(57)【要約】本発明は、発がんにおいてＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子が果たす役割に関し、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子、またはそのような二本鎖分子を含む組成物もしくはベクターを投与することにより、がんを治療または予防するための方法を特徴とする。本発明はまた、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを検出する段階を含む、対象におけるがんを検出または診断するための方法およびキットも特徴とする。本発明はさらに、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを検出する段階を含む、がんを有する対象の予後を評価または判定するための方法およびキットを特徴とする。また、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現または活性に対するその効果を指標として用いて、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象由来の生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを測定する段階を含む、対象におけるがんを検出または診断する方法であって、該レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該対象におけるがんの存在、または該対象ががんに罹患していることが示され、発現レベルが、
（ａ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出すること；
（ｂ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること；および
（ｃ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法のいずれか１つによって測定される、方法。
【請求項２】
前記上昇が正常対照レベルよりも少なくとも１０％高い、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記対象由来の生物学的試料が生検標本、痰、血液、胸水、または尿を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
以下からなる群より選択される試薬を含む、がんを検出または診断するためのキット：
（ａ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【請求項５】
前記試薬が、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡに結合するプローブまたはプライマーセットである、請求項４記載のキット。
【請求項６】
前記試薬が、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体またはその断片である、請求項４記載のキット。
【請求項７】
以下の段階を含む、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質をＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと該試験物質との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合する試験物質を選択する段階。
【請求項８】
以下の段階を含む、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）該細胞におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下における発現レベルと比較して、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを低下させる該試験物質を選択する段階。
【請求項９】
以下の段階を含む、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質をＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下で検出された生物学的活性と比較して、該ポリペプチドの生物学的活性を抑制する該試験物質を選択する段階。
【請求項１０】
前記生物学的活性が細胞増殖増強活性、メチルトランスフェラーゼ活性、または抗アポトーシス活性である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階を含む、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）試験物質の非存在下におけるレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性レベルを低下させる該試験物質を選択する段階。
【請求項１２】
細胞に導入された場合にＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子であって、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、該センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む、単離された二本鎖分子。
【請求項１３】
前記センス鎖が前記標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する前記二本鎖分子を形成する、請求項１２記載の二本鎖分子。
【請求項１４】
介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドからなる、請求項１２記載の二本鎖分子。
【請求項１５】
一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
を有し、［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ'］は、［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、請求項１４記載の二本鎖分子。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか一項記載の二本鎖分子をコードするベクター。
【請求項１７】
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターであって、該センス鎖核酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、または３２に相当するヌクレオチド配列を含み、かつ該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖と該アンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ該ベクターが、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現する細胞に導入された場合に細胞増殖を阻害する、ベクター。
【請求項１８】
ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターの薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、がんの治療および予防のいずれかもしくは両方、または該対象におけるがん細胞増殖の阻害の方法であって、該二本鎖分子が、細胞に導入された場合にＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現および細胞増殖を阻害し、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成する、方法。
【請求項１９】
前記二本鎖分子が請求項１２〜１５のいずれか一項記載のものである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターの薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、がんの治療および予防のいずれかもしくは両方のためまたはがん細胞増殖の阻害のための組成物であって、該二本鎖分子が、細胞に導入された場合にＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現および細胞増殖を阻害し、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成する、組成物。
【請求項２１】
前記二本鎖分子が請求項１２〜１５のいずれか一項記載のものである、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
以下の段階を含む、がんを有する対象の予後を評価または判定するための方法：
（ａ）対象由来の生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを検出する段階；
（ｂ）段階（ａ）で検出された発現レベルを対照レベルと比較する段階；および
（ｃ）段階（ｂ）の比較に基づいて、該対象の予後を評価または判定する段階。
【請求項２３】
前記対照レベルが予後良好対照レベルであり、該対照レベルと比較した前記発現レベルの上昇が予後不良と関連付けられる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記発現レベルが、以下からなる群より選択される方法によって測定される、請求項２２記載の方法：
（ａ）ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出すること；
（ｂ）ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること；および
（ｃ）ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること。
【請求項２５】
前記対象由来の生物学的試料が生検標本を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
以下からなる群より選択される試薬を含む、がんを有する対象の予後を評価または判定するためのキット：
（ａ）ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【請求項２７】
前記試薬が、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡに結合するプローブまたはプライマーセットである、請求項２６記載のキット。
【請求項２８】
前記試薬が、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体またはその断片である、請求項２６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん研究、がん診断、およびがん治療の分野に関する。特に、本発明は、がん、特に膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌を検出もしくは診断するためまたは該がんの予後を評価もしくは判定するための方法、ならびに、がん、特に膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌を有する対象における疾患進行を治療および予防するためまたは対象において該がんを予防するための方法に関する。さらに本発明は、がん、特に膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌の治療および予防のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングするための方法に関する。
【０００２】
優先権
本出願は２０１０年８月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／３７５，４６４号の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
真核生物のゲノムは、ヌクレオソームのアレイであるクロマチン内にまとめられており、そのそれぞれの中で、１４６塩基対（ｂｐ）のＤＮＡが、コアヒストンタンパク質であるＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４の八量体に巻きついている（非特許文献１〜４）。ヒストンの翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、遺伝子転写、クロマチン構築、ＤＮＡ複製、組換え、およびＤＮＡ修復を含むゲノム過程の調節において重要な役割を果たす（非特許文献５〜７）。これらの過程の多様で状況特異的な調節は、特定のヒストンＰＴＭまたはＰＴＭの組み合わせを個々にまたはまとめて認識する相互作用調節因子によっておよび直接的な別個の調節結果によって促進されることが、提唱されている（非特許文献８）。メチルトランスフェラーゼ（およびデメチラーゼ）によって標的化されるリジン残基は、その部位の独自性、それが修飾されていないか（０ｍ）、またはモノメチル化されているか（１ｍ）、ジメチル化されているか（２ｍ）、もしくはトリメチル化されているか（３ｍ）、および、隣接部位におけるさらなるＰＴＭの存在が、部位特異的調節因子の結合を増強し得るために、ヒストンＰＴＭの中で可能性が最大である組み合わせおよび機能的複雑性を提供する（非特許文献９、１０）。
【０００４】
ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２は、挟動原体ヘテロクロマチンに特有であるヒストンＨ４Ｋ２０のジメチル化およびトリメチル化を触媒するヒストンメチルトランスフェラーゼである。現在のモデルによると、ＳＵＶ３９Ｈ活性の結果としてのＨ３Ｋ９ｍｅ３は、ヘテロクロマチンにおけるヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）結合を安定化し（非特許文献１１、１２）、ＨＰ１タンパク質は次いでヒストンメチルトランスフェラーゼＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２を動員し、これらは次にＨ４Ｋ２０をトリメチル化する（非特許文献１３〜１５）。
以前に、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼであるＳＭＹＤ３がそのメチルトランスフェラーゼ活性を介して細胞増殖を促進し、ヒトの発がんにおいて極めて重要な役割を果たすことが報告された（特許文献１、非特許文献１６〜２０）。ヒストンメチル化を含むエピジェネティクスに関する研究は進歩してきているものの、異常なヒストンメチル化（または脱メチル化）とヒトの発がんとの関係は、まだ完全には明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2005/071102
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Luger K, et al., Nature, 1997, 389, 251-260.
【非特許文献２】Wang GG,et al., Trends Mol Med 2007;13:363-372.
【非特許文献３】Wang GG, et al., Trends Mol Med 2007;13:373-380.
【非特許文献４】Esteller M , N Engl J Med 2008;358:1148-1159.
【非特許文献５】Berger SL, Nature 2007;447:407-412.
【非特許文献６】Downs JA, et al., Nature 2007;447:951-958.
【非特許文献７】Groth A, et al., Cell 2007;128:721-733.
【非特許文献８】Jenuwein T, et al., Science 2001;293:1074-1080.
【非特許文献９】Martin C, et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2005;6:838-849.
【非特許文献１０】Ruthenburg AJ, et al., Mol Cell 2007;25:15-30.
【非特許文献１１】Bannister AJ, et al., Nature 2001;410:120-124.
【非特許文献１２】Lachner M, et al., Nature 2001;410:116-120.
【非特許文献１３】Benetti R,et al., J Cell Biol 2007;178:925-936.
【非特許文献１４】Kourmouli N,et al., Biochem Biophys Res Commun 2005 ;337 :901-907.
【非特許文献１５】Schotta G,et al., Genes Dev 2004;18:1251-1262.
【非特許文献１６】Hamamoto R, et al.,Nat Cell Biol 2004;6:731-40.
【非特許文献１７】Hamamoto R, et al., Cancer Sci 2006;97:113-8.
【非特許文献１８】Kunizaki M, et al., Cancer Res 2007;67:10759-65.
【非特許文献１９】Silva FP, et al., Oncogene 2008;27:2686-92.
【非特許文献２０】Tsuge M, et al., Nat Genet 2005;37:1104-7.
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２、ならびにこれらが発がんにおいて果たす役割に関する。したがって、本発明は、がん、例えば膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病、食道癌、および胃癌を検出、診断、治療、および／または予防するための新規の組成物および方法、ならびに、がんの治療および予防のいずれかまたは両方に有用な物質をスクリーニングするための方法に関する。
【０００８】
特に、本発明は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子ががん細胞において過剰発現するという発見、ならびに、センス鎖およびアンチセンス鎖から構成される二本鎖分子であって、センス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が該センス鎖に相補的な配列を含み、該分子のセンス鎖とアンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２発現を阻害する前記二本鎖分子が、がん細胞の細胞増殖を阻害するのに有効であるという発見から生じる。
【０００９】
したがって、１つの局面において、本発明は、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のいずれかまたは両方を発現する細胞に導入された場合にＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子であって、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成する、単離された二本鎖分子を提供する。これらの二本鎖分子は単離された状態で利用されてもよく、または、ベクターにコードされ、該ベクターから発現されてもよい。したがって、別の局面において、本発明は、該二本鎖分子をコードするベクターおよび該ベクターを保有する宿主細胞を提供する。
【００１０】
別の局面において、本発明は、本発明の二本鎖分子またはベクターをそれを必要とする対象に投与することにより、がん、特に膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病、食道癌、および胃癌を含むがんの細胞増殖を阻害するため、または該がんを治療するための方法を提供する。そのような方法は、本発明の二本鎖分子またはベクターの１つまたは複数を含む組成物を対象に投与する段階を包含する。
【００１１】
別の局面において、本発明は、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病、食道癌、および胃癌を含むがんを治療するための組成物であって、本発明の二本鎖分子またはベクターの少なくとも１つを含む組成物を提供する。
さらに別の局面において、本発明は、対象由来の生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルを測定することにより、対象におけるがんを検出または診断する方法を提供する。該遺伝子の発現レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、対象におけるがん、特に膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病、食道癌、および胃癌を含むがんの存在、または対象が該がんに罹患していることが示される。
【００１２】
本発明はまた、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルががんの予後不良と相関するという発見にも関する。したがって、別の局面において本発明は、がんを有する対象の予後を評価または判定するための方法を提供し、該方法は、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを測定する段階、それを所定の参照発現レベルと比較する段階、および該比較に基づいて該対象の予後を評価または判定する段階を含む。
【００１３】
さらなる局面において、本発明は、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法を提供する。そのような物質は、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと結合するか、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性を低下させるか、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを低下させるか、またはＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の代用として働くレポーター遺伝子の発現もしくは活性を低下させる。
さらなる局面において、本発明は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２のｍＲＮＡ、タンパク質、または生物学的活性を検出するための試薬を含む、がんを検出もしくは診断するためまたはがんの予後を評価もしくは判定するためのキットを提供する。
【００１４】
より具体的には、本発明は以下の［１］〜［２８］を提供する：
［１］対象由来の生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを測定する段階を含む、対象におけるがんを検出または診断する方法であって、該レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該対象におけるがんの存在、または該対象ががんに罹患していることが示され、発現レベルが、
（ａ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出すること；
（ｂ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること；および
（ｃ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法のいずれか１つによって測定される、方法；
［２］前記上昇が正常対照レベルよりも少なくとも１０％高い、［１］記載の方法；
［３］前記対象由来の生物学的試料が生検標本、痰、血液、胸水、または尿を含む、［１］記載の方法；
［４］以下からなる群より選択される試薬を含む、がんを検出または診断するためのキット：
（ａ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬；
［５］前記試薬が、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡに結合するプローブまたはプライマーセットである、［４］記載のキット；
［６］前記試薬が、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体またはその断片である、［４］記載のキット；
［７］以下の段階を含む、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質をＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと該試験物質との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合する試験物質を選択する段階；
［８］以下の段階を含む、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）該細胞におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下における発現レベルと比較して、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを低下させる該試験物質を選択する段階；
［９］以下の段階を含む、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質をＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下で検出された生物学的活性と比較して、該ポリペプチドの生物学的活性を抑制する該試験物質を選択する段階；
［１０］前記生物学的活性が細胞増殖増強活性、またはメチルトランスフェラーゼ活性、または抗アポトーシス活性である、［９］記載の方法；
［１１］以下の段階を含む、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法：
（ａ）試験物質を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）試験物質の非存在下におけるレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性レベルを低下させる該試験物質を選択する段階；
［１２］細胞に導入された場合にＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子であって、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、該センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む、単離された二本鎖分子；
［１３］前記センス鎖が前記標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する前記二本鎖分子を形成する、［１２］記載の二本鎖分子；
［１４］介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドからなる、［１２］記載の二本鎖分子；
［１５］一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
を有し、［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２からなる群より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ'］は、［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［１４］記載の二本鎖分子；
［１６］［１２］〜［１５］のいずれか１項記載の二本鎖分子をコードするベクター；
［１７］センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターであって、該センス鎖核酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、または３２に相当するヌクレオチド配列を含み、かつ該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖と該アンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ該ベクターが、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現する細胞に導入された場合に細胞増殖を阻害する、ベクター；
［１８］ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターの薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、がんの治療および予防のいずれかもしくは両方、または該対象におけるがん細胞増殖の阻害の方法であって、該二本鎖分子が、細胞に導入された場合にＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現および細胞増殖を阻害し、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成する、方法；
［１９］前記二本鎖分子が［１２］〜［１５］のいずれか１項記載の二本鎖分子である、［１８］記載の方法；
［２０］ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターの薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、がんの治療および予防のいずれかもしくは両方のためまたはがん細胞増殖の阻害のための組成物であって、該二本鎖分子が、細胞に導入された場合にＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現および細胞増殖を阻害し、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成する、組成物；
［２１］前記二本鎖分子が［１２］〜［１５］のいずれか１項記載の二本鎖分子である、［２０］記載の組成物；
［２２］以下の段階を含む、がんを有する対象の予後をモニタリングまたは評価または判定するための方法：
（ａ）対象由来の生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを検出する段階；
（ｂ）段階（ａ）で検出された発現レベルを対照レベルと比較する段階；および
（ｃ）段階（ｂ）の比較に基づいて、患者の予後を評価または判定する段階；
［２３］前記対照レベルが予後良好対照レベルであり、該対照レベルと比較した前記発現レベルの上昇が予後不良と関連付けられる、［２２］記載の方法。
［２４］前記発現レベルが、以下からなる群より選択される方法によって測定される、［２２］記載の方法：
（ａ）ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出すること；
（ｂ）ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること；および
（ｃ）ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること；
［２５］前記対象由来の生物学的試料が生検標本を含む、［２２］記載の方法；
［２６］以下からなる群より選択される試薬を含む、がんを有する対象の予後をモニタリングまたは評価または判定するためのキット：
（ａ）ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬；
［２７］前記試薬が、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡに結合するプローブまたはプライマーセットである、［２６］記載のキット；ならびに
［２８］前記試薬が、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体またはその断片である、［２６］記載のキット。
【００１５】
本発明の１つまたは複数の局面は特定の目的を達成できる一方、１つまたは複数の他の局面は特定の他の目的を達成できることが、当業者によって理解されよう。各目的はあらゆる点で、本発明のすべての局面に等しく当てはまらない場合がある。したがって、前述の目的を、本発明のいずれか１つの局面に関して選択的に考慮することができる。
【００１６】
本発明のこれらおよびその他の目的および特徴は、添付の図面および以下の実施例と併せて以下の詳細な説明を読んだ場合に、より十分に明らかになるであろう。しかしながら、前述の発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様のものであり、本発明および本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないこともまた理解されよう。特に本明細書において、本発明をいくつかの特定の態様に関して説明するが、その説明は本発明の例証であり、本発明の限定として構成されるわけではないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に思い至ることができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および後述の特定の態様から明らかになると考えられ、当業者には容易に明らかになるであろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるすべての合理的な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の様々な局面および適用は、以下の図面の簡単な説明ならびに発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明らかになるであろう。
【図１Ａ−Ｂ】図１は、イギリス人患者および日本人患者の膀胱癌におけるＳＵＶ４２０Ｈ１／Ｈ２発現の上昇を示す。Ａ：イギリス人症例の正常膀胱組織および膀胱腫瘍組織におけるＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子発現。ＳＵＶ４２０Ｈ１／Ｈ２の発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって解析し、結果を箱ひげ図により示す（中央値５０％を四角で囲む）。相対的ｍＲＮＡ発現とは、ＧＡＰＤＨおよびＳＤＨ発現によって正規化された値を示す。統計解析には、マンホイットニーのＵ検定を使用した。Ｂ：日本人患者における正常膀胱組織と膀胱腫瘍組織の間のＳＵＶ４２０Ｈ１／Ｈ２発現の比較。各試料のシグナル強度をｃＤＮＡマイクロアレイによって解析し、結果を箱ひげ図により示す（中央値５０％を四角で囲む）。統計解析には、マンホイットニーのＵ検定を使用した。
【図１Ｃ】Ｃ：１６種類の正常組織および膀胱腫瘍組織におけるＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベル。データをＧＡＰＤＨ発現およびＳＤＨ発現によって正規化し、相対的ＳＵＶ４２０Ｈ２発現とは、正常膀胱組織の値と比較した比率を示す（１＝ＳＡＥＣ発現）。
【図２Ａ】図２は、様々な種類のヒト癌におけるＳＵＶ４２０Ｈ１／Ｈ２発現の上昇を示す。Ａ：子宮頸癌、骨肉腫、肺癌（ＳＣＬＣ）、および軟部組織腫瘍における正常組織と腫瘍組織の間のＳＵＶ４２０Ｈ１発現の比較。各試料のシグナル強度をｃＤＮＡマイクロアレイによって解析し、結果を箱ひげ図により示す（中央値５０％を四角で囲む）。統計解析には、マンホイットニーのＵ検定を使用した。
【図２Ｂ】Ｂ：乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、および肺癌（ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ）における正常組織と腫瘍組織の間のＳＵＶ４２０Ｈ２発現の比較。各試料のシグナル強度をｃＤＮＡマイクロアレイによって解析し、結果を箱ひげ図により示す（中央値５０％を四角で囲む）。統計解析には、マンホイットニーのＵ検定を使用した。
【図２Ｃ−Ｄ】Ｃ：組織マイクロアレイ上の肺癌組織および正常肺組織における強陽性、弱陽性、および陰性のＳＵＶ４２０Ｈ２染色の代表例。Ｄ：ＮＳＣＬＣ患者の全生存期間のカプラン・マイヤー推定値（Ｐ＝０．００２３、ログランク検定）。
【図３Ａ−Ｂ】図３は、正常細胞株ならびに膀胱癌および肺癌腫瘍細胞株におけるＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２の発現、ならびに２種類のＳＵＶ４２０Ｈ１特異的ｓｉＲＮＡによるＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈの内因性発現の抑制を示す。Ａ、Ｂ：３種類の正常細胞株、１４種類の膀胱癌細胞株、および５種類の肺癌細胞株におけるＳＵＶ４２０Ｈ１（Ａ）およびＳＵＶ４２０Ｈ２（Ｂ）の発現。発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって解析し、相対的ｍＲＮＡ発現とは、ＧＡＰＤＨおよびＳＤＨ発現によって正規化された値を示す。
【図３Ｃ−Ｄ】Ｃ、Ｄ：Ａ５４９細胞およびＳＢＣ５細胞における、２種類のＳＵＶ４２０Ｈ１特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＵＶ４２０Ｈ１＃１および＃２）および２種類のＳＵＶ４２０Ｈ２特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＵＶ４２０Ｈ２＃１および＃２）によるＳＵＶ４２０Ｈ１（Ｃ）およびＳＵＶ４２０Ｈ２（Ｄ）の内因性発現の抑制を示す定量的リアルタイムＰＣＲ。ｓｉＥＧＦＰを対照として使用した。ｍＲＮＡ発現レベルをＧＡＰＤＨおよびＳＤＨ発現によって正規化し、値はｓｉＥＧＦＰに対して相対的である（ｓｉＥＧＦＰ＝１）。
【図４Ａ−Ｂ】図４は、膀胱癌細胞株および肺癌細胞株の生存率ならびに細胞周期動態に対するＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２  ｓｉＲＮＡノックダウンの効果を示す。Ａ、Ｂ：２種類の膀胱癌細胞株（ＳＷ７８０およびＲＴ４）および３種類の肺癌細胞株（Ａ５４９、ＬＣ３１９、およびＳＢＣ５）の生存率に対するＳＵＶ４２０Ｈ１（Ａ）およびＳＵＶ４２０Ｈ２（Ｂ）ｓｉＲＮＡノックダウンの効果。相対細胞数とは、ｓｉＥＧＦＰ処理細胞に対して正規化された値を示す。結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤである。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定を用いて算出した（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。
【図４Ｃ−Ｄ】Ｃ：Ａ５４９細胞における細胞周期動態に対するｓｉＳＵＶ４２０Ｈ２の効果。細胞周期分布は、材料および方法に記載されるように、ヨウ化プロピジウムで染色した後にフローサイトメトリーによって解析した。Ｄ：細胞周期状態によって細胞を分類する、ＦＡＣＳ結果の数値的解析。Ｓ期およびＧ２／Ｍ期にあるＴ−ＲＥｘ−ＳＵＶ４２０Ｈ２細胞の割合は、対照細胞（Ｔ−ＲＥｘ−ＭｏｃｋおよびＴ−ＲＥｘ−ＣＡＴ）よりもわずかに高い。３回の独立した実験の平均値±ＳＤ。フィッシャーのＰＬＳＤ事後検定を用いて、Ｐ値を算出した（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１）。
【図４Ｅ−Ｆ】Ｅ：ｓｉＳＵＶ４２０Ｈ２処理してから７２時間後のＳＷ７８０、Ａ５４９、およびＳＢＣ５細胞のコロニー形成アッセイ。Ｆ：ＳＢＣ５細胞における細胞周期動態に対するｓｉＳＵＶ４２０Ｈ２の効果。細胞周期分布は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ＢｒｄＵおよび７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で共役染色した後にフローサイトメトリーによって解析した。
【図５】図５は、癌細胞のＳＵＶ４２０Ｈ２ノックダウン依存性アポトーシス誘導の効果を示す。Ａ：抗ＰＡＲＰ１抗体および抗切断型カスパーゼ３抗体を用いたウェスタンブロッティング。抗ＧＡＰＤＨ抗体を内部対照として使用した。Ｂ：蛍光システムを用いたＴＵＮＥＬアッセイ。アポトーシス細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８により染色し、核をヨウ化プロピジウム；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）５９４により対比染色した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
態様の説明
本明細書に記載の方法および材料と類似したまたは同等の任意の方法および材料を、本発明の態様の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料を以下に記載する。しかしながら、本発明の材料および方法を記載する前に、本明細書に記載される特定のサイズ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣行的な実験法および最適化に従って変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載において用いられる専門用語は特定の種類または態様を説明する目的のためのみのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
本明細書において言及される各出版物、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション配列もしくはその他の配列、特許、または特許出願の開示は、その全体が参照により明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書におけるいずれも、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
特記しない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。
【００１９】
定義：
本明細書で用いられる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、特記しない限り「少なくとも１つの」を意味する。
物質（例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に関連して用いられる「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、天然源中にも含まれ得る少なくとも１つの物質を実質的に含まないということを示す。したがって、単離されたまたは精製された抗体とは、そのタンパク質（抗体）が由来する細胞もしくは組織供給源由来の細胞物質、例えば糖質、脂質、および他の混入タンパク質を実質的に含まないか、または、化学合成された場合には化学的前駆体および他の化学物質を実質的に含まない、抗体を指す。「細胞物質を実質的に含まない」という用語は、ポリペプチドが単離されるかまたは組換えによって産生される細胞の細胞成分から、該ポリペプチドが分離された、該ポリペプチドの調製物を含む。
【００２０】
