(57)【要約】  本発明は、ＣＬＤＮ６に結合する抗体を使った、ＣＬＤＮ６を発現する細胞に関連する腫瘍疾患、特にがんおよびがん転移の処置および／または防止に関する。本願は、腫瘍細胞の表面上のＣＬＤＮ６への抗体の結合が、腫瘍の成長を阻害し、腫瘍患者の生存期間を延長し、寿命を伸長するのに十分であることを実証する。さらに、ＣＬＤＮ６への抗体の結合は、奇形癌または胎児性癌、特に精巣の胚細胞性腫瘍などといったＣＬＤＮ６陽性胚細胞性腫瘍の成長を効率よく阻害する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボで腫瘍の成長を阻害する抗体であって、腫瘍の細胞がクローディン６（ＣＬＤＮ６）を発現し、抗体がＣＬＤＮ６に結合する能力を有する抗体。
【請求項２】
前記抗体がＣＬＤＮ６への結合によって前記腫瘍の成長を阻害する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体はＣＬＤＮ６に特異的である、請求項１または請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であるか、抗体のフラグメントまたは合成抗体である、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記腫瘍が、卵巣がん、特に卵巣腺癌および卵巣奇形癌、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む肺がん、特に扁平上皮肺癌および腺癌、胃がん、乳がん、肝がん、膵がん、皮膚がん、特に基底細胞癌および扁平上皮癌、悪性黒色腫、頭頚部がん、特に悪性多形性腺腫、肉腫、特に滑膜肉腫および癌肉腫、胆管がん、膀胱のがん、特に移行上皮癌および乳頭癌、腎がん、特に明細胞腎細胞癌および乳頭状腎細胞癌を含む腎細胞癌、結腸がん、回腸のがんを含む小腸がん、特に小腸腺癌および回腸の腺癌、精巣胎芽性癌、胎盤性絨毛癌、子宮頸がん、精巣がん、特に精巣精上皮腫、精巣奇形腫および胎児性精巣がん、子宮がん、胚細胞性腫瘍、特に奇形癌または胎児性癌、好ましくは精巣の胚細胞性腫瘍、ならびにそれらの転移形態から成る群より選択される、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
（ｉ）アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５９（ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ３６Ａ）、ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５８（ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ２７Ａ）、またはＤＳＭ  ＡＣＣ３０５７（ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２）の下で寄託されたクローンによって産生されるまたは前記クローンから得ることができる抗体、
（ｉｉ）（ｉ）の下の抗体のキメラ化またはヒト化形態である抗体、
（ｉｉｉ）（ｉ）の下の抗体の特異性を有する抗体、および
（ｉｖ）（ｉ）の下の抗体の抗原結合部分または抗原結合部位を含み、（ｉ）の下の抗体の抗原結合部分または抗原結合部位が、好ましくは（ｉ）の下の抗体の可変領域を含む抗体、
から成る群より選択される抗体。
【請求項７】
少なくとも１つの治療エフェクター成分に取り付けられた請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の抗体であって、前記治療エフェクター成分が、好ましくは、放射性標識、細胞毒または細胞傷害性酵素である抗体。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の抗体を産生する能力を有するハイブリドーマ。
【請求項９】
アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５９（ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ３６Ａ）、ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５８（ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ２７Ａ）、またはＤＳＭ  ＡＣＣ３０５７（ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２）の下で寄託されたハイブリドーマ。
【請求項１０】
好ましくは治療用または予防用腫瘍ワクチンの形態にある、請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の前記抗体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
腫瘍疾患の処置または防止に使用するための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
腫瘍疾患を有する患者または腫瘍疾患を発症する危険性がある患者を処置する方法であって、前記腫瘍の細胞がクローディン６（ＣＬＤＮ６）を発現し、前記方法がＣＬＤＮ６に結合する能力を有する抗体の投与を含む方法。
【請求項１３】
前記抗体が、患者に投与されたときに、ＣＬＤＮ６への結合によって、患者における腫瘍の成長を阻害する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が少なくとも１つの治療エフェクター成分に取り付けられており、前記治療エフェクター成分が、好ましくは、放射性標識、細胞毒または細胞傷害性酵素である、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がＣＬＤＮ６に特異的である、請求項１２〜請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であるか、抗体のフラグメントまたは合成抗体である、請求項１２〜請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、請求項１０または請求項１１に記載の医薬組成物の投与を含む、請求項１２〜請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍疾患が、卵巣がん、特に卵巣腺癌および卵巣奇形癌、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む肺がん、特に扁平上皮肺癌および腺癌、胃がん、乳がん、肝がん、膵がん、皮膚がん、特に基底細胞癌および扁平上皮癌、悪性黒色腫、頭頚部がん、特に悪性多形性腺腫、肉腫、特に滑膜肉腫および癌肉腫、胆管がん、膀胱のがん、特に移行上皮癌および乳頭癌、腎がん、特に明細胞腎細胞癌および乳頭状腎細胞癌を含む腎細胞癌、結腸がん、回腸のがんを含む小腸がん、特に小腸腺癌および回腸の腺癌、精巣胎芽性癌、胎盤性絨毛癌、子宮頸がん、精巣がん、特に精巣精上皮腫、精巣奇形腫および胎児性精巣がん、子宮がん、胚細胞性腫瘍疾患、特に奇形癌または胎児性癌、好ましくは精巣の胚細胞性腫瘍疾患、ならびにそれらの転移形態から成る群より選択される、請求項１１に記載の医薬組成物または請求項１２〜請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＬＤＮ６が、配列表の配列番号：１に従う核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の抗体、請求項１０、請求項１１および請求項１８のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１２〜請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＬＤＮ６が、配列表の配列番号：２に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む、請求項１〜請求項７および請求項１９のいずれか一項に記載の抗体、請求項１０、請求項１１、請求項１８および請求項１９のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１２〜請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボで標的指向抗体を用いるがん療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは世界中いたるところで深刻な健康問題であり、依然として主たる死因の一つである。がん細胞は、その起源である非悪性細胞とは生物学的にかなり相違する。これらの相違はがん発生中に獲得された遺伝子改変によるものであり、これらの相違が、なかんずく、がん細胞における質的または量的に改変された分子構造の形成ももたらす。この種のがん関連構造は、特に、悪性形質転換の過程においてその発現が誘導または強化される遺伝子産物である。
【０００３】
免疫系は、先天免疫および適応免疫という２つの別個の様式によって、細胞を認識し、破壊する能力を有する。先天性構成成分は、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、および顆粒球から成る。これらの細胞は細胞形質転換に関与する分子パターンを同定し、様々なサイトカインおよび炎症性メディエーターを放出する。先天性応答には外来抗原に対する記憶能（これは適応免疫応答に存在する特徴である）がない。後者の免疫系構成成分は、外来抗原に対する特異性をも特徴とし、それはリンパ球上の受容体の存在によってもたらされる。適応応答では抗原提示細胞（ＡＰＣ）も役割を果たす−抗原提示細胞は外来抗原を貪食し、それらを主要組織適合遺伝子複合体との関連においてリンパ球に提示する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子との関連において抗原を認識する受容体を担持しており、これらの受容体は、次いで、それらの細胞が、サイトカインを放出し、ＣＤ８＋リンパ球（細胞傷害性Ｔリンパ球；ＣＴＬ）またはＢ細胞をさらに活性化することを可能にする。ＣＴＬは細胞媒介性免疫の一部であり、ＭＨＣクラスＩ分子との関連において提示された細胞を、アポトーシスまたはパーフォリン媒介性細胞溶解によって排除する能力を有する。Ｔ細胞媒介性免疫が抗腫瘍応答において極めて重要な役割を果たすことは、広く是認されている。Ｂ細胞は免疫グロブリンの放出に関与し、その点において、液性免疫系の一部である。
【０００４】
しかるべく狙いを定め、強化するのであれば、免疫機能を治療的に利用して、悪性病変を制御し、さらには根絶することができる。発がんに関与する遺伝的変化および後成的変化は、微生物抗原と同じように免疫系によって認識される抗原を生成させる。
【０００５】
抗体は、がん療法で使用するために臨床に導入されて成功を収め、この１０年間で、腫瘍学における最も有望な治療法として台頭してきた。抗体ベースのがん療法は、潜在的に、従来の薬剤と比較して、高い特異性および低い副作用プロフィールを有し得る。抗体が正常細胞と新生物細胞とを正確に識別することと、その作用様式が毒性の低い免疫学的抗腫瘍機序、例えば補体活性化や細胞傷害性免疫細胞の動員などに依拠しているという事実が、その理由である。
【０００６】
クローディンは、上皮および内皮の密着結合内に位置する内在性膜タンパク質である。クローディンは、４つの膜貫通セグメントと２つの細胞外ループとを有し、Ｎ末端とＣ末端は細胞質内に位置すると予想されている。クローディン（ＣＬＤＮ）膜貫通タンパク質ファミリーは上皮および内皮密着結合の維持に決定的役割を果たしており、細胞骨格の維持および細胞シグナル伝達においても役割を果たしているかもしれない。
【０００７】
本発明者らは、ＣＬＤＮ６が、様々ながんの組織において発現される一方、正常な非がん組織における発現は胎盤に限られることを見いだした。そのようながんには、卵巣がん、特に卵巣腺癌および卵巣奇形癌、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む肺がん、特に扁平上皮肺癌および腺癌、胃がん、乳がん、肝がん、膵がん、皮膚がん、特に基底細胞癌および扁平上皮癌、悪性黒色腫、頭頚部がん、特に悪性多形性腺腫、肉腫、特に滑膜肉腫および癌肉腫、胆管がん、膀胱のがん、特に移行上皮癌および乳頭癌、腎がん、特に明細胞腎細胞癌および乳頭状腎細胞癌を含む腎細胞癌、結腸がん、回腸のがんを含む小腸がん、特に小腸腺癌および回腸の腺癌、精巣胎芽性癌、胎盤性絨毛癌、子宮頸がん、精巣がん、特に精巣精上皮腫、精巣奇形腫および胎児性精巣がん、および子宮がん、ならびにそれらの転移形態が含まれる。
【０００８】
さらに本発明者らは、ＣＬＤＮ６を発現する無傷細胞の表面上のＣＬＤＮ６に特異的に結合する能力を有する抗体を作製することができた。ＣＬＤＮ６以外のクローディンタンパク質、特にＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４およびＣＬＤＮ９を発現する細胞、またはこれらのＣＬＤＮタンパク質のいずれをも発現しない細胞への結合は、これらの抗体では観察されなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ここに本発明者らは、腫瘍細胞の表面上のＣＬＤＮ６への抗体結合が有意な腫瘍成長阻害を与えるのに十分であることを実証することにより、これらの知見を拡張する。ＣＬＤＮ６でトランスフェクトされた腫瘍細胞および非トランスフェクト異種移植片の腫瘍成長のインビボ評価により、ＣＬＤＮ６への抗体結合によって媒介されるＣＬＤＮ６トランスフェクト細胞の腫瘍成長の特異的阻害が示された。さらに、ＣＬＤＮ６への抗体結合は、内因性にＣＬＤＮ６を発現する腫瘍細胞のインビボでの腫瘍成長を阻害するのに十分であることも実証された。これは、ＣＬＤＮ６への抗体結合が腫瘍成長を阻害するのに有効であることの原理証明を確立するものであり、ＣＬＤＮ６を標的とすることによって腫瘍成長を阻害するように設計される治療抗体にとって、ＣＬＤＮ６が魅力的な標的であることの証拠を提供する。
【００１０】
さらに、ＣＬＤＮ６への抗体結合が、インビボで、ヒトＣＬＤＮ６陽性胚細胞性腫瘍細胞株の腫瘍成長を効率よく阻害することも実証され、これにより、精巣胚細胞性腫瘍などの胚細胞性腫瘍を標的とし、それらの死滅を誘導するための選択的治療剤としての、ＣＬＤＮ６への抗体結合の有用性が実証された。
【００１１】
このように、本発明者らは、インビボでの腫瘍細胞の表面上のＣＬＤＮ６への抗体結合が腫瘍成長の減衰をもたらすことの初めての直接的証拠を提供し、ＣＬＤＮ６への特異的結合が、腫瘍成長を減衰させる治療的介入をもたらすことを実証する。さらに、本発明者らは、インビボでの腫瘍細胞の表面上のＣＬＤＮ６への抗体結合が、腫瘍患者の生存期間の延長および腫瘍患者の寿命の伸長をもたらすことの証拠を提供する。
【００１２】
したがって本発明は、ＣＬＤＮ６を発現する細胞に関連する腫瘍疾患、特にがんおよびがん転移の、ＣＬＤＮ６に結合する抗体を用いた処置および／または防止に関する。本願は、腫瘍細胞の表面上のＣＬＤＮ６への抗体の結合が、腫瘍の成長を阻害し、腫瘍患者の生存期間を延長し、腫瘍患者の寿命を伸長するのに十分であることを実証する。さらに、ＣＬＤＮ６への抗体の結合は、奇形癌または胎児性癌などのＣＬＤＮ６陽性胚細胞性腫瘍、特に精巣の胚細胞性腫瘍の成長を阻害するのにも十分である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１つの態様において、本発明は、インビボで腫瘍の成長を阻害する抗体に関し、ここで、腫瘍の細胞はクローディン６（ＣＬＤＮ６）を発現し、抗体はＣＬＤＮ６に結合する能力を有する。１つの実施形態では、抗体が、ＣＬＤＮ６に結合することによって腫瘍の成長を阻害する。１つの実施形態では、抗体がＣＬＤＮ６に特異的である。１つの実施形態では、抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体もしくはヒト化抗体であるか、抗体のフラグメントまたは合成抗体である。腫瘍は、卵巣がん、特に卵巣腺癌および卵巣奇形癌、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む肺がん、特に扁平上皮肺癌および腺癌、胃がん、乳がん、肝がん、膵がん、皮膚がん、特に基底細胞癌および扁平上皮癌、悪性黒色腫、頭頚部がん、特に悪性多形性腺腫、肉腫、特に滑膜肉腫および癌肉腫、胆管がん、膀胱のがん、特に移行上皮癌および乳頭癌、腎がん、特に明細胞腎細胞癌および乳頭状腎細胞癌を含む腎細胞癌、結腸がん、回腸のがんを含む小腸がん、特に小腸腺癌および回腸の腺癌、精巣胎芽性癌、胎盤性絨毛癌、子宮頸がん、精巣がん、特に精巣精上皮腫、精巣奇形腫および胎児性精巣がん、および子宮がん、ならびにそれらの転移形態から成る群より選択され得る。腫瘍は、奇形癌または胎児性癌などの胚細胞性腫瘍であり得る。胚細胞性腫瘍は精巣の胚細胞性腫瘍であり得る。
【００１４】
さらなる一態様において、本発明は、（ｉ）アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５９（ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ３６Ａ）、ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５８（ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ２７Ａ）、またはＤＳＭ  ＡＣＣ３０５７（ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２）の下で寄託されたクローンによって産生されるまたは前記クローンから得ることができる抗体、（ｉｉ）（ｉ）の下の抗体のキメラ化またはヒト化形態である抗体、（ｉｉｉ）（ｉ）の下の抗体の特異性を有する抗体、および（ｉｖ）（ｉ）の下の抗体の抗原結合部分または抗原結合部位を含む抗体、から成る群より選択される抗体に関する。（ｉ）の下の抗体の抗原結合部分または抗原結合部位は、（ｉ）の下の抗体の可変領域を含み得る。
【００１５】
上述の態様のいずれかによる抗体は、放射性標識、細胞毒または細胞傷害性酵素などの少なくとも１つの治療エフェクター成分に取り付けられていてもよい。
【００１６】
さらなる一態様において、本発明は、上述の態様のいずれかによる抗体を産生する能力を有するハイブリドーマに関する。
【００１７】
さらなる一態様において、本発明は、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５９（ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ３６Ａ）、ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５８（ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ２７Ａ）、またはＤＳＭ  ＡＣＣ３０５７（ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２）の下に寄託されたハイブリドーマに関する。
【００１８】
さらなる一態様において、本発明は、上述の態様のいずれかによる抗体を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、治療用または予防用腫瘍ワクチンの形態をとり得る。１つの実施形態では、医薬組成物が、腫瘍疾患の処置または防止に使用するための医薬組成物である。
【００１９】
さらなる一態様において、本発明は、腫瘍疾患を有する患者または腫瘍疾患を発症する危険性がある患者を処置する方法であって、腫瘍の細胞がクローディン６（ＣＬＤＮ６）を発現し、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有する抗体の投与を含む方法に関する。１つの実施形態では、抗体が、患者に投与されると、ＣＬＤＮ６に結合することによって、患者における腫瘍の成長を阻害する。１つの実施形態では、抗体が、放射性標識、細胞毒または細胞傷害性酵素などの少なくとも１つの治療エフェクター成分に取り付けられている。抗体は、ＣＬＤＮ６に特異的であり得る。抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体もしくはヒト化抗体であるか、抗体のフラグメントまたは合成抗体であり得る。１つの実施形態では、本方法が、上述の態様のいずれかによる医薬組成物の投与を含む。
【００２０】
上述の態様のいずれにおいても、腫瘍疾患は、卵巣がん、特に卵巣腺癌および卵巣奇形癌、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む肺がん、特に扁平上皮肺癌および腺癌、胃がん、乳がん、肝がん、膵がん、皮膚がん、特に基底細胞癌および扁平上皮癌、悪性黒色腫、頭頚部がん、特に悪性多形性腺腫、肉腫、特に滑膜肉腫および癌肉腫、胆管がん、膀胱のがん、特に移行上皮癌および乳頭癌、腎がん、特に明細胞腎細胞癌および乳頭状腎細胞癌を含む腎細胞癌、結腸がん、回腸のがんを含む小腸がん、特に小腸腺癌および回腸の腺癌、精巣胎芽性癌、胎盤性絨毛癌、子宮頸がん、精巣がん、特に精巣精上皮腫、精巣奇形腫および胎児性精巣がん、および子宮がん、ならびにそれらの転移形態から成る群より選択され得る。
【００２１】
上述の態様のいずれにおいても、腫瘍疾患は、胚細胞性腫瘍疾患、例えば奇形癌または胎児性癌を特徴とする疾患であり得る。胚細胞性腫瘍疾患は精巣の胚細胞性腫瘍疾患であり得る。
【００２２】
上述の態様のいずれにおいても、ＣＬＤＮ６は、配列表の配列番号：１に従う核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むことができ、かつ／または配列表の配列番号：２に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含むことができる。
【００２３】
本明細書で述べる抗体は、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有し、好ましくは、ＣＬＤＮ６を発現する細胞の表面と会合しているＣＬＤＮ６に結合する能力を有する。好ましくは、本抗体は、ＣＬＤＮ３に（特にそれがＣＬＤＮ３を発現する細胞の表面と会合している場合には）結合する能力を実質的に有さず、かつ／またはＣＬＤＮ４に（特にそれがＣＬＤＮ４を発現する細胞の表面と会合している場合には）結合する能力を実質的に有さない。好ましくは、本抗体は、ＣＬＤＮ９に（特にそれがＣＬＤＮ９を発現する細胞の表面と会合している場合には）結合する能力を実質的に有さない。最も好ましくは、本抗体はＣＬＤＮ６以外のＣＬＤＮタンパク質に（特にそれらが前記ＣＬＤＮタンパク質を発現する細胞の表面と会合している場合には）結合する能力を実質的に有さず、ＣＬＤＮ６に特異的である。好ましくは、前記ＣＬＤＮタンパク質を発現する前記細胞は無傷細胞、特に透過処理されていない細胞であり、細胞の表面と会合している前記ＣＬＤＮタンパク質は天然（すなわち非変性）立体配座を有する。好ましくは本抗体は、天然立体配座をとっているＣＬＤＮ６の１またはそれ以上のエピトープに結合する能力を有する。
【００２４】
特定の好ましい実施形態では、本明細書で述べる抗体が、生細胞の表面に存在するＣＬＤＮ６の天然エピトープ、例えば配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５の天然エピトープに結合する。さらなる好ましい実施形態では、本抗体はＣＬＤＮ６発現腫瘍細胞に特異的であり、ＣＬＤＮ６を発現しない腫瘍細胞には結合しない。好ましくは、本明細書で述べる抗体は、ＣＬＤＮ６に特異的に結合する。
【００２５】
１つの実施形態では、本明細書で述べる抗体が、ＣＬＤＮ６の細胞外部分内に位置するエピトープに結合する能力を有し、ここでＣＬＤＮ６の前記細胞外部分は、好ましくは、配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５のアミノ酸配列、より好ましくは配列番号：５のアミノ酸配列を含む。好ましくは、本抗体は、配列番号：５のアミノ酸配列内に位置するエピトープに結合する能力を有する。
【００２６】
