(57)【要約】  本発明は、真核細胞のゲノム中の標的配列を改変する方法に関し、該方法は、(a) 該細胞に、Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質、または該融合タンパク質を発現可能な形態でコードする核酸分子を導入する工程を含み、該融合タンパク質は、標的配列中に特異的に結合し、該標的配列中に二本鎖切断を導入する。本発明はさらに、標的配列の改変が、ドナー核酸配列との相同組換えによるものである本発明の方法に関し、(b) 核酸分子を細胞に導入する工程をさらに含み、該核酸分子は、ドナー核酸配列および標的配列に相同な領域を含む。本発明はまた、ゲノム中に改変された標的配列を有する非ヒト哺乳動物または非ヒト脊椎動物を作製する方法に関する。さらに、本発明は、Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞のゲノムにおいて標的配列を改変する方法であって、
(a)  該細胞に、Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質、または該融合タンパク質を発現可能な形態でコードする核酸分子を導入する工程を含み、
該制限ヌクレアーゼがFokIであり、該融合タンパク質が、標的配列中に特異的に結合し、かつ該標的配列中に二本鎖切断を導入する、方法。
【請求項２】
(b)  該細胞に核酸分子を導入する工程をさらに含む方法であって、
標的配列の改変が、ドナー核酸配列との相同組換えによるものであり、
該核酸分子が、ドナー核酸配列および標的配列に相同な領域を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該細胞が、哺乳動物細胞または脊椎動物細胞、植物細胞または真菌細胞からなる群より選択される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該細胞が卵母細胞である、請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
融合タンパク質または該融合タンパク質をコードする核酸分子が、マイクロインジェクションにより細胞に導入される、請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
(b)の核酸分子が、マイクロインジェクションにより細胞に導入される、請求項２〜４いずれか記載の方法。
【請求項７】
該融合タンパク質を発現可能な形態でコードする核酸分子がmRNAである、請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
標的配列に相同な領域が、ドナー核酸配列の5'末端および3'末端に位置する、請求項２〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
(b)の核酸分子に含まれる標的配列に相同な領域が、少なくとも400bpの長さを有する、請求項２〜８いずれか記載の方法。
【請求項１０】
標的配列の改変が、標的配列の少なくとも1つのヌクレオチドの置換、挿入および欠失からなる群より選択される、請求項１〜９いずれか記載の方法。
【請求項１１】
該細胞が、げっ歯類、イヌ、ネコ、霊長類、ウサギ、ブタもしくはウシからなる群より選択される哺乳動物由来のものであるか、または該細胞が、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、アヒル、ガン、ウズラならびにダチョウ、エミューおよびヒクイドリなどの平胸類からなる群より選択される鳥類由来のものであるか、または該細胞が、ゼブラフィッシュ由来のものである、請求項１〜１０いずれか記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１いずれか記載の方法により作製された細胞を偽妊娠メス宿主に移す工程を含む、ゲノム中に改変された標的配列を有する非ヒト脊椎動物または非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項１３】
偽妊娠メス宿主に移す前に、着床前胚を形成するように該細胞を培養するか、または該細胞を胚盤胞に導入する工程をさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
非ヒト哺乳動物が、げっ歯類、イヌ、ネコ、霊長類、ウサギ、ブタおよびウシからなる群より選択されるか、または非ヒト脊椎動物が、魚類および鳥類からなる群より選択される、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質であって、該制限ヌクレアーゼがFokIである、融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞のゲノムにおいて標的配列を改変する方法に関し、該方法は：(a) 該細胞に、Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質、または該融合タンパク質を発現可能な形態でコードする核酸を導入する工程を含み、ここで該融合タンパク質は、標的配列内に特異的に結合して標的配列内に二本鎖切断(break)を導入する。本発明はさらに、標的配列の改変が、ドナー核酸配列との相同組換えによる本発明の方法に関し、該方法は、(b) 該細胞に核酸分子を導入する工程をさらに含み、ここで該核酸分子は、ドナー核酸配列および標的配列に相同な領域を含む。本発明はまた、ゲノム中に改変された標的配列を保有する非ヒト哺乳動物または非ヒト脊椎動物の作製方法に関する。さらに、本発明は、Talエフェクタータンパク質および制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質に関する。
【０００２】
本明細書において、特許出願および製造業者のマニュアルを含む多くの書類が引用される。これらの書類の開示は、本発明の特許性に関連するものとはみなされないが、その全体において参照により本明細書に援用される。より具体的に、全ての参照される書類は、それぞれの個々の書類が具体的に個々に参照により援用されることが示されるのと同程度に、参照により援用される。
【背景技術】
【０００３】
ヒト、マウスおよび他の哺乳動物のゲノム配列を完全に解明することの主な目的は、ゲノム中の全ての遺伝子の機能的特徴付けならびに遺伝子産物およびそれらの分子相互作用ネットワークの同定にある。標的化され、予め設計されたマウス変異体の作製を可能にする方法が利用可能であるので、過去二十年間に、マウスは、ヒトの生物学および疾患を研究するための主要な哺乳動物遺伝子モデルへと進歩した。遺伝子ターゲッティングにより生殖細胞系および条件的ノックアウトマウスの作製を可能にするこの逆遺伝学アプローチは、マウス胚性幹(ES)細胞株の使用に頼っている。ES細胞株は、マウス胚盤胞の内部細胞塊からいったん確立されると、初期の多能性分化状態を維持しながら、細胞培養物中で無限に新生し得るという特有の性質を発揮する。この特性により、ES細胞を大量に増殖させることが可能になり、ほとんどの突然変異誘発法は不充分であるので、標的遺伝子中に特異的な遺伝子改変を有する純粋な幹細胞クローンへと拡大される稀な遺伝的バリアントを選択することが可能になる。マウス胚盤胞へとES細胞を導入し、その後の胚が移動して、これらの細胞は、キメラ胚の発生の、生殖細胞系を含む全ての細胞型に寄与する。生殖細胞系キメラと正常マウスの交配により、ES細胞中でなされた遺伝的改変は、その子孫に遺伝し、マウス生殖細胞系へと伝わる。
【０００４】
マウス逆遺伝学の基礎は、最初、1980〜90年の10年間に3段階で確立され、それ以降の基本スキームは、本質的に変化していない。これらの段階の第1は、培養マウス胚盤胞からのES細胞株の確立およびインビトロで多能性分化状態を維持する培養条件の確立であった(Evans MJ, Kaufman MH., Nature 1981; 292:154-6; Martin GR. Proc Natl Acad Sci U S A 1981; 78:7634-8)。数年後、胚盤胞へのマイクロインジェクションの際に、ES細胞は、キメラマウス中で生殖細胞系をコロニー化し得ることがまず報告された(Bradley A, Evans M, Kaufman MH, Robertson E., Nature 1984; 309:255-6; Gossler A, Doetschman T, Korn R, Serfling E, Kemler R., Proc Natl Acad Sci U S A 1986; 83:9065-9)。第3の段階は、予め計画された不活性変異をES細胞中の標的遺伝子に、遺伝子ターゲッティングベクターと内因性遺伝子座の間の相同組換えにより導入する技術(遺伝子ターゲッティング)に関する。遺伝子ターゲッティングにより、予め設計された部位特異的改変のマウスゲノムへの導入が可能になる(Capecchi MR. Trends Genet 1989; 5:70-6)。1987年のES細胞中の相同組換えの最初の実例(Thomas KR, Capecchi MR., Cell 1987; 51:503-12)および1989年の最初のノックアウトマウス系統の確立(Schwartzberg PL, Goff SP, Robertson EJ., Science 1989; 246:799-803)以来、遺伝子ターゲッティングは、多くの他の遺伝子に適用され、3000を超えるノックアウトマウス系統を作製するために、最近10年間に使用され、インビボでの遺伝子機能についての情報の富を提供してきた(Collins FS, Rossant J, Wurst W., Cell 2007; 128:9-13; Capecchi, M. R., Nat Rev Genet 2005; 6: 507-12)。
【０００５】
ES細胞中の標的化された遺伝子不活性化は、選択可能なマーカー(主として、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、neo)を標的遺伝子のエクソンに挿入することまたは1つ以上のエクソンの置き換えにより達され得る。最初、変異対立遺伝子は、特異的に設計された遺伝子ターゲッティングベクター中で、選択可能マーカーが、相同組換えを開始するための相同領域として機能する標的遺伝子のゲノムセグメントの両端に並ぶように集合する。相同組換えの頻度は、これらの相同アームの長さに伴って増加する。通常、合わせて10〜15kbの長さを有するアームは、20kbまでの外来遺伝子を収容する標準的な高コピープラスミドベクター中にクローニングされる。ランダムベクター組み込みを選択するために、負の選択マーカー、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼまたはジフテリア毒素遺伝子が、ターゲッティングベクターの一方の端に含まれ得る。ES細胞へのかかるベクターのエレクトロポレーションおよび適切な組込み物の選択の際に、相同組換え事象を起こしたクローンは、PCRまたはサザンブロット戦略を使用したゲノムDNAの分析により同定され得る。かかる標準的な遺伝子ターゲッティングベクターを使用して、相同組換えES細胞クローンが得られる効率は、安定な形質転換された(Neo耐性)ES細胞クローンの数に対して、0.1%〜10%の範囲である。この割合は、ベクター相同領域の長さ、この領域とES細胞のゲノムDNAとの配列同一性の程度、およびありそうなことに、個々のゲノム遺伝子座の相同組換えに対する差異的な接触しやすさに依存する。最適な割合は、より長い相同領域で、かつES細胞株のゲノムに対して配列同一性を有するゲノム断片(すなわち、両方が同遺伝子型であり、同型マウス系統由来であるべきである)を使用して達成される(te Riele H, Maandag ER, Berns A. 1992. Proc Natl Acad Sci U S A 89:5128-5132)。エレクトロポレーションによるES細胞の安定なトランスフェクションの頻度は約10-4である(すなわち、10,000個のエレクトロポレーションされた細胞から1つのNeo耐性クローン(cone))ので、相同組換えES細胞が得られる絶対的な効率は、10-5〜10-7の範囲にある(Cheah SS, Behringer RR., Methods Mol Biol 2000; 136: 455-63; DeChiara TM.; Methods Mol Biol 2001; 158: 19-45; Hasty P, Abuin A, Bradley A., 2000, In Gene Targeting: a practical approach, ed. AL Joyner, pp. 1-35. Oxford: Oxford UniversityPress; Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003. Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press)。
【０００６】
組み換えES細胞クローンの単離の際に、改変されたES細胞を胚盤胞に注入し、キメラの生殖細胞系を介して変異対立遺伝子を遺伝させ、変異系統を確立する。ヘテロ変異体の同系交配により、ホモ接合体を得て、これを表現型解析に使用し得る。
【０００７】
上述の「古典的な」遺伝子ターゲッティングアプローチを使用して、発生を通じて全ての細胞中にノックアウト変異を有する生殖細胞系変異体を得る。この戦略により、個体発生中の遺伝子の最初の基本的な機能を同定する。遺伝子産物が発生に重要な役割を果たす場合、その不活性化により、胚性致死が引き起こされ得、成体マウスにおけるさらなる分析が妨げられる。一般的に、全てのノックアウトマウス系統中約30%が胚性致死表現型を示し、特定の遺伝子の分類、例えば脈管形成を制御するものについては、この割合は100%に達し得る。胚性致死を回避するため、および特定の細胞型のみにおける遺伝子機能を研究するため、Guら(Gu H, Marth JD, Orban PC, Mossmann H, Rajewsky K., Science 1994; 265:103-6)は、遺伝子不活性化を特定の細胞型または発生段階に限定することを可能にする、改変された条件的遺伝子ターゲッティングスキームを導入した。条件的変異において、組換えによりloxPに続くエクソンの欠失が生じるように、部位特異的DNAリコンビナーゼCreの2つの34bp認識(loxP)部位を標的遺伝子のイントロンに挿入することにより、遺伝子不活性化は達成される。条件的変異はまず、2つのマウス系統の作製を要し、ES細胞における遺伝子ターゲッティングによりloxPがつながれた遺伝子断片を有する1つの系統が得られ、第2のトランスジェニック系統は、1つまたは複数の細胞型でCreリコンビナーゼを発現する。条件的な変異体は、Creトランスジェニック系統におけるリコンビナーゼ発現パターンに従って、標的遺伝子不活性化が空間的および時間的に限定された様式で起こるように、これら2つの系統を掛け合わせることにより作製される(Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse Embryo, third edition ed. Cold Spring Harbour,  New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press; Torres RM, Kuehn R. 1997. Laboratory protocols for conditional gene targeting. Oxford: Oxford University Press)。条件的変異体を使用して、ヌル対立遺伝子がしばしば胚性または新生児性致死表現型を生じるために生殖細胞系変異体を用いては解決できなかった種々の生物学的な疑問が取り組まれている。
【０００８】
まとめると、ES細胞における遺伝子ターゲッティングは、遺伝学的モデル系としてマウスを使用した哺乳動物遺伝子機能のインビボ解析を進歩させた。しかしながら、遺伝的に改変され得る生殖細胞系のコンピテントなES細胞系は、マウスのみから確立され得たので、この逆遺伝学アプローチは、現在、げっ歯類種に限定されている。ブタおよびヒツジ由来の初代細胞における相同組換え、その後の組換え体細胞由来の核の除核卵母細胞への移植(クローニング)により、この規則の例外が達成される(Lai L, Prather RS. 2003. Reprod Biol Endocrinol 2003; 1:82; Gong M, Rong YS. 2003. Curr Opin Genet Dev 13:215-220)。この方法は効率的でなく時間かかかるので、簡単で常套的な手順に発展する可能性はない。
