(57)【要約】  マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルは、ソフトゲルカプセルが室温で少なくとも約24ヶ月間安定であるように製造される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)約35℃〜約75℃の間の融点を有する少なくとも1種の植物性脂質を含む少なくとも1種のコーティングを有するマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を提供するステップと、
(b)マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を懸濁製剤に懸濁させて充填物を作るステップと、
(c)低強度および低温で充填物を混合して混合充填物を作るステップと、
(d)混合充填物中のマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌の凝集体を減少させて解凝集した充填物を作るステップと、
(e)解凝集した充填物をソフトゲルカプセル中にカプセル化するステップと
を含み、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌のコーティングの完全性が維持される、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルを製造する方法。
【請求項２】
酸素への暴露を制御しながら行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルが室温で少なくとも約24ヶ月間安定である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌の凝集体が、約33℃未満の温度で混合充填物を製粉することにより減少させられる、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
カプセル化後の前記マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌が約150〜約250ミクロンの間および約550ミクロン未満の平均粒径サイズを維持する、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
カプセル化後の前記マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌が約200ミクロンの平均粒径サイズを維持し、各マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌が約500ミクロン未満の平均粒径サイズを有する、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも1種の植物性脂質が、ポリグリセロールエステル、水素化ヤシ脂肪、ジパルミトステアリン酸グリセロール、ジステアリン酸ポリグリセリル-6、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記懸濁製剤が少なくとも油、懸濁脂肪または乳化剤を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記懸濁製剤が少なくとも1種の油と、懸濁脂肪、乳化剤およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1種の材料とを含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも1種の油がダイズ油、キャノーラ油、ヒマワリ油、マカダミア油、ラッカセイ油、グレープシード油、カボチャ種子油、亜麻仁油、亜麻子油、オリーブ油、トウモロコシ油、ベニバナ油、ゴマ油、松の実油、共役リノール酸、アーモンド油、桃仁油、杏仁油、クルミ油、ナタネ油、ラズベリー種子油、ビルベリー種子油、クランベリー種子油、ザクロ種子油および他の果実種子油、サジー油、チア油、エゴマ油、ジアグリセロール油、ω3の植物由来供給源、エイコサペンタエン酸の発酵供給源、ドコサヘキサエン酸の発酵供給源、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸および他のω3の組み合わせの発酵供給源、γ-リノレン酸および/またはステアリドン酸の供給源、分留ココナッツ油、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
懸濁脂肪が脂肪酸のモノグリセリド、脂肪酸のジグリセリド、蜜蝋、モノステアリン酸グリセリル、モノジオレイン酸グリセリル、分留パーム油誘導体、水素化パーム脂肪、水素化ダイズ油誘導体、植物性バター、中鎖トリグリセリド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１２】
乳化剤がレシチン、ポリソルベート、モノオレイン酸ソルビタンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１３】
混合が約15℃〜約32℃の間の温度および約3000rpm未満の強度で行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
凝集体を減少させるステップが、解凝集した充填物を約33℃未満の温度および低湿度環境に維持して行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
(f)充填したソフトゲルカプセルを二重乾燥するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
二重乾燥するステップが、カプセルを強制換気でタンブラー乾燥機中で乾燥させるステップ、引き続いて乾燥棚内部に並べたトレー上のカプセルを乾燥させるステップとで構成され、温度が約18℃〜約25℃であり、相対湿度が約8%〜約20%である、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
請求項1に記載の方法にしたがって作られるプロバイオティクスソフトゲルカプセル。
【請求項１８】
前記方法が酸素への暴露を制御しながら行われる、請求項17に記載のプロバイオティクスソフトゲルカプセル。
【請求項１９】
室温で少なくとも約24ヶ月間安定である、請求項18に記載のプロバイオティクスソフトゲルカプセル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全開示が参照により本明細書に組み込まれている、2010年8月10日に出願した米国仮特許出願第61/372350号の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルを製造する方法およびこの方法にしたがって作られた製品に関する。より具体的には、本発明の製品は、室温で少なくとも24ヶ月間安定である。
【背景技術】
【０００３】
プロバイオティクスは、粘膜および全身免疫を調節することにより、ならびに腸機能および腸管内の微生物バランスを改善することにより、宿主の生理機能に有益に影響する微生物系食事性補助剤である(Naidu, A.S.他(1999)、Probiotic spectra of lactic acid bacteria(LAB)、Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 39:3〜126頁)。免疫応答の調節、血清コレステロール濃度の低減、乳糖不耐症の改善、感染性腸疾患に対する耐性の増加、下痢の持続時間の減少、血圧の低下、および結腸がんの予防の手助けを含む、種々の栄養的および治療的効果がこれらのプロバイオティクスに起因するとされてきた。
【０００４】
しかしながら、宿主にこれらの有益な効果を及ぼすためには、プロバイオティクスは、生存能力を保持し、大量に大腸に到達しなければならない(Favaro-Trindade, C.S.他(2002)、J Microencapsulation 19(4):485〜494頁)。有効なプロバイオティクス細菌は、胃の条件を生き延び、腸管上皮に付着することにより、少なくとも一時的に、腸に定着することができるはずである(Conway, P.(1996)、Selection criteria for probiotic microorganisms、Asia Pacific J. Clin. Nutr 5:10〜14頁)。
【０００５】