したがって、細胞物質を実質的に含まないポリペプチドは、（乾燥重量あたり）約３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満の異種タンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも称される）を有する、ポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドが組換えによって作製される場合、いくつかの態様においてこれはまた培養培地を実質的に含まず、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、１０％未満、または５％未満の培養培地を有する、該ポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドが化学合成によって作製される場合、いくつかの態様においてこれは化学的前駆体および他の化学物質を実質的に含まず、タンパク質の合成に伴う化学的前駆体または他の化学物質が該タンパク質調製物の体積の（乾燥重量あたり）約３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満である該ポリペプチドの調製物を含む。特定のタンパク質調製物が単離されたまたは精製されたポリペプチドを含むことは、例えば、該タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および該ゲルのクマシーブリリアントブルー染色等の後に単一のバンドが出現することによって示され得る。１つの態様において、本発明の抗体を含むタンパク質は単離されているかまたは精製されている。
本発明の文脈において、「ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子」または「ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子」という語句は、ヒトのＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子、またはヒトのＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の機能的同等物のいずれかをコードする、ポリヌクレオチドを包含する。ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子は、従来のクローニング方法により天然ポリヌクレオチドとして自然界から、または選択されたヌクレオチド配列に基づいて化学合成により、得ることができる。ｃＤＮＡライブラリなどを使用して遺伝子をクローニングするための方法は当技術分野において周知である。
【００２１】
本発明の方法および組成物が「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」の文脈において有用である限り、そのような用語は本明細書において互換的に用いられ、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の作用を指す。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）することに加え、機能の回復および疾患関連の合併症の低減によって、既に確立された疾患の悪影響を低下させることを目的とした活動を包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を低減させることを目的とした広範囲の予防的療法を含み得る。
【００２２】
本発明の特定の態様ががんの治療および／もしくは予防、ならびに／またはその術後再発の予防を包含する限り、そのような方法は、以下の段階のいずれかを含み得る：がん細胞の外科的切除、がん性細胞増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害など。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を低下させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。また、治療により、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、蔓延、もしくは転移能の低下などの臨床的有効性がもたらされる場合に、該治療は「有効」とみなされ得る。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、がんの形成が遅延もしくは阻害されるか、またはがんの臨床症状が予防もしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の種類の腫瘍を診断または治療するための任意の公知の方法と共同して判定される。
【００２３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書において互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、天然アミノ酸ポリマーに加えて、１つまたは複数のアミノ酸残基が修飾残基であるか、または非天然残基、例えば対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体である、アミノ酸ポリマーに適用される。
【００２４】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされる天然アミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾された天然アミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾Ｒ基または修飾骨格を有する、化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、類似した機能を有する、化学物質を指す。
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、公知の３文字表記または１文字表記で呼ぶことができる。
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、特記されない限り互換的に用いられ、アミノ酸と同様に、広く認められたその１文字コードで呼ばれる。当該用語は、1つまたは複数の核酸がエステル結合によって結合している核酸（ヌクレオチド）ポリマーに適用される。核酸ポリマーはＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせからなってよく、天然核酸ポリマーおよび非天然核酸ポリマーの両方を包含する。
【００２５】
本明細書で用いられる「生物学的試料」という用語は、生物全体、または、その組織、細胞、もしくは構成部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液、および精液を含むがこれらに限定されない体液）のサブセットを指す。「生物学的試料」はさらに、生物全体からまたはその細胞、組織、もしくは構成部分のサブセットから調製された、ホモジネート、溶解物、抽出物、細胞培養物、もしくは組織培養物、あるいはその画分もしくは一部を指す。最後に、「生物学的試料」は、細胞成分、例えばタンパク質またはポリヌクレオチドを含む、生物が増殖した培地、例えば栄養ブイヨンまたはゲルを指す。
特記しない限り、「がん」という用語は、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌などの、ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を過剰発現するがんを指す。
【００２６】
遺伝子およびタンパク質：
ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２は、挟動原体ヘテロクロマチンに特有であるヒストンＨ４Ｋ２０のジメチル化およびトリメチル化を触媒するヒストンメチルトランスフェラーゼである。現在のモデルによると、ＳＵＶ３９Ｈ活性の結果であるＨ３Ｋ９ｍｅ３は、ヘテロクロマチンにおけるヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）結合を安定化し、ＨＰ１タンパク質は次いでヒストンメチルトランスフェラーゼＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２を動員し、これらは次にＨ４Ｋ２０をトリメチル化する。ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２は、選択的スプライシングを受けた転写物バリアントである。
【００２７】
上記遺伝子の核酸配列、およびそれらによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、当技術分野において公知である。例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、ＳＵＶ４２０Ｈ１についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４および２６、ＳＵＶ４２０Ｈ２についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８に示されるアミノ酸配列を含むがこれらには限定されず、かつこれらはまた、ＳＵＶ４２０Ｈ１についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６０１０５．３およびＮＰ＿０５７１１２．３、ＳＵＶ４２０Ｈ２についてはＮＰ＿１１６０９０．２を介して、それぞれ入手可能である。したがって、ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子およびＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の例示的な核酸配列はそれぞれ、ＳＵＶ４２０Ｈ１についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４および２６、ＳＵＶ４２０Ｈ２についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み得る。そのような核酸配列の例には、ＳＵＶ４２０Ｈ１についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３および２５、ＳＵＶ４２０Ｈ２についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に示される核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。これらの核酸配列データはまた、ＳＵＶ４２０Ｈ１についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１７６３５．３およびＮＭ＿０１６０２８．４、ＳＵＶ４２０Ｈ２についてはＮＭ＿０３２７０１．３を介して、それぞれ入手可能である。
【００２８】
本発明の１つの局面によれば、ポリペプチドの機能的同等物も「ポリペプチド」であると見なされる。本明細書において、ポリペプチドの「機能的同等物」とは、該ポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチドである。すなわち、該ポリペプチドの生物学的能力を保持する任意のポリペプチドを、本発明においてそのような機能的同等物として用いることができる。そのような機能的同等物には、該ポリペプチドの天然アミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたものが含まれる。あるいは、機能的同等物は、該ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性（配列同一性とも称される）、少なくとも約９０％〜９５％の相同性、または、約９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の相同性を有するアミノ酸配列で構成され得る。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」におけるアルゴリズムに従うことによって決定することができる。他の態様において、機能的同等物は、該遺伝子の天然ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチドであり得る。
本発明のポリペプチドには、その産生に用いた細胞もしくは宿主または利用した精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に差異があってもよい。それでもなお、該ポリペプチドと同等の機能を有する限り、これは、本発明の範囲内である。
【００２９】
「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、典型的には核酸の複雑な混合物中で、核酸分子がその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とは検出可能な程度にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下では異なり得る。配列が長いほど、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度、ｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件はまた、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加によって達成させてもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルはバックグラウンドのレベルの少なくとも２倍、またはバックグラウンドのレベルの１０倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例として、以下が挙げられる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベーション、あるいは５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベーション、加えて０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳにおいて５０℃で洗浄。
【００３０】
本発明の文脈において、ポリペプチドの機能的同等物をコードするポリヌクレオチドを単離するためのハイブリダイゼーション条件は、当業者によって慣行的に選択され得る。例えば「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を用いてプレハイブリダイゼーションを６８℃で３０分間またはそれ以上行い、標識プローブを添加して、６８℃で１時間またはそれ以上インキュベーションすることにより、ハイブリダイゼーションを行ってもよい。それに続く洗浄段階は、例えば低ストリンジェント条件下で行うことができる。例示的な低ストリンジェント条件としては、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、および、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。高ストリンジェント条件を用いてもよい。例示的な高ストリンジェント条件としては、室温で２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳにおける２０分間の洗浄を３回行った後に、３７℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける２０分間の洗浄を３回行い、５０℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける２０分間の洗浄を２回行うことが挙げられる。しかしながら、温度および塩濃度などのいくつかの要素がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与え得るため、当業者は必要なストリンジェンシーを達成するためにこれらの要素を適切に選択することができる。
【００３１】
一般的に、ポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸の改変は、該ポリペプチドの機能に影響しないことが知られている。実際に、特定のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加によって改変されたアミノ酸配列を有する変異または改変ポリペプチドは、元の生物学的活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984)；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982)；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。したがって当業者は、単一のアミノ酸もしくはわずかな割合のアミノ酸を変更するか、または１つのポリペプチドの変更により類似機能をもつポリペプチドが生じる「保存的改変」とみなされる、アミノ酸配列に対する個別の付加、欠失、挿入、もしくは置換が、本発明の文脈において許容されることを認識するであろう。よって本発明のポリペプチドは、当初開示された参照配列において１個、２個、またはさらにより多いアミノ酸を付加、挿入、欠失、および／または置換した、アミノ酸配列を有してもよい。
【００３２】
ポリペプチドの生物学的活性が維持される限り、アミノ酸変異の数は特に限定されるわけではない。しかしながら、アミノ酸配列の５％またはそれ未満を変更することが典型的である。したがって、１つの態様において、そのような変異体において変異させるアミノ酸の数は、一般的には３０アミノ酸またはそれ未満、２０アミノ酸またはそれ未満、１０アミノ酸またはそれ未満、５もしくは６アミノ酸またはそれ未満、あるいは３もしくは４アミノ酸またはそれ未満である。
【００３３】
変異させるアミノ酸残基を、アミノ酸側鎖の特性が保存される別のアミノ酸に変異させてもよい（保存的アミノ酸置換として知られるプロセス）。アミノ酸側鎖の特性の例としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が挙げられる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表が、当技術分野において周知である。例えば、以下の８群はそれぞれ、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
【００３４】
そのような保存的改変ポリペプチドは、ポリペプチドの機能的同等物に含まれる。しかしながら本発明はこれらに限定されず、ポリペプチドの機能的同等物は、該ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性が保持されている限り、非保存的改変物を含み得る。さらに、改変ポリペプチドは、多型バリアント、種間相同体、およびこれらのポリペプチドの対立遺伝子によってコードされるものを排除しない。
【００３５】
１つまたは複数のアミノ酸残基の付加によって改変されたポリペプチドの例は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの融合タンパク質である。融合タンパク質は、当業者に周知の技法によって、例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子をコードするＤＮＡを、別のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡとフレームが一致するように連結し、この融合ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、これを宿主内で発現させることによって、作製することができる。融合タンパク質の「その他の」成分は、典型的には、数個〜１２個のアミノ酸から構成される小さなエピトープである。得られる融合タンパク質がＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの目的の生物学的活性のいずれか１つを保持する限り、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドに融合させるペプチドまたはタンパク質に制限はない。本発明によって意図される例示的な融合タンパク質には、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと、他の小さなペプチドまたはタンパク質との、例えばＦＬＡＧ（Hopp TP, et al., Biotechnology 6: 1204-10 (1988)）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基を含む６×Ｈｉｓまたは１０個のＨｉｓ残基を含む１０×Ｈｉｓなどのポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、インフルエンザ凝集体または凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃ断片、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、ｐ１８ＨＩＶ断片、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶタグ）、Ｅタグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）、ＳＶ４０Ｔ抗原断片、ｌｃｋタグ、αチューブリン断片、Ｂタグ、プロテインＣ断片等との融合物が含まれる。本発明のタンパク質に融合させることができるタンパク質のその他の例には、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、免疫グロブリン定常領域、βガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が含まれる。
本発明によって意図される改変タンパク質のその他の例には、多型バリアント、種間相同体、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされるものが含まれる。
【００３６】
また本発明の文脈において、遺伝子とは、該ポリペプチドのそのような機能的同等物をコードするポリヌクレオチドを包含する。該タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するために、ハイブリダイゼーションに加えて、上記の配列情報に基づいて合成されたプライマーを用いる、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することができる。それぞれヒト遺伝子およびタンパク質と機能的に同等であるポリヌクレオチドおよびポリペプチドは通常、元のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して高い相同性を有する。「高い相同性」とは典型的に、４０％またはそれ以上、好ましくは６０％またはそれ以上、より好ましくは８０％またはそれ以上、さらにより好ましくは９０％〜９５％またはそれ以上の相同性を指す。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」におけるアルゴリズムに従うことによって決定することができる。
【００３７】
二本鎖分子：
本明細書で用いる場合、「単離された二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指し、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；例えば、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ；例えば、ＤＮＡとＲＮＡの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む。本明細書において、「二本鎖分子」は、「二本鎖核酸」、「二本鎖核酸分子」、「二本鎖ポリヌクレオチド」、「二本鎖ポリヌクレオチド分子」、「二本鎖オリゴヌクレオチド」、および「二本鎖オリゴヌクレオチド分子」とも称される。
【００３８】
本明細書で用いられる「標的配列」という用語は、標的遺伝子を発現する細胞に該配列を包含する二本鎖核酸分子が導入された場合に、該遺伝子のｍＲＮＡ全体の翻訳の抑制をもたらす、標的遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド配列を指す。標的配列に相当する配列を含む二本鎖分子が、標的遺伝子を発現している細胞において該遺伝子の発現を阻害する場合に、該遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド配列は標的配列であると判定され得る。標的配列がｃＤＮＡ配列によって示される場合、標的配列を規定するために、二本鎖ｃＤＮＡのセンス鎖配列、すなわちｍＲＮＡ配列がＤＮＡ配列に変換された配列が用いられる。二本鎖分子は、標的配列に相当する配列を有するセンス鎖、および該標的配列に対する相補配列を有するアンチセンス鎖からなり、アンチセンス鎖はセンス鎖と相補配列においてハイブリダイズし、二本鎖分子を形成する。本明細書において、「〜に相当する」という語句は、標的配列を、二本鎖分子のセンス鎖を構成するヌクレオチドの種類に応じて、変換することを意味する。例えば、標的配列がＤＮＡ配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖がＲＮＡ領域を有する場合には、該ＲＮＡ領域内の塩基「ｔ」は塩基「ｕ」に置き換えられる。一方、標的配列がＲＮＡ配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖がＤＮＡ領域を有する場合には、該ＤＮＡ領域内の塩基「ｕ」は塩基「ｔ」に置き換えられる。例えば、標的配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、または３２に示されるＲＮＡ配列であり、二本鎖分子のセンス鎖の３'側半分の領域がＤＮＡで構成される場合、「標的配列に相当する配列」は
「５'−ＧＡＧＵＵＣＵＧＣＧＡＧＴＧＴＴＡＣＡ−３'」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９の場合）、
「５'−ＧＡＡＡＵＵＡＵＵＣＡＡＡＧＡＡＣＡＴ−３'」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０の場合）、
「５'−ＧＧＡＵＣＵＧＡＧＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴ−３'」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１の場合）、または
「５'−ＧＣＡＵＡＧＣＵＣＵＧＡＣＣＣＴＧＧＡ−３'」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の場合）
である。
【００３９】
同様に、二本鎖分子のアンチセンス鎖に関して、標的配列に対する相補配列は、アンチセンス鎖を構成するヌクレオチドの種類に応じて規定され得る。例えば、標的配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、または３２に示されるＲＮＡ配列であり、二本鎖分子のアンチセンス鎖の５'側領域がＤＮＡで構成される場合には、「標的配列に対する相補配列」は
「５'−ＴＧＴＡＡＣＡＣＵＣＧＣＡＧＡＡＣＵＣ−３'」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９の場合）、
「５'−ＡＴＧＴＴＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＵＵＵＣ−３'」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０の場合）、
「５'−ＡＧＧＧＴＣＡＧＧＧＣＵＣＡＧＡＵＣＣ−３'」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１の場合）、または
「５'−ＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣ−３'」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の場合）
である。
【００４０】
一方、例えば、二本鎖分子がＲＮＡで構成される場合には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、または３２に示される標的配列に相当する配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、または３２に示されるリボヌクレオチド配列であり、該標的配列に対する相補配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、または３２に示されるリボヌクレオチド配列である。
二本鎖分子は、標的配列に相当する配列およびそれに対する相補配列に加えて、２〜５ヌクレオチド長を有する１つもしくは２つの３'オーバーハング（例えば、ｕｕ）、および／または、センス鎖とアンチセンス鎖とを連結してヘアピン構造を形成するループ配列を有してよい。
【００４１】
本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ＲＮＡが転写される鋳型をＤＮＡとした技術を含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的な技術を用いる。ｓｉＲＮＡには、標的遺伝子のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）の一部、標的遺伝子のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）の一部、またはその両方が含まれる（ヌクレオチド「ｔ」はｓｉＲＮＡにおいて「ｕ」と置き換えられる）。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＲＮＡを構築してもよい。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのいずれかであり得る。
【００４２】
本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、互いに対する相補配列で構成された、２つのＲＮＡ分子の構築物を指す。２本の鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列も含んでよい。
【００４３】
本明細書で使用される「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに対して相補的である第１の領域および第２の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステムループ構造を有するｓｉＲＮＡを指す。領域の相補性および指向性の程度は、塩基対形成が領域間で起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結され、かつ該ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によってループが生じる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【００４４】
本明細書で使用される「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡとＤＮＡの両方からなる二本鎖ポリヌクレオチド分子を指し、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する。本明細書中で、ハイブリッドとは、ＤＮＡからなるポリヌクレオチドとＲＮＡからなるポリヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示し、一方キメラとは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡを含有できるものを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡには、標的遺伝子のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）の一部、標的遺伝子のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）の一部、またはその両方が含まれる（ヌクレオチド「ｔ」はＲＮＡにおいて「ｕ」と置き換えられる）。単一転写産物が、標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的アンチセンス核酸配列の両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを構築することができる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれかであり得る。
【００４５】
本明細書で使用される「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、互いに対する相補配列からなる、２つの分子の構築物を指す。２本の鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡの両方からなる（キメラ分子）か、あるいは代替的に、分子の一方がＲＮＡからなり、もう一方がＤＮＡからなる（ハイブリッド二本鎖）。
【００４６】
本明細書で使用される「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに対して相補的である第１の領域および第２の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステムループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを指す。領域の相補性および指向性の程度は、領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結し、かつ該ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によってループが生じる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【００４７】
１つの態様において、本発明は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２に対する二本鎖分子を提供し、そのアンチセンス鎖は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２  ｍＲＮＡにハイブリダイズし、該遺伝子の通常一本鎖であるｍＲＮＡ転写物と結合することによりＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２  ｍＲＮＡの分解を誘導し、それによってタンパク質の翻訳を妨げ、したがって該タンパク質の発現を阻害する。本明細書において実証されるように、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を過剰発現するがん細胞株におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対するｄｓＲＮＡによって阻害され、その結果、該がん細胞株の増殖は抑制される（図４Aおよび４B）。したがって本発明は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現する細胞に導入された場合に該遺伝子の発現および細胞増殖を阻害し得る、単離された二本鎖分子を提供する。本発明の二本鎖分子は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の過剰発現に関連するがん細胞増殖を阻害するために有用であり、したがってこれは、がんを治療するための新規方法を提供し得る。例えば、本発明の二本鎖分子は、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のいずれかまたは両方を過剰発現する、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌（例えばＳＣＬＣまたはＮＳＣＬＣ）、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病、食道癌、および胃癌などのがんを治療するために適している。
【００４８】
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子の標的配列には、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択されるヌクレオチド配列が含まれる。
ＳＵＶ４２０Ｈ１に対する標的配列には、例えば
５'−ＧＡＧＵＵＣＵＧＣＧＡＧＵＧＵＵＡＣＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）または
５'−ＧＡＡＡＵＵＡＵＵＣＡＡＡＧＡＡＣＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）
が含まれる。
同様に、ＳＵＶ４２０Ｈ２に対する標的配列には、例えば
５'−ＧＧＡＵＣＵＧＡＧＣＣＣＵＧＡＣＣＣＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）または
５'−ＧＣＡＵＡＧＣＵＣＵＧＡＣＣＣＵＧＧＡ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）
が含まれる。
【００４９】
具体的には、本発明は以下の［１］〜［１８］記載の二本鎖分子を提供する：
［１］ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のいずれかまたは両方を発現する細胞に導入された場合にＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子であって、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該センス鎖が、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子配列の一部に相当するヌクレオチド配列を含む、単離された二本鎖分子；
［２］ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列と一致するＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡに対して作用する、［１］記載の二本鎖分子；
［３］センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む、［１］または［２］記載の二本鎖分子；
［４］センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約１００ヌクレオチド対の長さ未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１］〜［３］のいずれか１項記載の二本鎖分子；
［５］センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約７５ヌクレオチド対の長さ未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１］〜［４］記載のいずれか１項記載の二本鎖分子；
［６］センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約５０ヌクレオチド対の長さ未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［５］記載の二本鎖分子；
［７］センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約２５ヌクレオチド対の長さ未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［６］記載の二本鎖分子；
［８］センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約１９〜約２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、［７］記載の二本鎖分子；
［９］介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一ポリヌクレオチドで構成される、［１］〜［８］のいずれか１項記載の二本鎖分子；
［１０］一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
を有し、［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドで構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ'］は、［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［９］記載の二本鎖分子；
［１１］ＲＮＡで構成される、［１］〜［１０］のいずれか１項記載の二本鎖分子；
［１２］ＤＮＡおよびＲＮＡの両方で構成される、［１］〜［１０］のいずれか１項記載の二本鎖分子；
［１３］ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１２］記載の二本鎖分子；
［１４］センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡで構成される、［１３］記載の二本鎖分子；
［１５］ＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１２］記載の二本鎖分子；
［１６］アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、または、センス鎖の５'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域の両方がＲＮＡである、［１５］記載の二本鎖分子；
［１７］隣接領域が９〜１３ヌクレオチドで構成される、［１６］記載の二本鎖分子；ならびに
［１８］１つまたは２つの３'オーバーハングを含む、［１］〜［１７］のいずれか１項記載の二本鎖分子。
【００５０】
本発明の二本鎖分子について、以下でより詳細に説明する。
細胞における標的遺伝子発現の阻害能を有する二本鎖分子を設計するための方法は公知である。（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第６，５０６，５５９号を参照されたい。）例えば、ｓｉＲＮＡを設計するためのコンピュータプログラムは、Ａｍｂｉｏｎのウェブサイト（www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）から利用可能である。
コンピュータプログラムは、以下のプロトコールに基づいて、二本鎖分子のための標的ヌクレオチド配列を選択する。
【００５１】
標的部位の選択：