【０００９】
ES細胞におけるゲノムエンジニアリングによる標的化されたマウス変異体の作製および生殖細胞系遺伝キメラの誘導は、常套的な手順として確立されるが、このアプローチは典型的に、ベクター構築、ES細胞の培養および選択ならびにキメラの交配に1〜2年の作業を要する。遺伝子ターゲッティング計画の際に生じる典型的な問題は、ES細胞中での相同組換えの効率が低いことと、長期間のインビトロ培養および選択段階でのES細胞の生殖細胞系受容能の消失にある。したがって、わずか1系統のノックアウトマウスを成功裡に作製するのに、かなりの時間、分子生物学、ES細胞培養および胚操作の専門家の複合的な努力、ならびにそれに伴う技術的な基盤が必要である。
【００１０】
モデル系における実験により、遺伝子ターゲッティングベクターの相同組換えの頻度は、染色体標的配列中に二本鎖切断を誘導した場合、大きく増加することが示されている。18塩基対長認識部位でDNAを切断する酵母ホーミングエンドヌクレアーゼI-SceIを使用して、標的遺伝子中に認識部位が挿入され、これらの細胞中でI-SceIが発現される場合に、相同組換えおよび遺伝子ターゲッティングが、哺乳動物細胞において1000倍以上に刺激されることが最初に示された(Rouet, P., Smih, F., Jasin, M.; Mol Cell Biol 1994; 14: 8096-8106; Rouet, P., Smih, F.  Jasin, M.; Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 6064-6068)。相同性による(homology directed)修復のための遺伝子ターゲッティングベクターの非存在下で、細胞は、非相同末端結合(non-homologous end-joining)（NHEJ）により、高頻度で二本鎖切断を閉じる。この機構は間違いを起こし易いので、切断部位で多数のヌクレオチドの欠失または挿入が高頻度で生じる。切断部位が遺伝子のコーディング領域中に位置する場合、突然変異誘発集団由来のリーディングフレームシフト変異を生じる変異および標的遺伝子の非機能的ノックアウト対立遺伝子を示す変異を同定および選択しやすくなる。
【００１１】
過去には、人工的なヌクレアーゼ認識部位を導入する必要なく、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)が、内因性遺伝子の配列に二本鎖切断の刺激力(stimulatory power)をかける方法として開発された。相同性による修復のための遺伝子ターゲッティングベクターの非存在下でジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、哺乳動物細胞株中にノックアウト対立遺伝子を作製し、一細胞胚におけるZFN mRNAの発現の際にノックアウトゼブラフィッシュおよびラットを得た(Santiago Y, Chan E, Liu PQ, Orlando S, Zhang L, Urnov FD, Holmes MC, Guschin D, Waite A, Miller JC, Rebar EJ, Gregory PD, Klug A, Collingwood TN.; Proc  Natl Acad Sci U S A 2008; 105:5809-5814; Doyon Y, McCammon JM, Miller JC, Faraji F, Ngo C, Katibah GE, Amora R, Hocking TD, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD, Amacher SL.; Nat Biotechnol 2008; 26:702-708; Geurts AM, Cost GJ, Freyvert Y, Zeitler B, Miller JC, Choi VM, Jenkins SS, Wood A, Cui X, Meng X, Vincent A, Lam S, Michalkiewicz M, Schilling R, Foeckler J, Kalloway S, Weiler H, Menoret S, Anegon I, Davis GD, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD, Jacob HJ, Buelow R.; Science 2009;  325:433)。
【００１２】
さらに、遺伝子変換による二本鎖切断の相同性由来修復のために標的遺伝子に対する相同性領域を含む外因性の遺伝子ターゲッティングベクターの存在下で、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した。この方法は、哺乳動物細胞株における遺伝子エンジニアリングおよび初代ヒト細胞における遺伝子修正に適用されている(Urnov FD, Miller JC, Lee YL, Beausejour CM, Rock JM, Augustus S, Jamieson AC, Porteus MH, Gregory PD, Holmes MC.; Nature 2005; 435:646-651; Porteus MH, Baltimore D. 2003. Science 300:763; Hockemeyer D, Soldner F, Beard C, Gao Q, Mitalipova M, DeKelver RC, Katibah GE, Amora R, Boydston EA, Zeitler B, Meng X, Miller JC, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD, Jaenisch R.; Nat Biotechnol 2009; 27:851-857)。
【００１３】
ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用により高頻度の相同組換えが生じるが、新規のDNA標的配列に高い効率で結合するジンクフィンガータンパク質を設計するにはかなりの努力と時間が必要である。また、現在利用可能な資源を使用して、哺乳動物ゲノム中の1000塩基対の標的領域中にわずか1つのジンクフィンガーヌクレアーゼを見出し得たことが理解されている(Maeder, et al. 2008 Mol Cell 31(2): 294-301; Maeder, et al. 2009 Nat Protoc 4(10): 1471-501)。
【００１４】
したがって、本発明の技術的な課題は、例えば哺乳動物細胞または脊椎動物細胞などの真核細胞のゲノムを改変するための向上された手段および方法を提供することである。
【００１５】
この技術的課題の解決は、特許請求の範囲に特徴付けられる態様を提供することにより達成される。
【発明の概要】
【００１６】
したがって、本発明は、真核細胞のゲノム中の標的配列を改変する方法に関し、該方法は、(a) 該細胞に、Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質または該融合タンパク質を発現可能な形態でコードする核酸分子を導入する工程を含み、該融合タンパク質は、標的配列中に特異的に結合し、標的配列中に二本鎖切断を導入する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
用語「改変」は、本発明により使用する場合、ヌクレオチド配列中に変化をもたらす部位特異的なゲノム操作のことをいう。ヌクレオチド配列中にこれらの変化を含む遺伝的物質は、本明細書において「改変された標的配列」とも称される。用語「改変」としては、限定されないが、標的配列中の1つ以上のヌクレオチドの置換、挿入および欠失が挙げられる。
【００１８】
本明細書で使用する場合、用語「置換」は、他のヌクレオチドによるヌクレオチドの置き換えのことをいう。該用語は、例えば、点変異を生じる単一のヌクレオチドの置き換えを含む。前記点変異は、得られたタンパク質産物中にアミノ酸交換を引き起こし得るが、アミノ酸レベルでは反映されないこともある。用語「置換」には、例えば遺伝子の一部、エクソンまたはイントロンの一部など多数のヌクレオチドの置き換えならびに遺伝子全体の置き換えを生じる変異も包含される。
【００１９】
本発明に従って、用語「挿入」は、核酸分子への1つ以上のヌクレオチドの組み込みのことをいう。エクソンまたはイントロンの一部などの遺伝子の一部の挿入、ならびに遺伝子全体の挿入も用語「挿入」に包含される。挿入されたヌクレオチドの数が3で割り切れない場合、挿入は、遺伝子のコーディング配列中にフレームシフト変異を生じ得る。かかるフレームシフト変異は、変異後の遺伝子にコードされるアミノ酸を変化させる。いくつかの場合、かかる変異は、未熟な終止コドンに出くわす活性な遺伝子の翻訳を引き起こし、翻訳の終結および切断型タンパク質の産生をもたらす。挿入されたヌクレオチドの数が3で割り切れる場合、得られた挿入は、「インフレーム挿入」である。この場合、リーディングフレームは、挿入後に無傷なまま残り、挿入されたヌクレオチドが終止コドンをコードしない場合は、翻訳は最も高い確率で完了まで進む。しかしながら、挿入されたヌクレオチドのために、完了したタンパク質は、挿入の大きさに依存して、タンパク質の機能に影響し得る1つまたは多数の新たなアミノ酸を含む。
【００２０】
本発明に従って使用する場合、用語「欠失」は、ヌクレオチド、またはエクソンもしくはイントロンなどの遺伝子の一部ならびに遺伝子全体の消失のことをいう。用語「挿入」に関して定義されるように、3で割り切れない数のヌクレオチドの欠失は、フレームシフト変異を引き起こし、欠失後に生じるコドンの全てが翻訳時に不正確に読まれ、重度に変化したおよび最も高確率には機能しないタンパク質が産生されることがある。欠失がフレームシフト変異を生じない場合、すなわち欠失したヌクレオチドの数が3で割り切れるので、得られるタンパク質は、最終的なタンパク質としては変化するが、欠失の大きさに依存して、いくつかのアミノ酸を欠き、タンパク質の機能に影響を及ぼすことがある。
【００２１】
先に定義される改変は、ゲノムのコーディング領域に限定されないが、標的ゲノムのノンコーディング領域、例えばプロモーターまたはエンハンサーエレメントなどの調節領域中またはイントロン中においても生じ得る。
【００２２】
標的ゲノムの改変の例としては、限定されないが、遺伝子機能に対する影響を解析するための野生型遺伝子への変異の導入；変異した遺伝子による遺伝子全体の置き換え、または代替的に、標的配列が変異(1つまたは複数)を含む場合、どの変異が特定の影響の原因であるかを同定するためのこれらの変異の変化；遺伝子もしくはタンパク質の全体の除去または遺伝子もしくはタンパク質からの調節領域の除去ならびに例えばhisタグもしくはtapタグ等の精製タグなどの融合パートナーの導入が挙げられる。
【００２３】
本発明によると、用語「ゲノム中の標的配列」は、本発明の方法により改変されるゲノム位置のことをいう。「ゲノム中の標的配列」は、限定されないが、特定の改変に対するヌクレオチド(1つまたは複数)対象を含む。さらに、用語「ゲノム中の標的配列」は、第2の核酸分子の相同配列の結合のための領域も含む。言い換えると、用語「ゲノム中の標的配列」は、改変される関連のあるヌクレオチド(1つまたは複数)の周囲の配列も含む。好ましくは、用語「標的配列」は、改変される遺伝子全体のことをいう。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「真核細胞」は、単核または多核真核生物の任意の細胞、例えば脊椎動物などの動物ならびに真菌および植物由来の細胞のことをいう。
【００２５】
本発明に従って使用される用語「Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質」は、DNA結合ドメインを含む融合タンパク質のことをいい、該DNA結合ドメインは、Talエフェクターモチーフおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含むか、それらからなる。本発明の方法に使用される融合タンパク質は、天然の(制限)エンドヌクレアーゼの酵素活性を維持するかまたは本質的に維持する。本発明によると、(制限)エンドヌクレアーゼ機能は、エンドヌクレアーゼ活性の生物学的活性の少なくとも60%が維持される場合に本質的に維持される。好ましくは、エンドヌクレアーゼ活性の少なくとも75%または少なくとも85%が維持される。エンドヌクレアーゼの生物学的活性の少なくとも90%、例えば少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも98%、例えば少なくとも99%が維持されることがより好ましい。生物学的活性が完全に、すなわち100%まで維持されることが最も好ましい。また、本発明によると、融合タンパク質は、内因性エンドヌクレアーゼに比べて高い生物学的活性、すなわち100%より高い活性を有する。(制限)エンドヌクレアーゼの生物学的活性を評価する方法は、当業者に周知であり、限定されないが、エンドヌクレアーゼと組換えDNAのインキュベーションおよびゲル電気泳動による反応産物の分析が挙げられる(Bloch KD.; Curr Protoc Mol Biol 2001; Chapter 3:Unit 3.2)。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「Talエフェクタータンパク質」は、タンパク質のTAL（転写アクチベーター様）ファミリーに属するタンパク質のことをいう。これらのタンパク質は、キサントモナス属の細菌性植物病原体により発現される。大きなTALエフェクターファミリーのメンバーは、キサントモナスの重要なビルレンス因子であり、真核生物転写因子を模倣することにより宿主細胞を再プログラムする。多くの細菌の病原性は、細胞プロセスを操作するための、III型分泌を介したエフェクタータンパク質の真核細胞への注入に依存する。植物病原性キサントモナス由来のTALエフェクタータンパク質は、植物細胞核内で転写アクチベーターとして機能する重要なビルレンス因子である。PthXo1、キサントモナスコメ病原体のTALエフェクタータンパク質は、コメ遺伝子Os8N3の発現を活性化し、キサントモナスにコメ植物をクローン化させる。TALエフェクタータンパク質は、タンデムリピートの中央ドメイン、すなわちDNA結合ドメインならびに核局在化シグナル(NLS)および酸性転写活性化ドメインを特徴とする。このエフェクターファミリーのメンバーは、高度に保存され、主にそのリピートのアミノ酸配列およびリピートの数が異なる。TLAエフェクタータンパク質中のリピートの数および順番により、その特異的な活性が決定される。これらのリピートは、本明細書において「TALエフェクターモチーフ」と称される。このエフェクターファミリーのある代表的なメンバーの斑点細菌病菌由来のAvrBs3は、17.5個のリピートを含み、コショウ植物のBs3耐性遺伝子を含むUPA(AvrBs3により上方制御される)遺伝子の発現を誘導する(Kay, et al. 2005 Mol Plant Microbe Interact 18(8): 838-48; Kay, S. and U. Bonas 2009 Curr Opin Microbiol 12(1): 37-43)。AvrBs3のリピートは、AvrBs3のDNA結合に必須であり、異なる型のDNA結合ドメインを提示する。配列特異的DNA認識の機構は、TALエフェクターのDNA認識コードを明らかにしたAvrBs3、Hax2、Hax3およびHax4タンパク質に関する最近の研究により解明されている(Boch, J., et al. 2009 Science 326: 1509-12)。
【００２７】
