(57)【要約】  本発明は、脊椎動物被験体、特に哺乳類、好ましくはヒトにおける繊毛上皮組織の再生および／または分化能を評価する方法、および多繊毛上皮細胞の機能不全に関連する疾患の治療におけるマイクロＲＮＡの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物被験体の繊毛上皮組織の機能的毛様体形成を遂行する能力をin vitroで診断する方法であって、
（ｉ）該被験体の繊毛上皮組織の細胞によるｍｉＲＮＡの発現レベルを定量的に測定する工程；
（ｉｉ）該被験体の該繊毛上皮組織のｍｉＲＮＡ発現プロフィールを確定する工程；
（ｉｉｉ）該被験体のｍｉＲＮＡの発現プロフィールを、下表Ｉで示される１以上の他の健康被験体の繊毛上皮組織のｍｉＲＮＡの発現プロフィールと比較する工程（ここで、この発現レベルは発現強度のレベルとしてｌｏｇ２で表す）；
【表１】
2013500034.tif 000028
2013500034.tif 000029
（ｉｖ）該被験体によるその発現レベルが、該他の健康被験体による同じｍｉＲＮＡの発現レベルに対して少なくとも２倍、すなわちｌｏｇ２で少なくとも１単位異なる、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを同定する工程；および
（ｖ）工程（ｉｉ）で確定された該プロフィールの少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、該他の健康被験体による同じｍｉＲＮＡの発現レベルに対して少なくとも２倍、すなわちｌｏｇ２で少なくとも１単位異なる発現レベルを有する場合、該第一の被験体の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現異常と関係した繊毛上皮組織の機能的毛様体形成を遂行する能力の欠陥が証明される工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
繊毛上皮組織の繊毛の機能不全に関連する障害の予防および／または治療に用いるための配列番号１〜６、８〜５２、１５７〜１６２および２０１の配列のｈｓａ−ｍｉＲ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆおよびｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（下記表Ｂ参照）、配列番号５３〜５８、６０〜１０４、１６３〜１６８および２０２の配列のそれらの「スター」相補鎖、または場合により化学的に修飾されていてもよい相補的配列鎖、ならびに配列番号１０５〜１１０、１１２〜１５６、１６９〜１７４、１９３〜２００および２０３の配列のそれらの前駆体から選択される、請求項１に記載の方法によって同定されたｍｉＲＮＡ。
【請求項３】
原発性繊毛ジスキネジアまたはカルタゲナー症候群などの原発性繊毛病；内臓逆位；雄性および雌性不妊症；アルストレム症候群；バルデー・ビードル症候群；メッケル・グルーバー症候群；多発性嚢胞腎；網膜変性；シーニア・ローケン症候群；または、膵臓線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、細気管支炎およびウイルス起源の呼吸器系感染などの続発性繊毛病の予防および／または治療に用いるための請求項２に記載のｍｉＲＮＡ。
【請求項４】
気道上皮の再生および／または分化の障害を含む病態の予防および／または治療のための、請求項２または３に記載のｍｉＲＮＡ。
【請求項５】
前記病態が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、膵臓線維症、喘息、原発性繊毛ジスキネジア、気道の慢性炎症および感染ならびに呼吸不全などの慢性および／または遺伝性呼吸器系疾患を含んでなる群から選択される、請求項４に記載のｍｉＲＮＡ。
【請求項６】
ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（配列番号３８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｂ（配列番号３９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ（配列番号４０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ（配列番号４６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ（配列番号４７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ＊（配列番号９９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｃ（配列番号２０１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７５（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ（配列番号５２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８（配列番号４３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ（配列番号４８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１（配列番号３７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊（配列番号８９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１（配列番号２１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０（配列番号２２）およびｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ（配列番号４）、配列番号５５〜５７、６３、６５〜６７、７１〜７４、７７、７８、８３、８４、９０〜９２、９５、９８、１００、１０１、１０４および２０２の配列のそれらの「スター」相補鎖、場合により化学的に修飾されていてもよいそれらの相補的配列鎖、ならびに配列番号１０７〜１０９、１１５、１１７〜１１９、１２３〜１２６、１２９、１３０、１３５、１３６、１４１〜１４４、１４７、１５１〜１５３、１５６および２０３のそれらの前駆体を含んでなる群から選択される、請求項２〜５のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ。
【請求項７】
ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（配列番号３８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｂ（配列番号３９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ（配列番号４０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ（配列番号４６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ（配列番号４７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ＊（配列番号９９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｃ（配列番号２０１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７５（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ（配列番号５２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８（配列番号４３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３（配列番号１９）、および配列番号１０７、１１７、１１９、１２３、１３０、１４２〜１４４、１４７、１５０、１５１、１５３、１５６および２０３の配列のそれらの前駆体、および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−２０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａから選択される場合により化学的に修飾されていてもよいｍｉＲＮＡの少なくとも１つの「スター」相補鎖であるｈｓａ−ｍｉＲ−２０５＊（配列番号７２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１およびｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊（配列番号３７および８９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１＊（配列番号７３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７＊（配列番号６３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ＊（配列番号８３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ＊（配列番号６６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０＊（配列番号７４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ＊（配列番号５６）、ならびに配列番号１０８、１１５、１１８、１２４〜１２６、１３５および１４１の配列のそれらの前駆体を含んでなる群から選択される、請求項２〜５のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ。
【請求項８】
領域２〜７または領域３〜８に、ＧＧＣＡＧＵＧＡ（配列番号１７５）、ＡＡＵＣＡＣＵ（配列番号１７６）およびＡＵＣＡＣＵＡ（配列番号１７７）を含んでなる群から選択される認識配列を有する、請求項２〜５のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ。
【請求項９】
ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（配列番号３８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｂ（配列番号３９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ（配列番号４０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ（配列番号４６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ（配列番号４７）、およびｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｃ（配列番号２０１）を含んでなる群から選択される、請求項８に記載のｍｉＲＮＡ。
【請求項１０】
医薬品として用いるための、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７５（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ（配列番号１７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ｐ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１（配列番号２１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５（配列番号２７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ（配列番号３０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号３４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ（配列番号３５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ（配列番号３６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１（配列番号３７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｂ（配列番号３９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ（配列番号４０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５（配列番号４１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ（配列番号４２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８（配列番号４３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５（配列番号４４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ（配列番号４６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ（配列番号４７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｃ（配列番号２０１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ（配列番号４８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３９（配列番号５０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６（配列番号５１）、およびｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ（配列番号５２）、配列番号５５〜５７、６０、６１、６３〜６７、６９、７１、７２、７５〜７８、８０〜８４、８７〜８９、９１〜９６、９８〜１０４および２０２の配列のそれらの「スター」相補鎖、場合により化学的に修飾されていてもよいそれらの相補的配列鎖、ならびに配列番号１０７〜１０９、１１２、１１３、１１５〜１１９、１２１、１２３、１２４、１２７〜１３０、１３２〜１３６、１３９〜１４１、１４３〜１４８、１５０〜１５６、１９４、１９５、１９７および２０３のそれらの前駆体を含んでなる群から選択されるｍｉＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、脊椎動物、特に哺乳類、特にヒトにおける、機能的毛様体形成をもたらす繊毛上皮の再生および分化の分野、および該上皮の再生および分化のプロセスにおけるマイクロＲＮＡの関与、ならびに該マイクロＲＮＡによって変調される遺伝子に関する。
【０００２】
本発明はより詳しくは、多繊毛上皮細胞の繊毛の機能不全に関連する疾患、特に、気道上皮の再生および／または分化に欠陥がある慢性呼吸器系疾患などの、非機能的毛様体形成から生じる障害の治療におけるマイクロＲＮＡの使用に関する。
【０００３】
上皮の先端面を覆う繊毛細胞は、気道洗浄、胚移植または脳脊髄液循環などの種々の生理学的プロセスに不可欠である。不完全な毛様体形成は、多様な疾患の直接的原因であるか、または多様な疾患に関連する。
