(57)【要約】炎症性神経変性の状態もしくは疾患またはそれらの少なくとも１つの症状を治療するのに十分な量で、帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含む界面動電的に改変された流体（例えば、界面動電的に改変されたガス富化流体および溶液）が提供される。界面動電的に改変された流体または治療用組成物および方法は、所望により他の治療薬と組み合わせて、界面動電的に改変されたイオン水性流体を含む。特定の態様は、タウタンパク質のリン酸化および／または凝集の調節を提供する。特定の態様は、細胞膜電位および／または細胞膜伝導性、膜受容体、例えば、限定はされないが、Ｇタンパク質共役受容体、および細胞間結合等の膜タンパク質のうち少なくとも１つを調節することで前記炎症反応に関連する細胞内シグナル伝達の調整または調節を提供する。他の実施形態は、界面動電的に改変された流体および治療用組成物のための特定の投与経路または製剤を含む。【選択図】  図１８Ｂ
2013533320.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タウオパチーまたはその少なくとも１つの症状の治療用薬剤の調製のための界面動電的に改変された水性流体の使用であって、前記流体が、約１００ナノメートル未満の平均直径を主に有し、タウのリン酸化および／または凝集の調節、好ましくはタウのリン酸化および／または凝集の低減に十分な量でイオン水性流体中で安定に形成される帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含むことによって、対象におけるタウオパチーまたはその少なくとも１つの症状の治療を提供する、使用。
【請求項２】
前記帯電安定化した酸素含有ナノ構造が、流体が生細胞と接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量で、イオン水性流体中で安定に形成される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記帯電安定化した酸素含有ナノ構造が、流体中の主要な帯電安定化したガス含有ナノ構造種である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
帯電安定化した酸素含有ナノ構造として流体中に存在する溶解した酸素分子の割合が、０．０１％超、０．１％超、１％超、５％超；１０％超；１５％超；２０％超；２５％超；３０％超；３５％超；４０％超；４５％超；５０％超；５５％超；６０％超；６５％超；７０％超；７５％超；８０％超；８５％超；９０％超；および９５％超からなる群から選択される割合である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
全溶解酸素が、実質的に帯電安定化した酸素含有ナノ構造中に存在する、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
帯電安定化した酸素含有ナノ構造が、９０ｎｍ；８０ｎｍ；７０ｎｍ；６０ｎｍ；５０ｎｍ；４０ｎｍ；３０ｎｍ；２０ｎｍ；１０ｎｍ；および５ｎｍ未満からなる群から選択される大きさより小さい平均直径を主に有する、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
イオン水溶液が食塩水を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
流体が過酸素化されている、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
流体が溶媒和電子の形態を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
界面動電的に改変された水性流体の改変が、流体力学的に誘起され局在化した界面動電効果への流体の曝露を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
局在化した界面動電効果への曝露が、電圧パルスおよび電流パルスのうちの少なくとも１つへの曝露を含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
流体力学的に誘起された局在化した界面動電効果への流体の曝露が、流体を生成するのに使用される装置の界面動電効果を誘起する構造的特徴への、流体の曝露を含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
タウオパチーが、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性疾患、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉変性症（ピック病）、およびパンチドランカー（ＤＰ）（別名、ボクサー認知症、慢性ボクサー脳症）からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
タウオパチーが、嗜銀顆粒性疾患、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、および前頭側頭葉変性症（ピック病）のうちの少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
タウオパチーが前頭側頭型認知症を含む、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記その少なくとも１つの症状が、中枢神経系および脳における慢性炎症、並びに中枢神経系および脳における急性炎症からなる群から選択される少なくとも１つの状態に関する、請求項１に記載の使用。
【請求項１７】
界面動電的に改変された水性流体が、一酸化窒素レベルの局在レベルまたは細胞内レベルを調節する、請求項１に記載の使用。
【請求項１８】
界面動電的に改変された水性流体が、投与部位において、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの局在的な低減を促進する、請求項１に記載の使用。
【請求項１９】
治療が、炎症における相乗的または非相乗的な阻害または低減を目的として、別の抗炎症剤の同時使用または補助的使用をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項２０】
前記他の抗炎症剤が、ステロイドまたは糖質コルチコイドステロイドを含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
糖質コルチコイドステロイドがブデソニドまたはその活性誘導体を含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
治療が、少なくとも１つのさらなる治療薬が患者に投与される併用療法をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのさらなる治療薬が、酢酸グラチラマー、インターフェロン−β、ミトキサントロン、ナタリズマブ、ＭＭＰ−９阻害剤およびＭＭＰ−２阻害剤を含むＭＭＰ阻害剤、短時間作用性β２作動薬、長時間作用性β２作動薬、抗コリン薬、副腎皮質ステロイド、全身性副腎皮質ステロイド、マスト細胞安定剤、ロイコトリエン飾物物質、メチルキサンチン、β２作動薬、アルブテロール、レバルブテロール、ピルブテロール、アルホルモテロール（ａｒｔｆｏｒｍｏｔｅｒｏｌ）、ホルモテロール、サルメテロール、イプラトロピウムおよびチオトロピウムを含む抗コリン薬；ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾロン、プレドニゾンを含む副腎皮質ステロイド；モンテルカスト、ザフィルルカスト、およびジロートンを含むロイコトリエン飾物物質；クロモリンおよびネドクロミルを含むマスト細胞安定剤；テオフィリンを含むメチルキサンチン；イプラトロピウムおよびアルブテロール、フルチカゾンおよびサルメテロール、ブデソニドおよびホルモテロールを含む複合薬；ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、セチリジン、およびヒドロコルチゾンを含む抗ヒスタミン剤；タクロリムスおよびピメクロリムスを含む免疫系調節薬；シクロスポリン；アザチオプリン；ミコフェノール酸モフェチル；並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
少なくとも１つのさらなる治療薬がＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗薬である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２５】
ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗薬が、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰ受容体に特異的な中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、並びにＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子または２つ以上の受容体鎖の成分をコードするポリペプチドを含むＴＳＬＰ受容体融合タンパク質からなる群から選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
治療が、膜結合タンパク質の高次構造、リガンド結合活性、または触媒活性のうち少なくとも１つの調節を含む、細胞膜の構造または機能のうちの少なくとも１つを調節することを含む、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項２７】
膜結合タンパク質が、受容体、膜貫通受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、およびインテグリンからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
膜貫通受容体がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を含む、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）がＧタンパク質αサブユニットと相互作用する、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
Ｇタンパク質αサブユニットがＧαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ、およびＧα１２からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
少なくとも１つのＧタンパク質αサブユニットがＧαｑである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
治療が、全細胞伝導性を調節することを含む、細胞膜伝導性を調節することを含む、請求項２に記載の使用。
【請求項３３】
治療が、全細胞伝導性の少なくとも１つの電位依存性寄与を調節することを含む、全細胞伝導性を調節することを含む、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
治療が、カルシウム依存性細胞内伝達経路または系の調節を含む、細胞内シグナル伝達の調節を含む、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節することを含む、請求項２に記載の使用。
【請求項３５】
治療が、ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む細胞内シグナル伝達の調節を含む、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節することを含む、請求項２に記載の使用。
【請求項３６】
治療が、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む、細胞内シグナル伝達の調節を含む、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節することを含む、請求項２に記載の使用。
【請求項３７】
治療が、中枢神経および脳における慢性炎症、並びに中枢神経および脳における急性炎症からなる群から選択される少なくとも１つの状態または症状に関連する細胞内シグナル伝達を調節することを含む、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項３８】
治療が、細胞ネットワークまたは細胞層への投与を含み、それらの細胞間結合の調節をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３９】
細胞内接合が、密着結合、ギャップ結合、接着帯およびデスモソームからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記細胞ネットワークまたは細胞層が、ＣＮＳ血管における内皮細胞および内皮星状膠細胞の密着結合、血液脳脊髄液の密着結合または関門、肺上皮型結合、気管支上皮型結合、並びに腸上皮型結合からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項３８に記載の使用。
【請求項４１】
界面動電的に改変された水性流体が酸素化されており、流体中の酸素が、大気圧で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５，ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍ酸素の量で存在する、請求項１に記載の使用。
【請求項４２】
界面動電的に改変された流体の帯電安定化した酸素含有ナノ構造中に存在する酸素量が、大気圧で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５，ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍ酸素である、請求項１に記載の使用。
【請求項４３】
界面動電的に改変された水性流体が、溶媒和電子、および界面動電的に修飾または荷電された酸素種の形態のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項４４】
溶媒和電子または界面動電的に修飾もしくは荷電された酸素種の形態が少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
界面動電的に改変され酸素化された水性流体が、分子酸素によって、少なくとも部分的には、安定化した溶媒和電子を含む、請求項４３に記載の使用。
【請求項４６】
細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節する能力が、密閉された気密性容器中で少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月、またはより長い期間持続する、請求項２に記載の使用。
【請求項４７】
膜結合タンパク質がＣＣＲ３を含む、請求項２６に記載の使用。
【請求項４８】
タウオパチーまたはその少なくとも１つの症状の治療が、細胞内のＮＦ−κＢの発現および／または活性の調節；好ましくはＮＦ−κＢの発現および／または活性の低減を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項４９】
タウオパチーまたはその少なくとも１つの症状の治療用として適切な治療薬または組合せを製剤化する方法であって、
対象のタウオパチーまたはその少なくとも１つの症状の治療用として適切な治療薬を得ること；および
治療薬を、約１００ナノメートル未満の平均直径を主に有し、タウオパチーまたはその少なくとも１つの症状を治療するのに十分な量でイオン水性流体中で安定に形成され、帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含むある量の界面動電的に改変された水性流体と組合せることを含み、タウオパチー、またはその少なくとも１つの症状の治療用として適切な治療薬または組合せを製剤化する方法が提供される、方法。
【請求項５０】
帯電安定化した酸素含有ナノ構造が、流体が生細胞と接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量でイオン水性流体中で安定に形成される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
対象のタウオパチーまたはその少なくとも１つの症状の治療用として適切な治療薬；および約１００ナノメートル未満の平均直径を主に有し、タウオパチーまたはその少なくとも１つの症状を治療するのに十分な量でイオン水性流体中で安定に形成される帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含む、ある量の界面動電的に改変された水性流体を含む、医薬組成物。
【請求項５２】
請求項４９に記載の方法によって調製される、医薬組成物。
【請求項５３】
治療が、局所的、吸入、鼻腔内、経口的、静脈内（ＩＶ）および腹腔内（ＩＰ）投与のうちの少なくとも１つによる投与を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項５４】
界面動電的に改変された流体の帯電安定化した酸素含有ナノ構造が、本明細書で開示される表１および表２に記載の少なくとも１つの塩またはイオンを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項５５】
対象が哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項１に記載の使用。
【請求項５６】
治療が、タウのリン酸化および／または凝集を低減することを含む、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
特定の態様は、一般に炎症性神経変性疾患（例えば、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、ハンチントン病、片頭痛、脳アミロイド血管症、エイズに関連する炎症性神経変性の状態、加齢関連認知低下；哺乳動物におけるタウオパチー、軽度認知機能障害およびプリオン病）に関し、より具体的な態様では、タウオパチー（例えば、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性疾患、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉変性症（ピック病）、およびパンチドランカー（ＤＰ）（別名、ボクサー認知症、慢性ボクサー脳症））、並びに神経炎症の調整または調節に関し、さらに具体的には、本明細書に記載されるような少なくとも１つの界面動電的に生成された流体（例えば、界面動電的に生成されたガス富化流体）、例えば本明細書に記載されるようなガス富化され（例えば、酸素富化）界面動電的に生成された流体を含む治療用組成物を投与することにより、対象におけるタウオパチーまたはタウオパチー疾患の少なくとも１つの症状を治療または予防するための組成物および方法に関する。さらなる態様は併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患は、ニューロンまたはそれらの髄鞘の変質を特徴とする疾患群である。このニューロンの破壊は、最終的には、機能不全および能力障害をもたらす。炎症は、しばしば、神経変性疾患の構成要素であることが見出され、神経変性の病因に加担することがある（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。集合的に、これらの疾患には当該技術分野において認められている炎症性神経変性疾患が含まれる。いくつかの神経変性障害において、神経炎症は、何らかのニューロン大量消失が起こる数年前に発生し得る（非特許文献６）。マクロファージ、好中球、Ｔ細胞、星状膠細胞、および小膠細胞を含む、多くの異なる型の免疫細胞は、多発性硬化症（Ｍ．Ｓ．）、パーキンソン病、アミロイドーシス（例えば、アルツハイマー病）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、プリオン病、およびＨＩＶ関連痴呆等の免疫関連疾患の病変の一因となり得る。より具体的には、複数の研究グループによって、ＭＳにおいては、ミエリンへの損傷が炎症反応によって媒介されること（非特許文献７）、および白血球がＣＮＳに浸潤する際、Ｍ．Ｓ．発病が悪化すること（非特許文献８）が指摘された。ある研究グループは、ＣＮＳ炎症およびＭＳにおけるその効果を試験するための遺伝的モデルを開発している（動物モデルの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を通して）。さらに、炎症誘発性サイトカイン（特にＴＮＦ−α）が、アルツハイマー病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）において増加していることが発見された（非特許文献９）。従って、これらの炎症性神経変性疾患は、抗炎症剤によって効果的に治療され得る。
【０００３】
炎症性神経変性疾患には、限定はされないが、多発性硬化症（ＭＳ）、パーキンソン病、アミロイドーシス（例えば、アルツハイマー病）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ＨＩＶ関連認知症、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、ハンチントン病、片頭痛、脳アミロイド血管症、エイズ、加齢関連認知低下；哺乳動物における軽度認知機能障害およびプリオン病が含まれる。
【０００４】
多発性硬化症（ＭＳ）は中枢神経系（ＣＮＳ）の慢性炎症性神経変性疾患であり、世界中でおよそ１，１００，０００人、特に若年成人が罹患している（非特許文献１０）。ＭＳは病理学的には神経組織の脱髄によって特徴付けられ、それにより、病状が良性から慢性的進行パターンに及ぶ、多くの疾患形態のうちの１つが臨床的にもたらされる。より具体的には、多発性硬化症の５つの主要形態、すなわち１）良性多発性硬化症；２）再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）；３）二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）；４）一次性進行型多発性硬化症（ＰＰＭＳ）；および５）進行性再発性多発性硬化症（ＰＲＭＳ）が説明されている。慢性進行性多発性硬化症は、ＳＰＭＳ、ＰＰＭＳ、およびＰＲＭＳを指すのに集合的に用いられる用語である。再発性多発性硬化症は、混合型再発を伴うＳＰＭＳ、ＲＲＭＳおよびＰＲＭＳである。
【０００５】
疾患の経過の全体を通して、軸索を取り囲む髄鞘の破壊が進行する。軸索の完全性の保持には無傷のミエリンが不可欠であるため（Ｄｕｂｏｉｓ−Ｄａｌｃｑ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ．  ４８，  ９−１２  （２００５））、組織的な破壊は、臨床的には、しびれおよび疼痛、供応および平衡における問題、失明、並びに一般的な認知障害を含む、種々の神経性機能不全を最終的にもたらす。興味深いことに、ＭＳの進行は患者間でかなり異なる場合があり、その疾患を有して数十年間生きた後でさえ僅かな障害しか持たない患者がいる一方で、診断からたった数年後に車椅子に頼っている患者もいる。
【０００６】
ＭＳの病因は現在不明であるが、遺伝学的証拠、分子基盤、および免疫学的要因を検討している研究が、疾患の経過および脱髄（ｄｅｍｙｌｉｎａｔｉｏｎ）が起こる機構を解明し始めている。遺伝子解析において、いくつかの報告により、正規母集団（０．１％のＭＳ罹患率）と比べた場合、血縁個体がより高いＭＳの発生率を有し、一卵性双生児は、他方の双生児がＭＳを有する場合、該疾患を発症する可能性を３０％有し、二卵性双生児および兄弟姉妹は、別の兄弟姉妹がＭＳに罹患した場合、１〜２％の可能性を有することが示されている。いくつかのグループは、遺伝率に関与する遺伝子を見出すために連鎖および関連研究を利用し、ＭＳに罹患する相対リスクが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−ＤＲ２対立遺伝子の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ対立遺伝子を保有するものに対して、３〜４倍高いことを発見している。ＭＳに関連する他の遺伝子が特定されてはいるが、リスクはかなり低い。ＭＳ罹患率とＭＨＣクラスＩＩの関連は、ＭＳの病因におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の役割を強く示唆する（Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＡＭＡ  ２７０：２３６３−２３６９  （１９９３）；  Ｏｌｅｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ３８：１−３  （１９９１））。
【０００７】
さらに、健常人と比べて、ＭＳに罹患しているＭＳ患者において特異的に発現される遺伝子の特定が試みられている。遺伝子マイクロアレイが用いられており、１）プラーク型（急性対慢性）およびプラーク領域（活性対不活性）からの転写が試験され（Ｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｈｅｌｌｅｒ  （２００３））；２）インターフェロンβ処置を受けた患者および受けていない患者の両方からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）がＲＲＭＳ患者対対照で比較され（Ｓｔｕｒｚｅｂｅｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３））；３）ＭＳの動物モデルであるマウスにおける実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のＣＮＳ細胞が試験されている（Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２））。これらの実験が発見したことの多くは、抗炎症性抗アポトーシス遺伝子が下方制御され、炎症誘発性増殖遺伝子が上方制御されるという発見も含めて、予測されていたことである。驚くべき結果としては、オステオポンチン（Ｃｈａｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）およびＴＲＡＩＬ（Ｗａｎｄｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３））等の、治療への応用の可能性がある新規標的の特定が挙げられる。しかしながら、ＭＳ患者からの発現と、健常人からの発現を比較した際に、特異的な制御を有する遺伝子の多くは、ＭＳの罹患率および／または進行に影響し得るいずれの遺伝子も未だ不明であるため、ＭＳ発症における意義は不明である。
【０００８】
さらなる研究によって、自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞によって惹起された炎症反応が、ミエリンに対する損傷を媒介し得ることが確認された（Ｂｒｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２０６：１８１−１８５  （２００３））。一般に、ＭＳ発症中に髄鞘および軸索に生じる損傷の多くは、炎症誘発性（例えばＴｈ１およびＴｈ１７）サイトカインの分泌を含む炎症反応を生じる自己反応性Ｔ細胞応答を通じて発生すると考えられている（Ｐｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｒｅｈａｂｉｌ．  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．  ３９：１８７−１９９  （２００２）；  Ｈｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ３：２９１−３０１  （２００２））。
【０００９】
ＭＳに対する現在利用可能な治療法には、酢酸グラチラマー、インターフェロンβ、ナタリズマブ、およびミトキサントロンが含まれる。一般的に、これらの薬剤は、非特異的に免疫系を抑制し、疾患の全体的な進行を僅かに制限するだけである（Ｌｕｂｅｔｚｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １８：２３７−２４４）。従って、より良好にＭＳを治療するための治療方針を開発することが必要とされている。
【００１０】
酢酸グラチラマーは、ランダム重合体として、グルタミン酸、リジン、アラニン、およびチロシンから成る。酢酸グラチラマーは、限定された有効性、および重大な副作用、例えば、注射部位のしこり、悪寒、発熱、疼痛、息切れ、頻拍および不安を有する。一次進行型ＭＳを有する患者を９４３人用いる重要な臨床試験において、酢酸グラチラマーは、障害の進行および疾患を止めることができなかった（Ｗｏｌｉｎｓｋｙ，  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６１：１３−２４）。
【００１１】
インターフェロンβは、線維芽細胞によって産生される天然のタンパク質であり、自然免疫反応の一部である。ＭＳに対する薬剤として、インターフェロンβは、ＭＳ発症の割合を減少させることにおいて約１８〜３８％効果的である。副作用には、インフルエンザ様症状および注射部位での応答のような軽度のもの、並びにより重度のもの（例えば、うつ病、発作、および肝臓障害）が含まれる。
【００１２】
ミトキサントロンはＭＳに対する１つの治療法である。それはがんと闘うために用いる化学療法の処置として開発され、ＤＮＡの修復および合成を妨げることによって働き、がん細胞に特異的ではない。ミトキサントロンによる副作用はかなり重度になる場合があり、悪心、嘔吐、脱毛、心臓の損傷、および免疫抑制が含まれる。
【００１３】
ナタリズマブは、細胞接着分子であるα４−インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｅｎ）を標的とするヒト化モノクローナル抗体である。ナタリズマブは、炎症を引き起こす免疫細胞が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するのを妨げることによって働くと考えられている。副作用には疲労、頭痛、悪心、感冒、およびアレルギー反応が含まれる。
【００１４】
別の炎症性神経変性疾患であるパーキンソン病は、筋硬直および緩慢な身体の移動を含む、運動障害を特徴とする。パーキンソン病の最近の研究によって、サイトカインおよびＨＬＡ−ＤＲ抗原の発現増大によって、免疫応答が神経損傷の一因となり得ることが認められた（Ｃｚｌｏｎｋｏｗｓｋａ  ｅｔ．  ａｌ．  （２００２）  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｍｏｎｉｔ  ８：ＲＡ１６５−７７）。
【００１５】
アミロイドーシスは、あるタンパク質が変質した構造を有し、特定の組織において蓄積し、正常な組織機能を遮断するよう互いに結合する傾向がある場合に、発症する。これらの改変された構造タンパク質は、アミロイドと称される。しばしば、アミロイドーシスは２つの分類、すなわち原発性または続発性に分けられる。原発性アミロイドーシスは、不適当な免疫細胞機能を伴う病気から生じる。続発性アミロイドーシスは、通常、いくつかの他の慢性感染性疾患または慢性炎症性疾患の合併症から生じる。このような例としては、アルツハイマー病および関節リウマチが挙げられる。続発性アミロイドーシスの根本的な問題が炎症であるため、炎症の治療が有益であり得る。
【００１６】
アルツハイマー病はもう一つの種類の炎症性神経変性疾患である。前記疾患は、学習および記憶に関する障害の増加によって典型的に現れるが、認知能力異常を示す他の様式で現れ得る。疾患の経過を通して、大脳皮質におけるニューロンおよびシナプスの進行性喪失によって、神経組織の全体的な萎縮がもたらされる。アルツハイマー病の原因は明らかになっていないが、炎症が重要な役割を果たすと広く考えられており、臨床研究によって、疾患の病因にかなり寄与することが示されている（Ａｋｉｙａｍａ，  ｅｔ．  ａｌ．  （２０００）  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ．  ２１：３８３−４２１）。
【００１７】
筋萎縮性側索硬化症において、炎症と疾患の関連が示唆されている（Ｃｅｎｔｏｎｚｅ，  ｅｔ．  ａｌ．  （２００７）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ２８：１８０−７）。さらに、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡが、筋萎縮性側索硬化症の遺伝子導入マウスモデルの脊髄において発現されていることが見出されている。興味深いことに、転写物は、運動困難を発症するよりも前から早くも検出され、ＡＬＳによる死亡が起こるまで検出された（Ｅｌｌｉｏｔ  （２００１）  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ９５：１７２−８）。
タウオパチー
タウオパチーは、ヒトの脳での神経原線維変化（ＮＦＴ）における病的なタウタンパク質の凝集によりもたらされる、ある種の神経変性疾患である。タウタンパク質は、微小管の安定化に関与し、中枢神経系のニューロンに主に見出される。タウタンパク質の欠損により、微小管が適切に安定化されない場合、それによって、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性疾患、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉変性症（ピック病）およびパンチドランカー（ＤＰ）（別名、ボクサー認知症、慢性ボクサー脳症）等の痴呆がもたらされ得る。神経原線維変化がＤＰに少なくとも関与している）。上に列挙された非アルツハイマー型タウオパチーは、「ピック症候群」としてまとめて分類される場合もある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｍｉｎａｇａｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉ．  （２００２）  ２０２：１３−２３
【非特許文献２】Ａｎｔｅｌ  ａｎｄ  Ｏｗｅｎｓ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９９９）  １００：  １８１−１８９
【非特許文献３】Ｅｌｌｉｏｔｔ，  Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ．  Ｒｅｓ．  （２００１）  ９５：１７２−１７８
【非特許文献４】Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  （２００２）  ２５：９４５−９５３
【非特許文献５】Ｗｈｉｔｔｏｎ  ＰＳ．，  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  （２００７）  １５０：９６３−７６
【非特許文献６】Ｔａｎｓｅｙ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｆｒｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００８  １３：７０９−７１７
【非特許文献７】Ｒｕｆｆｉｎｉ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  （２００４）  １６４：１５１９−１５２２
【非特許文献８】Ｄｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  （２００８）  ５：４９
【非特許文献９】Ｇｒｅｉｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  ｏｆ  Ｓｃｉ  （２００６）  １０３５：２９０−３１５
【非特許文献１０】Ｐｕｇｌｉａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｓ．  （２００２）  １０４：１８２−１９１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
特定の態様は、タウオパチーまたはその少なくとも１つの症状を治療するための方法を提供し、該方法は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含み、タウのリン酸化を調節して対象におけるタウオパチーまたはその少なくとも１つの症状の治療を提供するのに十分な量でイオン水性流体中で安定に形成される、治療有効量の界面動電的に改変された水性流体を、必要とする対象に投与することを含む。ある特定の態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、流体が生細胞と接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量で、イオン水性流体中で安定に形成される。特定の実施形態では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、流体中の主な帯電安定化したガス含有ナノ構造種である。ある態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造として流体中に存在する溶解酸素分子の割合は、０．０１％超、０．１％超、１％超、５％超；１０％超；１５％超；２０％超；２５％超；３０％超；３５％超；４０％超；４５％超；５０％超；５５％超；６０％超；６５％超；７０％超；７５％超；８０％超；８５％超；９０％超；および９５％超からなる群から選択される割合である。特定の態様では、全溶解酸素は、帯電安定化した酸素含有ナノ構造中に実質的に存在する。ある実施形態では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、９０ｎｍ；８０ｎｍ；７０ｎｍ；６０ｎｍ；５０ｎｍ；４０ｎｍ；３０ｎｍ；２０ｎｍ；１０ｎｍ；および５ｎｍ未満からなる群から選択されるサイズ未満の平均直径を実質的に有する。
【００２０】
特定の態様では、イオン水溶液は食塩水を含む。
【００２１】
特定の態様では、流体は過酸素化されている。
【００２２】
特定の態様では、流体は溶媒和電子の形態を含む
【００２３】
特定の実施形態では、界面動電的に改変された水性流体の改変は、流体力学的に誘起され局在化した界面動電効果への流体の曝露を含む。ある態様では、局在化した界面動電効果への曝露は、電圧パルスおよび電流パルスのうち少なくとも１つへの曝露を含む。特定の態様では、流体力学的に誘起され局在化した界面動電効果への流体の曝露は、流体を生成するのに使用される装置の界面動電効果を誘起する構造的特徴への流体の曝露を含む。
【００２４】
ある態様では、タウオパチーには、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性疾患、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉変性症（ピック病）、およびパンチドランカー（ＤＰ）（別名、ボクサー認知症、慢性ボクサー脳症）からなる群から選択される少なくとも１つが含まれる。好ましくは、タウオパチーには、少なくとも１つの嗜銀顆粒性疾患、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、および前頭側頭葉変性症（ピック病）が含まれる。特定の実施形態では、タウオパチーには前頭側頭型認知症が含まれる。
【００２５】
ある態様では、前記その少なくとも１つの症状は、中枢神経系および脳における慢性炎症、並びに中枢神経系および脳における急性炎症からなる群から選択される少なくとも１つの状態に関連する。
【００２６】
特定の実施形態では、界面動電的に改変された水性流体は、一酸化窒素の局在レベルまたは細胞内レベルを調節する。ある態様では、界面動電的に改変された水性流体は、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの投与部位における局在的な低減を促進する。
【００２７】
特定の方法の態様は、別の抗炎症剤で対象を同時に、または補助的に治療することによる、炎症における相乗的または非相乗的な阻害または低減をさらに含む。特定の実施形態では、前記他の抗炎症剤には、ステロイドまたは糖質コルチコイドステロイド（例えば、ブデソニドまたはその活性誘導体を含む糖質コルチコイドステロイド）が含まれる。
【００２８】
特定の方法の態様には、少なくとも１つのさらなる治療薬が患者に投与される併用療法がさらに含まれる。ある態様では、前記少なくとも１つのさらなる治療薬は、酢酸グラチラマー、インターフェロンβ、ミトキサントロン、ナタリズマブ、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の阻害剤を含むＭＭＰ阻害剤、短時間作用性β２作動薬、長時間作用性β２作動薬、抗コリン薬、副腎皮質ステロイド、全身性副腎皮質ステロイド、マスト細胞安定剤、ロイコトリエン飾物物質、メチルキサンチン、β２作動薬、アルブテロール、レバルブテロール、ピルブテロール、アルホルモテロール（ａｒｔｆｏｒｍｏｔｅｒｏｌ）、ホルモテロール、サルメテロール、イプラトロピウムおよびチオトロピウムを含む抗コリン薬；ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾロン、プレドニゾンを含む副腎皮質ステロイド；モンテルカスト、ザフィルルカスト、およびジロートンを含むロイコトリエン飾物物質；クロモリンおよびネドクロミルを含むマスト細胞安定剤；テオフィリンを含むメチルキサンチン；イプラトロピウムおよびアルブテロール、フルチカゾンおよびサルメテロール、ブデソニドおよびホルモテロールを含む複合薬；ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、セチリジン、およびヒドロコルチゾンを含む抗ヒスタミン剤；タクロリムスおよびピメクロリムスを含む免疫系調節薬；シクロスポリン；アザチオプリン；ミコフェノール酸モフェチル；並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２９】
