(57)【要約】本明細書において、以下の工程を含む脂質粒子を産生するための方法を報告する：ｉ）変性アポリポタンパク質を含む第１溶液を提供すること、ｉｉ）第１溶液を、少なくとも２つの脂質及び合成界面活性剤を含むが、しかし、アポリポタンパク質を含まない第２溶液に加えること、及びｉｉｉ）工程ｉｉ）において得られた溶液から界面活性剤を除去し、それにより、脂質粒子を産生すること。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質粒子がZwittergent 3-8又はZwittergent 3-10の存在下で形成されることを特徴とする、ポリペプチドを含む脂質粒子を産生するための方法。
【請求項２】
ポリペプチドをZwittergentと約２時間〜約６０時間にわたりインキュベートすることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
以下の工程：
ｉ）変性ポリペプチドを含む第１溶液を提供すること、
ｉｉ）第１溶液を、少なくとも１つの脂質及びZwittergent 3-8又はZwittergent 3-10を含むが、しかし、ポリペプチド不含である第２溶液に加えること、及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）において得られた溶液からZwittergentを除去し、それにより、脂質粒子を産生すること
を含むことを特徴とする、請求項１〜２のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
以下の工程：
ｉ）未変性ポリペプチドを含む溶液を提供すること、
ｉｉ）少なくとも１つの脂質及びZwittergent 3-8又はZwittergent 3-10をｉ）の溶液に加えること、及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）において得られた溶液からZwittergentを除去し、それにより、脂質粒子を産生すること
を含むことを特徴とする、請求項１又は２のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドが、配列番号０１、０２、０４〜５２、６６、又は６７のアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を有し、又は、配列番号０１、０２、０４〜５２、６６、又は６７のアミノ酸配列の少なくとも８０%を含む少なくとも連続フラグメントを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドが、配列番号０１又は配列番号０２又は配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉであることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの脂質が２つの脂質であることを特徴とする、請求項３〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
２つの脂質が２つの異なるリン脂質であることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
第１リン脂質がＰＯＰＣであり、第２リン脂質がＤＰＰＣであることを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
界面活性剤が高いＣＭＣを伴う界面活性剤であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
除去が、ダイアフィルトレーション又は透析又は吸着によることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜３及び５〜１１のいずれか一項記載の方法を用いて得られる脂質粒子。
【請求項１３】
請求項１、２、及び４〜１１のいずれか一項記載の方法を用いて得られる脂質粒子。
【請求項１４】
請求項１２又は１３のいずれか一項記載の脂質粒子を含む医薬的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポタンパク質及び脂質粒子の分野にある。アポリポタンパク質、ホスファチジルコリン、及び脂質を含む脂質粒子を産生するための方法が本明細書において報告されており、脂質粒子の形成は合成界面活性剤Zwittergentの存在において実施される。
【０００２】
発明の背景
血漿リポタンパク質は、血液中の脂質輸送及び代謝を行う可溶性タンパク質−脂質複合体である。リポタンパク質のいくつかの主要なクラスが、それらの密度、サイズ、化学組成、及び機能に基づいて区別される。それらの間で、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子（高密度脂質粒子として代替的に表示される）は、１８０kDa〜３６０kDaのそれらの平均分子量において変動するいくつかのサブクラスで構成される。それらの平均脂質及びタンパク質含量は、各々の５０重量%である。ホスファチジルコリン（ＰＣ）は総脂質の３８%を占め、コレステリルエステルならびに少量の他の極性及び非極性脂質（遊離コレステロールを含む）が続く。主なタンパク質成分はアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）であり、ヒトＨＤＬ中の総タンパク重量の約６０%に相当する。
【０００３】
ヒト身体、特に循環体液（例えば血液など）中のコレステロールは、孤立分子としてではなく、しかし、特定のタンパク質（リポタンパク質）との複合体の形態で存在している。コレステロールの主要な分画は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）と又は高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と複合体化される。ＬＤＬ粒子は、主要タンパク質性化合物として、アポリポタンパク質Ｂを含むのに対し、ＨＤＬ粒子は、主要タンパク質性化合物として、アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む。
【０００４】
ＨＤＬ粒子により取り込まれたコレステロールは、酵素レシチンコレステロール−アシル−トランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）によりエステル化される。コレステロールエステルは、増加した疎水性を有し、ＨＤＬ粒子のコアに向かって拡散する。ＨＤＬコレステロール−エステル粒子は、肝臓に送達され、循環から除去されうる。
【０００５】
ＨＤＬ粒子及びその主要なポリペプチドアポリポタンパク質Ａ−Ｉが、逆コレステロール輸送（ＲＣＴ）に参加する。それにおいて、アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、細胞から、例えば、血管の壁の細胞からのコレステロールの排出、脂質の結合、及びレシチン−コレステロール−アセチル−トランスフェラーゼの活性化、ならびに、それにより肝臓による血漿流量を介したコレステロールの排除を増加させる。これは、細胞膜タンパク質ＡＴＰ結合カセットトランスポーターＡ−Ｉ（ＡＢＣＡ−Ｉ）を含む能動輸送プロセスである。
【０００６】
アポリポタンパク質Ａ−Ｉ及びアポリポタンパク質ベースの治療薬（例、再構成ＨＤＬ粒子）は、前世紀の７０年代後半及び８０年代前半には既に同定されていた。脂質粒子を含むアポリポタンパク質Ａ−Ｉ−Ｍｉｌａｎｏについて、臨床的な証明（動脈硬化患者における有意なプラーク低下を意味する）を示すことができた。アポリポタンパク質Ａ−Ｉ−Ｍｉｌａｎｏ（野生型アポリポタンパク質Ａ−Ｉの二量体）は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ分子の自然発生する変異体に従って設計された。二量体形成は、ジスルフィド結合の形成を可能にするシステインによるアミノ酸残基１７３（アルギニン）の交換により可能になる。
【０００７】
ＷＯ  ２００９／１３１７０４において、コレステロール及び無機物質を含むコアを含む他の分子を捕捉するために適したナノ構造が報告されている。混合物を得る約１時間内での中間混合物からの界面活性剤の枯渇を含む、ナノスケール結合二重層を産生するための方法が、ＷＯ  ２００９／０９７５８７に報告されている。ＷＯ  ２００６／１２５３０４において、冠動脈疾患を処置又は予防するための医薬的組成物が報告されている。脂質代謝及び心血管疾患に関連するアポリポタンパク質をコードする組成物が、ＵＳ  ２００２／１０１４２９５３に報告されている。ＷＯ  ２００５／０８４６４２において、アポタンパク質蝸牛状（ｃｏｃｈｅｌａｔｅ）組成物が報告されている。ＷＯ  ２００７／１３７４００において、弁狭窄症の処置のための方法及び化合物が報告されている。急性冠症候群の処置及び予防のため医薬的製剤、方法、及び投薬計画が、ＷＯ  ２００５／０４１８６６に報告されている。
【０００８】
ＷＯ  ２００９／０９７５８７において、ナノスケール結合二重層、使用及び生産の方法が報告されている。改善された耐容性を有する免疫原性組成物中での疎水性タンパク質の製剤が、ＷＯ  ２００５／０６５７０８に報告されている。ＷＯ  ２００６／０６９３７１において、アテローム性動脈硬化症を防止、阻害、及び／又は逆転させるための血漿脂質化の方法が報告されている。清浄化に続く、分析物のゆがみのないアッセイを得るための生物学的液体の清浄化のために逆ミセルを作製する組成物、使用、及び方法が、ＵＳ  ４，６０８，３４７に報告されている。
【０００９】
発明の概要
本明細書において、脂質粒子を産生するための方法が報告されており、ここで脂質粒子は合成界面活性剤の存在下で形成される。脂質粒子は、合成界面活性剤（例えばZwittergentなど）の存在下で形成することができることが見出されている。合成界面活性剤の使用によって、例えば、動物由来成分の使用が避けられる。
【００１０】
本明細書において報告される一局面は、脂質粒子を産生するための方法であって、ここで、脂質粒子は合成界面活性剤の存在下で形成される。
【００１１】
一実施態様において、合成界面活性剤はZwittergentである。別の実施態様において、ZwittergentはZwittergent 3-8又はZwittergent 3-10である。
【００１２】
一実施態様において、本方法は以下の工程：
ｉ）変性ポリペプチドを含む第１溶液を提供すること、
ｉｉ）第１溶液を、少なくとも１つの脂質及び合成界面活性剤を含む第２溶液（ポリペプチドを含まない、即ち、ポリペプチド不含である）に加えること、及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）において得られた溶液から界面活性剤を除去し、それにより、脂質粒子を産生すること
を含む。
【００１３】
別の実施態様において、本方法は以下の工程：
ｉ）未変性ポリペプチドを含む溶液を提供すること、
ｉｉ）脂質及び合成界面活性剤をｉ）の溶液に加えること、及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）において得られた溶液から界面活性剤を除去し、それにより、脂質粒子を産生すること
を含む。
【００１４】
一実施態様において、ポリペプチドは組換え産生されたポリペプチドである。
【００１５】
一実施態様において、ポリペプチドはアポリポタンパク質である。別の実施態様において、アポリポタンパク質は、精製されたアポリポタンパク質である。
【００１６】
一実施態様において、アポリポタンパク質は、配列番号０１、０２、０４〜５２、６６、及び６７のアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を有し、又は、配列番号０１、０２、０４〜５２、６６、及び６７のアミノ酸配列の少なくとも８０%を含む、少なくとも連続フラグメントを含む。
【００１７】
一実施態様において、アポリポタンパク質は配列番号０１、０２、０４〜５２、６６、又は６７より選択されるアミノ酸配列を有する、又は、そのアミノ酸配列の少なくとも８０%の少なくとも連続フラグメントである。
【００１８】
一実施態様において、アポリポタンパク質はアポリポタンパク質Ａ−Ｉである。一実施態様において、アポリポタンパク質Ａ−Ｉはヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉである。さらなる実施態様において、アポリポタンパク質は、配列番号０１、又は配列番号０２、又は配列番号６６、又は配列番号６７のアミノ酸配列を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉである。
【００１９】
一実施態様において、アポリポタンパク質は、Ｒ１５１Ｃ及びＲ１９７Ｃより選択される突然変異を伴う配列番号６のアミノ酸配列を有する。
【００２０】
一実施態様において、少なくとも１つの脂質は、リン脂質、脂肪酸、及びステロイド脂質より選択される。
【００２１】
一実施態様において、少なくとも１つの脂質は、場合により、リン脂質、脂肪酸、ステロイド脂質から互いに非依存的に選択される少なくとも２つの脂質である。別の実施態様において、少なくとも１つの脂質は１〜４つの脂質のものであり、即ち、それは１つの脂質、２つの脂質、３つの脂質、及び４つの脂質を含む群より選択される。
【００２２】
一実施態様において、第２溶液はリン脂質、脂質、及び界面活性剤を含む。
【００２３】
一実施態様において、第２溶液はリン脂質、脂質、界面活性剤、及びバッファー塩からなる。
【００２４】
一実施態様において、脂質は２つの異なるリン脂質である。別の実施態様において、脂質は２つの異なるホスファチジルコリンである。別の実施態様において、第１ホスファチジルコリンと第２ホスファチジルコリンは、ホスファチジルコリンのグリセロール骨格にエステル化された１つもしくは２つの脂肪酸残基又は脂肪酸残基の誘導体において異なる。一実施態様において、第１ホスファチジルコリンはＰＯＰＣであり、第２ホスファチジルコリンはＤＰＰＣである。
【００２５】
本明細書において報告される方法の一実施態様において、第１溶液は脂質粒子を実質的に含まない。
【００２６】
一実施態様において、本方法は、工程ｉｉ）後及び工程ｉｉｉ）に先立ち、以下の工程ｉｉａ）工程ｉｉ）において得られた溶液をインキュベートすることを含む。一実施態様において、インキュベーション及び／又は除去は４℃〜４５℃の温度である。
【００２７】
一実施態様において、ポリペプチドを、約０．５時間〜約６０時間にわたり合成界面活性剤（Zwittergent）とインキュベートする。一実施態様において、ポリペプチドを、約０．５時間〜約２０時間にわたり合成界面活性剤（Zwittergent）とインキュベートする。一実施態様において、ポリペプチドを、約２時間〜約６０時間にわたり合成界面活性剤（Zwittergent）とインキュベートする。一実施態様において、ポリペプチドを、約１２時間〜約２０時間にわたり合成界面活性剤（Zwittergent）とインキュベートする。一実施態様において、ポリペプチドを、約１６時間にわたり合成界面活性剤（Zwittergent）とインキュベートする。
【００２８】
一実施態様において、界面活性剤は、高いＣＭＣを伴う界面活性剤である。別の実施態様において、界面活性剤は、少なくとも５mMのＣＭＣを伴う界面活性剤である。
【００２９】
一実施態様において、除去は、ダイアフィルトレーション又は透析又は吸着による。
【００３０】
一実施態様において、吸着は、親和性又は疎水性クロマトグラフィーより選択される。一実施態様において、除去は透析よる。
【００３１】
一実施態様において、第１溶液は第１容積を有し、第２溶液は第２容積を有し、第１溶液中のアポリポタンパク質が定められた濃度で存在し、第２溶液中の脂質及び界面活性剤が各々が定められた濃度で存在し、ここで工程ｉｉ）において、アポリポタンパク質の、脂質の、及び界面活性剤の濃度が変化／低下され、脂質粒子の形成を許す。
【００３２】
一実施態様において、本方法は以下の工程：
ｉｖ）脂質粒子を精製し、それにより脂質粒子を産生すること
を含む。
【００３３】
一実施態様において、第２の方法は以下の工程ｉｉ）：
ｉｉ）少なくとも１つの脂質及び合成界面活性剤を、ｉ）の溶液に加え、脂質、界面活性剤、及びアポリポタンパク質の濃度及び濃度比を調整すること
を含む。
【００３４】
本明細書において報告される一局面は、本明細書において報告される方法により得られた脂質粒子である。
【００３５】
本明細書において報告される一局面は、本明細書において報告される方法を用いて得られるアポリポタンパク質を含む脂質粒子を含む医薬的組成物、ならびに動脈硬化症の処置のための医薬の製造のための本明細書において報告される脂質粒子の使用である。
【００３６】
発明の詳細な説明
定義
用語「アポリポタンパク質」は、脂質又はリポタンパク質粒子中にそれぞれ含まれるタンパク質を意味する。
【００３７】
用語「アポリポタンパク質Ａ−Ｉ」は、タンパク質−脂質及びタンパク質−タンパク質の相互作用特性を伴う両親媒性のヘリカルポリペプチドを意味する。アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、２４３アミノ酸残基を有する成熟ポリペプチドに切断されるプロアポリポタンパク質として分泌される２６７アミノ酸残基のプレプロアポリポタンパク質として肝臓及び小腸により合成される。アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、しばしばプロリンであり、一部の場合において、いくつかの残基から構成されるストレッチからなるリンカー部分により分離される２２アミノ酸残基の各々からなる６〜８の異なるアミノ酸リピートからなる。例示的なヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉアミノ酸配列が、GenPeptデータベースエントリＮＭ−００００３９又はデータベースエントリＸ００５６６；ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ−００００３０．１（ｇｉ  ４５５７３２１）に報告されている。ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（配列番号０６）には、自然発生バリアントが存在する。例えばＰ２７Ｈ、Ｐ２７Ｒ、Ｐ２８Ｒ、Ｒ３４Ｌ、Ｇ５０Ｒ、Ｌ８４Ｒ、Ｄ１１３Ｅ、Ａ−Ａ１１９Ｄ、Ｄ１２７Ｎ、欠失Ｋ１３１、Ｋ１３１Ｍ、Ｗ１３２Ｒ、Ｅ１３３Ｋ、Ｒ１５１Ｃ（アミノ酸残基１５１がＡｒｇからＣｙｓに変化されている：アポリポタンパク質Ａ−Ｉ−Ｐａｒｉｓ）、Ｅ１６０Ｋ、Ｅ１６３Ｇ、Ｐ１６７Ｒ、Ｌ１６８Ｒ、Ｅ１７１Ｖ、Ｐ１８９Ｒ、Ｒ１９７Ｃ（アミノ酸残基１７３がＡｒｇからＣｙｓに変化されている：アポリポタンパク質Ａ−Ｉ−Ｍｉｌａｎｏ）、及びＥ２２２Ｋなど。また、保存的アミノ酸修飾を有するバリアントも含まれる。
【００３８】
一実施態様において、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、免疫グロブリンＡプロテアーゼ（ＩｇＡプロテアーゼ）の切断部位のフラグメントを含む。ＩｇＡプロテアーゼからの公知の認識部位は、以下の配列を含み、「↓」は切断された結合の位置を意味する：
【化１】
2013538205.tif 000003
ここで、最初の３つが最も頻繁に選ばれ、切断される。
【００３９】