Talエフェクターモチーフまたはリピートは、32〜34アミノ酸タンパク質配列モチーフである。DNA塩基A、G、CまたはTに対する特異性を決定する2つの隣り合う高度に可変性の残基(12位および13位で)以外、該リピートのアミノ酸配列は保存されている。言い換えると、DNAへの結合は、DNA二重ヘリックスのヌクレオチドと、特定のTalエフェクタータンパク質のTalエフェクターモチーフ中の12位および13位の可変性残基との接触により媒介される(Boch, J., et al. 2009 Science 326: 1509-12)。したがって、Talエフェクタータンパク質中の連続アミノ酸リピートと標的DNA中の連続ヌクレオチドの間の1対1対応が見出された。それぞれのTalエフェクターモチーフは、主にDNA基質中の1ヌクレオチドを認識する。例えば、以下の実施例1に示すように、12位のヒスチジンと13位のアスパラギン酸の組合せは、特異的にシチジンに結合し、12位と13位の両方のアスパラギンの組合せは、特異的にグアノシンに結合し、12位のアスパラギンと13位のイソロイシンの組合せは、特異的にアデノシンに結合し、12位のアスパラギンと13位のグリシンの組合せは、特異的にチミジンに結合する。より長いDNA配列への結合は、直列のこれらのTalエフェクターモチーフのいくつかが連結して「Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメイン」を形成することにより達成される。したがって、用語「Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメイン」は、天然に存在するTalエフェクタータンパク質中に見られるDNA結合ドメインならびに以下の実施例に記載された特異的標的ヌクレオチド配列に結合するように設計されたDNA結合ドメインに関する。特異的標的配列を認識して切断するTalエフェクターモチーフ-ヌクレアーゼ融合タンパク質の作製のための、Talエフェクタータンパク質のかかるDNA結合ドメインの使用は、前記特定の標的を特異的に認識し得るTalエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインの信頼性の高い作製に依存する。Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインの作製方法は、本願に添付の実施例に開示される。
【００２８】
好ましくは、DNA結合ドメインは、天然に存在するTalエフェクタータンパク質、例えばAvrBs3、Hax2、Hax3またはHax4からなる群より選択されるTalエフェクタータンパク質中に見られるTalエフェクターモチーフに由来する(Bonas et al. 1989. Mol Gen Genet 218(1): 127-36; Kay et al. 2005 Mol Plant Microbe Interact 18(8): 838-48)。
【００２９】
好ましくは、制限ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼである。用語「エンドヌクレアーゼ」および「制限エンドヌクレアーゼ」は、本明細書において、当該技術分野により提供される周知の定義に従って使用される。よって、両方の用語は、ポリヌクレオチド鎖中のホスホジエステル結合の切断により核酸を切断し得る酵素のことをいう。好ましくは、エンドヌクレアーゼはII型S制限エンドヌクレアーゼ、例えばFokI、AlwI、SfaNI、SapI、PleI、NmeAIII、MboII、MlyI、MmeI、HpYAV、HphI、HgaI、FauI、EarI、EciI、BtgZI、CspCI、BspQI、BspMI、BsaXI、BsgI、BseI、BpuEIBmrIBcgIBbvI、BaeI、BbsIAlwIもしくはAcuIまたはIII型制限エンドヌクレアーゼ(例えば、EcoP1I、EcoP15I、HinfIII)である。また、本明細書において、メガヌクレアーゼ、例えばI-SceIも構想される。より好ましくは、エンドヌクレアーゼはFokIエンドヌクレアーゼである。FokIは、細菌性IIS型制限エンドヌクレアーゼである。これは、二本鎖DNA中の非パリンドロームペンタ-デオキシリボヌクレオチド5'-GGATG-3':5'-CATCC-3'を認識し、認識部位の9/13ヌクレオチド下流を切断する。FokIは、切断部位では、いかなる特異的配列も認識しない。一旦、DNA結合ドメイン(天然に存在するエンドヌクレアーゼFokIまたは本発明によるTalエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質のいずれか)が認識部位に固定されると、エンドヌクレアーゼドメインにシグナルが伝達され、切断が起こる。切断部位から融合タンパク質のDNA結合部位の距離は、融合タンパク質中に存在する特定のエンドヌクレアーゼに依存する。例えば、本発明の実施例で使用される融合タンパク質は、融合タンパク質の2つの結合部位に並ぶ6bp配列の中心を切断する。さらなる例として、FokIおよびEcoP15Iなどの天然に存在するエンドヌクレアーゼは、DNA結合部位からそれぞれ9/13および27bpの距離を切断する。
【００３０】
本発明によると、単一ヌクレアーゼドメインと結合するTalエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインを含む機能的モノマーとして提供される融合タンパク質が構想される。Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよびヌクレアーゼの切断ドメインは、互いに直接融合してもよいし、リンカーを介して融合してもよい。
【００３１】
本発明に従って使用される用語「リンカー」は、アミノ酸の続き(sequel)(すなわちペプチドリンカー)および非ペプチドリンカーに関連する。
【００３２】
本発明により構想されるペプチドリンカーは、少なくとも1アミノ酸長の(ポリ)ペプチドリンカーである。好ましくは、リンカーは、1〜100アミノ酸長である。より好ましくは、リンカーは、5〜50アミノ酸長であり、さらに好ましくは、リンカーは10〜20アミノ酸長である。リンカーの性質、すなわち長さおよび/またはアミノ酸配列は、分子の安定性および/または溶解度を改変し得るかまたは高め得ることが当業者に周知である。よって、リンカーの長さおよび配列は、本発明の融合タンパク質のそれぞれの部分の組成に依存する。
【００３３】
当業者は、種々のリンカーの適切性を試験する方法を知っている。例えば、分子の性質は、本発明の融合タンパク質のそれぞれの部分のヌクレアーゼ活性およびDNA結合特異性を試験することにより容易に試験され得る。
【００３４】
本発明の融合タンパク質を、発現可能な形態で該融合タンパク質をコードする核酸分子として提供する場合、リンカーは前記核酸分子によりコードされるペプチドリンカーであることが当業者に理解される。
【００３５】
本発明に従って使用される用語「非ペプチドリンカー」は、上述で定義されるペプチドリンカーを除外するが、2つ以上の反応基を有する結合基のことをいう。例えば、非ペプチドリンカーは、本発明の融合タンパク質の個々の部分の反応基に個々に結合する両端、例えばアミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基に反応基を有するポリマーであり得る。ポリマーの反応基としては、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、ケトン基、ビニルスルホン基、チオール基、ヒドラジド基、カルボニルジイミダゾール(CDI)基、炭酸ニトロフェニル(NPC)基、トリシレート基、イソシアネート基、およびスクシンイミド誘導体が挙げられる。スクシンイミド誘導体の例としては、プロピオン酸スクシンイミジル(SPA)、ブタン酸スクシンイミジル(SBA)、スクシンイミジルカルボキシメチレート(SCM)、スクシンイミジルスクシンアミド(SSA)、コハク酸スクシンイミジル(SS)、炭酸スクシンイミジルおよびN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)が挙げられる。非ペプチドポリマーの両端の反応基は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、非ペプチドポリマーは、一方の端にマレイミド基を有し、もう一方の端にアルデヒド基を有し得る。
【００３６】
好ましい態様において、リンカーはペプチドリンカーである。
【００３７】
より好ましくは、ペプチドリンカーは7個のグリシン残基からなる。
【００３８】
理論に限定されることを望まないが、本発明者らは、本発明の融合タンパク質による二本鎖切断の機構には、DNA基質を切断するために、ヌクレアーゼドメインの二量体化が必要であると考える。よって、好ましい態様において、工程(a)において少なくとも2つの融合タンパク質が細胞内に導入される。融合タンパク質の二量体化は、1種類のみの融合タンパク質が存在する場合にホモダイマーの形成をもたらし得、異なる種類の融合タンパク質が存在する場合にヘテロダイマーの形成をもたらし得る。本発明によると、Talエフェクタータンパク質の異なるDNA結合ドメインを有する少なくとも2つの異なる種類の融合タンパク質が細胞に導入されることが好ましい。少なくとも2種類の異なる融合タンパク質は、別々にまたは一緒に細胞に導入され得る。本明細書において、細胞への導入前に、同一または異なる融合タンパク質の2つのサブユニットの結合による機能的ダイマーとして提供される融合タンパク質も構想される。適切なリンカーは、上述で定義される。
【００３９】
用語「発現可能な形態で融合タンパク質をコードする核酸分子」は、細胞または細胞非含有系での発現の際に、機能的融合タンパク質を生じる核酸分子のことをいう。本明細書を通じて使用される場合、核酸分子および核酸配列は、DNA、例えばcDNAまたはゲノムDNAおよびRNAを含む。好ましくは、「RNA」に言及する態様はmRNAに関する。さらに、RNAウイルスのRNAの場合などのゲノムRNAが含まれる。
【００４０】
遺伝的コードの縮重のために、1種類より多くの核酸分子が本発明による融合タンパク質をコードし得ることを当業者は容易に理解する。3つ組コードが20種類のアミノ酸および終止コドンを指定するために縮重が生じる。遺伝的情報をコードするために利用される4つの塩基が存在するので、少なくとも21個の異なるコードを生成するために3つ組コドンが必要である。3つ組中の塩基について起こり得る43の可能性は、64個の可能性のあるコドンを生じ、いくつかの縮重が存在しなければならないことを意味する。結果的に、1つより多くから6個までの3つ組によりいくつかのアミノ酸がコードされる。縮重は、主に3つ組中の3番目の位置の変化により生じる。これは、同じ融合タンパク質をコードしているが異なる配列を有する核酸分子が本発明により使用され得ることを意味する。
【００４１】
本発明によると、用語「標的配列に特異的に結合し、標的配列中に二本鎖切断を導入する」は、融合タンパク質が、統計的に特定の配列のみに結合し、ゲノム中の関係のない他の配列には結合しないように設計されることを意味する。好ましくは、本発明による融合タンパク質は、少なくとも18個のTalエフェクターモチーフを含む。言い換えると、前記融合タンパク質中のTalエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインは、少なくとも18個のTalエフェクターモチーフで構成される。上述のダイマーからなる融合タンパク質の場合、これは、融合タンパク質のそれぞれのモノマーが少なくとも9個のTalエフェクターモチーフを含むことを意味する。より好ましくは、それぞれの融合タンパク質は、少なくとも12個のTalエフェクターモチーフ、例えば少なくとも14個または少なくとも16個のTalエフェクターモチーフを含む。本発明による融合タンパク質のDNA結合特異性を試験する方法は当業者に公知であり、限定されないが、転写レポーター遺伝子アッセイおよび電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)が挙げられる。
【００４２】
好ましくは、融合タンパク質の結合部位は、本発明により改変されるヌクレオチド(1つまたは複数)の上流(すなわち5')または下流(すなわち3')の500ヌクレオチドまで、例えば250ヌクレオチドまで、100ヌクレオチドまで、50ヌクレオチドまで、25ヌクレオチドまで、10ヌクレオチドまで、例えば5ヌクレオチドまでである。
【００４３】
本発明の好ましい態様において、標的配列の改変は、ドナー核酸配列との相同組換えによるものであり、さらに(b)核酸分子を細胞に導入する工程を含み、該核酸分子は、ドナー核酸配列および標的配列に相同な領域を含む。
【００４４】
用語「相同組換え」は、当該技術分野に提供される定義に従って使用される。よって、該用語は、同様のヌクレオチド配列を含む2つのDNA鎖が遺伝物質を交換する遺伝的組換えの機構ことをいう。細胞は、減数分裂の際に相同組換えを使用し、これは完全に特有の半数体染色体の組を作製するためのDNA再配列において機能するが、損傷したDNAの修復、特に二本鎖切断の修復にも機能する。相同組換えの機構は、当業者に周知であり、例えばPaques and Haberにより記載される(Paques F, Haber JE.; Microbiol Mol Biol Rev 1999; 63:349-404)。
【００４５】
本発明によると、用語「ドナー核酸配列」は、相同組換えのプロセスにおいて鋳型として機能し、標的配列に導入される改変を有する核酸配列のことをいう。このドナー核酸配列を鋳型として使用して、改変を含む遺伝情報を、細胞のゲノム中の標的配列にコピーする。非限定的な例において、ドナー核酸配列は、異なり、かつ相同組換えの際に点変異の導入をもたらす1つのヌクレオチドを除き、置き換えられる標的配列の一部と本質的に同一であり得るか、または標的配列中には予め存在しないさらなる遺伝子からなり得る。
【００４６】
本発明の標的配列の改変方法によると、工程(b)で細胞に導入される核酸分子は、上述のドナー核酸配列および標的配列に相同なさらなる領域を含む。工程(b)で細胞に導入される核酸分子は、融合タンパク質をコードする核酸分子ならびにドナー核酸配列および標的配列に相同な領域を含む核酸分子の両方を含み得ることを当業者は理解する。あるいは、工程(b)の核酸分子は、工程(a)に従って融合タンパク質をコードする核酸分子の他に導入されるさらなる核酸分子であり得る。
【００４７】
本発明による用語「標的配列に相同な領域」(本明細書において「相同アーム」ともいう)は、標的配列への特異的結合を確実にするのに充分な配列同一性を有する領域のことをいう。2つの核酸配列間の同一性レベルを評価する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、配列は、当該技術分野に公知の適切なコンピュータープログラムを使用して、電気的に整列され得る。かかるプログラムは、BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403)、WU-BLAST (Altschul and Gish (1996) Methods Enzymol. 266, 460)、FASTA (Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444)などのその変形物またはSmith-Watermanアルゴリズムの装置(SSEARCH, Smith and Waterman (1981) J. Mol. Biol., 147, 195)を含む。これらのプログラムは、ペアワイズ配列アライメントを提供することに加え、配列同一性レベル(通常パーセント同一性)および偶然のアライメントの起こる可能性(P値)も報告する。
【００４８】
好ましくは、「標的配列に相同な領域」は、標的配列の対応する部分と少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、さらに好ましくは少なくとも99.9%、最も好ましくは100%の配列同一性を有する。上述の配列同一性は、相同アームについて結合部位として機能する標的配列の部分に関してのみ定義される。よって、全標的配列と、本発明の標的配列を改変する方法の工程(b)の核酸分子の相同領域の間の全配列同一性は、ドナー核酸配列により置き換えられる標的配列の一部が存在するために、上述の配列同一性とは異なり得る。
【００４９】
標的配列に相同な少なくとも2つの領域が、(b)の核酸分子中に存在することが好ましい。
【００５０】
本発明の方法によると、融合タンパク質を細胞に導入する工程(a)および核酸分子を細胞に導入する工程(b)はいずれも、両立して、すなわち同時に行なわれるか、または別々に、すなわち個々に異なる時点で行われる。該工程が両立して行なわれる場合、融合タンパク質と核酸分子の両方は、並行して、例えば2つの別々の注入針を使用して投与され得るか、または混合して一緒に、例えば1つの針を使用して注入され得る。
【００５１】
本発明によると、驚くべきことに、遺伝子改変、例えば標的化された遺伝子改変を真核細胞のゲノムに導入して、Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質を使用して、10%までの予測されない高頻度の相同組換えを達成することが可能であることが見出された。
