(57)【要約】  本発明は、医薬品及び改変型β−ラクタマーゼに関する。具体的には、本発明は、新規の組換えβ−ラクタマーゼ、及び当該β−ラクタマーゼを含む医薬組成物に関する。また、本発明は、β−ラクタマーゼを改変するための方法、β−ラクタマーゼを生産するための方法、及びβ−ラクタム抗生物質誘発性の有害作用を治療又は予防するための方法に関する。さらに、本発明は、薬剤として用いるためのβ−ラクタマーゼ、及びβ−ラクタム抗生物質誘発性の有害作用を治療又は予防するための薬剤の製造におけるβ−ラクタマーゼの使用に関する。さらに、本発明は、ポリヌクレオチド及び当該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有しＡｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する配列番号１の位置に親水性アミノ酸残基を有するアミノ酸配列、又はその変異体若しくは断片を含む、β−ラクタマーゼ。
【請求項２】
Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する配列番号１の位置にあるβ−ラクタマーゼのアミノ酸が、親水性アミノ酸で置き換えられることを特徴とする、配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むβ−ラクタマーゼを改変する方法。
【請求項３】
β−ラクタマーゼが、配列番号１と少なくとも６８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、β−ラクタマーゼ活性を有し、Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する位置に、アスパラギン酸（Ｄ）以外の親水性アミノ酸残基を含む、その変異体若しくは断片を含む、請求項１に記載のβ−ラクタマーゼ又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
β−ラクタマーゼが、配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する位置にある親水性アミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）以外である、請求項１に記載のβ−ラクタマーゼ又は請求項２に記載の方法。
【請求項５】
親水性アミノ酸が、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びリシン（Ｋ）からなる群からの極性且つ正電荷の親水性アミノ酸から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のβ−ラクタマーゼ又は請求項２に記載の方法。
【請求項６】
親水性アミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）からなる群からの極性且つ中性電荷の親水性アミノ酸から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のβ−ラクタマーゼ又は請求項２に記載の方法。
【請求項７】
２７６位に対応する配列番号１の位置にあるアミノ酸がアスパラギンであることを特徴とする、請求項６に記載のβ−ラクタマーゼ。
【請求項８】
２７６位に対応する配列番号１の位置にあるアミノ酸がアルギニンであることを特徴とする、請求項５に記載のβ−ラクタマーゼ。
【請求項９】
２７６位に対応する配列番号１の位置にある親水性アミノ酸がαヘリックス内に位置することを特徴とする、請求項１から８までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼ又は方法。
【請求項１０】
β−ラクタマーゼが、Ａｍｂｌｅｒ分類に従ったＬｅｕ２２０及びＡｒｇ２４４からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸をさらに含むことを特徴とする、請求項１から９までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼ又は方法。
【請求項１１】
β−ラクタマーゼがペニシリン及び／又はセファロスポリンを加水分解することを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼ又は方法。
【請求項１２】
β−ラクタマーゼが、野生型β−ラクタマーゼと比較して、セファロスポリンに対する向上した触媒効率を有することを特徴とする、請求項１から１１までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼ又は方法。
【請求項１３】
セファロスポリンが、セフォペラゾン、セフトリアキソン、及びセファゾリンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載のβ−ラクタマーゼ又は方法。
【請求項１４】
ｖ）請求項１又は３から１３までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を準備するステップ、
ｖｉ）宿主細胞を該遺伝子で形質転換するステップ、
ｖｉｉ）β−ラクタマーゼを生産する宿主細胞を得るステップ、
ｖｉｉｉ）β−ラクタマーゼを回収するステップ
を含むことを特徴とする、請求項１又は３から１３までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼを生産する方法。
【請求項１５】
請求項１又は３から１３までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼをβ−ラクタム抗生物質と同時に又は連続的に対象に投与することを特徴とする、胃腸管におけるβ−ラクタム抗生物質誘発性の有害作用を治療又は予防する方法。
【請求項１６】
配列番号２若しくは４又はその縮重配列のいずれか１つの配列を含むか、或いは請求項１又は３から１３までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１又は３から１３までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼを含む医薬組成物。
【請求項１９】
薬剤として用いるための、請求項１又は３から１３までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼ。
【請求項２０】
胃腸管におけるβ−ラクタム抗生物質誘発性の有害作用を治療又は予防するための薬剤の製造における、請求項１又は３から１３までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼの使用。
【請求項２１】
β−ラクタマーゼ（単数又は複数）が経口的に投与されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法又は請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
β−ラクタマーゼ（単数又は複数）が患者の胃腸に直接的に投与されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法又は請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
β−ラクタマーゼ（単数又は複数）及びβ−ラクタム抗生物質が、腸溶コーティングされたペレットの形態で一緒に対象に投与されることを特徴とする、請求項１５若しくは２１から２２までのいずれか一項に記載の方法又は請求項２０から２２までのいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品及び改変型β−ラクタマーゼに関する。具体的には、本発明は、新規の組換えβ−ラクタマーゼ、及び当該β−ラクタマーゼを含む医薬組成物に関する。
【０００２】
また、本発明は、β−ラクタマーゼを改変するための方法、β−ラクタマーゼを生産するための方法、及びβ−ラクタム抗生物質誘発性の有害作用を治療又は予防するための方法に関する。さらに、本発明は、薬剤として用いるためのβ−ラクタマーゼ、及びβ−ラクタム抗生物質誘発性の有害作用を治療又は予防するための薬剤の製造におけるβ−ラクタマーゼの使用に関する。
【０００３】
さらに、本発明は、ポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００４】
β−ラクタム抗生物質は、その分子構造内のβ−ラクタム環を特徴とする。β−ラクタム環の完全性は生物学的活性に必須であり、これは、ペプチドグリカン合成の最後の段階である架橋反応を触媒する一連のトランスペプチダーゼの不活化をもたらす。β−ラクタム抗生物質ファミリーのメンバーは、ペニシリン、セファロスポリン、クラバム（又はオキサペナム）、セファマイシン、及びカルバペネムを含む。
【０００５】
β−ラクタマーゼは、β−ラクタム抗生物質を加水分解する、細菌の防御酵素である。β−ラクタマーゼの生産は、グラム陰性細菌におけるβ−ラクタム耐性を付与するための主要なメカニズムである。β−ラクタマーゼは、β−ラクタム環のアミド結合の不可逆的な加水分解を非常に効率的に触媒し、生物学的に不活性な生成物（単数又は複数）をもたらす。
【０００６】
異なるβ−ラクタマーゼタイプの酵素的特徴が多様であるため、それらを分類するためにいくつかの分類体系が提案されている。この分類は、２つの主要なアプローチ、すなわち、機能的分類及び分子的分類に基づく。
【０００７】
Ｂｕｓｈら（１９９５、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１２１１〜１２３３）によって提案されているβ−ラクタマーゼの機能的分類スキームは、４つのβ−ラクタマーゼグループを定義しており、これらは、その基質プロフィール及び阻害剤プロフィールに基づく。グループ１は、クラブラン酸によってあまり阻害されないセファロスポリナーゼからなる。グループ２は、活性部位特異的なβ−ラクタマーゼ阻害剤によって通常阻害される、ペニシリナーゼ、セファロスポリナーゼ、及び広域スペクトルβ−ラクタマーゼからなる。グループ３は、ペニシリン、セファロスポリン、及びカルバペネムを加水分解し、且つほとんど全てのβ−ラクタム含有分子によってほとんど阻害されない、メタロ−β−ラクタマーゼからなる。グループ４は、クラブラン酸によってあまり阻害されないペニシリナーゼからなる。サブグループもまた、グループ２のペニシリナーゼによるカルベニシリン又はクロキサシリン（オキサシリン）の加水分解速度に従って定義されている。
【０００８】
