(57)【要約】本発明者らは、より有効な遺伝子発現遮断化合物を提供する方法について検討した。本発明者らは、遺伝子発現遮断分子の有効性を驚異的に改善する、新規な構造的特徴を見出した。これらの特徴には、複数の３’末端の存在および５’末端におけるリンカーの存在が含まれる。驚くべきことには、これらの特徴は、遺伝子発現遮断化合物の有効性を、該化合物の生物学的不安定性を減少させるような様式で改善する。さらに驚くべきことには、この効果は、ＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドベースの化合物の両方に適用可能であり、伝統的なアンチセンスおよびＲＮＡｉ技術において適用されることが見出された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な２または３以上のオリゴヌクレオチドを含む合成オリゴヌクレオチドベースの化合物であって、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２または３以上のアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害する、前記化合物。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが、それぞれが独立して１５〜４０ヌクレオチド長である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドベースの化合物。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド結合を介して互いに結合されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドベースの化合物。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが、リンカーを介して互いに結合されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドベースの化合物。
【請求項５】
リンカーが、非ヌクレオチドリンカーである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドベースの化合物。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドが、１または２以上のリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ロックされた核酸、アラビノ糖ヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドベースの化合物。
【請求項７】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが修飾されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドベースの化合物。
【請求項８】
修飾オリゴヌクレオチドが、アルキルホスホナート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホナート、および非ヌクレオチドリンカーからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド間結合を有する、請求項７に記載のオリゴヌクレオチドベースの化合物。
【請求項９】
修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの２’−Ｏ−置換ヌクレオチドを含有する、請求項７に記載のオリゴヌクレオチドベースの化合物。
【請求項１０】
２’−Ｏ−置換が、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシ、２’−Ｏ−エトキシ、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アリール、および２’−Ｏ−アリルから選択される、請求項９に記載のオリゴヌクレオチドベースの化合物。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、遺伝子発現のＲＮＡｉ媒介性阻害に関与するタンパク質によって選択的に結合されるか、および／または切断される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドベースの化合物。
【請求項１２】
遺伝子発現のＲＮＡｉ媒介性阻害に関与するタンパク質が、ダイサー、アルゴノート、およびＲＩＳＣから選択される、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドベースの化合物。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、遺伝子発現のＲＮａｓｅＨ媒介性阻害に関与するタンパク質によって選択的に結合されるか、および／または切断される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドベースの化合物。
【請求項１４】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドベースの化合物および生理学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項１５】
１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な２つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドベースの化合物であって、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化１】
2013507905.tif 000025
ここで、ドメインＡまたはドメインＢの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡを形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、前記化合物。
【請求項１６】
１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な３つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドベースの化合物であって、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２または３以上のアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化２】
2013507905.tif 000026
ここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡ分子を形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、前記化合物。
【請求項１７】
１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な３つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドベースの化合物であって、該オリゴヌクレオチドの２つはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化３】
2013507905.tif 000027
ここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡ分子を形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、前記化合物。
【請求項１８】
１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な４つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドベースの化合物であって、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化４】
2013507905.tif 000028
ここで、ドメインＡまたはドメインＢまたはドメインＣまたはドメインＤの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡ分子を形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、前記化合物。
【請求項１９】
３つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドベースの化合物であって、該オリゴヌクレオチドの２つはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化５】
2013507905.tif 000029
ここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、一本鎖ＲＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドであり、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は少なくとも１つの一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、およびここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、細胞内または細胞外受容体のアンタゴニストであるオリゴヌクレオチドである、
を有する、前記化合物。
【請求項２０】
受容体がＴＬＲである、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチドベースの化合物。
【請求項２１】
遺伝子発現を阻害する方法であって、前記方法は、細胞を、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な２または３以上のオリゴヌクレオチドを含有する合成オリゴヌクレオチドベースの化合物に接触させることを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって該オリゴヌクレオチドは２または３以上のアクセス可能な３’末端を有し、および該オリゴヌクレオチドは前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害する、前記方法。
【請求項２２】
遺伝子発現をin vivoで阻害する方法であって、前記方法は、哺乳動物に対して、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な２または３以上のオリゴヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドベースの化合物を、薬学的有効量で投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって該オリゴヌクレオチドは２または３以上のアクセス可能な３’末端を有し、および該オリゴヌクレオチドは前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害する、前記方法。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチドが、Ｂｃｌ−２、ＥＧＦＲ、ｍｄｍ２、ＭｙＤ８８、ＰＣＳＫ９、サバイビン、またはＶＥＧＦをコードする１または２以上のＲＮＡに相補的である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドが、ＴＬＲをコードする１または２以上のＲＮＡに相補的である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＴＬＲが、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
投与経路が、非経口、筋肉内、皮下、腹腔内、静脈内、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼、または洗口から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
各オリゴヌクレオチドが、異なる一本鎖ＲＮＡ配列に相補的である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
１または２以上のタンパク質が介在する疾患または障害を有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、前記方法は、該哺乳動物に対して、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な２または３以上のオリゴヌクレオチドを含有する合成オリゴヌクレオチドベースの化合物を、薬学的有効量で投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって該オリゴヌクレオチドは２または３以上のアクセス可能な３’末端を有し、および該オリゴヌクレオチドは前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、ここで該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、前記１または２以上のタンパク質をコードする一本鎖ＲＮＡに相補的である、前記方法。
【請求項２９】
１つより多くのオリゴヌクレオチドが、１または２以上のタンパク質をコードする一本鎖ＲＮＡに相補的である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
１または２以上のタンパク質の少なくとも１つが、Ｂｃｌ−２、ＥＧＦＲ、ｍｄｍ２、ＭｙＤ８８、ＰＣＳＫ９、サバイビン、ＶＥＧＦ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
１または２以上のタンパク質が、Ｂｃｌ−２、ＥＧＦＲ、ｍｄｍ２、ＭｙＤ８８、ＰＣＳＫ９、サバイビン、ＶＥＧＦ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚障害、アレルギー、喘息、細菌もしくはウイルスもしくは真菌感染症、または病原菌による疾患から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
１種または２種以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、タンパク質、ペプチド、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激分子またはこれらの組み合わせをさらに投与することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
投与経路が、非経口、筋肉内、皮下、腹腔内、静脈内、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼、または洗口から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
１または２以上のタンパク質が介在する疾患または障害を発症するリスクを有する哺乳動物における、該疾患または障害を予防する方法であって、前記方法は、該哺乳動物に対して、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な２または３以上のオリゴヌクレオチドを含有する合成オリゴヌクレオチドベースの化合物を、予防有効量で投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって該オリゴヌクレオチドは２または３以上のアクセス可能な３’末端を有し、および該オリゴヌクレオチドは前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、ここで該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、前記１または２以上のタンパク質をコードする一本鎖ＲＮＡに相補的である、前記方法。
【請求項３６】
１または２以上のタンパク質の少なくとも１つが、Ｂｃｌ−２、ＥＧＦＲ、ｍｄｍ２、ＭｙＤ８８、ＰＣＳＫ９、サバイビン、ＶＥＧＦ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
１または２以上のタンパク質が、Ｂｃｌ−２、ＥＧＦＲ、ｍｄｍ２、ＭｙＤ８８、ＰＣＳＫ９、サバイビン、ＶＥＧＦ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚障害、アレルギー、喘息、細菌もしくはウイルスもしくは真菌感染症、または病原菌による疾患から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
哺乳動物がヒトである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
投与経路が、非経口、筋肉内、皮下、腹腔内、静脈内、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼、または洗口から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
１種または２種以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、タンパク質、ペプチド、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激分子またはこれらの組み合わせをさらに投与することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
哺乳動物において、選択された分子の一本鎖ＲＮＡ発現およびタンパク質活性を阻害する方法であって、該哺乳動物に対して、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な２または３以上のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドベースの化合物を、薬学的有効量で、タンパク質活性のアンタゴニストと組み合わせて投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって該オリゴヌクレオチドは２または３以上のアクセス可能な３’末端を有し、および該オリゴヌクレオチドは前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害する、前記方法。
【請求項４３】
選択された分子がＴＬＲである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＴＬＲアンタゴニストが、抗ＴＬＲ抗体またはその結合断片もしくはペプチド模倣薬、ＲＮＡベースの化合物、オリゴヌクレオチドベースの化合物、およびかかるＴＬＲ活性の小分子阻害剤からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化６】
2013507905.tif 000030
