するが、１６Ｃ４−ａｆｕｃでは死滅しない。しかし全ての細胞系にわたる比較は、抗原発現と、いずれかのｍＡｂにより媒介されるＡＤＣＣに対する感度との有意な相関を示さない。この相関の欠如は、ＣＤ１９およびＣＤ２０の双方を低濃度で発現するが、１６Ｃ４−ａｆｕｃによって効率的に死滅して、リツキシマブによって死滅しないＫａｒｐａｓ−４２２細胞によって例証される。
【００７９】
総合して、結果は、１６Ｃ４−ａｆｕｃが、複数の細胞系に対して、強力な生体外ＡＤＣＣ活性を有することを実証する。試験された１５細胞系の内１１で、１６Ｃ４−ａｆｕｃのＡＤＣＣ活性はＣＤ２０  ｍＡｂを凌いだ。しかしこの多様な悪性Ｂ細胞系の組では、抗原発現と、ＣＤ１９またはＣＤ２０  ｍＡｂ媒介ＡＤＣＣ感度とに有意な相関はなかった。
【００８０】
実施例２：１６Ｃ４−ａｆｕｃは生体外で患者由来ＣＬＬおよびＡＬＬ細胞に対して効果的である
Ｂ細胞系に対する１６Ｃ４−ａｆｕｃの活性を考慮して、主要白血病細胞に対するＣＤ１９  ｍＡｂの効果もまた調べた。ＣＬＬと診断された患者から６個のＰＢＭＣサンプルを得て、ＣＤ１９およびＣＤ２０に対する表面抗原密度を判定した。図２Ａに示されるように、これらのサンプル中のＢ細胞は、ＣＤ１９およびＣＤ２０を様々な程度に発現した。これらのサンプルのいくつかでは、ＣＤ２０抗原性部位の数はＣＤ１９部位の数を超えた。生体外ＦＡＣＳベースの細胞毒性アッセイを使用して、リツキシマブを陽性対照として、１６Ｃ４−ａｆｕｃがＣＬＬサンプル中でＢ細胞を殺傷する能力を評価した。図２Ｂ−２Ｄは、３つの代表的ＣＬＬサンプル（ＣＬＬ＃１０６、図２Ｂ；ＣＬＬ＃１０４、図２Ｃ；ＣＬＬ＃１０７、図２Ｄ）に対する、１６Ｃ４−ａｆｕｃおよびリツキシマブによるＡＤＣＣアッセイからの結果を示す。１６Ｃ４−ａｆｕｃのＥＣ５０値は、０．００７ｎＭ〜０．０６３ｎＭの範囲であった。対照的に、リツキシマブのＥＣ５０値は、０．６３９ｎＭ〜０．６８２ｎＭの範囲であった。１６Ｃ４−ａｆｕｃおよびリツキシマブによって媒介されるＡＤＣＣに対するＣＬＬ細胞の感度は、それぞれそれらのＣＤ１９およびＣＤ２０の表面発現と比較された（それぞれ図２Ｅおよび２Ｆ）。この分析からの結果は、ＣＤ１９およびＣＤ２０の双方について、抗原密度の増大と共に、より効率的な細胞死滅に向かう明らかな傾向を示す。これらの主要ＣＬＬサンプルの結果はまた、比較的低濃度の表面抗原発現で、生体外の枯渇を仲介する上で、１６Ｃ４−ａｆｕｃがリツキシマブよりも効果的であることも示す。
【００８１】
１６Ｃ４−ａｆｕｃ活性はまた、４人のＡＬＬ患者からのＰＢＭＣサンプルを用いたＦＡＣＳベースのＡＤＣＣアッセイ中でも試験された。これらのアッセイの内３つでは、健康なドナーからのからのＢ細胞と比較して、ＣＤ１９およびＣＤ２０の抗原密度を判定するのに十分な細胞数があった（図３Ａ）。正常末梢血Ｂ細胞では、ＣＤ１９およびＣＤ２０の平均密度は、それぞれ細胞あたり約２０，０００および約２００，０００抗原性部位と判定された。正常Ｂ細胞と比較して、２つのサンプルではＣＤ１９発現がいくらか低く、第３のＡＬＬサンプルでは２倍に増大していた（図３Ａ）。しかしＣＤ２０抗原性部位数は、より幅広く変動した。ＡＬＬがあるドナーからのサンプルのＡＤＣＣ  Ｂ細胞枯渇アッセイでは（図３Ｂ−３Ｅ）、１６Ｃ４−ａｆｕｃのＥＣ５０値は０．００２ｎＭ〜０．１３１ｎＭの範囲であった。これらの値は、リツキシマブで得られたＥＣ５０値の１／６〜１／１００未満であった。
【００８２】
総合して、結果は、１６Ｃ４−ａｆｕｃが、ＣＬＬおよびＡＬＬ患者からの主要白血病細胞に対するＡＤＣＣを事実上媒介することを示す。これらの生体外アッセイでは、ＣＤ１９  ｍＡｂがＣＤ２０  ｍＡｂリツキシマブよりも効果的であった。これはまた、その中で、ＣＤ２０発現レベルが、細胞表面ＣＤ１９レベルよりも顕著に高いサンプルにも当てはまる。
【００８３】
前記実験からの結果は、表Ｉに要約される。
【００８４】
【表１】
2013543869.tif 000002
【００８５】
実施例３：１６Ｃ４−ａｆｕｃはＦｃ依存性機序によってＳＣＩＤリンパ腫モデル中の腫瘍増殖を抑制する