乳酸菌または乳酸桿菌は、ヨーグルト、発酵乳およびケフィアなどの乳製品に組み込むために最も一般的に使用されているプロバイオティクスであり、その使用は絶えず広がっている。例えば、これらの菌は、現在、粉末、カプセルおよび錠剤などの栄養補助食品形態で添加されている。ビフィズス菌および連鎖球菌もまた、一般的に使用されているプロバイオティクス微生物である。乳酸桿菌は、一般的に回復後にプロバイオティクス機能活性(probio-functional activity) (すなわち、腸付着/保持、バクテリオシン/酵素の産生)を保持する有効な送達系を必要とする(Salminen, S.他(1996)、Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier: successful strains and future challenges、Antonie Van Leeuwenhoek 70:347〜3581頁)。さらに、生体内生存能力および消化管寿命の増加に加えて、室温での貯蔵寿命の延長が、有効な市販品の製造において依然として問題である。プロバイオティクス細菌の凍結乾燥がプロバイオティクスの保存および送達のための有効な方法であることが示されてきたが、湿度、通気(酸素利用可能性)、加工(すなわち、撹拌)および温度などのいくつかの物理化学的因子が細胞生存能力、したがって、貯蔵寿命を損ない得る。
【０００６】
科学文献により証明されているように、プロバイオティクス細菌を含む製品の安定性、生存能力(すなわち、生存能力のある微生物の含量)および品質が問題であった。ヨーグルトに関する1つの研究では、実験により、試験した6種の製品のうちの3種が生きた微生物の痕跡を含んでおらず、2種が低濃度しか含んでいないという証拠がもたらされた。Shah(2000) Journal of Dairy Science、83(4):894〜907頁。粉末、カプセルおよび錠剤などの固形剤形中に配されたプロバイオティクス細菌を含む製品に関して、同様の報告が出ている。プロバイオティクス細菌の安定性への主な挑戦は、水分活性、加工の物理的ストレスおよび温度である。体内の適当な送達部位でプロバイオティクス細菌を放出し、プロバイオティクスが定着するのを可能にするコーティングなどの保護手段を適用することも課題であった。コーティングしたプロバイオティクス細菌の適当な送達および定着が、新たに公開された研究で最近確認された(Del Piano, M.他(2010)、Evaluation of the intestinal colonization by microencapsulated probiotic bacteria in comparison to the same uncoated strains、Journal of Clinical Gastroenterology、44 Supp. 1:S42-6)。
【０００７】
プロバイオティクスの生存能力および貯蔵寿命を増加させるために油性懸濁液が利用されてきた。例えば、米国特許出願公開第2004/0223956号は、食用油に懸濁され、任意選択により、ツーピースハードシェルカプセル(two piece hard shell capsule)にカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含む組成物を開示している。
【０００８】
さらに、当業者は、プロバイオティクス微粒子を使用して生存能力および貯蔵寿命を増大させようと試みてきた。例えば、米国特許出願公開第2005/0266069号は、プロバイオティクス細菌のコアおよびセルロース系賦形剤が、コーティング剤および可塑剤でコーティングされたプロバイオティクス微粒子を含むプロバイオティクス製剤を開示している。
【０００９】
経験的に、ヒトもしくは動物が消費するための医薬品または他の物品を硬または軟ゼラチン(ソフトゲル)シェル中に安全にかつ好都合に詰めることができることが長く示されてきた。
【００１０】
充填されたワンピースソフトカプセルまたはソフトゲルは、広く知られており、長年種々の目的のために使用されており、液体充填材料を保持することができる。より頻繁には、ソフトゲルは、ビタミン、ミネラル、果実および植物抽出物、ならびに医薬品などの消費できる材料を、液体ビヒクルもしくは担体に封入するまたは包含するために使用される。
【００１１】
液体担体中の栄養剤もしくは医薬品の溶液または分散液のソフトカプセルへのカプセル化は、圧縮錠、コーティング錠もしくは素錠、またはバルク液体製剤などの他の剤形に対して多くの利点を提供する。溶液または分散液のカプセル化は、単位用量の正確な送達を可能にする。ソフトカプセルは、飲み込むのが容易で風味を付ける必要がなく、優れた酸素障壁(すなわち、カプセルシェルを通る酸素透過性が低い)、および干渉保護をもたらす剤形である。ソフトカプセルはまた、ヨーグルトおよび牛乳などの食品および液体よりも輸送が容易である。
【００１２】
プロバイオティクスは、シームレスまたは軟ゼラチンカプセルで市販されている。Bifa-15(商標)(Eden Food, Inc.、Clinton, Mich.)は、ビフィズス菌のためのシームレスマイクロカプセル化送達系であり、30億個の細菌を含むと主張している。カプセルは、オリゴ糖、甘味剤および香味剤と混合され、個々に包装された単一用量アルミニウム管で提供される。カプセルをまるごと飲み込み、噛まないという条件で、内容物を口に流し込む。Ultra-Dophilus(商標)(Nature's Plus、Melville、N.Y.)は、20億個の生存能力のある凍結乾燥されたラクトバチルス・アシドフィルス(L. acidophilus)を含む従来の大きさの軟ゼラチンカプセルである。Probiotocs12Plus(商標)は、製造時に、900コロニー形成単位効力を目的として12菌株の乳酸菌を含むソフトカプセルであり、冷蔵が必要とされない。各製品は製造時の生存能力を公表しているが、ラベルの主張が将来にわたって室温、例えば、22〜25℃での貯蔵後に満たされるという保証はない。ゼラチンカプセルに含まれるプロバイオティクスの生存能力の維持における同様の問題も特許文献から明らかである。
【００１３】
プロバイオティクス細菌を含む当技術分野のソフトゲルは、大部分は不成功であった。ソフトゲル製剤は、特に室温で、製品の設計した貯蔵寿命(典型的には2年)の間、通常はコロニー形成単位(CFU)で測定される所望の生存能力を維持しなかった。プロバイオティクス細菌の生命力は、あまりに急速に低下する傾向があるため成功しない。これは、一部は、ソフトゲル環境中の高い水分活性Aw(自由水)のためであると考えられている。このAw勾配は、ソフトゲル製造方法自体(特にカプセル化段階)と関連する。この段階中、カプセルシェル中に存在する水のいくらかは、シェルの中の製剤に移動し、ここでは自由形態で保持される。プロバイオティクス細菌を含む製剤の場合、自由水はプロバイオティクス細菌を活性化し、そのすぐ後に死なせる。
【００１４】
さらに、ソフトゲルの製造方法は、たとえコーティングされていてもプロバイオティクス細菌にストレスを与え、それによって生存能力および安定性を減少させ得るので、ソフトゲル中のプロバイオティクス細菌の安定性が課題である。
【００１５】
そのため、産業にとって課題であり続けているように、室温で長期間貯蔵した場合の製品中のプロバイオティクス細菌の生存能力および安定性を増加させる必要がある。特に、生存能力および貯蔵寿命が増加したプロバイオティクス細菌を含む安定なソフトゲルカプセルが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許出願公開第2004/0223956号
【特許文献２】米国特許出願公開第2005/0266069号
【特許文献３】イタリア特許出願第RM2009A000104号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Naidu, A.S.他(1999)、Probiotic spectra of lactic acid bacteria(LAB)、Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 39:3〜126頁
【非特許文献２】Favaro-Trindade, C.S.他(2002)、J Microencapsulation 19(4):485〜494頁
【非特許文献３】Conway, P.(1996)、Selection criteria for probiotic microorganisms、Asia Pacific J. Clin. Nutr 5:10〜14頁
【非特許文献４】Salminen, S.他(1996)、Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier: successful strains and future challenges、Antonie Van Leeuwenhoek 70:347〜3581頁
【非特許文献５】Shah(2000) Journal of Dairy Science、83(4):894〜907頁
【非特許文献６】Del Piano, M.他(2010)、Evaluation of the intestinal colonization by microencapsulated probiotic bacteria in comparison to the same uncoated strains、Journal of Clinical Gastroenterology、44 Supp. 1:S42-6