１．転写物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、個々のＡＡおよび３'側に隣接する１９ヌクレオチドの出現を記録する。Ｔｕｓｃｈｌらは、５'および３'非翻訳領域（ＵＴＲ）ならびに開始コドン近傍（７５塩基以内）の領域は、調節タンパク質結合部位がより多い可能性があること、ならびにＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体がｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げ得ることから、これらに対するｓｉＲＮＡの設計を避けることを推奨した。
２．潜在的な標的部位を適切なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）と比較し、他のコード配列と有意な相同性を有する全ての標的配列を検討から外す。基本的には、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/におけるＮＣＢＩサーバー上で得られるＢＬＡＳＴを使用する（Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25(17):3389-402）。
３．合成に適格である標的配列を選択する。遺伝子の長さに沿っていくつかの標的配列を選択して評価することが一般的である。
【００５２】
また、ｓｉＲＮＡを設計するために開発された任意のその他のアルゴリズムも、本発明の二本鎖分子の標的配列を設計するために使用されうる。
本発明において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２に示されるヌクレオチド配列が、本発明の二本鎖分子の標的配列として適していることが実証された。
上記の標的配列を標的とする二本鎖分子をそれぞれ調べ、これらがＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力を包含することを確認した。したがって本発明の１つの態様は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子についてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を標的とする二本鎖分子を提供する。
本発明の二本鎖分子は、単一の標的ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子配列に指向してもよく、または複数の標的ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子配列に指向してもよい。
【００５３】
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を標的とする本発明の二本鎖分子には、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子配列より選択される標的配列および／または該標的配列に対する相補配列のいずれかを含む、単離されたポリヌクレオチドが含まれる。ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２に相当する配列および／またはこれらのヌクレオチド配列に対する相補配列を含むものが含まれる。
【００５４】
１つの態様において、二本鎖分子は２つのポリヌクレオチドからなり、一方のポリヌクレオチドは標的配列に相当する配列、すなわちセンス鎖を有し、もう一方のポリヌクレオチドは該標的配列に対する相補配列、すなわちアンチセンス鎖を有する。センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。そのような二本鎖分子の例には、ｄｓＲＮＡおよびｄｓＤ／Ｒ−ＮＡが含まれる。別の態様において、二本鎖分子は、標的配列に相当する配列、すなわちセンス鎖と、該標的配列に対する相補配列、すなわちアンチセンス鎖の両方を有するポリヌクレオチドからなる。一般的に、センス鎖とアンチセンス鎖は介在鎖によって連結され、互いにハイブリダイズしてヘアピンループ構造を形成する。そのような二本鎖分子の例には、ｓｈＲＮＡおよびｓｈＤ／Ｒ−ＮＡが含まれる。いくつかの態様において、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を標的とする二本鎖分子は、標的配列としてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される配列を有してもよい。したがって、本発明の二本鎖分子の例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、または３２に相当する配列およびそれに対する相補配列において互いにハイブリダイズするポリヌクレオチド、ならびに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、または３２に相当する配列およびそれに対する相補配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【００５５】
言い換えれば、本発明の二本鎖分子は、標的配列のヌクレオチド配列を有するセンス鎖ポリヌクレオチド、および該標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを含み、両ポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。該ポリヌクレオチドを含む二本鎖分子において、鎖の一方または両方のポリヌクレオチドの一部がＲＮＡであってもよく、標的配列がＤＮＡ配列で規定される場合には、該標的配列およびそれに対する相補配列内のヌクレオチド「ｔ」は「ｕ」に置き換えられる。あるいは、該鎖の一方または両方のポリヌクレオチドの一部がＤＮＡであってもよく、標的配列がＲＮＡ配列で規定される場合には、該標的配列およびそれに対する相補配列内のヌクレオチド「ｕ」は「ｔ」に置き換えられる。
【００５６】
本発明の１つの態様において、本発明のそのような二本鎖分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖からなるステムループ構造を含む。センス鎖とアンチセンス鎖は、ループによって結合され得る。したがって本発明はまた、介在一本鎖によって連結されたかまたは介在一本鎖が隣接しているセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドを含む二本鎖分子も提供する。
【００５７】
しかしながら、本発明はこれらの例に限定されず、改変分子がＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現を抑制する能力を保持している限り、上記の核酸配列における軽微な改変は許容される。本明細書において、核酸配列に関連して用いられる語句「軽微な改変」とは、該配列に対する１個、２個、または数個のヌクレオチドの置換、欠失、付加、または挿入を示す。本発明の文脈において、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、および／または挿入に適用される場合の用語「数個」とは、３〜７個、３〜５個、３もしくは４個、または３個の核酸残基を意味し得る。
【００５８】
本発明に従って、実施例において利用される方法を用いて、本発明の二本鎖分子を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子発現を阻害するその能力について試験することができる。本明細書で後述される実施例では、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡのいくつかの部分のセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖で構成される二本鎖分子を、標準的な方法に従って、様々ながん細胞株（例えば、ＳＷ７８０、ＲＴ４、Ａ５４９、ＬＣ３１９、およびＳＢＣ−５を用いて）におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子産物の産生を低減させるそれらの能力についてインビトロで試験した。例えば、オリゴヌクレオチドも対照ｓｉＲＮＡ（例えばＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡ）もトランスフェクトしていない細胞と比較した、候補二本鎖分子をトランスフェクトした細胞における、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子産物の減少を、例えば、実施例：「定量的リアルタイムＰＣＲ」で提供されるプライマーなどのＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２のｍＲＮＡに対するプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって、検出することができる。続いて、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいてＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子産物の産生を低減させる候補標的配列を、細胞増殖に対するその阻害効果について試験することができる。続いて、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２産物の産生の低減およびがん細胞増殖の低減を確認するために、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいて細胞増殖を阻害する標的配列を、がんを有する動物、例えばヌードマウス異種移植モデルを用いてこれらのインビボでの能力について試験してもよい。
【００５９】
二本鎖分子に含まれるポリヌクレオチドがＲＮＡまたはその誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「ｔ」は「ｕ」に置き換えるものとする。したがって、本明細書で使用される「標的配列に相当する配列」という語句は、該標的配列の塩基「ｔ」が、ＲＮＡまたはその誘導体において「ｕ」に置き換えられたヌクレオチド配列、あるいは、該標的配列の塩基「ｕ」が、ＤＮＡまたはその誘導体において「ｔ」に置き換えられたヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド単位間のワトソンクリック型またはフーグスティーン型の塩基対形成を指し、「結合」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的なまたは化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチドおよび／または非リン酸化ジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドもまた同じ様式で互いに結合できる。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件下でハイブリダイズして、ほとんどまたは全くミスマッチを含まない安定な二重鎖を形成する。さらに、本発明の単離された二本鎖分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖のハイブリダイゼーションによって二本鎖分子またはヘアピンループ構造を形成することができる。１つの態様において、このような二本鎖分子は１０個のマッチあたりわずか１個のミスマッチしか含有しない。別の態様において、二重鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二本鎖分子はミスマッチを含有しない。
【００６０】
ポリヌクレオチドは、ＳＵＶ４２０Ｈ１に関して、４５６２または２７１１ヌクレオチド長未満であってよく、ＳＵＶ４２０Ｈ２に関して、２３１８ヌクレオチド長未満であってよい。例えば該ポリヌクレオチドは、５００ヌクレオチド長未満、２００ヌクレオチド長未満、１００ヌクレオチド長未満、７５ヌクレオチド長未満、５０ヌクレオチド長未満、または２５ヌクレオチド長未満であってよい。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子を形成するため、または、二本鎖分子をコードする鋳型ＤＮＡを調製するために有用である。二本鎖分子を形成するためにポリヌクレオチドを使用する場合、該ポリヌクレオチドは１９ヌクレオチドより長くてよく、２１ヌクレオチドより長くてよく、または約１９〜２５ヌクレオチド長を有してよい。したがって本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を提供し、該センス鎖は、標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、センス鎖は標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する。
【００６１】
二本鎖分子は、該二本鎖分子を細胞に導入した場合にＲＩＳＣ複合体のｍＲＮＡにおける相同配列を同定するためのガイドとして役立つ。同定された標的ＲＮＡはダイサーのヌクレアーゼ活性によって切断および分解され、これにより該二本鎖分子は最終的に、該ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの産生（発現）を低下させるかまたは阻害する。したがって、本発明の二本鎖分子は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする一本鎖を生成できる能力によって定義することができる。本明細書において、二本鎖分子から生成された一本鎖とハイブリダイズするｍＲＮＡの部分は「標的配列」または「標的核酸」または「標的ヌクレオチド」と称される。本発明において、「標的配列」のヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡのＲＮＡ配列を用いてだけでなく、該ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡまたは１つもしくは複数のエクソンのゲノム配列のＤＮＡ配列を用いても示すことができる。
【００６２】
本発明の二本鎖分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／または非リン酸化ジエステル結合を含有してもよい。当技術分野において周知である化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性および／または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に組み込まれ得る他の種類の化学修飾も認識するであろう（ＷＯ０３／０７０７４４、ＷＯ２００５／０４５０３７）。１つの態様では、分解耐性の向上または取り込みの改善を与えるために、修飾を用いてもよい。このような修飾の例には、ホスホロチオエート結合、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上で）、２'−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２'−デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）」ヌクレオチド、５'−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆デオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ）の組み込み（ＵＳ２００６０１２２１３７）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００６３】
別の態様において、二本鎖分子の安定性を向上させるために、または標的効率を増大させるために修飾を用いることができる。そのような修飾の例には、二本鎖分子の相補鎖２つの間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の３'末端または５'末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチドおよび２'−デオキシリボヌクレオチドが含まれる（ＷＯ２００４／０２９２１２）が、これらに限定されるわけではない。別の態様において、標的ｍＲＮＡにおけるおよび／または相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性を増減するために修飾を用いることができる（ＷＯ２００５／０４４９７６）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、または５−プロピニルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−デアザプリン、７−アルキルプリン、または７−アルケニルプリンに置換することができる。別の態様において、該二本鎖分子が３'オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３'末端ヌクレオチド突出ヌクレオチドを、デオキシリボヌクレオチドで置換することができる（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15（2）: 188-200）。さらなる詳細については、ＵＳ２００６０２３４９７０などの公開された文書が利用可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持している限り、任意の既知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に対して利用することができる。
【００６４】
さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る（例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、安定性の増大を示す。ＤＮＡとＲＮＡとの混合、即ちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）からなるハイブリッド型二本鎖分子、複数の一本鎖（ポリヌクレオチド）の一方または両方にＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成してもよい。
【００６５】
ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現する細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害できる限り、センス鎖がＤＮＡでありアンチセンス鎖がＲＮＡであるか、またはその反対でありうる。一部の態様において、センス鎖のポリヌクレオチドはＤＮＡであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドはＲＮＡである。また、キメラ型二本鎖分子は、遺伝子を発現する細胞に導入された場合に標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖とアンチセンス鎖の両方がＤＮＡおよびＲＮＡからなるか、またはセンス鎖とアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡおよびＲＮＡからなり得る。二本鎖分子の安定性を向上させるために、該分子は可能な限り多くのＤＮＡを含有し得るが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、発現の十分な阻害を誘導する範囲内で該分子がＲＮＡを含むことが必要であり得る。
【００６６】
キメラ型二本鎖分子の一例として、二本鎖分子の上流部分領域（即ちセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補配列に隣接する領域）はＲＮＡである。いくつかの態様において、上流部分領域とは、センス鎖の５'側（５'末端）およびアンチセンス鎖の３'側（３'末端）を示す。あるいは、センス鎖の５'末端および／またはアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域を、上流部分領域と称する。即ち、いくつかの態様では、アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、または、センス鎖の５'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡからなる。例えば、本発明のキメラまたはハイブリッド型二本鎖分子は以下の組み合わせを含み得る。
センス鎖：
５'−［−−−−−ＤＮＡ−−−−−］−３'
３'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５'：
アンチセンス鎖、
センス鎖：
５'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３'
３'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５'：
アンチセンス鎖、および
センス鎖：
５'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３'
３'−（−−−−−ＲＮＡ−−−−−）−５'：
アンチセンス鎖。
【００６７】
上流部分領域は、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内で、標的配列またはこれに対する相補配列の末端から数えて９〜１３ヌクレオチドからなるドメインであり得る。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子の例には、二本鎖分子の少なくとも上流半分の領域（センス鎖では５'側領域およびアンチセンス鎖では３'側領域）がＲＮＡでありかつもう半分がＤＮＡである、１９〜２１ヌクレオチド鎖長を有するものが含まれる。そのようなキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合、標的遺伝子の発現を阻害する効果はかなり高い（ＵＳ２００５０００４０６４）。
【００６８】
本発明において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えばショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびＤＮＡとＲＮＡからなるショートヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成してもよい。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる緊密なヘアピンターンを作製する、ＲＮＡの配列またはＲＮＡとＤＮＡの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、標的配列に相当する配列を含むセンス鎖と該標的配列に相当する相補配列を含むアンチセンスとを一本鎖上に含み、これらの配列はループ配列によって分かれている。一般的に、ヘアピン構造は細胞機序によって切断されてｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡとなり、その後、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に一致するｍＲＮＡと結合し、これを切断する。
【００６９】
ヘアピンループ構造を形成するために、任意のヌクレオチド配列で構成されるループ配列を、センス配列とアンチセンス配列との間に配置することができる。したがって、本発明は、一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
を有する二本鎖分子も提供し、ここで［Ａ］は標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である。標的配列は、例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ１の場合はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９および３０、ならびにＳＵＶ４２０Ｈ２の場合はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１および３２のヌクレオチド配列の中より選択され得る。
【００７０】
本発明はこれらの例には限定されず、［Ａ］における標的配列は、標的ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現を抑制する能力を該二本鎖分子が保持する限り、これらの例に由来する改変配列であり得る。領域［Ａ］は領域［Ａ'］とハイブリダイズし、領域［Ｂ］からなるループを形成する。介在一本鎖部分［Ｂ］、即ちループ配列は、３〜２３ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列の中より選択することができる（www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html）。さらに、２３個のヌクレオチドからなるループ配列は活性ｓｉＲＮＡも提供する（Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435-8, Epub 2002 Jun 26）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435- 8, Epub 2002 Jun 26；
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100（4）: 1639-44, Epub 2003 Feb 10；または
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4（6）: 457-67。
【００７１】
ヘアピンループ構造を有する本発明の例示的な二本鎖分子を以下に示す。以下の構造では、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣおよびＵＵＣＡＡＧＡＧＡの中より選択することができるが、本発明はこれらに限定されない：
ＧＡＧＵＵＣＵＧＣＧＡＧＵＧＵＵＡＣＡ−［Ｂ］−ＵＧＵＡＡＣＡＣＵＣＧＣＡＧＡＡＣＵＣ（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９の場合）；
ＧＡＡＡＵＵＡＵＵＣＡＡＡＧＡＡＣＡＵ−［Ｂ］−ＡＵＧＵＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＵＵＵＣ（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０の場合）。
ＧＧＡＵＣＵＧＡＧＣＣＣＵＧＡＣＣＣＵ−［Ｂ］−ＡＧＧＧＵＣＡＧＧＧＣＵＣＡＧＡＵＣＣ（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１の場合）。
ＧＣＡＵＡＧＣＵＣＵＧＡＣＣＣＵＧＧＡ−［Ｂ］−ＵＣＣＡＧＧＧＵＣＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣ（標的配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の場合）。
【００７２】
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、数個のヌクレオチドを３'オーバーハングとして標的配列のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端に付加することができる。３'オーバーハングにあるヌクレオチドの例には、「ｔ」および「ｕ」が含まれるが、これらに限定されるわけではない。付加されるヌクレオチドの数は少なくとも１もしくは２個、一般に２〜１０個、または２〜５個であり得る。付加されるヌクレオチドは二本鎖分子のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端で一本鎖を形成する。二本鎖分子がヘアピンループ構造を形成するための単一ポリヌクレオチドからなる場合、該単一ポリヌクレオチドの３'末端に３'オーバーハング配列を付加してもよい。
【００７３】
二本鎖分子を調製するための方法は特に限定されず、当技術分野で既知の化学合成法を含む。化学合成法に従って、一本鎖のセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。アニーリングに関する具体例には、合成した一本鎖ポリヌクレオチドを少なくとも約３：７のモル比で、約４：６のモル比で、または実質的に等モル量として（即ち約５：５のモル比で）混合することが含まれる。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリングした二本鎖ポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の一般的に利用される方法によって精製することができる。精製法の例には、アガロースゲル電気泳動を利用する方法が含まれる。残存する一本鎖ポリヌクレオチドを任意で、例えば適当な酵素を用いる分解によって取り除いてもよい。
【００７４】
あるいは、二本鎖分子のコード配列を、適切な細胞内での該二本鎖分子の発現を支持する調節配列（例えば、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ転写ユニットまたはヒトＨ１  ＲＮＡプロモーター）を該コード配列に隣接して含むベクター内にクローニングすることによって、その発現を独立して、あるいは時間的または空間的な様式で調整することができるように、該二本鎖分子を細胞内で転写してもよい。二本鎖分子のコード配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよい。二本鎖分子を産生することができるベクターについての詳細を以下に述べる。
【００７５】
本発明の二本鎖分子を含むベクター：
本明細書に記載の１つまたは複数の二本鎖分子を含むベクター、およびそのようなベクターを含有する細胞も、本発明に包含される。
具体的には、本発明は以下の［１］〜［１１］記載のベクターを提供する。
［１］ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のいずれかまたは両方を発現する細胞に導入された場合にＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する二本鎖分子をコードするベクターであって、そのような分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖で構成される、ベクター。
［２］二本鎖分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列と一致する、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２のｍＲＮＡに作用する、［１］記載のベクター；
［３］センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む、［１］または［２］記載のベクター；
［４］二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約１００ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１］〜［３］のいずれか１項記載のベクター；
［５］二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約７５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［４］記載のベクター；
［６］二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約５０ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［５］記載のベクター；
［７］二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約２５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［６］記載のベクター；
［８］二本鎖分子をコードするベクターであって、該二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズし、約１９〜約２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、［７］記載のベクター；
［９］二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一ポリヌクレオチドで構成される、［１］〜［８］のいずれか１項記載のベクター；
［１０］一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
を有する二本鎖分子をコードするベクターであって、［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドで構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ'］は、［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［９］記載のベクター；ならびに
［１１］二本鎖分子が、１つまたは２つの３'オーバーハングを含む、［１］〜［１０］のいずれか１項記載のベクター。
【００７６】
本発明のベクターは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードしてもよい。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入されると、ベクターが該分子を発現することを示す。１つの態様において、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節エレメントを含む。したがって、発現ベクターは、本発明の二本鎖分子の核酸配列をコードしてもよく、かつ該二本鎖分子の発現に適合していてもよい。本発明のそのようなベクターは、本発明の二本鎖分子を産生させるために用いることができ、またはがんを治療するための有効成分として直接用いることができる。
【００７７】
本発明のベクターは、例えば、二本鎖分子をコードする配列を、調節配列が（ＤＮＡ分子の転写によって）両方の鎖の発現を可能にする様式で該二本鎖分子の該コード配列に機能的に連結されるように発現ベクターにクローニングすることによって、作製することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5）。例えば、ｍＲＮＡに対するアンチセンス鎖であるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えばクローニングされるＤＮＡの３'末端に隣接するプロモーター配列）によって転写され、該ｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えば該クローニングされるＤＮＡの５'末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。転写後、センス鎖とアンチセンス鎖が互いにインビボでハイブリダイズして、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生成する。代替的に、二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする２つのベクター構築物を利用してセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ発現させ、次に二本鎖分子を形成させてもよい。さらに、クローニングした配列は、二次構造（例えばヘアピン）を有する構築物、即ち標的遺伝子のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を含有するベクターの単一転写産物をコードしてもよい。
【００７８】
本発明は、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのいずれかまたは両方を含むベクターを意図し、該アンチセンス鎖は該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ、該ベクターは、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、該遺伝子の発現を阻害する。
【００７９】
本発明のベクターはまた、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するように包含されてもよい（例えば相同的組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR &amp; Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号、同第５，８０４，５６６号、同第５，７３９，１１８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，６７９，６４７号、およびＷＯ９８／０４７２０を参照されたい。ＤＮＡベースの送達技術の例には、「ネイキッドＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン、ポリマー、ペプチドに仲介される）送達、カチオン性脂質複合体、および、粒子仲介性（「遺伝子銃」）または圧力仲介性の送達が含まれる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
【００８０】
本発明のベクターには、例えばウイルス性または細菌性のベクターが含まれる。発現ベクターの例には、牛痘ウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる（例えば米国特許第４，７２２，８４８号を参照されたい）。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしての、牛痘ウイルスの使用を伴う。標的遺伝子を発現する細胞に導入されると、組換え牛痘ウイルスが二本鎖分子を発現し、それにより該細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例にはカルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette Guerin；ＢＣＧ）ベクターが含まれる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載される。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与および生成に有用であり；例には、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクター等が含まれる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【００８１】
二本鎖分子を用いて、がん細胞増殖を阻害しかつがんを治療する方法：
本発明は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現の阻害を介してＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の機能不全を誘導することにより、がん細胞増殖、例えば、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌の細胞増殖を阻害するための方法を提供する。ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子発現は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を特異的に標的とする本発明の前述の二本鎖分子のいずれかによって、または該二本鎖分子のいずれかを発現し得る本発明のベクターによって、阻害され得る。
【００８２】
本発明の二本鎖分子およびベクターががん性細胞の細胞増殖を阻害する能力は、これらが、がんを治療するための方法、ならびに、その術後再発、二次再発、または転移再発を治療または予防するための方法において使用可能であることを示すものである。したがって本発明は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子または該分子を発現するベクターを投与することにより、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の過剰発現に関連するがん、例えば、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、または胃癌を有する患者を治療するための方法を提供する。正常な器官では該遺伝子がほとんど発現しないことから、本発明の治療法は、副作用を引き起こすことなく実施され得る。
【００８３】
具体的には、本発明は以下の［１］〜［４０］記載の方法を提供する：
［１］ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターの薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、対象におけるがんの治療および予防のいずれかもしくは両方またはがん細胞増殖の阻害の方法であって、該二本鎖分子が、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のいずれかまたは両方を発現する細胞に導入された場合にＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現および細胞増殖を阻害し、該分子が、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、方法；
［２］二本鎖分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡに作用する、［１］記載の方法；
［３］センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む、［１］または［２］記載の方法；
［４］がんが、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌からなる群より選択される、［１］〜［３］のいずれか１項記載の方法；
［５］ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子に対する二本鎖分子を対象に投与する場合に、がんが、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、および軟部組織腫瘍からなる群より選択される、［４］記載の方法；
［６］ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子を対象に投与する場合に、がんが、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、および肺癌からなる群より選択される、［４］記載の方法；
［７］ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子に対する二本鎖分子を対象に投与する場合に、肺癌が小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）である、［５］記載の方法；
［８］複数種類の二本鎖分子が投与される、［１］〜［７］のいずれか１項記載の方法；
［９］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約１００ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１］〜［３］のいずれか１項記載の方法；