次に、１６Ｃ４−ａｆｕｃが生体内で腫瘍増殖を阻害する能力を試験した。１６Ｃ４の抗腫瘍有効性は、ＳＣＩＤマウス中で増殖させた、複数のヒトＣＤ１９＋リンパ腫異種移植片中で評価した。
【００８６】
ＣＤ１９に対するｍＡｂの全部ではないが一部は、抗増殖性活性を有した。（Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９４；８３（５）：１３２９−１３３６）以前、ｍＡｂ  １６Ｃ４は、形質転換Ｂ細胞系ならびに健康なドナーからの一次Ｂ細胞の増殖を阻害することが示された。（Ｈｅｒｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，２０１０，３３５（１）：２１３−２２２）抗腫瘍効果に対するＡＤＣＣの貢献度を判定するために、１６Ｃ４−ａｆｕｃの有効性を、Ｆｃ−媒介エフェクター機能除去について改変されたＣＤ１９  ｍＡｂのバージョンであるｍＡｂ  １６Ｃ４−ＴＭと比較した。（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ，２００８；Ｄ６４：７００−７０４）ＤａｕｄｉおよびＲａｊｉＳＣＩＤ−リンパ腫異種移植モデルの双方で、皮下細胞移植に続いて７日目に開始して、毎週２．５ｍｇ／ｋｇの投与量で抗体を評価した。どちらも抗体も腫瘍増殖の低下をもたらしたが、脱フコシル化抗ＣＤ１９  ｍＡｂの方が、エフェクターなしの変異ｍＡｂ  １６Ｃ４−ＴＭよりも効果的であった（図４）。Ｒａｊｉモデルでは、３３日目（アイソタイプ対照治療群が、腫瘍サイズのために終了しなくてはならなかった時点）において、１６Ｃ４−ａｆｕｃは腫瘍増殖を８４％阻害し、１６Ｃ４−ＴＭは腫瘍増殖を４６％阻害した（図４Ｂ）。Ｄａｕｄｉモデルでは、３３日目には、１６Ｃ４−ａｆｕｃは腫瘍増殖を８８％阻害し、ｍＡｂ  １６Ｃ４−ＴＭは腫瘍増殖を３９％阻害した（図４Ａ）。これらの結果は、生体内における腫瘍増殖の効果的な阻害のために、Ｆｃ依存性エフェクター機能が必要であることを実証する。結果はまた、ＣＤ１９  ｍＡｂが、エフェクター機能不在下で（程度ははるかにより低いが）腫瘍増殖を遅延させ得ることを示し、これは恐らくはｍＡｂの抗増殖活性の結果である。
【００８７】
実施例４：１６Ｃ４−ａｆｕｃはヒトＢ細胞リンパ腫の複数ＳＣＩＤマウスモデル中で腫瘍増殖を抑制する
マウスモデル中で、腫瘍の増殖を抑制するに必要な１６Ｃ４−ａｆｕｃの用量を判定した。ＳＣＩＤ／Ｒａｊｉ皮下異種移植モデルにおいて、一連のｍＡｂ用量および投与スケジュールを試験した。ｍＡｂ投与範囲は、０．３、１、３、および１０ｍｇ／ｋｇの１６Ｃ４−ａｆｕｃを含んだ。投与計画バリエーションは、１、３、および５用量を含み、細胞移植後の５日目に１回目の用量を投与した（図５）。全体的に、１６Ｃ４−ａｆｕｃの生体内有効性は、用量およびスケジュール依存性であった。ここに提示されるモデルでは、５用量の１６Ｃ４−ａｆｕｃ（図５Ｂ）が、３用量（図５Ａ）よりも強力な抗腫瘍活性をもたらした。しかし３ｍｇ／ｋｇによる処置は、１０ｍｇ／ｋｇによる処置と同等の有効性を達成した。引き続く研究では、３ｍｇ／ｋｇの用量が使用され、毎週２回、合計５用量投与された。
【００８８】
この用量を使用して、リツキシマブを陽性対照および評価基準として、複数の皮下ＳＣＩＤリンパ腫異種移植モデルにおける１６Ｃ４−ａｆｕｃの効性を評価した。図６は、Ｎａｍａｌｗａ（図６Ａ）、Ｄａｕｄｉ（図６Ｂ）、およびＴｏｌｅｄｏ細胞（図６Ｃ）を用いた腫瘍モデルからの結果を示す。これらのモデルでは、１６Ｃ４は、対照群で得られた結果と比較して、腫瘍増殖をそれぞれ８２％、９１％、および８８％阻害した。Ｎａｍａｌｗａ腫瘍がリツキシマブ処置に対して応答不良であったのに対し、Ｄａｕｄｉ異種移植片は、１６Ｃ４−ａｆｕｃよりもＣＤ２０  ｍＡｂによって増殖がいくらかより良く阻害された。Ｔｏｌｅｄｏ腫瘍モデルでは、２つのｍＡｂは同等の有効性を示した。
【００８９】
