(57)【要約】  本発明は、血清半減期の改善された薬物の融合物及びコンジュゲートに関する。これら融合物及びコンジュゲートは、免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメイン及びインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子を含む。本発明は、更に、このような薬物の融合物及びコンジュゲートを含む使用、製剤、組成物、及び装置に関する。また、本発明は、融合物及びコンジュゲートの一部として存在する２以上のインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子を含む組成物、並びにその使用及び製剤に関する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の融合物又はコンジュゲートを含む組成物であって、前記融合物又はコンジュゲートが、（ａ）インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子から選択され、且つ（ｂ）前記インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子の半減期を延長させるタンパク質又はペプチド、との融合物又はコンジュゲートとして存在する少なくとも２つの分子、を含むか又はこれらからなる、組成物。
【請求項２】
前記半減期を延長させるタンパク質又はペプチドが、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンに結合するものである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記半減期を延長させるタンパク質が、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンに対して特異的に結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも２つの個々の融合物又はコンジュゲートを含む組成物であって、各個々の融合物又はコンジュゲートが、（ａ）インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子から選択され、（ｂ）前記インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子の半減期を延長させるタンパク質又はペプチド、との融合物又はコンジュゲートとして存在する１以上の分子、を含むか又はこれらからなる、組成物。
【請求項５】
前記半減期を延長させるタンパク質又はペプチドが、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンに結合するものである、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記半減期を延長させるタンパク質が、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンに対して特異的に結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチンのうちの少なくとも１つが、ＧＬＰ−１、ＰＹＹ、エキセンディン、あるいはインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチンの活性を保持しているこれらの機能的変異体、類似体、突然変異体、又は誘導体であるペプチド、から選択される、請求項１〜６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
インクレチンのうちの少なくとも１つが、（ａ）図１（ｉ）（配列番号９）に示すアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ突然変異体、又はその突然変異体、誘導体、若しくは類似体、（ｂ）図１（ｊ）（配列番号１０）に示すアミノ酸配列を有するエキセンディン−４分子、又はその突然変異体、誘導体、若しくは類似体、及び（ｃ）図１（ｓ）（配列番号１９）に示すアミノ酸配列を有するＰＹＹペプチド、又はその突然変異体、誘導体、若しくは類似体から選択される、請求項１〜７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
血清アルブミンに対して特異的に結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）が、ＤＯＭ７ｈ−１４（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ７ｈ−１４のアミノ酸配列は図１（ｈ）の配列番号８に示す）、又はＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ７ｈ−１４−１０のアミノ酸配列は図１（ｏ）の配列番号１５に示す）、及びＲ１０８Ｃ突然変異を有するＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ７ｈ−１４−１０  Ｒ１０８Ｃのアミノ酸配列は図１（ｒ）の配列番号１８に示す）、及び７ｈ−１１−１５  ａｌｂｕｄａｂ（ＤＯＭ７ｈ−１１−１５のアミノ酸配列は図１（ｐ）の配列番号１６に示す）、及び７ｈ−１１−１５  Ｒ１０８Ｃ  ａｌｂｕｄａｂ（ＤＯＭ７ｈ−１１−１５  Ｒ１０８Ｃのアミノ酸配列は図１（Ｔ）の配列番号４７に示す）、あるいは血清アルブミンにおける同じエピトープに結合するか、又は血清アルブミンに対する結合についてこれらのうちのいずれかと競合するｄＡｂ、から選択される、請求項１〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン分子及び／又は腸管ペプチドを接合させるアミノ酸又は化学リンカーと、血清アルブミンに結合するｄＡｂとを更に含む、請求項１〜９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
アミノ酸リンカーが、図１（ｋ）（配列番号１１）に示すアミノ酸配列を有するヘリカルリンカー、図１（ｌ）（配列番号１２）に示すアミノ酸配列を有するｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、又はＰＥＧリンカーから選択される、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
ＰＥＧリンカーが、図３に示すＰＥＧリンカーの構造を有する、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子が、ｄＡｂのＮ末端又はＣ末端のいずれか又は両方に存在する、請求項１〜１２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
１以上のインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチドがｄＡｂのＣ末端に存在し、更に、１以上のインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子がｄＡｂのＮ末端に存在する、請求項１〜１３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５】
図１ａ〜１ｇ（配列番号１〜７）、及び図１ｍ〜１ｎ（配列番号１３〜１４）、及び図１ｕ〜１ｖ（配列番号４８〜４９）、及び図３又はＤｏｍ７ｈ−１１−１５（Ｒ１０８Ｃ）−ＰＥＧ−３−３６ＰＹＹ（１０位がリシン）（ａｌｂｕｄａｂ成分がＤｏｍ７ｈ−１１−１５（Ｒ１０８Ｃ）であることを除いて図３に示す構造を有する）に記載のペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂ分子のうちの１以上を含む、請求項１〜１４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６】
（ａ）ＤＡＴ０１１５分子（図１ｂの配列番号２に示すアミノ酸配列を有する）と、（ｂ）同時に、別々に、又は順次使用するための複合調製物としてのＤｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）−ＰＥＧ−３−３６ＰＹＹ（１０位がリシン）（図３に示す構造を有する）、又は（ｃ）Ｄｏｍ７ｈ−１１−１５（Ｒ１０８Ｃ）−ＰＥＧ−３−３６ＰＹＹ（１０位がリシン）（ａｌｂｕｄａｂ成分がＤｏｍ７ｈ−１１−１５（Ｒ１０８Ｃ）であることを除いて図３に示す構造を有する）のいずれかとを含む、請求項３又は６記載の組成物。
【請求項１７】
ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体又は少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域から選択される前記半減期を延長させるタンパク質又はペプチドに追加の分子を結合させることによるか、又は抗体ドメインにコンジュゲートさせることによってその流体力学的サイズを増大させるように、前記タンパク質又はペプチドを更にフォーマット化する、請求項１〜１６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１８】
融合物又はコンジュゲートが、更なるペプチド又はポリペプチド部分を含む、請求項１〜１７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１９】
融合物又はコンジュゲートが、Ｄｏｍ７ｈ−１４、ＤＯＭ  ７ｈ−１１−１５、又はＤｏｍ７ｈ−１４−１０ｄＡｂのうちのいずれか、から選択されるＡｌｂｕｄＡｂに対して同じ又は異なる結合特異性を有する追加のｄＡｂ部分を含む、請求項１〜１８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０】
追加のｄＡｂが、Ｄｏｍ７ｈ−１４、Ｄｏｍ７ｈ−１１−１５、又はＤｏｍ７ｈ−１４−１０ｄＡｂのうちのいずれか、との結合について競合する、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
融合物又はコンジュゲートが、１２時間以上、例えば１２〜２１日間のヒトにおける排出半減期を有する、請求項１〜２０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２２】
融合物又はコンジュゲートが、約５μＭ〜約１ｐＭの範囲のＫＤでヒト血清アルブミンに結合する、請求項１〜２１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２３】
薬学的又は生理学的に許容できる担体、賦形剤、又は希釈剤と組合せて、請求項１〜２２のいずれか一項記載の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項２４】
更なる治療剤又は活性剤を含む、請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
被験体に別々に、順次、又は同時に投与するための、（ａ）請求項１〜２４のいずれか一項記載の組成物と、（ｂ）更なる治療剤又は活性剤とを含む、組成物。
【請求項２６】
請求項３又は６記載の２以上の融合物又はコンジュゲートを含む組成物であって、各々が、療法において同時に、別々に、又は順次使用するための複合調製物として、（ａ）１以上のインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子であって、（ｂ）血清アルブミンに特異的に結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）、との融合物又はコンジュゲートとして存在する１以上のインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子を含むか又はこれらからなる、組成物。
【請求項２７】
代謝性疾患又は障害の治療又は予防において使用するための、請求項１〜２６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２８】
疾患又は障害が、高血糖症、耐糖能異常、β細胞欠損、糖尿病（１型若しくは２型の糖尿病又は妊娠性糖尿病）、肥満、過食を特徴とする疾患から選択される、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
代謝性疾患又は障害を治療又は予防するための薬剤の製造における、請求項１〜２８のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項３０】
皮下、静脈内、又は筋肉内注射によって被験体に送達するための薬剤の製造における、請求項１〜２８のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項３１】
非経口、経口、直腸内、経粘膜、皮下注射、目、肺、又はＧＩ管送達のための薬剤の製造における、請求項１〜２８のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項３２】
治療上又は予防上有効な量の請求項１〜２８のいずれか一項記載の組成物を患者に投与することを含む、代謝性疾患を治療又は予防する方法。
【請求項３３】
請求項１〜２８のいずれか一項記載の組成物を含む経口、注射可能、吸入可能、又は噴霧可能な製剤。
【請求項３４】
請求項１〜２８のいずれか一項記載の組成物を含む坐剤の形態の持続放出製剤。
【請求項３５】
請求項１〜２８のいずれか一項記載の組成物を含むフリーズドライ製剤。
【請求項３６】
請求項１〜２８のいずれか一項記載の組成物を含む送達装置。
【請求項３７】
請求項１〜２８のいずれか一項記載の融合物をコードする単離又は組換え核酸。
【請求項３８】
請求項１５記載の融合物をコードする核酸。
【請求項３９】
請求項３７又は３８記載の核酸を含むベクター。
【請求項４０】
請求項３７若しくは３８記載の核酸、又は請求項３９記載のベクターを含む、非胚性宿主細胞。
【請求項４１】
患者の高血糖に関連する代謝性疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、治療上又は予防上有効な量の請求項１〜２８のいずれか一項記載の組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項４２】
前記疾患又は障害が、高血糖症、耐糖能異常、β細胞欠損、糖尿病（１型若しくは２型の糖尿病又は妊娠性糖尿病）、肥満、過食を特徴とする疾患から選択される、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
患者におけるインスリン生成を刺激する及び／又はインスリン感受性を高める方法であって、少なくとも１用量の請求項１〜２８のいずれか一項記載の組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項４４】
腫瘍成長、例えば膵臓腫瘍の成長を治療又は予防する方法であって、治療上若しくは予防上有効な量の請求項１〜２８のいずれか一項記載の組成物、又は例えば本明細書に記載されるもののうちのいずれか等のＰＹＹ及びＡｌｂｕｄＡｂを含む単一の融合物若しくはコンジュゲートを前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項４５】
膵臓炎を治療又は予防する方法であって、治療上若しくは予防上有効な量の請求項１〜２８のいずれか一項記載の組成物、又はＰＹＹ及びＡｌｂｕｄＡｂを含む単一の融合物若しくはコンジュゲートを前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項４６】
ＰＹＹが３−３６ＰＹＹであり、ＡｌｂｕｄＡｂが本明細書に記載されるもののうちのいずれかである、請求項４４又は４５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清半減期の改善された薬物の融合物及びコンジュゲートに関する。これら融合物及びコンジュゲートは、免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメイン及びインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子を含む。本発明は、更に、このような薬物の融合物及びコンジュゲートを含む使用、製剤、組成物、及び装置に関する。また、本発明は、融合物及びコンジュゲートの一部として存在する２以上のインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子を含む組成物、並びにその使用及び製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療及び／又は診断目的に有用であり得る活性を有する多くの薬物は、投与されたときに体内から急速に排出されるので価値が限定されている。例えば、治療上有用な活性を有する多くのポリペプチドは、腎臓を介して循環から急速に取り除かれる。したがって、望ましい治療効果を達成するためには、大用量を投与したり頻度の高い投薬レジメンを使用したりしなければならない。改善された薬物動態特性を有する改善された治療剤及び診断剤が必要とされている。
【０００３】
体循環又は大循環における半減期が短いこのような薬物の分類の１つは、グルカゴン様ペプチド１等のインクレチンホルモン、及び例えばエキセンディン−４等のエキセンディン、及びＰＹＹ等の他の腸管ペプチドである。
【０００４】
グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−１は、強力なグルコース依存性インスリン分泌及び静グルカゴン（ｇｌｕｃａｇｏｎｏｓｔａｔｉｃ）作用、膵臓のβ細胞に対する栄養効果、並びに消化管の分泌及び運動性に対する阻害効果を有するインクレチンホルモンであり、上記作用及び効果が組合せられて血漿グルコースを低下させ、血糖可動域を狭める。更に、ＧＬＰ−１は、その満腹感を高める能力を介して食物摂取量を減らし、それによって体重増加を制限し、更には体重減少を引き起こす場合さえもある（Ｄｒｕｃｋｅｒ（２００２年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２２：５３１−５４４、Ｇｉｏｒｇｉａｎｏら（２００６年）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ７４：Ｓ１５２−１５５）、Ｈｏｌｔ（２００２年）Ｄｉａｂｅｔｅｓ／Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １８：４３０−４４１）。まとめると、これら作用は、抗糖尿病剤にとって非常に望ましいと考えられる独特のプロファイルをＧＬＰ−１に与えており、その理由は、特にその血糖降下効果がグルコース依存性であることが、重篤な低血糖症のいかなるリスクも最低限に抑えるはずであるためである。しかし、その薬物動態学的／薬力学的プロファイルは、ネイティブなＧＬＰ−１が治療上有用でないことを示すものである。したがって、ＧＬＰ−１は連続的に投与されたとき非常に有効であるが、単回の皮下注射では短時間の効果しか得られない。ＧＬＰ−１は、インビボにおいて酵素分解を非常に受けやすく、この酵素分解は、急速に生じ、非インスリン分泌性の代謝産物が生成されるので、恐らく、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による開裂が最も関連性が高い（Ｍｅｔｌｅｉｎ（１９９９年）Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ８５：９−２４４）。したがって、その代謝的安定性及び薬物動態学的／薬力学的プロファイルに影響を及ぼす要因についての理解に基いて、ＧＬＰ１の治療能を利用するためのストラテジーが、研究の主な焦点であった。
【０００５】
生物活性を維持しながら分解を減速させる方法でペプチダーゼを阻害するか又はＧＬＰ−１を改変することを試みる多くの研究が行われた。国際特許公開第０５／０２７９７８号パンフレットは、延長された作用プロファイルを有するＧＬＰ−１誘導体について開示している。国際特許公開第０２／４６２２７号パンフレットは、ＧＬＰ−１又は類似体（これら類似体についての開示は、本発明で使用することができるＧＬＰ−１類似体の例として、参照することによって本明細書に組み込まれる）に融合しているポリペプチド（例えばアルブミン）を含む異種融合タンパク質について開示している。国際特許公開第０５／００３２９６号パンフレット、国際特許公開第０３／０６００７１号パンフレット、国際特許公開第０３／０５９９３４号パンフレットは、ホルモンの半減期を延長させることを試みるためにＧＬＰ−１をアルブミンと融合させたアミノ融合タンパク質について開示している。
【０００６】
ペプチドＹＹは、摂食に応答して神経内分泌細胞によって放出される短い（３６アミノ酸）タンパク質である。循環におけるＰＹＹ濃度は、食後に増加し、絶食時に減少する。ペプチドＹＹは、ＮＰＹ受容体を通して作用を発揮して、胃の運動性を阻害し、結腸における水及び電解質の吸収を増加させる。ペプチドＹＹは、食事に応答して回腸及び結腸における神経内分泌細胞によって分泌され、食欲を減退させることが示されている（Ｂａｌｌａｎｔｙｎｅ（２００６年）Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １６：６５１−６５８、Ｂａｔｔｅｒｈａｍ（２００３年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３４９：９４１−８、Ｂｏｅｙら（２００７年）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２８：３９０−３９５、およびＫａｒｒａら（２００９年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ５８７：１９−２５）。
【０００７】
エキセンディン−４は、アメリカドクトカゲの唾液で見出されたホルモンであり、ＧＬＰ−１のアゴニストであり、且つ非常に強力なインスリン分泌促進効果も有する。ＧＬＰ−１とは対照的に、エキセンディン−４は非常に長いインビボ半減期を有する。
【０００８】
エキセンディン−４は、グルコース代謝及びインスリン分泌の調節において、ヒトのグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）に類似する生物学的特性を示す。エキセンディン−４は、膵臓のβ細胞によるグルコース依存性のインスリン分泌を強化し、不適切に高いグルカゴン分泌を抑制し、胃内容排出を減速させる（ＤｅＦｒｏｎｚｏら（２００５年）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２８：５：１０９２−１００、Ｅｄｗａｒｄｓら（２００１年）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２８１：Ｅ１５５−１６２、Ｋｏｌｔｅｒｍａｎら（２００３年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ８８（７）：３０８２−９、およびＮｉｅｌｓｅｎら（２００４年）Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １１７：７７−８８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
医学では、ＧＬＰ−１ペプチド、ＰＹＹ、エキセンディン、又はインスリン分泌促進性及び／又はインクレチン効果及び／又は食欲抑制効果を有する他の剤等のインクレチン及び／又はインスリン分泌促進剤及び／又は腸管ペプチド剤を含み、医学において、例えば糖尿病及び肥満等の代謝性病態の治療及び／又は予防において使用することができる改善された組成物が依然として非常に必要とされている。
【００１０】
したがって、インクレチン／インスリン分泌促進剤／腸管ペプチド含有剤（例えば、ＧＬＰ−１、エキセンディン−４、ＰＹＹ）を含む新規治療用組成物を提供して、低い毒性及び治療上の利点を維持しながらインビボにおいてより強力且つより持続時間の長い作用を提供することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、（ａ）例えば（化学的又は遺伝的）融合物又はコンジュゲートとして存在する、インクレチン及び／又はインスリン分泌促進剤及び／又は腸管ペプチドから選択される（すなわち、２以上の）分子の組合せを含む単一分子（例えば単一の融合物又はコンジュゲート）を含む（又はからなる）組成物；あるいは（ｂ）各個々の分子が１以上のインクレチン及び／又はインスリン分泌促進剤及び／又は腸管ペプチドを含む２以上の個々の分子を含む組成物を提供する。また、これら組成物（ａ）及び／又は（ｂ）は、更なるタンパク質又はポリペプチド、例えば、ヒト血清アルブミン等の血清アルブミンに結合することができる半減期の延長されたタンパク質又はポリペプチド又はペプチド、例えば、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、例えば、ヒト血清アルブミン等の血清アルブミンに結合するｄＡｂ（Ａｌｂｕｄａｂ（商標））を含んでもよい。
