(57)【要約】  本発明の実施形態は、核酸を有効成分として送達するためのデバイスおよび方法を含む。本発明の実施形態は、核酸を有効成分として送達するためのデバイスおよび方法を含む。一実施形態では、有効成分を送達するための物品が含まれる。本物品は、核酸、トランスフェクション剤、および糖類保護剤を含む脱水複合体を含むことができる。核酸とトランスフェクション剤はリポソームまたはリポプレックスを形成することができる。脱水複合体はポリマーマトリックス内に配置することができる。脱水複合体は微粒子内に配置することができる。他の実施形態も本明細書に含まれる。
2013530235.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸とトランスフェクション剤、および
糖類保護剤、
を含む脱水複合体、
を含む有効成分を送達するための物品。
【請求項２】
前記脱水複合体が凍結乾燥した粒子状物質を含む、請求項１または３〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項３】
前記脱水複合体が噴霧乾燥した粒子状物質を含む、請求項１〜２または４〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項４】
前記トランスフェクション剤が脂質トランスフェクション剤を含む、請求項１〜３または５〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項５】
前記脂質トランスフェクション剤がカチオン性脂質を含む、請求項１〜４または６〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項６】
前記トランスフェクション剤が脂質様物質を含む、請求項１〜５または７〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項７】
前記脱水複合体がＳＮＡＬＰ（安定な核酸−脂質粒子）を含む、請求項１〜６または８〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項８】
前記脱水複合体中の前記核酸およびカチオン性脂質に対する糖類保護剤のｗ／ｗ比が１に対して５未満である、請求項１〜７または９〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項９】
前記核酸がｓｉＲＮＡを含む、請求項１〜８または１０〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１０】
前記糖類保護剤が直鎖多糖類を含む、請求項１〜９または１１〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１１】
前記糖類保護剤が分岐多糖類を含む、請求項１〜１０または１２〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１２】
前記糖類保護剤がグリコーゲンを含む、請求項１〜１１または１３〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１３】
前記糖類保護剤がマルトデキストリンを含む、請求項１〜１２または１４〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１４】
前記糖類保護剤が疎水性基で誘導体化されている、請求項１〜１３または１５〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１５】
前記糖類保護剤が、疎水性基で誘導体化されたマルトデキストリンを含み、０．３未満の置換度を有し、前記誘導体化されたマルトデキストリンが水溶性である、請求項１〜１４または１６〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１６】
前記核酸とトランスフェクション剤がリポソームを構成する、請求項１〜１５または１７〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１７】
前記核酸とトランスフェクション剤がリポプレックスを構成する、請求項１〜１６または１８〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１８】
第１のポリマーマトリックスをさらに含み、前記脱水複合体が前記第１のポリマーマトリックス内に分散されている、請求項１〜１７または１９〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１９】
前記第１のポリマーマトリックスが分解性のポリマーを含む、請求項１〜１８または２０〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２０】
前記第１のポリマーマトリックスが、スプレーコーティングまたはディップコーティングにより形成された層を含む、請求項１〜１９または２１〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２１】
前記第１のポリマーマトリックスが、ラクチド、グリコリド、カプロラクトン、ポリエチレングリコール、またはこれらの誘導体からなる群から選択される１つ以上のサブユニットを含むポリマーを含む、請求項１〜２０または２２〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２２】
前記第１のポリマーマトリックスがターポリマーを含む、請求項１〜２１または２３〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２３】
前記第１のポリマーマトリックスが粘性流体を含む、請求項１〜２２または２４〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２４】
前記第１のポリマーマトリックスと前記脱水複合体が微粒子を形成する、請求項１〜２３または２５〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２５】
前記微粒子の直径が約１μｍ〜約１５０μｍである、請求項１〜２４または請求項２６〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２６】
前記微粒子の直径が約２０μｍ〜約８０μｍである、請求項１〜２５または請求項２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２７】
第２のポリマーマトリックスをさらに含み、前記微粒子が前記第２のポリマーマトリックス内に配置され、前記第２のポリマーマトリックスが前記第１のポリマーマトリックスとは異なるポリマーを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２８】
放出制御製剤中に組み込まれる核酸とトランスフェクション剤との複合体のトランスフェクション活性を維持する方法であって、
核酸、トランスフェクション剤、および糖類保護剤を水溶液中で合わせて、有効成分組成物を形成する工程と、
前記有効成分組成物から水を除去して脱水複合体を形成する工程と
を含む方法。
【請求項２９】
水を除去する工程が、前記有効成分組成物を凍結乾燥する工程を含む、請求項２８または３０〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
水を除去する工程が、前記有効成分組成物を噴霧乾燥する工程を含む、請求項２８〜２９または３１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記脱水複合体を有機溶媒に再懸濁させる工程をさらに含む、請求項２８〜３０または３２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記トランスフェクション剤が脂質トランスフェクション剤を含む、請求項２８〜３１または３３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記脂質トランスフェクション剤がカチオン性脂質を含む、請求項２８〜３２または３４〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記トランスフェクション剤が脂質様物質を含む、請求項２８〜３３または３５〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸とトランスフェクション剤が一緒にＳＮＡＬＰ（安定な核酸−脂質粒子）を構成する、請求項２８〜３４または３６〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記有効成分組成物中の前記核酸およびカチオン性脂質に対する糖類のｗ／ｗ比が１に対して５未満である、請求項２８〜３５または３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記核酸がｓｉＲＮＡを含む、請求項２８〜３６または３８〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記糖類保護剤が直鎖多糖類を含む、請求項２８〜３７または３９〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記糖類保護剤が分岐多糖類を含む、請求項２８〜３８または４０〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記糖類保護剤がグリコーゲンを含む、請求項２８〜３９または４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記糖類保護剤がマルトデキストリンを含む、請求項２８〜４０または請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記糖類保護剤が疎水性基で誘導体化されている、請求項２８〜４１または４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記糖類保護剤が、疎水性基で誘導体化されたマルトデキストリンを含み、０．３未満の置換度を有し、前記誘導体化されたマルトデキストリンが水に可溶である、請求項２８〜４２または４４〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記核酸とトランスフェクション剤がリポソームを構成する、請求項２８〜４３または４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸とトランスフェクション剤がリポプレックスを構成する、請求項２８〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
放出制御製剤の製造方法であって、
核酸、トランスフェクション剤、および糖類を水性媒体中で合わせて、有効成分組成物を形成する工程と、
前記有効成分組成物を処理して前記水性溶媒を除去して脱水複合体を形成する工程と、
前記脱水複合体をポリマー組成物と合わせる工程と
を含む方法。
【請求項４７】
前記脱水複合体を前記ポリマー組成物と合わせる前に、前記脱水複合体を有機溶媒に再懸濁させる工程をさらに含む、請求項４６または４８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリマー組成物が有機溶媒を含む、請求項４６〜４７または４９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記脱水複合体とポリマー組成物を処理して微粒子を形成する工程をさらに含む、請求項４６〜４８または５０〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリマー組成物が、ラクチド、グリコリド、ポリエチレングリコール、およびカプロラクトン、またはこれらの誘導体からなる群から選択される１つ以上のサブユニットを含むポリマーを含む、請求項４６〜４９または５１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記有効成分組成物を処理して前記水性溶媒を除去する工程が、前記有効成分組成物を凍結乾燥する工程を含む、請求項４６〜５０または５２〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記有効成分組成物を処理して前記溶媒を除去する工程が、前記有効成分組成物を噴霧乾燥する工程を含む、請求項４６〜５１または請求項５３〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記トランスフェクション剤が脂質トランスフェクション剤を含む、請求項４６〜５２または５４〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記脂質トランスフェクション剤がカチオン性脂質を含む、請求項４６〜５３または５５〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記トランスフェクション剤が脂質様物質を含む、請求項４６〜５４または５６〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記核酸とトランスフェクション剤が一緒にＳＮＡＬＰ（安定な核酸−脂質粒子）を構成する、請求項４６〜５５または５７〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記有効成分組成物中の前記核酸およびカチオン性脂質に対する糖類のｗ／ｗ比が１に対して５未満である、請求項４６〜５６または５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記核酸がｓｉＲＮＡを含む、請求項４６〜５７または５９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記糖類保護剤がグリコーゲンを含む、請求項４６〜５８または６０〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記核酸とトランスフェクション剤がリポソームを構成する、請求項４６〜５９または６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記核酸とトランスフェクション剤がリポプレックスを構成する、請求項４６〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国以外の全ての国を指定国とする出願人である、米国国内企業のＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．、ならびに、米国のみを指定国とする出願人である米国市民のＪｏｓｅｐｈ  Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＭｃＧｏｎｉｇｌｅ、および米国市民のＪｏｒａｍ  Ｓｌａｇｅｒの名義で、２０１１年６月２９日にＰＣＴ国際特許出願として出願されており、２０１０年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／３５９，８１４号明細書の優先権を主張し、それらの内容は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、有効成分（または活性薬剤ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ）を送達するためのデバイスおよび方法に関する。より詳細には、本発明は、核酸を有効成分として送達するためのデバイスおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