【００５２】
本発明の方法の切断工程を行うことは、非相同末端結合(NHEJ)修復による二本鎖切断の修復に伴うヌクレオチド消失により、自発的なゲノム改変を高頻度で引き起こす。また、ドナー核酸配列および標的配列に相同な領域を含む核酸分子を提供することにより、標的化されたゲノムの改変は、高い特異性で達成され得る。
【００５３】
頻度が向上された遺伝的改変を達成するためのいくつかの方法が当該技術分野で公知である。かかる方法としては、例えば相同組換えを達成するためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用が挙げられる。しかしながら、新しいDNA標的配列に高い効率で結合するジンクフィンガータンパク質を設計するために、かなりの労力と時間が必要である。さらに、一般的に、隣り合うジンクフィンガーは互いに影響を及ぼす。よって、配列特性を高めるために、組合せ方法においてこれらを単純により大きなタンパク質に合わせることはできない。結果的に、前もって選択されたジンクフィンガータンパク質に新しいジンクフィンガーを付加することには、それぞれ個々の工程について面倒なスクリーニングおよび選択手順が必要である。さらに、分かっているDNA結合コードが不完全であり、ジンクフィンガードメインをコードする供給源が制限されるために、現在では、任意の所定のDNA標的配列に特異的なジンクフィンガータンパク質に融合されたヌクレアーゼを設計することは困難である。現在利用可能な供給源を使用して、哺乳動物ゲノム中の1000塩基対の標的領域中にただ1つのジンクフィンガーヌクレアーゼを見出し得たと理解されている(Maeder, et al. 2008 Mol Cell 31(2): 294-301; Maeder, et al. 2009 Nat Protoc 4(10): 1471-501)。
【００５４】
標的配列特異的DNA二本鎖切断を達成するために使用される別の方法は、哺乳動物ゲノム中には天然に存在しない特異的な18bp認識配列に結合する制限酵素様I-SceIを示す酵母由来のメガヌクレアーゼ(meganuclease)の使用である。しかしながら、メガヌクレアーゼのDNA結合特異性の組合せコードは明らかにされていない。これまで、メガヌクレアーゼのDNA結合ドメインの再設計により、これまでにその天然の結合配列中の1個または数個のヌクレオチドの置換のみが可能になった(Paeques and Duchateau, 2007 Curr Gene Ther 7(1): 49-66)。そのため、メガヌクレアーゼ標的部位の選択は非常に限定され、現在でも、哺乳動物ゲノム中の任意の好ましい標的に結合する新規のメガヌクレアーゼを設計することは可能ではない。
【００５５】
これらの方法とは対照的に、TalエフェクターDNA結合ドメインは、任意のゲノム中の任意の標的配列に適用され得る選択された特異性を有して、新規のDNA結合タンパク質の構築のための単純な組合せコードを提供する。
【００５６】
本発明によると、現在当業者が直面している上述の課題を解決する標的ゲノムに遺伝的改変を導入する方法が提供される。特に、任意の数のヌクレオチド特異的Talエフェクターモチーフを組み合わせて、本発明の融合タンパク質に使用される配列特異的DNA結合ドメインが形成され得る。したがって、目的の任意の配列は、費用効果的で、簡単かつ迅速な方法でターゲッティングされ得る。
【００５７】
好ましい態様において、標的ゲノムの成功裡な改変について細胞が分析される。
【００５８】
改変の有無を分析するための方法は、当該技術分野で周知であり、限定されることなく、核酸分子の物理的分離に基づくアッセイ、配列決定アッセイならびに切断および消化アッセイ、およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるDNA分析が挙げられる。
【００５９】
核酸分子の物理的分離に基づくアッセイの例としては、限定されることなく、MALDI-TOF、変性勾配ゲル電気泳動および当該技術分野に公知の他のかかる方法が挙げられる(例えば、Petersen et al., Hum. Mutat. 20 (2002) 253-259; Hsia et al., Theor. Appl. Genet. 111 (2005) 218-225; Tost and Gut, Clin. Biochem. 35 (2005) 335-350; Palais et al., Anal. Biochem. 346 (2005) 167-175参照)。
【００６０】
配列決定アッセイの例は、限定されることなく、直接配列決定、自動DNAシークエンサーにおける蛍光SSCPおよびピロシークエンシング(Pyrosequencing)による配列解析のアプローチを含む。これらの手順は当該技術分野に一般的である(例えば、Adams et al. (編), 「Automated DNA Sequencing and Analysis」, Academic Press, 1994; Alphey, 「DNA Sequencing: From Experimental Methods to Bioinformatics」, Springer Verlag Publishing, 1997; Ramon et al., J. Transl. Med. 1 (2003) 9; Meng et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 90 (2005) 3419-3422参照)。
【００６１】
切断および消化アッセイの例としては、限定されることなく、制限断片長多形アッセイ(RFLPアッセイ)、RNase保護アッセイ、化学切断法に基づくアッセイ、酵素ミスマッチ切断アッセイなどの制限消化アッセイが挙げられる(例えば、Youil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 87-91; Todd et al., J. Oral Maxil. Surg. 59 (2001) 660-667; Amar et al., J. Clin. Microbiol. 40 (2002) 446-452参照)。
【００６２】
代替的に、所望の改変の有無について細胞を分析する代わりに、適切な選択マーカーの取り込みにより成功裡に改変された細胞を選択し得る。選択マーカーとしては、当該技術分野において周知であり、当業者により常套的に使用される正および負の選択マーカーが挙げられる。選択マーカーの非限定的な例としては、dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、G418またはグルタミンシンターゼ(GS)が挙げられる(Murphy et al., Biochem J. 1991, 227:277; Bebbington et al., Bio/Technology 1992, 10:169)。これらのマーカーを使用して、細胞を選択培地中で増殖させ、最も高い耐性を有する細胞を選択する。相同組換えまたはランダム組み込みにより標的ゲノム中に組み込まれ得る組み合わされた正-負選択マーカーも構想される。正の選択後、リコンビナーゼ認識部位の隣にある正の選択マーカーを含む第1のカセットを、マーカーが少ない第2のカセットに対するリコンビナーゼ媒介カセット交換により交換する。次いで、負の選択により、所望の交換カセットを含むクローンを得る。
【００６３】
本発明の方法の好ましい態様において、細胞は、哺乳動物細胞または脊椎動物細胞、植物細胞または真菌細胞からなる群より選択される。
【００６４】
本発明の方法のさらに好ましい態様において、細胞は卵母細胞である。
【００６５】
本明細書で使用する場合、用語「卵母細胞」は、生殖に関与するメスの生殖細胞、すなわち卵子または卵細胞のことをいう。本発明によると、用語「卵母細胞」は、受精前の卵母細胞、および接合子とも称される受精した卵母細胞の両方を含む。したがって、受精前の卵母細胞は、母性染色体のみを含むが、受精後の卵母細胞は、母性および父性の両方の染色体を含む。受精後、卵母細胞は、数時間、例えばマウスでは受精後18時間まで、二重ハプロイド状態のままである。
【００６６】
本発明の方法のより好ましい態様において、卵母細胞は受精した卵母細胞である。
【００６７】
本明細書で使用する場合、用語「受精した卵母細胞」は、受精しようとしている精子と融合した後の卵母細胞のことをいう。受精後数時間(例えば、マウスでは18時間まで)、卵母細胞は二重ハプロイド状態であり、1つの母性ハプロイド前核および1つの父性ハプロイド前核を含む。2つの前核が一緒に移動した後、それらの膜が壊れて、2つのゲノムが凝縮されて染色体になり、二倍体生物が再構築される。好ましくは、本発明の方法に使用される哺乳動物卵母細胞または鳥類卵母細胞は、二重ハプロイド状態の受精した哺乳動物卵母細胞または鳥類卵母細胞である。
【００６８】
受精した卵母細胞の全能性接合子へのリモデリングは、生物学における最も複雑な細胞トランスフォーメーションの1つのことをいう。顕著に、この変化は、転写因子の非存在下で起こり、そのため卵形成の際に卵母細胞中に蓄積したmRNAに依存する。一次減数分裂前期の複糸期で拘束される成長しているマウス卵母細胞は、多くの自身の遺伝子を転写および翻訳して、8細胞期までの発生を補助するのに十分なタンパク質の貯蔵を生成する。これらの転写産物は、卵母細胞成熟および卵活性化の二段階で卵母細胞を誘導し、卵母細胞は接合子になる。典型的に、卵母細胞は、排卵されて、第二の拘束点に到達する前に受精コンピテントになる。卵母細胞が卵に成熟する際に、卵母細胞は二次減数分裂の中期で拘束され、転写が停止して、mRNAの翻訳が低下する。この時点で、排卵されたマウスの卵は直径0.085mm、体積約300ピコリットルであり、通常の体細胞の大きさの1000倍を超える(Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003. Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press)。
【００６９】
哺乳動物の一生および胚発生は、精子が卵と受精して接合子を形成した際に開始する。卵の受精は、卵活性化を誘発し、減数分裂の完了および前核の形成にシグナル伝達することにより、接合子へのトランスフォーメーションが完了する。この段階で、接合子は1細胞胚であり、精子由来のハプロイド父性前核および卵母細胞由来の母性前核を含む。マウスにおいて、この全能性一細胞期は、約18時間だけ続き、その後最初の体細胞分裂が起こる。
【００７０】
全動物の生殖細胞系は一細胞内に接触可能であるので、全能性一実体として、哺乳動物接合子は、ゲノムエンジニアリングの好ましい基質と見なされる。しかしながら実験のアクセスし易さおよび接合子の操作は、利用可能である数が非常に限定されており(数十〜100)、性質の持続が非常に短いので、重度に制限される。これらのパラメーターは、10-5未満の頻度で起こる遺伝子ターゲッティングなどのほとんどのゲノム操作が、1つの標準培養プレート中で107個の細胞数まで増殖される培養胚性幹細胞中でのみ成功裡に実施され得ることを容易に説明する。この規則の例外のみが、注入された接合子の30%までのトランスジーン組み込みの高い頻度のために常套的な手順へと発展し前核DNA注入によるトランスジェニックマウスの作製に関わる(Palmiter RD, Brinster RL.; Annu Rev Genet 1986; 20:465-499)。マイクロインジェクションされたトランスジーンはゲノムにランダムに組み込まれるので、この方法は、正常なゲノムのバックグラウンドに対してさらなる遺伝子を発現させるためだけに使用され得るが、内因性遺伝子の標的化された改変は可能にならない。
【００７１】
標的化された遺伝子操作についての接合子の潜在性を特徴付けるBrinsterによる初期の報告(Brinster RL, Braun RE, Lo D, Avarbock MR, Oram F, Palmiter RD.; Proc Natl Acad Sci U S A 1989; 86:7087-7091)では、14ヶ月の注入において10,000を超える接合子からただ1つの標的化されたマウスが得られたので、このアプローチは実用的でないと示された。したがって、Brinsterらは、この方法におけるさらなる試みをあきらめた。低い組換え頻度に加えて、Brinsterらは、(修復された)組織適合性クラスII遺伝子の機能が大きく損なわれた標的化された対立遺伝子において、望ましくない変異が自発的に多く生じることを記した。Brinsterらの経験から、接合子前核におけるゲノムDNAの生理学的、生化学的および後成的な関連は、高頻度で起こるトランスジーンのランダム組み込み以外の標的化遺伝子操作を達成するためには好ましくないことが推定され得た。
【００７２】
また、卵母細胞の胚への発生の生物学は、標的化遺伝子操作のためのさらなる障害をもたらす。受精した哺乳動物の卵において、DNA複製を行なう2つの前核は、直接的に融合せず、2細胞胚を生成する接合子の最初の対細胞分裂の準備においてそれぞれの前核の膜が壊れるまで、互いに近づいて別々のままでる。1細胞接合子段階は、特有の転写および翻訳制御機構を特徴とする。最も大きな特徴の1つは、1細胞胚がS期を完了して2細胞胚を形成したかどうかに関わらず、受精後約24時間、接合子ゲノムの発現を遅らせる接合子時計と称される時間依存的な機構である(Nothias JY, Majumder S, Kaneko KJ, DePamphilis ML.; J Biol Chem 1995;270:22077-22080)。自然では、接合子時計は、凝集した減数分裂状態から選択された遺伝子が転写され得る1つへとクロマチンがリモデリングされ得るまで、接合子遺伝子活性化(ZGA)を遅らせるという利点をもたらす。父性ゲノムは、ヒストンで置き換えられなければならないプロタミンで完全に包まれているので、ZGAが防がれなければ、いくつかの遺伝子は未成熟で発現され得る。細胞特異的な転写は、特異的エンハンサーまたはトランスアクチベーターにより特異的プロモーターが活性化され得る段階へと発生が進むまで、新たに形成された染色体は、全部ではないがほとんどのプロモーターを抑制しなければならないということを要する。マウスにおいて、2細胞胚の形成は、母性遺伝子依存から接合子遺伝子活性化(ZGA)への変化を区別する。哺乳動物の間で、接合子遺伝子活性化(ZGA)の前の発生の程度は、1〜4回の卵割事象で、種によって異なる。母性mRNAの分解は、減数分裂性の成熟および2細胞胚の90%完了により誘発されるが、母性のタンパク質合成は8細胞期まで続く。転写制御に加えて、接合子時計は、2細胞期まで発生期mRNAの翻訳を遅らせる(Nothias JY, Miranda M, DePamphilis ML.; EMBO J 1996; 15:5715-5725)。そのため、前核に注入されたトランスジェニック発現ベクターからのタンパク質の産生は、mRNAの出現の10〜12時間後まで達成されない。
【００７３】
Geurtsらは、最近、ラット接合子のゲノム中で二本鎖切断を誘導するためにジンクフィンガーヌクレアーゼが使用され得ることを見出した(Geurts AM, Cost GJ, Freyvert Y, Zeitler B, Miller JC, Choi VM, Jenkins SS, Wood A, Cui X, Meng X, Vincent A, Lam S, Michalkiewicz M, Schilling R, Foeckler J, Kalloway S, Weiler H, Menoret S, Anegon I, Davis GD, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD, Jacob HJ, Buelow R.; Science 2009; 325:433)。この研究において、誘導された鎖の切断は、DNA切断の部位でヌクレオチドを消失するかまたは獲得する、ランダムに起こった変異対立遺伝子を後で同定するために、内因性のエラーが起こりやすいDNA修復機構に残った。ジンクフィンガーヌクレアーゼ切断部位が遺伝子のエクソン領域中に位置すると仮定すると、変異対立遺伝子のいくつかにおいてリーディングフレームシフトが起こり、それにより切断された機能しないタンパク質の産生が引き起こされる。しかし、この方法は、遺伝子のコーディング領域中に方向性のない変異の生成をもたらすのみである。これまで、予め計画されたヌクレオチド置換などの方向性のある改変を誘導すること、レポーター遺伝子およびリコンビナーゼ認識部位などの外因性DNA配列を挿入すること、または例えばマウスとヒトのコーディング領域を置き換えることは可能ではなかった。
