(57)【要約】本発明は、ＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片の治療有効量を炎症性腸疾患を有する対象の腸粘膜へ局所投与することによる、潰瘍性大腸炎及びクローン病を包含する炎症性腸疾患、並びにその他の関連疾患を治療するための方法及び組成物を提供する。本発明はさらに、腸粘膜においてＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片の治療有効量をin situで産生できる組み換え微生物を対象に投与することを含んでなる、炎症性腸疾患を治療する方法を提供する。【選択図】図１６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法が、対象の腸粘膜に治療有効量のＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片を局所的に投与することを含んでなる、それを必要としている対象の炎症性腸疾患、粘膜の炎症性病変又は腸の炎症性病変を治療する方法。
【請求項２】
ＩＬ−２７を胃腸送達システムを用いて投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
胃腸送達システムが、対象の腸粘膜でＩＬ−２７をin situで産生するのに有効な組み換え微生物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組み換え微生物が微小植物種である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
微小植物種が、Bacteriodes, Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Eschericia, Lactobacillus, Enterococcus, 又は Lactococcus の細菌属に属している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
組み換え微生物が、非共生性で非コロニー形成性の細菌種である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
組み換え微生物がグラム陽性細菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細菌種が、Lactococcus 又は Enterococcus 属に属している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
胃腸送達システムが、ＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片を含有している微小粒子である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
微小粒子がさらに、胃腸管内にＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片の制御放出を可能にするコーティングを含有している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
コーティングがさらに、ＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片の連続放出又は持続放出を可能にする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
炎症性腸疾患がクローン病である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＩＬ−２７の治療有効量が腸粘膜の炎症を少なくとも１０〜９０％減少させるのに十分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＩＬ−２７の治療有効量が腸粘膜の炎症を少なくとも７０〜８０％減少させるのに十分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
方法がさらに、第二治療薬を併用投与することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
第二治療薬が、コルチコステロイド、スルファサラジン、スルファサラジンの誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、サイトカイン、又はサイトカイン拮抗薬である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
サイトカイン又はサイトカイン拮抗薬が腫瘍壊死因子α拮抗薬、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３５である，請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第二治療薬を静脈内、腹腔内、経口又は経皮投与によって併用投与する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
方法が、治療有効量のＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片を産生できる組み換え微生物を対象に投与することを含んでなる、それを必要としている対象におけるＩＬ−２７に感受性がある疾患を治療する方法。
【請求項２１】
組み換え微生物が対象の腸粘膜においてＩＬ−２７をin situで産生する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
組み換え微生物が微小植物種である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
微小植物種が、Bacteriodes, Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Eschericia, Lactobacillus, Enterococcus, 又は Lactococcus の細菌属に属している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
組み換え微生物が、非共生性で非コロニー形成性の細菌種である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
組み換え微生物が、グラム陽性細菌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
細菌種が、Lactococcus 又は Enterococcus 属に属している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
疾患が、腸、胃、肝臓、膵臓又は腹膜を包含する、胃腸管の組織における炎症性疾患である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
疾患が、Ｉ型糖尿病、重症な食物アレルギー、又はセリアック病を包含する、胃腸系以外の炎症性又は非炎症性疾患である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
ＩＬ−２７の治療有効量が胃腸管における非特異的炎症を少なくとも１０〜９０％減少させるのに十分である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ＩＬ−２７の治療有効量が胃腸管における非特異的炎症を少なくとも７０〜８０％減少させるのに十分である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
疾患が結腸癌又は胃腸管の組織のその他の癌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
方法がさらに、第二治療薬を併用投与することを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
第二治療薬が、コルチコステロイド、スルファサラジン、スルファサラジンの誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、サイトカイン、又はサイトカイン拮抗薬である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
サイトカイン又はサイトカイン拮抗薬が腫瘍壊死因子‐α拮抗薬、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３５である，請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
第二治療薬を静脈内、腹腔内、経口又は経皮投与によって併用投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
胃腸管の組織に治療有効量のＩＬ−２７をin situで産生できる組み換え微生物を含んでなる、医薬組成物。
【請求項３７】
組み換え微生物が微小植物種である、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
微小植物種が、Bacteriodes, Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Eschericia, Lactobacillus, Enterococcus, 又は Lactococcus の細菌属に属している、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
組み換え微生物が、非共生性で非コロニー形成性の細菌種である、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
組み換え微生物がグラム陽性細菌である、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
細菌種が、Lactococcus 又は Enterococcus 属に属している、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
胃腸管の組織に治療有効量のＩＬ−２７をin situで発現できる組み換え Lactococcus lactis を含んでなる、医薬組成物。
【請求項４３】
微小粒子が胃腸管内にＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片の制御放出を可能にするコーティングを含んでいる、活性成分を胃腸管に放出するのに適しているＩＬ−２７を含んでなる微小粒子。
【請求項４４】
請求項４３に記載の微小粒子を含んでなる、医薬組成物。
【請求項４５】
腸粘膜内に治療有効量のＩＬ−２７をin situで産生できる組み換え微生物及び炎症性腸疾患の治療に使用するための説明書を含んでなる、キット。
【請求項４６】
組み換え微生物が微小植物種である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
微小植物種が、Bacteriodes, Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Eschericia, Lactobacillus, Enterococcus, 又は Lactococcus の細菌属に属している、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
組み換え微生物が、非病原性の細菌種である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４９】
組み換え微生物がグラム陽性細菌である、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
細菌種が、Lactococcus 又は Enterococcus 属に属している、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
微小粒子がＩＬ−２７及びＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片の胃腸管内への制御放出を可能にするコーティングを含んでいる、活性成分を胃腸管内に放出するのに適している微小粒子を含んでなるキット。
【請求項５２】
キットが第二治療薬をさらに含んでいる、請求項４５又は５１に記載のキット。
【請求項５３】
第二治療薬が、コルチコステロイド、スルファサラジン、スルファサラジンの誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、サイトカイン、又はサイトカイン拮抗薬である、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
サイトカイン又はサイトカイン拮抗薬が腫瘍壊死因子‐α拮抗薬、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３５である，請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
炎症性腸疾患がクローン病である、請求項４５に記載のキット。
【請求項５６】
炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、請求項４５に記載のキット。
【請求項５７】
対象が哺乳動物である、請求項１又は３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項５８】
対象がヒトである、請求項１又は３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項５９】
ＩＬ−２７が配列番号１（ヒト）又は配列番号３（マウス）で表されるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１又は３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項６０】
ＩＬ−２７が配列番号２（ヒト）又は配列番号４（マウス）で表されるアミノ酸配列を有している、請求項１又は３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項６１】
ＩＬ−２７が配列番号１（ヒト）又は配列番号３（マウス）で表されるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
ＩＬ−２７が配列番号２（ヒト）又は配列番号４（マウス）で表されるアミノ酸配列を有している、請求項３６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１０年６月１７日に出願された、米国仮特許出願第６１／３５５，９６５号の優先権を主張し、その内容の全ては参照により本明細書に取り込まれている。
【０００２】
（政府の支援）
本研究は国立衛生研究所（National Instituteｓ of Health）の所内研究プログラム（ＭＨＳＮ２６３２００９００００７１）によって支援された。政府は本発明に対してある特定の権利を有している。
【０００３】
（参照による取り込み）