最も広く用いられている分類は、Ａｍｂｌｅｒ分類であり、それは、β−ラクタマーゼを４つのクラス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）に分け、それらのアミノ酸配列に基づく（Ａｍｂｌｅｒ  １９８０、Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．２８９：３２１〜３３１）。クラスＡ、Ｃ、及びＤは、セリンβ−ラクタマーゼ酵素の進化的に異なるグループをまとめ、クラスＢは、亜鉛依存性の（「ＥＤＴＡ阻害型の」）β−ラクタマーゼ酵素をまとめる（Ａｍｂｌｅｒ  Ｒ．Ｐ．ら、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２７６：２６９〜２７０）。クラスＡ、Ｃ、及びＤは、セリンβ−ラクタマーゼに属し、このラクタマーゼでは、β−ラクタムの加水分解は、活性部位におけるセリンによって仲介される。セリンβ−ラクタマーゼは、β−ラクタムの標的酵素であるＤＤペプチダーゼ（Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンカルボキシペプチダーゼ）に関連する。セリンβ−ラクタマーゼがβ−ラクタム抗生物質を加水分解するメカニズムは、非共有結合性のアンリ−ミカエリス複合体、共有結合性のアシル−酵素中間体、及び脱アシル化を含む、３段階の経路に従うと考えられている（Ｍａｔａｇｎｅら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３３０：５８１〜５９８）。アシル化のメカニズムは、全てのセリンβ−ラクタマーゼグループに共通のメカニズムであると考えられるが、理論計算に基づくと、クラスＡ、Ｃ、及びＤのセリンβ−ラクタマーゼの基質脱アシル化メカニズムは、互いに異なると考えられる。脱アシル化メカニズムは、共通の及びグループに特異的な元素レベルのプロセスを有する（Ｈａｔａ  Ｍら、２００６、Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ．２９：２１５１〜２１５９）。
【０００９】
バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）のセリンβ−ラクタマーゼ並びにＴＥＭ−１ファミリー、ＳＨＶ−１ファミリー、及びＣＴＸ−Ｍファミリーは、主に、クラスＡのβ−ラクタマーゼとして、また例えばペニシリン及びアンピシリンを加水分解する良好な能力を有するペニシリナーゼとして分類されている。クラスＡのβ−ラクタマーゼは、１９４０年代に、ペニシリン耐性の黄色ブドウ球菌（Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓ）において最初に同定された。プラスミド媒介性（plasmid-borne）ペニシリン耐性遺伝子であるＴＥＭ−１は、２０年後に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発見された。その後、セリンβ−ラクタマーゼはまた、ほとんどのセファロスポリンを加水分解する能力を獲得し、さらには特定のセファロスポリンサブセットの加水分解に特化することが示された。これらの広範囲のスペクトルを有するβ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）のほとんどは、ＴＥＭ−１酵素、ＴＥＭ−２酵素、又はＳＨＶ−１酵素の誘導体である。最近は、クラスＡのＥＳＢＬの新たなグループであるＣＴＸ−Ｍ酵素の膨大な出現を記載する報告が増加している。現今では、ＣＴＸ−Ｍ酵素が最も頻繁に観察されるＥＳＢＬであり、５つの主要なファミリーに下位分類される。ＣＴＸ−Ｍ酵素は、ペニシリン並びに第１世代、第２世代、及び第３世代のセファロスポリンを含む、広い基質範囲を有する（Ｂｏｎｎｅｔ，Ｒ．２００４．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：１〜１４）。
【００１０】
クラスＡのβ−ラクタマーゼ（ＴＥＭ、ＳＨＶ、ＣＴＸ−Ｍ、バチルス種のβ−ラクタマーゼ）の間の配列類似性は中程度であるが、全てのセリンβ−ラクタマーゼの結晶構造は、特に高い類似性を示す（Ｍａｔａｇｎｅら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３３０：５８１〜５９８;Ｔｒａｎｉｅｒ  Ｓ．ら、２０００、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７５：２８０７５〜２８０８２;Ｓａｎｔｉｌｌａｎａ  Ｅ．ら、２００７、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４：５３５４〜５３５９）。この酵素は２つのドメインからなる。一方のドメインは、３つのαヘリックスに対して押し込まれている５本鎖のβシートからなり、一方、アルファドメインである第２のドメインは、８つのαヘリックスからなる。活性部位ポケットは、これらの２つのドメインの間の界面の一部であり、オメガループによって限定されている。オメガループは、全てのクラスＡのβ−ラクタマーゼで保存された構造エレメントであり、基本的に触媒反応に関与する（図１）。
【００１１】
触媒又は基質の認識に関するいくつかの保存されたペプチド配列（エレメント）が、クラスＡのβ−ラクタマーゼにおいて同定されている。第１の保存されたエレメントである７０−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ−７３（Ａｍｂｌｅｒ分類）は、αヘリックス２の７０位に活性なセリン残基を、７３位にリシンを含む。第２の保存されたエレメントは、αドメインにおけるＳＸＮループ（Ａｍｂｌｅｒ分類に従った１３０と１３２との間の位置）であり、ここでこれは、触媒性空洞の片側を形成する。第３の保存されたエレメント（Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２３４と２３６との間の位置）は、βシート３の最も内側の鎖上にあり、触媒性空洞のもう一方の側を形成する。第３の保存されたエレメントは通常、ＫＴＧである。しかし、一部の例外的なケースでは、リシン（Ｋ）がヒスチジン（Ｈ）又はアルギニン（Ｒ）によって置き換えられていてもよく、いくつかのβ−ラクタマーゼでは、スレオニン（Ｔ）がセリン（Ｓ）によって置換されていてもよい（Ｍａｔａｇｎｅら、１９９８．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３３０：５８１〜５９８）。
【００１２】
β−ラクタムに対するβ−ラクタマーゼ媒介性の耐性は、ここ数十年でのβ−ラクタムの多用により、病原体微生物叢及び片利共生微生物叢の間で広く拡大している。実際、抗生物質耐性は、ヒト及び獣医学の医薬における周知の臨床的問題であり、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に由来する数百の異なるβ−ラクタマーゼが精製され、科学文献において特徴付けされている。抗微生物剤の使用は低減しておらず、さらに、抗微生物耐性は日常生活の一部となっているため、これらの医薬的問題を解決するための新規のアプローチが、常に、且つ緊急に求められている。
【００１３】
ヒトの腸内微生物叢は、例えば免疫応答系を刺激し、食物の消化を助け、潜在的な病原細菌の異常増殖を予防することによって、ヒトの健康における重要な役割を果たす、複雑な細菌集団である。抗微生物剤、例えばβ−ラクタムは、正常な微生物叢に影響を与えることが知られている。抗微生物剤が正常な腸内微生物叢の変化を促す効力は、薬剤投与量、投与経路、並びに抗生物質の薬物動態／薬物力学及び特性を含む、いくつかの因子と関連する（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  Ａ．ら、２００１、Ｌａｎｃｅｔ  １：１０１〜１１４）。腸内微生物叢は、抗生物質治療が完了した後に正常に戻る傾向を有するが、選択された耐性片利共生細菌の長期にわたる持続性が報告されている（Ｓｊｏｌｕｎｄ  Ｍ．ら、２００３、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１３９：４８３〜４８７）。このような持続性及び抗生物質耐性遺伝子の交換によって、片利共生微生物叢が、抗生物質耐性遺伝子の保有者とみなされる。
【００１４】
特定の非経口投与されたβ−ラクタム様アンピシリン、セフトリアキソン、セフォペラゾン、及びピペラシリンは、一部、胆汁中排泄を介して小腸の近位部内（十二指腸）に除去される。腸管内の残りの未吸収のβ−ラクタムは、抗生物質に関連する下痢、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼを生産するグラム陰性桿菌（ＥＳＢＬ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、及び真菌などの病原細菌の異常増殖、並びに正常な腸内微生物叢及び潜在的な病原細菌の両方の中からの抗生物質耐性株の選択をもたらす、正常な腸内微生物叢の生態学的バランスに対する望ましくない効果を生じさせ得る。
【００１５】
β−ラクタマーゼの治療目的は、胃腸管（ＧＩＴ）における未吸収の抗生物質を不活化し、これにより、正常な腸内微生物叢を維持し、潜在的に病原性の微生物を伴うその異常増殖を予防することである（ＷＯ９３／１３７９５）。
【００１６】
β−ラクタマーゼ製剤には少なくとも３つの要件があり、これらはＧＩＴ標的療法に適している。第１の要件は、ＧＩＴにおいて広く存在する条件下で酵素活性を保つことである。様々な腺からＧＩＴ内に分泌される様々なプロテアーゼによるタンパク質分解性の破壊に対する耐性は、β−ラクタマーゼ療法の実現可能性のための典型的な前提条件である。別の重要な考慮事項は、小腸の異なる区画に存在するｐＨ値の範囲である。これらのｐＨ値は通常、５（十二指腸）と７．５（回腸）との間で変化する。したがって、意図した治療目的のための候補として適格であるためには、β−ラクタマーゼは、ｐＨ範囲５〜７．５にわたって高い酵素活性を示す必要がある。
【００１７】
β−ラクタマーゼ又はその生成物の第２の要件は、β−ラクタムを効率的に加水分解することである。抗生物質治療エピソードの間の小腸糜粥内のβ−ラクタム抗生物質の濃度は、胆汁中排泄を介する特定のβ−ラクタムの除去に最も関連する。適切なβ−ラクタマーゼは、腸内微生物叢の変化を生じさせるレベルよりも低いＧＩＴβ−ラクタム濃度を効果的に加水分解することを可能にする動態パラメータを有する必要がある。理想的な動態パラメータセットは、最大反応速度Ｖｍａｘの高い数値と組み合わされた、ミカエリス定数ＫＭの低い数値からなる。高いＶｍａｘ値は、十分なレベルの破壊能力をもたらすために必要であり、一方、低いＫＭ値は、低い基質濃度でのβ−ラクタム分解活性を確実にするために必要である。
【００１８】
β−ラクタマーゼ又はその生成物の第３の要件は、医薬組成物の製造における比較的高い温度などの条件に耐性であることである。さらに、生産プロセスにおいて、水性賦形剤と原薬との混合分散は、適切なｐＨでの高レベルの溶解度を要する。
【００１９】