【００７４】
かかる遺伝的改変の導入には、特異的に設計された遺伝子ターゲッティングベクターと標的遺伝子の相同組換えが必要である。接合子において高い割合の相同組換えを達成する手段はこれまで知られていなかったので、体細胞における遺伝子ターゲッティング、ならびにその後のヒツジおよびブタ由来の除核された卵母細胞への核の移動は、代用技術として使用されていた(Lai L, Prather RS. 2003. Reprod Biol Endocrinol 2003; 1:82; Gong M, Rong YS. 2003. Curr Opin Genet Dev 13:215-220)。しかしながら、両方の技術は手間がかかりそれほど効率的でなく、それらの併用は実用的でなく、常套的な適用のために充分に適していない。
【００７５】
本発明によると、当業者が現在直面している上述の課題を解決する標的ゲノムに遺伝的改変を導入する方法が提供される。本発明の方法を使用すると、ここでは遺伝的に改変された動物を、従来技術の方法のいずれかを使用するよりも早く、簡単にかつ費用効果的に作製することが可能である。
【００７６】
本発明の方法の別の好ましい態様において、融合タンパク質または該融合タンパク質をコードする核酸分子は、マイクロインジェクションにより卵母細胞に導入される。
【００７７】
卵母細胞へのマイクロインジェクションは、核(受精前)、前核(受精後)への注入、および/または細胞質(受精の前後両方)への注入によりなされ得る。受精した卵母細胞を使用する場合、前核への注入は、1つの前核または両方の前核のいずれかに対して行なわれる。本発明の標的配列を改変する方法の工程(a)のTalフィンガーヌクレアーゼまたはTalフィンガーヌクレアーゼをコードするDNAの注入は、好ましくは核/前核になされ、工程(a)のTalフィンガーヌクレアーゼをコードするmRNAの注入は、好ましくは細胞質になされる。工程(b)の核酸分子の注入は、好ましくは核/前核になされる。しかしながら、工程(b)の核酸分子の注入はまた、前記核酸分子が核局在化シグナルを有する核酸配列として提供される場合に、細胞質になされ得、核/前核への送達を確実にし得る。好ましくは、マイクロインジェクションは、核/前核および細胞質への注入によりなされる。例えば、核/前核に針が導入され得、第1の量のTalフィンガーヌクレアーゼおよび/または核酸分子が核/前核に注入される。卵母細胞から針を抜きながら、第2の量のTalフィンガーヌクレアーゼおよび/または核酸分子が細胞質に注入される。
【００７８】
マイクロインジェクションを実施する方法は当該技術分野で周知であり、例えばNagyら(Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003. Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press)および以下の本明細書の実施例に記載される。
【００７９】
本発明の方法の別の好ましい態様において、工程(b)の核酸分子は、マイクロインジェクションにより細胞に導入される。
【００８０】
より好ましい態様において、発現可能な形態で融合タンパク質をコードする核酸分子はmRNAである。
【００８１】
本発明の方法の別の好ましい態様において、標的配列に相同な領域は、ドナー核酸配列の5'および3'末端に配置される。
【００８２】
この好ましい態様において、ドナー核酸配列は、本発明の方法に使用される核酸分子が標的配列に相同な第1の領域、続いてドナー核酸配列、次いで標的配列に相同な第2の領域からなるように、標的配列に相同な2つの領域に並ぶ。
【００８３】
本発明の方法のさらに好ましい態様において、核酸分子に含まれる標的配列に相同な領域は、それぞれ少なくとも400bpの長さを有する。より好ましくは、該領域は少なくとも500ヌクレオチド、例えば少なくとも600ヌクレオチド、少なくとも750bpヌクレオチド、より好ましくは少なくとも1000ヌクレオチド、例えば少なくとも1500ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも2000ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも2500ヌクレオチドの長さを有する。核酸分子に含まれる標的配列に相同な領域の最大長さは、使用されるクローニングベクターの種類に依存し、col EI複製起点を使用した大腸菌高コピープラスミド(例えばpBluescript)中それぞれ20,000ヌクレオチド長までであり得るか、またはF因子起点を使用したプラスミド中(例えばpTARBAC1などの、例えばBACベクター中)それぞれ300,000ヌクレオチド長までであり得る。
【００８４】
本発明の方法のさらに好ましい態様において、標的配列の改変は、標的配列の少なくとも1つのヌクレオチドの置換、挿入および欠失からなる群より選択される。本発明によると、置換、例えば1〜3ヌクレオチドの置換などの置換およびloxP部位(34ヌクレオチド長)などの外因性配列の挿入、または例えばレポーター遺伝子などのcDNAの挿入が好ましい。かかるレポーター遺伝子のcDNAは、例えば6kb長までであり得る。
【００８５】
本発明の方法の別の好ましい態様において、細胞は、げっ歯類、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ブタもしくはウシからなる群より選択される哺乳動物由来であるか、またはニワトリ、シチメンチョウ、キジ、アヒル、ガン、ウズラおよびダチョウ、エミューおよびヒクイドリなどの平胸類からなる群より選択される鳥類由来であるか、または細胞は、ゼブラフィッシュ、サケ、マス、コイ(common carp)またはコイ(coi carp)などの魚類由来である。
【００８６】
本明細書に記載される全ての哺乳動物、鳥類および魚類は、当業者に周知であり、従来技術および当業者の一般的な知識により分類学的に定義される。
【００８７】
「げっ歯類」の非限定的な例は、マウス、ラット、リス、シマリス、ジリス、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、アレチネズミ、モルモット、デグー、チンチラ、プレーリードッグおよびウッドチャックである。
【００８８】
「イヌ」の非限定的な例としては、イヌ亜種のメンバーならびにオオカミ、キツネ、ジャッカルおよびコヨーテが挙げられる。
【００８９】
「ネコ」の非限定的な例としては、2種類の亜科のメンバー：ヒョウ、例えばライオン、トラ、ジャガーおよびレオパルド、ならびにネコ、例えばクーガー、チーター、サーバル、オオヤマネコ、カラカル、オセロットおよび飼いネコが挙げられる。
【００９０】
用語「霊長類」は、本明細書で使用する場合、例えばオナガザル類(旧世界ザル)または広鼻猿類(新世界ザル)を含む全てのサル、ならびにキツネザル、メガネザル、類人猿およびマーモセット(Callithrix jacchus)が挙げられる。
【００９１】
一態様において、哺乳動物卵母細胞は、ヒト卵母細胞ではない。別の態様において、受精した卵母細胞はヒト卵母細胞ではない。
【００９２】
本発明はさらに、ゲノム中に改変された標的配列を有する非ヒト脊椎動物または非ヒト哺乳動物を作製する方法に関し、該方法は、本発明の方法により作製された細胞を偽妊娠メス宿主に移す工程を含む。
【００９３】
本発明によると、用語「本発明の方法により作製された細胞を偽妊娠メス宿主に移す工程」は、受精した卵母細胞を移すこと以外に例えば2細胞、4細胞、8細胞、16細胞および胚盤胞(70〜100細胞)期の着床前(pre-implantation)の胚を移すことも含む。前記着床前の胚は、細胞を、着床前の胚に発生するのに適切な条件下で培養することにより得られ得る。さらに、細胞の胚盤胞への注入または融合は、着床前の胚を得る適切な方法である。本発明の方法で作製した細胞が体細胞である場合、誘導された多能性幹細胞の誘導は、例えば細胞を培養する前、細胞の着床前の胚への注入または融合前など細胞をメス宿主に移す前に必要である。卵母細胞または着床前の胚を偽妊娠メス宿主に移す方法は、当該技術分野で周知であり、例えばNagyら(Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003. Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press)に記載される。
【００９４】
さらに、ゲノム中に改変された標的配列を有する非ヒト脊椎動物または哺乳動物を作製する方法によると、メス宿主に移す前に成功裡のゲノム改変の分析工程を行うことが構想される。非限定的な例として、卵母細胞は、2細胞、4細胞または8細胞期まで培養され得、得られた胚を破壊または改変することなく1つの細胞を除去し得る。次いで、例えばPCRまたはサザンブロット技術または本明細書上述の方法のいずれかを使用して、ゲノム構成の分析、例えばゲノム改変の有無の分析が行なわれ得る。移す前の成功裡のゲノム決定のかかる分析方法は、当該技術分野で公知であり、例えばPeippoら(Peippo J, Viitala S, Virta J, Raty M, Tammiranta N, Lamminen T, Aro J, Myllymaki H, Vilkki J.; Mol Reprod Dev 2007; 74:1373-1378)に記載される。
【００９５】
細胞が卵母細胞である場合、ゲノム中に改変された標的配列を有する非ヒト脊椎動物または哺乳動物を作製する方法は、(a)本発明の方法により脊椎動物または哺乳動物の卵母細胞のゲノム中の標的配列を改変する工程；(b) (a)で得られた卵母細胞を偽妊娠メス宿主に移す工程；および任意に(c)メス宿主から産まれた子孫を、改変の存在について分析する工程を含む。
【００９６】
この非ヒト脊椎動物または哺乳動物を作製する方法について、卵母細胞の受精が必要である。前記受精は、本発明の非ヒト脊椎動物または哺乳動物を作製する方法による工程(a)における標的配列の改変前に起こり得、すなわち受精した卵母細胞が、本発明による標的配列を改変する方法に使用され得る。受精はまた、工程(a)の標的配列の改変後に行なわれ得、すなわち本発明による標的配列を改変する方法に未受精卵母細胞が使用され得、次いで卵母細胞は、偽妊娠メス宿主に移す前に受精される。
【００９７】
メス宿主から産まれた子孫中の改変の存在を分析する工程は、作製された非ヒト脊椎動物または哺乳動物がゲノム中に改変された標的配列を有するかどうかの必要な情報を提供する。したがって、改変の存在は、前記子孫がゲノム中に改変された標的配列を有することを示し、改変の非存在は、前記子孫がゲノム中に改変された標的配列を有さないことを示す。改変の有無を分析する方法は、先に詳述されている。
【００９８】
本発明の方法により作製された非ヒト脊椎動物または非ヒト哺乳動物は、とりわけ目的の遺伝子の機能およびかかる動物中のゲノムの改変の表現型的発現/結果の研究に有用である。さらに、本発明の非ヒト哺乳動物は、疾患モデルとしておよび治療剤/組成物を試験するために使用され得ることが構想される。さらに、本発明の非ヒト脊椎動物または哺乳動物は、家畜繁殖にも使用され得る。
【００９９】
好ましい態様において、非ヒト脊椎動物または哺乳動物を作製する方法はさらに、細胞を培養して、着床前の胚を形成する工程または偽妊娠メス宿主に移す前に、胚盤胞に細胞を導入する工程を含む。細胞を培養して着床前の胚を形成する方法または胚盤胞に細胞を導入する方法は、当該技術分野周知であり、例えばNagyら(上述)に記載される。
【０１００】
本明細書で使用する場合、用語「胚盤胞に細胞を導入する工程」は、胚盤胞への細胞の注入ならびに胚盤胞と細胞の融合を包含する。胚盤胞に細胞を導入する方法は、当該技術分野、例えばNagyら(上述)に記載される。
【０１０１】
本発明はさらに、本発明の上述の方法により得られる非ヒト脊椎動物または非ヒト哺乳動物に関する。
【０１０２】
好ましい態様において、非ヒト哺乳動物は、げっ歯類、イヌ、ネコ、霊長類、ウサギ、ブタまたはウシからなる群より選択されるか、あるいは非ヒト脊椎動物は、魚類、例えばゼブラフィッシュ、サケ、マス、コイ(common carp)もしくはコイ(coi carp)、または鳥類、例えばニワトリ、シチメンチョウ、キジ、アヒル、ガン、ウズラおよび平胸類、例えばダチョウ、エミューおよびヒクイドリからなる群より選択される。
【０１０３】
本発明はさらに、Talエフェクタータンパク質および制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質に関する。本発明の方法の文脈における融合タンパク質に関する上述の全ての定義および好ましい態様は、必要な変更を加えて適用される。さらに、本発明はまた、本発明の融合タンパク質を含むキットに関する。該キットの種々の内容物は、1つ以上のバイアルなどの1つ以上の容器に梱包され得る。該バイアルは、内容物の他に、貯蔵のための保存剤または緩衝剤を含み得る。また、該キットは使用説明書を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
図面は、以下を示す：
【図１】図1は、マウスゲノムRosa26座を認識する本発明による融合タンパク質ペアの設計である。マウスRosa26座の第1のイントロン由来の標的配列は中央XbaI部位を含む。融合タンパク質Venus-TalRosa2-Fok-KKは、FokI-KK触媒ドメインに融合した、上段のDNA鎖中の下線が引かれた標的配列を認識する14個のTalエフェクターモチーフ(リピート1〜14)を含む。融合タンパク質Venus-TalRosa1-Fok-ELは、下段のDNA鎖中の下線が引かれた配列を認識する12個のTalエフェクターモチーフ(リピート1〜12)を含む。両方のリピートドメインは、Tに対する不変の第1のリピート「0」および不変の最終リピート「12.5」または「14.5」に隣り合う。2つの融合タンパク質は、6塩基対のスペーサー配列で分離される。
【図２ａ】図2は、マウスゲノムRosa26座を認識する本発明の融合タンパク質の構造およびアミノ酸配列である。Rosa26特異的TalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質のペアの中心部分を示す。それぞれのモチーフは、12位および13位で変化する34アミノ酸を含み、Rosa26標的配列、以下のコード：Cを認識するH12+D13、N12+N13＞G、N12+I13＞AおよびN12+G13＞Tに対する特異性を決定する。両方のTalエフェクターDNA結合ドメインは、N末端でVenusに融合し、C末端でFokI触媒可変ドメインFok-KKまたはFok-ELに融合する。
【図２ｂ】図2は、マウスゲノムRosa26座を認識する本発明の融合タンパク質の構造およびアミノ酸配列である。Rosa26特異的TalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質のペアの中心部分を示す。それぞれのモチーフは、12位および13位で変化する34アミノ酸を含み、Rosa26標的配列、以下のコード：Cを認識するH12+D13、N12+N13＞G、N12+I13＞AおよびN12+G13＞Tに対する特異性を決定する。両方のTalエフェクターDNA結合ドメインは、N末端でVenusに融合し、C末端でFokI触媒可変ドメインFok-KKまたはFok-ELに融合する。
【図３】図3は、本発明のTalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質の構造モデルである。I-Tasserソフトウェアを使用した、マウスRab38遺伝子中の標的配列(GGT-GGC-CCG-GTA-GT)を認識する14個のTalエフェクターモチーフのアレイの構造モデリング。上部(上段グラフ)および下図(中段グラフ)に見られるように、Talエフェクターモチーフは、中央DNA分子(示さず)を取り囲み得る超らせん構造中に整列する。したがって、側面図(下段部グラフ)から、開放中央空間が基質DNA分子を収容することが明らかである。αヘリックスを形成するタンパク質領域を、模式的なチューブで示す。各34残基Talエフェクターモチーフは、DNA配列特異的結合を決定する12位および13位で曝露されたアミノ酸と結合する2つのヘリックスに折りたたまれる。