本明細書で引用又は参照された全ての文献及び本明細書で引用された文献で引用又は参照された全ての文献は、本明細書で述べられているか又は参照により本明細書に取り込まれている何れかの文献にある産物に関する製造会社の取扱い説明書、説明、製品規格、及び製品仕様書と共に、参照により本明細書に取り込まれていて、本発明の実施に用いることができる。
【背景技術】
【０００４】
１．発明の分野
本発明は、適切な送達手段、例えば、望ましいサイトカインを産生するように遺伝子組み換えされた組み換え微生物又は対象の胃腸管にサイトカインを局所的に送達する微小粒子による送達によって、抗炎症性サイトカインを腸粘膜に投与することによる、潰瘍性大腸炎及びクローン病を包含する、炎症性腸疾患の治療に関している。
【０００５】
２．背景
炎症性腸疾患は、先天性及び適応免疫応答の異常な活性化に関与する胃腸管の部分の慢性非特異性炎症によって特徴付けられる胃腸疾患のグループを示す。合衆国だけで１４００万人の個人が炎症性腸疾患に罹っている。潰瘍性大腸炎及びクローン病は、ヒトにおける炎症性腸疾患の最も顕著な例である。これらは小児の発育遅延、直腸脱、血便（例えば、下血及び／又は血便）、消耗、鉄の欠乏、及び貧血、例えば、鉄欠乏性貧血及び慢性疾患に伴う貧血又は慢性炎症性の貧血を包含する、多くの症状及び合併症と関連している。さらに、結腸を手術的に除去しない限り潰瘍性大腸炎患者の２０％が最終的に結腸癌を発症するという点で、炎症性腸疾患は非常に結腸癌に罹り易くさせる。
【０００６】
一般に、炎症性腸疾患は腸内細菌に対する異常な炎症性応答の進展を伴う腸管ホメオスタシスの崩壊を反映していると考えられている。乱された宿主−細菌相互作用というこの仮説を支持する１つの証拠は、抗生物質による治療が患者における疾患活性の改善に適度な効果を有しているということである。さらなる証拠は、炎症性腸疾患の患者は腸内細菌と特異的に反応するＴ細胞を有しているのに対して、正常な患者はこのようなＴ細胞を欠いているという証明に由来している。炎症性腸疾患のマウスモデルが広範に研究されて、腸内細菌と過剰反応する、免疫系が腸に付加的な損傷を引き起こすという考えを裏付けている。
【０００７】
潰瘍性大腸炎は、結腸粘膜に最初に徴候を有する、慢性、非特異的、炎症性、そして潰瘍性疾患であるとより具体的に言及される。これは高い頻度で、出血性下痢、痙攣性腹痛、血便及び粘液便、不快感、発熱、貧血、食欲不振、体重減少、白血球増加、低アルブミン血症、及び上昇した赤血球沈降速度（「ＥＳＲ」）によって特徴付けられる。合併症には、出血、中毒性大腸炎、中毒性巨大結腸症、偶発性直腸膣瘻、及び結腸癌の発症に対するリスク増加を包含できる。この疾患は、関節炎、強直性脊柱炎、仙腸関節炎、後部ブドウ膜炎、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、及び上強膜炎のような、非結腸性合併症とも関連している。治療は、疾患の重症度及び期間でかなり変化する。例えば、脱水及び電解質不均衡を防ぐための輸液療法が重症症状に対してしばしば適応されている。また、特定の食事療法がある場合に有用である。薬剤は各種のコルチコステロイド、スルファサラジン及びその幾つかの誘導体、及び場合により免疫抑制剤を包含する。
【０００８】
クローン病は、潰瘍性大腸炎と共通の特性を数多く持っている。クローン病は、広範に広がっている潰瘍性大腸炎の病変とは対照的に、病変が隣接する正常な腸と明確に区別できるという点で識別しやすい。クローン病は主に回腸（回腸炎）及び回腸と結腸（回結腸炎）を悪化させる。場合によっては、結腸だけが罹患して（肉芽腫性大腸炎）、ある場合は小腸全体が発症する（空回腸炎）。まれに、胃、十二指腸、又は食道が罹患する。臨床例のほぼ半数において、病変はサルコイド様の類上皮細胞肉芽腫を含んでいる。クローン病の病変は深い潰瘍、浮腫、及び線維症を含む貫壁性になることがあり、これは閉塞及び瘻孔形成を、さらに膿瘍形成をもたらすことがある。これは、線維症、閉塞、瘻孔形成、及び膿瘍の合併症が潰瘍性大腸炎に見られることもたまにあるが、通常非常に浅い病変を生じる潰瘍性大腸炎とは対照的である。
【０００９】
治療法は両疾患に対して同様であって、ステロイド、スルファサラジン及びその誘導体、並びにシクロスポリンＡ、メルカプトプリン及びアザチオプリンのような免疫抑制剤を包含する。最近開発された治療法では、炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の全身的遮断が幾つかのクローン病症例で高い有効性を示したが、患者の約３分の２が応答しなかった。さらに、長期に渡るＴＮＦ−αの中和が他の部位での感染性、例えば結核の再活性を増大するという懸念がある。従って、潰瘍性大腸炎及びクローン病、並びに胃腸管及び関連領域のその他の炎症性疾患を包含する、炎症性腸疾患を治療するためのより特異的な治療手段の要求が高まっている。
【００１０】
ＩＢＤを包含する、胃腸管に関連する炎症を下方制御する最近の代替え手段は、抗炎症性サイトカイン治療、すなわち、炎症を減少させる傾向にあるという特性を有しているサイトカインの投与によるものである。例えば、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、あらゆる側面の免疫活性の完全な下方制御を示す、強力で排他的な抗炎症性サイトカインである。ＩＬ−１０は最近臨床的に評価されている。しかしながら、遺伝子組み換えＩＬ−１０の全身投与は、望ましくない副作用のために完全に中止されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＩＢＤ及び胃腸管のその他の関連する炎症性疾患を治療するための現在知られている治療方法に関する当該技術分野における上記の問題点を考慮して、このような問題点を最小化又は回避する新しい治療方法が大変望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、潰瘍性大腸炎及びクローン病を包含する炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及びその他の関連する炎症性疾患を治療するためのこれまで未知の治療方法を提供することによって、当該技術分野における問題点を克服する。この方法は、サイトカイン、インターロイキン−２７（「ＩＬ−２７」）を腸粘膜に投与すること、例えば、安全で効果的な方法で、微生物による送達システムを用いてＧＩ管に局所送達することによるか、又は対象の胃腸管内へサイトカインの制御された送達に適している微小粒子として、を包含している。
【００１３】
インターロイキン−２７（ＩＬ−２７）は多面的なサイトカインであって、炎症促進性（Cox et al., J. Exp. Med. 208:115-123 (2010）を参照されたい）及び抗炎症活性（Schmidt et al., Inflamm. Bowel Dis. 11:16-23 (2005)を参照されたい）の両方を有している。ＩＢＤ病変におけるＩＬ−２７の役割は解決されないままであり、今のところ、如何にＩＬ−２７がその抗炎症性を増強し、そして／又はその炎症促進特性を無効にできるかについて当該技術からは明らかでない。ＩＢＤを治療するためにＩＬ−１０の代替物を探すときに、ＩＬ−２７の抗炎症特性がＩＬ−１０の誘導に関連しているので、ＩＬ−２７は選ばれそうにもない。
【００１４】
しかし、本発明者らは驚くべきことに、in situで送達されるとＩＬ−２７が、ＩＬ−１０より著しく効果的な抗炎症性分子であることを発見した。従って、本発明は、炎症性腸疾患を治療するためのこれまで未知で、さらに予想外な、効果的な治療方法を提供する。この方法は、例えば、微生物送達システム又は胃腸管内への活性成分の制御された送達をもたらす微小粒子を用いて、治療剤ＩＬ−２７を腸粘膜へ直接局所投与することを包含している。本発明は免疫抑制サイトカインの全身送達に関連する負の効果（Colombel, Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2:163-176 (2008); Sandborn, Dig Dis.  28:536-542 (2010); 及び Van Assche et al., Curr. Opin. Gastroenter. 25:323-328 (2009)を参照されたい）も避けて、驚くべきことにＩＬ−２７の炎症促進活性を無効にした。
【００１５】
一態様では、本発明はそれを必要としている対象における炎症性腸疾患、粘膜の炎症性病変又は腸管炎症性病変を治療する方法を提供する。実施態様では、方法はＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片の治療有効量を対象の腸粘膜に局所的に投与することを包含する。
【００１６】
実施態様では、胃腸送達システムを用いて、ＩＬ−２７を投与する。
【００１７】
実施態様では、炎症性腸疾患はクローン病又は潰瘍性大腸炎である。
【００１８】
一態様では、本発明は、それを必要としている対象におけるＩＬ−２７に敏感である疾患を治療する方法を提供する。実施態様では、方法は、治療有効量のＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片を産生できる組み換え微生物を対象に投与することを包含する。実施態様では、組み換え微生物が対象の腸粘膜においてin situでＩＬ−２７を産生する。
【００１９】
実施態様では、疾患は胃腸管の組織における炎症性疾患で、腸、胃、肝臓、膵臓又は腹膜の炎症を包含する。実施態様では、疾患は胃腸系の外の炎症性又は非炎症性疾患であって、Ｉ型糖尿病、重篤な食物アレルギー、又はセリアック病を包含する。実施態様では、疾患は結腸癌又は胃腸管の組織のその他の癌である。
【００２０】
一態様では、本発明は、ＩＬ−２７を含有している微小粒子を提供する。実施態様では、微小粒子は胃腸管内で活性成分を放出するのに適している。関連する実施態様では、微小粒子はＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片の胃腸管内への制御放出が可能なコーティングを有している。
【００２１】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されている微小粒子の何れかを有している医薬組成物を提供する。実施態様では、医薬組成物は上記の微小粒子を有している。
【００２２】
一態様では、本発明は、胃腸管の組織においてin situで治療有効量のＩＬ−２７を産生できる組み換え微生物を有している医薬組成物を提供する。
【００２３】
関連する態様では、本発明は、胃腸管の組織においてin situで治療有効量のＩＬ−２７を発現できる乳酸連鎖球菌（Lactococcus Lactis）を有している医薬組成物を提供する。
【００２４】
一態様では、本発明は、胃腸管の組織においてin situで治療有効量のＩＬ−２７を産生できる組み換え微生物を含有しているキットを提供する。実施態様では、キットは炎症性腸疾患の治療に用いるための使用説明書を含有している。実施態様では、炎症性腸疾患はクローン病又は潰瘍性大腸炎である。
【００２５】
一態様では、本発明は、胃腸管内に活性成分を放出するのに適している微小粒子を含有しているキットを提供する。実施態様では、ここで微小粒子はＩＬ−２７を含有している。実施態様では、微小粒子はＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片を胃腸管内へ制御放出できる剤形又はコーティングを有している。関連する実施態様では、コーティングはさらにＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片の連続又は持続放出が可能である。実施態様では、キットは炎症性腸疾患の治療に用いるための使用説明書を含有している。実施態様では、炎症性腸疾患はクローン病又は潰瘍性大腸炎である。
【００２６】
上記態様及び実施態様の何れかでは、ＩＬ−２７の治療有効量は、腸粘膜の炎症を少なくとも１０〜２５％、２５〜５０％、１０〜５０％、５０〜９０％、５０〜７５％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９０〜９９％、又は９５〜９９％減少するのに十分である。実施態様では、ＩＬ−２７の治療有効量は腸粘膜の炎症を少なくとも１０〜９０％減少するのに十分である。関連する実施態様ではＩＬ−２７の治療有効量は腸粘膜の炎症を少なくとも７０〜８０％減少するのに十分である。
【００２７】
上記態様及び実施態様の何れかでは、方法は第二治療薬を併用投与することを含んでいるか又はキットが第二治療薬を含有している。実施態様では、第二治療薬はコルチコステロイド、スルファサラジン、スルファサラジンの誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、サイトカイン又はサイトカイン拮抗薬である。関連する実施態様では、サイトカイン又はサイトカイン拮抗薬は、腫瘍壊死因子−α拮抗薬、ＩＬ−１０。ＩＬ−２７、又はＩＬ−３５である。
【００２８】
実施態様では、併用投与される第二治療薬は静脈内に、腹腔内に、経口で又は経皮で投与される。関連する実施態様では、併用投与される第二治療薬は胃腸送達システムを用いて投与される
【００２９】
上記態様及び実施態様の何れかでは、胃腸送達システムは、対象の腸粘膜においてin situでＩＬ−２７を産生するのに有効な組み換え微生物である。
【００３０】
上記態様及び実施態様の何れかでは、組み換え微生物は本明細書に記載されている微小植物種の何れかであって、これに限定されないが、ｉ）バクテロイデス（Bacteriodes）、クロストリジウム（Clostridium）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、ユーバクテリウム（Eubacterium）、ルミノコッカス（Ruminococcus）、ペプトコッカス（Peputococcus）、エシェリキア（Eschericia）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、エンテロコッカス（Enterococcus）、又はラクトコッカス（Lactococcus）の細菌属；ｉｉ）ハンゼヌラ（Hansenula）、クリベロマイセス（Kluiveromyces）、ピキア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、又はシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）の酵母属；及びｉｉｉ）カンジダ（Candida）、サッカロミセス（Saccharomyces）、アスペルギルス（Aspergillus）又はペニシリウム（Penicillium）の真菌属に属する微小植物種を包含する。実施態様では、胃腸送達システムは、ラクトコッカス又はエンテロコッカス属に属する細菌種である。関連する実施態様では、細菌種は乳酸連鎖球菌（L. lactis）又はエンテロコッカス・フェシウム（E, faecium）である。ある実施態様では、細菌種は L. lactis faecium 又はその亜種及び菌株の何れかで、例えば、限定されないが、乳酸連鎖球菌ｓｓｐ．クレモリス（cremoris）、乳酸連鎖球菌ｓｓｐ．ホルドニエ（hordniae）、乳酸連鎖球菌ｓｓｐ．ラクティス、乳酸連鎖球菌ｓｓｐ．bv. ジアセチルラクティス（diacetylactis）などである。ある実施態様では、細菌種がE, faecium 又はその亜種又は菌株の何れかであって、例えば、限定されないが、E, faeciumＬＭＧ１５７０９株である。