【００１２】
１つの実施形態では、本発明は、単一の（化学的又は遺伝的）融合物又は単一のコンジュゲート分子を含む（又はからなる）組成物であって、前記融合物又はコンジュゲートが（ａ）インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン分子及び／又は腸管ペプチド（例えば、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）ペプチド、３−３６ＰＹＹ、エキセンディン−４、ＧＬＰ、例えばＧＬＰ−１、例えばＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ突然変異体）から選択される２以上の分子を含むか又はこれらからなり、前記（ａ）が、（ｂ）血清アルブミンに特異的に結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）（例えば、ＤＯＭ７ｈ−１４（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ７ｈ−１４のアミノ酸配列は図１（ｈ）の配列番号８に示す）、又は例えばＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ７ｈ−１４−１０のアミノ酸配列は図１（ｏ）の配列番号１５に示す）、又はＤＯＭ７ｈ−１１−１５（ＤＯＭ７ｈ−１１−１５のアミノ酸配列は図１（Ｐ）の配列番号１６に示す）、又は例えばＲ１０８Ｃ突然変異を有するＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ７ｈ−１４−１０  Ｒ１０８Ｃのアミノ酸配列は図１（ｒ）の配列番号１８に示す）、又は例えばＤＯＭ７ｈ−１１−１５（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）、又は例えばＲ１０８Ｃ突然変異を有するＤＯＭ７ｈ−１１−１５（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ７ｈ−１１−１５  Ｒ１０８Ｃのアミノ酸配列は図１（ｔ）の配列番号４７に示す）との単一の融合物又はコンジュゲートとして存在する組成物を提供する。１つの実施形態では、融合物又はコンジュゲートは、２×ＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ  ＤＯＭ７ｈ−１４  ｄＡｂ融合物（ＤＡＴ０１１４、アミノ酸配列は図１（ａ）の配列番号１に示す）ではない。
【００１３】
別の実施形態では、単一の融合物又はコンジュゲートは、ＰＹＹ（例えば、ＰＹＹ３−３６）と、エキセンディン（例えば、エキセンディン−４）と、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンに結合する１以上のｄＡｂ、例えば本明細書に記載するＡｌｂｕｄａｂ（商標）のうちの任意の１つとを含むか、又はこれらからなる。１つの実施形態では、単一の融合物は、図１（ｕ）の配列番号４８に示すアミノ酸配列を有する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載又は開示する個々の融合物又はコンジュゲート化分子のいずれかを含むか又はこれからなる組成物、及び単独で投与されるか又は任意の好適な医薬賦形剤若しくは添加剤と共に製剤化されたときの（例えば、組合せについて本明細書に記載する使用のいずれかについての）前記組成物の使用を更に提供する。
【００１５】
また、本発明は、本明細書に記載される個々の融合物のいずれかをコードする核酸を提供する。
【００１６】
上記の１つの実施形態では、インクレチン／インスリン分泌促進剤／腸管ペプチド分子は、異なるインクレチン／インスリン分泌促進剤／腸管ペプチド分子であってもよく、同じであってもよい。また、血清アルブミンに結合するｄＡｂ（すなわちＡｌｂｕｄＡｂ（商標））は、例えば国際特許公開第２００６／０５９１０６号パンフレット又は国際特許公開第０５／１１８６４２号パンフレット又は国際特許公開第２００８０９６１５８号パンフレットまたは国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５３６４０号又は米国特許出願第６１／１６３，９９０号に記載又は参照されているもののうちのいずれか１つであってもよい。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、更に、２以上の個々の融合物又はコンジュゲートを含む（又はからなる）組成物であって、各融合物又はコンジュゲートが、（ａ）インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン分子及び／又は腸管ペプチド（例えば、ＰＹＹペプチド、３−３６ＰＹＹ、エキセンディン−４、ＧＬＰ、例えばＧＬＰ−１、例えばＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ突然変異体）から選択される１以上の分子を含むかこれらからなり、前記（ａ）が、（ｂ）血清アルブミンに特異的に結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）（例えば、ＤＯＭ７ｈ−１４（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ７ｈ−１４のアミノ酸配列は図１（ｈ）の配列番号８に示す）、又は例えばＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ７ｈ−１４−１０のアミノ酸配列は図１（ｏ）の配列番号１５に示す）、又はＤＯＭ７ｈ−１１−１５（ＤＯＭ７ｈ−１１−１５のアミノ酸配列は図１（Ｐ）の配列番号１６に示す）、又は例えばＲ１０８Ｃ突然変異を有するＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ７ｈ−１４−１０  Ｒ１０８Ｃのアミノ酸配列は図１（ｒ）の配列番号１８に示す）、又は例えばＤＯＭ７ｈ−１１−１５（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）、又は例えばＲ１０８Ｃ突然変異を有するＤＯＭ７ｈ−１１−１５（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ７ｈ−１１−１５  Ｒ１０８Ｃのアミノ酸配列は図１（ｔ）の配列番号４７に示す）との単一の融合物又はコンジュゲートとして存在する組成物を提供する。１つの実施形態では、この組成物は、図１ａ〜１ｇ及び図１ｍ〜１Ｖ、並びに図３に示す分子、並びにＤｏｍ７ｈ−１１−１５（Ｒ１０８Ｃ）−ＰＥＧ−３−３６のＰＹＹ（１０位がリシンである）分子（ＡｌｂｕｄＡｂ構成要素がＤｏｍ７ｈ−１１−１５（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂであることを除いて、図３に示す構造を有する）から選択される１以上の分子を含んでもよい。
【００１８】
上記２以上の融合物又はコンジュゲートを含む（又はこれらからなる）このような組成物は、例えば、高血糖症、耐糖能異常、β細胞欠損、糖尿病（例えば、１型若しくは２型の糖尿病又は妊娠性糖尿病）非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、高脂血症、若しくは肥満、又は過食及び／又はエネルギー消費の変化を特徴とする疾患等の代謝性疾患を例えば治療又は予防するための療法において同時に、別々に、又は順次使用するための複合調製物であってもよい。
【００１９】
本発明の融合物又はコンジュゲートは、例えば、高血糖症、耐糖能異常、β細胞欠損、糖尿病（例えば、１型若しくは２型の糖尿病又は妊娠性糖尿病）非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、高脂血症、若しくは肥満、又は過食及び／又はエネルギー消費の変化を特徴とする疾患等の代謝性疾患を例えば治療又は予防するための療法において同時に、別々に、又は順次使用するための複合調製物として、一緒に又は順次投与されるとき相乗作用を示すことができる（相乗作用とは、投与されたときの効果が、それぞれを単独で投与したときの効果を単純に足し合わせた効果よりも高いことを意味する）。
【００２０】
また、相乗作用は、１分子に２以上のインクレチン又はインスリン分泌促進剤又は腸管ペプチドが存在することに起因する場合もあり、ＡｌｂｕｄＡｂとインクレチン又はインスリン分泌促進剤又は腸管ペプチドとの間の相互作用に起因する場合もある。
【００２１】
本発明に係る組成物のいずれか１つでは、インクレチン及び／又はインスリン分泌促進性分子及び／又は腸管ペプチドは、例えば、ＰＹＹペプチド、例えば３−３６又は１３−３６；エキセンディン−４、ＧＬＰ、例えばＧＬＰ−１、例えばＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ突然変異体から選択されてもよく、あるいは、例えばインクレチン／インスリン分泌促進活性を保持することができるこれらペプチドの突然変異体、類似体、又は誘導体であってもよい。ＧＬＰ、ＰＹＹ、エキセンディンは、国際特許公開第２００６／０５９１０６号に記載されているもののうちのいずれであってもよい。これらペプチドの突然変異体、類似体、又は誘導体は、インクレチン及び／又はインスリン分泌促進活性を保持しているものであってよい。
【００２２】
インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子（例えば、ＰＹＹ、エキセンディン、ＧＬＰ−１等）は、ｄＡｂとの融合物（又はコンジュゲート）として存在するとき、ｄＡｂのＮ末端又はＣ末端のいずれか、あるいはｄＡｂ配列内の点に連結することができる。１つの実施形態では、１以上のインクレチン及び／又はインスリン分泌促進剤及び／又は腸管ペプチド分子は、ｄＡｂのＮ末端との融合物（又はコンジュゲート）として存在し、また、１以上のインクレチン及び／又はインスリン分泌促進剤及び／又は腸管ペプチド分子は、ｄＡｂのＣ末端との融合物（又はコンジュゲート）としても存在する。
【００２３】
また、インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子、例えば、エキセンディン−４及び／又はＧＬＰ−１を例えばｄＡｂと接合させるアミノ酸又は化学リンカーが任意で存在してもよい。リンカーは、ヘリカルリンカー、例えば、図１（ｋ）の配列番号１１に示す配列のヘリカルリンカーであってもよく、又は例えば図１（ｌ）の配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するｇｌｙ−ｓｅｒリンカーであってもよい。
【００２４】
あるいは、リンカーは、例えばＰＥＧリンカー、例えば図３に示すＰＥＧリンカーであってもよい。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明の融合物（又はコンジュゲート）は、更なる分子、例えば更なるペプチド又はポリペプチドを含んでもよい。
【００２６】
１つの実施形態では、本発明は、以下の２つの個々の分子を含むか又はこれらからなる組成物を提供する：
（ａ）エキセンディン−４、（Ｇ４Ｓ）３リンカー、７ｈ−１４ＡｌｂｕｄＡｂ（ＤＡＴ０１１５、図１ｂの配列番号２に提示されるアミノ酸配列を有する）である遺伝的融合物；及び
（ｂ）リシン（ＰＹＹの１０位に導入される）及び４回反復ＰＥＧリンカーを介してＣ末端がアミド化されたＰＹＹ３−３６にコンジュゲートしているＤｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂであるペプチドコンジュゲート。線は、Ｄｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂの自由Ｃ末端システインとＰＹＹ配列の１０位のリシンとを共有結合しているリンカーを表す。このペプチドコンジュゲートのアミノ酸配列及び構造は、以下の通りである（図３の配列番号３０にも示す）。
【化１】
2013506628.tif 000003
【００２７】
（配列番号３７）
式中、Ｄｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）のＣ末端システインは、リンカーを介してＰＹＹペプチドにおけるリシンに共有結合している。
【００２８】
化学リンカーは、以下の構造を有する：
【化２】
2013506628.tif 000004
【００２９】
上記２つの分子、（ａ）エキセンディン−４、（Ｇ４Ｓ）３リンカー、７ｈ−１４  ＡｌｂｕｄＡｂである遺伝的融合物：（ＤＡＴ０１１５、図１ｂに提示されるアミノ酸配列）、及び（ｂ）：
リシン及び（図３に示す構造の）４回反復ＰＥＧリンカーを介してＰＹＹ３−３６にコンジュゲートしているＤｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂであるペプチドコンジュゲートは、本明細書に記載される療法で同時、別々、又は順次に使用するのに好適な複合調製物として存在してもよい。
【００３０】
あるいは、上記組成物では、ペプチドコンジュゲート（ｂ）（図３に示す構造である）は、以下の分子によって置換されてもよい：Ｄｏｍ７ｈ−１１−１５（Ｒ１０８Ｃ）−ＰＥＧ−３−３６ＰＹＹ（１０位がリシン）（ＡｌｂｕｄＡｂ構成要素がＤｏｍ７ｈ−１１−１５（Ｒ１０８Ｃ）であることを除いて図３に示す構造を有する）。
【００３１】
上記組成物の更に別の代案では、ペプチドコンジュゲート（ｂ）（図３に示されている構造である）は、以下の分子によって置換されてもよい：図１（ｖ）の配列番号４９に示されているアミノ酸配列を有するＰＹＹ−Ｄｏｍ７ｈ−１４−１０融合物。
【００３２】
更なる実施形態では、本発明は、ＰＹＹ（例えばＰＹＹ３−３６）と、エキセンディン（例えばエキセンディン−４）と、１以上のＡｌｂｕｄＡｂ、例えば、本明細書に記載するＡｌｂｕｄＡｂのうちのいずれかとを含むかこれらからなる組成物を提供する。１つの実施形態では、単一の融合物は、図１（ｕ）の配列番号４８に示すアミノ酸配列を有する。
【００３３】
Ｄｏｍ７ｈ−１４は、血清アルブミンに結合するヒト免疫グロブリン単一可変ドメイン又はｄＡｂ（Ｖｋ）であり、そのアミノ酸配列は、図１（ｈ）の配列番号８に示されている。Ｄｏｍ７ｈ−１４  ｄＡｂのＣＤＲ領域は、図１（ｈ）の配列番号８に示されているアミノ酸配列において強調されている。
【００３４】
Ｄｏｍ７ｈ−１４−１０は、血清アルブミンに結合するヒト免疫グロブリン単一可変ドメイン又はｄＡｂ（Ｖｋ）であり、そのアミノ酸配列は、図１（ｈ）の配列番号８に示されている。Ｄｏｍ７ｈ−１４−１０  ｄＡｂのＣＤＲ領域は、図１（ｏ）の配列番号１５に示されているアミノ酸配列において強調されている。
【００３５】
Ｄｏｍ７ｈ−１１−１５は、血清アルブミンに結合するヒト免疫グロブリン単一可変ドメイン又はｄＡｂ（Ｖｋ）であり、そのアミノ酸配列は、図１（ｐ）の配列番号１６に示されている。Ｄｏｍ７ｈ−１１−１５  ｄＡｂのＣＤＲ領域は、図１（ｐ）の配列番号１６に示されているアミノ酸配列において強調されている。
【００３６】
Ｒ１０８Ｃ突然変異を有するＤｏｍ７ｈ−１４−１０は、血清アルブミンに結合するヒト免疫グロブリン単一可変ドメイン又はｄＡｂ（Ｖｋ）であり、そのアミノ酸配列は、図１（Ｒ）の配列番号１８に示されている。
【００３７】
Ｒ１０８Ｃ突然変異を有するＤｏｍ７ｈ−１１−１５は、血清アルブミンに結合するヒト免疫グロブリン単一可変ドメイン又はｄＡｂ（Ｖｋ）であり、そのアミノ酸配列は、図１（ｔ）に示されている。
【００３８】
Ｒ１０８Ｃ突然変異とは、未変異配列におけるＣ末端のアルギニンがシステインによって置換されている突然変異を指し、本発明の１つの態様では、本明細書に記載されるＡｌｂｕｄＡｂのうちのいずれかがこの突然変異を有してもよい。
【００３９】
本発明で使用する「融合物」は、血清アルブミンに結合するｄＡｂを１つの部分として含み、且つインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子である更なる部分を含む融合タンパク質を指す。血清アルブミン及びインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子に結合するｄＡｂは、単一の連続ポリペプチド鎖の別個の部（部分）として存在してもよい。ｄＡｂとインクレチン／インスリン分泌促進剤／腸管ペプチド部分とは、ペプチド結合を通して互いに直接結合してもよく、好適なアミノ酸、又はペプチド、又はポリペプチドのリンカーを通して結合してもよい。必要に応じて、追加の部分、例えば、（例えば、第３、第４の）ペプチド又はポリペプチド及び／又はリンカー配列が存在してもよい。ｄＡｂは、インクレチン／インスリン分泌促進剤／腸管ペプチド分子に対してＮ末端に位置してもよく、Ｃ末端に位置してもよく、内部に存在してもよい。特定の実施形態では、融合タンパク質は、１以上（例えば、１〜約２０）のｄＡｂ部分を含有する。
【００４０】
本発明で使用する「コンジュゲート」は、インスリン分泌促進剤／インクレチン／腸管ペプチド分子に共有結合又は非共有結合している血清アルブミンに結合するｄＡｂを含む組成物を指す。インスリン分泌促進剤／インクレチン／腸管ペプチド分子は、ｄＡｂに直接共有結合してもよく、好適なリンカー部分を通して間接的に共有結合してもよい。インスリン分泌促進剤／インクレチン／腸管ペプチド分子は、アミノ末端、カルボキシ末端等の任意の好適な位置で、又は天然の若しくは改変された好適なアミノ酸側鎖（例えば、リシンのεアミノ基又はシステインのチオール基）を通してｄＡｂに結合することができる。あるいは、インスリン分泌促進剤／インクレチン／腸管ペプチド分子は、ｄＡｂに直接（例えば、静電相互作用、疎水性相互作用）又は間接的に（例えば、相補的な結合パートナー（例えば、ビオチン及びアビジン）の非共有結合を通して、この場合、一方のパートナーがインスリン分泌促進剤／インクレチン分子に共有結合し、相補的な結合パートナーがｄＡｂに共有結合する）非共有結合することができる。ｄＡｂは、Ｎ末端に位置してもＣ末端に位置してもよく、あるいは、インクレチン／インスリン分泌促進性／腸管ペプチド分子に対して内部に存在してもよい。特定の実施形態では、コンジュゲートタンパク質は、１以上（例えば、１〜約２０）のｄＡｂ部分を含有する。
【００４１】
また、本発明は、例えば図２に示す核酸を含む、本発明に記載する融合物をコードする核酸を含む組成物を提供する。
【００４２】
また、これら核酸を含む宿主細胞、例えば、非胚性宿主細胞、例えば、原核生物又は真核生物（哺乳類等）の宿主細胞、例えば、大腸菌又は酵母の宿主細胞を提供する。
【００４３】
本発明は、更に、本発明の融合物を生成する方法であって、本発明の融合物をコードする組換え核酸を発現させるのに好適な条件下で、前記組換え核酸及び／又はコンストラクトを含む上記の宿主細胞等の宿主細胞を維持して、融合物を生成させることを含む方法を提供する。
【００４４】
また、本発明は、本発明の組成物を含む医薬組成物を提供する。
【００４５】
本発明は、更に、例えば、高血糖症、耐糖能異常、β細胞欠損、糖尿病（例えば、１型若しくは２型の糖尿病又は妊娠性糖尿病）非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、高脂血症、又は肥満、又は過食を特徴とする疾患等の代謝性疾患又は病態の治療において使用するため等、医学において使用するための本発明の組成物を提供し、例えば、前記組成物は、食欲を抑えたりエネルギー消費、膵臓炎を変化させたりするために用いることができ、また、腫瘍成長、例えば膵臓の腫瘍成長（例えば膵臓腺癌）を予防するために用いることもでき、治療上有効な量の本発明の組成物を前記個体に投与することを含む。また、本発明は、膵臓炎を治療及び／又は予防するため、また腫瘍成長、例えば、膵臓の腫瘍成長（例えば膵臓腺癌）を予防するために（単独で用いようと組合せて用いようと）用いるための本明細書に記載するＰＹＹ  ＡｌｂｕｄＡｂのうちのいずれかを含む組成物を提供する。
【００４６】
また、本発明は、疾患又は障害、例えば本明細書に記載する疾患又は障害、例えば、高血糖症、耐糖能異常、β細胞欠損、糖尿病（例えば、１型若しくは２型の糖尿病又は妊娠性糖尿病）、非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、高脂血症、又は肥満、又は過食を特徴とする疾患等の代謝性疾患又は病態を有する個体を治療する方法を提供し、例えば、食欲を抑えたりエネルギー消費、膵臓炎を変化させたりするために用いることができ、また、腫瘍成長、例えば膵臓の腫瘍成長を予防するために用いることもでき；治療上有効な量の本発明の組成物を前記個体に投与することを含む。
【００４７】
本発明に従って治療又は予防することができる他の代謝性疾患又は病態としては、インスリン抵抗性、インスリン欠乏、高インスリン血症、高血糖症、脂質異常症、高脂血症、高ケトン血症、高グルカゴン血症、高血圧症、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化、腎不全、ニューロパシー（例えば自律性ニューロパシー、副交感神経ニューロパシー及び多発性ニューロパシー）、網膜症、白内障、代謝障害（例えばインスリン及び／又はグルコース代謝障害）、内分泌障害、肥満、体重減少、肝臓障害（例えば肝疾患、脂肪肝、肝硬変、及び肝臓移植に関連した障害）及びこれら疾患又は障害に関連する病態が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
更に、本発明の化合物で予防又は治療することができる糖尿病に関連する病態としては、高血糖症、肥満、糖尿病性網膜症、モノニューロパシー、多発性ニューロパシー、アテローム性動脈硬化、潰瘍、心疾患、卒中、貧血、（例えば足及び手の）壊疽、不能症、感染症、白内障、腎臓機能の低下、自律神経系の機能不全、白血球機能異常、手根管症候群、デュピュイトラン拘縮、及び糖尿病性ケトアシドーシスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
また、本発明は、高血糖に関連する疾患を治療又は予防する方法であって、少なくとも１用量の組成物、例えば、本発明の医薬組成物を患者又は被験体に投与することを含む方法を提供する。
【００５０】
本願に患者又は被験体と記載するとき、これは、ヒト又は非ヒトの患者又は被験体を意味し得る。
【００５１】
本発明は、更に、本発明のコンジュゲート又は融合物を用いて、患者のインスリン応答性を調節する方法、並びに細胞によるグルコースの取り込みを増加させる方法、及び細胞のインスリン感受性を調節する方法に関する。また、患者におけるインスリンの合成及び放出を刺激する方法、インスリンの取り込みに対する脂肪、筋肉、又は肝臓の組織の感受性を強化する方法、グルコースの取り込みを刺激する方法、消化過程を減速させる方法、食欲を減退させる方法、エネルギー消費を変化させる方法、又はグルカゴンの分泌をブロックする方法であって、本発明の組成物を前記患者に投与すること、例えば、少なくとも１用量の組成物、例えば本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００５２】
本発明の組成物、例えば医薬組成物は、単独で投与されてもよく、例えば以下のような他の分子又は部分と組合せて投与されてもよい：ポリペプチド、治療用タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンの分子に共有結合している２分子のＧＬＰ−１であるＡｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅ（商標））及び／又は分子（例えば、インスリン及び／又は他のタンパク質（抗体を含む）、ペプチド、又は患者におけるインスリン感受性、体重、心疾患、高血圧、ニューロパシー、細胞代謝、及び／又はグルコース、インスリン、若しくは他のホルモン濃度を調節する小分子）。特定の実施形態では、本発明のコンジュゲート又は融合物は、インスリン（又はインスリンの誘導体、類似体、融合タンパク質、又は分泌促進物質）と組合せて投与される。
【００５３】
