(57)【要約】  本開示は、糸状菌宿主株、並びに、その作製及び使用のための組み換えＤＮＡ構築物に関する。糸状菌宿主株は、組み換え酵素及び変異体の信頼できる発現を達成するのに特に有用である。
2013533737.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌宿主細胞発現系であって、
ａ．染色体ＤＮＡの中に非相同組み換え（ＮＨＲ）経路の１つ以上の構成要素の破壊と、第１選択機能を欠く第１選択マーカーと、第２選択機能を付与するように機能する第２選択マーカーと、を含有する菌細胞宿主、並びに、
ｂ．前記菌宿主細胞に導入されると、前記第１選択機能を前記第１選択マーカーに付与する配列と、目的の遺伝子の１つ以上を発現させるように機能する配列と、前記染色体選択マーカーに隣接する配列と実質的な相同性を有する配列と、を含有する核酸分子、を含み、
前記相同配列が、機能性第１選択マーカーを生じ、前記第２選択マーカーを除去し、前記目的の遺伝子を発現させる相同組み換え事象を引き起こす、糸状菌宿主細胞発現系。
【請求項２】
前記ＮＨＲ経路の１つ以上の構成要素が、ｋｕ８０、ｋｕ７０、ｒａｄ５０、ｍｒｅ１１、ｘｒｓ２、ｌｉｇ４及びｘｒｓからなる群から選択される、請求項１に記載の糸状菌宿主細胞発現系。
【請求項３】
前記第１選択マーカー及び前記第２選択マーカーが、ａｌｓＲ、ａｍｄＳ、ｈｙｇＲ、ｐｙｒ２、ｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ｓｕｃＡ、ブレオマイシン耐性マーカー、ブラスチジン耐性マーカー、ピリチアミン耐性マーカー、クロリムロンエチル耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、アデニン経路遺伝子、トリプトファン経路遺伝子、及びチミジンキナーゼからなる群から選択される異なるマーカーである、請求項１に記載の糸状菌宿主細胞発現系。
【請求項４】
前記菌宿主細胞が、トリコデルマ、アオカビ、アスペルギルス、フミコーラ、クリソスポリウム、フザリウム、アカパンカビ及びエメリセラからなる群から選択される属から得たものである、請求項１に記載の糸状菌宿主細胞発現系。
【請求項５】
前記トリコデルマがトリコデルマ・リーゼイである、請求項４に記載の糸状菌宿主細胞発現系。
【請求項６】
前記アスペルギルスがアスペルギルス・ニガーである、請求項４に記載の糸状菌宿主細胞発現系。
【請求項７】
前記目的の遺伝子が、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の糸状宿主細胞発現系。
【請求項８】
前記目的の遺伝子が、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、加水分解酵素、インベルターゼ、異性化酵素、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクタートリアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解性酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の糸状宿主細胞発現系。
【請求項９】
前記目的の遺伝子が、ペプチドホルモン、成長因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原及びこれらの断片からなる群から選択される、請求項１に記載の糸状宿主細胞発現系。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の糸状宿主細胞発現系において目的の遺伝子を発現させる方法であって、前記核酸分子を前記糸状菌宿主細胞の中に導入すること、前記宿主細胞を培養すること、及び前記第１選択機能を有するが前記第２選択機能を持たない宿主細胞を選択すること、を含む、方法。
【請求項１１】
前記目的の遺伝子の発現についてのアッセイを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的の遺伝子によりコードされるポリペプチドの生化学的機能についてのアッセイを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願第６１／３５１，２８６号（２０１０年６月３日出願）に対する優先権を主張するものであり、これらの開示内容は、参照により本出願に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、糸状菌宿主株、並びに、その作製及び使用のための組み換えＤＮＡ構築物に関する。糸状菌宿主株は、目的のタンパク質を高信頼性又は低変動性のやり方で発現させるのに、並びに、組み換えタンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを効率的にスクリーニングするのに、特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
糸状菌宿主細胞株は、様々なタンパク質を発現させるために、設計されてきた。これらのタンパク質は、それゆえに、場合により精製後に、様々な産業、学術又は他の用途において使用することができる。この発現プロセスは、多くの場合、予測不可能であり得る。調製された形質転換体のうちの、たとえあったとしても、非常に少数しか目的の酵素を実際に生じないことはよくあることである。異種遺伝子（例えば、非自生遺伝子、又は自然形態とは異なる形態で存在する自生遺伝子）の発現における変動性は、これらの核酸及び／又はアミノ酸配列に関連しない因子の結果として生じ得る。例えば、非相同の組み込みは、糸状菌において優勢である。それゆえに、発現ベクターは、ランダムにゲノムの中に組み込みを行い、場合により、形質転換体間の発現レベルに配置効果を生じる。加えて、不安定な形質転換体が生じる恐れがあり、安定な形質転換体を得るには形質転換体の更なるスクリーニングを必要とする。変動性もまた、多核性プロトプラストの形質転換の結果としての異核共存体の生成により生じる。したがって、低変動性を有しながら高信頼性で目的酵素を作製する手段は、明らかに利益をもたらす。
【０００４】
特定の産業用途にとって、真菌宿主株から作製されるこれらのタンパク質は、多くの場合、新たな望ましい特徴又は異なるレベルの特定の特徴を得るために、設計される。これらの場合では、現存している糸状菌宿主細胞株が、多くの場合、変異体タンパク質をコードするＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用される。発現効率及び／又はレベルの変動性のために、所与の変異体と別のものの特徴を比較することが困難になる。したがって、変異体が高信頼性で発現できる場合、特定の宿主株により発現できる場合、並びに、変異体がこれらの特徴をより容易に評価及び比較できるように平変動性レベルで発現できる場合、特別な利益は、明らかに存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
テロメアの染色体外複製ベクターをゲノム組み込みの代わりとして使用できるが、この方法は、形質転換体間の発現レベルにおける変動性をなくすものではない。それゆえに、当該技術分野は、糸状菌宿主株からの遺伝子発現における配列とは独立した差異を低減するためのツールから利益を享受する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、糸状菌宿主株、並びに、その作製及び使用のための組み換えＤＮＡ構築物に関する。糸状菌宿主株は高信頼性で形質転換体を作製し、発現レベルにおいて変動性を低減して酵素を発現させる。この糸状菌宿主細胞は、組み換えタンパク質をコードするＤＮＡライブラリーの効率的なスクリーニングに有用である。
【０００７】
特に、本開示は、ａ）染色体ＤＮＡの中に非相同組み換え（ＮＨＲ）経路の１つ以上の構成要素の破壊と、第１選択機能を欠く第１選択マーカーと、第２選択機能を付与するように機能する第２選択マーカーと、を含有する糸状菌細胞宿主、並びに、ｂ）この菌宿主細胞に導入されると、第１選択マーカーに第１選択機能を付与する配列と、目的の１つ以上の遺伝子又は目的の変異体遺伝子を発現するように機能する配列と、染色体選択マーカーに隣接する配列に対する実質的な相同性を有する配列と、を含有する核酸分子、を含む糸状菌宿主細胞発現系を提供し、ここで、相同配列は、相同組み換えを引き起こし、機能性第１選択マーカーを生じ、第２選択マーカーを除去し、目的の遺伝子又は目的の変異体遺伝子を発現させる。一部の実施形態では、ＮＨＲ経路の１つ以上の構成要素は、ｋｕ８０、ｋｕ７０、ｒａｄ５０、ｍｒｅ１１、ｘｒｓ２、ｌｉｇ４及びｘｒｓ２からなる群の１つ以上を含む。特定の実施形態では、ｂ）においてこの菌宿主細胞の中に導入される核酸分子は、非自生分子か又は菌宿主細胞に対して非自生形態で存在する自生分子かのいずれかであることができる。
【０００８】
遺伝子欠失は、欠失プラスミドの使用により達成され得る。例えば、欠失させること又は破壊されることが望まれる遺伝子は、プラスミドの中に挿入することができる。欠失プラスミドは、次に、所望の遺伝子コード領域に対して内部の適切な制限酵素部位にて切断され、その遺伝子コード配列又はその部分は選択マーカーで置換される。好ましくは約０．５ｋｂ〜約２．０ｋｂの、遺伝子が欠失する又は破壊される位置からの隣接ＤＮＡ配列は、選択マーカー遺伝子のいずれかの側にとどまる。好適な欠失プラスミドは、一般に、隣接ＤＮＡ配列を含む欠失遺伝子と、単一の直線状部分として除去される選択マーカー遺伝子と、を含有する断片を可能にするために存在する独特の制限酵素部位を有する。欠失プラスミドはまた、ＰＣＲを使用して所望の隣接領域及び選択マーカーを増幅することにより構築されてもよく、増幅された断片の末端にある制限酵素部位は、断片の結合を促進する。あるいは、欠失プラスミドは、適切な隣接ＤＮＡ及び選択マーカー配列を特定することにより、新たに合成することができる。
【０００９】
一部の実施形態では、第１選択マーカーと第２選択マーカーは、異なるマーカーである。一部の実施形態では、第１マーカーと第２マーカーは、ａｌｓＲ、ａｍｄＳ、ｈｙｇＲ、ｐｙｒ２、ｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ｓｕｃＡ、ブレオマイシン耐性マーカー、ブラスチジン耐性マーカー、ピリチアミン耐性マーカー、クロリムロンエチル耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、アデニン経路遺伝子、トリプトファン経路遺伝子及びチミジンキナーゼからなる群から独立して選択される。一部の実施形態では、相同配列のうちの少なくとも１つは、ｐｙｒ２配列からの上流又は下流である。一部の実施形態では、相同配列は、ｐｙｒ２配列から上流及び下流である。他の実施形態では、相同配列は、目的の１つ以上の遺伝子又は目的の１つ以上の変異体遺伝子を発現させるように機能する配列と、第１選択マーカーに第１選択機能を付与する配列と、を含む。一部の実施形態では、糸状菌宿主細胞は、トリコデルマ（Trichoderma）、アオカビ（Penicillium）、アスペルギルス（Aspergillus）、フミコーラ（Humicola）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、フザリウム（Fusarium）及びエメリセラ（Emericella）からなる群から選択される属の一種である。一部の実施形態ではトリコデルマはトリコデルマ・リーゼイ（T．reesei）であり、一方、他の実施形態ではアスペルギルスはアスペルギルス・ニガー（A．niger）である。
【００１０】
本開示は、目的の遺伝子又は目的の変異体遺伝子がヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びこれらの混合物からなる群から選択される、糸状宿主細胞発現系を提供する。目的の遺伝子又は変異体遺伝子の非限定例は、デンプン代謝に関与するタンパク質若しくは酵素、グリコーゲン代謝に関与するタンパク質若しくは酵素、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、加水分解酵素、インベルターゼ、異性化酵素、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクタートリアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解性酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ２−酸化還元酵素、ＥＣ  １．１．３．５）、これらの変異体、及びこれらの組み合わせをコードする。一部の実施形態では、目的の遺伝子又は目的の変異体遺伝子は、ペプチドホルモン、成長因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子及び微生物抗原（例えば、ＨＢＶ表面抗原、ＨＰＶ  Ｅ７など）並びにこれらの変異体（例えば、断片）からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。
【００１１】
加えて、本開示は、非自生分子か又は自生（ただし、非自生形態で存在する）分子かのいずれかであり得る、第１選択機能を第１選択マーカーに付与する核酸分子を糸状菌の中に導入することと、宿主細胞を培養することと、第１選択機能を有するが第２選択機能を欠く宿主細胞を選択することと、を含む、糸状菌宿主細胞における目的の遺伝子又は目的の変異体遺伝子の発現方法を提供する。一部の実施形態では、このようにして達成される発現は、当該技術分野における従来方法を使用して得られるものより高い信頼性を有する。一部の実施形態では、本方法は、目的の遺伝子若しくは目的の変異体遺伝子の発現についての、並びに／あるいは、目的の遺伝子により又は目的の変異体遺伝子によりコードされるポリペプチドの生化学的機能についての、アッセイを更に含む。
【００１２】
本明細書に引用されているすべての特許、特許出願、文書、ヌクレオチド及びタンパク質配列データベースの受入れ番号、並びに論文は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
以下の図表は、例示を意図したものであり、本明細書の開示又は請求項の範囲及び内容を制限するものではない。
【図１】ｑｕａｄ欠失誘導体株からの、ＭＡＤ６宿主株の欠失の概略的例示。
【図２】トリコデルマ・リーゼイのｋｕ８０欠失カセットの概略。
【図３】Ａｒｃｈｙ２株を作製するために使用されるｐｙｒ２欠失カセットの概略。
【図４】Ａｒｃｈｙ３株を作製するために使用されるｈｙｇＲ欠失カセットの概略。
【図５】トリコデルマ・リーゼイのｂｇｌ１欠失カセットの概略。
【図６】トリコデルマ・リーゼイのｅｇｌ３欠失カセットの概略。
【図７】ｃｒｅ組み換えの発現のために使用されるトリコデルマ・リーゼイのテロメアプラスミドベクターの概略。
【図８】目的の遺伝子又は目的の変異体遺伝子（ＧＯＩ）のポリヌクレオチドの導入の結果としての、ｐｙｒ２選択マーカーの不活性化及びａｍｄＳ選択マーカーの活性化を提供し、この例におけるＧＯＩは、ＣＢＨ２変異を示す。
【図９】実施例２に記載のように、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター。
【図１０】実施例２に記載のように、ｐＴｒｅｘ３ｇＭベクターを示す。
【図１１】実施例２に記載のように、Ｆｖ４３Ｂ発現ベクター、ｐＴｒｅｘ３ｇＭ−Ｆｖ４３Ｂ、を示す。
【図１２】実施例２に記載のように、Ｆｖ４３Ｃ発現ベクター、ｐＴｒｅｘ３ｇＭ−Ｆｖ４３Ｃ、を示す。
【図１３】ｆｖ４３Ｂで形質転換させたトリコデルマ・リーゼイのｑｕａｄ欠失クローンを用いて発現させたＦｖ４３ＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥ特性分析の写真である。全タンパク質に対するタンパク質百分率は、実施例２に従って量的に判定され、対応する欄の下方に列挙されている。
【図１４】ｆｖ４３Ｃで形質転換させたトリコデルマ・リーゼイのｑｕａｄ欠失クローンを用いて発現させたＦｖ４３ＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ特性分析の写真である。装填された全タンパク質に対するタンパク質百分率は、実施例２に従って量的に判定され、対応する欄の下方に列挙されている。
【図１５】ＭＡＤ６構築体を用いて発現させたＦｖ４３Ｂ及びＦｖ４３ＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ特性分析の写真である。全タンパク質に対するタンパク質百分率は、実施例２に従って量的に判定され、対応する欄の下方に列挙されている。
【図１６Ａ】実施例３に記載のようなＣＢＨ２変異体の４つのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験の写真。
【図１６Ｂ】実施例３に記載のようなＣＢＨ２変異体の平均発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示は、糸状菌宿主株、並びに、その作製及び使用のための組み換えＤＮＡ構築物に関する。糸状菌宿主株は、当該技術分野において既知の他の発現方法と比較して、より高い信頼性及び／又は発現レベルにおけるより低い変動性で、これらの宿主において目的の遺伝子又は変異体の発現を提供するために、使用することができる。糸状菌宿主株は、具体的な実施形態では、組み換えタンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを効率的にスクリーニングするのに有用である。
【００１５】
本明細書に記載の方法は、改善された信頼性で、目的のタンパク質又は目的の変異体を発現させる。この意味では、用語「改善された信頼性」は、（１）形質転換体の少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％）が安定な形質転換体であること、又は、形質転換体の少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％）がバックグラウンド発現レベルよりも多く意図された目的のタンパク質若しくは変異体を発現させること、並びに、（２）目的のタンパク質若しくは変異体が６０％未満（例えば、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、又は２％未満）の発現レベル変動で発現されること、に反映され、用語「発現レベル変動」は、最も高い発現レベルと最も低い発現レベルの間の差を最も高い発現レベルとバックグラウンド発現レベルの間の差である値で除算することにより定義され、これらはすべて同じ構築物及び同じ目的の遺伝子若しくは変異体で測定されるものである。
【００１６】
前述の一般的説明と後述の発明を実施するための形態はどちらも本明細書に記載の組成物及び方法を例示及び説明することのみを目的とし、これらを制限するものではないことを理解されたい。本出願では、単数形の使用は、特記しない限り、複数形も包含するものとする。「又は」の使用は、特記しない限り、「及び／又は」を意味するものとする。同様に、用語「含む（comprise）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（comprises）」、「含む（include）」、「含んでいる（including）」及び「含む（includes）」は、制限を意図するものではない。本明細書で参照されるすべての特許及び刊行物（例えば、このような特許及び刊行物内に開示されているすべてのアミノ酸及びヌクレオチド配列）は、参照により明示的に組み込まれるものとする。本明細書で提供される見出しは、本開示の様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、全体としての本明細書を参照することにより理解され得る。したがって、本明細書の用語は、全体として本明細書を参照することにより、より完全に定義されるものである。
【００１７】
本明細書で特に定義しない限り、本明細書で用いられる技術的及び科学的用語はすべて、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に解釈されるものと同じ意味を有するものである。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ  ＥＤ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、並びに、Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、当業者に本開示で使用される用語の多くの一般的辞書を提供する。本開示を実施又は試験する上で本明細書に記載されるものと同様又は同等のいかなる方法及び材料も使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。数範囲は、範囲を定義する数を包括する。特に示さない限り、それぞれ、核酸は左から右に５’→３’配向で記載され、アミノ酸は左から右にアミノ→カルボキシル配向で記載される。実施者は、当該技術分野の定義及び用語については、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，１９８９、並びに、Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３を参照されたい。本開示が記載されている特定の方法論、プロトコル及び試薬に限定されるものではなく、これらは変動し得ることを理解されたい。