生存期間または麻痺までの期間を主要エンドポイントとして、ＩＶ播種性腫瘍モデル中で、ＮａｍａｌｗａおよびＤａｕｄｉ細胞異種移植片を用いて、１６Ｃ４−ａｆｕｃの抗腫瘍効率をさらに試験した。Ｎａｍａｌｗａ（図６Ｅ）およびＤａｕｄｉ（図６Ｄ）モデルにおける１６Ｃ４−ａｆｕｃの投与は、対照群で観察された生存期間と比較して、生存期間をそれぞれ５０％および４３％増大させた。皮下リンパ腫モデルと同様、リツキシマブは、Ｎａｍａｌｗａ細胞を用いた全身性疾患モデルにおいて、軽微な効果のみを有した。Ｄａｕｄｉモデルでもまた、ｍＡｂ１６Ｃ４−ａｆｕｃおよびリツキシマブで観察された相対的有効性は、皮下モデルで観察された結果を再現した。結果は、１６Ｃ４−ａｆｕｃが、皮下および全身性モデルの双方でＢ細胞リンパ腫の複数モデルにおいて、腫瘍増殖を抑制することを示す。
【００９０】
実施例５：実施例５：腫瘍増殖の長期抑制をもたらす１６Ｃ４−ａｆｕｃとリツキシマブの組み合わせ
ＣＤ１９およびＣＤ２０  ｍＡｂによる、悪性Ｂ細胞の組み合わせ標的化によって媒介される腫瘍増殖阻害と、いずれかのｍＡｂ単独での標的化から得られる腫瘍増殖阻害とを比較した。４つの異なる皮下ＳＣＩＤリンパ腫／白血病モデル（Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、Ｏｃｉ−ＬＹ１９、Ｒａｍｏｓ、ＳＵＰ−Ｂ１５）を１６Ｃ４−ａｆｕｃおよびリツキシマブ単独で、または組み合わせて治療した。これらの実験では、１６Ｃ４−ａｆｕｃと同一スケジュールに従って同一濃度で、３ｍｇ／ｋｇで、合計５用量のリツキシマブが投与された。図５に示されるように、３ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇへの１６Ｃ４−ａｆｕｃの用量増大は、ＳＣＩＤ／Ｒａｊｉリンパ腫モデルにおいて、腫瘍増殖のより大きな阻害をもたらさなかった。しかし１６Ｃ４−ａｆｕｃとリツキシマブの組み合わせは、Ｒａｊｉ腫瘍増殖の長期抑制をもたらした（図７Ａ）。同様の結果は、皮下Ｄａｕｄｉリンパ腫モデル（図７Ｃ）でも得られ、２つのｍＡｂの組み合わせは、皮下リンパ腫のより大きな長期抑制をもたらした。Ｏｃｉ−ＬＹ１９皮下異種移植モデルではｍＡｂ組み合わせの効果は、あまりはっきりせず（図７Ｂ）、これはこのモデルにおけるリツキシマブの活性不良の結果かもしれない。しかしＣＤ１９  ｍＡｂは、良好な有効性を示し、ＣＤ１９  ｍＡｂとリツキシマブの組み合わせはより大きな腫瘍抑制をもたらした。同様に、Ｒａｍｏｓ異種移植モデル（図７Ｄ）ではｍＡｂ組み合わせの効果はあまりはっきりせず、これはこのモデルにおける１６Ｃ４−ａｆｕｃの比較的不良な活性の結果かもしれない。しかしＯｃｉ−ＬＹ１９モデルで見られたように、ＣＤ１９  ｍＡｂとリツキシマブの組み合わせは、このモデルでより大きな腫瘍抑制をもたらした。ＭＡｂ  １６Ｃ４−ａｆｕｃおよびリツキシマブはまた、ＳＵＰ−Ｂ１５  ＡＬＬ細胞を用いた皮下モデルにおいて、単独でおよび組み合わせて試験された（図７Ｅ）。１６Ｃ４−ａｆｕｃとリツキシマブの組み合わせは、単一作用物質よりも明白な腫瘍増殖阻害を有した。これに加えて、我々は、全身性Ｄａｕｄｉ腫瘍モデルにおいて、ＣＤ１９／ＣＤ２０  ｍＡｂ併用療法を試験した。皮下モデルからの結果と同様に、併用療法は、より大きな抗腫瘍有効性を示し、単一ｍＡｂ処置対照（データ示さず）を超える生存期間（９３．５％）増大がもたらされた。結果は、ＣＤ１９  ｍＡｂ  １６Ｃ４−ａｆｕｃとＣＤ２０  ｍＡｂリツキシマブの組み合わせが、ヒトＢ細胞リンパ腫の前臨床モデルにおいて、いずれかのｍＡｂ単独より大きな有効性を有することを実証する。
【００９１】
実施例６：ｈｕＣＤ１９／ＣＤ２０二重遺伝子導入マウスにおける併用療法の薬物動態学および薬物動力学
二重遺伝子導入動物は、ｈｕＣＤ１９遺伝子導入マウスとｈｕＣＤ２０遺伝子導入マウスの交配によって作成された。双方の系統は、先に良く特性解析されており、導入遺伝子をＢ細胞限定様式で発現し、それぞれＣＤ１９およびＣＤ２０  ｍＡｂによるＢ細胞枯渇研究に成功裏に使用されている。（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４：３８８４−３８９４；Ａｈｕｊａ  ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９：３３５１−３３６１；Ｙａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：１５１７８−１５１８３）。