ここで、ドメインＡまたはドメインＢの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡを形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項４６】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な３つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２または３以上のアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化７】
2013507905.tif 000031
ここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡ分子を形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項４７】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な３つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドの２つはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化８】
2013507905.tif 000032
ここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡ分子を形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項４８】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な４つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化９】
2013507905.tif 000033
ここで、ドメインＡまたはドメインＢまたはドメインＣまたはドメインＤの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡ分子を形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項４９】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、３つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドの２つはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化１０】
2013507905.tif 000034
ここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、一本鎖ＲＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドであり、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、少なくとも１つの一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、およびここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、細胞内または細胞外受容体のアンタゴニストであるオリゴヌクレオチドである、
を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項５０】
受容体がＴＬＲである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化１１】
2013507905.tif 000035
ここで、ドメインＡまたはドメインＢの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡを形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項５２】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な３つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２または３以上のアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化１２】
2013507905.tif 000036
ここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡ分子を形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項５３】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な３つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドの２つはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化１３】
2013507905.tif 000037
ここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡ分子を形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項５４】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な４つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化１４】
2013507905.tif 000038
ここで、ドメインＡまたはドメインＢまたはドメインＣまたはドメインＤの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡ分子を形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項５５】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、３つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドの２つはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化１５】
2013507905.tif 000039
ここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、一本鎖ＲＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドであり、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、少なくとも１つの一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、およびここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、細胞内または細胞外受容体のアンタゴニストであるオリゴヌクレオチドである、
を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項５６】
受容体がＴＬＲである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化１６】
2013507905.tif 000040
ここで、ドメインＡまたはドメインＢの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡを形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５８】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な３つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２または３以上のアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化１７】
2013507905.tif 000041
ここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡ分子を形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５９】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な３つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドの２つはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、および該オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化１８】
2013507905.tif 000042
ここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡ分子を形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項６０】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な４つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、該オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化１９】
2013507905.tif 000043
ここで、ドメインＡまたはドメインＢまたはドメインＣまたはドメインＤの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡ分子を形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項６１】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、３つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドの２つはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化２０】
2013507905.tif 000044
ここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、一本鎖ＲＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドであり、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、少なくとも１つの一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、およびここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、細胞内または細胞外受容体のアンタゴニストであるオリゴヌクレオチドである、
を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項６２】
受容体がＴＬＲである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化２１】
2013507905.tif 000045
ここで、ドメインＡまたはドメインＢの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡを形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項６４】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な３つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２または３以上のアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化２２】
2013507905.tif 000046
ここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡ分子を形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項６５】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な３つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドの２つはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化２３】
2013507905.tif 000047
ここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡ分子を形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項６６】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な４つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、および前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、前記１または２以上の一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化２４】
2013507905.tif 000048
ここで、ドメインＡまたはドメインＢまたはドメインＣまたはドメインＤの少なくとも１つは、相補的オリゴリボヌクレオチドにハイブリダイズされてｓｉＲＮＡ分子を形成するオリゴリボヌクレオチドである、
を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項６７】
オリゴヌクレオチドベースの化合物が、３つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドの２つはその５’末端で結合されており、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は２つのアクセス可能な３’末端を有し、前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、構造：
【化２５】
2013507905.tif 000049
ここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、一本鎖ＲＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドであり、したがって前記オリゴヌクレオチドベースの化合物は、少なくとも１つの一本鎖ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害し、およびここで、ドメインＡ、ドメインＢ、またはドメインＣの少なくとも１つは、細胞内または細胞外受容体のアンタゴニストであるオリゴヌクレオチドである、
を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６８】
受容体がＴＬＲである、請求項６７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（代理人整理番号：ＩＤＲ−０６２ＰＣ）
本発明は、遺伝子発現および／または活性を阻害するための、または、遺伝子発現および／または活性の阻害に応答する疾患および／または病態を診断する、処置する、および／または予防するための、化合物、組成物、および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の概要
遺伝子発現を阻害するための１つのアプローチは、アンチセンス技術またはＲＮＡ阻害（ＲＮＡｉ）である。これらのアプローチは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドの、選択されたｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ，プレＲＮＡ、またはミトコンドリアＲＮＡ標的に対する配列特異的結合および、これから生じる翻訳の阻害を利用する。翻訳および最終的に遺伝子発現の、このオリゴヌクレオチドに基づく阻害は、１または２以上の細胞機構の結果であり、これには限定されないが、（ｉ）翻訳の直接的（立体的）妨害、（ｉｉ）ＲＮａｓｅＨ媒介性阻害、および（ｉｉｉ）ＲＮＡｉ媒介性阻害（例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡ依存性ＲＮＡｉ（ｄｄＲＮＡｉ）、および一本鎖ＲＮＡｉ（ｓｓＲＮＡｉ））を含み得る。
【０００３】
アンチセンス技術の歴史から、ｍＲＮＡに結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの決定は比較的容易であるが、遺伝子発現を阻害する真の能力を有し、したがって良好な臨床的候補となるアンチセンスオリゴヌクレオチドの最適化は容易ではないことが明らかとなった。したがって、遺伝子発現を下方制御するオリゴヌクレオチドベースのアプローチの成功には、この結果を最も効率的に達成する最適化アンチセンスオリゴヌクレオチドが必要である。かかる最適化アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それのみで、または他の予防的および／または治療的組成物と組み合わせて用いることができる。
【０００４】
Zamecnik & Stephensonが、アンチセンスオリゴヌクレオチドをウイルスタンパク質の翻訳を阻害する手段として用いた最初の実証について公表して以来（Zemecnik and Stephenson (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 285-288）、オリゴヌクレオチドベースの化合物を遺伝子発現の阻害に利用することについて、多大な関心が寄せられてきた。これらの初期の取組みでは、in vivoでは本質的に不安定な、一本鎖の非修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドを用いて（Agrawal et al. (1992) Ann. NY Acad. Sci. 660:2-10）、in vivoでｍＲＮＡに結合し、酵素またはＲＮＡｓｅ分解のための二本鎖ＲＮＡテンプレートを作製した。続く取組みでは、ヌクレアーゼ抵抗性ホスホロチオアートおよび／またはメチルホスホナート結合を組み込んだオリゴデオキシリボヌクレオチドの効用が決定された（Agrawal et. al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:7079-7083；Metelev & Agrawal US 5,652,355；Metelev & Agrawal US 6,143,881；Matsukura et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7706）。