１つの実施形態において、本抗体は、配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５のアミノ酸配列、より好ましくは配列番号：５のアミノ酸配列を有するペプチド、または免疫学的に等価なペプチド、または前記ペプチドを発現する核酸もしくは宿主細胞で動物を免疫する工程を含む方法によって得ることができる。
【００２７】
異なる実施形態では、抗体が結合することのできるＣＬＤＮ６が、配列番号：２のアミノ酸配列または配列番号：６のアミノ酸配列を有する。抗体が、配列番号：２のアミノ酸配列を有するＣＬＤＮ６に結合する能力および配列番号：６のアミノ酸配列を有するＣＬＤＮ６に結合する能力を有することは、特に好ましい。
【００２８】
好ましい実施形態では、本明細書で述べる抗体が、以下の活性の１またはそれ以上を有する：（ｉ）ＣＬＤＮ６を発現する細胞の死滅、（ｉｉ）ＣＬＤＮ６を発現する細胞の増殖の阻害、（ｉｉｉ）ＣＬＤＮ６を発現する細胞のコロニー形成の阻害、および（ｉｖ）ＣＬＤＮ６を発現する細胞の転移の阻害。細胞の死滅、細胞の増殖の阻害および／または細胞のコロニー形成の阻害は、腫瘍成長を阻害するため（これには、腫瘍成長を停止させかつ／または防止すること、腫瘍成長を遅延させること、および／または既存の腫瘍のサイズを縮小させることが含まれる）に治療的に利用することができ、したがって、がん、がん転移および／またはがん細胞の転移拡大を処置または防止するために治療的に利用することができる。
【００２９】
好ましくは、本明細書で述べる抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）媒介性溶解、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介性溶解、アポトーシス、同型接着、および／または食作用を誘導することによって、好ましくはＣＤＣ媒介性溶解および／またはＡＤＣＣ媒介性溶解を誘導することによって、細胞の死滅を媒介する。
【００３０】
好ましくは、細胞のＡＤＣＣ媒介性溶解はエフェクター細胞（これは、特定の実施形態では、単球、単核球、ＮＫ細胞およびＰＭＮから成る群より選択される）の存在下で起こり、食作用はマクロファージによるものである。
【００３１】
ＣＬＤＮ６を発現する細胞、好ましくはがん細胞の増殖を阻害または低減する活性は、ブロモデオキシウリジン（５−ブロモ−２−デオキシウリジン、ＢｒｄＵ）を使用するアッセイにおいて、ＣＬＤＮ６発現がん細胞の増殖を決定することによって、インビトロで測定することができる。ＢｒｄＵはチミジンの類似体である合成ヌクレオシドであり、ＤＮＡ複製時にチミジンの代わりに（細胞周期のＳ期において）複製細胞の新たに合成されたＤＮＡに組み込まれ得る。組み込まれた化学物質を、例えばＢｒｄＵに特異的な抗体を使って検出することにより、ＤＮＡを活発に複製していた細胞が示される。
【００３２】
ＣＬＤＮ６を発現する細胞、好ましくはがん細胞のコロニー形成を阻害または低減する活性は、クローン原性アッセイにおいてインビトロで測定することができる。クローン原性アッセイは、細胞の生存および増殖に対する特定作用剤の有効性を試験するための微生物学的技術である。これは、増殖腫瘍細胞に対する薬剤または放射線の効果を決定するために、がんの研究室においてよく使用されている。実験は３つの主要な工程、すなわち（ｉ）細胞、特にがん細胞の試料に処置を適用する工程、（ｉｉ）組織培養容器に細胞をプレーティングする工程、および（ｉｉｉ）細胞を成長させる工程を伴う。生じたコロニーを固定し、染色し、計数する。コロニー形成は、個々の腫瘍細胞が器官に定着した場合の転移の形成に関して重要である。抗体の阻害活性は転移形成の抑制に関する抗体の潜在能力を示す。クローン原性アッセイにおいてコロニー形成を阻害または低減する活性を有する抗体は、がん細胞（特に本明細書において言及するがん型のがん細胞）の転移および転移拡大を処置または防止するのに、とりわけ有用である。
【００３３】
好ましい実施形態では、本明細書で述べる抗体が、ＣＬＤＮ６をその天然立体配座で保有している細胞に対して、１またはそれ以上の免疫エフェクター機能を示し、ここで、その１またはそれ以上の免疫エフェクター機能は、好ましくは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、アポトーシスの誘導、および増殖の阻害から成る群より選択され、好ましくはエフェクター機能がＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣである。
【００３４】
好ましくは、本明細書で述べる抗体によって発揮される腫瘍成長阻害または免疫エフェクター機能は、ＣＬＤＮ６への、好ましくはＣＬＤＮ６の細胞外部分内に位置するエピトープへの、前記抗体の結合によって誘導され、ＣＬＤＮ６の前記細胞外部分は、好ましくは配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５のアミノ酸配列、より好ましくは配列番号：５のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
本発明によれば、ＣＬＤＮ６を発現する細胞は、好ましくは、ＣＬＤＮ６とその細胞表面との会合を特徴とする。ＣＬＤＮ６を発現する細胞、またはＣＬＤＮ６とその細胞表面との会合もしくはＣＬＤＮ６をその天然立体配座で保有することを特徴とする細胞は、好ましくは、腫瘍細胞、例えばがん細胞、好ましくは本明細書で述べるがんからのがん細胞である。
【００３６】
本明細書で述べる抗体は、標的細胞傷害性、すなわち腫瘍細胞の死滅に備えるために、１またはそれ以上の治療エフェクター成分、例えば放射性標識、細胞毒、治療用酵素、アポトーシスを誘導する作用剤などに取り付けることができる。
【００３７】
１つの実施形態では、本明細書で述べる抗体が、（ｉ）ＣＬＤＮ６を発現する細胞に結合し、かつ（ｉｉ）ＣＬＤＮ６を発現しない細胞には結合しない。本明細書で述べる抗体は、好ましくは、（ｉ）ＣＬＤＮ６を発現する細胞の死滅を媒介し、かつ／またはＣＬＤＮ６を発現する細胞の増殖を阻害し、（ｉｉ）ＣＬＤＮ６を発現しない細胞の死滅は媒介せず、かつ／またはＣＬＤＮ６を発現しない細胞の増殖は阻害しない。
【００３８】
１つの実施形態において、本明細書で述べる抗体は、以下の性質の１またはそれ以上を特徴とすることができる：
ａ）ＣＬＤＮ６に対する特異性；
ｂ）約１００ｎＭまたはそれ以下、好ましくは約５〜１０ｎＭまたはそれ以下、より好ましくは約１〜３ｎＭまたはそれ以下の、ＣＬＤＮ６への結合親和性；
ｃ）ＣＬＤＮ６を発現する腫瘍細胞を枯渇させる能力；
ｄ）ＣＬＤＮ６を発現する腫瘍細胞の増殖を停止または遅延させる能力；
ｅ）ＣＬＤＮ６を発現する腫瘍細胞を有する対象の生存期間を延長する能力。
【００３９】
１つの実施形態では、本明細書で述べる抗体が、腫瘍細胞成長を低減し、かつ／または腫瘍細胞死を誘導し、それゆえに腫瘍阻害効果または腫瘍破壊効果を有する。
【００４０】
本明細書で述べる好ましい抗体は、以下の名称とアクセッション番号を有する、ＤＳＭＺ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，３８１２４  ブラウンシュヴァイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ），ドイツ）に寄託されたハイブリドーマ細胞によって産生される抗体、またはそのハイブリドーマ細胞から得ることができる抗体である：
１．２０１０年４月１３日に寄託された、ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ３６Ａ、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５９；
２．２０１０年４月１３日に寄託された、ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ２７Ａ、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５８；または
３．２０１０年４月１３日に寄託された、ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５７。
【００４１】
本発明の抗体を、本明細書では、抗体の名称に言及することによって、かつ／またはその抗体を産生するクローン（例えばｍｕＭＡＢ  ３６Ａ）に言及することによって、指定する。
【００４２】
さらなる好ましい抗体は、上述のハイブリドーマによって産生される抗体および上述のハイブリドーマから得ることができる抗体の特異性を有するもの、特に上述のハイブリドーマによって産生される抗体および上述のハイブリドーマから得ることができる抗体と同一のまたは高度に相同な抗原結合部分または抗原結合部位、特に可変領域を含むものである。好ましい抗体は、上述のハイブリドーマによって産生される抗体および上述のハイブリドーマから得ることができる抗体の領域と同一のまたは高度に相同なＣＤＲ領域を有するものであると考えられる。「高度に相同」とは、１〜５、好ましくは１〜４、例えば１〜３個または１もしくは２個の置換がなされ得ることと考えられる。特に好ましい抗体は、上述のハイブリドーマによって産生される抗体および上述のハイブリドーマから得ることができる抗体のキメラ化またはヒト化形態である。
【００４３】
本発明はまた、本明細書で述べる抗体を産生するハイブリドーマ細胞などの細胞に関する。
【００４４】
好ましいハイブリドーマ細胞は、以下の名称とアクセッション番号の１つを有する、ＤＳＭＺ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，３８１２４  ブラウンシュヴァイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ），ドイツ）に寄託されているものである：
１．２０１０年４月１３日に寄託された、ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ３６Ａ、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５９；
２．２０１０年４月１３日に寄託された、ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ２７Ａ、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５８；または
３．２０１０年４月１３日に寄託された、ＧＴ５１２ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５７。
【００４５】
本発明はまた、本明細書で述べる抗体またはそのパーツ、例えば抗体鎖をコードする遺伝子または核酸配列を含む核酸に関する。これらの核酸は、ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、または遺伝子工学において従来から使用されている他のベクターに含まれ得る。ベクターは、さらなる遺伝子、例えば適切な宿主細胞における適切な条件下でのベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子なども含み得る。さらに、ベクターは、適切な宿主におけるコード領域の適正な発現を可能にする発現制御エレメントを含み得る。そのような制御エレメントは当業者に知られており、プロモータ、スプライスカセットおよび翻訳開始コドンを含み得る。
【００４６】
好ましくは、本発明の核酸は、真核細胞または原核細胞における発現を可能にする発現制御エレメントに作動可能に取り付けられる。真核細胞または原核細胞における発現を確実にする制御エレメントは当業者に周知である。
【００４７】
核酸分子を構築するための方法、核酸分子を含むベクターを構築するための方法、適切に選ばれた宿主細胞にベクターを導入するための方法、または核酸分子の発現を引き起こすまたは達成するための方法は、当分野において周知である。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、本明細書において開示する核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。
【００４９】
１つの態様において、本発明は、本明細書で述べる抗体または抗体の組合せを含む組成物、例えば医薬組成物および診断組成物／キットを提供する。本発明の医薬組成物は医薬的に許容される担体を含んでもよく、場合により１またはそれ以上のアジュバント、安定剤などを含んでもよい。特定の実施形態では、組成物が、異なるエピトープに結合する抗体の組合せ、または異なる機能的特徴を有する（例えばＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣを誘導する）抗体の組合せを含む。
【００５０】
１つの実施形態では、本発明の医薬組成物が、治療用または予防用抗腫瘍ワクチンである。
【００５１】
１つの態様において、本発明は、腫瘍疾患を有する患者または腫瘍疾患を発症する危険性がある患者を処置するための治療方法および予防方法を提供する。１つの態様において、本発明は、腫瘍成長を阻害するための方法を提供する。１つの態様において、本発明は、腫瘍細胞死を誘導するための方法を提供する。これらの態様は、本明細書で述べる抗体または組成物の患者への投与を伴い得る。
【００５２】
本発明はまた、２またはそれ以上の抗ＣＬＤＮ６抗体の同時投与または逐次投与も含み、その場合、好ましくは、前記抗体の少なくとも１つがキメラ抗ＣＬＤＮ６抗体であり、かつ少なくとも１つのさらなる抗体がヒト抗ＣＬＤＮ６抗体であって、それらの抗体はＣＬＤＮ６の同じエピトープまたは異なるエピトープに結合する。好ましくは、まず最初に本発明のキメラＣＬＤＮ６抗体を投与し、次いでヒト抗ＣＬＤＮ６抗体を投与するが、この場合、ヒト抗ＣＬＤＮ６抗体は、好ましくは長期間にわたって、すなわち維持療法として投与される。
【００５３】
本明細書で述べる抗体または組成物は、細胞の成長が阻害されかつ／または細胞が死滅するように細胞を有効量の抗体または組成物と接触させることによって、ＣＬＤＮ６を発現する腫瘍細胞の成長を阻害しかつ／またはＣＬＤＮ６を発現する腫瘍細胞を選択的に死滅させ、そこで腫瘍成長を阻害するための様々な方法において、使用することができる。１つの実施形態において、本方法には、場合によりエフェクター細胞の存在下での、例えばＣＤＣ、アポトーシス、ＡＤＣＣ、食作用による、またはこれらの機序の２またはそれ以上の組合せによる、ＣＬＤＮ６を発現する腫瘍細胞の死滅が含まれる。
【００５４】
本明細書で述べる抗体または組成物は、ＣＬＤＮ６を発現する細胞が関わる腫瘍疾患を、そのような疾患に罹患している患者またはそのような疾患を発症する危険性がある患者に本抗体または組成物を投与することによって処置および／または防止するために使用することができる。
【００５５】
本発明は、腫瘍疾患の予防的および／または治療的処置、すなわち腫瘍疾患を有する患者または腫瘍疾患を発症する危険性がある患者を処置するための予防的および／または治療的処置を伴い得る。１つの態様において、本発明は、本明細書で述べる抗体および組成物の１またはそれ以上の投与を含む、腫瘍成長を阻害するための方法を提供する。
【００５６】
好ましくは、本明細書で述べる抗体および組成物は、組織または器官が腫瘍を含まなくても細胞がＣＬＤＮ６を発現するような組織または器官、例えば胎盤組織または胎盤には、治療活性物質、特に抗体が送達されないか実質的に送達されないような方法で投与される。この目的のために、本明細書で述べる作用剤および組成物を、局所的に投与することができる。
【００５７】
１つの態様において、本発明は、本明細書で述べる処置方法において使用するための、本明細書で述べる抗体を提供する。１つの実施形態において、本発明は、本明細書で述べる処置方法において使用するための、本明細書で述べる医薬組成物を提供する。
【００５８】
本明細書で述べる処置は、外科的切除および／または放射線および／または従来の化学療法と併用することができる。
【００５９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】抗ＣＬＤＮ６マウスモノクローナル抗体ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２、２７Ａおよび３６Ａの結合特異性。  ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２、２７Ａおよび３６Ａ抗体は、ＣＬＤＮ６を発現する細胞に強く結合する一方、ＣＬＤＮ３またはＣＬＤＮ４を発現する細胞には結合しない。
【図２】それぞれＣＬＤＮ６、３、４または９で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２結合の滴定。  ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２は、ヒトＣＬＤＮ６への強い結合と、ヒトＣＬＤＮ９への弱い結合を示す。この抗体はヒトＣＬＤＮ３または４のどちらとも相互作用しない。
【図３】それぞれＣＬＤＮ６、３、４または９で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのｍｕＭＡＢ  ２７Ａ結合の滴定。  ｍｕＭＡＢ  ２７Ａは、ヒトＣＬＤＮ６への強い結合と、ヒトＣＬＤＮ９への極めて弱い結合を示す。この抗体はヒトＣＬＤＮ３または４のどちらとも相互作用しない。
【図４】それぞれＣＬＤＮ６、３、４または９で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのｍｕＭＡＢ  ３６Ａ結合の滴定。  ｍｕＭＡＢ  ３６Ａは、ヒトＣＬＤＮ６への強い結合を示し、ヒトＣＬＤＮ９へは事実上結合しない。この抗体はヒトＣＬＤＮ３または４のどちらとも相互作用しない。
【図５】抗ＣＬＤＮ６マウスモノクローナル抗体ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２、２７Ａおよび３６Ａの相対的親和性。  ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２および２７Ａは３５０〜４５０ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０値を示し、結合の飽和を低濃度で達成するのに対し、ｍｕＭＡＢ  ３６Ａは最高濃度でも結合の飽和を示さない。
【図６】抗ＣＬＤＮ６マウスモノクローナル抗体ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性。  ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２は用量依存的にＣＤＣ活性を示す。
【図７】抗ＣＬＤＮ６マウスモノクローナル抗体ｍｕＭＡＢ  ２７Ａおよび３６Ａの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性。  ｍｕＭＡＢ  ２７Ａが用量依存的ＣＤＣ活性を示すのに対し、ｍｕＭＡＢ  ３６ＡはインビトロでＣＤＣを誘導することができない。
【図８】内因性にＣＬＤＮ６を発現するＮＥＣ８およびＮＥＣ８  ＬＶＴＳ２  ５４（ＣＬＤＮ６ノックダウン）に対するキメラ抗ＣＬＤＮ６抗体ｃｈｉｍＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２による抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の誘導。  キメラ抗ＣＬＤＮ６抗体ｃｈｉｍＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２は、２人の異なるドナーのエフェクター細胞によるＮＥＣ８細胞に対するＡＤＣＣを、用量依存的に誘導する。ＮＥＣ８  ＬＶＴＳ２  ５４細胞（ＣＬＤＮ６ノックダウン）に対するＡＤＣＣを誘導する効率は、ｃｈｉｍＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２では著しく低下する。
【図９】早期処置異種移植モデルにおけるｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２の治療効果。  ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２は、ヒトＣＬＤＮ６を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を移植されたマウスにおいて、特異的かつ強力な腫瘍成長阻害を示す。
【図１０】早期処置異種移植モデルにおけるｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２の治療効果。  クラスカル・ウォリス検定では、ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２による処置後、２８日目（およびそれ以降）には、腫瘍体積が有意に低減する。
【図１１】早期処置異種移植モデルにおけるｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２の治療効果。  モノクローナルマウス抗ＣＬＤＮ６抗体ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２で処置したマウスは、ＰＢＳ対照群と比較して、生存期間の延長を示す。
【図１２】早期処置異種移植モデルにおけるｍｕＭＡＢ  ２７Ａの治療効果。  ｍｕＭＡＢ  ２７Ａは、ヒトＣＬＤＮ６を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞が移植されたマウスにおいて、特異的かつ強力な腫瘍成長阻害を示す。
【図１３】早期処置異種移植モデルにおけるｍｕＭＡＢ  ３６Ａの治療効果。  ｍｕＭＡＢ  ３６Ａは、ヒトＣＬＤＮ６を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞が移植されたマウスにおいて、特異的かつ強力な腫瘍成長阻害を示す。
【図１４】早期処置異種移植モデルにおけるｍｕＭＡＢ  ２７Ａおよび３６Ａの治療効果。  モノクローナルマウス抗ＣＬＤＮ６抗体ｍｕＭＡＢ  ２７Ａおよび３６Ａで処置されたマウスは、生存期間の延長を示す。
【図１５】ＮＥＣ８細胞におけるヒトＣＬＤＮ３、４、６および９発現の免疫ブロット分析。  精巣胚細胞性腫瘍細胞株ＮＥＣ８は、ＣＬＤＮ６の発現だけを示し（Ａ）、ＣＬＤＮ３、４または９の発現は、それぞれ示さない（Ｂ）。
【図１６】フローサイトメトリを使ったＮＥＣ８細胞におけるＣＬＤＮ６表面発現の分析。  ＣＬＤＮ６はＮＥＣ８細胞上に発現される。
【図１７】腫瘍細胞株ＮＥＣ８が移植されたマウスを使った早期処置異種移植モデルにおけるｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２の治療効果。  ヒトＣＬＤＮ６を内因性に発現するＮＥＣ８細胞が移植されたマウスにおいて、ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２は、食塩水対照群と比較して、特異的かつ強力な腫瘍成長阻害を示した。
【図１８】腫瘍細胞株ＮＥＣ８が移植されたマウスを使った早期処置異種移植モデルにおけるｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２の治療効果。  クラスカル・ウォリス検定は、ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２による処置後、２１日目および４２日目に、腫瘍体積が低減していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
