(57)【要約】ｉｎ  ｓｉｔｕで、水性または他のアッセイ条件において化学発光酵素基質を生成する方法を開示する。該基質を使用して、光を生成する方法、酵素、抗原および／もしくは核酸を検出ならびに／または定量化する方法も開示する。これらの方法に関するキットも開示する。2013533354.tif 000079
2013533354.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、光を生成する方法：
（ａ）オキシダントを提供する工程；
（ｂ）以下の構造を有するエノールエーテルを提供する工程：
2013533354.tif 000052
式中、
ＡおよびＢは、１〜２０の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは１つまたは複数の電子活性基、可溶化基、または光促進基により置換されてもよく、ＡおよびＢがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの１つは、エノールエーテルの二重結合を形成する２つの炭素原子のうちの１つであり、
Ｒ１は、１〜２０の炭素原子を含むアルキル、６〜１４の炭素原子を含むアリール、７〜１５の炭素原子を含むアラルキル、４〜２０の炭素原子を含むヘテロアリール、または５〜２０の炭素を含むヘテロアラルキルであり、
Ｔは、光を放射できるアリール環またはヘテロアリール環であり、かつ
Ｒ２は、酵素部分によって切断可能でありＴ上で酸素アニオンを産出する結合を含む酵素切断可能基である；
（ｃ）１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成するために、水溶液、オキシダント、およびエノールエーテルを組み合わせる工程；
（ｄ）１，２−ジオキセタン酵素基質を切断できる酵素部分を含む酵素複合体を提供する工程；
（ｅ）反応混合物を形成するために、酵素複合体を、１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させる工程；ならびに
（ｆ）反応混合物に光を生成させる工程。
【請求項２】
前記オキシダントが、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、過酸化水素およびモリブデン酸ナトリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩および過酸化水素、アリールエンドペルオキシド、過酸化カルシウムペルオキシハイドレート、ならびにそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オキシダントが、過酸化水素、ならびに過酸化水素およびモリブデン酸ナトリウムである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＡまたはＢのうちの少なくとも１つが
2013533354.tif 000053
である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＡおよびＢがともに
2013533354.tif 000054
である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ１が、１〜２の炭素原子を含むアルキルまたは１〜２の炭素原子を含むトリフルオアルキル（ｔｒｉｆｌｕｏａｌｋｙｌ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｔが以下である、請求項１に記載の方法：
2013533354.tif 000055
式中、
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオメチル（ｔｒｉｆｌｕｏｍｅｔｈｙｌ）、トリフルロエチル（ｔｒｉｆｌｕｒｏｅｔｈｙｌ）、１〜２０の炭素原子を含む直鎖アルキル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルキル、２〜２０の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、１〜２０の炭素原子を含むアルコキシ、６〜１４の炭素原子を含むアリール、６〜１４の炭素原子を含むアリールオキシ、２〜２１の炭素原子を含むエステル、３〜３０の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、３〜３０の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、２〜２１の炭素原子を含むアルキルアミド、７〜１５の炭素原子を含むアリールアミド、２〜２１の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、７〜１５の炭素原子を含むアリールカルバモイル、１〜２０の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、６〜１４の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、３〜６０の炭素原子を含むトリアルキルシリル、１８〜４２の炭素原子を含むトリアリールシリル、７〜３２の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、１〜２０の炭素原子を含むアルキルアミドスルホニル、６〜１４の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、１〜２０の炭素原子を含むアルキルスルホニル、６〜１４の炭素原子を含むアリールスルホニル、２〜２０の炭素原子を含むアルキルチオおよび６〜１４の炭素原子を含むアリールチオからなる群から独立して選択され、かつ
Ｘは、硫黄原子、酸素原子、または窒素原子である。
【請求項８】
ＯＲ２が、ホスフェート、アセテート、１−ホスホ−２，３−ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ−ガラクトシド、α−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルコシド、α−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−マンノシド、β−フルクトフラノシド、β−Ｄ−グルクロニド、または以下である、請求項１に記載の方法：
2013533354.tif 000056
式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は各々独立してＨまたは１〜４の炭素原子のアルキル（分岐状または直鎖）である。
【請求項９】
Ｒ２が、
2013533354.tif 000057
である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ２がＥ−Ｌ−Ｎｕｃ−Ｚであり、式中、Ｅは求電子性原子を含む基であり、Ｚ基の酵素的切断に際してこの原子はＮｕｃ基の電子対によって攻撃され、近接性補助によって１，２−ジオキセタン酵素基質アニオンを放出し；Ｌは連結基であり；Ｎｕｃは求核原子であり；かつ、Ｚは酵素的切断可能基であり；式中、
Ｅは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり；
Ｌは、１〜４の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−、または−（ＣＨ２）ｍ−ＮＲ６−（ＣＨ２）ｎ−からなる群から選択され、式中、ｍおよびｎは０〜３であり、かつｍ＋ｎは２または３であり、式中、Ｒ６は、１〜１０の炭素原子を含むアルキルであり、かつ、連結基は、１〜２４の炭素原子を含むアルキル、２〜２４の炭素原子を含むアルケニル、１〜２４の炭素原子を含み、１〜２４の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、２〜２４の炭素原子を含み、１〜２４の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、６〜１０の炭素を含むアリール、１〜２４の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または２〜２４の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換することができ；
Ｎｕｃは酸素原子または硫黄原子であり；かつ
Ｚは、ホスホリル、アセチル、１−ホスホ−２，３−ジアシルグリセロシル（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｓｙｌ）、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α−Ｄ−ガラクトシル、β−Ｄ−ガラクトシル、α−Ｄ−グルコシル、β−Ｄ−グルコシル、α−Ｄ−マンノシル、β−Ｄ−マンノシル、β−フルクトフラノシル、β−Ｄ−グルコシドウランシル（ｇｌｕｃｏｓｉｄｕｒａｎｓｙｌ）、または
2013533354.tif 000058
であり、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は各々独立してＨまたは１〜４の炭素原子のアルキル（分岐状または直鎖）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｚが
2013533354.tif 000059
である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素部分が加水分解酵素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記加水分解酵素が、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、またはノイラミニダーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素部分が酵素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、光の放射が酵素の存在を示し、かつ放射された光の量をサンプル中に存在する酵素の量に相関させることができる、工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素部分が、抗原に結合可能な第１の抗体と、１，２−ジオキセタン酵素基質が分解して光を生成するように該基質を切断可能な酵素とを含む、酵素連結抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の抗体が、酵素に共有結合または非共有結合で連結される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の抗体が、標識に共有結合で連結され、前記酵素が、標識に非共有結合可能な分子に共有結合で連結される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標識がビオチンまたはビオチン誘導体であり、前記分子がアビジンまたはストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識がハプテンであり、前記分子が、ハプテンに結合可能な抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程；
（ｂ）抗原に結合可能な第２の抗体を含む固相を提供する工程；
（ｃ）酵素複合体を形成するためにサンプルおよび酵素連結抗体を固相と接触させる工程；ならびに
（ｄ）１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、光の放射が抗原の存在を示し、かつ放射された光の量を、サンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる、工程
をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
任意の未結合の酵素連結抗体を酵素複合体から除去する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記酵素部分が、抗原と、１，２−ジオキセタン酵素基質が分解して光を生成するように該基質を切断可能な酵素とを含む、酵素連結抗原である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗原が酵素に共有結合または非共有結合で連結される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗原が標識に共有結合で連結され、かつ前記酵素が、標識に非共有結合可能な分子に共有結合で連結される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標識がビオチンまたはビオチン誘導体であり、かつ前記分子がアビジンまたはストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記標識がハプテンであり、前記分子がハプテンに結合可能な抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程；
（ｂ）抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程；
（ｃ）酵素複合体を形成するためにサンプルおよび酵素連結抗原を固相と接触させる工程；ならびに
（ｄ）１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、放射された光の量を、サンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる、工程
をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
任意の未結合の酵素連結抗原を酵素複合体から除去する工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記酵素部分が、核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、１，２−ジオキセタン酵素基質が分解して光を生成するように該基質を切断可能な酵素とを含む、酵素連結オリゴヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドが酵素に共有結合または非共有結合で連結される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドが標識に共有結合で連結され、かつ前記酵素が、標識に非共有結合できる分子に共有結合で連結される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記標識がビオチンまたはビオチン誘導体であり、かつ前記分子がアビジンまたはストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記標識がハプテンであり、かつ前記分子が、ハプテンに結合可能な抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）核酸を含む疑いのあるサンプルを提供する工程；
（ｂ）核酸を固相へ固定化する工程、
（ｃ）酵素複合体を形成するために、固定化された核酸および酵素連結オリゴヌクレオチドを接触させる工程；ならびに
（ｄ）１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、光の放射が核酸の存在を示し、かつ放射された光の量を、サンプル中に存在する核酸の量に相関させることができる、工程
をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
任意の未結合の酵素連結オリゴヌクレオチドを酵素複合体から除去する工程をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記反応混合物が促進剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記促進剤が、ポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記促進剤がアクセプター色素をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記アクセプター色素がフルオレセインである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリマー性第四級アンモニウム塩が、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）、ポリ［ビニルベンジル（塩化ベンジルジメチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリブチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム）］、またはそれらの組み合わせである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリマー性第四級ホスホニウム塩が、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）およびポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）を含むコポリマー、またはそれらの組み合わせである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記エノールエーテルが、
2013533354.tif 000060
2013533354.tif 000061
2013533354.tif 000062
である、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
以下の工程を含む、サンプル中の酵素の存在または量を決定するアッセイ方法：
（ａ）オキシダントを提供する工程；
（ｂ）以下の構造を有するエノールエーテルを提供する工程：
2013533354.tif 000063
式中、
ＡおよびＢは、１〜２０の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは１つまたは複数の電子活性基、可溶化基、または光促進基により置換されてもよく、かつ、ＡおよびＢがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの１つは、エノールエーテルの二重結合を形成する２つの炭素原子のうちの１つであり、
Ｒ１は、１〜２０の炭素原子を含むアルキル、６〜１４の炭素原子を含むアリール、７〜１５の炭素原子を含むアラルキル、４〜２０の炭素原子を含むヘテロアリール、または５〜２０の炭素を含むヘテロアラルキルであり、
Ｔは、光を放射できるアリール環またはヘテロアリール環であり、かつ
Ｒ２は、酵素部分によって切断可能でありＴ上で酸素アニオンを産出する結合を含む酵素切断可能基である；
（ｃ）１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成するために、水溶液、オキシダント、およびエノールエーテルを組み合わせる工程；
（ｄ）１，２−ジオキセタン酵素基質が分解して光を生成するように該基質を切断可能な酵素を含む疑いのあるサンプルを提供する工程；
（ｅ）反応混合物を形成するために、サンプルを、１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させる工程；ならびに
（ｆ）１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、光の放射が酵素の存在を示し、かつ放射された光の量をサンプル中に存在する酵素の量に相関させることができる、工程。
【請求項４５】
以下の工程を含む、サンプル中の抗原の存在または量を決定するアッセイ方法：
（ａ）オキシダントを提供する工程；
（ｂ）以下の構造を有するエノールエーテルを提供する工程：
2013533354.tif 000064
式中、
ＡおよびＢは、１〜２０の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは１つまたは複数の電子活性基、可溶化基、または光促進基により置換されてもよく、かつ、ＡおよびＢがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの１つは、エノールエーテルの二重結合を形成する２つの炭素原子のうちの１つであり、
Ｒ１は、１〜２０の炭素原子を含むアルキル、６〜１４の炭素原子を含むアリール、７〜１５の炭素原子を含むアラルキル、４〜２０の炭素原子を含むヘテロアリール、または５〜２０の炭素を含むヘテロアラルキルであり、
Ｔは、光を放射できるアリール環またはヘテロアリール環であり、かつ
Ｒ２は、酵素部分によって切断可能でありＴ上で酸素アニオンを産出する結合を含む酵素切断可能基である；
（ｃ）１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成するために、水溶液、オキシダント、およびエノールエーテルを組み合わせる工程；
（ｄ）抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程；
（ｅ）抗原に結合可能な第１の抗体と、１，２−ジオキセタン酵素基質が分解して光を生成するように該基質を切断可能な酵素とを含む、酵素連結抗体を提供する工程；
（ｆ）抗原に結合可能な第２の抗体を含む固相を提供する工程；
（ｇ）酵素複合体を形成するため、サンプルおよび酵素連結抗体を固相と接触させる工程；
（ｈ）反応混合物を形成するため、酵素複合体を、１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させる工程；ならびに
（ｉ）１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、光の放射が抗原の存在を示し、かつ放射された光の量を、サンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる工程。
【請求項４６】
以下の工程を含む、サンプル中の抗原の存在または量を決定するアッセイ方法：
（ａ）オキシダントを提供する工程；
（ｂ）以下の構造を有するエノールエーテルを提供する工程：
2013533354.tif 000065
式中、