様々な医学的症状の有望な治療法の１つに、核酸を治療薬として投与する方法がある。しかし、核酸による治療の成功は、部位特異的送達、送達段階における安定性、および標的細胞内での実質的な生物学的活性の程度を含む様々な側面に依存する可能性がある。様々な理由から、これらの工程は達成が困難となり得る。
【０００４】
核酸をベースにする有効成分の投与方法の１つに、インプラントを送達プラットフォームとして使用する方法がある。この目的でインプラントを使用すると、核酸を部位特異的に送達することができる。しかし、このようなインプラントの使用には、製造上の課題、貯蔵安定性、望ましい溶出特性、および十分な有効成分の添加量などを含む、多くの実際的課題が伴う。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の実施形態は、核酸を有効成分として送達するためのデバイスおよび方法を含む。一実施形態では、有効成分を送達するための物品が含まれる。この物品は、核酸、トランスフェクション剤（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）および糖類保護剤を含む脱水複合体を含むことができる。核酸とトランスフェクション剤は、リポソームまたはリポプレックスを形成することができる。脱水複合体はポリマーマトリックス内に配置することができる。脱水複合体は微粒子内に配置することができる。
【０００６】
一実施形態では、放出制御製剤中に組み込まれる核酸とトランスフェクション剤の活性を維持する方法が含まれる。本方法は、核酸、トランスフェクション剤、および糖類保護剤を水溶液中で合わせて、有効成分組成物を形成する工程を含むことができる。本方法はまた、有効成分組成物から水を除去して脱水複合体を形成する工程を含むこともできる。本方法は、有機溶媒を含む溶液中に脱水複合体を再懸濁させる工程をさらに含むことができる。本方法は、脱水複合体とポリマー組成物から微粒子を形成する工程をさらに含むことができる。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、放出制御製剤の製造方法を含む。本方法は、核酸、トランスフェクション剤、および糖類を水性溶媒中で合わせて、有効成分組成物を形成する工程を含むことができる。本方法は、有効成分組成物を処理して水性溶媒を除去し、脱水複合体を形成する工程をさらに含むことができる。本方法は、脱水複合体をポリマー組成物と合わせる工程をさらに含むことができる。幾つかの実施形態では、ポリマー組成物は、１種類以上の有機溶媒をさらに含むことができる。本方法は、脱水複合体とポリマー組成物から微粒子を形成する工程をさらに含むことができる。
【０００８】
この概要は、本願の教示の幾つかの概観であり、本対象の排他的または網羅的治療（または処理）であることを意味するものではない。さらなる詳細については、発明を実施するための形態および添付の特許請求の範囲に記載する。以下の発明を実施するための形態を読解し、図面を見ると当業者には他の態様が明らかになるが、それらはいずれも限定的な意味に解釈されるべきではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびそれらの法定均等物により定義される。
【０００９】
以下の図面と関連して本発明をより完全に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本明細書の様々な実施形態による脱水複合体の概略図である。
【図２】本明細書の様々な実施形態による脱水複合体を含む微粒子の概略図である。
【図３】本明細書の様々な実施形態によるデバイスの概略図である。
【図４】本明細書の様々な実施形態によるデバイスの概略図である。
【図５】本明細書の様々な実施形態によるデバイスの概略図である。
【図６】本明細書の様々な実施形態によるデバイスの概略図である。
【図７】本明細書の様々な実施形態によるデバイスの概略図である。
【図８】本明細書の様々な実施形態によるデバイスの概略図である。
【図９】図８の医療用デバイスの線９−９’に沿った断面図である。
【図１０】ＮＴＥＲ／ｓｉＲＮＡ複合体に関する遺伝子ノックダウンデータのグラフである。
【図１１】ＤＯＴＡＰ／ｓｉＲＮＡリポソームに関する遺伝子ノックダウンデータのグラフである。
【図１２Ａ−Ｂ】リポソームとリポプレックスの両方の形態のｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体に関する遺伝子ノックダウンデータのグラフである。
【図１３】様々な糖類保護剤を有するＤＯＴＡＰ／ｓｉＲＮＡリポプレックスに関する遺伝子ノックダウンデータのグラフである。
【図１４】ＤＯＴＡＰ／ｓｉＲＮＡリポプレックスに関する遺伝子ノックダウンデータのグラフである。
【図１５】様々なポリマーを含む微粒子からのｓｉＲＮＡ放出のグラフである。
【図１６】様々なポリマーを含む微粒子からのＤＯＴＡＰ放出のグラフである。
【図１７】放出中のｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰの比を示すグラフである。
【図１８】ＤＯＴＡＰ／ｓｉＲＮＡリポプレックスに関する遺伝子ノックダウンデータのグラフである。
【図１９】ターポリマーからのｓｉＲＮＡの制御放出のグラフである。
【図２０】オルガノゲルからのｓｉＲＮＡの制御放出のグラフである。
【図２１】様々なターポリマーから放出されるＤＯＴＡＰ／ｓｉＲＮＡに関する遺伝子ノックダウンデータのグラフである。
【図２２】様々なオルガノゲルから放出されるＤＯＴＡＰ／ｓｉＲＮＡに関する遺伝子ノックダウンデータのグラフである。
【図２３】糖類保護剤としてグリコーゲンまたはデキストロースを含む、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ／ｓｉＲＮＡに関する遺伝子ノックダウンデータのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、様々な変更および代替の形態が可能であるが、その特定のものを例および図面として示しており、それらについて詳細に説明する。しかし、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されるものではないことを理解されたい。反対に、本発明は、本発明の精神および範囲に入る変更形態、均等物、および代替形態を包含するものとする。
【００１２】
核酸を有効成分として送達するためのデバイスおよび／またはコーティングの設計および製造には様々な課題が生じる。大きな課題の１つは、核酸の十分な治療効果を維持しながら、有効成分を運び、放出する組成物を配合することに関する。特に、一般にデバイスの製造に関連する様々な処理工程（溶媒への曝露、様々な温度への曝露、溶媒除去、不適合成分への曝露など）により、複合体化される核酸とトランスフェクション剤の不活性化または活性低下が起こる場合がある。
【００１３】
本発明の実施形態は、脱水複合体を含むデバイス、物品および／またはコーティングを含むことができ、脱水複合体の１つ以上の成分は、核酸有効成分とトランスフェクション剤との複合体の活性を維持する機能を果たす。一例として、脱水複合体は、核酸とトランスフェクション剤を含む複合体、および糖類保護剤を含むことができる。本明細書に示すように、このような製剤を使用して、処理工程中に核酸とトランスフェクション剤との複合体の活性を維持するおよび／または向上させることができる。
【００１４】
例として、幾つかの実施形態では、核酸とトランスフェクション剤との複合体は、水性溶媒中で形成することができる。場合によっては、凍結乾燥または真空乾燥などにより複合体から水を除去する（脱水する）ことが望ましいことがある。しかし、複合体の脱水プロセスの結果、核酸とトランスフェクション剤との複合体の活性が減弱する可能性がある。下記に示すように、本明細書に記載の実施形態を使用し、脱水工程に関連して核酸とトランスフェクション剤との複合体の活性を維持するおよび／または向上させることができる。
【００１５】
別の例として、脱水複合体を処理の一部として有機溶媒に再懸濁させてもよい。しかし、有機溶媒に再懸濁させると、核酸とトランスフェクション剤との複合体の活性が減弱する場合がある。下記に示すように、本明細書に記載の実施形態による製剤を使用し、非水性溶媒への再懸濁に関連して核酸とトランスフェクション剤との複合体の活性を維持するおよび／または向上させることができる。
【００１６】
核酸を有効成分として送達することに関する別の課題には、有効成分の添加量の制限が含まれる。例えば、デポー剤（ｄｅｐｏｔｓ）、微粒子、オルガノゲル、他の注射剤、およびコーティングされたデバイスを含む、特定の種類の薬物送達デバイスには、それに含むことができる成分の量に実際的な制限がある場合があることが分かるであろう。例えば、多くの心血管ステントは血管内に留置されるように設計されているため、デバイスのサイズに実際的な制限があり、従って、それに提供することができる材料の量に実際的な制限がある。本明細書の幾つかの実施形態は、核酸とトランスフェクション剤に対する糖類保護剤の量が比較的少ないが、依然として望ましい活性維持特性を示すことを特徴とする。例として、一実施形態では、脱水複合体中の核酸およびトランスフェクション剤に対する糖類保護剤のｗｔ．／ｗｔ．比は１に対して５以下である。このような比にすると、得られる製品中の核酸の添加量を比較的高くすることができる。
【００１７】
脱水複合体
本明細書の実施形態に使用される脱水複合体は、核酸とトランスフェクション剤を含むことができる。トランスフェクション剤は、核酸の細胞内送達を促進するように構成することができる。本明細書の実施形態に使用される脱水複合体は、糖類保護剤を含むこともできる。糖類保護剤の例については、以下により詳細に説明する。ここで図１を参照すると、本明細書の実施形態による複数の脱水複合体１０２が示されている。脱水複合体１０２は、核酸、トランスフェクション剤、および糖類保護剤を含むことができる。脱水複合体１０２は、以下により詳細に説明する様々な方法により形成することができる。
【００１８】
糖類保護剤としては、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類、および多糖類を挙げることができる。多糖類は、直鎖多糖類とも分岐多糖類ともし得る。例示的な糖類保護剤としては、デキストロース、ショ糖、麦芽糖、マンノースおよびトレハロース等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。例示的な糖類保護剤としては、さらに、ペントース、および／またはヘキソースサブユニットを含む多糖類、特に、グリコーゲンおよびアミロペクチンなどのグルカン、ならびにマルトデキストリンを含むデキストリンを含む多糖類、フルクトース、マンノース、およびガラクトース等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。多糖類としては、プルラン、アラビノース、ガラクタンなどのガム類も挙げることができる。
【００１９】
糖類保護剤としては、多糖類の誘導体も挙げることができる。多糖類は、結合点の役割を果たすことができるまたは他に糖類の特性を変化させるために化学修飾することができる様々な官能基を含むことが分かるであろう。ほんの一例として、糖類主鎖は、一般に、糖類を誘導体化するのに使用できるヒドロキシル基をかなりの数含むことが分かるであろう。例として、糖類を疎水性ペンダント基で誘導体化することができる。疎水性基による誘導体化に関するさらなる詳細については後述する。しかし、疎水性ペンダント基を有する多糖類を糖類保護剤として使用する幾つかの実施形態では、置換度は０．３未満である。
【００２０】
糖類保護剤としては、糖類および／または糖類のサブユニットおよび／またはブロックを含むコポリマーおよび／またはターポリマー等も挙げることができる。
【００２１】
本明細書の実施形態に使用される多糖類は、様々な分子量を有し得る。例として、本明細書の実施形態に使用されるグリコーゲンの分子量は、約２５０，０００より大きくすることができる。幾つかの実施形態では、本明細書の実施形態に使用されるグリコーゲンの分子量は、約１００，０００〜１０，０００，０００ダルトンとすることができる。
【００２２】
多糖類の分子量の改良は、ダイアフィルトレーション（または透析濾過）を使用して行うことができる。マルトデキストリンなどの多糖類のダイアフィルトレーションは、異なる孔径を有する限外濾過膜を使用して行うことができる。一例として、約１Ｋ〜約５００Ｋの範囲の分画分子量の膜を有する１つ以上のカセットの使用をダイアフィルトレーションプロセスに使用して、５００ｋＤａ未満の範囲、約１００ｋＤａ〜約５００ｋＤａの範囲、約５ｋＤａ〜約３０ｋＤａの範囲、約３０ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲、約１０ｋＤａ〜約３０ｋＤａの範囲、または約１ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲の平均分子量を有する多糖類製剤を提供することができる。
【００２３】
様々な分子量のマルトデキストリンおよびアミロースなどの多糖類が多くの異なる供給元から市販されていることが分かるであろう。例えば、Ｇｌｕｃｉｄｅｘ（商標）６（平均分子量約９５，０００Ｄａ）およびＧｌｕｃｉｄｅｘ（商標）２（平均分子量約３００，０００Ｄａ）がＲｏｑｕｅｔｔｅ（仏国）から市販されており；約１２，０００Ｄａ〜１５，０００Ｄａの分子量を含む様々な分子量のＭＡＬＴＲＩＮ（商標）マルトデキストリンがＧＰＣ（Ｍｕｓｃａｔｉｎｅ，Ｉｏｗａ）から入手可能である。
【００２４】
本発明の実施形態に使用される核酸としては、治療効果を発揮するように機能することができる様々な種類の核酸を挙げることができる。例示的な核酸の種類としては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸、アプタマー、リボザイム、ロックド核酸および触媒ＤＮＡを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
本発明の実施形態に使用される例示的なトランスフェクション剤としては、製造および送達プロセス中に核酸とトランスフェクション剤との複合体の活性を維持するために核酸と複合体化することができる化合物を挙げることができる。例示的なトランスフェクション剤としては、核酸の細胞内送達を促進することができるものを挙げることもできる。このようなものとして、トランスフェクション剤は、対象に投与される核酸の治療のための使用を向上させることができる。
