(57)【要約】  本発明は、操作されたヘテロ多量体タンパク質に、さらに具体的には、二重特異的抗体および免疫グロブリン様ヒンジ配列を含む他のヘテロ二量体タンパク質などのヘテロ二量体タンパク質を生産および精製するための方法に関する。このような操作されたヘテロ二量体タンパク質を生産および精製するための方法、ならびに診断および治療におけるそれらの使用もまた提供される。【図１】2013529084.tif 000011
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
共に相互作用して二量体ヒンジ境界を形成する第１の免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドおよび第２の免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドを含むヒンジ領域
を含むヘテロ二量体タンパク質であって、ヒンジ境界内の１つまたは複数の荷電アミノ酸の間の静電気的相互作用が、２つの第１のヒンジポリペプチド間または２つの第２のヒンジポリペプチド間の相互作用よりも第１のヒンジポリペプチドと第２のヒンジポリペプチドとの間の相互作用に有利であり、それによってホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成を促進する、ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２】
ヒンジ領域がＩｇＧヒンジ領域である、請求項１に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項３】
第１のヒンジポリペプチドが、野生型ＩｇＧヒンジ領域において少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むものであり、野生型アミノ酸が、第２のヒンジポリペプチドにおける対応するアミノ酸と逆の電荷を有するアミノ酸で置き換えられている、請求項２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項４】
第１のヒンジポリペプチドが、野生型ヒンジ領域において少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むものであり、第２のヒンジポリペプチドが、第１のヒンジポリペプチドにおけるアミノ酸修飾と同一の位置で、野生型ＩｇＧヒンジ領域において少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むものであり、第２のヒンジポリペプチドにおける野生型アミノ酸が、第１のヒンジポリペプチドにおける対応するアミノ酸と逆の電荷を有するアミノ酸で置き換えられている、請求項２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項５】
アミノ酸修飾が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、およびＧｌｕからなる群から選択される、請求項３または４に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項６】
ＩｇＧヒンジ領域がヒトＩｇＧヒンジ領域を含む、請求項３または４に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項７】
ヒトＩｇＧヒンジ領域がヒトＩｇＧ１ヒンジ領域を含む、請求項６に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項８】
第１のヒンジポリペプチドにおけるアミノ酸修飾が、２２１および２２８からなる群から選択される位置にある、請求項７に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項９】
第１のヒンジポリペプチドに融合した第１のＣＨ３ポリペプチドおよび第２のヒンジポリペプチドに融合した第２のＣＨ３ポリペプチドを含む免疫グロブリン様ＣＨ３領域をさらに含み、第１のＣＨ３ポリペプチドおよび第２のＣＨ３ポリペプチドが共に相互作用してＣＨ３境界を形成し、ＣＨ３境界内の１つまたは複数のアミノ酸が、ホモ二量体の形成を不安定化させ、かつホモ二量体の形成にとって静電気的に不利ではない、請求項７に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１０】
第１のＣＨ３ポリペプチドが、野生型ＩｇＧ１のＣＨ３領域配列において少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むものである、請求項９に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１１】
アミノ酸修飾が、３４９、３６８、４０５、および４０９からなる群から選択される位置にある、請求項１０に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１２】
アミノ酸修飾がＫ４０９Ｒである、請求項１１に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１３】
第２のＣＨ３ポリペプチドが、野生型ＩｇＧ１のＣＨ３領域配列において少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むものである、請求項９に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１４】
第１のヒンジポリペプチドが、Ａｒｇ２２１またはＧｌｕ２２１およびＡｒｇ２２８またはＧｌｕ２２８を含み、第１のＣＨ３ポリペプチドが、Ｇｌｕ３６８またはＡｒｇ４０９を含み、第２のヒンジポリペプチドが、Ａｒｇ２２１またはＧｌｕ２２１およびＡｒｇ２２８またはＧｌｕ２２８を含み、第２のＣＨ３ポリペプチドが、Ｇｌｕ３６８またはＡｒｇ４０９を含み、第１のヒンジポリペプチドの２２１位および２２８位、ならびに第１のＣＨ３ポリペプチドの３６８位および４０９位のアミノ酸が、第２のヒンジポリペプチドおよびＣＨ３ポリペプチドにおける対応するアミノ酸と同一ではない、
請求項１３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１５】
ヒトＩｇＧヒンジ領域がヒトＩｇＧ２ヒンジ領域を含む、請求項６に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１６】
第１のヒンジポリペプチドにおけるアミノ酸修飾が、２２３、２２５、および２２８からなる群から選択される位置にある、請求項１５に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１７】
第１のヒンジポリペプチドに融合した第１のＣＨ３ポリペプチドおよび第２のヒンジポリペプチドに融合した第２のＣＨ３ポリペプチドを含む免疫グロブリン様ＣＨ３領域をさらに含み、ＣＨ３境界内の１つまたは複数のアミノ酸が、ホモ二量体の形成を不安定化させ、かつホモ二量体の形成にとって静電気的に不利ではない、請求項１５に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１８】
第１のＣＨ３ポリペプチドが、野生型ＩｇＧ２のＣＨ３領域配列において少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むものである、請求項１７に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項１９】
アミノ酸修飾が、３６８および４０９からなる群から選択される位置にある、請求項１８に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２０】
第１のヒンジポリペプチドが、Ａｒｇ２２３またはＧｌｕ２２３、Ａｒｇ２２５またはＧｌｕ２２５、およびＡｒｇ２２８またはＧｌｕ２２８を含み、第１のＣＨ３ポリペプチドが、Ａｒｇ４０９またはＧｌｕ３６８を含み、第２のヒンジポリペプチドが、Ａｒｇ２２３またはＧｌｕ２２３、Ａｒｇ２２５またはＧｌｕ２２５、およびＡｒｇ２２８またはＧｌｕ２２８を含み、第２のＣＨ３ポリペプチドが、Ａｒｇ４０９またはＧｌｕ３６８を含み、第１のヒンジポリペプチドの２２３位、２２５位、および２２８位、ならびに第１のＣＨ３ポリペプチドの３６８位および４０９位のアミノ酸が、第２のヒンジポリペプチドおよびＣＨ３ポリペプチドにおける対応するアミノ酸と同一ではない、
請求項１９に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２１】
ヒトＩｇＧヒンジ領域がヒトＩｇＧ４ヒンジ領域を含む、請求項６に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２２】
第１のヒンジポリペプチドにおけるアミノ酸修飾が２２８位にある、請求項２１に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２３】
第１のヒンジポリペプチドが、Ｌｙｓ２２８またはＡｒｇ２２８を含み、第２のヒンジポリペプチドが、Ａｓｐ２２８またはＧｌｕ２２８を含む、請求項２２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２４】
ヒンジ領域が、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭヒンジ領域である、請求項１に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２５】
１つまたは複数の抗体重鎖を含む、請求項１に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２６】
１つまたは複数の抗体軽鎖をさらに含む、請求項２５に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２７】
抗体、マキシボディ、モノボディ、ペプチボディ、およびＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２８】
単一特異的な一価の、二重特異的な一価の、または二重特異的な二価の抗体である、請求項２７に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２９】
共に相互作用してＣＨ３境界を形成する第１のＣＨ３ポリペプチドおよび分離した第２のＣＨ３ポリペプチドを含む免疫グロブリン様ＣＨ３領域を含むヘテロ二量体タンパク質であって、ＣＨ３境界内の１つまたは複数のアミノ酸が、ホモ二量体の形成を不安定化させ、かつホモ二量体の形成にとって静電気的に不利ではなく、第１のＣＨ３ポリペプチドが、野生型ＣＨ３領域配列に対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項３０】
免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドを含むポリペプチドであって、ヒンジポリペプチドが、野生型免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドにおいて少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むものであり、野生型免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドを含むポリペプチドと比較して、第２のポリペプチドとヘテロ二量体タンパク質を形成する能力が増大している、ポリペプチド。
【請求項３１】
アミノ酸修飾が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、およびＧｌｕからなる群から選択される、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
ヒンジポリペプチドがＩｇＧヒンジポリペプチドを含む、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
ＩｇＧヒンジポリペプチドがヒトＩｇＧヒンジポリペプチドを含む、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
ヒトＩｇＧヒンジポリペプチドがヒトＩｇＧ１ヒンジポリペプチドを含む、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
ヒンジポリペプチドにおけるアミノ酸修飾が、２２１および２２８からなる群から選択される位置にある、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
免疫グロブリン様ＣＨ３ポリペプチドをさらに含み、ＣＨ３ポリペプチドが、野生型ＣＨ３ポリペプチドにおいて少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むものであり、野生型ＣＨ３ポリペプチドを含むポリペプチドと比較して、第２のポリペプチドとヘテロ二量体タンパク質を形成する能力が増大している、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
ＣＨ３ポリペプチドがヒトＩｇＧ１のＣＨ３ポリペプチドを含む、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
ＣＨ３ポリペプチドにおけるアミノ酸修飾が、３４９、３６８、４０５、および４０９からなる群から選択される位置にある、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
ヒトＩｇＧヒンジポリペプチドがヒトＩｇＧ２ヒンジポリペプチドを含む、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
ヒンジポリペプチドにおけるアミノ酸修飾が、２２３、２２５、および２２８からなる群から選択される位置にある、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
免疫グロブリン様ＣＨ３ポリペプチドをさらに含み、ＣＨ３ポリペプチドが、野生型ＣＨ３ポリペプチドにおいて少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むものであり、野生型ＣＨ３ポリペプチドを含むポリペプチドと比較して、第２のポリペプチドとヘテロ二量体タンパク質を形成する能力が増大している、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
アミノ酸修飾が、３６８および４０９からなる群から選択される位置にある、請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
ヒトＩｇＧヒンジポリペプチドがヒトＩｇＧ４ヒンジポリペプチドを含む、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
ヒンジポリペプチドにおけるアミノ酸修飾が２２８位にある、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
ヒンジポリペプチドが、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭヒンジポリペプチドである、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
請求項３０〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む抗体。
【請求項４７】
請求項３０〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４８】
請求項４７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４９】
請求項４７に記載の核酸または請求項４８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５０】
請求項３０〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチドを生産するための方法であって、１つまたは複数のアミノ酸修飾を、野生型免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドを含むポリペプチドに導入するステップを含み、前記アミノ酸修飾がヒンジポリペプチド内に導入され、前記ポリペプチドが、野生型免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドを含むポリペプチドと比較して、第２のポリペプチドとヘテロ二量体タンパク質を形成する能力が増大している、方法。
【請求項５１】
請求項３０〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチドを生産するための方法であって、１つまたは複数のアミノ酸修飾を、野生型免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドおよび野生型免疫グロブリン様ＣＨ３ポリペプチドを含むポリペプチドに導入するステップを含み、前記アミノ酸修飾が、ヒンジポリペプチドおよびＣＨ３ポリペプチド内に導入され、前記ポリペプチドが、野生型免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドおよび野生型免疫グロブリン様ＣＨ３ポリペプチドを含むポリペプチドと比較して、第２のポリペプチドとヘテロ二量体タンパク質を形成する能力が増大している、方法。
【請求項５２】
請求項４９に記載の宿主細胞を培養するステップ、および任意選択で、ポリペプチドを回収するステップを含む、請求項３０〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチドを生産するための方法。
【請求項５３】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質または請求項３０〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する細胞系。
【請求項５４】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質または請求項３０〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項５５】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質または請求項３０〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび担体を含む医薬組成物。
【請求項５６】
効果的な量の請求項５５に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象における状態、障害、または疾患を治療する方法。
【請求項５７】
ヘテロ二量体タンパク質を生産する方法であって、ヘテロ二量体タンパク質が、免疫グロブリン様ヒンジ領域を含む第１のポリペプチドおよび免疫グロブリン様ヒンジ領域を含む第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドのヒンジ領域および第２のポリペプチドのヒンジ領域が、共に相互作用してヒンジ境界を形成し、ヒンジ境界内の１つまたは複数の荷電アミノ酸が、ホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に静電気的に有利であり、
ａ）第１のポリペプチドをコードする核酸および第２のポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養するステップであって、培養された宿主細胞が第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを発現するステップ、および
ｂ）任意選択で、宿主細胞培養物からヘテロ二量体タンパク質を回収するステップ
を含む方法。
【請求項５８】
ヘテロ二量体タンパク質を生産する方法であって、ヘテロ二量体タンパク質が、免疫グロブリン様ヒンジ領域を含む第１のポリペプチドおよび免疫グロブリン様ヒンジ領域を含む第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドのヒンジ領域および第２のポリペプチドのヒンジ領域が、共に相互作用して、ヘテロ二量体の形成を促進するように操作されたヒンジ境界を形成し、ヒンジ境界内の１つまたは複数の荷電アミノ酸が、ホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に静電気的に有利であり、
ａ）第１の宿主細胞において第１のポリペプチドを発現させるステップ、
ｂ）第２の宿主細胞において第２のポリペプチドを発現させるステップ、
ｃ）任意選択で、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを単離するステップ、および
ｄ）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを、二量体化に適した条件下でインキュベートして、ヘテロ二量体タンパク質を生産するステップ
を含む方法。
【請求項５９】
ステップｄ）の条件が、ステップｃ）の２つのポリペプチドを還元剤とインキュベートすることである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
還元剤がグルタチオンである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
精製ステップをさらに含み、ヘテロ二量体タンパク質がクロマトグラフィーによって精製される、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６２】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質を精製する方法であって、精製がクロマトグラフィーステップを含む、方法。
【請求項６３】
免疫グロブリン様ＣＨ３領域を含むヘテロ二量体タンパク質を精製する方法であって、ＣＨ３領域が、共に相互作用してＣＨ３境界を形成する第１のＣＨ３ポリペプチドおよび第２のＣＨ３ポリペプチドを含み、ＣＨ３境界内の１つまたは複数の荷電アミノ酸の間の静電気的相互作用が、ホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に有利であり、精製がイオン交換クロマトグラフィーステップのステップからなる、方法。
【請求項６４】
免疫グロブリン様Ｆｃ領域を含むヘテロ二量体タンパク質を精製する方法であって、Ｆｃ領域が、共に相互作用してＦｃ境界を形成する第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドを含み、Ｆｃ境界内の１つまたは複数の荷電アミノ酸の間の静電気的相互作用が、ホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に有利であり、精製がクロマトグラフィーステップを含む、方法。
【請求項６５】
免疫グロブリン様ヒンジ領域を含むヘテロ二量体タンパク質を精製する方法であって、ヒンジ領域が、共に相互作用してヒンジ境界を形成する第１のヒンジポリペプチドおよび第２のヒンジポリペプチドを含み、ヒンジ境界内の１つまたは複数の荷電アミノ酸の間の静電気的相互作用が、ホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に有利であり、精製がクロマトグラフィーステップを含む、方法。
【請求項６６】
免疫グロブリン様Ｆｃ領域を含むヘテロ二量体タンパク質を精製する方法であって、精製が、Ｆｃ領域における静電気的相互作用の違いに基づく少なくとも１つのステップを含む、方法。
【請求項６７】
免疫グロブリン様ヒンジ領域を含むヘテロ二量体タンパク質を精製する方法であって、精製が、ヒンジ領域における静電気的相互作用の違いに基づく少なくとも１つのステップを含む、方法。
【請求項６８】
免疫グロブリン様定常領域を含むヘテロ二量体タンパク質を精製する方法であって、精製が、定常領域における静電気的相互作用の違いに基づく少なくとも１つのステップを含む、方法。
【請求項６９】
定常領域が重鎖定常領域である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
定常領域がＣＨ２領域またはＣＨ３領域である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
クロマトグラフィーステップがイオン交換クロマトグラフィーである、請求項６１〜６２および６４〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
完全長ヒト抗体であり、ヘテロ二量体タンパク質の第１の抗体可変ドメインが、ヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原に特異的に結合することによってヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することができ、ヘテロ二量体タンパク質の第２の抗体可変ドメインが、標的抗原に特異的に結合することができる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１０年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／３４５，０４７号および２０１１年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／４８５，０９７号の利益を主張するものであり、これらは両方とも、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、操作されたヘテロ多量体タンパク質に、さらに具体的には、二重特異的抗体および免疫グロブリン様ヒンジ配列を含む他のヘテロ二量体タンパク質などのヘテロ二量体タンパク質を生産および精製するための方法に関する。このような操作されたヘテロ二量体タンパク質を生産および精製するための方法、ならびに診断および治療におけるそれらの使用もまた提供される。
【背景技術】
【０００３】
抗体は、それにより治療分子として有用となる様々な特性を有する。高い特異性および選択性で細胞の内側または外側の分子標的に高い親和性で結合する能力に加えて、抗体は、その標的化された結合パートナーを、相補体誘導性経路およびＡＤＣＣ（抗体依存的細胞介在性細胞傷害性）に関連する活性などのエフェクター機能を介する、Ｆｃ受容体細胞介在性の食作用および死滅作用の影響を受けやすくさせる。
【０００４】
さらに、抗体は、様々な手段で操作して、その治療的有用性をさらに増大させることができる。延長されたインビボでの半減期を有する抗体は、例えば、Ｆｃ融合分子を操作することによって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生体適合性ポリマーで処理することによって、すなわち「ペグ化」によって、および当技術分野においてよく知られている他の操作方法によって、生産することができる。二重特異的抗体（ＢｓＡｂ）と呼ばれる、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体もまた、操作されている。Ｎｏｌａｎ，Ｏ．およびＲ．Ｏ’Ｋｅｎｎｅｄｙ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １０４０（１）：１〜１  １．；ｄｅ  Ｌｅｉｊ，Ｌ．ら、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ３１（１〜２）：１０５〜１２９（１９９８）；ならびにＣａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１〜２）：７〜１５（２００１）を参照されたい。従来の抗体は、Ｙ型分子の２つのアーム（Ｆａｂ領域の抗原結合部位を含む）のそれぞれにおいて同一の配列を有するが、二重特異的抗体は、２つのＦａｂ領域のそれぞれにおいて異なる配列を有し、その結果、Ｙ型分子のそれぞれのアームは、異なる抗原またはエピトープに結合する。
【０００５】
２つの異なる抗原性分子または異なるエピトープに結合することができることによって、ＢｓＡｂには、インビトロおよびインビボでの診断および免疫療法のための標的化物質としての広範な臨床用途がある。診断分野では、ＢｓＡｂは、例えば、細胞表面分子の機能的特性、異なるＦｃ受容体および細胞傷害性を仲介するその能力を研究するため（Ｆａｎｇｅｒら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１０１〜１２４（１９９２）；Ｎｏｌａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０４０：１〜１１（１９９０））、ならびに酵素および他の作用物質を固定して免疫診断および免疫アッセイの試薬および方法を得るために用いられている。
【０００６】
二重特異的抗体はまた、癌を含む様々な病状をインビトロまたはインビボで診断するために用いることができる（Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５（１９９０））。例えば、ＢｓＡｂの一方のアームは、腫瘍関連抗原に結合するように操作することができ、他方のアームは、検出可能なマーカーに結合するように操作することができる。例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合した一方のアームとＤＰＴＡに結合したもう一方のアームとを有するＢｓＡｂが、結腸直腸癌および甲状腺癌の放射免疫検出のために用いられた、Ｌｅ  Ｄｏｕｓｓａｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３４：１６６２〜１６７１（１９９３）を参照されたい。また、放射免疫検出によってＣＥＡを発現している結腸直腸癌を検出するための戦略を記載している、Ｓｔｉｃｋｎｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６６５０〜６６５５（１９９１）も参照されたい。
