(57)【要約】  統合された細胞ベースの薬理学的反応を示す天然細胞の心筋標本における化合物および薬物などの物質の、電気生理学的な不整脈誘発の収縮および他の効果を検出するための迅速で効率的な方法および装置が開示される。より具体的には、（１）光学ベースの技法およびカスタマイズされた刺激プロトコルを使用して心臓の再分極、収縮性および興奮性に対する化学物質、化合物および薬物の効果を迅速に、効率的に検出および検証するための、および（２）心臓筋細胞に対する電気生理学的効果および不整脈誘発の効果について化合物を迅速に、効率的に選別および選択するための方法が開示される。
2013543733.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験物質に曝す前に複数の細胞のデジタル映像記録を行う、また試験物質に曝した後に複数の細胞のデジタル映像記録を行う段階であって、前記映像記録のそれぞれが複数の映像静止フレームを含み、前記映像静止フレームのそれぞれが複数の画素を含む段階、
試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の各映像静止フレームから１つ以上の細胞領域を選択する段階、
試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の映像静止フレームの中から、また試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の映像静止フレームの中から参照フレームを選択する段階、
試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の映像静止フレームの１つ以上の細胞領域を、試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の参照フレームの１つ以上の細胞領域と比較することによって、試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録からの各映像静止フレーム中の各細胞領域内の画素変化を定量化する段階、
時間に対する定量化された画素変化に基づいて各細胞領域の反応時間曲線を計算する段階、
各細胞領域内で１つ以上の対象の領域を画定する段階、
前記１つ以上の対象の領域を、試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録および試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の参照フレームに適用する段階、
試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の映像静止フレームの１つ以上の対象の領域を、試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の参照フレームの１つ以上の対象の領域と比較することによって、試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録からの各映像静止フレーム中の各対象の領域内の画素変化を定量化する段階および
時間に対する定量化された画素変化に基づいて各対象の領域の反応時間曲線を計算する段階を含む、試験物質に対する複数の細胞の反応を判定する方法。
【請求項２】
複数の細胞を刺激に曝し、
複数の細胞を同時に映像記録して試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録を取得し、
複数の細胞を試験物質に曝し、
複数の細胞を刺激に曝し、
複数の細胞を同時に映像記録して試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録を取得することによって映像記録が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試験物質に曝す前に細胞を映像記録し、
前記試験物質に複数の細胞を曝し、
前記試験物質に曝した後に前記細胞を映像記録することによって映像記録が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複数の生細胞が、複数の心室筋細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
複数の生細胞が、複数の心房筋細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
複数の生細胞が、複数の幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
刺激が、事前にプログラムされたペーシングプロトコルを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
心室筋細胞が、鋭利に分離されたウサギ心室筋細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
心房筋細胞が、ウサギ心房筋細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
試験物質に対する細胞の反応の測定時に生細胞をデジタル画像化用に呈示する装置であって、
入口端部に流体入口ポートおよび出口端部に流体出口を有する流体チャネル、
前記流体チャネルの入口ポートに接続された流体ポンプデバイス、
前記流体チャネルを通って伸びる、生細胞に接着することができ光学的に透明または半透明なフィルムの細片、
前記フィルムの上に配置された少なくとも１つのフローセルであって、フィルムと共にシールを形成して密閉環境を形成することができる光学的に透明な上面および側壁を有する空洞を備えるフローセルおよび
少なくとも１つのフローセルをフィルムの上方に上昇させるまたは少なくとも１つのフローセルをフィルムの上まで下降させることができる、少なくとも１つのフローセルに接続された垂直アクチュエータを備える、装置。
【請求項１１】
流体チャネルの一部分を加熱するための加熱デバイスをさらに備える、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
光学的に透明または半透明なフィルムの細片が連続している、請求項１０に記載の装置。
【請求項１３】
