(57)【要約】本発明は、鉄酸化物ナノ粒子を形成する方法に関し、前記方法は次のステップ：（ａ）鉄酸化物／水酸化物及びオレイン酸又はその誘導体を第１の有機溶媒中に懸濁させるステップ；（ｂ）前記懸濁物の温度を、所定の速度で、最大３４０℃から５００℃まで上げるステップ；（ｃ）前記懸濁物をステップ（ｂ）の最大温度で約０．５から６時間熟成するステップ；（ｄ）前記懸濁物を冷却するステップ；（ｅ）第２の有機溶媒を添加するステップ；（ｆ）非溶媒を添加してナノ粒子を沈殿させて過剰の溶媒を除去するステップ；（ｇ）前記第２の有機溶媒中に前記ナノ粒子を分散させるステップ；（ｈ）ステップ（ｇ）の分散物とポリマー溶液を混合するステップ；及び（ｉ）場合により、前記第２の有機溶媒を除去するステップを含む。本発明はさらに、前記方法で得られる鉄酸化物ナノ粒子、その追加の変性、カプセル化及び修飾に関し、又前記ナノ粒子を磁気粒子イメージング（ＭＰＩ）、磁気粒子スペクトル（ＭＰＳ）のためのトレーサーとしての使用に関する。
2013529677.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄酸化物ナノ粒子を形成する方法であり、前記方法は次のステップ：
（ａ）鉄酸化物／水酸化物及びオレイン酸又はその誘導体を第１の有機溶媒中に懸濁させるステップ；
（ｂ）前記懸濁物の温度を、所定の速度で、最大３４０℃から５００℃まで上げるステップ；
（ｃ）前記懸濁物をステップ（ｂ）の最大温度で約０．５から６時間熟成するステップ；  
（ｄ）前記懸濁物を冷却するステップ；
（ｅ）第２の有機溶媒を添加するステップ；
（ｆ）非溶媒を添加してナノ粒子を沈殿させて過剰の溶媒を除去するステップ；
（ｇ）前記第２の有機溶媒中に前記ナノ粒子を分散させるステップ；
（ｈ）ステップ（ｇ）の分散物とポリマー溶液を混合するステップ；及び
（ｉ）場合により、前記第２の有機溶媒を除去するステップを含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であり、前記鉄酸化物／水酸化物が、鉄（ＩＩＩ）酸化物／水酸化物、鉄（ＩＩ）酸化物／水酸化物又は鉄（ＩＩＩ）及び鉄（ＩＩ）酸化物の混合物／水酸化物である、方法。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法であり、前記オレイン酸の誘導体が、オレイン酸アンモニウム、オレイン酸リチウム、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸マグネシウム、オレイン酸カルシウム、オレイン酸アルミニウム又はオレイン酸鉄である、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であり、前記オレイン酸アンモニウムが、式Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ＋を持つオレイン酸アルキルアンモニウムであり、ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が、アルキル、アリール又はシリル基であるか、又は水素である、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であり、前記オレイン酸アルキルアンモニウムが、オレイン酸テトラメチルアンモニウム、オレイン酸テトラエチルアンモニウム、オレイン酸テトラプロピルアンモニウム、オレイン酸テトラブチルアンモニウム又はオレイン酸ベンジルアンモニウムである、方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法であり、前記第１の有機溶媒が式ＣｎＨ２ｎ＋ｍで表されるアルカン溶媒であり、ここで１５≦ｎ≦３０及び−２≦ｍ≦２であり；及び／又は前記非溶媒が、アセトン、ブタノン、ペンタノン、イソブチルメチルケトン、ジエチルエーテル、メチルプロピルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル又はエチルシリルエーテルであり；及び／又は前記第２の溶媒が、ペンタン、イソペンタン、ネオペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロメタン又はジクロロエタンである、方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法であり、前記ステップ（ｂ）の温度増加の速度が、１分間に約１℃と１０℃の間の温度の増加である、方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法であり、ステップ（ｂ）の最大温度は、３４０℃から４００℃であり、及び／又は前記冷却ステップ（ｄ）での懸濁物の温度は、約４０℃から９０℃へ下げられる、方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法であり、前記熟成ステップ（ｃ）は約１から５時間実施される、方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法であり、前記ポリマーの溶液が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び／又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む親水性生物適合性コポリマーの本質的な水溶性緩衝液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む両親媒性リン脂質の本質的な水溶液、又は両親媒性ブロックコポリマー本質的な干渉水溶液である、方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法であり、ステップ（ｈ）の代わりに、ステップ（ｇ）で、クエン酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸及び／又はそれらの塩、デキストラン、カルボデキストラン、ポリオキシエチレン系ポリマー又はコポリマー、又はそれらの組み合わせなどの、親水性又は両親媒性安定化剤と混合するステップを含む、方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法であり、前記除去ステップ（ｉ）が、本質的に非閉鎖システムで混合物を撹拌することで実施され、それにより前記第２の有機溶媒が、親水性ナノ粒子の水溶液が得られるまで蒸発させることができる、方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法であり、次の１又はそれ以上の追加のステップ、
（ｊ）ステップ（ｉ）で得られ得るナノ粒子又はナノ粒子溶液を精製するステップ；
（ｋ）ステップ（ｉ）又は（ｋ）で得られ得るナノ粒子又はナノ粒子溶液を酸化剤又は還元剤で処理するステップ；
（ｌ）ステップ（ｉ）、（ｊ）又は（ｋ）で得られ得るナノ粒子の表面を、前記ポリマー又は安定化剤コーティングを除去、置換又は変更することで変性するステップ；
（ｍ）ステップ（ｉ）から（ｌ）で得られ得るナノ粒子を、ミセル、リポソーム、ポリマーソーム、血液細胞、ポリマーカプセル、デンドリマー、ポリマー又はヒドロゲルなどのキャリアでカプセル化又はクラスタ化するステップ；及び
（ｎ）ステップ（ｉ）から（ｍ）で得られ得るナノ粒子を、ターゲットリガンドで修飾する、ステップが実施される、方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の方法で得られ得る鉄酸化物ナノ粒子。
【請求項１５】
請求項１４の前記鉄酸化物ナノ粒子又は請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の方法で得られ得る鉄酸化物ナノ粒子の、磁気粒子イメージング（ＭＰＩ）又は磁気粒子スペクトル（ＭＰＳ）のためのトレーサーとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は鉄酸化物ナノ粒子形成のための方法に関し、前記方法は次のステップ：（ａ）鉄酸化物／水酸化物及びオレイン酸又はその誘導体を第１の有機溶媒中に懸濁させるステップ；（ｂ）前記懸濁物の温度を、所定の速度で、最大３４０℃から５００℃まで上げるステップ；（ｃ）前記懸濁物をステップ（ｂ）の最大温度で約０．５から６時間熟成するステップ；（ｄ）前記懸濁物を冷却するステップ；（ｅ）第２の有機溶媒を添加するステップ；（ｆ）非溶媒を添加してナノ粒子を沈殿させて過剰の溶媒を除去するステップ；（ｇ）前記第２の有機溶媒中に前記ナノ粒子を分散させるステップ；（ｈ）ステップ（ｇ）の分散物とポリマー溶液を混合するステップ；及び（ｉ）場合により、前記第２の有機溶媒を除去するステップを含む。本発明はさらに、前記方法で得られ得る鉄酸化物ナノ粒子、追加の変性、前記ナノ粒子のカプセル化と修飾、又同様に、前記ナノ粒子を磁気粒子イメージング（ＭＰＩ）又は磁気粒子スペクトル（ＭＰＳ）のためのトレーサーとしての使用、に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁性粒子イメージング（ＭＰＩ）は、トモグラフイメージング技術の一つであり、常時性ナノ粒子の磁性曲線の非線形性及び、前記粒子磁性がある磁場強度で飽和するという事実に依存する。医学的には、ＭＰＩは、身体に注入された常磁性ナノ粒子の磁性を用いて、前記ナノ粒子の例えば血液中の濃度を測定する。身体は天然由来のＭＰＩで観測可能な磁性物質を含まないことから、バックグランド信号が存在しないが、古典的な磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）方法では、インビトロ及びインビボでの前記閾値は、前記主組織からのバックグランド信号が一つの重要な限定因子となる。注入後、前記ＭＰＩはナノ粒子は、前記イメージ中の明るい信号として見え、それからナノ粒子の濃度が計算できる。高空間分解能を短い取得時間と組み合わせることで、ＭＰＩは、前記ナノ粒子が血液流に沿って流される際の動的な濃度変化を捉えることができる。これにより、ＭＰＩスキャナが広い範囲の機能測定を単一スキャンで実行することを可能とする。
【０００３】
ＭＰＩのスペクトル的変法は磁性粒子スペクトル（ＭＰＳ）であり、これはゼロ次元磁性粒子イメージング方法である。ＭＰＳは、イメージ再構成をすることなく再磁化信号を与え、従って、磁性粒子が振動磁場へ暴露される際に、磁性粒子の絶対的応答を特徴付ける効果的方法の一つである。ＭＰＳは従って、ＭＰＩと緊密にリンクされ、ＭＰＩにより測定される粒子特性は、これらの粒子のＭＰＩのためのトレーサとしての性能を特徴付けるものである。