【０００４】
毛様体形成プロセスには、繊毛細胞の属性の獲得（フェーズ１）で始まる一連の事象が含まれる。この第一段階は、Ｎｏｔｃｈとｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  １（ＤＬＬ１）などのそのリガンドの間の相互作用を介してＮｏｔｃｈシグナル伝達系による２つの隣接する細胞間の一方を阻害することからなる。ＤＬＬ１リガンドを発現する細胞は繊毛細胞の前駆細胞となると同時に、隣接する細胞におけるＮｏｔｃｈの活性化がこれらの細胞の繊毛細胞前駆細胞への変換を妨げる。本発明者らは、繊毛細胞の前駆細胞がｍｉＲ−４４９ファミリーのマイクロＲＮＡと転写因子ＦＯＸＪ１を発現することを示した。フェーズ２では、このｍｉＲ−４４９が細胞分裂を阻害し、分化を誘導する。繊毛細胞の前駆細胞において中心小体の増殖が始まり、この増殖に続いて基底小体の、細胞の頂端極への係留が起こるが、この段階の後に、適宜、軸糸の組み立ておよび繊毛合成が起こる。
【０００５】
上皮は内部媒体と外部環境の間のバリア機能を果たす。気道は、粘液を分泌し、繊毛で覆われた基底細胞（各繊毛細胞は何百という繊毛を持つ）からなる高度に分化した多列上皮で被覆されている。上皮表面に存在するこれらの多数の繊毛の協調した運動が、粘液繊毛クリアランスと呼ばれるプロセスの際、粘液によって運ばれた老廃物の除去を可能とする。これに関して、繊毛は第一線気道感染に対する防御プロセスにおいて重要な役割を果たす(Puchelle et al. Proc Am Thorac Soc (2006) 3, 726-733)。
【０００６】
気道上皮が病原性微生物、アレルゲン、毒性分子などによって引き起こされる環境ストレスに恒久的に曝されると、組織病変が生じる。これらの病変の後、気道上皮再生の生理学的プロセスが働き始める。このプロセスは、成功すれば、病変を修復し、呼吸器系組織の健全性を回復させ、病変は、分化して再び機能的となった組織に置き換わる。
【０００７】
この再生にはいくつかの段階が含まれる：
１）創傷床を埋めるために上皮細胞が増殖かつ／または遊走する、
２）これらの第一段階の後に、密着結合の形成および頂端極と基底極の間の膜タンパク（チャネル、イオン輸送体など）の特定の差示的対応を特徴とする細胞の極性化の段階の活性化が起こる(Puchelle et al. 2006; Hajj, R. et al. J Pathol (2007) 211, 340-350)、
３）繊毛細胞の表面における繊毛の形成（毛様体形成）と粘液の合成および分泌を担う分泌細胞の存在をもたらす最終分化段階。
【０００８】
このようにして、多列粘液繊毛上皮が病変に取って代わり、元の組織と同じ特性を有する機能的繊毛組織が再構成される。
【０００９】
考え合わせると、これらの生物学的現象はシグナル伝達機構および特定の遺伝子発現プロフィールに関連がある。気道上皮の分化および毛様体形成に関連づけられている、ある種の既知の作用因子としては、Ｆｏｘｊ１転写因子が最もよく議論されている(Yu, X. et al. (2008) Nat Genet 40, 1445-1453)。Ｆｏｘｊ１は毛様体形成の最終段階で働き、軸糸形成の際に、基底小体（小オルガネラ繊毛の基底部の形成に不可欠な中心小体に近接した構造組織）の、頂端膜への係留に役割を果たす(Gomperts, B.N. et al. (2004) J Cell Sci 117, 1329-1337 (2004))。
【００１０】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、膵臓線維症、喘息または原発性繊毛ジスキネジア（ＰＣＤ）、炎症および慢性感染などのある種の慢性呼吸器系疾患は、呼吸器系組織の破壊をもたらす(Marshall, W.F. (2008) J Cell Biol 180, 17-21)。まだ十分に理解されていない理由で、これらの疾患は上皮の再生および分化の欠陥に関連づけられている。これらの欠陥は、組織の異常な再構成、繊維症および不可逆的機能喪失をもたらす(Marshall, W.F., 2008)。これらの種々の疾患の治療的処置はまだ無く、呼吸器系組織の進行的破壊に様々な程度の有効性で対抗するための対症療法が利用できるに過ぎない。これに関して、機能的繊毛の形成（毛様体形成）をもたらす機構を解明することは、明確な治療利益を持った大きな挑戦と言える。
【００１１】
細胞の分化は、特定の遺伝子の発現を司る転写および翻訳の精密な時間的および空間的調節を含む。これらの事象は種々の分子的および機械的シグナルによって制御される。従って、分化および毛様体形成の基礎にある生理学的機構を理解することは、より特異的かつより効果的な治療アプローチの開発の不可欠な前段階である。
【００１２】
１９９３年に発見された、調節特性を有する約２２塩基の小さな非コードＲＮＡであるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡｓ）は、生存、アポトーシス、増殖、ホメオスタシスまたは分化などの細胞現象の調節に重要な役割を果たす(Lu, Y. et al. (2007) Dev Biol 310, 442-453)。
【００１３】
それらの作用機序は、ｍｉＲＮＡの数塩基と標的ｍＲＮＡの非コード３’部分との複合体の形成を含む。この相互作用は、標的ｍＲＮＡの脱安定化および／またはタンパク質合成の阻害を誘導するとされている。ｍｉＲＮＡとその標的の間の認識は、主としてｍｉＲＮＡの５’部分に位置する約７塩基の配列（以下、認識配列またはシード）によって制御される。よって、各ｍｉＲＮＡは、広範な個々のｍＲＮＡの安定性を調節する能力を有すると考えられる。
【００１４】
これまでに、ヒトにおいて７５０を超えるｍｉＲＮＡが同定され、それらが３０％を超える転写物を調節すると言われている。従って、これらのｍｉＲＮＡによる調節は遺伝子発現の主要な調節であると思われるが、その影響はこれまでは過小評価されていた(Berezikov, E. et al. (2005) Cell 120, 21-24; Xie, X. et al. (2005) Nature 434, 338-345)。
【００１５】
ｍｉＲＮＡは核において長い前駆体の形態で転写される。それらは核内で最初の成熟を受けて、より小さなヘアピン構造を有するｍｉＲＮＡの前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を生じる。この前駆体は核から細胞質へと輸送され、そこで最終的な成熟を受ける。そのループは酵素Ｄｉｃｅｒによって分解されて２本の一本鎖ｍｉＲＮＡ（５ｐ鎖と３ｐ鎖）を生じ、いわゆる成熟鎖が、標的ｍＲＮＡの非コード３’部分と相互作用する多タンパク質複合体（ＲＩＳＣ複合体：RNA induced silencing複合体）によって処理され、一方、いわゆる「スター(star)」相補鎖は分解を受ける。ｍｉＲＮＡ  ｍｉＲ−ｘｙ、ｍｉＲ−ｘｙ−ｚまたはｌｅｔ−７ｘの相補鎖はそれぞれｍｉＲ−ｘｙ＊、ｍｉＲ−ｘｙ−ｚ＊またはｌｅｔ−７ｘ＊と呼ばれる。
【００１６】
最近の研究では、マウスにおいて分化および形態形成機構、特に、胚発生および表皮の上皮細胞前駆体の増殖(Lena, A.M. et al. (2008) Cell Death Differ 15, 1187-1195; Yi, R. et al. (2008) Nature 452, 225-229)または肺発達(Lu, Y. et al. (2007) Dev Biol 310, 442-453 (2007); Harris, K.S. et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103, 2208-2213; Lu, Y. et al. (2008) Proc Am Thorac Soc 5, 300-304)におけるマイクロＲＮＡの重要性が実証された。より正確には、Lena et al.は、マウスにおいて肺の形態形成におけるｍｉＲ−１７−９２遺伝子座のｍｉＲＮＡの関与を実証した。マウスにおける肺の形態形成中にｍｉＲＮＡが関与するという証拠はあるものの、それらの厳密な役割、そしてそれらの作用機序はまだ検討されていない。
【００１７】
最後に、いくつかの研究が、癌、心肥大、糖尿病またはある種のウイルス感染などの疾患におけるある種のｍｉＲＮＡの特定の役割を示唆している(Triboulet, R. et al. (2007) Science 315, 1579-1582; Calin, G.A. & Croce, C.M. (2006) Nat Rev Cancer 6, 857-866; Grassmann, R. & Jeang, K.T. (2008) Biochim Biophys Acta 1779, 706-711; Latronico, M.V., (2008) Physiol Genomics 34, 239-242; Poy, M.N. et al. (2004) Nature 432, 226-230)。
【００１８】
これまでに、脊椎動物において、気道上皮などの繊毛上皮の再生および分化、ならびに毛様体形成の制御におけるｍｉＲＮＡの役割または関与を実証した研究はない。
【発明の概要】
【００１９】
よって、本発明者らは、脊椎動物における上皮組織の毛様体形成の制御、特に、粘液繊毛表面上皮におけるヒト気道上皮細胞の再生および分化におけるある種のｍｉＲＮＡの関与を始めて実証した。
【００２０】
より詳しくは、本発明者らは、ｍｉＲＮＡのハイスループットシーケンシング、ｍｉＲＮＡバイオチップ、ならびに定量的ＲＴ−ＰＣＲを組み合わせた種々の実験アプローチを用い、ヒト気道上皮の、また、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)の胚の繊毛表皮細胞の種々の分化段階に特異的に関与するｍｉＲＮＡ、すなわち、１）増殖段階、２）細胞の極性化、および３）最終分化および毛様体形成の特異的ｍｉＲＮＡの特徴を同定した。
【００２１】
本発明者らはまた、このようにして同定されたｍｉＲＮＡの、特にＤＬＬ１  Ｎｏｔｃｈリガンドの抑制を介した上皮組織の毛様体形成の制御における役割を確認した。
【００２２】
このように本発明者らは、ヒト気道上皮組織の再生および毛様体形成において示されたマイクロＲＮＡの役割が、脊椎動物のいずれの多繊毛上皮組織の毛様体形成の機構にも外挿可能であることを示した。
【００２３】
このようにして、再生および分化中の健康な気道上皮組織では、６３のｍｉＲＮＡが発現または抑制され、かつ／または有意な量で存在することが実証された（表ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩ参照）。健康個体に比べて病的個体では１以上のｍｉＲＮＡの発現に変化が見られることは１以上の遺伝子の発現の調節の欠陥の指標となり、従って、この変化は、過少発現のｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡを投与することによって、かつ／または過剰発現するｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ群の阻害剤(antagomir)を投与することによって補うことができる。
【００２４】
よって、本発明は、被験体の繊毛上皮組織の再生および分化能、従って機能的毛様体形成をもたらす能力を評価するための適用を見出し、本発明はまた該被験体の気道上皮組織の再生および／または分化能の評価を可能とし、本発明による方法はまたin vitroおよびin vivo診断の分野で特に興味深い。よって、本発明は、脊椎動物、特に哺乳類被験体、好ましくはヒトにおいて、繊毛上皮組織の機能的毛様体形成をもたらす能力を評価する方法であって、
（ｉ）該被験体の繊毛上皮組織のｍｉＲＮＡの発現レベルを定量的に測定する工程；
（ｉｉ）該被験体の繊毛上皮組織のｍｉＲＮＡ発現プロフィールを確定する工程；
（ｉｉｉ）該被験体のｍｉＲＮＡの発現プロフィールを、１以上の他の被験体の健康な繊毛上皮組織のｍｉＲＮＡの発現プロフィールと比較する工程（このプロフィールは下記表ＩのｍｉＲＮＡの一部または全部を含んでなる）；
（ｉｖ）該被験体によるその発現レベルが該他の被験体による同じｍｉＲＮＡの発現レベルに対して少なくとも２倍、すなわち発現レベルのいずれか１つが他の発現レベルの少なくとも２倍に相当する、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを同定する工程；および
（ｖ）工程（ｉｉ）で確定されたプロフィールの少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、表Ｉの発現プロフィールにおける同じｍｉＲＮＡの発現レベルに対して少なくとも２倍異なる発現レベルを有する場合に、該被験体の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現異常と関係した、繊毛上皮組織の機能的毛様体形成を遂行する能力の欠陥が証明される工程
を含んでなることを特徴とする方法に関する。この発現レベルをｌｏｇ２で表すと（表Ｉのように）、これは、ｌｏｇ２で表される供試被験体の発現レベルが１以上の他の健康な被験体における発現プロフィールに比べて少なくとも１単位異なる場合に、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現異常と関係した、繊毛上皮組織の再生および／または分化能、ならびに毛様体形成能の欠陥が見られるということを意味する。
【００２５】
本発明による方法の適用は、本発明者らが繊毛上皮組織の再生および／または分化能に関する診断を確立したいと考える被験体の繊毛上皮組織のｍｉＲＮＡの発現プロフィール、ならびに１以上の健康な、すなわち、繊毛上皮組織の分化および／もしくは再生ならびに毛様体形成の障害を持たないとして選択された被験体の繊毛上皮組織のｍｉＲＮＡの発現プロフィールの確定を必要とする。
【００２６】
そのもう１つの目的によれば、本発明は、哺乳類被験体、好ましくはヒトの気道上皮組織の再生および／または分化能ならびに機能的毛様体形成をもたらす能力を評価する方法であって、
（ｉ）該被験体の気道上皮組織のｍｉＲＮＡの発現レベルを定量的に測定する工程；
（ｉｉ）該被験体の気道上皮組織のｍｉＲＮＡ発現プロフィールを確定する工程；
（ｉｉｉ）該被験体のｍｉＲＮＡの発現プロフィールを、１以上の他の被験体の該健康な気道上皮組織のｍｉＲＮＡの発現プロフィールと比較する工程（このプロフィールは下記表ＩのｍｉＲＮＡの一部または全部を含んでなる）；
（ｉｖ）該被験体によるその発現レベルが該他の被験体による同じｍｉＲＮＡの発現レベルに対して少なくとも２倍、すなわち発現レベルのいずれか１つが他の発現レベルの少なくとも２倍に相当する、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを同定する工程；および
（ｖ）工程（ｉｉ）で確定されたプロフィールの少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、表Ｉの発現プロフィールにおける同じｍｉＲＮＡの発現レベルに対して少なくとも２倍異なる発現レベルを有する場合に、該被験体の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現異常と関係した、気道上皮組織の再生および／または分化能の欠陥が証明される工程
を含んでなることを特徴とする方法に関する。
【発明の具体的説明】
【００２７】
定義
「被験体」とは、脊椎動物個体、特に哺乳類、好ましくはヒトを意味する。好ましくは、本発明者らが繊毛上皮組織の、機能的毛様体形成をもたらす能力に関して診断を確立したいと考える被験体であり、より具体的には、気道上皮組織の再生および／または分化能を診断する対象、ならびに同じ種に属す健康な１個体の被験体または複数の被験体であり得る。
【００２８】
本発明に関して、「繊毛」および「多繊毛」は区別無く用いられ、目的とする上皮組織が、それらの細胞にいくつかの繊毛を有する場合と理解される。
