(57)【要約】本発明は、前立腺癌細胞におけるホルモンエスケープを評価するためのマーカーとしてのＣＸＣＬ５の使用に関する。本発明はさらに、前立腺癌細胞におけるホルモンエスケープを評価するための診断法およびキット、並びに、前立腺癌および／または前立腺癌におけるホルモンエスケープの処置または予防に使用するためのＣＸＣＬ５アンタゴニストを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌に罹患している患者におけるホルモンエスケープを評価するためのin vitroにおける方法であって、
ａ）前記患者の生物学的試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを測定する工程；および
ｂ）工程（ａ）で測定された量および／またはレベルを、ネガティブコントロール試料で測定されたＣＸＣＬ５の量および／またはレベルと比較する工程
を含み、前記ネガティブコントロール試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルと比較して、前記生物学的試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルの増加の検出は、前立腺癌細胞がホルモンエスケープを受けていることを示し、これにより前記患者におけるホルモンエスケープを評価する、前記方法。
【請求項２】
少なくとも２倍の増加は、前立腺癌細胞がホルモンエスケープを受けていることを示す、請求項１の方法。
【請求項３】
前記個体に対する処置レジメンを設計する工程をさらに含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）および（ｂ）は、前記患者におけるホルモンエスケープの開始をモニタリングするためにおよび／または薬物に対する前記患者の応答性をモニタリングするために、少なくとも２つの異なる時点において繰り返される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）の測定が、免疫化学、ＥｌｉｓａまたはＲＴ−ＰＣＲによって実施される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的試料が、前立腺組織、前立腺細胞、血清および尿からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ｉ．ＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを検出するための手段；および
ｉｉ．アンドロゲン非依存性前立腺癌に罹患している個体におけるＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを示すポジティブコントロール試料；および／または
ｉｉｉ．アンドロゲン依存性前立腺癌に罹患している個体におけるＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを示すネガティブコントロール試料
を含む、前立腺癌に罹患している患者におけるホルモンエスケープを評価するためのキット。
【請求項８】
アンドロゲン非依存性前立腺癌および／または前立腺癌におけるホルモンエスケープの治療または予防において使用するためのＣＸＣＬ５アンタゴニスト。
【請求項９】
前記ＣＸＣＬ５アンタゴニストが、ＣＸＣＬ５のドミナントネガティブ突然変異体、小分子、アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、アプタマー、ペプチドおよび抗体からなる群より選択される、請求項８記載のアンタゴニスト。
【請求項１０】
前記ＣＸＣＬ５アンタゴニストが、干渉ＲＮＡおよび抗体からなる群より選択される、請求項８記載のアンタゴニスト。
【請求項１１】
ａ）試験化合物を準備する工程；および
ｂ）前記試験化合物がＣＸＣＬ５の生物学的活性を阻害するかどうかを決定する工程
を含み、前記試験化合物がＣＸＣＬ５の生物学的活性を阻害するという決定は、前記試験化合物が、アンドロゲン非依存性癌の治療または予防のための薬物であることを示す、アンドロゲン非依存性癌の処置のための薬物についてスクリーニングするin vitroにおける方法。
【請求項１２】
前立腺癌におけるホルモンエスケープを評価するためのマーカーとしてのＣＸＣＬ５の使用。
【請求項１３】
アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞のための細胞モデルとしての前立腺癌細胞から誘導された組換え細胞株の使用であって、前記組換え細胞株のゲノムは、ＣＸＣＬ５を含む発現ベクターを含むことを特徴とする、前記使用。
【請求項１４】
請求項１３において定義したような組換え細胞株を含む非ヒト動物。
【請求項１５】
アンドロゲン非依存性前立腺癌のためのモデルとしての請求項１４の非ヒト動物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌細胞におけるホルモンエスケープを評価するためのマーカーとしてのＣＸＣＬ５の使用に関する。本発明はさらに、前立腺癌細胞におけるホルモンエスケープを評価するための診断法およびキット、並びに、前立腺癌および／または前立腺癌におけるホルモンエスケープの処置または予防に使用するためのＣＸＣＬ５アンタゴニストを提供する。
【０００２】
前立腺癌は、世界中でかなりの罹患率および死亡率を引き起こす疾病である。最も広まっている形態は前立腺腺癌である。米国だけで、毎年、約２１９，０００の新たな前立腺腺癌の症例があり、前立腺腺癌に起因して約２７，０００人が死亡している。前立腺腺癌によるこれらの死亡の実質的に全ては、ホルモン抵抗性（アンドロゲン非依存性）疾病を有する男性に起こる。
【０００３】
ホルモンエスケープは前立腺癌処置における大きな問題である。なぜなら、それは抗アンドロゲン物質を用いて処置された大半の患者に対して、１４カ月から３０カ月の一定の期間の後に生じるからである。
【０００４】
実際に、前立腺癌は、アンドロゲン性ステロイドの影響下で発達および進行する悪性疾患である。種々の形態のアンドロゲン枯渇療法が、手術がもはや効果的な処置選択肢ではない前立腺癌と診断された患者を処置するために使用される。前立腺癌患者のためのアンドロゲン枯渇療法の有効性は、腫瘍細胞の増殖を抑制し、そしてこれらの細胞の少なくとも何分の一かのアポトーシスを誘導するその能力に基づく。しかしながら、必然的に、アンドロゲン枯渇療法を生き延びた残った前立腺腫瘍細胞は、ホルモン難治性であると考えられる状態にまで進行する。なぜなら、その増殖および生存はもはや、処置患者のアンドロゲン枯渇環境においては抑制されないからである。別の言葉で言えば、これらの細胞においてホルモンエスケープが起こった。ホルモンエスケープの発生は、前立腺癌の高い罹患率および死亡率に関連する。
【０００５】
Araki et al. (2007 Cancer Res. 67:6854-62)は、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）がアンドロゲン非依存性前立腺癌の増殖および進行の分子決定基であることを教義し、そして、ＩＬ−８アンタゴニストを、アンドロゲン非依存性前立腺癌の処置のための化学療法の脈絡で使用し得ることを示唆する。しかしながら、Araki et al. (2007)は、この結論が最終的にはインターロイキンファミリーの他のメンバーにまで拡張され得ることを教義も示唆もしていない。
【０００６】
Begley et al. (2008 Neoplasia. 10:244-54)は、ＣＸＣＬ５の発現が、前立腺腫瘍の進行と一致して増加することを教義している。しかしながら、Begley et al. (2008)は、ＣＸＣＬ５の発現が、アンドロゲン依存性の原因または結果であるかどうかの教義はしていない。特に、Begley et al. (2008)は、ＣＸＣＬ５がホルモンエスケープの開始に役割を果たすという教義も示唆もしていない。逆に、Begley et al. (2008)は、アンドロゲン非依存性機序が、ＣＸＣＬ５により媒介される前立腺癌細胞の増殖応答に関与することを示唆している。
【０００７】
それ故、前立腺癌に罹患している患者におけるホルモンエスケープの開始を評価し、そしてホルモンエスケープが行なわれた患者を処置するのに効率的である薬物を同定する必要性がある。
【０００８】
発明の説明
ＣＸＣＬ５ケモカインは、グレードの高い前立腺腫瘍の上皮細胞において高度に発現されていることが判明した。さらに、侵襲性の前立腺癌細胞株は、より悪性度の低い前立腺癌細胞株よりも高いレベルのＣＸＣＬ５を産生する。このより高い発現は、ＣＸＣＬ５遺伝子プロモーターのより高い転写活性に起因することがさらに示された。
【０００９】
研究は、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）陽性の前立腺癌細胞株ＣＷＲ−Ｒ１を用いて行なわれた。ＣＷＲ−Ｒ１細胞をＣＸＣＬ５ ｃＤＮＡを用いてトランスフェクションし、そしてＣＸＣＬ５ ｃＤＮＡを安定に発現しているクローンを単離した。ＣＸＣＬ５の発現は、in vitroにおいて細胞の増殖を増加させ、そして細胞がプラスチック皿に付着する能力を低下させたことが驚くべきことに判明した。さらに、ＣＸＣＬ５の発現は、in vivoにおいてこれらの細胞に壮観な増殖を付与した。
【００１０】
ＣＸＣＬ５遺伝子はアンドロゲンにより調節されていることが驚くべきことに判明した。実際に、アンドロゲンを除去するとその発現はアップレギュレーションされ、一方、アンドロゲンの添加はその発現を減少させた。さらに、抗アンドロゲン物質のビカルタミドを用いてＣＷＲ−Ｒ１を処置すると、ＣＸＣＬ５の増加した発現がもたらされた。
【００１１】
ＣＸＣＬ５によるＣＷＲ−Ｒ１細胞の処理は、in vitroにおいてビカルタミドの存在下においてさえも細胞の増殖を増加させた。これはin vivoにおいて確認された。実際に、野生型ＣＷＲ−Ｒ１細胞はアンドロゲンの非存在下において増殖できない。これとは対照的に、ＣＸＣＬ５の存在は、ＣＷＲ−Ｒ１細胞の腫瘍取り込みを可能とした。さらに、ＣＷＲ−Ｒ１−ＣＸＣＬ５腫瘍を有する動物を去勢すると、ホルモンエスケープが生じ、一方、野生型ＣＷＲ−Ｒ１細胞はホルモンエスケープを受けることができなかった。
【００１２】
血清中ＣＸＣＬ５レベルが腫瘍のそのレベルと一致することがさらに判明し、このことは本発明の脈絡において、ＣＸＣＬレベルを前立腺細胞ではなく血清中で測定し得ることを実証する。ヒトにおいて、ＣＸＣＬ５はまた患者の血清および尿中においても検出され得る。
【００１３】
さらに、ＣＸＣＬ５活性の遮断は、その分裂促進効果を強く減少させることが判明した。
【００１４】
要約すると、ＣＸＣＬ５は、前立腺癌細胞のホルモンエスケープに関与する、アンドロゲンにより調節される遺伝子であることが判明した。従って、ＣＸＣＬ５は、前立腺癌におけるホルモンエスケープに対するマーカー、および前立腺癌の処置のための治療標的を構成する。
【００１５】
定義
「ＣＸＣＬ５」という用語は、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン５を指す。ヒトＣＸＣＬ５のアミノ酸配列は配列番号１（スイスプロットアクセッションナンバーＰ４２８３０）として示される。「ＣＸＣＬ５」という用語は、配列番号１のタンパク質（完全長および成熟アイソフォーム）並びに他の種におけるその相同体、タンパク質分解プロセシングによって得られたその変異体、そのスプライス変異体およびその対立遺伝子変異体を包含する。
【００１６】
本明細書において使用する「前立腺癌」という用語は、前立腺組織に位置する任意のタイプの悪性（すなわち良性ではない）腫瘍、例えば、前立腺腺癌、前立腺肉腫、未分化前立腺癌、前立腺扁平上皮癌、前立腺導管移行性癌および前立腺上皮内新生物を指す。前立腺癌は、好ましくは、前立腺の腺癌に対応する。
【００１７】
前立腺癌は、好ましくは、「アンドロゲン非依存性前立腺癌」、すなわち、ホルモン難治性および非応答性として臨床的に定義されている前立腺癌に対応する。
【００１８】
「処置法」によって、疾病に罹患している個体の状態を治癒、改善および／または寿命を延ばすことを目的とした方法を意味する。
【００１９】
「予防法」によって、疾病の発生を予防することを目的とした方法を意味する。
【００２０】
「生物学的試料」という用語は、任意のタイプの生物学的試料を指す。生物学的試料は、例えば、前立腺組織または前立腺細胞、最も好ましくは上皮前立腺癌細胞に対応し得、これは例えば手術による切除または生検によって得ることができる。ケモカインは分泌されているので、それらを直接的に生物学的液体中において検出することができる。例えば、ＣＸＣＬ５を患者の血清中および尿中において検出することができる（実施例９参照）。それ故、生物学的試料は、好ましくは、生物学的液体、例えば血液、血漿、血清、尿、精液またはリンパ液に対応する。特に、実施例７に示したように、血清中ＣＸＣＬ５レベルは、ＣＸＣＬ５の腫瘍内発現に相関する。さらに、従来技術からのデータは、前立腺癌に罹患している患者の血清中または血漿中のＣＸＣＬ５発現レベルの変動を検出することができることを確認する(Sung et al. Cancer Res. 2008 Dec 1;68(23):9996-10003, et Macoska et al. Prostate. 2008 Mar 1;68(4):442-52)。従って、生物学的試料は最も好ましくは血漿または血清に対応する。