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、(a)35℃〜75℃の間の融点を有する少なくとも1種の植物性脂質を含む少なくとも1種のコーティングを有するマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を提供するステップと、(b)マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を懸濁製剤に懸濁させて充填物(fill)を作るステップと、(c)低強度および低温で充填物を混合して混合充填物を作るステップと、(d)混合充填物中のマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌の凝集体を減少させて解凝集した(de-agglomerated)充填物を作るステップと、(e)解凝集した充填物をソフトゲルカプセル中にカプセル化するステップとを含み、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌のコーティングの完全性が維持される、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルを製造する方法に関する。好ましい実施形態では、本方法は、酸素への暴露を制御しながら行われ、さらに好ましい実施形態では、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルは、室温で少なくとも約24ヶ月間安定である。特定の実施形態では、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌の凝集体は、約33℃未満の温度で混合充填物を製粉することにより減少させられる。別の好ましい実施形態では、カプセル化後のマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌は、約150〜約250ミクロンの間の、より好ましくは約200ミクロンの平均粒径サイズを維持し、各マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌は約500ミクロン未満の平均粒径サイズを有する。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌のコーティングは、ポリグリセロールエステル、水素化パーム脂肪、ジパルミトステアリン酸グリセロール、ジステアリン酸ポリグリセリル-6、およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも1種の植物性脂質を含む。特定の好ましい実施形態では、懸濁製剤は、少なくとも油、懸濁脂肪または乳化剤、あるいは少なくとも1種の油と懸濁脂肪、乳化剤およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも1種の材料とを含む。
【００２０】
本発明の方法における混合は、好ましくは約15℃〜約32℃の間の温度および約3000rpm未満の強度で行われる。
【００２１】
本発明はまた、(a)約35℃〜約75℃の間の融点を有する少なくとも1種の植物性脂質を含む、少なくとも1種のコーティングを有するマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を提供するステップと、(b)マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を懸濁製剤に懸濁させて充填物を作るステップと、(c)低強度および低温で充填物を混合して混合充填物を作るステップと、(d)混合充填物中のマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌の凝集体を減少させて解凝集した充填物を作るステップと、(e)解凝集した充填物をソフトゲルカプセル中にカプセル化するステップの方法にしたがって作られ、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌のコーティングの完全性が維持される、プロバイオティクスソフトゲルカプセルに関する。
【００２２】
特定の実施形態では、プロバイオティクスソフトゲルカプセルは、酸素への暴露を制御しながら行われる方法にしたがって作られ、室温で少なくとも約24ヶ月間安定である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、プロバイオティクス細菌の生存能力を増加させる、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含む安定なソフトゲルカプセルを製造する方法を開発することにより、当技術分野の課題を解決しようと試みている。本発明者らは、室温でのより優れた安定性および約200ミクロンの平均粒径サイズを維持し、各マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌が約500ミクロン未満の粒径サイズを有する、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルを製造するための本発明の方法を発見した。
【００２４】
第1の実施形態は、(a)約35℃〜約75℃の間の融点を有する少なくとも1種の植物性脂質を含む少なくとも1種のコーティングを有するマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を提供するステップと、(b)マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を懸濁製剤に懸濁させて充填物を作るステップと、(c)低強度および低温で充填物を混合して混合充填物を作るステップと、(d)混合充填物中のマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌の凝集体を減少させて解凝集した充填物を作るステップと、(e)解凝集した充填物をソフトゲルカプセル中にカプセル化するステップとを含み、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌のコーティングの完全性が維持される、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルを製造する方法に関する。
【００２５】
本発明の第1の実施形態の方法は、約35℃〜約75℃の間の融点を有する少なくとも1種の植物性脂質を含む、少なくとも1種のコーティングを有するマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を提供するステップを含む。プロバイオティクス細菌をコーティングする目的は、プロバイオティクス細菌とソフトゲルカプセルのシェルから内部充填物製剤へ移動する自由水との間の接触を排除することである。プロバイオティクス細菌は、それだけに限らないが、頂部および/または底部スプレーを有する流動層技術、あるいはpH誘導性凝集に基づく他のコーティング技術を含む任意の既知の技術を使用してコーティングすることができる。マイクロカプセル化されたという用語は、本明細書で使用する場合、組成物によりコーティングされたことを意味する。一般的に、マイクロカプセル化は、約1ミクロン未満〜約200ミクロン前後の初期サイズを有する粒子のコーティングを含むと理解される。しかしながら、コーティングがいかなる間隙も孔もなく均質かつ均一であり、適当な障壁層を形成する限り、任意の合理的な厚さ、好ましくは1層当たり約20〜約25ミクロンの間のコーティングが適当である。本発明の目的のために、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を提供するステップは、市販のマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を得ることにより、または記載のコーティングによりプロバイオティクス細菌をコーティングすることにより達成することができる。
【００２６】