また、本発明は、例えば、高血糖症、膵臓炎、糖尿病（１型若しくは２型の糖尿病又は妊娠性糖尿病）、又は肥満、又は腸の運動過剰を特徴とする疾患等の代謝性障害等の上記疾患又は障害のうちのいずれか等の疾患又は障害の治療において用いるための、また、腫瘍成長、例えば膵臓の腫瘍成長（例えば膵臓腺癌）を予防するための本発明の組成物を提供する。
【００５４】
また、本発明は、例えば、高血糖症、糖尿病（１型若しくは２型の糖尿病又は妊娠性糖尿病）、又は肥満、膵臓炎、又は腸の運動過剰を特徴とする疾患等の代謝性障害、また例えば膵臓の腫瘍成長（例えば膵臓腺癌）等の上記疾患又は障害のうちのいずれか等の疾患又は障害を治療するための薬剤の製造における本発明の組成物の使用を提供する。
【００５５】
また、本発明は、療法、診断、又は予防において用いるための本明細書に記載する組成物のうちのいずれかの使用に関する。
【００５６】
本発明の組成物、例えば組成物のｄＡｂ成分は、例えば、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体又は少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体のＦｃ領域を結合させることによって、又は抗体のドメインにコンジュゲートさせることによって、半減期を更に延長させるためにより大きな流体力学的サイズを有するように更にフォーマット化されてもよい。例えば、血清アルブミンに結合するｄＡｂは、抗体のより大きな抗原結合断片としてフォーマット化されてもよい（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖとしてフォーマット化される）。
【００５７】
この開示全体を通して記載する本発明の他の実施形態では、本発明の融合物において「ｄＡｂ」を使用する代わりに、当業者は、血清アルブミンに特異的に結合するｄＡｂのＣＤＲ、例えば、血清アルブミンに結合するＤｏｍ７ｈ−１４又はＤｏｍ７ｈ−１４−１０又はＤｏｍ７ｈ−１４−１０Ｒ１０８ＣのＣＤＲを含むドメインを使用することができる（例えば、ＣＤＲは、好適なタンパク質のスカフォールド又はスケルトン、例えば抗体、ＳｐＡスカフォールド、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、又はＥＧＦドメインにグラフトされてもよい）と考えられる。したがって、全体としての開示は、ｄＡｂの代わりにこのようなドメインの開示を提供すると解釈される。
【００５８】
特定の実施形態では、本発明は、血清アルブミンに結合する本発明に係る第１のｄＡｂ、例えば本明細書に記載するもののうちのいずれか、例えばＤｏｍ７ｈ−１４と、前記第１のｄＡｂと同じ又は異なる結合特異性を有する第２のｄＡｂと、任意で、多重特異的リガンドの場合は更なるｄＡｂとを含む二重特異的リガンド又は多重特異的リガンドを含む本発明に係る組成物を提供する。第２のｄＡｂ（又は更なるｄＡｂ）は、任意で、異なる標的、例えばＦｇＦｒ１ｃ又はＣＤ５標的に結合してもよい。
【００５９】
本発明の他の実施形態では、ｄＡｂ成分は、参照することによって詳細が本明細書に組み込まれる国際特許公開第２００８０９６１５８号パンフレット又は国際特許公開第０５１１８６４２号パンフレットに開示されているｄＡｂのうちのいずれかであってもよい。
【００６０】
したがって、１つの態様では、本発明は、非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、又は静脈内注射、吸入、鼻送達、経粘膜（例えば舌下）送達、経皮膚、経皮、口腔送達、患者のＧＩ管への送達、直腸送達、又は目送達によって送達するための本発明の組成物を提供する。１つの態様では、本発明は、皮下注射又は筋肉内による送達、経皮送達、吸入、静脈内送達、鼻送達、経粘膜送達、口腔送達、患者のＧＩ管への送達、直腸送達又は目送達するための薬剤の製造における本発明の融合物又はコンジュゲートの使用を提供する。
【００６１】
１つの態様では、本発明は、皮下、筋肉内、又は静脈内注射、吸入、鼻送達、経粘膜（例えば舌下）送達、経皮膚、経皮、口腔送達、患者のＧＩ管への送達、直腸送達又は目送達による患者への送達方法であって、治療上有効な量の本発明の融合物又はコンジュゲートを患者に投与することを含む方法を提供する。
【００６２】
１つの態様では、本発明は、本発明の融合物又はコンジュゲートを含む経口、注射可能、吸入可能、噴霧可能、局所用又は目用の製剤を提供する。前記製剤は、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、又はシロップ剤、又は軟膏剤であってもよい。１つの態様では、本発明は、例えば飲料として、例えば肥満治療のための減量用飲料として販売されている飲料として、経口投与されてもよい。１つの態様では、本発明は、患者に直腸内送達するための製剤を提供し、前記製剤は、例えば坐剤として提供されてもよい。
【００６３】
ＧＬＰ−１化合物を非経口投与するための組成物は、例えば、国際特許公開第０３／００２１３６号パンフレット（参照することによって本明細書に組み込まれる）に記載されている通り調製することができる。
【００６４】
特定のペプチドを鼻に投与するための組成物は、例えば、欧州特許第２７２０９７号明細書（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）又は国際特許公開第９３／１８７８５号パンフレット（全て、参照することによって本明細書に組み込まれる）に一般的に記載されている通り調製することができる。
【００６５】
用語「被験体」又は「個体」は、本発明では、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、又は他のウシ科、ヒツジ、ウマ科、イヌ科、ネコ科の動物、げっ歯類又はネズミ科の種が挙げられるが、これらに限定されない哺乳類等の動物を含むと定義される。
【００６６】
また、本発明は、本発明の組成物と、薬物送達装置と、任意で使用説明書とを含む、本発明に係る組成物の被験体（例えば、ヒトの患者）への投与において使用するためのキットを提供する。組成物は、例えばフリーズドライ製剤等の製剤として提供され得る。特定の実施形態では、薬物送達装置は、注射器、ペン型注射装置、吸入器、鼻内又は目への投与装置（例えば噴霧器、点眼器、又は点鼻器）及び無針注射装置からなる群より選択される。
【００６７】
本発明の組成物（例えば、コンジュゲート又は融合物）は、保存のために凍結乾燥させてもよく、使用前に好適な担体中で再構成してもよい。任意の好適な凍結乾燥方法（例えば、噴霧乾燥、ケーク乾燥）及び／又は再構成技術を使用してもよい。凍結乾燥及び再構成は、抗体の活性喪失の程度を変化させる恐れがあり、それを補うために使用レベルを調節しなければならない場合があることを当業者は認識するであろう。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載する凍結乾燥（フリーズドライ）組成物を含む組成物を提供する。好ましくは、凍結乾燥（フリーズドライ）組成物は、再水和されたとき、活性（例えば、血清アルブミンに対する結合活性）のうちの多くても約２０％、又は多くても約２５％、又は多くても約３０％、又は多くても約３５％、又は多くても約４０％、又は多くても約４５％、又は多くても約５０％を失う。活性は、凍結乾燥される前の組成物の効果を生じさせるのに必要な組成物の量である。例えば、所望の期間に所望の血清濃度を達成及び維持するのに必要なコンジュゲート又は融合物の量である。組成物の活性は、凍結乾燥前に任意の好適な方法を用いて求めることができ、失われた活性の量を求めるために再水和後に同じ方法を用いて活性を求めてもよい。
【００６８】
また、本発明は、本発明の組成物を含む持続放出製剤を提供し、このような持続放出製剤は、例えば、ヒアルロン酸、ミクロスフィア、又はリポソーム、並びに他の薬学的に又は薬理学的に許容できる担体、賦形剤、及び／又は希釈剤と組合せられた本発明の組成物を含んでもよい。このような持続放出製剤は、例えば、坐剤の形態であってもよい。
【００６９】
１つの態様では、本発明は、本発明の組成物と、薬学的に又は薬理学的に許容できる担体、賦形剤、及び／又は希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１−１】（ａ）ＤＡＴ０１１４（配列番号１）、（ｂ）ＤＡＴ０１１５（配列番号２）、（ｃ）ＤＡＴ０１１６（配列番号３）、（ｄ）ＤＡＴ０１１７（配列番号４）のアミノ酸配列を示す。
【図１−２】（ｅ）ＤＡＴ０１１８（配列番号５）、（ｆ）ＤＡＴ０１１９（配列番号６）（ｇ）ＤＡＴ０１２０（配列番号７）（ｈ）Ｄｏｍ７ｈ−１４（配列番号８）（（Ａｌｂｕｄａｂ（商標）））（ＣＤＲが強調されている）、（ｉ）ＧＬＰ−１  ７−３７  Ａ（８）Ｇ（配列番号９）のアミノ酸配列を示す。
【図１−３】（ｊ）エキセンディン−４（配列番号１０）、（ｋ）ヘリカルリンカー（配列番号１１）（ｌ）Ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー（配列番号１２）、（ｍ）エキセンディン４、（Ｇ４Ｓ）３、リンカーＤＯＭ７ｈ−１４−１０融合物（ＤＭＳ７１３９：配列番号１３）、（ｎ）エキセンディン４、（Ｇ４Ｓ）３、リンカーＤＯＭ７ｈ−１１−１５融合物（ＤＭＳ７１４３：配列番号１４）、（ｏ）ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（配列番号１５）のアミノ酸配列を示す。
【図１−４】（ｐ）ＤＯＭ７ｈ−１１−１５（Ａｌｂｕｄａｂ（商標））（配列番号１６）、（ｑ）ＯｍｐＴ  ＡＷＡシグナルペプチド（リーダー）（配列番号１７）、（ｒ）ＤＯＭ７Ｈ−１４−１０  Ｒ１０８Ｃ突然変異体（Ａｌｂｕｄａｂ（商標）（配列番号１８）、（ｓ）ＰＹＹ３−３６（ＰＥＧで誘導された１０位のリシンを有する）（配列番号１９）（ｔ）７ｈ−１１−１５Ｒ１０８Ｃ（Ａｌｂｕｄａｂ（商標））（配列番号４７）；（ｕ）ＤＡＴ０１１６Ｒ１０８Ｃ：１９０ＰＹＹ（配列番号４８）のアミノ酸配列を示す。
【図１−５】（Ｖ）ＰＹＹ−Ｄｏｍ７ｈ−１４−１０  ａｌｂｕｄａｂの遺伝的融合物（配列番号４９）のアミノ酸配列を示す。
【図２−１】（ａ）ＤＡＴ０１１４（哺乳類コンストラクト）（配列番号２０）、（ｂ）ＤＡＴ０１１５（哺乳類コンストラクト）（配列番号２１）の核酸配列を示す。
【図２−２】（ｃ）ＤＡＴ０１１５（大腸菌コンストラクトのために最適化された）（配列番号２２）、（ｄ）ＤＡＴ０１１６（哺乳類コンストラクト）（配列番号２３）の核酸配列を示す。
【図２−３】（ｅ）ＤＡＴ０１１６（大腸菌コンストラクトのために最適化された）（配列番号２４）、（ｆ）ＤＡＴ０１１７（哺乳類のコンストラクト）（配列番号２５）の核酸配列を示す。
【図２−４】（ｇ）ＤＡＴ０１１７（大腸菌コンストラクトのために最適化された）（配列番号２６）、（ｈ）ＤＡＴ０１１８（哺乳類コンストラクト）（配列番号２７）の核酸配列を示す。
【図２−５】（ｉ）ＤＡＴ０１１９（哺乳類コンストラクト）（配列番号２８）、（ｊ）ＤＡＴ０１２０（哺乳類コンストラクト）（配列番号２９）の核酸配列を示す。
【図２−６】（ｋ）Ｄｏｍ７ｈ−１４（配列番号３０）、（ｌ）エキセンディン４、（Ｇ４Ｓ）３、リンカーＤＯＭ７ｈ−１４−１０融合物（ＤＭＳ７１３９：配列番号３１）の核酸配列を示す。
【図２−７】（ｍ）エキセンディン４、（Ｇ４Ｓ）３、リンカーＤＯＭ７ｈ−１１−１５融合物（ＤＭＳ７１４３：配列番号３２）（ｎ）Ｄｏｍ  ７ｈ−１４−１０（配列番号３３）、（ｏ）Ｄｏｍ  ７ｈ−１１−１５（配列番号３４）の核酸配列を示す。
【図２−８】（ｐ）Ｏｍｐ  ＡＷＡシグナルペプチド（配列番号３５）、（ｑ）Ｄｏｍ  ７ｈ−１４−１０  Ｒ（１０８）Ｃ（配列番号３６）の核酸配列を示す。
【図３】リシン及び４回反復ＰＥＧリンカーを介してＰＹＹ３−３６にコンジュゲートしているＤｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ａｌｂｕｄａｂであるペプチドコンジュゲートを示す。この分子は、実施例７〜９に詳述する実験で使用した。（配列番号３７）
【図４】ペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂで処理されたＤＩＯマウスにおける経時的な体重の変化を示す。
【図５】ペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂで処理されたＤＩＯマウスにおける経時的な食餌摂取量の変化を示す。
【図６】ペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂで処理されたＤＩＯマウスにおける体脂肪率（％）を示す（ベースライン及び１５日目）。
【図７】ペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂで処理されたマウスにおけるＤＩＯマウス（ベースライン対１５日目）の体脂肪及び除脂肪質量（Ｌｅａｎ  Ｍａｓｓ）の変化を示す。
【図８】ペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂで処理されたＤＩＯマウスにおける内分泌腺検体の測定値を示す。
【図９】ペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂの組合せ及び対照で処理されたＤＩＯマウスの肝臓における組織病理学的変化を示す。
【図１０】ペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂで処理されたｄｂ／ｄｂマウスにおけるグリコシル化ヘモグロビン  Ａ１ｃの測定値を示す。
【図１１】ペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂで処理されたｄｂ／ｄｂマウスにおけるＨｂＡ１ｃ（％）の変化（ベースライン対１６日目）を示す。
【図１２】ペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂで処理されたｄｂ／ｄｂマウスにおける血漿インスリンレベル（１６日目）を示す。
【図１３】ペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂで処理されたｄｂ／ｄｂマウスにおける経時的な体重の変化を示す。
【図１４】ペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂで処理されたｄｂ／ｄｂマウスにおける経時的な食餌摂取量の変化を示す。
【図１５−１】以下のリーダー：（ａ）ｏｍｐＡ（大腸菌由来）（配列番号３８）、（ｂ）ｏｍｐＡ−ＡＭＡ（人工配列）（配列番号３９）、（ｃ）ｏｍｐＡ−ＡＷＡ（人工配列）（配列番号４０）、（ｄ）ｏｍｐＴ（大腸菌由来）（配列番号４１）、（ｅ）ｏｍｐＴ−ＡＭＡ（人工配列）（配列番号４２）、（ｆ）ＧＡＳ（出芽酵母由来）（配列番号４３）、（ｇ）ＧＡＳ−ＡＭＡ（人工配列）（配列番号４４）のアミノ酸配列を示す。
【図１５−２】（ｈ）ＧＡＳ−ＡＷＡ（人工配列）（配列番号４５）（ｉ）ＰｅｌＢ（軟腐病菌）（配列番号４６）のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本明細書中では、本発明は、明確且つ簡潔な説明を記載することができるように実施形態を参照して説明される。実施形態は、本発明から逸脱することなく様々に組合せたり分離したりできることを意図し、またそのように認識されるべきである。
【００７２】
他に別段の定義がされない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術、及び生化学の）当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。分子遺伝学的及び生化学的方法（一般的に、参照することによって本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版．（１９８９年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９年）第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい）及び化学的方法の標準的な技術が用いられる。
【００７３】
本発明で使用する用語「インスリン分泌促進剤」は、ホルモンであるインスリンの合成、又は発現、又は活性を刺激することができるか、又は刺激を引き起こすことができる化合物を意味する。インスリン分泌促進剤の公知の例としては、例えば、グルコース、ＧＩＰ、ＧＬＰ、エキセンディン（例えば、エキセンディン−４及びエキセンディン−３）、ＰＹＹ（例えば、３−３６  ＰＹＹ）及びＯＸＭが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
本発明で使用する用語「インクレチン」は、グルコースレベルが正常であるとき、又は特にグルコースレベルが高いときに放出される量の増加を引き起こす種類の胃腸ホルモンを意味する。一例として、インクレチンとしては、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ＯＸＭ、ＶＩＰ、及びＰＰ（膵臓ポリペプチド）が挙げられる。
【００７５】
腸管ペプチドは、シグナル伝達機能を提供する腸管の異なる部分における様々な細胞から放出されるペプチドの分類であり、ＰＹＹも腸管ペプチドの一例である。
【００７６】
ポリペプチドに言及するとき本発明で使用する用語「類似体」は、ペプチドの１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されている及び／又は１以上のアミノ酸残基がペプチドから欠失している及び／又は１以上のアミノ酸残基がペプチドから欠失している及び／又は１以上のアミノ酸残基がペプチドに付加されている改変ペプチドを意味する。このようなアミノ酸残基の付加又は欠失は、ペプチドのＮ末端及び／又はペプチドのＣ末端で生じてよく、ペプチド内で生じてもよい。ＧＬＰ−１の類似体は、単純なシステムを用いて説明される：例えば、ＧＬＰ−１  Ａ８Ｇ（７−３７アミノ酸）は、８位における天然のアラニンがグリシン残基で置換されているＧＬＰ−１類似体を意味する。ペプチド類似体及びその誘導体の式は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法に従って用いられるアミノ酸の標準的な一文字略記を用いて記載される。
【００７７】
本発明で使用する「断片」は、ポリペプチドに対する言及において使用されるとき、完全な天然ポリペプチドのアミノ酸配列の一部と同じであるが全てが同じ訳ではないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。断片は、「自立型」であってもよく、単一のより大きなポリペプチドにおける単一の連続する領域として断片がその一部又は領域を形成しているより大きなポリペプチド内に含まれていてもよい。一例として、天然のＧＬＰ−１の断片は、天然のアミノ酸１〜３６のうちのアミノ酸７〜３６を含む。更に、ポリペプチドの断片は、天然の部分配列の変異体であってもよい。例えば、天然のＧＬＰ−１のアミノ酸７〜３０を含むＧＬＰ−１の断片は、その部分配列内にアミノ酸置換を有する変異体であってもよい。
【００７８】
本発明の好適なインスリン分泌促進剤の例としては、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１類似体、又はＧＬＰ−１類似体の誘導体が挙げられる。更に、エキセンディン−４、エキセンディン−４類似体、及びエキセンディン−４誘導体又は断片、並びにエキセンディン−３、エキセンディン−３誘導体、及びエキセンディン−３類似体、ＰＹＹ、ＰＹＹ−１誘導体、ＰＹＹ−１類似体、又はＰＹＹ−１類似体の誘導体、ＰＹＹ断片（例えば、３−３６及び／又は１３−３６ＰＹＹ）も挙げられる。
【００７９】
本発明で使用する用語「ＧＬＰ−１」は、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３８）、ＧＬＰ−１（７−３９）、ＧＬＰ−１（７−４０）、ＧＬＰ−１（７−４１）、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１誘導体、又はＧＬＰ−１類似体の突然変異体若しくは断片若しくは誘導体を意味する。このようなペプチド、突然変異体、類似体、及び誘導体は、インスリン分泌促進剤である。
【００８０】
例えば、ＧＬＰ−１は、図１（ｉ）の配列番号９に示すアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ突然変異体であってもよい。
【００８１】
更に、ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）及びその機能的誘導体を含み、且つＧＬＰ−１（１−３６）又はＧＬＰ−１（１−３７）のインスリン分泌促進活性を越えるインスリン分泌促進活性を有するペプチド断片、並びにインスリン分泌促進剤としてのその使用に関する国際特許出願第９０／１１２９６号パンフレット（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に記載されている（特に本発明で使用するための薬物の一例として、参照することによって本明細書に組み込まれる）。
【００８２】
国際公開第９１／１１４５７号パンフレット（Ｂｕｃｋｌｅｙら）は、本発明に係るＧＬＰ−１薬物としても有用である可能性がある活性ＧＬＰ−１ペプチド７−３４、７−３５、７−３６、及び７−３７の類似体を開示している（特に本発明で使用するための薬物又は剤の一例として、参照することによって本明細書に組み込まれる）。
【００８３】
本発明で使用する用語「エキセンディン−４ペプチド」は、エキセンディン−４（１−３９）、エキセンディン−４類似体、エキセンディン−４ペプチドの断片、エキセンディン−４誘導体、又はエキセンディン−４類似体の誘導体を意味する。このようなペプチド、断片、類似体、及び誘導体は、インスリン分泌促進剤である。エキセンディン−４（１−３９）のアミノ酸配列を図１（ｊ）の配列番号１０に示す。
【００８４】
本発明にとって有用である更なるエキセンディン類似体は、国際公開第９９／２５７２８号パンフレット（Ｂｅｅｌｅｙら）、国際公開第９９／２５７２７号パンフレット（Ｂｅｅｌｅｙら）、国際公開第９８／０５３５１号パンフレット（Ｙｏｕｎｇら）、国際公開第９９／４０７８８号パンフレット（Ｙｏｕｎｇら）、国際公開第９９／０７４０４号パンフレット（Ｂｅｅｌｅｙら）及び国際公開第９９／４３７０８号パンフレット（Ｋｎｕｄｓｅｎら）に開示されている（特に本発明で使用するための薬物又は剤の一例として、参照することによって本明細書に組み込まれる）。
【００８５】
本発明で使用する用語ＰＹＹは、摂食に応答して放出される短い（３６アミノ酸）タンパク質であるペプチドＹＹを指す。環におけるＰＹＹ濃度は、食後に増加し、絶食時に減少する。また、活性を保持しているＰＹＹペプチドの断片（例えば活性断片）、例えば３−３６及び１３−３６、並びにＰＹＹ類似体及び誘導体も本発明で有用である。
【００８６】
本発明で使用する「ペプチド」は、ペプチド結合を介して互いに接合される２〜約５０個のアミノ酸を指す。
【００８７】
本発明で使用する「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して互いに接合される少なくとも５０個のアミノ酸を指す。ポリペプチドは、一般的に、三次構造を含み、機能的ドメインに折り畳まれる。
【００８８】
本発明で使用する「ディスプレイシステム」は、物理的、化学的、又は機能的な特徴等の所望の特徴に基づいて選択するためにポリペプチド又はペプチドのコレクションにアクセス可能なシステムを指す。ディスプレイシステムは、（例えば、溶液中の、好適な支持体に固定化されている）ポリペプチド又はペプチドの好適なレパートリーであってもよい。また、ディスプレイシステムは、細胞発現系（例えば、形質転換された、感染した、トランスフェクトされた、又は形質導入された細胞における核酸のライブラリの発現、及び細胞の表面におけるコードされたポリペプチドのディスプレイ）又は無細胞発現系（例えば、エマルションコンパートメンタリゼーション及びディスプレイ）を使用する系であってもよい。代表的なディスプレイシステムは、核酸のコード化機能と、前記核酸によってコードされているポリペプチド又はペプチドの物理的、化学的、及び／又は機能的特徴とを関連づける。このようなディスプレイシステムが使用されるとき、所望の物理的、化学的、及び／又は機能的特徴を有するポリペプチド又はペプチドを選択することができ、選択されるポリペプチド又はペプチドをコードする核酸を容易に単離又は回収することができる。核酸のコード化機能と、ポリペプチド又はペプチドの物理的、化学的、及び／又は機能的特徴とを関連づける多くのディスプレイシステムが当技術分野において公知であり、例えば、バクテリオファージディスプレイ（ファージディスプレイ、例えば、ファージミドディスプレイ）、リボソームディスプレイ、エマルションコンパートメンタリゼーション及びディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミドにおけるディスプレイ、共有ディスプレイ等である。（例えば、欧州特許第０４３６５９７号明細書（Ｄｙａｘ）、米国特許第６，１７２，１９７号明細書（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら）、米国特許第６，４８９，１０３号明細書（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら）を参照されたい）。
