(57)【要約】  本発明は、ＤＣＣ融合タンパク質、ＤＣＣ融合タンパク質をコードする核酸分子、並びにそれらの生産方法、及び結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ及び転移性乳癌等の癌の治療におけるそれらの使用に関する。また本発明は、ＤＣＣ融合タンパク質を投与することにより、結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ及び転移性乳癌等の癌を治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含んでなるＤＣＣ融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＣＣ融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項３】
配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の核酸を含んでなり、該核酸を真核宿主細胞中において発現可能なベクター。
【請求項５】
請求項２又は３に記載の核酸分子又は請求項４に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＣＣ融合タンパク質を生産する方法であって、請求項２又は３に記載の核酸を真核宿主細胞中において発現させる工程と、該細胞又は細胞培養上清からＤＣＣ融合タンパク質を回収する工程を含んでなる方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法により得られるＤＣＣ融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１に記載のＤＣＣ融合タンパク質、請求項２又は３に記載の核酸分子、請求項４に記載のベクター、又は請求項５に記載の宿主細胞と；場合によっては薬学的に許容可能な担体を含有してなる薬学的組成物。
【請求項９】
癌の治療に使用される請求項８に記載の薬学的組成物又は請求項１又は７に記載のＤＣＣ融合タンパク質。
【請求項１０】
癌の治療のための医薬の製造のための、請求項８に記載の薬学的組成物又は請求項１又は７に記載のＤＣＣ融合タンパク質の使用。
【請求項１１】
請求項１又は７に記載のＤＣＣ融合タンパク質を、それを必要とする被験者に投与することにより、被験者の癌を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、Deleted in Colorectal Cancer（ＤＣＣ）の第５フィブロネクチンドメイン（５-フィブロネクチンドメイン）と抗体Ｆｃ部分を含むＤＣＣ融合タンパク質、これをコードする核酸分子及びその生産と癌治療のための使用に関する。
【０００２】
ネトリン-１はネトリンファミリーのメンバーであり、誘引及び反発の双方の形で、軸索ナビゲーションキューを示し、神経系の発達に主要な役割を担っている（Serafini, 1996, Cell 87: 1001-1014）。ネトリン-１に対する主要レセプターはＤＣＣ（Deleted in Colorectal Cancer）及びＵＮＣ５Ｈ（ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＮＣ５Ｈ２、ＵＮＣ５Ｈ３）であり、これらは全ていわゆる依存性受容体ファミリーに属している（Keino-Masu, 1996, Cell 87: 175-185；Ackermann, 1997, Nature 386: 838-842；Hong, 1999, Cell 97: 927-941；Mehlen, 1998, Nature 395: 801-804）。依存性受容体は、それらの各リガンドの非存在下でアポトーシスを誘導する能力を共有しており、よって、この能力は各リガンドの結合の際にブロックされる（Mehlen, 2004, Cell Mol Life Sci 61: 1854-1866；Bredesen, 2005, Cell Death Differ 12: 1031-1043）。
【０００３】
ヒトの様々な癌において、ＤＣＣの発現の低減又は損失、よってＤＣＣ誘導性アポトーシスの低減又は損失が観察されている（Kinzler, 1996, Proc Natl Acad Sci 100: 4173-4178）。さらに、ＵＮＣ５Ｈ遺伝子がほとんどの結腸直腸腫瘍においてダウンレギュレーションしていることも観察されており、これは、依存性受容体ＵＮＣ５Ｈの損失が腫瘍細胞の選択的利点であることを示している（Bernet, 2007, Gastroenterology 133: 1840-1848; Shin, 2007, Gastroenterology 133: 1849-1857）。しかしながら、依存性受容体ＤＣＣ及びＵＮＣ５Ｈのダウンレギュレーションが、様々な腫瘍細胞の生存率を高めるばかりでなく、それらのリガンドであるネトリン-１の自己分泌発現もまた観察されている。特に、大半の乳腺腫瘍、すなわち転移性乳癌はネトリン-１の増加した発現を示すことが示されている（Fitamant, 2008, Proc Natl Acad Sci 105: 4850-4855）。今日まで、ＤＣＣの細胞外部分のどのサブドメインがネトリン-１の結合の原因であるか、未だ明らかではない。第５フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（Geisbrecht, 2003, J Biol Chem 278: 32561-32568）及び第４フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（Kruger, 2004, J Neurosci 24: 10826-10834）の２つのサブドメインがこの文脈で検討されている。
【０００４】
過去に示されているように、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼとのＤＣＣ-５-フィブロネクチン融合タンパク質（ネトリン-１デコイタンパク質として作用；ここではＤＣＣ-５Ｆｂｎ-ＧＳＴとも称す）によるネトリン-１の中和が、依存性受容体ＤＣＣ及びＵＮＣ５Ｈを発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導しうる（欧州特許出願公開第１９８９５４６号）。ＦＬＡＧタグ化ＤＣＣ-５-フィブロネクチン融合タンパク質（ＤＣＣ-５Ｆｂｎ-ＧＳＴ）は、大腸菌中で組換え的に調製することができ、２週の期間にわたって肺への乳癌細胞の転移を低減することができる（Fitamant, 前掲）。さらに、ＤＣＣ-５Ｆｂｎ-ＧＳＴは、高レベルのネトリン-１を発現する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株の細胞死率を増加させることが証明されている（Delloye-Bourgeois, 2009, J Natl Cancer Inst 101: 237-247）。
【０００５】
しかしながら、ＤＣＣ-５Ｆｂｎ-ＧＳＴは、今もなお、いくつかの弱点を有しており、効果的であるためには、腫瘍内注射されなければならない。これは、おそらく、短い血漿半減期や速い分泌のような不利な薬理学的特性のためである。従って、依存性受容体誘導性アポトーシスの低減又は損失に関連した癌性疾患を治療するのに適したより効果的な化合物が必要とされている。
この技術的課題は、ここで提供される実施態様及び特許請求の範囲に提供される解決手段により解決される。
【０００６】
本発明は、Deleted in Colorectal Cancer（ＤＣＣ）の第５フィブロネクチンドメイン（５-フィブロネクチンドメイン；Ｆｎ５）と抗体Ｆｃ部分、特にヒトＩｇＧ１のＦｃとを含むＤＣＣ融合タンパク質（ここではＦｎ５-Ｆｃ融合タンパク質とも命名される）に関する。本発明で意外にも見出されたことは、ＤＣＣの第５フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインへのヒトＩｇＧ１分子のＦｃ部のＣ末端融合により、従来技術のＤＣＣ融合タンパク質と比較して、ＤＣＣ融合タンパク質の薬理学的特性の改善が得られることである。特に、ここで提供されるＤＣＣ融合タンパク質は、ＤＣＣ-５Ｆｂｎ-ＧＳＴタンパク質と比較して、ネトリン-１に対して増加した親和性を示す。
【０００７】