ＡおよびＢは、１〜２０の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは１つまたは複数の電子活性基、可溶化基、または光促進基により置換されてもよく、かつ、ＡおよびＢがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの１つは、エノールエーテルの二重結合を形成する２つの炭素原子のうちの１つであり、
Ｒ１は、１〜２０の炭素原子を含むアルキル、６〜１４の炭素原子を含むアリール、７〜１５の炭素原子を含むアラルキル、４〜２０の炭素原子を含むヘテロアリール、または５〜２０の炭素を含むヘテロアラルキルであり、
Ｔは、光を放射できるアリール環またはヘテロアリール環であり、
Ｒ２は、酵素部分によって切断可能でありＴ上で酸素アニオンを産出する結合を含む酵素切断可能基である；
（ｃ）１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成するために、水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせる工程；
（ｄ）抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程；
（ｅ）抗原と、１，２−ジオキセタン酵素基質が分解して光を生成するように該基質を切断可能な酵素とを含む、酵素連結抗原を提供する工程；
（ｆ）抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程；
（ｇ）酵素複合体を形成するために、サンプルおよび酵素連結抗原を固相と接触させる工程；
（ｈ）反応混合物を形成するために、酵素複合体を、１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させる工程；ならびに
（ｉ）１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、放射された光の量を、サンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる、工程。
【請求項４７】
以下の工程を含む、サンプル中の核酸の存在および／または量を決定するアッセイ方法：
（ａ）オキシダントを提供する工程；
（ｂ）以下の構造を有するエノールエーテルを提供する工程：
2013533354.tif 000066
式中、
ＡおよびＢは、１〜２０の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは１つまたは複数の電子活性基、可溶化基、または光促進基により置換されてもよく、かつ、ＡおよびＢがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの１つは、エノールエーテルの二重結合を形成する２つの炭素原子のうちの１つであり、
Ｒ１は、１〜２０の炭素原子を含むアルキル、６〜１４の炭素原子を含むアリール、７〜１５の炭素原子を含むアラルキル、４〜２０の炭素原子を含むヘテロアリール、または５〜２０の炭素を含むヘテロアラルキルであり、
Ｔは、光を放射できるアリール環またはヘテロアリール環であり、ならびに
Ｒ２は、酵素部分によって切断可能でありＴ上で酸素アニオンを産出する結合を含む酵素切断可能基である；
（ｃ）１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成するために、水溶液、オキシダント、およびエノールエーテルを組み合わせる工程；
（ｄ）核酸を含む疑いのあるサンプルを提供する工程；
（ｅ）核酸を固相へ固定化する工程；
（ｆ）核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、１，２−ジオキセタン酵素基質が分解して光を生成するように該基質を切断可能な酵素とを含む、酵素連結オリゴヌクレオチドを提供する工程；
（ｇ）酵素複合体を形成するために、固定化され酵素が連結したオリゴヌクレオチドを接触させる工程；
（ｈ）反応混合物を形成するために、酵素複合体を、１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させる工程；ならびに
（ｉ）１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、光の放射が核酸の存在を示し、かつ放射された光の量を、サンプル中に存在する核酸の量に相関させることができる、工程。
【請求項４８】
以下を含む、サンプル中の検体の存在または量を検出するためのキット：
（ａ）オキシダント、ならびに
（ｂ）以下の構造を有するエノールエーテル：
2013533354.tif 000067
式中、
ＡおよびＢは、１〜２０の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは１つまたは複数の電子活性基、可溶化基、または光促進基により置換されてもよく、かつ、ＡおよびＢがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの１つは、エノールエーテルの二重結合を形成する２つの炭素原子のうちの１つであり、
Ｒ１は、１〜２０の炭素原子を含むアルキル、６〜１４の炭素原子を含むアリール、７〜１５の炭素原子を含むアラルキル、４〜２０の炭素原子を含むヘテロアリール、または５〜２０の炭素を含むヘテロアラルキルであり、
Ｔは、光を放射できるアリール環またはヘテロアリール環であり、かつ
Ｒ２は、酵素部分によって切断可能でありＴ上で酸素アニオンを産出する結合を含む酵素切断可能基である。
【請求項４９】
前記オキシダントが、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、過酸化水素およびモリブデン酸ナトリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩および過酸化水素、アリールエンドペルオキシド、過酸化カルシウムペルオキシハイドレート、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記オキシダントが、過酸化水素、または過酸化水素およびモリブデン酸ナトリウムである、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
ＡまたはＢの少なくとも１つが
2013533354.tif 000068
である、請求項４８に記載のキット。
【請求項５２】
ＡおよびＢが、ともに
2013533354.tif 000069
である、請求項４８に記載のキット。
【請求項５３】
Ｒ１が、１〜２の炭素原子を含むアルキルまたは１〜２の炭素原子を含むトリフルオアルキル（ｔｒｉｆｌｕｏａｌｋｙｌ）である、請求項４８に記載のキット。
【請求項５４】
Ｔが以下である、請求項４８に記載のキット：
2013533354.tif 000070
式中、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオメチル（ｔｒｉｆｌｕｏｍｅｔｈｙｌ）、トリフルロエチル（ｔｒｉｆｌｕｒｏｅｔｈｙｌ）、１〜２０の炭素原子を含む直鎖アルキル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルキル、２〜２０の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、１〜２０の炭素原子を含むアルコキシ、６〜１４の炭素原子を含むアリール、６〜１４の炭素原子を含むアリールオキシ、２〜２１の炭素原子を含むエステル、３〜３０の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、３〜３０の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、２〜２１の炭素原子を含むアルキルアミド、７〜１５の炭素原子を含むアリールアミド、２〜２１の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、７〜１５の炭素原子を含むアリールカルバモイル、１〜２０の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、６〜１４の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、３〜６０の炭素原子を含むトリアルキルシリル、１８〜４２の炭素原子を含むトリアリールシリル、７〜３２の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、１〜２０の炭素原子を含むアルキルアミドスルホニル、６〜１４の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、１〜２０の炭素原子を含むアルキルスルホニル、６〜１４の炭素原子を含むアリールスルホニル、２〜２０の炭素原子を含むアルキルチオおよび６〜１４の炭素原子を含むアリールチオからなる群から独立して選択され、かつ
Ｘは、硫黄原子、酸素原子、または窒素原子である。
【請求項５５】
ＯＲ２が、ホスフェート、アセテート、１−ホスホ−２，３−ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ−ガラクトシド、α−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルコシド、α−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−マンノシド、β−フルクトフラノシド、β−Ｄ−グルクロニド、または
2013533354.tif 000071
であり、
式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は各々独立してＨまたは１〜４の炭素原子のアルキル（分岐状または直鎖）である、請求項４８に記載のキット。
【請求項５６】
Ｒ２が、
2013533354.tif 000072
である、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
Ｒ２がＥ−Ｌ−Ｎｕｃ−Ｚであり、式中、Ｅは求電子性原子を含む基であり、Ｚ基の酵素的切断に際してこの原子はＮｕｃ基の電子対によって攻撃され、近接性補助によって１，２−ジオキセタン酵素基質アニオンを放出し；Ｌは連結基であり；Ｎｕｃは求核原子であり；かつＺは酵素的に切断可能な基であり；式中、
Ｅは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり；
Ｌは、１〜４の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−、または−（ＣＨ２）ｍ−ＮＲ６−（ＣＨ２）ｎ−からなる群から選択され、式中、ｍおよびｎは０〜３であり、かつｍ＋ｎは２または３であり、式中、
Ｒ６は、１〜１０の炭素原子を含むアルキルであり、かつ連結基は、１〜２４の炭素原子を含むアルキル、２〜２４の炭素原子を含むアルケニル、１〜２４の炭素原子を含み、１〜２４の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、２〜２４の炭素原子を含み、１〜２４の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、６〜１０の炭素を含むアリール、１〜２４の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または２〜２４の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換することができ；
Ｎｕｃは酸素原子または硫黄原子であり；かつ
Ｚは、ホスホリル、アセチル、１−ホスホ−２，３−ジアシルグリセロシル（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｓｙｌ）、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α−Ｄ−ガラクトシル、β−Ｄ−ガラクトシル、α−Ｄ−グルコシル、β−Ｄ−グルコシル、α−Ｄ−マンノシル、β−Ｄ−マンノシル、β−フルクトフラノシル、β−Ｄ−グルコシドウランシル（ｇｌｕｃｏｓｉｄｕｒａｎｓｙｌ）、または
2013533354.tif 000073
であり、
式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は各々独立してＨまたは１〜４の炭素原子のアルキル（分岐状または直鎖）である、請求項４８に記載のキット。
【請求項５８】
Ｚが、
2013533354.tif 000074
である、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
促進剤をさらに含む、請求項４８のキット。
【請求項６０】
前記促進剤が、ポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩、またはそれらの組み合わせを含む、請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
前記促進剤がアクセプター色素をさらに含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
前記アクセプター色素がフルオレセインである、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
前記ポリマー性第四級アンモニウム塩が、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）、ポリ［ビニルベンジル（塩化ベンジルジメチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリブチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム）］、またはそれらの組み合わせである、請求項６０に記載のキット。
【請求項６４】
前記ポリマー性第四級ホスホニウム塩が、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）およびポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）を含むコポリマー；またはそれらの組み合わせである、請求項６０に記載のキット。
【請求項６５】
前記エノールエーテルが、
2013533354.tif 000075
2013533354.tif 000076
2013533354.tif 000077
である、請求項４８に記載のキット。
【請求項６６】
以下の工程を含む、１，２−ジオキセタン酵素基質を作製する方法：
（ａ）オキシダントを提供する工程；
（ｂ）以下の構造を有するエノールエーテルを提供する工程：
2013533354.tif 000078
式中、
ＡおよびＢは、１〜２０の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは１つまたは複数の電子活性基、可溶化基、または光促進基により置換されてもよく、かつ、ＡおよびＢがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの１つは、エノールエーテルの二重結合を形成する２つの炭素原子のうちの１つであり、
Ｒ１は、１〜２０の炭素原子を含むアルキル、６〜１４の炭素原子を含むアリール、７〜１５の炭素原子を含むアラルキル、４〜２０の炭素原子を含むヘテロアリール、または５〜２０の炭素を含むヘテロアラルキルであり、
Ｔは、光を放射できるアリール環またはヘテロアリール環であり、かつ
Ｒ２は、酵素部分によって切断可能でありＴ上で酸素アニオンを産出する結合を含む酵素切断可能基である；ならびに
（ｃ）１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成するために、水溶液、オキシダント、およびエノールエーテルを組み合わせる工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して診断アッセイ、より具体的には化学発光基質に関する。化学発光基質のｉｎ  ｓｉｔｕでの生成のために有用な方法および診断アッセイにおけるそれらの使用のための方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
臨床的な診断アッセイは好ましい最先端技術検出技術として現在化学発光を使用する。化学発光リードアウトによるアッセイは、検体定量化のための最も感受性の高い検出限界および最も広いダイナミックレンジを有する。標準的な実験室の機器、制御環境および技術支援が最小である分野または開発途上国における使用のための、単純化され小型化された自己充足的なおよび／または着実な診断プラットフォームをデザインする必要性が増えている。制御された保存条件が容易に利用可能でない場合には、現在の商業的に入手可能なジオキセタン基質は良好に機能しない。したがって、より良好な熱安定性を有する前駆体を使用して、ジオキセタン基質をｉｎ  ｓｉｔｕで生成する方法のための必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
第１の態様において、本発明は、光を生成する方法であって、（ａ）オキシダントを提供する工程と；（ｂ）以下の構造
2013533354.tif 000003
を有するエノールエーテルを提供する工程と；（ｃ）水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する工程と；（ｄ）１，２−ジオキセタン酵素基質を切断できる酵素部分を含む酵素複合体を提供する工程と；（ｅ）酵素複合体を１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させて反応混合物を形成する工程と；（ｆ）反応混合物が光を生成することを可能にする工程とを含む方法を提供する。
【０００４】
オキシダントは、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩および過酸化水素、アリールエンドペルオキシド、過酸化カルシウムペルオキシハイドレートならびにそれらの組み合わせから選択することができる。いくつかの実施形態において、オキシダントは、過酸化水素または過酸化水素およびモリブデン酸ナトリウムであり得る。
【０００５】
エノールエーテル［１］において、ＡおよびＢは、１〜２０の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され得、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは１つまたは複数の電子活性基、可溶化基または光促進基により置換されてもよく、ＡおよびＢがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの１つは、エノールエーテルの二重結合を形成する２つの炭素原子のうちの１つであり、
Ｒ１は、１〜２０の炭素原子を含むアルキル、６〜１４の炭素原子を含むアリール、７〜１５の炭素原子を含むアラルキル、４〜２０の炭素原子を含むヘテロアリールまたは５〜２０の炭素を含むヘテロアラルキルであり得、
Ｔは、光を放射できるアリール環またはヘテロアリール環であり得、
Ｒ２は、酵素部分によって切断可能でありＴ上で酸素アニオンを産出する結合を含む酵素切断可能基であり得る。
【０００６】
いくつかの実施形態において、エノールエーテルは、
2013533354.tif 000004
である少なくとも１つのＡまたはＢを有することができ、一方他の実施形態において、ＡおよびＢはともに
2013533354.tif 000005
である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、Ｒ１は１〜２の炭素原子を含むアルキルまたは１〜２の炭素原子を含むトリフルオアルキル（ｔｒｉｆｌｕｏａｌｋｙｌ）であり得る。
【０００８】
いくつかの実施形態において、Ｔは
2013533354.tif 000006
であり、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオメチル（ｔｒｉｆｌｕｏｍｅｔｈｙｌ）、トリフルロエチル（ｔｒｉｆｌｕｒｏｅｔｈｙｌ）、１〜２０の炭素原子を含む直鎖アルキル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルキル、２〜２０の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、１〜２０の炭素原子を含むアルコキシ、６〜１４の炭素原子を含むアリール、６〜１４の炭素原子を含むアリールオキシ、２〜２１の炭素原子を含むエステル、３〜３０の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、３〜３０の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、２〜２１の炭素原子を含むアルキルアミド、７〜１５の炭素原子を含むアリールアミド、２〜２１の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、７〜１５の炭素原子を含むアリールカルバモイル、１〜２０の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、６〜１４の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、３〜６０の炭素原子を含むトリアルキルシリル、１８〜４２の炭素原子を含むトリアリールシリル、７〜３２の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、１〜２０の炭素原子を含むアルキルアミドスルホニル、６〜１４の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、１〜２０の炭素原子を含むアルキルスルホニル、６〜１４の炭素原子を含むアリールスルホニル、２〜２０の炭素原子を含むアルキルチオおよび６〜１４の炭素原子を含むアリールチオからなる群から独立して選択され、Ｘは硫黄原子、酸素原子または窒素原子である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ＯＲ２は、ホスフェート、アセテート、１−ホスホ−２，３−ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ−ガラクトシド、α−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルコシド、α−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−マンノシド、β−フルクトフラノシド、β−Ｄ−グルクロニドまたは
