(57)【要約】  本明細書は、例えば、薬物スクリーニング、オーダーメイド医療、再生医療、創傷治癒、及び他の適用のための、三次元バイオアッセイとして使用できるマイクロ流体デバイスを提供する。デバイスは、小さいポリマーブロック内に一連のチャネル（例えば、小さい流体チャネル）を有し、１つ又はそれ以上のチャネルは、ポストによって適所に保持されている、コラーゲンなどの生体関連ゲルで充填することができる。本明細書に示されるように、デバイスが、内皮細胞などの細胞で覆われると、細胞が三次元で成長するのに充分な厚さであるゲル内で新たな血管が成長する。例えば、流体チャネルなどの他のチャネルは、薬物又は生体材料が三次元細胞成長にさらされることを可能にする。内皮細胞などの細胞を培養でき、それらが三次元ゲル足場の表面で成長するのを観察でき、ここでは、例えば、血管新生の速度、更にはガン細胞の細胞間血管新生及び細胞外血管新生の速度も測定できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学的に透明な材料からなる基材を備え、さらに
ｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル、
ｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル入口、
ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル出口、
ｉｖ）１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、及び
ｖ）複数のポスト
を備えるマイクロ流体デバイスであって、
各ゲルケージ領域の全部又は一部は、１つ又はそれ以上の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それにより１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域を作り出し；及び
各ゲルケージ領域は、ゲルケージ領域を形成する少なくとも１列のポストを備える、マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
各ポストが、三角形、台形、又はそれらの組み合わせを形成する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
三角形が二等辺三角形を形成し、台形が二等辺台形を形成する、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
各ゲルケージ領域がゲルチャネルを形成し、各ゲルチャネルが２つの平行なポストの列を備え、ここでポストの各列が各ゲルチャネルの長さに沿い、一方の列がゲルチャネルの一方側に沿い、他方の列がゲルチャネルの反対側に沿い、それにより各ゲルチャネルの各長さに沿ってゲルケージ領域を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
各ゲルチャネルの全部又は一部が、１つ又はそれ以上の流体チャネルの全部又は一部と平行である、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
ポストの各列に沿ったポスト間の距離が、ゲルケージ領域−流体チャネルの界面において、ゲルケージ領域内のポスト間の距離よりも近い、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
光学的に透明な材料が、ポリマー、プラスチック、又はガラスである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
ポリマーが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ＳＵ−８、環式オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）である、請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
１つ又はそれ以上のゲルケージ領域が、生体関連ゲルを備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
生体関連ゲルが、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、フィブロネクチン、又はヒアルロナンである、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１１】
ゲルがさらに、細胞、組織、又はそれらの組み合わせを備える、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
細胞が、ガン細胞、ニューロン、内皮細胞、平滑筋細胞、幹細胞、上皮細胞、又はそれらの組み合わせである、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
各ゲルケージ領域の長さが、約１０マイクロメートル〜約１００，０００マイクロメートルである、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１４】
１つ又はそれ以上の流体チャネルが細胞物質を備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１５】
細胞物質が、細胞、細胞培養培地、組織、成長因子、薬物、又はそれらの組み合わせである、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
細胞が、ガン細胞、ニューロン、内皮細胞、平滑筋細胞、幹細胞、上皮細胞、又はそれらの組み合わせである、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
組織が個体由来の組織生検試料である、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１８】
薬物が、転移抑制剤、血管新生抑制剤、血管新生促進剤、化学誘引性物質、化学忌避性物質、又はそれらの組み合わせである、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１９】
平行なポストの列における各ポスト間の距離が、約５マイクロメートル〜約３００マイクロメートルである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２０】
各ポストが、約５０マイクロメートル〜約５００マイクロメートルの幅である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２１】
各ポストが、約０．０１ｍｍ〜約１ｍｍの高さである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２２】
各ポストが、約０．１ｍｍの幅、約０．１ｍｍの長さ、そして約０．２５ｍｍの高さであり、平行なポストの列における各ポスト間の距離が約０．２ｍｍ離れている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２３】
ゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域の長さが、約１００マイクロメートル〜約１００，０００マイクロメートルである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２４】
ゲルケージ領域の幅が、約１０マイクロメートル〜約５０００マイクロメートルである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２５】
２つの平行なポストの列の間の距離が、約５マイクロメートルと約５０００マイクロメートルの間である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２６】
１つ又はそれ以上の流体チャネル及び１つ又はそれ以上のゲルケージ領域が、約１０マイクロメートル〜約１０ｍｍの長さを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２７】
１つ又はそれ以上の流体チャネル及び１つ又はそれ以上のゲルケージ領域が、同様な高さを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２８】
１つ又はそれ以上の流体チャネル及び１つ又はそれ以上のゲルケージ領域が、約１０マイクロメートル〜約１０００マイクロメートルの高さを有する、請求項２７に記載のデバイス。
【請求項２９】
１つ又はそれ以上の流体チャネルと１つ又はそれ以上のゲルケージ領域が、異なる高さを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３０】
１つ又はそれ以上の流体チャネルが約２００μｍの高さを有し、１つ又はそれ以上のゲルチャネルが約４００μｍの高さを有する、請求項２９に記載のデバイス。
【請求項３１】
１つ又はそれ以上の流体チャネルが、約０．２ｍｍの高さ×約４ｍｍの幅×約２０ｍｍの長さの寸法を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３２】
約７ｃｍの長さ×３ｃｍの幅×１ｃｍの高さの寸法を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３３】
１つ又はそれ以上の、圧力調整器、流量調整器、リザーバー、勾配生成器、温度調整器、又はそれらの組み合わせをさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３４】
ｉ）第１の流体チャネル、
ｉｉ）第２の流体チャネル、
ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体入口、
ｉｖ）１つ又はそれ以上の流体出口、
ｖ）ゲルチャネルを形成するゲルケージ領域、及び
ｖｉ）複数のポストを備え、
ゲルチャネルの一方側の全部又は一部は、第１の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であって、それにより第１のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し；
ゲルチャネルの他方側の全部又は一部は、第２の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であって、それにより第２のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し；
ゲルチャネルは、２つの平行なポストの列を備え、ここでポストの各列はゲルチャネルの長さに沿い、一方の列は第１のゲルチャネル−流体チャネルの界面においてゲルチャネルの一方側に沿い、他方の列は第２のゲルチャネル−流体チャネルの界面においてゲルチャネルの他方側に沿い、それによりうゲルチャネルの長さに沿ってゲルケージ領域を形成し；及び
各ポストは、三角形、台形、又はそれらの組み合わせを形成する、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３５】
第１の流体チャネルが第２の流体チャネルと接続する、請求項３４に記載のデバイス。
【請求項３６】
直列、並列、又はそれらの組み合わせで連結された少なくとも２つの請求項１に記載のデバイスを備えるハイスループットデバイス。
【請求項３７】
少なくとも２つのデバイスが、１つ又はそれ以上のマイクロチップ上で共に連結される、請求項３６に記載のハイスループットデバイス。
【請求項３８】
少なくとも２つのゲルケージ領域を備え、ここでゲルケージ領域がデバイスにおいて直列に配置される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３９】
ｖｉｉ）第２のゲルチャネルを形成する第２のゲルケージ領域、及び
ｖｉｉｉ）第３のゲルチャネルを形成する第３のゲルケージ領域をさらに備え、
ここで、第２のゲルチャネルの一方側の全部又は一部は、第１の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であって、それにより第３のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し；
第２のゲルチャネルの他方側の全部又は一部は、第２の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であって、それにより第４のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し；
第３のゲルチャネルの一方側の全部又は一部は、第１の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であって、それにより第５のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し；
第３のゲルチャネルの他方側の全部又は一部は、第２の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であって、それにより第６のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し；
第２のゲルチャネルは、２つの平行なポストの列を備え、そこではポストの各列は第２のゲルチャネルの長さに沿い、一方の列は第３のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第２のゲルチャネルの一方側に沿い、他方の列は第４のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第２のゲルチャネルの他方側に沿い、それにより第２のゲルチャネルの長さに沿ってゲルケージ領域を形成し；
第３のゲルチャネルは、２つの平行なポストの列を備え、そこではポストの各列は第３のゲルチャネルの長さに沿い、一方の列は第５のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第３のゲルチャネルの一方側に沿い、他方の列は第６のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第３のゲルチャネルの他方側に沿い、それにより第３のゲルチャネルの長さに沿ってゲルケージ領域を形成し；
第１のゲルケージ領域、第２のゲルケージ領域、及び第３のゲルケージ領域は、デバイスにおいて互いに直列に配置され；並びに
各ポストは、三角形、台形、又はそれらの組み合わせを形成する、請求項３４に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４０】
少なくとも２つのゲルケージ領域を備え、ゲルケージ領域がデバイスにおいて並列に配置される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４１】
ｉ）少なくとも３つの流体チャネル、
ｉｉ）少なくとも１つの流体チャネル入口、
ｉｉｉ）少なくとも１つの流体チャネル出口、及び
ｖｉ）少なくとも２つのゲルケージ領域を備え、
ゲルケージ領域がデバイスにおいて互いに並列に配置される、請求項４０に記載のデバイス。
【請求項４２】
少なくとも３つの流体チャネル入口及び１つの流体チャネル出口を備える、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項４３】
少なくとも１つの流体チャネル入口と流体チャネル出口の間に配置されるリザーバーをさらに備える、請求項４２に記載のデバイス。
【請求項４４】
１つ又はそれ以上のガスチャネルをさらに備え、ここで１つ又はそれ以上のガスチャネルの全部又は一部は、１つ又はそれ以上の流体チャネル、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、又はそれらの組み合わせの少なくとも一方側が側面に配置される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４５】
細胞に不透過性であって、そして細胞によって分泌された分子に透過性である膜をさらに備え、膜の一方側は、１つ又はそれ以上の流体チャネル、１つ又はそれ以上のゲルチャネル、又はそれらの組み合わせと接触する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４６】
細胞によって分泌された１つ又はそれ以上の分子に特異的に結合する捕捉剤をさらに備え、捕捉剤が膜の反対側にあり、膜を通過できない、請求項４５に記載のデバイス。
【請求項４７】
捕捉剤がデバイスから分離可能である、請求項４６に記載のデバイス。
【請求項４８】
捕捉剤がガラススライド上にある、請求項４７に記載のデバイス。
【請求項４９】
捕捉剤が、１つ又はそれ以上の流体チャネル、１つ又はそれ以上のゲルチャネル、又はそれらの組み合わせにおいて、細胞によって分泌された分子を特異的に結合する抗体である、請求項４８に記載のデバイス。
【請求項５０】
膜がポリウレタンから構成される、請求項４５に記載のデバイス。
【請求項５１】
各流体チャネルの一部分が１つ又はそれ以上のゲルケージ領域のある領域と接触し、各流体チャネルの残りの部分が１つ又はそれ以上のゲルケージ領域から離れるように延伸する、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５２】
３つ又はそれ以上の流体チャネル及び１つのゲルケージ領域を備える、請求項５１に記載のデバイス。
【請求項５３】
１つ又はそれ以上の流体チャネルが、「Ｃ」字型、「Ｖ」字型、「Ｕ」字型、又はそれらの組み合わせの形状であり、各流体チャネルの中間領域がゲルケージ領域と接触し、そして各流体チャネルの各端がゲルケージ領域から離れるように延伸する、請求項５２に記載のデバイス。
【請求項５４】
１つ又はそれ以上の流体チャネルがゲルケージ領域から半径方向に離れるように延伸する、請求項５３に記載のデバイス。
【請求項５５】
ゲルケージ領域が生体関連ゲルを備える、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項５６】
ゲルケージ領域がさらに、ニューロン、グリア細胞、アストロサイト、内皮細胞、幹細胞、又はそれらの組み合わせを備える、請求項５５に記載のデバイス。
【請求項５７】
１つ又はそれ以上の流体チャネルが、細胞培養培地、神経成長因子、又はそれらの組み合わせを備える、請求項５２に記載のデバイス。
【請求項５８】
ｉ）第１の流体チャネル、
ｉｉ）第２の流体チャネル、
ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体入口、
ｉｖ）１つ又はそれ以上の流体出口、
ｖ）楕円形ゲルケージ領域、及び
ｖｉ）複数のポストを備え、
ゲルケージ領域の一方側は、第１の流体チャネルが側面に配置されることにより第１のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域を作り出し、ゲルケージ領域の他方側は、第２の流体チャネルが側面に配置されることにより第２のゲルケージ領域−流体チャネルの界面を作り出し；そして
ゲルケージ領域は、ゲルケージ領域内で中央に配置された２つの平行なポストの列を備えることにより中央ゲルチャンバを作り出し、一列のポストは第１のゲルケージ領域−流体チャネルの界面に沿って半円形に配置されることにより、一方側で中央ゲルチャンバの一方側が側面に配置される第１のゲルチャンバを作り出し、一列のポストは第２のゲルケージ領域−流体チャネルの界面において半円形に配置されることにより、中央ゲルチャンバの他方側が側面に配置される第２のゲルチャンバを作り出す、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５９】
中央ゲルケージ領域、第１のゲルチャンバ、第２のゲルチャンバ、又はそれらの組み合わせがさらに組織を備える、請求項５８に記載のデバイス。
【請求項６０】
ａ）光学的に透明な材料の第１の部分の中に１つ又はそれ以上の流体チャネル及び１つ又はそれ以上のゲルケージ領域をエッチングして、１つ又はそれ以上の流体チャネル及び１つ又はそれ以上のゲルケージ領域を通る流れを可能にするように、１つ又はそれ以上の入口を作り出し、それによりデバイスの屋根と壁を作り出すこと；
ｂ）デバイスの床を形成する光学的に透明な材料の第２の部分と光学的に透明な材料の第１の部分を結合すること；
を含んでなる、請求項１に記載のデバイスを製造する方法。
【請求項６１】
流体チャネル、ゲルケージ領域、又はそれらの組み合わせを通ってコーティング剤を導入することをさらに含んでなる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
コーティング剤が、ポリ−Ｄ−リジン、ポリオルニチン、ラミン、コラーゲン、又はそれらの組み合わせである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
表面を疎水性にする物質とデバイスの表面を接触させることをさらに含んでなる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
物質が血漿である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
１つ又はそれ以上のゲルケージ領域の中にゲルを導入すること、それによりデバイスにおいて１つ又はそれ以上のゲル領域を作り出すことをさらに含んでなる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
ａ）請求項１に記載のデバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルの中に評価される薬剤を導入すること、ここでデバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルが内皮細胞を備え、デバイスの１つ又はそれ以上のゲルケージ領域がデバイスのゲルケージ領域内でゲル領域を形成するゲルを備える；そして
ｂ）内皮細胞が１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域においてゲル領域に接着するように促される条件下でデバイスを保持すること；及び
ｃ）内皮細胞と並べられた円錐様突起をゲル領域の中に作り出すことが、対照と比較して、薬剤の存在下で増強されるか、又は阻害されるかを確認することを含んでなり、
ここで、内皮細胞と並べられた円錐様突起をゲル領域の中に作り出すことが、対照と比較して、薬剤の存在下で増強された場合に、薬剤が血管新生性であり、内皮細胞と並べられた円錐様突起をゲル領域の中に作り出すことが、対照と比較して、薬剤の存在下で阻害された場合に、薬剤が血管新生抑制性である、薬剤が血管新生性であるか、又は血管新生抑制性であるかを特定する方法。
【請求項６７】
内皮細胞が、内皮細胞を備える流体チャネルの静水圧を上昇させることによってゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域においてゲル領域に接着することを促される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
内皮細胞が、薬剤の存在下で、内皮細胞と並べられた円錐様突起をゲル領域に作り出すか否かを、画像化技術を使用して確認する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
ａ）請求項１に記載のデバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルの中に評価される薬剤を導入すること、ここでデバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルは内皮細胞を備え、デバイスの１つ又はそれ以上の流体又はゲルケージ領域はガン細胞を備え、デバイスの１つ又はそれ以上のケージ領域はデバイスのゲルケージ領域においてゲル領域を形成するゲルを備える；そして
ｂ）内皮細胞が１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域においてゲル領域に接着するように促される条件下で、デバイスを保持すること、それにより細胞の内皮層を形成すること；及び
ｃ）ガン細胞が、薬剤の存在下で、ゲル内で分散して、細胞の内皮層又はそれらの組み合わせに向かって、及びそれらを横断して移動するか否かを確認することを含んでなり、ここで、ガン細胞がゲル内で分散せず、細胞の内皮層又はそれらの組み合わせに向かい及びそれらを横断して移動しなかった場合に、これは、薬剤が転移を阻害するために使用できることを示す、薬剤を転移に対して使用できるか否かを確認する方法。
【請求項７０】
ガン細胞が、薬剤の存在下で、ゲル内で分散して、細胞の内皮層又はそれらの組み合わせに向かって及びそれらを横断して移動したか否かを、適切な対照と比較する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
ガン細胞が、ガン患者のガン生検試料から切除された細胞である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
ａ）デバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルの中に内皮細胞を導入すること、ここでデバイスの１つ又はそれ以上のゲルケージ領域はさらに、ゲルケージをその中で形成するゲルを備える；及び
ｂ）内皮細胞がゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域においてゲルケージに接着し、内皮細胞と並べられた円錐様突起をゲルケージの中に作り出すように促される条件下で、デバイスを保持すること、それによりインビトロで血管を成長させること；を含んでなる、インビトロで血管を成長させる方法。
【請求項７３】
内皮細胞が導入される１つ又はそれ以上の流体チャネルが、デバイスにおいて１つ又はそれ以上のゲルケージ領域の中央にある、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ａ）請求項１に記載のデバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネル、請求項１に記載のデバイスの１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、又はそれらの組み合わせの中に、評価される薬剤及び神経細胞を導入すること、ここでデバイスの１つ又はそれ以上のゲルケージ領域は、デバイスのゲルケージ領域内でゲル領域を形成するゲルを備える；そして
ｂ）神経細胞がゲルケージ領域で増殖する条件下でデバイスを保持すること；及び
ｃ）神経細胞が、薬剤に向かって増殖するか、又は薬剤から離れるように増殖するかを確認すること；を含んでなり、
ここで神経細胞が薬剤に向かって増殖する場合に、薬剤は神経細胞の化学誘引剤であり、神経細胞が薬剤から離れるように増殖する場合に、薬剤は神経細胞の化学反反発剤である、  薬剤が神経細胞の化学誘引剤であるか、又は神経細胞の化学反発剤であるかを特定する方法。
【請求項７５】
ａ）請求項１に記載のデバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルの中に評価される薬剤を導入すること、ここで、デバイスの１つ又はそれ以上のゲルケージ領域が１つ又はそれ以上のゲルケージを形成するゲルを備え、ゲルケージがさらにガン組織の生検試料を備える；及び
ｂ）ガン組織の運動性が、薬剤の存在下で阻害されるか否かを確認すること、ここでガン組織の運動性が阻害される場合に、薬剤はガンを治療するために使用できる；を含んでなる、薬剤がガンを治療するために使用できるか否かを確認する方法。
【請求項７６】
生検試料が個々のガン患者のガン組織に由来し、薬剤がガン患者のガン組織を治療するために使用できる、請求項７５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１０年１０月１９日出願の米国仮特許出願第６１／３９４，６２４号及び２０１０年９月２９日出願の米国仮特許出願第６１／３８７，６７４号の優先権を主張する。
【０００２】
上記出願の全教示は参照により本明細書に組み込まれている。
【０００３】
政府の支援
本発明は、国立科学財団によって授けられたＥＲＩ第０７３５９９７号並びに、アメリカ国立衛生研究所からのＮＳ４１５９０、ＮＳ４５５２３及びＮＳ４９５５３に基づいた政府の支援によりなされた。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
細胞間相互作用の研究は、多数の病気の発症を理解するために重要である。細胞間相互作用を研究するためのデバイスは、典型的には、細胞が、一枚のコラーゲン又は他の生体適合性ゲルを覆う水平な単分子層上で成長することを可能にする。こうしたデバイスは、例えば、下方向に成長する血管を最終的に形成する内皮細胞と共に使用することができる。これらのデバイスに薬物を添加することが、デバイスの上部からの血管形成における薬物の効果の質的評価を可能にし、ここで、血管はゲル内に穴として現れる。しかしながら、側面から血管を画像化することは可能ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように、細胞間相互作用の研究を可能にする改良型デバイスの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
生細胞に対する影響を有する薬剤をスクリーニングするために使用できる細胞アッセイデバイスが本明細書に記載されている。例えば、デバイスは、血管新生抑制剤、転移抑制剤、創傷治療薬、及び再生医療薬をスクリーニングするために使用することができる。一態様において、デバイスは、血管を穴ではないが円錐として側面から見ることを可能にし、細胞の成長（例えば、ガン細胞の浸潤）に対する物質（例えば、薬物）の効果のさらに詳細な分析を可能にする。
【０００７】
特定の態様において、デバイスは、多細胞間相互作用の研究のためにハイスループット様式（例えば、ハイスループット抗ガン剤スクリーニング）で使用することができる三次元足場マイクロ流体デバイス（3D Scaffold Microfluidic Device）である。デバイスは、創薬及びオーダーメイド医療のために使用できる。例えば、デバイスは、研究の場で人体におけるガンの転移を食い止めるのに役立つ新薬のインビトロテストとして使用できると共に、医療の現場で特定の患者に対して最良の抗ガン転移剤を適合させるために使用できる。このデバイスは、容易な画像化、及び質的な結果だけでなく量的な結果を可能にする点で現在のデバイスより改良されている。
【０００８】
一態様において、デバイスは、光学的に透明な材料で構成された基材、並びに（ｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル、（ｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル入口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル出口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、及び（ｉｖ）複数のポストを備え、ここで各ゲルケージ領域の全部又は一部は１つ又はそれ以上の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置されていて、それにより１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域を作り出していて、そして各ゲルケージ領域はゲルケージ領域を形成する少なくとも１列のポストを備える。
