(57)【要約】  本発明は、糖渇望、肥満、メタボリックシンドロームの特徴（インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高血圧及び脂肪肝を含む）、多尿症、近位尿細管損傷、並びに糖尿病性腎臓疾患が含まれるが、これらに限定されない多様な疾患の予防及び治療の両方のための、アイソフォーム特異的フルクトキナーゼ（ケトヘキソキナーゼ）（ＫＨＫ）インヒビターの単独での又は多様な作用物質と組み合わせての使用に関する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者において、ＡＴＰ涸渇、ＭＣＰ−１産生及び／又は腎内尿酸産生を低減する方法であって、該被験者においてＫＨＫ−Ｃを阻害することを含む方法。
【請求項２】
該阻害することが、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを該被験者に投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａは阻害しない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが、リボザイム、干渉分子、ペプチド、小型分子又はＫＨＫ−Ｃを標的にする抗体からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが干渉分子を含み、該干渉分子が、ホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡメチル化ｓｉＲＮＡ、処理済ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ダイサー基質２７ｍｅｒ二重鎖及びこれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるメンバーを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが小型分子を含み、該小型分子が、
（Ｚ）−３−（メチルチオ）−１−フェニル−Ｎ’−（（（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシイミドアミド；
５−アミノ−３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
２−（３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−フェニルチアゾール；及び
これらの組み合わせ
からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
該投与することが、ＫＨＫ−Ｃの存在又は活性の増加により特徴付けられる疾患を治療又は予防するために実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
該投与することが、造影剤の投与に関連する急性腎臓障害（ＡＫＩ）を治療又は予防するために実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該投与することが、心血管手術、ＩｇＧ投与又は敗血症に関連するＡＫＩを治療又は予防するために実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
該投与することが、急性尿細管損傷を治療又は予防するために実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
該投与することが、注意欠陥障害、糖耽溺、肥満及びメタボリックシンドロームからなる群より選択される障害を治療又は予防するために実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
該投与することが、フルクトース、フルクトース含有糖及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるメンバーの渇望の減少を被験者にもたらすために実施される、請求項２に記載の方法。  
【請求項１３】
該被験者が糖尿病である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該被験者においてＡＴＰ涸渇、ＭＣＰ−１産生及び／又は腎内尿酸産生を減少するために選択される連結剤を該被験者に投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
該連結剤は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アルドステロンアンタゴニスト、アンフェタミン、アンフェタミン様作用物質、アンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、抗酸化剤、アルドースレダクターゼインヒビター、ビグアニド、ソルビトールデヒドロゲナーゼインヒビター、チアゾリジンジオン（グリタゾン）、チアジド及びチアジド様利尿剤、トリグリセリド合成インヒビター、キサンチンオキシダーゼインヒビター、並びにこれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
被験者においてＫＨＫ−Ｃ活性を阻害する方法であって、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを該被験者に投与することを含む方法。
【請求項１７】
該投与することが、該被験者の近位尿細管のＳ３セグメントにおけるＫＨＫ−Ｃ活性を阻害する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａは阻害しない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが、ＫＨＫ−ＣとＫＨＫ−Ａの両方を阻害する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが、リボザイム、干渉分子、ペプチド、小型分子、ＫＨＫ−Ｃを標的にする抗体及びこれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが干渉分子を含み、該干渉分子が、ホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、メチル化ｓｉＲＮＡ、処理済ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ダイサー基質２７ｍｅｒ二重鎖及びこれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるメンバーを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが小型分子を含み、該小型分子が、
（Ｚ）−３−（メチルチオ）−１−フェニル−Ｎ’−（（（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシイミドアミド；’
５−アミノ−３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
２−（３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−フェニルチアゾール；及び
これらの組み合わせ
からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
該投与することが、ＫＨＫ−Ｃの存在又は活性の増加により特徴付けられる疾患を治療又は予防するために実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
該投与することが、造影剤の投与に関連する急性腎臓障害（ＡＫＩ）を治療又は予防するために実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
該投与することが、急性尿細管毒性を治療又は予防するために実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
該投与することが、心血管手術、ＩｇＧ投与又は敗血症に関連するＡＫＩを治療又は予防するために実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
該投与することが、注意欠陥障害、糖耽溺、肥満及びメタボリックシンドロームからなる群より選択される障害を治療又は予防するために実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
該投与することが、フルクトース、フルクトース含有糖及びこれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーの渇望の減少を該被験者にもたらすために実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
該被験者が糖尿病である、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
連結剤であって、該ＫＨＫ−インヒビター若しくは該連結剤の効能を増加するのに又は該連結剤不在下での該被験者に対する毒性と比べて該連結剤の存在下での低下した毒性に基づいて該被験者に投与される、該ＫＨＫ−Ｃインヒビター若しくは該連結剤のいずれか低い用量を可能にするのに有効な連結剤を被験者に投与することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
該連結剤が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アルドステロンアンタゴニスト、アンフェタミン、アンフェタミン様作用物質、アンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、抗酸化剤、アルドースレダクターゼインヒビター、ビグアニド、ソルビトールデヒドロゲナーゼインヒビター、チアゾリジンジオン、チアジド及びチアジド様利尿剤、トリグリセリド合成インヒビター、キサンチンオキシダーゼインヒビター、並びにこれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
被験者への放射線造影剤の投与に関連する造影剤急性腎臓障害（ＡＫＩ）を治療又は予防する方法であって、該被験者にＫＮＫ−Ｃインヒビターを投与することを含む方法。
【請求項３３】
該ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａは阻害しない、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが、ＫＨＫ−ＣとＫＨＫ−Ａの両方を阻害する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが、リボザイム、干渉分子、ペプチド、小型分子又はＫＨＫ−Ｃを標的にする抗体からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが干渉分子を含み、該干渉分子が、ホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、メチル化ｓｉＲＮＡ、処理済ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ダイサー基質２７ｍｅｒ二重鎖及びこれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるメンバーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが小型分子を含み、該小型分子が、
（Ｚ）−３−（メチルチオ）−１−フェニル−Ｎ’−（（（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシイミドアミド；’
５−アミノ−３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
２−（３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−フェニルチアゾール；及び
これらの組み合わせ
からなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
該被験者が糖尿病である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
該投与することが、該被験者の近位尿細管のＳ３セグメントにおけるＫＨＫ−Ｃ活性を阻害する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験者に急性及び／又は慢性腎臓障害に活性な連結治療剤を投与することを更に含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
該連結治療剤が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アルドステロンアンタゴニスト、アンフェタミン、アンフェタミン様作用物質、アンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、抗酸化剤、アルドースレダクターゼインヒビター、ビグアニド、ソルビトールデヒドロゲナーゼインヒビター、チアジド及びチアジド様利尿剤、トリグリセリド合成インヒビター、キサンチンオキシダーゼインヒビター、並びにこれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
被験者において腎尿細管損傷を治療又は予防する方法であって、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを該被験者に投与することを含む方法。
【請求項４３】
該ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａは阻害しない、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
該腎尿細管損傷が、造影剤の投与に関連する急性腎臓障害（ＡＫＩ）である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
該腎尿細管損傷が、心血管手術、ＩｇＧ投与又は敗血症に関連するＡＫＩである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
該被験者に急性及び／又は慢性腎臓障害に活性な連結治療剤を投与することを更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
該連結治療剤が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アルドステロンアンタゴニスト、アンフェタミン、アンフェタミン様作用物質、アンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、抗酸化剤、アルドースレダクターゼインヒビター、ビグアニド、ソルビトールデヒドロゲナーゼインヒビター、チアゾリジンジオン、チアジド及びチアジド様利尿剤、トリグリセリド合成インヒビター、キサンチンオキシダーゼインヒビター、並びにこれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが、リボザイム、干渉分子、ペプチド、小型分子又はＫＨＫ−Ｃを標的にする抗体からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが小型分子を含み、該小型分子が、
（Ｚ）−３−（メチルチオ）−１−フェニル−Ｎ’−（（（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシイミドアミド；’
５−アミノ−３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
２−（３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−フェニルチアゾール；及び
これらの組み合わせ
からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
被験者において注意欠陥障害、糖耽溺、肥満及び／又はメタボリックシンドロームを治療又は予防する方法であって、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを該被験者に投与することを含む方法。
【請求項５１】
該ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａは阻害しない、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが、リボザイム、干渉分子、ペプチド、小型分子又はＫＨＫ−Ｃを標的にする抗体からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが小型分子を含み、該小型分子が、
（Ｚ）−３−（メチルチオ）−１−フェニル−Ｎ’−（（（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシイミドアミド；’
５−アミノ−３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
２−（３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−フェニルチアゾール；及び
これらの組み合わせ
からなる群より選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
注意欠陥障害、糖耽溺、肥満及び／又はメタボリックシンドロームに活性な連結治療剤を投与することを更に含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
該連結治療剤が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アルドステロンアンタゴニスト、アンフェタミン、アンフェタミン様作用物質、アンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、抗酸化剤、アルドースレダクターゼインヒビター、ソルビトールデヒドロゲナーゼインヒビター、チアジド及びチアジド様利尿剤、トリグリセリド合成インヒビター、並びにこれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
被験者においてフルクトース及び／又はフルクトース含有糖の渇望を低減する方法であって、該被験者においてＫＨＫ−Ｃを阻害することを含む方法。
【請求項５７】
該阻害することが、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを該被験者に投与することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが、リボザイム、干渉分子、ペプチド、小型分子又はＫＨＫ−Ｃを標的にする抗体からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
該被験者においてフルクトース、フルクトース含有糖及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるメンバーの渇望を低減するために、連結治療剤を投与することを更に含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
該連結治療剤が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アルドステロンアンタゴニスト、アンフェタミン、アンフェタミン様作用物質、アンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、抗酸化剤、アルドースレダクターゼインヒビター、ソルビトールデヒドロゲナーゼインヒビター、チアジド及びチアジド様利尿剤、トリグリセリド合成インヒビター、並びにこれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
該ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ａも阻害する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
被験者においてフルクトース摂取と無関係な肥満を治療する方法であって、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを該被験者に投与することを含む方法。
【請求項６３】
前記ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ａも阻害する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
被験者においてＢＭＩを最小限にする方法であって、該被験者においてＫＨＫ−Ｃを阻害することを含む方法。
【請求項６５】
該阻害することがＫＨＫ−Ｃインヒビターを該被験者に投与することを含み、該ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａを阻害しない、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ａも阻害する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アルドステロンアンタゴニスト、アンフェタミン、アンフェタミン様作用物質、アンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、抗酸化剤、アルドースレダクターゼインヒビター、ソルビトールデヒドロゲナーゼインヒビター、チアジド及びチアジド様利尿剤、トリグリセリド合成インヒビター、並びにこれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む連結治療剤を投与することを更に含む、請求項６４に記載の方法。 
【請求項６８】
必要性のある患者に腎臓尿細管機能を改善する方法であって、前記患者においてＫＨＫ−Ｃを阻害することを含み、該必要性のある患者が、糖尿病と関連する多尿症若しくは容量欠乏又は両方を示す方法。
【請求項６９】
前記阻害する工程が、治療有効量のＫＨＫ−Ｃインヒビターを投与することを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが小型分子を含み、該小型分子が、
（Ｚ）−３−（メチルチオ）−１−フェニル−Ｎ’−（（（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシイミドアミド；’
５−アミノ−３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
２−（３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−フェニルチアゾール；及び
これらの組み合わせ
からなる群より選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
該ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａは阻害しない、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