さらに、ここで詳述され、例証されるように、本発明のＤＣＣ融合タンパク質は、一過性発現でＨＥＫ２９３細胞中において高効率で生産され得る（＞８０ｍｇ／ｌ）。さらに、本発明のＤＣＣ融合タンパク質はＤＣＣの第５フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインの適切な折り畳みを可能にし、これが、ＤＣＣ-５Ｆｂｎと比較して、ネトリン-１に対するＤＣＣ融合タンパク質の良好な結合を生じせしめる（本発明のＤＣＣ融合タンパク質のＫＤは、ＤＣＣ-５Ｆｂｎ-ＧＳＴ融合タンパク質よりも２倍以上低い、Keino-Masu, 1996, Cell 87(2):175-85を参照）。
【０００８】
一般的に、本発明で提供されるＤＣＣ融合タンパク質は、ＤＣＣの第５フィブロネクチンドメイン（５-フィブロネクチンドメイン又はＦｎ５-ドメインとも称される）とヒトＩｇＧ１のＦｃ部を含む結合分子である。特に、本発明は配列番号２のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるＤＣＣ融合タンパク質に関する。配列番号２のアミノ酸１から１９はシグナルペプチド配列を示す。配列番号２並びに配列番号３のアミノ酸２０から３５３は成熟ＤＣＣ融合タンパク質を示す。従って、本発明は配列番号３のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるＤＣＣ融合タンパク質（Ｆｎ５変異体１とも称される）に関する。配列番号２のアミノ酸２０及び２１、並びに配列番号３のアミノ酸１及び２は、Ｆｎ-５ドメインの隣接天然アミノ酸を表す。配列番号２のアミノ酸２２から１１８並びに配列番号３のアミノ酸３から９９は、ＤＣＣの第５フィブロネクチンドメイン（５-フィブロネクチンドメイン又はＦｎ５-ドメイン）を表す。配列番号２のアミノ酸１１９から１２２、並びに配列番号３のアミノ酸１００から１０３は、Ｆｎ-５ドメインの隣接天然アミノ酸を表す。配列番号２のアミノ酸１２３から２５２、並びに配列番号３のアミノ酸１０４から２３３は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を表す。
【０００９】
ここに記載され、例証されるように、本発明のＤＣＣ融合タンパク質はネトリン-１に対して高い結合親和性を有する。従って、本発明のＤＣＣ融合タンパク質は、ネトリン-１に結合するデコイ分子として作用することができ、よって、ネトリン-１及びネトリン-１受容体、例えばＤＣＣ及びＵＮＣ５Ｈ（ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＮＣ５Ｈ２、ＵＮＣ５Ｈ３）の相互作用を阻害することができる。よって、本発明は、医薬として使用されるための、ここで提供されるＤＣＣ融合タンパク質に関する。特に、本発明は、癌の治療に使用されるための、ここで提供されるＤＣＣ融合タンパク質に関する。好ましくは、治療される癌は、癌細胞が表面上に依存性受容体ＤＣＣ及び／又はＵＮＣ５Ｈを発現し、又はＤＣＣ（Deleted in Colorectal Carcinoma）遺伝子発現（ＤＣＣタンパク質コードするhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geneからの遺伝子ＩＤ１６３０（２０１０年８月１０日にアップデート）（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ／バージョン：Ｐ４３１４６（２０１０年５月１８日の配列バージョン２、２０１０年８月１０日のファイルバージョン１０９）））及び／又はＵＮＣ５Ｈ１（ＵＮＣ５Ａ）遺伝子発現（遺伝子ＩＤ９０２４９（２０１０年６月２６日にアップデート））、及び／又はＵＮＣ５Ｈ２（ＵＮＣ５Ｂ）遺伝子発現（遺伝子ＩＤ２１９６９９（２０１０年７月２日にアップデート））、及び／又はＵＮＣ５Ｈ３（ＵＮＣ５Ｃ）遺伝子発現（遺伝子ＩＤ８６３３（２０１０年８月７日にアップデート））、及び／又はＵＮＣ５Ｈ４（ＵＮＣ５Ｄ）遺伝子発現（遺伝子ＩＤ１３７９７０（２０１０年７月２日にアップデート））で、ＵＮＣ-５ホモログタンパク質をコードするhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geneからのもの（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ／バージョン：Ｑ６ＺＮ４４（エントリーバージョン７４、配列バージョン３）、Ｏ０８７２２（エントリーバージョン７５、配列バージョン１）、Ｏ０８７４７（エントリーバージョン７９、配列バージョン１）、及びＱ６ＵＸＺ４（エントリーバージョン６９、配列バージョン１）の有意なアップレギュレーションを示すことを特徴とする。与えられた細胞が依存性受容体ＤＣＣ及び／又はＵＮＣ５Ｈを表面に発現するかどうかを決定する方法は、当該技術分野でよく知られており、限定されるものではないが、ＩＨＣ（免疫組織化学）又はＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）、定量的ＰＣＲ（例えば、六量体初回刺激ｃＤＮＡを用いる）、又は別法として発色性染料ベースのタンパク質検出技術（例えば、銀又はクーマシーブルー染色）と対のウエスタンブロット又は溶液及びゲル、ブロット及びマイクロアレにおけるタンパク質のための蛍光及び発光ベースの検出方法、例えば免疫染色、並びに免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ、及び質量分析を含む。本発明の文脈において、本発明のＤＣＣ融合タンパク質により治療される癌の例は、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、気管支肺胞上皮細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼内メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿��癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン細胞腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病で、上述の癌の任意の難治性型、又は上述の癌の一又は複数の組合せである。本発明のＤＣＣ融合タンパク質により治療される癌の特定の例は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び転移性乳癌である。
【００１０】
従って、本発明は、癌を治療するために使用される配列番号２のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるＤＣＣ融合タンパク質に関する。本発明は、癌を治療するために使用される配列番号３のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるＤＣＣ融合タンパク質に関する。本発明は、結腸直腸癌を治療するために使用される配列番号２のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるＤＣＣ融合タンパク質に関する。本発明は、ＮＳＣＬＣを治療するために使用される配列番号２のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるＤＣＣ融合タンパク質に関する。本発明は、転移性乳癌を治療するために使用される配列番号２のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるＤＣＣ融合タンパク質に関する。本発明は、結腸直腸癌を治療するために使用される配列番号３のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるＤＣＣ融合タンパク質に関する。本発明は、ＮＳＣＬＣを治療するために使用される配列番号３のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるＤＣＣ融合タンパク質に関する。本発明は、転移性乳癌を治療するために使用される配列番号３のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるＤＣＣ融合タンパク質に関する。
【００１１】