【０００９】
別の態様において、デバイスはさらに、少なくとも２つのゲルケージ領域を備え、ここでゲルケージ領域はデバイス内で互いに直列に配置される。別の態様において、デバイスはさらに、少なくとも２つのゲルケージ領域を備え、ゲルケージ領域はデバイス内で互いに並列に配置される。
【００１０】
別の態様において、デバイスは、（ｉ）第１の流体チャネル、（ｉｉ）第２の流体チャネル、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体入口、（ｉｖ）１つ又はそれ以上の流体出口、（ｖ）ゲルチャネルを形成するゲルケージ領域、（ｖｉ）ゲルチャネル入口、及び（ｖｉｉ）複数のポストを備える。このデバイスにおいて、ゲルチャネルの一方側の全部又は一部は、第１流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第１のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し、そしてゲルチャネルの他方側の全部又は一部は、第２流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第２のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出す。ゲルチャネルは、２つの平行なポストの列を備え、ここでポストの各列はゲルチャネルの長さに沿い、一方の列は第１ゲルチャネル−流体チャネルの界面においてゲルチャネルの一方側に沿い、他方の列は第２ゲルチャネル−流体チャネルの界面においてゲルチャネルの他方側に沿い、それによりゲルチャネルの長さに沿ってゲルケージ領域を形成し、そして各ポストは三角形、台形又はそれらの組み合わせを形成する。
【００１１】
さらに別の態様において、デバイスは、（ｉ）第１の流体チャネル、（ｉｉ）第２の流体チャネル、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体入口、（ｉｖ）１つ又はそれ以上の流体出口、（ｖ）第１のゲルチャネルを形成する第１のゲルケージ領域、及び（ｖｉ）複数のポストを備えるデバイスを備える。このデバイスにおいて、第１のゲルチャネルの一方側の全部又は一部は、第１の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第１のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し、第１のゲルチャネルの他方側の全部又は一部は、第２の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第２のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出す。第１のゲルチャネルは、２つの平行なポストの列を備え、ここでポストの各列は、第１のゲルチャネルの長さに沿い、一方の列は第１のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第１のゲルチャネルの一方側に沿い、他方の列は第２のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第１のゲルチャネルの他方側に沿い、それによりゲルチャネルの長さに沿って第１のゲルケージ領域を形成する。デバイスはさらに、（ｖｉｉ）ゲルチャネルの形態の第２のゲルケージ領域を備え、それにより第２のゲルチャネルを形成し；そして（ｖｉｉｉ）ゲルチャネルの形態の第３のゲルケージ領域を備え、それにより第３のゲルチャネルを形成する。第２のゲルチャネルの一方側の全部又は一部は、第１の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第３のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し、そして第２のゲルチャネルの他方側の全部又は一部は、第２の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第４のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出す。第２のゲルチャネルは、２つの平行なポストの列を備え、ここでポストの各列は、第２のゲルチャネルの長さに沿い、一方の列は、第３のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第２のゲルチャネルの一方側に沿い、そして他方の列は、第４のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第２のゲルチャネルの他方側に沿い、それにより第２のゲルチャネルの長さに沿ってゲルケージ領域を形成する。さらに、第３のゲルチャネルの一方側の全部又は一部は、第１の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第５のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し、そして第３のゲルチャネルの他方側の全部又は一部は、第２の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第６のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出す。第３のゲルチャネルは、２つの平行なポストの列を備え、ここでポストの各列は、第３のゲルチャネルの長さに沿い、一方の列は、第５のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第３のゲルチャネルの一方側に沿い、そして他方の列は第６のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第３のゲルチャネルの他方側に沿い、それにより第３のゲルチャネルの長さに沿ってゲルケージ領域を形成する。第１のゲルケージ領域、第２のゲルケージ領域及び第３のゲルケージ領域は、互いに対して直列である。デバイス内の各ポストは、三角形、台形又はそれらの組み合わせを形成する。このように、この実施態様において、各ゲルケージ領域は、第１の流体チャネル及び第２の流体チャネルと接触する。
【００１２】
別の態様において、デバイスは、光学的に透明な材料で構成された基材、並びに（ｉ）少なくとも３つの流体チャネル、（ｉｉ）少なくとも１つの流体チャネル入口、（ｉｉｉ）少なくとも１つの流体チャネル出口、（ｉｉｉ）少なくとも２つのゲルケージ領域、及び（ｉｖ）複数のポストを備え、ここでゲルケージ領域は互いに対して並列に配置される。各ゲルケージ領域の全部又は一部は、１つの流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それにより第１のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域、第２のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域、及び第３のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域を作り出し、そして各ゲルケージ領域は、ゲルケージ領域を形成する少なくとも１列のポストを備える。特定の態様において、各ゲルケージ領域はゲルチャネルを形成し、各ゲルチャネルは２つの平行なポストの列を備え、ここでポストの各列は各ゲルチャネルの長さに沿い、一方の列はゲルチャネルの一方側に沿い、他方の列はゲルチャネルの反対側に沿い、それにより各ゲルチャネルのそれぞれの長さに沿ってゲルケージ領域を形成する。
【００１３】
別の態様において、デバイスは、光学的に透明な材料で構成された基材、並びに（ｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル、（ｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル入口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル出口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、（ｉｖ）１つ又はそれ以上のガスチャネル、（ここで１つ又はそれ以上のガスチャネルの全部又は一部は１つ又はそれ以上の流体チャネル、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域又はそれらの組み合わせの少なくとも一方側を側面に配置している）、及び（ｖ）複数のポストを備える。各ゲルケージ領域の全部又は一部は、１つ又はそれ以上の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置されることにより、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域を作り出し、そして各ゲルケージ領域はゲルケージ領域を形成する少なくとも一列のポストを備える。１つ又はそれ以上のガスチャネルは、例えば、酸素を除去するために、デバイスを通過する（１つ又はそれ以上の）ガス（例えば、窒素、水素、ヘリウム、酸化窒素、一酸化炭素）の流れを可能にする。
【００１４】
別の態様において、デバイスは、光学的に透明な材料で構成された基材、並びに（ｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル、（ｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル入口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル出口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、（ｉｖ）細胞に対して不透過性であり且つ細胞によって分泌された分子に対して透過性である膜、（ここで膜の一方側は１つ又はそれ以上の流体チャネル、１つ又はそれ以上のゲルチャネル又はそれらの組み合わせと接触している）、及び（ｖ）複数のポストを備える。各ゲルケージ領域の全部又は一部は、１つ又はそれ以上の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置されていて、それにより１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域を作り出し、そして各ゲルケージ領域は、ゲルケージ領域を形成する少なくとも１列のポストを備える。デバイスはさらに、（１つ又はそれ以上の）細胞によって分泌された１つ又はそれ以上の分子と特異的に結合する（１つ又はそれ以上の）捕捉剤を備え、そして捕捉剤は、膜の反対側にあり、膜を通過できない。
【００１５】
別の態様において、デバイスは、光学的に透明な材料で構成された基材、並びに（ｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル、（ｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル入口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル出口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、及び（ｉｖ）複数のポストを備え、ここで各流体チャネルの一部は各ゲルケージ領域の一部と接触し、そして各流体チャネルの残りの部分は１つ又はそれ以上のゲルケージ領域から離れるように延伸している。各ゲルケージ領域は、「Ｔ字型」ゲルケージ領域を形成する３つのポストを備える。
【００１６】
別の態様において、デバイスは、（ｉ）第１の流体チャネル、（ｉｉ）第２の流体チャネル、（ｉｉｉ）第３の流体チャネル、（ｉｖ）１つ又はそれ以上の流体入口、（ｖ）１つ又はそれ以上の流体出口、（ｖｉ）Ｔ字型ゲルを形成するゲルケージ領域、及び（ｖｉｉ）複数のポストを備える。このデバイスにおいて、各流体チャネルの一部はゲルケージ領域の一部と接触し、そして各流体チャネルの残りの部分はゲルケージ領域から離れるように延伸している。各ゲルケージ領域は、「Ｔ字型」ゲルケージ領域を形成する３つのポストを備える。一態様において、各ポストは正方形を形成する。特定の態様において、流体チャネルは、「Ｃ」、「Ｖ」、「Ｕ」又はそれらの組み合わせの形状であり、ここで各流体チャネルの中間領域はゲルケージ領域と接触し、そして流体チャネルの各端部はゲルケージ領域から離れるように延伸している（例えば、ゲルケージ領域から半径方向に離れるように延伸する）。
【００１７】
別の態様において、デバイスは、（ｉ）第１の流体チャネル、（ｉｉ）第２の流体チャネル、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体入口、（ｉｖ）１つ又はそれ以上の流体出口、（ｖ）楕円形ゲルケージ領域、及び（ｖｉ）複数のポストを備え、ここでゲルケージ領域の一方側は、第１の流体チャネルが側面に配置されることにより、第１のゲルケージ領域−流体チャネルの界面を作り出し、そしてゲルケージ領域の他方側は、第２の流体チャネルが側面に配置されることにより、第２のゲルケージ領域−流体チャネルの界面を作り出す。ゲルケージ領域は、ゲルケージ領域の中央に配置される２つの平行なポストの列を備え、それにより中央ゲルチャンバを作り出し、一列のポストが第１のゲルケージ領域−流体チャネルの界面に沿って半円形に配置され、それにより一方側に中央ゲルチャンバの一方側が側面に配置されている第１のゲルチャンバを作り出し、そして一列のポストが第２のゲルケージ領域−流体チャネルの界面において半円形に配置され、それにより中央ゲルチャンバの他方側が側面に配置されている第２のゲルチャンバを作り出す。
【００１８】
別の態様において、本発明は、光学的に透明な材料の第１の部分内に１つ又はそれ以上の流体チャネル及び１つ又はそれ以上のゲルケージ領域をエッチングすること、そして１つ又はそれ以上の流体チャネル及び１つ又はそれ以上のゲルケージ領域を通る流れを可能にするために１つ又はそれ以上の入口を作り出すこと、それにによりデバイスの屋根と壁を作り出すこと、並びに光学的に透明な材料の第１の部分を、デバイスの床を形成する光学的に透明な材料の第２の部分とを結合することを含んでなるデバイスを作成する方法に関する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、（ａ）本明細書に記載されているようなデバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルの中に評価される薬剤を導入すること（ここで、デバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルは内皮細胞を備え、そしてデバイスの１つ又はそれ以上のゲルケージ領域はデバイスのゲルケージ領域内にゲル領域を形成するゲルを備えている）；並びに内皮細胞が１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域においてゲル領域と接着するように促される条件下でデバイスを保持することを含んでなる、薬剤が血管新生性であるか、又は血管新生抑制性であるかを特定する方法に関する。内皮細胞と並べられた円錐様突起をゲル領域の中に作り出すことが、薬剤の存在下で増強されるか、又は阻害されるかを確認して対照と比較する。内皮細胞と並べられた円錐様突起をゲル領域の中に作り出すことが、対照と比較して薬剤の存在下で増強された場合、薬剤は血管新生性であり、内皮細胞と並べられた円錐様突起をゲル領域の中に作り出すことが、対照と比較して薬剤の存在下で阻害された場合、薬剤は血管新生抑制性である。
【００２０】
別の態様において、本発明は、（ａ）本明細書に記載されているようなデバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルの中に評価される薬剤を導入すること（ここで、デバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルは内皮細胞を備え、デバイスの１つ又はそれ以上の流体又はゲルケージ領域はガン細胞を備え、そしてデバイスの１つ又はそれ以上のケージ領域はデバイスのゲルケージ領域においてゲル領域を形成するゲルを備えている）、並びに（ｂ）内皮細胞が１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域においてゲル領域と接着するように促される条件下でデバイスを保持すること、それにより細胞の内皮層を形成することを含んでなる、薬剤を転移に対して使用することができるか否かを確認する方法に関する。薬剤の存在下で、ガン細胞がゲル内で分散し、細胞の内皮層又はそれらの組み合わせに向かって及びそれらを横断して移動するか否かを確認して、ガン細胞がゲル内で分散せず、細胞の内皮層又はそれらの組み合わせに向かって及びそれらを横断して移動しなかった場合、このことは、薬剤が転移を阻害するために使用できることを示唆する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、（ａ）デバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルの中に内皮細胞を導入すること（ここで、デバイスの１つ又はそれ以上のゲルケージ領域はさらに、その中にゲルケージを形成するゲルを備えている）、並びに（ｂ）内皮細胞がゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域においてゲルケージと接着し且つ内皮細胞と並べられた円錐様突起をゲルケージの中に作り出すように促される条件下でデバイスを保持すること、それによりインビトロで血管を成長させることを含んでなる、インビトロで血管を成長させる方法に関する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、（ａ）本明細書に記載されているデバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネル、本明細書に記載されているデバイスの１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、又はそれらの組み合わせの中に、評価される薬剤と神経細胞とを導入すること（ここで、デバイスの１つ又はそれ以上のケージ領域は、デバイスのゲルケージ領域内でゲル領域を形成するゲルを備えている）、並びに（ｂ）神経細胞がゲルケージ領域において増殖する条件下でデバイスを保持することを包含する、薬剤が神経細胞の化学誘引剤であるか、又は化学反発剤であるかを特定する方法に関する。神経細胞が、薬剤に向かって増殖するか、または薬剤から離れるように増殖するかを確認して、神経細胞が薬剤に向かって増殖する場合、薬剤は神経細胞の化学誘引剤であり、神経細胞が薬剤から離れるように増殖する場合、薬剤は神経細胞の化学反発剤である。
【００２３】
別の態様において、本発明は、（ａ）本明細書に記載されているデバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルの中に、評価される薬剤を導入すること（ここで、デバイスの１つ又はそれ以上のゲルケージ領域は、１つ又はそれ以上のゲルケージを形成するゲルを備え、ゲルケージはさらにガン組織の生検材料を備えている）、並びに（ｂ）ガン組織の運動性が、薬剤の存在下で阻害されるか否かを確認すること（ここで、ガン組織の運動性が阻害される場合、薬剤はガンを治療するために使用できる）を含んでなる、薬剤がガンを治療するために使用できるか否かを確認する方法に関する。
【００２４】
特許又は出願ファイルは、カラーで仕上げられた図面を少なくとも１つ含む。カラー図面（複数を含む）を伴うこの特許又は特許出願公開物の複写は、要求及び必要な費用の納付により特許庁に提供される。
【００２５】
上記の内容は、添付の図面に説明されるように、下記の本発明の例示的な実施態様のさらに詳細な説明から明らかであり、図面において、同様な参照文字は、異なる図面全体を通して同じ部分を参照する。図面は、必ずしも原寸に比例しておらず、むしろ本発明の実施態様を例示することに重きが置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、デバイスの一実施態様の俯瞰図である。示された特定の実施態様に対して、測定値は約２５ｍｍ×約７５ｍｍ×１ｍｍである。内皮細胞が上部チャネルに播種されて、底部チャネルに到達する小さな血管を形成する。この構成が、血管新生又はガン細胞内／ガン細胞外血管新生の容易な顕微鏡画像化を可能にする。
【図２】図２は、図１のデバイスの別の図である。
【図３】図３は、台形のポストと、どのようにポストが急峻な角度を使用してゲルの液滴に適合するかを例示し、ポストの両側に２つの液滴を置くことは、三角形のポストを示唆し、ポストの角度は、基材の表面上のゲルによる接触角度によって決定される。
【図４】図４は、ゲルチャネルと、異なる高さを有する流体チャネルとを有するデバイスを例示する。
【図５】図５は、検証データを示す。
【図６Ａ−６Ｃ】図６Ａは、ソフトリソグラフィ技術を使用したデバイス製作プロセスである。ＳＵ−８フォトレジストが、シリコンウエハ上にスパンコーティングされ（６Ａ）、透明なマスクを通して紫外線にさらされる（６Ｂ）。ＰＤＭＳをウエハ上に注ぎ、８０℃で２時間硬化させ（６Ｃ）、架橋されたＰＤＭＳウエハを剥がし（６Ｄ）、ポートに孔を開け、チャネルを閉じるためにカバースリップと結合させる（６Ｅ）。図６Ｂは、成長因子勾配の下で三次元足場における軸索回転を研究するために開発された３チャネルのマイクロ流体デバイスの設計である。コラーゲン１が、ゲル充填チャネルに注入され、重合化される。関心のある化学物質が、右側チャネルに添加され、基本培地が、勾配を生成するように左側チャネルに添加され、ニューロンが、勾配に応答するように細胞チャネルに配置される（６Ｃ）。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａは、デバイスにおける三次元コラーゲンゲル全体の蛍光性デキストラン（４０ｋＤａ；１０μＭ）の勾配の低速撮影正規化画像である。図７Ｂは、ゲル領域に沿った水平な長方形を平均化することによって分析され、チャネル内での位置に対してプロットした拡散プロファイルである。２４時間の時点におけるデキストラン勾配のスナップショットが参考のために示されている。
【図８】図８は、デバイスにおける勾配回復の際の外部摂動の役割である。デキストラン勾配は、培地が全チャネルにおいて交換された後３０分で完全に回復する（図８Ａ）。１５０μＬのデキストラン溶液の化学誘引物質リザーバーへの添加後でさえも安定した線形勾配は変わらないままである（図８Ｂ）。
【図９】図９は、マイクロ流体デバイスにおける誘導キューの輸送のシミュレーションである。誘導キューの添加の２４時間後のコラーゲン足場領域にわたる定常状態濃度分布（図９Ａ）及びデバイスにおける濃度勾配（図９Ｃ）。（図９Ａ）と（図９Ｃ）とのそれぞれに示された破線に沿って描かれたこれらの領域における、濃度プロファイル（図９Ｂ）と濃度勾配（図９Ｄ）との時空間的展開。
【図１０】図１０は、マイクロ流体デバイスにおける細胞播種である。図１０Ａは、外部介入前に細胞チャネルにおいてガラスカバースリップ上に取り付けられたローダミンで染色されたニューロンの蛍光顕微鏡画像である。左側の培地チャネルと右側の化学誘引物質チャネルとを空にすることによって作り出される圧力差が、細胞チャネルを通る強い流れを作り出しゲルを通るわずかな流れを作り出して、ゲル上に細胞を次第に集めることとなる（図１０Ｂ）。播種後１２時間の、三次元コラーゲンゲルの中に成長する軸索とゲル表面上に集められたニューロンとの蛍光顕微鏡画像。
【図１１】図１１は、化学誘引物質による海馬ニューロンの軸索誘導である。図１１Ａ及び図１１Ｂは、右側チャネルの形質転換繊維芽細胞及び左側チャネルの正常な繊維芽細胞（１１Ａ）と両チャネルの正常な繊維芽細胞（１１Ｂ）とから放出されたネトリン１の存在下で培養されたローダミンで染色されたニューロンの蛍光画像である。図１１Ｃは、研究所で精製された１μｇ／ｍＬのネトリン１の外因性添加物で培養されたＤＣＣ形質転換ニューロンの共焦点顕微鏡画像である。図１１Ｄ〜Ｈは、研究所で精製された０．１μｇ／ｍＬのネトリン１を受け取った、ローダミンで染色されたニューロンの共焦点顕微鏡画像（１１Ｄ）、研究所で精製された１μｇ／ｍＬのネトリン１を受け取った、ローダミンで染色されたニューロンの共焦点顕微鏡画像（１１Ｅ）、研究所で精製された１０μｇ／ｍＬのネトリン１を受け取った、ローダミンで染色されたニューロンの共焦点顕微鏡画像（１１Ｆ）、外因性添加物がない、ローダミンで染色されたニューロンの共焦点顕微鏡画像（１１Ｇ）、及び１００ｎｇ／ｍＬの脳髄を受け取った、ローダミンで染色されたニューロンの共焦点顕微鏡画像（１１Ｈ）である。図１１Ｉは、各四分円内の軸索回転の定量化のために使用される測定基準であり、そして図１１Ｊ及び１１Ｋは、外部化学誘引性勾配に応じて各四分円において測定された軸索のパーセンテージである。
【図１２】図１２は、デバイスにおける海馬軸索回転の際のｓｌｉｔ−２の用量依存的な効果を示す。図１２Ａ及び１２Ｂは、２５０ｎｇ／ｍＬ（１２Ａ）及び６２．５ｎｇ／ｍＬ（１２Ｂ）のｓｌｉｔ−２から作成された勾配に応じたローダミンで染色されたニューロンの共焦点顕微鏡画像である。軸索回転の定量化は、２５０ｎｇ／ｍＬのｓｌｉｔ−２が、６２．５ｎｇ／ｍＬのｓｌｉｔ−２または添加物のない対照と比較して、非常に多くの数の軸索を勾配を下って拒絶したことを明らかにした（図１２Ｃ）。
【図１３】図１３Ａは、デバイスにおいて２５０ｎｇ／ｍＬのｓｌｉｔ−２と６２．５ｎｇ／ｍＬのｓｌｉｔ−２とによって作り出された勾配に応じた、三次元コラーゲン足場へのＤＲＧニューロン（ＤＡＰＩで染色された）の移動を示す。ｓｌｉｔ−２を受け取らない対照培養物内でのＤＲＧ移動が比較のために示した。図１３Ｂは、ニューロンの移動を培養培地に５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を添加することによって阻害した後の、２５０ｎｇ／ｍＬのｓｌｉｔ−２とｓｌｉｔ−２がないこと（対照）とに応じた、ＤＲＧ軸索の大規模な生長及び回転の蛍光顕微鏡画像である。図１３Ｃ及び１３Ｄは、ｓｌｉｔ−２勾配と対照培養物とにおける各四分円へのＤＲＧニューロンの移動（１３Ｃ）と軸索回転（１３Ｄ）との定量化を示す。勾配を下るＤＲＧニューロンの移動と軸索生長の際の２５０ｎｇ／ｍＬのｓｌｉｔ−２の顕著な走化性挙動が、対照と比較して観察された（ｐ＜０．００１）。
【図１４】リザーバーカバーが、圧力が等しいことを確実にするためにデバイスの上部に加えられる。化学誘引物質ポートは、化学誘引物質リザーバー（緑色）で覆われ、培地ポートと細胞チャネルポートとは、培地リザーバー（青色）で覆われる。小さいチャネルが、差圧が釣り合うように両リザーバーを接続する。
【図１５】図１５Ａは、ＣＯＭＳＯＬを使用した、Ｙ軸に沿った濃度勾配の評価である。Ｙ軸の位置１（黒色）とＹ軸の位置２（緑色）とを示す矢印を有する定常状態での濃度分布であり、Ｙ軸の位置１（黒色）とＹ軸の位置２（緑色）とに沿って濃度分布勾配が（１５Ｂ）と（１５Ｃ）にそれぞれプロットされている。両方の位置での濃度勾配値は、直接的な量的比較を可能にするように、２４時間後位置１の最大濃度勾配値に関して正規化されている（ＤＣ／ｄｘ＝１）。化学誘引物質がｔ＝０で添加される時に、位置１と位置２とにおける濃度勾配は存在しない。しかしながら、培地交換の間の２４時間後、安定した濃度勾配が確立される。
【図１６】図１６は、腫瘍細胞移動の際の間質流の効果を調べるためのマイクロ流体細胞培養システムである。図１６Ａは、マイクロ流体デバイスの概略図である。デバイスは、細胞がコラーゲン１ゲル（桃色）中で懸濁される領域によって分離された２つのチャネル（青色と緑色）からなる。ゲル全体に圧力勾配を加えることによって、一貫した流動場が発生する。流動場を検証するために、蛍光マイクロスフィアが大量の培地の中に導入され、低速度撮影画像をビーズを追跡するために撮った。マイクロ流体デバイスは、成長培地や標的組織へのアクセスを細胞に提供する。培地チャネル（矢印）、組織ウェル（星印）、及び体細胞ウェル（矢尻）とを示すデバイスの概略図である。（ａ）培地チャネル（矢印）、組織ウェル（星印）、及び体細胞ウェル（矢印）とを示す詳細。図１６Ｂは、コンピュータ計算モデル（青色）に対する流線ベクトルと、図１６Ａの破線によって示されたデバイスの領域の位相差画像とに重ね合わされた蛍光マイクロスフィア（緑色）を追跡することによって観察される速度ベクトルである。実験で観察された速度ベクトルは、大きさでのＦＥＭモデル（１６Ｃ）と方向（１６Ｄ）でのＦＥＭモデルとによって予測された速度ベクトルと同様である（平均±ＳＥＭ、流速間で＊＊ｐ＜０．０１。計算された平均角度は、０°と９０°との間）。
【図１７】図１７は、間質流が細胞移動の方向に影響を与えることを示す。図１７Ａは、間質流場における細胞移動の経時的サンプル画像である。流れは、画像の上部から底部まで３．０μｍ／ｓである。図１７Ｂは、１つの対照デバイスからのサンプルデータである。極性ヒストグラムは、１つのデバイスにおける集団内の細胞に対する純移動ベクトルの角度分布を示す。対照デバイス内の流れのない細胞は、不規則に移動する。流れは移動ベクトル角度の分布を変える（図１７Ｃ）。１つのデバイスからのこのサンプルデータにおいて、細胞移動バイアスは、流れに対するものである。細胞移動における方向バイアスを定量化するために、２つの測定基準がコンピュータ計算される。流線移動の測定基準は、流線に沿った移動バイアスの測定値であり（図１７Ｄ）、そして方向的な移動の測定基準は、流線に沿った細胞移動に対する上流移動バイアスまたは下流移動バイアスの測定値である（図１７Ｅ）。
【図１８】図１８は、間質流が、腫瘍細胞移動の方向にバイアスを導入することを示す。細胞は、図１７Ａ〜図１７Ｅに示される測定基準に従って得点を付けた。「高い」と「低い」とはそれぞれ、２５×１０４個の細胞／ｍｌと５×１０４個の細胞／ｍｌとを指す。間質流にさらされた細胞は、流線に沿って優先的に流れ、このバイアスは、流速と細胞密度とＣＣＲ７受容体活動の関数である（図１８Ａ）。０．３μｍ／ｓの流動場でＣＣＲ７を遮断することが、流線移動のスコアを非常に減少させる（ｐ＜０．０１）。３．０μｍ／ｓの流動場において、ＣＣＲ７を遮断することが、流線移動スコアを増加させるという逆の効果を有するが、低細胞密度（ｐ＜０．０５）においてのみ有する。間質流にさらされた細胞は、流速と細胞密度とＣＣＲ７受容体活動との関数として上流または下流に優先的に移動した（図１８Ｂ）。方向性移動のスコアは、流速を増加させることによってより負になる。活性ＣＣＲ７を用いて細胞密度を増やすことが、下流から上流への方向的なバイアスを反転させるが（両方の流速に対してｐ＜０．０１）、ＣＣＲ７が遮断された時には、方向的な移動のスコアは、より負にあり、細胞密度に依存しない（平均±ＳＴＤは、１つのデバイスにおける各細胞に対するスコアを平均化し（ｎ＞１５）、各条件において３つのデバイスに対するスコアを平均化することによってコンピュータ計算される）。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｄは、交互に配置され同じ媒質チャネルを共有する３つのゲル領域を備えるＳ字型または蛇行状のデバイスの例示。従って、同じ媒質が、ゲル内で少なくとも３つの異なる細胞の種類と相互作用することができる。この実施態様において、２つの入口チャネルが融合して単一の出口になり、単一の出口は、連続的な流れの実験において有用である。