特定の実施形態では、前記少なくとも１つのさらなる治療薬は、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲの拮抗薬である（例えば、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲの拮抗薬は、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰ受容体に特異的な中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、並びに２つ以上の受容体鎖の成分をコードするＴＳＬＰＲ−免疫グロブリンＦｃ分子またはポリペプチドを含むＴＳＬＰ受容体融合タンパク質からなる群から選択される）。
【００３０】
ある態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節は、膜結合タンパク質の高次構造、リガンド結合活性、または触媒活性のうち少なくとも１つを調節することを含む、細胞膜の構造または機能のうち少なくとも１つを調節することを含む。ある態様では、膜結合タンパク質には、受容体、膜貫通受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、およびインテグリンからなる群から選択される少なくとも１つが含まれる。特定の実施形態では、膜貫通受容体にはＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）が含まれる。ある態様では、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）はＧタンパク質のαサブユニットと相互作用する（例えば、Ｇタンパク質のαサブユニットは、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ、およびＧα１２からなる群から選択される少なくとも１つを含む）。
【００３１】
特定の実施形態では、細胞膜伝導性を調節することには、全細胞伝導性を調節することが含まれる。ある態様では、全細胞伝導性を調節することには、全細胞伝導性の少なくとも１つの電位依存性寄与を調節することが含まれる。
【００３２】
特定の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節は、カルシウム依存性細胞内伝達経路または系の調節；ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む細胞内シグナル伝達を調節すること；アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む細胞内シグナル伝達を調節すること；並びに中枢神経および脳における慢性炎症、並びに中枢神経および脳における急性炎症からなる群から選択される少なくとも１つの状態または症状に関連する細胞内シグナル伝達を調節することのうち少なくとも１つを含む細胞内シグナル伝達を調節することを含む。
【００３３】
ある態様は、細胞ネットワークまたは細胞層への投与を含み、その中の細胞間結合の調節をさらに含む。特定の実施形態では、細胞間結合には、密着結合、ギャップ結合、接着帯およびデスモソームからなる群から選択される少なくとも１つが含まれる。ある態様では、細胞ネットワークまたは細胞層には、ＣＮＳ血管内における内皮細胞および内皮型星状膠細胞の密着結合、血液脳脊髄液の密着結合または関門、肺上皮型結合、気管支上皮型結合、並びに腸上皮型結合からなる群から選択される少なくとも１つが含まれる。
【００３４】
特定の実施形態では、界面動電的に改変された水性流体は酸素化されており、流体中の酸素は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素の量で存在する。ある態様では、界面動電的に改変された流体の帯電安定化した酸素含有ナノ構造に存在する酸素の量は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素である。
【００３５】
ある態様では、界面動電的に改変された水性流体は、溶媒和電子、および界面動電的に修飾または荷電された酸素種の形態のうち少なくとも１つを含む。ある実施形態では、溶媒和電子または界面動電的に修飾または荷電された酸素種の形態は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。ある態様では、界面動電的に改変され酸素化された水性流体は、分子酸素によって少なくとも部分的に安定化された溶媒和電子を含む。
【００３６】
特定の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節する能力は、密閉された気密容器内で、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、またはより長期間持続する。
【００３７】
ある態様では、膜結合タンパク質はＣＣＲ３を含む。
【００３８】
特定の態様では、タウオパチーまたはその少なくとも１つの症状を治療することには、細胞内ＮＦ−κＢの発現および／または活性の調節が含まれる。
【００３９】
さらなる態様は、タウオパチーまたはその少なくとも１つの症状の治療用として適切な治療薬を製剤化する方法を提供し、該方法は、対象のタウオパチーまたはその少なくとも１つの症状の治療用として適切な治療薬を得ること；並びに該治療薬を、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含み、タウオパチーまたはその少なくとも１つの症状を治療するのに十分な量でイオン水性流体中で安定に形成され、タウオパチーまたはその少なくとも１つの症状の治療用として適切な治療薬の製剤化が提供される、ある量の界面動電的に改変された水性流体と組み合わせることを含む。ある態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、流体が生細胞と接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量でイオン水性流体中で安定に形成される。
【００４０】
さらなる態様は、対象のタウオパチーまたはその少なくとも１つの症状の治療用として適切な治療薬；および約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含み、タウオパチーまたはその少なくとも１つの症状を治療するのに十分な量でイオン水性流体中で安定に形成されるある量の界面動電的に改変された水性流体を含む医薬組成物を提供する。
【００４１】
さらなる態様は、本明細書で開示される方法によって調製される医薬組成物を提供する。
【００４２】
ある態様では、治療には、局所的、吸入、鼻腔内、経口的、静脈内（ＩＶ）および腹腔内（ＩＰ）のうち少なくとも１つによる投与が含まれる。
【００４３】
特定の態様では、界面動電的に改変された流体の帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、本明細書で開示される表１および表２に記載の少なくとも１つの塩またはイオンを含む。
【００４４】
特定の態様では、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００４５】
ある態様では、治療にはタウのリン酸化の調節が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ガス富化流体および脱イオン化対照流体の存在下における分裂促進アッセイのサイトカインプロファイルを示す。
【図２】加圧ポットの含酸素流体（１）、本発明のガス富化流体（２）、または対照である脱イオン化流体（３）の存在下で、脾細胞をＭＯＧと接触させた結果を示す。
【図３−１】Ａ〜Ｃは、２つの時点（１５分（左パネル）および２時間（右パネル））、異なる電位プロトコールにおける上皮細胞膜の極性およびイオンチャネル活性に対する界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の効果を評価した、一連のパッチクランプ法実験の結果を示す。
【図３−２】Ａ〜Ｃは、２つの時点（１５分（左パネル）および２時間（右パネル））、異なる電位プロトコールにおける上皮細胞膜の極性およびイオンチャネル活性に対する界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の効果を評価した、一連のパッチクランプ法実験の結果を示す。
【図４】Ａ〜Ｃは、図３Ａ〜Ｃに関連する実験に関して、３つの電位プロトコール（Ａ．０ｍＶからのステッピング；Ｂ．−６０ｍＶからのステッピング；Ｃ．−１２０ｍＶからのステッピング）および２つの時点（１５分（白丸）および２時間（黒丸））での、ＲＮＳ−６０電流データからのＳｏｌａｓ電流データの減算により得られるグラフを示す。
【図５−１】Ａ〜Ｄは、異なる外部塩類溶液を用いる、異なる電位プロトコール（パネルＡおよびＣは０ｍＶからのステッピングを示し；パネルＢおよびＤは−１２０ｍＶからのステッピングを示す）での、上皮細胞膜の極性およびイオンチャネル活性に対する界面動電的に生成された流体の効果を評価した一連のパッチクランプ法実験の結果（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）およびＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））を示す。
【図５−２】Ａ〜Ｄは、異なる外部塩類溶液を用いる、異なる電位プロトコール（パネルＡおよびＣは０ｍＶからのステッピングを示し；パネルＢおよびＤは−１２０ｍＶからのステッピングを示す）での、上皮細胞膜の極性およびイオンチャネル活性に対する界面動電的に生成された流体の効果を評価した一連のパッチクランプ法実験の結果（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）およびＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））を示す。
【図６−１】Ａ〜Ｄは、図５Ａ〜Ｄに関連する実験に関して、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）およびＲｅｖｅｒａ６０（パネルＣおよびＤ）に対する２つの電位プロトコール（パネルＡおよびＣ、０ｍＶからのステッピング；ＢおよびＤ、−１２０ｍＶからのステッピング）での、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（ひし形）および４０ｍＭ  ＣａＣｌ２（黒四角）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図５に示される）の減算によって得られたグラフを示す。
【図６−２】Ａ〜Ｄは、図５Ａ〜Ｄに関連する実験に関して、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）およびＲｅｖｅｒａ６０（パネルＣおよびＤ）に対する２つの電位プロトコール（パネルＡおよびＣ、０ｍＶからのステッピング；ＢおよびＤ、−１２０ｍＶからのステッピング）での、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（ひし形）および４０ｍＭ  ＣａＣｌ２（黒四角）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図５に示される）の減算によって得られたグラフを示す。
【図７】本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）が、多発性硬化症（ＭＳ）の当該技術分野において認められている実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットモデルにおいて実質的に効果的であったことを示す。
【図８】図７に示される実験に用いられたＥＡＥ誘導および治療計画の概略図を示す。
【図９】図９Ａは、図７および８に示される実験で使用されたＥＡＥ治療計画を受けた動物の体重（グラム単位）をグラフ表示したものである。図９Ｂは、ＥＡＥ治療計画を受けた動物の体重変化を計算したもの（パーセント単位）を示す。
【図１０−１】Ａ〜Ｄは、図７および８に示される実験で用いられたようなＥＡＥ治療計画中に、ビヒクル対照と比較した場合に、本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）が総白血球（ＷＢＣ）、好中球、およびリンパ球のレベルに対しほとんど影響を持たないことを示す。パネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、それぞれ、試験の０、７、１４、および２１日目における結果を示す。
【図１０−２】Ａ〜Ｄは、図７および８に示される実験で用いられたようなＥＡＥ治療計画中に、ビヒクル対照と比較した場合に、本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）が総白血球（ＷＢＣ）、好中球、およびリンパ球のレベルに対しほとんど影響を持たないことを示す。パネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、それぞれ、試験の０、７、１４、および２１日目における結果を示す。
【図１１−１】Ａ〜Ｈ（Ａ〜Ｄ）は、本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）が、図７および図８に示される実験で使用されたようなＥＡＥ処置計画を開始後、７日目（Ａ〜Ｄ）および１８日目（Ｅ〜Ｈ）にサイトカインレベルに対して有する効果を示す。パネルＡおよびＥは、処置後のＩＬ−１７レベルを示す。パネルＢおよびＦは、処置後のＩＬ−１αレベルを示す。パネルＣおよびＧは、処置後のＩＬ−１βレベルを示す。パネルＤおよびＨは、処置後のＩＬ−４レベルを示す。
【図１１−２】Ａ〜Ｈ（Ａ〜Ｄ）は、本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）が、図７および図８に示される実験で使用されたようなＥＡＥ処置計画を開始後、７日目（Ａ〜Ｄ）および１８日目（Ｅ〜Ｈ）にサイトカインレベルに対して有する効果を示す。パネルＡおよびＥは、処置後のＩＬ−１７レベルを示す。パネルＢおよびＦは、処置後のＩＬ−１αレベルを示す。パネルＣおよびＧは、処置後のＩＬ−１βレベルを示す。パネルＤおよびＨは、処置後のＩＬ−４レベルを示す。
【図１１−３】Ａ〜Ｈ（Ａ〜Ｄ）は、本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）が、図７および図８に示される実験で使用されたようなＥＡＥ処置計画を開始後、７日目（Ａ〜Ｄ）および１８日目（Ｅ〜Ｈ）にサイトカインレベルに対して有する効果を示す。パネルＡおよびＥは、処置後のＩＬ−１７レベルを示す。パネルＢおよびＦは、処置後のＩＬ−１αレベルを示す。パネルＣおよびＧは、処置後のＩＬ−１βレベルを示す。パネルＤおよびＨは、処置後のＩＬ−４レベルを示す。
【図１１−４】Ａ〜Ｈ（Ａ〜Ｄ）は、本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）が、図７および図８に示される実験で使用されたようなＥＡＥ処置計画を開始後、７日目（Ａ〜Ｄ）および１８日目（Ｅ〜Ｈ）にサイトカインレベルに対して有する効果を示す。パネルＡおよびＥは、処置後のＩＬ−１７レベルを示す。パネルＢおよびＦは、処置後のＩＬ−１αレベルを示す。パネルＣおよびＧは、処置後のＩＬ−１βレベルを示す。パネルＤおよびＨは、処置後のＩＬ−４レベルを示す。
【図１２】本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）が、マウス小膠細胞（ＢＶ−２小膠細胞）における誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）およびインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）のＭＰＰ＋による発現誘導を減弱するが、対照生理食塩水（ＮＳ）では減弱されないことを示す。
【図１３】ＲＮＳ６０が、ヒトＳＨＳＹ５Ｙニューロン細胞の原線維Ａβ（１−４２）仲介性アポトーシスを抑制するが、生理食塩水対照（ＮＳ）では抑制されないことを示す。分化後、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞を、異なる濃度のＲＮＳ６０またはＮＳのいずれかと共に１時間インキュベートし、その後１μＭの原線維Ａβ（１−４２）ペプチドに曝した。処理の１８時間後、アポトーシスをＴＵＮＥＬ（カルバイオケム社）でモニターした。対照として、Ａβ（４２−１）ペプチドもインキュベートした。結果は３つの独立した実験を表わしている。
【図１４】多発性硬化症（ＭＳ）の当該技術分野において認められている実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスＭＯＧモデルで、用量反応性の様式で臨床スコアを抑制することにおいて、ＲＮＳ６０は実質的に効果的であるが、ビヒクル対照（ビヒクル）は効果的でないことを示す。高用量および低用量のＲＮＳ−６０の治療的連日投与、並びに高用量のＲＮＳ−６０の３日毎の投与（投与またはＲＮＳ−６０は、全ての場合において、最初の臨床徴候と同時に開始）は共に、臨床スコアの著しい減少を示した（白ひし形＝ビヒクル対照；白四角＝デキサメタゾン陽性対照；明るい「ｘ」＝臨床徴候の発生から低用量（０．０９ｍｌ  ＲＮＳ６０）連日投与；暗い「ｘ」＝臨床徴候の発生から高用量（０．２ｍｌ  ＲＮＳ６０）３日毎投与；および白三角＝臨床徴候の発生から高用量（０．２ｍｌ  ＲＮＳ６０）連日投与）。
【図１５】Ａ〜Ｂは、白血球の細胞表面受容体であるＣＤ１９３（ＣＣＲ３）の発現レベルを、生理食塩水またはＲＮＳ−６０のいずれかを用いて比較した、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析の結果を示す。Ｘ軸は試料の対数蛍光を表わし、Ｙ軸は試料中に生じる蛍光の現象を表わしている。
【図１６】Ａ〜Ｃは、白血球の細胞表面受容体である、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）（パネルＡ）；ＣＤ１１Ｂ（パネルＢ）；およびＣＤ３（パネルＣ）の発現レベルを、生理食塩水またはＲＮＳ−６０のいずれかを用いて比較した、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析の結果を示す。Ｘ軸は試料の対数蛍光を表わし、Ｙ軸は試料に生じる蛍光の事象を表わしている。
【図１７】Ａ〜Ｃは、ＭＢＰ刺激を受けたＴ細胞におけるＮＦκＢの活性化に対するＲＮＳ６０の効果を試験した、２つのゲル移動度シフト実験（パネルＡおよびＢ）およびルシフェラーゼ活性（レポーター遺伝子）アッセイ（パネルＣ）の結果を示す。
【図１８Ａ】Ａ〜Ｂは、一次ニューロンにおける原線維Ａβ（１−４２）媒介性のタウのリン酸化に対するＲＮＳ６０の効果を試験した実験の結果を示す。タウのリン酸化を、βチューブリンおよびリン酸化タウに対する抗体を用いる二重標識免疫蛍光法によってモニターした。βチューブリンはニューロンのマーカーとして用い、ＤＡＰＩ染色は細胞の核を可視化するのに用いた。
【図１８Ｂ】Ａ〜Ｂは、一次ニューロンにおける原線維Ａβ（１−４２）媒介性のタウのリン酸化に対するＲＮＳ６０の効果を試験した実験の結果を示す。タウのリン酸化を、βチューブリンおよびリン酸化タウに対する抗体を用いる二重標識免疫蛍光法によってモニターした。βチューブリンはニューロンのマーカーとして用い、ＤＡＰＩ染色は細胞の核を可視化するのに用いた。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明の詳細な説明
本明細書に開示するある実施形態は、新規の界面動電的に生成された流体を含む治療組成物を、部位に接触させるか対象（例えば、哺乳動物またはヒト）に投与することにより、炎症性神経変性疾患の少なくとも１つの症状を治療する組成物および方法を提供することに関する。この炎症性神経変性疾患には、タウオパチー（例えば、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性疾患、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉変性症（ピック病）、およびパンチドランカー（ＤＰ：ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｐｕｇｉｌｉｓｔｉｃａ）（別名ボクサー認知症、慢性ボクサー脳症））が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、界面動電的に生成された流体は、酸素富化水を含む、界面動電的に生成されたガス富化流体を含む。
【００４８】
タウオパチーは、ヒトの脳内の神経原線維変化（ＮＦＴ）におけるタウタンパク質の病理学的凝集に起因する、神経変性疾患の一分類である。タウタンパク質は、微小管の安定化に関与し、主として中枢神経系内のニューロンに位置する。タウタンパク質に欠陥が生じると、微小管が適切に安定化されなくなるため、結果として認知症、例えばアルツハイマー病、嗜銀顆粒性疾患、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉変性症（ピック病）、およびパンチドランカー（ＤＰ）（別名ボクサー認知症、慢性ボクサー脳症）（ＤＰにおいては神経原線維変化が少なくとも関係する）が発症し得る。上記のアルツハイマー病以外のタウオパチーは、「ピック症候群」として、まとめて分類されている。特定の態様によれば、開示される界面動電的に生成された流体は、アルツハイマー病以外のタウオパチーすなわちピック症候群（例えば、嗜銀顆粒性疾患、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉変性症（ピック病）、ＤＰ等）の治療で実質的な有用性を有する。
【００４９】
嗜銀顆粒性疾患（ＡＧＤ；ブラーク病とも呼ばれる）は、主として辺縁構造（例えば、扁桃、海馬、および基底正中側頭／嗅内皮質）に影響する神経変性過程を特徴とする、散発的で晩期発症型の認知症である（Ｔｏｌｎａｙ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｌｉｍｂｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  １９９７；  ９３：４７７−８４を参照。この文献は、その全体、特にタウタンパク質の過剰リン酸化のＡＧＤへの関わりに関する教示が本明細書に組み込まれる）。この疾患名は、４つの微小管結合リピート（４−Ｒタウ）を有する異常にリン酸化したタウタンパク質アイソフォームから主としてなるニューロンの細胞質内に、銀に染まる（銀親和性の）顆粒すなわちコイル小体が発見されたことにちなんで付けられた（Ｔｏｇｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｓ  ａ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ４−ｒｅｐｅａｔ  ｔａｕｏｐａｔｈｙ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２００２；  ６１：５４７−５６；  Ｔｏｇｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｉｎ  ａ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｂｒａｉｎ  ｂａｎｋ  ａｎｄ  ｌａｃｋ  ｏｆ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ．  Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００２；  １２：４５−５２。これらの文献は、その全体、特にタウタンパク質のＡＧＤへの関わりに関する教示が本明細書に組み込まれる）。ＡＧＤの症状には、短期記憶の減少、単語発見の困難、読み書きの困難、方向感覚の喪失、行動障害（人格変化、攻撃性と短気を伴う情緒障害）が含まれる。これらの症状の前後に記憶障害が発生することがある。発症年齢は７０歳前後であり、罹病期間は４〜８年である。ニューロン変性がタウタンパク質の機能不全に関連すると考えられている。興味深いことに、ＡＧＤは、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症といった他のタウオパチーと同時に存在し得る（Ｄｉｃｋｓｏｎ，  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２０１０；  ３（１）：  １−２３。この文献は、その全体、特に非アルツハイマー変性疾患の神経病理に関する教示が本明細書に組み込まれる）。現在のＡＧＤの治療法には、アルツハイマー病で使われる治療法が含まれる。
【００５０】
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、脳の前頭葉の変性が引き起こす臨床症候群であり、変性は後方の側頭葉まで伸びることもある。ＦＴＤは、前頭側頭葉変性が引き起こす３つの症候群の１つであり、早期発症型の認知症としてはアルツハイマー病に次いで２番目に多い（Ｈａｂｅｒｌａｎｄ，  Ｃ  （２０１０）．  “Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｏｒ  ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｏｂａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ−−ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ａ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ”．  Ｉｄｅｇｇｙｏｇｙａｓｚａｔｉ  ｓｚｅｍｌｅ  ６３  （３−４）：  ８７−９３。この文献は、その全体、特に前頭側頭型認知症の神経病理に関する教示が本明細書に組み込まれる）。症状は、前頭葉の機能を基に（大きく）２つのグループに分類できる。１つは行動上の症状（および／または人格変化）、もう１つは実行機能の問題に関連する症状である。行動上の症状には、嗜眠、および自発性喪失すなわち逆の脱抑制が含まれる。実行機能とは、計画してまとめ上げる認知技能であり、したがって、患者は、複雑な計画や順序決定を必要とする技能を発揮できなくなる。加えて、ＦＴＤには、原発性進行性失語（ＰＰＡ）、意味性認知症（ＳＤ）といった特定の臨床徴候がある。発症年齢は４０〜５０歳前後であり、生存期間中央値は７年である。ＦＴＤの治療法は存在しない。
【００５１】
進行性核上性麻痺（スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群とも呼ばれる）は、脳内のある特定の神経細胞の損傷により引き起こされる障害であり、進行性の協調不全、頸部と体幹の硬直、眼球運動の困難、動作緩慢、認知機能障害、および転倒を伴い得る歩行困難を特徴とする。ＰＳＰ（進行性核上性麻痺）は４Ｒタウオパチー（４つのリピートを有するタウアイソフォームの凝集）に属する（Ｓｅｒｇｅａｎｔ  Ｎ．，  Ｗａｔｔｅｚ  Ａ．  ａｎｄ  Ｄｅｌａｃｏｕｒｔｅ  Ａ．  （１９９９）  Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ  ａｎｄ  ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：  ｔａｕ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ  ｅｘｏｎ  １０  ｉｓｏｆｏｒｍｓ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７２，  １２４３−１２４９。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＰＳＰは非常に個別的な疾患であり、罹患する人、症状、および進行速度は様々である。「古典的な」ＰＳＰ症例の初期症状は、不意に転倒する（通常は後ろに転倒）傾向を伴う。他の一般的症状として、頸部の固縮と後屈、および診断上の重要な特徴である核上性麻痺が挙げられる。核上性麻痺は、「意志による」上下注視の困難、すなわち、患者が頭を動かさずに随意的に眼を上下に動かす能力の障害である。ＰＳＰ患者の歩行は軽度に不安定であり、歩隔が拡大する。ＰＳＰは、パーキンソン病に似た症状を特徴とする障害である（不安定歩行、硬直動作、および軽度認知症を含む）。初期においてはパーキンソン病と誤診されやすい。ＰＳＰの他の徴候として、小さく判読しづらい手書き文字、および人格の若干の変化がよく見られる。認知症状としては、発話流ちょう性の低下、注意欠陥、実行機能不全、情報処理速度の低下、および複雑で抽象的な思考の障害が挙げられる。それにもかかわらず、患者は、現在起きていることを非常によく認識している。行動変化としては、情動不安定および感情爆発が挙げられる。必ず、認知変化に先行して運動症状が最初に現れる。疾患の進行は５〜１０年と緩慢である。発症年齢は一般に５０歳以上であり、罹病期間は７年である。治療法は、症状の抑制を狙いとする。進行性核上性麻痺の公知の治癒法は存在しない。レボドパおよび抗コリン剤で一時的に症状を軽減できることがある。
【００５２】
大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）または大脳皮質基底核神経節変性症（ＣＢＧＤ）は、大脳皮質と基底核が関係する希な進行性神経変性疾患であり、顕著な運動障害と認知機能障害を特徴とする。ＣＢＤは、パーキンソン病（ＰＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）などの他の疾患と症状が似ているため、臨床診断は困難である。ＣＢＤは本質的に散発性である。多くの皮質下核が変性に冒され、前頭部および頭頂部の新皮質に変性が広がり、ニューロン内の病変部およびアストロサイトにタウタンパク質が凝集することが原因である。遺伝的危険因子は、タウ遺伝子中のＨ１Ｈ１である。ＣＢＤは４Ｒタウオパチー（４つのリピートを有するタウアイソフォームの凝集）に属する（Ｓｅｒｇｅａｎｔ  Ｎ．，  Ｗａｔｔｅｚ  Ａ．  ａｎｄ  Ｄｅｌａｃｏｕｒｔｅ  Ａ．  （１９９９）  Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ  ａｎｄ  ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：  ｔａｕ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ  ｅｘｏｎ  １０  ｉｓｏｆｏｒｍｓ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７２，  １２４３−１２４９。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。症状としては、協調運動不全、アキネジア（無動）、固縮（運動強要に対する抵抗）、平衡障害（障害性バランス）などのパーキンソニズム；および四肢異緊張症（筋肉の異常姿勢）が挙げられる。この他に、認知・視空間障害、先行症（慣れ親しんだ故意の動作を行う能力の喪失）、発話の躊躇・停止、間代性筋けいれん、および嚥下障害（飲み下し困難）などの症状が発生することもある。ＣＢＤは進行性疾患であり、１年〜数年の過程に渡って大部分のＣＢＤ患者は徐々に悪化し、症状は上肢、下肢、および他の身体領域へと進行する。発症年齢は６０歳前後である。罹病期間は５〜１０年である。現在、この疾患の進行を遅らせることのできる薬剤その他の治療法は存在せず、症状を軽減できるものはほとんどない。クロナゼパムなどの薬剤を用いて、振戦および間代性筋けいれんを多少抑制できる場合がある。バクロフェンが固縮の若干の軽減に寄与し得る。パーキンソン病で使われているレボドパなどのドーパミン作用薬は、有益であることは希であるが、一部のＣＢＤ患者に役立つことがある。
【００５３】
前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）は、脳の前頭葉および側頭葉の萎縮に関連し、頭頂葉および後頭葉は維持する、臨床的、病理学的、および遺伝学的に異種性の障害群を表す名称である。年齢６５歳超のグループでは、ＦＴＬＤはおそらく、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、血管性認知症に次いで４番目に多い認知症原因である。６５歳未満のグループでは、ＦＴＬＤはアルツハイマー病に次いで２番目に多い認知症原因である。一部の患者では、ＦＴＬＤの症状はアルツハイマー病と重複することがある。ＦＴＬＤの臨床プロフィールの原因となる病理過程は異種的であり、主として、タウ遺伝子またはタウタンパク質の種々の機能障害（突然変異、凝集、異常産生）に関連する。患者の皮質、より特定的には前頭側頭領域に様々な種類の脳病変が蓄積することで、これらの種々の異常な過程が明らかになる（ピック小体、神経原線維変化、アストロサイト斑）。
【００５４】
パンチドランカー（ＤＰ）は、神経変性疾患または認知症の一種であり、アマチュアボクサーまたはプロボクサーの他、脳振盪を起こす他のスポーツ選手に影響し得る。この疾患は、慢性ボクサー脳症、外傷性ボクサー脳症、ボクサー認知症、ボクシングに関連する慢性外傷性脳損傷（ＣＴＢＩ−Ｂ）、パンチドランク症候群（「パンチー」）とも呼ばれるほか、異型の１つとして、慢性外傷性脳症という呼称もある。ＤＰの症状および兆候は長期の潜伏期（何十年に及ぶこともある）に渡って進行的に発生し、平均発症時期はボクサーとしてのキャリア開始から約１２〜１６年後である。プロボクサーの約１５〜２０％が、この状態に冒されると考えられている。この状態は、頭部に繰り返し打撃を受けたボクサーに発生するものであり、認知症、知能低下、記憶障害、パーキンソニズム、または振戦および協調運動障害として現れる。発話障害と不安定歩行が生じることもある。ＤＰ患者は、不適切または爆発的な挙動をする傾向があり、病的嫉妬または妄想性障害を現すことがある。このような症状を現す個人を、ＤＰ患者の別の呼称である「パンチー」と特徴付けることもできる。ＤＰ患者の脳は萎縮し、例えば小脳のニューロンが消失している。患者は、アルツハイマー病およびパーキンソニズムで使われる薬剤で治療され得る。
【００５５】
本明細書のさらなる実施形態は、タウオパチー関連の合併症を防止または軽減するための（例えば認知機能障害の症状の軽減を含む）治療用組成物および治療方法に関する。
【００５６】
界面動電的に生成された流体：
本明細書で使用する「界面動電的に生成された流体」とは、本明細書の実施例の目的上、本明細書に詳述される代表的な混合装置により生成される、本出願人の発明による界面動電的に生成された流体を指す（米国公開特許第２００８０２１９００８８号および国際公開第２００８／０５２１４３号も参照のこと。両方とも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書に開示され提示されるデータが示すように、界面動電流体は、先行技術である含酸素化非界面動電流体（例えば、加圧ポット含酸素化流体等）を含む、先行技術である非界面動電流体と比べて、新規かつ根本的に異なる流体を表す。本明細書の様々な態様で開示されるように、界面動電的に生成された流体は、独特かつ新規の物理的および生物学的特性を有する。例えば下記の特性を含むが、これらに限定されない。
【００５７】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含み、この流体により生細胞に接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される。
【００５８】
特定の態様では、界面動電的に生成された流体とは、本明細書に記載される装置機能局在化効果等の、流体力学的に誘起され、局在化した（例えば、全流体体積に関して不均一な）界面動電効果（例えば、電圧／電流パルス）の存在下で生成された流体を指す。特定の態様では、この流体力学的に誘起され局在化した界面動電効果は、本明細書に開示され論じられるように、表面に関連した二重層および／または流動電流効果と組み合わされる。
【００５９】
特定の態様では、投与される本発明の界面動電的に改変された流体は、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、帯電安定化した酸素含有ナノ構造を含む。ある実施形態では、界面動電的に改変された流体は、過酸素化される（例えば、標準食塩水中、それぞれ、２０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの溶解酸素を含む、ＲＮＳ−２０、ＲＮＳ−４０、およびＲＮＳ−６０である）。特定の実施形態では、界面動電的に改変された流体は、過酸素化されない（例えば、１０ｐｐｍ（例えば、標準食塩水中ほぼ周囲レベルの溶解酸素）を含むＲＮＳ−１０またはＳｏｌａｓである）。ある態様では、本発明の界面動電的に改変された流体の塩分、無菌性、ｐＨ等は、流体が界面動電的に生成されるときに確立され、適切な経路により滅菌流体が投与される。あるいは、流体の塩分、無菌性、ｐＨ等のうちの少なくとも１つは、流体の投与前に、投与経路に生理学的に適合するように、（例えば、滅菌食塩水または適切な希釈剤を用いて）適切に調整される。好ましくは、流体の塩分、無菌性、ｐＨ等のうちの少なくとも１つを調整するために使用される希釈剤および／または食塩溶液および／または緩衝組成物も、界面動電流体であるか、または他の手段により適合性を有する。
【００６０】
特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体は、食塩水（例えば、１つ以上の溶解塩；例えば、アルカリ金属ベースの塩（Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋等）、アルカリ土類ベースの塩（例えば、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋）等、または遷移金属ベースの陽イオン（例えば、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ等）を含み、いずれの場合も、任意の好適なアニオン成分（Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＰＯ４−、ＳＯ４−、および窒素ベースのアニオンが含まれるが、これらに限定されない）を共に含む。特定の態様は、種々の組み合わせおよび濃度において、かつ任意で対イオンの混合物と共に、混合塩ベースの界面動電流体（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、遷移金属イオン等）を含む。特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体は、標準食塩水（例えば、約０．９％  ＮａＣｌまたは約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）を含む。特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体は、濃度が少なくとも０．０００２Ｍ、少なくとも０．０００３Ｍ、少なくとも０．００１Ｍ、少なくとも０．００５Ｍ、少なくとも０．０１Ｍ、少なくとも０．０１５Ｍ、少なくとも０．１Ｍ、少なくとも０．１５Ｍ、または少なくとも０．２Ｍの食塩水を含む。特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体の伝導率は、少なくとも１０μＳ／ｃｍ、少なくとも４０μＳ／ｃｍ、少なくとも８０μＳ／ｃｍ、少なくとも１００μＳ／ｃｍ、少なくとも１５０μＳ／ｃｍ、少なくとも２００μＳ／ｃｍ、少なくとも３００μＳ／ｃｍ、または少なくとも５００μＳ／ｃｍ、少なくとも１ｍＳ／ｃｍ、少なくとも５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも４０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも８０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１００ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１５０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも２００ｍＳ／ｃｍ、少なくとも３００ｍＳ／ｃｍ、または少なくとも５００ｍＳ／ｃｍである。特定の態様では、本明細書に開示される生物活性塩安定化ナノ構造（例えば、塩で安定化された酸素含有ナノ構造）の形成を可能にするという条件で、任意の塩を使用して、本発明の界面動電的に改変された流体を調製してよい。
【００６１】
特定の態様によれば、帯電安定化したガス含有のナノ構造を含む本発明の流体組成物の生物学的効果は、流体のイオン成分を改変することにより、かつ／または流体のガス成分を改変することにより、調節（例えば、増加、減少、調整等）することができる。
【００６２】
特定の態様によれば、帯電安定化したガス含有のナノ構造を含む本発明の流体組成物の生物学的効果は、流体のガス成分を改変することにより、調節（例えば、増加、減少、調整等）することができる。好ましい態様では、本発明の界面動電流体の調製時に酸素を使用する。さらなる態様では、窒素、酸素、アルゴン、二酸化炭素、ネオン、ヘリウム、クリプトン、水素、およびキセノンから選ばれる少なくとも１つの他のガスと酸素の混合物を使用する。上述のように、ガス成分を変化させることを伴うことを含め、イオンを変化させてもよい。