Ｉｐｓａｔ  Ｐ１Ａと呼ばれる酵素療法が、消化管内部におけるβ−ラクタム抗生物質の有害作用を予防するために開発されている。Ｉｐｓａｔ  Ｐ１Ａ送達系は、非経口的に投与されたペニシリングループのβ−ラクタム（例えば、ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、及びピペラシリン）を、胆管系を介して排出されるβ−ラクタマーゼ阻害剤（例えば、タゾバクタム、スルバクタム、クラブラン酸）を伴って、又は伴わずに、不活化するように設計されている（ＷＯ２００８０６５２４７;Ｔａｒｋｋａｎｅｎ、Ａ．Ｍ．ら、２００９、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５３：２４５５〜２４６２）。Ｐ１Ａ酵素は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）７４９／Ｃの小型エキソβ−ラクタマーゼの組換え形態であり（ＷＯ２００８０６５２４７）、これは、クラスＡに属し、機能的分類でサブグループ２ａにグループ化される。バチルス・リケニフォルミスのβ−ラクタマーゼ及びそのＰ１Ａ誘導体は、例えばペニシリン、アンピシリン、アモキシシリン、又はピペラシリンを分解する高い加水分解能力を有するペニシリナーゼであると考えられ（表１）、それらは通常、クラブラン酸、スルバクタム、又はタゾバクタムなどの活性部位特異的β−ラクタマーゼ阻害剤によって阻害される（Ｂｕｓｈ  Ｋ．ら、１９９５、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ３９：１２１１〜１２３３）。
【００２０】
しかし、Ｐ１Ａ酵素は、非常に限られた、セファロスポリングループ又はカルバペネムグループに属するβ−ラクタム抗生物質を不活化する能力しか有さない。採用されるβ−ラクタマーゼはセファロスポリンに対してほとんど活性を有さないため、これらは、小腸管内の未吸収のβ−ラクタムを不活化するための非経口セファロスポリン療法と組み合わせて利用することができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
したがって、例えばメタロ−β−ラクタマーゼにおいて見られるような、基質プロフィールが拡張した新規のβ−ラクタマーゼ又はＰ１Ａ誘導体が不可欠である。
【００２２】
本発明は、新規の遺伝子操作されたＰ１Ａβ−ラクタマーゼ誘導体、さらに、β−ラクタマーゼを改変及び生産するための新規の方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の新規のＰ１Ａβ−ラクタマーゼ組換え誘導体は、適切なβ−ラクタマーゼの上記の３つの要件を満たし（すなわち、酵素活性を保つ能力を有し、β−ラクタムを効率的に加水分解し、且つ医薬組成物の製造における条件に耐える）、さらに、拡張した基質プロフィールを有する。本発明のβ−ラクタマーゼはまた、小腸管における胆管から除去されたβ−ラクタムを不活化するための、非経口セファロスポリン療法と組み合わせて用いることができる。
【００２４】
本発明は、新規のＩｐｓａｔ  Ｐ３Ａ薬学的タンパク質（Ｄ２７６Ｎ置換されたＰ１Ａ誘導体）の予備研究及び前臨床研究を強調し、単一原薬用量を提示する。
【００２５】
本発明は、β−ラクタマーゼを改変するため及びβ−ラクタマーゼを生産するための迅速且つ効率的な方法を可能にする。さらに、本発明によって、さらに効果的で特異的な治療が利用可能になる。
【００２６】
本発明の酵素は、様々なグループのβ−ラクタム抗生物質によって誘発される有害作用を治療又は予防するための原薬の大規模製造に適している。
【００２７】
本発明の目的は、新規のβ−ラクタマーゼ、特にバチルス・リケニフォルミスのβ−ラクタマーゼを提供すること、並びに当該β−ラクタマーゼに関する生成物、方法、及び使用を提供することである。医薬品産業におけるさらなる開発のためのツールもまた、本発明によって提示される。
【００２８】
本発明は、配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有しＡｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する配列番号１の位置に親水性アミノ酸残基を有するアミノ酸配列、又はその変異体若しくは断片を含む、β−ラクタマーゼに関する。
【００２９】
本発明はまた、本発明のβ−ラクタマーゼを含む医薬組成物に関する。
【００３０】
本発明はまた、配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むβ−ラクタマーゼを改変する方法であって、Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する配列番号１の位置にあるβ−ラクタマーゼのアミノ酸が、親水性アミノ酸で置き換えられる方法に関する。
【００３１】
さらに、本発明は、β−ラクタマーゼを生産する方法に関するものであり、本方法は以下のステップを含む：
ｉ）本発明のβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を準備するステップ、
ｉｉ）宿主細胞を当該遺伝子で形質転換するステップ、
ｉｉｉ）β−ラクタマーゼを生産する宿主細胞を得るステップ、
ｉｖ）β−ラクタマーゼを回収するステップ。
【００３２】
さらに、本発明は、本発明のβ−ラクタマーゼをβ−ラクタム抗生物質と同時に又は連続的に対象に投与することによって、胃腸管におけるβ−ラクタム抗生物質誘発性の有害作用を治療又は予防する方法に関する。
【００３３】
さらに、本発明は、薬剤として用いるためのβ−ラクタマーゼに関する。
【００３４】
さらに、本発明は、胃腸管におけるβ−ラクタム抗生物質誘発性の有害作用を治療又は予防するための薬剤の製造におけるβ−ラクタマーゼの使用に関する。
【００３５】
さらに、本発明は、配列番号２若しくは４又はその縮重配列のいずれか１つの配列を含むか、或いは本発明のβ−ラクタマーゼをコードするポリヌクレオチドに関するものである。本発明はまた、当該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】バチルス・リケニフォルミスβ−ラクタマーゼ（ＰｅｎＰの小型エキソ形態）のβ−ラクタマーゼ三次元構造を示す図である。Ｒ−２４４及びＤ−２７８の保存されたアミノ酸残基及び側鎖残基に印が付けてある。図は、ＭｏｌＳｏｆ−Ｂｒｏｗｓｅｒプログラムを用いて作成した。
【図２】バチルス・リケニフォルミスのＤ２７６Ｎβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ｐ１Ａ誘導体）のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は配列番号３の配列に対応し、この配列において、Ｘａａはアスパラギン（Ａｓｎ）である。ヌクレオチド配列は配列番号４の配列に対応し、この配列において、ヌクレオチドトリプレットｎｎｎはａａｔである。オープンリーディングフレームは、ｐＫＴＨ１４１分泌ベクターに由来するａｍｙＱ遺伝子（ＷＯ２００８／０６５２４７）の３１アミノ酸長のシグナル配列（下線が引かれている）を有する２９９アミノ酸のポリペプチドをコードする。予測されるシグナルペプチダーゼ切断部位は、−１位のアラニン（Ａ）の後ろにある。ＮＨ２−ＱＡＳ伸長をコードするＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位は太字で表されている。成熟Ｄ２７６Ｎ突然変異酵素は、＋１位のグルタミン（Ｑ）から開始する。したがって、成熟Ｄ２７６Ｎ突然変異β−ラクタマーゼは、ＨｉｎｄＩＩＩによってコードされるＮＨ２−ＱＡＳ伸長を含む２６８個のアミノ酸残基を含む。アスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）への単一アミノ酸置換は、Ａｍｂｌｅｒ分類体系における２７６位に対応する２８０位（太字で表されている）に位置し、配列番号３の配列のアミノ酸位置２４９に対応する。  精製されたＤ２７６Ｎ突然変異酵素のＮＨ２末端配列を、タンパク質シーケンサーにおいて自動Ｅｄｍａｎ分解によって決定した。分析によって、Ｄ２７６Ｎ突然変異酵素が、その親Ｐ１Ａ酵素と同様の様式で（ＷＯ２００８／０６５２４７）、その推定アミノ末端にＮＨ２−ＱＡＳＫＴ−ペンタペプチドを欠いていることが実証された。本願の例４及び例６において利用されている、精製されたＤ２７６Ｎ突然変異酵素の主要画分は、＋６位のグルタミン酸から開始し、２６３個のアミノ酸残基からなり、２９２７２の分子量を有する。
【図３】バチルス・リケニフォルミスに由来するＰ１ＡのＤ２７６Ｒ置換β−ラクタマーゼ遺伝子のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は配列番号３の配列に対応し、この配列において、Ｘａａはアルギニン（Ａｒｇ）である。ヌクレオチド配列は配列番号４の配列に対応し、この配列において、ヌクレオチドトリプレットｎｎｎはｃｇｃである。
【図４】セフトリアキソン（体重１ｋｇ当たり３０ｍｇのセフトリアキソン）を静脈内投与した後のビーグル犬（ｎ＝５）の空腸糜粥におけるセフトリアキソンの濃度に対する、経口投与された腸溶コーティングされているＤ２７６Ｎ置換β−ラクタマーゼ（Ｐ３Ａ）ペレットの効果を示す図である（中塗りの四角）。β−ラクタマーゼペレットは、セフトリアキソン注射の１０分前に与えた。中塗りのダイヤ型は、β−ラクタマーゼ治療を行わずにセフトリアキソンを単回投与（ｉ．ｖ．）した後に達した、空腸のセフトリアキソン濃度を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
β−ラクタマーゼは、腸の正常な微生物叢の変化及びβ−ラクタム耐性細菌の異常増殖を含む、β−ラクタム誘発性の有害作用を予防するために、胃腸管における未吸収のβ−ラクタムを不活化する際に用いられている（ＷＯ９３１３７９５、ＷＯ２００８０６５２４７、ＷＯ２００７１４７９４５）。本発明はここで、驚くべき変化した基質プロフィールを示す、バチルス・リケニフォルミスの改変型β−ラクタマーゼを提供する。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、β−ラクタマーゼは、β−ラクタムを加水分解する酵素を言う。β−ラクタム環のアミド結合の加水分解によって、抗微生物剤が生物学的に不活性となる。本明細書において用いられる場合、クラスＡのβ−ラクタマーゼ（Ａｍｂｌｅｒ分類）はセリンβ−ラクタマーゼを言い、このセリンβ−ラクタマーゼにおいて、β−ラクタムの加水分解は、αヘリックス２におけるアミノ酸位置７０に通常存在する、活性部位におけるセリンによって仲介される。クラスＡのβ−ラクタマーゼには、限定はしないが、Ｌｅｎ−１、ＳＨＶ−１、ＴＥＭ−１、ＰＳＥ−３／ＰＳＥ−３、ＲＯＢ−１、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、例えば５／Ｂタイプ１、５６９／Ｈタイプ１、及び５６９／Ｈタイプ３、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｓｉｓ  ｓｐ）、バチルス・リケニフォルミス、例えばＰｅｎＰ、バチルス・ウェイヘンステファネンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）、バチルス・クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ＰＣ１、Ｓｍｅ−１、ＮｍｃＡ、ＩＭＩ−Ｍタイプ、ＰＥＲ−Ｍタイプ、ＶＥＢ−Ｍタイプ、ＧＥＳ−Ｍタイプ、ＫＰＣ−Ｍタイプ、ＣＭＥ−Ｍタイプ、並びにＣＴＸ−Ｍタイプのβ−ラクタマーゼが含まれる。