【図２０】図２０は、９６時間後にＣＧＳ２（２．５ｍｇ／ｍｌ）内で安定化させられた微小血管網を示す。図２０Ａ〜２０Ｂは、黄色い破線で印を付けられた成熟した血管網を示す位相差画像及び共焦点顕微鏡画像である。スケールバー：２０Ａ（３００μｍ）；２０Ｂ（６４０μｍ）。
【図２１】図２１は、１０８時間後のＣＧＳ２（２．５ｍｇ／ｍｌ）における管腔状成熟を示す。図２１Ａ〜２１Ｂは、白色の破線で印を付けた成熟した管腔状形態を示す位相差画像及び共焦点顕微鏡画像である。スケールバー：２１Ａ（３００μｍ）；２１Ｂ（６４０μｍ）。
【図２２】図２２は、ＨＵＶＥＣの最初の播種後９６時間の三次元ＣＧＳ内のガン転移システムである。図２２Ａ〜２２Ｄは、三次元ＣＧＳ（２．５ｍｇ／ｍｌ）内のＨＵＶＥＣの血管網形成と、二次元チャネルからのＡ５４９の移動とを示す、顕微鏡画像の位相差、及びライブ共焦点顕微鏡を用いた低速度撮影モザイク画像化である。図２２Ｃ〜２２Ｄは、管腔形成の開始と血管内異物侵入とを示す、ＩＭＡＲＩＳを用いた三次元可視化画像である。スケールバー：（２２Ａ〜２２Ｂ）（２５０μｍ）；（２２Ｃ）（１００μｍ）；（２２Ｄ）（５０μｍ）。
【図２３】図２３は、ＧＭ６００１を用いたり用いなかったりした、ＣＧＳ２へのＡ５４９の移動を示す。図２３Ａ〜２３Ｄ及び図２３Ｃ〜２３Ｄはそれぞれ、ＧＭ６００１を用いたり用いなかったりした６時間後及び１８時間後におけるライブ共焦点低速度撮影画像である。Ａ５４９の移動には、黄色い線で印を付けてある。
【図２４】図２４は、細胞から分泌された分子の視覚化を可能にする非繊維膜デバイスの例示である。非繊維膜デバイスは、マイクロ流体デバイスの「床」を形成する顕微鏡スライドを取り除き、ＥＬＩＳＡから細胞を分離するためにナノ繊維膜を用いる標準的なＥＬＩＳＡアッセイと顕微鏡スライドを交換する。ナノ繊維膜は、細胞がアッセイを汚さないこと（汚染しないこと）、またはアッセイを損なわないことを確実にしながら、関心のある分子がナノ繊維膜を通過することを可能にするように選択され、そして細胞粘着のために選択される。関心のある分子は、細胞の真下の範囲を通って漏れるだけであるので、関心のある分子の分泌は、局所化ができる。上側の図（上側の左右）は、デバイスの断面図を示す。標準的なハイスループットデバイスは、微小チャネルの壁と「天井」とを形成するためにＰＤＭＳを使用するが、ガラスカバースリップが「床」のために使用される。ＥＬＩＳＡアッセイは、ガラス表面にパターン付けできるので、関心のある分子を検知するためにデバイスの床として使用されるガラスカバースリップは、適切な抗体（左上側の画像における青色の「Ｙ」）でコーティングできる。細胞はこの表面に取り付けることが困難であり、細胞移動や他の生物学的影響が、コーティングを汚したり破損したりすることがあるので、多孔性膜が、ガラス（両方の上側の画像におけるナノ繊維膜）の上に「マット」として置かれる。システムの水密性を保持するために、ＰＤＭＳリングを導入できる（右上側の画像）。下側の図は、製作されたデバイスを示す。
【図２５】図２５は、低酸素デバイスの例示である。体内やマイクロ流体デバイス内で、細胞は、生存するために酸素を必要とする。多くの場合に、細胞は、取得した酸素の量に基づいて非常に様々な応答をする。あまりにも少ない（低酸素）と、細胞は、異常な行動をするか、または死滅し、あまりにも多い（酸素過剰）と、細胞はまた、異常な行動をするか、または死滅する。通常の室内の酸素濃度は、約２１％であり、体内では、２〜５％ほどである。（酸素レベルを２〜５％に保持する）低酸素デバイスは、前途有望な研究分野である。この低酸素デバイスは、培地チャネル左側及び／または右側に１つ又はそれ以上（例えば、２つ）のチャネルを走らせ、これらの追加のチャネルは、窒素ガスで充填される。例えば、チャネルの並びは図に示されるようなものである。窒素チャネル１−＞培地チャネル１−＞ゲルケージ−＞培地チャネル２−＞窒素チャネル２。室内圧力よりも高い圧力においてこれらのチャネルを通って窒素ガスを流すことによって、酸素がＰＤＭＳから継続的に押し出され、細胞を低酸素状態にすることができる。培地は溶解した酸素を含むこともできるが、これを制御できるか、または培地が静的な流れを有することができる（流れを有さないことができる）ので、培地内の溶解した酸素が細胞によってゆっくりと使い果たされる。
【図２６】図２６は、ゲル領域が平行であるハイスループット多重デバイスを示す。このデバイスは、単一種類の培養のために利用可能なゲルを増加させるか、または、培地が単一の培地ポートに注入された場合に、ゲルに植え込まれた異なる細胞型が同じ培地条件にさらされることを可能にする。多くの培地ポートを通って培地を注入する時に、各ゲルは、異なる２つの培地条件にさらすことができる。この様式において、ゲル領域１は、培地条件１とみなすことができるが、ゲル領域２は、培地条件２及び培地条件３などとみなすことができる。これは、ある細胞型がゲル中で懸濁される間の、その細胞に対する異なる培地条件（例えば、薬物、圧力差など）の影響に関する迅速な調査を可能にする。培地チャネルの隔壁は、ゲルチャネル内で細胞からの細胞分泌物の混合がないことを許す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書は、例えば、薬物スクリーニング、オーダーメイド医療、再生医療、創傷治癒、及び他の適用のための、三次元バイオアッセイとして使用できるマイクロ流体デバイスを提供する。デバイスは、小さいポリマーブロック内に一連のチャネル（例えば、小さい流体チャネル）を有し、１つ又はそれ以上のチャネルは、ポストによって適所に保持されている、コラーゲンなどの生体関連ゲルで充填することができる。本明細書に示されるように、デバイスが、内皮細胞などの細胞で覆われると、細胞が三次元で成長するのに充分な厚さであるゲル内で新たな血管が成長する。例えば、流体チャネルなどの他のチャネルは、薬物又は生体材料が三次元細胞成長にさらされることを可能にする。内皮細胞などの細胞を培養でき、それらが三次元ゲル足場の表面で成長するのを観察でき、ここでは、例えば、血管新生の速度、更にはガン細胞間の血管新生及びガン細胞外の血管新生の速度も測定できる。
【００２８】
このように、特定の実施態様において、デバイスは、インビトロで新たな血管を成長させ、新たな血管が様々な目的のために形成されるマイクロ環境を容易に変更するように使用することができる。これは、他の用途の中でも、ガン転移抑制薬の創薬用途、ガン成長抑制薬の創薬、再生医療及び創傷治癒の薬物の創薬、化学誘引物質及び／または化学反発物質の同定、及び患者に対する上記薬物の適切な用量や組み合わせの整合などにおいて有用である。例えば、個々の患者に最良の薬物を適合させるために、患者の腫瘍の組織生検材料を、患者の内皮細胞の培養物または内皮細胞株からの細胞の培養物のいずれかと共にデバイス内に配置することができる。異なる血管新生抑制薬と異なる転移抑制薬もまた、デバイス内に配置してもよく、デバイスは、個々のガンが薬物に応答する程度を決定するのを助ける。例えば同じチップ上に直列又は並列でこれらのデバイスのいくつかを一緒に、独立した流体チャネル又は共有の流体チャネルと連結することによって、ハイスループットデバイスを取得できる。さらなる変更が、注入、皮下注射シリンジ、またはポートを通じたマイクロマニピュレータによる配置のいずれかによって、生検ガン組織サンプルまたは生検ヒト組織サンプルなどの組織サンプルの全てを配置することを可能にする。デバイスはまた、血管が新生された筋肉などの組織のインビボでの発達を制御するために使用できる。
【００２９】
従って、一態様において、本発明は、光学的に透明な材料で構成される基材を備えるマイクロ流体デバイスに関する。基材は、１つ又はそれ以上の流体チャネル、１つ又はそれ以上の流体チャネル入口、１つ又はそれ以上の流体チャネル出口、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、及び複数のポストを備える。デバイスにおいて、各ゲルケージ領域の全部又は一部は、１つ又はそれ以上の流体チャネルの少なくとも１つの全部又は一部が側面に配置されることにより、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域を作り出し、複数のポストは、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域又は１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域にある。他の態様におい、基材の表面上のゲルの接触角度とポストの（１つ又はそれ以上の）角の内角との合計は約１８０°である。
【００３０】
本明細書において使用されるように、「マイクロ流体デバイス」は、典型的には小型スケール（マイクロリットル、ナノリットリ、ピコリットル）で流体及び／又はゲルの流れ及び／又は閉じ込めのための領域、チャネル、及び／またはチャンバを有するデバイスを示す。視覚化を容易にするために、マイクロ流体デバイスは、典型的には、本明細書において「光学的に透明な材料」と呼ばれる、光に対して透明な基材で構成される。当業者に理解されるように、適切な光学的に透明な材料は、ポリマー、プラスチック、及びガラスを含む。適切なポリマーの例は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ＳＵ−８、及び環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）である。特定の実施態様において、デバイスの全部又は一部は、生体適合性材料で作られ、例えば、材料は、生きている材料（例えば、細胞、組織）と適合性があるか、生きている材料に対して毒性がないか、又は生きている材料に対して有害でない材料である。
【００３１】
領域、チャネル、チャンバ
光学的に透明な材料はさらに、流体、ゲルなどの閉じ込めのための１つ又はそれ以上の画定された領域、チャネル、及び／またはチャンバを備える。一実施態様において、デバイスは、デバイスの意図した用途に適した、１本、２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、１０本、１１本、１２本、１３本、１４本、１５本、１６本、１７本、１８本、１９本、２０本、３０本、４０本、５０本、６０本、７０本、８０本、９０本、１００本など、又は任意の数のチャネルを備える。一部の領域、チャネル、及び／又はチャンバは、評価される（１つ又はそれ以上の）流体（例えば、細胞培養培地）、細胞物質、組織、及び／又は化合物（例えば、薬物）を含有するように使用することができるが、他のものは、ゲル（例えば、コラーゲンまたはＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）などの生体関連ゲル）を含有するように使用してもよい。
【００３２】
一態様において、デバイスは、１つ又はそれ以上の流体チャネルを備え、各流体チャネルは、主要な流れ方向（流体が主に流れる方向）を有する。１つ又はそれ以上の流体チャネルは、同じ主要な流れ方向又は異なる主要な流れ方向を有することができる。当業者に理解されるように、流体チャネルの数は、意図した用途に従って変化する。一実施態様において、デバイスは、１本、２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、１０本、１１本、１２本、１３本、１４本、１５本、１６本、１７本、１８本、１９本、２０本、３０本、４０本、５０本、６０本、７０本、８０本、９０本、１００本など、又はあらゆる任意の数の流体チャネルを備える。一態様においては、１本の流体チャネルがある。別の態様においては、２本の流体チャネルがある。さらに別の態様においては、３本の流体チャネルがある。
【００３３】
さらに別の態様において、デバイスは、静水圧の均等化のためにデバイス内で他の領域又はチャネルに接続する（１つ又はそれ以上の；複数の）高流体抵抗バイパスチャネル（または「均等化チャネル」）を備える（例えば、図１を参照されたい）。バイパスチャネルは、例えば、１つのチャネルが、充填後に、入口ポートに残っている流体の他の液滴よりも大きい液滴を有する時に圧力を均等化することを助けるために含むことができる。バイパスチャネルがなければ、２本のチャネル間で圧力を均等化するように動く流体の全てがコラーゲンを通って動き、かなりの数の細胞をコラーゲンの中に押す。静水圧の差によって一定量をこのように押すことは、ゲル内に細胞（例えば、ゲル−媒質の界面上に融合性単層を作る内皮細胞）を播種することに有用であるが、一部の例において、静水圧の差があまりに多いと、ゲルケージ領域−流体チャネルの界面上で数層の内皮細胞を押し始めることもある。数層を用いると、内皮細胞は自然環境で働くようには働かない。バイパスチャネルは、内皮細胞の最初の層をゲル上に押すために静水圧の最初の噴出を提供するが、それから別の層が形成される前に圧力を均等化することができる。こうして「バイパス」チャネルは、コラーゲンマトリックスを通過する間質流を減少／排除するために上流圧力を均等化するために有用である。バイパスチャネルは、流れ制御ポートを有していても有していなくてもよい。流れ制御ポートは、１つ又はそれ以上の媒質ポートが一定の流れの投入を有する（例えば、１つ又はそれ以上の媒質ポートの中にポンプ注入された媒質が、単一の流れ制御ポートから流れる）時に、バイパスチャネルが媒質に対するコレクタとして働くことを許容できる。
【００３４】
高抵抗「バイパス」チャネルの主な用途は、主要な培地チャネルにおける流れを用いる長期の実験の間に間質流を減少させることである。流路におけるわずかなインピーダンスの非対称性により、入口ポートにおける媒質リザーバーは、異なる速度で廃液でき、このことが、媒質リザーバーが時の経過と共にチャネルに供給している圧力水頭を変える。「バイパス」チャネルは、対称的な圧力及び流速の境界条件を強化することを助け、流路−ゲルケージ領域の界面がデバイスに生じる。
【００３５】
当業者に理解されるように、流体チャネルを、様々な形状に形成することができ、意図されるデバイスの用途に依存するだろう。例えば、（１つ又はそれ以上の）流体チャネルの全部又は一部は、線形であっても、湾曲状（例えば、蛇行状またはＳ字型）であっても、放射状（例えば、中央部分若しくは中央領域から離れるように放射すること、または中央部分若しくは中央領域に向かって収束すること、例えば、Ｖ字型、Ｕ字型、Ｃ字型）であっても、楕円形（例えば、円形）であっても、長方形（例えば、正方形）であっても、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【００３６】
デバイスが２つ以上の流体チャネルを備えるある態様において、流体チャネルを、チャネルの長さの全部又は一部に対して互いに平行に走らせることができる。他の態様において、流体チャネルは、チャネルの長さの全部又は一部について互いに向かって、及び／又は互いから離れ合うように融合させることができる。他の態様において、流体チャネルは、チャネルの長さの全部または一部に沿って物理的に接続される。他の態様において、１つ又はそれ以上の流路は、デバイスを通るよりもより対称的な流体流を確立するのを助けるように（例えば、高抵抗チャネルを融合させることを介してか、またはより細い高抵抗チャネルを介してかのいずれかで）接続することができる。さらに別の実施態様において、流体チャネルは、チャネルの長さに沿って物理的に接続されていない。すなわち、流体チャネルは、互いから独立している。さらなる態様において、１つ又はそれ以上の流体チャネルを備えるデバイスは、静的または動的な流体（例えば、培地）流条件のいずれかで保持できる。
【００３７】
デバイスはさらに、１つ又はそれ以上の流体入口と１つ又はそれ以上の流体出口とを備える。当業者に理解されるように、各流体チャネルは、そのチャネル自体の流体チャネル入口及び／又は流体チャネル出口を有することができ、あるいは１つ又はそれ以上の流体チャネルは、流体チャネル入口及び／又は流体チャネル出口を共有することができる。さらに、デバイスはまた、単一の流体チャネル入口及び／又は単一の流体チャネル出口を備えることができる。
【００３８】
デバイスはまた、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域を備えることができ、やはり当業者に理解されるように、ゲルケージ領域の数は、意図した用途に従って変化する。特定の態様において、デバイスは、１本、２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、１０本、１１本、１２本、１３本、１４本、１５本、１６本、１７本、１８本、１９本、２０本、３０本、４０本、５０本、６０本、７０本、８０本、９０本、１００本など、またはあらゆる任意の数のゲルチャネルを備える。特定の態様において、デバイスは１つのゲルケージ領域を備える。他の態様において、デバイスは２つのケージ領域を備える。さらに別の態様において、デバイスは３つのゲルケージ領域を備える。デバイス内の複数のゲルケージ領域は、様々な方法で組織化できる。例えば、デバイス（例えば、単一のマイクロ流体デバイス）内の複数のゲルケージ領域を、互いに直列及び／または並列に配置することができる。
【００３９】
流体チャネルに関して、ゲルケージ領域は、様々な形状に形成させることができ、デバイスの意図した用途に依存するだろう。例えば、（１つ又はそれ以上の）ゲルケージ領域の全部又は一部は、線形（例えば、ゲルチャネル）、湾曲状（例えば、蛇行状またはＳ字型）、放射状（例えば、中央部分若しくは中央領域から離れるように放射すること、または中央部分若しくは中央領域に向かって収束すること、例えば、Ｖ字型、Ｕ字型、Ｃ字型）、楕円形（例えば、円形）、長方形（例えば、正方形）など、又はそれらの組み合わせである。一態様において、ゲルゲージ領域はゲルチャネルの形態である。他の態様において、ゲルケージ領域は「Ｔ」字型の形態である。さらに別の態様において、ゲルケージ領域は正方形の形態である。さらに別の態様において、ゲルケージ領域は三日月形（例えば、半月）の形態である。
【００４０】
必要に応じて、デバイスはさらに、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域入口及び／又は１つ又はそれ以上のゲルケージ領域出口を備えることができる。流体チャネルに関して、各ケージ領域は、ケージ自体のケージ領域入口及び／又はケージ領域出口を有することができ、あるいは１つ又はそれ以上のゲルケージ領域は、ケージ領域入口及び／又はケージ領域出口を共有することができる。さらに、デバイスはまた、単一のゲルチャネル入口及び／又は単一のケージ領域出口を備えることができる。
【００４１】
特定の実施態様において、各ケージ領域の全部又は一部は、１つ又はそれ以上の流体チャネルの少なくとも１つの全部又は一部が側面に配置されることにより、１つ又はそれ以上の「ゲルケージ領域（例えば、ゲルチャネル）−流体チャネルの界面領域」を作り出す。本明細書において使用されるように、「側面に配置される」は、ゲルケージ領域の側面の一方又はそれぞれ（例えば、両方）に（１つ又はそれ以上の）流体チャネルの全部又は一部を有するゲルケージ領域を示し、すなわち、流体チャネルの全部又は一部が、ケージ領域の一方側又は各側に置かれる（例えば、第１の流体チャネルの全部又は一部が、第１のゲルケージ領域の一方側の全部又は一部に沿って走り、第１の流体チャネルの全部又は一部が、第１のゲルケージ領域の一方側の全部又は一部に沿って走り、第２の流体チャネルの全部又は一部が、第１のゲルケージ領域の他方側に沿って走る）。特定の実施態様において、１つ又はそれ以上の流体チャネルの全部又は一部は、１つ又はそれ以上のケージ領域の全部又は一部と接触（例えば、直接接触）している。特定の態様において、ゲルチャネル（複数を含む）から流体チャネル（複数を含む）を離す（またはゲルチャネル（複数を含む）から流体チャネル（複数を含む）を線引きする）もの全ては、１つ又はそれ以上のポストである。従って、ゲルが１つ又はそれ以上のゲルケージ領域に存在する時に、ゲル（複数を含む）は、１つ又はそれ以上の流体チャネルに存在するあらゆる流体と接触させることができる。特定の実施態様において、ゲルケージ領域の各側は、流体チャネルと接触している。他の実施態様において、（１つ又はそれ以上の）ゲルケージ領域の全部又は一部は、別の（１つ又はそれ以上の）ゲルケージ領域の全部又は一部が側面に配置されることにより、１つ又はそれ以上の「ゲルケージ領域−ゲルケージ領域の界面領域」を作り出す。当業者が理解するように、意図した用途に応じて、（１つ又はそれ以上の）ゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域、ゲルケージ領域−ゲルケージ領域の界面領域、流体チャネル−流体チャネルの界面領域、及びそれらの複合体（例えば、流体チャネル−ゲルチャネル−流体チャネル、流体チャネル−流体チャネル−ゲルチャネル−流体チャネル−ゲルチャネル、流体チャネル−ゲルチャネル−ゲルチャネル−流体チャネル、流体チャネル−ゲルチャネル−流体チャネル−ゲルチャネルなど）などの様々な界面領域が存在してよい。
【００４２】
一態様において、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域の長さの全て（全長）（又は長さの実質部分）は、１つ又はそれ以上の流体チャネルの長さの全て（全長）（または長さの実質部分）が側面に配置される。別の実施態様において、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域の全部又は一部は、１つ又はそれ以上の流体チャネルの全部又は一部に対して平行である。別の態様において、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域の長さの実質部分は、１つ又はそれ以上の流体チャネルの長さの実質部分が側面に配置されない。さらに別の態様において、１つ又はそれ以上の流体チャネルと１つ又はそれ以上のゲルケージ領域とは、界面（例えば、ゲル−流体の界面領域）において互いに収束する（例えば、物理的に接続する）。
【００４３】
ポスト
１つ又はそれ以上のゲルケージ領域内で、及び／又は（例えば、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域は互いに対して平行に走るので）１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域の境界に、複数の「ポスト」または「マイクロポスト」（例えば、約０．１ｍｍの幅、０．１ｍｍの長さ、及び０．２５ｍｍの高さ）がある。ポストの重要な特徴は、形状、寸法、そして間隔を含む。形状は、ゲル−液体の界面の配向に影響を与え（例えば、ゲル−液体の界面は、ポストの外側と同一平面になるように作られ、平坦であっても、又は湾曲していてもよい）、寸法は、デバイスを製造する困難さに影響を与え、間隔は、ゲル充填の間にゲル−液体の界面にわたって支持できる圧力に影響を与える。
【００４４】
特にハイスループットデバイス（ＨＴＤ）として使用するためにデバイスを設計し、ゲル領域の長さを延伸し、そして均一なゲル−流体の界面領域を達成する際に２つの主要な目的があった。より長いゲル領域は、より長い単層をデバイス内で形成することを可能にする。次に、これが、デバイス内でのより多くの数の細胞観察（従って、ＨＴＤ）を可能にし、これが、より統計学的に有意な結果をもたらすことを可能にする。ゲルケージ領域−流体領域の界面における不均一性は、場に不規則性をもたらす可能性があり、これが、制御不能な細胞観察をもたらす。本明細書に記載されるように、これらの２つの目的は、ポストの設計を介して対処された。
【００４５】
延伸したゲル領域は、ゲルマトリックスを収容するゲルポストの形状及び間隔を最適化することによって得ることができる。ゲルポスト最適化問題において固有のトレードオフが存在する。密な間隔のポストを使用することは、丈夫なゲルケージをもたらすが、デバイスの有効範囲を減少させ、結果としてスループットを減少させる一方、間隔が広いポストを使用することは、スループットの点では望ましいが、デバイスがゲル破損を起こしやすいという結果となり得、無駄になる可能性がある。本明細書にさらに記載されているように、ポストの形状は、実験観察のために均一な表面を提供するようにゲルの湾曲や膨隆の影響を最小化するように最適化された。
【００４６】
ポストは、デバイスの有効なゲルの長さを減少させるので、ポストの設置面積は可能な限り減少させた。しかしながら、ポストは、デバイス内にある時、ゲル（例えば、コラーゲン溶液）を収容する。最終的に、ポストの性能に影響を与える３つの主な態様がある。全体的な形状、角の角度、及び表面の粗さである。表面の粗さは、製作プロセスに依存する。
【００４７】
全体的なポストの形状
ポストは、様々な形状に形成することができ、デバイスの意図した用途に依存するだろう。例えば、ポストは、楕円形（例えば、円形）、長方形（例えば、正方形）、三角形、台形、六角形、涙滴形など、又はそれらの組み合わせの形態にできる。特定の態様において、ポストの形状は正方形の形状である。別の態様において、ポストは三角形の形状である。さらに別の態様において、ポストは台形の形状である。特定の態様において、各ポストの高さ対幅の比は、約１〜約４である。
【００４８】
本明細書において考察されるように、デバイスの寸法に依存して、ポストの形状は正方形であってよい（例えば、本明細書に記載されているスパイダーデバイスを参照されたい）。しかしながら、一部のデバイスにおいて、正方形のポスト（例えば、約１２０μｍの高さを有する約１００マイクロメートル（μｍ）×約１００マイクロメートル）は問題を引き起こした。ゲル領域を充填しすぎて、（ポスト間の）１つ又はそれ以上のゲル−培地の界面領域に培地チャネルへの漏れを容易に起こした。これは、多くの場合、全培地チャネルをふさぎデバイスを損なわせるほど深刻である。適切に充填した場合でさえ、より一般的に生じることは、表面張力によって引き起こされるわずかな膨隆であった。これは、細胞が依然として膨隆を覆って単層を形成できるので実験にはほとんど影響がないが、煩わしいものであった。別の一般的な問題は、不充分な充填におけるものであった。これは、細胞が中で凝集する「洞穴」を作り出す。細胞の凝集は、細胞の厚い多層コーティングを形成し、そのゲル−培地の界面領域が損なわれる。
【００４９】
適切な条件の下でさえ、膨隆は依然として顕著であった。本明細書に示されるように、ゲルの湾曲は、ポストが表面上でゲルの液滴の自然な形状により良く適合する場合には平坦にすることができる。ゲルの液滴の周りにポストを形成することは、鋭角（９０度未満）を必要としたので、三角形形状やそれらの変化形形状を調べた。もちろん、これは、正確な角度、すなわち液滴のサイズを提供せず、従って、使用される角度は、液滴がどの程度大きいかに依存する。
【００５０】
図３を参照されたい。図３は、鋭角を使用することが必要であったゲルの液滴にポストを適合させることを説明している。図３に示されるように、ポストの両側に２つの液滴を置くことは、三角形のポスト形状を示す。ポストの正確な角度は、基材の表面でのゲルの接触角度によって決定される。
【００５１】
本明細書で使用されているように、「接触角度」は、液体／蒸気の界面が固体表面と接触する角度である（図３）。接触角度は、何れか所定のシステムに特異的であり、３つの界面にわたる相互作用によって決定される。最も多くの場合に、その概念は、平坦な水平方向の固体表面上にある小さな液滴を用いて説明される。液滴の形状は、ヤングの関係式によって決定される。接触角度は境界条件の役割を果たす。接触角度は、接触角度ゴニオメータを使用して測定される。接触角度は、液体／蒸気の界面には限定されず、接触角度は２つの液体又は２つの蒸気の界面にも等しく適用可能である。
【００５２】
本明細書の目的のために、固体表面上の液滴を考慮する。液体が非常に強固に固体表面に引き付けられている（例えば、親水性の強い固体上の水）場合、液滴は固体表面上で完全に広がり、接触角度は０°に近くなる。親水性があまり強くない固体は、最大で９０°の接触角度を有する。親水性の高い表面の多くで、水の液滴は０°〜３０°の接触角度を示す。固体表面が疎水性の場合には、接触角度は９０°よりも大きい。疎水性が高い表面では、表面は、例えばフッ素化された表面などの低エネルギー材料上で〜１２０°ほどの高い水接触角度を有する。しかしながら、高度に粗い表面を有する一部の材料は、１５０°を超える水接触角度を有することがある。
【００５３】
ポストの角の角度
本明細書に記載されているように、特定のマイクロ流体デバイスに最適なポストの形状が確認された。ポストの角に対する鋭角と、ゲルと基材の表面との間に形成された接触角度は、一対の補角を形成することが見出され、これらの２つの角度の測定の合計角度は１８０°に等しい。図３を参照されたい。すなわち、ポストの角に対する正しい鋭角は、ゲルと基材表面との間に形成された接触角度の補角である角度である。特定の実施態様において、こうした特定の鋭角を有する三角形及び／又は台形のポストが使用される。他の実施態様において、正方形のポストが使用される（例えば、スパイダーデバイス）。しかしながら、当業者に理解されるように、特定のデバイスが、本明細書において特定のポストを用いて例示されているが、所望により、異なるポストの形状を使用できる。
【００５４】
上述のように、概して、接触角度は、液体の液滴が載っている表面と液体の液滴が接触する角度である。疎水性表面は水の液滴を「丸める」が、親水性表面は液滴を広げる。ゲルは主に水であるので、基材の疎水性は、ゲルの液滴が基材の表面に接触する角度に影響を与える。基材のゲル−液体の界面上に載るポストの角度と、ゲルの液滴が基材上に載る時のゲルの液滴の接触内角とは補角（すなわち、これらの２つの角度の合計の角度測定値は１８０°である）。これは、使用されるゲル−流体の界面で接触するポストの内角が、使用される材料と、血漿チャネルへの暴露、または化学物質、もしくはポリ−Ｄ−リジンなどのタンパク質でのコーティングなどの、ゲル組成物の基材の表面処理とに依存することを意味する。ポストの何れかの角の内角は、ポストの角がゲル−流体の界面に接触する場所である。この場合、例えば、ゲルチャネルの中央に向かって「内側」に向かう台形の角度は、ゲルだけを「見る」が、他の２つの内角は、ゲルと培地とを「見る」。ポストに対して正しい角度を使用することが、ゲル充填を大いに容易にして、そして正方形や他の形状を用いては達成することが非常に困難である平坦なコラーゲン−培地の界面を可能にする。一実施態様において、内角は、約９０°、約８０°、約７０°、約６０°、約５０°、約４０°、約３０°、約２０°以下である。特定の実施態様において、内角は約６０°である。
【００５５】
一実施態様において、三角形の３つの角度の２つに対して上述の補角を形成する三角形形状が、ポストに対して使用される。別の実施態様において、ゲルを用いてデバイスを装填する際に、より良好なゲルの流れを可能にする台形形状が、ポストに対して使用される。特に、１つ又はそれ以上のポストは、二等辺三角形、二等辺台形、又はそれらの組み合わせの形状である。
【００５６】
このように、接触角度は、基材材料（デバイスの素材）と表面処理とに依存する。例えば、ＰＤＭＳを用いて、１．５分間ピンク血漿に暴露する表面処理し、続いてポリ−Ｄ−リジン（細胞接着剤の一種）でコーティングし、そしてデバイスを洗浄及び焼成処理すると、約１２１°の接触角度が得られるだろう。これは、ポストの角の内角に対する約５９°の補角が、デバイス内のゲル−流体の界面で収束することを示す。ポリ−Ｄ−リジンは、大部分の親水性表面に容易に吸収され細胞に非特異的に結合するポリペプチドである。ポリ−Ｄ−リジンは、基材に対するコラーゲンの付着を促進する。このデバイスは疎水性表面であり、水はこの処理された表面上では非常に球状になろうとする。当業者に理解されるように、補角は製造目的のために約６０°に丸めることができる。
【００５７】