本明細書および以下の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上別段の必要がある場合を除き、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語とその異形（例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は、明示した要素、整数もしくは工程または要素、整数もしくは工程の群の包含を含意するが、他の要素、整数もしくは工程または要素、整数もしくは工程の群の除外を含意するわけではない（ただし、いくつかの実施形態では、そのような他の要素、整数もしくは工程または要素、整数もしくは工程の群が排除されることもあり得る）と理解されるであろう。すなわち、主題は、明示した要素、整数もしくは工程または要素、整数もしくは工程の群の包含にある。本発明の説明に関連して（とりわけ特許請求の範囲に関連して）使用される「ある（ａおよびａｎ）」ならびに「その（ｔｈｅ）」という用語ならびに類似する言及は、別段の表示が本明細書にある場合または文脈上明らかに矛盾する場合を除き、単数と複数の両方を包含すると解釈されるものとする。本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲に含まれる個々の値について個別に言及する簡略な方法として機能することを意図しているに過ぎない。別段の表示が本明細書にある場合を除き、個々の値は、あたかもそれが本明細書において個別に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書で述べる方法はすべて、本明細書において別段の表示がある場合または文脈上明らかに矛盾する場合を除き、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書に掲載するありとあらゆる実施例または例示的表現（例えば「など」）の使用は、本発明をより良く例示しようとしたものに過ぎず、別途特許請求の範囲に記載する本発明の範囲に限定を課すものではない。特許請求の範囲には記載のない何らかの要素であって、しかも本発明の実施に欠かすことができないものを示していると解釈すべき文言は、本明細書にはない。
【００６２】
クローディンは、密着結合の最も重要な構成成分であるタンパク質のファミリーであり、密着結合では、クローディンが、上皮の細胞間の細胞間隙における分子の流れを制御する傍細胞バリアを確立する。クローディンは膜を４回貫通する膜貫通タンパク質であり、Ｎ末端とＣ末端はどちらも細胞質内に位置する。第１細胞外ループは平均５３アミノ酸から成り、第２細胞外ループは２４アミノ酸前後から成る。ＣＬＤＮ６とＣＬＤＮ９は最も類似するＣＬＤＮファミリーのメンバーである。
【００６３】
本明細書で使用される「ＣＬＤＮ」という用語はクローディンを意味し、これには、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ９、ＣＬＤＮ４およびＣＬＤＮ３が含まれる。好ましくはＣＬＤＮはヒトＣＬＤＮである。
【００６４】
「ＣＬＤＮ６」という用語は、好ましくは、ヒトＣＬＤＮ６に関し、特に、（ｉ）配列表の配列番号：１に従う核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列、および／または（ｉｉ）配列表の配列番号：２または配列番号：６に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体、を含むタンパク質に関する。ＣＬＤＮ６の第１細胞外ループは、好ましくは、配列番号：２に示すアミノ酸配列または配列番号：６に示すアミノ酸配列のアミノ酸２８〜８０、より好ましくはアミノ酸２８〜７６、例えば配列番号：３に示すアミノ酸配列を含む。ＣＬＤＮ６の第２細胞外ループは、好ましくは、配列番号：２に示すアミノ酸配列または配列番号：６に示すアミノ酸配列のアミノ酸１３８〜１６０、好ましくはアミノ酸１４１〜１５９、より好ましくはアミノ酸１４５〜１５７、例えば配列番号：５に示すアミノ酸配列を含む。前記第１および／または第２細胞外ループは、好ましくは、ＣＬＤＮ６の細胞外部分を形成する。
【００６５】
「ＣＬＤＮ９」という用語は、好ましくは、ヒトＣＬＤＮ９に関し、特に、配列表の配列番号：７に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。ＣＬＤＮ９の第１細胞外ループは、好ましくは、配列番号：７に示すアミノ酸配列のアミノ酸２８〜７６を含む。ＣＬＤＮ９の第２細胞外ループは、好ましくは、配列番号：７に示すアミノ酸配列のアミノ酸１４１〜１５９を含む。前記第１および／または第２細胞外ループは、好ましくは、ＣＬＤＮ９の細胞外部分を形成する。
【００６６】
「ＣＬＤＮ４」という用語は、好ましくは、ヒトＣＬＤＮ４に関し、特に、配列表の配列番号：８に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。ＣＬＤＮ４の第１細胞外ループは、好ましくは、配列番号：８に示すアミノ酸配列のアミノ酸２８〜７６を含む。ＣＬＤＮ４の第２細胞外ループは、好ましくは、配列番号：８に示すアミノ酸配列のアミノ酸１４１〜１５９を含む。前記第１および／または第２細胞外ループは、好ましくは、ＣＬＤＮ４の細胞外部分を形成する。
【００６７】
「ＣＬＤＮ３」という用語は、好ましくは、ヒトＣＬＤＮ３に関し、特に、配列表の配列番号：９に従うアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。ＣＬＤＮ３の第１細胞外ループは、好ましくは、配列番号：９に示すアミノ酸配列のアミノ酸２７〜７５を含む。ＣＬＤＮ３の第２細胞外ループは、好ましくは、配列番号：９に示すアミノ酸配列のアミノ酸１４０〜１５８を含む。前記第１および／または第２細胞外ループは、好ましくは、ＣＬＤＮ３の細胞外部分を形成する。
【００６８】
上述のＣＬＤＮ配列には、前記配列の任意の変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、立体配座、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものが含まれる。対立遺伝子変異体は遺伝子の通常の配列の改変に関係し、その意義は不明であることが多い。完全な遺伝子配列決定を行うと、所与の遺伝子について、しばしば、数多くの対立遺伝子変異体が同定される。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列が起源とするものとは異なる種を起源とする核酸またはアミノ酸配列である。「ＣＬＤＮ」という用語は、（ｉ）ＣＬＤＮスプライス変異体、（ｉｉ）ＣＬＤＮの翻訳後修飾変異体、特にグリコシル化（例えばＮグリコシル化）状態が異なっている変異体を含む、（ｉｉｉ）ＣＬＤＮ立体配座変異体、（ｉｖ）ＣＬＤＮがん関連変異体およびＣＬＤＮ非がん関連変異体を包含するものとする。好ましくは、ＣＬＤＮはその天然立体配座で存在する。
【００６９】
「部分」という用語は断片を指す。アミノ酸配列またはタンパク質などの特定の構造に関して、その「部分」という用語は、前記構造の連続的または不連続的断片を示し得る。好ましくは、アミノ酸配列の部分は、前記アミノ酸配列のアミノ酸の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を含む。好ましくは、部分が不連続断片である場合、前記不連続断片は、ある構造の２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のパーツから構成され、各パーツはその構造の連続エレメントである。例えば、アミノ酸配列の不連続断片は、前記アミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上の、好ましくは４以下のパーツから構成されることができ、この場合、各パーツは、好ましくは、前記アミノ酸配列の少なくとも５連続アミノ酸、少なくとも１０連続アミノ酸、好ましくは少なくとも２０連続アミノ酸、好ましくは少なくとも３０連続アミノ酸を含む。
【００７０】
「パーツ」および「フラグメント」という用語は、本明細書では可換的に使用され、連続エレメントを指す。例えば、アミノ酸配列またはタンパク質などの構造のパーツとは、前記構造の連続エレメントを指す。ある構造の部分、パーツまたはフラグメントは、好ましくは、前記構造の１またはそれ以上の機能的性質を含む。例えば、エピトープまたはペプチドの部分、パーツまたはフラグメントは、好ましくは、それが由来するエピトープまたはペプチドと免疫学的に等価である。
【００７１】
本発明に関して「ＣＬＤＮの細胞外部分」という用語は、細胞の細胞外間隙に面していて、好ましくは前記細胞の外側から、例えば細胞の外側に位置する抗体などによってアクセス可能である、ＣＬＤＮのパーツを指す。好ましくは、この用語は、１またはそれ以上の細胞外ループもしくはそのパーツまたはＣＬＤＮの他の任意の細胞外パーツ（好ましくは前記ＣＬＤＮに特異的なもの）を指す。好ましくは前記パーツは、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、もしくは少なくとも５０アミノ酸またはそれ以上を含む。
【００７２】
本発明によれば、細胞によって発現されるＣＬＤＮは、好ましくは、前記細胞の表面と会合している。「細胞の表面と会合しているＣＬＤＮ」という用語は、ＣＬＤＮが前記細胞の形質膜と会合し、前記細胞の形質膜に位置していることを意味し、この場合、ＣＬＤＮの少なくとも１パーツ、好ましくは細胞外部分は、前記細胞の細胞外間隙に面していて、前記細胞の外側から、例えば細胞の外側に位置する抗体によって、アクセス可能である。会合は直接的であっても間接的であってもよい。例えば会合は、１またはそれ以上の膜貫通ドメイン、１またはそれ以上の脂質アンカー、および／または細胞の形質膜の外葉上に見いだすことができる他の任意のタンパク質、脂質、糖、もしくは他の構造との相互作用によるものであり得る。例えば、細胞の表面と会合しているＣＬＤＮは、細胞外部分を有する膜貫通タンパク質、すなわち内在性膜タンパク質であるか、または膜貫通タンパク質である別のタンパク質との相互作用によって細胞の表面と会合しているタンパク質であることができる。
【００７３】
ＣＬＤＮ６は、それが細胞の表面に位置し、かつ細胞に添加されたＣＬＤＮ６特異的抗体による結合にアクセス可能であるならば、前記細胞の表面と会合している。ＣＬＤＮ６が細胞によって発現される場合、前記細胞の表面と会合しているＣＬＤＮ６は、発現したＣＬＤＮ６のたんなる一部分であってもよいと理解すべきである。
【００７４】
「ＣＬＤＮを保有している細胞」という用語は、好ましくは、前記細胞がＣＬＤＮをその表面に保有していること、すなわちＣＬＤＮが前記細胞の表面と会合していることを意味する。
【００７５】
「細胞表面」または「細胞の表面」は、当分野におけるその通常の意味に従って使用され、それゆえにタンパク質および他の分子による結合のためにアクセス可能な細胞の外側を含む。
【００７６】
「細胞の表面上に発現されるＣＬＤＮ」という表現は、細胞によって発現されるＣＬＤＮが前記細胞の表面と会合した状態で見いだされることを意味する。
【００７７】
本発明によれば、発現および会合のレベルが胎盤細胞または胎盤組織における発現および会合と比較して低いのであれば、ＣＬＤＮ６は、細胞において実質的に発現されておらず、細胞表面と実質的に会合していない。好ましくは、発現および会合のレベルは、胎盤細胞または胎盤組織における発現および会合の１０％未満、好ましくは５％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％または０．０５％未満であるか、それよりさらに低い。好ましくは、発現および会合のレベルが、胎盤組織以外の非腫瘍形成性、非がん性組織における発現および会合のレベルを２倍まで、好ましくは１．５倍までしか上回らず、好ましくは前記非腫瘍形成性、非がん性組織における発現および会合のレベルを上回らないのであれば、ＣＬＤＮ６は、細胞において実質的に発現されておらず、細胞表面と実質的に会合していない。好ましくは、発現または会合のレベルが検出限界未満であり、かつ／または発現もしくは会合のレベルが低すぎて、細胞に添加されたＣＬＤＮ６特異的抗体による結合が可能にならないのであれば、ＣＬＤＮ６は、細胞において実質的に発現されておらず、細胞表面と実質的に会合していない。
【００７８】
本発明によれば、発現および会合のレベルが、胎盤組織以外の非腫瘍形成性、非がん性組織における発現および会合のレベルを好ましくは２倍以上、好ましくは１０倍、１００倍、１０００倍または１００００倍以上、上回っているのであれば、ＣＬＤＮ６は、細胞において発現されており、細胞表面と会合している。好ましくは、発現および会合のレベルが検出限界を上回り、かつ／または発現および会合のレベルが、細胞に添加されたＣＬＤＮ６特異的抗体による結合が可能になるほど十分に高ければ、ＣＬＤＮ６は、細胞において発現されており、細胞表面と会合している。好ましくは、細胞において発現されるＣＬＤＮ６は、前記細胞の表面上に発現されるか、または前記細胞の表面上に露出している。
【００７９】
「ラフト」という用語は、細胞の形質膜の外葉領域に位置する、スフィンゴ脂質とコレステロールに富む膜マイクロドメインを指す。そのようなドメイン内で会合する特定タンパク質の能力、および「凝集体」または「巣状凝集体」を形成するそれらの能力は、それらのタンパク質の機能を生じさせることができる。例えば、そのような構造体中にＣＬＤＮ６分子が移行すると、本発明の抗体が結合した後に、形質膜において高密度のＣＬＤＮ６抗原−抗体複合体が生じる。そのような高密度のＣＬＤＮ６抗原−抗体複合体は、ＣＤＣ時に補体系の効率的な活性化を可能にすることができる。
【００８０】
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に結びつけられた少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指し、その抗原結合部分を含む任意の分子を包含する。「抗体」という用語には、モノクローナル抗体およびそのフラグメントまたは誘導体が含まれ、限定するわけではないが、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、一本鎖抗体、例えばｓｃＦｖ、およびＦａｂフラグメントやＦａｂ'フラグメントなどの抗原結合性抗体フラグメントなどを含むと共に、あらゆる組換え形態の抗体、例えば原核生物において発現される抗体、非グリコシル化抗体、ならびに本明細書で述べる任意の抗原結合性抗体フラグメントおよび誘導体も含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域とから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域とから構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域と、それらの間に挿入された、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域とに、さらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序で配置された、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含んでいる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００８１】
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種からの免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子であって、分子の残りの免疫グロブリン構造はヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合された完全な可変ドメインを含むか、または可変ドメイン内の適当なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）だけを含み得る。抗原結合部位は、野生型であってもよいし、１またはそれ以上のアミノ酸置換によって修飾（例えば、より密接にヒト免疫グロブリンに似るように修飾）されていてもよい。ヒト化抗体のいくつかの形態では、ＣＤＲ配列がすべて保存されている（例えばマウス抗体からの６つのＣＤＲをすべて含むヒト化マウス抗体）。別の形態は、もとの抗体と比較して改変された１またはそれ以上のＣＤＲを有する。
【００８２】
「キメラ抗体」という用語は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの一部分が、特定の種に由来するまたは特定のクラスに属する抗体内の対応する配列と相同であり、鎖の残りのセグメントは、別の抗体内の対応する配列に相同である抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖の両方の可変領域が哺乳動物の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣し、定常部分は別の種に由来する抗体の配列に相同である。そのようなキメラ形態の明らかな利点の１つは、容易に入手できる非ヒト宿主生物からのＢ細胞またはハイブリドーマを、例えばヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて使用することにより、可変領域を現在公知の供給源から好都合に引き出すことができるという点である。この可変領域は調製の容易さという利点を有し、その特異性は供給源に影響されないが、一方、定常領域はヒトであるので、抗体を注射したときに、非ヒト供給源からの定常領域の場合よりも、ヒト対象からの免疫応答を惹起する可能性が低い。ただし、前記の定義は、この特定例に限定されるわけではない。
【００８３】
抗体の「抗原結合部分」（または単に「結合部分」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持している、抗体の１またはそれ以上のフラグメントを指す。完全長抗体のフラグメントが抗体の抗原結合機能を果たし得ることは示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインから成る一価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の１本の腕のＶＬドメインとＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）場合により合成リンカーによって接合されていてもよい２またはそれ以上の単離されたＣＤＲの組合せが含まれる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換え法を使用して、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対合して一価分子を形成する一本鎖タンパク質（これは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８５：５８７９−５８８３参照）としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって、それらを接合することもできる。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図されている。さらなる例は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合された結合ドメインポリペプチド、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域または軽鎖可変領域であることができる。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号および同第２００３／０１３３９３９号に、さらに開示されている。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の従来技術を用いて得られ、フラグメントは無傷抗体と同じ方法で有用性に関してスクリーニングされる。
【００８４】
本発明に記載する抗体は、受動抗腫瘍免疫療法に有用であり、標的細胞傷害、すなわち腫瘍細胞の死滅をもたらすために、治療エフェクター成分、例えば放射性標識、がん治療に適したシスプラチン、メトトレキサート、アドリアマイシンなどの化学療法剤、細胞毒、治療用酵素、アポトーシスを誘導する作用剤などに取り付けられていてもよいし、取り付けられていなくてもよい。
【００８５】
好ましくは、本明細書で述べる抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）媒介性溶解、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介性溶解、アポトーシス、同型接着および／または食作用を誘導することによって、好ましくはＣＤＣ媒介性溶解および／またはＡＤＣＣ媒介性溶解を誘導することによって、細胞の死滅を媒介する。本明細書で述べる抗体は、好ましくは、免疫系の構成成分と、好ましくはＡＤＣＣまたはＣＤＣを介して、相互作用する。しかし本発明の抗体は、単に細胞表面上の腫瘍抗原に結合し、よって例えば細胞の増殖をブロックすることによっても、効果を発揮し得る。
【００８６】
ＡＤＣＣは、本明細書で述べるエフェクター細胞、特にリンパ球の細胞死滅能力を表し、これは、好ましくは標的細胞が抗体によって印付けられることを必要とする。
【００８７】
ＡＤＣＣは、好ましくは、抗体が腫瘍細胞上の抗原に結合し、抗体Ｆｃドメインが免疫エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と係合した場合に起こる。Ｆｃ受容体のファミリーはいくつか同定されており、特定細胞集団は規定されたＦｃ受容体を特徴的に発現する。ＡＤＣＣは、様々な程度の即時腫瘍破壊を直接誘導するための機序であって、抗原提示および腫瘍に対するＴ細胞応答の誘導にもつながるものであるとみなすことができる。好ましくは、ＡＤＣＣのインビボでの誘導は、腫瘍に対するＴ細胞応答と、宿主由来の抗体応答とにつながるであろう。
【００８８】
ＣＤＣは、抗体によって導くことができるもう一つの細胞死滅方法である。ＩｇＭは補体活性化にとって最も有効なアイソタイプである。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３も、古典的補体活性化経路を介してＣＤＣを導くのに、どちらも非常に有効である。好ましくは、このカスケードでは、抗原−抗体複合体の形成が、関与する抗体分子（例えばＩｇＧ分子）のＣＨ２ドメイン上の、ごく近接した、複数のＣ１ｑ結合部位を曝露させる（Ｃ１ｑは補体Ｃ１の３つのサブコンポーネントの１つである）。好ましくは、曝露されたこれらのＣ１ｑ結合部位が、それまでは低親和性であったＣ１ｑ−ＩｇＧ相互作用を、アビディティの高いものへと転化させ、それが一連の他の補体タンパク質が関与する事象のカスケードの引き金を引き、エフェクター細胞走化性／活性化因子であるＣ３ａおよびＣ５ａのタンパク質分解的放出につながる。好ましくは補体カスケードは、細胞内外への水および溶質の自由な通行を促進する細胞膜中の細孔を作り出し、アポトーシスにつながり得る、膜侵襲複合体の形成で終了する。
【００８９】
「抗体」という用語には、「二重特異性分子」、すなわち２つの異なる結合特異性を有する分子が含まれる。例えばこの分子は、（ａ）細胞表面抗原と（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体とに結合し、またはそれらと相互作用し得る。「抗体」という用語には、「多重特異性分子」または「ヘテロ特異性分子」、すなわち３つ以上の異なる結合特異性を有する分子も含まれる。例えばこの分子は、（ａ）細胞表面抗原と、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体と、（ｃ）少なくとも１つの他の構成成分とに結合し、またはそれらと相互作用し得る。したがって本発明には、ＣＬＤＮ６と、エフェクター細胞上のＦｃ受容体などといった他の標的とに対する、二重特異性、三重特異性、四重特異性および他の多重特異性分子が含まれるが、これらに限定されるわけではない。「抗体」という用語には、「二重特異性抗体」も含まれ、これにはダイアボディも含まれる。ダイアボディは、ＶＨドメインとＶＬドメインとが１本のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、前記ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対合して２つの抗原結合部位を生じさせることを強いる、二価の二重特異性抗体である（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら（１９９３）米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。
【００９０】