【００３９】
ペプチド及びポリヌクレオチドの配列同一性
本発明の突然変異β−ラクタマーゼ（Ｄ２７６Ｘ、Ｐ１Ａ誘導体）のアミノ酸配列は、配列番号１及び配列番号３として示される。対応するヌクレオチド配列は、配列番号２及び配列番号４として示される。配列番号１は、β−ラクタマーゼの二次構造の形成に関与するアミノ酸配列を示す。配列番号３は、３１アミノ酸長のシグナル配列を含む、タンパク質の完全長アミノ酸配列を示す。
【００４０】
本発明のβ−ラクタマーゼは、配列番号１又は３と少なくとも３０、３５、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．８、９９．９、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００４１】
本発明の具体的な実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１又は３と少なくとも３０、３５、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．８、９９．９、又は１００％の同一性を有する。
【００４２】
本発明の１つの好ましい実施形態において、本発明のβ−ラクタマーゼは、配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の別の好ましい実施形態において、β−ラクタマーゼは、配列番号１又は３と少なくとも６０％の配列同一性を有する。
【００４３】
本発明の１つの実施形態において、配列番号１との上記の配列同一性のいずれかを有するアミノ酸配列を含むβ−ラクタマーゼは、Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する配列番号１の位置に、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）からなる群から選択される親水性アミノ酸を有する。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、ペプチドは、配列番号１又は３で示される配列を有する。本発明の１つの実施形態において、β−ラクタマーゼは、配列番号１又は３で示される配列を有し、この配列において、Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する位置にある親水性アミノ酸残基（配列番号１又は３においてＸａａとして印が付けてある）はアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）である。本発明の別の実施形態において、β−ラクタマーゼは、配列番号１又は３で示される配列を有し、この配列において、Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する位置にある親水性アミノ酸残基（配列番号１又は３においてＸａａとして印が付けてある）はアスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）である。
【００４５】
任意の配列と本発明の配列との同一性は、本発明の配列全体との同一性を言う。配列同一性は、任意の従来の生物情報学的方法によって、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌｓ）又はＦＡＳＴＡ（ＦＡＳＴ−ＡＩＩ）を用いて決定することができる。
【００４６】
本発明はまた、新規のβ−ラクタマーゼの任意の変異体又は断片に関する。本明細書において用いられる場合、β−ラクタマーゼの断片又は変異体は、生物学的機能を有する、すなわち酵素的に活性である、任意の部分又は変異体を言う。変異体は、ペプチド配列におけるわずかな変化、例えば、突然変異、わずかな欠失又は挿入を有するペプチドを言う。断片及び変異体は、Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する位置に親水性アミノ酸を含むべきである。親水性アミノ酸は、典型的には、アスパラギン酸（Ｄ）以外のものである。
【００４７】
配列番号３から得ることが可能であり、細胞の外側に分泌される、β−ラクタマーゼの様々な短い形態が存在する。これらは、エキソ形態と呼ばれる。エキソ形態は、細胞壁又は培地におけるプロテアーゼの加水分解活性の結果生じる。
【００４８】
Ｄ２７６Ｘ、Ｄ２７６Ｎ、Ｄ２７６Ｒ、突然変異形態、Ｐ１Ａ誘導体、又はＰ３Ａは、本明細書において用いられる場合、配列番号３の任意のβ−ラクタマーゼ活性な断片及び／若しくは変異体、又は明示されたアミノ酸配列（配列番号１）を含む変異体を包含する。特に、本発明のβ−ラクタマーゼはＮＨ２切断型の形態であり、ＮＨ２切断型の形態とは、β−ラクタマーゼがアミノ末端で切断されていることを意味する。ＮＨ２切断に加えて、β−ラクタマーゼは、β−ラクタマーゼ活性を有する限りにおいて、１つ又は複数のさらなるアミノ酸の欠失、置換、及び／又は挿入を含み得る。前記改変は、天然の変型若しくは突然変異体、又は例えば遺伝子工学によって導入された、人工の改変であり得る。
【００４９】
差次的にアミノ末端が切断されたエキソ形態が、バチルス・リケニフォルミスの成長培地において見出されている。このようなエキソ形態もまた、本発明に包含される。Ｍａｔａｇｎｅらは、天然宿主のバチルス・リケニフォルミス７４９／Ｃによって生産された細胞外形態における様々な程度の微小不均一性を記載している（Ｍａｔａｇｎｅ  Ａ．ら、１９９１．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２７３：５０３〜５１０）。異なるＮ末端アミノ酸残基を有する以下の５つの異なる分泌型エキソ形態が同定された。
【化１】
2013529905.tif 000002
【００５０】
最初のアミノ酸残基は太字で表されている。Ｃ末端のアミノ酸残基は右側に示されている。セリン（Ｓ）から開始するエキソ形態は、バチルス・リケニフォルミスのβ−ラクタマーゼの「大型分泌型形態」と呼ばれ、リシン（Ｋ）から開始するものは「小型分泌型形態」と呼ばれる。
【００５１】
第１のαヘリックス（α１ヘリックス）はアスパラギン酸（Ｄ）（イタリック体で表されている）から開始し、最後のαヘリックス（α１１ヘリックス）の最後はアスパラギン（Ｎ）（イタリック体で表されている）で終わる。本発明の１つの実施形態によると、β−ラクタマーゼは、タンパク質の二次構造に関与する（Ｋｎｏｘ  Ｊ．Ｒ．ら、１９９１．Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２０：４３５〜４５５）、配列番号１のアミノ酸１〜２５８又は配列番号３のアミノ酸７〜２６４を少なくとも含む。本発明の別の実施形態によると、前記配列番号１のアミノ酸１〜２５８又は配列番号３のアミノ酸７〜２６４の１つ又は複数は、欠失しているか又は置き換えられている。
【００５２】
本発明のさらに別の実施形態によると、β−ラクタマーゼのアミノ末端は、ＮＨ２−ＫＴＥＭＫＤＤ（配列番号３のアミノ酸４〜１０）で開始する。このいわゆるＥＳ−βＬエキソ形態は、Ｇｅｂｈａｒｄら（Ｇｅｂｈａｒｄ  Ｌ．Ｇ．ら、２００６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：３５８（１）２８０〜２８８）によって記載されているように、最大２１個の連続する残基をさらに欠き得る。本発明の別の実施形態によると、アミノ末端は、配列番号３のグルタミン酸（Ｅ）で開始し、特に、これは、ＮＨ２−ＥＭＫＤＤ（配列番号３のアミノ酸６〜１０）で開始するか、或いは、これは、ＮＨ２−ＭＫＤＤ（配列番号３のアミノ酸７〜１０又は配列番号１のアミノ酸１〜４）で開始する。
【００５３】
β−ラクタマーゼのアミノ末端配列における可変領域は、様々なβ−ラクタマーゼ形態の酵素的パラメータの不変性の要因となる厳格な構造を有さない。
【００５４】
β−ラクタマーゼのカルボキシル末端の最後４つのアミノ酸ＭＮＧＫ−ＣＯＯＨ（配列番号３のアミノ酸２６５〜２６８）は、二次構造の一部ではなく、したがってまた、活性を失うことなく欠失し得る。別の実施形態において、最大９個のＣ末端アミノ酸が欠失し得る。Ｃ末端切断型形態のタンパク質は、Ｓａｎｔｏｓら、（Ｓａｎｔｏｓ  Ｊ．ら、２００４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１７１５〜１７２３）によって記載されている。
【００５５】
上記に説明した、β−ラクタマーゼの異なる形態の全ては、β−ラクタマーゼ活性を有する他の形態のタンパク質と共に、本発明に包含される。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２若しくは４のいずれか１つの配列又はその縮重配列を含み得るか又は有し得る。配列番号２又は４のいずれか１つで示される配列の縮重配列であるポリヌクレオチドは、配列番号２又は４と比較して１つ又は複数の異なるヌクレオチドを有するが同一のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを言う。好ましくは、配列番号２又は４のヌクレオチドトリプレットｎｎｎは、親水性アミノ酸を、最も好ましくはＮ又はＲをコードする。本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列などのヌクレオチドの配列であり、一本鎖又は二本鎖のポリ核酸であり得る。ポリヌクレオチドという用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びｍＲＮＡを包含する。
【００５７】
本発明の具体的な実施形態によると、ポリヌクレオチドは、配列番号２又は４のヌクレオチド配列のいずれか１つ又はその断片と少なくとも３０、３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．８、又は９９．９％の同一性を有する。
【００５８】
本発明の１つの具体的な実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２又は４の配列のいずれか１つで示される配列を有する。
【００５９】
クラスＡ  β−ラクタマーゼの２７６位（Ａｍｂｌｅｒ）にあるアミノ酸
アミノ酸位置２７６にあるアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）は、広範なクラスＡ  β−ラクタマーゼ内に存在する。Ａｓｎ２７６の機能は、ＴＥＭβ−ラクタマーゼ及びＳＨＶβ−ラクタマーゼにおいて集中的に研究されており、これらにおいて、Ａｓｎ２７６は、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）２４４のグアニジウム基と水素結合を形成し、したがって、Ａｒｇ２４４の側鎖の可動性を限定する。
【００６０】