【００８９】
本発明で使用する「機能的」とは、特異的結合活性等の生物活性を有するポリペプチド又はペプチドを説明する。例えば、用語「機能的ポリペプチド」は、その抗原結合部位を通して標的抗原に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
【００９０】
本発明で使用する「標的リガンド」は、ポリペプチド又はペプチドによって特異的又は選択的に結合されるリガンドを指す。例えば、ポリペプチドが抗体又はその抗原結合断片であるとき、標的リガンドは、任意の所望の抗原又はエピトープであってもよい。標的抗原に対する結合は、機能的であるポリペプチド又はペプチドに依存する。
【００９１】
本発明で使用する抗体は、天然に抗体を産生する任意の種に由来していようと、組換えＤＮＡ技術によって作製されていようと、血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母、又は細菌から単離されていようと、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、若しくはＩｇＥ又は断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合されたＦｖ、ｓｃＦｖ、閉構造多重特異的抗体、ジスルフィド結合されたｓｃＦｖ、ダイアボディ等）を指す。
【００９２】
本発明で使用する「抗体フォーマット」は、任意の好適なポリペプチド構造に抗原に対する結合特異性を付与するために１以上の抗体可変ドメインを組み込むことができる構造を指す。様々な好適な抗体フォーマットが当技術分野において公知であり、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／又は軽鎖のホモダイマー及びヘテロダイマー、前述のいずれかの抗原結合断片（例えば、Ｆｖ断片（例えば単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合したＦｖ）、ＦＡｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）、単一抗体可変ドメイン（例えばｄＡｂ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、及び前述のいずれかの改変バージョン（例えば、ポリエチレングリコール又は他の好適なポリマー又はヒト化ＶＨＨの共有結合によって改変される）である。
【００９３】
語句「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、他のＶ領域又はドメインとは独立に抗原又はエピトープに特異的に結合する抗体の可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に他の領域又はドメインが必要ではない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは、更なる可変ドメインとは独立に抗原に結合する）、他の可変領域又は可変ドメインとのフォーマット（例えば、ホモ又はヘテロ多量体）で存在してもよい。「ドメイン抗体」又は「ｄＡｂ」は、これらの用語が本明細書で使用されるとき、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。「単一の免疫グロブリン可変ドメイン」は、本発明で使用される「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。「単一抗体可変ドメイン」は、この用語が本明細書で使用されるとき、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、１つの実施形態では、ヒト抗体可変ドメインであるが、げっ歯類（例えば、参照することによってその全文が本明細書に組み込まれる国際公開第００／２９００４号パンフレットに開示されている）、テンジクザメ、及びラクダ科のＶＨＨｄＡｂ等の他の種に由来する単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ科のＶＨＨは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ及びグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、これらは、天然に軽鎖が欠けている重鎖抗体を産生する。ＶＨＨは、ヒト化することもできる。
【００９４】
「ドメイン」は、タンパク質の残りと無関係の三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。一般的に、ドメインは、タンパク質の別々の機能特性に関与しており、多くの場合、タンパク質及び／又はドメインの残りの機能を失うことなく付加、除去、又は他のタンパク質に転移することができる。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。したがって、単一抗体可変ドメインは、完全な抗体可変ドメイン、並びに例えば、１以上のループが抗体可変ドメインに特徴的ではない配列、あるいは切頭されているか又はＮ末端若しくはＣ末端に伸長を含む抗体可変ドメインによって置換されている改変可変ドメイン、並びに完全長ドメインの少なくとも結合活性及び特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片を含む。
【００９５】
用語「ライブラリ」とは、異種のポリペプチド又は核酸の混合物を指す。ライブラリは、各々が単一のポリペプチド又は核酸配列を有するメンバーで構成される。この点で、「ライブラリ」は、「レパートリー」と同義である。ライブラリ中に存在する多様性は、ライブラリのメンバー間の配列の差に起因する。ライブラリは、ポリペプチド又は核酸の単純な混合物の形態をとってもよく、核酸のライブラリで形質転換された生物又は細胞、例えば、細菌、ウイルス、動物、又は植物の細胞等の形態であってもよい。１つの実施形態では、各個々の生物又は細胞は、１つのみ又は制限された数のライブラリメンバーを含有する。１つの実施形態では、核酸は、前記核酸によってコードされるポリペプチドを発現させるために、発現ベクターに組み込まれる。したがって、ライブラリが宿主生物の集団の形態をとり得る態様では、各生物は、発現してその対応するポリペプチドメンバーを生成することができる核酸形態でライブラリの単一メンバーを含有する発現ベクターのうちの１以上のコピーを含有する。したがって、宿主生物の集団は、多様なポリペプチドの多くのレパートリーをコードする能力を有する。
【００９６】
本発明で使用する用語「用量」は、全てが１度に被験体に投与されるか（単位用量）、又は規定の時間間隔で２回以上被験体に投与される融合物又はコンジュゲートの量を指す。例えば、用量は、１日間（２４時間）（日用量）、２日間、１週間、２週間、３週間、又は１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、又は６ヶ月間、又はそれ以上の期間に（例えば、単回投与によって又は２回以上の投与によって）被験体に投与される融合物又はコンジュゲートの量を指す場合もある。用量間の間隔は、任意の所望の時間量であってよい。
【００９７】
語句「半減期」は、例えば、天然の機序による分解及び／又はクリアランス又は隔離に起因して、融合物又はコンジュゲートの血清中又は血漿中濃度がインビボで５０％低下するのにかかる時間を指す。本発明の組成物は、インビボで安定化され、分解及び／又はクリアランス又は隔離に対して耐性である血清アルブミン分子、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合させることによって半減期が増加される。これら血清アルブミン分子は、それ自体インビボにおける半減期が長い天然タンパク質である。半減期の長い分子に対して特異的ではない類似の分子よりも長い期間、インビボで機能活性が持続している場合、分子の半減期は増加している。例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）並びにインクレチン及び／又はインスリン分泌促進剤及び／又は腸管ペプチド、例えばＧＬＰ−１、ＰＹＹ、又はエキセンディンに対して特異的なｄＡｂを含む本発明の組成物は、ＨＳＡに対する特異性が存在しない、すなわちＨＳＡに結合しないが別の分子には結合する同じリガンドと比較される。例えば、前記リガンドは、細胞における第３の標的に結合することができる。典型的には、半減期は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又はそれ以上増加する。半減期を２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、又はそれ以上の範囲で増加させることが可能である。あるいは、又は更に、半減期を最大３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍増加させることが可能である。
【００９８】
本発明で使用する「流体力学的サイズ」は、水溶液を通じた分子の拡散に基づいた分子（例えば、タンパク質分子、リガンド）の見掛けのサイズを指す。溶液を通じたタンパク質の拡散又は移動を処理してタンパク質の見掛けのサイズを導くことができ、この場合前記サイズは、タンパク質粒子の「ストークス半径」又は「流体力学的半径」によって得られる。タンパク質の「流体力学的サイズ」は、質量及び形状（立体構造）に依存し、その結果、同じ分子量を有する２つのタンパク質は、タンパク質の全体の立体構造に基づいて様々な流体力学的サイズを有する場合がある。
【００９９】
２つの配列間の「相同性」又は「同一性」又は「類似性」（これら用語は本発明では互換的に用いられる）の計算は、以下の通り実施される。最適に比較する目的のために配列をアラインメントする（例えば、最適なアラインメントのために第１及び第２のアミノ酸又は核酸のうちの一方又は両方にギャップを導入してもよく、比較のために非相同配列を無視してもよい）。１つの実施形態では、比較のためにアラインメントするレファレンス配列の長さは、前記レファレンス配列の長さのうちの少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置又は核酸位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列中のある位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められている場合、分子は、その位置において同一である（本発明で使用するアミノ酸又は核酸の「相同性」は、アミノ酸又は核酸の「同一性」に等しい）。２つの配列間の同一性割合は、前記２つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要のあるギャップ数及び各ギャップの長さを考慮して、前記配列が共有している同一の位置数の関数である。本発明で定義されるアミノ酸及び核酸配列のアラインメント、及び相同性、類似性、又は同一性は、デフォルトのパラメータを用いてアルゴリズムＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓを用いて調製し、求めることができる（Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔ．Ａ．ら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，１７４：１８７−１８８（１９９９年））。
【０１００】
アミノ酸配列の翻訳後修飾：アミノ酸配列の翻訳後修飾は、天然で生じる場合もあり、これらは、例えば、残基の脱アミド化又はＮ末端の環化又は付加又は欠失を含む場合があることが知られている。したがって、本発明は、このような翻訳後修飾、例えば、配列の脱アミド化形態から生じる、本明細書に開示する配列の変異体を含む。
【０１０１】
核酸、宿主細胞：
本発明は、本明細書に記載する本発明の組成物、例えば融合物をコードする単離及び／又は組換え核酸に関する。
【０１０２】
本明細書で「単離」と称される核酸は、そのオリジナルの環境（例えば、細胞内又はライブラリ等の核酸の混合物中）における他の物質（例えば、ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ等の他の核酸）から分離されている核酸である。単離核酸は、ベクター（例えば、プラスミド）の一部として単離することができる。
【０１０３】
本発明で「組換え」と称される核酸は、例えば、制限酵素、相同的組換え、ウイルス等を用いてベクター又は染色体にクローニングする等の人工的組換えに依る方法を含む組換えＤＮＡ法によって生成される核酸、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて調製される核酸である。
【０１０４】
また、本発明は、本明細書に記載する本発明の組成物、例えば融合物をコードする核酸を含む（１以上の）組換え核酸又は発現コンストラクトを含む、例えば哺乳類又は微生物等の組換え宿主細胞に関する。また、本明細書に記載する本発明の組成物、例えば融合物を調製する方法であって、融合ポリペプチドの発現に適切な条件下で本発明の組換え宿主細胞、例えば哺乳類又は微生物の組換え宿主細胞を維持することを含む方法を提供する。前記方法は、必要に応じて、融合物を単離又は回収する工程を更に含んでもよい。
【０１０５】
例えば、本発明の組成物、例えば本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸分子（すなわち、１以上の核酸分子）、又はこのような核酸分子を含む発現コンストラクト（すなわち、１以上のコンストラクト）を好適な宿主細胞に導入して、選択された宿主細胞に適切な任意の方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）を用いて組換え宿主細胞を作製することができ、その結果、前記核酸分子は、１以上の発現制御エレメントに機能的に連結される（例えば、ベクターにおいて、細胞内過程によって作製されたコンストラクトにおいて、宿主細胞のゲノムに組み込まれる）。得られる組換え宿主細胞は、発現に好適な条件下で（例えば、インデューサの存在下で、好適な動物において、適切な塩、成長因子、抗生物質、栄養補助物質等を添加した好適な培養培地において）維持することができ、それによって、コードされているペプチド又はポリペプチドが生成される。必要に応じて、コードされているペプチド又はポリペプチドを（例えば、哺乳類、動物、宿主細胞、培地、乳から）単離又は回収してもよい。このプロセスは、トランスジェニック動物の宿主細胞における発現を包含する（例えば、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌを参照されたい）。ペプチド又は融合タンパク質又はコンジュゲートは、次いで、発現宿主において、培養培地において、精製中又は精製後、例えば、Ｃ末端のアミド化を介して、例えば化学的又は酵素的に更に修飾されてもよい。
【０１０６】
また、本明細書に記載する本発明の組成物、例えば融合ポリペプチドは、例えば化学合成又は任意の他の好適な方法によって好適なインビトロ発現系において生成することができる。
【０１０７】
本明細書に記載及び例証される本発明の組成物、例えば融合物及びコンジュゲートは、一般的に、高い親和性で血清アルブミンに結合する。
【０１０８】
例えば、融合物又はコンジュゲートは、（表面プラズモン共鳴によって測定されたとき）、例えば、４００〜８００ｎｍ、例えば、６００ｎｍで約５μＭ〜約１００ｐＭ、例えば、約１μＭ〜約１００ｐＭの親和性（ＫＤ；ＫＤ＝Ｋｏｆｆ（ｋｄ）／Ｋｏｎ（ｋａ））でヒト血清アルブミンに結合することができる。
【０１０９】
本発明の組成物、例えば融合物又はコンジュゲートは、大腸菌又はピキア属の種（例えば、ピキア・パストリス）において発現することができる。１つの実施形態では、融合物は、大腸菌若しくはピキア属の種（例えば、ピキア・パストリス）；又は哺乳類細胞培養（例えば、ＣＨＯ又はＨＥＫ２３９細胞）で発現するとき、少なくとも約０．５ｍｇ／Ｌの量で分泌される。本明細書に記載する融合物又はコンジュゲートは、大腸菌若しくはピキア属の種、又は哺乳類細胞で発現するとき分泌可能であるが、これらは、大腸菌又はピキア属の種を使用しない合成化学法又は生物学的生成法等の任意の好適な方法を用いて生成することもできる。
【０１１０】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、有効な量が投与されたとき、国際公開第２００６／０５９１０６号パンフレット（例えば、国際公開第２００６／０５９１０６号パンフレットの１０４〜１０５ページ）又は本明細書の実施例に記載される動物モデル等の動物モデルにおいて有効である。一般的に、有効な量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。疾患のモデルは、ヒトにおける治療有効性の指標であると当業者に認識されている。
【０１１１】
一般的に、本発明の組成物は、薬理学的又は生理学的に適切な担体と共に精製形態で利用される。典型的には、これら担体は、水溶液又はアルコール／水溶液、エマルション又は懸濁剤、生理食塩水及び／又は緩衝媒体を含む任意の担体を含んでもよい。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲル液、デキストロース及び塩化ナトリウム、及び乳酸加リンゲル液を挙げることができる。好適な生理学的に許容できる佐剤は、懸濁液中にポリペプチド複合体を維持する必要がある場合、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、及びアルギン酸塩等の増粘剤、スクロース、トレハロース、ソルビトール、ｔｗｅｅｎ−２０又はｔｗｅｅｎ−８０等の洗剤から選択することができる。
【０１１２】
静脈内用ビヒクルとしては、流体及び栄養補充液及び電解質補充液、例えば、リンゲル液に基づくもの等が挙げられる。また、保存剤、並びに抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、及び不活性気体等の他の添加剤が存在してもよい（Ｍａｃｋ（１９８２年）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版）。徐放製剤を含む様々な好適な製剤を用いてもよい。
【０１１３】
本発明に係る医薬組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られているものであってよい。療法については、本発明の薬物の融合物又はコンジュゲートを標準的な技術に従って任意の患者に投与することができる。
【０１１４】
投与は、非経口的に、静脈内に、経粘膜送達（例えば舌下）、皮下注射によって、筋肉内に、腹腔内に、経口的に、経皮的に、経粘膜的に、肺経路を介して、鼻送達を介して、ＧＩ送達、直腸内送達、又は目送達を含む適切なモードによって行うことができ、あるいは適切にカテーテルにより直接注入してもよい。投薬量及び投与頻度は、患者の年齢、性別、及び症状、他の薬物の同時投与、使用禁忌、及び医師が考慮すべき他のパラメータに依存する。投与は、指定の通り局所であっても全身であってもよい。
【０１１５】
本発明の組成物は、保存用に凍結乾燥させてもよく、使用前に好適な担体で再構成してもよい。この技術は、従来の免疫グロブリンで有効であることが示されており、当技術分野において公知である凍結乾燥及び再構成技術を使用することができる。当業者は、凍結乾燥及び再構成が抗体の活性喪失の程度を変化させる恐れがあり（例えば、従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体よりも活性の喪失が大きい傾向がある）、それを補うために使用レベルを上方調整しなければならない場合があることを認識する。
【０１１６】
予防的適用では、例えば、糖尿病前症又はインスリン抵抗性の個体に投与するとき、本融合物又はコンジュゲートを含有する組成物は、疾患の発症を予防する、阻害する、又は遅延させるために（例えば、寛解又は静止状態を維持するか、又は急性相を防ぐために）、同様又は僅かに低い投薬量で投与されてもよい。当業者は、疾患を治療、抑制、又は予防するための適切な投薬間隔を求めることができる。疾患を治療、抑制、又は予防するために本発明の組成物を投与するとき、１日当たり４回以内、１日当たり１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間毎に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、６ヶ月毎に１回、又はより長い間隔で、例えば、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ）の用量で投与してよい。
【０１１７】
本明細書に記載される組成物を用いて実施される治療又は療法は、治療前に存在する１以上の症状に対して、又はこのような組成物若しくは他の好適な対照で処理されていない個体（ヒト又はモデル動物）における１以上の症状に対して、１以上の症状又は徴候が（例えば、少なくとも１０％、又は臨床評価尺度において少なくとも１ポイント）低減又は緩和される場合「有効」であると考えられる。症状は、標的とされる疾患又は障害の正確な性質に依存して明らかに変化するが、当業者又は技術者によって測定することができる。
【０１１８】
同様に、本明細書に記載する組成物を用いて実施される予防は、前記組成物で処理されていない同様の個体（ヒト又はモデル動物）における１以上の症状に対して、１以上の症状又は徴候の発症又は重篤度が遅延、低減、又は消滅された場合「有効」である。
【０１１９】
本発明の組成物は、他の治療剤又は活性剤、例えば、他のポリペプチド又はペプチド又は小分子と併用投与されてもよい。これら更なる剤としては、例えば、メトホルミン、インスリン、グリタゾン（例えば、ロサグリタゾン）、免疫抑制剤、免疫刺激剤等の様々な薬物を挙げることができる。
【０１２０】
本発明の組成物は、１以上の更なる治療剤又は活性剤と一緒に投与及び／又は製剤化されてもよい。本発明の組成物が追加の治療剤と共に投与される場合、融合物又はコンジュゲートは、前記追加の剤の投与前に、投与と同時に、投与と共に、又は投与後に投与されてもよい。一般的に、本発明の組成物及び追加の剤は、治療効果が重複するように投与される。
【０１２１】
半減期：
インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子、例えば、ＧＬＰ−１、ＰＹＹ、又はエキセンディンリガンドの半減期が増加することは、インビボにおける用途において有用である。本発明は、インビボにおけるインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド薬物、例えば、ＧＬＰ及びエキセンディンの半減期を増加させることによってこの問題を解決し、結果として、これら分子の機能活性の体内における持続時間を長くする。
【０１２２】
