(57)【要約】本発明は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］−メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性シュウ酸塩に関する。本発明はまた、そのような結晶性シュウ酸塩を含む組成物；そのような結晶性シュウ酸塩を、例えば、肺の障害を処置するために使用する方法；およびそのような結晶性シュウ酸塩を調製するためのプロセスに関する。
2013538857.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝−フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性シュウ酸塩であって；該結晶性シュウ酸塩は：
（ａ）１１．６６±０．２０、１５．７５±０．２０、１９．５５±０．２０、２３．００±０．２０、および２３．４５±０．２０の２θ値における回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられるイソプロパノール溶媒和物；ならびに
（ｂ）１５．３２±０．２０、１６．９０±０．２０、１９．２５±０．２０、および２３．７３±０．２０の２θ値における回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる水和物
から選択される、結晶性シュウ酸塩。
【請求項２】
前記結晶性シュウ酸塩は、１１．６６±０．２０、１５．７５±０．２０、１９．５５±０．２０、２３．００±０．２０、および２３．４５±０．２０の２θ値における回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられるイソプロパノール溶媒和物である、請求項１に記載の結晶性シュウ酸塩。
【請求項３】
前記結晶性シュウ酸塩は、ピーク位置が図１に示されるパターンのピーク位置に実質的に一致する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる、請求項２に記載の結晶性シュウ酸塩。
【請求項４】
前記結晶性シュウ酸塩は、約１６２℃〜約１６４℃の範囲に及ぶ融点によって特徴付けられる、請求項２に記載の結晶性シュウ酸塩。
【請求項５】
前記結晶性シュウ酸塩は、図２に示されるものに実質的に一致する示差走査熱分析トレースによって特徴付けられる、請求項２に記載の結晶性シュウ酸塩。
【請求項６】
前記結晶性シュウ酸塩は、１５．３２±０．２０、１６．９０±０．２０、１９．２５±０．２０、および２３．７３±０．２０の２θ値における回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる水和物である、請求項１に記載の結晶性シュウ酸塩。
【請求項７】
前記結晶性シュウ酸塩は、ピーク位置が図３に示されるパターンのピーク位置に実質的に一致する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる、請求項６に記載の結晶性シュウ酸塩。
【請求項８】
前記結晶性シュウ酸塩は、約１６２℃〜約１６４℃の範囲に及ぶ融点によって特徴付けられる、請求項６に記載の結晶性シュウ酸塩。
【請求項９】
前記結晶性シュウ酸塩は、図４に示されるものに実質的に一致する示差走査熱分析トレースによって特徴付けられる、請求項６に記載の結晶性シュウ酸塩。
【請求項１０】
薬学的組成物であって、該薬学的組成物は：
（ａ）請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の結晶性シュウ酸塩；および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア
を含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
薬学的組成物であって、該薬学的組成物は：
（ａ）請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の結晶性シュウ酸塩；
（ｂ）ステロイド性抗炎症剤、またはその薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物；および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア
を含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
肺の障害を処置する方法であって、該方法は、請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の結晶性シュウ酸塩を患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項１３】
肺の障害を処置する方法であって、該方法は、（ａ）請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の結晶性シュウ酸塩；および（ｂ）ステロイド性抗炎症剤、またはその薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物を患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項１４】
前記肺の障害は、慢性閉塞性肺疾患または喘息である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物において気管支拡張をもたらす方法であって、該方法は、請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の結晶性シュウ酸塩を吸入によって該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項１６】
治療において使用するための、請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の結晶性シュウ酸塩。
【請求項１７】
肺の障害の処置において使用するための、請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の結晶性シュウ酸塩。
【請求項１８】
慢性閉塞性肺疾患または喘息の処置において使用するための、請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の結晶性シュウ酸塩。
【請求項１９】
医薬の製造のための、請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の結晶性シュウ酸塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、ジアミド化合物の新規の結晶性シュウ酸塩に関する。本発明はまた、そのような結晶性塩を含む薬学的組成物、そのような結晶性塩を調製するために有用なプロセスおよび中間体、ならびにそのような結晶性塩を、例えば、肺の障害を処置するために使用する方法に関する。
【０００２】
技術水準
２０１０年１０月２８日に公開された国際公開第２０１０／１２３７６６  Ａ１号は、肺の障害（例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および喘息）を処置するための治療剤として有用であることが予期されるジアミド化合物を開示する。本願において開示される１つの化合物は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］−メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルであり、これは、式Ｉ
【０００３】
【化１】
2013538857.tif 000003
によって表される化学構造を有する。
【背景技術】
【０００４】
肺の障害を処置するために使用される治療剤は、代表的に、吸入デバイス（例えば、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、定量吸入器（ＭＤＩ）、またはネブライザー吸入器）を用いて直接気道に投与される。そのようなデバイスにおいて使用するために治療剤を製剤化する場合に、著しい分解も結晶性の損失もなく、微粉化されるか、または他の方法で製剤化され、保存され得る治療剤の安定な結晶性の形態を有することは有益である。特に、上記結晶性の形態は、過度に吸湿性または潮解性であるべきではない。さらに、上記結晶性の形態は、加工および保存の間の熱劣化を最小限にするために、比較的高い融点（すなわち、約１３０℃よりも高い）を有するべきではない。
【０００５】
しかし、有機化合物の結晶性の形態の形成は、非常に予測できない。有機化合物の形態がもしあれば、それが結晶性であることを予測するための確実な方法は存在しない。さらに、結晶性の形態がもしあれば、それが、例えば、薬学的吸入デバイスにおいて使用するための所望される物理的特性を有することを予測するための方法は存在しない。
【０００６】
目下、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝−フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性の形態は開示されていない。従って、この化合物の安定な結晶性の形態の必要性が存在する。特に、受容可能なレベルの吸湿性、および比較的高い融点を有する安定な非潮解性の結晶性の形態の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、結晶性固体状態の形態であるビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルのシュウ酸付加塩に関する。そのような結晶性シュウ酸塩としては、結晶性シュウ酸塩イソプロパノール溶媒和物、および結晶性シュウ酸塩水和物が挙げられる。
【０００８】
本発明の特定の結晶性シュウ酸塩は、大気の水分にさらされる場合に、非潮解性であること、および受容可能な吸湿性特性を有することが見出されている。さらに、本発明の結晶性シュウ酸塩は、少なくとも約１６０℃の比較的高い融点を有する。
【０００９】
従って、１つの局面において、本発明は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝−エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性シュウ酸塩を提供する。
【００１０】
１つの実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、１１．６６±０．２０、１５．７５±０．２０、１９．５５±０．２０、２３．００±０．２０、および２３．４５±０．２０の２θ値における回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられるイソプロパノール溶媒和物である。この結晶性の形態または多形は、Ｆｏｒｍ  １と指定されている。
【００１１】
別の実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、１５．３２±０．２０、１６．９０±０．２０、１９．２５±０．２０、および２３．７３±０．２０の２θ値における回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる水和物である。この結晶性の形態または多形は、Ｆｏｒｍ  ２と指定されている。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝−フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性シュウ酸塩を約１日〜約５日の期間の間、約８０％相対湿度〜約１００％相対湿度に曝すことによって調製される水和物である。
【００１３】
別の局面において、本発明は、本発明の結晶性シュウ酸塩を含む組成物を提供する。
【００１４】
１つの実施形態において、上記組成物は、（ａ）本発明の結晶性シュウ酸塩、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物である。
【００１５】
別の実施形態において、上記組成物は、（ａ）本発明の結晶性シュウ酸塩；（ｂ）ステロイド性抗炎症剤、またはその薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物；および（ｃ）薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物である。
【００１６】
別の局面において、本発明は、治療における使用のための本発明の結晶性シュウ酸塩を提供する。
【００１７】
１つの実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、肺の障害の処置において使用される。特定の実施形態において、上記肺の障害は、慢性閉塞性肺疾患である。別の特定の実施形態において、上記肺の障害は、喘息である。
【００１８】
１つの実施形態において、本発明は、肺の障害を処置する方法を提供し、上記方法は、本発明の結晶性シュウ酸塩を患者に投与する工程を含む。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、肺の障害を処置する方法を提供し、上記方法は、（ａ）本発明の結晶性シュウ酸塩；および（ｂ）ステロイド性抗炎症剤、またはその薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物を患者に投与する工程を含む。
【００２０】
