(57)【要約】  本発明は、間葉幹細胞培養用の培養培地に関し、より詳しくは基本培地、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸、牛胎児血清、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、non essential amino acid）、インスリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（N-acetyl-L-cysteine）、塩化カルシウム、及びヒドロコルチゾンを含有する間葉幹細胞培養用の培地組成物、及びこれを利用した間葉幹細胞の培養方法に関するものである。本発明によると、幹細胞治療に必要な間葉幹細胞の細胞数を短時間に獲得することができ、間葉幹細胞の分化能を向上させ、幹細胞を利用した細胞治療に有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基本培地、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸、牛胎児血清、塩基性線維芽細胞成長因子、非必須アミノ酸、インスリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、塩化カルシウム及びヒドロコルチゾンを含有する間葉幹細胞培養用の培地組成物。
【請求項２】
前記基本培地は、ＤＭＥＭ−ＨＧ、Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ、及びこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の間葉幹細胞培養用の培地組成物。
【請求項３】
０．０５〜１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、２〜２０％の牛胎児血清、１〜１００ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子、１〜１００μＬ／ｍＬの非必須アミノ酸、０．１〜１００μｇ／ｍＬのインスリン、０．２〜２０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、０．０１〜１ｍＭの塩化カルシウム、及び５ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンを含有することを特徴とする請求項１に記載の間葉幹細胞培養用の培地組成物。
【請求項４】
前記非必須アミノ酸は、グリシン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン及びセリンからなることを特徴とする請求項１または請求項３に記載の間葉幹細胞培養用の培地組成物。
【請求項５】
前記非必須アミノ酸は、７５０ｍｇ／Ｌのグリシン、８９０ｍｇ／Ｌのアラニン、１，３２０ｍｇ／Ｌのアスパラギン、１，３３０ｍｇ／Ｌのアスパラギン酸、１，４７０ｍｇ／Ｌのグルタミン酸、１，１５０ｍｇ／Ｌのプロリン、及び１，０５０ｍｇ／Ｌのセリンからなることを特徴とする請求項４に記載の間葉幹細胞培養用の培地組成物。
【請求項６】
前記間葉幹細胞は、羊膜由来の間葉幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の間葉幹細胞培養用の培地組成物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の培地組成物において羊膜由来幹細胞を培養することを特徴とする間葉幹細胞の培養方法。
【請求項８】
前記間葉幹細胞は、羊膜由来の間葉幹細胞であることを特徴とする請求項５に記載の間葉幹細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉幹細胞培養用の培養培地に関し、より詳しくは基本培地、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸、牛胎児血清、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、non essential amino acid）、インスリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（N-acetyl-L-cysteine）、塩化カルシウム及びヒドロコルチゾンを含有する間葉幹細胞培養用の培地組成物及びこれを利用した間葉幹細胞の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞（stem cell）とは、自己複製能力を有すると共に、二つ以上の細胞に分化する能力を有する細胞をいい、万能幹細胞（totipotent stem cell）、分化万能性幹細胞（pluripotent stem cell）、多能性幹細胞（multipotent stem cell）に分類できる。