2013533354.tif 000007
（式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は各々独立してＨまたは１〜４の炭素原子のアルキル（分岐状または直鎖）である）であり得る。
【００１０】
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、
2013533354.tif 000008
であり得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、Ｒ２はＥ−Ｌ−Ｎｕｃ−Ｚであり得、そこでＲ２は  Ｅ−Ｌ−Ｎｕｃ−Ｚであり、式中、Ｅは求電子性原子を含む基であり、Ｚ基の酵素的切断に際してこの原子はＮｕｃ基の電子対によって攻撃され、近接性補助によって１，２−ジオキセタン酵素基質アニオンを放出し；Ｌは連結基であり；Ｎｕｃは求核原子であり；Ｚは酵素的切断可能基であり；式中、Ｅはカルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり；Ｌは、１〜４の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−または−（ＣＨ２）ｍ−ＮＲ６−（ＣＨ２）ｎ−からなる群から選択され、式中、ｍおよびｎは０〜３であり、ｍ＋ｎは２または３であり、式中、Ｒ６は１〜１０の炭素原子を含むアルキルであり、連結基は、１〜２４の炭素原子を含むアルキル、２〜２４の炭素原子を含むアルケニル、１〜２４の炭素原子を含み、１〜２４の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、２〜２４の炭素原子を含み、１〜２４の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、６〜１０の炭素を含むアリール、１〜２４の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または２〜２４の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換することができ；Ｎｕｃは酸素原子または硫黄原子であり；Ｚは、ホスホリル、アセチル、１−ホスホ−２，３−ジアシルグリセロシル（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｓｙｌ）、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α−Ｄ−ガラクトシル、β−Ｄ−ガラクトシル、α−Ｄ−グルコシル、β−Ｄ−グルコシル、α−Ｄ−マンノシル、β−Ｄ−マンノシル、β−フルクトフラノシル、β−Ｄ−グルコシドウランシル（ｇｌｕｃｏｓｉｄｕｒａｎｓｙｌ）または
2013533354.tif 000009
であり、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は各々独立してＨまたは１〜４の炭素原子のアルキル（分岐状または直鎖）である。これらのいくつかにおいて、Ｚは、
2013533354.tif 000010
2013533354.tif 000011
である。
【００１２】
酵素部分は加水分解酵素を含むことができる。いくつかの実施形態において、加水分解酵素はアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼまたはノイラミニダーゼであり得る。
【００１３】
いくつかの実施形態において、酵素部分は酵素であり得る。
【００１４】
いくつかの実施形態において、方法は、１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された任意の光を検出し、光の放射が酵素の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する酵素の量に相関させることができる工程をさらに含むことができる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、酵素部分は、抗原に結合可能な第１の抗体および１，２−ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む酵素連結抗体であり得る。
【００１６】
実施形態のいくつかにおいて、第１の抗体は酵素に共有結合または非共有結合で連結され得る。これらのいくつかにおいて、第１の抗体は標識に共有結合で連結され、酵素は標識に非共有結合できる分子に共有結合で連結され得る。これらのいくつかにおいて、標識はビオチンまたはビオチン誘導体であり、分子はアビジンまたはストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）であり得る。他において、標識はハプテンであり、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。
【００１７】
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と；（ｂ）抗原に結合可能な第２の抗体を含む固相を提供する工程と；（ｃ）サンプルおよび酵素連結抗体を固相と接触させて酵素複合体を形成する工程と；（ｄ）１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、光の放射が抗原の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる工程とをさらに含むことができる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、方法は、任意の未結合の酵素連結抗体を酵素複合体から除去する工程をさらに含むことができる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、酵素部分は、抗原および１，２−ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む酵素連結抗原であり得る。
【００２０】
いくつかの実施形態において、抗原は酵素に共有結合または非共有結合で連結され得る。
【００２１】
いくつかの実施形態において、抗原は標識に共有結合で連結され、酵素は標識に非共有結合できる分子に共有結合で連結され得る。これらのいくつかにおいて、標識はビオチンまたはビオチン誘導体であり、分子はアビジンまたはストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）であり得る。他において、標識はハプテンであり、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。
【００２２】
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と；（ｂ）抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程と；（ｃ）サンプルおよび酵素連結抗原を固相と接触させて酵素複合体を形成する工程と；（ｄ）１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、放射された光の量をサンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる工程とをさらに含むことができる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、方法は、任意の未結合の酵素連結抗原を酵素複合体から除去する工程をさらに含むことができる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、酵素部分は、核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドおよび１，２−ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む酵素連結オリゴヌクレオチドであり得る。
【００２５】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは酵素に共有結合または非共有結合で連結され得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは標識に共有結合で連結され、酵素は標識に非共有結合できる分子に共有結合で連結され得る。これらのいくつかにおいて、標識はビオチンまたはビオチン誘導体であり、分子はアビジンまたはストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）であり得る。他において、標識はハプテンであり、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。
【００２７】
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）核酸を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と；（ｂ）核酸を固相へ固定化する工程と、（ｃ）固定化された核酸および酵素連結オリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成する工程と；（ｄ）１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、光の放射が核酸の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する核酸の量に相関させることができる工程とをさらに含むことができる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、方法は、任意の未結合の酵素連結オリゴヌクレオチドを酵素複合体から除去する工程をさらに含むことができる。
【００２９】
いくつかの実施形態において、反応混合物は促進剤をさらに含むことができる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、促進剤はポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩またはそれらの組み合わせを含み得る。これらのいくつかにおいて、促進剤はアクセプター色素をさらに含み得る。これらのいくつかの中で、アクセプター色素はフルオレセインであり得る。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ポリマー性第四級アンモニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）、ポリ［ビニルベンジル（塩化ベンジルジメチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリブチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム）］またはそれらの組み合わせであり得る。
【００３２】
他の実施形態において、ポリマー性第四級ホスホニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）およびポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）を含むコポリマー、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００３３】
いくつかの実施形態において、エノールエーテル［１］は、
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2013533354.tif 000014
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であり得る。
【００３４】
他の態様において、本発明は、サンプル中の酵素の存在または量を決定するアッセイ方法であって、（ａ）オキシダントを提供する工程と；（ｂ）構造［１］を有し、上記のような置換基を有するエノールエーテルを提供する工程と；（ｃ）水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する工程と；（ｄ）１，２−ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と；（ｅ）サンプルを１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させて反応混合物を形成する工程と；（ｆ）１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、光の放射が酵素の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する酵素の量に相関させることができる工程とを含む方法を提供する。
【００３５】
他の態様において、本発明は、サンプル中の抗原の存在または量を決定するアッセイ方法であって、（ａ）オキシダントを提供する工程と；（ｂ）構造［１］を有し、上記のような置換基を有するエノールエーテルを提供する工程と；（ｃ）水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する工程と；（ｄ）抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と；（ｅ）抗原に結合可能な第１の抗体および１，２−ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む酵素連結抗体を提供する工程と；（ｆ）抗原に結合可能な第２の抗体を含む固相を提供する工程と；（ｇ）サンプルおよび酵素連結抗体を固相と接触させて酵素複合体を形成する工程と；（ｈ）酵素複合体を１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させて反応混合物を形成する工程と；（ｉ）１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、光の放射が抗原の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる工程とを含む方法を提供する。
【００３６】
他の態様において、本発明は、サンプル中の抗原の存在または量を決定するアッセイ方法であって、（ａ）オキシダントを提供する工程と；（ｂ）構造［１］を有し、上記のような置換基を有するエノールエーテルを提供する工程と；（ｃ）水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する工程と；（ｄ）抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と；（ｅ）抗原および１，２−ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む酵素連結抗原を提供する工程と；（ｆ）抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程と；（ｇ）サンプルおよび酵素連結抗原を固相と接触させて酵素複合体を形成する工程と；（ｈ）酵素複合体を１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させて反応混合物を形成する工程と；（ｉ）１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、放射された光の量をサンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる工程と含む方法を提供する。
【００３７】
他の態様において、本発明は、サンプル中の核酸の存在または量を決定するアッセイ方法であって、（ａ）オキシダントを提供する工程と；（ｂ）構造［１］を有し、上記のような置換基を有するエノールエーテルを提供する工程と；（ｃ）水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する工程と；（ｄ）核酸を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と；（ｅ）核酸を固相へ固定化する工程と；（ｆ）核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドおよび１，２−ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む酵素連結オリゴヌクレオチドを提供する工程と；（ｇ）固定化され、酵素が連結したオリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成する工程と；（ｈ）酵素複合体を１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させて反応混合物を形成する工程と；（ｉ）１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、光の放射が核酸の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する核酸の量に相関させることができる工程とを含むアッセイ方法を提供する。
【００３８】
他の態様において、本発明は、サンプル中の検体の存在および／または量を検出するためのキットを提供する。キットはオキシダントおよび構造［１］を有し上記のような置換基を有するエノールエーテルを含む。エノールエーテルの様々な実施形態は構造［１］  およびその置換基を有し、オキシダントも上記され、本発明のキットおよび方法に等しく適用可能である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、キットは促進剤も含み得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、促進剤はポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩またはそれらの組み合わせを含み得る。これらのいくつかにおいて、促進剤はアクセプター色素をさらに含み得る。これらのいくつかにおいて、アクセプター色素はフルオレセインであり得る。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ポリマー性第四級アンモニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）、ポリ［ビニルベンジル（塩化ベンジルジメチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリブチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム）］またはそれらの組み合わせであり得る。
【００４２】
他の実施形態において、ポリマー性第四級ホスホニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）およびポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）を含むコポリマー、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００４３】
いくつかの実施形態において、構造［１］を有するエノールエーテルは上で示されるようなエノールエーテル（［２］〜［１８］）のいずれか１であり得る。他の態様において、本発明は、１，２−ジオキセタン酵素基質を作製する方法であって、（ａ）オキシダントを提供する工程と；（ｂ）以下の構造
2013533354.tif 000016
を有するエノールエーテルを提供する工程と：（ｃ）水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する工程とを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】水溶液中のアルカリｐＨでＮａ２ＭｏＯ４／Ｈ２Ｏ２の酸化システムを使用する、ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェート（ＡＭＰＰＤ−ＥＥ）のジオキセタン基質（ＡＭＰＰＤ（登録商標））への転換のための反応スキームを示す。
【図２】出発材料（ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェート（ＡＭＰＰＤ−ＥＥ）対照）の溶出ピークを示すＨＰＬＣトレースである。
【図３】所望されるジオキセタン（ＡＭＰＰＤ（登録商標）対照）の溶出ピークを示すＨＰＬＣトレースである。
【図４】混合対照（ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェート（ＡＭＰＰＤ−ＥＥ）およびＡＭＰＰＤ（登録商標））の溶出ピークを示すＨＰＬＣトレースである。
【図５】ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェート（ＡＭＰＰＤ−ＥＥ）のＡＭＰＰＤ（登録商標）への酸化完了を示すＨＰＬＣトレースである。
【図６】水溶液中のアルカリｐＨでＮａ２ＭｏＯ４／Ｈ２Ｏ２の酸化システムを使用する、ＡＤＰ−Ｓｔａｒエノールエーテルホスフェート（ＡＤＰ＊−ＥＥ）のＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）（ＡＤＰ＊−ＥＥ−Ｏ）への転換、続いてアルカリフォスファターゼによるジオキセタンの活性化のための反応スキームを示す。
【図７】ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）（ＡＤＰ＊）ジオキセタン対照、２つのＡＤＰ−Ｓｔａｒエノールエーテル（ＡＤＰ＊−ＥＥ−Ｏ１およびＡＤＰ＊−ＥＥ−Ｏ２）酸化、および商業的に入手可能なＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）（ＣＤＰ＊）ジオキセタン対照のアルカリフォスファターゼによる活性化についてＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）放射曲線を示す。
【図８】ＡＭＰＰＤ（登録商標）の５５℃での熱安定性のグラフを示す。
【図９】ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェート（ＡＭＰＰＤ−ＥＥ）の５５℃での熱安定性のグラフを示す。
