(57)【要約】  本開示は、タウ関連性の神経学的障害の治療において用いるための、好ましくは免疫原性担体に連結した、抗原性タウペプチドを包含する免疫原および組成物に関する。本開示はさらに、これらの免疫原および組成物を生産するための方法、ならびに医薬品におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性担体に連結した抗原性タウペプチドを包含する免疫原であって、前記抗原性タウペプチドが、配列番号４、６〜２６、１０５および１０８〜１１２から選択されるアミノ酸配列を包含し、前記抗原性タウペプチドが、式（Ｇ）ｎＣによって表されるリンカーによって、前記免疫原性担体に共有結合によって連結しており、前記リンカーが、前記ペプチドのＣ末端（ペプチド−（Ｇ）ｎＣ）またはＮ末端（Ｃ（Ｇ）ｎ−ペプチド）にあり、ｎが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である免疫原。
【請求項２】
前記抗原性タウペプチドが、配列番号４および６〜１３から選択されるアミノ酸配列を包含する、請求項１に記載の免疫原。
【請求項３】
前記抗原性タウペプチドが、配列番号１１で示されるアミノ酸配列から構成される、請求項２に記載の免疫原。
【請求項４】
前記抗原性タウペプチドが、配列番号１４〜１９から選択されるアミノ酸配列を包含する、請求項１に記載の免疫原。
【請求項５】
前記抗原性タウペプチドが、配列番号１６で示されるアミノ酸配列から構成される、請求項４に記載の免疫原。
【請求項６】
前記抗原性タウペプチドが、配列番号２０〜２４から選択されるアミノ酸配列を包含する、請求項１に記載の免疫原。
【請求項７】
前記抗原性タウペプチドが、配列番号２１で示されるアミノ酸配列から構成される、請求項６に記載の免疫原。
【請求項８】
前記抗原性タウペプチドが、配列番号１０５および１０８〜１１２から選択されるアミノ酸配列を包含する、請求項１に記載の免疫原。
【請求項９】
前記抗原性タウペプチドが、配列番号１０５で示されるアミノ酸配列から構成される、請求項８に記載の免疫原。
【請求項１０】
前記免疫原性担体が、ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰ、ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ、およびＱｂｅｔａ  ＶＬＰから構成される群から選択されるウイルス様粒子である、請求項１から９のいずれか一項に記載の免疫原。
【請求項１１】
免疫原性担体に連結した抗原性タウペプチドをそれぞれ包含する少なくとも２つの免疫原を包含する組成物であって、
ａ）第１の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号４および６〜１３から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｂ）第２の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１４〜１９から選択されるアミノ酸配列から構成される
組成物。
【請求項１２】
免疫原性担体に連結した抗原性タウペプチドをそれぞれ包含する少なくとも２つの免疫原を包含する組成物であって、
ａ）第１の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号４および６〜１３から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｂ）第２の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号２０〜２４から選択されるアミノ酸配列から構成される
組成物。
【請求項１３】
免疫原性担体に連結した抗原性タウペプチドをそれぞれ包含する少なくとも２つの免疫原を包含する組成物であって、
ａ）第１の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１４〜１９から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｂ）第２の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号２０〜２４から選択されるアミノ酸配列から構成される
組成物。
【請求項１４】
免疫原性担体に連結した抗原性タウペプチドをそれぞれ包含する少なくとも２つの免疫原を包含する組成物であって、
ａ）第１の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号４および６〜１３から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｂ）第２の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１０５および１０８〜１１２から選択されるアミノ酸配列から構成される
組成物。
【請求項１５】
免疫原性担体に連結した抗原性タウペプチドをそれぞれ包含する少なくとも２つの免疫原を包含する組成物であって、
ａ）第１の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１４〜１９から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｂ）第２の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１０５および１０８〜１１２から選択されるアミノ酸配列から構成される
組成物。
【請求項１６】
免疫原性担体に連結した抗原性タウペプチドをそれぞれ包含する少なくとも２つの免疫原を包含する組成物であって、
ａ）第１の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号２０〜２４から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｂ）第２の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１０５および１０８〜１１２から選択されるアミノ酸配列から構成される
組成物。
【請求項１７】
第１の免疫原、第２の免疫原、第３の免疫原、および第４の免疫原から構成される群から選択される少なくとも３つの免疫原を包含する組成物であって、第１の免疫原、第２の免疫原、第３の免疫原、および第４の免疫原のそれぞれが、免疫原性担体に連結した抗原性タウペプチドを包含し、
ａ）第１の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号４および６〜１３から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｂ）第２の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１４〜１９から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｃ）第３の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号２０〜２４から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｄ）第４の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１０５および１０８〜１１２から選択されるアミノ酸配列から構成される
組成物。
【請求項１８】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の免疫原または請求項１１から１７のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容できる賦形剤とを包含する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、アルツハイマー病および軽度認知障害などの、タウ関連性の神経学的障害または症状を治療するための、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）などの免疫原性担体に連結した抗原性タウペプチドを包含する、免疫原、免疫原性組成物、および医薬組成物に関する。本開示はさらに、これらの免疫原、免疫原性組成物、および医薬組成物を生産する方法、ならびに医薬品におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー認知症またはＡＤとも呼ばれるアルツハイマー病は、記憶力低下および重度の知能低下を生じさせる進行性の神経変性障害または症状である。ＡＤは、認知症の最も一般的な形態であり、全ての認知症の半分超を占める。世界中で２６００万人を超える人がＡＤの影響に苦しんでいると推定され、この数は、集団が高齢化するにつれて、２０５０年までに４倍になると予想されている（Ｂｒｏｏｋｍｅｙｅｒら、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ＆  Ｄｅｍｅｎｔｉａ３：１８６〜１９１（２００７））。人命の損失および生活の質の低減に加え、平均的なＡＤ患者が診断後に８から１０年間生存し、高いレベルの日常的な介護を必要とすることを考慮すると、社会にとっての経済的損失は莫大である。早期に、わずかな記憶力低下および混乱を訴える患者は、軽度認知障害（ＭＣＩ）に罹患していると特徴付けられ、これは、一部の場合には、アルツハイマー病の典型的な症候まで進み、知的能力および社会的能力の重度の障害をもたらす。
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、典型的には、脳における老人斑および神経原線維変化の蓄積によって特徴付けされ、この蓄積によって、神経細胞が死滅し、その後、進行性の認知低下が生じる。現在利用可能なＡＤ治療法のほとんどは、症候を治療することに焦点を置いているが、疾患の進行を必ずしも止めるわけではない。したがって、ＡＤの衰弱させる影響からニューロンを防御することができる治療法を特定するために、新たなアプローチが望まれていることは明らかである。
【０００４】
ＡＤを治療するための最新の治療的アプローチは、広く認められている「アミロイドカスケード仮説」に基づくものである。この概念は、病態生理学的役割が、モノマー形態からオリゴマー形態の、神経毒およびシナプス毒としてのアミロイド−β（Ａβ）に帰するものであるとみなし、前記アミロイド−βはまた、アミロイド斑においてはポリマーとして堆積し、これは、ＡＤ病理の特性の１つである。Ａβ形態の全範囲に対するモノクローナル抗体は、脳−血液平衡を血液側に移動させ、それによって脳のＡβ蓄積量を激減させるため、有効であると考えられる。
【０００５】
ＡＤの病態生理学は、単に老齢斑へのＡβの堆積によって特徴付けされるだけではなく、神経原線維変化（ＮＦＴ）の蓄積も含む。ＮＦＴは、高リン酸化型タウタンパク質と共に連結している対合したらせん状フィラメントによって形成されている原線維である。タウは、３０を超える異なるセリン残基およびスレオニン残基（Ｈａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１：２４６５〜２４７６（１９９８））ならびにいくつかのチロシン残基（Ｌｅｂｏｕｖｉｅｒら、ＪＡＤ  １８：１〜９（２００９））で、様々なキナーゼによって一時的にリン酸化され得る。ＡＤにおいて、キナーゼ活性とホスファターゼ活性との間には明らかに不均衡があり、その結果、ＮＦＴとして凝集および蓄積する高リン酸化形態のタウタンパク質が生じる。
【０００６】
軽度認知障害（ＭＣＩ）は、最も一般的には、加齢で通常予想されるものを超えた、無視しがたい記憶障害を有するが、認知症またはＡＤの他の症候はまだ示していないものとして定義される。ＭＣＩは、通常の加齢に伴う認知上の変化と初期の認知症との間の一時的な状態であると考えられる。記憶力の低下が主な症候である場合、このタイプのＭＣＩは、健忘性ＭＣＩとしてさらに下位定義される。このサブタイプのＭＣＩを有する個体は、１年につきおよそ１０〜１５％の速度でＡＤを進行する可能性が最も高い（Ｇｒｕｎｄｍａｎ  Ｍら、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．６１、５９〜６６、２００４）。２００５年に発表された大規模な研究が、ＭＣＩ患者の治療が試験の１年目の間にＡＤへの移行を遅延させ得ることを実証するための最初の臨床試験であり（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＲＣら、ＮＥＪＭ  ３５２、２３７９〜２３８８、２００５）、このことは、これらの患者がまた、ＡＤへの治療的介入にとっての有望な集団であることを示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
近年の研究は、病理学的タウの神経原線維変化マウスモデルにおける、リン酸化型タウペプチドに対するワクチン接種が、脳において凝集したタウを低減させ、神経原線維変化に関連する行動障害を改善させることを報告した（Ａｓｕｎｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７：９１１５〜９１２９（２００７））。認知の低下およびＡＤの進行に対する高リン酸化型タウおよびＮＦＴの影響は完全には理解されていないが、近年の見解では、アミロイドのみを標的化することは、疾患の過程で改善を見るためには十分ではなく、さらなるまたは別の標的化が必要となることが示唆されている（Ｏｄｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：３９４１３（２００６））。これを考慮して、タウタンパク質の疾患性立体構造を標的化する能動ワクチンアプローチが、ＡＤおよびＭＣＩのための有効な治療用ワクチンを生成するために必要であり得る。
【０００８】
さらに、関係する病理学的形態を特異的に標的化するタウワクチンが潜在的に有利であり得る、タウ病理すなわち「タウオパチー」に同様に関連する、ＡＤおよびＭＣＩ以外の多くの疾患がある。これらの疾患には、いくつかを挙げると、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、ピック病、進行性核上性麻痺、および筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズム認知症複合症が含まれる（例えば、Ｓｐｉｒｅｓ−Ｊｏｎｅｓら、ＴＩＮＳ  ３２：１５０〜９（２００９）を参照されたい）。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、免疫応答、特に抗体応答を誘発して、病理学的な高リン酸化状態にある自己抗原タウに対する抗体力価をもたらし得る、少なくとも１つの抗原性タウペプチドを包含する、新規な免疫原、免疫原性組成物、および医薬組成物を提供する。このような免疫原、免疫原性組成物、および医薬組成物は、アルツハイマー病およびＭＣＩなどの高リン酸化型タウ関連性の神経変性疾患の誘発および発症に対する治療的効果を有する、免疫応答、特に抗体応答を誘発する能力などの、多くの望ましい特性を示す。
【００１０】
１つの態様において、本開示は、免疫原性担体に連結した少なくとも１つの抗原性タウペプチドを包含する免疫原であって、前記抗原性タウペプチドが、ｐＳｅｒ−３９６リン酸化タウエピトープ、ｐＴｈｒ−２３１／ｐＳｅｒ−２３５リン酸化タウエピトープ、ｐＴｈｒ−２３１リン酸化タウエピトープ、ｐＳｅｒ−２３５リン酸化タウエピトープ、ｐＴｈｒ−２１２／ｐＳｅｒ−２１４リン酸化タウエピトープ、ｐＳｅｒ−２０２／ｐＴｈｒ−２０５リン酸化タウエピトープから選択される、リン酸化タウエピトープを包含する免疫原を提供する。
【００１１】
１つの例において、前記リン酸化タウエピトープは、ｐＳｅｒ−３９６リン酸化タウエピトープである。さらなる例において、前記リン酸化タウエピトープは、ｐＴｈｒ−２３１／ｐＳｅｒ−２３５リン酸化タウエピトープである。さらなる例において、前記リン酸化タウエピトープは、ｐＴｈｒ−２３１リン酸化タウエピトープである。さらなる例において、前記リン酸化タウエピトープは、ｐＳｅｒ−２３５リン酸化タウエピトープである。さらなる例において、前記リン酸化タウエピトープは、ｐＴｈｒ−２１２／ｐＳｅｒ−２１４リン酸化タウエピトープである。さらなる例において、前記リン酸化タウエピトープは、ｐＳｅｒ−２０２／ｐＴｈｒ−２０５リン酸化タウエピトープである。さらなる例において、前記リン酸化タウエピトープは、ｐＴｙｒ１８リン酸化タウエピトープである。
【００１２】
別の態様において、本開示は、免疫原性担体に連結した少なくとも１つの抗原性タウペプチドを包含する免疫原であって、前記抗原性タウペプチドが、配列番号４、６〜２６、１０５、および１０８〜１１２から選択されるアミノ酸配列を包含する免疫原を提供する。
【００１３】
１つの例において、前記抗原性タウペプチドは、式（Ｇ）ｎＣによって表されるリンカーによって、前記免疫原性担体に共有結合によって連結しており、前記リンカーは、前記ペプチドのＣ末端（ペプチド−（Ｇ）ｎＣ）またはＮ末端（Ｃ（Ｇ）ｎ−ペプチド）にあり、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。さらなる例において、前記リンカーは、前記タウペプチドのＮ末端にあり、ｎは１または２である。別の例において、前記リンカーは、前記タウペプチドのＣ末端にあり、ｎは１または２である。さらなる例において、前記抗原性タウペプチドは、配列番号４および６〜１３から選択されるアミノ酸配列を包含する。さらなる例において、前記抗原性タウペプチドは、配列番号４および６〜１３から選択されるアミノ酸配列から構成される。さらなる例において、前記抗原性タウペプチドは、配列番号１１で示されるアミノ酸配列から構成される。
【００１４】
別の例において、前記抗原性タウペプチドは、配列番号１４〜１９から選択されるアミノ酸配列を包含する。さらなる例において、前記抗原性タウペプチドは、配列番号１４〜１９から選択されるアミノ酸配列から構成される。さらなる例において、前記抗原性タウペプチドは、配列番号１６で示されるアミノ酸配列から構成される。
【００１５】
別の例において、前記抗原性タウペプチドは、配列番号２０〜２４から選択されるアミノ酸配列を包含する。さらなる例において、前記抗原性タウペプチドは、配列番号２０〜２４から選択されるアミノ酸配列から構成される。さらなる例において、前記抗原性タウペプチドは、配列番号２１で示されるアミノ酸配列から構成される。
【００１６】
別の例において、前記抗原性タウペプチドは、配列番号１０５および１０８〜１１２から選択されるアミノ酸配列を包含する。さらなる例において、前記抗原性タウペプチドは、配列番号１０５および１０８〜１１２から選択されるアミノ酸配列から構成される。さらなる例において、前記抗原性タウペプチドは、配列番号１０５で示されるアミノ酸配列から構成される。
【００１７】
１つの態様において、本開示は、前記免疫原性担体が、ヘモシアニン（ＫＬＨなど）、血清アルブミン、グロブリン、回虫から抽出されたタンパク質、または不活化された細菌毒素である、本明細書において記載される免疫原のいずれかを提供する。
【００１８】
１つの態様において、本開示は、前記免疫原性担体が、ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰ、ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ、およびＱｂｅｔａ  ＶＬＰから構成される群から選択されるウイルス様粒子である、本明細書において記載される免疫原のいずれかを提供する。１つの例において、本開示は、本明細書において開示される少なくとも２つの免疫原を包含する組成物を提供する。さらなる例において、組成物は、本明細書において記載される少なくとも３つの免疫原を包含する。
【００１９】
１つの例において、本開示は、本明細書において記載される少なくとも２つの免疫原を包含する組成物であって、
ａ）第１の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号４および６〜１３から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｂ）第２の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１４〜１９から選択されるアミノ酸配列から構成される
組成物を提供する。
【００２０】
別の例において、本開示は、本明細書において記載される少なくとも２つの免疫原を包含する組成物であって、
ａ）第１の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号４および６〜１３から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｂ）第２の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号２０〜２４から選択されるアミノ酸配列から構成される
組成物を提供する。
【００２１】
別の例において、本開示は、本明細書において記載される少なくとも２つの免疫原を包含する組成物であって、
ａ）第１の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１４〜１９から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｂ）第２の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号２０〜２４から選択されるアミノ酸配列から構成される
組成物を提供する。
【００２２】
さらなる例において、本開示は、本明細書において記載される少なくとも２つの免疫原を包含する組成物であって、
ａ）第１の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号４および６〜１３から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｂ）第２の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１０５および１０８〜１１２から選択されるアミノ酸配列から構成される
組成物を提供する。
【００２３】
さらなる例において、本開示は、本明細書において記載される少なくとも２つの免疫原を包含する組成物であって、
ａ）第１の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１４〜１９から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｂ）第２の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１０５および１０８〜１１２から選択されるアミノ酸配列から構成される
組成物を提供する。
【００２４】
さらなる例において、本開示は、本明細書において記載される少なくとも２つの免疫原を包含する組成物であって、
ａ）第１の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号２０〜２４から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｂ）第２の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１０５および１０８〜１１２から選択されるアミノ酸配列から構成される
組成物を提供する。
【００２５】
別の例において、本開示は、本明細書において記載される４つの免疫原のうち少なくとも３つを包含する組成物であって、
ａ）第１の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号４および６〜１３から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｂ）第２の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１４〜１９から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｃ）第３の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号２０〜２４から選択されるアミノ酸配列から構成され、
ｄ）第４の免疫原の抗原性タウペプチドが、配列番号１０５および１０８〜１１２から選択されるアミノ酸配列から構成される
組成物を提供する。
【００２６】
さらなる例において、本開示は、前記抗原性タウタンパク質のそれぞれが、独立して、式（Ｇ）ｎＣによって表されるリンカーによって、前記免疫原性担体に共有結合によって連結しており、前記リンカーのそれぞれが、独立して、前記タウペプチドのＣ末端（ペプチド−（Ｇ）ｎＣ）またはＮ末端（Ｃ（Ｇ）ｎ−ペプチド）にあり、各ｎが、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、本明細書において記載される組成物のいずれかを提供する。さらなる例において、本開示は、前記リンカーのそれぞれが、タウペプチドのＮ末端にあり、各ｎが、独立して、１または２である、本明細書において記載される組成物のいずれかを提供する。
【００２７】
別の態様において、本開示は、４つの免疫原のうち少なくとも３つを包含する組成物であって、
ａ）第１の免疫原が、Ｑｂｅｔａ  ＶＬＰに連結した少なくとも１つの抗原性タウペプチドを包含し、前記抗原性タウペプチドが配列番号１１から構成され、前記ペプチドが、式（Ｇ）ｎＣによって表されるリンカーによって、前記ＶＬＰに共有結合によって連結しており、前記リンカーが、前記タウペプチドのＣ末端（ペプチド−（Ｇ）ｎＣ）またはＮ末端（Ｃ（Ｇ）ｎ−ペプチド）にあり、ｎが１または２であり、
ｂ）第２の免疫原が、Ｑｂｅｔａ  ＶＬＰに連結した少なくとも１つの抗原性タウペプチドを包含し、前記抗原性タウペプチドが配列番号１６から構成され、前記ペプチドが、式（Ｇ）ｎＣによって表されるリンカーによって、前記ＶＬＰに共有結合によって連結しており、前記リンカーが、前記タウペプチドのＣ末端（ペプチド−（Ｇ）ｎＣ）またはＮ末端（Ｃ（Ｇ）ｎ−ペプチド）にあり、ｎが１または２であり、
ｃ）第３の免疫原が、Ｑｂｅｔａ  ＶＬＰに連結した少なくとも１つの抗原性タウペプチドを包含し、前記抗原性タウペプチドが配列番号２１から構成され、前記ペプチドが、式（Ｇ）ｎＣによって表されるリンカーによって、前記ＶＬＰに共有結合によって連結しており、前記リンカーが、前記タウペプチドのＣ末端（ペプチド−（Ｇ）ｎＣ）またはＮ末端（Ｃ（Ｇ）ｎ−ペプチド）にあり、ｎが１または２であり、
ｄ）第４の免疫原が、Ｑｂｅｔａ  ＶＬＰに連結した少なくとも１つの抗原性タウペプチドを包含し、前記抗原性タウペプチドが配列番号１０５から構成され、前記ペプチドが、式（Ｇ）ｎＣによって表されるリンカーによって、前記ＶＬＰに共有結合によって連結しており、前記リンカーが、前記タウペプチドのＣ末端（ペプチド−（Ｇ）ｎＣ）またはＮ末端（Ｃ（Ｇ）ｎ−ペプチド）にあり、ｎが１または２である
組成物を提供する。
【００２８】
１つの例において、第１、第２、および第３の免疫原のリンカーのそれぞれは、各抗原性タウペプチドのＮ末端にあり、前記リンカーのそれぞれについて、ｎは２である。
【００２９】
別の態様において、本開示は、アラム、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、およびサポニンベースのアジュバントから選択される少なくとも１つのアジュバントをさらに包含する、本明細書において記載される免疫原または組成物のいずれかを包含する組成物を提供する。
【００３０】
さらなる態様において、本開示は、本明細書において記載される免疫原または組成物のいずれかと薬学的に許容できる賦形剤とを包含する医薬組成物を提供する。１つの例において、少なくとも１つのアジュバントは、ＣｐＧ７９０９（配列番号２７）、ＣｐＧ１０１０３（配列番号２８）、およびＣｐＧ２４５５５（配列番号２９）から選択される、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。
【００３１】
さらなる態様において、本開示は、本明細書において記載される免疫原または組成物のいずれかと薬学的に許容できる賦形剤とを包含する医薬組成物を提供する。
【００３２】
別の態様において、本開示は、本明細書において記載される免疫原、組成物、または医薬組成物のいずれかを哺乳動物に投与するステップを包含する免疫化方法を提供する。例えば、１つの態様において、このような投与は、薬学的に有効な用量の、本明細書において記載される免疫原、組成物、または医薬組成物のいずれかを用いることによって行われる。
【００３３】
別の態様において、本開示は、治療上有効な量の、本明細書において記載される免疫原、免疫原組成物、または医薬組成物のいずれかを哺乳動物に投与するステップを包含する、前記哺乳動物におけるタウ関連性の神経学的障害を治療する方法を提供する。
【００３４】
１つの態様において、このような投与は、薬学的に有効な用量の、本明細書において記載される免疫原、組成物、または医薬組成物のいずれかを用いることによって行われる。
【００３５】
別の態様において、本開示は、ａ）薬学的に有効な量の、本明細書において記載される免疫原、免疫原組成物、または医薬組成物のいずれか、およびｂ）薬学的に有効な用量の、少なくとも１つのアジュバントを哺乳動物に投与するステップを包含する、前記哺乳動物におけるタウ関連性の神経学的障害を治療する方法を提供する。１つの例において、少なくとも１つのアジュバントは、アラム、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、およびサポニンベースのアジュバントから選択される。さらなる例において、少なくとも１つのアジュバントは、ＣｐＧ７９０９（配列番号２７）、ＣｐＧ１０１０３（配列番号２８）、およびＣｐＧ２４５５５（配列番号２９）から選択されるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。
【００３６】
さらなる例において、前記神経学的障害はアルツハイマー病である。別の例において、前記神経学的障害は、軽度認知障害として診断される。別の例において、前記神経学的障害は、健忘性ＭＣＩとして診断される。
【００３７】
別の例において、本開示は、薬剤を製造するための、本明細書において記載される免疫原、組成物、または医薬組成物のいずれかの使用を提供する。例えば、１つの態様において、このような薬剤は、哺乳動物におけるタウ関連性の神経学的障害を治療するために用いることができる。１つの例において、前記神経学的障害はアルツハイマー病である。別の例において、前記神経学的障害は、軽度認知障害（ＭＣＩ）として診断される。別の例において、前記神経学的障害は、健忘性ＭＣＩとして診断される。
【００３８】
さらなる態様において、本開示は、本明細書において記載される免疫化方法のいずれかに応答して生産される、単離された抗体であって、高リン酸化形態のヒトタウに特異的に結合する抗体を提供する。
【００３９】
さらなる態様において、本開示は、高リン酸化形態のヒトタウに特異的に結合する抗体を哺乳動物に投与するステップを包含する、前記哺乳動物におけるタウ関連性の神経学的障害を治療する方法であって、前記抗体が、本明細書において記載される免疫化方法のいずれかに応答して生産される方法を提供する。
【００４０】
さらなる態様において、本開示は、哺乳動物におけるタウ関連性の神経学的障害を治療するための薬剤の製造のための、本明細書において記載される抗体のいずれかの使用を提供する。１つの例において、前記神経学的障害はアルツハイマー病である。別の例において、前記神経学的障害は、軽度認知障害（ＭＣＩ）として診断される。別の例において、前記神経学的障害は、健忘性ＭＣＩとして診断される。
【００４１】
さらなる態様において、本開示は、配列番号４、６から２６、３１から７６、および１０５から１１２から選択されるアミノ酸配列から構成されるかまたは前記アミノ酸配列から基本的に構成される、単離されたペプチドを提供する。さらなる態様において、本開示は、前記単離されたペプチドのいずれかをコードする単離された核酸を提供する。さらなる態様において、本開示は、前記核酸のいずれかを包含する発現ベクターを提供する。さらなる態様において、本開示は、前記発現ベクターのいずれかを包含する宿主細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、実施例５において記載される、皮下で免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウス群の説明と、力価および選択性の結果とを示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、３００μｇのペプチド、１００μｇのペプチド−ＫＬＨ、または１００μｇのペプチド−ＶＬＰで、皮下で免疫化した。記載されている場合、５０μＬのＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をアジュバントとして用いた。抗原特異的力価決定アッセイ（実施例１３を参照されたい）において試験した血清希釈は、１：３０から１：７，２９０の範囲であった。
【図２】実施例５において記載される、免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウス群の説明と、力価の結果とを示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、皮下で免疫化した。記載されている場合、５０μＬのＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄをアジュバントとして用いた。抗原特異的力価決定アッセイ（実施例１３を参照されたい）において試験した血清希釈は、１：９００から１：１，９６８，３００の範囲であった。