【０００３】
成体幹細胞は、人体の各臓器に既に存在する細胞を採取、幹細胞を発生させたもので、特定組織だけに分化する特徴がある。しかし、最近では成体幹細胞を利用して、肝細胞等各種の多様な組織に分化させる実験が成功しており注目される。
【０００４】
多能性幹細胞は、成体骨髄から最初に分離され（Y. Jiang et al., Nature, 418:41, 2002）、その後、他の種々の成体組織においても確認された（C.M. Verfaillie, Trends Cell Biol., 12:502, 2002）。換言すると、骨髄は最も広く知られた幹細胞のソースであり、多能性幹細胞は、皮膚、血管、筋肉及び脳においても確認された（J.G. Toma et al., Nat. Cell Biol., 3:778, 2001; M. Sampaolesi et al., Science, 301:487, 2003; Y. Jiang et al., Exp. Hematol., 30:896, 2002）。しかし、骨髄のような成体組織内に幹細胞は非常に稀に存在して、このような細胞は、分化誘導することなく培養し難く、特異的にスクリーニングされた培地がなければ、その細胞を培養することが困難である。即ち、幹細胞は、分離して体外で保存するのが非常に困難である。一方、胎児組織（fetal tissue）で間葉幹細胞の分離を研究した結果、豊富な間葉幹細胞があることが明らかになったが、細胞治療剤を目的に胎児組織の使用は倫理的に制限があるため、細胞治療剤として用いるには限界があった。胎児間葉幹細胞（ｆｅｔａｌ  ＭＳＣ）に対するソースとして臍帯血（Umbilical cord blood、ＵＣＢ）からも間葉幹細胞を分離されたが、その数が非常に少なく、増殖がうまくいかない問題点があった。
【０００５】
最近、羊膜（amnion、amniotic membrane、またはamniotic lining membrane）、即ち胎盤（placenta）、及び発生中の哺乳類の胚芽を囲む最内側の薄膜構造に間葉幹細胞が存在することが知られており、これを分離および培養する技術が開発されている（ＷＯ２００６/０１９３５７、韓国登録特許第０７９５７０８号、韓国登録特許第０８１８２１４号）。
【０００６】
しかし、従来の羊膜由来幹細胞の培養方法は、幹細胞の増殖に長時間掛かるという短所があった。
そこで、本発明者らは、分化能を維持しながら、羊膜由来幹細胞の増殖率を向上させることができる方法を開発しようと鋭意努力した結果、ＤＭＥＭ−Ｐ及びＫＳＦＭ−Ｐを混合した培地において羊膜由来幹細胞を培養する場合、分化能を維持しながら、細胞増殖能を向上させることができることを確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、分化能を維持しながらも高い細胞増殖率を持つ間葉幹細胞培養用培養培地を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記培養培地を利用して、間葉幹細胞を培養する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、基本培地、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸、牛胎児血清、塩基性線維芽細胞成長因子、非必須アミノ酸、インスリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、塩化カルシウム及びヒドロコルチゾンを含有する間葉幹細胞培養用の培地組成物を提供する。
さらに本発明は、前記培地組成物において羊膜由来幹細胞を培養することを特徴とする間葉幹細胞の培養方法を提供する。
【０００９】
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＤＭＥＭ−Ｐ、ＫＳＦＭ−Ｐ、またはＤＭＥＭ−ＰとＫＳＦＭ−Ｐ混合培地で３日目培養された羊膜由来間葉幹細胞の写真である。
【図２】ＤＭＥＭ−Ｐ、ＫＳＦＭ−Ｐ、またはＤＭＥＭ−ＰとＫＳＦＭ−Ｐ混合培地で４日目培養された羊膜由来間葉幹細胞の写真である。
【図３】ＣＤ３１に対する各グループ毎の柔細胞分析結果を示した。
【図４】ＣＤ３４に対する各グループ毎の柔細胞分析結果を示した。
【図５】ＣＤ４５に対する各グループ毎の柔細胞分析結果を示した。
【図６】ＣＤ２９に対する各グループ毎の柔細胞分析結果を示した。
【図７】ＣＤ４４に対する各グループ毎の柔細胞分析結果を示した。
【図８】ＣＤ７３に対する各グループ毎の柔細胞分析結果を示した。
【図９】ＤＭＥＭ−ＰとＫＳＦＭ−Ｐ混合培地（グループ２）で培養された羊膜由来間葉幹細胞のＰ１継代細胞を示した写真である。