【００２６】
好適なトランスフェクション剤の例示的な種類としては、カチオン性化合物（正味の正電荷を有する化合物）と電荷中性化合物の両方を挙げることができる。例として、好適なトランスフェクション剤としてはカチオン性および非カチオン性ポリマー、ならびにカチオン性および非カチオン性脂質を挙げることができる。例示的なカチオン性脂質としては、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロール）；１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＥＰＣ）；１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）；１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）およびこれらの誘導体を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。例示的なヘルパー脂質または膜融合性脂質としては、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；コレステロール；１，２−ジオクタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。他の例示的な脂質としては、脂質様物質（ｌｉｐｉｄｏｉｄｓ）、ａｔｕｐｌｅｘ製剤、および前述の脂質のペグ化された形態を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。場合によっては、脂質の混合物を使用して複合体を形成することができる。
【００２７】
好適なトランスフェクション剤としては、シクロデキストリンを含有するポリカチオン、ヒストン、カチオン化ヒト血清アルブミン、アミノ多糖類（キトサンなど）、ペプチド（ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）など）、およびポリアミン（ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリプロピレンイミン、ポリアミドアミンデンドリマー、およびポリ（β−アミノエステル）など）を挙げることもできる。
【００２８】
トランスフェクション剤としては、ペプチド−核酸送達構成体を形成するために、核酸結合ドメインおよび核局在化ドメインを含むものなどのペプチドを挙げることもできる。本明細書で使用する場合、「ペプチド」という用語は、１つのアミノ酸（残基）のカルボキシル基と次のアミノ酸（残基）のアミノ基から形成されるアミド結合により結合した２つ以上のアミノ酸残基を含有する任意の化合物を含むものとする。このようなものとして、ペプチドには、オリゴペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質等を含むことができる。本明細書では多くの異なるペプチドが考えられることが分かるであろう。ＭＰＧとして知られる例示的なペプチドの１つは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１タンパク質由来の疎水性ドメインと、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化配列（ＮＬＳ）からの塩基性ドメインの２部から構成される２７個のアミノ酸からなる両親媒性ペプチド（Ｎ−ＴＥＲ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｉＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍとしてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されている）である。ＭＰＧΔＮＬＳとして知られる別の例示的なペプチドもまた、２７個のアミノ酸からなる２部構成の（または２つの部分からなる）両親媒性ペプチドである。他の例示的なペプチドとしては、ポリ−アルギニン融合ペプチドを挙げることができる。さらに他の例示的なペプチドとしては、タンパク質導入ドメインと二本鎖ＲＮＡ結合ドメインが結合したものが挙げられる。
【００２９】
他のトランスフェクション剤としては、固体核酸脂質ナノ粒子（ＳＮＡＬＰ）、リポソーム、タンパク質導入ドメイン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、およびペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質を含む）等を挙げることができる。さらに、トランスフェクション剤は、それらが特定の種類の細胞を標的にすることを可能にする分子にコンジュゲートされてもよい。標的剤の例としては、特定の細胞表面分子を認識し、それに結合する抗体およびペプチドが挙げられる。
【００３０】
脱水複合体は、トランスフェクション剤と核酸から様々なプロセスにより形成することができる。場合によっては、例えば、カチオン性トランスフェクション剤はアニオン性核酸分子と相互作用し、縮合して緻密な規則正しい複合体になる。このようなものとして、幾つかの実施形態では、核酸は単に、核酸とトランスフェクション剤との間の複合体を形成するために、トランスフェクション剤と接触することができる。
【００３１】
脂質、脂質様物質、または他の両親媒性分子を含むトランスフェクション剤と複合体化した核酸は、少なくとも２つの構造的に異なる形態、即ち、リポプレックスまたはリポソームの形態で存在することができる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「リポプレックス」という用語は、ミセル（疎水性部分が内側を向き、極性基が外側を向いて配向した両親媒性分子の凝集体）からなる人工ベシクルまたは脂質二重層を指すものとし、ｓｉＲＮＡが外側を被覆し、ミセルまたは脂質二重層を構成する分子の極性基と接している。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「リポソーム」という用語は、リポソーム内に核酸有効成分の一部を封入する脂質の連続二重層または多重二分子層（ｍｕｌｔｉｂｉｌａｙｅｒ）からなる人工ベシクルを指すものとする。
【００３４】
リポプレックスとリポソームは同じ成分を含み得ること多いが、それらの構造が大きく異なるのは、使用する調製方法に起因する可能性がある。リポソームの形成方法としては、受動的封入、エタノール液滴封入、エタノール不安定化リポソームへの核酸の封入、逆相蒸発封入、およびエタノールで希釈して安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）を形成することによる自発的ベシクル形成（ＭａｃＬａｃｈｌａｎ  Ｉ．Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｉｎ：Ｃｒｏｏｋｅ  ＳＴ，ｅｄｉｔｏｒ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（ＦＬ）：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；２００８．ｐ．２３７−７０に記載の方法）を挙げることができる。
【００３５】
対照的に、リポプレックスを形成するためには、通常、まずリポソームまたはミセルを形成した後、ｓｉＲＮＡなどの核酸をリポソームまたはミセルの外面に複合体化させる。例えば、ｓｉＲＮＡと反応する前に、ＤＯＴＡＰ（トランスフェクション剤の非限定例の１つに過ぎない）をまず脱イオン蒸留水中にミセルとして配合することができる。一方法では、ＤＯＴＡＰ溶液のエタノールをまずロータリーエバポレータ（ｒｏｔｏｖａｐ）で蒸発させ、ＤＯＴＡＰの皮膜を形成する。次いで、音波処理を使用して、ＤＯＴＡＰを脱イオン蒸留水に溶解し、ナノサイズのミセルを形成する。次いで、ｓｉＲＮＡとの後反応（ｓｉＲＮＡでミセルの外側を被覆する）により、リポプレックスを形成することができる。しかし、リポプレックスおよびリポソームを形成する他の方法も使用できることが分かるであろう。
【００３６】
幾つかの実施形態では、糖類保護剤の量は、核酸およびトランスフェクション剤の量と比較して、比較的少ない。例として、幾つかの実施形態では、核酸およびトランスフェクション剤に対する糖類保護剤のｗｔ．／ｗｔ．比は１に対して２５以下である。幾つかの実施形態では、核酸およびトランスフェクション剤に対する糖類保護剤のｗｔ．／ｗｔ．比は１に対して１５以下である。幾つかの実施形態では、核酸およびトランスフェクション剤に対する糖類保護剤のｗｔ．／ｗｔ．比は１に対して１０以下である。幾つかの実施形態では、核酸およびトランスフェクション剤に対する糖類保護剤のｗｔ．／ｗｔ．比は１に対して５以下である。
【００３７】
本明細書の実施形態による微粒子の形成は、接触工程、合わせる工程、混合工程、分散工程、音波処理工程、形成工程、抽出工程、溶媒除去工程、および乾燥工程等の１つ以上を含む、様々な工程を含むことができることが分かるであろう。幾つかの実施形態では、合わせられた試薬溶液を形成するために、核酸溶液をトランスフェクション剤溶液と接触させることができる。幾つかの実施形態では、核酸溶液と接触させる前に、まず、ミセルを形成するようにトランスフェクション剤溶液を処置することができる。幾つかの実施形態では、糖類保護剤を核酸溶液に、トランスフェクション剤溶液に、または合わせた後、合わせられた試薬溶液に添加することができる。幾つかの実施形態では、ポリマーおよび／または医薬品添加物などの他の成分を核酸溶液に、トランスフェクション剤溶液に、または合わせた後、合わせられた試薬溶液に添加することもできる。核酸とトランスフェクション剤を複合体化した後、それらを含む溶液を複合体溶液と称することができる。
【００３８】
幾つかの実施形態では、脱水複合体を形成するために複合体溶液から水を除去することができる。水の除去は様々な方法で達成できることが分かるであろう。可能な溶媒除去方法は、濾過工程、遠心分離工程、減圧濃縮工程、蒸発工程、凍結乾燥工程、および噴霧乾燥工程等を含むことができる。幾つかの実施形態では、複合体溶液を凍結乾燥することができる。凍結乾燥法は、温度を低下させる工程と内容物を減圧下に置く工程を含むことができる。水を除去した結果、脱水複合体を形成することができる。本明細書の様々な実施形態により、脱水および関連する処理が活性に及ぼし得る悪影響から核酸とトランスフェクション剤との複合体の活性を保護することができる。
【００３９】
幾つかの実施形態では、コーティング、およびインプラントなどのデバイス等を製造するために、脱水複合体にさらに他の工程を施すことができる。例として、幾つかの実施形態では、脱水複合体を、１種類以上のポリマーを含む溶液と合わせることができる。幾つかの実施形態では、１種類以上のポリマーを含む溶液は、有機溶媒を含むこともできる。場合によっては、ポリマー溶液と合わせる前に、脱水複合体を有機溶媒中に再懸濁させることができる。幾つかの実施形態では、脱水複合体をポリマー溶液に直接再懸濁させることができる。本明細書の様々な実施形態により、有機溶媒への再懸濁が活性に及ぼし得る悪影響から、核酸とトランスフェクション剤との複合体の活性を保護することができる。
【００４０】
幾つかの実施形態では、脱水複合体を、１種類以上のポリマーを含む溶液と合わせて、脱水複合体を含有する粒子（または微粒子）を形成するように処理することができる。ここで図２を参照すると、本明細書の実施形態による複数の粒子２０６が示されている。各粒子２０６は、ポリマーマトリックス２０４内に配置される１以上の脱水複合体２０２を含むことができる。
【００４１】
様々な方法を使用してこのような粒子（微粒子を含む）を形成できることが分かるであろう。例として、粒子は、実質的に米国特許第５，４０７，６０９号明細書に記載のプロセスで調製することができ、この文献は参照により本明細書に援用される。このプロセスは、水性連続相（水および界面活性剤および／または増粘剤）と疎水性相（ポリマー溶媒、ポリマーおよび脱水複合体）とを含むエマルションの調製を含む、エマルションをベースにするプロセスとすることができる。温度は周囲温度（一般に約１５〜３０℃である）であってもよい。エマルションの形成後、ポリマー溶媒を水性抽出相に抽出することができる。十分な量のポリマー溶媒を抽出して微粒子を硬化させた後、微粒子を篩で捕集し、洗浄して、微粒子の表面に残存する界面活性剤を除去することができる。次いで、微粒子を窒素流で長時間、例えば、約１２時間乾燥させた後、少なくとも実質的に乾燥するまで、幾つかの実施形態では好都合には約３日間、室温の真空オーブンで乾燥させることができる。
【００４２】
微粒子の調製には、比較的簡単な装置を使用してもよい。システムは、異なる流れのための貯蔵容器、管類、三方弁、およびホモジナイザーを使用して容易に組み立てられる。さらに、流量計、温度監視装置、粒度監視装置などの様々な監視装置が含まれてもよい。水性連続相およびホモジナイザーに接続する三方弁に接続された第１の管に有機溶液を導入することができる。ホモジナイザーに接続するラインに入る２つの流れの流量を制御することにより、２つの流れの比、ならびに、ホモジナイザー中での滞留時間を制御することができる。ホモジナイザーからの流出液は、水流が導入される三方弁に接続するラインを通って流出する。ここでも、流量比により、ホモジナイザー流出液流への水の量が制御される。水抽出工程の滞留時間は、管の長さと、合流した流れの流量で制御することができる。次いで、２つ以上の篩を通過させて所望の範囲外の微粒子を排除することにより、微粒子をサイズ分別することができる。
【００４３】
本明細書の実施形態による脱水複合体を含有する粒子は、その成分の特定の性質およびその形成に使用される方法に基づいて様々な寸法を有し得る。幾つかの実施形態では、粒子の平均直径は約１μｍ〜約５００μｍであってもよい。幾つかの実施形態では、粒子の平均直径は約１０μｍ〜約１５０μｍであってもよい。
【００４４】
幾つかの実施形態では、脱水複合体は、ポリマーマトリックスを含む粘性液体内に組み込まれてもよい。ここで図３を参照すると、本明細書の実施形態による、粘性ポリマーマトリックス３１０を含むデバイス３００（インプラントなど）が示されている。図示するように、脱水複合体３０２を粘性ポリマーマトリックス３１０内に分散させることができる。ポリマーマトリックスを形成し、粘性液体の性質を有するポリマーとしては、ターポリマーを挙げることができる。特定の実施例では、ターポリマー組成物は、注射により投与することができる粘性液体−ポリマー薬物送達プラットフォームであってもよい。
【００４５】