少なくとも１つのフローセルが、生細胞に電気刺激プロトコルを施すことができる電気接点を各端部にさらに備える、請求項１０に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、ある物質の効果を判定する方法に関し、より具体的には、収縮反応、光学的検出方式およびカスタマイズプログラムされた電気刺激のような検出プロトコルに基づいて、生細胞に対する諸物質の電気生理学的な不整脈誘発の変力および他の効果をインビトロで迅速に検出し測定する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓または他の生物組織に対する薬物の様々な効果をインビトロで評価する現在の方法では、時間がかかると共に技法的に複雑な細胞内記録法を日常的に使用する。さらに、ほとんどの場合これらの評価は一般に、シンシチウム標本または分離細胞に１つずつ適用される。
【０００３】
通常、様々な物質が無い状態および／または存在する状態で得られた細胞内記録は、筋線維の心臓活動電位に対するそれらの様々な物質の効果の証拠を得るために比較される。いくつかある態様の中でも、ある物質は、（活動電位持続時間すなわちＡＰＤの延長として顕在化される）心臓の再分極を遅らせることによって筋線維の心臓活動電位に影響を及ぼしまたは（ＡＰＤの短縮として顕在化される）心臓の再分極を加速し得る。
【０００４】
残念ながら、いくつかの欠点が存在する。すなわち、これらの細胞内記録を得るための現在の方法は持続するのが困難であり、細胞内記録を得るために用いられる実験は、主として薬物平衡時間が特に心筋に対して長いために時間がかかり、また細胞内記録では、適切な試料サイズを確保するのに複数の検体からの組織収集を必要とする。加えて、この手法では、ある物質の、収縮性（多くの興奮性組織の生来の特性）または興奮性の変化（多くの興奮性組織のもう一つの生来の特性）に影響を及ぼす潜在的な効果は評価しない。
【０００５】
遅れた心臓再分極は、心臓不整脈誘発（特に心室頻拍）の代替マーカーと考えられている。心臓再分極を遅らせる物質の効果が、より時間のかかる刺激作用の間に誇張される「逆使用依存性」と名付けられた効果は、繰り返し実証されてきた。残念ながら、加速された（または変則的な）ペーシング中の物質の効果は、通常では考慮に入れられない。このことは、心室頻拍として知られるまれな薬物誘発の多形性心室性頻拍に関連する不整脈誘発リスクの評価において、調律を開始することが一般に不規則な刺激パターンまたは期外収縮を伴うので、重要なことがある。
【０００６】
安全性または有効性の評価中の化学物質および／または化合物によって、心臓のどのイオンチャネルまたは伸縮性タンパク質が影響を受ける可能性があるかは本質的に未知であるので、身体に対する諸物質の電気生理効果を評価するには、分離された筋細胞から得られるものなどの統合された細胞反応が好ましい。
【０００７】
刺激に対して、特に電気刺激に対して機械的に反応する（すなわち、伸長または収縮する）生細胞の能力は、前の電気刺激からの細胞の回復にとりわけ依存する。言い換えると、電気刺激による細胞の伸長または収縮は、前の電気刺激から「正常なバイアスまたは再分極に戻る」細胞の敏捷さに一部は依存する。心臓細胞の場合では、この反応能力は不応性と呼ばれ、「心臓活動電位」と密接に関連している。
【０００８】
細胞の心臓活動電位は、多くの要因による影響を受ける可能性がある。例えば、細胞に物質を導入／露出することが心臓活動電位に影響を及ぼすことが示されてきた。再分極を遅らせ心臓活動電位の持続時間を延ばす、薬物および／または他の化学物質のようないくつかの物質は、不応性を延ばすと言われる。一例として、いずれかの内向きイオン（例えば、ナトリウムまたはカルシウム）電流を増大する物質は、心臓活動電位の上昇を引き起こし得る。そうする際に、これらの物質は、非常に早い刺激または早期刺激に反応する細胞の能力を制限する。このような物質を使用することによって、不応性は、（１）外向き再分極電流の低減または（２）興奮性内向き電流を伝導するチャネルの一時的な低減および／もしくは回復の遅延により、延ばされ得る。
【０００９】
同様に、再分極を加速し、心臓活動電位持続時間を短縮する物質は、不応性を短縮すると言われる。不応性の変化は、不整脈誘発と関連づけられてきた。例えば、遅れた再分極は心室性不整脈誘発（心室頻拍を含む）と関連づけられ、短縮された心房再分極（および不応性）は心房性不整脈誘発（心房の粗動および細動など）ならびに心室細動と関連づけられてきた。
【００１０】
不応性の変化はイオン電流に対する効果に起因し得るが、多数のイオン電流が統合的に作用して不応性を規定する可能性があり、また諸物質が異なる濃度で不確定的に多数のイオン電流に影響を及ぼし得るので、ある物質の、どれか個別のイオン電流に対する効果を理解しても不応性に対する効果が適切に予測されない。したがって、不応性の変化は通常、無傷の統合された細胞系（例えば、筋線維）において評価される。しかし、変化の直接的な電気生理学的測定（微小電極またはパッチ電極をベースとする記録技法を使用）および統合された細胞系の不応性の変化を測定することは、単調で退屈であり、技法的には複雑であり、また高スループットには適していない。
【００１１】
したがって、ある物質の身体に対する効果を検出するための、現在使用されている方法の短所を克服する改善された方法を提供することが望ましい。
【００１２】
本発明は、より簡単な方法で検体使用が少なくてよく、また必要とされる技術的専門知識が最小限でありながら、技法的要求が厳しい既知の方法の細胞内記録法を用いずに、細胞に対する、特に心臓筋細胞に対する薬物の効果の評価、特に電気生理学的効果の評価を行えるようにする。本発明はまた、電気生理学的パラメータ（再分極および興奮性の変化）が調査される間に細胞に対する試験物質の機械的効果（特に心臓の収縮性）の変化を同時に評価できるようにする。
【００１３】
さらに、本発明では、反応を判定するのに非浸襲的な光学的方法を使用し、細胞は生理的条件下で判定される。本発明の検出方式は、技法的要求の厳しさが少ない。加えて、本発明の検出方式は、既知の手法よりも高速で効率的である。既存のエッジ検出法は、複数の細胞からの多くの測定値を並行してサポートするための規模拡大が簡単にできない。エッジ検出はまた、低い画像コントラスト、デブリによりエッジが適切に画定されない場合、または部分的に重なり合う可能性がある密に詰められた細胞を実験フローセルチャンバで収容する場合に問題が多い。最後に、この手法は、多様な細胞型（例えば、心房および心室の心臓筋細胞）に適用可能であり、また、機械的反応が電気的興奮性の回復によって引き起こされるまたはそれに依存する、どんな収縮性組織に由来する細胞に対しても使用することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、興奮性細胞に対する化合物または薬物などの物質の効果を測定するための高速で高スループットの非浸襲的で効率的な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の方法は、