さらに別の実施形態において、本発明は、哺乳動物において気管支拡張をもたらす方法を提供し、上記方法は、本発明の結晶性シュウ酸塩を吸入によって哺乳動物に投与する工程を含む。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、医薬の製造における使用のための本発明の結晶性シュウ酸塩を提供する。
【００２２】
本発明の他の局面および実施形態は、本明細書中に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本発明の種々の局面は、添付の図面を参照することによって例示される。
【図１】図１は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］−メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性シュウ酸塩イソプロパノール溶媒和物（Ｆｏｒｍ  １）についての粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを示す。
【図２】図２は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝−フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性シュウ酸塩イソプロパノール溶媒和物（Ｆｏｒｍ  １）についての示差走査熱分析（ＤＳＣ）トレースを示す。
【図３】図３は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］−メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性シュウ酸塩イソプロパノール溶媒和物（Ｆｏｒｍ  １）についての熱重量分析（ＴＧＡ）トレースを示す。
【図４】図４は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］−メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性シュウ酸塩水和物（Ｆｏｒｍ  ２）についての粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを示す。
【図５】図５は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］−メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性シュウ酸塩水和物（Ｆｏｒｍ  ２）についての示差走査熱分析（ＤＳＣ）トレースを示す。
【図６】図６は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］−メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性シュウ酸塩水和物（Ｆｏｒｍ  ２）についての熱重量分析（ＴＧＡ）トレースを示す。
【図７】図７は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］−メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性シュウ酸塩水和物（Ｆｏｒｍ  ２）についての動的水分収着（ＤＭＳ）トレースを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、結晶性固体状態の形態であるビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルのシュウ酸付加塩（そのイソプロパノール溶媒和物および水和物を含む）に関する。本発明の結晶性シュウ酸塩は、１つまたはそれより多くのまったく異なった（ｄｉｓｔｉｎｃｔ）結晶性固体状態の形態として存在し得、本発明は、別段示されない限り、すべてのそのような形態（形態の混合物を含む）を包含する。
【００２５】
１つの実施形態において、本発明は、本明細書中でＦｏｒｍ  １と称される、式Ｉの化合物のシュウ酸付加塩の結晶性シュウ酸塩の固体状態の第一の形態を提供する。Ｆｏｒｍ  １は、イソプロパノール溶媒和物の形態である。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、本明細書中でＦｏｒｍ  ２と称される、式Ｉの化合物のシュウ酸付加塩の結晶性シュウ酸塩の固体状態の第二の形態を提供する。Ｆｏｒｍ  ２は、水和物である。
【００２７】
式Ｉの化合物は、（Ｒ）配置を有する１つのキラル中心を含む。しかし、別段示されない限り、重大ではない量の（Ｓ）立体異性体が、本発明の組成物中に存在し得、ただし、上記組成物の任意の有用性は、全体として、そのような異性体の存在によって排除されないことが当業者によって理解される。
【００２８】
式Ｉの化合物およびその中間体は、市販のＭＤＬ（登録商標）ＩＳＩＳ／Ｄｒａｗソフトウェア（Ｓｙｍｙｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＡｕｔｏＮｏｍ機能を用いて名付けられている。
【００２９】
定義
本発明の化合物、組成物、方法、およびプロセスを記載する場合、以下の項目は、別段示されない限り、以下の意味を有する。
【００３０】
用語「融点」は、最大吸熱熱流が示差走査熱分析によって観測される温度を意味する。
【００３１】
用語「微粉化」または「微粉化された形態で」は、粒子の少なくとも約９０％が約１０μｍ未満の直径を有する粒子を意味する。
【００３２】
用語「溶媒和物」は、溶質の１つまたはそれより多くの分子（すなわち、式Ｉの化合物のシュウ酸塩）と、溶媒の１つまたはそれより多くの分子との会合（例えば、複合体または凝集体）を意味する。代表的な溶媒としては、例として、水およびイソプロパノールが挙げられる。上記溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物である。
【００３３】
用語「治療上有効な量」は、処置を必要とする患者に投与する場合に、処置を達成するために十分な量を意味する。
【００３４】
用語「処置すること」または「処置」は：
（ａ）  疾患または医学的状態が起こらないようにすること、すなわち、患者または被験体の予防的処置；
（ｂ）  疾患または医学的状態を改善すること、すなわち、患者における疾患または医学的状態を排除するか、または患者における疾患または医学的状態の回帰を生じさせること；
（ｃ）  疾患または医学的状態を抑制すること、すなわち、患者における疾患または医学的状態を遅くすること、または患者における疾患または医学的状態の発症を阻止すること；あるいは、
（ｄ）  患者における疾患または医学的状態の症状を緩和すること
を意味する。
【００３５】
用語「単位剤形」は、患者に投薬するために適した物理的に別々の単位、すなわち、単独または１つもしくはそれより多くのさらなる単位と組み合わせて治療効果を生み出すように計算された所定の量の治療剤を含む各単位を意味する。例えば、そのような単位剤形は、乾燥粉末吸入器のカプセル剤、定量吸入器からの定量、カプセル剤、錠剤、丸剤などであり得る。
【００３６】
本発明の代表的な結晶性シュウ酸塩
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝−フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性シュウ酸塩は、少なくとも２つの異なる結晶性の形態で存在することが見出されている。本発明の目的のために、これらの形態は、本明細書中でＦｏｒｍ  １およびＦｏｒｍ  ２と識別される。
【００３７】
Ｆｏｒｍ  １は、約１１．６６±０．２０、約１５．７５±０．２０、約１９．５５±０．２０、約２３．００±０．２０、および約２３．４５±０．２０の２θ値において、他のピークの中でも顕著な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンによって特徴付けられるイソプロパノール溶媒和物である。Ｆｏｒｍ  １は、約１６２℃〜約１６４℃における（例えば、約１６３．３℃における）吸熱熱流においてピークを示す示差走査熱分析（ＤＳＣ）トレースを有する。Ｆｏｒｍ  １は、式Ｉの化合物のシュウ酸塩１モル当量当たり、約１モル当量〜約２モル当量のイソプロパノールを含み、それには、約１．２５モル当量〜約１．７５モル当量（例えば、１．５モル当量）が挙げられる。
【００３８】
Ｆｏｒｍ  ２は、約１５．３２±０．２０、約１６．９０±０．２０、約１９．２５±０．２０、および約２３．７３±０．２０の２θ値において、他のピークの中でも顕著な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンによって特徴付けられる水和物である。Ｆｏｒｍ  ２は、約１６２℃〜約１６４℃における（例えば、約１６２．６℃における）吸熱熱流においてピークを示す示差走査熱分析（ＤＳＣ）トレースを有する。Ｆｏｒｍ  ２は、式Ｉの化合物のシュウ酸塩１モル当量当たり、約１モル当量〜約３モル当量の水を含み、それには、約１．５モル当量〜約２モル当量が挙げられる。
【００３９】
本発明の結晶性シュウ酸塩は、１モル当量の式Ｉの化合物当たり、約０．９０モル当量と約１．１０モル当量との間のシュウ酸を代表的に含み；１モル当量の式Ｉの化合物当たり、約０．９５モル当量と約１．０５モル当量との間のシュウ酸が挙げられる。特定の実施形態において、本発明のシュウ酸塩は、１モル当量の式Ｉの化合物当たり、約１モル当量のシュウ酸を含む。モル比は、従来の方法（例えば、１３Ｃ  ＮＭＲ、元素分析、イオン分析、またはＨＰＬＣ）を用いて決定される。
【００４０】
本発明の結晶性シュウ酸塩は、代表的に、シュウ酸またはシュウ酸二水和物、およびビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝−フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルを用いて調製される。シュウ酸およびシュウ酸二水和物は、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されている。本発明において用いられるビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝−エチル）ピペリジン−４−イルエステルは、下の実施例に記載される手順を用いて、または本願の背景のセクションに記載された同一人に譲渡された米国出願に記載される手順を用いることによって、市販の出発物質および試薬から容易に調製され得る。
【００４１】
本発明の結晶性シュウ酸塩を調製するための方法またはプロセスは、実施例において提供される。代表的に、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝−フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルは、希釈剤中、約０．９０モル当量〜約１．１モル当量（例えば、１．０モル当量）のシュウ酸またはシュウ酸二水和物と接触させられる。一般に、この反応は、約０℃〜約６０℃の範囲に及ぶ温度において行われ；約２０℃〜約３５℃（例えば、約２５℃〜約３０）が挙げられる。この反応に適切な不活性希釈剤としては、必要に応じて水を含む、メタノール、イソプロパノールなどが挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて、反応混合物は、結晶化を容易にするために従来の装置を用いて音波処理され得る。
【００４２】
本発明の結晶性シュウ酸塩を調製するプロセスは、主に特定の結晶性の形態を生成するために、必要に応じて種晶の使用を含み得る。例えば、Ｆｏｒｍ  ２の種晶を用いることによって、結晶性シュウ酸塩水和物は、種晶と実質的に同じ形態（すなわち、Ｆｏｒｍ  ２）を有して調製され得る。そのような種晶は、本発明の結晶性シュウ酸塩を初めに形成する場合に使用され得る、またはそれらは、結晶性の形態もしくは部分的に結晶性の形態を再結晶化するために使用され得る。
【００４３】
代表的に、種晶は、撹拌せずに、そして冷却せずに、ゆっくりとした結晶化によって調製される。例示として、種晶を得るために、式Ｉの化合物は代表的に、溶解をもたらすのに十分な温度で希釈剤中に溶解される。例えば、式Ｉの化合物は、熱い、メタノール中１０％（ｖ／ｖ）の水中に溶解され、次に周囲温度に冷却される。この溶液は、ゆっくりと蒸発させられて、本発明の結晶性シュウ酸塩を提供する。得られた結晶は、濾過または他の従来の手段によって単離される。あるいは、種晶は、結晶性物質の以前の調製物から得られ得る。
【００４４】
Ｆｏｒｍ  ２の結晶性は、結晶性物質が、高い湿度の下で周囲温度にて保存される場合に向上することが見出されている。例えば、Ｆｏｒｍ  ２のサンプルが８４％相対湿度で周囲温度にて保存される場合、結晶性はサンプルのＰＸＲＤパターンによって測定される際に、約５日の期間にわたって向上した。
【００４５】
組成物、組み合わせ物、および製剤
本発明の結晶性シュウ酸塩は、他の物質（例えば、治療剤、キャリア、賦形剤、希釈剤、および溶媒など）と組み合わせられて、組成物を形成し得る。
【００４６】
１つの実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、キャリアまたは賦形剤とともに製剤化されて、薬学的組成物または製剤を形成し得る。そのような薬学的組成物は、代表的に、治療上有効な量の本発明の結晶性シュウ酸塩を含む。しかし、いくつかの場合において、上記薬学的組成物は、治療上有効な量より多い量（例えば、濃縮されたバルク組成物）；または治療上有効な量より少ない量（例えば、複数単位投与を意図した単位剤形）を含み得る。