【００３１】
実施態様では、胃腸送達システムは非共生且つ非コロニー形成細菌種である。関連する実施態様では、細菌はグラム陽性細菌である。ある実施態様では、細菌種はラクトコッカス又はエンテロコッカス属に属している。
【００３２】
実施態様では、胃腸送達システムは、ＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片を含有している微小粒子である。関連する実施態様では、微小粒子はさらに、ＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片を胃腸管内に制御放出できる剤形を含有している。関連する実施態様では、微小粒子はさらに、ＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片を胃腸管内に制御放出できるコーティングを含有している。コーティングは薬剤の制御放出をもたらすことができる、本明細書に記載されているか又は当該技術分野で周知のコーティングの何れかでよい。実施態様では、コーティングはさらにＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片の連続又は持続放出を可能にする。
【００３３】
上記態様及び実施態様の何れかでは、対象は哺乳動物であってよい。実施態様では、対象はヒトである。
【００３４】
上記態様及び実施態様の何れかでは、ＩＬ−２７は配列番号１（ヒト）又は配列番号３（マウス）で表されるヌクレオチド配列でコードされる。
【００３５】
上記態様及び実施態様の何れかでは、ＩＬ−２７は配列番号２（ヒト）又は配列番号４（マウス）で表されるアミノ酸配列を有している。
【００３６】
本発明の更なる目的及び利点は、一部は以下の説明に記載され及び一部は説明から自明であり、又は本発明の実施によって確認できるだろう。本発明の目的及び利点は、添付されている特許請求の範囲で指摘されているものを含む、本明細書に開示されている構成要素及び組合わせを用いて実現され達成されるだろう。前記の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方は単に例示的で説明的であって、特許請求されている本発明を限定するものではないことを理解されたい。この明細書に取り込まれてその一部を構成する、添付されている図面は本発明の幾つかの実施態様を説明して、明細書と共に本発明の精神を説明するのに役立っている。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
一例として提供されているが、本発明が記載されている具体的な実施態様に限定されることを意図していいない、以下の詳細な記載は、添付した図面と組合わせると最も良く理解することができる。
【００３８】
【図１】図１は、図で説明したＩＬ−２７産生及びその活性を提供する。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、遺伝子組み換えされたL. lactis がＩＬ−２７（ＬＬ−ＩＬ−２７）及びＩＬ−３５（ＬＬ−ＩＬ−３５）を発現できることを示す。図２Ａはゲルを含んでいる。マウスＩＬ−２７又はマウスＩＬ−３５を発現する組み換えL.lactis の培養物から上澄液を採取して、そこに含まれているタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。検出可能な抗Ｅｂｉ３抗体（「Ｅｂｉ３」はＩＬ−２７及びＩＬ−３５両方のβ鎖成分である）を用いてＩＬ−２７及びＩＬ−３５をウェスタンブロットで検出した。図２Ｂはゲルを含んでいる。ＩＬ−２７の生物活性を、そのリンパ球を刺激する能力及びウェスタンブロットで検出したＳｔａｔ １及びＳｔａｔ ３のリン酸化を誘導する能力によって測定した。その結果は、組み換え L.lactis によって産生されたＩＬ−２７が活動性で、Ｓｔａｔ １及びＳｔａｔ ３のリン酸化をもたらすことを明らかにした。図２Ｃはグラフを含んでいる。ＩＬ−２７の生物活性を、ＥＬＩＳＡで確認する増大したＩＬ−１０分泌及び定量ＰＣＲで確認するようなＴｂｅｔｍＲＮＡ産生によっても測定した。ｒＩＬ−２７＝市販の組み換えＩＬ−２７；ＬＬ−ＩＬ−２７＝ＩＬ−２７を発現する組み換え L.lactis 。
【図３】図３Ａ及び３Ｂは、ＬＬ−ＩＬ−２７がインビボで局所送達されることを示す。ＬＬ−ＩＬ−２７を正常Ｃ５７Ｂ１／６雄性マウスに強制経口投与した。図３Ａは、処置マウスの腸からのL.lactis の回収を示すグラフを含んでいる。ＬＬ−ＩＬ−２７投与の１２時間後に、異なった領域の腸を、エリスロマイシン耐性細菌コロニーについて分析した。有意な数のコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）が腸の至る所で検出された（２匹のマウスから得られた代表的な結果を示す）。生きている L.lactis を胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、及び近位、末端、且つ遠位の結腸中から回収した。図３Ｂは、処置したマウスにおけるＩＬ−１０レベルを示すグラフを含んでいる。強制投与６時間後に、ＩＬ−ベクターでコントロール処置したマウス（Ｃで表した）と比較したＬＬ−ＩＬ−２７処置マウスの多様な領域の管腔内容物中のＩＬ−１０を検出した（Ｔで表した）。その結果は、強制経口投与された L.lactis ＩＬ−２７は標的臓器において局所的に作用可能であることを明らかにした。
【図４】図４は、ＬＬ−ＩＬ−２７の治療効果を示すグラフを含んでいる。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のＴ細胞移植モデルを用いてＬＬ−ＩＬ−２７の幾つかの潜在的な治療効果を評価した。処置は症状発症時に、例えば、Ｒａｇ１−１−宿主におけるＣＤ４５ＲＢ（ｈｉ）Ｔ細胞の移植後６週間に開始した。６９日目に、ＬＬ−ＩＬ−２７で処置したＩＢＤマウス（ｎ＝５）は全て健常であったのに対して、ＩＬ−コントロールベクター処置マウス（ｎ＝５）はどれも最終時点まで生存していなかった。
【図５】図５Ａ〜５Ｊは、ＬＬ−ＩＬ−２７が遠位結腸を絨毛破壊及び炎症性浸潤から守ることを示す組織学的染色である。ＬＬベクターのコントロール群及びＬＬ−ＩＬ−３５で処置したその他の群における深刻な病変と比較すると、１匹のＩＢＤマウスにおける軽度な細胞浸潤を除いてＩＬ−２７群の細胞に病変が観察されなかった。遠位結腸の切片（２ｃｍ）をホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋して、通常の方法でＨ＆Ｅ染色を実施した。図５Ａ〜５Ｄ：非処置ＩＢＤマウス。Ａ）４倍、炎症性浸潤及び過形成腺窩によって非常に肥厚した結腸粘膜。Ｂ）１０倍、杯細胞が枯渇した過形成腺窩、腺窩腫瘍及び粘膜における炎症性浸潤。Ｃ）１０倍、腸上皮内腫瘍、腺窩腫瘍及び粘膜における炎症性浸潤。Ｄ）４０倍、単核細胞、好中球及び好酸球の炎症性浸潤、図５Ｅ〜５Ｇ：ＬＬ−ＩＬ−２７処置マウス。Ｅ）４倍、結腸粘膜は正常な組織構造を有している。Ｆ）１０倍、杯細胞を有する正常な結腸腺窩。Ｇ）４０倍、杯細胞を有する正常な結腸腺窩、炎症性浸潤がない。図５Ｈ〜５Ｊ：ＬＬ−ＩＬ−３５処置ＩＢＤマウス。Ｈ）１０倍、炎症性浸潤及び過形成腺窩を有する肥厚した結腸粘膜。Ｉ）１０倍、杯細胞が枯渇した過形成腺窩及び粘膜における炎症性浸潤。Ｊ）４０倍、単核細胞、好中球及び好酸球の炎症性浸潤。
【図６】図６は、ＬＬ−ＩＬ−２７対非処置マウス（「ＵＴ」）、ＬＬ−ベクターマウス及びＬＬ−ＩＬ−３５マウスによって生じる保護を示すグラフを含んでいる。保護は炎症性腸疾患の幾つかのパラメータによって測定して疾患活動性インデックス（Disease Activity Index: DAI）に反映した（Ostanin et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296:G135-G146 (2009)を参照されたい。これは慢性大腸炎のＴ細胞移植モデルに関するより詳細のための参照により本明細書に取り込まれている）。ＬＬ−ＩＬ−２７は便中の潜血の出現を完全に防止した。さらに、ＬＬ−ＩＬ−２７で処置したＩＢＤマウスはほぼ正常な便の硬さを伴い、そして体重減少がある程度緩和された。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、ＬＬ−ＩＬ−２７の投与が処置したＩＢＤマウスにおける炎症性サイトカインの転写レベルを減少することを示す。図７Ａは、ＬＬ−ＩＬ−２７ＩＢＤマウス、ＬＬ−ベクターＩＢＤマウス、及び正常健常マスス由来の遠位結腸における炎症性サイトカインの転写レベルに対するＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示すグラフを含んでいる。ベクター群と比べて、ＬＬ−ＩＬ−２７群においてＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＮＦγ、ＩＬ−２３、及びＩＬ−４に関する転写の有意な減少が観察された。Ｔｈ１７細胞のマーカーである、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ及びＲＯＲγｔの転写も減少した。図７Ｂは、ＰＴ−ＰＣＲ産物の代表的なゲルを含んでいる。
【図８】図８は、組み換えヒトＩＬ−２７のヌクレオチド配列を提供し、ここではα鎖配列とＥＢＩ３鎖配列が融合している。この配列を配列番号１と定義する。
【図９】図９は、配列番号１に対応するアミノ酸配列を提供し、これは配列「ＳＲＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＧＫＬ」（配列番号５）を有しているリンカーによってＥＢＩ３鎖と融合しているα鎖を含んでいる。このアミノ酸配列を配列番号２と定義する。
【図１０】図１０は、組み換えマウスＩＬ−２７のヌクレオチド配列を提供し、ここではα鎖配列とＥＢＩ３鎖配列が融合している。この配列を配列番号３と定義する。
【図１１】図１１Ａは、配列番号３に対応するアミノ酸配列を提供し、これは配列「ＳＲＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＧＫＬ」を有しているリンカーによってＥＢＩ３鎖と融合しているα鎖を含んでいる。この配列を配列番号４と定義する。図１１Ｂは、マススＩＬ−２７構築物の詳細な図解を提供する。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、マウス及びヒトＩＬ−２７の構築物を説明している。図１２Ａは、マウスＩＬ−２７をコードして、L.lactis を形質転換するために用いることができる、ＤＮＡ発現ベクター、ｐＡＧＸ０７６６の構築物の図解を提供する。図１２ＢはヒトＩＬ−２７をコードして、L.lactis を形質転換するために用いることができる、ＤＮＡ発現ベクター、ｐＬＬｈＩＬ−２７の構築物の図解を提供する。
【図１３】図１３Ａ及び１３ＢはマウスＩＬ−３５の配列を示す。図１３Ａはヌクレオチド配列（配列番号６）を提供し、図１３Ｂは対応するアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図１４】図１４は、ＩＬ−１０の誘導にはＲａｇ１−１−マウスにおけるＴ細胞の存在が必要であることを示すグラフを含んでいる。Ｒａｇ−１−欠損Ｔ細胞及びグラフはＬＬ−ＩＬ−２７によるＩＬ−１０の誘導がないことを示す。Ｔ細胞の移植に続いてＩＢＤがＲａｇ−１−マウスに誘導されて、グラフはＬＬ−ＩＬ−２７がこれらのマウスにＩＬ−１０を誘導することを示す。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂは、ＬＬ−ＩＬ−２７で処置したＩＢＤマウスにおけるＩＬ−１０産生Ｔ細胞を特徴付けている。上皮内細胞（ＩＥＬ）を、健常Ｃ５７Ｂ１／６マウス、ＩＢＤＲａｇ１−１−非処置（ＵＴ）マウス、ＬＬ−コントロールベクターで処置したＩＢＤマウス、及びＬＬ−ＩＬ−２７で処置したＩＢＤマウスから単離した。図１５Ａは、ＬＬ−ＩＬ−２７ＩＢＤマウスにおいて顕著なＣＤ４＋ＣＤ８＋集団の存在を示しているフローサイトメトリー結果を含んでいる。対照的に、健常Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、ＣＤ８細胞の優位性を示し；ＩＢＤＲａｇ１−１−非処置マウス及びＬＬ−ベクターで処置したＩＢＤマウスはＣＤ４浸潤を示した。図１５Ｂはフローサイトメトリー結果を含んでいる。ＩＬ−１０レポーターＴ細胞を用いてＩＢＤを誘導した。その結果はＬＬ−ＩＬ−２７ＩＢＤマウスで観察された最も優位なレポーター発現はＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞であったことを示している。
【図１６】図１６は、ＩＬ−２７がＩＬ−１０と比べてインビボで増大した保護をもたらすことを明らかにしている。ＩＬ−２７（ＬＬ−ＩＬ−２７）又はＩＬ−１０（ＬＬ−ＩＬ−１０）を発現する組み換え L.lactis の効果をＩＢＤのマウスモデルで評価した。図１６は、ＬＬ−ＩＬ−２７及びＬＬ−ＩＬ−１０マウスの生存率を示すグラフを含んでいる。その結果はＩＬ−１０は死を遅延させたものの、生存したＬＬ−ＩＬ−１０マウスは存在しなかったことを示している。対照的に、ＬＬ−ＩＬ−２７は実質的により大きな保護をもたらした。より多くのマウスが生存して、死亡したマウスは長期間生存していた。
【図１７】図１７は、エンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）によるヒトインターロイキン−２７（ｈＩＬ２７）の発現を示す。図１７は、E. faecium 株ｓＡＧＸ０２７０（負のコントロール）及びｓＡＧＸ０３１７によるヒトｈＩＬ２７分泌の定量を示すグラフである。分泌されたｈＩＬ２７の量を３時間におけるｎｇ／１０９ＣＦＵ細胞として表して、Ｙ軸上に示した。その結果は、E. faecium 株ｓＡＧＸ０３１７が異種のｈＩＬ２７を効率的に分泌できるということを明らかにした。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、少なくとも一部分が、免疫抑制及び免疫刺激の両方（又は抗炎症性及び炎症促進性）の特性（すなわち、ＩＬ−２７の多面的特性と称される）を有していることが知られているサイトカインである、ＩＬ−２７が炎症性腸疾患及びＩＬ−２７に感受性があるその他の疾患の治療に対する治療的有用性をもたらすという予期せぬ発見に基づいている。ＩＢＤを治療するための治療分子としてのＩＬ−２７の多面的特性及びＩＬ−１０にこれが無いことが、ＩＬ−２７をＩＢＤを治療するためには見込みのない候補としている。それにも関わらず、本発明者らは、本発明の方法及び技術、例えば、微生物に基づく送達系、又は対象の胃腸管内への制御送達をもたらすコーティングを有する微小粒子を介する局所送達を用いたときに、ＩＢＤの治療におけるＩＬ−２７の著しい有効性を驚いたことに発見した。
【００４０】
（本発明によって治療可能な炎症性腸疾患及びその他の疾患、ＩＢＤ）