【００２１】
前立腺に由来する細胞が少数でこのような生物学的液体中に見られることを注記し得る。従って、生物学的液体を場合により前立腺に由来する組織または細胞について濃縮し得る。前立腺細胞の濃縮は、例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対して指向される抗体などの前立腺選択的抗体を使用した蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの細胞選別法を使用して達成され得る。あるいは、濃縮は、このような前立腺特異的抗体、例えば抗ＰＳＡ抗体でコーティングされた、磁気ビーズまたは他の固相支持体、例えばカラムを使用して達成され得る。
【００２２】
「抗体」は、完全な免疫グロブリン分子だけでなく、抗原結合部位を保持したそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよびその他のフラグメントも含むことを意味する。「抗体」という用語はまた、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）および単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）などの抗体の遺伝子工学された誘導体も含む。この用語はさらに、ファージディスプレイ技術または分子のための他のランダム選択技術を使用して産生され得る、抗体様分子を含む。この用語は、全てのクラスの抗体、およびより具体的にはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であれば好ましい。「モノクローナル抗体」という用語は、唯一つのタイプの抗原を認識する抗体を指す。「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマによって産生される抗体（Kohler and Milstein 1975 Nature 256:495-7）および遺伝子工学を通して得られる組換え抗体の両方を包含する。より具体的には、モノクローナル抗体は、例えばファージディスプレイ（Vaughan et al. 1998 Nat Biotechnol. 16:535-9）またはトランスジェニック技術（Lonberg 2005 Nat Biotechnol. 23:1117-25）によって産生され得る、キメラ抗体（Boulianne et al. 1984 Nature 312:643-6）、ヒト化抗体（Jones et al. 1986 Nature 321:522-5）および完全ヒト抗体を包含する。抗体をヒト患者に投与しようとするならば、モノクローナル抗体は完全なヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体であれば好ましい。
【００２３】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、抗体フラグメントから形成されるＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ディアボディおよび多重特異的抗体を含む。「Ｆａｂ」という用語は、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを示し、ＩｇＧをプロテアーゼのパパインで処理することによって得られるフラグメントの中で、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分と完全なＬ鎖が、ジスルフィド結合を通して共に結合している。
【００２４】
「Ｆ（ａｂ’）２」は、ＩｇＧをプロテアーゼのペプシンで処理することによって得られるフラグメントの中で、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合した、Ｆａｂよりも僅かに大きい、約１００，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指す。
【００２５】
「Ｆａｂ’」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指す。
【００２６】
一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から通常発現される、共有結合したＶＨ：:ＶＬヘテロダイマーである。本発明のヒトｓｃＦｖフラグメントは、好ましくは遺伝子組換え技術を使用することによって、適切なコンフォメーションに保持されたＣＤＲを含む。
【００２７】
「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーである。二価および多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖｓの会合によって自発的に形成され得るか、または二価ｓｃ（Ｆｖ）２などのペプチドリンカーによって一価ｓｃＦｖｓをカップリングすることによって生成され得る。
【００２８】
「ジアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対を形成させ、そして２つの抗原結合部位を作る。
【００２９】
「ｓｉＲＮＡ」という用語は、二本鎖の中のＲＮＡ鎖のいずれかに相同なｍＲＮＡ配列を分解するように作用し、そして細胞、例えば哺乳動物細胞（ヒト細胞を含む）および身体、例えば哺乳動物の身体（ヒトを含む）において特定の遺伝子の転写後サイレンシングを引き起こし得る、低分子干渉ＲＮＡを指す。ＲＮＡ干渉の現象は、例えば、Bass (2001 Nature 411:428-29)、Elbahir et al. (2001 Nature 411: 494-98)、Fire et al. (1998 Nature 391:806-11)およびWO 01/75164に記載および考察されており、ここでは干渉ＲＮＡを作製する方法も考察されている。本明細書において開示した遺伝子産物をコードする配列および核酸に基づいたｓｉＲＮＡは典型的には、１００より少ない塩基対を有し、そして例えば約３０塩基対またはより短くあり得、そして相補的ＤＮＡ鎖の使用を含む当技術分野において公知のアプローチまたは合成アプローチによって作製され得る。ｓｉＲＮＡは干渉を引き起こすことができ、そして細胞、例えば哺乳動物細胞（ヒト細胞を含む）および身体、例えば哺乳動物の身体（ヒトを含む）において特定の遺伝子の転写後サイレンシングを引き起こし得る。本発明による例示的なｓｉＲＮＡは、３０、２５、２２、２０、１５、１０または５ヌクレオチドまでの長さ、またはそのあたりまたはその間の任意の整数の長さを有し得る。最適な抑制性ｓｉＲＮＡを設計するためのツールは、DNAengine Inc. (Seattle, Washington, USA)およびAmbion, Inc. (Austin, Texas, USA)から入手できるものを含む。
【００３０】
「ｓｈＲＮＡ」（すなわち「ショートヘアピンＲＮＡ」）という用語は、タイトなヘアピンターンを作り、そしてＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンスするために使用される、ＲＮＡ配列を指す。ＳｈＲＮＡはウイルスベクターを用いて、一般的にはレンチウイルスベクターを用いて細胞に導入され、よってそれらは通常、細胞のゲノムに組み込まれる。それ故、それらは娘細胞まで継代され、遺伝子サイレンシングが遺伝されることが可能となる。ＳｈＲＮＡ構築物は一般に、ＲＮＡが確実に合成されるためのプロモーターを含む。一旦産生されると、ｓｈＲＮＡヘアピン構造は細胞機械によって切断されてｓｉＲＮＡとなり、これはその後、前記の機序に従って遺伝子発現をサイレンスし得る。
【００３１】
別個の意味を有するが、「含む（comprising）」、「有する」、「含む（containing）」および「からなる」という用語は本明細書全体を通して同義語として使用され、そして互いに置き換え得る。
【００３２】
本発明による診断法および使用
ＣＸＣＬ５ケモカインは、グレードの高い前立腺腫瘍の上皮細胞において高度に発現されていることが判明した。さらに、驚くべきことに、ＣＸＣＬ５は、前立腺癌細胞のホルモンエスケープに関与する、アンドロゲンにより調節される遺伝子であることが判明した。最後に、前立腺癌細胞におけるＣＸＣＬ５の過剰発現がホルモンエスケープを誘導することがin vivoのマウスにおいて実証された。全体として、これらのデータは、アンドロゲンによって調節されそしてその過剰発現がホルモンエスケープに至る、ＣＸＣＬ５は、前立腺癌におけるホルモンエスケープに重要な役割を果たしていることを示す。
【００３３】
それ故、本発明の局面は、前立腺癌におけるホルモンエスケープを評価するためのマーカーとしてのＣＸＣＬ５の使用に関する。増加した量および／または増加した発現レベルのＣＸＣＬ５は、ホルモンエスケープを示す。
【００３４】
「マーカーとして使用」によって、in vitroでの使用を意味し、ＣＸＣＬ５が例えばリガンド、抗体、プローブおよび／またはプライマーを使用して検出される。それ故、本発明はまた、前立腺癌におけるホルモンエスケープを評価するための、生物学的試料中のＣＸＣＬ５を検出するための手段の使用にも関する。前記の生物学的試料は、前立腺癌に罹患している個体から、または罹患している可能性のある個体から前もって採取された。
【００３５】
１つの態様において、ＣＸＣＬ５は、少なくとも１つの他のケモカイン、例えばＣＸＣＬ８などと組み合わせて使用される。
【００３６】
本発明はさらに、アンドロゲン非依存性前立腺癌を診断するためのin vitroにおける方法に関し、
ａ）前立腺癌に罹患しているまたは罹患している可能性のある個体の生物学的試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを測定する工程；
ｂ）工程（ａ）で測定された量および／または発現レベルを、ネガティブコントロール試料で測定された量および／またはレベルと比較する工程
を含み、前記のネガティブコントロール試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルと比較して、前記生物学的試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルの増加の検出は、前記個体が、アンドロゲン非依存性前立腺癌に罹患している可能性があることを示す。
【００３７】
ＣＸＣＬ５の発現はホルモンエスケープに相関しているので、本発明はまた、前立腺癌に罹患している患者におけるホルモンエスケープを評価するためのin vitroにおける方法に関し、
ａ）前記患者の生物学的試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを測定する工程；および
ｂ）工程（ａ）で測定された量および／またはレベルを、ネガティブコントロール試料中で測定されたＣＸＣＬ５の量および／またはレベルと比較する工程
を含み、前記のネガティブコントロール試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルと比較して、前記生物学的試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルの増加の検出は、前立腺癌細胞がホルモンエスケープを受けていることを示し、これにより前記患者におけるホルモンエスケープを評価する。
【００３８】
前記増加（あれば）は好ましくは統計学的に有意である。生物学的試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルが、ネガティブコントロール試料中の量および／またはレベルと比較して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍増加する場合に、増加は統計学的に有意であると判断する。
【００３９】
特定の態様において、本発明による方法は、
ａ）前記患者の生物学的試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを測定する工程；および
ｂ）工程（ａ）で測定されたＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを、ネガティブコントロール試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルと比較する工程；
ｃ）前記生物学的試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルが、前記のネガティブコントロール試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルと比較して増加しているかどうかを決定する工程