［１０］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約７５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［９］記載の方法；
［１１］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約５０ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１０］記載の方法；
［１２］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約２５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１１］記載の方法；
［１３］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約１９〜約２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１２］記載の方法；
［１４］二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドで構成される、［１］〜［１３］のいずれか１項記載の方法；
［１５］二本鎖分子が、一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
を有し、［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドで構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ'］は、［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［１４］記載の方法；
［１６］二本鎖分子がＲＮＡである、［１］〜［１５］のいずれか１項記載の方法；
［１７］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む、［１］〜［１５］のいずれか１項記載の方法；
［１８］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１７］記載の方法；
［１９］センス鎖およびアンチセンス鎖のポリヌクレオチドがそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡで構成される、［１８］記載の方法；
［２０］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１７］記載の方法；
［２１］アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、または、センス鎖の５'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域の両方がＲＮＡで構成される、［２０］記載の方法；
［２２］隣接領域が９〜１３ヌクレオチドで構成される、［２１］記載の方法；
［２３］二本鎖分子が１つまたは２つの３'オーバーハングを含む、［１］〜［２２］のいずれか１項記載の方法；
［２４］二本鎖分子が、該分子に加えて、トランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む組成物中に含まれる、［１］〜［２３］のいずれか１項記載の方法。
［２５］二本鎖分子がベクターによってコードされる、［１］記載の方法；
［２６］ベクターによってコードされる二本鎖分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡに作用する、［２５］記載の方法。
［２７］ベクターによってコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［２５］または［２６］記載の方法。
［２８］がんが、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌からなる群より選択される、［２５］〜［２７］のいずれか１項記載の方法；
［２９］ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子に対する二本鎖分子をコードするベクターを対象に投与する場合に、がんが、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、および軟部組織腫瘍からなる群より選択される、［２８］記載の方法；
［３０］ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子をコードするベクターを対象に投与する場合に、がんが、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、および肺癌からなる群より選択される、［２８］記載の方法；
［３１］ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子に対する二本鎖分子をコードするベクターを対象に投与する場合に、肺癌がＳＣＬＣである、［２９］記載の方法；
［３２］複数種類の二本鎖分子が投与される、［２５］〜［３１］のいずれか１項記載の方法；
［３３］ベクターによってコードされる二本鎖分子のセンス鎖が約１００ヌクレオチド対の長さ未満の長さを有する、［２５］〜［３２］のいずれか１つの方法；
［３４］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約７５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［３３］記載の方法；
［３５］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約５０ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［３４］記載の方法；
［３６］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約２５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［３５］記載の方法；
［３７］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約１９〜約２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、［３６］記載の方法；
［３８］ベクターによってコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドで構成される、［２５］〜［３７］のいずれか１項記載の方法；
［３９］ベクターによってコードされる二本鎖分子が、一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
を有し、［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドで構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ'］は、［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［３８］記載の方法；ならびに
［４０］ベクターによってコードされる二本鎖分子が、該分子に加えてトランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む組成物中に含まれる、［２５］〜［３９］のいずれか１項記載の方法。
【００８４】
本発明の方法を以下により詳細に説明する。
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現する細胞の増殖は、該細胞をＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子、該分子を発現するベクター、またはこれを含む組成物と接触させることによって阻害することができる。該細胞をさらにトランスフェクション剤と接触させてもよい。適切なトランスフェクション剤は、当技術分野において公知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、細胞が、該分子に曝露されていない細胞と比較してより低い速度で増殖するかまたは低下した生存率を有することを示す。細胞増殖は、当技術分野において公知の方法によって、例えばＭＴＴ細胞増殖アッセイ法を用いて測定することができる。
【００８５】
本発明の二本鎖分子の標的遺伝子を発現または過剰発現する限り、いかなる種類のがん細胞の増殖も、本発明の方法に従って抑制され得る。例示的ながん細胞には、膀胱癌細胞、子宮頸癌細胞、骨肉腫細胞、肺癌細胞、軟部組織腫瘍細胞、乳癌細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、食道癌細胞、および胃癌細胞が含まれる。例えば、膀胱癌細胞、子宮頸癌細胞、骨肉腫細胞、肺癌細胞（特にＳＣＬＣ細胞）、または軟部組織腫瘍細胞の増殖を阻害するために、ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子に対する二本鎖分子またはそれをコードするベクターが使用され得る。例えば、膀胱癌細胞、乳癌細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、食道癌細胞、胃癌細胞、または肺癌細胞の増殖を阻害するために、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子またはそれをコードするベクターが使用され得る。肺癌は、ＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣであり得る。さらに、ＮＳＣＬＣは腺癌、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、および大細胞癌を含む。
【００８６】
したがって、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２に関連する疾患に罹患しているかまたはその発症リスクを有する患者（対象）を、本発明の二本鎖分子の少なくとも１つ、該分子の少なくとも１つを発現する少なくとも１つのベクター、または該分子もしくは該ベクターの少なくとも１つを含む少なくとも１つの組成物を投与することによって、治療することができる。例えば、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、または胃癌を有する患者（対象）を、本発明の治療方法に従って治療することができる。典型的な態様において、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌（特にＳＣＬＣ）、または軟部組織腫瘍を有する患者に、ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子に対する二本鎖分子またはそれをコードするベクターが投与され得る。他の典型的な態様において、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、または肺癌を有する患者に、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子またはそれをコードするベクターが投与され得る。がんの種類は、診断される特定の種類の腫瘍に従って、標準的な方法によって同定することができる。膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、または胃癌は、例えば、肺癌マーカーとしての癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＹＦＲＡ、およびｐｒｏ−ＧＲＰ、ならびに膀胱癌マーカーとしてのTPA等の公知の腫瘍マーカーを用いて、または、胸部Ｘ線検査および／もしくは喀痰細胞診を用いて、診断され得る。いくつかの態様において、本発明の方法によって治療を受ける患者は、従来法、例えばＲＴ−ＰＣＲまたは免疫測定法により、患者（対象）由来の生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを検出することによって、選択される。いくつかの態様において、本発明の治療の前に、患者（対象）由来の生検標本を、当技術分野で公知の方法、例えば免疫組織化学的解析またはＲＴ−ＰＣＲにより、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の過剰発現について確認してもよい。
【００８７】
がん細胞増殖を阻害し、それによってがんを治療するための本発明の方法によれば、複数種類の二本鎖分子（または、これらを発現するベクターもしくはこれらを含有する組成物）を投与する場合、該分子はそれぞれ異なる構造を有しうるが、同一の標的配列と一致するｍＲＮＡに作用し得る。あるいは、複数種類の二本鎖分子は、同一遺伝子の異なる標的配列と一致するｍＲＮＡに作用し得、または、異なる遺伝子の異なる標的配列と一致するｍＲＮＡに作用し得る。例えば、本方法は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の１つ、２つ、またはそれ以上の標的配列に指向する二本鎖分子を利用することができる。あるいは、本方法は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子および他の遺伝子の標的配列に指向する二本鎖分子を利用することができる。
【００８８】
がん細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子を、該分子と対応するｍＲＮＡ転写物との結合を達成するための形態で、細胞に直接導入してもよい。あるいは、上記のように、二本鎖分子をコードするＤＮＡをベクターとして細胞に導入してもよい。二本鎖分子およびベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強剤、例えばＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｗａｋｏ  ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用してもよい。
【００８９】
治療により、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、蔓延、もしくは転移能の低下などの臨床的有効性がもたらされる場合に、該治療は「有効」とみなされる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、それががんの形成を遅延させるもしくは阻害すること、またはがんの臨床症状を予防もしくは緩和することを意味する。有効性は、特定の種類の腫瘍を診断または治療するための任意の公知の方法と共同して判定されてもよい。
【００９０】
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量でＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２  ｍＲＮＡを分解し得ることが理解される。いずれかの理論に束縛されるわけではないが、本発明の二本鎖分子は、触媒的な様式で標的ｍＲＮＡの分解を引き起こし得ると考えられる。したがって、標準的ながん治療に比べて、治療効果を発揮するためにがん部位またはその近くに送達されることが必要な二本鎖分子は、有意に少ない。
【００９１】
当業者は、対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状および他の状態；投与経路などの要素；ならびに投与が局所的であるのか全身的であるのかを考慮することにより、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子の有効量を、容易に決定することができる。概して、本発明の二本鎖分子の有効量は、約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、または約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭの、がん部位またはその近傍での細胞間濃度である。より多いまたはより少ない量の二本鎖分子も投与可能であることが意図される。特定の状況に関して必要となる正確な投与量は、当業者によって容易かつ慣行的に決定され得る。
【００９２】
本発明の方法を用いて、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２のいずれかまたは両方を発現するがん；例えば、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、または胃癌の、増殖または転移を阻害することができる。具体的には、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２のｍＲＮＡ配列より選択される標的配列を含む二本鎖分子が、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、または胃癌の治療のために使用されうる。肺癌は、ＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣであってよい。同様に、ＮＳＣＬＣは、腺癌、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、および大細胞癌を含む。
【００９３】
がんを治療するために、本発明の二本鎖分子を該二本鎖分子とは別の薬剤と組み合わせて対象に投与することもできる。代替的に、本発明の二本鎖分子を、がんを治療するために設計された別の治療法と組み合わせて対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、がんの治療またはがん転移の予防に現在利用されている治療法（例えば放射線療法、外科的手術、および、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、またはタモキシフェンなどの化学療法剤を用いた治療）と組み合わせて投与することができる。
本方法において、二本鎖分子を、送達物質と組み合わせたネイキッド二本鎖分子として、または該二本鎖分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして、対象に投与することができる。
該二本鎖分子と組み合わせた投与に適した送達物質には、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ脂溶性物質、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリジン）またはリポソームが含まれる。本発明のいくつかの態様において、送達物質はリポソームである。
【００９４】
リポソームは、肺腫瘍組織などの特定の組織への二本鎖分子の送達を支援でき、かつまた該二本鎖分子の血中半減期も増大させ得る。本発明における使用に適したリポソームは標準的な小胞形成脂質から形成され得、これは一般に、中性のまたは負に帯電したリン脂質および、コレステロールなどのステロールを含む。一般に脂質の選択は、所望のリポソームのサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期などの要素を考慮して導かれる。リポソームの調製に関しては、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、および米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号（その開示全体が参照により本明細書に引用される）に記載されたような様々な方法が知られている。
【００９５】
本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、該リポソームをがん部位に送達することができるリガンド分子を含んでよい。リガンドには、腫瘍または小胞内皮細胞に多く存在する受容体に結合するもの、例えば腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が含まれ得る。
いくつかの態様において、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを回避するように修飾する。１つの態様では、リポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
【００９６】
リポソームを調製するのに用いるオプソニン化阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用されるように、オプソニン化阻害部分は、化学的にまたは物理的にリポソーム膜に付着すると、例えば脂質可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，９２０，０１６号に記載されるように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および網内系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもずっと長く循環中に残存する。このため、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
【００９７】
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性」の微小血管系が流れ込む組織内に蓄積することが知られている。したがって、ステルスリポソームはそのような微小血管系欠損を特徴とする組織、例えば固形腫瘍を標的とし、これは効率的にこれらのリポソームを蓄積させる。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減は、肝臓および脾臓への有意な蓄積を妨害することによってステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
【００９８】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、分子量約５００ダルトン〜約４０，０００ダルトン、または約２，０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンの水溶性ポリマーを含む。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＰＧ；ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドンなどの合成ポリマー；直鎖状、分岐鎖状またはデンドリマーのポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびに、ガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドが含まれる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧもしくはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーはまた、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナン；アミノ化多糖またはオリゴ糖（直鎖または分岐鎖）；あるいは、たとえばカルボン酸基の連結が得られたカルボン酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
いくつかの態様において、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。
【００９９】
オプソニン化阻害部分は、多くの既知の技術のいずれか１つによってリポソーム膜と結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば比率３０：１２のテトラヒドロフランと水を用いる６０℃での還元アミノ化によって、ステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０１００】
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で述べられた。本発明の二本鎖分子を少なくとも１つ発現するそのようなベクターもまた、直接、または、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１脂溶性物質、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリジン）またはリポソームを含む好適な送達物質と組み合わせて、投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者のがん領域に送達するための方法は当技術分野内である。
【０１０１】
本発明の二本鎖分子は、該二本鎖分子をがん部位に送達するのに適した任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路によって投与することができる。
【０１０２】
好適な腸内投与経路には、経口送達、直腸送達、または鼻腔内送達が含まれる。
好適な非経口投与経路には、血管内投与（例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系へのカテーテル点滴注入）；組織周囲および組織内注射（例えば腫瘍組織周囲および腫瘍内注射）；皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着（例えば浸透圧ポンプによる）；例えばカテーテルもしくは他の留置装置（例えば、多孔性、非孔性またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント）によるがん部位の領域またはその近傍への直接適用；ならびに吸入が含まれる。一般に、二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、がん部位またはその近傍に行われる。
【０１０３】
本発明の二本鎖分子は、単回投与量または複数回投与量で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入による場合、該注入は、単回の持続投与量であってもよく、または複数回の注入によって送達することもできる。一般に、がん部位のまたはその近傍の組織内へ、該二本鎖分子を直接注射する。本発明のいくつかの態様において、がん部位のまたはその近傍の組織への、該二本鎖分子の複数回注射が利用される。
【０１０４】
当業者はまた、本発明の二本鎖分子を所定の対象に投与するための適当な投与レジメンを容易に決定することもできる。例えば二本鎖分子を、例えばがん部位またはその近傍での単回注射または沈着として、対象に一回で投与することができる。代替的に、二本鎖分子を、約３日〜約２８日、または約７日〜約１０日の期間にわたり、１日１回または２回、対象に投与することができる。典型的な投与レジメンでは、二本鎖分子を７日間、１日１回、がん部位またはその近傍に注射することができる。投与レジメンに複数回投与が含まれる場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投与レジメン全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことができることが理解される。
【０１０５】
本発明において、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２を過剰発現するがんを、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｃ）それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分によって治療することができる。
【０１０６】
したがって、１つの態様において、本発明は、（ｉ）治療すべきがんを対象が有するかどうかを診断し、かつ／または（ｉｉ）がんを治療するための対象を選択する方法を提供し、該方法は、
ａ）治療すべきがんを有すると疑われる対象から入手したがん細胞または組織におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルを測定する段階；
ｂ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の該発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象が治療すべきがんを有すると診断する段階；ならびに
ｄ）段階c）において対象が治療すべきがんを有すると診断された場合、がん治療のために該対象を選択する段階
を含む。
【０１０７】
代替的に、そのような方法は、
ａ）治療すべきがんを有すると疑われる対象から入手したがん細胞または組織におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルを測定する段階；
ｂ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の該発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルががん性対照レベルと類似しているかまたは同等である場合に、該対象が治療すべきがんを有すると診断する段階；ならびに
ｄ）段階c）において対象が治療すべきがんを有すると診断された場合、がん治療のために該対象を選択する段階
を含む。
【０１０８】
がんには、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、または胃癌が含まれるが、これらに限定されない。したがって本方法は、有効成分としての本発明の二本鎖分子の投与の前に、治療すべきがん細胞または組織におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルが、同じ臓器の正常細胞と比較して上昇しているか否かを確認する段階を含んでもよい。したがって、１つの態様において、本発明は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２を（過剰）発現しているがんを治療するための方法を提供し、該方法は、
ｉ）治療すべきがんを有する対象から入手したがん細胞または組織におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルを測定する段階；
ｉｉ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の該発現レベルを正常対照と比較する段階；ならびに
ｉｉｉ）正常対照と比較してＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２を過剰発現するがんを有する対象に対して、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｃ）それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも１つの成分を投与する段階
を含んでもよい。あるいは本発明は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２を過剰発現するがんを有する対象への投与に用いるための、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｃ）それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む薬学的組成物も提供する。言い換えれば、本発明は、治療される対象を
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、または
（ｃ）それをコードするベクター
を用いて同定するための方法をさらに提供し、該方法は、対象由来のがん細胞または組織におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルを測定する段階を含んでよく、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増大により、該対象が、本発明の二本鎖分子
によって治療されうるがんを有することが示される。
【０１０９】
本発明のがん治療法を、以下でより詳細に説明する。
本方法によって治療される対象は、典型的には哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが含まれるが、これらに限定されない。
本発明に従って、対象から採取したがん細胞または組織におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルが測定される。発現レベルは、当技術分野で既知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルとして測定することができる。例えば、ハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション）、チップまたはアレイ、プローブ、RT-PCRを用いて、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の転写産物レベルを測定することができる。
【０１１０】
あるいは、本発明の治療のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、観察されるタンパク質（ＳＵＶ４２０Ｈ１についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４および２６、ＳＵＶ４２０Ｈ２についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）の量を測定してもよい。
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学解析によって、染色強度を測定してもよい。即ちこの測定において、強い染色は、タンパク質の存在量／レベルの増大を示すと同時に、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の高い発現レベルを示す。
ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチド、および／またはそれらをコードするポリヌクレオチドを検出または測定するための方法は、上記（がんを検出または診断する方法）のように例証され得る。
【０１１１】
二本鎖分子を含む組成物：
上記に加えて、本発明はまた、本発明の二本鎖分子または該分子をコードするベクターの少なくとも１つを含む薬学的組成物も提供する。
本発明の文脈において、「組成物」という用語は、特定量の特定成分を含む生成物、および特定量の特定成分の組み合わせから直接的または間接的に生じる任意の生成物を指すために用いられる。「薬学的」という修飾語に関連して用いられる場合（「薬学的組成物」などの場合）、そのような用語は、有効成分と担体を構成する任意の不活性成分とを含む生成物、ならびに、任意の２つもしくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体形成、もしくは凝集から、または１つもしくは複数の成分の解離から、または１つもしくは複数の成分の他の種類の反応もしくは相互作用から直接的または間接的に生じる任意の生成物を含む、生成物を包含することが意図される。したがって、本発明の文脈において、「薬学的組成物」という用語は、本発明の分子または化合物と薬学的または生理学的に許容される担体を混合することにより作製される任意の生成物を指す。
本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、液体または固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料を含むがこれらに限定されない、薬学的または生理学的に許容される材料、組成物、物質、または溶剤を意味する。
【０１１２】
本明細書における「有効成分」という用語は、生物学的または生理学的に活性な組成物中の物質を指す。特に、薬学的組成物の文脈において、「有効成分」という用語は、目的の薬理学的効果を示す物質を指す。例えば、がんの治療または予防に使用するための薬学的組成物の場合、剤または組成物中の有効成分は、がん細胞および／または組織に対する少なくとも１つの生物学的または生理学的作用を直接的または間接的にもたらし得る。好ましくは、そのような作用には、がん細胞増殖の低減または阻害、がん細胞および／または組織の損傷または殺傷等が含まれ得る。製剤化される前には、「有効成分」は「バルク」、「原薬」、または「原体」とも称され得る。
【０１１３】
具体的には、本発明は以下の［１］〜［４０］記載の組成物を提供する：
［１］ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する単離された二本鎖分子もしくは薬学的に許容されるその塩の薬学的有効量、または該二本鎖分子をコードするベクター、および薬学的に許容される担体を含む、がんの治療および予防のいずれかまたは両方、ならびにがん細胞増殖の阻害のための組成物であって、該がん細胞および該がんがＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現し、該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖で構成されており、該二本鎖分子が、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のいずれかまたは両方を発現する細胞に導入された場合にＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する、組成物；
［２］二本鎖分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡに作用する、［１］記載の組成物；
［３］二本鎖分子が、センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む、［１］または［２］記載の組成物；
［４］がんが、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌からなる群より選択される、［１］〜［３］のいずれか１項記載の組成物；
［５］ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子に対する二本鎖分子が組成物中に含まれる場合に、がんが、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、および軟部組織腫瘍からなる群より選択される、［４］記載の組成物；
［６］ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子が組成物中に含まれる場合に、がんが、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、および肺癌からなる群より選択される、［４］記載の組成物；
［７］肺癌がＳＣＬＣである、［５］の組成物；
［８］複数種類の二本鎖分子を含む、［１］〜［７］のいずれか１項記載の組成物；
［９］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約１００ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１］〜［８］のいずれか１項記載の組成物；
［１０］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約７５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［９］記載の組成物；
［１１］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約５０ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１０］記載の組成物；
［１２］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約２５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１１］記載の組成物；
［１３］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約１９〜約２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１２］記載の組成物； 
［１４］二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一ポリヌクレオチドで構成される、［１］〜［１３］のいずれか１項記載の組成物；
［１５］二本鎖分子が、一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
を有し、［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖配列であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ'］は、［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖である、［１４］記載の組成物；
［１６］二本鎖分子がＲＮＡである、［１］〜［１５］のいずれか１項記載の組成物；
［１７］二本鎖分子がＤＮＡおよび／またはＲＮＡである、［１］〜［１５］のいずれか１項記載の組成物； 
［１８］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１７］記載の組成物；
［１９］センス鎖およびアンチセンス鎖のポリヌクレオチドがそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡで構成される、［１８］記載の組成物；
［２０］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１７］記載の組成物；
［２１］アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、または、センス鎖の５'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域の両方がＲＮＡで構成される、［２０］記載の組成物；
［２２］隣接領域が９〜１３ヌクレオチドで構成される、［２１］記載の組成物；
［２３］二本鎖分子が１つまたは２つの３'オーバーハングを含む、［１］〜［２２］のいずれか１項記載の組成物；
［２４］トランスフェクション増強剤を含む、［１］〜［２３］のいずれか１項記載の組成物；
［２５］二本鎖分子がベクターによってコードされる、［１］記載の組成物；
［２６］ベクターによってコードされる二本鎖分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡに対して作用する、［２５］記載の組成物；
［２７］ベクターによってコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む、［２５］または［２６］記載の組成物；
［２８］がんが、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌からなる群より選択される、［２５］〜［２７］のいずれか１項記載の組成物；
［２９］ベクターにコードされるＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子に対する二本鎖分子が組成物中に含まれる場合に、がんが、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、および軟部組織腫瘍からなる群より選択される、［２８］記載の組成物；