用語「アポリポタンパク質模倣体」は、それぞれのアポリポタンパク質の機能を模倣する合成ポリペプチドを意味する。例えば、「アポリポタンパク質Ａ−Ｉ模倣体」は、天然アポリポタンパク質Ａ−Ｉのような、コレステロールの除去、即ち、逆コレステロール排出に関して同程度の生物学的機能を示す合成ポリペプチドである。一実施態様において、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ模倣体は、疎水性−親水性界面にクラスター化された正荷電アミノ酸残基及び親水性面の中央にクラスター化された負荷電アミノ酸残基を伴う少なくとも１つの両親媒性アルファ−ヘリックスを含む。アポリポタンパク質Ａ−Ｉの機能を模倣するために、アポリポタンパク質模倣体は、１５〜２９アミノ酸残基、一実施態様において、２２アミノ酸残基
【化２】
2013538205.tif 000004
のリピートポリペプチドを含む。
【００４０】
用語「少なくとも１つ」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上を意味する。用語「少なくとも２つ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上を意味する。
【００４１】
用語「心血管疾患」は、一般的に、心臓又は血管に関する疾患又は状態、例えば動脈硬化、冠動脈心疾患、脳血管疾患、大動脈腸骨動脈疾患、虚血性心疾患、又は末梢血管疾患などを意味する。そのような疾患は、疾患の結果としての有害事象、例えば心筋梗塞、脳卒中、狭心症、一過性脳虚血発作、うっ血性心不全、大動脈瘤などに先立って発見されないことがあり、大部分が被験体の死亡をもたらす。
【００４２】
用語「コール酸」は、３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−ｏｉｃ酸又はそれらの塩、特にナトリウム塩を意味する。脂質粒子の形成は、アポリポタンパク質を界面活性剤可溶化脂質とそれらのそれぞれの転移温度でインキュベートすることにより実施することができる。
【００４３】
用語「臨界ミセル濃度」及びその省略形「ＣＭＣ」は、互換的に使用することができ、個々の界面活性剤分子（単量体）が自発的にミセル（ミセル、丸棒、ラメラ構造など）に凝集するものを上回る、サーファクタント又は界面活性剤の濃度を意味する。
【００４４】
用語「保存的アミノ酸修飾」は、本発明に従って脂質粒子又はアポリポタンパク質の特性に影響を与えない、又は変えないアミノ酸配列の修飾を意味する。修飾は、当技術分野において公知の標準的技術（例えば部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介性突然変異誘発など）により導入することができる。保存的アミノ酸修飾は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基を用いて置換されているものを含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を伴うアミノ酸を含む。「バリアント」タンパク質は、従って、本明細書において、アミノ酸配列において、「親」タンパク質のアミノ酸配列と、１０まで、一実施態様においては、約２〜約５の付加、欠失、及び／又は置換だけ異なる分子を指す。アミノ酸配列の改変は、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327、及びQueen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033により記載される通りに、分子モデリングに基づく突然変異誘発により実施することができる。
【００４５】
用語「界面活性剤」は、表面活性化学物質を意味する。「界面活性剤」は、一般的に、非極性の疎水性部分及び極性の親水性部分を伴う両親媒性分子である。用語「双性イオン界面活性剤」は、全体的なゼロ電荷を有し、同時に、少なくとも１つの正荷電部分及び少なくとも１つの負荷電部分を含む表面活性化学的化合物を意味する。一実施態様において、界面活性剤は、糖ベースの界面活性剤、ポリオキシアルキレンベースの界面活性剤、胆汁塩ベースの界面活性剤、合成界面活性剤、又はそれらの組み合わせより選択される。用語「糖ベースの界面活性剤」は、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−ベータ−Ｄ−マルトピラノシド、又は５−シクロヘキシルペンチル−ベータ−Ｄ−マルトピラノシド、及びそれらの誘導体より選択される界面活性剤を意味する。用語「胆汁塩ベースの界面活性剤」は、コール酸ナトリウム、コール酸カリウム、コール酸リチウム、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−イル−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、及びそれらの誘導体より選択される界面活性剤を意味する。用語「ポリオキシアルキレンベースの界面活性剤」は、Tween 20、Triton X-100、Pluronic F68、及びそれらの誘導体より選択される界面活性剤を意味する。用語「合成界面活性剤」は、Zwittergent 3-6、Zwittergent 3-8、Zwittergent 3-10、Zwittergent 3-12、及びそれらの誘導体より選択される界面活性剤を意味する。
【００４６】
用語「高密度リポタンパク質粒子」又はその省略形「ＨＤＬ粒子」は、互換的に使用することができ、主なタンパク質性化合物としてアポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質−タンパク質複合体を意味する。
【００４７】
用語「イムノアッセイ」は、固相上に吸着／固定化された抗体（捕捉抗体）、抗原、及び、酵素を用いてコンジュゲートした、抗原の別のエピトープに対する抗体（トレーサー抗体）との複合体の形成を含む、モノクローナル抗体を用いた標準的な固相イムノアッセイを意味する。このように、サンドイッチが形成される：固相−捕捉抗体−抗原−トレーサー抗体。サンドイッチにより触媒される反応において、抗体コンジュゲート酵素の活性は、インキュベーション培地中の抗原濃度に比例する。標準的なサンドイッチ方法は、また、二重抗原架橋イムノアッセイと呼ばれる。なぜなら、捕捉及びトレーサー抗体が抗原の異なるエピトープに結合するためである。アッセイの他の型は、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、及び酵素連結イムノアッセイである。そのようなアッセイ、ならびに実際的な適用及び手順を行うための方法が、当業者に公知である。イムノアッセイは、同種又は異種イムノアッセイとして実施することができる。
【００４８】
用語「脂質排出を増加させる」及びその文法的な等価物は、脂質排出の増加レベル及び／又は速度を意味し、脂質排出を促し、脂質排出を増強し、脂質排出を促進し、脂質排出を上方調節し、脂質排出を改善し、及び／又は細胞もしくはプラークからの脂質排出を増大させる。一実施態様において、脂質排出は、リン脂質、トリグリセリド、コレステロール、及び／又はコレステロールエステルの排出を含む。
【００４９】
用語「ＤＭＰＣ」はリン脂質ジミリストイルホスファチジルコリンを意味する。
【００５０】
用語「ＤＰＰＣ」は、リン脂質１，２−ジ−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンを意味し、また、１，２−ジパルミトイルホスファチジルコリンとして言及される。
【００５１】
用語「多量体」は、２又はそれ以上の単量体からなる複合体を意味する。多量体は、単量体の間の非共有結合性相互作用により形成される。各単量体は多量体化ドメインを含む。一実施態様において、多量体は２つ又は３つの単量体を含む。別の実施態様において、多量体化ドメインは、各単量体中に含まれる個々の多量体化ドメイン間の非共有結合性相互作用を介して相互作用する。用語「多量体化ドメイン」は、２つ又はそれ以上の単量体分子を共有結合的又は非共有結合的に会合することが可能なアミノ酸配列を意味する。多量体化ドメインは、異なる、類似の、又は同一のアミノ酸配列の多量体化ドメインと相互作用することが可能である。一実施態様において、多量体化ドメインは、配列番号５３のコンセンサスアミノ酸配列と少なくとも６８%同一であるアミノ酸配列を有するテトラネクチン三量体化構造要素又はその誘導体である。一実施態様において、配列番号５３の位置５０のシステイン残基は、異なるアミノ酸残基により、別の実施態様においては、セリン残基、又はスレオニン残基、又はメチオニン残基により置換される。多量体化ドメインを含むポリペプチドは、また、多量体化ドメインを含む１つ又は複数の他のポリペプチドと会合することができる。多量体形成は、適した条件下でポリペプチドを混合することにより簡単に開始することができる。別の実施態様において、多量体化ドメインは配列番号５３のアミノ酸配列を有し、ここで１〜１０残基が、アミノ酸配列のＮ又はＣ末端から欠失されている又はそれに付加されている。さらなる実施態様において、多量体化ドメインは配列番号５３のアミノ酸配列を有し、ここで６又は９のアミノ酸残基がアミノ酸配列のＮ末端から欠失されている。さらに別の実施態様において、多量体化ドメインは配列番号５３のアミノ酸配列を有し、ここでＮ末端アミノ酸残基Ｌ又はＮ末端アミノ酸残基Ｃ及びＬが欠失されている。一実施態様において、多量体化ドメインはテトラネクチン三量体化構造要素であり、配列番号５４のアミノ酸配列を有する。多量体は、一実施態様において、ホモマーである。
【００５２】
多量体はホモマー又はヘテロマーでありうる。なぜなら、多量体化ドメインを含む異なるアポリポタンパク質は、多量体に組み込まれるように組み合わせることができるからである。一実施態様において、多量体は三量体のホモマーである。
【００５３】
一実施態様に従い、多量体化ドメインはテトラネクチンから得られる。一実施態様において、多量体化ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を有するテトラネクチン三量体化構造要素を含む。テトラネクチン三量体化構造要素の三量体化効果は、２つの他のテトラネクチン三量体化構造要素のコイルドコイル構造と相互作用し、三量体を形成するコイルドコイル構造により起こされる。テトラネクチン三量体化構造要素は、ヒトテトラネクチンから、ウサギテトラネクチンから、マウステトラネクチンから、又はサメ軟骨のＣ型レクチンから得てもよい。一実施態様において、テトラネクチン三量体化構造要素は、配列番号５３のコンセンサス配列と少なくとも６８%、又は少なくとも７５%、又は少なくとも８１%、又は少なくとも８７%、又は少なくとも９２%の同一性を有する配列を含む。
【００５４】
用語「非共有結合性相互作用」は、非共有結合力、例えばイオン性相互作用力（例、塩橋）、非イオン性相互作用力（例、水素結合）、又は疎水性相互作用力（例、ファンデルワールス力又はπ−スタッキング相互作用）などを意味する。
【００５５】
用語「相転移温度」は、脂質の物理的状態において秩序あるゲル相からの変化を誘導するために要求される温度を意味し、そこでは、炭化水素鎖は完全に伸長され、無秩序な液晶相に密接に充填され、そこでは、炭化水素鎖がランダムに配向されて、流体である。脂質粒子の形成は、使用されるリン脂質／リン脂質混合物の相転移温度で又はそれ以上で行ってもよい。一部のホスファチジルコリン及びそれらの混合物の相転移温度を、以下の表１に列挙する。
【００５６】
【表１】
2013538205.tif 000005
【００５７】
用語「ホスファチジルコリン」は、１つのグリセロール部分、２つのカルボン酸部分、及び１つのホスホコリン部分からなる分子を意味し、ここでグリセロール部分がエステル結合（即ち、２つのカルボン酸エステル結合及び１つのリン酸エステル結合）により共有結合的に他の部分に結合しており、それにより、リン酸エステル結合はグリセロール部分の１−ヒドロキシル基又は３−ヒドロキシル基のいずれかに対する。用語「カルボン酸部分」は、少なくとも１つのアシル基（Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｏ）を含む有機部分を意味する。ホスファチジルコリンは任意の種類又は供給源でありうる。一実施態様において、ホスファチジルコリンは、卵ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジラウリルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、１−オレオイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ならびにそれらの類似体及び誘導体より選択される。
【００５８】
全てのリン脂質は、本明細書において使用される通り、任意の供給源、即ち、（適切な場合）大豆、牛乳、卵、又はさらには動物（ヒトを除く）の内臓に由来しうる。それらは、天然起源由来、又は半合成もしくはさらには完全合成でありうる。
【００５９】
「ポリペプチド」は、天然に又は合成的に産生されるかを問わず、ペプチド結合により連結されたアミノ酸からなるポリマーである。約２０未満のアミノ酸残基のポリペプチドが「ペプチド」として言及されうるのに対し、２つ又はそれ以上のポリペプチドからなる、又は１００を超えるアミノ酸残基の１つのポリペプチドを含む分子は「タンパク質」として言及されうる。ポリペプチドは、また、非アミノ酸成分（例えば炭水化物基、金属イオン、又はカルボン酸エステルなど）を含みうる。非アミノ酸成分は、細胞により加えてもよく、それにおいてポリペプチドが発現されており、細胞の型によって変動しうる。ポリペプチドは、それらのアミノ酸骨格構造又はそれをコードする核酸に関して、本明細書において定義される。付加基（例えば炭水化物基など）は、一般的には特定されないが、しかし、それにもかかわらず、存在しうる。
【００６０】
用語「ＰＯＰＣ」はリン脂質１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンを意味し、また、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリンとして言及される。
【００６１】
用語「迅速な」は、最大で１０時間以内に完了するプロセスを意味する。迅速な希釈は、第１溶液が最大で１０時間で第２溶液に加えられるプロセスである。一実施態様において、プロセスは、最大で５時間、さらなる実施態様において、最大で２時間で完了する。
【００６２】
用語「実質的に含まない」は、タンパク質及び１つ又は複数の脂質を含む溶液が、５%未満（ｗ／ｗ）の脂質粒子、２．５%未満の脂質粒子、１%未満の脂質粒子、又は０．５%未満の脂質粒子を含むことを意味する。
【００６３】
用語「バリアント」は、また、本明細書において報告されるアポリポタンパク質のバリアント又はアポリポタンパク質模倣体を含み、ここでバリアントでは、それぞれのアポリポタンパク質又はアポリポタンパク質模倣体のアミノ酸配列が１つ又は複数のアミノ酸置換、付加、又は欠失を含む。修飾は、アポリポタンパク質受容体又はアポリポタンパク質変換酵素についてのアポリポタンパク質の親和性を増加もしくは減少させうる、又は、それぞれのアポリポタンパク質と比較して、アポリポタンパク質バリアントの安定性を増加させうる、又は、水溶液中のそれぞれのアポリポタンパク質と比較して、アポリポタンパク質バリアントの溶解度を増加させうる、又は、宿主細胞における／によるそれぞれのアポリポタンパク質と比較して、アポリポタンパク質バリアントの組換え産生を増加させうる。
【００６４】
本明細書において報告される
脂質粒子が、単独の界面活性剤として合成界面活性剤を使用することにより形成することができることが見出されている。
【００６５】
少なくとも５mMのＣＭＣを伴う合成界面活性剤を使用することが有利である。
【００６６】
１時間超の合成界面活性剤の存在下におけるポリペプチドのインキュベーション工程を実施することができる（例、２〜６０時間にわたる）。
【００６７】
既に、濃度０．５×ＣＭＣで、即ち、ミセル形成のために要求される濃度の半分で、脂質粒子の形成を検出することができる。このように、少量の界面活性剤だけが脂質粒子の形成のために必要である。これは、利点（例えばこの脂質粒子のインビボでの適用による有害作用の低下リスクなど）を有する。なぜなら、より少濃度の界面活性剤が脂質粒子の形成のために要求されるからである。
【００６８】
また、溶液（変性タンパク質を含んでいるが、しかし、界面活性剤及び脂質を含んでいない）から直接的に脂質粒子を産生するための改善された方法との組み合わせで、界面活性剤及び少なくとも１つの脂質を含む溶液中への迅速な希釈により、合成界面活性剤の使用はさらにより有利である。
【００６９】
脂質粒子の産生のための方法
本明細書において、脂質粒子を産生するための方法が報告されており、ここで脂質粒子は合成界面活性剤の存在下で形成される。脂質粒子は、合成界面活性剤のみの存在において形成することができ、ここで合成界面活性剤は少なくとも５mMのＣＭＣを有することが見出されている。合成界面活性剤の使用は、例えば、動物由来成分の使用を避け、界面活性剤の低濃度での脂質粒子の形成を許す。
【００７０】
本明細書において報告される一局面は、ポリペプチド及び脂質を含む脂質粒子を産生するための方法であり、ここで脂質粒子は、合成界面活性剤の存在下で形成される。
【００７１】
一実施態様において、合成界面活性剤は、少なくとも１０mMのＣＭＣを有する。別の実施態様において、合成界面活性剤は、少なくとも３５mMのＣＭＣを有する。
【００７２】
一実施態様において、合成界面活性剤は、合成界面活性剤の０．５×ＣＭＣの濃度での脂質粒子の形成をもたらす。
【００７３】
一実施態様において、ポリペプチド及び合成界面活性剤を、約２時間〜約６０時間にわたりインキュベートする。
【００７４】
一実施態様において、合成界面活性剤はZwittergentである。別の実施態様において、ZwittergentはZwittergent 3-8又はZwittergent 3-10である。
【００７５】
一実施態様において、本方法は以下の工程を含む：
ポリペプチド、少なくとも１つの脂質、及び合成界面活性剤を含む溶液から界面活性剤を除去し、それにより、脂質粒子を産生すること。
【００７６】
一実施態様において、本方法は以下の工程：
ｉ）ポリペプチド、少なくとも１つの脂質、及び合成界面活性剤を含む溶液を約２時間〜約６０時間にわたりインキュベートすること、及び
ｉｉ）溶液から界面活性剤を除去し、それにより、脂質粒子を産生すること
を含む。
【００７７】
一実施態様において、本方法は以下の工程：
ｉ）変性アポリポタンパク質を含む第１溶液を提供すること、
ｉｉ）第１溶液を、少なくとも１つの脂質及び合成界面活性剤を含むが、しかし、アポリポタンパク質を含まない第２溶液に加えること、及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）において得られた溶液から界面活性剤を除去し、それにより、脂質粒子を産生すること
を含む。
【００７８】
一実施態様において、本方法は以下の工程：
ｉ）未変性ポリペプチドを含む溶液を提供すること、
ｉｉ）少なくとも１つの脂質及び合成界面活性剤を、ｉ）の溶液に加えること、及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）において得られた溶液から界面活性剤を除去し、それにより、脂質粒子を産生すること
を含む。
【００７９】
別の実施態様において、本方法は以下の工程：
ｉ）未変性アポリポタンパク質を含む溶液を提供すること、
ｉｉ）少なくとも１つの脂質及び合成界面活性剤を、ｉ）の溶液に加えること、及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）において得られた溶液から界面活性剤を除去し、それにより、脂質粒子を産生すること
を含む。
【００８０】
一実施態様において、第２溶液は、リン脂質、脂肪酸、及びステロイド脂質より互いに非依存的に選択される少なくとも２つの異なる脂質を含む。別の実施態様において、少なくとも２つの異なる脂質は、２つの異なるホスファチジルコリンである。別の実施態様において、第１ホスファチジルコリンはＰＯＰＣであり、第２ホスファチジルコリンはＤＰＰＣである。