論理的には、基材に９０°の接触角度を有するよう設計されている表面処理を与えた場合、正方形のポストで充分である。これが、このゲル収容概念の限界である。しかしながら、三角形又は台形の形状が、ゲルがチャネルを通ってより良好に流れることを可能にするので、選択された。狭いゲルチャネルを通って流れるのはより困難であるが、三角形の内側に向いた先端を切断して、チャネルの有効幅を増加させた。適切な表面処理と組み合わせた適切なポストは、平坦なゲル−界面の境界をもたらすことができる。
【００５８】
特定の実施態様において、台形ポストと同様に、各側が約０．１ｍｍである三角形ポストが、一般的である。しかしながら、本明細書に記載されているように、スパイダーデバイスや生検（半月形）デバイスの実施態様などの他のデバイスに対するポストは、例えば、円形、正方形、鐘形、その他の任意の形状など、何れの形状であってもよい。マイクロポストは、０．２ｍｍ離れてよいが、これは、ゲルの厚さ、デバイス構造の材料特性、デバイス表面の改変、及び他の多くの要因に依存して長くなったり短くなったりしてよい。ポスト又はマイクロポストは、ゲルケージ領域の長さに沿って一種の「ゲルケージ」を形成する。マイクロポストは、コラーゲンやその他の種類のゲルなどの生体関連ゲルでデバイスを充填することを可能にするように設計される。マイクロポスト間のゲルの表面張力が、ポスト内に含有されたゲルを保持する。台形や三角形の形状は、概して「尖った」端が細胞から離れてゲルに向かうように向いている特定のデバイスにおいて最も効果的であることが分かった。尖った端は、表面接触角度に従った内角であり、これらの端は培地チャネルに向いている。ある態様において、ポストは、概して、接続された２つの平行なチャネル間の境界に沿って並び、接続された２つの平行なチャネルの一方のチャネルは、例えば培養培地または細胞物質などの流体のために保留されるが、他方のチャネルは、何れかの生体関連ゲルで充填される。ポストのパターンによって作られた形状、すなわちゲルケージの形状は変化してもよい。デバイスのある態様は、互いに平行に走るチャネルの長さを分けるために三角形形状のポストの２つの平行な列を含み、残りの２つの側を構成するチャネル入口とチャネル出口とを有する長方形を形成する。円形や半円形などの他の形状をポストによって形成でき、マイクロポストのその他何れかの形状、何れかの形状のマイクロポストを使用してもよい。
【００５９】
特定の実施態様において、ポスト間の距離が、充填の間にゲル−流体の境界間の持続可能な圧力低下を最大化するために、ポスト間の距離がゲルケージ領域の中心に向かうよりも（ゲル−流体（ゲルケージ領域−流体チャネル）の界面における）ゲルケージ領域の縁に近くなるようにポストをは配向する。例としては、三角形又は台形のポストを有するデバイスを含み、ポストの上部又は先端は、ゲルケージ領域の中心に向かって向き、ポストの基部は、流体−ゲルの界面にある。
【００６０】
空気−ゲルの界面にわたる圧力低下は、ΔＰ＝γ（ｌ／ＲＸ＋ｌ／ＲＺ）によって与えられ、ΔＰは圧力低下であり、γは表面張力であり、ＲＸとＲＺとはゲル界面の湾曲半径である。充填プロセスの間の圧力摂動に耐えるゲル界面は、大きいΔＰを有することのできるものである。従って、ΔＰを最大化するγ、ＲＸ、及びＲＺを選択することが望ましい。γはゲル流体の性質であるので、あまり変更することはできない。ＲＺはチャネルの高さに依存するので、ＲＸがポスト間隔と関連付けできる残っている唯一のパラメータである。このように、ＲＸを最小化することが望ましく、これは、隣接する２つのポスト間の最も近い地点におけるポストの間隔の２倍に等しい。
【００６１】
収束する幾何形状は、より小さい半径をもたらし、充填の間のより良好な閉じ込めのために高い圧力低下を与える。本明細書で使用されるような、「収束すること」とは、ゲルはゲルチャネルの中心からゲルチャネルの外側に向かって流れるので、ゲルが接触するポスト間の間隔が減少する時を指す。充填後、接触角度は（より）平坦なゲル−流体の界面を作り出す。分岐する幾何形状はより大きな半径を作り出し、これは、充填のための高い圧力に耐えることができない。
【００６２】
本明細書で望まれる特性は、疎水性表面に関して、ゲル領域の中心から流体領域に動くにつれて、ポストの幾何形状が収束されなければならいということである。このことはゲル充填を安定したプロセスにするので重要である。三角形及び台形のポストは、特定のデバイスでこの効果を達成するポストの例である。充填の間、デバイスの上流端において膨隆が生じ、デバイスの長さに沿って減少する。充填後、（静止流体）圧力は釣り合い、余分な膨隆量はデバイス全体に拡散される。
【００６３】
表面の粗さ
表面張力はゲルチャネルの境界内にゲルを保持する。ゲルの表面がポスト、ゲル、及び培地の接触点（ポストの外側の角）において粗いポストに適合しようとすると、ポストの粗い表面がゲルの表面上に小さな応力点を生じさせる。これは、ポストから表面張力を「破壊」することも、そして培地チャネルに漏れることもなく、注入段階の間にゲルに加えることができる全圧力を低下させる効果を有する。すなわち、粗い表面は、ゲルチャネルを適切に充填することをより困難にする。特定の実施態様において、ポストは基材と同じ材料で作られる。
【００６４】
ポストの配置
デバイス内の複数のポストは、デバイス内に様々な配向で配置させることができ、デバイスに対して意図された用途に依存する。例えば、デバイス内の複数のポストの全部又は一部を、単一の列、２つ又はそれ以上の平行な列、「Ｔ」字型、円形、半円形、長方形など、又はそれらの組み合わせで配置することができる。
【００６５】
特定の態様において、各ゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域又は各ゲルケージ領域は、２つの平行な列のポストを備え、ポストの各列は、各ゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域の長さに沿っており、一方の列は、ゲルケージ領域の内側境界に沿っており、他方の列は、ゲルチャネルの外側境界に沿っていることにより、ゲルチャネルを形成する。デバイスのゲル領域は、２列のポストを備えるケージによって形成され、一方の列は、流体−ゲルまたはゲル−ゲルの界面間に１つの境界を形成し、もう一方の列は、全く異なる別の流体−ゲル又はゲル−ゲルの界面間に全く異なる境界を形成する。ポストのサイズと形状とは、有効性を最大化するように変えることができる。さらに、ポストの寸法、ポストの間隔、及びポストの形状は、ゲル領域内でのゲル充填を可能にするように選択される。
【００６６】
本明細書で提供されるデバイスは、例えば、０．１２５ｍｍのポスト間隔を有する６６部位（ポスト間に６６エリア）を有し、８．２５ｍｍの全ゲル領域（例えば、全線形領域）をｍもたらすことができる。従来のデバイスは、何れかの１つのチャネルに対して０．９ｍｍのゲル−流体の界面を提示できるだけであるが、本明細書に記載されているデバイスは、例えば、何れかの１つのゲルチャネルに対して４．１２５ｍｍを提示できて、これは、従来のデバイスと比較して、ゲル−流体の全表面積の約４５８％の増加である。ある態様において、全ゲル領域は、約１．５ｍｍ、約２ｍｍ、約２．５ｍｍ、約３ｍｍ、約３．５ｍｍ、約４ｍｍ、約４．５ｍｍ、約５ｍｍ、約５．５ｍｍ、約６．０ｍｍ、約６．５ｍｍ、約７．０ｍｍ、約７．５ｍｍ、約８．０ｍｍ、約８．５ｍｍ、約９．０ｍｍ、約９．５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、約２５ｍｍなどである。他の態様において、本明細書で提供されるデバイスは、従来のデバイスと比較して、約５０％、約７５％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約２２５％、約２５０％、約２７５％、約３００％、約３２５％、約３５０％、約３７５％、約４００％、約４２５％、約４５０％、約４７５％、約５００％、約５２５％、約５５０％、約５７５％、約６００％、約６２５％、約６５０％、約６７５％、約７００％、約７２５％、約７５０％、約７７５％、約８００％、約８２５％、約８５０％、約８７５％、約９００％、約９２５％、約９５０％、約９７５％、約１０００％などの増加であるゲル−流体の全表面積を提供できる。さらに別の態様において、ｔ個の部位におけるポストからポストまでの距離ｘとして定義される全ゲル領域（例えば、全線形ゲル領域）は、約１００マイクロメートル（μｍ）から約１０メートル（ｍ）、約１マイクロメートルから約１ミリメートル（ｍｍ）、約１ｍｍから約１ｍなどであり得る。
【００６７】
ゲルケージ領域の特性
適切なポスト形状が取得された後、適切なゲルケージ領域の特性を確認した。ゲルケージ内の連続するポスト間の距離、ゲルケージ（例えば、チャネル）の高さ及び幅、並びにゲルケージ領域の長さが、ゲルケージ領域を首尾よく充填する可能性、従ってデバイスを首尾よく製造する可能性を決定する。
【００６８】
適切なポスト形状を用いても、ゲル充填は他の要因に依存する。概して、ゲル充填は、ゲルを注入するために加えられる圧力がゲル−培地の界面の全体に沿った何れかの地点における表面張力よりも常に小さくなければならない前提で誘導される。例えば、１つのポストに欠陥があり、局所的に応力の高い地点を作り出した場合、注入の圧力がその地点で可能な最大表面張力よりも大きいとすぐに、ゲルがその地点でゲルチャネルから漏れ、デバイスを損なう。
【００６９】
概して、低注入圧はゲルをゲルチャネルまで数ミリメートル流すが、チャネルの充填された部分が成長すると、流れる抵抗が大きくなり、デバイスを充填し続けるためには、より大きな圧力が注入部位において必要になる。長いデバイスは、充分に注入するためには大きな圧力を必要とし、あらゆる地点において、注入圧力が局所的な表面張力よりも高く、漏れを引き起こす機会が多いことを意味する。いくつかの要因を、漏れの可能性を少なくするように改変できる。デバイスの寸法の例として図１を参照されたい。これは単なる参照であり、製造モデルの最終的な寸法を反映していない。
【００７０】
ポスト間の距離
ポストの間隔がより近いと、ポスト間の表面張力をより強くする。これは、他の全てのものが等しい場合には、非常に間隔が近いポストを有するチャネルは、間隔が広いポストを有するチャネルよりも遠い距離を充填できることを意味する。しかしながら、間隔が近いポストは、ゲル−培地の相互作用の量を制限し、細胞が三次元ゲルマトリックスの中に成長することをより困難にする。（より幅が広いゲル領域を望む）ユーザに対するデバイスの品質と（幅が広いゲル領域はデバイスを首尾よく充填することをより困難にするので）製造可能性との間のトレードオフが存在する。一実施態様において、ポストからポストへの間隔は、約１マイクロメートルから約５００マイクロメートル、約５マイクロメートルから約４５０マイクロメートル、約１０マイクロメートルから約４００マイクロメートル、または約５０マイクロメートルから約３００マイクロメートルの幅である。他の実施態様において、ポスト間の間隔は、約１０マイクロメートル、約２０マイクロメートル、約３０マイクロメートル、約４０マイクロメートル、約５０マイクロメートル、約６０マイクロメートル、約７０マイクロメートル、約８０マイクロメートル、約９０マイクロメートル、約１００マイクロメートル、約１１０マイクロメートル、約１２０マイクロメートル、約１３０マイクロメートル、約１４０マイクロメートル、約１５０マイクロメートル、約１６０マイクロメートル、約１７０マイクロメートル、約１８０マイクロメートル、約１９０マイクロメートル、約２００マイクロメートル、約２１０マイクロメートル、約２２０マイクロメートル、約２３０マイクロメートル、約２４０マイクロメートル、約２５０マイクロメートル、約２６０マイクロメートル、約２７０マイクロメートル、約２８０マイクロメートル、約２９０マイクロメートル、約３００マイクロメートル、約３１０マイクロメートル、約３２０マイクロメートル、約３３０マイクロメートル、約３４０マイクロメートル、約３５０マイクロメートル、約３６０マイクロメートル、約３７０マイクロメートル、約３８０マイクロメートル、約３９０マイクロメートル、約４００マイクロメートル、約４１０マイクロメートル、約４２０マイクロメートル、約４３０マイクロメートル、約４４０マイクロメートル、約４５０マイクロメートル、約４６０マイクロメートル、約４７０マイクロメートル、約４８０マイクロメートル、約４９０マイクロメートル、約５００マイクロメートルである。特定の実施態様において、各ポストは、約３００マイクロメートルの幅であり、それは、約１２０マイクロメートルのゲル−培地の界面領域を与える。特定の実施態様において、ポストからポストへの間隔は約４２０マイクロメートルである。
【００７１】
ゲルケージ領域の高さ
チャネルの高さは、ポストの間隔と関連する。一態様において、チャネルの高さは、ポスト間の間隔の量とほぼ等しい。上から見た時に比較的真っ直ぐなゲル−培地の界面を用いた場合、その界面を横から見ただけであったとしても依然として何らかの湾曲が存在する。ゲルは依然としてデバイスの上部「天井」と底部「床」とに接触して、それらは、上部−底部の寸法で平坦な界面に対して適切に角度付けられていない。上から見た際の膨隆の場合、これが横から見た時と同じ膨隆（同じ湾曲）であることが望ましい。これは、膨隆が多く見られる一部のデバイスではより重要であるが、ハイスループットデバイスにおいては依然として維持されていた。
【００７２】
より高いデバイスもまたより良い実験結果の助けとなる。細胞は、デバイスの上部天井及び底部天井並びに床などの表面に沿って成長することを好む傾向がある。より高いゲル領域は、上面や底面に粘着するのではなく、細胞に三次元ゲルを進ませようとする。特定の実施態様において、デバイスはまた、培地チャネルからゲルケージ領域までのステップアップ（増大）（例えば、階段状デバイス）を備えることができる。一態様において、流体チャネルとゲルケージ領域との間のステップは、２重ステップ、３重ステップ、４重ステップなどに関する。例えば、デバイスは、約２００μｍの高い培地チャネルと約４００μｍの高いゲルチャネルとを備えることができる。他の実施態様において、１つ又はそれ以上の流体チャネルは、約１０μｍ、約２０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、約１２５ｍ、約１５０μｍ、約１７５μｍ、約２００μｍ、約２２５μｍ、約２５０μｍ、約３００μｍ、約３５０μｍ、約４００μｍ、及び約５００μｍの高さを有し、１つ又はそれ以上のゲルチャネルは、約２０μｍ、約４０μｍ、８０μｍ、約１００μｍ、約１５０μｍ、約２００μｍ、約２５０μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７００μｍ、約８００μｍ、約９００μｍ、及び約１０００μｍの高さを有する。より短い培地チャネルは、培地の使用をより少なくすることを可能にし、これは、希少で高価な培地試薬が使用される時に費用を節約する。より高いゲル領域は、機械的に硬いデバイスの「天井」や「床」からの、より自由な運動及びより少ない相互作用や干渉を可能にする（例えば、図４を参照されたい）。
【００７３】
ゲルチャネルの幅
典型的には、より幅が広いゲルチャネルは充填するのがより容易であり、より幅が狭いチャネルは、より高い抵抗を有するので、充填するためにより圧力を必要とする。流体抵抗は、チャネルの幅と長さとの両方に依存する。デバイスを充填するために必要な圧力が、ポスト間のゲル−培地の界面の表面張力よりも小さい場合には、ゲルは、充填を続け、漏れたりしない。充填されたゲル領域が長くなると、充填するために必要とされる圧力が増加し、最終的にポスト間領域の表面張力に匹敵し、漏れを引き起こす。これは、長いチャネルを充填するためには、ゲルチャネルは（抵抗を減らすために）幅が広くなければならないか、または（表面張力を増やすために）ポストの間隔を短くしなければならないかのいずれかであることを意味する。ポスト間隔、チャネルの幅、及び充填可能なチャネルの最大の長さとの間に相互作用がある。
【００７４】
ゲルケージ領域
他のバージョンのマイクロデバイスは、当時、どのような構成が最も良いか知られていなかったので、ランダムな構成のポストを使用する。ポストは、ケージの内側と周囲に沿ってとの両方で位置決めされた。例えば、３チャネルのデバイスは、全く異なる４つのゲルケージを有し、それぞれが２つのポストを有する。対照的に、本明細書に記載されているデバイスは、２つの平行な列のポストを備えることができ、ゲル充填ポートの出口は、長方形ゲルケージの他方の２つの壁を形成する。
【００７５】
ゲル
本明細書に示すように、デバイスはさらに、ゲルチャネル内にゲルを備えることにより、デバイス内にゲル領域を形成することができる。細胞外マトリックスとして働く何れかの関連のゲル、例えば、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、フィブロネクチンなどを使用することができる。
【００７６】
ある態様において、ゲル領域（単一のゲル領域）の長さは、約１００マイクロメートルから約１００，０００マイクロメートルであってよい。他の態様において、ゲル領域は、約５００マイクロメートル、約１０００マイクロメートル、約５０００マイクロメートル、約１０，０００マイクロメートル、約１５，０００マイクロメートル、約３０，０００マイクロメートル、約５０，０００マイクロメートル、又は約１００，０００マイクロメートルである。当業者に理解されるように、デバイスは、（例えば、互いに直列の、互いに並列の、又はそれらの組み合わせの）複数のゲルケージ領域を有することにより、単一のデバイスにおけるゲル領域の全長を増加させる（例えば、観察エリアを増加させる）ことができる。さらに、複数のゲルケージ領域は、各ゲルケージ領域で同じゲル又は同様なゲルを有することができるか、あるいは複数のゲルケージ領域は、異なるゲル（例えば、組成が異なるゲル、特性（例えば、剛性）が異なるゲルなど、及びそれらの組み合わせ）を有することができる。
【００７７】
このように、他の態様において、デバイスはハイスループット特性のものである。ハイスループットデバイスは、特定の細胞条件を考慮した実験観察を増加させるための必要性に対処する。並列又は直列で行われた観察の数を増加させることは、あまりに多くのデバイスを作る必要を伴うことなく統計学的に有意な細胞培養測定法を取得するという重要な利益を有することにより、実験調査やスクリーニングプロセスを促進する。さらに、単一のデバイスでの観察の数を増加させることはデバイスからデバイスへの変化によって導入されるさらなる変動を最小化する。
【００７８】
所定の条件の組み合わせの下での実験観察の数は、デバイス内での細胞成長領域（例えば、チャネル）の数に直接比例するか、あるいは培養下の細胞によって形成された単層の表面積に直接比例する。本明細書に記載されているハイスループットデバイスは、長さが延長されたゲル領域がチャネル間に配置されることを可能にすることによってこの面積増加を達成する。
【００７９】
このデバイスを本当にハイスループットにするために、これらのゲル領域のいくつかを、互いに対して直列又は並列に配置することができ、別個の流体チャネル、接続された流体チャネル、又は接続性の混合した流体チャネルのいずれかの流体チャネルを、ゲル領域へ及びゲル領域から走らせることができる。
【００８０】
他の実施態様は、生検組織の配置のための円形ゲルケージ領域を含む。この組織は、ゲル領域と接触して配置され、発せられた化学シグナルがゲルを貫通し、実験的に関連するか、または臨床的に関連する薬物に組織をさらすことを可能にする。ゲルチャネル及び／又は流体チャネルはさらに、細胞物質、例えば、細胞、細胞培養培地、組織、成長因子、薬物（治療薬、診断薬）、又はそれらの組み合わせを備えることができる。特定の実施態様において、ゲルケージ領域（例えば、ゲルチャネル）及び／又は流体チャネルはさらに、細胞、例えば、細胞の懸濁液を備えることができる。こうした細胞の例は、ガン細胞、ニューロン、内皮細胞、平滑筋細胞、幹細胞、上皮細胞、又はそれらの組み合わせを含む。特定の実施態様において、細胞は、画像化プロセスを向上させるためにマーカで染色させる。適切なマーカは、何れかの細胞型のアクチンフィラメントを視覚化するためのローダミン−ファロイジン（Invitrogen）、内皮細胞間結合を視覚化するためのＶＥ−カドヘリン抗体、核を視覚化するためのＤＡＰＩ、及びリアルタイム画像化を可能にするためのＧＦＰ−細胞質タンパク質を構成的に発現する細胞株などの蛍光マーカを含む。
【００８１】
別の適用は、流体（例えば、媒質）チャネルの中に挿入することができるカプセル化細胞を使用することである。利点は、細胞が共に移動して混合されることを妨げる一方で、細胞によって分泌された因子が別の細胞集団で機能できることである。
【００８２】
薬物／薬剤のリザーバー、及び／又はデバイス（例えば、オンチップ）上で薬物／薬剤のリザーバーを混合するために必要なチャネルを添加することもまた包含される。
【００８３】
デバイスの特定の実施態様
本明細書で提供されるものは、光学的に透明な材料から構成され、そしてさらに１つ又はそれ以上の流体チャネル、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、及び複数のポストを備えるマイクロ流体デバイスであって、例えば、細胞移動、ガン転移、血管新生、全組織生検を研究するために、及び、創傷治癒、ガン（例えば、転移）及び再生医療（例えば、神経）で使用できる薬剤を発見するために使用できる。これらの代替デバイスにおいて、ゲルケージ領域と流体チャネルとは、そのために設計されポストの形状にあまり依存しない特定の用途を促進するように構成される。
【００８４】
ハイスループットデバイス
一態様において、デバイスは、光学的に透明な材料からなる基材、並びに（ｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル、（ｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル入口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル出口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、及び（ｉｖ）複数のポストを備え、ここで各ゲルケージ領域の全部又は一部は、１つ又はそれ以上の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それにより１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域を作り出し、そして各ゲルケージ領域は、ゲルケージ領域を形成する少なくとも１列のポストを備える（例えば、図１を参照されたい）。別の態様において、デバイスはさらに、少なくとも２つのゲルケージ領域を備え、ゲルケージ領域は、デバイス内で互いに直列で配置される。別の態様において、デバイスはさらに、少なくとも２つのゲルケージ領域を備え、ゲルケージ領域は、デバイス内で互いに並列で配置される。
【００８５】
特定の態様において、各ゲルケージ領域は、ゲルチャネルを形成し、各ゲルチャネルは、２つの平行な列のポストを備え、ポストの各列は、各ゲルチャネルの長さに沿い、一方の列はゲルチャネルの一方側に沿い、他方の列はゲルチャネルの反対側に沿うことにより、各ゲルチャネルの各長さに沿ってゲルケージ領域を形成する。
【００８６】
別の態様において、デバイスは、（ｉ）第１の流体チャネル、（ｉｉ）第２の流体チャネル、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体入口、（ｉｖ）１つ又はそれ以上の流体出口、（ｖ）ゲルチャネルを形成するゲルケージ領域、（ｖｉ）ゲルチャネル入口、及び（ｖｉｉ）複数のポストとを備える。このデバイスにおいて、ゲルチャネルの一方側の全部又は一部は、第１の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第１のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し、ゲルチャネルの他方側の全部又は一部は、第２の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第２のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出す。ゲルチャネルは、２つの平行なポストの列を備え、ポストの各列は、ゲルチャネルの長さに沿い、一方の列は、第１のゲルチャネル−流体チャネルの界面においてゲルチャネルの一方側に沿い、他方の列は、第２のゲルチャネル−流体チャネルの界面においてゲルチャネルの他方側に沿うことにより、ゲルチャネルの長さに沿ってゲルケージ領域を形成し、各ポストは、三角形、台形、又はそれらの組み合わせを形成する。
【００８７】
蛇行状デバイス
さらに別の態様において、デバイスは、（ｉ）第１の流体チャネル、（ｉｉ）第２の流体チャネル、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体入口、（ｉｖ）１つ又はそれ以上の流体出口、（ｖ）第１のゲルチャネルを形成する第１のゲルケージ領域、及び（ｖｉ）複数のポストを備えるデバイスを備える（例えば、図１９Ａ〜図１９Ｃを参照されたい）。このデバイスにおいて、第１のゲルチャネルの一方側の全部又は一部は、第１の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第１のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し、第１のゲルチャネルの他方側の全部又は一部は、第２の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第２のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出す。第１のゲルチャネルは、２つの平行なポストの列を備え、ポストの各列は、第１のゲルチャネルの長さに沿い、一方の列は、第１のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第１のゲルチャネルの一方側に沿い、他方の列は、第２のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第１のゲルチャネルの他方側に沿うことにより、ゲルチャネルの長さに沿って第１のゲルケージ領域を形成する。デバイスはさらに、（ｖｉｉ）ゲルチャネルの形態の第２のゲルケージ領域を備えることにより、第２のゲルチャネルを形成し、そして（ｖｉｉｉ）ゲルチャネルの形態で第３のゲルケージ領域を備えることにより、第３のゲルチャネルを形成する。第２のゲルチャネルの一方側の全部又は一部は、第１の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第３のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し、第２のゲルチャネルの他方側の全部又は一部は、第２の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第４のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出す。第２のゲルチャネルは、２つの平行なポストの列を備え、ポストの各列は、第２のゲルチャネルの長さに沿い、一方の列は、第３のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第２のゲルチャネルの一方側に沿い、他方の列は、第４のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第２のゲルチャネルの他方側に沿うことにより、第２のゲルチャネルの長さに沿ってゲルケージ領域を形成する。さらに、第３のゲルチャネルの一方側の全部又は一部は、第１の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第５のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し、第３のゲルチャネルの他方側の全部又は一部は、第２の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第６のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出す。第３のゲルチャネルは、２つの平行なポストの列を備え、ポストの各列は、第３のゲルチャネルの長さに沿い、一方の列は、第５のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第３のゲルチャネルの一方側に沿い、他方の列は、第６のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第３のゲルチャネルの他方側に沿うことにより、第３のゲルチャネルの長さに沿ってゲルケージ領域を形成する。デバイス内の各ポストは、三角形、台形、又はそれらの組み合わせを形成する。このように、この実施態様においては、各ゲルケージ領域は、第１の流体チャネル及び第２の流体チャネルと接触する。
【００８８】
一態様において、各ゲルケージ領域に対するポストの数は、上部側で１０本、そして底部側で１０本で構成される。このように、この態様において、デバイスは、合計で６０本の機械ポストを有する。
【００８９】
多重化デバイス
別の態様において、デバイスは、光学的に透明な材料で構成された基材、並びに（ｉ）少なくとも３つの流体チャネル、（ｉｉ）少なくとも１つの流体チャネル入口、（ｉｉｉ）少なくとも１つの流体チャネル出口、（ｉｉｉ）少なくとも２つのゲルケージ領域、及び（ｉｖ）複数のポストを備える（例えば、図２６Ａ〜図２６Ｂを参照されたい）。各ゲルケージ領域の全部又は一部は、１つの流体チャネルの全部又は一部が側面に配置されることにより、第１のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域、第２のゲルケージ領域−流体チャネルの界面、及び第３のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域を作り出し、各ゲルケージ領域は、ゲルケージ領域を形成する少なくとも１列のポストを備える。特定の態様において、各ゲルケージ領域は、ゲルチャネルを形成して、各ゲルチャネルは、２つの平行な列のポストを備え、ポストの各列は、各ゲルチャネルの長さに沿い、一方の列は、ゲルチャネルの一方側に沿い、他方の列は、ゲルチャネルの反対側に沿うことにより、各ゲルチャネルのそれぞれの長さに沿ってゲルケージ領域を形成する。
【００９０】