本明細書に記載するとき、本発明の組成物は、インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子単独と比べて、インビボにおける血清又は血漿半減期を劇的に延ばす及び／又はＡＵＣを増加させる及び／又は平均滞留時間（ＭＲＴ）を増加させることができる。更に、インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子の活性は、一般的に、本発明の組成物（例えば、コンジュゲート又は融合物）において実質的に変化しない。しかし、インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子単独と比較して本発明の組成物の活性が若干変化することは許容でき、一般的に、本発明の組成物の薬物動態特性を改善することによって補われる。例えば、本発明の組成物は、インクレチン／インスリン分泌促進性単独よりも低い親和性で標的に結合する可能性があるが、組成物の薬物動態特性が改善されたことによって（例えば、インビボにおける血清半減期の延長、ＡＵＣの増加）、インクレチン／インスリン分泌促進剤単独に比べてほぼ同等又はより優れた効力を有する。更に、本発明の組成物の半減期が増加したことにより、本発明の組成物は、インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド薬物単独よりも低い頻度で投与することができる、例えば、１ヶ月に１回又は１週間に１回患者に投与してもよく、また、インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド単独の投与よりも血中のインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド剤の濃度をより一定にすることができるので、所望の治療又は予防効果が達成される。
【０１２３】
リガンドの半減期の薬物動態分析及び測定の方法は、当業者によく知られている。詳細は、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ａら：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ及びＰｅｔｅｒｓら，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６年）に見出すことができる。また、ｔα及びｔβ半減期及び曲線下面積（ＡＵＣ）等の薬物動態パラメータについて記載している「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」，Ｍ  Ｇｉｂａｌｄｉ＆Ｄ  Ｐｅｒｒｏｎ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ発行，第２版（１９８２年）も参照されたい。
【０１２４】
半減期（ｔ１／２α及びｔ１／２β）及びＡＵＣ及びＭＲＴは、時間に対するリガンドの血漿又は血清濃度の曲線から求めることができる。例えば、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ分析パッケージ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ９４０４０，ＵＳＡから入手可能）を用いて、曲線をモデル化することができる。第１の相（α相）では、リガンドは、患者の体内に主に分配されるが、一部は排出される。第２の相（β相）は、リガンドが分配され、リガンドが患者からなくなるとともに血清濃度が低下するときの終末相である。ｔα半減期は第１の相の半減期であり、ｔβ半減期は第２の相の半減期である。更に、当技術分野において周知である非コンパートメント適合モデルを用いて半減期を求めることもできる。
【０１２５】
１つの実施形態では、本発明は、本発明に係る融合物又はコンジュゲートを含む組成物であって、前記融合物又はコンジュゲートが、例えば、ヒト被験体において、約１２時間以上、例えば約１２時間〜約２１日間、例えば約２４時間〜約２１日間、例えば約２〜８日間、例えば約３〜４日間の範囲の排出半減期を有する組成物を提供する。
【０１２６】
本発明の組成物、すなわち、本明細書に記載する融合物及びコンジュゲートを含む組成物は、幾つかの更なる利点を提供する。ドメイン抗体成分は、非常に安定であり、抗体及び抗体の他の抗原結合断片に比べて小さく、大腸菌又は酵母（例えば、ピキア・パストリス）又は哺乳類細胞（例えばＣＨＯ細胞）で発現することによって高収率で生成することができ、且つ血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を、ヒト起源のライブラリ又は任意の所望の種から容易に選択することができる。したがって、血清アルブミンに結合するｄＡｂを含む本発明の組成物は、哺乳類細胞（例えば、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体）で一般的に生成される治療剤よりも容易に生成することができ、免疫原性ではないｄＡｂを用いることもできる（例えば、ヒトｄＡｂをヒトの疾患の治療又は診断に用いることができる）。
【０１２７】
血清アルブミンに結合するｄＡｂを含有する薬物組成物の一部であるとき、インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子の免疫原性が低下する場合がある。したがって、本発明は、（インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子単独よりも）免疫原性が低下し得る、又は血清アルブミンに結合するｄＡｂを含有する薬物組成物の状況において実質的に免疫原性でなくなり得る組成物を提供する。したがって、このような組成物は、被験体の免疫系による抗薬物抗体の同化に起因する効果の喪失を最小限に抑えながら経時的に繰り返し被験体に投与することができる。
【０１２８】
更に、本明細書に記載する組成物は、インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド剤単独よりも高い安全性プロファイル及び少ない副作用を有することができる。例えば、ｄＡｂの血清アルブミン結合活性の結果として、本発明の融合物又はコンジュゲートは、血管循環における滞留時間が長くなる。更に、本発明の組成物は、血液脳関門を通過したり、全身投与（例えば、静脈内投与）後中枢神経系に蓄積したりすることが実質的に不可能である。したがって、本発明の組成物は、インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド剤単独と比べて、安全性は高く且つ副作用は少なく投与することができる。同様に、本発明の組成物は、薬物単独よりも特定の器官（例えば、腎臓又は肝臓）に対する毒性が低い場合がある。
【実施例】
【０１２９】
実施例１：ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）又はエキセンディン−４とＤＯＭ７ｈ−１４  ＡｌｂｕｄＡｂとの遺伝融合物の発現：
エキセンディン−４又はグリシンによって置換された８位のアラニンを有するＧＬＰ−１（７−３７）（［Ｇｌｙ８］ＧＬＰ−１）のいずれかを、ＤＯＭ７ｈ−１４（以下に示すアミノ酸配列を有する血清アルブミン（ａｌｂｕｄａｂ）に結合するドメイン抗体（ｄＡｂ））との融合物としてｐＴＴ−５ベクター（ＣＮＲＣ，Ｃａｎａｄａから入手可能）にクローニングした。いずれの場合も、ＧＬＰ−１又はエキセンディン−４がコンストラクトの５’末端に存在し、ｄＡｂが３’末端に存在していた。図１（Ａ〜Ｇ）に示すアミノ酸配列を有する合計７つのコンストラクト（ＤＡＴ０１１４、ＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７、ＤＡＴ０１１８、ＤＡＴ０１１９、ＤＡＴ０１２０）を作製した。ＧＬＰ−１又はエキセンディン−４とｄＡｂとの間には、リンカーが存在しないか、あるいはｇｌｙ−ｓｅｒリンカー（Ｇ４Ｓ×３）、ヘリカルリンカー（「Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｎｋｅｒｓ  ｗｈｉｃｈ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ａ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １４（８）：５２９−３２．４５６）、又はＧＬＰ−１若しくはエキセンディン−４とｄＡｂとの間の第２のＧＬＰ−１部分からなるリンカーが存在していた。リンカーは、ＧＬＰ−１又はエキセンディン−４をｄＡｂから分離して、ＧＬＰ−１又はエキセンディン−４とＧＬＰ−１受容体との間の結合の立体障害を防ぐためのスペーサとして含まれていた。コンストラクトの配列を図１（Ａ〜Ｇ）の配列番号１〜７に示す。
【０１３０】
（Ｑｉａｇｅｎ  ＣＡから入手可能な内毒素を含まないプラスミドＧｉｇａキットを用いて）アルカリ溶解を用いて大腸菌で内毒素を含まないＤＮＡを調製し、それを用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞（ＣＮＲＣ，Ｃａｎａｄａから入手可能）をトランスフェクトした。フラスコ１個当たり３３３μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２５０μｇのＤＮＡを用いて、１．７５×１０６細胞／ｍＬで２５０ｍＬ／フラスコのＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクションし、５日間３０℃で発現させた。上清を遠心分離によって回収し、プロテインＬを用いて親和性精製を行った。タンパク質を樹脂にバッチ結合させ、カラムにパックし、１０カラム体積のＰＢＳで洗浄した。タンパク質を０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２）５０ｍＬで溶出し、Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）で中和した。予測されるサイズのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで同定した。サイズを以下の表１に示す。
【表１】
2013506628.tif 000005
【０１３１】
実施例２：ＧＬＰ−１及びエキセンディン−４  ＡｌｂｕｄＡｂ融合物が血清アルブミンに結合することを示す：
ＧＬＰ−１及びエキセンディン−４  ＡｌｂｕｄＡｂ融合物を、表面プラズモン共鳴（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能なＢｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）によって分析して、親和性に関する情報を得た。血清アルブミンでコーティングされたＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップ（カルボキシメチル化デキストランマトリクス）を用いて分析を実施した。約１０００共鳴単位（ＲＵ）の試験される各血清アルブミン（ヒト、ラット、及びマウスの血清アルブミン）をｐＨ５．５の酢酸バッファで固定化した。Ｂｉｏｃｏｒｅ  ＡＢのフローセル１は、コーティングされておらず且つブロッキングされているネガティブコントコールであり、フローセル２は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（８１５ＲＵ）でコーティングされており、フローセル３は、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）（８２６ＲＵ）でコーティングされており、フローセル４は、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）（９３８ＲＵ）でコーティングされていた。試験した各融合分子を上記実施例に記載の通り哺乳類組織培養で発現させた。
【０１３２】
ＢＩＡＣＯＲＥ  ＨＢＳ−ＥＰバッファ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）で希釈することによって様々な濃度の融合分子を調製し（１６ｎＭ〜２μＭの範囲）、ＢＩＡＣＯＲＥチップに流した。
【０１３３】
親和性（ＫＤ）の領域におけるｄＡｂの濃度によって作成されるトレースに会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）及び解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）曲線を当てはめることによって、ＢＩＡＣＯＲＥトレースからＫＤを計算した。ＫＤ（親和性）を以下の表２に要約する。
【表２】
2013506628.tif 000006
【０１３４】
上記結果は、融合分子が全ての種類の血清アルブミンに結合する能力を保持していることを立証し、これは、インビボにおける半減期が延長されている可能性があることを示唆する。
【０１３５】
実施例３：ＧＬＰ−１及びエキセンディン−４  ＡｌｂｕｄＡｂ融合物は、ＧＬＰ−１受容体結合アッセイ（ＧＬＰ−１Ｒ  ＢＡ）において活性である：
融合物を１００ｍＭのＮａＶＩ、２０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ６．２）でバッファ交換した。一方、ＣＨＯ  ６ＣＲＥ  ＧＬＰ１Ｒ細胞（ルシフェラーゼレポーター遺伝子をドライブする６つのｃＡＭＰ応答エレメントで安定にトランスフェクトされ、ヒトＧＬＰ−１受容体も有するＣＨＯ  Ｋ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣから入手可能））を、懸濁培地に２×１０５細胞／ｍＬで播種した。懸濁培養を２４時間維持した。次いで、２ｍＭのＬグルタミン（２．５×１０５細胞／ｍＬ）を含有する１５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ（Ｓｉｇｍａから入手可能）で細胞を希釈し、アッセイされる化合物を１０μＬ／ウェル含有する３８４ウェルプレートに分配した。アッセイ対照の添加後、プレートをインキュベータに戻して、３７℃及び５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。インキュベーション後、ｓｔｅａｄｙ  ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）をキットに記載の通りウェルに添加し、プレートを自己接着性プレートシール（Ｗｅｂｅｒ  Ｍａｒｋｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．カタログ番号６０７７８０）で密封した。プレートをリーダー（Ｖｉｅｗｌｕｘ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に入れ、５分間プレインキュベートした後、蛍光を読み取り、結果をプロットした。１０μＭのアルブミンの存在又は不在下にて、様々な濃度の化合物でアッセイして、アルブミンの有り無しで用量応答曲線を当てはめた。ＥＣ５０を計算し、以下の表３に要約した：
【表３】
2013506628.tif 000007
【０１３６】
上記結果は、試験した融合分子が全てＧＬＰ−１受容体に結合する効力を保持していることを実証する。また、上記結果は、この効力が血清アルブミンの存在下で保持されていることを示す。したがって、これら融合分子は、インビボにおいてＧＬＰ−１受容体に結合する能力を保持している可能性がある。
【０１３７】
実施例４：ＨＥＫ２９３哺乳類組織培養におけるＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７、及びＤＡＴ０１２０の発現、次いで、プロテインＬ親和性捕捉及びイオン交換クロマトグラフィーによる精製：
本実験の目的は、インビボ及びインビボにおける特性評価のためにタンパク質を生成することであった。既に記載の通り、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における哺乳類組織培養でｐＴＴ−５ベクターからタンパク質を発現させた。簡潔に述べると、内毒素を含まないＤＮＡを調製し、精製し、それを用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞をトランスフェクトした。振盪インキュベータ内で３０℃にて５日間タンパク質を発現させ、培養物をスピンダウンし、上清（対象タンパク質を含有する）を回収した。プロテインＬアガロースｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ親和性樹脂（樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製、プロテインＬはインハウスでカップリングした）において親和性捕捉によって上清からタンパク質を精製した。次いで、約１０カラム体積のＰＢＳで樹脂を洗浄し、次いで、約５カラム体積の０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．０）でタンパク質を溶出した。この場合（前述の例と対照的に）、次いで、更なる精製を行った。タンパク質（ｔｒｉｓ−グリシン中）を２０ｍＭの酢酸（ｐＨ５．０）でバッファ交換した後、Ａｋｔａを用いて、予め２０ｍＭの酢酸（ｐＨ５．０）で平衡化された１つ（又は並行して２つ）の６ｍＬのｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。同じバッファで洗浄した後、２０ｍＭの酢酸（ｐＨ５．０）中の０〜０．７５Ｍ又はＮａＣｌ勾配を介してタンパク質を溶出した。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及び質量分析によって正確なサイズの画分を同定し、次いで、合わせて最終的なタンパク質サンプルを作製した。次いで、タンパク質を２０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ６．２）、１００ｍＭのＮａＣｌでバッファ交換し、０．５〜５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。タンパク質を０．２μＭのフィルタで濾過して、確実に滅菌した。
【０１３８】
実施例５：ＰＹＹ（３−３６）Ｄｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂペプチドコンジュゲート（図３に示す構造を有する）（これはリシン及び４回反復ＰＥＧリンカーを介してＰＹＹ３−３６にコンジュゲートされているＤｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ａｌｂｕｄａｂである）の生成：
Ｄｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ａｌｂｕｄａｂを、以下に記載する通り大腸菌で発現させ精製した。ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）をコードする遺伝子をベクターｐＥＴ３０にクローニングした。発現ベクターにクローニングするために、５’にＮｄｅＩ制限酵素部位を有し、続いてＰＥＬ  Ｂリーダー配列（図１５（ｉ）の配列番号４６に示すアミノ酸配列）を有するアセンブリＰＣＲとして融合物を生成した。ベクター及びアセンブリＰＣＲをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで切断し、次いで、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いてインサートをベクターにライゲーションした。このライゲーション物２マイクロリットルをＭａｃｈＩ細胞の形質転換に用いた。回復増殖期間後、カルベニシリンを含有する寒天プレートに細胞をプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーの配列を決定し、正確な配列を含有するものをプラスミドの増殖及び単離に用いた（Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｅｐ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）。ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をプラスミドＤＮＡで形質転換し、得られたコロニーを発現培養物の接種に用いた。５０ｍＬの変法ＴＢ培地（Ｓｉｇｍａ）を含有する２５０ｍＬのフラスコに接種することによって発現させ、これをＯＤ＝０．１で接種し、次いで、５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンを添加して３０℃で増殖させた。Ａ６００＝０．５〜１にて、細胞をＩＰＴＧで誘導し最終濃度を５０μＭにし、２３℃で一晩増殖を続けた。次いで、培養上清を１時間３７００×ｇで遠心分離することによって清澄化した。次いで、プロテインＬ  ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号２８−４０５８−０３，プロテインＬがカップリングしている）を用いて清澄化された上清から発現したタンパク質を精製し、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．０）を用いてプロテインＬから溶出し、次いで、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を１／５溶出体積添加することによって中和した。次いで、０．１Ｍのクエン酸を用いてタンパク質のｐＨを調整し、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５）で平衡化されている３０ｍＬのＳｏｕｒｃｅ  Ｓ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。０〜１００の５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５）、１ＭのＮａＣｌの勾配をＡｋｔａＸｐｒｅｓｓ  ＦＰＬＣ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１５０ｍＬ超適用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで画分を分析し、最も純度の高い生成物を含有する画分をプールした。最終タンパク質を５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、５ｍＭのＥＤＴＡで脱塩した。
【０１３９】
次いで、図３に示すＰＥＧリンカーを用いてＰＹＹ３−３６アミノ酸分子（但し、ＰＥＧリンカーで誘導体化できる１０位にリシンを有する）にＤｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）を連結させる。ＰＹＹ及びＰＥＧは、標準的な化学合成によって調製した。次いで、ＰＥＧリンカーの末端のマレイミドを用いて、上記の通り調製したＤｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ａｌｂｕｄａｂの自由システインにＰＹＹペプチドをコンジュゲートさせた。最終濃度が５ｍＭになるようにジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加することによってＤｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）の自由システインを還元し、３０分間インキュベートし、最後に５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、５ｍＭのＥＤＴＡで脱塩してＤＴＴを除去した。次いで、マレイミドで活性化されたペプチドを１：１の比でタンパク質と混合し、インキュベートしてコンジュゲートさせた。
【０１４０】
上記と同様の方法でイオン交換クロマトグラフィーによって未反応のＤｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）からコンジュゲートを精製した。最後に、上記と同様の方法でプロテインＬ親和性精製を用いて、コンジュゲート中で濃縮された画分を自由ペプチドから精製した。最終的なコンジュゲートをバッファ交換し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析によって分析した。
【０１４１】
実施例６：エキセンディン−４及びＤＯＭ７ｈ−１４−１０／ＤｏＭ７ｈ−１１−１５  ＡｌｂｕｄＡｂの遺伝的融合物の発現及び精製