【０００７】
癌の免疫療法のための二重特異的抗体の使用は概説されている（例えば、上記のＮｏｌａｎおよびＯ’Ｋｅｎｎｅｄｙ  １９９０；上記のｄｅ  Ｌｅｉｊら（１９９８）；ならびに上記のＣａｒｔｅｒ，Ｐ．（２００１）を参照されたい）。ＢｓＡｂは、患者の細胞免疫防御機構を、腫瘍細胞または感染性病原体（例えば、ＨＩＶウイルスまたはインフルエンザウイルスなどのウイルスに感染した細胞；トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）などの原生動物）に特異的に向けるために用いることができる。特に、免疫調節された細胞傷害性を、ＢｓＡｂの一方のアームを望ましい標的（例えば、腫瘍細胞または病原体）に結合するように操作し、ＢｓＡｂの他方のアームをＴ細胞受容体またはＦｃガンマ受容体などの細胞傷害性誘発分子に結合するように操作する（それによって、下流の免疫エフェクター経路を活性化する）ことによって、向け直すことができる。この戦略を用いて、ＦｃガンマＲＩＩＩに結合するＢｓＡｂは、インビトロでナチュラルキラー（ＮＫ）細胞／大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）細胞による腫瘍細胞死滅作用を仲介し、インビボで腫瘍の成長を阻害することが示されている（例えば、Ｓｅｇａｌら、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：１７９（１９８９）；Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ２（４）ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９２）ｐ．１．を参照されたい）。別の例において、ＦｃガンマＲＩＩＩに結合する一方のアームとＨＥＲ２受容体に結合するもう一方のアームとを有する二重特異的抗体が、ＨＥＲ２抗原を過剰発現する腫瘍を治療するために開発された（Ｈｓｅｉｈ−Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：６８３２〜６８３９（１９９２）；およびＷｅｉｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：９４〜１００（１９９３））。また、抗ｐ１８５（ＨＥＲ２）に結合した抗ＣＤ３を含む完全にヒト化されたＦ（ａｂ’）２ＢｓＡｂを用いてＴ細胞を標的化して、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する腫瘍細胞を死滅させた、Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５（１）：２１７（１９９２）も参照されたい。
【０００８】
二重特異的抗体の使用は、十分な量および純度でＢｓＡｂを得ることが困難であることによって遅れている。従来、ＢｓＡｂは、ハイブリッドハイブリドーマ技術を用いて作製された（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７〜５３９（１９８３））。化学結合によってＢｓＡｂを作製するための方法がその後記載されている（例えば、Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７〜２２５（１９９２）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｓｕｐｐｌ．）７：４５〜５０（１９９２）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７〜１５５３（１９９２）を参照されたい）。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８（１９９３）によって記載されたダイアボディ技術は、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を利用して（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）、ＢｓＡｂ断片を作製するための別の手順を提供している。
【０００９】
多重特異的（例えば二重特異的）抗体のヘテロ多量体（例えばヘテロ二量体）を生産するために、ホモ多量体よりも所望のヘテロ多量体の形成に有利な方法を用いることが望ましい。Ｆｃを含有するＢｓＡｂを得るための１つの方法は、依然として、２つの抗体が共発現するハイブリッドハイブリドーマ技術である（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７〜５４０（１９８３）；Ｓｕｒｅｓｈ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １２１：２１０〜２２８（１９８６）を参照されたい）。しかし、これは収率および純度に関して不十分であることが多く、所望のヘテロ多量体はさらに精製することが困難であることが多い。ヘテロ多量体の形成に有利な他の技術が記載されており、これは、「ノブイントゥーホール」戦略と呼ばれる、ＣＨ３ドメイン境界にある多量体化ドメインにおける立体的に相補的な突然変異の操作を伴う（例えば、Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：６１７〜６２１（１９９６）；Ｍｅｒｃｈａｎｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（７）：６７７〜８１（１９９８）を参照されたい；また、米国特許第５，７３１，１６８号および米国特許第７，１８３，０７６号も参照されたい）。両ＣＨ３ドメインにおけるＣＨ３−ＣＨ３境界を形成する１つまたは複数の残基を荷電アミノ酸で置き換えて、ヘテロ二量体の形成を促進することを伴う技術もまた、記載されている。ＷＯ２００９／０８９００４。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
組換え細胞培養物からのＢｓＡｂの直接的もしくは効率的な発現および回収を可能にする、かつ／または効率的な収率および純度で生産され得る、または当技術分野における二重特異的抗体と比較して増大した安定性を有するものなどの、二重特異的抗体断片および／または完全長のＢｓＡｂを操作するための新たな方法を見出すことが望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様において、本発明は、ヒンジ領域を含むヘテロ多量体（例えばヘテロ二量体）タンパク質を提供し、ここで、ヒンジ領域は、共に相互作用して二量体ヒンジ境界を形成する第１の免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドおよび第２の免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドを含み、ヒンジ境界内の１つまたは複数の荷電アミノ酸の間の静電気的相互作用は、２つの第１のヒンジポリペプチドの間または２つの第２のヒンジポリペプチドの間の相互作用よりも第１のヒンジポリペプチドと第２のヒンジポリペプチドとの間の相互作用に有利であり、それによってホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成を促進する。一部の実施形態において、ヒンジ領域は、ＩｇＧヒンジ領域である。一部の実施形態において、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＩｇＧ２ヒンジ領域、ＩｇＧ３ヒンジ領域、またはＩｇＧ４ヒンジ領域である。一部の実施形態において、ＩｇＧヒンジ領域は、ヒトＩｇＧヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ＩｇＧ２ヒンジ領域、ＩｇＧ３ヒンジ領域、またはＩｇＧ４ヒンジ領域）を含む。
【００１２】
一部の実施形態において、第１のヒンジポリペプチドは、野生型（ＷＴ）ヒンジ領域（例えばＩｇＧヒンジ領域）に対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、ここで、野生型アミノ酸は、第２のヒンジポリペプチドにおける対応するアミノ酸と逆の電荷を有するアミノ酸で置き換えられている。
【００１３】
一部の実施形態において、第１のヒンジポリペプチドは、野生型ヒンジ領域（例えばＩｇＧヒンジ領域）において少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むものであり、第２のヒンジポリペプチドは、第１のヒンジポリペプチドにおけるアミノ酸修飾に近接しているかまたはそれと同一の位置で、野生型ヒンジ領域（例えばＩｇＧヒンジ領域）において少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むものであり、ここで、第２のヒンジポリペプチドにおける野生型アミノ酸は、第１のヒンジポリペプチドにおける対応するアミノ酸と逆の電荷を有するアミノ酸で置き換えられている。一部の実施形態において、アミノ酸修飾は、荷電残基（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、およびＡｓｐ）または極性残基（例えば、ＳｅｒおよびＴｈｒ）であり得る。一部の実施形態において、第１のヒンジポリペプチドはヒトＩｇＧ１を含み、第１のヒンジポリペプチドにおけるアミノ酸修飾は、２２１および２２８からなる群から選択される位置にある。一部の実施形態において、第１のヒンジポリペプチドはヒトＩｇＧ２を含み、第１のヒンジポリペプチドにおけるアミノ酸修飾は、２２３、２２５、および２２８からなる群から選択される位置にある。一部の実施形態において、第１のヒンジポリペプチドはヒトＩｇＧ４を含み、第１のヒンジポリペプチドにおけるアミノ酸修飾は、２２８位にある。
【００１４】
他の実施形態において、本発明のヘテロ二量体タンパク質はさらにＣＨ３領域を含み、ＣＨ３領域は、共に相互作用してＣＨ３境界を形成する第１のＣＨ３ポリペプチドおよび第２のＣＨ３ポリペプチドを含み、ＣＨ３境界内の１つまたは複数のアミノ酸は、ホモ二量体の形成を不安定化させ、かつホモ二量体の形成にとって静電気的に不利ではない。
【００１５】
一部の実施形態において、本発明のヘテロ多量体（例えばヘテロ二量体）タンパク質は、例えば、抗体、マキシボディ、モノボディ、ペプチボディ、およびＦｃ融合タンパク質であり得る。一部の実施形態において、ヘテロ二量体タンパク質は、二重特異的抗体である。一部の実施形態において、ヘテロ二量体タンパク質は、単一特異的な一価、二重特異的な一価、または二重特異的な二価（例えば、単一特異的一価抗体、二重特異的一価抗体、または二重特異的二価抗体）である。
【００１６】
別の態様において、本発明は、第１の免疫グロブリン様Ｆｃ領域と第２の免疫グロブリン様Ｆｃ領域（例えば、ヒンジ領域および／またはＣＨ３領域）との間の境界を改変または操作することによって所望のヘテロ多量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質（例えば二重特異的抗体）の形成を増強するための戦略を提供する。一部の実施形態において、ヒンジ境界を形成する１つまたは複数の残基は、荷電残基の間の静電気的相互作用がホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に静電気的に有利となるように、荷電残基で置き換えられている。さらなる実施形態において、ＣＨ３境界を形成する１つまたは複数の残基はさらに、ＣＨ３境界の間の相互作用がホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成をさらに促進するように、荷電残基で置き換えられている。一部の実施形態において、操作されたＣＨ３境界は、ホモ二量体の形成を不安定化させる。一部の実施形態において、操作されたＣＨ３境界は、ホモ二量体の形成にとって静電気的に不利ではない。一部の実施形態において、操作されたＣＨ３境界は、ホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に立体的に有利である。一部の実施形態において、操作されたＣＨ３境界は、ホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に静電気的に有利である。
【００１７】
別の態様において、共に相互作用してＣＨ３境界を形成する第１のＣＨ３ポリペプチドおよび分離した第２のＣＨ３ポリペプチドを含む免疫グロブリン様ＣＨ３領域を含むヘテロ多量体（例えばヘテロ二量体）タンパク質が、本明細書において開示され、ここで、ＣＨ３境界内の１つまたは複数のアミノ酸は、ホモ二量体の形成を不安定化させ、かつホモ二量体の形成にとって静電気的に不利ではない。一部の実施形態において、第１のＣＨ３ポリペプチドは、野生型ＣＨ３領域配列におけるアミノ酸修飾を含むものである。一部の実施形態において、第１のＣＨ３ポリペプチドはさらに、野生型ＣＨ３配列における第２のアミノ酸修飾を含むものである。一部の実施形態において、第１のＣＨ３ポリペプチドはさらに、野生型ＣＨ３配列における第３のアミノ酸修飾を含むものである。一部の実施形態において、第２のＣＨ３ポリペプチドは、野生型ＣＨ３領域配列におけるアミノ酸修飾を含むものである。一部の実施形態において、第２のＣＨ３ポリペプチドはさらに、野生型ＣＨ３領域配列における第２のアミノ酸修飾を含むものである。一部の実施形態において、第２のＣＨ３ポリペプチドはさらに、野生型ＣＨ３領域配列における第３のアミノ酸修飾を含むものである。
【００１８】
一部の実施形態において、ＣＨ３領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＣＨ３領域である。一部の実施形態において、ＣＨ３領域は、ヒトＩｇＧのＣＨ３領域（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＣＨ３領域）を含む。
【００１９】
一部の実施形態において、ＣＨ３ポリペプチドにおけるアミノ酸修飾は、３４９、３６８、４０５、および４０９からなる群から選択される位置にあるアミノ酸置換である。一部の実施形態において、アミノ酸修飾は、Ｋ４０９Ｒ、Ｌ３６８Ｅ、およびＬ３６８Ｄからなる群から選択される。
【００２０】
一部の実施形態において、第１のＣＨ３ポリペプチドにおけるアミノ酸修飾はＫ４０９Ｒであり、第２のＣＨ３ポリペプチドにおけるアミノ酸修飾はＬ３６８ＥまたはＬ３６８Ｄである。
【００２１】
別の態様において、本発明はまた、ａ）第１のポリペプチドをコードする核酸分子および第２のポリペプチドをコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養するステップ（第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは同一の核酸分子または１つもしくは複数の異なる核酸分子から発現される）であって、培養された宿主細胞が第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを発現するステップ、およびｂ）任意選択で、宿主細胞培養物からヘテロ二量体タンパク質を回収するステップを含む、本発明のヘテロ多量体（例えばヘテロ二量体）タンパク質を生産する方法を提供する。
【００２２】
別の態様において、本発明はまた、ａ）第１の宿主細胞において第１のポリペプチドを発現させるステップ、ｂ）第２の宿主細胞において第２のポリペプチドを発現させるステップ、ｃ）任意選択で、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを単離するステップ、およびｄ）２つのポリペプチドを、二量体化に適した条件下で（例えば、例えばグルタチオンなどの還元剤を用いて）インキュベートして、ヘテロ二量体タンパク質を生産するステップを含む、本発明のヘテロ多量体（例えばヘテロ二量体）タンパク質を生産する方法を提供する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、ホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に静電気的に有利な１つまたは複数のＦｃ領域（例えば、ヒンジ領域および／またはＣＨ３領域）を含むヘテロ二量体タンパク質を精製する方法を提供する。
【００２４】
別の態様において、本発明はまた、免疫グロブリン様Ｆｃ領域を含むヘテロ二量体タンパク質を精製する方法を提供し、精製は、Ｆｃ領域における静電気的相互作用の違いに基づく少なくとも１つのステップを含む。本発明の方法によって精製することができるヘテロ二量体タンパク質は、免疫グロブリン様ヒンジ領域および／または定常領域（例えば、ＣＨ２領域またはＣＨ３領域）を含み得る。
【００２５】
一部の実施形態において、本方法は、ヒンジ領域における静電気的相互作用の違いに基づく少なくとも１つのステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、定常領域における静電気的相互作用の違いに基づく少なくとも１つのステップを含む。一部の実施形態において、定常領域は、重鎖定常領域、すなわちＣＨ２領域またはＣＨ３領域であり得る。一部の実施形態において、本方法は、クロマトグラフィーステップ（例えばイオン交換クロマトグラフィー）を含む。
【００２６】
別の態様において、本発明は、本発明のヘテロ多量体（例えばヘテロ二量体）タンパク質の生産に関連するポリペプチド、核酸、ベクター、および宿主細胞を提供する。本発明はまた、本発明のヘテロ多量体タンパク質、例えばヘテロ二量体タンパク質を含む医薬組成物／製剤、ならびにこのような組成物の使用方法を提供する。
【００２７】
別の態様において、対象における状態、障害、または疾患を治療する方法が提供され、本方法は、本発明のヘテロ多量体（例えばヘテロ二量体）タンパク質を含む効果的な量の医薬組成物を対象に投与するステップを含む。
【００２８】
別の態様において、本発明はまた、免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドを含むポリペプチドを提供し、ここで、ヒンジポリペプチドは、野生型免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、前記ポリペプチドは、野生型免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドを含むポリペプチドと比較して、第２のポリペプチドとヘテロ二量体タンパク質を形成する能力が増大している。
【００２９】
別の態様において、本発明はまた、ＣＨ３ポリペプチドを含むポリペプチドを提供し、ここで、ＣＨ３ポリペプチドは、野生型ＣＨ３ポリペプチドに対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、前記ポリペプチドは、野生型ＣＨ３ヒンジポリペプチドを含むポリペプチドと比較して、第２のポリペプチドとヘテロ二量体タンパク質を形成する能力が増大している。一部の実施形態において、アミノ酸修飾は、Ｋ４０９Ｒ、Ｌ３６８Ｅ、およびＬ３６８Ｄからなる群から選択される。
【００３０】
本発明の別の態様において、本明細書において記載されるヘテロ二量体タンパク質（例えば二重特異的抗体）は、完全長ヒト抗体を含み、ここで、ヘテロ二量体タンパク質の第１の抗体可変ドメインは、ヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原に特異的に結合することによってヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することができ、ヘテロ二量体タンパク質の第２の抗体可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合することができる。一部の実施形態において、ヒト抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ヘテロ二量体タンパク質を説明するために、本明細書によって用いられる命名法を説明するための、典型的な抗体突然変異体を示す図である。
【図２】ヒトＩｇＧ２ΔＡ  Ｆｃ領域配列（配列番号１）を示す図である。
【図３】ｐＣｉ．Ｄｂ．３ｘＦＬＡＧ（またはＨＡ）．Ａｂ１．ｈＦｃ１ベクターについてのベクターマップを示す図である。
【図４】ヒトＩｇＧ１野生型Ｆｃ領域配列（配列番号１１）を示す図である。
【図５】ヒトＩｇＧ４野生型Ｆｃ領域配列（配列番号１２）を示す図である。
【図６Ａ】ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４ヒンジ領域のアラインメントを示す図である。
【図６Ｂ】ヒトＩｇＧ４突然変異体およびＩｇＧ１突然変異体の表である。
【図６Ｃ】ヒトＩｇＧ２突然変異体の表である。
【図７Ａ】ＩｇＧ４突然変異体からの二重特異的抗体の形成の分析を示す図である。
【図７Ｂ】ＩｇＧ４突然変異体からの二重特異的抗体の形成の分析を示す図である。
【図８Ａ】ＩｇＧ２突然変異体からの二重特異的抗体の形成の分析を示す図である。
【図８Ｂ】ＩｇＧ２突然変異体からの二重特異的抗体の形成の分析を示す図である。
【図９Ａ】Ｋ４０９ＲバックグラウンドにおけるＩｇＧ２ヒンジ突然変異についてのスクリーニングの結果を示す図である。
【図９Ｂ】Ｋ４０９ＲバックグラウンドにおけるＩｇＧ２ヒンジ突然変異についてのスクリーニングの結果を示す図である。
【図１０】ヒトＩｇＧ４、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ１のＣＨ３領域のアラインメントを示す図である。
【図１１Ａ】様々なヒトＩｇＧ４突然変異体に対する「Ｇｌｕ」スキャンの結果を示す図である。
【図１１Ｂ】様々なヒトＩｇＧ４突然変異体に対する「Ｇｌｕ」スキャンの結果を示す図である。
【図１２Ａ】様々なヒトＩｇＧ２突然変異体に対する「Ｇｌｕ」スキャンの結果を示す図である。
【図１２Ｂ】様々なヒトＩｇＧ２突然変異体に対する「Ｇｌｕ」スキャンの結果を示す図である。
【図１３Ａ】ヒンジ領域とＣＨ３領域との両方における突然変異がヒトＩｇＧ２突然変異体のヘテロ二量体／二重特異的抗体の形成にとって重要であることを示す図である。
【図１３Ｂ】ヒンジ領域とＣＨ３領域との両方における突然変異がヒトＩｇＧ２突然変異体のヘテロ二量体／二重特異的抗体の形成にとって重要であることを示す図である。
【図１４Ａ】様々なヒトＩｇＧ１突然変異体に対する「Ｇｌｕ」スキャンの結果を示す図である。
【図１４Ｂ】様々なヒトＩｇＧ１突然変異体に対する「Ｇｌｕ」スキャンの結果を示す図である。
【図１５Ａ】異なるＩｇＧアイソタイプの間の二重特異的抗体の形成の比較を示す図である。
【図１５Ｂ】異なるＩｇＧアイソタイプの間の二重特異的抗体の形成の比較を示す図である。
【図１６Ａ】ｈＩｇＧ１突然変異体のイオン交換溶出プロファイルを示す図である。破線は、ヒンジ領域に２２１Ｒ突然変異および２２８Ｒ突然変異を有し重鎖のＣＨ３ドメインに４０９Ｒ突然変異を有するＡｂ１抗体を表す。
【図１６Ｂ】ｈＩｇＧ１突然変異体のイオン交換溶出プロファイルを示す図である。点線は、ヒンジに２２１Ｅ突然変異および２２８Ｅ突然変異を有しＣＨ３ドメインに３６８Ｅを有するＡｂ２  ｈＩｇＧ１抗体を表す。
【図１６Ｃ】ｈＩｇＧ１突然変異体のイオン交換溶出プロファイルを示す図である。実線は、Ａｂ１変異体およびＡｂ２変異体を１ｍＭのグルタチオンと共にインキュベーションした後に形成されるＡｂ１−Ａｂ２二重特異的抗体反応生成物の溶出プロファイルを表す。
【図１７Ａ】ｈＩｇＧ２突然変異体のイオン交換溶出プロファイルを示す図である。点線は、ヒンジに２２３Ｅ突然変異、２２５Ｅ突然変異、および２２８Ｅ突然変異を有しＣＨ３ドメインに３６８Ｅを有するＡｂ２  ｈＩｇＧ１抗体を表す。
【図１７Ｂ】ｈＩｇＧ１突然変異体のイオン交換溶出プロファイルを示す図である。破線は、ヒンジ領域に２２３Ｒ突然変異、２２５Ｒ突然変異、および２２８Ｒ突然変異を有し重鎖のＣＨ３ドメインに４０９Ｒ突然変異を有するＡｂ１抗体を表す。
【図１７Ｃ】ｈＩｇＧ１突然変異体のイオン交換溶出プロファイルを示す図である。実線は、Ａｂ１変異体およびＡｂ２変異体を２ｍＭのグルタチオンと共にインキュベーションした後に形成されるＡｂ１−Ａｂ２二重特異的抗体反応生成物の溶出プロファイルを表す。
【図１８Ａ】ｈＩｇＧ２突然変異体のイオン交換溶出プロファイルを示す図である。ヒンジ突然変異を、図１７Ａ〜１７Ｃにおいて示される構築物に対して交換し、総電荷差が少ない２つの抗体を生じさせた。ヒンジ突然変異と異なる可変ドメインとを対にすることは、二重特異的抗体の形成に対して影響しなかった。点線は、ヒンジに２２３Ｒ突然変異、２２５Ｒ突然変異、および２２８Ｒ突然変異を有しＣＨ３ドメインに３６８Ｅを有するＡｂ２  ｈＩｇＧ１抗体を表す。
【図１８Ｂ】ｈＩｇＧ２突然変異体のイオン交換溶出プロファイルを示す図である。ヒンジ突然変異を、図１７Ａ〜１７Ｃにおいて示される構築物に対して交換し、総電荷差が少ない２つの抗体を生じさせた。ヒンジ突然変異と異なる可変ドメインとを対にすることは、二重特異的抗体の形成に対して影響しなかった。破線は、ヒンジ領域に２２３Ｅ突然変異、２２５Ｅ突然変異、および２２８Ｅ突然変異を有し重鎖のＣＨ３ドメインに４０９Ｒ突然変異を有するＡｂ１抗体を表す。
【図１８Ｃ】ｈＩｇＧ２突然変異体のイオン交換溶出プロファイルを示す図である。ヒンジ突然変異を、図１７Ａ〜１７Ｃにおいて示される構築物に対して交換し、総電荷差が少ない２つの抗体を生じさせた。ヒンジ突然変異と異なる可変ドメインとを対にすることは、二重特異的抗体の形成に対して影響しなかった。実線は、Ａｂ１変異体およびＡｂ２変異体を２ｍＭのグルタチオンと共にインキュベーションした後に形成されるＡｂ１−Ａｂ２二重特異的抗体反応生成物の溶出プロファイルを表す。
【図１９Ａ】修飾されたヒンジポリペプチドと軽鎖配列との共発現が二重特異的抗体を生産することを示す図である。破線は、Ａｂ２軽鎖と共に発現した、重鎖に２２３Ｒ突然変異、２２５Ｒ突然変異、２２８Ｒ突然変異、および４０９Ｒ突然変異を有する対照Ａｂ１抗体を表す。
【図１９Ｂ】修飾されたヒンジポリペプチドと軽鎖配列との共発現が二重特異的抗体を生産することを示す図である。点線は、２２３Ｅ突然変異、２２５Ｅ突然変異、２２８Ｅ突然変異、および３６８Ｅ突然変異を有する対照抗体Ａｂ２  ｈＩｇＧ２を表す。
【図１９Ｃ】修飾されたヒンジポリペプチドと軽鎖配列との共発現が二重特異的抗体を生産することを示す図である。二点鎖線は、ｈＩｇＧ２．ＲＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ１重鎖およびｈＩｇＧ２．ＥＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ２重鎖とＡｂ２軽鎖とを共発現させることによって形成される二重特異的抗体のイオン交換クロマトグラフィーのトレースを表す。
【図１９Ｄ】修飾されたヒンジポリペプチドと軽鎖配列との共発現が二重特異的抗体を生産することを示す図である。実線は、Ａｂ２軽鎖を有する精製されたＡｂ１（２２３Ｒ、２２５Ｒ、２２８Ｒ、および４０９Ｒ）重鎖およびＡｂ２（２２３Ｅ、２２５Ｅ、２２８Ｅ、および３６８Ｅ）を２ｍＭのグルタチオンと共にインキュベーションした後に形成されるＡｂ１−Ａｂ２二重特異的抗体反応生成物の溶出プロファイルを表す。
【図２０Ａ】修飾されたヒンジポリペプチドと軽鎖配列との共発現が二重特異的抗体を生産することを示す図である。点線は、２２１Ｅ突然変異、２２８Ｅ突然変異、および３６８Ｅ突然変異を有する対照抗体Ａｂ２  ｈＩｇＧ１を表す。
【図２０Ｂ】修飾されたヒンジポリペプチドと軽鎖配列との共発現が二重特異的抗体を生産することを示す図である。破線は、Ａｂ２軽鎖と共に共発現した、重鎖に２２１Ｒ突然変異、２２８Ｒ突然変異、および４０９Ｒ突然変異を有する対照Ａｂ１抗体を表す。
【図２０Ｃ】修飾されたヒンジポリペプチドと軽鎖配列との共発現が二重特異的抗体を生産することを示す図である。二点鎖線は、ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ１重鎖およびｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ２重鎖とＡｂ２軽鎖とを共発現させることによって形成される二重特異的抗体のイオン交換クロマトグラフィーのトレースを表す。
【図２０Ｄ】修飾されたヒンジポリペプチドと軽鎖配列との共発現が二重特異的抗体を生産することを示す図である。実線は、Ａｂ２軽鎖を有する精製されたＡｂ１（２２１Ｒ、２２８Ｒ、および４０９Ｒ）重鎖およびＡｂ２（２２１Ｅ、２２８Ｅ、および３６８Ｅ）を１ｍＭのグルタチオンと共にインキュベーションした後に形成されるＡｂ１−Ａｂ２二重特異的抗体反応生成物の溶出プロファイルを表す。
【図２１Ａ】本発明の方法が、可変ドメインの正体に依存せず、したがって広く適用可能であることを示す図である。点線は、ヒンジに２２１Ｅ突然変異および２２８Ｅ突然変異を有しＣＨ３ドメインに３６８Ｅを有するＡｂ３  ｈＩｇＧ１抗体を表す。
【図２１Ｂ】本発明の方法が、可変ドメインの正体に依存せず、したがって広く適用可能であることを示す図である。破線は、ヒンジ領域に２２１Ｒ突然変異および２２８Ｒ突然変異を有し重鎖のＣＨ３ドメインに４０９Ｒ突然変異を有するＡｂ４抗体を表す。
【図２１Ｃ】本発明の方法が、可変ドメインの正体に依存せず、したがって広く適用可能であることを示す図である。実線は、Ａｂ４変異体およびＡｂ３変異体を１ｍＭのグルタチオンと共にインキュベーションした後に形成されるＡｂ４−Ａｂ３二重特異的抗体反応生成物の溶出プロファイルを表す。
【図２２Ａ】可変ドメインが同一であっても、イオン交換クロマトグラフィーを用いてＩｇＧ１（２２１Ｅ、２２８Ｅ、および３６８Ｅ）突然変異体からＩｇＧ１突然変異体（２２１Ｒ、２２８Ｒ、および４０９Ｒ）を分離し得ることを示す図である。これらの２つの変異体のヘテロ二量体もまた、イオン交換クロマトグラフィーを用いてホモ二量体から分離することができる。点線は、ヒンジに２２１Ｅ突然変異および２２８Ｅ突然変異を有しＣＨ３ドメインに３６８Ｅを有するＡｂ４  ｈＩｇＧ１抗体を表す。