【００２９】
ある組織におけるｍｉＲＮＡの発現プロフィールとは、選択された値に相当するかまたはそれを超える発現レベルを有する全てのｍｉＲＮＡを意味する。
【００３０】
細胞または組織におけるｍｉＲＮＡの発現レベルは、その細胞または組織に存在するｍｉＲＮＡを測定することによって決定される。
【００３１】
ｍｉＲＮＡの発現レベルは、当業者に既知のいずれの技術によって測定してもよく、本発明者らは特に、ＲＮＡ抽出工程後の、ｍｉＲＮＡのハイスループットシーケンシング、ＮＡＳＢＡ(nucleic acid strand based amplification)、プライマー伸長、またはｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーションを可能とするＤＮＡチップによるシーケンシングを挙げる。
【００３２】
ｍｉＲＮＡの発現レベルは、以下のようなものなどの種々の手段によって表すことができる。
【００３３】
＊ｌｏｇ２で表される発現レベル強度。この値は、細胞または組織に存在するｍｉＲＮＡの量を表す。発現プロフィールの確定のためには、ｌｏｇ２で表される発現レベル強度が３以上であるｍｉＲＮＡを使用することが好ましい。
【００３４】
この発現レベル強度は、発現したｍｉＲＮＡを測定するために用いられる技術に応じた異なる手段によって計算することができる。
【００３５】
Agilent型（下記に示される例を参照）のチップ上の蛍光を測定する場合には、発現レベルの測定値は蛍光強度に相当し、次にそれからｌｏｇ２を計算する。ハイスループットシーケンシングの場合には、発現レベル強度は、ｍｉＲＮＡの配列が決定される回数を示し、この数値を配列の総数に対してノーマライズした後にそのｌｏｇ２を計算する。
【００３６】
＊細胞または組織で発現されるｍｉＲＮＡの総量に対する同じ細胞または同じ組織中のあるｍｉＲＮＡの発現パーセンテージを表す存在度。この場合、その存在度が０．１％以上、好ましくは０．５％以上、より好ましくは１％以上であるｍｉＲＮＡが確保される。
【００３７】
好ましくは、発現レベルを特徴付ける値はｌｏｇ２で表される。
【００３８】
下記の表Ｉは、発現レベルが健康ヒト気道上皮組織のｍｉＲＮＡの発現レベル強度としてｌｏｇ２で表される発現プロフィールを示す。
【表１】
2013500034.tif 000002
2013500034.tif 000003
【００３９】
本発明による方法は、本発明者らがその組織の機能的毛様体形成を制御する能力、特に再生および／または分化能に関する診断の確立を望む被験体の繊毛上皮組織、特に呼吸器系のマイクロＲＮＡの発現プロフィールを、特定の分化段階において確定された１以上の被験体の健康な繊毛上皮組織のｍｉＲＮＡの発現プロフィール（このようなプロフィールは表ＩＶで確認することができる）と比較することからなる付加的工程を備えることができる。
【００４０】
よって、本発明は、繊毛上皮組織の繊毛の機能不全に関連する障害の予防および／または治療に用いるための、配列番号１〜６、８〜５２、１５７〜１６２および２０１の配列のｈｓａ−ｍｉＲ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆおよびｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、配列番号５３〜５８、６０〜１０４、１６３〜１６８および２０２の配列のそれらの「スター」相補鎖、または場合により化学的に修飾されていてもよい相補的配列鎖、ならびに配列番号１０５〜１１０、１１２〜１５６、１６９〜１７４、１９３〜２００および２０３の配列のそれらの前駆体（下表Ｉ参照）から選択される、本発明による方法によって同定された少なくとも１つのｍｉＲＮＡに関する。
【００４１】
繊毛上皮組織とは、その細胞がそれらの先端面に繊毛を有する組織を意味し、哺乳類では、それは特に気道上皮または卵管および子宮内膜の上皮、脳の脈絡膜叢および上衣細胞の上皮、ならびに雄性の精子、精巣網および精管の上皮である。
【００４２】
ある第一の一本鎖核酸断片の相補的配列鎖は、その配列が該第一の断片の配列と相補的であり、該第一断片と対合することができる、一本鎖核酸断片を意味する。
【００４３】
本発明に関して、化学的に修飾された相補的配列鎖も使用可能であり、すなわち、それらの配列は、それらの細胞内および細胞外安定性を向上させ、かつ、酸性または塩基性条件での、ならびにヌクレアーゼの作用下での加水分解感受性を小さくするために化学的修飾された１以上の塩基を含んでなり、考えられる修飾としては、特に、T. M. Ranaの総説(Nature Reviews, 2007, Vol. 8: 23-36)で干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として挙げられ、または国際出願ＷＯ２００７／０２１８９６に記載されているものがあり、特に、相補的配列鎖は、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−ＯＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）塩基などの、２’で修飾されたヌクレオチドから選択される化学的に修飾されたヌクレオチドを含んでなり得る。
【００４４】
表ＩＩ−本発明によるｍｉＲＮＡ、ならびにそれらのヌクレオチド配列、それらの相補鎖のヌクレオチド配列およびそれらの前駆体のヌクレオチド配列の参照
【表２】
2013500034.tif 000004
2013500034.tif 000005
【００４５】
従って、本発明によるｍｉＲＮＡは、いわゆる原発性繊毛病、すなわち、繊毛の機能不全に直接関連する疾患の予防および／または治療に対して特に注目され、これらの原発性繊毛病は特に、
原発性繊毛ジスキネジアまたはカルタゲナー症候群；
内臓逆位；
雄性不妊症（精子の運動）および雌性不妊症（例えば、子宮外妊娠）；
アルストレム症候群；
バルデー・ビードル症候群；
メッケル・グルーバー症候群；
多発性嚢胞腎；
網膜変性；
シーニア・ローケン症候群
である。
【００４６】
本発明によるｍｉＲＮＡはまた、いわゆる続発性繊毛病、すなわち、
膵臓線維症；
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；
喘息；
細気管支炎；
ウイルス起源の呼吸器系感染
などの繊毛機能の欠陥に関連する疾患の予防および／または治療に対して注目される。
【００４７】
従って、本発明による使用は、より詳しくは、気道上皮の再生および／または分化の障害を含む病態の予防および／または治療に適用が見出せ、これらの病態としては、特に、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、膵臓線維症、喘息、原発性繊毛ジスキネジア、気道の慢性炎症および感染ならびに呼吸不全などの慢性および／または遺伝性呼吸器系疾患がある。
【００４８】
慢性および／または遺伝性呼吸器系疾患（例えば、ＣＯＰＤ、膵臓線維症、喘息、ＰＣＤ、アレルギー性鼻炎など）は、主要な公衆衛生問題であり、工業国における死因の第４位であり、罹患率が急速に増加していることから、これらの疾患の治療により良くねらいを定めることができるように、それらの原因および機構をより良く理解する必要に迫られている。
【００４９】
喘息は、小児では最も多い慢性呼吸器系疾患であり（５〜２０％）、入院の主な原因の１つとなっている。呼吸器系アレルギーの急増および工業汚染の増加が、一般集団における喘息の原因の大きな増加の原因となっている(O van Schayck, et al. IPAG DIAGNOSIS & MANAGEMENT HANDBOOK. Chronic Airways Diseases. A Guide for Primary Care Physicians. 1-34, 2005)。
【００５０】
ＣＯＰＤは、罹患率と高い死亡率に関連する一群の呼吸器系疾患である。ＣＯＰＤは吸入された有害粒子（煙草が最も代表的である）によって引き起こされ、呼吸器系組織を弱らせる炎症および慢性感染をもたらす。喫煙者の約１５％が一生のうちにＣＯＰＤを発症する可能性がある。世界保健機関は、世界で１１億人近くの喫煙者が存在し、ＣＯＰＤ罹患率は世界の集団の０．８〜６％であると推計している。研究では、２０２０年にはＣＯＰＤは世界の死因の第３位になると推測されている。これらの疾患の原因および機構はまだ知られていない部分が大きいが、おそらく他の因子（遺伝的、後成的）もＣＯＰＤの発症に影響を及ぼしている可能性がある(O van Schayck, et al. 2005)。
【００５１】
膵臓線維症は、外分泌腺、従って、様々な器官（肺、膵臓、肝臓、汗腺、腸）のあらゆる分泌上皮組織を侵す、白色人種集団において最も多い遺伝病である（２５００人に１人）。上皮におけるイオン輸送の欠陥が、特に炎症および慢性呼吸器系感染の一因である粘膜の肥厚をもたらし、不可逆的組織が生じ、重篤な呼吸不全が生じる。この疾患を治癒させる治療法は無いが、科学的および医学的知識の進展が、患者の平均余命を１９６０年代の３年から現在の約４５年に引き延ばしたという対症療法の確立を可能とした。
【００５２】
原発性繊毛ジスキネジア（ＰＣＤ）は、粘液繊毛クリアランスの欠陥、炎症および慢性感染ならびに不可逆的組織破壊をもたらす気道上皮の繊毛運動の欠陥を引き起こす、まれな常染色体劣性遺伝疾患である（１５０００人に１人）。
【００５３】
気道上皮の再生および／または分化の障害を含む疾患の治療の展望を持つこれらのｍｉＲＮＡの重要性が、これらのｍｉＲＮＡが、気道上皮の再生および／または分化に関与することが知られている遺伝子を調節するという事実によって確認される（実施例ＩＩＩ参照）。
【００５４】
本発明に関して、毛様体形成過程で繊毛上皮組織内に有意な量で存在するｍｉＲＮＡ（好ましくは、その存在度は総ｍｉＲＮＡの少なくとも１％である、表ＩＩＩ参照）を使用することが好ましい。従って、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（配列番号３８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｂ（配列番号３９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ（配列番号４０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ（配列番号４６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ（配列番号４７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ＊（配列番号９９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｃ（配列番号２０１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７５（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ（配列番号５２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８（配列番号４３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ（配列番号４８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１（配列番号３７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊（配列番号８９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１（配列番号２１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０（配列番号２２）およびｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ（配列番号４）、配列番号５５〜５７、６３、６５〜６７、７１〜７４、７７、７８、８３、８４、９０〜９２、９５、９８、１００、１０１、１０４および２０２の配列のそれらの「スター」相補鎖、場合により化学的に修飾されていてもよいそれらの相補的配列鎖、ならびに配列番号１０７〜１０９、１１５、１１７〜１１９、１２３〜１２６、１２９、１３０、１３５、１３６、１４１〜１４４、１４７、１５１〜１５３、１５６および２０３のそれらの前駆体から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを使用することが好ましい。
【００５５】
これらのｍｉＲＮＡのうち、その発現が誘導されるものは、その発現が抑制されるものと区別することができ（表ＩＶ）、健康個体のｍｉＲＮＡ発現プロフィールに匹敵するｍｉＲＮＡ発現プロフィールを再生するためには、繊毛上皮組織の毛様体形成、特に、気道上皮組織の再生および分化の過程でその発現が誘導される１以上のｍｉＲＮＡ、および／またはその発現が抑制される１以上のｍｉＲＮＡを使用することが有利であると思われる。従って、本発明の有利な変形形態によれば、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（配列番号３８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｂ（配列番号３９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ（配列番号４０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ（配列番号４６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ（配列番号４７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ＊（配列番号９９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｃ（配列番号２０１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７５（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ（配列番号５２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８（配列番号４３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３（配列番号１９）、および配列番号１０７、１１７、１１９、１２３、１３０、１４２〜１４４、１４７、１５０、１５１、１５３、１５６および２０３の配列のそれらの前駆体、および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−２０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａから選択されるｍｉＲＮＡの少なくとも１つの「スター」相補鎖（これらの「スター」相補鎖は、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５＊（配列番号７２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１およびｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊（配列番号３７および８９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１＊（配列番号７３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７＊（配列番号６３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ＊（配列番号８３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ＊（配列番号６６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０＊（配列番号７４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ＊（配列番号５６）である）、ならびに配列番号１０８、１１５、１１８、１２４〜１２６、１３５および１４１の配列のそれらの前駆体から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡが本発明に従って使用される。