（１）試験物質に曝す前に複数の細胞のデジタル映像記録を行う、また試験物質に曝した後に複数の細胞のデジタル映像記録を行うことにおいて、映像記録のそれぞれが複数の映像静止フレームを含み、映像静止フレームのそれぞれが複数の画素を含むこと、
（２）試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の各映像静止フレームから１つ以上の細胞領域を選択すること、
（３）試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の映像静止フレームの中から、また試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の映像静止フレームの中から参照フレームを選択すること、
（４）試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の映像静止フレームの１つ以上の細胞領域を、試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の参照フレームの１つ以上の細胞領域と比較することによって、試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録からの各映像静止フレーム中の各細胞領域内の画素変化を定量化すること、
（５）時間に対する定量化された画素変化に基づいて各細胞領域の反応時間曲線を計算すること、
（６）各細胞領域内で１つ以上の対象の領域を画定すること、
（７）１つ以上の対象の領域を、試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録および試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の参照フレームに適用すること、
（８）試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の映像静止フレームの１つ以上の対象の領域を、試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の参照フレームの１つ以上の対象の領域と比較することによって、試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録からの各映像静止フレーム中の各対象の領域内の画素変化を定量化することおよび
（９）時間に対する定量化された画素変化に基づいて各対象の領域の反応時間曲線を計算することによって、試験物質に対する複数の細胞の反応を測定する方法を含む。
【００１６】
本発明の方法はまた、
（１）複数の細胞を刺激に曝し、
（２）複数の細胞を同時に映像記録して試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録を取得し、
（３）複数の細胞を試験物質に曝し、
（４）複数の細胞を刺激に曝し、
（５）複数の細胞を同時に映像記録して試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録を取得することによって、試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録を取得し、また試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録を取得する実験プロトコルの方法を含む。
【００１７】
本発明の方法はさらに、（１）試験物質に曝す前に複数の細胞を映像記録し、（２）複数の細胞を試験物質に曝し、（３）試験物質に曝した後に細胞を映像記録することによって、試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録を取得し、また試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録を取得する実験プロトコルの方法を含む。好ましい一実施形態において、この手法は、細胞が自発的に収縮性である場合に適用される。
【００１８】
特定の実施形態において、本発明の方法は、（１）光学ベースの技法およびカスタマイズされた刺激プロトコルの両方を使用して、心臓の再分極、収縮性および興奮性に対する化学物質、化合物および／または薬物の効果を迅速に、効率的に検出、測定および／または検証することおよび（２）生細胞に対する、特に心臓筋細胞に対する電気生理学的効果および／または不整脈誘発の効果（ならびに収縮性および興奮性に対する効果）について化合物を迅速に、効率的に選別および選択することを可能にする。好ましい実施形態において、これらの細胞は、統合された細胞ベースの薬理学的反応を示す天然の心筋標本に由来する。
【００１９】
本発明の別の態様で、試験物質に対する細胞の反応の測定時に生細胞をデジタル画像化用に呈示する装置が用意される。本発明による装置は、生細胞が試験されるときまでそれらを保存し養い、装置の一区域から別の区域まで生細胞を搬送し、細胞を試験物質に、例えば薬物に、場合によって電気刺激プロトコルに曝しながら生細胞をデジタル記録装置に呈示する役割を果たす。本発明による装置は、
入口端部に流体入口ポートおよび出口端部に流体出口を有する流体チャネル、
流体チャネルの入口ポートに接続された流体ポンプデバイス、
流体チャネルを通って伸びる、生細胞に接着することができ光学的に透明または半透明なフィルムの細片、
フィルムの上に配置された少なくとも１つのフローセルであって、フィルムと共にシールを形成して密閉環境を形成することができる光学的に透明な上面および側壁を有する空洞を備えるフローセルおよび
少なくとも１つのフローセルをフィルムの上方に上昇させるまたは少なくとも１つのフローセルをフィルムの上まで下降させることができる、少なくとも１つのフローセルに接続された垂直アクチュエータを含む。
【００２０】
