(57)【要約】  本発明は、トランスジェニック植物及び/又は植物細胞においてダイズサビ病菌に対する耐性を増加させる方法に関する。それらの植物において、ADR-1タンパク質の含有量及び/又は活性は、組換えADR-1遺伝子を含まない野生型植物と比較して増加する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物及び/又は植物細胞においてダイズサビ病菌耐性を増加させる方法であって、少なくとも一つのADR-1タンパク質の含有量及び/又は活性が、野生型植物及び/又は野生型植物細胞と比較して増加する方法。
【請求項２】
前記ADR-1タンパク質が、
(i)配列番号1、その機能的断片と少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％若しくは100％の同一性を有する組換え核酸及び/又はそのようなその核酸とハイブリダイズできる組換え核酸によりコードされる、並びに/或いは
(ii)配列番号2、その機能的断片、そのオルソログ及び/又はパラログと少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は100％の同一性を有するタンパク質である、
請求項1に記載の方法。
【請求項３】
(a)プロモーターと機能的に連結している、
(i)配列番号1及び/若しくはその機能的断片と少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％若しくは100％の同一性を有する組換え核酸及び/又はそのようなその核酸とハイブリダイズできる組換え核酸、並びに/或いは
(ii)配列番号2、その機能的断片、そのオルソログ及び/又はパラログと少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は100％の同一性を有するタンパク質をコードする組換え核酸
を含む発現カセットで植物細胞を安定に形質転換する工程と、
(b)前記植物細胞から植物を再生する工程と、
(c)前記植物においてダイズサビ病菌耐性を生成又は増加させるのに十分な量及び期間でADR-1タンパク質をコードする前記組換え核酸を発現させる工程と
を含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
(a)(i)配列番号1、その機能的断片と少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％若しくは100％の同一性を有する組換え核酸及び/又はそのような核酸とハイブリダイズできる核酸、並びに/或いは
(ii)配列番号2、その機能的断片、そのオルソログ及び/又はパラログと少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は100％の同一性を有するタンパク質をコードする組換え核酸
であって、以下と作動可能に連結している組換え核酸、
(b)プロモーター及び
(c)転写終結配列
を含む組換えベクター構築物。
【請求項５】
前記プロモーターが、構成的、病原体誘導性プロモーター及び/又は葉肉特異的プロモーターである、請求項3に記載の方法又は請求項4に記載のベクター構築物。
【請求項６】
請求項4又は5に記載のベクター構築物で形質転換されたトランスジェニックダイズ植物、トランスジェニック植物部分又はトランスジェニック植物細胞。
【請求項７】
ダイズサビ病菌に対して増加した耐性を有するトランスジェニック植物の生成方法であって、
(a)請求項4又は5に記載のベクター構築物を植物及び/又は植物細胞内に導入する工程と、
(b)前記植物細胞から植物を再生する工程と、
(c)(i)配列番号2、その機能的断片、そのオルソログ及び/又はパラログと少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は100％の同一性を有するタンパク質、並びに/或いは
(ii)配列番号1、その機能的断片と少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％若しくは100％の同一性を有する核酸及び/又はそのような核酸とハイブリダイズできる核酸によりコードされるタンパク質
を発現させる工程と
を含む方法。
【請求項８】
好ましくは種子である、請求項6に記載の植物の収穫可能な部分。
【請求項９】
好ましくはダイズミール及び/又はダイズ油である、請求項6に記載の植物、請求項7に記載の方法により生成可能な植物及び/又は請求項8に記載の植物の収穫可能な部分に由来する生成物。
【請求項１０】
生成物の生成方法であって、
a)請求項6に記載の植物又は請求項7に記載の方法により得ることが可能な植物を成長させる工程と、
b)本発明の植物及び/若しくはそれらの植物の部分、例えば種子から又はそれにより前記生成物を生成する工程と
を含む方法。
【請求項１１】
前記ダイズサビ病菌が、ファコプソラ・パキリジ及び/又はファコプソラ・メイボミエである、請求項1〜3、5、7のいずれか1項に記載の方法又は請求項6に記載の植物。
【請求項１２】
前記植物がダイズである、請求項1〜3、5、7若しくは11に記載の方法又は請求項6若しくは11に記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック植物及び/又は植物細胞においてダイズサビ病菌に対する耐性を増加させる方法に関する。それらの植物において、ADR-1タンパク質の含有量及び/又は活性は、組換えADR-1遺伝子を含まない野生型植物と比較して増加する。
【０００２】
更に、本発明は、ダイズサビ病菌に対して増加した耐性を有するトランスジェニック植物及び/又は植物細胞並びに機能的ADR-1遺伝子又はその断片をコードする配列と同一又は相同な配列を含む組換え発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００３】
農作物植物の栽培は主にヒト及び動物のための食料の生産に役立つ。特に、現今では一般的である単一栽培は伝染病のような疾患の蔓延の影響を受けやすい。その結果、生産量が著しく減少する。今まで、病原生物は主に殺虫剤を用いることにより抑制されてきた。現今では、植物又は病原体の遺伝的素質を直接修飾する可能性もまた、ヒトに利用されている。
【０００４】
耐性は通常、有害な病原体による感染及びコロニー形成を防止するか、又は少なくとも削減する、植物の能力を意味する。異なる機構が天然に生じる耐性において識別され得、その耐性により、植物は植物病原性生物によるコロニー形成を回避する。病原体と宿主との間のそれらの特異的相互作用は感染経過を決定する(Schopfer及びBrennicke(1999)Pflanzenphysiologie、Springer Verlag、Berlin-Heidelberg、独国)。
【０００５】
宿主耐性とも呼ばれる、系統特有の耐性に関して、適合性相互作用と不適合性相互作用の間で区別がなされる。適合性相互作用において、相互作用は毒性病原体と罹病性植物との間で生じる。病原体は生存し、再生構造を構築でき、一方で宿主はほとんど死滅する。他方で、病原体が植物に感染するが、その増殖が症状の弱い発生前又は後に阻害される場合、不適合性相互作用が生じる。後者の場合、植物はそれぞれの病原体に耐性がある(Schopfer及びBrennick、上記参照)。しかしながら、この種の耐性は特定の株又は病原体に特異的である。
【０００６】
適合性及び不適合性の両方の相互作用において、宿主の病原体に対する防御反応及び特異的反応が生じる。しかしながら、実際は、この耐性は多くの場合、病原体の新たな毒性系統の急速な進化的発生のために克服される(Neuら、(2003)American Cytopathol.Society、MPMI 16 No.7:626-633)。
【０００７】
大部分の病原体は植物種特異的である。これは、病原体が、他の植物種ではなく、特定の植物種において疾患を誘導し得ることを意味する(Heath(2002)Can.J.Plant Pathol.24:259-264)。特定の植物種において病原体に対する耐性は非宿主耐性と呼ばれる。非宿主耐性は、植物病原体からの強力、広範、且つ恒久的な防御を与える。非宿主耐性を提供する遺伝子は、非宿主植物における特定の疾患に対して強力、広範且つ恒久的な防御の機会を提供する。特にこのような耐性は病原体の異なる株に作用する。
【０００８】
菌は世界中に分布している。約100000種の異なる菌種が今まで知られている。サビ病菌は非常に重要である。それらは、五つまでの異なる胞子期(不動精子、サビ胞子、夏胞子、冬胞子及び担子胞子)で複雑な発生サイクルを有し得る。
【０００９】
病原菌による植物の感染の間、異なる段階が通常観察される。植物病原菌とそれらの潜在的な宿主植物との間の相互作用の第1の段階は、菌による植物のコロニー形成について決定的である。感染の第1期の間、胞子は、植物の表面に付着し、発芽し、菌が植物に侵入する。菌は、気孔、皮目、排水組織(hydatodes)及び創傷などの既存の出入り口を介して植物に侵入し得るか、又はそれらは、機械力の結果として、及び細胞壁消化酵素を用いて植物表皮に直接侵入し得る。特異的感染構造が植物の侵入のために発達する。ダイズサビ病菌であるファコプソラ・パキリジ(Phakopsora pachyrhizi)は植物表皮に直接侵入する。表皮細胞を横断した後、葉肉の細胞間隙に菌は到達し、そこで菌が葉に広がり始める。栄養素を獲得するために、菌は葉肉細胞に侵入し、葉肉細胞内部で吸器を発生させる。侵入プロセスの間、侵入した葉肉細胞の原形質膜はインタクトなままである。従って、ダイズサビ病菌はダイズとの生体栄養性相互作用を確立する。
【００１０】
多くのサビ病菌などの生体栄養性植物病原菌は、それらの栄養素に関して植物の生細胞の代謝に依存する。死体栄養性植物病原菌は、それらの栄養素に関して植物の死細胞に依存する。侵入した細胞が壊死になるとすぐに、ダイズサビ病菌は表皮に直接侵入するので、それは中間位置を占有する。侵入後、菌は強制的に生体栄養性のライフスタイルに変化する。本質的にこのような感染戦略に従う生体栄養性菌病原体のサブグループは、本発明の目的で、「ヘミネクロトロヒック(heminecrotrohic)」と称される。
【００１１】
ダイズサビ病菌は最近ますます重要となってきている。疾患は、病原体サビ病菌であるファコプソラ・パキリジ(Sydow)及びファコプソラ・メイボミエ(Phakopsora meibomiae)(Arthur)により引き起こされる場合がある。それらは、担子菌綱、サビ菌目、ファコプソラセア(Phakopsoraceae)科に属する。両方のサビ病菌は広範囲のマメ科宿主植物に感染する。アジア型サビ病菌とも称されるP.パキリジは、ダイズ(Glycine max)に対してより攻撃的な病原体であるので、少なくとも現在のところ、農業に関して非常に重要である。P.パキリジはほとんど全て世界の熱帯及び亜熱帯のダイズ生産地帯で見ることができる。P.パキリジは、自然条件下でマメ科の17科からの31種に感染でき、制御条件下で更に60種で増殖できる(Sinclairら(編)、Proceedings of the rust workshop(1995)、National SoyaResearch Laboratory、Publication No.1(1996);Rytter J.L.ら、Plant Dis.87、818(1984))。P.メイボミエはカリブ海沿岸及びプエルトリコに見出されており、今までのところ重大な被害をもたらしていない。
【００１２】
P.パキリジは、現在、殺菌剤のみにより野外で抑制できる。全範囲の分離株に対して耐性を有するダイズ植物は得られていない。耐性植物を探索して、ダイズのP.パキリジに対する耐性を媒介する、4種の優性遺伝子Rpp1〜4が発見された。P.パキリジが新たな毒性系統を発生させたため、耐性は急速に失われた。
【００１３】
ここ数年、菌性疾患、例えばダイズサビ病菌は、農業生産における悪疫として重要性を高めている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Schopfer及びBrennicke(1999)Pflanzenphysiologie、Springer Verlag、Berlin-Heidelberg、独国
【非特許文献２】Neuら、(2003)American Cytopathol.Society、MPMI 16 No.7:626-633
【非特許文献３】Heath(2002)Can.J.Plant Pathol.24:259-264
【非特許文献４】Sinclairら(編)、Proceedings of the rust workshop(1995)、National SoyaResearch Laboratory、Publication No.1(1996)
【非特許文献５】Rytter J.L.ら、Plant Dis.87、818(1984)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、従来技術において、菌を抑制し、菌耐性植物を提供する方法を開発することが要求されている。
【００１６】
多くの研究が植物の表皮層に感染するうどん粉病及びべと病の分野で実施されている。しかしながら、葉肉に感染するダイズサビ病菌に対処する問題は未解決のままである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
驚くべきことに、本発明者らは、シロイヌナズナ(Arabidopsis)由来のADR-1遺伝子の過剰発現がダイズサビ病菌に対する耐性を増加させることを見出した。
【００１８】
本発明の目的は、トランスジェニック植物及び/又はトランスジェニック植物細胞においてダイズサビ病菌に対する耐性を増加させる方法を提供することである。更なる目的は、ダイズサビ病菌に対する耐性があるトランスジェニック植物、そのような植物を生成する方法及び上記の方法に有用なベクター構築物を提供することである。この目的は主請求項の主題により達成される。本発明の好ましい実施形態は副請求項の特徴により定義される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】配列番号1を有するシロイロナズナ由来のADR-1遺伝子の完全長配列を示す図である。
【図２】ADR-1タンパク質の配列(配列番号2)を示す図である。
【図３】ADR-1遺伝子(配列番号3、5、7)上及びADR-1タンパク質(配列番号4、6、8)の異なるモチーフを示す図である。
【図４】本発明による有用な一つのベクター構築物の概略図である。
【図５−１】本発明による一つのベクター構築物の全ヌクレオチド配列（配列番号9）を示す図である。
【図５−２】図５−１の続きである。
【図５−３】図５−２の続きである。
【図６】サビ病菌P.パキリジに対する野生型及びトランスジェニック(ADR-1を発現する)ダイズ植物の罹患した葉の面積のレベルを決定するために使用される評価システムを示す図である。