ターポリマーは、３種類の異なるモノマー繰り返し単位から構成されるポリマーである。ターポリマーとしては、米国特許出願公開第２００９／０１２４５３５号明細書に記載のものを挙げることができ、この文献の内容は参照により本明細書に援用される。ターポリマーは、とりわけ、ラクチド、グリコリド、ε−カプロラクトンなどの様々な異なるモノマー繰り返し単位を含むことができる。幾つかの例示的なターポリマーは、（ヒドロキシル含有）アルコール開始剤を使用して調製することができる。アルコール開始剤の選出および選択により、最終ポリマーの特性を変化させるまたは操作することができる方法が可能になる。例えば、脂質様もしくは長鎖アルコール開始剤または低粘度アルコール開始剤を選択することにより、得られるターポリマーの最終粘度に影響を及ぼすことができる。例えば、脂質様開始剤である１−ドデカノールまたはオレイルアルコールを使用して調製されるターポリマーは、低分子開始剤（グリコール酸エチルなど）から調製される類似のターポリマーより低い粘度を有することができる。また、中鎖または長鎖（脂質様）アルコール開始剤を選択することにより、得られるポリマーの相対的親油性に影響を及ぼすことができる。親水性または水溶性アルコール開始剤（例えば、メトキシＰＥＧ−４００など）を選択することにより、得られるポリマーの相対的親水性に影響を及ぼすことができる。疎水性開始剤を使用してポリマーの相対的分解速度を低下させることができるが、逆に、より親水性の高い開始剤では分解速度を比較的速くすることができる。ポリマーアルコール開始剤を選択することにより、または２つ以上のヒドロキシル基を含有する開始剤を選択することにより、得られるポリマーの粘度または流動学的挙動に影響を及ぼすことができる。ポリオールを使用して、剪断減粘挙動、または鎖長に大きく依存する粘度などの特異な流動学的性質を有する分岐ターポリマーを調製することができる。さらに、モノマー組成の変更により、最終ポリマーの特性を調節することができる他の経路が可能となる。例えば、コポリマー組成の操作（例えば、カプロラクトンの相対的含有量の増加など）を使用して、ガラス転移温度を低下させること、粘度を低下させること、疎水性を変化させること、および全体的分解速度に影響を及ぼし、それを操作することができる。
【００４６】
また、脱水粒子を含む微粒子（脱水粒子単独とは異なる）を粘性ポリマーマトリックス内に組み込むこともできることが分かるであろう。ここで図４を参照すると、複数の微粒子４０６を含む粘性ポリマーマトリックス４１０を含むデバイス４００が示されている。微粒子４０６は、１以上の脱水複合体を含むことができる。幾つかの実施形態では、本明細書の実施形態によるデバイスは、微粒子の外側の脱水複合体の他に、微粒子の内側の脱水複合体も両方とも含むことができる。ここで図５を参照すると、粘性ポリマーマトリックス５１０を、１以上の脱水複合体を含む微粒子５０６、ならびに微粒子５０６の外側の脱水複合体５０２と共に含むデバイス５００の一例が示されている。
【００４７】
幾つかの実施形態では、脱水複合体および／または微粒子内の脱水複合体をオルガノゲル内に配置することができる。本明細書で使用する場合、オルガノゲルとは、生体適合性ポリマーを、１種類以上の有機溶媒（その少なくとも１つは水と混和しない）から構成される生体適合性溶媒系に溶解した組み合わせである。液体は、例えば、有機溶媒とすることができ、それには、例えば、安息香酸ベンジル、ヘプタン酸エチル、オクタン酸エチル、ＤＭＳＯ、ＮＭＰ、トリアセチン、グリセロールトリブチレート、グリコフロール、ＤＭＩ、鉱物油、または植物油が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
幾つかの実施形態では、有機相を低分子量ゲル化剤分子の自己組織化により生じる三次元網目構造に固定化することにより、オルガノゲルを調製することができる。オルガノゲルは他の方法で形成できることも分かるであろう。チロシンをベースにするオルガノゲル、レシチンオルガノゲル、ソルビタンエステルオルガノゲル、脂肪酸オルガノゲル、およびポリエチレンオルガノゲル等を含む様々なオルガノゲル系を使用できることが分かるであろう。
【００４９】
幾つかの実施形態では、分解性ポリマー、非分解性ポリマー、および／またはこれらの組み合わせを含むことができるポリマーマトリックス内に、脱水粒子および／または脱水粒子を含む微粒子を組み込むことができる。幾つかの実施形態では、埋込型デバイスの一部を形成する基材上に配置されるポリマーマトリックス内に、脱水粒子および／または微粒子を含むことができる。ここで図６を参照すると、ポリマーマトリックス６１０を含むデバイス６００の概略図が示されている。複数の脱水複合体６０２をポリマーマトリックス６１０内に配置することができる。ここで図７を参照すると、ポリマーマトリックス７１０を含むデバイス７００の概略図が示されている。中に脱水複合体が配置されている複数の微粒子７０６が、ポリマーマトリックス７１０内にあることが分かるであろう。ポリマーマトリックス６１０および７１０は、ターポリマー、オルガノゲル、ならびに他の様々な分解性および／または非分解性ポリマー、またはこれらの組み合わせを含む様々なポリマーを含むことができる。
【００５０】
本発明の実施形態に使用されるさらに他の例示的な分解性ポリマーとしては、天然ポリマーまたは合成ポリマーの両方を挙げることができる。分解性ポリマーの例としては、ポリマー主鎖中に加水分解に対して不安定な結合を有するものを挙げることができる。分解性ポリマーの例としては、酵素分解されるものを挙げることもできる。本発明の分解性ポリマーとしては、内部腐食性を有するものと表面腐食性を有するものの両方を挙げることができる。
【００５１】
合成分解性ポリマーとしては：分解性ポリエステル（ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（ジオキサノン）、ポリラクトン（例えば、ポリ（カプロラクトン））、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）、ポリ（３−ヒドロキシバレレート）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ（タルトロン酸）、ポリ（β−マロン酸）、ポリ（プロピレンフマレート）など）；分解性ポリエステルアミド；分解性ポリ酸無水物（ポリ（セバシン酸）、ポリ（１，６−ビス（カルボキシフェノキシ）ヘキサン、ポリ（１，３−ビス（カルボキシフェノキシ）プロパン）；分解性ポリカーボネート（チロシンをベースにするポリカーボネートなど）；分解性ポリイミノカーボネート；分解性ポリアリレート（チロシンをベースにするポリアリレートなど）；分解性ポリオルトエステル；分解性ポリウレタン；分解性ポリホスファゼン；およびこれらのコポリマーを挙げることができる。
【００５２】
とりわけ、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）などの前述のものを含む分解性ポリエステルはまた、以下に限定されないが、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡ、ＰＧＡ−ＰＥＧ−ＰＧＡ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ、ＰＥＧ−ＰＬＡ、ＰＥＧ−ＰＧＡ、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ、これらのメトキシＰＥＧ変種、およびこれらの転移物を含むジブロックまたはトリブロックコポリマーのように、ポリエーテル（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）ポロキサマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）のブロックを含有するように構成することもできる。このようなマルチブロックポリマーは既知の様々な方法で生成できることが分かるであろう。望ましい特性を有するマルチブロックコポリマーを得るために、成分の相対的重量パーセンテージを変えることができる。幾つかの実施形態では、マルチブロックコポリマー中のＰＥＧのｗｔ．％は、約０．１ｗｔ．％〜約９９ｗｔ．％であってもよい。ＰＥＧの分子量としては、１００Ｄａ〜２００，０００Ｄａを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態では、マルチブロックコポリマーのポリエステル成分のｗｔ．％は、約０．１ｗｔ．％〜約９９ｗｔ．％であってもよい。
【００５３】
分解性ポリマーの具体例としては、次の一般構造、すなわち、
［−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ６Ｈ４−Ｃ（Ｏ）−］ｘ［−Ｏ−（ＣＨ２）４−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ６Ｈ４−Ｃ（Ｏ）−］ｙ、
（式中、−Ｃ６Ｈ４−はテレフタル酸の各エステル化分子からの２価の芳香環残基を示し、ｎは各親水性ＰＥＧブロック中のエチレンオキサイド単位の数を表し、ｘはコポリマー中の親水性ブロックの数を表し、ｙはコポリマー中の疎水性ブロックの数を表す）
で記載することができる、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）とポリ（ブチレンテレフタレート）をベースにするポリ（エーテルエステル）マルチブロックコポリマーが挙げられる。添え字「ｎ」は、ＰＥＧブロックの分子量が約３００〜約４０００となるように選択することができる。コポリマー構造中のｎ、ｘおよびｙの値を変えることにより、様々な物理的特性（例えば、親水性、接着性、強度、展性、分解性、耐久性、可撓性）および有効成分放出特性（例えば、制御されたポリマー分解および膨張による）が付与されるようにブロックコポリマーを設計することができる。このような分解性ポリマーとしては、特に、米国特許第５，９８０，９４８号明細書に記載のものを挙げることができ、この文献の内容全体が参照により本明細書に援用される。
【００５４】
本発明の分解性ポリマーは、プレポリマーＡおよびＢに由来する少なくとも２つの加水分解性セグメントを含むマルチブロックコポリマーを含むことができ、これらのセグメントは多官能性連鎖延長剤により結合されており、プレポリマーＡおよびＢ、ならびにトリブロックコポリマーＡＢＡおよびＢＡＢから選択され、マルチブロックコポリマーは非晶質であり、生理学的（身体）条件で３７℃（Ｔｇ）以下の１つ以上のガラス転移温度（Ｔｇ）を有する。プレポリマーＡおよびＢは、ラクチド（Ｌ、ＤまたはＬ／Ｄ）、グリコリド、ε−カプロラクトン、δ−バレロラクトン、トリメチレンカーボネート、テトラメチレンカーボネート、１，５−ジオキセパン−２−オン、１，４−ジオキサン−２−オン（ｐ−ジオキサノン）または環状酸無水物（オキセパン−２，７−ジオン）などの環状モノマーに由来する、加水分解性ポリエステル、ポリエーテルエステル、ポリカーボネート、ポリエステルカーボネート、ポリ酸無水物またはこれらのコポリマーとすることができる。多官能性連鎖延長剤は、特にジイソシアネート連鎖延長剤とすることができるが、二酸またはジオール化合物とすることもできる。プレポリマーの組成は、得られるコポリマーの最高ガラス転移温度が身体条件で３７℃未満となるように選択されてもよい。Ｔｇ３７℃未満の要求を満たすために、前述のモノマーまたはモノマーの組み合わせの一部が他のものより好ましい場合がある。これはそれ自体でＴｇを低下させることができるか、またはプレポリマーはコポリマーのガラス転移温度を低下させるのに十分な分子量を有するポリエチレングリコールで変性される。分解性マルチブロックコポリマーは、非晶質の加水分解性配列を含むことができ、それらのセグメントは多官能性連鎖延長剤により結合されていてもよく、それらのセグメントは異なる物理的特性および分解特性を有する。例えば、グリコリド−ε−カプロラクトンセグメントとラクチド−グリコリドセグメントからなるマルチブロックコポリエステルは、２つの異なるポリエステルプレポリマーから構成することができる。セグメントのモノマー組成、セグメント比および長さを制御することにより、性質を容易に調整できる様々なポリマーを得ることができる。このような分解性マルチブロックコポリマーとしては、特に、米国特許出願公開第２００７／０１５５９０６号明細書に記載のものを挙げることができ、この文献の内容全体が参照により本明細書に援用される。
【００５５】
分解性ポリエステルアミドとしては、モノマーのＯＨ−ｘ−ＯＨ、ｚ、およびＣＯＯＨ−ｙ−ＣＯＯＨ（式中、ｘはアルキルであり、ｙはアルキルであり、ｚはロイシンまたはフェニルアラニンである）から生成されるものを挙げることができる。このような分解性ポリエステルアミドとしては、特に、米国特許第６，７０３，０４０号明細書に記載のものを挙げることができ、この文献の内容全体が参照により本明細書に援用される。
【００５６】
分解性ポリマー材料はまた、（ａ）非ペプチドポリアミノポリマー；（ｂ）ポリイミノカーボネート；（ｃ）アミノ酸由来のポリカーボネートおよびポリアリレート；ならびに（ｄ）ポリ（アルキレンオキサイド）ポリマーから選択することもできる。
【００５７】
一実施形態では、分解性ポリマー材料は非ペプチドポリアミノ酸ポリマーから構成される。例示的な非ペプチドポリアミノ酸ポリマーは、例えば、米国特許第４，６３８，０４５号明細書（「Ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」、１９８７年１月２０日）に記載されている。一般的に言えば、これらのポリマー材料は、下記に示す次の２つの構造、すなわち、
【化１】
2013530235.tif 000003
｛式中、モノマー単位は、側鎖基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は天然のアミノ酸の側鎖である）の１つ以上が加水分解に対して不安定な結合により結合されており；Ｚは任意の望ましいアミン保護基または水素であり；Ｙは任意の望ましいカルボキシル保護基またはヒドロキシルである｝
の１つを有する２個または３個のアミノ酸単位を含むモノマーから得られる。各モノマー単位は天然のアミノ酸を含み、それらはモノマー単位としてアミドまたは「ペプチド」結合以外の結合により重合する。モノマー単位はペプチド結合により結合した２個または３個のアミノ酸から構成され、従って、ジペプチドまたはトリペプチドを含むことができる。モノマー単位の正確な組成に関わらず、それらは全て、ポリペプチド鎖に典型的なアミド結合を形成するアミノ基およびカルボキシル基ではなくそれらの各側鎖による、加水分解に対して不安定な結合で重合する。このようなポリマー組成物は無毒性であり、分解性であり、様々な治療用途における有効成分の送達に関してゼロ次放出速度論を提供することができる。これらの態様によれば、アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒドロキシリシン、アルギニン、ヒドロキシプロリン、メチオニン、システイン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、シトルリン、オルニチン、ランチオニン、ヒポグリシンＡ、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、αアミノアジピン酸、カナバニン、ベンコール酸（ｖｅｎｋｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、チオールヒスチジン、エルゴチオニン、ジヒドロキシフェニルアラニン、および、十分に認識され、タンパク質化学で特性が決定されている他のアミノ酸を含む、天然のＬ−αアミノ酸から選択される。
【００５８】