【００５６】
その発現が繊毛上皮組織の毛様体形成、特に、気道上皮組織の再生および／または分化の過程で変調される前記ｍｉＲＮＡのうち、その発現が誘導されるもの、すなわち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（配列番号３８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｂ（配列番号３９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ（配列番号４０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ（配列番号４６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ（配列番号４７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｃ（配列番号２０１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ＊（配列番号９９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７５（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ（配列番号５２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８（配列番号４３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３（配列番号１９）、ならびに配列番号１０７、１１７、１１９、１２３、１３０、１４２〜１４４、１４７、１５０、１５１、１５３、１５６および２０３の配列のそれらの前駆体が、本発明に従って好ましく用いられる。
【００５７】
本発明はまた、上皮組織の毛様体形成過程、または気道上皮組織の再生および／または分化過程でその発現が誘導される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを発現する発現ベクターの使用に関する。真核細胞においてＲＮＡを発現することができ、かつ、それにｍｉＲＮＡの発現カセットがクローニングされるいずれの発現ベクターも本発明において使用可能である。
【００５８】
本発明はまた、ｍｉＲＮＡの領域２〜７、すなわち、ｍｉＲＮＡの２番〜７番のヌクレオチド、またはｍｉＲＮＡの領域３〜８、すなわち、ｍｉＲＮＡの３番〜８番のヌクレオチドに位置する認識配列ＧＧＣＡＧＵＧ（配列番号１７５）を有するｍｉＲＮＡの使用に関し、それらは特にｍｉＲＮＡｓ  ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（配列番号３８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ（配列番号４０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ（配列番号４６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ（配列番号４７）およびｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｃ（配列番号２０１）である。
【００５９】
本発明はまた、ｍｉＲＮＡの領域２〜７または領域３〜７に位置する認識配列ＡＡＵＣＡＣＵ（配列番号１７６）を有するｍｉＲＮＡの使用に関し、それは特にｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｂ（配列番号３９）である。
【００６０】
本発明はさらに、ｍｉＲＮＡの領域２〜７または領域３〜７に位置する認識配列ＡＵＣＡＣＵＡ（配列番号１７７）を有するｍｉＲＮＡの使用に関し、それは特にｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−３ｐ（配列番号４０）である。
【００６１】
本発明は最後に、医薬品として用いるための、配列番号３〜５、８、９、１１〜１５、１７、１９、２０、２３〜２６、２８〜３２、３５〜３７、３９〜４４、４６〜５２および２０１の配列のｍｉＲＮＡ、場合により化学的に修飾されていてもよい、配列番号５５〜５７、６０、６１、６３〜６７、６９、７１、７２、７５〜７８、８０〜８４、８７〜８９、９１〜９６、９８〜１０４および２０２の配列のそれらの相補鎖またはｍｉＲＮＡ阻害剤(antagomir)、ならびに配列番号１０７〜１０９、１１２、１１３、１１５〜１１９、１２１、１２３、１２４、１２７〜１３０、１３２〜１３６、１３９〜１４１、１４３〜１４８、１５０〜１５６、１９４、１９５、１９７および２０３の配列のそれらの前駆体から選択される上記の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの使用に関する。
【００６２】
上記の構成の他、本発明はさらに、本発明の実施例ならびに添付図面に示される、下記の説明から明らかとなる他の構成も含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した細胞の形態を明らかにする、共焦電子顕微鏡に観察されたヒト気道上皮細胞の初代培養物の顕微鏡写真を示す。また、これらの細胞を、上皮分化マーカーの発現を調べるために免疫標識した（繊毛細胞に対してはチューブリン−β４（図１Ｅ〜Ｆ）、粘液分泌細胞に対してはムチンＭＵＣ５ＡＣ（図１Ｇ〜Ｈ）、および基底細胞に対してはサイトケラチン１３（図１Ｉ〜Ｊ））。分化の状態を評価した。
【図２Ａ】異なる３人の患者におけるヒト気道上皮の種々の分化段階の少なくとも１つにおいて最も強い発現を有する２６のｍｉＲＮＡを示す累積ヒストグラムを表す：ＡＬＩ−Ｄ０（Ｄ０、増殖）、ＡＬＩ−Ｄ７（Ｄ７、増殖および極性化）、ＡＬＩ−ＦＣ（ＦＣ、毛様体形成開始）、ＡＬＩ−ＷＤ（ＷＤ、完全に分化した上皮）。
【図２Ｂ】異なる３人の患者におけるヒト気道上皮の種々の分化段階の少なくとも１つにおいて最も強い発現を有し、かつ、有意に変調される２２のｍｉＲＮＡを示す累積ヒストグラムを表す：ＡＬＩ−Ｄ０（Ｄ０、増殖）、ＡＬＩ−Ｄ７（Ｄ７、増殖および極性化）、ＡＬＩ−ＦＣ（ＦＣ、毛様体形成の開始）、ＡＬＩ−ＷＤ（ＷＤ、完全に分化した上皮）。
【図３】統計学的に表され（Ａ＞８、Ｐ＜０．０５）、少なくとも１つの細胞培養条件において変調される（１＜Ｍ＜−１）ｍｉＲＮＡの発現強度の変動を細胞培養の分化状態の関数として示すAgilent（登録商標）ｍｉＲＮＡチップによって得られる階層的クラスターを示す（黒い四角ほど、ｍｉＲＮＡの発現が少ない）。
【図４】ハイスループットシーケンシング（ＨＴＳ）およびｍｉＲＮＡチップ（Agilent（商標））において得られた結果の間の相関を示すグラフである。
【図５】図に示されているように各分化段階で供試した各ｍｉＲＮＡの５ｐ鎖の定量的ＰＣＲによって観察された変動のヒストグラムを示す。結果は異なる３人のドナーの平均を示す。
【図６】毛様体形成中に調節されるマイクロＲＮＡを示す２つのグラフを合わせたものである。図ａおよびｃは、未分化ＨＡＥＣ細胞（繊毛を持たない、段階ＡＬＩ−Ｄ０）（図ａ）および胚段階Ｅ１１．５（原腸胚）前および段階Ｅ２６（尾芽胚）後のアフリカツメガエル胚の表皮外植体（図ｃ）における、総マイクロＲＮＡに対するパーセンテージとしてのマイクロＲＮＡの存在度を示す。図ｂおよびｄは、同じデータを繰り返したものであり、ｍｉＲＮＡの定量的存在度を示す。
【図７】繊毛細胞におけるｍｉＲ−４４９の特異的局在を可視化するための顕微鏡写真を表す。これらの試験は、２１日目のＨＡＥＣ細胞培養物（段階ＡＬＩ−Ｄ２１）（顕微鏡写真ａ、ｂ、ｃ）、ヒト気管支組織（顕微鏡写真ｅ、ｆ、ｇ）または尾芽胚段階のアフリカツメガエル胚（顕微鏡写真ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ）の凍結切片に対して、ｍｉＲ−４４９（顕微鏡写真ａ、ｅ、ｆ、ｈ、ｉ、ｊ、ｌ）またはｍｉＲ−３１（顕微鏡写真ｂ）に向けられたジゴキシゲニン標識ＬＮＡプローブと陰性対照としてのランダムプローブ（「スクランブル」）（顕微鏡写真ｃ、ｇ、ｉ）を用いたin situハイブリダイゼーションにより行った。アフリカツメガエル胚の繊毛細胞は、アセチル化チューブリンに対する原発性抗体で免疫組織標識することによって同定した。ｍｉＲ−４４９に対するＬＮＡプローブは繊毛円筒細胞を標識する（顕微鏡写真ａ、ｅ、ｈ）。これに対して、ｍｉＲ−３１に対するプローブは基底細胞を優先的に標識した（顕微鏡写真ｂ）。粘液分泌細胞は抗ムチン抗体ＭＵＣ５ＡＣで標識された（パネルｅに矢印で示す）。図ｄは、ヒト気道上皮組織の基底細胞および繊毛円筒細胞におけるｍｉＲ−４４９、ｍｉＲ−３１およびｍｉＲ−３４の発現レベルを示す。
【図８】錐体細胞（繊毛＋分泌）と基底細胞の間で有意に調節されるマイクロＲＮＡのマッピングを示す（ヒートマップ）。円柱の上に位置する５つのマイクロＲＮＡは錐体細胞（繊毛＋分泌）に特異的であり、これより下は、ｍｉＲＮＡの外観が薄くなるほど、基底細胞に対する特異性が高くなる。
【図９】図で示された２×２比較のそれぞれに関する、２つの分化段階の比のｌｏｇ２（横座標）と統計的有意性の値（縦座標）の間の関係を示すグラフである。有意に過剰発現される遺伝子が濃い灰色で示され（グラフの右手側）、有意に抑制される遺伝子が中間の灰色で示される（グラフの左手側）。
【図１０】図に示されるように、検討した培養条件のそれぞれにおける、カベオリン−１ｍＲＮＡの発現強度のｌｏｇ２を示すヒストグラムである。
【図１１】ルシフェラーゼリポーター遺伝子がＣａｖ−１および対照（ＰＳＩＣＨＥＣＫ）のｍＲＮＡの非コード３’部分と融合される場合の、ルシフェラーゼ活性に関して選択された各ｍｉＲＮＡの効果（対照ベクターＰＳＩＣＨＥＣＫで得られた最大効果の％で表す）を示すヒストグラムである。データは陰性対照ｍｉＲＮＡで得られた結果に対してノーマライズしたものである。
【図１２】ｍｉｒ−４４９ａ、ｍｉｒ−４４９ｂ、ｍｉｒ−３４ａ、ｍｉｒ−３４ｂ＊およびｍｉｒ−３４ｃに共通の認識配列（「シード」）の配列を含む遺伝子の富化を示すグラフを合わせたものである。分析した遺伝子の数（約２５０００）を横座標に示し、これらの遺伝子はそれらの抑制または発現レベルに従って分布し、すなわち、遺伝子は、最大抑制から最大誘導まで左から右に示される。縦座標は、富化レベルの統計値をｌｏｇ１０で表したものである（縦座標に示されるエンリッチメントスコアは、van Dongen S et al. Nat Methods. 2008 Dec; 5(12): 1023-5により記載されている超幾何二項累積モデルに従って計算したＰ値のｌｏｇ１０の絶対値に相当する）。ＨＡＥＣ細胞にトランスフェクトされたｍｉＲＮＡが各グラフに示される。
【図１３】ＩＰＡソフトウエアを用いた、本発明によるｍｉＲＮＡの発現によって変調された遺伝子に関する生物学的機能および疾患の同定結果を示す。
【図１４】ｍｉＲ−４４９の発現の抑制による毛様体形成の阻害を示す。  （ａ，ｂ）ＨＥＡＣ細胞をそれらの再生中（一般に２１日間）、抗ｍｉＲ−４４９阻害剤(antagomirs)または対照阻害剤(antagomir)（２０ｎＭ）で数回処理する。繊毛細胞のパーセンテージは、核の数に対するチューブリン−β４陽性細胞の数の比率として定義した（２０視野／１フィルターおよび３フィルター／１ドナー）。顕微鏡写真（ａ）は、対照阻害剤(antagomir)（Ａｎｔａｇｏ−Ｎｅｇ）または抗ｍｉＲ−４４９阻害剤(antagomir)（Ａｎｔａｇｏ−４４９）で処理したＨＡＥＣ細胞に典型的な免疫標識を示す。ヒストグラムは、各実験条件に対して１視野当たりの繊毛細胞のパーセンテージを示す（ｎ＝６、＊＊＊、Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定）。顕微鏡写真（ｂ）は、抗ｍｉＲ−４４９阻害剤(antagomir)はｍｉＲ４４９ａおよびｍｉＲ−４４９ｂの発現を抑制するが、ｍｉＲ−２１の発現には効果がないことを示す（ｎ＝６、ｎｓ＝有意でない、＊＊、Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定）。  アフリカツメガエルでの試験：３０ｎｇの対照モルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯ）（顕微鏡写真ｃ、ｄ、ｈ）またはＭＯ  ｍｉＲ−４４９ａ／ｂ／ｃ（各１０ｎｇ）と２．５ｎｇの蛍光リシン−デキストラン（ＦＬＤｘ、橙色／褐色、顕微鏡写真ｃおよびｆ）または注射された細胞を追跡するための５００ｐｇのＴＤ−ｔｏｍａｔｏ−ＣＡＡＸ  ｍＲＮＡ（顕微鏡写真ｇ、ｉ）を含んでなる混合物を、卵割期のアフリカツメガエル胚の表皮に注射する。  顕微鏡写真ｅおよびｆでは、in situハイブリダイゼーション技術を用い、チューブリン−αで標識することによる繊毛細胞前駆体の検出が可能である。  顕微鏡写真ｆ：ｍｉＲ−４４９枯渇領域（上）は、注射されなかった領域（下）に比べて多いチューブリン−α陽性細胞を示す。顕微鏡写真ｈおよびｉは、抗アセチル化チューブリン抗体を用いた、オタマジャクシ段階の胚における繊毛の検出を示す。画像は尾ひれの領域で得る。ＭＯ  ｍｉＲ−４４９とｍＲＮＡ  ＴＤ−ｔｏｍａｔｏ−ＣＡＡＸを同時注射した細胞では繊毛は検出されない。グラフｇは、対照外植体（２２５細胞、８テール）およびＭＯ  ｍｉＲ−４４９で改変されたもの（２４２細胞、８テール、ｐ＝０．０３６、Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）において、繊毛を発達させる注射細胞（赤色蛍光ＴＤ−ｔｏｍａｔｏ陽性）のパーセンテージを示す。
【図１５】ｍｉＲ−４４９の抑制による繊毛細胞の分化の誘導を示す。ＭＯ抗ｍｉＲ−４４９または対照ＭＯとＦＬＤｘの混合物を、卵割期の胚の表皮に注射する。これらの胚を初期神経胚段階で固定した後、チューブリン−α、Ｔｅｘ１５およびＦｏｘｊ１のリボプローブとのin situハイブリダイゼーションを行い、その後、免疫標識してＦＬＤｘ（蛍光リシン−デキストラン）の存在を確認する。次に、これらの胚を、注射領域における繊毛細胞前駆体の密度をより良く可視化するために切片にする。これら３つのマーカーに関して、ｍｉＲ−４４９の発現の抑制は、繊毛細胞前駆体の増加をもたらした。
【図１６】この図の４つのセクションは、ウェブサイトhttp://www.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideFrame.html.で説明されているように、遺伝子の富化の結果を示す。ＧＳＥＡはエンリッチメントスコア（ＥＳ）を計算するが、このスコアは、ある遺伝子リスト内で遺伝子が過剰発現される程度を表す。正のＥＳは、遺伝子集団の左での遺伝子富化を示し（過剰発現遺伝子に相当する）、負のＥＳは、遺伝子集団の右での遺伝子富化を示す（下方調節遺伝子に相当する）。各セクションでは、パネルの上の部分が、左に示されている遺伝子集団のエンリッチメントスコアのグラフである。パネルの中央の部分は、リストにおいて遺伝子集団のメンバーが明らかな場合に示す（「細胞周期」または「毛様体形成」）。パネルの下の部分は、遺伝子発現と細胞表現型の間の相関を尺度化するメトリックスケジューリングの値を示し、正の値は第一の表現型（ｍｉＲ−４４９の分化または過剰発現）との相関を示し、負の値は第二の表現型（分化していない、または対照）との相関を示す。これらの実験データは総て、Base Gene Expression Omnibusに受託番号ＧＳＥ２２１４７で保存される。