を含み、増加した量および／または発現レベルは、前立腺癌細胞がホルモンエスケープを受けていることを示し、これにより前記患者におけるホルモンエスケープを評価する。
【００４０】
本明細書全体を通して使用する「コントロール試料」という用語は、既知量のＣＸＣＬ５を含む試料、または健康であることが知られるもしくは前立腺癌に罹患していることが知られる個体から採取した試料を指す。このようなコントロール試料は、例えば、個体群において決定されたＣＸＣＬ５の平均量に対応する既知量のＣＸＣＬ５を含み得る。ＣＸＣＬ５は、コントロール試料内で、例えばポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡとして存在し得る。
【００４１】
コントロール試料は、ポジティブコントロール試料またはネガティブコントロール試料のいずれかに対応し得る。
【００４２】
「ポジティブコントロール試料」は、例えば、アンドロゲン非依存性前立腺癌に罹患している個体に見られるＣＸＣＬ５の量を示す、ＣＸＣＬ５の量を含み得る。
【００４３】
「ネガティブコントロール試料」は、例えば、健康個体（すなわち前立腺癌に罹患していない個体）に見られるＣＸＣＬ５の量、またはアンドロゲン依存性前立腺癌に罹患している個体におけるＣＸＣＬ５の量のいずれかを示す、ＣＸＣＬ５の量を含み得る。
【００４４】
ＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを測定するための方法は当技術分野において周知である。量および／または発現レベルは、ｍＲＮＡを定量することによって、またはタンパク質を定量することによってのいずれかにより測定され得る。適切な方法としては、例えば、免疫化学、Ｅｌｉｓａ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、ノザンブロット、ＰＣＲ（例えばＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅法（ＴＭＡ）、相補鎖置換増幅法（ＳＤＡ）および核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
【００４５】
好ましい態様において、ＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルは、Ｅｌｉｓａによって、例えば化学発光Ｅｌｉｓａアッセイを通して測定される。このアッセイは、例えば、実施例１の１５段落に記載の通りに実施され得る。簡潔に言うと、このアッセイは、
−  マイクロタイタープレートを、抗ＣＸＣＬ５抗体（例えばポリクローナル抗ヒトＣＸＣＬ５Ａｂ、例えばR&D SystemsのＭＡＢ２５４）でコーティングする工程；
−  前記マイクロタイタープレートを洗浄する工程；
−  生物学的試料を加える工程；
−  マイクロタイタープレートを洗浄する工程；
−  ビオチニル化抗ＣＸＣＬ５抗体（例えばビオチニル化ポリクローナル抗ヒトＣＸＣＬ５Ａｂ、例えばR&D SystemsのＢＡＦ２５４）を加える工程；
−  前記マイクロタイタープレートを洗浄する工程；
−  ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（例えばBD Pharmingen製）を加える工程；
−  マイクロタイタープレートを洗浄する工程；
−  発光基質（例えばＣＳＰＤ（登録商標）１，２−ジオキセタン発光基質）を加える工程；および
−  発光を読み取る工程（例えばCentro LB960 Bertholdルミノメーターで）
を含み得る。
【００４６】
本発明による前記方法はさらに、前記個体のための処置レジメンを設計する工程を含み得る。適切な処置レジメンの選択は、工程（ａ）で測定された量および／またはレベルに基づき、これは前立腺癌のアンドロゲン依存性を示す。前立腺癌がアンドロゲン依存性であるならば、臨床医はアンドロゲン療法を選択し得る。一方、前立腺癌がアンドロゲン非依存性であるならば、臨床医は化学療法を選択し得る。これらの療法は、追加的に放射線療法および／または手術と組合せ得る。
【００４７】
高いレベルのＣＸＣＬ５は、前立腺癌が重度であることを示す。それ故、このような癌細胞を有する患者は、積極的な化学療法によって処置される必要がある。従って、本発明は、積極的な化学療法によって処置されるに適した前立腺癌に罹患している患者を選択するための方法に関し、これは、前記患者からの生物学的試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを測定する工程、並びにＣＸＣＬ５の高い量および／または発現レベルが工程（ａ）で測定されたならば患者を選択する工程を含む。
【００４８】
「ＣＸＣＬ５の高い量および／または発現レベルを有する患者」によって、ネガティブコントロール試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルよりも少なくとも５０％高い、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍高い、ＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを有する患者を意味する。
【００４９】
「積極的な化学療法」によって、悪性度の高い癌を処置するに適した化学療法を意味する。特に、このような積極的な化学療法は第２選択の処置であり、これは副作用を誘導し得、それ故、悪性度が高くない癌の場合には好ましい処置レジメンを構成しない。積極的な化学療法は、典型的には、高用量の薬物を用いて行なわれる組合せ化学療法に対応する。このような第２選択の処置は、シクロホスファミド（Astra Medica）、５−フルオロウラシル（Schering Health Care、Cambridge Laboratories）、ビンクリスチン（Eli Lilly）、シスプラチンおよびエピルビシン（Pharmacia）、リン酸エストラムスチン（Pharmacia、Pierre Fabre）、ビノレルビン（Pierre Fabre）、パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb）およびドセタキセル（Sanofi-Aventis）などの薬物を用いて行なわれる化学療法を含む。
【００５０】
本発明による前記方法を少なくとも２回の異なる時点において繰り返し、患者におけるホルモンエスケープをモニタリングおよび／または処置に対する患者の応答性をモニタリングし得る。例えば、患者の長期処置の脈絡では、生物学的試料を一定の間隔で患者から採取し得る（例えば毎月、２か月毎または１年に２回）。
【００５１】
処置に対する患者の応答性をモニタリングする脈絡では、生物学的試料を、好ましくは、患者の処置の開始前および開始後に採取する。
【００５２】
より具体的には、本発明は、薬物に対する、前立腺癌に罹患している患者の応答性をモニタリングするためのin vitroにおける方法に関し、前記方法は、
ａ）前記薬物を用いて前記患者を処置する前および後に、前記患者の生物学的試料中のＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを測定する工程；
ｂ）工程（ａ）で測定された量および／または発現レベルを比較する工程；および場合により
ｃ）前記の量および／または発現レベルの差異を、前記患者を処置するための薬物の有効性と相関させる工程
を含む。
【００５３】
処置開始前の量および／または発現レベルと比較した、処置開始後の量および／または発現レベルの増加は、ホルモンエスケープが起こっており、そして前記薬物は前記患者を処置するのに効果的ではないことを示す。逆に、工程（ｂ）で量および／または発現レベルの有意な差異が見られなければ、または工程（ｂ）で減少が見られれば、患者は前記薬物に応答し、そして薬物は前記患者を処置するのに効果的である。
【００５４】
本発明によるキット
本発明はさらに、前記方法において有用であるキットを開示する。このようなキットは、ＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを検出するための手段を含む。
【００５５】
それらは、例えば、アンドロゲン非依存性前立腺癌を診断するために、前立腺癌に罹患している患者におけるホルモンエスケープを評価するために、処置レジメンを設計するために、前立腺癌の進行をモニタリングするために、および／または前立腺癌に罹患している患者におけるホルモンエスケープの開始をモニタリングするために、薬物に対する応答性をモニタリングするために、および／または前立腺癌に罹患している患者の処置を調整するために使用され得る。
【００５６】
キットはさらに、ＣＸＣＬ５以外のケモカインの量および／または発現レベルを検出するための手段、例えば、ＣＸＣＬ８の量および／または発現レベルを検出するための手段などを含み得る。
【００５７】
好ましい態様において、本発明によるキットは、ＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを検出するための手段に加えて、前立腺癌に罹患している個体におけるＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを示すコントロール試料を含む。
【００５８】
本発明によるキットは、例えば、ＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを検出するための手段に加えて、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）：
ｉ．アンドロゲン非依存性癌に罹患している個体におけるＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを示すポジティブコントロール試料；
ｉｉ．健康個体におけるＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを示すネガティブコントロール試料；
ｉｉｉ．アンドロゲン依存性癌に罹患している個体におけるＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを示すネガティブコントロール試料；および／または
ｉｖ．前立腺癌を診断する、前立腺癌の重度を評価するおよび／または前立腺癌におけるホルモンエスケープの開始を評価する上での、前記キットの使用説明書
を含み得る。
【００５９】
このようなキットは、例えば、（ｉ）および（ｉｉ）、（ｉ）および（ｉｉｉ）、（ｉ）および（ｉｖ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）、（ｉｉ）および（ｉｖ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｖ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）、または（ｉ）から（ｉｖ）の全てを含み得る。
【００６０】
ＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを検出するための手段は当技術分野において周知である。それらは、例えば、ＣＸＣＬ５をコードする遺伝子またはｃＤＮＡのフラグメントまたはそれに相補的な配列を含むまたはからなるプライマーおよびプローブ、並びに、ＣＸＣＬ５に特異的に結合する抗体を含む。
【００６１】
このような手段を、フルオロフォアまたは放射性化合物などの検出可能な化合物を用いて標識し得る。例えば、ＣＸＣＬ５に特異的に結合するプローブまたは抗体を、検出可能な化合物を用いて標識し得る。あるいは、キットが抗体を含む場合、キットはさらに、検出可能な化合物で標識された二次抗体を含み得、この二次抗体はＣＸＣＬ５に特異的に結合する標識されていない抗体に結合する。
【００６２】
ＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを検出するための手段はまた、例えば反応緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液および／または洗浄緩衝液などの試薬を含み得る。前記手段は、例えばバイアルまたはマイクロタイタープレート中に存在し得るか、またはプライマーおよびプローブの場合ではそうであり得るようにマイクロアレイなどの固相支持体に付着され得る。
【００６３】
キットは、例えば、ＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを検出するための手段として配列番号４および５のプライマーを含み得る。あるいは、キットは、ＭＡＢ２５４抗体（R&D Systems, Minneapolis, USA）および／またはＡＦ２５４抗体（R&D Systems, Minneapolis, USA）を、ＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを検出するための手段として含み得る。
【００６４】