ＴＥＭ酵素又はＳＨＶ酵素におけるアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）の置換は、クラブラン酸、スルバクタム、又はタゾバクタムなどのセリンβ−ラクタマーゼ阻害剤に対する耐性に大きく寄与する１つであるとして認識されている。ＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼのＮ２７６Ｄ（Ａｓｐ）置換変異体は、阻害剤耐性β−ラクタマーゼ（ＴＥＭ−３５及びＴＥＭ−３６などのＩＲＴ酵素）内に存在する。Ｎ２７６Ｄ変異体は、野生型ＴＥＭ−１酵素よりもクラブラン酸及びタゾバクタムに対して耐性であるが、同時に、様々なペニシリンに対するＮ２７６Ｄ変異体の触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、ＴＥＭ−１野生型酵素における触媒効率の５０％未満である。セファロスポリンに対するＮ２７６Ｄ変異体の触媒有効性は、野生型ＴＥＭ−１の触媒有効性と比較して低減している（Ｓａｖｅｓ  Ｉら、１９９５、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７０：１８２４０〜１８２４５）。
【００６１】
ＴＥＭ−１と同様に、ＳＨＶ−１  β−ラクタマーゼ又はＳＨＶ−５  β−ラクタマーゼにおけるＮ２７６Ｄ置換は、セリンβ−ラクタマーゼ阻害剤に対する耐性を増強させるが、ほとんどのβ−ラクタムに対するそれらの加水分解効率を低減させる（Ｇｉａｋｋｏｕｐｉ  Ｐ．ら、１９９９、Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、４３：２３〜２９）。さらに、ＳＨＶ−１酵素又はＳＨＶ−５酵素におけるＮ２７６Ｄ置換は、「第４世代」のセファロスポリン、セフピロム、及びセフェピムを分解するそれらの能力を適度に向上させる。
【００６２】
ＳＨＶタイプのβ−ラクタマーゼであるＯＨＩＯ−１において、Ｎ２７６Ｇ（Ｇｌｙ）突然変異体は、クラブラン酸に対して高度に耐性であることが示されており、一方、ＴＥＭ−１由来のＮ２７６Ｇ突然変異体は、クラブラン酸に対する中程度の耐性を有しているにすぎない（Ｂｏｎｏ−ｍｏ  ＲＡら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１２４７：１２１〜１２５）。
【００６３】
ＣＴＸ−Ｍ酵素のファミリーにおいて、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）は、典型的には２７６位に存在し（Ｂｏｎｎｅｔ  Ｒ．、２００４、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、４８：１〜１４）、Ａｒｇ２７６の突然変異は、酵素活性の拡張に影響する。セフォタキシムに対するＣＴＸ−Ｍ酵素の相対的加水分解速度は、Ａｒｇ２７６の置換によって穏やかに低減する。さらに、Ａｒｇ２７６Ｔｒｐ、Ａｒｇ２７６Ｃｙｓ、Ａｒｇ２７６Ｓｅｒ、及びＡｒｇ２７６Ｇｌｙ  ＣＴＸ−Ｍ突然変異酵素は、β−ラクタマーゼ阻害剤耐性のレベルに影響しない（Ｂｏｎｎｅｔ  Ｒ．、２００４、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、４８：１〜１４;Ｐｅｒｅｚ−Ｌｌａｒｅｎａ  Ｆ．Ｊ．ら、２００８、Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、６１：７９２〜７９７）。
【００６４】
【表１】
2013529905.tif 000003
【００６５】
ここで、本発明において、配列番号１（バチルス・リケニフォルミスＰｅｎＰ誘導体、すなわちＰ１Ａ誘導体）と少なくとも６０％の配列同一性を有しＡｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する配列番号１の位置に親水性アミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含むβ−ラクタマーゼは、拡張したβ−ラクタムスペクトル及びβ−ラクタムに対する向上した触媒効果を示す。
【００６６】
以前は、セリンβ−ラクタマーゼ阻害剤に対する耐性又は様々なβ−ラクタムに対する触媒特性における、２７６位にあるアスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸置換の役割は、バチルス種のβ−ラクタマーゼ、具体的にはバチルス・リケニフォルミスのβ−ラクタマーゼの間では研究されていなかった。
【００６７】
本明細書において用いられる場合、Ａｍｂｌｅｒ分類に従ったアミノ酸残基２７６は、配列番号１のアミノ酸位置２４３及び配列番号３のアミノ酸位置２４９に対応する。
【００６８】
典型的には、本発明のβ−ラクタマーゼは、アスパラギン酸（Ｄ）以外の、Ａｍｂｌｅｒ分類の２７６位に対応する位置にある親水性アミノ酸を有する。アミノ酸は、その側鎖の化学的及び／又は構造的特性に基づいて分類される。アミノ酸分類グループには親水性アミノ酸が含まれ、これは、以下の群に分けられる：極性且つ正電荷の親水性アミノ酸、極性且つ中性電荷の親水性アミノ酸、極性且つ負電荷の親水性アミノ酸、芳香族の極性且つ正電荷の親水性アミノ酸。本明細書において用いられる場合、「親水性アミノ酸」は、上記のグループ全ての親水性アミノ酸を含み、すなわち、極性且つ正電荷の親水性アミノ酸、極性且つ中性電荷の親水性アミノ酸、極性且つ負電荷の親水性アミノ酸、及び／又は芳香族の極性且つ正電荷の親水性アミノ酸を言う（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｄ．ｃｕｒｔｉｎ．ｅｄｕ．ａｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ／ｔｕｔｏｒｉａｌｓ／ＡＡｓ／ＡＡ．ｈｔｍｌ）。「極性且つ正電荷の親水性アミノ酸」は、アルギニン（Ｒ）又はリシン（Ｋ）を言う。「極性且つ中性電荷の親水性アミノ酸」は、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、又はスレオニン（Ｔ）を言う。「極性且つ負電荷の親水性アミノ酸」は、アスパルテート（Ｄ）又はグルタメート（Ｅ）を言う。「芳香族の極性且つ正電荷の親水性アミノ酸」はヒスチジン（Ｈ）を言う。
【００６９】
本発明の１つの実施形態において、親水性アミノ酸は、Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する配列番号１の位置にある、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）からなる群から選択される中性電荷又は正電荷の親水性アミノ酸である。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態において、Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する配列番号１の位置にあるβ−ラクタマーゼの親水性アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びリシン（Ｋ）からなる群の極性且つ正電荷の親水性アミノ酸から選択される。最も好ましくは、Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する配列番号１の位置にあるアミノ酸は、アルギニンである。
【００７１】
本発明の別の好ましい実施形態において、親水性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）からなる群の極性且つ中性電荷の親水性アミノ酸から選択される。最も好ましくは、２７６位に対応する配列番号１の位置にあるアミノ酸は、アスパラギンである。
【００７２】
本発明のさらに好ましい実施形態において、２７６位に対応する配列番号１の位置にある親水性アミノ酸は、αヘリックス内に位置する。αヘリックスは、タンパク質二次構造のモチーフであり、コイル状の立体構造に類似している。αヘリックスは、ＤＮＡ結合モチーフにおいて特定の特異性を有し得る（例えば、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、及びジンクフィンガーモチーフ）。本発明の好ましい実施形態において、アミノ酸残基２７６は、最後のαヘリックス１１に位置する（図１）。このαヘリックス１１は、クラスＡ  β−ラクタマーゼの間で保存されていない。
【００７３】
クラスＡ  β−ラクタマーゼの特異的な特徴
クラスＡ  β−ラクタマーゼの１つの特異的な特徴は、Ａｒｇ２７８のグアニジウム基である。ＣＴＸ−Ｍ酵素は、三次元構造内で等価の位置に存在する、Ａｒｇ２７８、Ａｒｇ２４４、又はＡｒｇ２２０を有する。２２０位又は２４４位にあるアルギニンは、ＴＥＭ−１（Ｌｅｕ２２０及びＡｒｇ２４４）及びストレプトコッカス・アルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）のＧβ−ラクタマーゼ（Ａｒｇ２２０及びＡｓｎ２４４）の触媒特性に必須であることが示されている。アルギニン２４４又はアルギニン２２０の塩基性グアニジウム基は、β−ラクタムの結合、又はクラブラン酸などの「自殺」阻害剤の不活化化学に寄与することが提案されている（Ｍａｔａｇｎｅら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３３０：５８２〜５９８;Ｐｅｒｅｚ−Ｌｌａｒｅｎａら、２００８、Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、６１：７９２〜７９７）。バチルス・リケニフォルミスのＰｅｎＰにおいて、Ａｒｇ−２４４残基は、アスパラギン酸２７６と塩結合を形成する（Ｈｅｒｚｂｅｒｇ、Ｏ．１９９１、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２１７：７０１〜７１９;Ｋｎｏｘ，Ｊ．Ｒ．、ａｎｄ  Ｐ．Ｃ．Ｍｏｅｗｓ、１９９１、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２０：４３５〜５５５）。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態において、β−ラクタマーゼは、それぞれ配列番号１のＬｅｕ１８９及びＡｒｇ２１２に対応する、Ａｍｂｌｅｒ分類に従ったＬｅｕ２２０及びＡｒｇ２４４からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸をさらに含む。
【００７５】
バチルス・リケニフォルミスのβ−ラクタマーゼ（ＰｅｎＰ、Ｐ１Ａ）
本発明のβ−ラクタマーゼは、バチルス・リケニフォルミス７４９／Ｃ株に由来する。バチルス・リケニフォルミス７４９／Ｃのβ−ラクタマーゼ（ＰｅｎＰ;ペニシリンアミド−β−ラクタムヒドロラーゼ、ＥＣ３．５．２．６）は、クラスＡ  β−ラクタマーゼの機能的分類においてサブグループ２ａに属する（Ｂｕｓｈ  Ｋ．ら、１９９５、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ３９：１２１１〜１２３３）。バチルス・リケニフォルミスのβ−ラクタマーゼは、例えばペニシリン、アンピシリン、アモキシシリン、又はピペラシリンを分解するための高い加水分解能力を有するペニシリナーゼであると考えることができ、これは通常、クラブラン酸、スルバクタム、又はタゾバクタムなどの活性部位特異的なβ−ラクタマーゼ阻害剤によって阻害される（Ｂｕｓｈ  Ｋ．ら、１９９５、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１２１１〜１２３３）。