さらなる背景として、炎症性腸疾患（本明細書では「ＩＢＤ」と称することもできる）は、潰瘍性大腸炎（本明細書では「ＵＣ」と称することもできる）及びクローン病（本明細書では「ＣＤ」と称することもできる）の総称であって、これは異なった疾患と見なされるが、多くの共通する特性を有し、そして恐らく少なくとも幾つかの病理学的メカニズムを共有している。まれに、それらの症状の特異性のために、クローン病とも潰瘍性大腸炎とも確定診断できない。両者は、腹痛、嘔吐、下痢、直腸出血、体重減少を含む多様な重複症状、並びに関節炎、肝臓及び眼疾患、皮膚徴候、壊疽性膿皮症及び原発性硬化性胆管炎を含む多種の関連疾患を示すことがある。診断は通常、病変の生検を用いた結腸内視鏡検査による。
【００４１】
一般に、ＣＤは口から直腸に渡る消化管のどの部分にも影響を及ぼし得る。それに反して、ＵＣは主に結腸及び直腸に限定される。さらに、ＵＣは通常、腸の粘膜上皮内層に限定されるのに対して、ＣＤは全ての腸壁に影響を及ぼし得る。従って、ＵＣはほぼ結腸、直腸の近位に現れて、特徴的な病変は粘膜の表在性潰瘍であり：ＣＤは、胃、食道及び十二指腸を含む、腸内のどこにでも出現する可能性があり、そして病変は通常、広範な線状亀裂と言われている。
【００４２】
これらの疾患の正確な病因は未知であって、初期病変は明確に特定されていない；しかし、特にクローン病においては、表層上皮の斑状壊死、腺状腺窩に隣接する白血球の巣状滞留、並びに上皮内リンパ球及びある特定のマクロファージ集団の増大した数が推定状の初期変化として記載されている。１つの説は、ＩＢＤは腸内細菌に対する異常な炎症応答の進展による腸内ホメオスタシスの破綻を反映するということである。この乱された宿主−微生物相互作用という仮説を支持する１方面の証拠は、抗生物質による治療が患者における疾患活性を改善することに対して適度な効果を有しているということである。さらなる証拠は、ＩＢＤ患者は腸内細菌に対して特異的に反応するＴ細胞を有しているのに対して、正常患者はそのようなＴ細胞が欠如しているという証明に由来している。また、ＩＢＤのマウスモデルが広範に研究されて、腸管フローラに対して過剰に反応する、免疫系が腸に巻き添え損害をもたらす可能性があるという概念を支持している。それにも関わらず、免疫系の異常、遺伝性素因、環境的及び生理学的因子を含む因子の組み合わせはこの疾患の転帰を確認するために重要であろう。重症度に応じて、ＩＢＤは、症状をコントロールするために、プレドニゾロン、ＴＮＦ阻害、アザチオプリン（イムラン）、メトトレキサート、又は６−メルカプトプリンのような、免疫抑制を必要とする。より一般的に、ＩＢＤの治療はメサラミンの一形態を必要としている。多くの場合、疾患の発症をコントロールするするためにステロイドが用いられて、維持薬物として一度許諾された。クローン病患者及び最近は潰瘍性大腸炎患者における数年に渡る使用において、生物学的製剤がＴＮＦ阻害剤などとして用いられている。重症な例では、腸切除、狭窄形成、或いは一時的又は永久人工肛門又は回腸人工肛門造設術のような手術を必要とするだろう。腸疾患のための代替え医学療法は多種の形態で存在するが、長期に渡るステロイド暴露又は手術的な切除を避けるために根本的な病変をコントロールすることに集中している。
【００４３】
通常、治療は、プレドニゾロンのような、高い抗炎症効果を有する薬剤の投与によって開始する。炎症が首尾よくコントロールされたら、患者を、メサラミンである、アサコール（Asacol）のような弱い薬剤に切り替えて、疾患を寛解期に維持する。目的を達成できない場合は、患者に応じて、上記の免疫抑制剤をメサラミン（これも抗炎症効果を有している）と組合わせて、投与してもよいか又は投与しなくてもよい。
【００４４】
ヒストプラスマは、ＩＢＤの徴候及び症状を有する免疫不全患者において「深刻に考えること」であるヒストプラスマ症と呼ばれる腸疾患を引き起こす毒素を産生する。ナイスタチン（広範スペクトル腸内抗真菌剤）及びイトラコナゾール（Sporanox）又はフルコナゾール（Diflucan）などの抗真菌剤が、下痢、体重減少、発熱、及び腹痛のような同じ症状を全て共有しているクローン病及び潰瘍性大腸炎のようなＩＢＤ疾患の治療に提案されている。特に、炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の遮断があるクローン病症例において高い効果を示しているが、約３分の２の患者は応答しない。さらに、ＴＮＦαの持続的中和が、他の部位における感染に対する感受性の増大、例えば、結核の再活性を引き起こすという懸案事項がある。従って、より特異的な治療手段に対する大きな要望があって、ＩＢＤにおけるサイトカインの研究がさらなる治療標的を明らかにすることを期待されている。現在の治療の明確な欠点を考慮して、疾病病因における多種サイトカインの役割を含む、これらの疾患に対する免疫学的根拠に内在しているより良い見解に基づく、炎症性腸疾患に対する新規な治療選択に対する医学的な大きな要望がある。本発明は、ＩＢＤの１つ又はそれ以上の症状を治療又は減少するために、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む、炎症性腸疾患を有する患者にＩＬ−２７、又はその治療用変異体若しくは断片を投与するための新規な方法、組成物及びキットを提供することによって、当該技術を有利に進歩させる。ＩＬ−２７の多面的特性（すなわち、炎症促進性及び抗炎症性特性を有すること）がこれをＩＢＤを治療するための候補になりにくくしている。それにも関わらず、本発明者らは本発明の方法及び技術、例えば、微生物による送達システムを介する局所送達方法を用いてこのような治療におけるその有用性を発見した。
一実施態様では、ＩＬ−２７の投与は胃腸送達システムを用いて実施され、これは例えば、菌株の対象への経口摂取又は経口送達に続いて、胃腸管内にＩＬ−２７を発現してそして局所的に放出するように遺伝子組み換えした組み換え細菌株、例えば、L.lactis 又は E.faecium をを含むことができるので、代替えの全身送達経路の好ましくない副作用を避ける。
【００４５】
（その他の治療可能な疾患）
本発明は、対象の罹患身体部位に治療有効量のＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片を産生できる組み換え微生物を局所的に投与することによって、ＩＬ−２７の投与に対して感受性がある疾患を治療する方法も提供する。
【００４６】
ある特定の実施態様では、疾患は腸（例えば、セリアック病、憩室炎及び虫垂炎を含む）、胃、肝臓、膵臓又は腹膜、或いは胃腸管又は消化系のその他の組織の炎症性疾患であり得る。このようなその他の疾患は口腔、食道、膵臓、膵管、肝臓、胆嚢、十二指腸、胆管、小腸（回腸）、大腸（結腸）、盲腸、虫垂、又は直腸の炎症性疾患を包含できる。本発明の方法、組成物及びキットで治療できる胃腸系を冒す特定の疾患は、例えば、憩室炎（憩室症から発生して結腸の外側に炎症性嚢（憩室）を形成する、大腸に多く見られる一般的な消化器系疾患）、セリアック病（グルテンタンパク質に対して生じる自己免疫反応に起因する、中幼少期以後の全ての年齢の遺伝的に罹り易い人に生じる小腸の自己免疫疾患）、虫垂炎（虫垂の炎症によって特徴付けられる疾患）、胃腸炎（胃及び小腸をの両方を含む、胃腸管の炎症で、急性の下痢をもたらし、そしてこれは多くは幾つかのウィルスによる感染によって、まれに細菌、その毒素、寄生虫又は食品又は医薬品中の何かの副作用に起因している）、膵炎（多くの原因による膵臓の慢性又は急性の炎症）、又は消化性潰瘍を包含できる。
【００４７】
別の実施態様では、疾患は、胃腸系以外であってよく、例えば、Ｉ型糖尿病、重篤な食物アレルギー、及びセリアック病を包含できる。
【００４８】
さらに別の実施態様では、疾患は胃腸管又は消化器系の癌であってよく、これは例えば、結腸癌、或いは胃腸管又は消化器系の何れかの組織の癌、例えば、口腔、食道、膵臓、膵管、肝臓、胆嚢、十二指腸、胆管、小腸（回腸）、大腸（結腸）、盲腸、虫垂、又は直腸に生じる癌であってよい。既に指摘したように、ＩＢＤは結腸癌のリスクを少なくとも２０％増大させることに関連していて；従って、特定の実施態様では、本発明の方法を、他の抗炎症剤が癌の進行を遅らせることが示されている結腸癌を治療するために用いることができる。
【００４９】
（用語の使用）
本発明は、以下の本発明の好ましい実施態様の詳細な記載及びここに含まれる実施例を参照することによってより容易に理解することができる。本発明の方法及び技術を開示及び記載する前に、本発明は、具体的な分析又は合成方法に限定されない、そのようなものとして、もちろん、変更可能であることを理解すべきである。本明細書で用いられている専門用語は具体的な実施態様を記載するためだけが目的であって限定を意図していないということも理解されたい。別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術及び科学用語は本発明が属する技術分野の当業者によって普通に理解されている意味を有している。
【００５０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられているような、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別のことを明確に示していない限り、複数への言及も含んでいる。従って、例えば、「１つの遺伝子（ａ ｇｅｎｅ）」は１つ又はそれ以上の遺伝子に言及していて当業者に公知の等価物などを含んでいる。
【００５１】
明確に述べられているか又は文脈から自明である場合を除いて、用語「又は」は包括的であると理解される。
【００５２】
用語「含んでいる」は、語句「含んでいるが〜に限定されない」を意味するように本明細書で用いられていて、これと同義語で用いられている。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「含む」、「含んでいる」、「含有している」、「有している」等は、米国特許法がそれらに対して見なしている意味を有していて、「包含する」、「包含している」等を意味することができ；「本質的に〜からなっている」又は「本質的に〜からなる」等は、米国特許法が見なしている意味を有していて、この用語は制約がなく、列挙されているものの基本的且つ新規な特性が、列挙されているもの以上の存在によって変更されない限り、列挙されているもの以上の存在を許容しているが、先行技術の態様を除外する。
【００５４】
本明細書で用いられる用語「生体サンプル」又は「患者サンプル」又は「試験サンプル」又は「サンプル」は、診断、予後診断、又は関心のある対象の評価を目的とする対象又は患者の臓器から、又は成分（例えば、細胞）から得たサンプルを示す。サンプルは、例えば、ＩＢＤに関連する病変を含んでいる胃腸組織（例えば、腸粘膜）であってよい。実施態様では、このようなサンプルは進行中の疾患の転帰又は疾患に対する治療計画の効果を確認する目的で得ることができる。サンプルはＩＢＤの診断又は分析に関連しているものを含む、生体の組織又は体液であってよい。サンプルはＩＢＤを有する患者由来のサンプルである臨床サンプルであってよい。このようなサンプルは、これに限定されないが、食道、胃、十二指腸（胃と小腸の接続点）、小腸、大腸（結腸）、回腸（小腸と大腸の接続点）、Ｓ字結腸、直腸、肛門、糞便から得られるような組織又は体液を含む、胃腸管の組織又は体液の何れか、又は目、肝臓、腎臓、皮膚、結合組織（ＩＢＤに起因する関連関節炎のため）を含む進行しているＩＢＤによって影響を受けている身体の何れかの領域から得られる組織又は体液の何れか、又は進行しているＩＢＤによって影響を受けているその他の臓器又は組織又は体液を包含する。
【００５５】
用語「対象」又は「患者」は、治療、観察、又は実験の目的である動物を示す。ほんの一例として、対象は、これに限定されないが、ヒト又は、家畜、農場動物、動物園の動物、スポーツ動物、ペット及び実験動物のような非ヒト哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛のような）；類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジーのような霊長類；イヌ及びオオカミのようなイヌ科の動物；ネコ、ライオン及びトラのようなネコ科の動物；ウマ、ロバ、及びシマウマのようなウマ科の動物；ウシ、ブタ、及びヒツジのような食用動物；シカ及びキリンのような有蹄動物；マウス、ラット、ハムスター及びモルモットような齧歯動物；その他を包含するが、これに限定されない。
【００５６】
本明細書で用いられる用語、特定の受容体又は結合パートナー「と特異的に結合する」又は「に対して特異的な」は、例えば、本発明のＩＬ−２７を胃腸管の組織へ送達するためのミクロスフェア（微小粒子）送達システムとの関連で、他の受容体又は分子の何れとも実質的に結合せずに、その特定の受容体又は結合パートナーと結合することである。
【００５７】
本明細書で用いられる用語「治療」又は「治療すること」は、何れかの一連の行為、活動、適用、治療、などを包含し、ここで、ヒトを含む対象（又は患者）は、対象の疾患を、直接又は間接的に改善すること、又は対象の疾患又は障害（例えば、クローン病又は潰瘍性大腸炎を含む、ＩＢＤ）の進展を遅延すること、或いは治療を受けている疾患又は障害（例えば、クローン病又は潰瘍性大腸炎を含む、ＩＢＤ）の少なくとも１つの症状を改善することを目的として、薬剤又は組成物（又は本発明の薬剤を発現する組み換え生物）を与えられるか又は投与される。
【００５８】
用語「併用療法（combination therapy  又は co-therapy）」は、病気、疾患及び／又は障害、例えば、クローン病又は潰瘍性大腸炎を含む、ＩＢＤを治療するために、２つ又はそれ以上の治療薬を投与することを意味する。このような投与は２つ又はそれ以上の治療薬を実質的に同時手法によって「同時投与」することを包含している。１つの療法は、ＩＬ−２７又はその治療用変異体若しくは断片を発現又は産生するように遺伝子組み換えされた微生物の投与に関連する本発明の実施態様に基づくことができる。第二の療法は、本発明の疾患、例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎を包含する、ＩＢＤを治療するために公知の治療法、例えば、治療用サイトカイン、例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に基づくことができる。２つ又はそれ以上の連続併用投与される治療薬の順序は限定されない。２つ又はそれ以上の治療薬の投与は別の経路、例えば、局所経路（本発明の組み換え微生物を用いる薬剤の胃腸管送達）と全身経路（非経口、注射、経皮）によって投与してもよい。
【００５９】
語句「治療有効量」は、所定の治療法と関連する有害な副作用を避けるか最小化しながら、病気、疾患及び／又は障害の重症度及び／又はその症状を改善する目標を達成できる何れかの経路によって投与される本発明の各薬剤（例えば、ＩＬ−２７）の量を意味する。ある特定の実施態様では、治療有効量は胃腸管に送達される組み換え微生物の送達と関連していて、当該微生物治療有効量の薬剤、例えば本発明のＩＬ−２７を発現及び放出するように組み替えられている。治療有効量の決定は当業者の知識や技能の範囲内であって、そのような人によってなされる通常の試験で決定できる。当然のことながら、そのような決定はその一部が、どの投与経路が用いられるかによって決まるだろう。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「薬学的に許容される」は、対象の事項が医薬品として用いるのに適していることを意味している。
【００６１】