【０００５】
遺伝子発現を阻害する別のクラスのＲＮＡベースの分子を、リボザイムという。リボザイムはステムループ構造を形成し、ＲＮＡ標的に結合して、直接その切断に介在する（Cech, T. (1990) Ann. Rev. Biochem. 59:543）。リボザイムは標的ＲＮＡに選択的に結合し、トランスエステル化または加水分解反応を触媒して、一本鎖ＲＮＡの特定のホスホジエステル結合を切断する。細胞に導入されると、リボザイムは、標的ｍＲＮＡに結合してかかるｍＲＮＡの翻訳を阻害する能力を有する。一本鎖アンチセンス技術と同様に、リボザイムの安定性および活性は、一定の化学的修飾をリボザイム構造に組み込むことによって改善された（Goodchild US 6,204,027；Goodchild US 6,573,072）。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイム技術が進歩し続ける間に、その他のオリゴヌクレオチドベースの技術についての発見がなされている。
【０００６】
Fire and Melloによる先駆的発見に基づいて（Fire et al. (1998) Nature, 391:806-811)、取組みは、哺乳類系におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術（例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡ依存性ＲＮＡｉ（ｄｄＲＮＡｉ）、および一本鎖ＲＮＡｉ（ｓｓＲＮＡｉ））へと方向を変えた。ＲＮＡｉとは、特定のｍＲＮＡ標的にハイブリダイズするよう設計されている低分子オリゴヌクレオチドを用いた、遺伝子発現の転写後阻害プロセスを指す（(Fire et al. (1998) Nature 391:806-811；Zamore et al. (2000) Cell, 101:25-33)。ｓｉＲＮＡの場合、低分子二本鎖ＲＮＡ分子は、細胞酵素マシナリーを用いて相同体標的ＲＮＡ分子を切断する（Rana (2007) Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 8:23-36）。二本鎖ＲＮＡｉ技術は、一旦細胞内に入るとダイサーと呼ばれる酵素により結合されて２１〜２３個のヌクレオチドに切断される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の、投与または発現に依存する。得られたダイサー−ｄｓＲＮＡ複合体は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる、アルゴノート（Argonaut）含有タンパク質複合体に送達され、これと相互反応する。ＲＩＳＣは、細胞内に存在して特定のｍＲＮＡ分子を触媒的に分解すると考えられている。ＲＩＳＣにより結合されると、ｄｓＲＮＡは巻きとかれて、ｓｓＲＮＡ−ＲＩＳＣ複合体となり、これは標的ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる。ハイブリダイズすると、ＲＩＳＣ複合体はｍＲＮＡを分解する。場合によっては、ダイサーのｄｓＲＮＡ特異的プロセスは、ＲＩＳＣと直接相互反応する一本鎖ＲＮＡｉ（ｓｓＲＮＡｉ）組成物を用いて回避され、遺伝子発現の阻害を達成する（Holen et al. (2003) Nuc. Acids Res. 31:2401-2407）。ＲＮＡｉ技術は標的ｍＲＮＡに選択的に結合することができるが、かかる分子はまた、ＴＬＲ３との相互反応を介して、非特異的免疫刺激を誘発することも認められている（Kleinman et al, (2008) Nature 452:591-597；De Veer et. al. (2005) Immun. Cell Bio. 83:224-228；Kariko et al. (2004) J. Immunol. 172:6545-6549）。この非特異的免疫活性化は、ＲＮＡｉ技術の医薬剤としての有効性について問題を提起した。
【０００７】
アンチセンスに基づく技術の各々は一定の成功をもたらしているが、オリゴヌクレオチドベースであるために、これら技術の各々はin vivoで不安定であり、また的外れの効果、例えば意図されない免疫刺激（Agrawal & Kandimalla (2004) Nature Biotech. 22:1533-1537）などをもたらす可能性を有するという、本質的な問題がある。ｄｓＲＮＡの場合、これらのオリゴヌクレオチドは、細胞への非効率なin vivo送達という別の問題を有するようである（Medarova et. al (2007) Nature Med. 13:372-377）。アンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤候補について多くの臨床試験がなされたが、ただ１つのみがＦＤＡにより薬剤として認められたに過ぎない。このアンチセンス化合物はＣＭＶの処置用に承認されたが、製品として市場化されてはいない。さらに、リボザイムまたはｓｉＲＮＡ薬剤候補は、未だＦＤＡによって承認されていない。
【０００８】
これらの技術の各々を最適化するアプローチは、生体安定性、標的認識（例えば、細胞透過性、熱安定性）、およびin vivo活性への対処に焦点を絞ってきた。多くの場合、これらには競合的な判断が必要である。例えば、伝統的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスフェートエステルヌクレオチド間結合を利用しており、これは、効果的であるには生物学的に不安定すぎることが証明された。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドを修飾して、これらをさらに生物学的に安定にすることに焦点があてられた。初期のアプローチでは、ヌクレオチド間結合の修飾に焦点を当て、細胞ヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性を高めようとした。これらのアプローチにより、種々の非天然のヌクレオチド間結合、例えばホルホロチオアート、メチルホスホナート（Sarin et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:7448-7451）、およびペプチドベースの結合（Matsukura et. al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7706；Agrawal et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:7079-7083；Miller (1991) Bio-Technology 9:358）などを有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの開発がもたらされた。しかしこれらの修飾は、分子の標的特異性を低下させ、望ましくない生物学的活性を生じさせた。
【０００９】
安定性を改善し、特異性および生物学的活性を保持するための後のアプローチでは、ホスホジエステルおよびホルホロチオアートヌクレオチド間結合を含有する、混合主鎖オリゴヌクレオチドを利用する。この混合主鎖により、ホスホジエステル結合のみのオリゴヌクレオチドと比べて、生物学的安定性が改善されたかまたはこれを保持する、オリゴヌクレオチドがもたらされた（Agrawal et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:1401-1405；米国特許公報第20010049436号）。オリゴヌクレオチのド研究を通して、これらの分子は、in vivoでエキソヌクレアーゼによる分解を受けやすく、主な分解が分子の３’末端から起こることが認められた（Shaw et. al (1991) Nucleic Acids Res. 19:747-750；Temsamani et al. (1993) Analytical Bioc. 215:54-58）。そのため、このエキソヌクレアーゼ活性を回避するアプローチでは、以下を利用した：（ｉ）５’および／または３’終端でのキャップ構造（Tesamani et. al (1992) Ann. NY Acad. Sci. 660:318-320；Temsamani et al. (1993) Antisense Res. Dev. 3:277-284；Tang et al. (1993) Nucl. Acids Res. 20:2729-2735）、（ｉｉ）２または３以上のオリゴヌクレオチドを、分子間の５’−３’、５’−２’、２’−３’、３’−２’、または３’−３’結合を介して結合する（Agrawal et al. US 6,489,464）、（ｉｉｉ）３’末端でそれ自身を折りたたむ、自己ハイブリダイズオリゴヌクレオチド、これはヘアピンを作製し、３’−エキソヌクレアーゼ活性が開始されるアクセスポイントを除去する（Tang et al. (1993) Nucl. Acids Res. 20:2729-2735）、または（ｉｖ）ＲＮＡをオリゴヌクレオチド分子に組み込み、こうしてＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子を作製する（Metelev at al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:2929-2934；Metelev US 5,652,355；Metelev & Agrawal US 6,143,881；Metelev& Agrawal US 6,346,614；Metelev & Agrawal US 6,683,167；Metelev & Agrawal US 7,045,609）。
【００１０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性を改善し、特異性および生物学的活性を保持するための別のアプローチでは、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ標的に結合する、三重鎖形成性のポリピリミジンオリゴヌクレオチドを利用する。ポリピリミジンオリゴヌクレオチドは、フーグスティーン水素結合を介して主溝の二本鎖ＤＮＡに結合することができ、１つのポリプリンおよび２つのポリピリミジン鎖を含む、Ｔ：Ａ−ＴおよびＣ：Ｇ−Ｃ’塩基トリプレットの三重構造を形成する（Moser, H E. and Dervan, P.B. (1987) Science 238, 645-650；Cooney, et al (1988) Science 241, 456-459）。分子内三重鎖はまた、ＤＮＡホモプリンおよびホモピリミジン鎖が溶解して再度畳まれる場合に形成される（Vasqueza, .M. and Wilson, J. H. (1998) Trends Bioche. Sci. 23, 4-9）。第三の鎖の存在は、ＤＮＡの柔軟性に重大な制限をもたらし、主溝にそって特定タンパク質を認識するその能力を変化させ（Shields, G.C., et al. (1997) Am. Chem. Soc, 119, 7463-7469；Jimenez-Garcia, E., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 24640-24648）、転写の阻害および究極的には遺伝子発現の低下をもたらす。配列特異的に二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに結合することができるオリゴヌクレオチドは、転写／翻訳レギュレーターとして作用することができ、遺伝子発現の調節を制御するための有望な抗遺伝子／アンチセンス戦略を提供した（Giovannangeli, C. and Helene, C. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 413；Giovannangeli, C, et al. (1996) Biochemistry 35, 10539；Maher, L.J., et al. (1992) Biochemistry 31, 70）。しかし、安定な三重鎖の形成条件は、塩基認識の制限および三重鎖形成性オリゴヌクレオチドのプロトン化に必要な非生理学的酸性ｐＨ条件のために、問題が多い。
【００１１】
かかる安定な三重鎖を形成する試みにおいて、リンカーを介して結合している（すなわち、５’→３’の極性を有する１つの配列に続いて、３’→５’の極性を有する別の配列、またはその逆）、極性の逆転したポリピリミジンオリゴヌクレオチドが記載されている（Froehler, US5,399,676；Froehler US5,527,899；Froehler US5,721,218）。かかる極性の逆転したオリゴヌクレオチドにおいて、逆位の片側の配列は、三重らせんコードにより二重鎖のポリプリン鎖に結合し、反対側の配列は二重鎖の逆の鎖において隣接して位置するポリプリン部位に結合するであろう（ダイアグラム１Ａ）。この様式において、三重らせん認識の拡張は、必要でありかつ標的配列ストレッチが利用可能である場合には、二重鎖の１つの鎖から別の鎖へ、さらにもとに戻るようにと認識を切り替えることによって可能である。さらに、これらのオリゴヌクレオチドはまた、ダイアグラム１Ｂに示すように、二重鎖と共にＤループを形成してもよい。この状況において、第一極性の領域は三重鎖を形成でき、一方逆転部位は、二重鎖の１つの鎖の部分を置換して、その領域において置換二重鎖をもたらす。スイッチバックオリゴヌクレオチドは大きな二重結合活性を持ち得るため、これらのオリゴヌクレオチドは、二重鎖の形態の、疾患の原因となる望ましくないＤＮＡまたはＲＮＡを不活性化するのに有用となり得る。しかし、このような分子の組成物は、二重鎖ＲＮＡまたはＤＮＡのポリプリン部位を標的とする、ポリピリミジン配列に限定されている。
【化１】
2013507905.tif 000002
【００１２】
代替的に、三重らせん形成によって一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを標的とする戦略が開発されている。１つのアプローチは、逆転極性のフォールドバック型三重鎖形成性オリゴヌクレオチドを用いて、ポリピリミジンＤＮＡまたはＲＮＡ一本鎖を標的とすることである（Kandimalla, E.R., et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117, 6416-6417；Kandimalla, E.R., and Agrawal, S. (1996) Biochemistry 35, 15332）。かかるフォールドバック型三重鎖形成性オリゴヌクレオチドにおいて、ポリピリミジンオリゴヌクレオチドおよびその相補的ポリプリン鎖は、３’−３’連結または５’−５’連結を介して連結される。３’−３’または５’−５’結合を介して連結された相補的配列を含むかかるオリゴヌクレオチドは、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン塩基対合を介して、並行鎖二重鎖を形成する。相補的ポリピリミジン鎖が利用可能な場合、これらは三重らせん構造を形成する（ダイアグラム２）。
【化２】
2013507905.tif 000003
【００１３】
相当の努力にも関わらず、的外れな効果なしで安定性を改善し、標的認識を維持するための取り組みは、臨床的効用を有すると考えられるオリゴヌクレオチドを一般に生成していない。したがって、現在のアンチセンスベースの技術は、生物学的に安定で、標的特異的であり、遺伝子発現の効率的な阻害剤である化合物を作製するチャレンジについて開かれている。したがって新しいアプローチが必要とされている。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、遺伝子発現を調整するのに有用な、オリゴヌクレオチドベースの化合物を用いた化合物、組成物、および方法に関し、該オリゴヌクレオチドベースの化合物は、その５’末端を通して結合されて２または３以上のアクセス可能な３’末端の存在を許容する、２または３以上の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有し、遺伝子発現を効果的に阻害または低減する。驚くべきことには、本発明者らは、かかるオリゴヌクレオチド化合物は、非結合アンチセンスオリゴヌクレオチドよりも効果的であることを見出した。
【００１５】
第１の側面において、本発明は、１または２以上のｍＲＮＡ配列に相補的な２または３以上のオリゴヌクレオチドを含む新規な合成オリゴヌクレオチドベースの化合物であって、ここで該オリゴヌクレオチドは、その５’末端で結合されて２または３以上のアクセス可能な３’末端の存在を許容し、および前記１または２以上のＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害する、前記化合物を提供する。
【００１６】
第２の側面において、本発明は、医薬組成物を提供する。これらの組成物は、第１の側面による任意の合成オリゴヌクレオチドベースの化合物を、薬学的または生理学的に許容し得る担体中に含んでよい。
【００１７】
第３の側面において、本発明は、遺伝子発現を阻害する方法であって、細胞を、本発明の第１の側面による合成オリゴヌクレオチドベースの化合物と接触させることを含む、前記方法を提供する。
【００１８】
第４の側面において、本発明は、哺乳動物における遺伝子発現を阻害する方法であって、該哺乳動物に対して、本発明の第１の側面による合成オリゴヌクレオチドベースの化合物を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００１９】
第５の側面において、本発明は、哺乳動物におけるＴＬＲ媒介性、Ｂｃｌ−２媒介性、ＥＧＦＲ媒介性、ｍｄｍ２媒介性、ＭｙＤ８８媒介性、ＰＣＳＫ９媒介性、サバイビン媒介性、またはＶＥＧＦ媒介性の応答を、本発明の第１の側面による合成オリゴヌクレオチドベースの化合物であって、オリゴヌクレオチドが、１または２以上の、ＴＬＲ、Ｂｃｌ−２、ＥＧＦＲ、ｍｄｍ２、ＭｙＤ８８、ＰＣＳＫ９、サバイビン、またはＶＥＧＦのｍＲＮＡ配列に相補的である、前記化合物の投与を介して阻害する方法を提供する。
【００２０】
第６の側面において、本発明は、哺乳動物におけるＴＬＲ媒介性、Ｂｃｌ−２媒介性、ＥＧＦＲ媒介性、ｍｄｍ２媒介性、ＭｙＤ８８媒介性、ＰＣＳＫ９媒介性、サバイビン媒介性、またはＶＥＧＦ媒介性の応答を、本発明の第１の側面による合成オリゴヌクレオチドベースの化合物であって、オリゴヌクレオチドが、１または２以上の、ＴＬＲ、Ｂｃｌ−２、ＥＧＦＲ、ｍｄｍ２、ＭｙＤ８８、ＰＣＳＫ９、サバイビン、またはＶＥＧＦのｍＲＮＡ配列に相補的である前記化合物を、ＴＬＲ、ＥＧＦＲ、ｍｄｍ２、ＭｙＤ８８、ＰＣＳＫ９、サバイビン、またはＶＥＧＦタンパク質の活性のアンタゴニストと組み合わせて投与することを介して、阻害する方法を提供する。
【００２１】
第７の側面において、本発明は、哺乳動物における遺伝子発現を阻害する方法であって、該哺乳動物に対して、本発明によるオリゴヌクレオチドベースの化合物を投与することを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。いくつかの好ましい態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドベースの化合物は、その免疫応答を阻害することが必要な哺乳動物に投与される。
【００２２】