【図１０】ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェート（ＡＭＰＰＤ−ＥＥ）の単独（左側グラフ）ならびにＡＭＰＰＤ（登録商標）およびＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェート（ＡＭＰＰＤ−ＥＥ）の混合物（右側グラフ）の４０℃での熱安定性を示す。右グラフにおいて、左側のバーはＡＭＰＰＤ（登録商標）に関するデータであり、一方右側の対応するバーはＡＭＰＰＤ−ＥＥに関するデータである。
【図１１】モリブデン酸ナトリウムの存在下におけるＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェート（ＡＭＰＰＤ−ＥＥ）の４０℃での熱安定性を示す。
【図１２】方法Ａ：酵素によるホスフェートエノールエーテル（ＡＭＰＰＤ−ＥＥ）の脱リン酸化続いてジオキセタンへの水性酸化を示す。
【図１３】アルカリホスファターゼ希釈曲線についてのシグナル（相対的発光単位、ＲＬＵで）を、グロー（方法Ａによって生成されたｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤ）ｖｓ．方法Ａにおける対照（ＡＭＰＰＤ（登録商標））について示す。
【図１４】アルカリホスファターゼ希釈曲線についてのＳ／Ｎ比（Ｓ／Ｎ）を、グロー（方法Ａによって生成されたｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤ）ｖｓ．方法Ａにおける対照（ＡＭＰＰＤ（登録商標））について示す。
【図１５】酵素活性に対する過酸化水素およびモリブデン酸ナトリウムの効果を示す。
【図１６】モリブデン酸ナトリウム濃度の低下が酵素活性を回復させることを示す。
【図１７】方法Ｂ：ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェート（ＡＭＰＰＤ−ＥＥ）のジオキセタンへの水性酸化（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤ）、続いて酵素による脱リン酸化を示す。
【図１８】アルカリホスファターゼ希釈曲線についてのシグナル（ＲＬＵで）を、方法Ｂによって生成されたｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤｖｓ．対照ＡＭＰＰＤ（登録商標）について示す。
【図１９】アルカリホスファターゼ希釈曲線についてのシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を、方法Ｂによって生成されたｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤｖｓ．対照ＡＭＰＰＤ（登録商標）について示す。
【図２０】アルカリホスファターゼ希釈曲線についてのシグナル（ＲＬＵで）を、方法Ｂによって生成されたｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（ＡＤＰ−Ｓｔａｒ−ＥＥ）ｖｓ．ＣＳＰＤ（登録商標）、ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）対照について示す。
【図２１】アルカリホスファターゼ希釈曲線についてのシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を、方法Ｂによって生成されたｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（ＡＤＰ−Ｓｔａｒ−ＥＥ）ｖｓ．ＣＳＰＤ（登録商標）、ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）対照について示す。
【図２２】３０分のＩＬ−６のＥＬＩＳＡ感度曲線を、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤ  ｖｓ．対照ＡＭＰＰＤ（登録商標）について示す。
【図２３】ＩＬ−６のＥＬＩＳＡによって評価されたｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤ産生の時間経過を示す。
【図２４】化学発光促進剤（Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ（商標））の存在下における、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（ＡＤＰ  Ｓｔａｒ  ＥＥ）ｖｓ．対照ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）およびＣＳＰＤ（登録商標）についての光放射曲線を示す。
【図２５】化学発光促進剤（Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ（商標））の存在下における、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（ＡＤＰ  Ｓｔａｒ  ＥＥ）ｖｓ．対照ジオキセタン、ＣＳＰＤ（登録商標）、ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）についての最大光シグナル曲線（％）を経時的に示す。
【図２６】ｒｈＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ検出曲線を、化学発光促進剤（Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ（商標））の存在下における、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（ＡＤＰ−Ｓｔａｒ  ＥＥ）ｖｓ．対照ジオキセタン、ＣＳＰＤ（登録商標）、ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）について示す。
【図２７】ＴＢＱ促進剤（ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリブチルアンモニウム）］）の存在下における、ｉｎ  ｓｉｔｕで生成されたＡＤＰ−Ｓｔａｒ（ＡＤＰ＊）についてのバックグラウンド対シグナルの（Ｓ／Ｂ）キネティクスを示す。
【図２８】ＴＢＱ促進剤の存在下における、ｉｎ  ｓｉｔｕで生成されたＡＤＰ−Ｓｔａｒ（ＡＤＰ＊）についての３０分の時間ポイントでのＩＬ−６のＥＬＩＳＡ感度比較を示す。
【図２９】ＴＢＱ促進剤の存在下における、ｉｎ  ｓｉｔｕで生成されたＡＤＰ−Ｓｔａｒ（ＡＤＰ＊）についての６０分の時間ポイントでのＩＬ−６のＥＬＩＳＡ感度比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は本明細書において開示される実施形態に限定されていないことを理解されたい。さらに、方法およびキットは、様々な工程または構成要素を「含む」という用語で記載される（「含むが、これらに限定されない」という意味として解釈される）が、方法およびキットは、さらに様々な工程および構成要素からも「本質的になる」または「なる」ことができ、かかる用語は閉じたメンバーの群を本質的に定義すると解釈されるべきである。最終的に、本明細書および添付の請求項中で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指示しない限り複数の指示物を含むことが指示される。
【００４６】
定義
アクセプター色素は、光を放射する他の分子からエネルギー（特に光）を受け取ることができ、同様に、検出可能なエネルギー（この場合もやはり好ましくは光）を放射することができる分子を指す。
【００４７】
検体は、分析手順において決定される物質または化学物質の組成を指す。本明細書において使用される時、この用語は、抗原または抗体を含むが、これらに限定されない。
【００４８】
抗原は、抗体が結合できる物質を指す。
【００４９】
抗体は、血液または他の脊椎動物の体液中に見出され、外来物を同定し中和するために免疫系によって使用されるガンマグロブリンタンパク質を指す。本明細書において使用される時、この用語は、抗原を結合することができる任意のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体またはその断片を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
促進剤とは、１，２−ジオキセタン酵素基質の酵素的切断およびその後の分解からもたらされる特異的な光エネルギー生産を増加させ、観察されたこの光産生が促進剤のない状態で観察されたものを超える、水溶性物質を指す。
【００５１】
酵素は化学物質反応を触媒するタンパク質を指す。
【００５２】
ハプテンは、大きなキャリアー（タンパク質等）に付加された場合のみに免疫反応を誘発できる低分子を指す。
【００５３】
加水分解酵素またはヒドロラーゼは、化学物質結合の加水分解を触媒し、酵素のＥＣ番号分類においてＥＣ３として分類される酵素を指す。
【００５４】
核酸はＤＮＡ、ＲＮＡまたはその断片を指す。
【００５５】
オリゴヌクレオチドは短い核酸ポリマーを指す。本明細書において使用される時、この用語は、２〜１０００の核酸を含む核酸ポリマーを含むが、これらに限定されない。
【００５６】
オキシダントは、容易に酸素原子を移す化学化合物、または酸化還元化学物質反応において電子を獲得する物質である。本明細書において使用される時、用語は、酸化薬剤または酸化剤という用語と互換的に使用される。
【００５７】
本発明は、ｉｎ  ｓｉｔｕで、水性または他の条件において化学発光酵素基質を生成する、および／または光を生成するためにこの基質を使用する方法を提供する。光の生成を使用して、サンプル中の酵素、抗原または核酸の存在を決定することができる。これらの方法は、組み合わせた場合に水溶液中で１，２−ジオキセタン酵素基質を形成する、安定化したエノールエーテルおよびオキシダントに関する。本発明は、サンプル中の検体の存在および／または量の検出のためのキットも提供する。キットは、組み合わせた場合に水溶液中で１，２−ジオキセタン酵素基質を形成する、安定化したエノールエーテルおよびオキシダントを含む。これらの方法およびキットは、当技術分野で認められているアッセイにおいて有益である。
【００５８】
一態様から見ると、本発明は光を生成する方法を提供する。方法はオキシダントを提供する工程と；構造
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を有するエノールエーテルを提供する工程と：水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する工程と；１，２−ジオキセタン酵素基質を切断できる酵素部分を含む酵素複合体を提供する工程と；酵素複合体を１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させて反応混合物を形成する工程と；反応混合物が光を生成することを可能にする工程とを含む。
【００５９】
これらの方法の１つの工程において、オキシダントが提供される。このオキシダントは、エノールエーテル［１］をその対応する１，２−ジオキセタン酵素基質に転換することができるものであるだろう。
【００６０】
いくつかの実施形態において、オキシダントは、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩および過酸化水素、アリールエンドペルオキシド、過酸化カルシウムペルオキシハイドレートならびにそれらの組み合わせから選択することができる。これらの実施形態のいくつかにおいて、オキシダントは、過酸化水素または過酸化水素およびモリブデン酸ナトリウムであり得る。
【００６１】
オキシダントは溶液または粉末として提供され得る。オキシダントが複数の構成要素を含む場合には、これらの構成要素の１つまたは複数（しかしすべてでない）は、エノールエーテルの有無にかかわらず組み合わせることができる。
【００６２】
これらの方法の他の工程において、エノールエーテル［１］が提供される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、エノールエーテル［１］は、直鎖アルキル、直鎖アルケニル、分岐状アルキル、分岐状アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルキル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択されるＡおよびＢを有することができ、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは１つまたは複数の電子活性基、可溶化基または光促進基により置換されてもよく、ＡおよびＢがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの１つは、エノールエーテルの二重結合を形成する２つの炭素原子のうちの１つである。
【００６４】
電子活性基の例は以下のものを含む。Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、１〜２０の炭素原子を含む直鎖アルキル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルキル、２〜２０の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、１〜２０の炭素原子を含むアルコキシ、６〜１４の炭素原子を含むアリール、６〜１４の炭素原子を含むアリールオキシ、２〜２１の炭素原子を含むエステル、３〜３０の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、３〜３０の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、２〜２１の炭素原子を含むアルキルアミド、７〜１５の炭素原子を含むアリールアミド、２〜２１の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、７〜１５の炭素原子を含むアリールカルバモイル、１〜２０の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、６〜１４の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、３〜６０の炭素原子を含むトリアルキルシリル、１８〜４２の炭素原子を含むトリアリールシリル、７〜３２の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、１〜２０の炭素を含むアルキルアミドスルホニル、６〜１４の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、１〜２０の炭素原子を含むアルキルスルホニル、６〜１４の炭素原子を含むアリールスルホニル、２〜２０の炭素原子を含むアルキルチオおよび６〜１４の炭素原子を含むアリールチオ。
【００６５】
可溶化基の例は以下のものを含む。カルボン酸基、マロン酸基、ヒドロキシル基、サルフェート基、スルホネート基、ホスフェート基およびアンモニウム基；ポリ（エトキシ）ｎ基［−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｎ］（式中、ｎ＝１〜３０、カルボン酸基、マロン酸基、ヒドロキシル基、サルフェート基、スルホネート基、ホスフェート基およびアンモニウム基を末端とする）；ポリ［−Ｏ−（ＣＨ２−）ｎ］（式中、ｎ＝１〜３０、カルボン酸基、マロン酸基、ヒドロキシル基、サルフェート基、スルホネート基、ホスフェート基およびアンモニウム基を末端とする）。
【００６６】
光促進基の例は以下のものを含む。アルキルアンモニウム基、アルキルホスホニウム基、アルキルスルホニウム基；アルキルアリールアンモニウム基、アルキルアリールホスホニウム基およびアルキルアリールスルホニウム基；またはアリールアンモニウム基、アリールホスホニウム基およびアリールスルホニウム基；およびポリ（アルキルアンモニウム）基、ポリ（アルキルホスホニウム）基、ポリ（アルキルスルホニウム）基；ポリ（アルキルアリールアンモニウム）基、ポリ（アルキルアリールホスホニウム）基およびポリアルキルアリールスルホニウム基；またはポリ（アリールアンモニウム）基、ポリ（アリールホスホニウム）基およびポリ（アリールスルホニウム）基等のカチオン性モイエティまたはポリカチオン性モイエティ。
【００６７】
いくつかの実施形態において、ＡおよびＢは、１〜２０の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され得、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは１つまたは複数の電子活性基、可溶化基または光促進基により置換されてもよく、ＡおよびＢがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの１つは、エノールエーテルの二重結合を形成する２つの炭素原子のうちの１つである。
【００６８】
いくつかの実施形態において、ＡまたはＢのうちの少なくとも１つは
2013533354.tif 000018
であり得る。他の実施形態において、ＡおよびＢは、ともに
2013533354.tif 000019
であり得る。
【００６９】
いくつかの実施形態において、エノールエーテル［１］は、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアラルキルであり得るＲ１を有するだろう。これらのいくつかにおいて、Ｒ１は、１〜２０の炭素原子を含むアルキル、６〜１４の炭素原子を含むアリール、７〜１５の炭素原子を含むアラルキル、４〜２０の炭素原子を含むヘテロアリール、または５〜２０の炭素を含むヘテロアラルキルであり得る。これらのいくつかにおいて、Ｒ１は１〜２の炭素原子を含むアルキルまたは１〜２の炭素原子を含むトリフルオアルキル（ｔｒｉｆｌｕｏａｌｋｙｌ）であり得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、エノールエーテル［１］は、光を放射できるヘテロアリール環を含むが、これらに限定されない、アリール環化合物または縮合多環式化合物であり得るＴを有する。光の産生を妨害せず、付加されているジオキセタン環の４−炭素原子の原子価を満たすように、Ｔが選択される。Ｔは、対応するジオキセタン分解断片がエネルギーを吸収し、励起状態を形成し、その励起状態から断片が光学的に検出可能なエネルギーを放射して基底状態に戻ることを可能にする光を放射する蛍光団を形成する多数の蛍光発色団基のいずれかを示す。Ｔはまた、酵素によって切断可能な結合を含む酵素切断可能基により置換されて、ジオキセタン環に結合された電子豊富なモイエティ（例えば酸素アニオン、硫黄アニオンまたは窒素アニオン）を、直接または後続するｐＨの調整のいずれかによって産出する。
【００７１】
いくつかの実施形態において、Ｔはアリール（フェニル等）であり得、それは電子活性基、可溶化基または光促進基により置換され得る。
【００７２】
いくつかの実施形態において、Ｔは、酵素によって切断した場合に縮合多環モイエティを電子豊富にし、次にジオキセタン化合物を光の放射のために分解可能にする結合を含む、酵素的に切断可能な不安定な環置換基を有する縮合多環含有蛍光団モイエティであり得る。
【００７３】
その残基がこの蛍光団モイエティの形成に使用できる縮合多環化合物の中には、９〜約３０の環炭素原子を含有する縮合多環芳香族炭化水素環の蛍光化合物が含まれ、例えばナフタレン：
2013533354.tif 000020
ペンタレン、アズレン、ヘプタレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、ビフェニレン、ペリレン、アセナフチレン、フェナントレン、アントラセン、アセフェナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセンおよび同種のものに加えて、１つまたは複数の非不安定置換基例えば、１〜２０の炭素原子を有する分岐状アルキル基または直鎖アルキル基（例えばメチル、ｎ−ブチルまたはデシルが包含される）、１〜７の炭素原子を有する分岐状ヘテロアルキル基または直鎖ヘテロアルキル基（例えばメトキシ、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルが包含される）；１または２つの環を有するアリール基（例えばフェニル）；１または２つの環を有するヘテロアリール基（例えばピロリルまたはピラゾリル）；３〜７の炭素原子を有するシクロアルキル基（環状で、例えばシクロヘキシルが包含される）；３〜６の炭素原子を有するヘテロシクロアルキル基（環状で、例えばジオキサンが包含される）；１または２つの環を有するアラルキル基（例えばベンジル）；１または２つの環を有するアルカリール基（例えばトリル）；電子吸引基（１〜７の炭素原子を有するペルフルオロアルキル基等、例えばトリフルオロメチルが包含される）；ハロゲン；ＣＯ２Ｈ、ＺＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＮＯ２、ＺＮＯ２、ＣＮまたはＺＣＮ（式中、Ｚは１〜７の炭素原子を有する分岐状アルキル基または直鎖アルキル基であり、例えばメチル基、または１もしくは２つの環を有するアリール基（例えばフェニル）が包含される）；電子供与基（例えば分岐状または直鎖のＣ１−Ｃ７アルコキシ基、例えばメトキシまたはエトキシ）：１または２つの環を有するアラルコキシ基（例えばフェノキシ）；分岐状または直鎖のＣ１−Ｃ７アルコキシ基（例えばメトキシまたはエトキシ）；１または２つの環を有するアラルコキシ基（例えばフェノキシ）；分岐状または直鎖のＣ１−Ｃ７ヒドロキシアルキル基（例えばヒドロキシメチルまたはヒドロキシエチル）；１または２つの環を有するヒドロキシアリール基（例えばヒドロキシフェニル）；分岐状または直鎖のＣ１−Ｃ７アルキルエステル基（例えばアセテート）；１または２つの環を有するアリールエステル基（例えばベンゾアート）；または１または２つの環を有するヘテロアリール基（例えばベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾールまたはベンゾトリアゾール）により置換されたその誘導体が包含される。
【００７４】