【００８１】
自然発生する又は組換え産生されたポリペプチド（例えば、ヒトＨＤＬ粒子に由来するアポリポタンパク質Ａ−Ｉ又は脱脂アポリポタンパク質Ａ−Ｉなど）からの脂質粒子の産生のための多数の異なる方法が報告されている。それにおいて、例えば、リン脂質（例えばパルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンなど）と界面活性剤（例えばコール酸ナトリウムなど）の水性混合物を、精製アポリポタンパク質Ａ−Ｉとインキュベートし、ここでアポリポタンパク質Ａ−Ｉが非変性形態で用いられる。界面活性剤は、脂質粒子の形成後に透析又はダイアフィルトレーションにより除去される。
【００８２】
現在、脂質粒子の形成のために、少なくとも５mMのＣＭＣを伴う合成界面活性剤を使用することができることが見出されている。一方で、そのような合成界面活性剤を用いて、低い界面活性剤濃度が脂質粒子の形成のために要求され、他方で、より均質な産物が得られる（即ち、副産物がより少ない産物）。より低いＣＭＣを伴う合成界面活性剤（例えば、２．８mMのＣＭＣを伴うZwittergent 3-12など）であれば、そのより高い濃度が、脂質粒子、全く言うまでもなく、形成されるより不均質な産物の形成のために要求される（図１９を参照のこと）。
【００８３】
合成界面活性剤は、自然において発生しない、又は天然供給源から単離されない、又は自然において発生する合成的に産生される界面活性剤ではない界面活性剤である。このように、合成界面活性剤はヒトにより完全に設計される。５mM又はそれ以上のＣＭＣを伴う合成界面活性剤の例は、Zwittergent 3-8（ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート；ＣＭＣ＝３３０mM−３９０mM）、Zwittergent 3-10（ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート；ＣＭＣ＝２５mM−４０mM）、Ｆｏｓコリン−１０（ＣＭＣ＝１１mM）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート；ＣＭＣ＝８mM）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート；ＣＭＣ＝８mM）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＣＭＣ＝１９mM）である。
【００８４】
本明細書において報告される方法は、単一工程において完全に変性したアポリポタンパク質Ａ−Ｉをリフォールディング及び脂質化することをもたらす。本明細書において報告される方法を使用することにより、（ｉ）改善した産物の質を伴う脂質粒子を得ることができ、（ｉｉ）アポリポタンパク質Ａ−Ｉの時間がかかる前処理を省略することができ、及び（ｉｉｉ）バイオ医薬品産生のための大規模処理が初めて可能となる。
【００８５】
脂質粒子形成プロセス開発のために考慮しなければならない主なポイントは、ｉ）生物学的活性のための要件、及びｉｉ）脂質粒子の製造可能性に向けられる技術的要件である。例えば、アポリポタンパク質を含む脂質粒子の形成のために、これらの要件は、反対方向を指す。
【００８６】
技術的な観点から、１６の炭素原子及びより短い鎖を伴うカルボン酸部分を含む飽和リン脂質が選ばれうる（例、ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＰＰＣ；ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＭＰＣなど）。それとは対照的に、生物学的データから、少なくとも１６の炭素原子の鎖を伴うカルボン酸部分を含む非飽和リン脂質（例、パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＰＯＰＣ；ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＳＯＰＣ）は、より効果的で、非肝臓毒性であると仮定することができる。
【００８７】
脂質の組み合わせの選択は、アポリポタンパク質を含む脂質粒子の効力及び肝臓の安全性を決定する。ウサギを使用した脂質粒子を含むＤＭＰＣのインビボ試験では、３０mg/kgを用いて処置されたウサギが重度の副作用が示したが、しかし、生存したのに対し、１００mg/kgを用いて処置たされたウサギは死亡したことが見出されている。結果は、脂質化が、コレステロール動員のため及び結果的に分子の効力のために必要とされることを明らかに示した（図２３）。
【００８８】
インビトロの機能テストでは、単一のホスファチジルコリン（例えばＤＰＰＣ又はＰＯＰＣなど）を含む脂質粒子がＬＣＡＴを活性化することが確認された。
【００８９】
また、脂質粒子が異なるリン脂質の組み合わせを含む場合、コレステロール排出がより高いことが示された。
【００９０】
【表２】
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【００９１】
これらの結果は、また、インビボデータにより確認され、全ての組み合わせについてのコレステロール動員を実証する。しかし、単一のホスファチジルコリンＤＰＰＣだけ、又はＤＰＰＣ及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）の組み合わせを含む脂質粒子について、肝臓酵素における増加を決定することができる（図１）。
【００９２】
このように、また、局面は、本明細書において報告される方法により得られる脂質粒子である。
【００９３】
技術的な観点から、純粋なＤＰＰＣを用いた脂質粒子の形成は、純粋なＰＯＰＣを用いた形成と比較して、より簡便である。沈殿物形成のリスクが、異なるリン脂質の組み合わせを使用することにより低下する。また、純粋なＤＰＰＣについての４１℃の相転移温度は、４℃の相転移温度を有する純粋なＰＯＰＣと比較して、脂質粒子の調製を簡単にすることができる。また、得られた産物はより均質である。これは、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ、タンパク質−脂質組成の決定（タンパク質コンジュゲート分析）も許す分析ツールを介した脂質粒子分析により確認することができる。図２において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＵＶ２８０検出）において分解されたサンプルのクロマトグラムを示す。サンプルの不均質は、複数の分離又はセミデタッチピークの発生により見ることができる。
【００９４】
純粋なＰＯＰＣが脂質粒子を産生するために使用される場合での脂質粒子中の１アポリポタンパク質単量体当たりのＰＯＰＣ分子の数は、一実施態様において４０〜８５、一実施態様において５０〜８０、一実施態様において５４〜７５である。
【００９５】
純粋なＤＰＰＣが脂質粒子を産生するために使用される場合での脂質粒子中の１アポリポタンパク質単量体当たりのＤＰＰＣ分子の数は、一実施態様において５０〜１５０、一実施態様において６５〜１３５、一実施態様において７６〜１２３、及び一実施態様において８６〜１０２である。
【００９６】
モル比１：３のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの混合物が脂質粒子を産生するために使用される場合での脂質粒子中の１アポリポタンパク質単量体当たりの脂質分子の数は、一実施態様において約５０〜約１２０、一実施態様において約６５〜約１０５、及び一実施態様において約７２〜約９６である。
【００９７】
モル比１：１のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの混合物が脂質粒子を産生するために使用される場合での脂質粒子中の１アポリポタンパク質単量体当たりの脂質分子の数は、一実施態様において５０〜１２０、一実施態様において６０〜１００、一実施態様において７１〜９２、及び一実施態様において７１〜８５である。
【００９８】
モル比３：１のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの混合物が脂質粒子を産生するために使用される場合での脂質粒子中の１アポリポタンパク質単量体当たりの脂質分子の数は、一実施態様において５０〜１０５である。
【００９９】
モル比３：１のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの混合物が脂質粒子を産生するために使用される場合での脂質粒子中の１アポリポタンパク質単量体当たりの脂質分子の数は、一実施態様において６０〜９５である。
【０１００】
モル比３：１のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの混合物が脂質粒子を産生するために使用される場合での脂質粒子中の１アポリポタンパク質単量体当たりの脂質分子の数は、一実施態様において６０〜９０である。
【０１０１】
モル比３：１のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの混合物が脂質粒子を産生するために使用される場合での脂質粒子中の１アポリポタンパク質単量体当たりの脂質分子の数は、一実施態様において６０〜８８である。
【０１０２】
モル比３：１のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの混合物が脂質粒子を産生するために使用される場合での脂質粒子中の１アポリポタンパク質単量体当たりの脂質分子の数は、一実施態様において６２〜８０である。
【０１０３】
モル比３：１のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの混合物が脂質粒子を産生するために使用される場合での脂質粒子中の１アポリポタンパク質単量体当たりの脂質分子の数は、一実施態様において６６〜８６である。
【０１０４】
モル比３：１のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの混合物が脂質粒子を産生するために使用される場合での脂質粒子中の１アポリポタンパク質単量体当たりの脂質分子の数は、一実施態様において６４〜７０である。
【０１０５】
モル比３：１のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの混合物が脂質粒子を産生するために使用される場合での脂質粒子中の１アポリポタンパク質単量体当たりの脂質分子の数は、一実施態様において約６６である。
【０１０６】
アポリポタンパク質及びＰＯＰＣを含む脂質粒子の産生のために、一実施態様においてアポリポタンパク質とＰＯＰＣのモル比１：４０〜１：１００を用い、一実施態様においてモル比１：４０〜１：８０を用い、及び一実施態様においてモル比約１：６０を用いる。
【０１０７】
アポリポタンパク質及びＤＰＰＣを含む脂質粒子の産生のために、一実施態様においてアポリポタンパク質とＤＰＰＣのモル比１：７０〜１：１００を用い、一実施態様においてモル比１：８０〜１：９０を用い、及び一実施態様においてモル比約１：８０を用いる。
【０１０８】
アポリポタンパク質、ＰＯＰＣ、及びＤＰＰＣを含む脂質粒子の産生のために、一実施態様において１：３モル比のＰＯＰＣとＤＰＰＣを伴うアポリポタンパク質とＰＯＰＣ及びＤＰＰＣのモル比１：６０〜１：１００を用い、一実施態様においてモル比１：７０〜１：９０を用い、及び一実施態様においてモル比約１：８０を用いる。
【０１０９】
アポリポタンパク質、ＤＰＰＣ、及びＰＯＰＣを含む脂質粒子の産生のために、一実施態様において１：１モル比のＰＯＰＣとＤＰＰＣを伴うアポリポタンパク質とＰＯＰＣ及びＤＰＰＣのモル比１：６０〜１：１００を用い、一実施態様においてモル比１：６０〜１：８０を用い、及び一実施態様においてモル比約１：７０を用いる。
【０１１０】
アポリポタンパク質、ＤＰＰＣ、及びＰＯＰＣを含む脂質粒子の産生のために、一実施態様において３：１モル比のＰＯＰＣとＤＰＰＣを伴うアポリポタンパク質とＰＯＰＣ及びＤＰＰＣのモル比１：６０〜１：１００を用い、一実施態様においてモル比１：５０〜１：７０を用い、及び一実施態様においてモル比約１：６０を用いる。
【０１１１】
一実施態様において、脂質の混合物を、脂質粒子を産生するために使用する場合、混合物は、４℃〜４５℃、一実施態様において１０℃〜３８℃、及び、一実施態様において１５℃〜３５℃の相転移温度を有する。
【０１１２】
一実施態様において、アポリポタンパク質及びリン脂質は、溶液中でアポリポタンパク質：リン脂質のモル比約１：５０〜約１：１００である。一実施態様において、モル比は約１：５０〜１：８０である。
【０１１３】
アポリポタンパク質を含む脂質粒子の形成のために、異なる方法が公知である（例えば凍結乾燥、凍結融解、界面活性剤可溶化（透析が続く）、マイクロ流動化、超音波処理、及び均質化など）。
【０１１４】
脂質粒子は、一実施態様において、１脂質粒子当たり平均数１〜１０のアポリポタンパク質分子、一実施態様において、１脂質粒子当たり１〜８のアポリポタンパク質分子、及び、一実施態様において、１脂質粒子当たり１〜４のアポリポタンパク質分子を含む。
【０１１５】
一実施態様において、脂質粒子は、１脂質粒子当たり平均数少なくとも１、又は２、又は３、又は４、又は５、又は６、又は７、又は８、又は９、又は１０のアポリポタンパク質分子を含む。一実施態様において、平均数は１である。
【０１１６】
一実施態様において、脂質粒子は、アポリポタンパク質の他、１つ又は複数のさらなるポリペプチドを含む。
【０１１７】
限定されることなく、脂質粒子は、脂質、特にコレステロールを取り込むための酵素の補因子及び／又は担体としての役割を果たしうる。
【０１１８】
合成界面活性剤の他、１又は複数の界面活性剤は、本明細書において報告される通り、脂質粒子中に存在することができる。そのような界面活性剤は、任意の界面活性剤、即ち、医薬的に許容可能な界面活性剤又は非毒性濃度の他の界面活性剤、例えば非イオン性又はイオン性界面活性剤などでありうる。非イオン性界面活性剤は、１つ又は複数のヒドロキシル基を含む有機化合物のアルキレンオキシド誘導体でありうる。一実施態様において、非イオン性界面活性剤は、エトキシル化及び／又はプロポキシ化アルコール又はエステル化合物又はそれらの混合物より選択される。別の実施態様において、エステルは、ソルビトール及び脂肪酸のエステル（例えばソルビタンモノオレエート又はソルビタンモノパルミテート、油性スクロースエステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンステロールエーテル、ポリオキシエチレン−ポリプロポキシアルキルエーテル、ブロックポリマー及びセチルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油又は硬化ヒマシ油誘導体及びポリグリセリン脂肪酸エステルなど）より選択される。一実施態様において、非イオン性界面活性剤は、Pluronic（登録商標）、Poloxamer（登録商標）、Span（登録商標）、Tween（登録商標）、Polysorbate（登録商標）、Tyloxapol（登録商標）、Emulphor（登録商標）、又はCremophor（登録商標）より選択される。
【０１１９】
イオン性界面活性剤は胆管薬剤であることができる。一実施態様において、イオン性界面活性剤は、コール酸もしくはデオキシコール酸、又はそれらの塩及び誘導体より、あるいは遊離脂肪酸（例えばオレイン酸、リノール酸、及びその他など）より選択される。
【０１２０】
一実施態様において、イオン性界面活性剤は、カチオン性脂質（Ｃ１０−Ｃ２４アルキルアミン又はアルカノールアミンなど）及びカチオン性コレステロールエステルより選択される。一実施態様において、界面活性剤は、高いＣＭＣを伴う界面活性剤である。さらなる実施態様において、界面活性剤は、少なくとも５mMのＣＭＣを伴う界面活性剤である。
【０１２１】
一実施態様において、脂質粒子は、０．７５重量%未満の界面活性剤を含む。
【０１２２】
一実施態様において、脂質粒子は、０．３０重量%未満の界面活性剤を含む。
【０１２３】
一実施態様において、脂質粒子は、０．１重量%未満の界面活性剤を含む。
【０１２４】
一実施態様において、脂質粒子は、０．０５重量%未満の界面活性剤を含む。
【０１２５】
本発明に従った方法の一実施態様において、第１溶液は脂質粒子を実質的に含まない。
【０１２６】
一実施態様において、本方法は、工程ｉｉ）後及び工程ｉｉｉ）に先立ち、以下の工程ｉｉａ）工程ｉｉ）において得られた溶液をインキュベートすることを含む。一実施態様において、インキュベーションは約１２時間〜約２０時間にわたる。別の実施態様において、インキュベーションは約１６時間にわたる。
【０１２７】
一実施態様において、インキュベーション及び／又は除去は４℃〜４５℃の温度である。
【０１２８】
一実施態様において、除去は、ダイアフィルトレーション又は透析による。
【０１２９】
一実施態様において、第１溶液は第１容積を有し、第２溶液は第２容積を有し、第１溶液中のポリペプチド（例えばアポリポタンパク質など）が定められた濃度を有し、第２溶液中の脂質及び界面活性剤が、各々が定められた濃度を有し、ここで工程ｉｉ）において、アポリポタンパク質の、脂質の、及び界面活性剤の濃度が変化／低下され、脂質粒子の形成がもたらされる。
【０１３０】
一実施態様において、本方法は以下の工程：
ｉｖ）脂質粒子を精製し、それにより脂質粒子を産生すること
を含む。
【０１３１】
異なる脂質粒子を、本明細書において報告される方法を用いて形成することができる。
【０１３２】
例えば、アポリポタンパク質を含む脂質粒子の産生のために、１６の原子及びより短い鎖を伴うカルボン酸部分を含む飽和リン脂質が技術的な観点から選ばれうる（例、ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＰＰＣ；ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＭＰＣなど）。それとは対照的に、生物学的データから、少なくとも１６のＣ原子の鎖を伴うカルボン酸部分を含む非飽和リン脂質（例、パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＰＯＰＣ；ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＳＯＰＣ）は、より効果的で、非肝臓毒性であると仮定することができる。
【０１３３】
ホスファチジルコリンＤＰＰＣ及びＰＯＰＣならびにそれらの混合物は、アポリポタンパク質を含む脂質粒子の形成のために使用することができる。これらの例示的なホスファチジルコリンは、１つのカルボン酸部分において異なり、ホスホグリセロール骨格に対してエステル化された１つの同一のカルボン酸部分を有する。脂質粒子の製造は、ＤＰＰＣを使用した場合にはより簡単であった。対照的に、ＰＯＰＣは、特に、コレステロールエステル中への動員コレステロールの変換のために必要であるレシチンコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）酵素の活性化のための基質として、インビトロ機能アッセイにおいてより効果的であった。異なるモル比の２つのホスファチジルコリン（例、ＰＯＰＣ及びＤＰＰＣとして）の混合物を含む脂質粒子が、１つのホスファチジルコリンだけを含む脂質粒子と比較して、改善された特性を有することが見出されている（図４を参照のこと）。
【０１３４】
例えば、脂質粒子はＰＯＰＣだけを含むことができる。１アポリポタンパク質単量体当たりのＰＯＰＣ分子の数は、アポリポタンパク質と脂質のモル比１：４０〜１：８０までが脂質粒子の産生において使用される場合、５４〜７５の間で変動しうる。一実施態様において、アポリポタンパク質とＰＯＰＣのモル比は１：４０〜１：８０であり、一実施態様において、モル比は１：５０〜１：７０であり、一実施態様において、モル比は約１：６０である。