【図２２Ｂ】可変ドメインが同一であっても、イオン交換クロマトグラフィーを用いてＩｇＧ１（２２１Ｅ、２２８Ｅ、および３６８Ｅ）突然変異体からＩｇＧ１突然変異体（２２１Ｒ、２２８Ｒ、および４０９Ｒ）を分離し得ることを示す図である。これらの２つの変異体のヘテロ二量体もまた、イオン交換クロマトグラフィーを用いてホモ二量体から分離することができる。破線は、ヒンジ領域に２２１Ｒ突然変異および２２８Ｒ突然変異を有し重鎖のＣＨ３ドメインに４０９Ｒ突然変異を有するＡｂ４抗体を表す。
【図２２Ｃ】可変ドメインが同一であっても、イオン交換クロマトグラフィーを用いてＩｇＧ１（２２１Ｅ、２２８Ｅ、および３６８Ｅ）突然変異体からＩｇＧ１突然変異体（２２１Ｒ、２２８Ｒ、および４０９Ｒ）を分離し得ることを示す図である。これらの２つの変異体のヘテロ二量体もまた、イオン交換クロマトグラフィーを用いてホモ二量体から分離することができる。実線は、ヘテロ二量体ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ４．Ａｂ４／ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ４．Ａｂ４の溶出プロファイルを表す。
【図２３Ａ】可変ドメインが同一であっても、イオン交換クロマトグラフィーを用いてＩｇＧ１（２２１Ｅ、２２８Ｅ、および３６８Ｅ）突然変異体からＩｇＧ１突然変異体（２２１Ｒ、２２８Ｒ、および４０９Ｒ）を分離し得ることの別の例を示す図である。これらの２つの変異体のヘテロ二量体もまた、イオン交換クロマトグラフィーを用いてホモ二量体から分離することができる。点線は、ヒンジに２２１Ｅ突然変異および２２８Ｅ突然変異を有しＣＨ３ドメインに３６８Ｅを有するＡｂ３  ｈＩｇＧ１抗体を表す。
【図２３Ｂ】可変ドメインが同一であっても、イオン交換クロマトグラフィーを用いてＩｇＧ１（２２１Ｅ、２２８Ｅ、および３６８Ｅ）突然変異体からＩｇＧ１突然変異体（２２１Ｒ、２２８Ｒ、および４０９Ｒ）を分離し得ることの別の例を示す図である。これらの２つの変異体のヘテロ二量体もまた、イオン交換クロマトグラフィーを用いてホモ二量体から分離することができる。破線は、ヒンジ領域に２２１Ｒ突然変異および２２８Ｒ突然変異を有し重鎖のＣＨ３ドメインに４０９Ｒ突然変異を有するＡｂ３抗体を表す。
【図２３Ｃ】可変ドメインが同一であっても、イオン交換クロマトグラフィーを用いてＩｇＧ１（２２１Ｅ、２２８Ｅ、および３６８Ｅ）突然変異体からＩｇＧ１突然変異体（２２１Ｒ、２２８Ｒ、および４０９Ｒ）を分離し得ることの別の例を示す図である。これらの２つの変異体のヘテロ二量体もまた、イオン交換クロマトグラフィーを用いてホモ二量体から分離することができる。実線は、ヘテロ二量体ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ３．Ａｂ３／ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ３．Ａｂ３の溶出プロファイルを表す。
【図２４Ａ】示された突然変異体（Ｂ）についての二重特異的抗体の形成の比較（Ａ）を示す図である。
【図２４Ｂ】示された突然変異体（Ｂ）についての二重特異的抗体の形成の比較（Ａ）を示す図である。
【図２５Ａ】同様に、示された突然変異体（Ｂ）についての二重特異的抗体の形成の比較（Ａ）を示す図である。
【図２５Ｂ】同様に、示された突然変異体（Ｂ）についての二重特異的抗体の形成の比較（Ａ）を示す図である。
【図２６Ａ】ｈＩｇＧ１突然変異体およびｈＩｇＧ２突然変異体のイオン交換溶出プロファイルを示す図である。実線は、Ａｂ２変異体およびＡｂ１変異体をグルタチオン（ｈＩｇＧ１では１ｍＭ、ｈＩｇＧ２では２ｍＭ）と共にインキュベーションした後に形成されるＡｂ２−Ａｂ１二重特異的抗体反応生成物の溶出プロファイルを表す。ＣＨ３のみの突然変異は、野生型ｈＩｇＧ１と比較して約１２％のＩｇＧ１のヘテロ二量体タンパク質の形成（Ｋ４０９ＲおよびＬ３６８Ｅでの突然変異）をもたらした。
【図２６Ｂ】ｈＩｇＧ１突然変異体およびｈＩｇＧ２突然変異体のイオン交換溶出プロファイルを示す図である。実線は、Ａｂ２変異体およびＡｂ１変異体をグルタチオン（ｈＩｇＧ１では１ｍＭ、ｈＩｇＧ２では２ｍＭ）と共にインキュベーションした後に形成されるＡｂ２−Ａｂ１二重特異的抗体反応生成物の溶出プロファイルを表す。ＣＨ３のみの突然変異は、野生型ｈＩｇＧ１と比較して約１３％のＩｇＧ２のヘテロ二量体タンパク質の形成（Ｋ４０９ＲおよびＬ３６８Ｅでの突然変異）をもたらした。
【図２６Ｃ】ｈＩｇＧ１突然変異体およびｈＩｇＧ２突然変異体のイオン交換溶出プロファイルを示す図である。実線は、Ａｂ２変異体およびＡｂ１変異体をグルタチオン（ｈＩｇＧ１では１ｍＭ、ｈＩｇＧ２では２ｍＭ）と共にインキュベーションした後に形成されるＡｂ２−Ａｂ１二重特異的抗体反応生成物の溶出プロファイルを表す。ヒンジ突然変異（Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｄ２２１Ｅ、およびＰ２２８Ｅでの突然変異）とＣＨ３突然変異（Ｋ４０９ＲおよびＬ３６８Ｅでの突然変異）との両方の組み合わせは、野生型ｈＩｇＧ１と比較して約９０％のＩｇＧ１ヘテロ二量体タンパク質の形成をもたらした。
【図２６Ｄ】ｈＩｇＧ１突然変異体およびｈＩｇＧ２突然変異体のイオン交換溶出プロファイルを示す図である。実線は、Ａｂ２変異体およびＡｂ１変異体をグルタチオン（ｈＩｇＧ１では１ｍＭ、ｈＩｇＧ２では２ｍＭ）と共にインキュベーションした後に形成されるＡｂ２−Ａｂ１二重特異的抗体反応生成物の溶出プロファイルを表す。
【図２７】野生型ｈＩｇＧ１抗体（Ａｂ５およびＡｂ６）について、親突然変異体単一特異的抗体（ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ６．Ａｂ６／ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ６．Ａｂ６）について、および二重特異的抗体（（ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ５．Ａｂ５／ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ６．Ａｂ６）についての示差走査熱量測定プロファイルを示す図である。
【図２８Ａ】二重特異的抗体の、アミン結合した（抗原Ａ）−ｈＦｃに対する結合、および「サンドイッチ」分析物（または抗原）のパネルに対する結合を示すセンサーグラムを示す図である。
【図２８Ｂ】二重特異的抗体のアミン結合した（抗原Ｄ）−ｈＦｃに対する結合、および「サンドイッチ」分析物（または抗原）のパネルに対する結合を示すセンサーグラムを示す図である。
【図２９】単一特異的および二重特異的なＡｂ３およびＡｂ４による成長阻害を、Ｃａｌ２７細胞（上部のパネル）およびＦａＤｕ細胞（下部のパネル）においてアッセイしたことを示す図である。Ａｂ３．ｂｉＦｃ（バツ印）は、親突然変異抗体である（ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ３．Ａｂ３／ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ３．Ａｂ３）。Ａｂ３−Ａｂ４二重特異的抗体（白抜きの四角）は、二重特異的突然変異抗体である（ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ３．Ａｂ３／ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ４．Ａｂ４）。Ａｂ３／ｎｃ．ｂｉＦｃ（白抜きの丸）は、一方のアームに陰性対照抗体（Ａｂ６）を有する一価のＡｂ３である（ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ３．Ａｂ３／ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ６．Ａｂ６）。Ａｂ３．ｈＩｇＧ１（黒い菱形）は、ｈＩｇＧ１における野生型二価Ａｂ３である（Ａｂ３．野生型ｈＩｇＧ１）。Ａｂ４．ｈＩｇＧ１（白抜きの三角）は、ｈＩｇＧ１における野生型二価Ａｂ４である（Ａｂ４．野生型ｈＩｇＧ１）。Ａｂ４ｎｃ．ｂｉＦｃ（白抜きの菱形）は、一方のアームに陰性対照抗体（Ａｂ６）を有する一価のＡｂ４である（ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ４．Ａｂ４／ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ６．Ａｂ６）。「ｎｃ」は、陰性対照抗体を示す。
【図３０】Ｃａｌ２７細胞において測定された一価で二重特異的なＡｂ３抗体およびＡｂ４抗体の解離速度定数を示す図である。二重特異的Ａｂ３／Ａｂ４抗体（白抜きの四角）は、二重特異的突然変異抗体である（ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ３．Ａｂ３／ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ４．Ａｂ４）。Ａｂ４／ｎｃ.ｂｉＦｃ（バツ印）は、一方のアームに陰性対照（非特異的）抗体（Ａｂ６）を有する一価のＡｂ４である（ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ４．Ａｂ４／ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ６．Ａｂ６）。Ａｂ３／ｎｃ．ｂｉＦｃ（白抜きの三角）は、一方のアームに陰性対照抗体（Ａｂ６）を有する一価のＡｂ３である（ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ３．Ａｂ３／ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ６．Ａｂ６）。実線および点線は、単一指数方程式に適合されている。
【図３１Ａ】ヘテロ二量体タンパク質（二重特異的なＥｐＣＡＭ／ＣＤ３抗体（（図において「ｈＧ２−ＥｐＣＡＭ−ＣＤ３」として表される））の、腫瘍細胞（ＳＷ４８０）を死滅させる能力が、インビトロで細胞傷害性Ｔ細胞によって仲介されたことを示す図である。Ｅ／Ｔは、エフェクター細胞と標的細胞との間の比率を示す。
【図３１Ｂ】ヘテロ二量体タンパク質（二重特異的なＥｐＣＡＭ／ＣＤ３抗体（（図において「ｈＧ２−ＥｐＣＡＭ−ＣＤ３」として表される））の、腫瘍細胞（ＳＷ４８０）を死滅させる能力が、インビトロで細胞傷害性Ｔ細胞によって仲介されたことを示す図である。Ｅ／Ｔは、エフェクター細胞と標的細胞との間の比率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、ヘテロ多量体複合体分子、さらに具体的には、例えば二重特異的抗体などの少なくとも１つの免疫グロブリン様ヒンジ領域を含むヘテロ二量体タンパク質を生成するための方法、組成物、キット、および製品を提供する。本発明は、実用的な収率および望ましい純度でヘテロ多量体複合体分子を作製および精製する方法を提供する。本発明は、多重特異的な性質であり高度に安定な分子の使用が望ましくかつ／または必要とされる、様々な障害または病理学的状態の診断および／または治療に用いることができる複合体分子の効率的な生産を可能にする。本発明の方法、組成物、キット、および製品の詳細は、本明細書において提供される。
【００３３】
全体的な技術および定義
本明細書において別段の規定がない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。さらに、文脈により別段の定めがない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。全体として、本明細書において記載される細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名と、これらの技術とは、当技術分野においてよく知られており、一般的に用いられている。
【００３４】
本発明の方法および技術は、別段の指示がない限り、全体として、当技術分野においてよく知られている従来の方法に従って、かつ本明細書の全体にわたり引用および議論される様々な一般的な参考文献およびさらに具体的な参考文献において記載されているように、実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）；ならびにＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、当技術分野において一般に行われるように、または本明細書において記載されるように、製造者の仕様に従って行われる。本明細書において記載される分子生物学、生化学、免疫学、分析化学、合成有機化学、ならびに医化学および薬化学に関連して用いられる命名と、これらの実験手順および技術とは、当技術分野においてよく知られており、一般的に用いられている。本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変型は、言及された整数または整数群を含むことを含意するがいかなる他の整数または整数群も排除するものではないことが理解される。
【００３５】
「抗体」は、その可変領域内に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合し得る、免疫グロブリン分子である。本明細書において用いられる場合、文脈によって別段の指示がない限り、この用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、サメ抗体およびラクダ抗体を含む一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）およびドメイン抗体）、ならびに抗体部分を含む融合タンパク質、多価抗体、多重特異的抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限りの二重特異的抗体）および本明細書において記載される抗体断片、そして抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のあらゆる他の修飾された立体構造、例えば、限定はしないが、ミニボディ、マキシボディ、ナノボディ、ペプチボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびｂｉｓ−ｓｃＦｖを含むことを意図する（例えば、ＨｏｌｌｉｎｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３（９）：１１２６〜１１３６（２００５）を参照されたい）。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭなどのあらゆるクラス（またはそのサブクラス）の抗体が含まれ、抗体は、いずれかの特定のクラスのものである必要はない。抗体の重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置はよく知られている。
【００３６】
「抗原断片」は、無傷抗体の一部分のみを含み、ここで、前記部分は、無傷抗体内に存在する場合の前記部分と通常関連している機能の少なくとも１つ、好ましくはほとんどまたは全てを好ましくは保持している。
【００３７】
本願における残基の指定は、ＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに基づく（Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．、第５版）。
【００３８】
「二価抗体」は、分子（例えばＩｇＧ）当たり２つの抗原結合部位を含む。一部の場合において、２つの結合部位は同一の抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は二重特異的であり得る（以下を参照されたい）。
【００３９】
「一価抗体」は、分子（例えばＩｇＧ）当たり１つの抗原結合部位を含む。一部の場合において、一価抗体は２つ以上の抗原結合部位を有し得るが、結合部位は異なる抗原に由来する。
【００４０】
「多重特異的抗体」は、２つ以上の抗原またはエピトープを標的化するものである。「二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異的（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、または「二機能性」抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、多重特異的抗体の一種であり、限定はしないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合を含む、様々な方法によって生産することができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ（１９９０）、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１；ならびにＫｏｓｔｅｌｎｙら、（１９９２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３を参照されたい。二重特異的抗体の２つの結合部位は、同一のまたは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。
【００４１】
表現「抗原結合アーム」、「標的分子結合アーム」、およびその変型は、本明細書において用いられる場合、目的の標的分子を特異的に結合する能力を有する本発明の抗体の構成部分を言う。通常、および好ましくは、抗原結合アームは、免疫グロブリンポリペプチド配列の複合体、例えば、免疫グロブリン軽鎖および重鎖のＣＤＲ配列および／または可変ドメイン配列である。
【００４２】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において用いられる場合、ほぼ均質な抗体の集団から得られる抗体を言い、すなわち、集団を構成する個別の抗体は、微量で存在し得る考えられる天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原に対するものである。さらに、異なる抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に対するものである。
【００４３】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、一部の実施形態において、所望の生物学的活性を示す限りの、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体における対応する配列に同一または相同であるが、鎖（単数または複数）の残りが、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体における対応する配列に同一または相同である、「キメラ」抗体、およびこのような抗体の断片が具体的に含まれ得る（米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。
【００４４】
「ヒト化された」形態の非ヒト（例えばマウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域の残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体は、さらに、レシピエント抗体またはドナー抗体において見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに高めるために行われる。通常、ヒト化抗体は、全てまたはほぼ全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつ全てまたはほぼ全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインのほぼ全てを含む。ヒト化抗体はまた、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を含んでいてよい。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）を参照されたい。また、以下の総説およびそれにおいて引用される参考文献も参照されたい：ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５〜１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５〜１０３８（１９９５）；ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８〜４３３（１９９４）。
【００４５】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、かつ／または本明細書において開示されるヒト抗体を作製するための技術のいずれかを用いて作製されたものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に排除する。
【００４６】
本明細書において用いられる場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質（「アドヘシン」、例えば、受容体、リガンド、または酵素）の「結合ドメイン」と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター構成要素とを組み合わせる、抗体様分子または免疫グロブリン様分子を指す。構造的に、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識部位および抗原結合部位（抗原組み合わせ部位）以外の（すなわち「異種の」）、所望の結合特異性を有するアドヘシンのアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭなどのあらゆる免疫グロブリンから得ることができる。
【００４７】
「ヘテロ多量体」、「ヘテロ多量体複合体」、または「ヘテロ多量体ポリペプチド」は、少なくとも第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む分子であり、第２のポリペプチドは、アミノ酸配列が、少なくとも１アミノ酸残基、第１のポリペプチドと異なる。ヘテロ多量体は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドによって形成される「ヘテロ二量体」を含み得るか、または、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドに加えてポリペプチドが存在する、さらに高次の三次構造を形成し得る。
【００４８】
「ヘテロ二量体」、「ヘテロ二量体タンパク質」、「ヘテロ二量体複合体」、または「ヘテロ多量体ポリペプチド」は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む分子であり、第２のポリペプチドは、アミノ酸配列が、少なくとも１アミノ酸残基、第１のポリペプチドと異なる。
【００４９】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において、任意の長さの、好ましくは比較的短い（例えば、１０〜１００アミノ酸）のアミノ酸鎖を言うために、区別せずに用いられる。鎖は、線状または分枝鎖状であってよく、これは、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、かつ／または非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語はまた、天然にまたは介入によって修飾されている、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば標識構成要素とのコンジュゲーションによって修飾されているアミノ酸鎖を含む。同様にこの定義に含まれるものは、例えば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）および当技術分野において知られている他の修飾を含むポリペプチドである。ポリペプチドが一本鎖または会合鎖として生じ得ることが理解される。
【００５０】
用語「Ｆｃ領域」は、本明細書において用いられる場合、通常、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含む二量体複合体を言い、ここで、Ｃ末端ポリペプチド配列は、無傷抗体のパパイン消化によって得ることができるものである。Ｆｃ領域は、非変性Ｆｃ配列または変異体Ｆｃ配列を含み得る。免疫グロブリンのＦｃ配列は、通常、２つの定常ドメイン、すなわちＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ４ドメインを含んでいてもよい。用語「Ｆｃポリペプチド」は、Ｆｃ領域を形成するポリペプチドの１つを言うために本明細書において用いられる。一部の実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、適切な免疫グロブリンから、例えば、様々なＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプの少なくとも１つから、またはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＭから得ることができるか、またはこれに由来し得る。一部の実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、（通常はそのＮ末端に）野生型ヒンジ配列の一部または全てを含む。一部の実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、野生型ヒンジ配列を含まない。Ｆｃポリペプチドは、非変性Ｆｃ配列または変異体Ｆｃ配列を含み得る。
【００５１】
「Ｆｃ融合体」は、本明細書において用いられる場合、１つまたは複数のポリペプチドがＦｃポリペプチドに機能可能に連結しているタンパク質を意味する。Ｆｃ融合体は、免疫グロブリンのＦｃ領域と、通常は任意のタンパク質、ポリペプチド、または低分子であり得る融合パートナーとを組み合わせる。事実上、あらゆるタンパク質または低分子は、Ｆｃに結合してＦｃ融合体を生成し得る。タンパク質融合パートナーには、限定はしないが、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、または一部の他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインが含まれ得る。低分子融合パートナーには、Ｆｃ融合体を治療標的に向ける任意の治療物質が含まれ得る。このような標的は、任意の分子、例えば、限定はしないが、疾患に関与する細胞外受容体であり得る。
【００５２】
「ヒンジ領域」、「ヒンジ配列」、およびその変型には、本明細書において用いられる場合、当技術分野において知られている意味が含まれ、それは、例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、ＮＹ）（第４版、１９９９）；Ｂｌｏｏｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）、６：４０７〜４１５；Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９７）、２０９：１９３〜２０２において説明されている。
【００５３】
「免疫グロブリン様ヒンジ領域」、「免疫グロブリン様ヒンジ配列」、およびその変型は、本明細書において用いられる場合、免疫グロブリン様分子または抗体様分子（例えば、イムノアドヘシン）のヒンジ領域およびヒンジ配列を言う。一部の実施形態において、免疫グロブリン様ヒンジ領域は、そのキメラ形態、例えば、キメラＩｇＧ１／２ヒンジ領域を含む、あらゆるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプから、またはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＭから得ることができるか、またはこれに由来し得る。
【００５４】
用語「ベクター」は、本明細書において用いられる場合、自らが結合している別の核酸を輸送し得る核酸分子を言うことを意図する。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントをその中にライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを言う。別のタイプのベクターは、ファージベクターである。別のタイプのベクターは、その中でさらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内にライゲーションすることができる、ウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性の哺乳動物ベクター）における自律的な複製が可能である。他のベクター（例えば、非エピソーム性の哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内に導入する際に宿主細胞のゲノム内に組み込むことができ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが機能可能に連結している遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単純に「組換えベクター」）と呼ばれる。通常、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられるベクター形態であるため、区別せずに用いられ得る。
【００５５】
本明細書において区別せずに用いることができる「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、単離可能な、ポリマー形態の少なくとも１０塩基長のヌクレオシドまたはヌクレオチドを言う。この用語には、一本鎖形態および二本鎖形態が含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および／もしくはそれらの類似体、または、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼによってもしくは合成反応によってポリマー内に組み込まれ得る、任意の基質であり得る。