幾つかの実施形態では、本明細書の実施形態による分解性マトリックスの形成に使用される分解性ポリマーは、１つ以上の疎水性ペンダント基が結合している多糖類を含むことができる。本明細書に記載する場合、置換度（ＤＳ）とは、炭化水素セグメントを含むペンダント基で置換されている、モノマー単位当たりの反応基（ヒドロキシルおよび他の反応基を含む）の平均数を指す。疎水性ペンダント基を有する多糖類を使用して本明細書の実施形態による分解性マトリックスの一部を形成する幾つかの実施形態では、置換度は０．３以上である。疎水性ペンダント基を有する多糖類を糖類保護剤として使用する幾つかの実施形態では、置換度は０．３未満である。もちろん、置換に使用される特定のペンダント基によるが、置換度が０．３未満の場合、得られる変性多糖類は実質的に水溶性を維持することが多い。
【００５９】
分解性ポリマーはまた、１つ以上の疎水性ペンダント基が結合している天然分解性多糖類を含むこともできる。多くの場合、疎水性誘導体は、多糖類に結合している炭化水素セグメントを含む複数の基を含む。炭化水素セグメントを含む複数の基が結合している場合、それらを集合的に疎水性誘導体の「疎水性部分」と称する。従って、疎水性誘導体は、疎水性部分と多糖類部分とを含む。
【００６０】
多糖類部分は天然分解性多糖類を含むことができ、天然分解性多糖類とは酵素分解することができる非合成の多糖類を指す。天然分解性多糖類には、植物または動物などの天然の供給源から得られる多糖類および／または多糖類誘導体が含まれる。天然分解性多糖類には、天然分解性多糖類を処理または変性して得られた任意の多糖類が含まれる（例えば、マルトデキストリンは、デンプンを処理して得られる天然分解性多糖類である）。例示的な天然分解性多糖類としては、マルトデキストリン、アミロース、シクロデキストリン、ポリアルジトール、ヒアルロン酸、デキストラン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、ペントサンポリサルフェート、およびキトサンが挙げられる。具体的な多糖類としては、デンプン製剤に由来する及び／又はデンプン製剤中に見られるもの（例えば、マルトデキストリン、アミロース、およびシクロデキストリン）などの分岐をほとんどまたは全く有していない低分子量ポリマーがある。従って、天然分解性多糖類は、実質的に非分岐のまたは完全に非分岐のポリ（グルコピラノース）ポリマーであってもよい。
【００６１】
考えられる別の種類の天然分解性多糖類としては、天然分解性非還元性多糖類がある。非還元性多糖類は不活性なマトリックスを提供することができ、それによりタンパク質および酵素などの医薬品有効成分（ＡＰＩ）の安定性が改善される。非還元性多糖類とは、トレハロース（α−Ｄ−グルコピラノシルα−Ｄ−グルコピラノシド）およびショ糖（β−Ｄ−フルクトフラノシルα−Ｄ−グルコピラノシド）などの非還元性二糖類（２つの単糖類がそれらのアノマー中心で結合したもの）のポリマーを指す。例示的な非還元性多糖類としては、ＧＰＣ（Ｍｕｓｃａｔｉｎｅ，Ｉｏｗａ）から入手可能なポリアルジトールが挙げられる。別の態様では、多糖類は、繰り返し（１→３）Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル単位を含むポリマーなどのグルコピラノシルポリマーである。
【００６２】
デキストランは、生体高分子であるデキストランの主鎖単位に１−３結合した側鎖を有するα−Ｄ−１，６−グルコース−結合グルカンである。デキストランは、グルコピラノースモノマー単位の２位、３位、および４位にヒドロキシル基を含む。デキストランは、ショ糖含有媒体をロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）Ｂ５１２Ｆで発酵して得ることができる。
【００６３】
デキストランは、低分子量製剤として得ることができる。ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）およびバーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）などのカビから得られる酵素（デキストラナーゼ）は、デキストランを分解することが分かっている。同様に多くの細菌もデキストランを低分子量の糖に分解する細胞外デキストラナーゼを産生する。
【００６４】
コンドロイチン硫酸は、Ｄ−ガラクトサミンとＤ−グルクロン酸の繰り返し二糖類単位を含み、通常、これらの繰り返し単位を１５〜１５０個含有する。コンドロイチナーゼＡＣは、コンドロイチン硫酸ＡおよびＣ、ならびにコンドロイチンを切断する。
【００６５】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、β−１，４−グルクロン酸単位とβ−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位が交互に結合している天然由来の直鎖ポリマーである。ＨＡは結合組織液中の主要なグリコサミノグリカンである。ヒアルロニダーゼの存在下でＨＡを断片化することができる。
【００６６】
多くの態様では、多糖類部分と疎水性部分は、天然分解性多糖類の疎水性誘導体を主として含む。重量パーセンテージに基づいて、多糖類部分は疎水性誘導体の約２５％ｗｔ以上、約２５％〜約７５％の範囲、約３０％〜約７０％の範囲、約３５％〜約６５％の範囲、約４０％〜約６０％の範囲、または約４５％〜約５５％の範囲とすることができる。同様に、全疎水性誘導体の重量パーセンテージに基づいて、疎水性部分は、疎水性誘導体の約２５％ｗｔ以上、約２５％〜約７５％の範囲、約３０％〜約７０％の範囲、約３５％〜約６５％の範囲、約４０％〜約６０％の範囲、約４５％〜約５５％の範囲とすることができる。例示的な態様では、疎水性誘導体は、その重量の約５０％が多糖類部分によるものであり、その重量の約５０％がその疎水性部分によるものである。
【００６７】
疎水性誘導体は、水に不溶であるという性質を有する。不溶性という用語は、当該技術分野で使用される標準的な用語であり、溶媒１０，０００部以上につき溶質１部を意味する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄ．（２０００），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｍｄ．を参照されたい）。
【００６８】
疎水性誘導体は、１種類以上の疎水性化合物を天然分解性多糖類ポリマーと結合させることにより調製することができる。天然分解性多糖類の疎水性誘導体の調製方法を本明細書に記載する。
【００６９】
幾つかの実施形態では、「ペンダント基」とは、式（ＣＨｎ）ｍ（式中、ｍは２以上であり、ｎは独立して２または１である）を有する共有結合した炭素原子の基を指すことができる。炭化水素セグメントは飽和炭化水素基を含んでも、または不飽和炭化水素基を含んでもよく、その例としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、環状アルキル基、環状アルケニル基、芳香族炭化水素基およびアラルキル基が挙げられる。特に、ペンダント基としては、線状、直鎖、または分岐のＣ１〜Ｃ２０アルキル基；アミン末端炭化水素、またはヒドロキシル末端炭化水素が挙げられる。別の実施形態では、ペンダント基としては、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、ポリカプロラクトン、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド−ｃｏ−カプロラクトン）のターポリマー、またはこれらの組み合わせなどのポリエステルが挙げられる。
【００７０】
天然分解性多糖類の疎水性誘導体の合成において、様々な要因を考慮することができる。これらの要因としては、天然分解性多糖類の物理的および化学的性質（そのサイズ、および多糖類の反応基の数と有無、および溶解度を含む）、炭化水素セグメントを含む化合物の物理的および化学的性質（そのサイズおよび溶解度を含む）、および化合物と多糖類との反応性が挙げられる。
【００７１】
天然分解性多糖類の疎水性誘導体の調製は、任意の好適な合成手順で行うことができる。多糖類主鎖からペンダントする炭化水素セグメントを有する基が所望の数得られるように、合成を行うことができる。ペンダント基の数および／または密度は、例えば、多糖類の使用可能な反応基（例えば、ヒドロキシル基）に対する、炭化水素セグメントを含む化合物の相対的濃度を制御することにより、制御することができる。
【００７２】
幾つかの実施形態では、多糖類からペンダントする炭化水素セグメントを有する基の種類と量は、疎水性多糖類が水に不溶となるのに十分な種類と量とすることができる。これを達成するために、一般的な方法として、多糖類主鎖からペンダントする炭化水素セグメントを有する基が重量で０．２５（ペンダント基）：１（多糖類モノマー）の範囲の量となる、疎水性多糖類を得るまたは製造する。
【００７３】
グルコピラノース単位対ペンダント基の重量比は変わり得るが、通常、約１：１〜約１００：１となる。特に、グルコピラノース単位対ペンダント基の重量比は、約１：１〜約７５：１、または約１：１〜約５０：１とすることができる。さらに、ペンダント基の性質と量により、多糖類に好適な置換度を付与することができる。通常、置換度は約０．１〜５または約０．５〜２の範囲となる。
【００７４】
これらの誘導体化レベルを例示するために、非常に低分子量（１０，０００Ｄａ未満）のグルコピラノースポリマーを、炭化水素セグメントを有する化合物と反応させて低分子量の疎水性グルコピラノースポリマーを得る。一実施形態では、天然分解性多糖類であるマルトデキストリン１０ｇ（ＭＷ３０００〜５０００Ｄａ；約３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランなどの好適な溶媒に溶解させる。次いで、無水酪酸１８ｇ（０．１１ｍｏｌ）を有する溶液をマルトデキストリン溶液に添加する。反応を進行させて、マルトデキストリンポリマーのピラノース環にペンダントのブチレート基を効率的に形成する。このレベルの誘導体化の結果、ブチレート基によるマルトデキストリンのヒドロキシル基の置換度（ＤＳ）は約１となる。
【００７５】
マルトデキストリンおよびモノマー単位当たり３個のヒドロキシル基を含む他の多糖類では、平均で、グリコピラノースモノマー単位当たり３個のヒドロキシル基の１個がブチレート基で置換される。この置換レベルを有するマルトデキストリンポリマーは、本明細書では、マルトデキストリン−ブチレートＤＳ１と称される。
【００７６】
ＤＳの増加は、多糖類に炭化水素セグメントを提供する化合物の量を漸増することにより達成することができる。別の例として、マルトデキストリン１０ｇ（ＭＷ３０００〜５０００Ｄａ；約３ｍｍｏｌ）を無水酪酸０．３２ｍｏｌと反応させることにより、ＤＳが２．５のブチリル化マルトデキストリンが調製される。
【００７７】
置換度は、多糖類の疎水性に影響を及ぼす可能性がある。また、多糖類主鎖に結合している炭化水素セグメントを有する基をかなりの量有する（高ＤＳで例示される）疎水性誘導体から形成されたインプラントは、一般に比較的疎水性が高く、比較的分解しにくい可能性がある。例えば、マルトデキストリン−ブチレートＤＳ１から形成されたインプラントの方が、マルトデキストリン−ブチレートＤＳ２から形成されたインプラントより分解速度が速い。
【００７８】
多糖類主鎖からペンダントする基に存在する炭化水素セグメントの種類もまた、ポリマーの疎水性に影響を及ぼす可能性がある。一態様では、インプラントは、炭化水素セグメントが短鎖分岐アルキル基であるペンダント基を有する疎水性多糖類を使用して形成される。例示的な短鎖分岐アルキル基は分岐Ｃ４〜Ｃ１０基である。これらの種類のペンダント基を有する疎水性ポリマーの調製は、マルトデキストリンとバルプロ酸／無水バルプロ酸とマルトデキストリンとの反応（ＭＤ−ｖａｌ）により例示される。この反応を行うと、０．５〜１．５の範囲などの比較的低いヒドロキシル基置換度を得ることができる。これらの多糖類は置換度が比較的低いが、短鎖分岐アルキル基により多糖類にかなりの疎水性が付与される。
【００７９】
天然分解性多糖類の疎水性誘導体の調製には、様々な合成スキームを使用することができる。幾つかの調製方法では、ペンダントの多糖類ヒドロキシル基を、炭化水素セグメントおよびヒドロキシル基と反応する基を含む化合物と反応させる。この反応により、炭化水素セグメントを含むペンダント基を有する多糖類を得ることができる。
【００８０】
ヒドロキシル反応性基の例としては、アセタール、カルボキシル、酸無水物、および酸ハロゲン化物等が挙げられる。これらの基を使用して、炭化水素セグメントと多糖類主鎖との間に加水分解により切断可能な共有結合を形成することができる。例えば、本方法により炭化水素セグメントを有するペンダント基を得ることができ、このペンダント基は切断可能なエステル結合で多糖類主鎖に結合している。これらの態様では、天然分解性多糖類の合成疎水性誘導体は、酵素により切断可能な化学結合（ポリマー主鎖）と酵素以外で加水分解により切断可能な化学結合（ペンダント基とポリマー主鎖との結合）の両方を含むことができる。
【００８１】
ペンダント基を多糖類に結合させるのに使用できる他の切断可能な化学結合（例えば、代謝により切断可能な共有結合）としては、カルボン酸エステル、カーボネート、ボレート、シリルエーテル、ペルオキシエステル基、ジスルフィド基、およびヒドラゾン基が挙げられる。このようなものとして、本明細書の分解性ポリマーは、シリルエーテルで誘導体化されたマルトデキストリンを含むことができることが分かるであろう。
【００８２】
任意の好適な化学基を多糖類主鎖に結合させて、疎水性を有する多糖類を得ることができ、この多糖類は水に不溶となる。特に、ペンダント基は、炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）およびイオウ（Ｓ）から選択される１つ以上の原子を含むことができる。
【００８３】
幾つかの態様では、ペンダント基は、直鎖、分岐、または環状のＣ２〜Ｃ１８基である炭化水素セグメントを含む。より具体的には、炭化水素セグメントは、Ｃ２〜Ｃ１０またはＣ４〜Ｃ８の直鎖、分岐、または環状の基を含む。炭化水素セグメントは、それぞれ、飽和であってもまたは不飽和であってもよく、アルキル基を含んでもまたは芳香族基を含んでもよい。炭化水素セグメントは加水分解性結合または非加水分解性結合により多糖類鎖に結合していてもよい。
【００８４】
本発明の分解性ポリマーとしては、特に、米国特許出願公開第２００５／０２５５１４２号明細書、米国特許出願公開第２００７／００６５４８１号明細書、米国特許出願公開第２００７／０２１８１０２号明細書、米国特許出願公開第２００７／０２２４２４７号明細書、米国特許出願公開第２００７／０２６００５４号明細書に記載のものなどの多糖類を挙げることができ、これらの文献は全てその内容全体が参照により本明細書に援用される。
【００８５】
本発明の分解性ポリマーとしては、さらに、コラーゲン／ヒアルロン酸ポリマーを挙げることができる。
【００８６】