【図７】ADR-1過剰発現ベクター構築物を発現する22のトランスジェニックダイズ植物の評価の結果を示す図である。ADR-1タンパク質を発現するT0ダイズ植物に、ファコプソラ・パキリジの胞子を接種した。全ての葉についての罹患した葉の面積の評価を接種から14日後に実施した。全ての葉について、菌のコロニーを示すか、又は強い黄変褐色化を示す葉の面積の割合の平均を罹患した葉の面積をみなした。全ての22のダイズにおいて、ADR-1を発現するT0植物(RT-PCRにより発現を検査した)を、非トランスジェニック対照植物と並行して評価した。罹患した葉の面積の中央値を図7に示す。ADR-1の過剰発現は、非トランスジェニック対照植物と比較して罹患した葉の面積を大いに減少させる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、本発明の好ましい実施形態及び本明細書に含まれる実施例の以下の詳細な説明を参照することにより、より迅速に理解され得る。他に示されない限り、本明細書で使用する用語は関連分野の当業者により従来の使用に従って理解される。本明細書に提供される用語の定義に加えて、分子生物学における一般用語の定義はまた、Riegerら、1991 Glossary of genetics:classical and molecular、第5版、Berlin:Springer-Verlag;及びCurrent Protocols in Molecular Biology、F.M.Ausubelら、編、Current Protocols、a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.、(1998補遺)にも見出され得る。明細書及び請求項に使用される場合、「一つ(a)」又は「一つ(an)」は、それが使用される文脈に応じて一つ又は複数を意味し得ることは理解される。従って、例えば、「一つの細胞」という言及は、少なくとも一つの細胞が利用できることを意味し得る。本明細書に使用される専門用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のものであり、制限することを意図していないことは理解される。
【００２１】
本明細書全体にわたって、種々の刊行物が参照される。それらの刊行物及びそれらの刊行物内に引用されるそれらの参考文献の全ての開示はその全体が、本発明に関連する技術分野をより完全に記載するために、本出願に参照として組み込まれる。クローニング、DNA単離、増幅及び精製について、DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどに関与する酵素反応についての標準的な技術、並びに種々の分離技術は当業者に公知であり、一般的に利用されているものである。多くの標準的な技術は、Sambrookら、1989 Molecular Cloning、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Plainview、N.Y.;Maniatisら、1982 Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory、Plainview、N.Y.;Wu(編)1993 Meth.Enzymol.218、Part I;Wu(編)1979 Meth Enzymol.68;Wuら、(編)1983 Meth.Enzymol.100 and 101;Grossman及びMoldave(編)1980 Meth.Enzymol.65;Miller(編)1972 Experiments in Molecular Genetics、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y.;Old及びPrimrose、1981 Principles of Gene Manipulation、University of California Press、Berkeley;Schleif及びWensink、1982 Practical Methods in Molecular Biology;Glover(編)1985 DNA Cloning Vol. I and II、IRL Press、Oxford、UK;Hames及びHiggins(編)1985 Nucleic Acid Hybridization、IRL Press、Oxford、UK;並びにSetlow及びHollaender 1979 Genetic Engineering:Principles and Methods、Vols.1-4、Plenum Press、New Yorkに記載されている。利用される場合、略語及び命名は当該技術分野において標準とみなされ、本明細書に引用されているものなどの専門誌において一般的に使用されている。
【００２２】
タンパク質の「相同体」は、対象となる非修飾タンパク質に対してアミノ酸置換、欠失及び/又は挿入を有し、且つ、それらが由来する非修飾タンパク質と類似した機能的活性を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び/又は酵素を包含する。
【００２３】
核酸の「相同体」は、対象となる非修飾核酸に対して核酸置換、欠失及び/又は挿入を有するヌクレオチド及び/又はポリヌクレオチドを包含し、そのような核酸によりコードされるタンパク質は、それらが由来する非修飾核酸によりコードされる非修飾タンパク質と類似した又はより高い機能的活性を有する。特に核酸の相同体は縮重アミノ酸コードに基づいた置換を包含する。
【００２４】
「欠失」とは、タンパク質からの一つ若しくは複数のアミノ酸の除去、又はDNA、ssRNA及び/若しくはdsRNAからの一つ若しくは複数の核酸の除去を指す。
【００２５】
「挿入」とは、タンパク質又は核酸内の所定の部位に導入されている一つ又は複数のアミノ酸残基又は核酸残基を指す。
【００２６】
「置換」とは、類似した特性(例えば、類似した疎水性、親水性、抗原性、αヘリックス構造又はβシート構造を形成又は分解する傾向)を有する他のアミノ酸とのタンパク質のアミノ酸の交換を指す。
【００２７】
核酸レベルにおいて、置換とは、他の核酸との核酸の交換を指し、ここで、修飾核酸によりコードされるタンパク質は類似した機能を有する。特に、核酸の相同体は縮重アミノ酸コードに基づいた置換を包含する。
【００２８】
アミノ酸置換は典型的に単一残基であるが、タンパク質に組み込まれる機能的制約に応じてクラスター化してもよく、1〜10個のアミノ酸の範囲であってもよく、挿入又は欠失は通常、約1〜10個のアミノ酸残基のオーダーである。アミノ酸置換は好ましくは保存的アミノ酸置換である。保存的置換の表は当該技術分野において周知である(例えばCreighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(編)及び以下の表1を参照のこと)。
【表１】
2013538053.tif 000002
【００２９】
アミノ酸置換、欠失及び/又は挿入は、例えば固相ペプチド合成などの当該技術分野において周知のペプチド合成技術を用いて、又は組換えDNA技術によって容易になされ得る。
【００３０】
タンパク質の置換、挿入又は欠失変異体を生成するためにDNA配列を操作する方法は当該技術分野において周知である。例えば、DNAの所定部位に置換突然変異を作製するための技術は当業者に周知であり、M13突然変異誘発、T7-遺伝子インビトロ突然変異誘発(USB、Cleveland、OH)、QuickChange部位特異的突然変異誘発(Stratagene、San Diego、CA)、PCR介在性部位特異的突然変異誘発又は他の部位特異的突然変異誘発プロトコルが含まれる。
【００３１】
オルソログ及びパラログは、遺伝子の祖先関係を説明するために使用される進化概念を包含する。パラログは先祖遺伝子の複製により生じた同じ種内の遺伝子であり、オルソログは種分化により生じた異なる生物由来の遺伝子であり、共通の祖先遺伝子由来でもある。
【００３２】
「ドメイン」という用語は、進化的に関連するタンパク質の配列のアラインメントに沿った特定の位置に保存されたアミノ酸のセットを指す。他の位置におけるアミノ酸は相同体の間で変化してもよいが、特定の位置において高度に保存されているアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性又は機能に不可欠である可能性が高いアミノ酸を示す。
【００３３】
例えば、SMART(Schultzら. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95、5857-5864; Letunicら(2002) Nucleic Acids Res 30、242-244)、InterPro(Mulderら、(2003) Nucl. Acids. Res. 31、315-318)、Prosite(Bucher及びBairoch (1994)、A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R.、Brutlag D.、Karp P.、Lathrop R.、Searls D.、編、pp53-61、AAAI Press、Menlo Park;Huloら、Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137、(2004))、又はPfam (Batemanら、Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002))などの専門的なデータベースがドメインの同定のために存在している。タンパク質配列のコンピュータによる解析のためのツールのセットが、ExPASyプロテオミクスサーバで利用可能である(Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteigerら、ExPASy:the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis、Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003))。ドメイン又はモチーフはまた、配列アラインメントなどによる慣用の技術を用いて同定してもよい。
【００３４】
比較のための配列アラインメントの方法は当該技術分野において周知であり、そのような方法には、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及びTFASTAが含まれる。GAPは、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する二つの配列のグルーバル(すなわち完全配列に及ぶ)アラインメントを見つけるためにNeedleman及びWunsch((1970)J Mol Biol 48:443-453)のアルゴリズムを使用する。BLASTアルゴリズム(Altschulら(1990)J Mol Biol215:403-10)は、配列同一性の割合を計算し、二つの配列間の類似性の統計的分析を実施する。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター(NCBI)により公衆に入手可能である。相同体は、例えば、デフォルトペアワイズアラインメントパラメータ、及びパーセンテージでのスコアリング法を用いる、ClustalW多配列アラインメントアルゴリズム(バージョン1.83)を使用して容易に同定され得る。類似性及び同一性のグローバルパーセンテージはまた、MatGATソフトウェアパッケージで利用可能な方法の一つを使用して決定してもよい(Campanellaら、BMC Bioinformatics.2003年7月10日;4:29.MatGAT:an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)。少しのマニュアルの編集を、当業者に明らかであるように、保存されたモチーフ間のアラインメントを最適化するために実施してもよい。更に、相同体を同定するための完全長配列を使用する代わりに、特定のドメインを使用してもよい。配列同一性の値は、デフォルトパラメータを使用する上述のプログラムを使用して、全核酸若しくはアミノ酸配列にわたって、又は選択されたドメイン若しくは保存されたモチーフ(複数も可)にわたって決定してもよい。ローカルアラインメントに関して、Smith-Watermanアルゴリズムが特に有用である(Smith TF、Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1);195-7)。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「ダイズサビ病菌耐性」、「ダイズサビ病菌に対する耐性がある」、「ダイズサビ病菌に耐性がある」、「サビ病菌耐性」、「サビ病菌に対する耐性がある」、「サビ病菌に耐性がある」、「菌耐性」、「菌に対する耐性がある」及び/又は「菌に耐性がある」という用語は、ダイズサビ病菌、特にファコプソラ・パキリジ(Sydow)及びファコプソラ・メイボミエ(Arthur)による感染を減少させるか又は予防することを意味する。「耐性」という用語はダイズ耐性を指す。耐性は、植物が感染に100％耐性があることを示すとは必ずしも限らない。好ましい実施形態において、耐性植物におけるダイズサビ病菌による感染に対する耐性は、ダイズサビ病菌に対する耐性がない野生型植物と比較して10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、又は95％より高い。好ましくは、野生型植物は、ダイズサビ病菌に対する増加した耐性を有する植物の遺伝子型と類似、より好ましくは同一の植物であるが、ADR-1遺伝子、その機能的断片及び/又はADR-1遺伝子とハイブリダイズできる核酸の組換え核酸を含まない。好ましくは、野生型植物は、ADR-1遺伝子、その機能的断片及び/又はADR-1遺伝子とハイブリダイズできる核酸の内因性核酸を含まない。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「ダイズサビ病菌耐性」、「ダイズサビ病菌に対する耐性がある」、「ダイズサビ病菌に耐性がある」、「サビ病菌耐性」、「サビ病菌に対する耐性がある」、「サビ病菌に耐性がある」、「菌耐性」、「菌に対する耐性がある」及び/又は「菌に耐性がある」という用語は、野生型植物と比較して、ダイズサビ病菌による感染を回避し、サビ病菌を殺傷し、ダイズサビ病菌の発生、成長及び/又は増殖を妨げ、減少させ、遅延させ、停止させる、植物の能力を指す。植物の菌耐性のレベルは、種々の方法、例えば、全体の葉の面積に対する感染した葉の面積をスコア付け/測定することにより決定され得る。耐性のレベルを決定する別の可能性は、植物におけるダイズサビ病菌のコロニーの数を計数すること、又はそれらのコロニーにより生産される胞子の量を測定することである。菌侵入の程度を決定する別の方法は、定量的(q)PCRによりサビ病菌DNAの量を具体的に測定することである。