【００４７】
上記薬学的組成物は、代表的に、約０．０１重量％〜約９５重量％の本発明の結晶性シュウ酸塩を含み、それには、例えば、約０．０５重量％〜約３０重量％；または約０．１重量％〜約１０重量％が挙げられる。
【００４８】
そのような薬学的組成物は、従来のキャリアまたは賦形剤を用いて調製され得る。特定のキャリアもしくは賦形剤、またはキャリアもしくは賦形剤の組み合わせの選択は、種々の要因（例えば、投与の様式、または処置される疾患もしくは医学的状態）に依存する。薬学的組成物を調製するための多くの適切なキャリアおよび賦形剤は市販されている。例えば、物質は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入され得る。投与の特定の様式に適した薬学的組成物を調製するための手順および物質は、薬学的な技術分野（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｈｉｔｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（２０００）；およびＨ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｈｉｔｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９９９）が挙げられる）において記載される。
【００４９】
薬学的に受容可能なキャリアの代表的な例としては：（１）糖（例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース）；（２）デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、およびジャガイモデンプン）；（３）セルロース、およびその誘導体（例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース）；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）凝脂、およびワックス（例えば、ココアバター、および坐剤用ワックス）；（９）液体油（室温で）（例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油）；（１０）グリコール（例えば、プロピレングリコール）；（１１）ポリオール（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール）；（１２）エステル（例えば、オレイン酸エチル、およびラウリン酸エチル）；（１３）寒天；（１４）緩衝剤（例えば、水酸化マグネシウム、および水酸化アルミニウム）；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェン除去水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；（２１）圧縮プロペラントガス（例えば、クロロフルオロカーボン、およびヒドロフルオロカーボン）；ならびに（２２）薬学的組成物に用いられる非毒性の他の適合可能な物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
薬学的組成物は、代表的に、本発明の結晶性シュウ酸塩を、薬学的に受容可能なキャリアおよび任意の他の任意選択の成分と完全におよび密に、混合すること、またはブレンドすることによって調製される。必要であれば、または所望される場合、得られた均一にブレンドされた混合物は次に、従来の手順および装置を用いて、錠剤、カプセル剤、丸剤、キャニスター、カートリッジ、ディスペンサーなどに成形され得るか、または充填され得る。
【００５１】
１つの実施形態において、上記薬学的組成物は、吸入投与に適している。吸入投与のための薬学的組成物は、代表的に、エアゾールまたは粉末の形態である。そのような組成物は、一般に、吸入器送達デバイス（例えば、定量吸入器（ＭＤＩ）、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、ネブライザー吸入器、または同様の送達デバイス）を用いて投与される。
【００５２】
特定の実施形態において、上記薬学的組成物は、乾燥粉末吸入器を用いて吸入によって投与される。そのような乾燥粉末吸入器は、代表的に、上記薬学的組成物を、吸息中に患者の空気の流れ（ａｉｒ−ｓｔｒｅａｍ）に分散される流動性（ｆｒｅｅ−ｆｌｏｗｉｎｇ）粉末として投与する。流動性粉末組成物を達成するために、上記治療剤は、代表的に、適切な賦形剤（例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、デキストロース、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、またはそれらの組み合わせ）とともに製剤化される。代表的に、上記治療剤は、微粉化され、適切なキャリアと組み合わせられて、吸入に適した組成物を形成する。従って、１つの実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、微粉化された形態である。
【００５３】
乾燥粉末吸入器において使用するための代表的な薬学的組成物は、微粉化された形態での、ラクトースおよび本発明の結晶性シュウ酸塩を含む。そのような乾燥粉末組成物は、例えば、乾式粉砕されたラクトースを上記治療剤と組み合わせ、次に構成要素を乾式ブレンドすることによって作製され得る。上記組成物は次に、代表的に、乾燥粉末ディスペンサー、または乾燥粉末送達デバイスで使用するための吸入カートリッジもしくはカプセルへ充填される。
【００５４】
吸入によって治療剤を投与することに適した乾燥粉末吸入器送達デバイスは、当該分野において記載され、そのようなデバイスの例は、市販されているものである。例えば、代表的な乾燥粉末吸入器送達デバイスまたは製品としては、Ａｅｏｌｉｚｅｒ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；Ａｉｒｍａｘ（ＩＶＡＸ）；ＣｌｉｃｋＨａｌｅｒ（Ｉｎｎｏｖａｔａ  Ｂｉｏｍｅｄ）；Ｄｉｓｋｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；Ｄｉｓｋｕｓ／Ａｃｃｕｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；Ｅａｓｙｈａｌｅｒ（Ｏｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ）；Ｅｃｌｉｐｓｅ（Ａｖｅｎｔｉｓ）；ＦｌｏｗＣａｐｓ（Ｈｏｖｉｏｎｅ）；Ｈａｎｄｉｈａｌｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）；Ｐｕｌｖｉｎａｌ（Ｃｈｉｅｓｉ）；Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ＳｋｙｅＨａｌｅｒ／Ｃｅｒｔｉｈａｌｅｒ（ＳｋｙｅＰｈａｒｍａ）；Ｔｗｉｓｔｈａｌｅｒ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）；Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；Ｕｌｔｒａｈａｌｅｒ（Ａｖｅｎｔｉｓ）；などが挙げられる。
【００５５】
別の特定の実施形態において、上記薬学的組成物は、定量吸入器を用いて吸入によって投与される。そのような定量吸入器は、代表的に、圧縮プロペラントガスを用いて、測定量の治療剤を放出する。従って、定量吸入器を用いて投与される薬学的組成物は、代表的に、液化プロペラント中に上記治療剤の溶液または懸濁物を含む。任意の適切な液化プロペラントは、ヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）（例えば、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４ａ）、および１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパン（ＨＦＡ  ２２７））；およびクロロフルオロカーボン（例えば、ＣＣｌ３Ｆ）を含んで用いられる。特定の実施形態において、上記プロペラントは、ヒドロフルオロアルカンである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロフルオロアルカン製剤は、共溶媒（例えば、エタノールまたはペンタン）、および／または界面活性剤（例えば、ソルビタントリオレエート、オレイン酸、レシチン、およびグリセリン）を含む。
【００５６】
定量吸入器において使用するための代表的な薬学的組成物は、約０．０１重量％〜約５重量％の本発明の結晶性シュウ酸塩；約０重量％〜約２０重量％のエタノール；および約０重量％〜約５重量％の界面活性剤を含み；残りはＨＦＡプロペラントである。そのような組成物は、代表的に、上記治療剤、エタノール（存在する場合）、および上記界面活性剤（存在する場合）を含む適切な容器に、冷却または加圧されたヒドロフルオロアルカンを加えることによって調製される。懸濁物を調製するために、上記治療剤は、微粉化され、次に上記プロペラントと組み合わせられる。上記組成物は次に、定量吸入器デバイスの一部分を代表的に形成するエアゾールキャニスターに充填される。
【００５７】
吸入によって治療剤を投与するのに適した定量吸入器デバイスは、当該分野において記載され、そのようなデバイスの例は、市販されているものである。例えば、代表的な定量吸入器デバイスまたは製品としては、ＡｅｒｏＢｉｄ  Ｉｎｈａｌｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｏｒｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；Ａｔｒｏｖｅｎｔ  Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  Ａｅｒｏｓｏｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）；Ｆｌｏｖｅｎｔ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；Ｍａｘａｉｒ  Ｉｎｈａｌｅｒ（３Ｍ）；Ｐｒｏｖｅｎｔｉｌ  Ｉｎｈａｌｅｒ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）；Ｓｅｒｅｖｅｎｔ  Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  Ａｅｒｏｓｏｌ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；などが挙げられる。
【００５８】
別の特定の実施形態において、上記薬学的組成物は、ネブライザー吸入器を用いて、吸入によって投与される。そのようなネブライザーデバイスは、代表的に、上記薬学的組成物をミストとしてスプレーさせ、そのミストを患者の気道に運ぶ高速の空気の流れを生み出す。従って、ネブライザー吸入器において使用するために製剤化される場合、上記治療剤は、適切なキャリアに溶解されて、溶液を形成し得る。あるいは、上記治療剤は、微粉化され、適切なキャリアと組み合わされて、微粉化された粒子の懸濁物を形成し得る。
【００５９】
ネブライザー吸入器において使用するための代表的な薬学的組成物は、微粉化された形態での約０．０５μｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの本発明の結晶性シュウ酸塩を含む等張水性懸濁物を含む。１つの実施形態において、上記溶液は、約４〜約６のｐＨを有する。
【００６０】
吸入によって治療剤を投与するのに適したネブライザーデバイスは、当該分野において記載され、そのようなデバイスの例は、市販されているものである。例えば、代表的なネブライザーデバイスまたは製品としては、Ｒｅｓｐｉｍａｔ  Ｓｏｆｔｍｉｓｔ  Ｉｎｈａｌａｌｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）；ｔｈｅ  ＡＥＲｘ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｒａｄｉｇｍ  Ｃｏｒｐ．）；ｔｈｅ  ＰＡＲＩ  ＬＣ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅｕｓａｂｌｅ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ（Ｐａｒｉ  ＧｍｂＨ）；などが挙げられる。
【００６１】
所望される場合、本発明の結晶性シュウ酸塩は、１つまたはそれより多くの他の治療剤と組み合わせて投与され得る。本発明のこの局面において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、他の治療剤と物理的に混合されて両方の剤を含む組成物を形成するか；または各剤は、同時もしくは逐次のいずれかで、患者に別個に投与されるかのいずれかである。
【００６２】
例えば、本発明の結晶性シュウ酸塩は、従来の手順および装置を用いて第二の治療剤と組み合わせられて、本発明の結晶性シュウ酸塩および上記第二の治療剤を含む組成物を形成し得る。さらに、上記治療剤は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせられて、本発明の結晶性シュウ酸塩、第二の治療剤、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を形成し得る。この実施形態において、上記組成物の構成要素は、代表的に、混合されるか、またはブレンドされて、物理的混合物を作り出す。上記物理的混合物は次に、本明細書中に記載される経路のうちの任意のものを用いて患者に投与される。