第８の側面において、本発明は、疾患または障害を有する患者を治療的に処置する方法を提供し、かかる方法は、該患者に対して、本発明によるオリゴヌクレオチドベースの化合物を、治療有効量で投与することを含む。種々の態様において、処置する疾患または障害は、癌、自己免疫障害、感染症、気道炎症、炎症性疾患、皮膚障害、アレルギー、喘息、または病原菌による疾患である。病原菌は、限定することなく、細菌、寄生生物、真菌、ウイルス、ウイロイド、およびプリオンを含む。
【００２３】
第９の側面において、本発明は、疾患または障害を予防する方法を提供し、かかる方法は、疾患または障害を発症するリスクのある対象に対して、本発明によるオリゴヌクレオチドベースの化合物を、薬学的有効量で投与することを含む。種々の態様において、予防する疾患または障害は、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性疾患、感染症、アレルギー、喘息、または病原菌による疾患である。病原菌は、限定することなく、細菌、寄生生物、真菌、ウイルス、ウイロイド、およびプリオンを含む。
【００２４】
第１０の側面において、本発明は、障害を予防または処置する方法を提供し、かかる方法は、以下を含む：サイトカインまたはケモカインであって、限定することなく、免疫細胞、Ｔ調節細胞、Ｂ細胞、ＰＢＭＣ、ｐＤＣ，およびリンパ球細胞を含む前記サイトカインまたはケモカインを産生することができる細胞を単離すること；かかる細胞を、標準細胞培養条件下で培養すること、かかる細胞をex vivoで本発明の第１の側面によるオリゴヌクレオチドベースの化合物で処理して、単離された細胞が低減されたレベルのサイトカインまたはケモカインを産生または分泌するようにすること；および、処理された細胞を治療の必要な患者に対して投与または再投与して、疾患の予防および／または処置のためにサイトカインおよび／またはケモカインを阻害すること。本発明のこの側面は、活性免疫細胞を産生する標準の養子細胞免疫療法技術に従ってもよい。
【００２５】
第１１の側面において、本発明は、本発明の第１の側面による化合物および、１または２以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、化学療法剤（伝統的化学療法および新しい標的療法の両方）、キナーゼ阻害剤、アレルゲン、抗生物質、アゴニスト、アンタゴニスト、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、アプタマー、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激分子、またはこれらの組み合わせを含有する、組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのリニア合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル、ＣＥ＝シアノエチル。
【００２７】
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのパラレル合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル、ＣＥ＝シアノエチル。
【００２８】
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞における、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を表す図である。データは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、例２に従って培養および処理した細胞における、ＴＬＲ９アゴニスト活性を阻害する能力を実証する。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞における、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を表す図である。
【００２９】
【図２Ｃ】図２Ｃは、マウスＴＬＲ７を発現するＨＥＫ２９３細胞における、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を表す図である。データは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、例２に従って培養および処理した細胞における、ＴＬＲ７アゴニスト活性を阻害する能力を実証する。
【００３０】
【図２Ｄ】図２Ｄは、マウスＭｙＤ８８を発現するＨＥＫ２９３細胞における、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を表す図である。データは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、例２に従って培養および処理した細胞における、ＭｙＤ８８アゴニスト活性を阻害する能力を実証する。
【００３１】
【図３】図３は、マウス脾細胞における、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を表す図である。データは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、例２に従って処理した脾細胞における、ＴＬＲ９ｍＲＮＡの翻訳またはタンパク質合成を阻害する能力を実証する。
【００３２】
【図４】図４は、ヒトＰＢＭＣにおける、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を表す図である。データは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、例２に従って処理したヒトＰＢＭＣにおける、ＴＬＲ９ｍＲＮＡの翻訳またはタンパク質合成を阻害する能力を実証する。
【００３３】
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、例３に従ってin vivo投与の後の、ＴＬＲ９誘導性ＩＬ−１２を阻害する、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を表す図である。データは、本発明の例示のＴＬＲ９アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与が、in vivoでのＴＬＲ９発現の下方制御を引き起こし、ＴＬＲ９アゴニストによるＩＬ−１２の誘導を防止可能であることを実証する。さらに一般的には、データは、本発明のＴＬＲ９アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ＴＬＲ９アゴニストによる炎症誘発性サイトカインの誘導を阻害する能力を実証する。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、例３に従ってin vivo投与の後の、ＴＬＲ９誘導性ＩＬ−１２を阻害する、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を表す図である。
【００３４】
【図５Ｃ】図５Ｃは、例３に従ってin vivo投与の後の、ＭｙＤ８８誘導性ＩＬ−１２を阻害する、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドのin vivo活性の持続時間を表す図である。データは、本発明の例示のＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与が、in vivoでのＭｙＤ８８発現の下方制御を引き起こし、ＴＬＲ９アゴニストによるＩＬ−１２の誘導を、リニアアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは３’−３’結合アンチセンスオリゴヌクレオチドのどちらよりも長く、防止可能であることを実証する。さらに一般的には、データは、本発明のＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ＴＬＲ９アゴニストによる炎症誘発性サイトカインの誘導を阻害する能力を実証する。
【００３５】
【図６】図６は、例３に従ってin vivo投与の後の、ＴＬＲ９誘導性ＩＬ−１２を用量依存的に阻害する、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を表す図である。データは、本発明のＴＬＲ９アンチセンスオリゴヌクレオチドのin vivo投与が、in vivoでのＴＬＲ９発現の用量依存的な下方制御を引き起こし、ＴＬＲ９アゴニストによるＩＬ−１２の誘導を防止可能であることを実証する。さらに一般的には、データは、本発明のＴＬＲ９アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ＴＬＲ９アゴニストによる炎症誘発性サイトカインの誘発を選択的に阻害する能力を実証する。
【００３６】
【図７】図７は、例３に従ってin vivo投与の後の、ＴＬＲ９誘導性ＩＬ−１２を時間依存的に阻害する、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を表す図である。データは、本発明のＴＬＲ９アンチセンスオリゴヌクレオチドのin vivo投与が、in vivoでのＴＬＲ９発現の時間依存的な下方制御を引き起こし、ＴＬＲ９アゴニストによるＩＬ−１２の誘導をより長い時間防止可能であることを実証する。さらに一般的には、データは、本発明のＴＬＲ９アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ＴＬＲ９アゴニストによる炎症誘発性サイトカインの誘導を時間依存的に阻害する能力を実証する。
【００３７】
【図８Ａ】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、マウスＪ７７４細胞における、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を表す図である。データは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、例２に従って処理されたマウスＪ７７４細胞における、ＴＬＲ９ｍＲＮＡの、転写、翻訳、またはタンパク質合成を阻害する能力を実証する。
【図８Ｂ】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、マウスＪ７７４細胞における、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を表す図である。
【図８Ｃ】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、マウスＪ７７４細胞における、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を表す図である。
【００３８】
【図８Ｄ】図８Ｄは、ヒトＨｅＬａ細胞における、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を表す図である。データは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、例２に従って処理されたヒトＨｅＬａ細胞における、ＶＥＧＦｍＲＮＡの転写を阻害する能力を実証する。
【００３９】
【図９】図９は、ヒトＢ細胞における、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を表す図である。データは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、例２に従って処理されたヒトＢ細胞における、ＴＬＲ９ｍＲＮＡの翻訳またはタンパク質合成を阻害する能力を実証する。
【００４０】
【図１０】図１０は、ヒトｐＤＣにおける、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を表す図である。データは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、例２に従って処理されたヒトｐＤＣにおける、ＴＬＲ９ｍＲＮＡの翻訳またはタンパク質合成を阻害する能力を実証する。
【００４１】
【図１１】図１１は、例３に従ってin vivo投与の後の、ＴＬＲ９誘導性ＩＬ−１２を阻害する、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を表す図である。データは、本発明の例示のＴＬＲ９アンチセンスオリゴヌクレオチドのin vivo投与が、in vivoでのＴＬＲ９発現の下方制御を引き起こし、ＴＬＲ９アゴニストによるＩＬ−１２の誘導を防止可能であることを実証する。さらに一般的には、データは、本発明のＴＬＲ９アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ＴＬＲ９アゴニストによる炎症誘発性サイトカインの誘導を阻害する能力を実証する。
【００４２】
【図１２】図１２は、マウスＴＬＲ７を発現するＨＥＫ２９３細胞における、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を表す図である。データは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、例２に従って培養および処理された細胞における、ＴＬＲ７アゴニスト活性を阻害する能力を実証する。
【００４３】
【図１３】図１３は、例４に従って処理された、本発明の例示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、選択的結合および切断を表す図である。図１３において、レーン１は基質のみであり；レーン２はＴ１ヌクレアーゼであり；レーン３は5'-AAUGCUUGUCUGUGCAGUCC-3'（配列番号２８）であり；レーン４は5'-AAUGCUUGUCUGUGCAGUCC-X-CCUGACGUGUCUGUUCGUAA-5'であり；レーン５は3'-CCUGACGUGUCUGUUCGUAA-X-AAUGCUUGUCUGUGCAGUCC-3'（配列番号２１）であり；レーン６は5'-AAUGCUUGUCUGUGCAGUCC-AAUGCUUGUCUGUGCAGUCC-3'であり；レーン７は5'-CUGUCoAoAoAoUoGoCoUoUoGoUoCoUoGoUoGoCoAoGoUoCoCoACGAU-3'（配列番号２９）であり；レーン８はｄｓＲＮＡであり；およびレーン９は２０マーＤＮＡアンチセンスであり；ここで全ての配列は、「ｏ」（ホスホジエステル結合）で表したものを除き、ホスホロチオアート主鎖を有し；下線のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを表す。データは、本発明のオリゴヌクレオチドが、遺伝子発現のＲＮＡｉ媒介性阻害に関連するタンパク質および酵素による結合および切断について、最適な構造を提供することを実証する。
【００４４】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、新規なアンチセンスオリゴヌクレオチドの、遺伝子発現を下方制御するための治療的および予防的使用に関する。かかる分子は、例えば遺伝子発現を調節するための組成物の提供において、または、患者、対象、動物もしくは生物における遺伝子発現の調節に応答可能な疾患および／または病態を処置するか、および／または予防することにおいて、有用である。
【００４５】
本明細書に引用された特許および出版物は当分野の知識のレベルを反映し、これらはその全体がここに参照として組み込まれる。これら特許および出版物と本明細書の教示の間におけるいかなる不一致も、後者を支持して解決されるものとする。
【００４６】
本発明の目的、その種々の特徴、および発明それ自体は、添付の図面と共に読む場合に以下の説明からより完全に理解することができ、ここでは、以下の用語は認められた意味を有する。
【００４７】
用語「２’−Ｏ−置換」とは、ペントース部分の２’位の、次のものよる置換を意味する：１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む−Ｏ−低級アルキル基（例えば、限定はしないが２’−Ｏ−メチル）による、または２〜６個の炭素原子を有する−Ｏ−アリールまたはアリル基による置換であって、ここで、かかるアルキル、アリールまたはアリル基は、非置換であるかまたは置換されていてもよく（例えば２’−Ｏ−メトキシエチル、エトキシ、メトキシ、ハロ、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルバルコキシル（carbalkoxyl）、もしくはアミノ基により）；または、ヒドロキシル基、アミノ基、またはハロ基による置換、ただし２’−Ｈ基による置換ではない。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、その５’終端において４または５個の２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、および／またはその３’ 終端において４または５個の２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドを含む。
【００４８】
指向的に用いられる場合、「３’」という語は一般的に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの別の領域または位置から、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’の（ヌクレオチドの３’末端に向かう）領域または位置をいう。
【００４９】
「３’末端」という語は一般的に、構成成分オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドを指す。「その３’末端で結合している２または３個以上のオリゴヌクレオチド」は一般的に、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド間の結合を指し、これは直接的に５’、３’、または２’ヒドロキシル基を介してもよく、または間接的に非ヌクレオチドリンカーを介してもよい。かかる結合はまた、ヌクレオシドを介して、ヌクレオシドの２’および３’ヒドロキシル位置の両方を利用してもよい。かかる結合はまた、３’末端ヌクレオチドの機能性糖または核酸塩基を利用してもよい。
【００５０】
指向的に用いられる場合、「５’」という語は一般的に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの別の領域または位置から、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’（ヌクレオチドの５’末端に向かう）領域または位置をいう。
【００５１】
「５’末端」という語は一般的に、構成成分オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドを指す。「その５’末端で結合している２または３個以上の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」は一般的に、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチド間の結合を指し、これは直接的に５’、３’、または２’ヒドロキシル基を介してもよく、または間接的に非ヌクレオチドリンカーを介してもよい。かかる結合はまた、ヌクレオシドを介して、ヌクレオシドの２’および３’ヒドロキシル位置の両方を利用してもよい。かかる結合はまた、５’末端ヌクレオチドの機能性糖または核酸塩基を利用してもよい。