【０１３５】
このように、アポリポタンパク質及びＰＯＰＣを含む脂質粒子の産生のために、アポリポタンパク質とＰＯＰＣのモル比は一実施態様において１：４０〜１：１００であり、一実施態様において、モル比は１：４０〜１：８０であり、及び、一実施態様において、モル比は約１：６０である。
【０１３６】
例えば、脂質粒子はＤＰＰＣだけを含むことができる。１アポリポタンパク質単量体当たりのＤＰＰＣ分子の数は、アポリポタンパク質と脂質のモル比１：４０〜１：８０までが脂質粒子の産生において使用される場合、７６〜１２３の間で変動しうる。一実施態様において、アポリポタンパク質とＤＰＰＣのモル比は１：７０〜１：１００であり、一実施態様において、モル比は１：７５〜１：９０であり、一実施態様において、モル比は約１：８０である。
【０１３７】
例えば、脂質粒子を、モル比１：３のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの混合物から開始して産生することができる。１アポリポタンパク質単量体当たりのリン脂質分子の数は、アポリポタンパク質と脂質のモル比１：６０〜１：１００までが脂質粒子の産生において使用される場合、７２〜１１２の間で変動しうる。一実施態様において、アポリポタンパク質とＰＯＰＣ及びＤＰＰＣのモル比は１：７０〜１：９０であり、一実施態様において、モル比は１：７５〜１：８５であり、一実施態様において、モル比は約１：８０である。
【０１３８】
このように、アポリポタンパク質、ＰＯＰＣ、及びＤＰＰＣを含む脂質粒子の産生のために、一実施態様において１：３モル比のＰＯＰＣとＤＰＰＣを伴うアポリポタンパク質とＰＯＰＣ及びＤＰＰＣのモル比は１：６０〜１：１００であり、一実施態様において、モル比は１：７０〜１：９０であり、及び、一実施態様において、モル比は約１：８０である。
【０１３９】
例えば、脂質粒子を、モル比１：１のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの混合物から開始して産生することができる。１アポリポタンパク質単量体当たりのリン脂質分子の数は、アポリポタンパク質と脂質のモル比１：６０〜１：１００までが脂質粒子の産生において使用される場合、７１〜１１１の間で変動しうる。一実施態様において、アポリポタンパク質とＰＯＰＣ及びＤＰＰＣのモル比は１：６０〜１：８０であり、一実施態様において、モル比は１：６５〜１：７５であり、一実施態様において、モル比は約１：７０である。
【０１４０】
このように、アポリポタンパク質、ＤＰＰＣ、及びＰＯＰＣを含む脂質粒子の産生のために、一実施態様において１：１モル比のＰＯＰＣとＤＰＰＣを伴うアポリポタンパク質とＰＯＰＣ及びＤＰＰＣのモル比は１：６０〜１：１００であり、一実施態様において、モル比は１：６０〜１：８０であり、及び、一実施態様において、モル比は約１：７０である。
【０１４１】
例えば、脂質粒子を、モル比３：１のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの混合物から開始して産生することができる。１アポリポタンパク質単量体当たりのリン脂質分子の数は、アポリポタンパク質と脂質のモル比１：６０〜１：１００までが脂質粒子の産生において使用される場合、４６〜９３の間で変動しうる。一実施態様において、アポリポタンパク質とＰＯＰＣ及びＤＰＰＣのモル比は１：５０〜１：７０であり、一実施態様において、モル比は１：５５〜１：６５であり、一実施態様において、モル比は約１：６０である。
【０１４２】
このように、アポリポタンパク質、ＤＰＰＣ、及びＰＯＰＣを含む脂質粒子の産生のために、アポリポタンパク質とＰＯＰＣ及びＤＰＰＣのモル比（それによりＰＯＰＣとＤＰＰＣは３：１モル比である）は一実施態様において１：６０〜１：１００であり、一実施態様において、モル比は１：５０〜１：７０であり、及び、一実施態様において、モル比は約１：６０である。
【０１４３】
一実施態様において、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の水溶液として提供され、組換え産生後の下流プロセシング又はアポリポタンパク質産生の任意の他の供給源から得ることができ、変動する純度を伴う異なる濃度のアポリポタンパク質を含むことができる。
【０１４４】
基本的に、脂質粒子形成は、それらのそれぞれの転移温度でポリペプチドと界面活性剤可溶化脂質をインキュベートすることにより達成される。透析による界面活性剤の除去は、脂質二重層からなる脂質粒子の形成をもたらす。
【０１４５】
例えば、脂質粒子形成は、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又はその多量体を、界面活性剤可溶化脂質と、それらのそれぞれの転移温度でインキュベートすることにより達成される。透析による界面活性剤の除去は、α−ヘリックスアポリポタンパク質により囲まれた脂質二重層からなる脂質粒子の形成をもたらす。
【０１４６】
脂質粒子は、沈殿及び／又はクロマトグラフィー工程の組み合わせにより精製することができる。例えば、過剰な界面活性剤、即ち、脂質粒子の部分ではない界面活性剤を、疎水性吸着クロマトグラフィー工程において除去することができる。一実施態様において、脂質粒子を精製するための方法の工程は、疎水性吸着クロマトグラフィー工程を含む。別の実施態様において、疎水性吸着工程用のクロマトグラフィー材料は、Extracti Gel D（Pierce Biotechnology, Rockford IL, USAより入手可能）、CALBIOSORBTM（Calbiochem, San Diego, CA, USAより入手可能）、SDR 30 HyperDTM Solvent-Detergent Removal Chromatography Resin（PALL Corporation, Ann Arbor, MI, USAより入手可能）より選択される。脂質粒子は、界面活性剤不含の溶液を用いて疎水性吸着材料から回収される。このクロマトグラフィー工程は、低ＣＭＣを伴う界面活性剤について特に有用である。
【０１４７】
一実施態様において、透析を使用して、高ＣＭＣを伴う界面活性剤を除去する。
【０１４８】
医薬的及び診断的組成物：
本明細書において報告される方法により得られる脂質粒子は、疾患又は状態の処置及び／又は診断のために使用することができる。
【０１４９】
本明細書において報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又は本明細書において報告される脂質粒子は、非正常な脂質レベル又は身体成分内の脂質の沈着（例えば血管中のプラークなど）により特徴付けられる、疾患又は状態の処置及び／又は診断のために使用することができる。
【０１５０】
ＬＣＡＴ触媒コレステロールエステル化を支持する、得られたタンパク質−脂質複合体の能力を決定するために、コレステロールを、エタノールコレステロール溶液の迅速な添加により、本明細書において報告される脂質粒子に取り込ませた。純粋なＰＯＰＣを含む脂質粒子は、それらのアポリポタンパク質成分（例えば野生型アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又はテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉなど）に非依存的にＤＰＰＣを含む複合体よりも良いＬＣＡＴ基質である（図３）。
【０１５１】
ＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの異なる混合物を含む脂質粒子中のコレステロールエステル化の初期速度は、コレステロールエステル化の初期速度から分かる通り、混合物が純粋なホスファチジルコリンのいずれよりも良いＬＣＡＴ基質であることを示している（表３及び図４を参照のこと）。
【０１５２】
【表３】
2013538205.tif 000007
【０１５３】
ＴＨＰ−１単球性白血病細胞をホルボールミリスチン酸アセテートに露出させて得られ、放射性標識コレステロールトレーサーを用いて添加したマクロファージ様ヒトＴＨＰ１細胞を、コレステロールアクセプターテスト化合物に暴露させた。
【０１５４】
アクセプターテスト化合物により誘導される排出速度を、上清中のコレステロール放射活性と細胞プラスそれらの上清中の放射活性の合計の比率として計算し、アクセプターを含まない培地に曝露した細胞と比較し、線形近似により分析することができる。並列実験を、主にＡＢＣＡ−１を上方調節し、ＡＢＣＡ−１媒介性輸送に向けた排出に偏らせることが公知であるＲＸＲ−ＬＸＲアゴニストに曝露された及び暴露されていない細胞を使用して実施することができる。
【０１５５】
ＲＸＲ−ＬＸＲ脂質粒子を用いて前処理されていない細胞において、非脂質化テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを用いて得られた排出と比較し、コレステロール排出におけるより高い増加を見ることができる。排出に対する脂質混合物の小さな影響だけが、テストシリーズにおいて観察することができる（図５）。ＲＸＲ−ＬＸＲを用いて前処理した細胞において、脂質粒子（非脂質化テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ）のコレステロール排出における同程度の増加を見ることができる。全体的な増加は、前処理していない細胞を用いて観察されるものと比較して、より高かった。排出に対する脂質混合物の小さな影響だけが、テストシリーズにおいて観察することができる（図６）。
【０１５６】
異なる脂質粒子を、ウサギにおいてインビボでテストした。脂質粒子を静脈内注入として適用し、連続血液サンプリングを適用後９６時間にわたり実施した。肝酵素、コレステロール、及びコレステロールエステルの値を決定した。血漿中濃度は、初期分布相（血漿中濃度の対数線形下落が続く）を含む、全てのテストされた脂質粒子について同程度である（図７）。表４から分かる通り、薬物動態パラメーターは、全てのテスト化合物について類似している。観測された半減期は１．５日に近い。
【０１５７】
【表４】
2013538205.tif 000008
【０１５８】
図８から分かる通り、コレステロールは血漿中に動員され、エステル化される。血漿コレステロールエステルレベルは、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの濃度が既に減少している後でさえ、増加し続ける。血漿中テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉレベルが約０．５mg/ml（通常の野生型アポリポタンパク質Ａ−Ｉの約５０%）まで低下している場合、増加したコレステロールエステルレベルを検出することができる。
【０１５９】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子は、ウサギにおいて、ならびにマウスにおいて肝臓酵素を誘導しない（図１及び９から分かる通り）。また、溶血を、静脈内適用後２時間に得られた血漿サンプル中で決定することはできない（図１０）。
【０１６０】
従って、本発明の局面は、本明細書において報告されるアポリポタンパク質又は本明細書において報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子を含む医薬的組成物及び診断用組成物である。
【０１６１】
本明細書において報告される脂質粒子は、非脂質化アポリポタンパク質及び他の脂質粒子と比較して、改善したインビボ特性を有する（以下の表５に示す通り）。
【０１６２】
【表５】
2013538205.tif 000009
2013538205.tif 000010
【０１６３】
コレステロールが血液中に動員される効率は、インビボでのアポリポタンパク質の投与後、総コレステロールのそれぞれの可動域をアポリポタンパク質濃度と比較することにより決定することができる。定量的評価のために、ベースライン補正された総コレステロールの濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）とアポリポタンパク質の濃度−時間曲線下面積の商を計算した。
【０１６４】
本明細書において報告される脂質粒子、特に、配列番号０１のテトラネクチン−アポリポタンパク質ならびにモル比３：１のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣを含む脂質粒子は、増強されたインビボでのコレステロール動員を示す。
【０１６５】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ
上に概要を示す脂質粒子の他、本明細書においてテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉも報告されている。
【０１６６】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、ヒトテトラネクチン三量体化構造要素及び野生型ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉの融合タンパク質である。ヒトテトラネクチン部分のアミノ酸配列は、位置１０のイソロイシン残基（自然発生する切断部位）で開始して最初の９アミノ酸だけ短縮することができる。この切断の結果として、位置４のスレオニン残基でのＯ−グリコシル化部位が欠失されている。テトラネクチン三量体化構造要素とヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉの間で、５アミノ酸残基「ＳＬＫＧＳ」（配列番号０３）が除去された。
【０１６７】
改善された発現及び精製のために、コンストラクトは、Ｎ末端精製タグ（例、ヘキサヒスチジンタグ）及びＩｇＡプロテアーゼ切断部位を含んで生成することができる。特異的な切断の結果として、２つのアミノ酸−第１アラニン又はグリシン又はセリン又はプロリンとして及び第２プロリンとして−が、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−ＩのＮ末端に維持されている。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、配列番号１のアミノ酸配列を有することができる。
【０１６８】
テトラネクチン三量体化構造要素は、個々のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体の各々の間の非共有結合性相互作用により構成される三量体テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ多量体の形成をもたらすドメインを提供する。
【０１６９】
代替の精製方法を使用することにより、精製タグ及びＩｇＡプロテアーゼ切断部位を省略して、配列番号２のアミノ酸配列のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉをもたらすことができる。
【０１７０】
一実施態様において、アポリポタンパク質は、保存的アミノ酸置換を含むバリアント又はアポリポタンパク質Ａ−Ｉ模倣体でありうる。
【０１７１】
アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、ＮＭＲ分光法を介して、又はモノクローナルもしくはポリクローナル抗アポリポタンパク質Ａ−Ｉ抗体を使用することにより、酵素的に決定することができる。本明細書において報告される他の局面は、従って、本明細書において報告される通り、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉに特異的に結合するポリクローナル及びモノクローナル抗体である。そのような抗体は、当業者に公知の方法を用いて得ることができる。また、イムノアッセイにおける使用のための抗体の標識は、当業者に公知の方法を用いて実施することができる。
【０１７２】
一実施態様において、アポリポタンパク質は、保存的アミノ酸置換を含むバリアント、又はアポリポタンパク質Ａ−Ｉ模倣体でありうる。一実施態様において、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、配列番号０２、又は配列番号６６、又は配列番号６７のアミノ酸配列を有し、ここでＸは配列番号６８〜配列番号１０５より選択される。
【０１７３】
このように、一実施態様において、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは
【化３】
2013538205.tif 000011
のアミノ酸配列を有する。
【０１７４】
一実施態様において、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは
【化４】
2013538205.tif 000012
のアミノ酸配列を有する。
【０１７５】
一実施態様において、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは
【化５】
2013538205.tif 000013
のアミノ酸配列を有し、ここでＸは以下のアミノ酸配列
【化６】
2013538205.tif 000014
のいずれかでありうる。
【０１７６】
異種ポリペプチドがＥ．  ｃｏｌｉ株において産生される場合、アミノ末端メチオニン残基は、通常、プロテアーゼにより効率的に切断されず、このように、アミノ末端メチオニン残基は、産生されたポリペプチド中に部分的に存在している。
【０１７７】
以下の実施例、配列リスト、及び図面を提供し、本発明の理解を助け、その真の範囲は添付の特許請求の範囲において示される。示される手順は、本発明の精神から逸脱することなく変更することができることが理解される。
【０１７８】
配列リストの説明
【表６】
2013538205.tif 000015
2013538205.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】それらの脂質組成において異なる５つの脂質粒子を用いて行われたインビボのウサギ試験の結果。上：コレステロール動員、及び、このように、効力を、全ての調製バッチについて示すことができた。下：肝臓酵素の増加が、単一リン脂質としてのＤＰＰＣの使用により生成された脂質粒子について注目された。
【図２】本発明に従ったＰＯＰＣ及びアポリポタンパク質の脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析；モル比１：２０〜１：１６０。
【図３】ＬＣＡＴ活性に対するＤＰＰＣ及びＰＯＰＣの影響。
【図４】ＰＯＰＣ及び／又はＤＰＰＣを含む脂質粒子中のコレステロールエステル化の初期速度。
【図５】ＲＸＲ−ＬＸＲアゴニストを用いてプライムしていない細胞におけるＴＨＰ−１由来泡沫細胞へのコレステロール排出。
【図６】ＲＸＲ−ＬＸＲアゴニストを使用したＡＢＣＡ−Ｉ経路活性化後のＴＨＰ−１由来泡沫細胞へのコレステロール排出。
【図７】異なるアポリポタンパク質組成物の時間依存的血漿中濃度。
【図８】血漿中のコレステロール動員及びエステル化の時間及び濃度経過。
【図９】１００mg/kgの単回静脈内注射後のマウスにおける本発明に従ったアポリポタンパク質を含む異なる組成による肝臓酵素放出の比較。
【図１０】インビボのウサギ試験−血漿中の自然溶血。
【図１１】２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を使用した脂質粒子の分析的ＳＥＣ。
【図１２】５０mM  Ｋ２ＨＰＯ４、２５０mMアルギニン塩酸塩、７．５%トレハロース（ｐＨ７．５）を使用した脂質粒子の分析的ＳＥＣ。