被験者において糖尿病性多尿症を治療する方法であって、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを該被験者に投与することを含む方法。
【請求項７３】
該ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａは阻害しない、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
被験者において脂肪肝を治療する方法であって、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを該被験者に投与することを含む方法。
【請求項７５】
該ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａは阻害しない、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
被験者において糖尿病性腎症を治療する方法であって、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを該被験者に投与することを含む方法。
【請求項７７】
該ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａは阻害しない、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
哺乳動物の耽溺関連挙動を減少、阻害又は排除する方法であって、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む有効量の組成物を前記哺乳動物に投与することを含み、該耽溺関連挙動が、フルクトース及び／又はスクロース摂取の強迫衝動に関連する方法。
【請求項７９】
被験者において注意欠陥障害を治療又は予防する方法であって、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを該被験者に投与することを含む方法。
【請求項８０】
連結剤を該被験者に投与することを更に含み、該連結剤がアンフェタミン又はアンフェタミン様化合物を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
該ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａは阻害しない、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
ＫＨＫ−Ａに対してＫＨＫ−Ｃを差次的に阻害することができる化合物をスクリーニングする方法であって、
少なくとも１つのＫＨＫインヒビター試験化合物をＫＨＫ−Ｃポリペプチドと接触させること、及び
前記少なくとも１つのＫＨＫインヒビター試験化合物の、前記ＫＨＫ−Ｃポリペプチドへの結合を検出することを含み、前記ＫＨＫ−Ｃポリペプチドに結合する試験化合物が、潜在的なＫＨＫインヒビター作用物質であると同定される
方法。
【請求項８３】
ＫＨＫ−Ｃを阻害することができる化合物をスクリーニングする方法であって、
ｉ）ＫＨＫ−Ｃポリペプチドの活性を試験化合物と接触させることなく決定すること、及び
ｉｉ）前記ＫＨＫ−Ｃポリペプチドの活性を試験化合物と接触させて決定することを含み、前記ＫＨＫ−Ｃポリペプチドの活性を調節する試験化合物が、潜在的なＫＨＫインヒビター作用物質であると同定される
方法。
【請求項８４】
ＫＨＫ−Ｃインヒビターを含むＫＨＫ−Ｃの存在又は活性の増加により特徴付けられる合併症を治療又は予防する組成物。
【請求項８５】
該ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａは阻害しない、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが、リボザイム、干渉分子、ペプチド、小型分子又はＫＨＫ−Ｃを標的にする抗体からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８７】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが干渉分子を含み、該干渉分子が、ホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、メチル化ｓｉＲＮＡ、処理済ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ダイサー基質２７ｍｅｒ二重鎖及びこれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるメンバーを含む、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８８】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが小型分子を含み、該小型分子が、
（Ｚ）−３−（メチルチオ）−１−フェニル−Ｎ’−（（（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシイミドアミド；’
５−アミノ−３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
２−（３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−フェニルチアゾール；及び
これらの組み合わせ
からなる群より選択される、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８９】
ＫＨＫ−Ｃの存在又は活性の増加により特徴付けられる合併症において活性である連結治療剤を更に含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９０】
該連結治療剤が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アルドステロンアンタゴニスト、アンフェタミン、アンフェタミン様作用物質、アンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、抗酸化剤、アルドースレダクターゼインヒビター、ビグアニド、ソルビトールデヒドロゲナーゼインヒビター、チアゾリジンジオン（グリタゾン）、チアジド及びチアジド様利尿剤、トリグリセリド合成インヒビター、キサンチンオキシダーゼインヒビター、並びにこれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む、請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
ＫＮＫ−Ｃインヒビターを含む、被験者への放射線造影剤の投与に関連する造影剤急性腎臓障害（ＡＫＩ）を治療又は予防する組成物。
【請求項９２】
該ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａは阻害しない、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９３】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが、リボザイム、干渉分子、ペプチド、小型分子又はＫＨＫ−Ｃを標的にする抗体からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９４】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが干渉分子を含み、該干渉分子が、ホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、メチル化ｓｉＲＮＡ、処理済ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ダイサー基質２７ｍｅｒ二重鎖及びこれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるメンバーを含む、請求項９３に記載の組成物。
【請求項９５】
放射線造影剤の投与に関連する造影剤急性腎臓障害（ＡＫＩ）を治療又は予防するのに活性な連結治療剤を更に含む、請求項９３に記載の組成物。
【請求項９６】
該連結治療剤が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アルドステロンアンタゴニスト、アンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、抗酸化剤、アルドースレダクターゼインヒビター、ビグアニド、ソルビトールデヒドロゲナーゼインヒビター、チアゾリジンジオン、キサンチンオキシダーゼインヒビター、並びにこれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む、請求項９５に記載の組成物。
【請求項９７】
ＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む、腎尿細管損傷を治療又は予防する組成物。
【請求項９８】
該ＫＨＫ−ＣインヒビターがＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａは阻害しない、請求項９７に記載の組成物。
【請求項９９】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが、リボザイム、干渉分子、ペプチド、小型分子、ＫＨＫ−Ｃを標的にする抗体及びこれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項９７に記載の組成物。
【請求項１００】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが干渉分子を含み、該干渉分子が、ホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、メチル化ｓｉＲＮＡ、処理済ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ダイサー基質２７ｍｅｒ二重鎖及びこれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるメンバーを含む、請求項９９に記載の組成物。
【請求項１０１】
該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが小型分子を含み、該小型分子が、
（Ｚ）−３−（メチルチオ）−１−フェニル−Ｎ’−（（（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシイミドアミド；’
５−アミノ−３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
２−（３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−フェニルチアゾール；及び
これらの組み合わせ
からなる群より選択される、請求項１００に記載の組成物。
【請求項１０２】
腎尿細管損傷を治療又は予防するのに活性な連結治療剤を更に含む、請求項９７に記載の組成物。
【請求項１０３】
該連結治療剤が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アルドステロンアンタゴニスト、アンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、抗酸化剤、アルドースレダクターゼインヒビター、ビグアニド、ソルビトールデヒドロゲナーゼインヒビター、チアゾリジンジオン、キサンチンオキシダーゼインヒビター、並びにこれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む、請求項１０２に記載の組成物。
【請求項１０４】
フルクトース及び／又はフルクトース含有化合物への渇望を減少するのに有用な、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む組成物。
【請求項１０５】
前記ＫＨＫ−Ｃインヒビターが、ＫＨＫ−ＡとＫＨＫ−Ｃのインヒビターの組み合わせである、請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記ＫＨＫ−Ｃインヒビターが、リボザイム、干渉分子、ペプチド核酸、ペプチド、小型分子、ＫＨＫ−Ｃを標的にする抗体及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるメンバーを含む、請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０７】
該組成物が連結治療化合物を更に含む、請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０８】
被験者においてＫＨＫ−Ｃ活性を阻害する方法であって、
（Ｚ）−３−（メチルチオ）−１−フェニル−Ｎ’−（（（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシイミドアミド；’
５−アミノ−３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
２−（３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−フェニルチアゾール；及び
これらの組み合わせ
からなる群より選択される有効量の化合物を該被験者に投与することを含む方法。
【請求項１０９】
ＫＨＫ−Ｃインヒビターを含み、該ＫＨＫ−Ｃインヒビターが、
（Ｚ）−３−（メチルチオ）−１−フェニル−Ｎ’−（（（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシイミドアミド；’
５−アミノ−３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
２−（３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−フェニルチアゾール；及び
これらの組み合わせ
からなる群より選択される化合物を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
【０００２】
本出願は、２０１０年８月６日に出願された米国仮特許出願第６１／３７１，２５５号の優先権を主張し、その開示全体が本明細書で援用される。
【０００３】
政府支援
【０００４】
本発明は、国立衛生研究所により授与された許可番号ＨＬ０６８６０７による政府支援によってなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００５】
技術分野
【０００６】
本発明者らは、宿主を糖渇望、肥満、メタボリックシンドローム及び腎疾患により特徴付けられる代謝状態に至らせるキーとなる酵素としてフルクトキナーゼを同定した。特に、フルクトキナーゼＣ若しくはフルクトキナーゼＡ及びＣの両方を標的にするアイソフォーム特異的インヒビター、若しくは、他の治療剤を用いる又は用いないフルクトキナーゼＡの刺激は、これらの状態の有効な治療である。
【０００７】
背景技術
【背景技術】
【０００８】
フルクトキナーゼ（ケトヘキソキナーゼ、ＫＨＫ）は、フルクトース代謝におけるキーとなる酵素であり、フルクトースをリン酸化して、フルクトース−１−リン酸にする。次に、フルクトース１−リン酸は、アルドラーゼＢ及びトリオキナーゼにより代謝されて、ジヒドロキシアセトンリン酸及びグリセルアルデヒド３−リン酸になり、これらは最終的に解糖されて、トリグリセリドを生成する。小腸、肝臓及び腎臓に存在する主なフルクトキナーゼアイソフォームであるフルクトキナーゼＣ（ＫＨＫ−Ｃ）、並びに大部分の組織、とりわけ骨格筋に発現するフルクトキナーゼＡ（ＫＨＫ−Ａ）からなる、フルクトキナーゼの２つの主要なアイソフォームが存在する。
【０００９】
最近の研究は、高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）、スクロース等、主に添加糖の形態のフルクトースの過剰摂取が、肥満及び糖尿病のまん延に関与しうることを示唆している。（１〜２）高濃度のフルクトースを動物（３）及びヒト（２、４）に投与すると、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬコレステロール、脂肪肝及び高血圧を含むメタボリックシンドロームの特徴を誘発することができる。これらの特徴は、等量のグルコース又はデンプンを投与した被験者には見られない。（２）動物モデルにおける実験と同様に、この種の研究は、メタボリックシンドロームを誘発するフルクトースの効果が過剰エネルギー摂取と無関係であることを明確に実証している。（５）
【００１０】
更に、全ての動物は糖（スクロース）が好きであり、それは、甘味の刺激が脳でドーパミンを刺激して快感を引き起こすためである。１〜２スクロースに加えて、グルコース、フルクトース、人工糖（スクラロース）等の他の甘味物質も、ドーパミン反応を刺激することができる。しかし、マウスの糖の反復摂取は、渇望又は耽溺症候群を引き起こす可能性がある。これらの動物は、薬物耽溺において観察されるものと同様の特徴を発生し、食餌から糖を排除した後又はナロキソンの投与後に不安又は退薬症状の徴候を示す。３〜４この機構は、慢性的なドーパミン刺激による側坐核におけるドーパミンレセプター（とりわけ、Ｄ２レセプター）の低減に関連すると思われ、前頭皮質及び前頭前皮質における制御機構の損失をもたらす。５この経路の重要性は、正常な制御の損失をもたらす機構として認識が高まっており、肥満、注意欠陥多動障害、さらには攻撃的行動及び認知症の病因に関与し得る。２、６〜１０したがって、糖の渇望を防止する方法を同定することは、これらの状態の頻度を減らすのに大いに役立つ可能性がある。
【００１１】
フルクトースは、また、ラットにおいてレプチン抵抗性を誘発すること及び食餌摂取量の増加を助長することが示されている。（９）インスリン及びグレリンの全身放出の効果に基づいて（１０）又は中枢効果の結果として（１１）、飽満を停止しないことがあることも示唆されている。したがって、フルクトース摂取は体重増加を引き起こしうる。
【００１２】
フルクトースがメタボリックシンドロームを誘発する機構は、完全には知られていないが、尿酸レベルを上昇させ、内皮性障害及び酸化的ストレスを誘発するフルクトースの能力により仲介されると考えられる。（３、６）尿酸の生成はフルクトキナーゼによるフルクトースのリン酸化の際に生じるため、本発明者らは、フルクトキナーゼがフルクトースに反応したメタボリックシンドロームを発症する原因であると仮定した。（１、７）
【００１３】
現在まで、フルクトキナーゼを阻害する研究は限定されている。本発明者らは、腎臓の近位尿細管細胞におけるフルクトキナーゼによるフルクトースの代謝が、尿酸及び炎症性仲介物質の生成を伴う酸化促進反応を引き起こしうることを報告した。（８）特定のｓｉＲＮＡによるフルクトキナーゼのノックダウンは、この炎症促進性反応を阻止することができた。（８）
【００１４】
上記の研究は、フルクトキナーゼがメタボリックシンドロームにおいて重要な役割を担いうることを示唆しているが、本発明者らは、フルクトキナーゼの幾つかの新規の役割及びそのアイソフォームを同定し、これらが本特許出願の基礎を構成する。
【００１５】
発明の概要
【発明の概要】
【００１６】
本発明者らの最近の研究は、文献においてこれまで示されていないＫＨＫの追加的な役割を同定した。
【００１７】
第１は、ＫＨＫ、特にＫＨＫ−Ｃが糖渇望（スクロース又は高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）への渇望として定義される）において重要な役割を担うという本発明者らの発見に関連する。糖渇望は、特有のプロセスであり、糖に対する具体的な欲求から構成される。糖渇望は、脳におけるドーパミン作動性シグナル伝達により仲介されることが示されており、麻薬で観察することができる耽溺反応と類似している。（１２）糖渇望は、味覚レセプターにより仲介されると考えられてきたが、味覚レセプターのシグナル伝達が阻止されたときも、糖への渇望は依然として生じる。（１３）したがって、糖渇望における具体的な機構は不明である。
【００１８】
第２の発見は、ＫＨＫの阻害がフルクトースに反応した脂肪蓄積も防止することである。この点に関して、フルクトースはＫＨＫを介してメタボリックシンドロームに関与すると仮定されているが、肥満を誘発するその能力は、実験動物において示すことが困難であり、このプロセスにおけるＫＨＫの役割は証明されていない。（９）対照的に、本発明者らは、ＫＨＫ−Ｃ及びＫＨＫ−Ａを欠くマウスがフルクトース誘発性脂肪増から保護され、より脂肪の少ない除脂肪体重も維持することを見出した。ＫＨＫ−Ｃ又はＫＨＫ−ＣとＫＨＫ−Ａの組み合わせの阻害が食物フルクトースによる肥満を阻止することができるという観察に加えて、本発明者らは、ＫＨＫ−Ｃ及びＫＨＫ−Ａを欠くマウスが、グルコース添加飲料水により誘発される肥満から保護されるという驚くべき発見もした。本質的には、グルコースの飲用は、ポリオール経路のアルドースレダクターゼ（ＡＲ）の活性化をもたらし、これはグルコースをソルビトールに変換し、次にソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）によりフルクトースに変換される。次に内因性フルクトースは、ＫＨＫにより代謝されて、脂肪蓄積を刺激する尿酸等の副産物を生成する。
【００１９】
したがってＫＨＫ−Ｃインヒビターの使用は、多様な利益をもたらしうる。まず、減量しようとしている糖渇望の問題を有する被験者の治療に有用である。また、これはフルクトース含有糖からの糖摂取の低減を助ける有用な補助剤であり、したがって、メタボリックシンドローム、肥満、脂肪肝及び慢性腎臓疾患に有益であるはずである。最後に、これは、被験者が無糖又は無フルクトース食の食事制限中であっても、食物炭水化物から内因的に産生されたフルクトースの効果を阻止して減量を助ける。
【００２０】
加えて、本発明者らは、驚くべきことに、宿主の状態による急性及び慢性腎尿細管損傷がフルクトキナーゼＣ（ＫＨＫ−Ｃ）の活性化によってもたらされる機構を見出した。特に、本発明者らは、驚くべきことに、フルクトースの内因的産生は良性のプロセスではなく、むしろフルクトキナーゼＣ（ＫＨＫ−Ｃ）を発現する又は過剰発現する細胞に実質的な損傷をもたらす可能性があることを見出した。理論に束縛されるものではないが、近位尿細管グルコースレベルの上昇は、ポリオール経路のアルドースレダクターゼ（ＡＲ）を活性化し、これはグルコースをソルビトールに変換し、次にソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）によりフルクトースに変換されると考えられる。
【００２１】
大部分の腎臓細胞で代謝は終了するが、近位尿細管のＳ３セグメントは、構成レベルのフルクトキナーゼＣ（ケトヘキソキナーゼ、ＫＨＫ−Ｃ）を有することで他の肝細胞と比べて独特である。ＫＨＫ−Ｃは、フルクトースを急速にリン酸化し、一過性ＡＴＰの涸渇、アデニンヌクレオチドの代謝回転及び尿酸産生をもたらす点において、糖代謝に関与する他の酵素と区別される。次に、尿酸は、動員のためのケモカインであるＭＣＰ−１の合成及びマクロファージの活性化を刺激する酸化剤として作用する。尿細管細胞は、ＡＴＰ涸渇の結果膨張し、その刷子縁を失い始めることがある、及び／又は局所炎症性反応は、微小血管の損傷をもたらしうる。損傷が軽度な場合、刷子縁機能が損なわれる作用として、多尿症及びファンコニ様症候群を生じる。損傷が重篤な場合、急性尿細管細胞損失及び急性腎臓障害（ＡＫＩ）を発症しうる。損傷が慢性である場合、低度尿細管間質性線維症を発症しうる。