［３０］ベクターにコードされるＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子が組成物中に含まれる場合に、がんが、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、および肺癌からなる群より選択される、［２８］記載の組成物；
［３１］肺癌がＳＣＬＣである、［２９］記載の組成物；
［３２］複数種類の二本鎖分子をコードするベクター、または、異なる二本鎖分子をそれぞれコードする複数種類のベクターを含む、［２５］〜［２８］のいずれか１項記載の組成物；
［３３］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約１００ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［２５］〜［３２］のいずれか１項記載の組成物；
［３４］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約７５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［３３］記載の組成物；
［３５］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約５０ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［３４］記載の組成物；
［３６］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約２５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［３５］記載の組成物；
［３７］二本鎖分子のセンス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約１９〜約２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、［３６］記載の組成物；
［３８］ベクターによってコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドで構成される、［２５］〜［３７］のいずれか１項記載の組成物；
［３９］二本鎖分子が、一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
を有し、［Ａ］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドで構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ'］は、［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖である、［３８］記載の組成物；
［４０］トランスフェクション増強剤を含む、［２５］〜［３９］のいずれか１項記載の組成物；ならびに
本発明の組成物の更なる詳細を、以下に記載する。
【０１１４】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の技術に従って、薬学的組成物として製剤化されてもよい。本発明の組成物は、少なくとも無菌でありかつ発熱物質を含まないことを特徴とし得る。本明細書で用いられる「薬学的組成物」は、ヒトおよび獣医学的使用のための製剤を含む。したがって本組成物は、ヒトおよびその他の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーのための薬剤として使用され得る。
【０１１５】
本発明の文脈において、本発明の適切な薬学的製剤には、経口、直腸、鼻、局所（頬側、舌下、および経皮を含む）、膣、または非経口（筋肉内、皮下、および静脈内を含む）投与に適したもの、あるいは、吸入または吹送による投与に適したものが含まれる。他の製剤には、治療剤を放出する移植可能なデバイスおよび粘着性のパッチが含まれる。所望の場合、有効成分を持続放出するように上記の製剤を適合させてもよい。
本発明の組成物を調製するための方法は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載されるような、当技術分野における技術の範囲内である。
【０１１６】
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体と混合された、本発明の二本鎖分子の少なくとも１つもしくはそれらをコードするベクター（例えば、０．１〜９０重量％）、または該分子の薬学的に許容される塩を含む。薬学的に許容される担体は典型的に、水、緩衝水、生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
【０１１７】
本発明によれば、組成物は複数種類の二本鎖分子を含んでよく、該分子のそれぞれは、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２の異なる標的配列、またはＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２および他の遺伝子の標的配列に指向し得る。例えば、組成物はＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の１個、２個、またはそれ以上の標的配列に指向する二本鎖分子を含み得る。あるいは、例えば組成物は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の標的配列に指向する二本鎖分子および他の遺伝子の標的配列に指向する二本鎖分子を含み得る。
【０１１８】
さらに、本発明の組成物は、１つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクターを含み得る。例えば、ベクターは、１種類、２種類、または数種類の本発明の二本鎖分子をコードし得る。あるいは、本発明の組成物は、それぞれが異なる二本鎖分子をコードする、複数のベクターを含み得る。
さらに、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物中に該分子を封入するリポソームとして含まれ得る。リポソームの詳細に関しては、「二本鎖分子を用いて、がん細胞増殖を阻害しかつがんを治療する方法」の項を参照されたい。
【０１１９】
本発明の組成物はまた、従来の薬学的賦形剤および／または添加剤も含み得る。適切な薬学的賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝液、およびｐＨ調整剤が含まれる。適切な添加剤には、生理学的に生体適合性のある緩衝液（例えば、トロメタミン塩酸塩）、キレート剤（例えば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミドなど）もしくはカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）の添加、または任意で、カルシウム塩もしくはナトリウム塩の添加（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、または乳酸カルシウム）が含まれる。本発明の組成物は、液体形態での使用のために包装することができ、または凍結乾燥することもできる。
固体組成物には、従来の非毒性固体担体、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を用いることができる。
【０１２０】
例えば、経口投与のための固体組成物は、上記の担体および賦形剤のいずれか、ならびに１０〜９５％、または２５〜７５％の本発明の二本鎖分子の１つまたは複数を含み得る。エアロゾル（吸入）投与のための組成物は、上記のようにリポソーム中に封入される０．０１〜２０重量％、または１〜１０重量％の本発明の二本鎖分子の１つまたは複数、および噴霧剤を含み得る。鼻腔内送達の場合、組成物は担体、例えばレシチンを含み得る。
【０１２１】
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のインビボ機能を阻害しない限り、他の薬学的有効成分を含み得る。例えば、本組成物は、がんを治療するために従来用いられている化学療法剤を含み得る。
薬学的組成物はまた、抗生物質、免疫抑制剤、または保存剤などのその他の有効成分を含んでもよい。さらに、本発明の製剤は、上記で特に言及された成分に加え、該製剤の種類を考慮して当技術分野における従来的なその他の剤を含んでもよいことが理解されるべきであり；例えば、経口投与に適した製剤は着香剤を含んでもよい。
代替的に、本発明は、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のいずれかまたは両方を発現するがんの治療において使用するための本発明の二本鎖核酸分子を、さらに提供する。
【０１２２】
別の態様において、本発明はまた、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現を特徴とするがんを治療するための薬学的組成物または医薬の製造における、本発明の二本鎖分子の使用も提供する。例えば本発明は、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２のいずれかまたは両方を発現するがん、例えば膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌の治療用の薬学的組成物の製造のための、細胞におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子の使用に関し、ここで該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択されるヌクレオチド配列を標的とする。
【０１２３】
あるいは、本発明はさらに、薬学的または生理学的に許容される担体を、該遺伝子を過剰発現する細胞におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現を阻害する二本鎖核酸分子と共に製剤化する段階を含む、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２のいずれかまたは両方の発現を特徴とするがんの治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供し、該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつ有効成分としてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、および３２の中より選択されるヌクレオチド配列を標的とする。
【０１２４】
別の態様において、本発明はまた、有効成分と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合する段階を含む、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２のいずれかまたは両方の発現を特徴とするがんの治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスも提供し、ここで、該有効成分が、該遺伝子を過剰発現する細胞におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１７、１９、および２１の中より選択されるヌクレオチド配列を標的とする。
【０１２５】
がんを検出または診断する方法：
ＳＵＶ４２０Ｈ１の発現は、膀胱癌（図１Ａおよび１Ｂ）、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌（図２Ａ）、膀胱癌細胞株および肺癌細胞株（図３Ａ）において特異的に上昇していることが見出された。ＳＵＶ４２０Ｈ２の発現は、膀胱癌（図１Ａおよび１Ｂ）、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、肺癌（図２Ｂ）、膀胱癌細胞株、および肺癌細胞株（図３Ｂ）において特異的に上昇していることが見出された。したがって、本明細書において同定された遺伝子ならびにそれらの転写産物および翻訳産物は、がん、例えば膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌のマーカーとして診断的に有用である。また、対象由来の生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルを測定することにより、がん、例えば膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌を診断することもできる。具体的には、本発明は、対象由来の生物学的試料におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルを測定することにより、がん、例えば膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌を検出または診断するための方法を提供する。本発明の方法によって診断可能な肺癌には、ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣが含まれる。また、ＮＳＣＬＣには、腺癌、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、および大細胞癌が含まれる。
【０１２６】
本発明に従って、対象の状態を調べるための中間的な結果が提供され得る。そのような中間的な結果を付加的な情報と組み合わせて、医師、看護師、または他の実務者が、対象が疾患に罹患していると診断するのを補助してもよい。すなわち、本発明は、癌を調べるための診断マーカーＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２を提供する。あるいは、本発明は、対象由来の組織中のＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを測定する段階を含む、対象由来の組織、例えば膀胱組織試料、子宮組織試料、骨組織試料、肺組織試料、軟部組織試料、乳房組織試料、ミエロイド組織（骨髄組織）試料、食道組織試料、および胃組織試料中のがん細胞を検出または同定するための方法を提供し、ここで、該発現レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該組織中のがん細胞の存在または疑いが示される。対象が疾患に罹患していると診断する際、医師、看護師、または他の医療実務者を補助するために、そのような結果を付加的な情報と組み合わせることができる。言い換えれば、本発明は、疾患対象が疾患に罹患していると診断するのに有用な情報を医師に提供し得る。例えば本発明に従って、対象から採取された組織中のがん細胞の存在に関して疑いがある場合には、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルに加えて、組織病理学、血中の公知の腫瘍マーカーのレベル、および該対象の臨床経過等を含む該疾患の別の局面を考慮することにより、臨床決定に至ることができる。例えば、いくつかの周知の血中の診断用肺腫瘍マーカーは、ＩＡＰ、ＡＣＴ、ＢＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＣＡ１３０、ＣＥＡ、ＫＭＯ−１、ＮＳＥ、ＳＣＣ、ＳＰ１、Ｓｐａｎ−１、ＴＰＡ、ＣＳＬＥＸ、ＳＬＸ、ＳＴＮ、およびＣＹＦＲＡであり、血中の膀胱腫瘍マーカーは、ＢＴＡ、ＩＡＰなどである。すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現解析の結果は、対象の疾患状態をさらに診断するための中間的な結果として役立つ。
【０１２７】
具体的には、本発明は以下の［１］〜［１３］記載の方法を提供する：
［１］対象由来の生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを測定する段階を含む、対象におけるがんを検出または診断する方法であって、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの上昇が、該対象ががんに罹患しているかまたはその発症リスクを有することを示し、該発現レベルが、
（ａ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２のｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること、および
（ｃ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法のいずれかによって測定される、方法。
［２］発現レベルが正常対照レベルを少なくとも１０％上回る、［１］記載の方法；
［３］がんが、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌からなる群より選択される、［１］または［２］記載の方法；
［４］ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子の発現レベルを測定する場合に、がんが、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、および軟部組織腫瘍からなる群より選択される、［３］記載の方法；
［５］ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを測定する場合に、がんが、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、および肺癌からなる群より選択される、［３］記載の方法；
［６］肺癌がＳＣＬＣである、［４］記載の方法；
［７］発現レベルが、前記遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより測定される、［１］〜［６］のいずれか１項記載の方法；
［８］発現レベルが、前記遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体の結合を検出することにより測定される、［１］〜［６］のいずれか１項記載の方法；
［９］対象由来の生物学的試料が生検試料、痰、血液、胸水、または尿を含む、［１］〜［８］のいずれか１項記載の方法；
［１０］対象由来の生物学的試料が上皮細胞を含む、［１］〜［９］のいずれか１項記載の方法；
［１１］対象由来の生物学的試料ががん細胞を含む、［１０］記載の方法；ならびに
［１２］対象由来の生物学的試料ががん性上皮細胞を含む、［１１］記載の方法。
［１３］癌が膀胱癌である場合、対象由来の生物学的試料が対象由来の膀胱組織試料であり、癌が子宮頸癌である場合、対象由来の生物学的試料が対象由来の子宮組織試料であり、癌が骨肉腫である場合、対象由来の生物学的試料が対象由来の骨組織であり、癌が肺癌である場合、対象由来の生物学的試料が対象由来の肺組織試料であり、癌が軟部組織腫瘍である場合、対象由来の生物学的試料が対象由来の軟部組織試料であり、癌が乳癌である場合、対象由来の生物学的試料が対象由来の乳房組織試料であり、癌が慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である場合、対象由来の生物学的試料が対象由来のミエロイド組織（骨髄組織）試料であり、癌が食道癌である場合、対象由来の生物学的試料が対象由来の食道組織であり、かつ癌が胃癌である場合、対象由来の生物学的試料が対象由来の胃組織試料である、［３］記載の方法。
【０１２８】
がん（例えば、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌）を診断する方法を、以下でより詳細に説明する。
本発明の方法によって診断される対象は、典型的には哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１２９】
本発明のいくつかの態様において、がんの診断を行うために、診断される対象から生物学的試料を採取する。ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の転写産物または翻訳産物を含むかまたは含むと疑われる限り、任意の生物学的材料を測定のための生物学的試料として用いることができる。生物学的試料には、診断のために望ましいかまたはがん性であると疑われる身体組織、ならびに体液、例えば、生検試料、血液、痰、胸水、および尿が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。例えば、生物学的試料は、上皮細胞、または、がん性上皮細胞もしくはがん性であると疑われる組織に由来する上皮細胞を含む細胞群を含み得る。さらに、必要に応じて、採取された身体組織および体液から細胞を精製し、その後生物学的試料として用いてもよい。
【０１３０】
例えば、本発明によると、診断または検出に適したがんには膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌が含まれる。これらの癌を診断または検出するために、対象由来の生物学的試料が、以下の器官から採取され得る。
膀胱：膀胱癌の場合
子宮：子宮頸癌の場合
骨：骨肉腫の場合
肺：肺癌の場合
軟部組織：軟部組織腫瘍の場合
乳房：乳癌の場合
ミエロイド（骨髄）：慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の場合
食道：食道癌の場合
胃：胃癌の場合
本発明の方法に従って、対象由来の生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルを測定した後、対照試料中のそれと比較することによって、特定の健康状態または疾患状態と関連付ける。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写産物（核酸）レベルで測定することができる。例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを用いて定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で行ってもよい。アレイはＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２を含む複数の遺伝子（例えば、様々ながん特異的遺伝子）の発現レベルを検出するために使用され得る。当業者は、ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３および２５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１７６３５．３およびＮＭ＿０１６０２８．４）およびＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０３２７０１．３）の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２のｃＤＮＡをプローブとして用いてもよい。必要に応じて、色素、蛍光標識、および同位体などの適切な標識でプローブを標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
【０１３１】
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によりプライマーを用いて、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の転写産物を定量することができる。そのようなプライマーもまた、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。例えば、「実施例」で用いられるプライマーまたはプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６、７、８、９、１０、１１、および１２）を、ＲＴ−ＰＣＲによる検出に使用することができるが、本発明はそれらに限定されるわけではない。
【０１３２】
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または低ストリンジェントな条件下で、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２のｍＲＮＡとハイブリダイズする。上記で定義されたのと同様、本明細書で用いられる「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される。通常、ストリンジェントな条件とは、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３においてナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、より長いプローブまたはプライマーについては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
【０１３３】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出することができる。例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質の量を測定することができる。翻訳産物として該タンパク質の量を測定するための方法には、該タンパク質またはその断片を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質への結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に用いることができる。タンパク質検出のためのこのような種類の抗体を調製する方法は当技術分野において周知であり、そのような抗体およびそれらの同等物を調製するために、本発明において任意の方法を使用することができる。
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルをそれらの翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質に対する抗体またはその断片を用いる免疫組織化学的解析により、染色強度を観察することができる。すなわち、強力な染色が観察されることにより、該タンパク質の存在量の増加、および同時にＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の高い発現レベルが示される。
【０１３４】
さらに、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質の量は、ヒストンメチル化などのＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質の生物学的活性を測定することによって決定することができる。上記のように、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２は、挟動原体ヘテロクロマチンに特有であるヒストンＨ４Ｋ２０のジメチル化およびトリメチル化を触媒するヒストンメチルトランスフェラーゼである。したがって、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質をそれらの生物学的活性に基づいて定量するのに有用である。ヒストン（特にヒストンＨ４Ｋ２０）のメチル化レベルは、当技術分野で周知の方法によって測定することができる。
【０１３５】
あるいは、細胞増殖増強活性を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質の生物学的活性として用いてもよい。本発明によれば、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現を阻害すると、膀胱癌および肺癌細胞において細胞増殖の抑制が起こり、その結果、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質が細胞増殖を促進する。ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質の細胞増殖増強活性を測定するには、細胞を生物学的試料の存在下で培養し、次に増殖の速度を検出することにより、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することにより、生物学的試料の細胞増殖増強活性を測定することができる。
本発明の文脈において、対象におけるがんまたは対象由来の生物学的試料中のがん細胞を検出または同定するための方法は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子発現レベルの測定から開始される。測定されたら、前述の技法のいずれかを用いて、この値を対照レベルと比較する。
【０１３６】
本発明の文脈において、「対照レベル」という語句は、対照試料中で検出された試験遺伝子の発現レベルを指し、かつ正常対照レベルおよびがん対照レベルの両方を包含する。「正常対照レベル」という語句は、正常な健常個体において、またはがんに罹患していないことが判明している個体群において検出された遺伝子発現のレベルを指す。正常な個体とは、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および／または胃癌の臨床症状がない個体である。正常対照レベルは、非がん性組織から得られた正常細胞を用いて測定され得る。「正常対照レベル」はまた、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および／または胃癌に罹患していないことが判明している個体または個体群の正常な健常組織または細胞において検出された試験遺伝子の発現レベルであってもよい。一方、「がん対照レベル」という語句は、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および／または胃癌に罹患している個体または個体群のがん性組織または細胞において検出された試験遺伝子の発現レベルを指す。対象由来の試料中で検出されたＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該対象（該試料が採取された）が、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および／または胃癌に罹患しているかまたはその発症リスクを有することが示される。本発明の文脈において、対象由来の生物学的試料は、試験対象、例えばがんを有すると疑われる患者から採取された任意の組織であってよい。例えば、組織は上皮組織を含み得る。より詳細には、組織は、がん性であると疑われる領域から採取された上皮細胞であってよい。あるいは、試料中のＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルを、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のがん対照レベルと比較することもできる。試料の発現レベルとがん対照レベルが類似していることにより、対象（該試料が採取された）ががんに罹患しているかまたはその発症リスクを有することが示される。その他のがん関連遺伝子の発現レベルも測定および比較する場合、試料とがん性である参照との間で遺伝子発現パターンが類似していることにより、対象ががんに罹患しているかまたはその発症リスクを有することが示される。
【０１３７】
対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が判明している一名／複数名の対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、試験生物学的試料と同時に測定することができる。あるいは、対照レベルは、疾患状態が判明している対象由来の試料中のＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の予め測定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計学的方法により決定することもできる。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベース由来であってもよい。さらに、本発明の１つの局面に従って、生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から測定された複数の対照レベルと比較することもできる。１つの態様において、本発明の方法は、患者由来の生物学的試料のものと類似した組織型に由来する参照試料から測定された対照レベルを使用する。さらに、疾患状態が判明している群におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルの基準値を使用してもよい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値±２Ｓ．Ｄ．または平均値±３Ｓ．Ｄ．の範囲を基準値として用いることができる。
【０１３８】
診断の精度を向上させるために、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルに加えて、その他のがん関連遺伝子、例えば、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および／または胃癌において差次的に発現することが知られている遺伝子の発現レベルも測定することができる。さらに、複数のがん関連遺伝子の発現レベルを比較する場合、試料とがん性である参照との間の遺伝子発現パターンが類似していることにより、対象が、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および／または胃癌に罹患しているかまたはその発症リスクを有することが示される。
【０１３９】
本発明の文脈において、遺伝子発現が、対照レベルから例えば１０％、２５％、もしくは５０％変化もしくは上昇しているか、または、対照レベルと比較して少なくとも０．１倍、少なくとも０．２倍、少なくとも０．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、もしくは少なくとも１０倍、もしくはそれ以上変化または上昇している場合に、遺伝子発現レベルが「変化した」または「上昇した」と考えられる。したがって、生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を含む膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および／または胃癌マーカー遺伝子の発現レベルは、対応するがんマーカー遺伝子の対照レベルから、例えば１０％、２５％、もしくは５０％上昇しているか、または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上まで上昇している場合に、上昇したと見なすことができる。
試験生物学的試料の発現レベルと対照レベルの差を、細胞のがん性状態および非がん性状態によって発現レベルが相違しないことが既知である対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１４０】
がんの予後を評価するための方法：
本発明はさらに、ＳＵＶ４２０Ｈ２発現が患者の予後不良と有意に関連しているという発見に関する。したがって、本発明はまた、対象由来の生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを測定し；測定された発現レベルを対照レベルと比較して；その比較に基づいて該対象の予後を評価または判定することにより、がんを有する対象の予後を判定または評価するための方法も提供する。典型的な態様において、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）を有する対象の予後が、本発明の方法によって評価または判定される。
【０１４１】
加えて、治療の有効性を評価するためおよび／または疾患状態（例えば、進行、退縮、または寛解）をモニタリングするために、治療前後のＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを本発明の方法に従って比較することもできる。具体的には、治療後の対象由来の生物学的試料において検出された発現レベル（すなわち、治療後レベル）を、同一の対象から治療開始前に採取した生物学的試料において検出された発現レベル（すなわち、治療前レベル）と比較することができる。治療前レベルと比較して治療後レベルが低下していることにより、関心対象の治療が有効であることが示されるのに対し、治療前レベルと比較して治療後レベルが上昇しているかまたは同様であることにより、臨床転帰または予後があまり好ましくないことが示される。
【０１４２】
本明細書で用いられる「有効な」という用語は、治療が、病理学的に上方制御される遺伝子の発現の低下、病理学的に下方制御される遺伝子の発現の上昇、または対象におけるがんの大きさ、蔓延、もしくは転移能の低下をもたらすことを示す。関心対象の治療が予防的に適用される場合、「有効な」とは、治療によって、腫瘍形成が遅延するかもしくは妨害されること、または疾患の少なくとも１つの臨床症状が遅延するか、妨害されるか、緩和されることを意味する。対象における腫瘍の状態の評価は、標準的な臨床プロトコールを用いて行うことができる。
加えて、治療の有効性は、がんを診断するための任意の公知の方法に関連して判定することもできる。がんは、例えば症候性の異常、例えば体重減少、腹痛、背部痛、食欲不振、悪心、嘔吐、および全身倦怠感、衰弱、ならびに黄疸を同定することによって診断することができる。
【０１４３】
本明細書において、「予後」という用語は、症例の性質および症状によって示される、疾患の推定される転帰および該疾患からの回復見込みに関する予想を指す。したがって、あまり好ましくない、ネガティブな、不良な予後は、短い治療後生存期間または低い生存率によって定義される。逆に、ポジティブな、好ましい、または良好な予後は、長い治療後生存期間または高い生存率によって定義される。
「予後を評価する（または判定する）」という語句は、対象のがんの将来の転帰（例えば、悪性度、がんが治癒する見込み、生存等）を予測する、予想する、または所与の検出もしくは測定と関連付ける能力を指す。例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルの経時的な測定によって、対象の転帰（例えば、悪性度の上下、がんのグレードの上下、がんが治癒する見込み、生存期間等）を予測することが可能になる。
【０１４４】
本発明の文脈において、「予後を評価する（または判定する）」という語句は、がん、進行、特にがんの再発、転移拡散、および疾患再発の予測および尤度解析を包含することが意図される。予後を評価するまたは判定するための本発明の方法は、治療的介入、病期分類などの診断基準、ならびに、新生物性疾患の転移または再発に関する疾患モニタリングおよび監視を含む、治療様式に関する判断において臨床的に用いられることが意図される。
【０１４５】
本発明の文脈において、対象由来の生物学的試料は、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の転写産物または翻訳産物を含むかまたは含むと疑われる限り、評価される対象に由来する任意の試料であってよい。典型的な態様において、対象由来の生物学的試料は肺細胞（肺から採取された細胞）を含む。例えば、がん性領域から採取された肺組織試料を、対象由来の生物学的試料として使用することができる。生物学的試料は、試験対象から採取された組織より精製された細胞であってもよい。あるいは、対象由来の生物学的試料は、痰、血液、血清、または血漿などの体液を含み得る。生物学的試料は、治療前、治療中、および／または治療後を含む様々な時点で、対象から採取することができる。
【０１４６】
本発明によれば、対象由来の生物学的試料中で測定されたＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルが高いほど、治療後の寛解、回復、および／または生存率に関する予後がより不良であり、かつ臨床転帰不良の可能性がより高い。したがって、本発明の方法によれば、比較に用いられる「対照レベル」は、例えば、治療後にがんの良好なまたはポジティブな予後を示した個体または個体群において、任意の種類の治療の前に検出されたＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルであってよく、これは本明細書において「予後良好対照レベル」と称される。あるいは、「対照レベル」は、治療後にがんの不良なまたはネガティブな予後を示した個体または個体群において、あらゆる種類の治療の前に検出されたＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルであってよく、これは本明細書において「予後不良対照レベル」と称される。「対照レベル」は、単一の参照群に由来する単一の発現パターンであってもよく、または複数の発現パターンに由来してもよい。したがって対照レベルは、疾患状態（予後良好または予後不良）が判明しているがん患者または対象群におけるあらゆる種類の治療の前に検出されたＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルに基づいて決定することができる。いくつかの態様において、疾患状態または予後が判明している対象群におけるＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルの基準値を用いることができる。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値±２Ｓ．Ｄ．または平均値±３Ｓ．Ｄ．の範囲を基準値として用いることができる。
対照レベルは、疾患状態（予後良好または予後不良）が判明しているがん対象（対照または対照群）から、あらゆる種類の治療前に予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、試験生物学的試料と同時に測定することができる。
【０１４７】
あるいは、対照レベルは、対照群から予め採取し保存しておいた試料中のＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計学的方法により決定することもできる。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベース由来であってもよい。
さらに、本発明の１つの局面において、対象由来の生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料において測定された対照レベルなどの複数の対照レベルと比較することができる。概して、対象由来の生物学的試料のものと類似した組織型に由来する参照試料において対照レベルが測定された。
【０１４８】
本発明によれば、対象由来の生物学的試料中で測定されたＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルと予後良好対照レベルが類似していることにより、対象の予後が好ましいかまたは良好であることが示される。同様に、対象由来の生物学的試料中で測定されたＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルが予後良好対照レベルと比較して上昇していることにより、治療後の寛解、回復、生存率、および／または臨床転帰に関する予後が好ましくなく不良であることが示される。一方、対象由来の生物学的試料中で測定されたＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルが予後不良対照レベルと比較して低下していることにより、対象の予後が好ましいかまたは良好であることが示される。同様に、該２つのレベルが類似していることにより、治療後の寛解、回復、生存率、および／または臨床転帰に関する予後が好ましくなく不良であることが示される。本発明の文脈において、治療後に癌の良好なまたは不良な予後を示した対象から採取された肺癌細胞は、それぞれ予後良好対照レベルまたは予後不良対照レベルの好ましい生物学的試料である。