【図４Ａ】図4は、本発明のTalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質についての発現ベクターである。Rosa26標的配列特異的TalエフェクターDNA結合ドメインTalRosa1およびTalrosa2は、フレーム中でN末端のVenusとの融合(核局在シグナル-NLSを含む)およびC末端のFokIヌクレアーゼのKKまたはEL変異との融合を提供するプラスミド主鎖に連結され、プラスミドpCAG-venus-TalRosa1-Fok-EL(配列番号:2)およびpCAG-venus-TalRosa2-Fok-KK(配列番号:4)を生じる。TalエフェクターDNA結合ドメインを、7個のグリシン残基(7xGly)のペプチドリンカーによりFokドメインに連結する。venus-TalRosa-Fokタンパク質のコーディング領域は、脊椎動物細胞中で、CAGハイブリッドプロモーターからmRNAに転写され得、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列(ポリA)により終結され得る。代替的に、mRNAは、ATG開始コドンの上流に位置するファージ由来のT7プロモーターからインビトロで転写され得、インビトロで、venus-TalRosa1-Fok-EL(配列番号:3)およびvenus-TalRosa2-Fok-KK(配列番号:5)タンパク質に翻訳され得る。
【図４Ｂ】図4は、本発明のTalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質についての発現ベクターである。Rosa26標的配列特異的TalエフェクターDNA結合ドメインTalRosa1およびTalrosa2は、フレーム中でN末端のVenusとの融合(核局在シグナル-NLSを含む)およびC末端のFokIヌクレアーゼのKKまたはEL変異との融合を提供するプラスミド主鎖に連結され、プラスミドpCAG-venus-TalRosa1-Fok-EL(配列番号:2)およびpCAG-venus-TalRosa2-Fok-KK(配列番号:4)を生じる。TalエフェクターDNA結合ドメインを、7個のグリシン残基(7xGly)のペプチドリンカーによりFokドメインに連結する。venus-TalRosa-Fokタンパク質のコーディング領域は、脊椎動物細胞中で、CAGハイブリッドプロモーターからmRNAに転写され得、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列(ポリA)により終結され得る。代替的に、mRNAは、ATG開始コドンの上流に位置するファージ由来のT7プロモーターからインビトロで転写され得、インビトロで、venus-TalRosa1-Fok-EL(配列番号:3)およびvenus-TalRosa2-Fok-KK(配列番号:5)タンパク質に翻訳され得る。
【図５】図5は、遺伝子ターゲッティングベクターpRosa26.8-2およびマウスRosa26座でのTalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ補助相同組換えである。A: 遺伝子ターゲッティングベクターpRosa26.8-2の構造。Rosa26座に対する5'および3'相同領域(5'HR、3'HR)は、スプライシングアクセプター(SA)配列、β-ガラクトシダーゼコーディング領域およびポリアデニル化配列(pA)を含むレポーター遺伝子カセットに隣り合う。B: マウスRosa26座のゲノム構造。Rosa26の第1の2つのエクソンおよびエクソン1の上流のRosa26プロモーター(矢印)が示される。イントロン1中のpRosa26.8-2ベクターに対する相同領域は点線で示され、TalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質(図1、図2)のペアに対する標的部位は矢印で示される。標的部位での融合タンパク質誘導二本鎖切断の際に、pRosa26.8による相同組換えが刺激され、組み換えられたRosa26座が生じる。C: 組換えられたRosa26座。組換えを介したレポーター遺伝子カセットの融合タンパク質の標的配列への移動の際に、レポータースプライシングアクセプターは、Rosa26エクソン1配列にスプライシングされ、β-ガラクトシダーゼ(βGal)をコードするmRNAの産生をもたらす。
【図６】図6は、pRosa26.8-2遺伝子ターゲッティングベクターと一緒にRosa26特異的融合タンパク質をコードするmRNAの注入によりRosa26座で遺伝的に改変されたマウスの作製のスキームである。A: 過剰排卵されたメスから回収した受精した卵母細胞。B: 遺伝子ターゲッティングベクターおよびTalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードするmRNAの、受精した卵母細胞の1つの前核および細胞質へのマイクロインジェクション。C: 注入された胚のインビトロ培養およびレポーター遺伝子活性の評価。注入された胚は、偽妊娠メスに直接移され得るか、または生体染色を使用した場合は、レポーター活性の検出後に移され得るかのいずれかである。D: 偽妊娠メスは、マイクロインジェクションされた胚から生きた子孫を産む。E: 誘導された遺伝的改変の存在について子孫の遺伝子型決定をする。さらなる交配のために陽性動物を選択して、遺伝子標的化系統を確立する。
【図７】図7は、TAL-FokIヌクレアーゼ発現ベクターである。Talヌクレアーゼ発現ベクターpCAG-Tal-IX-Fokは、CAGプロモーター領域、ならびにBsmBI制限部位の中央ペアの上流にATG開始コドン(矢印)、核局在化配列(NLS)、FLAGタグ配列(FLAG)、リンカー、Talタンパク質AvrBs3(AvrN)の110アミノ酸をコードするセグメントおよびその不変N末端Talリピート(r0.5)を含む転写ユニットを含む。BsmBI部位の下流で、転写ユニットは、不変C末端Talリピート(rx.5)、Talタンパク質AvrBs3由来の44アミノ酸をコードするセグメント、FokIヌクレアーゼドメインのコーディング配列およびポリアデニル化シグナル配列(bpA)を含む。TalリピートをコードするDNAセグメントは、可変Tal-Fokヌクレアーゼ融合タンパク質の発現のために、pCAG-Tal-IX-FokのBsmBI部位に挿入され得る。A: ArtTal1-Fok Talヌクレアーゼを作製するために、指定された標的配列#1を認識する12個のTalリピートのアレイをpCAG-Tal-IX-Fokに挿入した。B: AvrBs-Fok Talヌクレアーゼを作製するために、指定された標的配列#2を認識する17個のTalリピートのアレイをpCAG-Tal-IX-Fokに挿入した。C: TalRab1-Fok Talヌクレアーゼを作製するために、指定された標的配列#3を認識する13個のTalリピートのアレイをpCAG-Tal-IX-Fokに挿入した。D: TalRab2-Fok Talヌクレアーゼを作製するために、指定された標的配列#4を認識する14個のTalリピートのアレイをpCAG-Tal-IX-Fokに挿入した。それぞれの34アミノ酸Talリピートは、以下で示す標的配列(NI > AまたはNS > A、NG > T、HD > C、NN > G)のDNAヌクレオチドの1つへの結合に寄与する12/13位でリピートのアミノ酸コードを示す四角で表される。
【図８】図8は、Talヌクレアーゼレポーターアッセイである。A: Talヌクレアーゼレポータープラスミドは、CMVプロモーター領域、β-ガラクトシダーゼのN末端セグメントをコードする400bp配列および終止コドンを含む。このユニットは、15bpのスペーサー領域(NNN...)で分離されるArtTal-Fok (a)、AvrBs-Fok (b)、TalRab1-Fok (c)またはTalRab2-Fok (d)について2つの逆方向の認識配列(下線)からなるTalヌクレアーゼ標的領域につながる。Talヌクレアーゼ標的領域は、β-ガラクトシダーゼの完全コーディング領域およびポリアデニル化シグナル(pA)につながる。標的配列に対するヌクレアーゼ活性を試験するために、Talヌクレアーゼ発現ベクター(図7)を、その対応するレポータープラスミドと一緒に一過的にHEK 293細胞に共トランスフェクトする。Talヌクレアーゼタンパク質の発現の際に、レポータープラスミドは、Talヌクレアーゼ標的配列中のヌクレアーゼ誘導二本鎖切断により開環される(はさみ)。B: 二本鎖切断に隣り合うDNA領域は、同一の400bpより大きいものであり、整列され得、相同組換えDNA修復により組み換えられ得る(X)。C: 開環したレポータープラスミドの相同組換えにより、β-ガラクトシダーゼ酵素を産生する機能的β-ガラクトシダーゼ発現ベクターが生じる。2日後、トランスフェクトされた細胞集団を溶解して、溶解物中の酵素活性を、化学発光レポーターアッセイにより決定する。レポーターに触媒された発光のレベルを測定し、Talヌクレアーゼ活性を示す。
【図９】図9は、HEK 293細胞中のTalヌクレアーゼの活性である。Talヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を試験するために、ArtTal1-Fok、AvrBs-Fok、TalRab1-FokおよびTalRab2-Fokについての発現ベクター(図7)を、対応するレポータープラスミド(図8)と一緒に、一過的にHEK 293細胞にトランスフェクトする。レポータープラスミドの標的配列に対する特異的ヌクレアーゼ活性は、相同組換えおよびβ-ガラクトシダーゼの発現を生じる。トランスフェクションの2日後、細胞集団を溶解して、化学発光レポーターアッセイによりβ-ガラクトシダーゼ活性を決定した。共トランスフェクトされたルシフェラーゼ発現プラスミドの活性に対して発光のレベルを標準化して、1.0と定義した陽性対照β-ガラクトシダーゼベクターpCMVβの活性と比較して示す。それぞれのトランスフェクトされた試料についての値は、トランスフェクトした、並んでいる3つの培養ウェル由来の平均値およびSDを示す。A: ヌクレアーゼ発現ベクターなしのArtTal1-FokまたはAvrBs-Fok-レポータープラスミドのトランスフェクションは、ルシフェラーゼプラスミド単独のトランスフェクションと同等の低いバックグラウンドレベルのβ-ガラクトシダーゼを生じる。対照的に、pCAG-ArtTal1-FokとArtTal1-Fok-レポータープラスミドまたはpCAG-AvrBs-FokとAvrBs-Fok-レポータープラスミドの共トランスフェクションは、TalヌクレアーゼArtTal1-FokおよびAvrBs-Fokのヌクレアーゼ活性を示すβ-ガラクトシダーゼ活性の大きな増加をもたらした。B: ヌクレアーゼ発現ベクターなしのTalRab1-FokまたはTalRab2-Fokレポータープラスミドのトランスフェクションは、ルシフェラーゼプラスミド単独のトランスフェクションと同等の低いバックグラウンドレベルのβ-ガラクトシダーゼを生じる。対照的に、pCAG-TalRab1-FokとTalRab1-Fok-レポータープラスミドまたはpCAG-TalRab2-FokとTalRab2-Fok-レポータープラスミドの共トランスフェクションは、TalヌクレアーゼTalRab1-FokおよびTalRab2-Fokのヌクレアーゼ活性を示す、β-ガラクトシダーゼ活性の30〜50倍の増加を生じた。
【図１０】図10は、Talヌクレアーゼの標的配列特異性である。関係のないDNA配列と比較して、予想される標的配列に対するTalRab1-FokおよびTalRab2-Fokヌクレアーゼの特異性を試験するために、TalRab1-Fok-レポータープラスミド単独をトランスフェクトしたか、TalRab1-Fokについて対応する発現ベクターと共トランスフェクトしたか、またはTalRab2-Fok、ArtTal1-FokもしくはAvrBs-Fokについての発現ベクターと一緒に共トランスフェクトした。ArtTal1-Fok発現ベクターとArtTal1-Fok-レポータープラスミドの特異的な組み合わせにおいてのみ強力なヌクレアーゼ活性が生じた。逆に、TalRab1-Fok発現ベクターは、TalRab2-Fok-レポータープラスミドに対してヌクレアーゼ活性を発揮しなかった。
【図１１】図11は、Rosa26座へのVenusレポーター遺伝子の標的化組み込みである。A: スプライシングアクセプター(SA)およびポリA部位を含む、1.1kb Venus遺伝子の、Rosa26座への挿入のためのターゲッティングベクターpRosa26.3-3。Rosa26プロモーター(Pr.)、第1のエクソン、Rosa-5'およびvenusサザンブロットプローブ、XbaI(X)およびBamHI(B)部位、およびフラグメントの位置を示す。B: イントロンXbaI部位(X)と重複するTALヌクレアーゼ認識部位を含むRosa26野生型座の構造。C: 組み換えたRosa26対立遺伝子の構造。野生型Rosa26座は、5.8kbのBamHIバンドを生じ、レポーター遺伝子の標的化組み込みは、Rosa26 5'-プローブにより検出される予測3.1kb BamHIフラグメントの存在により示される。標的化された座は、vebusハイブリダイゼーションプローブを使用して3.9kbのバンドを生じる。
【図１２】図12は、Rosa26座へのVenusレポーター遺伝子の標的化組み込みである。TalRosa1、TalRosa2 mRNAおよびターゲッティングベクターpRosa26.3-3の接合子共インジェクション由来のマウスの尾部のゲノムDNAをBamHIで消化して、Rosa26 5'-プローブ(上部ボックス)またはvenusプローブ(下部ボックス)を使用してサザンブロットにより分析した。BamHI消化DNAの内部Venusプローブでの分析により、試料番号24〜28および番号30〜34において予想される3.9kbのバンドが示された。Rosa26 5'-プローブでのBamHI消化DNAの分析により、試料番号24〜28、番号30および32〜34において、Rosa26での組換えを示す5.8kbの野生型バンドおよびさらなるバンドが示された。このさらなるバンドは、予想される3.1kbフラグメントの代わりに3.9kbのサイズで現れた。「C」で標識した3つのレーンは、生殖細胞系にRosa26.3-3標的化対立遺伝子(図11C)を含む対照マウス由来の尾部のDNAのBamHI消化物を示す。
【０１０５】
実施例により本発明を例示する。
【実施例】
【０１０６】
実施例1: Rosa26特異的TalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質の構築
融合タンパク質設計