幾つかの実施形態では、本明細書の実施形態のポリマーマトリックスは、非分解性ポリマーを含むことができる。一実施形態では、非分解性ポリマーには異なるポリマーの混合物が含まれる。本明細書で使用する場合、「（メタ）アクリレート」という用語は、ポリマーの記載に使用される場合、メチル基を含む形態（メタクリレート）またはメチル基を含まない形態（アクリレート）を意味するものとする。本発明の非分解性ポリマーとしては、ポリ（アルキル（メタ）アクリレート）およびポリ（芳香族（メタ）アクリレート）からなる群から選択されるポリマーを挙げることができ、「（メタ）」は、当業者には、アクリルおよび／またはメタクリルの形態のこのような分子（それぞれアクリレートおよび／またはメタクリレートに対応する）を含むものと理解されるであろう。例示的なポリマーとしては、ポリ（ｎ−ブチルメタクリレート）（ｐＢＭＡ）がある。好適なポリマーの例としては、ポリ（アリール（メタ）アクリレート）、ポリ（アラルキル（メタ）アクリレート）、およびポリ（アリールオキシアルキル（メタ）アクリレート）からなる群から選択されるポリマーも挙げられる。好適なポリマーの例としては、ビーズ、ペレット、顆粒などの形態の、酢酸ビニル濃度約１０％〜約５０％（１２％、１４％、１８％、２５％、３３％のものが市販されている）のポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）（ｐＥＶＡ）も挙げられる。酢酸ビニルのパーセンテージが低いｐＥＶＡコポリマーほど通常の溶媒に不溶となり、酢酸ビニルのパーセンテージが高いものほど耐久性が低くなる。
【００８７】
例示的な非分解性ポリマー混合物としては、ｐＢＭＡとｐＥＶＡとの混合物が挙げられる。このポリマー混合物は、絶対ポリマー濃度（即ち、コーティング材料中の両方のポリマーを合わせた全濃度）約０．２５ｗｔ．％〜約９９ｗｔ．％で使用することができる。この混合物は、コーティング溶液中の個々のポリマー濃度約０．０５ｗｔ．％〜約９９ｗｔ．％で使用することもできる。一実施形態では、ポリマー混合物は、分子量１００キロダルトン〜９００キロダルトンのｐＢＭＡと酢酸ビニル含有量２４〜３６重量パーセントのｐＥＶＡコポリマーを含む。一実施形態では、ポリマー混合物は、分子量２００キロダルトン〜３００キロダルトンのｐＢＭＡと酢酸ビニル含有量２４〜３６重量パーセントのｐＥＶＡコポリマーを含む。コーティング混合物中に溶解または懸濁した１種類または複数種類の有効成分の濃度は、最終コーティング材料の重量に基づいて０．０１〜９９重量パーセントの範囲であってもよい。
【００８８】
非分解性ポリマーは、（ｉ）ポリ（アルキレン−ｃｏ−アルキル（メタ）アクリレート、（ｉｉ）エチレンと他のアルキレンとのコポリマー、（ｉｉｉ）ポリブテン、（ｉｖ）ジオレフィン由来の非芳香族ポリマーおよびコポリマー、（ｖ）芳香族基含有コポリマー、および（ｖｉ）エピクロロヒドリン含有ポリマーからなる群から選択される１種類以上のポリマーを含むこともできる。
【００８９】
非分解性ポリマーとしては、「ＤＥＶＩＣＥＳ，ＡＲＴＩＣＬＥＳ，ＣＯＡＴＩＮＧＳ，ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＡＣＴＩＶＥ  ＡＧＥＮＴ  ＲＥＬＥＡＳＥ  ＯＲ  ＨＥＭＯＣＯＭＰＡＴＩＢＩＬＩＴＹ」と題された米国特許出願公開第２００７／００２６０３７号明細書に記載のものを挙げることもでき、この文献の内容全体が参照により本明細書に援用される。具体例として、非分解性ポリマーは、ブチルメタクリレート−ｃｏ−アクリルアミドメチルプロパンスルホネート（ＢＭＡ−ＡＭＰＳ）のランダムコポリマーを含むことができる。幾つかの実施形態では、ランダムコポリマーは、ＡＭＰＳを約０．５ｍｏｌ．％〜約４０ｍｏｌ．％の量で含むことができる。
【００９０】
デバイス
前述のように、本明細書の実施形態の脱水複合体、脱水複合体を含む微粒子、および脱水複合体および／または微粒子を含むポリマーマトリックスは、それ自体でインプラントまたはデバイスとして使用することができる。例えば、幾つかの実施形態では、脱水複合体、脱水複合体を含む微粒子、およびポリマーマトリックスは、対象に注射するまたは他の方法で投与することができる。さらに、脱水複合体は、ポリマー溶液を含む有機溶媒に組み込んだ後、スプレーコーティングもしくはディップコーティングまたは他のコーティング方法により医療用デバイス上に堆積させることができる。
【００９１】
さらに、脱水複合体、脱水複合体を含む微粒子、および脱水複合体および／または微粒子を含むポリマーマトリックスは、他の要素を有するデバイスの一部を形成することができる。例えば、幾つかの実施形態では、脱水複合体および／または脱水複合体を含む微粒子、およびポリマーマトリックスを、医療用デバイスの一部を形成する基材上に配置することができる。この文脈では、例示的な医療用デバイスとしては、脈管用デバイス、例えば、グラフト（例えば、腹部大動脈瘤グラフトなど）、ステント（例えば、通常はニチノールから製造される自己拡張型ステント、通常はステンレス鋼から製造されるバルーン拡張型ステント、分解性冠動脈ステントなど）、弁（例えば、ポリマーまたは炭素機械弁、組織弁、経皮的およびソーイングカフ等を含む弁設計）、大静脈フィルタ、動脈瘤排除デバイス、人工心臓、心臓ジャケット（ｃａｒｄｉａｃ  ｊａｃｋｅｔｓ）、および心臓補助装置（左室補助装置を含む）、埋込型除細動器、電気刺激装置およびリード（ペースメーカー、リードアダプタ、およびリードコネクタを含む）、埋込型医療用デバイス電源装置（例えば、電池など）、末梢心血管デバイス、心房中隔欠損閉鎖具、左心耳フィルタ、弁輪形成デバイス（例えば、弁輪形成リング）、僧帽弁修復デバイス、血管インターベンションデバイス、心室補助ポンプ、および血管アクセスデバイス（非経口栄養カテーテル、血管アクセスポート、中心静脈アクセスカテーテルを含む）；外科用デバイス、例えば、全ての種類の縫合糸、ステープル、吻合デバイス（吻合閉鎖具を含む）、縫合糸アンカー、止血バリア（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｂａｒｒｉｅｒｓ）、ねじ、プレート、クリップ、血管用インプラント、組織足場、脳脊髄液シャント、水頭症用シャント、整形外科用デバイス、例えば、関節用インプラント、寛骨臼カップ、膝蓋骨ボタン（ｐａｔｅｌｌａｒ  ｂｕｔｔｏｎｓ）、骨修復／増強デバイス、脊髄用デバイス（例えば、人工椎間板（ｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｋｓ）等）、骨ピン、軟骨修復デバイス、および人工腱；歯科用デバイス、例えば、歯科用インプラントおよび歯科用破損修復デバイス；薬物送達デバイス、例えば、薬物送達ポンプ、硝子体内薬物送達デバイス；眼窩インプラント、緑内障ドレナージシャントおよび眼内レンズを含む眼用デバイス；泌尿器用デバイス、例えば、陰茎用デバイス（例えば、インポテンス用インプラント）、括約筋、尿道、前立腺、および膀胱用デバイス（例えば、失禁用デバイス、良性前立腺肥大症管理デバイス、前立腺癌用インプラントなど）、合成補綴物、例えば、偽乳房および人工臓器（例えば、すい臓、肝臓、肺、心臓など）；神経用デバイス、例えば、神経刺激装置、神経カテーテル、神経血管バルーンカテーテル、神経動脈瘤治療コイル、およびニューロパッチ；グルコースセンサ、心臓センサ、動脈内血液ガスセンサを含むバイオセンサデバイス；腫瘍用インプラント；および疼痛管理インプラントを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
幾つかの態様では、本発明の実施形態は、眼用デバイスを含み、眼用デバイスに関連して使用することができる。これらの態様による好適な眼用デバイスは、目の任意の所望の部位に有効成分を提供することができる。幾つかの態様では、デバイスを使用して、有効成分を前眼部（水晶体の前）、および／または後眼部（水晶体の後ろ）に送達することができる。また、必要に応じて、好適な眼用デバイスを使用して有効成分を目の近傍の組織に提供することもできる。
【００９３】
幾つかの態様では、本発明の実施形態は、目の外部または内部の部位に配置されるように構成された眼用デバイスに関連して使用することができる。好適な外部デバイスは、有効成分を局所投与するように構成することができる。このような外部デバイスは、角膜（例えば、コンタクトレンズ）または眼球結膜などの目の外面に留置することができる。幾つかの実施形態では、好適な外部デバイスは、目の外面の近傍に留置することができる。
【００９４】
ここで図８を参照すると、本発明の一実施形態による例示的な医療用デバイス８００の概略図が示されている。この実施形態では、医療用デバイス８００は、眼用ねじ（ｅｙｅ  ｓｃｒｅｗ）または眼用コイル（ｅｙｅ  ｃｏｉｌ）である。しかし、他の種類の医療用デバイスも本明細書の範囲に含まれることが分かるであろう。さらに他の医療用デバイスの例について後述する。医療用デバイス８００は、先端部８０２、コイル状の本体８０４、およびキャップ部材８０６を備える。
【００９５】
ここで図９を参照すると、図８の線９−９’に沿った図８の医療用デバイス３００の断面図が示されている。この図では、基材８１０上に溶出制御層８１２が配置されている。溶出制御層８１２は、本明細書に記載の脱水複合体８１４を、任意選択により、分解性および／または非分解性ポリマーを含むポリマーマトリックスなどの１種類以上の他の成分と共に含むことができる。基材８１０は、金属、セラミックス、ポリマー、およびガラス等を含む様々な材料を含むことができるが、これらの限定されるものではない。
【００９６】
以下の実施例を参照すると、本発明をより十分に理解することができる。これらの実施例は本発明の特定の実施形態の代表例であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００９７】
実施例１：糖類保護剤を有するｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰリポソームおよびｓｉＲＮＡ／Ｎ−ｔｅｒ複合体
抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡおよび非標的指向性対照のｓｉＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）から入手した。ｓｉＲＮＡおよびＤＯＴＡＰまたはＮ−ＴＥＲ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む複合体の一連の５０μｌサンプルは、１サンプル当たり２０ｎＭのｓｉＲＮＡ１．５μｌ（０．４３μｇ）で調製された。試薬をまとめて添加した後、得られた溶液を５０−μｌサンプルに等分した。
【００９８】
ａ）ｓｉＲＮＡ／Ｎ−ＴＥＲ粒子形成：
各サンプルについて、ｓｉＲＮＡ１．５μｌをＮ−ＴＥＲ緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）４５μｌで希釈した。Ｎ−ＴＥＲ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）３．７５μｌを添加し、ボルテックスミキサーで撹拌した。グリコーゲン（貝類（または甲殻類）由来、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＭＷ不明−通常約１，０００，０００Ｄａ）の脱イオン蒸留水溶液（２５ｍｇ／ｍｌまたは５０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを、得られた複合体に添加した。次いで、卓上型凍結乾燥機を使用して、混合物を凍結乾燥した。グリコーゲンを有する凍結乾燥サンプルをジクロロメタン（ＤＣＭ）に分散させた後、真空乾燥して溶媒を除去した。
【００９９】
ｂ）ｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ／コレステロール粒子形成：
ＤＯＴＡＰはＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から入手し、コレステロールはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。各サンプルについて、２０μＭのｓｉＲＮＡ１．５μｌを脱イオン蒸留水４５μｌで希釈した。１ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰ／コレステロールのエタノール溶液（ＤＯＴＡＰ対コレステロールの比９：１）４．２μｌを添加し、ボルテックスミキサーで十分に撹拌した。グリコーゲンの脱イオン蒸留水溶液（２５ｍｇ／ｍｌまたは５０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを、得られたリポソーム複合体に添加した。次いで、卓上型凍結乾燥機を使用して、混合物を凍結乾燥し、有機溶媒に容易に懸濁することができる微粒子状固体を得た。グリコーゲンを有する凍結乾燥サンプルをジクロロメタン（ＤＣＭ）に分散させた後、真空乾燥して溶媒を除去した。
【０１００】
ｃ）対照：
グリコーゲンなどの医薬品添加物を添加することなく、ｓｉＲＮＡをＤＯＴＡＰまたはＮ−ＴＥＲと合わせることにより、対照サンプルを調製した。あるいは、新たに調製されたｓｉＲＮＡとＤＯＴＡＰまたはＮ−ｔｅｒとの複合体にグリコーゲンを添加したが、その後、凍結乾燥は行わなかった。
【０１０１】
試験手順：
１．）凍結乾燥サンプル、２．）凍結乾燥し、溶媒に懸濁し、乾燥したサンプル、および３．）液体対照に、５μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（ｄｏｘ）を有する細胞培地を添加し、最終容量６００μｌ（ｓｉＲＮＡ濃度５０ｎＭ）とした。１００μｌを、トランスフェクションの２４時間前に、ＨＲ５ＣＬ１１細胞を播種した９６ウェルプレート（１ウェル当たり細胞１０，０００個）の４つのウェルに添加した。残りの溶液を培地で希釈し、２５ｎＭのｓｉＲＮＡを得、再度、１００μｌを４つのウェルに入れた。Ｎ−ｔｅｒ含有複合体では、細胞培地はＤＭＥＭ１０％ｗ／ｖＦＢＳからなり、トランスフェクション複合体を有する培地を２４時間放置した。ＤＯＴＡＰ／ｓｉＲＮＡ複合体では、ＤＭＥＭ／５μｇ／ｍｌ  ｄｏｘをＦＢＳなしで使用した。３時間インキュベートした後、細胞培地を新鮮なＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５μｇ／ｍｌ  ｄｏｘと交換し、さらに２４時間インキュベートした。
【０１０２】
次いで、細胞を、製造業者の推奨に従ってＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで希釈したＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に１．５時間インキュベートし、毒性を評価した。培地を全て除去し、Ｇｌｏ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞を溶解した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して発光により、ルシフェラーゼ含有量を測定した。ルシフェラーゼアッセイから得られた生データを毒性データに対して、除した後、５０００を乗ずることにより正規化した。遺伝子ノックダウンは、１００％−ＲＬＵｌｕｃ／ＲＬＵ対照＊１００％として表される。ＲＬＵ＝相対発光量。