「抗体」には、「ヘテロ抗体」（この用語は、一つに連結された２またはそれ以上の抗体、その誘導体、または抗原結合領域であって、そのうちの少なくとも２つが異なる特異性を有するものを指す）も含まれる。これらの異なる特異性には、エフェクター細胞上のＦｃ受容体に対する結合特異性、および標的細胞（例えば腫瘍細胞）上の抗原またはエピトープに対する結合特異性が含まれる。
【００９１】
「標的細胞」とは、本発明の抗体が標的にすることのできる、対象（例えばヒトまたは動物）中の任意の望ましくない細胞を意味するものとする。好ましい実施形態では、標的細胞が、ＣＬＤＮ６を発現する細胞である。ＣＬＤＮ６を発現する細胞には、典型的には、腫瘍細胞が含まれる。
【００９２】
本明細書で使用される「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識相および活性化相ではなく、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞には、骨髄系またはリンパ系起源の細胞、例えばリンパ球（例えばＢ細胞および細胞溶解性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球；ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、マスト細胞、および好塩基球が含まれる。いくつかのエフェクター細胞は、特異的Ｆｃ受容体を発現し、特異的免疫機能を実行する。好ましい実施形態では、エフェクター細胞が抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力を有し、例えば好中球はＡＤＣＣを誘導する能力を有する。例えばＦｃＲを発現する単球、マクロファージは、標的細胞を特異的に死滅させることおよび抗原を免疫系の他の構成成分に提示すること、または抗原を提示する細胞に結合することに関与する。別の実施形態では、エフェクター細胞が、標的抗原、標的細胞、または微生物を貪食することができる。エフェクター細胞上での特定のＦｃＲの発現は、サイトカインなどの体液性因子によって調節することができる。例えば、ＦｃγＲＩの発現はインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）によって上方調節されることが見いだされている。この強化された発現は、標的に対するＦｃγＲＩ担持細胞の細胞傷害活性を増大させる。エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食または溶解することができる。
【００９３】
本明細書で述べる抗体はヒト抗体であり得る。本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域を有する抗体を含むことが意図されている。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含み得る。
【００９４】
本明細書で述べる抗体はモノクローナル抗体であり得る。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。１つの実施形態では、不死化細胞と融合させた非ヒト動物（例えばマウス）から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって、モノクローナル抗体が産生される。
【００９５】
本明細書で述べる抗体は組換え抗体であり得る。本明細書で使用される「組換え抗体」という用語には、（ａ）免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（例えばマウス）またはそこから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから、単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体、および（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う他の任意の手段によって調製され、発現され、創製され、または単離された抗体など、組換え手段によって調製され、発現され、創製され、または単離された、あらゆる抗体が含まれる。
【００９６】
本明細書で使用される「トランスフェクトーマ」という用語には、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、植物細胞、または酵母細胞を含む真菌などの、抗体を発現する組換え真核生物宿主細胞が含まれる。
【００９７】
本明細書にいう「異種抗体」は、そのような抗体を産生するトランスジェニック生物との関連において定義される。この用語は、トランスジェニック生物から成るのではない生物に見いだされるものに対応するアミノ酸配列またはコード核酸配列を有し、一般にトランスジェニック生物以外の種に由来する抗体を指す。
【００９８】
本明細書にいう「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物起源の軽鎖と重鎖とを有する抗体を指す。例えば、マウス軽鎖と会合したヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。
【００９９】
本発明には、本明細書で述べるすべての抗体およびその誘導体が含まれ、それらは、本発明においては、「抗体」という用語で包含される。「抗体誘導体」という用語は、抗体の任意の修飾形態、例えば抗体と別の作用剤または別の抗体もしくは抗体フラグメントとのコンジュゲートを指す。
【０１００】
本明細書で述べる抗体は、好ましくは単離されている。本明細書にいう「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図されている（例えば、ＣＬＤＮ６に特異的に結合する単離された抗体は、ＣＬＤＮ６以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ヒトＣＬＤＮ６のエピトープ、アイソフォームまたは変異体に特異的に結合する単離された抗体は、他の関連抗原、例えば他の種からの関連抗原（例えばＣＬＤＮ６種ホモログ）に対して交差反応性を有し得る。さらにまた、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まないものであり得る。本発明の１つの実施形態では、「単離された」モノクローナル抗体の組合せは、異なる特異性を有し、明確に定義された組成で組み合わされている抗体に関する。
【０１０１】
本発明によれば、抗体は、それがあらかじめ定められた標的に対して有意な親和性を有し、標準的アッセイにおいて前記あらかじめ定められた標的に結合するのであれば、前記あらかじめ定められた標的に結合する能力を有する。「親和性」または「結合親和性」は、多くの場合、平衡解離定数（ＫＤ）によって測定される。好ましくは、「有意な親和性」という用語は、１０−５Ｍ以下、１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、または１０−１２Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）での、あらかじめ定められた標的への結合を指す。
【０１０２】
抗体は、それが標的に対して有意な親和性を有さず、標準的アッセイにおいて前記標的に有意に結合しないのであれば、前記標的に結合する能力を（実質的に）有さない。好ましくは、抗体は、それが、無傷細胞の表面上に発現された標的への前記抗体の結合を決定するフローサイトメトリ分析（ＦＡＣＳ分析）において、前記標的に検出可能な程度に結合しないのであれば、前記標的に結合する能力を（実質的に）有さない。好ましくは、抗体は、最大２、好ましくは１０、より好ましくは２０、特に５０または１００μｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度で存在するのであれば、前記標的に検出可能な程度に結合しない。好ましくは、抗体は、それが、その抗体が結合する能力を有するあらかじめ定められた標的への結合に関するＫＤより少なくとも１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、または１０６倍高いＫＤで、ある標的に結合するのであれば、その標的に対して有意な親和性を有さない。例えば、その抗体が結合する能力を有する標的への抗体の結合に関するＫＤが１０−７Ｍであるとすると、その抗体が有意な親和性を有さない標的への結合に関するＫＤは、少なくとも１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍ、１０−３Ｍ、１０−２Ｍ、または１０−１Ｍであるだろう。
【０１０３】
好ましくは、本発明の抗体は、あらかじめ定められた標的、特にＣＬＤＮ６に、特異的に結合する能力を有する。
【０１０４】
抗体は、それが、あらかじめ定められた標的に結合する能力を有すると同時に、他の標的に結合する能力を有さないのであれば、すなわち他の標的に対する有意な親和性を有さず、標準的アッセイにおいて他の標的に有意に結合しないのであれば、前記あらかじめ定められた標的に特異的である。本発明によれば抗体は、それが、ＣＬＤＮ６に結合する能力を有するが、他の標的、特にＣＬＤＮ６以外のクローディンタンパク質、例えばＣＬＤＮ９、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ３およびＣＬＤＮ１などに結合する能力を（実質的に）有さないのであれば、ＣＬＤＮ６に特異的である。好ましくは、抗体は、それが、ＣＬＤＮ６以外のクローディンタンパク質、例えばＣＬＤＮ９、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ３およびＣＬＤＮ１への親和性および結合が、クローディンとは無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または非クローディン膜貫通タンパク質、例えばＭＨＣ分子またはトランスフェリン受容体、または他の任意の指定されたポリペプチドへの親和性または結合を有意に上回らないのであれば、ＣＬＤＮ６に特異的である。好ましくは、抗体は、それが、特異的でない標的への結合に関するＫＤより少なくとも１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、または１０６倍低いＫＤで、あらかじめ定められた標的に結合するのであれば、前記あらかじめ定められた標的に特異的である。例えば、特異的な標的への抗体の結合に関するＫＤが１０−７Ｍであるとすると、特異的でない標的への結合に関するＫＤは、少なくとも１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍ、１０−３Ｍ、１０−２Ｍ、または１０−１Ｍであるだろう。
【０１０５】
標的への抗体の結合は、任意の適切な方法を使って実験的に決定することができる：例えばＢｅｒｚｏｆｓｋｙら「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、および本明細書で述べる方法を参照のこと。親和性は従来の技術を使って、例えば平衡透析によって；またはＢＩＡｃｏｒｅ２０００計器を使用し、製造者が概説する一般的手順を使って；または放射性標識標的抗原を使用し、ラジオイムノアッセイによって；または当業者に知られる他の方法によって、容易に決定することができる。親和性データは、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄら，Ａｎｎ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ，５１：６６０（１９４９）の方法によって分析し得る。特定の抗体−抗原相互作用の親和性測定値は、例えば塩濃度、ｐＨなど、異なる条件下で測定すれば、変動し得る。したがって親和性および他の抗原結合パラメータ、例えばＫＤ、ＩＣ５０の測定は、好ましくは、抗体および抗原の標準化された溶液と、標準化された緩衝液を使ってなされる。
【０１０６】
本明細書にいう「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれ、ＩｇＧ２ａ（例えばＩｇＧ２ａ，κ，λ）、ＩｇＧ２ｂ（例えばＩｇＧ２ｂ，κ，λ）、ＩｇＧ３（例えばＩｇＧ３，κ，λ）およびＩｇＭ抗体が含まれる。ただし、ＩｇＧ１、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体を含む他の抗体アイソタイプも、本発明によって包含される。
【０１０７】
本明細書にいう「アイソタイプスイッチ」は、抗体のクラスまたはアイソタイプが、あるＩｇクラスから他のＩｇクラスの１つに変化する現象を指す。
【０１０８】
本明細書で使用される「天然に生じる」という用語が、ある物体に適用される場合、これは、その物体を自然界に見いだすことができるという事実を指す。例えば、自然界にある供給源から単離することができる生物（ウイルスを含む）中に存在し、かつ実験室において人間によって意図的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に生じるものである。
【０１０９】
本明細書で使用される「再編成された」という用語は、Ｖセグメントが、それぞれ基本的に完全なＶＨまたはＶＬドメインをコードするような配置で、Ｄ−ＪまたはＪセグメントに直接隣接して位置している、重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の構成を指す。再編成された免疫グロブリン（抗体）遺伝子の遺伝子座は、生殖細胞系ＤＮＡとの比較によって同定することができ；再編成された遺伝子座は、少なくとも１つの組換えられたヘプタマー／ノナマー相同性エレメントを有するであろう。
【０１１０】
Ｖセグメントに関して本明細書で使用される「再編成されていない」または「生殖細胞系構成」という用語は、ＶセグメントがＤまたはＪセグメントに直接隣接するように組換えられていない構成を指す。
【０１１１】
本発明によれば、抗体は、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびヒトを含む（ただしこれらに限るわけではない）様々な種に由来し得る。抗体には、１つの種、好ましくはヒトに由来する抗体定常領域が別の種に由来する抗原結合部位と組み合わされているキメラ分子も含まれる。さらにまた、抗体には、非ヒト種に由来する抗体の抗原結合部位がヒト起源の定常領域およびフレームワーク領域と組み合わされているヒト化分子も含まれる。
【０１１２】
抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、様々な技術によって作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順は好ましいが、原理的に、モノクローナル抗体を作製するための他の技術、例えばＢリンパ球のウイルス形質転換もしくはがん性形質転換、または抗体遺伝子のライブラリを用いるファージディスプレイ技術も使用することができる。
【０１１３】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための好ましい動物系は、マウスの系である。マウスにおけるハイブリドーマ作製は、十分に確立された手順である。免疫プロトコールと、融合用の免疫脾細胞を単離するための技術は、当分野において公知である。融合パートナー（例えばマウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。
【０１１４】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための他の好ましい動物系は、ラットおよびウサギの系である（例えばＳｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔら，米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）９２：９３４８（１９９５）に記載されている。Ｒｏｓｓｉら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２４：２９５（２００５）も参照のこと）。
【０１１５】
さらにもう一つの好ましい実施形態では、ＣＬＤＮ６に対するヒトモノクローナル抗体を、マウス系ではなくヒト免疫系のパーツを保有するトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウスを使って生成させることができる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソーマルマウスには、それぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスとして知られるマウスが含まれ、これらを本明細書では集合的に「トランスジェニックマウス」という。そのようなトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の作製は、国際公開第２００４／０３５６０７号においてＣＤ２０に関して詳述されているように、実施することができる。
【０１１６】
モノクローナル抗体を生成させるためのさらにもう一つの戦略は、所定の戦略の抗体を産生するリンパ球から抗体をコードする遺伝子を直接単離することである。例えばＢａｂｃｏｃｋら，１９９６；Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ，ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｔｒａｔｅｇｙを参照のこと。組換え抗体工学の詳細については、Ｗｅｌｓｃｈｏｆ  ａｎｄ  Ｋｒａｕｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ＩＳＢＮ−０−８９６０３−９１８−８およびＢｅｎｎｙ  Ｋ．Ｃ．Ｌｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＩＳＢＮ  １−５８８２９−０９２−１も参照のこと。
【０１１７】
ＣＬＤＮ６に対する抗体を生成させるために、上述のように、ＣＬＤＮ６配列に由来する担体コンジュゲートペプチド、組換え発現されたＣＬＤＮ６抗原もしくはそのフラグメントの濃縮調製物、および／またはＣＬＤＮ６もしくはそのフラグメントを発現する細胞で、マウスを免疫することができる。あるいは、完全長ヒトＣＬＤＮ６またはそのフラグメントをコードするＤＮＡでマウスを免疫することもできる。ＣＬＤＮ６抗原の精製調製物または濃縮調製物を使った免疫が抗体をもたらさない場合は、免疫応答を促進するために、ＣＬＤＮ６を発現する細胞、例えば細胞株で、マウスを免疫することもできる。
【０１１８】
免疫応答は、免疫プロトコールの経過中に、尾静脈または後眼窩からの採血によって得られる血漿および血清試料を使って監視することができる。融合には、十分な力価の抗ＣＬＤＮ６免疫グロブリンを有するマウスを使用することができる。特異的抗体を分泌するハイブリドーマの割合を高めるために、犠死および脾切除の３〜５日前に、ＣＬＤＮ６発現細胞の腹腔内または静脈内投与で、マウスを追加免疫することができる。
【０１１９】
ＣＬＤＮ６に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成させるために、免疫マウスから得られるリンパ節、脾臓または骨髄から細胞を単離し、それらを、マウス骨髄腫細胞株などの適当な不死化細胞株と融合させることができる。次に、その結果生じたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングすることができる。次に、個々のウェルを、抗体分泌ハイブリドーマについて、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。ＣＬＤＮ６発現細胞を使用する免疫蛍光法およびＦＡＣＳ分析により、ＣＬＤＮ６に対して特異性を有する抗体を同定することができる。抗体分泌ハイブリドーマを再びプレーティングし、再びスクリーニングして、抗ＣＬＤＮ６モノクローナル抗体に関して依然として陽性であれば、限界希釈法によってサブクローニングすることができる。次に、安定なサブクローンをインビトロで培養することで、特性付けのために組織培養培地中で抗体を生成させることができる。
【０１２０】
本発明の抗体は、例えば、当分野ではよく知られているとおり、組換えＤＮＡ技術と遺伝子トランスフェクション法の組合せを使って、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて作製することもできる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）。
【０１２１】
例えば、１つの実施形態では、国際公開第第８７／０４４６２号、国際公開第第８９／０１０３６号および欧州特許第３３８８４１号に開示されているＧＳ遺伝子発現系または当分野において周知の他の発現系によって使用されるような真核生物発現プラスミドなどの発現ベクターに、対象とする１または複数の遺伝子（例えば抗体遺伝子）をライゲーションすることができる。クローン化された抗体遺伝子を有する精製プラスミドを、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３細胞などの真核生物宿主細胞、あるいは植物由来細胞、真菌または酵母細胞のような他の真核細胞に導入することができる。これらの遺伝子を導入するために使用される方法は、当分野で記述されている方法、例えば電気穿孔、リポフェクチン、リポフェクタミンその他であることができる。宿主細胞へのこれらの抗体遺伝子の導入後に、抗体を発現する細胞を同定し、選択することができる。これらの細胞はトランスフェクトーマに相当し、その後、それらを発現レベルに関して増幅させ、抗体を生産するためにスケールアップすることができる。組換え抗体は、これらの培養上清および／または細胞から単離し、精製することができる。
【０１２２】
あるいは、クローン化した抗体遺伝子を、微生物、例えば大腸菌などの原核細胞を含む他の発現系において発現させることもできる。さらにまた、抗体は、トランスジェニック非ヒト動物において、例えばヒツジおよびウサギからの乳、もしくはニワトリの卵において、またはトランスジェニック植物において生産することもできる；例えば、Ｖｅｒｍａ，Ｒ．ら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２１６：１６５−１８１；Ｐｏｌｌｏｃｋら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：１４７−１５７；およびＦｉｓｃｈｅｒ，Ｒら（１９９９）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：８２５−８３９参照。
【０１２３】
マウスモノクローナル抗体は、毒素または放射性同位体で標識した場合、ヒトにおける治療用抗体として使用することができる。非標識マウス抗体は、反復適用した場合、ヒトにおいて高度に免疫原性であり、治療効果の低下につながる。主たる免疫原性は重鎖定常領域によって媒介される。ヒトにおけるマウス抗体の免疫原性は、それぞれの抗体をキメラ化またはヒト化すれば、低減するまたは完全に回避することができる。キメラ抗体は、その異なる部分が異なる動物種に由来する抗体、例えばマウス抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体である。抗体のキメラ化は、（例えばＫｒａｕｓら，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ＩＳＢＮ−０−８９６０３−９１８−８で述べられているように）マウス抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をヒト重鎖および軽鎖の定常領域と接合することによって達成される。好ましい実施形態では、ヒトκ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に接合することによって、キメラ抗体を生成させる。同じく好ましい実施形態では、ヒトλ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に接合することによって、キメラ抗体を生成させることができる。キメラ抗体を生成させるための好ましい重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。キメラ抗体を生成させるための他の好ましい重鎖定常領域は、ＩｇＧ２、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＭである。