【図１０】ＤＭＥＭ−ＰとＫＳＦＭ−Ｐ混合培地（グループ２）で培養された羊膜由来間葉幹細胞のＰ２継代細胞を示した写真である。
【図１１】アリザリンレッドＳ（Alizalin red S）染色法を利用して、ＤＭＥＭ−Ｐ、または混合培地（グループ２）で培養された羊膜由来間葉幹細胞が骨形成細胞に分化されることを各条件毎に確認した結果を示した。
【図１２】ＤＭＥＭ−Ｐ、または混合培地（グループ２）で培養した後、各条件毎に骨細胞に分化した羊膜由来間葉幹細胞のアリザリンレッドＳ濃度を定量化して対照群（骨分化を誘導しなかった群）と比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一観点において、本発明は、基本培地、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸、牛胎児血清、塩基性線維芽細胞成長因子、非必須アミノ酸、インスリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、塩化カルシウム及びヒドロコルチゾンを含有する間葉幹細胞培養用の培地組成物に関する。
【００１２】
本発明において、前記基本培地は、ＤＭＥＭ−ＨＧ、Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ、及びこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする。
【００１３】
本発明において、前記各培地成分の含有量は、０．０５〜１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、２〜２０％の牛胎児血清、１〜１００ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子、１〜１００μＬ／ｍＬの非必須アミノ酸、０．１〜１００μｇ／ｍＬのインスリン、０．２〜２０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、０．０１〜１ｍＭの塩化カルシウム、及び５ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンであることを特徴とする。
【００１４】
本発明において、前記非必須アミノ酸は、グリシン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン及びセリンからなることを特徴とし、前記非必須アミノ酸は、７５０ｍｇ／Ｌのグリシン、８９０ｍｇ／Ｌのアラニン、１，３２０ｍｇ／Ｌのアスパラギン、１，３３０ｍｇ／Ｌのアスパラギン酸、１，４７０ｍｇ／Ｌのグルタミン酸、１，１５０ｍｇ／Ｌのプロリン、及び１，０５０ｍｇ／Ｌのセリンからなることを特徴とする。
【００１５】
本発明において、前記間葉幹細胞は、羊膜由来の間葉幹細胞であることを特徴とする。
【００１６】
他の観点において、本発明は、前記培地組成物において羊膜由来幹細胞を培養することを特徴とする間葉幹細胞の培養方法に関する。
【００１７】
本発明において、前記間葉幹細胞は、羊膜由来の間葉幹細胞であることを特徴とする。
【００１８】
本発明の一様態において用いられる羊膜由来間葉幹細胞は、胎盤から分離した羊膜組織全体から抽出される種々の細胞を用いるのではなく、羊膜間葉幹細胞だけを抽出して分離して用いた。
【００１９】
本発明の一様態において、羊膜由来間葉幹細胞を分離する方法は、分娩時に集められた胎盤組織から、羊膜組織を分離し、分離した羊膜組織を滅菌生理食塩水で洗浄した後、外科用はさみでできる限り細切した。細切した組織にコラゲナーゼ溶液を入れてよく混合した後、フラスコに入れて、フラスコを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで９０分間反応させて組織を溶解させた。溶解した組織をセルストレーナー（Cell strainer）でろ過し、遠心分離した。遠心分離後、上澄み液を取り除いて、ＤＭＥＭ−Ｐで細胞沈殿物を懸濁させＴ−フラスコに播いた後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３〜４日間インキュベーションさせ培養容器に付着した間葉幹細胞だけを取得した。
【００２０】
本発明の一様態で、用いられた羊膜由来間葉幹細胞は、ＤＭＥＭ−Ｐ培地とＫＳＦＭ−Ｐ培地を各々単独で用いて培養した場合より、ＤＭＥＭ−Ｐ培地とＫＳＦＭ−Ｐ培地を混合した培地で細胞増殖率が優秀で、特に、ＤＭＥＭ−Ｐ培地とＫＳＦＭ−Ｐ培地を６６：３３で混合した培地で最も高い増殖率を示した。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当分野において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００２２】