【０００４】
ＭＰＩの重要な１つの側面は、適切な磁性材料、即ち効果的に検出可能な磁性ナノ粒子トレーサを提供することである。しかしこれまで、検出可能なＭＰＩトレーサ材料は商品化されていない。
【０００５】
磁性材料の適正はその磁化特性に密接にリンクされている。磁性ナノ粒子トレーサの磁化は、いくつかのパラメータに依存し、最も重要には磁性材料自体の組成、その容積及び異方性、及びその粒子サイズ分布である。磁気共鳴イメージング応用での毒性学的理由と経験により、鉄酸化物の超常磁性粒子（ＳＩＰＯ）がＭＰＩのトレーサの開発の材料上の選択であると考えられる。ＭＰＳの信号強度は鉄酸化物のサイズにより増加することから、有用な信号は、約１５ｎｍよりも大きい磁性コアを持つ粒子からのみ得られる。
【０００６】
さらに、前記粒子は、約２５ｋＨｚの周波数の高速再磁化に従うためには、単分散、かつ磁気異方性定数を２ｋＪ／ｍ３よりも小さくする必要がある。従って、ＭＰＩに効果的となる鉄酸化物ナノ粒子は非常に狭いサイズ分布、非常に好適な形状制御及び容易にスケールアップできる可能性を持つことを示すことが必要である。さらに、粒子は水溶性である必要がある。
【０００７】
ＳＩＰＯの製造方法はこの技術分野で知られている。一般には、とりわけ４つの合成方法が区別されている：熱分解方法、水熱合成方法、共沈殿方法及びミクロエマルジョン技術である。ＳＩＰＯをＰＭＩにおいて使用可能とするには、熱分解方法が選択される合成方法である。
【０００８】
一般に、熱分解は、安定化剤、コーティング剤及びさらに、還元剤や酸化剤などの添加物の存在下で有機溶媒中で適切な前駆体分子を分解することを伴う。Ｙｕらの「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００４、２３０６−２３０７」には、鉄オレイン酸塩の熱分解による狭いサイズ分布の鉄酸化物ナノ粒子の合成が記載されている。しかし、従来技術で記載された方法でのナノ粒子は、ＭＰＩ又はＭＰＳにおいては十分な性能がないことが示される。特に、これらの方法のいずれもが、イメージングの標準粒子Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（Ｒ）の性能よりも優れた性能を示すものではなかった。
【０００９】
従って、Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（Ｒ）を超える優れたＭＰＩ／ＭＰＳ性能を持つ水溶性鉄酸化物ナノ粒子を製造する、簡単でかつ効果的な合成方法への要求が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｙｕら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００４、２３０６−２３０７。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、この要求に鑑み、優れたＭＰＩ／ＭＰＳ性能を持つ水溶性鉄酸化物ナノ粒子の合成を可能にする手段及び方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題は、具体的に次のステップを含む方法により達成され得る：
（ａ）鉄酸化物／水酸化物及びオレイン酸又はその誘導体を第１の有機溶媒中に懸濁させるステップ；
（ｂ）前記懸濁物の温度を、所定の速度で、最大３４０℃から５００℃まで上げるステップ；
（ｃ）前記懸濁物をステップ（ｂ）の最大温度で約０．５から６時間熟成するステップ；
（ｄ）前記懸濁物を冷却するステップ；
（ｅ）第２の有機溶媒を添加するステップ；
（ｆ）非溶媒を添加してナノ粒子を沈殿させて過剰の溶媒を除去するステップ；
（ｇ）前記第２の有機溶媒中に前記ナノ粒子を分散させるステップ；
（ｈ）ステップ（ｇ）の分散物とポリマー溶液を混合するステップ；及び
（ｉ）場合により、前記第２の有機溶媒を除去するステップを含む。
【００１３】
この方法は、直接的及び、簡単、安価なかつ使用が容易な出発材料を用いるという利点を提供する。得られる鉄酸化物ナノ粒子は水溶液中で安定であり、これまで使用されているＲｅｓｏｖｉｓｔ（Ｒ）粒子に比較して劇的に優れたＭＰＩに性能を持つ。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様では、鉄酸化物／水酸化物は、前記鉄（ＩＩＩ）酸化物／水酸化物、鉄（ＩＩ）／水酸化物又は鉄（ＩＩＩ）と鉄（ＩＩ）酸化物の混合物／水酸化物である。
【００１５】
さらに好ましい実施態様では、前記のオレイン酸の誘導体は、オレイン酸アンモニウム、オレイン酸リチウム、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸マグネシウム、オレイン酸カルシウム、オレイン酸アルミニウム又はオレイン酸鉄である。
【００１６】
さらに、特に好ましい実施態様では、前記オレイン酸アンモニウムは、式Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ＋を持つオレイン酸アルキルアンモニウムであり、ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はアルキル、アリール又はシリル又は水素である。
【００１７】
他の特に好ましい実施態様では、前記オレイン酸アルキルアンモニウムは、オレイン酸テトラメチルアンモニウム、オレイン酸テトラエチルアンモニウム、オレイン酸テトラプロピルアンモニウム、オレイン酸テトラブチルアンモニウム又はオレイン酸ベンジルアンモニウムである。さらに好ましい実施態様では、前記第１の有機溶媒は、一般式ＣｎＨ２ｎ＋ｍで表されるアルカン溶媒であり、１５≦ｎ≦３０及び−２≦ｍ≦２である。さらに又はこれに代えて、前記の非溶媒は、アセトン、ブタノン、ペンタノン、イソブチルメチルケトン、ジエチルエーテル、メチルプロピルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル又はエチルシリルエーテルである。追加の又はこれに代えて、前記第２の溶媒は、ペンタン、イソペンタン、ネオペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロメタン又はジクロロエタンである。
【００１８】
他の好ましい実施態様では、ステップ（ｂ）の温度増加の速度は、１分間に約１℃と１０℃の間の温度の増加である。
【００１９】
本発明のさらに好ましい実施態様では、ステップ（ｂ）の最大温度は、３４０℃から４００℃である。
さらに又はこれに代えて、前記冷却ステップ（ｄ）での懸濁物の温度は、約４０℃から９０℃へ下げられる。
【００２０】
本発明の他の好ましい実施態様では、前記熟成ステップ（ｃ）は約１から５時間実施される。
【００２１】
本発明の他の好ましい実施態様では、前記ポリマーの溶液は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び／又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む親水性生物適合性コポリマーの本質的な水溶性緩衝液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む両親媒性リン脂質の本質的な水溶液、又は両親媒性ブロックコポリマーの本質的な緩衝水溶液である。
【００２２】
他の好ましい実施態様では、ステップ（ｈ）の代わりに、ステップ（ｇ）で、クエン酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸及び／又はそれらの塩、デキストラン、カルボデキストラン、ポリオキシエチレン系ポリマー又はコポリマー、又はそれらの組み合わせなどの、親水性又は両親媒性安定化剤と混合するステップを含む。
【００２３】
他の好ましい実施態様では、前記除去ステップ（ｉ）は、本質的に非閉鎖システムで混合物を撹拌することで実施され、それにより前記第２の有機溶媒が、親水性ナノ粒子の水溶液が得られるまで蒸発させることができる。
【００２４】
他の特に好ましい実施態様では、次の１又はそれ以上の追加のステップ、
（ｊ）ステップ（ｉ）で得られ得るナノ粒子又はナノ粒子溶液を精製するステップ；
（ｋ）ステップ（ｉ）又は（ｋ）で得られ得るナノ粒子又はナノ粒子溶液を酸化剤又は還元剤で処理するステップ；
（ｌ）ステップ（ｉ）、（ｊ）又は（ｋ）で得られ得るナノ粒子の表面を、前記ポリマー又は安定化剤コーティングを除去、置換又は変更することで変性するステップ；
（ｍ）ステップ（ｉ）から（ｌ）で得られ得るナノ粒子を、ミセル、リポソーム、ポリマーソーム、血液細胞、ポリマーカプセル、デンドリマー、ポリマー又はヒドロゲルなどのキャリアでカプセル化又はクラスタ化するステップ；及び
（ｎ）ステップ（ｉ）から（ｍ）で得られ得るナノ粒子を、ターゲットリガンドで修飾する、ステップが実施される。
【００２５】
さらなる側面では、本発明は、前記の方法で得られ得る鉄酸化物ナノ粒子に関する。
【００２６】
さらなる側面では、本発明は、前記の鉄酸化物ナノ粒子又は前記の方法で得られ得る鉄酸化物ナノ粒子を、磁気粒子イメージング（ＭＰＩ）又は磁気粒子スペクトル（ＭＰＳ）のためのトレーサーとしての使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、合成の熱分解で出発物質として使用される固体粉砕ＦｅＯ（ＯＨ）のサイズ分布を示す。上図は、容量加重サイズ分布が示され、下図は、数加重サイズ分布が示される。