【０１２４】
抗体は、主として６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）中に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。この理由から、ＣＤＲ内のアミノ酸配列はＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間で多様である。ＣＤＲ配列は大半の抗体−抗原相互作用を担っているので、異なる性質を有する異なる抗体からのフレームワーク配列上に移植された特定の天然に生じる抗体からのＣＤＲ配列を含んでいる発現ベクターを構築することにより、前記特定の天然に生じる抗体の性質を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；およびＱｕｅｅｎ，Ｃ．ら（１９８９）米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）８６：１００２９−１００３３参照）。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースから入手することができる。これらの生殖細胞系配列は、Ｂ細胞成熟の間にＶ（Ｄ）Ｊ接合によって形成される完全に組み立てられた可変遺伝子を含まないので、成熟抗体遺伝子配列とは異なるであろう。生殖細胞系遺伝子配列はまた、可変領域の全域にわたって、個々の位置でも、高親和性二次レパートリー抗体の配列とは異なるであろう。例えば、体細胞突然変異は、フレームワーク領域１のアミノ末端部分およびフレームワーク領域４のカルボキシ末端部分では比較的低頻度である。さらにまた、多くの体細胞突然変異は抗体の結合特性をあまり変化させない。このため、もとの抗体の結合特性と類似する結合特性を有する無傷組換え抗体を再現するために特定抗体のＤＮＡ配列全体を得る必要はない（国際公開第９９／４５９６２号参照）。ＣＤＲ領域にまたがる部分重鎖および軽鎖配列は、典型的には、この目的にとって十分である。組換えられた抗体可変遺伝子にはどの生殖細胞系Ｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ）遺伝子セグメントとＪ（ｊｏｉｎｉｎｇ）遺伝子セグメントとが寄与したかを、部分配列を使って決定する。次に、生殖細胞系配列を使用して可変領域の欠けている部分を充填する。重鎖および軽鎖リーダー配列はタンパク質成熟の間に切断され、最終的な抗体の性質には寄与しない。欠けている配列を付加するために、クローン化されたｃＤＮＡ配列を、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅によって、合成オリゴヌクレオチドと組み合わせることができる。あるいは、可変領域全体を一組の短いオーバーラップしたオリゴヌクレオチドとして合成し、ＰＣＲ増幅によって一つにすることで、完全な合成可変領域クローンを創製することもできる。この工程には、特定の制限部位の排除もしくは組み入れ、または特定コドンの最適化などといった、一定の利点がある。
【０１２５】
天然配列と同じアミノ酸コード能力を有する合成Ｖ配列を創製するために、ハイブリドーマからの重鎖および軽鎖転写産物のヌクレオチド配列を使って、オーバーラップする一組の合成オリゴヌクレオチドを設計する。合成重鎖およびκ鎖配列は、次の３つの点で、天然配列とは異なることができる：オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅を容易にするために、一続きの反復ヌクレオチド塩基を中断させる；最適な翻訳開始部位をコザック規則（Ｋｏｚａｋ，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０）に従って組み込む；およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を翻訳開始部位の上流に工作する。
【０１２６】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方について、最適化されたコード鎖配列および対応する非コード鎖配列を、対応する非コードオリゴヌクレオチドのほぼ中間点で、３０〜５０ヌクレオチドに分割する。したがって、各々の鎖について、オリゴヌクレオチドを１５０〜４００ヌクレオチドのセグメントにわたるオーバーラップする二本鎖のセットにアセンブルすることができる。次に、そのプールを鋳型として使用することで、１５０〜４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を作製する。典型的には、１つの可変領域オリゴヌクレオチドセットを２つのプールに分割し、それらを別々に増幅して、２つのオーバーラップＰＣＲ産物を生成させる。次に、これらのオーバーラップ産物をＰＣＲ増幅によって一つにすることで、完全な可変領域を形成させる。また、発現ベクター構築物に容易にクローニングすることができるフラグメントを生成させるために、重鎖または軽鎖定常領域のオーバーラップフラグメントをＰＣＲ増幅に含めることも望ましいと考えられる。
【０１２７】
再構築されたキメラ化またはヒト化重鎖および軽鎖可変領域を、次に、クローン化したプロモータ、リーダー、翻訳開始、定常領域、３'非翻訳、ポリアデニル化および転写終結配列と組み合わせることで、発現ベクター構築物を形成させる。重鎖および軽鎖発現構築物を組み合わせて単一のベクターに入れるか、宿主細胞に同時トランスフェクトするか、逐次的にトランスフェクトするか、または別々にトランスフェクトしてからそれらを融合させることで、両方の鎖を発現する宿主細胞を形成させることができる。ヒトＩｇＧκ用発現ベクターの構築において使用するためのプラスミドを説明する。ＰＣＲ増幅したＶ重鎖およびＶκ軽鎖ｃＤＮＡ配列を使って完全な重鎖および軽鎖ミニ遺伝子を再構築することができるように、プラスミドを構築することができる。これらのプラスミドは、完全ヒトまたはキメラＩｇＧ１κまたはＩｇＧ４κ抗体を発現させるために使用することができる。他の重鎖アイソタイプを発現させるために、またはλ軽鎖を含む抗体を発現させるために、同様のプラスミドを構築することができる。
【０１２８】
したがって、本発明のもう一つの態様では、本明細書で述べる抗ＣＬＤＮ６抗体の構造特徴を使って、ＣＬＤＮ６への結合などといった、本発明の抗体の少なくとも１つの機能特性を保持している、構造的に関連したヒト化抗ＣＬＤＮ６抗体が創製される。より具体的には、マウスモノクローナル抗体の１またはそれ以上のＣＤＲ領域を、組換えによって公知のヒトフレームワーク領域およびＣＤＲと組み合わせることで、さらなる組換え操作されたヒト化抗ＣＬＤＮ６抗体を創製することができる。
【０１２９】
ＣＬＤＮ６に結合する抗体の能力は、実施例で述べるような標準的な結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫蛍光法およびフローサイトメトリ分析）を用いて決定することができる。
【０１３０】
「エピトープ」という用語は、分子中の抗原性決定基、すなわち免疫系によって認識される（例えば抗体によって認識される）分子中のパーツを指す。例えば、エピトープは、免疫系によって認識される、抗原上の孤立した三次元部位である。本発明においては、エピトープは、好ましくはＣＬＤＮタンパク質に由来する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などといった分子の化学的に活性な表面基群から成り、通常は特異的な三次元構造特徴、ならびに特異的な電荷特徴を有する。立体配座エピトープと非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合が失われるが、後者への結合は失われないという点で識別される。ＣＬＤＮなどのタンパク質のエピトープは、好ましくは前記タンパク質の連続部分または不連続部分を含み、好ましくは５〜１００、好ましくは５〜５０、より好ましくは８〜３０、最も好ましくは１０〜２５アミノ酸長である。例えば、エピトープは、好ましくは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長であり得る。
【０１３１】
本明細書で使用される「不連続エピトープ」という用語は、タンパク質の一次配列内の少なくとも２つの別々の領域から形成されるタンパク質抗原上の立体配座エピトープを意味する。
【０１３２】
本発明によれば、「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関する。「特異的結合」とは、抗体などの作用剤が、それが特異的であるエピトープなどの標的に対して、別の標的への結合との比較で、より強く結合することを意味する。ある作用剤が、第一標的に、第二標的に関する解離定数（ＫＤ）よりも低い解離定数で結合する場合、その作用剤は、第二標的との比較で、第一標的に、より強く結合する。好ましくは、作用剤が特異的に結合する標的に関する解離定数（ＫＤ）は、その作用剤が特異的には結合しない標的に関する解離定数（ＫＤ）よりも、１０２倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍、１０８倍以上、１０９倍、または１０１０倍以上低い。
【０１３３】
本明細書で使用される「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことが意図されている。核酸は、本発明によれば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子および化学合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖の線状分子または共有結合で環状に閉じた分子として、存在し得る。
【０１３４】
本発明に従って述べる核酸は、好ましくは単離されている。「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、インビトロで増幅されたこと、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産されたこと、（ｉｉｉ）例えば切断とゲル電気泳動分画によって、精製されたこと、または（ｖｉ）例えば化学合成によって、合成されたこと、を意味する。単離された核酸は、組換えＤＮＡ技術による操作に利用することができる核酸である。
【０１３５】
核酸は、本発明によれば、単独で、または他の核酸（これは同種であっても異種であってもよい）と組み合わされて存在し得る。好ましい実施形態では、核酸が、前記核酸に対して同種であっても異種であってもよい発現制御配列に機能的に連結されており、ここで、「同種」という用語は、核酸が天然でもその発現制御配列に機能的に連結されていることを意味し、「異種」という用語は、核酸が天然ではその発現制御配列に機能的に連結されていないことを意味する。
【０１３６】
ＲＮＡおよび／またはタンパク質もしくはペプチドを発現する核酸などの核酸と発現制御配列は、それらが、前記核酸の発現または転写が前記発現制御配列の制御下または影響下にあるように互いに共有結合されているのであれば、互いに「機能的に」連結されている。核酸が機能的タンパク質に翻訳されるものであって、発現制御配列がコード配列に機能的に連結されているのであれば、前記発現制御配列の誘導は、コード配列におけるフレームシフトを引き起こすことなく、または前記コード配列が所望のタンパク質もしくはペプチドに翻訳され得ない事態を引き起こすことなく、前記核酸の転写をもたらす。
【０１３７】
「発現制御配列」または「発現制御エレメント」という用語は、本発明によれば、プロモータ、リボソーム結合部位、エンハンサー、および遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を調節する他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列を調節することができる。発現制御配列の正確な構造は種または細胞型に応じて異なり得るが、一般的には、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列等々の、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５'非転写配列ならびに５'および３'非翻訳配列を含む。より具体的には、５'非転写発現制御配列は、機能的に連結された核酸の転写制御のためのプロモータ配列が含まれているプロモータ領域を含む。発現制御配列は、エンハンサー配列または上流活性化配列も含み得る。
【０１３８】
本発明によれば、「プロモータ」または「プロモータ領域」という用語は、発現される核酸配列に対して上流（５'側）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼのための認識および結合部位を提供することによって配列の発現を制御する核酸配列に関する。「プロモータ領域」は、遺伝子の転写の調節に関与するさらなる因子のためのさらなる認識および結合部位を含み得る。プロモータは、原核生物遺伝子または真核生物遺伝子の転写を制御し得る。さらにまた、プロモータは「誘導的」であることができ、誘導剤に応答して転写を開始し得るか、または転写が誘導剤によって制御されない場合には、「構成的」であり得る。誘導的プロモータの制御下にある遺伝子は、誘導剤が存在しなければ、発現されないか、またはわずかしか発現されない。誘導剤の存在下では、遺伝子のスイッチが入って作動するか、または転写のレベルが上昇する。これは、一般に、特異的転写因子の結合によって媒介される。
【０１３９】
本発明において好ましいプロモータには、ＳＰ６、Ｔ３およびＴ７ポリメラーゼ用のプロモータ、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモータ、ＣＭＶプロモータ、およびそれらの人工ハイブリッドプロモータ（例えばＣＭＶ）であって、１または複数のパーツが、例えばヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）などの他の細胞タンパク質の遺伝子のプロモータの１または複数のパーツに融合されていて、追加の１または複数のイントロンを含むまたは含まないものが含まれる。
【０１４０】
本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡの生産またはＲＮＡとタンパク質／ペプチドの生産を含む。この用語は核酸の部分的発現も含む。さらにまた、発現は一過性にまたは安定に行われ得る。本発明によれば、発現という用語には、「異状発現」または「異常発現」も含まれる。
【０１４１】
「異状発現」または「異常発現」とは、本発明によれば、基準と比較して、好ましくは非腫瘍形成性正常細胞または健常個体における状態と比較して、発現が改変されていること、好ましくは増加していることを意味する。発現の増加とは、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１００００％またはそれ以上の増加を指す。１つの実施形態では、発現が疾患組織にのみ見いだされ、健常組織における発現は抑止されている。
【０１４２】
好ましい実施形態において、核酸分子は、本発明によれば、適宜、その核酸の発現を制御するプロモータと共に、ベクター中に存在する。「ベクター」という用語は、本明細書ではその最も一般的な意味で使用され、核酸用の任意の中間媒体であって、該核酸が例えば原核細胞および／または真核細胞に導入され、適宜、ゲノム内に組み込まれることを可能にするものを含む。この種のベクターは、好ましくは、細胞内で複製および／または発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスゲノムを含む。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、一般に、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体外遺伝物質の構築物、通常は環状ＤＮＡ二本鎖に関する。
【０１４３】
抗体発現用のベクターとして、抗体の重鎖と軽鎖が異なるベクター内に存在するベクター型または重鎖と軽鎖が同じベクター内に存在するベクター型のいずれかを使用することができる。
【０１４４】
特定の核酸配列およびアミノ酸配列、例えば配列表に示すものに関して本明細書で与える教示は、前記特定配列と機能的に等価な配列、例えば特定アミノ酸配列の性質と同じまたは類似する性質を示すアミノ酸配列、および特定核酸配列によってコードされるアミノ酸配列の性質と同じまたは類似する性質を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列をもたらす、前記特定配列の修飾体とも関連づけられるように解釈されるべきである。
【０１４５】
同様に、特定抗体または特定抗体を産生するハイブリドーマに関して本明細書で与える教示は、特定抗体のアミノ酸配列および／または核酸配列と比較して修飾されているが機能的には等価であるアミノ酸配列および／または核酸配列を特徴とする抗体にも関連づけられるように解釈されるべきである。１つの重要な性質は、抗体のその標的への結合を保持すること、または抗体のエフェクター機能を持続させることである。好ましくは、特定配列と比較して修飾されている配列は、それが抗体内の前記特定配列と置き換わったときに、標的への前記抗体の結合を保持し、好ましくは、ＣＤＣ媒介性溶解またはＡＤＣＣ媒介性溶解などといった、本明細書で述べる前記抗体の機能を保持している。
【０１４６】
特にＣＤＲ、超可変領域および可変領域の配列が、標的に結合する能力を失わずに修飾され得ることは、当業者には理解されるであろう。例えば、ＣＤＲ領域は、本明細書において特定される抗体の領域に同一であるか、または高度に相同であるだろう。「高度に相同」という文言から、ＣＤＲ内では１〜５、好ましくは１〜４、例えば１〜３または１もしくは２個の置換を行い得ると考えられる。加えて、超可変領域および可変領域は、それらが本明細書で具体的に開示する抗体の領域と実質的相同性を示すように修飾し得る。
【０１４７】
本明細書で述べる特定核酸には、特定の宿主細胞または宿主生物におけるコドン使用頻度を最適化する目的で修飾された核酸も含まれると理解すべきである。生物間でのコドン使用頻度の相違は、異種遺伝子発現に関する様々な問題につながり得る。もとの配列の１またはそれ以上のヌクレオチドを変化させることによるコドン最適化は、核酸を発現させる同種または異種宿主における前記核酸の発現の最適化、特に翻訳効率の最適化をもたらすことができる。例えば、抗体の定常領域および／またはフレームワーク領域をコードする、ヒト由来の核酸を、本発明に従って、例えばキメラ抗体またはヒト化抗体を調製するために使用する場合には、前記核酸を、コドン使用頻度を最適化する目的で修飾することが、おそらく好ましいだろうし、前記核酸（場合によっては、異種核酸、例えば本明細書で述べるような他の生物に由来する核酸に融合されているもの）を、マウスまたはハムスターなどといったヒトとは異なる生物からの細胞中で発現させる場合には、特にそうである。例えば、ヒト軽鎖および重鎖定常領域をコードする核酸配列は、最適化されたコドン使用頻度をもたらすヌクレオチド置換を、１またはそれ以上、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、かつ好ましくは最大１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０もしくは１００またはそれ以上含むように修飾することができる。そのようなヌクレオチド置換は、好ましくは、コードされるアミノ酸配列の変化をもたらさないヌクレオチドの置換に関するか、またはそれぞれヒト軽鎖および重鎖定常領域をコードする他の核酸配列内の対応する位置における対応する置換に関する。
【０１４８】
好ましくは、特定核酸配列と、前記特定核酸配列と比較して修飾された核酸配列または前記特定核酸配列の変異体である核酸配列との間の同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるだろう。ＣＬＤＮ６核酸変異体についていえば、同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００または少なくとも約６３０ヌクレオチドの領域に対して与えられる。好ましい実施形態では、同一性の程度が、配列表に示す核酸配列などの参照核酸配列の全長に対して与えられる。好ましくは、２つの配列は、互いにハイブリダイズして安定な二重鎖を形成する能力を有し、そのハイブリダイゼーションは、好ましくは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件（ストリンジェントな条件）下で実施される。ストリンジェントな条件は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｅｄｉｔｏｒｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されており、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、６５℃でのハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写された膜を、例えば２×ＳＳＣ中、室温で洗浄し、次に０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中、６８℃までの温度で洗浄する。
【０１４９】
例えば核酸配列およびアミノ酸配列に関して、本発明における「変異体」という用語には、任意の変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、立体配座、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものが含まれる。対立遺伝子変異体は遺伝子の正常配列の改変に関係し、その意義は不明であることが多い。完全な遺伝子配列決定を行うと、所与の遺伝子について、しばしば、数多くの対立遺伝子変異体が同定される。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列が起源とするものとは異なる種を起源とする核酸またはアミノ酸配列である。
【０１５０】
核酸分子に関して、「変異体」という用語には、縮重核酸配列が含まれ、ここで、縮重核酸とは、本発明によれば、遺伝暗号の縮重ゆえに参照核酸とはコドン配列が異なっている核酸である。
【０１５１】
さらに、本発明によれば、特定核酸配列の「変異体」には、１または複数の、例えば少なくとも２、少なくとも４、または少なくとも６個の、かつ好ましくは最大３、最大４、最大５、最大６、最大１０、最大１５、または最大２０個の、ヌクレオチドの置換、欠失および／または付加を含む核酸配列が含まれる。
【０１５２】
本発明に関して、アミノ酸配列の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。
【０１５３】
挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１またはそれ以上のアミノ酸残基が、アミノ酸配列中の特定の部位に挿入されるが、ランダム挿入とその結果生じる産物の適当なスクリーニングも考えられる。
【０１５４】
アミノ酸欠失変異体は、配列からの１またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。
【０１５５】
アミノ酸置換変異体は、配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その代わりに別の残基が挿入されていることを特徴とする。相同タンパク質またはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列中の位置での修飾、および／またはアミノ酸を類似する性質を有する別のアミノ酸で置き換えることは、好ましい。
【０１５６】
好ましくは、タンパク質変異体中のアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち同じように荷電しているアミノ酸または同じように非荷電であるアミノ酸の置換である。
【０１５７】