【００９２】
リツキシマブサンプルまたは対照が投与され、およそ３６時間後に１６Ｃ４−ａｆｕｃ追加される投与計画後に、ＣＤ１９／ＣＤ２０遺伝子導入マウス中で１６Ｃ４−ａｆｕｃレベルを測定した。マウス血中の１６Ｃ４−ａｆｕｃレベルは、最長１６８０時間目まで測定した。４種の別個の投与が考察された。１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１ｍｇ／ｋｇ）＋対照（例えばリツキシマブなし）；１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋対照；１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１ｍｇ／ｋｇ）＋リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）；１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）。図８Ａは、実験の薬物動態学的結果を示す。単独投与またはリツキシマブと一緒の投与に関わりなく、より高用量の１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）は、より低用量の１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１ｍｇ／ｋｇ）よりも、血中により長時間保持された。
【００９３】
実施例７：ｈｕＣＤ１９／ＣＤ２０遺伝子導入マウスにおけるＢ細胞枯渇
併用療法によって媒介される生体内Ｂ細胞枯渇の程度をリツキシマブ単独の効果と比較した（図８Ｂ）。二重遺伝子導入ｈｕＣＤ１９／ＣＤ２０マウスに、（ｉ）リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、（ｉｉ）１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１ｍｇ／ｋｇ）；（ｉｉｉ）１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）；（ｉｖ）リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１ｍｇ／ｋｇ）；（ｖ）リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）の１つを投与した。様々な用量での投与後、周期的に、フローサイトメトリーによって、残留する血中および脾臓Ｂ細胞数を測定した。
【００９４】
図９は、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）の併用療法の最大用量が、最長持続期間にわたって血液および脾臓からの最大Ｂ細胞枯渇百分率をもたらすことを示す。特に、１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１ｍｇ／ｋｇ）の追加的投与のおよそ３８４時間（または１６日間）後に、Ｂ細胞枯渇は急激に低下する。Ｂ細胞枯渇の同様の低下は、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはリツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１ｍｇ／ｋｇ）が追加されたおよそ８４０時間（または３５日間）後に観察されるが、Ｂ細胞枯渇の百分率は、後者の投与量の投与後に上昇するようであった。より高用量の１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）が追加された場合、Ｂ細胞枯渇に対する影響は（単独または組み合わせ投与に関わらず）、より低用量の１６Ｃ４−ａｆｕｃと比較して、そしてリツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）単独と比較して、長期である。しかし最強かつ最長の効果は、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋１６Ｃ４−ａｆｕｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）の併用療法で観察される。