【００７６】
バチルス・リケニフォルミス７４９／Ｃのβ−ラクタマーゼは、３０７個のアミノ酸残基からなるプレタンパク質として発現する。転移しその２６アミノ酸残基長のシグナル配列が除去された後、これは、アミノ末端のシステイン（Ｃ２７）がジアチルグリセリドとチオエーテル結合を形成している、膜固定型のリポタンパク質となる。バチルス・リケニフォルミスのβ−ラクタマーゼはまた、リポタンパク質形態のタンパク質分解産物である分泌型（細胞外）形態としても見られる（Ｉｚｕｉ  Ｋ．ら、１９８０、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：１８８２〜１８８６;Ｍａｔａｇｎｅ  Ａ．ら、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、２７３：５０３〜５１０）。アミノ酸残基４３〜３０７の小型の分泌型形態（小型エキソ形態、Ｐ１Ａ）をコードする、バチルス・リケニフォルミス７４９／Ｃのβ−ラクタマーゼ遺伝子の領域は、宿主ベクターである枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の生産系を仕立てるためのＤＮＡ断片として選択されている（ＷＯ２００８０６５２４７）。
【００７７】
機能
β−ラクタマーゼは、ペニシリン、セファロスポリン、クラバム（又はオキサペナム）、セファマイシン、及びカルバペネムなどの、β−ラクタム環を含むβ−ラクタム抗生物質を加水分解する。本発明の好ましい実施形態において、β−ラクタマーゼは、ペニシリン及び／又はセファロスポリンを加水分解する。「ペニシリン」は、元はペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）に由来する、いくつかの天然ペニシリン又はペニシリンの半合成変異体を言う。ペニシリンには、限定はしないが、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ヘタシリン、オキサシリン、メズロシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、及びピペラシリンが含まれる。
【００７８】
セファロスポリンにおいて、β−ラクタム環は、ペニシリンにおいて見られる５員のチアゾリジン環よりも６員のジヒドロチアジン環に縮合する。それらの生物学的活性に基づいて、セファロスポリンは６つの世代に分けられるが、一部のセファロスポリンは、特定の世代にグループ化されていない。本発明の１つの具体的な実施形態において、β−ラクタマーゼは、野生型β−ラクタマーゼと比較して、セファロスポリンに対する向上した触媒効率を有する。本発明によれば、Ａｍｂｌｅｒ分類に従って番号付けされた２７６位にあるアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）又はアルギニン（Ｒ）などの親水性アミノ酸残基で置換されている、バチルス・リケニフォルミスのβ−ラクタマーゼは、セファロスポリンなどのβ−ラクタム抗生物質に対する拡張した活性を示す。
【００７９】
本発明の１つの実施形態において、セファロスポリンは、セフォペラゾン、セフトリアキソン、及びセファゾリンからなる群から選択される。
【００８０】
本明細書において用いられる場合、β−ラクタマーゼの触媒効率は、β−ラクタム抗生物質を加水分解する能力を言う。向上した触媒効率は、任意の生体試料又は対象から、任意の従来のインビトロ、エクスビボ、又はインビボでの方法によって測定することができる。
【００８１】
β−ラクタマーゼを生産及び改変する方法
本発明のβ−ラクタマーゼは、任意の従来の遺伝子操作方法を用いて酵素を改変することによって生産することができる。推論設計（rational design）、ランダム突然変異生成、ＤＮＡシャッフリング（ランダム組換え）、ファージディスプレイ、全ゲノムシャッフリング、ヘテロ二本鎖、設計されたオリゴヌクレオチドの一時的な鋳型集合体に対するランダムキメラ生成、突然変異誘発性及び一方向性の再集合、エキソンシャッフリング、Ｙライゲーションに基づくブロックシャッフリング、非相同組換え、進化分子工学(directed evolution)と、推論設計（rational design）との組み合わせなどの方法を、生産において用いることができる。さらに、突然変異酵素は、部位特異的突然変異生成、及びオーバーラップ伸長技術によるスプライシングを用いて得ることができる。
【００８２】
本発明の１つの実施形態において、β−ラクタマーゼを改変する方法は、Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する配列番号１の位置にあるアミノ酸を親水性アミノ酸で置き換えることによる、配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むβ−ラクタマーゼを改変するステップを含む。親水性アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）からなる群から例えば選択される、任意の親水性アミノ酸であり得る。
【００８３】
本発明の１つの実施形態において、非親水性アミノ酸は、Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する配列番号１の位置にある親水性アミノ酸で置き換えられている。
【００８４】
本発明のβ−ラクタマーゼはまた、例えば、ペプチド合成などの合成方法によって、又は宿主細胞における組換え生産によって生産することができる。本発明の好ましい実施形態において、酵素は組換え酵素である。本明細書において用いられる場合、「組換え」遺伝物質は、典型的には様々な由来のＤＮＡ鎖などの遺伝物質の組み合わせである遺伝物質を言い、これは、配列の組み合わせ又は挿入によって生産されている。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、プロモーターなどの任意の内因性又は外因性の調節因子の制御下で挿入することができる。組換えタンパク質は、組換えＤＮＡに由来する。
【００８５】
目的の少なくとも１つのポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド断片は、細胞から単離することができるか、又は合成によって生産することができる。このポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド断片は、宿主細胞に形質転換することができる。本発明の任意のペプチドを生産するための適切な宿主細胞は、任意の真核細胞又は原核細胞、好ましくは細菌、最も好ましくはバチルス種の株、例えば枯草菌、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｉｓ）、又はバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）であり得る。
【００８６】
本明細書において用いられる場合、「形質転換」は、外来遺伝物質、好ましくはＤＮＡによる、細胞の遺伝的変化であって、この遺伝物質の発現をもたらすものを言う。外来遺伝物質は、そのままで、又はベクター、プラスミドなどの任意の他の遺伝物質内に組み込まれた形で、導入することができる。任意の遺伝子操作方法又は任意の分子クローニング方法を、本発明のポリヌクレオチドでの宿主細胞の形質転換に用いることができる。外来遺伝物質を真核細胞内に導入する様々な方法が存在する。ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン）、リポソーム、及びナノ粒子（例えば金）などの材料が、形質転換のための担体として用いられている。遺伝物質はまた、例えばウイルス又はベクターを担体として用いて細胞内に導入することができる。細胞内に外来遺伝物質を導入するための他の方法には、限定はしないが、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、トランスフェクション、ソノポレーション、熱ショック、及びマグネトフェクションが含まれる。
【００８７】
宿主細胞が本発明のペプチドを適切な条件で生産した後、ペプチドを例えば細胞から精製することができるか、又は分泌型形態のペプチドを例えば培地から回収することができる。本発明の好ましい実施形態において、β−ラクタマーゼは分泌型である。
【００８８】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明のβ−ラクタマーゼを含む。組成物は、ただ１つのβ−ラクタマーゼ、又はそれ以上の、例えば少なくとも２つ、３つ、４つなどの異なるβ−ラクタマーゼを含み得る。
【００８９】
本発明の医薬組成物はまた、本発明のβ−ラクタマーゼ以外の任意の活性成分を含み得る。
【００９０】
医薬組成物は、例えば固体、半固体、又は液体形態で、例えば錠剤、ペレット、カプセル、溶液、エマルジョン、又は懸濁液の形態で用いることができる。好ましくは、組成物は、経口投与又は腸内適用のためのものである。
【００９１】
本発明の少なくとも１つのβ−ラクタマーゼ、又は本発明のポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に加えて、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体（単数又は複数）、アジュバント（単数又は複数）、賦形剤（単数又は複数）、補助賦形剤（単数又は複数）、消毒剤（単数又は複数）、安定剤（単数又は複数）、結合剤（単数又は複数）、充填剤（単数又は複数）、潤滑剤（単数又は複数）、懸濁剤（単数又は複数）、可塑剤、着色剤、フィルム形成剤、糖、アルコール、流動促進剤、及び希釈剤、並びに／又は対応する生成物において通常見られる構成要素を含み得る。
【００９２】
本発明の生成物又は医薬組成物は、所望の効果をもたらすために十分な量でβ−ラクタマーゼを含む。
【００９３】
生成物又は医薬組成物は、当技術分野において知られている任意の従来のプロセスによって製造することができる。β−ラクタマーゼは、任意の医薬品生成物に添加することができるか、又は任意の調製ステップの間に任意の作用物質と混合することができる。本発明のβ−ラクタマーゼはまた、例えば、医薬品生成物において、又は医薬品生成物が分解した後の標的組織において、適切な条件でβ−ラクタマーゼ遺伝子を発現させることによって、生産することができる。
【００９４】