本明細書で用いられる用語「その治療用断片若しくは変異体」は次のものを示す。用語「治療用断片」又は、あるいは、「生物活性の」、「生物学的に活性な」、又は「その生物学的に活性な部分」は、本発明のＩＬ−２７（又はその他のポリペプチド薬剤、例えば、本発明で意図されている第二治療薬）の断片を示し、これは本発明の全長又は天然のＩＬ−２７の生物活性の実質的なレベルを保持しているが、好ましくはその活性の９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％又は６０％を保持している。治療用断片は、本明細書で更に検討するような、何れかの適切な方法で、それが上で示した活性レベルを保持するようにポリペプチドの何れかの末端（Ｎ−末端又はＣ−末端）又は内部を欠失させて作成できる。用語「治療用変異体」は、公知の化学又は生物化学タンパク質、又は生物学的に（すなわち、細胞内で）又は化学的に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化或いは脂質又は糖質の付加によって、産生された翻訳後修飾を有して作成できる又は得ることができる何れかのＩＬ−２７（又は本発明のその他のポリペプチド薬剤の何れか）を示し、これは少なくとも上記の活性レベルを有する（増大した活性を有していてもよい）修飾ポリペプチドをもたらす。変異体はＩＬ−２７の適切なアゴニストを示してもよく、これは実質的に同じ効果を伴ってＩＬ−２７受容体と結合して活性化する。すなわち、ここではアゴニストによる効果は天然のＩＬ−２７による効果の少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、又は６０％である。
【００６２】
本明細書で用いられる用語「アミノ酸（複数を含む）」は全ての天然Ｌ−α−アミノ酸を示す。アミノ酸は１文字又は３文字表示の何れかで特定できる；Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸；Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン；Ｔｈｒ Ｔ スレオニン；Ｌｅｕ Ｌ ロイシン；Ｓｅｒ Ｓ セリン；Ｔｙｒ Ｙ チロシン；Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸；Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン；Ｐｒｏ Ｐ プロリン；Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン；Ｇｌｙ Ｇ グリシン；Ｌｙｓ Ｋ リジン；Ａｌａ Ａ アラニン；Ａｒｇ Ｒ アルギニン；Ｃｙｓ Ｃ システイン；Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン；Ｖａｌ Ｖ バリン；Ｇｌｎ Ｑ グルタミン； Ｍｅｔ Ｍ メチオニン；及びＡｓｎ Ｎ アスパラギン。
【００６３】
当然のことながら、これらのアミノ酸は化学組成及びそれらの側鎖の特性に従って分類できる。これらは大きく２群、荷電及び非荷電、に分類される。これらの各群はアミノ酸をより正確に分類するためにサブグループに分けられる。
Ｉ．荷電アミノ酸
酸性残基：アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性残基：リジン、アルギニン、ヒスチジン
ＩＩ．非荷電アミノ酸
親水性残基：セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン
脂肪族残基：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
非極性残基：システイン、メチオニン、プロリン
芳香族残基：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン
【００６４】
本明細書で用いられる用語「相同性」は、配列を整列させて、必要に応じて、ギャップを導入して、周知の方法（例えば、ＢＬＡＳＴ整列手段）によって最大相同性パーセントを得た後の、その天然対応物（例えば、天然のＩＬ−２７）のアミノ酸配列における残基と一致する候補アミノ酸配列における残基のパーセンテージであると定義される。整列の方法及びコンピュータプログラムは当該技術分野において周知である。
【００６５】
本明細書で用いられる「置換突然変異体」は、天然配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されていて、別のアミノ酸がその場所の同じ位置に挿入されているものである。置換は単一でもよく、ここでは分子中１つのアミノ酸だけが置換されており、或いは複数でもよく、ここでは同一分子内の２つ又はそれ以上のアミノ酸が置換されている。「挿入突然変異体」は天然配列における特定部分のアミノ酸のすぐ近接部に１つ又はそれ以上のアミノ酸が挿入されているものである。アミノ酸のすぐ近接部とは、アミノ酸のカルボキシ又はアミノ官能基の何れかに結合したことを意味する。「欠失突然変異体」は天然アミノ酸において１つ又はそれ以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失突然変異体は分子の特定領域において１つ又は２つのアミノ酸欠失を有している。
【００６６】
本明細書で用いられる用語「症状」は、病気又は患者の疾患の主観的な証拠の何れかを示す。これは、患者に知覚されているような証拠を包含している。ＩＢＤの症状の例は、下痢、腹痛、発熱、下血、血便、及び体重減少、並びに本明細書の他の場所で示されているその他の症状を包含する。
【００６７】
本明細書で用いられる用語「サイン」は、一般に病気又は疾患の客観的な証拠を示し、通常、検査医によって認識されるようなもの、或いは実験室的な評価又は超音波若しくははＸ線写真のようなその他の試験で明らかにされる特性である。ＩＢＤのサインの幾つかの例は、腹部腫瘤、舌炎、アフタ性潰瘍、裂肛、肛門周囲瘻孔、貧血、呼吸障害、及び鉄欠乏を包含する。サインと症状は時に重複する。例えば、患者が血便（症状）を訴えて、便サンプルの臨床検査が血液に陽性（サイン）である。
【００６８】
本明細書で用いられる用語「サイトカイン」は、様々な範囲の細胞型によって一時的に産生され、通常は局所的に作用して、細胞表面受容体と結合して特定の遺伝子の発現を活性化する、ポリペプチド因子を意味する。
【００６９】
本明細書で用いられる用語「ＩＬ−２７」又は「インターロイキン−２７」は、本発明の方法、組成物、キット及びその他の態様で利用される２重ポリペプチド鎖（天然のＩＬ−２７において非共有相互作用に関わる１本のα鎖及び１本のβ（又は「Ｅｂｉ３」）鎖を含んでいる）サイトカインを示す。ＩＬ−２７は、ヒト、マウス、或いはその他の哺乳動物又は動物の何れかによって発現又はコードされる天然のＩＬ−２７を包含できる。ＩＬ−２７はこのような動物（ヒトを含む）によって自然に産生されたＩＬ−２７の何れかの突然変異体バージョン、又は実験的に構築されたそれらの突然変異体バージョンの何れかも包含できる。突然変異は、欠失、挿入、置換、反転などを包含する、何れかの方法で生じうる。ＩＬ−２７の変異体バージョンは、ヒト由来天然ＩＬ−２７の活性の少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％又は６０％を有していることを意味しているが、特定の変異によって、ヒト配列に比べて増大した活性を有していてもよい。特定の実施態様では、ＩＬ−２７は、短いポリペプチド「リンカー」を介するα鎖とβ鎖の両方の融合である点で、組み換え型である。このような形態は実施例で言及するように、「ＩＬ−２７ハイパーカイン（hyperkine）」と称することもある。
実施態様では、ＩＬ−２７は、配列Ｎ−ＳＲＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＧＫＬ−Ｃ（配列番号５）を有するポリペプチドリンカーを介するヒトα鎖とβ鎖の融合に対応していて、配列番号２で表されるアミノ酸配列（及び配列番号１で表されるヌクレオチド配列によってコードされる）を有している。
別の実施態様では、ＩＬ−２７は、配列Ｎ−ＳＲＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＧＫＬ−Ｃ（配列番号５）を有するポリペプチドリンカーを介するマウスα鎖とβ鎖の融合に対応していて、配列番号４で表されるアミノ酸配列（及び配列番号２で表されるヌクレオチド配列によってコードされる）を有している。しかしながら、本発明は式Ｉの一般式に従って、ＩＬ−２７のα鎖とβ鎖を、何れかの順序で結合するために適切な何れのリンカー（本明細書の他の場所にさらに記載されている）も意図している。
【００７０】
【化１】
2013530187.tif 000003
【００７１】
本明細書で用いられる用語「炎症性腸疾患」又は「ＩＢＤ」は、結腸、小腸及び胃腸管の別の領域の炎症性疾患の群を示し、本明細書の別の場所により詳細に記載されている。ＩＢＤの主な型はクローン病（「ＣＤ」）及び潰瘍性大腸炎（「ＵＣ」）である。ＩＢＤは胃腸管の組織の炎症性疾患について、さらに、皮膚、肝臓及びその他の領域を含む、胃腸管の外の臓器系に生じる疾患の兆候についても包括的である。
【００７２】
本明細書で用いられる用語「グラム陽性細菌」又は「グラム陽性細菌（複数）」は当該技術分野で公知の一般的な意味を有している。さらに説明すると、グラム陽性細菌（複数を含む）は、クリスタル・バイオレット染色を保持するとしてグラム染色によって確認できる。
【００７３】
本明細書で用いられる用語「単離された」又は「精製された」ポリペプチド又はタンパク質、或いはそれらの生物学的に活性なタンパク質は、ポリペプチド、例えば、ＩＬ−２７をそれから得る細胞又は組織の供給源に由来する細胞物質又はその他の夾雑タンパク質を実質的に含んでいない。
【００７４】
用語「コードする核酸分子」、「コードするＤＮＡ配列」、及び「コードするＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸のらせん構造に従ったデオキシリボヌクレオチドの順序又は配列を示す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、その核酸分子によってコードされる対応するポリペプチド鎖に従ったアミノ酸の順序を決定する。従って、ＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。
【００７５】
核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「操作可能に結合している」。例えば、プレ配列又は分泌リーダー（例えば、L. lactis 又は本発明のその他の組み換え微生物から発現されたタンパク質の放出又は分泌のための分泌リーダー配列）に関するＤＮＡはそれがポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されている場合、ポリペプチド（例えばＩＬ−２７）をコードするＤＮＡと操作可能に結合している；それが配列の転写に影響を与える場合、プロモータ又はエンハンサーはコード配列と操作可能に結合している；又は、それが翻訳を促進するように位置している場合、リポゾーム結合部位はコード配列と操作可能に結合している。一般に、「操作可能に結合してる」は、結合しているＤＮＡ配列が隣接していて、そして分泌リーダの場合には隣接してリーディング相にある。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。結合は適当な制限酵素認識部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを従来の実施に従って用いる。
【００７６】
用語「複製可能な発現ベクター」及び「発現ベクター」は、通常２重螺旋の、ＤＮＡの断片を示し、これは外来ＤＮＡの断片内に挿入できる。外来ＤＮＡは異種ＤＮＡ（例えばＩＬ−２７をコードするＤＮＡ）と定義され、これは宿主細胞（例えば、L. lactis 又は E. faecium）内には天然に見出されない。ベクターは外来又は異種ＤＮＡを適切な宿主細胞（例えば、L. lactis 又は E. faecium）内に運搬するために用いられる。宿主細胞内では、ベクターは宿主の染色体ＤＮＡとは無関係に複写することができ、そしてベクターの幾つかのコピー及びそれが挿入された（外来）ＤＮＡが作成される。また、ベクターは外来ＤＮＡをポリペプチド内に翻訳することを可能にする必要な要素を含んでいる。外来ＤＮＡによってコードされたポリペプチドの多くの分子がこのように迅速に合成される。本発明は、望ましいポリペプチド（例えば、ＩＬ−２７）をコードするＤＮＡを宿主細胞自体の染色体と一体化できるように、本発明のポリペプチドをコードする外来遺伝子を用いて、宿主細胞、例えば、L. lactis のゲノムを遺伝子操作する公知の方法も意図していて、これはより安定な外来遺伝子（ＩＬ−２７）の提供を可能にする。
【００７７】
本明細書で用いられる用語「形質転換」は、染色体外要素としてか又は染色体統合によるかの何れかで、ＤＮＡを複写できるようにＤＮＡを生体内に導入することを意味する。
【００７８】
本明細書で用いられる用語「トランスフェクション」は、コード配列が実際に発現されようとされなかろうと、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを示す。
【００７９】
本明細書で用いられる用語「形質転換宿主細胞」及び「形質転換された」は、ＤＮＡの細胞内への導入を示す。細胞を「宿主細胞」と称して、これは原核細胞又は真核細胞であってよい。典型的な原核宿主細胞は多種の E. coli を包含する。本発明では、ある特定の実施態様で宿主細胞はBacteriodes、Clostridium、Fusobacterium、Eubacterium、Ruminococcus、Peptococcus、Eschericia、Lactobacillus  或いは Candida、Saccharomyces、Aspergillus 又はペニシリウム Penicillium のような真菌を含む、胃腸管の正常微小植物の何れかを包含できる。ある特定の別の実施態様では、宿主細胞は、Lactococcus lactics 又は関連微生物のような、非共生細菌も包含でき、これは胃腸管に定着しない傾向にある。典型的な真核宿主細胞はチャイニーズハムスターの卵巣細胞又はヒト胎児腎臓２９３細胞のような、哺乳動物である。通常、導入されたＤＮＡは挿入されたＤＮＡ片を含有しているベクターの形態にある。導入されたＤＮＡ配列は、宿主細胞と同じ種、又は宿主細胞と異なる種に由来してよく、或いは幾つかの外来ＤＮＡ及び幾つかの異種ＤＮＡを含有している、ハイブリッドＤＮＡ配列であってよい。
【００８０】
本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」は、組成物の活性成分と組合わせたときに、その成分が生物活性を保持できるようにして、対象の免疫系と破壊的な反応を引き起こさない、何れかの物質を包含する。例は、これに限定されないが、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、油／水乳剤のような乳剤、及び多種の湿潤剤のような標準的な医薬用担体の何れかを包含する。エアゾール又は非経口投与用の典型的な希釈剤はリン酸緩衝生理食塩水又は生理食塩水（０．９％）である。このような担体を含有している組成物は周知の従来方法によって製剤化される（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 14th Ed., Mack Publishing Col, Easton Pa. 18042, USA を参照されたい）。薬学的に許容される賦形剤は当該技術分野で周知であって、例えば、A. Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Remington’s Pharmaceutical Sciences, 14th Ed. or latest edition, Mack Publishing Col, Easton Pa. 18042, USA; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc を含む各種の刊行物に十分に記載されている。