【００５６】
ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびその類似体などの、修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後に行われ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、合成後に、標識とのコンジュゲーションなどによって、さらに修飾され得る。他のタイプの修飾には、例えば、「キャップ」、類似体での天然ヌクレオチドの１つまたは複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）でのヌクレオチド間修飾、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｏｌｙ−Ｌ−リジンなど）などの懸垂部分を含有するヌクレオチド間修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレンなど）でのヌクレオチド間修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するヌクレオチド間修飾、アルキル化剤を含有するヌクレオチド間修飾、修飾された結合（例えば、アルファアノマー核酸など）でのヌクレオチド間修飾、ならびに未修飾形態のポリヌクレオチド（単数または複数）が含まれる。さらに、糖内に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、例えばホスホン酸基、リン酸基によって置き換えられ得るか、標準的な保護基によって保護され得るか、もしくはさらなるヌクレオチドへのさらなる結合を作るために活性化され得るか、または、固体もしくは半固体の担体にコンジュゲートされ得る。５’末端および３’末端のＯＨは、リン酸化され得るか、またはアミンもしくは１から２０炭素原子の有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、一般に当技術分野において知られている類似の形態のリボース糖またはデオキシリボース糖を含有し得、これには、例えば、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−アリルリボース、２’−フルオロリボース、または２’−アジドリボース、炭素環式の糖類似体、アルファアノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース、またはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、および脱塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。１つまたは複数のホスホジエステル結合は、代替的な結合基によって置き換えることができる。これらの代替的な結合基には、限定はしないが、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、ＲまたはＲ’のそれぞれは、独立して、Ｈであるか、または、エーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含有してよい、置換されたもしくは置換されていないアルキル（１〜２０Ｃ）である）によって置き換えられている実施形態が含まれる。ポリヌクレオチド内の全ての結合が同一である必要はない。前述のことは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書において言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００５７】
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において用いられる場合、通常、短い、通常は一本鎖の、通常は合成のポリヌクレオチドを言い、これは通常、約２００ヌクレオチド未満の長さであるが、必ずしもそうではない。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、相互排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の記載は、オリゴヌクレオチドに等しくかつ完全に適用される。
【００５８】
本明細書において用いられるヌクレオチド配列についての言及は、別段の特定がない限り、その相補体を含む。したがって、特定の配列を有する核酸への言及は、文脈によって別段の定義がない限り、その相補配列を有するその相補鎖を含むと理解される。
【００５９】
「細胞」または「細胞系」には、本明細書において用いられる場合、本発明のヘテロ二量体タンパク質、ポリペプチド、または核酸を発現させるために用いることができる様々なタイプの細胞、例えば、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、ラット細胞、ヒト細胞が含まれる。
【００６０】
用語「精製」およびその文法上の変型は、ポリペプチドおよび１つまたは複数の不純物を含有する混合物から少なくとも１つの不純物を完全にまたは部分的に除去し、それによって組成物におけるポリペプチドの純度レベルを向上させる（すなわち、組成物における不純物（単数または複数）の量（ｐｐｍ）を減少させることによって）ことを意味するように用いられる。本発明によると、精製は、免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドまたは免疫グロブリン様ヒンジ領域およびＣＨ３領域のうちの１つまたは複数の静電気的状態に基づいて分離する少なくとも１つの精製ステップを用いて行われる。一部の実施形態において、少なくとも１つの精製ステップは、イオン交換クロマトグラフィーを含むか、またはイオン交換クロマトグラフィーから本質的になる。
【００６１】
用語「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」は、目的のイオン化可能な溶質（例えば、混合物内の目的のタンパク質）が適切なｐＨ条件および伝導性のもとで（例えば、共有結合による付着によって）固相イオン交換材料に結合している逆電荷のリガンドと相互作用して、その結果、目的の溶質が混合物内の溶質不純物または溶質汚染物質よりも多くまたは少なく荷電化合物と非特異的に相互作用するようになる、クロマトグラフィープロセスを言う。混合物内の汚染溶質は、イオン交換材料のカラムから洗浄され得るか、または樹脂に結合し得るか、または目的の溶質よりも速くもしくは遅く樹脂から除去され得る。「イオン交換クロマトグラフィー」には、具体的には、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、および混合モードクロマトグラフィーが含まれる。
【００６２】
「ブロック」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害するかまたは低減させる抗体である。「アゴニスト抗体」は、本明細書において用いられる場合、目的のポリペプチドの機能的活性の少なくとも１つを模倣する抗体である。
【００６３】
用語「免疫エフェクター細胞」または「エフェクター細胞」は、本明細書において用いられる場合、標的細胞の生存能力に影響するように活性化され得る、ヒト免疫系における細胞の天然レパートリー内の細胞を言う。標的細胞の生存能力には、細胞の生存、増殖、および／または他の細胞と相互作用する能力が含まれる。
【００６４】
本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体に向けられた実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」と言及する記載には、「Ｘ」の記載が含まれる。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。
【００６５】
実施形態が「含む」という語を用いて本明細書において記載されている場合は常に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という観点で記載されている他の類似の実施形態もまた提供されることが理解される。
【００６６】
本発明の態様または実施形態がマーカッシュグループまたは選択肢の他のグルーピングの観点で記載されている場合、本発明は、列挙されるグループ全体をまとめて含むだけではなく、グループの各メンバーも個別に含み、メイングループの全ての考えられるサブグループも含み、また、グループメンバーの１つまたは複数が非存在のメイングループも含む。本発明はまた、特許請求の範囲に記載の発明におけるグループメンバーのいずれかの１つまたは複数を明確に排除することを想定する。
【００６７】
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。典型的な方法および材料が本明細書において記載されるが、本明細書において記載されるものに類似または同等の方法および材料もまた、本発明の実施または試験において用いることができる。本明細書において言及される全ての刊行物および他の参考文献は、参照によってその全体が組み込まれる。矛盾するケースでは、定義を含む、本明細書が優先される。多くの文献が本明細書において引用されるが、この引用は、これらの文献のいずれかが当技術分野における共通の一般知識の一部を形成することの承認を構成するものではない。本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変型は、言及された整数または整数群を含むことを含意するがいかなる他の整数または整数群も排除するものではないことが理解される。文脈により別段の定めがない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。材料、方法、および例は、例示的なものにすぎず、限定することを意図しない。
【００６８】
ヘテロ多量体タンパク質
文脈により別段の指示がある場合を除き、用語「第１の」ポリペプチドおよび「第２の」ポリペプチドならびにその変型は、一般的な識別子にすぎず、本発明のヘテロ多量体タンパク質、例えばヘテロ二量体タンパク質の、特異的なまたは特定のポリペプチドまたは構成要素を同定すると考えられるものではない。
【００６９】
一態様において、本発明は、ヒンジ領域を含むヘテロ多量体タンパク質、例えばヘテロ二量体タンパク質を提供し、ここで、ヒンジ領域は、共に相互作用して、ヘテロ二量体の形成を促進するように操作されたヒンジ境界を形成する、第１の免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドおよび第２の免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドを含み、すなわち、第１の免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドおよび第２の免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドは、第１の免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドまたは第２の免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドが同様のヒンジ（すなわち、第１と第１、または第２と第２）ポリペプチドと相互作用してホモ二量体ヒンジ領域を形成するよりも速くかつ／または優れた親和性もしくは安定性で相互作用してヘテロ二量体ヒンジ領域を形成する傾向がある。本発明の一部の実施形態において、１つまたは複数の荷電アミノ酸は、それらがホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に静電気的に有利となるようにヒンジ境界内の１つまたは複数の他のアミノ酸と相互作用するように、ヒンジ境界内で存在するかまたは操作されている。
【００７０】
一部の実施形態において、ヒンジ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭヒンジ領域である。一部の実施形態において、ヒンジ領域は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物のＩｇＧ領域である。一部の実施形態において、ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４ヒンジ領域、またはそのキメラ型である。
【００７１】
本発明の一部の実施形態またはヘテロ二量体タンパク質において、第１のヒンジポリペプチドは、野生型ＩｇＧヒンジ領域に対する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、ここで、野生型アミノ酸は、第２のヒンジポリペプチドにおける対応するアミノ酸と逆の電荷を有するアミノ酸で置き換えられている。本発明の一部の実施形態またはヘテロ二量体タンパク質において、第１のヒンジポリペプチドは、野生型ＩｇＧヒンジ領域に対する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含み、第２のヒンジポリペプチドは、第１のヒンジポリペプチドにおけるアミノ酸修飾と近接しているか、並んでいるか、または同一の位置にある、野生型ＩｇＧヒンジ領域に対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、ここで、第２のヒンジポリペプチドにおける野生型アミノ酸は、第１のヒンジポリペプチドにおける対応するアミノ酸と逆の電荷を有するアミノ酸で置き換えられている。当業者には容易に理解されるように、ヒンジポリペプチドは三次元構造を形成し、したがって、ヒンジ領域におけるアミノ酸は、必ずしも、帯電などによる非共有結合により「相互作用する」ために、ヒンジ領域における１つまたは複数の他のアミノ酸と近接するかまたは並ぶように線状配列で同一である必要も連続している必要もない。
【００７２】
別の態様において、本発明はまた、ヒンジ領域およびＣＨ３領域を含むヘテロ二量体タンパク質を提供する。一部の実施形態において、ＣＨ３領域は、ホモ二量体の形成を不安定化するようにおよびヘテロ二量体の形成を促進するように操作されている。一部の実施形態において、操作されたＣＨ３領域は、ホモ二量体の形成にとって静電気的に不利ではない。一部の実施形態において、ヒンジ領域およびＣＨ３領域の両方は、ホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成に静電気的に有利となるように操作されている。
【００７３】
別の態様において、本発明はまた、ヒンジ領域を含むヘテロ多量体Ｆｃ融合タンパク質、例えばヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供し、ここで、ヒンジ領域は、遭遇して共に相互作用して、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の形成を促進するように操作されたヒンジ境界を形成する、第１の免疫グロブリンヒンジポリペプチドおよび第２の免疫グロブリンヒンジポリペプチドを含み、ヒンジ境界内の１つまたは複数の荷電アミノ酸は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の形成を静電気的に促進する。ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の例には、限定はしないが、二重特異的抗体、単一特異的抗体、および多重特異的抗体が含まれる。一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は抗体である。他の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は抗体ではない。
【００７４】
別の態様において、本発明はまた、ヒンジ領域を含む二重特異的抗体を提供し、ここで、ヒンジ領域は、遭遇して共に相互作用して、二重特異的抗体の形成を促進するように操作されたヒンジ境界を形成する、第１の免疫グロブリンヒンジポリペプチドおよび第２の免疫グロブリンヒンジポリペプチドを含み、ヒンジ境界内の１つまたは複数の荷電アミノ酸は、二重特異的抗体の形成を静電気的に促進する。
【００７５】
別の態様において、本発明はまた、ヒンジ領域およびＣＨ３領域を含む二重特異的抗体またはＦｃ融合ヘテロ二量体タンパク質を提供し、ここで、ヒンジ領域および／またはＣＨ３領域は、ホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成に有利となるように操作されている。一部の実施形態において、ヒンジ領域は、ホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成に静電気的に有利となるように操作されている。一部の実施形態において、操作されたＣＨ３領域は、ホモ二量体の形成にとって静電気的に不利ではない。
【００７６】
別の態様において、本発明はまた、ヒンジ領域およびＣＨ３領域を含む二重特異的抗体またはＦｃ融合ヘテロ二量体タンパク質を提供し、ここで、ＣＨ３領域は、ホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成に有利となるように操作されている。一部の実施形態において、操作されたＣＨ３領域は、ホモ二量体の形成にとって静電気的に不利ではない。
【００７７】
一部の実施形態において、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、２つの抗体断片、例えばＦｃまたはＦｃ融合ポリペプチドなどを含み得る。Ｆｃ融合ポリペプチドは、通常、異種ポリペプチド配列、例えば限定はしないが抗原結合ドメインなどに融合した、Ｆｃ配列（またはその断片）を含む。１つの典型的なＦｃ融合ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ配列に融合した受容体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（例えば、ＩｇＧ２  Ｆｃに融合したＦｉｔ受容体ＥＣＤ）である。
【００７８】
一部の実施形態において、ヒンジ領域（例えば、限定はしないが、ヒトＩｇＧ４、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ１ヒンジ領域）におけるアミノ酸修飾（単数または複数）は、ヒンジ領域の任意の１つまたは複数の残基で生じる。一部の実施形態において、アミノ酸修飾（単数または複数）は、ヒンジ領域の２１６位、２１７位、２１８位、２１９位、２２０位、２２１位、２２２位、２２３位、２２４位、２２５位、２２６位、２２７位、２２８位、２２９位、および２３０位（Ｋａｂａｔのナンバリングスキーム）の１つまたは複数で生じる。
【００７９】
一部の実施形態において、ＣＨ３領域（例えば、限定はしないが、ヒトＩｇＧ４、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ１のＣＨ３領域）におけるアミノ酸修飾（単数または複数）は、ＣＨ３領域の任意の１つまたは複数の残基で生じる。一部の実施形態において、アミノ酸修飾（単数または複数）は、ＣＨ３領域の３４１位、３４２位、３４３位、３４４位、３４５位、３４６位、３４７位、３４８位、３４９位、３５０位、３５１位、３５２位、３５３位、３５４位、３５５位、３５６位、３５７位、３５８位、３５９位、３６０位、３６１位、３６２位、３６３位、３６４位、３６５位、３６６位、３６７位、３６８位、３６９位、３７０位、３７１位、３７２位、３７３位、３７４位、３７５位、３７６位、３７７位、３７８位、３７９位、３８０位、３８１位、３８２位、３８３位、３８４位、３８５位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、３９１位、３９２位、３９３位、３９４位、３９５位、３９６位、３９７位、３９８位、３９９位、４００位、４０１位、４０２位、４０３位、４０４位、４０５位、４０６位、４０７位、４０８位、４０９位、４１０位、４１１位、４１２位、４１３位、４１４位、４１５位、４１６位、４１７位、４１８位、４１９位、４２０位、４２１位、４２２位、４２３位、４２４位、４２５位、４２６位、４２７位、４２８位、４２９位、４３０位、４３１位、４３２位、４３３位、４３４位、４３５位、４３６位、４３７位、４３８位、４３９位、４４０位、４４１位、４４２位、４４３位、４４４位、４４５位、４４６位、および４４７位（Ｋａｂａｔのナンバリングスキーム）の１つまたは複数で生じる。
【００８０】
一部の実施形態において、ヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域）におけるアミノ酸修飾（単数または複数）は、２１９、２２１、２２７、および２２８から選択される位置で生じる。一部の実施形態において、ヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域）におけるアミノ酸修飾（単数または複数）は、２２１および２２８から選択される位置で生じる。一部の実施形態において、ＣＨ３領域（例えば、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域）におけるアミノ酸修飾（単数または複数）は、３４９、３６８、４０５、および４０９から選択される位置で生じる。一部の実施形態において、ＣＨ３領域におけるアミノ酸修飾（単数または複数）には、Ｋ４０９Ｒ、Ｌ３６８Ｄ、および／またはＬ３６８Ｅが含まれる。一部の実施形態において、アミノ酸修飾は、ヒンジ領域における２２１位および２２８位（例えば、（Ｄ２２１ＲまたはＤ２２１Ｅ）および（Ｐ２２８ＲまたはＰ２２８Ｅ））ならびにヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域における４０９位または３６８位（例えば、Ｋ４０９ＲまたはＬ３６８Ｅ）で生じる。
【００８１】
一部の実施形態において、ヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域）におけるアミノ酸修飾は、２２２、２２３、２２５、２２７、および２２８から選択される位置にある。一部の実施形態において、ヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域）におけるアミノ酸修飾は、２２３、２２５、および２２８から選択される位置にある。一部の実施形態において、ＣＨ３領域（例えば、ヒトＩｇＧ２のＣＨ３領域）におけるアミノ酸修飾は、３４９、３６８、４０５、および４０９から選択される位置にある。一部の実施形態において、ＣＨ３領域（例えば、ヒトＩｇＧ２のＣＨ３領域）におけるアミノ酸修飾は、３６８および４０９から選択される位置にある。一部の実施形態において、ＣＨ３領域におけるアミノ酸修飾（単数または複数）には、Ｋ４０９Ｒ、Ｌ３６８Ｄ、および／またはＬ３６８Ｅが含まれる。一部の実施形態において、アミノ酸修飾は、ヒンジ領域における２２３位、２２５位、および２２８位（例えば、（Ｃ２２３ＥまたはＣ２２３Ｒ）、（Ｅ２２５ＥまたはＥ２２５Ｒ）、および（Ｐ２２８ＥまたはＰ２２８Ｒ））ならびにヒトＩｇＧ２のＣＨ３領域における４０９位または３６８位（例えば、Ｋ４０９ＲまたはＬ３６８Ｅ）で生じる。
【００８２】
一部の実施形態において、ヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域）におけるアミノ酸修飾は、２１７および２２８から選択される位置にある。一部の実施形態において、ヒンジ領域におけるアミノ酸修飾（単数または複数）には、２２８位での修飾が含まれる。
【００８３】
別の態様において、本発明はまた、ホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に静電気的に有利となるように操作されたヒンジ領域を含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｆｃ領域（例えば、ヒンジ領域、またはヒンジ領域およびＣＨ３領域）における１つまたは複数の修飾されたアミノ酸を含み、これは、ヘテロ二量体の形成を静電気的に促進し得る。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３領域に修飾を含まない。一部の実施形態において、Ｆｃ配列の一部（しかし全てではない）は、本発明の抗体に存在しない。これらの実施形態の一部において、存在しないＦｃ配列は、ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインの少なくとも一部であり、一部のケースでは全てである。
【００８４】
一部の実施形態において、ヘテロ二量体のヒンジ領域および／またはＣＨ３領域は、表１の１〜６７行目において示される置換の組み合わせのいずれかを含む。一部の実施形態において、第１のヒンジポリペプチドおよび／またはＣＨ３ポリペプチドは、表１において示される置換の組み合わせのいずれかを含む。一部の実施形態において、第２のヒンジポリペプチドおよび／またはＣＨ３ポリペプチドは、表１において示される置換の組み合わせのいずれかを含む。表１において、位置は太字で示される（すなわち、ヒンジの２２１位、２２３位、２２５位、および２２８位、ならびにＣＨ３の３６８位および４０９位）。１〜１５行目は、ＩｇＧ１のヒンジおよび／またはＩｇＧ２のＣＨ３において生じる置換に対応する。１６〜６３行目は、ＩｇＧ２のヒンジおよび／またはＣＨ３において生じる置換に対応する。６４〜６７行目は、ＩｇＧ４のヒンジにおいて生じる置換に対応する。Ｅ／Ｄは、ＣＨ３ポリペプチドにおける３６８位の、ＧｌｕまたはＡｓｐでの置換を示す。
【００８５】
【表１−１】
2013529084.tif 000003
【００８６】
【表１−２】
2013529084.tif 000004
本発明の別の態様において、本明細書において記載されるヘテロ二量体タンパク質（例えば二重特異的抗体）は、完全長ヒト抗体を含み、ヘテロ二量体タンパク質の第１の抗体可変ドメインはヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原に特異的に結合することによってヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することができ、ヘテロ二量体タンパク質の第２の抗体可変ドメインは標的抗原に特異的に結合することができる。一部の実施形態において、ヒト抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。一部の実施形態において、ヘテロ二量体タンパク質は、免疫学的に不活性のＦｃ領域を含む。
【００８７】
ヒト免疫エフェクター細胞は、当技術分野において知られている様々な免疫エフェクター細胞のいずれかであり得る。例えば、免疫エフェクター細胞は、限定はしないがＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、ヒトリンパ細胞系のメンバーであり得る。免疫エフェクター細胞はまた、例えば、限定はしないが、限定はしないが単球、好中性顆粒球、および樹状細胞を含む、ヒト骨髄系のメンバーであり得る。このような免疫エフェクター細胞は、標的細胞に対する細胞傷害効果もしくはアポトーシス効果、またはエフェクター抗原の結合による活性化での他の所望の効果を有し得る。
【００８８】
エフェクター抗原は、ヒト免疫エフェクター細胞上に発現する抗原（例えば、タンパク質またはポリペプチド）である。ヘテロ二量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体タンパク質または二重特異的抗体）によって結合され得るエフェクター抗原の例には、限定はしないが、ヒトＣＤ３（またはＣＤ３（分化クラスター）複合体）、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２５、ＣＤ６４、およびＣＤ８９が含まれる。
【００８９】
標的細胞は、非変性のまたはヒトに対して外来の細胞であり得る。非変性標的細胞では、細胞は、悪性細胞となるように形質転換されているかまたは病理学的に修飾されている（例えば、ウイルス、マラリア原虫、または細菌に感染した非変性標的細胞）。外来標的細胞では、細胞は、細菌、マラリア原虫、またはウイルスなどの侵入病原体である。
【００９０】
標的抗原は、病的状態（例えば、炎症性疾患、増殖性疾患（例えば癌）、免疫障害、神経疾患、神経変性疾患、自己免疫疾患、感染性疾患（例えば、ウイルス感染または寄生体感染）、アレルギー反応、移植片対宿主疾患、または宿主対移植片疾患）にある標的細胞上で発現する。標的抗原は、エフェクター抗原ではない。標的抗原の例には、限定はしないが、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＣＣＲ５（５型ケモカイン受容体）、ＣＤ１９、ＨＥＲ（ヒト上皮成長因子受容体）−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＣＩｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、フコシルＧＭ１、Ｐｏｌｙ  ＳＡ、ＧＤ２、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｈｈ（ソニック・ヘッジホッグ）、Ｗｕｅ−１、血漿細胞抗原、（膜結合型）ＩｇＥ、ＭＣＳＰ（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−アルファ前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカーおよびＩＩ型ＭＩＳ（ミュラー管阻害物質）受容体、ｓＴｎ（シアル化型Ｔｎ抗原、ＴＡＧ−７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＬＧ、ＳＡＳ、ならびにＣＤ６３が含まれる。
【００９１】