本発明は、ここに記載され提供されるＤＣＣ融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。従って、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸分子に関する。また本発明は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする核酸分子に関する。特に、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子に関する。配列番号１のヌクレオチド１６から１０７４は、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＯＲＦを表す。従って、本発明は、配列番号１のヌクレオチド１６から１０７４のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子に関する。配列番号１のヌクレオチド７３から１０７４は、配列番号３のアミノ酸配列をコードするＯＲＦを表す。従って、本発明は、配列番号１のヌクレオチド７３から１０７４のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子に関する。
【００１２】
本発明の核酸分子は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子でありうる。またそれらは核酸アナログ、例えばチオリン酸オリゴヌクレオチド、置換リボ−オリゴヌクレオチド、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＧＮＡ（グリコール核酸）分子、ＴＮＡ（トレオース核酸）分子、モルホリノポリヌクレオチド、又はアンタゴｍｉｒ（コレステロールコンジュゲート）核酸分子、又は当該技術分野で知られているそれらの任意の修飾体（例えば、修飾体の例については、米国特許第５５２５７１１号、米国特許第４７１１９５５号、米国特許第５７９２６０８号、又は欧州特許出願公開第３０２１７５号を参照）。本発明の核酸分子は、天然に生じる核酸残基、又は人工的に生産される核酸残基でありうる。核酸残基の例は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、キサンチン（Ｘ）、及びヒポキサンチン（ＨＸ）である。本発明の文脈において、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は、核酸分子のそれぞれのタイプに応じて交換可能に使用されうる。例えば、当業者がよく知っているように、ＤＮＡの一部としてのチミン（Ｔ）は、対応する転写されたｍＲＮＡの一部としてのウラシル（Ｕ）に対応する。本発明の核酸分子は一本鎖又は二本鎖、直鎖状又は環状、天然又は合成であり得、他の定義がなされない場合は、何ら大きさの制限はない。また核酸分子は、以下にさらに詳述するようにプロモーターを含みうる。プロモーターは相同性又は異種性でありうる。特定の実施態様では、ここに提供される核酸分子は、このプロモーターのコントロール下にある。
【００１３】
一般的に、ここで使用される場合、ここに提供される配列の核酸配列を含むポリヌクレオチドはまた前記核酸配列からなるポリヌクレオチドでありうる。
【００１４】
さらに、本発明によれば、本発明の核酸分子はベクター中にクローニングされうる。ここで使用される「ベクター」なる用語は、特に、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、及び遺伝操作で一般的に使用されている他のベクターを意味する。好ましい実施態様では、これらのベクターは、細胞、真菌細胞等の真核細胞、微生物の細胞、例えば酵母又は原核細胞の形質転換に適している。特に好ましい実施態様では、このようなベクターは、例えば本発明の核酸分子を転写するための、細菌細胞の安定した形質転換に適している。例えば、ベクターは、図２に示され、ここの実施例１に記載されたｐＵＣ１８又は７８００でありうる。よって、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター、例えばｐＵＣ１８又は７８００に関する。よって、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むベクター、例えばｐＵＣ１８又は７８００に関する。また本発明は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むベクター、例えばｐＵＣ１８又は７８００に関する。特に、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含むベクター、例えばｐＵＣ１８又は７８００に関する。また本発明は、配列番号１のヌクレオチド１６から１０７４のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含むベクター、例えばｐＵＣ１８又は７８００に関する。さらに本発明は、配列番号１のヌクレオチド７３から１０７４のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含むベクター、例えばｐＵＣ１８又は７８００に関する。一般的に、ベクターは真核宿主細胞において前記核酸分子を発現可能でありうる。
【００１５】
従って、本発明の一態様では、提供されるベクターは発現ベクターである。一般的に、発現ベクターは文献に広く記載されている。通例、それらは、選択される宿主において複製を可能にする複製起源と選択マーカー遺伝子ばかりでなく、プロモーター、大抵の場合では、転写のための終止シグナルを含む。プロモーターと終止シグナルの間には、好ましくは、発現が所望される核酸配列／分子の挿入を可能にする少なくとも一つの制限部位又はポリリンカーが存在する。
【００１６】
ここで提供されるベクターが、本発明の文脈において用いられるのに適し、例えばここに記載のＤＣＣ融合タンパク質の発現に適したプロモーターを既に含む、従来から知られている発現ベクターを利用することにより産生される場合、核酸分子は、得られるベクターが、この発明の文脈で用いられるのに適した一つのプロモーターのみを好ましくは含むようにそのベクター中に挿入される。プロモーターは、一般的には異種性又は相同性でありうる。また、ここに記載のベクターは、一を越えるプロモーターを含んでいてもよく、各それぞれのプロモーターは異種性又は相同性であってもよい。当業者には、このような挿入を如何にして実施できるかは分かる。例えば、プロモーターは、核酸コンストラクトから又はライゲーションの前に発現ベクターから切除されうる。
【００１７】
本発明に係るタンパク質は、好ましくは組換え手段により生産される。好ましくは、タンパク質発現は真核細胞においてなされ、ポリペプチドの続く単離と通常は薬理学的に許容可能な純度までの精製を伴う。タンパク質発現では、そのタンパク質をコードする核酸は、標準的な方法で発現ベクターに挿入される。発現は、適切な安定した真核宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞等において実施され、タンパク質は細胞（溶解後の細胞又は上清）から回収される。
【００１８】
さらなる実施態様では、本発明の核酸分子及び／又はここに記載のポリヌクレオチドがクローン化されるベクターは、宿主細胞中に形質導入、形質転換又は形質移入され、又は他の導入がなされうる。例えば、宿主細胞は真核細胞又は原核細胞、好ましくは真核細胞である。非限定的な例としては、宿主細胞は哺乳動物細胞である。ここに記載の宿主細胞は、本発明において記載され提供されるＤＣＣ融合タンパク質を産生せしめるために特に有用であるものである。
【００１９】
一般的に、上に記載した宿主細胞は、本発明で提供される核酸分子（例えば、配列番号１の配列、配列番号１のヌクレオチド１６から１０７４又は配列番号１のヌクレオチド７３から１０７４を含むか又は該配列からなる）、又はここに記載のベクターを含んでなる原核又は真核細胞、好ましくは真核細胞、又はそのような細胞から誘導され、ここに記載の核酸分子又はベクターを含む細胞でありうる。好ましい実施態様では、宿主細胞は、ゲノムに組み込まれて本発明の核酸分子を含むように、本発明の核酸分子又はここに記載のベクターを含み、つまりこれらを用いて遺伝的に修飾される。例えば、ここに記載のそのような宿主細胞は、ヒト、酵母、又は真菌細胞でありうる。特定の一態様では、宿主細胞は、本発明の核酸分子を転写可能である。ここに記載の宿主細胞を産生せしめるために使用される異なった対応する発現系の例の概説は、例えばMethods in Enzymology 153 (1987), 385-516, Bitter (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544)、Sawers (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9)、Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4)、Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463)、及びGriffiths (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440)に含まれる。