【図１７】ｍｉＲ−４４９が細胞周期およびＮｏｔｃｈ経路を標的とすることを示すという結果を表す。  細胞周期：グラフ（ａ）は、Ａｒｅｇ、Ｃｃｎｂ１、Ｃｃｎｅ２、Ｃｄｃ２５ａのｍＲＮＡの非コード３’部分と融合されたルシフェラーゼリポーター遺伝子の活性の、ｍｉＲ−４４９ａ／ｂおよびｍｉＲ−３４ａ／ｃ５−ｐによる変調を示す。  Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路：グラフ（ｃ）は、ＤＬＬ１およびＮｏｔｃｈ  １のｍＲＮＡの非コード３’部分と融合されたルシフェラーゼリポーター遺伝子の活性の、ｍｉＲ−４４９ａ／ｂおよびｍｉＲ−３４ａ／ｃ５−ｐによる変調を示す。  実験は総て、少なくとも２回、３反復で行った。値はウミシイタケルシフェラーゼの内部対照に対してノーマライズした。エラーバーは標準偏差を示す。  グラフ（ｂ）は、ｍｉＲ−４４９およびｍｉＲ−３４による、細胞周期のＧ１期での遮断を示す。  グラフ（ｄ）は、ＨＡＥＣ細胞の毛様体形成に対する、ＤＡＰＴ（１０μＭ）によるＮｏｔｃｈ経路の阻害効果を示す。  顕微鏡写真（ｅ）および（ｆ）は、表皮にＭＯ抗ｍｉＲ−４４９および蛍光リシン−デキストラン（ＦＬＤｘ）の混合物の注射を施した卵割期の胚を示す。in situハイブリダイゼーションによる染色は、ｍｉＲ−４４９を欠いた表皮におけるＤＬＬ１の持続的発現を示す。  パネル（ｇ）は、表皮に対照ＭＯ、ＭＯ抗ｍｉＲ−４４９およびＭＯ  ＤＩＩ１またはｍＲＮＡ  ＤＬＬ１の注射を施した卵割期の胚を示す。繊毛は抗アセチル化チューブリン抗体（赤色）で染色された。各条件につき、ＦＬＤｘ陽性（緑色）の少なくとも２００細胞（６〜８テール）が繊毛を持つ（Ｐ＜０．０３）。ＤＩＩ１のｍＲＮＡの注射は、繊毛細胞前駆体の数を増加させるが、毛様体形成を抑制することに着目すべきである。ＤＩＩ１発現の減衰は毛様体形成を誘導する。
【実施例】
【００６４】
Ｉ−生物学的細胞モデルの作製
Ｉ−Ａ．ヒト気道上皮細胞
これらの試験は、鼻中隔形成術、鼻甲介切除術またはポリープ切除術下の患者から採取した鼻甲介またはポリープから単離された健康なヒト気道上皮細胞の初代培養物で行った。次に、分化を誘導する目的で、これらの細胞をＩＶ型コラーゲンで覆われた多孔質支持体（Transwell（商標）クリア、ポリエステル、０．４μｍ、Costar）上の、気液界面（ＡＬＩ）で培養した(Puchelle, E et al., 2006)。気道上皮の形態的および生理学的特徴は詳細に記載されている(Puchelle, E et al., 2006)。
【００６５】
Ｉ−Ａ．１．材料および方法
患者および組織サンプル
鼻腔閉塞のための鼻甲介切除術もしくはポリープ切除術または鼻中隔形成術を受ける予定であった３人の患者から下鼻甲介または鼻ポリープを採取した(Dr. Castillo, ORL Department, Pasteur Hospital, Nice, France)。喘息、膵臓線維症またはアレルギーを有する患者は試験から除外した。これらの手順は総て、ニース・ソフィア・アンティポリス大学の倫理委員会によって認可されたものである。
【００６６】
健康なヒト気道上皮細胞（ＨＡＥＣ）の単離および培養
鼻粘膜に由来する健康なＨＡＥＣの初代培養は、従前の研究から適合させた方法によって行った(Wu et al., 1985; Marcet et al., 2007; LeSimple et al., 2007)。切除後、すぐに組織を、ＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ、Invitrogen）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Gibco、Invitrogen）、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Gibco, Invitrogen）、１００ｍｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（Gibco, Invitrogen）および２．５ｍｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（Gibco, Invitrogen）を含有する平衡塩溶液（ＨＢＳＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋不含）Invitrogen）に浸漬する。ＨＢＳＳ−ＨＥＰＥＳ−抗生物質媒体で３回洗浄した後、組織を０．１％のプロナーゼ(Sigma)で４℃にて一晩消化する。次に、組織を消化媒体から注意深く取り出し、鼻粘膜表面の気道上皮細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＨＢＳＳ−ＨＥＰＥＳ−抗生物質媒体を用いて穏やかに攪拌することによって間質から解離させた。この細胞懸濁液を４℃にて１０分、１５０ｇで遠心分離し、細胞ペレットを１０％ＦＣＳ−ＨＢＳＳ−ＨＥＰＥＳ−抗生物質に再懸濁させ、再び遠心分離する。その後、この第二の細胞ペレットを１０％ＦＣＳ−抗生物質−ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Invitrogen）の媒体に、細胞凝集塊を解離させるためにニードル（０．８ｍｍ）および１０ｍｌシリンジを用いて再懸濁させる。次に、これらの細胞をＩＶ型コラーゲン(Sigma)で被覆された透過性多孔質支持体（Transwell（商標）, Costar, Sigma）上に播種し（１０４／ｃｍ２）、加湿雰囲気中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。翌日、培養培地を、以下のホルモン添加剤および他の増殖因子：インスリン、アポトランスフェリン、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、エピネフリン、ヒドロキシコルチゾン、３，３０，５−トリヨードチロニン、内皮細胞成長添加剤、レチノイン酸（低濃度、約１０ｎＭ）、アムホテリシンＢ（２．５ｍｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、硫酸ゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）およびＬ−グルタミン（２ｍＭ）を含有するＢＥＢＭ培地(Lonza)を用いて再構成した増殖培地（ＢＥＧＭ）に置き換える。
【００６７】
気道上皮細胞単層は一般に培養７日後にコンフルエンスに達する。次に、細胞が気液界面にくるように上面の培地を取り出し、基底外側培地を分化培地、すなわち、この時には気道上皮を、粘液繊毛分化を誘導するためにレチノイン酸を約３００ｎＭの高濃度で加えること以外は上記と同じ添加剤を含有する１：１比のＢＥＢＭ／ＤＭＥＭに置き換える。次に、この実験を、経上皮抵抗が５００ｏｈｍ／ｃｍ２を超える分化した培養物に対して行う。
【００６８】
免疫組織化学標識ならびに共焦および電子顕微鏡
気液界面で増殖させた気道細胞培養物からの膜の切片をアセトンまたはメタノール中で固定する（１０分、−２０℃）。ＰＢＳですすいだ後、非特異的部位をＰＢＳ−ＢＳＡ３％でブロックし、その後、一次抗体を、用いる抗体によって室温にて１時間〜４℃で１６時間、ＰＢＳ−ＢＳＡ−１％でインキュベートする。すすいだ後、結合した二次抗体を、ＰＢＳ−ＢＳＡ１％に溶解させ、室温で１時間インキュベートする。すすいだ後、核をＤＡＰＩで標識し、ハリスヘマトキシリンで対比染色する。すすいだ後、これらのスライドを取り付け、共焦顕微鏡で観察する。２つのマウス抗体を含む二重連続標識の場合、一次抗体の空き部位をブロックする工程を、抗マウス抗Ｆａｂ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いて室温で３０分間行う。
【００６９】
電子顕微鏡の場合には、細胞を、１．６％のグルタルアルデヒドを含有する０．１Ｍリン酸一ナトリウムバッファーで固定する。
【００７０】
気道上皮細胞の選別
鼻ポリープの間質を解離した後、上皮細胞（約２０．１０６）をＰＢＳ−ＢＳＡ−ＥＤＴＡ中で３０分間インキュベートし、その後、標識抗体ＣＤ１５１−ＰＥおよび抗ＴＦ（組織因子）−ＦＩＴＣとともに４℃で２０分間インキュベートする（Hajj, R. et al., Stem Cells 25, 139-148 (2007)参照）。２回洗浄した後、細胞をＰＢＳ−ＥＤＴＡにとり、完全性が変化した細胞を標識するためにＤＡＰＩとともにインキュベートする。
【００７１】
細胞選別は、青、赤および紫の３つのレーザーを備えたＦＡＣＳＡｒｉａソーター(BD Biosciences)で行った。死細胞、凝集塊および二重細胞は排除した。二重陽性の基底細胞集団（ＣＤ１５１＋／ＦＴ＋）および陰性の円筒細胞集団（繊毛細胞および粘液分泌細胞を含む）（ＣＤ１５１−／ＦＴ−）を選択し、５０００イベント／秒（周波数３０ＭＨｚ）の速度で選別した。その後、選別された細胞の純度および属性を細胞計数および免疫細胞化学によって確認した。
【００７２】
Ｉ−Ａ．２．ヘマトキシリンおよびエオジンで標識された細胞の形態観察
上皮分化マーカー（繊毛細胞のチューブリン−β４（図１Ｅ〜Ｆ）、粘液分泌細胞のムチンＭＵＣ５ＡＣ（図１Ｇ〜Ｈ）および基底細胞のサイトケラチン１３（図１Ｉ〜Ｊ））の発現を調べるために免疫標識を行った。
【００７３】
分化の状態は共焦および電子顕微鏡によって評価した。分化の４つの重要な段階を検討することにした。
（１）気液界面の確立の１日目（ＡＬＩ−Ｄ０）に、細胞は増殖し、層状の扁平上皮を生成する。
（２）気液界面５〜７日後（ＡＬＩ−Ｄ７）、細胞の極性化が始まる。
（３）気液界面約１４日後、細胞は多列上皮を形成し、細胞表面に最初の繊毛が見られ（ＡＬＩ−ＦＣ）、同時に細胞の伸長が見られ、毛様体形成の開始を示す（図１Ｃ）。
（４）気液界面約２１日後（ＡＬＩ−ＷＤ）、気道上皮は、大部分の細胞が円筒状で繊毛を有する完全な分化段階である多列となり、下層をなす基底細胞層ならびに粘液分泌細胞を伴う（図１Ｄ）。
【００７４】
培養３〜４週間後、表面気道上皮の３つの細胞タイプ（すなわち、基底（図１Ｉ〜Ｊ）、分泌細胞（図１Ｇ〜Ｈ）および繊毛細胞（図１Ｅ〜Ｆ）の形態学的基準および特異的分化マーカーが見て取れる。
【００７５】
ＩＩ−毛様体形成中に選択された細胞におけるｍｉＲＮＡの発現の測定
ハイスループットシーケンシングの技術は、複雑な混合物中のある特定のｍｉＲＮＡの存在度を確定することを可能とする。
【００７６】
ある試験条件内でのｍｉＲＮＡの特異的配列の数に基づき、総てのｍｉＲＮＡ内での該ｍｉＲＮＡの存在度を評価することができる。
【００７７】
ＩＩ−１．材料および方法
アフリカツメガエル胚の繊毛表皮細胞
Hayes et al. (Dev Biol 312 (1), 115 (2007))に記載されているようなアフリカツメガエル胚の繊毛表皮を粘液繊毛上皮モデルとして用いる。
【００７８】
全ＲＮＡの抽出および品質管理
気液界面で培養した４つの分化段階：ＡＬＩ−Ｄ０（０日目）、ＡＬＩ−Ｄ７（７日目）、ＡＬＩ−ＦＣ（約１４日目の、最初の繊毛出現の際）およびＡＬＩ−ＷＤ（約２１日目の、完全に分化したもの）のＨＡＥＣから全ＲＮＡを抽出した。細胞を、トリゾール（商標）(Invitrogen)を含む試薬中で溶解させる。小ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを含む全ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＲＮＥａｓｙカラム(Qiagen)にて、供給者の説明書に従って精製する。
【００７９】
まず、全ＲＮＡサンプルの純度および濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を用いて評価する。２６０／２８０（分光光度計で測定されたサンプルの２６０および２８０ｎｍにおける吸光度の値の比）および２６０／２３０（分光光度計で測定されたサンプルの２６０および２３０ｎｍにおける吸光度の値の比）比は、１．５〜２の間であればＲＮＡ純度を表し、それらは様々であり、２に近い値を持たなければならない。
【００８０】
アフリカツメガエル胚細胞の全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット(Qiagen)を用いて精製した。
【００８１】
次に、これらのＲＮＡをＲＮＡナノチップ(Agilent Technologie, France)にロードし、それらの品質（ＲＮＡの完全性および分解レベル）を、Bioanalyzer System (Agilent Technologies, France)を用いて分析した。
【００８２】
マイクロＲＮＡのハイスループットシーケンシング
小ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを含む全ＲＮＡを上記のように単離する。この手順は、Applied Biosystems Ligase-Enhanced Genome Detection technology (LEGenD（商標）)に基づき、SOLiD（商標）Small RNA Expressionキット(Applied Biosystems, France)に基づく。この方法を用いれば、サンプルの小ＲＮＡを二本鎖ＤＮＡのライブラリーに変換することができ、それは新世代ハイスループットシーケンシングとしてApplied Biosystems SOLiD（商標）Systemにより開発されたものである。
【００８３】
マイクロＲＮＡのハイスループットシーケンシングは、供給者の推奨に従って行った。要するに、小ＲＮＡを含む全ＲＮＡを小ＲＮＡの５’末端をシーケンシングするためのマトリックスを作製するためにはアダプターミックスＡと、または３’末端のシーケンシングのためにはアダプターミックスＢとハイブリダイズさせ（６５℃で１０分、次いで、１６℃で５分）、連結させた（サーモサイクラーにて１６℃で２〜１６時間）。次に、これらのサンプルを逆転写させて（４２℃で３０分）相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。この小ＲＮＡのライブラリーをＰＣＲにより増幅し、ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた後、増幅された小ＲＮＡをそれらのサイズ（供給者の説明書によれば約１０５〜１５０塩基長）に応じて切り出し、ゲルから抽出し、溶出させ、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁させる。その後、核酸の濃度を測定し、ノーマライズした後にシーケンシングのためのサンプル調製を行う。
【００８４】
ハイスループットシーケンシングからのデータの統計分析
統計分析は、Bioconductor（商標）(Peter Dalgaard, Statistics and computing, Introductory statistics with R. Springer, 2002; R. Gentleman, V.J. Carey, W. Huber, R.A. Irizarry, S. Dudoit. Statistics for biology and health. Bioinformatics and computational biology solutions using R and bioconductor. Springer, 2005)のソフトウエアＲを用いて行う。
【００８５】