本発明のさらなる特徴、利点および諸実施形態が示されることまたはこれらが以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲を考察することにより明らかにすることができる。さらに、前述の「発明の概要」も以下の「発明を実施するための形態」も例示的なものであり、特許請求された本発明の範囲を限定することなくさらなる説明を提示するものである。
【００２１】
添付の図面は、本発明がさらに理解されるように含まれ、本開示に組み込まれてその一部をなすが、本発明の好ましい諸実施形態を図示し、「発明を実施するための形態」と共に本発明の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明による反応時間曲線の下方に示された、本発明により、また事前にプログラムされたパルスプロトコルにより計算された反応時間曲線の一例を示す図である。図１に描かれている事前にプログラムされたパルスプロトコルは、パルスプロトコルの間中に規則的に間隔をあけられた刺激に次第に近づけて配置された早期刺激により規則的に妨げられている、規則的に間隔をあけられた刺激を呈示する。
【図２】本発明の方法を実践する装置の一例を示す図である。
【図３】筋細胞の一群に対する早期刺激を伴うペーシングプロトコルに対する重ね合わされた反応時間画素数（平均ぺーシング反応に対し正規化）を示す図である。
【図４】細胞領域の反応時間曲線に所定の除去基準を場合によって適用し、所定の除去基準を満たさない反応時間曲線と一致する細胞領域を除去する操作を示す図である。描かれているのは、細胞領域（点線）にセグメント化された映像静止フレームであり、実線ボックスは、対象の領域になるべき所定の除外基準を満たした細胞領域を示す。
【図５】本発明の好ましい一実施形態の装置を示す概略図である。
【図６】本発明の装置内で生細胞を１つの区域から別の区域まで搬送するのに使用できる、光学的に透明または半透明で可撓性のポリマーフィルムの細片を示す図である。
【図７】生細胞を試験物質に曝しながら生細胞をデジタル記録デバイスに呈示し、場合によって生細胞に電気刺激プロトコルを施すために使用できる１つ以上のフローセルのクラスターの平面図である。
【図８】１つ以上のフローセルのクラスター、締付機構およびデジタル記録デバイスを描いている前部断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、興奮性生細胞に対する試験物質（例えば、化合物または薬物）の効果を判定するための迅速で非浸襲的および効率的な方法を提供する。本発明の方法は、
（１）試験物質に曝す前に複数の細胞のデジタル映像記録を行う、また試験物質に曝した後に複数の細胞のデジタル映像記録を行うことにおいて、映像記録のそれぞれが複数の映像静止フレームを含み、映像静止フレームのそれぞれが複数の画素を含むこと、
（２）試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の各映像静止フレームから１つ以上の細胞領域を選択すること、
（３）試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の映像静止フレームの中から、また試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の映像静止フレームの中から参照フレームを選択すること、
（４）試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の映像静止フレームの１つ以上の細胞領域を、試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の参照フレームの１つ以上の細胞領域と比較することによって、試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録からの各映像静止フレーム中の各細胞領域内の画素変化を定量化すること、
（５）時間に対する定量化された画素変化に基づいて各細胞領域の反応時間曲線を計算すること、
（６）各細胞領域内で１つ以上の対象の領域を画定すること、
（７）１つ以上の対象の領域を、試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録および試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の参照フレームに適用すること、
（８）試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の映像静止フレームの１つ以上の対象の領域を、試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の参照フレームの１つ以上の対象の領域と比較することによって、試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録からの各映像静止フレーム中の各対象の領域内の画素変化を定量化することおよび
（９）時間に対する定量化された画素変化に基づいて各対象の領域の反応時間曲線を計算することによって、試験物質に対する複数の細胞の反応を測定する方法を含む。
【００２４】
複数の細胞に刺激が加えられる実施形態において、この刺激は、事前にプログラムされたペーシングプロトコルを含み得る。例えば、複数の細胞は、規則的にペース調整された連続するパルス列（それぞれが休止期間によって分離されている）からなる事前にプログラムされたペーシングプロトコルを使用して電気的に刺激されることが可能であり、各列は、場合によって前のパルス列に対して周波数または振幅を増加または低減させる。事前にプログラムされたペーシングプロトコルはまた、１つ以上の早期パルスを含み得る。例えば、事前にプログラムされたパルスプロトコルは、不応性を規定するためのパルスプロトコルの間中に規則的に間隔をあけられた刺激に次第に近づけて配置された早期刺激により規則的に妨げられている、規則的に間隔をあけられた刺激を呈示し得る。事前にプログラムされたペーシングプロトコルはまた、徐々に増加または低減するパルス振幅を含み得る。例えば、事前にプログラムされたパルスプロトコルは、興奮性を規定するためのパルスプロトコルの間中に振幅または強度が徐々に低減する刺激を呈示し得る。
【００２５】
本発明の他の実施形態においては、複数の細胞は電気的に興奮性であり、形状、形態または内部再構成（それだけには限らないが、収縮を含む）の変化と共に反応する。分離された細胞、単一もしくは複数の細胞クラスターもしくは細胞アイランド、細胞シートもしくは細胞層または組織もまた使用され得る。別法として、化学的または機械的刺激に対して形状、形態または内部再構成の変化と共に反応する複数の細胞もまた使用され得る。あるいは、複数の細胞は自発的に活性であり（例えば、ある種の幹細胞）、刺激が不要なこともある。