【００２２】
糖尿病の被験者では、ＡＲ、ＳＤＨ及びＫＨＫ−Ｃは、糖尿による尿浸透圧の上昇によって上方制御されると考えられる。さらに、放射線造影剤投与を受けている被験者では、同じ酵素は造影剤の効果によって上方制御されると考えられる。敗血症のような状況又は心血管手術の後では、同じ酵素は、虚血の効果により上方制御される。本発明者らは、腎毒性であることが知られている放射線造影剤が、アルドースレダクターゼを活性化し、続いて細胞で生じる正常な高グルコース流量と関連してＫＨＫを活性化した結果、腎尿細管損傷を引き起こしうることを見出した。したがって、造影剤を投与した糖尿病性野生型マウスは、急性腎臓障害を発症したが、これは糖尿病性ＫＨＫノックアウトマウスでは観察されなかった。
【００２３】
本明細書に記載されるＫＨＫ−Ｃ（ＫＨＫ−Ｃ又はＫＨＫ−Ａ及びＫＨＫ−Ｃ）インヒビターを含む方法及び組成物は、個別に又は組み合わされて、少なくともＫＨＫ−Ｃの存在又は活性の増加により特徴付けられる障害又は身体状態の治療に適している。一実施態様において、障害又は身体状態は、ＫＨＫ−Ｃ、並びにＫＨＫ−Ａの存在又は活性の増加により特徴付けられる。
【００２４】
本明細書に記載される組成物及び方法により治療又は予防される例示的な障害には、腎損傷が含まれるが、これに限定されず、これには、造影剤の投与に関連する急性腎臓障害（ＡＫＩ）、心血管手術又は敗血症に関連するＡＫＩ等の急性又は慢性腎尿細管損傷の任意の形態が含まれるが、これらに限定されない。加えて、本明細書に記載される方法及び組成物を、注意欠陥障害又は注意欠陥多動性障害（「注意欠陥障害」と総称される）、糖耽溺、肥満、メタボリックシンドローム、脂肪肝、糖尿病性多尿相、糖尿病性腎障害及び／又は哺乳動物の他の耽溺関連挙動の治療又は予防に利用しても、しなくてもよい。更なる実施態様において、本明細書に記載される方法及び組成物を、フルクトース及び／若しくはフルクトース含有糖に対する被験者の渇望を減少するため；体重指数を低減するため；又は腎臓機能を改善するために、被験者に投与しても、しなくてもよい。本明細書に記載されるように、本明細書に記載される方法及び組成物を、単一の療法として又はＫＨＫインヒビターとして同じ若しくは異なる障害若しくは身体状態を治療若しくは予防するために被験者に投与される連結治療剤と併用投与してもよい。
【００２５】
図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本発明を、図面を考慮しながら以下の記載により説明する。
【００２７】
【図１】図１は、ＫＨＫ−Ａ／Ｃ  ＫＯ（ノックアウト）マウスが野生型（ＷＴ）マウスと比較して、フルクトース含有水に好みを全く示さず、スクロース等のフルクソース含有糖にあまり好みを示さず、グルコース含有水に対して継続的な好みを示すことを示す。
【００２８】
【図２】図２は、ＫＨＫ−Ａのみを欠く（ＫＨＫ−Ａ  ＫＯ）マウスが肥満から保護されず、むしろ飲料水中のフルクトース（１５％又は３０％溶液）のいずれかを２５週間供給したとき、野生型（ＷＴ）マウスと比較して体重増加が促進されたこと示すグラフを含む。
【００２９】
【図３】図３は、体脂肪量の一般的マーカーとしての副睾丸脂肪が、フルクトースを与えた野生型（ＷＴ）マウスで増加したが、脂肪の増加は、ＫＨＫ−Ａ／Ｃ  ＫＯマウスでは防止されたが、フルクトースを毎日投与したＫＨＫ−Ａ  ＫＯマウスでは促進されたことを示すグラフを含む。
【００３０】
【図４】図４は、血清インスリン及び血清レプチンの両方が、フルクトースを与えた野生型（ＷＴ）マウスで増加したが、これらの増加は、ＫＨＫ−Ａ／Ｃ  ＫＯマウスでは防止され、食物フルクトースを投与したＫＨＫ−Ａ  ＫＯマウスでは促進されたことを示すグラフを含む。
【００３１】
【図５】図５は、脂肪及び肝臓内トリグリセリドレベルが、フルクトースを与えた野生型（ＷＴ）マウスで上昇したことを示す。これらの効果は、ＫＨＫ−Ａ／Ｃマウスでは防止されたが、食物フルクトースを投与したＫＨＫ−Ａ  ＫＯマウスでは増強された。
【００３２】
【図６】図６は、血清フルクトースが、食物フルクトースを摂取しなかったにもかかわらずＫＨＫ−ＡＣ  ＫＯ及びＫＨＫ−Ａ  ＫＯマウスの両方で増加したこと、並びに３０％フルクトース飲料水を摂取した野生型マウスで観察されたものと同様であったことを示す。
【００３３】
【図７】図７Ａ〜７Ｆは、グルコースを与えた野生型（ＷＴ）マウスにおいて観察された増加した体脂肪量及び肝臓内トリグリセリドが、ＫＨＫ−Ａ／Ｃ  ＫＯマウスでは阻止されたこと及びアルドースレダクターゼ（ＡＲ）発現が、グルコース摂取ＷＴマウスにおいて増加したこと、また肝臓ＫＨＫ活性も増加したことを示す。
【００３４】
【図８】図８は、近位尿細管における内因性フルクトース代謝を概略的に示す。
【００３５】
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、アルドースレダクターゼ（ＡＲ）及びフルクトキナーゼ（ＫＨＫ）が糖尿病マウスの腎皮質において上方制御されることを示す。
【００３６】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｉは、野生型（ＷＴ）及びフルクトキナーゼノックアウト（ＫＨＫ−ＫＯ）マウスの両方が、ＳＴＺ注射の後に同様の血中グルコースレベル（図１０Ａ）を有したが、ＫＨＫ  ＫＯマウスは、多尿症（図１０Ｂ）、糖尿（図１０Ｃ）、リン酸塩尿症（図１０Ｄ）、並びに尿ＮＧＡＬ排泄（図１０Ｅ）及び尿アルブミン排泄（図１０Ｆ）により示される尿細管損傷から保護されたことを示す。野生型マウスの腎損傷も、血清クレアチニンの増加と関連し、腎機能障害を実証している（図１０Ｇ）。刷子縁の損失、空胞変性、尿細管萎縮及び増殖からなる組織学的損傷も、糖尿病野生型マウス（図１０Ｈ）には存在したが、ＫＨＫ  ＫＯマウスには存在しなかった（図Ｉ）。
【００３７】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、造影剤の注射が、糖尿病野生型（ＷＴ）マウスにおいて、ソルビトール（図１１Ａ）、フルクトース（図１１Ｂ）及びＫＨＫ活性（図１１Ｃ）の腎皮質レベルを、造影剤を投与しなかった対照糖尿病ＷＴマウスと比較して有意に上昇させることを示し、造影剤が腎皮質においてアルドースレダクターゼ（ＡＲ）及びフルクトキナーゼ（ＫＨＫ）活性の急激な増加を誘発することを実証している。
【００３８】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｅは、尿細管損傷が、放射線造影剤を受けた糖尿病ＷＴマウスでは顕著であるが、乏尿症（図１２Ａ）、血清ＢＵＮ及びクレアチニンレベル（図１２Ｂ及び１２Ｃ）、並びに組織学的損傷（図１２Ｄ及び１２Ｅ）に関して、造影剤をうけた糖尿病ＫＨＫ  ＫＯマウスでは完全に阻止されたことを示す。
【００３９】
【図１３】図１３は、腎ソルビトールの増加（図１３Ａ）に示されるように、アルドースレダクターゼ（ＡＲ）の腎皮質活性の増加が明白であり、ＡＴＰレベルの低減（図１３Ｂ）及び腎皮質尿酸レベルの増加（図１３Ｃ）に示されるように、フルクトキナーゼ活性の増加が明白である、マウスの虚血再灌流を示す。
【００４０】
発明を実施するための形態
【発明を実施するための形態】
【００４１】
発見の細目には、ＫＨＫ  Ｃ又はＫＨＫ  ＣとＫＨＫ  Ａの両方を特異的に阻害して、下記に概略される特定の状態を治療することができる作用物質の使用が含まれる。
【００４２】
定義
【００４３】
本明細書中、作用物質、薬剤又はペプチドを被験者に「投与する」又は「投与」という用語には、意図される機能を実施するために化合物を被験者に導入又は送達する任意の経路が含まれる。投与する又は投与は、経口、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内若しくは皮下）、直腸内又は局所を含む任意の適切な経路により実施することができる。投与する又は投与には、自己投与又は別の人による投与が含まれる。
【００４４】
本明細書中、用語「同時投与される」、「同時投与する」又は「併用投与」は、例えば連結剤をＫＨＫ−Ｃインヒビターの投与と共に投与することに関して使用されるとき、ＫＨＫ−Ｃインヒビター及び連結剤の両方が同時に生理学的効果を達成するこができるような投与を意味する。しかし２つの作用物質は、必ずしも一緒に投与される必要はない。特定の実施態様において、一方の作用物質の投与を他方の投与よりも先に行うことができるが、そのような同時投与は、典型的には、両方の作用物質が被験者の体内（例えば、血漿内）に同時に存在する結果となる。
【００４５】
本明細書中、用語「糖尿病性」又は「糖尿病」は、膵臓がほとんど又は全くインスリンを産生しない１型糖尿病；身体がインスリンの効果に抵抗性になる又はインスリンをほとんど若しくは全く産生しない２型糖尿病；或いは高い血糖（高血糖症）及び尿中の糖の排泄（糖尿）のいずれか又は両方の症状を含む他の一次疾患の後遺症として生じる疾患状態を意味する。
【００４６】
本明細書中、用語「疾患」、「障害」又は「合併症」は、被験者の正常の状態からの任意の逸脱を意味する。好ましい実施態様において、本発明の方法及び組成物は、ＫＨＫタンパク質の発現が疾患を有する被験者と疾患を有さない試験者の間で異なる疾患の診断及び治療に有用である。本発明は、腎疾患が含まれるが、これに限定されない任意の数の疾患において用途が見出される。
【００４７】
本明細書中、用語「有効量」、「有効な量」、「治療有効量」などは、所望の結果を達成するのに必要な投与量及び期間で有効な量を意味する。ＫＨＫ−Ｃインヒビターと本明細書に記載される連結剤との同時投与の場合、連結剤、ＫＨＫ−Ｃインヒビター又はＫＨＫ−Ｃインヒビターと連結剤の組み合わせが、有効量を供給することができる。
【００４８】
本明細書中、遺伝子又はポリヌクレオチドの文脈における用語「発現」は、ＲＮＡへの遺伝子又はポリヌクレオチドの転写を伴う。用語は、ＲＮＡの、ポリペプチド鎖への後翻訳及びタンパク質への組立も伴ってもよいが、必ずしもそうである必要はない。
【００４９】
本明細書中、用語「干渉分子」は、標的遺伝子配列のサイレンシング等の遺伝子発現に直接的又は間接的な影響を有する全ての分子、例えばＲＮＡ又はＲＮＡ様分子を意味する。他の干渉ＲＮＡ分子の例には、ｓｉＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、一本鎖ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メチル化ｓｉＲＮＡ又は循環ＲＮａｓｅ及びダイサー置換２７ｍｅｒ二重鎖による分解からｓｉＲＮＡを保護するために処理された他のｓｉＲＮＡが含まれる。「ＲＮＡ様」分子の例には、１つ以上の化学的に修正されたヌクレオチド、１つ以上の非ヌクレオチド、１つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又は１つ以上の非ホスホジエステル結合を含有するｓｉＲＮＡ、一本鎖ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。したがって、ｓｉＲＮＡ、一本鎖ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びダイサー置換２７ｍｅｒ二重鎖は、「干渉分子」のサブセットである。「干渉分子」には、ＰＭＯｓを含めることもできる。
【００５０】
本明細書中、用語「ホスホチオエートモルホリノオリゴマー」又は「ＰＭＯ（ａ  ＰＭＯ）又は（ＰＭＯｓ）」は、ＲＮＡ又はＤＮＡに天然に見出される同じ核酸塩基（すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル又はチミン）を有する分子を意味するが、これらはＲＮＡに使用されるリボース環の代わりにモルホリン環に結合している。これらは、ホスホジエステル又はホスホロチオエート基ではなくホスホロジアミデートを介して結合することもできる。結合の修飾は、通常の生理学的ｐＨ範囲でのイオン化を排除するため、生物又は細胞のＰＭＯは非電荷分子である。ＰＭＯの主鎖全体は、これらの修飾サブユニットから作製されている。
【００５１】
本明細書中、用語「アンチセンス配列」は、ハイブリダイズする標的核酸分子に少なくとも部分的に相補的であるオリゴマー化合物を意味する。特定の実施態様において、アンチセンス化合物は、標的核酸の発現を調節（増加又は減少）する。アンチセンス化合物には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体及びこれらのキメラの組み合わせである化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書中、用語「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）は、１つ以上の外来小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子が標的遺伝子の発現を停止するために使用される、後翻訳遺伝子サイレンシング（ＰＧＳＲ）プロセスを意味する。
【００５３】
本明細書中、「ｓｉＲＮＡ」（短干渉ＲＮＡ）は、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の配列に相補的である、一般におよそ１５〜３０ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ分子を意味する。
【００５４】
本明細書中、「ｓｈＲＮＡ」（小型ヘアピンＲＮＡ）は、遺伝子発現を阻害又は抑制するために使用することができる短「ヘアピン回転」ＲＮＡ配列である。
【００５５】
本明細書中、「組成物」、「医薬組成物」又は「治療剤」は、全て、少なくともＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む組成物を含む。場合により、「組成物」、「医薬組成物」又は「治療剤」は、薬学的に許容される希釈剤又は担体を更に含む。干渉分子の場合、例えば干渉分子を、リン酸緩衝生理食塩水のような１つ以上の薬学的に許容される希釈剤と組み合わせることができる。本明細書中、薬学的に許容される組成物は、特に、本明細書に記載される被験者への投与が意図される少なくとも１つのＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む組成物を意味する。
【００５６】
本明細書中、用語「ＫＨＫ−Ｃインヒビター」には、ＫＨＫ−Ｃ又はＫＨＫ−ＡとＫＨＫ−Ｃの両方を選択的に阻害するインヒビターが含まれる。
【００５７】
本明細書中、用語「ＫＨＫ」は、他に特に特定されない限り、ＫＨＫ−Ａ及びＫＨＫ−Ｃを意味する。
【００５８】
本明細書中、用語「予防する」は、疾患状態に暴露される又は罹患しやすくなっているかもしれないが、まだ疾患状態の症状を経験又は表していない被検者において、疾患状態の臨床症状を発生させないこと、例えば疾患の発症を阻害することを意味する。
【００５９】
本明細書中、用語「造影剤」又は「放射線造影剤」は、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、Ｘ線撮影等のＸ線による画像化技術での内部身体構造の可視化を改善するために使用される医療造影剤を意味する。一実施形態において、放射線造影剤は、ジアトリゾエート又はジアトリゾ酸、メトリゾエート、イオキサグレート、イオパミドール、イオヘキシル、イオキシラン、イオポミド、イオジキサノール又はこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されないヨウ素又はバリウム化合物を含む。
【００６０】
本明細書中、用語「被験者」は、特定の治療の受容者であるヒト、非ヒト霊長類、齧歯類などが含まれるが、これらに限定されない任意の動物（例えば、哺乳動物）を意味する。
【００６１】
本明細書中、用語「治療する」又は「治療」又は「緩和」は、治療処置と予防又は防止手段の両方を意味し、その目的は、標的の病理状態又は障害を予防又は遅延（軽減）することである。
【００６２】
第１章：糖渇望、肥満及び注意欠陥障害、並びにメタボリックシンドロームのためのフルクトキナーゼの阻害
【００６３】
糖渇望が生じる機構は謎のままである。味覚レセプターが主要な役割を担うと最初考えられていたが、味覚レセプターのシグナル伝達を阻止しても、糖（スクロース）は、依然として強力なドーパミン反応を脳において誘発し、一方、人工糖は誘発しない。（１５）本発明者らは、フルクトース及び糖（スクロース）への渇望がフルクトキナーゼに依存していることを示している。具体的には、フルクトキナーゼノックアウトマウス（ＫＨＫ−Ａ／Ｃ  ＫＯマウス）は、飲料水のみよりも１５％フルクトース含有水に好みを示さず、スクロース飲料水の摂取は５０％低減した。対照的に、ＫＨＫ−Ａ／Ｃ  ＫＯ（ノックアウト）マウスは、グルコース含有飲料水には継続的に好みを示す（図１）。
【００６４】
これらの研究は、フルクトキナーゼの阻止は、フルクトースへの渇望を阻止し、高フルクトースコーンシロップ、スクロース等のフルクトース含有糖への渇望も低減することを示す。糖渇望は、肥満、食物関連耽溺障害及び注意欠陥多動性欠陥症候群を引き起こすのに主要な役割を担うと考えられる糖耽溺の兆候であるため、フルクトキナーゼインヒビターの使用は、これらの障害の補助治療になりうる。
【００６５】
本発明の一態様によると、フルクトキナーゼ（ＫＨＫ−Ａ及びＫＨＫ−Ｃ又はＫＨＫ−Ｃのみ）を阻止し、それに応じてフルクトースのみ、スクロース、高フルクトースコーンシロップ又は転化糖を含むフルクトース含有糖への渇望を阻止するＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む方法及び組成物が提供される。体内でソルビトール等のフルクトースへ変換されうる糖への渇望も阻止される。
【００６６】
本発明の別の態様によると、渇望による反復糖摂取が肥満を誘発しうるため、糖耽溺症候群を阻止することができる、したがって肥満の補助治療になりうるＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む方法及び組成物が提供される。
【００６７】
本発明の別の態様によると、被験者においてフルクトース及び／又はフルクトース含有糖への渇望を低減する方法であって、被験者におけるＫＨＫ−Ｃ活性の阻害を含む方法が提供される。一実施態様において、該方法は、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを被験者に投与することを含む。
【００６８】
本発明の別の態様によると、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む、フルクトース及び／又はフルクトース含有化合物への渇望を低減するのに有用な組成物が提供される。
【００６９】
本発明のなお別の態様によると、糖渇望による糖摂取は、おそらく注意欠陥障害又は注意欠陥多動性障害（「注意欠陥障害」と総称される）の主要な原因であるため、注意欠陥多動性障害を予防又は治療するためにフルクトキナーゼを阻止するＫＨＫインヒビターを含む方法及び組成物が提供される。そのようなインヒビターは、また、注意欠陥多動性障害と診断された子供及び成人において又は医師が関心を示す、患者の不注意、集中困難等が含まれるが、これらに限定されない注意欠陥多動性障害の発症が心配される兆候の症状でありうる場合、有用な補助治療である。
【００７０】
本発明の別の態様によると、注意欠陥障害、糖耽溺、肥満及び／又はメタボリックシンドロームを治療又は予防する方法が提供される。方法には、被験者にＫＨＫ−Ｃインヒビターを投与することが含まれる。注意欠陥障害、糖耽溺、肥満及び／又はメタボリックシンドロームを治療又は予防する組成物も同様に提供されうる。
【００７１】
本発明の別の態様によると、被験者において脂肪肝を治療する方法が提供される。方法は、被験者においてＫＨＫ−Ｃ又はＫＨＫ−ＡとＫＨＫ−Ｃの両方を阻害することを含む。脂肪肝を治療する組成物も同様に提供されうる。
【００７２】
本発明の別の態様によると、被験者の耽溺関連挙動を減少、阻害又は排除する方法であって、ＫＨＫ−Ｃインヒビター（ＫＨＫ−Ｃ又はＫＨＫ−ＡとＫＨＫ−Ｃの両方を阻害する）を含む組成物を被験者に投与することを含み、耽溺関連挙動が、フルクトース及び／又はスクロース摂取の強迫衝動に関連する方法が提供される。ＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む、哺乳動物の耽溺関連挙動を減少、阻害又は排除する組成物も同様に提供されうる。
【００７３】
第２章：肥満のためのフルクトキナーゼの阻害
【００７４】
フルクトースは、蜂蜜及び果実に存在する糖であり、多様な糖の主要な成分でもあり、最も注目されるものはスクロース（糖の５０％を構成する）及び高フルクトースコーンシロップである。研究は、フルクトース又はフルクトース含有糖の投与が動物の肥満を誘発することができることを示し、これは、おそらく、レプチン抵抗性を誘導すること及び正常な飽満機構を阻止することによる。１６〜１７
【００７５】
本発明者らは、現在出版されている文献に基づいて予測されなかった２つの新規の発見をしている。第１に、フルクトースによる肥満が被験者において治療又は予防される程度が、フルクトキナーゼアイソフォームのＫＨＫ−Ａ又はＫＨＫ−Ｃが阻止されているかによって決まることを発見している。大部分の権威は、ＫＨＫ−Ｃが、フルクトースを活性的に代謝する唯一のＫＨＫアイソフォームであると考えていた。しかし、本発明者らは、両方のＫＨＫアイソフォームを欠く（ＫＨＫ−Ａ／Ｃ  ＫＯ）マウスがフルクトース誘発性肥満を発症しないこと、ＫＨＫ−Ａのみを欠く（ＫＨＫ−Ａ  ＫＯ）マウスが肥満から保護されず、むしろ飲料水中のフルクトース（１５％又は３０％溶液）のいずれかを２５週間供給されたとき、体重増加が促進されることを最近見出した（図２）。
【００７６】
更に、本発明者らは、両方のＫＨＫアイソフォーム（ＫＨＫ−Ａ及びＫＨＫ−Ｃ）を欠くマウスは体脂肪の増加、インスリン抵抗性（高インスリン血症）、上昇した血清レプチンレベル（レプチン抵抗性の測度）及び脂肪肝から保護され、ＫＨＫ−Ａノックアウトマウスは、フルクトースを摂取した野生型マウスと比較して悪化した脂肪蓄積、高いインスリン及びレプチンレベル、並びに脂肪肝を示すことも示した（図３〜５）。これらの研究は、食物フルクトース誘発性肥満を予防又は治療するために、両方のＫＨＫアイソフォームを阻止、ＫＨＫ−Ｃを阻止又はＫＨＫ−Ａを刺激しなければならないことを実証している。
【００７７】
更に、本発明者らは、ＫＨＫ−Ｃインヒビターが、フルクトース又はフルクトース含有糖を含有しないグルコース又はデンプンに基づいた食物からの肥満を防止するにも有用であることを見出した。これは、おそらくグルコースをフルクトースに変換するポリオール経路により、大量のフルクトースが食物フルクトースの不在下で内因的に生成されるという事実に起因する。ポリオール経路の存在は知られているが、グルコース代謝全体のわずか１％を占めると考えられたため、糖尿病にかかっていない個人における役割は大したものではないと広く考えられてきた。さらに、ポリオール経路の一次効果はソルビトールの産生に起因し、ポリオール経路による毒性の仲介におけるフルクトースの役割は考慮されてこなかった。また事実、本発明までは、ポリオール経路が肥満の病因と関連することとは考慮されてこなかった。
【００７８】