【０１４９】
対象由来の生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルは、該発現レベルが対照レベルと１．０倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、またはそれ以上異なる場合に、変化したと見なすことができる。
試験生物学的試料中で測定された発現レベルと対照レベルの間の差は、対照、例えばハウスキーピング遺伝子に対して正規化することができる。例えば、がん性細胞と非がん性細胞との間で発現レベルが相違しないことが既知であるポリヌクレオチド、例えばβ−アクチン、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１をコードするポリヌクレオチドを用いて、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを正規化することができる。
【０１５０】
当技術分野で周知の技術を用いて対象由来の生物学的試料中の遺伝子産物を検出することによって、発現レベルを測定することができる。本発明の方法によって検出される遺伝子産物には、転写産物および翻訳産物の両方、例えばｍＲＮＡおよびタンパク質が含まれる。
例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の転写産物は、該遺伝子転写物に対するＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子プローブを用いるハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション解析により、検出することができる。検出は、チップまたはアレイ上で行うことができる。アレイは、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を含む複数の遺伝子の発現レベルを検出するために使用され得る。別の例として、例えばＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に特異的なプライマーを用いる、逆転写に基づくポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）といった増幅に基づく検出法を、該検出に使用することができる（実施例を参照されたい）。ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に特異的なプローブまたはプライマーは、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の全配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）を参照することにより、従来の技術を用いて設計および調製することができる。例えば、実施例で用いられるプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、および１２）を、ＲＴ−ＰＣＲによる検出に使用してもよいが、本発明はそれらに限定されるわけではない。
【０１５１】
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で用いる「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとで）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である。Ｔｍにおいて標的配列は一般に過剰に存在するため、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成することができる。
【０１５２】
代替的に、予後の評価または判定のために翻訳産物を検出することができる。例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質の量を測定することができる。翻訳産物として該タンパク質の量を測定するための方法には、ＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質を特異的に認識する抗体またはその断片を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質への結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に用いることができる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの同等物を調製することができる。
【０１５３】
ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、ＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質に対する抗体またはその断片を用いる免疫組織化学的解析により、染色強度を観察してもよい。すなわち、強力な染色の観察によりＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質の存在の増加、およびそれと同時にＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の高い発現レベルが示される。
さらに、ＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質の量は、ヒストンメチル化などのＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質の生物学的活性を測定することによって決定することができる。上記のように、ＳＵＶ４２０Ｈ２は、ヒストンＨ４Ｋ２０のジメチル化およびトリメチル化を触媒するヒストンメチルトランスフェラーゼである。したがって、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性は、ＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質をその生物学的活性に基づいて定量するのに有用である。ヒストンのメチル化レベルは、当技術分野で周知の方法によって測定することができる。
【０１５４】
さらに、ＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質は細胞増殖増強活性を有することが知られている。したがって、そのような細胞増殖増強活性を指標として用いて、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを測定することができる。例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ２を発現する細胞を調製し、対象由来の生物学的試料の存在下で培養した後、増殖速度を検出することにより、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することにより、該対象由来の生物学的試料の細胞増殖活性を測定することができる。
【０１５５】
さらに、評価の精度を向上させるために、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルに加えて、その他の予後遺伝子マーカー、例えばその発現ががんの予後に関連することが知られている遺伝子の発現レベルを測定することもできる。そのような他の肺癌予後遺伝子マーカーの例には、本明細書においてその全文が参照により組み入れられているＷＯ２００９／０２８５８０およびＷＯ２００５／０９０６０３に記載のものが含まれる。
【０１５６】
あるいは、本発明に従って、対象の予後を評価するための他の試験結果に加えて、中間的な結果もまた提供され得る。そのような中間結果は、医師、看護師、または他の実務者が対象の進行および／または予後を評価、判定、モニタリング、または推定するのを補助することができる。予後を評価するために、本発明によって得られる中間的な結果と組み合わせて考慮され得るさらなる情報には、対象の臨床症状および身体状態が含まれる。
【０１５７】
言い換えれば、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルは、がんに罹患している対象の予後を評価、予測、または判定するのに有用な予後マーカーである。したがって本発明はまた、がんに罹患している対象の予後を評価、予測、または判定するために予後マーカーを検出するための方法も提供し、該方法は、
ａ）対象由来の生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを検出または測定する段階、および
ｂ）段階ａ）において検出または測定された発現レベルを該対象の予後と関連付ける段階
を含む。
具体的には、本発明によると、対照レベルと比較した発現レベルの上昇は、予後不良（低い生存率）の可能性または疑いを示す。
本方法の文脈において、がんの予後について評価を受ける対象は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含む、哺乳動物であり得る。
【０１５８】
がんを診断するため、がんの予後を評価もしくは判定するため、またはがん療法の有効性をモニタリングするためのキット：
本発明は、がんまたはがんの発症素因を診断または検出するためのキットを提供する。本発明はまた、がんの予後を評価もしくは判定するため、またはがん療法の有効性をモニタリングするためのキットも提供する。本発明の文脈において、がんの例には、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌が含まれる。典型的な態様において、ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子の発現レベルを測定する場合、診断または検出されるがんは、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、および軟部組織腫瘍からなる群より選択される。典型的な態様において、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を測定する場合、診断または検出されるがんは、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、および肺癌からなる群より選択される。肺癌は、ＳＣＬＣまたはＮＳＣＬＣであってよい。典型的な態様において、予後を評価または判定されるがんは、肺癌である。
【０１５９】
具体的には、本キットは、患者由来の生物学的試料中のＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を含み、該試薬は以下の群より選択され得る：
（ａ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【０１６０】
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬には、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２  ｍＲＮＡの一部に対する相補配列を有するオリゴヌクレオチドのような、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２  ｍＲＮＡに特異的に結合するかまたはＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２  ｍＲＮＡを同定する核酸が含まれる。このような種類のオリゴヌクレオチドは、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２  ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例証される。このような種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化することができる。さらに、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２  ｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることもできる。
【０１６１】
本発明のプローブまたはプライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、典型的には、核酸の少なくとも約２０００、１０００、５００、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、もしくは２５塩基の、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２配列を含む連続したセンス鎖ヌクレオチド配列と、またはＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２配列を含む核酸のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列と、またはこれらの配列の天然変異体と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。詳細には、例えば、１つの態様において、５〜５０ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドを、検出すべき遺伝子を増幅するためのプライマーとして用いることができる。別の態様において、特定サイズ、一般的には１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いて、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを検出することができる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの長さは、１５〜２５塩基から選択することができる。そのようなオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いることによる遺伝子の検出のためのアッセイ手法、装置、または試薬は周知である（例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはＰＣＲ）。これらのアッセイにおいて、プローブまたはプライマーはタグまたはリンカー配列を含んでもよい。さらに、検出可能な標識または捕捉されるアフィニティーリガンドでプローブまたはプライマーを修飾してもよい。あるいは、ハイブリダイゼーションに基づいた検出手法において、数百（例えば、約１００〜２００）塩基長〜数キロ（例えば、約１０００〜２０００）塩基長を有するポリヌクレオチドをプローブとして用いることもできる（例えば、ノーザンブロッティングアッセイまたはｃＤＮＡマイクロアレイ解析）。
【０１６２】
一方、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質を検出するのに適した試薬には、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質に対する抗体またはその断片が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質に対する結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を試薬として用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの同等物を調製することができる。さらに、直接連結または間接標識技法により、抗体またはその断片をシグナル発生分子で標識することができる。標識および、抗体を標識しかつそれらの標的に対する抗体の結合を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に使用することができる。さらに、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質を検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることもできる。
【０１６３】
さらに、例えば、対象由来の生物学的試料中の発現したＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質によるメチルトランスフェラーゼ活性または細胞増殖増強活性を測定することにより、生物学的活性を測定することができる。
例えば、対象由来の生物学的試料を、ヒストンなどのメチル化可能な基質と共にインキュベーションした後、メチル化ヒストンに対する抗体を用いて、残存するメチル化ヒストンを検出することにより、該生物学的試料中のメチルトランスフェラーゼ活性を測定することができる。したがって本キットは、ヒストン（特にヒストンＨ４）および抗メチル化ヒストン抗体を含み得る。そのような抗体の例には、ヒストンＨ４のメチル化リジン２０に結合する抗体が含まれる。
【０１６４】
一方、生物学的試料の存在下で細胞を培養した後、増殖の速度を検出するかまたは細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することにより、細胞増殖増強活性を測定することができる。したがって、本キットは、細胞を培養するための培地および１つまたは複数の容器を含み得る。キットは、前述の試薬のうちの２つ以上を含んでもよい。さらに、キットは、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対するプローブあるいはＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質に対する抗体またはその断片を結合させるための固体基質および試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性対照試料、ならびにＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体を含み得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用説明を含む添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業的観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。これらの試薬等は、ラベルを貼った容器内に含まれ得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。
本発明の１つの局面に従って、がんを診断するための本発明のキットは、陽性対照試料または陰性対照試料のいずれかまたは両方をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、樹立された膀胱癌細胞株、子宮頸癌細胞株、骨肉腫細胞株、肺癌細胞株、軟部組織腫瘍細胞株、乳癌細胞株、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株、食道癌細胞株、および／または胃癌細胞株であってよい。好ましい態様において、そのような細胞株は、以下からなる群より選択される：
５６３７  ２５３Ｊ、２５３Ｊ−ＢＶ、ＥＪ２８、ＨＴ１１９７、ＨＴ１３７６、ＨＴ１５７６、Ｊ８２、ＭＴ１９７、ＲＴ４、ＳＣａＢＥＲ、ＳＷ７８０、Ｔ２４、ＵＭＵＣ３等などの膀胱癌細胞株；
Ａ５４９、Ｈ２１７０、ＬＣ３１９、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＳＢＣ５等などの肺癌細胞株；
あるいは、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２陽性対照試料はまた、膀胱癌患者、子宮頸癌患者、骨肉腫患者、肺癌患者、軟部組織腫瘍患者、乳癌患者、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者、食道癌患者、および／または胃癌細胞株癌患者から採取された臨床的な膀胱癌組織、子宮頸癌組織、骨肉腫組織、肺癌組織、軟部組織腫瘍組織、乳癌組織、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）組織、食道癌組織、および／または胃癌組織であってもよい。あるいは、陽性対照試料は、カットオフ値を決定し、そのカットオフ値を上回る量のＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２  ｍＲＮＡまたはＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質を含む試料を調製することにより、調製され得る。本明細書において、「カットオフ値」という語句は、正常範囲とがん性範囲を分割する値を指す。例えば当業者は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いてカットオフ値を決定することができる。本発明のキットは、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２  ｍＲＮＡまたはＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドのカットオフ値量を提供する、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２標準試料を含み得る。一方、陰性対照試料は、非がん性細胞株または、正常な膀胱組織、子宮頸部組織、骨組織、肺組織、軟部組織、乳房組織、骨髄、食道組織、および／もしくは胃組織などの非がん性組織から調製してもよく、あるいは、カットオフ値未満のＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２  ｍＲＮＡまたはＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質を含む試料を調製することにより、調製してもよい。
【０１６５】
本発明の１つの態様として、試薬がＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２  ｍＲＮＡに対するプローブである場合には、該試薬を、多孔性ストリップなどの固体基質上に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成させてもよい。多孔性ストリップの測定領域または検出領域には、核酸（プローブ）をそれぞれ含む複数の部位が含まれ得る。検査ストリップはまた、陰性および／または陽性対照用の部位を含み得る。あるいは、対照部位は、検査ストリップとは別のストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含み得る、すなわち、第１検出部位ではより大量、以降の部位ではより少量である。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈する部位の数により、試料中に存在するＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２  ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、適切に検出可能な任意の形状で構成することができ、典型的には、検査ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
【０１６６】
本発明のキットは、陽性対照試料、陰性対照試料、および／またはＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２陽性組織試料を回収することによって調製することができ、その後、そのＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２レベルを分析する。あるいは、精製されたＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２のタンパク質またはポリヌクレオチドを、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２を含まない試料に添加して、陽性試料すなわちＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２標準物質を形成してもよい。
【０１６７】
抗がん物質のスクリーニング：
本発明の文脈において、本スクリーニング法により同定される物質は、任意の物質、または複数の物質を含む組成物であり得る。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験物質は、単一の物質であってもよく、物質の組み合わせであってもよい。本方法において物質の組み合わせを使用する場合、該物質を連続的にまたは同時に接触させることができる。
あるいは、本発明は、がんの治療もしくは予防またはがん細胞増殖の阻害に対する試験物質の治療効果を評価する方法を提供する。
本発明のスクリーニング法においては、任意の試験物質、例えば細胞抽出物、細胞培養物上清、発酵微生物の生成物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド物質、合成微小分子物質（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマー等の核酸構築物を含む）、および天然物質を使用することができる。本発明の試験物質は、（１）生物学的ライブラリ法、（２）空間的にアドレス可能なパラレル固相ライブラリ法または溶液相ライブラリ法、（３）逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法、（４）「一ビーズ一物質」ライブラリ法、および（５）アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリ法はペプチドまたは核酸ライブラリに限定され得るが、他の４つのアプローチは物質のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または低分子ライブラリにも適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67）。分子ライブラリを合成する方法の例は、当技術分野において見つけることができる（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13、Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6、Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994、Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061、Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51）。物質のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照されたい）、または、ビーズ（Lam, Nature 1991, 354: 82-4）、チップ（Fodor, Nature 1993, 364: 555-6）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号、および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9）、もしくはファージ（Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90、Devlin, Science 1990, 249: 404-6、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10、米国特許出願第２００２１０３３６０号）の表面に提供され得る。
【０１６８】
本スクリーニング法のいずれかによってスクリーニングされた物質の構造の一部が付加、欠失、および／または置換により変換された化合物は、本発明のスクリーニング法により得られる物質に含まれる。
さらに、スクリーニングした試験物質がタンパク質である場合、該タンパク質をコードするＤＮＡを得るために、該タンパク質の全アミノ酸配列を決定して該タンパク質をコードする核酸配列を推定してもよく、または、得られた該タンパク質の部分アミノ酸配列を分析して該配列に基づきオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、該プローブを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを入手してもよい。あるいは、Ｇｅｎｂａｎｋなどのタンパク質または核酸配列のデータベースを検索することによって、該タンパク質をコードするＤＮＡを入手してもよい。がんを治療または予防するための候補である試験物質の調製におけるその有用性を判定することによって、入手したＤＮＡを確認することができる。
【０１６９】
本明細書中に記載されるスクリーニングにおいて有用な試験物質とは、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質または元のタンパク質の生物学的活性が欠如したその部分ペプチドにインビボで特異的に結合する抗体でもあり得る。
試験物質ライブラリの構築は当技術分野で周知であるが、以下の本明細書において、本発明のスクリーニング法に関する試験物質の同定およびそのような物質のライブラリの構築についてのさらなるガイダンスを提供する。
【０１７０】
本発明の１つの局面において、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルおよび／または生物学的活性の抑制は、がん細胞増殖の抑制につながる。したがって、物質がＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現および／または活性を抑制する場合、そのような抑制は、対象における潜在的治療効果の指標となる。本発明の文脈において、潜在的治療効果とは、合理的に予想される臨床的有効性を指す。そのような臨床的有効性の例には以下が含まれるが、これらに限定されるわけではない：
（ａ）ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現の低下、
（ｂ）対象におけるがんの大きさ、蔓延、増殖、もしくは転移能の低下、
（ｃ）がん形成の予防、または
（ｄ）がんの臨床的症状の予防または緩和。
【０１７１】
（ｉ）分子モデリング：
試験物質ライブラリの構築は、求められる特性、および／または、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質の分子構造を知ることでより容易になる。さらなる評価に適した試験物質を予備スクリーニングするための1つのアプローチは、試験物質とＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質の間の相互作用のコンピュータモデリングである。
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の可視化、および該分子と相互作用すると考えられる新たな物質の合理的設計が可能になる。三次元の構築は典型的に、選択した分子のＸ線結晶解析またはＮＭＲイメージングのデータに依存する。分子動力学は力場データを必要とする。コンピュータグラフィックシステムによって、新たな物質が標的分子にどのように結合するかを予測することが可能になり、該物質および該標的分子の構造の実験的操作が結合特異度を改善できるようになる。軽微な変化を一方または両方に加えた場合に、分子−物質間の相互作用がどうなるのかを予測するには、通常は分子設計プログラムと使用者との間にユーザーフレンドリーなメニュー形式のインターフェースを備えた、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型コンピュータが必要である。
【０１７２】
上記に概説される分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭＭプログラムおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）が含まれる。ＣＨＡＲＭＭは、エネルギー最小化および分子ダイナミクスの機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング、および分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡにより、互いに対する分子のインタラクティブな構築、修飾、可視化、および挙動分析が可能になる。
多数の論文、例えばRotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66、Ripka, New Scientist 1988, 54-8、McKinlay &amp; Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22、Perry &amp; Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93、Lewis &amp; Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62、および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90で、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングが概説されている。
【０１７３】
化学物質をスクリーニングおよび図式化する他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.（Pasadena，Calif.）、Allelix, Inc（Mississauga，Ontario，Canada）、およびHypercube, Inc.（Cambridge，Ontario）等の企業から市販されている。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9、Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24、Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78、Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
後述のように、推定インヒビターが同定されたら、コンビナトリアル化学技術を用いて、同定された推定インヒビターの化学的構造に基づいて任意の数の変異体を構築することができる。得られた推定インヒビターすなわち「試験物質」のライブラリを、がん、例えば膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌を治療または予防するための試験物質を同定するための本発明の方法を用いて、スクリーニングしてもよい。
【０１７４】
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成：
試験物質のコンビナトリアルライブラリは、既知のインヒビター中に存在するコア構造の知識を含む合理的薬物設計プログラムの一部として作製することができる。このアプローチにより、適当なサイズにライブラリを維持することが可能になり、これによってハイスループットスクリーニングが容易になる。代替的に、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより、単純な、特に短い重合体分子ライブラリを構築してもよい。この後者のアプローチの一例は、全ペプチドが６アミノ酸長のライブラリである。そのようなペプチドライブラリは６アミノ酸ごとの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
【０１７５】
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれによって作成することができる。コンビナトリアル化学ライブラリには、ペプチドライブラリ（例えば米国特許第５，０１０，１７５号、Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93、Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。化学的多様性ライブラリを作成するための他の化学を使用することもできる。そのような化学としては、ペプチド（例えば国際公開公報第９１／１９７３５号）、コード化ペプチド（例えば国際公開公報第９３／２０２４２号）、ランダムバイオオリゴマー（random bio-oligomer）（例えば国際公開公報第９２／０００９１号）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのダイバーソマー（diversomer）（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13）、ビニローグ（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568）、グルコース骨格を有する非ペプチド性（nonpeptidal）ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8）、低分子化合物ライブラリの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661）、オリゴカルバメート（oligocarbamate）（Cho et al., Science 1993, 261: 1303）、および／またはペプチジルホスホネート（peptidylphosphonate）（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658）、核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14、およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号を参照されたい）、糖質ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22、米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、ならびに有機低分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン（Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.）、イソプレノイド（米国特許第５，５６９，５８８号）、チアゾリジノンおよびメタチアゾノン（metathiazanone）（米国特許第５，５４９，９７４号）、ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号）、モルホリノ化合物（米国特許第５，５０６，３３７号）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）等を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０１７６】
コンビナトリアルライブラリの調製のための装置は市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ，３９０  ＭＰＳ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ、４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ、９０５０  Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡを参照されたい）。加えて、数多くのコンビナトリアルライブラリがそれ自体で市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ等を参照されたい）。
【０１７７】
（ｉｉｉ）その他の候補：
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」（Scott &amp; Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6）を用いて、非常に大きなライブラリを構築することができる（例えば１０６個〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74）、およびFodor et al.の方法（Science 1991, 251: 767-73）が例示的である。Furka et al.（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93）、Houghten（米国特許第４，６３１，２１１号）、およびRutter et al.（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験可能なペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
アプタマーは、特定の分子標的に強く結合する核酸からなる巨大分子である。ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（Science. 249: 505-510 (1990））は、アプタマー選択のためのＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）法を開示している。ＳＥＬＥＸ法では、核酸分子の大きなライブラリ（例えば、１０１５個の異なる分子）をスクリーニングに使用することができる。
【０１７８】
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドに結合する物質のスクリーニング：
本発明において、対応する正常器官では低発現であったにもかかわらず、膀胱癌（図１Ａおよび１Ｂ）、子宮頸癌、骨肉腫、および肺癌（図２Ａ）においてＳＵＶ４２０Ｈ１の過剰発現が検出された。あるいは、対応する正常器官では低発現であったにもかかわらず、膀胱癌（図１Ａおよび１Ｂ）、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、および肺癌（図２Ｂ）においてＳＵＶ４２０Ｈ２の過剰発現が検出された。
【０１７９】