【００２６】
本発明の方法は、少なくとも２つの時期に取得された複数の細胞のデジタル映像記録、すなわち試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録および試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の解析を含めた。刺激が複数の細胞に加えられる実施形態において、映像記録は、
（１）複数の細胞を刺激に曝し、
（２）複数の細胞を同時に映像記録して試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録を取得し、
（３）複数の細胞を試験物質に曝し、
（４）複数の細胞を刺激に曝し、
（５）複数の細胞を同時に映像記録して試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録を取得することによって、取得される。
【００２７】
複数の細胞のデジタル映像記録はまた、複数の細胞が異なる濃度の試験物質に曝されている間に取得されることもある。
【００２８】
本発明の方法はさらに、（１）試験物質に曝す前に複数の細胞を映像記録し、（２）複数の細胞を試験物質に曝し、（３）試験物質に曝した後に細胞を映像記録することによって、試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録を取得し、また試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録を取得する実験プロトコルの方法を含む。好ましい一実施形態において、この手法は、細胞が自発的に収縮性である場合に適用される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態において、細胞（例えば、筋細胞）の不応性の変化は、刺激から導出された収縮反応または収縮を開始する原因となる細胞内カルシウムトランジェントに基づいて判定される。特に、再分極に対する薬物効果は、刺激速度が次第に増加されるまたは規則的な刺激が早期刺激により妨げられるプログラム可能ペーシングプロトコルの間中に、複数の細胞の、特に筋細胞の収縮する能力に基づいて評価することができる。特に、興奮性に対する薬物効果は、刺激強度が次第に増大または低減するプログラム可能ペーシングプロトコルの間中に、複数の細胞の、特に筋細胞の収縮する能力に基づいて評価することができる。これらの収縮効果は、反応の振幅およびパターンに基づいて特徴付けられ、この特徴付けは、単一の刺激、次いで複数の刺激に細胞が反応しなくなる刺激速度を含む。他の実施形態においては、電圧感応性またはイオン感応性（例えば、カルシウムまたはナトリウム感応性）色素を使用して、細胞に対する試験物質の電気生理学的効果を直接測定することができる。このような実施形態において、細胞の反応する能力は、例えば、細胞内カルシウム依存性蛍光色素の発光強度の変動、電圧感応性色素からの信号の変動、または焦点もしくは光散乱などの顕微鏡的画像パラメータの変動としての細胞内カルシウムトランジェントの変化により検出することができる。
【００３０】
本発明によれば、１つ以上の細胞領域が各映像記録から選択される。これら１つ以上の領域は、所定の細胞領域選択基準を適用することによって選択される。例えば、各細胞領域が映像静止フレーム中の画像化された各細胞と一致して、細胞を画像化していない各映像静止フレームの部分が除外され得る。別法として、映像記録の各映像静止フレームは、各区域に細胞が存在すること、部分的に存在することまたは存在しないことにかかわらずセグメント化されて、その細胞領域（例えば、１つの格子）が選択され得る。どの実施形態においても、これらの細胞領域は、事前にプログラムされたセグメント化プロトコルから細胞領域が導出される、自動化された方法で指定することができ、このプロトコルは、画像化された各細胞と一致する映像静止フレームの部分を選択するように設計された所定の基準に従って、または図４に例示された映像静止フレームの領域を選択することによって、細胞領域を指定することができる。別法として、細胞領域は、映像記録の人手による検査および映像記録中の画像化された各細胞と一致する部分のセグメント化または選択によって、指定することもできる。細胞領域の外側に位置する部分は、場合によってさらなる分析により除外され得る。本発明の一実施形態において、細胞領域は映像静止フレーム全体を構成し得る。
【００３１】
本発明によれば、試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の映像静止フレームが参照フレームとして選択される。好ましくは、この参照フレームは、複数の細胞が静止状態にある時間と合致するように選択される。試験物質に曝す前に複数の細胞が刺激を受けた場合、参照フレームは、細胞がパルス刺激に反応していない時点と合致するように選ぶことができる。例えば、参照フレームは、細胞領域の静止状態が最もあり得る時間的位置を決定することによって、例えば、各映像フレームまたは可能性のあるすべての参照位置での映像フレームのサブセットまたは参照位置のサブセットに対する画素数変化を合計することに基づいて、最大数の静止映像フレームと類似している静止映像フレームを選択することによって選ぶことができる。別法として、参照フレームは、各映像フレームの画素輝度を計算し、細胞物質が周囲の空間よりも暗いか明るいかに応じて計算された最小または最大の画素輝度を有する映像フレームを参照フレームとして選択することにより、細胞領域の静止状態が最もあり得る時間的位置を決定することによって選ぶことができ、この参照フレーム選択手順は、複数の細胞が自発的に活性である場合に特に好ましい。別の代替形態では、参照フレームは、試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の全映像静止フレームのトリム平均を計算して平均フレームを形成することによって選択され、この平均フレームは、試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の参照フレームとして選択される。
【００３２】