本発明の１つの好ましい実施形態において、β−ラクタマーゼ（単数又は複数）及びβ−ラクタム抗生物質は、腸溶コーティングされたペレットの形態で共に対象に投与される。水性ベースのコーティング形態は、親水性Ｐ１Ａタンパク質のコーティングプロセスに最も有利な材料であると考えられる。腸溶特性を達成するために一般的に用いられ本発明においても有用である水性ポリマーは、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）などのポリメタクリレート、セルロースベースのポリマー、例えばＤｕｏｄｃｅｌｌ（登録商標）などのセルロースエーテルなど、又はセルロースエステル、例えばＡｑｕａｔｅｒｉｃ（登録商標）、又はポリ酢酸ビニルコポリマー、例えばＯｐａｄｒｙ（登録商標）である。
【００９５】
本発明のβ−ラクタマーゼ又は本発明の医薬組成物は、β−ラクタム抗生物質と同時に又は連続的に対象に投与することができる。本発明の１つの実施形態において、β−ラクタマーゼ又は医薬組成物は、β−ラクタム抗生物質の前に、例えばβ−ラクタム抗生物質の５から３０分前に投与される。β−ラクタマーゼ及びβ−ラクタム抗生物質（単数又は複数）は、同一の製剤又は異なる製剤内にあってよい。
【００９６】
β−ラクタムの有害作用及び治療
β−ラクタム抗生物質に対する有害作用、すなわち不都合な薬剤反応には、限定はしないが、下痢、吐き気、発疹、じんましん、重複感染、発熱、嘔吐、紅斑、皮膚炎、血管性浮腫、及び偽膜性大腸炎が含まれ得る。
【００９７】
本発明の好ましい実施形態において、治療又は予防すべき有害作用は、胃腸管（ＧＩＴ）内で生じる。本明細書において用いられる場合、胃腸管は、口から肛門まで延びている消化構造を言う。胃腸管は、口、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、小腸、結腸、盲腸、直腸、及び肛門を含む。
【００９８】
本発明のβ−ラクタマーゼ又は本発明の医薬組成物は、経口的に対象に投与することができるか、又は直接的に胃腸管に投与することができる。酵素の組み合わせの製剤（単数又は複数）は、ＧＩＴ又は他の望ましくない身体区画、例えば皮膚若しくは膣腔における未吸収のβ−ラクタムを不活化するためのものである。医薬組成物は、経口的に投与される製剤、皮膚科製剤、又は膣坐剤であり得、液体の、即時放出投与製剤、遅延放出投与製剤、又は持続放出投与製剤を含み得る。
【００９９】
本発明の１つの好ましい実施形態において、β−ラクタマーゼ（単数又は複数）は経口的に投与される。本発明の別の好ましい実施形態において、β−ラクタマーゼ（単数又は複数）は、患者の胃腸に直接的に投与される。
【０１００】
治療される対象は、ヒト又はペット若しくは生産動物などの動物、例えば犬、猫、牛、豚、鶏、若しくは馬であり得る。本発明の好ましい実施形態において、対象はヒトである。
【０１０１】
本発明は、以下の実施例によって説明されるが、この実施例は、限定的なものでは全くない。
【実施例】
【０１０２】
（例１）Ｄ２７６Ｎ突然変異酵素及びＤ２７６Ｒ突然変異酵素の構築
バチルス・リケニフォルミスのβ−ラクタマーゼのＤ２７６Ｎ突然変異体及びＤ２７６Ｒ突然変異体を、以前に公開された手順に従って（Ｈｏｒｔｏｎ  Ｒ．Ｍ．ら、１９８９、Ｇｅｎｅ  ７７：６１〜６８）、Ｐ１Ａ  β−ラクタマーゼをコードするｐＲＳＨ１０プラスミドを最初のＰＣＲ反応の鋳型として用いる、Splicing-by-overlap extension（ＳＯＥ）突然変異生成によるスプライシングによって構築した。プライマーは、配列が共通の領域を有する２つの異なるＰＣＲ産物をもたらすように設計した。断片を次に、その後のＰＣＲ増幅において、オーバーラップ領域を用いて融合した。所望の突然変異は、最初のＰＣＲにおいて突然変異誘発性プライマーを用いて達成した。
【０１０３】
Ｄ２７６Ｎ突然変異体では、突然変異を野生型遺伝子における所望の位置で生じさせ、ＧＡＴコドンをＡＡＴコドンに変換した。第１のＰＣＲ増幅において用いたプライマーを表２に示す。第１のＰＣＲにおける増幅断片のサイズは、２１ｎｔ長のオーバーラップ領域を有する、８００ｎｔ及び２２０ｎｔであった。
【０１０４】
【表２】
2013529905.tif 000004
【０１０５】
第２のＰＣＲ反応（ＳＯＥ反応）において、２つのオーバーラップ断片を、その後の伸長反応において共に融合した。外側のプライマー（フォワード−１及びリバース−１）を伸長反応に含めると、ＰＣＲによる融合生成物が増幅される。精製されたＳＯＥ生成物を、ＷＯ２００８／０６５２４７において記載されているように、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＫＴＨ１４１分泌ベクターにライゲーションした。
【０１０６】
枯草菌ＲＳ３０３のコンピテント細胞を、ライゲーション混合物で形質転換した。ルリア−カナマイシンプレート上の陽性クローンを、単一コロニーの細菌塊をニトロセフィン溶液内に懸濁することによってスクリーニングした。陽性クローンは、ニトロセフィンを効果的に加水分解し、ニトロセフィン溶液の色を黄から赤に変化させた。ハイブリッドプラスミドを単一クローンの細胞から精製した。ＰＣＲ生成された領域の正確な配列を、ＤＮＡ配列決定によって検証した。
【０１０７】
Ｄ２７６Ｒ突然変異体では、ＧＡＴコドンをＣＧＣコドンに変換することによって、突然変異を所望の位置に生じさせた。Ｄ２７６Ｒ突然変異株の構築は、リバース−Ｄ２７６Ｒ−プライマー及びフォワード−Ｄ２７６Ｒ−プライマーを最初のＰＣＲで用いたことを除いて、Ｄ２７６Ｎ突然変異体の構築と同様に行った（表２を参照されたい）。
【０１０８】
（例２）Ｄ２７６Ｎ突然変異β−ラクタマーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）のヌクレオチド配列
発現構築物を陽性クローンから単離し、挿入部分をＤＮＡ配列決定した。Ｄ２７６Ｎ突然変異β−ラクタマーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列によって、Ａｓｎに対するＡｓｐの置換が所望のコドンで正確に生じたことが明らかになった（図２）。さらに、Ｄ２７６Ｎ突然変異β−ラクタマーゼ遺伝子のＤＮＡ配列によって、バチルス・アミロリケファシエンスのαアミラーゼの３１アミノ酸長のシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、及びＤ２７６Ｎ突然変異遺伝子の完全な配列の間のインフレームでの融合が明らかになった。シグナルペプチダーゼは、−１位のアラニン（Ａ）と＋１位のグルタミン（Ｑ）との間のペプチド結合を切断すると予測される。成熟Ｄ２７６Ｎ  β−ラクタマーゼは、発現構築物におけるＨｉｎｄ  ＩＩＩクローニング部位に由来するＮＨ２−ＱＡＳ−トリペプチドのＮＨ２末端伸長を有する。したがって、推定アミノ酸配列に基づいて、成熟Ｄ２７６Ｎ突然変異β−ラクタマーゼは、２６８個のアミノ酸残基を含む。
【０１０９】
（例３）Ｄ２７６Ｒ突然変異β−ラクタマーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）のヌクレオチド配列
バチルス・リケニフォルミスのβ−ラクタマーゼ遺伝子における２７６位（Ａｍｂｌｅｒ分類）でのアスパラギン酸からアルギニンへの所望の置換を確認するために、発現構築物を陽性クローンから単離し、インサートのヌクレオチド配列を例２と同様に配列決定した。得られたヌクレオチド配列に従うと、推定アミノ酸配列は所望のＤ２７６Ｒ置換を含み、成熟Ｄ２７６Ｒ突然変異酵素は２６８個のアミノ酸残基を含む（図３）。
【０１１０】
（例４）Ｄ２７６Ｎ突然変異β−ラクタマーゼ（Ｐ３Ａ）の生化学的分析
酵素標本の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、９５パーセントを超えると推定した（データは示していない）。
【０１１１】
野生型（Ｐ１Ａ）及びＤ２７６Ｎ（Ｐ３Ａ）突然変異体のバチルス・リケニフォルミスβ−ラクタマーゼの動態パラメータを、様々なタイプのβ−ラクタムの加水分解について決定し、表３にまとめる。酵素反応は、適切な酵素濃度及び様々な濃度のペニシリン基質又はセファロスポリン基質を用いて、３０℃の２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）内で行った。ｋｃａｔ値及びＫｍ値を、Ｈａｎｅｓ線形化方法を利用して得た。主な結果を以下に記載する。
【０１１２】
（ｉ）ペニシリン
ペニシリン（アンピシリン、アモキシシリン、又はピペラシリン）の加水分解に対するＤ２７６Ｎ置換の効果は、野生型酵素の酵素効率の５１〜８０パーセントの酵素効率であり、大きなものではなかった。その結果、ペニシリンでのＤ２７６Ｎ突然変異酵素のｋｃａｔ／Ｋｍ値は、最大２倍以下低減した。
【０１１３】
（ｉｉ）セファロスポリン
予想した通り、ペニシリンに関して、野生型β−ラクタマーゼは、第１世代（カファゾリン（ｃａｆａｚｏｌｉｎｅ））、第２世代（セフロキシム）、及び第３世代（セフトリアキソン、セフォタキシム、セフタジジム、セフォペラゾン、及びセフェピム）のセファロスポリンを含む様々なセファロスポリンに対する酵素効率をほとんど有さなかった（表１）。驚くべきことに、特定のセファロスポリンに対する、好ましくはセフォペラゾンに対する、さらに好ましくはセフトリアキソンに対する、Ｄ２７６Ｎ突然変異酵素の酵素効率は、野生型酵素で得られる酵素効率と比較して本質的に向上した。セフトリアキソン及びセフォペラゾンに対するＫｍ定数は減少し、それに伴って、セフトリアキソン及びセフォペラゾンについての代謝回転数（ｋｃａｔ）は、野生型酵素（Ｐ１Ａ）の代謝回転数と比較して増大した。したがって、バチルス・リケニフォルミスのβ−ラクタマーゼの２７６位でのアスパラギン酸−アスパラギン置換は、バチルス・リケニフォルミスのβ−ラクタマーゼにおけるβ−ラクタム基質プロフィールの拡張に寄与する。
【０１１４】
【表３】
2013529905.tif 000005
【０１１５】
（例５）Ｄ２７６Ｒ突然変異酵素の生化学的特徴付け
Ｄ２７６Ｒ突然変異酵素を構築して、Ａｓｐ２７６が置換に耐えるかどうかを評価し、Ｄ２７６Ｎ酵素において観察されるβ−ラクタマーゼ活性の拡張に対するＤ２７６Ｒ置換の寄与を評価した。
【０１１６】
培養上清から得られたＤ２７６Ｒ及びＤ２７６Ｎの粗酵素試料を、試験材料として用いた。酵素試料の純度及び量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行うことによって推定した。様々なβ−ラクタムについてのＤ２７６Ｒ突然変異酵素及びＤ２７６Ｎ突然変異酵素の加水分解速度を、Ｖｍａｘ値を決定することによって行った。得られた結果を、表４におけるＤ２７６Ｎ酵素のものと比較した相対活性（％）として表す。
【０１１７】
全体として、ペニシリン及びセファロスポリンの両方についてのＤ２７６Ｒβ−ラクタマーゼの触媒効率は、Ｄ２７６Ｎ酵素の触媒効率に匹敵する。Ｄ２７６Ｎ酵素との比較において、Ｄ２７６Ｒ酵素は、セフトリアキソンに対する活性が低減しており、セフォペラゾンに対する活性が向上している。この研究によって、β−ラクタムの拡張型スペクトルが、バチルス・リケニフォルミスのβ−ラクタマーゼにおける２７６位のアスパラギン酸をアルギニン又はアスパラギンなどの親水性アミノ酸残基で置換することによって達成され得ることが示された。これはまた、所望の酵素改変が、２７６位のアスパラギン酸をグルタミン（Ｑ）、リシン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、又はスレオニン（Ｔ）などの別の親水性アミノ酸残基で置換することによって達成され得ることを示す。