本発明の核酸分子又はここに記載のベクターを用いた宿主細胞の形質転換又は遺伝子操作は、例えばSambrook 及び Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA；Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990に記載されているように、標準的な方法により実施されうる。本発明の一態様では、ここで提供される核酸分子又はここに記載のベクターを含む宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３-Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（ヒト胚性腎臓細胞株２９３、Invitrogen）でありうる。従って、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含んでなるＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３-Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に関する。また本発明は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含んでなるＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３-Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に関する。また本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含んでなるＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３-Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に関する。また本発明は、配列番号１のヌクレオチド１６から１０７４のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含んでなるＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３-Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に関する。また本発明は、配列番号１のヌクレオチド７３から１０７４のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含んでなるＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３-Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に関する。
【００２０】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むここに記載され提供されるｐＵＣ１８又は７８００等のベクターを含んでなるＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３-Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に関する。また本発明は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むここに記載され提供されるｐＵＣ１８又は７８００等のベクターを含んでなるＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３-Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に関する。また本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含んでなるここに記載され提供されるｐＵＣ１８又は７８００等のベクターを含んでなるＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３-Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に関する。また本発明は、配列番号１のヌクレオチド１６から１０７４のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含むここに記載され提供されるｐＵＣ１８又は７８００等のベクターを含んでなるＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３-Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に関する。また本発明は、配列番号１のヌクレオチド７３から１０７４のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含むここに記載され提供されるｐＵＣ１８又は７８００等のベクターを含んでなるＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３-Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に関する。
【００２１】
本発明は、ここに記載された宿主細胞においてここに記載され提供された核酸分子を発現させ、前記細胞又は細胞培養上清からＤＣＣ融合タンパク質を回収する工程を含む、ここに記載され提供されたＤＣＣ融合タンパク質を生産する方法に関する。従って、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるＤＣＣ融合タンパク質を生産する方法であって、宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３-Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞）において配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸分子を発現させ、前記細胞又は細胞上清からＤＣＣ融合タンパク質を回収する工程を含む方法に関する。従って、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるＤＣＣ融合タンパク質を生産する方法であって、宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３−Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞）において配列番号３のアミノ酸配列をコードする核酸分子を発現させ、前記細胞又は細胞上清からＤＣＣ融合タンパク質を回収する工程を含む方法に関する。本発明は、ここに記載され提供される方法により得られたか又は得ることができるＤＣＣ融合タンパク質に関する。
【００２２】
本発明は、ここで提供されるＤＣＣ融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター、及び／又はここに記載の宿主細胞を含む組成物に関する。ここで提供されるＤＣＣ融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター、及び／又はここに記載の宿主細胞を含む組成物は、薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤をさらに含みうる。従って、本発明は、場合によっては薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤と共に、医薬として使用されるための、ここで提供されるＤＣＣ融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター、及び／又はここに記載の宿主細胞に関する。従って、本発明は、ここで提供されるＤＣＣ融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター、及び／又はここに記載の宿主細胞を含有し、場合によっては、薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤をさらに含む薬学的組成物に関する。一般的に、適切な薬学的担体の例は当該技術分野でよく知られており、リン酸緩衝食塩水、水、エマルション、例えば油／水エマルション、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液等を含む。