本発明によれば画素変化は、試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の映像静止フレームの１つ以上の細胞領域を、試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録の参照フレームの１つ以上の細胞領域と比較することによって、試験物質に曝す前の複数の細胞の映像記録からの各映像フレーム中の各細胞領域内で定量化される。例えば、画素変化は、１つ以上の細胞領域からの各画素を、複数の細胞の映像記録の参照フレームからの対応する画素と、複数の細胞の映像記録の参照フレームからの対応する画素と比較し、事前に選択された値だけ変化する画素を数えることによって定量化することができる。別法として、画素変化は、画素の輝度の平均、中心値、最頻値、トリム平均または類似の平均化手法から導出された１つ以上の細胞領域の総画素輝度を計算し、この１つ以上の細胞領域の総画素輝度を、参照フレームの１つ以上の細胞領域について同じ平均化手法を実行することによって導出された１つ以上の細胞領域の総画素輝度と比較することによって定量化することもできる。
【００３３】
１つ以上のピークを含む反応時間曲線が、時間に対する画素の変化量に基づいて細胞領域ごとに計算される。本発明の方法により計算された反応時間曲線の一例が図１に示されている。収縮持続時間（例えば、全単収縮の１０−９０％として表される）、ピーク収縮（変力状態の尺度）、短縮のピーク速度（（＋ｄＬ／ｄＴ）ｍａｘ）、弛緩のピーク速度（−ｄＬ／ｄＴ）、初期からピーク短縮までの時間（Ｔｐｅａｋ）、およびピーク短縮から弛緩までの時間（Ｔｐｅａｋ−９０、変弛緩状態の尺度）などの値が反応時間曲線の解析によって計算され得る。不応期間、早期刺激に対する反応の喪失、ノイズ（例えば、ピーク対高さベースラインノイズ）、平均ピーク高さおよび平均ピーク幅などの集約値もまた、反応時間曲線の解析によって計算され得る。
【００３４】
１つ以上の対象の領域は、各細胞領域内で画定される。各細胞領域が対象の領域として単純に画定されてよく、すなわち細胞領域と対象の領域は互いに合致し得る。好ましい一実施形態において、所定の除外基準が応答時間曲線に適用され、この所定の除外基準を満たさない細胞領域は、さらなる解析から除去される。所定の除外基準のカテゴリーには、例えば、反応時間曲線の解析から計算された値が含まれる。例えば、ある細胞領域が、所定の範囲の値以外の収縮持続時間を呈示する反応時間曲線を有することによって除外されることがある。所定の除外基準を適用する結果、死んでいる細胞、非反応性細胞または反応性が不十分な細胞を含有する細胞領域は、さらなる解析からこうして除外することができ、１つ以上の対象の領域は、所定の除外基準に適合する反応時間曲線を有する細胞領域として画定される。すなわち、この好ましい実施形態においては、対象の領域が、望ましい収縮挙動を呈示する細胞を有する細胞領域と一致するように画定される。
【００３５】
本発明によれば、対象の領域は、試験物質に曝された後の複数の細胞の映像記録に適用されることによって、さらなる解析に供される。試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録からの映像静止フレームが、参照フレームとして選択される。好ましくは、この参照フレームは、複数の細胞が静止状態にある時間と合致するように選択される。試験物質に曝した後に複数の細胞が刺激を受けた場合、参照フレームが、パルス刺激に細胞が反応していない時点と合致するように選ばれ得る。例えば、参照フレームは、対象の領域の静止状態が最もあり得る時間的位置を決定することによって、例えば、各映像フレームまたは可能性のあるすべての参照位置での映像フレームのサブセットまたは参照位置のサブセットに対する画素数変化を合計することに基づいて、最大数の静止映像フレームと類似している静止映像フレームを選択することによって選ばれてよい。別法として、参照フレームは、各映像フレームの画素輝度を計算し、細胞物質が周囲の空間よりも暗いか明るいかに応じて計算された最小または最大の画素輝度を有する映像フレームを参照フレームとして選択することにより、対象の領域の静止状態が最もあり得る時間的位置を決定することによって選ばれてよく、この参照フレーム選択手順は、複数の細胞が自発的に活性である場合に特に好ましい。別の代替形態では、参照フレームは、試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の全映像静止フレームのトリム平均を計算して平均フレームを形成することによって選択され、この平均フレームは、試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の参照フレームとして選択される。
【００３６】
本発明によれば画素変化は、試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の映像静止フレームの１つ以上の対象の領域を、試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録の参照フレームの１つ以上の対象の領域と比較することによって、試験物質に曝した後の複数の細胞の映像記録からの各映像フレーム中の各対象の領域内で定量化される。例えば、画素変化は、１つ以上の対象の領域からの各画素を、複数の細胞の映像記録の参照フレームからの対応する画素と、複数の細胞の映像記録の参照フレームからの対応する画素と比較し、事前に選択された値だけ変化する画素を数えることによって定量化され得る。別法として、画素変化は、画素の輝度の平均、中心値、最頻値、トリム平均または類似の平均化手法から導出された１つ以上の対象の領域の総画素輝度を計算し、この１つ以上の対象の領域の総画素輝度を、参照フレームの１つ以上の対象の領域について同じ平均化手法を実行することによって導出された１つ以上の対象の領域の総画素輝度と比較することによって定量化されてもよい。
【００３７】
場合によって、本発明の一実施形態において、所定のサブ領域除去基準を満たさない対象領域内のサブ領域が、さらなる考察により除去される。例えば、サブ領域除去基準は、平均輝度の望ましくない変化に基づき得る。
【００３８】
場合によって、画素定量化の際に徐々に変化する差異を差し引くために、ベースライン補正アルゴリズムが１つ以上の対象の領域に適用され得る。
【００３９】