任意のプロバイオティクス細菌を本発明に使用してよい。プロバイオティクス細菌は、市販の供給源から購入しても、既知の方法にしたがって培養(増殖)してもよい。プロバイオティクスは、典型的には乳酸桿菌属、ビフィドバクテリウム属、連鎖球菌属、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ペディオコッカス属(Pediococcus)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)、ロイコノストック属(Leuconostoc)およびサッカロミセス属(Saccharomyces)に属する。乳酸桿菌属では、以下の種がプロバイオティクス活性を有する:ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・クリスパトス(L. crispatus)、ラクトバチルス・ガセリ(L. gasseri)、ラクトバチルス・デルブレッキイ  (L. delbrueckii)  グループ、ラクトバチルス・サリバリウス(L. salivarius)、ラクトバチルス・カゼイ(L. casei)、ラクトバチルス・パラカゼイ(L. paracasei)、ラクトバチルス・プランタラム(L. plantarum)グループ、ラクトバチルス・ラムノサス(L. rhamnosus)、ラクトバチルス・ロイテリ(L. reuteri)、ラクトバチルス・ブレビス(L. brevis)、ラクトバチルス・ブフネリ(L. buchneri)、ラクトバチルス・ファーメンタム(L. fermentum)、ラクトバチルス・フルクチボランス(L. fructivorans)、ラクトバチルス・ルミニス(L. ruminis)、ラクトバチルス・サケイ(L. sakei)およびラクトバチルス・バギナリス(L. vaginalis)。本発明の好ましい実施形態では、プロバイオティクス細菌は、以下の種から選択される:ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・クリスパトス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・デルブレッキイグループ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタラムグループ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(B. adolescentis)、ビフィドバクテリウム・アングラタム(B. angulatum)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(B. bifidum)、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(B. breve)、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム(B. catenulatum)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(B. infantis)、ビフィドバクテリウム・アニマリス(B. animalis)、ビフィドバクテリウム・ラクティス(B. lactis)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(B. longum)、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラツム(B. pseudocatenulatum)、ストレプトコッカス・サーモフィラス(S. thermophilus)、出芽酵母(Sacch. Cerevisiae)グループおよびこれらの組み合わせ。
【００２７】
好ましい実施形態では、本発明に使用するプロバイオティクス細菌は、1〜12種の菌株、好ましくは2〜6種の菌株、より好ましくは3種の菌株で構成される。プロバイオティクス細菌は、任意の固形形態であり得る。好ましくは、プロバイオティクス細菌は、凍結乾燥または噴霧乾燥により製造される乾燥粉末の形態である。
【００２８】
コーティングは、約35℃〜約75℃の間の融点を有する少なくとも1種の植物性脂質を含み、その結果としてコーティングは、マイクロカプセル化された細菌を含むソフトゲルカプセルを製造する方法中、製品の貯蔵中、または胃十二指腸管(胃および十二指腸)を通って移行する間、または胃の低pH中で、溶解せず、軟化せずまたは完全性が低下しない。理論上、ソフトゲルカプセルは、ヒト体内の胃にマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含む充填物を放出し、次いで、その内容物は腸管に送達される;プロバイオティクス細菌は、プロバイオティクスをコーティングから放出するのに適当なpHを有する腸に送達されたときのみ活性化され、次いで、定着して宿主に最適な利益をもたらす。好ましい実施形態では、植物性脂質は、約45℃〜約65℃の間、より好ましくは約50℃〜約60℃の間の融点を有する。好ましい実施形態では、植物性脂質は、ジステアリン酸ポリグリセリル(Plurol Stearique WL 1009など)、パルミトステアリン酸グリセリル(Precirol Ato5など)、飽和脂肪酸(Revel Cなど)、ラウリン酸由来でない水素化植物性脂肪および水素化パーム脂肪、ステアリンならびにこれらの組み合わせである。より好ましくは、植物性脂質は、ポリグリセロールエステル、水素化パーム脂肪、ジパルミトステアリン酸グリセロールまたはPlurol Stearique WL1009としても知られているジステアリン酸ポリグリセリル-6 CAS61725-93-7、またはこれらの組み合わせである。
【００２９】
任意選択により、プロバイオティクス細菌は、2つ以上の層、すなわち、二重、三重等でコーティングされていてよく、各層はプロバイオティクス細菌上の別々のおよび異なるコーティングで、層の少なくとも1つは、上に列挙した脂質の1つまたは組み合わせである。この実施形態では、各コーティングは、連続してプロバイオティクス細菌上に適用される。例えば、二重コーティングをプロバイオティクス細菌に適用することができる。複数コーティングは、ソフトゲルカプセルの内側に存在する自由水からのプロバイオティクス細菌の保護を増加させる。二重コーティングは、参照により本明細書に組み込まれている、2009年3月9日に出願した同時継続のイタリア特許出願第RM2009A000104号でさらに説明されている。
【００３０】
本発明の第1の実施形態の方法は、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を懸濁製剤に懸濁させて充填物を作るステップを含む。本発明の懸濁製剤は、当技術分野で既知の任意の技術により調製することができる。1つの理論に限定されることなく、懸濁製剤は、マイクロカプセル化された細菌とソフトゲルカプセルのシェルから内部環境への自由水進入との間の接触を効果的に限定し、それによってプロバイオティクス細菌の生存能力および安定性の増加をもたらすと考えられている。懸濁製剤は、粉末の懸濁を維持し、均質な混合物を確保するのに適当な濃度に調節することができる。当業者は、要求される濃度および懸濁液の濃度の調節の仕方を容易に理解するだろう。
【００３１】
本発明の実施形態では、懸濁製剤は、少なくとも油、懸濁脂肪または乳化剤を含む。さらなる実施形態では、懸濁製剤は、少なくとも1種の油と懸濁脂肪、乳化剤およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1種の材料とを含む。好ましい実施形態では、懸濁製剤は、少なくとも1種の油および少なくとも1種の懸濁脂肪で構成される;別の好ましい実施形態では、懸濁製剤は、少なくとも1種の油および少なくとも1種の乳化剤で構成される;さらに別の好ましい実施形態では、懸濁製剤は、少なくとも1種の油、懸濁脂肪および乳化剤の各々を含む。特定の実施形態では、懸濁脂肪は、油の増粘剤としておよび懸濁製剤の均質性を確保するために使用される。
【００３２】
本発明で使用するのに適した油には、それだけに限らないが、ダイズ油、キャノーラ油、ヒマワリ油、マカダミア油、ラッカセイ油、グレープシード油、カボチャ種子油、亜麻仁油、亜麻子油、オリーブ油、トウモロコシ油、ベニバナ油、ゴマ油、松の実油、共役リノール酸、アーモンド油、桃仁油、杏仁油、クルミ油、ナタネ油、ラズベリー種子油、ビルベリー種子油、クランベリー種子油、ザクロ種子油および他の果実種子油、サジー油、チア油、エゴマ油、ジアグリセロール(DAG)油、ω3の植物由来供給源、エイコサペンタエン酸(EPA)の発酵供給源、ドコサヘキサエン酸(DHA)の発酵供給源、魚油およびオキアミ油を含むEPA、DHAおよび他のω3の組み合わせの発酵供給源、γ-リノレン酸(GLA)および/またはステアリドン酸(SA)の供給源、分留ココナッツ油、ならびにこれらの組み合わせが含まれる。DHA、EPAおよびALAの供給源には、それだけに限らないが、魚油、酵母または他の微生物もしくは単細胞供給源、ならびに植物油、主に亜麻子、ダイズおよびキャノーラが含まれる。GLAの供給源には、それだけに限らないが、月見草油、クロフサスグリ種子油、ボラージ種子、およびエキウム油が含まれる。
【００３３】
本発明に使用するのに適した懸濁脂肪には、それだけに限らないが、脂肪酸のモノグリセリド、脂肪酸のジグリセリド、蜜蝋、モノステアリン酸グリセリル、モノジオレイン酸グリセリル、分留パーム油誘導体、水素化パーム脂肪、水素化ダイズ油誘導体、植物性バター、中鎖トリグリセリド(MCT)、およびこれらの組み合わせが含まれる。
【００３４】