好ましくは、特定アミノ酸配列と、前記特定アミノ酸配列と比較して修飾されているアミノ酸配列または前記特定アミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の（例えば実質的な相同性を示すアミノ酸配列間の）類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるだろう。ＣＬＤＮ６ポリペプチド変異体についていえば、類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０アミノ酸の領域に対して与えられる。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度が、配列表に示すアミノ酸配列などの参照アミノ酸配列の全長に対して与えられる。
【０１５８】
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換に相当するアミノ酸のパーセンテージを示す。２つのポリペプチド配列または核酸配列の間の「配列同一性」は、それらの配列の間で同一であるアミノ酸またはヌクレオチドのパーセンテージを示す。
【０１５９】
「同一性パーセンテージ」という用語は、最良アラインメント後に得られる、比較しようとする２つの配列間で同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを表するものとし、このパーセンテージは純粋に統計的であり、２つの配列間の相違はそれらの全長にわたってランダムに分布する。２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の配列比較は、従来どおり、それらを最適に整列した後にこれらの配列を比較することによって実施され、前記比較は、配列類似性を有する局所領域を同定し、比較するために、セグメントごとにまたは「比較ウインドウ」ごとに実施される。比較のための配列の最良アラインメントは、手作業で行われる他、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８５，２４４４の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを用いたコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によっても行われ得る。
【０１６０】
同一性パーセンテージは、比較される２つの配列間で同一な位置の数を決定し、その数を比較した位置の数で除し、これら２つの配列間の同一性パーセンテージが得られるように、得られた結果に１００を乗じることによって算定される。
【０１６１】
「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて行い得る。例えば：（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれ；（ｂ）極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれ；（ｃ）正電荷（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれ；（ｄ）負電荷（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。置換は、典型的には、（ａ）〜（ｄ）の群内で行い得る。加えて、グリシンとプロリンは、αへリックスを破壊するそれらの能力に基づいて互いに置換され得る。いくつかの好ましい置換は、以下の群内で行われ得る：（ｉ）ＳとＴ；（ｉｉ）ＰとＧ；ならびに（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ。遺伝暗号ならびに組換え技術および合成ＤＮＡ技術が公知であることから、当業者は、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【０１６２】
本発明には、本明細書で述べる核酸配列、アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質、特に抗体の誘導体が含まれる。
【０１６３】
「誘導体」という用語は、ヌクレオチド塩基上、糖上、またはリン酸基上での、核酸の任意の化学的誘導体化を含む。「誘導体」という用語は、天然には存在しないヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含有する核酸も含む。好ましくは、核酸の誘導体化は、その安定性を増大させる。
【０１６４】
本発明によれば、タンパク質およびペプチドの「誘導体」は、タンパク質およびペプチドの修飾形態である。そのような修飾には任意の化学的修飾が含まれ、そのような修飾は、糖質、脂質および／またはタンパク質もしくはペプチドなどといった、タンパク質またはペプチドに関連する任意の分子の、１または複数の置換、欠失、および／または付加を含む。「誘導体」という用語は、前記タンパク質およびペプチドのあらゆる機能的化学等価物にも及ぶ。好ましくは修飾ペプチドは、増加した安定性および／または増加した免疫原性を有する。
【０１６５】
本発明によれば、核酸配列、アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質の変異体、誘導体、修飾形態、フラグメント、パーツまたは部分は、好ましくは、それぞれ、それが由来する核酸配列、アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質の機能特性を有する。そのような機能特性は、抗体または抗体標的、特にＣＬＤＮ６などといった、ペプチドまたはタンパク質との相互作用、核酸の選択的結合、および酵素活性を含む。１つの実施形態では、核酸配列、アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質の変異体、誘導体、修飾形態、フラグメント、パーツまたは部分が、それぞれ、それが由来する核酸配列、アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質と免疫学的に等価である。１つの実施形態では、機能特性は免疫学的特性である。
【０１６６】
本発明によれば、細胞は、好ましくは無傷細胞、すなわち、酵素、細胞小器官、または遺伝物質などといったその正常細胞内構成成分を放出していない無傷の膜を有する細胞である。無傷細胞は、好ましくは生細胞、すなわち、その正常な代謝機能を保有する能力を有する生きている細胞である。好ましくは、細胞はヒト細胞である。
【０１６７】
「細胞」は、「宿主細胞」であり得る。本明細書にいう「宿主細胞」とは、組換え核酸が導入されている細胞を指すことが意図されている。
【０１６８】
「トランスジェニック動物」という用語は、１またはそれ以上の導入遺伝子、好ましくは重鎖および／もしくは軽鎖導入遺伝子、または導入染色体（動物の天然ゲノムＤＮＡに組み込まれているものまたは組み込まれていないもの）を含むゲノムを有し、好ましくは導入遺伝子を発現する能力を有する動物を指す。例えば、トランスジェニックマウスは、そのマウスが、ＣＬＤＮ６抗原および／またはＣＬＤＮ６を発現する細胞で免疫された場合に、ヒト抗ＣＬＤＮ６抗体を産生するように、ヒト軽鎖導入遺伝子と、ヒト重鎖導入遺伝子またはヒト重鎖導入染色体のいずれかとを有することができる。ヒト重鎖導入遺伝子は、トランスジェニックマウス、例えばＨＣｏ７またはＨＣｏｌ２マウスなどのＨｕＭＡｂマウスの場合のように、マウスの染色体ＤＮＡに組み込むか、またはヒト重鎖導入遺伝子を、国際公開第０２／４３４７８号に記載されているトランスクロモソーマル（例えばＫＭ）マウスの場合のように、染色体外に維持することができる。そのようなトランスジェニックおよびトランスクロモソーマルマウスは、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよびアイソタイプスイッチを受けることにより、ＣＬＤＮ６に対するヒトモノクローナル抗体の多数のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＥ）を産生する能力を有し得る。
【０１６９】
本発明によれば、「治療エフェクター成分」という用語は、治療効果を発揮し得る任意の分子を意味する。本発明によれば、治療エフェクター分子は、好ましくは、ＣＬＤＮ６を発現する細胞へと選択的に誘導され、治療エフェクター分子には、抗がん剤、放射性同位体、毒素、細胞分裂阻害薬または細胞溶解薬などが含まれる。抗がん剤は、例えば、アミノグルテチミド、アザチオプリン、ブレオマイシン硫酸塩、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビジン（ｃｙｔａｒａｂｉｄｉｎｅ）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｎ）、ドキソルビシン、タキソール、エトポシド、フルオロウラシル、インターフェロン−α、ロムスチン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトタン、プロカルバジンＨＣｌ、チオグアニン、ビンブラスチン硫酸塩およびビンクリスチン硫酸塩を含む。他の抗がん剤は、例えばＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，"Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．、特にＣｈａｐｔｅｒ  ５２（Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  （Ｐａｕｌ  Ｃａｌａｂｒｅｓｉ  ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ  Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ）に記載されている。毒素は、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、コレラ毒素、百日咳毒素、リシン、ゲロニン、アブリン、ジフテリア外毒素またはシュードモナス外毒素などのタンパク質であり得る。毒素残基は、コバルト−６０などの高エネルギー放出放射性核種であってもよい。
【０１７０】
本明細書にいう「低減する」または「阻害する」とは、レベル（例えば細胞の増殖のレベル）の全体的低下、好ましくは５％またはそれ以上、１０％またはそれ以上、２０％またはそれ以上、より好ましくは５０％またはそれ以上、最も好ましくは７５％またはそれ以上の全体的低下を引き起こす能力を意味する。「阻害する」という用語またはそれに類する表現には、完全な阻害または本質的に完全な阻害、すなわちゼロへの低減または本質的にゼロへの低減が含まれる。
【０１７１】
「増加する」または「強化する」などの用語は、好ましくは、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも１００％程度の増加または強化に関する。
【０１７２】
「免疫学的に等価」という用語は、免疫学的に等価なアミノ酸配列などの免疫学的に等価な分子が、例えば体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の誘導、誘導される免疫反応の強さおよび／または持続時間、もしくは、誘導される免疫反応の特異性などといった免疫学的効果のタイプに関して、同じまたは本質的に同じ免疫学的性質を示し、かつ／または同じまたは本質的に同じ免疫学的効果を発揮することを意味する。本発明において、「免疫学的に等価な」という用語は、好ましくは、免疫に使用されるペプチドもしくはペプチド変異体または抗体の免疫学的効果または性質に関して使用される。具体的な免疫学的性質の一つは、抗体に結合し、適切な場合には、免疫応答を（好ましくは抗体の生成を刺激することによって）生じさせる能力である。例えばアミノ酸配列は、対象の免疫系に曝露されたときに、前記アミノ酸配列が、参照アミノ酸配列（例えばＣＬＤＮ６のパーツを形成する参照アミノ酸配列）と反応する特異性を有する免疫反応（好ましくは抗体）を誘導するのであれば、参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。
【０１７３】
本発明において、「免疫エフェクター機能」という用語には、腫瘍の播種および転移の阻害を含む腫瘍成長の阻害および／または腫瘍発生の阻害をもたらす、免疫系の構成成分が媒介する任意の機能が含まれる。好ましくは、免疫エフェクター機能は腫瘍細胞の死滅をもたらす。好ましくは、本発明における免疫エフェクター機能は、抗体が媒介するエフェクター機能である。そのような機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、腫瘍関連抗原（例えばＣＬＤＮ６）を保有する細胞におけるアポトーシスの（例えば表面抗原への抗体の結合による）誘導、および／または腫瘍関連抗原を保有する細胞の増殖の阻害、好ましくはＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを含む。したがって、１またはそれ以上の免疫エフェクター機能を媒介する能力を有する抗体は、好ましくは、ＣＤＣ媒介性溶解、ＡＤＣＣ−媒介性溶解、アポトーシス、同型接着、および／または食作用を誘導することによって、好ましくはＣＤＣ媒介性溶解および／またはＡＤＣＣ媒介性溶解を誘導することによって、細胞の死滅を媒介することができる。抗体は、単に腫瘍細胞表面上の腫瘍関連抗原に結合することによっても、効果を発揮し得る。例えば抗体は、ただ単に腫瘍細胞表面上の腫瘍関連抗原に結合することによって、腫瘍関連抗原の機能をブロックし、またはアポトーシスを誘導し得る。
【０１７４】
本明細書で述べる抗体、組成物および方法は、腫瘍疾患、例えばＣＬＤＮ６を発現する腫瘍細胞の存在を特徴とする疾患を有する対象を処置するために、使用することができる。処置および／または防止することができる腫瘍疾患の例には、本明細書で述べるものを含めて、ＣＬＤＮ６を発現するすべてのがんおよび腫瘍実体が包含される。
【０１７５】
本明細書で述べる抗体、組成物および方法は、本明細書で述べる疾患を防止するための免疫またはワクチン接種にも使用し得る。
【０１７６】
本発明によれば、「疾患」という用語は、がん、特に本明細書で述べるがんの形態を含む、任意の病的状態を指す。
【０１７７】
「ＣＬＤＮ６を発現する細胞が関わる疾患」とは、本発明によれば、疾患組織または疾患器官の細胞におけるＣＬＤＮ６の発現が、好ましくは、健常組織または健常器官における状態と比較して増大していることを意味する。増大とは、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１００００％またはさらにそれ以上の増大を指す。１つの実施形態では、発現が疾患組織においてのみ見いだされ、健常組織における発現は抑止されている。本発明によれば、ＣＬＤＮ６を発現する細胞が関わる疾患またはＣＬＤＮ６を発現する細胞に関連する疾患には、がん疾患などの腫瘍疾患が含まれる。さらに、本発明によれば、がん疾患などの腫瘍疾患は、好ましくは、腫瘍細胞またはがん細胞がＣＬＤＮ６を発現するものである。
【０１７８】
本発明によれば、「腫瘍」または「腫瘍疾患」という用語は、細胞（新生物細胞または腫瘍細胞と呼ばれるもの）の異常な成長によって形成される腫脹または病巣を指す。「腫瘍細胞」とは、急速で制御されない細胞増殖によって成長し、新しい成長を開始させた刺激が途絶えた後も成長し続ける異常細胞を意味する。腫瘍は、構造的組織化および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常は、異質な組織塊（これは、良性、前悪性または悪性のいずれかであり得る）を形成する。
【０１７９】
良性腫瘍は、がんの悪性形質の３つすべてを欠いている腫瘍である。したがって、定義上、良性腫瘍は、無制限の攻撃的成長をすることがなく、周囲組織に侵入することがなく、非隣接組織に拡がる（転移する）ことがない。良性腫瘍のよくある例には、色素性母斑および子宮類線維腫が含まれる。
【０１８０】
「良性」という用語は軽度で非進行性の疾患を含意し、事実、多くの種類の良性腫瘍は健康にとって無害である。しかし、がんの侵入性を欠いているという理由で「良性腫瘍」と定義される新生物の中には、それでもなお、健康に負の影響を与え得るものもある。その例には、「マス効果」（血管などの重要臓器の圧迫）を生じる腫瘍、または一定のホルモンを過剰産生し得る内分泌組織の「機能的」腫瘍（例には甲状腺腺腫、副腎皮質腺腫、および下垂体腺腫が含まれる）が含まれる。
【０１８１】
良性腫瘍は、典型的には、悪性的に振る舞うそれらの能力を阻害する外表面で囲まれている。いくつかの例では、一定の「良性」腫瘍が、将来的に悪性がんを発生させることがあり、これは、腫瘍の新生物細胞の亜集団における、さらなる遺伝子変化に起因するものである。この現象の顕著な一例が管状腺腫であり、これは、結腸がんへの重要な前駆体である一般的なタイプの結腸ポリープである。管状腺腫中の細胞は、しばしばがんへと進行する大半の腫瘍と同様に、細胞の成熟および外観に、異形成と総称される一定の異常を示す。これらの細胞異常は、稀にしかがん化しないまたは決してがん化しない良性腫瘍には見られないが、孤立した塊を形成しない他の前がん組織異常（例えば子宮頸部の前がん病変）には見られる。権威ある専門家の中には、異形成腫瘍を「前悪性」と呼び、「良性」という用語は稀にしかがんを発生させないまたは決してがんを発生させない腫瘍のためにとっておくことを好む人々もいる。
【０１８２】
新生物は、新形成の結果としての異常な組織塊である。新形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａ：ギリシャ語で新しい成長の意）は、細胞の異常な増殖である。細胞の成長は、それを取り囲む正常組織の成長を上回り、それら正常組織と協調しない。刺激が途絶えた後でさえ、同じく過剰な成長が持続する。これは通常、しこりまたは腫瘍を引き起こす。新生物は良性、前悪性または悪性であり得る。
【０１８３】
「腫瘍の成長」または「腫瘍成長」は、本発明によれば、そのサイズを増加しようとする腫瘍の性向、および／または増殖しようとする腫瘍細胞の性向に関する。
【０１８４】
好ましくは「腫瘍疾患」は、本発明によれば、がん疾患、すなわち悪性疾患であり、腫瘍細胞はがん細胞である。好ましくは、「腫瘍疾患」はＣＬＤＮ６を発現する細胞を特徴とし、腫瘍細胞はＣＬＤＮ６を発現する。
【０１８５】
がん（医学用語：悪性新生物）は、一群の細胞が制御されない成長（正常範囲を超えて分裂）、侵入（隣接する組織への貫入とその破壊）、および時には転移（リンパまたは血液を介した身体の他の場所への拡大）を示す疾患の一種である。これら３つの悪性形質により、がんは、自己限定性で侵入も転移もしない良性腫瘍と区別される。大半のがんは腫瘍を形成するが、白血病のように腫瘍を形成しないものもある。
【０１８６】
ＣＬＤＮ６を発現する細胞は、好ましくは、腫瘍細胞またはがん細胞、好ましくは本明細書で述べる腫瘍およびがんの腫瘍細胞またはがん細胞である。好ましくは、そのような細胞は、胎盤細胞以外の細胞である。
【０１８７】
がんは、その腫瘍に似ている細胞のタイプによって、それゆえにその腫瘍の起源であると推定される組織によって分類される。これらは、それぞれ組織学および場所である。
【０１８８】
「がん」という用語は、本発明によれば、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、子宮内膜がん、腎がん、副腎がん、甲状腺がん、血液がん、皮膚がん、脳のがん、子宮頸がん、腸のがん、肝がん、結腸がん、胃がん、腸がん、頭頚部がん、胃腸がん、リンパ節がん、食道がん、直腸結腸がん、膵がん、耳鼻咽喉科（ＥＮＴ）がん、乳がん、前立腺がん、子宮のがん、卵巣がんおよび肺がん、ならびにそれらの転移を含む。その例は、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、子宮頸癌、または上述のがんタイプまたは腫瘍の転移である。がんという用語は、本発明によれば、がん転移も含む。
【０１８９】
好ましい腫瘍疾患またはがんは、本発明によれば、卵巣がん、特に卵巣腺癌および卵巣奇形癌、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む肺がん、特に扁平上皮肺癌および腺癌、胃がん、乳がん、肝がん、膵がん、皮膚がん、特に基底細胞癌および扁平上皮癌、悪性黒色腫、頭頚部がん、特に悪性多形性腺腫、肉腫、特に滑膜肉腫および癌肉腫、胆管がん、膀胱のがん、特に移行上皮癌および乳頭癌、腎がん、特に明細胞腎細胞癌および乳頭状腎細胞癌を含む腎細胞癌、結腸がん、回腸のがんを含む小腸がん、特に小腸腺癌および回腸の腺癌、精巣胎芽性癌、胎盤性絨毛癌、子宮頸がん、精巣がん、特に精巣精上皮腫、精巣奇形腫および胎児性精巣がん、および子宮がん、ならびにそれらの転移形態から成る群より選択される。
【０１９０】
特に好ましい腫瘍疾患またはがんは、本発明によれば、卵巣がん、肺がん、転移性卵巣がんおよび転移性肺がんから成る群より選択される。好ましくは卵巣がんは卵巣癌または卵巣腺癌である。好ましくは、肺がんは癌または腺癌であり、好ましくは細気管支がん、例えば細気管支癌または細気管支腺癌である。１つの実施形態において、腫瘍細胞は、そのようながんの細胞である。転移性卵巣がんには転移性卵巣癌および転移性卵巣腺癌が含まれ、転移性肺がんには転移性肺癌、転移性肺腺癌、転移性細気管支癌、および転移性細気管支腺癌が含まれる。
【０１９１】
主な肺がんのタイプは、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。非小細胞肺癌には３つの主たるサブタイプ、すなわち肺扁平上皮癌、腺癌、および大細胞肺癌がある。腺癌は肺がんの約１０％を占める。このがんは通常、肺の末梢に見られ、小細胞肺がんおよび扁平上皮肺がん（どちらも、より中央に位置する傾向がある）とは対照的である。
【０１９２】
皮膚がんは皮膚上の悪性成長である。最も一般的な皮膚がんは基底細胞がん、扁平上皮がん、および黒色腫である。悪性黒色腫は重篤なタイプの皮膚がんである。これは、メラノサイトと呼ばれる色素細胞の制御されない成長によるものである。
【０１９３】
本発明によれば、「癌」とは、上皮細胞由来の悪性腫瘍である。この群は、一般的な形態の乳がん、前立腺がん、肺がんおよび結腸がんを含む最も一般的ながんを表す。
【０１９４】
「細気管支癌」は、終末細気管支の上皮に由来すると考えられる肺の癌であって、この癌では、新生物組織が肺胞壁に沿って延び、肺胞内で小塊に成長する。細胞の一部および肺胞中の物質にムチンが認められる場合があり、これには剥離細胞も含まれている。
【０１９５】
「腺癌」は、腺組織に起源を有するがんである。この組織は、上皮組織として知られる、さらに大きな組織カテゴリの一部でもある。上皮組織には、皮膚、腺、ならびに身体の腔および器官を裏打ちする他の様々な組織が含まれる。上皮は、発生学的には、外胚葉，内胚葉および中胚葉に由来する。細胞が分泌性を有する限り、腺癌と分類されるために細胞が腺の一部である必要は、必ずしもない。この形態の癌はヒトを含む一部の高等哺乳動物において発生し得る。高分化型腺癌はそれらが由来する腺組織に似ている傾向にあるが、低分化型はそうではない場合がある。病理学者は、生検からの細胞を染色することによって、その腫瘍が腺癌であるか、他の何らかのタイプのがんであるかを決定することになる。腺癌は、体内での腺の遍在性ゆえに、身体の多くの組織に生じ得る。各腺は同じ物質を分泌するわけではないだろうが、細胞に外分泌機能がある限り、それは腺性であるとみなされ、その悪性形態は、それゆえに腺癌と呼ばれる。悪性腺癌は他の組織に侵入し、転移するのに十分な時間が与えられれば、しばしば転移する。卵巣腺癌は最も一般的なタイプの卵巣癌である。これには、漿液性および粘液性腺癌、明細胞腺癌ならびに類内膜腺癌が含まれる。
【０１９６】
「嚢胞腺癌」は、卵巣がんの一タイプで、表層上皮性・間質性腫瘍の悪性形態である。
【０１９７】
表層上皮性・間質性腫瘍は、卵巣表層上皮（変性した腹膜）または異所性の子宮内膜組織もしくはファロピウス管（卵管）組織に由来する考えられる卵巣新生物の一種である。この群の腫瘍は、全卵巣腫瘍の大半を占める。
【０１９８】
「絨毛癌」は、通常は胎盤の、悪性栄養膜高侵襲性がんである。これは、肺への早期血行性拡大を特徴とする。
【０１９９】
腎細胞癌は、腎細胞がんまたは腎細胞腺癌としても知られ、近位曲尿細管（血液をろ過して老廃物を除去する腎臓内の極めて小さな管）の内層を起源とする腎臓がんである。腎細胞癌は、成人では群を抜いて最も一般的なタイプの腎臓がんであり、すべての尿生殖器腫瘍の中で最も致死的である。腎細胞癌の明確に異なるサブタイプは、明細胞腎細胞癌および乳頭状腎細胞癌である。明細胞腎細胞癌は最も一般的な形態の腎細胞癌である。顕微鏡で見ると、明細胞腎細胞癌を構成する細胞は、ごく薄い色または透明に見える。乳頭状腎細胞癌は２番目に一般的なサブタイプである。これらのがんは、腫瘍の大半とはいわないまでも一部において、小指様の突起（乳頭と呼ばれる）を形成する。