【００６３】
あるいは、上記治療剤は、患者への投与前に、別個およびまったく異なったままであり得る。この実施形態において、上記治療剤は、投与前には物理的に一緒に混合されていないが、別個の剤または組成物として、同時投与または逐次投与される。例えば、本発明の結晶性シュウ酸塩は、各治療剤について別個の区画（例えば、ブリスターパック）を用いる吸入送達デバイスを用いて、別の治療剤とともに吸入によって同時投与または逐次投与され得る。あるいは、組み合わせ物は、別個の送達デバイス、すなわち、各治療剤について１つの送達デバイスを用いて投与され得る。さらに、上記治療剤は、異なる投与経路（すなわち、１つは吸入によるものであり、もう１つは、経口投与によるものである）によって送達され得る。
【００６４】
本発明の結晶性シュウ酸塩と適合可能な任意の治療剤は、そのような塩と組み合わせて使用され得る。特定の実施形態において、上記第二の治療剤は、吸入によって有効に投与されるものである。例示として、使用され得る治療剤の代表的なタイプとしては、抗炎症剤（例えば、ステロイド性抗炎症剤（コルチコステロイドおよびグルココルチコイドが挙げられる）、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、およびＰＤＥ４インヒビター）；気管支拡張剤（例えば、ＰＤＥ３インヒビター、アデノシン２ｂ調節因子、およびβ２アドレナリン作動性受容体アゴニスト）；抗感染剤（例えば、グラム陽性抗生物質、グラム陰性抗生物質、および抗ウイルス剤）；抗ヒスタミン；プロテアーゼインヒビター；求心性遮断剤（例えば、Ｄ２アゴニスト、およびノイロイキン調節因子）；ならびにムスカリン性受容体アンタゴニスト（抗コリン薬）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような治療剤の数多くの例は、当該分野において公知である。これらの他の治療剤についての適切な用量も当該分野において公知であり、代表的に、約０．０５μｇ／日〜約５００ｍｇ／日の範囲に及ぶ。１つの実施形態において、上記第二の治療剤は、肺の障害を処置するために有用である。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、ステロイド性抗炎症剤と組み合わせて投与される。代表的なステロイド性抗炎症剤としては、ジプロピオン酸ベクロメタゾン；ブデソニド；ブチキソコルトプロピオネート；２０Ｒ−１６α，１７α−［ブチリデンビス（オキシ）］−６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１７β−（メチルチオ）アンドロスタ−４−エン−３−オン（ＲＰＲ−１０６５４１）；シクレソニド；デキサメタゾン；６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソアンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−チオカルボン酸Ｓ−フルオロメチルエステル；６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−［（４−メチル−１，３−チアゾール−５−カルボニル）オキシ］−３−オキソアンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−チオカルボン酸Ｓ−フルオロメチルエステル；６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−１７α−プロピオニルオキシアンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−チオカルボン酸（Ｓ）−（２−オキソテトラヒドロフラン−３Ｓ−イル）エステル；フルニソリド；フロ酸フルチカゾン；プロピオン酸フルチカゾン；メチルプレドニゾロン；フロ酸モメタゾン；プレドニゾロン；プレドニゾン；ロフレポニド；ＳＴ−１２６；トリアムシノロンアセトニド；など、ならびにそれらの薬学的に受容可能な塩および溶媒和物が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなステロイド性抗炎症剤は、市販されているか、または従来の手順および試薬を用いて調製され得る。例えば、ステロイド性抗炎症剤の調製および使用は、２００３年３月２５日に発行された米国特許第６，５３７，９８３号；２００４年６月１５日に発行された米国特許第６，７５０，２１０  Ｂ２号；２００４年７月６日に発行された米国特許第６，７５９，３９８  Ｂ２号；２００５年２月２２日に発行された米国特許第６，８５８，５９６  Ｂ２号；２００６年９月５日に発行された米国特許第７，１０１，８６６  Ｂ２号；およびそれらにおいて引用された参考文献に記載されている。
【００６６】
上記ステロイド性抗炎症剤は、用いられる場合、代表的に、本発明の結晶性シュウ酸塩と共投与される場合に治療上有益な効果を生み出す量で投与される。代表的に、上記ステロイド性抗炎症剤は、１用量当たり約０．０５μｇ〜約５００μｇの上記剤を提供するために十分な量で投与される。
【００６７】
代表的な薬学的組成物としては、以下の例が挙げられるが、これらに限定されない：
Ａ．  乾燥粉末組成物
本発明の微粉化された結晶性シュウ酸塩（１００ｍｇ）は、乾式粉砕されたラクトース（２５ｇ）とブレンドされる。このブレンドされた混合物は次に、はがすことができるブリスターパックの個々のブリスターへ、１用量当たり約１０μｇ〜約５００μｇの本発明の結晶性シュウ酸塩を提供するために十分な量で充填される。ブリスターの中身は、乾燥粉末吸入器を用いて投与される。
【００６８】
Ｂ．  乾燥粉末組成物
本発明の微粉化された結晶性シュウ酸塩（１ｇ）は、乾式粉砕されたラクトース（２００ｇ）とブレンドされて、１：２００の結晶性シュウ酸塩：ラクトースの重量比を有するバルク組成物を形成する。ブレンドされた組成物は、１用量当たり約１０μｇと約５００μｇとの間の本発明の結晶性シュウ酸塩を送達することが可能な乾燥粉末吸入デバイスへパックされる。
【００６９】
Ｃ．  乾燥粉末組成物
本発明の微粉化された結晶性シュウ酸塩（１００ｍｇ）および微粉化されステロイド性抗炎症剤（５００ｍｇ）は、乾式粉砕されたラクトース（３０ｇ）とブレンドされる。このブレンドされた混合物は次に、はがすことができるブリスターパックの個々のブリスターへ、１用量当たり約１０μｇ〜約５００μｇの本発明の結晶性シュウ酸塩を提供するために十分な量で充填される。ブリスターの中身は、乾燥粉末吸入器を用いて投与される。
【００７０】
Ｄ．  定量吸入器組成物
本発明の微粉化された結晶性シュウ酸塩（１０ｇ）は、脱塩水（２００ｍＬ）中にレシチン（０．２ｇ）を溶解させることによって調製された溶液中に分散される。得られた懸濁物は、スプレー乾燥され、次に微粉化されて、約１．５μｍよりも小さい平均直径を有する粒子を含む微粉化された組成物を形成する。上記微粉化された組成物は次に、定量吸入器によって投与される場合に、１用量当たり約１０μｇ〜約５００μｇの本発明の結晶性シュウ酸塩を提供するために十分な量で、加圧された１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含む定量吸入器カートリッジに充填される。
【００７１】
有用性
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝−エチル）ピペリジン−４−イルエステルは、β２アドレナリン作動性受容体アゴニストおよびムスカリン性受容体アンタゴニストの両方の活性を有し、従って、本化合物のシュウ酸塩は、β２アドレナリン作動性受容体またはムスカリン性受容体によって媒介される医学的状態、すなわち、β２アドレナリン作動性受容体アゴニストまたはムスカリン性受容体アンタゴニストでの処置によって改善される医学的状態を処置するための治療剤として有用であることが予期される。
【００７２】
そのような医学的状態は、例えば、Ｅｇｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｕｂｔｙｐｅｓ：Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｕｅｔｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＤＮ＆Ｐ  １０（８），４６２−４６９（１９９７）；Ｅｍｉｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｂｅｔａ−Ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍ．，５３（６），３８９−４０４（１９９８）；およびそこに引用される参考文献の教示によって例示されるように当該分野において公知である。例えば、そのような医学的状態としては、例示として、可逆的な気道閉塞に関連する肺の障害または疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気管支炎、気腫、肺の線維症など）が挙げられる。慢性閉塞性肺疾患、すなわちＣＯＰＤは、Ｂａｒｎｅｓ，Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２０００：３４３：２６９−７８、およびそこに引用される参考文献の教示によって例示されるように、多様な呼吸状態（慢性閉塞性気管支炎および気腫が挙げられる）を含むことが、当該分野において公知である。他の状態としては、早産、うつ病、うっ血性心不全、皮膚疾患（例えば、炎症性、アレルギー性、乾癬性、および増殖性の皮膚疾患）、消化の酸性度を下げることが望ましい状態（例えば、消化性潰瘍化および胃潰瘍化）、および筋肉消耗性疾患（ｍｕｓｃｌｅ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）が挙げられる。
【００７３】
１つの局面において、本発明は、治療において使用するための、本発明の結晶性シュウ酸塩を提供する。例えば、本発明の結晶性シュウ酸塩は、肺の障害（例えば、慢性閉塞性肺疾患、または喘息）を処置するために使用され得る。
【００７４】
本発明の結晶性シュウ酸塩は、肺の障害を処置するために使用される場合、処置を必要とする患者に投与される。１つの実施形態において、上記結晶性シュウ酸塩は、吸入によって投与される。本発明の結晶性シュウ酸塩は、１日当たり複数用量（例えば、１日２回または１日３回）、１日当たり１用量（例えば、毎日）、１週間当たり単一用量、または必要とされる通りに投与され得る。一般に、肺の障害を処置するための用量は、約１０μｇ／日〜約１，０００μｇ／日の範囲に及ぶ。
【００７５】
本発明の結晶性シュウ酸塩は、吸入によって哺乳動物に投与される場合、代表的に、気管支拡張をもたらし、従って、本発明の結晶性シュウ酸塩は、哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、モルモット、ラットなど）において気管支拡張をもたらすための剤として有用である。この実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、代表的に、気管支拡張をもたらす量で、吸入によって哺乳動物に投与される。一般に、気管支拡張をもたらすための用量は、約０．２５μｇ／ｋｇ〜約２０μｇ／ｋｇの範囲に及ぶ。
【００７６】
本発明の結晶性シュウ酸塩は、治療剤として用いられる場合、必要に応じて、１つまたはそれより多くの他の治療剤と組み合わせて投与される。特に、本発明の結晶性シュウ酸塩をステロイド性抗炎症剤とともに投与することによって、三重の肺の治療、すなわち、β２アドレナリン作動性受容体アゴニスト活性、ムスカリン性受容体アンタゴニスト活性、および抗炎症性活性が、たった２つの治療剤を用いて達成され得る。２つの治療剤を含む薬学的組成物（および組み合わせ物）は、代表的に、３つの治療剤を含む組成物と比較して、製剤化することおよび／または投与することがより容易であるので、そのような２つの構成要素の組成物は、３つの治療剤を含む組成物よりも著しい利点を提供する。従って、特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物、組み合わせ物、および方法は、ステロイド性抗炎症剤またはその薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物をさらに含む。
【００７７】
本発明の結晶性シュウ酸塩の特性および有用性は、当業者に公知である種々のインビトロおよびインビボでのアッセイを用いて実証され得る。例えば、代表的なアッセイは、以下の実施例において記載される。
【実施例】
【００７８】
実施例
以下の実施例を本発明の種々の代表的な実施形態および局面を例示するために提供し、具体的に示されない限り、あらゆる様式において本発明の範囲を限定することは意図されない。
【００７９】
以下の実施例において使用される全ての試薬、出発物質、および溶媒を商業的供給業者（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、別段示されない限り、さらなる精製なしで使用した。以下の略語を希釈剤に使用する。：ＤＣＭ＝ジクロロメタン；ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド；ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル；ＭｅＯＨ＝メタノール；およびＴＨＦ＝テトラヒドロフラン。