【図２】図２は、サンプル１．１（実施例１）及びサンプル２．２（実施例２）の磁気粒子スペクトル（ＭＰＳ）を、Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（Ｒ）と比較して示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ヘキサン中でのサンプルＡ（実施例３）の結果を、Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（Ｒ）と比較して示す。サンプルＡは鉄量で正規化された（図３Ａ参照）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ヘキサン中でのサンプルＢ（実施例３）の結果を、Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（Ｒ）と比較して示す。サンプルＢは鉄量で正規化された（図３Ｂ参照）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ヘキサン中でのサンプルＣ（実施例３）の結果を、Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（Ｒ）と比較して示す。サンプルＣは鉄量で正規化された（図３Ｃ参照）。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ヘキサン中でのサンプルＤＧ（実施例３）の結果を、Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（Ｒ）と比較して示す。サンプルＤは鉄量で正規化された（図３Ｄ参照）。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ヘキサン中でのサンプルＥ（実施例３）の結果を、Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（Ｒ）と比較して示す。サンプルＥのＭＰＳスペクトルは、ＭＰＳ曲線の第３ハーモニックに正規化された。
【図３Ｆ】図３Ｆは、ヘキサン中でのサンプルＦ（実施例３）の結果を、Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（Ｒ）と比較して示す。サンプルＦは鉄量で正規化された（図３Ｆ参照）。
【図３Ｇ】図３Ｇは、ヘキサン中でのサンプルＧ（実施例３）の結果を、Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（Ｒ）と比較して示す。サンプルＧは鉄量で正規化された（図３Ｇ参照）。
【図４Ａ】図４Ａは乾燥サンプルＡの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージングを示す。図４Ａイメージは、通常の透過ＴＥＭイメージである。
【図４Ｂ】図４Ｂは乾燥サンプルＢの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージングを示す。図４Ｂのイメージは、通常の透過ＴＥＭイメージである。
【図４Ｃ】図４Ｃは乾燥サンプルＣの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージングを示す。図４Ｃのイメージは、通常の透過ＴＥＭイメージである。
【図４Ｄ】図４Ｄは乾燥サンプルＣの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージングを示す。図４Ｄのイメージは高分解能ＴＥＭイメージ（ＨＲ−ＴＥＭ）である。
【図４Ｅ】図Ｅは乾燥サンプルＣの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージングを示す。図４Ｅは高角度暗視野イメージングである。
【図５】図５は、乾燥サンプルＡ、Ｂ、ＣのＸＲＤスペクトルを、Ｆｅ３Ｏ４標準サンプル（参照）と比較して示す。マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）及びγ−Ｆｅ２Ｏ３（ヘマタイト）の理論的パターンを参照として示される。全てのサンプルの鉄酸化物コアの組成は、Ｆｅ２Ｏ３（マグネタイト）タイプであると結論された。
【図６】図６は、サンプルＣ（ヘキサン溶液）のＶＳＭスペクトルを示す。
【図７】図７は、鉄オレイン酸アニオン（ｏａ−）の構造式を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明者は、優れたＭＰＩ／ＭＰＳ性能を持つ水溶性鉄酸化物ナノ粒子の合成を可能にする手段及び方法を開発した。これらのナノ粒子は、ＭＰＩ、ＭＰＳ又はＭＲＩ用トレーサーとして最適である。
【００２９】
本発明は、具体的な実施態様により説明されるが、これらの記載は本発明を限定するものではない。
【００３０】
本発明の詳細な説明の前に、本発明を理解するための重要な定義を示す。
【００３１】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される、単数形「一つの」は、特に記載されていない限りそれぞれの複数形をも含む。
【００３２】
本発明においては、用語「約」は、当業者が、問題と成る構成の技術的効果が保証されることを理解できる精度の範囲を示す。前記用語は通常は、示される数値からの±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％及びさらに好ましくは±５％の偏差を意味する。
【００３３】
理解されるべきことは、用語「含む」は限定的な意味ではない、ということである。本発明において、用語「からなる」は、用語「含む」の一つの好ましい実施態様と考えられる。以下、群が少なくともある数の実施態様を含むとして定義される場合に、これはまた、好ましくはこれらの実施態様のみからなる群を又含むことを意味する。  
さらに記載及び特許請求の範囲での用語「第１の」、「第２の」、「第３の」又は「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」等は類似する要素を区別するために使用されているものであり、連続性又は時間順序を説明するためには必須ではない。理解されるべきことは、使用される用語は、適切な状況では互いに交換可能であり、ここで記載される実施態様は、ここで記載され示される順序とは異なる順序で操作することが可能である、ということである。
【００３４】
用語「第１の」、「第２の」、「第３の」又は「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」等は、方法又は使用のステップに関係するが、これらのステップの間の時間又は時間間隔の整合性はなくてもよく、即ち、以上又は以下で記載される適用において指示されていない限り、ステップは、同時に実施されてもよく、又はステップの間に秒、分、時間、日、週、月又は年の間隔があってもよい。
【００３５】
理解されるべきことは、本発明は、ここで記載される具体的方法、手順、試薬などに限定されるものではなく、これらは変更し得る、ということである。また理解されるべきことは、ここで使用される用語は、具体的な実施態様を説明するためだけのものであり、特許請求の範囲でのみ限定されるべき本発明の範囲を限定することを意図するものではない、ということである。特に定義されていない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者により通常理解されるものと同じ意味を持つ。
【００３６】
上で定めたように、本発明は、一つの側面では、鉄酸化物ナノ粒子の形成方法に関し、前記方法は次のステップ：
（ａ）鉄酸化物／水酸化物及びオレイン酸又はその誘導体を第１の有機溶媒中に懸濁させるステップ；
（ｂ）前記懸濁物の温度を、所定の速度で、最大３４０℃から５００℃まで上げるステップ；
（ｃ）前記懸濁物をステップ（ｂ）の最大温度で約０．５から６時間熟成するステップ；
（ｄ）前記懸濁物を冷却するステップ；
（ｅ）第２の有機溶媒を添加するステップ；
（ｆ）非溶媒を添加してナノ粒子を沈殿させて過剰の溶媒を除去するステップ；
（ｇ）前記第２の有機溶媒中に前記ナノ粒子を分散させるステップ；
（ｈ）ステップ（ｇ）の分散物とポリマー溶液を混合するステップ；及び、
（ｉ）場合により、前記第２の有機溶媒を除去するステップを含む。
【００３７】
前記合成の最初のステップは、鉄酸化物／水酸化物及びオレイン酸又はその誘導体を第１の有機溶媒に懸濁させることを含む。ここで使用される用語「第１の有機溶媒」とは、高沸点での反応に適した有機溶媒を意味する。好ましくは、有機溶媒は、アルカンである。より好ましくは、前記アルカンは飽和アルカンであり、より好ましくは直鎖飽和アルカンである。溶媒は単独で、又は異なる溶媒と組み合わせて、例えば２つの溶媒と組み合わせて溶媒として使用され得る。好ましくは、より適切な温度制御が可能となるように、純粋な溶媒、例えばアルカン溶媒の使用である。
【００３８】
本発明の好ましい実施態様では、前記第１の有機溶媒は、一般式ＣｎＨ２ｎ＋ｍで表され、１５≦ｎ≦３０及び−２≦ｍ≦２、好ましくは１８≦ｎ≦２２及び０≦ｍ≦２、より好ましくはｎ＝２０及びｍ＝２である。使用されるこれらの溶媒の例は、オクタデカン、トリコサン及びパラフィンワックスである。特に好ましくは、第１の有機溶媒としてイコサンである。
【００３９】
本発明の具体的な実施態様では、使用される前記第１の有機溶媒は、ナノ粒子合成ステップ（ｂ）の温度により選択され得る。例えば、イコサンの沸点は約３４３℃であり；イコサンは従って約３４０℃での温度での反応に好適に使用され得る。又は、括弧内に示されるアルカン溶媒が使用でき、好ましくはより高温度、より好ましくは以下で示されるアルカンであり、示される沸点近くの温度で使用され得る：ヘニコサン（３５７℃）、ドコサン（３６６℃）、トリコサン（３８０℃）、テトラコサン（３９１℃）、ペンタコサン（４０２℃）、ヘキサコサン（４１２℃）、ヘプタコサン（４２２℃）、オクタコサン（４３２℃）、ナノコサン（４４１℃）、トリアコサン（４５０°Ｃ）、ヘントリアコンタン（４５８℃）、ドトリアコンタン（４６７℃）、トリロリアコンタン（４７５℃）、テトラトリアコンタン（４８３℃）、ペンタトリアコンタン（４９０℃）、ヘキサトリアコンタン（４９７°Ｃ）。さらに、これらの２又はそれ以上のサブグループの全ての組み合わせも使用され得る。
【００４０】
又は、反応圧力条件の調節、例えば増加させることで、上で示された沸点より高い温度で前記第１の有機溶媒を使用することを可能にする。
【００４１】
ここで用語「鉄酸化物／水酸化物」とは、例えば０、＋２、＋３又は＋４酸化状態、好ましくは＋２又は＋３酸化状態などの異なる酸化状態の鉄酸化物を、又は例えば０、＋２、＋３又は＋４酸化状態、好ましくは＋２又は＋３酸化状態などの異なる酸化状態の鉄水酸化物を意味する。好ましくは、この用語は、鉄（ＩＩ）酸化物、鉄（ＩＩＩ）酸化物、鉄（ＩＩ）鉄（ＩＩＩ）酸化物、鉄（ＩＩ）水酸化物、鉄（ＩＩＩ）水酸化物、鉄（ＩＩ）鉄（ＩＩＩ）水酸化物、鉄（ＩＩ）酸化水酸化物、鉄（ＩＩＩ）酸化水酸化物など又はそれらの水和物又はそれらの任意の組み合わせに関連する。
【００４２】
本発明の好ましい実施態様では、前記鉄酸化物／水酸化物は、鉄（ＩＩＩ）／水酸化物、鉄（ＩＩ）酸化物／水酸化物又は鉄（ＩＩＩ）及び鉄（ＩＩ）酸化物／水酸化物の混合物である。
【００４３】
使用されるオレイン酸は、例えば図７に示されるオレイン酸又はその誘導体である。好ましくは、高温度で少なく部分的に使用溶媒に溶解し得るオレイン酸誘導体である。
【００４４】