１つ以上のピークを含む反応時間曲線が、時間に対する画素の変化量に基づいて対象の領域ごとに計算される。本発明の方法により計算された反応時間曲線の一例が図１に示されている。収縮持続時間（例えば、全単収縮の１０−９０％によって表される）、ピーク収縮（変力状態の尺度）、短縮のピーク速度（（＋ｄＬ／ｄＴ）ｍａｘ）、弛緩のピーク速度（−ｄＬ／ｄＴ）、初期からピーク短縮までの時間（Ｔｐｅａｋ）およびピーク短縮から弛緩までの時間（Ｔｐｅａｋ−９０、変弛緩状態の尺度）などの値が、反応時間曲線の解析によって計算され得る。不応期間、早期刺激に対する反応の喪失、ノイズ（例えば、ピーク対高さベースラインノイズ）、平均ピーク高さおよび平均ピーク幅などの集約値もまた、反応時間曲線の解析によって計算され得る。
【００４０】
本発明によれば、反応時間曲線は次に、試験物質に曝す前および試験物質に曝した後に対象の領域について比較され得る。本発明の実践において、生成された反応曲線が、個別化されたおよび／または凝集した細胞挙動を高品質で表したものを示すことは明らかである。すなわち、試験物質に曝す前後の対象領域の反応曲線を比較することで、複数の細胞に対する試験物質の直接の効果が示され、複数の細胞が採取された統合細胞系に対するある物質の効果について正確に予測することが可能になる。例えば、電気興奮性の変化が、収縮反応の閾値を規定するために使用された反応時間曲線（次第に増大または低減する振幅を伴い規則的に加えられる刺激からなる刺激プロトコルによって引き出されている）が存在することまたは不在であることに基づいて評価され得る。本発明の具体的な適用例には、例えば、心臓組織に対する原体の有害作用の予測が含まれる。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、細胞は心臓筋細胞（心室または心房起源）であり、実験チャンバ、好ましくはフローセルに入れられ、その中で画像化され、所定の温度で維持される。複数の細胞の挙動についての最善の調査のために、好ましくは、温度は生理的温度またはその近くであるが、他の温度が用いられてもよい。非近接心臓筋細胞は、心筋分解などの既知の手法によって得ることができる。好ましくは、刺激プロトコルを受ける複数の細胞は、ＨＥＰＥＳで緩衝されたタイロード液を用いた灌流の間中、１．０Ｈｚの電場刺激を使用して刺激される。試験物質は、好ましくは、生理食塩緩衝液に含まれた試験物質を用いて灌流される。複数の細胞それぞれは、好ましくは１−３×の倍率で目に見えるようにされる。映像は、３０Ｈｚ以上の好ましいサンプリングで記録される。
【００４２】
好ましい実施形態において、本発明は、解析されるべき複数の細胞をそれぞれが収容する複数の実験チャンバの映像記録の解析を含む。このような実施形態においては、画像化デバイスおよびチャンバ（１つ以上）を互いに移動できる場合、１つ以上の実験チャンバを単一の映像取得デバイスで見ることができる。別法として、複数の映像取得デバイスが１つ以上の実験チャンバ専用にされ、デバイスおよびチャンバの物理的位置が互いに固定されることもある。各チャンバの映像の取り込みおよび解析は、上述の技法により並行して進行し得る。このような実施形態においては、任意の所与の時間に並行検定を実現すると共に、複数の試験物質の効果を同時に調査すること、もしくは試験物質の濃度を変えること、またはその両方を可能にする。各チャンバ内の試験物質の濃度を制御し、実験プロトコルを繰り返すことによって、チャンバごとに試験物質に対する濃度−反応関係を評価することもまた可能である。
【００４３】
好ましい実施形態において、試験物質に曝した後の複数の細胞の複数の映像記録が、異なる試験物質濃度または異なる試験物質を用いて複数の細胞を曝すことと合致するように作成され得る。このような記録は、上述の本発明の方法により解析される。
【００４４】
好ましい実施形態において、本発明は、オフラインまたはオンラインの解析ソフトウェアをオンラインまたは内部ネットワークで利用し、それによって、所定の収縮パラメータ、自動化された試験物質追加、データ収集および編集、ならびに報告書作成に基づく、細胞領域および／または対象の領域の自動選択が可能になる。さらに、反応時間曲線およびこれらから計算されるどの値も後の参照のために保存することができ、その結果、本発明は、同じ複数の細胞に対して続きの複数回実施しなくてもよいことになる。すなわち、本発明は、多数の複数細胞に対する試験物質の効果を同時に評価するシステムを実現する。
【００４５】
特に好ましい実施形態においては、本発明は、単収縮の変化および分離された心臓心室筋細胞または心臓幹細胞の不応性の変化に基づいて、加速された再分極と遅延された再分極の両方を評価するための自動化されたインビトロＱＴ選別検定を記述する。上述の映像記録およびデータ解析手法を含む検定の実践の際に、心臓の再分極、変力状態および興奮性に影響を及ぼし不整脈誘発と関連づけられる薬物の効果が容易に、また迅速に評価される。
【００４６】
濃度依存性の効果が薬物の特徴付けの一部として評価され、濃度反応曲線として表され得る。心臓の収縮性に対する正負の変力性の効果が、収縮性反応の振幅に基づいて評価される。この検定により、細胞の、特に筋細胞の伸長および／または収縮の迅速で容易な評価が、光学ベースの画素変換技法、プログラム可能電気刺激およびコンピュータ解析を使用して可能になり、それによって、時間制約のある（および労働集約的）微小電極記録および解析が不要になる。さらに、検定は、機能的で統合された再分極検定が緊急に必要とされることに高いスループットで迅速に、効率的に応じて、化合物を心臓ＱＴ再分極傾向について選別することができる。この検定は、必要とされる実験条件（長い回復期間および平衡期間、ならびに筋肉組織当たりの線維の数が少ないことを含む）および人件費によるスループットの制約と動物使用の両方により高スループット選別に適さない現在の方法と比べて、いくつかの利点をもたらす。さらに、細胞反応を測定するのに光学的方法を使用することおよび統合された細胞系のメンバーではない細胞（すなわち、非近接細胞）を制御された生理学的条件下で評価することの結果として、本明細書に記載の方法は、従来の方法よりも実施するのが容易であり、要する時間が少なく、また化学物質および薬物に対する電気生理学的反応を評価するための微小電極記録技法の必要性をなくす。
【００４７】