【００６３】
本明細書に開示される教示事項およびアッセイシステム（例えば、細胞ベースのサイトカインアッセイ、パッチクランプアッセイ等）から、当業者であれば、本明細書に開示される生物活性を達成するための適切な塩およびその濃度を容易に選択できるであろう。
【００６４】
表１．代表的なカチオンおよびアニオン
【表１−１】
2013533320.tif 000003
【表１−２】
2013533320.tif 000004
【００６５】
【表２−１】
2013533320.tif 000005
【表２−２】
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【００６６】
表２．代表的なカチオンおよびアニオン
【表３】
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【００６７】
【表４】
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【００６８】
【表５】
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【００６９】
【表６】
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【００７０】
【表７】
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【００７１】
本開示は新規のガス富化流体について記載しており、このガス富化流体には、糖尿病および糖尿病関連障害の治療に有用な、ガス富化イオン水溶液、水性食塩溶液（例えば、標準の水性食塩溶液、および本明細書で論じられ、かつ当技術分野でも認識されると考えられる、生理学的に適合する任意の食塩溶液を含む他の食塩溶液）、細胞培養培地（例えば、最小培地、および他の培養培地）が含まれるが、これらに限定されない。培地が成長に必須の栄養素のみを含む場合、「最小」培地と称する。原核生物の宿主細胞に関しては、最小培地は、一般に、炭素、窒素、リン、マグネシウム、ならびに微量の鉄およびカルシウムの源を含む（Ｇｕｎｓａｌｕｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｔｅｒ，  Ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，  Ｖ．  １，  Ｃｈ．  １  Ａｃａｄ．  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｎ．Ｙ．  （１９６０））。ほとんどの最小培地は、炭素源としてグルコース、窒素源としてアンモニア、およびリン源としてオルトリン酸塩（例えば、ＰＯ４）を使用する。標的タンパク質の産生を阻害することなく最適な成長を促すため、成長させる特定の原核生物または真核生物に応じて、培地成分を変更または補足することができる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２７：  ８１８−８２４  （１９８５））。
【００７２】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、その中に溶解されるレポーター溶質（例えば、トレハロース）の１３Ｃ−ＮＭＲの線幅を調節するのに適している。ＮＭＲ線幅効果は、例えば、本明細書の特定の実施例で説明されているように、試験流体中の溶質の「タンブリング」を測定する間接的方法におけるものである。
【００７３】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、−０．１４Ｖ、−０．４７Ｖ、−１．０２Ｖ、および−１．３６Ｖのうちのいずれか１つでの特徴的な矩形波ボルタンメトリーピーク差；−０．９ボルトでのポーラログラフピーク；ならびに−０．１９および−０．３ボルトでのポーラログラフピークの不存在のうちの少なくとも１つによって特徴付けられ、これらは、本明細書の特定の実施例に開示されるように、界面動電的に生成された流体に特有のものである。
【００７４】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、細胞膜伝導性（例えば、本明細書に開示されるパッチクランプ実験において測定される、全細胞伝導性の電位依存性寄与）を改変するのに適している。
【００７５】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は含酸素化され、流体中の酸素は、大気圧において、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの溶解酸素量で存在する。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、大気圧で、またはおおよその周囲酸素レベルで、１５ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満の溶解酸素を有する。
【００７６】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は含酸素化され、流体中の酸素は約８ｐｐｍ〜約１５ｐｐｍの量で存在し、この場合、本明細書では「Ｓｏｌａｓ」とも称する。
【００７７】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、溶媒和電子（例えば、酸素分子により安定化されたもの）、および界面動電的に修飾され、かつ／または帯電した酸素種のうちの少なくとも１つを含み、ある実施形態では、この溶媒和電子および／または界面動電的に修飾もしくは荷電された酸素種は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。
【００７８】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、対照の非界面動電的に改変された流体に対して異なる（例えば、上昇または低下した）誘電率で特徴付けられる。好適な態様では、界面動電的に改変された流体は、対照の非界面動電的に改変された流体に対して異なる、上昇した誘電率で特徴付けられる。誘電率（ε）（ファラド毎メートル）とは、ある物質が電場により極性を与えられ、それにより物質内の総電場を低減する能力の尺度である。したがって、誘電率（ｐｅｒｍｉｔｔｉｖｉｔｙ）は、物質が電場を伝導する（すなわち「許可」（ｐｅｒｍｉｔ）する）能力に関係する。密接に関係する特性の１つであるキャパシタンス（Ｃ）（ファラド；クーロン／ボルト）は、ある物質の両端に電圧をかけた場合に、その物質が電荷を保持する能力を示す尺度である（例えば、２枚の並行した導電板に挟まれた誘電体層が最良モデルである）。キャパシタンスＣのコンデンサの両端に電圧Ｖを印加した場合、コンデンサが保持できる電荷Ｑは印加電圧Ｖに正比例し、キャパシタンスＣが比例定数となる。したがって、Ｑ＝ＣＶすなわちＣ＝Ｑ／Ｖとなる。コンデンサのキャパシタンスは、誘電体層の誘電率εによって異なるだけでなく、コンデンサの面積Ａ、および２枚の導電板間の分離距離ｄによっても異なる。誘電率とキャパシタンスの数学的関係は、Ｃ＝ε（Ａ／ｄ）である。使用する誘電体が真空である場合、キャパシタンスＣｏ＝εｏ（Ａ／ｄ）となる。ここで、εｏは真空の誘電率（８．８５×１０−１２Ｆ／ｍ）である。比誘電率（ｋ）、すなわち物質の相対誘電率は、真空の誘電率εｏに対する物質の誘電率εの比であり、よってｋ＝ε／εｏである（真空の比誘電率は１）。ｋ値の低い誘電体は、誘電率の低い誘電体であり、すなわち極性を有し電荷を保持する能力が低い。これに対して、ｋ値の高い誘電体は、誘電率が高い。ｋ値の高い誘電体は電荷を保持する能力が高いため、コンデンサ用の好適な誘電体である。ｋ値の高い誘電体は、デジタルデータを電荷の形で保存するメモリーセルにも使用される。
【００７９】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、細胞内シグナル伝達の調節を提供するのに十分なだけ細胞膜構造または機能を改変する（例えば、膜結合タンパク質の立体配座、リガンド結合活性、または触媒活性を改変する）のに適しており、特定の態様では、膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体（例えば、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、ＴＳＬＰ受容体、β２アドレナリン受容体、ブラジキニン受容体等）、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、およびインテグリンからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。ある態様では、作用を受けたＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｇタンパク質αサブユニット（例えば、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ、およびＧα１２）と相互作用する。
【００８０】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、細胞内シグナル伝達を調節するのに適しており、この調節は、カルシウム依存性の細胞伝達経路またはシステムの調節（例えば、ホスホリパーゼＣ活性の調節、またはアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節）を含む。
【００８１】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、実施例および本明細書の他の箇所に記載される、種々の生物学的活性（例えば、サイトカイン、受容体、酵素、および他のタンパク質、ならびに細胞内シグナル経路の調節）により特徴付けられる。
【００８２】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、グラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／またはナタリズマブとの相乗効果を示す。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、本明細書の実施例に示されるように、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）におけるＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現を低下させる。
【００８３】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、本明細書の実施例に示されるように、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）におけるＤＥＰ誘発された細胞表面結合ＭＭＰ９のレベルを抑制する。
【００８４】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体の生物学的効果は、ジフテリア毒素により阻害され、このことは、本明細書の実施例に示されるように、β遮断、ＧＰＣＲ遮断、カルシウムチャネル遮断が、界面動電的に改変された水性流体の活性（例えば、制御性Ｔ細胞機能に対する活性）に影響を及ぼすことを示す。
【００８５】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体の物理的および生物学的効果（例えば、細胞内シグナル伝達の調節を提供するのに十分な細胞膜構造または機能の改変能力）は、閉鎖された容器内（例えば、閉鎖された気密性容器内）で、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、またはそれ以上の期間持続する。
【００８６】
したがって、さらなる態様は、このような界面動電的に生成された溶液を提供し、界面動電的に改変された含酸素化水性流体または溶液を生産する方法を提供する。本方法は、相対運動で２つの相隔てる表面の間に流体物質の流れを提供し、それらの間の混合体積を画定することと（ここで、混合体積内また混合体積を通過して流動流体物質が１回移動する際の滞留時間は０．０６秒超または０．１秒超である）、流動流体物質中に少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素を溶解し流体または溶液を界面動電的に改変するのに適した条件下で、混合体積内において酸素（Ｏ２）を流動流体物質に導入することと、を含む。ある態様では、酸素は、１００ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、または４００ミリ秒未満の間に流動流体物質中に注入される。特定の実施形態では、体積に対する表面積の比は、少なくとも１２、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０である。
【００８７】
さらなる態様は、界面動電的に改変された含酸素化水性流体または溶液を生産する方法を提供し、本方法は、２つの相隔てる表面の間に流体物質の流れを提供し、それらの間の混合体積を画定することと、１００ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、または４００ミリ秒未満において、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、もしくは少なくとも６０ｐｐｍの酸素を流動流体物質に注入するのに適した条件下で、混合体積内において酸素を流動流体物質に導入することと、を含む。ある態様では、混合体積内での流動物質の滞留時間は、０．０６秒超または０．１秒超である。特定の実施形態では、体積に対する表面積の比は、少なくとも１２、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０である。
【００８８】
さらなる実施形態は、界面動電的に改変された含酸素化水性流体または溶液を生産する方法を提供し、本方法は、第１の物質と第２の物質を混合することにより出力混合物を作製するための混合装置の使用を含み、この装置は、第１の物質の源から第１の物質を受容するように構成された第１のチャンバと；固定子と；回転軸を有する回転子であって、固定子内部に配設され、その中の回転軸の周囲を回転するように構成され、回転子および固定子のうちの少なくとも１つは、複数のスルーホールを有する、回転子と；回転子と固定子の間に画定される混合チャンバであって、第１のチャンバと流体連通し、そこから第１の物質を受容するように構成され、第２の物質は、回転子および固定子のうちの１つに形成された複数のスルーホールを介して混合チャンバに提供される、混合チャンバと；混合チャンバと流体連通し、そこから産出物質を受容するように構成された、第２のチャンバと；第１のチャンバ内部に格納された第１の内部ポンプであって、第１のチャンバから混合チャンバに第１の物質を送出するように構成される、第１の内部ポンプと、を含む。ある態様では、第１の内部ポンプは、第１の物質が混合チャンバに流入する前に第１の物質に周速度を与えるように構成される。
【００８９】
さらなる実施形態は、界面動電的に改変された含酸素化水性流体または溶液を生産する方法を提供し、本方法は、第１の物質と第２の物質を混合することにより出力混合物を作製するための混合装置の使用を含み、この装置は、固定子と；回転軸を有する回転子であって、固定子内部に配設され、その中の回転軸の周囲を回転するように構成される回転子と；回転子と固定子の間に画定される混合チャンバであって、第１の物質が混合チャンバに入る際に通る第１の開口末端と、産出物質が混合チャンバを出る際に通る第２の開口末端と、を有し、第２の物質が回転子と固定子のうちの少なくとも１つを通って混合チャンバに流入する、混合チャンバと；混合チャンバの第１の開口末端の少なくとも大部分と連通する第１のチャンバと；混合チャンバの第２の開口末端と連通する第２のチャンバと、を含む。
【００９０】
追加の態様は、上記の方法のいずれかに従って作製された、界面動電的に改変された含酸素化水性流体または溶液を提供する。特定の態様では、投与される本発明の界面動電的に改変された流体は、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、帯電安定化した酸素含有ナノ構造を含む。ある実施形態では、界面動電的に改変された流体は、過酸素化される（例えば、標準食塩水中、それぞれ、２０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの溶解酸素を含む、ＲＮＳ−２０、ＲＮＳ−４０、およびＲＮＳ−６０である）。特定の実施形態では、界面動電的に改変された流体は、過酸素化されない（例えば、１０ｐｐｍ（例えば、標準食塩水中ほぼ周囲レベルの溶解酸素）を含むＲＮＳ−１０またはＳｏｌａｓである）。ある態様では、本発明の界面動電的に改変された流体の塩分、無菌性、ｐＨ等は、流体が界面動電的的に生成されるときに確立され、適切な経路により滅菌流体が投与される。あるいは、流体の塩分、無菌性、ｐＨ等のうちの少なくとも１つは、流体の投与前に、投与経路に生理学的に適合するように、（例えば、滅菌食塩水または適切な希釈剤を用いて）適切に調整される。好ましくは、流体の塩分、無菌性、ｐＨ等のうちの少なくとも１つを調整するために使用される希釈剤および／または食塩溶液および／または緩衝組成物も、界面動電流体であるか、または他の手段によりこれらと適合性を有する。
【００９１】
本開示は、新規のガス富化流体について記載しており、このガス富化流体には、ガス富化イオン水溶液、水性食塩溶液（例えば、標準の水性食塩溶液、および本明細書で論じられ、かつ当技術分野でも認識されると考えられる、生理学的に適合する任意の食塩溶液を含む他の食塩溶液）、細胞培養培地（例えば、最小培地、および他の培養培地）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
炎症
炎症は、異物、特に微生物起源の異物による侵入に対する対象の防衛反応として発生し得る。加えて、機械的外傷、毒素、および新生組織形成が炎症反応を誘発する場合がある。白血球の蓄積およびその後の活性化が、大部分の炎症形態の発症原因における主要な事象である。炎症による欠失は、宿主を弱化させ、感染症または創傷を悪化させやすい状態にし得る。長期的炎症反応等の過度の炎症は、糖尿病、動脈硬化症、白内障、慢性皮膚疾患、再かん流傷害、および癌が挙げられるが、これらに限定されない炎症性疾患、感染性髄膜炎、リウマチ熱等の感染後症候群、全身性エリテマトーデスおよびリウマチ性関節炎等のリウマチ性疾患を引き起こし得る。これらの疾患は、毎年世界中の何百万人もの人々に発症し、死亡率および罹患率の増加を引き起こす。これらの様々な疾病過程における炎症反応に共通性があるため、その調節が、ヒト疾患の予防および治療における主要素となっている。
【００９３】
炎症性サイトカインの過剰産生は、多数の炎症性および自己免疫疾患の発症原因に関連付けられている。ＴＮＦαの分泌は、炎症カスケードの開始において、初期事象であり（Ｂｒｅｎｎａｎ  Ｆ．  Ｍ．，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ，  １９８９，  ２：２４４−７；  Ｈａｗｏｒｔｈ  Ｃ，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９１，  ２１：２５７５−２５７９）、これらの疾患の開始および維持に直接的に寄与する。インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、一酸化窒素（ＮＯ）、ＩＦＮ−γ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびＩＬ−１０を含む他のサイトカインも、何らかの役割を果たす。これらのサイトカインの一部（例えば、ＩＬ−８）は、炎症反応を増加または悪化させ得るが、他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）は、炎症反応を軽減または緩和させ得る。
【００９４】
免疫系の細胞、特にマクロファージは、活性化刺激に反応してこれらのサイトカインの多くを分泌する。サイトカインの標的細胞は、任意の身体区画に局在化し得、長距離機序を介して、または隣接細胞に対して作用し得る。したがって、サイトカインは、局部的に、または全身に渡って炎症を調節し得る。
【００９５】
メタロプロテイナーゼ
メタロプロテイナーゼは、例えばＮ．  Ｍ．  Ｈｏｏｐｅｒ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５４：１−６，  １９９４に記載されているようなファミリーおよびサブファミリーに分類されるプロテイナーゼ（酵素）のスーパーファミリーである。メタロプロテイナーゼの例としては、コラゲナーゼ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１３）、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９）、ストロメライシン（ＭＭＰ３、ＭＭＰ１０、ＭＭＰＩＩ）、マトリリシン（ＭＭＰ７）、メタロエラスターゼ（ＭＭＰ１２）、エナメリシン（ＭＭＰ１９）、ＭＴ−ＭＭＰ（ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７）等のマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）；ＴＮＦ変換酵素（ＡＤＡＭ１０およびＴＡＣＥ）等のセクレターゼおよびシェダーゼを含む、レプロリシンもしくはアダマリシンまたはＭＤＣファミリー；プロコラーゲン処理プロテイナーゼ（ＰＣＰ）等の酵素を含む、アスタシンファミリー；ならびにアグリカナーゼ、エンドセリン変換酵素ファミリー、およびアンジオテンシン変換酵素ファミリー等の他のメタロプロテイナーゼが挙げられる。集合的に、メタロプロテイナーは、コラーゲン、プロテオグリカン、およびフィブロネクチン等の広範囲のマトリクス基質を開裂することが知られている。メタロプロテイナーゼは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等の生物学的に重要な細胞メディエーターの処理または分泌；および低親和性ＩｇＥ受容体ＣＤ２３等の生物学的に重要な膜タンパク質の翻訳後タンパク質分解処理または脱落に関連付けられている（例えば、Ｎ．  Ｍ．  Ｈｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３２１：２６５−２７９，  １９９７を参照のこと）。
【００９６】
したがって、当然のことながら、メタロプロテイナーゼは、組織の再構築（例えば、胚発生、骨形成、月経中の子宮の再構築等）を伴う、多くの生理的疾病プロセスにおいて重要であると考えられる。さらに、１つ以上のメタロプロテイナーゼの活性の阻害は、これらの疾病または状態、例えば、関節の炎症（特に、関節リウマチ、変形性関節炎、および痛風）、胃腸管の炎症（特に、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、および胃炎）、皮膚の炎症（特に、乾癬、湿疹、皮膚炎）等の様々な炎症性およびアレルギー性疾患；腫瘍転移または浸潤；変形性関節炎等の細胞外マトリクスの抑制されない分解に関連する疾病；骨吸収疾病（骨粗しょう症およびパジェット病等）；異常血管形成に関連する疾病；糖尿病に関連するコラーゲンの再構築の亢進、歯周病（歯肉炎等）、角膜潰瘍、皮膚の潰瘍、術後疾患（結腸吻合等）、および真皮創傷治癒；中枢および末梢神経系の脱髄疾患（多発性硬化症等）；アルツハイマー病；再狭窄およびアテローム性動脈硬化症等の心臓血管疾患において観察される細胞外マトリクスの再構築；喘息；鼻炎；ならびに慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＥＤ）において、十分有効であり得る。
【００９７】
ＭＭＰ１２は、マクロファージエラスターゼあるいはメタロエラスターゼとしても知られ、最初はマウスにおいてクローン化され（Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７：  ４６６４，  １９９２）、１９９５年に、同じグループによりヒトでもクローン化された。ＭＭＰ１２は、活性化マクロファージにおいて優先的に発現され、喫煙者からの肺胞マクロファージから（Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２６８：  ２３８２４）、ならびにアテローム性硬化症の病変部における泡沫細胞中で（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １５３：  １０９，  １９９８）、分泌されることが示された。ＣＯＰＤのマウスのモデルは、６ヶ月間、１日当たり２本、週６日タバコの煙でのマウスへの刺激に基づいている。野生型マウスは、この処置の後に肺気腫を発症した。ＭＭＰ１２ノックアウトマウスをこのモデルにおいてテストすると、有意な気腫を発症せず、ＭＭＰ１２がＣＯＰＤ病因の鍵酵素であることを強く示唆した。ＣＯＰＤ（気腫および気管支炎）におけるＭＭＰ１２等のＭＭＰの役割は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎａｇａｗａ，  １９９９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  １（１）：  ２９−３８で考察されている。近年、喫煙はヒト頸動脈プラークにおけるマクロファージ浸潤およびマクロファージ由来ＭＭＰ−１２発現を増加させることが発見された（Ｍａｔｅｔｚｋｙ  Ｓ，  Ｆｉｓｈｂｅｉｎ  Ｍ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０２：（１８），  ３６−３９  Ｓｕｐｐｌ．  Ｓ，  Ｏｃｔ．  ３１，  ２０００）。
【００９８】
ＭＭＰ９−（ゼラチナーゼＢ；９２ｋＤａ−ＩＶ型コラゲナーゼ；９２ｋＤａゼラチナーゼ）は、１９８９年に、初めて精製され、次いでクローン化し配列決定された分泌タンパク質である（Ｓ．  Ｍ．  Ｗｉｌｈｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４  （２９）：  １７２１３−１７２２１，  １９８９；誤植公開、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５  （３６）：  ２２５７０，  １９９０）（このプロテアーゼに関する詳細な情報および参考文献の総説については、Ｔ．  Ｈ．  Ｖｕ  ＆  Ｚ．  Ｗｅｒｂ  （１９９８）  （Ｉｎ：  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，  １９９８，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｗ．  Ｃ．  Ｐａｒｋｓ  ＆  Ｒ．  Ｐ．  Ｍｅｃｈａｍ，  ｐｐ．  １１５−１４８，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．  ＩＳＢＮ  ０−１２−５４５０９０−７）を参照のこと）。ＭＭＰ９の発現は通常、栄養膜、破骨細胞、好中球、およびマクロファージを含む、数個の細胞型に制限される（Ｖｕ  ＆  Ｗｅｒｂ、上記を参照）。しかしながら、発現は、成長因子またはサイトカインへの細胞の曝露を含む、いくつかのメディエーターにより、これらの同一の細胞または他の細胞型において誘起され得る。これらは、炎症反応の開始に関連付けされることの多い同一のメディエーターである。他の分泌ＭＭＰと同様に、ＭＭＰ９は、不活性な酵素前駆体として放出され、続いて切断されて、酵素的に活性な酵素を形成する。インビボでのこの活性化に必要とされるプロテアーゼは知られていない。活性ＭＭＰ９対不活性酵素のバランスは、ＴＩＭＰ−１（メタロプロテイナーゼ−１組織阻害剤）という自然発生タンパク質との相互作用により、インビボでさらに調節される。ＴＩＭＰ−１は、ＭＭＰ９のＣ末端領域に結合し、ＭＭＰ９の触媒ドメインの阻害をもたらす。ＭＭＰ９前駆体の誘導発現のバランス、前駆体から活性ＭＭＰ９への切断、およびＴＩＭＰ−１の存在が組み合わされて、局所部位に存在する触媒活性ＭＭＰ９の量が決定される。タンパク質分解活性ＭＭＰ９は、ゼラチン、エラスチン、ならびに天然ＩＶ型およびＶ型コラーゲを含む基質を攻撃するが、天然Ｉ型コラーゲン、プロテオグリカン、またはラミニンに対する活性はない。様々な生理学的および病理学的プロセスにおけるＭＭＰ９の役割を関係づけるデータが増えている。生理学的役割は、胚着床の初期段階における子宮上皮を通じた胚栄養膜の浸潤；骨の成長および発達における何らかの役割；および血管系から組織への炎症細胞の移動を含む。
【００９９】
酵素免疫測定法を使用して測定されるＭＭＰ９放出は、他の集団と比較して、未治療の喘息患者からの体液およびＡＭ上清中で有意に増強された（Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐ．  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５：５８３−５９１，  １９９７）。また、ＭＭＰ９発現の増加が、特定の他の病的状態において観察され、このことにより、ＣＯＰＤ、関節炎、腫瘍転移、アルツハイマー病、多発性硬化症、および心筋梗塞等の急性の冠動脈疾患をもたらすアテローム性動脈硬化症におけるプラーク破裂等の疾病プロセスに、ＭＭＰ９が関連付けられている（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０７０８７６３７Ａ３号も参照のこと）。
【０１００】
近年、ＭＭＰ−９のレベルは、健常な対照対象と比較して、安定している喘息患者において有意に増加し、急性喘息患者ではさらに高いことが示されている。ＭＭＰ−９は、気道炎症細胞の浸潤および気道過敏性の誘起において重要な役割を果たし、ＭＭＰ−９が、喘息を誘起し維持する上で重要な役割を有し得ることを示している（Ｖｉｇｎｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｐｕｔｕｍ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９／ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｒａｔｉｏ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｉｒｆｌｏｗ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ，  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １５８：１９４５−１９５０，  １９９８；  Ｈｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｈａｌｅｄ  ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｓｕｂｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ，  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０４：３５６−３６３，  １９９９；  Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ  ａｓｔｈｍａ，  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １７２：５５９−５６５，２００５；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｏｌｕｅｎｅ  ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｓｔｈｍａ  ｃａｎ  ｂｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０８：１０２１−１０２６，  ２００１；  ａｎｄ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ＩＣＡＭ−１  ａｎｄ  ＶＣＡＭ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｏｌｕｅｎｅ  ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｓｔｈｍａ，  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１１１：１２７８−１２８４）。
【０１０１】
ＭＭＰ阻害剤：
多くのメタロプロテイナーゼ阻害剤が知られている（例えば、Ｂｅｃｋｅｔｔ  Ｒ．  Ｐ．  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍ．，  １９９８，  Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｐａｔｅｎｔｓ，  ８（３）：２５９−２８２；  ａｎｄ  ｂｙ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  １９９９，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９９（９）：２７３５−２７７６によるＭＭＰ阻害剤の概説を参照のこと）。国際公開第０２／０７４７６７号は、ＭＭＰ阻害剤として、特に強力なＭＭＰ１２阻害剤として有用である、ある式のヒダントイン誘導体を開示している。米国特許出願第１１／７２１，５９０号（第２００８００３２９９７号として公開）は、メタロプロテイナーゼの阻害剤であり、ＭＭＰ１２およびＭＭＰ９等のＭＭＰの阻害において特に着目される、ヒダントイン誘導体のさらなるグループを開示している。ＭＭＰ１２、ＭＭＰ９等のＭＭＰを阻害するための新規トリアゾロン誘導体は、米国特許出願第１０／５９３５４３号（第２００７０２１９２１７号として公開）に開示されている。さらなるＭＭＰ１２およびＭＭＰ９阻害剤は、第１１／５０９，４９０号（第２００６０２８７３３８号として公開）に開示されている（第１０／８３１２６５号（第２００４０２５９８９６号として公開）も参照のこと）。
【０１０２】
加えて、４−（４−フェノキシフェニルスルホニル）ブタン−１，２−ジチオール（１）および５−（４−フェノキシフェニルスルホニル）ペンタン−１，２−ジチオール（２）という２つの化合物は、選択的に結合して、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を強力に阻害することが示されている（Ｂｅｒｎａｒｄｏ，  ｅｔ．  ａｌ  （２００２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：１１２０１−１１２０７）。この２つの化合物は、ＭＭＰ−２および−９を阻害するために医療の場で有意に使用され、炎症を軽減し得る。加えて、あるテトラサイクリン抗生物質（例えば、ミノサイクリンおよびドキシサイクリン）の抗生濃度より低い濃度での使用は、ＭＭＰ活性を効果的に阻害することが示されている。本発明のある態様は、ＭＭＰの阻害に有用な補助的抗菌レベルと組み合わせて本発明の流体を用いることを含む。
【０１０３】
治療方法
「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患、障害、もしくは状態、またはこれらの１つ以上の症状を正常化、緩和、その進行を阻害、または予防することを指し、かつこれらの意味を含意し、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「治療的に（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ）」とは、本明細書に定義されるように、治療の行為を指す。
【０１０４】
「治療有効量」は、疾患、障害、もしくは状態、またはこれらの１つ以上の症状を正常化、緩和、その進行を阻害、または予防する上で十分な、本明細書に提供される本発明を実践する過程において利用される任意の化合物の任意の量である。
【０１０５】
本明細書のある実施形態は、炎症性神経変性疾患等のある状態または疾患と関連する炎症の少なくとも１つの症状を予防するまたは緩和することによる、対象に対する治療組成物および治療方法に関する。例えば、本明細書に開示される治療組成物および／または方法は、多発性硬化症（ＭＳ）、パーキンソン病、アミロイドーシス（例えば、アルツハイマー病）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、プリオン病、およびＨＩＶ関連認知症からなる群より選ばれる１つ以上の状態または疾患を治療または予防するために有用であり得る。
【０１０６】
炎症と関連する多くの状態または疾患は、ステロイド、メトトレキサート、免疫抑制剤（シクロホスファミド、シクロスポリン、アザチオプリン、およびレフルノミド等を含む）、非ステロイド系抗炎症剤（例えば、アスピリン、アセトアミノフェンおよびＣＯＸ−２阻害剤）、金剤、ならびに抗マラリア治療剤を用いて治療されている。これらの薬剤は種々の欠点を有し、副作用には、注射部位反応、発疹、上気道感染、自己免疫疾患および感染に対する感受性の増加等が含まれる。加えて、より簡便で適合性の高い経口経路または局所皮膚経路とは異なり、多くの抗炎症性調合薬は、静脈内（ＩＶ）投与または皮下（ＳＣ）投与を必要とする。したがって、炎症に関連する状態および疾患に対する新規の薬剤および治療方法の開発の必要性が未だに存在する。
【０１０７】
ＭＳに対する現行の治療には、グラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、およびナタリズマブが含まれる。グラチラマー酢酸塩は、ランダムポリマーとして、グルタミン酸、リジン、アラニン、およびチロシンから構成される。グラチラマー酢酸塩は、有効性が限られ、さらに、例えば注射部位のしこり、悪寒、発熱、疼痛、息切れ、頻拍、および不安等の重大な副作用がある。一次進行型ＭＳに罹患した９４３人の患者を使用する重要な臨床試験では、グラチラマー酢酸塩は、身体障害の進行および疾患を停止できなかった（Ｗｏｌｉｎｓｋｙ，  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６１：１３−２４）。
【０１０８】
インターフェロン−βは、線維芽細胞および一部の自然免疫応答により産生される、自然発生のタンパク質である。ＭＳに対する薬物として、インターフェロン−βは、ＭＳの発症を減少させるのに約１８〜３８％効果的である。副作用には、インフルエンザに似た症状および注射部位反応のような軽度のもの、ならびにより重篤なもの（例えば、うつ病、発作、および肝臓障害）が含まれる。
【０１０９】
ミトキサントロンは、ＭＳの治療剤である。ミトキサントロンは、癌の攻撃に用いる化学療法として開発され、ＤＮＡの修復および合成を阻害することにより作用し、癌細胞に対して特異的ではない。ミトキサントロンによる副作用は、かなり重篤となることがあり、嘔気、嘔吐、脱毛、心臓障害、および免疫抑制が含まれる。
【０１１０】
ナタリズマブは、細胞接着分子であるα４インテグリンを標的とするヒト化モノクローナル抗体である。ナタリズマブは、炎症を起こす免疫細胞が血液脳関門を通過するのを防止することにより作用すると考えられる。副作用には、疲労、頭痛、嘔気、風邪、およびアレルギー反応が含まれる。
【０１１１】
概して、これらの薬剤は、非特異的な方法で免疫系を抑制し、疾患の全体的な進行をごくわずかしか抑制しない（Ｌｕｂｅｔｚｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １８：２３７−２４４）。したがって、ＭＳをより良好に治療する治療戦略を開発する必要性が存在する。
【０１１２】
併用療法：
さらなる態様は、本明細書に開示される本発明の方法を提供し、本方法は、併用療法をさらに含み、少なくとも１つの追加の治療剤を患者に投与する。ある態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、グラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、およびナタリズマブ、ならびに／またはＭＭＰの阻害剤からなる群より選ばれる。
【０１１３】
界面動電的に生成されたガス富化流体および溶液の抗炎症活性：
本発明のある態様によれば、本明細書に開示されるガス富化流体および／または溶液は、抗炎症の特性および効果を有し、炎症性神経変性に関連する疾患または障害に罹患している対象の治療のための抗炎症剤として使用できる。図１は、健常な献血者から得た刺激されたリンパ球のサイトカインプロファイルの実験結果を示す。図１に見られるように、本発明の酸素富化流体（水）は、特定のサイトカイン、特に、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＬ−１βの下方制御に影響を及ぼした。
【０１１４】
炎症性サイトカインの産生増加は、多数の炎症性および自己免疫疾患の発症原因に関連付けられている。ＴＮＦαの分泌は、炎症カスケードの開始における主な事象の一つであり（Ｂｒｅｎｎａｎ  Ｆ．  Ｍ．，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ，  １９８９，  ２：２４４−７；  Ｈａｗｏｒｔｈ  Ｃ，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９１，  ２１：２５７５−２５７９）、炎症性および自己免疫疾患の開始および維持に直接的に寄与する。インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、一酸化窒素、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦを含む、他の炎症促進性サイトカインも、ある役割を果たし、他方、ＩＬ−１０等の抗炎症性サイトカインは、疾患を軽減し得る。免疫系の細胞、特にマクロファージは、活性化刺激に反応してこれらのサイトカインの多くを分泌する。
【０１１５】