シーケンシングを行った各マイクロＲＮＡについて、そのマイクロＲＮＡの５ｐ鎖および３ｐ鎖の配列数を１０６配列に対してノーマライズし、各マイクロＲＮＡの発現の存在度％に変換した。次に、ソフトウエアＲを用い、これらのデータを線形モデルおよび経験的ベイズの手法に従ってノーマライズした。次の分析のために、少なくとも１つの培養条件において発現率（または存在度）％が全マイクロＲＮＡの１％より高く、｜Ｌｏｇ２比｜が０．５未満で、補正後のＰ値が０．０５未満マイクロＲＮＡだけを保持した。
【００８６】
マイクロＲＮＡチップ(Agilent Technologies)によるマイクロＲＮＡｏｍｅの分析
マイクロＲＮＡのハイスループットシーケンシングと並行して、マイクロＲＮＡの発現レパートリー（マイクロＲＮＡｏｍｅ）を、Agilent（商標）マイクロＲＮＡチップ技術を用いて調べる。このために、以前と同じ患者からのＲＮＡサンプルを用い、Agilent（商標）ｍｉＲＮＡチップ（８６６のヒトｍｉＲＮＡおよび８９のヒトウイルスｍｉＲＮＡ、すなわち、Sanger miRBase v.12.0, Agilent Technologies, Franceに収められ参照できる全てのヒトｍｉＲＮＡを含むヒトｍｉＲＮＡマイクロアレイｖ２）上で、「ｍｉＲＮＡ標識およびハイブリダイゼーション」キットを供給者(Agilent Technologies)の説明書に従って標識し、ハイブリダイズさせた。
【００８７】
ＤＮＡチップ（Affymetrix（商標））によるトランスクリプトームの分析
トランスクリプトームの分析のため、上記のように、全ＲＮＡを精製し、それらの品質を確認する。
【００８８】
次に、GeneChip（商標）Human Gene 1.0 ST Array (Affymetrix（商標))で分析を行う。このチップ上には、２８８６９の各遺伝子が、その遺伝子の全長にわたる約２６のプローブによって表される。「完全転写物（ＷＴ）センス標的標識および対照試薬、流体工学および走査装置および基本分析ソフトウエア」を用いて、全ＲＮＡを標識し、ハイブリダイズさせる。
【００８９】
ＤＮＡチップ(Affymetrix（商標）)によって得られたトランスクリプトームデータの分析
データ分析は、statistical consortium Rによって開発されたソフトウエアR Bioconductorを用いて行う。次に、これらのデータを、チップ分析の際に得られる情報の大規模分析および保存のために開発された情報システムMedianteインターフェース(Le Brigand and Barbry, 2007)の手段によって可視化する。
【００９０】
Affymetrix（商標）チップの場合、データは、バックグラウンドノイズの補正、ノーマライゼーション工程およびプローブのレベルのレポートを実行するＲＭＡ(Robust Multi-Chip Average)アルゴリズムを用いて分析する。この方法は、特に低い値の発現に高い精度を示し、他の多くの既知の方法よりも高い特異性および感受性を示す(Irizarry et al., 2003)。これらのデータを、R Bioconductorソフトウエアを用い、線形モデルおよび経験的ベイズの手法に従ってノーマライズする。実験的レプリカに対するそれらの統計的有意性の関数としてｌｏｇ２で表した定量的遺伝子調節レベルを示すために、Volcanoプロットの形態のグラフを用いる（図７）。
【００９１】
in situハイブリダイゼーション
４％パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences)中で固定した後、ＡＬＩ−Ｄ２１段階の細胞培養物またはヒト気道組織の凍結切片をアセチル化し、脱イオン化ホルムアミド５０％、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ８．０、１０％デキストラン硫酸、１×デンハート溶液および０．５ｍｇ／ｍｌの酵母ＲＮＡ中、ジゴキシゲニン標的マイクロＲＮＡ(Exiquon, Woburn, MA)で標識した０．３ｎｇ／μｌのＬＮＡプローブとともに５５℃で一晩インキュベートする。
【００９２】
これらのプローブの配列は、
ｍｉＲ−４４９の場合：ccagctaacaatacactgcc（配列番号２０４）
ｍｉＲ−３１の場合：agctatgccagcatcttgcct（配列番号２０５）
陰性対照マイクロＲＮＡ（「スクランブル」）の場合：gtgtaacacgtctatacgccca（配列番号２０６）
である。
【００９３】
プローブは、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質(DakoCytomation)上でシグナル増幅キット「Tyramide Signal Aplificatin Plus DNP AP System」(Perkin Elmer)を用い、抗ジゴキシゲニン抗体(Roche)を結合させたペルオキシダーゼとともに一連のインキュベーションを行うことによって検出した。
【００９４】
次に、一部のスライドを抗ＭＵＣ５ＡＣマウス抗体に曝し、「LSAB2 System-HRP」キット(Dako)で検出した。切片をエオジン／サフラン色素「Nuclear Fast Red」で対比染色し、オイキット封入剤(Electron Microscopy Sciences)を用いて封入した。
【００９５】
アフリカツメガエルにおいて、Marchal, L et al. (Proc Natl Acad Sci USA 106 (41), 17437 (2009))により記載されているように、ＮＡＳＣＯ雌から得た卵を試験管内受精し、培養し、注入する。ＤＩＩ１およびセントリン−２−ＧＦＰのｃＲＮＡを、「Ambion mMessage Machine」キットを用いて作製する。膜結合ベクターＴｄ−ｔｏｍａｔｏ−ＣＡＡＸ（Chenbei Changによる寄贈）をＡｓｅＩで線状化し、ｃＲＮＡを、Ｓｐ６ポリメラーゼを用いて合成する。蛍光リシン−デキストラン（ＦＬＤｘ、２．５ｎｇ／細胞）を、生きた胚を標識するためのモルホリノ（ＭＯ）オリゴヌクレオチドとともに同時注入し、胚におけるＭＯの分布をモニタリングするために抗フルオレセイン免疫検出を行う。注入は総て二反復で行う。
【００９６】
モノジゴキシゲニン(Exiqon)で標識された抗ｍｉＲ−４４９ａ  ＬＮＡプローブをin situハイブリダイゼーションに用い、ハイブリダイゼーションはKloosterman et al. (Nat Methods 3 (1), 27 (2006))によって記載されているように行った。チューブリン−α、ＤＩＩ１、Ｔｅｘ１５およびＦｏｘｊ１のアンチセンスリボゾームプローブは、チューブリン−αおよびＤＩＩ１の場合にはDeblandre et al. (Development 126 (21), 4715 (1999))、Ｔｅｘ１５の場合にはHayes et al. (Dev Biol 312 (1), 115 (2007))、Ｆｏｘｊ１の場合にはPohl et al. (Dev Genes Evol 214 (4), 200 (2004))によって記載されているように作製した。
【００９７】
ＩＩ−２．選択された細胞におけるｍｉＲＮＡの発現
ＩＩ−２．Ａ．ＨＡＥＣ細胞
このように、本発明者らは、現在知られている総てのヒトｍｉＲＮＡ（約７５０）に関して、まず、ｍｉＲＮＡのハイスループットシーケンシング（ＨＴＳ）技術によって１１５のｍｉＲＮＡが分化中に、８を超える強度値（シーケンシングを行ったｍｉＲＮＡ数をノーマライズしたもののＬｏｇ２に相当する）で発現されることを見出した。
【００９８】
シーケンシング技術を用い、シーケンシグを行った各ｍｉＲＮＡの存在度％を決定することができる。このように本発明者らは、驚くことに、２６のｍｉＲＮＡがヒト気道上皮の種々の分化段階に、１％を超える存在度で存在することを確認することができた（図および下記の表ＩＩＩＡに示される）。
【００９９】
同定されたこれら２６のｍｉＲＮＡは、それらだけでヒト気道上皮で発現される全ｍｉＲＮＡの８０％程度をカバーし、この量は、気道上皮組織の再生および／または分化プロセスにそれらが関与していることを示す。
【０１００】
これら２６のｍｉＲＮＡのさらに詳細な分析では、２２のｍｉＲＮＡがヒト気道上皮の４つの分化段階の少なくとも１つで有意に調節され、これは全ｍｉＲＮＡの約７０％に相当し、１３のｍｉＲＮＡが過剰発現され、９つのｍｉＲＮＡが抑制されることを示す（図２Ｂおよび下記の表ＩＶ参照）。
【０１０１】
変調値（２つの分化段階における、ｌｏｇ２で表される発現レベル強度の比としても表される）は、各列の上に示される２つの分化段階における、ｌｏｇ２で表される発現強度レベル間の差として計算される。
【０１０２】
表ＩＩＩＡ．ヒト気道上皮で有意に発現され、ｍｉＲＮＡのハイスループットシーケンシング（ＨＴＳ）によって同定した場合に少なくとも１つの分化段階で１％を超える存在度を有するｍｉＲＮＡ
【表３】
2013500034.tif 000006
2013500034.tif 000007
2013500034.tif 000008
【０１０３】
表ＩＶ．気道上皮の分化中に有意に発現および変調され、ｍｉＲＮＡのハイスループットシーケンシング（ＨＴＳ）によって同定した場合に１％を超える存在度を有するｍｉＲＮＡ
【表４】
2013500034.tif 000009
2013500034.tif 000010
【０１０４】
その後、本発明者らは、Agilent  ｍｉＲＮＡチップを用い、ヒト気道上皮のｍｉＲＮＡの発現レパートリーを調べ、ハイスループットシーケンシングにおいて得られた結果をAgilent（商標）市販ｍｉＲＮＡチップで得られる結果と比較した。この技術を用い、４８のｍｉＲＮＡが４つの分化のうち少なくとも１つにおいて有意に発現および変調されることを見出した（発現レベル強度のｌｏｇ２＞８；１＜ｌｏｇ２（比）＜−１および補正後のＰ値＜０．０５）（図３および表Ｖ参照）。
【０１０５】
表Ｖ．Agilent（商標）ｍｉＲＮＡチップにより同定した場合の、気道上皮の分化中に有意に発現および変調されるｍｉＲＮＡ
【表５】
2013500034.tif 000011
2013500034.tif 000012
【０１０６】
ｍｉＲＮＡのハイスループットシーケンシング（ＨＴＳ）またはAgilent（商標）ｍｉＲＮＡチップにおいて少なくとも１つの細胞培養条件で有意に変調および発現されることが分かったｍｉＲＮＡを比較すると、これら２つの技術で得られた結果の間には相関係数ｒ＝０．９１０６という強い相関が見られる（図４参照）。
【０１０７】
まとめると、少なくとも１つの培養条件におけるＨＴＳでは２６のｍｉＲＮＡが検出および選択され（発現存在度が１％を超える）、Agilent（商標）ｍｉＲＮＡチップでは４８のｍｉＲＮＡが検出および選択された（ｌｏｇ２で表される発現レベル強度が８を超える）。この２つの技術によって得られた共通のｍｉＲＮＡを計算に入れると、６１の異なるｍｉＲＮＡが少なくとも１つの上皮分化条件で有意に発現したことになる（６０は表ＶＩに示され、これにｈｓａ−ｍｉＲ−１９７５（表ＩＩＩ参照）を加えなければならない）。
【０１０８】
ＨＴＳにおいて、有意に調節され、十分な存在度であると確認された２２のｍｉＲＮＡは、Agilent（商標）ｍｉＲＮＡチップでも、様々な有意性および様々な強度レベルで変調されることが分かる。
【０１０９】
上記のように、ｍｉＲＮＡは、ヘアピン構造を有する前駆体の形態で合成され、その後、酵素Ｄｉｃｅｒによって最終的な成熟を受けて２本の小さな一本鎖ＲＮＡ（５ｐおよび３ｐ）を生じ、この成熟型と呼ばれる２本のうち１本の鎖がＲＩＳＣ複合体と相互作用してその変調機能を発揮し、スターと呼ばれる他方の相補鎖（ｍｉｒ−ｘｙ＊で表される）は分解される。従って、本発明者らは、様々な技術（ｍｉＲＮＡチップ、シーケンシング、ＰＣＲ）を用いて、各ｍｉＲＮＡの２鎖を体系的に評価した。本発明者らは、選択されたｍｉＲＮＡのいくつかで、これらの２鎖（５ｐおよび３ｐ）が変調されることを観察したが、ある選択されたｍｉＲＮＡでは、２鎖のうち一方だけが多く発現されること分かった。
【０１１０】
表ＶＩ．Agilent（商標）ｍｉＲＮＡチップおよびＨＴＳ間での、変調および発現されたｍｉＲＮＡの比較
【表６】
2013500034.tif 000013
2013500034.tif 000014
2013500034.tif 000015
【０１１１】
ｍｉｒ−４４９ａ、ｍｉｒ−４４９ｂ、ｍｉｒ−４４９ｂ＊、ｍｉｒ−３４ａ、ｍｉｒ−３４ｂ（３ｐ）、ｍｉｒ−３４ｂ＊（５ｐ）、ｍｉｒ−３４ｃ（５ｐ）が分化中に有意に変調され、従って、気道上皮分化の開始の誘導および維持に関与すると分かることを述べておくべきであろう。
【０１１２】
これらの５つのｍｉＲＮＡ：ｍｉｒ−４４９ａ、ｍｉｒ−４４９ｂ、ｍｉｒ−３４ａ、ｍｉｒ−３４ｂ、ｍｉｒ−３４ｃは、分化中、より詳しくは毛様体形成の開始時に強く誘導されることが分かる。ひと度、誘導されれば、それらの発現は、完全に分化した上皮を含め、分化中、高く安定なままである。上皮のｍｉＲＮＡの完全に分化したレパートリーはこれら５つのｍｉＲＮＡの顕著な存在度を特徴とし、これら５つのｍｉＲＮＡはこの組織で発現される全ｍｉＲＮＡの総数の２０％近くに相当する。しかしながら、ｍｉｒ−３４ａに関しては、他の４つのｍｉＲＮＡよりも低い強度で誘導され、比較的早い、ＡＬＩ−Ｄ７段階で見られる。
【０１１３】
興味深いことに、ｍｉｒ−４４９ａ、ｍｉｒ−４４９ｂ、ｍｉｒ−３４ａ、ｍｉｒ−３４ｂおよびｍｉｒ−３４ｃの各ｍｉＲＮＡの５ｐ鎖は、それらの認識配列のレベルで配列相同性を有し、このことは、それらがある特定の転写物を共通に標的とすることを示唆する。
【０１１４】
本発明者らがこれらの５つのｍｉＲＮＡに力を集中させたのはそのためである。これらのｍｉＲＮＡならびにｍｉｒ−３１（気道上皮の分化中に抑制されることが分かっている）の調節レベルを第三のアプローチとしての定量的ＰＣＲによって確認した（図５参照）。
【０１１５】
気道上皮の分化中に過剰発現されるこれら５つのｍｉＲＮＡは、２つに異なるｍｉＲＮＡファミリー、ｍｉｒ−４４９およびｍｉｒ−３４に属す。さらにｍｉｒ−４４９ａとｍｉｒ−４４９ｂのゲノム位置は同じであり、両者とも、ヒト第５染色体にあるｃｄｃ２０ｂ遺伝子の２番目のイントロンのレベルに位置する（５ｑ１１．２、ｃｈｒ５：５４４５６３８８−５４５０４７６０）。ｍｉｒ−３４ファミリーは、第１染色体の遺伝子間領域に位置するｍｉｒ−３４ａから構成されるが、ｍｉＲＮＡ  ｍｉｒ−３４ｂおよびｍｉｒ−３４ｃは同じクラスターに属し、両者とも第１１染色体の遺伝子間領域に位置する。ｍｉｒ−３４ファミリーは、ｐ５３シグナル伝達経路と機能的に関連づけられている。
【０１１６】
ＩＩ−２．Ｂ．アフリカツメガエル胚の繊毛表皮細胞
このモデルに関して得られた結果を下表ＩＩＩＢおよび図６（ＨＡＥＣ細胞に関する結果も表す）に示す。
【０１１７】
これらの試験は、ここでもまた、マイクロＲＮＡファミリーｍｉＲ−４４９、より詳しくは、ｍｉＲ−４４９ａが、毛様体形成中に断然最も強く誘導されるマイクロＲＮＡとなっていることを示す。
【０１１８】
表ＩＩＩＢ  アフリカツメガエル胚表皮の、非繊毛細胞に比べて繊毛細胞で有意に発現されたｍｉＲＮＡ
【表７】
2013500034.tif 000016
【０１１９】
ＩＩ−２．Ｃ．考察
ｍｉＲ−４４９は、増殖中のＨＡＥＣ細胞におけるマイクロＲＮＡの全配列の０．０１％未満に相当するが、これらのｍｉＲ−４４９は、分化したＨＡＥＣ細胞で発現されるマイクロＲＮＡの８％超に相当する（図６のグラフａおよびｂ参照）。さらに、アフリカツメガエル細胞中のｍｉＲ−４４９ａは分化中に有意に増え、表皮外植体の繊毛細胞中の全マイクロＲＮＡ配列の最大３９％を占める（図６のグラフｃ〜ｄ参照）。
【０１２０】
上記で指摘したように、ｍｉＲ−４４９およびｍｉＲ−３４は、マイクロＲＮＡの１つの同じスーパーファミリーに属す。興味深いことに、この２つのモデルにおいて、毛様体形成中にｍｉＲ−３４ファミリーのメンバーの発現も、ｍｉＲ−４４９の程度よりも低いながら、誘導されたことを述べておく（図６のａおよびｂ参照）。
【０１２１】