このような担体を含有する薬学的組成物は、よく知られている一般的な方法により処方することができる。これらの薬学的組成物は、被験者に適切な用量、すなわち癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌が治療される被験者の体重当たり、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約１０ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、投与することができる。組成物の投与は、様々な方法、例えば経腸的、経口的（例えば、丸薬、錠剤、頬用、舌下用で、崩壊可能なカプセル、薄膜、液体溶液又は懸濁剤、粉剤、固形結晶又は液体）、直腸的（例えば、座薬、浣腸）、注射を介して（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は経皮的）、吸入を介して（例えば、気管支的）、局所的、経膣的、皮膚的、経鼻的になされ又は投与されうる。投薬レジメンは主治医及び臨床要因により決定されるであろう。医療分野でよく知られているように、任意の一患者への投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、一般的な健康状態、及び同時投与される他の薬剤に依存する。ここで提供されるＤＣＣ融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター及び／又は宿主細胞と、場合によってはここに記載の薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含有する組成物及び薬学的組成物は、局所的又は全身的に投与されうる。投与は、好ましくは静脈内又は皮下的になされる。組成物及び薬学的組成物は、また、例えば内部又は外部の標的部位への微粒子銃での送達により、又は動脈内の部位へのカテーテルにより、標的部位に直接投与されうる。非経口投与のための調製物は、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルションを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、水、アルコール性／水性溶液、エマルション又は懸濁液、例えば生理食塩水及び緩衝媒体を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油を含む。静脈内用ビヒクルは、流体及び栄養補液、電解質補充液（例えば、リンゲルデキストロースをベースとするもの）等を含む。保存料及び他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等が存在していてもよい。さらに、特に上述の要因を考慮して、上述した例示的範囲より下又は上の用量も考えられる。
【００２３】
既に記載したように、ここで提供されるＤＣＣ融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター、及び／又はここに記載の宿主細胞を含んでなるここに記載の組成物は、被験者の癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌を治療するために使用できる。従って、本発明は、癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌の治療に使用されるここで提供されるＤＣＣ融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター、及び／又はここに記載の宿主細胞を含む薬学的組成物に関する。既に記載したように、薬学的組成物は、上述したような薬理学的に許容可能な担体、賦形剤、及び／又は希釈剤をさらに含有しうる。よって本発明は、癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌の治療に使用される配列番号２のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるＤＣＣ融合タンパク質と、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤とを含有してなる薬学的組成物に関する。よって本発明は、癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号３のアミノ酸配列を含むか又は該配列からなるＤＣＣ融合タンパク質と、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸分子と、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号３のアミノ酸配列をコードする核酸分子と、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号１のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子と、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号１のヌクレオチド１６から１０７４のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子と、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号１のヌクレオチド７３から１０７４のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子と、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含んでなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号１のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含んでなる上述したベクターと、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号１のヌクレオチド１６から１０７４のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含んでなる上述したベクターと、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌の治療に使用される、配列番号１のヌクレオチド７３から１０７４のヌクレオチド配列を含むか又は該配列からなる核酸分子を含んでなる上述したベクターと、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。本発明は、癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌の治療に使用される、ここで提供され記載される核酸分子又はベクターと、上述した薬理学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含有してなる薬学的組成物に関する。
【００２４】
本発明は、癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌を治療する医薬を製造するための、ここで提供されるＤＣＣ融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター又は宿主細胞の使用に関する。また本発明は、ここで提供されるＤＣＣ融合タンパク質、ここで提供される核酸分子、ここに記載のベクター又は宿主細胞を、それを必要とする被験者に投与することによる、被験者の癌、特に結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ又は転移性乳癌を治療する方法に関する。
【００２５】
一般的に、上述したように被験者に投与されるここに記載され提供される化合物及び組成物の投薬量は、ここで特定され記載されるそれぞれのまた全ての薬剤実施態様及び使用に対して選択されうる。
【００２６】
一般的に、本発明において治療される被験者は哺乳動物であり得、好ましくはヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明で提供され記載されたＤＣＣ融合タンパク質のドメイン構造の模式的提示。
【図２】ＤＣＣ融合タンパク質（Ｆｎ５-Ｆｃ；図１に示す）発現ベクター７８００のプラスミドマップ。