【図３】実施例６においてさらに記載される、皮下で免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスの説明を示す図である。１００μｇのペプチドを初回免疫に用い、１００μｇのペプチド−ＶＬＰを追加免疫に用いた。記載されている場合、７５０μｇのアラム（Ａｌ（ＯＨ）３）をアジュバントとして用いた。抗原特異的力価決定アッセイ（実施例１３を参照されたい）において試験した血清希釈は、１：８００から１：１，７５０，０００の範囲であった。ＮＤは、決定されていないことを意味する。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃは、実施例７において記載される、筋肉内で免疫化されたＴＧ４５１０＋＋マウスの結果を示す図である。図４Ａは、群１から７についての力価の結果を示し、図４Ｂは、群８から１７についての力価の結果を示す。図４Ｃは、群１から６についての選択性の結果を示す。ＣＰＧはＣｐＧ−２４５５５である。アラムはＡｌ（ＯＨ）３である。抗原特異的力価決定アッセイ（実施例１３を参照されたい）において試験した血清希釈は、１：５，０００から１：１５，８００，０００の範囲であった。ＮＤは、決定されていないことを意味する。
【図５】実施例８において記載される、免疫化されたマウスの説明を示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、筋肉内（ＩＭ）経路または皮下（ＳＣ）経路を介して免疫化した。記載されている場合、９０μｇのペプチド−ＶＬＰを用いた。記載されている場合、１，５９５μｇのアラム（Ａｌ（ＯＨ）３）、２０μｇのＣｐＧ−２４５５５、および１２μｇのＡＢＩＳＣＯ−１００を用いた。抗原特異的力価決定アッセイ（実施例１３を参照されたい）において試験した血清希釈は、１：５，０００から１：１５，８００，０００の範囲であった。検量線の検出の下限は、０．００２５ｍｇ／ｍＬであった。ＮＡは、該当なしであることを意味する。
【図６】実施例１１において記載される、免疫化されたマウスの説明を示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、筋肉内で免疫化した。１００μｇのペプチド−ＶＬＰを用いた。記載されている場合、２５２（７５０）μｇのアラム（Ａｌ（ＯＨ）３）を用いた。抗原特異的力価決定アッセイ（実施例１３を参照されたい）において試験した血清希釈は、１：５００から１：２，７２０，０００の範囲であった。ＮＤは、決定されていないことを意味する。
【図７】実施例１１において記載される、免疫化されたマウスの説明を示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、筋肉内で免疫化した。７５０μｇのアラム（Ａｌ（ＯＨ）３）をアジュバントとして用いた。抗原特異的力価決定アッセイ（実施例１３を参照されたい）において試験した血清希釈は、１：５００から１：１５，８００，０００の範囲であった。
【図８】実施例１２において記載される、免疫化されたマウスの説明を示す図である。ＴＧ４５１０−／−（野生型同腹子）マウスを、筋肉内で免疫化した。記載されている場合、１００μｇの各ペプチド−ＶＬＰを、０日目の初回免疫および１４日目の追加免疫に用いた。記載された量のアラム（Ａｌ（ＯＨ）３）を用いた。「未処理」群の血清をプールした。抗原特異的力価決定アッセイ（実施例１３を参照されたい）において試験した血清希釈は、１：５，０００から１：１５，８００，０００の範囲であった。
【図９】実施例１２において記載される、免疫化されたマウスの説明を示す図である。ＴＧ４５１０−／−（野生型同腹子）マウスを、筋肉内で免疫化した。１００μｇの各ペプチド−ＶＬＰを、０日目の初回免疫および１４日目の追加免疫に用いた。アラムなし、または５０４μｇのアラム（Ａｌ（ＯＨ）３）を用いた。脾臓を２１日目に回収した。インターフェロンγＴ細胞ＥＬＩｓｐｏｔによって測定した、５×１０５個の脾臓細胞当たりのスポットの数を示す（図１４を参照されたい）。結果は、３つの脾臓のものである。ペプチドＨＢＶ−１（配列番号７７）は、無関係のペプチドであった。ＢＳＡは無関係のタンパク質であった。ＮＤは、決定されていないことを示す。＊は、必要に応じて、無関係のペプチドまたはタンパク質と対比してｐ＜０．０５であることを示す。
【図１０】ヒトタウアイソフォーム２のアミノ酸配列、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５９０１（配列番号３０）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
定義および一般技術
本明細書において別段の定義がない限り、本開示に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。全体として、本明細書において記載される、細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学、ハイブリダイゼーション、分析化学、合成有機化学、ならびに医化学および薬化学に関連して用いられる命名、およびそれらの技術は、当技術分野において周知であり一般に用いられているものである。
【００４４】
本開示の方法および技術は、通常、別段の指示がない限り、当技術分野において周知の、ならびに本明細書の全体にわたって引用および議論される様々な一般的な参考文献およびさらに具体的な参考文献において記載されている、従来の方法に従って行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、当技術分野において一般に行われるように、または本明細書において実現されるように、製造者の仕様書に従って行われる。
【００４５】
本明細書において用いられる「軽度認知障害（ＭＣＩ）」は、記憶障害および認知障害のカテゴリーであって、０．５という臨床的認知症尺度（ＣＤＲ）（例えば、Ｈｕｇｈｅｓら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．１４０：５６６〜５７２、１９８２を参照されたい）によって典型的に特徴付けされ、記憶障害によってさらに特徴付けされるが、他の認知領域における機能の障害によっては特徴付けされないカテゴリーを言う。記憶障害は、好ましくは、「パラグラフ試験」などの試験を用いて測定される。軽度認知障害と診断される患者は、遅延再生能力の障害を示すことが多い。軽度認知障害は、典型的には、加齢と関連し、通常、４５歳以上の患者において生じる。
【００４６】
本明細書において用いられる「認知症」という用語は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、第４版、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９９４（「ＤＳＭ−ＩＶ」）において定義されているような、最も広い意味での精神的症状を言う。ＤＳＭ−ＩＶは、「認知症」を、記憶の障害を含む複数の認知障害によって特徴付けされると定義しており、様々な認知症を、推定される病因に従って列挙している。ＤＳＭ−ＩＶは、認知症および関連する精神障害のこのような診断、カテゴリー化、および治療についての、一般に認められている標準を説明している。
【００４７】
「タウ」または「タウタンパク質」という用語は、神経細胞における微小管の安定化に関連し、広範なタウ凝集体の、例えば神経原線維変化の一成分である、タウタンパク質を言う。特に、本明細書において用いられる「タウタンパク質」という用語は、配列番号３０のヒトタウ、または修飾を有するかもしくは有さない他のヒトアイソフォーム、または任意の他の動物から得られる対応するオルソログを包含するかまたはこれらから構成される、任意のポリペプチドを包含する。本明細書において用いられる「タウタンパク質」という用語はさらに、限定はしないが、上記に定義されたタウタンパク質のグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化を含む、翻訳後修飾を包含する。
【００４８】
「タウオパチー」という用語は、タウ関連性の障害または症状、例えば、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病、１７番染色体に関連する前頭側頭型認知症およびパーキンソニズム（ＦＴＤＰ−１７）、パーキンソン病、脳卒中、外傷性の脳損傷、軽度認知障害などを言う。
【００４９】
「抗原」および「免疫原」という用語は、本明細書において用いられる場合はほぼ同じ意味であり、ＭＨＣ分子によって提示された場合に、抗体、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって結合され得る分子を言う。本明細書において用いられる「抗原」および「免疫原」という用語はまた、Ｔ細胞エピトープを包含する。抗原はさらに、免疫系によって認識され得、かつ／または液性免疫応答および／もしくは細胞性免疫応答を誘発して、Ｂリンパ球および／もしくはＴリンパ球の活性化をもたらし得る。しかし、このためには、少なくともいくつかのケースにおいて、抗原がヘルパーＴ細胞エピトープを含有しているかまたはそれに連結しており、アジュバントを与えられていることが必要であり得る。抗原は、１つまたは複数のエピトープ（例えば、ＢエピトープおよびＴエピトープ）を有し得る。上記で言及された特異的反応は、抗原が、典型的には高度に選択的に、その対応する抗体またはＴＣＲと好ましくは反応し、他の抗原によって引き起こされ得る多数の他の抗体またはＴＣＲとは反応しないことを示すものである。本明細書において用いられる抗原はまた、いくつかの個別の抗原の混合物であってもよい。「抗原」および「免疫原」という用語は両方とも、限定はしないがポリペプチドを包含する。
【００５０】
「抗原性部位」という用語および「抗原性エピトープ」という用語は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いられ、ＭＨＣ分子という脈絡において抗体またはＴ細胞受容体によって免疫特異的に結合され得る、ポリペプチドの連続的なまたは不連続的な部分を言う。免疫特異的結合は、非特異的結合を除外するが、必ずしも交差反応性を除外するわけではない。抗原性部位は、典型的には、抗原部位に特有の空間的立体構造の５から１０個のアミノ酸を包含する。
【００５１】
本明細書において用いられる場合、アミノ酸残基に関連する「リン酸化」という用語は、リン酸化されていない場合には通常はヒドロキシル基が存在する残基の側鎖上の、リン酸基の存在を言う。このようなリン酸化は、典型的には、ヒドロキシル基からリン酸基（−ＰＯ３Ｈ２）への水素原子の置換として生じる。当業者には認識されているように、その場の環境のｐＨに応じて、このリン酸基は、荷電していない中性基（−ＰＯ３Ｈ２）として、または１つ（−ＰＯ３Ｈ−）もしくは２つ（−ＰＯ３２−）の負の電荷を有して存在し得る。典型的にはリン酸化され得るアミノ酸残基には、セリン、スレオニン、およびチロシンの側鎖が含まれる。本開示の全体にわたって、リン酸化されているアミノ酸残基は、太字によって示され、下線が引かれている。
【００５２】
本明細書において用いられる場合、アミノ酸残基への言及は、１文字記号または３文字記号によって示される（例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７５、ｐ．７２を参照されたい）。
【００５３】
「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という冠詞は、１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）の、その冠詞の文法上の目的に言及するために、本明細書において用いられる。例えば、「１つの（ａｎ）要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。さらに、文脈から別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、内容上、明らかな別段の指示がない限り、複数形の用語は単数形を含む。
【００５４】
「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、ポリマーの長さに関係なく、アミノ酸のポリマーを言い、したがって、タンパク質断片、オリゴペプチド、およびタンパク質が、ペプチドまたはポリペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾を特定または除外するものではなく、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合による付着を含むポリペプチドが、ポリペプチドという用語によって明確に包含される。また、アミノ酸（例えば、非天然由来のアミノ酸、無関連の生物学的系においてただ天然に生じるアミノ酸、哺乳動物系から得られる修飾されたアミノ酸などを含む）の１つまたは複数の類似体を含有するポリペプチド、置換された連結ならびに天然由来および非天然由来の両方の当技術分野において知られている他の修飾を有するポリペプチドも定義に含まれる。
【００５５】
本明細書において用いられる「タウ断片」という用語は、本明細書において定義されるタウタンパク質の少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個の連続するアミノ酸を包含するかまたはこれから構成される、任意のポリペプチドを包含する。
【００５６】
本明細書において用いられる「ｐＳｅｒ−３９６リン酸化タウエピトープ」という用語は、アミノ酸配列ＫＳＰ（すなわち、ヒトタウ配列のＬｙｓ−３９５  Ｓｅｒ−３９６  Ｐｒｏ−３９７）を包含するペプチドを言い、ここで、前記セリン残基はリン酸化されており、配列の番号付けは、配列番号３０として提供されるヒトタウアイソフォーム２に基づく。ｐＳｅｒ−３９６リン酸化タウエピトープは、典型的には、約３から約２５アミノ酸長である。
【００５７】
本明細書において用いられる「ｐＴｈｒ−２３１／ｐＳｅｒ−２３５リン酸化タウエピトープ」という用語は、アミノ酸配列ＴＰＰＫＳ（配列番号１）（すなわち、ヒトタウ配列のＴｈｒ−２３１  ＰｒＯ−２３２  ＰｒＯ−２３３  Ｌｙｓ−２３４  Ｓｅｒ−２３５）を包含するペプチドを言い、ここで、スレオニン残基およびセリン残基はそれぞれリン酸化されており、配列の番号付けは、配列番号３０として提供されるヒトタウアイソフォーム２に基づく。このようなエピトープは、典型的には、約５から約２５アミノ酸長である。ｐＴｈｒ−２３１／ｐＳｅｒ−２３５リン酸化タウエピトープはまた、リン酸化されているＴｈｒ−２３１残基を包含するがリン酸化されたＳｅｒ−２３５残基は含まない、または、リン酸化されたＳｅｒ−２３５残基を包含するがリン酸化されたＴｈｒ−２３１エピトープは含まない、このエピトープの形態を言い得る。このエピトープのこのような型は、典型的には、約３から約２０アミノ酸長である。
【００５８】
本明細書において用いられる「ｐＴｈｒ−２１２／ｐＳｅｒ−２１４リン酸化タウエピトープ」という用語は、アミノ酸配列ＴＰＳ（すなわち、ヒトタウ配列のＴｈｒ−２１２  Ｐｒｏ−２１３  Ｓｅｒ−２１４）を包含するペプチドを言い、ここで、スレオニン残基およびセリン残基はそれぞれリン酸化されており、配列の番号付けは、配列番号３０として提供されるヒトタウアイソフォーム２に基づく。ｐＴｈｒ−２１２／ｐＳｅｒ−２１４リン酸化タウエピトープは、典型的には、約３から約２５アミノ酸長である。
【００５９】
本明細書において用いられる「ｐＳｅｒ−２０２／ｐＴｈｒ−２０５リン酸化タウエピトープ」という用語は、アミノ酸配列ＳＰＧＴ（配列番号３）（すなわち、ヒトタウ配列のＳｅｒ−２０２  Ｐｒｏ−２０３  Ｇｌｙ−２０４  Ｔｈｒ−２０５）を包含するペプチドを言い、ここで、セリン残基およびスレオニン残基はそれぞれリン酸化されており、配列の番号付けは、配列番号３０として提供されるヒトタウアイソフォーム２に基づく。ｐＳｅｒ−２０２／ｐＴｈｒ−２０５リン酸化タウエピトープは、典型的には、約４から約２５アミノ酸長である。
【００６０】
本明細書において用いられる「精製された」および「単離された」という用語は、同義である。例えば、ポリペプチドに関連する「単離された」または「精製された」という用語は、ポリペプチドの由来源または誘導源に基づいて、（１）そのポリペプチドの天然の状態では伴う天然に付随する成分を伴わないポリペプチド、（２）同一の種の他のタンパク質を実質的に含まないポリペプチド、（３）異なる種の細胞によって発現されるポリペプチド、または（４）天然には存在しないポリペプチドを言う。したがって、化学的に合成された、またはその天然由来源である細胞とは異なる細胞系において合成されたポリペプチドは、その天然に付随する成分から「単離」されることになる。ポリペプチドはまた、当技術分野において周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって、天然に付随する成分を実質的に含まないようにすることができる。ポリペプチドは、試料の少なくとも約６０から７５％が単一のポリペプチド種を示す場合、「実質的に純粋である」か、「実質的に均質である」か、または「実質的に精製されている」。ポリペプチドは、モノマーまたはマルチマーであり得る。実質的に純粋なポリペプチドは、典型的には、ポリペプチド試料の約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％ｗ／ｗ、より一般的には約９５％を包含し得、好ましくは９９％を超える純度であり得る。タンパク質の純度または均質性は、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動と、その後に行う、当技術分野において周知の染料でゲルを染色することによる単一のポリペプチドバンドの可視化などの、当技術分野において周知の多くの手段によって示すことができる。特定の目的では、ＨＰＬＣまたは当技術分野において周知の精製のための他の手段を用いることによって、より高い分解を得ることができる。
【００６１】
本明細書において用いられる、タウ関連性の神経学的障害という用語は、タウ（特に、高リン酸化形態のタウ）が役割を有すると考えられている、任意の疾患または他の症状を意味する。このような障害、疾患、および／または症状は、典型的には、神経原線維変化（典型的には、高リン酸化形態のタウを伴う）の存在に相関し、限定はしないが、アルツハイマー病、ＭＣＩ、前頭側頭型認知症、ピック病、進行性核麻痺、大脳皮質基底核変性症、グアム島のパーキンソニズム認知症複合症、および他のタウオパチーを含む。
【００６２】
本明細書において用いられる「抗原性タウペプチド」という用語は、哺乳動物種、例えばヒトから得られるものなどの、全てのタウ由来のポリペプチド、ならびにそれらの変異体、類似体、オルソログ、ホモログ、および誘導体、ならびに「抗原性タウペプチドの生物学的活性」を示すそれらの断片を包含する。例えば、「抗原性タウペプチド」という用語は、配列番号１から２６、３１から７６、および１０５〜１２２から選択されるアミノ酸配列を包含するか、これらから構成されるか、またはこれらから基本的に構成されるポリペプチド、ならびに同一の生物学的活性を基本的に示すそれらの変異体、ホモログ、および誘導体を言う。
【００６３】
本明細書において用いられる「抗原性タウペプチドの生物学的活性」という用語は、開示される抗原性タウペプチドの、対象において、アンタゴニストプロファイルで自己タウ抗体を誘発する能力を言い、このような自己抗体は、高リン酸化された病理学的形態のタウのレベルを低下させ得るが、正常な高リン酸化されていない非病理学的形態のタウには実質的に結合することができない。さらに、抗原性タウペプチドの生物学的活性を有する抗原性タウペプチドは、患者に投与された場合にタウ特異的Ｔ細胞応答を最少化するように設計することができる。特定の構築物が本開示の範囲内にあるかどうかを確認するためにどの技術を用いることができるかは、当業者に明らかであろう。このような技術には、本開示の実施例の節において記載される技術が含まれるが、これに制限されるわけではなく、また以下のものにも制限されない。推定上の抗原性タウペプチドの生物学的活性を有するペプチドをアッセイして、そのペプチドの免疫原性を確認する（例えば、推定上のペプチドによって生じた抗血清が、高リン酸化形態のタウは結合するが、高リン酸化されていない非病理学的形態のタウは実質的には結合しないかどうかを決定する）ことができる。さらに、推定上の抗原性タウペプチドの生物学的活性を有するペプチドをアッセイして、そのペプチドがタウ特異的Ｔ細胞介在性応答を実質的に誘発するかどうかを決定することができる。
【００６４】
本明細書において用いられる「高リン酸化型」または「異常リン酸化型」という用語は、タウ分子当たり少なくとも約７個（すなわち、約７個以上）のリン酸基を含有するタウを言う（例えば、Ｋｏｐｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：２４３７４〜８４（１９９３）を参照されたい）。高リン酸化型タウは、ＡＤ患者において見られる神経原線維変化（ＮＦＴ）および対合したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の主要な成分であり、高リン酸化は、タウの正常な生物学的活性の低下および自己凝集に関与する。いくつかのタウ残基は、典型的には、ＰＨＦおよびＮＦＴなどの病理学的な高リン酸化形態でのみ、リン酸化されて見出される。このような残基には、Ｓｅｒ−２０２、Ｔｈｒ−２０５、Ｔｈｒ−２１２、Ｓｅｒ−２１４、Ｔｈｒ−２３１、Ｓｅｒ−２３５、Ｓｅｒ−３９６、および／またはＳｅｒ−４０４、Ｔｙｒ−１８が含まれる。したがって、微小管へのタウの結合に通常は関与しない複数の部位、特にタウの微小管結合領域に隣接しＰＨＦおよびＮＦＴの主要な成分を包含するプロリンに富んだ領域において見られる部位でリン酸化されているタウタンパク質もまた、高リン酸化型タウまたは異常リン酸化型タウという用語に含まれる。
【００６５】
抗原性タウペプチド
ヒトタウタンパク質は、中枢神経系のニューロンにおいて比較的多く存在するが他の箇所ではあまり一般的ではない、微小管関連タンパク質である。脳組織において、タウは、タウ遺伝子のエキソン２、３、および１０における選択的スプライシングの結果、６つの異なるアイソフォームとして存在する。ヒトタウアイソフォーム２（配列番号３０）は、本明細書において、本開示の全てのタウペプチドに関するアミノ酸の番号付けのための参照として用いられる。タウは通常、チューブリンと相互作用して、微小管を安定化させ、微小管へのチューブリンのアセンブリを促進し、タンパク質の軸索内輸送を生じさせる。タウは、ヒト成人の脳において、正常な状態では、分子当たり２から３個のリン酸基を典型的に含有する、発生学的に調節されているリンタンパク質である。しかし、タウは、３０を超える異なる残基で、主にＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフで、異なるキナーゼによって一時的にリン酸化され得る（Ｈａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１：２４６５〜２４７６（１９９８））。
【００６６】
本開示の抗原性タウペプチドは、典型的には小さいサイズのものであり、その結果、それらは、病理学的形態のタウにおけるエピトープが見出される、タウタンパク質全体から選択される１つの領域を模倣する。先に記載したように、このような病理学的形態のタウは、典型的には、タウタンパク質内の特定のアミノ酸でのリン酸化によって特徴付けされる。したがって、本開示の抗原性タウペプチドは、典型的には、１００アミノ酸長未満、例えば７５アミノ酸未満、例えば５０アミノ酸未満である。本開示の抗原性タウペプチドは、典型的には、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または約３０アミノ酸長である。配列表において提供される本開示の抗原性タウペプチドの具体的な例には、４から３１アミノ酸長の範囲のペプチドが含まれる。当業者には明らかとなろうが、このような抗原性ペプチドは、典型的には遊離Ｎ末端を有し、カルボキシル化またはアミド化されたＣ末端を有し得る。
【００６７】
本開示の抗原性ペプチドは、高リン酸化形態または病理学的形態のヒトタウの一部に由来するアミノ酸配列を包含する。特に、このような抗原性タウペプチドは、典型的には、特異的なリン酸化タウエピトープを包含し、このエピトープは、文献において、これらのエピトープを結合する抗体に関して言及され得る（例えば、ＰＨＦ１、ＴＧ３、ＡＴ８、および／またはＡＴ１００、例えば、Ｈａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（３２）：２３６４５〜２３６５４（２００７）；Ｐｅｎｎａｎｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３３７：１０９７〜１１０１（２００５）；Ｐｏｒｚｉｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３５８：６４４〜６４９（２００７）を参照されたい）。
【００６８】
本開示は、単独でまたは互いに組み合わせて用いた場合に、病理学的形態の高リン酸化型タウに対する免疫応答を引き起こすために有利に用いることができる、ヒトタウタンパク質の特異的抗原性領域を同定した。例えば、ｐＳｅｒ−３９６リン酸化タウエピトープは、典型的には、リン酸化されたセリン残基Ｓｅｒ−３９６を含むヒトタウの断片である。このような断片は、典型的には、約３から約２０アミノ酸長（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）であり、Ｓｅｒ−３９６のＮ末端側およびＣ末端側の両方に、天然ヒトタウ配列の少なくとも１つのアミノ酸を含む。例えば、ｐＳｅｒ−３９６リン酸化タウエピトープは、典型的には、配列番号３０で示されるヒトタウ配列の残基３９５、３９６、および３９７（すなわち、Ｌｙｓ−３９５  Ｓｅｒ−３９６  Ｐｒｏ−３９７であり、Ｓｅｒ−３９６はリン酸化されている）を包含する。このようなｐＳｅｒ−３９６エピトープはまた、天然ヒト配列のリン酸化されたセリン残基Ｓｅｒ−４０４をさらに包含し得る。ｐＳｅｒ−３９６リン酸化タウエピトープを包含するタウペプチドの例は、配列番号４および６〜１３として提供される。
【００６９】
さらに、例えば、ｐＴｈｒ−２３１／ｐＳｅｒ−２３５リン酸化タウエピトープは、典型的には、リン酸化されたスレオニン残基Ｔｈｒ−２３１およびリン酸化されたセリン残基Ｓｅｒ−２３５の両方を含む、ヒトタウの断片である。代替として、ｐＴｈｒ−２３１／ｐＳｅｒ−２３５リン酸化タウエピトープは、Ｔｈｒ−２３１またはＳｅｒ−２３５の１つのみを含む。このようなエピトープは、典型的には、約３から約２０アミノ酸長（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）であり、Ｔｈｒ−２３１のＮ末端側に天然ヒトタウ配列の少なくとも１つのアミノ酸（すなわち、Ａｒｇ−２３０）を、および／またはＳｅｒ−２３５のＣ末端側に少なくとも１つのアミノ酸（すなわち、Ｐｒｏ−２３６）を含む。ｐＴｈｒ−２３１／ｐＳｅｒ−２３５エピトープを包含するタウペプチドの例は、配列番号１４〜１９として提供される。
【００７０】
さらに、例えば、ｐＴｈｒ−２１２／ｐＳｅｒ−２１４リン酸化タウエピトープは、典型的には、リン酸化されたスレオニン残基Ｔｈｒ−２１２およびリン酸化されたセリン残基Ｓｅｒ−２１４を含む、ヒトタウの断片である。このようなエピトープは、典型的には、約３から約２０アミノ酸長（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）であり、Ｔｈｒ−２１２のＮ末端側に天然ヒトタウ配列の少なくとも１つのアミノ酸（すなわち、Ａｒｇ−２１１）を、およびＳｅｒ−２１４のＣ末端側に少なくとも１つのアミノ酸（すなわち、Ｌｅｕ−２１５）を含む。ｐＴｈｒ−２１２／ｐＳｅｒ−２１４エピトープを包含するタウペプチドの例は、配列番号２０〜２４として提供される。
【００７１】
さらに、例えば、ｐＳｅｒ−２０２／ｐＴｈｒ−２０５リン酸化タウエピトープは、典型的には、リン酸化されたセリン残基Ｓｅｒ−２０２およびリン酸化されたスレオニン残基Ｔｈｒ−２０５を含む、ヒトタウの断片である。このようなエピトープは、典型的には、約６から約２０アミノ酸長（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）であり、典型的には、Ｓｅｒ−２０２のＮ末端側に天然ヒトタウ配列の少なくとも１つのアミノ酸（すなわち、Ｇｌｙ−２０１）を、およびＴｈｒ−２０５のＣ末端側に少なくとも１つのアミノ酸（すなわち、Ｐｒｏ−２０６）を含む。ｐＳｅｒ−２０２／ｐＴｈｒ−２０５エピトープを包含するタウペプチドの例は、配列番号２５として提供される。
【００７２】
さらに、例えば、ｐＴｙｒ−１８リン酸化タウエピトープは、典型的には、リン酸化されたチロシン残基Ｔｙｒ−１８を含む、ヒトタウの断片である。このようなエピトープは、典型的には、約６から約２０アミノ酸長（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）であり、典型的には、Ｔｙｒ−１８のＮ末端側に天然ヒトタウ配列の少なくとも１つのアミノ酸（すなわち、Ｔｈｒ−１７）を、およびＴｙｒ−１８のＣ末端側に少なくとも１つのアミノ酸（すなわち、Ｇｌｙ−１９）を含む。ｐＴｙｒ−１８エピトープを包含するタウペプチドの例は、配列番号１１２として提供される。
【００７３】
本開示の抗原性タウペプチドにはまた、上記のリン酸化タウエピトープを包含するタウペプチドが含まれてもよく、これには、少数のアミノ酸が置換されているか、付加されているか、または欠失しているが、同一の免疫原性特性を基本的に保持しているペプチドが含まれる。さらに、このように誘導された抗原性タウペプチドは、抗原性タウペプチドの立体構造上の拘束が可能になるように、および／または適切な化学が実施された後の免疫原性担体への抗原性タウペプチドのカップリングが可能になるように、アミノ酸によって、特にＮ末端およびＣ末端で、さらに修飾することができる。
【００７４】
本開示の抗原性タウペプチドはまた、その免疫学的特性から基本的に逸脱することなく、アミノ酸が欠失しているか、挿入されているか、または置換されている、タウのアミノ酸配列に由来する機能的に活性な変異体ペプチドを包含し、すなわち、このような機能的変異体ペプチドは、抗原性タウペプチドの実質的な生物学的活性を保持している。典型的には、このような機能的変異体ペプチドは、配列番号１から２６、３１から７６、および１０５〜１２２のいずれかにおいて記載されるアミノ酸配列に相同な、好ましくは高度に相同なアミノ酸配列を有する。
【００７５】
１つの態様において、このような機能的に活性な変異体ペプチドは、配列番号１から２６、３１から７６、および１０５〜１２２から構成される群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示す。
【００７６】
ポリペプチドのアミノ酸配列同一性は、Ｂｅｓｔｆｉｔ、ＦＡＳＴＡ、またはＢＬＡＳＴなどの既知のコンピュータプログラムを用いて従来通り決定することができる（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３〜９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５〜２１９（２０００）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３〜４１０（１９９０）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７）を参照されたい）。特定の配列が、例えば参照アミノ酸配列に９５％同一であるかどうかを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを用いる場合、パラメータは、同一性のパーセンテージが参照アミノ酸配列の完全長にわたって計算されるように、また参照配列におけるアミノ酸残基の総数の最大５％の相同性においてギャップが認められるように設定される。ポリペプチド間の同一性のパーセンテージの決定において、この前述の方法は、本明細書において開示される全てのタンパク質、断片、またはそれらの変異体に適用可能である。
【００７７】
機能的に活性な変異体は、対立遺伝子変異体および種変異体などの天然由来の機能的に活性な変異体、ならびに、例えば突然変異生成技術または直接的な合成によって生産され得る、非天然由来の機能的に活性な変異体を包含する。
【００７８】
機能的に活性な変異体は、配列番号１から２６および３１から７６で示されるペプチドのいずれかと、例えば約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸残基が異なるが、それでもなお、抗原性タウの生物学的活性を保持している。この比較にアラインメントが必要である場合、配列は、最大の相同性となるようアラインされる。変異の位置は、生物学的活性が配列番号１から２６、３１から７６、および１０５〜１２２で示されるペプチドのいずれかに実質的に類似している限り、ペプチド内のどこに存在してもよい。
【００７９】
表現型上サイレントなアミノ酸置換を行う方法に関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）において提供されており、これは、変化に対するアミノ酸配列の許容性を研究するために２つの主要な戦略があることを教示している。
【００８０】
第１の戦略は、進化の過程の間の自然淘汰によるアミノ酸置換の許容性を利用するものである。異なる種におけるアミノ酸配列を比較することによって、種間で保存されているアミノ酸位置を特定することができる。これらの保存されたアミノ酸は、タンパク質の機能にとって重要である可能性が高い。逆に、自然淘汰によって置換が許容されているアミノ酸位置は、タンパク質の機能にとって重大ではない位置を示す。したがって、アミノ酸置換を許容する位置は、修飾されるペプチドの特異的免疫原性活性を依然として維持しながら、修飾することができる。
【００８１】
第２の戦略は、遺伝子操作を用いて、クローン化遺伝子の特異的位置にアミノ酸変化を導入し、タンパク質の機能にとって重大な領域を同定する。例えば、部位特異的突然変異生成またはアラニンスキャニング突然変異生成を用いることができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５（１９８９））。得られた変異体ペプチドは、次に、抗原性タウの特異的な生物学的活性について試験することができる。
【００８２】
Ｂｏｗｉｅらによると、これらの２つの戦略によって、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど許容性であることが明らかにされている。著者はさらに、どのアミノ酸変化がタンパク質内の特定のアミノ酸位置で許容的である可能性が高いかを示している。例えば、（タンパク質の三次構造内で）最も埋もれているかまたは最も内側のアミノ酸残基は、非極性側鎖を必要とし、その一方で、表面または外側の側鎖の特徴は、通常ほとんど保存されない。
【００８３】
タンパク質のアミノ酸に突然変異を導入する方法は、当業者に周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい）。