本発明者らにより実施された研究は、両方のフルクトキナーゼアイソフォームを欠くるマウス（ＫＨＫ−Ａ／Ｃ  ＫＯマウス）又はフルクトキナーゼＡアイソフォームを欠くマウス（ＫＨＫ−Ａ  ＫＯマウス）において、食物フルクトースを摂取していないにもかわらず、３０％フルクトースを補充した飲料水（後者は、総カロリーの４０％超がフルクトースからのものである食餌に対応する）を摂取した野生型マウスにおいて観察されたものと同様の血清フルクトースレベルの自然上昇があることを示した。ＫＨＫ−Ａ／Ｃ  ＫＯ及びＫＨＫ−Ａ  ＫＯの両方のマウスが、フルクトース非含有食餌を摂取しているのにもかかわらずそのような高い血清フルクトースレベルを有するという観察は、ＫＨＫがフルクトースの大量の内因性貯蔵の代謝に関与することを示す（図６）。
【００７９】
更に、本発明者らは、大量のフルクトースが食物フルクトースの不在下で毎日生成されていることを最初に見出している。内因性フルクトース生成の唯一の既知の供給源が炭水化物及びデンプンに存在する食物グルコースであるため、炭水化物が糖尿病を引き起こしうる機構は、ＫＨＫを介した代謝による内因性フルクトースの産生を伴う可能性がある。
【００８０】
図７Ａ〜７Ｆに示されているように、飲料水中のグルコース（３０％）を摂取したマウスは糖尿病を発症したが、体重の絶対的変化（図７Ａ）と体重の変化％（図７Ｂ）の両方及び総脂肪量を反映する副睾丸脂肪量の増加（図７Ｃ）、並びに脂肪肝の測度としての肝臓内トリグリセリド（図７Ｄ）がＫＨＫ  Ａ／Ｃノックアウト（ＫＯ）マウスで防止された。更に、アルドースレダクターゼ（ＡＲ）発現（図７Ｅ）、並びに肝臓ＫＨＫ活性（図７Ｆ）が、グルコース摂取ＷＴマウスにおいて増加し、グルコースがおそらく肝臓のＡＲの活性を介してＫＨＫ活性を活性化することを実証している。これらのデータは、炭水化物、特にグルコース含有炭水化物に誘発される肥満を防止する、ＫＨＫインヒビターの新たな適応症を示す。
【００８１】
本発明の一つの態様によると、本明細書に記載されているＫＨＫ−Ｃインヒビターは、ＡＨＡによると毎日おそらく＞５０又は７５ｇ以上の大量の糖を消費する被験者のような被験者において、肥満の補助治療として有用である。本発明者らの研究は、また、本明細書に記載されているＫＨＫ−Ｃインヒビターを介してＫＨＫ−Ｃ又はＫＨＫ−Ａ及びＫＨＫ−Ｃを阻止することは、フルクトース含有糖を摂取しない被験者においても肥満の一般的な予防及び治療に有用である。これは、相当量の炭水化物を含有しない食事を維持することがほぼ不可能なためである。したがって、本明細書に記載されているＫＨＫ−Ｃインヒビターは、肥満に関与する炭水化物経路を阻止することにより、体重の減少を目的とする食事制限又は医療若しくは外科的処置を支援する補助剤としても有用でありうる。
【００８２】
本発明の別の態様によると、肥満疾患の治療及び／又は予防のために両方のアイソフォーム（ＫＨＫ−Ａ及びＫＨＫ−Ｃ）を阻止する、ＫＨＫ−Ｃを阻止する又はＫＨＫ−Ａを刺激するＫＨＫインヒビター及び方法が提供される。一実施態様において、疾患は肥満である。肥満とは、無糖、低糖又は低フルクトース系食事制限中の被験者を含む、全ての食事誘発性肥満を意味する。重要なことは、炭水化物は全ての食物の成分であるため、ＫＨＫインヒビターを含むこの治療剤の使用は、全ての形態の肥満に有益であるということである。一実施態様において、被験者のフルクトース摂取と無関係な肥満を治療する方法が提供される。この方法は、例えばＫＨＫ−Ｃインヒビターを被験者に投与することにより、被験者においてＫＨＫ−Ｃを阻害することを含む。ＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む組成物も同様に提供される。
【００８３】
本発明の別の態様によると、被験者において体重指数（ＢＭＩ）を最小限にする方法が提供される。この方法は、例えばＫＨＫ−Ｃインヒビターを被験者に投与することにより、被験者においてＫＨＫ−Ｃを阻害することを含む。ＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む組成物も同様に提供される。
【００８４】
第３章：急性及び慢性腎疾患のためのフルクトキナーゼの阻害
【００８５】
本発明者らは、食事にフルクトースを投与すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腎尿細管損傷を引き起こし１８、ラットに腎疾患も引き起こしうる１９〜２０ことを以前報告した。更に本発明の態様は、フルクトキナーゼが、急性及び慢性糖尿病性腎疾患を含む多くの特定の腎臓疾患において、並びに放射線造影剤、ソルビトール投与（例えば、ソルビトールを含有するＩｇＧ調製物の投与）、虚血再灌流（心血管手術の後等）及び敗血症を含む多種多様な条件による急性腎臓障害において、重要な役割を担うという発見に関する。これらの条件のうち、フルクトキナーゼが関与すると考えられたものはなかった。ＫＨＫ  Ｃは、主に肝臓、腸及び腎臓の近位尿細管に存在する酵素である。２１腎臓におけるＫＨＫ（ＫＨＫ−Ａ及びＫＨＫ−Ｃ）の役割はほとんど分かっておらず、食物フルクトースの代謝に大した役割は担っていないと考えられてきた。２２しかし、近位尿細管は、広範囲なグルコース吸収の部位である。正常な条件下では、大部分のグルコースは変化することなく血流に吸収されるが、グルコースはポリオール経路を介してフルクトースに変換されうることが知られており、ここでグルコースは、最初にアルドースレダクターゼ（ＡＲ）によりソルビトールに変換され、続いてソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）によりフルクトースに変換される。２２ＡＲ及びＳＤＨは正常な条件下で近位尿細管においてごくわずかしか発現しないため、内因性（例えば、非食物）フルクトースは、通常ほとんど存在しない。
【００８６】
しかし、ＡＲは、高グルコース、高浸透圧及び虚血を含む多様な刺激により増加されうる。このことは、糖尿病におけるＡＲの活性化が、腎臓疾患又は他の糖尿病合併症に寄与しうることを示唆する研究を導いた。２３しかし、これらの研究のいずれにおいてもＫＨＫの関与が疑われたことはなく、毒性が存在するとしても、ソルビトールに起因すると多くは考えられた。本発明の一態様において、本発明者らは、多種多様な腎疾患が、近位尿細管におけるＫＨＫ活性化により仲介されることを見出し、ここで、近位尿細管における内因性フルクトースの産生はＫＨＫを活性化し、局所腎損傷を引き起こす毒性下流産物（尿酸、酸化剤及び単球遊走因子（ＭＣＰ−１））の生成をもたらす（図８）。
【００８７】
本明細書に記載されている組成物及び方法は、急性又は慢性糖尿病性腎疾患の治療及び予防に利用することができる。正常な条件下、アルドースレダクターゼ（ＡＲ）は、腎髄質に発現し、近位尿細管に位置する腎皮質には発現しない。しかし、糖尿病では、例えば、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発性糖尿病のマウスにおいて、ＡＲ及びＳＤＨは、野生型（ＷＴ）マウスにおいて観察されるものと比較して腎皮質において上方制御され、近位尿細管で吸収されたグルコースのソルビトール及びフルクトースへの変換をもたらす（図９Ａ〜９Ｄ）。
【００８８】
腎フルクトースの増加はＫＨＫ基質を提供するはずであり、本発明者らが以前に示しているように、フルクトースをフルクトース−１−リン酸へ変換し、尿酸、酸化剤及び単球遊走因子（ＭＣＰ−１）等の炎症性仲介物質の生成を伴う。１８これは、局所尿細管損傷をもたらす。この仮定に一致するように、本発明者らは、急性糖尿病と関連する近位尿細管損傷が両方のＫＨＫアイソフォームを欠くマウスにおいて完全に防止されたことを見出している（図１０Ａ〜１０Ｉ）。図１０Ａ〜１０Ｉに示されているように、野生型及びＫＨＫノックアウト（ＫＨＫ−ＫＯ）マウスの両方が、ＳＴＺ注射の後に同様の血中グルコースレベル（図１０Ａ）を有したが、ＫＨＫ  ＫＯマウスは、多尿症（図１０Ｂ）、糖尿（図１０Ｃ）、リン酸塩尿症（図１０Ｄ）、並びにＮＧＡＬ排泄（図１０Ｅ）及び尿アルブミン排泄（図１０Ｆ）により示される尿細管損傷から保護された。野生型マウスの腎損傷も、血清クレアチニンの増加と関連し、腎機能障害がＫＨＫ−ＫＯマウスにおいて阻止されたことを実証している（図１０Ｇ）。刷子縁の損失、空胞変性、尿細管萎縮及び増殖からなる組織学的損傷も、糖尿病野生型マウス（図１０Ｈ）には存在したが、ＫＨＫ  ＫＯマウス（図Ｉ）には存在しなかった。
【００８９】
これらの例における研究は、ＫＨＫの阻止が、糖尿病により誘発された尿細管損傷を防止できることを最初に実証している。尿細管損傷が、急性糖尿病性疾患のみならず、慢性糖尿病性腎疾患の発症においても重要であるため２４、ＫＨＫの阻止は、急性と慢性の両方の糖尿病性腎症の予防に非常に有益である。加えて、本発明者らの後の研究（下記参照）が、炎症性反応を引き起こす主な原因はＫＨＫ−Ｃアイソフォームであることを示しているため、本発明者らの研究は、（ａ）一般的なＫＨＫインヒビター（両方のアイソフォームＫＨＫ−Ａ若しくはＫＨＫ−Ｃに対する）又は（ｂ）本明細書に完全に記載されているＫＨＫ−Ｃ特異的インヒビターのいずれかが、急性及び慢性糖尿病性腎症に対して保護的であるはずであることを示唆している。
【００９０】
また、重要なことに、本発明者らは、腎ＫＨＫ経路がおそらく全ての形態の急障害損傷において主要な役割を担うことも見出している。これは、ＡＲ及びＳＤＨが多様な刺激により上方制御されうるからであり、通常大量のグルコースが近位尿細管において吸収されるため、そのような上方制御は、ＫＨＫを活性化し、局所腎損傷を引き起こすと仮定される。本発明者らは、異なる２種類の急性腎臓障害（ＡＫＩ）において特定の証拠を有する。
【００９１】
第１の例は、放射線造影剤腎毒性である。高浸透圧性及び等浸透圧性の両方の放射線造影剤が、患者にＡＫＩを誘発しうることが知られているが、理由は今も不明である。高浸透圧性造影剤は、等浸透圧性造影剤よりも腎毒性があると考えられるが、両方とも、特に糖尿病の被験者にＡＫＩを引き起こす可能性がある。本発明者らは、等浸透圧性造影剤（Ｉｓｏｖｕｅ）を使用して、糖尿病野生型（ＷＴ）及びＫＨＫ  ＫＯマウスの造影剤誘発性ＡＫＩの古典モデルで実施した（図１１Ａ〜１１Ｃ）。２４図１１Ａ〜１１Ｃに示されているように、造影剤の注射が、ソルビトール（図１１Ａ）、フルクトース（図１１Ｂ）及びＫＨＫ活性（図１１Ｃ）の腎皮質レベルにおける有意な増加をもたらし、造影剤が（浸透圧に関わらず）近位尿細管においてＫＨＫ活性の急激な増加を誘発することを実証している。
【００９２】
近位尿細管損傷は、放射線造影剤を受けているＷＴマウスにおいて顕著であったが、ＫＨＫ  ＫＯマウスでは完全に阻止された（図１２Ａ〜１２Ｅ）。最初、ＷＴマウスは、造影剤注射の後に顕著な乏尿症を発症したが、これはＫＨＫ  ＫＯマウスでは防止された（図１２Ａ）。より重要なことは、造影剤を受けている糖尿病ＷＴマウスは、ＢＵＮとクレアチニン（図１２Ｃ及び１２Ｄ）の両方において顕著な上昇を示し、これはＫＨＫ  ＫＯマウスでは防止されたことである。刷子縁の損失及び局所炎症が示される重篤な近位尿細管損傷も、放射線造影剤を受けているＷＴマウス（図１２Ｄ）では存在したが、同様に処理されたＫＨＫ  ＫＯマウス（図１２Ｅ）では不在であった。これらの研究は、放射線造影剤関連ＡＫＩを予防する手段として、ＫＨＫを阻止する新たな役割を実証している。
【００９３】
第２の例は、心血管手術後等、虚血再灌流後のＡＫＩである。内因性フルクトース又はＮＫＨの役割が、この状態によるＡＫＩの予防又は治療の標的として考えられたことはなかった。しかし、虚血はＡＲを調節することが知られており、本発明者らは、マウスにおける虚血再灌流（ＩＡＫＩ）が、ＡＲ活性化（図１３Ａ）と一致するソルビトールの腎皮質レベルの上昇と関連すること、並びにＫＨＫ活性化（図１３Ｂ及びＣ）と一致する低ＡＴＰ及び高腎内尿酸レベルと関連することを見出した。これらの研究は、虚血再灌流と関連するＡＫＩがＫＨＫによっても仲介されることを強く示唆している。
【００９４】
加えて、他の形態のＡＫＩには、ソルビトール（ＩｇＧ含有溶液中）が役割を担うと考えられるＩｇＧ療法と関連するＡＫＩが含まれる。この形態のＡＫＩにおけるＫＨＫの役割について考えた者はいなかったが、ソルビトールがＳＤＨ基質であり、フルクトース産生をもたらすため、ＩｇＧ療法と関連するＡＫＩは、おそらくＫＨＫ依存性形態のＡＫＩである。同様に、敗血症も肝臓の虚血によってもたらされるため、敗血症によるＡＫＩはおそらくＫＨＫ依存性である。このことは、ＫＨＫの阻止が、予防（例えば、造影剤、ソルビトール又は心血管若しくは他の手術後等の特定の傷害）及び傷害が長期でありうる場合（例えば、糖尿病、敗血症及びＩＣＵの被験者のような再発性虚血）の予防又は治療の両方に関する大部分の形態のＡＫＩにおいて役立つはずである。
【００９５】
本発明の別の態様によると、本発明者らは、ＫＨＫの両方のアイソフォーム（ＫＨＫ−Ａ又はＫＨＫ−Ｃ）を阻止する又はＫＨＫ−Ｃのみを阻止するＫＨＫ−Ｃインヒビターが、糖尿病性腎疾患の予防に有用であることを見出している。これには、急性尿細管損傷及び制御不能な糖尿病に関連する多尿症、並びに放射線造影剤、敗血症又は虚血により糖尿病に生じる急性腎不全症候群及び慢性糖尿病性腎臓疾患を阻止することが含まれる。糖尿病は、１型又は２型糖尿病であるかに関係なくこれらの合併症の危険性を大幅に高めるため、ＫＨＫインヒビターの投与は、真性糖尿病（空腹時血糖＞１２４ｍｇ／ｄｌ）と診断された任意の被験者の治療に有用であろう。
【００９６】
本発明の別の態様によると、両方のアイソフォームを阻止する又はアイソフォームＣのみを阻止するＫＨＫ−Ｃインヒビターは、急性尿細管損傷及び制御不能な糖尿病に関連する多尿症、並びに放射線造影剤、敗血症又は虚血により糖尿病に生じる急性腎不全症候群の治療及び予防において、初期糖尿病性腎症（微量アルブミン尿の存在、すなわち尿アルブミン３０〜３００ｍｇ／ｄ）又はフランク糖尿病性腎症（尿アルブミン排泄＞３００ｍｇ／ｄ）として定義される慢性糖尿病性腎臓疾患の治療において有用であろう。
【００９７】
本発明の別の態様によると、両方のアイソフォームを阻止する又はアイソフォームＣのみを阻止するＫＨＫ−Ｃインヒビターは、糖尿病の不在下での放射線造影剤、敗血症又は虚血による急性腎臓障害を治療又は予防するのに有用であろう。具体的には、ＫＨＫインヒビターの投与は、放射線造影剤の投与の前若しくは広範囲の心血管手術の前に被験者又は敗血症を発症していると疑われる被験者に提供することができる。特に危険性の高い被験者には、腎機能のベースライン低減（推定ＧＦＲ＜６０／ｍｌ／分若しくは病期３以上の慢性腎臓障害）を有するもの、顕著なタンパク尿（＞３００ｍｇ／ｄ）を有する被験者、急性腎臓障害の病歴を有する被験者、尿酸の上昇（＞６ｍｇ／ｄｌ）を有する被験者、糖尿病を有する被験者又は不十分な肝臓若しくは心臓機能を有する被験者が含まれる。
【００９８】
本発明の一態様によると、図８に示されている経路では、被験者においてＡＴＰ涸渇、ＭＣＰ−１産生及び／又は腎内尿酸産生を低減する方法であって、被験者においてＫＨＫ−Ｃ活性を阻害することを含む方法が提供される。一実施態様において、阻害は、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを被験者に投与することにより実施される。
【００９９】
本発明の別の態様によると、被験者において糖尿病性腎合併症を治療する方法であって、被験者にＫＨＫ−Ｃインヒビターを投与することを含む方法が提供される。糖尿病性腎合併症には、急性多尿症、尿細管機能不全及び急性腎損傷のうち１つ以上が含まれうる。一実施態様において、ＫＨＫ−ＣインヒビターはＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａは阻害しない。
【０１００】
本発明の別の態様によると、被験者においてＫＨＫ−Ｃ活性を阻害する方法であって、有効量のＫＨＫ−Ｃインヒビターを被験者に投与することを含む方法が提供される。
【０１０１】
本発明の別の態様によると、被験者において腎尿細管損傷を治療又は予防する方法が提供される。この方法は、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを被験者に投与することを含む。
【０１０２】
本発明の別の態様によると、必要性のある被験者において肝臓尿細管機能を改善する方法が提供される。この方法は、ＫＨＫ−Ｃ又はＫＨＫ−Ａ又はＫＨＫ−Ｃの両方を被験者において阻害することを含み、ここで必要性のある被験者は、糖尿病に関連する多尿症若しくは容量欠乏又はその両方を示す。
【０１０３】
本発明の別の態様によると、被験者において糖尿病性多尿症を治療する方法が提供される。この方法は、例えばＫＨＫ−Ｃインヒビターを投与して、ＫＨＫ−Ｃ又はＫＨＫ−Ａ及びＫＨＫ−Ｃの両方を前記被験者において阻害することを含む。
【０１０４】
本発明の別の態様によると、被験者において糖尿病性腎症を治療する方法が提供される。この方法は、例えばＫＨＫ−インヒビターを被験者に投与して、ＫＨＫ−Ｃ又はＫＨＫ−Ａ及びＫＨＫ−Ｃの両方を前記被験者において阻害することを含む。
【０１０５】
本発明の別の態様によると、被験者において放射線造影剤の投与に関連する造影剤急性腎臓障害（ＡＫＩ）を治療又は予防する方法であって、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを被験者に投与することを含む方法が提供される。
【０１０６】
本発明の別の態様によると、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む、ＡＴＰ涸渇、ＭＣＰ−１産生及び／又は腎内尿酸産生を低減するための組成物が提供される。
【０１０７】
本発明の別の態様によると、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む、被験者において放射線造影剤の投与に関連する造影剤急性腎臓障害（ＡＫＩ）を治療又は予防する組成物が提供される。また、組成物を心血管手術時近くで投与することができる。特定の実施態様において、この組成物は、手術前及び／又は手術後の２週間、１週間、３日間、２４時間に投与される。
【０１０８】
本発明の別の態様によると、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む、腎尿細管損傷を治療又は予防する組成物が提供される。
【０１０９】
本発明の別の態様によると、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む、ＫＨＫ−Ｃの存在又は活性の増加により特徴付けられる腎合併症のための組成物が提供される。
【０１１０】
本発明の別の態様によると、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む、ＫＨＫ−Ｃの存在又は活性の増加により特徴付けられる腎合併症を治療又は予防する組成物が提供される。
【０１１１】
一実施態様において、ＫＨＫ−Ｃの存在又は活性の増加により特徴付けられる疾患は、例えば、造影剤の投与に関連する急性腎臓障害（ＡＫＩ）、ＩｇＧ療法に関連するＡＫＩ又は虚血再灌流後のＡＫＩである。理論に束縛されるものではないが、例えば放射線造影剤の投与は、造影剤の高浸透圧性に起因して、アルドースレダクターゼ（ＡＲ）活性を上方制御し、下流のソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）及びＫＨＫ−Ｃ産生を上方制御する（図１を参照のこと）と考えられる。近位尿細管において通常吸収される多量のグルコースは、フルクトース及びその毒性最終産物、例えば尿酸、酸化剤及びケモカイン、例えばＭＣＰ−１を生成するように作用する。
【０１１２】
ＡＫＩを当該技術分野で既知の診断方法に従って定義することができる。一実施態様において、ＡＫＩは、急速な時間経過（４８時間未満）により特徴付けられ、ここで、血清クレアチニンの絶対増加≧０．３ｍｇ／ｄｌ（≧２６．４μｍｏｌ／ｌ）、血清クレアチニンの増加率≧５０％等、血清クレアチニンの上昇により及び／又は６時間超で＜０．５ｍｌ／ｋｇ／時間として定義される尿量の低減により特徴付けられる腎臓機能の低減が存在する。
【０１１３】
別の実施態様において、ＫＨＫ−Ｃの存在又は活性の増加により特徴付けられる疾患は、腎尿細管損傷、腎尿細管毒性等の腎合併症である。腎尿細管損傷は、急性尿細管拡張、空胞変性、壊死等の腎尿細管の変性病変の存在により特徴付けることができる。腎尿細管損傷は、酸化的ストレス及びＭＣＰ−１等の炎症性媒介物への尿細管の曝露によってもたらされることがある。多尿症は、尿の過剰又は異常な大量生産及び／又は通過状態（成人で２４時間に少なくとも２．５又は３Ｌ）として通常定義される。多尿症及び尿細管毒性の両方が存在する場合、これらを急性多尿症／尿細管毒性と総称することができる。一実施態様において、組成物及び方法は、上記に記述された多尿症及びファンコニ様症候群等の腎損傷によるより軽度な合併症に利用される。
【０１１４】
特定の実施態様において、治療剤は、以下の腎臓疾患（ＫＤ）の病期の症状に罹患している患者を治療するために使用される：
【０１１５】
−ＫＤ病期１：正常又は増加した糸球体濾過量（ＧＦＲ）；微量アルブミン尿、／タンパク尿、血尿又は組織学的変化に反映される腎臓障害の幾つかの証拠、
【０１１６】
−ＫＤ病期２：ＭＤＲＤ  ＧＦＲにより定義されたＧＦＲの軽度の減少（８９〜６０ｍｌ／分／１．７３ｍ２として定義）、
【０１１７】
−ＫＤ病期３  ＭＤＲＤ  ＧＦＲにより定義されたＧＦＲの中程度の減少（５９〜３０ｍｌ／分／１．７３ｍ２）、
【０１１８】
−ＫＤ病期４  ＧＦＲの大幅な減少（２９〜１５ｍｌ分／１．７３ｍ２）。
【０１１９】
第４章：総括
【０１２０】
以下の情報は、例えば糖渇望、肥満及び腎疾患に関して上記１〜３に記載された組成物、方法などのいずれかに当てはまる。
【０１２１】
本発明の一態様によると、被験者において、ＡＴＰ涸渇、ＭＣＰ−１産生及び／又は腎内尿酸産生を低減する方法が提供される。この方法は、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを被験者に投与することを含む。
【０１２２】
本発明の別の態様によると、被験者においてＫＨＫ−Ｃ活性を阻害する方法であって、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを被験者に投与することを含む方法が提供される。
【０１２３】
本発明の別の態様によると、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む、ＫＨＫ−Ｃの存在又は活性の増加により特徴付けられる合併症を治療又は予防する組成物が提供される。
【０１２４】
一実施態様において、ＫＨＫインヒビターはＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ａは阻害しない。ＫＨＫ−Ａを阻害しないことは、インヒビターがＫＨＫ−Ｃの活性を阻害するために特異的に標的とされること及びこのことが、阻害されるＫＨＫ−Ｃの活性又は発現をＫＨＫ−Ａの活性又は発現よりも大きな程度でもたらすことを意味する。理論に束縛されるものではないが、ＫＨＫ−Ａは、高いＫｍ値に示されるように、少なくともＫＨＫ−Ｃほど急速にフルクトースを代謝しないと考えられる。更に、理論に束縛されるものではないが、高いＫｍ及びより遍在的な分布のために、ＫＨＫ−Ａは、フルクトースによるＡＴＰ涸渇又は細胞内尿酸生成をＫＨＫ−Ｃと同じ重篤度で誘発しないことがある。とは言っても、特定の実施態様においては、ＫＨＫ−Ｃインヒビターは、ＫＨＫ−Ｃ活性のみならずＫＨＫ−Ａ活性も阻害しうる。
【０１２５】