大部分の菌病原体についての特異的プローブ及びプライマー配列は文献において入手可能である(Frederick RD、Snyder CL、Peterson GLら、2002 Polymerase chain reaction assays for the detection and discrimination of the rust pathogens Phakopsora pachyrhizi and P-meibomiae PHYTOPATHOLOGY 92(2)217-227)。好ましくは、ダイズサビ病菌耐性は非宿主耐性である。非宿主耐性とは、植物が、ダイズサビ病菌病原体の菌株、好ましくはファコプソラ・パキリジの菌株の少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％及び好ましくは100％に対して耐性があることを意味する。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、「核酸分子の一つの鎖が塩基対合を介して相補鎖に結合する任意のプロセス」を含む(J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology、Stockton Press、New York)。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度(すなわち、核酸分子間の結合の強度)は、核酸分子間の相補性の程度、関わる条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのTm、及び核酸分子内のG:C比などの因子の影響を受ける。本明細書で使用する場合、「Tm」という用語は「融点」の意味で使用される。融点は2本鎖の核酸分子の集団が半分に解離して1本鎖になる温度である。核酸分子のTmを計算する式は当該技術分野において周知である。標準の参考文献に示されるように、核酸分子が1M NaClの水溶液中に含まれる場合、Tm値の単純な計算は式:Tm=81.5+0.41(％ G+C)により計算し得る[例えば、Anderson及びYoung、Quantitative Filter Hybridization、in Nucleic Acid Hybridization (1985)を参照のこと]。他の参考文献は、構造並びに配列の特徴を考慮に入れてTmを計算する更に複雑な計算を含む。ストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、N.Y. (1989)、6.3.1-6.3.6に見出され得る。
【００３８】
特に、ストリンジェンシー条件という用語は、相補的核酸分子(DNA、RNA、ssDNA又はssRNA)に対する断片又はそれと同一である100個の連続ヌクレオチド若しくはそれ以上、150個の連続ヌクレオチド若しくはそれ以上、200個の連続ヌクレオチド若しくはそれ以上、又は250個の連続ヌクレオチド又はそれ以上が、特定の核酸分子(DNA、RNA、ssDNA又はssRNA)と、50℃又は65℃、好ましくは65℃での2×SSC、0.1％SDS中での洗浄を伴う50℃での7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTAにおけるハイブリダイゼーションと等価な条件下でハイブリダイズする条件を指す。好ましくは、ハイブリダイズ条件は、50℃又は65℃、好ましくは65℃での1×SSC、0.1％SDS中での洗浄を伴う50℃での7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTAにおけるハイブリダイゼーションと等価であり、より好ましくはハイブリダイズ条件は、50℃又は65℃、好ましくは65℃での0.1×SSC、0.1％SDS中での洗浄を伴う50℃での7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTAにおけるハイブリダイゼーションと等価である。好ましくは、相補的ヌクレオチドは断片又は全ADR-1遺伝子とハイブリダイズする。好ましくは、相補的ポリヌクレオチドはダイズサビ病菌耐性を提供することができるADR-1遺伝子の部分とハイブリダイズする。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「ADR-1遺伝子」という用語は、配列番号1と、又は配列番号2及び/又はその機能的断片と少なくとも60％の同一性を有するタンパク質をコードする配列と少なくとも60％の同一性を有する遺伝子を指す。一実施形態において、ADR-1遺伝子の相同体は、DNAレベル及び/又はタンパク質レベルにおいて、本明細書に具体的に開示される配列及び/又はその機能的断片において与えられる全DNA領域又はタンパク質領域に対して、少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、特に好ましくは少なくとも90％、かなり特に好ましくは少なくとも95％、かなり特に好ましくは少なくとも98％又は100％の同一性を有する。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「ADR-1タンパク質」という用語は、配列番号2及び/又はその断片を有するタンパク質をコードする配列と少なくとも60％の同一性を有するタンパク質を指す。一実施形態において、ADR-1タンパク質の相同体は、本明細書に具体的に開示される配列及び/又はその機能的断片において与えられる全タンパク質領域にわたって少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、特に好ましくは少なくとも90％、かなり特に好ましくは少なくとも95％、かなり特に好ましくは少なくとも98％又は100％の同一性を有する。
【００４１】
二つの核酸間の「同一性」又は「相同性」は、各々の場合、核酸の全長に対して言及するものである。
【００４２】
例えば、同一性は、以下の設定でClustal法(Higgins DG、Sharp PM.Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Cmoput Appl.Biosci.1989 Apr;5(2):151-1)を利用するInformax社(USA)のVector NTI Suite 7.1プログラムにより計算され得る:
マルチプルアラインメントパラメータ:
ギャップ開始ペナルティ                10
ギャップ伸長ペナルティ                10
ギャップ分離ペナルティ範囲            8
ギャップ分離ペナルティ                オフ
アラインメント遅延に対する同一性％    40
残基特異的ギャップ                    オフ
親水性残基ギャップ                    オフ
トランジション重み付け                0
ペアワイズアラインメントパラメータ:
FASTアルゴリズム                      オン
K-tupleサイズ                          1
ギャップペナルティ                      3
ウインドウサイズ                        5
ベストダイアゴナルの数                  5
代替として同一性は、Chenna,Ramu、Sugawara,Hideaki、Koike,Tadashi、Lopez,Rodrigo、Gibson,Toby J、Higgins,Desmond G、Thompson,Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500、ウェブページ:http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#及び以下の設定に従って決定し得る:
DNAギャップ開始ペナルティ              15.0
DNAギャップ伸長ペナルティ              6.66
DNAマトリクス                          同一(identity)
タンパク質ギャップ開始ペナルティ        10.0
タンパク質ギャップ伸長ペナルティ        0.2
タンパク質マトリクス                    Gonnet
タンパク質/DNA ENDGAP                -1
タンパク質/DNA GAPDIST                4
本明細書に述べた全ての核酸配列(一本鎖及び二本鎖のDNA及びRNA配列、例えばcDNA及びmRNA)は、ヌクレオチド構成要素から化学合成により、例えば、個々の重複する、二重螺旋の相補的核酸構成要素の断片縮合により、公知の方法で作製できる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホアミダイト法により公知の方法で実施できる(Voet、Voet、第2版、Wiley Press、New York、896-897ページ)。合成オリゴヌクレオチドの蓄積及びDNAポリメラーゼのKlenow断片によるギャップの充填及びライゲーション反応並びに一般的クローニング技術は、Sambrookら(1989)(下記を参照のこと)に記載されている。
【００４３】
本発明による有用な核酸と、ADR-1遺伝子との間の配列同一性は、配列比較及び当該技術分野において公知のアラインメントアルゴリズム(Gribskov及びDevereux、Sequence Analysis Primer、Stockton Press、1991及びそれに引用されている参考文献を参照のこと)により最適化してもよく、例えば、デフォルトパラメータを使用するBESTFITソフトウェアプログラム(例えば、University of Wisconsin Genetic Computing Group)において実施されるようなSmith-Watermanアルゴリズムによるヌクレオチド配列間の相違の割合を計算する。配列番号1を有する核酸との少なくとも60％の配列同一性、好ましくは少なくとも70％の配列同一性、80％、90％、95％、98％の配列同一性、又は更に100％の配列同一性が好ましい。
【００４４】
「植物」という用語は、他に明確に文脈に示さない限り、任意の成熟段階又は発生段階にある植物、並びに任意のこのような植物から得られるか又は由来する任意の組織又は器官(植物部分)を包含することを意図する。植物部分には、限定されないが、植物細胞、茎、根、花、胚珠、雄しべ、種子、葉、胚、分裂組織部位、カルス組織、葯培養物、配偶体、胞子体、花粉、小胞子、プロトプラスト、毛状根培養物などが含まれる。本発明はまた、本発明の植物により生成された種子を含む。好ましくは、種子は組換えADR-1遺伝子を含む。一実施形態において、種子は、植物種子の野生型種類と比較して菌感染に対する増加した耐性について何世代にもわたって同じ特徴を示す。本明細書で使用する場合、「植物細胞」には、限定されないが、プロトプラスト、配偶子産生細胞、及び全植物に再生する細胞が含まれる。植物の種々の組織の組織培養及びそれら由来の植物の再生は当該技術分野において周知であり、広く公開されている。
【００４５】
本明細書において「内因性ADR-1遺伝子」という言及は、その天然の形態で(すなわち、あらゆるヒトの介入を有さない)植物に見出される対象の遺伝子を指す。組換えADR-1遺伝子は、後で植物に(再)導入される(導入遺伝子)単離形態における同じ遺伝子(又は実質的に相同の核酸/遺伝子)を指す。例えば、このような導入遺伝子を含有するトランスジェニック植物は内因性遺伝子の発現に加えて導入遺伝子発現の実質的な増加を生じ得る。単離遺伝子は生物から単離してもよいか、又は例えば化学合成による人工のものであってもよい。本発明によるトランスジェニック植物は任意の遺伝子座に組み込まれる組換えADR-1遺伝子を含み、場合により植物はまた、天然の遺伝子バックグラウンド内にその内因性遺伝子を含んでもよい。好ましくは、植物は内因性ADR-1遺伝子を含まない。
【００４６】
本発明の目的で、例えば、ADR-1遺伝子を含む核酸配列、発現カセット又はベクター構築物に関して、「組換え」とは、遺伝子技術的方法(gentechnological method)によりもたらされる全てのそれらの構築物であって、
(a)ADR-1タンパク質をコードするADR-1配列、又は
(b)本発明によるADR-1核酸配列に作動可能に連結される遺伝子制御配列(複数も可)、例えばプロモーター、又は
(C)a)及びb)
のいずれかが、それらの天然の遺伝子環境に位置しないか、又は遺伝子技術的方法により修飾されている、構築物を意味する。修飾は、例えば、一つ又は複数の核酸残基の置換、付加、欠失、逆位又は挿入の形態をとってもよい。天然遺伝子環境は、元の植物における天然ゲノム若しくは染色体座又はゲノムライブラリーにおける存在又は天然プロモーターとの組合せを意味すると理解される。
【００４７】
ゲノムライブラリーの場合、核酸配列の天然の遺伝子環境は好ましくは少なくとも部分的に保持される。環境は少なくとも一つの側において核酸配列に隣接し、少なくとも50bp、好ましくは少なくとも500bp、特に好ましくは少なくとも1000bp、最も好ましくは少なくとも5000bpの配列長を有する。
【００４８】
天然に生じる発現カセット、例えば核酸配列の天然のプロモーターと、上に定義した本発明の方法に有用なタンパク質をコードする対応する核酸配列との天然に生じる組合せは、この発現カセットが、例えば突然変異誘発処理などの非天然の合成(「人工」)法により修飾される場合、組換え発現カセットになる。適切な方法は例えば米国特許第5,565,350号又はWO00/15815に記載されている。更に、天然に生じる発現カセット、例えば核酸配列の天然プロモーターと、上に定義した本発明の方法に有用なタンパク質をコードする対応する核酸配列との天然に生じる組合せは、この発現カセットが天然の遺伝子環境に組み込まれないが、異なる遺伝子環境に組み込まれる場合、組換え発現カセットになる。
【００４９】
更に、本発明の文脈において、「単離核酸」又は「単離タンパク質」という用語は、一部の場合において、「組換え核酸」又は「組換えタンパク質」のそれぞれに対する同義語とみなしてもよく、その天然の遺伝子環境に位置しない、及び/又は遺伝子技術方法(gentechnical method)により修飾されている核酸又はタンパク質を指すことに留意されたい。
【００５０】