様々な細胞型が炎症過程に関与する。単球、マクロファージ、および他の免疫細胞によるＴＮＦαの過剰産生は、多数の疾患の発症における主要素である。特にマクロファージおよびＴ細胞は、免疫応答の開始および維持において中心的役割を果たす。マクロファージは、病理的刺激または免疫原性刺激により活性化されると、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、一酸化窒素（ＮＯ）、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦその他を含む多数のサイトカインを放出することにより応答する。Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＮＦ−γ、および他の炎症性サイトカインを放出する。これらのサイトカインは他の免疫細胞を活性化し、サイトカインの一部は、独立した細胞毒としての役割も果たすこともできる。マクロファージおよびＴ細胞に由来する炎症性メディエーターの過剰放出は、特に、正常細胞および周辺組織の損傷をもたらす。
【０１１６】
炎症促進性サイトカインは、ＨＩＶ−ＡＩＤＳ、ならびにサイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、およびヘルペス科ウイルスを含む他のウイルス感染と関連付けられているる。ＴＮＦαは、ヒトサイトメガロウイルスの主要な前初期エンハンサー／プロモーターの基礎活性を増強し、前単球細胞において潜在性ＨＣＭＶ感染の再活性化で何らかの役割を果たし得る（Ｐｒｏｓｃｈ  Ｓ．，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９５，  ２０８：１９７−２０６）。
【０１１７】
また、多くの炎症性サイトカインは、敗血症または内毒素性ショックに罹患した患者の死亡原因となる。例えば、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βは、敗血症、敗血症性ショック、および内毒素性ショックにおいて、既知の中心的な役割を有する。これらのサイトカインの濃度増大は、ホスホリパーゼＡ２（Ｇｒｏｎｉｃｈ  Ｊ．，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９４，  ９３：１２２４−１２３３）およびＮＯシンターゼに対する遺伝子発現の誘導とともに、発熱、低血圧、およびショック（Ｓｍｉｔｈ  Ｊ．  Ｗ．  ｅｔ．  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １９９２，  １０：１１４１−１１５２；  Ｃｈａｐｍａｎ  Ｐ．  Ｂ．，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １９８７，  ５：１９４２−１９５１）と関連する。
【０１１８】
平滑筋細胞からのＮＯの誘導は、敗血症性ショック時に、平均動脈圧および全身血管抵抗の低下を媒介するが、このことはＮＯの基本的な役割を示唆している。したがって、ＩＬ−８、ＩＬ−１β、およびＮＯに対する下方制御効果を標的とする療法は、敗血症、敗血症性ショック、および内毒素性ショックを含む、炎症性の疾患または障害の治療に有益となり得る。
【０１１９】
ＴＮＦαの過剰産生は、糖尿病およびリウマチ性関節炎等の多くの自己免疫疾患の臨床上の徴候に寄与する。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）も、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαレベルの増加によって誘発される。狼瘡患者においては、血清Ｃ反応性タンパク質、ＩＬ−１β、およびＴＮＦαのレベルが対照群よりも高く、炎症反応の増加が疾患において何らかの役割を果たすことを示唆した（Ｌｉｏｕ  Ｌ．  Ｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  ２００１，  １９：５１５−５２３）。ＳＬＥの一形態である神経精神的エリテマトーデス（ＮＰＬＥ）患者の実験により、ＴＮＦαに対するｍＲＮＡを発現する末梢血単核細胞数、および一酸化窒素代謝物質の脳脊髄液濃度が、ＮＰＬＥ疾患の重症度と相関したことが示された（Ｓｖｅｎｕｎｇｓｓｏｎ  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎ．  Ｒｈｅｕｍ．  Ｄｉｓ．  ２００１，  ６０：３７２−９）。
【０１２０】
ＩＬ−１およびＴＮＦαは、動物モデルの様々な急性および慢性反応において、中心的な役割を果たす。加えて、ＩＬ−１１、ＩＦＮα、およびＩＦＮβは、炎症性反応を上方制御する場合もある。反対に、いくつかのサイトカインは、炎症反応の下方制御に関与する（すなわち、特にＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３）。実施例１に記述されているように、本発明のガス富化流体と接触した細胞は、Ｔ３抗原を有する対照培地と比べて、Ｔ３抗原によるＩＦＮ−γレベルの増加を示し、一方、Ｔ３抗原を有する対照培地と比べて、Ｔ３抗原を有する本発明のガス富化培地のＩＬ−８は低かった。加えて、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αのレベルは、ＰＨＡを有する対照培地と比べて、ＰＨＡを有する本発明のガス富化培地の方が低く、一方、ＩＬ−１βレベルは、ＰＨＡを有する対照培地と比べて、ＰＨＡを有する本発明のガス富化流体培地の方が低かった。本発明のガス富化培地単独では、ＩＦＮ−γレベルは対照培地よりも高かった。これらの結果は、抗炎症微小環境と一致する。
【０１２１】
ＮＯは、炎症反応のメディエーターおよびレギュレーターとして認識されている。ＮＯは、病原体に対する細胞毒性作用を有するが、対象自身の組織に悪影響を及ぼすこともある（Ｋｏｒｈｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ４（４）：  ４７１−９，  ２００５）。ＮＯは、可溶性グアニル酸シクラーゼと反応して環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）を形成し、ＮＯの多くの効果を媒介する。ＮＯはまた、分子酸素およびスーパーオキシドアニオンと相互作用して、様々な細胞機能を修飾できる活性酸素種を産生し得る。ＮＯのこれらの間接的な効果は、炎症において重要な役割を持ち、ＮＯは、誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）により大量に産生され、活性酸素種は、活性化した炎症細胞により合成される。
【０１２２】
ケラチン生成細胞、線維芽細胞、内皮細胞のほか、おそらく他の細胞もＮＯを産生し得る。ＮＯの血管作用のいくつかは、血管拡張、血管内皮への血小板粘着の阻害、血管内皮への白血球粘着の阻害、およびスーパーオキシドの除去を含む（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｖ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐ．  ｖ．  １０６  （５）：  １１３９−１１４３）。
【０１２３】
さらに、ＮＯ合成酵素の阻害は、創傷収縮を遅延し、コラーゲン組織を改変し、新表皮の厚さ（ｎｅｏｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）を改変することが示されている（Ａｍａｄｅｕ  ａｎｄ  Ｃｏｓｔａ，  Ｊ．  Ｃｕｔａｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ３３：  ４６５−４７３，  ２００６）。創傷におけるマスト細胞移動および血管形成も、ＮＯの阻害により影響を受ける（同上）。特定の機構理論に拘束されるものではないが、ある実施形態では、本発明のガス富化流体は、局在性および／もしくは細胞内ＮＯの産生または分解を調節し得、このことは、本明細書に開示する実施例部分において例示する多様な創傷治癒効果と一致する。調節経路が可変であるために、本発明のガス富化流体は、ある実施形態ではＮＯの産生を増加させ、かつ／またはＮＯの分解を遅延させ得る一方で、他の実施形態では、ＮＯ産生を減少させ、かつ／またはＮＯの分解を加速させ得る。
【０１２４】
特に、本明細書の実施例９に記述されているように、酸素富化食塩溶液で処置した創傷は、４日目〜１１日目で創傷治癒が増加し、３日目〜１１日目では、酸素富化食塩溶液で処置した創傷の新表皮は、生理食塩水で処置した創傷の表皮の２倍〜４倍の速度で移動したことを示した。この実験はまた、より成熟した表皮層の早期形成で証明されるように、１５日〜２２日間で、酸素富化食塩溶液で処置した創傷の方が高速に分化したことも示した。すべての段階で、通常の治癒と関連する表皮に生じる肥厚は、酸素富化食塩溶液で処置した創傷内では生じなかった。
【０１２５】
したがって、こうした種々の創傷治癒効果に従い、ただし特定の理論に拘束されることを所望せずに、酸素富化食塩溶液は、創傷内で、ＮＯの局在性および／または細胞内レベルを調節し得ると考えられる。ＮＯは、創傷治癒において、成長因子、コラーゲン沈着、炎症、マスト細胞移動、表皮肥厚、および新血管形成を調節する。さらに、一酸化窒素が、酸素により調節される誘導酵素により産生される。
【０１２６】
マスト細胞移動の場合は、酸素富化溶液に対する初期および後期の移動の差異も生じた。このことは、ＮＯ合成の阻害に関する当技術分野の公知の事項と一致する（Ａｍａｄｅｕ  ａｎｄ  Ｃｏｓｔａ，  Ｊ．  Ｃｕｔａｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ３３：  ４６５−４７３，  ２００６）。
【０１２７】
炎症プロセスの最初の２段階では、異物が破壊されるか（例えば、異物が生命体である場合）、その周辺の組織が弛緩する（例えば、異物が破片である場合）かのいずれかである。治癒段階では、炎症が鎮静し始め、個体の血管および脈管パターンが再び正常になり、創傷の修復が開始する。修復プロセスにおける３つの主要事象は、（１）線維芽細胞を増殖することによる新結合組織の形成、（２）上皮の再生、および（３）新しい毛細血管の増生である。
【０１２８】
炎症が鎮静する前でさえ、通常は休眠状態で存在する線維芽細胞が、周囲の正常組織から損傷領域への移動を開始する。線維芽細胞は、アメーバ様運動でフィブリンの鎖に沿って移動し、自身を治癒領域全体に分布させる。いったん損傷組織中の位置に固定されると、線維芽細胞はコラーゲンを合成し始め、このタンパク質を分泌し、このタンパク質自身を繊維として配列する。この繊維は、その長軸で応力が最も高い方向に自身を配向させる。コラーゲンの束が成長して堅固になるにつれ、線維芽細胞は次第に変性し、この束に密接に付着して、損傷領域が瘢痕組織に変形する。
【０１２９】
瘢痕組織の形成と同時に、創傷の端の無傷の上皮細胞が増殖し始め、１枚のシートとして損傷領域の中心に向かって動き始める。炎症が鎮静するにつれ、血液の直接供給の必要性が生じ、創傷部位に血管形成が発生する。
【０１３０】
炎症は、多数の細胞型が関与する複雑なプロセスである。例えば、マスト細胞は、初期段階の血管拡張の引き金となるメディエーターを放出し、これに内皮細胞の分離および内皮下層中のコラーゲン繊維の露出が伴う。血管内に形成される細胞間隙の線維が血小板を捕捉し、これらの細胞からのメディエーターの放出の引き金となる。
【０１３１】
血小板に加えて、露出したコラーゲン繊維もまた、拡張した血管壁の孔を通って濾過される血漿のタンパク質と相互作用する。この相互作用は、血液凝固カスケードを誘発する要因である血管拡張の増加、血管の浸透性および走化性の増加を含む。
【０１３２】
加えて、補体カスケードは、いくつかの刺激により活性化され得る。いくつかの刺激とは、損傷した血管、損傷細胞により放出されるタンパク質分解酵素、任意の関与細菌の膜成分、および抗原−抗体複合体である。活性化した補体成分の一部は、走化因子として作用し、白血球が炎症領域へと流入する原因となる一方、他の補体成分は、食作用を促進し、細胞溶解に関与する。
【０１３３】
加えて、本発明のガス富化流体または溶液はまた、炎症の少なくとも１つの態様に関与する少なくとも１つのサイトカインを調節し得、これらのサイトカインには、ＭＡＦ（マクロファージ活性化因子）、ＭＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）、ＭＣＦ（マクロファージ走化因子）、ＬＭＩＦ（白血球遊走阻止因子）、ＨＲＦ（ヒスタミン放出因子）、ＴＦ（伝達因子）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５等）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ζ、ＩＦＮ−δ等）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージＣＳＦ）、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージＣＳＦ）、ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ（ＩＬ−３）、線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、ＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β等）、ＮＡＰ−２（好中球活性化タンパク質２）、ＰＦ−４（血小板因子４）、トロンボグロブリン、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β−＋（マクロファージ炎症性タンパク質）、ランテス（血小板やＴ細胞由来の好酸球走化性物質）、ＨＳＰ（熱ショックタンパク質）、ＧＲＰ（グルコース調節タンパク質）、ユビキチン等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
したがって、ある実施形態では、ガス富化流体および／または治療組成物は、抗炎症分子またはサイトカインの産生および／または分泌を増加させ、あるいは抗炎症分子またはサイトカインの分解を減少させ、それにより、炎症および／または炎症性神経変性の少なくとも１つの症状を緩和または予防し得る。他の実施形態では、本発明のガス富化流体および／または治療組成物は、抗炎症分子またはサイトカインの産生および／または分泌を減少させ、あるいは抗炎症分子もしくはサイトカインの分解を増加させ、それにより、炎症および／または炎症性神経変性の少なくとも１つの症状を緩和または予防し得る。
【０１３５】
以前の研究では、脱髄の増加およびリウマチ性関節炎のヒト自己免疫疾患に対する動物モデル系であるＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）の悪化における、抗−ＭＯＧ抗体の重要な役割を示した（Ｌｉｎｉｎｇｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９２．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．  ４０：２１９−２２４）。また、抗ＭＯＧ抗体は、多発性硬化症の発症原因に関連付けられている（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ２００３  Ｊｕｌ  １０；３４９（２）：１３９−４５）。
【０１３６】
図２および実施例３に記述されているように、本発明のガス富化流体は、動物が事前に抗原刺激を受けた抗原に対してリンパ球応答を増幅する。図２に示されるように、溶媒和電子を含む本発明のガス富化流体を用いて再構成される流体中で培養した場合、リンパ球増殖は、加圧された含酸素化流体（加圧ポット）または対照の脱イオン流体と比較して、ＭＯＧ刺激に反応して増大した。
【０１３７】
代表的な関連の分子間相互作用：
従来より、量子的特性は１０−１０メートル未満の素粒子に属すると考えられ、一方、日常生活の巨視的世界は、ニュートンの運動の法則に従って挙動するという点で古典的であると称される。
【０１３８】
近年、分子は、希釈と共に大きさが増加するクラスターを形成すると説明されている。これらのクラスターは、直径が数マイクロメートルあり、希釈すると非線形的にサイズが増大すると報告されている。直径１００ナノメートルの量子コヒーレント領域が純水中に発生すると仮定され、コヒーレント領域における水分子の集団振動が、最終的に電磁場変動に位相固定され得る。これにより、水中での安定振動を提供し、水の集合構造を変化させる水中の溶解物質に特異的な、持続性のコヒーレント振動の励起という形で、「記憶」の一形態を提供し、このことが今度は、発生する特異的コヒーレント振動を決定し得る。これらの振動が磁場相連結により安定化しても、希釈時の水は、依然として「種（ｓｅｅｄ）」のコヒーレント振動を保持し得る。分子のクラスターのサイズが増大すると、それに応じてその電磁的痕跡が増幅され、水の保持するコヒーレント振動が増強される。
【０１３９】
溶解分子のクラスターサイズの変化、および水の詳細な微視的構造にもかかわらず、コヒーレント振動の特異性は、なおも存在し得る。水の特性の変化を検討するための１つのモデルは、結晶化が関係する考慮事項に基づく。
【０１４０】
ナノスケールケージを形成する簡易プロトン化水クラスターが、本出願人の以前の特許出願である国際公開第２００９／０５５７２９号に示されている。プロトン化水クラスターは、一般に、Ｈ＋（Ｈ２０）ｎの形態をとる。いくつかのプロトン化水クラスターは、電離層等に自然発生する。特定の理論に拘束されるものではないが、特定の態様によれば、他のタイプの水クラスターまたは構造（クラスター、ナノケージ等）が可能であり、こうした構造には、本発明の産出物質に与えられる酸素および安定化した電子を含む構造が含まれる。酸素原子は、得られた構造に取り込まれ得る。半結合ナノケージの化学反応は、酸素および／または安定化した電子を、長期間、溶解したままにすることが可能である。医薬化合物等の他の原子または分子は、徐放目的のためにケージ形成され得る。溶液物質および溶解化合物の特異的化学反応は、これらの物質の相互作用により異なる。
【０１４１】
以前の実験により、混合装置により処理された流体が、クラスター構造関連の流体分析と一致する様々な構造特性を示すことが実証されている。例えば、国際公開第２００９／０５５７２９号を参照のこと。
【０１４２】
帯電安定化したナノ構造（例えば、帯電安定化した酸素含有ナノ構造）：
本出願人の国際公開第２００９／０５５７２９号の「二重層効果」、「滞留時間」、「注入速度」、「気泡サイズ測定」において以前に説明されているように、界面動電混合装置は、第１の物質および第２の物質の、複合動的乱流を伴う、独特で非線形の流体動力学的相互作用を、わずか数ミリ秒で生成し、新規の界面動電効果を提供する効果的に膨大な表面積（装置の面積および１００ｎｍ未満の例外的に小さい気泡の面積を含む）と接触する複合混合を提供する。加えて、絶縁回転子および固定子機能を含む特別に設計された混合装置を用いて、機能局在界面動電効果（電圧／電流）が示された。
【０１４３】
当技術分野においてよく認識されているように、電荷再分配および／または溶媒和電子は、水溶液中で、極めて不安定であることが知られている。特定の態様によれば、本出願人の界面動電効果（例えば、特定の態様では溶媒和電子を含む、電荷再分配）は、産出物質（例えば、食塩溶液、イオン溶液）内で、驚くほど安定化される。実際には、本明細書に記載されるように、本発明の界面動電流体（例えば、ＲＮＳ−６０またはＳｏｌａｓ）の特性および生物活性の安定性は、数ヶ月間、気密性容器内で維持することができる。このことは、本発明の溶液の特性および活性の精製および／または維持および／または媒介の支援に、溶解ガス（例えば、酸素）が関与していることを示す。重要なことは、電荷再分配および／または溶媒和電子は、流体により生細胞（例えば、哺乳類細胞）と接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量で、本発明の界面動電イオン水性流体中に安定的に構成されることである（例えば、本明細書にも開示されている、国際公開第２００９／０５５７２９号の細胞パッチクランプの実施例２３を参照）。
【０１４４】
本発明の界面動電流体（例えば、界面動電食塩溶液）の安定性および生物学的適合性を説明するために、本明細書の「分子間相互作用」に記載されるように、本出願人は、水分子と水中に溶解された物質（例えば、酸素）の分子との間の相互作用が、水の全体構造を変化させ、ナノスケールケージクラスター（本発明の産出物質に与えられる、酸素および／または安定化した電子を含むナノ構造を含む）を提供することを提案した。機構に拘束されるものではないが、特定の態様のナノ構造の構成は、ナノ構造が、溶解ガス（例えば、酸素）を（少なくとも形成および／または安定性および／または生物活性のために）含み；細胞膜またはその関連の構成要素と接触する際に、界面動電流体（例えば、ＲＮＳ−６０またはＳｏｌａｓ食塩流体）が、電荷および／または電荷効果を調節する（例えば、授与または受容する）のを可能にし；かつ、特定の態様では、生物学的に関連した形態において、溶媒和電子の安定化を提供する（例えば、運ぶ、持つ、捕獲する）ような構成である。
【０１４５】
特定の態様によれば、本開示により支持されるように、イオンまたは食塩（例えば、標準食塩水、ＮａＣｌ）溶液において、本発明のナノ構造は、帯電安定化した水和殻内に少なくとも１つの溶解ガス分子（例えば、酸素）を含み得る、帯電安定化したナノ構造（例えば、平均直径１００ｎｍ未満）を含む。さらなる態様によれば、帯電安定化した水和殻は、上記の少なくとも１つの溶解ガス分子（例えば、酸素）を持つケージまたは空隙を含み得る。さらなる態様によれば、好適な帯電安定化した水和殻の供給によって、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、溶媒和電子（例えば、安定化した溶媒和電子）をさらに含み得る。
【０１４６】
機構または特定の理論に拘束されるものではないが、本優先日の後、周囲（大気）気体と平衡状態にある水性液体中のイオンにより安定化された帯電安定化微小気泡が、提案されている（Ｂｕｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，  １０４：４８６−４９８，  ２００７；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本発明の特定の態様によれば、本出願人の新規の界面動電流体は、帯電安定化した酸素含有ナノ構造の新規の生物学的活性形態を含み、そして、このような構造の新規の配列、クラスター、または会合をさらに含み得る。
【０１４７】
帯電安定化した微小気泡モデルによれば、水構造の短距離分子秩序は、ガス分子の存在により破壊され（例えば、非吸着イオンと初期に複合した溶解ガス分子は、短距離秩序の欠陥をもたらす）、イオン性溶滴の濃縮を提供する。この欠陥は、水分子の第１および第２の配位圏に取り囲まれ、これらの配位圏において、それぞれ、６および１２の空孔を占める吸着イオン（例えば、電気二重層を形成するためのＮａ＋イオンの「スクリーニングシェル（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｈｅｌｌ）」の捕捉）および非吸着イオン（例えば、第２の配位圏を占めるＣｌ−イオン）に交互に充填される。不飽和イオン溶液（例えば、不飽和食塩溶液）において、この水和した「細胞核」は、第１および第２の配位圏が、それぞれ、６つの吸着イオンおよび５つの非吸着イオンにより充填されるまで、安定した状態を保ち、次いで、ガス分子を含有する内部空隙を生成するクーロン爆発を受け、吸着イオン（例えば、Ｎａ＋イオン）は、得られる空隙の表面に吸着され、一方、非吸着イオン（またはその一部分）は、溶液に拡散する（Ｂｕｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、上記を参照）。このモデルにおいては、ナノ構造における空隙は、その表面に吸着されたイオン（例えば、Ｎａ＋イオン）間でのクーロン反発により、崩壊が阻止される。空隙含有のナノ構造の安定性は、空隙／気泡表面への同様の電荷を有する溶解イオンの選択的吸着、および溶解ガスと気泡内部のガスとの間の拡散平衡によるものであると仮定され、負の静電圧（得られる電気二重層により与えられる外部からの静電圧）は、界面張力に対して安定補償を提供し、気泡内部のガス圧力は、周囲圧力により均衡を保つ。このモデルによれば、このような微小気泡の形成は、イオン成分を必要とし、ある態様では、衝突が媒介する粒子間会合が、より大きな秩序クラスター（配列）の形成を提供し得る（同上）。
【０１４８】
帯電安定化した微小気泡モデルは、粒子がガス状微小気泡であり得ることを示唆するが、周囲大気と平衡状態にあるイオン溶液中にこのような構造が自然形成されることのみ企図しており、酸素がこのような構造を形成できるかどうかに関しては、特徴付けされておらず、かつ未特定のままであり、同様に、溶媒和電子がこのような構造により会合および／または安定化され得るかどうかに関しても、未特定のままである。
【０１４９】
特定の態様によれば、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造を含む本発明の界面動電流体は、新規であり、微小気泡モデルによる、仮定の非界面動電的かつ大気中の、帯電安定化した微小気泡構造とは基本的に異なる。重要なことは、対照の食塩溶液は本明細書に開示される生物学的特性を持たないが、他方、本出願人の帯電安定化したナノ構造は、帯電安定化した酸素含有ナノ構造の新規かつ生物学的に活性な形態を提供するという事実があり、この事実から少なくとも部分的に派生するこの結論が不可避であることである。
【０１５０】
本発明の特定の態様によれば、本出願人の新規の界面動電装置および方法は、大気と平衡状態にあるイオン流体、または非界面動電的に生成された任意の流体中で自然に発生し得るか発生し得ない任意の量を超える、かなりの量の帯電安定化したナノ構造を含む、界面動電的に改変された新規の流体を提供する。特定の態様では、帯電安定化したナノ構造は、帯電安定化した酸素含有ナノ構造を含む。さらなる態様では、帯電安定化したナノ構造はすべて、もしくは実質的にすべて、帯電安定化した酸素含有ナノ構造であり、または、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、界面動電流体において主要な帯電安定化したガス含有のナノ構造種である。
【０１５１】
なおさらなる態様によれば、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、溶媒和電子を含むか内部に持つことができ、それにより、新規の安定化した溶媒和電子担体を提供する。特定の態様では、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、新規のタイプのエレクトライド（または逆エレクトライド）を提供する。このエレクトライドは、単一の有機配位カチオンを有する従来の溶質エレクトライドとは対照的に、空隙または酸素原子を含有する空隙の周辺に安定的に配列された複数のカチオンを有し、配列されたナトリウムイオンは、有機分子によってではなく、水の水和殻によって配位される。特定の態様によれば、溶媒和電子は、水分子の水和殻により収容され得る。または好ましくは、すべてのカチオンに渡って分布するナノ構造の空隙内に収容され得る。ある態様では、本発明のナノ構造は、配列した複数のナトリウムカチオンに渡って溶媒和電子の分布／安定化を提供するだけでなく、空隙中にケージを形成した酸素分子（複数可）と溶媒和電子との会合または部分的会合を提供することにより（すなわち、溶媒和電子はナトリウム原子の配列および少なくとも１つの酸素原子に渡って分布する）、溶液中の新規の「スーパーエレクトライド」を提供する。したがって、特定の態様によれば、本発明の界面動電流体と関連して本発明で開示される「溶媒和電子」は、水分子による直接の水和を含む従来のモデルでは溶媒和されない場合がある。あるいは、乾燥したエレクトライド塩と限定的に同様に、本発明の界面動電流体中の溶媒和電子は、帯電安定化した複数のナノ構造に渡って分布して、水溶液中の高次の配列を安定化させるために「格子接着剤（ｌａｔｔｉｃｅ  ｇｌｕｅ）」を提供し得る。
【０１５２】
特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、細胞膜もしくはその成分、またはタンパク質等と相互作用して、生物学的活性を媒介することができる。特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または溶媒和電子を持つ帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、細胞膜もしくはその成分、またはタンパク質等と相互作用して、生物学的活性を媒介することができる。
【０１５３】
特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、電荷および／もしくは帯電効果供与体（送達）として、かつ／または電荷および／もしくは帯電効果受容体として、細胞膜もしくはその成分、またはタンパク質等と相互作用して、生物学的活性を媒介することができる。特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または溶媒和電子を持つ帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、電荷および／もしくは帯電効果供与体として、かつ／または電荷および／もしくは帯電効果受容体として、細胞膜と相互作用して、生物学的活性を媒介することができる。
【０１５４】
特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、本発明の界面動電流体の観察された安定性および生物学的特性と一致し、かつこれらを説明し、さらに、イオン水溶液（例えば、食塩溶液、ＮａＣｌ等）中の安定化した溶媒和電子を提供する、新規のエレクトライド（または逆エレクトライド）を提供する。
【０１５５】
特定の態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、帯電安定化した酸素含有ナノ気泡を実質的に含み、またはその形態をとり、またはこれを発生させることができる。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有クラスターは、帯電安定化した酸素含有ナノ構造の相対的に大きな配列の形成、および／または帯電安定化した酸素含有ナノ気泡もしくはその配列の形成を提供する。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、疎水性表面と接触する際、疎水性ナノ気泡の形成を提供することができる。
【０１５６】
特定の態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、少なくとも１つの酸素分子を実質的に含む。ある態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、またはそれ以上の酸素分子を実質的に含む。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、約２０ｎｍ×１．５ｎｍのナノ気泡（例えば、疎水性ナノ気泡）を含むか発生させ、約１２個の酸素分子（例えば、酸素分子の大きさ（約０．３ｎｍ×０．４ｎｍ）、理想気体の状態方程式ｎ＝ＰＶ／ＲＴに基づく。ここで、Ｐ＝１ａｔｍ、Ｒ＝０．０８２  ０５７  ｌ．ａｔｍ／ｍｏｌ．Ｋ；Ｔ＝２９５Ｋ；Ｖ＝ｐｒ２ｈ＝４．７×１０−２２Ｌ、ここで、ｒ＝１０×１０−９ｍ、ｈ＝１．５×１０−９ｍ、およびｎ＝１．９５×１０−２２モル）を含む。
【０１５７】
ある態様では、イオン水性流体中の帯電安定化構造を有する、このようなナノ構造またはその配列にある流体中に存在する、酸素分子の割合は、０．１％超、１％超、２％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超超、６５％、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、および９５％超からなる群より選ばれる割合である。好ましくは、この割合は、約５％超、約１０％超、約１５％超、または約２０％超である。イオン水性流体中の帯電安定化構造を有する、帯電安定化した酸素含有ナノ構造またはその配列の実質的な大きさは、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、１０ｎｍ未満、５ｎｍ未満、４ｎｍ未満、３ｎｍ未満、２ｎｍ未満、および１ｎｍ未満からなる群より選ばれる大きさである。好ましくは、この大きさは、約５０ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満である。
【０１５８】
ある態様では、本発明の界面動電流体は、溶媒和電子を含む。さらなる態様では、本発明の界面動電流体は、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造、および／またはその配列を含み、これらは、１つまたは複数の溶媒和電子、および独特な電荷分布（極性、対称、非対称の電荷分布）のうちの少なくとも１つを含む。ある態様では、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有ナノ構造、および／またはその配列は、常磁性を有する。
【０１５９】
対照的に、本発明の界面動電流体と比較して、対照の加圧ポット含酸素化流体（非界面動電流体）等は、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節が可能な、このような界面動電的に生成され帯電安定化し生物学的に活性なナノ構造および／または生物学的に活性な帯電安定化した酸素含有ナノ構造、および／またはその配列を含まない。
【０１６０】
ガス富化流体を生成するシステム
本出願人の特許出願国際公開第２００９／０５５７２９号に以前開示されたシステムおよび方法は、最小の受動的損失を伴う高濃度で、ガス（例えば、酸素）を安定的に富化させることが可能である。このシステムおよび方法を効果的に使用して、多種多様のガスを高い割合で、多種多様の流体中に富化することができる。単なる例として、一般的には室温で溶解酸素の約２〜３ｐｐｍ（百万分率）のレベルを有する脱イオン水が、開示されたシステムおよび／または方法を用いて、少なくとも約５ｐｐｍ、少なくとも約１０ｐｐｍ、少なくとも約１５ｐｐｍ、少なくとも約２０ｐｐｍ、少なくとも約２５ｐｐｍ、少なくとも約３０ｐｐｍ、少なくとも約３５ｐｐｍ、少なくとも約４０ｐｐｍ、少なくとも約４５ｐｐｍ、少なくとも約５０ｐｐｍ、少なくとも約５５ｐｐｍ、少なくとも約６０ｐｐｍ、少なくとも約６５ｐｐｍ、少なくとも約７０ｐｐｍ、少なくとも約７５ｐｐｍ、少なくとも約８０ｐｐｍ、少なくとも約８５ｐｐｍ、少なくとも約９０ｐｐｍ、少なくとも約９５ｐｐｍ、少なくとも約１００ｐｐｍ、またはいずれかの値以上もしくはそれらの間の範囲の溶解酸素のレベルを達成することができる。特定の代表的な実施形態によれば、約３０〜６０ｐｐｍの溶解酸素レベルで酸素富化水が生成され得る。
【０１６１】
表３は、酸素富化食塩溶液（表３）で処置された治癒創傷、および本発明のガス富化酸素富化食塩溶液のサンプルにおいて得られた様々な分圧測定を示す。
【０１６２】
【表８】
2013533320.tif 000012
【０１６３】
投与経路および形態
特定の代表的な実施形態では、本発明のガス富化流体は、炎症の少なくとも１つの症状を予防または緩和するように、単独で、または別の治療剤と組み合わせて、治療組成物として機能し得る。本発明の治療組成物は、それを必要とする対象に投与可能な組成物を含む。ある実施形態では、治療組成物製剤は、担体、アジュバント、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味料、香料、および結合剤からなる群より選ばれる、少なくとも１つの添加剤も含み得る。
【０１６４】
本明細書で使用される「薬剤的に許容可能な担体」および「担体」とは、概して、非毒性で不活性の固体、半固体、もしくは液体の充填剤、希釈剤、封入物質、または任意の種類の製剤補助物質を指す。薬剤的に許容可能な担体としての機能を果たし得る物質のいくつかの非限定的な例として、ラクトース、グルコース、およびスクロース等の糖類；コーンスターチおよびポテトスターチ等のデンプン；セルロース、およびその誘導体である、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース等；トラガカント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬用ワックス等の賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油等の油類；プロピレングリコール等のグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝溶液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム等の他の非毒性の適合性滑沢剤があり、さらに、調剤者の判断に従って、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味料、香料、保存料、および抗酸化剤も組成物中に存在し得る。特定の態様では、このような担体および賦形剤は、本発明のガス富化流体または溶液であり得る。
【０１６５】
例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、または希釈剤等の、本明細書に記載されている薬剤的に許容可能な担体は、当業者には公知である。一般に、薬剤的に許容可能な担体は、治療剤に対して化学的に不活性であり、使用条件下では有害な副作用も毒性もない。薬剤的に許容可能な担体は、ポリマーおよびポリマーマトリクス、ナノ粒子、微小気泡等を含み得る。
【０１６６】
本発明の治療用ガス富化流体に加えて、治療組成物はさらに、不活性希釈剤、例えば追加の非ガス富化水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含み得る。当業者であれば認識するように、特定の治療組成物の新規の改善された製剤、新規のガス富化治療流体、および新規のガス富化治療流体を送達する新規の方法は、１つ以上の不活性希釈剤を、組成が同一、類似、または異なるガス富化流体に置き換えることにより取得し得る。例えば、酸素を水または脱イオン水中に混合してガス富化流体を生成し、この流体を従来の水に置き換えるか補完することにより、ガス富化流体が得られる。
【０１６７】
ある実施形態では、本発明のガス富化流体は、１つ以上の治療剤と組み合わせてよく、かつ／または単独で使用してよい。特定の実施形態では、ガス富化流体を取り込むことは、脱イオン水、食塩溶液等の当技術分野で公知の１つ以上の溶液を、１つ以上のガス富化流体に置き換えることを含み、それにより、対象に送達する改善された治療組成物を提供することができる。
【０１６８】
ある実施形態が提供する治療組成物は、本発明のガス富化流体、医薬組成物もしくは他の治療剤またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは溶媒、および少なくとも１つの医薬担体もしくは希釈剤を含む。これらの医薬組成物は、前述の疾患または状態の予防および治療ならびに上記のような治療法において、使用され得る。好ましくは、担体は、薬剤的に許容可能であり、かつ、組成物中の他の成分に適合する（すなわち、有害な影響を与えない）ものでなければならない。担体は、固体または液体でよく、好ましくは、単位用量製剤として、例えば、活性成分の０．０５〜９５重量％を含有し得る錠剤として製剤化される。
【０１６９】
可能な投与経路としては、経口、舌下、口腔、非経口（例えば、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、大槽内、膀胱内、髄腔内、または静脈内）、直腸、局所（経皮、膣内、眼球内、耳内、鼻腔内、植込み可能装置または物質の吸入、注射、または挿入を含む）が含まれる。
【０１７０】
投与経路
特定の対象に対する最適な投与手段は、治療する疾患もしくは状態の性質および重症度、または使用する治療法の性質、ならびに治療組成物もしくは追加の治療剤の性質によって異なる。ある実施形態では、経口投与または局所投与が好ましい。
【０１７１】
経口投与に好適な製剤は、それぞれ既定量の活性化合物を含有する錠剤、カプセル、カシェ剤、シロップ、エリキシル剤、チューインガム、「ロリポップ」（棒付きキャンディ）剤、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、トローチ剤、またはゲルコーティングされたアンプルのような個別単位；粉末または顆粒；水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液；または水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤として、提供し得る。
【０１７２】
経口投与に好適なさらなる製剤は、様々な定量加圧エアロゾル、噴霧器、ネブライザー、または吸入器を用いて発生し得る微粒子粉末またはミスト剤を含むように提供され得る。特に、治療剤の粉末または他の化合物は、本発明のガス富化流体中に溶解または懸濁され得る。
【０１７３】
舌下または口腔投与等による経粘膜的方法に好適な製剤は、活性化合物および通常は風味付けされるベース、例えば、砂糖およびアカシアまたはトラガカントを含むトローチ剤、パッチ剤、錠剤等、ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースアカシア等の不活性ベース中に活性化合物を含むパステル剤を含む。
【０１７４】
非経口投与に好適な製剤は、一般に、既定濃度の活性ガス富化流体を含有し、かつ場合によっては別の治療剤を含有する滅菌水溶液を含み、この水溶液は、好ましくは、対象とするレシピエントの血液と等張である。非経口投与に好適なさらなる製剤は、界面活性剤、シクロデキストリン等の生理的に好適な共溶媒および／または錯化剤を含有する製剤を含む。水中油型乳剤も、ガス富化流体の非経口投与用の製剤に好適であり得る。このような溶液は、好ましくは静脈内投与されるが、皮下注射または筋肉内注射により投与されてもよい。