【００８４】
突然変異はまた、「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの市販されているキットを用いて導入することができる。抗原性タウペプチドの機能に有意に影響しないアミノ酸を置き換えることによる、前記抗原性タウペプチドに対する機能的に活性な変異体の生成は、当業者が実現することができる。本開示に従ったペプチドの１つにおいて行うことができるアミノ酸置換の１つのタイプは、保存的アミノ酸置換である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。通常、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的には変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なるケースでは、配列同一性のパーセントまたは類似性の程度を上方修正して、置換の保存的性質について補正することができる。この修正を行うための手段は、当業者に周知である（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４３：３０７〜３１（１９９４）を参照されたい）。
【００８５】
類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の基の例には、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン、３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが含まれる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００８６】
代替として、保存的な置き換えは、Ｇｏｎｎｅｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３〜４５（１９９２）において開示されているＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて正の値を有する、任意の変化である。「中程度に保存的な」置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて負ではない値を有する任意の変化である。
【００８７】
機能的に活性な変異体ペプチドはまた、ハイブリダイゼーション技術を用いて単離することができる。簡潔に述べると、目的のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、例えば配列番号１から２６、３１から７６、および１０５〜１２２をコードする核酸配列の全体または一部に対して高い相同性を有するＤＮＡを用いて、機能的に活性なペプチドを調製する。したがって、本開示の抗原性タウペプチドはまた、配列番号１から２６および３１から７６のいずれかに機能的に同等なペプチドを含み、配列番号１から２６、３１から７６、および１０５〜１２２のいずれかをコードする核酸とハイブリダイズする核酸分子またはその相補体によってコードされ得る。当業者であれば、容易に入手できるコドン表を用いて、本明細書において開示されるペプチドをコードする核酸配列を容易に決定することができる。したがって、これらの核酸配列は、本明細書において提示されていない。
【００８８】
機能的に活性な変異体であるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸のためのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、１０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、１×デンハート溶液、および１×サケ精子ＤＮＡ（低いストリンジェンシー条件）である。より好ましい条件は、２５％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、１×デンハート溶液、および１×サケ精子ＤＮＡ（中程度のストリンジェンシー条件）であり、さらに好ましい条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、１×デンハート溶液、および１×サケ精子ＤＮＡ（高いストリンジェンシー条件）である。しかし、いくつかの因子が、上記のホルムアミド濃度以外のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響し、当業者であれば、同様のストリンジェンシーを実現するためにこれらの因子を適切に選択することができる。
【００８９】
機能的に活性な変異体をコードする核酸分子はまた、目的のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、例えば配列番号１から２６、３１から７６、および１０５〜１２２で示されるペプチドのいずれかをコードする核酸分子ＤＮＡの一部をプローブとして用いる、ＰＣＲなどの遺伝子増幅方法によって単離することができる。
【００９０】
ペプチド／タンパク質の生産
本開示のポリペプチドは、天然由来源に由来してもよく、哺乳動物、例えばヒト、霊長類、ネコ、イヌ、ウマ、マウス、またはラットから単離されてもよい。したがって、本開示のポリペプチドは、標準的なタンパク質精製技術を用いて細胞源または組織源から単離することができる。
【００９１】
代替として、ポリペプチドは、化学的に合成することができるか、または、組換えＤＮＡ技術を用いて生産することができる。例えば、本開示のポリペプチド（例えば、タウ断片）は、当技術分野において周知の固相手順によって合成することができる。適切な合成は、「Ｔ−ｂｏｃ」手順または「Ｆ−ｍｏｃ」手順を利用することによって行うことができる。環状ペプチドは、完全に自動化された装置において周知の「Ｆ−ｍｏｃ」手順およびポリアミド樹脂を用いる固相方法によって合成することができる。代替として、当業者には、手作業でこのプロセスを行うために必要な実験手順が理解されよう。固相合成のための技術および手順は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＰｒｅｓｓのＩＲＬ（１９８９）によって発行されている、Ｅ．ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ．ＳｈｅｐｐａｒｄによるＳｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ならびにＤ．Ａｎｄｒｅａｕらによる、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．３５：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍ．Ｗ．ＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎおよびＢ．Ｍ．Ｄｕｎｎ編）、ｃｈａｐｔｅｒ  ７、ｐｐ．９１〜１７１において記載されている。
【００９２】
代替として、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野において周知の技術を用いて、適切な発現系において発現し得る発現ベクター中に導入することができ、その後、発現した目的のポリペプチドを単離および精製することができる。様々な細菌発現系、酵母発現系、植物発現系、哺乳動物発現系、および昆虫発現系が当技術分野において利用可能であり、任意のこのような発現系を用いることができる。場合によって、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、無細胞翻訳系において翻訳することができる。
【００９３】
本開示の抗原性タウペプチドはまた、複数の遺伝子の存在、選択的転写事象、選択的ＲＮＡスプライシング事象、ならびに選択的翻訳事象および選択的選択後事象の結果生じるものを包含し得る。ポリペプチドは、前記ポリペプチドが非変性細胞において、または翻訳後修飾の改変もしくは省略をもたらす系において発現した場合と実質的に同一の翻訳後修飾の存在をもたらす系、例えば培養細胞において発現させることができ、前記実質的に同一の翻訳後修飾は、例えば、非変性細胞において発現する場合に存在するグリコシル化または切断である。
【００９４】
本開示のポリペプチド、例えば抗原性タウポリペプチドは、他の非タウアミノ酸配列またはタウ由来ではないアミノ酸配列、例えば、本明細書において定義されるアミノ酸リンカーまたはシグナル配列または免疫原性担体と、タンパク質の精製において有用なリガンド、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌タンパク質Ａとを含有する融合タンパク質として生産することができる。本開示の２つ以上の抗原性タウポリペプチドが融合タンパク質中に存在し得る。異種ポリペプチドを、例えば本開示のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。本開示のポリペプチドはまた、相同なアミノ酸配列、すなわち、他のタウ配列またはタウ由来の配列を包含する融合ポリペプチドとして生産することができる。
【００９５】
拘束型ペプチド
本開示の抗原性タウペプチドは、直鎖状であるか、または立体構造上拘束されているものであり得る。分子に関連して本明細書において用いられる場合、「立体構造上拘束されている」という用語は、三次元構造が長時間１つの空間配置に実質的に維持されている、ポリペプチドなどの分子を意味する。立体構造上拘束されている分子は、特性が向上している可能性があり、例えば、親和性、免疫原性、代謝安定性、膜透過性、または可溶性が向上している可能性がある。さらに、このような立体構造上拘束された分子は、その非変性の立体構造に類似した立体構造で抗原性タウエピトープを提示し、それによって、自己タウ分子をさらに認識しやすい抗タウ抗体を誘発すると予想される。立体構造上の拘束の方法は、当技術分野において周知であり、限定はしないが架橋および環化を含む。
【００９６】
直鎖状のペプチド鎖またはポリペプチド鎖に立体構造上の拘束を導入するために、いくつかのアプローチが当技術分野において知られている。例えば、ペプチド内の２つの隣接するアミノ酸の間を架橋すると、局所的な立体構造上の修飾が生じ、その柔軟性は、通常のペプチドと比較して限られている。このような架橋を形成するためのいくつかの可能性には、ラクタムおよびピペラジノンの組み込みが含まれる（例えば、ＧｉａｎｎｉｓおよびＫｏｌｔｅｒ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．編、３２：１２４４（１９９３）を参照されたい）。
【００９７】
ペプチドに関して本明細書において用いられる場合、「環状」という用語は、２つの隣接していないアミノ酸またはアミノ酸類似体間の分子内結合を含む構造を言う。環化は、共有結合または非共有結合を介して行うことができる。分子内結合には、限定はしないが、骨格と骨格との結合、側鎖と骨格との結合、側鎖と側鎖との結合、側鎖と末端基との結合、および末端と末端との結合が含まれる。環化の方法には、限定はしないが、隣接していないアミノ酸またはアミノ酸類似体の側鎖間のジスルフィド結合の形成、Ｌｙｓ残基およびＡｓｐ／Ｇｌｕ残基の側鎖間のアミド結合の形成、セリン残基とＡｓｐ／Ｇｌｕ残基との間のエステル結合の形成、例えば１つのアミノ酸またはその類似体の側鎖基とアミノ末端残基のＮ末端アミンとの間のラクタム結合の形成、ならびにリジノノルロイシン結合およびジチロシン結合の形成が含まれる。炭素型のジスルフィド連結、例えばエテニル連結またはエチル連結（Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃ．１４：８９８〜９０２（２００８））、および適切に多置換された求電子試薬、例えばジハロアルカン、トリハロアルカン、またはテトラハロアルカンでのアルキル化反応（ＰＮＡＳ、１０５（４０）、１５２９３〜１５２９８（２００８）；ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、６：８２１〜８２４（２００５））もまた用いることができる。立体構造上の拘束をペプチドに組み込むために、様々な修飾されたプロリン類似体もまた用いることができる（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．、３９：２７３８〜２７４４（１９９６）；ＰｆｅｉｆｅｒおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１９７７〜１９７８（１９９８））。本開示のペプチドを環化するために用いることができる化学によって、限定はしないがラクタム結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、トリアゾリジン結合、チオエーテル結合、またはスルホニウム結合を含む結合で、ペプチドが環化される。
【００９８】
米国特許公開第２００４−０１７６２８３号において記載されている、立体構造上拘束されたペプチドの設計における、さらに別のアプローチは、目的の短いアミノ酸配列を鋳型に付着させて、環状の拘束されたペプチドを生成することである。このような環状ペプチドは、それらの鋳型によって構造的に安定化され、それによって、ウイルスおよび寄生体上の立体構造エピトープを模倣し得る三次元立体構造をもたらすだけではなく、血清におけるタンパク質分解に対して、直鎖状ペプチドよりも耐性がある。米国特許公開第２００４−０１７６２８３号はさらに、ペプチドの超二次構造を安定化させるために、適切に位置したアミノ酸に骨格をカップリングさせるための、合成アミノ酸の調製による、立体構造上拘束された架橋ペプチドの合成を開示している。架橋は、オルトゴナルに保護された（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノプロリン残基の第一アミノ基を、グルタミンの適切に位置した側鎖カルボキシル基にアミドカップリングさせることによって、行うことができる。このアプローチにならって、少なくとも１つのプロリンが（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノプロリンによって置き換えられており、側鎖カルボキシル基を導入するために、グルタミン酸がアラニンの置き換えとして組み込まれているＣＳタンパク質の、立体構造上拘束されたテトラペプチド反復が調製されている。
【００９９】
架橋戦略にはまた、αらせん立体構造を模倣するように設計された「ステープル」ペプチドを形成するためのＧｒｕｂｂｓ閉環メタセシス反応の適用（Ａｎｇｅｗ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３７：３２８１（１９９８）；ＪＡＣＳ  １２２：５８９１（２０００））、多機能化された糖の使用、トリプタチオニン連結の使用、（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｅｕ．Ｊ．２４：３４０４〜３４０９（２００８））、ならびに側鎖アミノ酸残基として組み込まれるかまたはペプチド配列の骨格中に位置し得るアジドおよびアルキンの「クリック」反応の使用（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ  ８（２４）：１１２８〜１１３７（２００３））が含まれる。金属イオンが、金属陽イオンに連動する特異的残基（例えば、ヒスチジン）の隔離を介して直鎖状ペプチドの拘束された立体構造を安定化させ得ることも、文献において知られている（Ａｎｇｅｗ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４２：４２１（２００３））。同様に、非天然の酸およびアミンの機能性またはポリアミンおよびポリ酸の機能性を有する直鎖状ペプチド配列の機能化を用いて、活性化およびアミド結合形成の後に環化構造にアクセスすることを可能にすることができる。
【０１００】
１つの実施形態によれば、抗原性タウペプチドは、抗原性タウペプチドの２つの隣接していないアミノ酸、例えば、Ｎ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸を、互いに分子内共有結合することにより、立体構造上拘束されている。別の実施形態によれば、本開示の抗原性タウペプチドは、足場分子への共有結合によって立体構造上拘束されている。さらなる実施形態によれば、抗原性タウペプチドは、簡単に拘束されており、すなわち、一方の末端（Ｃ末端またはＮ末端）で、またはいずれの末端にも位置していない別のアミノ酸を介して、足場分子に結合している。別の実施形態によれば、抗原性タウペプチドは、二重に拘束されており、すなわち、Ｃ末端およびＮ末端の両方で足場分子に結合している。
【０１０１】
足場（「プラットフォーム」とも呼ばれる）は、共有結合を介して、抗原性タウペプチドが取り得る立体構造の数を低減させ得る、任意の分子であり得る。立体構造を拘束する足場の例には、タンパク質およびペプチド、例えばリポカリン関連分子、例えばβバレルを含有するチオレドキシンおよびチオレドキシン様タンパク質、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＡ）、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、エグリンＣ）、抗体またはその構造的に堅固な断片、ＧＦＰまたはＹＦＰなどの蛍光タンパク質、コノトキシン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインのループ領域、ＣＴＬＡ−４、ならびにウイルス様粒子（ＶＬＰ）が含まれる。
【０１０２】
他の適切なプラットフォーム分子には、セファロースなどの糖質が含まれる。プラットフォームは、直鎖状または環状の分子であってもよく、例えば、閉じてループを形成している。プラットフォームは、通常、抗原性タウペプチドとは異種である。このような、プラットフォームに連結した立体構造上拘束されたペプチドは、直鎖状ペプチドよりもタンパク質分解に対して耐性であり得る。
【０１０３】
１つの実施形態によれば、足場は、異種担体タンパク質またはＶＬＰなどの、本開示において定義される免疫原性担体である。さらなる実施形態において、抗原性タウペプチドは、免疫原性担体上に簡単に拘束されている。さらなる実施形態において、抗原性タウペプチドは、免疫原性担体上に二重に拘束されている。このように、抗原性タウペプチドは、細胞内認識分子として特に適切な構造であることが明らかにされている、立体構造上拘束されたループ構造を形成する。
【０１０４】
本開示の抗原性タウペプチドは、プラットフォームへのコンジュゲーションを容易にするために、例えば、一方もしくは両方の末端に末端システインを付加することによって、および／あるいは二重グリシン頭部もしくは尾部、リジン残基で終わるリンカー、またはこのような機能を行うことが当業者に知られている任意の他のリンカーなどのリンカー配列を付加することによって、修飾され得る。ペプチド配列全体を担体にカップリングして、あらゆる位置化学的問題および化学選択性問題を避けるための、生体直交型化学（上記のクリック反応など）もまた、用いることができる。Ｊｏｎｅｓら（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２、４１：４２４１〜４２４４）において記載されているような柔軟性のないリンカーは、免疫学的応答の向上をもたらすことが知られており、同様に用いることができる。
【０１０５】
さらなる実施形態において、抗原性タウペプチドは、それ自体が担体に結合している多価鋳型に付着しており、したがって、抗原の密度が増大する（以下を参照されたい）。多価鋳型は、（限定はしないが）オリゴグルタメートまたはオリゴキトサンなどの、適切に機能化されたポリマーまたはオリゴマーであり得る。
【０１０６】
【化１】
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【０１０７】
前記リンカーは、ペプチドのＮ末端またはペプチドのＣ末端またはペプチドの両端に位置し得る。前記リンカーは、０から１０アミノ酸長、例えば０から６アミノ酸長であり得る。代替として、Ｄ立体異性体形態の１つまたは複数のアミノ酸の付加または置換を行って、例えばペプチドの安定性を増強させるために、有利な誘導体を生じさせることができる。
【０１０８】
様々なリンカーを用いる、全てが本開示の範囲内にあり様々な実施形態を構成する、コンジュゲーションの典型的な組み合わせを以下に示す：
ペプチド−ＧＧＧＧＧＣ（配列番号７９）−足場、ペプチド−ＧＧＧＧＣ（配列番号８０）−足場、ペプチド−ＧＧＧＣ（配列番号８１）−足場、ペプチド−ＧＧＣ−足場、ペプチド−ＧＣ−足場、ペプチド−Ｃ−足場、ペプチド−ＧＧＧＧＧＫ（配列番号８２）、ペプチド−ＧＧＧＧＫ（配列番号８３）、ペプチド−ＧＧＧＫ（配列番号８４）、ペプチド−ＧＧＫ、ペプチド−ＧＫ、ペプチド−Ｋ、ペプチド−ＧＧＧＧＳＣ（配列番号８５）、ペプチド−ＧＧＧＳＣ（配列番号８６）、ペプチド−ＧＧＳＣ（配列番号８７）、ペプチド−ＧＳＣ、ペプチド−ＳＣ、ペプチド−ＧＧＧＧＣ（配列番号８０）、ペプチド−ＧＧＧＣ（配列番号８１）、ペプチド−ＧＧＣ、ペプチド−ＧＣ、ＣＳＧＧＧＧ（配列番号８８）−ペプチド、ＣＳＧＧＧ（配列番号８９）−ペプチド、ＣＳＧＧ（配列番号９０）−ペプチド、ＣＳＧ−ペプチド、ＣＳ−ペプチド、ＣＧＧＧＧ（配列番号９１）−ペプチド、ＣＧＧＧ（配列番号９２）−ペプチド、ＣＧＧ−ペプチド、ＣＧ−ペプチド。
【０１０９】
様々なリンカーおよび二重に拘束されたペプチドを用いる、コンジュゲーションの例示的な組み合わせを以下に示すが、担体は、担体の同一のモノマーまたは担体の異なるモノマーであってもよい。以下の例において、ＧＣリンカーは、上記に例示したＧＫリンカーもしくはＧＳＣリンカーのいずれか、または当業者に知られている任意の他のリンカーによって置換され得る。
担体−ＣＧＧＧＧＧ（配列番号９３）−ペプチド−ＧＧＧＧＧＣ（配列番号７９）−担体、担体−ＣＧＧＧＧ（配列番号９１）−ペプチド−ＧＧＧＧＣ（配列番号８０）−担体、担体−ＣＧＧＧ（配列番号９２）−ペプチド−ＧＧＧＣ（配列番号８１）−担体、担体−ＣＧ−ペプチド−ＧＣ−担体、担体−Ｃ−ペプチド−Ｃ−担体。
【０１１０】
１つの実施形態において、末端システイン残基が、もし抗原性タウペプチドのアミノ酸配列内にまだ存在していなければ、配列番号１から２６で示される配列のいずれかを包含するかまたはそれらから構成される抗原性タウペプチドの一方または両方の末端に付加されて、立体構造上拘束されたペプチドを生成する。
【０１１１】
別の実施形態において、様々な数のグリシン残基および１つの末端システイン残基を包含するＧＣリンカーが、配列番号１から２６で示される配列のいずれかを包含するかまたはそれらから構成される抗原性タウペプチドの一方または両方の末端に付加されて、立体構造上拘束されたペプチドを生成する。好ましくは、ＧＣリンカーは、１から１０個のグリシン残基、より好ましくは１個、２個、３個、４個、または５個のグリシン残基を包含する。
【０１１２】
さらに別の実施形態において、様々な数のグリシン残基および１つの末端システイン残基を包含するＧＣリンカーが、配列番号１から２６で示される配列のいずれかを包含するかまたはそれらから構成される抗原性タウペプチドの一方の末端に付加され、末端システイン残基が、もし抗原性タウペプチドの他方の末端にまだ存在していなければ、前記抗原性ペプチドの他方の末端に付加される。好ましくは、ＧＣリンカーは、１から１０個のグリシン残基、より好ましくは１個、２個、３個、４個、または５個のグリシン残基を包含する。
【０１１３】
免疫原性担体
本開示の１つの実施形態において、本開示の抗原性タウペプチドまたはポリペプチドは、免疫原性担体分子に連結して、ワクチン接種プロトコルのための免疫原を形成する。本明細書における「免疫原性担体」という用語には、宿主動物における免疫原性応答を独立して引き起こす能力を有する物質であって、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質内の遊離カルボキシル基、アミノ基、もしくはヒドロキシル基と、免疫原性担体物質上の対応する基との間のペプチド結合もしくはエステル結合の形成を直接介して、または従来の二官能性連結基を介する結合によって、または融合タンパク質として、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に連結し得る（例えば、共有結合によってカップリングし得る）物質が含まれる。
【０１１４】
本開示の免疫原において用いられる担体のタイプは、当業者に容易に理解されよう。このような免疫原性担体の例は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミン、グロブリン、チログロブリン、ヘモグロビン、ヘモシアニン（特に、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））、回虫から抽出されたタンパク質、破傷風毒素もしくはジフテリア毒素（ＴＴおよびＤＴ）もしくはＣＲＭ１９７などの不活化細菌毒素もしくはトキソイド、ツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）、またはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のタンパク質Ｄ（ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１８９２６）もしくはそれらの組換え断片（例えば、ＴＴの断片Ｃのドメイン１、またはＤＴの転座ドメイン、またはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質ＤのＮ末端の１００から１１０アミノ酸を包含する、タンパク質Ｄの３分の１（ＧＢ９７１７９５３．５））、ポリリジン、ポリグルタミン酸、リジン−グルタミン酸コポリマー、リジンまたはオルニチンを含有するコポリマー、リポソーム担体などである。
【０１１５】
１つの実施形態において、免疫原性担体はＫＬＨである。別の実施形態において、免疫原性担体はウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、好ましくは、組換えウイルス様粒子である。
【０１１６】
本明細書において用いられる「ウイルス粒子」という用語は、ウイルスの形態学的形態を言う。いくつかのウイルスタイプにおいて、ウイルス粒子は、タンパク質カプシドに囲まれた遺伝子を包含し、別のものは、エンベロープ、尾部などのさらなる構造を有する。
【０１１７】
本明細書において用いられる「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、複製不可能なおよび／もしくは非感染性のウイルス粒子を言うか、または、ウイルス粒子に類似している、複製不可能なおよび／もしくは非感染性の構造、例えばウイルスのカプシドを言う。本明細書において用いられる「複製不可能」という用語は、ＶＬＰが包含するゲノムを複製できないことを言う。本明細書において用いられる「非感染性」という用語は、宿主細胞へ侵入できないことを言う。１つの例において、ウイルス様粒子は、ウイルスのゲノムまたはゲノム機能の全てまたは一部を欠いているため、複製不可能および／または非感染性である。例えば、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムが物理的または化学的に不活化されているウイルス粒子である。さらに、例えば、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの複製可能な成分および感染性の成分の全てまたは一部を欠いている。ウイルス様粒子は、ウイルスのゲノムとは異なる核酸を含有し得る。ウイルス様粒子の１つの例はウイルスカプシドであり、例えば、対応するウイルス、例えばＲＮＡファージなどのバクテリオファージのウイルスカプシドである。「ウイルスカプシド」または「カプシド」という用語は、ウイルスタンパク質サブユニットからなる高分子アセンブリを言う。例えば、６０個、１２０個、１８０個、２４０個、３００個、３６０個、および３６０を超えるウイルスタンパク質サブユニットが存在し得る。これらのサブユニットの相互作用によって、固有の反復構成を有するウイルスカプシドまたはウイルスカプシド様構造が形成され得、前記構造は、例えば球状または管状である。
【０１１８】
本明細書において用いられる場合、「ＲＮＡファージのウイルス様粒子」という用語は、ＲＮＡファージの被覆タンパク質、それらの変異体または断片を包含するか、またはこれらから基本的に構成されるか、またはこれらから構成されるウイルス様粒子を言う。例えば、ＲＮＡファージのウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの構造に類似していてもよく、複製不可能および／または非感染性であり、ＲＮＡファージの複製機構をコードする１つまたは複数の遺伝子を少なくとも欠き、また、ウイルスによる宿主への付着または宿主内への侵入に関与する１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子を欠く可能性がある。しかし、この定義はまた、前述の１つまたは複数の遺伝子が依然として存在するが不活性であり、したがって同様にＲＮＡファージの複製不可能なおよび／または非感染性のウイルス様粒子を生じさせる、ＲＮＡファージのウイルス様粒子を包含する。本開示内で、「サブユニット」および「モノマー」という用語は、この文脈内でほぼ同じ意味で、同等に用いられる。さらに、本開示において、「ＲＮＡファージ」という用語および「ＲＮＡバクテリオファージ」という用語は、ほぼ同じ意味で用いられる。
【０１１９】
本開示は、哺乳動物におけるリン酸化型タウに対する免疫応答を誘発するおよび／または増強させるための組成物および方法を提供する。本開示の組成物は、少なくとも１つの抗原性タウペプチドに連結したウイルス様粒子（ＶＬＰ）を包含し得る。例えば、抗原性タウペプチドは、ＶＬＰに連結して、整列した反復性の抗原−ＶＬＰアレイを形成し得る。例えば、１つのケースでは、本明細書において記載される少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも６０個、少なくとも１２０個、少なくとも１８０個、少なくとも３６０個、または少なくとも５４０個のペプチドが、ＶＬＰに連結している。
【０１２０】
ＲＮＡファージ被覆タンパク質の１８０個のサブユニットの自己アセンブリから形成され、宿主ＲＮＡを場合によって含有するカプシド構造は、本明細書において、「ＲＮＡファージ被覆タンパク質のＶＬＰ」と呼ばれる。具体的な例は、Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質のＶＬＰである。この特定のケースにおいて、Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質のＶＬＰは、Ｑｂｅｔａ  ＣＰサブユニット（抑制を介してさらに長いＡ１タンパク質のあらゆる発現を不可能にするＴＡＡ停止コドンを例えば含有するＱｂｅｔａ  ＣＰ遺伝子の発現によって生成する、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：９〜１５（１９９６）を参照されたい）から独占的にアセンブリされてもよく、または、カプシドアセンブリ内にＡ１タンパク質サブユニットをさらに含有し得る。通常、カプシド形成を確実にするためには、カプシドアセンブリ内のＱｂｅｔａ  ＣＰに対するＱｂｅｔａ  Ａ１タンパク質のパーセンテージは限定される。
【０１２１】
本開示の状況における免疫原性担体として適しているＶＬＰの例には、限定はしないが、Ｂ型肝炎ウイルスのカプシドタンパク質（Ｕｌｒｉｃｈら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．５０：１４１〜１８２（１９９８））、麻疹ウイルス（Ｗａｒｎｅｓら、Ｇｅｎｅ  １６０：１７３〜１７８（１９９５））、シンドビスウイルス、ロタウイルス（米国特許第５，０７１，６５１号および米国特許第５，３７４，４２６号）、口蹄疫ウイルス（Ｔｗｏｍｅｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１６０３〜１６１０（１９９５））、ノーウォークウイルス（Ｊｉａｎｇ，Ｘ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１５８０〜１５８３（１９９０）；Ｍａｔｓｕｉ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１４５６〜１４６１（１９９１））、レトロウイルスＧＡＧタンパク質（ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／３０５２３）、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐｌ、Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質（ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１１２９１）、ヒトパピローマウイルス（ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／１５６３１）、ヒトポリオーマウイルス（Ｓａｓｎａｕｓｋａｓ  Ｋ．ら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０（３）：３８１〜３８６（１９９９）；Ｓａｓｎａｕｓｋａｓ  Ｋ．ら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ、３ｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ「Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２６〜２９（２００１））、ＲＮＡファージ、Ｔｙ、ｆｒファージ、ＧＡファージ、ＡＰ２０５ファージ、特にＱｂｅｔａファージが含まれる。
【０１２２】