【００８０】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、別段示されない限り、４００ＭＨｚ  Ｖａｒｉａｎ  ＡＳ４００スペクトロメーターにおいて記録した。化学シフトを、内部標準としてのテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対して、ｐｐｍでのδ値として報告する。結合定数（Ｊ値）をヘルツ（Ｈｚ）で示し、多重度を以下の略語を用いて報告する：ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｍ＝多重線、ｂｒ＝ブロード、ｎｄ＝決定されない。
【００８１】
液体クロマトグラフィー質量分光法（ＬＣ−ＭＳ）条件
Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｇ１３１２Ａ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｐｕｍｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＺＯＲＢＡＸ  Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ３．５μｍ  Ｒｘ、Ｂｏｎｕｓ−ＲＰカラム（３．５μｍの粒径；２．１ｍｍ×５０ｍｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＡＰＩ  １５０ＥＸ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＬＣ／ＭＳ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｃｉｅｘ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、ＬＣ−ＭＳデータを得た。使用した溶媒系は：
溶媒Ａ：９８％の水および２％のアセトニトリル（ｖ／ｖ）＋１ｍＬ／ＬのＴＦＡ
溶媒Ｂ：９０％のアセトニトリルおよび１０％の水（ｖ／ｖ）＋１ｍＬ／ＬのＴＦＡ
流速：５００μＬ／分
勾配：（方法１０−９０）：３分間にわたって１０％のＢから９０％のＢ
（方法２−９０）：３分間にわたって２％のＢから９０％のＢ
（方法１０−７０）：３分間にわたって１０％のＢから７０％のＢ
であった。
【００８２】
ＨＰＬＣ条件
ＨＰ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＺＯＲＢＡＸ  Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ３．５μｍ  Ｒｘ、Ｂｏｎｕｓ−ＲＰカラム（３．５μｍの粒径；２．１ｍｍ×５０ｍｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、またはＡｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８  ＨＰＬＣカラム（２．７μｍの粒径、３．０ｍｍ×３ｃｍ）を用いて、ＨＰＬＣを行った。使用した溶媒系は：
溶媒Ａ：９８％の水および２％のアセトニトリル（ｖ／ｖ）＋１ｍＬ／ＬのＴＦＡ
溶媒Ｂ：９０％アセトニトリルおよび１０％の水（ｖ／ｖ）＋１ｍＬ／ＬのＴＦＡ
流速：５００μＬ／分
勾配：（方法１０−５０）：６分間にわたって１０％のＢから５０％のＢ
（方法１０−７０）：６分間にわたって１０％のＢから７０％のＢ
（方法２−９０）：６分間にわたって２％のＢから９０％のＢ
であった。
【００８３】
実施例１
３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオン酸の調製
ＤＣＭ（５００ｍＬ）中、ビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステル（５０．０ｇ、１６８．７ｍｍｏｌ）（例えば、２００６年２月１６日に公開された米国特許公開第２００６／００３５９３１  Ａ１号を参照のこと）およびアクリル酸（１５．１ｍＬ、２１９．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液を５０℃で一晩加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物をＭｅＯＨ（６００ｍＬ）中に溶解させた。得られた溶液を７５℃で２時間加熱し、その後、室温で約４８時間静置させた。得られた固体を濾過によって収集し、ＭｅＯＨで洗浄し、乾燥させて表題化合物（６１．５ｇ、９９％の収率）を得た。
【００８４】
実施例２
メチル５−メチルアミノペンタノエート塩酸塩の調製
水酸化ナトリウム水溶液（４Ｍ、１１．０ｍＬ、４４．０ｍｍｏｌ）中の１−メチル−２−ピペリジノン（４．４０ｍＬ、４０．０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液を１００℃で１５時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、その後、濃塩酸でｐＨ２に酸性化した。上記混合物を次に、減圧下で濃縮して、桃色がかった白色固体として粗製５−メチルアミノペンタン酸を得た。粗製５−メチルアミノペンタン酸にＭｅＯＨ（４０．０ｍＬ、９８７ｍｍｏｌ）および濃塩酸（０．３３ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた濁った溶液を６０℃で３９時間加熱し、その時点でＬＣ−ＭＳは、残りの出発物質を示した。さらなる濃塩酸（０．３３ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を６０℃で３３時間加熱し、その後、６５℃でさらに２４時間加熱した。ＬＣ−ＭＳは、残りの出発物質を示した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＭｅＯＨ中の塩化水素の溶液（１．２５Ｍ）を残留物に加えた。得られた混合物を６０℃で７２時間加熱し、その時点で残りの出発物質は、ＬＣ−ＭＳによって観測されなかった。反応混合物を減圧下で部分的に濃縮し、形成された固体物質を濾過によって除去し、ＭｅＯＨで洗浄した。濾液を次に、減圧下で濃縮して、メチル５−メチルアミノペンタノエート塩酸塩（７．５７ｇ、１００％の収率）を薄黄色固体として提供した。
ＬＣ−ＭＳ（方法２−９０）：保持時間１．１０分；  ｍ／ｚ  １４６．４  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋．    １Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）  δ  ４．８６（ｓ），  ３．６６（ｓ），  ３．３０（ｔ），  ３．００（ｔ），  ２．６９（ｓ），  ２．４１（ｔ），  １．７１（ｍ）。
【００８５】
実施例３
５−（｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオニル｝メチルアミノ）ペンタン酸メチルエステルの調製
ＤＣＭ（１６０ｍＬ）中、メチル５−メチルアミノペンタノエート塩酸塩（７．２７ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）、３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオン酸（１３．３ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（５．１４ｇ、３７．８ｍｍｏｌ）と、２，６−ルチジン（１２．５ｍＬ、１０８ｍｍｏｌ）との混合物を室温で３時間撹拌した。Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（１０．４ｇ、５４．０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（約１００ｍＬ）を加え、層を分離した。水層をＤＣＭ（５０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中３０％〜１００％のＥｔＯＡｃ；次にＤＣＭ中２％〜１０％のＭｅＯＨ）によって精製して、表題化合物（１２．３８ｇ、６９％の収率）を薄黄色の粘稠な油状物／白色固体として得た。
ＬＣ−ＭＳ（方法２−９０）：保持時間２．４３分；  ｍ／ｚ  ４９６．６  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋．    １Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ  ８．１０（ｄ，  １Ｈ），  ７．４０（ｍ，  ６Ｈ），  ７．２０（ｍ，  ２Ｈ），  ６．５８（ｓ，  １Ｈ），  ４．７４（ｍ，  １Ｈ），  ３．６６（ｄ，  ３Ｈ），  ３．３７（ｔ，  １Ｈ），  ３．２９（ｍ，  １Ｈ），  ２．９７（ｓ，  ２Ｈ），  ２．９１（ｓ，  １Ｈ），  ２．７０（ｍ，  ４Ｈ），  ２．４９（ｍ，  ２Ｈ），  ２．３４（ｍ，  ４Ｈ），  １．９２（ｍ，  ２Ｈ），  １．６０（ｍ，  ５Ｈ）。
【００８６】
実施例４
５−（｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオニル｝メチルアミノ）ペンタン酸の調製
５−（｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオニル｝−メチルアミノ）ペンタン酸メチルエステル（１０．２１ｇ、２０．６０ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（２０ｍＬ）、および水（２０ｍＬ）の混合物に、ＬｉＯＨ：水が１：１の混合物（１．９７ｇ、４１．２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で４時間撹拌し、次に上記混合物のｐＨを、塩酸水溶液（１Ｎ）を用いて約ｐＨ２に調整した。水層をＤＣＭ（２×約８０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物（１２．２３ｇ、定量的）をオフホワイトの泡状固体（残留ｔｅｒｔ−ブチルアルコールを含む）として得た。
ＬＣ−ＭＳ（方法２〜９０）：保持時間２．３２分；  ｍ／ｚ  ４８２．４  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋。
【００８７】
実施例５
２−（４−ニトロフェニル）−１，３−ジオキソランの調製
トルエン（８００ｍＬ）中、ｐ−ニトロベンズアルデヒド（１０１．５ｇ、６７２ｍｍｏｌ）、エチレングリコール（１１２ｍＬ）およびｐ−トルエンスルホン酸（１２．８ｇ、６７．２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを備えたフラスコにおいて、１２０℃で４時間加熱した。室温に冷却後、反応混合物を減圧下で濃縮した。残留物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（８００ｍＬ）を加え、この混合物を室温で１５分間撹拌した。得られた固体を濾過によって単離し、減圧下で乾燥させて表題化合物（１２１．８ｇ、９２％の収率）を黄色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ＝８．１２（ｄ，  ２Ｈ），  ７．５９（ｄ，  ２Ｈ），  ５．７８（ｓ，  １Ｈ），  ３．８−４．０（ｍ，  ４Ｈ）。
【００８８】
実施例６
４−（１，３−ジオキソラン−２−イル）フェニルアミンの調製
乾燥窒素下で、二酸化白金（２２７ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（４２０ｍｇ、５．００ｍｍｏｌ）との混合物に、ＥｔＯＨ（３０．０ｍＬ）中の２−（４−ニトロフェニル）−１，３−ジオキソラン（９７６ｍｇ、５．００ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を水素で１５分間バブリングし、次に水素雰囲気（バルーン）下で２時間撹拌した。反応混合物を次に、ＭｅＯＨで洗浄しながらＣｅｌｉｔｅのパッドを通して濾過した。濾液を減圧下で濃縮して、表題化合物（０．８０ｇ、９６％の収率）を得た。
【００８９】
実施例７
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−（１，３−ジオキソラン−２−イル）−フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの調製
ＤＣＭ（４８．４ｍＬ）中、５−（｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］−プロピオニル｝メチルアミノ）ペンタン酸（２．３３ｇ、４．８４ｍｍｏｌ）、４−（１，３−ジオキソラン−２−イル）フェニルアミン（８００ｍｇ、５ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．２６ｍＬ、７．２６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（６９２ｍｇ、５．０８ｍｍｏｌ）、およびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．３９ｇ、７．２６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を次に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物（３．０４ｇ、１００％の収率）を黄色固体として得た。