【０１７５】
尿道、直腸、または膣内投与に好適な製剤は、ゲル剤、クリーム剤、ローション剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、乳剤、溶解可能な固形物質、潅水等を含む。こうした製剤は、好ましくは、座薬ベースを形成する１つ以上の固体担体（例えばカカオバター）中に活性成分を含む単位用量座薬として提供される。あるいは、本発明のガス富化流体を用いた結腸洗浄は、結腸または直腸投与用に製剤化され得る。
【０１７６】
局所、眼球内、耳内、または鼻内投与に好適な製剤は、軟膏、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、ペースト剤、ゲル剤（ヒドロゲル等）、スプレー剤、分散性粉末および顆粒、乳剤、流動噴射剤を用いたスプレー剤またはエアロゾル（例えば、リポソームスプレー剤、点鼻剤、鼻腔用スプレー剤等）、ならびに油を含む。このような製剤に好適な担体は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびこれらの組み合わせを含む。経鼻または鼻腔内送達は、定量のこれらの製剤または他の製剤を含み得る。同様に、耳内または眼球内は、点滴剤、軟膏、刺激流体等を含み得る。
【０１７７】
本発明の製剤は、いかなる好適な方法でも調製してよく、一般的には、ガス富化流体を、任意で、液体もしくは微粉化した固体担体、またはその双方を有する活性化合物とともに、必要とされる比率で均一かつ緊密に混合し、次いで、必要に応じて、得られた混合物を所望の形状に付形することにより調製する。
【０１７８】
例えば、錠剤は、粉末または顆粒状の活性成分、および１つ以上の任意の成分、例えば、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤または界面活性分散剤を含む均質混合物を圧縮するか、または粉末活性成分および本発明のガス富化流体の均質混合物を成形することにより、調製し得る。
【０１７９】
吸入による投与に好適な製剤は、多様な定量加圧エアロゾル、噴霧器、ネブライザー、または吸入器を用いて発生し得る微粒子粉末またはミスト剤を含む。特に、治療剤の粉末または他の化合物は、本発明のガス富化流体中に溶解または懸濁され得る。
【０１８０】
口からの肺投与に関しては、気管支樹への送達を確実にするために、粉末または溶滴の粒度は、一般に、０．５〜１０μＭ、好ましくは１〜５μＭである。鼻投与に関しては、鼻腔内の保持を確実にするために、１０〜５００μＭの粒度が好ましい。
【０１８１】
定量吸入器は、一般に液化噴射剤中の治療剤の懸濁液または溶液製剤を含有する、加圧エアロゾルディスペンサーである。ある実施形態では、本明細書に開示されるように、本発明のガス富化流体を、標準液化噴射剤に加えて、またはその代わりに、使用され得る。これらの装置は、使用時に、定量（一般に１０〜１５０μＬ）を送達するように適合させた弁を経て製剤を放出して、治療剤およびガス富化流体を含有する微粒子噴霧を生成する。好適な噴射剤には、特定のクロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、およびこれらの混合物が含まれる。
【０１８２】
製剤は、１つ以上の共溶媒、例えば、エタノール界面活性剤、例えば、オレイン酸または三オレイン酸ソルビタン、酸化防止剤、および好適な風味剤をさらに含有してよい。ネブライザーは、細いベンチュリ穴を通る圧縮ガス（一般に空気または酸素）の加速によるか、あるいは超音波撹拌のいずれかにより、活性成分の溶液または懸濁液を治療エアロゾルミストに変換する市販の装置である。ネブライザーで用いるのに好適な製剤は、製剤の最大４０％ｗ／ｗ、好ましくは２０％ｗ／ｗ未満をなす、ガス富化流体中の別の治療剤からなる。加えて、蒸留水、滅菌水、または希釈水性アルコール溶液等の他の担体を利用でき、こうした担体は、好ましくは、例えば塩化ナトリウム等の塩の添加により、体液と等張にされる。任意の添加剤として、特に製剤が滅菌調製されていない場合は防腐剤を含み、メチルヒドロキシ−ベンゾエート、酸化防止剤、香味剤、揮発油、緩衝剤、および界面活性剤を含み得る。
【０１８３】
吸入による投与に好適な製剤は、吸入器により送達されるか、または鼻からの吸入により鼻腔に取り込まれ得る微粉砕散剤を含む。吸入器内において、一般にゼラチン製またはプラスチック製のカプセルまたはカートリッジに散剤を入れ、原位置で穴開けまたは開放して、吸入時に装置から引き出される空気または手動ポンプにより散剤を送達する。吸入器で使用する散剤は、活性成分だけからなるか、または活性成分、好適な粉末希釈剤（例えばラクトース）、および任意の界面活性剤を含む粉末ブレンドからなる。活性成分は、一般に、製剤の０．１〜１００ｗ／ｗをなす。
【０１８４】
上記で具体的に言及されている成分に加えて、本発明の製剤は、問題となっている製剤のタイプを考慮して、当業者に公知の他の薬剤を含んでよい。例えば、経口投与に好適な製剤は、香味料を含んでよく、経鼻投与に好適な製剤は、香料を含んでよい。
【０１８５】
本発明の治療組成物は、個別の治療剤として、あるいは、複数の治療剤を組み合わせて、医薬品と併せて使用可能な従来の任意の方法で投与することができる。
【０１８６】
当然のことながら、投与量は、特定の薬剤の薬力学的特性、ならびに投与の様式および経路；レシピエントの年齢、健康状態、および体重；症状の性質および程度；同時治療の種類；治療頻度；ならびに所望の効果、といった既知の要因により異なる。活性成分の１日の投与量は、体重１キログラム（ｋｇ）あたり約０．００１〜１０００ミリグラム（ｍｇ）であり、好ましくは、０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量であると予想できる。ある態様によれば、活性成分の１日の投与量は、０．００１リットル〜１０リットルであり、好ましくは約０．０１リットル〜１リットルであり得る。
【０１８７】
剤形（投与に好適な組成物）は、単位あたり約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を包含する。これらの医薬組成物では、活性成分は、通常、組成物の総重量に基づき約０．５〜９５重量％の量で存在し得る。
【０１８８】
軟膏、ペースト剤、フォーム剤、咬合剤（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、クリーム剤、およびゲル剤も、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、シリコン、ベントナイト、シリカ酸、およびタルク、またはこれらの混合物のような賦形剤を含有することができる。散剤およびスプレー剤も、ラクトース、タルク、シリカ酸、水酸化アルミニウム、およびケイ酸カルシウム、またはこれらの物質の混合物のような賦形剤を含有することができる。ナノ結晶抗菌性金属の溶液を、エアロゾル医薬品の製造で日常的に使用されている公知の手段のいずれかにより、エアロゾルまたはスプレー剤に変換することができる。概して、このような方法は、通常は不活性担体ガスを用いて溶液の容器を加圧すること、または加圧手段を提供することと、小さな穴に加圧ガスを通すことを含む。スプレー剤はさらに、窒素、二酸化炭素、および他の不活性ガス等の常用の噴射剤を含有することができる。加えて、対象に治療化合物を投与するために必要な任意の経路において、本発明のガス富化治療組成物または流体とともに、マイクロスフェアまたはナノ粒子を使用してよい。
【０１８９】
注射用製剤は、アンプルおよびバイアル等の密閉した単位用量容器または多用量容器中に存在することができ、使用直前に滅菌液体賦形剤またはガス富化流体の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管できる。即時注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。注射可能な組成物用の効果的な医薬担体の必要条件は、当業者には公知である。例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｊ．  Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐａ．，  Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，  Ｅｄｓ．，  ２３８−２５０  （１９８２）  ａｎｄ  ＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，  Ｔｏｉｓｓｅｌ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  ６２２−６３０  （１９８６）を参照のこと。
【０１９０】
局所投与に好適な製剤としては、本発明のガス富化流体を含み、かつ任意で追加の治療剤および香味剤（通常、スクロースおよびアカシア）またはトラガカントを含むトローチ剤；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性ベース中にガス富化流体を含み、かつ任意で追加の治療剤を含む香錠；好適な液体担体中にガス富化流体を含み、かつ任意で追加の治療剤を含む口腔洗薬または含嗽液；ならびにクリーム剤、乳剤、ゲル剤等が挙げられる。
【０１９１】
加えて、直腸投与に好適な製剤は、乳化ベースまたは水溶性ベースなどの様々なベースと混合することにより座薬として提示できる。膣内投与に適した製剤は、活性成分に加えて、当技術分野で適切なものとして知られる担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、フォーム剤、またはスプレー剤として提示できる。
【０１９２】
好適な医薬担体は、当分野における標準の参考テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。
【０１９３】
本発明の文脈において、対象、特に動物、特にヒトへの投与量は、妥当な時間枠の間、当該動物に治療反応を起こすのに十分な量であるべきである。当業者であれば、投与量は、動物の状態、動物の体重、および治療対象の状態を含む様々な要因によって異なることを認識するであろう。好適な用量は、対象において、所望の反応に影響を及ぼすことが知られている濃度の治療組成物をもたらす用量である。
【０１９４】
用量のサイズも、投与の経路、タイミング、および頻度、ならびに治療組成物の投与および所望の生理的効果に伴って発生し得る副作用の存在、性質、および程度によって決まる。
【０１９５】
化合物の組み合わせの投与については、（１）化合物の組み合わせを共製剤にして同時に投与するか、または（２）交互に、すなわち個別の医薬製剤を連続的に、逐次的に、並行して、または同時に送達することにより投与し得ることが認識されるであろう。交互の治療では、第２、および任意の第３の活性成分の投与の遅延が、活性成分の組み合わせの相乗的な治療効果の利益を損失しないようにするべきである。（１）または（２）のいずれかの投与方法によるある実施形態によれば、理想的には、最も有効な結果を達成するように、化合物の組み合わせを投与するべきである。（１）または（２）のいずれかの投与方法によるある実施形態では、理想的には、活性成分のそれぞれのピーク血漿濃度を達成するように、化合物の組み合わせを投与するべきである。組み合わせ共製剤の投与による１日に１回１錠のレジメンは、炎症性神経変性疾患に罹患している一部の患者に対して実施可能であり得る。組み合わせの活性成分の効果的なピーク血漿濃度は、約０．００１〜１００μＭの範囲にある。最適なピーク血漿濃度は、特定の患者に処方される製剤および投与レジメンにより達成され得る。本発明の流体およびグラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／もしくはナタリズマブ、またはこれらのいずれかの生理学的に機能的な誘導体は、同時に与えられるか逐次的に与えられるかによらず、個々に、複数で、またはこれらの任意の組み合わせで投与され得ることも理解されるであろう。一般に、交互の治療（２）の際は、各化合物の有効投与量が順次に投与され、共製剤治療（１）では、２つ以上の化合物の有効投与量が一緒に投与される。
【０１９６】
本発明による組み合わせは、単位剤形の医薬製剤として簡便に提示され得る。簡便な単位投与製剤は、それぞれ、１ｍｇ〜１ｇの任意の量（例えば１０ｍｇ〜３００ｍｇであるが、これに限定されない）の活性成分を含む。本発明の流体と、グラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／もしくはナタリズマブとを組み合わせた相乗効果は、幅広い比率で、例えば、１：５０〜５０：１（本発明の流体：グラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／もしくはナタリズマブ）で実現され得る。一実施形態では、この比は、約１：１０〜１０：１の範囲であり得る。別の実施形態では、丸剤、錠剤、カプレット、またはカプセル剤等の共製剤の組み合わせ剤形における、本発明の流体と、グラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／もしくはナタリズマブの重量／重量比は、約１である。すなわち、本発明の流体と、グラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／もしくはナタリズマブはほぼ等量となる。他の代表的な共製剤では、本発明の流体と、グラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／またはナタリズマブの量は、これより多いかまたは少ない。一実施形態では、各化合物は、単独で使用された場合に抗炎症活性を示す量の組み合わせで利用される。本発明の範囲内において、他の比および量の化合物の上記組み合わせが企図されている。
【０１９７】
単位剤形は、本発明の流体と、グラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／もしくはナタリズマブ、またはこれらのいずれかの生理学的に機能的な誘導体、ならびに薬剤的に許容可能な担体をさらに含む得る。
【０１９８】
当業者であれば、治療に使用するのに必要な本発明の組み合わせにおける活性成分の量は、治療対象の状態の性質、患者の年齢および状態を含む種々の要因によって異なり、最終的には、主治医または医療関係者の裁量によって決まることを認識するであろう。考慮すべき要因としては、投与経路および製剤の性質、動物の体重、年齢、および全身状態、ならびに治療する疾患の性質および重症度が挙げられる。
【０１９９】
同時投与または逐次投与用の単位剤形の任意の２つの活性成分と、第３の活性成分とを組み合わせることも可能である。３部分からなる組み合わせを、同時または逐次的に投与してよい。逐次投与する場合、この組み合わせは、２つまたは３つの投与物で投与され得る。ある実施形態によれば、本発明の流体ならびにグラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／またはナタリズマブの３部分からなる組み合わせを、任意の順序で投与してよい。
【０２００】
以下の実施例は、単なる例示を意図しており、何ら限定するものではない。
【実施例】
【０２０１】
実施例１
微小気泡サイズ
実験は、ガス微小気泡サイズの限界を決定するために、本発明の散布器を用いることにより、ガス富化流体を用いて行った。微小気泡サイズの限界は、０．２２および０．１ミクロンフィルターを通してガス富化流体を通過させることによって立証された。これらの試験を行う際、ある体積の流体を本発明の散布器に通過させ、ガス富化流体を発生させた。６０ミリリットルの本流体を６０ｍｌ注射器中に流し入れた。続いて、注射器内の流体の溶解酸素レベルをウィンクラー滴定で測定した。注射器内の流体を、０．２２ミクロンのミリポア社製Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＰ５０フィルターを通して、５０ｍｌビーカー中に注いだ。続いて、５０ｍｌビーカー中の物質の溶解酸素の割合を測定した。以下の表４に示される結果を得るために、実験を３回行った。
【０２０２】
【表９】
2013533320.tif 000013
【０２０３】
表に見られるように、注射器内で測定された溶解酸素レベルおよび５０ｍｌビーカー内で測定された溶解酸素レベルは、散布物質を０．２２ミクロンフィルターを通過させることによって有意な変化は生じなかったが、このことは、流体中の溶解ガスの微小気泡が０．２２ミクロンより大きくないことを意味している。
【０２０４】
第二の試験を行い、そこで、１回分の食塩水を本発明の散布器で富化し、出力溶液の試料をフィルター処理していない状態で収集した。フィルター処理していない試料の溶解酸素レベルは４４．７ｐｐｍであった。０．１ミクロンフィルターを用いて本発明の散布器からの酸素富化溶液を濾過し、２つのさらなる試料を収集した。第一の試料について、溶解酸素レベルは４３．４ｐｐｍであった。第二の試料について、溶解酸素レベルは４１．４ｐｐｍであった。最後に、フィルターを除去し、最終試料をフィルター処理していない溶液から収集した。この場合、最終試料は４５．４ｐｐｍの溶解酸素レベルを有していた。これらの結果は、ミリポア社製０．２２ミクロンフィルターを使用した結果と一致した。従って、食塩水内のガス気泡または微小気泡の大部分は、およそ０．１ミクロン未満のサイズである。
【０２０５】
実施例２
（サイトカインプロファイルを決定した）
混合リンパ球を１人の健康な献血者から得た。軟膜試料を標準的な手順に従って洗浄し、血小板を除去した。リンパ球を、２×１０６／プレートの濃度で、本発明のガス富化流体または蒸留水（対照）のいずれかで希釈したＲＰＭＩ培地（＋５０ｍｍ  ＨＥＰＥＳ）に播種した。細胞を、１マイクログラム／ｍＬ  Ｔ３抗原、または１マイクログラム／ｍＬ  フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）レクチン（汎Ｔ細胞活性化因子）で刺激し、あるいは刺激しなかった（陰性対照）。２４時間インキュベーションした後、細胞の生存率を調べ、上清を抽出し凍結した。
【０２０６】
上清を解凍し、遠心し、サイトカイン発現について、ＸＭＡＰ（登録商標）（ルミネックス社）ビーズＬＩＴＥプロトコールおよびプラットフォームを用いて試験した。
【０２０７】
２００万個の細胞を、本発明の酸素富化流体（水）（ウェル１、３、および５）または蒸留水（２、４および６）のいずれかを含む完全ＲＰＭＩ＋５０ｍｍ  Ｈｅｐｅｓ（水で１０×ＲＰＭＩを１×に希釈）中で、２４ウェルプレートの６ウェル中に播種した。細胞を、１μｇ／ｍｌ  Ｔ３抗原（ウェル１および２）またはＰＨＡ（ウェル３および４）で刺激した。対照ウェル５および６は刺激しなかった。２４時間後、細胞の生存率を調べ、上清を収集し凍結した。次に、上清を解凍し、８，０００ｇで回転してペレットにした。上澄みの上清を、ＬＵＭＩＮＥＸ  ＢＥＡＤ  ＬＩＴＥ（商標）プロトコールおよびプラットフォームを用いて、列挙したサイトカインについてアッセイした。数値データを表５に表わし、対応する棒グラフを図１に示す。注目すべきことに、ＩＦＮ−γレベルは、Ｔ３抗原を含む対照培地においてよりも、Ｔ３抗原を含む本発明のガス富化培地においてより高かったが、一方で、ＩＬ−８は、Ｔ３抗原を含む対照培地においてよりも、Ｔ３抗原を含む本発明のガス富化培地においてより低かった。さらに、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αレベルは、ＰＨＡを含む対照培地においてよりも、ＰＨＡを含む本発明のガス富化培地においてより低かったが、一方、ＩＬ−１βレベルは、ＰＨＡを含む対照培地と比較した場合、ＰＨＡを含む本発明のガス富化流体においてより低かった。本発明のガス富化培地単独において、ＩＦＮ−γレベルは、対照培地においてよりも、より高かった。
【０２０８】
【表１０】
2013533320.tif 000014
【０２０９】
実施例３
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）
図２に記載されるように、ＭＯＧ抗原ペプチドに応答してのリンパ球増殖は、加圧した含酸素流体（加圧ポット）または脱イオン化対照流体と比較したとき、本発明のガス富化流体の存在下で培養した場合に増加した。従って、本発明のガス富化流体は、細胞が以前抗原刺激された抗原に対するリンパ球の増殖応答を増幅する。
【０２１０】
既知のマウス配列に対応するミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド３５−５５（ＭＯＧ３５−５５）（Ｍ−Ｅ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ｙ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｆ−Ｓ−Ｒ−Ｏ−Ｖ−Ｈ−Ｌ−Ｙ−Ｒ−Ｎ−Ｇ−Ｋ）（配列番号１；公開第ＵＳ２００８０１３９６７４号参照；参照により本明細書に組み込まれる；この配列番号１を目的とするものも含む）を合成した。次に、５×１０５個の脾臓細胞を、以前にＭＯＧで免疫したＭＯＧ  Ｔ細胞受容体遺伝子導入マウスから採取し、本発明のガス富化流体、加圧含酸素水（加圧ポット水）または対照脱イオン化水で再構成した０．２ｍｌのＴＣＭ流体中で培養した。脾細胞を、ＭＯＧ  ｐ３５−５５と共に、それぞれ４８時間または７２時間培養した。培養物を１Ｃｉ  ［３Ｈ］−チミジンでパルスし、１６時間後に収穫した。３連培養の［３Ｈ］チミジン取り込みの平均ｃｐｍを算出した。結果を図２に示す。
【０２１１】
実施例４
サイトカイン発現
特定の態様では、ヒト混合リンパ球を本発明の界面動電流体中、あるいは対照流体内で、Ｔ３抗原もしくはＰＨＡによって刺激し、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、エオタキシン、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦｂ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、レプチン、ＴＮＦ−β、ＴＦＧ−β、およびＮＧＦにおける変化を評価した。図１から分かるように、試験された炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＧＭ−ＣＳＦ）、ケモカイン（ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、およびエオタキシン）、炎症性酵素（ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、およびＭＭＰ−９）、アレルゲン応答（ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ２３、Ｂ７−１、およびＢ７−２）、並びにＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−５）は、対照流体と比べ試験流体において減少した。対照的に、試験された抗炎症サイトカイン（例えば、ＩＬ１Ｒ−α、ＴＩＭＰ）は、対照流体と比べ試験流体において増加した。
【０２１２】
出願人は、これらのデータをさらに詳しく説明するために、アレルギー性過敏症反応の評価を目的として、オボアルブミン感作を含む当該技術分野において認められているモデル系を使用した。試験したエンドポイントは、前記反応の具体的な細胞学的且つ細胞成分、並びにタンパク質およびＬＤＨの血清学的測定値であった。エオタキシン、ＩＬ−１Ａ、ＩＬ−１Ｂ、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１Ａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−Ａ、およびＶＣＡＭの分析を含む、サイトカイン分析を行った。
【０２１３】
簡潔には、雄Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットに、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）（２００ｍｇ／ｍＬ）含有溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）中の０．５ｍＬのオボアルブミン（ＯＶＡ）グレードＶ（Ａ５５０３−１Ｇ、シグマ社）を、１日目、２日目、および３日目に１回ずつ腹腔内注射した。試験は、２×２要因配置無作為化の処置（４群）であった。免疫反応を起こさせるための２週間の待機期間の後、ラットを１週間、ＲＤＣ１６７６−００（レバレシオ社（Ｒｅｖａｌｅｓｉｏ）専売装置を通して処理された無菌食塩水）、またはＲＤＣ１６７６−０１（レバレシオ社専売装置を通して処理し、さらなる酸素を付加した無菌食塩水）のいずれかで曝露または処置した。１日１回の１週間の処置の終了時に、２つの群を半分に分けて、各群の５０％のラットに吸入による食塩水またはＯＶＡ曝露のいずれかを与えた。
【０２１４】
具体的には、最初のシリアル化（ｓｅｒｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）から１４日後、１２匹のラットを、７日間連続で毎日３０分間、吸入により、ＲＤＣ１６７６−００に曝露した。系を通る空気の流量は１０リットル／分に設定した。計１２匹のラットを、噴霧物質が入り、エアロネブの１２個のサブチャンバに均等に分配される単一ポートを有するパイチャンバ中に整列させた。
【０２１５】
最初の感作から１５日後、１２匹のラットを、７日間連続で毎日３０分間、超音波噴霧により、ＲＤＣ１６７６−０１に曝露した。同じ噴霧器およびチャンバを用いて、気流も１０リットル／分に設定した。ＲＤＣ１６７６−００を最初に噴霧し、ＲＤＣ１６７６−０１を噴霧する前にエアロネブチャンバを完全に乾燥させた。
【０２１６】
最後の噴霧処置からおよそ２時間後、ＲＤＣ１６７６−００群の６匹のラットを、Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ（モデル１Ａ−１Ｂ）を用いて気管内注入により送達されるＯＶＡ（食塩水中で１％）に再曝露した。ＲＤＣ１６７６−００群のその他の６匹のラットは、対照群として、気管内注入によって送達される食塩水に曝露した。次の日、ＲＤＣ１６７６−０１群で前記手順を繰り返した。
【０２１７】
再曝露から２４時間後、各群の全てのラットを、ペントバルビタールナトリウムを過剰投与することにより安楽死させた。全血液試料を下大静脈から採取し、２つの異なる血液採取管、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  ＴｕｂｅおよびＱｉａｇｅｎ  ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  Ｔｕｂｅに入れた。肺器官を処理して、ＲＴ−ＰＣＲ用に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液および肺組織を得て、このモデルにおいて肺の炎症に関わることが知られているサイトカイン発現のマーカーの変化を評価した。肺の右側の４葉の完全性を保つために、片側洗浄技術を使用した。左「大」葉を洗浄し、一方、４枚の右葉は、結紮し、直ちにＴＲＩ−ｚｏｌ（商標）中に入れ、ホモジナイズし、さらなる処理のために実験室に送達した。
【０２１８】
ＢＡＬ分析
肺洗浄液を収集し、６００〜８００ｇ、４℃で１０分間遠心し、細胞をペレットにした。上清を新しい管に移し、−８０℃で凍結した。気管支肺胞洗浄液（「ＢＡＬ」）を２つのアリコートに分割した。第一のアリコートを遠心沈殿させ、上清を砕いたドライアイス上で急速凍結させ、−８０℃に入れ、さらなる処理のために実験室に輸送した。存在するタンパク質およびＬＤＨの量は、それぞれ、血清タンパク質（該タンパク質は、この実験でのように曝露時に膜を通過して漏れる血清成分である）および細胞死のレベルを表わす。独自の試験側（ｔｅｓｔ  ｓｉｄｅ）は、対照よりもわずかに少ないタンパク質を示した。
【０２１９】
気管支肺胞洗浄液の第二のアリコートを、総タンパク質およびＬＤＨ含有量について評価し、さらに細胞診に供した。処置群は、全細胞が、食塩水対照群よりも多いことを示した。さらに、対照群と比べ、処置群において好酸球の増加があった。対照側と比べ処置群において、わずかに異なる多形核細胞も存在した。
【０２２０】
血液分析．
全血を、１．２〜２．０ｍＬの血液を管に移し、少なくとも３０分間凝血させることにより、分析した。残りの血液試料（およそ３．５〜５．０ｍＬ）は、ＴＲＩ−ｚｏｌ（商標）またはＰＡＸｇｅｎｅ（商標）を用いてＲＮＡ抽出用に保存した。次に、凝血させた血液試料を、１２００ｇ、室温で１０分間遠心した。血清（上清）を取って２本の新しい管に入れ、該血清は−８０℃に保存した。
【０２２１】
Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＢ−１２６、モレキュラーリサーチセンター社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｉｎｃ．））を使用するＲＮＡ抽出について、０．２ｍＬの全血または血漿を、０．２ｍＬの全血または血漿あたり２０μＬの５Ｎ  酢酸を補充した０．７５ｍＬのＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＢＤに加えた。管を振盪し、−８０℃で保存した。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）を用いて、室温でおよそ２時間、管をインキュベートした。次に、管を横向きに置いて−２０℃のフリーザーに２４時間保存し、その後長期貯蔵のために−８０℃に移した。
【０２２２】
Ｌｕｍｉｎｅｘ分析．
Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームにより、ミクロビーズ分析を、抗体が関連する結合反応の基質として利用したが、これは、光度ユニットで読み出し、定量化された標準で比較することができる。各血液試料は、２つの試料として同時に検査した。測定ユニットは光度ユニットであり、群を、独自開発の流体を有する、ＯＶＡ曝露対照、ＯＶＡ曝露処置、および食塩水曝露処置に分けた。
【０２２３】
Ａｇｉｌａｎｔ遺伝子アレイデータ作成のために、肺組織を摘出し、ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＲ１１８、モレキュラーリサーチセンター社）中に浸した。簡潔に説明すると、およそ１ｍＬのＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔを、各管の中の５０〜１００ｍｇの組織に加えた。試料を、ｇｌａｓｓ−Ｔｅｆｌｏｎ（商標）またはＰｏｌｙｔｒｏｎ（商標）ホモジナイザーを用いて、ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ中で、ホモジナイズした。試料を−８０℃で保存した。
【０２２４】
要約すると、この、既知の感作に対する炎症反応の標準的アッセイは、少なくとも血液試料において、顕著な臨床的且つ血清学的な影響を生じた。さらに、かなりの数の対照動物が生理学的なストレスを受けて処理中に死亡しかけたが、ＲＤＣ１６７６−０１処置群はいずれも、そのような臨床的なストレス効果を示さなかった。これは、その後、ＯＶＡ曝露群におけるＲＤＣ１６７６−０１処置群とＲＤＣ１６７６−０１処置群の間で、およそ３０％の差異で、サイトカインの血中濃度に反映された。対照的に、ＯＶＡ非曝露群におけるＲＤＣ１６７６−０１処置群とＲＤＣ１６７６−０１処置群の間のサイトカイン、細胞および血清学的プロファイルには小さく非常にわずかな変化しかなく、このことは、恐らく、流体それ自体の最小ベースライン変化を表わしているに過ぎない。
【０２２５】
実施例５
（調節性Ｔ細胞アッセイを用いて、Ｔ細胞増殖の調節、並びに調節性Ｔ細胞アッセイにおけるサイトカイン（ＩＩ−１０）および他のタンパク質（例えば、ＧＩＴＲ、グランザイムＡ、ＸＣＬ１、ｐＳｔａｔ５、およびＦｏｘｐ３））の生成、並びに、例えばＰＢＭＣにおけるトリプターゼの生成における、本発明の界面動電的に生成された流体の効果を示した）
【０２２６】
本明細書で開示される特定の実施形態のＴ細胞調節能を、抗原提示細胞を照射し、抗原およびＴ細胞を導入することによって試験した。通常、これらの刺激されたＴ細胞は増殖する。しかし、調節性Ｔ細胞の導入の結果、通常のＴ細胞増殖は抑制される。
【０２２７】
方法：
簡潔に説明すると、分離に用いるＦＩＴＣと複合体化した抗ＣＤ２５（ＡＣＴ−１）抗体は、ダコ・サイトメーション社（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、イリノイ州シカゴ）から購入した。使用したその他の抗体は以下である：ＣＤ３（可溶条件に対しＨＩＴ３ａ）、ＧＩＴＲ（ＰＥと複合体化）、ＣＤ４（Ｃｙ−５およびＦＩＴＣと複合体化）、ＣＤ２５（ＡＰＣと複合体化）、ＣＤ２８（ＣＤ２８．２クローン）、ＣＤ１２７−ＡＰＣ、グランザイムＡ（ＰＥと複合体化）、ＦｏｘＰ３（バイオレジェンド社（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））、マウスＩｇＧ１（アイソタイプ対照）、およびＸＣＬ１抗体。全ての抗体は、製造業者の取扱説明書に従って使用した。
【０２２８】
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｒｏｓｅｔｔｅキット（ステムセル・テクノロジー社（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて、末梢全血から単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ１２７−ＡＰＣ抗体、抗ＣＤ２５−ＰＥ抗体および抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体とともにインキュベートした。細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ／ｎＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５応答性Ｔ細胞に、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａを用いるフローサイトメトリーで分離した。
【０２２９】
抑制アッセイを、丸底９６ウェルマイクロタイタープレート中で行った。３．７５×１０３個のＣＤ４＋ＣＤ２５陰性応答性Ｔ細胞、３．７５×１０３個の自己調節性Ｔ細胞、３．７５×１０４個の同種照射ＣＤ３枯渇ＰＢＭＣを、記載の通りに加えた。全ウェルに、抗ＣＤ３（５．０ｕｇ／ｍｌのクローンＨＩＴ３ａ）を追加した。Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃で７日間培養した。インキュベーション終了の１６時間前に、１．０ｍＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウェルに加えた。プレートをトムテック（Ｔｏｍｔｅｃ）社製セルハーベスターを用いて収集し、３Ｈ−チミジン取り込みを、パーキンエルマー社製シンチレーションカウンターを用いて測定した。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＳｔｅｍＳｅｐヒトＣＤ３＋Ｔ細胞枯渇（ステムセル・テクノロジー社（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、次いで４０Ｇｙの照射を用いてＴ細胞を枯渇させた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から成った。
【０２３０】
調節性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の条件で刺激し、その後Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ赤色生存率色素（インビトロジェン社）、並びに表面マーカーのＣＤ４、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７で染色した。細胞をＬｙｚｅ／Ｆｉｘ  ＰｈｏｓＦｌｏｗ（商標）緩衝液中に固定し、変性Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（登録商標）で透過処理した。その後、細胞を、それぞれの特定の選択された分子に対する抗体で染色した。
【０２３１】
統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて行った。２群間の比較を、両側の独立スチューデントのｔ試験を用いて行った。３群間の比較を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。０．０５未満のＰ値を有意であると見なした（両側）。２群間の相関は、Ｓｐｅａｒｍａｎ係数を介して、ｒ値が０．７超または−０．７未満である場合に、統計学的に有意であると決定した（両側）。
【０２３２】
要約すると、データは、対照流体（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）中のＰＭと比較して、ＰＭおよびＲｅｖの存在下で、増殖の減少を示し、このことは、アッセイにおいて相対的に減少した増殖に示されるように、本発明の界面動電的に生成された流体Ｒｅｖが調節Ｔ細胞の機能を向上させたことを示す。さらに、本実施例の証拠は、β遮断、ＧＰＣＲ遮断およびＣａチャネル遮断が、調節性Ｔ細胞の機能に対するＲｅｖｅｒａの活性に影響することを示す。
【０２３３】
実施例６
（本発明の界面動電的に生成された流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）を散布したＣａｌｕ−３細胞に対し行ったパッチクランプ分析によって、（ｉ）ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓへの曝露が全細胞伝導性の増加をもたらしたこと、（ｉｉ）ＲＮＳ−６０への細胞の曝露が、１５分間のインキュベーション時間で明らかな、非線形伝導性の増加を生じさせたこと、並びに（ｉｉｉ）ＲＮＳ−６０への細胞の曝露が、カルシウム伝導性チャネルに対してＲＮＳ−６０食塩水の効果を生じさせたことが明らかになった。）
【０２３４】
要約
本実施例では、パッチクランプ試験を行って、本明細書に記載されるような、全細胞電流を調節するための有用性を含む、本発明の界面動電的に生成された食塩水流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の有用性をさらに確認した。２組の実験を行った。
【０２３５】
１組目の実験のデータの概要は、Ｓｏｌａｓ食塩水を用いて得られた全細胞伝導性（電流対電位の関係）は、インキュベーション時間（１５分、２時間）、および全電位プロトコールの両方に対して、高度に比例することを示す。しかしながら、Ｓｏｌａｓと共により長くインキュベーション（２時間）することが、全細胞伝導性を増加させたことは明らかである。ＲＮＳ−６０への細胞の曝露は、デルタ電流（Ｒｅｖ−Ｓｏｌ減算）に示されるように、非線形伝導性における増加を生じさせ、これは、１５分間のインキュベーション時間でのみ明らかである。ＲＮＳ−６０のこの非線形電流に対する効果は消失し、代わりに２時間のインキュベーション時間で高度に線形となる。全ての電位プロトコールで存在するが、非線形全細胞伝導性の寄与は、上述のように、電位感受性があった。
【０２３６】
２組目の実験のデータの概要は、非線形電流に対してＲＮＳ−６０食塩水の効果が存在することを示しており、これは外液中の高カルシウムにおいて明らかにされた。非線形全細胞伝導性の寄与は、電位感受性ではあるが、両方の電位プロトコールに存在し、カルシウム伝導性チャネルに対するＲＮＳ−６０食塩水の効果を示す。
【０２３７】
１組目の実験（伝導性の増加；および非線形電位により調節される伝導性の活性化）
材料および方法
気管支上皮株Ｃａｌｕ−３をパッチクランプ試験に使用した。Ｃａｌｕ−３気管支上皮細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−５５）を、実験の時まで、ガラス製のカバーガラス上で、１０％ＦＢＳを補充したハムＦ１２およびＤＭＥＭ培地の１：１混合物中で培養した。簡潔に説明すると、全細胞電位固定装置を用いて、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０；６０ｐｐｍ溶解酸素を含む界面動電的に処理された生理食塩水；本実施例では「薬剤」と称する場合もある）に曝露されたＣａｌｕ−３細胞に対する効果を測定した。
【０２３８】
パッチクランプ法を使用して、上皮細胞膜の極性およびイオンチャネル活性に対する試験物質（ＲＮＳ−６０）の効果を評価した。具体的には、全細胞電位固定を、気管支上皮株Ｃａｌｕ−３に対して、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｎ−メチルＤ−ＧｌｕｃアミンでｐＨ７．４に調整）から成る浸漬溶液中で行った。基底電流を測定し、その後ＲＮＳ−６０を細胞に散布した。
【０２３９】
より具体的には、パッチピペットを、２段階Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ  ＰＢ−７垂直プラーを用いて、ホウケイ酸ガラス（ガーナーグラス社（Ｇａｒｎｅｒ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏ、カリフォルニア州クレアモント）から引き抜き、次いで、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ  ＭＦ−９マイクロホージ（ナリシゲ・インターナショナルＵＳＡ社（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＵＳＡ、ニューヨーク州イーストメドウ）を用いて、６〜１２Ｍオームの抵抗まで、先端熱加工した。ピペットを、１３５  ＫＣｌ、１０  ＮａＣｌ、５  ＥＧＴＡ、１０  Ｈｅｐｅｓ含有（単位ｍＭ）細胞内液（ｐＨはＮＭＤＧ（Ｎ−メチル−Ｄ−Ｇｌｕｃアミン）で７．４に調整）で満たした。
【０２４０】