この実験の目的は、ＤＭＳ７１３９及びＤＭＳ７１４３を効率的に発現させることであった。ＤＭＳ７１３９は、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（血清アルブミンに結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）、ａｌｂｕｄａｂとしても知られている）とエキセンディン−４との融合物であり、ＤＭＳ７１４３は、正確にプロセシングされたＮ末端を有する、大腸菌におけるＤＯＭ７ｈ−１１−１５（血清アルブミンに結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）、ａｌｂｕｄａｂとしても知られている）とエキセンディン−４との融合物である。次いで、後の実験においてこの融合物のエキセンディン−４部分の活性及びＡｌｂｕｄＡｂ部分の活性について試験することができた。ＤＯＭ７ｈ−１４−１０又はＤＯＭ７ｈ−１１−１５との融合物としてエキセンディン−４をクローニングし、ここでは、エキセンディン−４ペプチドがコンストラクトの５’末端に存在し、ＡｌｂｕｄＡｂが３’末端に存在していた。各々がエキセンディン−４ペプチドとＡｌｂｕｄＡｂとの間に（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを含む合計２つのコンストラクトを作製した。リンカーは、エキセンディン４をｄＡｂから空間的に分離して、エキセンディン−４とＧＬＰ−１受容体との間の結合の立体障害を防ぐためのスペーサとして含まれていた。コンストラクトの配列を図１（ｍ）及び１（ｎ）に示す。発現ベクターにクローニングするために、５’にＮｄｅＩ制限酵素部位を有し、続いて改変ＯｍｐＴ（図１（ｑ）の配列番号１７に示すアミノ酸配列を有するＯｍｐＴ  ＡＷＡ）を有し、３’末端にＢａｍＨＩ部位を有するアセンブリＰＣＲとして融合物を生成した。ＯｍｐＴ  ＡＷＡシグナルペプチドは、最後３つのコドンをが野性型「ＴＣＴＴＴＴＧＣＣ」から、ＳＦＡの代わりにＡＷＡをコードする「ＧＣＴＴＧＧＧＣＣ」に変化している。この変化は、大腸菌のシグナルペプチダーゼによる正確な部位のプロセシングを改善する。
【０１４２】
更に、融合物の配列は、ペプチダーゼ切断部位の直後に始まる。ＮｃｏＩ切断部位が導入されており、これは、シグナルペプチドの最後のコドン及びエキセンディン−４配列の最初の２つのアミノ酸と重複している。この変化は、将来のサブクローニングを促進するとともに、自由Ｎ末端とエキセンディン−４との融合物の生成を導く。上に列記される変化を含む改変ｐＥＴ１２ａ発現ベクターをｐＤＯＭ３５と命名した。ベクター及びアセンブリＰＣＲをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで切断し、次いで、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いてインサートをベクターにライゲーションした。このライゲーション物２マイクロリットルをＭａｃｈＩ細胞の形質転換に用いた。回復増殖期間後、カルベニシリンを含有する寒天プレートに細胞をプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーの配列を決定し、正確な配列を含有するものをプラスミドの増殖及び単離に用いた（Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｅｐ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）。ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をプラスミドＤＮＡで形質転換し、得られたコロニーを発現培養の接種に用いた。ＴＢ  Ｏｎｅｘ培地（Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）自己誘導溶液を添加した）、１滴の消泡剤（ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ２０４；Ｓｉｇｍａ）及び１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンに４×０．５リットルの培養物を接種することによって発現させた。培養物を２５０ｒｐｍで攪拌しながら３０℃で三晩インキュベートし、次いで、培養上清を１時間３７００×ｇで遠心分離することによって清澄化した。次いで、発現したタンパク質を、プロテインＬ  ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号２８−４０５８−０３，プロテインＬがカップリングしている）を用いて清澄化された上清から精製し、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．０）を用いてプロテインＬから溶出し、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）０．１体積を用いて中和した。次のタンパク質を濃縮し、バッファＡ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム−酢酸、ｐＨ５．０）で透析し、ＡｋｔａＸｐｒｅｓｓ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）におけるイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質をバッファＡ（塩を含まないバッファ）中でＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓ  ６ｍｌカラムにロードし、次いで、７５分間０〜７５％のＢを含むバッファＢ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム−酢酸、ｐＨ５．０、１ＭのＮａＣｌ）勾配で少しずつ溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析で画分を分析し、正確な質量を有するものをプールした。最終タンパク質を２０ｍＭのクエン酸  ０．１ＭのＮａＣｌバッファで透析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析によって構造特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を再確認した。
【０１４３】
実施例７：メラニン保有細胞の機能バイオアッセイにおけるエキセンディン−４  ＡｌｂｕｄＡｂ（上記の通り作製されるＤＡＴ０１１５）及びＰＹＹ（３−３６）ＡｌｂｕｄＡｂ融合ペプチド（実施例５に記載の通り作製され、図３に示す構造を有する）の薬理学的プロファイル
エキセンディン−４  ＡｌｂｕｄＡｂ（ＤＡＴ０１１５）及びＰＹＹ（３−３６）ＡｌｂｕｄＡｂ（実施例５に記載の通り作製され、図３に示す構造を有する）の薬理学的プロファイルを、対象受容体でトランスフェクトされた細胞を用いるメラニン保有細胞の機能バイオアッセイにおいて求めた。前記バイオアッセイは、本質的にＪａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら．（２００５年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １２．９．１−１２．９．１６に記載の通り実施した。
【０１４４】
エキセンディン−４及びＰＹＹ（３−３６）ＡｌｂｕｄＡｂ融合ペプチドの薬理学的プロファイルを表４に示す。結果は、エキセンディン−４及びＰＹＹ（３−３６）の両方の融合ペプチドが、これらのコグネート受容体（Ｅｘｅｎｄｉｎ−４  ＡｌｂｕｄＡｂ／ＧＬＰ−１Ｒ及びＰＹＹ（３−３６）／ＮＰＹ２Ｒ）のヒト及びマウスの形態の両方を活性化する能力を保持していることを示す。ＮＰＹ受容体に対するＰＹＹ（３−３６）ＡｌｂｕｄＡｂの見掛けの選択性を以下の順序でランク付けする：ヒト受容体についてはＮＰＹ２Ｒ＞ＮＰＹ５Ｒ＊＞ＮＰＹ１Ｒ＞ＮＰＹ４Ｒ、マウス受容体についてはＮＰＹ２Ｒ＞ＮＰＹ５Ｒ＞ＮＰＹ４Ｒ＞ＮＰＹ１Ｒ。ＮＰＹ２Ｒのペプチド活性を同じ種内の他のＮＰＹ受容体と比較したとき（表５から計算）、選択性の値は、数百倍から１０００倍超変動する。
【表４】
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【０１４５】
実施例８：ＰＹＹ−ａｌｂｕｄａｂ（実施例５に記載の通り、図３に示す構造を有する）と組合せられたエキセンディン−ａｌｂｕｄａｂ（ＤＡＴ０１１５）は、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおける複数のパラメータに対する相乗効果を引き起こす：
オスの食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ）及び痩せ型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ）を全ての実験で用いた。ＤＩＯ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスを集団飼育し、離乳時から製造供給元による高脂肪食餌（カロリーの４５％が脂肪）を与えた。ＤＩＯマウス（体重４０〜５０ｇ）及び年齢の同じ対照を単体飼育し、１２時間明／暗サイクル（ＡＭ５：００〜ＰＭ５：００に点灯）で一定温度（約２２℃）にて維持した。マウスには、食餌（ＤＩＯにはＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｄ１２４５１、４５％脂肪；痩せ型にはＬａｂ  Ｄｉｅｔ  ５００１、１３．５％脂肪）及び水に自由に接近させた。全ての動物用プロトコールは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣのＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅの施設内動物実験委員会によって承認された。ペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂは、毎日新たに調製したか、又は１度に調製し小分けにして−７０℃で凍結させた。複合投与の場合、１回の注射のみですむように薬物を一緒に混合した。
【０１４６】
慢性肥満効力実験：実験の開始前６週間、ＤＩＯ  Ｃ５６ＢＬ／６マウス及び年齢の同じ痩せ型対照を飼育箱に慣れさせた。１５日間にわたって５ｍＬ／ｋｇの用量体積で２〜４ｐｍを２日毎に動物に皮下投与した。
【０１４７】
動物群に以下の通り投薬した：
（ａ）には、０．１ｍｇ／ｋｇのＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂを投与した（ＰＹＹ  ＥＤ２０群）
（ｂ）には、１．０ｍｇ／ｋｇのＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂを投与した（ＰＹＹ  ＥＤ８０群）
（ｃ）には、０．０１ｍｇ／ｋｇのエキセンディン−ａｌｂｕｄａｂ（ＤＡＴ０１１５）を投与した（エキセンディンＥＤ２０群）
（ｄ）には、０．１ｍｇ／ｋｇのエキセンディン−ａｌｂｕｄａｂ（ＤＡＴ０１１５）を投与した（エキセンディンＥＤ８０群）
（ｅ）ＥＤ２０  ｃｏｍｂｏには、０．０１ｍｇ／ｋｇのエキセンディン−４−ａｌｂｕｄａｂ（ＤＡＴ０１１５）と混合された０．１ｍｇ／ｋｇのＰＹＹ−ａｌｂｕｄａｂを単回投与した
（ｆ）ＥＤ８０  ｃｏｍｂｏには、０．１ｍｇ／ｋｇのエキセンディン−４−ａｌｂｕｄａｂ（ＤＡＴ０１１５）と混合された１．０ｍｇ／ｋｇのＰＹＹ−ａｌｂｕｄａｂを単回投与した
（ｇ）には、０．１ｍｇ／ｋｇの対照エキセンディン−４のみを投与した。
【０１４８】
薬物の開始前に、最初の日がビヒクルであり次の２日間は擬注射である３日間のビヒクル導入期間を用いた。ＱＭＲ機器（Ｅｃｈｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ．）を用いて、薬物の開始日の３〜４日前及び１５日目にベースラインの脂肪質量及び除脂肪質量測定を行った。体重測定は、最初の薬物投与の４日前に開始し、月曜日、水曜日、及び金曜日毎に行い、最初の測定値を用いて動物を無作為化した。最初の薬物投与の４〜６日前から始めて平日に毎日、食餌供給器の重量を測定して、食餌摂取量を計算した。過剰の食餌をこぼした動物は、実験の開始前に取り除いた。実験中、過剰の食餌をケージから取り除き、正確さを高めるために食餌供給器の重量に付加した。８〜１０匹の動物（ｎ＝８〜１０）を痩せ型対照群として用い、８匹の動物（ｎ＝８）を全ての他の処理群として用いた。薬物処理開始の１６日後、末端心臓採血を介して全血、血漿、及び血清サンプルを回収する前少なくとも４時間絶食させた。全血を用いてＨｂＡ１ｃ（％）を求め、血漿は胃腸ホルモンパネルに用い、血清は複数の臨床化学パラメータを求めるために用いた。最後に、主な器官及び組織（心臓、腎臓、肝臓、肺、胃、十二指腸、結腸、膵臓、褐色脂肪、白色脂肪、屠肉）を１６日目に摘出し、巨視的及び微視的な組織学的検査のために１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。
【０１４９】
Ａ）ＰＹＹ−ａｌｂｕｄａｂと組合せられたエキセンディン−４−ａｌｂｕｄａｂ（ＤＡＴ０１１５）の体重に対する効果
上記全ての処理群が、明らか且つ持続的な体重減少を示した。図４を参照されたい。効果は、一般的に、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０を除く全ての群で７日後にはプラトーに達した。Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０は、処理後１５日目までにプラトーに達しなかった。１５日目において、ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ用量（ビヒクルに対して２％減少）に加えてエキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．０１ｍｇ／ｋｇ用量（ビヒクルに対して４．５％減少）を添加すると、ビヒクル対照に対して体重が６．５％減少すると予測されていた。しかし、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０群でＡｌｂｕｄＡｂを組合せた場合、１１．２％の体重減少が観察され、これは、予測相加作用よりも大きい（ｐ＜０．０５）。
【０１５０】
ＥＤ８０群では、僅か処理の最初の７日後に体重に対する相加効果よりも大きい効果が観察された。これら処理の効果が７日目に相加的であった場合、ビヒクルに対して体重が２０．１％減少すると予測されていた（ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  １．０ｍｇ／ｋｇの７．１％及びエキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇの１３．０％）。７日目のＣｏｍｂｏ  ＥＤ８０群では２１．６％の減少が観察され、これは、予測相加性データと比べて統計的に有意ではない。しかし、１５日目の時点では、ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  １．０ｍｇ／ｋｇ群はビヒクルに対して約７．８％の減少を示し、エキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ群は、ビヒクルに対して１６．８％の減少を示しており；これら２つの用量群を足し合わせると、体重が２４．６％減少するはずであった。実際には、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群では３２．８％の減少が観察され、これは、予測相加性データよりも統計的に有意に大きい（ｐ＜０．０５）。
【０１５１】
Ｂ）ＰＹＹ−ａｌｂｕｄａｂと組合せられたエキセンディン−４−ａｌｂｕｄａｂ（ＤＡＴ０１１５）の食餌摂取量に対する効果
ビヒクル対照に対する幾つかのレベルの食餌摂取阻害が、全ての処理群で観察された。図５を参照されたい。Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０を除く全ての処理群で、時間とともにビヒクル対照レベルに戻った。１日及び２日目では、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０は、ベースライン（ビヒクルに正規化）に対して毎日平均２５．１％の食餌摂取阻害を示したが、２群を足し合わせると、食餌摂取が５．７％減少するであろうという控えめな結果が予測されていた。全ての他の時点では、相加効果が観察された。
【０１５２】
ＥＤ８０用量群（ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  １．０ｍｇ／ｋｇ及びエキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ）では、体重に対する相加効果が早い時点で観察された。しかし、１０日目の時点から始まって、４２％の食餌摂取阻害が観察されたが、組合せの効果が単に相加的であった場合に予測されていた食餌摂取阻害は１７％であった（ｐ＜０．０５）。この効果は、実験の残りの期間継続し、ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  １．０ｍｇ／ｋｇ群（２．５％の食餌摂取阻害）及びエキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ群（０．８％の食餌摂取阻害）の付加から、２群の組合せ（Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０）では食餌摂取が３．３％阻害されると予測されていた１４日目に最もよく例証され得る。最終的に、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０では１９．２％の食餌摂取阻害が観察され、これは、組合せが相加効果を有する場合に予測される値と比べて統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）である。組合せ群における食餌摂取阻害は、食欲減退活性が、ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ及びエキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂの組合せについての体重減少機序の少なくとも一因となることを示す。
【０１５３】
Ｃ．ＰＹＹ−ａｌｂｕｄａｂと組合せられたエキセンディン−４−ａｌｂｕｄａｂ（ＤＡＴ０１１５）の体組成の変化に対する効果
エキセンディン−４  ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ群、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０群、及びＣｏｍｂｏ  ＥＤ８０群で体脂肪率の絶対変化が観察された（全ての群について、ビヒクルに対してｐ＜０．０１）。図６及び７を参照されたい。また、両方のＣｏｍｂｏ処理群は、１５日間の処理期間にわたって体脂肪率の減少を示し、組合せの相加効果よりも大きいことと整合している。具体的には、ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ群の体脂肪率は、１．８％低下し、エキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．０１ｍｇ／ｋｇ群は、体脂肪率の０．６％の減少を示し、いずれも有意な変化を示さない（両方の値をビヒクル対照における変化に対して正規化した）。対照的に、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０処理群では、体脂肪率が４．８％減少し、これは、予測される相加値である２．４％よりも有意に大きい（ｐ＜０．０５）。より高い用量では、予測される相加的減少は８．６％であった（ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  １．０ｍｇ／ｋｇ及びＥｘｅｎｄｉｎ−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ；それぞれ、１．８％及び６．８％の減少）。しかし、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群で観察された変化は、２０．０％の減少であり、これは、相加性によって予測された変化よりも有意に大きい（ｐ＜０．０５）。
【０１５４】
Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群は、３９．５％から１８．９％に体脂肪率が低下した。痩せ型対照とＣｏｍｂｏ  ＥＤ８０群との間に、体脂肪率の有意な差はもはや存在していなかった（ｐ＝０．４３）。したがって、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群は、肥満しやすい環境（すなわち、高脂肪食餌へのアクセス）で維持されているにもかかわらず、痩せ型対照に「正常化」された。これは、過剰の体脂肪が１００％失なわれることに相当する。
【０１５５】
単独療法群及び組合せ処理群の両方について体脂肪量の用量依存的変化が観察された。処理期間中、ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ群では、体脂肪量が０．８ｍｇ減少した（ビヒクル対照に対してｐ＝０．２９）が、エキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ群では、体脂肪量が１．４ｍｇ減少した（ビヒクル対照に対してｐ＜０．０５）。これら処理が体脂肪量に対して相加効果を有していた場合、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０群では体脂肪量が２．２ｍｇ減少すると予測していた。しかし、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０群では体脂肪量が３．８ｍｇ減少し、これは、予測相加値よりも有意に大きい（ｐ＜０．０５）。
【０１５６】
類似の分析をＥＤ８０群についても実施した。ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  １．０ｍｇ／ｋｇ群では体脂肪量が２．２グラム減少した（ビヒクル対照に対してｐ＜０．０１）が、エキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ群では体脂肪量が平均５．７グラム減少した（ビヒクル対照に対してｐ＜０．０１）。これら２つの群を足し合わせると、組合せて７．９ｇ体脂肪量が減少すると予測されていた。しかし、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群では１１．３ｇの体脂肪量減少が観察された（ビヒクル対照に対してｐ＜０．０１）。相加性に基づく予測データと観察されたデータとの間の差は、統計的に有意である（ｐ＜０．０５）。
【０１５７】
処理群の中でも若干の除脂肪質量の減少が観察されたが、効果の規模は、体脂肪量に対する効果よりも除脂肪質量に対する効果の方が遥かに小さかった。全体としては、全体重減少のうちの約８０％が体脂肪であり、これは、食事療法及び運動を用いる臨床試験で観察される体脂肪量減少対除脂肪質量減少の比に一致している。
【０１５８】
Ｄ．ＰＹＹ−ａｌｂｕｄａｂと組合せられたエキセンディン−４−ａｌｂｕｄａｂ（ＤＡＴ０１１５）の内分泌検体における変化に対する効果（図８を参照されたい）
Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群では、インスリンレベルがビヒクル対照群の僅か１／１０であった（それぞれ、血漿中２６１７ｐｇ／ｍＬ及び２５９ｐｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０５）。このインスリンの減少は、理に適っている。その理由は、動物が試験の開始及び終了時に正常血糖であったためである。すなわち、インスリンの減少は、恐らく低血糖に対する保護である。
【０１５９】
Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群におけるレプチンレベルは、ビヒクル対照群よりも９０％超低かった（ビヒクルでは血漿中５１．６ｎｇ／ｍＬ；Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群では血漿中４．７ｎｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０１）。これは、痩せ型対照レベル（血漿中９．８ｎｇ／ｍｌ）に匹敵しており、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群における体脂肪量の劇的な減少に起因する可能性がある。更に、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０群及びエキセンディン−４−ａｌｂｕｄａｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ群は、ビヒクル対照よりも有意に低い血漿レプチン値を有していた（それぞれ、３４．８ｎｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０１及び３１．４ｎｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０１）。これら効果は、体脂肪量の減少に関連していると考えられる。