ｍｉＲ−４４９ファミリーは脊椎動物において保存されていると思われ、Ｃｄｃ２０ｂ（ヒトおよびカエルにおいてｍｉＲ−４４９クラスターが位置する）の相同遺伝子座を調べたところ、完全にまたは部分的に配列決定された脊椎動物ゲノムの総てにｍｉＲ−４４９が存在することが明らかになった。
【０１２２】
分化したＨＡＥＣ細胞およびアフリカツメガエル表皮の繊毛細胞は、基底細胞、粘液分泌細胞および多繊毛細胞を含む異なる細胞種の混合物からなる。
【０１２３】
ＨＡＥＣ初代培養物（図７の顕微鏡写真ａおよびｃ参照）およびヒト気管支組織（図７の顕微鏡写真ｅおよびｇ参照）に対するin situハイブリダイゼーションにより、ｍｉＲ−４４９は多繊毛円筒細胞では発現されるが、基底細胞（図７の顕微鏡写真ａ参照）またはｍｕｃ５ＡＣ陽性分泌細胞（図７の顕微鏡写真ｅ参照）では発現されないことが明らかになった。
【０１２４】
これらの結果を、ヒト気道の上皮に由来する、円筒細胞を富化した画分（主として多繊毛細胞およびいくらかの粘液分泌細胞から構成される）および基底細胞を富化した画分に対するハイスループットシーケンシング試験によって確認した。
【０１２５】
図７のグラフｄは繊毛細胞画分におけるｍｉＲ−４４９の富化を示すが、観察されるｍｉＲ−３４の発現はより均質で、両タイプの細胞に見られた。
【０１２６】
最後に、アフリカツメガエル胚の細胞に対するin situハイブリダイゼーションにより、ｍｉＲ−４４９の発現は繊毛細胞に限られることが明らかになった。これらの細胞はアセチル化チューブリンによる標識に対して陽性である（図７の顕微鏡写真ｈおよびｌ参照）。
【０１２７】
これらの結果は総て、脊椎動物の多繊毛細胞で最も存在度の高いマイクロＲＮＡはｍｉＲ−４４９であることを示す。
【０１２８】
ＩＩＩ−選択されたｍｉＲＮＡの特異的標的の決定
ＩＩＩ−１．各ｍｉＲＮＡの特異的細胞種の同定
天然の気道上皮と同様に、これらの試験で用いたin vitro分化モデルは、基底細胞、繊毛細胞および粘液分泌細胞からなる。各細胞種に特異的なｍｉＲＮＡのレパートリーを同定するために、本発明者らは、特異的マーカーの手段によるフローサイトメトリーによる細胞選別を用いた(Hajj, R. et al. 2007)。この技術を用い、成体気道前駆体細胞（先験的に基底細胞に相当する）（このような細胞はテトラスパニンＣＤ１５１と組織因子に対して二重陽性を呈する）を、これらの同じマーカーに対して陰性を呈する錐体細胞（すなわち、繊毛細胞および粘液分泌細胞）から単離、選択および選別した。これらは３人の異なるドナーから得られたポリープまたは鼻甲介から精製されたものであった。
【０１２９】
全ＲＮＡを抽出した後、ｍｉＲＮＡの発現プロフィールを、Agilent（商標）市販チップの手段またはハイスループットシーケンシング（ＨＴＳ）によって確定した。これら２つの試験アプローチにより、ｍｉｒ−４４９ａ、ｍｉｒ−４４９ｂ、ｍｉｒ−３４ａ、ｍｉｒ−３４ｂ、ｍｉｒ−３４ｂ＊（ｍｉｒ−３４ｂ−５ｐ）、ｍｉｒ−３４ｃおよびｍｉｒ−３４ｃ＊（ｍｉｒ−３４ｃ−３ｐ）を含む、選択されたいくつかのｍｉＲＮＡに関して、上皮繊毛細胞におけるそれらの特異的発現が確認される。さらに、この細胞選別試験は、培養細胞（例えばｍｉｒ−３１、ｍｉｒ−３１＊、ｍｉｒ−２０５、ｍｉｒ−１３０ａ、ｍｉｒ−１９３ｂ）において呈されるｍｉＲＮＡは基底細胞に対して特異性が高いことを示すことができる（図８および表ＶＩＩ）。本発明者らは、このように初めて、ｍｉＲＮＡの発現レパートリーを分化中の気道上皮の異なる細胞種に特異的に帰すものである。
【０１３０】
表ＶＩＩ．ＨＴＳおよびAgilent（商標）チップにより同定された基底細胞または錐体細胞（繊毛＋分泌）の特異的ｍｉＲＮＡ
【表８】
2013500034.tif 000017
2013500034.tif 000018
【０１３１】
ＩＩＩ−２．選択されたｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡの同定
ｍｉＲＮＡ生物学における大きな試みは、それらが調節する標的ｍＲＮＡを実験的に同定および特性決定可能にすることである。この目標を持って、in silicoアプローチ（標的を予測するためのバイオインフォマティックソフトウエア）を実験アプローチ（トランスクリプトームチップ、ｍｉＲＮＡならびにルシフェラーゼと融合させた対象遺伝子の３’−ＵＴＲ部分を含むリポーターベクターの異所発現）に組み合わせた。補足実験として、免疫細胞化学、ビデオ顕微鏡および生化学的アプローチを用いた。
【０１３２】
標的を予測するためのいくつかのアルゴリズムが提案されている。それらは一般に、ｉ）ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡの５’領域における標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ（認識配列）との間の相補性；ｉｉ）標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおけるこの配列の系統発生的保存、に基づく。
【０１３３】
これらの対象ｍｉＲＮＡによって潜在的に調節される標的遺伝子を決定するために、本発明者らは、発現チップ(Affymetrix, human HuGene 1.0 ST microarrays)によるｍＲＮＡのプロファイリングを確立した。分析したサンプルは、分化中のｍｉＲＮＡの測定に用いたものと同じである。補足的アプローチは、選択されたｍｉＲＮＡの発現レベルをトランスフェクションにより操作した後の、気道上皮細胞のトランスクリプトームの評価からなった。標的遺伝子は、バイオインフォマティックエイド(Mediante, Ingenuity Pathway（商標）)の手段により、上皮の再生および分化に関して選択した。従って、本発明者らは、従前に同定したｍｉＲＮＡとヒト気道上皮の再生および分化に関連づけられているある数の転写物との間の機能的リンクを確立することができた。得られた結果は、５００〜１０００の転写物が分化に関連していることを示す（図９参照）。
【０１３４】
ＡＬＩ−ＦＣとＡＬＩ−ＷＤとの間ではいくつかの遺伝子の発現だけが異なり、これは、ひと度、毛様体形成が誘導されたところで、ＲＮＡの発現の安定性を示す。
【０１３５】
ＩＩＩ−３．ｍｉＲＮＡ  ｍｉｒ−４４９ａ、ｍｉｒ−４４９ｂ、ｍｉｒ−３４ａ、ｍｉｒ−３４ｂおよびｍｉｒ−３４ｃの５ｐ鎖に共通の予測標的遺伝子のin silico同定
認識配列レベルで配列相同性を有する５つの選択されたｍｉＲＮＡ  ｍｉｒ−４４９ａ、ｍｉｒ−４４９ｂおよびｍｉｒ−３４ａ、ｍｉｒ−３４ｂ−５ｐ（ｍｉｒ−３４ｂ＊）およびｍｉｒ−３４ｃ−５ｐの各５ｐ鎖に関して、Mediante network interface (www.microarray.fr)からアクセス可能な予測バイオインフォマティックツール（すなわち、TargetScan, mirbase target, picTar and Microcible 2to8)を用い、予測された標的遺伝子を取得した。本発明者らは、まず、目的とする５つのｍｉＲＮＡに共通の予測された標的遺伝子を選択し、上記で詳説した方法論によって確認した。個々に取得した各ｍｉＲＮＡに対する３５００近くの予測標的のうち、１２２９の標的が、選択された５つのｍｉＲＮＡに共通である。次に、この１２２９の予測標的を、分化中に、より詳しくは、完全に分化した状態と最初の未分化増殖段階の間（ＡＬＩ−ＷＤとＡＬＩ−Ｄ０（ｎ＝３ドナー））に有意に抑制されたもの（約１０００、Ｐ＜０．０５）と比較した。このように、結果は、気道上皮の再生に重要な役割を果たす可能性のある、選択された５つのｍｉＲＮＡに共通の６２の遺伝子を示す（表ＶＩＩＩ参照）。これらの遺伝子の中でも、特に、カベオリン−１が見出される。これらの結果は、カベオリン−１が分化中、強く阻害されることを示す（図８参照）。
【０１３６】
表ＶＩＩＩ．気道上皮の分化中に阻害されることが分かった、選択されたマイクロＲＮＡの予測標的遺伝子のリスト
【表９】
2013500034.tif 000019
2013500034.tif 000020
2013500034.tif 000021
【０１３７】
この対象標的遺伝子のリストに、本発明者らは、ｍｉＲ−３１および／またはｍｉＲ−１３０ａのバイオインフォマティクスによって予測された標的である遺伝子Ｒｆｘ２、Ｒｆｘ３、ＦｏｘＪ１およびＳＴＡＴＨを加えることができる。
【０１３８】
ＩＶ−選択されたｍｉＲＮＡの標的としてのカベオリン−１の検証
カベオリン−１（Ｃａｖ−１）は、カベオラと呼ばれる原形質膜の小さな陥入の形成に不可欠な２２ｋＤａの膜タンパク質である。Ｃａｖ−１遺伝子は接着細胞（内皮細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞）で発現される。
【０１３９】
より詳しくは、カベオリンは基底細胞および繊毛上皮細胞の膜表面に存在することが示されており、これらの細胞種における重要な役割を示唆している(Krasteva, G. et al. (2006) Respir Res 7, 108)。カベオリン−１の発現の喪失は、上皮の増殖および分化の欠陥をもたらす可能性がある(Yang, G. et al. (2008) Exp Mol Pathol 84, 131-140)。
【０１４０】
さらに、カベオリンは、呼吸器系疾患に対する種々の形態の感受性に関連づけられている。例えば、カベオラは多様な受容体を含み、Ｃａｖ−１は細胞表面に存在するトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βの受容体の数の減少に関連づけられている。初期の研究では、ＴＧＦ−β経路の妨害による、いくつかの呼吸器系疾患におけるカベオリン−１欠乏の関与の可能性が強調された(Le Saux, C.J. et al. (2008) J Biol Chem 283, 5760-5768)。
【０１４１】
さらに、いくつかの微生物が細胞に感染するために選択的にカベオラを利用することが示されている(Norkin, L.C. et al. (2001) Exp Cell Res 266, 229-238)。これらのカベオラは気道上皮の繊毛細胞の基底外側表面に位置するので、上皮病変が存在する場合には、病原体のエンドサイトーシスに特に関与する可能性がある(Krasteva, G. et al., 2006)。実際に、アデノウイルスは、それらの病原能を発揮するために、上皮または体とジャンクションの完全性を低下させて繊毛細胞の側底膜に接近する必要がある(Walters, R.W. et al. (1999) J Biol Chem 274, 10219-10226)。最後に、基底細胞は感染により弱いと思われる(Pickles, R.J. et al. (1996) Hum Gene Ther 7, 921-931 (1996)。このことと一致して、カベオラの数は繊毛細胞よりも基底細胞に多いことが示されている(Krasteva, G. et al., 2006)。
【０１４２】
ＩＶ−１．試験の原理
ＭｉｃｒｏＣｉｂｌｅアルゴリズムを用いた。このアルゴリズムは、Ｃａｖ−１転写物おいて、ｍｉｒ−３４ａ／３４ｃ−５ｐ、ｍｉｒ−４４９ａ／ｂに対する３つの異なる固定部位に対して、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐに対する７つの異なる固定部位を同定する。本発明者らは、Ｃａｖ−１の全３’−ＵＴＲ部分がルシフェラーゼコード配列の下流に挿入されたリポーター遺伝子の発現ベクターを構築した。次に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をこのベクターおよび選択された５つの各ｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ３４ａ／ｂ−５ｐ／ｃ−５ｐ／４４９ａ／ｂ）でコトランスフェクトし、それぞれ陰性対照ｍｉＲＮＡの場合と比較した。
【０１４３】
ＩＶ−２．材料および方法
３’−ＵＴＲ発現ベクターおよびルシフェラーゼ活性の測定
カベオリンの非コード部分（３’−ＵＴＲ）の完全配列（配列番号１７８）をＰＣＲによって増幅した後、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクター(Promega)のＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングする。
【０１４４】
目的とする合成マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ＊、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐおよび陰性対照ｍｉＲ（ｍｉＲ−Ｎｅｇ１））は、Ambion社(Applied Biosystems)により合成された。白色９６穴プレートにて、トランスフェクション剤としてリポフェクトアミン２０００(Invitrogen)を用い、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１穴当たり２００００細胞）に対し、１００ｎｇのプラスミドベクターｐｓｉＣｈｅｃｋ２および５ｎｍｏｌの合成ｍｉＲＮＡでリバーストランスフェクションを行った。トランスフェクション４８時間後、およびホタルルシフェラーゼの活性を、Ｄｕａｌ  Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステムキット(Promega)を用いて評価し、照度計(Luminoskan Ascent, Thermolab system)に手段によって測定した。
【０１４５】
シグナル伝達経路の同定
目的とする遺伝子と他の官能基との間の相互作用のネットワークを同定するために、ソフトウエアIngenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Mountain View, USA)を用いた。１を超える比を有する遺伝子を選択した。このように、生物学的機能および疾患と本発明者らの試験結果を関連づけることができる。
【０１４６】
ＩＶ−３．結果
本発明者らは、ルシフェラーゼ遺伝子をカベオリン−１の非コード３’部分と融合させた場合、ｍｉｒ−３４ｂ−５ｐがルシフェラーゼ遺伝子の発現を有意に阻害したことを示した（Ｐ＜０．０１）。これらの結果は、本発明者らが見出した分化中にはカベオリン−１が強く阻害されることと合わせると、Ｃａｖ−１は気道上皮の分化プロセスに関与するｍｉｒ−３４ｂ＊（ｍｉｒ−３４ｂ−５ｐ）の特異的標的であることを示唆する（図１１）。
【０１４７】
おそらく抑制性のカベオリン−１以外のｍｉＲＮＡ、ｍｉｒ−４４９ａ、ｍｉｒ−４４９ｂ、ｍｉｒ−３４ａおよびｍｉｒ−３４ｂ＊は、１以上の他の遺伝子の調節において働くと思われる。
【０１４８】
同じ原理に従い、カベオリンを用いて行った試験は、目的とする他の標的遺伝子を用いた場合にも再現された。すなわち、以下の遺伝子：ＡＲＥＧ（配列番号１７９）、ＡＵＲＫＡ（配列番号１８０）、ＣＡＰＮ１３（配列番号１８１）、ＣＣＮＢ１（配列番号１８２）、ＣＣＮＥ２（配列番号１８３）、ＣＤＣ６（配列番号１８４）、ＣＤＣ２５Ａ（配列番号１８５）、ＣＥＮＰＫ（配列番号１８６）、ＣＥＰ５５（配列番号１８７）、ＣＤＣ２０Ｂ（配列番号１８８）、Ｅ２Ｆ７（配列番号１８９）、ＦＯＸＭ１（配列番号１９０）、ＳＴＡＴＨ（配列番号１９１）およびＴＯＰ２Ａ（配列番号１９２）の３’−ＵＴＲ配列をクローニングした。
【０１４９】
表ＩＸ−選択されたｍｉＲＮＡの少なくとも１つによって検証された標的遺伝子のリスト
【表１０】
2013500034.tif 000022
【０１５０】
標的をその発現がｍｉＲＮＡによって阻害されるかどうか検証する。
【０１５１】
Ｖ−ＤＮＡチップ(Affymetrix（商標）)による、目的とするｍｉＲＮＡ：ｍｉｒ−４４９ａ、ｍｉｒ−４４９ｂ、ｍｉｒ−３４ａ、ｍｉｒ−３４ｂ＊、ｍｉｒ−３４ｃ−５ｐの標的の同定