本発明に使用するのに適した乳化剤には、それだけに限らないが、レシチン、ポリソルベート、モノオレイン酸ソルビタンおよびこれらの組み合わせが含まれる。
【００３５】
特定の実施形態では、充填物は、好ましくは約0.5重量%〜約50重量%のマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌および約50重量%〜約99.5重量%の懸濁製剤を含む。
【００３６】
本発明の第1の実施形態の方法は、低強度および低温で充填物を混合して混合充填物を作るステップを含む。混合は、完全性を損なわないような、すなわち、プロバイオティクス細菌のコーティングおよびプロバイオティクス細菌の細胞完全性を損なわないような低強度および低温で行われる。マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌のコーティングの完全性および粒径を維持することは、本発明により達成されるプロバイオティクス細菌の生存能力および安定性を増加させる重要な態様である。
【００３７】
プロバイオティクス細菌の細胞構造およびプロバイオティクス細菌のコーティングの完全性を顕微鏡分析により分析して、これらが無傷および未損傷のままであるかどうかを決定することができる。無傷の細胞構造およびコーティングの組み合わせは、定着することができる生存能力のあるプロバイオティクス細菌をもたらす。この定着する能力は、総生菌数(cfu/g)により測定することができ、処理後の糞便の細菌組成分析を通して確認することができるだろう。
【００３８】
本明細書で使用する「低強度」とは、約3000rpm(約50Hz)未満の速度で混合することを指す。低強度はまた、ブレード型、ミキサーおよび混合スクリーンの選択にも関連する。好ましくは、ブレード型、ミキサーおよび混合スクリーンは、懸濁液へのせん断応力を最小化するが、安定で均質な懸濁液を達成し、プロバイオティクス細菌上のコーティングへの損傷をもたらさずに凝集および粒径を減少させるよう選択される。当業者は、低強度および低せん断のための適当なブレード型、ミキサーおよび混合スクリーンを容易に選択することができるだろう。混合およびせん断の強度は、当業者が容易に理解する因子の組み合わせにより制御することができる。本発明に使用するのに適した混合装置には、それだけに限らないが、例えば、内蔵乳化/均質化装置を備えるもしくは備えないアンカースターラーまたは静的逆混合(contra mixing)撹拌機、ならびにBecomixerおよびSkermann撹拌槽を含む撹拌槽、ならびに適当なブレードもしくは混合スクリーンを備えたRossおよびSilversonミキサーが含まれる。本明細書で使用する「低温」とは、約33℃未満の温度を指す。温度は、ソフトゲルが飲み込まれて、意図した目的地に送達されて体温がプロバイオティクス細菌を活性化するまで寿命が開始しないようプロバイオティクス細菌を不活性にしておくよう約33℃未満に保たれる。温度を低く保つことにより、プロバイオティクス細菌およびコーティングの生存能力ならびに安定性が維持される。好ましくは、混合の低温は、約15℃〜約32℃の間、より好ましくは、約20℃〜約30℃の間、最も好ましくは、約25℃に維持される。
【００３９】
本発明の第1の実施形態の方法は、混合充填物中のマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌の凝集体を減少させて解凝集した充填物を作るステップを含む。一部の「凝集体を減少させること」は、粒子のサイズを減少させ、くっついていた粒子を分離することを意味する。解凝集した充填物は、好ましくはマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌が主に互いに分離されるように解凝集される。同様に、この解凝集した充填物は、より好ましくは制御された粒径で形成された均質かつ均一な充填製剤であり、優れた品質のソフトゲルカプセルの有効なカプセル化および送達を可能にする。マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌の粒子は、カプセル化に適したサイズまで解凝集および減少させなければならない。解凝集は、任意の既知の手段により達成することができるが、プロバイオティクス細菌がソフトゲルカプセル中に移動した自由水から保護されたままであり、生存能力のあるプロバイオティクス細菌をヒト体内中の意図した位置に送達するよう、プロバイオティクス細菌上のコーティングの完全性を維持するように行われなければならない。解凝集工程は、好ましくはプロバイオティクス細菌が製造方法、貯蔵および経口摂取を通して生存能力があるままであり、胃の中で適当に放出および活性化されるよう、プロバイオティクス細菌の細胞構造の完全性を維持するように行われる。
【００４０】
特定の実施形態では、凝集体を減少させるステップは、製粉により行われる。好ましい実施形態では、凝集体減少、好ましくは製粉は、33℃未満の温度、好ましくは約25℃で行われる。さらに、このステップは、好ましくは約20%未満の湿度、より好ましくは約18%未満の湿度を意味する低湿度環境で行われる。好ましい実施形態では、凝集体減少、好ましくは製粉は、前のステップで凝集したかもしれない粒子を分離し、それによって実質的に均質な充填物を作る。
【００４１】
特定の実施形態では、製粉は、充填物に導入される熱を管理するよう制御された間隙設定および速度を有する三本ロール圧延機を使用して達成される。同様に、温度、エネルギー、酸素および水進入が、充填物に導入される熱を管理するよう制御される限り、別の当技術分野で既知の任意の他の装置または製粉を凝集体減少のために使用することができる。好ましくは、水および酸素の進入は、製粉中完全に避けられる。特定の実施形態では、凝集体を減少させるステップは、製粉および脱気の複数パート工程である。脱気は、空気またはガス泡を抜き出す真空下で行うことができ、真空は酸素暴露を減らすために窒素または任意の適当なガス下で破壊されるだろう。本明細書に開示する加工ステップの全てで、高い均質性および安定性を有するカプセル化された充填物を製造するために、充填物の通気および湿度を減少させるよう行動をとることができる。空気が充填物中に捕捉されると、これは酸化の問題、安定性の減少およびカプセル化の問題を引き起こし得る。
【００４２】
凝集体を減少させることとは、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌の平均粒径を標準化すること、および/または製造方法中に形成される粒子の凝集体を解凝集させることを指す。解凝集後の平均粒径サイズは、約150ミクロン〜約250ミクロンの間、好ましくは約200ミクロンであり得、各マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌は、好ましくは約550ミクロン未満、より好ましくは約500ミクロン未満、さらにより好ましくは約400ミクロン未満の粒径サイズを有し、最も好ましくは、粒子の少なくとも約90%が約350ミクロン〜約50ミクロンの間の直径サイズを有する。
【００４３】
本発明の第1の実施形態の方法は、解凝集した充填物をソフトゲルカプセル中にカプセル化するステップを含む。解凝集した充填物のソフトゲルカプセルへのカプセル化は、当技術分野で既知の任意の方法または製造装置を使用して行うことができる。例えば、ソフトゲルカプセルは、回転ダイカプセル化装置を使用して製造することができる。さらに、ソフトゲルカプセルは、当技術分野で既知の任意の材料から作ることができる。非限定的な例として、ソフトゲルカプセルは、標準的な回転ダイカプセル化技術、ならびにそれだけに限らないが、ゼラチン、グリセリン、天然もしくは加工デンプン、ソルビトールの供給源、水を含む材料のブレンドから選択される噛むことができるまたは飲み込める目的のための組み込みシェル材料、カラゲナン、加工デンプン、グリセリンおよび/またはソルビトールの供給源、水およびリン酸ナトリウムの選択を使用したVEGICAPS(商標)SOFT技術を使用して作ることができる。
【００４４】
本発明の第1の実施形態の好ましい実施形態では、本方法は、酸素への暴露を制御しながら行われる。これは、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を酸化から保護し、プロバイオティクス細菌の安定性を増加させるために行われる。酸素への暴露を制御することは、追加の酸素を導入しない手段をとること、存在する酸素の量を減少させる手段をとること、および中の酸素を完全に避ける手段をとることを意味し得る。酸素への暴露を制御するための手段は、本発明の方法ステップの各々で異なっていてもよいし、ひとまとめに同じであってもよい。酸素への暴露を制御することは、容易に理解され、当業者に既知の任意の手段により行うことができる。特定の好ましい実施形態では、方法ステップの各々は、窒素下、すなわち、連続的窒素ブランケット下で行われる。
【００４５】