従って、本発明の目的でのトランスジェニック植物は、ADR-1核酸が元の植物のゲノムに存在しない、及び/又は元の植物のゲノムのそれらの天然の遺伝子座ではない、元の植物若しくは他の植物のゲノムに存在することを意味すると理解される。天然の遺伝子座は、特定染色体上の位置、好ましくは特定遺伝子の間の位置、より好ましくは元の植物と同じ配列バックグラウンドを意味する。核酸は同種的又は異種的に発現できる。トランスジェニックは好ましくは、元の植物にはない及び/又はゲノムにおける非天然の遺伝子座での本発明による核酸の発現、すなわち核酸の異種発現が起こることを意味すると理解される。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「トランスジェニック」という用語は好ましくは、それらの天然の遺伝子座にないADR-1遺伝子の全て又は一部を含有する、任意の植物、植物細胞、カルス、植物組織、又は植物部分を指す。好ましくは、ADR-1遺伝子の全て又は一部は、染色体又は安定な染色体外エレメントに安定に組み込まれ、そのため、それは継続的に世代に伝わる。
【００５２】
「発現」又は「遺伝子発現」又は「含有量の増加」という用語は、一つの特異的遺伝子又は複数の特異的遺伝子又は特異的遺伝子ベクター構築物の転写を意味する。「発現」又は「遺伝子発現」という用語は特に、一つの遺伝子又は複数の遺伝子又は遺伝子ベクター構築物の、構造的RNA(rRNA、tRNA)又はmRNA内への転写を意味し、タンパク質へのmRNAの後の翻訳があるか又はない。そのプロセスは、DNAの転写及び得られるmRNA産物のプロセシングを含む。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「増加した発現」又は「過剰発現」又は「含有量の増加」という用語は、元の野生型の発現レベルに付加される発現の任意の形態を意味する。本発明の目的で、元の野生型発現レベルはまた、ゼロ(発現がない)であってもよい。
【００５４】
遺伝子又は遺伝子産物の発現を増加させる方法は、当該技術分野において十分に証明されており、例えば、適切なプロモーターにより駆動される過剰発現、転写エンハンサー又は翻訳エンハンサーの使用が含まれる。プロモーター又はエンハンサーエレメントとして機能する単離核酸は、目的のタンパク質をコードする核酸の発現を上方制御するようにポリヌクレオチドの非異種形態の適切な位置(典型的に上流)に導入してもよい。例えば、内因性プロモーターは、突然変異、欠失、及び/若しくは置換によりインビボで変化してもよい(Kmiec、米国特許第5,565,350号;Zarlingら、WO9322443を参照のこと)か、又は単離プロモーターは、遺伝子の発現を制御するように適切な配向及び本発明の遺伝子からの距離で植物細胞に導入してもよい。
【００５５】
タンパク質発現が望まれる場合、一般に、ポリヌクレオチドコード領域の3’末端にポリアデニル化領域を含むことが望ましい。ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子から、種々の他の植物遺伝子から、又はT-DNAから誘導することができる。付加される3’末端配列は、例えば、ノパリンシンターゼ又はオクトピンシンターゼ遺伝子から、又は代替として別の植物遺伝子から、又はあまり好ましくないが任意の他の真核遺伝子から誘導してもよい。
【００５６】
イントロン配列はまた、細胞質基質に蓄積する成熟メッセージの量を増加させるために5’非翻訳領域(UTR)及び/又は部分コード配列のコード配列に付加してもよい。植物及び動物発現構築物の両方における転写単位にスプライス可能なイントロンを含めることは、mRNA及びタンパク質レベルの両方において1000倍まで遺伝子発現を増加させることが示されている(Buchman及びBerg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callisら  (1987) Genes Dev 1:1183-1200)。典型的に、遺伝子発現のこのようなイントロン増強は、転写単位の5’末端に近接して配置される場合、最大になる。トウモロコシイントロンAdh1-Sイントロン1、2及び6、Bronze-1イントロンの使用は当該技術分野において公知である。一般的な情報に関しては、The Maize Handbook、Chapter 116、Freeling及びWalbot、編、Springer、N.Y.(1994)を参照のこと。
【００５７】
「機能的断片」という用語は、完全長核酸及び/又は完全長タンパク質の一部のみを含むが、依然として同じ機能、すなわち植物において発現する場合、ダイズサビ病菌耐性を提供する、任意の核酸及び/又はタンパク質を指す。好ましくは、断片は、元の配列の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％を含む。好ましくは、機能的断片は、元の核酸及び/又は元のタンパク質におけるような連続核酸又はアミノ酸を含む。
【００５８】
一実施形態において、ADR-1核酸の断片は、ADR-1遺伝子に対して少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも1500、少なくとも2000ヌクレオチドの長さにわたって上に定義したような同一性を有する。
【００５９】
この文脈において「類似機能活性」又は「類似機能」という用語は、任意の相同体及び/又は断片が、植物において発現する場合、ダイズサビ病菌耐性を提供することを意味する。好ましくは、類似機能活性とは、ADR-1ヌクレオチド配列の配列番号1の組換え発現及び/又は組換えADR-1タンパク質配列の配列番号2により提供される機能活性と比較して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％又はそれ以上のダイズサビ病菌耐性を意味する。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「増加した活性」という用語は、増加した活性を有する任意のタンパク質が、単に内因性ADR-1遺伝子を発現するだけである野生型植物と比較して増加したダイズサビ病菌耐性を提供することを意味する。本発明の目的で、元の野生型発現レベルはまた、ゼロ(発現がない)であってもよい。
【００６１】
本明細書で言及する場合、「導入」又は「形質転換」という用語は、移入に使用される方法に関係なく、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞内への移入を包含する。器官形成によるか又は胚形成によるかに関係なく、後でクローン増殖できる植物組織は、本発明のベクター構築物で形質転換でき、そこから全植物が再生される。選択される特定の組織は、形質転換される特定の種に利用可能であり、且つ最適であるクローン増殖系に応じて変化する。例示的な組織標的には、葉ディスク、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存の分裂組織(例えば頂端分裂組織、腋芽及び根分裂組織)、及び誘導分裂組織(例えば子葉分裂組織及び胚軸分裂組織)が含まれる。ポリヌクレオチドは、一過的又は安定に宿主細胞内に導入してよく、例えばプラスミドとして組み込まれずに維持してもよい。或いは、それは宿主ゲノム内に組み込まれてもよい。次いで、当業者に公知の方法で、得られた形質転換植物細胞を使用して形質転換植物を再生し得る。
【００６２】
「ターミネーター」という用語は、一次転写産物の3’プロセシング及びポリアデニル化並びに転写の終了のシグナルとなる転写単位の末端におけるDNA配列である制御配列を包含する。ターミネーターは天然遺伝子、様々な他の植物遺伝子、又はT-DNAに由来し得る。付加されるターミネーターは、例えばノパリンシンターゼ若しくはオクトピンシンターゼ遺伝子、又は代替的に別の植物遺伝子、又はあまり好ましくないが任意の他の真核遺伝子に由来し得る。
【００６３】
トランスジェニック植物細胞は、上記ベクター構築物のうちの一つで形質転換し得る。植物細胞を含む宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする適切な方法は植物バイオテクノロジーの分野において周知である。組換え発現ベクターを植物細胞内に形質転換して、本発明のトランスジェニック植物を得るために任意の方法を使用し得る。双子葉(dicotyledenous)植物を形質転換するための一般的方法は、例えば、米国特許第4,940,838号;同第5,464,763号などに記載されている。特定の双子葉植物、例えば綿を形質転換するための方法は、米国特許第5,004,863号;同第5,159,135号;及び同第5,846,797号に説明されている。ダイズ形質転換法は、米国特許第4,992,375号;同第5,416,011号;同第5,569,834号;同第5,824,877号;同第6,384,301号に説明されており、EP0301749(B1)において使用され得る。形質転換法は、形質転換の直接及び間接法を含んでもよい。好適な直接法には、ポリエチレングリコール誘導性DNA取込み、リポソーム介在性形質転換(米国特許第4,536,475号)、遺伝子銃を使用する微粒子銃の方法(Fromm MEら、Bio/Technology. 8(9):833-9、1990; Gordon-KammらPlant Cell 2:603、1990)、エレクトロポレーション、DNA含有溶液における乾燥胚のインキュベーション、及びマイクロインジェクションが含まれる。これらの直接形質転換法の場合、使用されるプラスミドは任意の特定の要件を満たさなくてもよい。pUCシリーズ、pBR322、M13mpシリーズ、pACYC184などの単純なプラスミドを使用してもよい。インタクトな植物が形質転換細胞から再生される場合、追加的な選択可能マーカー遺伝子が好ましくはプラスミドに入れられる。直接形質転換技術は同様に双子葉植物及び単子葉植物に好適である。
【００６４】
形質転換はまた、アグロバクテリウム(Agrobacterium)(例えばEP0116718)による細菌感染、ウイルスベクターによるウイルス感染(EP0067553;米国特許第4,407,956号;WO95/34668;WO93/03161)又は花粉(EP0270356;WO85/01856;米国特許第4,684,611号)により実施することができる。アグロバクテリウムに基づいた形質転換技術(特に双子葉植物に関して)は当該技術分野において周知である。アグロバクテリウム株(例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)又はアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes))は、プラスミド(Ti又はRiプラスミド)、及びアグロバクテリウムによる感染後に植物に移入されるT-DNAエレメントを含む。T-DNA(移入されたDNA)は植物細胞のゲノムに組み込まれる。T-DNAは、Ri-又はTi-プラスミドに局在化してもよいか、又はいわゆるバイナリーベクターに別個に含まれる。アグロバクテリウムが介在する形質転換法は、例えばHorsch RBら(1985)Science225:1229に記載されている。アグロバクテリウムが介在する形質転換は双子葉植物に最適であるが、単子葉植物にも適合されている。アグロバクテリウムによる植物の形質転換は、例えばWhite FF、Vectors for Gene Transfer in Higher Plants、Transgenic Plants、Vol. 1、Engineering and Utilization、S.D. Kung及びR. Wuにより編纂、Academic Press、1993、pp.15-38;Jenes Bら  Techniques for Gene Transfer、Transgenic Plants、Vol. 1、Engineering and Utilization、S.D. Kung及びR. Wuにより編纂、Academic Press、1993、pp.128-143;Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225に記載されている。形質転換により一過的又は安定な形質転換及び発現が生じ得る。本発明のヌクレオチド配列は、広範な綱内の任意の植物及び植物細胞に挿入してもよいが、それは作物細胞に特に有用である。遺伝子操作された植物細胞は、熟練した作業者によく知られている全ての方法により再生することができる。好適な方法は、S.D. Kung及びR. Wu、Potrykus又はHofgen及びWillmitzerによる上述の刊行物に見出され得る。
【００６５】
一般に形質転換後、植物細胞又は細胞集団は、対象の遺伝子とともに同時移入された植物が発現可能な遺伝子によりコードされる一つ又は複数のマーカーの存在に対して選択され、その後、形質転換された材料が全植物に再生される。形質転換植物を選択するために、形質転換において得られる植物材料は、概して、形質転換植物が非形質転換植物から識別できるような選択条件に供される。例えば、上記の方法で得られる種子を植え付け、初期の成長期の後、噴霧により好適な選択に供され得る。更なる可能性は、適切な場合、滅菌後、形質転換種子のみが植物に成長できるように好適な選択剤を使用して寒天プレートで種子を成長させることにある。代替として、形質転換植物は、上記のもののように選択可能なマーカーの存在についてスクリーニングされる。
【００６６】
DNA移入及び再生後、推定上の形質転換植物もまた、対象の遺伝子の存在、コピー数及び/又はゲノム構成について、例えばサザン解析を用いて評価し得る。その代替として又はそれに加えて、新しく導入されたDNAの発現レベルは、ノーザン及び/又はウェスタン解析を使用してモニターしてもよく、両方の技術は当業者に周知である。
【００６７】
生成した形質転換植物は、クローン増殖又は古典的育種技術などによる種々の手段により増殖させてもよい。例えば、第1の世代(すなわちT1)の形質転換植物を自家受粉して、ホモ接合性の第2の世代(すなわちT2)の形質転換体を選択してもよく、次いでT2植物を古典的育種技術により更に増殖させてもよい。生成した形質転換生物は種々の形態をとってもよい。例えば、それらは、形質転換細胞及び非形質転換細胞のキメラ;クローン形質転換体(例えば、発現カセットを含むように形質転換した全ての細胞);形質転換及び非形質転換組織の接ぎ木(例えば、植物において、形質転換台木が非形質転換接ぎ穂に接ぎ木される)であってもよい。
【００６８】
本発明は、植物及び/又は植物細胞においてサビ病菌耐性を増加させる方法であって、少なくとも一つのADR-1タンパク質の含有量及び/又は活性が、野生型植物及び/又は植物細胞と比較して増加する方法を提供する。
【００６９】
その方法の一実施形態において、ADR-1タンパク質は、配列番号1、その機能的断片と少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％の同一性若しくは100％の同一性を有する組換え核酸及び/又はそのような核酸とハイブリダイズできる核酸によりコードされるタンパク質、並びに/或いは配列番号2、その機能的断片、そのオルソログ及び/又はパラログと少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％の同一性又は100％の同一性を有するタンパク質である。
【００７０】