【０２００】
肉腫は、結合組織細胞または間葉細胞に由来する悪性腫瘍である。これは上皮起源である癌とは対照的である。滑膜肉腫は稀な形態のがんであり、通常は、腕または脚の関節近くに発生する。これは軟部組織肉腫の一つである。
【０２０１】
胚細胞性腫瘍は、胚細胞に由来する新生物である。胚細胞性腫瘍はがん性腫瘍または非がん性腫瘍であることができる。胚細胞は通常、性腺（卵巣および精巣）の内部に見いだされる。性腺外（例えば頭部、口内、頚部、骨盤；胎児、乳児および幼児では、身体の正中線上、特に尾骨の先端に見いだされることが最も多い）を起源とする胚細胞性腫瘍は、胚発生時の間違いに起因する先天性異常であり得る。
【０２０２】
胚細胞性腫瘍を２種類に大別すると精上皮腫と非精上皮腫であり、非精上皮腫には、奇形癌、胎児性癌、卵黄嚢腫瘍、絨毛癌および分化型奇形腫が含まれる。非精上皮腫からの細胞株は大半が胎児性癌と等価である。すなわちそれらは、一部はレチノイン酸などの分化誘導因子に応答し得るものの、ほとんどすべてが、基礎条件下では分化しない幹細胞から構成される。
【０２０３】
奇形癌とは、奇形腫と胎児性癌もしくは絨毛癌またはその両方との混合物である胚細胞性腫瘍を指す。この種の混合胚細胞性腫瘍は、単に、胎児性癌または絨毛癌の要素を伴う奇形腫として知られることもあるし、奇形腫構成成分を無視して、単にその悪性構成成分、すなわち胎児性癌および／または絨毛癌だけに言及することで知られることもある。
【０２０４】
リンパ腫および白血病は、造血（血液形成）細胞に由来する悪性疾患である。
【０２０５】
芽細胞性腫瘍または芽細胞腫は、未熟組織または胚性組織に似た腫瘍（通常は悪性）である。これらの腫瘍の多くは、小児において最も一般的である。
【０２０６】
「転移」とは、そのもとの部位から身体の別のパーツへのがん細胞の拡がりを意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発性腫瘍からの悪性細胞の脱離、細胞外マトリックスへの侵入、体腔および脈管に入るための内皮基底膜の貫入、そして次に、血液による輸送後の、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新たな腫瘍、すなわち続発性腫瘍または転移性腫瘍の成長は、血管新生に依存する。腫瘍転移はしばしば原発性腫瘍の除去後にも起こるが、これは、腫瘍細胞または腫瘍構成成分が残存していて、転移能を発生させ得るからである。１つの実施形態において、「転移」という用語は、本発明によれば、「遠隔転移」に関し、これは原発性腫瘍および所属リンパ節系から離れている転移に関する。
【０２０７】
続発性腫瘍または転移性腫瘍の細胞は、もとの腫瘍における細胞に似ている。これは、例えば、卵巣がんが肝臓に転移した場合、続発性腫瘍は異常な肝細胞ではなく異常な卵巣細胞で構成されることを意味する。肝臓における腫瘍は、その場合、肝がんではなく転移性卵巣がんと呼ばれる。
【０２０８】
卵巣がんの場合、転移は、次の方法で起こり得る：直接的接触または拡張による方法。これは、卵巣の近くまたは周囲に位置する隣接組織または隣接器官、例えばファロピウス管、子宮、膀胱、直腸などに侵入することができる；腹腔への播種または脱落による方法。これは、卵巣がんが拡がる最も一般的な方法である。がん細胞は卵巣塊の表面を突き破り、肝臓、胃、結腸または横隔膜などの腹部内の他の構造体へと「落ちる」；卵巣塊を離脱してリンパ管に侵入し、次に身体の他の領域または肺もしくは肝臓などといった遠隔器官へと移動する方法；卵巣塊を離脱して血液系に侵入し、身体の他の領域または遠隔器官へと移動する方法。
【０２０９】
本発明によれば、転移性卵巣がんには、ファロピウス管におけるがん、腹部の器官におけるがん、例えば腸におけるがん、子宮におけるがん、膀胱におけるがん、直腸におけるがん、肝臓におけるがん、胃におけるがん、結腸におけるがん、横隔膜におけるがん、肺におけるがん、腹部または骨盤（腹膜）の内層におけるがん、および脳におけるがんが含まれる。同様に、転移性肺がんとは、肺から体内の遠隔部位および／またはいくつかの部位に拡がったがんを指し、これには、肝臓におけるがん、副腎におけるがん、骨におけるがん、および脳におけるがんが含まれる。
【０２１０】
再燃または再発は、ある人が、過去に罹患した状態に再び罹患した場合に起こる。例えば、ある患者が腫瘍疾患を患い、前記疾患の処置を受けて成功したことがあり、再び前記疾患を発症した場合、前記新たに発症した疾患は再燃または再発とみなされ得る。ただし、本発明によれば、腫瘍疾患の再燃または再発は、もとの腫瘍疾患の部位でも起こり得るものの、必ずしも、もとの腫瘍疾患の部位で起こるとは限らない。したがって例えば、ある患者が卵巣腫瘍を患い、処置を受けて成功したことがある場合、再燃または再発は卵巣腫瘍の発生、または卵巣とは異なる部位での腫瘍の発生であり得る。腫瘍の再燃または再発には、腫瘍がもとの腫瘍の部位に発生する状況だけでなく、もとの腫瘍の部位とは異なる部位に発生する状況も含まれる。好ましくは、患者が処置を受けたもとの腫瘍は原発性腫瘍であり、もとの腫瘍の部位とは異なる部位にある腫瘍は、続発性または転移性腫瘍である。
【０２１１】
「処置する」とは、対象における腫瘍を防止または排除するか、腫瘍のサイズまたは腫瘍の数を低減すること；対象における腫瘍の成長を停止または遅延させること；対象における新しい腫瘍の発生または腫瘍転移を阻害するか遅延させること；現在がんを有しているまたは過去にがんを有していた対象における症状および／または再発の頻度または重症度を減少させること；および／または対象の寿命を伸長、すなわち増加させることを目的として、本明細書で述べる化合物または組成物を対象に投与することを意味する。
【０２１２】
特に「疾患の処置」という用語には、疾患またはその症状を治療すること、その持続時間を短縮すること、改善させること、防止すること、その進行または悪化を減速させまたは阻害すること、あるいはその発症を防止しまたは遅延させることが含まれる。
【０２１３】
「危険性がある」とは、母集団と比較して、腫瘍疾患、特にがんが発生する可能性が通常より高いと同定された対象、すなわち患者を意味する。加えて、腫瘍疾患、特にがんを有していた対象または現在有している対象は、がんが発生する危険性が増加している対象であり、したがって、対象はがんを発生させ続ける可能性がある。腫瘍を現在有している対象または腫瘍を有していた対象は、腫瘍転移の危険性も増加している。
【０２１４】
「免疫療法」という用語は、特異的免疫反応が関わる処置に関する。本発明において、「防御する」、「防止する」、「予防的」、「防止的」または「防御的」などの用語は、個体における腫瘍の発生および／または増殖の防止もしくは処置またはその両方、特に対象が腫瘍を発生させる可能性を最小限に抑えること、または腫瘍の発生を遅延させることに関する。例えば、上述のように腫瘍の危険性がある人は、腫瘍を防止するための治療の候補であるだろう。
【０２１５】
免疫療法の予防的施行、例えば本発明の組成物の予防的投与は、好ましくは、腫瘍成長の発生から受容者を防御する。免疫療法の治療的施行、例えば本発明の組成物の治療的投与は、腫瘍の進行／成長の阻害につながり得る。これは、腫瘍の進行／成長の減速、特に、好ましくは腫瘍の排除につながる、腫瘍の進行の分断を含む。
【０２１６】
「インビボで」という用語は、対象内での状況に関する。
【０２１７】
「対象」、「個体」または「患者」という用語は可換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物に関する。例えば、本発明において哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマなどの家畜、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどの実験動物、ならびに動物園の動物などといった飼育下の動物である。本明細書で使用される「動物」という用語にはヒトも含まれる。「対象」という用語には、患者、すなわち疾患（好ましくはＣＬＤＮ６の発現に関連する疾患、好ましくはがんなどの腫瘍疾患）を有する動物（好ましくはヒト）も含めることができる。
【０２１８】
免疫用またはワクチン接種用の組成物の一部として、好ましくは本明細書で述べる１またはそれ以上の作用剤が、免疫応答を誘導するためのまたは免疫応答を増加させるための１またはそれ以上のアジュバントと一緒に投与される。「アジュバント」という用語は、免疫応答を延長または強化または加速する化合物に関する。本発明の組成物は、好ましくは、アジュバントを添加しなくても、その効果を発揮する。それでもなお、本願の組成物は任意の公知アジュバントを含有し得る。アジュバントは、油エマルション（例えばフロイントアジュバント）、ミネラル化合物（例えばミョウバン）、細菌産物（例えば百日咳菌毒素）、リポソーム、および免疫刺激複合体など、不均一な一群の化合物を含む。アジュバントの例は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）である。ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、ＤＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ；国際公開第９６／３３７３９号）、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、およびＱＳ−Ｌ１（Ｓｏら，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ７：１７８−１８６）などのサポニン、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、ビタミンＥ、モンタナイド、ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｋｒｉｅｇら，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−５４９）、ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールなどの生物学的に分解可能な油から調製された種々の油中水型エマルション。
【０２１９】
本発明によれば、「試料」は、本発明において有用である任意の試料、特に体液を含む組織試料および／または細胞試料などの生物学的試料であることができ、パンチ生検を含む組織生検や、血液、気管支吸引液、喀痰、尿、糞便または他の体液の採取などといった、従来の方法で得ることができる。本発明によれば、「試料」という用語には、加工された試料、例えば生物学的試料の画分または単離物、例えば核酸およびペプチド／タンパク質単離物なども含まれる。
【０２２０】
患者の免疫応答を刺激する他の物質も投与し得る。例えばワクチン接種では、サイトカインを、リンパ球に対するその調節特性ゆえに、使用することができる。そのようなサイトカインは、例えば、ワクチンの防御作用を増加させることが示されているインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）（Ｈａｌｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１４３２−１４３４）、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１８を含む。
【０２２１】
免疫応答を強化し、それゆえにワクチン接種において使用し得る化合物は、いくつも知られている。前記化合物は、タンパク質または核酸の形態で提供される共刺激分子、例えばＢ７−１およびＢ７−２（それぞれＣＤ８０およびＣＤ８６）を含む。
【０２２２】
本発明の治療活性化合物は、注射または注入による投与を含む任意の従来経路で投与され得る。投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または経皮的に行われ得る。好ましくは、抗体は、肺エアロゾルによって治療的に投与される。
【０２２３】
さらなる１つの実施形態では、本発明の抗体を、胎盤を横切るそれらの輸送が防止または低減されるように製剤化することができる。これは、当分野で公知の方法によって、例えば抗体のＰＥＧ化によって、またはＦ（ａｂ）２'フラグメントの使用によって、行うことができる。さらに、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ−Ｒｕｎｄｌｅｓ  Ｃ，Ｚｈｕｏ  Ｚ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｂ，Ｋｅｅｎａｎ  Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌｙｃｏｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５２：１７７−１９０およびＬａｎｄｏｒ  Ｍ．（１９９５）Ｍａｔｅｒｎａｌ−ｆｅｔａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７４：２７９−２８３も参照することができる。
【０２２４】
本発明の組成物は有効量で投与される。「有効量」とは、単独で、またはさらなる投薬と一緒に、所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患または特定の状態を処置する場合、所望の反応とは、好ましくは、その疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅くすること、特に疾患の進行を中断することまたは反転させることを含む。疾患または状態の処置における所望の反応は、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の防止でもあり得る。
【０２２５】
本発明の組成物の有効量は、処置すべき状態、疾患の重症度、年齢、生理的条件、サイズおよび体重を含む患者の個体パラメータ、処置の継続期間、併用療法（存在する場合）のタイプ、具体的投与経路などといった因子に依存するであろう。したがって、投与される本発明の組成物の用量は、種々のそのようなパラメータに依存し得る。患者における反応が初回用量では不十分な場合は、より高い用量（またはより局所的な異なる投与経路によって達成される、事実上、より高い用量）を使用し得る。
【０２２６】
本発明の医薬組成物は、好ましくは滅菌されており、所望の反応または所望の効果を生成させるために、有効量の治療活性物質を含有する。
【０２２７】
本発明の医薬組成物は、一般に、医薬適合量で、かつ医薬適合調製物に入れて、投与される。「医薬適合（性）」とは、医薬組成物の活性構成成分の作用と相互作用しない無毒性材料を指す。この種の調製物は、通常、塩類、緩衝物質、保存剤、担体、補助免疫強化物質、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチドなどのアジュバント、サイトカイン、ケモカイン、サポニン、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＲＮＡなど、そして適宜、他の治療活性化合物を含有し得る。医薬品に使用する場合、塩類は医薬適合性であるべきである。ただし、医薬適合性でない塩類を、医薬適合性塩を調製するために使用することはでき、医薬適合性でない塩類も本発明に含まれる。薬理学的および医薬的に適合するこの種の塩類は、限定するわけではないが、以下の酸から調製されたものを含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。医薬適合性塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としても調製され得る。
【０２２８】
本発明の医薬組成物は医薬適合性担体を含み得る。「担体」という用語は、適用を容易にするために活性構成成分が混合される天然または合成の有機または無機構成成分を指す。本発明によれば、「医薬適合性担体」という用語には、患者への投与に適した１またはそれ以上の適合性固形または液状充填剤、希釈剤または封入物質が含まれる。本発明の医薬組成物の構成成分は、通常は、所望の医薬効力を実質的に損なうような相互作用が起こらないようなものである。
【０２２９】
本発明の医薬組成物は、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、および塩中のリン酸などといった、適切な緩衝物質を含有し得る。
【０２３０】
医薬組成物は、適宜、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールなどの適切な保存剤も含有し得る。
【０２３１】
医薬組成物は通常は均一な剤形で提供され、自体公知の方法で調製され得る。本発明の医薬組成物は、例えばカプセル剤、錠剤、口中錠、溶液、懸濁液、シロップ剤、エリキシル剤の形態、またはエマルションの形態をとり得る。
【０２３２】
非経口投与に適した組成物は、通常、好ましくは受容者の血液と等張な、活性化合物の滅菌水性または非水性調製物を含む。適合性担体および適合性溶媒の例は、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、通常は滅菌された固定油が、溶液または懸濁液の媒質として使用される。
【０２３３】
本発明を図面と以下の実施例によって詳しく説明するが、これらは例示を目的として使用されているに過ぎず、限定を意図していない。これらの説明と実施例により、当業者は、本発明に同様に含まれるさらなる実施形態に到達することができる。
【実施例】
【０２３４】
ここで使用される技術および方法は、本明細書で説明されるか、または自体公知の方法で、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｅｌｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．などに記載されているように行われる。すべての方法は、キットおよび試薬の使用を含めて、具体的表示がある場合を除き、製造者の情報に従って実行される。
【０２３５】
実施例１：材料および方法
Ａ．ＣＬＤＮ６に対するマウス抗体の生成
ａ．完全長ＣＬＤＮ６およびＣＬＤＮ６フラグメントをコードする発現ベクターの生成
完全長ＣＬＤＮ６（配列番号：２）をコードする非天然コドン最適化ＤＮＡ配列（配列番号：１０）を、化学合成によって調製し（ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ，ドイツ）、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），米国）にクローニングすることにより、ベクターｐ３９５３を得た。停止コドンの挿入により、ベクターがコードするｍｙｃ−Ｈｉｓタグに融合することなく、ＣＬＤＮ６タンパク質を発現させることが可能になった。市販の抗ＣＬＤＮ６抗体（ＡＲＰ，０１−８８６５；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ３６５６）を用いるウエスタンブロット分析、フローサイトメトリ分析および免疫蛍光分析によって、ＣＬＤＮ６の発現を調べた。
【０２３６】
加えて、ＣＬＤＮ６の推定細胞外ドメイン２（ＥＣ２）フラグメント（配列番号：５）を、Ｎ末端Ｉｇκリーダー由来のシグナルペプチドおよびそれに続く正しいシグナルペプチダーゼ切断部位（配列番号：１２）を確保するための４つの追加アミノ酸との融合物としてコードしているコドン最適化ＤＮＡ配列（配列番号：１１）を調製し、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓベクターにクローニングすることにより、ベクターｐ３９７４を得た。免疫に先だって、一過性にトランスフェクトしパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定したＣＨＯ−Ｋ１細胞での免疫蛍光顕微鏡法により、市販の抗ｍｙｃ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ＭＡＢ２２７６）を使って、ＥＣ２フラグメントの発現を確認した。
【０２３７】
ｂ．ＣＬＤＮ６を安定に発現する細胞株の生成
ベクターｐ３９５３を使用し、標準的技術によって、ＣＬＤＮ６を安定に発現するＨＥＫ２９３およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１細胞株を生成させた。
【０２３８】
ｃ．免疫
ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２：０日目、１６日目および３６日目に、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、２５μｇのｐ３９７４プラスミドＤＮＡで、４μｌのＰＥＩ−マンノース（ＰＥＩ−Ｍａｎ；ＰｏｌｙＰｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎのｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（商標）−Ｍａｎ）（５％グルコースを含むＨ２Ｏ中の１５０ｍＭ  ＰＥＩ−Ｍａｎ）と共に、腹腔内注射によって免疫した。４８日目および６２日目に、ＣＬＤＮ６を安定に発現するようにｐ３９５３ベクターでトランスフェクトされた２×１０７個のＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１骨髄腫細胞で、腹腔内注射により、マウスを免疫した。６２日目に投与された細胞は、注射前に、３０００ｒａｄを照射したものであった。
【０２３９】
ｍｕＭＡＢ  ２７Ａ：ＣＬＤＮ６を安定に発現するようにｐ３９５３ベクターでトランスフェクトされた２×１０７個のＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１骨髄腫細胞で、腹腔内注射により、０日目および１３日目に、Ｂａｌｂ／ｃ  マウスを免疫した。腫瘍を発生させたマウスを、ｐ３９５３ベクターで安定にトランスフェクトされた２×１０７個のＨＥＫ２９３細胞で、腹腔内注射により、２１日目に、追加免疫した。３日後に、マウスを犠死させ、脾細胞を調製した。５×１０７個の脾細胞を、別のＢａｌｂ／ｃマウスに、静脈内注射によって移植した。３５日目、４９日目、６７日目および１０４日目に、移植マウスを、ｐ３９５３ベクターで安定にトランスフェクトされた２×１０７個のＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１骨髄腫細胞で、ＨＰＬＣ精製されたホスホロチオエート修飾ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＰＴＯ−ＣｐＧ−ＯＤＮ）（５０μｇ；５'−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ；Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  オペロン  バイオテクノロジー（Ｏｐｅｒｏｎ），ドイツ）と共に、腹腔内注射によって免疫した。投与前に、細胞をマイトマイシンＣ（５μｇ／ｍｌ，シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），Ｍ４２８７）で処理した。
【０２４０】
ｍｕＭＡＢ  ３６Ａ：０日目、１６日目および３６日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２５μｇのｐ３９７４プラスミドＤＮＡで、４μｌのＰＥＩ−マンノース（ＰＥＩ−Ｍａｎ；ＰｏｌｙＰｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎのｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（商標）−Ｍａｎ）（５％グルコースを含むＨ２Ｏ中の１５０ｍＭ  ＰＥＩ−Ｍａｎ）と共に、腹腔内注射によって免疫した。５５日目、６９日目および８５日目に、ＣＬＤＮ６を安定に発現するようにｐ３９５３ベクターでトランスフェクトされた２×１０７個のＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１骨髄腫細胞で、腹腔内注射により、マウスを免疫した。８５日目には、細胞を、ＨＰＬＣ精製されたＰＴＯ−ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＰＢＳ中５０μｇ；５'−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ；Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  オペロン  バイオテクノロジー（Ｏｐｅｒｏｎ），ドイツ）と一緒に投与した。