【００１８】
１．定義
以下の用語は、本明細書を全体として参照することによってより十分に定義される。
【００１９】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基の単鎖からできている化合物又は分子を指す。本明細書で使用するとき、用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と同義であり得る。
【００２０】
「変異体」は、Ｃ末端及びＮ末端のいずれか又は両方に１つ以上のアミノ酸を付加することにより、アミノ酸配列の１つの若しくは多数の異なる部位にて１つ以上のアミノ酸を置換することにより、あるいは、タンパク質のいずれかの若しくは両方の末端にて又はアミノ酸配列の１つ以上の部位にて１つ以上のアミノ酸を欠失させることにより、前駆体タンパク質（例えば、自生タンパク質）から誘導されるタンパク質を意味する。目的のタンパク質（例えば、「目的の遺伝子」によりコードされている）の変異体又は「目的の変異体」（「目的の変異体遺伝子」によりコードされている）の調製は、当該技術分野において既知の任意の手段により行うことができる。例えば、目的の変異体は、自生タンパク質をコードするＤＮＡ配列（例えば、目的の遺伝子）を修飾し、修飾したＤＮＡ配列を好適な宿主に形質転換させ、修飾されたＤＮＡ配列を発現させて、目的の変異体を形成させることにより、調製される。非限定例では、目的のセルラーゼの変異体は、当該技術分野において既知の任意の手段により行われ得る。例えば、セルラーゼ変異体は、その自生の（すなわち、自然発生する）対応物をコードするＤＮＡ配列を修飾し、修飾されたＤＮＡ配列を好適な宿主に形質転換させ、修飾されたＤＮＡ配列を発現させて、変異体セルラーゼを形成させることにより、調製される。本開示の目的の変異体酵素は、目的の自生酵素のものと比較して、変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。目的の変異体酵素は、特定の実施形態では、目的の自生酵素の一部の特徴を保持し得るが、一方、目的の自生酵素からの特定の変異した特徴を有する。例えば、本開示の変異体セルラーゼは、前駆体酵素アミノ酸配列と比較して変異したアミノ酸配列を含むペプチドを含み、ここで、この変異体セルラーゼは、前駆体酵素の特徴的なセルロース分解性を保持するが、一部の特定の態様では、変異した特性を有し得る。例えば、変異体セルラーゼは、最適ｐＨの上昇、又は温度上昇、又は酸化安定度上昇、又は、非セルロース系物質に対する親和力若しくは結合力の減少を有し得るが、その特徴的なセルロース分解活性を保持する。
【００２１】
非限定例では、本開示による目的の変異体は、変異体をコードするヌクレオチド配列から誘導され得ると想到され、ここで、発現された変異体の機能活性は保持される。例えば、セルラーゼ変異体は、セルラーゼ変異体をコードするＤＮＡ断片から誘導され得、ここで、発現された変異体のセルラーゼ活性は保持される。セルラーゼをコードするＤＮＡ断片は、一部の実施形態では、５’末端又は３’末端のいずれかにてセルラーゼＤＮＡ配列に結合されているヒンジ又はリンカーをコードするＤＮＡ配列又は部分を更に含み得、ここで、コードされているセルラーゼ領域の機能活性は保持される。用語「変異体」及び「誘導体」は、本明細書で互換的に使用され得る。
【００２２】
「等価残基」は、三次元構造がＸ線結晶解析により判定されている前駆体又は参照酵素についての三次元構造のレベルでの相同性を判定することにより定義され得る。例えば、等価残基は、セルラーゼとハイポクレア・ジェコニア（Hypocrea jecorina）ＣＢＨ２の特定のアミノ酸残基の主鎖原子の２つ以上の原子配位（ＮはＮ上に、ＣＡはＣＡ上に、ＣはＣ上に、ＯはＯ上に）がアラインメント後、０．１３ｎｍ以内であり、好ましくは０．１ｎｍ以内であるものとして、定義される。アラインメントは、酵素と問題の前駆体／参照酵素の非水素タンパク質原子の原子配位の最大限の重複をもたらすように、最良のモデルが配向及び配置された後で、達成される。例えば、好適なモデルとしては、入手可能な最高解像度での実験回折データについて最小のＲ因子を与える結晶学的モデルが挙げられる。例えば、米国特許出願公報第２００６／０２０５０４２号を参照されたい。
【００２３】
前駆体又は参照酵素の特定の残基と機能的に類似している等価残基は、所定のやり方で酵素の構造に、基質結合に又は触媒に対して、変異、修飾又は寄与し得るような配座を採用し得る残基として定義される。例えば、ハイポクレア・ジェコニアＣＢＨ２の等価残基は、定義されているやり方でタンパク質構造、基質結合又は触媒に対して、変異、修飾又は寄与し得るような配座を採用し得るセルラーゼのアミノ酸である。一部の実施形態では、等価残基は、所与の残基の主鎖原子が相同位置の占有に基づく等価基準を満たさないこともあるが、残基の側鎖原子の１つ以上（例えば、２、３又はそれ以上）の原子配位が前駆体／参照酵素の対応する側鎖原子から短い距離以内（例えば、約０．０２ｎｍｍ以内、約０．０５ｎｍ以内、約０．０８ｎｍ以内、約０．１０ｎｍ以内、約０．１２ｎｍ以内、約０．１３ｎｍ以内、約０．１４ｎｍ以内、約０．１５ｎｍ以内、約０．１７ｎｍ以内、約０．１８ｎｍ以内、約０．２０ｎｍ以内、約０．２５ｎｍ以内など）に位置するような程度に相同な位置を占有するものであることができる。例えば、三次元構造がＸ線結晶解析により得られるセルラーゼは、好適には、所与の残基の主鎖原子が相同位置の占有に基づく等価基準を満たさないといえども、残基の側鎖原子の少なくとも２つの原子配位がハイポクレア・ジェコニアＣＢＨ２の対応する側鎖原子から０．１３ｎｍに位置する等価残基を含み得る。ハイポクレア・ジェコニアＣＢＨ２の結晶構造は、Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７（９）：１０３５〜４５に示されている。
【００２４】
用語「核酸分子」は、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子及びｃＤＮＡ分子を含む。遺伝コードの縮重の結果として、所与のタンパク質及び／又はその変異体をコードする多数のヌクレオチド配列が作製され得るものと理解される。本開示は、目的の変異体酵素をコードするあらゆる可能な変異体ヌクレオチド配列を想到しており、これらのすべては遺伝コードの縮重も可能である。例えば、複数のヌクレオチド配列は、ＣＢＨ２及び／又はその変異体などのセルラーゼをコードすることができ、これらは、遺伝コードの縮重のため、本明細書に記載の方法又はプロセスにより製造することができる。
【００２５】
「異種」核酸構築物又は配列は、自生ではない、すなわち、発現される細胞に対して自生形態で存在しない、配列の一部を有する。制御配列に関して、異種は、今ではその発現を制御している同一の遺伝子を制御するように、天然では機能しない制御配列（すなわち、プロモーター又はエンハンサー）を指す。通常、異種核酸配列は、それらが存在する細胞又は遺伝子の一部にとって内因性ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、電気穿孔法又はこれらに類するものにより、細胞に添加されている。「異種」核酸構築物は、自生細胞に見られる制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同一である又は異なる制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせを含有し得る。
【００２６】
本明細書で使用するとき、用語「ベクター」は、異なる宿主間での移動のためにデザインされた核酸構築物を指す。「発現ベクター」は、異なる細胞に異種ＤＮＡ断片を組み込み、発現させる能力を有するベクターを指す。多くの原核及び真核細胞性発現ベクターは、市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者に既知である。
【００２７】
したがって、「発現カセット」又は「発現ベクター」は、標的細胞において特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素との組み換え又は合成で生じた核酸構築物である。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウィルス又は核酸断片の中に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分は、他の配列としては、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。
【００２８】
本明細書で使用するとき、「プラスミド」は、クローニングベクターとして使用される環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築物を指し、これは多くの細菌及び一部の真核生物において染色体外自己複製遺伝要素を形成する。
【００２９】
本明細書で使用するとき、「選択マーカーをコードするヌクレオチド配列」は、細胞中での発現が可能であるヌクレオチド配列を指し、ここで、選択マーカーの発現は、発現させた遺伝子を含有する細胞に、対応する選択作用剤の存在下又は対応する選択培養条件下で、培養する能力を付与する。
【００３０】
本明細書で使用するとき、「プロモーター」は、下流遺伝子を直接転写する働きをする核酸配列を指す。プロモーターは、通常、標的遺伝子が発現される宿主細胞にとって適切である。プロモーターは、他の転写及び翻訳制御核酸配列（「制御配列」とも称する）は、多くの場合、所与の遺伝子を発現させるために使用される。概して、転写及び翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始及び終止配列、及びエンハンサー又はアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書で定義されるとき、「キメラ遺伝子構築物」は、制御因子を含む異なる遺伝子の部分から構成され得る非自生遺伝子（すなわち、宿主に導入されているもの、又は、宿主にその自生形態で存在しないもの）を指す。宿主細胞の形質転換のためのキメラ遺伝子構築物は、典型的には、タンパク質コード領域に、又は、選択マーカーキメラ遺伝子においては、例えば、形質転換された細胞に抗生物質耐性を付与する、タンパク質をコードしている選択マーカー遺伝子に、機能するように連結している転写制御領域（プロモーター）から構成される。宿主細胞での形質転換のための本開示の典型的なキメラ遺伝子は、構成性又は誘導性である転写制御領域、タンパク質コード配列及びターミネーター配列を含む。キメラ遺伝子構築物はまた、標的タンパク質の分泌が所望される場合、シグナルペプチドをコードする第２  ＤＮＡ配列を含み得る。例えば、例えば、Ａｒｃｈｙ  ３トリコデルマ・リーゼイ株といった本明細書に記載の構築物の特定のものは、キメラ遺伝子構築物である。
【００３２】
核酸は、別の核酸配列と機能関係に配置されると「機能するように連結」される。例えば、分泌リーダーをコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に加わるプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡと機能するように連結され、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に機能するように連結され、あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置する場合、コード配列に機能するように連結される。通常、「機能するように連結」は、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には、隣接し、リーディングフレームにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接する必要はない。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合には、ＰＣＲのための合成オリゴヌクレオチドアダプター、リンカー又はプライマーを従来の実践法に従って使用する。
【００３３】
本明細書の選択マーカーは、完全選択機能を有する場合に「機能する」と言うものとする。
【００３４】
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生するのに関与するＤＮＡの部分を指し、これは、このコード領域に先行する領域及び後続する領域（例えば、５’非翻訳配列（５’ＵＴＲ）又は「リーダー」配列及び３’ＵＴＲ又は「トレイラー」配列）、並びに、個々のコード部分（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでもよく、含まなくてもよい。
【００３５】
概して、目的の変異体をコードする核酸分子は、中〜高の厳密性条件下で野生型前駆体／参照配列に対してハイブリッド形成する。例えば、ＣＢＨ２などの変異体セルラーゼをコードする核酸分子は、中〜高の厳密性条件下で、本明細書では配列番号７として提供されているもののような野生型配列に対してハイブリッド形成する。しかしながら、特定の実施形態では、目的の酵素をコードするヌクレオチド配列は、実質的に異なるコドン使用頻度を反映する場合もあるが、目的の同じ酵素をコードし続け得る。例えば、このコード配列は、特定のコドンが宿主により利用される頻度に従って、特定の原核又は真核発現系において目的の酵素又は変異体のより強固な発現を促進するために修飾されてもよい（例えば、糸状菌における発現のための遺伝子の最適化を説明している、Ｔｅ’ｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９０：１３〜１９，２０００を参照されたい）。
【００３６】
核酸配列は、参照核酸配列に対して、これらの２つの配列が中〜高の厳密性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で互いに特異的にハイブリッド形成する場合に、「選択的にハイブリッド形成可能」であるとみなされる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最高厳密性」は典型的には約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低温）にて生じ、「高厳密性」はＴｍよりも約５℃〜約１０℃低温にて生じ、「中厳密性」又は「中度厳密性」はプローブのＴｍよりも約１０℃〜約２０℃低温にて生じ、「低厳密性」はＴｍよりも約２０℃〜約２５℃低温にて生じる。機能的に、最高厳密性条件は、ハイブリダイゼーションプローブとの厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する配列を特定するために使用される一方で、高厳密性条件は、プローブとの約８０％以上の配列同一性を有する配列を特定するために使用される。
【００３７】
中〜高厳密性ハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において周知である（例えば、本明細書に参照により明示的に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ，１９８９，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ  １１及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３を参照されたい）。高厳密性条件の例としては、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト液、０．５％  ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍＬ変性キャリアＤＮＡの中での約４２℃におけるハイブリダイゼーション、それに続いての、２ｘＳＳＣ及び０．５％  ＳＤＳの中での室温における洗浄、並びに、０．１ｘＳＳＣ及び０．５％  ＳＤＳの中で４２℃における２回の追加の洗浄、が挙げられる。
【００３８】
例えば、細胞又は核酸、タンパク質又はベクターについての参照と共に使用するとき、用語「組み換え」は、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが異種核酸若しくはタンパク質の導入、又は、自生核酸若しくはタンパク質の変異により修飾されたこと、あるいは、細胞がそのように修飾された細胞から誘導されること、を意味する。それゆえに、組み換え細胞は、細胞の自生（非組み換え）形態には見出されない遺伝子を発現させ、又は、別の方法では異常に発現させた、低発現させた、若しくは全く発現させない自生遺伝子を発現させる。
【００３９】
本明細書で使用するとき、細胞についての参照付きでの用語「形質転換された」、「安定に形質転換された」又は「トランスジェニック」は、細胞が、非自生（又は、その自生形態では存在しない）核酸配列を、そのゲノムの中に統合されている、又は、複数の世代にわたって維持されるエピソームプラスミドとして有することを意味する。
【００４０】
本明細書で使用するとき、用語「発現」は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて産生されるプロセスを指す。このプロセスは、転写と翻訳の両方を含む。
【００４１】
核酸配列を細胞の中に挿入する文脈での用語「導入された」は、「トランスフェクション」又は「形質転換」又は「形質導入」を意味し、核酸配列を原核又は真核細胞のなかに組み込むことを示し、ここで、この核酸配列は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアＤＮＡ）の中に組み込まれ、自律レプリコンへと転化され、又は、一過性発現される（例えば、トランスフェクションされたｍＲＮＡ）。
【００４２】
用語「目的のタンパク質又は変異体の発現」は、目的の遺伝子又は目的の変異体の転写及び翻訳を指し、その産物は、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後に加工されたポリペプチド及びこれらの誘導体を含む。例えば、「ＣＢＨ２発現」は、ｃｂｈ２遺伝子又はその変異体の転写及び翻訳を指し、その産物は、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後に加工されたポリペプチド及びこれらの誘導体を含み、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、ハイポクレア・ジェコニア（トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーゼイ又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）としても既知）及びハイポクレア・シュワイニッチ（Hypocrea schweinitzii）などの関連種からのＣＢＨ２を含む。発現レベルは、例えば、目的のタンパク質若しくは変異体についてのウェスタンブロット、目的の遺伝子若しくは変異体遺伝子のｍＲＮＡについてのノーザンブロット分析及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ並びに好適な基質についての酵素活性アッセイといった様々な既知の方法により判定することができる。例として、ＣＢＨ２発現についてのアッセイとしては、ＣＢＨ２タンパク質についてのウェスタンブロット、ｃｂｈ２  ｍＲＮＡについてのノーザンブロット分析及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、並びに、以下に記載のようなリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）及びｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＡＨＢＡＨ）アッセイ：（ａ）ＰＡＳＣ：（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２６８，６４９８〜６５０７，Ｗｏｏｄ，Ｔ．（１９８８）ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６０．Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｐａｒｔ  ａ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｎｄ  Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Ｗｏｏｄ，Ｗ．＆  Ｋｅｌｌｏｇ，Ｓ．Ｅｄｓ．），ｐｐ．１９〜２５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）及び（ｂ）ＰＡＨＢＡＨ：（Ｌｅｖｅｒ，Ｍ．（１９７２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７，２７３，Ｂｌａｋｅｎｅｙ，Ａ．Ｂ．＆  Ｍｕｔｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．（１９８０）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  ＆  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，３１，８８９，Ｈｅｎｒｙ，Ｒ．Ｊ．（１９８４）Ｊ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ，９０，３７）が挙げられる。