一実施形態において、その方法は、
(a)(i)プロモーターと機能的に連結している配列番号1及び/若しくはその機能的断片と少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％の同一性若しくは100％の同一性を有する組換え核酸配列、並びに/又は
(ii)配列番号2、その機能的断片、そのオルソログ及び/若しくはパラログと少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％の同一性若しくは100％を有するタンパク質をコードする組換え核酸
を含む発現カセットで植物細胞を安定に形質転換する工程と、
(b)前記植物細胞から植物を再生する工程と、
(c)前記植物においてダイズサビ病菌耐性を生成又は増加させるのに十分な量及び時間でADR-1タンパク質をコードする前記核酸配列を発現させる工程と
を含む。
【００７１】
一実施形態において、植物は、インゲンマメ(Phaseolus)の属(サヤインゲン(French bean)、ドワーフビーン(dwarf bean)、クライミングビーン(climbing bean)(ファセオラス・ブルガリス(Phaseolus vulgaris))、ライマメ(Lima bean)(ファセオラス・ルナタスL.(Phaseolus lunatus L.))、テパリービーン(Tepary bean)(ファセオラス・アクチフォリウスA.Gray(Phaseolus acutifolius A.Gray))、ベニバナインゲン(runner bean)(ファセオラス・コシネウス(Phaseolus coccineus))を含む);ダイズ属(ツルマメ(Glycine soja)、ダイズ(グリシン・マックス(L.)メリル(Glycine max(L.)Merill))を含む);エンドウマメ(エンドウ属(Pisum))(しわのない又は丸い種子のエンドウマメとも呼ばれている、皮をむいているエンドウマメ(ピサム・サチバムL.コンバー.サチバム(Pisum sativum L.convar.sativum))を含む);マローファットエンドウマメ(ピサム・サチバムL.コンバー.メデュラレ・アレフ.エメンド.C.O.レーム(Pisum sativum L.convar.medullare Alef.emend.C.O.Lehm))、サヤエンドウ(snow pea)とも呼ばれる、サヤエンドウ(sugar pea)(ピサム・サチバムL.コンバー.アキィフィウム・アレフ・エメンド.C.O.レーム(Pisum sativum L. convar. axiphium Alef emend. C.O. Lehm))、食用のサヤエンドウ(edible-podded pea)又は絹さや(ピサム・グランダ・スネイダL.コンバー.スネイデュロp.スネイデリウム(Pisum granda sneida L.convar.sneidurium));ピーナッツ(アラキス・ヒポガエア(Arachis hypogaea))、クローバー(ジャジクソウ属の種(Trifolium spec.))、メディック(medick)(ウマゴヤシ属(Medicago))、クズ(kudzu vine)(プエラリア・ロバタ(Pueraria lobata))、一般的なルーサン(common lucerne)、アルファルファ(alfalfa)(M.サチバ.L.(M.sativa L.))、ヒヨコマメ(chickpea)(ヒヨコマメ属(Cicer))、レンズマメ(lentil)(レンズ(Lens)(レンズ・クリナリス・メディック.(Lens culinaris Medik.)))、ハウチワマメ(lupin)(ルピナス(Lupinus));ベッチ(vetch)(ソラマメ(Vicia))、フィールドビーン(field bean)、ブロードビーン(broad bean)(ビチア・ファバ(Vicia faba))、レンリソウ(vetchling)(ラチラス属(Lathyrus))(ガラスマメ(chickling pea)(ラチラス・サチバス(Lathyrus sativus))、ヒースエンドウ(heath pea)(ラチラス・ツベロサス(Lathyrus tuberosus))を含む);ササゲ属(モスビーン(moth bean)(ビグナ・アコニチフォリア(Jacq.)マレシャル)(Vigna aconitifolia(Jacq.)Marechal)、アズキ(adzuki bean)(ビグナ・アングラリス(Willd.)オフィ& H.オオハシ(Vigna angularis(Willd.)Ohwi & H.Ohashi))、ウルドビーン(urd bean)(ビグナ・ムンゴ(L.)ヘッパー(Vigna mungo(L.)Hepper))、ヤエナリ(mung bean)(ビグナ・ラジアタ(L.)R.ウィルクゼク(Vigna radiata(L.)R.Wilczek))、フタゴマメ(bambara groundnut)(ビグナ・サブテラン(L.)バードク(Vigna subterrane(L.)Verdc.))、ツルアズキ(rice bean)(ビグナ・アンベラタ(サンブ.)オフィ&H.オオハシ(Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi & H. Ohashi))、ビグナ・ベキシラタ(L.)A.リッチ.(Vigna vexillata(L.)A.Rich.)、三つの亜種のジュウロクササゲ(asparagus bean)、ササゲ(cowpea)、ハタササゲ(catjang bean)におけるビグナ・ウングイクラタ(L.)ワルプ.(Vigna unguiculata(L.)Walp.))を含む);キマメ(pigeonpea)(カジャナス・カジャン(L.)ミル種(Cajanus cajan(L.)Millsp.))、マクロチロマ(Macrotyloma)の属(ゼオカルパマメ(geocarpa groundnut)(マクロチロマ・ゼオカルパム(ハームス)マレシャル&バウデット(Macrotyloma geocarpum(Harms)Marechal & Baudet))、ソラマメ(horse bean)(マクロチロマ・ユニフォルム(ラム.)バードク.(Macrotyloma uniflorum(Lam.)Verdc.))を含む);シカクマメ(goa bean)(ホスホカルパス・テトラゴノロブス(L.)DC.(Psophocarpus tetragonolobus(L.)DC.))、アフリカヤムビーン(African yam bean)(スフェノスチリス・ステノカルパ(ヘースト.ex A.リッチ.)ハームス(Sphenostylis stenocarpa(Hochst.ex A.Rich.)Harms))、エジプトクロマメ(Egyptian black bean)、ドリコスビーン(dolichos bean)、フジマメ(lablab bean)(ラブラブ・プルプレウス(L.)スウィート(Lablab purpureus(L.)Sweet))、ヤムビーン(クズイモ属(Pachyrhizus))、グアビーン(guar bean)(シアモプシス・テトラゴノロブス(L.)タウブ.(Cyamopsis tetragonolobus(L.)Taub.));及び/又はナタマメ(Canavalia)(タチナタマメ(カナバリア・エンシフォルミス(L.)DC.(Canavalia ensiformis(L.)DC.))、ナタマメ(sword bean)(カナバリア・グラジアタ(ジャック.)DC.(Canavalia gladiata(Jacq.)DC.))を含む)の植物を含む、マメ科植物である。
【００７２】
本発明による好ましい植物はダイズである。
【００７３】
更に、本発明は、
(a)(i)配列番号1、その機能的断片と少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％若しくは100％の同一性を有する組換え核酸及び/又はそのような核酸とハイブリダイズできる核酸を有する組換え核酸、並びに/或いは
(ii)配列番号2、その機能的断片、オルソログ及び/又はパラログと少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％の同一性又は100％を有するタンパク質をコードする組換え核酸を含む組換え核酸
であって、以下と作動可能に連結している組み換え核酸、
(b)プロモーター及び
(c)転写終結配列
を含む組換えベクター構築物を含む。
【００７４】
組換えベクター構築物及び/又は組換え核酸に関して、「機能的に連結している」という用語は、(例えばベクターが宿主植物細胞内に導入される場合、宿主植物細胞において)ADR-1遺伝子の発現を可能にする方法で、組換え核酸が、プロモーター、ターミネーター調節配列、エンハンサー及び/又は他の発現制御エレメント(例えばポリアデニル化シグナル)を含む、調節配列に連結していることを意味することが意図される。そのような調節配列は、例えば、Goeddel、Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185、Academic Press、San Diego、CA(1990)並びにGruber及びCrosby、Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology、編 Glick及びThompson、Chapter 7、89-108、CRC Press:Boca Raton、Florida(これらの参考文献を含む)に記載されている。調節配列は、多くの種類の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、及び特定の宿主細胞において又は特定の条件下でのみヌクレオチド配列の発現を指示するものを含む。ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、望まれるRNAの発現レベル及び/又は同様物などのそのような要因に依存し得ることは当業者により理解されるだろう。ダイズサビ病菌感染を予防及び/又は減少させるために、本発明のベクター構築物を植物宿主細胞内に導入して、それにより、ADR-1タンパク質を生成できる。
【００７５】
本発明によるプロモーターは、構成的、誘導性、特に病原体誘導性、発生段階優先型、細胞種類優先型、組織優先型及び/又は器官優先型であってもよい。構成的プロモーターはほとんどの条件下で活性である。構成的プロモーターの非限定的な例には、CaMV 19S及び35Sプロモーター(Odellら、1985、Nature 313:810-812)、sX CaMV 35Sプロモーター(Kayら、1987、Science 236:1299-1302)、Sep1プロモーター、コメアクチンプロモーター(McElroyら、1990、Plant Cell 2:163-171)、シロイヌナズナアクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター(Christensenら、1989、Plant Molec.Biol.18:675-689);pEmu(Lastら、1991、Theor.Appl.Genet.81:581-588)、ゴマノハグサモザイクウイルス35Sプロモーター、Smasプロモーター(Veltenら、1984、EMBO J.3:2723-2730)、GRP1-8プロモーター、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター(米国特許第5,683,439号)、アグロバクテリウムのT-DNA由来のプロモーター、例えばマンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、及びオクトピンシンターゼ、リブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット(ssuRUBISCO)プロモーター、及び/又は同様物が含まれる。菌、特にダイズサビ病菌と接触する細胞においてRNAを発現するプロモーターが好ましい。代替として、プロモーターは、菌との接触部位から離れた植物組織においてRNAの発現を駆動してもよく、次いでRNAは、菌と接触する細胞、特に菌が感染した部位の細胞及び/又はその近くに、植物により輸送されてもよい。
【００７６】
好ましくは、プロモーターは、構成的プロモーター、根特異的プロモーター、葉肉特異的プロモーター、及び/又は菌誘導性プロモーターである。プロモーターの制御下で産生されるRNAの量で測定されるその活性が、その非誘導性状態におけるよりも、その誘導性状態において少なくとも30％、40％、50％、好ましくは少なくとも60％、70％、80％、90％、より好ましくは少なくとも100％、200％、300％高い場合、プロモーターは誘導性である。プロモーターの制御下で産生されるRNAの量で測定されるその活性が、同じ植物の他の細胞種又は組織におけるよりも、特定の細胞種、組織又は器官において少なくとも30％、40％、50％、好ましくは少なくとも60％、70％、80％、90％、より好ましくは100％、200％、300％高い場合、プロモーターは、細胞特異的、組織特異的又は器官特異的であり、好ましくは他の細胞種又は組織は同じ植物の器官、例えば根の細胞種又は組織である。器官特異的プロモーターの場合、プロモーター活性は、他の植物器官、例えば葉、茎、花又は種子におけるプロモーター活性と比較される必要がある。
【００７７】
発生段階優先型プロモーターは、発生の特定の段階において優先的に発現する。組織及び器官優先型プロモーターは、葉、根、種子、及び/又は木部などの特定の組織又は器官において優先的に発現するものを含む。組織優先型及び器官優先型プロモーターの例には、限定されないが、果物優先型、胚珠優先型、雄性組織優先型、種子優先型、外皮優先型、塊茎優先型、柄優先型、果皮優先型、葉優先型、柱頭優先型、花粉優先型、葯優先型、花弁優先型、萼優先型、小花柄優先型、長角果優先型、茎優先型、根優先型プロモーター及び/又は同様物が含まれる。種子優先型プロモーターは、種子発生及び/又は発芽の間に優先的に発現する。例えば、種子優先型プロモーターは、胚優先型、内胚乳優先型及び/又は種皮優先型であってもよい。Thompsonら、1989、BioEssays 10:108を参照のこと。種子優先型プロモーターの例には、限定されないが、セルロースシンターゼ(celA)、Cim1、ガンマ-ゼイン、グロブリン-1、トウモロコシ19kDゼイン(cZ19B1)及び/又は同様物が含まれる。
【００７８】