【００５２】
「約」という語は、一般的に、正確な数が重要でないことを意味する。したがって、１または２少ない数のヌクレオシド残基または１から数個の追加のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、上記のそれぞれの態様の等価物として意図される。
【００５３】
「アクセス可能な（accessible）」の語は、本発明の化合物に関連する場合、一般に、分子の関連部分が、化合物に対する意図された応答を示すために必要な細胞成分によって認識され得ることを意味する。
【００５４】
「アゴニスト」の語は、一般に、細胞の受容体に結合して応答を引き起こす物質をいう。アゴニストはしばしば、リガンドなどの天然の物質の作用を模倣する。
【００５５】
「アンタゴニスト」の語は、一般に、アゴニストまたはリガンドの効果を弱める物質をいう。
【００５６】
「気道炎症」という語は一般的に、限定することなく、アレルゲンに起因する気道の炎症を含み、これは喘息を含む。
【００５７】
「アレルゲン」という語は一般的に、対象への曝露によってアレルギー反応を引き起こすところの、抗原または通常はタンパク質である分子の抗原部分をいう。典型的には、対象は、例えば膨疹および発赤試験（wheal and flare test）または当該技術分野において知られたあらゆる方法によって示されるように、アレルゲンに対してアレルギー性である。分子は、たとえ対象の小さなサブセットのみが、該分子への曝露によってアレルギー性（例えばＩｇＥ）免疫応答を示す場合でも、アレルゲンという。
【００５８】
「アレルギー」という語は一般的に、限定することなく、食物アレルギー、呼吸器アレルギーおよび皮膚アレルギーを含む。
【００５９】
「抗原」という語は一般的に、抗体またはＴ細胞抗原受容体によって認識され、選択的に結合される物質のことをいう。抗原は、これに限定されないが、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、およびそれらの組み合わせを含んでよい。抗原は天然または合成であってよく、一般的にその抗原に特異的な免疫応答を誘導する。
【００６０】
「自己免疫障害」という語は一般的に、「自分」の抗原が免疫系の攻撃を被る障害をいう。かかる語は、限定することなく、エリテマトーデス、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、関節リウマチ、敗血性ショック、全身性脱毛症、急性播種性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、ハイドロックス病（hydrox disease）、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、汗腺膿瘍、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、限局性強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性喘息（autoimmune asthma）、敗血性ショック、および乾癬を含む。
【００６１】
「生物学的不安定性」の語は一般的に、in vivoで分解され続いて不活性化される、分子の能力をいう。オリゴヌクレオチドについて、かかる分解はエキソヌクレアーゼ活性および／またはエンドヌクレアーゼ活性から生じ、ここでエキソヌクレアーゼ活性は、ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの３’または５’末端から切断することをいい、エンドヌクレアーゼ活性とは、ホスホジエステル結合をオリゴヌクレオチドの末端以外の位置において切断することをいう。
【００６２】
「癌」という語は一般的に、限定することなく、異常なまたは制御されていない細胞増殖および／または分裂に起因する、あらゆる悪性増殖または腫瘍をいう。癌はヒトおよび／または哺乳動物で起こり得、任意のおよび全ての組織において生じ得る。癌を有する患者の処置は、異常なまたは制御されていない細胞増殖および／もしくは分裂または転移が影響を受けるように、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンを投与することを含んでよい。
【００６３】
「担体」という語は一般的に、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有ベシクル、マイクロスフェア、リポソーム被包、または医薬製剤に用いられるその他の材料を包含する。担体、賦形剤または希釈剤の特性は、特定の用途に対する投与経路に依存するであろうことが理解されるだろう。これらの材料を含有する薬学的に許容し得る製剤の調製は、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990などに記載されている。
【００６４】
「共投与」または「共投与された」という語は一般的に、少なくとも２つの異なる物質を、免疫応答を調節するために、十分に近い時間で投与することをいう。共投与は、少なくとも２つの異なる物質の、任意の順序における単一用量または分離された用量での、同時投与および、数日までの時間的間隔が置かれた順序で投与することをいう。
【００６５】
「組み合わせて」という語は一般的に、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物ならびに、患者の処置過程において該化合物の活性を無効にしない、疾患および病態を処置するのに有用な別の剤を投与することを意味する。かかる投与は、同時投与、および数秒から数日までの時間的間隔が置かれた順序を含む、あらゆる順序で行われてよい。かかる組合せ処置はまた、本発明の化合物および／または独立して他の剤の、単回より多くの投与を含んでよい。本発明の化合物および他の剤の投与は、同一または異なる経路によるものであってよい。
【００６６】
「個体」または「対象」または「患者」の語は一般的に、ヒトなどの哺乳動物をいう。
【００６７】
「キナーゼ阻害剤」の語は一般的に、細胞における、リン酸化依存性の細胞シグナル伝達および／または増殖経路に拮抗するか、これを阻害する分子をいう。キナーゼ阻害剤は、天然または合成であってよく、経口療法として投与され得る小分子を含む。キナーゼ阻害剤は、標的のキナーゼ分子の活性化を迅速かつ特異的に阻害する能力を有する。タンパク質キナーゼは魅力的な薬物標的であり、その理由の一部は、これらが広範囲のシグナル伝達および増殖経路を調節し、多くの異なるタンパク質を含むからである。そのため、キナーゼ阻害剤は、癌、心臓血管疾患、炎症性疾患、糖尿病、黄斑変性症、および神経障害を含む、キナーゼシグナル伝達が関与する疾患の処置に大きな可能性を有する。キナーゼ阻害剤の非限定的例は、ソラフェニブである。
【００６８】
「リニア合成」という語は一般的に、１つのオリゴヌクレオチドの１つの末端から開始して、他端まで線形的に進行する合成をいう。リニア合成は、同一または非同一（長さ、塩基組成、および／または組込まれた化学的修飾に関して）どちらかのモノマー単位をオリゴヌクレオチドに組込むことを可能にする。
【００６９】
「哺乳動物」という語は明示的に、温血脊椎動物を含むことを意図し、これには限定することなく、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、畜牛、ウシ、ブタ、ヒツジおよびウサギを含む。
【００７０】
「ヌクレオシド」という語は一般的に、糖、通常はリボース、デオキシリボース、ペントース、アラビノースまたはヘキソース、およびプリンまたはピリミジン塩基からなる化合物をいう。
【００７１】
「ヌクレオチド」という語は一般的に、糖に連結したリン含有基を含むヌクレオシドをいう。
【００７２】
「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオチド誘導体」という語は一般的に、修飾複素環式塩基、修飾糖部分、またはそれらのあらゆる組み合わせを含むヌクレオシドである。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド誘導体は、本明細書に記載されたように、非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。本発明の目的のために、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド誘導体、ピリミジンまたはプリンアナログあるいは非天然のピリミジンまたはプリンは互換的に用いることができ、これは非天然の塩基および／または非天然の糖部分を含むヌクレオシドをいう。本発明の目的のために、塩基は、それがグアニン、シトシン、アデニン、チミンまたはウラシルでない場合、非天然であると考えられ、糖は、それがβ−リボ−フラノシドまたは２’−デオキシリボ−フラノシドでない場合、非天然であると考えられる。
【００７３】
本明細書で用いる場合、「修飾オリゴヌクレオチド」という語は、そのヌクレオチドの少なくとも２つが合成結合を介して共有結合しているオリゴヌクレオチドをいい、該合成結合とはすなわち、１つのヌクレオチドの５’末端と、５’ヌクレオチドホスフェートが任意数の化学基により置き換えられている他のヌクレオチドの３’末端との間の、ホスホジエステル結合以外の結合である。用語「修飾オリゴヌクレオチド」はまた、２’−Ｏ−、４’−Ｃ−メチレン−ｂ−Ｄ−リボフラノシル核酸、アラビノース核酸、置換アラビノース核酸、ヘキソース核酸、ペプチド核酸、モルホリノ、ならびに、修飾塩基および／または糖を有する少なくとも１つのヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−置換リボヌクレオチド、５’−メチルシトシンリボヌクレオチド、および／または３’−Ｏ−置換リボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドも包含する。
【００７４】
用語「核酸」は、ゲノム領域またはそれから転写されるＲＮＡ分子を包含する。いくつかの態様において、核酸はｍＲＮＡである。
【００７５】
用語「リンカー」は一般に、糖、塩基、または主鎖を介した共有結合または非共有結合によりオリゴヌクレオチドに連結することができる、任意の部分をいう。非共有結合は、限定することなく、静電相互作用、親水性相互作用、πスタッキング相互作用、水素結合およびそれらの組み合わせであってよい。かかる非共有結合の非限定的例には、ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティーン塩基対合および塩基スタッキングが含まれる。リンカーは、２または３以上のヌクレオシオドを連結するために用いることができ、またはリンカーは、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端ヌクレオチドに連結することができる。かかるリンカーは、非ヌクレオチドリンカーまたはヌクレオシドリンカーのどちらかであることができる。
【００７６】
用語「非ヌクレオチドリンカー」は一般に、共有結合または非共有結合によりオリゴヌクレオチドに連結させることができる２つのヌクレオチド間に直接存在する結合以外の、化学部分をいう。好ましくは、かかる非ヌクレオチドリンカーは、長さが約２オングストローム〜約２００オングストロームであり、シスまたはトランス配向のどちらであってもよい。
【００７７】
用語「ヌクレオチド間結合」は一般に、２つのヌクレオシドを、それらの糖（例えば３’−３’、２’−３’、２’−５’、３’−５’、５’−５’）を介して連結する化学結合をいい、隣接するヌクレオシドの間のリン原子および帯電した、または中性の基（例えばホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートまたはメチルホスホナート）からなる。
【００７８】
用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合されたヌクレオシド単位から形成されるポリヌクレオシドをいい、これには例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、合成または天然のヌクレオチド、ホスホジエステルまたは修飾結合、天然塩基または修飾塩基、天然糖または修飾糖、またはこれらの成分の組み合わせを含んでよい。ヌクレオシド単位は、ウイルス、細菌、細胞残屑、またはオリゴヌクレオチドベースの組成物（例えばｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ）の一部であってよい。かかるオリゴヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む既存の核酸源からも得ることができるが、好ましくは合成法により産生される。ある態様において、各ヌクレオシド単位は、複素環式塩基およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換ヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−置換アラビノース、２’−Ｏ−置換アラビノースまたはヘキソース糖基を含む。ヌクレオシド残基は、多くの知られているヌクレオシド間結合の任意のものにより互いに結合することができる。かかるヌクレオシド間結合としては、限定することなく、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホナート、アルキルホスホナート、アルキルホスホノチオアート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カルボナート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホナート、架橋ホスホロチオアート、およびスルホンヌクレオシド間結合が挙げられる。「オリゴヌクレオチド」という語はまた、１または２以上の立体特異的ヌクレオシド間結合（例えば、（ＲＰ）−または（ＳＰ）−ホスホロチオアート、アルキルホスホナート、またはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドを包含する。本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は明示的に、結合がリン酸基を含もうと含まなかろうと、あらゆるかかるヌクレオシド間結合を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを意図する。ある例示の態様において、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオアートまたはホスホロジチオアート結合、あるいはそれらの組み合わせであってよい。例示の態様において、合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオアートヌクレオチド間結合により結合される。ホスホロチオアート結合は、混合されたＲｐおよびＳｐエナンチオマーであってよく、またはこれは、ＲｐもしくはＳｐどちらかの形態において立体規則性または実質的に立体規則性であってよい（Iyer et al. (1995) Tetrahedron Asymmetry 6: 1051-1054を参照のこと）。ある態様において、本発明のアンチセンス組成物内の１または２以上のオリゴヌクレオチドは、１または２以上の２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−ｂ−Ｄ−リボフラノシル核酸を含み、ここでリボースは２’および４’炭素の間の結合により修飾されており、これが、リボースを３’末端の構造的立体配座に固定する。
【００７９】
用語「一本鎖ＲＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチド」等とは、生理学的条件下で、オリゴヌクレオチドが、その核酸塩基と一本鎖ＲＮＡ配列の核酸塩基とのワトソン−クリック相互反応により十分な数の水素結合を形成して、一本鎖ＲＮＡ配列と二重らせんを形成することを意味する。これは、フーグスティーン水素結合を介して、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドと対照的である。
【００８０】
語「相補的」とは、生理学的条件下で、例えばワトソン−クリック塩基対合（オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸の間の相互作用）により、またはフーグスティーン塩基対合（オリゴヌクレオチドと二本鎖核酸の間の相互作用）により、または任意の他の手段により（これには、オリゴヌクレオチドの場合、ＲＮＡに結合して擬結節形成を引き起こすことを含む）、核酸配列に結合するオリゴヌクレオチドを意味することを意図する。ワトソン−クリックまたはフーグスティーン塩基対合による生理学的条件下での結合は、核酸配列の機能との干渉を観察することにより、実際的に測定される。
【００８１】
用語「ペプチド」は、該ペプチドがハプテンであろうと無かろうと、例えば抗体産生またはサイトカイン活性などの生物学的応答に影響するのに十分な長さおよび組成を有するアミノ酸のオリゴマーまたはポリマーを一般的にいう。用語「ペプチド」は、修飾アミノ酸（天然または非天然であるかどうかにかかわらず）を含んでもよく、かかる修飾は、これに限定されないが、リン酸化、グリコシル化、ＰＥＧ化、脂質化（lipidization）およびメチル化を含む。
【００８２】
用語「薬学的に許容し得る」とは、本発明の化合物の有効性または本発明の化合物の生物学的活性に干渉しない、非毒性物質を意味する。
【００８３】
用語「生理学的に許容し得る」とは、細胞、細胞培養物、組織または有機体などの生体系に適合的な、非毒性物質をいう。好ましくは生体系は生物であり、例えば哺乳動物を含む脊椎動物、特にヒトである。
【００８４】
用語「予防有効量」とは、一般に、望ましくない生物学的効果の発生を防止または減少させるのに十分な量をいう。
【００８５】
用語「治療有効量」または「薬学的有効量」とは、一般に、例えば限定することなく、疾患または障害の兆候または症状の予防、低減、改善または除去を含む有益な結果などの望ましい生物学的効果に対して、影響を及ぼすのに十分な量をいう。したがって、医薬組成物または方法の各活性成分の総量は、例えば限定することなく、免疫刺激を特徴とする慢性の病態の回復などの、有意義な患者の利益を示すのに十分である。したがって、「薬学的有効量」は、それが投与される状況に依存するであろう。薬学的有効量は、１または２以上の予防的または治療的投与において投与してよい。それのみで投与される個別の活性成分に適用される場合、この用語は、その成分のみをさす。組み合わせに適用される場合は、この用語は、組み合わせ投与か、連続投与か、または同時投与であるかどうかにかかわらず、治療効果をもたらす活性成分の組み合わせの量をさす。
【００８６】
「処置」という語は一般的に、症状の緩和、または疾病の進行を遅らせるかまたは改善することを含み得る、有益な、または所望の結果を得ることを意図したアプローチをいう。
【００８７】
［遺伝子発現］の語は、一般に、遺伝子からの情報が機能的遺伝子産物の合成に用いられるプロセスをいい、該産物はタンパク質であってよい。このプロセスには、タンパク質の転写、ＲＮＡスプライシング、翻訳、および翻訳語修飾が関与することができ、タンパク質合成のためのｍＲＮＡ、プレＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、およびその他のテンプレートを含むことができる。