【図３】ニワトリネトリン-１に対する本発明で提供され記載されたＤＣＣ融合タンパク質（配列番号３）の結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析。Ｆｎ５変異体１は、アミンカップリングされた捕捉分子を介してチップ表面に捕捉された。一連の増加濃度のニワトリネトリン-１を注射し、プラズモン表面共鳴変化により、動態結合挙動をモニターした。相対単位（ＲＵ）対コントロールチップとしてのこれらの変化を、時間（ｘ軸）に対してｙ軸に記録した。
【図４】Ｈ３５８細胞を用いたカスパーゼ-３活性化アッセイ。様々に処理された細胞の可溶化物におけるカスパーゼ-３活性を、バッファー処理コントロール細胞（ｃｔｒｌ）に対して正規化された相対単位としてグラフにした。ポジティブコントロールとして、細胞をＤＣＣの全細胞外ドメイン（ＤＣＣ ＥＣＤ）を含むＦｃ融合タンパク質で処理した。カスパーゼ活性における同じ最大の増加は、≧２μｇ／ｍｌの濃度で、Ｆｎ５変異体１融合タンパク質により誘導させることができる。過剰の組換えネトリン-１の添加は、１０μｇ／ｍｇのＦｃ５変異体１によるカスパーゼ-３活性化を鈍らせる。
【図５】Ｈ３５８及びＡ５４９異種移植のインビボ腫瘍細胞増殖阻害。ヌードマウスにおけるＨ３５８（上のグラフ）及びＡ５４９（下のグラフ）肺癌細胞の皮下異種移植の腫瘍増殖。ノギス測定により決定されるｍｍ３での腫瘍体積（ｙ軸）を経時的（０日＝播種の日）（ｘ軸）にグラフ化した。治療を〜１００ｍｍ３の平均腫瘍サイズで開始した。＜上のグラフ＞：ビヒクル処置動物（菱形の符号）は、２０ｍｇ／ｋｇのＦｎ５変異体１融合タンパク質（矩形の符号）で、週に１回腹腔内的に治療された動物よりも、より早いＨ３５８腫瘍細胞増殖を示している。時間軸の上の矢印は毎週の処置を示している。＜下のグラフ＞：ビヒクル処置動物（菱形の符号）は、２０ｍｇ／ｋｇのＦｎ５変異体１融合タンパク質（三角の符号）で、週に２回腹腔内的に治療された動物よりも、より早いＡ５４９腫瘍細胞増殖を示した。同じ用量で週１回の治療では、中程度の腫瘍増殖（矩形の符号）になった。「トラップ」は変異体１融合タンパク質（配列番号３）を意味する。  実施例は本発明を例証するものである
【実施例】
【００２８】
実施例１：Ｆｎ５-Ｆｃ融合タンパク質
プラスミド構築
Sambrook, J.等, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているような標準的な方法を使用し、ＤＮＡを操作した。製造者の使用説明書に従って分子生物学的試薬を使用した。所望の遺伝子セグメントを遺伝子合成により調製した。合成された遺伝子断片を特定の発現ベクターにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【００２９】
発現プラスミド７８００
ベクター７８００は、例えば人工ＩｇＦｃ融合タンパク質の一過性発現用の発現プラスミドであり、ここで、ヒトＤＣＣ（Deleted in Colorectal Cancer）受容体の第５細胞外フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインは、何らの修飾又は人工的リンカー配列を導入することなく、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域（Ｆｃ定常領域；ヒンジ-ＣＨ２-ＣＨ３）に融合される；図２参照。
【００３０】
１０８４ｂｐｓのＤＮＡセグメント（配列番号１）を、化学的遺伝子合成及び所望するＤＣＣ融合タンパク質（Ｆｎ５-Ｆｃ融合タンパク質）（配列番号２）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするＰＣＲ技術により調製した。ＤＣＣ融合タンパク質（Ｆｎ５-Ｆｃ融合タンパク質）は、マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列（配列番号２のアミノ酸１から１９）、ヒトＤＣＣ受容体第５細胞外フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（配列番号２のアミノ酸２２から１１８；ＤＣＣ（Deleted in Colorectal Carcinoma）のアミノ酸８４３から９３９：ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ４３１４６（配列バージョン２）、Ｆｎ５ドメインのＣ末端（配列番号２のアミノ酸１１９から１２２）及びＮ末端（配列番号２のアミノ酸２０から２１）に第５フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（Ｆｎ５ドメイン）の隣接天然アミノ酸、及びヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃ定常領域（配列番号２のアミノ酸１２３から３５３）からなる。Ｆｎ５-Ｆｃ発現カセットを容易に組み立てるために、化学的に調製されたＤＮＡセグメントは、それぞれ５'及び３'末端での独特のＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接している。Ｆｎ５-Ｆｃ構造遺伝子（ＯＲＦ；配列番号１のヌクレオチド１６から１０７４）を、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化部位からの最初期エンハンサー及びプロモーターにつなげた。
【００３１】
ＤＣＣ融合タンパク質（Ｆｎ５-Ｆｃ融合タンパク質）のための発現カセットの他に、プラスミドは、
−  大腸菌中でのこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、及び
−  大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
【００３２】
ＴＤＣＣ融合タンパク質（Ｆｎ５-Ｆｃ融合タンパク質）のコード化配列（例えば、配列番号１）の転写ユニットは、以下のエレメントを含む：
−  ヒトサイトメガロウイルスからの最初期エンハンサー及びプロモーター、
−  ヒト抗体生殖遺伝子の５'非翻訳領域、
−  マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−  Ｆｎ５-Ｆｃ融合タンパク質コード配列（配列番号１のヌクレオチド１６から１０７４）、及び
−  ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列。
【００３３】
発現プラスミド７８００のプラスミドマップを図２に示す。成熟ＤＣＣ融合タンパク質の（すなわち、シグナル配列がない）アミノ酸配列を配列番号３に示す（Ｆｎ５変異体１）。
【００３４】
ベクター７８０９は、配列番号４に示すように、（配列番号３に示される成熟ＤＣＣ融合タンパク質（Ｆｎ５-Ｆｃ融合タンパク質）と比較して）アミノ酸位置１０７のＣｉｓからＡｌａへの置換を生じる抗体ヒンジ定常領域内の単一点突然変異による、７８００の構築に使用されるＤＣＣ融合タンパク質（Ｆｎ５-Ｆｃ融合タンパク質；成熟タンパク質に対する配列番号３）とは異なるＦｎ５-Ｆｃ融合タンパク質変異体用の発現プラスミドである。
【００３５】
実施例２：一過性形質移入及び発現
実施例１に例証される本発明に係る組換えタンパク質は、懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３-Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（ヒト胚性腎臓細胞株２９３、Invitrogen）の一過性形質移入により得た。形質移入細胞を、ウルトラ-グルタミン（Biowhittake/Lonza）又はＬ-グルタミン(Sigma)のいずれかである６ｍＭのグルタミンが補填されたＦ１７培地（Gibco）又はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地（Invitrogen）において、８％のＣＯ２、３７℃で、３０ｍｌから２５０ｍｌの培地スケールで振とうフラスコ内で培養した。形質移入では、フェクチン(Fectin)(Invitrogen)を、４：３の試薬（μｌ）対ＤＮＡの比で使用した。細胞培養上清を含むポリペプチドを、形質移入の６〜８日後に収集した。例えばＨＥＫ２９３細胞等におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般的情報は、Meissner, P.等, Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に与えられている。ＤＣＣ融合タンパク質（配列番号３）は、ＨＥＫ２９３-Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞中での一過性発現で、少なくとも１００ｍｇ／Ｌの比率で高い効率で分泌された。