培養したＣａｌｕ−３細胞を、以下の細胞外溶液（単位ｍＭ）を含むチャンバ内に入れた：１３５  ＮａＣｌ、５  ＫＣｌ、１．２  ＣａＣｌ２、０．５  ＭｇＣｌ２および１０  Ｈｅｐｅｓ（遊離酸）（ｐＨはＮＭＤＧで７．４に調整した）。
【０２４１】
細胞を、オリンパス社製ＩＸ７１顕微鏡（オリンパス社、日本、東京）の４０倍ＤＩＣ対物レンズを用いて観察した。細胞が接着したギガシールを構築した後、穏やかな吸引を行って導通させ、ホールセル構造（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を得た。導通直後、細胞は、−１２０、−６０、−４０および０ｍＶに電位固定され、±１００ｍＶ（５００ｍｓ／ステップ）の電圧ステップで刺激された。対照条件における全細胞電流を収集した後、同じ細胞に、上記の対照流体と同一の細胞外溶質およびｐＨを含む試験流体を、槽を通して散布し、同じプロトコールを用いて異なる保持電位での全細胞電流を記録した。
【０２４２】
電気生理学的データを、Ａｘｏｎ  Ｐａｔｃｈ２００Ｂ増幅器を用いて得て、１０ｋＨｚで低域フィルタリングし、１４００Ａ  Ｄｉｇｉｄａｔａ（アクソン・インストラメント社（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州ユニオンシティー）を用いてデジタル化した。ｐＣＬＡＭＰ１０．０ソフトウェア（アクソン・インストラメント社）を使用して、データを得て、分析した。ステップ中におよそ４００ｍｓｅｃでの実際の電流値を保持電位（Ｖ）に対してプロットすることにより、電流（Ｉ）対電位（Ｖ）の関係性（全細胞伝導性）を得た。Ｉ／Ｖ関係の傾きは、全細胞伝導性である。
【０２４３】
薬剤および化学薬品
示される場合はいつでも、細胞は、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（５００ｍＭ）、ＩＢＭＸ（イソブチル−１−メチルキサンチン（ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｅ）、２００ｍＭ）およびフォルスコリン（１０ｍＭ）を含有するｃＡＭＰ刺激性反応混液で刺激された。ｃＡＭＰ類似体である８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ））は、Ｈ２Ｏ溶液中の２５ｍＭストックから使用した。フォルスコリン（シグマ社）およびＩＢＭＸ（シグマ社）は、１０ｍＭフォルスコリンおよび２００ｍＭ  ＩＢＭＸストック溶液を両方含有するＤＭＳＯ溶液から使用した。得られたデータは、５〜９個の細胞に対する全細胞電流の平均値±標準誤差として表わした。
【０２４４】
結果：
図３Ａ〜Ｃは、２つの時点（１５分（左パネル）および２時間（右パネル））、異なる電位プロトコール（Ａ、０ｍＶからのステッピング；Ｂ、−６０ｍＶからのステッピング；およびＣ、−１２０ｍＶからのステッピング）での、上皮細胞膜の極性およびイオンチャネル活性に対する界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の効果を評価した一連のパッチクランプ法実験の結果を示す。結果は、ＲＮＳ−６０（黒丸）が、全細胞伝導性に対して、Ｓｏｌａｓ（白丸）よりも大きな影響を有することを示す。その実験では、３つの電位プロトコールにおいて、並びに１５分および２時間インキュベーションの両方の時点で、同様の結果が見られた
【０２４５】
図４Ａ〜Ｃは、３つの電位プロトコール（「デルタ電流」）（Ａ、０ｍＶからのステッピング；Ｂ、６０ｍＶからのステッピング；およびＣ、−１２０ｍＶからのステッピング）、並びに２つの時点（１５分（白丸）および２時間（黒丸））での、ＲＮＳ−６０電流データからのＳｏｌａｓ電流データの減算から得られるグラフを示す。これらのデータは、ＲＮＳ−６０を用いての１５分の時点で、２時間の時点では存在しない非線形電位依存性成分が存在することを示した。
【０２４６】
前の実験でのように、「生理」食塩水でのデータは、基準として用いられる、非常に一貫した、時間依存的な伝導性を与えた。本結果は、群をＳｏｌａｓまたはＲＮＳ−６０食塩水のいずれかに適合させることによって得られ、基礎条件（ｃＡＭＰなし、他のいかなる刺激もなし）下でのＲＮＳ−６０食塩水へのＣａｌｕ−３細胞の曝露が、より短いインキュベーション時間（１５分）での電位調節性の伝導性の活性化と合致した、時間依存的な効果を生じさせたことを示す。この現象は、２時間のインキュベーション時点ではそれほど明らかではなかった。本明細書のいずれかの箇所に記載されるように、ｃＡＭＰ「反応混液」での刺激によって伝導性が増加した場合に、線形成分はより明らかである。それにもかかわらず、２時間のインキュベーション時間は、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ食塩水の両方に対して、より高度な線形伝導性を示し、この場合、ＲＮＳ−６０食塩水は、Ｓｏｌａｓ単独と比べたとき、全細胞伝導性が倍になった。この証拠は、全細胞伝導性に対する少なくとも２つの寄与、すなわち非線形電位調節性伝導性、および線形伝導性の活性化が、ＲＮＳ−６０食塩水によって影響されることを示しており、これは、より長いインキュベーション時間でより明らかである。
【０２４７】
２組目の実験（カルシウム伝導性チャネルに対する効果）
２組目の実験の方法：
一般的なパッチクランプ法については上記を参照されたい。以下の２組目の実験では、基礎条件下でＣａｌｕ−３細胞を用いて０ｍＶまたは−１２０ｍＶのいずれかの保持電位からステッピングするプロトコールを用いて、さらに追加のパッチクランプ試験を行い、全細胞電流を調節するために、本発明の界面動電的に生成された食塩水流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の有用性をさらに確認した。
【０２４８】
それぞれの場合における全細胞伝導性を、いずれかの食塩水を用いて１５分間インキュベートした細胞から得られた電流対電位関係から得た。全細胞伝導性に対しカルシウム伝導性チャネルの寄与が存在するか否か、およびこの全細胞伝導性の一部がＲＮＳ−６０食塩水を用いたインキュベーションによって影響されるか否かを決定するため、細胞を、インキュベーション期間後に生理食塩水中でパッチした（高ＮａＣｌの外液を伴うが、内液は高ＫＣｌを含有する）。次いで、外部食塩水を、ＮａＣｌをＣｓＣｌに置き換えた溶液と置き換え、主な外部陽イオンを置き換えることによって伝導性に変化があるどうかを測定した。その後これらの条件下で、同じ細胞を、カルシウム流入ステップがより明らかになるように、漸増濃度のカルシウムに曝露した。
【０２４９】
結果：
図５Ａ〜Ｄは、異なる電位プロトコール（パネルＡおよびＣは、０ｍＶからのステッピングを示し、一方パネルＢおよびＤは−１２０ｍＶからのステッピングを示す）で、異なる外部塩類溶液を用いて、上皮細胞膜の極性およびイオンチャネル活性に対する界面動電的に生成された流体（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）およびＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））の効果を評価した、一連のパッチクランプ法実験の結果を示す。これらの実験では、１５分の１つの時点が用いられた。Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）の場合、１）外液としてＮａＣｌの代わりにＣｓＣｌ（四角のシンボル）を用いることが、対照（ひし形シンボル）と比較した場合、線形挙動で全細胞伝導性が増加させたこと；並びに２）２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（丸シンボル）および４０ｍＭ  ＣａＣｌ２（三角シンボル）のＣａＣｌ２が共に、非線形様式で全細胞伝導性を増加させたことを、結果は示している。ＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ）の場合、１）外液としてＮａＣｌの代わりにＣｓＣｌ（四角のシンボル）を用いることが、対照（ひし形シンボル）と比較した場合、全細胞伝導性に対する影響をほとんど持たなかったこと；および２）４０ｍＭ（三角シンボル）のＣａＣｌ２が、非線形の様式で全細胞伝導性を増加させたことを、結果は示している。
【０２５０】
図６Ａ〜Ｄは、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）およびＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ）について、２つの電位プロトコール（パネルＡおよびＣ、０ｍＶからのステッピング；並びにＢおよびＤ、−１２０ｍＶからのステッピング）での、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（ひし形シンボル）および４０ｍＭ  ＣａＣｌ２（四角のシンボル）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図５に示される）の減算によって得られたグラフを示す。ＳｏｌａｓおよびＲＮＳ−６０溶液の両方が、カルシウムにより誘発される非線形全細胞伝導性を活性化したことを、結果は示す。効果はＲＮＳ−６０を用いた場合により大きく（用量反応性を示す）、ＲＮＳ−６０を用いた場合のみ、より高いカルシウム濃度で増加された。さらに、より高いカルシウム濃度における非線形カルシウム依存性伝導性は、前記電位プロトコールによっても増加した。
【０２５１】
この２組目の実験のデータは、Ｃａｌｕ−３細胞において得られる全細胞伝導性データに対する、ＲＮＳ−６０食塩水およびＳｏｌａｓ食塩水の効果をさらに示す。データが示すことは、いずれかの食塩水を用いての１５分間のインキュベーションが、全細胞伝導性に対する明確な効果を生み、それが、ＲＮＳ−６０を用いて、外部カルシウムを増加させる場合に、最も明白であるということであり、さらには、ＲＮＳ−６０食塩水が、全細胞伝導性のカルシウム依存性非線形成分を増加させるということである。
【０２５２】
蓄積された証拠により、Ｒｅｖａｌｅｓｉｏ食塩水によるイオンチャネルの活性化が示唆されており、それが、基底細胞伝導性に対し異なる寄与を与えている。
【０２５３】
出願人の他のデータ（例えば、出願人の他の実施例のデータ）と総合すると、本発明の特定の態様は、膜構造、膜電位もしくは膜伝導性、膜タンパク質もしくは受容体、イオンチャネル、脂質成分、または細胞によって交換可能な細胞内成分（例えば、カルシウム依存性細胞内シグナル伝達系等のシグナル経路）のうち少なくとも１つの調節を含む細胞内シグナル伝達を調節するための組成物および方法を提供し、該方法には、膜上構造（例えば、膜および／もしくは膜タンパク質、受容体または他の膜成分）例えば、限定はされないが、ＧＰＣＲおよび／またはｇ−タンパク質における電気化学的および／または立体構造的な変化を与えるための、本発明の界面動電的に生成された溶液の使用が含まれる。さらなる態様によれば、これらの効果は遺伝子発現を調節し、例えば個々の伝達成分の半減期等に依存して、持続し得る。
【０２５４】
実施例７
（本発明の界面動電流体は、当該技術分野において認められている多発性硬化症（ＭＳ）の急性実験的アレルギー性（自己免疫性）脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットＭＢＰモデルにおいて、用量反応性の様式で、実質的に効果的であることが示された）
【０２５５】
要約：
本実施例では、本発明の界面動電流体ＲＮＳ−６０を、２つの用量で、予防的投与計画および治療的投与計画の両方において、当該技術分野において認められているミエリン塩基性タンパク質ＭＢＰ誘発性急性実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のラットモデルにおいて、評価した。本発明の界面動電流体ＲＮＳ−６０は、用量反応性の様式で、実質的に効果的であることが示された。治療的（ＭＢＰ注射と同時に開始されるＲＮＳ−６０の連日投与）および予防的（ＭＢＰ注射の７日前に開始されるＲＮＳ−６０の連日投与）ＲＮＳ−６０投与計画の両方が、臨床スコアの著しい減少、および遅発（高用量群）を示した。従って、本発明の特定の態様によれば、本発明の界面動電組成物は、当該技術分野において認められているヒトＭＳのラットモデルにおけるＥＡＥの症状を軽減および防止することを含む治療に対し、実質的な有用性を有する。従って、本発明のさらなる態様によれば、本発明の界面動電組成物は、罹患した哺乳動物（好ましくはヒト）におけるＭＳの症状を軽減および防止することを含む治療に対し、実質的な有用性を有する。さらなる態様では、本発明の界面動電組成物は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、それにより、中枢神経系の炎症性疾患を治療するための新規の方法を提供した。
【０２５６】
多発性硬化症（ＭＳ）
多発性硬化症（ＭＳ）は中枢神経系（ＣＮＳ）の脱髄疾患であり、若年成人において最も一般的な、機能障害性の神経性疾患の１つである。この疾患の主な特徴は、脱髄および炎症の病巣領域である。疾病経過は、予測不可能で且つ生涯に渡るものであり、男性よりも、より一般的には女性に、発症する。前記疾患の病因は、遺伝的要因および環境的要因に依存しているように思われる。末梢において、抗原は、ＭＣＨ  ＩＩを介して抗原提示細胞（ＡＰＣ）に結合される。Ｔｈ０細胞は抗原に結合し、活性化および分化を起こす。接着分子およびマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、Ｔｈ１細胞が、血液脳関門（ＢＢＢ）と結合し、透過するのを促す。ＢＢＢを通過しＣＮＳに入ると、Ｔｈ１細胞は抗原−ＭＨＣ複合体と結合し、炎症誘発性サイトカインを産生して、ＣＮＳに損傷をもたらす。自己免疫系は、ミエリンタンパク質を外来性であると認識し、攻撃を開始する。従来より、Ｔｈ１細胞は前記疾患の病態において主な役割を果たすと考えられているが、最新の知見では、Ｔｈ１７細胞、ＩＬ−６およびＴＧＦ−βの炎症誘発性カスケードが、ＥＡＥおよびＭＳの病因において決定的な役割を果たしていることが示されている。
【０２５７】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、実験的アレルギー性脳脊髄炎とも称され、多発性硬化症（ＭＳ）の非ヒト動物モデルである。ＭＳではないが、ＥＡＥの種々の形態およびステージは、ＭＳの種々の形態およびステージと多くの点で非常に類似している。より具体的には、ＥＡＥは、急性または慢性再発性で、後天性で、炎症性且つ脱髄性である、自己免疫疾患である。動物に、神経細胞（ニューロン）を取り囲む絶縁被覆であるミエリンを構成する種々のタンパク質（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ））の全てまたは一部を注射し、ヒトにおけるＭＳに非常に類似している、動物自身のミエリンに対する自己免疫応答を誘導する。ＥＡＥは、いくつかの異なる動物種、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、マカク、アカゲザルサルおよびマーモセットにおいて誘導されている。免疫学的手段の数、有効性、動物の寿命および繁殖力、並びに誘発された疾患のＭＳへの類似点を含む様々な理由から、マウスおよびラットが最も一般的に用いられる種である。急性のラットＥＡＥモデルは、強力な炎症性成分を有しており、それ故、ＭＳにおける免疫事象を標的とする薬剤の、治療薬としての可能性を調査するのに適切なモデルである。
【０２５８】
ＭＢＰ誘発性ＥＡＥ
ＬｅｗｉｓラットにおけるＭＰＢは、一回用量後に、主に後肢の麻痺を特徴とする再発をもたらす。Ｌｅｗｉｓラットは、０日目にＭＢＰ注射を受ける。疾患は１２日目〜１６日目に発症し、疾患の完全な回復は１８日目〜２１日目に起こる。前記モデルは自己限定的であり、脱髄は示さない。
【０２５９】
材料および方法
試験流体（ＲＮＳ−６０）の生成および特徴付け
フィルター滅菌したＲＮＳ−６０が、第ＵＳ２００８／０２１９０８８号（２００８年９月１１日に公開）、第ＵＳ２００８／０２８１００１号（２００８年１１月１１日に公開）および第ＷＯ２００８／０５２１４３号（２００８年５月２日に公開）に従って、出願人によって調製され、これらの文献の全ては、それらの全体において、特に出願人の本発明の界面動電流体を調製するための装置および／または方法に関する全ての態様に関して、参照により本明細書に組み込まれる。ウィンクラー滴定アッセイで測定された、使用されたＲＮＳ−６０の溶解酸素（ＤＯ）含有量は、５９ｐｐｍであった（Ｙ．Ｃ．  Ｗｏｎｇ  ＆  Ｃ．Ｔ．  Ｗｏｎｇ．  Ｎｅｗ  Ｗａｙ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ  Ａ−Ｌｅｖｅｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４，  Ｐａｇｅ  ２４８．またはＳｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ  −  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＩＳＢＮ  ０−８７５５３−２３５−７）。ＲＮＳ−６０流体に、試験品（ＴＩ）番号、受領日、保存条件および使用期限を示すラベルを貼った。試験施設における試験中の安定性を確実にするため、ＲＮＳ−６０の保存条件および取扱いは、出願人の明細書に従った。流体は、使用していないときは２〜８℃で冷蔵した。流体を入れるバイアルは、使い捨ての容器として用いた。
【０２６０】
ビヒクル対照流体
ビヒクル対照流体は、ホスピーラ（Ｈｏｓｐｉｒａ）社製の注射用（０．９％）生理食塩水であった。
【０２６１】
デキサメタゾン
デキサメタゾンは、シグマ社から購入した（カタログ番号Ｄ１７５６；ロット番号０９６Ｋ１８０５）。投与用に、デキサメタゾン（白色粉末）をエタノールに希釈して１ｍｇ／ｍｌの濃度を得て、次いで蒸留水に再度希釈して０．１ｍｇ／ｍｌの投与濃度を得た。
【０２６２】
ＥＡＥ誘発品：
ＭＢＰ抗原
ＭＢＰはモルモット由来のミエリン塩基性タンパク質であった（Ｄｅｓ−Ｇｌｙ−７７、Ｄｅｓ−Ｈｉｓ−７８）−ＭＢＰ（６８〜８４）；カタログ番号Ｈ−６８７５；ＭＤバイオサイエンス社（ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により提供）。ＭＢＰを２ｍｇ／ｍｌの濃度で生理食塩水に溶解させた；
【０２６３】
ＣＦＡ感作剤
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）は、ＭＤバイオサイエンス社（ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｒｗｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）から得た（カタログ番号ＩＭＡＤ−４）。加熱殺菌されたヒト結核菌Ｈ３７  Ｒａを４ｍｇ／ｍｌの濃度で含有するＣＦＡ懸濁液は、供給されたままに使用した；
【０２６４】
ＭＢＰ／ＣＦＡエマルジョン（抗原性／感作剤）
試験の０日目に行われる単回接種の前に、ルアーフィッティングで連結された２本の注射器を使用して、１容量のＭＢＰ溶液を等量のＣＦＡ  ４ｍｇ／ｍｌと混合し、乳剤質の混合物を完全に混合して、１００μｌ／動物の全投与体積と等しくした。投与量は、足底内注射領域に、２×５０μｌの皮下（ＳＣ）両側注射剤として送達された。
【０２６５】
試験動物；ラット
６０匹の雌Ｌｅｗｉｓラット（試験開始時に６〜７週齢）を、ハーラン・ラボラトリーズ・イスラエル社（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｓｒａｅｌ，  Ｌｔｄ）から得た。処置開始時の動物の重量偏差は、平均重量の２０％を超過すべきではない。本試験に使用された動物の健康状態は、到着時に検査する。良好な健康状態にある動物のみを、実験室条件に馴化させ、本試験に使用した。本試験を開始する前に、少なくとも５日間、動物を馴化させた。馴化中、および試験期間全体を通して、動物は、出入制限げっ歯類施設中で飼育し、固い底部を備え、寝床材料として無菌のかんな屑を床敷きしたポリプロピレンケージ中に、最大５匹のラットの群で、飼育した。動物は、市販のげっ歯類食餌で不断給餌され、自由に飲料水にアクセスでき、飲料水は、ステンレス鋼製給水管（ｓｉｐｐｅｒ  ｔｕｂｅ）を有するポリエチレンボトルを介して各ケージに供給された。本試験で使用した食餌バッチのフィードロット分析は、本試験データと共に記録に含まれる。水は定期的にモニターした。自動制御される環境条件は、試験室が２０〜２４℃の温度、３０〜７０％の相対湿度（ＲＨ）、１２時間：１２時間の明：暗周期、および１５〜３０換気／時を維持するよう設定した。温度およびＲＨを毎日モニターした。明周期を親時計（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｌｏｃｋ）でモニターした。動物には、尾標識を用いて、独自の動物識別を施した。この番号は、各ケージの正面に見えるケージ札にも表示させた。ケージ札には、試験および群の番号、投与経路、性別、株および処置群に関する他の全ての詳細も含まれた。
【０２６６】
【表１１】
2013533320.tif 000015
【０２６７】
試験手順および急性ＥＡＥマウスモデルの原理
実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）の臨床的特徴および病理的特徴の多くを模倣する、中枢神経系（ＣＮＳ）の自己免疫性脱髄疾患である。急性のラットモデルは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中でエマルジョン化したミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の試験０日目での単回皮下（ＳＣ）注射によって誘導される、感作期間から成る。
【０２６８】
ＥＡＥ誘導および治療計画の概略図を図８に示す。
【０２６９】
ＥＡＥ誘導：
ＭＢＰ／ＣＦ  Ａ．
図８の概略図に示されるように、全ての動物は、試験０日目（試験開始）に、ＭＢＰおよびＣＦＡのホモジネート乳剤質混合物から成る、単回接種物注射を受けた（ＭＢＰ／ＣＦＡ脳炎惹起性乳剤質接種物（１００μｇ  ＭＢＰ／２００μｇ  ＣＦＡ）は、１００μｌ／動物の総投与体積で注射され、２×５０μｌの皮下（ＳＣ）両側注射剤として、足底内注射領域に送達された）。
【０２７０】
処置：
処置の投与計画および手順
全ての化合物は、動物をスコア化する者とは異なる者により、毎日新しく調製された。動物をスコア化した者は、群番号のみ標識されたバイアルを受け取り、処置については知らされていなかった。
【０２７１】
投与経路：（ｉ）ＲＮＳ−６０（ＩＶ）；（ｉｉ）ビヒクル対照：（ＩＶ）；および（ｉｉｉ）陽性対照：（ＩＰ）。
【０２７２】
用量レベルおよび投与量：（ｉ）ＲＮＳ−６０：低用量  ３５０ｇに対し２ｍｌ；高用量  ３５０ｇに対し４ｍｌ；（ｉｉ）ビヒクル対照：０；および（ｉｉｉ）陽性対照（デキサメタゾン）：１ｍｇ／ｋｇ。
【０２７３】
対症的ケア．
試験の経過中に決定されない限り、ＥＡＥ実験効果が予期されたおよび／もしくは観察された時点で（単回の脳炎惹起性接種からおよそ８〜１２日目後）、または動物が前回測定値から１５％超の体重減少、もしくは最初の体重測定値の２０％超の減少を示していた場合、臨機応変に適切な対症的ケアを行った。
【０２７４】
給餌および給水
飲料水に浸された、細断されたペレットまたは粉状のげっ歯類食餌から成る、追加の水源を、ケージ底部の、腹這いで進む／非移動性の動物の正面に設置した。
【０２７５】
脱水
動物は、体重が最初の測定値の１０％以内に戻るまで、少なくとも１日２回、最大２ｍｌ／動物／日の５％デキストロース溶液による皮下（ＳＣ）補足流体療法を受ける場合がある。
【０２７６】
排尿
動物の腹部の触診は、排尿を補助するため、および動物が膀胱を空にできるかどうかを観察するために行われた。
【０２７７】
他の特殊なケア
動物の肛門周辺部および後肢を、必要に応じて、湿らせたガーゼパッドで清潔にした。
【０２７８】
観察および検査：
臨床徴候
２１日間の試験全体を通して、ＥＡＥ臨床的スコアリングおよび評価（以下参照）に加えて少なくとも１日１回、注意深い臨床検査を行い、記録した。観察には、皮膚、毛、目、粘膜、分泌および排泄（例えば下痢）の発生頻度、並びに自律神経活動（例えば、流涙、唾液分泌、立毛、瞳孔の大きさ、異常な呼吸パターン）、歩調、姿勢、並びに処置に対する応答における変化、並びに異常挙動、振戦、痙攣、睡眠および昏睡の有無が含まれる。
【０２７９】
体重
体重減少は、疾患発症の最初の兆候であり得るが、一方、急激な著しい体重増加はＥＡＥ症状の軽快に付随して起こる傾向がある。従って、個々の動物の体重測定は、試験０日目（試験開始）のＥＡＥ誘導の直前に行い、その後は全２１日間の観察期間全体を通して毎日行った。
【０２８０】
ＥＡＥ臨床的スコアリングおよび評価
初めに、ＥＡＥ誘導（試験０日目）前に、全ての動物について、いずれの神経性の応答および症状の兆候もないかを検査し、その後は、全２１日間の観察期間全体を通して毎日検査した。実験上のバイアスを避けるため、ＥＡＥ反応は、適応された具体的な処置について知らされていないスタッフによって、可能な限り、盲検方式で判定される。以下の表７に示すように、古典的な、当該技術分野において認められている、従来の０〜５スケールに従って、重症度の低い順にＥＡＥ反応をスコア化して記録した。
【０２８１】
【表１２】
2013533320.tif 000016
【０２８２】
血液試料
試験終了日（２１日目）、全ての動物は、注射の１時間後に採血された。試料は、試験０日目（予防群のみ）、７日目、１４日目、および２１日目に採取した。血漿はヘパリン処置したバイアルに採取し、−２０℃に保った。３００μｌの体積を血球数分析用に貯蔵し、１００μｌを、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを介するさらなるサイトカイン分析用に貯蔵して使用した。血球数は０、７、１４、および２１日目に分析した。
【０２８３】
組織採取
試験終了時、動物を４％ＰＦＡに浸した。脳および脊髄を採取し、４％ＰＦＡ中に保持した。
【０２８４】
人道的エンドポイント
瀕死状態であることが判明した動物および／または激しい痛みを示し重度の苦痛の兆候を持続している動物は、人道的に安楽死させた。
【０２８５】
統計的／データ評価：
評価は、全処置群対ビヒクル対照群において得られた、絶対値、割合（％）変化および群平均値として表わされた、神経性症状と体重の両方において記録された相対的な変化に主に基づいたものである。適切な統計手法によるデータ分析を適用して、治療効果の有意性を判定した。
【０２８６】
動物ケアおよび使用記述：
本試験は、適切な実験動物のケアおよび使用における道義的行為のための委員会（ｔｈｅ  ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｎｄｕｃｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に提出された、本試験が規則および規定に準拠している旨の申請書の承認後に行われた。
【０２８７】
結果：
本試験の結果を図７に示す。図７では、時間（ＭＢＰ注射からの日数）をＸ軸に示し、「臨床的スコア」（上記「材料および方法」以下を参照）をＹ軸に示す。
【０２８８】
図７は、本発明の界面動電流体（ＲＨＳ−６０）が、当該技術分野において認められている多発性硬化症（ＭＳ）の実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットモデルにおいて、実質的に効果的であったことを示す（上記「材料および方法」以下を参照）。
【０２８９】
具体的には、ビヒクル対照群（黒ひし形）と比較して、１７日間に渡って、治療的（ＭＢＰ注射と同時に開始するＲＮＳ−６０の連日投与）および予防的（ＭＢＰ注射の７日前に開始するＲＮＳ−６０の連日投与）ＲＮＳ−６０投与計画の両方が、臨床スコアの著しい減少、および遅発（高用量）を示した。
【０２９０】
低用量（毎日１ｃｃ注射）ＲＮＳ−６０治療群の臨床スコアは、ビヒクル対照群のそれのおよそ２分の１（１／２）であったが、一方、高用量（毎日２ｃｃ注射）ＲＮＳ−６０治療群の臨床スコアは、ビヒクル対照群のそれのおよそ５分の１（１／５）〜１０分の１（１／１０）であるだけでなく、発症遅延も示した。
【０２９１】
低用量（毎日１ｃｃ注射）ＲＮＳ−６０予防群の臨床スコアは、ビヒクル対照群のそれのおよそ３分の１（１／３）であったが、一方、高用量（毎日２ｃｃ注射）ＲＮＳ−６０予防群の臨床スコアは、１６日間を通してゼロ（検出可能な臨床スコアなし）であり、実質的な発症遅延を示しただけでなく、１７日目に観察可能になったとき、同じ時点のビヒクル対照群のそれの１０分の１未満（１／１０）であった。
【０２９２】
従って、本発明の特定の態様によれば、本発明の界面動電組成物は、当該技術分野において認められているヒトＭＳのラットモデルにおけるＥＡＥの症状を軽減および防止することを含む治療に対し、実質的な有用性を有する。
【０２９３】
実施例８
（本発明の界面動電流体は、当該技術分野において認められている多発性硬化症（ＭＳ）の急性実験的アレルギー性（自己免疫性）脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットＭＢＰモデルにおいて、ラットの体重維持に有効であることが示された）
【０２９４】
要約：
本実施例は、実施例７に記載された実験に供されたラットの体重変化を開示する。体重減少は、疾患発症の最初の兆候であり得るが、一方、急激な著しい体重増加はＥＡＥ症状の軽快に付随して起こる傾向がある。従って、個々の動物の体重測定は、試験０日目（試験開始）のＥＡＥ誘導の直前に行い、全２１日間の全体を通して毎日行った。体重に対する本発明の界面動電流体ＲＮＳ−６０の効果は、ＥＡＥラットモデルに供されたラットの体重維持に有効であることが示された（図９）。
【０２９５】
体重データ：
図９は、体重を、グラム単位で（パネルＡ）、および１００グラムを基準にしたパーセンテージ（パネルＢ）として、示したものである。本実施例で処置された動物における平均体重のわずかな低下の後、平均体重は増加を開始し、試験終了まで継続した。試験終了時、平均体重増加は、ビヒクル処置動物（１Ｆ群）において２０％であった。試験全体を通して、試験０日目に開始して投与されたデキサメタゾン処置群（２Ｆ群）は、試験中に平均体重が１０％減少した。試験終了時、デキサメタゾン処置動物は、２％の平均体重を失った。予防的な、低用量処置群（３Ｆ群）は、試験１〜３日目に最大４％の平均体重減少を示し、その後、試験終了日までに平均体重が２３％増加した。予防的な、高用量処置群（４Ｆ群）は、試験１〜３日目に最大５％の平均体重減少を示し、その後、試験終了日までに平均体重は２８％増加した。治療的な、低用量処置群（５Ｆ群）は、試験１〜３日目に最大４％の平均体重減少を示し、その後、試験終了日までに平均体重は２１％増加した。治療的な、高用量処置群（６Ｆ群）は、試験１〜３日目に最大４％の平均体重減少を示し、その後、試験終了日までに平均体重は１９％増加した。
【０２９６】
従って、本発明の界面動電流体ＲＮＳ−６０は、ＥＡＥラットモデルに供されたラットの体重維持に有効であることが分かった。
【０２９７】
従って、本発明の特定の態様によれば、本発明の界面動電組成物は、当該技術分野において認められているヒトＭＳのラットモデルにおけるＥＡＥの症状を軽減および防止することを含む治療に対し、実質的な有用性を有する。
【０２９８】
実施例９
（本発明の界面動電流体は、当該技術分野において認められている多発性硬化症（ＭＳ）の急性実験的アレルギー性（自己免疫性）脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットＭＢＰモデルに供されたラットから採血した血液試料中の白血球、好中球、およびリンパ球のレベルに対しては、わずかな影響しかないことが示された）
【０２９９】
要約：
本実施例は、実施例７に記載された実験中にラットから採血した血液試料中の白血球、好中球、およびリンパ球のレベルを開示する。サイトカインレベルにおける変化が白血球における全体的な変化によるものであったかどうかを決定するため、出願人は、実験全体を通して、ＥＡＥ実験に供されたラットから血液試料を採血した。
【０３００】
白血球、好中球、およびリンパ球のレベル：
図１０Ａ〜Ｄは、ＥＡＥ実験全体を通して採血された血液試料中の白血球、好中球、およびリンパ球のレベルを示す。
【０３０１】
試験０日目（パネルＡ）、７日目（パネルＢ）、１４日目（パネルＣ）および２１日目（パネルＤ）に試験品を投与してから１時間後に、白血球（ＷＢＣ）、好中球およびリンパ球を計数した。動物が試験７日目にビヒクルで処置された１時間後の最大のＷＢＣ数は、８．２３±０．３６ポイントであった。デキサメタゾン処置は、ビヒクルに対して、平均ＷＢＣ数を２．４６±０．３８ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に減少させた。低用量試験品での治療的処置（５Ｆ群）は、ビヒクルに対して、平均ＷＢＣ数を９．５９±０．４６ポイント（ｐ＜０．１）まで有意に増加させた。高用量試験品での治療的処置（群６Ｆ）は、ビヒクルに対して、平均ＷＢＣ数を１０．８４±０．８８ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に増加させた。
【０３０２】
動物が試験１４日目にビヒクルで処置された１時間後の最大ＷＢＣ数は、６．３４±０．２８ポイントであった。デキサメタゾン処置は、ビヒクルに対して、平均ＷＢＣ数を３．７９±０．６９ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に減少させた。高用量試験品での予防的処置（４Ｆ群）は、ビヒクルに対して、平均ＷＢＣ数を７．８３±０．５１ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に増加させた。低用量試験品での治療的処置（５Ｆ群）は、ビヒクルに対して、平均ＷＢＣ数を７．６５±０．５２ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に増加させた。高用量試験品での治療的処置（６Ｆ群）は、ビヒクルに対して、平均ＷＢＣ数を８．０５±０．４３ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に増加させた。動物が試験２１日目にビヒクルで処置された１時間後の最大ＷＢＣ数は、９．０９±０．７５ポイントであった。デキサメタゾン処置は、ビヒクルに対して、平均ＷＢＣ数を５．１２±０．５７ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に減少させた。
【０３０３】
動物が試験７日目にビヒクルで処置された１時間後の最大好中球数は、２６．２０±１．６２ポイントであった。デキサメタゾン処置は、ビヒクルに対して、平均好中球数を６５．３８±４．６２ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に増加させた。高用量試験品での予防的処置（４Ｆ群）は、ビヒクルに対して、平均好中球数を３１．９０±０．９６ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に増加させた。高用量試験品での治療的処置（６Ｆ群）は、ビヒクルに対して、平均好中球数を３３．９０±２．７９ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に増加させた。
【０３０４】
動物が試験１４日目にビヒクルで処置された１時間後の最大好中球数は、３３．００±２．５８ポイントであった。デキサメタゾン処置は、ビヒクルに対して、平均好中球数を７３．１０±３．１５ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に増加させた。
【０３０５】
動物が試験２１日目にビヒクルで処置された１時間後の最大好中球数は、４１．４０±２．３２ポイントであった。デキサメタゾン処置は、ビヒクルに対して、平均好中球数を８９．３３±１．９７ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に増加させた。高用量試験品での治療的処置（６Ｆ群）は、ビヒクルに対して、平均好中球数を３４．６０±３．０８ポイント（ｐ＜０．１）まで有意に減少させた。
【０３０６】
試験７日目にビヒクルで処置された１時間後の最大リンパ球数は、７３．２０±１．９５ポイントであった。デキサメタゾン処置は、ビヒクルに対して、平均リンパ球数を３０．６３±１．３１ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に減少させた。高用量試験品での予防的処置（４Ｆ群）は、ビヒクルに対して、平均リンパ球数を６８．３０±１．４２ポイント（ｐ＜０．１）まで有意に減少させた。高用量試験品での治療的処置（６Ｆ群）は、ビヒクルに対して、平均リンパ球数を６４．８０．±３．００ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に減少させた。
【０３０７】
試験１４日目にビヒクルで処置された１時間後の最大リンパ球数は、６６．１０±２．５３ポイントであった。デキサメタゾン処置は、ビヒクルに対して、平均リンパ球数を２６．８０±３．２３ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に減少させた。
【０３０８】
試験２１日目にビヒクルで処置された１時間後の最大リンパ球数は、５７．５０±２．０９ポイントであった。デキサメタゾン処置は、ビヒクルに対して、平均リンパ球数を１０．１１±２．０８ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に減少させた。高用量試験品での治療的処置（６Ｆ群）は、ビヒクルに対して、平均リンパ球数を６６．２０±２．７４ポイント（ｐ＜０．０５）まで有意に増加させた。
【０３０９】
従って、予防的および治療的に高用量で投与された本発明の界面動電流体ＲＮＳ−６０は、ビヒクルに対して、試験７日目に、好中球数を有意に増加させ、リンパ球数を有意に減少させた。本発明の界面動電流体ＲＮＳ−６０は、予防的に高用量で投与された場合、並びに治療的に高用量および低用量で投与された場合に、ビヒクルに対して、試験１４日目に、ＷＢＣ数を有意に増加させた。治療的に高用量で投与された試験品ＲＮＳ６０は、ビヒクルに対して、試験２１日目に、好中球数を有意に減少させ、リンパ球数を増加させた。従って、本発明の界面動電流体ＲＮＳ−６０は、ＷＢＣ、好中球、およびリンパ球の全体的なレベルに対しほとんど影響しないことが分かった。
【０３１０】
実施例１０
（本発明の界面動電流体は、当該技術分野において認められている多発性硬化症（ＭＳ）の急性実験的アレルギー性（自己免疫性）脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットＭＢＰモデルに供されたラットから採血された血液試料中の、ある種のサイトカインのレベルに影響することが示された。）
【０３１１】
要約：
本実施例は、実施例７に記載された実験中にラットから採血された血液試料中に発見されたサイトカインのレベルを開示する。本発明の界面動電流体ＲＮＳ−６０を、実施例７に記載された治療的投与計画において評価した。本発明の界面動電流体ＲＮＳ−６０は、ＥＡＥラットモデルに供されたラットから採血された血液試料中のある種のサイトカインのレベルに影響することが示された。
【０３１２】
ある種のサイトカインが、多発性硬化症に関与することが示されている。特に、ＣＴＬＡ−８またはＩＬ−１７Ａとしても知られているインターロイキン１７（ＩＬ−１７）は、急性および慢性ＥＡＥにおける中枢神経系で、上昇したレベルを有することが示されている（Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ，  Ｈ．  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （２００５），  ２３７：１２３−１３０）。ＩＬ−１７は、種々の非免疫細胞からの広範な他のサイトカインの分泌を刺激する炎症誘発性サイトカインである。ＩＬ−１７は、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞および内皮細胞のような接着細胞によるＩＬ−６、ＩＬ−８、ＰＧＥ２、ＭＣＰ−１およびＧ−ＣＳＦの分泌を誘導することが可能であり、また、ＩＣＡＭ−１の細胞表面発現、Ｔ細胞の増殖、並びに照射された線維芽細胞の存在下で培養された場合の、ＣＤ３４＋ヒト前駆細胞の好中球への成長および分化を誘導することもできる（Ｆｏｓｓｉｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６，  ５４１−５５１）。ＩＬ−１７は、活性化した記憶Ｔ細胞によって主に産生され、遍在的に分布した細胞表面受容体（ＩＬ−１７Ｒ）に結合することによって作用する（Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  ９，  ７９４−８００）。炎症反応調節において同様の役割および異なる役割の両方を有する、いくつかのＩＬ−１７相同体が、同定されている。ＩＬ−１７サイトカイン／受容体ファミリーの総括については、Ｄｕｍｏｎｔ，  ２００３，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｐａｔｅｎｔｓ，  １３，  ２８７−３０３を参照されたい。
【０３１３】
ＩＬ−１７は、関節リウマチおよび気道炎症、並びに臓器移植拒絶反応および抗腫瘍性免疫等の異常な免疫応答によって媒介されるいくつかの疾患に寄与し得る。ＩＬ−１７活性の阻害剤は当該技術分野において周知であり、例えば、ＩＬ−１７Ｒ：Ｆｃ融合タンパク質が、コラーゲン誘発関節炎におけるＩＬ−１７の役割を示すために用いられ（Ｌｕｂｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００１，１６７，  １００４−１０１３）、中和ポリクローナル抗体は、腹膜癒着形成を低減するために用いられている（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，  １９５，  １４７１−１４７８）。中和モノクローナル抗体が市販されている（Ｒ＆Ｄシステムズ社、イギリス）。