特定の態様において、キットは、化学発光Ｅｌｉｓａアッセイ、例えば実施例１、１５段落に記載した化学発光Ｅｌｉｓａアッセイなどを実施するのに適している。このようなキットは、例えば、ＣＸＣＬ５の量および／または発現レベルを検出するための手段として以下：
−  場合によりマイクロタイタープレート上にコーティングされた、抗ＣＸＣＬ５抗体（例えばポリクローナル抗ヒトＣＸＣＬ５ Ａｂ、例えばR&D SystemsのＭＡＢ２５４）；
−  ビオチニル化抗ＣＸＣＬ５抗体（例えばビオチニル化ポリクローナル抗ヒトＣＸＣＬ５Ａｂ、例えばR&D SystemsのＢＡＦ２５４）；場合により
−  ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（例えばBD Pharmingen製）；および場合により
−  発光基質（例えばＣＳＰＤ（登録商標）１，２−ジオキセタン発光基質）
を含み得る。
【００６５】
in vivoにおけるイメージング
前立腺におけるＣＸＣＬ５レベルはまた、in vivoにおいてイメージング技術を使用して検出され得る。それ故、本発明のさらなる局面は、アンドロゲン非依存性前立腺癌のイメージングに使用するための、検出可能な部分およびＣＸＣＬ５に特異的に結合する抗体を含む、診断剤を提供する。
【００６６】
本明細書で前記に提示したように、ＣＸＣＬ５の発現レベルは、前立腺癌細胞の侵襲性およびアンドロゲン依存性に正に相関する。それ故、このような診断剤は、アンドロゲン非依存性前立腺癌の診断に、患者におけるホルモンエスケープの評価に、処置レジメンの設計に、前立腺癌の進行をモニタリングするのに、および／または前立腺癌に罹患している患者におけるホルモンエスケープの開始をモニタリングするのに、薬物に対する応答性をモニタリングするのに、および／または前立腺癌に罹患している患者の処置を調整するのに有用である。
【００６７】
イメージング技術としては、例えばシンチグラフィー研究、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、光学イメージング、単一光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）および陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）が挙げられる。
【００６８】
「検出可能な部分」によって、患者への本発明の診断剤の投与後に標的部位に位置する場合に、身体の外側から非侵襲的に検出され得る部分を意味する。検出可能な部分は、選択したイメージング技術に依存する。典型的には、容易に検出可能な部分は放射性元素であるか、またはそれを含む。
【００６９】
シンチグラフィー研究のための適切な検出可能な部分としては、例えばテクネチウム９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、５１Ｃｒ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅおよび２０１Ｔｌが挙げられる。ＭＲＩのための適切な検出可能な部分としては、例えば、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１９Ｆ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、ガドリニウム、マンガンおよび鉄が挙げられる。光学イメージングのための適切な検出可能な部分としては、多くの近赤外線（ＮＩＲ）フルオロフォア、例えばKodak X-SIGHTナノスフィア、並びに色素および色素コンジュゲート、例えばCy（登録商標）5.5、Cy7、Alexa Fluor（登録商標）680、Alexa Fluor 750、IRDye（登録商標）680、およびIRDye 800CWが挙げられる。ＳＰＥＣＴの脈絡では、１８Ｆおよび放射性トレーサ、例えば９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、２０１Ｔｌおよび１３３Ｘｅを検出可能な部分として使用することができる。ＰＥＴを実施するのに適した検出可能な部分としては、例えば、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂおよび６８Ｇａが挙げられる。
【００７０】
好ましくは、容易に検出可能な部分は、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８ＦまたはＮＩＲフルオロフォアを含むまたはからなる。
【００７１】
本発明のさらなる局面は、（ｉ）本発明による診断剤を、前立腺癌に罹患している、または罹患している可能性のある個体に投与する工程、および（ｉｉ）前記個体の前立腺に前記診断剤の結合の有無を検出する工程を含む、前立腺癌をイメージングする方法を提供する。
【００７２】
本発明のさらなる局面は、前立腺癌を診断する方法を提供し、前記方法は、（ｉ）本発明による診断剤を、前立腺癌に罹患している、または罹患している可能性のある個体に投与する工程、および（ｉｉ）前記個体の前立腺への前記診断剤の結合の有無を検出する工程を含み、前記個体の前立腺への前記診断剤の結合の検出は、前記個体が前立腺癌に罹患している可能性があることを示す。
【００７３】
前記方法はまた、前記個体の前立腺への前記診断剤の結合レベルを検出し、そして前記レベルを、前立腺癌の重度および／または前立腺癌におけるホルモンエスケープの開始と相関させることによって、前立腺癌の重度を評価するのに、および／または前立腺癌におけるホルモンエスケープの開始を評価するのに使用され得る。
【００７４】
本発明によるアンタゴニストおよびこのようなアンタゴニストをスクリーニングするための方法
前立腺癌においては、ＣＸＣＬ５のレベルがアンドロゲンによって負に調節され（図５参照）、そして抗アンドロゲン物質によって正に調節されている（図６参照）ことが驚くべきことに判明した。一方で、アンドロゲンの除去はＣＸＣＬ５の発現を増加させる。この後者の現象は、前立腺癌に罹患している患者において観察されるホルモンエスケープ現象と非常に類似している。それ故、ホルモン療法処置時に、ＣＸＣＬ５レベルは増加し、これにより前立腺癌細胞はより悪性度が高く、より転移性となり、アンドロゲンの非存在下において増殖することができるようになると考えられる。結果として、ホルモンエスケープは、ＣＸＣＬ５の生物学的活性を阻害することによって予防または処置され得る。
【００７５】
それ故、本発明は、前立腺癌のおよび／または前立腺癌におけるホルモンエスケープの処置または予防において使用するためのＣＸＣＬ５アンタゴニストを提供する。本発明によるＣＸＣＬ５アンタゴニストは、好ましくは、アンドロゲン非依存性前立腺癌の処置または予防において使用するためのものである。
【００７６】
本明細書において使用する「ＣＸＣＬ５アンタゴニスト」という用語は、ＣＸＣＬ５の生物学的活性を阻害または減少させる化合物を指す。
【００７７】
ＣＸＣＬ５の生物学的活性は、その濃度（すなわちその発現レベル）およびその比活性の両方に依存する。それ故、本発明によるＣＸＣＬ５アンタゴニストは、例えば、（ｉ）前立腺細胞におけるＣＸＣＬ５の発現を減少または阻害し得、および／または（ｉｉ）結合パートナーへのＣＸＣＬ５の結合を減少または阻害し、これにより、シグナル伝達経路内のシグナルの伝達を減少または阻害し得る。
【００７８】
化合物がＣＸＣＬ５アンタゴニストであるかどうかを決定するための方法は、当業者には周知である。
【００７９】
例えば、当業者は、化合物が前立腺細胞におけるＣＸＣＬ５の発現を減少または消失させるかどうかを、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫染色またはウェスタンブロットによって評価することができる。実施例１．６および１．７に提供したプロトコールを例えば使用し得る。
【００８０】
ＣＸＣＬ５の生物学的活性はまた、前立腺細胞におけるその天然の結合パートナー、例えばそのレセプター（群）などにＣＸＣＬ５が結合する能力を評価することによって測定され得る。例えば、ＣＸＣＬ５はＣＸＣＲ２レセプターに結合することが知られている。ＣＸＣＬ５のその結合パートナーの１つ（例えばＣＸＣＲ２）への結合は、例えば、ツーハイブリッドシステム、免疫沈降法または表面プラズモン共鳴装置（BIAcore）を使用して評価され得る。前立腺細胞におけるその天然の結合パートナーの少なくとも１つ（例えばＣＸＣＲ２）へのＣＸＣＬ５の結合を減少または消失させる化合物が、ＣＸＣＬ５アンタゴニストとして定義される。
【００８１】
あるいは、ＣＸＣＬ５の生物学的活性は、走化性を測定することによって評価され得る。走化性を誘起するＣＸＣＬ５の能力を減少または消失させる化合物が、ＣＸＣＬ５アンタゴニストとして定義される。
【００８２】
ＣＸＣＬ５の生物学的活性はまた、ＣＸＣＬ５によって誘導されるシグナル伝達カスケードが活性化されるかどうかを決定することによって測定され得る。例えば、ウェスタンブロットによるＥＲＫリン酸化の定量を測定することができる（例えば、Begley et al. 2008 Neoplasia 10:244-254参照）。
【００８３】
ＣＸＣＬ５アンタゴニストは、任意のタイプの化合物に対応し得る。それは例えば、ＣＸＣＬ５のドミナントネガティブな突然変異体、化合物、例えば小分子、アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）、アプタマー、ペプチドまたは抗体に対応し得る。
【００８４】
本発明によるＣＸＣＬ５アンタゴニストは、好ましくは精製および／または単離されており、すなわち、それは、ヒト身体から、動物身体から、および／または化合物のライブラリーから精製および／または単離されている。特定の態様において、本発明によるＣＸＣＬ５アンタゴニストは、天然に存在する化合物には対応しない。それは好ましくは薬学的組成物に製剤化されている。
【００８５】
本発明はまた、有効量のＣＸＣＬ５アンタゴニストをそれを必要とする個体に投与する工程を含む、前立腺癌および／または前立腺癌におけるホルモンエスケープを処置または予防する方法に関する。「有効量」によって、処置しようとする疾病を予防または処置することのできるＣＸＣＬ５アンタゴニストの濃度を達成するに十分な量を意味する。このような濃度は当業者によって慣用的に決定され得る。実際に投与される化合物の量は、典型的には、処置しようとする状態、選択する投与経路、投与する実際の化合物、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の症状の重度などを含む関連する環境を鑑みて医師によって決定される。用量は投与されるＣＸＣＬ５アンタゴニストの安定性に依存し得ることが当業者によって理解される。「それを必要とする個体」によって、処置または予防しようとする疾病に罹患している、または罹患している可能性のある個体を意味する。本発明の脈絡における処置しようとする個体は、任意の哺乳動物に対応し得る。好ましい態様において、個体はヒトである。
【００８６】
このようなＣＸＣＬ５アンタゴニストは当技術分野において周知である。例えば、ＣＸＣＲ２のアンタゴニスト、従ってＣＸＣＬ５のアンタゴニストとしては、以下：
−  強力で選択的なＣＸＣＲ２ケモカインレセプターアンタゴニストである、ＳＢ２２５００２（White et al. 1998 J Biol Chem 273:10095-98）；
−  ＳＢ２７２８４４（Glynn et al. 2002 Pulm Pharmacol Ther. 15:103-10）；
−  ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２レセプターの非競合的アロステリック阻害剤であるレペルタキシン（Repertaxin）；
−  高親和性のＣＸＣＲ２アンタゴニストであるＳＢ２６５６１０（de Kruijf et al. 2009 J Pharmacol Exp Ther 329:783-90）；
−  ＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ１をターゲティングする経口で活性な小分子アンタゴニストであるＳＣＨ５２７１２３およびＳＣＨ４７９８３３（Holz et al. 2010 Eur Respir J 35:564-70およびSingh et al. 2009 Clin Cancer Res 15:2380-6）；
−  ＣＸＣＬ８突然変異体およびＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２アンタゴニストである、ＣＸＣＬ８（３−７４）Ｋ１１Ｒ／Ｇ３１Ｐ（Gordon et al. 2005 J Leukoc Biol 78:1265-72）；
−  特許出願ＷＯ２００８／０００４０８の４頁２２行から１２頁６行に記載のような式Ｉ：
【化１】
2013533458.tif 000002
で示される化合物；
および特に以下の化合物：