ＫＨＫ−Ｃインヒビターは、ＫＨＫ−Ｃを標的にするリボザイム、干渉分子、ペプチド、小型分子又は抗体のうち１つ以上を含むことができる。特定の実施態様において、ＫＨＫ−Ｃインヒビターは、ＫＨＫ−Ｃ及び場合によりＫＨＫ−Ａの発現のサイレンシング等、ＫＨＫ−Ｃの遺伝子発現の変化に参加することができる干渉分子を含む。限定することなく、干渉分子は、ホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、他の任意のアンチセンス配列又はこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０１２６】
本発明に記載されている方法及び組成物は、ＫＨＫ−Ｃの存在又は活性の増加により特徴付けられる任意の疾患の治療に利用することができる。ＫＨＫ−Ｃは、３つの主な組織：肝臓、小腸及び腎臓の近位尿細管のＳ３セグメントに発現すると考えられる。一実施態様において、この組成物及び方法は、近位尿細管のＳ３セグメントにおけるＫＨＫ−Ｃの活性を阻害する。尚、本明細書に記載されている組成物及び方法は、糖尿病被験者における使用に限定されない。一実施態様において、被験者は、放射線造影剤投与を受けている又は心血管手術を受けている又は敗血症である非糖尿病の個人等、非糖尿病でありうる。別の実施態様において、被験者は実際に糖尿病である。糖尿病被験者は、被験者においてグルコースから内因的に産生されたフルクトースの量の増加のために、ＫＨＫ−Ｃの有害な活性にさらにより感受性があると思われる。
【０１２７】
ＫＨＫは、下記に提示されているジェンバンク受入番号に記載されている配列の一部に向けられたｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はＰＭＯを介するサイレンシングを含む、下記に更に記載されている多数の方法により阻害することができる。ｓｉＲＮＡサイレンシングについては米国特許出願第２００６０１１０４４０号を参照のこと。これは、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される。上記に考察されたように、ＫＨＫ−Ｃ又はＫＨＫ−ＡとＫＨＫ−Ｃの両方を阻害するように作用物質を開発して、肥満、糖渇望及び腎臓のグルコース誘導性尿細管機能不全の証拠に有益な効果を達成することができる。
【０１２８】
尚、本明細書に開示されている組成物及び方法を、本明細書において定義される任意の被験者に投与することができる。一実施態様において、被験者はヒトである。別の実施態様において、被験者、愛玩動物、例えばネコ、イヌであり、特定の実施態様では、過体重の愛玩動物又は動物である。尚、対応する組成物、例えば医薬組成物を本明細書に記載されている任意の方法において使用することができる。
【０１２９】
スクリーニング法
【０１３０】
本発明は、ＫＨＫポリペプチドに結合する若しくはＫＨＫポリペプチドの活性を調節する又はＫＨＫポリヌクレオチドに結合する及びＫＨＫポリヌクレオチドの発現を阻害する若しくは発現に影響を与える試験化合物をスクリーニングするアッセイを提供する。試験化合物は、好ましくはＫＨＫポリペプチドに結合する。より好ましくは、試験化合物は、ＫＨＫ活性を試験化合物の不在下と比べて少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０又は１００％減少又は増加する。
【０１３１】
本発明の一態様によると、ＫＨＫ−Ａに対してＫＨＫ−Ｃを差次的に阻害可能な化合物をスクリーニングする方法が提供される。該方法は、少なくとも１つのＫＨＫインヒビター試験化合物をＫＨＫ−Ｃポリペプチドと接触させることを含む。さらに、前記少なくとも１つのＫＨＫインヒビター試験化合物の、前記ＫＨＫ−Ｃポリペプチドへの結合の検出を含み、前記ＫＨＫ−Ｃポリペプチドに結合する試験化合物は、潜在的なＫＨＫインヒビター作用物質であると同定される。
【０１３２】
本発明の別の態様によると、ＫＨＫ−Ｃを阻害することができる化合物をスクリーニングする方法が提供される。該方法は、ｉ）ＫＨＫ−Ｃポリペプチドの活性を試験化合物と接触させることなく決定すること；及びｉｉ）前記ＫＨＫ−Ｃポリペプチドの活性を試験化合物と接触させて決定することを含み、前記ＫＨＫ−Ｃポリペプチドの活性を調節する試験化合物は、潜在的なＫＨＫインヒビター作用物質であると同定される。
【０１３３】
試験化合物
【０１３４】
試験化合物は、潜在的に治療活性を有する作用物質、すなわちＫＨＫポリペプチドに結合する若しくはポリペプチドの活性を調節する又はＫＨＫポリヌクレオチドに結合する若しくはポリペプチドの活性に影響を与える作用物質に関連する。試験化合物は、当該技術分野で既知の薬理学的作用物質でありうる又は薬理学的活性を有することが知られていなかった化合物でありうる。化合物は、天然に生じたもの又は実験室で設計したものでありうる。これらを微生物、動物若しくは植物から単離すること、組み換え的に産生すること又は当該技術分野で既知の化学的方法により合成することができる。望ましい場合、試験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的に指定可能な平行固相又は液相ライブラリー、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ‐１化合物」ライブラリー法、アフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法が含まれるがこれらに限定されない、当該技術で既知の多数のコンビナトリアルライブラリー法のいずれかを使用して得られる。生物学的ライブラリーの手法は、ポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つの手法は、化合物のポリペプチド、非ペプチドオリゴマー又は小型分子ライブラリーに適用可能である。Ｌａｍ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２、１４５、１９９７を参照のこと。
【０１３５】
分子ライブラリーの合成方法は当該技術分野で周知である（例えば、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，６９０６，１９９３；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，１１４２２，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２６７８，１９９４；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，１３０３，１９９３；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３、２０５９，１９９４；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０６１；Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，１２３３，１９９４を参照のこと）。
【０１３６】
１．２．ハイスループットスクリーニング
【０１３７】
試験化合物を、ハイスループットスクリーニングを使用して、ＫＨＫポリペプチド若しくはポリヌクレオチドに対して結合する若しくは阻害する又はＫＨＫ活性若しくはＫＨＫ遺伝子発現に影響を与える能力についてスクリーニングすることができる。ハイスループットスクリーニングを使用して、多くの別々の化合物を並行して試験することができ、これにより多数の試験化合物を素早くスクリーニングすることができる。最も広い範囲に確立された技術は、９６ウエルマイクロタイタープレートを利用する。マイクロタイタープレートのウエルは、典型的には、５０〜５００μｌのアッセイ容量を必要とする。プレートに加えて、多くの器具、材料、ピペット類、ロボティクス、プレート洗浄機及びプレート読み取り機が９６ウエルフォーマットに適合するよう市販されている。あるいは、「フリーフォーマットアッセイ」又は試料間に物理的な障壁のないアッセイを使用することができる。
【０１３８】
１．３．結合アッセイ
【０１３９】
結合アッセイでは、試験化合物は、好ましくは、正常の生物学的活性が防止されるように例えばＫＨＫポリペプチドの活性部位に結合し、占有する小型分子であるが、必ずしもそうである必要はない。そのような小型分子の例には、小型ペプチド又はペプチド様分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
結合アッセイでは、試験化合物又はＫＨＫポリペプチドのいずれかが、蛍光、放射性同位体、化学発光又はホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ若しくはルシフェラーゼ等の酵素標識等、検出可能な標識を含むことができる。ＫＨＫポリペプチドに結合している試験化合物は、例えば電波放出を直接数えることにより、シンチレーション計数により又は適切な基質の検出可能な産物への変換を決定することにより検出することができる。
【０１４１】
本明細書の教示を備えた当業者は、試験化合物の結合を検出する複数の従来の方法が存在することを理解するだろう。例えば、ＫＨＫポリペプチドへの試験化合物の結合は、いずれの反応体を標識することなく決定することができる。マイクロフィジオメーターを使用して、試験化合物とＫＨＫポリペプチドの結合を検出することができる。マイクロフィジオメーター（例えば、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲ（商標））は、光アドレス可能電位差測定センサ（ＬＡＰＳ）を使用して細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析器具である。この酸化速度の変化を、試験化合物とＫＨＫポリペプチドの相互作用との指標として使用することができる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，１９０６１９１２，１９９２）。
【０１４２】
別の代替的な例において、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ＆Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．６３，２３３８２３４５，１９９１及びＳｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５，６９９７０５，１９９５）等の技術を用いてＫＨＫポリペプチドに結合する試験化合物の能力を決定することができる。ＢＩＡは、いずれの反応体も標識することなく生体特異相互作用をリアルタイムで研究する技術である（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標））。光学現象の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）における変化を、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として使用することができる。
【０１４３】
本発明のなお別の態様において、ＫＨＫポリペプチドを２ハイブリッドアッセイ又は３ハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７２，２２３２３２，１９９３；Ｍａｄｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１２０４６１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４，９２０９２４，１９９３；Ｉｗａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８，１６９３１６９６，１９９３；及びＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）において「ベイトタンパク質」として使用し、ＫＨＫポリペプチドと結合又は相互作用し、その活性を調節する他のタンパク質を同定することができる。
【０１４４】
多くのスクリーニングの実施態様において、ＫＨＫポリペプチド（若しくはポリヌクレオチド）又は試験化合物のいずれかを固定化し、反応体の一方又は両方の非結合形態から結合形態を分離するのを促進する、並びにアッセイの自動化に適合させるのが望ましい場合がある。したがって、ＫＨＫポリペプチド（若しくはポリヌクレオチド）又は試験化合物のいずれかを固体支持体に結合することができる。適切な固体支持体には、ガラス若しくはプラスチックスライド、組織培養プレート、マイクロタイターウエル、チューブ、シリコンチップ、ビーズ等の粒子（ラテックス、ポリスチレン若しくはガラスビーズが含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、ＫＨＫポリペプチド（若しくはポリヌクレオチド）又は試験化合物を固体支持体に結合することができ、これには共有及び非供給結合、受動吸収、又はポリペプチド（若しくはポリヌクレオチド）又は試験化合物と固体支持体とにそれぞれ結合している結合分子の対の使用が含まれる。試験化合物は、好ましくは、整列して固体支持体に結合しており、それによって個別の試験化合物の位置を突き止めることができる。反応体を含有する任意の適切な容器において、試験化合物をＫＨＫポリペプチド（又はポリヌクレオチド）へ結合することができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管及びマイクロ遠心分離管が含まれる。
【０１４５】
特定の実施態様において、ＫＨＫポリペプチドは、ＫＨＫポリペプチドの固体支持体への結合を可能にするドメインを含む融合タンパク質でありうる。例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を、グルタチオンセファローゼビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ミズーリ州セントルイス）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、次にこれを試験化合物又は試験化合物及び非吸着ＫＨＫポリペプチドと組み合わせ、混合物を、複合体形成を促す条件下（例えば、塩及びｐＨの生理学的条件下）でインキュベートする。インキュベート後、ビーズ又はマイクロタイタープレートウエルを洗浄して、あらゆる非結合成分を除去する。反応体の結合は、上記に記載されたように直接的又は間接的に決定することができる。あるいは、これらの複合体を、結合が決定される前に固体支持体から解離することができる。
【０１４６】
固体支持体にタンパク質又はポリヌクレオチドを固定化する他の技術も、本発明のスクリーニングアッセイに使用することができる。例えば、ＫＨＫポリペプチドへ（若しくはポリヌクレオチド）又は試験化合物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチン化ＫＨＫポリペプチド（若しくはポリヌクレオチド）又は試験化合物は、ビオチンＮＨＳ（Ｎヒドロキシスクシンイミド）から当該技術分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  イリノイ州ロックフォード）を使用して調製し、ストレプトアビジン被覆９６ウエルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のウエルに固定化することができる。あるいは、ＫＨＫポリペプチド、ポリヌクレオチド又は試験化合物に特異的に結合するが、ＫＨＫポリペプチドの活性部位等、所望の結合部位に干渉しない抗体を、プレートのウエルに誘導体化することができる。非結合標的又はタンパク質を、抗体結合によりウエルにおいて捕捉することができる。
【０１４７】
そのような複合体を検出する方法には、ＧＳＴ固定化複合体について上記に記載されたものに加えて、ＫＨＫポリペプチド又は試験化合物に特異的に結合する抗体を使用する複合体の免疫検出、ＫＨＫポリペプチドの活性の検出に依存する酵素結合アッセイ及び非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動が含まれる。
【０１４８】
ＫＨＫポリペプチド又はポリヌクレオチドに結合する試験化合物のスクリーニングも無傷細胞で実施することができる。ＫＨＫポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む任意の細胞を、細胞に基づくアッセイ系に使用することができる。ＫＨＫポリヌクレオチドは、細胞において天然に生じうる又は上記に記載されたような技術を使用して導入することができる。試験化合物の、ＫＨＫポリペプチド又はポリヌクレオチドへの結合は、上記に記載されたように決定される。
【０１４９】
１．４．酵素アッセイ
【０１５０】
試験化合物は、ＫＨＫポリペプチドのＫＨＫ活性を増加又は減少する能力について試験することができる。ＫＨＫ活性は、実施例に記載されているように測定することができる。酵素アッセイは、精製ＫＨＫポリペプチド、細胞膜調製物又は無傷細胞のいずれかを試験化合物と接触させた後に実施することができる。ＫＨＫポリペプチドのＴＧＳ活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０又は１００％減少する試験化合物は、ＫＨＫ活性を減少する潜在的な治療剤であると同定される。ＴＧＳ  ＫＨＫポリペプチドを少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０又は１００％増加する試験化合物は、ＴＧＳ活性を増加する潜在的な治療剤であると同定される。
【０１５１】
１．５．遺伝子発現
【０１５２】
別の実施態様において、ＫＨＫ遺伝子発現を増加又は減少する試験化合物が同定される。ＫＨＫポリヌクレオチドを試験化合物と接触させて、ＫＨＫポリヌクレオチドのＲＮＡ又はポリペプチド産物の発現を決定する。試験化合物の存在下での適切なｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現レベルを、試験化合物の不在下でのｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現レベルと比較する。次に試験化合物を、この比較に基づいた発現のモジュレーターとして同定することができる。例えば、ｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現が、試験化合物の不在下より存在下で大きい場合、試験化合物は、ｍＲＮＡ又はポリペプチド発現のスティミュレーター又はエンハンサーとして同定される。あるいは、ｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現が、試験化合物の不在下より存在下で小さい場合、試験化合物は、ｍＲＮＡ又はポリペプチド発現のインヒビターとして同定される。
【０１５３】
細胞におけるＫＨＫ  ｍＲＮＡ又はポリペプチド発現のレベルは、ｍＲＮＡ又はポリペプチドを検出する当該技術分野で周知の方法により決定することができる。定性的又は定量的な方法のいずれかを使用することができる。ＫＨＫポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在は、例えば、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロティング及び免疫組織化学等の免疫化学法を含む当該技術分野で既知の多様な方法を使用して決定することができる。あるいは、ポリペプチド合成は、ＫＨＫポリペプチドへの標識アミノ酸の組み込みを検出することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、細胞培養において又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系において決定することができる。
【０１５４】
そのようなスクリーニングは、無細胞アッセイ系又は無傷細胞のいずれかにおいて実施することができる。ＫＨＫポリヌクレオチドを発現する任意の細胞を、細胞に基づくアッセイ系に使用することができる。ＫＨＫポリヌクレオチドは、細胞において天然に生じることができる又は上記に記載されたような技術を使用して導入することができる。初代培養又はＣＨＯ若しくはヒト胎児腎臓２９３細胞等の樹立細胞系を使用することができる。
【０１５５】
医薬組成物
【０１５６】
本発明は、また、ＫＨＫ−Ｃ若しくはＫＨＫ−ＡとＫＨＫ−Ｃの両方を阻害する又はＫＨＫ−Ａを刺激するがＫＨＫ−Ｃを刺激しない１つ以上の治療剤を含む組成物、例えば医薬組成物に関する。一実施態様において、治療剤は、ＫＨＫ−Ｃを阻害するが、ＫＨＫ−Ｃの様にはＫＨＫ−Ａを阻害しない。治療剤には、ＫＨＫポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを利用するスクリーニング法により同定されるものが含まれる。治療剤を患者に投与して、治療効果を達成することができ、すなわち、ＫＨＫ活性を調節して、肥満、糖渇望及び／又は尿細管機能を治療及び／又は予防するのに有用でありうる。本発明の組成物は、例えば、本明細書に記載されたスクリーニング法の実施態様により同定される治療剤を含むことができ、これはＫＨＫポリペプチドに結合する若しくはＫＨＫポリペプチドの活性に影響を与える又はＫＨＫポリヌクレオチドに結合する及び／若しくはＫＨＫポリヌクレオチドの発現に影響を与えるこれらの能力によって同定される。これらの組成物は、単独で又は安定化化合物等の少なくとも１つの他の作用物質と組み合わせて投与することができ、これは、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース及び水が含まれるが、これらに限定されない任意の滅菌生体適合性医薬担体で投与することができる。これらの組成物は、患者に単独で又は他の作用物質、薬剤若しくはホルモンと組み合わせて投与することができる。
【０１５７】
活性成分に加えて、これらの組成物は、薬学的に使用可能な調合剤への活性化合物の加工を促進する賦形剤及び補助剤を含む適切な薬学的に許容される担体を含有することができる。本発明の組成物を、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、鞘内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下又は直腸内の手段が含まれるが、これらに限定されない様々な経路により投与することができる。経口投与用の組成物は、経口投与に適した投与量で、当該技術分野で周知の薬学的に許容される担体を使用して処方することができる。そのような担体により、医薬組成物を患者の摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして処方することができる。
【０１５８】
処方及び投与の技術についての更なる詳細は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳの最新版（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（ペンシルベニア州イーストン））に見られ、これは参考として本明細書で援用される。医薬組成物は調製後、適切な容器に入れ、指示された状態の治療のためにラベルを付けることができる。ラベルには、量、頻度及び投与方法が記載される。
【０１５９】
したがって、本明細書に記載されているような治療活性を有する作用物質の例として、調節剤、アンチセンス核酸分子、小型分子ＫＨＫインヒビター、ペプチドインヒビター、特定の抗生物質、リボザイム、干渉分子又はＫＨＫ−Ｃ若しくはＫＨＫ−ＣとＫＨＫ−Ａの両方を標的にするＫＨＫポリペプチド結合分子などが挙げられるが、これらに限定されない。一実施態様において、作用物質は干渉分子を含み、干渉分子は、ホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、メチル化ｍｉＲＮＡ、処理済ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びこれらの任意の組み合わせを含む。