したがって、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子または該遺伝子によってコードされるタンパク質を用いて、本発明は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドに結合する物質をスクリーニングする方法を提供する。がん、例えば膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現のために、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドに結合する物質は、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２のいずれかまたは両方を過剰発現するがん細胞（例えば、膀胱癌細胞、子宮頸癌細胞、骨肉腫細胞、肺癌細胞、軟部組織腫瘍細胞、乳癌細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、食道癌細胞、または胃癌細胞）の増殖を抑制し得、かつしたがって、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２過剰発現のいずれかまたは両方に関連するがん（例えば、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、または胃癌）を治療または予防するために有用であり得る。したがって本発明はまた、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドを用いた、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２のいずれかまたは両方を過剰発現するがん細胞（例えば、膀胱癌細胞、子宮頸癌細胞、骨肉腫細胞、肺癌細胞、軟部組織腫瘍細胞、乳癌細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、食道癌細胞、および胃癌細胞）の増殖を抑制する物質をスクリーニングするための方法、ならびにＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２過剰発現のいずれかまたは両方に関連するがん（例えば、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌）を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法も提供する。
ＳＵＶ４２０Ｈ１を標的とする場合、がんは、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、および軟部組織腫瘍からなる群より選択され得る。
【０１８０】
ＳＵＶ４２０Ｈ２を標的とする場合、がんは、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、および肺癌からなる群より選択され得る。肺癌はＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣを含む。また、ＮＳＣＬＣは、腺癌、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、および大細胞癌を含む。
具体的には、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする本発明の方法の１つの態様において、該方法は、
（ａ）試験物質をＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドまたはその断片と該試験物質との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該ポリペプチドまたは断片に結合する試験物質を、がんを治療または予防するための候補物質として選択する段階
を含み得る。
【０１８１】
別の態様において、本発明はまた、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の過剰発現に関連するがんの治療もしくは予防に対するまたはがん細胞増殖の阻害に対する試験物質の治療効果を評価する方法も提供し得、該方法は、
（ａ）試験物質を、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドまたはその断片と該試験物質との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）試験物質の潜在的治療効果を段階（ｂ）で検出された結合活性と関連付ける段階であって、該ポリペプチドまたは断片に結合する試験物質ががんを治療または予防するための候補物質である場合に、該潜在的治療効果が示される、段階
を含む。
【０１８２】
本発明において、治療効果は、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的断片に対する結合活性と相関し得る。例えば、試験物質がＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的断片に結合する場合には、該試験物質を、治療効果を有する候補物質として同定または選択することができる。あるいは、試験物質がＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドにもその機能的断片にも結合しない場合には、該試験物質を、有意な治療効果を有さない物質として同定することができる。
【０１８３】
本発明の方法を以下でより詳細に説明する。
スクリーニングのために使用されるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドは、組み換えポリペプチドまたは天然由来のタンパクもしくはその部分ペプチドであり得る。試験物質と接触させるポリペプチドは例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。好ましい態様において、該ポリペプチドは、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２のいずれかもしくは両方を発現する細胞から単離されるか、または、インビトロにおいて試験物質と接触するように化学的に合成される。
【０１８４】
例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。そのようなスクリーニングは、例えば免疫沈降法によって、特に以下の様式で実施することができる。ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドをコードする遺伝子を外来遺伝子に対する発現ベクター、例えばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳおよびｐＣＤ８に挿入することによって、該遺伝子を宿主（例えば、動物、細菌、または真菌）細胞等において発現させることができる。
【０１８５】
発現に使用するプロモーターは、一般的に使用可能な任意のプロモーターであってよく、例えばＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson（ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141（1982））、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91: 217-23（1990））、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108: 193(1991)）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704(1987)）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466(1988)）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9(1987)）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94(1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946(1989)）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター等が含まれる。
【０１８６】
外来遺伝子を発現させるために、任意の方法、例えば電気穿孔法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26(1987)）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52(1987)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17(1984)、Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3(1984)）、リポフェクチン法（Derijard B., Cell 76: 1025-37(1994)、Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30(1993)、Rabindran et al., Science 259: 230-4(1993)）等に従って、宿主細胞への遺伝子の導入を実施することができる。
【０１８７】
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるポリペプチドは、その特異性が明らかになっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を該ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に導入することによって、モノクローナル抗体のエピトープを含む融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ−抗体システムを用いることができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。その複数のクローニング部位を使用することによって、例えばβ−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等との融合タンパク質を発現することができるベクターが、市販されている。また、融合によってＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの特性が変わらないように、数アミノ酸〜１２アミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することによって調製された、融合タンパク質も報告されている。エピトープ、例えばポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶタグ）、Ｅタグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）等、およびこれらを認識するモノクローナル抗体は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。
【０１８８】
免疫沈降において、適当な界面活性剤を使用して調製された細胞溶解物にこれらの抗体を加えることによって、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと、該ポリペプチドとの結合能を含むポリペプチドと、抗体とからなる。上記エピトープに対する抗体の使用に加えて、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドに対する抗体を使用して免疫沈降を実施することもでき、該抗体は上述のように調製することができる。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、例えばプロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースによって免疫複合体を沈降させることができる。ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子によってコードされるポリペプチドが、ＧＳＴなどのエピトープとの融合タンパク質として調製され得る場合、次に免疫複合体を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドに対する抗体の使用と同じように、これらのエピトープと特異的に結合する物質、例えばグルタチオン−セファロース４Ｂを用いて形成することができる。
免疫沈降は、例えば文献（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York（1988））の方法に従ってまたは準じて実施することができる。
【０１８９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは免疫沈降タンパク質の解析に一般的に使用され、結合したタンパク質を、適当な濃度のゲルを用いて該タンパク質の分子量によって解析することができる。ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドに結合したタンパク質は、クマシー染色または銀染色などの一般的な染色法では検出が困難であるため、該タンパク質に対する検出感度は、放射性同位体、３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインを含有する培養培地中で細胞を培養し、該細胞中のタンパク質を標識し、該タンパク質を検出することにより向上させることができる。タンパク質の分子量が明らかである場合、標的タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、その配列を決定することができる。
【０１９０】
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、例えばウェスト−ウェスタンブロット解析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90（1991））を使用することができる。具体的には、ファージベクター（例えばＺＡＰ）を用いて、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと結合するタンパク質を発現していると予想される培養細胞（例えばＳＷ７８０、ＲＴ４、Ａ５４９、ＬＣ３１９、およびＳＢＣ５）からｃＤＮＡライブラリを調製し、ＬＢ−アガロース上で該タンパク質を発現させ、発現した該タンパク質をフィルター上に固定し、精製および標識したＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドを上記のフィルターと接触させて、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと結合するタンパク質を発現したプラークを標識に従って検出することによって、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと結合するタンパク質を得ることができる。ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの結合を利用することによって、あるいはＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２と特異的に結合する抗体、またはＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと融合したペプチドもしくはポリペプチド（例えばＧＳＴ）を利用することによって、標識してもよい。放射性同位体または蛍光色素等を使用する方法を使用してもよい。
【０１９１】
あるいは、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612（1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92（1994）」を参照されたい）。
【０１９２】
ツーハイブリッドシステムにおいて、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドを、ＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合させ、酵母細胞内で発現させる。ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと結合するタンパク質を発現することが予想される細胞から発現したらＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域と融合するように、ｃＤＮＡライブラリを調製する。次に、該ｃＤＮＡライブラリを上記の酵母細胞に導入し、検出された陽性クローン（本発明のポリペプチドと結合するタンパク質が酵母細胞で発現すると、両者の結合がレポーター遺伝子を活性化し、これにより陽性クローンが検出可能となる）から、該ライブラリに由来するｃＤＮＡを単離する。上記で単離されたｃＤＮＡを大腸菌に導入して該タンパク質を発現させることによって、該ｃＤＮＡによってコードされたタンパク質を調製することができる。ＨＩＳ３遺伝子に加えて、レポーター遺伝子として、例えばＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
【０１９３】
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと結合する物質を、アフィニティークロマトグラフィを用いてスクリーニングしてもよい。例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化してもよく、試験物質を該カラムにアプライする。本明細書における試験物質は例えば、細胞抽出物、細胞溶解物等であり得る。試験物質をロードした後、カラムを洗浄し、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと結合した物質を調製することができる。試験物質がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、該配列に基づきオリゴＤＮＡを合成し、プローブとして該オリゴＤＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを得る。
【０１９４】
本発明において結合した物質を検出または定量するための手段として、表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサを使用することができる。そのようなバイオセンサを使用する場合、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと試験物質との相互作用は、標識を用いることなく微量のポリペプチドだけを用いて、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Pharmacia）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサを用いて、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと試験物質との結合を評価することが可能である。
【０１９５】
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドと結合するタンパク質だけでなく化学物質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するための、固定化されたＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドを合成化学物質、または天然物質バンク、またはランダムファージペプチドディスプレイライブラリに曝露した場合にＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドに結合する物質をスクリーニングする方法、および、ハイスループットなコンビナトリアル化学技術を用いてスクリーニングする方法（Wrighton et al., Science 273: 458-64（1996）、Verdine, Nature 384: 11-13（1996）、Hogan, Nature 384: 17-9(1996)）は、当業者に既知である。
【０１９６】
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの全長に加えて、該ポリペプチドの断片を、それが天然のＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を保持している限り、本発明のスクリーニングに用いることができる。そのような生物学的活性には、細胞増殖活性、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性、抗アポトーシス活性などが含まれる。
【０１９７】
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドおよびその断片がそれらの生物学的活性の少なくとも１つを保持している限り、該ポリペプチドまたはその断片を他の物質にさらに連結させてもよい。使用可能な物質には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が含まれる。これらの種類の修飾を行って、付加的な機能を付与すること、または該ポリペプチドおよび断片を安定化することができる。
【０１９８】
本発明の方法に用いられるＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドまたはその断片は、従来の精製法により天然タンパク質として自然界から、または選択されたアミノ酸配列に基づいて化学合成により、得ることができる。例えば、合成のために採用できる従来のペプチド合成法には、以下が含まれる：
１）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
２）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
３）ペプチド合成，丸善，１９７５；
４）ペプチド合成の基礎と実験，丸善，１９８５；
５）医薬品の開発（続  第１４巻）ペプチド合成，広川書店，１９９１；
６）ＷＯ９９／６７２８８；および
７）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【０１９９】
あるいは、ポリペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学的方法を通じて、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドを得ることができる（例えば、Morrison J., J Bacteriology 1977, 132: 349-51；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62）。例えば、最初に、目的タンパク質を発現可能な形態で（例えば、プロモーターを含む調節配列の下流に）コードするポリヌクレオチドを含む適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換し、次に該宿主細胞を培養して、該タンパク質を産生させる。より具体的には、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、またはｐＣＤ８などの、外来遺伝子を発現させるためのベクターに、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドをコードする遺伝子を挿入することにより、該遺伝子を宿主（例えば、動物）細胞等で発現させる。発現用に、プロモーターを用いることができる。例えばＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982, 83-141）、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 1990, 91:217-23）、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 1991, 108:193）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 1987, 152:684-704）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 1988, 8:466）、ＣＭＶ最初期プロモーター（Seed et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:3365-9）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen et al., J Mol Appl Genet 1982, 1:385-94）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 1989, 9:946）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター等を含む、一般的に用いられている任意のプロモーターを使用することができる。ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現させるための宿主細胞へのベクターの導入は、任意の方法、例えばエレクトロポレーション法（Chu et al., Nucleic Acids Res 1987, 15:1311-26）、リン酸カルシウム法（Chen et al., Mol Cell Biol 1987, 7:2745-52）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 1984, 12:5707-17；Sussman et al., Mol Cell Biol 1985, 4:1641-3）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ法（Derijard B, Cell 1994, 7:1025-37；Lamb et al., Nature Genetics 1993, 5:22-30；Rabindran et al., Science 1993, 259:230-4）等に従って行うことができる。
【０２００】
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドを、インビトロ転写およびインビトロ翻訳系で作製することもできる。
試験物質と接触させるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドは、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であってよい。
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドに結合する物質として本方法によってスクリーニングされる試験物質は、がんを治療または予防する可能性を有する候補物質であり得る。これらの候補物質ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療物質を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、これらの候補物質を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を過剰発現するがん細胞と接触することにより、がん細胞増殖を抑制する能力についてさらに調べることができる。
【０２０１】
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性を抑制する物質のスクリーニング：
本発明は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性（例えば、がん細胞増殖増強活性）を抑制する物質をスクリーニングする方法、ならびに膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌を含む、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２過剰発現のいずれかまたは両方に関連するがんを治療または予防するための候補物質をスクリーニングする方法を提供する。ＳＵＶ４２０Ｈ１を標的とする場合、がんは、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、および軟部組織腫瘍からなる群より選択され得る。ＳＵＶ４２０Ｈ２を標的とする場合、がんは、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、および肺癌からなる群より選択され得る。肺癌はＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣを含む。また、ＮＳＣＬＣは、腺癌、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、および大細胞癌を含む。
【０２０２】
したがって本発明は、以下の段階を含む、がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補物質をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）試験物質をＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下で検出された該ポリペプチドの生物学的活性と比較して、該ポリペプチドの生物学的活性を抑制する該試験物質を選択する段階。
【０２０３】
別の態様において、本発明は、以下の段階を含む、がんの治療もしくは予防、またはがん細胞増殖の阻害に対する試験物質の治療効果を評価する方法を提供する：
（ａ）試験物質をＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）該試験物質の潜在的治療効果を段階（ｂ）で検出された生物学的活性と関連付ける段階であって、試験物質の非存在下で検出された該ポリペプチドの生物学的活性と比較して、該試験物質が該ポリペプチドの生物学的活性を抑制する場合に、該潜在的治療効果が示される、段階。
【０２０４】
代替的に、いくつかの態様において、本発明は、以下の段階を含む、がんの治療もしくは予防、または、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２のいずれかもしくは両方の過剰発現に関連するがんの阻害に対する試験物質の治療効果を評価または推定するための方法を提供する：
（ａ）試験物質を、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）潜在的治療効果を試験物質と関連付ける段階であって、試験物質の非存在下で検出されたＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの生物学的活性と比較して、該試験物質が該ポリペプチドの生物学的活性を抑制する場合に、該潜在的治療効果が示される、段階。
【０２０５】
そのようながんには、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌が含まれる。本発明において、治療効果は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性と相関し得る。例えば、試験物質が、該物質の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性を抑制または阻害する場合には、該試験物質を、治療効果を有する候補物質として同定または選択することができる。あるいは、試験物質が、該物質の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性を抑制または阻害しない場合には、該試験物質を、有意な治療効果を有さない物質として同定することができる。
【０２０６】
本発明の方法を以下により詳細に説明する。
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性を保持する限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに用いることができる。例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドおよびその機能的同等物を、本スクリーニング法において用いることができる。ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性の例には、細胞増殖増強活性、メチルトランスフェラーゼ活性、および抗アポトーシス活性が含まれる。これらの活性を、スクリーニングの指標として用いることができる。
【０２０７】
このスクリーニングにより単離された物質は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってその機能を阻害する分子を指す。該用語はまた、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２をコードする遺伝子の発現を低下させるかまたは阻害する分子も指す。さらに、このスクリーニングによって単離された物質は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドとその他の分子（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）とのインビボ相互作用を阻害する物質の候補である。
【０２０８】
本発明において、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現を抑制することにより、細胞増殖が低減する。したがって、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性を低下させる候補物質をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性のある候補物質を同定することができる。候補物質ががんを治療または予防する可能性は、がん、例えば膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌に対する治療物質を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
【０２０９】
本方法において検出される生物学的活性が細胞増殖増強活性である場合には、例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドを発現する細胞を調製し、該細胞を試験物質の存在下で培養し、細胞増殖の速度を測定すること、細胞周期を測定すること等、および、例えば図３および４に示される細胞の生存またはコロニー形成活性を測定することによって、それを検出することができる。ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２を発現する細胞の増殖速度を低下させる物質を、がん、特に膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌を含むがんを治療または予防するための候補物質として選択することができる。いくつかの態様において、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現する細胞は、インビトロでＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を外因的または内因的に発現する、単離された細胞または培養細胞であってもよい。
【０２１０】
より具体的には、本方法は、
（ａ）試験物質を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２を過剰発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）の細胞において細胞増殖増強活性を測定する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下における細胞増殖増強活性と比較して、細胞増殖増強活性を低下させる該試験物質を選択する段階
を含み得る。
いくつかの態様において、本発明の方法は、
（ｄ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２をほとんどまたは全く発現しない細胞に対する影響を有さない試験物質を選択する段階
をさらに含み得る。
【０２１１】
本発明の方法において検出される生物学的活性がメチルトランスフェラーゼ活性である場合、ポリペプチドを、基質（例えば、ヒストンＨ４Ｋ２０、Ｈ３Ｋ９）および補因子（例えば、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）と、該基質のメチル化に適した条件下で接触させ、該基質のメチル化レベルを検出することによって、メチルトランスフェラーゼ活性を測定することができる。
より具体的には、本方法は、
（ａ）試験物質の存在下で、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドまたはその断片とメチル化のための基質を接触させる段階；
（ｂ）該基質のメチル化レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下で検出されたメチル化レベルと比較して、該基質のメチル化レベルを抑制する該試験物質を選択する段階
を含み得る。
【０２１２】
本発明において、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性を、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。例えば、適切なメチル化アッセイ条件下で、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２および基質を標識されたメチルドナーと共にインキュベーションすることができる。ヒストン（例えば、ヒストンＨ４）ペプチド（ヒストンの全長またはその断片）およびＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）を、それぞれ基質およびメチルドナーとして用いることができる。典型的な態様において、ヒストンＨ４の２０番目のリジンを含み、かつ、１０個もしくはそれ以上のアミノ酸残基、１５個もしくはそれ以上のアミノ酸残基、２０個もしくはそれ以上のアミノ酸残基、２５個もしくはそれ以上のアミノ酸残基、３０個もしくはそれ以上のアミノ酸残基、または３５個もしくはそれ以上のアミノ酸残基を有するヒストンＨ４断片を、基質として用いることができる。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および蛍光光度解析によって、ヒストンペプチドへの放射標識の移行を検出することができる。あるいは反応後に、濾過によってメチルドナーからヒストンペプチドを分離して、フィルター上に保持された放射標識の量をシンチレーション測定によって定量することもできる。メチルドナーに付着させることができるその他の適切な標識、例えば発色標識および蛍光標識、ならびにヒストンペプチドへのこれらの標識の移行を検出する方法が、当技術分野において公知である。
【０２１３】
あるいは、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性は、非標識メチルドナー、およびメチル化ヒストンペプチドを選択的に認識する試薬を用いて測定することもできる。例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチド、メチル化される基質（例えば、ヒストンＨ４またはその断片）、およびメチルドナーを、該基質のメチル化を可能にする条件下でインキュベーションした後、免疫学的方法によってメチル化基質のレベルを検出することができる。メチル化基質を認識する抗体を用いる任意の免疫学的技法を、検出に使用することができる。例えば、メチル化ヒストン（例えば、ヒストンＨ４Ｋ２０ｍｅ２またはヒストンＨ４Ｋ２０ｍｅ３）に対する抗体が市販されている（abcam Ltd.）。メチル化ヒストンを認識する抗体を用いるＥＬＩＳＡまたは免疫ブロッティングを、本発明に使用することができる。
【０２１４】
さらに、メチルトランスフェラーゼ活性を検出する本発明の方法は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドを発現する細胞を調製し、該細胞を試験物質の存在下で培養して、例えばメチル化領域に特異的に結合する抗体の使用によりヒストン（特に、ヒストンＨ４Ｋ２０）のメチル化レベルを測定することによって、行うことができる。
より具体的には、本方法は、
［１］試験物質を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２を発現する細胞と接触させる段階；
［２］ヒストンのメチル化レベルを検出する段階；および
［３］試験物質の非存在下におけるメチル化レベルと比較して、ヒストンのメチル化レベルを低下させる該試験物質を選択する段階
を含み得る。
【０２１５】
本発明において、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現を抑制することにより、癌細胞のアポトーシスが誘導される（図５Ａおよび５Ｂ）。本発明の方法において検出される生物学的活性が抗アポトーシス活性である場合には、例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドを発現する細胞を調製し、該細胞を試験物質の存在下で培養して、例えば図５Ａおよび５Ｂに示されるように、アポトーシス誘導のマーカーであるＰＡＲＰ１および／もしくはカスパーゼ３の切断を検出することによって、またはＴＵＮＥＬアッセイによりＤＮＡ断片化を検出することによって、これを検出することができる。ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２を発現する細胞のアポトーシスを誘導する物質は、がん、特に膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌を含むがんを治療または予防するための候補物質として選択され得る。いくつかの態様において、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現する細胞は、インビトロでＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を外因的または内因的に発現する、単離された細胞または培養細胞であってよい。
【０２１６】
より具体的には、本方法は、
（ａ）試験物質を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２を過剰発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）の細胞のアポトーシスレベルを検出する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下におけるアポトーシスレベルと比較して、アポトーシスレベルを上昇させる該試験物質を選択する段階
を含み得る。
いくつかの態様において、本発明の方法は、
（ｄ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２をほとんどまたは全く発現しない細胞に対する影響を有さない試験物質を選択する段階
をさらに含み得る。
【０２１７】
ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドのいずれかまたは両方を発現する細胞には、例えば、がん、例えば膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、または胃癌から樹立された細胞株が含まれ、このような細胞が該遺伝子を発現する限り、該細胞を本発明の上記スクリーニングに用いることができる。あるいは、該遺伝子を発現するように、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドの発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることもできる。
【０２１８】
本明細書において定義される「生物学的活性（例えば、細胞増殖増強活性、メチルトランスフェラーゼ活性、または抗アポトーシス活性）を抑制する」とは、好ましくは、該物質の非存在下と比較した少なくとも１０％の抑制、少なくとも２５％、５０％、もしくは７５％の抑制、または少なくとも９０％の抑制であり得る。