【図１３】モル比１：２０〜１：３２０のＰＯＰＣ及びテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子の未変性ＰＡＧＥ（レーン１：未変性マーカー；レーン２：モル比１：３２０；レーン３：モル比１：１６０；レーン４：モル比１：８０；レーン５：モル比１：８０（ｆ／ｔ）；レーン６：モル比１：４０；レーン７：モル比１：２０；レーン８：アポリポタンパク質（六量体を形成する））。
【図１４】モル比１：２０〜１：１６０のＰＯＰＣ及びテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析。
【図１５】ＰＯＰＣ及びテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子のＳＥＣクロマトグラムの重ね合わせ（ＵＶ２８０シグナル）。
【図１６】モル比１：４０で得られた、ＰＯＰＣ及びテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析。
【図１７】モル比１：２０〜１：１００を用いて得られた、ＤＰＰＣ及びテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子の未変性ＰＡＧＥ（１：分子量マーカー；２：脂質を伴わないテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；３：１：２０；４：１：４０；５：１：６０；６：１：８０；７：１：１００）。
【図１８】モル比１：６０（最上曲線）〜１：１００（最低曲線）で得られた、ＰＯＰＣ：ＤＰＰＣ  ＝  ３：１の混合物及びテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析（ＵＶ２８０シグナル）。
【図１９】コール酸、Zwittergent 3-8、３−１０、及び３−１２を使用したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子の未変性ＰＡＧＥ  ＳＤＳ。各ゲル上のレーン１：純粋なアポリポタンパク質；各ゲル上のレーン２：参照としての０．１×ＣＭＣコール酸脂質化サンプル。
【図２０】３×ＣＭＣ  Zwittergent 3-8及びＰＯＰＣ（モル比、アポリポタンパク質：リン脂質＝１：６０）を使用したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳタンパク質コンジュゲート分析。
【図２１】２×ＣＭＣ  Zwittergent 3-10及びＰＯＰＣ（モル比、アポリポタンパク質：リン脂質＝１：６０）を使用したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳタンパク質コンジュゲート分析。
【図２２】ＰＯＰＣを使用したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳタンパク質コンジュゲート分析。上：未変性テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉから形成された脂質粒子；下：変性テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉから形成された脂質粒子。
【図２３ａ】ＤＭＰＣ（１：１００）（ジミリストイルホスファチジルコリン）（ａ）を用いて脂質化した、ＰＢＳ中で脂質化していない（ｂ）テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを用いて実施したインビボのウサギ試験の結果。
【図２３ｂ】ＤＭＰＣ（１：１００）（ジミリストイルホスファチジルコリン）（ａ）を用いて脂質化した、ＰＢＳ中で脂質化していない（ｂ）テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを用いて実施したインビボのウサギ試験の結果。
【図２４Ａ】５℃及び４０℃で保存された、野生型アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａ）及び本明細書において報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ｂ）を含む脂質粒子のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図２４Ｂ】５℃及び４０℃で保存された、野生型アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａ）及び本明細書において報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ｂ）を含む脂質粒子のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【０１８０】
材料及び方法
サイズ排除−ＨＰＬＣ：
クロマトグラフィーは、ASI-100 HPLCシステム（Dionex, Idstein, Germany）上のTosoh Haas TSK 3000 SWXLカラムを用いて行った。溶出ピークを、ＵＶダイオードアレイ検出器（Dionex）により２８０nmでモニターした。１mg/mlへの濃縮サンプルの溶解後、カラムを、安定したベースラインが達成されるまで、２００mMリン酸二水素カリウム及び２５０mM塩化カリウム（ｐＨ７．０）からなるバッファーを用いて洗浄した。分析実行を、流量０．５ml/分を使用し、３０分にわたり室温で、均一濃度条件下で実施した。クロマトグラムを、Chromeleon（Dionex, Idstein, Germany）を用いて手動で統合した。凝集（%）を、高分子量形態の曲線下面積（ＡＵＣ）を単量体ピークのＡＵＣと比較することにより決定した。
【０１８１】
動的光散乱（ＤＬＳ）：
ＤＬＳは、典型的にはサブミクロンサイズ範囲において粒子サイズを測定するための非侵襲的技術である。本発明において、温度制御された石英キュベット（２５℃）を伴うZetasizer Nano S装置（Malvern Instruments, Worcestershire, UK）を、１nmと６μmの間のサイズ範囲をモニターするために使用した。後方散乱されたレーザー光の強度を、１７３°の角度で検出した。強度は、粒子拡散スピードに依存している速度で変動し、それは、次に、粒子サイズにより支配される。粒子サイズデータは、従って、散乱光強度における変動の分析から生成することができる（Dahneke, B.E. (ed.), Measurement of Suspended Particles by Quasielectric Light Scattering, Wiley Inc. (1983)；Pecora, R., Dynamic Light Scattering: Application of Photon Correlation Spectroscopy, Plenum Press (1985)）。強度ごとのサイズ分布を、ＤＴＳソフトウェア（Malvern）の複数のナローモードを使用して計算した。実験は、未希釈サンプルを用いて行った。
【０１８２】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ：
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳは、サイズ排除クロマトグラフィーと３つの検出器システムとの組み合わせである：ｉ）ＵＶ検出、ｉｉ）屈折率検出、及びｉｉｉ）光散乱検出。サイズによる分離のために、GE HealthcareからのSuperose 6カラム10/300 GLカラムを使用する。本方法を、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）を用いて、流量０．４ml/分を適用し、均一濃度で実行する。３つの検出器システムを直列に連結する。完全な脂質粒子（タンパク質−脂質粒子）シグナルは、屈折率検出器によりモニターされるのに対し、２８０nmで決定されるＵＶ吸光度は、タンパク質部分により誘導されたシグナルを決定する。脂質分画の割合は、完全シグナルからのタンパク質ＵＶシグナルの単純な引き算により得られる。光散乱を適用することによって、それぞれの種の分子量の検出、及び、このように、脂質粒子の完全で詳細な説明がもたらされる。
【０１８３】
界面活性剤の決定：
残留界面活性剤の決定は、蒸発光散乱検出器（ＲＰ−ＥＬＳＤ）と合わせた逆相クロマトグラフィーにより行った。カラムとして、Phenomenex（Aschaffenburg, Germany）からのLuna C18（４．６×１５０mM、５μm、１００A）を使用した。１０kDaメンブレンを通した遠心分離後、９０μlのフロースルーをＨＰＬＣ分離のために使用した。溶出を、０．１%（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む７４%（ｖ／ｖ）メタノール溶液を用いて、均一濃度条件下で実施した。カラム温度を３０℃に設定した。検出を、蒸発光散乱検出器により、噴霧温度３０℃、蒸発温度８０℃、及び気体流１．０l/分を適用して実施した。残留界面活性剤の定量化を、コール酸の場合において、０．２２μg〜７．５μgコール酸の範囲で、検量線の確立により行った。
【０１８４】
タンパク質の決定：
タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０nmでの光学密度（ＯＤ）を決定することにより決定した。
【０１８５】
組換えＤＮＡ技術：
標準的な方法を使用して、ＤＮＡを操作した（Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載される通り）。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。
【０１８６】
実施例１
Ｅ．  ｃｏｌｉ発現プラスミドの作製及び説明
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドを、組換え手段により調製した。発現された融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＮからＣ末端方向で、以下：
−  アミノ酸メチオニン（Ｍ）
−  ＣＤＬＰＱＴＨＳＬ（配列番号５５）のアミノ酸配列を有するインターフェロン配列のフラグメント、
−  ＧＳリンカー、
−  ＨＨＨＨＨＨ（配列番号５６）のアミノ酸配列を有するヘキサヒスチジンタグ、
−  ＧＳリンカー、
−  ＶＶＡＰＰＡＰ（配列番号６０）のアミノ酸配列を有するＩｇＡプロテアーゼ切断部位、及び
−  配列番号０２のアミノ酸配列を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ
の通りである。
【０１８７】
上に記載するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドは、前駆体ポリペプチドであり、そこから、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドが、ＩｇＡプロテアーゼを使用したインビトロでの酵素的切断により放出された。
【０１８８】
前駆体ポリペプチドをコードする融合遺伝子を、適切な核酸セグメントの連結により、公知の組換え方法及び技術を用いて組み立てた。化学合成により作製した核酸配列をＤＮＡ配列決定により確認した。配列番号３１の融合タンパク質をコードする配列番号０１のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの産生のための発現プラスミドを、以下の通りに調製した。
【０１８９】
Ｅ．  ｃｏｌｉ発現プラスミドの作製
プラスミド４９８０（４９８０−ｐＢＲｏｒｉ−ＵＲＡ３−ＬＡＣＩ−ＳＡＣ）は、Ｅ．  ｃｏｌｉにおけるコア−ストレプトアビジンの発現のための発現プラスミドである。それは、プラスミド１９６６（１９６６−ｐＢＲｏｒｉ−ＵＲＡ３−ＬＡＣＩ−Ｔリピート；ＥＰ−Ｂ１４２２２３７において報告される）に由来する３１４２bp長のＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩベクターフラグメントと、４３５bp長のコア−ストレプトアビジンをコードするＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩフラグメントとのライゲーションにより生成した。
【０１９０】
コア−ストレプトアビジンＥ．  ｃｏｌｉ発現プラスミドは以下の要素：
−  Ｅ．  ｃｏｌｉにおける複製のためのベクターｐＢＲ３２２からの複製起点（Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90に従ったｂｐ位置２５１７−３１６０に対応する）、
−  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｐｙｒＦ変異体株（ウラシル要求性）の相補性によりプラスミド選択をもたらすオロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＵＲＡ３遺伝子（Rose, M. et al. Gene 29 (1984) 113-124）、
−  以下を含むコア−ストレプトアビジン発現カセット、
−  Stueber, D., et al.（前を参照のこと）に従った合成リボソーム結合部位を含むＴ５ハイブリッドプロモーター（Bujard, H., et al. Methods. Enzymol.155 (1987) 416-433及びStueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990)121-152に従ったＴ５−ＰＮ２５／０３／０４ハイブリッドプロモーター）、
−  コア−ストレプトアビジン遺伝子、
−  ２つのバクテリオファージ由来の転写ターミネーター、λ−Ｔ０ターミネーター（Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414）及びｆｄ−ターミネーター（Beck E. and Zink, B. Gene 1-3 (1981) 35-58）、
−  Ｅ．  ｃｏｌｉからのｌａｃＩリプレッサー遺伝子（Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769）
を含む。
【０１９１】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ前駆体ポリペプチドの発現のための最終的な発現プラスミドを、唯一の隣接ＥｃｏＲＩ及びＣｅｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を使用してベクター４９８０からコア−ストレプトアビジン構造遺伝子を切り出し、前駆体ポリペプチドをコードするＥｃｏＲＩＩ／ＣｅｌＩＩ制限部位に隣接する核酸を、３１４２bp長のＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩ４９８０ベクターフラグメント中に挿入することにより調製した。
【０１９２】
実施例２
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの発現
融合タンパク質の発現のために、Ｅ．  ｃｏｌｉ栄養要求性（ＰｙｒＦ）の相補性により、抗生物質不含のプラスミド選択を可能にするＥ．  ｃｏｌｉ宿主／ベクターシステムを用いた（ＥＰ  ０９７２８３８及びＵＳ  ６，２９１，２４５）。
【０１９３】
Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ１２株ＣＳＰＺ−２（ｌｅｕＢ、ｐｒｏＣ、ｔｒｐＥ、ｔｈ−１、ΔｐｙｒＦ）を、発現プラスミドｐ（ＩＦＮ−Ｈｉｓ６−ＩｇＡテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ）を用いたエレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換されたＥ．  ｃｏｌｉ細胞を、最初に、寒天プレート上で、３７℃で増殖させた。
【０１９４】
発酵プロトコール１：
前発酵のために、約１g/lのＬ−ロイシン、約１g/lのＬ−プロリン、及び約１mg/lのチアミンＨＣｌを添加したSambrook et al.（Molecular Cloning: A laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd edition (December 1989)）に従ったＭ９培地を使用してきた。
【０１９５】
前発酵のために、バッフルを伴う１０００mlエルレンマイヤーフラスコ中のＭ９培地３００mlに、初代シードバンクアンプルからの２mlを用いて接種した。培養を、光学密度（５７８nm）１−３が得られるまで、３７℃で１３時間にわたりロータリーシェーカー上で実施した。
【０１９６】
発酵のために、Riesenberg et al.（Riesenberg, D., et al., J. Biotechnol. 20 (1991) 17-27）に従ったバッチ培地を使用した：２７．６g/lグルコース＊Ｈ２Ｏ、１３．３g/l  ＫＨ２ＰＯ４、４．０g/l  （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、１．７g/lクエン酸塩、１．２g/l  ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、６０mg/l鉄（ＩＩＩ）クエン酸塩、２．５mg/l  ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１５mg/l  ＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ、１．５mg/l  ＣｕＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、３mg/l  Ｈ３ＢＯ３、２．５mg/l  Ｎａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、８mg/l  Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２＊２Ｈ２Ｏ、８．４mg/l  Titriplex III、１．３ml/l  Synperonic １０%消泡剤。バッチ培地に、５．４mg/lチアミン−ＨＣｌならびに１．２g/lのＬ−ロイシン及びＬ−プロリンをそれぞれ添加した。フィード１溶液は、１９．７g/l  ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを添加した７００g/lグルコースを含んだ。ｐＨ調節のためのアルカリ溶液は、５０g/lのＬ−ロイシン及び５０g/lのＬ−プロリンそれぞれを添加した水性１２．５%（ｗ／ｖ）ＮＨ３溶液であった。全ての成分を脱イオン水中に溶解した。
【０１９７】
発酵を１０l  Biostat C DCU3発酵槽（Sartorius, Melsungen, Germany）中で行った。６．４lの無菌発酵バッチ培地プラス前発酵からの３００mlの接種材料を用いて開始し、バッチ発酵を３７℃、ｐＨ６．９±０．２、５００mbar、及び通気速度１０l/分で実施した。最初に添加したグルコースが枯渇した後、温度を２８℃にシフトし、発酵はフェッドバッチモードに入った。ここで、溶解酸素（ｐＯ２）の相対値を、一定に増加する撹拌スピード（１０時間内に５５０rpmから１０００rpmに及び１６時間内に１０００rpmから１４００rpmに）及び通気率（１０時間中に１０l/分から１６l/分に及び５時間中に１６l/分から２０l/分に）との組み合わせにおいてフィード１を加えることにより、５０%（例、DO-stat、例、Shay, L.K., et al., J. Indus. Microbiol. Biotechnol. 2 (1987) 79-85を参照のこと）に保った。追加のアミノ酸を用いた供給は、約８時間の培養後にｐＨがより低い調節限界（６．７０）に達した際でのアルカリ溶液の添加に起因した。組換え治療用タンパク質の発現は、光学密度７０で１mM  ＩＰＴＧの添加により誘導した。