【００３６】
実施例３：ＳＤＳ-ＰＡＧＥを使用する発現分析
４倍濃度のＬＤＳ試料バッファー（４×ＬＤＳ）：４ｇのグリセロール、０．６８２ｇのＴＲＩＳ（トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン）、０．６６６ｇのＴＲＩＳ-ＨＣｌ（トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン塩酸塩）、０．８ｇのＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）、０．００６ｇのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酸）、０．７５ｍｌのＳｅｒｖａ Ｂｌｕｅ Ｇ２５０の１重量％（ｗ／ｗ）水溶液、０．７５ｍｌのフェノールレッドの１重量％（ｗ／ｗ）水溶液を水に添加して、１０ｍｌの全容量にした。
【００３７】
分泌タンパク質を含む培養ブロスを遠心分離に供し、細胞と細胞屑を除去した。清澄にされた上清のアリコートを１／４容量（ｖ／ｖ）の４×ＬＤＳ試料バッファー及び１／１０容量（ｖ／ｖ）の０．５Ｍの１,４-ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と混合した。ついで、試料を７５℃で１０分インキュベートし、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによりタンパク質を分離させた。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）プレキャストゲル系（Pre-Cast gel system）(Invitrogen)を、製造者の使用説明書に従って使用した。特に、１０％のＮｕＰＡＧＥ(登録商標)Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ビス−トリスプレキャストゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳランニングバッファーを使用した。成熟ＤＣＣ融合タンパク質（Ｆｎ５変異体１：配列番号３；及び変異Ｆｎ５変異体１：配列番号４）を、クーマシーブルーブリリアント染色を用いた染色後にはっきりと検出することができた。培養上清における発現収量は＞１００ｍｇ／Ｌであった。これに対して、（プラスミド７８０１、７８０２及び７８０３に基づき上述した実施例１に記載されているようにして同様に発現された）Ｆｎ５変異体２（配列番号６）又はＦｎ４＋Ｆｎ５変異体１及び２（それぞれ配列番号５及び配列番号７）を含んでなる他のコンストラクトの発現収量は、低い発現収量しか示さなかった。結果を表１に示す。
2013538051.tif 000002
【００３８】
実施例４：アフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーによるタンパク質の精製
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー
発現され、分泌されたポリペプチドを、プロテインＡ親和性材料Ｍａｂセレクトシュア(MabSelectSure)(GE Healthcare)を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。簡潔に述べると、遠心分離（１００００ｇ、１０分）及び０．４５μｍフィルターによる濾過後、ポリペプチドを含む清澄な培養上清を、ＰＢＳバッファー（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ及び２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化されたＭａｂセレクトシュアカラムに適用した。未結合のタンパク質を、平衡バッファーでの洗浄により除去した。ポリペプチドを０．１Ｍのクエン酸バッファー、ｐＨ３．３で溶離させ、生成物を含む画分を１ＭのＴＲＩＳ、ｐＨ９．０で中和した。その後、溶液を、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０のバッファーで、４℃で透析し、Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮装置で濃縮し、さらなるプロセシングまで、氷水浴中に保存した。
【００３９】
サイズ排除クロマトグラフィー
ポリペプチドを含む溶液を、同じヒスチジンバッファーで平衡にされたスーパーデックス（Superdex）２００高ロードカラム（GE HealthCare）に適用した。画分を収集した。全ての画分を分析用ＳＥＣ（スーパーデックス２００、GE HealthCare）により分析し、純粋な単量体性コンジュゲートを伴う画分をプール化し、−８０℃で凍結保存した。
ポリペプチドの完全性は、先の段落に記載されたように、還元剤の存在及び非存在下、クーマシーブリリアントブルーで染色して、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析した。
【００４０】
実施例５：表面プラズモン共鳴による結合アッセイ
機器：Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００(GE Healthcare)
ソフトウェア：Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００コントロール、バージョン２．０２
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００エバルエーション、バージョン２．０２
アッセイフォーマット：チップ：ＣＭ５-チップ
ＤＣＣ融合タンパク質（Ｆｎ５変異体１；配列番号３）を、アミンカップリングされた捕捉分子を介して捕捉した。一連の増加濃度のネトリン-１を注射した。
アミンカップリング捕捉分子を単独で含むチップ表面を、可能なバッファー効果又はネトリン−１の非特異的結合の修復のために参照コントロール表面として使用した。
捕捉分子：Ｆｎ５変異体１のために抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ由来、Jackson Immuno Research JIR 109-005-098）。
【００４１】
捕捉分子のアミンカップリング
製造者の使用説明書に従っての標準的なアミンカップリング：ランニングバッファー：：ＨＢＳ-Ｎバッファー、ＥＤＣ／ＮＨＳの混合物により活性化、５０００ＲＵのリガンド密度用；捕捉抗体をカップリングバッファーＮａＡｃ、ｐＨ４．５、ｃ＝３０μｇ／ｍＬで希釈した；最終的に残存する活性化カルボキシル基を１Ｍのエタノールアミンの注入によりブロックした。
２５℃でのＤＣＣ融合タンパク質（Ｆｎ５変異体１；配列番号３）に結合するネトリン-１の動態特徴付け
ランニングバッファー：ＰＢＳ＋０．０５％（ｖ／ｖ）のトゥイーン２０
フローセル２から４でのＦｎ５変異体１の捕捉：流量５μＬ／分、接触時間７２秒、ｃ（Ｆｎ５変異体１）＝１００ｎＭ，、ランニングバッファー＋１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで希釈。
【００４２】
検体試料：
古典的濃度シリーズを、ｃ＝４００−１ｎＭの間で５又は６の増加濃度の検体を逐次注入することにより、流量５０μＬ／分で測定した。検体を３分注入し、解離相が２０分続いた。異なる製造者からの様々なネトリン-１試料を測定に使用した（ヒトネトリン-１、アレキシス(Alexis)５２２-１００-００００／ヒトメトリン-１Netris Pharma／ニワトリネトリン-１、アレキシス５２２-１０６-２０１０）。
１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５、接触時間２分、流量３０μＬ／分を使用し、各サイクル（＝各濃度）後に再生を実施した。
【００４３】
図３は、例えば、様々な濃度の注入されたチキンネトリン-１での、捕捉検体ＤＣＣ融合タンパク質（Ｆｎ５変異体１；配列番号３）の典型的な結合及び解離曲線を示す。
【００４４】
通常の二重参照（コントロール参照：捕捉分子への検体の結合；フローセル：ブランクとしてネトリン-１の濃度「０」）と、モデル「滴定動態」１：１結合を用いた計算を使用して、動態パラメーターを計算した。
2013538051.tif 000003
【００４５】
実施例６：Ｈ３５８細胞を用いたカスパーゼ３活性化アッセイ