目的とするｍｉＲＮＡの発現によって特異的に変調される遺伝子を決定するために、ｍｉｒ−４４９ａ、ｍｉｒ−４４９ｂ、ｍｉｒ−３４ａ、ｍｉｒ−３４ｂ＊およびｍｉｒ−３４ｃ−５ｐの各ｍｉＲＮＡを未分化気道上皮細胞（ＨＡＥＣ）の初代培養物にトランスフェクトし、トランスフェクション４８時間後に、トランスクリプトームチップ(Affymetrix（商標）)によって、特異的に変調される遺伝子を調べた。
【０１５２】
ｍｉｒ−４４９ａ、ｍｉｒ−４４９ｂ、ｍｉｒ−３４ａ、ｍｉｒ−３４ｂ＊、ｍｉｒ−３４ｃ−５ｐは同じ「シード」（配列２〜７）を共有することから、それらは共通の標的と相互作用することができる。このようにして、これらのｍｉＲＮＡによって有意に変調されるものとして９５の共通遺伝子が得られた。
【０１５３】
従来、ｍｉＲＮＡは、その標的ｍＲＮＡに対して直接それらの発現を抑制する働きをすると仮定されている。図１２は、これらの各ｍｉＲＮＡの４８時間のトランスフェクションに応答した、目的とするこれらのｍｉＲＮＡの認識配列の相補的領域を含む標的遺伝子の富化を示す。本発明者らは、９５の変調遺伝子に関して、４１の遺伝子が有意に抑制されることを観察した（表Ｘ参照）。
【０１５４】
これらの４１の抑制遺伝子のうち１８の遺伝子が、選択された５つのｍｉＲＮＡ（表ＸＩ参照）に共通であり、かつ、前記ｍｉＲＮＡによるその調節が気道上皮の分化において、および呼吸器系疾患（膵臓線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、原発性繊毛ジスキネジアなど）に対する治療戦略の実施において重要な役割を果たし得る予測標識である（in silico分析による）。
【０１５５】
表ＩＸ：ＨＡＥＣでの目的とする各ｍｉＲＮＡのトランスフェクション後における、ｍｉＲＮＡ  ｍｉｒ−３４ａ、ｍｉｒ−３４ｂ＊、ｍｉｒ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉｒ−４４９ａおよびｍｉｒ−４４９ｂに共通な４１の抑制遺伝子
【表１１】
2013500034.tif 000023
2013500034.tif 000024
2013500034.tif 000025
【０１５６】
表ＸＩ．ｍｉｒ−４４９ａ、ｍｉｒ−４４９ｂ、ｍｉｒ−３４ａ、ｍｉｒ−３４ｂ＊およびｍｉｒ−３４ｃ−５ｐに共通であり、かつ、ＨＡＥＣにおいて選択された各ｍｉＲＮＡのトランスフェクション後に抑制される予測標的
【表１２】
2013500034.tif 000026
2013500034.tif 000027
【０１５７】
Ingenuity Pathway Analysisソフトウエア（ＩＰＡ）(Ingenuity Systems, Mountain View, USA)を用いたバイオインフォマティック分析により、これらの遺伝子間の相互作用のネットワークを特定し、生物学的機能および疾患と試験結果とを関連づけることが可能になった（図１３参照）。
【０１５８】
選択されたｍｉＲＮＡの発現によって調節される経路は、細胞周期調節のための主要経路である。
【０１５９】
ＶＩ−  毛様体形成に対するｍｉＲ−４４９発現抑制の機能的効果に関する検討
次に、毛様体形成に対するｍｉＲ−４４９発現減衰の効果を検討した。
【０１６０】
ＶＩ−Ａ．材料および方法
ＨＡＥＣ細胞
６つの独立したＨＡＥＣ細胞培養物を、ｍｉＲ−４４９に対するオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、コレステロール分子に結合させ、再生期間中の毛様体形成を評価した。
【０１６１】
これらの試験では、３’において２’−Ｏ−メチル結合によってコレステロール分子と結合させた、配列：5’-ascscsagcuaacaauacacugcscsa-Chol-3’（配列番号２０７）（ホスホロチオエート結合は下付き文字ｓで示す）を有するｍｉＲ−４４９ａのアンチセンスオリゴヌクレオチド(antagomir)（Eurogentec (Seraing, Belgium)に従って得たもの）を用いる。
【０１６２】
このantagomirはヒト(Homo sapiens)のｍｉＲ−４４９ａ（完全一致）およびｍｉＲ−４４９ｂ（ミスマッチを含む）を標的とする。
【０１６３】
用いる陰性対照は、Eurogentecからの、配列：5’-csasuscgucgaucguagcgscsa-Chol-3’（配列番号２０８）のＣｌｅａｒ−ｍｉＲ（ｔｍ）である。
【０１６４】
antagomir（１００μＭ）をウシ胎児血清（ＦＣＳ）中、室温で３０分間プレインキュベートする。次に、分化培地中のantagomir−ＦＣＳ混合物（２０μＭのantagomir）を初代ＨＡＥＣ細胞の上面に加える。３７℃で２時間後、この混合物を引き上げて気液界面を再び作る。
【０１６５】
トランスフェクションは、対照細胞が完全な分化に達するまで（通常、２１日後）、５日ごとに新たに調製したantagomirで更新する。
【０１６６】
アフリカツメガエル
ｍｉＲ−４４９に対するモルホリノ（ＭＯ）オリゴヌクレオチド(GeneTools, LLC, Philomath, Oregon, USA)は以下の配列を有する。
ＭＯ−４４９ａ：5’-ACCAGCTAACATTACACTGCCT-3’（配列番号２０９）
ＭＯ−４４９ｂ：5’-GCCAGCTAAAACTACACTGCCT-3’（配列番号２１０）
ＭＯ−４４９ｃ：5’-ACAGCCAGCTAGCAAGTGCACTGCC-3’（配列番号２１１）および
対照ＭＯ：5’-TGCACGTTTCAATACAGACCGT-3’（配列番号２１２）
【０１６７】
用いる抗ＤＬＬ１  ＭＯはMorichika et al. (Dev Growth Differ 52 (2), 235 (2010))によって記載されているものである。
【０１６８】
ＶＩ−Ｂ．結果および考察
そのantagomirによって無効とされるｍｉＲ−４４９は、ＡＬＩ−Ｄ２１段階の繊毛ＨＡＥＣ細胞の数に有意な減少をもたらし（毛様体形成阻害の平均値２．３±０．３、ｎ＝６、Ｐ＜０．００１）（図１４参照）、並行してｍｉＲ−４４９発現にも同程度の減少をもたらす（図１４、顕微鏡写真ｂ）。
【０１６９】
ＭｉＲ−４４９はまた、アフリカツメガエル胚の細胞において、成熟ｍｉＲ−４４９を標的とするモルホリノオリゴヌクレオチドの混合物の表皮注射によって無効とされた。ｍｉＲ−４４９が無効となると、尾芽胚の胚発生段階およびオタマジャクシ（ｎ＝１１２）においてアセチル化チューブリン染色によって明らかにされるように、多毛様体形成が阻害される（図１４、顕微鏡写真ｃ〜ｉ参照）。
【０１７０】
多毛様体形成には、（ｉ）細胞周期の明確な終了、それに続く（ｉｉ）新たに合成された中心小体に由来する何百もの基底小体の増殖を特徴とする中心小体形成(centriologenesis)；（ｉｉｉ）基底小体の頂端膜への遊走（頂端膜で基底小体は微小管の組織化の中心として働き、および可動性の軸糸の組み立てを可能とする）が必要である。
【０１７１】
検討した２つのモデルでは、チューブリン陽性細胞（繊毛の染色）とセントリン−２陽性細胞（基底小体の染色）との比はｍｉＲ−４４９の発現抑制によっては影響を受けず、このことはｍｉＲ−４４９が中心小体の形成前に働くことを示唆する。
【０１７２】
アフリカツメガエル表皮におけるｍｉＲ−４４９の無効化は多毛様体形成を抑制するが、α−チューブリン、Ｔｅｘ１５および転写因子Ｆｏｘｊ１を含む繊毛細胞マーカーのｍＲＮＡの発現は抑制しなかったことに注目するのは興味深い（図１５参照）。これらのデータは、ｍｉＲ−４４９は最終分化に必要であるが、多繊毛細胞の特性化には必要でないことを示唆し、従って、脊椎動物における毛様体形成の主要調節因子としてのｍｉＲ−４４９の役割を確実なものとなる。
【０１７３】
ＶＩＩ−ｍｉＲ−４４９標的に対するｍｉＲ−４４９のトランスフェクションの効果
毛様体形成に対するｍｉＲ−４４９の影響を評価するためには、ｍｉＲ−４４９の標的が最終分化中、およびｍｉＲ−４４９のトランスフェクション後に阻害されたかどうかを確認することが望ましいと思われた。
【０１７４】
ＶＩＩ−Ａ．材料および方法
フローサイトメトリーによる細胞周期の分析
肺腺癌のＡ５４９細胞の細胞周期を血清欠乏の一晩の培養によって同調させた後、マイクロＲＮＡでトランスフェクトし、次に、これらの細胞を、Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中で３０％コンフルエントまで培養する。これらの細胞を４８時間後に回収し、８０％エタノールで固定し、ＲＮアーゼＡ（５０μｇ／ｍｌ）を含有する０．１ｍｌのヨウ化プロピジウム溶液で染色する（３７℃、３０分）。
【０１７５】
データをＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター(Becton-Dickinson)で読み取る。Ｇ１期、Ｓ期およびＧ２＋Ｍ期の細胞のパーセンテージを、Pro Cellquestソフトウエアで計算した。
【０１７６】
プラスミドの構築およびルシフェラーゼ活性の測定
Ａｒｅｇ、Ｃｃｎｂ１、Ｃｃｎｅ２、Ｃｄｃ２５ａ、ＤＩＩ１およびＮｏｔｃｈ１の非翻訳３’領域の完全配列または部分配列を増幅し、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクター(Promega)にクローニングした。
【０１７７】
このようにして得られたｐｓｉＣｈｅｃｋベクターの構築物を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、合成マイクロＲＮＡまたは陰性対照(Ambion, Applied System)とともにコトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、Pottier et al. (PLoS One 4 (8), e6718 (2009))により記載されているように測定する。
【０１７８】
ＶＩＩ−Ｂ．結果
ｍｉＲ−４４９の標的を、（ｉ）ＨＡＥＣ細胞の４つの再生段階（ＡＬＩ−Ｄ０、ＡＬＩ−Ｄ７、ＡＬＩ−Ｄ１４、ＡＬＩ−Ｄ２１）における発現プロフィール、（ｉｉ）ｍｉＲ−４４９でトランスフェクトされた増殖中のＨＡＥＣ細胞を用いた場合の発現プロフィールの分析によって定義した。Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) (Edgar et al. Nucleic Acids Res 30 (1), 207 (2002))によって特異的に発現されたｍＲＮＡの機能的注釈により、Ｇ２／Ｍ期と関連し、かつ、毛様体形成と関連する遺伝子の有意な増加が明らかである（図１６参照）。
【０１７９】
ｍｉＲ−４４９によって変調される転写物を、マイクロＲＮＡの標的を予測するためのツール(http://www.microarray.fr:8080/merge/index)を用いて分析すると、このマイクロＲＮＡの可能性のあるいくつかの標的が特定され、これをルシフェラーゼ試験で検証した（図１７、顕微鏡写真ａ、ｃ）。
【０１８０】
検証されたｍｉＲ−４４９ａ／ｂの標的の第一群は、アンフィレグリン（Ａｒｅｇ）、サイクリンＢ１（Ｃｃｎｂ１）、サイクリンＥ２（Ｃｃｎｅ２）および細胞周期の調節に関与するタンパク質をコードする細胞分裂周期２５ホモログＡ（Ｃｄｃ２５Ａ）を含んでなる。実際、ｍｉＲ−４４９のトランスフェクションは、Feng, M. et al. (Cell Cycle 9 (2), 213 (2010))、 Lize et al. (Cell Death Differ (2009), Noonan et al. (Oncogene 28 (14), 1714 (2009))およびYang, X. et al. (Genes Dev 23 (20), 2388 (2009))により報告されているように、細胞周期のＧ１期での停止をもたらし（図１７ｂ）、これは中心小体形成の誘導前の重要な段階である。
【０１８１】
検証されたｍｉＲ−４４９の標的の第二群は、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈリガンドであるＤＬＬ１から構成される（図１７ｃ）。興味深いことに、ＨＡＥＣ細胞の再生中にＮｏｔｃｈシグナル伝達経路をγ−セクレターゼアンタゴニスト（ＤＣＴ、１０μＭ）で遮断すると、毛様体形成が有意に増強され（図１７ｄ）、これはTsao et al. (Development 136 (13), 2297 (2009))の総説と一致する。
【０１８２】
これらの結果は、アフリカツメガエル表皮の繊毛細胞の前駆体がまさにそれらの分化時にＮｏｔｃｈのリガンドＤＩＩ１を一時的に発現するという所見、およびＤＩＩ１の発現がこれらの前駆細胞におけるｍｉＲ−４４９の蓄積と並行して、経時的に急速に低下するという所見と矛盾がない（図１７ｅ）。
【０１８３】
この所見から予測できるように、ＤＩＩ１の内因的発現は、ＭＯｍｉＲ−４４９で改変された胚の繊毛細胞の前駆体において高く維持され（図１７ｅおよびｆ）、このことはｍｉＲ−４４９がＤＩＩ１の発現を抑制することを示唆する。
【０１８４】
ＶＩＩＩ−毛様体形成に対する持続的ＤＩＩ１活性の効果
次に、毛様体形成に対する持続的ＤＩＩ１活性の結果を評価した。
【０１８５】
ｍｉＲ−４４９に対する結合部位を欠いたＤＩＩ１の合成ＲＮＡを注射すると、（１）繊毛細胞の過度な分化、（２）これらの細胞の大多数における不完全な毛様体形成（ｍｉＲ−４４９が欠乏した胚において見られたものと同じ表現型）が生じる（図１７ｇ）。
【０１８６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の側方阻害は、多繊毛細胞の特徴を抑制することが知られている。ＤＩＩ１の過剰発現後に見られる繊毛細胞の分化の増進は、Deblandre et al. (Development 126 (21), 4715 (1999))により報告されているように、おそらくはＮｏｔｃｈ活性の阻害によって引き起こされる。
【０１８７】
並行して、モルホリノオリゴヌクレオチドによる内因性ＤＩＩ１の発現抑制は、繊毛細胞の過度な分化をもたらした（図１７ｇ）。よって、ｍｉＲ−４４９は、ＤＩＩ１の発現を抑制することによって多毛様体形成を誘発することができる。このモデルの裏付けとして、ｍｉＲ−４４９発現の減衰によって引き起こされる不完全な多毛様体形成は、ｍｉＲ−４４９の標的であるＤＩＩ１の阻害によって効果的に回復される（図１７ｇ）。
【０１８８】
従って、これらの結果は、ＤＩＩ１発現の抑制はｍｉＲ−４４９の作用機序の中枢にあることを示す。
【図１】
2013500034.tif 000030
【図３】
2013500034.tif 000031
【図４】
2013500034.tif 000032
【図８】
2013500034.tif 000033
【図２Ａ】
2013500034.tif 000034
【図２Ｂ】
2013500034.tif 000035
【図５】
2013500034.tif 000036
【図６】
2013500034.tif 000037
【図７】
2013500034.tif 000038
【図９】
2013500034.tif 000039
【図１０】
2013500034.tif 000040
【図１１】
2013500034.tif 000041
【図１２】
2013500034.tif 000042
【図１３】
2013500034.tif 000043
【図１４】
2013500034.tif 000044
【図１５】
2013500034.tif 000045
【図１６】
2013500034.tif 000046
【図１７】
2013500034.tif 000047
【配列表】
2013500034000001.app
【国際調査報告】
2013500034.tif 000048
2013500034.tif 000049
2013500034.tif 000050
2013500034.tif 000051
2013500034.tif 000052
2013500034.tif 000053