他の好適な組織優先型又は器官優先型プロモーターには、限定されないが、ナタネ由来のナピン(napin)遺伝子プロモーター(米国特許第5,608,152号)、ソラマメ(Vicia faba)由来のUSP-プロモーター(Baeumleinら、1991、Mol Gen Genet.225(3):459-67)、シロイヌナズナ由来のオレオシンプロモーター(PCT出願WO98/45461)、ファセオラス・ブルガリス由来ファゼオリンプロモーター(米国特許第5,504,200号)、アブラナ属(Brassica)由来のBce4-プロモーター(PCT出願WO91/13980)、又はレグミンB4プロモーター(LeB4;Baeumleinら、1992、Plant Journal、2(2):233-9)、及びトウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、コメなどの単子葉植物において種子特異的発現を与えるプロモーターが含まれる。注目すべき好適なプロモーターは、オオムギ由来のlpt2又はlpt1遺伝子プロモーター(PCT出願WO95/15389及びPCT出願WO95/23230)又はPCT出願WO99/16890に記載されているもの(オオムギホルデイン遺伝子、コメグルテリン遺伝子、コメオリジン(rice oryzin)遺伝子、コメプロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、オートムギグルテリン遺伝子、モロコシカシリン(Sorghum kasirin)遺伝子、及び/又はライムギセカリン遺伝子由来のプロモーター)である。
【００７９】
本発明による有用なプロモーターには、限定されないが、主要な葉緑素a/b結合タンパク質プロモーター、ヒストンプロモーター、Ap3プロモーター、β-コングリシン(conglycin)プロモーター、ナピンプロモーター、ダイズレクチンプロモーター、トウモロコシ15kDゼインプロモーター、22kDゼインプロモーター、27kDゼインプロモーター、g-ゼインプロモーター、ワキシー(waxy)、シュランケン1(shrunken 1)、シュランケン2(shrunken 2)、ブロンズ(bronze)プロモーター、Zm13プロモーター(米国特許第5,086,169号)、トウモロコシポリガラクツロナーゼ(PG)(米国特許第5,412,085号及び同第5,545,546号)、SGB6プロモーター(米国特許第5,470,359号)、並びに合成及び/又は他の天然プロモーターが含まれる。
【００８０】
表皮特異的(Epidermisspezific)プロモーターは、以下:
-WIR5(=GstA1);acc.X56012;Dudler & Schweizer、
-GLP4、acc.AJ310534;Wei Y.、Zhang Z.、Andersen C.H.、Schmelzer E.、Gregersen P.L.、Collinge D.B.、Smedegaard-Petersen V.and Thordal-Christensen H.、Plant Molecular Biology 36、101(1998)、
-GLP2a、acc.AJ237942、Schweizer P.、Christoffel A.及びDudler R.、Plant J.20、541(1999);
-Prx7、acc.AJ003141、Kristensen B.K.、Ammitzboll H.、Rasmussen S.K.及びNielsen K.A.、Molecular Plant Pathology、2(6)、311(2001);
-GerA、acc.AF250933;Wu S.、Druka A.、Horvath H.、Kleinhofs A.、Kannangara G.及びvon Wettstein D.、Plant Phys Biochem 38、685(2000);
-OsROC1、acc.AP004656
-RTBV、acc.AAV62708、AAV62707;Kloti A.、Henrich C.、Bieri S.、He X.、Chen G.、Burkhardt P.K.、Wunn J.、Lucca P.、Hohn T.、Potrykus I.and  Futterer J.、PMB 40、249(1999);
-ジャガイモ由来のキチナーゼChtC2-プロモーター(Ancilloら、Planta.217(4)、566、(2003));
-AtProT3プロモーター(Grallathら、Plant Physiology.137(1)、117(2005));
-シロイヌナズナ由来のSHN-プロモーター(クチン及びワックス産生に関与するAP2/EREBP転写因子)(Aaronら、Plant Cell.16(9)、2463(2004));及び/又は
-コムギ由来のGSTA1(Dudlerら、WP2005306368及びAltpeterら、Plant Molecular Biology.57(2),271(2005))
からなる群から選択し得る。
【００８１】
葉肉特異的(Mesophyllspezific)プロモーターは、以下:
-PPCZm1(=PEPC);Kausch A.P.、Owen T.P.、Zachwieja S.J.、Flynn A.R.及びSheen J.、Plant Mol.Biol.45、1(2001);
-OsrbcS,Kyozukaら、PlaNT Phys 102、991(1993);Kyozuka J.、McElroy D.、Hayakawa T.、Xie Y.、Wu R.及びShimamoto K.、Plant Phys.102,991(1993);
-OsPPDK、acc.AC099041;
-TaGF-2.8、acc.M63223;Schweizer P.、Christoffel A.及びDudler R.、Plant J.20、541(1999);
-TaFBPase、acc.X53957;
-TaWIS1、acc.AF467542;米国特許出願第200220115849号;
-HvBIS1、acc.AF467539;米国特許出願第200220115849号;及び/又は
-ZmMIS1、acc.AF467514;米国特許出願第200220115849号
からなる群から選択し得る。
【００８２】
病原体誘導性プロモーターは、以下:
-HvPR1a、acc.X74939;Bryngelssonら、Mol.Plant Microbe Interacti.7(2)、267(1994);
-HvPR1b、acc.X74940;Bryngelssonら、Mol.Plant Microbe Interact.7(2)、267(1994);
-HvB1,3gluc;acc.AF479647;
-HvPrx8、acc.AJ276227;Kristensenら、Molecular Plant Pathology、2(6)、311(2001);及び/又は
-HvPAL、acc.X97313;Wei Y.、Zhang Z.、Andersen C.H.、Schmelzer E.、Gregersen P.L.、Collinge D.B.、Smedegaard-Petersen V.及びThordal-Christensen H.Plant Molecular Biology 36、101(1998)
からなる群から選択し得る。
【００８３】
構成的プロモーターは、以下:
-パセリ由来のPcUbiプロモーター(WO03/102198)
-CaMV 35Sプロモーター:カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(Benfeyら、1989 EMBO J.8(8):2195-2202)、
-STPTプロモーター:シロイロナズナ(Arabidopsis thaliana)短鎖トリオースリン酸輸送体プロモーター(Short Triose phosphat translocator promoter)(アクセッション番号_123979)
-Act1プロモーター:-オリザ・サティバ(Oryza sativa)アクチン1遺伝子プロモーター(McElroyら  1990 PLANT CELL 2(2) 163-171 a)及び/又は
-EF1A2プロモーター:グリシン・マックス翻訳伸長因子EF1アルファ(米国特許出願第20090133159号)
からなる群から選択し得る。
【００８４】
ある種類の組換えベクター構築物は、中に付加的なDNAセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖DNAループと称される、「プラスミド」である。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、付加的なDNAセグメントはウイルスゲノムの中にライゲーションすることができる。特定の組換えベクター構築物は、それらが中に導入される宿主植物細胞において自己複製できる。他の組換えベクター構築物は、宿主細胞内への導入時に宿主植物細胞のゲノム内に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。特に、ベクター構築物は、ベクターが機能的に連結している遺伝子の発現を指示できる。しかしながら、本発明は、等価の機能を果たす、ウイルスベクター(例えば、ジャガイモウイルスX、タバコ茎えそウイルス、及び/又はジェミニウイルス)などのこのような他の形態の発現ベクター構築物を含むことを意図する。
【００８５】
好ましいベクター構築物は配列番号9を有する配列を含む。
【００８６】
本発明は更に、ADR-1遺伝子を含むベクター構築物で形質転換されたトランスジェニックダイズ植物、植物部分又は植物細胞を提供する。好ましくは、ベクター構築物は、上に定義したベクター構築物である。
【００８７】
本発明によるトランスジェニックダイズ植物の収穫可能な部分は本発明の一部である。収穫可能な部分は、ADR-1遺伝子を含む種子、根、葉及び/又は花であってもよい。トランスジェニックADR-1遺伝子を含むダイズが好ましい。
【００８８】
本発明によるトランスジェニックダイズ植物由来の生成物、その部分又はその収穫可能な部分は本発明の一部である。
【００８９】
本発明はまた、生成物の生成方法であって、a)本発明の植物を成長させる工程と、b)本発明の植物及び/若しくはその部分、例えばそれらの植物の種子から又はそれにより前記生成物を生成する工程とを含む方法を含む。更なる実施形態において、その方法は、a)本発明の植物を成長させる工程と、b)植物から上で定義した収穫可能な部分を除去する工程と、c)本発明の収穫可能な部分から又はそれにより前記生成物を生成する工程とを含む。
【００９０】
一実施形態において、生成物の生成方法は、
a)本発明の植物又は本発明の方法により得ることが可能な植物を成長させる工程と、
b)本発明の植物及び/又はそれらの植物の部分、例えば種子から又はそれにより前記生成物を生成する工程と
を含む。
【００９１】
植物が成長する部位で生成物を生成することができ、植物が成長している部位から植物及び/又はその部分を除去して生成物を生成することができる。典型的に、植物は成長し、所望の収穫可能な部分は植物から除去され、反復サイクルで実施可能な場合、生成物は植物の収穫可能な部分から生成される。例えば本発明の植物の収穫可能な部分を繰り返して除去することにより、及び必要な場合、生成物を得るためにそれらの植物の更なる処理により、生成物生成の工程を繰り返すことを可能にしながら、植物を成長させる工程を本発明の方法が実施されるごとに一回のみ実施し得る。本発明の植物を成長させる工程を繰り返し、蓄積された植物又は植物部分についての生成物の生成を後で一度実施するまで、植物又は収穫可能な部分は保存することも可能である。また、植物を成長させる工程及び生成物を生成する工程は、時間的に重なって、更にかなりの程度まで同時に、又は連続して実施してもよい。一般に植物は、生成物を生成するまでいくらかの時間成長させる。
【００９２】
一実施形態において、本発明の前記方法によって生成された生成物は、限定されないが、食料、飼料、食品補足物、飼料補足物、繊維、化粧品又は薬剤などの植物生成物である。食料は栄養素のために又は栄養素を補足するために使用される組成物とみなされる。動物飼料及び動物飼料補足物は特に食料とみなされる。
【００９３】
好ましい生成物はダイズミール及び/又はダイズ油である。
【００９４】
別の実施形態において、本発明の生成方法は、限定されないが、植物抽出物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂肪、油、ポリマー、ビタミンなどの農産物を生成するために使用される。
【００９５】
植物生成物は、かなりの程度まで一つ又は複数の農産物からなることが可能である。
【００９６】
本発明のトランスジェニック植物は、種子を作製するために植物育種の公知の方法を使用して、類似のトランスジェニック植物と、又は本発明の核酸を欠くトランスジェニック植物と、又は非トランスジェニック植物と交配してよい。更に、本発明のトランスジェニック植物細胞又は植物は、一つ又は複数の核酸を含む別のトランスジェニック植物を含んでもよく、及び/又はそれらと交配してもよく、それにより、植物及び/又はその子孫において導入遺伝子の「積み重ね」を作製する。次いで種子が植え付けられて、本発明の核酸を含む、交配された稔性トランスジェニック植物を得る。交配された稔性トランスジェニック植物は、雌の親により又は雄の親により遺伝を受け継いだ特定の発現カセットを有してもよい。第2の植物は近交系植物であってもよい。交配された稔性トランスジェニックはハイブリッドであってもよい。また、これらの交配された稔性トランスジェニック植物のいずれかの種子も本発明の範囲内に含まれる。本発明の種子は、稔性トランスジェニック植物から収穫することができ、トランスジェニックADR-1遺伝子を含む組換え核酸を含むハイブリッド植物株を含む、本発明の形質転換された植物の子孫世代を成長させるために使用することができる。
【００９７】
本発明によれば、導入された組換え核酸は、それが非染色体自律レプリコンに取り込まれるか、又は植物染色体に組み込まれる場合、植物細胞において安定に維持され得る。染色体外の非複製若しくは複製ベクター構築物又は染色体に組み込まれるベクター構築物に存在するかに関わらず、組換え核酸は好ましくは植物発現カセットに存在する。植物発現カセットは好ましくは、機能的に連結している植物細胞において遺伝子発現を駆動できる調節配列を含有し、それにより、各配列はその機能、例えばポリアデニル化シグナルによる転写の終結を果たすことができる。好ましいポリアデニル化シグナルは、TiプラスミドpTiACH5(Gielenら、1984、EMBO J.3:835)のオクトピンシンターゼとして知られている遺伝子3又はその機能的等価物などのアグロバクテリウム・ツメファシエンスt-DNA由来のものであるが、同様に植物において機能的に活性な全ての他のターミネーターも好適である。植物遺伝子発現は非常に多くの場合、転写レベルに制限されないので、植物発現カセットは好ましくは、RNAに対するポリペプチド比を増強させるタバコモザイクウイルス由来の5’-非翻訳リーダー配列を含有するオーバードライブ配列などの翻訳エンハンサーのような他の機能的に連結している配列を含有する(Gallieら、1987、Nucl.Acids Research 15:8693-8711)。植物発現ベクターの例には、Becker,D.ら、1992,New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border、Plant Mol.Biol.20:1195-1197;Bevan,M.W.、1984、Binary Agrobacterium vectors for plant transformation、Nucl.Acid.Res.12:8711-8721;及びVectors for Gene Transfer in Higher Plants;Transgenic Plants、Vol.1、Engineering and Utilization、編:Kung and R.Wu、Academic Press、1993、S.15-38に詳述されているものが含まれる。