【０１６０】
本明細書に記載されている組成物及び方法は、それぞれ、有効量のＫＨＫ−Ｃインヒビターを含むことができる。一実施態様において、ＫＨＫ−Ｃインヒビターは、１つ以上の連結治療剤と組み合わされて、被験者に所望の効果をもたらす。この効果は、有効量のＫＨＫ−Ｃインヒビター、有効量の連結剤又はＫＨＫ−Ｃと１つ以上の連結治療剤との有効量の組み合わせにより実現することができる。尚、１つ以上の治療剤と組み合わせたＫＨＫ−Ｃインヒビターの投与は、ＫＨＫ−Ｃインヒビター、連結剤又は両方の効能を有利に増加しうる。
【０１６１】
特定の実施態様において、ＫＨＫの阻害は、ＫＨＫ遺伝子の遺伝子発現、翻訳又は活性の下方制御を伴う。下記に考察される治療活性、並びに治療剤のスクリーニング及び産生に関連するＫＨＫの２つのアイソフォームが存在する：ＫＨＫ−Ｃ（ＫＨＫの主な形態、ジェンバンク受入番号ＮＭ＿００６４８８（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｖａｌ＝５６７０３４）
【０１６２】
配列番号１及び２、並びにＫＨＫ−Ａ（ジェンバンク受入番号ＮＭ＿０００２２１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｖａｌ＝４５５７６９２）配列番号３及び４。
【０１６３】
本明細書に記載されている方法及び組成物を、１つ以上のＫＨＫ遺伝子のいずれかの遺伝子発現、翻訳又は活性を阻害する発現を阻害するよう方向づけることができる。特定の実施態様において、本明細書に記載されている方法及び組成物は、ＫＨＫ−Ｃの遺伝子発現、翻訳又は活性を阻害するよう方向づけられる。
【０１６４】
作用物質を動物モデルに使用して、そのような作用物質による治療の効能、毒性又は副作用を決定することができる。また、組成物は、本発明の治療剤に加えて、連結剤を含むことができる。ＫＨＫインヒビターを含む治療剤と組み合わせて使用することができる多くの異なる作用物質の総括的な考察は、米国特許公開第２００８０２５５１０１号に記載されており、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される。特定の実施態様によると、小型分子ＫＨＫインヒビターには、１−デオキシ−フルクトース又は５−チオ−ｄ−フルクソースが含まれるが、これらに限定されない。Ｒａｕｓｈｅｌ  ａｎｄ  Ｃｌｅｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６：２１６９−２１７５（１９７７）を参照のこと。
【０１６５】
本明細書に記載されているＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む治療剤又は組成物と使用されるために含まれる例示的な化合物は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アルドステロンアンタゴニスト、アンフェタミン、アンフェタミン様作用物質、アンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、抗酸化剤、アルドースレダクターゼインヒビター、ビグアニド、ソルビトールデヒドロゲナーゼインヒビター、チアゾリジンジオン（グリタゾン）、チアジド及びチアジド様利尿剤、トリグリセリド合成インヒビター、尿酸低下薬、例えばキサンチンオキシダーゼインヒビター、並びにこれらの組み合わせからなる群より選択することができる。
【０１６６】
当業者であれば、多数の送達機構が、治療剤を必要な領域に送達するために利用可能であることを理解するだろう。例えば、作用物質を、送達ビヒクルとしてリポソームを使用して送達することができる。好ましくは、リポソームは動物において安定しており、少なくとも約３０分間、より好ましくは少なくとも約１時間、さらにより好ましくは少なくとも約２４時間投与される。リポソームは、試薬、特にポリヌクレオチドをヒト等の動物における特定の部位に標的化することができる脂質組成物を含む。
【０１６７】
本発明に有用なリポソームは、標的細胞の細胞膜に融合して、その内容物を細胞に送達することができる脂質組成物を含む。好ましくは、リポソームのトランスフェクション効率は、約１０６の細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌあたり約０．５μｇのＤＮＡ、より好ましくは約１０６の細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌあたり約１．０μｇのＤＮＡ、さらにより好ましくは約１０６の細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌあたり約２．０μｇのＤＮＡである。好ましくは、リポソームの直径は、約１００〜５００ｎｍ、より好ましくは約１５０〜４５０ｎｍ、さらにより好ましくは約２００〜４００ｎｍである。
【０１６８】
本発明の使用に適したリポソームには、例えば当業者に既知の遺伝子送達方法に慣用的に使用されるリポソームが含まれる。より好ましくは、リポソームには、ポリカチオン性脂質組成物を有するリポソーム及び／又はポリエチレングルコールに結合したコレステロール主鎖を有するリポソームが含まれる。場合により、リポソームは、リポソームの外面に露出した細胞特異的リガンド等、リポソームを特定の細胞型に標的化することができる化合物を含む。
【０１６９】
当該技術分野で標準の方法を使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボソームのような試薬とリポソームの複合体を形成することができる（例えば、米国特許第５，７０５，１５１号を参照のこと）。好ましくは、約０．１μｇ〜約１０μｇのポリヌクレオチドが約８ｎｍｏｌのリポソームと組み合わされ、より好ましくは約０．５μｇ〜約５μｇのポリヌクレオチドが約８ｎｍｏｌのリポソームと組み合わされ、さらにより好ましくは約１．０μｇのポリヌクレオチドが約８ｎｍｏｌのリポソームと組み合わされる。
【０１７０】
別に実施態様において、抗体を、レセプター仲介標的化送達を使用して特定の組織にｉｎ  ｖｉｖｏで送達することができる。レセプター仲介ＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１，２０２−０５（１９９３）；Ｃｈｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＤＩＲＥＣＴ  ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，ｅｄ）（１９９４）；Ｗｕ＆Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６２１−２４（１９８８）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，５４２−４６（１９９４）；Ｚｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，３６５５−５９（１９９０）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，３３８−４２（１９９１）に教示されている。 
【０１７１】
２．１  治療有効用量の決定
【０１７２】
本明細書のスクリーニング法により同定される治療剤の治療有効用量の決定は、当業者であれば十分行うことができる。治療有効用量は、治療有効用量の不在下で生じるものと比較した、ＫＨＫ活性を調節する活性成分の量を意味する。
【０１７３】
治療効能及び毒性、例えば、ＥＤ５０（個体群の５０％に治療的に有効な用量）及びＬＤ５０（個体群の５０％に致死的な用量）は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的な手順により決定することができる。毒作用と治療作用の用量比は、治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表わすことができる。
【０１７４】
正確な投与量は、治療を必要とする被験者に関する要因を考慮して、医師によって決定される。投与量及び投与は、十分なレベルの活性成分を提供するように又は所望の効果を維持するように調整される。考慮されうる要因には、疾患状態の重篤度、被験者の一般的な健康状態、被験者の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬剤の組み合わせ、反応感度、並びに療法に対する耐容性／反応性が含まれる。長期作用組成物を、特定の製剤の半減期及びクリアランス率に応じて、３〜４日毎、毎週又は２週間に１回投与することができる。
【０１７５】
通常の投与量は、投与経路に応じて０．１から１００，０００マイクログラムまで、総用量の最大約１ｇまで変更することができる。特定の投与量及び送達方法についての指針は、文献において提供されており、当該技術分野の医師に利用可能である。当業者は、タンパク質又はこれらのインヒビターとは異なる製剤をヌクレオチドに用いる。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置などに特異的であろう。
【０１７６】
好ましくは、治療剤は、ＫＨＫ遺伝子の発現又はＫＨＫポリペプチドの活性を、試薬の不在下と比べて少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０又は１００％低減する。ＫＨＫ遺伝子の発現レベル又はＫＨＫポリペプチドの活性を低減するために選択された機構の有効性を、例えば、ＫＨＫ特異的ｍＲＮＡへのヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、定量ＲＴ−ＰＣＲ、ＫＨＫポリペプチドの免疫学的検出又はＫＨＫ活性の測定により評価することができる。
【０１７７】
２．２  連結治療剤
【０１７８】
上記に記載された実施態様のいずれかにおいて、本発明の組成物のいずれかを、標的疾患の治療及び予防のために他の適切な治療剤（連結剤又は連結治療剤）と同時投与することができる。従来の薬学的原則に従って、当業者は併用療法に使用される適切な連結剤を選択することができる。治療剤の組み合わせは相乗的に作用して、上記に記載された多様な障害の治療又は予防を行うことができる。この手法を使用すれば、少ない投与量で、それぞれの作用物質の治療効能を達成することができ、したがって、有害な副作用の可能性を低減する。本明細書に記載されているＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む治療法及び組成物のいずれかを、そのような療法を必要とする被験者に別の連結剤と同時投与することができる。
【０１７９】
本明細書に記載されている任意の形態のＫＨＫ−Ｃインヒビターを処方及び／又は投与することができる例示的な連結剤には、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アルドステロンアンタゴニスト、アンフェタミン、アンフェタミン様作用物質、アンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、抗酸化剤、アルドースレダクターゼインヒビター、ビグアニド、ソルビトールデヒドロゲナーゼインヒビター、チアゾリジンジオン（グリタゾン）、チアジド及びチアジド様利尿剤、トリグリセリド合成インヒビター、尿酸低下剤、例えばキサンチンオキシダーゼインヒビター、並びにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
例示的なＡＣＥインヒビターには、ベナゼプリル（ロテンシン）、カプトプリル、エナラプリル（バソテック）、フォシノプリル、リシノプリル（プリニビル、ゼストリル）、モエキシプリル（ユニバスク）、ペリンドプリル（アセオン）、キナプリル（アキュプリル）、ラミプリル（アルテース）、トランドラプリル（マビック）及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８１】
例示的なアルドステロンアンタゴニストには、スピロノラクトン、エプレレノン、カンレノン（カンレノ酸カリウム）、プロレノン（プロレノン酸カリウム）、メクスレノン（メクスレノン酸カリウム）及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８２】
例示的なアンフェタミンには、アンフェタミン、メタアンフェタミン、メチルフェニデート、ｐ−メトキシアンフェタミン、メチレンジオキシアンフェタミン、２，５−ジメトキシ−４−メチルアンフェタミン、２，４，５−トリメトキシアンフェタミン及び３，４−メチレンジオキシメタアンフェタミン、Ｎ−エチルアンフェタミン、フェネチリン、ベンズフェタミン及びクロルフェンテルミン、並びにＡｄｄｅｒａｌｌ（登録商標）のアンフェタミン化合物；アクテドロン；アクテミン；アジパン；アケドロン；アロデン；アルファ−メチル−（＋−）−ベンゼンエタンアミン；アルファ−メチルベンゼンエタンアミン；アルファ−メチルフェネチルアミン；アンフェタミン；アンフェート；アノレキシン；ベンゼバール；ベンゼドリン；ベンジルメチルカルビナミン；ベンゾロン；ベータ−アミノプロピルベンゼン；ベータ−フェニルイソプロピルアミン；ビフェタミン；デスオキシノルエフェドリン；ジエタミン；ＤＬ−アンフェタミン；エラストノン；フェノプロミン；フィナム；イソアミン；イソミン；メコドリン；モノフォス；マイドリアル；ノルエフェドラン；ノビドリン；オベシン；オベシネ；オベトロール；オクテドリネ；オクテドリン；フェナミン；フェネドリン；フェネチルアミン；アルファ−メチル−；ペルコモン；プロファミナ；プロフェタミン；プロピサミン；ラセフェン；ラフェタミン；リナラトール；シンパミン；シンパテドリン；シンパチナ；シンパテドリン及びウェッカミンが含まれるが、これらに限定されない。例示的なアンフェタミン様作用物質には、メチルフェニデートが含まれるが、これに限定されない。ＡＤＤの治療用の例示的な化合物には、メチルフェニデート、デキストロアンフェタミン／アンフェタミン、デキストロアンフェタミン及びアトモキセチン（非刺激物質）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８３】
例示的なアンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト又はアンギオテンシンレセプターブロッカー（ＡＲＢ）には、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、バルサルタン及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８４】
例示的な抗酸化剤化合物には、Ｌ−アスコルビン酸又はＬ−アスコルベート（ビタミンＣ）、メナキノン（ビタミンＫ２）、プラストキノン、フィロキノン（ビタミンＫ１）、レチノール（ビタミンＡ）、トコフェロール（例えば、α、β、γ及びδ−トコトリエノール、ユビキノール及びユビキオン（コエンザイムＱ１０））；並びにアセトフェノン、アントラキノン、ベンゾキノン、ビフラボノイド、カテコールメラニン、クロモン、縮合タンニン、クマリン、フラボノイド（カテキン及びエピカテキン）、加水分解性タンニン、ヒドロキシケイ皮酸、ヒドロキシベンジル化合物、イソフラボノイド、リグナン、ナフトキノン、ネオリグナン、フェノール酸、フェノール（ビスフェノール及び他の立体ヒンダードフェノール、アミノフェノール及びチオビスフェノールを含む）、フェニル酢酸、フェニルプロペン、スチルベン及びキサントンを含む環状又は多環式化合物が含まれるが、これらに限定されない。追加的な環状又は多環式酸化防止剤化合物には、アピゲニン、オーレシン、オーロイシジン、バイオカニンＡ、カプサイシン、カテキン、コニフェリルアルコール、コニフェリルアルデヒド、シアニジン、ダイゼイン、ダフネチン、デイフィニジン、エモジン、エピカテキン、エリオジシトール、エスクレチン、フェルラ酸、ホルモノネチン、ゲルニステイン、ジンゲロール、３−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、３−ヒドロキシクマリン、ジュグロン、ケエンフェロール、ルヌラル酸、ルテオリン、マルビジン、マンギフェリン、４−メチルウンベリフェロン、ミセルチン、ナリンゲニン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジン、フロレチン、ｐ−ヒドロキシアセトフェノン、（＋）−ピノレシノール、プロシアニジンＢ−２、ケルセチン、レスベラトール、レゾルシノール、ロスマリン酸、サリチル酸、スコポレイン、シナピン酸、シナポイル−（Ｓ）−マレエート、シナピルアルデヒド、シルギニルアルコール、テリグランジンウンベリフェロン及びバニリンが含まれる。酸化防止剤は、また、植物抽出物から、例えばブラックベリー、ブルーベリー、黒ニンジン、チョークチェリー、クランベリー、クロフサスグリ、ニワトコ、赤ブドウ及びその果汁、ハイビスカス、オレガノ、ベニイモ、赤ワイン、ローズマリー、ストロベリー、茶（例えば、紅茶、緑茶又は白茶）から、並びにエラグ酸のような多様な植物成分から得られる。
【０１８５】
例示的なアルドースレダクターゼインヒビターには、エパルレスタット、ラニレスタット、フィダレスタット、ソルビニル及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８６】
例示的なビグアニドには、メトホルミン、フェンホルミン（めったに使用されない）、ブホルミン、プログアニル及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８７】
例示的なチアゾリジンジオンには、トログリタゾン、ピオグリタゾン、シグリタゾン、ロシグリタゾン、エングリタゾン及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８８】
例示的なソルビトールデヒドロゲナーゼインヒビターは、米国特許第６，８９４，０４７号、同第６，５７０，０１３号、同第６，２９４，５３８号及び米国特許出願公開第２００５００２０５７８号に開示されており、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される。
【０１８９】
例示的なチアジド及びチアジド様利尿剤には、ベンゾチアジアジン誘導体、クロルタリドン、メトラゾン及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９０】
例示的なトリグリセリド合成インヒビターには、ジグリセリドアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ−１）インヒビターが含まれるが、これに限定されない。
【０１９１】
例示的な尿酸低下剤には、アロプリノール、オキシプリノール、チソプリンフェブキソスタット、イノシトール（例えば、フィチン酸及びミオイノシトール）等のキサンチンオキシダーゼインヒビター、並びにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９２】
本発明における使用に適した連結治療剤は、また、上記の化合物の任意の組み合わせ、プロドラッグ、薬学的に許容される塩、類似体及び誘導体を含んでもよいことが理解される。
【０１９３】
一実施態様において、ＫＨＫ−Ｃインヒビターを、急性又は慢性腎臓疾患に活性な１つ以上の他の治療剤と共に被験者に投与することができる。この使用における例示的な連結治療剤には、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アルドステロンアンタゴニスト、アンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、抗酸化剤、アルドースレダクターゼインヒビター、ビグアニド、ソルビトールデヒドロゲナーゼインヒビター、チアゾリジンジオン（グリタゾン）、キサンチンオキシダーゼインヒビター及び／又は急性若しくは慢性腎臓疾患の治療に使用される任意の他の作用物質が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９４】
別の実施態様において、ＫＨＫインヒビターを、メタボリックシンドローム、肥満、糖耽溺、糖渇望及び注意欠陥障害の治療において他の作用物質と共に投与することができる。この目的に例示的な連結治療剤には、本明細書に記載されているＫＨＫ−Ｃインヒビターの任意の形態で処方及び／又は投与することができる例示的な連結剤には、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アルドステロンアンタゴニスト、アンフェタミン、アンフェタミン様作用物質、アンギオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、抗酸化剤、アルドースレダクターゼインヒビター、ソルビトールデヒドロゲナーゼインヒビター、チアジド及びチアジド様利尿剤、トリグリセリド合成インヒビター、並びに／又はメタボリックシンドローム、肥満、糖耽溺、糖渇望及び／若しくは注意欠陥障害の治療に使用される任意の他の作用物質が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９５】
本明細書に記載されているＫＨＫインヒビターのいずれか１つ以上が連結治療剤と組み合わされる場合、ＫＨＫインヒビターは、重要なことに、連結治療剤の効能の増加を可能にすることがある又は関連する用量に依存した毒性を有しうる他の治療剤の用量の低減を可能にすることがあることが、当業者に理解される。
【０１９６】
本発明の連結製剤の投与様式は、ＫＨＫ−Ｃインヒビター及び連結剤が投与時に組み合わされる限り、特に限定されない。そのような投与様式は、例えば、（１）ＫＨＫ−Ｃインヒビター及び連結剤を同時に処方して得られた単一製剤を投与すること；（２）ＫＨＫ−Ｃインヒビター及び連結剤を別々に処方して得られた２つの作用物質を、同一経路を介して同時に投与すること；（３）ＫＨＫ−Ｃインヒビター及び連結剤を別々に処方して得られた２つの作用物質を、同一の経路を介して連続的及び断続的に投与すること；（４）ＫＨＫ−Ｃインヒビター及び連結剤を別々に処方して得られた２つの製剤を、異なる経路を介して同時に投与すること；並びに／或いは（５）ＫＨＫ−Ｃインヒビター及び連結剤を別々に処方して得られた２つの製剤を、異なる経路を介して連続的及び断続的に投与すること（例えば、ＫＨＫ−Ｃ若しくはその組成物、続いて連結剤若しくはその組成物又はその逆）などでありうる。
【０１９７】
連結製剤の用量は、ＫＨＫ−Ｃインヒビター及び／又は連結剤の処方、被験者の年齢、体重、状態及び投与形態、並びに投与様式及び期間によって変わりうる。当業者であれば、用量が上記に記載された多様な要因に応じて変わりうること、並びにより少ない量が時には十分でありうること及び過剰な量が時には必要であるべきであることを、容易に理解する。
【０１９８】
連結剤を、問題のある副作用を引き起こさない範囲内において任意の量で用いることができる。連結剤の１日用量は、特に制限はなく、疾患の重篤度、被験者の年齢、性別、体重及び感受性、並びに投与の時間及び間隔、医薬製剤の特性、調製、種類及び活性成分に応じて変わりうる。被験者、例えば哺乳動物の体重１ｋｇあたりの例示的な１日経口用量は、薬剤として０．００１〜２０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜５００ｍｇ、より好ましくは約０．１〜約１００ｍｇであり、通常１回から４回に分けて与えられる。