２−メチル−２−｛［１−（４−トリフルオロメトキシ−ベンジルオキシ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−カルボニル］−アミノ｝−プロピオン酸；２−｛［１−（ベンゾチアゾール−２−イルメトキシ）−５，６，７，８−テトラヒドローナフタレン−２−カルボニル］−アミノ｝−２−メチル−プロピオン酸；２−メチル−２−｛［１−（４−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−カルボニル］−アミノ｝−プロピオン酸；２−メチル−２−｛［１−（６−トリフルオロメチル−ピリジン−３−イルメトキシ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−カルボニル］−アミノ｝−プロピオン酸；２−｛［１−（ベンゾチアゾール−２−イルメトキシ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−カルボニル］−アミノ｝−２−メチル−酪酸；２−メチル−２−｛［１−（４−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−カルボニル］−アミノ｝−酪酸；２−メチル−２−｛［１−（６−トリフルオロメチル−ピリジン−３−イルメトキシ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−カルボニル］−アミノ｝−酪酸；２−｛［１−（２−フルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−カルボニル］−アミノ｝−２−メチル−プロピオン酸；２−メチル−２−｛［１−（４−トリフルオロメトキシ−ベンジルオキシ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−カルボニル］−アミノ｝−酪酸；２−｛［１−（２−フルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−カルボニル］−アミノ｝−２−メチル−酪酸；２−メチル−２−｛［７−メチル−４−（４−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−インダン−５−カルボニル］−アミノ｝−プロピオン酸；２−メチル−２−｛［７−（４−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−６−カルボニル］−アミノ｝−プロピオン酸；２−メチル−２−｛［４−（４−トリフルオロメチルベンジルオキシ）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−５−カルボニル］−アミノ｝−プロピオン酸；２−メチル−２−｛［４−（５−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルメトキシ）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−５−カルボニル］−アミノ｝−プロピオン酸；および
−  選択的なＣＸＣＲ２アンタゴニスト機能を示すＮ，Ｎ’−ジアリール尿素（Widdowson et al. 2004 J Med Chem 47:1319-21）
が挙げられる。
【００８７】
好ましい態様において、前記ＣＸＣＬ５アンタゴニストは抗体である。ＣＸＣＬ５を特異的に認識する抗体は当技術分野において周知であり、そしてこれには、例えば、R&D systems（カタログ番号ＡＦ２５４）によって市販されているヤギＥＮＡ−７８ポリクローナル抗体が含まれる。従って、抗体は、例えばR&D systemsによって市販されているＥＮＡ−７８ポリクローナル抗体、その抗体と交差反応するモノクローナル抗体、または、例えばKohlerおよびMilstein (1975 Nature 256:495-7)に記載のようなハイブリドーマの産生を通して得られた、ポリクローナル抗体から得られたモノクローナル抗体に対応し得る。
【００８８】
別の好ましい態様において、ＣＸＣＬ５アンタゴニストはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを得るための方法は当技術分野において周知である。例えば、抑制性ｓｉＲＮＡを設計するためのツールは、DNAengine Inc. (Seattle, Washington, USA)またはAmbion, Inc. (Austin, Texas, USA)から購入し得る。さらに、ＣＸＣＬ５をターゲティングするｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを例えばSigma-Aldrichから購入することができる。ｓｈＲＮＡは、例えば、配列番号６の配列によってコードされるｓｈＲＮＡに対応し得る。
【００８９】
代替的にまたは追加的に、当業者は、スクリーニングを実施することによって、このようなＣＸＣＬ５アンタゴニストを単離し得る。
【００９０】
それ故、本発明の別の局面は、前立腺癌、特にアンドロゲン非依存性癌の処置のための薬物についてのin vitroにおけるスクリーニング法に関し、これは
ａ）試験化合物を準備する工程；および
ｂ）前記試験化合物が、例えば前立腺細胞において、ＣＸＣＬ５の生物学的活性を阻害するかどうかを決定する工程
を含み、前記試験化合物がＣＸＣＬ５の生物学的活性を阻害するという決定は、前記試験化合物が、前立腺癌の処置または予防のための薬物であることを示す。
【００９１】
前記したような方法の１つなどの、当技術分野において周知の任意の方法を工程（ｂ）で使用し得る。好ましい態様において、工程（ｂ）を前立腺細胞を用いて、最も好ましくは前立腺癌細胞を用いて実施する。例えば、前記試験化合物がＣＸＣＬ５の生物学的活性を阻害するかどうかを決定する前記工程は、例えば、
−  前記試験化合物が、前立腺細胞においてＣＸＣＬ５の発現を阻害するかどうかを決定する工程；および／または
−  前記試験化合物が、前立腺細胞において天然の結合パートナーへのＣＸＣＬ５の結合を阻害するかどうかを決定する工程
を含むまたはからなり得る。
【００９２】
より具体的には、このin vitroにおける方法は、
ａ）試験化合物を準備する工程；および
ｂ）例えば前立腺細胞において、前記試験化合物の存在下においてＣＸＣＬ５の生物学的活性を決定する工程；
ｃ）例えば前立腺細胞において前記試験化合物の非存在下においてＣＸＣＬの生物学的活性を決定する工程；および
ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）の結果を比較する工程
を含み得、工程（ｂ）で測定した生物学的活性が、工程（ｃ）で測定した生物学的活性よりも低いという決定は、前記試験化合物が、前立腺癌の処置または予防のための薬物であることを示す。
【００９３】
試験化合物は、任意のタイプの化合物に対応し得る。それは例えば、ＣＸＣＬ５のドミナントネガティブな突然変異体、小分子、アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）、アプタマー、ペプチドおよび抗体に対応し得る。好ましい態様において、小分子、ペプチド、抗体またはアプタマーのライブラリーを、本発明による方法を用いてスクリーニングする。
【００９４】
本発明はまた、前立腺癌の処置のための薬物（ＣＸＣＬ５アンタゴニスト）についてスクリーニングするためのターゲットとしてのＣＸＣＬ５の使用、および前立腺癌におけるホルモンエスケープの予防のための薬物（ＣＸＣＬ５アンタゴニスト）についてスクリーニングするためのターゲットとしてのＣＸＣＬ５の使用に関する。
【００９５】
細胞モデルおよび動物モデル
本発明の別の局面は、前立腺癌細胞から誘導された組換え細胞株に関し、これは、そのゲノムが、ＣＸＣＬ５をコードする核酸を含む発現ベクターを含むことを特徴とする。このような組換え細胞株は安定にＣＸＣＬ５を発現し、そして例えばアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞のための細胞モデルとして使用され得る。
【００９６】
本発明はさらに、本発明による組換え細胞株を含む、アンドロゲン非依存性前立腺癌のための非ヒト動物モデルに関する。このような非ヒト動物は、アンドロゲン非依存性前立腺癌のためのモデルとして、例えば前立腺癌に関する研究の脈絡において、前立腺癌の処置または予防のための薬物の前臨床試験中に使用され得る。
【００９７】
本発明はまた、本発明による組換え宿主細胞を前記動物の前立腺に接種する工程を含むアンドロゲン非依存性前立腺癌のための非ヒト動物モデルを産生するための方法、並びに、このような方法によって得ることのできる動物モデルに関する。
【００９８】
動物は、任意の非ヒト動物、例えばマウス、ラット、ウサギまたはサルに対応し得る。好ましい態様において、動物は無胸腺ヌードマウス、例えばＮｕ／Ｆｏｘｎ１無胸腺ヌードマウスである。
【００９９】
ジャーナル記事または要約、公表された特許出願、発行された特許または任意の他の参考文献を含む、本明細書において引用した全ての参考文献は、引用した参考文献に提示された全てのデータ、表、図面および本文を含めて、本明細書への参照により全体が組み入れられる。
【０１００】
本発明は、以下の実施例および図面の点からさらに評価される。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、ＣＸＣＬ５発現レベルが前立腺癌組織のグリーソンスコアと正に相関することを示す。ＣＸＣＬ５の定量は、異なるグリーソンスコアを有する前立腺癌組織における免疫染色によって実施された。患者の数を示す。
【図２Ａ】図２は、侵襲性の前立腺癌細胞株が高いレベルのＣＸＣＬ５を産生することを示す。Ａ．前立腺癌細胞株によるＣＸＣＬ５分泌のＥｌｉｓａ定量。結果は３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。Ｂ．リアルタイムＰＣＲによる前立腺癌細胞株におけるＣＸＣＬ５ＲＮＡレベルの定量。結果は３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。Ｃ．前立腺癌細胞株におけるＣＸＣＬ５遺伝子プロモーター活性の測定。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。
【図２Ｂ】図２は、侵襲性の前立腺癌細胞株が高いレベルのＣＸＣＬ５を産生することを示す。Ａ．前立腺癌細胞株によるＣＸＣＬ５分泌のＥｌｉｓａ定量。結果は３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。Ｂ．リアルタイムＰＣＲによる前立腺癌細胞株におけるＣＸＣＬ５ＲＮＡレベルの定量。結果は３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。Ｃ．前立腺癌細胞株におけるＣＸＣＬ５遺伝子プロモーター活性の測定。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。
【図２Ｃ】図２は、侵襲性の前立腺癌細胞株が高いレベルのＣＸＣＬ５を産生することを示す。Ａ．前立腺癌細胞株によるＣＸＣＬ５分泌のＥｌｉｓａ定量。結果は３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。Ｂ．リアルタイムＰＣＲによる前立腺癌細胞株におけるＣＸＣＬ５ＲＮＡレベルの定量。結果は３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。Ｃ．前立腺癌細胞株におけるＣＸＣＬ５遺伝子プロモーター活性の測定。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。
【図３Ａ】図３は、ＣＸＣＬ５がＣＷＲ−Ｒ１細胞の増殖を増強し、そしてその付着能を減少させることを示す。Ａ．ＣＷＲ−Ｒ１、ＣＷＲ−Ｒ１−ＬＵＣ、Ｃ２Ｓ２およびＣ３Ｓ２の安定なクローンにおけるＣＸＣＬ５分泌レベル。Ｃ２Ｓ２およびＣ３Ｓ２は、ＣＸＣＬ５ｃＤＮＡを用いて安定にトランスフェクションされた２つのＣＷＲ−Ｒ１クローンである。Ｂ．ＣＷＲ−Ｒ１細胞のin vitroにおける増殖。結果は３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを示す。Ｃ．種々の時間後のプラスチック皿上へのＣＷＲ−Ｒ１細胞のin vitroにおける細胞接着。結果は３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。
【図３Ｂ】図３は、ＣＸＣＬ５がＣＷＲ−Ｒ１細胞の増殖を増強し、そしてその付着能を減少させることを示す。Ａ．ＣＷＲ−Ｒ１、ＣＷＲ−Ｒ１−ＬＵＣ、Ｃ２Ｓ２およびＣ３Ｓ２の安定なクローンにおけるＣＸＣＬ５分泌レベル。Ｃ２Ｓ２およびＣ３Ｓ２は、ＣＸＣＬ５ｃＤＮＡを用いて安定にトランスフェクションされた２つのＣＷＲ−Ｒ１クローンである。Ｂ．ＣＷＲ−Ｒ１細胞のin vitroにおける増殖。結果は３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを示す。Ｃ．種々の時間後のプラスチック皿上へのＣＷＲ−Ｒ１細胞のin vitroにおける細胞接着。結果は３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。