【０３１４】
従って、ＭＳの病因においてＩＬ−１７が果たす役割に基づいて、出願人は、本発明の界面動電流体ＲＮＳ−６０が、ＥＡＥ試験においてラットから採血した血液試料中のＩＬ−１７レベルに対して有する効果を調べた。
【０３１５】
サイトカインデータ：
血液中の種々のサイトカインのレベルを試験中に分析した。簡潔に説明すると、注射の１時間後に全ての動物から採血し、血漿をヘパリン処置したバイアルに収集した。同一試料からの複数のサイトカインの同時測定を可能にする、Ｌｕｍｉｎｅｘ法（パノミクス社（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）製ＰｒｏｃａｒｔａラットサイトカインアッセイキットＰＣ４１２７を使用）によって、種々の炎症性サイトカインについて、１００μｌの試料を分析した。非ガウス分布データおよびアッセイの検出限界以下の偶然の結果のために、打ち切りデータのノンパラメトリックのコックス回帰モデルを、異なる流体の比較に適用した。図１１Ａ〜Ｈに示されるように、ＩＬ１ａ、ＩＬ１ｂ、およびＩＬ１７のレベルは、両方の治療的処置用量（高用量および低用量）のＲＮＳ６０によって、最も顕著に減少した。ＭＢＰ誘発性ＥＡＥの臨床症状は、１０日目前後に始まり、１８日目前後にピークとなる。それ故、我々は、７日目（疾患症状の直前）および１８日目（疾患のピークの前後）を、サイトカイン分析にとって最も重要な時点であると見なした。１０匹の動物／群から、７日目および１８日目におけるＩＬ１ａ、ＩＬ１ｂおよびＩＬ１７の全身レベルを、図１１Ａ〜Ｈに示す。
【０３１６】
ＩＬ−１は、主要な炎症誘発性サイトカインの１つであり、自然免疫反応の上流のメディエーターである。ＩＬ−１は、種々の増殖および栄養因子、炎症性メディエーター、接着分子並びに他のサイトカインの産生を、直接的および間接的に、並びに正のフィードバックループを用いて、誘導する（Ａ．  Ｂａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２２  （２００２），  ｐｐ．  ６０７１−６０８２；    Ｐ．Ｎ．  Ｍｏｙｎａｇｈ，  Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ：  ａ  ｋｅｙ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ  ｔｏ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ，  Ｊ．  Ａｎａｔ．  ２０７  （２００５），  ｐｐ．  ２６５−２６９）。これらには、ＮＧＦ、ＩＣＡＭ１、ＩＬ６、ＴＮＦａ、ＣＳＦ等の重要な調節因子が含まれる。ＭＳの進行は、末梢での自己抗原反応性Ｔ細胞の活性化をもたらし、その後ＣＮＳへと浸潤する。ＩＬ−１はＭＳの発症において極めて重大であるが、それは、ＩＬ−１が、ミエリン特異的なＴ細胞活性化に関わるだけでなく、末梢におけるマクロファージ活性化の主要なメディエーターでもあるためである［Ｒ．  Ｆｕｒｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＨＳＶ−１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ＭＯＧ（３５−５５）−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｃ５７ＢＬ／６  ｍｉｃｅ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １４  （２００７），  ｐｐ．  ９３−９８））。ＭＳのＥＡＥモデルにおいて、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの両方が、炎症過程のメディエーターであることが示されている。末梢のＩＬ−１βレベルは臨床経過と相関し、ＩＬ−１β反応性が、ＥＡＥ中、ＣＮＳ浸潤性マクロファージおよび常在性小膠細胞において示されている（（Ｃ．Ａ．  Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｓ  ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｄ  ｂｙ  ＩＬ−１  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４６  （１９９１），  ｐｐ．  ２９８３−２９８９））。従って、ＩＬ−１は、ＥＡＥおよびＭＳにおける適切な治療標的である。ＩＬ−１の非選択的な阻害機構が、ＭＳの既存の治療薬、例えばインターフェロンβ、抗炎症糖質コルチコイド、免疫抑制剤、アトルバスタチンおよびω−３多価不飽和脂肪酸において示されている［  Ｆ．Ｌ．  Ｓｃｉａｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｂｅｔａ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．  ６  （Ｓｕｐｐｌ．  ２）  （２０００），  ｐｐ．  Ｓ３３−Ｓ３７．  ；  Ｒ．  Ｐａｎｎｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ  ａｆｔｅｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．  ７９  （２００５），  ｐｐ．  ３４０−３５０；  Ａ．Ｐ．  Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｏｍｅｇａ−３  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｎｕｔｒ．  ２１  （２００２），  ｐｐ．  ４９５−５０５））。
【０３１７】
図１１Ｃ〜Ｆに示されるように、ＲＮＳ６０の静脈内（ＩＶ）投与は、ＩＬ１αおよびＩＬ１βの両方の全身レベルを効果的に低下させる。ＩＬ１αについて、ＲＮＳ６０処置は、ビヒクル処置群と比較して、その血中レベルを有意に低下させ、この時点でのデキサメタゾンと同程度に効果的であった。しかし、１８日目の時点では、処置は、ＩＬ１αの全身レベルに対して有意な影響を有していない。ＩＬ１βの全身レベルは、ＲＮＳ６０のＩＶ処置の７日後に、いかなる毒性副作用の兆候もなく、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈｓｏｎｅ）処置群に匹敵するレベルまで、有意に減少した。同じ傾向が１８日目時点で見られるが、その差異は、対照群と比較した場合、統計的に有意ではない。ＩＬ−１７は、強力な炎症誘発効果を有する極めて重大なエフェクターサイトカインでもある。ＩＬ−１７は、腫瘍壊死因子−αおよびケモカイン等の他の炎症誘発性サイトカインの発現を誘導し、好中球を誘引し、樹状細胞の成熟を高める（Ｋｏｌｌｓ  ＪＫ，  Ｌｉｎｄｅｎ  Ａ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ２００４  Ｏｃｔ；２１（４）：４６７−７６）。ＩＬ−１７産生細胞は、コラーゲン誘発関節炎、大腸炎、乾癬、およびＥＡＥ等の自己免疫疾患において必須の炎症性メディエーターであると考えられている。ＥＡＥにおけるＴヘルパー１７細胞はＣＤ４＋細胞であり、それらは末梢免疫系および炎症を起こした中枢神経系の両方に存在する。さらに、ＩＬ−１７の中和によって臨床疾患が改善し、これは、ＩＬ−１７欠乏動物におけるＥＡＥ重症度の低減に類似した発見である（（ｆｒｏｍ  Ｇｏｌｄ  ａｎｄ  Ｌｕｈｄｅｒ，  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７−Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｋｅｙ  Ｐｌａｙｅｒ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００８  Ｊａｎｕａｒｙ；  １７２（１）：  ８−１０．）。７日間のＲＮＳ６０でのＩＶ処置は、前と同様に、デキサメタゾン処置動物と同様のレベルまで、血液中のＩＬ１７レベルの有意な低減を引き起こした。処置から１８日後でさえ、結果は統計的に有意ではなかったが、同じことが続いた。ＲＮＳ６０が、ＩＶ注射の２１日後でさえ、目立った毒性副作用を起こさずに、ＩＬ１レベルを低下させるだけでなく、ＥＡＥにおける２つの重要なサイトカイン、ＩＬ１およびＩＬ１７の組み合わせを低下させるのに効果的であることをに注目することは重要である。
【０３１８】
ＩＬ１およびＩＬ１７に加えて、神経系の炎症で重要な役割を担ういくつかの他の分子も、ＲＩＳ６０によって調節される。これらにはランテス、ＫＣ、ＮＧＦおよびＩＣＡＭが含まれる（データ未記載）。
【０３１９】
従って、本発明の界面動電流体ＲＮＳ−６０は、ＥＡＥ試験におけるラットから採血された血液試料中のＩＬ−１７レベルに対し有意な効果を有した。さらに、ＩＬ−１７は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＰＧＥ２、ＭＣＰ−１およびＧ−ＣＳＦの分泌を刺激するため、本発明の界面動電流体ＲＮＳ−６０は、血液中のこれらのサイトカインのレベルに対し有意な効果を有するであろう。従って、本発明の特定の態様によれば、本発明の界面動電組成物は、当該技術分野において認められているヒトＭＳのラットモデルにおけるＥＡＥの症状を軽減および防止することを含む治療に対し、実質的な有用性を有する。
【０３２０】
実施例１１
（ＲＮＳ−６０は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析によって、細胞表面受容体：ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）；ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）；ＣＤ１１Ｂ；およびＣＤ３の発現に対して、顕著な効果を有することが示された）
【０３２１】
要約
出願人は蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を用いて、本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）または生理食塩水対照流体のいずれかと共にインキュベートした白血球上の細胞表面受容体、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）；ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）；ＣＤ１１Ｂ；およびＣＤ３の発現レベルを比較した。
【０３２２】
方法：
フィコール‐ハイパーク分離されたＰＢＭＣ（アフェレーシス−全細胞）を、ＲＮＳ６０または生理食塩水（ＮＳ）の３０％溶液中でおよそ１時間プレインキュベートし；
ＰＢＭＣを、２μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｌで２４または４０時間活性化させ；
細胞を収集および洗浄し、ブロッキング／染色緩衝液中で、染色および固定し；
細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【０３２３】
結果：
ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）に関しては、該受容体は、生理食塩水対照中での受容体の発現レベルと比較した場合、ＲＮＳ−６０存在下で実質的に下方制御される。この下方制御は、ＭＡＰＫ  ｐ３８のリン酸化に影響し（データ未記載）、それによって次にエオタキシンが下方制御され（例えば、２００９年４月３０日に公開された、出願人による公開特許出願第ＷＯ２００９／０５５７２９号の実施例１３および図５７を参照）、それによって次にＩＬ５が下方制御され、加えて好酸球数が変化し、それが、例えば、気管支収縮反応を変化させる因子の１つとなる。
【０３２４】
２００９年４月３０日に公開された、出願人の公開特許出願第ＷＯ２００９／０５５７２９号の実施例１３で論じられたように、オボアルブミン曝露モデルの文脈では、ＲＮＳ−６０は、生理食塩水の効果と比較した場合、ＯＶＡ曝露群における血清エオタキシンレベルを減少させた。従って、特定の態様によれば、ＲＮＳ−６０はリガンドであるエオタキシンおよびその受容体であるＣＣＲ３の両方を減少させる可能性を有する。
【０３２５】
ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）に関しては、生理食塩水中での受容体の発現レベルと比較した場合、該受容体はＲＮＳ−６０存在下で下方制御される。
【０３２６】
ＣＤ１１Ｂに関しては、生理食塩水中での受容体の発現レベルと比較した場合、該受容体はＲＮＳ−６０存在下で下方制御される。
【０３２７】
ＣＤ３に関しては、生理食塩水中での受容体の発現レベルと比較した場合、該受容体はＲＮＳ−６０存在下で下方制御される。
【０３２８】
特定の態様によれば、本明細書の本実施例の他の場所に記載されるように、本発明の界面動電組成物は、炎症を低減することに対し、実質的な有用性を有する。機構に束縛されるものではないが、例えば、本明細書の他の場所で論じらたように、ＩＬ７Ｒは、サイトカイン受容体様因子２遺伝子（ＣＲＬＦ２）と二量体化して、ＴＳＬＰ受容体を形成する（Ａｌ  Ｓｈａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２００：１５９−１６８）。ＴＳＬＰは、未成熟Ｂ細胞の発生をｉｎ  ｖｉｔｒｏで駆動するＩＬ７様サイトカインであり、骨髄樹状細胞において、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞がヘルパーＴ細胞２型（Ｔｈ２）表現型に分化するのを促進し、ＣＤ４＋Ｔｈ２記憶細胞の増殖を促進することができる（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｃｕｒｒ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｒｅｐ．  ６：３７２−３７６）。ＴＳＬＰは、樹状細胞により媒介されるＴｈ２型炎症反応を誘発すると考えられており、アレルギー性炎症の主幹スイッチと見なされており（Ｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３５７：９９−１０４）、これはＭＳの病因に関連する（例えば、Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ３９：１０８３−１０９１；２００７年７月２９日にオンラインで公開され、参照により本明細書に組み込まれる；ＩＬ７Ｒα対立遺伝子のＭ．Ｓ．との関連を参照）。さらなる態様では、本発明の界面動電組成物は、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）を調節すること（例えば、低下させること）に対し、実質的な有用性を有する。多発性硬化症（ＭＳ）では、組織におけるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）活性は、ＭＭＰおよびそれらの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）間の均衡の結果である。ＭＭＰ−９は急性ＭＳ病変において優勢であり、ＴＩＭＰ−１により阻害されるが、一方、ＭＭＰ−２は慢性疾患等における細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の再構築に関与する可能性があり、ＴＩＭＰ−２により阻害される（例えば、参照により本明細書に組み込まれた、Ａｖｏｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  ＮｅｕｒｏＩｍｍｕｎｏｌ，１３６：４６−５３，  ２００３を参照）。
【０３２９】
従って、本発明のさらなる態様によれば、本発明の界面動電組成物は、罹患した哺乳動物（好ましくはヒト）におけるＭＳの症状を軽減および防止することを含む治療に対し、実質的な有用性を有する。
【０３３０】
別のさらなる態様によれば、本発明の界面動電組成物は、本明細書の他の場所に記載されるような少なくとも１つのさらなるＭ．Ｓ．治療薬と一緒に投与することができる。
【０３３１】
従って、本発明のさらなる態様によれば、本発明の界面動電組成物は、罹患した哺乳動物（好ましくはヒト）における炎症性神経変性疾患（例えば、本明細書の他の場所で定義されたような、アルツハイマー病、パーキンソン病、アミロイドーシス型疾患）の症状を軽減および防止することを含む治療に対し、実質的な有用性を有する。
【０３３２】
実施例１２
（本発明の界面動電流体（例えば、ＲＮＳ６０）は、小膠細胞において、ｉＮＯＳおよびＩＬ−１βの両方の発現を用量依存的に阻害することが示された）
【０３３３】
要約：
本明細書に記載の特定の態様によれば、本発明の界面動電流体は、パーキンソン病（ＰＤ）の治療に対し、実質的な有用性を有する。
【０３３４】
パーキンソン病（ＰＤ）は、ヒトにおける最も破壊的な神経変性障害の１つである。ＰＤはあらゆる年齢層で現れ得るが、３０歳よりも若い人ではまれである。臨床的には、ＰＤは振戦、運動緩徐、硬直および姿勢不安定によって特徴付けられる。病理学的には、ＰＤは、黒質緻密部（ＳＮｐｃ）における細胞質内封入（レービー小体）の存在と関連する、神経膠症およびドパミン作動性ニューロンの進行性変性によって示される。死後のＰＤ脳では、死滅していくニューロンが、アポトーシスの形態的特徴、例えば細胞収縮、染色体凝縮、およびＤＮＡ断片化を示すことが報告されている。従って、疾患増悪を停止する効果的な神経保護的治療方法を開発することが、最も重要である。ＭＰＴＰマウスモデルは、ＰＤに対する治療方法の試験および確認に対し、実質的な有用性を有する。
【０３３５】
小膠細胞の活性化は、パーキンソン病（ＰＤ）並びに他の神経変性障害の病因において重要な役割を果たしている。ＰＤの具体的な特徴は、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）中毒性動物においてモデル化されている。ＭＰＴＰの神経毒性効果は、それのＭＰＰ＋への変換に依存している。。膠細胞では、モノアミンオキシダーゼＢ（ＭＡＯ−Ｂ）はＭＰＴＰをＭＰＰ＋に変換し、これが次に膠細胞を活性化する。最近では、ＭＰＰ＋が小膠細胞において炎症性分子の発現を誘導することが示されている。
【０３３６】
本実施例では、ＭＰＰ＋刺激された小膠細胞における炎症性分子の発現を調節するＲＮＳ６０の能力が確認された。
【０３３７】
材料および方法
簡潔に説明すると、マウスＢＶ−２小膠細胞を、異なる濃度のＲＮＳ６０および生理食塩水（ＮＳ）と共に１時間インキュベートし、その後、無血清条件下で２μＭ  ＭＰＰ＋で刺激した。
【０３３８】
結果：
図１２において半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析で証明されるように、ＭＰＰ＋単独によって、マウスＢＶ−２小膠細胞において、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）およびインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）ｍＲＮＡの発現が誘導された。有意に、ＲＮＳ６０は、小膠細胞におけるｉＮＯＳおよびＩＬ−１βの両方の発現を用量依存的に阻害した（図１２）。対症的に、同様の実験条件下で、生理食塩水対照（ＮＳ）は、これら２つの炎症誘発性遺伝子の発現に対し効果を持たなかった（図１２）が、このことは効果の特異性を示している。
【０３３９】
具体的には、図１２は、本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）が、マウス小膠細胞における誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）およびインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）のＭＰＰ＋による発現誘導を減弱するが、対照生理食塩水（ＮＳ）は減弱しないことを示す。無血清培地中で１時間、異なる濃度のＲＮＳ６０および生理食塩水（ＮＳ）と共にプレインキュベーションされたＢＶ−２小膠細胞を、ＭＰＰ＋（パーキンソン病様毒素）で刺激した。刺激から６時間後、全ＲＮＡを単離しｉＮＯＳおよびＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲで分析した。結果は、３つの独立した実験を表わしている。
【０３４０】
従って、特定の態様によれば、ＭＰＰ＋はパーキンソン病様毒素であるため、これらの結果は、ＲＮＳ６０が、当該技術分野において認められているパーキンソン病のＭＰＴＰ誘発性マウスモデルにおいて保護的効果を有することを示す。
【０３４１】
特定の態様によれば、本発明の界面動電流体は、パーキンソン病（ＰＤ）の治療に対し、実質的な有用性を有する。
【０３４２】
実施例１３
（本発明の界面動電流体（例えば、ＲＮＳ６０）が、アミロイド−β毒性からニューロンを保護することが示された）
【０３４３】
要約：
本明細書に記載の特定の態様によれば、本発明の界面動電流体は、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療に対し、実質的な有用性を有する。
【０３４４】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性の神経細胞死および記憶喪失をもたらす神経変性障害である。死後のＡＤ脳におけるＴＵＮＥＬ染色の増加は、ＡＤ患者の脳におけるニューロンがアポトーシスによって死滅することを示す。線維性アミロイド−βペプチドはＡＤの病態生理に関わる。神経病理学的には、前記疾患は、アミロイド前駆体タンパク質由来の４０〜４３個のアミノ酸のタンパク質分解フラグメントであるβ−アミロイド（Ａβ）タンパク質、およびリン酸化したタウの凝集体から成る、神経原線維変化および老人斑によって特徴付けられる。遺伝子導入マウスにおけるＡβペプチドの細胞内過剰発現は、クロマチン分節化、凝集、およびＴＵＮＥＬ染色増加をもたらすことが見出されている。細胞培養試験によって、Ａβペプチドが神経細胞に対しアポトーシス性で且つ細胞傷害性であることも示されており、原線維Ａβ１−４２ペプチドが神経細胞においてアポトーシスを誘導することができることが示されている。
【０３４５】
さらに、研究は次第に、炎症とＡＤの関連性を特徴付けることに次第に目的とされるようになっており、広範な膠細胞の活性化がプラークおよびもつれの周囲に発見されている。
【０３４６】
本実施例では、ヒトＳＨＳＹ５Ｙ神経細胞においてＡβ（１−４２）誘発性アポトーシスを遮断することにおけるＲＮＳ６０の効果を確認した。
【０３４７】
材料および方法
カルバイオケム社製の市販キット（ＴｄＴ  ＦｒａｇＥＬ（商標））を用いて、ＳＨＳ５Ｙヒト神経細胞（ｎｅｒｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）の断片化ＤＮＡを、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を介した、原線維Ａβ１−４２への応答で生成されたＤＮＡ断片の３′−ＯＨ末端の結合によって、ｉｎ  ｓｉｔｕで検出した。簡潔に説明すると、カバーガラスを２０μｇ／ｍｌのプロテアーゼＫを用いて室温で１５分間処理し、ＴｄＴ染色前に洗浄した。
【０３４８】
結果：
図１３に示されるように、原線維Ａβ１−４２ペプチドは、神経細胞におけるアポトーシス小体の形成を顕著に誘導した。Ａβ１−４２処理後のニューロンのプロセシングの消失も観察された（２列目；図１３）。対照的に、逆順ペプチドＡβ４２−１は、ニューロンのアポトーシスおよびプロセス消失を誘導できなかった（３列目；図１３）。有意に、試験された異なる用量のＲＮＳ６０は、Ａβ（１−４２）誘発性アポトーシスを顕著に遮断し、神経細胞でのプロセスを保護した（４列目、５列目＆６列目；図１３）。対照的に、生理食塩水対照流体（ＮＳ）は、Ａβ（１−４２）誘発性アポトーシスおよびプロセス消失に対し効果を持たなかった（７列目＆８列目；図１３）。
【０３４９】
具体的には、図１３は、ＲＮＳ６０はヒトＳＨＳＹ５Ｙ神経細胞の原線維Ａβ（１−４２）仲介性アポトーシスを抑制するが、生理食塩水対照（ＮＳ）では抑制が起こらないことを示す。分化後、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞を異なる濃度のＲＮＳ６０またはＮＳのいずれかと共に１時間インキュベートし、その後１μＭの原線維Ａβ（１−４２）ペプチドに曝した。処置から１８時間後、アポトーシスをＴＵＮＥＬ（カルバイオケム社）でモニターした。Ａβ（４２−１）ペプチドも、対照としてインキュベートした。結果は、３つの独立した実験を示す。
【０３５０】
これらの結果は、病因試薬のＡＤ（原線維Ａβ１−４２）が、ＲＮＳ６０感受性経路を介して、ニューロンにおいてアポトーシスを誘導したことを示す。
【０３５１】
特定の態様によれば、本発明の界面動電流体は、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療に対し、実質的な有用性を有する。
【０３５２】
実施例１４
（本発明の界面動電流体が、当該技術分野において認められている多発性硬化症（ＭＳ）のマウスＭＯＧモデルにおいて、用量反応性の様式で臨床スコアを抑制することにおいて実質的に効果的であることが示された）
【０３５３】
要約：
本実施例では、本発明の界面動電流体ＲＮＳ−６０を、当該技術分野において認められている多発性硬化症（ＭＳ）の実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスＭＯＧモデルにおいて、治療的投与計画における２つの投与量で評価した。
【０３５４】
材料および方法
実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）の臨床的特徴および病理的特徴の多くを模倣する、中枢神経系（ＣＮＳ）の自己免疫性脱髄疾患である。ＭＯＧマウスモデルは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中にエマルジョン化されたＭＯＧの試験０日目における単回皮下（ＳＣ）注射（２００μｇ  ＭＯＧ／３００μｇ  ＣＦＡが、２００μｌ／動物の総用量体積で注射され、傍腰部に渡って、２×１００μｌの皮下両側注射剤として送達される）；続く、試験０日目のＥＡＥ誘導時に１回、および４８時間後の試験２日目にもう一度の、腹腔内（ＩＰ）注射を介した、２０μｇ／ｋｇ（およそ４００ｎｇ／マウス）の百日咳毒素（ＰＴ）による、腹腔内（ＩＰ）追加免疫刺激によって誘導される、感作期間から成る（Ｇｉｌｇｕｎ−Ｓｈｅｒｋｉ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７：２０１−２０７，  ２００３）。その後動物を、図１４に示されるように、ＲＮＳ６０  ＩＶ点滴で処置した。使用した動物は、ハーラン・ラボラトリーズ・イスラエル社（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｓｒａｅｌ，  Ｌｔｄ．）から得た雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１０匹の動物／群）；若年成体；試験開始時８〜９週齢、であった。
【０３５５】
全ての動物を、ＥＡＥ誘導（試験０日目）前に神経性の反応および症状の兆候について検査し、その後３５日間の観察期間全体に渡って、毎日検査した。ＥＡＥ反応を、重症度の低い順に、当該技術分野において認められている０〜１５スケールに従って、スコア化し、記録した。臨床スコアを、各セクションのスコアを合計することにより決定した（例えば、Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  ２００５；  Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｒｔｉｃｌｅ  １０．１０９６／ｆｊ．０４−２０３０ｆｊｅ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ａｕｇｕｓｔ  ４，  ２００５を参照）。
【０３５６】
結果：
図１４は、ＲＮＳ６０が、当該技術分野において認められている多発性硬化症（ＭＳ）のマウスＭＯＧモデルにおいて、用量反応性の様式で、臨床スコアを抑制することにおいて実質的に効果的であるが、ビヒクル対照（ビヒクル）は効果的でないことを示す。ＲＮＳ−６０の高用量および低用量の両方の、治療的な連日投与、並びにＲＮＳ−６０の３日毎の高用量投与（投与またはＲＮＳ−６０は、全ての場合において、最初の臨床徴候と同時に開始）は、臨床スコアの著しい減少を示した（白ひし形＝ビヒクル対照；白四角＝デキサメタゾン陽性対照；明るい「ｘ」＝臨床徴候の発生から低用量（０．０９ｍｌ  ＲＮＳ６０）の連日投与；暗い「ｘ」＝臨床徴候の発生から高用量（０．２ｍｌ  ＲＮＳ６０）の３日毎の投与；および白三角＝臨床徴候の発生から高用量（０．２ｍｌ  ＲＮＳ６０）の連日投与）。
【０３５７】
本明細書上記の実施例のＭＢＰモデルと比較した場合、本マウスＭＯＧモデルは、ＭＢＰモデルが示さない、ＭＳの特徴的な軸索損傷を模倣するその能力について、当該技術分野において周知であり、観察される治療効果をより長期に渡って広げる（ＭＢＰモデルでの２１日目と比較して、２８〜３０日）。さらなる態様によれば、ＲＮＳ６０は、本マウスＭＯＧモデルにおける軸索損傷を低減することにおいて実質的に効果的であるが、ビヒクル対照（ビヒクル）は効果的でない。
【０３５８】
本発明の特定の態様によれば、本発明の界面動電組成物は、当該技術分野において認められているヒトＭＳのマウスモデルにおける症状を軽減および防止することを含む治療に対し、実質的な有用性を有する。本発明のさらなる態様によれば、本発明の界面動電組成物は、罹患した哺乳動物（好ましくはヒト）におけるＭＳの症状を軽減および防止することを含む治療に対し、実質的な有用性を有する。
【０３５９】
さらに別の態様では、本発明の界面動電組成物は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、それによって中枢神経系の炎症性疾患を治療するための新規の方法を提供する。
【０３６０】
実施例１５
（蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析によって、ＲＮＳ−６０が、細胞表面受容体：ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）；ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）；ＣＤ１１Ｂ；およびＣＤ３の発現に対して顕著な効果を有することが示された）
【０３６１】
要約．
出願人は蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を使用して、本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）または生理食塩水対照流体のいずれかと共にインキュベートした白血球上での細胞表面受容体、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）；ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）；ＣＤ１１Ｂ；およびＣＤ３の発現レベルを比較した。
【０３６２】
方法：
フィコール‐ハイパーク分離したＰＢＭＣ（アフェレーシス−全細胞）を、ＲＮＳ６０のまたは生理食塩水（ＮＳ）の３０％溶液中で、およそ１時間プレインキュベートした。
ＰＢＭＣを２μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｌで２４時間または４０時間活性化した。
細胞を収集し、洗浄し、ブロッキング／染色緩衝液に入れ、染色および固定した。
細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【０３６３】
結果：
ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）に関しては、図１５Ｂに示されるように、該受容体は、生理食塩水対照中での受容体発現レベルと比較した場合、ＲＮＳ−６０存在下で実質的に下方制御される。この下方制御は、ＭＡＰＫ  ｐ３８のリン酸化に影響し（データ未記載）、それが次にエオタキシンを下方制御し（例えば、実施例４を参照）、それが次にＩＬ５を下方制御し（データ未記載）、さらに好酸球数も変化させ（例えば、実施例４を参照）、それが、例えば、気管支収縮反応を変化させる因子の１つとなる。
【０３６４】
オボアルブミン曝露モデルの文脈において上記実施例４で論じられたように、ＲＮＳ−６０は、生理食塩水の効果と比較した場合、ＯＶＡ曝露群において血清エオタキシンレベルを減少させた。従って、特定の態様によれば、ＲＮＳ−６０は、リガンドであるエオタキシンおよびその受容体であるＣＣＲ３の両方を減少させる可能性を有する。
【０３６５】
ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）に関しては、図１６Ａに示されるように、該受容体は、生理食塩水中での受容体の発現レベルと比較した場合、ＲＮＳ−６０存在下で下方制御される。
【０３６６】
ＣＤ１１Ｂに関しては、図１６Ｂに示されるように、該受容体は、生理食塩水中での受容体の発現レベルと比較した場合、ＲＮＳ−６０存在下で下方制御される。
【０３６７】
ＣＤ３に関しては、図１６Ｃに示されるように、該受容体は、生理食塩水中での受容体の発現レベルと比較した場合、ＲＮＳ−６０存在下で下方制御される。
【０３６８】
実施例１６
（ＲＮＳ６０は、ＭＢＰ刺激を受けたＴ細胞においてＮＦκＢの活性化を減弱したが、生理食塩水（ＮＳ）は減弱しなかった）
【０３６９】
要約．
ＮＦ−κＢキナーゼは、炎症を介した状態および疾患における炎症反応を仲介していると、当該技術分野において広く認識されているキナーゼである。
【０３７０】
本実施例は、ＲＮＳ６０が、ＭＢＰ刺激を受けたＴ細胞におけるＮＦκＢの活性化を減弱したが、生理食塩水（ＮＳ）は減弱しなかったことを示す。従って、特定の態様によれば、本発明の界面動電的に生成された流体は、炎症並びに炎症を介した状態および疾患、例えば、限定はされないが、糖尿病および関連する代謝障害、インスリン抵抗性、神経変性疾患（例えば、Ｍ．Ｓ．、パーキンソン病、アルツハイマー病等）、喘息、嚢胞性線維症、血管／冠状動脈疾患、網膜および／または黄斑変性、消化器障害（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病等．）の治療に対し、実質的な有用性を有する。
【０３７１】
方法．
図１７Ａおよび１７Ｂに示される実験用に、ＭＢＰ−免疫化マウスから単離されたＴ細胞を、ＭＢＰで再刺激し、２４時間後、細胞に異なる濃度のＲＮＳ６０およびＮＳを与えた。処置から２時間後、核抽出物におけるＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を、電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）によってモニターした。
【０３７２】
図１７Ｃに示される実験用に、ＭＢＰ−免疫化マウスから単離したＴ細胞に、ＮＦ−κＢ依存性受容体のコンストラクトであるＰＢＩＩＸ−Ｌｕｃを形質移入し、続いて、ＭＢＰで再刺激した。ＭＢＰ刺激から２４時間後、細胞を異なる濃度のＲＮＳ６０およびＮＳで２時間処理し、続いて、ルシフェラーゼアッセイキット（プロメガ社）による、全細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性のアッセイに供した。他の場合では、また、ＭＢＰ刺激を受けたＴ細胞を、３０ｎＭ  ＰＭＡで１時間刺激した。これらの場合では、ＰＭＡは、ＲＮＳ６０およびＮＳでの前処理の１時間後に加えた。結果は、３つの別々の実験の平均値＋標準偏差である。
【０３７３】
結果．
図１７Ａ〜Ｃは、ＲＮＳ６０がＭＢＰ刺激を受けたＴ細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を減弱したが、生理食塩水（ＮＳ）は減弱しなかったことを示す。具体的には、図１７Ａおよび１７Ｂは、ＲＮＳ６０（図１７Ａおよび１２４Ｂの中央の３本のレーンを参照）が、ＭＢＰ刺激を受けたＴ細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を、用量反応性の様式で減弱したが、ＮＳ（図１７Ａおよび１７Ｂの一番右側のレーンを参照）は減弱しなかったことを示す。
【０３７４】
同様に、図１７Ｃの棒グラフは、ＲＮＳ６０（図１７Ａおよび１７Ｂの２本目、３本目および４本目のバーを参照）が、ＭＢＰ刺激されたＴ細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を減弱し、それ故、形質移入されたＮＦ−κＢ依存性レポーターコンストラクト（ＰＢＩＩＸ−Ｌｕｃ）からの、全細胞抽出物でのルシフェラーゼ活性も用量反応性の様式で減弱したが、ＮＳ（図１７Ａおよび１７Ｂの５本目のバーを参照）は減弱しなかったことを示す。
【０３７５】
従って、特定の態様によれば、開示される界面動電的に生成された流体は、炎症並びに炎症を介した状態および疾患、例えば、限定はされないが、糖尿病および関連する代謝障害、インスリン抵抗性、神経変性疾患（例えば、Ｍ．Ｓ．、パーキンソン病、アルツハイマー病等）、喘息、嚢胞性線維症、血管／冠状動脈疾患、網膜および／または黄斑変性、消化器障害（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病等）の治療に対し、実質的な有用性を有する。
【０３７６】
実施例１７
（ＲＮＳ６０は一次ニューロンにおいて原線維Ａβ１−４２ペプチドにより誘導されるタウのリン酸化を減弱したが、生理食塩水（ＮＳ）は減弱しなかった）
【０３７７】
要約．
タウオパチーは、当該技術分野において認識されているように、（例えば、対象のニューロンにおいて）タウタンパク質のリン酸化増加を示すことによって特徴づけられる。タウオパチーには、限定はされないが、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性疾患、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉変性症（ピック病）、およびパンチドランカー（ＤＰ）（別名、ボクサー認知症、慢性ボクサー脳症）が含まれる。
【０３７８】
本発明の特定の態様は、タウオパチーまたはその少なくとも１つの症状を治療するための方法を提供し、該方法は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含み、タウのリン酸化を調節し対象におけるタウオパチーまたはその少なくとも１つの症状の治療を提供するのに十分な量でイオン水性流体中で安定に形成される、治療有効量の界面動電的に改変された水性流体を、必要とする対象に投与することを含む。ある態様では、帯電安定化した酸素含有ナノ構造は、流体が生細胞と接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうち少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量で、イオン水性流体中で安定に形成される。
【０３７９】
図１８Ａ〜Ｂは、一次ニューロンにおける原線維Ａβ（１−４２）を介したタウのリン酸化に対する、生理食塩水（ＮＳ）対照と比較した場合の、ＲＮＳ６０の効果を調べている実験で得られた結果を示す。タウのリン酸化を、βチューブリンおよびリン酸化タウに対する抗体を用いる二重標識免疫蛍光法によって、モニターした。βチューブリンをニューロンのマーカーとして使用し、ＤＡＰＩ染色を細胞の核を可視化するために用いた。「（ｐ）−タウ」と標識されたカラムの上から３番目および４番目のパネルは、タウのリン酸化がＲＮＳ６０によって用量依存的に阻害されたが、一方、対照の生理食塩水（「ＮＳ」）は、１０％の高用量ででさえ、効果を持たなかったこと（「（ｐ）−タウ」と標識されたカラムの一番下のパネルを参照）を示す。
【０３８０】
実施例１８
（ＲＮＳ６０は、１Ａ型ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）を介した、ＩκＢαの発現上昇およびＮＦ−κＢ活性化の阻害を介して、膠細胞における炎症性分子の発現を阻害したが、生理食塩水（ＮＳ）は阻害しなかった）
【０３８１】
要約
神経炎症は、タウオパチーを含む様々な神経変性障害の病因の根底を成している。熱心な研究にもかかわらず、その発症を止める、または進行を停止させるための効果的な治療は存在しない。本明細書で論じられるように、ＲＮＳ６０は、帯電安定化したナノ構造を含有する０．９％食塩水であり、これは、酸素高圧化で、生理食塩水をテイラー‐クエット‐ポアズイユ流に曝すことによって生成されている。本実施例は、ＲＮＳ６０が、１Ａ型ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）を介した、ＩκＢαの発現上昇およびＮＦ−κＢ活性化の阻害を介して、膠細胞における炎症性分子の発現を阻害することを示す。一貫して、ＲＮＳ６０処置は、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）中毒性マウスの黒質緻密部（ＳＮｐｃ）において、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＩκＢαのレベルを増加させ、ＮＦ−κＢの活性化を阻害し、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現を減弱した。これらの発見は、ドパミン作動性のニューロン保護に類似しており、線条体の神経伝達物質を正常化し、ＭＰＴＰ中毒性マウスにおける運動機能を改善させた。これらの結果は、それらをまとめると、ＲＮＳ６０の新規の抗炎症特性を描写しており、ヒトタウオパチーおよび他の神経変性障害（例えば、パーキンソニズム）における本化合物の治療的役割を示唆している。
【０３８２】
方法：
初代マウス小膠細胞および星状膠細胞の単離