本発明の好ましい実施態様では、前記オレイン酸誘導体は、オレイン酸アンモニウム、オレイン酸リチウム、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸マグネシウム、オレイン酸カルシウム、オレイン酸アルミニウム又はオレイン酸鉄、又はこれらの任意の組み合わせである。
【００４５】
さらに特に好ましい実施態様では、前記オレイン酸アンモニウムは、好ましいオレイン酸誘導体はオレイン酸アルキルアンモニウムであり、アンモニウム基は式Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ＋であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は同一又は独立して異なり、アルキル、アリール又はシリル基又は水素である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は同じであってよく又は独立して異なっていてもよい。さらに、Ｒ１とＲ２は同じであるか、又は独立して異なっていてよく、Ｒ３とＲ４は同じであるか、又は独立して異なっていてよく、Ｒ１とＲ３は同じであるか、又は独立して異なっていてよく、Ｒ１とＲ４は同じであるか、又は独立して異なっていてよく、Ｒ１とＲ３は同じであるか、Ｒ２とＲ３は同じであるか、Ｒ２とＲ４は同じであるか、又は独立して異なっていてよく、又は独立して異なっていてよく、又は独立して異なっていてよい。
【００４６】
さらに、特に好ましい実施態様では、前記オレイン酸アンモニウムが、オレイン酸テトラメチルアンモニウム、オレイン酸テトラエチルアンモニウム、オレイン酸テトラプロピルアンモニウム、オレイン酸テトラブチルアンモニウム又はオレイン酸ベンジルアンモニウム又はそれらの誘導体又はそれらの混合物であり得る。
【００４７】
さらなる実施態様では、オレイルアミンとオレイン酸又はその誘導体の組み合わせが前記の第１の有機溶媒中に懸濁される。又は、オレイルアミンと前記の鉄酸化物／水酸化物の組み合わせ、又はオレイルアミンと前記の鉄酸化物／水酸化物及びオレイン酸又はその誘導体の組み合わせが、第１の有機溶媒中に懸濁される。
【００４８】
前記懸濁ステップの溶媒料は懸濁させる内容物の量により調節され得る。
例えば、溶媒に量は、懸濁される内容部の容積又は重量の、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、５０倍又は１００倍で使用され得る。
【００４９】
懸濁ステップは、全ての適切な技術により実施され、例えば、溶媒中の内容物を撹拌する、反応混合物を振り混ぜる、回転運動を与えるなどである。懸濁ステップは、鉄酸化物／水酸化物及び／又はオレイン酸又はその誘導体が完全に懸濁されるまで実施され、例えば鉄酸化物／水酸化物沈殿物が視覚的に見えなくなるまでである。懸濁ステップは、例えば約１分間、２分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４５分間又は６０分間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間又はこれらの間の任意の時間で実施され得る。
【００５０】
懸濁ステップは、適切な任意の温度で実施され、好ましくは約３５℃から６５℃であり、例えば約３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃又は６５℃である。温度はさらに、約２５℃よりも低くてよく、又は約７５℃へ上げてもよい。懸濁ステップの間に、温度は一定に、例えば上記指示の温度のいずれかに維持されてもよく、又は変更されてもよい。例えば、温度は最初はより低く、例えば約３５℃に設定され、その後徐々に、約５０℃、６０℃又は６５℃まで上げられ得る。又は、温度は最初より高い温度、例えば約５０℃、５５℃、６０℃又は６５℃に設定され、その後徐々に、３５℃、４０℃又は４５℃へ下げられ得る。さらに、種々の順序の組み合わされた増減の温度プロフィール、例えば最初減少して後増加され、最後に減少させる、などが使用され得る。
【００５１】
本発明の具体的な実施態様では、前記の鉄酸化物／水酸化物及びオレイン酸又はその誘導体は、特定のモル又は質量比で使用され得る。例えば、鉄酸化物／水酸化物：オレイン酸の比は、約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９又は１：２０で使用され得る。特に好ましい実施態様では、鉄酸化物／水酸化物：オレイン酸の質量比は、１：４、１：８又は１：１２である。
【００５２】
合成のさらなるステップで、前記懸濁物の温度が、最高３４０℃から５００℃へ上げられ得る。好ましくは、懸濁物の温度は、最大３４０℃から４００℃へ上げられる。最大温度は、例えば、３４０℃、３４１℃、３４２℃、３４３℃、３４４℃、３４５℃、３５０℃、３６０℃、３７０℃、３８０℃、３９０℃、４００℃、４１０℃、４２０℃、４３０℃、４４０℃、４５０℃、４６０℃、４７０℃、４８０℃、４９０℃又は５００℃である。またより高い５００℃を超える温度も本発明に含まれる。
【００５３】
特に好ましい実施態様では、前記最高温度は、使用される第１の有機溶媒の沸点により選択され、例えばイコサンでは約３４０−３４３℃、ヘンイコサンでは約３５７℃、ドコサンでは約３６６℃、トリコサンでや約３８０℃、テトラコサンでは約３９１℃、ペンタコサンでは約４０２℃、ヘキサコサンでは約４１２℃、ヘプタコサンでは約４２２℃、オクタコサンでは約４３２℃、ノナコサンでは約４４１℃、トリアコサンでは約４５０℃、ヘントリアコンタンでは約４５８℃、ドトリアコンタンでは約４６７℃、トリトリアコンタンでは約４７５℃、テトラトリアコンタンでは約４８３℃、ペンタトリアコンタンでは約４９０℃又はヘキサトリアコンタンでは約４９７℃である。
【００５４】
温度増加は、好ましくは、所定の速度で増加させる。本発明の好ましい実施態様では、ステップ（ｂ）の温度増加は、１分間に約１℃から１０℃の間であり得る。又は、ステップ（ｂ）の温度増加は、２分間、３分間又は５分間に約１℃から１０℃の間であり得る。例えば、温度は、１分、２分、３分又は５分毎に、１℃、２℃、２．５℃、３℃、３．５℃、４℃、４．５℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃又は１０℃増加され得る。好ましくは、温度は、１分に３．３℃の速度で増加され得る。
【００５５】
合成にさらなるステップでは、ステップ（ｂ）の懸濁物が熟成され、又はステップ（ｂ）の最高温度で約０．５から６時間沸騰させる。本発明の特に好ましい実施態様では、前記熟成又は沸騰ステップは約１時間から５時間実施され得る。前記熟成又は沸騰は、例えば０．５時間、０．７５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間又は６時間実施され得る。さらには、６時間を超えるより長い熟成／沸騰時間も本発明に含まれる。合成の熟成／沸騰ステップの間、温度は好ましくは先行ステップの最高温度、例えば３４０℃に維持される。又は、温度は、最高温度３４０℃と５００℃の間で変更され得る。さらなる実施態様では、温度はまた、約２００℃、２５０℃、３００℃、３１０℃、３２０℃又は３３０℃へ下げられ得る。温度変更は、１回又はそれ以上実施し、それぞれの変更の後ステップ（ｂ）で使用される最高温度へ戻され得る。温度変更は、即ちステップ（ｂ）の最大温度に比べて増加又は減少させる期間は、例えば１０から２０分の範囲の短い時間、又は例えば３０分以上、１時間、２時間、３時間、４時間を超える長い時間であり得る。前記期間は熟成ステップの期間に依存する。
【００５６】
合成にさらなるステップでは、ステップ（ｃ）の懸濁物が冷却される。冷却は、適切な冷却装置により、又は適切に冷却された環境へ移すことで実施され得る。好ましい実施態様では、懸濁物は、約４０℃から９０℃へ冷却され、より好ましくは約５０℃から８０℃の温度へ冷却される。反応混合物は、例えば約４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃又は９０℃へ冷却され得る。
【００５７】
冷却は、上で示した温度のいずれかへの即時に温度変化させることで実施され得る。又は、冷却は徐々に、例えばステップ（ｄ）の反応混合物の温度を、１分、２分、５分１０分又は２０分毎に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０℃下げていくことで実施され得る。
【００５８】
ナノ粒子の合成にさらなるステップでは、ステップ（ｄ）の懸濁物へ第２の有機溶媒が添加される。ここで用語「第２の有機溶媒」とは、より低温度での反応、例えば温度範囲４０℃から９０℃の範囲又は４０℃から８０℃での反応に適する有機溶媒を意味する。好ましくは、第２の有機溶媒は第１の有機溶媒よりも低い沸点、例えば２０℃から９０℃及び／又は低い粘性を持つ。第２の有機溶媒は好ましくは短鎖アルカンである。
【００５９】
本発明の特に好ましい実施態様で、この合成ステップで使用される第２の有機溶媒の好ましい例は、ペンタン、イソペンタン、ネオペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロメタン及びジクロロエタンである。特に好ましくは、ペンタン又はヘキサンの使用である。第２の有機溶媒は、単独で又は異なる溶媒の混合物、例えば２種類の短鎖アルカンの混合物が溶媒として使用され得る。好ましくは、純粋な溶媒の使用である。
【００６０】
ナノ粒子の合成にさらなるステップでは、ステップ（ｅ）の反応混合物に非溶媒が添加され、ナノ粒子の沈殿を生成させる。ここで用語「非溶媒」とは、低沸点の有機化合物であって、反応混合物を本質的に溶解しない、即ち熱分解ステップで形成されるナノ粒子を溶解しない有機化合物を意味する。
【００６１】
本発明の特に好ましい実施態様では、前記非溶媒は、アセトン、ブタノン、２−ブタノン、ペンタノン、２−ペンタノン、イソブチルメチルケトン、イソブチルメチルケトン、メトルプロピルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル、エチルイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル又はジイソプロピルエーテルである。
【００６２】
非溶媒の添加は、具体的実施態様では、反応混合物を、例えば前記の撹拌により撹拌することにより実施され得る。添加される非溶媒の量は、ステップ（ｆ）の生成物の量及び容量により調節され得る。
【００６３】