【００９５】
材料と方法
細胞および試薬
ヒトＢ白血病およびリンパ腫細胞系Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｎａｍａｌｗａ、Ｔｏｌｅｄｏ、Ｆａｒａｇｅ、およびＲＬは、米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から得られた。細胞系ＯＣＩ−ＬＹ−１９、Ｇｒａｎｔａ−５１９、Ｋａｒｐａｓ−４２２、Ｎａｌｍ−６、Ｋａｒｐａｓ−１１０６Ｐ、ＤＢ、ＪＶＭ−２、ＪＶＭ−１３、およびＭＥＣ２は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られた。ＫＣ１３３３ＮＫ細胞系（ヒトＣＤ１６発現する）は、ＢｉｏＷａ  Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）から得られた。全ての細胞系は、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で維持され、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が添加された。血液サンプルは、インフォームドコンセントを得た後に、健康なドナーから得た。ＣＬＬまたはＡＬＬと診断された患者からの凍結フィコール・ハイパック精製ＰＢＭＣサンプルは、Ｃｕｒｅｌｉｎｅ，Ｉｎｃ．から得た。ヒト化親和性最適化および脱フコシル化ＣＤ１９  ｍＡｂ  １６Ｃ４−ａｆｕｃ、ｍＡｂ  １６Ｃ４（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  １６Ｃ４）、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照ｍＡｂ  Ｒ３４７、およびｍＡｂ  １６Ｃ４−ＴＭは、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐによって提供された。１６Ｃ４−ＴＭ  ｍＡｂ  Ｆｃは、エフェクター機能を排除するように改変される。（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ，２００８；Ｄ６４：７００−７０４）ＣＤ２０  ｍＡｂリツキシマブ（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ，Ｉｎｃ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）は、生体外および生体内アッセイにおいて陽性対照として使用された。
【００９６】
ＡＤＣＣエフェクター機能が改善されたＣＤ１９  ｍＡｂを作成するために、ヒトＣＤ１９を認識するマウスＩｇＧ１  ｍＡｂ  ＨＢ１２ｂ（Ｋａｎｓａｓ  ａｎｄ  Ｔｅｄｄｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９１；１４７：４０９４−４１０２）をヒト化して親和性を最適化し、ｍＡｂ  １６Ｃ４をもたらした。均一脱フコシル化抗体作成するために  フコシルトランスフェラーゼ欠損産生ＣＨＯ細胞系（ＢｉｏＷａ  Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢｉｏＷａ  Ｉｎｃ．；Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）中で、ヒト化ＩｇＧ１  ｍＡｂ  １６Ｃ４を発現させて、１６Ｃ４−ａｆｕｃを作成した。
【００９７】
Ｂ細胞系上の抗原発現の判定