【００８１】
（ＩＬ−２７及びその生物学的に活性な断片又は変異体）
本発明は、少なくともその一部が、免疫抑制（抗炎症）と免疫刺激（炎症促進）特性の両方を有していることが知られているサイトカイン、ＩＬ−２７が炎症性腸疾患の治療に治療的有用性をもたらすという予想外の発見に基づいている。
【００８２】
ヒト及びマウスにおいて、ＩＬ−２７は、２つのサブユニット、エプスタイン・バー・ウィルス誘導遺伝子３（Ｅｂｉ３）（ＩＬ−２７Ｂ又はＩＬ−２７β又は「β」サブユニットとしても知られている）及びＩＬ２７−ｐ２８（ＩＬ−３０又は「α」サブユニットとしても知られている）、からなるサイトカインのＩＬ−１２ファミリーに属しているヘテロ二量体サイトカインである。通常は、ＩＬ−２７は抗原提示細胞によって産生されてＢ及びＴリンパ球の活性を調製する機能を果たしている。例えば、Larousserie et al., Am. J. Pathol. 166: 1217-1228 (2005)及び米国特許第７，１４８，３３０号公報（これらはその全てが参照により本明細書に取り込まれている）を参照されたい。
【００８３】
ＩＬ−２７の抗炎症性は、公知の強力な抗炎症性サイトカインである、ＩＬ−１０の発現を誘導するその能力に基づいていると思われる。ＩＬ−１０は明白に抗炎症性分子であるので、そしてＩＬ−１０の直接投与が予想以上の結果を生じたので、ＩＬ−１０はＩＢＤ治療のための治療分子の開発に好ましい選択である。しかしながら、Steidler et al., Ann N Y Acad Sci 1182:135-145 (2009) に記載されているように、ＩＬ−１０の全身投与は臨床試験中に重篤な副作用をもたらした。そのため、ＩＢＤを治療するために全身投与されるＩＬ−１０を開発する取り組みは断念されている。本明細書に記載されている結果は、ＩＬ−２７の局所投与がＩＢＤを治療するのに非常に効果的であるということを明らかにしている。この知見は、ＩＬ−２７の高い有効性は当該技術分野における以前の知見から予測可能ではなく、そして当該技術分野の他のどこにも具体的に教示又は示唆されてもいなかったので驚くべきものである。
【００８４】
実際、ＩＢＤの治療剤としてのＩＬ−２７の適用は、有益又は有害な効果の何れかを支持していると見なされる報告を含んでいる、刊行文献に基づいては予測可能ではない。例えば、腸炎疾患に対する治療戦略としてＩＬ−２７の阻害が提案されている（例えば、国際公開第２００８／０７０７５１Ａ１号公報を参照されたい）。ＩＢＤのような炎症性疾患の病因は極めて複雑であり、この候補薬剤のインビボ効果の予測を困難にしている。
【００８５】
さらに、多数の観察では、ＩＢＤにおけるL. lactis−ＩＬ−２７の悪い転帰を予測している。これには、免疫応答を促進すること、ＩＢＤにおける効果的な治療に対して期待されるような免疫応答を阻害しないこととしてそれを特徴付けている、ＩＬ−２７の初期の記載（Pflanz et al, Immunity 16:779-90 (2002)）を包含している。負の転帰を予測している別の観察は、ＩＢＤにおいて、ＩＬ−２７の１本の鎖、ＥＢＩ３が腸内で構造的に発現されて、別の鎖、Ｐ２８が腸の炎症を増大するというものである（Schmidt et al., Inflamm. Bowel Dis. 11:16-23 (2005); Masser et al., Immunology 112:437-445 (2004)）。これらの観察はＩＬ−２７の過剰産生が実際にＩＢＤを引き起こして、それにより治療剤としてのＩＬ−２７に対して好ましくない転帰が予測されるということを示唆している。大腸炎の１つのマウスモデルにおいて、１本のＩＬ−２７鎖の欠失は有効ではなく、ＩＢＤを悪化も改善もしない（Nieuwenhuis et al., PNAS, 99:16951-56 (2002)）。ＩＬ−２７受容体の部分が欠失していることが記載されている最近の論文にはＩＢＤが悪化したことがを記載されていて（Honda et al., Inflamm. Bowel Dis. 11:1044-1052 (2005)）、ここでもＩＢＤの治療剤としてのＩＬ−２７の有益な効果の逆を予測している。
【００８６】
刊行文献に基づくと、全ての報告には、ＩＬ−３５の免疫抑制効果が一貫して観察されているので、ＩＬ−３５がＩＢＤにおいて治療有用性を有するより良い候補であった（Bettinni et al., Current Opinion in Immunology 21:612-618 (2009)）。しかしながら、本願の実施例に示したように、ＩＬ−３５を発現する L. lactis はマウスのＩＢＤにおいて治療有用性を示さなかった。
【００８７】
一実施態様では、本発明のＩＬ−２７は、リンカーによって互いに共有結合しているα及びβサブユニットの両方を含んでいるキメラポリペプチドであって、以下の式を有している。
【００８８】
【化２】
2013530187.tif 000004
【００８９】
ＩＬ−２７のこの形態は、リンカーが介在ポリペプチド配列である場合、ＩＬ−２７をL. lactis 又は E. faecium のような細菌宿主中で単一キメラポリペプチドとして合成できるという利点を有している。また、本発明のＩＬ−２７配列を、配列のコドン使用頻度を遺伝子の発現が生じる組み換え微生物に対して最適化、例えば、L. lactis 又は E. faecium に対して最適化するように遺伝子組み換えすることもできる。
【００９０】
従って、一実施態様では、本発明の組成物、方法及びキットは、配列番号２のアミノ酸配列で示され、配列番号１のヌクレオチド配列でコードされ、そして配列：Ｎ−ＳＲＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＧＫＬ−Ｃ（配列番号５）を有するポリペプチドリンカーによって結合した天然ヒトＩＬ−２７のヒトα及びβ鎖を含み、宿主細胞 L. lactis 及び E. faecium  に対するコドン使用頻度を最適化されている、ＩＬ−２７を利用する。
【００９１】
別の実施態様では、本発明の組成物、方法及びキットは、配列番号４のアミノ酸配列で示され、配列番号３のヌクレオチド配列でコードされ、そして配列：Ｎ−ＳＲＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＧＫＬ−Ｃ（配列番号５）を有するポリペプチドリンカーによって結合した天然マウスＩＬ−２７のヒトα及びβ鎖を含み、宿主細胞 L. lactis 及び E. faecium に対するコドン使用頻度を最適化されている、ＩＬ−２７を利用する。
【００９２】
リンカー配列は、単一ポリペプチドとしてＩＬ−２７の翻訳を可能にするよう機能して、ＩＬ−２７の全体的な機能を損なわせない限り、何れかの適切なアミノ酸配列であってよい。好ましくは、キメラＩＬ−２７は天然のＩＬ−２７の生物活性を約１００％有しているべきであるか、又はキメラＩＬ−２７は天然のＩＬ−２７サイトカインの生物活性を少なくとも約９５％、又は少なくとも９０％又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約５０％有していてもよい。
【００９３】
別の実施態様では、本発明のＩＬ−２７は、ポリペプチドが細菌送達システム（例えば、L. lactis システム）から分泌又は放出されるのを可能にするのに適しているリーダー配列を包含できる。ある特定の実施態様では、ＩＬ−２７の分泌を可能にするために、L. lactis 及び E. faecium 中で用いるのに適している分泌リーダーをコードする断片は個々のα及び／又はβ鎖のＩＬ−２７配列、或いはα鎖及びβ鎖が結合している配列の５’末端又は３’末端に付加することができる。これはＮ−末端又はＣ−末端に分泌リーダー延長を有するＩＬ−２７α−β融合タンパク質、又はＩＬ−２７αとＩＬ−２７βの融合タンパク質をもたらす。この断片はｕｓｐ４５遺伝子（van Asseldonk et al., Gene 95:155-160 (1990)、これは参照により本明細書に取り込まれている）由来の、配列Ｎ−ＭＫＫＫＩＩＳＡＩＬＭＳＴＶＩＬＳＡＡＡＰＬＳＧＶＹＡ−Ｃを有する、周知の L. lacts 分泌リーダーをコードできるが、本発明で用いられる微生物媒体、例えば、L. lactis 又は E. faecium 中で機能するその他の分泌リーダー配列もコードする。
【００９４】
組み換え微生物以外の方法による投与を意図する実施態様では、本発明は、天然型（例えば、ヒト、マウス又はその他の起源から単離したもの）、又はα及びβサブユニットがリンカーによって共有結合している、化学的に融合している、あるいはいくつかの適当な方法で結合するような型を含む、ＩＬ−２７の何れかの形態を意図している。ここで、リンカーはポリペプチドリンカー又はＩＬ−２７の生物活性を減少させない適切なその他の型のリンカーであってよい。好ましくは、用いられるＩＬ−２７は天然のＩＬ−２７の約１００％の生物活性を有しているべきであり、或いはＩＬ−２７は天然のＩＬ−２７サイトカインの生物活性の少なくとも約９９％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約５０％を有していてもよい。
【００９５】
既に述べたように、本発明はＩＬ−２７の生物活性断片及び変異体の使用及び投与を意図している。ＩＬ−２７の多種の生物活性断片及び変異体の構造は、その全てが参照により本明細書に取り込まれている、米国特許第７，１４８，３３０号の主題である。
【００９６】
何れかの天然又は組み換えＩＬ−２７種及びＩＬ−２７のその他の生物活性断片及び／又は変異体の、アミノ酸配列、糖鎖付加変異体及び共有結合誘導体（例えば、同一又は異なる起源に由来するＩＬ−２７の融合α及びβ鎖を包含できる、キメラ変異体）は、当該技術分野で公知の方法で製造できる。１つの方法では、ＩＬ−２７をコードするＤＮＡの特定領域又は部位を突然変異生成、すなわち、ＩＬ−２７の部位特異的突然変異生成の標的とすることができる。突然変異体は、制限エンドヌクレアーゼ（ＤＮＡを特定部位で開裂する）、ヌクレアーゼ（ＤＮＡを分解する）及び／又はポリメラーゼ（ＤＮＡを合成する）のようなＤＮＡ修飾酵素を用いて作成できる。ライゲーションに続くＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, 1989 の１５．３項に記載されているように、欠失を作り出すために用いることができる。
【００９７】
オリゴヌクレオチド特異的突然変異生成もＩＬ−２７の置換変異体を製造する方法として用いることができる。これは、本発明に従って用いることができる欠失及び挿入変異体を好都合に製造するためにも使用できる。この技術は、他の公知の情報源のなかでも、Adelman et al., DNA 2:183 (1983) に記載されているように当該技術分野で周知である。オリゴヌクレオチドは、Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:5765 (1978) に記載されているように、当該技術分野で周知の技術を用いて容易に合成できる。この技術で用いるための一本鎖鋳型の作製は、前記 Sambrook et al. の４．２１−４．４１項に記載されている。
【００９８】
ＰＣＲ突然変異生成も本発明の方法に用いることができるＩＬ−２７変異体を作製するために適している。ＰＣＲ技術は、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号公報、Sambrook et al.の１４項、又はCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience 1991 の１５節に記載されている。
【００９９】
このＩＬ−２７変異体をコードするＤＮＡは、さらにクローニング及び発現するために複製可能な発現ベクターに挿入できる。多数のベクターが利用可能であって、適切なベクターの選択は、１）それをＤＮＡ増幅（クローニング）のために或いは発現のため用いるのか、２）ベクターに挿入するＤＮＡの大きさ、及び３）ベクターを用いて形質転換される宿主細胞によって決定される。それぞれのベクターはその機能及びそれが適合する宿主細胞によって決まる多種の成分を含んでいる。ベクター成分は一般に、これに限定されないが、以下のものの１つ又はそれ以上を包含する：シグナル配列、複製の起点、１つ又はそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター及び転写ターミネータ配列。
【０１００】
適切なベクターは標準的な組み換えＤＮＡ手法を用いて製造できる。単離されたプラスミドとＤＮＡ断片を開裂し、適合させ、そして特定の順番に集めて結合して所望のベクターを生成する。
【０１０１】
結合後、挿入された外来遺伝子を有するベクターを適切な宿主細胞内に形質転換する。形質転換された細胞を抗生物質（通常は、テトラサイクリン（ｔｅｔ）又はアンピシリン（ａｍｐ）であって、ベクター上にｔｅｔ及び／又はａｍｐ耐性遺伝子が存在するためにこれに対して耐性になっている）上で培養することによって選択する。形質転換細胞を培地中で生育し、次いでプラスミドＤＮＡ（プラスミドは目的の外来遺伝子に結合したベクターを示す）を単離する。次いでこのプラスミドＤＮＡを制限マッピング及び／又はＤＮＡシークエンシングによって分析する。ＤＮＡシークエンシングの方法は当該技術分野で周知である。例えば、Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981) 又はMaxam et al., Methods of Enzymology, 65:499 (1980) の方法を参照されたい。
【０１０２】
当業者は、本発明を実施するために必要な遺伝子操作、例えば、ＤＮＡ発現ベクター又はエンジニアリング細菌を製造することは当該技術分野における周知の方法及び原理を用いて実施できるということを理解できるであろう。このような操作を実施するのに必要な遺伝子及び／又は分子生物学の手段は、Invitrogen, Inc., Clontech, Inc., BD Biosciences, Promega, Inc., New England Biolabs, Inc. 等からのような、商業的供給源から得られるものを含む、当該技術分野で周知の何れかの手段であってよい。
【０１０３】
ＩＬ−２７の糖鎖付加変異体を意図していて、これも当該技術分野で周知の技術で製造できる。ポリペプチドの糖鎖付加は、これに限定されないが、Ｎ−結合又はＯ−結合を包含する。Ｏ−結合糖鎖付加部位を、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列にセリン又はスレオニンの１つ又はそれ以上の付加、又はそれによる置換によって修飾することができる。容易にするために、通常ＤＮＡレベル変化させて、本質的にアミノ酸配列変異体の製造について公知の技術を用いる。