当業者には容易に明らかとなろうが、本開示の免疫原性担体として用いられるＶＬＰは、何らかの特定の形態に限定されるわけではない。粒子は、化学的に、または天然もしくは非天然であり得る生物学的プロセスを介して合成することができる。例えば、このタイプの実施形態には、ウイルス様粒子またはその組換え形態が含まれる。より具体的な実施形態において、ＶＬＰは、ＶＬＰを形成することが知られているウイルスのいずれかの組換えポリペプチドを包含し得るか、または代替としてこれらから構成され得る。ＶＬＰはさらに、このようなポリペプチドの１つまたは複数の断片、およびこのようなポリペプチドの変異体を包含し得るか、またはこれらから構成され得る。ポリペプチドの変異体は、例えば、それらの野生型対応物と、アミノ酸レベルで、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を共有し得る。本開示における使用に適した変異体ＶＬＰは、それらの生物が「ウイルス様粒子」を形成し得る限り、任意の生物に由来してもよく、本明細書において定義される「免疫原性担体」として用いられ得る。
【０１２３】
本開示に従った好ましいＶＬＰには、ＨＢＶのカプシドタンパク質もしくはコア抗原および表面抗原（それぞれＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇ）、またはそれらの組換えタンパク質もしくは断片、およびＲＮＡファージの被覆タンパク質またはそれらの組換えタンパク質もしくは断片、より好ましくは、Ｑｂｅｔａの被覆タンパク質またはそれらの組換えタンパク質もしくは断片が含まれる。
【０１２４】
１つの実施形態において、本開示の抗原性タウペプチドと組み合わせて用いられる免疫原性担体は、ＨＢｃＡｇタンパク質である。本開示の状況において用いられ得るＨＢｃＡｇタンパク質の例は、当業者が容易に決定することができる。例には、限定はしないが、Ｙｕａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１０１２２〜１０１２８（１９９９）、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ００／１９８３３３、ＷＯ００／１７７１５８、ＷＯ００／２１４４７８、ＷＯ００／３２２２７、ＷＯ０１／８５２０８、ＷＯ０２／０５６９０５、ＷＯ０３／０２４４８０、およびＷＯ０３／０２４４８１において記載されているＨＢＶコアタンパク質が含まれる。本開示における使用に適したＨＢｃＡｇは、それらの生物が「ウイルス様粒子」を形成し得る限り、任意の生物に由来してもよく、本明細書において定義される「免疫原性担体」として用いられ得る。
【０１２５】
本開示の状況において用いられ得る、特に目的のＨＢｃＡｇ変異体は、１つまたは複数の天然由来のシステイン残基が欠失しているかまたは置換されている変異体である。遊離システイン残基が多くの化学的副反応に関与し得ることは、当技術分野において周知であり、前記化学的副反応には、ジスルフィド交換、例えば他の物質との組み合わせ療法において注射もしくは形成される化学物質もしくは代謝産物との反応、またはＵＶ光への曝露の際の直接的な酸化およびヌクレオチドとの反応が含まれる。したがって、ＨＢｃＡｇが核酸を結合する強い傾向を有するという事実を特に考慮すると、毒性付加物が生じ得る。こうして、毒性付加物は多様な種間に分布しており、それぞれ独立して低濃度で存在し得るが、一緒になると毒性レベルに達する。上記のことを考慮すると、天然由来のシステイン残基を除去するように修飾されているＨＢｃＡｇをワクチン組成物において用いる１つの利点は、抗原または抗原決定基が付着している場合に毒性種が結合し得る部位が、減るかまたは完全に除去されることである。
【０１２６】
さらに、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列を欠く、ＨＢｃＡｇのプロセシングされた形態をまた、特に、プロセシングが生じない条件下でＨＢｃＡｇが生産される場合（例えば、細菌系における発現）に、本開示の状況において用いることができる。
【０１２７】
本開示に従う他のＨＢｃＡｇ変異体には、ｉ）標準的な配列比較コンピュータアルゴリズムを用いて、野生型ＨＢｃＡｇアミノ酸配列の１つに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一なポリペプチド配列、またはその小部分、ｉｉ）少なくとも１個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３４個、または３５個のアミノ酸がＣ末端から除去されている変異体を含む、Ｃ末端切断変異体、ｉｉ）少なくとも１個、２個、５個、７個、９個、１０個、１２個、１４個、１５個、または１７個のアミノ酸がＮ末端から除去されている変異体を含む、Ｎ末端切断変異体、ｉｉｉ）少なくとも１個、２個、５個、７個、９個、１０個、１２個、１４個、１５個、または１７個のアミノ酸がＮ末端から除去されており、少なくとも１個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３４個、または３５個のアミノ酸がＣ末端から除去されているＨＢｃＡｇを含む、Ｎ末端およびＣ末端の両方で切断されている変異体が含まれる。
【０１２８】
本開示の範囲内にあるさらに他のＨＢｃＡｇ変異体タンパク質は、外来エピトープの免疫原の提示を増強させるように修飾された変異体であって、４つのアルギニン反復の１つまたは複数が欠失しているがＣ末端システインは保持されている変異体（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／９８３３３を参照されたい）、ならびに、ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／１４４７８、ＷＯ０３／１０２１６５、およびＷＯ０４／０５３０９１において記載されているものなどの、Ｃ末端が切断されたキメラＨＢｃＡｇである。
【０１２９】
別の実施形態において、本開示の抗原性タウペプチドと組み合わせて用いられる免疫原性担体は、ＨＢｓＡｇタンパク質である。本開示の状況において用いられ得るＨＢｓＡｇタンパク質は、当業者が容易に決定することができる。例には、限定はしないが、米国特許第５，７９２，４６３号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ０２／１０４１６およびＷＯ０８／０２０３３１において記載されているＨＢＶ表面タンパク質が含まれる。本開示における使用に適したＨＢｓＡｇは、それらの生物が「ウイルス様粒子」を形成し得る限り、任意の生物に由来してもよく、本明細書において定義される「免疫原性担体」として用いられ得る。
【０１３０】
さらに別の実施形態において、本開示の抗原性タウペプチドと組み合わせて用いられる免疫原性担体は、Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質である。Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されると、カプシドに自己アセンブリすることが明らかにされた（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ  Ｔ．Ｍ．ら、ＧＥＮＥ  １３７：１３３〜１３７（１９９３））。得られたカプシドまたはウイルス様粒子は、２５ｎｍの直径およびＴ＝３の準対称を有する２０面体のファージ様カプシド構造を示した。さらに、バクテリオファージＱｂｅｔａの結晶構造は明らかにされている。カプシドは１８０コピーの被覆タンパク質を含有し、前記被覆タンパク質は、ジスルフィド架橋によって共有結合性のペンタマーおよびヘキサマーにおいて連結して（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：５４３５５５４（１９９６））、Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質のカプシドの顕著な安定性をもたらす。Ｑｂｅｔａカプシドタンパク質はまた、有機溶媒および変性剤に対する突出した耐性を示す。Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質のカプシドの高い安定性は、特に本開示の状況における哺乳動物およびヒトの免疫化およびワクチン接種におけるその使用にとって、有利な特徴である。
【０１３１】
本開示の状況において用いられ得るＱｂｅｔａ被覆タンパク質の例は、当業者が容易に決定することができる。例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０５６９０５、ＷＯ０３／０２４４８０、ＷＯ０３／０２４４８１において幅広く記載されており、限定はしないが、ＰＩＲデータベースにおいて記載されているアミノ酸配列、すなわち、Ｑｂｅｔａ  ＣＰに関しては受託番号ＶＣＢＰＱｂｅｔａ、Ｑｂｅｔａ  Ａ１タンパク質に関しては受託番号ＡＡＡ１６６６３、および、Ｎ末端のメチオニンが切断されている変異体タンパク質を含むそれらの変異体、１００個、１５０個、または１８０個ものアミノ酸がなくなっているＱｂｅｔａ  Ａ１のＣ末端切断形態、欠失もしくは置換によるリジン残基の除去または置換もしくは挿入によるリジン残基の付加によって修飾されている変異体タンパク質（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０２４４８１において開示されているＱｂｅｔａ−２４０、Ｑｂｅｔａ−２４３、Ｑｂｅｔａ−２５０、Ｑｂｅｔａ−２５１、およびＱｂｅｔａ−２５９を参照されたい）、および本明細書において記載されるＱｂｅｔａコアタンパク質のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を示す変異体を含む。本開示における使用に適した変異体Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質は、それらの生物が「ウイルス様粒子」を形成し得る限り、任意の生物に由来してもよく、本明細書において定義される「免疫原性担体」として用いられ得る。
【０１３２】
連結
本開示の抗原性タウペプチドは、化学的コンジュゲーションを介して、または遺伝子操作された融合パートナーの発現によって、免疫原性担体にカップリングさせることができる。カップリングは、必ずしも直接的なものである必要はないが、リンカー配列を介して生じ得る。より一般的には、抗原性ペプチドが免疫原性担体に融合しているか、コンジュゲートしているか、さもなければ付着している場合、スペーサー配列またはリンカー配列が、抗原性ペプチドの一方または両方の末端に典型的に付加される。このようなリンカー配列は、通常、プロテアソーム、エンドソームのプロテアーゼ、または細胞の他の小胞状成分によって認識される配列を包含する。
【０１３３】
１つの実施形態において、本開示のペプチドは、免疫原性担体との融合タンパク質として発現する。ペプチドの融合は、免疫原性担体の一次配列内への挿入によって、または免疫原性担体のＮ末端もしくはＣ末端への融合によって行うことができる。以降、免疫原性担体へのペプチドの融合タンパク質に言及する場合、サブユニット配列のいずれかの末端への融合または担体配列内へのペプチドの内部挿入が包含される。融合は、以降言及される場合、担体の配列内に抗原性ペプチドを挿入することによって、担体の配列の一部を抗原性ペプチドで置換することによって、または欠失、置換、もしくは挿入の組み合わせによって、実施することができる。
【０１３４】
免疫原性担体がＶＬＰである場合、キメラ抗原性ペプチド−ＶＬＰサブユニットは通常、ＶＬＰに自己アセンブリし得る。ＶＬＰのサブユニットに融合したエピトープを提示するＶＬＰはまた、本明細書において、キメラＶＬＰと呼ばれる。例えば、ＥＰ０４２１６３５Ｂは、ウイルス様粒子内の外来ペプチド配列を提示するための、キメラヘパドナウイルスコア抗原粒子の使用を記載している。
【０１３５】
隣接アミノ酸残基を、抗原性ペプチドの配列のいずれかの末端に付加して、ＶＬＰのサブユニットの配列のいずれかの末端に融合するか、または、ＶＬＰのサブユニットの配列にこのようなペプチド性配列を内部挿入することができる。グリシン残基およびセリン残基は、融合されるペプチドに付加される隣接配列において用いるために特に好ましいアミノ酸である。グリシン残基はさらなる柔軟性を付与し、この柔軟性は、ＶＬＰサブユニットの配列内への外来配列の融合の潜在的な不安定化効果を弱め得る。
【０１３６】
本開示の具体的な実施形態において、免疫原性担体は、ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰである。ＨＢｃＡｇのＮ末端への抗原性ペプチドの融合タンパク質（Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：１１５７１１６３（１９９９））またはいわゆる主要免疫優性領域（ＭＩＲ）内の挿入への抗原性ペプチドの融合タンパク質が記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１）、ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／９８３３３）、本開示の具体的な実施形態である。ＭＩＲにおける欠失を伴うＨＢｃＡｇの天然由来の変異体が記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））、Ｎ末端またはＣ末端への融合、および野生型ＨＢｃＡｇと比較しての欠失部位に対応するＭＩＲの位置での挿入は、本開示のさらなる実施形態である。Ｃ末端への融合もまた記載されている（Ｐｕｍｐｅｎｓら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））。当業者であれば、従来の分子生物学的技術を用いて融合タンパク質を構築する方法についてのガイダンスを容易に見出すであろう。ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質をコードし、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質の発現に有用なベクターおよびプラスミドが記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１）；Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：１１５７〜１１６３（１９９９））、この開示の実施において用いられ得る。自己アセンブリの効率の最適化およびＨＢｃＡｇのＭＩＲ内に挿入されるエピトープの提示の最適化にとって重要な因子は、挿入部位の選択、および挿入の際にＭＩＲ内のＨＢｃＡｇ配列から欠失されるアミノ酸の数（欧州特許第ＥＰ０４２１６３５、米国特許第６，２３１，８６４号）、または言い換えると、ＨＢｃＡｇのどのアミノ酸が新たなエピトープで置換されるべきかである。例えば、ＨＢｃＡｇのアミノ酸７６〜８０、７９〜８１、７９〜８０、７５〜８５、または８０〜８１の、外来エピトープでの置換が記載されている（Ｐｕｍｐｅｎｓら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１）；欧州特許ＥＰ０４２１６３５；米国特許第６，２３１，８６４号；ＰＣＴ特許公開第ＷＯ００／２６３８５）。ＨＢｃＡｇは長いアルギニン尾部を含有し、これは、カプシドアセンブリには不必要であり、核酸を結合し得る。このアルギニン尾部を包含しているかまたは欠いているＨＢｃＡｇは、共に、本開示の実施形態である。
【０１３７】
本開示の別の具体的な実施形態において、免疫原性担体は、ＲＮＡファージのＶＬＰ、好ましくはＱｂｅｔａのＶＬＰである。ＲＮＡファージの主要被覆タンパク質は、細菌、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現すると、自発的にＶＬＰにアセンブリする。抗原性ペプチドがＱｂｅｔａの切断形態のＡ１タンパク質のＣ末端に融合しているか、またはＡ１タンパク質内に挿入されている、融合タンパク質構築物が記載されている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））。Ａ１タンパク質は、ＵＧＡ停止コドンでの抑制によって生成し、３２９アミノ酸長、またはＮ末端メチオニンの切断を考慮すると、３２８アミノ酸長を有する。アラニン（Ｑｂｅｔａ  ＣＰ遺伝子によってコードされる２番目のアミノ酸）の前のＮ末端メチオニンの切断が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において通常生じ、これは、Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質のＮ末端にも当てはまる。Ａ１遺伝子の一部である、ＵＧＡアンバーコドンの３’は、１９５アミノ酸長を有するＣＰ伸長をコードする。ＣＰ伸長の７２位と７３位との間への抗原性ペプチドの挿入は、本開示のさらなる実施形態をもたらす（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：９〜１５（１９９６））。Ｃ末端が切断されたＱｂｅｔａ  Ａ１タンパク質のＣ末端での抗原性ペプチドの融合は、本開示のさらに好ましい実施形態をもたらす。例えば、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６）は、１９位で切断されたＱｂｅｔａ  ＣＰ伸長のＣ末端でエピトープが融合されている、Ｑｂｅｔａ  Ａ１タンパク質融合体を記載している。
【０１３８】
Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６）によって記載されているように、融合エピトープを提示する粒子のアセンブリは、典型的には、モザイク粒子を形成するために、Ａ１タンパク質−抗原融合体および野生型ＣＰの両方の存在を必要とする。しかし、抗原性ペプチドが融合したＶＬＰサブユニットのみからなるウイルス様粒子、ここでは特に、ＲＮＡファージＱｂｅｔａ被覆タンパク質のＶＬＰを包含する実施形態もまた、本開示の範囲内である。
【０１３９】
モザイク粒子の生産は、多くの手段によって実施することができる。Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：９〜１５（１９９６）は、３つの方法を記載しており、これらはすべて、本開示の実施において用いることができる。第１のアプローチにおいて、ＶＬＰ上の融合エピトープの効率的な提示は、ＴｒｐへのＵＧＡコドンの翻訳をもたらすクローン化ＵＧＡサプレッサーｔＲＮＡをコードするプラスミド（ｐＩＳＭ３００１プラスミド（Ｓｍｉｌｅｙら、Ｇｅｎｅ  １３４：３３〜４０（１９９３））を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株における、ＣＰとＣＰ伸長との間にＵＧＡ停止コドンを有するＱｂｅｔａ  Ａ１タンパク質融合体をコードするプラスミドの発現によって仲介される。別のアプローチにおいて、ＣＰ遺伝子の停止コドンがＵＡＡに修飾され、Ａ１タンパク質−抗原融合体を発現する第２のプラスミドが共形質転換される。第２のプラスミドは、異なる抗生物質耐性をコードし、複製の起点は、第１のプラスミドに適合する。第３のアプローチにおいて、ＣＰおよびＡ１タンパク質−抗原融合体は、バイシストロニックな様式でコードされ、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６）のＦｉｇｕｒｅ  １において記載されているように、Ｔｒｐプロモーターなどのプロモーターに機能可能に連結している。
【０１４０】
さらに、抗原または抗原決定基の融合に適したＶＬＰは、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０２４４８１において記載されており、バクテリオファージｆｒ、ＲＮＡファージＭＳ−２、パピローマウイルスのカプシドタンパク質、レトロトランスポゾンＴｙ、酵母、およびまた、レトロウイルス様粒子、ＨＩＶ２  Ｇａｇ、ササゲモザイクウイルス、パルボウイルスＶＰ２  ＶＬＰ、ＨＢｓＡｇを含む（米国特許第４，７２２，８４０号および欧州特許第ＥＰ００２０４１６Ｂ１）。本開示の実施に適したキメラＶＬＰの例はまた、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：１（１９９６）において記載されている。本開示における使用を意図したＶＬＰのさらなる例は、ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−４５、ＣＲＰＶ、ＣＰＯＶ、ＨＩＶ  ＧＡＧ、およびタバコモザイクウイルスである。さらなる例には、ＳＶ−４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ロタウイルス、およびノーウォークウイルスのＶＬＰが含まれる。
【０１４１】
免疫原性担体にカップリングしているまたはしていない本開示に従った抗原性タウペプチドを含む、本開示の一部を形成する、組換えによって発現された任意のペプチドまたはタンパク質では、前記ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸もまた、その核酸を包含する発現ベクター、およびその発現ベクター（自律的にまたは染色体に挿入された）を含有する宿主細胞のように、本開示の一態様を形成する。ペプチドまたはタンパク質を上記の宿主細胞において発現させ、それから免疫原を単離することによる、ペプチドまたはタンパク質を組換えによって生産する方法は、本開示のさらなる態様である。
【０１４２】
別の実施形態において、本開示のペプチドは、当技術分野において周知の技術を用いて、免疫原性担体に化学的にカップリングされる。コンジュゲーションは、単一点でのコンジュゲーション（例えば、Ｎ末端点またはＣ末端点）を介してペプチドの自由な動きを可能にするように、またはペプチドの両端が免疫原性タンパク質もしくはＶＬＰなどの足場構造にコンジュゲートしているロックダウン構造として生じ得る。このようなコンジュゲーションは、当業者に知られているコンジュゲーション化学を介して、例えば、システイン残基、リジン残基、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸などの、コンジュゲーション点として一般に知られている他のカルボキシ部分を介して実施され得る。したがって、例えば、共有結合による直接的なカップリングのために、ＣＤＡＰおよびＳＰＤＰなどの一般に市販されているヘテロ二官能性リンカーを利用して（製造者の指示を用いて）、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、またはＮ−［ｙ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステルを利用することが可能である。アシルヒドラジンペプチド誘導体を介する、タンパク質担体へのペプチド、特に環化ペプチドのコンジュゲーションの例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０９２７１４において記載されている。カップリング反応の後、免疫原は、透析方法、ゲル濾過方法、画分化方法などによって、容易に単離および精製することができる。システイン残基で終わっているペプチド（好ましくは、環化領域外のリンカーを有する）は、マレイミド化学を介して、担体タンパク質に共有結合によって都合よくコンジュゲートさせることができる。
【０１４３】
免疫原性担体がＶＬＰである場合、同一のアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有するいくつかの抗原性ペプチドを、単一のＶＬＰ分子にカップリングさせて、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／３２２２７、ＷＯ０３／０２４４８１、ＷＯ０２／０５６９０５、およびＷＯ０４／００７５３８において記載されているような方向付けされたようにいくつかの抗原決定基を提示する、反復性で整列した構造を好ましくはもたらすことができる。
【０１４４】
本開示の１つの態様において、抗原性ペプチドは、化学的架橋、典型的にはおよび好ましくはヘテロ二官能性架橋剤を用いることによる化学的架橋によって、ＶＬＰに結合させる。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が、当技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、ヘテロ二官能性架橋剤は、第１の付着部位と、すなわちＶＬＰまたはＶＬＰサブユニットのリジン残基の側鎖アミノ基と反応し得る官能基、および、好ましい第２の付着部位と、すなわち、抗原性ペプチドに融合しており、場合によっては還元によって反応に利用可能ともされているシステイン残基と反応し得る、さらなる官能基を含有する。典型的には誘導体化と呼ばれる、手順の第１のステップは、ＶＬＰと架橋剤との反応である。この反応の生成物は、活性化型担体とも呼ばれる活性化されたＶＬＰである。第２のステップにおいて、未反応の架橋剤は、ゲル濾過または透析などの標準的な方法を用いて除去される。第３のステップにおいて、抗原性ペプチドは活性化型ＶＬＰと反応し、このステップは、典型的にはカップリングステップと呼ばれる。未反応の抗原性ペプチドは、例えば透析によって、第４のステップにおいて除去されてもよい。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が、当技術分野において知られている。これらには、好ましい架橋剤ＳＭＰＨ（Ｐｉｅｃｅ）、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、および、例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）から入手可能で、アミノ基に対して反応性である１つの官能基とシステイン残基に対して反応性である１つの官能基とを有する、他の架橋剤が含まれる。上記の架橋剤は全て、チオエーテル連結の形成をもたらす。
【０１４５】
本開示の実施において適している別のクラスの架橋剤は、カップリングの際に抗原性ペプチドとＶＬＰとの間にジスルフィド連結を導入することによって特徴付けされる。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えば、ＳＰＤＰおよびＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）が含まれる。架橋剤でのＶＬＰの誘導体化の程度は、各反応パートナーの濃度、他方の試薬に対する一方の試薬の過剰度、ｐＨ、温度、およびイオン強度などの実験条件を変化させることによって影響され得る。カップリングの程度、すなわち、ＶＬＰのサブユニット当たりの抗原性ペプチドの量は、上記の実験条件を変化させてワクチンの要求に適合させることによって調節することができる。
【０１４６】
抗原性ペプチドをＶＬＰに結合させる別の方法は、ＶＬＰの表面上のリジン残基と抗原性ペプチド上のシステイン残基との連結である。いくつかの実施形態において、ＶＬＰへのカップリングには、第２の付着部位またはその一部としてシステイン残基を含有するアミノ酸リンカーを抗原性ペプチドに融合することが必要とされ得る。通常、柔軟なアミノ酸リンカーが好ましい。アミノ酸リンカーの例は、（ａ）ＣＧＧ、（ｂ）Ｎ末端γ１リンカー、（ｃ）Ｎ末端γ３リンカー、（ｄ）Ｉｇヒンジ領域、（ｅ）Ｎ末端グリシンリンカー、（ｆ）ｎ＝０から１２でありｋ＝０から５である（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｎ、（ｇ）Ｎ末端グリシン−セリンリンカー、（ｈ）ｎ＝０から３でありｋ＝０から５でありｍ＝０から１０でありｉ＝０から２である（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｍ（Ｓ）ｉ（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ｉ）ＧＧＣ、（ｋ）ＧＧＣ−ＮＨ２、（ｌ）Ｃ末端γ１リンカー、（ｍ）Ｃ末端γ３リンカー、（ｎ）Ｃ末端グリシンリンカー、（ｏ）ｎ＝０から１２でありｋ＝０から５である（Ｇ）ｎＣ（Ｇ）ｋ、（ｐ）Ｃ末端グリシン−セリンリンカー、（ｑ）ｎ＝０から３でありｋ＝０から５でありｍ＝０から１０でありｔ＝０から２でありｏ＝０から８である（Ｇ）ｍ（Ｓ）ｔ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（Ｇ）ｏＣ（Ｇ）ｋから構成される群から選択される。アミノ酸リンカーのさらなる例は、免疫グロブリンのヒンジ領域、グリシンセリンリンカー（ＧＧＧＧＳ）ｎ、およびグリシンリンカー（Ｇ）ｎであり、全ては、第２の付着部位としてシステイン残基をさらに含有し、さらにグリシン残基を含有していてもよい。典型的には、前記アミノ酸リンカーの好ましい例は、Ｎ末端γ１：ＣＧＤＫＴＨＴＳＰＰ（配列番号９４）、Ｃ末端γ１：ＤＫＴＨＴＳＰＰＣＧ（配列番号９５）、Ｎ末端γ３：ＣＧＧＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰ（配列番号９６）、Ｃ末端γ３：ＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰＧＧＣＧ（配列番号９７）、Ｎ末端グリシンリンカー：ＧＣＧＧＧＧ（配列番号９８）、およびＣ末端グリシンリンカー：ＧＧＧＧＣＧ（配列番号９９）である。
【０１４７】
疎水性抗原性ペプチドがＶＬＰに結合する場合に、本開示の実施において特に適している他のアミノ酸リンカーは、Ｎ末端リンカーではＣＧＫＫＧＧ（配列番号１００）もしくはＣＧＤＥＧＧ（配列番号１０１）であり、またはＣ末端リンカーではＧＧＫＫＧＣ（配列番号１０２）およびＧＧＥＤＧＣ（配列番号１０３）である。Ｃ末端リンカーでは、末端システインは、Ｃ末端でアミド化されていてもよい。
【０１４８】
本開示のいくつかの実施形態において、ペプチドのＣ末端のＧＧＣＧ（配列番号１０４）リンカー、ＧＧＣリンカー、もしくはＧＧＣ−ＮＨ２（「ＮＨ２」はアミド化を表す）リンカー、またはペプチドのＮ末端のＣＧＧが、アミノ酸リンカーとして好ましい。通常、グリシン残基は、大きなアミノ酸同士の間に挿入され、システインは、カップリング反応におけるさらに大きなアミノ酸の潜在的な立体障害を避けるための、第２の付着部位として用いられる。本開示のさらなる実施形態において、アミノ酸リンカーＧＧＣ−ＮＨ２は、抗原性ペプチドのＣ末端に融合される。
【０１４９】
抗原性ペプチド上に存在するシステイン残基は、好ましくは、活性化されたＶＬＰ上のヘテロ二官能性架橋剤と反応するために還元状態であり、すなわち、遊離システイン、または遊離スルフヒドリル基を有するシステイン残基が利用可能である。システイン残基が酸化形態で結合部位として機能する場合、例えば、システイン残基がジスルフィド架橋を形成している場合、例えばＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはｐ−メルカプトエタノールでのこのジスルフィド架橋の還元が好ましい。ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０５６９０において記載されているように、低濃度の還元剤がカップリングに適合しているが、当業者が知っているように、より高い濃度はカップリング反応を阻害し、このケースでは、カップリングの前に、例えば透析、ゲル濾過、または逆相ＨＰＬＣによって、還元剤が除去されるか、またはその濃度が下げられるべきである。
【０１５０】
上記の方法に従ってヘテロ二官能性架橋剤を用いることによって抗原性ペプチドをＶＬＰに結合させると、方向付けされた様式でのＶＬＰへの抗原性ペプチドのカップリングが可能になる。抗原性ペプチドをＶＬＰに結合させる他の方法には、カルボジイミドＥＤＣおよびＮＨＳを用いて抗原性ペプチドをＶＬＰに架橋する方法が含まれる。
【０１５１】
他の方法において、抗原性ペプチドは、グルタルアルデヒド、ＤＳＧＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）、またはＶＬＰのアミン基もしくはカルボキシル基に対して反応性の官能基を有する他の既知のホモ二官能性架橋剤などの、ホモ二官能性架橋剤を用いてＶＬＰに付着させる。
【０１５２】
ＶＬＰを抗原性ペプチドに結合させる他の方法には、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／２３９５５において記載されているように、ＶＬＰがビオチン化されており、抗原性ペプチドがストレプトアビジン融合タンパク質として発現している方法、または抗原性ペプチドおよびＶＬＰの両方がビオチン化されている方法が含まれる。このケースにおいて、抗原性ペプチドは、ストレプトアビジンに対する抗原性ペプチドの比率を調節することによってストレプトアビジンまたはアビジンにまず結合し、それによって、遊離結合部位が、次のステップにおいて添加されるＶＬＰの結合に依然として利用可能となるようにすることができる。代替として、全ての成分を「ワンポット」反応で混合することができる。可溶性形態の受容体および可溶性形態のリガンドが利用可能であり、ＶＬＰまたは抗原性ペプチドに架橋され得る、他のリガンド−受容体対を、抗原性ペプチドをＶＬＰに結合するための結合剤として用いることができる。代替として、リガンドまたは受容体のいずれかを抗原性ペプチドに融合して、受容体またはリガンドのいずれかにそれぞれ化学的に結合しているかまたは融合しているＶＬＰへの結合を仲介させることができる。融合はまた、挿入または置換によって行うことができる。
【０１５３】
立体的に可能であれば、ＲＮＡファージのＶＬＰの露出したリジン残基を好ましくは介して、１つまたはいくつかの抗原分子が、ＲＮＡファージ被覆タンパク質のカプシドまたはＶＬＰの１つのサブユニットに付着し得る。ＲＮＡファージの被覆タンパク質のＶＬＰの、特にＱｂｅｔａ被覆タンパク質のＶＬＰの特異的な特徴は、したがって、サブユニット当たりいくつかの抗原をカップリングする可能性である。これによって、密な抗原アレイの生成が可能になる。
【０１５４】
本開示の１つの実施形態において、ウイルス様粒子への少なくとも１つの抗原または抗原決定基の結合および付着はそれぞれ、ウイルス様粒子の少なくとも１つの第１の付着部位と抗原性ペプチドの少なくとも１つの第２の付着との間の、それぞれ相互作用および関連による。
【０１５５】
Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質のＶＬＰまたはカプシドは、それらの表面上に、カプシドの内部を指しＲＮＡと相互作用する３つのリジン残基、およびカプシドの外部に露出した４つの他のリジン残基との規定されたトポロジーで、規定された数のリジン残基を提示する。これらの規定された特性は、リジン残基がＲＮＡと相互作用する粒子内部への抗原の付着よりも、粒子の外部への抗原の付着に有利である。他のＲＮＡファージ被覆タンパク質のＶＬＰもまた、それらの表面上に規定された数のリジン残基を有し、これらのリジン残基の規定されたトポロジーを有する。