【図３Ｃ】図３は、ＣＸＣＬ５がＣＷＲ−Ｒ１細胞の増殖を増強し、そしてその付着能を減少させることを示す。Ａ．ＣＷＲ−Ｒ１、ＣＷＲ−Ｒ１−ＬＵＣ、Ｃ２Ｓ２およびＣ３Ｓ２の安定なクローンにおけるＣＸＣＬ５分泌レベル。Ｃ２Ｓ２およびＣ３Ｓ２は、ＣＸＣＬ５ｃＤＮＡを用いて安定にトランスフェクションされた２つのＣＷＲ−Ｒ１クローンである。Ｂ．ＣＷＲ−Ｒ１細胞のin vitroにおける増殖。結果は３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを示す。Ｃ．種々の時間後のプラスチック皿上へのＣＷＲ−Ｒ１細胞のin vitroにおける細胞接着。結果は３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。
【図４】図４は、ＣＸＣＬ５がin vivoにおいて腫瘍増殖を劇的に増強することを示す。ＣＷＲ−Ｒ１−ＬＵＣまたはＣＷＲ−Ｒ１ Ｃ２Ｓ２細胞を、無胸腺マウスの前立腺に同所性に注入した。in vivoにおける腫瘍増殖をBerthold NightOwlカメラを用いて測定した。結果は、１群あたり６匹のマウスの平均±ＳＤを示す。
【図５Ａ】図５は、ＣＸＣＬ５ＲＮＡレベルが、ＬＮＣａＰおよびＣＷＲ−Ｒ１細胞においてアンドロゲンによってダウンレギュレーションされていることを示す。ＣＷＲ−Ｒ１（Ａ）またはＬＮＣａｐ（Ｂ）細胞を、全ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、活性炭処理済み血清（ＣＤＦＣＳ）または１０−８Ｍジヒドロテストステロンの補充されたＣＤＦＣＳ（ＣＤＦＣＳ＋ＤＨＴ）のいずれかの存在下で培養した。ＣＸＣＬ５ＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって測定した。ＦＣＳの存在下におけるＣＸＣＬ５レベルを１に設定した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。
【図５Ｂ】図５は、ＣＸＣＬ５ＲＮＡレベルが、ＬＮＣａＰおよびＣＷＲ−Ｒ１細胞においてアンドロゲンによってダウンレギュレーションされていることを示す。ＣＷＲ−Ｒ１（Ａ）またはＬＮＣａｐ（Ｂ）細胞を、全ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、活性炭処理済み血清（ＣＤＦＣＳ）または１０−８Ｍジヒドロテストステロンの補充されたＣＤＦＣＳ（ＣＤＦＣＳ＋ＤＨＴ）のいずれかの存在下で培養した。ＣＸＣＬ５ＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって測定した。ＦＣＳの存在下におけるＣＸＣＬ５レベルを１に設定した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。
【図６Ａ】図６は、抗アンドロゲン物質のビカルタミドの効果を示す。Ａ．ＣＸＣＬ５ＲＮＡレベルは、ＣＷＲ−Ｒ１細胞において抗アンドロゲン物質のビカルタミドによってアップレギュレーションされる。ＣＷＲ−Ｒ１細胞を、全ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中、０．１、１または１０μMのビカルタミドの非存在下または存在下において培養した。ＣＸＣＬ５ＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって測定した。ＦＣＳの存在下におけるＣＸＣＬ５レベルを１に設定した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。Ｂ．ＣＸＣＬ５は、抗アンドロゲン物質のビカルタミドの非存在下および存在下の両方においてＣＷＲ−Ｒ１細胞の増殖を増強する。ＣＷＲ−Ｒ１細胞をＦＣＳ中で培養した。いくらかの細胞を１０−５Ｍのビカルタミドで処理した。細胞をエタノールビヒクル（Ｃ）またはＣＸＣＬ５（１または５０ng/ml）のいずれかで処理した。増殖を、細胞を計測することによって処理から５日後に定量した。
【図６Ｂ】図６は、抗アンドロゲン物質のビカルタミドの効果を示す。Ａ．ＣＸＣＬ５ＲＮＡレベルは、ＣＷＲ−Ｒ１細胞において抗アンドロゲン物質のビカルタミドによってアップレギュレーションされる。ＣＷＲ−Ｒ１細胞を、全ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中、０．１、１または１０μMのビカルタミドの非存在下または存在下において培養した。ＣＸＣＬ５ＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって測定した。ＦＣＳの存在下におけるＣＸＣＬ５レベルを１に設定した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。Ｂ．ＣＸＣＬ５は、抗アンドロゲン物質のビカルタミドの非存在下および存在下の両方においてＣＷＲ−Ｒ１細胞の増殖を増強する。ＣＷＲ−Ｒ１細胞をＦＣＳ中で培養した。いくらかの細胞を１０−５Ｍのビカルタミドで処理した。細胞をエタノールビヒクル（Ｃ）またはＣＸＣＬ５（１または５０ng/ml）のいずれかで処理した。増殖を、細胞を計測することによって処理から５日後に定量した。
【図７Ａ】図７は、ＣＸＣＬ５が、in vivoにおいて前立腺癌細胞に対してアンドロゲン非依存性増殖を付与することを示す。Ａ．ＣＷＲ−Ｒ１−ＬｕｃまたはＣＷＲ−Ｒ１−ＣＸＣＬ５（クローンＣ２Ｓ２）細胞を、注入から６日前に去勢しておいた無胸腺マウスの前立腺に注入した。腫瘍の増殖をBerthold NightOwlカメラを用いて毎週測定した。結果は、１群あたり８匹のマウスの平均±ＳＤを示す。Ｂ．ＣＷＲ−Ｒ１−ＬｕｃまたはＣＷＲ−Ｒ１−ＣＸＣＬ５（クローンＣ２Ｓ２）細胞を、無胸腺マウスの前立腺に注入した。注入から１４日後、マウスを２つの群に分けた：一方は去勢したもの、そして他方はニセで処理したもの。腫瘍の増殖をBerthold NightOwlカメラを用いて毎週測定した。結果は、１群あたり８匹のマウスの平均±ＳＤを示す。矢印は去勢の時期を示す。
【図７Ｂ】図７は、ＣＸＣＬ５が、in vivoにおいて前立腺癌細胞に対してアンドロゲン非依存性増殖を付与することを示す。Ａ．ＣＷＲ−Ｒ１−ＬｕｃまたはＣＷＲ−Ｒ１−ＣＸＣＬ５（クローンＣ２Ｓ２）細胞を、注入から６日前に去勢しておいた無胸腺マウスの前立腺に注入した。腫瘍の増殖をBerthold NightOwlカメラを用いて毎週測定した。結果は、１群あたり８匹のマウスの平均±ＳＤを示す。Ｂ．ＣＷＲ−Ｒ１−ＬｕｃまたはＣＷＲ−Ｒ１−ＣＸＣＬ５（クローンＣ２Ｓ２）細胞を、無胸腺マウスの前立腺に注入した。注入から１４日後、マウスを２つの群に分けた：一方は去勢したもの、そして他方はニセで処理したもの。腫瘍の増殖をBerthold NightOwlカメラを用いて毎週測定した。結果は、１群あたり８匹のマウスの平均±ＳＤを示す。矢印は去勢の時期を示す。
【図８Ａ】図８は、血清中のＣＸＣＬ５レベルが腫瘍内発現に相関することを示す。Ａ．全抽出物を、ＣＷＲ−Ｒ１またはＣＷＲ−Ｒ１−ＣＸＣＬ５細胞の移植された動物の前立腺腫瘍から調製した。ＣＸＣＬ５腫瘍内レベルをＥｌｉｓａによって決定した。結果は５匹の動物の平均±ＳＤを示す。Ｂ．同じマウスからの血清を回収し、そしてＣＸＣＬ５含量についてアッセイした。結果は５匹の動物の平均±ＳＤを示す。
【図８Ｂ】図８は、血清中のＣＸＣＬ５レベルが腫瘍内発現に相関することを示す。Ａ．全抽出物を、ＣＷＲ−Ｒ１またはＣＷＲ−Ｒ１−ＣＸＣＬ５細胞の移植された動物の前立腺腫瘍から調製した。ＣＸＣＬ５腫瘍内レベルをＥｌｉｓａによって決定した。結果は５匹の動物の平均±ＳＤを示す。Ｂ．同じマウスからの血清を回収し、そしてＣＸＣＬ５含量についてアッセイした。結果は５匹の動物の平均±ＳＤを示す。
【図９Ａ】図９は、ＣＸＣＬ５の遮断により、ＰＣ−３の細胞増殖が阻害されることを示す。Ａ．ＰＣ−３細胞を４日間増殖させ、そして処理しないか（コントロール）、またはアイソタイプコントロール抗体としてのヤギ血清（１／２０に希釈）で処理するか（アイソタイプ）または０．５μg/mlのＣＸＣＬ５抗体で処理した（ＣＸＣＬ５Ａｂ）。処理したまたはしない培地を、２日目に交換した。結果は、３回の独立した実験の４日後の、ルシフェラーゼ活性の平均±ＳＤを示す。Ｂ、Ｃ．ＰＣ−３細胞を、非ターゲットｓｈＲＮＡコントロール（ｓｈＣｔ）またはｓｈＣＸＣＬ５ベクターを用いてトランスフェクションした。４日後、培地を回収し、そしてＣＸＣＬ５レベルをＥＬｉｓａによって測定した（Ｂ）。細胞数を４日目に計測した（Ｃ）。代表的な実験をここに示す。
【図９Ｂ】図９は、ＣＸＣＬ５の遮断により、ＰＣ−３の細胞増殖が阻害されることを示す。Ａ．ＰＣ−３細胞を４日間増殖させ、そして処理しないか（コントロール）、またはアイソタイプコントロール抗体としてのヤギ血清（１／２０に希釈）で処理するか（アイソタイプ）または０．５μg/mlのＣＸＣＬ５抗体で処理した（ＣＸＣＬ５Ａｂ）。処理したまたはしない培地を、２日目に交換した。結果は、３回の独立した実験の４日後の、ルシフェラーゼ活性の平均±ＳＤを示す。Ｂ、Ｃ．ＰＣ−３細胞を、非ターゲットｓｈＲＮＡコントロール（ｓｈＣｔ）またはｓｈＣＸＣＬ５ベクターを用いてトランスフェクションした。４日後、培地を回収し、そしてＣＸＣＬ５レベルをＥＬｉｓａによって測定した（Ｂ）。細胞数を４日目に計測した（Ｃ）。代表的な実験をここに示す。
【図９Ｃ】図９は、ＣＸＣＬ５の遮断により、ＰＣ−３の細胞増殖が阻害されることを示す。Ａ．ＰＣ−３細胞を４日間増殖させ、そして処理しないか（コントロール）、またはアイソタイプコントロール抗体としてのヤギ血清（１／２０に希釈）で処理するか（アイソタイプ）または０．５μg/mlのＣＸＣＬ５抗体で処理した（ＣＸＣＬ５Ａｂ）。処理したまたはしない培地を、２日目に交換した。結果は、３回の独立した実験の４日後の、ルシフェラーゼ活性の平均±ＳＤを示す。Ｂ、Ｃ．ＰＣ−３細胞を、非ターゲットｓｈＲＮＡコントロール（ｓｈＣｔ）またはｓｈＣＸＣＬ５ベクターを用いてトランスフェクションした。４日後、培地を回収し、そしてＣＸＣＬ５レベルをＥＬｉｓａによって測定した（Ｂ）。細胞数を４日目に計測した（Ｃ）。代表的な実験をここに示す。
【図１０Ａ】図１０は、ＣＸＣＬ５レベルをヒト血清中および尿中において測定できることを示す。ＣＸＣＬ５レベルは、２０人の患者の血清（Ａ）または尿（Ｂ）中で化学発光ＥＬＩＳＡによって決定された。
【図１０Ｂ】図１０は、ＣＸＣＬ５レベルをヒト血清中および尿中において測定できることを示す。ＣＸＣＬ５レベルは、２０人の患者の血清（Ａ）または尿（Ｂ）中で化学発光ＥＬＩＳＡによって決定された。
【０１０２】
配列の記載
配列番号１は、ＣＸＣＬ５のアミノ酸配列を示す。
【０１０３】
配列番号２〜５は、リアルタイムＰＣＲ実験の脈絡でｍＲＮＡレベルを検出するために使用されるプライマー配列を示す。
【０１０４】
配列番号６は、ＣＸＣＬ５をターゲティングするｓｈＲＮＡをコードする配列を示す。
【０１０５】
実施例
実施例１：材料および方法
１．１．細胞培養
ＣＷＲ−Ｒ１およびＬＮＣａＰ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびゲンタマイシンを用いて完成される、グルタマックスを含むＲＰＭＩ １６４０（Invitrogen, Carlsbad, USA）中に維持した。アンドロゲンによる刺激のために、細胞を１０％ＣＤＦＣＳ（活性炭デキストラン処理ＦＣＳ）の補充されたフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ １６４０中で４日間培養することによって、あらゆる実験の前に細胞からステロイドを除去した。
【０１０６】
１．２．ＣＸＣＬ５の免疫組織化学
４０の病的スコア（グリーソン６〜１０）および８つの非病的スコアを含む、前立腺癌の組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を使用した（SuperBioChips Laboratories, Korea）。
【０１０７】
免疫染色を、ＴＭＡ上で、標準的なアビジン−ビオチン複合体技術およびＣＸＣＬ５に対するマウスモノクローナル抗体を使用して実施した。トリス緩衝液ｐＨ９．０中のスライドにマイクロ波を当てることによってスライドを前処理して、抗原を想起した。その後、ＴＭＡを２時間かけて室温で一次ＣＸＣＬ５抗体（ヒトＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８ ＭＡＢ２５４；R&D Systems, Minneapolis, USA）と共に１５μg/mlのＰＢＳの濃度でインキュベーションした。ＣＸＣＬ５発現を、染色の強度に基づいて、盲検的にネガティブ（スコア＝０）、弱い（スコア＝１）、中程度（スコア＝２）または強い（スコア＝３）としてスコアリングした。製品スコアを全組織のスコアについて計算し、そして平均製品スコアを各グリーソンスコアについて決定した。
【０１０８】