【０１１８】
【表４】
2013529905.tif 000006
【０１１９】
（例６）Ｄ２７６Ｎβ−ラクタマーゼのインビボでの研究
バチルス・リケニフォルミスのＤ２７６Ｎ突然変異β−ラクタマーゼ酵素が、非経口療法の間に胃腸管内に排出されたセフトリアキソン（ＣＲＯ）を不活化する能力を、犬モデルにおいて調べた。研究用の実験用ビーグル犬には、幽門よりもおよそ１７０ｃｍ遠位の空腸にニップルバルブを外科的に挿入し、分析のための試料の回収を可能にする。腸の外科手術は、腸の運動性を変化させなかった。５頭のビーグル犬を各実験で用いた。
【０１２０】
研究は、２回の連続的な治療として行った。第１の治療（β−ラクタマーゼ療法を伴わない対照実験）において、単回用量のセフトリアキソン（ヒトにおける約１グラム用量のＣＲＯに相当する、体重１ｋｇ当たり３０ｍｇのセフトリアキソン（ＣＲＯ））を、犬に最初の給餌を行った２０分後に静脈内投与した。空腸試料を１０時間の様々な時点で回収した。胆嚢内に蓄積したセフトリアキソンの胆汁中排泄を誘発するために、犬に、セフトリアキソン投与の５時間４０分後に再び給餌した。
【０１２１】
空腸糜粥試料を迅速に凍結し、分析まで−２０℃で保存した。糜粥試料を、干渉物質を沈殿させるために、過塩素酸−クエン酸で前処理した。沈殿物を遠心分離によって除去した。ＵＶ検出を伴う逆相高圧クロマトグラフィー法を、上清中のセフトリアキソンの定量に用いた。
【０１２２】
第２の治療において、Ｄ２７６Ｎ突然変異β−ラクタマーゼを、ハードゼラチンカプセル内に充填された腸溶コーティングされたペレットとして、セフトリアキソン注射の１０分前に与えた。腸溶コーティング投与形態は、医薬品産業における経口製品の間で一般的である。腸溶コーティング製剤は、無傷形態で胃を通過するように、及び投与形態の内容物を小腸内で放出させるように設計されている。腸溶性の固体製剤を適用する理由は、原薬を酵素の破壊的作用若しくは胃の低ｐＨ環境から保護するため、又は原薬誘発性の胃粘膜の刺激、吐き気、若しくは出血を防ぐため、又は原薬を未希釈形態で小腸内の標的部位に送達するためである。これらの基準に基づいて、腸溶コーティングされた製剤を、遅延作用投与形態のタイプであるとみなすことができる。ポリメタクリル酸コポリマーＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ３０Ｄ−５５を、ｐＨ依存性の腸溶コーティングされた投与形態を達成するために用いた。体重１ｋｇ当たり約０．４４ｍｇの活性Ｄ２７６Ｎβ−ラクタマーゼを含む、単回用量の腸溶コーティングされたペレットを、第２の治療において用いた。
【０１２３】
両治療から得られた結果を図４に表す。治療１は、高濃度のセフトリアキソンが非経口セフトリアキソン療法の間に小腸管内に排出されることを示した。最も高い空腸濃度（空腸糜粥１グラム当たり約１５００マイクログラム）は、セフトリアキソン注射の６０分後に見られた。空腸のセフトリアキソンレベルの増大が、犬の第２の給餌の後に観察され（３４０分の時点）、これは、食物刺激された、胆嚢におけるセフトリアキソン含有胆汁排出物の蓄積を示す。
【０１２４】
治療２は、経口投与されたＤ２７６Ｎ突然変異β−ラクタマーゼが空腸のセフトリアキソンレベルを定量（空腸糜粥１マイクログラム当たり１０マイクログラムのセフトリアキソン）の限度近くまで低減させ得ることを示した。この所見は、Ｄ２７６Ｎ突然変異β−ラクタマーゼが、非経口セフトリアキソンの使用に関連する副作用を低減させるための強力な原薬候補であることを示す。さらに、アンピシリン、アモキシシリン、及びピペラシリンなどのペニシリンに対する高い活性に基づいて、Ｄ２７６Ｎ突然変異酵素又はＤ２７６Ｒ突然変異酵素は、ＷＯ２００８０６５２４７において記載されているβ−ラクタマーゼ療法における代替的な原薬として用いることができる。
【図１】
2013529905.tif 000007
【図３】
2013529905.tif 000008
【図２】
2013529905.tif 000009
【図４】
2013529905.tif 000010
【配列表】
2013529905000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年3月23日(2012.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１と少なくとも６８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はβ−ラクタマーゼ活性を有し、Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する位置に、アスパラギン酸（Ｄ）以外の親水性アミノ酸残基を含む、その変異体若しくは断片を含む、β−ラクタマーゼ。
【請求項２】
Ａｍｂｌｅｒ分類に従った２７６位に対応する配列番号１の位置にあるβ−ラクタマーゼのアミノ酸が、アスパラギン酸（Ｄ）以外の親水性アミノ酸で置き換えられることを特徴とする、配列番号１と少なくとも６８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むβ−ラクタマーゼを改変する方法。
【請求項３】
前記β−ラクタマーゼが、配列番号１と少なくとも６８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のβ−ラクタマーゼ。
【請求項４】
前記親水性アミノ酸が、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びリシン（Ｋ）からなる群からの極性且つ正電荷の親水性アミノ酸から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のβ−ラクタマーゼ又は請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記親水性アミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）からなる群からの極性且つ中性電荷の親水性アミノ酸から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のβ−ラクタマーゼ又は請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記２７６位に対応する配列番号１の位置にあるアミノ酸が、アスパラギンであることを特徴とする、請求項５に記載のβ−ラクタマーゼ。
【請求項７】
前記２７６位に対応する配列番号１の位置にあるアミノ酸が、アルギニンであることを特徴とする、請求項４に記載のβ−ラクタマーゼ。
【請求項８】
前記２７６位に対応する配列番号１の位置にある親水性アミノ酸が、αヘリックス内に位置することを特徴とする、請求項１から７までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼ又は方法。
【請求項９】
前記β−ラクタマーゼが、Ａｍｂｌｅｒ分類に従ったＬｅｕ２２０及びＡｒｇ２４４からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸をさらに含むことを特徴とする、請求項１から８までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼ又は方法。
【請求項１０】
前記β−ラクタマーゼが、ペニシリン及び／又はセファロスポリンを加水分解することを特徴とする、請求項１から９までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼ又は方法。
【請求項１１】
前記β−ラクタマーゼが、野生型β−ラクタマーゼと比較して、セファロスポリンに対する向上した触媒効率を有することを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼ又は方法。
【請求項１２】
前記セファロスポリンが、セフォペラゾン、セフトリアキソン、及びセファゾリンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載のβ−ラクタマーゼ又は方法。
【請求項１３】
ｉ）請求項１又は３から１２までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を準備するステップ、
ｉｉ）宿主細胞を該遺伝子で形質転換するステップ、
ｉｉｉ）該β−ラクタマーゼを生産する宿主細胞を得るステップ、
ｉｖ）該β−ラクタマーゼを回収するステップ
を含むことを特徴とする、請求項１又は３から１２までのいずれか１項に記載のβ−ラクタマーゼを生産する方法。
【請求項１４】
請求項１又は３から１２までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼをβ−ラクタム抗生物質と同時に又は連続的に対象に投与することを特徴とする、胃腸管におけるβ−ラクタム抗生物質誘発性の有害作用を治療又は予防する方法。
【請求項１５】
配列番号２若しくは４又はその縮重配列のいずれか１つの配列を含むか、或いは請求項１又は３から１２までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１又は３から１２までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼを含む医薬組成物。
【請求項１８】
薬剤として用いるための、請求項１又は３から１２までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼ。
【請求項１９】
胃腸管におけるβ−ラクタム抗生物質誘発性の有害作用を治療又は予防するための薬剤の製造における、請求項１又は３から１２までのいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼの使用。
【請求項２０】
前記β−ラクタマーゼ（単数又は複数）が経口的に投与されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法又は請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記β−ラクタマーゼ（単数又は複数）が患者の胃腸に直接的に投与されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法又は請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
前記β−ラクタマーゼ（単数又は複数）及び前記β−ラクタム抗生物質が、腸溶コーティングされたペレットの形態で一緒に対象に投与されることを特徴とする、請求項１４若しくは２０から２１までのいずれか１項に記載の方法又は請求項１９から２１までのいずれか一項に記載の使用。
【国際調査報告】
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