【０１５６】
本開示のさらなる実施形態において、第１の付着部位はリジン残基であり、かつ／または第２の付着はスルフヒドリル基もしくはシステイン残基を包含する。本開示のさらなる実施形態において、第１の付着部位はリジン残基であり、第２の付着部位はシステイン残基である。さらなる実施形態において、抗原または抗原決定基は、システイン残基を介して、ＲＮＡファージ被覆タンパク質のＶＬＰのリジン残基に、特にＱｂｅｔａ被覆タンパク質のＶＬＰに結合する。
【０１５７】
ＲＮＡファージに由来するＶＬＰの別の利点は、細菌における発現収量が高いことであり、これにより、手頃なコストで大量の物質の生産が可能になる。さらに、担体としてＶＬＰを用いることで、可変の抗原密度をそれぞれ有する強力な抗原アレイおよびコンジュゲートの形成が可能になる。特に、ＲＮＡファージのＶＬＰの使用、ここでは特にＲＮＡファージＱｂｅｔａ被覆タンパク質のＶＬＰの使用により、非常に高いエピトープ密度を達成することができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、免疫原性コンジュゲートの混合物、すなわち、１つまたは複数の抗原性タウペプチドにカップリングした免疫原性担体を包含し得る。したがって、これらの免疫原性組成物は、アミノ酸配列が異なる免疫原性担体からなり得る。例えば、「野生型」ＶＬＰタンパク質と１つまたは複数のアミノ酸残基が改変されている（例えば、欠失、挿入、または置換されている）修飾されたＶＬＰタンパク質とを包含するワクチン組成物が調製され得る。代替として、同一の免疫原性担体を用いことができるが、それらは、異なるアミノ酸配列の抗原性タウペプチドにカップリングされている。
【０１５９】
したがって、本開示はまた、ｉ）本開示に従った抗原性タウペプチドを提供するステップ、ｉｉ）本開示に従った免疫原性担体、好ましくはＶＬＰを提供するステップ、およびｉｉｉ）前記抗原性タウペプチドと前記免疫原性担体とを組み合わせるステップを包含する、免疫原を生産するための方法に関する。１つの実施形態において、前記組み合わせステップは、化学的架橋を介して、好ましくはヘテロ二官能性架橋剤を介して行われる。
【０１６０】
抗原性タウペプチドを包含する組成物
本開示はまた、好ましくは免疫原性担体に連結した、より好ましくはＶＬＰに連結した、さらに好ましくはＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、またはＱｂｅｔａのＶＬＰに連結した、本開示の抗原性タウペプチドと、場合によっては少なくとも１つのアジュバントとを包含する組成物、特に「対象免疫原性組成物」とも呼ばれる免疫原性組成物に関するものである。このような免疫原性組成物は、特に医薬組成物として製剤されると、アルツハイマー病などのタウ関連性の障害を予防、治療、または軽減するために有用であると考えられる。
【０１６１】
免疫原性組成物
いくつかの実施形態において、本開示に従った対象免疫原性組成物は、配列番号１から２６、３１から７６、および１０５から１２２から選択されるアミノ酸配列を包含する抗原性タウペプチドを包含する。いくつかの実施形態において、前記抗原性タウペプチドは、免疫原性担体、好ましくはＶＬＰ、より好ましくはＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、またはＱｂｅｔａのＶＬＰに連結している。
【０１６２】
本開示に従った抗原性タウペプチドを包含する対象免疫原性組成物は、以下にさらに詳細に記載されるように、多くの手段で製剤することができる。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、対象免疫原性組成物は、単一種の抗原性タウペプチドを包含し、例えば、免疫原性組成物は、そのほぼ全てが同一のアミノ酸配列を有する抗原性タウペプチドの集団を包含する。別の実施形態において、対象免疫原性組成物は、２つ以上の異なる抗原性タウペプチドを包含し、例えば、免疫原性組成物は、集団のメンバーでアミノ酸配列が異なり得る、抗原性タウペプチドの集団を包含する。
【０１６４】
例えば、いくつかの実施形態において、対象免疫原性組成物は、好ましくは免疫原性担体に連結し、より好ましくはＶＬＰに連結し、さらに好ましくはＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、またはＱｂｅｔａのＶＬＰに連結し、配列番号１から２６、３１から７６、および１０５〜１２２から選択される第１のアミノ酸配列を包含する、第１の抗原性タウペプチドと、好ましくは免疫原性担体に連結し、より好ましくはＶＬＰに連結し、さらに好ましくはＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、またはＱｂｅｔａのＶＬＰに連結し、配列番号１から２６、３１から７６、および１０５〜１２２から好ましくは選択される第２のアミノ酸配列を包含する、少なくとも第２の抗原性タウペプチドとを包含し、第２のアミノ酸配列は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６から１０個、または１５個のアミノ酸が、第１のアミノ酸配列と異なる。
【０１６５】
別の例として、対象免疫原性組成物は、好ましくは免疫原性担体に連結し、より好ましくはＶＬＰに連結し、さらに好ましくはＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、またはＱｂｅｔａのＶＬＰに連結し、配列番号１から２６、３１から７６、および１０５〜１２２から選択される第１のアミノ酸配列を包含する、第１の抗原性タウペプチドと、好ましくは免疫原性担体に連結し、より好ましくはＶＬＰに連結し、さらに好ましくはＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、またはＱｂｅｔａのＶＬＰに連結し、配列番号１から２６、３１から７６、および１０５〜１２２から好ましくは選択される第２のアミノ酸配列と（第２のアミノ酸配列は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６から１０個、または１５個のアミノ酸が、第１のアミノ酸配列と異なる）、好ましくは免疫原性担体に連結し、より好ましくはＶＬＰに連結し、さらに好ましくはＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、またはＱｂｅｔａのＶＬＰに連結し、配列番号１から２６、３１から７６、および１０５〜１２２から好ましくは選択される第３のアミノ酸配列を包含する、少なくとも第３の抗原性タウペプチド（第３のアミノ酸配列は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６から１０個、または１５個のアミノ酸が、第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列の両方と異なる）とを包含する。
【０１６６】
他の実施形態において、対象免疫原性組成物は、上記のマルチマー化されている抗原性タウペプチドを包含する。本明細書において用いられる場合、「抗原性タウペプチドを包含する免疫原性組成物」または「本開示の免疫原性組成物」または「対象免疫原性組成物」という用語は、免疫原性担体に結合しているまたはしていない単一種（マルチマー化されているまたはされていない）または複数種の（１つまたは複数の）抗原性タウペプチドを包含する免疫原性組成物を言う。
【０１６７】
アジュバント
いくつかの実施形態において、対象免疫原性組成物は、少なくとも１つのアジュバントを包含する。適切なアジュバントには、哺乳動物における、好ましくはヒトにおける使用に適したものが含まれる。ヒトにおいて用いることができる既知の適切なアジュバントの例には、必ずしも限定はしないが、アラム、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（商標）（４．３％ｗ／ｖのスクアレン、０．５％ｗ／ｖのポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％ｗ／ｖのソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ８５））、ＣｐＧ含有核酸（シトシンがメチル化されていないもの）、ＱＳ２１（サポニンアジュバント）、ＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−脱アセチル型ＭＰＬ）、Ａｑｕｉｌｌａの抽出物、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．６４：７１３（１９９８）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０３１８４、ＷＯ９６／１１７１１、ＷＯ００／４８６３０、ＷＯ９８／３６７７２、ＷＯ００／４１７２０、ＷＯ０６／１３４４２３、およびＷＯ０７／０２６１９０を参照されたい）、ＬＴ／ＣＴ突然変異体、Ｄ，Ｌ−ラクチドグリコリド共重合体（ＰＬＧ）微小粒子、Ｑｕｉｌ  Ａインターロイキンなどが含まれる。限定はしないが動物実験を含む獣医学的適用では、フロイントアジュバント、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれるＣＧＰ１１６３７）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれるＣＧＰ１９８３５Ａ）、ならびに、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中に、細菌から抽出される３つの成分、すなわちモノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有する、ＲＩＢＩを用いることができる。
【０１６８】
組成物の有効性を増強させるためのさらなる典型的なアジュバントには、限定はしないが、（１）水中油型エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（以下を参照されたい）または細菌細胞壁成分などの他の特異的免疫刺激剤を有するかまたは有さない）、例えば、（ａ）マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロンの粒子中に製剤された、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）および０．５％Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンに共有結合によって連結したムラミルトリペプチド（ＭＴＰ−ＰＥ）を含有していてもよい）を含有するＭＦ５９（商標）（ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５のＣｈａｐｅｒ  １０）、（ｂ）サブミクロンのエマルジョン中にマイクロ流体化されているまたはより大きな粒子サイズのエマルジョンを生成するようにボルテックスされた、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および１つまたは複数の細菌細胞壁成分、例えば、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））を含有する、ＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、（２）ＱＳ２１、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）、Ａｂｉｓｃｏ（登録商標）（Ｉｓｃｏｎｏｖａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、もしくはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）などのサポニンアジュバント、またはそれらから生成する粒子、例えばＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）（このＩＳＣＯＭは、さらなる洗浄剤を含んでいない可能性がある、例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／０７６２１）、（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、（４）サイトカイン、例えば、インターロキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／４４６３６）など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など、（５）肺炎球菌糖と共に用いる場合には場合によっては実質的にアラム非存在下の（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ００／５６３５８）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル型ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、例えば、英国特許第ＧＢ−２２２０２２１および欧州特許第ＥＰ−Ａ−０６８９４５４、（６）３ｄＭＰＬと例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ、例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１、（７）ＣｐＧモチーフを包含するオリゴヌクレオチド［Ｋｒｉｅｇ、Ｖａｃｃｉｎｅ（２０００）１９：６１８〜６２２；Ｋｒｉｅｇ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ（２００１）３：１５〜２４；Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９７）３：８４９〜８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（１９９７）９４：１０８３３〜１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９８）１６０：８７０〜８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ（１９９７）１８６：１６２３〜１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅａｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）２７：２３４０〜２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｍｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９８８）１６：１２１６〜１２２４；Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７４：５４６〜５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（１９９６）９３：２８７９〜２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１５７：１８４０〜１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９６）１５６：４５７０〜４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１６７：７２〜７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９８８）７９：８６６〜８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１５７：２１１６〜２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）１４７：１７５９〜１７６４；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９６）１５７：４９１８〜４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９６）１５７：５３９４〜５４０２；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６０：４７５５〜４７６１；およびＹｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９８）１６０：５８９８〜５９０６；ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５５４９５、ＷＯ９８／３７９１９、およびＷＯ９８／５２５８１］、すなわち、シトシンがメチル化されていない、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチド、（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５２５４９、（９）オクトキシノールと組み合わされたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／２１２０７）、または、オクトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わされたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／２１１５２）、（１０）サポニンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（ＰＣＴ公開第ＷＯ００／６２８００）、（１１）免疫刺激物質および金属塩粒子、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／２３１０５、（１２）サポニンおよび水中油型エマルジョン、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１１２４１、（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（＋ステロールでもよい）、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／５７６５９、（１４）免疫刺激剤として作用して組成物の有効性を増強させる他の物質、例えば、Ｎ−アセチ���ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタルニニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）を含むムラミルペプチド、（１５）ポリＩ：Ｃおよび類似の成分、例えばＨｉｌｔｏｎｏｌおよびＡｍｐｌｉｇｅｎなどのＴＬＲ３リガンドを含む、天然のまたは合成のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンド（例えば、Ｋａｎｚｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１３：１５５２〜１５５９（２００７）において記載されている）が含まれる。
【０１６９】
１つの実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、少なくとも１つのアジュバントを包含する。特定の実施形態において、前記アジュバントは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、より好ましくはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。１つの実施形態において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、核酸配列５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’（ＣｐＧ７９０９、配列番号２７）を有する。別の実施形態において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、核酸配列５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ３’（ＣｐＧ２４５５５、配列番号２９）を有する。免疫刺激性オリゴヌクレオチドの配列番号２９の核酸配列は、最も３’側のＣＧジヌクレオチドの逆転によって、以前に報告された免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ１０１０３）５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＴＴ３’（配列番号２８）と異なる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性が、ＣｐＧモチーフの数、ＣＧジヌクレオチドに隣接する配列、（１つまたは複数の）ＣｐＧモチーフの位置、およびＣｐＧモチーフ間の間隔に依存することが以前に報告されているため（Ｂａｌｌａｓら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；Ｈａｒｔｍａｎｎら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；Ｋｌｉｎｍａｎら、２００３、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、これらの２つの免疫刺激性オリゴヌクレオチド間の活性の類似性は、驚くべきものである。免疫原性オリゴヌクレオチドＣｐＧ２４５５５における最も３’側のＣＧジヌクレオチドの除去は、以前の開示から予想された、この免疫原性オリゴヌクレオチドの、抗原特異的免疫応答を増大させる能力に対して、負の影響をもたらさなかった。ＣｐＧ２４５５５は、ＣｐＧ１０１０３と比較して、類似の、およびいくつかのケースでは増強された免疫刺激活性を示した。
【０１７０】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖であり得る。通常、二本鎖分子はインビボでより安定であるが、一本鎖分子は、増大した免疫活性を有する。したがって、本開示のいくつかの態様において、核酸は一本鎖であることが好ましく、他の態様において、核酸は二本鎖であることが好ましい。
【０１７１】
本明細書において開示されるＣｐＧ配列のいずれか（例えば、ＣｐＧ２４５５５、ＣｐＧ１０１０３、およびＣｐＧ７９０９）では、ヌクレオチド間連結のいずれかは、ホスホロチオエート結合またはホスホジエステル結合であり得る。
【０１７２】
「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いられ、複数のヌクレオチド、すなわち、リン酸基と、置換されたピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、またはウラシル（Ｕ））または置換されたプリン（例えば、アデニン（Ａ）またはグルタミン（Ｇ））である交換可能な有機塩基とに連結している糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を包含する分子を意味する。本明細書において用いられる場合、この用語は、オリゴリボヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチドからリン酸を除いたもの）および任意の他の有機塩基を含有するポリマーを言う。核酸分子は、既存の核酸源（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から得ることができるが、好ましくは合成によるものである（例えば、核酸合成によって生産される）。
【０１７３】
１つの実施形態において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、天然のＲＮＡおよびＤＮＡと比較して、ホスホジエステルヌクレオチド間架橋、β−Ｄ−リボース（デオキシリボース）単位、および／または天然のヌクレオシド塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル）による、様々な化学的修飾および置換を包含し得る。化学的修飾の例は、当業者に知られており、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅ．ら（１９９０）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３；「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ」、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ＆  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＵＳＡ  １９９３；Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ら（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３６：１０７〜１２９；およびＨｕｎｚｉｋｅｒ  Ｊ．ら（１９９５）、Ｍｏｄ．Ｓｙｎｔｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７：３３１〜４１７において記載されている。本開示に従ったオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾を有し得、各修飾は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡからなる同一の配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のホスホジエステルヌクレオシド間架橋および／または特定のβ−Ｄ−（デオキシ）リボース単位および／または特定の天然ヌクレオシド塩基の位置に位置する。
【０１７４】
例えば、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾を包含し得る。このような修飾は、ａ）修飾されたヌクレオシド間架橋による、ヌクレオシドの３’末端および／または５’末端に位置するホスホジエステルヌクレオシド間架橋の置き換え、ｂ）脱リン酸架橋による、ヌクレオシドの３’末端および／または５’末端に位置するホスホジエステル架橋の置き換え、ｃ）別の単位による、糖リン酸骨格の糖リン酸単位の置き換え、ｄ）修飾された糖単位による、β−Ｄ−リボース単位の置き換え、ならびにｅ）天然ヌクレオシド塩基の置き換えから選択され得る。
【０１７５】
核酸にはまた、Ｃ−５プロピンピリミジン修飾塩基および７−デアザ−７−置換プリン修飾塩基などの、置換されたプリンおよびピリミジンが含まれる（Ｗａｇｎｅｒら、１９９６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４０〜４）。プリンおよびピリミジンには、限定はしないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに他の天然由来および非天然由来の核酸塩基、置換されたおよび置換されていない芳香族部分が含まれる。他のこのような修飾は、当業者に周知である。
【０１７６】
修飾された塩基は、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、およびＵなどの、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて典型的に見られる天然由来の塩基と化学的に異なるが、これらの天然由来の塩基と基本的な化学的構造を共有する、任意の塩基である。修飾されたヌクレオシド塩基は、例えば、ヒポキサンチン、ウラシル、ジヒドロウラシル、偽ウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、２，４−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換された７−デアザプリン、好ましくは７−デアザ−７−置換プリンおよび／または７−デアザ−８−置換プリン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、例えば、Ｎ４−エチルシトシン、５−ヒドロキシデオキシシチジン、５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、Ｎ４−アルキルデオキシシチジン、例えば、Ｎ４−エチルデオキシシチジン、６−チオデオキシグアノシン、およびニトロピロールのデオキシリボヌクレオシド、Ｃ５−プロピニルピリミジン、およびジアミノプリン、例えば、２，６−ジアミノプリン、イノシン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、または天然ヌクレオシド塩基の他の修飾から選択され得る。このリストは例示的なものであり、限定的なものであると解釈されるものではない。
【０１７７】
本開示のいくつかの態様において、本明細書において記載される免疫刺激性オリゴヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドは、好ましくはメチル化されていない。メチル化されていないＣｐＧモチーフは、メチル化されていないシトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、メチル化されていない５’シトシンの後に３’グアノシンがあり、リン酸結合によって連結されている）である。他の態様において、ＣｐＧモチーフはメチル化されている。メチル化されたＣｐＧモチーフは、メチル化されたシトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、メチル化された５’シトシンの後に３’グアノンシンがあり、リン酸結合によって連結されている）である。
【０１７８】
本開示のいくつかの態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、修飾されたシトシンを含有し得る。修飾されたシトシンは、シトシンの天然由来または非天然由来のピリミジン塩基類似体であり、これは、オリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を低下させることなく、この塩基を置き換えることができる。修飾されたシトシンには、限定はしないが、５−置換シトシン（例えば、５−メチルシトシン、５−フルオロシトシン、５−クロロシトシン、５−ブロモシトシン、５−ヨードシトシン、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ジフルオロメチルシトシン、および置換されていないまたは置換されている５−アルキルシトシン）、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン（例えば、Ｎ４−エチルシトシン）、５−アザシトシン、２−メルカプトシトシン、イソチトシン、偽イソシトシン、縮合環系を有するシトシン類似体（例えば、Ｎ，Ｎ’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン）、ならびにウラシルおよびそれらの誘導体（例えば、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ブロモビニルウラシル、４−チオウラシル、５−ヒドロキシウラシル、５−プロピニルウラシル）が含まれる。好ましいシトシンのいくつかには、５−メチルシトシン、５−フルオロシトシン、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、およびＮ４−エチルシトシンが含まれる。本開示の別の実施形態において、シトシン塩基は、ユニバーサル塩基（例えば、３−ニトロピロール、Ｐ塩基）、芳香環系（例えば、フルオロベンゼンまたはジフルオロベンゼン）、または水素原子（ｄＳｐａｃｅｒ）によって置換される。
【０１７９】
本開示のいくつかの態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、修飾されたグアニンを含有し得る。修飾されたグアニンは、グアニンの天然由来または非天然由来のプリン塩基類似体であり、これは、オリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を低下させることなく、この塩基を置き換えることができる。修飾されたグアニンには、限定はしないが、７−デアザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２−置換グアニン（例えば、Ｎ２−メチルグアニン）、５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換されたアデニン（例えば、Ｎ６−メチルアデニン、８−オキソアデニン）、８−置換グアニン（例えば、８−ヒドロキシグアニンおよび８−ブロモグアニン）、および６−チオグアニンが含まれる。本開示の別の実施形態において、グアニン塩基は、ユニバーサル塩基（例えば、４−メチルインドール、５−ニトロインドール、およびＫ塩基）、芳香環系（例えば、ベンズイミダゾールまたはジクロロベンズイミダゾール、１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボン酸アミド）、または水素原子（ｄＳｐａｃｅｒ）によって置換される。
【０１８０】
特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド間連結を含み得る。これらの修飾された結合は、分解に対して部分的に耐性であり得る（例えば、安定化されている）。「安定化された核酸分子」は、（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを介する）インビボでの分解に対して比較的耐性である核酸分子を意味する。安定化は、長さまたは二次構造に依存し得る。数十から数百キロベース長さの核酸は、インビボでの分解に対して比較的耐性である。より短い核酸では、二次構造は安定化し、それらの効果を増大させることができる。ステムループ構造の形成は、核酸分子を安定化させ得る。例えば、核酸の３’末端が上流領域に対する自己相補性を有しており、そのため、再びフォールディングしてステムループ構造を形成し得る場合、核酸は安定化し、さらなる活性を示し得る。
【０１８１】