１．３．ＣＸＣＬ５を発現する細胞株の作製およびｓｈＲＮＡ構築物
ＣＷＲ−Ｒ１細胞を、ＣＭＶ−ホタルルシフェラーゼを用いてＪｅｔＰＥＩ試薬（MP Biomedicals, Irvine, USA）を使用して、ｐＬｖ０１−ＣＸＣＬ５プラスミド（Origene, Rockville, USA）またはコントロールとしての空ベクターのいずれかを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションは、製造業者のプロトコールに従って実施された。コロニーを２mg/mlのＧ４１８で選択した。各コロニーのルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ活性緩衝液（Promega, Madison, USA）の注入後にルミノメーターＭＩＴＲＡＳを使用して試験した。ＣＸＣＬ５の構成的発現をＥＬＩＳＡを使用して測定した。
【０１０９】
１．４．プラスチック皿上への細胞株の細胞接着
ＣＸＣＬ５を安定に発現しているＣＷＲ−Ｒ１の細胞接着を研究するために、クローンをプラスチック皿上に播種した。２０００００個の細胞を１２ウェルのプレートに播種した。ウェルを種々の時点で（５、１０、１５、３０、４５、６０分後）ＰＢＳ（２回）を用いて洗浄した。その後、２００μlの溶解緩衝液（Promega, Madison, USA）を各ウェルに加えた。各ウェルのルシフェラーゼ活性を以前に記載されているように測定した。種々の時点における発光を、各ウェルに最初に播種された細胞数の発光と比較することによって、接着率を計算した。
【０１１０】
１．５．ＣＸＣＬ５プロモーターの一過性トランスフェクション
ＣＸＣＬ５開始部位に対してヌクレオチド−１３７９／＋４３からなる、ＣＸＣＬ５プロモーターを、ｐｘＰ２ルシフェラーゼリポータープラスミド（GenBankアクセッションナンバーＡＦ０９３６８２．１）にクローニングした。３×１０５個のステロイドを除去した細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、１２ウェルプレートの、１０％ＣＤＦＣＳの補充されたフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０中に播種した。トランスフェクションをリポフェクタミンを使用して製造業者の推奨に従って、すなわち、１ウェルあたり２μgのＣＸＣＬ５プロモーターｐｘＰ２−ＣＸＣＬ５ルシフェラーゼリポーターを、０．５μgの内部標準リポータープラスミド（ＣＭＶ−Ｇａｌ）と共に使用して実施した。６時間インキュベーションした後、培地を除去し、そして細胞を新たな培地に入れた。２４時間後、細胞を収集し、そしてCentro LB960 Bertholdルミノメーターを使用してルシフェラーゼ活性についてアッセイした。β−ガラクトシダーゼを以前に記載されているように（Freund et al. 2004 Oncogene 23:6105-6114）決定した。
【０１１１】
１．６．ＣＸＣＬ５のＥｌｉｓａによる定量
ＣＸＣＬ５の分泌を、製造業者の推奨に従って、ＥＬＩＳＡ（R&D Systems, Minneapolis, USA）によって測定した。簡潔に言うと、平底９６ウェルマイクロタイタープレート（Probind, Falcon）を、ＰＢＳ中４μg/mlの特異的ポリクローナル抗ヒトＣＸＣＬ５抗体（MAB254, R&D Systems）でコーティングし、そして一晩かけて室温でインキュベーションした。その後、プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．５）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（洗浄緩衝液）を用いて洗浄した。プレートを、ＰＢＳ中２％ＢＳＡおよび５％スクロースを用いて１時間かけて室温で遮断し、その後、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄した。試料または標準を加え、そしてプレートを室温で２時間かけてインキュベーションした。腫瘍内タンパク質のために、８０μgの全抽出物を使用した。ＣＸＣＬ５の血清レベルのために、５０μgの血清を使用した。プレートを３回洗浄した。ビオチニル化ポリクローナル抗ヒトＣＸＣＬ５抗体（AF254, R&D Systems）を６００ng/ml（ｐＨ７．５のＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中）で加え、そしてプレートを室温で２時間かけてインキュベーションした。プレートを３回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートを加え、そしてプレートを２０分間かけて室温でインキュベーションした。プレートを再度洗浄し、そして３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン発色基質を加えた。プレートを４５０nmで自動マイクロタイタープレート読取機で読取りした。
【０１１２】
１．７．化学発光ＣＸＣＬ５のＥＬＩＳＡ
ＣＸＣＬ５の分泌を、化学発光アプローチを使用するためにいくらかの改変を加えて、ＥＬＩＳＡ（R&D Systems）によって測定した。簡潔に言うと、平底９６ウェルの不透明で白色のマイクロタイタープレート（Nunc）を、特異的なポリクローナル抗ヒトＣＸＣＬ５Ａｂ（MAB254, R&D Systems）（ＰＢＳ中２μg/ml）を用いて一晩かけて４℃でコーティングし、そしてその後、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）と０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（洗浄緩衝液）を用いて洗浄した。プレートを遮断緩衝液（ＰＢＳ中０．２％カゼイン）を用いて１時間かけて室温で遮断し、そしてその後、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄した。試料または標準を加え、そしてプレートを室温で１時間かけてインキュベーションした。ＣＸＣＬ５の血清レベルのために、２μlの血清を使用し、そして尿のために、２０μlの試料を使用した。プレートを３回洗浄した。ビオチニル化ポリクローナル抗ヒトＣＸＣＬ５Ａｂ（BAF254, R&D Systems）（遮断緩衝液中１００ng/ml）を加え、そしてプレートを室温で１時間かけてインキュベーションした。プレートを３回洗浄し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（BD Pharmingen）を加え、そしてプレートを３０分間かけて室温でインキュベーションした。プレートを再度洗浄し、そして３０分間の間にＣＳＰＤ（登録商標）１，２−ジオキセタン発光基質を加え、その後、Centro LB960 Bertholdルミノメーターで発光を読取りした。
【０１１３】
１．８．ＣＸＣＬ５ＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲによる定量
全ＲＮＡを、TriReagent (Euromedex, Souffelweyersheim, France)を使用して調製した。ＲＮＡの量を、２６０nmにおける分光測定法によって推定した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、リボヌクレアーゼを含まない１３μlの水中における３μgの全ＲＮＡの逆転写（ＲＴ）から得られた。１μlのｄＮＴＰ（２５０mM；Gibco BRL）の存在下においてプライマーとしての１μlのランダムヘキサヌクレオチド（ｐｄ（Ｎ）６、５０mM）をＲＮＡに加え、そして５分間７０℃でインキュベーションした。後で、逆転写酵素（１μl）および逆転写酵素緩衝液５×（４μl）を含む５μlの混液をＲＮＡ溶液に加え、そして１時間４２℃でインキュベーションした。その後、リアルタイムＰＣＲ定量を、以前に記載されているように（Lucas et al. 2003 Biochem Biophys Res Commun 309:1011-1016）SYBR Greenアプローチ（Light Cycler; Roche）を使用して実施した。各試料について、ＣＸＣＬ５ｍＲＮＡレベルをＲＳ９ｍＲＮＡレベル（参照遺伝子）を用いて正規化した。使用したプライマーは以下であった。
【化２】
2013533458.tif 000003
【０１１４】
１．９．増殖アッセイ
１ウェルあたり２．５×１０４個の細胞を３つの２４ウェル培養プレートの以前に記載した完全増殖培地中に播種した。細胞数を、２日間毎に６日間、malassezスライドで計測することによって、またはルシフェラーゼ活性を測定することによって決定した。完全ウシ胎児血清中での増殖のために、細胞を、ＲＰＭＩ１６４０を含む１％ＦＣＳ中に維持した。アンドロゲンの効果を試験するために、細胞を、１０％ＦＣＳの補充されたフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。
【０１１５】
１．１０．動物
８週令の雄Ｎｕ／Ｆｏｘｎ１無胸腺ヌードマウスをHarlanから得た。マウスを実験前に１週間かけて気候順応させ、そして層流ボックスに病原体を含まない条件下で保持し（６匹のマウス／ケージ）、そして標準的な条件下で維持した（２２±２℃、４５±１０％相対湿度、１２時間の光／１２時間の暗闇のサイクルを毎日、標準的な食事および水を自由に）。全ての実験は、実験動物研究のためのフランスガイドラインに従って実施した。
【０１１６】
１．１１．異種移植およびin vivoにおける生物発光イメージング
注入前に、ＣＷＲ−Ｒ１−ＬｕｃまたはＣＷＲ−Ｒ１−ＣＸＣＬ５細胞をトリプシン処理した。１０６個の細胞を、マトリゲル（３：１、ｖ／ｖ、BD Biosciences）と合わせた、４０μlのＰＢＳ中で調製した。１群のマウス（ｎ＝１６）を移植の１週間前に去勢した。全てのマウスに、麻酔した動物の手術により露出された前立腺に同所性に１０６個のＣＷＲ−Ｒ１−ＬｕｃまたはＣＷＲ−Ｒ１−ＣＸＣＬ５細胞を移植した。その後、ルシフェラーゼ活性を毎週８週間かけて測定した。ルシフェラーゼ活性を測定するために、マウスを最初にイソフルランガス麻酔システム（T.E.M., Bordeaux, France）によって鎮静化した。その後、マウスの腹腔内に、水溶液中の１２５mg/kg（体重）のルシフェリン（ナトリウム塩；Promega）を注入した。発光をNightOWL II LB 981 CCDカメラを使用して測定し、そして５分間積分した。対象の領域（ＲＯＩ）のシグナル強度を得て、そしてデータを光子として表現した（計数／秒）。バックグラウンドは、動物の近くの非発光領域に置かれた同じサイズの領域から定められ、そしてその後、測定した発光シグナル強度から差し引いた。全ての光学測定は、カメラ設定、撮影時間、動物からの距離および領域サイズを含めて、同じ条件下で実施した。動物内で放射される検出された光子の空間的な分布を示す、青色（最も強度が弱い）から赤色（最も強度が強い）までの疑似カラー発光イメージを、WinLightソフトウェア（Berthold Technologies）を使用して作製した。血清ＣＸＣＬ５レベルの測定のために、マウスを４２日目に屠殺し、そして血液および腫瘍を回収した。
【０１１７】
１．１２．タンパク質抽出物の調製
腫瘍試料を、MagNA Lyser装置（Roche）で７０００ｒ／分で１５秒間、セラミックビーズを含有するチューブ（Lysing matrix, MP Biomedical）、および試料の重量の２倍のＴＥＧ緩衝液（１０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１．５mM ＥＤＴＡ、およびプロテアーゼ阻害剤（５μg/mlアプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチンＡ、および０．１mMフェニルメチルスルホニルフルオライド）を含む１０％グリセロール）中で粉砕した。その後、溶解液を１００００rpmで３０分間４℃で遠心分離にかけ、そして上清を保存した。
【０１１８】
１．１３．ＣＸＣＬ５抗体を用いての遮断実験
１０３個のＰＣ−３細胞を、２４ウェル中のＲＰＭＩ１６４０を含む１％ＦＣＳ中に播種した。次の日から４日間、処理していない（コントロール）またはアイソタイプコントロール抗体としてヤギ血清（１／２０に希釈）でもしくは０．５μg/mlのＣＸＣＬ５抗体（ＡＦ−２５４、R&D system）で処理。処理をしたまたはしない培地を２日目に交換した。細胞数をルシフェラーゼ活性を測定することによって４日目に決定した。
【０１１９】
１．１４．ｓｈＣＸＣＬ５を用いての遮断実験
６ウェル中のＲＰＭＩ１６４０を含む１０％ＦＣＳ中に播種した１０５個のＰＣ−３細胞を、４μgの非ターゲットｓｈＲＮＡコントロールベクター（ShC002, Mission Library, Sigma-Aldrich）またはｓｈＣＸＣＬ５ベクター（SHCLND-NM_002994 - TRCN0000057934NM_002994.3-304s1c1TRC1、配列番号６：
【化３】