【０１６０】
胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）濃度は、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０群で有意に減少し（ビヒクル対照に対してｐ＜０．０５）、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群において強い傾向を示した（ビヒクル対照に対してｐ＝０．０８）。
【０１６１】
Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群におけるアミリンレベル（血漿中６８ｐｇ／ｍＬ）は、ビヒクル対照（血漿中２５０ｐｇ／ｍＬ；ｐ＜０．０１）よりも有意に低かった。更に、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群のアミリンレベルは、痩せ型対照レベル（血漿中８７ｐｇ／ｍＬ）と殆ど同じであった。Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０群は、減少に対して強い傾向を示し（血漿中１７１ｐｇ／ｍＬ；ビヒクル対照に対してｐ＝０．０５４）、エキセンディン−４−ａｌｂｕｄａｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ群は、ビヒクル対照よりも有意に低かった（血漿中１６３ｐｇ／ｍＬ；ｐ＜０．０１）。
【０１６２】
グレリンレベルは、エキセンディン−４−ａｌｂｕｄａｂ単独療法群において組合せ群に殆ど等しいレベルまで上昇していた。これは、エキセンディン−４活性のみが、グレリン曝露の増加に関与している可能性が最も高いことを示す。
【０１６３】
ＰＹＹレベルは、ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂを投与した動物で高く、これは恐らく血漿中に投与されたペプチドを直接検出しているためであると思われる。しかし、これら値は、循環中のＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂの絶対濃度の指標ではない。
【０１６４】
Ｅ．ＰＹＹ−ａｌｂｕｄａｂと組合せられたエキセンディン−４−ａｌｂｕｄａｂ（ＤＡＴ０１１５）の血清化学パラメータの変化に対する効果
全体的に、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０を含む大部分の処理群及びＥＤ８０群で試験した全ての群で、血清化学物質の優れたプロファイルが観察された。痩せ型対照群は、痩せ型動物とＤＩＯ群との間に相対差を表す。値は、全ての他の群についての変化を表す、その理由は、これら群が試験の開始前に単一集団から無作為化されたためである。Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０群は、グルコース及び総コレステロールに対して幾つかの有意な改善を示し、一方トリグリセリド及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルにおいて改善傾向を示した（表５）。
【０１６５】
ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  １．０ｍｇ／ｋｇ群及びエキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ群について、グルコース、総コレステロール、総ビリルビン、クレアチニン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、及び総タンパク質の領域において有意な改善が観察された。しかし、これら効果は、一般的に、組合せ（Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群）で観察された効果よりも低かった。Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群は、血清化学物質において多くの有意な変化を示した。（血中尿素窒素（ＢＵＮ）を除く）これら変化の全ては、動物を病理学的肥満状態から正常痩せ型状態にする改善を表す。例えば、肝臓の酵素であるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）は、ビヒクル対照ＤＩＯマウスで高いが、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群の処理では、７９％減少して痩せ型対照のレベルになった。他の有意な改善としては、ＨｂＡ１ｃ、総コレステロール、トリグリセリド、総ビリルビン、クレアチニン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、及び総タンパク質が挙げられる。これら変化の全ては、ＤＩＯの血清化学物質を痩せ型対照の化学物質により近づけるものであり、有益であると考えられた。
【表５】
2013506628.tif 000009
【０１６６】
Ｆ．ＰＹＹ−ａｌｂｕｄａｂと組合せられたエキセンディン−４−ａｌｂｕｄａｂ（ＤＡＴ０１１５）の組織病理における変化に対する効果
オスミウム染色によって確認される肝臓における細胞質内脂肪滴は、ＤＩＯビヒクル対照マウスにおける重篤度が著しく、大部分の肝細胞に影響を及ぼしている。Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０を投与したＤＩＯマウスでは、細胞質内脂肪滴が著しく減少した（最小限から検出不可能）（図９を参照されたい）。Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０、ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ（１．０ｍｇ／ｋｇ）、エキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ（０．１ｍｇ／ｋｇ）、及びエキセンディン−４（０．１ｍｇ／ｋｇ）を投与したＤＩＯマウスではＣｏｍｂｏ  ＥＤ８０肝臓でみられるよりも応答程度の低い同様の変化が注目された。しかし、処理されたＤＩＯマウスの肝臓［Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０、ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ（１．０ｍｇ／ｋｇ）、エキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ（０．１ｍｇ／ｋｇ）、及びエキセンディン−４（０．１ｍｇ／ｋｇ）］、褐色脂肪組織［Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０、ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ（１．０ｍｇ／ｋｇ）、エキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ（０．０１及び０．１ｍｇ／ｋｇ）、及びエキセンディン−４（０．１ｍｇ／ｋｇ）］、及び腎臓（Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０のみ）では、細胞質内脂肪滴の減少からなる試験物品に関連する微視的変化が観察された。これら群におけるこれら組織変化は、血清トランスアミナーゼ、総コレステロール、ＨＤＬ、及びグルコースの減少と相関していた。Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０及びＥＤ８０では、トリグリセリドも減少していた。これら変化は、意図される薬理作用に関連しており、有益であると考えられた。
【０１６７】
実施例９：ｄｂ／ｄｂマウスにおける糖尿病パラメータに対するエキセンディン−ＡｌｂｕｄＡｂ（ＤＡＴ０１１５）とＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ（実施例５に記載の通り、図３に示す構造を有する）との組合せの効果
オスのｄｂ／ｄｂ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を全ての実験に用いた。ｄｂ／ｄｂマウス（Ｂ６．Ｃｇ−ｍ  ＋／＋  Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊ）及び対照は、供給元によって集団飼育されていた。ｄｂ／ｄｂマウス（１０〜１２週齢）及び年齢の同じ対照をＧＳＫに輸送し、そこで単体飼育し、１２時間明／暗サイクル（ＡＭ５：００〜ＰＭ５：００点灯）で一定温度（約２２℃）にて維持した。マウスには、食餌（ｄｂ／ｄｂ及びその対照についてＬａｂＤｉｅｔ  ５Ｋ６７、１６％脂肪）及び水に自由に接近させた。全ての動物用プロトコールは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣのＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅの施設内動物実験委員会によって承認された。ペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂは、毎日新たに調製した。１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのクエン酸、ｐＨ６．２（濾過滅菌）で構成されるクエン酸ビヒクルバッファを用いて原液を希釈することによって、正確な投与濃度の薬物を得た。複合投与の場合、１回の注射のみですむように薬物を一緒に混合した。
【０１６８】
慢性糖尿病有効性研究：実験の開始前２週間、ｄｂ／ｄｂマウス及び年齢の同じ痩せ型対照を飼育箱に慣れさせた。１５日間にわたって５ｍＬ／ｋｇの用量体積で２〜４ｐｍを２日毎に動物に皮下投与した。薬物の開始前に、最初の日がビヒクルであり次の２日間は擬注射である３日間のビヒクル導入期間を用いた。ＱＭＲ機器（Ｅｃｈｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ．）を用いて薬物の開始の３日前及び１５日目にベースラインの体脂肪量及び除脂肪質量測定を行った。体重測定は、最初の薬物投与の４日前に始めて月曜日、水曜日、及び金曜日毎に行った。薬物投与開始の２日前に、満腹時のグルコース値及びＨｂＡ１ｃ％値を測定するために尾を切り取ることによって血液サンプルを採取した。このデータを用いて動物を様々な群に無作為化した。最初の薬物投与の４〜６日前から始めて平日に毎日、食餌供給器の重量を測定して、食餌摂取量を計算した。過剰の食餌をこぼした動物は、実験の開始前に取り除いた。実験中、過剰の食餌をケージから取り除き、正確さを高めるために食餌供給器の重量に付加した。８匹の動物（ｎ＝８）を痩せ型対照群として用い、８匹の動物（ｎ＝８）を全ての他の処理群として用いた。組合せＥＤ８０群についての１日食餌摂取量が計算され、その量が次の日に与えられる同時飼育群が含まれていた。薬物処理開始の１６日後、末端心臓採血を介して全血、血漿、及び血清サンプルを回収する前少なくとも４時間動物を絶食させた。全血を用いてＨｂＡ１ｃ（％）を求め、血漿は胃腸ホルモンパネルに用い、血清は複数の化学物質にアクセスするために用いた。最後に、主な器官及び組織（心臓、腎臓、肝臓、肺、胃、十二指腸、結腸、膵臓、褐色脂肪、白色脂肪、屠肉）を１６日目に摘出し、巨視的及び微視的な組織学的検査のために１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。
【０１６９】
Ａ．ＰＹＹ−ａｌｂｕｄａｂと組合せられたエキセンディン−４−ａｌｂｕｄａｂ（ＤＡＴ０１１５）のヘモグロビンＡ１ｃの割合の変化に対する効果
ビヒクル対照動物は、ベースライン時の平均７．１４％から１６日目の平均９．０３％まで、１８日間にＨｂＡ１ｃ％が増加した。これは、その期間中糖尿病表現型が実質的に進行したことを示す。図１０及び１１を参照されたい。Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０、ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  １．０ｍｇ／ｋｇ及びエキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ群を含む複数回投与群において糖尿病表現型の進行の阻害が観察された（ビヒクル増加に対してｐ＜０．０５）。ＨｂＡ１ｃ％の絶対減少は、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群でのみ観察された（ベースラインに対してｐ＜０．０１）。Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群は、グリコシル化ＨｂＡ１ｃが６．８３％から５．１６％に低下した。痩せ型非糖尿病対照とＣｏｍｂｏ  ＥＤ８０群との間に、グリコシル化ＨｂＡ１ｃの有意な差はもはや存在していなかった（ｐ＜０．０１）。したがって、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０処理群における糖尿病患者（ｄｂ／ｄｂ）マウスは、完全に正常なレベルのグリコシル化ＨｂＡ１ｃ％を有しており、ほとんど正常な痩せ型対照動物に「正常化」されていた。
【０１７０】
同時飼育対照（Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０動物が消費したのと同じ量の食餌を給餌）は、ビヒクル対照動物から有意な変化は示さなかった（ｐ＝０．１１）。これは、食餌摂取の阻害が、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群のＨｂＡ１ｃ低下の主な機序ではなかったことを示す。
【０１７１】
ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  １．０ｍｇ／ｋｇ群（１．１６％の減少、ｐ＜０．０５）、エキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ群（０．８０％の減少、ｐ＜０．０５）、並びにＣｏｍｂｏ  ＥＤ２０群（０．８９％の減少、ｐ＜０．０５）及びＣｏｍｂｏ  ＥＤ８０群（３．５７％の減少、ｐ＜０．０１）を含む複数の群においてグリコシル化ＨｂＡ１ｃの有意な変化が観察された。
【０１７２】
Ｃｏｍｂｏ群を同様の方法で分析した。ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ群及びエキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．０１ｍｇ／ｋｇ群は、ビヒクル対照群から有意な変化を示さなかったが、組合せでは（Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０群）、グリコシル化ＨｂＡ１ｃが０．８９％減少した。Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０用量群では、予測された相加的減少は、ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  １．０ｍｇ／ｋｇ群及びエキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ群について１．９６％であった。しかし、組合せ（Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群）では、グリコシル化ＨｂＡ１ｃの３．５７％の減少が観察された。この減少は、単独療法群の相加性によって予測されるものよりも有意に大きかった（ｐ＜０．０５）。
【０１７３】
Ｂ．ＰＹＹ−ａｌｂｕｄａｂと組合せられたエキセンディン−４−ａｌｂｕｄａｂ（ＤＡＴ０１１５）の血漿インスリンの変化に対する効果
低用量単独療法処理群は、ビヒクル対照と比較して血漿インスリンレベルが増加する傾向を示した（ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ、ｐ＝０．０５２；エキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．０１ｍｇ／ｋｇ、ｐ＝０．１７）。Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０群では、血漿インスリンレベルは、２１３０７ｐｇ／ｍＬに達し、これは、血漿中９４７０ｐｇ／ｍＬであるビヒクル対照群よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  １．０ｍｇ／ｋｇ群（３０４６７ｐｇ／ｍＬ；ビヒクル対照に対してｐ＜０．０５）及びエキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ群（３２０３６ｐｇ／ｍＬ；ビヒクル対照に対してｐ＜０．０１）もインスリンレベルが高かった。（図１２を参照されたい）
Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群では、インスリンレベルは、ビヒクル対照レベルよりも５倍超高かった（それぞれ、血漿中５５９５０ｐｇ／ｍＬ及び９４７０ｐｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０５）。これら特に高いインスリンレベルは、これら動物において観察されるグルコース低下効果の少なくとも一部に関与していると考えられる。
【０１７４】
ＥＤ８０同時飼育対照群は、４４３８ｐｇ／ｍＬの血漿インスリン濃度を有しており、これは、ビヒクル対照レベルよりも有意に低く（ｐ＜０．０１）、体重減少による可能性が最も高い。
【０１７５】
Ｃ．ＰＹＹ−ａｌｂｕｄａｂと組合せられたエキセンディン−４−ａｌｂｕｄａｂ（ＤＡＴ０１１５）の体重増加阻害に対する効果
糖尿病試験では体重もモニタされた。ｄｂ／ｄｂマウスの急速な体重増加に起因して、このモデルを用いて体重減少に加えて体重増加の阻害を評価することもできる。この実験は、ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  １．０ｍｇ／ｋｇ、エキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０及びＣｏｍｂｏ  ＥＤ８０処理が体重増加の阻害において有効であったことを示す。図１３を参照されたい。
【０１７６】
１５日目までに、ビヒクル対照に対して１．５％の減少傾向を示した（ｐ＝０．１８）ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇと、単独では有意な効果を有しなかったエキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．０１ｍｇ／ｋｇとの間で明らかな協働が生じた。組合せでは、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０群は、ビヒクル対照よりも有意に体重増加が少なかった（ビヒクルでは９．５％の体重増加、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０では４．４％の体重増加；ｐ＜０．０１）。
【０１７７】
Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群を同様の方法で分析した。１５日目において、ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  １．０ｍｇ／ｋｇ群はビヒクルから５．９％の減少を示し、エキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ群は、ビヒクルから９．２％の減少を示した；これら２つの用量群を足し合わせると、１５．１％体重が減少するはずであった。実際には、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群では２６．２％の減少が観察され、これは、予測された相加性データに対して統計的に有意に大きい（ｐ＜０．０５）。
【０１７８】
最初の８日間で、同時飼育対照（Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群との同時飼育）は、１２．８％の体重減少を示し、これは、同じ期間にわたるＣｏｍｂｏ  ＥＤ８０群（１２．３％の体重減少）に匹敵していた。しかし、８日後、同時飼育対照はビヒクル対照とほぼ同じ速度で体重が増加したが、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群は、体重減少を維持した。これは、同時飼育群で８．４％、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群で１６．７％の正味の体重減少を生じさせた（両方の群について、ベースラインに対してｐ＜０．０１）。このリバウンド効果及び１５日目で生じた体重の差は、８日後に同時飼育群とＣｏｍｂｏ  ＥＤ８０群との間に代謝の差が生じ、これは組合せ物に起因するものであり、単に体重に対する効果ではないことを示唆する。
【０１７９】
Ｄ．ＰＹＹ−ａｌｂｕｄａｂと組合せられたエキセンディン−４−ａｌｂｕｄａｂ（ＤＡＴ０１１５）の食餌摂取阻害に対する効果
ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ及びエキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．０１ｍｇ／ｋｇ群を除く全ての群で、１５日間にわたって有意な食餌摂取量の減少が観察された。図１４を参照されたい。一般的に、食餌摂取の阻害は、最初の５日間大きかったが、その後、若干の１日食餌摂取量の安定化がみられた。１５日目（平均１３〜１５日目）、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ２０、ＰＹＹ−ＡｌｂｕｄＡｂ  １．０ｍｇ／ｋｇ、及びエキセンディン−４−ＡｌｂｕｄＡｂ  ０．１ｍｇ／ｋｇ群は全て、平均して１日当たりの食餌摂取量が６．９〜７．０ｇであった。これは、ビヒクル対照群によって消費された食餌９．０ｇよりも有意に少なかった（ｐ＜０．０５）。
【０１８０】
食餌摂取量の劇的な減少は、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群で最初に観察された。５日目まで、この群の動物は平均して１日当たり２ｇ未満の食餌しか摂取せず、これは、ビヒクル対照動物の９ｇよりも遥かに少なかった（ｐ＜０．０１）。１０日目まで食餌摂取量の僅かなリバウンドが観察され、このとき食餌摂取レベルは安定化していた。１５日目まで、Ｃｏｍｂｏ  ＥＤ８０群は、１日当たり４．８ｇの食餌を消費し、これは、ビヒクル対照群の食餌摂取量の約半分である。
【０１８１】
食餌摂取量は、食餌摂取の有意な減少が観察された群のいずれにおいてもビヒクル対照レベルには戻らなかった。処理群の食餌摂取量は安定しており、実験の１０〜１５日目にはビヒクル対照群とほぼ平行していた。これは、これら動物が、負のエネルギーバランス（代謝的補償はないと推定される）を保っている可能性があり、ビヒクル対照に比べて体重が減少し続ける可能性があることを示唆する。
【０１８２】
実施例１０：ＰＹＹ３−３６  ＡｌｂｕｄＡｂ（ＤＭＳ７６２０）は、用量依存的に食餌摂取を抑制し、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおける体重減少を引き起こす：
オスの食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ）を全ての実験で使用した。ＤＩＯマウスを単体飼育し、１２時間明／暗サイクル（ＡＭ５：００〜ＰＭ５：００点灯）で一定温度及び湿度（それぞれ、約２２℃及び５０％）にて維持した。マウスには、自由に食餌（ＤＩＯには、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｄ１２４５１、４５％脂肪）及び水に自由に接近させた。全ての動物用プロトコールは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣのＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅの施設内動物実験委員会によって承認された。ペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂｓは、１度に調製し、小分けにして−８０℃で凍結させた。複合投与の場合、１回の注射のみですむように薬物を一緒に混合した。