《実施例１：羊膜組織から間葉幹細胞の分離》
実験に必要な羊膜組織は胎盤から分離し、分離した組織は抗生剤が含まれている生理食塩水、またはＤＭＥＭ（Dulbecco modified Eagle medium）培地に入れて研究室まで運搬した。
【００２３】
クリーンベンチ内で羊膜組織を５ｇ定量して２回滅菌生理食塩水で洗浄して、ペトリ皿に洗浄された羊膜組織を外科用はさみでできる限り細切した。細切された組織にコラゲナーゼ溶液を入れてよく混合した後、フラスコに入れて、フラスコを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで９０分間反応させて、組織の溶解を確認した。溶解した組織を５０ｍＬチューブに予め準備して置いたセルストレーナーでろ過し、遠心分離した。遠心分離後、上澄み液を取り除いて、ＤＭＥＭ−Ｐで細胞沈殿物を懸濁させてＴ−フラスコに播いた後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３〜４日間インキュベーションさせ培養容器に付着した間葉幹細胞のみ得た。
【００２４】
《実施例２：分離した羊膜間葉幹細胞のＤＭＥＭ−Ｐ及びＫＳＦＭ−Ｐ混合培地における培養》
前記取得した羊膜由来間葉幹細胞を、ＤＭＥＭ−Ｐ（表１）及びＫＳＦＭ−Ｐ（表３）培地の混合培地を表４に記載された混合比で混合した培地を用いて、Ｔ１７５フラスコに１．０×１０６細胞を分株して３７℃で４日間培養を行い、培地は二日に一回ずつ交換した。培養３日及び４日目の細胞写真を各々図１及び図２に示した。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
【表２】
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【００２７】
【表３】
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【００２８】
【表４】
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【００２９】
培養４日目に、培養された羊膜由来間葉幹細胞をＨＢＳＳバッファーで洗浄した後、ＴｒｙｐＬＥ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）、または０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを入れて、３７℃で１０分間反応させた。ＦＢＳが含まれた培地を入れてトリプシンを不活性化させた後、取得した羊膜由来間葉幹細胞の細胞数を測定した。
その結果、表４、図１及び図２に示したように、ＤＭＥＭ−Ｐ培地とＫＳＦＭ−Ｐ培地を単独で用いた培地でより、ＤＭＥＭ−Ｐ培地とＫＳＦＭ−Ｐ培地を混合した培地で培養された場合、羊膜由来幹細胞がずっと速く、培養４日目の細胞数においても、顕著に多いことが確認された。
【００３０】
表５に示したように、グループ２のＤＭＥＭ−Ｐ培地とＫＳＦＭ−Ｐ培地を６６：３３で混合した培地で最も高い増殖率を示し、前記混合比の混合培地を以後継代培養に用いた。
【００３１】
【表５】
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【００３２】
《実施例３：混合培地で培養された羊膜由来間葉幹細胞の免疫学的特性》
表面抗原発現の柔細胞分析（Flow cytometry analysis）
実施例２で混合培地で培養された羊膜由来間葉幹細胞を表面ＣＤシリーズ抗原マーカーでキャラクタライゼーションした。ＣＤ２９（単核球マーカー）、ＣＤ３１（内皮細胞及び幹細胞マーカー）、ＣＤ３４（造血幹細胞マーカー）、ＣＤ４４、ＣＤ４５（ＰＴＰＲ，ＡＳＶ，Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｍａｒｋｅｒ）、ＣＤ７３をＦＡＣＳ分析に適用した。
【００３３】
実施例１で取得した羊膜由来間葉幹細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理した後、細胞を回収して５分間１５００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み液を捨てた後、ブロッキングバッファー溶液（５％血清（正常ヤギ血清＋正常ウマ血清））を入れて、４℃で６０分間反応させた後、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄み液を捨てた後、細胞をＰＢＳに浮遊させて、陰性対照及びＣＤ抗原マーカーの数に、１×１０５ｃｅｌｌを分株した。