特定の実施態様において、デバイスは、光学的に透明な材料で構成された基材、並びに（ｉ）第１の流体チャネル、（ｉｉ）第２の流体チャネル、（ｉｉｉ）第３の流体チャネル、（ｉｖ）少なくとも１つの流体チャネル入口、（ｖ）少なくとも１つの流体チャネル出口、（ｖｉ）第１のゲルチャネルを形成する第１のゲルケージ領域、（ｖｉｉ）第２のゲルチャネルを形成する第２のゲルケージ領域、及び（ｖｉｉｉ）複数のポストを備える。第１のゲルチャネルの一方側の全部又は一部は、第１の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第１のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し、第１のゲルチャネルの他方側の全部又は一部は、第２の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第２のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出す。第１のゲルチャネルは、２つの平行なポストの列を備え、ポストの各列は、第１のゲルチャネルの長さに沿い、一方の列は、第１のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第１のゲルチャネルの一方側に沿い、他方の列は、第２のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第１のゲルチャネルの他方側に沿うことにより、ゲルチャネルの長さに沿って第１のゲルケージ領域を形成する。第２のゲルチャネルの一方側の全部又は一部は、第２の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第３のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出し、第２のゲルチャネルの他方側の全部又は一部は、第３の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それらに対して平行であることにより、第４のゲルチャネル−流体チャネルの界面領域を作り出す。第２のゲルチャネルは、２つの平行なポストの列を備え、ポストの各列は、第２のゲルチャネルの長さに沿い、一方の列は、第３のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第２のゲルチャネルの一方側に沿い、他方の列は、第４のゲルチャネル−流体チャネルの界面において第２のゲルチャネルの他方側に沿うことにより、ゲルチャネルの長さに沿って第２のゲルケージ領域を形成する。
【００９１】
デバイスはさらに、３つの流体チャネル入口と、１つの流体チャネル出口とを備えることができる。さらに、デバイスはさらに、３つの流体チャネル入口と１つの流体チャネル出口との間に位置決めされたリザーバーを備えることができる。
【００９２】
低酸素デバイス
別の態様において、デバイスは、光学的に透明な材料で構成された基材、並びに（ｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル、（ｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル入口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル出口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、（ｉｖ）１つ又はそれ以上のガスチャネル（ここで、１つ又はそれ以上のガスチャネルの全部又は一部は、１つ又はそれ以上の流体チャネル、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、又はそれらの組み合わせの少なくとも一方側が側面に配置される）、及び（ｖ）複数のポストを備える（例えば、図２５を参照されたい）。各ゲルケージ領域の一方側の全部又は一部は、１つ又はそれ以上の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置されることにより、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域を作り出し、各ゲルケージ領域は、ゲルケージ領域を形成する少なくとも一列のポストを備える。１つ又はそれ以上のガスチャネルは、例えば、酸素を除去するために、デバイスを通過する（１つ又はそれ以上の）ガス（例えば、窒素、水素、ヘリウム、酸化窒素、一酸化炭素）の流れを可能にする。
【００９３】
ナノファイバ膜デバイス
別の態様において、デバイスは、光学的に透明な材料で構成された基材、並びに（ｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル、（ｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル入口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル出口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、（ｉｖ）細胞に対して不透過性であり且つ細胞によって分泌された分子に対して透過性でがある膜（ここで、膜の一方側は、１つ又はそれ以上の流体チャネル、１つ又はそれ以上のゲルチャネル、又はそれらの組み合わせと接触している）、及び（ｖ）複数のポストを備える（例えば、図２４を参照されたい）。各ゲルケージ領域の全部又は一部は、１つ又はそれ以上の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置されることにより、ゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域を１つ又はそれ以上作り出し、各ゲルケージ領域は、ゲルケージ領域を形成する少なくとも１列のポストを備える。デバイスはさらに、（１つ又はそれ以上の）細胞によって分泌された１つ又はそれ以上の分子と特異的に結合する（１つ又はそれ以上の）捕捉剤を備え、捕捉剤は、膜の反対側にあり、膜を通過することができない。本明細書で使用されるような、「捕捉剤」は、細胞によって分泌された分子を直接的又は間接的のいずれかで特異的に認識する（例えば、結合する）物質である。当業者に理解されるように、捕捉剤は、抗体の全部又は抗原性部分、ストレプトアビジン／ビオチンなどを含む。特定の態様において、捕捉剤はガラススライド上にある。さらに別の態様において、捕捉剤は（例えば、さらなる分析のために）デバイスから離すことができる。
【００９４】
スパイダーデバイス
別の態様において、デバイスは、光学的に透明な材料で構成された基材、並びに（ｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル、（ｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル入口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体チャネル出口、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、及び（ｉｖ）複数のポストと備え、ここで、各流体チャネルの一部は、各ゲルケージ領域の一部と接触し、各流体チャネルの残りの部分は、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域から離れるように延伸している（図６Ａ〜図６Ｃを参照されたい）。各ゲルケージ領域は、「Ｔ字型」ゲルケージ領域を形成する３つのポストを備える。
【００９５】
別の態様において、デバイスは、（ｉ）第１の流体チャネル、（ｉｉ）第２の流体チャネル、（ｉｉｉ）第３の流体チャネル、（ｉｖ）１つ又はそれ以上の流体入口、（ｖ）１つ又はそれ以上の流体出口、（ｖｉ）Ｔ字型ゲルを形成するゲルケージ領域、及び（ｖｉｉ）複数のポストを備える。このデバイスにおいて、各流体チャネルの一部は、ゲルケージ領域の一部と接触し、そして各流体チャネルの残りの部分は、ゲルケージ領域から離れるように延伸している。各ゲルケージ領域は、「Ｔ字型」ゲルケージ領域を形成する３つのポストを備える。一態様において、各ポストは正方形を形成する。特定の態様において、流体チャネルは、「Ｃ」、「Ｖ」、「Ｕ」、又はそれらの組み合わせの形状であり、各流体チャネルの中間領域はゲルケージ領域と接触し、そして流体チャネルの各端はゲルケージ領域から離れるように延伸している（例えば、ゲルケージ領域から放射状に離れるように延伸している）。
【００９６】
生検デバイス又は半月形デバイス
別の態様において、デバイスは、（ｉ）第１の流体チャネル、（ｉｉ）第２の流体チャネル、（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の流体入口、（ｉｖ）１つ又はそれ以上の流体出口、（ｖ）楕円形ゲルケージ領域、及び（ｖｉ）複数のポストを備え、ゲルケージ領域の一方側は、第１の流体チャネルが側面に配置されることにより、第１のゲルケージ領域−流体チャネルの界面を作り出し、そしてゲルケージ領域の他方側は、第２の流体チャネルが側面に配置されることにより、第２のゲルケージ領域−流体チャネルの界面を作り出す（図１６Ａを参照されたい）。ゲルケージ領域は、ゲルケージ領域内で中央に配置された２つの平行なポストの列を備えることにより、中央ゲルチャンバを作り出し、一列のポストが、第１のゲルケージ領域−流体チャネルの界面に沿って半円形に配置されることにより、一方側で中央ゲルチャンバの一方側を側面に配置する第１のゲルチャンバを作り出し、そして一列のポストが、第２のゲルケージ領域−流体チャネルの界面において半円形に配置されることにより、中央ゲルチャンバの他方側が側面に配置される第２のゲルチャンバを作り出す。
【００９７】
このように、ある態様において、このデバイスは、３つの隣接するゾーン、すなわち、（１）中央ゲルチャンバ、（２）中央ゲルチャンバが側面に配置される２つの標的組織チャンバ（及び／又はゲルチャンバ）、及び（３）ゲル領域が側面に配置される少なくとも２つの培地チャネルを備える（例えば、そしてデバイスの上面からアクセス可能であってよい）。細胞を、例えば、標的組織チャンバに対する横方向の開口部を使用して中央ゲルチャンバの中に播種することができる。実施例３に示されるように、コラーゲンゲル表面上の底部チャネルに詰め込まれたニューロンは、ゲル中に三次元に軸索を延伸させて、そして成長する軸索を、軸索の応答や回転を定量化するために、軸索の成長の方向に対して直角な化学勾配にさらした。実験研究やコンピュータによる研究は、これらのデバイスで３０分以内に線形の安定した化学勾配を確立することができ、そして最大で４８時間継続したことを示した。細胞培養研究は、これらのデバイスにおいて培養された、海馬ニューロン及び後根神経節ニューロンの移動と軸索誘導に対する化学誘引性（ネトリン−１、脳髄）勾配と化学反発性（ｓｌｉｔ−２）勾配との劇的な効果を明らかにした。これらの３チャネルデバイスにおける安定した化学勾配は、病気／損傷の条件の下でニューロン経路の再生に適する可能性がある薬物をスクリーニングするためだけでなく、ガン細胞の移動や細胞間相互作用を研究するためにも使用できる。
【００９８】
特定の態様において、デバイスの各ゲルケージ領域は、２９本ずつの２つの平行な列で５８本の台形のポストを備えることができる（例えば、ハイスループットデバイス、ナノファイバ膜デバイス）。別の態様において、デバイスの各ゲルケージ領域は、２０本ずつの２列で４０本の台形のポストを備える。別の態様において、デバイスの各ゲルケージ領域は、１０本ずつの２列で２０本の台形のポストを備える（例えば、蛇行状デバイス）。別の態様において、デバイスの各ゲルケージ領域は、７本ずつの２列で１４本の台形のポストを備える（例えば、低酸素デバイス）。別の態様において、デバイスの各ゲルケージ領域は、５本ずつの２平行列で１０本の台形のポストを備える（例えば、多重化デバイス）。別の態様において、デバイスの各ゲルケージ領域は、以下のような構成を有する１６本のポストを備える。その構成では、５本のポストが中央ゲルケージの左側の周りに半円形を形成し、３本のポストが中央ゲルケージの左側を形成し、３本のポストが中央ゲルケージの右側を形成し、そして５本のポストが、ゲルケージの右側の周りに半円形を形成する。ポストは、正方形であるか、又は半円形のポストが半円形の半径と等しい半径を有する丸い外面を有してよい（例えば、生検デバイス又は半円形デバイス）。別の態様において、デバイスの各ゲルケージは、３本の正方形のポストを備える（例えば、スパイダーデバイス）。
【００９９】
任意選択の構成要素
大部分のデバイスに対して行うことができる改変の１つが、１つ又はそれ以上のゲルチャネルの追加、例えば、第１のゲルチャネルの隣に第２のゲルチャネルを追加することである。図５の写真において、第２のゲルチャネルは、内皮細胞などの細胞が培地チャネル１で培養されることを可能にするが、ゲルチャネル１が補充され、培地チャネル２は、乾燥しているか、又は一時的に細胞培養培地で充填する。この技術は、細胞が、他のチャネルを充填することを必要とせずに、ゲル表面上に単層を形成することを可能にする。これは、内皮細胞が単層を形成するために数日間を必要とする場合に有用である一方で、第２のゲル又は培地チャネルに配置されるあらゆる細胞を完全に形成された単層の存在下で播種することを必要とする。第２のゲルチャネルは、様々な方法で大部分のデバイスに追加できる。
【０１００】
さらに、デバイスは、複数のデバイスが、１つのリザーバー又は複数のリザーバーから培地を取り出すことを可能にするように多重化できる。これは、複数のデバイスが、共通の供給源から供給されることを可能にするか、または恐らく、２つの異なる薬物の勾配の設定を可能にする。次いで、異なる薬物濃度の組み合わせを、その勾配から「取り出し」、そして異なる細胞培養部位に供給することができる。
【０１０１】
さらに、生検試料及び／又は組織試料を、培地チャネル又はゲル領域のいずれかに配置することができる。特定の実施態様において、生検試料をゲル領域に配置する。また、これらの「生検」デバイスを使用する際には、生検デバイスは通常、システムが充填されているか又は培地が交換されている間に、特定の位置に生検試料を保持するために必要な数本のポストを含有する。こうした実施態様において、円形又は半円形のゲルケージを使用することができる。
【０１０２】
作成方法
別の態様において、本発明は、デバイスを製作する方法及びその方法によって製作されたデバイスに関する。一実施態様において、デバイスは２つの部分に製造される。（例えば、ポリマー、ガラス、またはプラスチックの）上部部分は、そこにエッチングされたマイクロチャネルを有する。このエッチングは、例えば、マイクロマシニング、フォトリソグラフィ、熱エンボス加工、ソフトリソグラフィ、マイクロ射出成形、又はその他の製造技術を用いて行うことができる。エッチングされたチャネルは、チャネルの「屋根」と「壁」とを作る。チャネルの「床」は、上部部分に結合された（例えば、ポリマー、ガラス、またはプラスチックの）単純な平坦な部分で構成される。デバイスの「床」は、デバイスの「屋根」と「壁」に使用したものと同じ又は同様の材料で作られるか、或いは異なる材料で作られるかのいずれかである。結合は、エポキシなどの様々な方法で行うことができるか、あるいはＰＤＭＳ及びガラスの場合、両方の部分をピンク血漿にさらし、単にそれらを互いに接触させて配置させることによって行うことができる。
【０１０３】
マイクロチャネルを通る流体流を可能にするように上部部分に穴を作成する。これらの穴は、マイクロチャネルの端に、またはマイクロチャネルの長さに沿ってどこにでも配置することができる。上部部分と底部部分とを結合した後、チャネルを通ってコーティング用化学物質を流すことが必要であっても必要でなくてもよい。ポリ−ｄ−リジン又は他の化学物質を、細胞接着を促進しゲルを安定化させるためにチャネルを通して洗い流してもよい。これは、デバイスの疎水性を制御するために使用しても使用しなくてもよい。なぜならば、細胞培地がチャネルを通って流れることを可能にするために、一部の材料はさらなる表面処理を必要とするからである。
【０１０４】
次いで、デバイスにゲルを充填することができる。ゲルは、「ゲルケージ」又は「ゲルケージ領域」を完全に充填する。表面張力は、ゲルがゲルケージから漏れるのを防ぐ。ゲルはゲル充填ポートを介してデバイスの中に注入される（図１を参照されたい）。ゲル挿入に対する異なる圧力時間注入特性を、注入されたゲルの品質を改善するために使用してもよい。ゲルは、チャネルに入るために注入圧力の初期発射を必要とし、それからゲル充填を終了させるための持続的な低い圧力を必要とするだろう。あるいはゲルをゲルケージの両端から同時に注入してもよい。次に、ゲルを（例えば、細胞培養インキュベータで一時間）硬化できる。そのようにして、デバイスは細胞播種の準備が整う。
【０１０５】
従って、一態様において、本発明は、１つ又はそれ以上の流体チャネルと１つ又はそれ以上のゲルケージ領域とを光学的に透明な材料の第１の部分の中にエッチングして、１つ又はそれ以上の流体チャネルと１つ又はそれ以上のゲルケージ領域とを通る流れを可能にするように１つ又はそれ以上の入口を作り出すことにより、デバイスの屋根と壁とを作り出すこと、及びデバイスの床を形成する光学的に透明な材料の第２の部分に光学的に透明な材料の第１の部分を結合することを包含する、デバイスを作る方法に関する。方法はさらに、チャネルを通ってコーティング剤を導入することを包含できる。コーティング剤の例は、ポリ−Ｄ−リジン、ポリオルニチン、ラミン、コラーゲン、又はそれらの組み合わせを含む。方法はさらに、表面を疎水性にする物質とデバイスの表面を接触させることを包含できる。そのような物質の例は、血漿を含む。方法はさらに、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域の中にゲルを導入することにより、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域をデバイスに作り出すことを包含できる。
【０１０６】
デバイスの使用法
本明細書で提供されるデバイスは、様々な目的のために使用することができる。本明細書に記載されているように、デバイスの例は図１に見ることができる。第１の流体チャネルは、ゲルチャネルと平行して、そしてゲルチャネルと接触して走る。ゲルチャネルは、ゲルと流体チャネルとの間の境界上でゲルを含有するために三角形のポスト（本明細書においてはマイクロポストとも呼ばれる）の２つの平行な列を有する。ゲルチャネルは、第１の流体チャネルと第２の流体チャネルとの両方に対して平行に走る。第２の流体チャネルもまたゲルチャネルと接触する。出口は、流体がデバイスの中に流入したりデバイスの中から流出したりすることを可能にするように、ドリルで穴を開けるか又は別の方法で作り出される。
【０１０７】
細胞（例えば、内皮細胞）は、流体ポートの１つによって第１の流体チャネルの中に導入（例えば、注入）できる。内皮細胞は、ゲルチャネルにわたる圧力勾配を引き起こす、第１の流体チャネルの静水圧を上げることによってゲル−流体チャネルの境界の壁に接着するように促される。流体はゲルチャネルを通って浸透し、内皮細胞を一掃し、内皮細胞をゲル壁上に載せる。細胞は、より長い又はより短い期間のいずれかである所望の日数の間（例えば、３〜７日間）培養される。本明細書で示されるように、内皮細胞は三次元の円錐様の突起である「芽」を第１の流体チャネルの中からのゲルの中に作り出した。これらの芽は最終的に内皮細胞と並べられ血管壁を模倣する。芽の発生又は成長を遅らせる試みのために、又は発芽の頻度やサイズを増やすために、別の（例えば、第２の）流体チャネルに薬物を適用することができる。発芽の遅延又は休止は、薬物が将来性のある血管新生抑制剤であることを示し、継続的な抗ガン分析の標的である。発芽の加速は、創傷治癒や再生医療において用途を有する、血管新生のための良い薬物候補を示す。
【０１０８】
さらに、ガン細胞（例えば、ガン患者のガン生検試料と関連しない細胞）を、可能性がある（１つ又はそれ以上の）抗ガン転移抑制剤と、又は抗ガン剤の組み合わせと共に別の流体チャネルの中に注入することができる。数日間デバイスを培養した後に、ガン細胞が内皮層を貫通して領域又はチャネル（例えば、ゲルケージ領域、ゲルチャネル）の中に入らなかった場合、薬物又は薬物の組み合わせは抗ガン剤ではない。ガン細胞がガン患者のガン生検試料と関連しない細胞である態様において、その薬物又は薬物の組み合わせは、その患者のガンの転移を止める（又は治療する）ために適切ではない。例えば、ガン細胞が第１の流体チャネルにおいて示される場合、その薬物又は薬物の組み合わせは、他の人には有効である可能性もあるが、その個々の患者には適していない。
【０１０９】
当業者に理解されるように、本明細書に記載されているデバイスの実施態様を製作することができる。例えば、円形ゲルケージの中にドリルで穴を開けた大きいポートを有する円形ゲルケージは、ガン生検試料全体を配置するのに適している可能性がある。全てが直列又は全てが並列であり、直列及び並列であり、互いに接続されいて、及び／又は分離されている、のいずれかで任意の数の流体チャネル−ゲルチャネルの組み合わせが存在してよい。例えば、第１の流体チャネル、第１のゲルチャネル、第２の流体チャネル、第２のゲルチャネル、そして最後に第３の流体チャネルを有し、各チャネルがマイクロポストによって分離されたデバイスが関連している。いくつかのゲルケージを、ゲルケージの間の別個又は共通の流体チャネルと直列又は並列に連結してもよい。これは、複数の抗がん剤を同時にテストすることを可能にするか、又は恐らく、１つの組織生検試料をできる限り多くの非干渉性転移抑制剤でテストすることを可能にする。本明細書で示されるように、チャネルは必ずしも真っ直ぐではなく、長さ全体を通して先細りにしたり幅を広げたりすることができる（又はできない）。投入ポートや出口ポートの数だけでなく、チャネルの高さも非常に様々であってよい。
【０１１０】
ガンは一般的に、体内の特定の部位で始まる。ガンが成長する時には、ガンは自分自身に栄養を与えなければならず、そうするために、血管新生と呼ばれるプロセスにおいて新たな血管をガンの中に誘導する。転移として公知のプロセスにおいてガンが広がる時には、個々のガン細胞は、原発性の腫瘍から分離して、体の他の部分に転移するために血管やリンパ管を使用する。血流の中に入るために、ガン細胞は、血管壁、特に、血管壁と並ぶ内皮細胞を通って進まなければならない。これは、血管外遊走として知られる。ガン細胞は、移動後に体の組織の中に入るために血管壁を通って戻って入り込まなければならず、これは血管内異物侵入と呼ばれる。血管新生、血管外遊走、及び血管内異物侵入は全て、抗ガン剤の標的である。
【０１１１】
本明細書に記載されているデバイスは、例えば、内皮細胞が、制御された生化学条件下で三次元ゲルにおいて新たな血管の芽を形成することを可能にする様々なインビトロのアッセイで使用することができる。中央チャネルは、内皮細胞が播種されて成長することを可能にする。中央チャネルの隣のチャネルは、コラーゲン（例えば、生検デバイス）で予め充填することができる。内皮細胞は、中央チャネルのコラーゲン製側壁上の単層の中でに成長することができる。次いで、新たな血管が中央チャネルからコラーゲンの中に発芽できる。こうしたデバイスは、新たな薬物が新たな血管の形成を遅らせ得る程度を、又は血管内異物侵入抑制剤又は血管外遊走抑制剤の存在を伴う、若しくはそれらの存在を伴わない血管の中へのガン細胞の侵入の程度を非常に容易に画像化することを可能にする。
【０１１２】
血管新生抑制剤の創薬の実施態様において、新たな血管内異物侵入抑制剤を外側チャネルの１つに、そして対照として他の外側チャネルに標準的な細胞培養培地を配置させてもよい。デバイスは、薬物効果の量的評価を可能にする。転移抑制剤の創薬の実施態様において、デバイスは上記のように、ただし播種するための細胞株又は生検試料のいずれか由来のガン細胞を用いて処理することができる。それから、デバイスは、画像化を容易にし、下流画像処理を介して、新たに形成された血管の芽を通って進入したガン細胞の数、及びそのプロセスが可能性のある転移抑制剤を用いてどのように遅らせられたかの定量的分析を可能にする。
【０１１３】
オーダーメイド医療の実施態様において、患者又は細胞株のいずれかに由来する内皮細胞が新たな血管を形成することが可能になった後に、生検済みガン細胞をデバイスに配置することができる。次に、いくつかの細胞内血管新生抑制剤又は血管新生抑制剤をこれらのデバイスでテストすることができる。異なる患者は異なる転移抑制剤に応答すると思われるので、これらのデバイスは、どの薬物がその患者に対する細胞内血管新生や血管新生を止めたか、そしてどの薬物が止めないかを検出するために使用することができる。
【０１１４】
従って、一態様において、本発明は、薬剤が血管新生性であるか血管新生抑制性であるかを特定する方法に関し、その方法は、（ａ）本明細書に記載されているようなデバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルの中に、評価される薬剤を導入すること（ここで、デバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルは内皮細胞を備え、そしてデバイスの１つ又はそれ以上のゲルケージ領域はデバイスのゲルケージ領域内でゲル領域を形成するゲルを備える）、及び内皮細胞が１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域においてゲル領域に接着するよう促される条件下でデバイスを保持すること、を包含する。薬剤の存在下で、内皮細胞と並べられる円錐様突起をゲル領域の中に作り出すことが増強されるか、又は阻害されるかを確認して、対照と比較する；薬剤の存在下で内皮細胞と並べられる円錐様突起をゲル領域の中に作り出すことが、対照と比較して増強される場合、薬剤は血管新生性であり、薬剤の存在下で内皮細胞と並べられる円錐様突起をゲルの中に作り出すことが、対照と比較して阻害される場合、薬剤は血管新生抑制性である。特定の態様において、内皮細胞は、内皮細胞を備える流体チャネルの静水圧を上げることによって、ゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域においてゲル領域に接着することを促される。別の態様において、薬剤の存在下で内皮細胞が内皮細胞と並べられる円錐様突起をゲル領域の中に作り出すことを、画像化技術を使用して確認する。
【０１１５】
別の態様において、本発明は、薬剤が転移に対して使用できるか否かを確認する方法に関し、その方法は、（ａ）本明細書に記載されているデバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルの中に、評価される薬剤を導入すること（ここで、デバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルは内皮細胞を備え、デバイスの１つ又はそれ以上の流体又はゲルのケージ領域はガン細胞を備え、そしてデバイスの１つ又はそれ以上のケージ領域はデバイスのゲルケージ領域にゲル領域を形成するゲルを備えている）、及び（ｂ）内皮細胞が１つ又はそれ以上のゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域においてゲル領域に接着することを促される条件下でデバイスを保持することにより、内皮細胞の層を形成すること、を包含する。ガン細胞が、薬剤の存在下で、ゲル内で分散し、内皮細胞の層又はそれらの組み合わせに向かって及びそれらを横断して移動するか否かを確認して、ガン細胞がゲル内で分散せず、且つ内皮細胞の層又はそれらの組み合わせに向かって及びそれらを横断して移動しなかった場合に、これは薬剤を転移を阻害するために使用できることを示す。一態様において、ガン細胞が、薬剤の存在下で、ゲル内で分散し、内皮細胞の層又はそれらの組み合わせに向かって及びそれらを横断して移動したか否かを、適切な対照と比較する。別の態様において、ガン細胞は、ガン患者のガン生検試料から分離された細胞である。
【０１１６】
別の態様において、本発明は、インビトロで血管を成長させる方法に関し、その方法は、（ａ）本明細書で提供されるデバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルの中に内皮細胞を導入すること（ここで、デバイスの１つ又はそれ以上のゲルケージ領域はさらに、そこにゲルケージを形成するゲルを備えている）、及び（ｂ）内皮細胞が、ゲルケージ領域−流体チャネルの界面領域においてゲルケージに接着するように促され、そして内皮細胞と並べられる円錐様突起をゲルケージの中に作り出す条件下でデバイスを保持すること、それによりインビトロで血管を成長させることを包含する。一態様において、内皮細胞が導入される１つ又はそれ以上の流体チャネルは、デバイスの１つ又はそれ以上のゲルケージ領域の中央にある。
【０１１７】
別の態様において、本発明は、薬剤が神経細胞の化学誘引剤であるか、化学反発剤であるかを特定する方法に関し、その方法は、（ａ）本明細書に記載されているデバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネル、本明細書に記載されているデバイスの１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、又はそれらの組み合わせの中に、評価される薬剤と神経細胞とを導入すること（ここで、デバイスの１つ又はそれ以上のケージ領域は、デバイスのゲルケージ領域内でゲル領域を形成するゲルを備えている）、及び（ｂ）神経細胞がゲルケージ領域で増殖する条件下でデバイスを保持することを包含する。神経細胞が、薬剤に向かって増殖するか、又は薬剤から離れるように増殖するかどうか；神経細胞が薬剤に向かって増殖する場合、その薬剤は神経細胞の化学誘引剤であり、神経細胞が薬剤から離れるように増殖する場合、その薬剤は神経細胞の化学反発剤である。
【０１１８】
別の態様において、本発明は、薬剤がガンを治療するために使用できるか否かを確認する方法に関し、その方法は、（ａ）本明細書に記載されているデバイスの１つ又はそれ以上の流体チャネルの中に、評価される薬剤を導入すること（ここで、デバイスの１つ又はそれ以上のゲルケージ領域は１つ又はそれ以上のゲルケージを形成するゲルを備え、そしてゲルケージはさらに、ガン性組織の生検試料を備えている）、及び（ｂ）ガン組織の運動性が薬剤の存在下で阻害されるか否かを確認すること （ここで、ガン組織の運動性が阻害される場合に、その薬剤はガンを治療するために使用することができる）を包含する。一態様において、生検試料は個々のガン患者のガン組織に由来し、薬剤はガン患者のガン組織を治療するために使用することができる。
【実施例】
【０１１９】
実施例１  ガン集団が移動するのを防ぐための転移抑制剤の濃度テスト
方法
ヒト肺ガン細胞株Ａ５４９由来の赤色（ｃｏｌｕｒｅ）細胞をＨ２Ｂタンパク質（ｍ−Ｃｈｅｒｒｙ）で形質転換させて、部分的に分離して４０μｍと７０μｍとの間のサイズが不揃いの細胞集合体をもたらした。これを１００マイクロメートルの濾過器を通して吸引し１００マイクロメートル未満の半径を有する細胞集合体を有する培地をもたらした。これを第２の４０マイクロメートルのフィルタを通して注ぎ、４０マイクロメートルと１００マイクロメートルとの間のＡ５４９集合体を有する培地を得た。次に、２分間８００ｒｐｍで細胞を遠心分離して、培地を吸引した。
【０１２０】
２０マイクロリットルのリン酸緩衝液溶液（BD Bioscience）に１ＭのＮａＯＨを９マイクロリットル添加することによってコラーゲンゲルを調製し、それから４６マイクロリットルの超高純度Ｈ２Ｏを添加した。最終的に、２．５ｍｇ／ｍＬのラット尾コラーゲンタイプ１（BD Bioscience）を１２５マイクロリットル添加し、充分に混合した。
【０１２１】
次に、Ａ５４９集合体をコラーゲンゲルと混合し、ゲル内に集合体の混合物を得た。次に、１０マイクロリットルのゲルを図１及び図２に示されるデバイスの中央チャネルの中に注入し、デバイス内で３６個の別個のゲル−流体の界面を得た。
【０１２２】
分離したＧＦＰタンパク質標識でヒト臍帯静脈内皮細胞を形質転換し、第１の培地チャネルの中に流した。細胞のない培地を第２のチャネルに添加した。第１の培地チャネルの各ポートに培地の小さい気泡を添加して、静水圧勾配をもたらし、ゲル−培地の界面に細胞を押した。気泡を取り除く前に、圧力勾配を一時間保持した。デバイスを培養して、０時間、１２時間、３６時間、６０時間、８４時間、及び１０８時間で画像化した。内皮細胞はゲル−培地の界面上だけでなく培地チャネルの底部に沿って内皮単層を作り出すことが分かった。
【０１２３】
対照群においては、システムに薬物を添加しなかった。実験群においては、市販のガン転移抑制剤イレッサ（AstraZeneca）、すなわちＥＧＦＲ−ＴＫ酵素遮断剤を１００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、１５００ｎＭ、及び２０００ｎＭの用量で内皮細胞培地に添加した。
【０１２４】