一部の実施形態において、本明細書において記載されるヘテロ二量体タンパク質（例えば二重特異的抗体）は、完全長ヒト抗体を含み、ここで、ヘテロ二量体タンパク質の第１の抗体可変ドメインは、ヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原（例えばＣＤ３抗原）に特異的に結合することによってヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することができ、ヘテロ二量体タンパク質の第２の抗体可変ドメインは、標的抗原（例えば、ＣＤ２０抗原またはＥｐＣＡＭ）に特異的に結合することができ、ヘテロ二量体タンパク質の第１の抗体可変ドメインおよび第２の抗体可変ドメインの両方は、ヒンジ領域における２２１位および２２８位（例えば、（Ｄ２２１ＲまたはＤ２２１Ｅ）および（Ｐ２２８ＲまたはＰ２２８Ｅ））およびＣＨ３領域における４０９位または３６８位（例えば、Ｋ４０９ＲまたはＬ３６８Ｅ）にアミノ酸修飾を含む。
【００９２】
一部の実施形態において、本明細書において記載されるヘテロ二量体タンパク質（例えば二重特異的抗体）は、完全長ヒト抗体を含み、ここで、ヘテロ二量体タンパク質の第１の抗体可変ドメインは、ヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原（例えばＣＤ３抗原）に特異的に結合することによってヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することができ、ヘテロ二量体タンパク質の第２の抗体可変ドメインは、標的抗原（例えば、ＣＤ２０抗原またはＥｐＣＡＭ）に特異的に結合することができ、ヘテロ二量体タンパク質の第１の抗体可変ドメインおよび第２の抗体可変ドメインの両方は、ヒンジ領域における２２３位、２２５位、および２２８位（例えば、（Ｃ２２３ＥまたはＣ２２３Ｒ）、（Ｅ２２５ＥまたはＥ２２５Ｒ）、および（Ｐ２２８ＥまたはＰ２２８Ｒ））およびＣＨ３領域における４０９位または３６８位（例えば、Ｋ４０９ＲまたはＬ３６８Ｅ）にアミノ酸修飾を含む。
【００９３】
本発明の別の態様において、本明細書において開示されるヘテロ二量体タンパク質は、例えばＰＣＴ公開ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７において記載されているような既知の技術を用いて、対象に投与する際の免疫原性が低減するように脱免疫化することができる。
【００９４】
他の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、別のポリペプチドまたは分子作用物質に結合した本明細書において開示されるヘテロ二量体ポリペプチド、例えば二重特異的抗体の全てまたは一部分を含む、融合抗体またはイムノアドヘシンを作製することなどによって、修飾または誘導体化することができる。本明細書において開示されるヘテロ多量体ポリペプチド、例えばヘテロ二量体ポリペプチド（例えば二重特異的抗体）は、例えばインビボでの半減期を延長するために、さらに安定な融合分子を生産することによって、および／または、一般に「ペグ化」と呼ばれる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生体適合性ポリマーでの処理によって、または当技術分野においてよく知られている多くの他の操作方法のいずれかによって、修飾または誘導体化することができる。
【００９５】
ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、よく知られている技術を用いて、限定はしないがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基またはエチル基、エステル、糖質基などを含む、化学基で誘導体化することができる。これらの化学基（および、インビボでの安定性治療化合物に用いられている、それと同様の他のもの）は、ヘテロ二量体ポリペプチドの生物学的特徴を向上させるため、例えば、血清での半減期および生物活性を増大させるために有用である。
【００９６】
ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質はまた、当技術分野において知られている多数の方法のいずれかを用いて標識することができる。本明細書において用いられる場合、用語「標識」または「標識された」は、別の分子を抗体内に組み込むことを言う。一実施形態において、標識は、検出可能なマーカーであり、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組み込み、または、ポリペプチドへの、マークされたアビジン（例えば、光学的方法または比色分析方法によって検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部分の付着である。別の実施形態において、標識またはマーカーは治療的であってもよく、例えば、薬剤コンジュゲートまたは毒素であってもよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野において知られており、用いることができる。ポリペプチドの標識の例には、限定はしないが、放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、第２のレポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、第２の抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、磁気物質、例えばガドリニウムキレート、毒素、例えば百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体またはホモログが含まれる。一部の実施形態において、標識には様々な長さのスペーサーアームが付着して、潜在的な立体障害の可能性を低減させる。
【００９７】
核酸、ベクター、および細胞
本発明はまた、修飾された免疫グロブリン様ヒンジ配列またはＦｃ関連配列を含む本明細書において開示されるポリペプチドをコードする核酸分子および核酸配列を含む。一部の実施形態において、異なる核酸分子が、本明細書において開示されるヘテロ二量体タンパク質、例えば二重特異的抗体の、１つまたは複数の鎖または一部をコードする。他の実施形態において、同一の核酸分子が、本明細書において開示されるヘテロ二量体タンパク質をコードする。
【００９８】
一態様において、本発明は、本明細書において開示されるヘテロ二量体タンパク質の鎖の１つまたは上記のその一部をコードする核酸配列を提供する。本発明の核酸分子には、本発明の核酸配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％、またはそれ以上同一なものなどの、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸が含まれる。
【００９９】
核酸配列の文脈における用語「配列同一性パーセント」は、最大の対応でアラインした場合に同一である、２つの配列における残基を意味する。配列同一性の比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約１８ヌクレオチド、さらに通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、さらに典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも約３６、４８、またはそれ以上のヌクレオチドの長さにわたり得る。ヌクレオチド配列の同一性を測定するために用いることができる、当技術分野において知られている多くの異なるアルゴリズムが存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎのプログラムである、ＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較することができる。例えばプログラムＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含むＦＡＳＴＡは、クエリー配列とおよびサーチ配列との間の最良のオーバーラップの領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する（参照によって本明細書に組み込まれる、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３〜９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５〜２１９（２０００）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７〜２５８（１９９６）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７６：７１〜８４（１９９８））。別段の特定がない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムのデフォルトパラメータが用いられる。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトパラメータ（語長６およびスコアリングマトリクスのためのＮＯＰＡＭ因子）と共に用いて、またはＧａｐを、参照によって本明細書に組み込まれるＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１において提供されるそのデフォルトパラメータと共に用いて、決定することができる。
【０１００】
さらなる態様において、本発明は、本明細書において開示されるヘテロ多量体タンパク質もしくはヘテロ二量体タンパク質の鎖もしくは一部の１つもしくは複数または本明細書において記載されるその一部をコードする核酸配列を含むベクターを提供する。
【０１０１】
さらなる態様において、本発明は、本明細書において開示されるヘテロ二量体タンパク質の鎖もしくは一部の１つもしくは複数または本明細書において記載されるその一部を発現させるために適切なベクターを提供する。
【０１０２】
別の実施形態において、本発明の核酸分子は、特定のアミノ酸配列のプローブまたはＰＣＲプライマー、例えばヒンジ配列および重鎖ドメイン配列などにおける特異的抗体配列として用いられる。例えば、核酸は、診断方法におけるプローブとして、または、有用な配列をコードするさらなる核酸分子を単離するためにとりわけ用いることができるＤＮＡ領域を増幅するためのＰＣＲプライマーとして用いることができる。一部の実施形態において、核酸分子はオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、目的の抗体の重鎖および軽鎖のヒンジ領域および定常ドメイン領域に由来する。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、本明細書において記載される本発明のヘテロ二量体ポリペプチド、例えば二重特異的抗体、またはその断片の修飾されたヒンジ領域の１つまたは複数の全てまたは一部分をコードする。
【０１０３】
本発明の組換え発現ベクターは、一部の実施形態において、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有し得る。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、タンパク質の所望の発現レベルなどなどの因子に依存し得ることは、当業者に理解されよう。哺乳動物宿主細胞の発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマに由来する、プロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびに強力な哺乳動物プロモーター、例えば非変性免疫グロブリンプロモーターおよびアクチンプロモーターが含まれる。ウイルスの調節エレメントのさらなる説明およびその配列については、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号、米国特許第４，５１０，２４５号、および米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。プロモーターおよびベクターの記載を含む、植物において抗体を発現させるための方法、および植物の形質転換は、当技術分野において知られている。例えばＵＳ６，５１７，５２９を参照されたい。細菌細胞または真菌細胞、例えば酵母細胞においてポリペプチドを発現させる方法もまた、当技術分野においてよく知られている。
【０１０４】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子などの、さらなる配列を有し得る。選択マーカー遺伝子によって、ベクターが導入されている宿主細胞の選択が容易になる（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，６３４，６６５号、および米国特許第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する。例えば、選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサートの選択／増幅と共にｄｈｆｒ−宿主細胞において用いるため）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８の選択のため）、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子が含まれる。
【０１０５】
用語「発現制御配列」は、本明細書において用いられる場合、それらがライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングを生じさせるために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列には、適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列、およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質のｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳の効率を増強させる配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強させる配列；ならびに必要な場合には、タンパク質の分泌を増強させる配列が含まれる。このような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物においては、このような制御配列には通常、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が含まれ、真核生物においては、通常、このような制御配列にはプロモーターおよび転写終結配列が含まれる。用語「制御配列」は、最低でも、その存在が発現およびプロセシングに必須である、全ての構成要素を含み、また、その存在が有利であるさらなる構成要素、例えばリーダー配列および融合パートナー配列を含み得ることが意図される。
【０１０６】
ヘテロ多量体タンパク質を生産する方法
一態様において、本発明は、第１の免疫グロブリン様Ｆｃ領域と第２の免疫グロブリン様Ｆｃ領域（例えば、ヒンジ領域、ＣＨ３領域、またはヒンジ領域およびＣＨ３領域）との間の境界を改変または操作することによって、所望のヘテロ多量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質、例えばＦｃ融合タンパク質の形成を増強するための戦略を提供する。一部の実施形態において、ヒンジ境界を形成する１つまたは複数の残基は、荷電残基の間の静電気的相互作用がホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に静電気的に有利となるように、荷電残基で置き換えられている。さらなる実施形態において、ＣＨ３境界を形成する１つまたは複数の残基は、ＣＨ３境界の間の相互作用がホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成をさらに促進するように、荷電残基でさらに置き換えられている。一部の実施形態において、操作されたＣＨ３境界は、ホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に静電気的に有利である。一部の実施形態において、操作されたＣＨ３境界は、ホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体形成に立体的に有利である。他の実施形態において、操作されたＣＨ３境界は、ホモ二量体の形成を不安定化させるが、ホモ二量体の形成にとって静電気的に不利ではない。
【０１０７】
一部の実施形態において、本明細書において開示される第１のヒンジ領域および第１のＣＨ３領域に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むヘテロ二量体タンパク質の形成は、このような修飾を有さない野生型ヘテロ二量体タンパク質と比較して実質的に増大している。一部の実施形態において、第１のヒンジ領域および第１のＣＨ３領域に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むヘテロ二量体タンパク質の形成は、このような修飾を有さない野生型ヘテロ二量体タンパク質と比較して、少なくとも約５１％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％のいずれかである。一部の実施形態において、ヒンジ領域におけるアミノ酸修飾（単数または複数）は、２１７、２１８、２１９、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、および２２８から選択される位置で生じる。一部の実施形態において、ＣＨ３領域におけるアミノ酸修飾（単数または複数）は、３４９、３６８、４０５、および４０９から選択される位置で生じる。
【０１０８】
一部の実施形態において、本明細書において開示される第１のヒンジ領域および第２のヒンジ領域の両方ならびに第１のＣＨ３領域および第２のＣＨ３領域の両方に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むヘテロ二量体タンパク質の形成は、このような修飾を有さない野生型ヘテロ二量体タンパク質と比較して実質的に増大している。一部の実施形態において、第１のヒンジ領域および第２のヒンジ領域の両方ならびに第１のＣＨ３領域および第２のＣＨ３領域の両方に１つまたは複数のアミノ酸修飾を含むヘテロ二量体タンパク質の形成は、このような修飾を有さない野生型ヘテロ二量体タンパク質と比較して、少なくとも約５１％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％のいずれかである。一部の実施形態において、ヒンジ領域におけるアミノ酸修飾（単数または複数）は、２１７、２１８、２１９、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、および２２８から選択される位置で生じる。一部の実施形態において、ＣＨ３領域におけるアミノ酸修飾（単数または複数）は、３４９、３６８、４０５、および４０９から選択される位置で生じる。
【０１０９】
別の態様において、本発明はまた、本発明のヘテロ多量体タンパク質、例えばヘテロ二量体タンパク質を生産する方法を提供する。
【０１１０】
一部の実施形態において、本方法は、ａ）修飾されたＦｃ領域（例えば、ヒンジ領域および／またはＣＨ３領域）を含む第１のポリペプチドをコードする核酸分子、および修飾されたＦｃ領域（例えば、ヒンジ領域および／またはＣＨ３領域）を含む第２のポリペプチドをコードする同一のまたは異なる核酸分子を含む宿主細胞を培養するステップであって、培養された宿主細胞が第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを発現するステップ、ならびにｂ）宿主細胞培養物からヘテロ多量体タンパク質、例えばヘテロ二量体タンパク質を回収するステップを含む。一部の実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、２つの異なるＦｃ融合ポリペプチドである。一部の実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、２つの異なる抗体重鎖である。一部の実施形態において、宿主細胞はさらに、別のポリペプチド、例えば軽鎖を発現する。一部の実施形態において、軽鎖は、両方の重鎖と会合し得る。２つの異なる重鎖と単一の軽鎖を共発現させる方法は、例えば以下の実施例３において詳細に記載される。
【０１１１】
一部の実施形態において、本方法は、ａ）第１の宿主細胞において第１のポリペプチドを発現させるステップ、ｂ）第２の宿主細胞において第２のポリペプチドを発現させるステップ、ｃ）ステップａ）の第１のポリペプチドおよびステップｂ）の第２のポリペプチドを単離するステップ、ならびにｄ）ステップｃ）の２つのポリペプチドおよびステップｃ）の単離されたポリペプチドを多量体の形成、例えば二量体化に適した条件下でインキュベートして、ヘテロ多量体タンパク質、例えばヘテロ二量体タンパク質を生産するステップを含む。一部の実施形態において、分子または抗体は、適切な還元剤（例えばグルタチオン）を含有する生理食塩水内に混合することができる。任意の適切な生理食塩水および適切なｐＨ、例えば、ダルベッコリン酸緩衝溶液（Ｄ−ＰＢＳ）を含むものを用いることができる。一部の実施形態において、第１の宿主細胞および／または第２の宿主細胞はさらに、別のポリペプチド、例えば軽鎖を発現する。
【０１１２】
当業者は、よく知られている技術を用いて、明細書において開示される方法に従って用いるための、分子または抗体の相対量を容易に決定することができる。
【０１１３】
本明細書において開示される方法において、インキュベーションは、様々な温度で行うことができる。このような温度は、当業者によって認識され、例えば、混合された分子または抗体において変性または分解などの有害な物理的変化が生じないインキュベーション温度を含む。一部の実施形態において、インキュベーションは３７℃で行われる。
【０１１４】
多くの宿主細胞のいずれも、本発明の方法において用いることができる。このような細胞は、当技術分野において知られている（このうちの一部は、本明細書において記載されている）か、または、当技術分野において知られている通常の技術を用いて、本発明の方法における使用に対する適合性に関して経験的に決定することができる。一部の実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞はグラム陰性細菌細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、内因性プロテアーゼ活性を欠いた株のものである。一部の実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞の遺伝子型は、ｄｅｇＰ遺伝子およびｐｒｃ遺伝子を欠き、突然変異ｓｐｒ遺伝子を有する。本発明の他の実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【０１１５】
一部の実施形態において、本発明の方法はさらに、宿主細胞におけるその発現が本発明の二重特異的抗体またはヘテロ二量体タンパク質の収率を増強させる分子をコードするポリヌクレオチドまたは組換えベクターを宿主細胞において発現させるステップを含む。例えば、このような分子は、シャペロンタンパク質であり得る。一実施形態において、前記分子は、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＧ、およびＦｋｐＡからなる群から選択される原核性ポリペプチドである。これらの方法の一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤｓｂＡおよびＤｓｂＣの両方をコードする。
【０１１６】
非ハイブリドーマ宿主細胞、およびタンパク質を組換え的に生産する方法
一態様において、本発明は、本発明の抗体またはその一部の組換え発現を可能にする組換え宿主細胞を提供する。このような組換え宿主細胞においてこのような組換え発現によって生産される抗体は、本明細書において、「組換え抗体」と呼ばれる。本発明はまた、このような宿主細胞の子孫細胞、およびこれによって生産される抗体を提供する。用語「組換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）は、本明細書において用いられる場合、組換え発現ベクターが導入されている細胞を意味する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」が特定の対象細胞だけではなくこのような細胞の子孫も意味することを理解されたい。特定の修飾が突然変異または環境的影響に起因してその後の世代において生じ得るため、このような子孫は、実際は、親細胞に同一ではない可能性があるが、本明細書において用いられる用語「宿主細胞」の範囲内にやはり含まれる。このような細胞は、上記の本発明に従ったベクターを含み得る。
【０１１７】
別の態様において、本発明は、上記の抗体またはその一部を作成するための方法を提供する。一実施形態に従うと、前記方法は、上記のベクターでトランスフェクトまたは形質転換された細胞を培養するステップ、および前記抗体またはその一部を回収するステップを含む。抗体をコードする核酸分子およびこれらの核酸分子を含むベクターを、適切な哺乳動物宿主細胞、植物宿主細胞、細菌宿主細胞、または酵母宿主細胞のトランスフェクションに用いることができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための任意の既知の方法によるものであり得る。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は、当技術分野においてよく知られており、デキストランを用いるトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンを用いるトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチド（単数または複数）のカプセル化、および核内へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションを含む。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞内に導入することができる。細胞を形質転換する方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，９１２，０４０号、米国特許第４，７４０，４６１号、および米国特許第４，９５９，４５５号を参照されたい。植物細胞を形質転換する方法は、当技術分野においてよく知られており、例えば、アグロバクテリウムを用いる形質転換、微粒子銃形質転換、直接的な注射、エレクトロポレーション、およびウイルス形質転換を含む。細菌細胞および酵母細胞を形質転換する方法もまた、当技術分野においてよく知られている。
【０１１８】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は、当技術分野においてよく知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系を含む。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、および多くの他の細胞系が含まれる。特に好ましい細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有するかを決定することを介して選択される。用いることができる他の細胞系は、昆虫細胞系、例えばＳｆ９細胞またはＳｆ２１細胞である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現を、またはさらに好ましくは、宿主細胞が成長する培地内への抗体の分泌を可能にするために十分な時間にわたり、宿主細胞を培養することによって生産される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収することができる。適切な植物宿主細胞には、例えば、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アオウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどが含まれ得る。適切な細菌宿主細胞には、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種が含まれ得る。適切な酵母宿主細胞には、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれ得る。
【０１１９】
生産細胞系からの本発明のポリペプチドまたはその一部の発現は、多くの既知の技術を用いて増強させることができる。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下での発現を増強させるための一般的なアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号、欧州特許第０２５６０５５号、欧州特許第０３２３９９７号、および欧州特許第０３３８８４１号に関連して、全体または一部が議論されている。
【０１２０】
異なる細胞系によってまたはトランスジェニック動物において発現される、ＦｃポリペプチドまたはＦｃ領域および免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドを含むポリペプチド、例えば抗体は、そのグリコシル化パターンが互いに異なる可能性が高い。免疫グロブリン様ヒンジ配列を含むポリペプチドの全てのヘテロ二量体、二重特異的ポリペプチド、抗体などを含む、本発明のポリペプチドの全てのこのような「糖型」は、そのグリコシル化状態にかかわらず、さらに一般的にはいかなる翻訳後修飾（単数または複数）の存在または非存在にかかわらず、本発明の一部であると考えられる。
【０１２１】