【００４３】
用語「宿主細胞」は、ベクターを含有し、発現構築物の複製及び／又は転写又は転写及び翻訳（発現）を補助する細胞を指す。本開示での使用のための宿主細胞は、大腸菌細胞などの原核細胞、又は、酵母、植物、昆虫、両生類又は哺乳類細胞などの真核細胞であることができる。特定の実施形態では、宿主細胞は、好適には、糸状菌である。
【００４４】
用語「糸状菌」は、当業者により認識される任意の及びすべての糸状菌を意味する。好ましい真菌は、アスペルギルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、フザリウム（Fusarium）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、アオカビ（Penicillium）、フミコーラ（Humicola）、アカパンカビ（Neurospora）又は、エメリセラ（Emericella）、ボタンタケ（Hypocrea）などのこれらの代替的性形態からなる群から選択される。無性産業用真菌トリコデルマ・リーゼイが子嚢菌ハイポクレア・ジェコニアのクローン誘導体であることは今では示されている（Ｋｕｈｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９３：７７５５〜７７６０，１９９６を参照されたい）。
【００４５】
木材腐朽菌トリコデルマ、コンポスト細菌サーモモノスポラ（Thermomonospora）、バチルス（Bacillus）及びセルロモナス（Cellulomonas）、ストレプトミセス（Streptomyces）並びに、真菌フミコーラ、アスペルギルス及びフザリウムなどの多くの微生物は、セルロースを加水分解する酵素を産生する。
【００４６】
本明細書で使用するとき、用語「単離された」又は「精製された」は、天然で関連している少なくとも１つの成分から除去される核酸又はアミノ酸を指す。
【００４７】
「糸状菌」は、副分類である真菌及び卵菌のすべての菌糸形態を含む。例えば、糸状菌としては、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス、エメリセラ、フザリウム、フミコーラ、ケカビ（Mucor）、ミセリオフトーラ（Myceliophthora）、アカパンカビ、スキタリジウム（Scytalidium）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）又はトリコデルマ種が挙げられるが、これらに制限されない。一部の実施形態では、糸状菌は、アスペルギルス・アクレアータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）であり得る。一部の実施形態では、糸状菌は、フザリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クルックウェレンセ（Fusarium crookwellense）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レティキュラツム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブキヌム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロスム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコセキオイデス（Fusarium trichothecioides）又はフザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）であり得る、一部の実施形態では、糸状菌は、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコーラ・ラヌギノーサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオフトーラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポーラ・クラッサ（Neurospora crassa）、スキタリジウム・サーモフィルム（Scytalidium thermophilum）又はチエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）である。一部の実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ・リーゼイであり、例えば、ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０（１９８４）ｐｐ．４６〜５３；Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ  Ｂ．Ｓ．，Ｃａｎ．，１〜２０，１９８７）、ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１）、ＮＲＲＬ  １５７０９、ＡＴＣＣ  １３６３１、５６７６４、５６４６６、５６７６７であり、あるいは、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、例えば、ＡＴＣＣ  ３２０９８及び３２０８６である。一部の実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０であり、これは、トリコデルマ・リーゼイＡＴＣＣ  ５６７６５としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。これに関し、一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の糸状菌のいずれか１つの全細胞培養調製物を提供する。
【００４８】
通常、微生物は、酵素の産生に好適な細胞培養培地で培養される。培養は、当該技術分野で既知の手順を用いて、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む好適な栄養培地で行われる。好適な培養培地、温度範囲、並びに、培養及び酵素産生に好適な他の条件は、当該技術分野において既知である。非限定例としては、トリコデルマ・リーゼイによるセルラーゼの産生についての通常温度範囲は、２４℃〜２８℃である。
【００４９】
通常、「全細胞培養調製物」は、回収及び／又は精製を全く若しくは最小限にしか用いない発酵により産生されるときに使用される。例えば、いったん目的の酵素又は変異体（あるいは１つを超える目的の酵素又は変異体）が細胞により細胞培養培地の中に分泌されてから、目的の酵素又は変異体を含有する細胞培養培地を使用することができる。一部の実施形態では、全細胞培養調製物は、細胞培養培地、細胞外酵素及び細胞を含む発酵物質の未分画内容物を含む。あるいは、全細胞培養調製物は、任意の便利な方法により、例えば、沈殿、遠心分離、親和性、濾過又は当該技術分野において既知の任意の他の方法により、処理することができる。一部の実施形態では、全細胞培養調製物は、例えば、濃縮し、その後、更なる精製なしで使用することができる。一部の実施形態では、全細胞培養調製物は、細胞の生存能力を低下させるか又は細胞を殺す化学作用剤を含む。一部の実施形態では、細胞は、当該技術分野において既知の方法を用いて、溶解又は透過される。例えば、目的のセルラーゼ又は変異体（例えば、ＣＢＨ２又はその変異体、Ｆｖ４３Ｂ、Ｆｖ４３Ａ）は、細胞により細胞培養培地の中に分泌することができ、この細胞培養培地はこのセルラーゼ又は変異体を含有する。この細胞培養培地は、全細胞培養調製物として使用することができる。
【００５０】
２．分子生物学
特定の実施形態では、本開示は、目的の酵素又は変異体の発現をもたらす。特定の実施形態では、目的の酵素又は変異体をコードする遺伝子は、糸状菌において機能性であるプロモーターの制御下に置かれる。この実施形態の例では、糸状菌において機能性である好適なプロモーターの制御下で変異体ｃｂｈ２遺伝子を発現させる方法が提供される。組み換え遺伝学の分野における既知の技術を適用することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，１９８９；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９９０；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４を参照されたい）。
【００５１】
３．組み換えタンパク質の発現
本開示の方法は、任意の特定の方法に発現方法を限定しない組み換えタンパク質を発現させる人工宿主細胞に関連する。目的の組み換えタンパク質又は変異体は、好ましくは、細胞から分泌される。本開示は、タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質導入、形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。温度、ｐＨ及びこれらに類するものなどの培養条件は、形質導入、形質転換又はトランスフェクションに先立って親宿主細胞に予め使用されたものであり、当業者には明白である。
【００５２】
一アプローチでは、糸状菌又は酵母菌は、プロモーター又は生物学的に活性なプロモーター断片又は１つ以上の（例えば、一連の）エンハンサーを有する発現ベクターでトランスフェクションされ、宿主細胞株で機能し、目的のタンパク質又は変異体をコードするＤＮＡ部分に機能するように連結され、その結果、目的のタンパク質又は変異体は細胞株で発現される。
【００５３】
Ａ．核酸構築物／発現ベクター
目的のタンパク質又は変異体をコードする天然又は合成のポリヌクレオチド断片は、糸状菌又は酵母菌に導入することができ、複製することができるキメラ構築物又はベクターの中に組み込まれ得る。本明細書に開示されているベクター及び方法は、タンパク質又は変異体の発現のために宿主細胞中で使用するのに好適である。導入される細胞中で複製可能及び生存可能である限り、任意のベクターを使用することができる。多数の好適なベクター及びプロモーターは、当業者に既知であり、多くは市販されている。クローン及び発現ベクターはまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９及びＳｔｒａｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，１９８１に記載されており、これらは各々本明細書に参照により明示的に組み込まれる。真菌に好適な発現ベクターは、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎ：Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ，Ｌ．Ｌ．（ｅｄｓ．）Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３９６〜４２８に記載されている。適切なＤＮＡ配列は、様々な手順によりプラスミド又はベクター（本明細書では総じて「ベクター」と呼ぶ）の中に挿入され得る。場合により、このＤＮＡ配列は、既知の手順を用いて、好適な制限エンドヌクレアーゼ部位の中に挿入される。他の例では、制限消化及び／又は連結を伴わないベクター構築方法が好適に適用され得る。このような手順及び関連するサブクローニング手順は、当業者の既知の範囲内であるとみなされる。
【００５４】
目的のタンパク質又は変異体についてコードする配列を含む組み換え糸状菌は、目的のタンパク質又は変異体のコード領域を糸状菌の選択された株の細胞の中に導入することにより、産生され得る。
【００５５】
いったん所望の形態の核酸配列が得られたら、これは様々なやり方で修飾され得る。例えば、配列が非コード隣接領域を伴う場合、これらの隣接領域は、切除、変異誘発などにさらされ得る。それゆえに、トランジション、トランスバージョン、欠失及び挿入は、天然に生じる配列において行われ得る。
【００５６】
選択されたコード配列は、既知の組み換え技術に従って好適なベクターの中に挿入され、糸状菌の形質転換に使用され得る。遺伝コードの固有の縮重に起因して、同じ又は機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、目的のタンパク質又は変異体をクローン及び発現させるのに使用され得る。したがって、コード領域内でのこのような置換は、本開示の範囲に収まる配列変異体に含まれる。これらの配列の任意のもの及びすべては、本明細書に記載のものと同じやり方で利用することができる。例えば、ＣＢＨ２などのセロビオヒドロラーゼの配列変異体は、目的のタンパク質又は変異体がセルラーゼである場合に使用することができる。
【００５７】
用語「セルラーゼ」、「セルロース分解性酵素」又は「セルラーゼ酵素」は、セルラーゼポリマーをより短いセロオリゴ糖オリゴマー、セロビオース及び／又はグルコースに加水分解できる酵素の範疇を指す。エキソグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びグルコシダーゼなどのセルラーゼの数多くの例は、特に真菌、植物及び細菌などのセルロース分解性組織から得られてきた。これらの微生物により産生される酵素は、セルロースをグルコースに転化するのに有用な三種の作用を有するタンパク質の混合物である：エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）及びβ−グルコシダーゼ。これらの三つの異なるタイプのセルラーゼ酵素は、層状的に作用して、セルロース及びその誘導体をグルコースに転化する。
【００５８】
ハイポクレア・ジェコニアからのＣＢＨ２は、グリコシルヒドロラーゼファミリー６（すなわち、Ｃｅｌ６）のメンバーであり、特にハイポクレア・ジェコニアにおいて同定されたファミリーの第１メンバーであった（すなわち、Ｃｅｌ６Ａ）。グリコシルヒドロラーゼファミリー６はエンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼ／エキソグルカナーゼの両方を含有し、ＣＢＨ２はセロビオヒドロラーゼ／エキソグルカナーゼである。それゆえに、語句ＣＢＨ２、ＣＢＨ２型タンパク質及びＣｅｌ６セロビオヒドロラーゼは、多くの場合、本明細書において互換的に使用される。それゆえに、用語「変異体ｃｂｈ２遺伝子」は、ハイポクレア・ジェコニアからのｃｂｈ２遺伝子の核酸配列がコード配列を除去、付加及び／又は操作することにより変更されたことを意味する。
【００５９】
本開示はまた、上記のような１つ以上のタンパク質をコードする核酸配列を含む組み換え核酸構築物を含む。この構築物は、プラスミド又はウィルスベクターなどのベクターを含み、これらの中には順配向又は逆配向で本開示の配列が挿入されている。
【００６０】
キメラ構築物は、目的のタンパク質又は変異体についてのコード配列を含み得る。一部の実施形態では、コード配列は、（ｉ）単離で、（ｉｉ）例えば、融合タンパク質又はシグナルペプチドのコード配列などの追加のコード配列と組み合わせて（但し、コード配列は優性コード配列である）、（ｉｉｉ）例えば、イントロン及び制御要素（例えば、好適な宿主におけるコード配列の発現に有効な、プロモーター及びターミネーター要素又は５’及び／若しくは３’非翻訳領域）などの非コード配列と組み合わせて、並びに／あるいは（ｉｖ）コード配列が自生若しくは非自生遺伝子であるベクター又は宿主環境において、存在する。
【００６１】
特定の態様では、キメラ構築物は、インビトロで細胞の中にタンパク質をコードする核酸配列を移動させるために、採用される。好ましくは、タンパク質をコードする核酸配列を移動させる細胞は、確立された糸状菌又は酵母菌株である。目的のタンパク質又は変異体の長期にわたる産生のために、安定した発現が好ましい。安定した形質転換体を産生するのに有効な様々な既知の方法が、本開示を実施するのに使用され得る。
【００６２】
好適なベクターは、典型的には、選択マーカーをコードする核酸配列、挿入部位、並びに、プロモーター及び終止配列などの好適な制御要素を備えている。ベクターは、コード配列に機能するように連結された、例えば、イントロン及び制御要素（例えば、宿主細胞における（並びに／あるいは、修飾された可溶性タンパク質コード配列が正常に発現されないベクター又は宿主細胞環境における）コード領域の発現にとって有効な、プロモーター及びターミネーター要素又は５’及び／若しくは３’非翻訳領域）などの非コード配列が挙げられる、調節配列を含んでもよい。多くの好適なベクター及びプロモーターは当業者に既知であり、多くは市販されており、並びに／あるいは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（上記）に記載されている。
【００６３】
好適なプロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０  ｅａｒｌｙプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、説明するようなｔｅｔ−ｏｎ又はｔｅｔ−ｏｆｆシステムにおけるｔｅｔ応答因子（ＴＲＥ）を含有するプロモーター（ＣｌｏｎＴｅｃｈ及びＢＡＳＦ）、β−アクチンプロモーター、並びに、特定の金属塩の付加により上方制御できるメタロチオネインプロモーターなどの、構成性プロモーター及び誘導性プロモーターが挙げられる。プロモーター配列は、発現目的のための特定の糸状菌により認識されるＤＮＡ配列である。これは、目的のタンパク質又は変異体をコードするＤＮＡ配列に機能するように連結されている。このような連結は、目的のタンパク質をコードするＤＮＡの開始コドンに対するプロモーターの配置を含む。プロモーター配列は、目的のタンパク質又は変異体の発現を媒介する転写又は翻訳制御配列を含有する。非限定例としては、アスペルギルス・ニガー、Ａ．アワモリ又はＡ．オリザエの、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ又はα−グルコシダーゼをコードする遺伝子、Ａ．ニデュランスのｇｐｄＡ又はｔｒｐＣ遺伝子、ニューロスポーラ・クラッサのｃｂｈ１又はｔｒｐ１遺伝子、Ａ．ニガー又はリゾムコール・ミエヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼをコードする遺伝子、ハイポクレア・ジェコニア（トリコデルマ・リーゼイ）のｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２又は他のセルラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターが挙げられる。
【００６４】
適切な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、様々な宿主にとって適切なマーカーは当該技術分野において周知である。好適な選択マーカー遺伝子の例としては、Ａ．ニデュランス又はトリコデルマ・リーゼイからのａｒｇＢ、Ａ．ニデュランスからのａｍｄＳ、ニューロスポーラ・クラッサ又はトリコデルマ・リーゼイからのｐｙｒ４、アスペルギルス・ニガー又はＡ．ニデュランスからのｐｙｒＧが挙げられる。好適な選択マーカーの追加の例としては、ｔｒｐｃ、ｔｒｐ１、ｏｌｉＣ３１、ｎｉａＤ又はｌｅｕ２が挙げられるがこれらに限定されず、これらは、ｔｒｐ−、ｐｙｒ−、ｌｅｕ−及びこれらに類するものなどの変異株を形質転換するために使用されるキメラ構築物に含まれる。
【００６５】
このような好適なマーカーは、形質転換体に、糸状菌には通常は代謝されない代謝産物を利用する能力を付与する。例えば、酵素アセトアミダーゼをコードするハイポクレア・ジェコニアからのａｍｄＳ遺伝子は、形質転換体細胞が窒素源としてのアセトアミド上で培養することを可能にする。選択マーカー（例えば、ｐｙｒＧ）は、栄養要求変異株が選択最少培地上で培養する能力を回復させ得、あるいは、選択マーカー（例えば、ｏｌｉｃ３１）は、形質転換体に阻害薬又は抗生物質の存在下で培養する能力を付与し得る。
【００６６】
選択マーカーコード配列は、当該技術分野で一般に採用される方法を用いて、任意の好適なプラスミドの中にクローニングされる。好適なプラスミドの例としては、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＲＡＸ及びｐＵＣ１００が挙げられる。ｐＲＡＸプラスミドは、Ａ．ニデュランスからのＡＭＡＬ配列を含有し、これによりＡ．ニガーにおける複製が可能になる。
【００６７】
本開示を実施するにあたって、特に明記しない限り、当該技術分野内に存在する分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ及び免疫学の従来技術を採用するものとする。このような技術は文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９８７；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３；及びＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１を参照されたい。
【００６８】
Ｂ．組み換えタンパク質産生のための糸状菌及び培養条件