2013533458.tif 000004
Mission Library, Sigma-Aldrich）を用いて、Jet-PEI（登録商標）プロトコールを使用して各ウェルにおいてトランスフェクションした。トランスフェクションから８時間後に培地を交換した。ＣＸＣＬ５の分泌を、４８時間後に馴化培地中でＥＬＩＳＡ（Duoset, DY254, R&D system）によって定量した。細胞を、トランスフェクションから４日後にmalassezスライドを使用して計測した。
【０１２０】
１．１５．ヒト試料
血清および尿を、前立腺癌の疑いのために受診したが癌が診断されたか否かは示されていない一連のランダムな患者から得た。
【０１２１】
実施例２：ＣＸＣＬ５は、より悪性度の高い前立腺癌において発現される。
正常な前立腺および前立腺癌におけるＣＸＣＬ５発現の評価を免疫組織化学によって行なった。結果は、ＣＸＣＬ５が主に上皮前立腺癌細胞によって産生されることを示した。さらに、ＣＸＣＬ５レベルは、前立腺腫瘍の悪性度の指標であるグリーソンスコア（図１）と共に増加した。
【０１２２】
明確な悪性度を示し、そしてアンドロゲンレセプター（ＡＲ、前立腺癌細胞のアンドロゲン感受性のメディエーター）を発現するまたはしない、明確な前立腺癌細胞株におけるＣＸＣＬ５の分泌を次にＥＬＩＳＡによって研究した。ＰＣ３、ＰＣ３−ＬＵＣ、ＤＵ１４５およびＭＤＡＰＣａ１は、ＡＲを発現しない悪性度の高い前立腺癌細胞株である。ＢＲＦ４１Ｔ、ＣＷＲ−Ｒ１、２２ＲＶ１、ＬＮＣａＰ、Ｃ４−２およびＬＡＰＣ４は、中程度の悪性度であり、ＡＲを発現する、前立腺癌細胞である。ＨＰＶ７、ＢＰＨ−１、ＢＲＦ−５５Ｔは良性で過形成の前立腺細胞株である。
【０１２３】
ＡＲ陰性の悪性度の高い細胞株は、ＡＲ陽性の細胞株と比較して、より高いレベルのＣＸＣＬ５を分泌した（図２Ａ）。さらに、過形成の細胞株は、非常に可変性のレベルのＣＸＣＬ５を分泌した。
【０１２４】
ＥＬＩＳＡアッセイを通して得られたこれらの結果は、ＲＮＡレベルで確認された（図２Ｂ）。
【０１２５】
最後に、ＣＸＣＬ５プロモーター構築物を異なる前立腺癌株にトランスフェクションした。ＣＸＣＬ５プロモーター活性は、ＡＲ陽性細胞株と比較してＡＲ陰性前立腺癌株においてより高かったことが示された（図２Ｃ）。
【０１２６】
まとめると、これらの結果は、ＣＸＣＬ５は、グレードの高い前立腺腫瘍の上皮細胞によって、すなわち、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞において高度に発現されていることを実証する。
【０１２７】
実施例３：ＣＸＣＬ５は前立腺癌細胞のin vitroにおける増殖を増強する。
ＣＷＲ−Ｒ１細胞の安定なトランスフェクション体が、ＣＸＣＬ５ｃＤＮＡを用いてのトランスフェクションによって作製された。このようにして得られた安定なＣＷＲ−Ｒ１トランスフェクション体をさらにルシフェラーゼ遺伝子を用いてトランスフェクションし、in vivoにおいてその増殖をモニタリングした。野生型ＣＷＲ−Ｒ１細胞（ＣＷＲ−Ｒ１と呼ぶ）およびルシフェラーゼ遺伝子のみを用いてトランスフェクションされたＣＷＲ−Ｒ１細胞（ＣＷＲ−Ｒ１Ｌｕｃと呼ぶ）をコントロールとして使用した。
【０１２８】
Ｃ３Ｓ２およびＣ２Ｓ２と呼ばれる２つの別個のクローンを選択した。これらのクローンは、それぞれＣＸＣＬ５の中程度（Ｃ３Ｓ２）および高度（Ｃ２Ｓ２）の発現を示した。特に、これらのクローンにおけるＣＸＣＬ５の分泌は、ＤＵ−１４５またはＭＤＡ−ＰＣａ１などのＡＲ陰性細胞株においてより低かった。
【０１２９】
ＣＸＣＬ５を発現するクローンは、親ＣＷＲ−Ｒ１細胞よりも２から３倍速い増殖を示した（図３Ｂ）。
【０１３０】
腫瘍細胞は転移するために支持体に付着する変化した能力を有さなければならないので、プラスチック皿へのin vitroにおける付着の動態を実施した。Ｃ２Ｓ２およびＣ３Ｓ２クローンは、野生型細胞よりも遅い付着動態を有することが示された（図３Ｃ）。
【０１３１】
まとめると、これらの結果は、正常細胞をＣＸＣＬ５を用いてトランスフェクションすると、野生型細胞と比べてより速い増殖および支持体に付着する変化した能力を示すトランスフェクション体が得られることを実証する。
【０１３２】
実施例４：ＣＸＣＬ５はin vivoにおいて前立腺癌細胞の増殖を劇的に増加させる。
その後、腫瘍増殖に対するＣＸＣＬ５の効果を評価した。
【０１３３】
ＣＷＲ−Ｒ１−ＬＵＣ細胞またはＣ２Ｓ２細胞を無胸腺マウスの前立腺に注入した。興味深いことに、ＣＸＣＬ５を発現する細胞は、野生型細胞と比べてその増殖の劇的な増加を示した（図４）。
【０１３４】
この結果はさらに、ＣＸＣＬ５が細胞増殖において役割を果たすことを実証する。
【０１３５】
実施例５：ＣＸＣＬ５はアンドロゲンにより調節される遺伝子である。
ＣＸＣＬ５が前立腺腫瘍のホルモンエスケープに関与し得るかどうかを評価するために、次に、ＣＸＣＬ５がアンドロゲンによって調節されるかどうかを研究した。
【０１３６】
血清の脱ステロイド化によるアンドロゲンの除去は、ＣＷＲ−Ｒ１（図５Ａ）およびＬＮＣａＰ（図５Ｂ）細胞におけるＣＸＣＬ５ＲＮＡレベルを強く増加させたことが観察された。他方で、培地にジヒドロテストステロンを添加すると、ＣＸＣＬ５ＲＮＡのレベルは部分的に減少した（図５）。
【０１３７】
ＣＸＣＬ５の発現に対するビカルタミド（抗アンドロゲン物質）の効果も研究した。ビカルタミドは、ＣＷＲ−Ｒ１細胞においてＣＸＣＬ５ＲＮＡを２から３倍増加させたことが観察された（図６Ａ）。
【０１３８】
ビカルタミドで処理したＣＷＲ−Ｒ１細胞は、減少した増殖を示した（図６Ｂ）。逆に、ＣＸＣＬ５を発現する安定なクローンについて観察されたように、組換えＣＸＣＬ５の添加は、ＣＷＲ−Ｒ１細胞の増殖を２〜４倍増加させた（図６Ｂ）。興味深いことに、ＣＸＣＬ５の添加はまた、ビカルタミドによる増殖の阻害を部分的に軽減し得る（図６Ｂ）。
【０１３９】
この結果は、ＣＸＣＬ５がアンドロゲンによって負に調節されていることを示す。
【０１４０】
実施例６：ＣＸＣＬ５は、ビカルタミドの非存在下および存在下の両方においてＣＷＲ−Ｒ１細胞の増殖を増加させる。
ＣＸＣＬ５が、in vivoにおいてＣＷＲ−Ｒ１細胞に対してアンドロゲン非依存性増殖を付与し得るかどうかが次に決定された。
【０１４１】
無胸腺マウスを去勢し、そしてその後、ＣＷＲ−Ｒ１またはＣ２Ｓ２細胞を前立腺に接種した（図７Ａ）。ＣＷＲ−Ｒ１細胞は、アンドロゲンの非存在下において腫瘍を形成できなかった。他方で、Ｃ２Ｓ２細胞は、去勢された動物において非常に急速に腫瘍を形成することができた。
【０１４２】
ホルモンエスケープを評価するために、ＣＷＲ−Ｒ１またはＣ２Ｓ２細胞を、無胸腺マウスの前立腺に注入した（図７Ｂ）。接種から２週間後、マウスを２群に分け、一方は去勢し、他方はニセの操作をした。ＣＷＲ−Ｒ１細胞は去勢した動物においては増殖できなかったが、インタクトな動物では、Ｃ２Ｓ２細胞と比べて２から３週間の遅延はあったが増殖することができた（図７Ｂ）。他方で、Ｃ２Ｓ２細胞は去勢によって弱い影響を受け、そして減少した増殖の１週間の後に、去勢されていない動物に存在する細胞と同じくらい急速に再度増殖した。
【０１４３】
これらの結果は、ＣＸＣＬ５を発現する腫瘍を有する動物が去勢された場合に、ホルモンエスケープが起こることを示す。これとは対照的に、野生型はエスケープしない。まとめると、これらのデータは、ＣＸＣＬ５が前立腺癌細胞のホルモンエスケープに関与する新規なアンドロゲンにより調節される遺伝子であることを示す。
【０１４４】
実施例７：血清中ＣＸＣＬ５レベルは、ＣＸＣＬ５の腫瘍内発現と相関する。
血清中濃度の測定が実行可能であり、そしてＣＸＣＬ５の腫瘍内発現と一致し得るかどうかを決定するために、ＣＷＲ−Ｒ１またはＣＷＲ−Ｒ１−ＣＸＣＬ５腫瘍のいずれかを有するマウスの血清およびマウスの腫瘍の全細胞抽出物におけるＣＸＣＬ５の発現を分析した。図８Ａに示されるように、腫瘍内発現は、ＣＷＲ−Ｒ１細胞の腫瘍よりも、ＣＷＲ−Ｒ１−ＣＸＣＲ５細胞から構成される腫瘍の方が１０倍以上高かった。ＣＷＲ−Ｒ１腫瘍を有する動物の血清において、本発明者らはＣＸＣＬ５レベルを検出することができず、一方、ＣＸＣＬ５レベルは、ＣＷＲ−Ｒ１−ＣＸＣＬ５腫瘍を有する動物において高かった（約１３０pg/ml）（図８Ｂ）。これは、血清中ＣＸＣＬ５レベルが腫瘍のそのレベルと一致することを実証する。
【０１４５】
実施例８：ＣＸＣＬ５作用の阻害は細胞増殖を減少させる。
以前の結果に基づいて、ＣＸＣＬ５作用の遮断は見込みある治療アプローチを構成し得る。この理論を実証するために、２つのアプローチを使用した。１つは特異的な遮断抗体を使用することによるＣＸＣＬ５作用の遮断、もう１つは、ｓｈＲＮＡ法を用いてのＣＸＣＬ５発現のダウンレギュレーションによるＣＸＣＬ５作用の遮断である。
【０１４６】
高いレベルのＣＸＣＬ５を天然に発現し、そして非常に悪性度の高いＰＣ−３細胞を使用した。特異的抗体を用いてＣＸＣＬ５の作用を遮断した場合に、ＰＣ−３細胞の増殖が、非特異的な免疫血清と比較して強く減少したことが観察された（図９Ａ）。
【０１４７】
ＰＣ−３細胞におけるＣＸＣＬ５の発現は、それらをＣＸＣＬ５に対するｓｈＲＮＡ構築物を用いてトランスフェクションすることによって阻害された。ＣＸＣＬ５の発現は、４日間の阻害後に非ターゲットｓｈＲＮＡコントロールベクターと比べて強く減少したことが観察された（図９Ｂ）。トランスフェクションされた細胞の増殖を測定すると、ＣＸＣＬ５の阻害はまた、１０倍超でＰＣ−３細胞の増殖を劇的に阻害し得ることが観察された。
【０１４８】
結論すると、２つのアプローチは、ＣＸＣＬ５の作用の遮断がその分裂促進効果を強く減少させ得ることを明らかに実証する。
【０１４９】
実施例９：ＣＸＣＬ５はヒト血清中および尿中に検出され得る。
この実験の目標は、ＣＸＣＬ５タンパク質が、ヒト患者の血中および尿中に検出され得ることを実証することであった。これを達成するために、前立腺癌が疑われる２０人の患者の血液および尿を回収した。本発明者らは感度の高い化学発光ＥＬＩＳＡアッセイを据えた（実施例１の段落１．１５参照）。血清中では、ＣＸＣＬ５のレベルは２１７pg/ml〜２１８２pg/mlの範囲であった。尿中では、ＣＸＣＬ５のレベルははるかにより低く、４．２pg/ml〜５７pg/mlの範囲であった（図１０）。このことは、ＣＸＣＬ５タンパク質が患者の尿および血清中に検出され得ることを実証する。
【０１５０】
実施例１０：結論
ホルモンエスケープは前立腺癌処置における大きな問題である。なぜなら、抗アンドロゲン物質で処置した全ての患者に１４カ月から３０カ月の一定の期間の後に起こるからである。ホルモン難治性の前立腺癌のためのマーカーおよび治療ターゲットの探索は重要であるようである。本発明者らは本明細書において、ケモカインＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８）がグレードの高い前立腺腫瘍の上皮細胞によって高度に発現されていることを示す。さらに、侵襲性の前立腺癌細胞株は、より悪性度の低い細胞株と比べて、より高いレベルのＣＸＣＬ５を産生する。このより高い発現は、ＣＸＣＬ５遺伝子プロモーターのより高い転写活性に起因する。アンドロゲンレセプター（ＡＲ）陽性の前立腺癌細胞株ＣＷＲ−Ｒ１におけるＣＸＣＬ５ｃＤＮＡの安定なトランスフェクションは、そのin vitroにおける増殖を増加させ、そしてプラスチック皿に付着するその能力を減少させる。さらに、ＣＸＣＬ５は、これらの細胞にin vivoにおける壮観な増殖を付与する。本発明者らはまた、ＣＸＣＬ５遺伝子がアンドロゲンにより調節され：アンドロゲンの除去はその発現をアップレギュレーションし、一方で、アンドロゲンの添加はその発現を減少させることを実証する。さらに、抗アンドロゲン物質のビカルタミドを用いてＣＷＲ−Ｒ１細胞を処理すると、ＣＸＣＬ５の発現は増加する。ＣＷＲ−Ｒ１細胞のＣＸＣＬ５による処理は、ビカルタミドの存在下でさえもin vitroにおける細胞増殖を増加させることができる。In vivoにおいて、ＣＸＣＬ５はアンドロゲンの非存在下においてＣＷＲ−Ｒ１細胞の腫瘍取り込みを可能とし、一方、野生型細胞はこれらの条件では増殖できない。さらに、ＣＷＲ−Ｒ１−ＣＸＣＬ５腫瘍を有する動物が去勢されると、ホルモンエスケープが起こり、一方、野生型細胞はエスケープしない。本発明者らはまた、ＣＸＣＬ血清レベルが、マウスにおけるＣＸＣＬ５の腫瘍内発現と相関することを示す。ヒトにおいて、ＣＸＣＬ５を血清中および尿中に検出することができた。さらに、本発明者らは、ＣＸＣＬ５遮断抗体によって、またはｓｉＲＮＡアプローチによりその発現をダウンレギュレーションすることによって、ＣＸＣＬ５の作用を遮断することは、前立腺癌細胞の増殖を阻害することを示す。まとめると、本発明者らのデータは、ＣＸＣＬ５は前立腺癌細胞のホルモンエスケープに関与する新規なアンドロゲンにより調節される遺伝子であり、これは新規な治療ターゲットを構成し得ることを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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