インビボにおける使用では、核酸は好ましくは（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼを介する）分解に対して比較的耐性である。インビボで投与されると、核酸骨格の修飾が核酸の活性を増強させることが実証されている。ステムループなどの二次構造は、分解に対して核酸を安定化させ得る。代替として、核酸の安定化は、リン酸骨格の修飾を介して実現され得る。好ましい安定化された核酸は、少なくとも部分的なホスホロチオエート修飾骨格を有する。ホスホロチオエートは、ホスホロアミデート化学またはＨ−ホスホロネート化学のいずれかを用いる自動技術を用いて合成することができる。アリールホスホネートおよびアルキルホスホネートは、例えば米国特許第４，４６９，８６３号において記載されているように作製することができ、アルキルホスホトリエステル（これにおいて、荷電した酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号において記載されているように、アルキル化されている）は、市販されている試薬を用いる自動固相合成によって調製することができる。ＤＮＡ骨格の他の修飾および置換を作製するための方法が記載されている（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：１６５）。ＣｐＧモチーフを有する２’−Ｏ−メチル核酸はまた、エトキシ修飾型ＣｐＧ核酸のように、免疫活性化を生じさせる。実際、ＣｐＧ効果を完全になくす骨格修飾は見出されていないが、前記効果は、Ｃを５−メチルＣで置き換えることによって大きく低減する。ホスホロチオエート連結を有する構築物は、最大の活性をもたらし、細胞内のエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解から核酸を保護する。他の修飾された核酸には、ホスホジエステル修飾核酸、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート核酸の組み合わせ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ−エトキシ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。これらの組み合わせおよび免疫細胞に対するこれらの特別な効果のそれぞれは、ＣｐＧ核酸に関して、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／０２５５５およびＷＯ９８／１８８１０、ならびに米国特許第６，１９４，３８８号および米国特許第６，２３９，１１６号においてさらに詳細に論じられている。これらの修飾された核酸は、増強したヌクレアーゼ耐性、増大した細胞取り込み、増大したタンパク質結合、および／または改変された細胞内局在化に起因して、さらなる刺激活性を示し得ると考えられる。
【０１８２】
インビボでの投与では、核酸は、標的細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、単球細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）表面への高親和性の結合および／または標的細胞による細胞取り込みの増大をもたらす分子を伴って、「核酸送達複合体」を形成し得る。核酸は、イオン性であり得るか、または、当技術分野において周知の技術を用いて、共有結合によって適切な分子を伴い得る。様々なカップリング剤または架橋剤、例えば、タンパク質Ａ、カルボジイミド、およびＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を用いることができる。核酸は代替として、周知の技術を用いて、リポソームまたはビロソーム中にカプセル化することができる。
【０１８３】
他の安定化された核酸には、限定はしないが、非イオン性ＤＮＡ類似体、例えばアルキルホスフェートおよびアリールホスフェート（これにおいて、荷電したホスホネート酸素は、アルキル基またはアリール基によって置き換えられている）、荷電した酸素部分がアルキル化されているホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステルが含まれる。いずれかのまたは両方の末端にジオール、例えばテトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールを含有する核酸はまた、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性であることが示されている。いくつかの実施形態において、本開示の免疫刺激性オリゴヌクレオチドには、少なくとも１つの親油性の置換されたヌクレオチド類似体および／またはピリミジン−プリンジヌクレオチドが含まれ得る。
【０１８４】
オリゴヌクレオチドは、１つまたは２つのアクセス可能な５’末端を有し得る。２つのこのような５’末端を有する修飾されたオリゴヌクレオチドを生じさせることは、例えば２つのオリゴヌクレオチドを３’−３’連結を介して付着させて、１つまたは２つのアクセス可能な５’末端を有するオリゴヌクレオチドを生成することによって可能である。３’−３’連結は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、または任意の他の修飾されたヌクレオチド間架橋であり得る。このような連結を実現するための方法は、当技術分野において知られている。例えば、このような連結は、Ｓｅｌｉｇｅｒ，Ｈ．ら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ３’−３’−  ａｎｄ  ５’−５’−ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅｓ  ａｓ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９１）、１０（１〜３）、４６９〜７７およびＪｉａｎｇ，ら、Ｐｓｅｕｄｏ−ｃｙｃｌｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）、７（１２）、２７２７〜２７３５において記載されている。
【０１８５】
さらに、３’末端ヌクレオシド間の連結がホスホジエステル、ホスホロチオエート、または他の修飾された架橋ではない、３’−３’連結型オリゴヌクレオチドを、トリエチレングリコールホスフェート部分またはテトラエチレングリコースホスフェート部分などのさらなるスペーサーを用いて調製することができる（Ｄｕｒａｎｄ，Ｍ．ら、Ｔｒｉｐｌｅ−ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｏｎｅ（ｄＡ）１２  ａｎｄ  ｔｗｏ（ｄＴ）１２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｒｉｄｇｅｄ  ｂｙ  ｔｗｏ  ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｃｈａｉｎｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２）、３１（３８）、９１９７〜２０４、米国特許第５，６５８，７３８号および米国特許第５，６６８，２６５号）。代替として、非ヌクレオチド性リンカーを、標準的なホスホロアミダイト化学を用いて、エタンジオール、プロパンジオール、または脱塩基性デオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）単位（Ｆｏｎｔａｎｅｌ，Ｍａｒｉｅ  Ｌａｕｒｅｎｃｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４）、２２（１１）、２０２２〜７）から誘導することができる。非イオン性リンカーは、１回もしくは複数回組み込むことができるか、または、互いに組み合わせて、連結される２つのオリゴヌクレオチドの３末端間で任意の所望の距離を可能にする。
【０１８６】
ヌクレオシドの３’末端および／または５’末端に位置するホスホジエステルヌクレオシド間架橋は、修飾されたヌクレオシド間架橋によって置き換えることができ、前記修飾されたヌクレオシド間架橋は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ＮＲ１Ｒ２−ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、α−ヒドロキシベンジルホスホネート、ホスフェート−（Ｃ１−Ｃ２１）−Ｏ−アルキルエステル、ホスフェート−［（Ｃ６−Ｃ１２）アリール−（Ｃ１−Ｃ２１）−Ｏ−アルキル］エステル、（Ｃ１−Ｃ８）アルキルホスホネート架橋、および／または（Ｃ６−Ｃ１２）アリールホスホネート架橋、（Ｃ７−Ｃ１２）−α−ヒドロキシメチルアリール（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０１３６３において開示されている）から選択され、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ２０）アリール、および（Ｃ６−Ｃ１４）アリールは、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノによって置換されていてもよく、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、水素、（Ｃ１−Ｃ１８）アルキル、（Ｃ６−Ｃ２０）アリール、（Ｃ６−Ｃ１４）アリール、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、好ましくは水素、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、好ましくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、および／もしくはメトキシエチルであるか、または、Ｒ１およびＲ２は、それらを坦持する窒素原子と共に、Ｏ基、Ｓ基、およびＮ基から選択されるさらなるヘテロ原子をさらに含有し得る５から６員の複素環を形成する。
【０１８７】
脱リン酸架橋によるホスホジエステル架橋の置き換えは、ヌクレオシドの３’末端および／または５’末端に位置し（脱リン酸架橋は、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ  Ａ．「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌ．２０、「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ」、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ  １９９３、Ｃｈａｐｔｅｒ  １６、ｐｐ．３５５ｆｆにおいて記載されている）、脱リン酸架橋は、例えば、脱リン酸架橋ホルムアセタール、３’−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホン、および／またはシリル基から選択される。
【０１８８】
本開示の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、キメラ骨格を有していてもよい。キメラ骨格は、２つ以上のタイプの連結を包含する骨格である。１つの実施形態において、キメラ骨格は、式：５’Ｙ１Ｎ１ＺＮ２Ｙ２  ３’によって表すことができる。Ｙ１およびＹ２は、１から１０個の間のヌクレオチドを有する核酸分子である。Ｙ１およびＹ２はそれぞれ、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間連結を含む。キメラオリゴヌクレオチドの少なくとも２つのヌクレオチドは骨格の修飾を含むため、これらの核酸は、１つのタイプの「安定化された免疫刺激性核酸」の例である。
【０１８９】
キメラオリゴヌクレオチドに関して、Ｙ１およびＹ２は、互いに独立していると考えられる。このことは、Ｙ１およびＹ２のそれぞれが、同一の分子内に、互いに異なる配列および異なる骨格連結を有していてもいなくてもよいことを意味する。いくつかの実施形態において、Ｙ１および／またはＹ２は、３から８個の間のヌクレオチドを有する。Ｎ１およびＮ２は、Ｎ１ＺＮ２が全部で少なくとも６個のヌクレオチドを有する限り、０から５個の間のヌクレオチドを有する核酸分子である。Ｎ１ＺＮ２のヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を有し、修飾された骨格を有する核酸を含まない。Ｚは、免疫刺激性核酸モチーフであり、好ましくは、本明細書において列挙されるものから選択される。
【０１９０】
式Ｙ１Ｎ１ＺＮ２Ｙ２の中央のヌクレオチド（Ｎ１ＺＮ２）は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合を有し、Ｙ１およびＹ２は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間連結を有するが、２つ以上の修飾されたヌクレオチド間連結を有し得るか、またはさらに全ての修飾されたヌクレオチド間連結を有し得る。好ましい実施形態において、Ｙ１および／またはＹ２は、少なくとも２つのもしくは２から５個の間の修飾されたヌクレオチド間連結を有するか、または、Ｙ１が５個の修飾されたヌクレオチド間連結を有し、Ｙ２が２個の修飾されたヌクレオチド間連結を有する。いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート修飾連結、ホスホロジチオエート連結、またはｐ−エトキシ修飾連結である。
【０１９１】
核酸にはまた、２’位のヒドロキシル基および５’位のリン酸基以外の低分子量の有機基に共有結合によって付着している骨格糖を有する核酸が含まれる。したがって、修飾された核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含む。さらに、修飾された核酸は、リボースの代わりにアラビノースまたは２’−フルオロアラビノースなどの糖を含み得る。したがって、核酸は、骨格の組成において異種であり得、それによって、ペプチド−核酸（アミノ酸骨格と核酸塩基とを有する）などの、共に連結したポリマー単位のあらゆる考えられる組み合わせを含有する。いくつかの実施形態において、核酸は、骨格の組成において均質である。
【０１９２】
糖リン酸骨格の糖リン酸単位（すなわち、糖リン酸単位を共に形成するβ−Ｄ−リボースおよびホスホジエステルヌクレオシド間架橋）（すなわち、糖リン酸骨格は、糖リン酸単位からなる）は、別の単位によって置き換えることができ、他の単位は、例えば、「モルホリノ誘導体」オリゴマー（例えば、Ｓｔｉｒｃｈａｋ  Ｅ．Ｐ．ら、（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：６１２９〜４１において記載されている）の構築、すなわち例えばモルホリノ誘導体による置き換え、またはポリアミド核酸（「ＰＮＡ」、例えばＮｉｅｌｓｅｎ  Ｐ．Ｅ．ら、（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３〜７において記載されている）の構築、例えば、ＰＮＡ骨格単位、例えば２−アミノエチルグリシンによる置き換えに適している。オリゴヌクレオチドは、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを伴う骨格切片を有するオリゴヌクレオチドなどの、糖質骨格の他の修飾および置き換えを有し得る。アルキルリンカーは、枝分かれしていてもいなくてもよく、置換されていてもいなくてもよく、化学的に純粋であるかまたはラセミ混合物であり得る。
【０１９３】
βリボース単位またはβ−Ｄ−２’デオキシリボースユニットは、修飾された糖単位によって置き換えることができ、修飾された糖単位は、例えば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−２’−デオキシリボース、Ｌ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−アラビノース、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボースから選択され、好ましくは、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボースは、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルケニルリボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］リボース、２’−ＮＨ２−２’−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロフラノース、α−アラビノフラノース、２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロヘキソピラノース、ならびに炭素環式糖類似体（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  Ｊ．（１９９２）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：８３２０において記載されている）および／または開鎖糖類似体（例えば、Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅら、（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：７２２３において記載されている）および／または二環糖類似体（例えば、Ｔａｒｋｏｖ  Ｍ．ら、（１９９３）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．７６：４８１において記載されている）である。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、特に、ホスホジエステルヌクレオシド間結合またはホスホジエステル様ヌクレオシド間連結によって連結されている一方または両方のヌクレオチドでは、糖は、２’−Ｏ−メチルリボースである。
【０１９５】
本開示のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の多くの手順のいずれかを用いて、デノボ合成することができる。例えば、ｂ−シアノエチルホスホロアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．、（１９８１）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１５８９）、ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇら、（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１〜４０５４；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９〜５４０７；Ｇａｒｅｇｇら、（１９８６）２７：４０５５〜４０５８；Ｇａｆｆｎｅｙら、（１９８８）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９〜２６２２）。これらの化学は、市場で入手可能な、様々な自動核酸合成装置によって行うことができる。これらのオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドと呼ばれる。代替として、Ｔに富んだジヌクレオチドおよび／またはＴＧジヌクレオチドが、プラスミドにおいて大規模で生産され得（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｔ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９を参照されたい）、より小さな片に分離されるかまたは丸ごと投与される。核酸は、制限酵素、エキソヌクレアーゼ、またはエンドヌクレアーゼを用いるものなどの既知の技術を用いて、既存の核酸配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から調製することができる。
【０１９６】
ホスホロチオエートなどの修飾された骨格は、ホスホロアミデート化学またはＨ−ホスホネート化学を用いる自動技術を用いて合成することができる。例えば米国特許第４，４６９，８６３号において記載されているように、アリールホスホネートおよびアルキルホスホネートを作製することができ、アルキルホスホトリエステル（荷電した酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号において記載されているようにアルキル化されている）は、市販されている試薬を用いる自動固相合成によって調製することができる。ＤＮＡ骨格の他の修飾および置換を作製するための方法が記載されている（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４、１９９０；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：１６５、１９９０）。
【０１９７】
このように調製される核酸は、単離された核酸と呼ばれる。「単離された核酸」は通常、細胞、核、ミトコンドリア、またはクロマチンから、および汚染物質と考えられ得る任意の他の成分から核酸と共に分離された成分から分離された核酸を言う。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、当業者に知られている方法に従って免疫原性担体と簡単に混合することができる（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０２４４８０を参照されたい）。本開示の他の実施形態において、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、ＶＬＰ中に封入され得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０２４４８１を参照されたい）。
【０１９９】
本開示の状況におけるアジュバントの例には、アラム；ＣｐＧ７０７９、ＣｐＧ１０１０３、およびＣｐＧ２４５５５などのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド；ならびに単独でまたは組み合わせて用いることができるＩｓｃｏｍａｔｒｉｘなどのサポニンベースのアジュバントが含まれる。
【０２００】
したがって、本開示は、抗原性タウペプチドを包含する、好ましくは配列番号１から２６、３１から７６、および１０５から１２２から構成される群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも１つのアジュバントとを包含する免疫原性組成物を提供する。前記抗原性タウペプチドは、好ましくは、免疫原性担体、好ましくはＶＬＰ、より好ましくはＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、またはＱｂｅｔａのＶＬＰに連結している。１つの実施形態において、前記アジュバントは、サポニンベースのアジュバント、好ましくはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘである。別の実施形態において、前記アジュバントはアラムである。さらに別の実施形態において、前記アジュバントは、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。好ましくは、前記アジュバントは、ＣｐＧ７９０９またはＣｐＧ１０１０３である。より好ましくは、前記アジュバントは、ＣｐＧ２４５５５である。
【０２０１】
さらに別の実施形態において、前記少なくとも１つのアジュバントは、アラム、サポニンベースのアジュバント、およびＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドから構成される群から好ましくは選択される、２つのアジュバントを包含する。好ましい実施形態において、前記アジュバントは、アラムおよびＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、好ましくは、ＣｐＧ７９０９であり、好ましくはＣｐＧ１０１０３であり、より好ましくはＣｐＧ２４５５５である。別の好ましい実施形態において、前記アジュバントは、サポニンベースのアジュバント、好ましくはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ、およびＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、好ましくはＣｐＧ７９０９、好ましくはＣｐＧ１０１０３、より好ましくはＣｐＧ２４５５５である。別の好ましい実施形態において、前記アジュバントは、アラムおよびサポニンベースのアジュバントであり、好ましくはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘである。
【０２０２】
さらに別の実施形態において、前記少なくとも１つのアジュバントは、アラム、サポニンベースのアジュバント、好ましくはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ、およびＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、例えばＣｐＧ７９０９、ＣｐＧ１０１０３、およびＣｐＧ２４５５５から構成される群から好ましくは選択される、３つのアジュバントを包含する。
【０２０３】
製剤
本開示はまた、１つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤を伴う製剤中の、本開示の抗原性タウペプチドまたはその免疫原性組成物を包含する医薬組成物を提供する。「賦形剤」という用語は、本明細書において、活性原料以外の任意の原料、すなわち、免疫原性担体に最終的にカップリングされ、１つまたは複数のアジュバントと組み合わされていてもよい本開示の抗原性タウペプチド以外の任意の原料を記載するために用いられる。（１つまたは複数の）賦形剤の選択は、特定の投与様式、可溶性および安定性に対する賦形剤の影響、ならびに投薬形態の性質などの因子に大きく依存する。本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容できる賦形剤」には、物理学的に適合する、任意のおよび全ての溶媒、分散媒質、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容できる賦形剤のいくつかの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。多くのケースにおいて、組成物中に、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。薬学的に許容できる物質のさらなる例は、活性原料の保存期間または有効性を増強させる、湿潤剤、あるいは微量の補助物質、例えば、湿潤もしくは乳化剤、防腐剤、または緩衝剤である。
【０２０４】
本開示の医薬組成物およびそれらを調製するための方法は、当業者に容易に明らかになろう。このような組成物およびそれらを調製するための方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５）において見ることができる。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件下で製造される。
【０２０５】
本開示の医薬組成物は、１つの単一単位用量または複数の単一単位用量として、大量に調製、包装、または販売され得る。本明細書において用いられる場合、「単位用量」は、事前に決定された量の活性原料を包含する個別の量の医薬組成物である。活性原料の量は、通常、対象に投与される活性原料の投薬量、またはこのような投薬量の都合の良い画分、例えばこのような投薬量の２分の１もしくは３分の１に等しい。
【０２０６】
本開示の医薬組成物は、典型的には、非経口投与に適している。本明細書において用いられる場合、医薬組成物の「非経口投与」には、対象の組織の物理的破損と組織における破損を介する医薬組成物の投与とによって特徴付けされ、したがって、血流内、筋肉内、または内部器官内への直接的な投与を一般的にもたらす、任意の経路の投与が含まれる。したがって、非経口投与には、限定はしないが、例えば、組成物の注射による、外科的切開を介する組成物の適用による、組織を貫通する非外科的創傷を介する組成物の適用による、医薬組成物の投与が含まれる。特に、非経口投与は、限定はしないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、髄腔内、心室内、尿道内、頭蓋内、滑液嚢内の注射または点滴、および腎臓透析点滴技術を含むことが意図されている。好ましい実施形態には、静脈内経路、皮下経路、皮内経路、および筋肉内経路が含まれる。
【０２０７】
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、典型的には、滅菌水または無菌等張生理食塩水などの薬学的に許容できる担体と組み合わされた活性原料を包含する。このような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で、調製、包装、または販売され得る。注射可能な製剤は、アンプル、または防腐剤を含有する複数回用量容器などの単位投薬形態で、調製、包装、または販売され得る。非経口投与のための製剤には、限定はしないが、懸濁液、溶液、油性媒質または水性媒体中のエマルジョン、ペーストなどが含まれる。このような製剤はさらに１つまたは複数のさらなる原料を包含し得、前記原料には、限定はしないが、懸濁剤、安定剤、または分散剤が含まれる。非経口投与のための製剤の１つの実施形態において、活性原料は、適切な媒体（例えば、発熱物質を有さない滅菌水）で再構成して、その後、再構成された組成物を非経口投与するために、乾燥（すなわち、粉末または顆粒）形態で提供される。非経口製剤はまた、塩、糖質、および（好ましくは、３から９のｐＨまでの）緩衝剤などの賦形剤を含有し得る水性溶液を含むが、いくつかの適用では、前記非経口製剤は、無菌非水性溶液として、または発熱物質を有さない滅菌水などの適切な媒体と組み合わせて用いるための乾燥形態として、さらに適切に製剤され得る。例示的な非経口投与形態には、無菌水性溶液内の、例えば水性のプロピレングリコール溶液またはデキストロース溶液内の溶液または懸濁液が含まれる。このような投薬形態は、必要であれば、適切に緩衝することができる。有用な、他の非経口投与可能な製剤には、微結晶形態の活性原料を包含するもの、またはリポソーム調製物中に活性原料を包含するものが含まれる。非経口投与のための製剤は、即時放出および／または調節放出されるように製剤することができる。調節放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出、およびプログラム放出が含まれる。
【０２０８】
例えば、１つの態様において、無菌の注射可能溶液は、好ましくは免疫原性担体にカップリングされ、最終的には１つまたは複数のアジュバントと組み合わされる、所要の量の抗原性タウペプチドを、上記に列挙された原料の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒中に組み込み、必要に応じてその後に濾過滅菌することによって、調製することができる。通常、分散液は、活性化合物を、基礎分散媒質と上記に列挙されたものからの所要の他の原料とを含有する無菌媒体中に組み込むことによって調製される。無菌の注射可能溶液を調製するための無菌粉末のケースでは、好ましい調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライであり、これにより、活性原料と任意のさらなる所望の原料との粉末が、事前に滅菌濾過されたこれらの溶液から得られる。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆を用いることによって、分散液のケースでは所要の粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、維持することができる。注射可能な組成物の持効性吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【０２０９】
例として、本開示の非限定的な医薬組成物は、約５．０から約６．５の範囲位のｐＨを有し、約１ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの本開示のペプチド、約１ミリモル濃度から約１００ミリモル濃度のヒスチジン緩衝液、約０．０１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、約１００ミリモル濃度から約４００ミリモル濃度のトレハロース、および約０．０１ミリモル濃度から約１．０ミリモル濃度のＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物を包含する、無菌水性溶液としての製剤である。
【０２１０】
本開示の抗原性タウペプチドはまた、鼻腔内で、または吸入によって、典型的には、粉末吸入器からの乾燥粉末（単独で、混合物として、または混合成分粒子として、例えば、適切な薬学的に許容できる賦形剤と組み合わされた混合成分粒子として）の形態で、適切な推進剤の使用を伴うもしくは伴わない加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー（好ましくは、細かい霧を生じさせるための電気流体力学を用いるアトマイザー）、もしくは噴霧器からのエアロゾルスプレーとして、または鼻腔滴として投与することができる。
【０２１１】
加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、または噴霧器は、通常、例えば活性物質を分散させるか、安定化させるか、または活性物質の放出を延長するための適切な作用物質と（１つまたは複数の）推進剤とを包含する本開示の組成物の溶液または懸濁液を、溶媒として含有する。
【０２１２】
乾燥粉末製剤または懸濁液製剤において用いる前に、薬剤生成物は通常、吸入による送達に適したサイズ（典型的には、５ミクロン未満）まで微粉化される。これは、任意の適切な粉砕方法、例えばスパイラルジェットミル、流動床ジェットミル、ナノ粒子を形成するための超臨界流体処理、高圧ホモジナイズ、または噴霧乾燥によって行うことができる。