さらに、Ｔによって示される蛍光団モイエティの縮合多環部分は、縮合多環芳香族複素環の蛍光化合物、例えば、ベンゾ［ｂ］チオフェン、ナフト［２，３−ｂ］チオフェン、チアントレン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチン、キノリン、イソキノリン、フェナントリジン、フェナジン、フェノキサジン、フェノチアジン、フェナントロリン、プリン、４Ｈ−キノリジン、フタラジン、ナフチリジン、インドール、インドリジン、クロマン、イソクロマン、インドリン、イソインドリン、および同種のものの残基でもあり得、前述の非不安定置換基の１つまたは複数により非置換または置換され、９〜約３０の環原子を含有し、包括的には、その大部分は炭素原子である。
【００７５】
いくつかの実施形態において、Ｔは
2013533354.tif 000021
（式中、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオメチル（ｔｒｉｆｌｕｏｍｅｔｈｙｌ）、トリフルロエチル（ｔｒｉｆｌｕｒｏｅｔｈｙｌ）、直鎖アルキル、分岐状アルキル、直鎖アルケニル、分岐状アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルキル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキル、ポリシクロヘテロアルケニル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、エステル、トリアルキルアンモニウム、トリアルキルホスホニウム、アルキルアミド、アリールアミド、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド、トリアルキルシリル、トリアリールシリル、アルキルアリールシリル、アルキルアミドスルホニル、アリールアミドスルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルチオおよびアリールチオからなる群から独立して選択される）であり得る。これらのいくつかにおいて、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオメチル（ｔｒｉｆｌｕｏｍｅｔｈｙｌ）、トリフルロエチル（ｔｒｉｆｌｕｒｏｅｔｈｙｌ）、１〜２０の炭素原子を含む直鎖アルキル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルキル、２〜２０の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、４〜６０の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、１〜２０の炭素原子を含むアルコキシ、６〜１４の炭素原子を含むアリール、６〜１４の炭素原子を含むアリールオキシ、２〜２１の炭素原子を含むエステル、３〜３０の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、３〜３０の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、２〜２１の炭素原子を含むアルキルアミド、７〜１５の炭素原子を含むアリールアミド、２〜２１の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、７〜１５の炭素原子を含むアリールカルバモイル、１〜２０の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、６〜１４の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、３〜６０の炭素原子を含むトリアルキルシリル、１８〜４２の炭素原子を含むトリアリールシリル、７〜３２の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、１〜２０の炭素原子を含むアルキルアミドスルホニル、６〜１４の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、１〜２０の炭素原子を含むアルキルスルホニル、６〜１４の炭素原子を含むアリールスルホニル、２〜２０の炭素原子を含むアルキルチオおよび６〜１４の炭素原子を含むアリールチオからなる群から独立して選択され得る）であり得る。
【００７６】
いくつかの実施形態において、エノールエーテル［１］は、ホスフェート、アセテート、１−ホスホ−２，３−ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ−ガラクトシド、α−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルコシド、α−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−マンノシド、β−フルクトフラノシド、β−Ｄ−グルクロニドまたは
2013533354.tif 000022
（式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は各々独立してＨまたは１〜４の炭素原子のアルキル（分岐状または直鎖）である）である、ＯＲ２を有することができる。これらのいくつかにおいて、Ｒ２は
2013533354.tif 000023
である。
【００７７】
Ｒ２（酵素的に切断可能な置換基）は、一般式
2013533354.tif 000024
（式中、Ｍ＋はカチオン（アルカリ金属（例えばナトリウムまたはカリウム）、アンモニウム、またはＣ１−７アルキル、アラルキルもしくは芳香族第四級アンモニウムカチオン、Ｄ３が各々アルキル（例えばメチルまたはエチル、アラルキル、例えばベンジル）であり得るかまたは複素環システム（例えばピリジニウム）の一部を形成するＮ（ＤＲ３）４＋、および特にジナトリウム塩等）を示す）によって示されるリン酸エステル基を含み得る。かかる第四級アンモニウムカチオンは、ポリマー性骨格にそれらの四級化基の１つを通して連結させることもでき、すなわち
2013533354.tif 000025
（式中、ｎは１を越えるか、またはポリ第四級アンモニウム塩（すなわちイオネンポリマー）の一部であり得る）である。
【００７８】
いくつかの実施形態において、Ｒ２はＥ−Ｌ−Ｎｕｃ−Ｚ（式中、Ｅは求電子性原子を含む基であり、Ｚ基の酵素的切断に際してこの原子はＮｕｃ基の電子対によって攻撃され、近接性補助によって１，２−ジオキセタン酵素基質アニオンを放出し；Ｌは連結基であり；Ｎｕｃは求核原子であり；Ｚは酵素的切断可能基であり；式中、
Ｅはカルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり得；
Ｌは、１〜４の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−または−（ＣＨ２）ｍ−ＮＲ６−（ＣＨ２）ｎ−からなる群から選択され得、式中、ｍおよびｎは０〜３であり、ｍ＋ｎは２または３であり、式中、Ｒ６は１〜１０の炭素原子を含むアルキルであり、連結基は、１〜２４の炭素原子を含むアルキル、２〜２４の炭素原子を含むアルケニル、１〜２４の炭素原子を含み、１〜２４の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、２〜２４の炭素原子を含み、１〜２４の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、６〜１０の炭素を含むアリール、１〜２４の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または２〜２４の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換することができ；
Ｎｕｃは酸素原子または硫黄原子であり得；
Ｚは、ホスホリル、アセチル、１−ホスホ−２，３−ジアシルグリセロシル（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｓｙｌ）、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α−Ｄ−ガラクトシル、β−Ｄ−ガラクトシル、α−Ｄ−グルコシル、β−Ｄ−グルコシル、α−Ｄ−マンノシル、β−Ｄ−マンノシル、β−フルクトフラノシル、β−Ｄ−グルコシドウランシル（ｇｌｕｃｏｓｉｄｕｒａｎｓｙｌ）または
2013533354.tif 000026
であり得、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は各々独立してＨまたは１〜４の炭素原子のアルキル（分岐状または直鎖）である）であり得る。
【００７９】
いくつかの実施形態において、Ｚは
2013533354.tif 000027
であり得る。
【００８０】
いくつかの実施形態において、エノールエーテル［１］は、
2013533354.tif 000028
2013533354.tif 000029
2013533354.tif 000030
2013533354.tif 000031
であり得る。
【００８１】
これらの方法の他の工程において、水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する。水溶液は水、１つもしくは複数の緩衝液構成要素、１つもしくは複数の有機溶媒、１つもしくは複数の着色剤、１つもしくは複数の防腐剤、またはそれらの組み合わせを含むことができる。１，２−ジオキセタン酵素基質の提供に必要な水溶液中のオキシダントおよびエノールエーテルの濃度の決定は、診断技術分野における当業者の技術内である。
【００８２】
これらの方法の他の工程において、１，２−ジオキセタン酵素基質を切断できる酵素部分を含む酵素複合体が提供される。酵素部分は、酵素、酵素連結抗体、酵素連結抗原または酵素連結オリゴヌクレオチドであり得る。
【００８３】
酵素部分は、１，２−ジオキセタン酵素基質を切断できる酵素を含む。いくつかの実施形態において、酵素は加水分解酵素であり得る。加水分解酵素は、エステル結合を切断しＥＣ  ３．１として分類される酵素または糖結合を切断しＥＣ  ３．２として分類される酵素を含み、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼまたはノイラミニダーゼを含むが、これらに限定されない。
【００８４】
酵素、抗原または核酸を含む疑いのあるサンプルがアッセイされる。サンプルは生物学的または非生物学的な起源であり得る。サンプルが生物学的起源である場合、それは血液、血清、血漿、尿、糞便、唾液、粘液、精液、組織、組織抽出物、細胞培養培地、細胞、細胞抽出物、および同種のものであり得る。
【００８５】
いくつかの実施形態において、酵素部分は酵素であり得る。これらの実施形態において、サンプル中の酵素は酵素複合体を含む。酵素複合体を１，２−ジオキセタン酵素基質と接触させて反応混合物を形成し、反応混合物が光を生成することを可能にする。
【００８６】
いくつかの実施形態において、光の放射が検出され、かかる放射が酵素の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する酵素の量に相関させることができる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、酵素部分は酵素連結抗体であり得る。酵素連結抗体は、抗原に結合可能な第１の抗体、および１，２−ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む。これらの実施形態において、酵素連結抗体、抗原、および抗原に結合可能で固相上に固定化された第２の抗体は、酵素複合体を構成する。酵素複合体を１，２−ジオキセタン酵素基質と接触させて反応混合物を形成し、反応混合物が光を生成することを可能にする。
【００８８】
いくつかの実施形態において、抗原を含む疑いのあるサンプルを、第１の抗体および酵素を含む酵素連結抗体ならびに第２の抗体を含む固相と接触させ、そこで両方の抗体は抗原を結合することができ、１，２−ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素複合体を提供する。サンプル、酵素連結抗体および固相は任意の順序で組み合わせることができる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、方法は、酵素複合体の洗浄によって、任意の未結合の酵素連結抗体を酵素複合体から除去する工程をさらに含み得る。これは、酵素複合体の構成要素と適合性のある緩衝液の添加および除去によって実行することができる。かかる緩衝液は診断技術分野において周知である。固相の追加の洗浄工程を実行することができる。
【００９０】
第１の抗体、第２の抗体または両方はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組換え抗体であり得る。
【００９１】
固相は、ビーズ、試験管、マルチウェルプレート、マイクロアレイ、ゲル、膜、微粒子、ナノ結晶、量子ドットおよび同種のものであり得る。これらの固相が作製される材料は診断技術分野において公知である。
【００９２】
第２の抗体は、診断技術分野において公知の技法によって、固相に対する抗体の非共有結合または共有結的な付加によって固相上に固定化することができる。
【００９３】
第１の抗体は酵素に共有結合または非共有結合で連結され得る。非共有結合で連結される場合、第１の抗体は標識に共有結合で連結され、酵素は標識に非共有結合できる分子に共有結合で連結される。
【００９４】
いくつかの実施形態において、標識はビオチンまたはビオチン誘導体であり、分子はアビジンまたはストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）であり得る。ビオチン誘導体は置換を有するビオチン分子である。ビオチン構造の一部が欠損しているビオチン分子もビオチン誘導体と判断される。ビオチン誘導体は置換された合成ビオチンに加えて天然に存在するビオチンも含む。
【００９５】
いくつかの実施形態において、標識はハプテンであり、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。ハプテンとしてのジゴキシゲニンの使用および分子としての抗ジゴキシゲニンは、診断技術分野において公知である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、酵素部分は酵素連結抗原であり得る。酵素連結抗原は、抗原、および１，２−ジオキセタン酵素基質を切断できる酵素を含む。これらの実施形態において、酵素複合体は、抗原を結合できる抗体を含む固相に結合された酵素連結抗原を含む。酵素複合体を１，２−ジオキセタン酵素基質と接触させて反応混合物を形成し、反応混合物が光を生成することを可能にする。
【００９７】
いくつかの実施形態において、抗原を含む疑いのあるサンプルは、酵素連結抗原、および抗原に結合できる抗体を含む固相と接触させることができる。サンプル、酵素連結抗原および固相は任意の順序で組み合わせることができる。
【００９８】
いくつかの実施形態において、方法は、酵素複合体の洗浄によって、任意の未結合の酵素連結抗原を酵素複合体から除去する工程をさらに含み得る。これは、酵素複合体の構成要素と適合性のある緩衝液の添加および除去によって実行することができる。かかる緩衝液は診断技術分野において周知である。固相の追加の洗浄工程を実行することができる。
【００９９】
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組換え抗体であり得る。
【０１００】
固相は、ビーズ、試験管、マルチウェルプレート、マイクロアレイ、ゲル、膜、微粒子、ナノ結晶、量子ドットおよび同種のものであり得る。これらの固相が作製される材料は診断技術分野において公知である。
【０１０１】
抗体は、固相に対する抗体の非共有結合または共有結的な付加によって固相に固定化することができる。
【０１０２】
抗体は酵素に共有結合または非共有結合で連結され得る。非共有結合で連結される場合、抗原は標識に共有結合で連結され、酵素は標識に非共有結合できる分子に共有結合で連結され得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、上記のように、標識はビオチンまたはビオチン誘導体であり、分子はアビジンまたはストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）であり得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、標識はハプテンであり、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。ハプテンとしてのジゴキシゲニンの使用および分子としての抗ジゴキシゲニンは、診断技術分野において公知である。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、酵素部分は酵素連結オリゴヌクレオチドである。酵素連結オリゴヌクレオチドは、特定の核酸にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、および１，２−ジオキセタン酵素基質を切断できる酵素を含む。これらの実施形態において、酵素複合体は、核酸を含む固相にハイブリダイズされた酵素連結オリゴヌクレオチドを含む。酵素複合体を１，２−ジオキセタン酵素基質と接触させて反応混合物を形成し、反応混合物が光を生成することを可能にする。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、方法は、核酸を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と；核酸を固相上へ固定化する工程と；固定化された核酸および酵素連結オリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成する工程と；１，２−ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、光の放射が核酸の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する核酸の量に相関させることができる工程とをさらに含むことができる。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、方法は、酵素複合体の洗浄によって、任意の未結合の酵素連結抗体オリゴヌクレオチドを酵素複合体から除去する工程をさらに含み得る。これは、酵素複合体の構成要素と適合性のある緩衝液の添加および除去によって実行することができる。かかる緩衝液は診断技術分野において周知である。固相の追加の洗浄を実行することができる。
【０１０８】
固相は、ビーズ、試験管、マルチウェルプレート、マイクロアレイ、ゲル、膜、微粒子、ナノ結晶、量子ドットおよび同種のものであり得る。これらが作製される材料は診断技術分野において公知である。
【０１０９】
オリゴヌクレオチドは酵素に共有結合または非共有結合で連結され得る。非共有結合で連結される場合、オリゴヌクレオチドは標識に共有結合で連結され、酵素は標識に非共有結合できる分子に共有結合で連結され得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、上記のように、標識はビオチンまたはビオチン誘導体であり、分子はアビジンまたはストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）であり得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、標識はハプテンであり、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。ハプテンとしてのジゴキシゲニンの使用および分子としての抗ジゴキシゲニンは、診断技術分野において公知である。
【０１１２】
この方法の他の工程において、サンプルを１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させて反応混合物を形成する。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、サンプルは１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液に添加することができ、一方他の実施形態において１，２−ジオキセタン酵素基質を含む水溶液をサンプルに添加することができる。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、反応混合物は促進剤をさらに含み得る。促進剤はＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）および他のミセル形成物質を含み得る。促進剤はポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩またはそれらの組み合わせを含み得る。ポリマー性第四級アンモニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）、ポリ［ビニルベンジル（塩化ベンジルジメチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリブチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム）］またはそれらの組み合わせであり得る。ポリマー性第四級ホスホニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）およびポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）を含むコポリマー、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、促進剤はアクセプター色素をさらに含み得る。これらの実施形態の中で、アクセプター色素は蛍光色素であり得る。これらの実施形態のいくつかにおいて、蛍光色素はフルオレセインであり得る。
【０１１６】
これらの方法の他の工程において、反応混合物が光を生成することを可能にする。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、光は肉眼により観察されるか、またはＸ線フィルムもしくは生成された光を検出および測定できる装置を使用して測定され得る。生成された光を検出および測定できる装置は、ルミノメーター、フィルムを用いるカメラ、または電荷結合カメラを含むが、これらに限定されない。
【０１１８】