【０１９８】
発酵の終わりに、細胞質及び可溶性の発現されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体に移し、発酵槽中の全培養ブロスを収集前の１又は２時間にわたり５０℃に加熱する加熱工程を用いる（例、ＥＰ  Ｂ  １  ４８６  ５７１を参照のこと）。その後、発酵槽の内容物を、フロースルー遠心機を用いて遠心分離し（１３，０００rpm、１３l/時間）、収集したバイオマスを、さらなる処理まで−２０℃で保存した。合成されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ前駆体タンパク質が、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体（ＩＢ）の形態で不溶性細胞デブリ分画において独占的に見出された。
【０１９９】
合成された融合タンパク質が、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体（ＩＢ）の形態で不溶性細胞デブリ分画において独占的に見出された。
【０２００】
発酵槽から取り出されたサンプル（誘導前の１つ及びタンパク質発現の誘導後の専用の時間点での他）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析する。すべてのサンプルから、同じ量の細胞（ＯＤ標的＝５）を、５mLのＰＢＳバッファー中に再懸濁し、氷上で超音波処理を介して破壊する。次に、各懸濁液の１００μlを遠心分離し（１５，０００rpm、５分間）、各上清を回収し、別々のバイアルに移す。これは、可溶性と不溶性の発現標的タンパク質を識別するためである。各上清（＝可溶性）分画に３００μl、各ペレット（＝不溶性）分画に４００μlのＳＤＳサンプルバッファー（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685）を加える。サンプルを振盪下で、９５℃で１５分間にわたり加熱し、サンプル中の全てのタンパク質を可溶化し、低下させる。室温まで冷却後、各サンプルの５μlを４〜２０%TGX Criterion Stain Freeポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）に移す。加えて、５μlの分子量標準（Precision Plus Protein Standard, Bio-Rad）及び既知の産物タンパク質濃度（０．１μg/μl）を伴う３量（０．３μl、０．６μl、及び０．９μl）定量化標準をゲル上に位置付ける。
【０２０１】
電気泳動を２００Vで６０分間にわたり実行し、その後、ゲルをGelDOC EZ Imager（Bio-Rad）に移し、ＵＶ照射を用いて５分間にわたり処理した。ゲル画像を、Image Lab分析ソフトウェア（Bio-Rad）を使用して分析した。３つの標準を用いて、線形回帰曲線を、係数＞０．９９を用いて計算し、それについて、元のサンプル中の標的タンパク質の濃度を計算した。
【０２０２】
発酵プロトコール２：
前発酵のために、約１g/lのＬ−ロイシン、約１g/lのＬ−プロリン、及び約１mg/lのチアミンＨＣｌを添加したSambrook et al.（Molecular Cloning: A laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd edition (December 1989)）に従ったＭ９培地を使用してきた。
【０２０３】
前発酵のために、バッフルを伴う１０００mlエルレンマイヤーフラスコ中の改変Ｍ９培地の３００mlに、寒天プレートから又は初代シードバンクアンプルからの１〜２mlを用いて接種した。培養を、光学密度（５７８nm）１−３が得られるまで、３７℃で１３時間にわたりロータリーシェーカー上で実施した。
【０２０４】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの発酵及び高収率発現のために、以下のバッチ培地及びフィードを使用した：８．８５g/lグルコース、６３．５g/l酵母エキス、２．２g/l  ＮＨ４Ｃｌ、１．９４g/l  Ｌ−ロイシン、２．９１g/l  Ｌ−プロリン、０．７４g/l  Ｌ−メチオニン、１７．３g/l  ＫＨ２ＰＯ４＊Ｈ２Ｏ、２．０２g/l  ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２５．８mg/lチアミン−ＨＣｌ、１．０ml/l  Synperonic  １０%消泡剤。フィード１溶液は、１．６７g/l  Ｌ−メチオニン及び５g/l  Ｌ−ロイシン及びＬ−プロリンを各々添加した３３３g/l酵母エキス及び３３３g/l  ８５%グリセロールを含んだ。フィード２は、６００g/l  Ｌ−プロリンの溶液であった。ｐＨ調節のためのアルカリ溶液は１０%（ｗ／ｖ）のＫＯＨ溶液であった。酸として７５%グルコース溶液を使用した。全ての成分を脱イオン水中に溶解した。
【０２０５】
発酵を１０l  Biostat C DCU3発酵槽（Sartorius, Melsungen, Germany）中で行った。５．１５ｌの無菌発酵バッチ培地プラス前発酵からの３００mlの接種材料を用いて開始し、フェドバッチ発酵を２５℃、ｐＨ６．７±０．２、３００mbar、及び通気速度１０l/分で実施した。最初に添加したグルコースが枯渇する前に、培養は光学密度１５（５７８nm）に達し、フィード１を７０g/時間で開始した際、発酵はフェッドバッチモードに入った。培養中のグルコース濃度をモニターし、グルコース蓄積を避けながら、上限調節限界６．９に近いｐＨを保ちながら、フィード１が最高値１５０g/時間に増加した。光学密度５０（５７８nm）で、フィード２を一定の供給速度１０ml/時間で開始した。溶解酸素（ｐＯ２）の相対値を、撹拌スピード（５００rpmから１５００rpm）、通気速度（１０l/分から２０l/分に）、及び圧力（３００mbarから５００mbarに）を並行して増加させることにより５０%超に保った。組換え治療用タンパク質の発現を、光学密度９０で１mM  ＩＰＴＧの添加により誘導した。
【０２０６】
発酵槽から取り出された７つのサンプル（誘導前の１つ及びタンパク質発現の誘導後の専用の時間点での他）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析する。すべてのサンプルから、同じ量の細胞（ＯＤ標的＝５）を、５mLのＰＢＳバッファー中に再懸濁し、氷上で超音波処理を介して破壊する。次に、各懸濁液の１００μlを遠心分離し（１５，０００rpm、５分間）、各上清を回収し、別々のバイアルに移す。これは、可溶性と不溶性の発現標的タンパク質を識別するためである。各上清（＝可溶性）分画に３００μl、各ペレット（＝不溶性）分画に２００μlのＳＤＳサンプルバッファー（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685）を加える。サンプルを振盪下で、９５℃で１５分間にわたり加熱し、サンプル中の全てのタンパク質を可溶化し、低下させる。室温まで冷却後、各サンプルの５μlを１０%  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（Novagen）に移す。加えて、５μlの分子量標準（Precision Plus Protein Standard, Bio-Rad）及び既知の産物タンパク質濃度（０．１μg/μl）を伴う３量（０．３μl、０．６μl、及び０．９μl）定量化標準をゲル上に位置付ける。
【０２０７】
電気泳動を２００Vで３５分間にわたり実行し、次に、ゲルを、クーマシーブリリアントブルーＲ色素を用いて染色し、加熱した水を用いて脱染し、デジタル化のために光学式デンシトメーター（GS710、Bio-Rad）に移した。ゲル画像を、Quantity One 1-D分析ソフトウェア（Bio-Rad）を使用して分析した。３つの標準を用いて、線形回帰曲線を、係数＞０．９８を用いて計算し、それについて、元のサンプル中の標的タンパク質の濃度を計算した。
【０２０８】
発酵の終わりに、細胞質及び可溶性の発現されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体（ＩＢ）に移し、発酵槽中の全培養ブロスを収集前の１又は２時間にわたり５０℃に加熱する加熱工程を用いる（例、ＥＰ  Ｂ  １  ４８６  ５７１を参照のこと）。加熱工程後、合成されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ前駆体タンパク質が、ＩＢの形態で不溶性細胞デブリ分画において独占的に見出された。
【０２０９】
発酵槽の内容物を４〜８℃に冷却し、フロースルー遠心機を用いて遠心分離し（１３，０００rpm、１３l/時間）、収集したバイオマスを、さらなる処理まで−２０℃で保存した。収集された全バイオマス収率は、発現されたコンストラクトに依存して、３９g/l〜９０g/l乾燥物質の範囲であった。
【０２１０】
実施例３
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの調製
封入体調製を、リン酸カリウム緩衝溶液又はＴｒｉｓ緩衝溶液（０．１M、１mM  ＭｇＳＯ４、ｐＨ６．５を添加）中の収集された細菌細胞の再懸濁により行った。ＤＮＡｓｅの添加後、細胞を、９００barの圧力での均質化により破壊した。１．５M  ＮａＣｌ及び６０mM  ＥＤＴＡを含むバッファー溶液を、均質化した細胞懸濁液に加えた。２５%（ｗ／ｖ）ＨＣｌを用いた５．０へのｐＨ値の調整後、最終的な封入体スラリーがさらなる遠心分離工程後に得られた。スラリーを、さらなる処理まで使い捨て滅菌ビニール袋中で、−２０℃で保存した。
【０２１１】
封入体スラリー（約１５kg）をグアニジン塩酸溶液（１５０l、６．７M）中に可溶化した。深層ろ過による可溶化液の清澄化後、この溶液をＺｎキレートアフィニティークロマトグラフィー材料に適用した。融合ポリペプチドをＺｎ−キレートクロマトグラフィー材料により精製し、ＩｇＡプロテアーゼにより切断した。その後、ポリペプチドを、陰イオン交換クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィー工程を用いてさらに精製した。これらの工程を、尿素を含む溶液（７M）中、即ち、変性条件下で実施した。これらの工程を、ポリペプチドフラグメント、エンドトキシン、及びさらなる不純物の除去のために使用した。６．７Mグアニジニウム塩酸を含む溶液中へのダイアフィルトレーションを行った。得られた最終溶液は、変性テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む。
【０２１２】
実施例４
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉのリフォールディング及び脂質化
ａ）一般的な方法
純粋な結晶ＰＯＰＣ又はＤＰＰＣ（Lipoid, Switzerland）は、リン脂質：コール酸のモル比１：１．３５でコール酸を含む水性バッファー（脂質化バッファー）中に溶解されている。混合物を、透明な溶液が得られるまで、窒素雰囲気下で、光から保護して、室温で（ＰＯＰＣ）又は５５℃で（ＤＰＰＣ）インキュベートした。透明な脂質コール酸溶液を４℃（ＰＯＰＣ）に冷却する、又は、４１℃（ＤＰＰＣ）で保存する。精製テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、定められたアポリポタンパク質：リン脂質比で４℃（ＰＯＰＣ）又は４１℃（ＤＰＰＣ）で加えている。脂質粒子形成のために、反応混合物を、一晩、４℃（ＰＯＰＣ）又は４１℃（ＤＰＰＣ）で、窒素雰囲気下で、光から保護して、インキュベートした。最後に、コール酸を、脂質化バッファーに対する広範な透析（４℃／４１℃）により除去した。最後に、サンプルを遠心分離して、沈殿物質を除去した。
【０２１３】
純粋なＰＯＰＣ又は純粋なＤＰＰＣを含むコール酸可溶化脂質溶液を、上に記載する通りに調製している。脂質混合物は、所望の比率で脂質溶液を組み合わせることにより調製し、その後それぞれのＴｍ（Ｔｍ＝相転移温度）で保存した。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子形成を、純粋な脂質溶液について記載される通りに実行したが、しかし、選ばれた脂質混合物のそれぞれのＴｍであった。
【０２１４】
以下：
１．２５０mMアルギニン塩酸塩、７．５%スクロースをｐＨ７．５で添加した５０mMリン酸カリウムバッファー。
２．２５０mMアルギニン塩酸塩、７．５%スクロース、及び１０mMメチオニンをｐＨ７．５で添加した５０mMリン酸水素二カリウムバッファー。
３．１４０mM  ＮａＣｌ、１０mMメチオニンをｐＨ７．５で添加した２５０mM  Ｔｒｉｓ−ヒドロキシルアミノメタン（ＴＲＩＳ）。
４．２５０mMアルギニン塩酸塩、７%トレハロース、及び１０mMメチオニンをｐＨ７．５で添加した５０mMリン酸水素二カリウムバッファー
の脂質化バッファーをテストしている。
【０２１５】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉサンプルから形成された脂質粒子の均質性は、分析的ＳＥＣにより評価されている（図１１及び１２）。全体的に、脂質化バッファーの選択は、リン脂質の選択と比較して、軽微な効果だけ有する。ＤＰＰＣ脂質粒子が１つの主ピークとして溶出するのに対し、ＰＯＰＣ脂質粒子は２つのピークパターンを示す。脂質化バッファーの選択は、アポリポタンパク質の精製プロセス及び安定化された脂質不含アポリポタンパク質の供給により影響された。脂質粒子形成が、脂質化バッファーにかかわりなく、実行可能であることが示された。テストされた種々のバッファーの間で、最も適切な脂質化バッファーは、２５０mM  Ｔｒｉｓ、１４０mM  ＮａＣｌ、１０mMメチオニン、ｐＨ７．５であると特定された。
【０２１６】
脂質混合物は定められた量の各アポリポタンパク質を含んだ。リン脂質（例、ＰＯＰＣ）の量をそれに従って計算した。脂質のモル量の全ての計算が、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体に基づいた。
【０２１７】
ｂ）ＰＯＰＣ及びコール酸
【０２１８】
【表７】
2013538205.tif 000017
【０２１９】
モル比１：４０〜１：１６０は、全体のプロセスの間に透明なままである。過剰なリン脂質を介した混濁又はタンパク質沈殿のいずれも観察されなかった。
【０２２０】
脂質粒子サンプルを未変性ＰＡＧＥにより分析している（図１３を参照のこと）。最も均質なバンドパターンが、サンプル１：８０を用いて見出された（レーン４）。また、１×凍結／解凍（−８０℃）は、サンプルの外観を変えなかった（レーン５）。サンプル１：３２０及び１：１６０のバンドパターンは、複数のバンドをもたらす不均質な産物を示す（レーン２及び３）。サンプル１：４０及びまた１：２０は、主な産物バンドの下に追加のバンドを有する（レーン６及び７）。純粋なテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの移動パターンが、図１３のレーン８に示されている。
【０２２１】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析を使用して、脂質粒子及びそれらのアポリポタンパク質−リン脂質組成の均質性に関する詳細な情報を得た（タンパク質コンジュゲート分析）。図１４は、ＳＥＣ分解サンプルのクロマトグラムを示す（ＵＶ２８０検出）。ここで、１：１６０サンプルは３つの分離ピークに分けられる。１：８０サンプルは、二重ピークとして表示される通り、異なるサイズの少なくとも２種を含むように見えた。サンプル１：２０から得られたピークが最も均質な産物を示す。
【０２２２】
実験を、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（３．８４mg/ml；１０mg/サンプル）を使用して行い、アポリポタンパク質：リン脂質のモル比を５の工程において１：４０〜１：８０に増加させた。１：４０を下回るモル比では、脂質粒子形成が不完全である。１：８０を上回るモル比を実験的に除く：透析によるコール酸の除去後、サンプルは混濁した。さらに、脂質粒子は、より高い脂質比でより不均質になった。
【０２２３】
【表８】
2013538205.tif 000018
【０２２４】
−３℃の転移温度でのインキュベーションの間に、全てのサンプルが光学的に透明なままであった。透析によるコール酸の除去後、サンプル１：４０〜１：６５の増加する混濁が観察された。沈殿物を遠心分離により除去することができたが、サンプルは後に透明なままであった。
【０２２５】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析を使用して、形成した脂質粒子及びそれらのアポリポタンパク質−リン脂質組成の均質性に関する詳細な情報を得た（タンパク質コンジュゲート分析）。全ての脂質粒子が分析用サイズ排除クロマトグラフィーで同程度に均質であったが（ＳＥＣ；図１５）、より低いモル比でより明白である軽微な後ピークを表示している。また、より高い分子量に向かった、より高いモル比でのピークパターンにおける顕著なシフトがある。それぞれの保持時間を表８に与える。
【０２２６】
【表９】
2013538205.tif 000019
【０２２７】
タンパク質−コンジュゲート分析（表８にまとめる）は、ＳＥＣカラムから溶出された各脂質粒子についてのタンパク質（ＭＷタンパク質）及び脂質成分（ＭＷ脂質）の全分子量の計算を可能にする。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体（３２．７kDa）及びＰＯＰＣ（７６０Da）の分子量に基づき、脂質粒子の組成（ｎタンパク質及びｎ  ＰＯＰＣ）を計算することができる。全てのモル比で脂質粒子の主ピークにおいて見出されたアポリポタンパク質成分の分子量は約１００kDaであり、１脂質粒子当たりのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ三量体に相当した。ｎ（ＰＯＰＣ）／ｎ（タンパク質単量体）の比率は、脂質粒子中の１テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体当たりのＰＯＰＣ分子の数を与える。１テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体当たりのＰＯＰＣ分子の数は、１：４０〜１：８０までのモル比が適用されているが、５４〜７５の間で変動する。値%タンパク質は、脂質化の程度についてのパラメーターである。脂質粒子中のタンパク質のパーセンテージが低いほど、脂質化の程度がより高い。
【０２２８】
【表１０】
2013538205.tif 000020
【０２２９】
ｃ）ＤＰＰＣ及びコール酸
脂質化に先立ち、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、５０mM  ＫＨ２ＰＯ４、２５０mMアルギニン塩酸塩、７%トレハロース、１０mMメチオニンに対してｐＨ７．５で透析した。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（３．８４mg/ml、１サンプル当たり３mg）を、５の工程において１：６０〜１：１００の増加する脂質濃度のモル比を使用して脂質化している。脂質化バッファーは、２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ、１０mMメチオニン、ｐＨ７．５であった。