ヘテロ多量体タンパク質を精製する方法
別の態様において、本発明は、クロマトグラフィーによって免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドもしくは免疫グロブリン様ヒンジ領域および／またはＣＨ３領域の１つまたは複数の静電気的状態（例えば、電荷の差）に基づいてヘテロ二量体タンパク質を精製する方法を提供する。免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドもしくは免疫グロブリン様ヒンジ領域および／またはＣＨ３領域の１つまたは複数の静電気的状態（例えば、電荷の差）に基づいてヘテロ二量体タンパク質およびホモ二量体タンパク質を含む混合物からヘテロ二量体タンパク質を単離するクロマトグラフィー方法が、本明細書において開示される。静電気的状態または電荷の差は、イオン強度および／またはｐＨレベルによって影響され得る。
【０１２２】
クロマトグラフィーには、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーが含まれる。液相クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ（高性能（または高圧）液体クロマトグラフィー）およびＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィー））を用いて、上記に開示されるクロマトグラフィーを実施することができる。アフィニティークロマトグラフィーのためのカラムの例には、タンパク質Ａ（合成の、組換えの、または非変性の）カラムおよびプロテインＧ（合成の、組換えの、または非変性の）カラムが含まれる。
【０１２３】
一部の実施形態において、クロマトグラフィーから得られる精製されたヘテロ二量体タンパク質調製物は、純度が高く、すなわち、存在するホモ二量体は約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．１、０．０１パーセントのいずれか未満から０％である。一部の実施形態において、クロマトグラフィーはイオン交換クロマトグラフィーである。
【０１２４】
一部の実施形態において、精製されるヘテロ二量体タンパク質は、Ｆｃ領域が共に相互作用してＦｃ境界を形成する第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドを含み、Ｆｃ境界内の１つまたは複数の荷電アミノ酸の間の静電気的相互作用がホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に有利である、免疫グロブリン様Ｆｃ領域を含み、ここで、精製は、免疫グロブリン様ヒンジポリペプチドもしくは免疫グロブリン様ヒンジ領域およびＣＨ３領域の１つまたは複数の静電気的状態に基づいて分離する少なくとも１つの精製ステップを用いて行われる。一部の実施形態において、少なくとも１つの精製ステップは、イオン交換クロマトグラフィー方法の１つのステップを含むかまたはこれから本質的になる。一部の実施形態において、精製ステップは、イオン交換クロマトグラフィー方法の１つのステップからなる。Ｆｃ領域が共に相互作用してＦｃ境界を形成する第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドを含み、Ｆｃ境界内の１つまたは複数の荷電アミノ酸の間の静電気的相互作用がホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に有利である免疫グロブリン様Ｆｃ領域を含むヘテロ二量体タンパク質を精製するための任意の他の適切な方法を用いて、本明細書において開示され本発明によって包含されるヘテロ多量体タンパク質、例えばヘテロ二量体を精製することができる。
【０１２５】
一部の実施形態において、精製されるヘテロ二量体タンパク質は、ヒンジ領域が共に相互作用してヒンジ境界を形成する第１のヒンジポリペプチドおよび第２のヒンジポリペプチドを含み、ヒンジ境界内の１つまたは複数の荷電アミノ酸の間の静電気的相互作用がホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に有利である、免疫グロブリン様ヒンジ領域を含み、ここで、精製は、ヒンジ領域が共に相互作用してヒンジ境界を形成する第１のヒンジポリペプチドおよび第２のヒンジポリペプチドを含み、ヒンジ境界内の１つまたは複数の荷電アミノ酸の間の静電気的相互作用がホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に有利である免疫グロブリン様ヒンジ領域を含むヘテロ二量体タンパク質を精製するイオン交換クロマトグラフィー方法の１つのステップを含むかまたはこれから本質的になる。一部の実施形態において、精製ステップは、イオン交換クロマトグラフィー方法のステップからなる。
【０１２６】
一部の実施形態において、精製されるヘテロ二量体タンパク質は、ＣＨ３領域が共に相互作用してＣＨ３境界を形成する第１のＣＨ３ポリペプチドおよび第２のＣＨ３ポリペプチドを含み、ＣＨ３境界内の１つまたは複数の荷電アミノ酸の間の静電気的相互作用がホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に有利である、免疫グロブリン様ＣＨ３領域を含み、ここで、精製は、ＣＨ３領域が共に相互作用してＣＨ３境界を形成する第１のＣＨ３ポリペプチドおよび第２のＣＨ３ポリペプチドを含み、ＣＨ３境界内の１つまたは複数の荷電アミノ酸の間の静電気的相互作用がホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に有利である免疫グロブリン様ＣＨ３領域を含むヘテロ二量体タンパク質を精製するイオン交換クロマトグラフィー方法のステップを含むかまたはこれから本質的になる。一部の実施形態において、精製ステップは、イオン交換クロマトグラフィー方法のステップからなる。
【０１２７】
ヘテロ多量体タンパク質を用いる方法
本発明はまた、本明細書において記載されるヘテロ多量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体ポリペプチドまたは二重特異的抗体）のための様々な治療用途を提供する。一態様において、ヘテロ多量体タンパク質は、第１のタンパク質（例えば、第１のヒト抗体可変ドメイン）をエフェクター抗原に結合させることによって、および第２のタンパク質（例えば、第２のヒト抗体可変ドメイン）を標的抗原に結合させることによって様々な疾患（例えば、癌、自己免疫疾患、またはウイルス感染）を治療するために用いることができる。例えば、ヘテロ多量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体ポリペプチドまたは二重特異的抗体）は、細胞傷害性を向け直すため、血栓溶解剤を凝血塊に送達するため、免疫毒素を腫瘍細胞に送達するため、または酵素活性化されたプロドラッグを標的部位（例えば腫瘍）で変換させるために用いることができる。
【０１２８】
別の態様において、ヘテロ多量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体ポリペプチドまたは二重特異的抗体）は、治療物質の特異性を増大させるためおよび／または相乗的なもしくはさらなる経路（例えば、代謝経路または生化学的経路）を調節するために用いることができる。例えば、ヘテロ多量体タンパク質（例えば、ヘテロ二量体ポリペプチドまたは二重特異的抗体）は、受容体／受容体、受容体／リガンド、リガンド／リガンド、細胞／細胞、リガンド／ペイロード、受容体／ペイロード、または単一受容体を結びつけることができる。
【０１２９】
医薬組成物
一態様において、本発明は、薬学的に許容できる担体内に本発明のヘテロ多量体ポリペプチド、例えばヘテロ二量体ポリペプチド、例えば二重特異的抗体、または上記のその一部を含む、医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、中性形態（両性イオン形態を含む）で存在し得るか、または正もしくは負に荷電した種として存在し得る。一部の実施形態において、ポリペプチドは、対イオンと複合して、１つまたは複数のポリペプチドおよび１つまたは複数の対イオンを含む複合体を言う「薬学的に許容できる塩」を形成してもよく、ここで、対イオンは、薬学的に許容できる無機および有機の酸および塩基に由来する。
【０１３０】
ヘテロ二量体タンパク質またはその一部は、単独で、または本発明の１つもしくは複数の他のポリペプチドと組み合わせて、または１つもしくは複数の他の薬剤と組み合わせて（またはその任意の組み合わせとして）投与することができる。したがって本発明の医薬組成物、方法、および使用はまた、以下に詳述されるように、他の活性物質との組み合わせ（同時投与）の実施形態を含む。
【０１３１】
本明細書において用いられる場合、本発明の抗体および１つまたは複数の他の治療物質に関する、用語「同時投与」、「同時投与された」、および「と組み合わせて」は、以下を意味し、言い、かつ含むことを意図する：（ｉ）本明細書において開示されるヘテロ二量体および治療物質（単数または複数）のこのような組み合わせの、治療を必要としている前記患者への同時投与（この場合、前記構成要素はこれらの構成要素を患者にほぼ同時に放出する単回剤形に共に製剤化されている）、（ｉｉ）本明細書において開示されるヘテロ二量体および治療物質（単数または複数）のこのような組み合わせの、治療を必要としている前記患者へのほぼ同時の投与（この場合、前記構成要素は、患者によってほぼ同時に取り込まれ、そうすると前記構成要素が前記患者にほぼ同時に放出される、個別の剤形に互いに分かれて製剤化されている）、（ｉｉｉ）本明細書において開示されるヘテロ二量体および治療物質（単数または複数）のこのような組み合わせの、治療を必要としている前記患者への連続投与（この場合、前記構成要素は、各投与間の十分な時間間隔を伴って患者によって連続的な時点で取り込まれ、そうすると、前記構成要素が前記患者に実質的に異なる時点で放出される、個別の剤形に互いに分かれて製剤化されている）、ならびに（ｉｖ）本明細書において開示されるヘテロ二量体および治療物質（単数または複数）のこのような組み合わせの、治療を必要としている前記患者への連続投与（この場合、前記構成要素は、制御された様式で前記構成要素を放出し、そうすると、これらが、患者に同時におよび／または異なる時点で同時放出、連続放出、および／またはオーバーラップ放出され、ここで、各部分は、同一のまたは異なる経路で投与されてもよい、単回剤形に共に製剤化されている）。
【０１３２】
通常、本明細書において開示されるヘテロ二量体タンパク質またはその一部は、１つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤（単数または複数）と組み合わせた製剤として投与されることに適している。用語「賦形剤」は、本発明の化合物（単数または複数）以外の任意の成分を記載するために本明細書において用いられる。賦形剤（単数または複数）の選択は、特定の投与態様、溶解度および安定性に対する賦形剤の影響、ならびに剤形の性質などの因子に大きく依存する。本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容できる賦形剤」には、生理学的に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒質、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容できる賦形剤の一部の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組み合わせである。多くのケースにおいて、組成物内に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。薬学的に許容できる物質のさらなる例は、抗体の保存期間または有効性を増強させる、湿潤剤または微量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤、または緩衝剤である。
【０１３３】
本発明の医薬組成物およびその調製方法は、当業者に容易に明らかとなろう。このような組成物およびその調製方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５）において見ることができる。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件下で製造される。
【０１３４】
本発明の医薬組成物は、大量に、１つの単一単位用量で、または複数の単一単位用量で、調製、包装、または販売することができる。本明細書において用いられる場合、「単位用量」は、所定の量の活性成分を含む、医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、通常、対象に投与される活性成分の投与量、またはこのような投与量の都合の良い画分、例えばこのような投与量の２分の１または３分の１に等しい。当技術分野において認められている、ペプチド、タンパク質、または抗体を投与するためのあらゆる方法を、本明細書において開示されるヘテロ二量体タンパク質およびその一部に適切に採用することができる。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は、典型的には、非経口投与に適している。本明細書において用いられる場合、医薬組成物の「非経口投与」には、対象組織の物理的破壊および破壊を介する組織への医薬組成物の投与によって特徴付けされる、したがって通常は、血流内、筋肉内、または内臓内への直接的な投与をもたらす、あらゆる投与経路が含まれる。非経口投与には、したがって、限定はしないが、組成物の注射による、外科的切開を介する組成物の適用による、組織を貫通する非外科的な創傷を介する組成物の適用などによる、医薬組成物の投与が含まれる。具体的には、非経口投与には、限定はしないが、皮下の、腹腔内の、筋肉内の、胸骨内の、静脈内の、動脈内の、髄腔内の、脳室内の、尿道内の、頭蓋内の、滑液嚢内の注射または注入、および腎臓透析注入技術が含まれると考えられる。好ましい実施形態には、静脈内経路および皮下経路が含まれる。
【０１３６】
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、典型的には、通常、滅菌水または無菌の等張生理食塩水などの薬学的に許容できる担体と組み合わされた活性成分を含む。このような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で、調製、包装、または販売することができる。注射可能な製剤は、単位剤形で、例えばアンプル、または防腐剤を含有する多回用量容器で、調製、包装、または販売することができる。非経口投与のための製剤には、限定はしないが、懸濁液、溶液、油性媒体または水性媒体内のエマルジョン、ペーストなどが含まれる。このような製剤はさらに、限定はしないが懸濁剤、安定剤、または分散剤を含む、１つまたは複数のさらなる成分をさらに含み得る。非経口投与のための製剤の一実施形態において、活性成分は、適切な媒体（例えば、発熱性物質を有さない滅菌水）で再構成して、その後、再構成された組成物を非経口投与するために、乾燥（すなわち、粉末または粒状）形態で提供される。非経口製剤にはまた、塩、炭水化物、および緩衝剤（好ましくは３から９のｐＨまで）などの賦形剤を含有し得る水性溶液が含まれるが、一部の適用では、非経口製剤は、無菌の非水性溶液として、または発熱性物質を有さない滅菌水などの適切な媒体と組み合わせて用いるための乾燥形態として、さらに適切に製剤化することができる。典型的な非経口投与形態には、無菌の水溶液、例えば水性プロピレングリコール溶液またはデキストロース溶液内の、溶液または懸濁液が含まれる。このような剤形は、必要に応じて、適切に緩衝することができる。有用な他の非経口投与可能な製剤には、微晶質形態のまたはリポソーム調製物内の活性成分を含むものが含まれる。非経口投与のための製剤は、即時放出および／または調節放出となるように製剤化することができる。調節放出製剤には、制御放出製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、標的放出製剤、およびプログラム放出製剤が含まれる。例えば、一態様において、無菌の注射可能な溶液は、所要の量のヘテロ二量体タンパク質、例えば二重特異的抗体を、上記に列挙された成分の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒内に組み込み、必要であればその後、濾過滅菌することによって、調製することができる。通常、分散は、活性化合物を、塩基性分散媒質および上記に列挙されたもののうち所要の他の成分を含有する無菌媒体内に組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末のケースでは、好ましい調製方法は、活性成分の粉末と、先に無菌濾過されたその溶液からの任意のさらなる所望の成分とをもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆を用いることによって、分散のケースでは所要の粒子サイズを維持することによって、および境界活性剤を用いることによって、維持することができる。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物内に含めることによってもたらされ得る。
【０１３７】
本発明の典型的な非限定的な医薬組成物は、約５．０から約６．５の範囲のｐＨを有し、約１ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの本明細書において開示されるヘテロ二量体タンパク質、約１ミリモル濃度から約１００ミリモル濃度のヒスチジン緩衝液、約０．０１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、約１００ミリモル濃度から約４００ミリモル濃度のトレハロース、および約０．０１ミリモル濃度から約１．０ミリモル濃度のＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物を含む無菌水溶液としての製剤である。
【０１３８】
投薬レジメンは、最適な所望の応答をもたらすように調節することができる。例えば、単一のボーラスを投与することができるか、複数の分割用量を経時的に投与することができるか、または用量を、急迫的な治療的状況によって指示されたように比例的に低減もしくは増大させることができる。投与の容易性および投与量の均一性のために、非経口組成物を投薬単位形態に製剤化することが、基本的に有利である。投薬単位形態は、本明細書において用いられる場合、治療される患者／対象のための単位投与量として適した物理的に個別の単位を言い、各単位は、所要の薬学的担体と組み合わされた、所望の治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の投薬単位形態の仕様は、通常、（ａ）化学療法物質の固有の特徴および達成されるべき特定の治療的効果または予防的効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療のためのこのような活性化合物の配合の当技術分野に特有の限定によって、およびこれらに直接的に応じて、決定される。
【０１３９】
したがって、当業者には、本明細書において提供される開示に基づいて、用量および投薬レジメンが治療分野においてよく知られている方法に従って調節されることが理解されよう。すなわち、最大耐用量を容易に確定することができ、検出可能な治療的利益を患者にもたらす効果的な量もまた、検出可能な治療的利益を患者にもたらすために各作用物質を投与するための時間的要件と同様に、確定することができる。したがって、特定の用量および投与レジメンが本明細書において例示されるが、これらの例は、本発明の実施において患者に提供され得る用量および投与レジメンを限定するものでは全くない。
【０１４０】
投与量値が、軽減されるべき状態のタイプおよび重症度で変化し得、単回用量または複数回用量を含み得ることに留意されたい。任意の特定の対象について、特異的な投薬レジメンが、個体の要求および組成物を投与するかまたは投与を監督する人の専門的な判断に従って経時的に調節されるべきであること、ならびに本明細書において説明される投与量範囲は典型的なものにすぎず、特許請求される組成物の範囲または実施を限定することを意図しないこともまた理解されたい。さらに、本発明の組成物を用いる投薬レジメンは、疾患のタイプ、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重症度、投与経路、および採用される特定の抗体を含む、様々な因子に基づき得る。したがって、投薬レジメンは広く変化し得るが、標準的な方法を用いて通常通りに決定することができる。例えば、用量は、毒性効果などの臨床効果および／または実験値を含み得る薬物動態学的または薬力学的なパラメータに基づいて調節することができる。したがって、本発明は、当業者によって決定される、患者内での用量増加を含む。適切な投与量およびレジメンの決定は、関連する分野においてよく知られており、本明細書において開示される教示を提供された当業者には、包含されることが理解されよう。
【０１４１】
ヒト対象への投与では、本明細書において開示されるヘテロ二量体タンパク質の毎月用量の全量は、典型的には、当然のことながら投与態様に応じて、患者当たり約０．５から約１２００ｍｇの範囲である。例えば、静脈内の毎月用量は、患者当たり約１から約１０００ｍｇを要し得る。毎月用量の全量は、単回用量または分割用量で投与することができ、医師の指示で、本明細書によって示される典型的な範囲から外れてもよい。
【０１４２】
本明細書において開示されるヘテロ二量体タンパク質、例えば二重特異的抗体またはその一部の治療上または予防上効果的な量の典型的な非限定的範囲は、１カ月当たり患者当たり約１から約１０００ｍｇである。一部の実施形態において、ヘテロ二量体タンパク質は、１カ月当たり患者当たり約１から約２００または約１から約１５０ｍｇで投与することができる。
【実施例】
【０１４３】
以下の実施例は、ヒンジ領域のみに、ヒンジ領域およびＣＨ３領域の両方に、またはＣＨ３領域のみに突然変異を含むヘテロ二量体タンパク質の構築、生成、および精製を記載する。以下の実施例は、本発明の方法および材料を説明するためのものである。当業者には自明の、当技術分野において通常見られる、記載された条件およびパラメータの適切な変更および適合は、本発明の趣旨および範囲の内にある。
【０１４４】
【表１−３】
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【０１４５】
（実施例１）ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４抗体突然変異体クローンの生成
ＰＣＲ突然変異生成
この実施例および以下の他の実施例において、ヒトＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、およびＩｇＧ４抗体の突然変異体クローンをＰＣＲ突然変異生成によって生成した。ヒトＩｇＧ２抗体の突然変異体クローンでは、ＩｇＧ２ΔＡ  Ｆｃ領域（図２の配列番号１）を有する抗抗原Ａ抗体（Ａｂ１とも呼ばれる）を、ＰＣＲ反応の２つのステップで鋳型として用いた（反応当たり約０．０５μｇ）（図４）。野生型ＩｇＧ２のＦｃ領域と比較して、このＩｇＧ２ΔＡは、Ａ３３０Ｓ置換およびＰ３３１Ｓ置換を有する。この実施例において記載される全てのＰＣＲ反応で、ＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｋｉｔ（カタログ番号６００２５０）を用い、最終ｄＮＴＰ濃度は０．５ｍＭであった。
【０１４６】
第１のステップにおいて、２つの個別のＰＣＲ反応ＡおよびＢが存在した。反応Ａにおいて、第１のプライマー対ｈＦｃ２．ｆ（フォワードプライマー、表２の配列番号２）およびｈＦｃ２．ヒンジ．ｒ（リバースプライマー、表２の配列番号３）をそれぞれ４０ｐｍｏｌで用いた。反応Ｂにおいて、第２のプライマー対ｈＦｃ２．ヒンジ．ｍｕｔＡ１．ｆ（突然変異を含有するフォワードプライマー、表２の配列番号４）およびＮｏｔ．ｈＦｃ２．ｒ（リバースプライマー、表２の配列番号５）をそれぞれ４０ｐｍｏｌで用いた。フォワードプライマーｈＦｃ２．ヒンジ．ｍｕｔＡ１．ｆは、野生型ＩｇＧ２ヒンジ領域と比較して、突然変異した核酸を含み、所望の突然変異がヒンジ領域内に導入されていた。本明細書において記載されるＰＣＲ反応のアニーリング温度は５４℃である。ＰＣＲ反応において用いられるプライマーは、縮重ヌクレオチドを含み、すなわち、配列内の「Ｓ」はプライマー内のＣまたはＧを表し、「Ｒ」はプライマー内のＡまたはＧを表す。
【０１４７】
反応Ａおよび反応Ｂから得られるＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号２８７０６）によってゲル精製し、３０μｌのＥＢ緩衝液内でさらに溶出した。
【０１４８】
ＰＣＲ反応の第２のステップにおいて、反応Ａおよび反応Ｂから得られる２．５μｌの精製されたＰＣＲ産物をそれぞれ、まずプライマーを加えずに８サイクル増幅し、次に、以下のプライマー（それぞれ４０ｐｍｏｌ）を用いて２０サイクルを行った：フォワードプライマー：ｈＦｃ２．ｆ（配列番号２）およびリバースプライマー：Ｎｏｔ．ｈＦｃ２．ｒ（配列番号５）。本明細書において記載されるＰＣＲ反応のアニーリング温度は５４℃である。
【０１４９】
第２のステップから得られるＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号２８７０６）によってゲル精製し、３０μｌのＥＢ緩衝液内でさらに溶出した。精製されたＰＣＲ産物をＡｐａＩおよびＮｏｔＩによって消化し、ｐＣｉ．Ｄｂ．３ＸＦＬＡＧ．Ａｂ１．ｈＦｃ１ベクターまたはｐＣｉ．Ｄｂ．ＨＡ．Ａｂ１．ｈＦｃ１ベクター内にさらにクローニングした（図３）。
【０１５０】
多くの異なる突然変異含有プライマー（配列番号６〜１０）を用いて、第１のステップのＰＣＲ反応においてｈＦｃ２．ｈｉｎｇｅ．ｍｕｔＡ１．ｆを置き換え、異なる突然変異をヒンジ領域内に導入した。ＣＨ３領域にＫ４０９Ｒ置換を有するヒトＩｇＧ２ΔＡ抗体の突然変異体であるＩｇＧ２ΔＡ（Ｋ４０９）もまた、ヒトＩｇＧ２ΔＡ抗体の鋳型を置き換えるための鋳型として用いて、異なる突然変異をヒンジ領域内に生じさせた。
【０１５１】
ＩｇＧ１およびＩｇＧ４抗体突然変異体を、先に記載した手順と基本的に同一の手順を用いて、ＰＣＲ突然変異生成プロセスによって生成させた。ヒトＩｇＧ１抗体の突然変異体クローンでは、ＣＨ３領域にＫ４０９Ｒ置換を有する抗体Ａｂ１  ＩｇＧ１をコードするＤＮＡ（図４の配列番号１１）をＰＣＲ鋳型として用いた。ヒトＩｇＧ４抗体の突然変異体クローンでは、野生型抗体Ａｂ１  ＩｇＧ４のＦｃ領域（図５の配列番号１２）をＰＣＲ鋳型として用いた。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４突然変異体クローンの生成に用いたプライマーを、表２に列挙する。
【０１５２】
突然変異体クローン
複数の突然変異体クローンを、ヒンジ領域に突然変異残基を有するヒトＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、およびＩｇＧ４抗体について生成した。ヒトＩｇＧ４抗体の突然変異体クローンでは、野生型Ｆｃヒンジ領域内の残基Ｓｅｒ２２８（図６Ａの下線を引かれた残基を参照されたい）を、図６Ｂの表に列挙する突然変異体クローンにおける正に荷電した残基（ＬｙｓまたはＡｒｇ、グループＡ）または負に荷電した残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ、グループＢ）に突然変異させた。グループＡＩおよびＢＩにおけるヒトＩｇＧ２抗体の突然変異体クローンでは、ＩｇＧ２と比較してＡ３３０Ｓ置換およびＰ３３１Ｓ置換を有するヒトＩｇＧ２ΔＡ抗体を鋳型として用いた。グループＡＩおよびＢＩにおける突然変異体クローンでは、ＣＨ３領域にＫ４０９Ｒ置換を有するヒトＩｇＧ２ΔＡ抗体突然変異体であるＩｇＧ２ΔＡ（Ｋ４０９）を鋳型として用いた。図６Ａにおいて下線を引かれている、抗体鋳型のヒンジ領域内の３つの残基Ｃｙｓ２２３、Ｇｌｕ２２５、およびＰｒｏ２２８を、正に荷電した残基（ＡｒｇまたはＬｙｓ）または負に荷電した残基（ＧｌｕまたはＡｓｐ）にそれぞれ突然変異させて、図６Ｂの表に列挙する突然変異体クローンを生産した。上記のヒトＩｇＧ１抗体の突然変異体クローンでは、ヒトＩｇＧ１（Ｋ４０９Ｒ）突然変異体を鋳型として用い、図６Ａにおいて下線を引かれている、ヒンジ領域内の残基Ｓｅｒ２２１およびＰｒｏ２２８をそれぞれ、正に荷電した残基（ＡｒｇまたはＬｙｓ）または負に荷電した残基（ＧｌｕまたはＡｓｐ）に突然変異させて、図６Ｂの表に列挙する突然変異体クローンを生成させた。
【０１５３】
異なるＦｃ領域を有する突然変異体を区別するために、ＩｇＧ４のグループＡの突然変異体ならびにＩｇＧ２のグループＡＩおよびＡＩＩの突然変異体を、Ｎ末端３ｘＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＧＬＥ、配列番号５３）をさらに含むように操作し、一方、ＩｇＧ４のグループＢの突然変異体ならびにＩｇＧ２のグループＢＩおよびＢＩＩの突然変異体を、Ｎ末端ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＬＥ、配列番号５４）をさらに含むように操作した。
【０１５４】
【表２】
2013529084.tif 000006
【０１５５】
（実施例２）ＩｇＧ４ヒンジ含有ヘテロ二量体
この実施例は、突然変異体ＩｇＧ４ヒンジを含有するヘテロ二量体タンパク質を記載する。
【０１５６】