他の態様から見ると、本発明は、オキシダントおよび構造［１］を有するエノールエーテル（両者は上で定義される）を含むサンプル中の検体の存在または量を検出するためのキットを提供する。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、オキシダントは、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩および過酸化水素、アリールエンドペルオキシド、過酸化カルシウムペルオキシハイドレートならびにそれらの組み合わせから選択することができる。これらの実施形態のいくつかにおいて、オキシダントは、過酸化水素または過酸化水素およびモリブデン酸ナトリウムであり得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、キットは上記のような促進剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、キットは上記のようなアクセプター色素をさらに含み得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、キットは、その構成要素を使用するための説明書をさらに含むことができる。
【０１２２】
以下の実施例は、本発明を説明するが限定しないことを意図する。
【実施例】
【０１２３】
実施例１
エノールエーテルホスフェートの一般的合成
ａ．エノールエーテルトリエステルホスフェートの合成
2013533354.tif 000032
Ａ、Ｂ、Ｒ１およびＲ６は、発明を実施するための形態において定義された通りである。
【０１２４】
オキシ塩化リン（１．５当量）を、ピリジン（０．７ｍｌ／ｍｍｏｌｅフェノールエノールエーテル、塩基性酸化アルミニウムの上で一晩乾燥した）に、アルゴン雰囲気下の０℃で徐々に添加する。少量の白色煙が指摘されるが、沈殿は形成されない。このＰＯＣｌ３溶液に、無水ＴＨＦ（３ｍｌ／ｍｍｏｌｅフェノールエノールエーテル）中のフェノールエノールエーテル（３０ｍｍｏｌｅ、１当量）の溶液を、９０分間にわたって滴下漏斗を介して添加する。白色ピリジン塩酸塩沈殿が添加の間に形成される。余剰体積のＴＨＦを使用して保存ボトルおよび滴下漏斗をリンスし、反応混合物に添加する。懸濁物を０℃で１５分間および室温で３時間撹拌する。次いで反応混合物を冷却して０℃に戻し、３−ヒドロキシプロピオニトリル（３．９５当量）を注射器を介して細い流れで徐々に添加する。０℃で５分間の撹拌後に、さらに多くの白色沈殿物が途中で析出するが、混合物は室温で一晩撹拌する。沈殿物を濾過によって除去し、ヘキサン中のＥｔＯＡｃでリンスする。合わせた濾液を減圧下で濃縮して、淡黄色油を得た。
【０１２５】
粗製産物に飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１３ｍｌ／ｍｍｏｌｅフェノールエノールエーテル）を添加し、次いで適切な水を添加して任意の存在する塩を溶解する。水溶液をヘキサン中の６０％ＥｔＯＡｃにより３回抽出する。合わせた有機溶液を水およびブラインで連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥し、回転蒸発装置によって濃縮する。粘着性の粗製産物をヘキサン中の５％のＥｔＯＡｃにより３回粉砕する（加熱し、室温次いで０℃まで冷却する）。ＴＬＣにより、残存するピリジンの大部分ならびに微量の未反応出発フェノールエノールエーテルおよびわずかなビス−アリールモノ−シアノエチルホスフェートトリエステル副産物が粉砕によって除去されることが示される。次いで、産物を一定の重さのゴムまで真空下でポンプで減圧する。
【０１２６】
ｂ．エノールエーテルホスフェートの合成
2013533354.tif 000033
Ａ、Ｂ、Ｒ１およびＲ６は発明を実施するための形態において定義された通りである。
【０１２７】
無水ＭｅＯＨ（３ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）中のホスフェートトリエステルエノールエーテル（２８ｍｍｏｌｅ、１当量）の溶液に、ＭｅＯＨ溶液中の４．３７Ｍ  ＮａＯＭｅ（２当量）を、アルゴン雰囲気下の０℃で、注射器を介して細い流れで添加する。混合物を０℃で数分間撹拌し、次いで室温まで温める。大量の沈殿が室温での撹拌の間に形成される。フラスコを時々軽く叩いて、撹拌溶液の中へ沈着する固体を戻し入れる。濃厚な懸濁物を一晩撹拌する。反応混合物を回転蒸発装置に置いてＭｅＯＨ体積の約２分の１を除去し、残存する懸濁物に１．５％水／アセトン（７ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）を添加する。追加体積のアセトン（７ｍｌ／ｍｍｏｌトリエステルホスフェート）を添加して大部分の粉末を濾過器に移す。濾過ケーキを冷アセトン（２ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）でリンスし、真空デシケーター中で乾燥するまでポンプで減圧して、白色紛体を得た。
【０１２８】
粗製粉末を水（０．３５ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）中に溶解し、ブフナー漏斗上で溶液を濾過することによってさらに精製する。追加体積の水（０．３５ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）を使用して保存容器および濾過漏斗をリンスし、濾過する。次いで合わせた濾液をフリーザーボトルに移し、追加体積の水（０．３５ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）を使用して濾過フラスコをリンスし、溶液に添加する。合わせた水溶液をアセトン（１３ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）に添加した場合、重い沈殿物が溶液から析出する。追加体積のアセトン（１．４ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）を添加してより容易な濾過のために懸濁物を希釈する。３０分間ベンチ上で懸濁物を放置し、次いで白色沈殿物を濾過によって回収する。濾過ケーキをアセトンで複数回洗浄し、一定の重さの白色紛体まで真空デシケーター中で乾燥する。
【０１２９】
実施例２
ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェートの合成
ＡＭＰＰＤエノールエーテルフェノールの合成は米国特許第５，１７７，２４１号中で報告される。
2013533354.tif 000034
【０１３０】
ｂ．ＡＭＰＰＤエノールエーテルトリエステルホスフェートの合成
2013533354.tif 000035
オキシ塩化リン（１．５当量）を、ピリジン（０．７ｍｌ／ｍｍｏｌｅフェノールエノールエーテル、塩基性酸化アルミニウムの上で一晩乾燥した）に、アルゴン雰囲気下の０℃で徐々に添加する。沈殿物は形成されない。このＰＯＣｌ３溶液に、無水ＴＨＦ（３ｍｌ／ｍｍｏｌｅフェノールエノールエーテル）中のＡＭＰＤＤエノールエーテルフェノール（３０ｍｍｏｌｅ、１当量）の溶液を、９０分間にわたって滴下漏斗を介して添加する。白色ピリジン塩酸塩沈殿が添加の間に形成される。余剰体積のＴＨＦを使用して保存ボトルおよび滴下漏斗をリンスし、反応混合物に添加する。懸濁物を０℃で１５分間および室温で３時間撹拌する。次いで反応混合物を冷却して０℃に戻し、３−ヒドロキシプロピオニトリル（３．９５当量）を注射器を介して細い流れで徐々に添加する。０℃で５分間の撹拌後に、さらに多くの白色沈殿物が途中で析出するが、混合物を室温で一晩撹拌する。沈殿物を濾過によって除去し、ヘキサン中のＥｔＯＡｃでリンスする。合わせた濾液を減圧下で濃縮して、淡黄色油を得た。粗製産物に飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１３ｍｌ／ｍｍｏｌｅフェノールエノールエーテル）を添加し、次いで適切な水を添加して任意の存在する塩を溶解する。水溶液をヘキサン中の６０％ＥｔＯＡｃにより３回抽出する。合わせた有機溶液を水およびブラインで連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥し、回転蒸発装置によって濃縮する。粘着性の粗製産物をヘキサン中の５％のＥｔＯＡｃにより３回粉砕する（加熱し、室温次いで０℃まで冷却する）。ＴＬＣにより、残存するピリジンの大部分ならびに微量の未反応出発エノールエーテルフェノールおよびわずかなビス−アリールモノ−シアノエチルホスフェートトリエステル副産物が粉砕によって除去されることが示される。次いで、産物を一定の重さのゴムまで真空下でポンプで減圧する。
【０１３１】
ｃ．ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェートの合成
2013533354.tif 000036
無水ＭｅＯＨ（３ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）中のＡＭＰＰＤエノールエーテルトリエステルホスフェート（２８ｍｍｏｌｅ、１当量）の溶液に、ＭｅＯＨ溶液中の４．３７Ｍ  ＮａＯＭｅ（２当量）を、アルゴン雰囲気下の０℃で、注射器を介して細い流れで添加する。混合物を０℃で数分間撹拌し、次いで室温まで温める。大量の沈殿が室温での撹拌の間に形成される。フラスコを時々軽く叩いて、撹拌溶液の中へ沈着する固体を戻し入れる。濃厚な懸濁物を一晩撹拌する。反応混合物を回転蒸発装置に置いてＭｅＯＨ体積の約２分の１を除去し、残存する懸濁物に１．５％水／アセトン（７ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）を添加する。追加体積のアセトン（７ｍｌ／ｍｍｏｌトリエステルホスフェート）を添加して大部分の粉末を濾過器に移す。濾過ケーキを冷アセトン（２ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）でリンスし、真空デシケーター中で乾燥するまでポンプで減圧して、白色紛体を得た。
【０１３２】
粗製粉末を水（０．３５ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）中に溶解し、ブフナー漏斗上で溶液を濾過することによってさらに精製する。追加体積の水（０．３５ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）を使用して保存容器および濾過漏斗をリンスし、濾過する。次いで合わせた濾液をフリーザーボトルに移し、追加体積の水（０．３５ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）を使用して濾過フラスコをリンスし、溶液に添加する。合わせた水溶液をアセトン（１３ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）に添加した場合、重い沈殿物が溶液から析出する。追加体積のアセトン（１．４ｍｌ／ｍｍｏｌｅトリエステルホスフェート）を添加してより容易な濾過のために懸濁物を希釈する。３０分間ベンチ上で懸濁物を放置し、次いで白色沈殿物を濾過によって回収する。濾過ケーキをアセトンで複数回洗浄し、一定の重さの白色紛体まで真空デシケーター中で乾燥する。
【０１３３】
実施例３
ＡＤＰ−ＳｔａｒエノールエーテルホスフェートおよびＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）の合成
ホスホン酸合成は米国特許第５，５８２，９８０号、カラム５、行１８〜６２中で報告される。
2013533354.tif 000037
【０１３４】
ｃ．ＡＤＰ−Ｓｔａｒメトキシエノールエーテルの合成
2013533354.tif 000038
【０１３５】
１４０ｍｌの無水ＴＨＦ中のジエチル１−メトキシ−１−（４−クロロ−３−メトキシフェニル）メタンホスホナート（２１．１ｇ、６５．４ｍｍｏｌｅ、１．１当量）の溶液を、アルゴン雰囲気下で−７８℃まで冷却し、滴下漏斗を介してヘキサン中の４１ｍｌのｎ−ブチルリチウム（１．６Ｍ、６５．４ｍｍｏｌｅ、１．１当量）により２０分間以上の間処理した。もたらされたオレンジ色の反応混合物を−７８℃で１５分間撹拌し、次いで粉末の２−アダマンタノン（８．９３ｇ、５９．５ｍｍｏｌｅ）を１ポーションで添加した。反応混合物を−７８℃で４０分間撹し、次いで室温まで加温し、最終的に激しいブタンの発生について注意しながら１．５時間加熱還流した。反応混合物を冷却して室温に戻し、この温度で一晩維持した。翌朝、反応混合物中の揮発性物質を回転蒸発によって除去した。次いで残留物をヘキサン中の飽和ＮａＨＣＯ３溶液と５％のＥｔＯＡｃとの間で分配した。水溶液をヘキサン中の５％ＥｔＯＡｃにより３回抽出した（合計３００ｍｌ）。合わせた有機溶液をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥し、シリカゲルプラグに通過させた。濾液の濃縮後に、黄色油を得た。粗製産物を３０ｍｌのＭｅＯＨ中で結晶化した。２０ｍｌのＭｅＯＨ中での第２の再結晶後に、１１．９９ｇのわずかに黄色の固体（６３．２％）を得た。合わせた母液をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の０〜４％のＥｔＯＡｃ）によってさらに精製し、８ｍｌのＭｅＯＨ中で２回結晶化し、わずかに黄色の固体として産物の第２の収穫物を１．７４ｇ（９．２％）得た。
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【０１３６】
ｄ．ＡＤＰ−Ｓｔａｒエノールエーテルフェノールの合成
2013533354.tif 000040
ＮａＨ（ミネラルオイル中で６０％、１．６３ｇ、４０．８ｍｍｏｌｅ、１．３当量）をヘキサンで３回（３×１５ｍｌ）リンスし、もたらされた湿ったＮａＨ粉末にアルゴン気流を乾燥するまで送風し、真空下で５分間の短い間ポンプで減圧した。無水ＤＭＦ（３５ｍｌ）中の粉末ＮａＨの懸濁物に、ＥｔＳＨ（３．１ｍｌ、４２．３ｍｍｏｌｅ、１．３５当量）を、アルゴン雰囲気下で０℃で１０分間にわたって注射器を介して１滴ずつ添加した。激しいガスの発生が添加の間に直ちに起こり、もたらされた清澄なナトリウムエチルチオラート溶液を０℃で５分間および室温で２５分間撹拌した。溶液を冷却して０℃に戻し、ナトリウムエチルチオラート溶液を固体のＡＤＰ−Ｓｔａｒメトキシエノールエーテル（１０ｇ、３１．４ｍｍｏｌｅ）の１ポーションで処理した。懸濁物を１２０〜１２５℃で加熱還流し、加熱の間に均一混合物が生じ、後に還流の間に濁ってきた。２時間の還流後に、ＴＬＣにより反応の完了が示された。反応混合物を冷却して室温に戻し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液でクエンチした。水溶液をヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃにより３回抽出した（合計１５０ｍｌ）。合わせた有機溶液をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥し、粗いシリカゲルプラグ（４０〜１４０メッシュ）に通過させた。濾液を回転蒸発によって濃縮して穏やかな悪臭のある白色紛体を得た。粗製産物を粉砕によって精製した。３０ｍｌのヘキサンと共に加熱し、続いて冷却し一晩冷蔵庫中に保存し、濾過した後に、白色の固体として８．７８ｇの産物（９１．８％）を得た。
2013533354.tif 000041
【０１３７】
ｅ．ＡＤＰ−Ｓｔａｒエノールエーテルトリエステルホスフェートの合成
2013533354.tif 000042
オキシ塩化リン（４．２ｍｌ、４６．３ｍｍｏｌｅ、１．５当量）を、ピリジン（２２ｍｌ、塩基性酸化アルミニウムの上で一晩乾燥した）に、アルゴン雰囲気下の０℃で徐々に添加する。少量の白色煙が指摘されるが、沈殿は形成されなかった。このＰＯＣｌ３溶液に、９４ｍｌの無水ＴＨＦ中のＡＤＰ−Ｓｔａｒエノールエステルフェノール（９．４１ｇ、３０．８７ｍｍｏｌｅ）の溶液を、９０分間にわたって滴下漏斗を介して添加した。白色ピリジン塩酸塩沈殿が添加の間に形成された。余剰の１０ｍｌのＴＨＦを使用して保存ボトルおよび滴下漏斗をリンスし、反応混合物に添加した。懸濁物を０℃で１５分間および室温で２時間４０分撹拌した。次いで反応混合物を冷却して０℃に戻し、３−ヒドロキシプロピオニトリル（８．３ｍｌ、１２２ｍｍｏｌｅ、フェノールに基づいて３．９５当量）を注射器を介して細い流れで徐々に添加した。０℃で５分間の撹拌後に、さらに多くの白色沈殿物が途中で析出したが、混合物を室温で一晩（〜１５．５時間）撹拌した。沈殿物を濾過によって除去し、６０ｍｌのヘキサン中のＥｔＯＡｃでリンスした。合わせた濾液を減圧下で濃縮して、淡黄色油を得た。
【０１３８】
粗製産物を４００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３溶液に添加し、次いで適切な水を添加して任意の存在する塩を溶解した。水溶液をヘキサン中の６０％ＥｔＯＡｃにより３回抽出した（合計４００ｍｌ）。合わせた有機溶液を水およびブラインで洗浄し（各々１５０ｍｌ）、無水Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥し、回転蒸発によって濃縮する。粘着性の粗製産物を各々４０ｍｌのヘキサン中の５％のＥｔＯＡｃにより３回粉砕した（加熱し、室温次いで０℃まで冷却する）。ＴＬＣにより、残存するピリジンの大部分、微量の未反応出発材料ＡＤＰ−Ｓｔａｒエノールエーテルフェノールおよびわずかなビス−アリールモノ−シアノエチルホスフェートトリエステル副産物がこれらの粉砕によって除去されることが示された。次いで産物は一定の重さまで真空下でポンプで減圧され、１３．４ｇ（９２％）の淡黄色のゴムとして得られた。
2013533354.tif 000043
【０１３９】
ｆ．ＡＤＰ−Ｓｔａｒエノールエーテルホスフェートの合成
2013533354.tif 000044
８５ｍｌの無水ＭｅＯＨ中のＡＤＰ−Ｓｔａｒエノールエーテルトリエステルホスフェート（１３．８３ｇ、２８．２ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ＭｅＯＨ溶液（１２．９ｍｌ、５６．３ｍｍｏｌｅ、２当量）中の４．３７Ｍ  ＮａＯＭｅを、アルゴン雰囲気下の０℃で、注射器を介して細い流れで添加した。混合物を０℃で２分間撹拌し、次いで室温まで温めた。大量の沈殿が室温での撹拌の間に形成された。フラスコを時々軽く叩いて、撹拌溶液の中へ沈着する固体を戻し入れた。濃厚な懸濁物を１７．５時間撹拌した。アセトニトリル／ＮａＨＣＯ３勾配を使用する解析ＨＰＬＣモニタリングは、８．３分で所望される産物；１３．６分で不完全な反応中間体モノ−シアノエチルモノ−アリールホスフェートジエステル；１６．９分で副産物ビス−アリールホスフェートジエステル、および１９．６分でＡＤＰ−Ｓｔａｒフェノールエノールエーテルを示した。反応混合物を回転蒸発装置に置いて約４５ｍｌのＭｅＯＨを除去し、残存する懸濁物に３ｍｌの水および次いで２００ｍｌのアセトンを添加した。溶液をブフナー漏斗で濾過した。追加の１０ｍｌの水を使用して保存容器および濾過漏斗をリンスし、濾液に添加した。次いで合わせた濾液を１リットルの凍結乾燥器用のボトルに移し、追加の１０ｍｌの水を使用して濾過フラスコをリンスし、溶液に添加する。合わせた水溶液を３６０ｍｌのアセトンに添加した場合、重い沈殿物が溶液から析出した。追加の４０ｍｌのアセトンを添加して後のより容易な濾過のために懸濁物を希釈した。３０分間ベンチ上で懸濁物を放置し、次いで白色沈殿物を濾過によって回収した。濾過ケーキをアセトンで複数回洗浄し（合計２００ｍｌ）、１０．０７ｇの白色紛体（８３．９％）の一定の重さで産物の第１の収穫物として得られるまで、真空デシケーター中で乾燥させた。
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．４２（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），３．３５（ｓ，３Ｈ），３．０８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），２．５７（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１．６８−１．９８（ｍ，１２Ｈ）．
【０１４０】
濾液を冷蔵庫中で冷却している間に、より多くの沈殿物が溶液中で析出した。産物の追加の第２の収穫物１．３８８ｇ（１１．６％）を濾過によって得た。そのプロトンＮＭＲスペクトルは第１の収穫産物のものと同一であった。両方の収穫物からの産物の解析ＨＰＬＣピークの積分は９９．４％よりも大きかった。
【０１４１】
ｇ．ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）の合成
ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）は、米国特許第５，５８２，９８０号中で報告されるＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）の合成に従って、化合物５（５〜６カラム）の手技において５−クロロ−２−アダマンタノンの代わりに２−アダマンタノンを置き換えることによって合成される。すべての他の工程はＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）について報告されたものと同一である。
【０１４２】
基質のために使用することができるエノールエーテルホスフェートの他の例は以下のものを含むが、これらに限定されない。
米国特許第６，３５５，４４１号内で引用されるベンゾチアゾールエノールエーテルホスフェートおよびアナログ。
（３−ホスホリルオキシフェニル）メトキシメチレントリシクロ［７．３．１．０２，７］トリデカ−２，７−エン、ジナトリウム塩。米国特許第６，４６１，８７６号。
［（３−ホスホリルオキシフェニル）（２，２，２−トリフルオロエトキシ）メチレン］トリシクロ［７．３．１．０２，７］トリデカ−２，７−エン、ジナトリウム塩。米国特許第６，４６１，８７６号。
（３−ホスホリルオキシ−４−クロロフェニル）メトキシメチレントリシクロ［７．３．１．０２，７］トリデカ−２，７−エン、ジナトリウム塩。米国特許第６，４６１，８７６号。
［（４−メトキシ）−４−（３−ホスホリルオキシフェニル）］スピロ［１，２−ジオキセタン−３，１３'−（８−ｎ−プロピル）トリシクロ［７．３．１，０２，７］トリデカ−２，７−エン］、ジナトリウム塩。米国特許第６，４６１，８７６号。