【０１９９】
ＫＨＫ−Ｃインヒビター及び連結剤が被験者に投与される場合、作用物質を同時に投与することができるが、連結剤を最初に投与し、次にＫＨＫ−Ｃインヒビターを投与すること又はＫＨＫ−Ｃインヒビターを最初に投与し、次に連結剤を投与することもできる。断続的に投与される場合、間隔は、投与される活性成分、投与形態及び投与様式に応じて変わりえ、例えば、連結剤が最初に投与される場合、ＫＨＫ−インヒビターを、連結剤の投与後１分から３日以内、好ましくは１０分から１日以内、より好ましくは１５分から１時間以内に投与することができる。例えば、ＫＨＫ−Ｃインヒビターが最初に投与される場合、連結剤を、ＫＨＫ−Ｃインヒビターの投与後１分から１日以内、好ましくは１０分から６時間後以内、より好ましくは１５分から１時間以内に投与することができる。
【０２００】
ＫＨＫ−Ｃインヒビター及び連結剤の記載は、単独のＫＨＫ−Ｃインヒビター、単独の連結剤、組成物の一部、例えば場合により１つ以上の医薬担体を含む組成物の一部を意味すると理解される。必要に応じて、２つ以上の連結剤を被験者に投与することができることも考慮される。
【０２０１】
ポリペプチド
【０２０２】
本発明の態様によるＫＨＫポリペプチドは、配列番号２及び４で示されるアミノ酸配列又は下記に定義されるその生物学的に活性な変種から選択される少なくとも１２、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０又は２６５の隣接アミノ酸を含む。したがって本発明のＫＨＫポリペプチドは、ＫＨＫタンパク質の一部、完全長ＫＨＫタンパク質又は全て若しくは一部のＫＨＫタンパク質を含む融合タンパク質でありうる。
【０２０３】
３．１  生物学的に活性な変種
【０２０４】
生物学的に活性である、すなわち能力をリン酸化フルクトースに与えるＫＨＫポリペプチド変種も、本出願の目的のＫＨＫポリペプチドであると考えられる。好ましくは、天然又は非天然に生じるＫＨＫポリペプチド変種は、配列番号２で示されるアミノ酸又はそのフラグメントに少なくとも約５５、６０、６５又は７０、好ましくは約７５、８０、８５、９０、９６、９６又は９８％の同一性があるアミノ酸配列を有する。推定ＫＨＫポリペプチド変種と配列番号２のアミノ酸配列との同一率は、Ｂｌａｓｔ２整列プログラム（Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、標準遺伝子コード）を使用して決定される。
【０２０５】
同一性率の変動は、例えば、アミノ酸置換、挿入又は欠失に起因しうる。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸に対する１つのアミノ酸の置き換えとして定義される。置換アミノ酸が同様の構造及び／又は化学特性を有する場合、その性質は保存的である。保存的置き換えの例として、イソロイシン又はバリンによるロイシンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換又はセリンによりトレオニンの置換が挙げられる。
【０２０６】
アミノ酸挿入又は欠失は、アミノ酸配列への又はアミノ酸配列内の変化である。これらは、典型的に約１〜５アミノ酸の範囲で起こる。どのアミノ酸残基が、ＫＨＫポリペプチドの生物学的又は免疫学的活性を無くすことなく置換、挿入又は欠失されうるかを決定する指針は、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウエア等、当該技術分野で周知のコンピュータープログラムを使用して見出すことができる。アミノ酸の変化が生物学的に活性なＫＨＫポリペプチドをもたらすかは、例えば、本明細書に記載されているように、ＫＨＫ活性をアッセイすることにより容易に決定することができる。
【０２０７】
３．２  融合タンパク質
【０２０８】
本発明の幾つかの実施態様において、融合タンパク質を作り出すことが有用である。例として、融合タンパク質は、ＫＨＫポリペプチドアミノ酸配列に対する抗体を生成するため及び多様なアッセイ系に使用するために有用である。例えば、融合タンパク質を使用して、ＫＨＫポリペプチドのタンパク質と相互作用するタンパク質を同定することができる。酵母２ハイブリッド又はファージディスプレイ系等のタンパク質間相互作用のためのタンパク質アフィニティークロマトグラフィー又はライブラリーに基づくアッセイをこの目的に使用することができる。そのような方法は、当該技術分野で周知であり、薬剤スクリーンとして使用することもできる。
【０２０９】
ＫＨＫポリペプチド融合タンパク質は、ペプチド結合により一緒に融合した２つのポリペプチドセグメントを含む。例えば、第１ポリペプチドセグメントは、配列番号２又は上記に記載されたようなその生物学的に活性な変種の少なくとも１２、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５又は２５０隣接アミノ酸を含むことができる。第１ポリペプチドセグメントも、完全長ＫＨＫタンパク質を含むことができる。
【０２１０】
第２ポリペプチドセグメントは、完全長タンパク質又はタンパク質フラグメントでありうる。融合タンパク質の構築に一般的に使用されるタンパク質には、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＲ）を含む自己蛍光タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が含まれる。加えて、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含むエピトープタグが、融合タンパク質の構築に使用される。他の融合構築には、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ−ａＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン融合及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合が含まれうる。融合タンパク質を操作して、ＫＨＫポリペプチドコード配列と異種タンパク質配列の間に位置する切断部位を含めることもでき、それによって、ＫＨＫポリペプチドを切断し、異種部分から精製することができる。
【０２１１】
融合タンパク質を構築する多くのキットは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ウィスコンシン州マジソン）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホヤ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ（カリフォルニア州マウンテンビュー）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カリフォルニア州サンタクルーズ）、ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ；マサチューセッツ州ウォータータウン）及びＱｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カナダ国モントリオール；１−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）等の企業から入手可能である。
【０２１２】
ポリヌクレオチド
【０２１３】
ＫＨＫポリヌクレオチドは、一本又は二本鎖でありえ、ＫＨＫポリペプチドのコード配列又はコード配列の補体を含みうる。配列番号２又は４のＫＨＫポリペプチドのコード配列は、それぞれ配列番号１又は３に示されている。
【０２１４】
ＫＨＫポリペプチド、並びに配列番号１に示されるヌクレオチド配列に少なくとも約５０、５５、６０、６５、６０、好ましくは約７５、９０、９６又は９８％同一性がある相同性ヌクレオチド配列をコードする退縮ヌクレオチド配列も、ＫＨＫ様酵素ポリヌクレオチドである。２つのポリヌクレオチドの配列間の配列同一率は、ギャップ開始ペナルティーの−１２及びギャップ延長ペナルティーの−２によるアフィンギャップ検索を使用するＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いるＡＬＩＧＮ等のコンピュータープログラムを使用して決定される。生物学的に活性なＫＨＫポリペプチドをコードするＫＨＫポリヌクレオチドの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体及び変種も、ＫＨＫポリヌクレオチドである。
【０２１５】
４．１  ポリヌクレオチド変種及び相同体の同定
【０２１６】
上記に記載されたＫＨＫポリヌクレオチドの変種及び相同体も、ＫＨＫポリヌクレオチドである。典型的には、相同性ＫＨＫポリヌクレオチド配列は、候補ポリヌクレオチドを当該技術分野で既知の厳密な条件下で既知のＫＨＫポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより同定することができる。例えば、以下の洗浄条件で：２×ＳＳＣ（０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％のＳＤＳ、室温で２回、それぞれ３０分間；次に２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、５０℃で１回、３０分間；次に２×ＳＳＣ、室温で２回、それぞれ１０分間、最大約２５〜３０％の塩基対ミスマッチを含有する相同性配列を同定することができる。より好ましくは、相同性核酸鎖は、１５〜２５％の塩基対ミスマッチ、さらにより好ましくは５〜１５％の塩基対ミスマッチを含有する。
【０２１７】
本明細書に開示されているＫＨＫポリヌクレオチドの種相同体も、適切なプローブ又はプライマーを作製し、ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。二本鎖ＤＮＡのＴｍは相同性の１％毎の減少により１〜１．５℃低下することが良く知られている（Ｂｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１，１２３（１９７３））。したがって、ＫＨＫポリヌクレオチド又は他の種のポリヌクレオチドの変種は、推定相同性ＫＨＫポリヌクレオチドを、配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド又はその補体とハイブリダイズして、試験ハイブリッドを形成することにより、同定することができる。試験ハイブリッドの溶融温度を、完全に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むハイブリッドの溶融温度と比較し、試験ハイブリッド内の塩基対のミスマッチの数又は率を計算する。
【０２１８】
厳密なハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件に従ってＫＨＫポリヌクレオチド又はそれらの補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列も、ＫＨＫポリヌクレオチドである。厳密な洗浄条件は、当該技術分野で周知であり、十分理解されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄｅｄ．，１９８９，ｐａｇｅｓ  ９．５０―９．５１に開示されている。
【０２１９】
典型的には、厳密なハイブリダイゼーション条件では、温度と塩濃度の組み合わせは、試験下のハイブリッドの計算Ｔｍをおよそ１２〜２０℃下回るように選択されるべきである。配列番号１に示される核酸配列を有するＫＨＫポリヌクレオチド又はその補体と、核酸配列の１つに少なくとも約５０，好ましくは約７５、９０、９６又は９８％の同一性があるポリヌクレオチド配列とのハイブリッドのＴｍは、例えば下記Ｂｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．４８，１３９０（１９６２）の方程式を使用して計算することができる：
【０２２０】
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｌ）
【０２２１】
［式中、ｌ＝塩基対におけるハイブリッドの長さ］
【０２２２】
厳密な洗浄条件には、例えば、６５℃での４×ＳＳＣ又は５０％のホルムアミド、４２℃での４×ＳＳＣ又は６５℃での０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳが含まれる。極めて厳密な洗浄条件には、例えば、６５℃での０．２×ＳＳＣが含まれる。 
【０２２３】
４．２  ポリヌクレオチドの調製
【０２２４】
天然に生じるＫＨＫポリヌクレオチドを、膜成分、タンパク質、脂質等、他の細胞成分なしで単離することができる。ポリヌクレオチドは、細胞から作製して、標準的な核酸精製技術を使用して単離することができる又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の増幅技術を使用して若しくは自動合成機を使用して合成することができる。ポリヌクレオチドを単離する方法は、通常のものであり、当該技術分野で既知である。ポリヌクレオチドを得るためのそのような技術のいずれかを用いて、単離されたＫＨＫポリヌクレオチドを得ることができる。例えば、制限酵素及びプローブを使用して、ＫＨＫヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドフラグメントを単離することができる。単離されたポリヌクレオチドは、他の分子がない又は少なくとも７０、８０若しくは９０％ない調製物中に存在する。
【０２２５】
ＫＨＫ  ＤＮＡ分子は、ＫＨＫ  ｍＲＮＡをテンプレートとして使用する標準的な分子生物学技術により作製することができる。したがって、ＫＨＫ  ＤＮＡ分子は、当該技術分野で既知の分子生物学技術を使用して複製することができ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）等のマニュアルに開示されている。ＰＣＲ等の増幅技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドの追加的なコピーを得ることができる。本発明はこの手法を実証するのに成功している。
【０２２６】
あるいは、合成化学技術を使用して、ＫＨＫポリヌクレオチドを合成することができる。遺伝子コードの縮退は、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列又はその生物学的に活性な変種を有するＫＨＫポリペプチドをコードする、代替的なヌクレオチド配列の合成を可能にする。
【０２２７】
４．３  ポリヌクレオチドの発現
【０２２８】
ＫＨＫポリヌクレオチドを発現するために、ポリヌクレオチドを、挿入コード配列の転写及び翻訳のために必要なエレメントを含有する発現ベクターに挿入することができる。当業者に周知の方法を使用して、ＫＨＫポリペプチドをコードする配列、適切な転写及び翻訳制御エレメントを含有する発現ベクターを作成することができる。これらの方法には、ｉｎｖ  ｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組み換えが含まれる。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載されている。
【０２２９】
多様な発現ベクター／宿主系を利用して、ＫＨＫ酵素ポリペプチドをコードする配列を含有及び発現することができる。これらには、組み換えバクテリオファージ、プラスミド若しくはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）若しくは細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉ若しくはｐＢＲ３２２プラスミド）により形質転換された植物細胞系又は動物細胞系等の微生物が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３０】
制御エレメント又は調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写及び翻訳を実施するベクターエンハンサー、プロモーター、５’及び３’未翻訳領域の非翻訳領域である。そのようなエレメントは、強度及び特異性において変わりうる。利用されるベクター系及び宿主系に応じて、構成的及び誘導的プロモーターを含む様々な適切な転写及び翻訳エレメントを使用することができる。例えば、細菌系でクローニングするとき、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホヤ））又はｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のハイブリッドｌａｃＺプロモーター等の誘導性プロモーターを使用することができる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターを昆虫細胞に使用することができる。植物細胞のゲノムから誘導される（例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ及び貯蔵タンパク質遺伝子）又は植物ウイルスから誘導される（例えば、ウイルスプロモーター若しくはリーダー配列）プロモーター又はエンハンサーを、ベクター中にクローニングすることができる。哺乳類細胞系では、哺乳類遺伝子から又は哺乳類ウイルス由来のプロモーターが好ましい。ＫＨＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の複数のコピーを含有する細胞株を生成する必要がある場合、ＳＶ４０又はＥＢＶに基づくベクターを、適切な選択可能マーカーと共に使用することができる。
【０２３１】
宿主細胞
【０２３２】
本発明の特定の実施態様によると、ＫＨＫポリヌクレオチドは、発現、プロセッシング及び／又はスクリーニングのために宿主細胞に挿入する必要がある。宿主細胞株は、挿入配列の発現を調節する又は発現ＫＨＫポリペプチドを所望の様式にプロセスする能力によって選択することができる。ポリペプチドのそのような調節には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化が含まれるが、これらに限定されない。「プレプロ」形態のポリペプチドを切断する翻訳後プロセッシングを使用して、正確な挿入、折り畳み及び／又は機能を促進することもできる。翻訳後活性についての特定の細胞機構及び特徴的機構を有する異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３及びＷ１３８）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ,Ｖａ．２０１１０−２２０９）から入手可能であり、外来タンパク質の正確な修飾及びプロセッシングを確実にするよう選択することができる。
【０２３３】
安定した発現は、組み換えタンパク質の長期高収率産生にとって好ましい。例えば、ＫＨＫポリペプチドを安定して発現する細胞株を、ウイルス複製起点及び／又は内因性発現エレメントを含有し、同じ又は別のベクターに選択可能マーカー遺伝子を含有することができる発現ベクターを使用して、形質転換することができる。ベクターの導入に続いて、選択培地に交換する前に、細胞を濃縮培地で１２日間増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は、選択に抵抗性を付与することであり、その存在は、導入されたＫＨＫ配列をうまく発現する細胞の増殖及び回収を可能にする。安定して形質転換された細胞の抵抗性クローンを、細胞型に適した組織培養技術を使用して繁殖させることができる。例えば、ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６を参照のこと。
【０２３４】
５．１  発現の検出
【０２３５】
ポリペプチドに特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用してＫＨＫポリペプチドの発現を検出及び測定する多様なプロトコールは、当該技術分野で既知である。例として、酵素結合免疫吸着物アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。２ＫＨＫポリペプチドの２つの非相互作用エピトープに反応性のモノクローナル抗体を使用する２部位モノクローナル系イムノアッセイを使用することができる又は競合結合アッセイを使用することができる。これら及び他のアッセイは、Ｈａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＲＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ（ミネソタ州セントポール）１９９０及びＭａｄｄｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８，１２１１１２１６,１９８３に記載されている。
【０２３６】
５．２  ポリペプチドの発現及び精製
【０２３７】
ＫＨＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、タンパク質の発現及び回収に適した条件下で細胞培養により培養することができる。形質転換細胞により産生されるポリペプチドを、使用される配列及び／又はベクターに応じて、細胞内に分泌又は含有させることができる。当業者には周知のように、ＫＨＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを、原核細胞若しくは又は真核細胞の膜を介して可溶性ＫＨＫポリペプチドの分泌を指示する又は膜結合ＫＨＫポリペプチドの膜挿入を指示するシグナル配列を含有するように設計することができる。
【０２３８】
抗体
【０２３９】
抗体が本明細書において参照されており、本発明の多様な態様は、ＫＨＫポリペプチドに特異的な抗体を利用する。上記に記載されているように、治療剤の一例は抗体に関する。当該技術分野で既知の抗体の任意の種類を生成して、ＫＨＫポリペプチドのエピトープに特異的に結合させることができる。本明細書中、「抗体」には、エピトープをＫＨＫポリペプチドに結合することができる無傷の免疫グロブリン分子、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ等、そのフラグメントが含まれる。典型的には、エピトープの形成には少なくとも６、８、１０又は１２個の隣接アミノ酸が必要である。しかし、非隣接アミノ酸を伴うエピトープは、より多く、例えば少なくとも１５、２５又は５０個のアミノ酸を必要することがある。
【０２４０】
ＫＨＫポリペプチドに特異的に結合する抗体は、上記に記述されたように治療的に、並びにウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫沈降又は当該技術分野で既知の他の免疫化学アッセイ等の免疫化学アッセイに使用することができる。多様なイムノアッセイを使用して、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。競合結合又はイムノラジオメトリックアッセイについての多数のプロトコールは、当該技術分野で周知である。そのようなイムノアッセイは、典型的には、免疫原と、免疫原に特異的に結合する抗体との複合体形成の測定を伴う。本発明の実施態様に有用な抗体は、ポリクローナルでありうるが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０２４１】