ヒトＩｇＧ４抗体のグループＡおよびグループＢの突然変異体を共に混合して、４つの異なる組み合わせ対（図７Ｂに示される）とした。各対を、懸濁培養液内で成長させた２９３Ｆ細胞内に、抗体Ａｂ１軽鎖と共にコトランスフェクトした。簡潔に述べると、２９３Ｆ細胞を、三角フラスコ（８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ）内の２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地内に１×１０６個細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクション（５０ｍｌのトランスフェクションに基づく量は、必要に応じて増やすことができる）のために、２．５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭをまず２×１５ｍｌの試験管に添加した。５０μｇのＤＮＡ（重鎖Ａ：重鎖Ｂ：軽鎖＝１．５：１．５：２）を次に試験管Ａに添加した。１ｍｇ／ｍｌのトランスフェクション試薬溶液１００ｕｌを試験管Ｂに添加した。試験管Ａおよび試験管Ｂ内の材料を共に混合し、ＲＴで１５分間インキュベートした。ＤＮＡ−トランスフェクション試薬複合体溶液を細胞に添加し、次に、細胞をインキュベーターに戻した。２４時間後、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１の２０％ｗ／ｖのストック１．２５ｍｌを添加し、細胞をインキュベーターに戻した。上清を５日後に採取した。トランスフェクション試薬を、それを水中に１ｍｇ／ｍｌまで溶解し、ｐＨをＨＣｌで２．５未満に調節することによって、調製した。溶解した後、ｐＨをさらに７．０に調節し、その後、０．２２μｍの濾過を行った（分注および−２０℃での保管）。Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１を２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地内で２０％ｗ／ｖのストックとし、その後、０．２２μｍの濾過を行った（４℃での保管）。
【０１５７】
各調製物における全タンパク質を、プロテインＧカラム上でのイムノアフィニティー精製を用いて分離した（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇアガロース、Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２０３９９；ＩｇＧ溶出緩衝液、Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２１００４；例えば、ＢｊｏｒｃｋおよびＫｒｏｎｖａｌｌ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１３３）：９６９〜９７４（１９８４）を参照されたい）。各調製物における二重特異的抗体のパーセンテージを、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。簡潔に述べると、プレートを抗ＨＡで被覆し、検出抗体は抗ＦＬＡＧであった。野生型ＩｇＧ４領域を有する抗体Ａｂ１を、同じ様式で発現および精製し、また、野生型ＩｇＧ４は約５０％の二重特異的抗体を天然に形成するため、前記抗体をＥＬＩＳＡアッセイのための標準対照として用いた（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ  Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（３１７）：１５５４〜１５５７（２００７）；Ａａｌｂｅｒｓｅ  ＲＣら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１０５）：９〜１９（２００２））。
【０１５８】
二重特異的抗体を検出するために、各調製物から精製された全タンパク質０．１μｇ／ｍｌを、１μｇ／ｍｌの抗ＨＡタグ抗体を有する各ＥＬＩＳＡプレートに添加した。各調製物における二重特異的抗体を、ＨＲＰにコンジュゲートした抗ＦＬＡＧ抗体と反応させることによって検出した。
【０１５９】
ＥＬＩＳＡアッセイの結果（図７Ａ）は、ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域におけるホモ二量体と比較してヘテロ二量体のヒンジ領域の間の有利な静電気的相互作用に基づいてヘテロ二量体の形成を進めるための、１つまたは複数の突然変異の導入が、ヘテロ二量体抗体の形成の安定化を促進し、したがって、野生型ＩｇＧ４抗体のみを用いる同一の手順よりも多くの二重特異的抗体を生産したことを示す。
【０１６０】
（実施例３）ＩｇＧ２ヒンジ含有ヘテロ二量体
ヒトＩｇＧ２抗体のグループＡＩの突然変異体およびグループＢＩの突然変異体を共に混合して、３つの異なる組み合わせ対１Ａ、１Ｂ、および１Ｃ（図８Ｂに示される）とした。各対を、２９３細胞内に、抗体Ａｂ１軽鎖と共にコトランスフェクトした。ヒトＩｇＧ２抗体のグループＡＩＩの突然変異体およびグループＢＩＩの突然変異体もまた共に混合して、３つの異なる組み合わせ対２Ａ、２Ｂ、および２Ｃ（図８Ｂに示される）とした。各対を、懸濁２９３細胞内に、抗体Ａｂ１軽鎖と共にコトランスフェクトした。上清を５日後に採取した。各調製物内の全タンパク質を、プロテインＧカラムによって精製した。各調製物における二重特異的抗体のパーセンテージを、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。野生型ＩｇＧ２のＦｃ領域を有する抗体Ａｂ１を、同じ様式で発現および精製し、ＥＬＩＳＡアッセイのための標準対照として用いた。実施例１において記載されているように、１Ａ、１Ｂ、および１Ｃにおける全ての突然変異体は、野生型ＩｇＧ２ΔＡのＣＨ３領域を有し、２Ａ、２Ｂ、および２Ｃにおける全ての突然変異体は、ＩｇＧ２ΔＡのＣＨ３領域にＫ４０９Ｒ突然変異を有する。
【０１６１】
二重特異的抗体を検出するために、各調製物から精製された全タンパク質０．１μｇ／ｍｌを、１μｇ／ｍｌの抗ＨＡタグ抗体を有するＥＬＩＳＡプレートに添加した。各調製物における二重特異的抗体を、ＨＲＰにコンジュゲートした抗ＦＬＡＧ抗体によって検出した。
【０１６２】
ＥＬＩＳＡアッセイの結果（図８Ａ）は、ヒトＩｇＧ２ΔＡ抗体のＣＨ３領域におけるＫ４０９突然変異の導入が、ヘテロ二量体抗体の形成の促進を助けたことを示す。
【０１６３】
（実施例４）Ｋ４０９Ｒバックグラウンドにおけるヘテロ二量体の形成を促進するＩｇＧ２ヒンジ突然変異のスクリーニング
ヒトＩｇＧ２抗体のグループＡＩＩの突然変異体およびグループＢＩＩの突然変異体を組み合わせて、６つの異なる組み合わせ対Ａ〜Ｆ（図９Ｂに示される）とした。クローンの各対を、２９３細胞内に、抗体Ａｂ１軽鎖と共にコトランスフェクトした。上清を５日後に採取した。各調製物内の全タンパク質を、プロテインＧカラムによって精製した。各調製物における二重特異的抗体のパーセンテージを、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。野生型ＩｇＧ２のＦｃ領域を有する抗体Ａｂ１および野生型ＩｇＧ４のＦｃ領域を有する抗体Ａｂ１を、同じ様式で発現および精製し、両者を対照としてＥＬＩＳＡアッセイに用いた。この実施例における全ての突然変異体クローンは、ＩｇＧ２ΔＡのＣＨ３領域にＫ４０９Ｒ突然変異を有する。
【０１６４】
二重特異的抗体を検出するために、各調製物から精製された全タンパク質０．１７μｇ／ｍｌを、１μｇ／ｍｌの抗ＨＡタグ抗体を有するＥＬＩＳＡプレートに添加した。各調製物における二重特異的抗体を、ＨＲＰにコンジュゲートした抗ＦＬＡＧ抗体によって検出した。
【０１６５】
ＥＬＩＳＡアッセイの結果（図９Ａ）は、Ｋ４０９Ｒバックグラウンドにおいて、３つのヒンジ突然変異Ｃ２２３Ｅ、Ｅ２２５Ｅ、およびＰ２２８Ｅが３つのヒンジ突然変異Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、およびＰ２２８Ｒと組み合わされている場合、すなわち、図９ＡのカラムＤの場合、本発明者らが、試験された他の突然変異の組み合わせよりも多い二重特異的抗体を観察したことを示す。
【０１６６】
（実施例５）ヒトＩｇＧ４のＣＨ３領域の「Ｇｌｕ」スキャン
ヒトＩｇＧ４抗体のＣＨ３領域の１４個の位置を、一連の「Ｇｌｕ」スキャン実験を実施するために選択した。これらの１４個の位置を選択するための基準は、基本的に、Ｗ．Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（３７）：９２６６〜９２７３（１９９８）において記載されている通りであった。「Ｇｌｕ」スキャンのために選択された位置を、図１０に示すように１〜１４とナンバリングした。全ての突然変異体は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、カタログ番号２００５２２）の部位特異的突然変異生成キットを用いて生成した。ＣＨ３領域における特異的突然変異を生じさせるために用いたプライマーを表３に列挙する。
【０１６７】
ＩｇＧ４突然変異体を生じさせるために用いた鋳型クローンは、Ｎ末端の３ｘＦＬＡＧタグを有しそのヒンジ領域にＳ２２８Ｒ突然変異を有する、Ａｂ１．３．１１Ａであった。
【０１６８】
図１１Ｂに列挙する全ての突然変異体クローンおよび鋳型クローンを、個別に発現および精製した。等量の、ヒンジ領域にＳ２２８Ｅ突然変異を有しＮ末端のＨＡタグを有する、Ａｂ１．３．２Ａタンパク質、および様々なＡｂ１．３．１１Ａ  ＣＨ３突然変異体を共に混合して、様々な組み合わせ（図１１Ｂ）とし、０．５ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）と共に３７℃で２４時間にわたりさらにインキュベートした。ＣＨ３領域突然変異を有さないＡｂ１．３．１１Ａ鋳型もまた、等量のＡｂ１．３．２Ａタンパク質と混合し、０．５ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）と共に３７℃で２４時間にわたりさらにインキュベートした（図１１Ａのカラム１５）。ＧＳＨ反応のためのプロトコールは、基本的に、Ｌａｂｒｉｊｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（２７）、７６７〜７７１（２００９）において記載されている通りであった。
【０１６９】
【表３】
2013529084.tif 000007
【０１７０】
各ＧＳＨ反応から得られたサンプルを、氷冷したＰＢＳ−ＴＢ（０．２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）内に希釈し、二重特異的抗体の量を、実施例２において記載されているようにサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。野生型ＩｇＧ４のＦｃ領域を有する抗体Ａｂ１をまた同じ様式で発現および処理し、ＥＬＩＳＡアッセイにおける標準対照（図１１Ａのカラム１６）として用いた。
【０１７１】
図１１Ａに示すように、ＩｇＧ４のＣＨ３領域における１４個の突然変異のいずれも、ＣＨ３領域突然変異を有さない鋳型クローンと比較して、二重特異的抗体の形成において有意な増大をもたらさなかった。
【０１７２】
（実施例６）ヒトＩｇＧ２のＣＨ３領域の「Ｇｌｕ」スキャン
ヒトＩｇＧ２抗体のＣＨ３領域の１４個の位置を、一連の「Ｇｌｕ」スキャン実験を実施するために選択した。これらの１４個の位置を選択するための基準は、基本的に、実施例５に記載した通りであった。「Ｇｌｕ」スキャンのために選択された位置を、図１０に示すように１〜１４とナンバリングした。全ての突然変異体は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの部位特異的突然変異生成キットによって生成した。
【０１７３】
ＩｇＧ２突然変異体を生じさせるために用いた鋳型は、Ｎ末端のＨＡタグを有し、野生型ＩｇＧ２ΔＡのＣＨ３領域を有し、かつＩｇＧ２ΔＡのヒンジ領域に３つの突然変異Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、およびＰ２２８Ｒを有する、Ａｂ１．１．３Ｄであった。
【０１７４】
図１２Ｂに列挙する全ての突然変異体および野生型対照を、個別に発現および精製した。等量の、ヒンジ領域に３つの突然変異Ｃ２２３Ｅ、Ｅ２２５Ｅ、およびＰ２２８Ｅを有し、Ｎ末端のＨＡタグを有する、Ａｂ１．２．２Ｈタンパク質、ならびに様々なＡｂ１．１．３Ｄ  ＣＨ３突然変異体（ＦＬＡＧタグ）を共に混合して、様々な組み合わせ（図１２Ｂ）とし、０．５ｍＭのＧＳＨと共に３７℃で２４時間にわたりさらにインキュベートした。各ＧＳＨ反応から得られたサンプルを、氷冷したＰＢＳ−ＴＢ（０．２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）内に希釈し、形成された二重特異的抗体の量を、実施例２において記載されているようにサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。野生型ＩｇＧ４のＦｃ領域を有する抗体Ａｂ１、野生型ＩｇＧ２ΔＡのＦｃ領域を有する抗体Ａｂ１、および突然変異体ＩｇＧ２ΔＡ（Ｋ４０９Ｒ）のＦｃ領域を有する抗体Ａｂ１を同じ様式で発現および処理し、ＥＬＩＳＡアッセイにおける対照として用いた。
【０１７５】
図１２Ａに示すように、Ａｂ１．２．２Ｈタンパク質（３つの突然変異Ｃ２２３Ｅ、Ｅ２２５Ｅ、およびＰ２２８Ｅ）とＡｂ１．１．３Ｄ．Ｌ３６８Ｅタンパク質（３つの突然変異Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、およびＰ２２８Ｒ）とを混合すると、二重特異的抗体の生産（図１２Ａのカラム６）は、他の組み合わせおよび対照と比較して有意に増大した。
【０１７６】
（実施例７）ヒンジ突然変異およびＣＨ３突然変異はヘテロ二量体の形成に寄与し得る
一部の突然変異体のＡｂ１重鎖可変領域を、ラムダ軽鎖を含む抗抗原Ｂ抗体である、異なる抗体Ａｂ２の重鎖可変領域で置き換えた。
【０１７７】
図１３Ｂに列挙する全ての突然変異体および野生型対照を、個別に発現および精製した。等量の、図１３Ｂに列挙する抗体１および図１３Ｂに列挙する抗体２を共に混合し、０．５ｍＭのＧＳＨの存在下または非存在下で、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。各ＧＳＨ反応から得られたアリコートを、氷冷したＰＢＳ−ＴＢ（０．２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）内に希釈し、二重特異的抗体の量を、基本的には実施例２において記載されているように、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１７８】
二重特異的抗体を検出するために、各ＧＳＨ反応物から精製された全タンパク質０．２５μｇ／ｍｌを、１μｇ／ｍｌの抗原Ｂで被覆したＥＬＩＳＡプレートに添加した。各調製物における二重特異的抗体の量を、ＨＲＰにコンジュゲートした抗カッパ抗体によって検出した。抗体Ａｂ１は、カッパ軽鎖を含む抗抗原Ａ抗体である。
【０１７９】
図１３Ａに示すように、２つの異なる野生型ヒトＩｇＧ２ΔＡ抗体を穏やかな還元条件下で共に混合した場合（Ａ）（１ｍＭのＧＳＨ）、二重特異的抗体は対照と比較して検出されなかった。実施例４の結果と同様に、Ｋ４０９Ｒバックグラウンドにおいて、３つのヒンジ突然変異Ｃ２２３Ｅ、Ｅ２２５Ｅ、およびＰ２２８Ｅを３つヒンジ突然変異Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、およびＰ２２８Ｒと組み合わせた場合、すなわち、図１３Ａの（Ｂ）の場合、二重特異的抗体の形成の増大が観察された。実施例７の結果と同様に、重鎖ＣＨ３領域の１つにおいてＫ４０９Ｒ突然変異をＬ３６８Ｅで置き換えると、二重特異的抗体の形成がさらに増大した（Ｃ）。クローンをＣＨ３領域における突然変異のみと組み合わせると（Ｄ）、二重特異的抗体はあまり検出されなかった。野生型ヒトＩｇＧ４を、ＥＬＩＳＡのための標準対照として用いた（カラムＥ）。
【０１８０】
（実施例８）ヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域の「Ｇｌｕ」スキャン
ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ３領域の１４個の位置を、一連の「Ｇｌｕ」スキャン実験を実施するために選択した。これらの１４個の位置を選択するための基準は、基本的に、実施例５に記載した通りである。「Ｇｌｕ」スキャンのために選択された位置を、図１０に示すように１〜１４とナンバリングした。全ての突然変異体は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの部位特異的突然変異生成キットによって生成した。
【０１８１】
ＩｇＧ１突然変異体を生じさせるために用いた鋳型は、野生型ＩｇＧ１のＣＨ３領域、ＩｇＧ１ヒンジ領域における２つの突然変異Ｄ２２１ＥおよびＰ２２８Ｅを有する、Ａｂ２．ｈＦｃ１．ＥＥであった。
【０１８２】
図１４Ｂに列挙する全ての突然変異体および野生型対照を、個別に発現および精製した。等量の、ＣＨ３領域にＫ４０９Ｒ突然変異を有し、ヒンジ領域に２つの突然変異Ｄ２２１ＲおよびＰ２２８Ｒを有する、Ａｂ１．ｈＦｃ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ  ＩｇＧ１タンパク質、ならびに様々なＡｂ２．ｈＦｃ１．ＥＥ  ＩｇＧ１  ＣＨ３突然変異体を共に混合し、０．５ｍＭのＧＳＨの存在下または非存在下で、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。各ＧＳＨ反応から得られたサンプルを、氷冷したＰＢＳ−ＴＢ（０．２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）内に希釈し、二重特異的抗体の量を、実施例２において記載されているようにサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。野生型ＩｇＧ４のＦｃ領域を有するＡｂ１およびＡｂ２を同じ様式で発現および処理し、ＥＬＩＳＡにおける対照として用いた。野生型ＩｇＧ４のＦｃ領域を有する抗体Ａｂ１および野生型ＩｇＧ４のＦｃ領域を有する抗体１１Ａを同じ様式で発現および処理し、ＥＬＩＳＡアッセイにおける対照として用いた。
【０１８３】
図１４Ｂに示すように、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインにおける非常にわずかな位置、すなわち、Ｙ３４９、Ｌ３６８、およびＦ４０５が、Ｇｌｕによって置換され、ＥＥ（Ｋ４０９Ｒ）突然変異体と組み合わされると、二重特異的抗体の形成をさらに増大させる（カラム２、６、および１２）。
【０１８４】
（実施例９）二重特異的抗体の形成の比較
この実施例は、ＩｇＧ１ヒンジ含有ヘテロ二量体の調製を説明し、二重特異的抗体の形成を他のアイソタイプと比較する。
【０１８５】
図１５Ｂに示す全ての突然変異体および野生型対照を、個別に発現および精製した。等量の抗体１および抗体２を共に混合し、０．５ｍＭのＧＳＨの存在下または非存在下で、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。各ＧＳＨ反応から得られたサンプルを、氷冷したＰＢＳ−ＴＢ（０．２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）内に希釈し、二重特異的抗体の量を、先に記載したようにサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１８６】
図１５Ａに示すように、ＩｇＧ１ヒンジ領域の２つの位置Ｄ２２１およびＰ２２８での突然変異の導入は、ＩｇＧ１二重特異的抗体の形成のレベルに顕著に影響した。位置Ｄ２２１における突然変異を除去すると、ＣＨ３突然変異と組み合わされていても（カラム１）、二重特異的抗体の形成が劇的に減少した。３つ全てのアイソタイプにおいて、ＩｇＧ１突然変異体は、最大レベルの二重特異的抗体を生成した（カラム２、３、および４を比較されたい）。標準対照は、先の実施例と同一であった。
【０１８７】
（実施例１０）ヘテロ二量体抗体の生成および精製
ＩｇＧ１ヘテロ二量体を、２２１Ｒ、２２８Ｒ、および４０９Ｒ突然変異を有する抗体１と、２２１Ｅ、２２８Ｅ、および３６８Ｅ突然変異を有する抗体２とを、ＰＢＳにおいて１ｍＭのＧＳＨと共に２４時間にわたり３７℃でインキュベートすることによって調製した。異なる抗体可変領域Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、およびＡｂ４をヘテロ二量体の調製に用いた。ＩｇＧ２ヘテロ二量体を、２２３Ｒ、２２５Ｒ、２２８Ｒ、および４０９Ｒ突然変異を有する抗体１と、２２３Ｅ、２２５Ｅ、２２８Ｅ、および３６８Ｅ突然変異を有する抗体２とを、ＰＢＳにおいて２ｍＭのＧＳＨと共に２４時間にわたり３７℃でインキュベートすることによって調製した。ヘテロ二量体を、以下に記載するようにイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。ＩｇＧ４ヘテロ二量体を、２２８Ｒ突然変異を有する抗体１と、２２８Ｅ突然変異を有する抗体２とを、ＰＢＳにおいて１ｍＭのＧＳＨと共に２４時間にわたり３７℃でインキュベートすることによって調製した。
【０１８８】
全てのヘテロ二量体を、イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。簡潔に述べると、Ｆｃヘテロ二量体およびＦｃホモ二量体の分析的イオン交換分離を、弱陽イオン交換ＤＩＯＮＥＸ  Ｐｒｏｐａｃ  ＷＣＸ−１０Ｇ（４×５０ｍｍ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ４ポンプＬＣ系（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｃ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で実施した。タンパク質を５％緩衝液Ａ（２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．４）内に注入し、２５％から７５％の勾配の緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．４、および５００ｍＭのＮａＣｌ）内で、１ｍｌ／分の流量で２０分間にわたり溶出した。Ｆｃヘテロ二量体の大規模な精製を、弱陽イオン交換ＤＩＯＮＥＸ  Ｐｒｏｐａｃ  ＷＣＸ−１０Ｇ（４×２５０ｍｍ）カラムを備えたＡｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ）で行った。タンパク質を５％緩衝液Ａ（２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．４）内に注入し、１５％から７５％の勾配の緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．４、および５００ｍＭのＮａＣｌ）内で、１ｍｌ／分の流量で６０分間にわたり溶出した。図１６Ａ〜２３Ｃを参照されたい。
【０１８９】
（実施例１１）ヘテロ二量体の形成に対するＣＨ３突然変異の効果
この実施例は、ヘテロ二量体タンパク質の形成に対する様々なＣＨ３突然変異および／またはヒンジ突然変異の効果を説明する。
【０１９０】
ａ）Ｌ３６８Ｄ、Ｌ３６８Ｅ、およびＫ４０９ＲでのＣＨ３突然変異、ならびに野生型ヒンジまたは突然変異体ヒンジ
図２４Ｂに示す抗体突然変異体をコードするプラスミドベクターを、上記の方法を用いて調製した。抗体Ａｂ２は、ラムダ軽鎖を含む抗抗原Ｂ抗体であり、抗体Ａｂ１は、カッパ軽鎖を含む抗抗原Ａ抗体である。この実施例において、突然変異がＩｇＧ１ヒンジにおいて生じた場合、突然変異はＤ２２１位およびＰ２２８位にあった。突然変異がＩｇＧ２ヒンジにおいて生じた場合、突然変異はＣ２２３、Ｅ２２５、およびＰ２２８にあった。この実施例において、突然変異体の一部は、ＣＨ３突然変異および野生型（ｗｔ）ヒンジを含有していた。他の突然変異体は、ヒンジ領域およびＣＨ３領域の両方に突然変異を含有していた。この実施例において、ＣＨ３突然変異は、Ｋ４０９Ｒ、Ｌ３６８Ｄ、およびＬ３６８Ｅから選択された。
【０１９１】
図２４Ｂに示すグループＡおよびグループＢの突然変異体を、個別に発現および精製した。組み合わせ対１〜１１を二重特異的抗体の形成について試験した。組み合わせ対１〜１１のそれぞれで、等量の、特定されたグループＡ抗体および対応するグループＢ抗体を共に混合し、０．５ｍＭのＧＳＨの存在下または非存在下で、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。各ＧＳＨ反応から得られたサンプルを、氷冷したＰＢＳ−ＴＢ（０．２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）内に希釈し、二重特異的抗体の量をサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。二重特異的抗体を検出するために、各ＧＳＨ反応物から精製された全タンパク質０．２５μｇ／ｍｌを、１μｇ／ｍｌの抗原Ｂで被覆したＥＬＩＳＡプレートに添加した。各調製物における二重特異的抗体の量を、ＨＲＰにコンジュゲートした抗カッパ抗体によって検出した。
【０１９２】
図２４Ａに示すように、ＩｇＧ１におけるＫ４０９Ｒ  ＣＨ３突然変異の導入は、一部の二重特異的抗体形成を促進するために十分であった（カラム１）。逆に、Ｌ３６８Ｅ  ＣＨ３突然変異単独では、顕著な量の二重特異的抗体形成をもたらさなかった（カラム２）。
【０１９３】
ｂ）Ｌ３６８Ｅおよび／またはＫ４０９ＲでのＣＨ３突然変異、ならびに野生型ヒンジまたは突然変異体ヒンジ
図２５Ｂに示す抗体突然変異体をコードするプラスミドベクターを、上記の方法を用いて調製した。この実施例において、突然変異がＩｇＧ１ヒンジにおいて生じた場合、突然変異はＤ２２１位およびＰ２２８位にあった。突然変異がＩｇＧ２ヒンジにおいて生じた場合、突然変異はＣ２２３、Ｅ２２５、およびＰ２２８にあった。この実施例において、突然変異体の一部は、ＣＨ３突然変異および野生型（ｗｔ）ヒンジを含有していた。他の突然変異体は、ヒンジ領域およびＣＨ３領域の両方に突然変異を含有していた。この実施例において、ＣＨ３突然変異は、Ｋ４０９ＲおよびＬ３６８Ｅから選択された。
【０１９４】
図２５Ｂに示すグループＡおよびグループＢの突然変異体を、個別に発現および精製した。組み合わせ対１〜１５を、セクション（ａ）における上記の方法を用いて、二重特異的抗体の形成について試験した。
【０１９５】
ｈＩｇＧ１ヘテロ二量体およびｈＩｇＧ２ヘテロ二量体を、実施例１０に記載した方法を用いて、イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。図２６Ａ〜２６Ｄは、ＣＨ３のみの突然変異が、野生型ｈＩｇＧ１と比較して約１２％のＩｇＧ１または１３％のＩｇＧ２のヘテロ二量体タンパク質の形成（Ｋ４０９ＲおよびＬ３６８Ｅでの突然変異）をもたらすこと、およびヒンジ突然変異（Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｄ２２１Ｅ、およびＰ２２８Ｅでの突然変異）とＣＨ３突然変異（Ｋ４０９ＲおよびＬ３６８Ｅでの突然変異）との両方の組み合わせが、野生型ｈＩｇＧ１ヘテロ二量体と比較して約９０％のＩｇＧ１ヘテロ二量体タンパク質の形成をもたらすことを説明する。
【０１９６】
（実施例１２）二重特異的抗体およびその親の突然変異単一特異的抗体の安定性を測定する示差走査熱量測定
二重特異的抗体の安定性を測定する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を、全ての抗体試料、すなわち１）野生型ｈＩｇＧ１抗体５および６（Ａｂ５．野生型ｈＩｇＧ１およびＡｂ６．野生型ｈＩｇＧ１）、２）ヒンジ突然変異（Ｄ２２１ＥおよびＰ２２８Ｅ）とＣＨ３突然変異（Ｌ３６８Ｅ）とを有する親ｈＩｇＧ１抗体５、およびヒンジ突然変異（Ｄ２２８ＲおよびＰ２２８Ｒ）とＣＨ３突然変異（Ｋ４０９Ｒ）とを有する親ｈＩｇＧ１抗体６（ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ５．Ａｂ５またはｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ６．Ａｂ６）、ならびに３）Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｄ２２１Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、Ｌ３６８Ｅ、およびＫ４０９Ｒでの突然変異を有する二重特異的ｈＩｇＧ１抗体５＋６（ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ５．Ａｂ５／ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ６．Ａｂ６）について実施した。測定は、ＭＩＣＲＯＣＡＬ（商標）ＶＰキャピラリーＤＳＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）で、ＰＢＳ緩衝液内でｐＨ７．２の１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で行った．試料を、９０℃／時間の速度で３０から１１０℃でスキャンした。データ分析を、ＯｒｉｇｉｎＬａｂソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。
【０１９７】
野生型ｈＩｇＧ１抗体は、約８６℃のＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）を示し、一方、親ｈＩｇＧ１突然変異抗体５または６は、６０℃という低減したＴｍを有する。Ａｂ６突然変異体（ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ６．Ａｂ６／ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ６．Ａｂ６）のＴｍは、約７５℃のＣＨ３のＴｍを有するＦａｂドメインに類似していると考えられる。二重特異的抗体が形成されると、ＣＨ３ドメインのＴｍは約７５℃である。図２７。
【０１９８】
（実施例１３）二重特異的抗体による２つの異なる抗原の同時の結合
この実施例は、本明細書において開示されるヘテロ二量体タンパク質の、２つの異なる抗原を同時に結合する能力を説明する。