（３−ホスホリルオキシフェニル）メトキシメチレンアダマンタン−４，５−エン、ジナトリウム塩。米国特許第６，４６１，８７６号。
【０１４３】
実施例４
相間移動触媒作用によるエノールエーテル配糖体の一般的合成
2013533354.tif 000045
１Ｎ  ＮａＯＨ溶液およびＣＨ２Ｃｌ２の混合物中のフェノールエノールエーテル（１当量）およびＰＴＣ触媒、Ｂｕ４ＮＢｒ（１．０５当量）の強く撹拌した二相性混合物に、ＣＨ２Ｃｌ２中のペルアシルグリコシルブロミド＊（１．５当量）の溶液を室温で細い流れで添加した。混合物を６０分間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液を反応に添加し、この溶液をＣＨ２Ｃｌ２により３回抽出した。合わせたＣＨ２Ｃｌ２溶液を水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、保護されたグリコシルエノールエーテルを得た。
【０１４４】
ペルアシルグリコシルエノールエーテル（１当量）を１：１のＴＨＦ／ＭｅＯＨ中で溶解し、０℃で１Ｎ  ＮａＯＨを添加することによって脱保護し、次いで反応物を室温まで暖める。完全な脱保護に際して、反応物を固体のＮａＨＣＯ３により中和し、回転蒸発によって溶媒を取り除き、逆相クロマトグラフィーによって精製する。
【０１４５】
＊ペルアシルブロモグリコシドの例は以下の通りである。α−Ｄ−グルコピラノシルブロミド，２，３，４，６−テトラアセテート（ＣＡＳ＃５７２−０９−８）；α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド，２，３，４，６−テトラアセテート（ＣＡＳ＃  ３０６８−３２−４）；α−Ｄ−グルコピランウロン酸，１−ブロモ−１−デオキシ−メチルエステル，２，３，４−トリアセテート（ＣＡＳ＃２１０８５−７２−３）。
【０１４６】
実施例５
相間移動触媒作用によるグルコン−Ｓｔａｒエノールエーテルテトラアセテートの合成
ａ．グルコン−Ｓｔａｒエノールエーテルテトラアセテートの合成
2013533354.tif 000046
１Ｎ  ＮａＯＨ（２０ｍｌ）および１４ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中のＣＤＰ−Ｓｔａｒエノールエーテルフェノール（１．０２ｇ、３ｍｍｏｌｅ）およびＰＴＣ触媒、テトラブチルアンモニウムブロミド（１．０２ｇ、３．１５ｍｍｏｌｅ）の強く撹拌した混合物に、６ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中のα−Ｄ−グルコピラノシルブロミド，２，３，４，６−テトラアセテート（２．４７ｇ、６ｍｍｏｌｅ）を室温で添加した。出発材料がほとんど残っていないことがｔｌｃによって示されまで、反応物を３０分間撹拌した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３溶液でクエンチした。水層をＣＨ２Ｃｌ２により３回抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥した。４滴のトリエチルアミンを溶液に添加し、溶液を短いシリカゲルカラムに通過させ、１００ｍｌの４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンにより溶出して、オレンジ色のゴムを得た。
【０１４７】
４℃で一晩の保存後に、粗製産物を少量のＣＨ２Ｃｌ２中で溶解し、シリカゲルによりクロマトグラフィ分離し、２０％〜５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサンにより溶出した。カップリングした産物を含む画分を回収し濃縮して、淡黄色のゴム（２．３１ｇ、＞１００％）を得た。
【０１４８】
ｂ．グルコン−Ｓｔａｒエノールエーテルの合成
2013533354.tif 000047
粗製グルコン−Ｓｔａｒエノールエーテルテトラアセテート−（１．５ｇの理論的収量、３ｍｍｏｌ）の溶液に、１５滴のＭｅＯＨ中の４．３７Ｍ  ＮａＯＭｅを室温でピペットによって添加した。混合物を一晩撹拌し、アセテート加水分解は最小であった。追加の３０滴のＭｅＯＨ中の４．３７Ｍ  ＮａＯＭｅを添加し、混合物は黄色からオレンジへ変わり、加水分解は４時間後に完全であることがＴＬＣによって示された。塩化アンモニウム（１ｇ）を添加して反応をクエンチし、溶液を１時間撹拌した。塩化メチレンを添加して産物を沈殿させ、５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を、これ以上沈殿物が析出しなくなるまで添加した。沈殿物を濾過によって回収し、５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。粗製ゴムをシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンにより最初に溶出してＣＤＰ−Ｓｔａｒエノールエーテルフェノールを回収し、次いで５〜１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２によりカラムをフラッシングして、淡黄色の泡（１．１８ｇ、７９％）としてＧｌｕｃｏｎ−Ｓｔａｒエノールエーテルを得た。
【０１４９】
実施例６
Ｓｃｈｍｉｄｔグリコシド化によるエノールエーテルグリコシドの一般的合成
2013533354.tif 000048
ＣＨ２Ｃｌ２（６ｍｌ／当量フェノール）中のペルアシルグリコシルトリクロロアセトイミダート＊（１．２〜１．５当量）の撹拌溶液に、アルゴン雰囲気下の室温で、固体のフェノールエノールエーテル（１当量）を１ポーションで添加した。混合物を−２３℃まで冷却し、ＣＨ２Ｃｌ２（０．６ｍｌ／当量フェノール）中でＢＦ３・ＯＥｔ２（０．２当量）の溶液により１０分間にわたって徐々に処理した。反応混合物はＢＦ３・ＯＥｔ２添加の間に濁ってき、１．５時間にわたって０℃まで徐々に暖められた。反応物をＥｔ３Ｎ（５当量のＢＦ３・ＯＥｔ２）によりクエンチし、０℃で１０分間撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液とＣＨ２Ｃｌ２との間で分配し、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ペルアシル化グリコシルエノールエーテルを泡として回収した。
【０１５０】
ペルアシルグリコシルエノールエーテル（１当量）を１：１のＴＨＦ／ＭｅＯＨ中で溶解し、０℃で１Ｎ  ＮａＯＨを添加することによって脱保護し、次いで反応物を室温まで暖める。完全な脱保護に際して、反応物を固体のＮａＨＣＯ３により中和し、回転蒸発によって溶媒を取り除き、逆相クロマトグラフィーによって精製する。
【０１５１】
＊ペルアシルグリコシルトリクロロアセトイミダート合成は、Ｒ．Ｒ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９４，５０：２１による総説、およびその中で引用された参照文献中で報告されている。
【０１５２】
実施例７
Ｓｃｈｍｉｄｔグリコシド化によるグルクロノシルエノールエーテル合成
ａ．ペルアシルグルクロノシルＡＭＰＰＤエノールエーテルの合成
2013533354.tif 000049
ＣＨ２Ｃｌ２（２４ｍｌ／当量）中のペルアシルグルクロノシルトリクロロアセトイミダート（１．２当量）の溶液に、アルゴン雰囲気下の室温で、固体のフェノールエノールエーテル（１当量）を添加する。混合物を−２５℃まで冷却し、三フッ化ホウ素エーテラート（０．２当量）のＣＨ２Ｃｌ２溶液を１０分間にわたって徐々に添加して処理する。もたらされた濁った混合物は−２３℃〜−２０℃１時間、−２０℃〜−１０℃３０分間および−１０℃〜＋５℃３０分間の温度勾配で撹拌する。反応を＋５℃で１５分間Ｅｔ３Ｎによりクエンチし、続いて飽和ＮａＨＣＯ３溶液を添加する。混合物をＣＨ２Ｃｌ２により抽出し、水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥し、少量のＥｔ３Ｎを有機溶液に添加する。回転蒸発およびシリカゲルクロマトグラフィー後に粗製産物を得る。
【０１５３】
ｂ．グルクロノシルＡＭＰＰＤエノールエーテルの合成
2013533354.tif 000050
ペルアシルグルクロノシルＡＭＰＰＤエノールエーテル（１当量）を１：１のＴＨＦ／ＭｅＯＨ中で溶解し、０℃で１Ｎ  ＮａＯＨを添加することによって脱保護し、次いで反応物を室温まで暖める。脱保護の完了に際して、反応物を固体のＮａＨＣＯ３により中和し、回転蒸発によって溶媒を取り除き、次いで逆相クロマトグラフィーによって精製する。
【０１５４】
実施例８
水溶液中でのエノールエーテルのジオキセタンへの転換
２つのエノールエーテルホスフェートは、水性の塩基性条件における酸化によって、それらの対応する１，２−ジオキセタンアルカリフォスファターゼ基質に成功裏に転換された。１，２−ジオキセタンおよびＡＭＰＰＤ（登録商標）およびＡＤＰ−Ｓｔａｒをエノールエーテル前駆体から生成し、続いてアルカリホスファターゼ検出アッセイおよびＩＬ−６のＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）において使用した。モデル酸化条件およびジオキセタン形成の実証は以下に詳述する。
【０１５５】
ａ．ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェートのＡＭＰＰＤ（登録商標）への酸化
図１中で図示される反応スキームにおいて示されるように、ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェート（ＡＭＰＰＤ−ＥＥ）は、アルカリｐＨでＮａ２ＭｏＯ４／Ｈ２Ｏ２の酸化システムを使用して、水溶液中で１，２−ジオキセタン基質（ＡＭＰＰＤ（登録商標））へ効率的に酸化された。これについて使用された試薬は以下のとおりであった。
ＡＭＰ緩衝液：０．１Ｍアミノメチルプロパノール緩衝液（ｐＨ９．５）。
ＡＭＰＰＤ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＡＭＰ緩衝液中で１ｍｇ／ｍｌ
ＡＭＰＰＤ−ＥＥ、ＡＭＰ緩衝液（２．５ｍＭ）中で１ｍｇ／ｍＬ（２．３ｍＭ）。
Ｈ２Ｏ２ストック：水中で１０％（３Ｍ）（５０％溶液から、Ａｌｄｒｉｃｈ）。
Ｎａ２ＭｏＯ４ストック：４．８ｍｇ／ｍＬ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、〜２０ｍＭ。
【０１５６】
１０μＬのＡＭＰＰＤ−ＥＥ（０．２３ｍＭ）、４０μＬのＡＭＰ緩衝液、４０μＬのＨ２Ｏ２ストック（１Ｍ）および２０μＬのＮａ２ＭｏＯ４ストック（３．６ｍＭ）を組み合わせ、３７℃で１時間、次いで５５℃で１０分間反応させた。ＨＰＬＣによりこの反応の進行を追跡した。出発材料（ＡＭＰＰＤ−ＥＥ）の溶出ピークのＨＰＬＣトレースを対照トレースとして図２中で示す。所望される１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ（登録商標））の溶出ピークのＨＰＬＣトレースを図３中に示す。図４および図５のＨＰＬＣトレースは、ＡＭＰＰＤ−ＥＥ（８．１分）の所望されるジオキセタン基質（ＡＭＰＰＤ（登録商標））（７．３分）への酸化の進行を示す。反応から１時間１０分で明らかに１つの産物（ＡＭＰＰＤ（登録商標））が得られた。
【０１５７】
ｂ．ＡＤＰ−ＳｔａｒエノールエーテルホスフェートのＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）への酸化
アルカリｐＨでＮａ２ＭｏＯ４／Ｈ２Ｏ２による、ＡＤＰ−Ｓｔａｒエノールエーテルホスフェート（ＡＤＰ＊−ＥＥ）のＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）（ＡＤＰ＊）への酸化は、図６中で示される反応スキームに従って行った。使用された試薬は以下のとおりであった。
ＡＭＰ緩衝液：０．１Ｍアミノメチルプロパノール緩衝液（ｐＨ９．５）。
０．１Ｍ  Ｎａ２ＭｏＯ４（Ａｌｄｒｉｃｈ）。
ＡＤＰ＊−ＥＥ−Ｏストック：５０μＬの０．１Ｍ  Ｎａ２ＭｏＯ４ストックと組み合わせた２ｍＬのＡＭＰ緩衝液の中の１０ｍｇのＡＤＰ＊−ＥＥ（２．５ｍＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４と１１．７ｍＭ  ＡＤＰ＊−ＥＥ）。
Ｈ２Ｏ２ストック：水中の１０％（３Ｍ）（５０％溶液から、Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【０１５８】
１００μＬのＡＤＰ＊−ＥＥ−Ｏストックを４０μＬのＨ２Ｏ２ストックと組み合わせ、混合物を１時間５５℃で反応させる。この時の後に、反応混合物を０．５ｍＬのＡＭＰ緩衝液により希釈して、結果として１ｍｇ／ｍＬ（２．３ｍＭ）の１，２−ジオキセタンおよび０．５ｍＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４を含む溶液を得た。この溶液はＡＤＰ＊−ＥＥ酸化混合物と称される。ＡＤＰ＊  ＥＥのＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）への酸化は、もたらされたジオキセタンのアルカリホスファターゼによる活性化およびＴｕｒｎｅｒルミノメーターでの光放射の測定によって実証された。以下の試薬をこれについて使用した。
０．１Ｍアミノメチルプロパノール緩衝液、ｐＨ９．５（ＡＭＰ緩衝液）、
ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）（ＣＤＰ＊、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）：ＡＭＰ緩衝液中で６．２ｍｇ／ｍＬ（１２．５ｍＭ）、
ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）（ＡＤＰ＊、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）：０．１Ｍ  ＡＭＰ緩衝液中で１ｍｇ／ｍＬ（２．２ｍＭ）、
ＡＤＰ＊−ＥＥ酸化混合物：０．１Ｍ  ＡＭＰ緩衝液中で１ｍｇ／ｍＬ（２．３ｍＭ）、
ＴＢＱ：１０×Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ（商標）化学発光促進剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびアルカリホスファターゼ・ストック（ＡＰ）：８ｎｇ／ｍＬ（１７．４ｍｇ／ｍＬの濃縮物から）。
【０１５９】
１０μＬのＡＤＰ＊またはＡＤＰ＊−ＥＥ酸化混合物（それぞれ、０．２２ｍＭまたは０．２３ｍＭ）、１０μＬのＴＢＱ、８０μＬのＡＭＰ緩衝液および１０μＬのＡＰを組み合わせ、混合物からの発光を３７℃で２５分間連続的に測定した。１．６μＬのＣＤＰ＊（０．２ｍＭ）、１０μＬのＴＢＱ、８０μＬのＡＭＰ緩衝液および１０μＬのＡＰを組み合わせ、混合物からの発光を３７℃で２５分間連続的に測定した。
【０１６０】
図７は、ＡＤＰ−Ｓｔａｒ光放射曲線（ＡＤＰ−Ｓｔａｒジオキセタン対照およびＡＤＰ−Ｓｔａｒエノールエーテルホスフェート酸化の２つの産物について）は、商業的に入手可能なＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）ジオキセタン対照よりも高い光放射を示したことを示す。
【０１６１】
実施例９
試薬の熱安定性
Ｎａ２ＭｏＯ４の存在下において、水溶液ＡＭＰＰＤ（登録商標）、ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェート（ＡＭＰＰＤ−ＥＥ）およびＡＭＰＰＤ−ＥＥの熱安定性を検討した。図８および図１０中で示されるように、ＡＭＰＰＤ（登録商標）の熱による半減期は４０℃で〜４０日であり、半減期は５５℃で〜１０日へ低下する。比較において、図９および図１０中で示されるように、ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェートは４か月以上にわたって４０℃で実質的には熱分解を示さず、５か月以上にわたって５５℃で最小の熱分解を示した。Ｎａ２ＭｏＯ４の存在下におけるＡＭＰＰＤ−ＥＥの４０℃での熱安定性も検討したところ、図１１中で示されるように、Ｎａ２ＭｏＯ４の存在下におけるＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェートの熱分解は観察されなかった。
【０１６２】
エノールエーテルホスフェート熱安定性評価に加えて、Ｎａ２ＭｏＯ４、Ｈ２Ｏ２および尿素Ｈ２Ｏ２（商業的応用における一般のＨ２Ｏ２代替物）についての報告された熱安定性を検討した。表Ａ中で示されるように、モリブデン酸ナトリウムおよび過酸化水素は有意な熱分解を示さなかった。
【０１６３】
（表Ａ）酸化試薬熱安定性の評価
2013533354.tif 000051
【０１６４】
ｉｎ  ｓｉｔｕで生成されたジオキセタン（ＡＭＰＰＤ（登録商標）およびＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標））の安定性は、製造されたジオキセタンに類似する安定性を有することが予想される。ｉｎ  ｓｉｔｕで生成されたジオキセタンは、通常の制限（例えば６か月の間の４℃で保存）で将来の使用のために保存することができる。
【０１６５】
実施例１０
エノールエーテル基質による化学発光アッセイデザイン−方法Ａ
ｉｎ  ｓｉｔｕ  １，２−ジオキセタン基質形成をアッセイデザインへ応用するために、複数の方法においてｉｎ  ｓｉｔｕ基質形成を援用することが可能である。例えば、第１の工程として酵素活性または酵素標識が１，２−ジオキセタン基質前駆体（エノールエーテルフェノラート）を生成し、次いで第２の工程において、１，２−ジオキセタンへｉｎ  ｓｉｔｕ酸化され、それは形成に際して分解されて化学発光シグナルリードアウトを生じることにより検出シグナルが生成されるような、アッセイを実行することができる（方法Ａ）。この方法において、酸化工程を「ストップ」溶液として見なすことができる。あるいは、１，２−ジオキセタン前駆体の１，２−ジオキセタンへのｉｎ  ｓｉｔｕ酸化が第１の工程であり、酵素活性または酵素標識が第２の工程として１，２−ジオキセタンフェノラートを生成するような、アッセイを実行することができる（方法Ｂ）。第１の工程が酸化であり、続いて酵素検出がある、第２のアッセイ方法（方法Ｂ）は、セクションＩＶ（アルカリホスファターゼ活性に対するＮａ２ＭｏＯ４およびＨ２Ｏ２のクエンチング効果の可能性）中で記載される。
【０１６６】
方法Ａ（酵素活性化に続いて酸化）：
１）１，２−ジオキセタン基質のエノールエーテル前駆体の酵素活性化（例えばエノールエーテルフェノラートを産出するＡＭＰ緩衝液中でアルカリフォスファターゼによって）。
２）エノールエーテルフェノラートの酸化（例えば緩衝液（ｐＨ１０）中でＨ２Ｏ２／Ｎａ２ＭｏＯ４によって）。
【０１６７】
方法Ａを図１２中で示す。この方法において、酵素活性化に後続して基質に対するｉｎ  ｓｉｔｕ酸化が起こり、これはエンドポイントアッセイリードアウトに適合させることができ、そこで累積シグナルは酵素活性後に測定される。基質への酸化工程はアッセイ停止溶液としても機能する。
【０１６８】
使用した試薬：
ＡＭＰ緩衝液：０．１Ｍアミノメチルプロパノール緩衝液（ｐＨ９．８）。
ＴＢＱ：１０×Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ（商標）化学発光促進剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、
ＡＰ：８、１．６、０．３２、０．０６４ｎｇ／ｍＬのアルカリホスファターゼストック（１７．４ｍｇ／ｍＬの濃縮物から作製された）、
ＡＭＰＰＤ−ＥＥ：ＡＭＰ緩衝液中で１ｍｇ／ｍＬ（２．５ｍＭ）、
Ｈ２Ｏ２ストック：水中の１０％（３Ｍ）（５０％溶液から作製、Ａｌｄｒｉｃｈ）、
Ｎａ２ＭｏＯ４ストック：０．５Ｍ  Ｎａ２ＭｏＯ４（Ａｌｄｒｉｃｈ）、
ホスフェート：２Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ９．６）および
対照：
１０μＬのＡＭＰＰＤ（登録商標）（０．２１ｍＭ）、１０μＬのＴＢＱ、８０μＬのＡＭＰ緩衝液および１０μＬのＡＰ（様々な濃度で）を組み合わせ、混合物からの発光を３７℃で３０分間連続的に測定した。
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤ−ＥＥの酸化：
１０μＬのＡＭＰＰＤ−ＥＥ（０．２１ｍＭ）＋１０μＬのＴＢＱ＋［１０μＬのＡＰ（様々な濃度で）＋１０μＬのＡＭＰ緩衝液、３７℃で、１時間］、＋［８．５μＬのＮａ２ＭｏＯ４（３５ｍＭ）＋５０μＬのホスフェート＋２５μＬのＨ２Ｏ２ストック（０．６３Ｍ）、３０秒超音波処理、３７℃で］、９０分間、〜５分間読み取る（グロー）。
【０１６９】
方法Ａを使用して、ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェート（ＡＭＰＰＤ−ＥＥ）は、１）アルカリホスファターゼ（希釈範囲にわたって）によって脱リン酸化され（１０μＬのＡＭＰＰＤ−ＥＥ（０．２１ｍＭ）＋１０μＬのＴＢＱ＋［１０μＬのＡＰ（様々な濃度で）＋１０μＬのＡＭＰ緩衝液、３７℃で、１時間］）、２）ＡＭＰＰＤ（登録商標）へｉｎ  ｓｉｔｕで酸化され［８．５μＬのＮａ２ＭｏＯ４（３５ｍＭ）＋５０μＬのホスフェート＋２５μＬのＨ２Ｏ２ストック（０．６３Ｍ）、３０秒超音波処理、３７℃で］、３）ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤ（登録商標）ｖｓ．ＡＭＰＰＤ（登録商標）対照からの光放射が比較された（９０分間にわたって、５分間ごとに読み取る）。図１３および図１４中で示されるように、アルカリホスファターゼ希釈曲線について非常に類似した直線状化学発光リードアウトが、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤ（登録商標）および対照ＡＭＰＰＤ（登録商標）から生成された。
【０１７０】
実施例１１
アルカリホスファターゼ活性に対するＮａ２ＭｏＯ４およびＨ２Ｏ２のクエンチング効果の可能性