【００８８】
第１の側面において、本発明は、その５’末端で結合された２または３以上の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、新規なオリゴヌクレオチドベースの化合物を提供し、ここで該化合物は、２または３以上のアクセス可能な３’末端を有する。構成成分オリゴヌクレオチドの５’末端での結合は他のオリゴヌクレオチド結合から独立しており、直接的に５’、３’または２’ヒドロキシル基を介してもよく、または、間接的に非ヌクレオチドリンカーもしくはヌクレオシドを介した、ヌクレオシドの２’または３’ヒドロキシル位置のどちらかを利用したものでもよい。結合はまた、５’末端ヌクレオチドの機能性糖または核酸塩基を利用してもよい。
【００８９】
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物は、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、または非ヌクレオシドリンカーを介してその５’−５’末端で結合（conjugate）された、２つの同一または異なる配列を含む（ダイアグラム３）。かかる化合物は、遺伝子産物のアンチセンス下方制御のための、対象であるｍＲＮＡ標的の特定部位に相補的な１５〜２７のヌクレオチドを含む。同一配列を含む本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物は、特定のｍＲＮＡに、ワトソン−クリック水素結合相互作用を介して結合することができ、タンパク質発現を阻害する（ダイアグラム３）。異なる配列を含む本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物は、１または２以上のｍＲＮＡ標的の２または３以上の異なる領域に結合することができ、タンパク質発現を阻害する。かかる化合物は、標的ｍＲＮＡに相補的なヘテロヌクレオチド配列から構成され、ワトソン−クリック水素結合を介して安定な二重鎖構造を形成する。驚くべきことには、２つの自由な３’末端（５’−５’連結アンチセンス）を含むかかる配列は、１つの自由な３’末端を含むか、または自由な３’末端なしのものよりも、強力な遺伝子発現の阻害剤である。
【化３】
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【００９０】
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物は、遺伝子発現の阻害が有益である疾患を処置および／または予防するのに有用である。本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物としては、限定することなく、天然のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチドおよび／または主鎖修飾オリゴヌクレオチドを含有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。しかし、ｍＲＮＡがコードするタンパク質の翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、望ましくない生物学的効果、例えば不十分なアンチセンス活性、不適切なバイオアベイラビリティ、準最適な薬物動態または薬力学、意図されない免疫刺激、的外れな活性、および生物学的不安定性を含むがこれに限定されない効果を生成する可能性がある。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの最適設計は、標的ＲＮＡ配列に相補的な分子の単純な設計を超えた、多くの考慮を必要とする。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの調製には、アンチセンス活性への二次構造干渉を制限し、オリゴヌクレオチドの標的特異性を強化し、結合または競合因子（例えばタンパク質）との相互反応を最小化し、細胞取り込み、バイオアベイラビリティ、薬物動態および薬力学を最適化し、および／または免疫細胞活性化を阻害、予防または抑制するのに必要な変更を組み込むことが意図される。
【００９１】
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の一般構造は、次の式により記載することができる。
【００９２】
３’−Ｎｎ．．．Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４−５’−Ｌ−５’−Ｎ８Ｎ７Ｎ６Ｎ５．．．Ｎｍ−３’（式１）
【００９３】
式中、Ｌはヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであり；Ｎ１〜Ｎ８は、その各々の出現において、独立してヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり；ＮｍおよびＮｎは、その各々の出現において、独立してヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり；および、式中、ｍおよびｎは独立して０から約４０までの数値である。代表的な非ヌクレオチドリンカーを、表１に示す。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【００９４】
いくつかの態様において、小分子リンカーは、式：ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨのグリセロールまたはグリセロール相同体であって、式中、ｏおよびｐは独立して、１〜約６、１〜約４、または１〜約３の整数である。いくつかの別の態様において、小分子リンカーは、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。いくつかのかかる誘導体は、式：ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨを有し、式中、ｍは、０〜約１０、０〜約６、２〜約６、または２〜約４の整数である。
【００９５】
本発明のいくつかの非ヌクレオチドリンカーは、２つより多くの本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の連結を可能とする。例えば、小分子リンカーグリセロールは３つのヒドロキシル基を有し、これに、かかるオリゴヌクレオチドは共有的に連結される。したがって本発明のいくつかオリゴヌクレオチドベースの化合物は、１つのヌクレオチドまたは１つの非ヌクレオチドリンカーに結合した２または３以上のオリゴヌクレオチドを含有する。かかる本発明のオリゴヌクレオチドは、「分枝状」であるという。
【００９６】
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物は、２または３以上の自由な３’末端を有する少なくとも２つの結合アンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでよい。２または３以上のオリゴヌクレオチドを結合可能ないくつかの方法を、表２に示す。
【表２】
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【００９７】
式ＩＩおよび／またはＶのある態様において、Ｌはリンカーまたはヌクレオチド結合であり、ドメインＡおよび／またはドメインＢは、同一の標的ＲＮＡ配列または異なる標的ＲＮＡ配列に選択的にハイブリダイズするよう設計された、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００９８】
式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶのある態様において、Ｌはリンカーであり、ドメインＡおよび／またはドメインＢおよび／またはドメインＣは、同一の標的ＲＮＡ配列または異なる標的ＲＮＡ配列に選択的にハイブリダイズするよう設計された、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。例えば、一態様において、式ＩＩおよび／またはＩＩＩのドメインＡおよび／またはドメインＢおよび／またはドメインＣは、同一の標的ＲＮＡ配列列に選択的にハイブリダイズするよう設計された、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。この態様において、ドメインＡおよび／またはドメインＢおよび／またはドメインＣは、標的ＲＮＡ配列上の同一の領域に、または同一標的ＲＮＡ配列の異なる領域に、ハイブリダイズするよう設計することができる。
【００９９】
本発明のこの側面のさらなる態様において、ドメインＡ、ドメインＢおよびドメインＣは、独立してＲＮＡまたはＤＮＡベースのオリゴヌクレオチドである。この態様のある側面において、オリゴヌクレオチドは、混合された主鎖オリゴヌクレオチドを含有する。
【０１００】
別の態様において、式ＩＶのドメインＡおよび／またはドメインＢおよび／またはドメインＣの１または２以上は、１つの標的ＲＮＡ配列に選択的にハイブリダイズするよう設計された、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、残りのドメインＡおよび／またはドメインＢおよび／またはドメインＣの１または２以上は、異なる標的ＲＮＡ配列に選択的にハイブリダイズするよう設計された、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１０１】
別の態様において、式ＩＶのドメインＡ、ドメインＢまたはドメインＣの１または２以上は、細胞表面または細胞内受容体のアンタゴニストである。ある態様において、アンタゴニストはＴＬＲアンタゴニストである。
【０１０２】
別の態様において、式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよび／またはＶのドメインＡおよび／またはドメインＢおよび／またはドメインＣの１または２以上は、ドメインがｓｉＲＮＡ分子を含むような様式で相補的ＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた、ＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドである。
【０１０３】
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の、構成成分オリゴヌクレオチドは、少なくとも１４ヌクレオチド長の長さであるが、好ましくは１５〜４０ヌクレオチド長、好ましくは２０〜３０ヌクレオチド長である。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の、構成成分オリゴヌクレオチドは、独立して、長さが１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチド長であることができる。これらのオリゴヌクレオチドは、当分野に認識されている方法により調製することができ、例えば、手動または自動合成機により実施可能なホスホルアミデートまたはＨ−ホスホナート化学による。代表的な合成アプローチを、図１Ａおよび１Ｂに示す。本発明の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ｍＲＮＡにハイブリダイズするそれらの能力を損なうことなく、多くの方法により修飾してよい。かかる修飾には、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド間結合が、以下であるものが挙げられる：アルキルホスホナート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホナート、ホスフェートエステル、アルキルホスホノチオアート、ホスホルアミデート、カルバメート、カルボナート、ホスフェートヒドロキシル、アセトアミデート、またはカルボキシメチルエステル、または、これらとその他のヌクレオチド間結合（該結合は、１つのヌクレオチドの５’末端と他のヌクレオチドの３’末端の間の結合であって、ここで、５’ヌクレオチドホスホジエステル結合が、任意数の化学基で置き換えられているもの）との組み合わせ。
【０１０４】
本発明の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間結合の組み合わせを含んでよい。例えば、米国特許第5,149,797号には、メチルホスホナートまたはホスホルアミデート隣接領域間にあるホスホロチオアートコア領域を有する、伝統的なキメラオリゴヌクレオチドが記載されている。さらに、米国特許第5,652,356号には、オリゴヌクレオチドホスホロチオアートの１または２以上の領域が側面にある、１または２以上の非イオン性オリゴヌクレオチド領域（例えばアルキルホスホナートおよび／またはホスホルアミデートおよび／またはホスホトリエステルヌクレオシド間結合）を含む、「逆転」キメラオリゴヌクレオチドが開示されている。修飾ヌクレオチド間結合を有する種々の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標準法に従って調製可能である。ある態様においては、ホスホロチオアート結合は、混合されたＲｐおよびＳｐエナンチオマーであってよく、またはこれは、ＲｐもしくはＳｐどちらかの形態において立体規則性または実質的に立体規則性に作製してもよい。
【０１０５】
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物のその他の修飾としては、オリゴヌクレオチド分子の内部または末端（１または２以上）におけるものであって、ヌクレオシド間ホスフェート結合の分子への付加物を含み、例えばコレステロール、コレステリル、またはアミノ基と末端リボースの間に種々の数の炭素残基を有するジアミン化合物、および、デオキシリボースおよびホスフェート修飾物であって、反対側の鎖またはゲノムに結合する関連酵素もしくは他のタンパク質を切断するか、これに架橋するものである。かかる修飾オリゴヌクレオチドの例としては、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−ｂ−Ｄ−リボフラノシル、またはリボースの代わりにアラビノースなどの、修飾塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチド、または、その３’および５’位の両方において、ヒドロキシル基以外（その３’位において）またはホスフェート基以外（その５’位において）の化学基に連結している糖を有する、３’および５’−置換オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１０６】
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の糖に対するその他の修飾には、リボース部分の２’位への修飾を含み、これには、限定することなく、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む−Ｏ−アルキル基により、または２〜６個の炭素原子を有する−Ｏ−アリールもしくは−Ｏ−アリル基により置換された２’−Ｏ−を含み、かかる−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アリールまたは−Ｏ−アリル基は、非置換であるか、または例えばハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルバルコキシル（carbalkoxyl）、もしくはアミノ基により置換されていてもよい。これらの置換のいずれも、リボースの場合には天然の２’−ヒドロキシル基を有する他の残基、およびデオキシリボースの場合には２’Ｈ−の存在を除外することを意図しない。
【０１０７】
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物は、１または２以上のリボヌクレオチドを含むことができる。例えば、米国特許第5,652,355号には、ＤＮＡコア領域に隣接する２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドの領域を有する、伝統的なハイブリッドオリゴヌクレオチドが開示されている。米国特許第5,652,356号には、２つのオリゴデオキシリボヌクレオチド領域の間の２’−Ｏ−置換（または、２’ＯＨ、非置換）ＲＮＡ領域を含むオリゴヌクレオチドを含む、「逆転」ハイブリッドオリゴヌクレオチドが開示されており、これは、「伝統的な」ハイブリッドオリゴヌクレオチドに対して「逆転」した構造である。本発明の特に有用なオリゴヌクレオチドの非限定的例は、２’−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチドをその３’、５’、または３’および５’終端において有し、ここで少なくとも４個の、いくつかの例示の態様では５個の隣接するヌクレオチドがそのように修飾されている。２’−Ｏ−アルキル化基の非限定的例としては、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−ブチルおよび２’−Ｏ−メトキシ−エチルを含む。
【０１０８】
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物は、自動合成機および、図１Ｂに模式的に示し、さらに例１に記載したホスホルアミダイトアプローチを用いて、便利に合成することができる。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物は、リニア合成アプローチ（図１Ａ参照）により合成される。
【０１０９】
合成の代替様式は「パラレル合成」であり、ここでは合成は、中心リンカー部分から外側に進行する（図１参照）。米国特許第5,912,332号に記載のように、固体支持体結合リンカーをパラレル合成に用いることができる。代替的に、汎用固体支持体（例えば、ホスフェート連結制御細孔ガラス（phosphate attached controlled pore glass））を用いることもできる。
【０１１０】
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物のパラレル合成は、リニア合成に対していくつかの利点を有する：（１）パラレル合成は、同一のモノマー単位の組み込みを可能とする；（２）リニア合成と異なり、両方（または全ての）モノマー単位が同時に合成され、これにより、合成ステップ数および合成に必要な時間は、モノマー単位のそれらと同じである；および（３）合成ステップの低減は、最終の免疫調節オリゴヌクレオチド産物の純度および収率を改善する。
【０１１１】
リニア合成またはパラレル合成プロトコルのどちらかによる合成の最後に、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物は、濃縮アンモニア溶液により、またはもし修飾ヌクレオシドが組み込まれている場合はホスホルアミダイト供給業者の推奨にしたがって、便利に脱保護することができる。オリゴヌクレオチドベースの化合物の産物は、好ましくは、逆相ＨＰＬＣ、脱トリチル化、脱塩および透析により精製される。
【０１１２】