ＬＣ−ＭＳ（方法１０〜７０）：保持時間２．６７分；  ｍ／ｚ  ６２９．６  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋。
【００９０】
実施例８
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−ホルミルフェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの調製
塩酸水溶液（１Ｍ、１０ｍＬ）およびアセトニトリル（１０ｍＬ）中のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−（１，３−ジオキソラン−２−イル）フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（３．０４ｇ、４．８４ｍｍｏｌ）の撹拌混合物を５０℃で２時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液およびＤＣＭを残留物に加えた。層を分離し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物（２．８３ｇ、１００％の収率）を得た。
ＬＣ−ＭＳ（方法１０〜７０）：保持時間２．６７分；  ｍ／ｚ  ５８５．４  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋。
【００９１】
実施例９
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチル−シラニルオキシ）−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝−フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの調製
ＭｅＯＨ：ＤＣＭが１：１の混合物（４０．０ｍＬ、３１２ｍｍｏｌ）中、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−ホルミル−フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（２．８３ｇ、４．８４ｍｍｏｌ）、および５−［（Ｒ）−２−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−８−ヒドロキシ−１Ｈ−キノリン−２−オン酢酸塩（１．９１ｇ、４．８４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３．０８ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌し、次に層を分離した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して黄色固体を得た。上記固体をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％〜３０％のＭｅＯＨ＋０．５％のＮＨ４ＯＨ）によって精製して、表題化合物（３．６０ｇ、８２％の収率）を黄色固体として得た。
ＬＣ−ＭＳ（方法１０〜７０）：保持時間２．７２分；  ｍ／ｚ  ９０３．８  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋。
【００９２】
実施例１０
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）−ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルジトリフルオロ酢酸塩の調製
ＤＣＭ：ＤＭＦが９：１の混合物（３２．９ｍＬ）中、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］−メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（３．６０ｇ、３．９８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（１．９５ｍＬ、１２．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次に減圧下で濃縮した。残留物をＨＰＬＣ（方法１０〜７０）によって精製して、表題化合物（１．９０ｇ、４６％の収率）を白色固体として得た。
ＬＣ−ＭＳ（方法１０〜７０）：保持時間２．１２時間；  ｍ／ｚ  ７８９．６  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋。
【００９３】
実施例１１
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）−ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル二フッ化水素酸塩の調製
ＤＣＭ（２０ｍＬ）とＤＭＦ（２．５ｍＬ）との混合物中、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］−メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（３．８７ｇ、４．２８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（２．１ｍＬ、１３ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。ＤＣＭ（６８ｍＬ）を反応混合物に加え、次に、撹拌しながら、ＥｔＯＡｃ（６８ｍＬ）を滴下して加えた。薄い色の沈殿物が形成され、スラリーをもたらした。スラリー混合物を中程度の多孔度のフリット付き（ｆｒｉｔｔｅｄ）ガラスフィルターを通して濾過し、濾過ケークをＥｔＯＡｃ（２×１０ｍＬ）ですすぎ、次に、窒素プレスでプレス乾燥（ｐｒｅｓｓ  ｄｒｙ  ｏｎ  ａ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｐｒｅｓｓ）させて、表題化合物（３．７３ｇ、９９％の収率）を得た。
【００９４】
実施例１２
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）−ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの調製
ＭｅＯＨ中１０％の０．５Ｍの水酸化アンモニウムを含むＤＣＭ溶液（１５０ｍＬの合計溶液）中のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）−ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル二フッ化水素酸塩（１５．２ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）の溶液を、ＭｅＯＨ中１０％の０．５Ｍの水酸化アンモニウムを含むＤＣＭ溶液（２００ｍＬ）で前もって濡らされた粗いフリット付きガラス漏斗中のシリカゲル（８０ｇ）上に充填した。上記シリカゲルを、ＭｅＯＨ中２０％の０．５Ｍの水酸化アンモニウムを含むＤＣＭ溶液（１×１０００ｍＬ）ですすぎ；次にＭｅＯＨ中２５％の０．５Ｍの水酸化アンモニウムを含むＤＣＭ溶液（１×１０００ｍＬ）ですすいだ。濾液を減圧下で濃縮して黄色のガラス状固体（１３．６ｇ）を得た。この物質をＤＣＭ（６００ｍＬ）中に溶解させ、得られた溶液をフリット付きガラスフィルターを通して濾過し、フィルターをＤＣＭ（３×１５０ｍＬ）で洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、油浴を用いて残留物を５０℃に温め、高い減圧下に一晩保持して表題化合物（１２．７ｇ）（約６重量％のＤＣＭを含んだ）を提供した。
【００９５】
実施例１３
結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝−フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルシュウ酸塩水和物（Ｆｏｒｍ  ２）の調製
ＴＨＦ（５ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）中のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−キノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）−ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（０．５０ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＭｅＯＨ（２ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）中のシュウ酸二水和物（８０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。オフホワイトの沈殿物は、すぐに、および５分の期間にわたって形成され、固体が凝集して粘着性のボールを形成した。反応混合物を次に、６０℃で２時間加熱し、その時点において、上記混合物は、非常に細かい粒子のオフホワイトの粘稠なスラリーを形成していた。この混合物をゆっくりと室温に冷却し、次に約７２時間撹拌した。混合物を濾過する試みがなされたが、沈殿物のほとんどはフィルターを通り抜けた。濾液を次に、減圧下で濃縮して残留物を形成した。
【００９６】
約１／４の残留物を除去し、ＭｅＯＨ中１０％（ｖ／ｖ）の水の、熱い溶液中に溶解させた。この溶液を室温に冷却したが、沈殿物は形成されなかった。上記溶液を次に静置させ、４日の期間にわたってゆっくりと室温で蒸発させ、そのことにより、ある複屈折を示す粒子を生じた。時折、音波処理をしながら、撹拌を５日の期間にわたって続けて、より良好な複屈折を示す物質の白色スラリーを形成した。この物質を濾過によって収集し、高い減圧下で室温にて２時間乾燥させて、表題化合物を得た。ＰＸＲＤパターンは、この物質が結晶性または半結晶性であることを示した。
【００９７】
実施例１４
結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝−フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルシュウ酸塩水和物（Ｆｏｒｍ  ２）の調製
ＭｅＯＨ（１２．４ｍＬ）中、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−キノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］−メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（０．６５ｇ、０．８２４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、水（０．６ｍＬ）中のシュウ酸二水和物（１０４ｍｇ、０．８２４ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。わずかに粘着性の沈殿物がすぐに形成され、実施例１３からの種晶を加えた。得られたスラリーを室温で約７２時間撹拌し、次に５分間音波処理した。上記スラリーを次に、３０℃で一晩撹拌した。上記スラリーを次に、０℃に冷却し、３０分間撹拌し、濾過して沈殿物を収集した。濾過ケークを１時間空気乾燥させ、次に、高い減圧下で室温にて２時間乾燥させて、表題化合物（７０５ｍｇ、９６％の収率、＞９９％の純度）を得た。
実施例１５
高い相対湿度へのＦｏｒｍ  ２の曝露
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝−エチル）ピペリジン−４−イルエステルシュウ酸塩水和物（約１００ｍｇ；実施例１４から）を、ペトリ皿に置かれたフィルターペーパー上に広げた。上記ペトリ皿を、デシケーター内の、飽和塩化カリウム水溶液（１００ｍＬ）より上の有孔プレートの上に置き、デシケーターをしっかりと密閉した。チャンバー内の相対湿度は、湿度計によって測定する場合に約８４％ＲＨのままであった。３日後、固体をデシケーターから取り出した。この物質についてのＰＸＲＤ、ＤＳＣ、ＴＧＡ、ＤＭＳのプロットを、それぞれ図４、５、６、および７に示す。
【００９８】
実施例１６
結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝−フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルシュウ酸塩水和物（Ｆｏｒｍ  ２）の調製
ＭｅＯＨ（１９ｍＬ）中、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−キノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）−ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（１．０ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、水（１．０ｍＬ）中のシュウ酸二水和物（１６０ｍｇ、１．２６９ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。粘着性の黄色がかった沈殿物がすぐに形成された。反応混合物を４０℃で一晩加熱し、次に５分間音波処理した。反応混合物を次に、４０℃で１８時間加熱し、０℃に冷却し、沈殿物を濾過によって収集した。沈殿物を乾燥させて表題化合物（１．０５ｇ、９３％の収率、＞９９％の純度）を得た。