沈殿は、例えば１０分間から６０分間遠心分離することで集められ得る。遠心分離は、適切な任意の速度、例えば３０００から１００００ｒｐｍ、好ましくは４９００ｒｐｍで実施され得る。
【００６４】
続いて、過剰溶媒又は上澄みが捨てられる。沈殿ナノ粒子が得られ、次のステップのために保持される。
【００６５】
ナノ粒子の合成のさらなるステップは、ステップ（ｆ）で得られるナノ粒子を前記の第２の有機溶媒に溶解させることである。第２の有機溶媒としては、ステップ（ｅ）で使用される同じ溶媒が使用されるか、又は異なる溶媒が使用され得る。好ましくは、ペンタン又はヘキサンが使用され得る。前記分散ステップの溶媒の量は、ステップ（ｆ）の沈殿生成物の量により調節され得る。例えば、第２の溶媒の量は、ステップ（ｆ）の生成物の容量又は重量の、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、５０倍又は１００倍で使用され得る。混合は、適切な全ての時間間隔、例えば約３０分から２４時間、好ましくは約４５分から１８時間、さらに好ましくは約１時間から１４時間で実施され得る。
【００６６】
ナノ粒子の沈殿化及び続く分散は、一回のみ又は２回、３回、４回、５回、６回又はそれ以上繰り返し実施され得る。このステップの繰り返しは、ナノ粒子の純度を増加させると考えられる。
【００６７】
本発明の具体的な実施態様では、前記ステップに応じて合成されたナノ粒子が、第２の有機溶媒、好ましくは、ヘキサンの所定の容量、例えばヘキサン１０ｍｌに分散され得る。
【００６８】
従って、分散ナノ粒子は続いて、例えば実施例で説明される実験及び分析などの分析研究に、又は他の合成又は変更ステップのために使用され得る。
【００６９】
従って得られるナノ粒子は、単分散形で存在するか、又は多分散形で存在し得る。ここで用語「単分散」とは、狭いナノ粒子サイズ分布を意味する。本発明の単分散ナノ粒子は、ナノ粒子のより大きい群、例えば前記の方法により得られた１０００、１００００又は５００００のナノ粒子の群の平均サイズから僅か０．１から３ｎｍのみ異なるサイズを持ち得る。「多分散」形は、ナノ粒子のより大きい群、例えば前記記載の方法により得られた１０００、１００００又は５００００のナノ粒子の群の平均サイズから３ｎｍより大きく異なるサイズを持ち得る。このようなナノ粒子は、異なるサイズの群で存在し、それぞれは単分散形であるか、又は統計的又はより広いサイズ分布で存在し得る。
【００７０】
単分散ナノ粒子は、追加の合成のために直接使用されるか、又は異なるサイズの群と組み合わされる。多分散ナノ粒子は、直接使用され得るか、又は単分散ナノ粒子を得るため又はナノ粒子群の多分散性を低減するためにサイズ分画又は分離手順の対象とされ得る。例えば、サイズ分画又は分離は、国際公開第２００８／０９９３４６号明細書又は国際公開第２００９／０５７０２２号明細書の記載された装置又はシステムにより、又はその使用に基づき実施され得る。これに代えて又は追加して、粒子形による分画又は分離が実施され得る。
【００７１】
合成のさらなるステップでは、ステップ（ｇ）の分散物、又は本発明によるナノ粒子の全ての誘導、分画、分離又は他の方法で変性された混合物にポリマーの溶液が混合される。
【００７２】
本発明のこの好ましい実施態様では、前記ポリマー溶液は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び／又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む親水性生物適合性コポリマーの、本質的に水溶性緩衝液である。
【００７３】
本発明のさらに好ましい実施態様では、前記ポリマー溶液は、ＰＥＧを含む両親媒性リン脂質の本質的な水溶液である。
【００７４】
加えて本発明のさらに好ましい実施態様では、前記ポリマー溶液は、両親媒性ブロックコポリマーの本質的な水溶性緩衝液である。
【００７５】
ここで用語「本質的な水溶性」とは、溶液又は緩衝液中にＨ２Ｏが少なくとも５１％から９９．９９９％存在することを意味する。
【００７６】
特に好ましくは、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（プロピレングリコール）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）であり、例えばプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）である。より好ましくは、プルロニックＦ６８、プルロニックＦ１０８又はプルロニックＦ１２７の使用である。最も好ましくは、プルロニックＦ１２７の使用である。
【００７７】
さらに、この合成で使用される適切なポリマーは、両親媒性ＰＥＧ化リン脂質又は脂質である。これらのリン脂質の好ましい例は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧｘ−Ｙであり、ここでＹ＝ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ｘ＝２００〜５０００、又はＤＳＰＥ＝１、２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンである。脂質の好ましい例は、１、２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（ＯＭｅ））である。
【００７８】
混合ステップのためのポリマー溶液の量は、ステップ（ｆ）の沈殿生成物又はステップ（ｇ）の容量により調節され得る。例えば、ポリマー溶液の量は、ステップ（ｇ）の反応混合物の容量の、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍で使用され得る。混合は、適切な任意の時間間隔、例えば約５分から２４時間、好ましくは、約４５分から１８時間、より好ましくは約１時間から１４時間で実施され得る。
【００７９】
好ましい実施態様では、混合ステップは、２相混合物を、例えば本質的に非閉鎖システムで撹拌することで実施され得る。
【００８０】
本発明のさらなる実施態様では、ステップ（ｇ）の分散物が、親水性又は両親媒性安定化剤と混合される。かかる安定化剤の好ましい例は、クエン酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸及び／又はそれらの塩、デキストラン、カルボキシデキストラン、ポリエチレンオキシド系ポリマー又はコポリマー、又はそれらの組み合わせである。混合ステップのための安定化剤の量は、ステップ（ｆ）の沈殿生成物又はステップ（ｇ）の容量により調節され得る。例えば、安定化剤の量は、ステップ（ｇ）の反応混合物の容量の、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍で使用され得る。混合は、適切な任意の時間間隔で実施され、例えば約５分から５日、好ましくは約４５分から４８時間、より好ましくは約１時間から２４時間実施され得る。
【００８１】
好ましい実施態様では、混合ステップは、２相混合物を、例えば本質的に非閉鎖システムで撹拌することで実施され得る。
【００８２】
ナノ粒子の合成の最後の選択的ステップにおいて、先行するステップで得られるナノ粒子の溶液中に、ポリマー溶液を混合するか、又は親水性又は両親媒性安定化剤を混合することのいずれかにより前記第２の有機溶媒が除去され得る。この除去は、第２の有機溶媒を、好ましくはステップ（ｈ）の混合手順の間に蒸発させることで実施され得る。従って、前記蒸発ステップは、例えば適切な反応容器を使用する又は反応混合物を撹拌することで反応混合物の表面を増加させることで実施され得る。加えて又はこれに代えて、液体反応混合物と接触する気体空間又は領域は、換気又はガス交換ステップにより、前記空間又は領域の揮発成分濃度を下げるために変更され得る。本発明の特に好ましい実施態様では、前記除去ステップは、親水性ナノ粒子が得られるまで、前記第２の有機溶媒を蒸発させるために本質的に非閉鎖システム中で前記混合物を撹拌することで実施される。
【００８３】
合成の結果、親水性ナノ粒子の水溶液が得られる。
【００８４】
従って、得られたナノ粒子は単分散形で存在するか、又は前記の合成手順の際に実施された分離又は分画の性能とは無関係に、多分散形で存在し得る。従って、単分散ナノ粒子は、直接に又は異なるサイズの群と組み合わせて使用され得る。多分散ナノ粒子はまた、直接使用されるか、又は単分散ナノ粒子を得るため又はナノ粒子の多分散性を低減させるためにサイズ分画又は分離手順の対象とされ得る。
【００８５】
本発明のさらなるステップでは、前記ステップ又はその変法で得られたナノ粒子又はナノ粒子溶液をさらに、次の追加のステップ：
（ｊ）ステップ（ｉ）で得られたナノ粒子又はナノ粒子溶液を精製するステップ；
（ｋ）ステップ（ｉ）又はステップ（ｊ）で得られたナノ粒子又はナノ粒子溶液を酸化剤又は還元剤で処理するステップ；
（ｌ）ステップ（ｉ）、（ｊ）又は（ｋ）で得られたナノ粒子の表面を、前記コーティングを除去、交換又は変更することで変性するステップ；
（ｍ）ステップ（ｉ）から（ｌ）で得られたナノ粒子を、ミセル、リポソーム、ポリマーソーム、血液細胞、ポリマーカプセル、デンドリマー、ポリマー又はヒドロゲルで、カプセル化又はクラスタ化するステップ；及び
（ｎ）  ステップ（ｉ）から（ｍ）で得られたナノ粒子をターゲットリガンドで修飾するステップにより、処理、変性又は変更され得る
ステップ（ｉ）又はその変法で得られたナノ粒子又はナノ粒子溶液の精製は、例えば濾過で実施され得る。濾過は、任意に適切な方法、例えばミクロ濾過、超濾過、ナノ濾過、逆浸透圧などの動的濾過、又は真空濾過、加圧濾過又は膜濾過などの静的濾過を用いることで実施され得る。さらにモレキュラーシーブも使用され得る。
【００８６】
他の、選択的ステップで、ステップ（ｉ）又は（ｊ）又はその変法で得られ得るナノ粒子又はナノ粒子溶液は酸化剤又は還元剤で処理される。試薬の例は、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ピリジン−Ｎ−オキシド、ヘキサフルオロリン酸フェロセニウム及びテトラフルオロホウ酸フェロセニウムである。好ましくは、トリメチルアミン−Ｎ−オキシドの使用である。
【００８７】