哺乳動物細胞におけるTalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質の機能性を実証するために、本発明者らは、マウスRosa26座中のDNA標的配列を認識する一組の融合タンパク質を設計した(図1)(配列番号:1)。2つのTalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質は、一緒になって、二つに分かれた標的DNA領域に結合し、標的領域のスペーサー領域中に二本鎖切断を誘導して、哺乳動物細胞中の標的座で相同組換えを刺激しようとする。Rosa26標的ヌクレオチドは、融合タンパク質の結合領域が6塩基対のスペーサーにより分離され、それぞれの標的配列の先頭にTがくるように選択された。5'>3'方向の最初のTの下流の配列に続いて、NからC末端の順序で塩基特異的TalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質を一緒に、不変の最初の(0)および最後のTal-フィンガー(12,5;14,5)で始まる12個(TalRosa1)または14個のTal-フィンガー(TalRosa2)のアレイに結合させた(図1)。それぞれのTalエフェクターモチーフは、34アミノ酸からなり、その12および13位は、標的配列中のA、G、CまたはTの認識についての特異性を決定する(Boch, J., et al. 2009 Science 326: 1509-12)。Rosa26特異的TalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質(図2)を誘導するために、本発明者らは、Aを認識するアミノ酸N12およびI13を有するキサントモナスHax3タンパク質(GenBank受託番号AY993938.1由来のTalエフェクターモチーフ(リピート)#11(LTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHG；配列番号:24)、Cを認識するアミノ酸H12およびD13を有するHax3タンパク質由来のTalエフェクターモチーフ(リピート)#5(LTPQQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHG；配列番号:25)、ならびにTを認識するアミノ酸N12およびG13を有するキサントモナスHax4タンパク質(Genbank受託番号: AY993939.1)由来のTalエフェクターモチーフ(リピート)#4(LTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHG；配列番号:26)を選択した。標的Gヌクレオチドを認識するために、本発明者らは、アミノ酸12をNに、13をNに変えたHax4タンパク質由来のTalエフェクターモチーフ(リピート)#4 (LTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHG；配列番号:27)を使用した。塩基特異的DNA結合ドメインは、不変の最初のTalリピート(LDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLN；配列番号:28)で始まり、Hax3タンパク質由来の最後のTalリピート(LTPEQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALA；配列番号:29)が続く。Rosa26標的配列を認識するTalエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインは、Vector NTI (Invitrogen)またはDNAワークベンチ(CLC)ソフトウェアを使用してコンピューター上で設計し、フレーム中でN末端をGFPバリアントVenus、およびC末端を7グリシン残基のリンカーペプチドを介してFokIエンドヌクレアーゼの触媒ドメインと結合させ、TalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質のペア、すなわちvenus-TalRosa1-Fok-EL(配列番号:3)およびvenus-TalRosa2-Fok-KK(配列番号:5)(図2)を誘導した。FokIエンドヌクレアーゼの触媒ドメインは、通常ホモダイマーとして作用する。1つのTalRosaヌクレアーゼの意図しないゲノム標的配列でのホモダイマー形成を回避して、TalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質ペアの特異性を高めるために、本発明者らは、優先的にヘテロダイマーとして作用するFokI変異ドメイン「KK」および「EL」(Miller et al. 2007 Nat Biotechnol 25(7): 778-85)を使用した。本発明の融合タンパク質のDNA標的配列への結合をモデル化するために��本発明者らは、I-Tasserソフトウェア(Roy et al. 2010 Nat Protoc 5(4): 725-38)を使用して、マウスRab38遺伝子中の配列5'-GGTGGCCCGGTAGT-3'を認識するように設計された14個のTalエフェクターモチーフタンパク質の3D構造を計算し、Discovery studioソフトウェア(Accelerys)を使用して該構造を可視化した(図3)。該構造モデルによると、Talエフェクターモチーフは、中央のDNA分子を収容するように準備された超らせん構造に折りたたまれる。それぞれの34残基Talエフェクターモチーフは、DNA配列特異的結合を決定する12および13位で曝露されたアミノ酸により連結される2つのヘリックスに折りたたまれる(図3)。
【０１０７】
発現ベクター
哺乳動物細胞におけるTalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質の発現のためのベクターを誘導するために、市販のサービスプロバイダ(Geneart, Regensburg, Germany)により、TalエフェクターDNA結合ドメインのRosa26特異的コーディング領域を合成した。TalエフェクターDNA結合ドメインTalRosa1およびTalrosa2のDNAコーディングフラグメントをフレーム中で、特異的に、N末端でVenus蛍光タンパク質(核局在化シグナル-NLSを含む)と融合し、C末端でFokIヌクレアーゼのKKまたはEL変異に融合し、哺乳動物細胞におけるmRNAおよびタンパク質発現のための因子を提供するプラスミド主鎖に連結し、プラスミドpCAG-venus-TalRosa1-Fok-EL(配列番号:2)およびpCAG-venus-TalRosa2-Fok-KK(配列番号:4)を誘導した。TalエフェクターDNA結合ドメインは、7個のグリシン残基(7xGly)のペプチドリンカーによりFokドメインに連結される。venus-TalRosa-Fokタンパク質のコーディング領域は、哺乳動物細胞において、CAGハイブリッドプロモーターからmRNAへと転写され得、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列(ポリA)により終結され得る。代替的に、mRNAは、ATG開始コドンの上流に位置するファージ由来のT7プロモーターからインビトロで転写され得、インビトロでvenus-TalRosa1-Fok-EL(配列番号:3)およびvenus-TalRosa2-Fok-KK(配列番号:5)タンパク質に翻訳され得る。
【０１０８】
TalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質のDNA切断活性
インビトロヌクレアーゼ切断アッセイにより、設計したTalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質の機能を試験する。この目的のために、Promega(Madison, WI, USA)のTnT Quick coupledインビトロ転写/翻訳システム、次いで製造業者の使用説明書を使用して、venus-TalRosa-Fokヌクレアーゼ融合タンパク質のmRNAおよびタンパク質をpCAG-venus-TalRosa1-Fok-ELおよびpCAG-venus-TalRosa2-Fok-KKプラスミドから産生する。インビトロヌクレアーゼアッセイ(Kandavelou 2009 Methods Mol Biol 544: 617-36)において、合成されたタンパク質の画分を、Rosa26標的配列を含むプラスミドpbs-Rosa-targetseq (配列番号:7)と一緒にインキュベートし、TalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質ペアの切断活性を評価する。DNA基質の切断について、アガロースゲル電気泳動により反応を分析し、Tal-フィンガーヌクレアーゼペアがRosa26標的配列中に二本鎖切断を誘導し得ることを明らかにする。
【０１０９】
実施例2: 受精したマウス卵母細胞におけるTalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質補助相同組換え
この実験で、TalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質により誘導された二本鎖切断の部位で相同組換えが、妥当な頻度(>1%)で受精したマウス卵母細胞中で起こるかどうかを試験する。この目的のために、本発明者らは、相同領域を介してマウスRosa26座にレポーター遺伝子カセットが挿入される遺伝子ターゲッティングベクターpRosa26.8-2(配列番号:6)を構築した。このベクターは、Rosa26座の第1のイントロン由来の1kbの5'-および4kbの3'-相同領域と合わされたスプライシングアクセプター因子、β-ガラクトシダーゼおよびポリアデニル化配列のコーディング領域を含む(図5A、B)。Rosa26座は、マウスの全ての組織および発生段階で偏在的に発現することが見いだされ、トランスジーンの発現に適している第6染色体上の領域である(Zambrowicz BP, Imamoto A, Fiering S, Herzenberg LA, Kerr WG, Soriano P.; Proc Natl Acad Sci U S A 1997; 94:3789-3794; Seibler J, Zevnik B, Kuter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek T, Rode A, Heimann C, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kuhn R, Schwenk F.; Nucleic Acids Res 2003; 31:e12.)。組換えの際に、ベクターのスプライシングアクセプターは、融合転写産物がβ-ガラクトシダーゼをコードするように、Rosa26転写産物のドナー部位にスプライシングされる(図5C)。
【０１１０】
A) 結果
直鎖状にされたターゲッティングベクターを、Rosa26の標的配列(図1)を認識し、レポーター遺伝子カセットの挿入部位に二本鎖切断を誘導する(図5B)TalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質のペア(図2)をコードするインビトロで転写されたmRNAと一緒に、受精したマウス卵母細胞にマイクロインジェクションする(図6A、B)。マイクロインジェクションの際に、TalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質mRNAは、発生中の胚の1つ以上の細胞中に一方または両方のRosa26対立遺伝子において二本鎖切断を誘導するタンパク質に翻訳される。この事象は、ベクター中に存在する相同領域を介してpRosa26.8-2ベクターとRosa26対立遺伝子の組換えを刺激し、非相同レポーター遺伝子カセットのゲノムへの部位特異的挿入をもたらす(図5C)。これらの事象のタイミングに依存して、組換えは、2細胞胚、4細胞胚または8細胞胚の1つのみの細胞において1細胞胚以降で起こり得る。かかる成功裡の組換え事象を検出するために、マイクロインジェクションした接合子をさらにインビトロで培養し、最終的にβ-ガラクトシダーゼ基質として、不溶性の青色産物に変換されるX-Galと共にインキュベートする。マイクロインジェクション実験において、本発明者らは、1細胞期以降の発生段階で相同組換えが起こったことを示す高頻度のX-Gal染色胚を観察する。染色手順の前にこれらの胚を固定するので、この胚からさらにマウスを生じることはできない。
【０１１１】
B) レポーター遺伝子カセットを有する生きたマウスの作製
さらなる実験において、マイクロインジェクションされた接合子を、偽妊娠メスに移して、生きたマウスにまでさらに発生させる(Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003. Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring HarbourLaboratory Press)。これらの実験により、マイクロインジェクションされた接合子は、マウス胚に発生し得ること(図6)および組み込まれたレポーター遺伝子が発現することが示される。このような実験において、マイクロインジェクションされた接合子を偽妊娠メスマウスに移し、発生の18日目に胚を回収する。胚を安楽死させ、半分に切断し、半分の片方を上述のようにX-Gal染色液で染色する。この分析により、6個の胚の1つが、青色反応産物で示されるようにβ-ガラクトシダーゼレポーター遺伝子活性について強く陽性である。
【０１１２】
C) 成功裡のゲノム改変の分析
以下の実施例に拘束されることを望まないが、さらなる実験において胚および新生児、幼生体または成体のマウス由来のゲノムDNAを抽出することが構想される。次いで、このDNAを、Rosa26座で予想される相同組換え事象について、pRosa26の5' Rosa26相同アームの上流に位置する標識されたプローブを使用して、サザンブロット分析により分析し得、次いで11.5kbのバンドで認識され得、組み換えられたマウスは、3.65kbのさらなるバンドの存在で同定され得る。
【０１１３】
D) Venusレポーター遺伝子カセットを有する生きたマウスの作製
さらなる実験において、本発明者らは、Venus GFPタンパク質の発現についての1.1kbレポーターカセットを含む以外はpRosa26.8と同等である遺伝子ターゲッティングベクターpROSA26.3-3(配列番号:30)と組み合わせたRosa26特異的TalヌクレアーゼTalRosa1およびTalRosa2を使用した(図11)。
【０１１４】
環状DNAとしてターゲッティングベクターpRosa26.3-3を使用して、沈殿させ、注入バッファ(10mM Tris、0.1mM EDTA、pH7.2)に溶解した。注入のためのTalヌクレアーゼRNAを、直鎖状にした発現プラスミドpCAG-venus-TalRosa1-Fok-ELおよびpCAG-venus-TalRosa2-Fok-KKから、製造業者の使用説明書に従って、mMessage mMachineキット(Ambion)を使用して、T7プロモーターからのインビトロ転写により調製した。Poly(A)テイリングキットを使用してポリAテイルを付加することによりmRNAをさらに改変して、AmbionのMegaClearカラムを使用して精製した。最終的に、mRNAを沈殿させ、注入バッファに溶解した。注入実験のためのアリコートを30ng/μlのpRosa26.3-3および15ng/μlのそれぞれのTalヌクレアーゼmRNAの濃度に調整した。マイクロインジェクションのための受精した卵母細胞を単離するために、C57BL/6系統のオスとFVB系統の過剰排卵メスを交配した。過剰排卵のために、3週齢のFVBメスを交配の2日前に2.5IU妊娠雌馬血清(PMS)および交配日に2.5IUヒトじゅう毛性ゴナドトロピン(hCG)で処理した。受精した卵母細胞をプラグ陽性(plug positive)メスの卵管から単離して、標準的な手法に従って(Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003. Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press)、M2培地(Sigma-Aldrich Inc Cat. No. M7167)中でpRosa26.8-2/ZFN mRNA調製物を前核および細胞質にマイクロインジェクションした。
【０１１５】
マイクロインジェクションした接合子を偽妊娠メスに移して、それをさらに生きたマウスに発生させた。マイクロインジェクションした接合子由来の成体マウスから、サザンブロット分析のためにゲノム尾部DNAを抽出した。サザンブロット分析のために、6μgのゲノムDNAを、30単位のBamHI制限酵素で30μlの容積中、一晩消化して、次いで10単位の酵素で2〜3時間、再消化した。試料を、TBEバッファ中の0.8%アガロースゲルに充填し、55Vで一晩泳動した。次いで、ゲルを1.5M NaCl；0.5M NaOH中で1時間変性させ、0.1M Tris HCl pH7.5；0.5M NaCl中で1時間中和して、2xSSCで洗浄し、20xSSCで、Hybond N+膜(GE Healthcare)に一晩ブロットした。次いで膜を2xSSCで洗浄して、UV架橋して、-20℃で保存した。ハイブリダイゼーションのために、膜を回転させながら65℃で1時間、Churchバッファ(1% BSA、1mM EDTA、0.5Mリン酸バッファ、7% SDS)中でプレインキュベートした。記載されるように(Hitz, C. Wurst, W., Kuehn, R. 2007. Nucleic Acids Res. 35, e90)、プラスミドpCRII-Rosa5'-プローブからRosa26 5'-プローブ(配列番号:31)を460bp EcoRIフラグメントとして単離した。Venusプローブとして、pCS2-venusから730bpのBamHI/EcoRIフラグメント(配列番号:32)として単離したvenusコーディング領域を使用した。ハイブリダイゼーションプローブとして使用したDNAフラグメントを熱変性して、ハイプライマーDNA標識キット(Roche)を使用してP32でマーキングしたdCTP(Perkin Elmer)で標識した。標識したプローブDNAをMicroSpinTM S-200 HRカラム(GE Healthcare)で精製し、熱変性して、ハイブリダイゼーションバッファに添加し、膜を65℃で一晩回転させた。洗浄バッファ(2xSSC、0.5% SDS)を65℃に予め温めて、振盪しながら65℃で膜を3回(5分、30分、15分)洗浄した。次いで、-80℃で膜をBiomax MS1フィルムに曝して、現像まで1〜5日間増強スクリーン(Kodak)に曝した。透過光ライトテーブルの上で、デジタルカメラ(Canon)でオートラジオグラフの写真を撮りAdobe Photoshopソフトウェアで断片を切り取った。