組み換えタンパク質発現のために処理及び／又は改変され得る親糸状菌種の例としては、トリコデルマ（例えば、トリコデルマ・リーゼイ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・コニンギ）、アオカビ種、フミコーラ種（フミコーラ・インソレンスなど）、アスペルギルス種、クリソスポリウム種、フザリウム種、ボタンタケ種及びエメリセラ種が挙げられる。
【００６９】
形質転換された細胞は、親真菌株を培養するのに典型的に採用される条件下で、培養される。例えば、細胞は、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ａｕｂｅｒｔ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．７１〜８６，１９８８及びＩｌｍｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８〜１３０６，１９９７に記載されているような生理学的塩及び栄養素を含有する標準的な培地で培養することができる。様々な一般的な培養条件が好適であり得、例えば、培養物は、所望のレベルの組み換えタンパク質発現が達成されるまで、振盪培養器又は発酵槽内で２８℃にてインキュベートされる。
【００７０】
所与の糸状菌についての好適な培養条件は、科学文献に及び／又はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）などの真菌供給源から見出され得る。真菌培養が確立した後、細胞は、組み換えタンパク質の発現を生じさせる又は許容するのに有効な条件下に曝露される。
【００７１】
コード配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合には、誘導剤（例えば、砂糖、金属塩又は抗生物質）を、組み換えタンパク質発現を誘導するのに有効な濃度で培地に添加する。
【００７２】
一部の実施形態では、糸状菌はアスペルギルス・ニガーであり、これは、目的のタンパク質の過剰発現を得るのに有用な株である。例えば、アスペルギルス・ニガーｖａｒアワモリｄｇｒ２４６は、増加した量のセルラーゼを分泌することが既知である（Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ（２００２）４１：８９〜９８）。ＧＣＤＡＰ３、ＧＣＤＡＰ４及びＧＡＰ３−４などのアスペルギルス・ニガーｖａｒアワモリの他の株もまた既知である。例えば、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８〜７４３を参照されたい。
【００７３】
一部の実施形態では、糸状菌はトリコデルマ・リーゼイであり、これは、目的のタンパク質の過剰発現を得るのに有用な別の株である。一部の実施形態では、このような糸状菌宿主細胞は、有害な活性又は特徴（例えば、発現、安定性に対する有害、特定の特質についての問い合わせ又はアッセイを困難にする混乱作用など）に関連付けられる特定の遺伝子（又は本明細書では「有害遺伝子」）を欠失させる又は低減することができる。一部の実施形態では、このような真菌宿主細胞は、例えば、分泌増加、安定性増加、溶解度増加などといった特定の好ましい作用又は特徴に関連付けられる遺伝子（又は本明細書では「好ましい遺伝子」）を得る又は増強するように改変することができる。
【００７４】
例えば、トリコデルマ・リーゼイ株ＲＬ−Ｐ３７は、Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６〜５３（１９８４）により記載されているように、増加した量のセルラーゼ酵素を分泌することが既知である。ＲＬ−Ｐ３７の機能的等価物としては、トリコデルマ・リーゼイ株ＲＵＴ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６５）及び株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１）が挙げられる。これらの株は、ＣＢＨ１若しくはＣＢＨ２などの特定のセロビオヒドロラーゼ又は特定のエンドグルカナーゼが挙げられるがこれらに限定されないタンパク質及びその変異体を過剰発現させるのに有用であることも想到される。
【００７５】
例として、組み換えタンパク質が変異体ＣＢＨ２である場合、潜在的に有害である自生セルロース分解活性を欠く変異体を産生することが好ましい。それゆえに、変異体ＣＢＨ２をコードするＤＮＡフラグメントを含有するＤＮＡ構築物又はプラスミドを導入するのに先立って１つ以上のセルラーゼ遺伝子を欠失しているトリコデルマ宿主株を得ることが有用である。このような好適な多重欠失株は、例えば、米国特許第５，２４６，８５３号及び国際公開第９２／０６２０９号に開示されている方法により調製され得、ここで、これらの開示は参照により組み込まれるものとする。１つ以上のセルラーゼ遺伝子を失っている宿主微生物において変異体ＣＢＨ２セルラーゼを発現させることにより、同定手順及びそれに続く精製手順が単純化される。クローン化されたトリコデルマ種の任意の遺伝子はそれゆえに欠失させることができ、例えば、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１及びｅｇｌ２遺伝子並びにＥＧ  ＩＩＩ及び／又はＥＧＶタンパク質をコードする遺伝子は、トリコデルマ宿主株から欠失させることができる（例えば、それぞれ米国特許第５，４７５，１０１号及び国際公開第９４／２８１１７号を参照されたい）。
【００７６】
遺伝子欠失は、欠失又は欠損されるある形態の所望の遺伝子をプラスミドの中に挿入することにより達成され得る。欠失プラスミドは、次に、所望の遺伝子コード領域に対して内部の適切な制限酵素部位にて消化され、その遺伝子コード配列又はその部分は選択マーカーにより置換される。好ましくは約０．５ｋｂ〜約２．０ｋｂのサイズを有する、遺伝子が欠失する又は破壊される位置からの隣接ＤＮＡ配列は、選択マーカー遺伝子のいずれかの側にとどまることができる。好適な欠失プラスミドは、一般に、隣接ＤＮＡ配列を含む欠失遺伝子と、単一の直線状部分として除去される選択マーカー遺伝子と、を含有する断片を可能にするために存在する独特の制限酵素部位を有する。
【００７７】
一部の実施形態では、選択マーカーは、形質転換された微生物の検出を可能にするように選択される。選択された微生物において発現される任意の選択マーカー遺伝子は好ましいものであり得る。例えば、アスペルギルス種に関し、選択マーカーは、形質転換体における選択マーカーの存在が微生物の特性を有意に変更しないように、選択することができる。好適な選択マーカーの例は、アッセイ可能な生成物をコードする遺伝子である。例えば、宿主株において欠く場合に宿主株が栄養要求表現型を表すアスペルギルス種遺伝子の機能的コピーが使用され得る。選択マーカーは、トリコデルマ種についても存在する。
【００７８】
一部の実施形態では、アスペルギルス種のｐｙｒＧ−誘導体株は、機能性ｐｙｒＧ遺伝子で形質転換され、これは形質転換についての選択マーカーを提供する。ｐｙｒＧ−誘導体株は、フルオロロロチン酸（ＦＯＡ）耐性であるアスペルギルス種株を選択することにより、得ることができる。ｐｙｒＧ遺伝子は、ウリジンの生合成に必要とされる酵素であるオロチジン−５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼをコードする。完全ｐｙｒＧ遺伝子を有する株は、ウリジンを欠く培地で培養するが、フルオロオロチン酸には感受性である。したがって、ＦＯＡ耐性選択は、機能性オロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼ酵素を欠き、それゆえに培養のためにウリジンを必要とするｐｙｒＧ−誘導体株を選択するために使用することができる。ＦＯＡ選択技術を使用して、機能性オロテートピロホスホリボシル転移酵素を欠くウリジン要求性株を得ることも可能である。これらの細胞は、この酵素をコードする遺伝子の機能性コピーで形質転換することができる（Ｂｅｒｇｅｓ  ＆  Ｂａｒｒｅａｕ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３５９〜３６５（１９９１）及びｖａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６：７１〜７５）。誘導体株の選択は、上記ＦＯＡ耐性技術を用いて、行われる。一部の実施形態では、ｐｙｒＧ遺伝子は、選択マーカーとして採用される。
【００７９】
一部の実施形態では、ボタンタケ種（トリコデルマ種）のｐｙｒ４−誘導体株は、機能性ｐｒｙ４遺伝子で形質転換され、これは形質転換についての選択マーカーを提供する。ｐｙｒ４−誘導体株は、フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）に耐性であるボタンタケ種（トリコデルマ種）株の選択により得ることができる。ｐｙｒ４遺伝子は、ウリジンの生合成に必要とされる酵素であるオロチジン−５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼをコードする。完全ｐｙｒ４遺伝子を有する株は、ウリジンを欠く培地で培養するが、フルオロオロチン酸には感受性である。したがって、ＦＯＡ耐性選択は、機能性オロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼ酵素を欠き、それゆえに培養のためにウリジンを必要とするｐｙｒ４−誘導体株を選択するために使用することができる。ＦＯＡ選択技術を使用して、機能性オロテートピロホスホリボシル転移酵素を欠くウリジン要求性株を得ることも可能である。これらの細胞は、この酵素をコードする遺伝子の機能性コピーで形質転換することができる（Ｂｅｒｇｅｓ  ＆  Ｂａｒｒｅａｕ，１９９１）。誘導体株の選択は、上記のようにＦＯＡ耐性技術を用いて、行われる。一部の実施形態では、ｐｙｒ４遺伝子は、選択マーカーとして採用される。
【００８０】
例えば、上記に例示したもののような有害遺伝子が欠損又は欠失した単一ＤＮＡ断片は、次に、欠失プラスミドから単離され、適切なｐｙｒＧ−アスペルギルス又はｐｙｒ４−トリコデルマ宿主を形質転換するのに用いられる。形質転換体は、これらがｐｙｒＧ又はｐｙｒ４遺伝子産物を発現させ、それゆえに、宿主株のウリジン要求性を補う能力に基づいて同定及び選択される。サザンブロット分析は、その間に遺伝子のゲノムコピーのコード領域の部分又はすべてが欠失され、好適なｐｙｒ選択マーカーで置換されるダブルクロスオーバーイベントを同定及び確認するために、得られた形質転換体で好適に行うことができる。
【００８１】
上述した特定のプラスミドベクターがｐｙｒ形質転換体の調製に関するといえども、本開示はこれらのベクターに限定されるものではない。様々な遺伝子は、上記技術を上記のように用いて、アスペルギルス種又はボタンタケ種（トリコデルマ種）において欠失させる及び置換することができる。加えて、多くの選択マーカーは、本明細書で説明するように、好適である。実際、同定された任意の遺伝子は、上記方法を用いて、例えば、アスペルギルス種又はボタンタケ種といった任意の宿主のゲノムから好適に欠失させることができる。
【００８２】
特定の実施形態では、使用される宿主株は、選択された選択マーカーに対応する非機能性遺伝子（単数又は複数）を欠失する又は有するボタンタケ種（トリコデルマ種）の誘導体であり得る。例えば、ｐｙｒＧの選択マーカーがアスペルギルス種のために選択される場合、特定のｐｙｒＧ−誘導体株が形質転換手順において受容体として使用される。別の例では、ｐｙｒ４の選択マーカーがボタンタケ種のために選択される場合、特定のｐｙｒ４−誘導体株が形質転換手順において受容体として使用される。一部の実施形態では、例えば、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ又はｎｉａＤといった、アスペルギルス・ニデュランス遺伝子に類似したボタンタケ種（トリコデルマ種）遺伝子を含む選択マーカーが使用され得る。対応する受容体株は、したがって、それぞれａｍｄＳ−、ａｒｇＢ−、ｔｒｐＣ−又はｎｉａＤ−株などの誘導体株である。
【００８３】
目的のタンパク質又は変異体をコードするＤＮＡは、次に、適切な微生物への挿入のために調製することができる。本開示によると、目的のタンパク質又は変異体をコードするＤＮＡは、野生型タンパク質の活性を有するタンパク質又は変異体をコードするＤＮＡを含み得る。目的のタンパク質又は変異体をコードするＤＮＡ断片は、例えば、アスペルギルスにおけるｇｌａＡ遺伝子のプロモーター又はトリコデルマにおけるｃｂｈ１若しくはｅｇｌ１遺伝子のプロモーターといった、真菌プロモーター配列に機能的に結合され得る。
【００８４】
目的のタンパク質又は目的の変異体をコードするＤＮＡは、そのタンパク質又は変異体をコードするＤＮＡを保有する発現ベクターを構築することにより、調製され得る。目的のタンパク質又は変異体をコードする挿入ＤＮＡ断片を保有する発現ベクターは、例えば、典型的にはプラスミドの形態である、所与の宿主生物において自律的に複製できるか又は宿主のＤＮＡの中に統合することができる任意のベクターであり得る。特定の実施形態では、遺伝子の発現を得るために二つのタイプの発現ベクターが想到される。第１のタイプは、プロモーター、遺伝子コード領域及びターミネーター配列がすべて、発現される遺伝子に由来する、ＤＮＡ配列を含有する。望ましくない（例えば、不必要なドメインをコードしている）ＤＮＡ配列を欠失させ、それ自身の転写及び翻訳調節配列の制御下で発現されるドメインを残すことにより、所望される遺伝子トランケーションを得ることができる。選択マーカーはまた、所望の遺伝子配列の複数のコピーを宿主の中に統合するための選択を可能にするベクターの一部として含有され得る。
【００８５】
第２のタイプの発現ベクターは、予め組み立てられており、高レベル転写及び選択マーカーに有用な配列を含有する。遺伝子又はその一部についてのコード領域は、このような汎用発現ベクターの中に挿入することができ、それを発現カセットプロモーター及びターミネーター配列の転写制御下に置くことができると想到される。このような汎用発現ベクターの非限定例は、アスペルギルスにおけるｐＲＡＸである。目的の遺伝子若しくは変異体遺伝子又はこれらの一部は、強力なｇｌａａプロモーターの下流に挿入することができる。このような汎用発現ベクターの非限定例は、ボタンタケにおけるｐＴＥＸである。目的の遺伝子若しくは変異体遺伝子又はこれらの一部は、強力なｃｂｈ１プロモーターの下流に挿入することができる。
【００８６】
特定の実施形態では、ベクターにおいて、目的のタンパク質又は変異体をコードするＤＮＡ配列は転写及び翻訳配列に機能するように連結され、例えば、好適なプロモーター配列及びシグナル配列はリーディングフレームにおいて構造遺伝子に機能するように連結されている。プロモーターは、好適には、特定の宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり、宿主細胞に対して相同又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導され得る。任意のシグナルペプチドは、目的のタンパク質又は変異体の細胞外産生を提供し得る。シグナル配列をコードするＤＮＡは、好ましくは、発現される遺伝子と天然に関連しているものである。しかしながら、例えば、トリコデルマの、エキソセロビオヒドロラーゼから又はエンドグルカナーゼからといった、任意の好適な供給源からのシグナル配列が想到される。
【００８７】
目的のタンパク質又は変異体をコードするＤＮＡ配列をプロモーターに連結するために使用できるプロトコル及びこのような構築物を好適なベクターの中に挿入することは、当該技術分野において既知である。
【００８８】
本明細書に記載のＤＮＡベクター構築物は、形質転換、トランスフェクション、マイクロインジェクション、マイクロ穿孔法、微粒子銃照射及びこれらに類するものなどの既知の技術により、宿主細胞の中に導入され得る。
【００８９】
例えば、本明細書に記載のＤＮＡベクター又は構築物が真菌宿主細胞を形質転換するのに使用される場合、ＤＮＡに対するボタンタケ種（トリコデルマ種）の細胞壁の透過性は低いものであり得る。したがって、所望のＤＮＡ配列、遺伝子又は遺伝子断片の取り込みは、多くの場合、最小限である。形質転換プロセスに先立って誘導体株（例えば、使用される選択マーカーに対応する機能性遺伝子を欠くもの）のボタンタケ種（トリコデルマ種）細胞壁の透過性を上昇させるために、多くの方法を使用することができる。
【００９０】
特定の実施形態では、形質転換のためにアスペルギルス種又はボタンタケ種（トリコデルマ種）を調製するために、菌糸体からのプロトプラストを調製する。Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６；１９８９を参照されたい。菌糸は、発芽した栄養胞子から得ることができる。菌糸は、細胞壁を消化する酵素で処理され、プロトプラストを生じる。プロトプラストは次に懸濁培地内で浸透安定剤の存在により保護される。好適な安定剤としては、例えば、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム及びこれらに類するものが挙げられる。通常、安定剤の濃度は、０．８Ｍ〜１．２Ｍ（例えば、０．９Ｍ〜１．２Ｍ、１，０Ｍ〜１．２Ｍ、１．１Ｍ〜１．２Ｍなど）で様々であり得る。特定の実施形態では、１．２Ｍのソルビトールが懸濁培地内で安定剤として使用される。
【００９１】
宿主株（例えば、アスペルギルス種又はボタンタケ種（トリコデルマ種）へのＤＮＡの取り込みは、多くの場合、カルシウムイオン濃度に依存し得る。通常、約１０ｍＭのＣａＣｌ２〜約５０ｍＭのＣａＣｌ２（例えば、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約３５ｍＭ）が取り込み溶液中で使用される。取り込み溶液中にカルシウムイオンを含む他、多くの場合含まれる他の品目は、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ  ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ）又は１０ｍＭのＭＯＰＳのｐＨ  ６．０の緩衝液（モルホリンプロパンスルホン酸）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの緩衝系である。この緩衝液中のポリエチレングリコールは、細胞膜を溶解するように作用して、これにより培地の内容物が宿主細胞（例えば、アスペルギルス種又はボタンタケ種）の細胞質の中に送達されるようにし、プラスミドＤＮＡは核に移動される。特定の実施形態では、この溶解プロセスは、宿主染色体の中に統合されたプラスミドＤＮＡの複数のコピーを残す。
【００９２】
通常、１０５〜１０６／ｍＬ、好ましくは２×１０５／ｍＬの密度にて透過性処理にかけられたアスペルギルス種プロトプラスト又は細胞を含有する懸濁液が形質転換に使用される。同様に、１０８〜１０９／ｍＬ、好ましくは２×１０８／ｍＬの密度にて透過性処理にかけられたボタンタケ種（トリコデルマ種）プロトプラスト又は細胞を含有する懸濁液が形質転換に使用される。これらのプロトプラスト又は細胞の容量１００μＬを適切な溶液（例えば、１．２Ｍのソルビトール、５０ｍＭのＣａＣｌ２）の中で所望のＤＮＡと共に混合する。一部の実施形態では、相当な量のＰＥＧが取り込み溶液に添加される。例えば、約０．１〜約１容量の２５％  ＰＥＧ  ４０００をプロトプラスト懸濁液に添加することができる。具体例では、約０．２５容量の２５％  ＰＥＧ  ４０００をプロトプラスト懸濁液に添加する。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム及びこれらに類するものなどの添加物も取り込み溶液に添加してもよく、形質転換の助けとなり得る。
【００９３】
特定の実施形態では、混合物は、約０℃にて約１０〜約３０分の期間にわたってインキュベートされる。追加のＰＥＧを混合物に添加して、所望の遺伝子又はＤＮＡ配列の取り込みを強化することができる。特定の実施形態では、２５％  ＰＥＧ  ４０００は、形質転換混合物の５〜１５倍である容量で添加することができるが、より多量及び少量もまた好適であり得る。例えば、２５％  ＰＥＧ  ４０００は、一部の実施形態では形質転換混合物の１０倍の容量で添加される。ＰＥＧが添加された後、形質転換混合物は次に室温又は氷上のいずれかでインキュベートされ、その後、ソルビトール及びＣａＣｌ２溶液を添加する。プロトプラスト懸濁液を次に培養培地の溶融アリコートに添加する。この培養培地は、形質転換体の培養を許容する。多くの培養培地は、本開示の所望の形質転換体を培養するのに好適に使用することができる。特定の実施形態では、例えば、Ｐｙｒ＋形質転換体が選択されている場合、ウリジンを全く含有しない培養培地を使用することが好ましい。例えば、コロニーは、ウリジンを欠く培養培地上に移され、精製される。
【００９４】
この段階で、安定な形質転換体は、そのより速い培養速度により、不安定な形質転換体から識別され得る。また、例えば、トリコルデマといった、多くの糸状菌宿主について、ウリジンを欠く固体培養培地上でのギザギザした外郭とは反対に滑らかさを有する環状コロニーの形成を識別特性として使用することができる。一部の実施形態では、固体の非選択培地（例えば、ウリジンを含有している）上で形質転換体を培養し、この培養培地から胞子を採取し、これらの胞子の百分率を判定することにより、安定度の更なる試験及び選択が行われ得る。選択された胞子は、発芽を許容され、ウリジンを欠く選択培地上での培養を許容される。
【００９５】
Ｃ．宿主細胞内への組み換えタンパク質をコードする核酸配列の導入