さらに、ステップ（ｉ）、（ｊ）又は（ｋ）又はそれらの変法で得られ得るナノ粒子の表面は、前記コーティングを除去、交換又は変更することで変性され得る。そのような変性は、当業者に知られる適切な化学反応により実施され、例えば、Ｆ．Ｈｅｒｒａｎｚ等の「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ、２００８、１４、９１２６−９１３０」、Ｈｅｒｒａｎｚ等の「Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄｉａ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ、２００８、３、２１５−２２２」、Ｊ．Ｌｉｕ等の「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００９、１３１、１３５４−１３５５」、Ｗ．Ｊ．Ｍ．Ｍｕｌｄｅｒ等の「ＮＭＲ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００６、１９、１４２−１６４」又はＥ．Ｖ．Ｓｈｔｙｋｏｖａ等の「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃ、２００８、１１２、１６８０９−１６８１７」に記載されている。
【００８８】
他の選択的な追加の又は代わりのステップで、ステップ（ｉ）から（ｌ）又はその変法から得られ得るナノ粒子はキャリアを用いてカプセル化又はクラスタ化され得る。好ましくは、脂質、胆汁酸、サポニン、脂肪酸、合成両親媒性ブロックコポリマー又は卵黄リン脂質などの天然生成物などの１又はそれ以上の両親媒性分子からなるか又は含むキャリア構造が使用され得る。特に好ましくは、リン脂質及び合成ブロックコポリマーである。適切なキャリアの特に好ましい例は、ミセル、リポソーム、ポリマーソーム、血液細胞、ポリマー、カプセル、デンドリマー、ポリナー又はヒドロゲル又はそれらの混合物である。ここで用語「ミセル」とは、通常脂質、特にリン脂質から形成され、単層構造で編成される、小胞（ベシクル）型意味する。ミセルは通常は、疎水性内部又はキャビティを持つ。
【００８９】
ここで用語「リポソーム」は、通常は、脂質、特にリン脂質、即ち水溶性環境で二重層を持つ構造などの膜を形成する分子から形成される、小胞（ベシクル）型意味する。リポソームで使用される好ましいリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンが含まれる。特に好ましくは、リン脂質ＭＰＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００又はＬｉｓｓ  Ｒｈｏｄ  ＰＥである。
【００９０】
ここで用語「ポリマーソーム」とは、通常はブロックコポリマー両親媒性物、即ち脂質と類似の両親媒性を持つ合成両親媒性物からなる、小胞（ベシクル）型意味する。
この両親媒性（より親水性ヘッド部分とより疎水性テール部分を持つ）のために、前記ブロックコポリマーは、リポソームと類似のヘッド−テール及びテール−ヘッドの二層構造に自己集合することができる。リポソームに比べて、ポリマーソームはずっと大きい分子量を持ち、数平均分子等は通常、１０００から１０００００、好ましくは２５００から５００００、より好ましくは５０００から２５０００であり、通常は化学的に安定であり、生理的膜から漏れることや生理的膜に干渉することが少なく、かつより低い臨界凝集濃度により安定である。これらの性質により、オプソニン作用がより小さくかつ長い循環時間が得られる。
【００９１】
ここで用語「デンドリマー」とは、大きな合成ポリマーであり、中心コアから半径方向に原子が枝分かれし、さらにそれが枝分かれするように配置されている。デンドリマーの合成及び使用は、当業者に知られている。
【００９２】
ここで用語「ヒドロゲル」とは、水が分散媒体であるコロイドゲルを意味する。ヒドロゲルは静止状態では、ゲル内の３次元クロスリンクネットワークにより流動しない。ヒドロゲルは、天然又は合成ポリマーから形成され得る。ヒドロゲルの入手及び使用は当業者に知られている。
【００９３】
他の選択的な追加の又は代わりのステップで、ステップ（ｉ）から（ｍ）又はその変更で得られ得るナノ粒子はターゲットリガンドで修飾され得る。
【００９４】
ここで用語「ターゲットリガンド」とは、前記修飾ナノ粒子の相互作用及び／又は認識を適合性のある要素、又は安定化又は不安定化要素により可能にするターゲット主体を意味する。これらの要素は通常は前記ナノ粒子の外側又は外側表面に存在する。特に好ましくは、ナノ粒子を特定の組織型、特定の器官、細胞又は細胞型又は特に動物又は人の体の特定の身体部分を目標とすることを可能にする要素である。例えば、ターゲットリガンドの存在は、ナノ粒子を、肝臓、腎臓、肺、心臓、すい臓、胆嚢、脾臓、リンパ構造体、皮膚、脳、筋肉などへ目標とさせる。又は、ターゲットリガンドの存在は、特定の細胞タイプ、例えば表面に相互作用又は認識タンパク質を発現している癌細胞のターゲッティングを可能とする。本発明の好ましい実施態様では、ナノ粒子はタンパク質又はペプチド又はその断片を含み、ナノ粒子の外側で相互作用表面を提供する。かかるタンパク質の例は、リガンド又は他のレセプターと相互作用し得るレセプター分子、その抗原と相互作用し得る抗体又は抗体断片又はその誘導体、又はアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアジビン、レクチンと、結合し得るリガンドである。また本発明には、ビオチンなどの結合相互作用物の存在も含まれ、これは例えばタンパク質又はペプチドなどのビオチン化化合物の形で存在し得る。ナノ粒子はまた、適合性インテグレーター、例えばビタミン結合タンパク質又は抗体などと相互作用可能なビタミン又は抗原を含む。
【００９５】
他の側面では、本発明は、上記の合成方法又はその変法で得られる又は得られ得る鉄酸化物ナノ粒子に関する。鉄酸化物ナノ粒子は、任意の形状、状態又は条件であってよく、例えば、固体鉄酸化物ナノ粒子、例えば全ての適切な溶媒又は緩衝液中の溶解鉄酸化物ナノ粒子として提供され得る。さらに鉄酸化物ナノ粒子は、前記の単分散又は多分散形で提供され得る。
【００９６】
他の側面では、本発明は、前記の鉄酸化物ナノ粒子又は前記方法又はその変法で得られた又は得られ得る鉄酸化物ナノ粒子を磁気粒子イメージング（ＭＰＩ）又は磁気粒子スペクトル（ＭＰＳ）、又はＮＰＩとＭＰＳの組み合わせのためのトレーサー、例えば造影剤としての使用に関する。さらなる本発明の具体的な実施態様では前記鉄酸化物ナノ粒子はまた、従来の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のために、例えば造影剤として使用され得る。
【００９７】
従って、前記の方法又はその変法で得られた又は得られ得る鉄酸化物ナノ粒子は、疾患又は病理的状態の診断又は処置の方法において使用され、又は診断又は医薬的組成物、例えば疾患又は病理的状態の処置のため、特に、前記のナノ粒子により標的とされ得る、疾患、傷害、組織又は器官の不全などの疾患又は病理的状態の診断のための成分として使用され得る。
【００９８】
例えば、前記疾患領域又はゾーン又は障害のゾーンが心臓欠陥系に関連する場合には、疾患状態がターゲットされ得る。又は、前記疾患領域又はゾーン又は障害のゾーンがリンパ系に関連する場合には、疾患状態がターゲットされ得る。さらに、前記疾患領域又はゾーン又は障害のゾーンが脳脊髄液系に関連する場合には、疾患状態がターゲットされ得る。さらに、ターゲットされる疾患状態、即ち本発明のナノ粒子を用いて診断され治療され得る疾患状態は、限定されるものではないが、免疫系の不全又は疾患、例えば免疫細胞増殖、分化、又は免疫細胞の可動化（走行化）を含む。また、造血細胞の疾患又は不全が含まれる。免疫不全症候群の例は、血液タンパク質障害（例えば無ガンマグロブリン血症、ガンマグロブリン異常症）、毛細血管拡張性運動失調、共通変数免疫不全、ディジョージ症候群、血小板減少症又は血色素尿症を含む。さらに、心血管系疾患、障害及び条件及び／又は心血管以上、例えば動脈−動脈瘻、動静脈瘻、脳動脈静脈奇形、先天性心疾患、肺動脈閉鎖、シミター症候群が含まれる。先天性心疾患には、大動脈縮窄、ＣＯＲトリアータム、冠状血管異常、十字形心臓、右胸心、動脈管開存症、エプスタイン奇形、アイゼンメンゲル複合体、左心低形成症候群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、二重出口右心室、三尖弁閉鎖症、動脈管遺残、及び大動脈肺動脈中隔欠損、心内膜床欠損症、ルーテムバッハ症候群、ファロー三徴、心中隔欠損症などの心臓中隔欠損が含まれる。心血管疾患、障害及び／又は症状はまた、不整脈、カルチノイド心疾患、高心拍出量、低心拍出量、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌を含む）、心臓動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、発作性呼吸困難、心臓性浮腫、心臓肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心臓破裂、心室中隔破壊、心臓弁疾患、心筋疾患、心嚢液貯留、心膜炎、心嚢内気腫、心膜切開後症候群、肺性心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充血、心血管系妊娠合併症、シミター症候群、心血管梅毒、心血管系結核、などの心疾患を含む。不整脈には、洞性不整脈、心房細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダムスストークス症候群、束枝ブロック、洞房ブロック、ＱＴ延長症候群、副収縮、ロウン−ギャノング−レビン症候群、マハイムタイプ早期興奮症候群、ウォルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不全症候群、頻脈及び心室細胞が含まれる。頻拍は、発作性頻拍、上室性頻箔、心室固有調律亢進、房室結節内リエントリー性頻拍、洞性頻拍、トルサードドポアンツ及び心室頻拍を含む。心臓弁膜症は、大動脈弁不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音、大動脈弁逸脱、三尖弁逸脱、僧帽弁閉鎖不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈閉鎖、肺動脈弁不全、肺動脈弁狭窄症、三尖弁閉鎖症、三尖弁閉鎖不全症及び三尖弁狭窄が含まれる。新筋疾患は、アルコール性心筋症、肥大型心筋症、大動脈弁下狭窄、肺動脈弁下狭窄、拘束型心筋症、シャーガス心筋症、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、カーンズ症候群、心筋再灌流障害及び心筋炎を含む。心筋虚血には、狭心症、冠動脈瘤、冠状動脈硬化症、冠状動脈血栓症、冠攣縮性狭心症、心筋梗塞及び気絶心筋などの冠状動脈性心臓病を含む。