【００９９】
実施例１７
高い相対湿度へのＦｏｒｍ  ２の曝露
塩化カリウムの過飽和水溶液をデシケーターの底部で調製した（固体のＫＣｌは、長くはげしい撹拌後に残った）。秤量紙において、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルシュウ酸塩水和物（５００ｍｇ、０．５６９ｍｍｏｌ；実施例１６から）を広げ、上記秤量紙を、デシケーター内の、ＫＣｌ溶液の上にある有孔プラスチックプレート上に置き、デシケーターを閉めた。ＫＣｌ溶液の平衡蒸気圧に起因して、デシケーター内の相対湿度を８４％ＲＨに維持した。３日後、５日後、および１０日後にシュウ酸塩の一部におけるＰＸＲＤパターンを得た。ＰＸＲＤパターンは、５日に至るまでシュウ酸塩の結晶性が向上することを示した。結晶性における変化は、５日間と１０日間との間でわずかだった。
【０１００】
実施例１８
結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝−フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルシュウ酸塩水和物（Ｆｏｒｍ  ２）の調製
ＭｅＯＨ（４００ｍＬ）中、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−キノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）−ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（１１．０ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、水（２２ｍＬ）中のシュウ酸二水和物（１．７５８ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。粘着性の沈殿物がすぐに形成された。反応混合物を室温で一晩撹拌し、次に５分間音波処理した。反応混合物を次に、室温で４８時間撹拌し、次に４０℃で８時間加熱した。反応混合物をゆっくり周囲温度に冷却し、次に３０℃で約７２時間加熱した。沈殿物を濾過によって収集し、ＭｅＯＨ（１×５０ｍＬ）で洗浄し、高い減圧下で一晩乾燥させて表題化合物（１１．６ｇ、９４％の収率、＞９９％の純度）を得た。
【０１０１】
実施例１９
結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝−フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルシュウ酸塩イソプロパノール溶媒和物（Ｆｏｒｍ  １）の調製
結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］−メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルシュウ酸塩水和物（約４０ｍｇ）を、イソプロパノール中５％（ｖ／ｖ）の水の溶液（４ｍＬ）中に懸濁し、得られたスラリーを２００ｒｐｍで室温にて撹拌した。３日後、上記スラリーを吸引濾過によって濾過し、固体を空気中で乾燥させて表題化合物（３６ｍｇ）を得た。
【０１０２】
この物質についてのＰＸＲＤ、ＤＳＣ、およびＴＧＡスペクトルを、それぞれ図１、２、および３に示す。
【０１０３】
実施例２０
粉末Ｘ線回折
Ｒｉｇａｋｕ  ＭｉｎｉＦｌｅｘ  Ｘ線回折計を用いて、粉末Ｘ線回折分析を実施した。Ｘ線源は、２０ｋＶの出力電圧および１５ｍＡの電流を有するＣｕ−Ｋα放射線（λ＝１．５４０５１  Å）であった。サンプルにおける強度を最大にするように設定された入射スリット、発散スリット、および散乱スリットを有するＢｒａｇｇ−Ｂｒｅｎｔａｎｏ幾何学配置において、機器を作動した。測定について、少量の粉末（５ｍｇ〜２５ｍｇ）を単結晶シリコンサンプルホルダー上で穏やかにプレスして、滑らかな表面を形成し、Ｘ線曝露に供した。上記サンプルを２θ−２θモードで、１分間当たり０．０３°のステップサイズおよび２．０°の走査スピードで、２θにおいて２°〜４０°で走査した。データ収集をＲｉｇａｋｕ  Ｓｔａｎｄａｒｄ測定ソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２．０．０）によって制御し、Ｊａｄｅソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．５．１）によって分析した。
【０１０４】
Ｆｏｒｍ  １およびＦｏｒｍ  ２についての代表的な生の未処理ＰＸＲＤパターンを、それぞれ図１および図４に示す。Ｆｏｒｍ  １およびＦｏｒｍ  ２について、観測されたＰＸＲＤ  ２−θピーク位置およびｄ−間隔を、それぞれ表１および２に示す（約２０％以上の相対ピーク高（Ｈ％）を有するピークのみを列挙する）。
【０１０５】
【表１】
2013538857.tif 000004
【０１０６】
【表２】
2013538857.tif 000005
実施例２１
示差走査熱分析
Ｔｈｅｒｍａｌ  Ａｎａｌｙｓｔコントローラーを備えたＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｑ−１００モジュールを用いて、示差走査熱分析（ＤＳＣ）を実施した。データを収集し、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェアを用いて分析した。約２ｍｇのサンプルを正確に計量し、ふた付きのアルミニウムパンに入れた。周囲温度から約３００℃まで１０℃／分の線形加熱傾斜（ｌｉｎｅａｒ  ｈｅａｔｉｎｇ  ｒａｍｐ）を用いて、上記サンプルを評価した。使用中、ＤＳＣセルを乾燥窒素でパージした。Ｆｏｒｍ  １およびＦｏｒｍ  ２についての代表的なＤＳＣトレースを、それぞれ図２および図５に示す。
【０１０７】
上記ＤＳＣトレースにより、Ｆｏｒｍ  １およびＦｏｒｍ  ２が約１６２℃〜１６４℃の範囲での融点を有して、優れた熱安定性を有することが実証される。
【０１０８】
実施例２２
熱重量分析
高分解能を備えたＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｑ−５００モジュールを用いて熱重量分析（ＴＧＡ）を実施した。データを収集し、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェアを用いて分析した。約１０ｍｇの重さのサンプルを白金パンの上に置き、周囲温度から３００℃まで高分解な加熱速度で走査した。使用中、てんびんチャンバーおよび炉チャンバーを窒素流でパージした。Ｆｏｒｍ  １およびＦｏｒｍ  ２についての代表的なＴＧＡトレースを、それぞれ図３および図６に示す。
【０１０９】
実施例２３
動的水分収着判定
Ｆｏｒｍ  ２のサンプルについて、動的水分収着（ＤＭＳ）判定（水分収着−脱着プロフィールとしても公知である）を、ＶＴＩ大気下微量てんびん（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）、ＳＧＡ−１００システム（ＶＴＩ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ  ３３０１６）を用いて実施した。約１０ｍｇのサンプルサイズを使用し、分析の開始時に湿度を周囲の値に設定した。代表的なＤＭＳ分析は、３つの走査からなった：５％相対湿度（ＲＨ）／ステップの走査速度で、周囲から５％ＲＨ、５％ＲＨから９０％ＲＨ、９０％ＲＨから５％ＲＨ。質量を、２分毎に測定し、サンプルの質量が５つの連続した点について０．０１％以内に安定している場合、ＲＨを次の値（＋／−５％ＲＨ）に変更した。Ｆｏｒｍ  ２についての代表的なＤＭＳトレースを図７に示す。
【０１１０】
図７のＤＭＳトレースにより、Ｆｏｒｍ  ２が５％ＲＨ〜９０％ＲＨの湿度範囲において約１．６重量％というほんのわずかな重量増を有したことが実証される。可逆的水分収着／脱着プロフィールにより、Ｆｏｒｍ  ２が受容可能な吸湿性を有し、潮解性でないことが実証される。上記塩のＰＸＲＤプロフィールは、ＤＭＳの実験前および実験後で同様であり、このことは、水分収着および水分脱着のプロセスの間に物理的形態の変化が起こらなかったことを示唆した。
【０１１１】
生物学的アッセイおよび調製
実施例Ａ
ヒトＭ１、Ｍ２、Ｍ３、およびＭ４ムスカリン性受容体を発現する細胞からの細胞培養および膜調製
それぞれクローン化ヒトｈＭ１、ｈＭ２、ｈＭ３、およびｈＭ４ムスカリン性受容体サブタイプを安定に発現するＣＨＯ細胞系を、１０％のＦＢＳおよび２５０μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎを補ったＨａｍｓ  Ｆ−１２培地において、コンフルエントに近い状態（ｎｅａｒ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）まで増殖させた。上記細胞を、５％のＣＯ２、３７℃のインキュベーターにおいて増殖させ、ｄＰＢＳ中２ｍＭのＥＤＴＡで取り上げた（ｌｉｆｔｅｄ）。細胞を６５０×ｇでの５分間の遠心分離によって収集し、細胞ペレットを−８０℃で冷凍保存するか、または膜を、使用のためにすぐに調製した。
【０１１２】
膜調製物について、細胞ペレットを溶解バッファーに再懸濁し、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ−２１００組織破壊機（ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＡＧ；２０秒×２バースト（ｂｕｒｓｔ））で均質化した。粗製膜を、４℃にて４０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。膜ペレットを次に、再懸濁バッファーで再懸濁し、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織破壊機で再度均質化した。
【０１１３】
膜懸濁物のタンパク質濃度を、Ｌｏｗｒｙら、１９５１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９３，２６５に記載される方法によって決定した。全ての膜を、アリコートで−８０℃にて凍結保存するか、またはすぐに使用した。
【０１１４】
調製されたｈＭ５受容体膜のアリコートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）から購入し、使用まで−８０℃で保存した。
【０１１５】
実施例Ｂ
ムスカリン性受容体についての放射リガンド結合アッセイ
クローン化ムスカリン性受容体についての放射リガンド結合アッセイを、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、１００μＬの合計アッセイ体積で実施した。ｈＭ１、ｈＭ２、ｈＭ３、ｈＭ４、またはｈＭ５ムスカリン性サブタイプのいずれかを安定に発現するＣＨＯ細胞膜を、以下の特定の標的タンパク質濃度（μｇ／ウェル）（ｈＭ１については１０μｇ、ｈＭ２については１０μｇ〜１５μｇ、ｈＭ３については１０μｇ〜２０μｇ、ｈＭ４については１０μｇ〜２０μｇ、およびｈＭ５については１０μｇ〜１２μｇ）に、アッセイバッファー中に希釈して同様のシグナル（ｃｐｍ）を得た。アッセイプレートの添加前に、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織破壊機を用いて上記膜を短時間均質化した（１０秒間）。
【０１１６】
Ｌ−［Ｎ−メチル−３Ｈ］スコポラミンメチルクロリド（［３Ｈ］−ＮＭＳ）（ＴＲＫ６６６，８４．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を０．００１ｎＭ〜２０ｎＭの範囲に及ぶ濃度で用いて、放射リガンドのＫＤ値を決定するための飽和結合研究を実施した。
【０１１７】
試験化合物のＫｉ値の決定のための置換アッセイを、１ｎＭでの［３Ｈ］−ＮＭＳおよび１１個の異なる試験化合物の濃度を用いて実施した。上記試験化合物を最初に、希釈バッファー中４００μＭの濃度へ溶解させて、次に希釈バッファーを用いて１０ｐＭ〜１００μＭの範囲に及ぶ最終濃度まで５倍連続希釈にした。添加の順序およびアッセイプレートに添加された体積は、以下の通りであった：２５μＬの放射リガンド、２５μＬの希釈した試験化合物、および５０μＬの膜。アッセイプレートを３７℃で６時間インキュベートした。結合反応を、１％のＢＳＡにおいて前もって処理されたＧＦ／Ｂガラス繊維フィルタープレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）を通して急速濾過によって終結させた。フィルタープレートを洗浄バッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ）で３回すすいで、未結合の放射能を除去した。上記プレートを次に、空気乾燥させ、５０μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０液体シンチレーション流体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）を各ウェルに加えた。上記プレートを次に、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）においてカウントした。
【０１１８】