任意選択により、本発明の第1の実施形態の方法は、充填したソフトゲルカプセルを二重乾燥する(double drying)ステップを含む。二重乾燥工程は、ソフトゲルカプセルが過度に温められてプロバイオティクス細菌が活性化されないように乾燥工程を制御するために使用される。好ましい実施形態では、強制換気を備えるタンブラー乾燥機にソフトゲルカプセルを入れる第1のステップを有する二重乾燥が行われる。より好ましい実施形態では、タンブラー乾燥機は、約20℃の温度および約18%〜約30%前後、好ましくは約20%の湿度に維持される。
【００４６】
好ましい実施形態では、約18℃〜約25℃、好ましくは約20℃の温度および典型的には約8%〜約20%の間の制御された相対湿度のトレー、部屋またはオーブン上のソフトゲルカプセルを乾燥させる第2のステップを有する二重乾燥が行われる。
【００４７】
一般的に、当業者は、ソフトゲルカプセルをカプセルサイズおよび充填物密度に特に適した所望の硬度およびシェル水分含量に乾燥させることを知っている。硬度は、Bareiss硬度計を使用して決定することができ、シェル水分含量はKarl Fisher滴定法を使用して湿度を測定することにより決定することができる。
【００４８】
本発明の第1の実施形態では、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌のコーティングの完全性が維持される。好ましい実施形態では、混合充填物中のマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌の粒子の凝集が、コーティングまたはコーティング中のプロバイオティクス細菌の細胞構造の完全性を損なうことなく減少させられる。生存能力の減少をもたらすソフトゲルカプセル中の自由水との接触からプロバイオティクス細菌を守るために、コーティングの完全性を維持することが重要である。コーティングの完全性を維持することとは、プロバイオティクス細菌がカプセル中の懸濁製剤と直接接触しないように、任意の場所で実質的に摩耗していない、破損していないまたは薄くなっていないコーティングを指す。対照的に、コーティングの完全性を損なうこととは、プロバイオティクス細菌がカプセル中の懸濁製剤と直接接触するように、薄くなった、摩耗した、ひび割れしたまたは影響を及ぼされたコーティングを指す。プロバイオティクス細菌の細胞構造の完全性を維持することとは、変形していないまたは引き裂かれていない細胞構造を指す。対照的に、コーティング中のプロバイオティクス細菌の細胞構造の完全性を損なうこととは、細胞構造を変形させる、引き裂く、解体するまたはねじり、細胞構造を弱めることを指す。損なわれた細胞構造は、送達されたときに腸に定着する能力を有さない細胞をもたらし得る。
【００４９】
好ましい実施形態では、マイクロカプセル化されたソフトゲルカプセルは、室温で少なくとも約24ヶ月間安定である。カプセルの安定性とは、特定の期間後のカプセル中のプロバイオティクス細菌のコロニー形成単位(CFU)の維持を指す。これはまた、貯蔵寿命の終わりで製品ラベルに表示されたプロバイオティクス活性(cfu/g)を満たすことを指し得る。安定なソフトゲルカプセルは、室温で約24ヶ月後、1カプセル当たり初期投入量値の少なくとも約10%以上、より好ましくは、1カプセル当たり初期投入量の少なくとも約20%の総生細胞数を維持する。別の実施形態では、安定なソフトゲルカプセルは、室温で約24ヶ月後、1カプセル当たり初期投入量値の10%〜約95%の間、より好ましくは1カプセル当たり初期投入量の約20%〜約85%の間の総生細胞数を維持する。1カプセル当たり初期投入量値は、好ましくは約10億CFU〜約30億CFUの間、より好ましくは約20億CFUである。
【００５０】
本明細書では、「室温」とは、好ましくは約15℃〜約30℃、より好ましくは約20℃〜約25℃の間の温度、および約20%〜約75%、より好ましくは約50%〜約60%の間の湿度を指す。室温での安定性は消費者にとって重要であり、大半の製品はプロバイオティクス細菌の生存能力を維持するために冷蔵したままにしなければならないので、当技術分野で一般的に提供されていない。
【００５１】
特定の好ましい実施形態では、プロバイオティクスソフトゲルカプセルの包装は、水(湿度)、酸素、光および他の有害な影響からの保護を強化する。この包装は、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス菌株およびソフトゲルカプセルの充填物中の他の成分の安定性を支持ならびに保護する。好ましい包装には、それだけに限らないが、適当な障壁特性を有するブリスター包装、乾燥器を有するもしくは有さないプラスチックまたは金属容器、ならびに好ましくは乾燥器を有するもしくは有さない誘導密閉蓋を使用したガラスジャーが含まれる。好ましいブリスター包装には、異なる型の三重ブリスターフィルム、例えば三重Flexafarm Sbc(例えば、PVC 250my+PE 25my+PVDC 150g/mq sbcグレード)およびAquaba-PVC(例えば、PVC 250my+AQUABA 160g/mq)、Aclar、Alu-Aluフォーマットを含む標準および高障壁フィルム、中央の位置に軟質アルミニウムを備える三重層ブリスター箔(OPA)、他の層PVCおよびポリアミド、ならびに新世代多層ブリスター結合材料が含まれ得る。好ましいプラスチック容器は、任意の適当なプラスチック材料、例えば、HDPE(高密度ポリエチレン)、PP(ポリプロピレン)およびPET(ポリエチレンテレフタレート)で作られていてよく、一体型もしくは分離型防湿剤および/または脱酸素剤ミニパックもしくはフィルムを含んでいてもよい。好ましいガラス瓶は、着色ガラス、誘導密閉されているものであってよく、プラスチックもしくは金属蓋、および乾燥器もしくは脱酸素剤を備えていてもよい。好ましい金属容器には、誘導密閉されている、プラスチックもしくは金属蓋を有している、および/または乾燥器もしくは脱酸素剤を備えていてもよい、アルミニウムジャー、チューブまたは瓶が含まれ得る。
【００５２】
本発明の第2の実施形態では、プロバイオティクスソフトゲルカプセルは、(a)約35℃〜約75℃の間の融点を有する少なくとも1種の植物性脂質を含む少なくとも1種のコーティングを有するマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を提供するステップと、(b)マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を懸濁製剤に懸濁させて充填物を作るステップと、(c)低温および低圧で充填物を混合して混合充填物を作るステップと、(d)混合充填物中のマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌の凝集体を減少させて解凝集した充填物を作るステップと、(e)解凝集した充填物をソフトゲルカプセル中にカプセル化するステップとの方法にしたがって作られ、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌のコーティングの完全性が維持される。
【００５３】
加工ステップ、すなわち、コーティングするステップ、懸濁するステップ、混合するステップ、凝集体を減少させるステップ等に関する上記詳細は、本開示の第2の実施形態について本開示の第1の実施形態と同じである。同様に、第1の実施形態の酸素への暴露およびソフトゲルカプセルの安定性を制御することに関する上記詳細は、第2の実施形態について同じである。
【００５４】
本発明は、いかなる特定のプロバイオティクス細菌または懸濁製剤にも限定されないが、特に、室温で製品中のプロバイオティクス細菌の生存能力および安定性を維持する課題の解決に限定される。以下の実施例は、好ましい実施形態のいくつかの本発明の方法を説明する。特許請求の範囲の範囲内の他の実施形態は当業者に明らかであるだろう。
【実施例１】
【００５５】
マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルを本発明にしたがって製造した。ラクトバチルス・プランタラムLP01およびビフィドバクテリウム・ブレーベBR03をイタリア特許出願第RM2009A000104号に記載されている方法にしたがって、ジステアリン酸ポリグリセリル(Plurol Stearique WL1009)で単層コーティング(monocoated)した。懸濁製剤については、蜜蝋を約65℃でダイズ油に溶解した。次いで、ダイズレシチンを混合物に添加し、混ぜ合わせた製剤を約25℃以下で冷却した。マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌をダイズ油、蜜蝋およびダイズレシチンの冷却した懸濁製剤に懸濁させ、30℃未満で10分間混合した。以下のTable 1(表1)は、充填物中に存在する各成分の量を示している。次いで、製剤の酸化を防ぐために真空下および窒素下で、混合充填物を30℃未満の温度を維持しながら10分間三本ロール圧延機を使用して製粉し、製粉した充填物を600ミクロンの間隔を有するふるいに通した。