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の非限定的なリストを、次の表３の配列番号１〜配列番号１７５に示す。表３に示すように、オリゴヌクレオチドベースの化合物はホスホロチオアート（ＰＳ）結合を有するが、ホスホジエステル（ｏ）結合も含んでよい。当業者はしかし、ホスホジエステルまたは非ホスホジエステル部分に基づくその他の結合も含有してよいことを認識する。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表３−１３】
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【表３−１４】
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【０１１３】
本発明のこの側面において、本組成物は、一定のオリゴヌクレオチド組成物の免疫刺激活性が欠けている。一定のオリゴヌクレオチドベースの組成物は、免疫刺激モチーフを有し得ることが知られている。この免疫刺激活性には、オリゴヌクレオチドが非結合であるか、またはその３’末端で結合していることが必要である。したがって、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶに示すように、５’末端での結合を利用する本発明のオリゴヌクレオチドベースの組成物の結果として、その任意の固有の免疫刺激活性は、非結合であるかまたは３’末端もしくは２’−５’様式で結合しているオリゴヌクレオチドベースの組成物に存在する免疫刺激活性と比べて、阻害されることが意図される。
【０１１４】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の構造が、ＲＮａｓｅＨ媒介性および／またはＲＮＡｉ媒介性の遺伝子発現阻害に関与する酵素およびその他のタンパク質による結合について、最適な化合物を提供することを見出した。したがって、本発明のこの側面のさらなる態様において、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物は、ＲＮａｓｅＨ、ダイサー、アルゴノート、ＲＩＳＣまたはＲＮＡｉ媒介性の遺伝子発現の阻害に関与するその他のタンパク質により、選択的に結合されることができる。この選択的結合は、in vitroおよびin vivoでのＲＮａｓｅＨ媒介性および／またはＲＮＡｉ媒介性の遺伝子発現阻害を利用するための、最適なオリゴヌクレオチドベースの化合物を提供する。
【０１１５】
第２の側面において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物および生理学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤を提供する。
【０１１６】
第３の側面において、本発明は、遺伝子発現を阻害する方法であって、細胞を、本発明の第１の側面による合成オリゴヌクレオチドベースの化合物と接触させることを含む、前記方法を提供する。
【０１１７】
第４の側面において、本発明は、哺乳動物において遺伝子発現を阻害する方法であって、該哺乳動物に対して、本発明の第１の側面による合成オリゴヌクレオチドベースの化合物を投与することを含む、前記方法を提供する。本発明のこの側面のさらなる態様において、本発明の第１の側面による合成オリゴヌクレオチドベースの化合物は、限定することなく、癌遺伝子を含む、細胞増殖に関連するある遺伝子の発現および活性を阻害し得ることが、意図される。
【０１１８】
第５の側面において、本発明は、哺乳動物におけるＴＬＲ媒介性、Ｂｃｌ−２媒介性、ＥＧＦＲ媒介性、ｍｄｍ２媒介性、ＭｙＤ８８媒介性、ＰＣＳＫ９媒介性、サバイビン媒介性、またはＶＥＧＦ媒介性の応答を、本発明の第１の側面による合成オリゴヌクレオチドベースの化合物の投与を介して阻害する方法を提供し、ここでオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲシグナル伝達、またはＢｃｌ−２、ＥＧＦＲ、ｍｄｍ２、ＭｙＤ８８、ＰＣＳＫ９、サバイビン、もしくはＶＥＧＦ活性に関与する分子をコードする、１または２以上のｍＲＮＡ配列に相補的である。
【０１１９】
第６の側面において、本発明は、哺乳動物におけるＴＬＲ媒介性、Ｂｃｌ−２媒介性、ＥＧＦＲ媒介性、ｍｄｍ２媒介性、ＭｙＤ８８媒介性、ＰＣＳＫ９媒介性、サバイビン媒介性、またはＶＥＧＦ媒介性の応答を、本発明の第１の側面による合成オリゴヌクレオチドベースの化合物であって、オリゴヌクレオチドが１または２以上の、ＴＬＲ、Ｂｃｌ−２、ＥＧＦＲ、ｍｄｍ２、ＭｙＤ８８、ＰＣＳＫ９、サバイビン、またはＶＥＧＦのｍＲＮＡ配列に相補的である前記化合物を、ＴＬＲ、Ｂｃｌ−２、ＥＧＦＲ、ｍｄｍ２、ＭｙＤ８８、ＰＣＳＫ９、サバイビン、またはＶＥＧＦタンパク質の活性のアンタゴニストと組み合わせて投与することを介して、阻害する方法を提供する。
【０１２０】
第７の側面において、本発明は、哺乳動物における遺伝子発現を阻害する方法であって、該哺乳動物に対して、本発明によるオリゴヌクレオチドベースの化合物を投与することを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。好ましい態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドベースの化合物は、その免疫応答を阻害することが必要な哺乳動物に投与される。
【０１２１】
第８の側面において、本発明は、疾患または障害を有する患者を治療的に処置する方法を提供し、かかる方法は、該患者に対して、本発明によるオリゴヌクレオチドベースの化合物を、治療有効量で投与することを含む。種々の態様において、処置する疾患または障害は、癌、自己免疫障害、感染症、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、喘息、または病原菌による疾患である。病原菌は、細菌、寄生生物、真菌、ウイルス、ウイロイド、およびプリオンを含む。
【０１２２】
第９の側面において、本発明は、疾患または障害を予防する方法を提供し、かかる方法は、疾患または障害を発症するリスクのある対象に対して、本発明によるオリゴヌクレオチドベースの化合物を、薬学的有効量で投与することを含む。対象は、該対象が疾患もしくは障害の病原因子に暴露されてきたか、される可能性があるか、またはされるであろう場合に、または疾患もしくは障害になる遺伝的素因を有する場合に、疾患または障害を発症するリスクがあると考えられる。種々の態様において、予防する疾患または障害は、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性疾患、感染症、アレルギー、喘息、または病原菌による疾患である。病原菌は、細菌、寄生生物、真菌、ウイルス、ウイロイド、およびプリオンを含む。
【０１２３】
第１０の側面において、本発明は、障害を予防または処置する方法を提供し、かかる方法は、以下を含む：サイトカインまたはケモカインであって、限定することなく、免疫細胞、Ｔ調節細胞、Ｂ細胞、ＰＢＭＣ、ｐＤＣ，およびリンパ球細胞を含む前記サイトカインまたはケモカインを産生可能な細胞を単離すること；かかる細胞を、標準細胞培養条件下で培養すること、かかる細胞をex vivoで本発明の第１の側面によるオリゴヌクレオチドベースの化合物で処理して、単離された細胞が低減されたレベルのサイトカインまたはケモカインを産生または分泌するようにすること；および、処理された細胞を治療の必要な患者に対して投与または再投与して、疾患の予防および／または処置のためにサイトカインおよび／またはケモカインを阻害すること。本発明のこの側面は、活性免疫細胞を産生する標準の養子細胞免疫療法技術に従ってもよい。
【０１２４】
本発明のこの側面のいくつかの態様において、サイトカインまたはケモカインを産生することのできる細胞は、疾患または障害を有するかまたは有していない対象から単離してもよい。かかる単離には、同定および選択を含んでよく、標準の細胞単離手順を用いて実施することができ、これには、以下の特定の例に記載されたものを含む。このように単離された細胞は、標準の細胞培養手順に従い、標準の細胞培養条件を用いて培養され、これらには、以下の特定の例に記載された培養手順および条件を含んでよい。本発明のこの態様のさらなる側面において、単離された細胞は、少なくとも１つの本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の存在下において、かかる１または２以上の本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の不在下で培養した単離細胞と比較して、サイトカインおよび／またはケモカインの産生および／または分泌を抑制または阻害するのに十分な量および時間で、培養される。かかる時間は、数分から数時間、数日間であってよい。こうして単離および処理された細胞は、ドナーへの再投与の後に、または第２の患者への投与の後に使用が見出され、ここでかかるドナーまたは第２の患者は、サイトカインおよび／またはケモカインの産生および／または分泌の抑制または阻害を必要とするものである。例えば、ドナーへの再投与、または癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性疾患、感染症、アレルギー、喘息、または病原菌による疾患を有する第２の患者への投与である。かかる再投与または投与は、カテーテルまたは注射投与または任意のその他の有効な経路を含む、種々の様式で実施してよい。本発明のこの側面はまた、免疫応答を行うのに制限されたかまたは不完全な能力を有する可能性があるか、または免疫低下した（例えばＨＩＶに感染した患者および骨髄移植患者）患者において、使用を見出すことができる。
【０１２５】
第１１の側面において、本発明は、本発明の第１の側面による化合物および、１または２以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、化学療法剤（伝統的化学療法および新しい標的療法の両方）、キナーゼ阻害剤、アレルゲン、抗生物質、アゴニスト、アンタゴニスト、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、アプタマー、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激分子、またはこれらの組み合わせを含む、組成物を提供する。
【０１２６】
本発明のいずれの方法においても、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物は、直接的な遺伝子発現調節効果を、それのみで生成するか、および／または、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の遺伝子発現調節効果を減少させることなく疾患または病態を処置または予防するのに有用な、任意の他の剤と組み合わせて生成することにより、様々に作用することができる。本発明のいずれの方法においても、疾患または病態を処置または予防するのに有用な１または２以上の任意の他の剤としては、限定することなく、ワクチン、抗原、抗体、好ましくはモノクローナル抗体、細胞毒性剤、キナーゼ阻害剤、アレルゲン、抗生物質、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアンタゴニスト（例えばＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７のアンタゴニストおよび／またはＴＬＲ８のアンタゴニストおよび／またはＴＬＲ９のアンタゴニスト）、化学療法剤（伝統的化学療法および新しい標的療法の両方）、標的化治療剤、活性化細胞、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ペプチドワクチン、タンパク質ワクチン、ＤＮＡワクチン、アジュバント、および共刺激分子（例えばサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、または修飾アミノ酸を含むペプチド）、またはこれらの組み合わせを含む。例えば、癌の処置において、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物は、１または２以上の化学療法化合物、標的化治療剤および／またはモノクローナル抗体と組み合わせて投与できることが、意図される。代替的に、剤には、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含むことができる。代替的に、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物は、他の化合物（例えば脂質またはリポソーム）と組み合わせて投与して、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の特異性または遺伝子発現調節の程度を強化することができる。
【０１２７】
本発明のいずれの方法においても、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の、それのみまたは任意の他の剤と組み合わせた投与は、任意の適した経路で行うことができ、これには限定することなく、非経口、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼、または洗口形態を含む。本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の治療組成物の投与は、既知の手順を用い、有効量および疾患の症状または代理マーカーを低減するのに有効な期間を用いて、実施することができる。例えば、疾患および／または障害を処置するための、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の有効量は、症状を改善もしくは低減するため、または腫瘍、癌、または細菌もしくはウイルスもしくは真菌感染症を遅延もしくは緩和するために必要な量であることができる。遺伝子発現を調節する組成物の投与の文脈において、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の有効量は、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の不在における遺伝子発現と比較して、所望の調節を達成するのに十分な量である。任意の特定用途についての有効量は、処置する疾患または病態、投与する特定のオリゴヌクレオチド、対象の大きさ、または疾患もしくは病態の重篤度などの要因に依存して変化し得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、特定のオリゴヌクレオチドの有効量を経験的に決定することができる。
【０１２８】
全身的に投与する場合、治療組成物は好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の血液レベルで約０．０００１μＭ〜約１０μＭを達成するのに十分な用量で投与する。局所的投与については、これよりはるかに低い濃度が有効となり得、またはるかに高い濃度も耐容され得る。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の総用量は、１日患者当たり約０．００１ｍｇ〜１日体重１ｋｇ当たり約２００ｍｇの範囲である。ある態様において、総用量は、０．０８、０．１６、０．３２、０．４８、０．３２、０．６４、１、１０または３０ｍｇ／体重１ｋｇを毎日、週に２回、または毎週の投与であってよい。１または２以上の本発明の治療組成物の治療有効量を、同時に、または連続して、１個人に対する１回の処置エピソードとして投与することが望ましい場合もある。
【０１２９】
本発明のこの側面による方法は、遺伝子発現のモデル研究に有用である。方法はまた、ヒトまたは動物の疾患の、予防的または治療的処置に有用である。例えば、方法は、遺伝子発現用途の小児科的および獣医学的阻害に有用である。
【０１３０】
以下の例は、本発明のある好ましい態様をさらに説明することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１３１】
例１：
オリゴヌクレオチドベースの化合物の調製
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物を、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でホスホルアミダイト化学を用いて、化学的に合成した。ＴＡＣ保護（Ｕを除く）２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ ＲＮＡモノマー、Ａ、Ｇ、ＣおよびＵは、Sigma-Aldrichより購入した。７−デアザ−Ｇ、イノシンおよびロキソリビンモノマーは、ChemGenes Corporationより購入した。０．２５Ｍの５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール、ＰＣＡ−無水Ｃａｐ ＡおよびＣａｐ Ｂは、Glen Researchより購入した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の３％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）および５％３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（ビューケージ（Beaucage）試薬）は自家で作製した。
【０１３２】
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物は、標準のＲＮＡ合成プロトコルを用いて、１〜２μＭスケールで合成した。
【０１３３】
切断および塩基脱保護
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物を固体支持体から切断し、溶液をさらに６５℃に加熱して、エキソ環式アミンの保護基を除去した。得られた溶液は、SpeedVacで完全に乾燥した。
【０１３４】
１Ｅ  ＨＰＬＣ精製
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物を、イオン交換ＨＰＬＣで精製した。
カラム：Dionex DNAPac 100カラム（２２Ｘ２５０）
カラムヒーター：Chrom Tech TL-105ＨＰＬＣカラムヒーター、温度は８０℃に設定。
バッファーＡ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、２０％アセトニトリル。
バッファーＢ：３．０ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、２０％アセトニトリル
流量：１０ｍｌ／分
勾配：
０〜２分：０％Ｂ
２〜１１分：０％Ｂから３５％Ｂ
１１〜４１分：３５％Ｂから９０％Ｂ
４１〜４５分：１００％Ｂ
【０１３５】
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の粗溶液をＨＰＬＣに注入した。上記の勾配を実施して、画分を収集した。９０％を超える所望の産物を含有する全ての画分を混合し、次に溶液をほぼ乾燥するまでRoto Vapで濃縮した。ＲＮＡｓｅ非含有水を加えて、最終容量を１０ｍｌとした。
【０１３６】
Ｃ−１８逆相脱塩