循環器疾患はまた、動脈瘤、血管形成異常、細菌性血管腫症、ヒッペルリンダウ症、クリッペル−トルナウネイ−ウェーバ症候群、スタージ−ウェーバ症候群、血管神経性浮腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルイッシュ症候群、動脈閉塞性疾患、動脈炎、後動脈炎、結節性多発動脈炎、脳血管疾患、障害及び症状、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、閉塞症、血栓症、肢端紅痛症、痔、肝静脈閉塞性疾患、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞性疾患、レイノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞症、シミター症候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、アタシア毛細血管拡張症、遺伝性出血性毛細血管拡張症、精索静脈瘤、静脈瘤、血管炎及び静脈不全などの血管疾患を含む。動脈瘤は、解剖動脈瘤、偽動脈瘤、感染動脈瘤、破裂脳動脈瘤、大動脈瘤、脳動脈瘤、冠動脈瘤、心臓動脈瘤及び腸骨動脈瘤を含む。動脈閉塞性疾患は、動脈硬化、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性異形成、腸間膜血管閉塞、もやもや病、網膜動脈閉塞及び閉塞性血栓血管炎を含む。脳血管疾患、障害及び症状は、頸動脈疾患、脳アミロイドアンギオパチー、脳動脈瘤、脳無酸素症、脳動脈硬化症、脳動静脈奇形、脳動脈疾患、脳塞栓症及び血栓症、頸動脈血栓症、静脈洞血栓症、バレンベリー症候群、脳出血、硬膜外血腫、硬膜下血腫、サブアラキシノイド出血、脳梗塞、脳虚血（一時含む）、鎖骨下動脈スチール症候群、血管性頭痛、片頭痛及び椎骨脳底動脈循環不全を含む。さらに、アジソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、関節リューマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスツール症候群、グレーブス病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、眼炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多重内分泌障害、紫斑病、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫肺の炎症、ギラン・バレー候群、インスリン依存性糖尿病、自己免疫性炎症性眼疾患などの自己免疫疾患が含まれる。加えて、喘息（特にアレルギー性喘息）又はその他の呼吸系障害などのアレルギー性反応及び症状が含まれ：同じく、過剰増殖性疾患であって新生物、癌又は腫瘍、例えば、腹部、骨、乳房、消化器系、神経系（中枢及び末梢）、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部及び尿生殖路に存在する新生物、癌又は腫瘍が含まれる。さらに、過剰増殖性疾患の例は、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖性疾患、異常蛋白血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンストロンマクログロブリン血症症、組織球症及びその他の前記器官に存在する全ての過剰増殖性疾患が含まれる。さらに、神経変性疾患の状態、行動障害又は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脳炎、脱髄疾患、末梢神経障害、外傷、先天奇形、脊髄損傷、虚血、動脈瘤や出血を含む炎症状態が含まれる。
【００９９】
本発明のさらなる実施態様では、前記の方法又はその変法により得られ得る又は得られた鉄酸化物ナノ粒子は、輸送目的で、例えば医薬と組み合わせて使用され得る。
【０１００】
例としてそのような医薬は、人又は動物の体内の特定の位置で放出され得る。
【０１０１】
次の例及び図は、説明のために与えられる。理解されるべきことは、例及び図は、なんら限定的に解釈されるべきではない、ということである。当業者は、ここで示された原理のさらなる変更を含めることは明らかである。
【実施例】
【０１０２】
実施例１
第１の合成ブロックで、ＦｅＯ（ＯＨ）（２００ｍｇ、２．２５ｍｍｏｌ）、オレイン酸（ＨＯＡ）（２．５４ｇ、９．０ｍｍｏｌ）及びイコサン（１．２ｇ）を３つ口フラスコ（５０ｍｌ）に入れた。フラスコを加熱マントルに入れ、フラスコに撹拌器、熱電対に接続された温度センサ、及びバブル計を含むリフラックスコンデンサーを装着した。熱電対は、２時間で３．３℃／分の加熱速度で３６０℃へ設定された。分解の間、反応混合物の色は赤茶色から黒色に変わり、鉄酸化物ナノ粒子の形成を示した。フラスコを５０℃へ冷却した。ヘキサン（１０ｍｌ）を添加し、混合物を遠心分離用フラスコに移した。ナノ粒子はアセトン（２０ｍｌ）を添加することでヘキサン溶液から沈殿した。フラスコを３０分間、４９００ｒｐｍ（４６７１ｒｃｆ）で遠心した。黒い上澄みを捨てて、残ったナノ粒子をヘキサン（５ｍｌ）に再分散させ、アセトン（１０ｍｌ）で沈殿させた。この洗浄手順をさらに１回繰り返した。得られた精製ナノ粒子は１０ｍｌヘキサンに再分散させ貯蔵した（得られたサンプルはサンプル１．１とする）。
【０１０３】
第２の合成ブロックで、前記第１の合成ブロックで得たナノ粒子溶液を１０ｍｌのヘキサンで希釈した（溶液Ａ）。ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７（１．０９ｇ）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、２ｍｌ）内に溶解した（溶液Ｂ）。溶液Ａ（１．５ｍｌ）と溶液Ｂ（１．５ｍｌ）を混合し、広口ビーカー内に撹拌し、溶媒を蒸発させた。４３時間後、均一な、黒色水溶性ＰＢＳ溶液が得られた；実質的に全てのヘキサンは蒸発した。この溶液は少なくとも４週間は安定で、沈殿は観察されなかった（得られたサンプルをサンプル１．２とする）。
【０１０４】
得られた緩衝液の全鉄濃度は、プルシアンブルー系比色分析により、３．３３ｍｇ（Ｆｅ）／ｇと決定された。
【０１０５】
実施例２
第１の合成ブロックで、ロックで、ＦｅＯ（ＯＨ）（２００ｍｇ、２．２５ｍｍｏｌ）、オレイン酸（ＨＯＡ）（２．５４ｇ、９．０ｍｍｏｌ）及びイコサン（１．２ｇ）を３つ口フラスコ（５０ｍｌ）に入れた。フラスコを加熱マントルに入れ、フラスコに撹拌器、熱電対に接続された温度センサ、及びバブル計を含むリフラックスコンデンサーを装着した。熱電対は、２時間で３．３℃／分の加熱速度で３６０℃へ設定された。分解の間、反応混合物の色は赤茶色から黒色に変わり、鉄酸化物ナノ粒子の形成を示した。フラスコを５０℃へ冷却した。ヘキサン（１０ｍｌ）を添加し、混合物を遠心分離用フラスコに移した。ナノ粒子はアセトンを（２０ｍｌ）添加することでヘキサン溶液から沈殿した。フラスコを３０分間、４９００ｒｐｍ（４６７１ｒｃｆ）で遠心した。黒い上澄みを捨てて、残ったナノ粒子をヘキサン（５ｍｌ）に再分散させ、アセトン（１０ｍｌ）で沈殿させた。この洗浄手順をさらに１回繰り返した。得られた精製ナノ粒子は１０ｍｌヘキサンに再分散させ貯蔵した（得られたサンプルはサンプル２．１とする）。
【０１０６】
第２の合成ブロックで、前記第１の合成ブロックで得たナノ粒子溶液を１０ｍｌのヘキサンで希釈した（溶液Ａ）。ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７（０．３１ｇ）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、２０ｍｌ）内に溶解した（溶液Ｂ）。溶液Ａ（１．５ｍｌ）と溶液Ｂ（１．５ｍｌ）を混合し、広口ビーカー内に撹拌し、溶媒を蒸発させた。４３時間後、均一な、黒色水溶性ＰＢＳ溶液が得られた；実質的に全てのヘキサンは蒸発した。この溶液は少なくとも４習慣は安定で、沈殿は観察されなかった（得られたサンプルをサンプル２．２とする）。
【０１０７】
実施例３
得られたサンプルの性能を、磁気粒子スペクトル（ＭＰＳ）分析で試験した。サンプル１．１のＭＰＳ性能は、１ＭＨｚでＲｅｓｏｖｉｓｔ（Ｒ）よりも２桁程度優れており、より高い周波数ではさらに優れていた（図２参照）。サンプル２．１及び２．２は、１ＭＨｚでＲｅｓｏｖｉｓｔ（Ｒ）よりも１桁程度優れており、より高い周波数ではさらに優れていた（図２参照）。ヘキサン及び水中でのＭＰＳ、性能における差は、十分には理解されていないが、前記ナノ粒子を親水性化するための人ユナ化学修飾の結果であると考えられる。
【０１０８】
実施例４
第１の合成ブロックで、ＦｅＯ（ＯＨ）、オレイン酸及びイコサン（１．２ｇ）を３つ口フラスコ（５０ｍｌ）に入れた。ＦｅＯ（ＯＨ）及びオレイン酸の使用された量及び各成分の量論比は以下の表１に与えられる。フラスコを加熱マントルに入れ、フラスコに撹拌器、熱電対に接続された温度センサ、及びバブル計を含むリフラックスコンデンサーを装着した。熱電対は、２時間で３．３℃／分の加熱速度で３６０℃へ設定された。分解の間、反応混合物の色は赤茶色から黒色に変わり、鉄酸化物ナノ粒子の形成を示した。フラスコを５０℃へ冷却した。ヘキサン（１０ｍｌ）を添加し、混合物を遠心分離用フラスコに移した。ナノ粒子はアセトン（２０ｍｌ）を添加することでヘキサン溶液から沈殿した。フラスコを３０分間、４９００ｒｐｍ（４６７１ｒｃｆ）で遠心した。黒い上澄みを捨てて、残ったナノ粒子をヘキサン（５ｍｌ）に再分散させ、アセトン（１０ｍｌ）で沈殿させた。この洗浄手順をさらに１回繰り返した。得られた精製ナノ粒子は１０ｍｌヘキサンに再分散させ貯蔵した（得られたサンプルはサンプルＡからＨとする）。
【０１０９】
得られたサンプルの性能を、磁気粒子スペクトル（ＭＰＳ）分析で試験した。全てのサンプル分析をこれらのヘキサン溶液で実施した。
【０１１０】
表１：実施例４の異なる実験における反応混合物の組成とサンプルＡからＧ。
【０１１１】
【表１】
2013529677.tif 000003
反応条件の変更：
サンプルＡ、Ｂ、Ｃ及びＦは、ＦｅＯ（ＯＨ）：ＨＯＡの比が増加すると高周波数でＭＰＳ信号の増加を示した（図３Ａ、Ｂ、Ｃ及びＦ参照）。サンプルＤ、Ｅ及びＧは、ＦｅＯ（ＯＨ）及びＨＯＡの相対濃度に加えてまた、それらの絶対濃度も重要であり、最適範囲がサンプルＡ、Ｂ、Ｃ及びＦで説明される、ということを示す。さらに、サンプルＧは反応時間の重要性を示す。これらの説明された条件下で、反応を２時間行うことが、反応を６時間行うよりもよい結果を与えた。