【００５６】
次いで、製粉した充填物を以下のように標準的な回転ダイカプセル化装置を使用して軟ゼラチンカプセルにカプセル化した:製粉した充填物およびシェル材料を装置に接続した別々の受取器に充填した。装置は、溶解したシェル材料から2本の固形リボンを調製し、これを冷却して、MCTおよびレシチンの混合物で潤滑にした。2本のリボンをカプセルの形成に必要とされるサイズおよび形状の特定のポケットを有する2つの回転ダイの位置に向けた。次いで、対向するダイの連続する逆回転がダイに接触する2本のリボンの間の密閉を形成し、充填材料をそのように形成されたカプセル本体に同時に注入した。最後に、ダイの連続する回転がリボンから新たに形成されたカプセルを切断する。
【００５７】
その後、ソフトゲルカプセルを2つのバッチに分け、各バッチを2つのステップで乾燥させた。最初に、ソフトゲルカプセルの1バッチを標準的工程で乾燥させた、すなわち、約20%相対湿度および20℃で80分間、空気が外部環境から引かれる、強制換気を備えるタンブラー乾燥機に入れた。ソフトゲルカプセルの第2のバッチをより遅い工程で乾燥させた、すなわち、約20%相対湿度および20℃で122.5分間、空気が外部環境から引かれる、強制換気を備えるタンブラー乾燥機に入れた。第2のステップでは、各バッチからのソフトゲルカプセルをトレーに置き、約20%相対湿度および20℃で乾燥した調和空気を有する特別な換気を備える乾燥棚に並べた。ソフトゲルカプセルを、Bareiss硬度計を使用して測定される10Nの安定した硬度まで乾燥させた。
【００５８】
調製したソフトゲルカプセルの各バッチを、1つのグループはアルミキャップを有する暗いガラス瓶に貯蔵し、第2のグループはブリスター三重ポケットに貯蔵し、第3のグループは「バルク」に貯蔵した(ソフトゲルカプセルを不浸透性の三重層セロハン小袋に貯蔵したことを意味する)3つのグループに分けた。3つのグループのソフトゲルカプセルを25℃で貯蔵し、6ヶ月および18ヶ月の貯蔵後の貯蔵寿命を通して菌株のその後の安定性を確実に予測するパラメータを評価した。プロバイオティクス細菌の細胞構造およびコーティングの完全性を顕微鏡分析により分析した。プロバイオティクス細菌の細胞構造およびコーティングが無傷のままであれば、生存能力のあるプロバイオティクス細菌は定着することができる。この能力は、総生菌数(cfu/g)により測定され、処理後の糞便の細菌組成分析により確認することができるだろう。マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルは、室温で24ヶ月の貯蔵寿命で、1カプセル当たり20億CFU(2種の菌株の合計として)の標的を提供するために、製造した。以下のTable 3(表3)は、調製したソフトゲルカプセルのバッチを示しており、Table 4(表4)およびTable 5(表5)は、安定性評価の結果を示している。
【００５９】
【表１】
2013533313.tif 000002
【実施例２】
【００６０】
マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含む製粉した充填物を本発明にしたがって製造した。ラクトバチルス・プランタラムLP01およびビフィドバクテリウム・ブレーベBR03をイタリア特許出願第RM2009A000104号に記載されている方法にしたがって、ジステアリン酸ポリグリセリル(Plurol Stearique WL1009)で単層コーティングした。懸濁製剤については、ダイズ油を約65℃に加熱した。次いで、ダイズレシチンおよびモノステアリン酸グリセリルを混合物に添加し、混ぜ合わせた製剤を約25℃以下で冷却した。マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌をダイズ油、モノステアリン酸グリセリルおよびダイズレシチンの冷却した懸濁製剤に懸濁させ、30℃未満で10分間混合した。以下のTable 2(表2)は、充填物中に存在する各成分の量を示している。次いで、真空下および窒素下で、混合充填物を30℃未満で10分間三本ロール圧延機を使用して製粉し、製粉した充填物を600ミクロンの間隔を有するふるいに通した。
【００６１】
製粉した充填物中のマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌の初期安定性を顕微鏡分析により試験して、コーティングおよびプロバイオティクス細菌の細胞構造の完全性を確認した。コーティングしたプロバイオティクス細菌の数を、プロバイオティクス細菌とコーティングしていないプロバイオティクス細菌の総数の差として計算した。これらの試験結果は、実施例1の製粉した充填物についての初期安定性の結果と類似の初期安定性、例えば、プロバイオティクス細菌の細胞構造またはコーティングへの有意な損傷がないことを示した。そのため、実施例2のカプセル化された製粉した充填物は実施例1と類似の結果を有するだろうと想定された。そのため、実施例2をカプセル化せず、このような充填物を含むソフトゲルの安定性をさらに試験しなかった。
【００６２】
【表２】
2013533313.tif 000003
【００６３】
(比較実施例1)
マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルを、混合充填物を、製粉(凝集体減少)ステップを経ずにカプセル化したことを除いて実施例1の方法にしたがって製造した。製粉しないと、製造されるソフトゲルカプセルは低品質で、漏出が増加する。追加の加工ステップを加えて他の方法で漏出を減少させてもよいが、これらのステップは、潜在的に商業的に許容できない量までコストを増加させるだろう。
【００６４】
その後、ソフトゲルカプセルを2つのバッチに分け、各部分を2つのステップで乾燥させた。最初に、ソフトゲルカプセルの1バッチを標準的工程で乾燥させた、すなわち、約20%相対湿度および20℃で48分間、空気が外部環境から引かれる、強制換気を備えるタンブラー乾燥機に入れた。ソフトゲルカプセルの第2のバッチをより遅い工程で乾燥させた、すなわち、約20%相対湿度および20℃で122.5分間、空気が外部環境から引かれる、強制換気を備えるタンブラー乾燥機に入れた。第2のステップでは、各バッチからのソフトゲルカプセルをトレーに置き、乾燥した調和空気を有する特別な換気を備える乾燥棚に並べた。ソフトゲルカプセルを、Bareiss硬度計を使用して測定される9Nの安定した硬度まで乾燥させた。
【００６５】
調製したソフトゲルカプセルの各バッチを、1つのグループはアルミキャップを有する暗いガラス瓶に貯蔵し、第2のグループはブリスター三重ポケットに貯蔵し、第3のグループは「バルク」に貯蔵した3つのグループに分けた。ソフトゲルカプセルの3つのグループを25℃で貯蔵し、6ヶ月および18ヶ月の貯蔵後の貯蔵寿命を通して菌株のその後の安定性を確実に予測するパラメータを評価した。プロバイオティクス細菌の細胞構造およびコーティングの完全性を顕微鏡分析により試験した。コーティングしたプロバイオティクス細菌の数を、プロバイオティクス細菌とコーティングしていないプロバイオティクス細菌の総数の差として計算した。プロバイオティクス細菌の細胞構造およびコーティングが無傷のままであれば、生存能力のあるプロバイオティクス細菌は定着することができる。
【００６６】
マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルは、室温で24ヶ月の貯蔵寿命で、1カプセル当たり20億CFU(2種の菌株の合計として)の標的を提供するために、製造した。、以下のTable 3(表3)は、調製したソフトゲルカプセルのバッチを示しており、Table 4(表4)およびTable 5(表5)は、それぞれ6ヶ月および18ヶ月後の安定性評価の結果を示している。
【００６７】
【表３】
2013533313.tif 000004
【００６８】
【表４】
2013533313.tif 000005
【００６９】
【表５】
2013533313.tif 000006
【００７０】
Table 4(表4)に示される6ヶ月後およびTable 5(表5)に示される18ヶ月後の安定性データは、製粉後のソフトゲル中のプロバイオティクス細菌の安定性が、製粉しなかった試料中のプロバイオティクス細菌よりも一般的に高いこと、および製粉が乾燥の種類よりも安定性への影響が大きいことを示している。選択された包装型の各々は、酸化および安定性への他の潜在的に有害な影響からの適当な保護をもたらした。Table 4(表4)はまた、高い割合のコーティングした細胞(90%超)が6ヶ月で残っていることを示している。同様に、Table 5(表5)は、高い割合のコーティングした細胞(88%超)が18ヶ月で試験した各包装中に残っていることを示しているこれは、18ヶ月後でさえ存在する生存可能な細胞が非常に頑強であったことを示唆している。
【００７１】