方法Ｂのｉｎ  ｓｉｔｕジオキセタン生成によるアッセイ条件を開発する前に、酸化システムからの試薬がアルカリホスファターゼ活性に悪影響を及ぼすかどうか調べた。実験結果から、過酸化水素はアルカリホスファターゼ活性に影響を与えないが、モリブデン酸ナトリウムはアルカリホスファターゼ活性を有意にクエンチし、最大８５％光が減少することが示された（図１５を参照）。１ｍＭ未満までモリブデン酸ナトリウムの濃度を低下させることは、大部分のアルカリホスファターゼ活性を回復する（図１６を参照）。これらの結果に基づいて、方法Ｂのｉｎ  ｓｉｔｕジオキセタン生成は、はるかに低いモリブデン酸ナトリウム濃度を酸化システムのために使用して開発された。一重項酸素生成／反応系からの任意のクエンチング効果は酵素に特異的であり得、任意の酵素／検出基質ペアについて評価されなくてはならない。例えば、Ｎａ２ＭｏＯ４クエンチングはアルカリホスファターゼ酵素および／または関連する酵素ファミリーに特異的であり得、他の加水分解酵素についてはクエンチング効果を示さないかもしれない。
【０１７１】
使用した試薬：
ＡＭＰ緩衝液：０．１Ｍアミノメチルプロパノール緩衝液（ｐＨ９．８）、
ＡＭＰＰＤ（登録商標）：ＡＭＰ緩衝液中で１ｍｇ／ｍＬのＡＭＰＰＤ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
ＴＢＱ：１０×Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ（商標）化学発光促進剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）、
ＡＰ：アルカリホスファターゼストック、４０ｎｇ／ｍＬ（１７．４ｍｇ／ｍＬの濃縮物から）、
Ｈ２Ｏ２ストック：水中の１０％（３Ｍ）（５０％溶液から、Ａｌｄｒｉｃｈ）、
Ｎａ２ＭｏＯ４ストック：０．５Ｍ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、
実験条件：
対照：
１０μＬのＡＭＰＰＤ（登録商標）（２．３ｍＭ）、１０μＬのＴＢＱ、１２０μＬのＡＭＰ緩衝液および１０μＬのＡＰ（４０ｎｇ／ｍＬ）を組み合わせ、混合物からの発光を３７℃で３０分間連続的に測定した。
試験：
１０μＬのＡＭＰＰＤ（登録商標）（２．３ｍＭ）、１０μＬのＴＢＱ、８０μＬ    のＡＭＰ緩衝液、２５μＬのＨ２Ｏ２ストック（１０％）および１０μＬのＡＰ（４０ｎｇ／ｍＬ）を組み合わせ、混合物からの発光を３７℃で３０分間連続的に測定した。１０μＬのＡＭＰＰＤ（登録商標）（２．３ｍＭ）、１０μＬのＴＢＱ、１１５μＬのＡＭＰ緩衝液、様々な量のＮａ２ＭｏＯ４ストックおよび１０μＬのＡＰ（４０ｎｇ／ｍＬ）を組み合わせ、混合物からの発光を３７℃で３０分間連続的に測定した。
【０１７２】
実施例１２
エノールエーテル基質による化学発光アッセイデザイン−方法Ｂ
アッセイにおけるｉｎ  ｓｉｔｕジオキセタン基質生成の援用に対する代替のアプローチは、第１の工程中でエノールエーテルホスフェートを酸化するものであり、それはアッセイウェル中で行うか、または別々の容器中で行いそこから基質をアッセイウェルへ添加する。ｉｎ  ｓｉｔｕジオキセタン基質の酵素活性化（例えばアルカリフォスファターゼに基づくアッセイにおける脱リン酸化）はこの工程に後続し、化学発光のリードアウトを行う。方法Ｂをキネティックモードのアッセイのために使用して、アッセイシグナルが生成されるにつれて測定することこができる。このワークフローの融通性が必要なならば、使用者がアッセイの第１の工程（ｉｎ  ｓｉｔｕジオキセタン生成）を先立って行うことも方法Ｂでは可能である。
【０１７３】
方法Ｂ（酸化に続いて酵素活性化）：
１）１，２−ジオキセタン基質のエノールエーテル前駆体の酸化（例えば緩衝液（ｐＨ１０）中のＨ２Ｏ２／Ｎａ２ＭｏＯ４により１，２−ジオキセタン基質を産出する）。
２）ｉｎ  ｓｉｔｕ生成１，２−ジオキセタン基質の酵素活性化（例えばＡＭＰ緩衝液中のアルカリフォスファターゼにより１，２−ジオキセタンフェノラートを産出する）。
【０１７４】
方法Ｂを図１７中に示す。この方法において、ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェートをＡＭＰＰＤ（登録商標）へｉｎ  ｓｉｔｕで酸化し、アルカリホスファターゼ（希釈範囲にわたって）によって脱リン酸化し、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤ（登録商標）ｖｓ．ＡＭＰＰＤ（登録商標）対照からの光放射を比較した。この場合もやはり、アルカリホスファターゼ希釈曲線について非常に類似した直線状化学発光リードアウトが、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤ（登録商標）および対照ＡＭＰＰＤ（登録商標）から生成された（図１８および図１９を参照）。使用される実験条件を以下に記載する。
【０１７５】
０．１Ｍアミノメチルプロパノール緩衝液、ｐＨ９．８（ＡＭＰ緩衝液）中の２００μＬの５ｍｇ／ｍｌ（９ｍＭ）のＡＭＰＰＤ−ＥＥ＋５μＬの０．１Ｍ  Ｎａ２ＭｏＯ４（１．８ｍＭ）＋７５μＬの１０％Ｈ２Ｏ２（０．８Ｍ）を組み合わせること、および１時間５５℃で混合物をインキュベーションすることによって、ＡＭＰＰＤエノールエーテルをＡＭＰＰＤ（登録商標）へ酸化した。ＡＭＰ緩衝液を１ｍＬの最終的な体積まで添加して、〜１ｍｇ／ｍＬ（２．５ｍＭ）および０．５ｍＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４の濃度で酸化ＡＭＰＰＤ−ＥＥ（ＡＭＰＰＤ−ＥＥ−Ｏ）を含む溶液を生じた。ＡＭＰＰ−ＥＥ−Ｏの発光特性をＡＭＰＰＤ（登録商標）のものと比較した。
【０１７６】
アッセイのために使用した試薬：
ＡＭＰ緩衝液：０．１Ｍアミノメチルプロパノール緩衝液（ｐＨ  ９．８）、
ＡＭＰＰＤ：ＡＭＰ緩衝液中で１ｍｇ／ｍＬ（２．３ｍＭ）のＡＭＰＰＤ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、
ＡＭＰＰＤ−ＥＥ−Ｏ：ＡＭＰ緩衝液中で約１ｍｇ／ｍＬ（２．５ｍＭ）、
ＴＢＱ：１０×Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ（商標）化学発光促進剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、
ＡＰ：４０、８、１．６、０．３２、０．０６４ｎｇ／ｍＬの濃度のアルカリホスファターゼ（１７．４ｍｇ／ｍＬの濃縮物から作製された）。
【０１７７】
Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ測定（三重で測定）：
２０μＬ（０．４６ｍＭ）のＡＭＰＰＤ、１０μＬのＴＢＱ、６０μＬのＡＭＰ緩衝液および１０μＬのＡＰ（４、０．８、０．１６、０．０３２、０．００６４ｎｇ／ｍＬ）を組み合わせ、混合物からの発光を室温で２時間連続的に測定した。２０μＬのＡＭＰＰＤ−ＥＥ−Ｏ（０．５ｍＭ）、１０μＬのＴＢＱ、６０μＬのＡＭＰの緩衝液および１０μＬのＡＰ（４、０．８、０．１６、０．０３２、０．００６４ｎｇ／ｍＬ）を組み合わせ、混合物からの発光を室温で２時間連続的に測定した。
【０１７８】
方法Ｂも使用して、以前に論じられたように、ＡＤＰ−ＳｔａｒエノールエーテルホスフェートからのＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）のｉｎ  ｓｉｔｕ生成を評価する。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）および対照ＡＤＰ−Ｓｔａｒからの光放射曲線は、図７中で示されるように、重ねることができる。以下に記載するように、ＡＤＰ−Ｓｔａｒエノールエーテルホスフェート可溶性を提供する方法Ｂの修飾を行った。
【０１７９】
使用した試薬：
溶液Ａ：１２．５ｍＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４と共に、３０％アセトニトリル／７０％炭酸ナトリウム溶液＊中の２３．３ｍＭ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒ−ＥＥ。
溶液Ｂ：１０％Ｈ２Ｏ２。
＊炭酸ナトリウム溶液：１０リットルの水中の３２ｇｍの重炭酸ナトリウム＋１２ｇｍの炭酸ナトリウム
１ｍＬの溶液Ａおよび０．７ｍｌの溶液Ｂを組み合わせ、５５℃で１５分間加熱して（色が消えるまで）、１３．７ｍＭ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒストック溶液を生成した。
【０１８０】
試験：
１．７ｍＬのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒストック溶液を、５６．３ｍＬの０．１Ｍアミノメチルプロパノール緩衝液（ｐＨ９．５）および１ｍｇ／ｍＬのＳａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ（商標）化学発光促進剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と組み合わせて、０．４ｍＭ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒおよび１ｍｇ／ｍｌのＳａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ（商標）を含む溶液の生成した。ｉｎ  ｓｉｔｕ生成ＡＤＰ−Ｓｔａｒの性能は、アルカリホスファターゼ希釈曲線中のジオキセタン対照ＣＳＰＤ、ＡＤＰ−ＳｔａｒおよびＣＤＰ−Ｓｔａｒと比較して、対照ジオキセタンに類似していた（図２０および図２１を参照）。
【０１８１】
２つの異なるアッセイ／基質生成方法（方法Ａおよび方法Ｂ）を使用する、ｉｎ  ｓｉｔｕ生成ＡＭＰＰＤおよび対照ＡＭＰＰＤと類似した酵素希釈曲線の生成は、ｉｎ  ｓｉｔｕジオキセタン基質生成の原理が酵素アッセイ適用に容易に適合できることを実証する。同等の結果は、方法Ｂを使用するｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒおよび対照ジオキセタン、ＣＳＰＤ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）ならびにＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）について得られた。これらの基質生成およびアッセイデザイン原理はアルカリホスファターゼ基質およびアッセイにより実証されたが、他の加水分解酵素（β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−グルコシダーゼおよびノイラミニダーゼ）についてジオキセタン基質およびアッセイに一般的に適合させることができる。
【０１８２】
実施例１３
エノールエーテル基質によるモデル組換えヒトインターロイキン６（ｒｈＩＬ−６）のＥＬＩＳＡ
１．ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤ検出によるｒｈＩＬ−６のＥＬＩＳＡ
モデルの組換えｒｈＩＬ−６検出ＥＬＩＳＡをｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤおよび対照ＡＭＰＰＤ（登録商標）で同時に実行して、イムノアッセイにおけるｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤの性能を評価した。実験により、ｉｎ  ｓｉｔｕで生成されたＡＭＰＰＤは「等しい」モル量の基質を使用するアッセイにおいて対照ＡＭＰＰＤ（登録商標）と同様に動作し、エノールエーテルホスフェートの１００％の転換が想定されることが示された（図２２を参照）。ＥＬＩＳＡインキュベーション工程の間にｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤを調製することができ、アッセイに余分な時間を加えず、ＥＬＩＳＡアッセイ自体と比べてあまり不便ではなかった。全体的なアッセイ感受性およびダイナミックレンジは、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）（ＣＤＰ＊）により検出された内部ｒｈＩＬ−６のＥＬＩＳＡに十分匹敵していた。
【０１８３】
ｒｈＩＬ−６  ＥＬＩＳＡプレート調製（９６ウェルマイクロタイタープレート）：
１．捕捉抗体（２ｍｇ／ｍＬの抗ヒトＩＬ−６）によりＥＬＩＳＡプレートを一晩コートする。
２．プレートウェルを洗浄する。
３．３００μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ／０．０２％ツイーン２０／１％ＢＳＡ）によりプレートをブロックする。
４．プレートウェルを洗浄する。
【０１８４】
ｒｈＩＬ−６アッセイ：
５．１００μＬのサンプルまたはスタンダード（３０００ｐｇ／μＬ〜０．０００３ｐｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−６、１：６希釈で）をウェルへ添加し、室温で３０分間インキュベーションする。
６．プレートウェルを洗浄する。
７．１００μＬの１２．５ｎｇ／ｍｌビオチン化検出抗ＩＬ６抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、室温で１５分間インキュベーションする。プレートウェルを洗浄する。
８．１００μＬのアルカリフォスファターゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１：４０，０００希釈で添加する。
９．プレートウェルを洗浄する。
１０．各々のウェルへ１００μｌの基質溶液を添加し、室温で３０分間インキュベーションする。
１１．ルミノメーターを使用して２５℃の温度で３０分間で各々のウェルのＲＬＵを測定する。
【０１８５】
ＡＭＰＰＤのｉｎ  ｓｉｔｕジオキセタン調製：
溶液Ａを以下の溶液を組み合わせることによって調製して１２．７ｍＭのＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェートのストック溶液を得た。
５ｍｇ／ｍＬのＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェート（実施例２から；分子量３９４）。
２ｍＬの０．１Ｍアミノメチルプロパノール緩衝液、ｐＨ９．８（ＡＭＰ緩衝液）。
５０μＬの０．１Ｍ  Ｎａ２ＭｏＯ４。
【０１８６】
工程１−溶液Ｂの作製
１００μＬの溶液Ａ
３８μＬの１０％  Ｈ２Ｏ２（９．２ｍＭ  ＡＭＰＰＤ（登録商標）（分子量４２６）を作製する）
５５℃で１時間溶液を加熱する（Ｏ２バブルが出て、透明に色変化）
これは溶液Ｂである。化学発光促進剤もこの工程で添加することができる。
【０１８７】
工程２（２．５４ｍＭ）−２．５４ｍＭ  ＡＭＰＰＤの溶液Ｃの作製
１３８μＬの溶液Ｂ（９．２ｍＭ  ＡＭＰＰＤ（登録商標）を有する、ｉｎ  ｓｉｔｕで生成）
３６２μＬの０．１Ｍ  ＡＭＰ緩衝液（ｐＨ９．８）
これは２．５４ｍＭ  ＡＭＰＰＤ（登録商標）の溶液Ｃである。
【０１８８】
工程２（４ｍＭ）−４ｍＭ  ＡＭＰＰＤの溶液Ｃの作製
１３８μＬの溶液Ｂ（９．２ｍＭ  ＡＭＰＰＤ（登録商標）を有する、ｉｎ  ｓｉｔｕで生成された）
１４９．４μＬの０．１Ｍ  ＡＭＰ緩衝液（ｐＨ９．８）
これは４ｍＭ  ＡＭＰＰＤ（登録商標）の溶液Ｃである。
【０１８９】
工程３（０．２５ｍＭ）−０．２５ｍＭ  ＡＭＰＰＤの溶液Ｄの作製
１ｍＬの溶液Ｃ（２．５４ｍＭ  ＡＭＰＰＤ（登録商標））
１ｍＬの１０×Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
８ｍＬの０．１Ｍ  ＡＭＰ緩衝液（ｐＨ９．８）
これは０．２５ｍＭ  ＡＭＰＰＤ（登録商標）の溶液Ｄである。
１００μＬの溶液Ｄのを各々のウェルへ添加する。
【０１９０】
＊工程３（０．４ｍＭ）−０．４ｍＭ  ＡＭＰＰＤの溶液Ｄの作製
１ｍｌの溶液Ｃ（４ｍＭ  ＡＭＰＰＤ（登録商標））
１ｍｌの１０×Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
８ｍｌの０．１Ｍ  ＡＭＰ緩衝液（ｐＨ９．８）
これは０．４ｍＭ  ＡＭＰＰＤ（登録商標）の溶液Ｄである。
１００μＬの溶液Ｄを各々のウェルへ添加する。
＊スタンダードアッセイ検出は０．４ｍＭ  １，２−ジオキセタンおよび１ｍｇ／ｍｌの促進剤をを用いるので、これは比較アッセイ条件を設定する。
【０１９１】
実験の他のセットにおいて、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤを生成する酸化時間は多様であり、次いで基質性能を対照ＡＭＰＰＤ（登録商標）と共にｒｈＩＬ−６のＥＬＩＳＡによって評価した。時間経過実験は、３０分までに大部分のＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェートがｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤに転換されるようであることを示した。１５分間のｉｎ  ｓｉｔｕ生成ＡＭＰＰＤ  ｖｓ．６０分間のｉｎ  ｓｉｔｕ生成ＡＭＰＰＤを使用するイムノアッセイ性能（感受性およびダイナミックレンジ）における低下はほとんどなかった。３０分間のｉｎ  ｓｉｔｕ生成ＡＭＰＰＤ  ｖｓ．６０分間のｉｎ  ｓｉｔｕ生成ＡＭＰＰＤにより検出シグナル（ＲＬＵ）における差異もほとんどなかった。ＡＭＰＰＤエノールエーテルホスフェートのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＭＰＰＤへのある程度の転換が、Ｔ０結果によって示されるようにアッセイの間に起こる（図２３を参照）。
【０１９２】
２．ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒ検出によるｒｈＩＬ−６検出ＥＬＩＳＡ
ベンチマークテストの実験により、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒの光放射（ＲＬＵで）およびシグナル対ノイズ（Ｓ：Ｎ）を、対照ジオキセタンＣＳＰＤ（登録商標）、ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）と比較した。最大光放射はジオキセタン基質に応じて変動し、ＣＳＰＤ（登録商標）は３０分間でグローに到達し、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）は４５分間でグローに到達し、ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）は６０分間でグローに到達する（図２４および図２５を参照）。
【０１９３】
モデルのｒｈＩＬ−６  ＥＬＩＳＡを、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒおよび対照ジオキセタンＣＳＰＤ（登録商標）、ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標））と同時に実行し、イムノアッセイにおけるｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒの性能を評価した。実験により、ｉｎ  ｓｉｔｕ生成ＡＤＰ−Ｓｔａｒは対照ジオキセタン基質と同等に実行されることが示された。アッセイ感受性（ＩＬ−６の検出下限）、Ｓ／Ｎおよびダイナミックレンジは、ｉｎ  ｓｉｔｕ生成ＡＤＰ−Ｓｔａｒを含むすべての基質について類似していた（図２６を参照）。
【０１９４】
上記の溶液調製工程Ａ〜Ｄのうちの１つまたは複数の排除は、応用開発において所望され得る。溶液構成要素の修飾も特定の応用において所望され得る。溶液構成要素の修飾の一例は、アッセイ条件への緩衝液による希釈前に、酸化工程において存在する促進剤を用いた検出溶液の調製によって実証された。修飾したｉｎ  ｓｉｔｕジオキセタン調製を使用して、アルカリホスファターゼ検出曲線から、ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）対照（赤色および淡青色の放射曲線）と比較して、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒ（紺色および黄色の光放射曲線）は類似した感受性であることが示される（図２７を参照）。実際は、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒ検出溶液は、対照と比較して、放射最大への到達に際してより安定した光放射を与える。加えて、修飾したｉｎ  ｓｉｔｕ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒジオキセタン調製は、ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡについて対照ジオキセタンに匹敵するイムノアッセイ検出感度を与える（図２８および図２９を参照）。
【０１９５】
促進剤溶液中のｉｎ  ｓｉｔｕ生成ＡＤＰ−Ｓｔａｒ：
ａ）酸化はＡＭＰの緩衝液中の１１．７ｍＭ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒエノールエーテルホスフェート（実施例３から）および１０ｍｇ／ｍｌのＳａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋  Ｎａ２ＭｏＯ４で実行した。酸化後に、溶液はＡＭＰ緩衝液により１×へ希釈する。最終的な溶液濃度は以下の通りである。０．５８ｍＭ  ｉｎ  ｓｉｔｕ生成ＡＤＰ−Ｓｔａｒ／０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ。
ｂ）酸化はＡＭＰ緩衝液中の４ｍＭ  ＡＤＰ−Ｓｔａｒエノールエーテルホスフェート（実施例３から）および１０ｍｇ／ｍｌのＳａｐｐｈｉｒｅ＋Ｎａ２ＭｏＯ４で実行した。酸化後に、溶液はＡＭＰ緩衝液により１×へ希釈した。最終的に、０．４ｍＭ  ｉｎ  ｓｉｔｕ生成ＡＤＰ−Ｓｔａｒ／１ｍｇ／ｍｌ  Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ。
【０１９６】
添付の図面に関して本発明の具体的な実施形態を記載してきたが、本発明はそれらの正確な実施形態に限定されず、当業者であれば、添付の請求項によって定義されるような本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、本発明中で様々な変更および修正を行えることを認識すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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