Watersから購入したCC-18 Sep-Pakカートリッジを、初めに１０ｍｌのアセトニトリルで、次に１０ｍｌの０．５Ｍ酢酸ナトリウムで調整した。１０ｍｌの本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物の溶液を負荷した。次に１５ｍｌの水を用いて塩を洗い流した。本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物を、水中の１ｍｌの５０％アセトニトリルにより溶出した。
【０１３７】
溶液をSpeedVac内に３０分間置いた。残りの溶液を０．２マイクロフィルターに通し、次に乾燥まで凍結乾燥した。固体を次に再度水に溶解して、所望の濃度とした。
【０１３８】
最終溶液は０℃未満で保存した。
【０１３９】
キャピラリー電気泳動
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物を、次の条件に従ってキャピラリー電気泳動で分析した。
機器：Beckman 5010
毛細管：６２ｃｍｓｓＤＮＡ毛細管
試料の調製：０．２ＯＤの本発明のオリゴヌクレオチドベースの組成物を２００ｕｌのＲＮＡｓｅ非含有水に溶解した。
注入：５ＫＶで５秒間の動電学的注入
走行条件：１４ＫＶ、３０℃で５０分間
【０１４０】
イオン交換ＨＰＬＣ分析
本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物を、次の条件に従ってイオン交換ＨＰＬＣで分析した。
カラム：Dionex DNAPac ガードカラム（２２Ｘ２５０）
カラムヒーター：Chrom Tech TL-105ＨＰＬＣカラムヒーター、温度は８０℃に設定。
バッファーＡ：１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０％アセトニトリル。
バッファーＢ：２．０ＭのＬｉＣｌ、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０％アセトニトリル
流量：２ｍｌ／分
勾配：
０〜２分：０％Ｂ
２〜１０分：０％Ｂから１００％Ｂ
１０〜１５分：１００％Ｂ
【０１４１】
ＰＡＧＥ分析
０．３ＯＤの本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物を２０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、これを４ワットの定常電力で約５時間走行させた。ゲルは短波長ＵＶ光のもとで観察した。
【０１４２】
例２：
ヒトＰＢＭＣの単離
新しく採取した健康なボランティアの血液（CBR Laboratories, Boston, MA）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ficoll密度勾配遠心法（Histopaque-1077, Sigma）により単離した。
【０１４３】
ヒトｐＤＣの単離
ヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を、新しく得た健康なヒトボランティアの血液ＰＢＭＣから、製造業者の指示に従ってBDCA4細胞単離キット（Miltenyi Biotec）を用いて正の選択により単離した。
【０１４４】
ＰＢＭＣおよびｐＤＣの処理
ヒトＰＢＭＣを、５×１０６細胞／ｍｌを用いて４８ウェルプレートにプレートした。ヒトｐＤＣを、１×１０６細胞／ｍｌを用いて９６ウェルディッシュにプレートした。例示の本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物をＤＰＢＳ（ｐＨ７．４；Mediatech）に溶解し、これを細胞培養物に０、０．０１、１．０または１０．０μｇ／ｍｌの用量で加えた。細胞を次に３７℃で２４時間インキュベートし、続いて１０μｇ／ｍｌのＴＬＲ９アゴニストで２４時間刺激した。処理および刺激の後、上清をluminex多重またはＥＬＩＳＡアッセイ用に収集した。一定の実験においては、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６、および／またはＩＬ−１２のレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。サイトカイン抗体および標準を含む必要な試薬は、PharMingenより購入した。
【０１４５】
ＴＬＲ９アンチセンス活性のためのヒトＢ細胞アッセイ
ヒトＢ細胞を、ＰＢＭＣから、ＣＤ１９細胞単離キット（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）を用い製造業者の指示に従って、正の選択により単離した。
【０１４６】
アッセイに用いた培養培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地に１．５ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン混合物、および１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を補足したものである。
【０１４７】
全体で１ｍｌ当たり０．５×１０６のＢ細胞（すなわち、１×１０６／２００μｌ／ウェル）を、９６ウェル平底プレート内で５０μｇ／ｍｌの例示の本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物と共に２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞を１０μｇ／ｍｌのＴＬＲ９アゴニストで２４時間刺激した。処理および刺激の後、細胞抽出物を調製し、ＴＬＲ９ｍＲＮＡの量について分析した。
【０１４８】
ＴＬＲ９またはＴＬＲ７アンチセンス活性についてのＨＥＫ２９３細胞培養アッセイ
マウスＴＬＲ９またはＴＬＲ７を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（Invivogen, San Diego, CA）を、５％ＣＯ２インキュベータにおいて、４８ウェルプレート内の、１０％熱不活性化ＦＢＳを補足した２５０μＬ／ウェルのＤＭＥＭ中にプレートした。８０％の集密度において、培養物を一時的に、培養培地中４μＬ／ｍＬのリポフェクタミン（Invitrogen, Carlsbad, CA）の存在下、ヒト胎児アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポータープラスミド（pNifty2-Seap）（Invivogen）の分泌形態４００ｎｇ／ｍｌを用いてトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡおよびリポフェクタミンを、無血清培地中で別々に希釈し、室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、希釈したＤＮＡおよびリポフェクタミンを混合し、混合物をさらに室温で２０分インキュベートした。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡおよび１μＬのリポフェクタミンを含む、ＤＮＡ／リポフェクタミン混合物の２５μＬのアリコートを、細胞培養プレートの各ウェルに加え、細胞を６時間トランスフェクトした。トランスフェクションの後、培地を新鮮な培養培地（抗生物質なし）に置き換えて、０、０．０１、１または１０μｇ／ｍｌの、ＴＬＲ９またはＴＬＲ７特異的な本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物をウェルに加え、インキュベーションを２４時間継続した。アンチセンス処理に続いて、細胞を次に１０μｇ／ｍｌのＴＬＲ９またはＴＬＲ７アゴニストで２４時間刺激した。
【０１４９】
処理および刺激の最後に、２０μＬの細胞上清を各ウェルから取り出し、ＳＥＡＰアッセイについて、製造業者のプロトコル（Invivogen）に従ってQuanti Blue法によりアッセイした。データは、ＰＢＳ対照に対するＮＦ−κＢ活性の増加倍数で示す。
【０１５０】
ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはその他の特異的ＲＮＡ標的アンチセンス活性についてのＨＥＫ２９３細胞培養アッセイ
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８またはその他の特異的ＲＮＡ標的を阻害する活性を決定するために、次の手順に従った：マウスＴＬＲ７またはＴＬＲ８またはその他の特異的ＲＮＡ標的を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（Invivogen, San Diego, CA）を、５％ＣＯ２インキュベータにおいて、４８ウェルプレート内の、１０％熱不活性化ＦＢＳを補足した２５０μＬ／ウェルのＤＭＥＭ中にプレートした。８０％の集密度において、培養物を一時的に、培養培地中４μＬ／ｍＬのリポフェクタミン（Invitrogen, Carlsbad, CA）の存在下、ヒト胎児アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポータープラスミド（pNifty2-Seap）（Invivogen）の分泌形態４００ｎｇ／ｍｌを用いてトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡおよびリポフェクタミンを、無血清培地中で別々に希釈し、室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、希釈ＤＮＡおよびリポフェクタミンを混合し、混合物をさらに室温で２０分インキュベートした。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡおよび１μＬのリポフェクタミンを含む、ＤＮＡ／リポフェクタミン混合物の２５μＬのアリコートを、細胞培養プレートの各ウェルに加え、細胞を６時間トランスフェクトした。トランスフェクションの後、培地を新鮮な培養培地（抗生物質なし）に置き換えて、０、０．０１、１または１０μｇ／ｍｌの、本発明の特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドをウェルに加え、インキュベーションを２４時間継続した。アンチセンス処理に続いて、細胞を次に１０μｇ／ｍｌの標的のアゴニストで２４時間まで刺激した。
【０１５１】
処理および刺激の最後に、２０μＬの細胞上清を各ウェルから取り出し、ＳＥＡＰアッセイについて、製造業者のプロトコル（Invivogen）に従ってQuanti Blue法によりアッセイした。データは、ＰＢＳ対照に対するＮＦ−κＢ活性の増加倍数で示す。
【０１５２】
ＴＬＲ９アンチセンス活性についてのマウスＪ７７４細胞アッセイ
マウスＪ７７４マクロファージ細胞（American Type Culture Collection, Rockville, MD）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清および抗生物質（１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンＧ／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を補足したダルベッコ修飾イーグル培地で培養した。Ｊ７７４細胞を、６ウェルプレートに５×１０６細胞／ウェルの密度でプレートした。用量依存性実験のために、Ｊ７７４細胞を次に、０、１、１０、５０または１００μｇ／ｍｌの本発明のＴＬＲ９特異的オリゴヌクレオチドベースの化合物で処理し、インキュベーションを２４時間継続した。ｍＲＮＡへの効果を決定する実験のために、Ｊ７７４細胞を次に、０、１、または３μｇ／ｍｌの本発明のＴＬＲ９特異的オリゴヌクレオチドベースの化合物または対照オリゴヌクレオチドで処理し、インキュベーションを４８時間継続した。タンパク質への効果を決定する実験のために、Ｊ７７４細胞を次に、０または５０μｇ／ｍｌの本発明のＴＬＲ９特異的オリゴヌクレオチドベースの化合物または対照オリゴヌクレオチドで処理し、インキュベーションを４８時間継続した。アンチセンス処理に続いて、細胞抽出物を調製し、ＴＬＲ９ｍＲＮＡまたはＴＬＲ９タンパク質の量について分析した。
【０１５３】
ＶＥＧＦアンチセンス活性についてのＨｅＬａ細胞アッセイ
５×１０６のＨｅＬａ細胞（ATCC, Manassas, VA）を、１２ウェル培養プレート内の１０％ウシ胎仔血清（FBS, Mediatech, Manassas, VA）を補足したダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM, Mediatech, Manassas, VA）にプレートした。細胞トランスフェクションには、５μｌのリポフェクタミン（登録商標）２０００（Invitrogen, Carlsbad, CA）および５μｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、１００μｌの無血清ＤＭＥＭ中に混合し、室温で１５分間インキュベートした。細胞を無血清ＤＭＥＭで１回洗浄し、１００μｌのリポフェクタミン／オリゴヌクレオチド複合体を９００μｌの無血清ＤＭＥＭに加え、続いて５％ＣＯ２を用いて３７℃で２時間インキュベーションした。リポフェクタミンのみの群は対照として用いる。培地を次に、１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭに変更し、２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、全ＲＮＡを、製造業者の指示に従ってQIAGEN RNeasyミニキット（QIAGEN, Valencia, CA）を用いて単離した。１μｇのＲＮＡを用いて、製造業者の推奨に従ってHigh Capacity cDNA Reverse Transcriptionキット（Applied biosystems, Carlsbad, CA）を用いてｃＤＮＡの逆転写を行った。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）には、ＶＥＧＦ用（カタログＮＯ．Hs00900057_ml）およびＧＡＰＤＨ用（Hs99999905_ml）のプライマーおよびプローブを、Applied Biosystemsから購入した。５０ｎｇのｃＤＮＡを、ｑＰＣＲにおいてTaqman（登録商標）Fast Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）と共に用いて、反応はApplied BiosystemsのStepOnePlus? Real-Time PCR Systemで製造業者の指示に従って実施した。データを図８Ｄに、ΔΔＣＴ法を用いて、リポフェクタミン処理細胞に対する相対的なｍＲＮＡの量として示し、ここで、ΔＣＴ＝ＣＴＶＥＧＦ−ＣＴＧＡＰＤＨおよびΔΔＣＴ＝ΔＣＴオリゴヌクレオチド−ΔＣＴリポフェクタミンである。各バーは、２〜３の個別の実験を示す。
【０１５４】
ＴＬＲ９アンチセンス活性についてのＣ５７ＢＬ／６マウス脾細胞アッセイ
４〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスからの脾細胞を、ＲＰＭＩ完全培地で培養した。マウス脾細胞を５×１０６細胞／ｍｌで２４ウェルディッシュにプレートし、ＴＥバッファー（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解した本発明のＴＬＲ９特異的オリゴヌクレオチドベースの化合物で処理し、３７℃で２４時間インキュベートした。アンチセンス処理の後、細胞を次に、１０μｇ／ｍｌのＴＬＲ９アゴニストで２４時間刺激した。処理および刺激の後、上清を収集し、細胞培養上清物中のＩＬ−１２およびＩＬ−６分泌を、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した
【０１５５】
例３：
オリゴヌクレオチドベースの組成物のin vivo活性
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのin vivo活性を評価するために、５〜６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝３／群）に、本発明の例示のオリゴヌクレオチドベースの組成物を０．２５、２、または５ｍｇ／ｋｇで、またはＰＢＳを、左側腹部に皮下注射した。オリゴヌクレオチドベースの組成物の投与の２４時間後、マウスに、０．２５ｍｇ／ｋｇのＴＬＲアゴニストを右側腹部に皮下注射した。ＴＬＲアゴニスト投与の２時間後、血液を採取し、血清ＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。データは、ＩＬ−１２の絶対濃度またはＩＬ−１２産生のパーセンテージとして示す。
【０１５６】
オリゴヌクレオチドベースの組成物のin vivo活性の持続時間
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのin vivo活性の持続時間を評価するために、５〜６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝３／群）に、本発明の例示のオリゴヌクレオチドベースの組成物を５ｍｇ／ｋｇで、またはＰＢＳを、左側腹部に皮下注射した。オリゴヌクレオチドベースの組成物の投与の２４時間後、０．２５ｍｇ／ｋｇのＴＬＲアゴニストをマウスの右側腹部に、１、３、５、７、１０または１４日目に皮下注射した。ＴＬＲアゴニストの各投与の２時間後、血液を採取し、血清ＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。データは、ＩＬ−１２の絶対濃度またはＩＬ−１２産生のパーセンテージとして示す。
【０１５７】
例４：
アンチセンス関連タンパク質および酵素による、オリゴヌクレオチドベースの化合物の選択的結合および切断
アンチセンス関連タンパク質および酵素の、本発明のオリゴヌクレオチドベースの化合物または対照オリゴヌクレオチドに結合および切断する特異性を評価するために、以下のように処理した：３０ｍｌのバッファー（１０Ｘバッファー、Invitrogen）中の５’末端［γ―３２Ｐ］ラベル標的ｍＲＮＡ（例えば配列番号２１：１０ｎＭのヒト／マウスＴＬＲ７）および相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ（１０ｎＭ；ヒト／マウスＴＬＲ７）を８５℃で５分間加熱し、室温に２０分間冷却して、２本鎖のアニーリングを許容した。ヒトダイサー酵素（０．０２５Ｕ、Invitrogen）を反応溶液に加え、次に３７℃で１時間インキュベートした。１ｍｌの停止溶液（Invitrogen）および１０ｍｌのゲル負荷染料を試料溶液に加えて、よく撹拌した。試料を直ちに−８０℃に冷凍した。ＲＮＡ消化産物を１６％変性ＰＡＧＥ上で分析し、ゲルをＸ線フィルムに暴露し、オートラジオグラムを現像した。結果を図１３に示す。
【０１５８】
等価物
当業者は、ルーチンの実験以上のものを用いることなく、本明細書に記載の特定の物質および手順の多数の等価物を認識し、または解明することができる。例えば、オリゴヌクレオチドとオーバーラップするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてもよい。かかる等価物は本発明の範囲内と考えられ、以下のクレームに包含される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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