７．リボザイム
【０２４２】
リボザイムは、ＫＨＫ活性を調節する治療剤として有用な化合物の一部類である。リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡ分子である。例えば、Ｃｅｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６，１５３２１５３９；１９８７；Ｃｅｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，５４３５６８；１９９０，Ｃｅｃｈ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２，６０５６０９；１９９２，Ｃｏｕｔｕｒｅ＆Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２，５１０５１５、１９９６を参照のこと。リボザイムを使用して、ＲＮＡ配列を切断することにより遺伝子機能を阻害することができ、このことは当該技術分野で既知である（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，６４１，６７３号）。リボザイム作用の機構は、相補性標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、続く内因性切断を伴う。例として、特定のヌクレオチド配列の内因性切断を特異的及び効率的に触媒することができる操作ハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が挙げられる。
【０２４３】
したがって、本発明の別の態様は、ＫＨＫポリヌクレオチドのコード配列を使用して、ＫＨＫポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡに特異的に結合するリボザイムを生成することに関する。他のＲＮＡ分子をトランスで高度に配列特異的に切断することができるリボザイムを設計及び作成する方法が開発されており、当該技術分野の文献に記載されている（Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３４，５８５５９１，１９８８を参照のこと）。例えば、リボザイムの切断活性は、リボザイム中に別個の「ハイブリダイゼーション」領域を操作することにより、特定のＲＮＡに標的化することができる。ハイブリダイゼーション領域は、標的ＲＮＡに相補的な配列を含有し、したがって、標的と特異的にハイブリダイズする（例えば、Ｇｅｒｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許第３２１，２０１号を参照のこと）。
【０２４４】
ＫＨＫ  ＲＮＡ標的内の特定のリボザイム切断部位は、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位について標的分子を走査することにより、同定することができる。同定された時点で、標的を操作不能にしうる二次構造的特徴について、切断部位を含有する標的ＲＮＡの領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短ＲＮＡ配列を評価することができる。候補ＫＨＫ  ＲＮＡ標的に適しているものも、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションの接近性を試験することにより、評価することができる。より長い相補配列を使用すれば、標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増すことができる。リボザイムのハイブリダイズ及び切断領域は、相補領域を介して標的ＲＮＡをハイブリダイズすると、リボザイムの触媒領域が標的を切断できるよう、一体的に関連しうる。
【０２４５】
リボザイムは、ＤＮＡ構築物の一部として細胞に導入することができる。マイクロインジェクション、リポソーム仲介形質転換、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿等、機械的な方法を用いて、リボザイム含有ＤＮＡ構築物を、ＫＨＫ発現を減少することが望ましい細胞に導入することができる。あるいは、当該技術分野で既知のように、細胞が安定してＤＮＡ構築物を保持することが望ましい場合、構築物をプラスミドに供給し、別個のエレメントとして維持することができる又は細胞のゲノムに組み込むことができる。リボザイムコードＤＮＡ構築物は、プロモーターエレメント、エンハンサー又はＵＡＳエレメント等の転写調節エレメント及び細胞内のリボザイムの転写を制御する転写終止シグナルを含むことができる。
【０２４６】
Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，６４１，６７３号（その開示内容全体が参考として本明細書で援用される）に教示されているように、標的遺伝子の発現を誘発する要因に反応してリボザイム発現が生じるように、リボザイムを操作することができる。リボザイムを操作して、リボザイムと標的遺伝子の両方が細胞で誘導されたときにのみｍＲＮＡの破壊が生じるよう、追加的な調節レベルを提供することもできる。
【０２４７】
定義、並びに基本的な技術を実施する方法及び手段を含む分子生物学の標準的な教科書が参照され、本発明に包含される。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｌｉｇａ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）及びこれらが援用されている参考文献を参照のこと。
【０２４８】
干渉分子
【０２４９】
ＫＨＫは、例えば、上記に提示されているジェンバンク受入番号に記載されている配列の一部に向けられたｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを介するサイレンシングを含む多くの方法により阻害することができる。ｓｉＲＮＡ分子は、米国特許公報第２００６０１１０４４０号に記載の技術によりの配列番号１及び３の一部に対して調製することができ、治療化合物として使用することができる。ｓｈＲＮＡ構築物は、典型的には、３つの可能な方法；（ｉ）アニールした相補的オリゴヌクレオチド、（ｉｉ）プロモーターに基づいたＰＣＲ又は（ｉｉｉ）プライマー延長のうちの１つにより構築される。ｓｈＲＮＡ発現ベクターを作成する設計及びクローニング戦略については、Ｇｌｅｎ  Ｊ  ＭｃＩｎｔｙｒｅ，Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｃ  ＦａｎｎｉｎｇＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００６，６：１（５  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００６）を参照のこと。
【０２５０】
ｍｉＲＮＡ分子の調製についての背景情報は、例えば、米国特許公報第２０１１００２０８１６号、同第２００７／００９９１９６号；同第２００７／００９９１９３号；同第２００７／０００９９１５号；同第２００６／０１３０１７６号；同第２００５／０２７７１３９号；同第２００５／００７５４９２号；及び同第２００４／００５３４１１号（その開示内容は参考として本明細書で援用される）を参照のこと。また、米国特許第７，０５６，７０４号及び同第７，０７８，１９６号（ｍｉＲＮＡ分子の調製）（参考として本明細書で援用される）を参照のこと。合成ｍｉＲＮＡは、Ｖａｔｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００６  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５８、９８３−６及びＴｓｕｄａ，ｅｔ  ａｌ  ２００５  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２７，１２９９−３０６（参考として本明細書で援用される）に記載されている。
【０２５１】
干渉分子を使用して、治療効果を達成するためにＫＨＫ−Ｃ（ＫＨＫ−Ｃ又はＫＨＫ−Ａ及びＫＨＫ−Ｃ）遺伝子をサイレンシングする作用物質を提供することは、本発明の態様の範囲内である。特定の実施態様において、ヒトＫＨＫ遺伝子のサイレンシングは、上述のＫＨＫ酵素の配列のいずれか又は両方に基づいているべきである。
【０２５２】
ＫＨＫインヒビター化合物
【０２５３】
ＫＨＫ−Ｃを特異的に阻害するように小型分子化合物を生成できることを実証するために、本発明者らは、ＫＨＫ−Ｃの結晶構造の仮想スクリーン（コンピューターによるドッキング実験）を実施し、化合物をＺＩＮＣデータベースから同定した。これは、好ましいドッキングスコアを有し、提案された結合方式の追跡可視検査に基づいてタンパク質との相補的な相互作用を示した。表１に、ＫＨＫ−ＡよりもＫＨＫ−Ｃを優先して阻害することができる幾つかの化合物を示す。例えば、（Ｚ）−３−（メチルチオ）−１−フェニル−Ｎ’−（（（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシイミドアミド［下記の表１の１］は、１０ｕＭでＫＨＫ  Ｃに２５．６％の阻害を示し、１０ｕＭでＫＨＫ  Ａに７．０％の阻害を示す。５−アミノ−３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル［下記の表１の２］は、１００ｕＭでＫＨＫ  Ｃに１６．８％の阻害を示し、１００ｕＭでＫＨＫ  Ａに２９．４％の阻害を示す。２−（３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−フェニルチアゾール［下記の表１の３］は、１０ｕＭでＫＨＫ  Ｃに１９．９％の阻害を示す。
【０２５４】
【表１】
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【０２５５】
本発明の一態様によると、被験者においてＫＨＫ−Ｃ活性を阻害する方法が提供される。この方法は、下記からなる群より選択される有効量の化合物を被験者に投与することを含む。
【０２５６】
（Ｚ）−３−（メチルチオ）−１−フェニル−Ｎ’−（（（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシイミドアミド；
【０２５７】
５−アミノ−３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
【０２５８】
２−（３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−フェニルチアゾール；及び
【０２５９】
これらの組み合わせ
【０２６０】
本発明の別の態様によると、下記からなる群より選択される化合物を含むＫＨＫ−Ｃインヒビターを含む組成物、例えば医薬組成物が提供される。
【０２６１】
（Ｚ）−３−（メチルチオ）−１−フェニル−Ｎ’−（（（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）カルバモイル）オキシ）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシイミドアミド；’
【０２６２】
５−アミノ−３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル；
【０２６３】
２−（３−（メチルチオ）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−フェニルチアゾール；及び
【０２６４】
これらの組み合わせ
【０２６５】
この方法及び組成物を利用して、腎疾患、例えば造影剤の投与、心血管手術、ＩｇＧ投与又は敗血症と関連する急性肝臓障害（ＡＫＩ）、並びに注意欠陥障害、糖渇望、糖耽溺、肥満及びメタボリックシンドロームが含まれるが、これらに限定されない本明細書に記載されている疾患又は目的のいずれかを治療又は予防することができる。加えて、上記の化合物（１〜３）の１つ以上を、本明細書に記載されている１つ以上の連結治療剤と共に投与することができ、組成物も同様に、本明細書に記載されている１つ以上の連結治療剤を更に含むことができる。
【０２６６】
本発明の多様な実施態様が本明細書において示され、記載されているが、そのような実施態様は、例としてのみ提供されていることは明白である。様々な変形例、変更、及び置換を本明細書の発明から逸脱することなく行うことができる。したがって、本発明は添付の請求項の精神及び範囲によってのみ制限されることが意図される。
【０２６７】
参考文献
１．ジョンソン  ＲＪ、ペレズ−ポゾ  ＳＥ、ソーチン  ＹＹ、マニチウス  Ｊ、サンチェス−ロザダ  ＬＧ、フェイグ  ＤＩら、仮説：過剰フルクトース摂取及び尿酸は２型糖尿病を引き起こしうるか？  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ．  ２００９年２月；３０（１）：９６〜１１６
２．スタンホープ  ＫＬ、シュワルツ  ＪＭ、ケイム  ＮＬ、グリフィン  ＳＣ、ブレマー  ＡＡ、グラハム  ＪＬら、グルコース加糖ではなくフルクトース加糖飲料の消費は、過体重／肥満のヒトにおいて内臓脂肪症及び脂質を増加し、インスリン感受性を減少する  臨床研究ジャーナル（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）  ２００９年５月；１１９（５）：１３２２〜３４
３．ナガガワ  Ｔ、フー  Ｈ、ザリコフ  Ｓ、タトル  ＫＲ、ショート  ＲＡ、グルシャコバ  Ｏら、フルクトース誘導性メタボリックシンドロームにおける尿酸の因果的役割  米国生理学ジャーナル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）  ２００６年３月；２９０（３）：Ｆ６２５〜３１
４．ペレズ−ポゾ  ＳＥ、ショルド  Ｊ，ナガガワ  Ｔ、サンチェス−ロザダ  ＬＧ、ジョンソン  ＲＪ、リロ  ＪＬ、過剰フルクトース摂取は健康な成人男性においてメタボリックシンドロームの特徴を誘発する  国際肥満ジャーナル（ロンドン）（Ｊ  Ｏｂｅｓ  （Ｌｏｎｄ））  ２００９年１２月２２日
５．ロニカル  ＣＡ、ロイングジュイ  Ｓ、サンチェス−ロザダ  ＬＧ、ムー  Ｗ、ソーチン  ＹＹ、ナカガワ  Ｔら、カプリルとアロプリノールの組み合わせがフルクトース誘発性メタボリックシンドロームを遅延する  米国腎臓病学ジャーナル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ）  ２００９年８月２１日：３０（５）：３９９〜４０４
６．トラン  ＬＴ、ユエン  ＶＧ、マックネイル  ＪＨ、フルクトース摂取ラット：フルクトース誘発性インスリン抵抗性及び高血圧の機能のレビュー  分子細胞生化学（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）  ２００９年６月１８日
７．シーガル  ＭＳ、ゴラブ  Ｅ、ジョンソン  ＲＪ、フルコース指標は血糖指標よりも心血管疾患に関連が深いか？  欧州栄養学ジャーナル（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）  ２００７年１０月；４６（７）：４０６〜１７
８．シリロ  Ｐ、ゲルシュ  ＭＳ、ムー  Ｗ、シェーレル  ＰＭ、キム  ＫＭ、ジェズアルド  Ｌら、近位尿細管細胞におけるフルクトース誘発性炎症促進性仲介物質のケトヘキソキナーゼ依存性代謝  米国肝臓病学会ジャーナル（Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ）  ２００９年３月；２０（３）：５４５〜５３
９．シャピロ  Ａ、ムー  Ｗ、ロンカル  Ｃ、チェン  ＫＹ、ジョンソン  ＲＪ、スカルペース  ＰＪ、フルクトース誘導性レプチン抵抗性は、後の高脂肪摂取に反応してさらに体重を増加させる  米国生理学ジャーナル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）  ２００８年１１月；２９５（５）：Ｒ１３７０〜５
１０．テフ  ＫＬ、エリオット  ＳＳ、トスコプ  Ｍ、キーファー  ＴＪ、レーダー  Ｄ、ハイマン  Ｍら、食物フルコースは、女性において、循環インスリン及びレプチンを低減し、グレリンの食後抑制を減少し、トリグリセリドを増加する  臨床内分泌学及び代謝ジャーナル（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）  ２００４年６月；８９（６）：２９６３〜７２
１１．チャ  ＳＨ、セキネ  Ｔ、フクシマ  ＪＩ、カナイ  Ｙ、コバヤシ  Ｙ、ゴヤ  Ｔら、腎臓に主に発現するヒト有機アニオントランスポーター３の同定及び特徴決定  分子薬理学（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ）  ２００１年５月：５９（５）：１２７７〜８６
１２．アベナ  ＭＮ、ラダ  Ｐ、ヘベル  ＢＧ、ラットの糖のむちゃ食い  神経科学の現在のプロトコール（Ｓｕｇａｒ  ｂｉｎｇｅｉｎｇ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）／編集委員会、ジャクリーン  Ｎ  クローリーら、２００６年８月；第９章：ユニット９  ２３Ｃ
１３．デアラウジョ  ＩＥ、オリベイラ−マイア  ＡＪ、ソトニコバ  ＴＤ、ガイネトジノブ  ＲＲ、カロン  ＭＧ、ニコレリス  ＭＡら、味覚レセプターシグナル伝達の不在下での褒美の餌  ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）  ２００８年３月２７日；５７（６）：９３０〜４１
１４．パーク  ＳＨ、チョイ  ＨＪ、リー  ＪＨ、ウー  ＣＨ、キム  ＪＨ、ハン  ＨＪ、高グルコースは腎近位尿細管細胞繁殖を阻害し、ＰＫＣ、酸化的ストレス及びＴＧＦ−ベータ１に関与する  腎臓インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）  ２００１年５月；５９（５）：１６９５〜７０５
１５．デアラウジョ  ＩＥ、オリベイラ−マイア  ＡＪ、ソトニコバ  ＴＤ、ガイネトジノブ  ＲＲ、カロン  ＭＧ、ニコレリス  ＭＡら、味覚レセプターシグナル伝達の不在下での褒美の餌  ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）  ２００８年３月２７日；５７（６）：９３０〜４１
１６．シャピロ  Ａ、ムー  Ｗ、ロンカル  Ｃ、チェン  ＫＹ、ジョンソン  ＲＪ、スカルペース  ＰＪ、フルクトース誘導性レプチン抵抗性は、後の高脂肪摂取に反応してさらに体重増加を悪化させる  米国生理学ジャーナル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）  ２００８年１１月；２９５（５）：Ｒ１３７０〜５
１７．シャピロ  Ａ、ツマー  Ｎ、ガオ  Ｙ、チェン  ＫＹ、スカルペース  ＰＪ、高脂肪含有にもかかわらず無糖食により食物誘発性レプチン耐性が防止及び逆転される  英国栄養学ジャーナル（Ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）  ２０１１年３月２２日：１〜８
１８．シリロ  Ｐ、ゲルシュ  ＭＳ、ムー  Ｗ、シェーレル  ＰＭ、キム  ＫＭ、ジェズアルド  Ｌら、近位尿細管細胞におけるフルクトース誘発性前炎症性メディエータのケトヘキソキナーゼ依存性代謝  米国肝臓病学会ジャーナル（Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ）  ２００９年３月；２０（３）：５４５〜５３
１９．ゲルシュ  ＭＳ、ムー  Ｗ、シリロ  Ｐ、ロイングジュイ  Ｓ、チャン  Ｌ、ロニカル  Ｃら、デキストロースではなくフルクトースが慢性腎臓疾患の進行を促進する  米国生理学ジャーナル  ２００７年１０月；２９３（４）：Ｆ１２５６〜６１
２０．ナカヤマ  Ｔ、コスギ  Ｔ、ゲルシュ  Ｍ、コナー  Ｔ、サンチェス−ロザダ  ＬＧ、ラナスパ  ＭＡら、食物フルクトースは正常なラットの腎臓に尿細管間質損傷を引き起こす  米国生理学ジャーナル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）  ２０１０年３月；２９８（３）；Ｆ７１２〜２０
２１．ディグル  ＣＰ、シャイアース  Ｍ、リーチ  Ｄ、ブルック  Ｄ、カー  ＩＭ、マーカム  ＡＦら、ケトヘキソキナーゼ：主なフルクトース代謝酵素の発現及び局在化  組織化学細胞化学ジャーナル（Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ）  ２００９年８月；５７（８）：７６３〜７４
２２．タッピー  Ｌ、レ  ＫＡ、フルクトースの代謝効果及び肥満の世界的な増加  生理学レビュー（Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．）  １月；９０（１）：２３〜４６
２３．ペトラシュ  ＪＭ、全家：アルドースレダクターゼ及び密接に関連するアルド−ケトレダクターゼ  細胞分子生命科学（Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．）  ２００４年４月；６１（７〜８）：７３７〜４９
２４．ギルバート  ＲＥ、クーパー  ＭＥ、糖尿病性腎疾患における尿細管間質：糸球体損傷の結果を越える？腎臓インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）  １９９９年１１月；５６（５）１６２７〜３７
２５．リー  ＨＴ、ジャン  Ｍ、ビー  ＳＥ、ジュ  ＪＤ、ゴウバエバ  ＦＲ、ヤング  Ｊら、Ａ１アデノシンレセプターノックアウトマウスは急性放射線造影剤腎症に対してｉｎ  ｖｉｖｏで保護される  米国生理学ジャーナル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）  ２００６年６月；２９０（６）：Ｆ１３６７〜７５
２６．アデルマン  ＲＣ、バラード  ＦＪ、ワインハウス  Ｓ、ラット肝臓フルクトキナーゼの精製及び特性  生物化学ジャーナル（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．）  １９６７；２４２：（１４）：３３６０〜５
２７．アシプ  Ａ、ヘイワード  ＢＥ、オーレイリー  Ｊ、ボントロン  ＤＴ、正常及び突然変異組み換えヒトケトヘキソキナーゼの本態性果糖尿症の病因への適用および結果  糖尿病（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）  ２００３；５２（９）：２４２６〜３２
２８．サンチェス  ＪＪ、ゴンザレス  ＮＳ、ポンティス  ＨＧ、ラット肝臓のフルクトキナーゼ  Ｉ．精製及び特性  生化学生物物理学会報（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ）  １９７１；２２７（１）：６７〜７８
特許及びそれに引用されている特許関連文書を含む参考文献の教示は、本明細書の教示と一致しない程度でその開示内容全体が参考として本明細書で援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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