【００９８】
本発明によれば、ADR-1遺伝子は、植物細胞及び/又は菌においてADR-1タンパク質のタンパク質量又は機能を増加できる。好ましい実施形態において、ADR-1タンパク質のタンパク質量又は機能の増加は、構成的又は組織特異的に起こる。特に好ましい実施形態において、タンパク質量又はタンパク質機能の本質的な病原体誘導性の増加は、例えば、菌誘導性プロモーターの制御下でADR-1遺伝子の組換え発現により起こる。特に、ADR-1遺伝子の発現は菌が感染した部位で起こるが、好ましくはADR-1遺伝子の発現は、菌に感染していない組織において本質的に未変化のままである。好ましい実施形態において、植物及び/又は菌におけるADR-1タンパク質のタンパク質量は、ADR-1核酸で形質転換されていない野生型植物と比較して、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％又はそれ以上、増加する。好ましくは、野生型植物は、ADR-1核酸で形質転換した植物の遺伝子型と類似、より好ましくは同一の植物である。
【００９９】
更に本発明は、サビ病菌に対して増加した耐性を有するトランスジェニック植物の生成方法であって、
(a)上に定義した組換えベクター構築物を植物又は植物細胞に導入する工程と、
(b)前記植物細胞から植物を再生する工程と、
(c)(i)配列番号2、その機能的断片、そのオルソログ及び/又はパラログと少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は100％の同一性を有するタンパク質、並びに/或いは
(ii)配列番号1、その機能的断片と少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％の同一性又は100％を有する核酸及び/又はそのような核酸とハイブリダイズできる核酸によりコードされたタンパク質
を発現させる工程と
を含む方法を提供する。
【０１００】
ADR-1核酸配列は、N末端コイルドコイルモチーフ、ヌクレオチド結合部位及び/又はC末端ロイシンリッチリピートモチーフを含んでもよい。
【０１０１】
好ましくは、N末端コイルドコイルモチーフは、配列番号3と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は100％の同一性を有する。
【０１０２】
好ましくは、ヌクレオチド結合部位は、配列番号5と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は100％の同一性を有する。
【０１０３】
好ましくは、C末端ロイシンリッチリピートモチーフは、配列番号7となくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％又は100％の同一性を有する。
【０１０４】
ADR-1タンパク質配列は好ましくは、N末端コイルドコイルモチーフ、ヌクレオチド結合部位及び/又はC末端ロイシンリッチリピートモチーフを含む。
【０１０５】
好ましくは、N末端コイルドコイルモチーフは、配列番号4となくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は100％の同一性を有する。
【０１０６】
好ましくは、ヌクレオチド結合部位は、配列番号6と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は100％の同一性を有する。
【０１０７】
好ましくは、C末端ロイシンリッチリピートモチーフは、配列番号8と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は100％の同一性を有する。
【０１０８】
特定の種類のカテゴリー(ダイズサビ病菌に対して耐性のある植物及び/又はその部分、トランスジェニック植物細胞、ベクター構築物を生成するための方法、ベクター構築物の使用など)に使用される用語に与えられる全ての定義はまた、他のカテゴリーにも適用可能であり得る。
【０１０９】
実施例
以下の実施例は本発明についての特許請求の範囲を限定することを意図せず、むしろ特定の実施形態を例示することを意図する。当業者が想到する例示した方法の任意の変更は本発明の範囲内であることを意図する。
【実施例１】
【０１１０】
一般的方法
オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えばホスホアミダイト法を使用する公知の様式において与えることができる(Voet、Voet、第2版、Wiley Press New York、896-897ページ)。例えば、制限酵素切断、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精製、核酸のニトロセルロース及びナイロン膜へのトランスファー、DNA断片の連結、大腸菌(E.coli)細胞の形質転換、細菌培養、ファージ増殖及び組換えDNAの配列分析などの、本発明の目的で実施されるクローニング工程は、Sambrookら  Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、ISBN 0-87969-309-6に記載されているように実施する。組換えDNA分子のシークエンシングは、Sanger法(Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA74、5463(1977))に従って、MWG-Licorレーザ蛍光DNAシーケンサーを用いて実施する。
【実施例２】
【０１１１】
ADR-1過剰発現ベクター構築物のクローニング
過剰発現ADR-1ベクター構築物(図4及び図5)は以下のように調製した:
他に特定しない限り、Sambrookら、Molecular Cloning:A laboratory manual、Cold Spring Harbor 1989、Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている標準的な方法を使用する。
【０１１２】
cDNAは、Superscript II cDNA合成キット(Invitrogen)を使用することによりシロイロナズナ(生態型Col-0)RNAから生成した。cDNA調製及び精製の全ての工程はマニュアルの記載に従って実施した。
【０１１３】
配列番号1の配列は、Phusion hot-start、Pfu Ultra、Pfu Turbo又はHerculase DNAポリメラーゼ(Stratagene)のプロトコルに記載されているようにPCRによりcDNAから増幅させた。Pfu Ultra、Pfu Turbo又はHerculase DNAポリメラーゼのプロトコルの組成は以下の通りであった:1×PCR緩衝液、0.2mMの各dNTP、100ngのシロイヌナズナのcDNA(var Columbia-0)、50pmolのフォワードプライマー、50pmolのリバースプライマー、1uのPhusion hot-start、Pfu Ultra、Pfu Turbo又はHerculase DNAポリメラーゼ。
【０１１４】
増幅サイクルは以下の通りであった:
98℃で60秒の1サイクル、続いて各場合において98℃で10秒、60℃で30秒及び72℃で60秒の35サイクル、続いて72℃で10分の1サイクル、次いで4℃。
【０１１５】
クローニング目的でADR-1全長ORFを特異的に増加させるために以下のプライマー配列を使用した:
i)フォワードプライマー:5’CCGGTACCATGGCTTCGTTCATAGAT-3’(配列番号10)
ii)リバースプライマー:5’-TTGTCGACCTAATCGTCAAGCCAATC-3’(配列番号11)
増幅させた断片は、制限酵素Acc65I及びSalI(NEB Biolabs)を使用して消化し、全長ADR-1断片が、attL1とattL2組換え部位間にセンス方向に位置するように、Acc65I/Sallで消化したGateway pENTRYベクター(Invitrogen、Life Technologies、Carlsbad、California、USA)にライゲーションした。
【０１１６】
バイナリー植物形質転換ベクターを得るために、3連のLR反応(Gateway  system、(Invitrogen、Life  Technologies、Carlsbad、California、USA)を、パセリユビキチンプロモーターを含有するpENTRY-Aベクター、pENTRY-Bベクター中のADR-1及びt-Nosターミネーターを含有するpENTRY-Cベクターを使用することにより製造業社のプロトコルに従って実施した。(1)細菌選択についてカナマイシン耐性カセット(2)アグロバクテリア(Agorbacteria)中の複製についてpVS1オリジン(3)大腸菌中の安定な維持についてのpBR322複製起点及び(4)pcUbiプロモーターの制御下でのライトボーダー及びレフトボーダーの間のAHAS選択(図4)から構成されるバイナリーpDESTベクターを標的として使用した。組換え反応物を大腸菌(DH5アルファ)に形質転換し、ミニプレップし、特異的な制限酵素消化によりスクリーニングした。各ベクター構築物からの陽性クローンを配列決定し、ダイズ形質転換に供した。
【実施例３】
【０１１７】
ダイズ形質転換
ADR-1発現ベクター構築物(実施例2を参照のこと)をダイズに形質転換した。
【０１１８】
3.1ダイズ種子の滅菌及び発芽
実質的には任意のダイズの種類の任意の種子を本発明の方法に利用できる。種々のダイズ栽培品種(Jack、Williams 82、及びResnikを含む)がダイズ形質転換に適切である。きつく取り付けた蓋を有するデシケーター内で3.5mlの12N HClを100mlの漂白剤(5.25％次亜塩素酸ナトリウム)に滴下して加えることによって生成される塩素ガスを含むチャンバ内でダイズ種子を滅菌した。チャンバにおいて24〜48時間後、種子を取り除き、約18〜20個の種子を、100mmのペトリ皿内の5μMの6-ベンジル-アミノプリン(BAP)を含むか又は含まない固体GM培地に置いた。BAPを含まない実生はより伸長し、根が発育し、特に二次根及び側根が形成した。BAPは、より短く、よりがっちりした実生を形成することにより実生を強化する。
【０１１９】
25℃で光(>100μEinstein/m2s)の中で成長した7日齢の実生を3種の外植片の種類について外植片材料に使用した。この時に、種皮を割り、単葉を有する上胚軸を、最低限、子葉の長さまで成長させた。上胚軸は子葉節組織を回避するために少なくとも0.5cmであるべきである(ダイズ栽培品種及び種子のロットは発育時に変化する場合があるので、発芽段階の記載は特定の発芽時間より正確である)。
【０１２０】
実生全体(方法A、実施例3.3.1及び3.3.2を参照のこと)又は葉外植片(方法B、実施例3.3.3を参照のこと)の接種に関して、次いで実生を形質転換のために準備した。
【０１２１】
方法C(実施例3.3.4を参照のこと)に関して、胚軸並びに子葉の一つ及び半分又は両方の部分を各実生から取り除いた。次いで実生を2〜4週間増殖培地に置いた。実生は、そこから外植片を得るためにいくつかの分岐したシュートを生成する。大部分の外植片は頂芽から成長する小植物から生じた。これらの外植片は好ましくは標的組織として使用した。
【０１２２】
3.2-アグロバクテリウム培養物の増殖及び調製
アグロバクテリウム培養物は、固体YEP増殖培地(YEP培地:10g 酵母エキス、10g Bactoペプトン、5g NaCl、pHを7.0に調整し、最終体積をH2Oで1リットルにし、YEP寒天プレートのために20gの寒天を加え、オートクレーブ)上で、所望のバイナリーベクター(例えばH.Klee.R.Horsch及びS.Rogers 1987 Agrobacterium-Mediated Plant Transformation and its further Applications to Plant Biology;Annual  Rview of Plant Physiology Vol.38:467-486)を保有するアグロバクテリウム(例えばA.ツメファシエンス又はA.リゾゲネス)をストリーキングすることにより調製し、コロニーが現れるまで(約2日)25℃でインキュベートした。Ti又はRiプラスミドに存在する選択可能なマーカー遺伝子、バイナリーベクター、及び細菌染色体に応じて、異なる選択化合物を、YEP固体及び液体培地中でのA.ツメファシエンス及びリゾゲネス選択のために使用した。種々のアグロバクテリウム株を形質転換法のために使用できる。
【０１２３】
ほぼ2日後、単一コロニーを(滅菌したようじを用いて)採取し、50mlの液体YEPに抗生物質と共に接種し、0.8〜1.0の間のOD.sub.600に到達するまで(ほぼ2日)175rpm(25℃)で振盪した。形質転換のための作業グリセロールストック(15％)を調製し、1mlのアグロバクテリウムストックを1.5mlのエッペンドルフチューブ中にアリコートし、次いで-80℃で保存する。
【０１２４】
外植片接種の1日前に、200mlのYEPに、500mlのエルレンマイヤーフラスコ中で5.mu.l〜3mlの作業アグロバクテリウムストックで接種した。OD.sub.600が0.8〜1.0の間になるまでフラスコを25℃で一晩振盪した。ダイズ外植片を調製する前に、アグロバクテリウムを、20℃で5500×gにて10分間、遠心分離によりペレット化した。そのペレットを、所望の密度(OD.sub.600 0.5-0.8)まで液体CCM中に再懸濁し、使用前に少なくとも30分、室温に置いた。
【０１２５】
3.3-外植片調製及び共培養(接種)
3.3.1  方法A:形質転換の日における外植片調製
この時に実生は、少なくとも0.5cmからであるが、通常、0.5〜2cmの間の伸長した上胚軸を有した。4cmの長さまでの伸長した上胚軸を首尾良く利用した。次いで1)いくつかの根を有するか、又は有さない、ii)部分的な一つ又は両方の子葉を有する、外植片を調製し、頂端分裂組織を含む全ての予め形成した葉を取り除き、第1のセットの葉に位置する節を、鋭利な外科用メスを使用していくつかの切り込みで傷つけた。
【０１２６】
節におけるこの切り込みはアグロバクテリウム感染を誘発するだけでなく、腋生分裂組織細胞を分配し、予め形成したシュートに損傷を与えた。創傷及び調製後、外植片を別にしてペトリ皿に入れ、続いて30分間、液体CCM/アグロバクテリウム混合物で共培養した。次いで外植片を液体培地から取り除き、15個の固体の共培養培地を有する100mmのペトリプレート上の滅菌濾紙の上に置いた。創傷した標的組織は、それらが培地と直接接触するように置いた。