【０１１２】
透過電子顕微鏡：
ＴＥＭ分析をサンプルＡ、ＢおよびＣについて行った。図４から分かるように、ＭＰＳ信号はサンプルＡ（図４Ａ）からサンプルＢ（図４Ｂ）へ改善された。しかしこれらのＴＥＭイメージは、ナノ粒子の形態について有意な差を示していない。サンプルＡ及びＢ共に、単分散粒子を含み、類似する平均直径１６．３±１．７ｎｍ（サンプルＡ）及び１６．７±１．１ｎｍ（サンプルＢ）であった。ここで最も高いＭＰＳ信号を示したサンプルＣ（図４Ｃ参照）について、多面的コアを持つ粒子であることが見出された（図４Ｄ）。さらにこのサンプルはサンプルＡ及びＢよりも広いサイズ分布（平均直径１８．０±３．５ｎｍ）を示した。従って、この非単分散サンプルを分画することでさらに改良されたＭＰＳ性能が予測される。
【０１１３】
Ｘ線回折（ＸＲＤ）：
ＸＲＤは鉄酸化物粒子の結晶構造を分析するための非常に高感度の技術であり、鉄酸化物材料の異なるタイプを識別するための有力な手段である。サンプルＡ、Ｂ、ＣのＸＲＤを測定し、得られたスペクトルを理論的回折パターンと比較し、又Ｆｅ３Ｏ４参照サンプルと比較した（図５）。この分析により、全ての試験サンプル（Ａ、Ｂ及びＣ）は、主にＦｅ３Ｏ４鉄酸化物コアを含むことが同定された。
【０１１４】
振動スキャン磁化測定（ＶＳＭ）
前記ナノ粒子トレーサー材料の磁化曲線の高非線型性が優れたＭＰＳ性能にとって本質的である。サンプルＣの振動スキャン磁化分析の結果は図６に示される。図６から分かるように、前記サンプルは、非常に鋭い磁化曲線を示し、また１０７ｅｍｕ／ｇの高い飽和磁化を示し、これは磁気コアがＦｅ３Ｏ４として整合する。
【図１】
2013529677.tif 000004
【図２】
2013529677.tif 000005
【図３Ａ】
2013529677.tif 000006
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2013529677.tif 000009
【図３Ｅ】
2013529677.tif 000010
【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
2013529677.tif 000012
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2013529677.tif 000014
【図４Ｃ】
2013529677.tif 000015
【図４Ｄ】
2013529677.tif 000016
【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年1月7日(2013.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄酸化物ナノ粒子を形成する方法であり、前記方法は次のステップ：
（ａ）鉄酸化物／水酸化物及びオレイン酸又はその誘導体を第１の有機溶媒中に懸濁させるステップ；
（ｂ）前記懸濁物の温度を、所定の速度で、最大３４０℃から５００℃まで上げるステップ；
（ｃ）前記懸濁物をステップ（ｂ）の最大温度で約０．５から６時間熟成するステップ；  
（ｄ）前記懸濁物を冷却するステップ；
（ｅ）第２の有機溶媒を添加するステップ；
（ｆ）非溶媒を添加してナノ粒子を沈殿させて過剰の溶媒を除去するステップ；
（ｇ）前記第２の有機溶媒中に前記ナノ粒子を分散させるステップ；
（ｈ）ステップ（ｇ）の分散物とポリマー溶液、又はクエン酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸及び／又はそれらの塩、デキストラン、カルボデキストラン、ポリオキシエチレン系ポリマー又はコポリマー、又はそれらの組み合わせなどの、親水性又は両親媒性安定化剤と混合するステップ；及び
（ｉ）場合により、前記第２の有機溶媒を除去するステップを含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であり、前記鉄酸化物／水酸化物が、鉄（ＩＩＩ）酸化物／水酸化物、鉄（ＩＩ）酸化物／水酸化物又は鉄（ＩＩＩ）及び鉄（ＩＩ）酸化物の混合物／水酸化物である、方法。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法であり、前記オレイン酸の誘導体が、オレイン酸アンモニウム、オレイン酸リチウム、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸マグネシウム、オレイン酸カルシウム、オレイン酸アルミニウム又はオレイン酸鉄である、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であり、前記オレイン酸アンモニウムが、式Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ＋を持つオレイン酸アルキルアンモニウムであり、ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が、アルキル、アリール又はシリル基であるか、又は水素である、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であり、前記オレイン酸アルキルアンモニウムが、オレイン酸テトラメチルアンモニウム、オレイン酸テトラエチルアンモニウム、オレイン酸テトラプロピルアンモニウム、オレイン酸テトラブチルアンモニウム又はオレイン酸ベンジルアンモニウムである、方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法であり、前記第１の有機溶媒が式ＣｎＨ２ｎ＋ｍで表されるアルカン溶媒であり、ここで１５≦ｎ≦３０及び−２≦ｍ≦２であり；及び／又は前記非溶媒が、アセトン、ブタノン、ペンタノン、イソブチルメチルケトン、ジエチルエーテル、メチルプロピルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル又はエチルシリルエーテルであり；及び／又は前記第２の溶媒が、ペンタン、イソペンタン、ネオペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロメタン又はジクロロエタンである、方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法であり、前記ステップ（ｂ）の温度増加の速度が、１分間に約１℃と１０℃の間の温度の増加である、方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法であり、ステップ（ｂ）の最大温度は、３４０℃から４００℃であり、及び／又は前記冷却ステップ（ｄ）での懸濁物の温度は、約４０℃から９０℃へ下げられる、方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法であり、前記熟成ステップ（ｃ）は約１から５時間実施される、方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法であり、前記ポリマーの溶液が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び／又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む親水性生物適合性コポリマーの本質的な水溶性緩衝液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む両親媒性リン脂質の本質的な水溶液、又は両親媒性ブロックコポリマー本質的な干渉水溶液である、方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法であり、前記除去ステップ（ｉ）が、本質的に非閉鎖システムで混合物を撹拌することで実施され、それにより前記第２の有機溶媒が、親水性ナノ粒子の水溶液が得られるまで蒸発させることができる、方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法であり、次の１又はそれ以上の追加のステップ、
（ｊ）ステップ（ｉ）で得られ得るナノ粒子又はナノ粒子溶液を精製するステップ；
（ｋ）ステップ（ｉ）又は（ｋ）で得られ得るナノ粒子又はナノ粒子溶液を酸化剤又は還元剤で処理するステップ；
（ｌ）ステップ（ｉ）、（ｊ）又は（ｋ）で得られ得るナノ粒子の表面を、前記ポリマー又は安定化剤コーティングを除去、置換又は変更することで変性するステップ；
（ｍ）ステップ（ｉ）から（ｌ）で得られ得るナノ粒子を、ミセル、リポソーム、ポリマーソーム、血液細胞、ポリマーカプセル、デンドリマー、ポリマー又はヒドロゲルなどのキャリアでカプセル化又はクラスタ化するステップ；及び
（ｎ）ステップ（ｉ）から（ｍ）で得られ得るナノ粒子を、ターゲットリガンドで修飾する、ステップが実施される、方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法で得られ得る鉄酸化物ナノ粒子。
【請求項１４】
請求項１３の前記鉄酸化物ナノ粒子又は請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法で得られ得る鉄酸化物ナノ粒子の、磁気粒子イメージング（ＭＰＩ）又は磁気粒子スペクトル（ＭＰＳ）のためのトレーサーとしての使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
理解されるべきことは、用語「含む」は限定的な意味ではない、ということである。
本発明において、用語「からなる」は、用語「含む」の一つの好ましい実施態様と考えられる。以下、群が少なくともある数の実施態様を含むとして定義される場合に、これはまた、好ましくはこれらの実施態様のみからなる群を又含むことを意味する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
用語「第１の」、「第２の」、「第３の」又は「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」等は、方法又は使用のステップに関係するが、これらのステップの間の時間又は時間間隔の整合性はなくてもよく、即ち、以上又は以下で記載される適用において指示されていない限り、ステップは、同時に実施されてもよく、又はステップの間に秒、分、時間、日の間隔があってもよい。
【国際調査報告】
2013529677.tif 000021
2013529677.tif 000022