さらに、上記結果は、本発明による製粉が、製粉なしの工程を調製する(比較実施例1)よりもプロバイオティクス細菌上のコーティングへの損傷をもたらさないことを示している。製粉は、例えば、合理的なコストを維持するため、漏出を減らすため等に商業的に許容されるソフトゲルカプセルを製造する方法における重要なステップであるので、プロバイオティクス細菌上のコーティングを損傷しない製粉は本発明の重要な利点である。
【実施例３】
【００７２】
マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルを、実施例1の方法にしたがって、ただし全バッチをスケールアップして製造した。ソフトゲルカプセルを、実物大混合装置を使用して混合した。充填材料を真空下で脱気し、窒素下で真空を破壊した。この方法は、最終生成物中の捕捉ガス(主に酸素)の回避を容易にし、これが今度はカプセル化後の任意の潜在的に残っている酸素の酸化の減少になる。さらに、この方法は、カプセル間の用量含量均一性を確保するのに役立つ。次いで、この充填材料をカプセル化し、標準的工程で乾燥させた、すなわち、ソフトゲルカプセルを約20%相対湿度および20℃で135分間、空気が外部環境から引かれる、強制換気を備えるタンブラー乾燥機に入れた。第2の乾燥ステップでは、各バッチからのソフトゲルカプセルをトレーに置き、乾燥した調和空気を有する特別な換気を備える乾燥棚に並べた。ソフトゲルカプセルを、Bareiss硬度計を使用して測定される9Nの安定した硬度および20%未満のERH(平衡相対湿度)まで乾燥させた。
【００７３】
乾燥したソフトゲルカプセルを、1つのグループはアルミキャップを有する暗いガラス瓶に貯蔵し、第2のグループはブリスター三重ポケットに貯蔵し、第3のグループはプラスチックDuma容器に貯蔵した3つのグループに分けた。ソフトゲルカプセルの3つのグループを25℃で3ヶ月間貯蔵し、パラメータを評価して頑強性を評価した。プロバイオティクス細菌の細胞構造およびコーティングの完全性を顕微鏡分析により試験した。コーティングしたプロバイオティクス細菌の数を、プロバイオティクス細菌とコーティングしていないプロバイオティクス細菌の総数の差として計算した。プロバイオティクス細菌の細胞構造およびコーティングが無傷のままであれば、生存能力のあるプロバイオティクス細菌は定着することができる。マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルは、室温で24ヶ月の貯蔵寿命で、1カプセル当たり20億CFU(2種の菌株の合計として)の標的を提供するために、製造した。
【００７４】
Table 6(表6)は、実施例3の加工、乾燥および包装を示している。実施例3のバッチの頑強性を試験するために、実物大バッチの製造方法の間ならびに慎重な加工(Table 7(表7))および選択的包装(Table 8(表8))を通して得られる安定性の増加を示すために1ヶ月および3ヶ月の貯蔵後にも試料を採取した。温度および混合速度を慎重に制御および監視した。
【００７５】
【表６】
2013533313.tif 000007
【００７６】
【表７】
2013533313.tif 000008
【００７７】
【表８】
2013533313.tif 000009
【００７８】
Table 8(表8)は、全バッチスケールアップ後の1ヶ月および3ヶ月の貯蔵後に80%を超えるコーティングした細胞が残っていることを示している。Table 4(表4)およびTable 5(表5)に示されている実施例1の貯蔵後に残っているコーティングした細胞の割合を、実施例3の貯蔵後に残っているコーティングした細胞の割合と比較すると、工程をスケールアップするといくらかの割合の減少が常に想定される。3ヶ月の貯蔵後に80%超がまだ残っていたので(Table 8(表8))、ここで得られた結果は確実であった。したがって、全バッチスケールアップは、プロバイオティクス細菌の生存能力に有意に不利には影響しなかった。
【実施例４】
【００７９】
マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルを、1つのグループはアルミキャップを有する暗いガラス瓶に貯蔵し、第2のグループはブリスター三重ポケットに貯蔵し、第3のグループはプラスチックDuma容器に貯蔵した3つのグループを、それぞれを1つのサブグループは25℃で3ヶ月間貯蔵し、第2のサブグループは30℃で3ヶ月間貯蔵し、第3のサブグループは33℃で3ヶ月間貯蔵した3つのサブグループに分けたことを除いて実施例3の方法にしたがって製造した。
【００８０】
【表９】
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【００８１】
【表１０】
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【００８２】
Table 9(表9)およびTable 10(表10)は、コーティング効率(%)は影響されなかったが、貯蔵中の温度がプロバイオティクス菌株の生存能力に影響を及ぼす、例えば、33℃以上の温度はプロバイオティクス菌株の生存能力に明らかな影響を及ぼすことを示している。したがって、貯蔵中の温度およびエネルギーパラメータを慎重に制御することが必要である。そのため、他の加工ステップ、例えば、製粉中の温度も菌株の生存能力に影響を及ぼし、33℃未満のままに慎重に制御すべきであることが理解され得る。例えば、Table 7(表7)は、全バッチスケールアップ中、充填物の温度が25℃を超えず、この制御されたパラメータがプロバイオティクス細菌の長期間の安定性に貢献したことを示している。
【００８３】
回収したデータに基づき、全バッチスケールアップの結果(実施例3)は、本開示のソフトゲルカプセル製造方法の優れた頑強性を裏付ける。結論として、プロバイオティクス菌株の安定性は、菌株の安定性への温度の影響の試験(実施例4)により示されるように、コーティングの完全性に明らかに関連している。高温で、コーティングしていない細胞は分解し、37℃で1ヶ月後、残っている生きた菌株はほとんど全てコーティングされている(90%超)。コーティングは、プロバイオティクス菌株を腸に送達し、プロバイオティクス細菌が体温で腸に定着するのを可能にするよう設計される。温度および湿度の増加は、プロバイオティクス菌株が意図した定着部位に到達する前に、プロバイオティクス菌株を早まって活性化し、これが標的部位での定着の失敗、同様に意図した有益性の体への送達の失敗をもたらし得る。
【００８４】
結論として、回収したデータの全体的な分析から、十分な量の本開示にしたがって加工したプロバイオティクス細菌は、貯蔵寿命を通して生存能力があるままであるように思われる。このデータから、少なくとも20億CFU/カプセルの総生細胞数(10億の各菌株)が有効期限で残っているだろうと想定され得る。コーティングしていない細菌の量より5倍低い濃度のマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌が、同じ有効性でヒトの腸に定着することができる。さらに、マイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌が腸の意図した定着部位に送達されると、これらの細菌は、コーティングしていないプロバイオティクス細菌よりも5倍定着しやすい。Del Piano, M.他(2010)、Evaluation of the intestinal colonization by microencapsulated probiotic bacteria in comparison to the same uncoated strains、Journal of Clinical Gastroenterology、44 Supp. 1:S42-6を参照されたい。
【００８５】
したがって、本発明の方法には多数の利点が存在する。得られるマイクロカプセル化されたプロバイオティクス細菌を含むソフトゲルカプセルは、予期しない安定性、例えば、CFUおよびヒト消化器系へのプロバイオティクス細菌のより優れた送達のためのコーティングしたプロバイオティクス細菌の数を有する。
【００８６】
本明細書に開示する好ましい実施形態の多数の変更、修正および変形が当業者に明らかであるだろう、そして、これらは全て請求されている本発明の精神および範囲内にあると予想および意図される。例えば、特定の実施形態が詳細に記載されてきたが、当業者は、前記実施形態および変形を種々の型の置換、追加または代替材料を組み込むよう修正することができることを理解するだろう。したがって、本発明のわずかな変形しか本明細書に記載されていないが、このような追加の修正および変形ならびにこれらの同等物の実施は以下の特許請求の範囲に定義される本発明の精神および範囲内にあることを理解すべきである。本明細書で引用される全ての特許出願、特許および他の刊行物は、全体が参照により組み込まれる。
【国際調査報告】
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