１００ｎＭ及び５００ｎＭの薬物濃度の場合において、Ａ５４９ガン集合体はバラバラになることが分かり、個々のガン細胞は内皮単層に向かって移動し始めた。１０００ｎＭ、１５００ｎＭ、及び２０００ｎＭの場合において、ガン集合体はそのままであり、内皮細胞はコラーゲンの中に侵入し始めた。１０００ｎＭが最少有効量であり、ヒト対象における最少用量の研究のための良い開始点であることを示した。
【０１２５】
結果
ガン集団が移動することを防ぐための転移抑制剤の必要な濃度をテストするためにこのデバイスを使用した。
【０１２６】
ゲル内に埋め込まれた凝集したガン細胞の集団と共にゲルを注入することによってデバイスを調製した。次に、２つの流体ポートの一方の中に内皮細胞を注入した。次に、細胞を６日間培養し、毎日画像化した。５日目からは画像がないことに留意されたい。
【０１２７】
図５は、２つのデバイスの共焦点画像を示し、その２つのデバイスは、高濃度の転移抑制剤を装填したデバイスと、低濃度の薬物を装填したデバイスである。ガン細胞の核を赤色蛍光分子でタグ付けし、一方、内皮細胞の核を蛍光緑色でタグ付けした。最初、台形ポストを見ることは困難であったが、内皮細胞が構造体を形成してポストの周りを包み始めると、ポストは画像内で台形形状の「穴」を形成し始めた。
【０１２８】
６日間にわたって、画像５における濃度は細胞が分離して移動することを妨げるのに充分に高かった。画像６においては、濃度が非常に低いので、ガン細胞（赤色）が３日目に移動し始め、６日目までには内皮細胞チャネルに入り始めていた。
【０１２９】
従って、血管と同様に、全上皮単層が、第２の流体チャネルへのガン細胞の導入前に存在するようにアッセイを行うことができる。デバイスを転移抑制剤テストのために特殊化するそのさらなる改変は、ゲルが内皮細胞の形成のための足場としてだけ働くように中央ゲルチャネルの幅を減少させることを含み、ガン細胞が内皮細胞壁に到達するために通過するゲルをあまり有さないことを意味する。
【０１３０】
血管と同様に、全上皮単層は、第２の流体チャネルへのガン細胞の導入前に存在する。転移抑制剤テストのためにデバイスを特殊化するそのさらなる改変は、ゲルが内皮細胞の形成のための足場としてだけ働くように中央ゲルチャネルの幅を減少させることを含み、ガン細胞が内皮細胞壁に到達するために通過するコラーゲンゲルをあまり有さないことを意味する。
【０１３１】
実施例２  スパイダーデバイス−成長因子勾配に対する軸索応答を検討するためのハイスループットマイクロ流体アッセイ
拡散性勾配又は基材結合勾配による軸索誘導の検討は、現在の技術では困難である。この実施例では、化学勾配下で軸索誘導を検討するために使用される本明細書で提供されるマイクロ流体デバイスの一実施態様の設計、製作、および有用性を記述する。実験的な検討やコンピュータによる検討は、３０分以内の誘導キューの線形勾配の確立を明らかにして、それは最大４８時間安定していた。勾配は培地変更やデバイスの動きなどの外部摂動に反応しないことが分かった。ネトリン１（０．１〜１０μｇ／ｍＬ）及び脳髄（０．１μＬ／ｍＬ）の効果を軸索回転の際の化学誘引性の可能性について評価し、一方、ｓｌｉｔ−２（６２．５又は２５０ｎｇ／ｍＬ）をその化学忌避特性について検討した。海馬ニューロン又は後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンをマイクロチャネルの中に播種し、三次元コラーゲンゲルの表面に詰め込んだ（図６Ａ〜図６Ｃ）。軸索は三次元にマトリックスの中で成長し、軸索誘導に衝撃を与えるように軸索成長の方向に対して直交して誘導キューの勾配を作り出した。各軸索の平均回転角度を測定し、誘導キュー勾配の効果を定量化するために同様な条件下で培養した複数のデバイスにわたって平均化した。外部誘導キューを受け取らない対照培養物と比較して、脳髄及びネトリン１（１μｇ／ｍＬ）の存在下で、勾配に向かった顕著な正の回転が測定された（ｐ＜０．００１）。形質転換繊維芽細胞から放出されたネトリン１は、テストした全ての化学誘引性キューのうちで最も正の回転効果を有していた（ｐ＜０．００１）。ｓｌｉｔ−２は、２５０ｎｇ／ｍＬの濃度における海馬軸索誘導とＤＲＧ軸索誘導との両方において強い化学忌避特性を示した。ｓｌｉｔ−２はまた、三次元コラーゲンゲル中へのＤＲＧニューロンの侵入の際に同様な振舞いを示した（対照培養物に対してｐ＜０．０１）。つまり、結果は、神経生物学、細胞移動および増殖、マトリックス改造、及び他の細胞株との共培養を検討するための安定した化学勾配を生成させるこのマイクロ流体デバイスの有効性を示し、ガン生物学、組織工学、及び再生医療においてさらなる用途を有する。
【０１３２】
神経系の発達の間に、厳しく制御される複雑な神経ネットワークが、標的に到達する特定の経路に沿って軸索の成長を導く誘導分子の時空間的制御によって確立されている（B.J.Dickson, Science, 2002, 298, 1959）。このプロセスは、環境において異なる長さスケールで動作する複数の誘引性誘導キューや反発性誘導キューを感知したり、それらに応答したりする成長円錐（軸索の先端）の化学親和性に依存する（M.Tessier-Lavigne and C.S.Goodman, Science, 1996, 274, 1123）。しかしながら、誘導キューの送達が神経系内で維持される精度やメカニズムは依然として明らかではない。早期の研究は、軸索が、中枢神経系に対する損傷後に失われた神経ネットワークの接続を再生し正確に再確立することに失敗したことを示した（F.C.Wagner Jr and G.J.Dohrmann, Surg.Neurol, 1975, 3,125）。多数の組織工学の戦略が損傷部位で軸索再生を促進しようと調査してきたが（M.B.Bunge, J.Spinal.Cord.Med., 2008, 31, 262）、これらの手法に関して首尾よく実用的に実現することは、特に損傷部位における炎症環境において軸索応答と軸索回転とにおける発達的に重要な誘導キューの濃度と勾配との効果を解明することを条件としている。
【０１３３】
成長因子勾配は、神経系における細胞移動と軸索生長と誘導とを含む多くの生物学的現象に関与している（G.Curinga and G.M.Smith, Exp.Neurol, 2008, 209, 333）。軸索生長と軸索誘導は、組織を通るトンネル効果と遠くの標的との接続とを容易にするために基材に結合された拡散可能な勾配で構成された誘引性キューと反発性キューとの強調した行動によって制御されることが現在一般的に受け入れられている（D.Mortimer, T., et al, Trends.Neurosci, 2008,31,90）。軸索誘導に関するインビボ研究は、神経発達に関するキューを識別することには非常に強力であるが、ニューロン周囲のマイクロ環境を制御し、成長円錐がさらされる多数のキューの役割を評価することは不可能である。このように、研究者らは、軸索生長に対する成長因子の影響をインビトロで研究するための多数の実験技術やコンピュータ技術を開発してきた。１つの技術においては、コラーゲンマトリックスに埋め込まれた神経組織外植片を形質転換細胞（H.Chen,et al,Neuron,1998,21,1283）、マイクロビーズ（B.Gene,et al,PLOS Biology,2004,2,2112）、又はコラーゲンゲルの表面上の拡散可能なマイクロパターン勾配（W.J.Rosoff,et al,Nat.Neurosci.,2004,7,678）から放出される誘導キューの供給源にさらす。これらのアッセイにおける定量化は、より高い濃度側とより低い濃度側とにおける外植片からの軸索生長を比較することに制限された。これらの方法は、特定のキューに対するニューロン集団の全体的な応答を識別することに成功したが、これらの方法は、概して、軸索生長と軸索勾配とに対する生体分子勾配の効果を区別することができない。さらに、二次元のコーティングされた表面上での濃密な軸索重複により、個々の軸索が外植片から成長すると、個々の軸索を追跡することは困難である。他のインビトロアッセイにおいて、誘導キューの非連続的勾配（S.Lang,et al,Anal.Bioanal.Chem.,2007,390,809）又は連続的勾配（S.Dertinger,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,20
02,99,12542）は、表面に印刷され、その表面上では、ニューロンが培養され、軸索成長が観察される。しかしながら、この技術の限界は、基材結合勾配と二次元培養とに対してのみに適していることを含む。
【０１３４】
マイクロピペット回転アッセイは、一般的にインビトロで軸索誘導を研究するために使用される（Z.Pujic,et al,J.Neurosci.Meth.,2008,170,220）。この場合、マイクロピペットは、化学誘引性物質の連続点源として働き、誘導軸索成長に対する拡散によって成長因子勾配を生み出す（J.Q.Zheng,et al,Nature,1994,368,140; K.Buck and J.Zheng,J.Neurosci.,2002,22,9358）。しかしながら、局所化された因子の送達によって生み出される勾配は、空間的に不均一であり、拡散性キューの分子量、マイクロピペットの先端の高さ、並びにパルスの持続時間および振動数によって顕著に異なる。上記のアッセイの全てにおいて、これらの従来の方法で発生させられた勾配は、不安定であり、定量化が難しく、明確な時空間制御を欠く場合が多い。生理学的に関連する成長因子の勾配の複雑性やそれらの特定の細胞シグナル伝達プロセスを解明するために、細胞外マトリックス環境における成長因子の時空間送達に対するユーザ定義の制御、及びその環境内で細胞を直接視覚化する能力が必要となる。
【０１３５】
過去１０年にわたって、マイクロ流体デバイスは、細胞培養用途において人気を得てきた。なぜならば、マイクロ流体デバイスは、物理的環境や化学的環境の変化に細胞がどのように応答するかを調査するための卓越したプラットフォームを提供するからである（N.Li,A.Tourovskaia and A.Folch, Crit.Rev.Biomed.Eng., 2003, 31, 423; J.El-Ali,et al,Nature,2006,442,403; AFolch and M.Toner, Ann.Rev.Biomed.Eng.,2000,2,227）。これらのデバイスはまた、マイクロメートルの精度、定量化可能な特性、及び実験の再現性を有する充分に定義された二次元及び三次元の細胞培養環境を作り出すことに有用である。単純な幾何形状を有するマイクロ流体デバイスもまた、軸索成長に対する機械的制約の影響を示すために開発された（H.Francisco,et al,Biomaterials,2007,28,3398）が、軸索回転と軸索誘導とは、これらのデバイスにおいては検討することができない。同様なマイクロ流体勾配ミキサが、ニューロンの生存や生長に対する基材結合勾配の影響を研究するために開発された（G.Li,J.Lui and D.Hoffman-Kim, Ann.Biomed.Eng.,2008,36,889）。ニューロンはせん断応力に影響を受ける（S.S.Margulies, et al. J.Biomech.,1990,23,823）ので、これらの勾配生成デバイスは、軸索回転に対する拡散性キューの影響を調査するには適していない可能性がある。これに関して、基材キューの表面勾配を利用するデバイス（L.J.Millet,et al,Lab Chip,2010,10,1525）又は微小溝に基づいたデバイス（A.M.Taylor,et al,Nat.Methods.,2005,2,599; J.W.Park,et al,Nat.Protoc,2006,1,2128）は、細胞本体から軸索を単離したり軸索成長や軸索回転を検討したりするのにより効果的であり得る。安定した生体分子勾配が、拡散性成長因子による軸索誘導を検討するためにマイクロ流体デバイスにおいて作り出せることが、これらの初期の研究から理解できるが、こうしたマイクロ流体デバイスはまだ存在しない。
【０１３６】
本明細書には、三次元インビトロ細胞培養モデルにおいて拡散性因子による軸索誘導を検討するために使用することができるマイクロ流体デバイスの一実施態様が記載される。このデバイスで培養されたニューロンは、三次元の生理学的構成において軸索を延伸し、軸索成長の方向に対して直交する誘導キュー勾配に成長する軸索をさらし、軸索成長を、軸索誘導を検討するための効果的な方法にする。本明細書は、様々な化学誘引性／化学反発性の誘導キュー、それらの送達様式、及び変化可能な濃度勾配の海馬ニューロンやＤＲＧニューロンの軸索生長や軸索回転に対する影響を検討するためのデバイスについてのこの実施態様の有用性を明らかにする。デバイスのこの実施態様はまた、例えば、単一培養物又は共培養物のいずれかとして他の神経細胞型を検討するために使用することができる。このデバイスはまた、神経科学、発生細胞生物学、先端生体材料及びマイクロ流体技術のインターフェースにおいて用途を有する。
【０１３７】
実験例
マイクロ流体デバイス：設計及び製作
別の箇所で詳細に記載されているフォトリソグラフィ技術とソフトリソグラフィ技術とを使用してマイクロ流体デバイスのこの実施態様を制作した（Y.N.Xia and G.M.Whitesides,Ann.Rev.Mat.Sci.,1998,28,154）。図６Ａ〜６Ｃに示されるように、ＡｕｔｏＣＡＤ（Autodesk、San Rafael、CA）でデバイスの設計を作り出し、ＣＡＤファイルから透明マスクを作り出し、そして高解像度プリンタ（PageWorks,MA）によって印刷した。１２０μｍの厚さのＳＵ８フォトレジストでシリコンウエハを最初にスピンコーティングした。デバイスのネガパターンで印刷された透明マスクをウエハを覆って配置し、紫外線にさらし、その紫外線が、さらされた範囲でフォトレジストを架橋した。次に、架橋されていないフォトレジストを洗浄し、デバイスのポジ型レリーフで層にされたシリコンウエハを得た。マイクロ流体デバイスは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ；Dow Corning,USA）をレプリカ成形し、８０℃のオーブンで２．５時間、シリコン原版に対して脱気エラストマー混合物（１０：１、ベース：硬化剤）を硬化させること（J.C.McDonald,et al,Electrophoresis,2000,21,27）によって作られた。重合化ＰＤＭＳデバイスをシリコン原版から剥がし、個々のデバイス（直径３０ｍｍ、高さ１ｃｍ）を切断して、直径４ｍｍ及び１ｍｍの標準的な穴あけ器を使用してマイクロ流体デバイスに入口と出口とを切り取った。細胞培養の前に、ＰＤＭＳウエハを掃除し、架橋されていないＰＤＭＳを除去しデバイスを殺菌するために１２０℃で３５分間（殺菌２０分／乾燥１５分）の間オートクレーブ処理した。ガラスのカバースリップは空気でホコリを払い、３０分間（乾燥）の間オートクレーブ処理した。ガラスカバースリップは空気で埃を払って、３０分間オートクレーブ処理（乾燥）した。ＰＤＭＳ表面とカバースリップを結合する前に、それらを４５秒間の間空気プラズマによって酸化して、チャネルを閉鎖しデバイス製作を完了した。この表面処理はＰＤＭＳとカバースリップとの間の不可逆的な結合を確実なものにし、漏れを防ぐことも助けた。ゲル足場を充填する前に疎水性を回復するために、デバイスを８０℃で一晩保持した。
【０１３８】
ＰＤＭＳデバイスにおけるコラーゲンゲル装填
表面を（上記の通りに）疎水性にした殺菌ＰＤＭＳウエハをラット尾から単離した２ｍｇ／ｍＬのコラーゲンタイプ１（BD Biosciences,San Jose,CA；４℃で保存）で充填した。ｐＨ７．４で２ｍｇ／ｍＬの溶液を取得するために、１０ＸのＰＢＳ、１ＭのＮａＯＨ及び組織培養グレードの水との混合物にコラーゲン原液を添加することによってコラーゲン溶液を調製した。２μＬのコラーゲンゲル溶液で予め装填した冷たいピペット先端をデバイスのゲル装填ポートの中に注意深く下げ、マイクローピラー内の指定されたゲル領域を充填するまで、氷冷したゲルをデバイスの中にミクロ注入した（図６Ａ〜６Ｃ）。各実験条件に対して複数のデバイスにこのプロセスを繰り返した。ゲル注入の後、ヒドロゲルが乾燥するのを防ぐために、加湿容器にＰＤＭＳウエハを置き、加湿インキュベータにおいて３７℃で３０分間ゲルを重合化させた。実験の２４時間前にゲルを充填し、マイクロチャネル内のあらゆる気泡を再吸収できるようにインキュベータ内に放置した。
【０１３９】
勾配のシミュレーションと視覚化
コラーゲンゲルの重合化の次に、細胞培養培地でマイクロ流体チャネルを充填した。化学誘引性チャネルにおける培地（図６Ａ〜６Ｃ）を、初期濃度が１０μＭの蛍光ＦＩＴＣ−デキストラン（４０ｋＤａ、Invitrogen,CA）の希釈溶液と交換した静的条件下で、勾配検討を行った（図７Ａ〜７Ｂ）。他のチャネルを無血清培地で充填した。Ｎｉｋｏｎ ＴＥ３００蛍光顕微鏡（Nikon Instruments Inc.,NY,USA）で蛍光強度を捕捉した。最初の３０分間は５分毎に、それから３〜５時間は３０分毎に、Ｏｐｅｎｌａｂ（Improvision,Waltham,MA）データ獲得ソフトウェアを使用してＨａｍａｍａｔｓｕカメラ（Hamamatsu, Shizuoka, Japan）でゲル領域に関する一連の蛍光画像を取得した。次に、培地の過剰な乾燥を防ぐためにデバイスをインキュベータに持って行き、画像を獲得する前に３０分間顕微鏡スタンド上でデバイスを安定させることによって６時間の間隔でさらなる画像を取った。各時点におけるゲル全体の蛍光強度の変化を取得するためにＭＡＴＬＡＢ（Math Works,Natick,MA）で特注コードを使用して時空間蛍光画像の画像処理を行った。つまり、背景強度値を減算することによって画素値を正規化し、それから１０μＭのデキストランの最大画素値で除算した。ゲル領域に沿って水平な長方形を平均化することによって拡散プロファイルを分析して、チャネル内の長方形の位置に対して図を描いた（図７Ｂの挿入図）。一連の画像のうちの最初の画像から取得された最大値と最小値とで各画像を正規化した。
【０１４０】
異なる実験条件下で濃度勾配を定量化し、パラメータ分析を行うためにＣＯＭＳＯＬ（Burlington,MA）で拡散−対流−反応の有限要素モデルを作り出した。対照チャネルおよびゲル充填ポートの入口における供給源条件（ＣＳＯＵＲＣＥ）と対照チャネル及びゲル充填ポートの出口におけるシンク条件（ＣＳＩＮＫ）とを表すために数値モデルの境界において定濃度境界条件を定義した。過渡シミュレーションに関して、条件チャネルにおける初期濃度を特徴付け実験をシミュレーションするために入口の初期濃度と等しく設定した。実験の特徴に基づいて、２ｍｇ／ｍＬのコラーゲンゲルに関して、コラーゲンマトリックスの内側の成長因子拡散に対してＤＧＥＬ＝５．１×１０−１１ｍ２／ｓの拡散係数を定義し、その係数は、Helm、et al.によって報告された値と合致した（C.L.Helm,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2005,102,15779）。チャネルを含有する培地の内側の拡散係数を、４０ｋＤａの分子量のタンパク質に関するストークス−アインシュタインの関係に従って、ＤＭ＝６×１０−１１ｍ２／ｓに設定した。シミュレーションを行うための数値格子は、約４００，０００個の有限要素からなった。
【０１４１】
ニューロンの単離及び培養
デバイスで培養された主要な海馬ニューロンや後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンを別の箇所で詳細に記載されたプロトコルにより胎生１４．５日から胎生１６．５日のマウスから取得した（R.Li,Methods.Cell.Biol,1998,57,167; W.E.Thomas,Life.Sci.,1986,38,297; A.V.Kwiatkowski,et al,Neuron,2007,56,441）。顕微解剖された皮質を解離して、１ｍＬ当たり１０００万個の細胞の最終濃度で無血清培地に再懸濁した。解離直後に、デバイス（ｎ＝テスト条件当たりに１０台のデバイス）の中にニューロンを播種し、１〜２日培養し、あらゆる誘導キューが導入される前に、１日２回全てのチャネルを無血清培地で交換した。全ての細胞培養物を５％のＣＯ２で３７℃の加湿インキュベータ内で保持した。ネトリン１の検討（図１１Ａ〜１１Ｃ）に関して、海馬ニューロンをａｍａｘａのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎを使用して形質転換し、ｐｍａｘ−ｇｆｐプラスミドをＤＣＣ（大腸ガン欠失）受容体を発現するプラスミドと共形質転換した（M.J.Galko and M.Tessier-Lavigne,Science,2000,289,1365）。
【０１４２】
誘導キューの添加及び培地変更
チャネルに添加されたネトリン１を複数の供給源から取得した。例えば、研究所で単離された（T.Serafini,et al,Cell,1994,78,409）ネトリン１（０．１〜１０μｇ／ｍＬ）、及びｃＤＮＡで形質転換された安定した繊維芽細胞株（K.Low,et al,J.Neurosci.,2008,28,1099）から放出されたネトリン１。０．１μｇ／ｍＬの商業的に取得したネトリン１（R&D Systems,Minneapolis, MN）もまた同様な培養条件下でテストしたが、研究所で精製されたネトリン１の利点と比較してさらなる利点を全く提供しなかった。新鮮なマウスの脳組織全部から研究所で脳髄を調製した。つまり、プロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤カクテル；Roche,USA）を補完した低張液中でロータステータで脳組織を均質化し、濾過し、ブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて全タンパク質含有量を測定して、０．１μＬ／ｍＬの濃度に希釈した。使用した化学忌避物質はｓｌｉｔ−２（６２．５又は２５０ｎｇ／ｍＬ；R&D Systems,Minneapolis,MN）であった。化学的感知の検討に関して、細胞播種の２４〜４８時間後に全ポートから培地を除去し、既知の濃度の誘導キューを含有する３５０μＬの培地を化学誘引物質チャネルに導入し、そして残りの２つのチャネルのそれぞれに３５０μＬの無血清培地を導入した。繊維芽細胞から放出されるネトリン１を用いる実験に関して、化学誘引物質チャネル（供給源）に形質転換繊維芽細胞（１×１０５個の細胞）を播種し、そして左側のチャネル（シンク）に通常の繊維芽細胞（１×１０５個の非形質転換細胞）を播種した。形質転換されなければ、これらの通常の繊維芽細胞は、本質的に培地にネトリンを放出しない。形質転換繊維芽細胞から放出されたネトリン１は、コラーゲン１ゲル全体に拡散して、勾配を作り出す。化学勾配を常に保持するために規則的な間隔で培地を交換した。誘導キューを受け取らなかった対照デバイスをテストケースと同じ手順で培養した。
【０１４３】
軸索生長及び軸索回転の特徴付け
軸索分布を特徴付け、デバイス内の三次元コラーゲンゲルにおいて軸索回転を定量化するために、位相差顕微鏡法、蛍光顕微鏡検査法及び共焦点顕微鏡検査法を使用した。ＨａｍａｍａｔｓｕカメラとＯｐｅｎｌａｂ画像獲得ソフトウェアとを装備したＮｉｋｏｎ  ＴＥ３００顕微鏡で蛍光画像と位相差画像とを獲得した。４％ＰＦＡでの固定（３０分）後に軸索染色と核染色とを行った。固定したサンプルを１Ｘのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で三度すすぎ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘで処理し（１分〜２分）、１ＸのＰＢＳで二度すすぎ、ＤＡＰＩ（核に対して）およびローダミンファロイジン（アクチンに対して）の混合物を注入（３０分）して、１ＸのＰＢＳを用いた最終洗浄工程を続けた。Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｕｉｔｅ（Perkins Elmer Life Science）獲得ソフトウェアを備えたスピニングディスク共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ）を使用して共焦点画像を収集した。一連の２０個の光学的な連続部分（５μｍの厚さ）を取得し、整列した画像を積み重ねて、Ｉｍａｒｉｓ（Bitplane,MN）を使用する三次元視覚化のためにレンダリングした。成長円錐に導く各軸索の長さに沿った最終の１００μｍの部分をＮｅｕｒｏｎＪ（E.Meijering,et al,Cytometry.Part.A,2004,58,167）で追跡して、水平方向の線（０°）に対してこの部分が作る角度を測定した。４つの四分円のうち、Ｑ１の値（−６０°〜＋６０°）は誘導キューに向かった成長を反映し、Ｑ３の値（１２０°〜２４０°）は、誘導キューから外れることを反映する（図１１Ｊ）。同様な条件下で培養されたデバイスに対して四分円１と四分円３とにおける軸索の数を数え、テストケースと対照培養物（誘導キューがない）との間の統計学的に有意な値を、各実験条件下で全てのデバイスからのデータを平均化することによってＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用してコンピュータ計算した。ＤＲＧを用いる検討に関して、同様の手順を用いて、各四分円に移動した細胞の数を測定し定量化した。
【０１４４】
結果及び考察
マイクロ流体デバイスの実装
マイクロ流体デバイスは、従来の勾配生成技術と比較すると、ハイスループットで低費用の実験を含む多数の実用的な利点を提供する。さらに、マイクロ流体デバイスは、複数の勾配生成細胞培養環境を平行して実装することを可能にする高価な試薬の必要量が少なくてすむ。この検討において記載されているマイクロ流体デバイスのこの実施態様は、インビトロで軸索誘導を検討するための新たなプラットフォームを提供し、そして現在の他の技術では利用不可能な多くの独自の特徴を提供する。（ｉ）これは、製作するのが容易であり、操作するのが簡単であり、実験の再現性がより信頼できる。（ｉｉ）細胞はより生理学的な条件下で培養できる。なぜならば、細胞は、組織状の配座に詰め込まれ、三次元マトリックスを通って軸索を突き出すからである（図１０Ａ〜１０Ｂ）。これらのニューロンからの良好な生存及び生長は、将来これらの細胞を培養する非常に効果的な方法を示唆する。（ｉｉｉ）三次元ゲル全体の化学勾配を、軸索の生態を検討するために所望の時点で確立することができる。（ｉｖ）１つのデバイス毎に複数の軸索を用いて、そして１つのバッチ当たりに複数のデバイスを用いて、たった１つの実験で統計学的に有意なデータを取得することが可能である。（ｖ）これは、三次元で軸索を追跡して回転角度をコンピュータ計算するのが容易であるので、詳細な分析や定量化の助けとなる。こうしたデバイスは、化学勾配に応答する軸索誘導を検討するための効率的なツールを提供する。
【０１４５】
この実施態様において、デバイスはＴ字型ゲル領域と３つのチャネルとを有し（図６Ｂ）、その３つのチャネルは、培地チャネル、細胞チャネル及び誘導キューチャネルである。右側チャネルに添加された誘導キューがゲルを通って拡散すると、他のチャネルは、同じものに対するシンクとして働くので、ゲル全体に勾配を作り出す。以前の研究は、皮質ニューロンの初期軸索生長が横方向に導かれ、より横方向の位置で漸進的な軸索回転を有するのが支配的であることを示した（H.B.M.Uylings,et al,in The cerebral cortex of the rat,ed.B.KolbおよびR.C.Tees,Cambridge,MIT,1990,p 35-76）。このように、細胞本体に対して、増強された軸索生長と勾配に対する最終的な回転応答とを視覚化するために充分に長くなるように意図的にゲル領域を設計した。３つのＰＤＭＳポスト（図６）は、構造的な支持をゲルに提供し、そしてゲルが培地チャネルの中にあふれるのを防ぐ。このように、この構成において、軸索生長の方向は勾配の方向に対して直交し、これを軸索誘導の検討のための有効な仕組みにする。さらに、細胞が狭いチャネルを通って循環しなければならない時、せん断応力による損傷のリスクが増加する。細胞を培養したチャンバは細胞本体よりも数桁大きく、細胞の生存の機会を非常に増やし、そして細胞をデバイスに導入する間の機械的活性化の傾向を減らす。
【０１４６】
以前の研究では、三次元足場内の細胞は、その細胞が三次元で他の細胞やＥＣＭに接触するより自然な環境下で存在するので、天然の細胞の応答を二次元基材よりもしっかりと引き起こすことが期待されることを明らかにした（W.M.Saltzman,et al,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,665,259）。（天然組織におけるような）三次元足場内での細胞遺伝子の発現は、細胞接着分子、成長因子、及び機械的刺激を含む足場由来キューによって規制することができるので、ＥＣＭを基にした足場は、天然のインテグリン−ＥＣＭの相互作用を引き起こして天然の細胞の表現型を保持する可能性がより高い（L.GriffithおよびM.Swartz,Nat.Rev.,2006,7,211）。再構築された２ｍｇ／ｍｌのタイプ１コラーゲンのヒドロゲルを本検討で使用し、直径が５０〜２００ｎｍで孔サイズが約０．５〜１μｍであるフィブリルを有する重合化マトリックスを製作した（N.Yamamura,et al,Tissue.Eng.,2007,13,1443）。タイプ１コラーゲンは神経系において支配的な細胞外マトリックス成分ではないが、タイプ１コラーゲンは、二次元培養物と三次元培養物との両方における軸索生長を検討するために他の研究者らによって成功裏に使用されてきた（G.Li and D.Hoffman-Kim,Tissue.Eng.Part B.,2008,14,33）。本明細書に記載されている検討はまた、マトリゲル又はペプチドゲルと比較して、ニューロンの生存や軸索生長に対するコラーゲンタイプ１の悪影響を示さなかった。
【０１４７】
勾配の確立および安定化
予備的勾配実験において、化学誘引物質をデバイスに添加し、勾配を作り出そうとして、他の全チャネルを同じ量の無血清培地で充填した。しかしながら、恐らくは側面チャネル間のわずかな圧力差により、平衡を得た後でさえも、ゲルを通る対流を観察し、これは、拡散勾配がゲル全体に形成されるのを防ぐ。こうして、側面チャネルにおいて平衡化された圧力を保持するために、２つの部分を有するＰＤＭＳリザーバーシステムをデバイスの上部に設置した（図１４）。化学誘引物質（又は忌避物質）培地を充填したリザーバーの一方の部分は、化学誘引物質のチャネルポートを取り囲んだが、培地で充填された他方の部分は、他の２つのチャネルを覆った。直径１．５ｍｍの半円筒形の形状の小さいチャネルをリザーバーのこれらの２つの部分に接続し、圧力の平衡化を可能にすることにより、ゲルを通る勾配を保存した。図７Ａは、デバイスにおいて４０ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストランを用いて得られた勾配の典型的な時間依存のスナップショットを示し、そのスナップショットから、ゲル全体の濃度プロファイルを２日間にわたって取得した（図７Ｂ）。勾配は確立するために３０分かかり、安定した勾配は最大２日間保持できることが観察された。勾配は最初の３０分は左側に進み、その後、化学誘引物質が、ゲルの入口の周囲で化学誘引物質チャネルからゆっくりと使い果たされ、徐々に細胞と培地チャネルとに蓄積される。線形勾配からの逸脱は、Ｔ字型のゲル領域により明らかであるが、その逸脱は再現の可能性が高く、コンピュータ計算モデルによって予測することができ、必要な場合には実験解釈の際の主な原因となる。
【０１４８】