【０１０４】
グリコシドとの化学的又は酵素的結合を有しているＩＬ−２７変異体も意図していて、これは糖質置換の数又はプロファイルを修飾又は増大するためにも用いられる。これらがＯ−結合（又はＮ−結合）糖鎖付加が可能なポリペプチドの生産を必要としていない点でこれらの手法は有利である。用いられる結合方法によって、糖（複数を含む）は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（Ｃ）システインのもののような遊離の水酸基、（ｄ）セリン、スレオニン、又はヒドロキシプロリンのもののような遊離のスルフヒドリル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンのもののような芳香族残基又は（ｆ）グルタミンのアミノ基に付加してもよい。これらの方法は当該技術分野において周知である。例えば、国際出願公開第ＷＯ ８７／０５３３０号公報及び Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981) を参照されたい。
【０１０５】
ＩＬ−２７変異体は糖質修飾を有するものも包含できる。化学的脱グリコシル化はトリフルオロメタンスルホン酸又は同等化合物への暴露を必要としている。この処理は結合糖を除いて、殆ど又は全ての糖の開裂をもたらす一方、ポリペプチドを元のままにしておく。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987) 及び Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981) に記載されている。Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987)  に記載されているように、多種のエンド及びエキソグリコシダーゼによって糖部分を除去することもできる。 Duskin et al., J. Biol. Chem. 257, 3105 (1982) に記載されているように、グリコシル化はツニカマイシンによって抑制される。ツニカマイシンはタンパク質−Ｎ−グリコキシダーゼ結合の形成を阻害する。
【０１０６】
グリコシル化ＩＬ−２７変異体も意図されていて、適切な宿主細胞を選択することによって生産できる。例えば、酵母は哺乳動物のシステムのものと著しく異なるグリコシル化を導入する。同様に、選択された変異体の供給源とは異なる種（例えば、ハムスター、昆虫、マウス、ブタ、ウシ又はヒツジ）又は組織（例えば、肺、肝臓、リンパ、間葉又は表皮）起源を有する哺乳動物細胞は、変異グリコシル化を導入する能力についてごく普通にスクリーニングすることができる。
【０１０７】
ＩＬ−２７の共有結合誘導体及びグリコシル化変異体の使用もこれの範囲内である。このような修飾は、ＩＬ−２７変異体の標的アミノ酸残基を選択された側鎖又は末端残基と反応可能な有機誘導化試薬と反応させることによって、或いは選択された組み換え宿主細胞中で機能する翻訳後修飾のメカニズムを利用して、導入できる。共有結合誘導体化は、生物学的に活性なＩＬ−２７変異体を、対応する天然ＩＬ−２７のその受容体へ結合する質的能力を保持しつつ生物活性を欠いているか、又はその他の特性、すなわち、分子の半減期、安定性、その他を改善するような誘導体へ変換するのに役立つ。このような修飾は当該技術分野における通常の技術範囲内であって、過度の実験なしで実施される。いくつかの翻訳後誘導体化は発現されたポリペプチドに対する組み換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル及びアスパラギニル残基はしばしば対応するグルタミル及びアスパルチル残基に翻訳後脱アミド化される。あるいは、これらの残基は弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基の何れの形態も本発明の範囲内にある。その他の翻訳後修飾はプロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル及びスレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman Co., San Francisco pp. 79-86 (1983)］、Ｎ−末端アミンのアセチル化、及びいくつかの例では、ＩＬ−２７のＣ−末端カルボキシルのアミド化を包含する。
【０１０８】
その他の共有結合誘導体は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号、同第４，１７９，３３７、又は同第５，１１６，９６４号公報に述べられている方法で、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンのような、非タンパク質性ポリマーと共有結合したＩＬ−２７を包含する。
【０１０９】
（ＩＬ−２７の生物活性アッセイ）
本発明は、本発明のＩＬ−２７ポリペプチド、又はＩＬ−２７の生物活性断片及び変異体を特性化に用いるための何れか適切な分析技術及び手段も意図している。
【０１１０】
本発明が意図しているＩＬ−２７並びにその断片及び変異体の生物活性を試験するために用いられる１つのアッセイはＳｔａｔ １又はＳｔａｔ ３のリン酸化レベルの検出である。別のアッセイでは、本発明が意図しているＩＬ−２７並びにその断片及び変異体の生物活性はＩＬ−１０産生の増大したレベルによって測定できる。さらに別のアッセイでは、ＩＬ−２７並びにその断片及び変異体の生物活性はＴｂｅｔレベルの増大によって測定できる。リン酸化及び増大した基質レベルを検出する方法は当該技術分野において周知である。このような方法は、これに限定されないが、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＦＡＣＳ分析、免疫蛍光、免疫組織化学的染色、ウェスタンブロット（免疫ブロット）、ＥＬＩＳＡ、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法、等を包含する。
【０１１１】
本発明のＩＬ−２７の生物活性は動物モデルにおけるＩＢＤの病態に対するその影響によっても評価できる。このような動物モデルは当該技術分野において公知であって、ＩＢＤの研究においてしばらくの間用いられている。これらは、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む、ＩＢＤを治療するための治療薬の影響を理解するための一般に認められているモデルである。このモデルの動物に、例えば、ＩＬ−２７をコードする核酸分子、ＩＬ−２７ポリペプチド自体、胃腸管においてＩＬ−２７を産生するように遺伝子組み換えされた微生物の治療有効量の投与による、又は別の胃腸送達システム（さらに以下で説明されるような）による投与を含む、本明細書でさらに以下で説明されるような、何れかの適切な方法でＩＬ−２７を投与することができる。
【０１１２】
ＩＢＤの何れかの適切な動物モデルを本発明は意図している。例えば、ＩＢＤの動物モデルの第１群は、ある種のＩＢＤによく似ている疾患を自然発症している動物を包含する。自然発症動物モデルは、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス、こまねずみ、C.difficile に起因するブタ赤痢及びウマ大腸炎、並びにワタボウシタマリンを包含する。これらの動物が罹っている疾患は最近５つの型にさらに細かく分類され、そのうちの２つはＵＣに類似している。これらのモデルのうち、タマリン動物の大部分は腸疾患のある形態を有しており、そしてこれらの多くは、ＵＣ患者のように、大腸癌も発症しているので、本発明において有用なモデルとすることができる。
【０１１３】
別の手段では、エタノール、酢酸、ホルマリン、免疫複合体、トリニトロベンゼン・スルホン酸（ＴＮＢＳ）、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）、細菌産物又はカラギーナンのような、各種刺激物を、急性又は慢性炎症を起こすために用いることができる。このようなモデルは Morris et al., Gastroenterology 96, 795 (1989) に記載されている。
【０１１４】
さらに別の手段では、トランスジェニック動物をモデルＩＢＤとして用いることができる。強直性脊椎炎を有する多くのヒト患者もＨＬＡ−Ｂ２７に対する遺伝子を持っている。このような患者はＩＢＤを発症するリスクがより大きいということが観察されている。関節疾患に加えて、モデル脊椎関節症として作出された、ＨＬＡ−Ｂ２７トランスジェニックラットは、一致はしていないが、ＣＤと多くの類似性を有する腸の慢性炎症の症状も示した。従って、ＨＬ／Ｂ２７トランスジェニックラットをモデルＩＢＤに利用できる。
【０１１５】
ＩＬ−１０「ノックアウト」マウスに基づいているその他の適切なトランスジェニック動物モデルを利用できる。ＩＬ−１０はＴＨ２細胞によって生産され、Ｂ細胞を刺激して抗体を産生し、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＴＮＦαの産生を減少するマクロファージを下方調節し、そして抗原提示のバランスをマクロファージからＢ細胞へシフトする。ＩＬ−１０はＩＦＮγの産生も減少するので、ＴＨ１細胞及びナチュラルキラー細胞の活性を減少させる。出生時から抗ＩＬ−１０抗体で処置された（週に３回、ｉ．ｐ．投与）マウスは体重及び主要組織の組織構造に変化を示さない。Ｂ及びＴ細胞リンパ球の数及び比率も正常である。しかしながら、ＩｇＡ産生が劇的に減少するのに対して、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ−２ｂの濃度は増加する。また、マーカーＬｙ−１を担持している特定のＢ細胞集団である、腹膜Ｂ細胞のほぼ全面的な枯渇が観察された。これらのＢ細胞は骨髄から連続して生じ、体細胞変異の影響を受けない限局的免疫グロブリンレパートリーを有し、そして血漿中に見られる多くのＩｇＭに関与する。これら特定Ｂ細胞の枯渇は抗ＩＬ−１０抗体で処置したマウスで産生されたＩＮＦγの増大したレベルに起因しているかもしれない。このことは、抗ＩＬ−１０抗体と同時にＩＮＦγを投与すると、Ｌｙ−１Ｂ細胞が生き残るという観察によって支持されている。
【０１１６】
本発明で意図している別のＩＢＤマウスモデル系は、Dr.Fiona Powrie (Oxford, UK)によって開発されたものである。このモデルでは、Ｔ細胞を精製し、ＣＤ４５ＲＢを高発現するように濃縮し、次いでＲａｇ１−１−受容動物に導入する。Ｔ細胞導入の約６週間後に、ＩＢＤの兆候が現れ始める。２ヶ月までに、細胞は死に始めるか又は安楽死させなければならず、そして１０週間までにほぼ全てのマウスが死亡している。本発明の実施態様では、実施例に記載されているように、ＩＬ−２７（配列番号４）を発現しているか、又はコントロールベクターを担持している L.lactis を６週時点で開始して毎日強制経口投与すると、著しい治療効果をもたらした。別の免疫抑制サイトカインである、ＩＬ−３５も L.lactis にクローン化して同じ実験で試験した。しかしながら、ＩＬ−３５は治療効果を示さなかった。
【０１１７】
また、本発明は、ＩＬ−２７の生物活性を試験するためにＩＢＤのインビトロモデルの使用を意図している。ＩＢＤのインビトロモデルは開発されていて、Braegger et al. in Chapter 8 of Immunology of Gastrointestinal Disease, MacDonald, T. T. ed., Immunology and Medicine Series, Volume 19, Kluwer Academic Publishers (1992) に記載されており：MacDonald et al. Exp. Med. 167:1341-1349 (1988) も参照されたい。このモデルでは、妊娠１５〜２０週段階で、Ｔリンパ球を含有しているヒト胎児腸組織（小腸又は大腸）の小さい移植片（直径１〜２ｍｍ）を培養する。ヒト胎児の腸は、形態、上皮細胞再生及び腸細胞機能を保持して数週間にわたって臓器培養中に維持できる。移植片中の全てのＴ細胞は、ヤマゴボウマイトジェン又はモノクローナル抗ＣＤ３抗体の存在下で培養すると活性化される。移植片の肉眼的形態はＴ細胞活性化の結果として大きな変化を示す。Ｔ細胞活性化の結果である小腸移植片内の変化は、クローン病の初期段階に見られる粘膜変化とよく似ていて、結腸移植片に見られる杯細胞の枯渇も潰瘍性大腸炎の特徴である。このモデルは、Ｔ細胞の腸上皮との相互作用を研究するために、そして特に、本発明のＩＬ−２７の存在によるＴ細胞活性化への応答を観察するために用いることができる。
【０１１８】
前記インビボ及びインビトロアッセイの何れの組み合わせも本発明のＩＬ−２７の生物活性を試験するために用いることができる。
【０１１９】
（ＩＬ−２７組成物）
本発明は、クローン病又は潰瘍性大腸炎を包含する、ＩＢＤを治療するために、それを必要としている対象（例えば、炎症性腸疾患を有するか又は有する可能性があるヒト）に投与することができるＩＬ−２７又はその生物学的に活性な断片又は変異体（又はそれらをコードする核酸分子）を含んでいる組成物に関する。本発明は、ＩＬ−２７（又はその生物学的に活性な断片又は変異体）をコードする核酸分子を含んでいる組成物、ＩＬ−２７ポリペプチド（又はその生物学的に活性な断片又は変異体）を含んでいる組成物、又は胃腸管に送達されて（例えば、経口摂取によって）、それらの組み換えタンパク質（例えば、ＩＬ−２７）を胃腸管の１つ又はそれ以上の目的組織（例えば、腸粘膜）に発現又は放出するように遺伝子組み換えされた細菌又はその他の微生物（真核又は原核生物）を含んでいる組成物のような、適切な形態の何れかを意図している。当然のことながら、用いられる特定の医薬組成物はＩＬ−２７又はその他の薬剤を対象に送達するために用いられる投与手段によって決まる。このような方法は以下にさらに詳細に記載されている。
【０１２０】
例えば、遺伝子治療手段は、目的の部位（例えば、腸組織内）で、コードされている目的の組み換えタンパク質（例えば、ＩＬ−２７）を発現できる適切な核酸分子をそれを必要としている対象に送達するために用いることができる、ＩＬ−２７をコードする核酸分子の投与を意図していて、ここではそのような送達は、ＩＢＤ病変の部位に又は結腸、小腸又はその他の領域の疾患部位に直接投与するような、適切な方法の何れかによって達成される。本発明のこのような核酸分子の対象の胃腸管内への良好な送達を達成するための何れか適切な公知方法が意図されている。例えば、本発明のポリペプチド剤をコードする核酸分子の送達を増大するために、ミクロスフェア（微小球体）送達システムを利用できる。ミクロスフェア送達システムは、対象の胃腸管内に本発明の核酸の局所放出（例えば、腸溶性コーティング製剤及び結腸製剤のような、放出制御製剤）をもたらすコーティングを有する微小粒子を包含する。このような方法のさらなる詳細は以下に示されている。
【０１２１】
クローン病又は潰瘍性大腸炎を包含する、ＩＢＤを治療するために、それを必要としている対象（例えば、炎症性腸疾患を有するか又は有する可能性があるヒト）に、本発明のＩＬ−２７ポリペプチド（又はその生物学的に活性な断片又は変異体）又はその他のポリペプチド薬剤を投与するために適切な方法及び組成物も意図されている。本発明のこのようなポリペプチドを対象の胃腸管内への良好な局所送達を達成するために適切な公知方法の何れか．．例えば、対象の胃腸管内へのポリペプチドの局所放出（例えば、腸溶性コーティング製剤及び結腸製剤のような、放出制御製剤）をもたらすコーティングを有する微小粒子のようなミクロスフェア送達システムを用いることができる。このような方法のさらなる詳細は以下に示されている。