【０１０３】
結果を図１０〜図１１に示す。
【０１０４】
実施例２：グリコーゲンを有するｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰリポプレックスまたはリポソームの活性の最適化
リポソームは次のように調製した。２０μＭのｓｉＲＮＡ１７．５μｌを脱イオン蒸留水７２．５μｌで希釈した。ＤＯＴＡＰのＥｔＯＨ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを添加し、混合し、音波処理した。
【０１０５】
リポプレックスは次のように調製した。ＤＯＴＡＰのエタノール溶液をロータリーエバポレータ装置で減圧下にて蒸発させ、薄膜を形成した。次いで、ＤＯＴＡＰ膜を水に１ｍｇ／ｍｌで溶解させ、音波処理した後、０．２μｍの真空濾過器で濾過した。２０μＭのｓｉＲＮＡ１７．５μｌを脱イオン蒸留水３２．５μｌで希釈した。ＤＯＴＡＰの脱イオン蒸留水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを添加し、十分に混合した。
【０１０６】
核酸／トランスフェクション剤複合体対糖類保護剤のｗｔ／ｗｔ比が１：１または１：２．５となるように、グリコーゲンまたはデキストロースの脱イオン蒸留水溶液を添加した。得られた混合物を凍結乾燥し、酢酸エチル２５０μｌに再懸濁した。十分な懸濁を確実にするために、混合物を音波処理した。次いで、溶媒を減圧留去した。固体を血清非含有ＤＭＥＭに再溶解させてｓｉＲＮＡ濃度５０ｎＭとし、ＨＲ５ＣＬ１１細胞に塗布し、活性を試験した。１００μｌを、トランスフェクションの２４時間前に、ＨＲ５ＣＬ１１細胞を細胞１０，０００個／ウェルで播種した９６ウェルプレートの３つのウェルに添加した。３時間インキュベートした後、細胞培地を新鮮なＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５μｇ／ｍｌ  ｄｏｘと交換し、さらに２４時間インキュベートした。
【０１０７】
次いで、細胞をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅと共に１．５時間インキュベートし、毒性を評価した。培地を全て除去し、Ｇｌｏ溶解緩衝液を使用して細胞を溶解した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイを使用して発光により、ルシフェラーゼ含有量を測定した。ルシフェラーゼアッセイから得られた生データを毒性データに対して、除した後、５０００を乗ずることにより正規化した。遺伝子ノックダウンは、１００％−ＲＬＵｌｕｃ／ＲＬＵ対照＊１００％として表される。ＲＬＵ＝相対発光量。
【０１０８】
結果を図１２Ａ〜図１２Ｂに示す。
【０１０９】
実施例３：凍結乾燥および溶媒曝露後の活性に対する様々な多糖類の効果
この実施例では次の多糖類を使用した：
１．低分子量マルトデキストリン（ＬＭＷ  ＭＤ）（＜３０，０００Ｄａ（分画時）、ＧＰＣ，Ｍｕｓｃａｔｉｎｅ，ＩＡ）
２．デキストラン４０ｋＤａ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
３．高分子量マルトデキストリン（ＨＭＷ  ＭＤ）３２０ｋＤａ（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ、仏国）
４．β−シクロデキストリン（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）
５．疎水変性マルトデキストリン（低ＤＳ疎水性ＭＤ）３２０ｋＤａは、米国特許出願公開第２００７／０２６００５４号明細書に記載のように低置換度で調製し（Ｄ．Ｓ．０．１となるようにヘキサノエートで変性させ）、水に対する溶解性を維持するようにした。
６．貝類由来のグリコーゲン（ＭＷ、通常約１，０００，０００）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）。
【０１１０】
１００μｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ１０ｍｌと、ＤＯＴＡＰ水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１０ｍｌを使用して、実施例２に記載の手順に従ってリポプレックスを形成した。医薬品添加物：複合体の比が１：１、２：１または４：１となるように、リポプレックス１ｍｌ（ｓｉＲＮＡ５０μｇ、ＤＯＴＡＰ５００μｇ）に糖類水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ、２００μｌまたは４００μｌを添加した。得られた溶液を二等分した。半分を凍結乾燥し、酢酸エチルに再懸濁した。他の半分は４℃に維持した。次いで、ｓｉＲＮＡ濃度が２．５μＭとなるように、全てのサンプルに脱イオン蒸留水を添加した。
【０１１１】
ｓｉＲＮＡの濃度が５０ｎＭになるまで、サンプルを血清非含有ＤＭＥＭで希釈した。１００μｌを、ＨＲ５ＣＬ１１細胞を細胞１０５個／ｍｌで播種した９６ウェルプレートの３つのウェルに添加し、トランスフェクションの前に２４時間インキュベートした。３時間インキュベートした後、細胞培地を新鮮なＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５μｇ／ｍｌ  ｄｏｘと交換し、さらに２４時間インキュベートした。
【０１１２】
次いで、細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｂｌｕｅと共に１．５時間インキュベートし、毒性を評価した。培地を全て除去し、Ｇｌｏ溶解緩衝液を使用して細胞を溶解した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイを使用して発光により、ルシフェラーゼ含有量を測定した。ルシフェラーゼアッセイから得られた生データを毒性データに対して、除した後、５０００を乗ずることにより正規化した。遺伝子ノックダウンは、１００％−ＲＬＵｌｕｃ／ＲＬＵ対照＊１００％として表される。ＲＬＵ＝相対発光量。
【０１１３】
結果を図１３に示す。
【０１１４】
実施例４：多糖類を有するｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰリポプレックスのスケールアップ
ｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体は、ＤＯＴＡＰミセル水分散液（１ｍｇ／ｍｌ）を使用してリポプレックスを形成し、ｓｉＲＮＡの量が１２５μｇ、ＤＯＴＡＰが１．２５ｍｇとなるように作製した。デキストロース（単糖類）、グリコーゲン（実施例３に記載の貝類由来のもの）、または水溶性の疎水変性マルトデキストリン（実施例３に記載の低ＤＳ疎水性ＭＤ）を脱イオン蒸留水に２．５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、ｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体に糖類保護剤として１：２．９のｗｔ比（複合体：糖類）で添加した。これらのバッチからサンプルを採取し、凍結乾燥し、酢酸エチルに再懸濁させた。サンプルを真空乾燥した後、血清非含有ＤＭＥＭに再溶解させた。ｓｉＲＮＡの濃度が５０ｎＭになるまで、サンプルをＤＭＥＭでさらに希釈した。１００μｌを、ＨＲ５ＣＬ１１細胞を細胞１０５個／ｍｌで播種した９６ウェルプレートの３つのウェルに添加し、トランスフェクションの前に２４時間インキュベートした。３時間インキュベートした後、細胞培地を新鮮なＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５μｇ／ｍｌドキシサイクリンと交換し、さらに２４時間インキュベートした。
【０１１５】
次いで、細胞をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅと共に１．５時間インキュベートし、毒性を評価した。培地を全て除去し、Ｇｌｏ溶解緩衝液を使用して細胞を溶解した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイを使用して発光により、ルシフェラーゼ含有量を測定した。ルシフェラーゼアッセイから得られた生データを毒性データに対して、除した後、５０００を乗ずることにより正規化した。遺伝子ノックダウンは、１００％−ＲＬＵｌｕｃ／ＲＬＵ対照＊１００％として表される。ＲＬＵ＝相対発光量。
【０１１６】
結果を図１４に示す。
【０１１７】
実施例５：ｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ／グリコーゲン複合体を含有する微粒子
油／水型単相エマルション中で固体を形成するプロセスに基づいて、微粒子を調製した。これらの製剤の調製では、次のバッチを抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ１７倍、スクランブル（対照）ｓｉＲＮＡ９倍で作製した：
１ｍＭのｓｉＲＮＡ８８．０μｌ（１．２５ｍｇ）を脱イオン蒸留水１２．５ｍｌで希釈した。この溶液に、１ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰ１２．５ｍｌ（ｓｉＲＮＡとの比ｗ／ｗ１：１０、１２．５ｍｇ）を添加し、複数回ピペットで上下させることにより混合した。次いで、グリコーゲン３６．３ｍｇを脱イオン蒸留水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）７．２５ｍｌとして添加した。温度制御した凍結乾燥機で溶液を凍結乾燥させた。
【０１１８】
略称「Ｇｌｕ２」および「ＭＯ４０」は、表に示すおおよその分子量を有するマルトデキストリンポリマーを指す。略称「Ｈｅｘ」および「Ｐｒｏ」は、マルトデキストリンポリマーのヘキサノエートペンダント基およびプロパノエートペンダント基を指す。「Ｈｅｘ」および「Ｐｒｏ」の後ろの数字は、ポリマーの置換度を指す。
【０１１９】
【表１】
2013530235.tif 000004
【０１２０】
次の溶液を調製した：
ポリマーの２０％ｗ／ｗ（重量）酢酸エチル溶液。疎水変性マルトデキストリンは、米国特許出願公開第２００７／０２６００５４号明細書に記載のように調製した。
Ａ）使用したポリマーは以下の通りであった：
ａ．ヘキサノエートで変性したマルトデキストラン、Ｄ．Ｓ．１．６（「Ｇｌｕ２ｈｅｘ１．６」）；
ｂ．ヘキサノエートで変性したマルトデキストラン、Ｄ．Ｓ．  １．４（「Ｍ０４０ｈｅｘ１．４」）；
ｃ．ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、５０／５０ｗｔ．％ラクチド／グリコリド、固有粘度＝０．３５、（「ＤＬＧ３．５Ｅ」、Ｌａｋｅｓｈｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から入手）；または
ｄ．メトキシ−ポリエチレングリコールのジブロックコポリマー（Ｍｗ１５００Ｄａ）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡブロック６５／３５ｗｔ．％ラクチド／グリコリド）、固有粘度＝０．４９（「ＰＥＧ−ＰＬＧ６５／３５（ラクチド／グリコリド）」、Ｌａｋｅｓｈｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）、ＰＥＧはジブロックコポリマーの約２〜３ｗｔ．％を構成する。
Ｂ）連続相：
ａ．２％ＰＶＡ（Ａｍｓｒｅｓｃｏ、３５〜５０ｋＤａ）（ポリビニルアルコール）の脱イオン蒸留水溶液；または
ｂ．０．５％ＰＶＡ／４％ＰＥＧ２０ｋＤａの脱イオン蒸留水溶液（ＰＶＡ−ＰＥＧ）。
溶液は両方とも酢酸エチルで飽和された。
【０１２１】
凍結乾燥したｓｉＲＮＡ（ルシフェラーゼまたは非標的指向性対照）、ＤＯＴＡＰおよびグリコーゲン製剤を合わせて、ｓｉＲＮＡ２．５ｍｇ、ＤＯＴＡＰ２５ｍｇおよびグリコーゲン７２．５ｍｇを含有する材料１００ｍｇを得た。ポリマー溶液２．５グラム（ポリマー５００ｍｇ）を、凍結乾燥したｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ／グリコーゲンに添加した。３０秒間、「３」に設定したＩＫＡ−２５Ｔプローブを使用して固体を分散させた。この混合物を１５秒間、連続相１５０ｍｌに乳化させた（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ、２アームプローブ、１０００ｒｐｍ）。硬化させるために、エマルションを脱イオン蒸留水８５０ｍｌに注ぎ、３０分間撹拌した。１２５μｍと２０μｍのフィルタを積み重ねたもので粒子を濾過した。２０〜１２５および＜２０μｍ（存在する場合）の粒子を捕集し、凍結乾燥した。濾液を遠心分離し、＜２０μｍの粒子を捕集した。上清４００ｍｌを凍結乾燥し、遊離ｓｉＲＮＡを測定した。
【０１２２】
次のバッチを作製した：
【０１２３】
【表２】
2013530235.tif 000005
【０１２４】
制御放出を調べるために、微粒子製剤当たり約５０ｍｇをＰＢＳ１ｍｌに入れ、３７℃で放置した。特定の時間間隔で、緩衝液を新鮮なＰＢＳと交換した。ｑｒｔＰＣＲを使用してｓｉＲＮＡの放出を測定した。ｓｉＲＮＡに特異的なステムループプライマーを有するＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｓｉＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。次いで、リアルタイムＰＣＲで、ｓｉＲＮＡ配列に特異的なＴＡＱＭＡＮプライマーおよびプローブを使用してｃＤＮＡを評価した（試薬および装置はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ製）。結果を図１５に示す。
【０１２５】
さらに、ＬＣ／ＭＳを使用してＤＯＴＡＰ濃度を測定することにより、バッチ１および２からのＤＯＴＡＰの制御放出を分析した。各放出時点におけるＤＯＴＡＰ濃度を各時点におけるｓｉＲＮＡ濃度で除することにより、ＤＯＴＡＰ対ｓｉＲＮＡの比を算出した。結果を図１６および図１７に示す。
【０１２６】
放出ＤＯＴＡＰ／ｓｉＲＮＡの生物活性を調べるために、溶出緩衝液をＤＭＥＭで、１：１または１：５の比で希釈した。希釈した複合体１００μｌを、トランスフェクションの２４時間前にＨＲ５ＣＬ１１細胞を１ウェル当たり細胞１０，０００個で播種した９６ウェルプレートにトリプリケートで添加した。３時間インキュベートした後、細胞培地を新鮮なＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５μｇ／ｍｌ  ｄｏｘと交換し、さらに２４時間インキュベートした。
【０１２７】
次いで、細胞をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅと共に１．５時間インキュベートし、毒性を評価した。培地を全て除去し、Ｇｌｏ溶解緩衝液を使用して細胞を溶解した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイを使用して発光により、ルシフェラーゼ含有量を測定した。