本開示は、組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含むように遺伝学的に改変した細胞及び細胞組成物を更に提供する。親細胞又は細胞株は、クローニングベクター又は発現ベクターで遺伝学的に改変（すなわち、形質導入、形質転換又はトランスフェクション）され得る。ベクターは、上記に詳述されていたように、例えば、プラスミド、ウィルス粒子、ファージなどの形態であってもよい。
【００９６】
本開示の形質転換方法により、形質転換ベクターのすべて又は部分を糸状菌のゲノム内に安定的に統合することがもたらされ得る。自己複製染色体外形質転換ベクターの維持をもたらす形質転換もまた想到される。
【００９７】
相当の量の非自生又は自生タンパク質を発現させる糸状菌、例えば、トリコデルマ・リーゼイ、細胞株を産生するために、多くの標準的なトランスフェクション方法を使用することができる。例えば、多くの公開方法が存在し、トリコデルマの酵素産生株の中にＤＮＡ構築物を導入するためにはＬｏｒｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３４９〜３５６；Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１６９〜１７４；Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅ  ６：１５５〜１６４が挙げられ、アスペルギルスの酵素産生株の中にＤＮＡ構築物を導入するためにはＹｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０〜１４７４が挙げられ、フザリウムの酵素産生株の中にＤＮＡ構築物を導入するためにはＢａｊａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８２０２〜８２１２が挙げられ、ストレプトミセスの酵素産生株の中にＤＮＡ構築物を導入するためにはＨｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫが挙げられ、バチルスについてはＢｒｉｇｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：１３５〜１３８が挙げられる。
【００９８】
キメラ構築物（発現ベクター）を糸状菌（例えば、ハイポクレア・ジェコニア）の中に導入するための他の方法としては、粒子又は遺伝子銃、形質転換プロセスに先立つ糸状菌細胞壁の透過（例えば、高濃度のアルカリ、例えば、０．０５Ｍ〜０．４ＭのＣａＣｌ２又は酢酸リチウムの使用による）、原形質融合又はアグロバクテリウム媒介形質転換の使用が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコール及びＣａＣｌ２を有するプロトプラスト又はスフェロプラストによるこのような糸状菌形質転換方法の例は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｅ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６，１９８９；及びＰｅｎｔｔｉｌａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６３：１１〜２２，１９８８に記載されている。
【００９９】
異なるヌクレオチド配列を宿主細胞の中に導入するための任意の既知の手順が使用され得る。これらとしては、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、原形質融合、電気穿孔法、バイオリスティック、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウィルスベクター、並びに、宿主細胞の中にクローン化ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の異なる遺伝的物質を導入するための任意の他の既知の方法の使用が挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記）を参照されたい）。米国特許第６，２５５，１１５号に記載のアグロバクテリウム媒介トランスフェクション法も有用である。用される特定の遺伝工学手順が非自生又は内因性（しかしながら非自生形態）遺伝子を発現できる宿主細胞の中に少なくとも１つの遺伝子をうまく導入できることが重要である。
【０１００】
一部の実施形態では、組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含むキメラ構築物は、インビトロで転写することができ、得られたＲＮＡは例えば、インジェクションといった既知の方法により宿主細胞の中に導入することができる。
【０１０１】
本開示は、真菌酵素、その変異体、及びこれらの分子を含む組成物を産生することにおいて使用するためのハイポクレア・ジェコニア及びアスペルギルス・ニガーなどの糸状菌の新規及び有用な形質転換体を更に含む。本開示は、糸状菌、特に特定の組み換えタンパク質をコードする配列又は特定の内因性コード配列の欠失を含む真菌、の形質転換体を含む。
【０１０２】
目的のタンパク質又はその変異体のためのコード配列を含むキメラ構築物の導入に続いて、遺伝学的に改変された細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択又は組み換えタンパク質をコードする核酸配列の発現増幅にとって適切なように改変された従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨ及びこれらに類するものなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に予め使用されたものであり、当業者には明白である。
【０１０３】
このようなキメラ構築物が導入された細胞の子孫は、キメラ構築物に見られるタンパク質をコードする核酸配列を含むと通常考えられる。
【０１０４】
本開示は、真菌酵素、その変異体、又はこのような分子を含む組成物を産生することにおいて使用するためのＨ．ジェコニアなどの糸状菌の新規及び有用な形質転換体を更に含む。例えば、アスペルギルス・ニガーも、組み換えタンパク質及びその変異体の産生において使用され得る。本開示は、糸状菌、特に目的のタンパク質若しくはその変異体のコード配列又は特定の内因性タンパク質をコードする配列の欠失を含む真菌、の形質転換体を含む。
【実施例】
【０１０５】
本開示は、以下の実施例において更に詳細に説明されるが、これは、請求される本開示の範囲を制限することを意図するものでは決してない。添付の図は、本開示の明細及び説明の一体部分として考えられるものである。以下の実施例は、請求された開示を例示するために提供されるものであるが、制限するものではない。
【０１０６】
以下に続く実験開示において、以下の省略形を適用する：Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ若しくはｍＬ（ミリリットル）；μｌ若しくはμＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（ユニット）；Ｖ（ボルト）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈ若しくはｈｒ（時間）；℃（摂氏度）；ＱＳ（十分量）；ＮＤ（実施せず）；ＮＡ（該当なし）；ｒｐｍ（分当たり回転数）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）；ＨＣｌ（塩酸）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（塩基対）；ｋｂ（キロベース対）；ｋＤ（キロダルトン）；ｃＤＮＡ（コピー若しくは相補的ＤＮＡ）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）；ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）；ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ｗ／ｖ（重量対体積）；ｖ／ｖ（体積対体積）；ｇ（重力）；ＯＤ（光学密度）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）；及びＳＥＬ（部位評価ライブラリー）。
【０１０７】
（実施例１）
トリコデルマ・リーゼイ発現株の作製
発現レベルが同一アミノ酸配列の変異体全体にわたってより低変動性であるように、目的の変異体（この例ではＣＢＨ２変異体）の発現一貫性を増加させるように改善された株を作製した。特に、トリコデルマ・リーゼイ株を標的ベクターと組み合わせて成長させて、ｃｂｈ２変異体遺伝子の統合を強制した（例えば、調節配列と機能するように組み合わせたコード領域）。本開示の開発中調製された新しい株は、変異体ライブラリーをスクリーニングするのに有利である複数の変異を組み合わせている。遺伝工学工程の概略は、図１に示す。
【０１０８】
トリコデルマ・リーゼイのｑｕａｄ欠失誘導体株からのｋｕ８０の欠失。
【０１０９】
ｑｕａｄ欠失誘導体株は、国際公開第２００５／００１０３６に記載されている。ＭＵＳ５２の単一オルソログ（ヒトＫＵ８０のＮ．クラッサ・オルソログ）は、ハイポクレア・ジェコニアＱＭ６ａ（トリコデルマ・リーゼイ）のゲノム配列でのＴＢＬＡＳＴＮ検索により同定されており、結果的にトリコデルマ・リーゼイｋｕ８０、タンパク質ｉｄ  ５８２１３と命名され、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手可能である。トリコデルマ・リーゼイｋｕ８０遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１３として提供される：
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ｑｕａｄ欠失誘導体株からトリコデルマ・リーゼイｋｕ８０遺伝子を欠失させるために、例えば、国際公開第２００５／００１０３６号に概要が記載されているような標準的方法をこの目的のために適応させた。簡潔には、図２に概略的に示すように、１．３ｋｂの５’ｋｕ８０配列と２．３ｋｂの３’ｋｕ８０配列に挟まれて隣接される選択マーカーを採用するｋｕ８０欠失カセットを利用した。除草剤クロリムロンエチルに対する耐性を付与する変異体トリコデルマ・リーゼイａｌｓを選択マーカーとして使用した。例えば、国際公開第２００８／０３９３７０号を参照されたい。ｋｕ８０ノックアウトカセットのヌクレオチド配列は、７６８５塩基対の長さである：塩基１〜１２７１は５’ｋｕ８０相同領域に対応する；塩基１２８０〜７６８５はａｌｓ−クロリムロンエチル耐性変異体（Ａ１９０Ｄ）に対応する；並びに、塩基５３８１〜７６８５は３’ｋｕ８０相同領域に対応する。ｋｕ８０ノックアウトカセットのヌクレオチド配列は、配列番号１として提供される：
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【０１１０】
トリコデルマ・リーゼイΔｋｕ８０  ｑｕａｄ欠失誘導体株からのＡｒｃｈｙ２の作製
まず、ｐｙｒ２遺伝子をｋｕ８０ノックアウト株から欠失させた。ｐｙｒ２欠失カセットは、図３に概略的に描写されているように、トリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーター、ヒグロマイシン耐性遺伝子、並びに、５’及び３’ｐｙｒ２配列により隣接された部分ａｍｄＳ選択マーカーを含有した。これにより、ｐｙｒ２ノックアウト形質転換体の、ヒグロマイシン及びフルオロオロチン酸への耐性についてのスクリーニングが可能になった。部分ａｍｄＳ遺伝子は、遺伝子の３’部分を含有したが、プロモーター及びコード領域のアミノ末端部分を欠き、結果として非機能性であった。ｐｙｒ２ノックアウトカセットのヌクレオチド配列は、９２５９塩基対の長さである：塩基１〜１９９４はｐｙｒ２  ３’相同領域に対応する；塩基２００２〜３４９７はトリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーターに対応する；塩基３５６３〜５４４９はヒグロマイシン耐性選択マーカーに対応する；塩基５４５０〜７４４０はＡ．ニデュランスａｍｄＳ  ３’部分マーカーに対応する；並びに、塩基７４４１〜９２５９はｐｙｒ２  ５’相同領域に対応する。ｐｙｒ２ノックアウトカセットのヌクレオチド配列は、配列番号２として提供される：
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Ａｒｃｈｙ２トリコデルマ・リーゼイ株からのＡｒｃｈｙ３株の作製。
【０１１１】
Ａｒｃｈｙ  ２株は、ヒグロマイシン欠失カセットで形質転換されて、同じｐｙｒ２遺伝子座にて統合して、ｐｙｒ２遺伝子のコード領域でヒグロマイシン耐性遺伝子を置換した。ヒグロマイシン欠失カセットは、図４に描写されている。ｐｒ２遺伝子をｐｙｒ２遺伝子座内へと戻すこの再導入は、トリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーターと部分ａｍｄＳ選択マーカーの間にｐｙｒ２遺伝子を配置した。この株は、ウリジン原栄養性及びヒグロマイシンに対する感受性により選択された。ｈｙｇＲノックアウトカセットのヌクレオチド配列は、９０８８塩基対の長さである：塩基１〜１９９４はｐｙｒ２  ３’相同領域に対応する；塩基１９９５〜３４９７はトリコデルマ・リーゼイｃｂｈ１プロモーターに対応する；塩基３５６４〜５１３７はｐｙｒ２選択マーカーに対応する；塩基５２８０〜７２７０はＡ．ニデュランスａｍｄＳ  ３’部分マーカーに対応する；塩基７２７１〜９０８８はｐｙｒ２  ５’相同領域に対応する。ｈｙｇＲノックアウトカセットのヌクレオチド配列は、配列番号３として提供される：
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Ａｒｃｈｙ３トリコデルマ・リーゼイ株からのＡ５Ｄ株の作製。
【０１１２】
自生トリコデルマ・リーゼイｂｇｌ１を例えば、Ｍ．Ｗａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）．Ｇｅｎｅ  ８６（２）：１５３〜６２といった当該技術分野において既知のダブルクロスオーバー組み換え遺伝子再配置ベクターを用いて、Ａｒｃｈｙ  ３から欠失させた。ヒグロマイシン耐性をｂｇｌ１欠失に対する選択マーカーとして使用した。加えて、ヒグロマイシン耐性マーカーをｌｏｘＰ部位により隣接させた。ｂｇｌ１欠失カセットは、図５に描写されている。後続のヒグロマイシン耐性形質転換体をｂｇｌ１欠失について分析した。ｂｇｌ１の欠失について確認した株を次に、形質転換体の選択のためにｃｒｅリコンビナーゼをコードするテロメアベクター及び機能性ａｍｄＳで形質転換させて、ｃｒｅリコンビナーゼ発現によりヒグロマイシンの除去を促進し、ｌｏｘＰ部位の外をループさせた。ｃｒｅリコンビナーゼをコードするテロメアベクターを図７に概略的に描写する。形質転換体をまずアセトアミド培地上で得、次にジャガイモデキストロース寒天に移し、複製をヒグロマイシン培地上に蒔き、ヒグロマイシン感受性についてスクリーニングした。ヒグロマイシン感受性株を再びジャガイモデキストロース培地に移し、複製をアセトアミド培地に蒔いた。アセトアミド上で培養する能力を失い、テロメアベクターの喪失を示している株を選択した。ｂｇｌ１ノックアウトカセットのヌクレオチド配列は、配列番号４として提供される：
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テロメアベクター（ｐＴＴＴ−ｃｒｅ）のヌクレオチド配列は、配列番号５として提供される：
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Ａ５Ｄトリコデルマ・リーゼイ株からのＭＡＤ６株の作製。
【０１１３】
ｂｇｌ１欠失について先述したもの（上記を参照されたい）と同様の方法を用いて、自生ｅｇｌ３をＡ５Ｄ株（上記）から欠失させた。ｅｇｌ３欠失カセットの概略を図６に示す。ヒグロマイシン耐性をｅｇｌ３欠失に対する選択マーカーとして使用した。ヒグロマイシン耐性マーカーをｌｏｘＰ部位により隣接させた。形質転換体がｅｇｌ３の欠失を有することを確認した。Ａ５Ｄ株の作製について記載したように、この株からヒグロマイシンマーカーを除去した。Ａ５Ｄ株の作製について記載したようにこの株からｃｒｅリコンビナーゼをコードするテロメアベクターを除去した。ｅｇｌ３欠失カセットのヌクレオチド配列は、配列番号６として提供される：
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（実施例２）
酵素発現比較：Ｑｕａｄ欠失株ｖｓ．ＭＡＤ６株
１．ベクターの調製
２つのグリコシルヒドロラーゼファミリー４３タンパク質をトリコデルマ・リーゼイ株のＡｒｃｈｙ３及びｑｕａｄ欠失株で発現させた。遺伝子ｆｖ４３Ｂ及びｆｖ４３Ｃ、をフザリウム・バーティシリオイデス（Fusarium verticillioides）の遺伝子ＤＮＡからクローニングし、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて発現ベクターｐＴｒｅｘ３ｇＭの中に組み立てた。両方の遺伝子をまず、図９に描写しているように、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中にクローニングした。
【０１１４】
これらの遺伝子を続いてベクターｐＴｒｅｘ３ｇＭの中に組み換えしたが、そこでは、ｃｂｈＩプロモーターは目的の遺伝子のコード配列の上流にあり、ｃｂｈｌターミネーターは目的の遺伝子の終止コドンに下流にある。このベクターは追加的に、ｃｂｈｌターミネーターの３’末端にアスペルギルス・ニデュランス・アセトアミド（ａｍｄＳ）選択マーカーを含有する。このベクターを図１０に描写する。
【０１１５】
得られたＦｖ４３Ｂ発現ベクター、ｐＴｒｅｘ３ｇＭ−Ｆｖ４３Ｂ、を図１１に概略的に示す。
【０１１６】
発現ベクターｐＴｒｅｘ３ｇＭ内のＦｖ４３Ｂグリコシルヒドロラーゼの完全ヌクレオチド配列は、配列番号１４として下記に提供される。
【０１１７】
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得られたＦｖ４３Ｃ発現ベクター、ｐＴｒｅｘ３ｇＭ−Ｆｖ４３Ｃ、を図１２として概略的に示す。
【０１１８】
発現ベクターｐＴｒｅｘ３ｇＭ内のＦｖ４３Ｃグリコシルヒドロラーゼの完全ヌクレオチド配列は、配列番号１５として下記に提供される。
【０１１９】
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【０１２０】
フザリウム・バーティシリオイデスからのＧＨ４３ファミリー酵素Ｆｖ４３Ｂ、についてのヌクレオチド配列は、以下に配列番号１６として提供される：