１日目に細胞を無血清培地に播種した（ウェル当たり１ｍｌの培地を含む６ウェルプレートにウェル当たり２×１０５細胞）。２日目に培地を、ビヒクル（ＰＢＳ）のみ、又は１μｇ／ｍｌの成熟ＤＣＣ融合タンパク質（Ｆｎ５変異体１、配列番号３）、又は１μｇ／ｍｌのＦｎ５変異体１と１５０ｎｇ／ｍｌのネトリン-１を含んでいる１ｍｌの新鮮な無血清培地で置き換えた。１条件当たり２ウェルにおいて処理を実施した。３日目、２つの同じようにして処理されたウェルから浮遊及び全付着細胞を、一プールとして収集した。細胞ペレットを５５μＬの溶解バッファーに再懸濁させ、氷で１０分、溶解させた。ついで、ライセートを４℃で３分、最高速度で遠心分離することにより事前清浄化した。上清を新しいチューブに収集し、タンパク質濃度の測定中、氷上に保持した。白色の９６ウェルプレート中において、３０μｇ容量のタンパク質アリコートを、溶解バッファーを使用して最終容量５０μｌに調節した。５４μＬの反応バッファーと１μＬのＤＥＶＤ-ＡＦＣと０．５μＬのＤＴＴからなる５０μＬの反応混合物を各ウェルに添加した。蛍光の発生（４００ｎｍで励起、５１０ｎｍで発光）を、５分毎に全体で１時間、動態測定によりモニターした。あるいは、それができない場合は、最初の読み取りを混合物の添加直後に実施し、最終的な測定を３７℃での１時間のインキュベート後に実施した（光から保護）。全ての値を、ビヒクルコントロール試料に対して正規化した。結果を図４に示す。
【００４６】
実施例７：Ｈ３５８及びＡ５４９異種移植のインビボ腫瘍増殖阻害
Ｈ３５８異種移植：
５週齢の雌の胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスに、２００μＬのＰＢＳ中の５．０×１０６のＨ３５８細胞をマウスの左側腹部に皮下注射することにより移植し、マウス当たり１腫瘍を作製した。腫瘍が約１００ｍｍ３の体積に達したところで、２０ｍｇ／ｋｇのＦｎ５変異体１融合タンパク質(配列番号３)(ｎ＝１１匹のマウス)又は等しい容量のバッファー(ｎ＝１２匹のマウス)を、４連続週にわたり、週１回、腹腔内注射した。腫瘍サイズをノギスで測定した。腫瘍体積は、式ｖ＝０．５(ｌ×ｗ２)（ここで、ｖは体積であり、ｌは長さであり、ｗは幅である）で算出した。
【００４７】
Ａ５４９異種移植：
５週齢の雌の胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスに、Ａ５４９細胞をその左側腹部に皮下注射することにより移植した。腫瘍が約１００ｍｍ３の体積に達したところで、２０ｍｇ／ｋｇ用量のＦｎ５変異体１融合タンパク質(配列番号３)又は等しい容量のバッファーを、４連続週にわたり、週１回又は２回、腹腔内注射した(治療群当たりｎ＝１０匹のマウス)。腫瘍サイズをノギスで測定した。腫瘍体積は、式ｖ＝０．５(ｌ×ｗ２)（ここで、ｖは体積であり、ｌは長さであり、ｗは幅である）で算出した。図５をまた参照のこと(「トラップ」は変異体１融合タンパク質(配列番号３)を意味する)。
【００４８】
本発明で言及される配列
配列番号１
ＤＣＣ融合タンパク質(Ｆｎ５-Ｆｃ融合タンパク質)７８００をコードするＤＮＡ
人工配列
ａａｇｃｔｔｇｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇｔａｔｃａｔｃｃｔｃｔｔｃｔｔｇｇｔａｇｃａａｃａｇｃｔａｃａｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃａｇｃａｃｃｃｃｃａｔｇｃｔｇｃｃｔｃｃａｇｔｇｇｇｃｇｔｃｃａｇｇｃｃｇｔｇｇｃｔｃｔｃａｃａｃａｃｇａｃｇｃａｇｔｃｃｇｃｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｃｃｇａｔａａｃｔｃｔｇｔｔｃｃｃａａｇａａｔｃａｇａａａａｃｃｔｃａｇａａｇｔｇａｇａｃｔｇｔａｃａｃｔｇｔｃｃｇｃｔｇｇｃｇｇａｃａｔｃｃｔｔｃｔｃｃｇｃｔｔｃｔｇｃａａａｇｔａｔａａｇａｇｔｇａａｇａｃａｃｃａｃｔａｇｃｃｔｔｔｃｃｔａｃａｃｃｇｃｃａｃａｇｇｇｃｔｇａａａｃｃｔａａｃａｃｃａｔｇｔａｔｇａｇｔｔｔｔｃｔｇｔｇａｔｇｇｔａａｃａａａｇａａｔａｇｇａｇａｔｃａａｇｃａｃｃｔｇｇｔｃｃａｔｇａｃｔｇｃｔｃａｔｇｃａａｃａａｃｃｔａｃｇａｇｇｃｃｇｃｔｃｃａａａａｔｃｔｔｇｔｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｔｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃａｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｃｃｃｇｇｇｃａａａｔｇａｇｃｔａｇｃｇ
【００４９】
配列番号２
ＤＣＣ融合タンパク質(Ｆｎ５-Ｆｃ融合タンパク質)７８００のアミノ酸配列
人工配列
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＳＴＰＭＬＰＰＶＧＶＱＡＶＡＬＴＨＤＡＶＲＶＳＷＡＤＮＳＶＰＫＮＱＫＴＳＥＶＲＬＹＴＶＲＷＲＴＳＦＳＡＳＡＫＹＫＳＥＤＴＴＳＬＳＹＴＡＴＧＬＫＰＮＴＭＹＥＦＳＶＭＶＴＫＮＲＲＳＳＴＷＳＭＴＡＨＡＴＴＹＥＡＡＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００５０】
配列番号３
成熟ＤＣＣ融合タンパク質(Ｆｎ５-Ｆｃ融合タンパク質)７８００のアミノ酸配列
人工配列
ＳＴＰＭＬＰＰＶＧＶＱＡＶＡＬＴＨＤＡＶＲＶＳＷＡＤＮＳＶＰＫＮＱＫＴＳＥＶＲＬＹＴＶＲＷＲＴＳＦＳＡＳＡＫＹＫＳＥＤＴＴＳＬＳＹＴＡＴＧＬＫＰＮＴＭＹＥＦＳＶＭＶＴＫＮＲＲＳＳＴＷＳＭＴＡＨＡＴＴＹＥＡＡＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００５１】
配列番号４
成熟Ｆｎ５-Ｆｃ融合タンパク質７８０９のアミノ酸配列
人工配列
ＳＴＰＭＬＰＰＶＧＶＱＡＶＡＬＴＨＤＡＶＲＶＳＷＡＤＮＳＶＰＫＮＱＫＴＳＥＶＲＬＹＴＶＲＷＲＴＳＦＳＡＳＡＫＹＫＳＥＤＴＴＳＬＳＹＴＡＴＧＬＫＰＮＴＭＹＥＦＳＶＭＶＴＫＮＲＲＳＳＴＷＳＭＴＡＨＡＴＴＹＥＡＡＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００５２】
配列番号５
成熟Ｆｎ４-Ｆｎ５-Ｆｃ融合タンパク質７８０１のアミノ酸配列
人工配列
ＱＶＰＤＱＰＳＳＬＨＶＲＰＱＴＮＣＩＩＭＳＷＴＰＰＬＮＰＮＩＶＶＲＧＹＩＩＧＹＧＶＧＳＰＹＡＥＴＶＲＶＤＳＫＱＲＹＹＳＩＥＲＬＥＳＳＳＨＹＶＩＳＬＫＡＦＮＮＡＧＥＧＶＰＬＹＥＳＡＴＴＲＳＩＴＤＰＴＤＰＶＤＹＹＰＬＬＤＤＦＰＴＳＶＰＤＬＳＴＰＭＬＰＰＶＧＶＱＡＶＡＬＴＨＤＡＶＲＶＳＷＡＤＮＳＶＰＫＮＱＫＴＳＥＶＲＬＹＴＶＲＷＲＴＳＦＳＡＳＡＫＹＫＳＥＤＴＴＳＬＳＹＴＡＴＧＬＫＰＮＴＭＹＥＦＳＶＭＶＴＫＮＲＲＳＳＴＷＳＭＴＡＨＡＴＴＹＥＡＡＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００５３】
配列番号６
成熟Ｆｎ５-Ｆｃ融合タンパク質７８０２のアミノ酸配列
人工配列
ＳＴＰＭＬＰＰＶＧＶＱＡＶＡＬＴＨＤＡＶＲＶＳＷＡＤＮＳＶＰＫＮＱＫＴＳＥＶＲＬＹＴＶＲＷＲＴＳＦＳＡＳＡＫＹＫＳＥＤＴＴＳＬＳＹＴＡＴＧＬＫＰＮＴＭＹＥＦＳＶＭＶＴＫＮＲＲＳＳＴＷＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００５４】
配列番号７
成熟Ｆｎ４-Ｆｎ５-Ｆｃ融合タンパク質７８０３のアミノ酸配列
人工配列
ＱＶＰＤＱＰＳＳＬＨＶＲＰＱＴＮＣＩＩＭＳＷＴＰＰＬＮＰＮＩＶＶＲＧＹＩＩＧＹＧＶＧＳＰＹＡＥＴＶＲＶＤＳＫＱＲＹＹＳＩＥＲＬＥＳＳＳＨＹＶＩＳＬＫＡＦＮＮＡＧＥＧＶＰＬＹＥＳＡＴＴＲＳＩＴＤＰＴＤＰＶＤＹＹＰＬＬＤＤＦＰＴＳＶＰＤＬＳＴＰＭＬＰＰＶＧＶＱＡＶＡＬＴＨＤＡＶＲＶＳＷＡＤＮＳＶＰＫＮＱＫＴＳＥＶＲＬＹＴＶＲＷＲＴＳＦＳＡＳＡＫＹＫＳＥＤＴＴＳＬＳＹＴＡＴＧＬＫＰＮＴＭＹＥＦＳＶＭＶＴＫＮＲＲＳＳＴＷＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【図１】
2013538051.tif 000004
【図２】
2013538051.tif 000005
【図３】
2013538051.tif 000006
【図４】
2013538051.tif 000007
【図５】
2013538051.tif 000008
【配列表】
2013538051000001.app
【国際調査報告】
2013538051.tif 000009
2013538051.tif 000010
2013538051.tif 000011
2013538051.tif 000012