ｍＡｂ  １６Ｃ４またはリツキシマブをそれぞれ一次抗体として、それに続いて蛍光標識ヤギ抗ヒトｍＡｂを使用して、Ｂ細胞系上のＣＤ１９およびＣＤ２０発現のレベルを判定した。誘導結合アッセイでは、Ｂ細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ）に再懸濁した。未標識のｍＡｂ希釈液と共に、細胞を氷上で２０分間インキュベートし、洗浄して二次ｍＡｂ含有ＰＢＳに再懸濁した。氷上で２０分間後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、細胞表面の蛍光強度をフローサイトメトリーによって分析した。全ての細胞系で、ｍＡｂ  １６Ｃ４とリツキシマブの最大の結合は、濃度１μｇ／ｍｌで達成された。相対的抗原発現は、表Ｉで蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値として報告される。
【００９８】
正常および悪性Ｂ細胞上の抗原密度判定
抗ＣＤ１９クローンＨＤ３７および抗ＣＤ２０クローン２Ｈ７を一次抗体として、ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）製造会社の使用説明書を使用して、フローサイトメトリーによって、ＣＬＬまたはＡＬＬがあるドナーからの凍結ＰＢＭＣ、および健康な成人ドナーからのＰＢＭＣサンプルからのＢ細胞上のＣＤ１９およびＣＤ２０の抗原密度を判定した。
【００９９】
抗体依存性細胞傷害アッセイ
Ｅ：Ｔ比２．５：１で、標的指向（Ｔ）およびＮＫ作動体（Ｅ）細胞としてＢ白血病／リンパ腫細胞系を用いて、ＡＤＣＣアッセイを実施した。連続希釈ｍＡｂと共に細胞を４時間インキュベートし、製造会社の指示に従って実施されるＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出の検出によって、標的細胞溶解を測定した。全てのアッセイは、三連で行った。
【０１００】
多パラメータフローサイトメトリーを使用して、ＣＬＬまたはＡＬＬと診断されたドナーからの精製ＰＢＭＣを使用して、生体外ＡＤＣＣ活性を定量化した。全てのサンプルのリンパ球含有量は、９０％を超えた。健康なドナーからのＰＢＭＣサンプルと比較して、ＣＬＬまたはＡＬＬがあるドナーからのサンプルの大部分は、低濃度のＣＤ５６＋ＮＫ細胞を有した。そのためＣＬＬおよびＡＬＬ  ＰＢＭＣサンプルには、ＫＣ１３３３  ＮＫ細胞を添加した。凍結ＰＢＭＣ（ＣＬＬまたはＡＬＬ）サンプルを３７℃の水浴内で解凍し、洗浄して、（１０％熱不活性化ＦＢＳおよび２ｍＭＬ−グルタミン添加）ＲＰＭＩ  １６４０に再懸濁し、全容積２００μＬで、Ｎｕｎｃ  Ｕ９６ウェル丸底マイクロウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）内に５×１０４細胞／ウェルで播種した。ＫＣ１３３３  ＮＫエフェクター細胞（２５×１０４）を添加して、Ｅ：Ｔ比５：１を達成した。リツキシマブ、１６Ｃ４−ａｆｕｃ、または脱フコシル化アイソタイプ対照ｍＡｂ  Ｒ３４７の連続希釈を１０μｌアリコートでウェル（三連）に添加し、ＰＢＭＣを５％ＣＯ２と共に２０時間にわたり３７℃でインキュベートした。細胞毒性百分率は、抗ＣＤ１９フィコエリトリンＣｙ７（ＰＥ−Ｃｙ７）、抗ＣＤ２０  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、抗ＣＤ２２アロフィコシアニン（ＡＰＣ）または抗ＣＤ２２フィコエリトリン（ＰＥ）、および抗ＦｃεＲ１αフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含有する蛍光標識抗体のカクテル中で細胞を染色することで測定された。計数基準として、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加して、細胞サブセットの細胞濃度を測定した。ＬＳＲＩＩフローサイトメーター上でサンプルを得た。ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）ソフトウェア、バージョン７．２．２を用いて、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）データを分析した。ＩｇＧ１脱フコシル化ｍＡｂであるＲ３４７−ａＦｕｃを非枯渇治療対照として使用し、ゲートを判定するために使用した。各サンプル中の絶対計数ビーズの数を定量化した。製造会社の使用説明書に従って、標準計数ビーズを使用して、総ＣＤ２２＋またはＣＤ２０＋ＣＤ２２＋ゲート中の生存Ｂ細胞数を細胞濃度に転換した。以下の式に従って、Ｂ細胞枯渇（百分率細胞毒性）を計算した。