ＡＴＧＣＧＣＴＴＣＴＣＴＴＧＧＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＴＴＣＴＡＧＣＧＡＴＧＧＧＡＡＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＣＧＡＡＧＡＣＧＧＡＴＧＴＴＴＣＧＡＣＡＴＡＣＡＣＣＡＡＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＴＧＴＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＡＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＡＧＧＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＡＣＴＧＧＣＧＴＣＴＣＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧＴＡＴＧＣＡＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＧＡＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＧＡＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＴＣＡＴＣＴＧＣＧＡＡＴＡＣＣＴＧＧＧＣＧＴＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＧＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＣＧＡＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＡＧＴＧＡＣＣＣＴＧＴＴＡＣＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＡＡＴＣＡＣＡＴＣＧＡＣＣＣＣＧＡＴＣＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＡＣＧＧＡＡＡＧＧＴＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＴＣＡＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＴＴＧＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＧＣＴＴＡＧＣＣＣＧＧＡＧＣＴＴＡＡＴＡＴＣＴＧＧＡＡＣＧＧＣＡＣＡＧＧＡＧＧＴＧＴＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＡＴＡＴＣＴＡＣＡＡＧＣＧＣＧＡＣＧＧＴＴＡＣＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＧＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＴＡＴＣＡＣＡＡＴＣＧＣＴＣＧＧＧＣＣＣＧＣＡＡＧＡＴＣＡＣＣＧＧＣＣＣＣＴＡＴＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＡＴＡＡＣＡＡＣＣＣＡＡＴＣＴＴＧＡＣＣＡＡＣＣＧＣＧＧＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＴＡＣＴＴＣＣＡＧＡＣＴＧＴＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＴＣＴＧＴＴＣＣＡＡＧＡＴＡＣＣＡＡＧＧＧＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＧＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＴＧＣＴＡＣＴＣＧＣＡＴＣＡＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＧＴＴＴＣＡＣＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＴＴＧＴＴＣＡＡＴＧＧＣＡＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＡＡＴＧＧＣＣＣＡＡＧＴＴＧＣＡＡＣＣＡＧＴＡＣＧＡＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＣＣＧＡＣＧＣＧＡＡＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＣＡＡＣＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣＴＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＣＴＣＣＴＣＡＣＴＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＴＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＣＧＴＧＣＣＴＡＧＴＣＧＡＡＡＣＡＡＣＧＴＴＡＣＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＧＧＡＧＡＴＧＡＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＧＧＴＣＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＧＧＡＣＧＣＣＧＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＴＣＴＧＴＴＣＡＡＡＴＡＴＡＧＴＧＴＴＧＡＴＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＡＣＣＧＴＴＴＴＣＣＧＣＡＣＧＣＡＧＴＴＣＧＡＣＣＡＴＡＴＣＧＡＴＣＴＴＧＧＣＡＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＣＴＡＣＡＡＡＣＣＡＡＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＴＴＣＣＧＡＴＴＣＣＧＧＧＣＣＡＣＡＧＧＡＧＣＴＣＡＧＡＡＴＧＴＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧＡＡＧＧＴＡＧＴＡＣＣＧＧＴＣＣＣＣＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＧＴＣＴＡＣＡＴＡＴＣＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡＣＧＣＧＡＣＧＣＡＣＴＡＣＡＡＣＣＴＴＧＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣＡＡＧＡＣＴＣＴＣＧＡＣＡＴＣＧＣＧＡＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＴＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＧＧＧＴＴＣＡＴＴＴＧＴＴＧＧＴＡＧＴＴＴＧＣＴＴＧＧＡＣＣＴＴＡＴＧＣＴＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＡＴＧＴＣＣＣＡＡＧＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＴＣＴＡＴＧＴＧＡＣＣＣＡＡＴＧＧＡＣＴＴＡＴＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＣＡＣＡＡＧＡＧＡＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＧＴＴＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＣＡＧＡＡＴＴＧＴＡＧ
【０１２１】
Ｆｖ４３Ｂのタンパク質配列は以下に配列番号１７として提供される：
ＭＲＦＳＷＬＬＣＰＬＬＡＭＧＳＡＬＰＥＴＫＴＤＶＳＴＹＴＮＰＶＬＰＧＷＨＳＤＰＳＣＩＱＫＤＧＬＦＬＣＶＴＳＴＦＩＳＦＰＧＬＰＶＹＡＳＲＤＬＶＮＷＲＬＩＳＨＶＷＮＲＥＫＱＬＰＧＩＳＷＫＴＡＧＱＱＱＧＭＹＡＰＴＩＲＹＨＫＧＴＹＹＶＩＣＥＹＬＧＶＧＤＩＩＧＶＩＦＫＴＴＮＰＷＤＥＳＳＷＳＤＰＶＴＦＫＰＮＨＩＤＰＤＬＦＷＤＤＤＧＫＶＹＣＡＴＨＧＩＴＬＱＥＩＤＬＥＴＧＥＬＳＰＥＬＮＩＷＮＧＴＧＧＶＷＰＥＧＰＨＩＹＫＲＤＧＹＹＹＬＭＩＡＥＧＧＴＡＥＤＨＡＩＴＩＡＲＡＲＫＩＴＧＰＹＥＡＹＮＮＮＰＩＬＴＮＲＧＴＳＥＹＦＱＴＶＧＨＧＤＬＦＱＤＴＫＧＮＷＷＧＬＣＬＡＴＲＩＴＡＱＧＶＳＰＭＧＲＥＡＶＬＦＮＧＴＷＮＫＧＥＷＰＫＬＱＰＶＲＧＲＭＰＧＮＬＬＰＫＰＴＲＮＶＰＧＤＧＰＦＮＡＤＰＤＮＹＮＬＫＫＴＫＫＩＰＰＨＦＶＨＨＲＶＰＲＤＧＡＦＳＬＳＳＫＧＬＨＩＶＰＳＲＮＮＶＴＧＳＶＬＰＧＤＥＩＥＬＳＧＱＲＧＬＡＦＩＧＲＲＱＴＨＴＬＦＫＹＳＶＤＩＤＦＫＰＫＳＤＤＱＥＡＧＩＴＶＦＲＴＱＦＤＨＩＤＬＧＩＶＲＬＰＴＮＱＧＳＮＫＫＳＫＬＡＦＲＦＲＡＴＧＡＱＮＶＰＡＰＫＶＶＰＶＰＤＧＷＥＫＧＶＩＳＬＨＩＥＡＡＮＡＴＨＹＮＬＧＡＳＳＨＲＧＫＴＬＤＩＡＴＡＳＡＳＬＶＳＧＧＴＧＳＦＶＧＳＬＬＧＰＹＡＴＣＮＧＫＧＳＧＶＥＣＰＫＧＧＤＶＹＶＴＱＷＴＹＫＰＶＡＱＥＩＤＨＧＶＦＶＫＳＥＬ
フザリウム・バーティシリオイデスからのＧＨ４３ファミリー酵素Ｆｖ４３Ｃ、についてのヌクレオチド配列は、以下に配列番号１８として提供される：
ＡＴＧＣＧＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＴＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＧＴＧＧＣＣＴＴＣＣＴＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡＧＡＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＡＣＧＧＧＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＣＣＧＧＣＣＴＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＧＣＣＡＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＡＣＣＡＣＣＧＡＣＧＧＴＴＴＣＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＧＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＣＴＴＡＣＴＣＴＣＡＡＴＧＧＴＡＣＧＡＡＴＧＧＣＡＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＧＧＴＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＣＴＣＧＣＧＧＡＧＧＣＡＡＧＴＡＴＴＡＣＴＴＣＴＡＣＣＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＴＡＡＴＣＣＣＴＣＴＧＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＧＣＡＴＡＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＡＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＴＡＡＧＣＣＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＡＴＴＧＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＡＴＣＧＡＴＣＣＣＧＣＴＧＣＣＴＴＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＡＡＣＧＧＴＧＴＣＣＣＣＡＴＴＧＴＣＧＣＡＧＡＧＣＴＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＣＡＣＡＡＡＡＴＣＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＧＡＡＴＴＴＣＣＧＣＧＡＧＧＧＴＣＴＴＴＴＣＧＴＣＡＡＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＣＡＴＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＴＡＴＣＧＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＣＴＣＡＧＡＧＡＡＣＴＡＴＣＧＣＧＴＴＧＧＧＴＡＣＧＣＴＡＣＧＧＣＧＧＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＴＧＧＡＣＣＴＴＧＧＡＣＡＴＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＣＧＡＡＴＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＴＣＴＴＧＣＴＡＣＧＧＧＡＣＡＴＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＣＣＴＧＧＡＡＣＧＧＡＴＧＡＧＴＧＧＴＡＴＡＴＣＧＣＧＴＡＴＣＡＴＣＧＣＴＴＣＣＡＴＡＴＴＣＣＣＧＡＴＧＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＴＡＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＴＡＣＧＡＴＴＧＡＴＡＧＧＧＴＡＣＣＣＡＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＴＡＣＧＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＧＣＣＧＡＣＴＴＴＧＣＡＧＡＧＴＧＴＴＧＡＴＣＣＴＡＧＧＣＣＴＴＴＧＴＡＧ
【０１２２】
Ｆｖ４３Ｃについてのタンパク質配列は以下に配列番号１９として提供される：
ＭＲＬＬＳＦＰＳＨＬＬＶＡＦＬＴＬＫＥＡＳＳＬＡＬＳＫＲＤＳＰＶＬＰＧＬＷＡＤＰＮＩＡＩＶＤＫＴＹＹＩＦＰＴＴＤＧＦＥＧＷＧＧＮＶＦＹＷＷＫＳＫＤＬＶＳＷＴＫＳＤＫＰＦＬＴＬＮＧＴＮＧＮＶＰＷＡＴＧＮＡＷＡＰＡＦＡＡＲＧＧＫＹＹＦＹＨＳＧＮＮＰＳＶＳＤＧＨＫＳＩＧＡＡＶＡＤＨＰＥＧＰＷＫＡＱＤＫＰＭＩＫＧＴＳＤＥＥＩＶＳＮＱＡＩＤＰＡＡＦＥＤＰＥＴＧＫＷＹＩＹＷＧＮＧＶＰＩＶＡＥＬＮＤＤＭＶＳＬＫＡＧＷＨＫＩＴＧＬＱＮＦＲＥＧＬＦＶＮＹＲＤＧＴＹＨＬＴＹＳＩＤＤＴＧＳＥＮＹＲＶＧＹＡＴＡＤＮＰＩＧＰＷＴＹＲＧＶＬＬＥＫＤＥＳＫＧＩＬＡＴＧＨＮＳＩＩＮＩＰＧＴＤＥＷＹＩＡＹＨＲＦＨＩＰＤＧＮＧＹＮＲＥＴＴＩＤＲＶＰＩＤＫＤＴＧＬＦＧＫＶＴＰＴＬＱＳＶＤＰＲＰＬ
ｐＴｒｅｘ３ｇＭ−Ｆｖ４３Ｂ及びｐＴｒｅｘ３ｇＭ−Ｆｖ４３Ｃベクターを、各々独立して、ＰＥＧ媒介原形質融合によりＭＡＤ６株に、及び、粒子銃照射によるｑｕａｄ欠失株に、形質転換した。
【０１２３】
２．ｑｕａｄ欠失トリコデルマ・リーゼイ株の形質転換。
【０１２４】
ＰＤＳ−１０００／ヘリウムシステム（Ｂｉｏｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））による微粒子銃照射を製造者の教示に従って用いて、米国特許出願公開第２００６／０００３４０８号の実施例２に記載のように、ベクターｐＴｒｅｘ３ｇＭ−Ｆｖ４３Ｂ及びベクターｐＴｒｅｘ３ｇＭ−Ｆｖ４３Ｃを独立してトリコデルマ・リーゼイｑｕａｄ欠失株に形質転換した。
【０１２５】
３．ｆｖ４３Ｂ及びｆｖ４３Ｃで形質転換したトリコデルマ・リーゼイｑｕａｄ欠失クローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
国際公開第２０１１／０３８０１９号に記載のように、安定な形質転換体を９６ウェルマイクロタイタープレートで培養した。培養上清にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、続いて、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅステイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でクマシー青色染色を行った。ゲルをスキャンし、光学密度測定により分析した。ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈから）を使用し、ユーザーガイドのサブセクション２７．１３に記載のようにＡｎａｌｙｚｅ  Ｇｅｌサブメニュー機能を採用することにより、画像処理及びバンド強度定量化を行った。Ｆｖ４３Ｂタンパク質に対応するバンドを定量化し、総タンパク質の百分率として報告した。図１３は、ｆｖ４３Ｂで形質転換させたトリコデルマ・リーゼイｑｕａｄ欠失クローンから発現させたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真を提供する。
【０１２６】
Ｆｖ４３Ｃタンパク質に対応するバンドを定量化し、総タンパク質の百分率として報告した。Ｆｖ４３Ｃはゲル上を２つのバンドとして走っており、異なる糖型を表し、これらは光学密度測定分析において合計された。Ｆｖ４３Ｃで形質転換させたトリコデルマ・リーゼイｑｕａｄ欠失クローンから発現させたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図１４に示す。
【０１２７】
４．ＭＡＤ６トリコデルマ・リーゼイ株のＰＥＧ媒介原形質融合形質転換
ＰＣＲにより、プライマー１０６１Ｆ及び１０８５Ｒを用いて、ベクターｐＴｒｅｘ３ｇＭ−Ｆｖ４３Ｂ及びｐＴｒｅｘ３ｇＭ−Ｆｖ４３Ｃの発現カセット部分を各々増幅して、それぞれ５．１ｋｂ及び４．４ｋｂの線状ＤＮＡ断片を産生させ、これらをＭＡＤ６株のＰＥＧ媒介原形質融合形質転換に使用した（例えば、Ｐｅｎｔｉｌｌａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６１（２）：１５５〜１６４を参照されたい）。
【０１２８】
１０６１Ｆ：５’−ＧＡＣＣＧＧＡＣＧＴＧＴＴＴＴＧＣＣＣＴＴＣＡＴ−３’（配列番号２０）
１０８５Ｒ：５’−ＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＴＴＴＧＧＣＧＡＧＴＧ−３’（配列番号２１）
プロトプラストを作るために、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍからの連結酵素（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｌ１４１２）を１０ｍｇ／ｍＬで使用した。ＤＮＡ及びＰＥＧを形質転換させながらインキュベートした後、０．５％ウリジンを有する冷却した溶解ソルビトール／アセトアミド寒天にプロトプラストを添加した。これらのプレートを３０℃にてインキュベートした。２４時間後、０．５％ウリジンと１．２ｇ／Ｌの５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）を補充した同じ培地を等容量だけ重層形態のプレートに添加した。これらのプレートを３０℃にて一週間にわたってインキュベートした。以下のレシピを用いて、溶解ソルビトール／アセトアミド寒天を調製した：
ソルビトール／アセトアミド寒天
【表１】
2013533737.tif 000003
【０１２９】
５．ｆｖ４３Ｂ又はｆｖ４３Ｃで形質転換させたトリコデルマ・リーゼイＭＡＤ６クローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
国際公開第２０１１／０３８０１９号に記載のように、Ｆｖ４３Ｂの３つの形質転換体とＦｖ４３Ｃの２つの形質転換体を９６ウェルマイクロタイターウェルプレートで培養した。培養上清にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、続いて、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅステイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でクマシー青色染色を行った。ゲルをスキャンし、光学密度測定により分析した。ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈから）を使用し、ユーザーガイドのサブセクション２７．１３に記載のようにＡｎａｌｙｚｅ  Ｇｅｌサブメニュー機能を採用することにより、画像処理及びバンド強度定量化を行った。図１５は、ｆｖ４３Ｂ及びｆｖ４３Ｃで形質転換させたトリコデルマ・リーゼイＭＡＤ６クローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。Ｆｖ４３Ｃタンパク質に対応するバンドを定量化し、総タンパク質の百分率として報告した。Ｆｖ４３Ｃタンパク質はゲル上を２つのバンドとして走っており、異なる糖型を表し、これらは光学密度測定分析において合計された。
【０１３０】
６．発現されたタンパク質の量の定量的測定
ｑｕａｄ欠失株により発現されたタンパク質の量をＭＡＤ６株により得られたものと比較した。上記のように、関連するゲル、図１３、１４及び１５をスキャンし、光学密度測定により分析した。ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈから）を使用し、ユーザーガイドのサブセクション２７．１３に記載のようにＡｎａｌｙｚｅ  Ｇｅｌサブメニュー機能を採用することにより、画像処理及びバンド強度定量化を行った。目的のタンパク質の各々に対応するバンドを定量化し、総タンパク質の百分率として報告した。Ｆｖ４３Ｃはゲル上を２つのバンドとして走っており、糖型を表し、これらは光学密度測定分析において合計された。この分析の結果を以下の表２−１に要約する：
【表２】
2013533737.tif 000004
【０１３１】
この比較は、ＭＡＤ６株を使用する発現が、発現レベルにおいて最小限の変動性（例えば、２０％未満の変動性）を有するはるかに高い信頼性の発現をもたらしたことを明確に示している。対照的に、ｑｕａｄ欠失株を使用すると、かなりの部分の形質転換体が、目的のタンパク質を発現させるのに失敗しており、発現の変動性はかなりのものである（例えば、５０％を超える変動性）。
【０１３２】
（実施例３）
ハイポクレア・ジェコニアＣＢＨ２のＤＮＡライブラリーの作製
ＣＢＨ２変異体酵素をコードするＤＮＡライブラリーの作製のための参照配列として、ハイポクレア・ジェコニアＣＢＨ２タンパク質をコードする配列を含有するｐＴＴＴｐｙｒＧ−ｃｂｈ２プラスミド（例えば、国際特許第２０１０／１４１７７９号を参照されたい）を使用した。
【０１３３】
配列番号７は、参照の、ハイポクレア・ジェコニアＣＢＨ２をコードするＤＮＡ配列を説明する：