【０２３０】
【表１１】
2013538205.tif 000021
【０２３１】
脂質粒子形成の間に、タンパク質の沈殿又は過剰な脂質を介した混濁のいずれも観察されなかった。最終産物中のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの収率は、より多くのＤＰＰＣが脂質化のために使用された場合により高かった。
【０２３２】
残留脂質不含アポリポタンパク質が、未変性ＰＡＧＥ上の１：２０サンプルにおいて見出された（レーン３、図１７）。１：４０及び１：６０サンプルが未変性ＰＡＧＥ上で最も均質に見えるのに対し（レーン４及び５）、１：８０及び１：１００サンプルは主脂質粒子バンド（レーン６及び７）の上に追加のより高い分子のバンドを含む。
【０２３３】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳタンパク質コンジュゲート分析を使用して、ＤＰＰＣ脂質粒子形成の後に得られた脂質粒子の組成を特徴づけた（ＭＷ  ＤＰＰＣ：７３４Da）。均質なＳＥＣピークが、１：８０及びそれ以下のモル比で得られた。より高い脂質比で、前ピークが出現した（例、表１１中の１：９０サンプルを参照のこと）。
【０２３４】
【表１２】
2013538205.tif 000022
【０２３５】
脂質化の最も高い程度（タンパク質の最も低いパーセンテージ）が、１：８０〜１：９０のモル比を用いて見出される。また、ＤＬＳは、１４〜１７nmの粒子サイズで、比率１：８０〜１：９０で最も均質な粒子形成（＞９８%）を明らかにした。
【０２３６】
ｄ）７５%  ＤＰＰＣ／２５%  ＰＯＰＣ
脂質粒子形成を、以下のパラメーターを用いて、この実施例の項目ａ）〜ｃ）において報告される通りに従って行った：
タンパク質：３．８４mg/mlでのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、１サンプル当たり３mg
脂質化バッファー：２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ、１０mMメチオニンｐＨ７．５
脂質化：３４℃で
透析：４℃で
テストしたモル比：５の工程における脂質増加を伴う１：６０〜１：１００。
【０２３７】
脂質粒子形成は容易で、純粋な脂質を使用したプロセスと同程度であった。全てのサンプルが、プロセス及び透析の間に透明なままであった。脂質粒子の収率は、テストした全ての比率について類似していた（〜８５%）。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析は、モル比１：８０が、９０．９%の主ピーク、無前ピーク、及び９．１%の後ピークを伴う最も均質な脂質粒子をもたらすことを示した。タンパク質コンジュゲート分析は、全てのサンプルの主な種における１脂質粒子当たり１テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ三量体の存在を明らかにした（図１８ならびに表１２及び表１３を参照のこと）。
【０２３８】
【表１３】
2013538205.tif 000023
【０２３９】
【表１４】
2013538205.tif 000024
【０２４０】
ｅ）５０%  ＤＰＰＣ／５０%  ＰＯＰＣ
脂質粒子形成を、以下のパラメーターを用いて、この実施例の項目ａ）〜ｃ）において報告される通りに従って行った：
タンパク質：３．８４mg/mlでのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、１サンプル当たり３mg
脂質化バッファー：２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ、１０mMメチオニン、ｐＨ７．５
脂質化：２７℃で
透析：室温で
テストしたモル比：５の工程における増加脂質を伴う１：６０〜１：１００。
【０２４１】
全てのサンプルが、プロセス及び透析の間に透明なままであった。脂質粒子の収率は、テストした全ての比率について類似していた。
【０２４２】
【表１５】
2013538205.tif 000025
【０２４３】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子形成のために５０%ＤＰＰＣ及び５０%ＰＯＰＣの脂質混合物を使用して、最も均質な産物がモル比１：７０で得られた（表１４を参照のこと）。産物は主ピークに関して８９．９%純粋であり、１つの単一テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ三量体を含んだ（表１５を参照のこと）。
【０２４４】
【表１６】
2013538205.tif 000026
【０２４５】
ｆ）２５%  ＤＰＰＣ／７５%  ＰＯＰＣ
脂質粒子形成を、以下のパラメーターを用いて、この実施例の項目ａ）〜ｃ）において報告される通りに従って行った：
タンパク質：３．８４mg/mlでのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、１サンプル当たり３mg
脂質化バッファー：２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ、１０mMメチオニン、ｐＨ７．５
脂質化：１８℃で
透析：室温で
テストしたモル比：５の工程における増加脂質を伴う１：６０〜１：１００。
【０２４６】
脂質粒子形成は容易で、純粋な脂質を使用したプロセスと同程度であった。全てのサンプルが、プロセス及び透析の間に透明なままであった。
【０２４７】
【表１７】
2013538205.tif 000027
【０２４８】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの脂質粒子形成のために２５%ＤＰＰＣ及び７５%ＰＯＰＣの脂質混合物を使用して、最も均質な産物がモル比１：６０で得られた（表１７を参照のこと）。産物は主ピークに関して９０．２%純粋であり、１つの単一テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ三量体を含んだ（表１５を参照のこと）。
【０２４９】
【表１８】
2013538205.tif 000028
【０２５０】
ｇ）Zwittergentを使用した脂質粒子形成
脂質粒子形成を、以下のパラメーターを用いて、この実施例の項目ａ）〜ｃ）において報告される通りに従って（コール酸が合成界面活性剤Zwittergentにより置換されたことを除く）行った：
タンパク質：２３．５mg/mlでのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ
バッファー：５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７．２ｍＭグアニジニウム塩酸塩、１０mMメチオニン、ｐＨ８
脂質化バッファー：２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５
１００%ＰＯＰＣ、モル比アポリポタンパク質：リン脂質＝１：６０
【０２５１】
【表１９】
2013538205.tif 000029
2013538205.tif 000030
【０２５２】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子が、未変性ＰＡＧＥで分析されている。脂質不含テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉが１４０kDaで移動するのに対し（図１９中のレーン１）、脂質粒子は２３２kDa〜４４０kDaの間のより高い分子量に特徴的なシフトを示す。
【０２５３】
脂質不含テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（しかし、脂質粒子ではない）が、それぞれの界面活性剤の０．１×ＣＭＣだけを用いて調製した全てのサンプルにおいて検出された（図１９、レーン２、８、１３、及び１９）。しかし、０．５×ＣＭＣの界面活性剤濃度が、Zwittergent 3-8及び３−１０がテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを伴う脂質粒子形成を可能するために十分であった（レーン３、９、及び１４）。Zwittergent  ３−１２を用いて、脂質粒子形成は、２．０×ＣＭＣの濃度に達するまで生じなかった（レーン２１）。
【０２５４】
図２０は、３×ＣＭＣ  Zwittergent 3-8及びＰＯＰＣ（モル比アポリポタンパク質：リン脂質＝１：６０）を使用した、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳクロマトグラムを示す。タンパク質コンジュゲート分析の結果を表１８にまとめている。脂質粒子分画は、ＳＥＣクロマトグラム中の２つの重なるピークにおいて表示される通り、２つの異なる種からなる。しかし、これら２つの種は非常に類似しているが、主に１粒子当たりのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ分子の数において区別される（ピーク１について４．２及びピーク２について３．５）。
【０２５５】
【表２０】
2013538205.tif 000031
【０２５６】
図２１は、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析のクロマトグラムを示し、表１９は、２×ＣＭＣ  Zwittergent 3-10及びＰＯＰＣ（モル比アポリポタンパク質：リン脂質＝１：６０）を使用したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子についてのタンパク質コンジュゲート分析の概要を示す。両方のピークは、それぞれ３．５及び５のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ分子を含む脂質粒子を含む。
【０２５７】
【表２１】
2013538205.tif 000032
【０２５８】
Zwittergent  ３−１２及びＰＯＰＣ（モル比アポリポタンパク質：リン脂質＝１：６０）を使用したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子形成の結果を、表２１にまとめる。脂質粒子分画は、ＳＥＣクロマトグラム中の２つの重なるピークにおいて表示される通り、２つの異なる種からなる。しかし、これら２つの種は非常に類似しているが、主に１粒子当たりのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ分子の数において区別される。
【０２５９】
【表２２】
2013538205.tif 000033
【０２６０】
コール酸及びＰＯＰＣ（モル比アポリポタンパク質：リン脂質＝１：６０）を使用したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子形成の結果を、表２１にまとめる。脂質粒子分画は、ＳＥＣクロマトグラム中の２つの重なるピークにおいて表示される通り、２つの異なる種からなる。しかし、これら２つの種は非常に類似しているが、主に１粒子当たりのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ分子の数において区別される。
【０２６１】
【表２３】
2013538205.tif 000034
【０２６２】
実施例５
リフォールディング及び脂質粒子形成のための迅速な希釈方法
ａ）ＰＯＰＣ及びコール酸ナトリウム
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−ＩをＥ．  ｃｏｌｉにおいて発現させ、実施例１〜３（プロトコル１）に従って精製した。精製後、バッファーを、ダイアフィルトレーションにより、２５０mM  Ｔｒｉｓ、１４０mM  ＮａＣｌ、６．７Mグアニジニウム塩酸塩（ｐＨ７．４）を含む溶液に交換した。タンパク質濃度を２８mg/mlに調整した。
【０２６３】
脂質ストック溶液は、１００mol/lのＰＯＰＣを、２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ、１３５mMコール酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を含むバッファー中に室温で溶解することにより調製した。脂質ストック溶液を２時間にわたり室温でインキュベートした。リフォールディングバッファーは、７７mlの脂質ストック混合物を１４７８mlの２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に希釈することにより調製した。このバッファーを、追加の７時間にわたり室温で撹拌した。
【０２６４】
リフォールディング及び脂質粒子形成は、２５０mM  Ｔｒｉｓ、１４０mM  ＮａＣｌ、６．７Mグアニジン塩酸塩（ｐＨ７．４）中の１６２mlのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉのリフォールディングバッファーへの添加により開始した。これは、グアニジニウム塩酸塩の１：１０希釈をもたらす。溶液を、一定で撹拌しながら、１６時間にわたり室温でインキュベートした。界面活性剤の除去を、ダイアフィルトレーションにより行った。
【０２６５】
【表２４】
2013538205.tif 000035
【０２６６】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−ＩをＥ．  ｃｏｌｉにおいて発現させ、実施例１〜３（プロトコル２）に従って精製した。精製後、バッファーを、ダイアフィルトレーションにより、５０mM  Ｔｒｉｓ、１０mM  Ｌ−メチオニン、６．７Mグアニジニウム塩酸塩（ｐＨ７．４）を含む溶液に交換した。タンパク質濃度を２０．４mg/mlに調整した。
【０２６７】
脂質ストック溶液は、１００mol/lのリン脂質（比率３：１のＰＯＰＣ：ＤＰＰＣ）を、２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ、１０mM  Ｌ−メチオニン、１３５mMコール酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を含むバッファー中に室温で溶解することにより調製した。リフォールディングバッファーは、３．７mlの脂質ストック溶液を３５．６mlの２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に希釈することにより調製した。このバッファーを、追加の２時間にわたり室温で撹拌した。
【０２６８】
リフォールディング及び脂質粒子形成は、５０mM  Ｔｒｉｓ、１０mM  Ｌ−メチオニン、６．７Mグアニジン塩酸塩（ｐＨ８．０）中の９．８mlのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉのリフォールディングバッファーへの添加により開始した。これは、グアニジニウム塩酸塩の１：５希釈をもたらす。溶液を、一定で撹拌しながら、室温で一晩インキュベートした。界面活性剤の除去を、ダイアフィルトレーションにより行った。
【０２６９】
【表２５】
2013538205.tif 000036
【０２７０】
ｂ）ＰＯＰＣ及びＤＰＰＣ及びコール酸ナトリウム
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−ＩをＥ．  ｃｏｌｉにおいて発現させ、実施例１〜３に従って精製した。精製後、バッファーを、ダイアフィルトレーションにより、２５０mM  Ｔｒｉｓ、１４０mM  ＮａＣｌ、６．７Mグアニジニウム塩酸塩（ｐＨ７．４）を含む溶液中に交換した。タンパク質濃度を３０mg/mlに調整した。
【０２７１】
２つの別々の脂質ストック溶液を調製した。溶液Ａは、１００mol/lのＰＯＰＣを、２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ、１３５mMコール酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を含むバッファー中に室温で溶解することにより調製した。溶液Ｂは、１００mol/lのＤＰＰＣを、２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ、１３５mMコール酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に４１℃で溶解することにより調製した。脂質ストック溶液Ａ及びＢは、比率３：１で混合し、２時間にわたり室温でインキュベートした。リフォールディングバッファーは、３８４mlの脂質ストック混合物を６３６５mlの２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に希釈することにより調製した。このバッファーを、追加の２４時間にわたり室温で撹拌した。
【０２７２】
リフォールディング及び脂質粒子形成は、２５０mM  Ｔｒｉｓ、１４０mM  ＮａＣｌ、６．７Ｍグアニジン塩酸塩（ｐＨ７．４）中の７５０mlのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉのリフォールディングバッファーへの添加により開始した。これは、グアニジニウム塩酸塩の１：１０希釈をもたらす。溶液を、一定で撹拌しながら、室温で少なくとも１２時間にわたりインキュベートした。界面活性剤の除去を、ダイアフィルトレーションにより行った。
【０２７３】
【表２６】
2013538205.tif 000037
【０２７４】
ｃ）異なるグアニジン塩酸塩濃度
本発明のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−ＩをＥ．  ｃｏｌｉにおいて発現させ、封入体から金属キレートアフィニティークロマトグラフィープロセスにわたり精製した（実施例１〜３を参照のこと）。精製後、バッファーを、ダイアフィルトレーションにより、２５０mM  Ｔｒｉｓ、１４０mM  ＮａＣｌ、６．７Mグアニジニウム塩酸塩（ｐＨ７．４）を含む溶液中に交換した。タンパク質濃度を２８mg/mlに調整した。
【０２７５】
脂質ストック溶液は、１００モル／ｌのＰＯＰＣを、２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ、１３５mMコール酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を含むバッファー中に室温で溶解することにより調製した。脂質ストック溶液を２時間にわたり室温でインキュベートした。リフォールディングバッファーは、脂質ストック溶液を２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に希釈することにより調製した。このバッファーを、追加の１２時間にわたり室温で撹拌した。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの変動量をリフォールディングバッファー：１：５、１：７．５、１：１０、１：１２．５中に希釈した。これは、リフォールディングバッファー中のグアニジニウム塩酸塩の異なる残留濃度をもたらす。溶液を室温で一晩撹拌させ、リフォールディング及び脂質粒子形成を開始した。界面活性剤の除去を、透析により行った。
【０２７６】
【表２７】
2013538205.tif 000038
【０２７７】
ｄ）尿素の存在におけるＰＯＰＣ及びコール酸ナトリウム