いくつかの態様では、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドを発現しない対照細胞が用いられる。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補物質またはＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２関連疾患を治療もしくは予防するための候補物質をスクリーニングする方法も提供する：
ａ）試験物質の存在下で、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的断片を発現する細胞、およびＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドもその機能的断片も発現しない対照細胞を培養する段階；
ｂ）該タンパク質を発現する細胞および対照細胞の生物学的活性を検出する段階；ならびに
ｃ）対照細胞においておよび試験物質の非存在下で検出された生物学的活性と比較して、該タンパク質を発現する細胞において生物学的活性を阻害する該試験物質を選択する段階。
【０２１９】
さらに、本発明はまた、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２を発現するがん細胞、例えば膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、または胃癌の細胞の増殖を阻害するまたは低減させるための候補物質をスクリーニングする方法、ならびに、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２過剰発現に関連するがん、例えば膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、または胃癌を治療または予防するための候補物質をスクリーニングする方法も、提供する。
【０２２０】
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現を改変する物質のスクリーニング：
本発明は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現を阻害する物質は、がん細胞（例えば、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病、食道癌、または胃癌の細胞）の増殖を抑制すると予想され、よってがん（例えば、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病、食道癌、または胃癌）を治療または予防するのに有用であり得る。したがって、本発明はまた、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２を過剰発現するがん細胞、例えば膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病、食道癌、および胃癌の細胞の増殖を抑制する物質をスクリーニングする方法、ならびにＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２過剰発現に関連するがん、例えば膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病、食道癌、または胃癌を治療または予防するための候補物質をスクリーニングする方法も提供する。いくつかの態様において、ＳＵＶ４２０Ｈ１に関連するがんは、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、および軟部組織腫瘍を含み、ＳＵＶ４２０Ｈ２に関連するがんは、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、食道癌、胃癌、および肺癌を含む。
【０２２１】
ＳＵＶ４２０Ｈ１を標的とする場合、がんは、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、および軟部組織腫瘍からなる群より選択され得る。ＳＵＶ４２０Ｈ２を標的とする場合、がんは、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、および肺癌からなる群より選択され得る。肺癌はＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣを含む。また、「ＮＳＣＬＣ」とは、腺癌、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、および大細胞癌を含む。
【０２２２】
本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば以下の段階を含み得る：
（ａ）試験物質を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）該細胞におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下で検出された発現レベルと比較して、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを低下させる該試験物質を選択する段階。
【０２２３】
さらに、本発明は、
（ａ）物質を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験物質の潜在的治療効果を段階（ｂ）で検出された発現レベルと関連付ける段階であって、該試験物質の非存在下で検出された発現レベルと比較して、試験物質がＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを低下させる場合に、該潜在的治療効果が示される、段階
を含み得るがん細胞増殖の抑制またはがんの治療もしくは予防に対する試験物質の治療効果を評価する方法を提供する。
【０２２４】
本発明において、治療効果は、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルと相関し得る。例えば、試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して、該試験物質がＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを低下させる場合には、該試験物質を、治療効果を有する候補物質として同定または選択することができる。あるいは、試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して、該試験物質がＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを低下させない場合には、該試験物質を、有意な治療効果を有さない物質として同定することができる。
【０２２５】
本発明の方法を以下により詳細に説明する。
ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現する細胞には、例えば、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、例えばＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病、食道癌、または胃癌から樹立された細胞株が含まれ；そのような細胞を、本発明の上記スクリーニング法に用いることができる（例えば、ＳＷ７８０、ＲＴ４、Ａ５４９、ＬＣ３１９、ＳＢＣ５）。発現レベルは、当業者に周知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫染色、およびフローサイトメトリー解析によって評価することができる。本明細書において定義される「発現レベルを低下させる」とは、試験物質の非存在下における発現レベルと比較した、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルの少なくとも１０％の低下、少なくとも２５％、５０％、もしくは７５％のレベル低下、または少なくとも９５％のレベル低下であり得る。本明細書における試験物質には、例えば、化学物質、二本鎖分子等が含まれる。化学物質および二本鎖分子の調製のための方法は、上記の説明に記載されている。スクリーニング法においては、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現レベルを低下させる試験物質を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２過剰発現に関連するがん、例えば膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、例えばＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病、食道癌、および胃癌の治療または予防に用いられる候補物質として選択することができる。いくつかの態様において、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を発現する細胞は、インビトロでＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を外因的または内因的に発現する、単離された細胞または培養細胞であってもよい。
これらの候補物質ががんを治療または予防する可能性は、がんの治療物質を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。
【０２２６】
あるいは、本発明のスクリーニング方法は、以下の段階を含み得る：
（ａ）試験物質を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を検出する段階；ならびに
（ｃ）試験物質の非存在下で検出される発現レベルまたは活性と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる該試験物質を選択する段階。
【０２２７】
さらに本発明は、がんの治療もしくは予防またはがん細胞増殖の阻害における試験物質の治療効果を評価する方法を提供し、該方法は、
（ａ）試験物質を、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を検出する段階；ならびに
（ｃ）試験物質の潜在的治療効果を段階（ｂ）で検出された発現レベルまたは活性と関連付ける段階であって、試験物質の非存在下で検出される発現レベルまたは活性と比較して、該試験物質が該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる場合に、該潜在的治療効果が示される、段階
を含む。
【０２２８】
本発明において、治療効果はレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性と相関し得る。例えば、試験物質が、試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる場合には、該試験物質を、治療効果を有する候補物質として同定または選択することができる。あるいは、試験物質が、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させない場合には、該試験物質を、有意な治療効果を有さない物質として同定することができる。
【０２２９】
適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。例えば、レポーター遺伝子はルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を含み、宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等を含む。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の転写調節領域に連結することにより調製することができる。本明細書におけるＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２の転写調節領域とは、開始コドンから少なくとも５００ｂｐ上流まで、例えば少なくとも１，０００ｂｐ、５０００ｂｐ、または１０，０００ｂｐ上流までの領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離することができ、またはＰＣＲによって増やすことができる。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列を該遺伝子のいずれか一つの転写調節領域に連結することにより調製することができる。転写調節領域を同定する方法と、同じくアッセイプロトコールも、周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
【０２３０】
前記レポーター構築物を含むベクターを宿主細胞に導入することができ、該レポーター遺伝子の発現または活性を、当技術分野で周知の方法により（例えば、ルミノメーター、吸光分光計、フローサイトメーター等を用いて）検出することができる。本明細書において定義される「発現または活性を低下させる」とは、物質の非存在下と比較した、レポーター遺伝子の発現または活性の、少なくとも１０％の低下、少なくとも２５％、少なくとも５０％、もしくは少なくとも７５％の低下、または少なくとも９５％の低下を意味する。
【０２３１】
本発明において、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現の抑制は、細胞増殖を低減させる。したがって、レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる候補物質をスクリーニングすることにより、がんを治療または予防する可能性を有する候補物質を同定することができる。これらの候補物質ががんを治療または予防する可能性は、がんに対する治療物質を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドに結合する物質ががんの活性も阻害する場合、そのような物質はＳＵＶ４２０Ｈ１またはＳＵＶ４２０Ｈ２特異的な治療効果を有すると結論づけることができる。例えば、本発明の文脈において、そのような活性にはがん細胞増殖およびがんの転移活性が含まれる。
【０２３２】
以下の実施例において本発明の局面を説明するが、これらは添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
特記しない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料を用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。
【実施例】
【０２３３】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、この実施例は添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］材料および方法
組織試料およびＲＮＡ調製
膀胱摘除術（全摘除術／単純摘除術／部分摘除術を含む）または膀胱腫瘍の経尿道的切除術（ＴＵＲ−Ｂｔ）のいずれかの際に、原発性尿路上皮癌の外科標本１２４例を採取し、液体窒素中で瞬時に凍結した。正常膀胱尿路上皮の標本２８例を、悪性腫瘍のエビデンスがない患者の肉眼上正常な膀胱尿路上皮の領域から採取した。本試験への組織の使用は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ｓｈｉｒｅ  Ｌｏｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。３０μｍの切片計３０枚をＲＮＡ抽出用にホモジナイズし、ＲＮＡ抽出に使用した組織に隣接する７μｍの「サンドウィッチ」切片２枚を切り出し、染色し、独立したコンサルタントである尿路組織病理学者により細胞充実度および腫瘍悪性度について評価した。加えて、炎症細胞浸潤の程度に従って、切片をグレード分類した（低度、中度、および重度）。顕著な炎症細胞浸潤を示す試料を排除した［Wallard MJ,et al., British journal of cancer 2006;94: 569-577］。
製造業者のプロトコールに従って、ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（商標）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅ工程を含むＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔｓ（商標）（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃｒａｗｌｅｙ、ＵＫ）を用いて、ＲＮＡ純度を最適化した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００（商標）による全ＲＮＡ生物分析を行った。各試料由来の１μｌの再懸濁ＲＮＡをＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ（商標）にアプライし、製造業者の説明書に従って処理した。チップおよび試薬すべての供給元は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（Ｗｅｓｔ  Ｌｏｔｈｉａｎ、ＵＫ）であった。
【０２３４】
逆転写
ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）ＮＤ１０００分光光度計（Ｎｙｘｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、全ＲＮＡ濃度を測定した。製造業者の説明書に従って、２μｇのランダムヘキサマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を、２０μｌ反応で用いて、１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。次いで、ｃＤＮＡをＰＣＲ等級の水で１：１００希釈し、−２０℃で保存した。
【０２３５】
レーザーキャプチャーマイクロダイセクション
レーザーキャプチャーマイクロダイセクション用の組織は、上記に概説した手順に従って予め採取した。各組織から７μｍ厚の連続した切片５枚を切り出し、製造業者のプロトコールに従ってＨｉｓｔｏｇｅｎｅ（商標）染色液（Ａｒｃｔｕｒｕｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて染色した。その直後に、Ｐｉｘ  Ｃｅｌｌ  ＩＩレーザーキャプチャー顕微鏡（Ａｒｃｔｕｒｕｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いるマイクロダイセクションのためにスライドを転写した。この技法は、低出力赤外レーザーを使用して関心対象の細胞を覆う熱可塑性フィルムを融解させ、これに細胞を付着させるものである。
【０２３６】
各組織において間質区画および上皮／がん性区画の両方から、およそ１０，０００個の細胞をマイクロダイセクションした。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃｒａｗｌｅｙ、ＵＫ）を用いて、ＲＮＡを抽出した。混入を防ぐために、腫瘍の顕著な炎症領域を含むがんもしくは間質または顕著な炎症細胞浸潤を含む間質の領域は回避した。
全ＲＮＡを逆転写し、上記のようにｑＲＴ−ＰＣＲを行った。そのような少量の試料からのＲＮＡは低収量であることを考慮し、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）定量は実施しなかったが、無傷の出発ＲＮＡの量の正確な尺度としての内在性１８Ｓ  ＣＴ値に対する補正を用いた。転写物分析は、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子に対して実施した。
【０２３７】
マイクロダイセクションの精度を検証するため、ビメンチンおよびウロプラキンに対するプライマーおよびプローブを調達し、製造業者の説明書（Ａｓｓａｙｓ  ｏｎ  ｄｅｍａｎｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）に従ってｑＲＴ−ＰＣＲを行った。ビメンチンは主に間葉系由来細胞で発現し、間質マーカーとして使用された。ウロプラキンは尿路上皮分化のマーカーであり、上皮由来腫瘍の最大９０％において保存されている［Olsburgh J,et al., The Journal of pathology 2003;199:41-4921］。
【０２３８】
細胞培養
細胞株はすべて、適切な培地中で単層で培養した：２５３Ｊ、２５３Ｊ−ＢＶ、ＨＴ１１９７、ＨＴ１３７６、Ｊ８２、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭＵＣ３膀胱癌細胞、およびＳＢＣ５小細胞肺癌細胞には、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）；５６３７膀胱癌細胞、ならびにＡ５４９、Ｈ２１７０、およびＬＣ３１９非小細胞肺癌細胞には、ＲＰＭＩ１６４０培地；ＥＪ２８膀胱癌細胞およびＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ非小細胞肺癌細胞には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）；ＲＴ４およびＴ２４膀胱癌細胞には、マッコイ５Ａ培地；ＳＷ７８０細胞には、１０％ウシ胎仔血清および１％抗菌／抗真菌溶液（Ｓｉｇｍａ）を補充したリーボビッツＬ−１５。細胞はすべて、５％ＣＯ２を含む（２５３Ｊ、２５３Ｊ−ＢＶ、ＨＴ１１９７、ＨＴ１３７６、Ｊ８２、ＳＣａＢＥＲ、ＵＭＵＣ３、ＳＢＣ５、５６３７、Ａ５４９  Ｈ２１７０、ＬＣ３１９、ＥＪ２８、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＲＴ４、およびＴ２４）またはＣＯ２を含まない（ＳＷ７８０）加湿空気中で３７℃で維持した。製造業者のプロトコールに従ってＦｕＧＥＮＥ６（商標）（ＲＯＣＨＥ、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、細胞にトランスフェクトした。
【０２３９】
定量的リアルタイムＰＣＲ
上記のように、膀胱癌組織１２４例および正常膀胱組織２８例をＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ'ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌで調製した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応のために、ヒトＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）、ＳＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）、ＳＵＶ４２０Ｈ１、およびＳＵＶ４２０Ｈ２のすべてに対する特異的プライマーを設計した（表１のプライマー配列）。製造業者のプロトコールに従ってＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。５０％の、ＵＮＧを含まないＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮユニバーサルＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）、各５０ｎＭのフォワードおよびリバースプライマー、ならびに２μｌの逆転写ｃＤＮＡを適用した。増幅条件は、まず９５℃で５分間、次に、９５℃で１０秒間、５５℃で１分間、および７２℃で１０秒間からそれぞれなる４５サイクルであった。この後、融解曲線を描くために条件を９５℃で１５秒間、６５℃で１分間に設定して、５０℃まで１０秒間冷却した。標的遺伝子増幅のための反応条件は上記の通りであり、逆転写ＲＮＡ  ５ｎｇの同等物を各反応において使用した。
【０２４０】
試料中の相対ＲＮＡレベルを決定するため、１８Ｓ反応についてはＲＮＡ  ２〜０．６２５ｎｇおよび全標的遺伝子についてはＲＮＡ  ２０〜０．５ｎｇの範囲に及ぶｃＤＮＡの一連の２倍希釈物から、ＰＣＲ反応の検量線を作成した。ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７７００により、４５サイクルのＰＣＲ反応全体にわたる蛍光レベルの変化が測定され、各試料について、増幅が対数期に入る点と相関するサイクル閾値（Ｃｔ）の値が作成された。この値を出発鋳型の量の指標として使用した；したがって、Ｃｔ値が小さいほど、最初の無傷ｃＤＮＡの量がより多いことが示された。
【０２４１】
【表１】
2013538568.tif 000002
【０２４２】
ｓｉＲＮＡによるトランスフェクション
ヒトＳＵＶ４２０Ｈ１／Ｈ２転写物または対照ｓｉＲＮＡとしてＥＧＦＰ転写物を標的とするためのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖を、ＳＩＧＭＡ  Ｇｅｎｏｓｙｓから購入した。ｓｉＲＮＡ配列を表２に記載する。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、４８時間にわたりｓｉＲＮＡ二重鎖（１００ｎＭ最終濃度）を膀胱癌細胞株および肺癌細胞株にトランスフェクトし、Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（同仁堂）を用いて細胞生存率を確認した。
【０２４３】
【表２】
2013538568.tif 000003
【０２４４】
ＳＵＶ４２０Ｈ２を恒常的に発現する安定発現株の構築
Ｖ５タグ付ＳＵＶ４２０Ｈ２発現ベクター（ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＳＵＶ４２０Ｈ２）を調製し、ＳＵＶ４２０Ｈ２を条件付きで安定に発現させるために、そのゲノム内にＦｌｐ組換え標的（ＦＲＴ）部位を含むＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトした。Ｖ５タグ付クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）発現ベクター（ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＣＡＴ）を、発現の陰性対照として使用した。タンパク質レベルでのＳＵＶ４２０Ｈ２発現は、ウェスタンブロットおよび免疫細胞化学によって評価した。
【０２４５】
細胞周期解析のためのフローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳ）
ＳＵＶ４２０特異的ｓｉＲＮＡで処理したＡ５４９細胞を調製し、ＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃で７２時間培養した。次に、トリプシン処理後の細胞を回収し、アッセイ緩衝液１，０００μｌで２回洗浄し、５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その後、上清を廃棄し、アッセイ緩衝液２００μｌおよび固定緩衝液１，０００μｌを添加して、試料を室温で１時間インキュベーションした。最後に、ヨウ化プロピジウム試薬を添加し、フローサイトメーター（Ｃｅｌｌ  Ｌａｂ  Ｑｕａｎｔａ  ＳＣ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）により細胞周期プロファイルを解析した。各細胞分裂の割合を算出し、スチューデントのｔ検定を用いることによって統計学的に解析した。
【０２４６】
細胞周期および細胞増殖の連結アッセイ
５'−ブロモ−２'−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）フローキット（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、細胞周期動態を判定し、かつ増殖細胞のＤＮＡ中へのＢｒｄＵの取り込みを測定した。アッセイは、製造業者のプロトコールに従って行った。簡潔に説明すると、６ウェル組織培養プレートに細胞（ウェル当たり２×１０５個）を播種して一晩置き、１０％ＦＢＳを含む培地において最適化濃度のｓｉＲＮＡで７２時間処理した後、１０μＭのＢｒｄＵを添加して、さらに３０分間インキュベーションを継続した。浮遊細胞および接着細胞の両方を処理時点当たり３連のウェルからプールし、パラホルムアルデヒドおよび界面活性剤サポニンを含む溶液中で固定し、ＤＮＡａｓｅと共に３７℃で１時間インキュベーションした（試料当たり３０μｇ）。ＦＩＴＣ結合抗ＢｒｄＵ抗体（洗浄緩衝液で１：５０希釈；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加し、インキュベーションを室温で２０分間継続した。細胞を洗浄緩衝液で洗浄し、全ＤＮＡを７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ；試料当たり２０μＬ）で染色した後、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いてフローサイトメトリー解析を行い、ＣＸＰ解析ソフトウェアＶｅｒ２．２（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いて全ＤＮＡ含量（７−ＡＡＤ）を測定した。
【０２４７】
アポトーシスアッセイ
アポトーシスアッセイは、ウェスタンブロッティングおよびＴＵＮＥＬアッセイにより行った。Ａ５４９細胞およびＳＢＣ５細胞を調製した後、ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＳＵＶ４２０Ｈ２処理を行い、３７℃で７２時間インキュベーションした。全細胞溶解物をＲＩＰＡ様緩衝液により抽出し、αＰＡＲＰ−１抗体（Ｆ−２、マウスモノクローナル、ｓｃ−８００７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、α−切断型カスパーゼ−３抗体（Ａｓｐ１７５、ウサギポリクローナル、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および内部対照としてのαＧＡＰＤＨ抗体（Ｖ−１８、マウスモノクローナル、ｓｃ−２０３５７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いてウェスタンブロッティングを行った。ＴＵＮＥＬアッセイは、製造業者のプロトコールに従って、ＡｐｏｐＴａｇ（商標）フルオレセイン直接インサイチューアポトーシス検出キット（ＣＨＥＭＩＣＯＮ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）により行った。細胞を、２０μｌの１％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）中に細胞１×１０６個の密度で、１０分間室温で固定した。続いて、７５μｌの平衡化緩衝液を適用して１０秒間反応させた後、作用強度のＴｄＴ酵素を適用して、３７℃の加湿チャンバー内に１時間置いた。５５μｌの停止／洗浄緩衝液により、この反応を停止させた。アポトーシス細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８により染色し、核をヨウ化プロピジウム；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）５９４により対比染色した。
【０２４８】
［実施例２］ＳＵＶ４２０Ｈ１／Ｈ２発現は臨床癌組織において上方制御される
イギリス人臨床膀胱癌試料の小サブセットにおいて様々なヒストンメチルトランスフェラーゼの発現レベルを調べたところ、非癌性試料と比較して、癌試料においてＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２の有意な過剰発現が見出された（データは示さず）。続いて、膀胱癌試料１２４例および正常対照試料２４例（イギリス人）を解析し、正常細胞と比較して、腫瘍細胞においてＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２発現レベルが有意に上昇していることが確認された（図１Ａ）。性別、喫煙歴、悪性度、転移、および再発による腫瘍の細分類から、それらの発現レベルにおける有意差は認められなかった（表３）。次いで、いくつかの日本人臨床膀胱癌試料におけるＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２の発現パターンをｃＤＮＡマイクロアレイにより解析し、日本人患者の膀胱癌における有意な過剰発現を確認した（図１Ｂ）。加えて、多数の臨床試料による以前のマイクロアレイ発現解析［Kikuchi T, et al., Oncogene2003;22:2192-2205、Nakamura T, et al., Oncogene 2004;23:2385-2400、Nishidate T, et al., Int J Oncol 2004;25:797-819、Takata R, et al., Clin Cancer Res 2005;11:2625-2636.］により、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２発現の両方が様々な種類のがんにおいて有意に上方制御されることが示された（図２および表４）。これらの結果から、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２発現の調節不全が多くの種類のヒトがんに関与し得ることが示される。
【０２４９】
【表３】
2013538568.tif 000004
【０２５０】
【表４】
2013538568.tif 000005
【０２５１】
［実施例３］ＮＳＣＬＣ患者に関するＳＵＶ４２０Ｈ２発現と予後不良との関連性
次に、本発明者らは、膀胱腫瘍組織および様々な種類の正常組織の間でＳＵＶ４２０Ｈ２発現を比較し、膀胱腫瘍組織におけるＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルが正常組織におけるものよりも有意に高いことを見出した（図１Ｃ）。一貫して、膀胱癌細胞株におけるＳＵＶ４２０Ｈ２発現は、正常細胞株と比較して著しく高い（図３Ｂ）。
【０２５２】
また、ＳＵＶ４２０Ｈ２発現が、対応する非新生物組織と比較して肺腫瘍組織においても上昇していることが、ｃＤＮＡマイクロアレイ実験から示された（図２Ｂ）。肺癌組織におけるＳＵＶ４２０Ｈ２タンパク質発現の有意性をより詳細に解析するために、本発明者らは、外科的切除術を受けた３４０名のＮＳＣＬＣ患者由来の組織切片を含む組織マイクロアレイに対する免疫組織化学的解析を行った（図２Ｃ）。ＳＵＶ４２０Ｈ２は３４０例のうち２９５例において陽性染色され（８６．８％）、４５例において陰性染色された（１３．２％）。続いて、本発明者らは、ＳＵＶ４２０Ｈ２発現と臨床転帰との関連性を解析し、ＮＳＣＬＣ患者におけるＳＵＶ４２０Ｈ２の発現が、男性（Ｐ＝０．０３０５、フィッシャーの直接確率検定；表５）および原発腫瘍の切除後の腫瘍特異的５年生存率（ログランク検定によりＰ＝０．００２３；図２Ｄ）と有意に関連していることを見出した。単変量解析から、ＮＳＣＬＣ患者における予後不良と、ＳＵＶ４２０Ｈ２発現、年齢、性別、組織型（非ＡＤＣ対ＡＤＣ）、ｐＴ病期（腫瘍サイズ、Ｔ１対Ｔ２＋Ｔ３）、およびｐＮ病期（リンパ節状態、Ｎ０対Ｎ１＋Ｎ２）を含む複数の因子との間の関連性が明らかになった（表６）。加えて、多変量解析からも、年齢、ｐＴ、およびｐＮ因子と同様に、ＳＵＶ４２０Ｈ２状態が、本研究に登録された外科的治療を受けたＮＳＣＬＣ患者の独立予後因子として統計学的有意性を示すことが明らかになった（表６）。
これらの結果は、ＳＵＶ４２０Ｈ２発現の調節不全が多くの種類のヒトがんに関与し得、かつ外科的切除術後のＮＳＣＬＣ患者における負の転帰と相関し得ることを意味する。
【０２５３】
【表５】
2013538568.tif 000006
【０２５４】
【表６】
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【０２５５】
［実施例４］ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２による癌細胞増殖の調節
ヒトの発がんにおけるＳＵＶ４２０Ｈ１／Ｈ２の役割を調べるため、ＳＵＶ４２０Ｈ１を標的とする２種類の独立したｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＵＶ４２０Ｈ１＃１および＃２）およびＳＵＶ４２０Ｈ２を標的とする２種類の独立したｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＵＶ４２０Ｈ２＃１および＃２）を用いてノックダウン実験を行った。最初に、様々な膀胱癌細胞株および肺癌細胞株におけるＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２発現を調べ、正常細胞株における発現レベルと比較した（図３Ａおよび３Ｂ）。膀胱癌細胞株および肺癌細胞株におけるＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２の発現レベルは、正常細胞株よりも有意に高かった。加えて、ｓｉＳＵＶ４２０Ｈ１およびｓｉＳＵＶ４２０Ｈ２をトランスフェクトしたＡ５４９細胞およびＳＢＣ５細胞におけるＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２発現は、対照ｓｉＲＮＡであるｓｉＥＧＦＰをトランスフェクトした細胞におけるものと比較して有意に抑制された（図３Ｃおよび３Ｄ）。同じｓｉＲＮＡを用いて、２種類の膀胱癌細胞株（ＳＷ７８０、ＲＴ４）および３種類の肺癌細胞株（Ａ５４９、ＬＣ３１９、およびＳＢＣ５）において細胞増殖アッセイを行ったところ、ｓｉＳＵＶ４２０Ｈ１およびｓｉＳＵＶ４２０Ｈ２による有意な増殖抑制が認められた（図４Ａおよび４Ｂ）。ＳＵＶ４２０Ｈ２のノックダウン後の癌細胞増殖抑制は、コロニー形成アッセイによっても確認された（図４Ｅ）。ｓｉＲＮＡによって誘導された増殖抑制の機構をさらに評価するため、本発明者らは、フローサイトメトリーを用いて、ｓｉＲＮＡによる処理後の癌細胞の細胞周期状態を解析した（図４Ｃ）。ｓｉＳＵＶ４２０Ｈ２で処理した細胞では、対照ｓｉＲＮＡで処理した細胞と比較して、サブＧ１期の癌細胞の割合が有意に高かった（図４Ｃ下パネル）。この結果は、ＦＩＴＣ−ＢｒｄＵおよび７−ＡＡＤで染色した他のＦＡＣＳ解析によっても確認された（図４Ｆ）。これらのデータは、ＳＵＶ４２０Ｈ２のノックダウンが癌細胞のアポトーシスを誘導するようであることを意味する。ＳＵＶ４２０Ｈ２のノックダウンによるアポトーシス誘導をより詳細に検証するため、本発明者らは、ＰＡＲＰ１およびカスパーゼ３の切断をモニタリングするためのアポトーシスアッセイを行った。図５Ａに示されるように、ｓｉＳＵＶ４２０Ｈ２による処理後に、切断型のＰＡＲＰ１およびカスパーゼ３が観察された。さらに、ＴＵＮＥＬアッセイにより、ＳＵＶ４２０Ｈ２のノックダウン後の癌細胞のＤＮＡ断片化が示された（図５Ｂ）。これらの結果から、ｓｉＳＵＶ４２０Ｈ２による処理後にアポトーシスが誘導され得ることが明らかになる。
【０２５６】
ＳＵＶ４２０Ｈ２の上方制御ががん細胞増殖に影響を与える機構を解明するため、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘシステムを含むヒト胎児腎線維芽細胞（ＨＥＫ２９３）細胞（Ｔ−ＲＥｘ−２９３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＳＵＶ４２０Ｈ２過剰発現の影響を調べた。ＦＡＣＳ解析により細胞周期状態を解析し（図４Ｄ）、Ｔ−ＲＥｘ−ＳＵＶ４２０Ｈ２細胞におけるＳ期の割合が、対照細胞におけるそれと比較して有意に増加していることを見出した。これらの結果から、ＳＵＶ４２０Ｈ１／Ｈ２発現が、細胞周期進行の増強を通じてがん細胞の増殖において重要な役割を果たすこと、およびＳＵＶ４２０Ｈ２の阻害ががん細胞のサブＧ１期を誘導し得ることが示される。
これらの結果は、ＳＵＶ４２０Ｈクラスのヒストンメチルトランスフェラーゼとヒトの発がんとの関係を説明するものであり、これらの酵素が様々な種類の悪性腫瘍において理想的な治療標的となり得ることを実証した。
【０２５７】
産業上の利用可能性
本発明者らは、ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を特異的に標的とする二本鎖核酸分子によって、細胞増殖が抑制されることを示した。よって、ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子またはＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子を標的とする二本鎖核酸分子は、抗がん薬の開発に有用である。
ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子およびＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現は、膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、および胃癌において顕著に上昇する。特に、ＳＵＶ４２０Ｈ１遺伝子が膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、および軟部組織腫瘍において顕著に増加し、ＳＵＶ４２０Ｈ２が膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、胃癌、および肺癌において顕著に増加することが、確認された。
【０２５８】
したがって、これらの遺伝子マーカーはがんの診断マーカーとして都合よく使用可能であり、それらによってコードされるｍＲＮＡおよびタンパク質はがんの診断アッセイにおいて使用可能である。
さらに、本明細書に記載されるように、ＳＵＶ４２０Ｈ２遺伝子の発現はＮＳＣＬＣ患者の予後不良と関連付けられる。したがって、本発明はまた、新規予後マーカーであるＳＵＶ４２０Ｈ２も提供する。
さらに、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２ポリペプチドは、抗がん薬の開発のための有用な標的である。例えば、ＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２と結合するか、またはＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２の発現を阻止するか、またはＳＵＶ４２０Ｈ１もしくはＳＵＶ４２０Ｈ２の生物学的活性を阻害する物質は、抗がん剤、特に膀胱癌、子宮頸癌、骨肉腫、肺癌、軟部組織腫瘍、乳癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、食道癌、または胃癌の治療のための抗がん剤として治療的に有用であり得る。
【０２５９】
本発明をその特定の態様に関して詳細に説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正がその中でなされ得ることが、当業者には明らかであろう。本明細書で引用した刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献はすべて、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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