ＡＴＧＡＴＴＧＴＣＧＧＣＡＴＴＣＴＣＡＣＣＡＣＧＣＴＧＧＣＴＡＣＧＣＴＧＧＣＣＡＣＡＣＴＣＧＣＡＧＣＴＡＧＴＧＴＧＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＡＧＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＴＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＧＡＡＴＴＧＧＴＣＧＧＧＴＣＣＧＡＣＴＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＣＣＧＧＡＡＧＣＡＣＡＴＧＣＧＴＣＴＡＣＴＣＣＡＡＣＧＡＣＴＡＴＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＣＧＧＣＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＡＴＣＣＣＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＣＧＡＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＧＴＡＣＣＴＣＣＡＧＴＣＧＧＡＴＣＧＧＧＡＡＣＣＧＣＴＡＣＧＴＡＴＴＣＡＧＧＣＡＡＣＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＧＧＧＴＣＡＣＴＣＣＴＴＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＡＴＡＴＴＡＣＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＴＣＧＣＴＡＴＴＣＣＴＡＧＣＴＴＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＧＣＡＡＡＧＧＴＴＣＣＣＴＣＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧＡＴＡＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＣＴＣＴＣＡＴＧＧＡＧＣＡＡＡＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＣＡＴＣＣＧＣＡＣＣＧＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＧＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＧＣＣＧＧＡＣＡＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＧＡＣＴＴＧＣＣＧＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＧＣＴＧＣＣＣＴＴＧＣＣＴＣＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＴＡＣＴＣＴＡＴＴＧＣＣＧＡＴＧＧＴＧＧＣＧＴＣＧＣＣＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＡＣＴＡＴＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＴＣＧＴＣＡＡＡＴＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＡＴＴＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴＧＧＴＴＡＴＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＴＧＣＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＴＣＧＧＴＡＣＴＣＣＡＡＡＧＴＧＴＧＣＣＡＡＴＧＣＴＣＡＧＴＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＧＴＣＡＣＡＣＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＴＴＧＣＧＡＴＧＴＡＴＴＴＧＧＡＣＧＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣＡＴＣＧＴＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＴＣＴＴＣＧＣＧＧＡＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧＴＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＴＣＧＴＡＣＡＣＧＣＡＡＧＧＣＡＡＣＧＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＣＣＡＡＴＣＡＣＧＧＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＡＴＣＡＡＧＧＴＣＧＡＴＣＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＣＣＴＡＣＣＧＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＧＴＧＡＴＣＧＧＣＡＣＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＡＴＴＣＧＣＣＣＡＴＣＣＧＣＡＡＡＣＡＣＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＧＴＴＴＧＴＣＴＧＧＧＴＣＡＡＧＣＣＡＧＧＣＧＧＣＧＡＧＴＧＴＧＡＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧＣＧＣＣＡＣＧＡＴＴＴＧＡＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＣＣＴＴＧＣＡＡＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＴＧＧＴＴＣＣＡＡＧＣＣＴＡＣＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡＣＡＡＡＣＧＣＡＡＡＣＣＣＡＴＣＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ。
【０１３４】
配列番号８は、ハイポクレア・ジェコニアＣＢＨ２完全長タンパク質配列である：
ＭＩＶＧＩＬＴＴＬＡＴＬＡＴＬＡＡＳＶＰＬＥＥＲＱＡＣＳＳＶＷＧＱＣＧＧＱＮＷＳＧＰＴＣＣＡＳＧＳＴＣＶＹＳＮＤＹＹＳＱＣＬＰＧＡＡＳＳＳＳＳＴＲＡＡＳＴＴＳＲＶＳＰＴＴＳＲＳＳＳＡＴＰＰＰＧＳＴＴＴＲＶＰＰＶＧＳＧＴＡＴＹＳＧＮＰＦＶＧＶＴＰＷＡＮＡＹＹＡＳＥＶＳＳＬＡＩＰＳＬＴＧＡＭＡＴＡＡＡＡＶＡＫＶＰＳＦＭＷＬＤＴＬＤＫＴＰＬＭＥＱＴＬＡＤＩＲＴＡＮＫＮＧＧＮＹＡＧＱＦＶＶＹＤＬＰＤＲＤＣＡＡＬＡＳＮＧＥＹＳＩＡＤＧＧＶＡＫＹＫＮＹＩＤＴＩＲＱＩＶＶＥＹＳＤＩＲＴＬＬＶＩＥＰＤＳＬＡＮＬＶＴＮＬＧＴＰＫＣＡＮＡＱＳＡＹＬＥＣＩＮＹＡＶＴＱＬＮＬＰＮＶＡＭＹＬＤＡＧＨＡＧＷＬＧＷＰＡＮＱＤＰＡＡＱＬＦＡＮＶＹＫＮＡＳＳＰＲＡＬＲＧＬＡＴＮＶＡＮＹＮＧＷＮＩＴＳＰＰＳＹＴＱＧＮＡＶＹＮＥＫＬＹＩＨＡＩＧＰＬＬＡＮＨＧＷＳＮＡＦＦＩＴＤＱＧＲＳＧＫＱＰＴＧＱＱＱＷＧＤＷＣＮＶＩＧＴＧＦＧＩＲＰＳＡＮＴＧＤＳＬＬＤＳＦＶＷＶＫＰＧＧＥＣＤＧＴＳＤＳＳＡＰＲＦＤＳＨＣＡＬＰＤＡＬＱＰＡＰＱＡＧＡＷＦＱＡＹＦＶＱＬＬＴＮＡＮＰＳＦＬ
配列番号９は、ハイポクレア・ジェコニアＣＢＨ２成熟タンパク質配列である：
ＱＡＣＳＳＶＷＧＱＣＧＧＱＮＷＳＧＰＴＣＣＡＳＧＳＴＣＶＹＳＮＤＹＹＳＱＣＬＰＧＡＡＳＳＳＳＳＴＲＡＡＳＴＴＳＲＶＳＰＴＴＳＲＳＳＳＡＴＰＰＰＧＳＴＴＴＲＶＰＰＶＧＳＧＴＡＴＹＳＧＮＰＦＶＧＶＴＰＷＡＮＡＹＹＡＳＥＶＳＳＬＡＩＰＳＬＴＧＡＭＡＴＡＡＡＡＶＡＫＶＰＳＦＭＷＬＤＴＬＤＫＴＰＬＭＥＱＴＬＡＤＩＲＴＡＮＫＮＧＧＮＹＡＧＱＦＶＶＹＤＬＰＤＲＤＣＡＡＬＡＳＮＧＥＹＳＩＡＤＧＧＶＡＫＹＫＮＹＩＤＴＩＲＱＩＶＶＥＹＳＤＩＲＴＬＬＶＩＥＰＤＳＬＡＮＬＶＴＮＬＧＴＰＫＣＡＮＡＱＳＡＹＬＥＣＩＮＹＡＶＴＱＬＮＬＰＮＶＡＭＹＬＤＡＧＨＡＧＷＬＧＷＰＡＮＱＤＰＡＡＱＬＦＡＮＶＹＫＮＡＳＳＰＲＡＬＲＧＬＡＴＮＶＡＮＹＮＧＷＮＩＴＳＰＰＳＹＴＱＧＮＡＶＹＮＥＫＬＹＩＨＡＩＧＰＬＬＡＮＨＧＷＳＮＡＦＦＩＴＤＱＧＲＳＧＫＱＰＴＧＱＱＱＷＧＤＷＣＮＶＩＧＴＧＦＧＩＲＰＳＡＮＴＧＤＳＬＬＤＳＦＶＷＶＫＰＧＧＥＣＤＧＴＳＤＳＳＡＰＲＦＤＳＨＣＡＬＰＤＡＬＱＰＡＰＱＡＧＡＷＦＱＡＹＦＶＱＬＬＴＮＡＮＰＳＦＬ
合成ＣＢＨ２コンビナトリアルライブラリーは、ＧｅｎｅＯｒａｃｌｅ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により調製した。ＣＢＨ２の多数のアミノ酸残基を複数の他のアミノ酸残基で置換した。表３−１は、ＣＢＨ２コンビナトリアルライブラリーのメンバーの置換を列挙する（ＣＢＨ２成熟アミノ酸配列に従って番号付与した）。
【表３】
2013533737.tif 000005
【０１３５】
ライブラリーは精製ＰＣＲ産物として提供され、ここで、プライマーＧＡＣＣＧＧＡＣＧＴＧＴＴＴＴＧＣＣＣＴＴＣＡＴ（配列番号１０）及びＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＴＴＴＧＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号１１）を使用して、ハイポクレア・ジェコニア宿主株のｐｙｒ２遺伝子座における統合の強化のために、約１．１ｋｂのｃｂｈ１プロモーターの上流で、及び、１．８５ｋｂのａｍｄＳマーカーの下流で、隣接しているｃｂｈ２遺伝子を増幅した。発現カセットをスクリーニング株に相同組み換えする概略を図８に描写する。上記プライマーを用いてｐＴＴＴｐｙｒＧ−ＣＢＨ２から増幅されたＰＣＲ断片（部分ｃｂｈ１プロモーター、ｃｂｈ２遺伝子及び部分ａｍｄＳ遺伝子）のヌクレオチド配列は、以下に配列番号１２として提供される：
ＧＡＣＣＧＧＡＣＧＴＧＴＴＴＴＧＣＣＣＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＧＴＣＡＴＴＧＣＧＡＴＧＴＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧＡＣＣＧＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＴＡＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＴＧＴＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＣＧＣＣＴＣＧＡＡＧＧＴＴＣＡＣＧＧＣＡＡＧＧＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＴＡＧＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＧＣＡＡＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＣＣＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＧＴＡＣＡＴＡＡＧＴＴＡＡＴＧＣＣＴＡＡＡＧＡＡＧＴＣＡＴＡＴＡＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＣＡＡＴＣＡＡＧＴＧＧＣＴＡＡＡＣＧＴＡＣＣＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＡＡＣＧＧＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＡＣＧＴＴＴＧＴＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＡＧＴＣＣＡＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣＴＴＧＴＴＴＧＴＴＣＣＧＧＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＣＴＧＡＣＴＣＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＡＴＡＣＡＡＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＧＣＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＧＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＴＡＣＧＡＣＧＡＡＴＡＣＴＧＴＡＴＡＧＴＣＡＣＴＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＡＴＡＴＴＧＡＡＡＴＧＴＡＡＡＧＴＣＧＧＣＡＣＴＧＡＡＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＡＴＴＧＡＧＴＴＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＡＡＧＡＴＣＴＣＧＧＧＣＣＣＴＣＧＧＧＣＣＴＴＣＧＧＣＣＴＴＴＧＧＧＴＧＴＡＣＡＴＧＴＴＴＧＴＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＧＴＧＴＧＧＴＡＧＧＡＴＣＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＧＧＧＴＡＴＧＴＧＡＴＡＧＧＣＡＡＡＴＧＴＴＣＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＣＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＡＧＣＣＧＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＣＣＴＣＡＴＴＡＡＡＣＧＧＡＡＴＧＡＧＣＴＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＣＧＡＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＧＧＴＴＣＧＡＧＧＴＣＣＧＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＴＧＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴＣＡＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＧＴＣＡＡＣＣＡＴＣＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＴＧＴＣＧＧＣＡＴＴＣＴＣＡＣＣＡＣＧＣＴＧＧＣＴＡＣＧＣＴＧＧＣＣＡＣＡＣＴＣＧＣＡＧＣＴＡＧＴＧＴＧＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＡＧＣＧＴＣＴＧＧＴＡＡＴＴＡＴＧＴＧＡＡＣＣＣＴＣＴＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＡＧＡＴＡＴＧＴＣＡＡＧＧＧＧＣＣＡＡＴＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＧＡＡＴＴＧＧＴＣＧＧＧＴＣＣＧＡＣＴＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＣＣＧＧＡＡＧＣＡＣＡＴＧＣＧＴＣＴＡＣＴＣＣＡＡＣＧＡＣＴＡＴＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＣＧＧＣＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＡＴＣＣＣＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＣＧＡＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＧＴＡＣＣＴＣＣＡＧＴＣＧＧＡＴＣＧＧＧＡＡＣＣＧＣＴＡＣＧＴＡＴＴＣＡＧＧＣＡＡＣＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＧＧＧＴＣＡＣＴＣＣＴＴＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＡＴＡＴＴＡＣＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＴＣＧＣＴＡＴＴＣＣＴＡＧＣＴＴＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＧＣＡＡＡＧＧＴＴＣＣＣＴＣＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＣＴＧＴＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＴＣＴＧＴＴＡＣＴＧＡＡＧＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＣＴＣＴＣＡＴＧＧＡＧＣＡＡＡＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＣＡＴＣＣＧＣＡＣＣＧＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＧＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＧＣＣＧＧＡＣＡＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＧＡＣＴＴＧＣＣＧＧＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＧＣＴＧＣＣＣＴＴＧＣＣＴＣＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＴＡＣＴＣＴＡＴＴＧＣＣＧＡＴＧＧＴＧＧＣＧＴＣＧＣＣＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＡＣＴＡＴＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＴＣＧＴＣＡＡＡＴＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＡＴＴＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴＧＧＴＴＡＴＴＧＧＴＡＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＡＴＣＴＴＧＴＣＧＴＴＧＴＧＣＴＡＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＴＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＴＧＣＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＴＣＧＧＴＡＣＴＣＣＡＡＡＧＴＧＴＧＣＣＡＡＴＧＣＴＣＡＧＴＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＧＴＣＡＣＡＣＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＴＴＧＣＧＡＴＧＴＡＴＴＴＧＧＡＣＧＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣＡＴＣＧＴＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＴＣＴＴＣＧＣＧＧＡＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧＴＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＴＣＧＴＡＣＡＣＧＣＡＡＧＧＣＡＡＣＧＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＣＣＡＡＴＣＡＣＧＧＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＡＴＣＡＡＧＧＴＣＧＡＴＣＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＣＣＴＡＣＣＧＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＧＴＧＡＴＣＧＧＣＡＣＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＡＴＴＣＧＣＣＣＡＴＣＣＧＣＡＡＡＣＡＣＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＧＴＴＴＧＴＣＴＧＧＧＴＣＡＡＧＣＣＡＧＧＣＧＧＣＧＡＧＴＧＴＧＡＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧＣＧＣＣＡＣＧＡＴＴＴＧＡＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＣＣＴＴＧＣＡＡＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＴＧＧＴＴＣＣＡＡＧＣＣＴＡＣＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡＣＡＡＡＣＧＣＡＡＡＣＣＣＡＴＣＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＡＡＧＧＧＴＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＡＣＣＧＧＴＡＧＡＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＧＣＣＣＧＴＡＴＣＡＴＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＡＧＣＴＡＣＡＴＧＧＣＣＣＣＧＧＧＴＧＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＡＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＡＣＣＣＴＴＴＴＣＡＡＡＴＡＴＡＣＧＧＴＣＡＡＣＴＣＡＴＣＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＴＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＴＧＧＴＡＴＴＧＣＧＡＴＧＴＴＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＡＡＴＴＧＴＧＧＣＴＴＴＣＧＡＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＣＧＡＴＴＣＣＴＴＡＧＴＡＧＣＣＡＴＧＣＡＴＴＴＴＡＡＧＡＴＡＡＣＧＧＡＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＴＣＣＣＧＴＴＣＡＴＡＡＣＣＣＧＴＡＧＡＡＴＣＧＣＣＧＣＴＣＴＴＣＧＴＧＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＴＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＡＡＧＴＡＡＣＡＡＣＣＧＴＡＧＡＧＧＣＴＧＡＣＡＣＧＧＣＡＧＧＴＧＴＴＧＣＴＡＧＧＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＡＧＡＣＧＴＣＴＴＣＧＣＧＧＴＴＧＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＡＴＧＴＴＴＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＧＣＧＡＣＧＡＣＡＧＴＣＡＡＧＴＴＣＧＣＣＣＴＣＧＣＴＧＣＴＴＧＴＧＣＡＡＴＡＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＣＧＴＧＡＣＴＣＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＣＡＣＧＴＡＡＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＴＴＡＧＣＡＴＧＧＧＧＣＴＧＡＴＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＣＣＧＴＴＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＧＧＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＣＣＧＴＡＡＡＡＴＴＣＧＧＣＧＡＡＧＣＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＡＡＡＣＣＣＴＡＴＡＡＴＴＡＧＴＣＴＣＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＣＧＣＴＣＣＣＣＣＧＧＧＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧＧＧＣＴＡＡＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＴＴＴＡＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＣＴＡＴＡＡＧＣＴＡＡＣＡＣＡＧＡＡＴＧＣＣＴＣＡＡＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＡＴＡＡＧＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＴＣＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＣＡＧＡＣＧＣＴＧＣＣＴＧＣＧＧＡＡＧＡＣＡＧＣＧＴＴＡＴＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＴＣＡＧＡＧＧＣＣＧＡＡＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣＴＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＡＧＡＧＴＴＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＧＡＡＧＴＴＡＣＧＣＴＡＧＣＡＴＴＣＴＧＴＡＡＡＣＧＧＧＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＡＧＴＡＧＧＧＴＣＣＣＣＴＣＴＡＣＣＴＣＴＣＡＧＧＧＡＧＡＴＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＡＴＣＡＡＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＣＴＧＣＧＣＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＧＣＧＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＡＣＴＣＧＡＴＧＡＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＧＣＡＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＧＴＴＧＧＴＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＧＡＣＣＡＧＣＴＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧＧＴＡＣＡＣＣＧＴＴＧＣＣＣＣＴＡＡＧＴＣＧＴＴＡＧＡＴＧＴＣＣＣＴＴＴＴＴＧＴＣＡＧＣＴＡＡＣＡＴＡＴＧＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＡＡＡＣＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＣＡＡＧＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＴＣＧＧＴＴＣＴＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＡＡＡＧＣＣＧＧＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＡＣＧＴＣＡＡＧＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＴＣＴＧＣＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＧＧＧＣＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＣＣＣＡＣＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＣＧＡＴＣＧＴＴＧＧＧＡＴＴＣＧＴＧＧＴＧＧＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＡＡＣＧＧＡＴＡＴＣＧＧＴＧＧＣＴＣＧＡＴＴＣＧＡＧＴＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＧＧＴＣＴＡＡＧＧＣＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧＧＣＧＧＣＴＧＣＣＧＴＡＴＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＣＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＣＧＧＧＣＣＧＡＴＴＡＣＧＣＡＣＴＣＴＧＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＴＣＣＴＴＣＧＣＣＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＴＡＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＣＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＧＡＧＡＣＣＧＧＣＡＧＴＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＡＴＧＴＴＡＧＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＡＴＣＣＧＴＣＣＴＣＧＧＴＣＡＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＡＧＴＣＣＧＡＧＴＣＧＧＡＣＡＴＴＡＴＴＧＣＣＴＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＧＣＴＣＡＡＴＡＴＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＴＴＣＧＡＣＧＧＣＡＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＴＡＴＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＴＣＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＣＣＡＡＡＧＣＣＧＧＴＣＡＣＡＣＣ。
【０１３６】
実施例１に記載のＡＤ５ハイポクレア・ジェコニア株（Δｅｇｌ１、Δｅｇｌ２、Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｂｇｌ１）のプロトプラストを記載のような線状ＤＮＡライブラリーで形質転換させ（米国特許出願公開第２００６／００９４０８０号）、アセトアミドを含有する選択寒天上で２８℃にて７日にわたって培養した（０．６ｇ／Ｌのアセトアミド、１．６８ｇ／ＬのＣｓＣｌ、２０ｇ／Ｌのグルコース、６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．６ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．６ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌのウリジン、微量元素の塩、１０ｇ／Ｌの低融点アガロース）。２４時間後、この寒天に、１．２ｇ／Ｌのフルオロオロチン酸（ＦＯＡ）を補充した選択寒天を重ねた。合計３８０コロニーを、１．２ｇ／ＬのＦＯＡを含有するジャガイモデキストロース寒天に移し、２８℃にて４〜５日にわたってインキュベートした。胞子を新しいジャガイモデキストロース寒天プレートに移し、これを２８℃にて３日にわたってインキュベートした。
【０１３７】
別の方法としては、実施例１に記載のＭＡＤ６株のプロトプラストは、変異体ライブラリーのメンバーの発現のためにＡＤ５の代わりに採用することができる。同様に、追加のセルラーゼが不活性化されたＭＡＤ６株の誘導体のプロトプラストは、この目的に使用することができる。このような誘導体は、更に低いバックグラウンドセルラーゼ活性を呈する。
【０１３８】
ＣＢＨ２変異体タンパク質産生のために、９６ピンのレプリケーターを用いて胞子を、ＰＶＤＦフィルタープレート内で２％グルコース／ソホロース混合物を補充した２００μＬグリシン最少培地に移した：６．０ｇ／Ｌのグリシン、４．７ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４；５．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４；１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３３．０ｇ／ＬのＰＩＰＰＳ；ｐＨ  ５．５；炭素源として２％グルコース／ソホロース混合物を滅菌添加、１０ｍＬ／Ｌの１００ｇ／ＬのＣａＣｌ２、２．５ｍＬ／Ｌのトリコデルマ・リーゼイ微量元素（４００Ｘ）：１７５ｇ／Ｌの無水クエン酸；２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３。各ＣＢＨ２変異体を４組培養した。プレートを酸素透過性膜で封止した後、これらのプレートを、２００ｒｐｍで振盪しながら、２８℃にて６日にわたってインキュベートした。低圧下で培養培地をマイクロタイタープレートに移すことにより、上清を採取した。
【０１３９】
ＣＢＨ２を目的の特性について試験した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて、個々の変異体の発現を調査した。図１６Ａは、４つのＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真であり、多数の変異体の発現を示しており、図１６Ｂは、これらの変異体についての平均産生レベルを描写し、誤差バーは発現の変動性を示している。洗浄した希酸で予め処理した５０℃でのトウモロコシ茎葉についての比活性（ＰＣＳ  ５０℃）、５０℃でのトウモロコシ穂軸の比活性（ＣＣ  ５０℃）及び５７℃でのトウモロコシ穂軸の比活性（ＣＣ  ５７℃）を測定した。５７℃でのトウモロコシ穂軸において活性の回線を示した合計で１０の変異体を単離した。これらの株のゲノムＤＮＡを単離し、これらのｃｂｈ２遺伝子配列を判定した。トウモロコシ穂軸及びトウモロコシ茎葉についてのコンビナトリアルライブラリーの置換及び比活性性能指数を表３−２に示す。
【０１４０】
比活性についての性能指数は、変異体の標準化タンパク質発現レベルに基づいて判定された。
【表４】
2013533737.tif 000006
【０１４１】
ＰＣＳ  ５０℃トウモロコシ茎葉を記載のように２％（ｗ／ｗ）のＨ２ＳＯ４で前処理し（Ｓｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０５：６９〜８６，２００３）、その後、脱イオン水で複数回洗浄したところ、ｐＨ  ４．５を有するペーストを得た。酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を次に、５０ｍＭ酢酸ナトリウムの最終濃度まで添加し、この混合物を次に１ＮのＮａＯＨを適切に用いてｐＨ  ５．０まで適定した。反応混合物中のセルロース濃度はおよそ７％であった。このセルロース懸濁液を９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  ＰＳ）にウェル当たり６５μＬ添加した。各ウェルに、１０μＬの酵素サンプルを添加し、各々はｑｕａｄ欠失株（Δｅｇｌ１、Δｅｇｌ２、Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２）からの上清中４９μｇのタンパク質を含有した。
【０１４２】
野生型ＣＢＨ２又はＣＢＨ２変異体のいずれかを発現させているハイポクレア・ジェコニアからの培養上清を最大２０μＬ添加した。調節容量のアセテート緩衝液を添加して、合計容量の差を補った。プレートを封止した後、これらを、２００ｒｐｍで振盪しながら、５０℃にてインキュベートした。２日後、プレートを氷上で５分にわたって乗せ、１００μＬの１００ｍＭグリシンｐＨ  １０．０を添加した。混合後、プレートを３０００ｒｐｍにて５分にわたって遠心分離した。１０μＬの容量の上清を１９０μＬの水で希釈した。１０μＬの希釈溶液を、各ウェルの中に１００μＬのＡＢＴＳグルコースアッセイ混合物（２．７４ｍｇ／ｍＬの２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸、１Ｕ／ｍＬのセイヨウワサビペルオキシダーゼＶＩ型、１Ｕ／ｍＬのグルコースオキシダーゼ）を含有する新しい９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  ＰＳ）に移し、Ａ４２０の増加をマイクロタイタープレート光分析装置（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で記録した。各プレート上にある範囲のグルコース濃度を標準として含ませた（０；０．００８；０．０１６；０．０３１；０．０６３；０．１２５；０．２５；０．５；１ｍｇ／ｍＬ）。アッセイを２回行った。Ｔｅｍｋｉｎ等温式（ｙ＝ａ＋ｂ（ｌｎ（１＋ｃ＊ｘ）））にデータを入れることにより野生型ＣＢＨ２についての用量反応曲線を作成し、ＣＢＨ２変異体の活性を同じプレートの野生型ＣＢＨ２の計算した活性で除算して、性能指数を得た。
【０１４３】
トウモロコシ穂軸５０℃トウモロコシ穂軸を粉砕して、０．９ｍｍスクリーンを通過させ、その後、国際公開第２００６／１１０９０１号の実施例４に記載の方法に従って前処理した。前処理したトウモロコシ穂軸は、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ  ５．０中７％セルロース懸濁液として使用した。この懸濁液を９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  ＰＳ）にウェル当たり７０μＬ添加した。各ウェルに、ｑｕａｄ欠失株（Δｅｇｌ１、Δｅｇｌ２、Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２）からの上清の４６．５５μｇのタンパク質を含有する１０μＬ溶液を添加し、４．９０μｇのトリコデルマ・リーゼイＣＢＨ１、６．８４μｇのトリコデルマ・リーゼイＸｙｎ２  Ｙ５（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  ８：３９３〜４００，２００４）、２．２８μｇのフザリウム・バーティシリオイデス（Ｆｖ）５１Ａ、５．３２μｇのＦｖ３Ａ、０．７６μｇのＦｖ４３Ｄ、及び２．４５μｇのトリコデルマ・リーゼイＢＧＬ１を補充した。フザリウム・バーティシリオイデス酵素は、国際公開第２０１１／０３８０１９号に記載されている。
【０１４４】
野生型ＣＢＨ２又はＣＢＨ２変異体のいずれかを発現させるハイポクレア・ジェコニア株からの上清最大２０μＬを各ウェルに添加した。調節容量のアセテート緩衝液を添加して、合計容量の差を補った。このプレートを、２００ｒｐｍで振盪しながら、５０℃にてインキュベートした。２日後、プレートを氷上で５分にわたって乗せ、１００μＬの１００ｍＭグリシンｐＨ  １０．０を添加した。混合後、プレートを３０００ｒｐｍにて５分にわたって遠心分離した。１０μＬの容量の上清を１９０μＬの水で希釈した。この希釈溶液１０μＬを、１００μＬのＡＢＴＳグルコースアッセイ混合物を含有している新しい９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  ＰＳ）に移し、上記のようにアッセイ及び分析した。
【０１４５】
トウモロコシ穂軸５７℃トウモロコシ穂軸を粉砕して、０．９ｍｍスクリーンを通過させ、その後、国際公開第２００６／１１０９０１号の実施例４に記載の方法に従って前処理した。前処理したトウモロコシ穂軸は、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ  ５．０中７％セルロース懸濁液として使用した。この懸濁液を９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  ＰＳ）にウェル当たり７０μＬ添加した。各ウェルに、ｑｕａｄ欠失株（Δｅｇｌ１、Δｅｇｌ２、Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２）からの上清の４６．５５μｇのタンパク質を含有する１０μＬ溶液を添加し、４．９０μｇのＣＢＨ１変異体（Ｓ８Ｐ／Ｔ４１Ｉ／Ｎ８９Ｄ／Ｓ９２Ｔ／Ｓ１１３Ｎ／Ｓ１９６Ｔ／Ｐ２２７Ｌ／Ｄ２４９Ｋ／Ｔ２５５Ｐ／Ｓ２７８Ｐ／Ｅ２９５Ｋ／Ｔ２９６Ｐ／Ｔ３３２Ｙ／Ｖ４０３Ｄ／Ｓ４１１Ｆ／Ｔ４６２Ｉ）、６．８４μｇのトリコデルマ・リーゼイＸｙｎ２  Ｙ５（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  ８：３９３〜４００，２００４），２．２８μｇのＦｖ５１Ａ、５．３２μｇのＦｖ３Ａ、０．７６μｇのＦｖ４３Ｄ、２．４５μｇのＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ  β−グルコシダーゼを添加した。野生型ＣＢＨ２又はＣＢＨ２変異体のいずれかを発現させるハイポクレア・ジェコニア株からの上清最大２０μＬを添加した。調節容量のアセテート緩衝液を添加して、合計容量の差を補った。このプレートを、２００ｒｐｍで振盪しながら、５７℃にてインキュベートした。２日後、プレートを氷上で５分にわたって乗せ、１００μＬの１００ｍＭグリシンｐＨ  １０．０を添加した。混合後、プレートを３０００ｒｐｍにて５分にわたって遠心分離した。１０μＬの容量の上清を１９０μＬの水で希釈した。この希釈溶液１０μＬを、１００μＬのＡＢＴＳグルコースアッセイ混合物を含有している新しい９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  ＰＳ）に移し、上記のようにアッセイ及び分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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