【０１１６】
BamHI消化尾部DNA試料を、Rosa26.3-3ベクターの5' Rosa26相同アームの上流に位置する標識したプローブを使用して、サザンブロット分析によりRosa26座での相同組換え事象について分析した。次いで、Rosa26野生型対立遺伝子は、5.8kbのバンドで認識され得、組み換えられたマウスは、3.1kbのさらなるバンドの存在で同定され得る。venusプローブおよびBamHI消化を使用して、3.9kbのバンドが検出可能である(図11)。
【０１１７】
このような実験において、pRosa26.3-3およびTalRosa mRNAの接合子共インジェクション由来の36pupsの尾部DNAにより、5.8kb野生型Rosa26断片とは別のさらなる等モル以下のバンドの存在で示される9個の組み換えられたRosa26対立遺伝子が存在することが明らかになった(図12)。これらの組換えられたRosa26対立遺伝子は、細胞の画分中にのみ存在し、予想される3.1kbのサイズの代わりに約3.9kbのサイズを生じると思われる。しかしながら、ターゲッティングベクターの相同領域の外側にあるRosa26 5'-プローブの使用により、これらのバンドの存在は、Rosa26での真の組換え活性を示す。全ての組み替えられた尾部試料は、venusハイブリダイゼーションプローブにより検出される予想される3.9kbのBamHIバンドの存在により示されるように、venusレポーター遺伝子の存在について陽性を示した(図12)。
【０１１８】
本発明者らは、本発明のTalヌクレアーゼは、受精した卵母細胞で活性であり、ターゲッティングベクターと内因性遺伝子座の相同組換えを容易にすると結論付ける。
【０１１９】
実施例3: 材料および方法
プラスミド構築物
遺伝子ターゲッティングベクターpRosa26.8-2(配列番号:6)は、pgk-ジフテリア毒素A遺伝子を含む1.6kb断片の除去によるベクターpRosa26.8由来のものである。この目的のために、pRosa26.8をEcoRIとKpnIで消化して、KlenowおよびT4 DNAポリメラーゼでの処理によりベクター末端を平滑にし、12.4kbベクター断片を再度連結した。pRosa26.8は、I-SceI認識部位の、5' Rosa26相同アームの上流に位置するSacII部位への挿入ならびに5'相同アームの下流のβ-ガラクトシダーゼおよびポリアデニル化シグナルのコーディングに連結されたスプライシングアクセプター因子の挿入によるpRosa26.1由来のものであった(Soriano P.; Nat Genet 1999; 21:70-71)。マウスRosa26座の第1のイントロン中の標的部位(配列番号:1)を認識するTal-フィンガーヌクレアーゼのための発現ベクターは、上述の実施例に記載される。
【０１２０】
マイクロインジェクションのためのDNAおよびRNAの調製
I-SecIでの消化によりプラスミドpRosa26.8-2を直鎖状にし、沈殿させ、注入バッファ(10mM Tris、0.1mM EDTA、pH7.2)に溶解する。注入のためのTalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼRNAを、直鎖状にした発現プラスミドを調製して、製造業者の使用説明書に従って、mMessage mMachineキット(Ambion)を使用してT7プロモーターから転写する。該mRNAを、Poly(A)テイリングキットを使用してポリAテイルの付加によりさらに改変し、AmbionのMegaClearカラムで精製する。最終的に、mRNAを沈殿させ、注入バッファに溶解する。注入実験のためのアリコートを、5ng/μlのpRosa26.8-2および2.5ng/μlのそれぞれのTalエフェクターDNA結合ドメイン-ヌクレアーゼ融合タンパク質mRNAの濃度に調整する。
【０１２１】
受精した卵母細胞の単離および注入
受精した卵母細胞を単離するために、C57BL/6系統のオスと、FVB系統の過剰排卵メスを交配する。過剰排卵のために3週齢のFVBメスを、交配の2日前に2.5IUの妊娠雌馬血清(PMS)および交配日に2.5IUのヒトじゅう毛性ゴナドトロピン(hCG)で処理する。受精した卵母細胞をプラグ陽性メスの卵管から単離し、標準的な手法に従って(Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003. Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press)、M2培地(Sigma-Aldrich Inc Cat. No. M7167)中で、pRosa26.8-2/Venus-TalRosa1/2-Fok-KK/EL mRNA調製物を1つの前核および細胞質にマイクロインジェクションする。
【０１２２】
胚のインビトロ培養およびX-Gal染色
β-ガラクトシダーゼ活性の検出のために、マイクロインジェクションした卵母細胞を、さらに3日間、KSOM培地(Millipore, Cat. No. MR-020-PD)中、37℃/5% CO2/5% O2で培養し、リン酸緩衝化食塩水(PBS)中の4%ホルムアルデヒド中で10分間固定する。PBSでの洗浄後、胚をX-Gal染色液(PBS中5mM K3(FeIII(CN)6)、5mM K4(FeII(CN)6)、2mM MgCl2、1mg/ml X-Gal(5-ブロモ-クロロ-3-インドイル-β-D-ガラクトピラノシド))に移し、37℃で24時間までインキュベートした。
【０１２３】
実施例4: Talヌクレアーゼの発現ベクターおよびレポーターベクターの構築ならびにヒト293細胞中の特異的ヌクレアーゼ活性の決定
Talヌクレアーゼ発現ベクターの構築
哺乳動物細胞中でのTalヌクレアーゼの発現のために、本発明者らは、BsmBI制限部位のペアの上流に位置するTalヌクレアーゼのN末端アミノ酸1〜176(配列番号:9)をコードする配列を含むCAGハイブリッドプロモーター領域および転写ユニットを含む、遺伝的(generic)発現ベクターpCAG-Tal-IX-Fok(配列番号:8)(図7)を設計した。このN末端領域は、ATG開始コドン、核局在化配列、FLAG Tag配列、グリシンリッチリンカー配列、Talタンパク質AvrBs3の110アミノ酸をコードするセグメントおよびHax3 Talエフェクターの不変N末端Talリピートを含む。中央BsmBI部位の下流で、転写ユニットは、不変C末端Talリピート(34アミノ酸)およびTalタンパク質AvrBs3由来の44残基を含む78個のコドン(配列番号:10)、続いてFokIヌクレアーゼドメインのコーディング配列(配列番号:11)およびポリアデニル化シグナル配列(bpA)を含む。Talヌクレアーゼ標的配列に結合するように設計されたTalリピートのアレイをコードするDNAセグメントは、予め設計されたTal-Fokヌクレアーゼタンパク質の発現を可能にする上流および下流のコーディング領域と共に、フレーム中でpCAG-Tal-IX-FokのBsBI部位に挿入され得る。
【０１２４】
哺乳動物細胞中での発現についてTalヌクレアーゼベクターを作製するために、本発明者らは、4個の異なるTalリピートのアレイ(図7A〜D)のコーディング領域を有する4個の合成DNAセグメントをpCAG-Tal-IX-FokのBsBHI部位に挿入した。4個の発現ベクターpCAG-ArtTal1-Fok(配列番号:12)、pCAG-AvrBs-Fok(配列番号:13)、TalRab1-Fok(配列番号:14)およびTalRab2-Fok(配列番号:15)は、TalヌクレアーゼArtTal1-Fok(配列番号:16)、AvrBs-Fok(配列番号:17)、TalRab1-Fok(配列番号:18)およびTalRab2-Fok (配列番号:19)を発現し得る。TalエレメントアレイArtTal1は人工DNA標的配列#1(図7A)を認識し、TalアレイAvrBsは天然AvrBs3 Talタンパク質の標的配列#2(図7B)を認識し、TalアレイTalRab1(図7B)およびTalRab2(図7B)は、マウスRab38遺伝子由来の標的配列#3および#4に結合する。Talヌクレアーゼタンパク質の結合領域がTヌクレオチドで始まるように4個の標的配列を選択した。5'>3'の方向に、最初のTの下流の配列に続いて、特異的Tal DNA結合ドメインが一緒に、12(ArtTal1)、17(AvrBs)、13(TalRab1)または14(TalRab2)のTal因子のアレイに結合された(図7)。
【０１２５】
Talヌクレアーゼレポータープラスミドの構築
哺乳動物細胞中の4個のTalヌクレアーゼの活性および特異性を決定するために、本発明者らは、それぞれが15個のヌクレオチドスペーサー領域で分離された逆方向の4個の標的配列のうち1つの2コピーを含む4個のTalヌクレアーゼレポータープラスミドを構築した(図8a〜d)。この配置は、レポータープラスミドの標的配列の逆向きのペアと結合する2つのタンパク質分子のホモダイマーとして相互作用する単一の型のTalヌクレアーゼの活性を測定し得る。DNA結合およびFokIヌクレアーゼドメインの相互作用の際に、レポータープラスミドDNA二本鎖は、15bpスペーサー領域中で切断され、二本鎖切断を生じる。
【０１２６】
Talヌクレアーゼレポータープラスミドは、CMVプロモーター領域、β-ガラクトシダーゼのN末端セグメントをコードする400bp配列および終止コドンを含む。このユニットには、ArtTal1-Fok(図8a)、AvrBs-Fok(図8b)、TalRab1-Fok(図8c)またはTalRab2-Fok(図8d)についてのTalヌクレアーゼ標的領域(15bpのスペーサー領域で分離される2つの逆方向の認識配列からなる)が続く。レポータープラスミドArtTal1-Fok-(配列番号:20)、AvrBs-Fok-(配列番号:21)、TalRab1-Fok-(配列番号:22)およびTalRab2-Fok-レポーター(配列番号:23)中、Talヌクレアーゼ標的領域には、β-ガラクトシダーゼおよびポリアデニル化シグナル(pA)の完全コーディング領域が続く。特定の標的配列に対するヌクレアーゼ活性を試験するために、Talヌクレアーゼ発現ベクター(図7)を一過的に、その対応するレポータープラスミドと一緒に哺乳動物細胞に共トランスフェクトした。Talヌクレアーゼタンパク質の発現の際に、Talヌクレアーゼ標的配列中のヌクレアーゼ誘導二本鎖切断によりレポータープラスミドは開環する(図8A)。二本鎖切断に隣接するDNA領域は、同一の400bpを超えるものであり、相同組換えDNA修復により、整列され、組み換えられ得る(図8B)。開環したレポータープラスミドの相同組換えは、続いて、CMVプロモーターから転写される機能的β-ガラクトシダーゼのコーディング領域を生じ、β-ガラクトシダーゼタンパク質の産生をもたらす(図8C)。トランスフェクトされた細胞の溶解物において、β-ガラクトシダーゼの酵素活性は、化学発光により決定され得る。
【０１２７】
ヒト293細胞におけるTalヌクレアーゼ活性および特異性の測定
哺乳動物細胞におけるTalヌクレアーゼの活性および特異性を決定するために、本発明者らは、100万個のHEK293細胞(ATCC #CRL-1573) (Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R., J. Gen. Virol. 36, 59-74, 1977)に、Talヌクレアーゼ発現ベクター(図7)の1つの5μgのプラスミドDNAと一緒に、Talヌクレアーゼレポータープラスミド(図8)の1つの5μgをエレクトロポレートした。また、それぞれの試料は、5μgのホタルルシフェラーゼ発現プラスミドpCMV-hLucを受け、pBluescript(pBS)プラスミドDNAで20μgの全DNA量に調整された。トランスフェクションの際に、細胞を、6ウェル組織培養プレートの3つのウェル中に播種し、分析を開始する前に2日間培養した。分析について、それぞれのウェルのトランスフェクトされた細胞を溶解し、製造業者の使用説明書(Roche Applied Science, Germany)に従いルミノメーター(Berthold Centro LB 960)中、化学発光レポーターアッセイを使用して、溶解物のβ-ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼ酵素活性を個々に決定した。陽性対照として、本発明者らは、5μgのβ-ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCMVβと15μgのpBSをトランスフェクトし、陰性対照として、5μgのpCMV-hLucと15μgのpBSまたは5μgのpCMV-hLucを、5μgのTalヌクレアーゼレポータープラスミドおよび10μgのpBSを一緒にトランスフェクトした。それぞれの試料の3つのβ-ガラクトシダーゼの値を、ルシフェラーゼ活性のレベルに対して標準化し、β-ガラクトシダーゼ活性の平均値および標準偏差を計算して、1.0と定義されたpCMVβ陽性対照と比較して表した(図9)。この型の組換えアッセイにおいて、β-ガラクトシダーゼで触媒された発光は、レポータープラスミドの切断および修復を反映するので、それによりTalヌクレアーゼの活性が示される。
【０１２８】
図9Aで示されるように、pCMV-hLucおよびArtTal1-Fok-またはAvrBs-Fok-レポータープラスミドのトランスフェクションにより、非常に低いバックグラウンドレベルのβ-ガラクトシダーゼが生じた。対照的に、pCAG-ArtTal1-FokとArtTal1-Fok-レポータープラスミドの共トランスフェクションおよびpCAG-AvrBs-FokとAvrBs-Fok-レポータープラスミドの共トランスフェクションは、TalヌクレアーゼArtTal1-FokおよびAvrBs-Fokのヌクレアーゼ活性を示すβ-ガラクトシダーゼ活性の30〜50倍の増加を生じた。さらに、図9Bに示すように、TalRab1-FokまたはTalRab2-Fokレポータープラスミドのトランスフェクションは、ヌクレアーゼ発現ベクターなしでは、ルシフェラーゼプラスミド単独のトランスフェクションと同等の低いバックグラウンドレベルのβ-ガラクトシダーゼを生じる。対照的に、pCAG-TalRab1-FokとTalRab1-Fok-レポータープラスミドおよびpCAG-TalRab2-FokとTalRab2-Fok-レポータープラスミドの共トランスフェクションは、TalヌクレアーゼTalRab1-FokおよびTalRab2-Fokのヌクレアーゼ活性を示す、β-ガラクトシダーゼ活性の大きな増加を生じた。
【０１２９】
まとめると、これらの結果は、4個のTalヌクレアーゼが哺乳動物細胞中での発現の際に強力なヌクレアーゼ活性を生じることを示す。
【０１３０】
観察されたTalヌクレアーゼ活性が対応するヌクレアーゼ標的配列に対して特異性を生じるかどうかを決定するために、本発明者らは、関係のない標的配列と比較して、それらの真性の標的配列に対するTalRab1-FokおよびTalRab2-Fokヌクレアーゼの活性を試験した。この目的のために、TalRab1-Fok-レポータープラスミドを単独で(pBSと共に)トランスフェクトしたか、TalRab1-Fokについての対応する発現ベクターと一緒にまたはTalRab2-Fok、ArtTal1-FokもしくはAvrBs-Fokについての発現ベクターと一緒に共トランスフェクトした。図10に示すように、ArtTal1-Fok発現ベクターとArtTAl1-Fokレポータープラスミドの特定の組合せにおいてのみで強力なヌクレアーゼ活性が生じた。逆に、TalRab1-Fok発現ベクターは、TalRab2-Fokレポータープラスミドに対してヌクレアーゼ活性を生じなかった。
【０１３１】
まとめると、これらの結果は、本発明のTalヌクレアーゼは、企図する標的配列に対して高度に特異的であり、関係のないDNA配列を切断しないことを示す。
【０１３２】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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