【０２１３】
吸入器または散布器において用いるためのカプセル、ブリスター、およびカートリッジは、本開示の化合物の粉末混合物、適切な粉末ベース、および性能調節剤を含有するように製剤することができる。
【０２１４】
細かい霧を生じさせるための電気流体力学を用いるアトマイザーにおいて用いるための適切な溶液製剤は、作動当たり適切な用量の本開示の抗原性タウペプチドを含有し得、作動容積は、例えば１μＬから１００μＬまで様々であってもよい。
【０２１５】
メントールおよびレボメントールなどの適切な香料、またはサッカリンもしくはサッカリンナトリウムなどの甘味料を、吸入／鼻腔内投与を意図した本開示の製剤に添加することができる。
【０２１６】
吸入／鼻腔内投与のための製剤は、即時放出および／または調節放出されるように製剤することができる。調節放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出、およびプログラム放出が含まれる。
【０２１７】
乾燥粉末吸入器およびエアロゾルのケースでは、投薬単位は、規定量を送達するバルブによって決定される。本開示に従った単位は、典型的には、本開示の組成物の規程用量または「一吹き」を投与するように準備されている。１日の総用量は、典型的には、単一用量で投与されるか、またはより一般的には、分割された用量で終日にわたって投与される。
【０２１８】
抗原性タウペプチドを包含する医薬組成物はまた、経口経路投与のために製剤することができる。経口投与は、化合物が胃腸管に入るための嚥下、および／または、化合物が口から直接血流に入るための、口腔投与、舌投与、もしくは舌下投与を伴い得る。
【０２１９】
経口投与に適した製剤には、固体系、半固体系、および液体系、例えば、錠剤；多粒子、ナノ粒子、液体、または粉末を含有するソフトカプセルまたはハードカプセル；トローチ（液体充填されたものを含む）；ガム；ゲル；迅速に分散する投薬形態；フィルム；卵形剤；スプレー；および口腔／粘膜接着性パッチが含まれる。
【０２２０】
液体製剤には、懸濁液、溶液、シロップ、およびエリキシルが含まれる。このような製剤は、ソルトカプセルまたはハードカプセル（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースから作製される）における充填剤として用いられ得、典型的には、担体、例えば水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、または適切な油、ならびに１つまたは複数の乳化剤および／もしくは懸濁剤を包含する。液体製剤はまた、例えば小袋からの固体の再構成によって調製することができる。
【０２２１】
投薬
本開示の組成物は、免疫療法によって、タウ関連性の障害または症候のリスクがあるかまたはこれに罹患している対象における免疫応答を刺激することによって、前記患者におけるこのような障害または症候を治療、軽減、または予防するために用いることができる。免疫療法は、最初の免疫化と、その後に行うさらなる追加免疫、例えば、１回、２回、３回、またはそれ以上の追加免疫とを包含し得る。
【０２２２】
本開示の抗原性タウペプチドまたはその組成物の「免疫学的に有効な量」は、哺乳動物対象において病理学的形態のタウに対する免疫応答を誘発するために有効な、単一用量の、または一連の用量の一部としての、前記対象に送達される量である。この量は、治療される個体の健康状態および身体状態、治療される個体の分類上の群、個体の免疫系の、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を引き起こす能力、ワクチンの製剤、ならびに他の関連する因子に応じて変化する。量は、適切な試験を通して決定され得る、比較的広範囲のものであると予想される。
【０２２３】
「薬学的に有効な用量」または「治療上有効な量」は、対象における１つまたは複数のタウ関連性の障害または症候を治療または予防または軽減するために必要な用量である。薬学的に有効な用量は、投与される具体的な化合物、症候の重症度、副作用に対する対象の感受性、疾患のタイプ、用いる組成物、投与経路、治療される哺乳動物のタイプ、具体的な哺乳動物の、健康状態および身体状態などの考慮対象の身体的特徴、併用投薬治療、個体の免疫系の能力、所望される防御の程度、ならびに医学分野の当業者が認識する他の因子に依存し得る。予防目的では、各用量におけるペプチドの量は、典型的なワクチンにおける顕著な副作用を伴わずに免疫防御応答を誘発する量として選択される。最初のワクチン接種の後、対象には、適切に間隔をあけた、１回または複数回の追加免疫化を行うことができる。
【０２２４】
任意の特定の患者のための具体的な用量レベルは、用いられる具体的な化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食習慣、投与時間、投与経路、排出率、薬剤の組み合わせ、および治療している特定の疾患の重症度を含む、様々な因子に依存することが理解される。
【０２２５】
例えば、免疫原性担体に結合した本開示の抗原性タウペプチドは、それぞれ約０．１μｇから約２００ｍｇの用量で、例えば、約０．１μｇから約５μｇ、約５μｇから約１０μｇ、約１０μｇから約２５μｇ、約２５μｇから約５０μｇ、約５０μｇから約１００μｇ、約１００μｇから約５００μｇ、約５００μｇから約１ｍｇ、約１ｍｇから約１０ｍｇ、約１０ｍｇから約５０ｍｇ、または約５０ｍｇから約２００ｍｇの用量で対象に投与することができ、例えば１週間、２週間、３週間、４週間、２ヶ月、３ヶ月、および／または１年後に追加免疫が行われてもよい。いくつかの実施形態において、用量当たりの抗原性タウペプチドの量は、体重当たりで決定される。例えば、いくつかの実施形態において、抗原性ペプチドは、約０．５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの量、例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから約２ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇから約３ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇから約７ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約４０ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇから約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇから約７０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇから約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇから約９０ｍｇ／ｋｇ、または約９０ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇを超える量で投与される。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、単一用量の本開示に従った抗原性タウペプチドが投与される。他の実施形態において、複数用量の本開示に従った抗原性タウペプチドが投与される。投与の頻度は、様々な因子のいずれか、例えば、症候の重症度、所望される免疫防御の程度、組成物が予防目的または治癒目的のどちらで用いられるかなどに応じて変化し得る。例えば、いくつかの実施形態において、本開示に従った抗原性タウペプチドは、月に１回、月に２回、月に３回、１週間おき（ｑｏｗ）、週に１回（ｑｗ）、週に２回（ｂｉｗ）、週に３回（ｔｉｗ）、週に４回、週に５回、週に６回、１日おき（ｑｏｄ）、毎日（ｑｄ）、１日２回（ｑｉｄ）、１日３回（ｔｉｄ）投与される。本開示の組成物を予防目的で用いる場合、組成物は通常、初回投与および追加投与の両方で投与される。追加投与は、適切に間隔があいているか、または好ましくは、毎年、もしくは循環抗体のレベルが所望のレベル未満になるような回数で投与されることが予期される。追加投与は、もとの免疫原性担体分子の非存在下で、抗原性タウペプチドから構成されてもよい。このような追加構築物は、代替の免疫原性担体を包含してもよく、または担体の非存在下であってもよい。このような追加組成物は、アジュバントを伴ってまたは伴わずに製剤され得る。
【０２２７】
本開示に従った抗原性タウペプチドの投与の持続時間、例えば、抗原性タウペプチドを投与する期間は、様々な因子のいずれか、例えば患者の応答などに応じて変化し得る。例えば、抗原性タウペプチドは、約１日から約１週間、約２週間から約４週間、約１ヶ月から約２ヶ月、約２ヶ月から約４ヶ月、約４ヶ月から約６ヶ月、約６ヶ月から約８ヶ月、約８ヶ月から約１年、約１年から約２年、または約２年から約４年、またはそれ以上にわたる期間にわたって投与することができる。
【０２２８】
治療の使用および方法
本開示に従った抗原性タウペプチドを投与するステップを包含する、様々な治療方法もまた、本開示によって意図される。治療方法には、（１つまたは複数の）病理学的形態の自己タウに対する個体の免疫応答を誘発する方法、および個体におけるタウ関連性の障害または症候を予防、軽減、または治療する方法が含まれる。
【０２２９】
１つの態様において、本開示は、治療上有効な量の本開示の抗原性タウペプチド、またはそれらの免疫原性組成物もしくは医薬組成物を対象に投与するステップを包含する、前記対象におけるタウ関連性の障害または症候を治療、予防、または軽減するための方法を提供する。
【０２３０】
別の態様において、本開示は、治療上有効な量または免疫学的に有効な量の、本開示の抗原性タウペプチドまたはそれらの免疫原性組成物もしくは医薬組成物を対象に投与するステップを包含する、前記対象における（１つまたは複数の）病理学的形態の自己タウに対する免疫応答を誘発するための方法を提供する。
【０２３１】
「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、生物学的障害および／またはその付随する症候の少なくとも１つを軽減するかまたはなくす方法を言う。本明細書において用いられる場合、疾患、障害、または症状を「軽減する」は、疾患、障害、または症状の症候の重症度および／または発生頻度を低減させることを意味する。さらに、本明細書における「治療」への言及には、治癒的、緩和的、および予防的治療への言及が含まれる。前記対象は、好ましくはヒトであり、任意の年齢の男性または女性であり得る。
【０２３２】
本開示の他の態様は、好ましくはタウ関連性の障害の治療において、医薬品として用いるための、本開示に従った抗原性タウペプチドまたはそれらの免疫原性組成物もしくは医薬組成物に関する。
【０２３３】
さらに別の態様において、本開示は、好ましくはタウ関連性の障害を治療するための、医薬品の製造における、本開示の抗原性タウペプチドまたはそれらの免疫原性組成物もしくは医薬組成物の使用を提供する。
【０２３４】
本開示は、以下の実施例によってさらに例示され、これらの実施例は、さらなる限定として解釈されるべきではない。全ての図面、ならびに本開示を通して引用される全ての参考文献、特許、および公開された特許出願の内容は、参照することによってその全体が本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【０２３５】
用いられる数値（例えば、量、温度など）に関する精度を確実にするための努力は行ったが、ある程度の実験的な誤差およびずれがある。別段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧であるかまたはそれに近いものである。以下の実施例において用いられる場合、以下の省略形は以下の意味を有し、別段の指示がない限り、商業的な供給業者から容易に入手可能である。ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド、ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸、ＴＩＰＳ：トリイソプロピルシリルトリフルオロメタンスルホネート、ＴＣＥＰ：トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ｍｃＫＬＨ：マリカルチャーキーホールリンペットヘモシアニン、ＨＢＴＵ：Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸、ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド。
【０２３６】
（実施例１）
Ｑｂｅｔａプラスミドの構築
非変性Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質：Ｑｂｅｔａの被覆タンパク質に対応するコード配列、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０９９１１４のヌクレオチド１３０４から１７０５を、ＤＮＡ２．０（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって合成した。ＮｃｏＩ部位を導入するための５’修飾（ＣＣａｔｇｇ）ならびに２つの停止コドンおよびＸｈｏＩ部位を導入するための３’修飾（ｇｔａＴＴＡＡＴＧＡＣＴＣＧＡＧ−配列番号７８）を含めた。
【０２３７】
コドンを最適化されたＱｂｅｔａ被覆タンパク質：Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質をコードする配列をまた、Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ７：２８５（２００６））を用いて、発現のために最適化した。同一の５’修飾および３’修飾を、コドンを最適化されたＱｂｅｔａ被覆タンパク質中に組み込んだ。
【０２３８】
非変性Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質配列およびコドンを最適化されたＱｂｅｔａ被覆タンパク質配列の両方を、制限消化およびライゲーション反応を含む従来のＤＮＡサブクローニング方法を用いて、ｐＥＴ２８発現ベクター中に導入した。
【０２３９】
（実施例２）
合成タウペプチドの調製
配列番号３１〜７６、１０５〜１０７で示され、以下の実施例を通して用いられるそれらの対応する名称と共に以下の表５に示される、タウペプチド（Ａ−１からＡ−１１、Ｂ−１からＢ−６、Ｃ−１からＣ−５、Ｄ−１、Ｅ−１、およびＦ１と呼ばれ、加えてこれらのペプチドのリン酸化された型はＡ−１Ｐ、Ａ−２Ｐ、Ａ−３Ｐなどと示される）を、以下のように調製した。リンカー配列（ＣＧＧまたはＧＧＣ）を含有するリン酸化型タウペプチドまたは非リン酸化型タウペプチドの合成を、Ｓｙｍｐｈｏｎｙペプチド合成装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）上で固相合成技術を用いて行った。モノ保護アミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ［ＰＯ（Ｏ−Ｂｚｌ）ＯＨ］−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ［ＰＯ（Ｏ−Ｂｚｌ）ＯＨ］−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｔｙｒ［ＰＯ（Ｏ−Ｂｚｌ）ＯＨ］−ＯＨ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）を用いて、ホスホセリン、ホスホスレオニン、およびホスホチロシンを、リン酸化型の配列内に組み込んだ。第１のアミノ酸を含有するＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＡ樹脂（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）と、１ｍｍｏｌのＨＢＴＵで１時間にわたり活性化された、６．２５倍過剰なＦｍｏｃ保護された第２のアミノ酸（１ｍｍｏｌ）とを混合することによって、反応を開始させた。カップリング反応を、各アミノ酸について１回繰り返した。Ｆｍｏｃ基の除去を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンにおいて、２×５分間にわたり行った。樹脂と２．５％ＴＩＰＳおよび２．５％チオアニソールを含有する５ｍＬのＴＦＡ溶液とを、室温で３時間にわたりインキュベートすることによって、合成されたペプチドを樹脂から放出させた。濾過、ジエチルエーテルによる沈殿、および真空乾燥によって、粗ペプチドを回収した。ペプチドの精製を、ＢＥＨ１３０Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃ１８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ２５２５  Ｂｉｎａｒｙ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｏｄｕｌｅ）で行った。移動相は、緩衝液Ａとしての水中の０．１％ＴＦＡ、および緩衝液Ｂとしてのアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡから構成されるものであった。ペプチドを含有する回収された画分を合わせ、真空下で凍結乾燥した。９５％を超える純度を有する１００ｍｇの粗ペプチドの典型的な注射から、およそ２０ｍｇのペプチドを精製した。全ての精製されたペプチドを、ＬＣ−ＭＳで確認した。
【０２４０】
同様に、さらなるタウペプチド（配列番号１０８〜１２２）を合成し、精製した。
【０２４１】
（実施例３）
Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰ：発現、精製、およびタウペプチドとのコンジュゲーション
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＱｂｅｔａの発現：ＱｂｅｔａのｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ２８を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換した。単一のコロニーを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する５ｍＬの２×ＹＴ培地中に、３７℃で一晩、接種した。一晩経った接種材料を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する５００ｍＬのＴＢ培地に希釈し、３７℃で２５０ｒｐｍで、０．８のＯＤ６００まで成長させ、０．４ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で一晩誘導した。２５００ＲＣＦで１５分間にわたり遠心分離することによって、細胞を集菌した。細胞ペレットを−８０℃で保管した。
【０２４２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのＱｂｅｔａ  ＶＬＰの精製：全ての精製ステップは４℃で行った。Ｑｂｅｔａを発現する細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補った、２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−１００を含有する溶解緩衝液中に再懸濁した。再懸濁溶液をマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）に通し、その後、超遠心分離を行った。５０％の飽和まで硫酸アンモニウムを添加することによってタンパク質を沈殿させ、その後、１５，０００ＲＣＦで３０分間にわたり遠心分離した。ペレットを再懸濁し、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液中で、４℃で一晩透析した。透析された溶液を遠心分離し、次に、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ内で平衡したＣａｐｔｏ  Ｑカラム（ＧＥ）内にロードした。カラムを洗浄し、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液内で１００ｍＭのＮａＣｌから１ＭのＮａＣｌまでの勾配で、ランを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてＱｂｅｔａタンパク質を同定した。Ｑｂｅｔａを含有する画分を、１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＫＣｌ中で一晩透析し、ヒドロキシアパタイトカラム（Ｔｙｐｅ  ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．）内にロードした。カラムを洗浄し、１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＫＣｌを含有する緩衝液の１００％から、５００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、０．５ＭのＫＣｌを含有する緩衝液の１００％までの勾配で溶出した。Ｑｂｅｔａを含有する画分をプールし、透析し、２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．７Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４内で平衡したフェニルカラム内にロードした。タンパク質を、２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．７Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する緩衝液の１００％から、２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液の１００％までの勾配で溶出した。純粋なＱｂｅｔａを含有する画分をプールし、ＰＢＳ内で、４℃で一晩透析した。タンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイによって決定した。
【０２４３】
Ｑｂｅｔａ  ＶＬＰへのタウペプチドのカップリング：Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰへのタウペプチドのカップリングは、二官能性架橋剤ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が仲介するものであった（Ｆｒｅｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２２（２）：３６０〜３６９（２００４））。ペプチドを、１０ｍｇ／ｍＬの５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ｐＨ７．０）中に溶解し、等容積のＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ＴＣＥＰジスルフィド還元ゲルと共に室温で１時間にわたりインキュベートすることによって還元した。１０００×ｇで２分間にわたり遠心分離することによって、ペプチド溶液を回収した。ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の２ｍｇ／ｍＬのＱｂｅｔａ−ＶＬＰタンパク質を、ＤＭＳＯ中の７ｍＭのＳＭＰＨと共に室温で１時間にわたりインキュベートすることによって活性化した。誘導体化されたＶＬＰを、１０００×ｇで２分間にわたりＺｅｂａ  Ｄｅｓａｌｔ  Ｓｐｉｎカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通すことによって脱塩した。活性化されたＶＬＰ溶液を、１０倍モル濃度過剰な還元型ペプチドと、室温で２から３時間にわたり混合した。反応混合物を濃縮し、ＰＢＳ、または５０ｍＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７．４）中で、４℃で一晩透析した。タンパク質濃度を、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓタンパク質アッセイを用いて決定した。
【０２４４】
（実施例４）
ペプチド−ＫＬＨコンジュゲートの調製
ＣＧＧリンカーを有するタウペプチドＡ−１Ｐ（配列番号３１）をｍｃＫＬＨ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７７６０５）にコンジュゲートして、マウスにおけるその免疫原性を評価した。コンジュゲーションは、二官能性架橋剤ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が仲介するものであった。５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．０）中の１０ｍｇ／ｍＬのＡ−１Ｐペプチドを、等容積のＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ＴＣＥＰジスルフィド還元ゲルと、室温で１時間にわたり撹拌することによって最初に処理した。１０００×ｇで２分間にわたり遠心分離することによって、ペプチド溶液を回収した。ＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍＬのＫＬＨを、ＤＭＳＯ中の２００μＬの１００ｍＭのＳＭＰＨと共に室温で１時間にわたりインキュベートすることによって、ＫＬＨの活性化を実施した。反応混合物を、Ｚｅｂａ  Ｄｅｓａｌｔ  Ｓｐｉｎカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に通した。次に、回収された誘導体化されたＫＬＨを、還元型Ａ−１Ｐと室温で２時間にわたり混合した。反応混合物を、０．６ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ内で、４℃で一晩透析した。タンパク質濃度を、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓタンパク質アッセイを用いて決定した。
【０２４５】
（実施例５）
免疫原性およびＢ細胞記憶についてのペプチドでの免疫化の研究
表５に示される選択されたペプチドが免疫原性であるかを決定するため、および免疫学的記憶が生じるかを決定するために、実験を行った。図１Ａ、１Ｂ、および２において示されるように、３頭のＢａｌｂ／ｃマウスからなる群を、ペプチドまたはＱｂｅｔａ  ＶＬＰにコンジュゲートしたペプチドで０日目に初回免疫し、１４日目および１０１日目に追加免疫し、一方、数頭のマウスは、１０１日目に初回免疫したのみであった。血清を２８日目、１０１日目、１０４日目、１０８日目、および１１５日目に回収した。選択されたマウスの血清を、９４日目に回収した。免疫化された動物の抗体応答を、（実施例１３において記載されるように）抗原特異的力価決定アッセイを用いて調べた。
【０２４６】
２８日目の血清試料を用いるとペプチドが免疫原性であることを示す、抗原特異的ＩｇＧ力価の結果を、図１Ｂにまとめる。この研究は、ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をアジュバントとして用いて免疫化すると、ペプチドＡ−１、Ａ−１Ｐ、Ｂ−１Ｐ、およびＣ−１Ｐが免疫原性であることを示した。Ａ−１ＰペプチドおよびＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄで、またはＱｂｅｔａ−ＶＬＰにコンジュゲートしたＡ−１Ｐで初回免疫し、その後、１４日目にＡ−１Ｐ−Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰで追加免疫すると、Ａ−１Ｐ  ＴｉｔｅｒＭａｘ初回免疫追加免疫群よりも優れた抗体力価が生じた。アジュバントであるＫＬＨ（実施例４において記載されるように調製される）にコンジュゲートしたＡ−１Ｐで初回免疫および１４日目の追加免疫を行うとまた、Ａ−１Ｐ  ＴｉｔｅｒＭａｘ初回免疫追加免疫群よりも優れた抗体力価が生じた。
【０２４７】
免疫化に用いられるリン酸化型ペプチド（Ａ−１Ｐ、Ｂ−１Ｐ、Ｄ−１Ｐ、Ｃ−１Ｐ）または非リン酸化型ペプチド（Ａ−１）に対して引き起こされる抗体の選択性もまた試験した。これは、抗体力価を、免疫化に用いられる各ペプチドのリン酸化された型およびリン酸化されていない型の両方と比較することによって行った（図１Ｂを参照されたい）。非特異的力価と対比した特異的力価の比率を計算した。この実験において、Ａ−１（群１）に対する抗体応答は、動物を免疫化したペプチドのリン酸化状態について選択的であり（＜０．１倍）、一方、Ｃ−１Ｐ（群５）に対する抗体は選択的である可能性が高い（７より大きいＣ−１Ｐ／Ｃ−１力価比率）。群２（Ａ−１Ｐ）は選択的ではなかった。
【０２４８】
Ａ−１ＰのＢ細胞の記憶再生応答を示す結果を図２に示す。群Ａ（Ａ−１ＰおよびＴｉｔｅｒＭａｘで初回免疫、Ａ−１Ｐ−Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰで追加免疫）および群Ｂ（Ａ−１Ｐ−Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰで初回免疫および追加免疫）を、Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰにコンジュゲートしたＡ−１Ｐで１０１日目に初回免疫した群Ｃと比較した。３つ全ての群は、ＩｇＭ応答を有していた。１０１日目に追加免疫した両群において、１０４日目にＩｇＧが検出されたが、１０１日目に初回免疫した群ではＩｇＧは７日目まで検出されなかった。１０４日目の力価は、９４日目の力価よりも高かった。７日目および１４日目のＩｇＧ力価はまた、１０１日目に初回免疫した群（群Ｃ）よりも高かった。１０８日目および１１５日目の群Ａおよび群ＢのＩｇＧ力価は同一であったが、群ＣのＩｇＧ力価は、１１５日目までピークを迎えなかった。これらのデータは、長期の抗体応答およびＢ細胞の記憶再生を示す。
【０２４９】
（実施例６）
免疫原性についてのペプチドでの初回免疫化およびペプチド−ＶＬＰでの追加免疫化の研究
アラム（Ａｌ（ＯＨ）３、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ２％‘８５’、Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）をアジュバントとしたペプチドでの初回免疫として免疫化し、その後、Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰにコンジュゲートしたペプチドで追加免疫した場合に、表５の選択されたペプチドが免疫原性であるかを決定するために、実験を行った。図３に示すように、４頭のＢａｌｂ／ｃマウスからなる群を、０日目に初回免疫し、２８日目および５６日目に追加免疫した。血清を７９日目に回収した。免疫化された動物の抗体応答を、（実施例１３において記載されるように）抗原特異的力価決定アッセイを用いて調べた。
【０２５０】
結果を図３にまとめる。群１〜６では、免疫化に用いられたペプチドに対するＩｇＧ抗体は、試験された最大希釈（１：１，７４９，６００）で検出され、このことは、免疫化されたペプチド抗原に対する強力な抗体応答を示す。未処理群（群７）において、抗体は検出されなかった。ペプチドＤ−１ＰおよびＣ−１Ｐを用いる免疫化により生じた抗体は、ペプチドＥ−１Ｐを認識した。ペプチドＤ−１ＰおよびＣ−１Ｐは、Ｅ−１Ｐ中に完全に含有される。
【０２５１】
免疫化に用いられるリン酸化型ペプチド（Ａ−１Ｐ、Ｂ−１Ｐ、Ｄ−１Ｐ、Ｃ−１Ｐ、Ｅ−１Ｐ）または非リン酸化型ペプチド（Ａ−１）によって引き起こされる抗体の選択性を試験した。これは、リン酸化型ペプチドのリン酸化されていない型、および非リン酸化型ペプチドのリン酸化された型に対する抗体力価を決定することによって行った（図３を参照されたい）。非特異的力価と対比した特異的力価の比率を計算した。この実験において、Ｄ−１Ｐ（群４）、Ｃ−１Ｐ（群５）、およびＥ−１Ｐ（群６）に対する抗体は、動物を免疫化したペプチドのリン酸化状態について選択性であった（＞１０の力価比率）。
【０２５２】
（実施例７）
免疫原性についてのペプチド−ＶＬＰでの免疫化の研究
様々なアジュバントとのＱｂｅｔａ−ＶＬＰコンジュゲートとして免疫化した場合に、表５の選択されたペプチドおよびペプチドの組み合わせが免疫原性であるかを決定するために、実験を行った。図４において示されるように、４頭のＴＧ４５１０＋／＋（トランスジェニック二重陽性、Ｒａｍｓｄｅｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２５（４６）：１０６３７（２００５）を参照されたい）マウスまたはＴＧ４５１０−／−（野生型同腹子対照）マウスからなる群を、０日目に初回免疫し、５６日目と２８日目または２９日目とに追加免疫した。血清を６３日目に回収した。免疫化された動物の抗体応答を、実施例１３において記載されるように、抗原特異的ＩｇＧ力価決定アッセイを用いて調べた。
【０２５３】
６３日目の試料の結果を、図４にまとめる。全ての群において、免疫化に用いられたペプチドまたはペプチドの組み合わせに対する抗体（ＩｇＧ）は、７．７Ｅ＋０４から１．５８Ｅ＋０６の範囲の平均力価で検出された。それぞれ１００μｇまたは１０μｇの組み合わせにおける、３つのペプチド−Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰコンジュゲートでの免疫化は、１００μｇのペプチド−Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰコンジュゲート単独での免疫化と同様の力価を引き起こした。組み合わせ投与群１および２のＡ−１Ｐ、Ｂ−１Ｐ、およびＣ−１Ｐの力価は、関連する単一投与群（群３、４、および５）の力価の１．７から４．４倍である。組み合わせ投与群１１および１２のＡ−１Ｐ力価、Ｂ−１Ｐ力価、およびＣ−１Ｐ力価は、関連する単一投与群（群１３、１４、および１５）の力価の０．３２から２．８倍である。組み合わせ投与群１１および１２のＡ−１Ｐ、Ｂ−１Ｐ、およびＣ−１Ｐの力価は、関連する単一投与群（群１３、１４、および１５）の力価の０．３２から２．８倍である。アジュバント（アラム、ＣｐＧ−２４５５５（２００８年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６１／１２１，０２２号）、またはＡＢＩＳＣＯ−１００（Ｉｓｃｏｎｏｖａ）およびＣｐＧ−２４５５５）を用いた場合またはアジュバントを用いなかった場合に、抗体が検出された。ペプチドに対する抗体は、未処理対照では検出されなかった。