小膠細胞を、我々が以前記載したような変更（Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｊａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）を有する、ＧｉｕｌｉａｎおよびＢａｋｅｒの手順（Ｇｉｕｌｉａｎ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，  １９８６）に従って、混合された神経膠培養物から単離した。簡潔に説明すると、９日目に、混合された神経膠培養物を、ダルベッコー修飾イーグル培地／Ｆ−１２で３回洗浄し、回転式振盪培養機上で２４０ｒｐｍの振盪に３７℃で２時間曝した。浮遊細胞を洗浄し、プラスチックの組織培養フラスコ上に播種し、３７℃で１時間インキュベートした。さらなる試験用に、付着細胞を、新しいプレートに播種した。９０〜９５％の細胞が、Ｍａｃ−１陽性であることが分かった。１１日目に、混合された神経膠培養物を洗浄し、回転式振盪培養機上で、１８０ｒｐｍで１８時間、再度振盪した。浮遊細胞を除去し、残った細胞をトリプシン処理して、実験用の新しいプレートに播種した。９６％以上の細胞がＧＦＡＰ陽性であった。また、マウスＢＶ−２小膠細胞（ペルージャ大学のＶｉｒｇｉｎｉａ  Ｂｏｃｃｈｉｎｉの好意により提供を受けた）も維持し、上記の通りに誘導した。
【０３８３】
動物およびＭＰＴＰ中毒．
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ハーラン社（Ｈａｒｌａｎ、インディアナ州インディアナポリス）から購入した。動物の維持および実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従い、ラッシュ大学医療センター（ｔｈｅ  Ｒｕｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、イリノイ州シカゴ）の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。急性のＭＰＴＰ中毒については、マウスに、食塩水中のＭＰＴＰ−ＨＣｌ（１８ｍｇ／ｋｇの遊離塩基；シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）の、２時間間隔での４回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を与えた（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。対照動物には食塩水のみを与えた。
【０３８４】
ＲＮＳ６０処置．
マウスを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を介したＭＰＴＰ中毒の２日前から、ＲＮＳ６０およびＮＳ（３００ｍｌ／マウス／日）で処置した。
【０３８５】
ＮＯ合成のアッセイ
ＮＯの合成を、前述のようにグリース試薬を用いて、ＮＯと分子酸素との安定な反応産物である亜硝酸塩についての培養上清のアッセイによって測定した。
【０３８６】
ｐ８５ａ会合型（１Ａ型）およびｐ１０１会合型（１Ｂ型）のＰＩ３キナーゼのアッセイ
刺激後、細胞を、１％ｖ／ｖ  ノニデット  Ｐ−４０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ヨードアセトアミド、１０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  オルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルクロリド、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、１μｇ／ｍｌ  アンチパイン、１μｇ／ｍｌ  アプロチニン、および１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡを含有する、氷冷した細胞溶解緩衝液で溶解させた。溶解物を、４℃で１５分間インキュベートし、続いて１３，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清をｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｂｅａｄｓ（バイオラド社）を用いて、４℃で１時間プレクリアし、続いて１μｇ／ｍｌのｐ８５ａまたはｐ１０１モノクローナル抗体を添加した。４℃で２時間インキュベーションした後、タンパク質Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを加えて、得られた混合物をさらに４℃で１時間インキュベートした。免疫沈降物を細胞溶解緩衝液で２回、リン酸緩衝食塩水で１回、０．５Ｍ  ＬｉＣｌおよび１００ｍＭ  トリス（ｐＨ７．６）で１回、水で１回、およびキナーゼ緩衝液（５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））中で１回、洗浄した。ＰＩ３キナーゼ活性を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）および１ｍＭ  ＥＤＴＡ中での超音波処理によって分散した０．１ｍｇ／ｍｌ  ＰＩおよび０．１ｍｇ／ｍｌ  ホスファチジルセリンの１００μｌ脂質混合物を用いて、前述のように、測定した。反応を、２０μＣｉの［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＮＥＮ）および１００μＭ  ＡＴＰの添加によって開始させ、１５分後、８０μｌの１Ｎ  ＨＣｌおよび２００μｌのクロロホルム：メタノール（１：１）の添加によって終了させた。リン脂質をＴＬＣで分離し、ヨウ素蒸気への曝露およびオートラジオグラフィー（ＲＥＦ）によって可視化した。同様に、ｐ１１０ａ会合型およびｐ１１０ｂ会合型ＰＩ３キナーゼ活性をモニターするために、上清をｐ１１０ａおよびｐ１１０ｂに対する抗体で免疫沈降し、続いて、上記のように、免疫複合体脂質キナーゼアッセイを行った。
【０３８７】
ＰＩ３キナーゼの異なる変異コンストラクトの発現
クラスＩＡ  ＰＩ３キナーゼは、１１０ｋＤａの触媒サブユニット（ｐ１１０）および８５ｋＤａの調節サブユニット（ｐ８５）から成る。ｐ８５ａのドミナントネガティブ型において、ＰＩ３キナーゼのｐ１１０ａ／ｂサブユニットと結合するのに重要な、野生型ｐ８５ａの４７９〜５１３番目の残基のｉｎｔｅｒ−ＳＨ２領域の３５個のアミノ酸が、欠失しており、２つの他のアミノ酸（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）がこの欠失位置に挿入されている。コンストラクトの設計および前記タンパク質の発現を駆動するベクターの説明は、以前に公開されている。一方、ｐ１１０ａ／ｂの恒常的活性型変異体（ｐ１１０＊）では、ｐ８５のｉｎｔｅｒ−ＳＨ２ドメインがｐ１１０のＮＨ２末端に連結しており、一方、ｐ１１０ａ／ｂのキナーゼ欠乏変異体（ｐ１１０−ｋｄ）では、ＡＴＰ結合部位が変異している。１２ウェルプレートに播種した小膠細胞に、前述のように、製造業者のプロトコールを用い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ（インビトロジェン社）を用いて、０．２〜０．２５ｍｇの異なるプラスミドを形質移入した。
【０３８８】
電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）
先の記述のように（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｓａｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｂｒａｈｍａｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、核抽出物を調製し、ＥＭＳＡを行った。簡潔に説明すると、ＮＦ−κＢに対する共通結合配列を含有するＩＲＤｙｅ（商標）赤外色素末端標識オリゴヌクレオチドを、ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンス社（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ネブラスカ州リンカーン）から購入した。６マイクログラムの核抽出物を、結合緩衝液およびＩＲ標識プローブと共に、２０分間インキュベートした。その後、試料を０．２５×ＴＢＥ緩衝液（トリスホウ酸塩−ＥＤＴＡ）中の６％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンス社）によって分析した。
【０３８９】
ＮＦ−ｋＢの転写活性
ＮＦ−ｋＢの転写活性を、先の記述のように（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｓａｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｂｒａｈｍａｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、アッセイした。
【０３９０】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
全ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従い、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ−ＩＩ  ＲＮＡ試薬（バイオテック・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、テキサス州ヒューストン）を用いて、腹側中脳から単離した。全ての混入ゲノムＤＮＡを除去するために、全ＲＮＡをＤＮａｓｅで消化した。ＲＴ−ＰＣＲを、先の記述のように（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｂｒａｈｍａｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、ＲＴ−ＰＣＲキット（クロンテック社、カリフォルニア州マウンテンヴュー）を用いて行った。
【０３９１】
リアルタイムＰＣＲ分析
リアルタイムＰＣＲを、先の記述のように（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｂｒａｈｍａｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒミックスおよび最適化された濃度のＦＡＭ標識プローブおよびプライマーを用いて、ＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システム（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティ）で行った。データをＡＢＩ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １．６ソフトウェアを用いて処理した。
【０３９２】
免疫組織化学および計量形態学
先の記述のように（Ｂｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、ＭＰＴＰ中毒の７日後、マウスを屠殺し、それらの脳を固定し、包埋し、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）およびチオニン染色で処理した。ＳＮｐｃ中のＴＨ陽性ニューロンの総数を、光学的分画装置（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ）を用いることによって、ＳＴＥＲＥＯ  ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＴＯＲソフトウェア（マイクロブライトフィールド社（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ、バーモント州ウィリストン）で、立体解析学的に計数した。線条体のＴＨ免疫染色の定量化を、記載されたように（Ｂｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、行った。吸光度測定値を、デジタル画像解析（サイオン社（Ｓｃｉｏｎ）、メリーランド州フレデリック）によって得た。線条体におけるＴＨの光学濃度は、ドパミン作動性線維の神経支配を反映していた。新鮮凍結切片の蛍光免疫染色のために、ラット抗マウスＣＤ１１ｂ（１：１００）、ヤギ抗マウスＧＦＡＰ（１：１００）、ウサギ抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５（１：１００）、ヤギ抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５（１：１００）、ウサギ抗リン酸化ｐ６５（１：１００）、およびウサギ抗マウスｉＮＯＳ（１：２５０）を使用した。試料をマウントし、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＭＲＣ１０２４ＥＳ共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。
【０３９３】
ＨＰＬＣ分析．
線条体のドパミン、ＤＯＰＡＣ（３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸）およびＨＶＡ（ホモバニリン酸）のレベルを、先の記述のように（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  ；  Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）、定量化した。簡潔に説明すると、マウスをＭＰＴＰ中毒の７日後に頸椎脱臼により屠殺して、それらの線条体を採取し、直ちにドライアイスで凍結し、分析まで−８０Ｃで保存した。分析当日、組織をイソプロテレノールを含有する０．２Ｍ過塩素酸中で超音波処理し、得られたホモジネートを、２０，０００×ｇ、４Ｃで１５分間遠心した。ｐＨ調整および濾過の後、１０μｌの上清をＥｉｃｏｍｐａｋ  ＳＣ−３ＯＤＳカラム（ＪＭサイエンス社（ＪＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州グランドアイランド）から得た完全独立型ＨＰＬＣ−ＥＣＤ系ＥｉＣＯＭＨＴＥＣ−５００）に注入し、製造業者のプロトコールに従って分析した。
【０３９４】
ＭＰＰ＋を先に記載されたように測定した。簡潔に説明すると、ＭＰＴＰの最後の注射から３時間後にマウスから採取した黒質を、０．２Ｍ  過塩素酸中でホモジナイズし、上記のように処理した。その後、上清を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８分離カラム（２５０×４．６ｍｍ；２８０ｎｍ  ＵＶ波長）を用いて、移動相Ａ（０．０１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を含む１８ｍΩ  水）および移動相Ｂ（０．０１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を含むアセトニトリル）（１：４）から成る均一濃度勾配で、０．１５ｍｌ／分の流速において、Ｗａｔｅｒｓ２６９５分離モジュールＨＰＬＣ系で分析した。
【０３９５】
行動解析
２種類の行動実験を行った。これには、先の記述のように（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）、自発運動活性に対するオープンフィールド実験、および肢の運動に対するロータロッド（ｒｏｔｏｒｏｄ）実験が含まれる。自発運動活性を、ＭＰＴＰ注射の最終投与から７日後に、Ｄｉｇｉｓｃａｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒ（オムニテック・エレクトロニクス社（Ｏｍｎｉｔｅｃｈ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）、オハイオ州コロンブス）で測定した。このＤｉｇｉｓｃａｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒは、線条によって直接制御される行動である常同症および立ち上がり、並びに水平方向の活動性、移動総距離、移動の回数、移動時間、静止時間、平均距離、平均時間、および中心時間（ｃｅｎｔｅｒ  ｔｉｍｅ）等の他の基本的な歩行運動パラメーターを記録する。曝露または処置の前には必ず、マウスをＤｉｇｉｓｃａｎ  Ｉｎｆｒａ−ｒｅｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ内に毎日１０分間、およびロータロッド（ｒｏｔｏｒｏｄ）上に毎日１０分間、３日間連続で置いて訓練させ、それらのベースライン値を記録した。簡潔に説明すると、動物をそれらのケージから直接取り出して、オープンフィールド装置の指定された角に鼻を先にして静かに入れて、放した後に、５分間隔のデータ収集を開始した。ＤＩＧＩＳＣＡＮソフトウェアを用いて、赤外線ビームで自動的にモニターされた水平方向および垂直方向の活動性データを、分析および保存した。ロータロッド（ｒｏｔｏｒｏｄ）では、マウスの肢の運動を様々な速度で観察した。ストレスおよび疲労を取り除くため、マウスに５分間隔で休憩を与えた。その後、ＭＰＴＰの最終投与から７日後、オープンフィールドアッセイおよびロータロッド（ｒｏｔｏｒｏｄ）試験を、各マウスに対して別々に、６時間間隔で２回行った（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。自発運動活性の測定値を、ベースライン値比較後に評価した。
【０３９６】
統計
全ての値は平均値±標準誤差として表わされる。活性化小膠細胞中のｉＮＯＳ、ＩＬ−１ｂおよびＩｋＢａのｍＲＮＡ発現に対するＲＮＳ６０の用量依存効果を分析すると同時に、一元配置ＡＮＯＶＡを行った。他の場合では、スチューデントｔ検定を用いて、２群間の結果を比較した（例えば対照対ＭＰＴＰ、ＭＰＴＰ対ＲＮＳ６０等）。
【０３９７】
結果：
ＲＮＳ６０は、活性化マウス小膠細胞および星状膠細胞における炎症性分子の発現を減弱する。活性化小膠細胞および星状膠細胞は、過剰量のＮＯおよび炎症誘発性サイトカインを産生することが知られており、ドパミン作動性ニューロンを損傷する可能性を有する。ＭＰＴＰの神経毒性効果は、ＭＰＴＰのＭＰＰ＋への変換に依存する。膠細胞では、モノアミンオキシダーゼＢによってＭＰＴＰがＭＰＰ＋に変換され、それにより、次に膠細胞の活性化（ＲＥＦ）が引き起こされる。従って、我々は最初に、ＲＮＳ６０が、小膠細胞において、ＭＰＰ＋によるｉＮＯＳおよびＩＬ−１βの発現誘導を抑制し得るかどうかを調べた。ＲＮＳ６０は、ＢＶ−２小膠細胞におけるｉＮＯＳおよびＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現を、用量依存的に阻害した。同一バッチからの未処理のＮＳにはそのような阻害効果がなかったため、この効果はＲＮＳ６０に特有のものであった。ＭＰＰ＋に加え、他の多くの刺激が膠細胞を活性化することができ、例えば、マウス小膠細胞を含む異なる細胞型における種々の炎症性分子の典型的な誘導物質であるＬＰＳが挙げられる。ＲＮＳ６０およびＮＳと共に２時間プレインキュベートされた初代マウス小膠細胞を、ＬＰＳで刺激した。予想通り、ＬＰＳは初代小膠細胞においてｉＮＯＳタンパク質の発現を誘導した。ＲＮＳ６０は小膠細胞におけるＬＰＳによるｉＮＯＳの発現誘導を顕著に抑制したが、ＮＳは抑制しなかった。
【０３９８】
小膠細胞に加え、ＣＮＳには他の膠細胞が存在する。例えば、星状膠細胞はＣＮＳにおける主要な膠細胞であり、星状膠細胞の活性化は、いくつかの神経変性疾患の病因に関与している。以前に、我々は、ＩＬ−１βが星状膠細胞におけるｉＮＯＳの強力な誘導物質であることを示している。従って、我々は、ＩＬ−１β刺激された初代星状膠細胞におけるｉＮＯＳの発現に対するＲＮＳ６０の効果を調べた。小膠細胞と同様、ＲＮＳ６０は、この場合においても、初代マウス星状膠細胞におけるＩＬ−１β刺激ｉＮＯＳを顕著に阻害したが、ＮＳはそのような効果を持たなかった。（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）（ＭＴＴ）の結果は、試験されたすべての濃度において、ＲＮＳ６０が小膠細胞または星状膠細胞に対し毒性を持たなかったことを示しており、このことは、膠細胞のｉＮＯＳ発現に対するＲＮＳ６０の阻害効果が、細胞生存率におけるいかなる変化によるものでもないことを示唆している。
【０３９９】
ＲＮＳ６０は、小膠細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を阻害する。ＬＰＳおよびＭＰＰ＋を含む他の炎症性刺激は、ＮＦ−κＢの活性化を介してｉＮＯＳ発現を誘導することが知られている。ＲＮＳ６０が膠細胞におけるｉＮＯＳの発現を減弱することから、我々は、ＮＦ−κＢの活性化に対するＲＮＳ６０の効果を調べた。ＮＦ−κＢの活性化を、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合能および転写活性の両方によって、モニターした。ＬＰＳによるＢＶ−２小膠細胞の刺激は、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合能の誘導をもたらした。しかし、ＲＮＳ６０は、小膠細胞における、ＬＰＳにより誘導されたＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を阻害した。次に我々は、ＮＦ−κＢの転写活性に対するＲＮＳ６０の効果を試験した。予想通り、ＬＰＳはＮＦ−κＢ依存性のルシフェラーゼ転写を誘導した。ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合能に対するＲＮＳ６０の効果と一貫して、ＲＮＳ６０は、ＬＰＳ刺激された小膠細胞におけるＮＦ−κＢの転写活性も抑制した。ＮＳはこのような阻害効果を持たなかったことから、これらの結果は特有のものであった。これらの結果は、ＲＮＳ６０が、ＮＦ−κＢの活性化を抑制することによって、ｉＮＯＳの発現を減弱することを示す。
【０４００】
ＲＮＳ６０は膠細胞においてＩκＢαを上方制御する。抗炎症分子がＮＦ−κＢの活性化を抑制し得る複数の機序が存在するが、休止細胞においては、古典的なｐ６５：ｐ５０ヘテロ二量体が、ＩκＢαによって、不活性な複合体として細胞質においてアレストされている。新しく合成されたＩκＢαタンパク質は細胞質内および核内に蓄積し、そこでＮＦ−κＢ結合を減弱することも示されている。従って我々は、典型的ＮＦ−κＢヘテロ二量体の活性化を抑制するために、ＲＮＳ６０がＩκＢαを上方制御している可能性があると仮定した。興味深いことに、ＲＮＳ６０は、小膠細胞において時間依存的にＩκＢαタンパク質を顕著に上方制御したが、ＮＳは上方制御しなかった。ＩκＢαタンパク質における有意な増加は、ＲＮＳ６０処理から３０分間以内にのみ観察された。ＲＮＳ６０はＲｅｌＡ  ｐ６５の発現を上方制御しなかったことから、この効果は特異的なものであった。リアルタイムＰＣＲのデータも、ＲＮＳ６０によるＩκＢαｍＲＮＡの顕著な経時的増加を示すが、ＮＳでは示されなかった。同様に、ＲＮＳ６０はまた、用量依存的にＩκＢαの発現を増加させたが、ｐ６５およびｐ５０の発現は増加させなかった。このＩκＢα発現上昇を別の角度から確認するために、我々は二重標識免疫蛍光法も行った。ＲＮＳ６０は、ＣＤ１１ｂ陽性初代小膠細胞におけるＩκＢαの発現を顕著に増加させたが、ＮＳは増加させなかった。ＲＮＳ６０によるＩκＢα発現上昇が細胞型特異的なものであるかどうかを調べるために、次に我々は初代星状膠細胞をＲＮＳ６０で処理した。小膠細胞におけるその効果と同様に、ＲＮＳ６０は、ＧＦＡＰ陽性星状膠細胞におけるＩκＢαも上方制御した。
【０４０１】
ＲＮＳ６０による、小膠細胞におけるホスファチジルイノシトール−３（ＰＩ−３）キナーゼの活性化
次に我々は、ＲＮＳ６０がＩκＢα発現上昇のためのシグナルを伝達し得る機序を調べた。ＲＮＳ６０は、細胞膜と相互作用し得る帯電安定化したナノ構造を含有する。タンパク質および脂質の二重キナーゼであるＰＩ３キナーゼの活性化は細胞膜と密接に関連して起こるため、我々はＰＩ３キナーゼの活性化に対するＲＮＳ６０の効果を調べた。クラスＩＡ  ＰＩ３キナーゼは、受容体型チロシンキナーゼによって調節され、調節的８５ｋＤａサブユニットおよび触媒的１１０ｋＤａサブユニット（ｐ８５：ｐ１１０α／β）のヘテロ二量体から成る。一方、クラスＩＢ  ＰＩ３キナーゼは、１０１ｋＤａの調節サブユニットおよびｐ１１０γ触媒サブユニット（ｐ１０１／ｐ１１０γ）の二量体から成る。興味深いことに、脂質キナーゼ活性から明らかなように、ＲＮＳ６０が処理の１５分以内にｐ８５α会合型ＰＩ３キナーゼの活性化を顕著に誘導したが、ＮＳは誘導しなかったことを我々は観察したが、このことは、ＲＮＳ６０がクラスＩＡ  ＰＩ３キナーゼの活性化を誘導することを示唆している。しかし、ＲＮＳ６０がｐ１０１会合型ＰＩ３キナーゼ活性を活性化しなかったことから、ＲＮＳ６０はクラスＩＢ  ＰＩ３キナーゼを活性化することができないということが示唆される。次に我々は、この脂質キナーゼ活性に関与するクラスＩＡ  ＰＩ３キナーゼの触媒サブユニットの特定を試みた。調節サブユニットｐ８５αは、ｐ１１０αおよび／またはｐ１１０βの両方と会合することができる。免疫複合体脂質キナーゼアッセイによって、ＲＮＳ６０により誘導されたＰＩ３キナーゼの活性化が、ｐ１１０αおよびｐ１１０βの両方によるものであることことを、我々は観察した。
【０４０２】
ＲＮＳ６０による小膠細胞におけるＡｋｔの活性化
ＰＩ３キナーゼは様々な細胞機能と関連付けられており、これらの機能の多くが、クラスＩ  ＰＩ３キナーゼの、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ、ａｋａ  Ａｋｔ）を活性化する能力に関連している。従って、我々は、ＲＮＳ６０が小膠細胞におけるＡｋｔを活性化することができるかどうかを調べた。リン酸化Ａｋｔの免疫ブロット分析から明らかなように、ＰＩ３キナーゼの活性化と同様に、ＲＮＳ６０は刺激の３０分および６０分の時点で、全Ａｋｔのレベルを増加させることなく、Ａｋｔの活性化を顕著に誘導した。ＮＳはＡｋｔリン酸化に対するそのような効果を持たなかった。ＲＮＳ６０処理した小膠細胞におけるリン酸化Ａｋｔおよび全Ａｋｔの免疫蛍光分析によって、ＲＮＳ６０が小膠細胞におけるＡｋｔの活性化を誘導するが、ＮＳは誘導しないという結果も確認された。
【０４０３】
ＲＮＳ６０はＰＩ３キナーゼ−Ａｋｔシグナル経路の活性化を誘導したことから、我々は、ＲＮＳ６０がその抗炎症活性を示すために、この経路を利用しているかどうかの可能性を調べた。我々は、ＲＮＳ６０を介した抗炎症効果に対する、ＰＩ３キナーゼ阻害剤であるＬＹ２９４００２、およびＡｋｔ阻害剤であるＡｋｔＩの効果を調べた。予想通り、細菌性ＬＰＳは、小膠細胞において、ＮＯの産生およびｉＮＯＳタンパク質の発現を誘導した。ＲＮＳ６０は、ＬＰＳ刺激された小膠細胞において、ＮＯの産生およびｉＮＯＳタンパク質の発現も顕著に阻害した。しかしながら、ＬＹ２９４００２およびＡｋｔＩの両方によって、ＬＰＳ刺激された小膠細胞における、ｉＮＯＳの誘導に対するＲＮＳ６０の阻害効果が抑止されたが、このことは、ＲＮＳ６０を介したｉＮＯＳの抑制におけるＰＩ３キナーゼ−Ａｋｔ経路の関与を示している。次に我々は、ＲＮＳ６０が、ＩκＢα発現の上方制御およびＮＦ−κＢ活性化の抑制のためにＰＩ３キナーゼ−Ａｋｔ経路を必要とするかどうかも調べた。ｉＮＯＳの調節と同様に、ＬＹおよびＡｋｔＩの両方は、ＬＰＳ刺激された小膠細胞において、ＲＮＳ６０を介したＩκＢαのタンパク質およびｍＲＮＡの発現上昇も無効にし、ＲＮＳ６０を介したＮＦ−κＢ活性化に対する阻害を排除した。
【０４０４】
この観察結果をさらに確認するために、我々は、ＢＶ−２小膠細胞にｐ８５αのドミナントネガティブ変異体を形質移入した。ｐ１１０α／βサブユニットの結合に必要なｉｎｔｅｒ−ＳＨ２領域が破壊されているｐ８５αのドミナントネガティブ変異体の発現によって、Ｃ６膠細胞およびＢＶ−２膠細胞を含む様々な細胞型においてＰＩ３キナーゼ活性の阻害がもたらされたが、このことは、過剰発現されたｐ８５αのドミナントネガティブ変異体タンパク質が、ＰＩ３キナーゼの触媒サブユニットと会合しなかったことを示している。ウエスタンブロット分析およびリアルタイムＰＣＲから明らかなように、ＲＮＳ６０は、ＩκＢαのタンパク質およびｍＲＮＡの発現を、空ベクターを形質移入した小膠細胞においては誘導しが、ｐ８５αを形質移入した小膠細胞においては誘導しなかった。これらの結果は、ＲＮＳ６０が、小膠細胞においてＰＩ３キナーゼ−Ａｋｔシグナル経路を介して、ＩκＢαを上方制御し、その抗炎症効果を発現することを示唆している。
【０４０５】
次に我々は、ＰＩ３キナーゼの活性化のみが、小膠細胞におけるＩκＢαの発現を誘導するのに十分であるかどうかを調べた。ｐ１１０＊（ｐ１１０α／βの恒常的活性型変異体）の発現は、脂肪細胞におけるＧｌｕｔ４移行を促進するのに十分であるが、ｐ１１０−ｋｄ（キナーゼとして機能しない変異体（ｋｉｎａｓｅ  ｄｅａｄ  ｍｕｔａｎｔ））の発現では十分でないことが報告されている。従って、ｐ１１０α／βの活性を増加させるために、マウス小膠細胞にｐ１１０＊を形質移入した。以前我々は、ｐ１１０＊の発現は、ヒト星状膠細胞におけるＰＩ３キナーゼの脂質キナーゼ活性を増加させるが、ｐ１１０−ｋｄの発現では増加されないことを示している。ｐ１１０＊の過剰発現は、ＩκＢαのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を増加させることができたが、空ベクターの過剰発現では増加されなかった。一方、ｐ１１０−ｋｄはＩκＢαの発現に対し効果を持たなかった。これらの結果は、ＰＩ３キナーゼの活性化は小膠細胞におけるＩκＢαの発現を誘導するのに十分であることを示す。
【０４０６】
ＲＮＳ６０が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの小膠細胞および星状膠細胞において、抗炎症分子ＩκＢαのレベルを増加させたことから、我々は、ＲＮＳ６０が、ｉｎ  ｖｉｖｏのＭＰＴＰに曝したマウスの黒質において、ＩκＢαのレベルを増大させることができるかどうかを調べた。増加したＧＦＡＰおよびＣＤ１１ｂから明らかなように、ＭＰＴＰ中毒はｉｎ  ｖｉｖｏのＳＮｐｃにおいて、星状膠細胞症および小膠細胞症を顕著に誘導したが、ＭＰＴＰ曝露後にＩκＢα発現がわずかにしか減少されなかったことを我々は観察した。しかし、培養された星状膠細胞および小膠細胞におけるその効果と同様に、ＲＮＳ６０処理は、ｉｎ  ｖｉｖｏのＭＰＴＰ中毒性マウスのＳＮｐｃにおいて、ＧＦＡＰ陽性星状膠細胞およびＣＤ１１ｂ陽性小膠細胞の両方におけるＩκＢαレベルを有意に増加させた。
【０４０７】
ＲＮＳ６０処置がＮＦ−κＢの特異的阻害剤であるＩκＢα上方制御したことから、我々は、ＲＮＳ６０処置がｉｎ  ｖｉｖｏのＭＰＴＰに曝したマウスのＳＮｐｃにおいて、ＮＦ−κＢの活性化を抑制することができるかどうかを調べた。ＭＰＴＰの最終注射から７日後のＳＮｐｃにおいて、ＮＦ−κＢをモニターした。ＭＰＴＰ中毒は、食塩水処置と比べて、ＳＮｐｃにおいてＲｅｌＡ  ｐ６５の顕著な誘導をもたらした。二重標識免疫蛍光分析は、ｐ６５が主にＧＦＡＰ陽性星状膠細胞およびＣＤ１１ｂ陽性小膠細胞で発現されたことを示した。刺激により誘導されるＮＦ−κＢの核移行に加えて、刺激により誘導されるｐ６５のリン酸化が、核移行後の転写活性化において重要な役割を果たしていることが示されている。従って、リン酸化ｐ６５のレベルも、食塩水処置マウスと比べて、ＭＰＴＰ中毒性マウスのＳＮｐｃにおいて著しく高く、このことは、ｉｎ  ｖｉｖｏのＭＰＴＰで障害を受けたマウスのＳＮｐｃにおけるＮＦ−κＢ活性化を裏付けるものである。しかし、ＲＮＳ６０は、ｉｎ  ｖｉｖｏのＭＰＴＰ中毒性マウスのＳＮｐｃにおいて、リン酸化ｐ６５の誘導だけでなく、全ｐ６５の誘導を強力に阻害した。同様の条件下で、ＮＳはｐ６５の誘導およびｐ６５のリン酸化を阻害しなかった。
【０４０８】
炎症は、ＰＤおよびその動物モデルにおけるドパミン作動性ニューロンの喪失に関わっている。ＲＮＳ６０が膠細胞におけるｉＮＯＳの発現を阻害し、ｉｎ  ｖｉｖｏのＭＰＴＰ中毒性マウスの黒質においてＮＦ−κＢの活性化を抑制したことから、我々は、ＲＮＳ６０が、ｉｎ  ｖｉｖｏのＭＰＴＰに曝したマウスのＳＮｐｃにおいて、ｉＮＯＳの発現を抑制できるかどうかを調べた。腹側中脳切片におけるｉＮＯＳの免疫蛍光分析によって、ＭＰＴＰ中毒が黒質におけるｉＮＯＳタンパク質発現の顕著な増加を引き起こしたこと、並びにｉＮＯＳがＧＦＡＰ陽性星状膠細胞およびＣＤ１１ｂ陽性小膠細胞と共局在していたことが示された。しかしながら、マウスのＲＮＳ６０処置によって、ｉｎ  ｖｉｖｏの黒質におけるｉＮＯＳの顕著な抑制がもたらされたが、ＮＳによってはもたらされなかった。
【０４０９】
ＲＮＳ６０はＭＰＴＰ誘発性神経変性を防ぐ。マウスを、ＭＰＴＰ注射の２日前から、ＲＮＳ６０およびＮＳのｉ．ｐ．注射で毎日処置し、ＭＰＴＰの最終注射の７日後、動物に、ＴＨ免疫染色を用いて、ＳＮｐｃにおけるドパミン作動性の細胞体の定量化、および線条体における突出（ｐｒｏｊｅｃｔｉｎｇ）ドパミン作動性線維の定量化の処理を施した。ＭＰＴＰ中毒は、食塩水を注射された対照と比較した場合、ＳＮｐｃにおけるＴＨ陽性ニューロンのおよそ７０％の喪失および線条体におけるＴＨ  ＯＤの７５％の減少を引き起こした。しかし、ＲＮＳ６０で処置されたＭＰＴＰ注射マウスでは、ＳＮｐｃのＴＨ陽性ニューロンおよび線条体のＴＨ  ＯＤにおけるより少ない減少が観察された。一方、そのような保護効果はＮＳで処置されたＭＰＴＰ中毒性マウスにおいては見られなかった。次に、ＲＮＳ６０がＭＰＴＰによって引き起こされる生化学的欠損を防ぐかどうかを決定するために、我々は、ＭＰＴＰ処置から７日後の線条体におけるドパミン（ＤＡ）のレベルを定量化した。ＭＰＴＰ中毒によって、食塩水を注入されたマウスの線条体と比較して、線条体のＤＡにおいて約８０％の減少が引き起こされた。対照的に、ＲＮＳ６０で処置されたＭＰＴＰ中毒動物は、線条体のドパミンにおいて５０％の減少を示したが、一方、ＮＳ処置の場合、そのような保護は見られなかった。
【０４１０】
ＲＮＳ６０はＭＰＴＰ中毒性マウスの歩行運動機能を改善した。神経保護の最終的な治療目標は、機能障害を減少させることである。そのため、ＲＮＳ６０が構造的損傷および神経伝達物質の損傷を防ぐだけでなく、ＭＰＴＰによって引き起こされる機能障害も防ぐかどうかを調べるために、我々は、歩行運動およびオープンフィールドでの活動性をモニターした。ＭＰＴＰ注射は、ロータロッド（ｒｏｔｏｒｏｄ）での動作、運動時間、運動の回数、水平方向の活動性、総距離、立ち上がり、および常同症に著しい減少を引き起こした。一方、ＭＰＴＰは静止時間を増加させた。しかしながら、ＲＮＳ６０によって、ＭＰＴＰにより誘導された低歩行運動が有意に改善されたが、ＮＳでは改善されなかった。
【０４１１】
ＲＮＳ６０によって見られる神経保護は、膠細胞によるＭＰＴＰのＭＰＰ＋への変換が阻害されることによるものである可能性もある。この可能性に取り組むために、我々は、最後のＭＰＴＰ注射から３時間後の黒質におけるＭＰＰ＋のレベルを測定した。ＮＳは黒質におけるＭＰＰ＋のレベルに対し効果を持たなかったが、ＲＮＳ６０は驚くべきことに、黒質におけるＭＰＰ＋の供給力（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を６倍まで増加させた。まとめると、これらの結果は、ＲＮＳ６０は、黒質におけるＭＰＰ＋の供給力（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を著しく増加させるにもかかわらず、ＭＰＴＰに曝されたマウスの黒質線条体を保護することを示す。
【０４１２】
要約すると、我々は、ＲＮＳ６０が、（クラスＩＡ  ＰＩ−３Ｋ−Ａｋｔ）を介したＩκＢαの発現上昇およびＮＦ−κＢ活性化の阻害によって、抗炎症効果を示すことを示した。我々はまた、ＲＮＳ６０が、ＳＮｐｃにおけるＩκＢαを上方制御してＮＦ−κＢの活性化を遮断し、黒質におけるｉＮＯＳの発現を阻害し、黒質におけるドパミン作動性ニューロンの喪失を保護し、線条体におけるＴＨ線維および神経伝達物質を保存し、ＭＰＴＰ中毒性マウスにおける行動機能を改善することを示した。これらの結果は、ＲＮＳ６０の新規の生物学的特性を際立たせるものであり、ＲＮＳ６０がタウオパチーおよび他の神経変性障害への治療介入に一次治療または補助治療として用いられ得ることを示すものである。
【０４１３】
参照による組み込み．
本願において言及されている、および／または出願データシートに列挙されている、上記全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【０４１４】
本明細書の図面および詳細な説明は、限定的ではなく、例示的なものであると見なされるべきであり、本発明を開示された特定の形態および実施例に限定することを意図しないことは理解されるべきである。それとは逆に、本発明には、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、以下の特許請求の範囲により規定されるように、当業者には明らかな、さらなる変形、変更、再構成、置換、代替、設計上の選択、および実施形態の全てが含まれる。従って、以下の特許請求の範囲は、そのようなさらなる変形、変更、再構成、置換、代替、設計上の選択、および実施形態の全てを包含すると解釈されることが意図されている。
【０４１５】
前述の実施形態は、異なる他の構成要素に含有された、またはそれに関わる、異なる構成要素を表す。そのような示された構造は単に例示的なものであり、実際には、同一の機能を達成する多くの他の構造が実施可能であることを理解されたい。概念的な意味において、同一の機能性を達成するためのいかなる構成要素の配置も、所望の機能が達成されるように、効率的に「関連させ」られる。故に、特定の機能を達成するために組み合された本明細書のいかなる２つの構成要素も、構造または中間構成要素に関わりなく、所望の機能が達成されるように、互いに「関連させ」られているものと見なすことができる。同様に、そのように関連させられたいかなる２つの構成要素も、所望の機能を達成するために、互いに「機能的に連結されている」、または「機能的に共役している」と見なすことができる。
【０４１６】
本発明の特定の実施形態について示し、そして記載してきたが、当業者であれば、本明細書の教示に基づいて、本発明およびそのより広範な態様から逸脱することなく変更および変形を行うことができ、従って、添付の特許請求の範囲が、それらの範囲内に、全てのそのような変更および変形を、本発明の真の精神および範囲に属するものとして包含するものであることを理解できるであろう。さらに、本発明が添付の特許請求の範囲によってのみ定義されるものであることは理解されるべきである。一般に、本明細書、および特に、添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本体部分）に使用される用語は、一般的に、「開いている（ｏｐｅｎ）」用語（例えば、「〜を含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「〜を含んでいるが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈されるものとし、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも〜を有する（ｈａｖｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ）」と解釈されるものとし、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は、「〜を含むが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ｂｕｔ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈されるものとする等）として、意図されるものであることは、当業者には理解されよう。特定の数の導入される特許請求の範囲の詳述が意図される場合、そのような意図は、特許請求の範囲中に明確に引用され、そのような詳述がない場合には、そのような意図は存在しないことは、当業者には更に理解されよう。例えば、理解の援助として、以下の添付の特許請求の範囲は、特許請求の範囲の詳述を導入するために、前置きの表現である「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」および「１つまた複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」の使用を含有し得る。しかしながら、そのような表現の使用は、同一の特許請求の範囲が前置きの表現「１つもしくは複数の」または「少なくとも１つの」、および「ａ」または「ａｎ」等の不定冠詞を含むときでさえも（例えば、「ａ」および／または「ａｎ」は「少なくとも１つの」または「１つもしくは複数の」を意味すると通常は解釈されるべきである）、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による特許請求の範囲の詳述の導入が、このような導入された特許請求の範囲の詳述を含むあらゆる特定の特許請求の範囲を、ただ１つのそのような詳述を含む発明に限定することを意味すると解釈するべきではなく；同じことが特許請求の範囲の詳述の導入に使用される定冠詞の使用にも当てはまる。加えて、特定の数の導入された特許請求の範囲の詳述が明確に引用される場合であっても、そのような詳述は、少なくとも引用された数（例えば、他の修飾語句なしの「２つの詳述」の単なる詳述は、少なくとも２つの詳述、または２つ以上の詳述を通常は意味する）を意味すると通常は解釈されるべきことは、当業者には認識されよう。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて限定されない。
【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【国際調査報告】
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