Ｇｏｏｄｈｉｌｌらによる最近の検討は、実験的な手法とコンピュータ計算の手法との両方を使用して成長円錐による勾配検知を定量化した（G.J.Goodhill,Trends.Neurosci.,1998,21,226; G.J.Goodhill and J.S.Urbach,J.Neurobiol.,1999,31,230; J.S.Urbach and G.J.Goodhill,Neurocomputing,1999,26,39）。供給源における濃度によって正規化され百分率で表される、成長円錐の幅（〜１０μｍ）全体の濃度の変化によって勾配の急峻さを特徴付けた。０．１％の低さの勾配は成長円錐によって検知できるが、１％の勾配は、何らかの誘導を誘発するには充分であり、１０％急峻さはしっかりとした誘導を誘発する（W.J.Rosoff,et al,Nat.Neurosci.,2004,7,678）。成長円錐は、インビボにおいて成長円錐の天然の環境で様々な勾配にさらされるので、成長円錐は、濃度や勾配の大きさに従ってその形態や誘導方向を適合させている可能性がある（J.Xu,W.Rosoff,et al.,Development,2005,132,45）。その濃度が細胞表面の全受容体を飽和させるのに充分な高さである場合、勾配の量は全く影響を受けない。一方、濃度が非常に低い場合、高い勾配にも関わらず、ほとんどの受容体が活性化しない。こうして、成長因子に対する細胞応答において濃度レベルや濃度勾配の影響を切り離すことが最も良い。デバイスにおけるゲル全体の均一な線形勾配の保持についての歪み（例えば、シンクとして働くゲル充填領域や細胞チャネル）が理解されているにも関わらず、有限要素モデリングでは、検討した濃度で３％〜４％の急峻さが予測され、これは、しっかりとした軸索誘導を誘発するはずである。このデバイスにおいて長期間、より急峻な勾配を保持するために、例えば、培地を実験の間にゆっくりと側面チャネルを通過させることができる。この手順は、供給源チャネルにおいて化学誘引物質を常に補給するだけでなく、シンクとして働き得る細胞チャネルや培地チャネルにおける化学誘引物質の蓄積を防ぐ。
【０１４９】
外部摂動に対する勾配感度
実験の間の、勾配の確立や安定化における外部摂動の役割を２つの方法でテストした。その２つの方法は、規則的な間隔におけるデバイス内の培地変更、又はデバイスの上部における化学誘引物質リザーバーに１５０μＬのデキストラン溶液を添加することである。培地が全チャネルで交換された時、リザーバーとポートは空になり、新鮮な培地と交換される。濃度を培地交換の間モニタリングし（図８Ａ）、新鮮な培地からのより高い濃度がおよそ３０分でゲル全体に勾配を再確立したことを示し、その後、より高い濃度は安定したままだった。第２の実験において、既に３５０μＬの培地を含有している化学誘引物質リザーバーに１５０μＬのデキストラン溶液を添加した。これは、この区画において圧力を顕著に増加させ、その圧力は、ゲルが勾配を破壊することを通じてではなく、リザーバー接続チャネルを通じて効率的に平衡化された（図８Ｂ）。同様に、画像化のために（平衡状態で）インキュベータから顕微鏡にデバイスを移動させた場合、又はゲル表面上に細胞を詰め込んだ場合、或いはインキュベータ自体が振動を経験した場合に、ゲル全体にわたって顕著な勾配変化は観察されなかった。このように、これらの詳細な検討は、デバイスにおいて高い確実性で勾配が形成され、そして外部摂動から充分に回復することを示す。
【０１５０】
これらの進歩にも関わらず、多数の制御不能な変動性が細胞培養の検討において勾配破壊の原因となり得る。例えば、培地の急速な蒸発、ＰＤＭＳ壁又はＰＤＭＳポスト近くのコラーゲンゲル濃度の変化、チャネル内で洗い流されなかったデブリ、マトリックスへの誘導キューの結合などである。こうして、使用前にデバイスをオートクレーブ処理し視覚的に調べ、同じバッチからコラーゲンゲルを利用し、全ての実験に対して同じコラーゲンゲル−ニューロン比を維持するように必要な予防策を取った。
【０１５１】
勾配のシミュレーション
マイクロ流体デバイスにおける時間依存勾配の有限要素モデルを図９Ａ〜９Ｄに示した。デバイスにおけるゲル領域全体にわたる定常状態の濃度分布（図９Ａ）と、この領域における濃度プロファイルの時空間的展開（図９Ｂ）を計算した。初期条件において、化学誘引物質チャネルは１の濃度を有し、細胞チャネルと培地チャネルとは０の濃度を有する。ゲル領域全体の濃度勾配（濃度プロファイルの傾斜）分布を比較のために図９Ｃに示し、そしてその時空間的展開プロファイルを図９Ｄに示した。準定常濃度勾配が確立するのに約３０分かかることが分かり、その濃度勾配は、４２時間以内でゆっくりと減衰し、その後、化学誘引物質と培地を再補充する。さらに、減衰する濃度プロファイルは、時間経過と共にゲル領域内でより均一な勾配をもたらす。このように、濃度勾配の正確な知識と、シミュレーションを用いる詳細なパラメータ検討を行う能力とが、化学誘引物質の回転の可能性を解釈するための、成長円錐によって感知された化学誘引物質勾配を定量化するために重要である。
【０１５２】
海馬軸索誘導に対する化学誘引物質勾配の影響
実験の目的は、ニューロンがコラーゲンゲルの中に三次元でニューロンの軸索を成長させること、及びニューロンがゲル表面の近くにある場合に、ニューロンがニューロンの軸索を成長させる機会を高めることである。従って、図１０Ａ〜１０Ｂに示されるようにゲル全体の差圧によってゲル上に細胞を詰め込んだ。細胞チャネルの入口ポートに細胞懸濁液（２０μＬ）を置いて、他の全ポートから培地を除去した。細胞液滴によって作り出された高圧が細胞チャネルを通って出口ポートに向かって流れを誘発した。培地チャネルと化学誘引チャネルとの両方における低い圧力がゲルを通るわずかな流れを作り出すことにより、ゲル表面に細胞を詰め込む。圧力差を数回再確立することによって、流れを回復させて、ゲル上に詰め込まれる細胞密度を増加させた。詰め込まれていない細胞を排除するために細胞播種の２時間後、細胞チャネル内で培地を新たにした。
【０１５３】
フロアプレート細胞によって生み出される拡散性化学誘引物質であるネトリン１は、長い距離にわたって未成熟ニューロンの有向性移動を容易にすることによって、ニューロンの接続性の複雑なパターンを作り出すことに重要な役割を果たす。一部の研究は、ネトリン１がＤＣＣ受容体を介してインビトロで交連軸索の生長を媒介して（K.Keino-Masu,et al,Cell,1996,87,175）、網膜軸索伸長を高める（T.Serafini,T.,et al,Cell,1994,78,409; K.J.Mitchell,et al,Neuron,1996,17,203）ことを示した。一方、ネトリン１は、ＤＣＣとＵＮＣ−５ホモログ（ＵＮＣ５Ｈ）とからなるネトリン−受容体の複合体を介して媒介された、胚脊髄におけるオリゴデンドロサイト前駆細胞に対する化学誘引物質であることが示された（A.A.Jarjour,et al,J.Neurosci.,2003,23,3735）。このように、この検討において、マイクロ流体デバイスにおける海馬ニューロンの軸索回転及び軸索誘導に対する異なる様式を通じて送達されたネトリン１の役割をインビトロで評価した。
【０１５４】
外因性誘導キューのない対照デバイスで海馬ニューロンを培養した時（図１１Ｇ）に、予測した通り、大部分の軸索は、勾配が全くない場合、全く軸索回転を示さず、Ｑ１において全軸索のうちの８．３±３．１％だけを観察し、Ｑ３において１２．６±４．３％を観察した（ｎ＝１５１個の軸索；図１１Ｋ）。右側チャネルにおいて、ネトリンで形質転換した繊維芽細胞と培養したニューロンの軸索回転と、左側チャネルにおいて、通常の繊維芽細胞と培養したニューロンの軸索回転を図１１Ａに示す一方で、両チャネルにおいて正常な繊維芽細胞を用いた培養物の軸索回転を図１１Ｂに示した。ネトリンで形質転換した繊維芽細胞から放出されたネトリン１（図１１Ａ）は勾配に向かった全軸索の４３．４±６．５％を引き付け、７．１±３．９％だけが外れた（Ｑ１対Ｑ３に対してｐ＜０．００１；ｎ＝１１９個の軸索）。対照的に、ゲル全体にネトリン勾配のない、両側において通常の繊維芽細胞を用いた培養物（図１１Ｂ）は、優先的な軸索回転を示さなかった（Ｑ１対Ｑ３に対してｐ＞０．６；ｎ＝４５個の軸索）。前者の場合、ネトリンで形質転換した繊維芽細胞は、コラーゲンゲル全体に勾配を継続的に再補充した可能性があり、細胞チャネルと培地チャネルとはシンクとして働くが、これらの細胞から放出されたネトリン１の正確な濃度は、この時点では分からない。従って、繊維芽細胞から放出されたネトリン１は、形質転換していない繊維芽細胞培養と比較した時に、勾配に向かう軸索回転において３倍の増加を（ｐ＜０．００１；図１１Ｊ）、そして繊維芽細胞のない対照と比較した時に、５倍の増加を誘発した（ｐ＜０．００１）。
【０１５５】
１μｇ／ｍＬの研究所で精製されたネトリン１の外因性補給は、ネトリンのない対照においてＱ１に変わった軸索の百分率の３倍（対照に対してｐ＜０．００１）、勾配に向かってＤＣＣで形質転換した海馬の軸索回転（Ｑ１において２７．８±６％；Ｑ１対Ｑ３に対してｐ＜０．０１；ｎ＝１１７個の軸索）を促した（図１１Ｃ）。それから、勾配に対する軸索応答に対する研究所で精製されたネトリン濃度の差動効果をテストした。図１１Ｄ、図１１Ｅ、図１１Ｆはそれぞれ、０．１、１、及び１０μｇ／ｍＬのネトリンの存在下で培養された海馬ニューロンの代表的な蛍光画像を示す。これらの画像の定量分析は、０．１及び１０μｇ／ｍＬのネトリンが、ネトリンのない対照と比較して、軸索回転に対して顕著な化学誘引性の効果を有さなかったことを明らかにした（それぞれ、ｎ＝１３８個及びｎ＝３８個の軸索）。より濃度が高いネトリン（１０μｇ／ｍＬ）は、成長円錐受容体を飽和させ、軸索回転を抑制することもあり、これが、この用量において全く反応がないことを説明するが、これらの仮説を検証するためにさらなる検討が必要である。結論として、１μｇ／ｍＬのネトリンは、検討した用量範囲において、勾配に向かう軸索回転に対して最大の好ましい効果を提供した（他の全事例に対する１μｇ／ｍＬのネトリンに対してｐ＜０．０３）。
【０１５６】
０．１μｇ／ｍＬの脳髄を海馬ニューロン培養物に補った時（図１１Ｈ；ｎ＝２８個の軸索）に、対照と比較して、勾配に向かう軸索回転が３倍増加することを観察した（ｐ＜０．００５）。Ｑ１及びＱ３における軸索の百分率から明らかなように、海馬ニューロンが１μｇ／ｍＬの研究所ネトリンと０．１μｇ／ｍＬの脳髄との両方に同様に応答したことに留意することは興味深い（図１１Ｋ）。この軸索応答に寄与する脳髄混合物において各誘導キューの組成と濃度とを確認することは困難であるが、しかしながら、それは、既知の細胞型と組織標本を共培養するデバイスの有用性を示す。
【０１５７】
細胞培養環境は、二次元平面培養システム又はマイクロピペット回転アッセイと比較した場合に、このデバイスにおいては非常に生理学的である。成長している神経突起は、勾配が軸索成長の方向に対してほぼ直交するゲルの水平部分に到達した時に、化学誘引物質をデバイスに添加する。成長円錐は性質が非常に動的であり、環境キューを感知すること、細胞本体にシグナルを伝達すること、そしてそれに応じて軸索を誘導することの３つの重要な機能を満たす。成長円錐の移動は、アクチン上部構造と接続された細胞骨格要素の重合化／脱重合化によって媒介され、細胞骨格要素は、軸索生長、成長円錐の運動性及び誘導において重要な役割を果たすことを暗示している（D.Bentley and A.Toroian-Raymond,Nature,1986,323,712）。誘導キューは、インビトロの成長円錐における化学走化性応答を誘発することを示し、ネトリン１又はＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）などの誘引性キューは、勾配の方向に細胞骨格網を延伸して（J.Yao,et al,Nat.Neurosci.,2006,9,1265）、ｓｌｉｔ−２又はセマフォリン３Ａなどの反発性キューによって誘発されたタンパク質は、細胞骨格網を崩壊させる（M.Piper,et al,Neuron,2006,49,215）。ネトリン１はマトリックス環境に分泌され、ＥＭＣ分子と細胞膜とに結合することにより、ネトリンの拡散及びシグナル伝達の範囲を決定する（T.E.Kennedy,Biochem.Cell.Biol,2000,78,569）。こうして、ネトリンシグナル伝達は、異なるネトリン受容体の活性化によるものであり得、ＤＣＣ（大腸ガン欠失）受容体は主にネトリン誘引性を媒介し（M.J.Barallobre,et al.,Brain.Res.Rev.,2005,49,22）、そしてＵＮＣ−５受容体はネトリン反発性を媒介する（H.M.Cooper,et al,Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.,1999,26,749）。コラーゲン１は、神経系においてＥＣＭの支配的な成分ではなく、三次元コラーゲン１足場に結合するネトリン１はごく僅かであるので、デバイス内で軸索によって把握されている勾配に影響を与えない。この検討から得られた結果もまた、１μｇ／ｍＬのネトリン１勾配に向かう海馬軸索回転は、図１１ＣにおいてＤＣＣ受容体の明るい蛍光によって示される通り、成長円錐の前縁におけるＤＣＣ受容体の活性化によって媒介されることを明らかにした。
【０１５８】
海馬軸索回転に対するｓｌｉｔ−２の影響
ｓｌｉｔ−２は、前方脳室下帯から嗅球に移動する神経前駆体を撃退し（W.Wu,et al,Nature,1999,400,331）、Ｒｏｂｏ受容体と相互作用することによって培養における脊髄運動軸索を撃退し（H.S.et al,Cell,1999,96,807）、そして脳内でグリオーマ細胞誘導を媒介することが示されている。ｓｌｉｔ−２のＲｏｂｏ膜貫通受容体同等物に関して、ｓｌｉｔ−２は、正中線における交連軸索の誘導を規制することが示された（K.Brose、et al.、Cell、1999、96、795）。さらに、ｓｌｉｔ−２によって撃退された細胞は、ネトリンに向かう応答性を失うことが示された（E.Stein and M.Tessier-Lavigne,Science,2001,291,1928; F.Causeret,et al,Dev.Biol,2002,246,429）。ｓｌｉｔ−２の発現を欠損したノックアウトマウスにおいて、軸索誘導における重大な欠陥がインビボで観察された（A.S.Plump,et al,Neuron,2002,33,219）。ｓｌｉｔ−２は、神経生物学において充分に検討された化学忌避物質であるので、マイクロ流体デバイスにおける軸索回転に対するｓｌｉｔ−２勾配の影響を評価した。
【０１５９】
図１２Ａ〜１２Ｃは、２つのレベルが異なるｓｌｉｔ−２勾配における海馬軸索回転の代表的な崩壊性三次元共焦点顕微鏡画像を示す。より高い勾配（右側のチャネルにおいて２５０ｎｇ／ｍＬ）において、ｓｌｉｔ−２は、Ｑ１のそれ（１８．２±４．５％；Ｑ３対Ｑ１に対してｐ＜０．００１；ｎ＝６４個の軸索）と比較して、Ｑ３における軸索の百分率（４２．６±９．１％）から明らかなように、強力な化学忌避物質として働く（図１２Ａ）。対照的に、６２．５ｎｇ／ｍＬのｓｌｉｔ−２は、同様に強固な忌避性特性を示さなかった（図１２Ｂ；ｎ＝５１個の軸索）。ｓｌｉｔ−２の濃度を６２．５ｎｇ／ｍＬから２５０ｎｇ／ｍＬに増加させることは、高濃度から外れる軸索の百分率をほぼ３倍にした（ｐ＜０．００１；図１２Ｃ）。キューを受け取らない対照（図１１Ｇ）に対して、２５０ｎｇ／ｍＬのｓｌｉｔ−２は、勾配を下る軸索回転を３．４倍だけ増強した（ｐ＜０．００１）。しかしながら、海馬軸索回転の際のｓｌｉｔ−２に関するこの興味深い挙動の裏の分子メカニズム（例えば、受容体活性化）を理解するために、さらなる検討を必要とする。
【０１６０】
ＤＲＧ移動と軸索回転に対するｓｌｉｔ−２の影響
ＤＲＧ外植片を細胞チャネルに播種した時に、ニューロンはデバイスに過密となり、そして三次元コラーゲンゲルの中に積極的に移動した（図１３Ａ）。ｓｌｉｔ−２を受け取らない対照培養物において、Ｑ１及びＱ３の中へのニューロンの移動は、足場に勾配が全くないことにより同様なままであった（Ｑ１における１８．５±５．１％対Ｑ３における１５±６．５％）。一方、２５０ｎｇ／ｍＬのｓｌｉｔ−２の添加は、対照に対して５倍だけ（対照に対してｐ＜０．００１）、そして６２．５ｎｇ／ｍＬのｓｌｉｔ−２勾配に対して２．７倍だけ（ｐ＜０．０１）、勾配を下るＤＧＲニューロンの移動を大幅に増加させた（Ｑ３において７４±１２．５％；図８Ｃ）。移動するニューロンは、複数のプロセスを延長して、移動のために最も好ましく見える経路を選択することによって、走化性成長円錐とは異なるシグナル伝達経路を利用することを示した（M.W.Ward,et al,Mol.Cell.Neurosci.,2005,30,378）。細胞本体よりも前方にある、移動するＤＲＧニューロンの前縁（図１３Ａ）は、化学勾配下で適合させたこの戦略を裏付けている。まとめると、これらの結果は、２５０ｎｇ／ｍＬの濃度のｓｌｉｔ−２はＤＲＧニューロン移動に対して強固な化学忌避効果を発現することを示し、これらの観察の裏にある分子メカニズムを引き出すためには、さらなる検討を必要とする。
【０１６１】
ＤＲＧ細胞の成長と移動とを阻害し、コラーゲン足場の中への軸索伸長だけを可能にするために、本発明者らは、細胞の移動及び増殖を阻害するためにガン研究で幅広く使用されているピリミジン類縁薬物である５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、１０−５Ｍの濃度、Sigma Aldrich,USA）を添加した（J.Fried,et al.,Cancer.Res.,1981,41,2627）。これらの実験において、０日目に５−ＦＵと共にＤＲＧ外植片を細胞チャネルに播種し、２４時間の培養後、ゲルから５−ＦＵの痕跡を除去するために全チャネルを新鮮な培地で徹底的に洗浄した。この段階では足場の中への細胞の移動を観察しなかったので、右側チャネルに２５０ｎｇ／ｍＬのｓｌｉｔ−２を添加することによって、デバイスに勾配を確立した。代表的な蛍光画像は、２５０ｎｇ／ｍＬのｓｌｉｔ−２の存在（または不在）下で培養された三次元コラーゲン足場におけるＤＲＧニューロンの軸索の広範囲にわたる生長や回転を示す（図１３Ｂ）。定量分析は、対照培養物における４２±８％の軸索と比較して、ＤＲＧ軸索のうちの７０±１４．２％がｓｌｉｔ−２によって忌避された（対照に対してｐ＜０．０３）ことを明らかにした。対照培養物における阻害と比べて、Ｑ１の中へのＤＲＧニューロンの軸索回転はｓｌｉｔ−２の添加の際に顕著に（５６％だけ）阻害された（対照に対してｐ＜０．０５）。これらの結果は、このデバイスにおける海馬軸索回転に対する２５０ｎｇ／ｍＬのｓｌｉｔ−２の効果とおおまかに一致した（図１２Ａ〜１２Ｃ）。
【０１６２】
神経生物学の研究におけるこのデバイスの可能性に加えて、このデバイスは、組織工学用途や再生医療用途において有用である。多数の研究が、中枢神経系（ＣＮＳ）に対する損傷は、誘導キューやそれらの受容体の細胞遺伝子の発現を徹底的に変え得ることを報告した（C.A.Willson,et al.,Cell.Transplant.,2002,11,229）。特定の関心事の中で、ネトリン１及びその受容体の発現の変化は、脊髄や小脳に対する損傷に続いて識別され、それらの領域における切断された軸索の再生不全を説明する可能性がある（R.Wehrle,et al,Eur.J.Neurosci.,2005,22,2134）。これらの発達キューの操作、これらの複雑な時空間勾配の組織、細胞間相互作用や細胞−マトリックスの相互作用の理解、及び動物実験モデルにおける損傷したＣＮＳの修復のための複数の誘導因子の役割の解明は、難題であり費用のかかる作業であり得る。これらの状況下で、インビトロの単純で安価なマイクロ流体システムにおいて細胞マイクロ環境を再び作り出して、インビボでの効果的な軸索の再生及び誘導のために組織工学手法（例えば、末梢神経移植片、注入可能なヒドロゲル）の設計に対する誘導として各成分（ＥＣＭ分子、成長因子勾配、機械刺激、炎症環境など）の役割を理解することが有利である。
【０１６３】
結論
マイクロ流体デバイスのこの実施態様を設計し開発し、そして化学勾配下での軸索誘導を検討するために最適化した。このシステムの主な利点は、製作や使用の単純さ、生理学的な三次元環境下での細胞培養、及び長い持続時間の間の安定した勾配の保持を含む。外部ポンプを使用してチャネルを通って培地及び化学誘引物質を継続的に流すことによって、さらに長い間、一定の勾配を保持するための将来的な実験が進行中である。この検討において、ネトリン１、脳髄、及びｓｌｉｔ−２などの既知の誘導キューだけをインビトロでの海馬又はＤＲＧの軸索回転やＤＲＧニューロンの移動に対する影響に関して検討した。これらのデバイスはまた、新たな誘導分子をスクリーニングしたり、成長円錐の形態を検討したり、軸索誘導に関与する遺伝子を識別したりするために使用することができる。インビトロで既知の勾配に細胞をさらすための方法はほとんど存在しないので、このシステムはまた、走化性を研究するために他の細胞型を用いて使用することができる。最終的に、このマイクロ流体プラットフォームは、神経繊維工学のための生体材料の最適化、ガン細胞転移の検討、非常に特別なニューロンへの幹細胞の分化、及び血管新生において用途を有する。
【０１６４】
実施例３  間質流は競合メカニズムを介する腫瘍細胞の移動の方向に影響を与える
間質流は組織の細胞外マトリックスを通る流体の対流輸送である。この潜行性流体流は、繊維芽細胞、ガン細胞、内皮細胞、及び間葉系幹細胞などの細胞の形態や移動に影響を与えることが示されている。しかしながら、実験手順と実験装置との制約により、細胞が流れを検知するメカニズム、及び細胞応答の詳細と動力学とは大部分が不明なままである。安定した圧力勾配と流体流とを加え、三次元コラーゲンタイプ１足場に播種した細胞の過渡応答の直接的な視覚化を可能にするように、マイクロ流体細胞培養システムを設計した。ガン細胞の形態や転移に対する間質流の影響を調べ、そして間質流がＭＤＡ−ＭＢ２３１乳ガン細胞の転移の可能性を増加させることを示す先行研究（Shields et al.,2007,Cancer Cell,11:526-38）を拡張するために、このシステムを利用した。この先行研究と一致して、細胞は流れの存在下で流線に沿って移動したことが分かったが、細胞密度だけでなく流動場の強さが流線に沿った移動の方向偏りを決定したことをさらに示した。特に、高い播種密度の細胞又はＣＣＲ−７受容体を有する細胞のいずれかである細胞が、流れと共に移動するのを阻害するのではなく、流れに反して移動するのを阻害したことが分かった。本明細書で提供されるものは、ＣＣＲ７依存自己移植走化性が流れ共に移動することを導くメカニズムであるというさらなる証拠であるが、流れに反する移動をもたらすＣＣＲ７に依存しない競合メカニズムもまた示す。細胞濃度、間質流の速度及び受容体の活性の影響を調査する実験からのデータは、競合刺激は媒介されるせん断応力であるという本明細書における仮説を裏付けている。このメカニズムは転移性疾患の進展に重要な役割を果たす可能性がある。
【０１６５】
組織は、栄養素とシグナル伝達分子とを輸送する間質流を含有する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に存在する細胞から構成される（Swartz,MA and Fleury,ME,2007,Annu.Rev.Biomed.Eng.,9:229-56; Jain,R.K.,1987,Cancer Research,47:3039-3051）。リンパ管に向かうドレナージ、炎症、腫瘍成長や微小血管からの漏れによって局所的に上昇した圧力、及び筋肉収縮などの生理学的プロセスからもたらされる組織全体の浸透圧や静水圧の勾配はそれぞれ、ＥＣＭを通る流体流を駆動する（Jain,R.K,1987,Cancer Research,47:3039-3051; Boardman,K.C. and Swartz,M.A,2003,Circ.Res,92:801-808）。これが、間質流と呼ばれ、組織移植や生理学において役立つと長く認識されてきた（Swartz,MA and Fleury,ME,2007,Annu.Rev.Biomed.Eng,9:229-56; Levick,JR,1987,Q.J.Exp.Phys,72:409-37）。ＣｈａｒｙとＪａｉｎは、組織間質において流体流を直接観察するために光退色後に蛍光回復を使用して、約０．１〜２．０μｍ／秒である典型的な流速を決定し、そしてさらに最近の研究は、流れが４．０μｍ／秒の高速に到達することができることを示した（Chary,SR and Jain,RK,1989,Proc.Natl.Acad.Sci,86:5385-89; Dafni,H,et al,2002,Cancer Research,62:6731-6739）。
【０１６６】
腫瘍性組織は多くの場合に間質圧の局所的な増加によって特徴付けられるので、間質流は腫瘍の周囲において輸送を駆動する際に特に重要であり、腫瘍の境界において高い間質圧勾配をもたらす（Heldin,C,et al.,2004,Nat.Rev.Cancer, 4:806-13）。さらに、高い腫瘍内間質圧はガン患者に対する貧弱な予後と相関した（Curti,B.D,et al,1993,Cancer Res.,53:2204-2207(1993)）。従って、間質流は転移の形成において腫瘍細胞の移動を誘導する可能性がある刺激として浮上した（Curti,B.D,et al,1993,Cancer Res,53:2204-2207(1993); Chang,S.,et al,2008,Proc.Nat.Acad.Sci,105:3927-2932; Hofmann、M.,et al,2006,Neoplasia,8:89-95; Leunig,M.,et al,1992,Cancer Research,52:6553-6560）。
【０１６７】
Ｓｈｉｅｌｄｓらは、流れにさらされた細胞集団において転移の可能性が増加することを観察し、これは、ＣＣＲ７受容体に自己分泌ＣＣＬ２１リガンドを結合することを通じて活性化されたことを示した（Shields et al,2007,Cancer Cell,11:526-38）。自己移植走化性と呼ばれるこの自己分泌シグナル伝達メカニズムは流動場で生じ、その流動場では、対流が自己対流ケモカイン因子を送達し、細胞間ケモカイン勾配を作り出し、これが次に、走化性シグナルを提供する（Fleury,ME,et al,2006,Biophysical Journal,91:113-21）。
【０１６８】
自己移植走化性モデルを開発するためにＳｈｉｅｌｄｓらによって使用されたトランスウェルアッセイや同様な他のインビトロアッセイが、腫瘍細胞上で分離された刺激の系統的検討を可能にすることによって転移プロセスや腫瘍細胞の移動への貴重な見識を提供した（Curti,B.D,et al,1993,Cancer Res,53:2204-2207(1993); Chang,S.,et al,2008,Proc.Nat.Acad.Sci,105:3927-2932; Griffith,LG, and Swartz,MA,2006,Nat.Rev.MCB,7:211-24; Vickerman,V,et al,2008,Lab on a Chip,8:1468-77; Keenan,T.M and Folch,A,2007,Lab on a Chip,8:34-57; Keenan,T.M,2006,App.Phys.Letters,89:114103-1-114103-3; Jeon,N.L.,et al,2000,Langmuir,16:8311-8316;Friedl,P,et al,1995,Cancer Research,55:4557-4560; Helm,C,et al,2005,Proc.Nat.Acad.Sci,44:15779-15784; Wang,S and Tarbell,JM,2000,Arterioscler.Thromb.Vase.Biol,20:2220-2225; Ng,CP and Swartz,MA,2003,Am.J.Phiol.Heart Circ.Physiol,284:H1771-H1777）。しかしながら、培養条件やトランスウェルアッセイの画像化能力の制約が、細胞がどのように間質流を検知し、それに応答するかの詳細な理解を欠くことの一因となっている。さらに、自己移植走化性モデルの検証、及び流れに誘発された他の細胞刺激の調査は、細胞が生理学的に関連する三次元マトリックスに播種され、そして流れに対する時間依存の形態応答や移動応答を定量化できる細胞培養システムから明らかに利益を得るだろう。三次元培養システムは、繊維芽細胞（Ng,CP and Swartz,MA,2003,Am.J.Phiol.Heart Circ.Physiol,284:H1771-H1777; Boardman,K.C.and Swartz,M.A,2003,Circ.Res.92:801-808）、筋繊維芽細胞（Ng,C.P,et al,2005,J.Cell Science,118:4731-4740）、内皮細胞（Vickerman,V,et al,2008,Lab on a Chip,8:1468-77; Helm,C,et al,2005,Proc.Nat.Acad.Sci.44:15779-15784）、及び平滑筋細胞（Wang,S and Tarbell,JM,2000,Arterioscler,Thromb.Vasc.Biol.20:2220-2225）などの他の細胞型に対する間質流の影響を明らかにするために用いられてきた。
【０１６９】
本明細書は、生理学的に関連する三次元マトリックスにおける細胞移動の方向偏りや動力学を観察及び定量化できるマイクロ流体細胞培養システムを記載し、このシステムを腫瘍細胞の移動に対する間質流の影響を検討するために利用した。本明細書は、間質流が細胞移動の方向偏りに影響を与えること、及び移動応答が流速と細胞密度とに依存することを明らかにした。さらに、ＣＣＲ７経路を遮断することによって、流れの方向への移動に関するＣＣＲ７依存の自己移植走化性モデルを裏付ける証拠を提供し、そして第２の、ＣＣＲ７に依存しない経路は細胞が流れに反して移動するように刺激することを明らかにしている。明らかに独立したこれら２つのメカニズム間の競合は、間質流の影響下で細胞移動の方向を主に決定する。
【０１７０】
結果
細胞培養システムの設計及び間質流場の検証。三次元コラーゲンＩマトリックスにおいて乳ガン細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）を培養し、レベルの制御された間質流にこれらの細胞をさらすためのマイクロ流体細胞培養システムを利用した。システムは、コラーゲンＩゲルに懸濁された単一の細胞を含有する領域によって分離された２つのチャネルからなる（図１６Ａ）。ゲル領域全体に静水圧勾配を加えることによって、一定の流動場を発生させる。本発明者らのシステムの幾何形状のための多孔性培地を通る流れに関するＢｒｉｎｋｍａｎ方程式を解くためにＦＥＭソフトウェアを使用した（図１６Ｂ）。蛍光ミクロスフェアをバルク流体に添加し、蛍光低速度顕微鏡を使用してミクロスフェアを画像化することによって流動場を検証した（図１６Ｂ）。間質流の速度は、再現性であり、多数の予測と一致することが分かった（図１６Ｃ）。測定された速度ベクトルと予測された速度ベクトルとが同じ方向であることも観察した（図１６Ｄ）。以下では、各流動場は、それぞれ０．３μｍ／秒及び３．０μｍ／秒の概略的平均であるそれぞれの名目値で言及され、その名目値は公開されたインビボの間質流速度値の範囲の代表値である。ビーズ追跡データから、２ｍｇ／ｍｌのコラーゲンＩゲルの透水率が、既に公表されている値と似た１．５５×１０−１３ｍ２であることを確認した。
【０１７１】