【０２５４】
選択された群において、免疫化に用いられるリン酸化型（Ａ−１Ｐ、Ｂ−１Ｐ、Ｄ−１Ｐ、Ｃ−１Ｐ、Ｅ−１Ｐ）によって引き起こされる抗体の選択性を試験した。これは、群１〜７について、リン酸化型ペプチドのリン酸化されていない型に対する抗体力価を決定することによって行った（図４）。非特異的力価と対比した特異的力価の比率を計算した。この実験において、抗体は、全ての投与群において、Ｂ−１よりもＢ−１Ｐについて選択性であった（＞１０倍の力価比率）。抗体は、アラムを含有しない群である群６のみにおいて、Ｃ−１よりもＣ−１Ｐについて選択性であった。抗体は、群２、３、および６において、Ａ−１よりもＡ−１Ｐについて選択性であったが、アラムをアジュバントとした高用量の組み合わせで免疫化した群１ではそうではなかった。非リン酸化型ペプチドに対する抗体は、未処理対照では検出されなかった。
【０２５５】
（実施例８）
経路、アジュバント、およびアイソタイプについてのペプチド−ＶＬＰでの免疫化の研究
異なるアジュバントおよび投与経路を用いる場合に引き起こされる抗体の免疫原性およびアイソタイプを比較するために、実験を行った。図５において示されるように、３頭のＢａｌｂ／Ｃマウスからなる群を、０日目に初回免疫し、１７日目に追加免疫した。血清を２４日目に回収した。免疫化された動物の抗体応答を、実施例１３において記載されるように、抗原特異的力価決定アッセイを用いて調べた。
【０２５６】
Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰにコンジュゲートしたＡ−１Ｐを、皮下注射または筋肉内注射を介してＢＡＬＢ／ｃに送達した。異なる組み合わせの抗原をまた、筋肉内経路を介して試験した。２７日目の試料を用いた結果を、図５にまとめる。Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰにコンジュゲートし、アラムをアジュバントとしたＡ−１Ｐの皮下投与および筋肉内投与の両方が、ＩｇＧ抗体応答が引き起こした。筋肉内投与群は、皮下投与群（１１）よりも、Ａ−１力価に対するＡ−１Ｐの大きな比率を有していた（７０）。これは、投与経路が、応答の選択性に影響し得ることを示す。
【０２５７】
図５において示されるように、用いられたアジュバントの全ての組み合わせが、ＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ２ａ抗体を引き起こし、アラム含有群（群２および５ではそれぞれ２１および１２の比率）は、アラムをアジュバントとして含まなかった群３（０．１７）および群４（０．１７）よりも、ＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の比率が非常に大きかった。これは、Ｔｈ２に対する免疫応答を歪めるアラムの既知の効果と一致する（Ｌｉｎｄｂｌａｄ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８２（５）：４９７〜５０５（２００４）；Ｍａｒｒａｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．９：２８７〜２９３（２００９）を参照されたい）。これらの結果は、アジュバントが、この実施例において用いられるワクチンに対する抗体応答を改変するために用いられ得ることを示唆する。ペプチドに対する抗体は、未処理対照では検出されなかった。
【０２５８】
（実施例９）
リンカー分析のためのペプチド−ＶＬＰでの免疫化
免疫原性が表５の選択されたペプチドのリンカー（ＣＧＧまたはＧＧＣ）の位置によって影響されるかを決定するために、実験を行った。ここで、Ａ−１Ｐペプチドを、ペプチドのＮ末端（すなわち、配列番号３１−Ａ−１Ｐ）またはＣ末端（すなわち、配列番号４１−Ａ−１１Ｐ）上のリンカーと共に用いた。以下の表１において示されるように、４頭のＴＧ４５１０＋／＋マウスからなる群を、０日目に初回免疫し、１４日目に追加免疫した。マウスを２０日目に出血させた。免疫化された動物の抗体応答を、実施例１３において記載されるように、抗原特異的力価決定アッセイを用いて調べた。
【０２５９】
表１において示される結果に基づくと、Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰへのリンカー配列は、タウ特異的配列のＮ末端（ＣＧＧ）またはＣ末端（ＧＧＣ）上に位置させることができ、依然として、リン酸化選択性のＩｇＧ応答を引き起こす（＞１０倍の力価比率、表１）。この実験において用いられるペプチド（配列番号３１および４１）は、配列番号３１においてはＣＧＧリンカーがＮ末端であり配列番号４１においてはリンカーＧＧＣがＣ末端であることを除いて、同一の配列を有する。両方が、２０日目の試料において、同様のＩｇＧ力価を引き起こした。２つのペプチド配列によって引き起こされる抗体は、表１において示されるように、４９のおよび１３２を超える非リン酸化型ＩｇＧと対比したリン酸化型ＩｇＧの力価比率によって決定されるように、選択性であった。ペプチドに対する抗体は、５６日目の未処理対照では検出されなかった（図４の群７）。
【０２６０】
【表１】
2013500326.tif 000003
【０２６１】
（実施例１０）
切断型ペプチドに対するポリクローナル抗体の結合
表５の選択されたペプチドが、抗体が引き起こされる対象であるＡ−１Ｐ、Ｂ−１Ｐ、またはＣ−１Ｐ中に存在する免疫原性エピトープを含有しているかを決定するために、実験を行った。以下の表２において示されるように、Ａ−１Ｐ、Ｂ−１Ｐ、またはＣ−１Ｐでワクチン接種されたマウスから血清を回収した。免疫化された動物の抗体応答を、被覆されていないウェルの平均の２倍のシグナルは陽性であると考えられ、一方、被覆されていないウェルの平均の２倍未満は陰性であると考えられるという修正をデータ分析に加えて、（実施例１３において記載されるように）抗原特異的力価決定アッセイを用いて調べた。
【０２６２】
Ａ−１Ｐペプチド、Ｂ−１Ｐペプチド、またはＣ−１Ｐペプチドのペプチド−ＶＬＰコンジュゲートで免疫化された動物の抗体が、より短い型のこれらのペプチドのそれぞれに結合するかを決定するために、ＥＬＩＳＡを行った。試験された各タウペプチドをプレート抗原として用い、Ａ−１Ｐ−ＶＬＰ、Ｂ−１Ｐ−ＶＬＰ、またはＣ−１Ｐ−ＶＬＰで免疫化されたマウスの１：４×１０４および１：４×１０５希釈の血清を試験して、これらが、関係するペプチドに結合し得るかを決定した（表３を参照されたい）。これらの血清は、以前に、抗原特異的抗体を有することが示されている。血清は、関係する親ペプチド（Ａ−１Ｐおよび誘導体ではＡ−１Ｐ、Ｂ−１Ｐおよび誘導体ではＢ−１Ｐ、Ｃ−１ＰおよびＣ−１Ｐ／Ｅ−１Ｐ誘導体ではＣ−１Ｐ）で免疫化されたマウスから得た（表２を参照されたい）。各抗血清を、２倍希釈で用いた（１：４×１０４および１：４×１０５）。ペプチドへの結合が検出された場合は、陽性の結果を記載する。いずれの血清希釈からもシグナルが検出されなかった場合は、陰性の結果を記載する。Ａ−５Ｐ、Ａ−１０Ｐ、およびＢ−２Ｐを除く、試験された試料の全ては、陽性のシグナルを有し、このことは、完全長（親）ペプチドによって引き起こされた抗体がまた、試験されたさらに短い誘導体のほとんどに結合することを示すものであった。
【０２６３】
【表２】
2013500326.tif 000004
【０２６４】
【表３】
2013500326.tif 000005
【０２６５】
（実施例１１）
免疫原性および記憶についての切断型ペプチドでの免疫化の研究
Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰコンジュゲートとして免疫化した場合に、表５の選択されたペプチドが免疫原性であるかを決定するために、２つの実験を行った。これらの研究の１つはまた、免疫学的記憶が生じるかを決定するために用いた。ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのＴ細胞リガンドへのペプチド抗原の潜在的な結合を避けるために、より短い型のＡ−１Ｐ、Ｂ−１Ｐ、およびＣ−１Ｐ「親」ペプチドを試験した。ＭＨＣクラスＩＩ分子は通常、１３〜１７個のアミノ酸を有するペプチドを結合し、ＭＨＣ  Ｉの結合には少なくとも８アミノ酸長のペプチドが必要であるため（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７））、７から１１アミノ酸長のペプチドを選択した。したがって、１１個以下のアミノ酸を有するペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＣＤ４Ｔ細胞応答を誘発せず、７個のアミノ酸からなるペプチドは、ＣＤ４Ｔ細胞もＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＤ８Ｔ細胞応答も誘発しない。７アミノ酸長を有するペプチドＦ−１Ｐもまた試験した。図６において示されるように、３または６頭のＢａｌｂ／ｃマウスからなる群を、０日目に初回免疫し、１４日目に追加免疫した。３つの群をまた１０８日目に追加免疫し、３つの群を１０８日目に初回免疫した（図７を参照されたい）。２１日目、または２８日目、または１１１日目、１１５日目、および１２２日目、または２１日目、１０５日目、１１１日目、１１５日目、および１２２日目に、血清を回収した。免疫化された動物の抗体応答を、（実施例１３において記載されるように）抗原特異的力価決定アッセイを用いて調べた。
【０２６６】
結果を図６にまとめる。全てのペプチド−Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰコンジュゲートは、Ｂ−５Ｐを除いて、ＥＬＩＳＡにおいて試験したマウスの全てから抗原特異的ＩｇＧ抗体を引き起こし、Ｂ−５Ｐでは、３頭のマウスのうち２頭のみが、１：１５，８００の血清希釈で、検出可能な抗体を有していた。これらの結果は、ＣＧＧリンカーを有する７〜１１個のアミノ酸からなるタウペプチドが免疫原性であり、免疫原に特異的な抗体を引き起こし得ることを示す。
【０２６７】
免疫化に用いられるリン酸化型ペプチド形態に対して引き起こされる抗体の選択性を試験した（図６を参照されたい）。これらのペプチドのほとんどは、非リン酸化形態よりもリン酸化形態のペプチドについて選択性であった（＞１０倍の力価比率）。短縮されたＡ−１Ｐ誘導体、Ｂ−１Ｐ誘導体、およびＣ−１Ｐ誘導体の多くでは、リン酸化されていない型の免疫化ペプチドをプレート抗原として用いた場合、ＥＬＩＳＡシグナルが検出されなかった。短縮されたＡ−１Ｐ誘導体、Ｂ−１Ｐ誘導体、およびＣ−１Ｐ誘導体の多くの選択性は、親ペプチドに等しいか、または親ペプチドよりも優れている。ＣＧＧリンカーを有さないペプチドＡ−２Ｐの能動免疫化は、ＪＮＰＬ３タウＰ３０１Ｌを過剰発現している動物モデルにおいて、脳におけるタウの凝集を低減させ、神経原線維変化に関連する感覚運動障害の進行を遅らせることが報告されている（Ａｓｕｎｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７：９１１５（２００７））。Ａ−２Ｐは、Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰにコンジュゲートすると、免疫原性であった。しかし、引き起こされた抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、リン酸化されていない型（Ａ−２）と比較して、リン酸化された型のペプチド（Ａ−２Ｐ）について選択性ではなかった（１．７のＡ−２Ｐ／Ａ−２力価比率）。逆に、これらの抗体は、Ａ−１よりもＡ−１Ｐについて選択性であった（＞１０．０のＡ−１Ｐ／Ａ−１力価比率）。Ａ−２ＰおよびＡ−１ＰをＥＬＩＳＡ抗原として用いると、力価は同一であった。このことは、ほとんどの非リン酸特異的抗体のエピトープが、Ａ−１Ｐには含有されない、ペプチドＡ−２Ｐの１２個のアミノ酸を含むことを示唆する。この実験において、Ｃ−１Ｐは、アラムをアジュバントとして用いずに試験すると、アラムを用いる場合よりも優れた選択性を有した（それぞれ群１４および１０）。アラムなどのアジュバントは、非リン酸化型ペプチドと対比したリン酸化型ペプチドについての選択性を変化させるために用いることができる。ペプチドに対する抗体は、未処理対照では検出されなかった。これらの結果は、ＣＧＧリンカーを有する７〜１１個のアミノ酸からなるタウペプチドが、リン酸化ペプチド選択性抗体を引き起こし得ることを示す。
【０２６８】
Ａ−１Ｐ、Ｂ−１Ｐ、およびＣ−１Ｐについての記憶再生応答について試験した結果を図７に示す。０日目、１４日目、および１０８日目に初回免疫および追加免疫した、ペプチド−Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰ免疫化マウスについての、１１１日目、１１５日目、および１２２日目のＩｇＧ力価（最後の免疫化からそれぞれ＋３日、＋７日、および＋１４日）を、１０８日目に初回免疫したマウスのＩｇＧ力価と比較した。群１、２、および３は、最後の追加免疫の８４日目後の１０５日目に、高いＩｇＧ力価を有していた。１０８日目に初回免疫した群（群４、５、および６）と比較して、これらの群はまた、１１１日目と１１５日目との間にＩｇＧ力価が大きく増大した。これらのデータは、長期の抗体応答および記憶再生を示す。
【０２６９】
（実施例１２）
アラムと組み合わせた、および組み合わせていない、免疫原性およびＴ細胞応答についての、切断型ペプチドでの免疫化の研究
０または５０４μｇのアラム（Ａｌ（ＯＨ）３）とともに１００μｇのＱｂｅｔａ−ＶＬＰコンジュゲートで免疫化した場合、またはアラム有りまたは無しのペプチド−Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰコンジュゲートの組み合わせとして与えられた場合に、Ａ−１Ｐ、Ｂ−１Ｐ、およびＣ−１Ｐに由来するペプチド（表５）が免疫原性であるかを決定するために、実験を行った。脾臓におけるＴ細胞応答もまた分析した。図８において示されるように、３頭のＴＧ４５１０−／−野生型同腹子マウスからなる群を、０日目に初回免疫し、１４日目に追加免疫した。血清および脾臓を２１日目に回収した。免疫化された動物の抗体応答を、（実施例１３において記載されるように）抗原特異的力価決定アッセイおよび（図１４において記載されるように）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて調べた。
【０２７０】
抗原特異的ＩｇＧ力価は、５０４μｇのアラム（Ａｌ（ＯＨ）３）を有するかまたはアラムを有さないＱｂｅｔａ−ＶＬＰコンジュゲートとして免疫化した場合に、試験されたペプチドが全て免疫原性であったことを示す（図８を参照されたい）。全部で７５０μｇのアラムを伴う、３００μｇのペプチド−Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰコンジュゲートへの組み合わせとして、Ａ−８Ｐ、Ｂ−３Ｐ、およびＣ−２Ｐで免疫化すると、３つ全てのペプチドに対して選択的な抗体応答が生じた。
【０２７１】
リン酸化型ペプチドのリン酸化されていない型と対比した、免疫化されたリン酸化型ペプチドに対して引き起こされる抗体の選択性を、ＥＬＩＳＡによって試験した（図８）。非特異的力価と対比した特異的力価の比率が計算され、より大きな比率はより大きな選択性を示した。引き起こされた抗体は、アラムが初回免疫および追加免疫中に含まれていてもいなくても、ペプチド−Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰコンジュゲートが単独で免疫化されても組み合わせて免疫化されても、リン酸化形態のペプチドについて選択性であった。
【０２７２】
単一のペプチドＱｂｅｔａ−ＶＬＰで免疫化した後の脾臓におけるＴ細胞応答を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析を用いて分析した（図９を参照されたい）。親タウペプチド（Ａ−１Ｐ、Ｂ−１Ｐ、Ｃ−１Ｐ）およびそれらの対応する切断型に対して特異的なＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の頻度を、最後のペプチドＱｂｅｔａ−ＶＬＰ追加免疫の７日後の２１日目に分析した。無関係ペプチド対照（ＨＢＶ−１）と比較して、有意ではない数のＢ−１Ｐ、Ｂ−１、Ｂ−３Ｐ、Ｂ−３、Ｃ−１Ｐ、Ｃ−１、Ｃ−２Ｐ、またはＣ−２特異的ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞が、アラムの存在下または非存在下での、Ｂ−３Ｐ−Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰおよびＣ−２Ｐ−Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰでの免疫化の後に生じた。有意な（ｐ＜０．０５）レベルのＡ−３Ｐ特異的ＩＦＮ−γＴ細胞応答が、Ａ−３Ｐ−Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰでの免疫化の後に誘発された。Ａ−３Ｐペプチドは、予測されたマウスＭＨＣクラスＩ  Ｋｂ結合エピトープ（ＩＶＹＫＳＰＶＶ、Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２４：１３９７〜１３９８（２００８）を参照されたい）を含有し、このエピトープは、Ａ−３Ｐで免疫化された動物において観察されるＴ細胞応答に寄与し得る。このエピトープはまた、Ａ−１Ｐ、Ａ−１、Ａ−２Ｐ、Ａ−２、およびＡ−３において存在する。Ａ−１Ｐペプチドが７アミノ酸長のペプチド（Ａ−８Ｐ  Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰ）まで短縮されると、Ａ−８Ｐ  Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰで免疫化されたマウスにおけるＩＦＮ−γ特異的Ｔ細胞応答は、バックグラウンドレベルまで低減した。
【０２７３】
ＣＤ４ヘルパーＴ細胞は、アイソタイプスイッチした抗体応答の生成および記憶Ｂ細胞の生成に必要である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｊａｎｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、（２００７）を参照されたい）。したがって、ＩｇＧ抗体応答が、切断型リン酸タウペプチドＱｂｅｔａ−ＶＬＰでの免疫化の後に、それらのそれぞれのペプチドエピトープに対して生じたという所見は、ＣＤ４ヘルパーＴ応答がワクチンに対して誘発されることを示唆する。切断型ペプチドコンジュゲートでの免疫化の後に、有意なレベルのタウペプチド特異的Ｔ細胞が生成しなかったため、ワクチンの別の成分に対するＴ細胞応答について試験した。ＶＬＰタンパク質に対するＴ細胞応答の分析は、ＩＦＮ−γ特異的Ｔ細胞が、ＶＬＰエピトープに対して生成したことを示す（無関係タンパク質対照（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ａ９４１８）の４〜１５倍）。
【０２７４】
（実施例１３）
抗原特異的抗体力価決定
以下のアッセイを用いて、上記の実施例５〜１２において記載したように、免疫化された動物の抗体応答を決定した。
【０２７５】
比色ＥＬＩＳＡを用いて、陽性のシグナルによって表される、検出可能な抗原特異的抗体を有する血清の最大希釈を決定した。血清試料から連続希釈物を調製し、アッセイにおいて試験した。いくつかのアッセイにおいて、リン酸タウペプチドに特異的なモノクローナル抗体を、陽性対照または標準として用いた。ワクチン接種されていないマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ＴＧ４５１０＋／＋、またはＴｇ４５１０−／−）の血清を陰性対照として用いた。９６ウェル高結合ポリスチレンプレート（ＣｏＳｔａｒ  ９０１８）を、０．１Ｍの炭酸ナトリウム（ｐＨ８．２）（Ｓｉｇｍａ  Ｓ７７９５）中に希釈した１００μＬのペプチドで、４℃で１８から２１時間にわたり被覆した。Ｃ−１ＰおよびＣ−１が３μｇ／ｍＬであったことを除いて、全てのペプチドは０．３μｇ／ｍＬの濃度であった。翌日、被覆溶液を除去し、プレートを、室温で１時間にわたり、６００ｒｐｍでＨｅｉｌｄｏｌｐｈ  Ｔｉｔｒａｍａｘ１０００を用いて振とうしながら、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ  Ｐ２２８７）および１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ９４１８）を含有するＰＢＳ溶液（ＥＭＤ  ＯｍｎｉＰｕｒｅ６５０７）でブロックした。ブロック溶液を除去し、その後、試料をプレートに添加した。
【０２７６】
標準として用いられたマウス血清およびモノクローナル抗体を、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中の０．５または１ｌｏｇ希釈物を用いて連続希釈した。１：５００、１：５０００、または１：１５，８００から開始した、血清試料の６倍または８倍希釈物を、各試料について試験した。標準および陽性対照として用いたモノクローナル抗体は、Ａ−１Ｐでは抗タウ３９６（Ｚｙｍｅｄ  ３５−５３００）、Ｂ−１ＰではＡＴ−１８０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ  ＭＮ１０４０）、Ｄ−１ＰおよびＥ−１ＰではＡＴ−８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ  ＭＮ１０２０）、Ｃ−１ＰではＡＴ−１００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ  ＭＮ１０６０）であった。検量線のために、ウェル当たり５０、１５．８、５、１．５８、０．５、０．１５８、および０．０５ｎｇのモノクローナル抗体濃度を用いた。
【０２７７】
試料および標準を、２組のウェル中に、ウェル当たり１００μＬでプレートに添加した。プレートを、６００ｒｐｍで振とうしながら、室温で１時間にわたりインキュベートした。次にプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ中に１：３０００まで希釈した二次抗体（ＨＲＰＯコンジュゲート型抗マウスＩｇＧ、カタログ番号Ｍ３０１０７）を１００μＬ／ウェルで添加した。異なる二次抗体を、ＩｇＧ１（カタログ番号Ｍ３２１０７  １：２０００）、ＩｇＧ２ａ（カタログ番号Ｍ３２３０７  １：２０００）、およびＩｇＭ（カタログ番号３１５０７  １：３０００）の検出に用いた。二次抗体は、振とうしながら室温で１時間にわたり、プレートに結合させた。プレートを再びＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、最後の洗浄の後に、プレートを拭き取り乾燥した。発色させるために、１００μＬのＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＥＩＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  番号１７２−１０６７）を、室温で１１分間にわたり、各ウェルに添加した。反応を停止させるために、１００μＬの１Ｎの硫酸を各ウェルに添加した。吸光度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ｐｌｕｓ３８４で、４５０ｎｍで読み取った。各プレートのＯＤ閾値を、ＰＢＳ−Ｔで処理した全てのウェルの平均を得、これらのウェルの標準偏差を３回加算することによって計算した。標準偏差が計算され得ない場合、ＰＢＳ−ＴのＯＤを２倍した値を閾値として用いた。計算された閾値よりも大きい４５０ｎｍでの吸光度値を有する最初の試料希釈から、試料の力価を決定した。いくつかのアッセイでは、関係する陽性対照モノクローナルの希釈に基づいた検量線を用いて、検量線と比較した力価濃度を計算した。シグナルが検出されない場合には、試験された最低希釈または標準の値を計算に用い、最大希釈が陽性であった場合には、試験された最大希釈または標準の値を用いた。Ｎが２よりも大きい場合には、平均力価を計算し、一方、Ｎが１または２の場合には、個別の値を示した。各試料について、リン酸化型ペプチドの試料力価を、同一のペプチドのリン酸化されていない型の力価で割り、次に異なる試料について比率を平均化することによって、選択性の比率を決定した。１０を超える値または０．１未満の値は選択性であると考えた。選択性を決定するための最初の陽性希釈の使用は、最も控えめな方法であった。１または最大ＯＤの半分という閾値ＯＤなどの、他の方法を用いると、より大きな選択性値がもたらされる可能性がある。
【０２７８】
（実施例１４）
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５１０８３）を用いて、ペプチド−Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰでの免疫化の後のＴ細胞応答を測定した。ＥＬＩＳＰＯＴは、（低用量のアラムの存在下、またはアラムなしの）Ａ−８Ｐ、Ａ−３Ｐ、Ｂ−３Ｐ、Ｃ−２Ｐで免疫化されたマウスおよびまた免疫化されていないマウスから得られた、プールした脾臓（Ｎ＝３）で行った。９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレートを、５μｇ／ｍＬの捕捉抗マウスＩＦＮ−γ抗体と共に、４℃で一晩、平板培養した。抗体で被覆されたプレートを洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＶＷＲ  Ａ１５−２０４）を含有するＲＰＭＩ１６４０完全培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １１８７５−１１９）でブロックした。
【０２７９】
次に、脾臓細胞を、抗ＩＦＮ−γ抗体で被覆されたプレート中に、ウェル当たり５００，０００個脾臓細胞で播種し、５％ＣＯ２を有する３７℃のインキュベーター内で、１０μｇ／ｍＬのペプチド抗原またはタンパク質抗原で２０から２４時間にわたり刺激した。無関係ペプチド対照はＨＢＶ−１（配列番号７７）であり、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ９４１８）を、Ｑｂｅｔａ−ＶＬＰについての無関係タンパク質対照として用いた。ウェル当たり５５，５５５および１８，５２０個細胞で播種した脾臓細胞の、フォルボール１２−ミリステート１３アセテート（０．５μｇ／ｍＬのＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８１３９）およびイオノマイシン（０．５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉ０６３４）での刺激を、陽性対照として用いた。２０から２４時間のインキュベーション期間の後、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを蒸留水で２回洗浄し、その後、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ  Ｐ２２８７）を含有する１×ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １００１００７２））でさらに３回洗浄した。１０％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中に希釈された、２μｇ／ｍＬのビオチン化された抗ＩＦＮ−γ検出抗体を、室温で２時間にわたりインキュベートし、その後、ＰＢＳ１０％ＦＢＳ中に希釈された１：１００のストレプトアビジンＨＲＰと共にインキュベートすることによって、ＩＦＮ−γサイトカインを検出した。プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＩＦＮ−γスポットを、ＡＥＣクロマゲン基質を用いて可視化した（室温で１１分間のインキュベーション）。
【０２８０】
Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＥＬＩＳｐｏｔアナライザーおよび５．０Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔソフトウェアおよびウェル当たりの平均数を用いて、ＩＦＮ−γ陽性スポットをスキャン、捕捉、および計数した。無関係のペプチドがペプチド抗原についての陰性対照であり、一方、ＢＳＡが非コンジュゲート型ＶＬＰについての陰性対照であった。陽性と考えられるためには、平均スポット値は、スチューデントＴ検定を用いて、関係する陰性対照よりも有意に大きくなくてはならない（ｐ＜０．０５）。
【０２８１】
（実施例１５）
アジュバントの製剤および免疫化
本明細書において記載される具体的な実施例（例えば、実施例５〜１４）において用いられるアジュバントは、以下のようにして調製した。ＣｐＧ−２４５５５は、水中の２ｍｇ／ｍＬのストックに作製した。用いたアラムは、１０ｍｇ／ｍＬのアルミニウムを含有するＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ“８５”（Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）であった。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ“８５”を、１：１の比率で１００μｇのペプチドまたはＶＬＰコンジュゲート型ペプチドと混合した。全体として、最大２５μＬ（筋肉内ワクチン接種のため）または５０μＬ（皮下ワクチン接種のため）を、１００μｇのＶＬＰと共に溶液に添加し、迅速にボルテックスし、氷上に置いた。ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を、ペプチド溶液との１：１の比率で添加した。１００μＬの皮下用量のために、５０μＬのＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄを２ｍｇ／ｍＬのペプチド溶液５０μＬに添加し、Ｍｉｘｅｒｍｉｌｌ（ＳＰＥＸ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ）を用いて４℃で１０分間にわたり乳濁化した。２５μＬ（１２μｇ）のＡｂＩＳＣＯ−１００（Ｉｓｃｏｎｏｖａ）を最大１００μｇのＶＬＰ−ペプチド溶液および５μｇ（１０μｇ）のＣｐＧ−２４５５５に添加し、ボルテックスし、氷上に置いた。
【０２８２】
本明細書において記載される具体的な実施例（例えば、実施例５〜１４）において行った免疫化および動物研究は、一般に認められている方法に従って実施した。ワクチン接種では、最大１００μＬのワクチンを尾部の根元に皮下注射したか、または５０μＬを後前脛骨筋の一方もしくは両方に注射した。血液を、顎下のランセット切開を介して、または期間の最後には心穿刺を介して回収した。瀉血および頸椎脱臼の後に脾臓を除去し、５％ＢＰＳおよびＰｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１５１４０−１２２）を有する冷たい無菌ＨＢＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１４１７０）中に置いた。脾臓を７０μｍのスクリーン（Ｆａｌｃｏｎ）上ですり潰した。氷冷したＨＢＢＳ中で細胞を洗浄し、赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で溶解した。脾臓細胞をＧｕａｖａ  ＰＣＡ９６（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）で計数した。
【０２８３】
（実施例１６）
所望の免疫応答のためのＱｂｅｔａ／ＬＶＰに対するｐタウペプチドのコンジュゲーション密度の最適化
Ｑｂｅｔａ／ＶＬＰに対するｐタウペプチドエピトープのコンジュゲーション密度（Ｑｂｅｔａモノマーサブユニット当たりのペプチドの数）がｐタウ特異的抗体応答に影響するかを決定するために、実験を行った。ＳＭＰＨモル濃度の過剰およびｐタウペプチドの過剰を変化させることによってもたらされる異なるカップリング条件を用いて、異なるエピトープ密度の８個のｐタウ／ＶＬＰコンジュゲートを生産した（表４）。５頭のメスのＢａｌｂＣマウス（８週齢）からなる群を、０日目および１４日目（ｓｃ）に、７５０μｇのアラム（Ａｌ（ＯＨ）３）中の１００ｕｇの異なる密度の各コンジュゲートで免疫化した。２６日目に血清を回収した。免疫化された動物の抗体応答を、実施例１３において記載されるように、抗原特異的力価決定アッセイを用いて調べた。
【０２８４】
表４において示される２６日目の力価の結果に基づいて、Ａ−８Ｐ／ＱＢｅｔａでの２．３のコンジュゲーション濃度は、より高い（３．６）密度のコンジュゲート形態よりも高い力価の免疫応答をもたらした。異なるＢ−３Ｐ／Ｑｂｅｔａコンジュゲートでは、２．２および３．６のコンジュゲート密度形態で、力価は同様であり、最大であった。Ｃ−２Ｐ／Ｑｂｅｔａでは、２．２および３．５のエピトープコンジュゲーション密度が同様の力価をもたらし、これは、４．３のコンジュゲーション密度形態よりもわずかに高かった。結果は、エピトープのコンジュゲーション密度が、抗原特異的な様式で抗体応答に影響し得ること、および全体として、Ｑｂｅｔａモノマー当たり２〜３個のｐタウペプチドエピトープのコンジュゲーション密度をもたらすカップリング条件が好ましいことを示す。
【０２８５】
【表４】
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【０２８６】
【表５−１】
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【０２８７】
【表５−２】
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【０２８８】
【表５−３】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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