【０１２８】
ルシフェラーゼアッセイから得られた生データを毒性データに対して、除した後、５０００を乗ずることにより正規化した。遺伝子ノックダウンは、１００％−ＲＬＵｌｕｃ／ＲＬＵ対照＊１００％として表される。ＲＬＵ＝相対発光量。結果を図１８に示す。
【０１２９】
実施例６：ｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ／グリコーゲン複合体を含有するオルガノゲル／ターポリマー
実施例４に記載のｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ／グリコーゲンを有する凍結乾燥物を使用した。米国特許出願公開第２００７／０２６００５４号明細書に記載のように、Ｄ．Ｓ１．６のマルトデキストリン（Ｇｌｕ２）ヘキサノエート（Ｇｌｕ２Ｈｅｘ１．６）およびＤ．Ｓ．１．６のマルトデキストリン（Ｇｌｕ２）プロパノエート（Ｇｌｕ２Ｐｒｏ１．７）を調製した。次いで、Ｇｌｕ２Ｈｅｘ１．６を安息香酸ベンジル（ＢＢ）に３００ｍｇ／ｍｌで、またはヘプタン酸エチル（ＥＨ）に３００ｍｇ／ｍｌで溶解した。Ｇｌｕ−２  ｐｒｏ１．６を、安息香酸ベンジルとグリコフロール（ＧＦ）との９：１の比の混合物に２００ｍｇ／ｍｌまたは３００ｍｇ／ｍｌで溶解した。製剤を全て５５℃に維持した。凍結乾燥したｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ／グリコーゲン５０ｍｇをポリマー製剤２００ｍｇと合わせた。４種類のオルガノゲル製剤を後述のように調製した：
１−Ｇｌｕ２Ｈｅｘ１．６のＢＢ溶液（３００ｍｇ／ｍｌ）
２−Ｇｌｕ２Ｈｅｘ１．６のＥＨ溶液（３００ｍｇ／ｍｌ）
３−Ｇｌｕ２Ｐｒｏ１．７のＢＢ／ＧＦ溶液（２００ｍｇ／ｍｌ）
４−Ｇｌｕ２Ｐｒｏ１．７のＢＢ／ＧＦ溶液（３００ｍｇ／ｍｌ）
【０１３０】
ターポリマーは、米国特許出願公開第２００９／１２４５３５号明細書に記載のように合成した。次のターポリマーを使用した（ＤＬ＝ＤＬ−ラクチド＝、Ｌ＝Ｌ−ラクチド、Ｇ＝グリコリド、ＣＬ＝カプロラクトン）：
８’＝ドデカノール開始剤；１９：３１：５０ｗｔ．％−ＤＬ：Ｇ：ＣＬ；４７００Ｄａ；２０６ポアズ
２２＝ドデカノール開始剤；１９：２３：５８ｗｔ．％−Ｌ：Ｇ：ＣＬ；２４００Ｄａ；７３ポアズ
２３＝ＰＥＧ３５０開始剤；１６：１４：３３ｗｔ．％−ＤＬ：Ｇ：ＣＬ；５２００Ｄａ；４０１ポアズ
また、８’には１０％安息香酸ベンジル（溶媒）も配合し、粘度を減少させた。
【０１３１】
ターポリマー２００ｍｇをｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ／グリコーゲン凍結乾燥物５０ｍｇと混合した。得られた混合物を短時間遠心分離した（１０ｋｒｐｍで３０秒間）。
【０１３２】
制御放出試験のため、ＰＢＳ１ｍｌを製剤に添加し、３７℃で放置した。特定の時間間隔で、緩衝液を新鮮なＰＢＳと交換した。元のｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ／グリコーゲン混合物から、サンプルを水に溶解させた後、ＰＢＳで希釈し、３７℃に維持し、対照として使用した。回収した溶出緩衝液をＤＭＥＭで、１：１５または１：１５０の比で希釈した。１００μｌを、トランスフェクションの２４時間前にＨＲ５ＣＬ１１細胞を１ウェル当たり細胞１０，０００個で播種した９６ウェルプレートにトリプリケートで添加した。３時間インキュベートした後、細胞培地を新鮮なＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５μｇ／ｍｌ  ｄｏｘと交換し、さらに２４時間インキュベートした。
【０１３３】
次いで、細胞をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅと共に１．５時間インキュベートし、毒性を評価した。培地を全て除去し、Ｇｌｏ溶解緩衝液を使用して細胞を溶解した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイを使用して発光により、ルシフェラーゼ含有量を測定した。ルシフェラーゼアッセイから得られた生データを毒性データに対して、除した後、５０００を乗ずることにより正規化した。遺伝子ノックダウンは、１００％−ＲＬＵｌｕｃ／ＲＬＵ対照＊１００％として表される。ＲＬＵ＝相対発光量。
【０１３４】
実施例５のようにｓｉＲＮＡの放出を測定した。結果を図１９および図２０に示す。放出したｓｉＲＮＡ複合体の生物活性を図２１および図２２に示す。
【０１３５】
実施例７：比較的低濃度の溶媒に曝露された後、グリコーゲンの方がデキストロースよりカチオン性脂質複合体の活性を維持する
グリコーゲン（貝類由来、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｍ．Ｗ．通常１，０００，０００Ｄａ）は、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから入手した。デキストロースはＳｉｇｍａから入手し、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＲＮＡｉＭａｘ（ＬＦＲＮＡｉＭａｘ）（カチオン性脂質）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。ｓｉＲＮＡ標的指向性ルシフェラーゼまたは非特異的対照はＱｉａｇｅｎから入手した。
【０１３６】
製造業者の使用説明書に従ってｓｉＲＮＡ溶液をＬＦＲＮＡｉＭａｘ水溶液と合わせることにより（ＬＦＲＮＡｉＭＡｘ１μｌ対ｓｉＲＮＡ７ｐｍｏｌ）、水中にｓｉＲＮＡとリポフェクタミンとのリポプレックスを形成した。次いで、グリコーゲンまたはデキストロースを複合体に１０：１、５：１または１：１の質量比で添加した。対照として、水だけを複合体に添加した。その後、複合体を凍結乾燥し、次いで凍結乾燥した粉末を酢酸エチルに、音波処理を使用して分散させた。次いで、真空乾燥することにより複合体から酢酸エチルをストリッピングし、複合体を再水和させて細胞培養に使用し、遺伝子ノックダウンアッセイを行った。対照として、新鮮な複合体と凍結乾燥だけを行った複合体を試験した。
【０１３７】
グリコーゲンおよびデキストロースの存在下で溶媒に曝露された複合体の結果を図２３に示す。
【０１３８】
他の実施形態：
様々な実施形態では、本発明は、核酸とトランスフェクション剤、および糖類保護剤を含む脱水複合体を含む有効成分を送達するための物品を含む。幾つかの実施形態では、脱水複合体は、凍結乾燥した粒子状物質を含むことができる。幾つかの実施形態では、脱水複合体は、噴霧乾燥した粒子状物質を含むことができる。幾つかの実施形態では、トランスフェクション剤は、脂質トランスフェクション剤を含むことができる。幾つかの実施形態では、脂質トランスフェクション剤は、カチオン性脂質を含むことができる。幾つかの実施形態では、トランスフェクション剤は脂質様物質を含むことができる。幾つかの実施形態では、脱水複合体はＳＮＡＬＰ（安定な核酸−脂質粒子）を含むことができる。幾つかの実施形態では、脱水複合体中の核酸およびカチオン性脂質に対する糖類保護剤のｗ／ｗ比は１に対して５未満である。幾つかの実施形態では、核酸はｓｉＲＮＡを含むことができる。幾つかの実施形態では、糖類保護剤は、直鎖多糖類を含むことができる。幾つかの実施形態では、糖類保護剤は分岐多糖類を含むことができる。幾つかの実施形態では、糖類保護剤はグリコーゲンを含むことができる。幾つかの実施形態では、糖類保護剤は、マルトデキストリンを含むことができる。幾つかの実施形態では、糖類保護剤を疎水性基で誘導体化することができる。幾つかの実施形態では、糖類保護剤は、疎水性基で誘導体化されたマルトデキストリンを含むことができ、０．３未満の置換度を有することができ、誘導体化されたマルトデキストリンは水溶性である。幾つかの実施形態では、核酸とトランスフェクション剤は、リポソームを含むことができる。幾つかの実施形態では、核酸とトランスフェクション剤はリポプレックスを含むことができる。幾つかの実施形態では、物品は、第１のポリマーマトリックスをさらに含むことができ、脱水複合体は第１のポリマーマトリックス内に分散される。幾つかの実施形態では、第１のポリマーマトリックスは、分解性のポリマーを含むことができる。幾つかの実施形態では、第１のポリマーマトリックスは、スプレーコーティングまたはディップコーティングにより形成された層を含むことができる。幾つかの実施形態では、第１のポリマーマトリックスは、ラクチド、グリコリド、カプロラクトン、ポリエチレングリコール、またはこれらの誘導体からなる群から選択される１つ以上のサブユニットを含むポリマーを含むことができる。幾つかの実施形態では、第１のポリマーマトリックスは、ターポリマーを含むことができる。幾つかの実施形態では、第１のポリマーマトリックスは、粘性流体を含むことができる。幾つかの実施形態では、第１のポリマーマトリックスと脱水複合体は微粒子となり得る。幾つかの実施形態では、微粒子の直径は、約１μｍ〜約１５０μｍとなり得る。幾つかの実施形態では、微粒子の直径は、約２０μｍ〜約８０μｍとなり得る。幾つかの実施形態では、物品は、第２のポリマーマトリックスをさらに含むことができ、微粒子は第２のポリマーマトリックス内に配置され、第２のポリマーマトリックスは第１のポリマーマトリックスとは異なるポリマーを含む。
【０１３９】
様々な実施形態では、本発明は、放出制御製剤中に組み込まれる核酸とトランスフェクション剤との複合体のトランスフェクション活性を維持する方法を含み、本方法は、核酸、トランスフェクション剤、および糖類保護剤を水溶液中で合わせて有効成分組成物を形成する工程；および有効成分組成物から水を除去して脱水複合体を形成する工程を含む。様々な実施形態では、水を除去する工程は、有効成分組成物を凍結乾燥する工程を含むことができる。様々な実施形態では、水を除去する工程は、有効成分組成物を噴霧乾燥する工程を含むことができる。様々な実施形態では、本方法は、脱水複合体を有機溶媒中に再懸濁する工程をさらに含むことができる。様々な実施形態では、トランスフェクション剤は脂質トランスフェクション剤を含むことができる。様々な実施形態では、脂質トランスフェクション剤はカチオン性脂質を含むことができる。様々な実施形態では、トランスフェクション剤は脂質様物質を含むことができる。様々な実施形態では、核酸とトランスフェクション剤は一緒にＳＮＡＬＰ（安定な核酸−脂質粒子）を構成することができる。様々な実施形態では、有効成分組成物中の核酸およびカチオン性脂質に対する糖類のｗ／ｗ比は１に対して５未満である。様々な実施形態では、核酸はｓｉＲＮＡを含むことができる。様々な実施形態では、糖類保護剤は直鎖多糖類を含むことができる。様々な実施形態では、糖類保護剤は分岐多糖類を含むことができる。様々な実施形態では、糖類保護剤はグリコーゲンを含むことができる。様々な実施形態では、糖類保護剤はマルトデキストリンを含むことができる。様々な実施形態では、糖類保護剤は疎水性基で誘導体化されている。様々な実施形態では、糖類保護剤は、疎水性基で誘導体化されたマルトデキストリンを含むことができ、０．３未満の置換度を有することができ、誘導体化されたマルトデキストリンは水に可溶である。様々な実施形態では、核酸とトランスフェクション剤はリポソームとし得る。様々な実施形態では、核酸とトランスフェクション剤はリポプレックスとし得る。
【０１４０】
様々な実施形態では、本発明は放出制御製剤の製造方法を含み、本方法は、核酸、トランスフェクション剤、および糖類を水性溶媒中で合わせて有効成分組成物を形成する工程；有効成分組成物を処理して水性溶媒を除去し、脱水複合体を形成する工程；および脱水複合体をポリマー組成物と合わせる工程を含む。様々な実施形態では、本方法は、脱水複合体をポリマー組成物と合わせる前に、脱水複合体を有機溶媒中に再懸濁する工程をさらに含む。様々な実施形態では、ポリマー組成物は有機溶媒を含む。様々な実施形態では、本方法は、脱水複合体とポリマー組成物を処理して微粒子を形成する工程をさらに含む。様々な実施形態では、ポリマー組成物は、ラクチド、グリコリド、ポリエチレングリコール、およびカプロラクトン、またはこれらの誘導体からなる群から選択される１つ以上のサブユニットを含むポリマーを含む。様々な実施形態では、水性溶媒を除去するように有効成分組成物を処理する工程は、有効成分組成物を凍結乾燥する工程を含むことができる。様々な実施形態では、溶媒を除去するように有効成分組成物を処理する工程は、有効成分組成物を噴霧乾燥する工程を含むことができる。様々な実施形態では、トランスフェクション剤は脂質トランスフェクション剤を含むことができる。様々な実施形態では、脂質トランスフェクション剤はカチオン性脂質を含むことができる。様々な実施形態では、トランスフェクション剤は脂質様物質を含むことができる。様々な実施形態では、核酸とトランスフェクション剤は一緒にＳＮＡＬＰ（安定な核酸−脂質粒子）を含むことができる。様々な実施形態では、有効成分組成物中の核酸およびカチオン性脂質に対する糖類のｗ／ｗ比は１に対して５未満である。様々な実施形態では、核酸はｓｉＲＮＡを含むことができる。様々な実施形態では、糖類保護剤はグリコーゲンを含むことができる。様々な実施形態では、核酸とトランスフェクション剤はリポソームを含むことができる。様々な実施形態では、核酸とトランスフェクション剤はリポプレックスを含むことができる。
【図１】
2013530235.tif 000006
【図２】
2013530235.tif 000007
【図３】
2013530235.tif 000008
【図４】
2013530235.tif 000009
【図５】
2013530235.tif 000010
【図６】
2013530235.tif 000011
【図７】
2013530235.tif 000012
【図８】
2013530235.tif 000013
【図９】
2013530235.tif 000014
【図１０】
2013530235.tif 000015
【図１１】
2013530235.tif 000016
【図１２Ａ】
2013530235.tif 000017
【図１２Ｂ】
2013530235.tif 000018
【図１３】
2013530235.tif 000019
【図１４】
2013530235.tif 000020
【図１５】
2013530235.tif 000021
【図１６】
2013530235.tif 000022
【図１７】
2013530235.tif 000023
【図１８】
2013530235.tif 000024
【図１９】
2013530235.tif 000025
【図２０】
2013530235.tif 000026
【図２１】
2013530235.tif 000027
【図２２】
2013530235.tif 000028
【図２３】
2013530235.tif 000029
【国際調査報告】
2013530235.tif 000030
2013530235.tif 000031
2013530235.tif 000032
2013530235.tif 000033