【０１８３】
慢性肥満有効性研究：実験の開始前７週間、ＤＩＯ  Ｃ５６ＢＬ／６マウスを飼育箱に慣れさせた。６日間にわたって５ｍＬ／ｋｇの用量体積で１〜３ｐｍを２日毎（ｅ．ｏ．ｄ．）に動物に皮下投与した。
【０１８４】
動物群に以下の通り投薬した：
（ａ）には、３ｍｇ／ｋｇのＤＭＳ７６２０を投与した（ＤＭＳ７６２０  ３ｍｇ／ｋｇ群）
（ｂ）には、１ｍｇ／ｋｇのＤＭＳ７６２０を投与した（ＤＭＳ７６２０  １ｍｇ／ｋｇ群）
（ｃ）には、０．３ｍｇ／ｋｇのＤＭＳ７６２０を投与した（ＤＭＳ７６２０  ０．３ｍｇ／ｋｇ群）
（ｄ）には、０．１ｍｇ／ｋｇのＤＭＳ７６２０を投与した（ＤＭＳ７６２０  ０．１ｍｇ／ｋｇ群）
（ｅ）には、ビヒクル（クエン酸バッファ：２０ｍＭのクエン酸塩及び１００ｍＭのＮａＣｌ）を投与した。
【０１８５】
また、動物には０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ及び０．００３ｍｇ／ｋｇでも投与したことに留意すべきである。しかし、これら用量は、この実験における有効性について閾値を下回っていた。
【０１８６】
薬物の開始前に１日間のビヒクル導入期間を用いた。最初の薬物投与の４日前から始めて頻繁に体重測定を行い、最初の測定値を用いて動物を無作為化した。最初の薬物投与の４日前から始めて頻繁に食餌供給器の重量を測定して、食餌摂取量を計算した。過剰の食餌をこぼした動物は、実験の開始前に取り除いた。実験中、過剰の食餌をケージから取り除き、正確さを高めるために食餌供給器の重量に付加した。全ての群について１群当たり５匹の動物（ｎ＝５）を用いた。
【０１８７】
実施例１０の結果を以下の表６に示す。
【０１８８】
Ａ）体重に対するＰＹＹ３−３６  ＡｌｂｕｄＡｂ（ＤＭＳ７６２０）の効果
ＰＹＹ３−３６  ＡｌｂｕｄＡｂ（ＤＭＳ７６２０）の複数回投与は、体重の有意な減少を示した。６日目の体重の変化率は、ビヒクル対照で０．０％、ＤＭＳ７６２０（３ｍｇ／ｋｇ）で−１０．４％、ＤＭＳ７６２０（１ｍｇ／ｋｇ）で−４．６％、ＤＭＳ７６２０（０．３ｍｇ／ｋｇ）で−１．７％、及びＤＭＳ７６２０（０．１ｍｇ／ｋｇ）で−２．２％であった。３．０ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇの用量のＤＭＳ７６２０は、ビヒクル対照と有意に異なっていた。
【０１８９】
Ｂ）食物摂取に対するＰＹＹ３−３６  ＡｌｂｕｄＡｂ（ＤＭＳ７６２０）の効果
３．０ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、及び０．３ｍｇ／ｋｇの用量のＤＭＳ７６２０では、ビヒクル対照に対して食物摂取の有意な阻害が観察された。実験過程の間の平均１日食餌摂取量は、ビヒクル対照で３．０９グラム、ＤＭＳ７６２０（３ｍｇ／ｋｇ）で１．５２グラム、ＤＭＳ７６２０（１ｍｇ／ｋｇ）で２．３４グラム、ＤＭＳ７６２０（０．３ｍｇ／ｋｇ）で２．６４グラム、及びＤＭＳ７６２０（０．１ｍｇ／ｋｇ）で２．７６グラムであった。これは、ＤＭＳ７６２０（３ｍｇ／ｋｇ）で食餌摂取の５１．２％の減少、ＤＭＳ７６２０（１ｍｇ／ｋｇ）で２０．８％の減少、ＤＭＳ７６２０（０．３ｍｇ／ｋｇ）で１１．８％の減少、及びＤＭＳ７６２０（０．１ｍｇ／ｋｇ）で１６．６％の減少に相当する。
【表６】
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【０１９０】
実施例１１：エキセンディン−４及びペプチドＹＹの両方を用いた単一のＡｌｂｕｄＡｂ融合物の作製
突然変異オリゴの伸長及びテンプレートＤＮＡのＤＰＩＮ切断（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ）を用いて、Ｎ末端に分泌シグナル、Ｃ末端にシステインが導入されている哺乳類の発現ベクターｐＴＴ５にＤＡＴ０１１６をクローニングした。ＤＮＡの配列を決定し、一時的にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。
【０１９１】
哺乳類細胞の上清を清澄化し、プロテインＬ親和性クロマトグラフィーを用いて精製し、タンパク質質量を質量分析によって確認した。タンパク質を４℃保存から取り出し、ＤＡＴ０１１６Ｒ１０８Ｃを２×２０ｍＬの濃縮器で１２．５ｍＬに濃縮した。最終濃度が５ｍＭになるようにＤＴＴを添加し、１５分間サンプルをインキュベートした。次いで、２０ｍＭのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５７）、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロールでタンパク質を脱塩した。脱塩された画分をプールし、ｎ−エチルマレイミドを収容している５０ｍＬのファルコンチューブにＲ１０８Ｃ誘導体の１／１０の体積（約２ｍｇ）を添加した。残りのプールされているタンパク質を、５０ｍＬのファルコン内の様々な質量のＰＹＹペプチド（バッチ「１９０」）に添加した。サンプルを室温で３０分間回転させながらインキュベートし、ベンチトップで１０分間スピンし、４，５００ｒｐｍで遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、次いで４℃で一晩保存した。
【０１９２】
沈殿物が両方で観察され、Ｒ１０８Ｃ誘導体とサンプルとのカップリング反応物はタンパク質の添加直後に不透明になり、５分間以内に大きなフレークが形成された。他の反応では沈殿物は観察されなかった。
【０１９３】
一晩保存した後、溶液は僅かに曇っているように見えたが、静置すると、曇りとペレットとはそれほど容易に識別できなかった。
【０１９４】
５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）でサンプルを１／５に希釈し、２．５ｍＬ／分で２×６ｍＬのＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓカラム（予め０．５Ｍ  ＮａＯＨで清浄化され、希釈バッファで平衡化されている）に適用した。サンプル適用後、カラムを希釈バッファで洗浄し、次いで、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、１ＭのＮａＣｌの０〜１００％勾配に供した。次いで、カラムを２×ＰＢＳで洗浄し、最後に０．５ＭのＮａＯＨで清浄化した。
【０１９５】
酢酸ナトリウム画分及び２×ＰＢＳ画分を複数の２０ｍＬの遠心分離濃縮器で別々に濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、濾過滅菌し、２×２Ｌのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６）、１００ｍＭのＮａＣｌで透析した。タンパク質をＭＳ分析にかけた。
【０１９６】
ＤＡＴ０１１６Ｒ１０８Ｃ：１９０ＰＹＹにペプチドが僅かに混入していたため、これらタンパク質及び対応する酢酸ナトリウム画分プールをプロテインＬカラムに再適用した。
【０１９７】
１ｍＬのプロテインＬカラムを１×ＰＢＳで平衡化し、６ＭのグアニジンＨＣｌで清浄化した。カラムを２ｍＬ／分で１×ＰＢＳによって再平衡化し、ＤＡＴ０１１５Ｒ１０８Ｃ：１９０  ＰＹＹ酢酸ナトリウム溶出プールを適用した。適用後、カラムを１００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６）で洗浄し、最後に１００ｍＭのクエン酸（ｐＨ２．６）で溶出した。１００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６）でカラムを再平衡化し、２ＸＰＢＳ溶出プールを適用し、同様に精製した。６ＭのグアニジンＨＣｌでカラムを清浄化し、ＤＡＴ０１１６Ｒ１０８Ｃ：１９０  ＰＹＹ誘導体についてこのプロセスを繰り返した。
【０１９８】
タンパク質を１〜１．５ｍＬに濃縮し、室温で一晩、１．６Ｌの５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６）、１００ｍＭのＮａＣｌで透析した。次の朝、タンパク質を透析カセットから取り出し、ＯＤを測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に２００μＬを２０μＬに濃縮した。
【０１９９】
エキセンディン−４  ＡｌｂｕｄＡｂペプチドＹＹコンストラクトのサンプルをＹ２受容体アッセイに供して、ペプチドＹＹの機能を決定し、ＧＬＰ−１受容体アッセイに供して、エキセンディン−４の機能を決定した。表１０は、ｎ−エチルマレイミドでブロッキングされたエキセンディン−４  ＡｌｂｕｄＡｂ（ＤＡＴ０１１６  ｎＥＭ）及びペプチドＹＹで修飾されたエキセンディン−４  ＡｌｂｕｄＡｂ（ＤＡＴ０１１６  Ｒ１０８Ｃ  １９０ＰＹＹ）の活性を示す。ペプチドＹＹで修飾されたエキセンディン−４  ＡｌｂｕｄＡｂ融合物は、Ｙ２受容体ではペプチド対照よりも低い活性を示し、ＧＬＰ−１受容体では同様の効力を示す。ＰＹＹペプチドは、対照として含まれる。結果を表７に示す。
【表７】
2013506628.tif 000011
【０２００】
実施例１２：ＤＯＭ７ｈ−１４−１０  ＡｌｂｕｄＡｂとＰＹＹとの遺伝的融合物の発現：
Ｃ−末端に追加のグリシンが導入されているＰＹＹ３−３６を、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（以下に示すアミノ酸配列を有する血清アルブミンに結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）（ａｌｂｕｄａｂ））との融合物として、ｐＥＴ３０ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍｅｒｃｋ）から入手可能）にクローニングした。ＰＹＹは、コンストラクトの３’末端に存在しており、ｄＡｂは５’末端に存在していた。また、ＴＶＡＡＰＳリンカーを、ｄＡｂとＰＹＹ配列との間に導入した。前記リンカーは、ｄＡｂをＰＹＹから空間的に分離して、ＰＹＹとＮＰ受容体との間の結合の立体障害を防ぐためのスペーサとして含まれていた。このコンストラクトのアミノ酸配列を以下及び図１（ｖ）の配列番号４９に示す：
ＭＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＷＩＧＳＱＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＭＷＲＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＧＬＲＨＰＫＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹＧ
（配列番号４９）。
【０２０１】
（ｍｉｎｉｐｒｅｐキット、Ｑｉａｇｅｎ  ＣＡから入手可能を使用して）アルカリ溶解を使用して大腸菌でプラスミドＤＮＡを調製し、それを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）を形質転換した。単一コロニーを取り出し、１００ｍＬのＴＢ培地で３７℃にて一晩増殖させ、次いで、１／１００希釈を介して１Ｌの培養物を接種するために用いた。この培養物をＯＤが０．７に達するまで増殖させ、この時点でタンパク質の発現は、ＩＰＴＧの添加によって最終濃度７０μＭに誘導されていた。前記培養物を２３℃で一晩増殖させ、次いで、遠心分離によって回収し、ペレットを−２０℃で保存した。その後、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒミックス（１２．５ｍＬの１０×ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ）、１１２．５ｍＬのＰＢＳ、２５０μＬのｌｙｓｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）及び４つの完全プロテアーゼ阻害剤タブレット（Ｒｏｃｈｅ））で細胞を溶解させることによって封入体を調製した。５００ｍＬの培養物に由来するペレットを１００ｍＬのｂｕｇｂｕｓｔｅｒミックスに再懸濁させ、攪拌しながら３０分間室温でインキュベートし、次いで、２０分間３２０００ｇで遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットをＰＢＳ中２Ｍの尿素で洗浄し、次いで、３２０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、元の培養物体積の１／１２．５のバッファＢ（１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５％のグリセロール）中８Ｍの尿素にペレットを再懸濁させ、室温で１時間攪拌し、次いで、１６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清（封入体調製物）を４℃で保存した。
【０２０２】
タンパク質をリフォールディングバッファ（１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）、６０ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）で１／５０に希釈することによってリフォールディングし、濾過し、次いで遠心分離した。必要な場合、一晩室温で、１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）、０．００１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３０ｍＭのＮａＣｌ、１％のエタノール、１０μｇ／ｍＬのカタラーゼ、２．５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、１μＭの塩化銅、及び８０μＭのペプチジルグリシンαアミド化モノオキシゲナーゼと共に、８μＭのリフォールディングされたタンパク質をインキュベートすることによってＣ末端をアミド化した。質量分析によってアミド化を確認した（グリシンで伸長された融合タンパク質の分子量＝１６５９２；Ｃ末端がアミド化された融合タンパク質の分子量＝１６５３４）。
【０２０３】
バッファＹに平衡化されたＨｉＴｒａｐ  ＳＰＦＦカチオン交換カラムで精製を実施し、バッファＺの０〜１００％勾配で溶出した。バッファＹは、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）であり；バッファＺは、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）＋１ＭのＮａＣｌである。その後、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．２）及び１００ｍＭのＮａＣｌでタンパク質をバッファ交換し、濃縮し、−８０℃で保存した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年5月30日(2012.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の融合物又はコンジュゲートを含む組成物であって、前記融合物又はコンジュゲートが、（ａ）インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子から選択され、且つ（ｂ）前記インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子の半減期を延長させるタンパク質又はペプチド、との融合物又はコンジュゲートとして存在する少なくとも２つの分子、を含むか又はこれらからなり、前記半減期を延長させるタンパク質又はペプチドが、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンに対して特異的に結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む、組成物。
【請求項２】
少なくとも２つの個々の融合物又はコンジュゲートを含む組成物であって、各個々の融合物又はコンジュゲートが、（ａ）インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子から選択され、（ｂ）前記インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子の半減期を延長させるタンパク質又はペプチド、との融合物又はコンジュゲートとして存在する１以上の分子、を含むか又はこれらからなり、前記半減期を延長させるタンパク質又はペプチドが、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンに対して特異的に結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む、組成物。
【請求項３】
インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチンのうちの少なくとも１つが、ＧＬＰ−１、ＰＹＹ、エキセンディン、あるいはインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチンの活性を保持しているこれらの機能的変異体、類似体、突然変異体、又は誘導体であるペプチド、から選択される、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
インクレチンのうちの少なくとも１つが、（ａ）図１（ｉ）（配列番号９）に示すアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ突然変異体、又はその突然変異体、誘導体、若しくは類似体、（ｂ）図１（ｊ）（配列番号１０）に示すアミノ酸配列を有するエキセンディン−４分子、又はその突然変異体、誘導体、若しくは類似体、及び（ｃ）図１（ｓ）（配列番号１９）に示すアミノ酸配列を有するＰＹＹペプチド、又はその突然変異体、誘導体、若しくは類似体、から選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
血清アルブミンに対して特異的に結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）が、ＤＯＭ７ｈ−１４（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ７ｈ−１４のアミノ酸配列は図１（ｈ）の配列番号８に示す）、又はＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ７ｈ−１４−１０のアミノ酸配列は図１（ｏ）の配列番号１５に示す）、及びＲ１０８Ｃ突然変異を有するＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｖｋ）ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ７ｈ−１４−１０  Ｒ１０８Ｃのアミノ酸配列は図１（ｒ）の配列番号１８に示す）、及び７ｈ−１１−１５  ａｌｂｕｄａｂ（ＤＯＭ７ｈ−１１−１５のアミノ酸配列は図１（ｐ）の配列番号１６に示す）、及び７ｈ−１１−１５  Ｒ１０８Ｃ  ａｌｂｕｄａｂ（ＤＯＭ７ｈ−１１−１５  Ｒ１０８Ｃのアミノ酸配列は図１（Ｔ）の配列番号４７に示す）、あるいは血清アルブミンにおける同じエピトープに結合するか、又は血清アルブミンに対する結合についてこれらのうちのいずれかと競合するｄＡｂ、から選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６】
インスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン分子及び／又は腸管ペプチドを接合させるアミノ酸又は化学リンカーと、血清アルブミンに結合するｄＡｂとを更に含み、例えば、前記アミノ酸リンカーが、図１（ｋ）（配列番号１１）に示すアミノ酸配列を有するヘリカルリンカー、図１（ｌ）（配列番号１２）に示すアミノ酸配列を有するｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、又は図３に示すＰＥＧリンカーの構造を有するＰＥＧリンカー等のＰＥＧリンカー、から選択される、請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
図１ａ〜１ｇ（配列番号１〜７）、及び図１ｍ〜１ｎ（配列番号１３〜１４）、及び図１ｕ〜１ｖ（配列番号４８〜４９）、及び図３又はＤｏｍ７ｈ−１１−１５（Ｒ１０８Ｃ）−ＰＥＧ−３−３６ＰＹＹ（１０位がリシン）（ａｌｂｕｄａｂ成分がＤｏｍ７ｈ−１１−１５（Ｒ１０８Ｃ）であることを除いて図３に示す構造を有する）に記載のペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂ分子のうちの１以上を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
（ａ）ＤＡＴ０１１５分子（図１ｂの配列番号２に示すアミノ酸配列を有する）と、（ｂ）同時に、別々に、又は順次使用するための複合調製物としてのＤｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）−ＰＥＧ−３−３６ＰＹＹ（１０位がリシン）（図３に示す構造を有する）、又は（ｃ）Ｄｏｍ７ｈ−１１−１５（Ｒ１０８Ｃ）−ＰＥＧ−３−３６ＰＹＹ（１０位がリシン）（ａｌｂｕｄａｂ成分がＤｏｍ７ｈ−１１−１５（Ｒ１０８Ｃ）であることを除いて図３に示す構造を有する）のいずれか、とを含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
融合物又はコンジュゲートが、約５μＭ〜約１ｐＭの範囲のＫＤでヒト血清アルブミンに結合する、請求項１〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
薬学的又は生理学的に許容できる担体、賦形剤、又は希釈剤と組合せて、請求項１〜９のいずれか一項記載の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
被験体に別々に、順次、又は同時に投与するための、（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項記載の組成物を含み、且つ（ｂ）更なる治療剤又は活性剤を含む、組成物。
【請求項１２】
請求項２記載の２以上の融合物又はコンジュゲートを含む組成物であって、各々が、療法において同時に、別々に、又は順次使用するための複合調製物として、（ａ）１以上のインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子であって、（ｂ）血清アルブミンに対して特異的に結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）、との融合物又はコンジュゲートとして存在する、１以上のインスリン分泌促進剤及び／又はインクレチン及び／又は腸管ペプチド分子を含むか又はこれらからなる、組成物。
【請求項１３】
代謝性疾患又は障害の治療又は予防において使用するための請求項１〜１２のいずれか一項記載の組成物であって、例えば、前記疾患又は障害が、高血糖症、耐糖能異常、β細胞欠損、糖尿病（１型若しくは２型の糖尿病又は妊娠性糖尿病）、肥満、過食を特徴とする疾患から選択される、組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項記載の組成物を含む経口、注射可能、吸入可能、又は噴霧可能な製剤。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項記載の融合物をコードする単離又は組換え核酸。
【国際調査報告】
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2013506628.tif 000041
2013506628.tif 000042
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