リツキシマブ：
％細胞毒性＝｛１−［ＣＤ２２＋リツキシマブ処置細胞／ｍＬ］÷［ＣＤ１９＋ＣＤ２２＋対照処置細胞／ｍＬ］｝×１００
１６Ｃ４−ａｆｕｃ：
％細胞毒性＝｛１−［ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋１６Ｃ４細胞／ｍＬ］÷［ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋対照処置細胞／ｍＬ］｝×１００
Ｂ細胞細胞毒性の最大半量有効濃度（ＥＣ５０）は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の４変量曲線適合方程式を使用して計算された。
【０１０１】
ＳＣＩＤマウスリンパ腫モデル
複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）リンパ腫異種移植モデルおいて、腫瘍増殖の阻害生体内を研究した。４〜６週齢のメスＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスをＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）で繁殖させ、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅの実験動物資源施設で維持した。全てのマウス実験は、ＩＡＣＵＣ認可プロトコルに従って行われた。限局性および播種性ＳＣＩＤリンパ腫異種移植モデルの双方を使用して、研究を実施した。限局性皮下（ｓ．ｃ．）異種移植マウスモデルでは、０日目に、マウス（１０匹のコホート）に５×１０６腫瘍細胞を接種した。提示されるように腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって、５または７日目にマウスをｍＡｂまたはビヒクルで処置した。皮下モデルでは、腫瘍体積を経時的にモニターした。播種性ＳＣＩＤマウスモデルでは、１×１０６〜５×１０６個の細胞を尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。腫瘍細胞の注射後７日目に、コホート（各１０匹のマウス）を４日毎に１用量の投与で、３ｍｇ／ｋｇ体重の５用量のｍＡｂで処置した。播種性腫瘍モデルでは、生存期間、または死亡に先行する臨床症状である麻痺までの期間を評価項目として使用した。
【０１０２】
薬物動態学的／薬力学研究
ＭＳＤ電気化学発光（ＥＣＬ）免疫測定法方法を使用して、マウス血清中の１６Ｃ４およびリツキシマブを定量化した。１６Ｃ４−ａｆｕｃは、ＭＡ６０００ＭＳＤマイクロタイタープレートに被覆された、可溶性組換えマウス抗イディオタイプ抗体（Ｄ９）により捕捉される。次に、ビオチン化ロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異性抗体、それに続いてスルホ−ＴＡＧストレプトアビジンを使用して、いずれかの結合１６Ｃ４を検出する。これをＭＳＤ読み取り緩衝液と反応させ、ＥＣＬシグナルの生成と測定のために、プレートをＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ（商標）Ｉｍａｇｅｒモデル６０００リーダーにのせる。ＥＣＬ計数を１６Ｃ４濃度と関連付ける４パラメータ曲線適合を使用して、標準曲線からの内挿によって、サンプル中の１６Ｃ４−ａｆｕｃ濃度を判定する。
【０１０３】
ｈｕＣＤ１９／ＣＤ２０遺伝子導入マウスフローサイトメトリーによるＢ細胞数の解析