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−ＩをＥ．  ｃｏｌｉにおいて発現させ、実施例１〜３に従って精製した。精製後、バッファーを、ダイアフィルトレーションにより、２５０mM  Ｔｒｉｓ、１４０mM  ＮａＣｌ、６．７M尿素（ｐＨ７．４）を含む溶液に交換した。タンパク質濃度を２８mg/mlに調整する。
【０２７８】
脂質ストック溶液は、１００mol/lのＰＯＰＣを、２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ、１３５mMコール酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を含むバッファー中に室温で溶解することにより調製する。脂質ストック溶液を２時間にわたり室温でインキュベートする。リフォールディングバッファーは、７７mlの脂質ストック混合物を１４７８mlの２５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に希釈することにより調製する。このバッファーを、追加の７時間にわたり室温で撹拌する。
【０２７９】
リフォールディング及び脂質粒子形成は、２５０mM  Ｔｒｉｓ、１４０mM  ＮａＣｌ、６．７M尿素（ｐＨ７．４）中の１６２mlのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉのリフォールディングバッファーへの添加により開始する。これは、尿素の１：１０希釈をもたらす。溶液を、一定で撹拌しながら、１６時間にわたり室温でインキュベートした。界面活性剤の除去を、ダイアフィルトレーションにより行う。
【０２８０】
ｅ）ＰＯＰＣ及びコール酸ナトリウム及び野生型アポリポタンパク質Ａ−Ｉ
別の例示的な第２方法において、６．７Ｍグアニジン塩酸塩、５０mM  Ｔｒｉｓ、１０mMメチオニン（ｐＨ８．０）中のヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（野生型アポリポタンパク質Ａ−Ｉ）を脂質化バッファー中に１：５（ｖ／ｖ）希釈し、タンパク質濃度０．６mg/mlをもたらした。脂質化バッファーは、７mMコール酸、４mM  ＰＯＰＣ及び１．３mM  ＤＰＰＣからなり、脂質とタンパク質の比率２４０：１に相当した。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳを用いて、複合体形成を分析した。約２つのアポリポタンパク質分子が、約２００脂質分子からなる複合体中で見出された。
【０２８１】
【表２８】
2013538205.tif 000039
【０２８２】
実施例６
変性又は未変性タンパク質から開始する脂質粒子形成
実施例４において報告される方法（第１方法）は、脂質粒子形成のために未変性アポリポタンパク質を要求するのに対し、実施例５において報告される方法（第２方法）は、脂質粒子形成のために完全に変性したアポリポタンパク質を用いて開始する。
【０２８３】
例示的な第１方法において、６．７Mグアニジン塩酸塩、５０mM  Ｔｒｉｓ、１０mMメチオニン（ｐＨ８．０）中の変性テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを２５０mM  Ｔｒｉｓ、１４０mM  ＮａＣｌ、１０mMメチオニン（ｐＨ  ７．５）からなるバッファーに対してタンパク質濃度３．４６mg/mlでの広範に透析した。ＰＯＰＣ及びコール酸の混合物を次に加えて、溶液中の６mM  ＰＯＰＣ及び８mMコール酸の最終濃度をもたらした。これは、テトラネクチン−リポタンパク質Ａ−Ｉ単量体の１分子当たりＰＯＰＣの６０分子の比率（６０：１）に相当する。界面活性剤を、その後、ダイアフィルトレーションにより除去した。形成されたタンパク質脂質複合体の分析は、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによった。この方法を使用して、不均質な産物が形成されたのに対し、形成された種の約６０%は、３を上回るテトラネクチン−リポタンパク質Ａ−Ｉ単量体を含んだ。
【０２８４】
例示的な第２方法において、６．７Mグアニジン塩酸塩、５０mM  Ｔｒｉｓ、１０mMメチオニン（ｐＨ８．０）中の変性テトラネクチンアポリポタンパク質Ａ−Ｉを脂質化バッファー中に直接的に１：１０（ｖ／ｖ）希釈し、タンパク質濃度２．５mg/mlをもたらした。脂質化バッファーは、６mMコール酸及び４．５mM  ＰＯＰＣからなり、脂質とタンパク質の比率６０：１に相当した。この方法を使用して、均質な産物が、単一の形成種の９０%超を含んで形成されたのに対し、脂質の６０分子がテトラネクチンアポリポタンパク質Ａ−Ｉの１分子当たりに結合した（図２２を参照のこと）。
【０２８５】
【表２９】
2013538205.tif 000040
【０２８６】
実施例７
コール酸及びZwittergent可溶化ＰＯＰＣ／ＤＰＰＣを用いたインスリン−Ｆの脂質化
脂質粒子形成のために選ばれたタンパク質は、商業的に入手可能なインスリン（Humalog（登録商標）、Insulin Lispro、Lilly）である。タンパク質の分子量は５８０８Daである。脂質粒子中のインスリンについての検出限界を増加させるために、タンパク質を、ＮＨＳ−フルオレセイン（６−［フルオレセイン−５（６）−カルボキサミド］ヘキサン酸Ｎヒドロキシスクシンイミドエステル、Sigma Aldrich # 46940-5MG-F）を用いて標識している。
【０２８７】
ＮＨＳ−フルオレセイン標識インスリン（インスリン−Ｆ）のZwittergent及びコール酸媒介性脂質化を、実施例４において報告されている通りに、ＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの１：１混合物を使用して行った。０．５mM脂質混合物を、ＰＢＳ  ｐＨ  ７．４中の１×ＣＭＣコール酸、２×ＣＭＣ  Zwittergent 3-8、又は５×ＣＭＣ  Zwittergent 3-10のいずれかに溶解した。脂質の可溶化を、超音波浴中で、４５℃で１時間にわたり達成した。インスリン−Ｆを、１：２（Zwittergent 3-8）又は１：１．２（Zwittergent 3-10及びコール酸）のタンパク質：脂質のモル比で、可溶化脂質に加えた。脂質化混合物を１時間にわたり室温でインキュベートし、その後界面活性剤を除去するためのＰＢＳ  ｐＨ７．４に対する広範な透析をした。
【０２８８】
形成された脂質粒子及びコントロールサンプルを、蛍光検出（４９４nm  ｅｘｔ．、５２１nm  ｅｍ．）及びＵＶ２８０吸収を使用したＳＥ−ＨＰＬＣで分析した。１脂質化アプローチ当たり３つの異なるサンプルをＳＥ−ＨＰＬＣで分析した：ＰＢＳ中に溶解したインスリンＦ、ＰＢＳ中のインスリンＦを伴わないリポソーム、及びインスリンＦを含む脂質粒子。非脂質化インスリンＦが約４０分の溶出時間でカラムから溶出する。ピークを、蛍光及びＵＶ２８０検出により検出する。脂質化インスリンＦサンプルが、蛍光及びＵＶ２８０により検出される２つの別々のピークとしてカラムから溶出する。遅いピーク（約４０分で最高のピーク）が、インスリンＦコントロールサンプルと同時移動する。１５分の溶出時間での早いピークが、純粋なインスリンＦよりも高い分子量を有し、脂質化インスリンＦからなる。タンパク質不含の脂質粒子が１５分の溶出時間で溶出する。
【０２８９】
実施例８
アポリポタンパク質の適用
ａ）ＬＣＡＴ活性に対するＤＰＰＣ及びＰＯＰＣの影響
パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）のいずれか及び組換え野生型アポリポタンパク質Ａ−Ｉ又はテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉのいずれかを含む脂質粒子を、ＬＣＡＴによるコレステロールエステル化を支持するそれらの能力について検証した。
【０２９０】
トリチウム化コレステロール（４%；モルベースでのホスファチジルコリン含量と比べて）は、エタノールコレステロール溶液の添加により脂質粒子に取り込まれた。ＬＣＡＴ触媒コレステロールエステル化を支持する、得られたタンパク質−脂質複合体の能力を、１２５μl（１０mM  Ｔｒｉｓ、１５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＥＤＴＡ、１mM  ＮａＮ３；ｐＨ  ７．４；２mg/ml  ＨｕＦＡＦアルブミン；４mMベータメルカプトエタノール）中の０．２μg/ml組換えＬＣＡＴ酵素（ROAR biochemical）の存在下で１時間にわたり３７℃でテストした。反応をクロロホルム：メタノール（２：１）の添加により停止させ、脂質を抽出した。「パーセント」エステル化を、ＴＬＣ及びシンチレーション計数によるコレステロール−コレステリルエステル分離後に計算した。トレーサーの２０%未満が形成されたエステル中に取り込まれたため、反応速度は実験条件下で一定であると考えることができた。データを、XLfitソフトウェア（ＩＤＢＳ）を使用して、ミカエリスメンテン方程式に適合させた。結果の可視化については、図３を参照のこと。
【０２９１】
ｂ）ＬＣＡＴ活性に対するＤＰＰＣ／ＰＯＰＣの混合物の影響
脂質粒子を、界面活性剤としてコール酸を使用して、組換え野生型アポリポタンパク質Ａ−Ｉを３Ｈコレステロール、ＤＰＰＣ／ＰＯＰＣ混合物、及びコール酸と１：４：８０：１１３モル比で混合することにより調製した。ＤＰＰＣ／ＰＯＰＣ混合物は１００%  ＰＯＰＣ；７５%  ＰＯＰＣ；５０%  ＰＯＰＣ；２５%  ＰＯＰＣのいずれかを含んだ。
【０２９２】
透析によるコール酸除去後、ＬＣＡＴ触媒コレステロールエステル化を支持する、得られたタンパク質−脂質複合体の能力をテストした。３Ｈコレステロール（４%；モルベースでのホスファチジルコリン含量と比べて）は、エタノールコレステロール溶液の添加により脂質粒子に取り込まれた。ＬＣＡＴ触媒コレステロールエステル化を支持する、得られたタンパク質−脂質複合体の能力を、１２５μl（１０mM  Ｔｒｉｓ、１５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＥＤＴＡ、１mM  ＮａＮ３；ｐＨ  ７．４；２mg/ml  ＨｕＦＡＦアルブミン；４mMベータメルカプトエタノール）中の０．２μg/ml組換えＬＣＡＴ酵素（ROAR biochemical）の存在下で１時間にわたり３７℃でテストした。反応をクロロホルム：メタノール（２：１）の添加により停止させ、脂質を抽出した。「パーセント」エステル化を、ＴＬＣ及びシンチレーション計数によるコレステロール−コレステリルエステル分離後に計算した。トレーサーの２０%未満がエステル中に取り込まれたため、反応速度は実験条件において一定であると考えることができた。データを、XLfitソフトウェア（ＩＤＢＳ）を使用して、ミカエリスメンテン方程式に適合させた（図４に示す）。
【０２９３】
【表３０】
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【０２９４】
ｃ）ＴＨＰ−１由来泡沫細胞へのコレステロール排出
マクロファージ様ヒトＴＨＰ−１細胞を、ＴＨＰ−１単球性白血病細胞をホルボールミリスチン酸アセテートに露出させることにより得た。その後、細胞を、３Ｈコレステロールトレーサーを含むアセチル化ＬＤＬの存在下でのさらなる培養により添加した。これらのモデル泡沫細胞を、次に、４〜８時間にわたりコレステロールアクセプターテスト化合物に暴露した（下を参照のこと）。
【０２９５】
細胞培養上清を収集し、細胞を５%ＮＰ４０中に溶解した。分画排出を、細胞プラス上清中の放射活性の合計と比べた、上清中のコレステロール放射活性の比率として計算した。アクセプターを含まない培地に曝露された細胞からの排出を減算し、排出速度を線形近似により計算した。排出速度を、細胞からの排出を使用して、参照としての１０μｇ/ml野生型アポリポタンパク質Ａ−Ｉに対して標準化した（相対排出速度）。２つの別々の実験において得られた相対的排出速度を、コレステロールアクセプター濃度の関数としてプロットし、データをミカエリスメンテン方程式に適合した。
【０２９６】
並列実験を、ＡＢＣＡ−１トランスポーターを上方調節し、コレステロール輸送をＡＢＣＡ−１媒介性排出に向けて偏らせることが公知であるＲＸＲ−ＬＸＲアゴニストに曝露された細胞を使用して実施した。
【０２９７】
脂質混合物の適度な影響だけが、テストシリーズにおいて観察された（図５及び表２９）。
【０２９８】
【表３１】
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泡沫細胞のＲＸＲ−ＬＸＲ予備処置により、処置していない細胞を超える最大速度の６倍増で、非脂質化材料への排出が強く増大した。脂質粒子に対するインパクトはずっと少なく、２倍増で、コレステロール排出に対するＡＢＣＡ−１トランスポーターの貢献が低いことを示した（図６）。
【０２９９】
ｄ）インビボ試験
５つの脂質粒子のバリアント：
ｉ）ＰＯＰＣのみ
ii）ＤＰＰＣのみ
iii）ＰＯＰＣ：ＤＰＰＣ  ３：１
iv）ＰＯＰＣ：ＤＰＰＣ  １：１
ｖ）ＤＰＰＣ：ＳＭ  ９：１
を研究した。
ウサギに０．５時間わたり８０mg/kgで静脈内注入し（ｎ＝３ウサギ／テスト化合物）、その後注入後９６時間にわたる連続血液サンプリングをした。
【０３００】
ＥＬＩＳＡを用いたアポリポタンパク質レベルの分析：
−  薬物レベル
−  肝臓酵素、コレステロール、コレステロールエステルの血漿値に関するデータ。
【０３０１】
血漿中濃度は、全てのテストされた組成物について非常に類似しており、少し顕著な初期「分布」相、それに続く濃度の対数線形下落を示す（図７、表３）。
【０３０２】
【表３２】
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【０３０３】
決定された薬物動態（ＰＫ）パラメーターは、全てのテストされた化合物について類似していた。また、低い個体間変動が見出されている。決定された半減期は１．５日近くであり、即ち、野生型アポリポタンパク質Ａ−Ｉと比較して増加した。分布の容積は血漿容積に類似している（ウサギにおける約４０ml/kg）。
【０３０４】
ｆ）コレステロール動員
コレステロールが血漿中に動員され、エステル化される。血漿コレステリルエステルレベルは、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉが既に減少している後でさえ、増加し続ける。血漿テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉレベルが０．５mg/mlまで減少している場合（通常の野生型アポリポタンパク質Ａ−Ｉの約５０%）、増加したコレステロールエステルレベルが依然として検出可能である（図８）。
【０３０５】
ｇ）肝臓酵素放出
ＰＯＰＣを含むテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む脂質粒子は、肝臓酵素放出を誘導しない（図１）。ウサギと類似して、ＰＯＰＣ又はＰＯＰＣ／ＤＰＰＣ混合物を含む、本発明に従ったテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの単一静脈内注射はマウスにおいて安全である。ＤＰＰＣ：ＰＯＰＣをモル比１：３で含むアポリポタンパク質組成物は、ＰＯＰＣ単独と同程度であった（図９）。
【０３０６】
有意な溶血は、５つの調製物のいずれにおいても注入から２時間後まで観察されなかった。溶血を、テトラネクチンアポリポタンパク質Ａ−Ｉの静脈内適用後２時間目に得られた血漿サンプル中の赤色として測光法で決定した。全血の１００%溶血（０．４４%Triton X-100最終濃度により生成される）を較正のために使用した（図１０）。
【０３０７】
ｈ）ヒト臍帯静脈内皮細胞に対するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの抗炎症効果
継代５〜１０のＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を、それぞれのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ調製物中で１６時間にわたりインキュベートし、ＴＮＦαを用いて最後の４時間にわたり刺激した。ＶＣＡＭ１表面発現を、特異的な抗体を用いて、ＦＡＣＳにより検出した。
【０３０８】
実施例９
脂質粒子の安定性
Ｎ末端ヒスチジンタグ及びＩｇＡプロテアーゼ切断部位を含む野生型アポリポタンパク質Ａ−ＩをＥ．  ｃｏｌｉにおいて発現させ、上の実施例において報告される通りにカラムクロマトグラフィーにより精製した。ヒスチジンタグをＩｇＡプロテアーゼ切断により除去した。脂質粒子（ＨＤＬ粒子）を、タンパク質とLipoid S100大豆リン脂質混合物の１：１５０比率を使用して組み立てた。粒子を、５mMリン酸ナトリウム及び１%スクロースを含むバッファー中で、ｐＨ値７．３で保存した。ＳＥ−ＨＰＬＣは、１０日間にわたる脂質化及びインキュベーション後のインキュベーション時に３つの明確なピークを明らかにした。４０℃でのインキュベーション後、保持時間１０．８分での主要なピークを検出することができ（全タンパク質の４７%）、それは、５℃で保存されたサンプル中には存在しない。１０．８分のピークは、タンパク質の不安定化に起因する、可溶性の大きな分子量の集合体の形成を示す。
【０３０９】
ＰＯＰＣ：ＤＰＰＣ混合物（ＰＯＰＣとＤＰＰＣ比率３：１）から出発して得られた、本明細書において報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含むＨＤＬ粒子を、また、５℃及び４０℃でインキュベートした。上昇温度でのインキュベーションは、わずかな程度の前ピーク形成に導いたが、しかし、１０．８分での高分子量集合体への有意なシフトはなかった（１１分で＜２%増加）。これは、野生型アポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む粒子と比較して、改善されたＨＤＬ粒子の安定性を示す。
【０３１０】
実施例１０
コレステロール動員
コレステロールが血液中に動員される効率は、インビボでのアポリポタンパク質の投与後、総コレステロールのそれぞれの可動域をアポリポタンパク質濃度と比較することにより決定することができる。定量的評価のために、ベースライン補正された総コレステロールの濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）とアポリポタンパク質の濃度−時間曲線下面積の商を計算した。
【０３１１】
この実験において、以下の物質：
−  Ｎ末端ヒスチジンタグ及びＩｇＡプロテアーゼ切断部位を含む野生型アポリポタンパク質Ａ−ＩをＥ．  ｃｏｌｉにおいて発現させ、上の実施例において報告される通りにカラムクロマトグラフィーにより精製した；ヒスチジンタグをＩｇＡプロテアーゼ切断により除去した；脂質粒子（ＨＤＬ粒子）を、タンパク質とLipoid S100大豆リン脂質混合物の１：１５０比率を使用して組み立てた
−  アポリポタンパク質Ａ−Ｉ  Ｍｉｌａｎｏバリアント；脂質粒子（ＨＤＬ粒子）を、タンパク質とＰＯＰＣの１：４０比率を使用して組み立てた
−  本明細書において報告されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；脂質粒子（ＨＤＬ粒子）を、タンパク質とＰＯＰＣ及びＤＰＰＣの１：６０比率（比率３：１でのＰＯＰＣ及びＤＰＰＣ）を使用して組み立てた
を分析した。
【０３１２】
３つのＨＤＬ粒子をラットに適用した。それぞれのＡＵＣ比率について得られた値を表３０に示す。
【０３１３】
【表３３】
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【図２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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