結合データを、１部位競合モデルを用い、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて非線形回帰分析によって分析した。試験化合物についてのＫｉ値を、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（Ｃｈｅｎｇ  Ｙ；Ｐｒｕｓｏｆｆ  ＷＨ．（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２２（２３）：３０９９−１０８）を用いて、放射リガンドの、観測されたＩＣ５０値およびＫＤ値から計算した。Ｋｉ値をｐＫｉ値に変換して、相乗平均および９５％信頼区間を決定した。これらの概要的な統計を次に、データ報告のためにＫｉ値に変換し直した。
【０１１９】
このアッセイにおいて、より低いＫｉ値は、受容体について試験化合物がより高い結合親和性を有することを意味する。このアッセイにおいて、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］−メチル｝フェニルカルバモイル）−ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルジトリフルオロ酢酸塩は、０．１ｎＭ（データを最も近い０．１ｎＭに丸めた）のｈＭ３においてＫｉ値を有した。
【０１２０】
実施例Ｃ
ヒトβ１、β２、またはβ３アドレナリン作動性受容体を発現する細胞からの細胞培養および膜調製
クローン化ヒトβ１およびβ２アドレナリン作動性受容体を安定に発現するヒト胚性腎（ＨＥＫ−２９３）細胞系またはクローン化ヒトβ３アドレナリン作動性受容体を安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系を、５００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎの存在下で、１０％のＦＢＳを補った、ＤＭＥＭまたはＨａｍｓ  Ｆ−１２培地において、コンフルエントに近い状態まで増殖させた。細胞単層をＰＢＳ中２ｍＭのＥＤＴＡで取り上げた。細胞を１，０００ｒｐｍでの遠心分離によってペレットにし、細胞ペレットを−８０℃で冷凍保存するか、または膜を、使用のためにすぐに調製した。
【０１２１】
β１およびβ２受容体を発現する膜の調製について、細胞ペレットを溶解バッファー（４℃にて、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、氷上で、ぴったり合う（ｔｉｇｈｔ−ｆｉｔｔｉｎｇ）Ｄｏｕｎｃｅ型ガラスホモジェナイザー（３０ストローク）を用いて均質化した。
【０１２２】
よりプロテアーゼ感受性のβ３受容体を発現する膜について、５０ｍＬのバッファー当たり「２ｍＭのＥＤＴＡを有するＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｔａｂｌｅｔ」（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）（１錠）を補った溶解バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４）において、細胞ペレットを均質化した。ホモジェネートを２０，０００×ｇで遠心分離し、得られたペレットを、本明細書中に記載される通りに再懸濁および遠心分離することによって、溶解バッファーで１回洗浄した。最終ペレットを次に、氷冷結合アッセイバッファー（７５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁した。
【０１２３】
膜懸濁物のタンパク質濃度を、Ｌｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９５１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９３，２６５；およびＢｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７６，７２，２４８−５４に記載される方法によって決定した。全ての膜をアリコートで−８０℃にて凍結保存するか、またはすぐに使用した。
【０１２４】
実施例Ｄ
アドレナリン作動性受容体アゴニストの効力を決定するためのアッセイ
製造者の指示に従って、［１２５Ｉ］−ｃＡＭＰ（ＮＥＮ  ＳＭＰ００４，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用い、Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、放射線免疫アッセイフォーマットでｃＡＭＰアッセイを実施した。このアッセイについて、クローン化ヒトβ１またはβ２受容体を安定に発現するＨＥＫ−２９３細胞系を、１０％のＦＢＳおよびＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（５００μｇ／ｍＬ）を補ったＤＭＥＭにおいて、コンフルエントに近い状態まで増殖させるか；またはクローン化ヒトβ３アドレナリン作動性受容体を安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞系を、１０％のＦＢＳおよびＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（２５０μｇ／ｍＬ）を補ったＨａｍｓ  Ｆ−１２培地において、コンフルエントに近い状態まで増殖させた。細胞をＰＢＳですすぎ、２ｍＭのＥＤＴＡまたはＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％のトリプシン／０．５３ｍＭのＥＤＴＡ）を含むｄＰＢＳ（ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２なしのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）中で取り外した。Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞カウンターにおいて細胞をカウントした後、細胞を１，０００ｒｐｍでの遠心分離によってペレットにし、前もって室温に温められたＩＢＭＸを含む刺激バッファー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｋｉｔ）中に再懸濁して１．６×１０６細胞／ｍＬ〜２．８×１０６細胞／ｍＬの濃度にした。１ウェル当たり、約４０，０００細胞〜約８０，０００細胞をこのアッセイに使用した。試験化合物（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ−２０００において、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳに希釈し、１００μＭ〜１ｐＭの範囲に及ぶ１１個の異なる濃度において試験した。反応物を、３７℃で１０分間インキュベートし、［１２５Ｉ］−ｃＡＭＰ（ＮＥＮ  ＳＭＰ００４，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を含む冷検出バッファー（１００μＬ）を加えることによって止めた。生成されたｃＡＭＰの量（ｐｍｏｌ／ウェル）を、製造者の使用者マニュアルに記載される通りに、サンプルについて観測されたカウントおよびｃＡＭＰ標準に基づいて計算した。
【０１２５】
シグモイド式（ｓｉｇｍｏｉｄａｌ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）を用い、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、非線形回帰分析によってデータを分析した。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（Ｃｈｅｎｇ  Ｙ，ａｎｄ  Ｐｒｕｓｏｆｆ  ＷＨ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９７３，２２，２３，３０９９−１０８）を使用してＥＣ５０値を計算した。
【０１２６】
このアッセイにおいて、より低いＥＣ５０値は、試験した受容体において試験化合物がより高い機能的活性を有することを意味する。このアッセイにおいて、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］−メチル｝フェニルカルバモイル）−ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルジトリフルオロ酢酸塩は、１ｎＭ（データを最も近い１ｎＭに丸めた）のｈβ２においてＥＣ５０値を有した。
【０１２７】
実施例Ｅ
アイントホーフェンアッセイ
このアッセイは、ラットにおいて、メタコリン（ＭＣｈ）により誘導された気管支収縮に対して気管支保護を提供する試験化合物の能力を測定する。
【０１２８】
２００ｇと３５０ｇとの間の体重のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、全ての研究に使用した。
【０１２９】
試験化合物またはビヒクル（滅菌脱イオン水）を、５ｍＬの投薬溶液を用いて、パイ型（ｐｉｅ  ｓｈａｐｅｄ）吸入チャンバー（Ｒ＋Ｓ  Ｍｏｌｄｓ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）において、吸入（ＩＨ）によって１０分の期間にわたって投薬した。ラットを、２２ｐｓｉの圧力下でＢｉｏｂｌｅｎｄ（５％のＣＯ２／９５％の大気）によって駆動されたＬＣ  Ｓｔａｒ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  Ｓｅｔ  Ｍｏｄｅｌ  ２２Ｆ５１（ＰＡＲＩ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．Ｍｉｄｌｏｔｈｉａｎ，ＶＡ）から生じたエアゾールに曝した。別段示されない限り、１００μｇの試験化合物をラットに投薬した。
【０１３０】
所定の時点において、１２０ｍｇ／ｋｇのイナクチン（チオブタバルビタール）の腹腔内（ＩＰ）注射でラットに麻酔をかけた。動物が身体的刺激（例えば、趾をつまむ（ｔｏｅ  ｐｉｎｃｈ））に反応する場合、補充用量（４０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）を投与した。手術部位を剃り、首の腹面側の、１ｃｍ〜２ｃｍの正中切開を行った。頸静脈を分離し、食塩水が充填されたポリエチレンカテーテル（ＰＥ−５０）を挿入して（ｃａｎｎｕｌａｔｅｄ）ＭＣｈのＩＶ注入を可能にした。気管を切開して自由にし（ｄｉｓｓｅｃｔｅｄ  ｆｒｅｅ）、１４Ｇ針（＃ＮＥ−０１４，Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｓ，Ｍｉａｍｉ  Ｌａｋｅｓ，ＦＬ）を挿入した。気管のカニューレの配置後、１ｍＬ／１００ｇの体重の一回拍出量（しかし、２．５ｍＬの体積を超えない）、および１分間に９０回の脈拍の速度に設定したレスピレータ（Ｍｏｄｅｌ  ６８３，Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｉｎｃ．，ＭＡ）を用いて各ラットに換気を行わせた。Ｔ−コネクターを、レスピレータ呼気チューブに沿って置いて、Ｂｉｏｐａｃ（ＴＳＤ  １３７Ｃ）前置増幅器に接続されたＢｉｏｐａｃ変換器を用いて換気圧（ＶＰ）の変化の測定を可能にした。体温を、加熱パッドを用いて３７℃に維持した。
【０１３１】
Ａｃｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｄａｔａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いて、ＶＰの変化を記録した。ベースラインの値を少なくとも２．５分間収集した。次にラットを４０μｇ／ｋｇおよび８０μｇ／ｋｇのＭＣｈの非累積静脈内（ＩＶ）注入により調べた。ＭＣｈを、シリンジポンプ（ｓｐ２１０ｉｗ，Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）から２ｍＬ／ｋｇ／分の速度で、２用量のＭＣｈの間で２分の間隔をあけて、２．５分間静脈内に注入した。対照動物と比較して、処置動物における通気圧（ｃｍ  Ｈ２Ｏ）の変化をＭＣｈ応答の阻害％として表した。
【０１３２】
このアッセイにおいて、他の気管支収縮剤（例えば、ヒスタミンおよびアセチルコリン）を、ＭＣｈの代わりに使用し得る。さらに、ラットの代わりにモルモットを使用し得る。
【０１３３】
このアッセイにおいて、ＭＣｈ応答のより高い阻害％は、試験化合物がより大きな気管支保護効果を提供したことを示す。２４時間において、３０％よりも大きい阻害または３０％と等しい阻害は、作用の長い持続を示すものである。このアッセイにおいて、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−｛［（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−５−イル）エチルアミノ］−メチル｝フェニルカルバモイル）ブチル］メチルカルバモイル｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルジトリフルオロ酢酸塩は、２４時間において少なくとも約４０％の阻害を提供した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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