全てのマウス実験は、ＩＡＣＵＣ認可プロトコルに従って、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ動物施設の無菌環境で実施された。ｈｕＣＤ１９遺伝子導入マウスとｈｕＣＤ２０遺伝子導入マウスとの交配によって作成された、ｈｕＣＤ１９／ＣＤ２０二重遺伝子導入マウス中において、ＣＤ１９およびＣＤ２０  ｍＡｂによるＢ細胞生体内枯渇を評価した。（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４：３８８４−３８９４；Ａｈｕｊａ  ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９：３３５１−３３６１）。オス（ｎ＝１０５）およびメス（ｎ＝１０５）遺伝子導入マウス（９−１２週齢；時点／群あたり２匹のオスおよび２匹のメス）をＰＢＳ、１６Ｃ４−ａｆｕｃ、および／またはリツキシマブを尾静脈注射投与される６群に無作為化した。所定の時点で眼窩静脈叢から全血を採取し、フローサイトメトリーを使用してさらに分析した。ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートＢ２２０（ＣＤ４５Ｒ）およびＰＥコンジュゲートｍｕＣＤ１９で染色して、各サンプル中のＢ細胞数を判定した。Ｂ２２０＋ｍｕＣＤ１９＋Ｂ細胞はまた、Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｌｕｅコンジュゲートｈｕＣＤ２０と、ＡＰＣ−Ｃｙ７コンジュゲートｈｕＣＤ１９抗体の結合についても試験した。最後に、Ｔ細胞をＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ３抗体で染色した。サンプルをＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターにかけて、ＦｌｏｗＪｏでデータを分析した。
【０１０４】
援用
本明細書で言及される全ての刊行物および特許は、あたかも個々の出版物または特許を具体的に個々に参照によって援用すると示されるように、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。矛盾がある場合、その中のいずれの定義も含めて本出願が優先される。
【０１０５】
均等物
主題発明の特定の実施形態を考察したが、上の明細書は例示的であり、制限的であることは意図されない。本開示の多くの変形形態が、本明細書および下記の請求項を検討すれば、当業者には明白である。本開示の全範囲は、このような変形形態と共に、その均等物の全範囲および明細書と共に、特許請求の範囲を参照して判断されるベきである。
【０１０６】
１６Ｃ４抗体の配列
配列番号１、ＶＨドメイン
Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ
【０１０７】
配列番号２、ＶＨ  ＣＤＲ１
ＳＳＷＭＮ
【０１０８】
配列番号３、ＶＨ  ＣＤＲ２
ＲＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＶＫＦＫＧ
【０１０９】
配列番号４、ＶＨ  ＣＤＲ３
ＳＧＦＩＴＴＶＲＤＦＤＹ
【０１１０】
配列番号５、ＶＫドメイン
Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ
【０１１１】
配列番号６、ＶＫ  ＣＤＲ１
ＲＡＳＥＳＶＤＴＦＧＩＳＦＭＮ
【０１１２】
配列番号７、ＶＫ  ＣＤＲ２
ＥＡＳＮＱＧＳ
【０１１３】
配列番号８、ＶＫ  ＣＤＲ３
ＱＱＳＫＥＶＰＦＴ
【図１−１】
2013543869.tif 000003
【図１−２】
2013543869.tif 000004
【図２−１】
2013543869.tif 000005
【図２−２】
2013543869.tif 000006
【図３−１】
2013543869.tif 000007
【図３−２】
2013543869.tif 000008
【図４】
2013543869.tif 000009
【図５】
2013543869.tif 000010
【図６】
2013543869.tif 000011
【図６−２】
2013543869.tif 000012
【図７−１】
2013543869.tif 000013
【図７−２】
2013543869.tif 000014
【図７−３】
2013543869.tif 000015
【図８】
2013543869.tif 000016
【図９】
2013543869.tif 000017
【国際調査報告】
2013543869.tif 000018