【０１２７】
3.3.2  改変方法A:上胚軸外植片調製
4〜8日齢の実生から調製したダイズ上胚軸部分を、再生及び形質転換のための外植片として使用した。soyacv L00106CN、93-41131及びJackの種子を、4、約8日、サイトカイニンを含むか又は含まない1/10 MS塩又は類似組成の培地中で発芽させた。上胚軸外植片を、茎部分から子葉節及び茎節を取り除くことにより調製した。上胚軸を2〜5個の部分に切断した。腋生分裂組織を含む1次又はより高次の節に付着した部分が特に好ましい。
【０１２８】
外植片をアグロバクテリウム感染のために使用した。GUSマーカー遺伝子及びAHAS、bar又はdsdA選択可能マーカー遺伝子を有するプラスミドを保有するアグロバクテリウムAGL1を、適切な抗生物質を含むLB培地中で一晩培養し、収集し、アセトシリンゴンを含む接種培地に再懸濁した。新たに調製した上胚軸部分を、30〜60分間、アグロバクテリウム懸濁液に浸し、次いで外植片を滅菌濾紙上で拭き取り乾燥させた。次いで接種した外植片を、T-DNA送達を高めるために、2〜4日間、L-システイン及びTTD並びにアセトシリンゴンなどの他の化学物質を含む共培養培地で培養した。次いで感染した上胚軸外植片を、イマザピル(imazapyr)(AHAS遺伝子について)、グルホシネート(bar遺伝子について)、又はD-セリン(dsdA遺伝子について)などの選択剤を含むシュート誘導培地に入れた。再生したシュートを、選択剤を含む伸長培地で二次培養した。
【０１２９】
トランスジェニック植物の再生に関して、次いでその部分を、シュート誘導のために、BAP、TDZ及び/又はカイネチンなどのサイトカイニンを含む培地で培養した。4〜8週間後、培養した組織を、シュート伸長のために、低濃度のサイトカイニンを含む培地に移した。伸長したシュートを、根付かせ、植物発育のために、オーキシンを含む培地に移した。複数のシュートを再生した。
【０１３０】
強力なGUS発現を示す多くの安定な形質転換領域を回収した。ダイズ植物を上胚軸外植片から再生した。効率的なT-DNA送達及び安定な形質転換領域が実証された。
【０１３１】
3.3.3  方法B:葉外植片
葉外植片を調製するために、子葉を胚軸から取り除いた。子葉を互いから分離し、上胚軸を取り除いた。葉身、葉柄、及び托葉からなる初生葉(primary leaf)を、托葉の基部において注意深く切除することにより上胚軸から取り除き、それにより、腋生分裂組織が外植片上に含まれた。外植片を創傷させ、新たにシュート形成を刺激するために、任意の予め形成したシュートを取り除き、托葉の間の領域を鋭利な外科用メスで3〜5回切断した。
【０１３２】
外植片調製の直後、アグロバクテリウム懸濁液に、外植片を完全に漬けたか、又は創傷した葉柄端部を浸した。接種後、外植片を滅菌濾紙上で拭き取って、過剰なアグロバクテリウム培養物を取り除き、創傷面を、固体CCM培地(上記を参照のこと)に重層した円形の7cmのWhatman紙と接触させて、外植片を置いた。この濾紙はダイズ外植片におけるA.ツメファシエンス異常増殖を防止する。5個のプレートをパラフィルム(商標)「M」(American National Can、Chicago、III.、USA)で巻き、25℃にて暗所又は明所で3〜5日間インキュベートする。
【０１３３】
3.3.4  方法C:増殖した腋生分裂組織
増殖した腋生分裂組織を調製するために、3〜4週齢の小植物が増殖した外植片を使用した。腋生分裂組織の外植片は第1〜第4の節から調製できる。平均3〜4個の外植片を各実生から得た。外植片は、節間において腋生節の下0.5〜1.0cmを切断し、外植片から葉柄及び葉を取り除くことにより小植物から調製した。腋生分裂組織が存在する先端部を外科用メスで切断して、新たなシュート成長を誘導し、標的細胞のアグロバクテリウムへの侵入を可能にした。従って、0.5cmの外植片は茎及び芽を含んだ。
【０１３４】
切断すると、即座に外植片を20〜30分間、アグロバクテリウム懸濁液に入れた。接種後、外植片を滅菌濾紙上で拭き取り、過剰なアグロバクテリウム培養物を取り除き、次いでアグロバクバクテリウム株に応じて、固体CCM中にほぼ完全に漬けて置いたか、又は固体CCMに重層した円形の7cm濾紙の上側に置いた。この濾紙はダイズ外植片上でのアグロバクテリウム異常増殖を予防する。プレートはパラフィルム(商標)「M」(American National Can、Chicago、III.、USA)で巻き、25℃にて暗所で2〜3日間インキュベートした。
【０１３５】
3.4-シュート誘導
25℃にて暗所で3〜5日の共培養後、外植片を、(過剰なアグロバクテリウムを取り除くために)液体SIM培地(SIM、過剰なアグロバクテリウムを取り除くために、Olhoftら  2007 A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soyusing primary-node explants from seedlings In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant (2007) 43:536-549を参照のこと)又はModwash培地(1×B5主要塩、1×B5微量塩、1×MSIII鉄、3％スクロース、1×B5ビタミン、30mM MES、350mg/L Timentin(商標) pH5.6、WO2005/121345)中でリンスし、固体SIM培地に入れる前に、(特に葉身上の損傷を防ぐために)滅菌濾紙上で拭き取り乾燥させた。約5個の外植片(方法A)又は10〜20個(方法B及びC)の外植片を、標的組織が培地と直接接触するように置いた。最初の2週間の間、外植片は選択培地を用いるか又は用いずに培養できる。好ましくは、外植片を、1週間選択を用いずにSIM上に移した。
【０１３６】
葉外植片(方法B)に関して、培地の表面に対して外植片が垂直になるように、外植片は培地に置かれるべきであり、葉柄は培地に埋め込まれ、葉身は培地の外にある。
【０１３７】
増殖した腋生分裂組織(方法C)に関して、培地の表面に対して外植片が平行(求基的)になるように、外植片を培地中に置き、外植片は培地中に部分的に埋め込まれた。
【０１３８】
Scotch 394通気性テープ(3M、St.Paul、Minn.、USA)を巻いたプレートを、70〜100.mu.E/m.sup.2sにて18時間明/6時間暗サイクル下、平均25℃の温度で2週間、成長チャンバに置いた。外植片を、新たなシュートの成長が標的領域(例えば上胚軸より上の第1の節における腋生分裂組織)で生じるまで、選択を有するか又は有さないSIM培地に置いたままにした。この時間の間に新鮮な培地に移すことを行うことができる。約1週間後、外植片を、選択を有するか又は有さないSIMから選択を有するSIMに移した。この時に、種々のSIM中で葉外植片の葉柄の基部にて(方法B)、実生外植片に関しては初生節にて(方法A)、及び増殖した外植片の腋生節にて(方法C)かなりの新たなシュート発生が存在した。
【０１３９】
好ましくは、形質転換の前に形成した全てのシュートを、共培養後、2週間までに取り除いて、分裂組織から新たな成長を刺激した。これは、一次形質転換体においてキメラ現象を減少させ、トランスジェニック分裂組織細胞の増幅を増加させるのに役立った。この時間の間に、外植片を、より小さな部分に切断してもよいし、又はしてなくてもよい(すなわち上胚軸を切断することにより外植片から節を引き離す)。
【０１４０】
3.5-シュート伸長
SIM培地(好ましくは選択を含む)上で2〜4週間後(又はシュートの集団が形成するまで)、外植片を、シュート原基のシュート伸長を刺激するSEM培地(シュート伸長培地、Olhoftら  2007 A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soyusing primary-node explants from seedlingsIn Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant (2007) 43:536-549を参照のこと)に移した。この培地は選択化合物を含んでもよいし、又は含まなくてもよい。
【０１４１】
2〜3週ごとの後、死組織を注意深く取り除いた後、外植片を新鮮なSEM培地(好ましくは選択を含む)に移した。外植片は一緒に保持され、小片に断片化されず、いくらか健康に維持されるべきである。外植片が死ぬか又はシュートが伸長するまで、外植片を移し続けた。3cmより長い伸長したシュートを取り除き、約1週間(方法A及びB)、又は栽培品種に応じて約2〜4週間(方法C)、RM培地に置き、その時に根が形成し始めた。根を有する外植片の場合、それらを土壌に直接移した。根付いたシュートを土壌に移し、温室に移す前に2〜3週成長チャンバ中で強健にした。この方法を使用して得た再生植物は稔性であり、一つの植物につき平均500個の種子を生成した。
【０１４２】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスとの共培養の5日後、一過的なGUS発現は、特に外植片調製の際創傷した領域において(方法A)、実生の腋生分裂組織外植片に及んだ。初生節がシュート誘導及び再生に対してどのように応答するのかを見るために、外植片を、選択を有さないシュート誘導培地に置いた。これまで、70％より多くの外植片がこの領域において新たなシュートを形成した。SIM上で14日後、GUS遺伝子の発現は安定であり、このことはT-DNAのダイズゲノムへの組み込みを示す。加えて、予備実験により、SIM上で3週後に形成するGUS陽性シュートの形成が生じた。
【０１４３】
方法Cに関して、増殖した腋生分裂組織プロトコルを使用するダイズ小植物の平均再生時間は外植片接種から14週であった。従って、この方法は、稔性の健康なダイズ植物を導く速い再生時間を有する。
【実施例４】
【０１４４】
病原体アッセイ
4.1  クローンの回収
TO事象につき2〜3個のクローンを小さな6cmのポットに植えた。回収のために、クローンをPhytochamber中に12〜18日間維持した(16〜22℃の温度及び75％の湿度で16時間-昼及び8時間-夜のリズムで成長させた)。
【０１４５】
4.2  接種
サビ病菌はブラジルからの野生分離株である。植物にP.パキリジを接種した。
【０１４６】
接種のための適切な胞子材料を得るために、15〜20日前にサビ病菌に感染させたダイズ葉を接種の2〜3日前に取り、寒天プレート(H2O中に1％寒天)に移した。葉を上側を寒天上に置き、これにより、菌が組織を通して成長でき、非常に若い胞子を生成できる。接種溶液に関して、胞子を葉からたたいて離し、Tween-H2O溶液に加えた。Thoma計数チャンバにより光学顕微鏡下で胞子の計数を実施した。植物の接種に関して、胞子懸濁液を圧縮空気で作動する噴霧フラスコに加え、葉の表面が十分に湿るまで植物又は葉に均一に塗布した。肉眼でのアッセイのために、本発明者は1〜5×105胞子/mlの胞子密度を使用した。顕微鏡のために、5×105胞子/mlより多い密度を使用する。接種した植物を、平均22℃及び90％より高い空気湿度で温室チャンバに24時間置いた。その後、平均25℃及び70％の空気湿度でのチャンバ内で栽培を実施した。
【実施例５】
【０１４７】
顕微鏡スクリーニング:
病原体発生の評価のために、感染後、植物の接種した葉をアニリンブルーで48時間染色した。
【０１４８】
アニリンブルー染色は蛍光物質の検出に役立つ。宿主相互作用及び非宿主相互作用における防御反応の間、フェノール、カロース又はリグニンなどの物質が蓄積したか、又は生成され、局所的にパピラ(papillae)において又は細胞全体においてのいずれかで細胞壁に組み込まれた(過敏感反応、HR)。例えばカロースの場合、黄色蛍光を導く、アニリンブルーと結合した複合体が形成した。葉材料を、脱染溶液II(エタノール/酢酸6/1)を含有するファルコンチューブ又はディッシュに移し、90℃にて10〜15分間、水浴中でインキュベートした。脱染溶液IIをその後即座に取り除き、葉を水で2回洗浄した。染色のために、染色溶液II(0.05％アニリンブルー=メチルブルー、0.067M  リン酸水素二カリウム)中で葉を1.5〜2時間インキュベートし、その後即座に顕微鏡により分析した。
【０１４９】
異なる相互作用の種類を顕微鏡により評価(計数)した。Olympus UV顕微鏡BX61(入射光)及びUVロングパスフィルタ(励起:375/15、ビームスプリッタ:405LP)を使用する。アニリンブルー染色後、UV光下で胞子は青く見えた。緑/黄色染色により菌付着器の下にパピラを認識できた。過敏感反応(HR)を全細胞蛍光により特徴付けた。
【実施例６】
【０１５０】
ダイズサビ病菌に対する感受性の評価
ダイズサビ病の進行を、葉の裏側(背軸面)における罹患領域(胞子形成夏胞子堆により覆われた領域)の推定によりスコア付けした。更に葉の黄変を考慮に入れた(スキームについては図6を参照のこと)。
【０１５１】
ADR-1タンパク質を発現するT0ダイズ植物をファコプソラ・パキリジの胞子で接種した。22のT0ダイズ植物のP.パキリジに対するダイズの肉眼で見える疾患の症状を接種の14日後にスコア付けした。
【０１５２】
全ての葉について菌のコロニー又は強い黄変/褐色化を示す葉の面積の割合の平均を罹患した葉の面積とみなした。ADR-1を発現する22個のダイズT0植物(RT-PCRにより発現は確認された)を全て、非トランスジェニック対照植物と並行して評価した。非トランスジェニックダイズ植物由来のクローンを対照として使用した。罹患した葉の面積の中央値を、野生型植物と比較して組換えADR-1を発現する植物について図7に示す。ADR-1の過剰発現は非トランスジェニック対照植物と比較して罹患した葉の面積を強力に減少させる。このデータは、ADR-1発現ベクター構築物の植物体内発現が、非トランスジェニック対照と比較してトランスジェニック植物のより低い疾患スコアを導くことを明確に示す。従って、ダイズにおけるADR-1の発現はダイズサビ病菌に対するダイズの耐性を向上させる。
【図１】
2013538053.tif 000003
【図２】
2013538053.tif 000004
【図３】
2013538053.tif 000005
【図４】
2013538053.tif 000006
【図５−１】
2013538053.tif 000007
【図５−２】
2013538053.tif 000008
【図５−３】
2013538053.tif 000009
【図６】
2013538053.tif 000010
【図７】
2013538053.tif 000011
【配列表】
2013538053000001.app
【国際調査報告】
2013538053.tif 000012
2013538053.tif 000013
2013538053.tif 000014
2013538053.tif 000015