【０２４１】
マウスの血清におけるＣＬＤＮ６に対する抗体の存在は、ＣＬＤＮ６とＧＦＰをコードする核酸で同時トランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を使って、免疫蛍光顕微鏡法によって監視した。この目的のために、トランスフェクションの２４時間後に、ＰＦＡ固定細胞または非固定細胞を、免疫マウスからの血清の１：１００希釈液と共に、室温（ＲＴ）で４５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、Ａｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベートし、蛍光顕微鏡法に付した。
【０２４２】
モノクローナル抗体を生成させるために、検出可能な抗ＣＬＤＮ６免疫応答を伴うマウスを、脾摘出の４日前に、ｐ３９５３ベクターで安定にトランスフェクトされた２×１０７個のＨＥＫ２９３細胞の腹腔内注射によって追加免疫した。
【０２４３】
ｄ．ＣＬＤＮ６に対するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成
免疫マウスから単離された６×１０７個の脾細胞を、マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ１５８０）の細胞３×１０７個と、ＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ，ＣＲＬ１０７８３６４１００１）を使って融合した。細胞を平底マイクロタイタープレートに１ウェルあたり約５×１０４細胞の密度で播種し、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１％ハイブリドーマ融合およびクローニング用添加剤（ＨＦＣＳ，Ｒｏｃｈｅ，ＣＲＬ１１３６３７３５）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４．５％グルコース、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール、１×ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１×ＨＡＴサプリメント（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ＣＲＬ２１０６０）を含有するＲＰＭＩ選択培地中で約２週間培養した。１０〜１４日後に、抗ＣＬＤＮ６モノクローナル抗体について、個々のウェルをフローサイトメトリによってスクリーニングした。抗体分泌ハイブリドーマを限界希釈法によってサブクローニングし、抗ＣＬＤＮ６モノクローナル抗体について再び試験した。安定なサブクローンを培養することで、特性付けのために、組織培養培地中に少量の抗体を生成させた。親細胞の反応性を保持しているクローン（フローサイトメトリによって試験した）を各ハイブリドーマから少なくとも１つは選択した。各クローンにつき９バイアル細胞バンクを作成し、液体窒素中で保存した。
【０２４４】
Ｂ．フローサイトメトリ
ＣＬＤＮ６および他のクローディンへのモノクローナル抗体の結合を調べるために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、対応するクローディンコードプラスミドで一過性にトランスフェクトし、発現をフローサイトメトリで分析した。トランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞を識別するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をレポーターとしての蛍光マーカーで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで収穫し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に、２×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を、表示した濃度の適当な抗体と共に、４℃で３０分間インキュベートした。市販のマウス抗クローディン抗体である抗ＣＬＤＮ６（Ｒ＆Ｄ，ＣＲＬ  ＭＡＢ３６５６）、抗ＣＬＤＮ３（Ｒ＆Ｄ，ＭＡＢ４６２０）および抗ＣＬＤＮ４（Ｒ＆Ｄ，ＭＡＢ４２１９）を陽性対照とし、一方、マウスＩｇＧ２ｂ（Ｓｉｇｍａ，ＣＲＬ  Ｍ８８９４）をアイソタイプ対照とした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート抗マウスＩｇＧ１＋２ａ＋２ｂ＋３ａ特異的二次抗体（Ｄｉａｎｏｖａ，ＣＲＬ１１５−１３５−１６４）と共に、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙを使ったフローサイトメトリで結合を分析した。垂直軸上の抗体結合に対して、蛍光マーカーの発現を水平軸上にプロットした。
【０２４５】
ＣＬＤＮ６を内因性に発現する細胞株へのモノクローナル抗体の結合も、同様の方法で分析した。
【０２４６】
Ｃ．免疫ブロット分析
ＮＥＣ８細胞を、ＣＬＤＮ６、３、４および９発現について、免疫ブロット分析によって分析した。陽性対照としてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＣＬＤＮ６、３、４、９で一過性にトランスフェクトするか、陰性対照としてモックプラスミドでトランスフェクトした。細胞をレムリ緩衝液中に収穫し、溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。ゲルをブロットし、抗ＣＬＤＮ３（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），３４−１７００）、抗ＣＬＤＮ４（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），３２−９４００）、抗ＣＤＬＮ６（ＡＲＰ，０１−８８６５）または抗ＣＬＤＮ９（サンタクルーズ  バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ），ｓｃ−１７６７２）抗体で、それぞれ染色した。ペルオキシダーゼ標識二次抗体と共にインキュベートした後、ブロットをＥＣＬ試薬で発色させ、ＬＡＳ−３０００イメージャー（富士フイルム）を使って可視化した。
【０２４７】
Ｄ．ＣＤＣ分析
抗ＣＬＤＮ６抗体と共にインキュベートした標的細胞へのヒト補体の添加後に、非溶解細胞における細胞内ＡＴＰの含有量を測定することによって、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を決定した。超高感度な分析方法として、ルシフェラーゼの生物発光反応をＡＴＰの測定に使用した。
【０２４８】
ＣＬＤＮ６で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＬＤＮ６）を、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで収穫し、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地（ロンザ（Ｌｏｎｚａ），ＢＥ０４−４１８Ｑ）で２回洗浄し、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地に１×１０７細胞／ｍｌの濃度で懸濁した。２５０μｌの細胞懸濁液を０．４ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移し、ルシフェラーゼをコードするインビトロ転写ＲＮＡ（ルシフェラーゼＩＶＴ  ＲＮＡ）７μｇと混合した。細胞を、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ  Ｒａｄ））を使って、２００Ｖおよび３００μＦでのエレクトロポレーションに付した。エレクトロポレーション後に、細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含有する予温したＧｌｕｔａＭａｘ−Ｉ入りＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），３１３３１−０９３）２．４ｍｌに懸濁した。１ウェルにつき５０μｌの細胞懸濁液を白色９６ウェルＰＰプレートに播種し、３７℃および７．５％ＣＯ２でインキュベートした。エレクトロポレーションの２４時間後に、６０％ＲＰＭＩ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有するもの）および４０％ヒト血清（６人の健常ドナーから得られた血清プール）中のモノクローナルマウス抗ＣＬＤＮ６抗体５０μｌを、表示した濃度で細胞に加えた。全溶解対照にはＰＢＳ中の８％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を１ウェルにつき１０μｌずつ加え、一方、最大生細胞対照および実試料にはＰＢＳを１ウェルにつき１０μｌずつ加えた。３７℃および７．５％ＣＯ２における８０分のインキュベーション後に、１ウェルにつき５０μｌのルシフェリン混合物（ｄｄＨ２Ｏ中の３．８４ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−ルシフェリン、０．６４Ｕ／ｍｌ  ＡＴＰａｓｅおよび１６０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）を加えた。プレートを暗所、室温で４５分間インキュベートした。ルミノメーター（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００，ＴＥＣＡＮ）を使って生物発光を測定した。結果は積分されたデジタルの相対発光量（ＲＬＵ）として与えられる。
【０２４９】
特異的溶解は次のように算定される：
【数１】
2013533247.tif 000002
【０２５０】
Ｅ．ＡＤＣＣ分析
キメラ化モノクローナル抗ＣＬＤＮ６抗体を、内因性にＣＬＤＮ６を発現するＮＥＣ８細胞およびＣＬＤＮ６ノックダウンを有するＮＥＣ８細胞（ＮＥＣ８  ＬＶＴＳ２  ５４）に対する抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するその能力について、ルシフェラーゼに基づくアッセイ系で分析した。
【０２５１】
ＮＥＣ８またはＮＥＣ８  ＬＶＴＳ２  ５４標的細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで収穫し、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地で２回洗浄し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ  Ｒａｄ））を使って、２．５×１０６細胞に７μｇのルシフェラーゼＩＶＴ  ＲＮＡをエレクトロポレーションした（２００Ｖ、４００μＦ）。エレクトロポレーション後に、細胞を、２．４ｍｌの、１０％ＦＣＳを含有する予温したＲＰＭＩに懸濁した。１ウェルにつき５０μｌの細胞懸濁液（５×１０４細胞）を白色９６ウェルＰＰプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。Ｆｉｃｏｌｌ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１４４０−０３）を使って、健常ドナーの血液から、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を濃縮した。５％熱不活化ヒト血清を補足したＸ−Ｖｉｖｏ１５（ロンザ（Ｌｏｎｚａ），ＢＥ０４−４１８Ｑ）にＰＢＭＣを懸濁し、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。２〜４時間のインキュベーション後に、上清にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が濃縮された。ＰＢＳ中に表示の濃度で希釈した抗体２５μｌをＮＥＣ８細胞に加えた。濃縮されたＮＫ細胞を２０：１（エフェクター細胞対標的細胞）の比で加え、試料を３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。「ＣＤＣ」で説明したようにルシフェラーゼを使って細胞内ＡＴＰの含有量を測定することにより、細胞の溶解を決定した。
【０２５２】
Ｆ．早期処置アッセイ
早期抗体処置のために、ＰＢＳ２００μｌ中のＨＥＫ２９３−ＣＬＤＮ６細胞（ＣＬＤＮ６を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞）５×１０６個を、無胸腺ヌードＦｏｘｎ１ｎｕマウスの側腹部に皮下接種した。ＨＥＫ２９３モック細胞を陰性対照として使用した。各実験群は８匹の６〜８週齢雌マウスから成った。（それぞれＨＥＫ２９３−ＣＬＤＮ６細胞またはＨＥＫ２９３モック細胞が移植されたマウスの場合、食塩水対照群は、１０匹のマウスからなった）。接種の３日後に、週に２回、静脈内注射と腹腔内注射を交互に行うことにより、２００μｇの精製マウスモノクローナル抗体ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２、２７Ａおよび３６Ａを、４６日間適用した。ＰＢＳで処置した実験群を陰性対照とした。腫瘍体積（ＴＶ＝（長さ×幅２）／２）を隔週ごとに監視した。ＴＶはｍｍ３の単位で表され、経時的な腫瘍成長曲線の構築を可能にする。腫瘍が１５００ｍｍ３を上回る体積に到達したら、マウスを屠殺した。
【０２５３】
実施例２：本発明に従って得られた抗体のクローディンへの結合
ヒトＣＬＤＮ６、３、４および９へのマウスモノクローナル抗体ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２、２７Ａおよび３６Ａの結合を、対応するヒトクローディンを一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使って、フローサイトメトリによって分析した。非トランスフェクト（Ｑ３集団）細胞とトランスフェクト（Ｑ４集団）細胞とを識別するために、ＨＥＫ２９３Ｔを蛍光マーカーで同時トランスフェクトした。使用した抗体濃度は、ＣＬＤＮ６への結合を飽和させる濃度（２５μｇ／ｍｌ）であった。ヒトＣＬＤＮ６、３、４および９の発現を、ヒトクローディン６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ３６５６）、ヒトクローディン３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ４６２０）およびヒトクローディン４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ  ４２１９）に対する市販のモノクローナル抗体で確認した。
【０２５４】
ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２、２７Ａおよび３６Ａ抗体は、ＣＬＤＮ６を発現する細胞への強い結合を示すと同時に、ＣＬＤＮ３またはＣＬＤＮ４を発現する細胞には結合しなかった；図１参照。
【０２５５】
ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２、２７Ａおよび３６Ａ抗体を、異なる濃度（０．０１、０．１、１、１０、１００、１０００、１００００および２５０００ｎｇ／ｍｌ）で、ヒトＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４またはＣＬＤＮ９を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞と共にインキュベートした。結合をフローサイトメトリによって検出した：図２、３および４参照。ｙ軸は、抗体によって結合された細胞（Ｑ２集団）のパーセンテージを表し、ｘ軸は、使用した抗体の濃度を表す。
【０２５６】
ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２は、ヒトＣＬＤＮ６への強い結合と、ヒトＣＬＤＮ９への弱い結合を示した。ｍｕＭＡＢ  ２７Ａは、ヒトＣＬＤＮ６への強い結合と、ヒトＣＬＤＮ９への極めて弱い結合を示した。ｍｕＭＡＢ  ３６Ａは、ヒトＣＬＤＮ６への強い結合を示し、ヒトＣＬＤＮ９への結合は事実上示さなかった。どの抗体もヒトＣＬＤＮ３または４とは相互作用しなかった。
【０２５７】
相対的親和性を決定するために、ＨＥＫ２９３細胞の表面上に安定に発現されるヒトＣＬＤＮ６への抗ＣＬＤＮ６抗体の結合を、フローサイトメトリで分析した。飽和結合実験において、抗体の濃度をＦＡＣＳシグナル（蛍光強度の中央値）に対してプロットした；図５参照。ＥＣ５０（平衡時に結合部位の半分に結合する抗体濃度）を非線形回帰によって算定した。結果は、抗体が特徴的な結合パターンを有することを示している。ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２および２７Ａが低いＥＣ５０値（ＥＣ５０  ３５０〜４５０ｎｇ／ｍｌ）を示し、結合の飽和が低濃度で達成されたのに対し、ｍｕＭＡＢ  ３６Ａは、最も高い濃度でさえ、結合の飽和を示さなかった。
【０２５８】
実施例３：本発明に従って得られる抗体のエフェクター機能
ルシフェラーゼ依存的アッセイを使って非溶解細胞内の内因性ＡＴＰを検出することにより、抗ＣＬＤＮ６抗体のＣＤＣ活性を分析した。この目的のために、ヒトＣＬＤＮ６を安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、様々な濃度のｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２、２７Ａもしくは３６Ａまたは内部対照としての抗ＣＬＤＮ６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ３６５６）で処理した。
【０２５９】
ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２は用量依存的にＣＤＣ活性を示した；図６参照。ｍｕＭＡＢ  ２７Ａが用量依存的ＣＤＣ活性を示したのに対し、ｍｕＭＡＢ  ３６ＡはインビトロでＣＤＣを誘導することができなかった；図７参照。
【０２６０】
内因性にＣＬＤＮ６を発現するＮＥＣ８細胞およびＮＥＣ８  ＬＶＴＳ２  ５４（ＣＬＤＮ６ノックダウン）細胞に対する抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するキメラ抗ＣＬＤＮ６抗体ｃｈｉｍＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２の能力を決定した；図８参照。キメラ抗ＣＬＤＮ６抗体ｃｈｉｍＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２および陽性対照ハーセプチンは、二人の異なるドナーのエフェクター細胞によるＮＥＣ８細胞に対するＡＤＣＣを、用量依存的に誘導した。ＮＥＣ８  ＬＶＴＳ２  ５４細胞（ＣＬＤＮ６ノックダウン）に対するＡＤＣＣを誘導する効率は、ｃｈｉｍＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２では、ＮＥＣ８親細胞と比較して著しく低下したことから、ｃｈｉｍＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２の標的特異性が証明された。
【０２６１】
実施例４：本発明に従って得られる抗体の治療効力
ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２の治療効果を、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３−ＣＬＤＮ６異種移植片およびＨＥＫ２９３モック異種移植片を無胸腺ヌードＦｏｘｎ１ｎｕマウスに移植する早期処置異種移植モデルにおいて調べた。
【０２６２】
ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２は、ヒトＣＬＤＮ６を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞が移植されたマウスにおいて、特異的かつ強力な腫瘍成長阻害を示した；図９参照。ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２は、モック対照細胞が移植されたマウスにおける腫瘍成長に対して効果がなかった。別の食塩水対照マウス群には、ビヒクルとしてのＰＢＳを、適用した抗体と等価な注射体積で与えた。
【０２６３】
加えて、クラスカル・ウォリス検定により、ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２による処置後、２８日目（およびそれ以降）は、腫瘍体積が有意に減少することが示された；図１０参照。さらに、モノクローナルマウス抗ＣＬＤＮ６抗体ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２で処置されたマウスは、ＰＢＳ対照群と比較して生存期間の延長を示した。対照群としてＨＥＫ２９３モック細胞が移植されたマウスでは、抗体依存的効果は観察されなかった；図１１参照。
【０２６４】
同様に、早期処置異種移植モデルにおけるｍｕＭＡＢ  ２７ＡおよびｍｕＭＡＢ  ３６Ａの試験は、ヒトＣＬＤＮ６を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞が移植されたマウスにおける特異的かつ強力な腫瘍成長阻害を示した：図１２および１３参照。さらに、ｍｕＭＡＢ  ２７Ａおよび３６Ａは、移植マウスの生存期間を延長するのに有効であった；図１４参照。
【０２６５】
実施例５：胚細胞性腫瘍におけるがん標的としてのＣＬＤＮ６
ＮＥＣ８細胞におけるＣＬＤＮ３、４、６および９発現を免疫ブロット分析によって調べた。精巣胚細胞性腫瘍細胞株ＮＥＣ８は、ＣＬＤＮ６の発現だけを示し（Ａ）、ＣＬＤＮ３、４または９の発現は、それぞれ示さなかった（Ｂ）；図１５参照。使用した抗ＣＬＤＮ３、４および９抗体の特異性は、対応するヒトクローディンをコードする発現ベクターで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使って、ウエスタンブロットによって調べた。
【０２６６】
ＮＥＣ８細胞におけるＣＬＤＮ６の表面発現をフローサイトメトリを使って分析した。市販の抗ＣＬＤＮ６抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ３６５６）により、ＮＥＣ８細胞上のＣＬＤＮ６の発現が検出された；図１６参照。マウスＩｇＧ２ｂ（Ｓｉｇｍａ，ＣＲＬ  Ｍ８８９４）をアイソタイプ対照として使用した。
【０２６７】
腫瘍細胞株ＮＥＣ８が移植されたマウスを用いる早期処置異種移植モデルにおけるｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２の治療効果を調べた。食塩水対照群と比較して、ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２は、ヒトＣＬＤＮ６を内因性に発現するＮＥＣ８細胞が移植されたマウスにおける特異的かつ強力な腫瘍成長阻害を示した；図１７参照。クラスカル・ウォリス検定は、ｍｕＭＡＢ  ５Ｆ２Ｄ２による処置後、２１日目および４２日目に、腫瘍体積が減少したことを示している；図１８参照。
【図１】
2013533247.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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