細胞は優先的に流れと整列する。ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳ガン細胞をマイクロ流体デバイス内のコラーゲンＩゲルに播種した。ゲル内において三次元で細胞を懸濁し、三次元で移動させた（図１７Ａ）。共焦点反射率顕微鏡法は、細胞が移動すると細胞はコラーゲンマトリックスを劣化させ、移動の間、ゲル内に痕跡を残すことにより、タンパク質分解活性移動メカニズムを示唆した。細胞は、間質流にさらされた時に、流れの流線に平行に並んだ。より長い期間、細胞は突起を伸長させ、次に流れの流線と平行に多細胞ストリングを形成した。４０時間後、３．０μｍ／秒の流速にさらされた細胞は、流動場の流線と整列し、細胞のうちの８６±７％が局所的な流線の４５°の範囲内で整列した。流れにさらされない細胞は、ランダムに配向されたままであり、細胞のうちの５５±２％だけが局所的な流線の４５°の範囲内にあった。
【０１７２】
高い濃度で播種された細胞は、流れに反して移動する。１６時間にわたる低速度画像化を使用して、各細胞の集団の中心を追跡した。細胞の移動速度は、間質流の大きさ（０．１０μｍ／ｓ±０．０５）とは無関係であることが分かった。間質流にさらされた細胞は、全移動距離によって正規化した正味の移動距離として定義される方向性を増加させて移動した（対照に対する０．３９±０．０７１と比較して、０．３μｍ／ｓに対して０．６３±０．０７３、３．０μｍ／ｓに対して０．６１±０．０７１）。しかしながら、８時間で１つの細胞の直径よりも遠い距離を移動する細胞の百分率として定義される細胞の運動性は流れによる影響を受けなかった。
【０１７３】
間質流は細胞移動において方向偏りを誘発した。対照デバイス及び３．０μｍ／ｓの流れを有するデバイスに関する移動データの極座標系ヒストグラム（polar histogram）は、移動ベクトルの方向に対する流れの影響を明らかに示す（図１７Ａ〜図１７Ｅ）。流れを有するデバイスにおいて、細胞は優先的に流線に沿って移動した。細胞集団の移動方向を定量化するために、２つの測定法を提案した。「流線移動測定法」は、細胞が流線の４５°の範囲内で移動した場合に＋１を細胞に与え、細胞がこの範囲から外に移動した場合には−１を細胞に与える（図１７Ｄ）。細胞集団に対する＋１の平均スコアは、細胞の全てが流線に沿って移動していることを示し、スコア０は純粋にランダムな移動に対応し、スコア−１は、全ての細胞が流線に対して垂直に移動していることを示す。流線に沿った移動の方向偏りを決定するために、細胞が流れの方向に移動した場合には、その細胞に＋１を与え、細胞が流れに反して移動した場合には、その細胞に−１を与える「方向性移動測定法」をコンピュータ計算した（図１７Ｅ）。流線の４５°以内で移動する細胞の全てが、流れと共に移動している場合には、集団は＋１の平均スコアを有し、細胞がランダムに移動している場合には、集団は０のスコアを有し、細胞の全てが流れに反して移動している場合には、集団は−１のスコアを有する。
【０１７４】
２５×１０４個の細胞／ｍｌで播種されて間質流にさらされた細胞は、優先的に流れの流線に沿って移動し、０．３μｍ／秒に対して０．４７±０．０６の平均流線移動スコアを有し、３．０μｍ／秒に対して０．２４±０．０４の平均流線移動スコアを有した（平均±ＳＴＤ、図１８Ａ）。流線に沿って移動する細胞の中で、より多くの割合の細胞集団が下流ではなく上流に移動し、この上流への偏りの強度は間質流の速度の関数であった。０．３μｍ／秒の間質流速度においては、平均的な方向性移動のスコアは、−０．１８±０．１５であり、３．０μｍ／秒においては、方向偏りは−０．４０±０．０８までさらに増加した。対照デバイスにおける細胞は、いずれの方向にも優先的には移動しなかった（図１８Ｂ）。これらの結果は、細胞が優先的に流れと共に移動することを観察したＳｈｉｅｌｄｓらによって報告された結果とは反対であった。
【０１７５】
低い細胞播種密度において、細胞は流れと共に移動する。流れの下での方向性移動に対する細胞密度の影響をテストするために、２５×１０４個の細胞／ｍｌ及び５×１０４個の細胞／ｍｌの２つの異なる播種密度で実験を行った。この密度差は、約２倍だけ細胞間の距離が増加することに対応する。細胞間の距離を増加させたとしても、０．３μｍ／秒の間質流場における流線に沿った移動に対する偏りに影響を与えなかったが、わずかな割合の細胞が、より低い濃度で播種された時に、３．０μｍ／秒の間質流場において流線に沿って移動した（図１８Ａ）。
【０１７６】
しかしながら、細胞密度を減少させると、移動の方向に対して劇的な影響を及ぼし、方向性移動測定法における記号の変化によって示されるように、流れに対する移動の方向偏りの反転を引き起こし、それは、Ｓｈｉｅｌｄｓらと一致する結果である。０．３μｍ／秒の流速において、平均方向性移動スコアは、２５×１０４個の細胞／ｍｌにおいて−０．１７７±０．１５であったが、５×１０４個の細胞／ｍｌにおいて０．５７０±０．１８まで増加した。３．０μｍ／秒に対して、平均方向性移動スコアは、２５×１０４個の細胞／ｍｌにおいて−０．４０１±０．０８であったが、５×１０４個の細胞／ｍｌにおいて０．３０７±０．１６まで増加した（図１８Ｂ）。
【０１７７】
ＣＣＲ７シグナル伝達を遮断することにより、上流移動の傾向が増加する。２５×１０４個の細胞／ｍｌで播種され０．３μｍ／秒の間質流にさらされたデバイスにおいて、ＣＣＲ７の添加により、流線に沿った移動の偏りを低下させ、０．４７２±０．０６０から０．１７４±０．０７０に平均流線移動測定値を下げたが、３．０μｍ／秒の流動場においては細胞にほとんど影響がなかった（図１８Ａ）。両方の間質流速度において、ＣＣＲ７を遮断することにより、流れに反する方向性移動が増加した（図１８Ｂ）。
【０１７８】
ＣＣＲ７シグナル伝達が遮断された時に、播種密度が低い細胞は上流に移動する。興味深いことに、細胞密度を減少させることとＣＣＲ７を遮断することを組み合わせた効果が、流線に沿った移動偏りに対して流速依存性の変化をもたらした。０．３μｍ／秒では、５×１０４個の細胞／ｍｌにおいてＣＣＲ７遮断抗体を添加すると０．４８９±０．１２２から０．２０１±０．０３１に流線移動スコアが減少したが、３．０μｍ／秒では、５×１０４個の細胞／ｍｌにおいて０．０８８±０．１８８から０．３８４±０．０６に流線移動スコアが増加した（図１８Ａ）。
【０１７９】
５×１０４個の細胞／ｍｌで細胞を播種したデバイスにおいて、抗ＣＣＲ７遮断抗体の添加は、流れの方向における優先的な移動を完全に無視し、実際に、流れに反した移動を優先的に引き起こした。平均方向性移動スコアは、０．３μｍ／秒では０．５７０±０．１２から−０．４２０±０．１９に減少し、３．０μｍ／秒では０．３０７±０．１６から−０．６４９±０．１８に減少したように両流速において劇的に減少した（図１８Ｂ）。
【０１８０】
ＣＣＲ７を遮断することは、細胞移動の播種密度依存性を排除する。ＣＣＲ７遮断抗体を有する５×１０４個の細胞／ｍｌの細胞集団とＣＣＲ７遮断抗体を有する２５×１０４個の細胞／ｍｌの集団を比較した場合、方向性移動偏りに顕著な変化は存在しない。これらのデータは、遮断抗体の添加が方向性移動偏りに対する細胞濃度の影響を無視することを示唆する。さらに、影響は統計学的に有意ではないが、一貫した傾向が流速の影響において観察される。両方の細胞濃度において、０．３μｍ／秒から３．０μｍ／秒に流速を増加することにより、流線に沿って移動する細胞の百分率を増加させ、流線に沿って移動する細胞の上流移動偏りを増加させる（図１８Ａ〜１８Ｂ）。
【０１８１】
考察
細胞移動に対する間質流の影響。間質流は腫瘍細胞の移動に影響を与え、特に、移動の方向に劇的に影響を与えた。間質流を用いた全培養条件に関して、細胞は優先的に流線に沿って移動した。流線に沿って移動した細胞集団の相対的な割合と、流線に沿った上流及び下流の偏りとは、細胞密度、ＣＣＲ７活性、及び間質流の速度との関数であった。
【０１８２】
ＣＣＲ７及び自己移植走化性。３．０μｍ／秒及び０．３μｍ／秒の流動場において５×１０４個の細胞／ｍｌ及び２５×１０４個の細胞／ｍｌで播種された細胞に関して、ＣＣＲ７遮断抗体の添加は、下流移動の傾向を減少させた。これらのデータは、ＣＣＲ７受容体が下流移動に関与することを示し、従って、ＣＣＲ７ケモカイン受容体が自己移植走化性に関与するシグナル伝達経路において重要であると特定したＳｈｉｅｌｄｓらの知見を裏付けている（Shields et al,2007,Cancer Cell,11:526-38）。自己移植走化性は、ＣＣＲ７ケモカイン受容体によって検知され流れの方向に移動を刺激する自己分泌走化性シグナルの流れ誘導勾配の結果である。本明細書は、ＣＣＲ７が腫瘍細胞の移動に関与することを確認し、そしてＣＣＲ７が下流移動に直接関与することを明らかにすることによって自己移植走化性モデルを検証するデータを提供する。
【０１８３】
興味深いことに、ＣＣＲ７遮断抗体を用いない実験において、移動方向は細胞播種密度の強い関数であった。細胞濃度が増加すると、ほとんどの細胞は下流に移動せず、上流方向へ移動する一般的な傾向が現れ始めた。細胞移動の方向の密度依存性は、自己分泌ケモカイン濃度場と傍分泌ケモカイン濃度場との間の相互作用の結果であることが予測された。自己分泌ケモカイン勾配の結果としての自己移植走化性は、単一細胞に関して以前に検討された（Fleury,ME,et al,2006,Biophysical Journal,91:113-21）が、モデル内で隣接する細胞の影響を含む場合には、細胞密度を増加させることにより、他の細胞の下流の細胞に対する細胞間勾配の大きさを減少させることが観察された。これは、単一の細胞の局所的な影響が細胞の集団からのリガンド放出の影響によって圧倒されるという事実によるものである。結果として、細胞密度を増加させることにより、自己分泌細胞間勾配を減少させ、自己移植走化性に対するシグナルを減衰させ、そして下流へのＣＣＲ７媒介移動の傾向を減少させる。高い細胞濃度はより弱い自己移植走化性刺激をもたらすことのさらなる検証として、方向性移動の傾向は、高濃度で播種された細胞集団と遮断されたＣＣＲ７を有する細胞集団との間で同様である。
【０１８４】
競合シグナル。ＣＣＲ７が遮断された場合に、方向性移動スコアは、テストしたあらゆる条件で減少する。流線移動スコアの減少は、５×１０４個の細胞／ｍｌにおける細胞について公表されている。平均方向性移動スコアは、正から負に記号を変え、下流から上流への移動偏りのシフトを反映する。ＣＣＲ７が遮断される場合には、細胞密度と流速の両方に対する負の方向性移動スコアに刺激されるので、ＣＣＲ７に依存しない刺激は、ＣＣＲ７に依存する自己移植走化性と競合し、ＣＣＲ７が阻害されると、上流に移動するように細胞を刺激すると仮定した。これらの２つの刺激の相対強度が、細胞集団に対する移動における方向偏りを支配し、その相対強度は、細胞密度、間質流の速度、及びＣＣＲ７受容体の利用可能性の関数である。
【０１８５】
流線スコア及び方向性移動スコアが、ＣＣＲ７に依存しない刺激の性質に関する見識を提供する。方向性移動スコアは、単調に減少し（より負になり）、間質流の速度を増加させ、そしてこの効果は、ＣＣＲ７活性と播種密度とに関係がない。対照的に、低密度の細胞の下流移動は、０．３μｍ／秒の流速でピークになり、それから、３．０μｍ／秒で減少する。これらのデータは、ＣＣＲ７に依存しない刺激が、強度を増して間質流の速度を増加させることを示唆する。さらに、ＣＣＲ７が遮断される場合、方向性移動スコアは細胞播種密度とは関係がなく、ＣＣＲ７に依存しない刺激の強度は、細胞密度とは無関係であることを示唆する。興味深いことに、上流移動刺激は、低い細胞密度や低い流速であっても持続し、その刺激が細胞間相互作用とは関係がないことを示唆する。
【０１８６】
細胞を上流に駆動する刺激は、流速依存性であるが、細胞密度には依存しない。細胞上の流れ誘導応力は、流速の関数であり、自己分泌又は傍分泌のシグナル伝達刺激とは対照的に、細胞密度には依存しない。せん断応力が内皮（ＥＣ）細胞の移動において役割を果たすことは長く知られ（Branemark,P.I,1965,Bibl.Anat,7:9-28;Li,S.,Huang,N.F and Hsu,S,2005,J.of Cellular Biochem,96:1110-1126;Boardman,K.C. and Swartz,M.A,2003,Circ.Res.92:801-808; Branemark,P.I,1965,Bibl.Anat,7:9-28; Moldovan,N.I,et al,2000,Circ.Res,87:378-384; Galbraith,C.G.,et al,1998,Cell.Motil.Cytoskeleton,40:317-330; Helmke,B.P.,et al,2000,Circ.Res,86:745-752; Wang,N.,et al.,1993,Science,260:1124-1127）、Ｗａｎｇ及びＴａｒｂｅｌｌは、わずかな間質流の速度が、組織内のわずかな間質腔により、大きいせん断応力を細胞に伝えることができることを明らかにした（Wang,D.M. and Tarbell,J.M,1995,J.Biomech.Eng,117:358-363）。Ｂｒｉｎｋｍａｎの培地の範囲上の抗力に対するＧａｎａｐａｔｈｙの式を使用して、１．５×１０−６ｍ２の透過性の多孔性培地における半径１０μｍの全応力が、３．０μｍ／秒に対して０．１Ｐａであり、０．３μｍ／秒に対して０．０１Ｐａであることを推定した（Ganapathy,R,1997,Zeitschrift fur Angewandte Mathematik und Mechanik,77:871-875）。Ｌａｗｌｅｒらは、この大きさのせん断応力は、腫瘍細胞の形態に影響を与えることを明らかにし、三次元マトリックスを通る移動と関連付けられる、食道ガン細胞における動的な水泡形成が、０．０５Ｐａよりも大きいせん断応力に対するせん断速度を増加させると共に、増加することを見い出した（Lawler,K.,et al, 2006,Am.J.Physiol.Cell Physiol,291:668-677）。  
【０１８７】
三次元マトリックスにおいて細胞を通る流れは、細胞間せん断応力勾配をもたらして（Pedersen,J.A.,et al,2010,Cells in 3D matrix under intestinal flow: effects of extracellular matrix alignment on shear stress and drag forces,43:900-905）、この応力は、細胞−マトリックスの相互作用において非対称的な力をもたらす。例えば、上流側の張力と下流側の圧縮力をもたらす。張力はインテグリンを活性化でき、そして接着斑形成を推進できること（Galbraith,C.G.,et al,2001,J.Cell Biology,159:695-705; Kong,F.,et al,2009,J.Cell Biology,185:1275-1284）、及びインテグリンが三次元マトリックスにおける繊維芽細胞による、間質流誘発性マトリックスの再建を媒介すること（Ng,CP,et al.,2005,J.Cell Science,118:4731-4740）を示した。流れに誘発された応力勾配は、インテグリンおよびＦＡの活性化の差をもたらし、上流でより活性化され、上流では、細胞−マトリックスの接続は緊張していることが推測された。このメカニズムは、インテグリン上での張力の勾配により、偏ったインテグリン作動をもたらす恐れがある細胞間歪み勾配が増加する歪みに向かって細胞移動を誘導することを示したＬｏらによって検討されたメカニズムと同様であることが期待された（Lo,C,et al,2000,Biophysical J,79:144-152）。
【０１８８】
Ｆｌｅｕｒｙらは、コンピュータ計算モデルを開発し、間質流が、分泌されたＭＭＰの分布を偏らせ、細胞の下流にＭＭＰを蓄積させる結果となることを示した（Fleury,ME,et al.,2006,Biophysical Journal,91:113-21）。下流でＭＭＰの濃度を増やすと、マトリックスの劣化を増加させることとなり、上流での細胞−マトリックスの接続をさらに強固にし、上流移動を助ける。共焦点反射データは、細胞が移動すると、後縁においてマトリックスに空隙を残し、方向性のあるタンパク質分解は上流移動に関与するという仮定を裏付けることを明らかにした。方向性のあるタンパク質分解は、ＦＡ構造、細胞間応力分布、及びモルフォゲン分布を含む多くのメカニズムのうちの１つであると考えられ（Wang,S and Tarbell,JM,2000,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.20:2220-2225; Cukierman,E,et al,Science,294:1708-1713）、そのメカニズムは、二次元と三次元とで顕著に異なり、本発明者らのデータと、Ｌｉらのデータとの差の一因となり、Ｌｉらは、せん断応力が、細胞の下流縁において接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）の偏極回復、新たな接着斑の形成、及び二次元基質上に播種されたＥＣに対する流れの方向への続く移動を引き起こしたことを明らかにした（Li,S,et al,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.99:3546-3551）。
【０１８９】
インテグリン及びケモカイン受容体を介して活性化した移動経路はシグナル伝達カスケードに早期に収束するので、上流移動を推進するインテグリンの役割を解明することは困難である（Li,S.,Huang,N.F. and Hsu,S,2005,J.of Cellular Biochem,96:1110-1126; Lawler,K.,et al,2006,Am.J.Physiol.Cell Physiol,291:668-677;Shyy,J.,Y and Chien,S,2001,Circ.Res.91:769-775; Frame,M.C,2002,Biochimica et Biophysica Acta,1602:114-130）。ＦＡＫは、活性化したインテグリンと共局在化し、Ｓｒｃキナーゼを活性化させ（Thomas,J.W.,et al.,1998,J.Biol.Chem,273:577-583; Eide,B.L,et al,1995,Mol.Cell.Biol,15:2819-1817; Schaller,M.D.,et al,1994,Mol.Cell.Biol,14:1680-1688）、Ｓｒｃキナーゼは、腫瘍細胞の移動にとって重要な牽引力を調節する（Fincham,V.J and Frame,M.C,1998,EMBO J,17:81-92; Sieg,D.J,et al,1998,EMBO J,17:5933-5947）。本明細書に記載されているように、ＳｒｃキナーゼＰＰ２の特異的阻害剤（Li,S.,et al,1997,J.Biol.Chem,272:30455-30462; Jalali,S.,et al,1998,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol,18:227-234）、及び細胞はランダムに移動し、上流又は下流への偏った移動はなかったことが分かった。これらのデータは、下流移動のためのＣＣＲ７媒介自己移植走化性モデルと一致する。なぜならば、Ｓｒｃはリンパ球におけるＣＣＲ７経路に関与していたからである（Riol-Blanco,L.,et al,2005,J.Immunol,174:4070-4080; Bardi,G.,et al,2003,FEBS Letters,542:79-83）。ＰＰ２は上流移動も遮断したので、Ｓｒｃは上流移動に関与し、さらに、上流移動は細胞密度に関係ないので、ケモカイン受容体を介する傍分泌及び自己分泌のシグナル伝達は、Ｓｒｃ活性化の要因である可能性は低い。結果として、ＰＰ２データは、流れに誘発された応力勾配と方向性のあるタンパク質分解とが、インテグリン活性化、ＦＡ形成、及び続くＳｒｃ活性化を偏らせるようにし、流れに反する移動を刺激するという本明細書における仮定を裏付ける。
【０１９０】
間質流はガン治療のための薬物輸送に関して幅広く研究され（Heldin,C,et al.,2004,Nat.Rev.Cancer,4:806-13）、そしてインビボで、間質流圧（ＩＦＰ）は、頚ガン患者の生存と相関し（Milosevic,M.,et al,2001,Cancer Research,61:6400-6405）、間質流圧を減らすことが、腫瘍細胞の増殖を減らす（Hofmann,M.,et al,2006,Neoplasia,8:89-95）ことが示された。間質流は腫瘍から周囲のリンパ管に流れるので、ＣＣＲ７を遮断することにより、流れの方向への移動を阻害することが、腫瘍からの移動を減らし、転移形成の可能性を減らす可能性がある。細胞密度と間質流の速さとは細胞からの距離の増加と共に減少し、細胞密度と間質流の速度との両方が、腫瘍の境界において最も高い。本明細書におけるデータは、腫瘍表面から臨界的距離における「逃避半径」の存在を示す。逃避半径よりも短い半径距離の細胞に関して、間質流は細胞を上流に誘導し、腫瘍と共に集めて細胞を維持するが、逃避半径を越えて位置決めされた細胞に関しては、間質流は、廃液するリンパ管に向かって下流に細胞を誘導する。さらなるモデリングとインビボデータとが、逃避半径の存在を検証するために必要とされるが、逃避半径は、転移性疾患の重篤度を評価し、適切な治療を決定する重要なパラメータであり得る。間質流は、腫瘍細胞の移動に影響を与える、インビボの多くの生物化学的刺激や生物物理学的刺激のうちの１つに過ぎないが、間質流の考慮は、転移性疾患を理解し治療するために、そして組織工学的に構築された構築物を開発するために重要である。
【０１９１】
材料及び方法
細胞及びデバイスの調製
先に記載されているプロセスでソフトリソグラフィを使用して、マイクロ流体デバイスを製作した（Vickerman,V,et al,2008,Lab on a Chip,8:1468-77; Kothapalli；未公表データ）。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ、Ellsworth Adhesives,MA）を１０：１の基剤：硬化剤で混合し、シリコン原版の上に注ぎ、８０℃で一晩培養した。シリコン原版からＰＤＭＳを切断し、整えて、水の中でオートクレーブ処理した。それから、デバイスを乾燥オートクレーブ処理して、８０℃のオーブンで一晩乾燥した。次に、殺菌したＰＤＭＳデバイスを２分間プラズマ処理で表面活性化し（Ｈａｒｒｉｃｋ  Ｐｌａｓｍａ、Ithaca,NY）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ、Sigma-Aldrich,St.Louis,MO）でコーティングし、３７℃で一晩培養し、殺菌水で洗浄して、８０℃で一晩乾燥した。
【０１９２】
元々胸水に由来するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Manassas,VA）から取得して、１０％ＦＢＳ（Invitrogen）を有する１０ｘのＤＭＥＭ（Invitrogen,Carlsbad,CA）の標準的な成長培地で培養した。コラーゲンタイプ１（BD Biosciences,Bedford,MA）溶液を１０ｘのＤＭＥＭで緩衝剤処理し、ＮａＯＨでｐＨ８．９に滴定して、コラーゲン１の最終濃度を全溶液中で２ｍｇ／ｍｌにした。０．０５％のトリプシン／ＥＤＴＡで細胞を摘出して、１２０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。所望の濃度の培地に細胞を再懸濁し、次に、懸濁した細胞をコラーゲン１の溶液と混合して、最終細胞濃度を２．５×１０５又は０．５×１０５個の細胞／ｍｌ（全溶液）とした。マイクロピペットを使用して手でゲル−細胞の溶液をデバイスに添加して、カバーリップでデバイスを密封した。培地を添加する前にコラーゲンゲルが重合化するように、シールしたデバイスを３７℃で３０分間インキュベータに置いた。
【０１９３】
３７℃で一晩細胞を培養した。圧力勾配を加えるために、外部培地リザーバーをマイクロ流体チップに接続した。デバイスにリザーバーを接続するためにタイゴン（Compagnie de Saint-Gobain,Paris,France）チューブを有する改質ナルゲン（Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA）のボトルからリザーバーを作った。ゲル全体に所望の圧力勾配を確立する量で各リザーバーに培地を添加した。デバイスが画像化前に３７℃の熱平衡に到達するようにした（画像化及びデータの定量化に関する詳細に関してはＳＩ  ＡｐｐｅｎｄｉｘにおけるＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓを参照されたい）。
【０１９４】
培地を１０μｇ／ｍｌのヒト組み換えＥＧＦ（PeproTech,Rocky Hill,NJ）で補完した。ＣＣＲ７の遮断に関して、ヒトＣＣＲ７ＭＡｂ（R&D Systems）を５μｇ／ｍｌで培地に添加した。
【０１９５】
実施例４  抗転移性肺ガン薬物をスクリーニングするための三次元マイクロ流体システム
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の阻害は、肺ガンを治療するための有効な戦略として有用である可能性がある。特定のＭＭＰの正確な機能に関する知識の限界と共に選択的ＭＭＰ阻害剤の欠如が依然として臨床用途を妨げている。現在利用可能なＭＭＰ阻害剤を用いた治験の失望にも関わらず、第三世代のＭＭＰ阻害剤が現在検討中である。それらは特に、標的のＭＭＰだけを遮断するように設計されるが、抗標的のものも保持している。しかしながら、これはＭＭＰの関与と活性レベルとを理解する必要性を絶対的に強調するものであり、そして同時に、肺ガンの転移の間のＭＭＰ活性を決定するための特異的かつ高感度な定量的アッセイの開発の必要性も絶対的に強調する。
【０１９６】
抗転移性肺ガン薬物をスクリーニングするための三次元マイクロ流体システムを開発する目的のために、長期間にわたって成熟微小血管網を安定させることが研究された。いくつかの研究グループが、転移の一連のプロセスにおける個々のステップに焦点を当てる、ガン転移の重要なステップを検討するためのマイクロ流体デバイスの用途を報告した（Strell,C,et al,Mol.Life ScL,64:3306-3316(2007); Chaw,K.C.,et al,Lab Chip,7:1041-1047(2007); Liu,T.,et al,30:4285-4291(2009)）。しかしながら、これらの研究のうちのどれも、転移の一連のプロセスを研究する能力に至っていない。本明細書に記載されているものは、三次元マイクロ流体プラットフォームの範囲内で肺ガン転移の一連のプロセスを調べる方法である。この手法は、抗転移性肺ガン薬物をスクリーニングするために市販可能であり、そして特異的ＭＭＰ阻害剤を開発するためにも市販可能である。
【０１９７】
蛇状チャネルに沿って３つの異なるコラーゲンゲル足場（ＣＧＳ）（ＣＧＳ１（上部）、ＣＧＳ２（中間）、及びＣＧＳ３（底部））を含む灌流マイクロ流体デバイスを設計して、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ、Sylgard 184,Dow Chemical,MI）と、標準的なマイクロ流体プロトロルに関して先に記載されたようなソフトリソグラフィ（V.Vickerman,et al,Lab Chip,2008,8,1468-1477; S.Chung, R,et al,Lab Chip,2009,9,269-275）とを使用して製作した。図１９Ａ〜１９Ｄを参照されたい。デバイスの直径は、約３５０ｍｍであり、２つの独立した流路を有していた。流路の入口寸法は、約５００μｍ（幅）×１５０μｍ（高さ）であり、３つのＣＧＳの寸法は、約４，１００μｍ（長さ）×１，３００μｍ（幅）×１５０μｍ（高さ）であった。この特定のデバイスにおいて、出口において融合する２つの独立した流路が存在し（図１９Ａ）、そしてゲルポートを介して３つの異なる濃度のタイプ１コラーゲンゲル（BD Biosciences,MA,USA）で３つのＣＧＳを満たした。各ＣＧＳは２０個の台形の機械ポストを含んだ（図１９Ｂ）。
【０１９８】
ＣＧＳ内のヒト臍静脈血管細胞（ＨＵＶＥＣ）の血管網を作り出し、安定した成熟血管網を三次元ＣＧＳ内に形成した。静止状態を有するチャネルで肺ガン細胞（Ａ５４９）を共培養した。次に、広域スペクトルＭＭＰ阻害剤としてのＧＭ６００１、転移抑制剤対照としてのＭＭＰ２及びＭＭＰ９に対する特異的阻害剤、陰性対照としてのＭＭＰ７及びＭＭＰ１３に対する特異的阻害剤などの抗転移性肺ガン薬物をデバイスに適用することができる。転移の一連のプロセス（例えば、移動、脈管内侵入、血管外遊出）を、定性的及び定量的に調べることができ、走化性因子を使用することなく行うことができる。
【０１９９】
結果および考察
三次元ＣＧＳ内での微小血管網の成熟
ＨＵＶＥＣの安定した血管網の形成は、ＣＧＳ内の、播種密度、ＶＥＧＦの濃度、及びコラーゲン濃度に依存した。３×１０６個のＨＵＶＥＣ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、及び２．０〜２．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンにおける三次元ＣＧＳ内のＨＵＶＥＣの安定した血管網が収集された。図２０Ａ〜２０Ｂは、９６時間後にＣＧＳ２（２．５ｍｇ／ｍｌ）内で安定化した微小血管網を表す。血管成熟のシグナル伝達経路のためにＶＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）を適用し、そして血管安定化に関する細胞−マトリックスの相互作用を支配するためにＧＭ６００１（２４時間後１２．５μＭ）を適用した。図２１Ａ〜２１Ｂに示された管腔状の形成は、抗転移性ガン薬物のスクリーニングへの三次元血管網適用を示した。
【０２００】
ＣＧＳ内の微小血管網への肺ガン細胞の移動
最初のＨＵＶＥＣ播種の９６時間後にＡ５４９と共培養することによって、より好ましい移動及び脈管内侵入のステップを観察した。図２２Ａ〜２２Ｄは、三次元ＣＧＳ（２．０ｍｇ／ｍｌ）内のＡ５４９の移動及び脈管内侵入の一連のステップを示す、マイクロ流体ガン転移系の例を表した。
【０２０１】
肺ガン細胞に対するＭＭＰ阻害剤としてのＧＭ６００１の適用
９６時間後の１８時間の共培養においてＧＭ６００１（１２．５μＭ）を用いて、チャネルからＣＧＳ２へのＡ５４９肺ガン細胞の移動を示さなかった。対照的に、ＧＭ６００１を用いない同じ共培養物からの移動を観察した（図２３Ａ〜２３Ｄ）。
【０２０２】
走化性因子を全く用いない静的条件又は一時的条件下でのＡ５４９の移動及び脈管内侵入の一連のステップを観察した。このマイクロ流体転移系は、移動及び／又は脈管内侵入を阻害する抗転移性ガン薬物をスクリーニングするために使用することができる。また、血管外遊出は、より好ましい定量的データを取得するために、様々な三次元マイクロ環境を時空間的に制御することによって観察することができる。
【０２０３】
本明細書で引用された、全ての、特許、公開された出願及び参考文献の教示は、その全体が参照により組み込まれている。
【０２０４】
本発明は、その例示的な実施態様を参照して具体的に示され且つ記載されているが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の形態及び詳細における多様な変更を行うことができることを当業者は理解されるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図８】
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【図１６−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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