したがって、本発明による検定では、電気刺激に対する収縮反応に基づいて、分離された筋細胞の不応性の変化を評価することができる。図１−４に示された結果は、基本的な技法および本発明により分離された一群の心臓筋細胞の有効不応期を評価したときに得られた記録を示す。図２は、刺激および記録のために使用された物理的装置の一例を示す。図１は、典型的な刺激プロトコルおよび様式化された反応を示す。図１において、心室筋細胞は、対をなすパルスプロトコルを使用して電気的に刺激され、筋細胞が、１ｓ間隔の３つのペーシング刺激と間隔が可変であった１つの早期刺激とからそれぞれ構成された３つのパルス群の刺激列を使用してペース調整された（電界刺激を使用）。有効不応期（ＥＲＰ）は、平均の規則的にペース調整された反応の２５％に大きさが等しい測定可能筋細胞収縮を引き起こさなくなる最長早期刺激間隔と定義された。図３は、５００、３００および２００ミリ秒の間隔の早期刺激に対する重ね合わされた画素数反応（平均ぺーシング反応に対し正規化）を示す。この群の筋細胞について測定されたＥＲＰは２００−３００ミリ秒の間であり、線形補間されて２４０ｍｓになり得る。早期パルスを増大する段の大きさを小さくすることによって、より大きい分解能を得ることができる。
【００４８】
この例では、電界刺激が、二相性方形波刺激器に接続された２つの白金電極によって得られた。単一の刺激パルスの持続時間は５ミリ秒であり、強度は、約７ボルト／ｃｍである閾値を超える１２０パーセント（１２０％）に設定された。槽温度は、生理温度またはその近くの制御された温度に維持された。ペーシング信号と筋細胞収縮は同時に記録された。
【００４９】
本発明の一実施形態において、試験物質に対する細胞の反応の測定時に生細胞をデジタル画像化用に呈示する装置が用意される。この実施形態において、その装置は、生細胞が試験されるときまでそれらを保存し養い、装置の一区域から別の区域まで生細胞を搬送し、細胞を試験物質に、例えば薬物に、場合によって電気刺激プロトコルに曝しながら生細胞をデジタル記録装置に呈示する役割を果たす。本発明による装置は、入口端部の流体入口ポートおよび出口端部の流体出口を有する流体チャネル、流体チャネルの入口ポートに接続された流体ポンプデバイス、流体チャネルを通って伸びる、生細胞に接着することができ光学的に透明または半透明なフィルムの細片、フィルムの上に配置された少なくとも１つのフローセルであって、フィルムと共にシールを形成して密閉環境を形成することができる光学的に透明な上面および側壁を有する空洞を備えるフローセル、および少なくとも１つのフローセルに接続された、少なくとも１つのフローセルをフィルムの上方に上昇させるまたは少なくとも１つのフローセルをフィルムの上まで下降させることができる垂直アクチュエータを含む。
【００５０】
好ましい一実施形態において、生細胞を保存し養う装置は、入口端部５０３に流体入口ポート５０２および出口端部５０５に流体出口または排出ポート５０４を有する細長い流体チャネル５０１を備える。好ましい１つの実施形態において、流体チャネル５０１の寸法は、およそ幅１インチ×深さ７／８インチ×長さ３６インチである。この実施形態において、適切な流体ポンプデバイス、例えばぜん動ポンプは、流体チャネル５０１の入口ポート５０２に接続され、その結果、特定の流体、例えばバッファ液５０６が、所望のレベル５０７に維持されることおよび生細胞６０１を養うために流体チャネル５０１の入口端部５０３から出口端部５０５まで流されることが可能になる。好ましい一実施形態においてはまた、流体チャネルの一区域を生理的温度またはその近くまで加熱するためのデバイス５０８が設けられ、その結果、流体チャネル５０１のこの領域の生細胞６０１が生理的温度またはその近くに維持されることも可能になる。
【００５１】
本発明の好ましい一実施形態において、生細胞６０１を搬送する装置は、光学的に透明または半透明で可撓性のポリマーフィルム６０２の細片の上に生細胞６０１を蒔くことによって実現される。好ましい１つの実施形態において、ポリマーフィルム６０２は、寸法がおよそ厚さ０．００５インチ×幅７／８インチ×長さ４６インチである。別の好ましい実施形態において、ポリマーフィルム６０２は、ポリマーフィルム６０２への生細胞６０１の付着を助長するために、例えばアミン官能化された副層６０３のプラズマ重合によって特別に処理されているＦＥＰ（フッ化エチレンプロピレン）フィルムの連続細片を含む。この実施形態によれば、細胞が蒔かれたポリマーフィルム６０１、６０２の連続細片は、必要に応じてピンチローラ電動駆動機構５０９によって平行移動される。
【００５２】
好ましい一実施形態において、生細胞６０１は、デジタル記録装置８０１に呈示されると共に、細胞が蒔かれたポリマーフィルム６０１、６０２の一部分を１つ以上のフローセル７０１のクラスターの下に配置することによって試験物質に曝され、各フローセル７０２は、光学的に透明な上面８０４およびポリマーフィルム６０２に対し封止しやすくするためのエラストマーの側壁８０５を有する空洞８０３を備える。好ましい１つの実施形態において、各フローセルは、およそ幅１．５ｍｍ×高さ１．５ｍｍ×長さ８ｍｍである。この実施形態において、試験物質が一方の端部に注入され他方の端部から出されることが可能なように、開口７０３がフローセルの各端部に設けられる。場合によって、この実施形態において、フローセルの各端部の開口７０３は、生細胞に対する電気刺激プロトコルを施すために使用される電気接点を含む。この実施形態においてはまた、フローセルがポリマーフィルム６０２の上方に上昇されることまたはポリマーフィルム６０２の上面に強制的に押し付けられることが可能になるように、１つ以上のフローセル７０１のクラスターが、電動垂直アクチュエータ８０７および接続ブラケット８０８から構成される固定機構８０６に接続される。押し付けられると、各フローセルが、独立していて元に戻すことができる完全に密閉された環境８０９を生細胞の選択されたものの周囲に形成され、試験物質を導入すること、場合によって電気刺激プロトコルを施すことおよび密閉された生細胞６０１をデジタル映像記録することが可能になる。
【００５３】
本発明の特定の諸実施形態について本明細書で添付の図面を参照して詳細に説明してきたが、本発明はこれらの特定の実施形態に限定されず、様々な変更および修正が当業者により、特許請求された本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、実施形態に作用されてよい。
【００５４】
本願は、参照によりその全体で組み込む２０１０年１１月１２日出願の米国特許仮出願第６１／４１３，２０１号の優先権を主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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