【０１９９】
抗原ＡおよびＢ
Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００  ＳＰＲバイオセンサー機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）をこの分析に用いた。（抗原Ａ）−ｈＦｃ抗原を、アミン結合手順を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップの表面に結合させた。固定手順のためのランニング緩衝液は、ＨＢＳ−Ｔ＋（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）であった。ＣＭ５センサーの表面を、４００ｍＭのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）および１００ｍＭのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の１：１（ｖ／ｖ）の混合物を１０ｕｌ／分で７分間にわたり注入することによって活性化した。次に、（抗原Ａ）−ｈＦｃをｐＨ５．０の１０ｍＭの酢酸緩衝液内に５０μｇ／ｍＬまで希釈し、２０ｕｌ／分で７分間にわたり注入した。表面を、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）を１０ｕｌ／分でセンサー表面上に注入することによってブロックした。
【０２００】
固定した後、まず、２μｇ／ｍＬの二重特異的抗体（ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ１．Ａｂ１／ｈｌｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ２．Ａｂ２；Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｄ２２１Ｅ、およびＰ２２８Ｅのヒンジ領域ならびにＫ４０９ＲおよびＬ３６８ＥのＣＨ３領域での突然変異）を１０ｕｌ／分で１分間にわたり注入した。第２に、「サンドイッチ分析物」を１０ｕｌ／分で２分間にわたり注入した。試験した「サンドイッチ分析物」は、９７２ｎＭの抗原Ｂ、１０００ｎＭの（抗原Ａ）−ＥＣＤ−ｈｉｓ、およびランニング緩衝液であった。表面を、Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液および４ＭのＮａＣｌの２：１（ｖ／ｖ）の混合物（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）の６秒間の注入を２回行って再生した。
【０２０１】
図２８Ａは、二重特異的抗体ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ１．Ａｂ１／ｈｌｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ２．Ａｂ２が抗原Ａおよび抗原Ｂを同時に結合し得ること、ならびに非二重特異的抗体が検出されなかったことを示す。
【０２０２】
Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップ表面への抗原Ｂの結合を用いる類似の実験も行った。全ての実験条件は、２ｕｇ／ｍＬの二重特異的抗体を１分間ではなく４分間にわたり１０ｕｌ／分で注入したことを除いて、上記の（抗原Ａ）−ｈＦｃと同一であった。二重特異的抗体もまた、抗原Ａおよび抗原Ｂに同時に結合することができた。
【０２０３】
抗原Ｃおよび抗原Ｄ
Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００  ＳＰＲバイオセンサー機器もまた、この分析に用いた。（抗原Ｄ）−ｈＦｃを、アミン結合手順を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップの表面に結合させた。固定手順のためのランニング緩衝液はまた、ＨＢＳ−Ｔ＋であった。ＣＭ５センサーの表面を、４００ｍＭのＥＤＣおよび１００ｍＭのＮＨＳの１：１（ｖ／ｖ）の混合物を１０ｕｌ／分で７分間にわたり注入することによって活性化した。次に、（抗原Ｄ）−ｈＦｃをｐＨ６．５の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液内に３０μｇ／ｍＬまで希釈し、２０ｕｌ／分で７分間にわたり注入した。表面を、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）を１０ｕＬ／分でセンサー表面全体に注入することによってブロックした。
【０２０４】
固定した後、ランニング緩衝液を、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ７．４）を有するＨＢＳ−Ｔ＋に変えた。まず、１μｇ／ｍＬの二重特異的抗体（ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ４．Ａｂ４／ｈｌｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ３．Ａｂ３；Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｄ２２１Ｅ、およびＰ２２８Ｅのヒンジ領域ならびにＫ４０９ＲおよびＬ３６８ＥのＣＨ３領域での突然変異）を１０ｕｌ／分で２分間にわたり注入した。第２に、「サンドイッチ分析物」を１０ｕｌ／分で２分間にわたり注入した。試験した「サンドイッチ分析物」は、２０ｎＭの抗原Ｃ、２００ｎＭの（抗原Ｄ）−ＥＣＤ−ｈｉｓ、およびランニング緩衝液であった。表面を、Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液および４ＭのＮａＣｌの２：１（ｖ／ｖ）の混合物の１５秒間の注入を２回行って再生した。
【０２０５】
図２８Ｂは、二重特異的抗体ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ４．Ａｂ４／ｈｌｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ３．Ａｂ３が抗原Ｄおよび抗原Ｃを同時に結合し得ること、ならびに非二重特異的抗体が検出されなかったことを示す。
【０２０６】
Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップ表面への（抗原Ｃ）−ｈＦｃの結合を用いる類似の実験も行った。全ての実験条件は、（抗原Ｃ）−ｈＦｃをｐＨ６の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液内に３０ｕｇ／ｍＬまでではなくｐＨ５．０の１０ｍＭの酢酸緩衝液内に１０μｇ／ｍＬまで希釈し、２０ｕｌ／分で７分間にわたり注入したことを除いて、上記の（抗原Ｄ）−ｈＦｃと同一であった。二重特異的抗体もまた、抗原Ｃおよび抗原Ｄに同時に結合することができた。
【０２０７】
（実施例１４）Ｆｃガンマ受容体およびＦｃＲｎ受容体への二重特異的抗体の結合
この実施例は、本明細書において開示されるヘテロ二量体タンパク質の、Ｆｃ受容体に結合する能力を説明する。
【０２０８】
相互作用分析を、ＧＬＣセンサーチップを備えた、ＰＲＯＴＥＯＮ（商標）ＸＰＲ３６表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサー、およびアミン結合試薬（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、２５℃で行った。Ｆｃガンマ受容体の固定および分析のためのランニング緩衝液は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０であった。緩衝液を３０ｕＬ／分で流した。ＩｇＧのパネルを、標準的なＥＤＣ／スルホＮＨＳ介在性化学を用いて、個別の「リガンド」チャネル上に、約３００〜７００ＲＵのレベルまでアミン結合した。ＩｇＧには、Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｄ２２１Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、Ｌ３６８Ｅ、およびＫ４０９Ｒに突然変異を有する二重特異的ｈＩｇＧ１抗体１＋２（ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ１．Ａｂ１／ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ２．Ａｂ２）、Ｃ２２３Ｅ、Ｅ２２５Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｌ３６８Ｅ、およびＫ４０９Ｒに突然変異を有するｈＩｇＧ２抗体１＋２（ｈＩｇＧ２．ＥＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ１．Ａｂ１／ｈＩｇＧ２．ＲＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ２．Ａｂ２）、ならびにカッパ軽鎖を含むｈＩｇＧ１抗体およびｈＩｇＧ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）が含まれる。簡潔に述べると、これは、水中にそれぞれ１／６００に希釈されたストック溶液（０．４ＭのＥＤＣおよび０．１ＭのスルホＮＨＳを補った）の混合物で２分間にわたり活性化すること、ｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸ナトリウム内に２０ｕｇ／ｍＬで３分間にわたりＩｇＧに結合させること、および最後にｐＨ８．５の１ＭのエタノールアミンＨＣｌで３分間にわたりあらゆる過剰反応基を不活性化することを伴う。Ｆｃガンマ受容体はそれぞれ、受容体ごとに最適化した（典型的には、ヒトＦｃガンマ１では２００ｎＭ、他の受容体では１０ｕＭ）、様々な最高濃度を有する５倍連続希釈物として調製した。緩衝液ブランクを含む、各受容体の、５つの要素からなる連続希釈物を、「分析物」方向に３分間にわたり「ワンショット」モードで注入し、最大３０分の解離時間を可能にした。可能となった解離時間内で完全に解離しなかった受容体では、表面を、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｇｅｎｔｌｅ溶出緩衝液／４ＭのＮａＣｌの２：１（ｖ／ｖ）の混合物（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）の１８秒間の注入を２回行って、１００ｕＬ／分で再生した。一部の受容体を、結合サイクルに２重に注入して、アッセイが再現可能であることを確認した。
【０２０９】
固定されたＩｇＧとヒトＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）との相互作用を、異なる様式で行った。用いたＩｇＧは、上記と同一の二重特異的ｈＩｇＧ１抗体およびｈＩｇＧ２抗体１＋２である。用いた対照抗体は、ヒトＩｇＧ２ΔＡである。ＩｇＧをチャネル（Ａｂｄｉｃｈｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１１（１）：１３９〜１５１（２０１１））ではなく個別の反応スポット上に結合させ、分析ランニング緩衝液は、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ６．０）であり、ヒトＦｃＲｎは、それぞれ９００ｎＭの最大濃度を有する５倍および３倍の連続希釈物の両方として動態滴定モードで注入した。会合時間および解離時間は、それぞれ３分および５分であり、再生は不要であった。データの処理および分析は、ＰＲＯＴＥＯＮ（商標）Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアｖ２．１内で行った。各相互作用についての応答データを、インタースポット（未修飾のチップ）から応答を差し引き、かつ緩衝液ブランクから応答を差し引くことによって二重参照し、そして単純ラングミュア動態モデルに全体的に適合させた。平衡解離定数（ＫＤ）を、運動速度定数の比（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）から推定した。会合相内で迅速に平衡結合応答に達した相互作用では、ＫＤは平衡結合モデルを介して推定した。
【０２１０】
表４は、ＩｇＧ１二重特異的抗体およびＩｇＧ２二重特異的抗体の、Ｆｃガンマ（Ｆｃγ）受容体への結合が、対照ｈＩｇＧ１抗体およびｈＩｇＧ２抗体に類似していることを示す。表５は、ＩｇＧ１二重特異的抗体およびＩｇＧ２二重特異的抗体のＦｃＲｎ結合もまた対照ｈＩｇＧ２ΔＡ抗体に類似していることを示す。
【０２１１】
【表４】
2013529084.tif 000008
【０２１２】
【表５】
2013529084.tif 000009
【０２１３】
（実施例１５）二重特異的抗体のインビトロでの成長阻害アッセイおよび解離速度の測定
この実施例は、ヘテロ二量体タンパク質の、インビトロで細胞の成長を阻害する能力を説明する。
【０２１４】
その親の二価単一特異的抗体およびその一価対応物と比較した、細胞の成長に対するＡｂ３＋Ａｂ４  ＩｇＧ１二重特異的抗体のインビトロでの活性を決定した。
【０２１５】
成長阻害アッセイ
Ｃａｌ２７舌癌細胞またはＦａＤｕ頭頸部癌細胞を３０００個細胞／ウェルでＲＰＭＩ１６４０培地＋２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）内に播種し、９６ウェルプレート内で一晩成長させた。ＲＰＭＩ１６４０培地＋２％ＦＢＳ内の抗体の連続希釈物を次に各ウェルに添加し、細胞を３７℃で５日間成長させた。アッセイの最後に、細胞の量を、製造者のプロトコールの通りに、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）によって測定した。各抗体濃度での細胞の量を、対照ヒトＩｇＧ１での処理のものに対して正規化し、用量応答曲線の作成に用いた。全ての試料について３例ずつ行った。
【０２１６】
細胞に基づく抗体解離速度定数の測定
Ｃａｌ２７舌癌細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ内で、ポリ−Ｄ−リジンで被覆した９６ウェルプレート上で、コンフルエントに近づくまで成長させた。ウェルをＰＢＳで洗浄し、その後、２％パラホルムアルデヒドで、１５分間にわたり室温で固定した。全てのその後のインキュベーションは室温で行った。免疫蛍光染色のために、ウェルを、ＤＭＥＭ／Ｂ（ＤＭＥＭ＋５％ＢＳＡ）で１時間にわたりブロックした。ＤＭＥＭ／Ｂ内に希釈した、Ｄｙｌｉｇｈｔ８００で標識した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｄ、ＩＬ、ＵＳＡの標識キット）標的特異的抗体をウェルに添加し、１時間にわたりインキュベートした。ウェルを次に２５０ｕｌのＤＭＥＭ／Ｂで３回洗浄した。抗体−抗原の解離を測定するために、５０ｕｇ／ｍＬの未標識の標的特異的抗体１５０ｕｌを各ウェル（時点「０」のウェルを除く）に添加し、室温で最大２１時間の様々な時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの最後に、抗体溶液を廃棄し、１０ｕＭのＤＲＡＱ５（商標）（Ｂｉｏｓｔａｔｕｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）１００ｕｌで置き換え、さらに８分間にわたりインキュベートした。その後、ＤＲＡＱ５（商標）溶液を廃棄し、ウェルを、光から保護しながら空気乾燥した。時点「０」では、ウェルは、未標識の抗体とのインキュベーションは行わずに、ＤＲＡＱ５（商標）で直接染色した。全ての試料について３例ずつ行った。
【０２１７】
プレートを次に、Ｌｉ−Ｃｏｒ  ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）赤外線イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）によって読み取って、細胞表面上に結合したままのＤｙｌｉｇｈｔ８００標識抗体の量に相当する８００ｎｍでの蛍光強度、および、ＤＮＡを染色し、したがって各ウェル内の細胞数と相関する、７００ｎｍ（ＤＲＡＱ５）での蛍光強度を測定した。各ウェルについて８００ｎｍでの蛍光強度を７００ｎｍでの値によって正規化して、ウェルごとの細胞総数の変動を説明した。その後、各ウェルについての正規化された蛍光強度を、時点「０」での対応値によって再び正規化し、次に、解離時間に対してプロットして、指数関数的減衰曲線を作成した。この曲線を次に、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて単一指数減衰方程式に適合させて、見かけの解離速度定数を得た。
【０２１８】
Ａｂ３／Ａｂ４二重特異的抗体はＣａｌ２７細胞およびＦａＤｕ細胞の成長を効果的に阻害する
細胞の成長に対するＡｂ３／Ａｂ４二重特異的抗体のインビトロでの活性を調べるために、二重特異的抗体を、その親の二価単一特異的抗体およびその一価対応物と比較した。図２９に示すように、一価のＡｂ４／ｎｃ．ｂｉＦｃ（ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ４．Ａｂ４／ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ６．Ａｂ６；Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｄ２２１Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、Ｌ３６８Ｅ、およびＫ４０９Ｒでの突然変異）および二価のＡｂ４．ｈＩｇＧ１（Ａｂ４．野生型ｈＩｇＧ１）は、試験した全ての濃度で細胞の成長に対して有意な効果を有さず、一方、一価のＡｂ３／ｎｃ．Ｆｃ（ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ３．Ａｂ３／ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ６．Ａｂ６；Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｄ２２１Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、Ｌ３６８Ｅ、およびＫ４０９Ｒでの突然変異）は、１ｕｇ／ｍｌより高い濃度でＣａｌ２７細胞およびＦａＤｕ細胞の成長を阻害した（＞１０％）。それでも、一価のＡｂ３／ｎｃ．ｂｉＦｃ抗体の陰性対照（ｎｃ）アームをＡｂ４で置き換えて二重特異的抗体（ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ３．Ａｂ３／ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ４．Ａｂ４）を生じさせると、これは、Ａｂ３のアームの成長阻害活性を、二価単一特異的Ａｂ３抗体（Ａｂ３．ｈＩｇＧ１およびＡｂ３．ｂｉＦｃ）に匹敵するレベルまで顕著に上昇させた。この効果は、Ａｂ４のアームがその細胞表面標的に結合した結果、親和力が増大したためであると仮定され、その結果、細胞表面上のＡｂ３の局所的濃度、したがってＡｂ３標的の占有率を増大させる。図２９。
【０２１９】
Ａｂ３／Ａｂ４二重特異的抗体はその一価対応物よりも遅い見かけの解離速度定数を有する
二重特異的抗体における親和力の獲得の証拠を得るために、二重特異的抗体およびその一価対応物の見かけの解離速度定数を、Ｃａｌ２７細胞で測定した。図３０に示すように、Ａｂ３／Ａｂ４．ｂｉＦｃ（ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ３．Ａｂ３／ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ４．Ａｂ４）の見かけの解離速度定数は、一価抗体Ａｂ３／ｎｃ．ｂｉＦｃ（ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ３．Ａｂ３／ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ６．Ａｂ６）およびＡｂ４／ｎｃ．ｂｉＦｃ（ｈＩｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ４．Ａｂ４／ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ６．Ａｂ６）の見かけの解離速度定数よりも約２倍遅かった。総合すると、このデータは、Ａｂ３のアームおよびＡｂ４のアームの両方が細胞表面に結合することを介して二重特異的抗体が親和力を獲得したことを示唆する。
【０２２０】
（実施例１６）標的発現細胞の異種移植モデルに対する二重特異的抗体のインビボでの有効性研究
この実施例は、本明細書において記載される方法を用いて調製されたヘテロ二量体タンパク質のインビボでの有効性を説明する。
【０２２１】
二重特異的抗体のインビボでの有効性研究は、野生型の二価単一特異的抗体と比較して、標的発現細胞の異種移植モデルで行う。さらに具体的には、免疫不全ｎｕ／ｎｕマウスまたはＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）マウスにおける皮下腫瘍増殖曲線（限定はしないが膵臓癌、頭頸部癌、結腸癌、胃癌、乳癌、前立腺癌、または肺癌を含む、代表的な腫瘍タイプ）を有効性研究の前に確定して、腫瘍移植のための最適な細胞数を得る。典型的な有効性は、以下のステップで実施する：１）腫瘍細胞を、腫瘍サイズが５０〜１００ｍｍ３に達するまで、５〜８週齢の免疫不全マウス内に皮下移植するステップ、２）ボーラス尾静脈注射を介して投薬を行うステップ。治療に対する腫瘍の応答に応じて、動物に、１〜１００ｍｇ／ｋｇの二重特異的抗体（例えば、ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．Ａｂ４．Ａｂ４／ｈｌｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．Ａｂ３．Ａｂ３；Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｄ２２１Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、Ｌ３６８Ｅ、およびＫ４０９Ｒでの突然変異）または野生型抗体（ｈＩｇＧ１  Ａｂ３またはｈＩｇＧ１  Ａｂ４）を１週間に最大３回注射する。３）対照群における腫瘍サイズが２０００ｍｍ３に達するまで投薬を続けるステップ。全ての実験動物を体重の変化について毎日モニタリングする。腫瘍容積をキャリパー装置によって週に２回測定し、以下の式で計算する：腫瘍容積＝（長さ×幅２）／２。有効性は、腫瘍成長阻害のパーセンテージ（％ＴＧＩ）で表し、方程式１００−（Ｔ／Ｃ×１００）（式中、Ｔは治療群のＭＴＶ（腫瘍容積の中央値）であり、Ｃは対照群のＭＴＶである）を用いて計算する。二重特異的抗体は、腫瘍成長阻害において、野生型の二価単一特異的抗体と同程度に有効である。さらに、親和性を正常な組織まで低減させると、二重特異的抗体に対するＭＴＤ（最大耐量）は高くなり、それによって、優れた、最大耐量／最小治癒量として定義される治療指数が得られる。
【０２２２】
（実施例１７）ＣＤ２０陽性Ｂ細胞のＴ細胞介在性の死滅作用に対する二重特異的抗体のインビボでの研究
この実施例は、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞のＴ細胞介在性の死滅に対する、本明細書において記載される二重特異的抗体のインビボでの有効性を説明する。
【０２２３】
マウスＣＤ２０およびＣＤ３に特異的な完全長二重特異的抗体（ＩｇＧ２ΔＡ）（例えば、ｈＩｇＧ２．ＥＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．ＣＤ３．ＣＤ３／ｈＩｇＧ２．ＲＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．ＣＤ２０．ＣＤ２０（Ｃ２２３Ｅ、Ｅ２２５Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｌ３６８Ｅ、およびＫ４０９Ｒでの突然変異））を、本明細書において記載される方法を用いて生成した。用量応答実験を野生型Ｃ５７／Ｂ１６マウスにおいて行い、ＣＤ１９陽性リンパ球を、二重特異的ＣＤ３／ＣＤ２０抗体を単回静脈内投与した５日後に、末梢血において測定した。２００μｇ／ｋｇ以上の用量は、ＣＤ１９陽性リンパ球の集団を効果的に激減させた。表６を参照されたい。
【０２２４】
【表６】
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【０２２５】
（実施例１８）ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞のＴ細胞介在性の死滅作用に対する二重特異的抗体のインビトロでの研究
この実施例は、細胞傷害性Ｔ細胞によって仲介される、ヘテロ二量体タンパク質の、インビトロでの腫瘍細胞を死滅させる能力を説明する。
【０２２６】
ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３（例えば、ｈＩｇＧ２．ＥＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．ＥｐＣＡＭ．ＥｐＣＡＭ／ｈＩｇＧ２．ＲＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．ＣＤ３．ＣＤ３（Ｃ２２３Ｅ、Ｅ２２５Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、Ｃ２２３Ｒ、Ｅ２２５Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｌ３６８Ｅ、およびＫ４０９Ｒでの突然変異））に特異的な完全長ヒト二重特異的ＩｇＧ２ΔＡ抗体を、本明細書において記載される方法を用いて生成した。二重特異的ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３抗体の有効性を、エフェクター細胞と標的細胞との異なる比（例えば、Ｅ／Ｔ５およびＥ／Ｔ１０）および４日間の時間経過（例えば、２４時間目、４８時間目、７２時間目、９６時間目に測定した）で細胞死滅アッセイセットを用いて決定した。ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞（ＳＷ４８０）を標的細胞として用い、ＰＢＭＣ（末梢血単核球）を、健康なドナーの血液からエフェクター細胞として単離した。二重特異的ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３抗体の細胞傷害性の可能性を、ＣＹＴＯＴＯＸ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）によって評価した。図３１Ａおよび図３１Ｂは、この実施例において生成された二重特異的ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３抗体遺伝子がＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞（ＳＷ４８０）の死滅を誘発したことを示す。さらに具体的には、ＳＷ４８０細胞とＰＢＭＣとを少なくとも７２時間にわたり共培養した後、ＳＷ４８０細胞の有意な溶解が、二重特異的ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３抗体（図において「ｈＧ２−ＥｐＣＡＭ−ＣＤ３」として表示されている）を１０ｎＭで添加した後に観察された。ＳＷ４８０細胞を２００ｎＭ超の濃度で定量的に死滅させた。二重特異的ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３  ＩｇＧ１抗体（例えば、ｈＩｇＧ１．ＥＥ．Ｌ３６８Ｅ．ＥｐＣＡＭ．ＥｐＣＡＭ／ｈｌｇＧ１．ＲＲ．Ｋ４０９Ｒ．ＣＤ３．ＣＤ３；Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｄ２２１Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、Ｌ３６８Ｅ、およびＫ４０９Ｒでの突然変異）を用いる類似の細胞溶解の結果もまた観察された。
【０２２７】
開示される教示は様々な適用、方法、および組成物に関して記載されているが、本明細書における教示および以下の特許請求の範囲に記載の発明から逸脱することなく、様々な変化および変更を行うことができることが理解されよう。前述の実施例は、開示される教示をより良く説明するために提供されており、本明細書において提示される教示の範囲を限定することを意図しない。本教示はこれらの典型的な実施形態に関して記載されているが、当業者であれば、これらの典型的な実施形態の多くの変型および変更が、不必要な試験を伴わずに可能であることが容易に理解されよう。全てのこのような変型および変更は、本教示の範囲内である。
【０２２８】
特許、特許出願、出版物、教科書などを含む、本明細書において引用される全ての参考文献、およびそれにおいて引用される参考文献は、いまだそうでない限りにおいて、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。限定はしないが定義される用語、用語の使用法、記載される技術などを含む、組み込まれる文献および類似の材料の１つまたは複数が本願と異なるかまたは矛盾する場合、本願が優先される。
【０２２９】
前述の記載および実施例は、本発明の特定の具体的な実施形態を詳述し、本発明者によって考えられる最良の態様を記載するものである。しかし、前述のものが文章中でいかに詳細に記載されていても、本発明は多くの方法で実施され得、本発明は添付の特許請求の範囲およびあらゆるその同等物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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