各ウェルに抗体（Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）／ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）−標識マウス抗ヒトモノクローナル抗体）を入れて、４℃で４０分間インキュベーションした。インキュベーション後に１５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄み液を取り除いた後、ＰＢＳで洗浄し、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。そして、再度前記上澄み液を取り除いた後、ＰＢＳで洗浄し、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離する過程を繰り返した。上澄み液を取り除いた後、フローサイトメーター（Flow Cytometer）を利用して分析した。
【００３４】
その結果、各グループの羊膜由来間葉幹細胞はいずれもＣＤ２９、ＣＤ４４、及びＣＤ７３に対し陽性の免疫学的特性を示し、ＣＤ３１、ＣＤ３４、及びＣＤ４５に対し陰性の免疫学的特性を示した（図３〜図８）。
【００３５】
《実施例４：混合培地で継代培養された羊膜由来間葉幹細胞の増殖能比較》
実施例１で培養された細胞を各々１．０×１０６細胞／Ｔ１７５フラスコ濃度で継代培養して、Ｐ１及びＰ２世代の増殖能を確認した。
培養は、実施例１の培養方法と同様の条件で行った。
【００３６】
その結果、ＤＭＥＭ−Ｐ単独培地で培養した群（グループ１）のＰ１は、５日培養後、細胞数を計測した時、５．４×１０６細胞であるのに対して、ＤＭＥＭ−ＰとＫＳＦＭ−Ｐ培地を６６：３３で混合した群（グループ２）のＰ１は、４日だけ培養して細胞数を計測しても、１．２５×１０７細胞となり顕著に高い細胞増殖能を示した（図９）。
【００３７】
Ｐ２の場合は、ＤＭＥＭ−Ｐ単独培地で培養した群（グループ１）は、４日培養後計測した時、３．４×１０６細胞に増殖した細胞数がＰ１に比べて減少し、ＤＭＥＭ−ＰとＫＳＦＭ−Ｐ培地を６６：３３で混合した群（グループ２）の場合は、１．３８×１０７細胞となりＰ１に比べて増殖能が却って増加した（図１０）。
【００３８】
《実施例５：混合培地で継代培養された羊膜由来間葉幹細胞の免疫学適性比較》
実施例２と同様の方法で、ＤＭＥＭ−Ｐ培地を単独で用いて継代培養したＰ１及びＰ２と、ＤＭＥＭ−ＰとＫＳＦＭ−Ｐ培地を６６：３３で混合した培地を利用して継代培養したＰ１及びＰ２の免疫学的特性を確認した結果、各グループの羊膜由来間葉幹細胞はいずれもＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＨＬＡ−ＡＢＣに対して陽性の免疫学的特性を示し、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性の免疫学的特性を示した。
【００３９】
《実施例６：混合培地で培養された羊膜由来間葉幹細胞の骨分化定量》
実施例１で取得したＤＭＥＭ−Ｐ単独培地、及びＤＭＥＭ−Ｐ／ＫＳＦＭ−Ｐ混合培地で培養された羊膜由来間葉幹細胞を骨形成誘導培地（Ｎｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ＯｓｔｅｏＤｉｆｆ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で１８日間培養（３７℃、５％ＣＯ２、培地交換周期：３〜４日）して、間葉幹細胞を骨細胞に分化誘導させ、２日毎に分化培地を新しく取り換えた。骨細胞への分化は正常酸素状態及び低酸素状態（１〜５％）に分けて実施し、各分化条件を表６に示した。
【００４０】
培養開始後１８日目に、アリザリンレッドＳ染色法を利用して、羊膜由来間葉幹細胞が骨形成細胞に分化したことを確認し、ＤＭＥＭ−Ｐ単独培地で培養された細胞より、混合培地（グループ２）で培養された細胞の方が、高い骨細胞分化率を示し、培養時に過酸素状態で培養された細胞（Ｍ−Ｈ−Ｎ）がさらに高い分化能を示した（図１１及び図１２）。
【００４１】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明によると、幹細胞治療に必要な間葉幹細胞の数を短時間に獲得することができ、間葉幹細胞の分化能を向上させ、幹細胞を利用した細胞治療に有用である。
【００４３】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月15日(2013.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】
前記間葉幹細胞は、羊膜由来の間葉幹細胞であることを特徴とする請求項７に記載の間葉幹細胞の培養方法。
【国際調査報告】
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