【０１２２】
（組み換え微生物）
態様では、本発明は、目的のポリペプチド、例えば、ＩＬ−２７又はその生物学的に活性な断片及び変異体を、胃腸管１つ又はそれ以上の組織に発現できる（例えば、腸粘膜における局所分泌）組み換え微生物に関する。微生物は、組み換え分子を対象の胃腸管内へ送達できる微生物の何れであってもよい。
【０１２３】
実施態様では、組み換え微生物はグラム陽性細菌である。関連する実施態様では、グラム陽性細菌は目的の対象へ投与したときに害を及ぼさないか又は悪影響を及ぼさないという意味において非病原性である。
【０１２４】
実施態様では、グラム陽性細菌は、これに限定されないが、Lactococcus、Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus、Streptococcus、Aerococcus、Carnobacterium、Enterococcus、Oenococcus、Sporolactobacillus、Tetragenococcus、Vagococcus、及び Weisella 属を包含する、乳酸菌（ＬＡＢ）である。
【０１２５】
関連する実施態様では、ＬＡＢは、これに限定されないが、Lactococcus lactis, Lactococcus garvieae, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum 及び Lactococcus raffinolactis のような Lactococcus 種及びそれらの亜種及び株である。さらなる実施態様では、ＬＡＢは、これに限定されないが、Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. hordniae, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. bv. diacetylactis のような、その亜種及び菌株の何れかを包含する、Lactococcus lactis である。さらなる実施態様では、ＬＡＢはLactococcus lactis ssp. lactis ＣＶ５６株（Genbank 受け入れ番号 ＣＰ００２３６５．１）、Lactococcus lactis ssp. cremoris ＮＺ９０００株（Genbank 受け入れ番号ＣＰ００２０９４．１）、Lactococcus lactis ssp. lactis ＫＦ１４７株（Genbank 受け入れ番号ＣＰ００１８３４．１）、Lactococcus lactis ssp. lactis ＩＬ １４０３株（Genbank 受け入れ番号ＡＥ００５１７６．１）、及びLactococcus lactis ssp. cremoris ＳＫ１１株（Genbank 受け入れ番号ＣＰ０００４２５．１）である。これらの L.lactis 種のそれぞれの配列はその全てが参照により本明細書に取り込まれている。
【０１２６】
関連する実施態様では、ＬＡＢは Enterococcus  種である。さらなる実施態様では、ＬＡＢは Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、又は、これに限定されないが、Enterococcus faecium ＬＭＧ１５７０９株、のような、これらの亜種及び株である。
【０１２７】
ＩＬ−２７オープンリーディングフレーム又はコード配列を特定目的をもたらす追加配列と結合させることができるということを当業者は理解できるだろう。例えば、外来遺伝子の分泌を増大するために、遺伝子を分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列と結合させることができる。実施態様では、本発明に従う外来遺伝子、オープンリーディングフレーム又はコード配列はその５’末端でＵｓｐ４５分泌シグナルをコードするポリ核酸に結合している。関連する実施態様では、分泌シグナルは Lactococcus 種、例えば Lactococcus lactis 及びその亜種及び株を起源としている。関連する実施態様では、分泌シグナルはEnterococcus 種、例えば、Enterococcus faecium 及びその亜種及び株を起源としている。
【０１２８】
一般的に、分泌シグナル配列は、通常、脂質二層膜に取り込まれ、それによって宿主細胞から付随しているタンパク質又はペプチド配列の分泌を可能にする疎水性アミノ酸を含有している、約１６〜約３５のアミノ酸部分を示す。実施態様では、シグナル配列はタンパク質又はペプチドから開裂される。
【０１２９】
適切な宿主細胞中で作用する分泌シグナル配列は当該技術分野において周知である。典型的な Lactococcus シグナル配列はｕｓｐ４５のもの（米国特許第５，５５９，００７号公報参照）及びその他のもの（例えば、Perez-Martinez et al. Mol. Gen. Genet. 234:401-11 (1992); Sibakov et al., Appl. Environ. Microbiol. 57:341-8 (1991) を参照されたい）を包含する。実施態様では、シグナル配列はプロモーター配列とＯＲＦの間に位置している。例えば、シグナル配列はプロモーター配列から３’に、そして目的のポリペプチドのＯＲＦの前に位置している。関連する実施態様では、シグナル配列はアミノ酸配列、ＭＫＫＫＩＩＳＡＩＬＭＳＴＶＩＬＳＡＡＡＰＬＳＧＶＹＡ（ｕｓｐ４５）をコードする。或いは、突然変異ｕｓｐ４５シグナル配列（ｕｓｐ４５Ｎ）も用いることができ、これは目的のポリペプチドのさらに制御可能な産生及び分泌をもたらす。突然変異体は４位にリジン（Ｋ）の代わりにアスパラギン（Ｎ）、又はＫ４Ｎ突然変異を含んでいてもよい。実施態様では、シグナル配列はアミノ酸配列、ＭＫＫＮＩＩＳＡＩＬＭＳＴＶＩＬＳＡＡＡ  ＰＬＳＧＶＹＡＤＴＮをコードする。
【０１３０】
さらなる態様では、本発明は本明細書に記載されているようなポリ核酸を含んでいるレプリコンに関している。実施態様では、レプリコンは本明細書に記載されているような、ベクターである。実施態様では、ベクターは原核生物の発現に適している。別の実施態様では、ベクターはグラム陽性細菌中の相同的組み換えに適している。
【０１３１】
本発明は、治療のための本明細書に記載されているような本発明に従うグラム陽性細菌の使用にも関している。
【０１３２】
従って、一態様では、本発明は、医薬として使用するための本明細書に記載されているような本発明に従うグラム陽性細菌又はグラム陽性細菌を含んでいる医薬組成物に関している。別の態様では、治療又は処置で使用するための本明細書に記載されているような本発明に従うグラム陽性細菌又はグラム陽性細菌を含んでいる医薬組成物に関している。さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載されているような本発明に従うグラム陽性細菌又はグラム陽性細菌を含んでいる医薬組成物の医薬の製造のための使用に関している。さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載されているような本発明に従うグラム陽性細菌又はグラム陽性細菌を含んでいる医薬組成物を投与することを含んでなる、治療方法に関している。実施態様では、グラム陽性細菌はタンパク質、ポリペプチド又はペプチド（例えば、ＩＬ−２７）のような、産物をコードする１つ又はそれ以上の外来遺伝子を含んでいて、この産物は対象において治療又は予防効果を有している。
【０１３３】
本発明のグラム陽性細菌は単独又は１つ又はそれ以上の活性化合物と組合せて投与できる。後者はグラム陽性細菌の投与の前、後、又は同時に投与できる。
【０１３４】
本発明のグラム陽性細菌は治療する疾患を有しているヒト又は動物に投与するために医薬製剤中に懸濁することができる。このような医薬製剤は、これに限定されないが、生きているグラム陽性細菌及び投与に適している媒体を含んでいる。グラム陽性細菌は、通常の賦形剤、例えば、乳糖、その他の糖類、アルカリ及び／又はアルカリ土類ステアリン酸塩、炭酸塩、及び／又は硫酸塩（例えば、ステアリン酸マグネシウム、炭酸ナトリウム及び硫酸ナトリウム）、カオリン、シリカ、香味剤及び芳香剤などの存在下で凍結乾燥できる。このように凍結乾燥されたグラム陽性細菌をカプセル、錠剤、顆粒剤及び粉末剤（例えば、洗口粉末）の形態に調製でき、これらはそれぞれ経口で投与できる。或いは、あるグラム陽性細菌は適切な媒体中の水性懸濁液として調製でき、又は凍結乾燥した細菌を使用直前に適切な媒体に懸濁することができる。このような媒体は本明細書で参照している賦形剤及び、グルコース、グリシン及びサッカリンナトリウムなどの他の賦形剤とを包含する。
【０１３５】
経口投与に関しては、腸溶性（gastroresistant）経口剤形を製剤化でき、この剤形は、グラム陽性細菌の制御放出をもたらすのでそこでコードされる所望のタンパク質（例えば、ＩＬ−２７）の制御放出をもたらす化合物も包含できる。例えば、経口投与剤形（カプセル、錠剤、ペレット、顆粒剤、粉末剤）は、胃内で溶解又は崩壊しないが、腸内で溶解又は崩壊するので、崩壊しやすい胃を通過して、腸内での溶解及び吸収を可能にする、賦形剤（例えば、ポリマー、セルロースの誘導体及び／又は親油性物質）の薄層でコーティングできる。
【０１３６】
経口用剤形は、グラム陽性細菌の及び産生された外来タンパク質の徐放ができるように、例えば、制御放出、持続放出、遅延放出、持続作用錠剤又はカプセルに、設計することができる。これらの剤形は通常、従来のそして周知の賦形剤、例えば、親油性、高分子性、セルロース性、不溶性、膨潤性の賦形剤などを含んでいる。このような製剤は当該技術分野において周知であり、そして例えば以下の文献に記載されている：Hansel et al., Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 5th edition, William and Wilkins, 1990; Chien 1992, Novel drug delivery system, 2nd edition, M. Dekker; Prescott et al., Novel drug delivery, J.Wiley & Sons, 1989; 及び Cazzaniga et al., Int. J. Pharm. i08:7 (1994)。
【０１３７】
（ＩＬ−２７組成物の投与）
本発明は、本発明のＩＬ−２７及びその他の薬剤（このような薬剤を含有している医薬組成物を包含する）を、それを必要としている対象、例えば、炎症性腸疾患又はその症状を有するヒト、へ投与するための当該技術分野で許容される適切な技術又は手法を意図している。これらの投与技術は、ＩＬ−２７又はＩＬ−２７をコードする核酸のＩＢＤ病変又は結腸の罹患部へ直接注射による、制御された方法で胃腸管内へＩＬ−２７を送達する形態（例えば、制御放出コーティングされている微粒子）でのＩＬ−２７の投与、又は本発明のポリペプチド薬剤を胃腸管の１つ又はそれ以上の組織に発現して分泌する（例えば腸粘膜に局所分泌）ように組み替えられた遺伝子組み換え微生物の投与によるのような、局所送達方法を包含できる。
【０１３８】
実施態様では、本発明のＩＬ−２７又はその生物活性断片若しくはその変異体或いはその他のポリペプチド薬剤は、炎症性腸疾患を有しているか又は有する可能性のある対象に組み替え微生物を介して投与できる。ＩＬ−２７の投与に関して先に記載も示唆もされていないが、このような組み換え微生物の、サイトカインを含む、その他の組み換えタンパク質を送達するための使用は、例えば、国際公開第ＷＯ９６／１１２７７号、同第ＷＯ９７／１４８０６号、同第ＷＯ００／２３４７１号公報、米国特許第６，７４６，６７１号公報、Steidler et al., Infection and Immunity, 66:3183-3189 (1998);及び Steidler et al., Science, 289:1352-1355 (2000)の記載に見られ、これらはそれぞれその全てが参照により本明細書に取り込まれている。
【０１３９】
（組み換え微生物によるＩＬ−２７の投与）
一態様では、本発明は、動物における炎症性腸疾患の治療のための、組み換え技術によって作られた微生物、例えば、組み換え L. lactis 又は E. faecium を含んでいる医薬組成物の調製及び投与に関している。本発明はさらに、本発明の医薬組成物による治療を必要としている炎症性腸疾患を有している対象へこのような医薬組成物を投与する方法を含んでいる。
【０１４０】
本発明は、炎症性腸疾患の治療に有用である、組み換え技術によって作られた微生物、例えば、L. lactis 又は E. faecium を含んでいる医薬組成物を包含する。本発明のこの態様はある特定の微生物が動物の粘膜表面中で生存する能力を利用し、この粘膜は身体の外部と内部の境界面を示し、そして／又は胞子形成或いは溶解を受けるので、粘膜表面、例えば、腸粘膜表面で発現された組み換えタンパク質を放出する。動物に投与されると、所望の治療タンパク質、例えば、ＩＬ−２７或いはその生物活性断片又は変異体をコードする本発明の組み換え微生物は、これを発現及び産生する。このように産生されたタンパク質は次いで、産生部位で所望の治療効果を有するか、又は所望の解剖学的位置に選択的に輸送されてそこで所望の治療効果を発揮する。
【０１４１】
本発明においては、微生物は、多種の細胞型、例えば、細菌、真菌、及び／又は酵母細胞を遺伝子的に操作するための当該技術分野で入手可能な公知技術を用いて所望の組み換えタンパク質を発現するように操作される。細菌及びその他の微生物のある特定の特性は、本発明の治療用組み換えタンパク質、例えば、ＩＬ−２７又はその生物活性断片若しくは変異体の投与のための担体としてそれらが有用になるように利用される。
【０１４２】
これらの特性は、これに限定されないが，上皮細胞へ接着する微生物の能力（Karlsson et al., Ann. Rev. Biochem. 58:309 (1989)を参照されたい）；胞子を形成する微生物の能力、ここで胞子は悪条件に耐性を示して大量のタンパク質を生産できる（Kaiser et al., Cell 73:237 (1993)を参照されたい）；胃腸管の多種組織及び部位に対する指向性を有する微生物の能力を包含する。
【０１４３】
ある特定の微生物はとりわけ、腸管の粘膜、口及び食道の粘膜、鼻、咽頭、気管の粘膜、膣粘膜、皮膚、目、及耳（粘膜）に対して選択的指向性を有していることが知られている。このような微生物、例えば、細菌は、動物の特定の疾患状況の治療に有用な所望のタンパク質をコードする、所望の遺伝子を含有するように操作される。微生物はタンパク質をin situ で、すなわち、動物の内部で生産し、次いで送達するので、所望のタンパク質を動物に投与する。
【０１４４】
所望の遺伝子を含むことに加えて、細菌による所望のタンパク質の産生又は標的部位又は組織又は細胞へのその送達を促進するその他の配列要素をコードするように微生物を操作することもできる。このような配列要素は、これに限定されないが、タンパク質の構成的又は誘導的発現を促進する、或いは細菌におけるタンパク質の過剰発現を促進するプロモーター／調節配列を包含する。追加の配列要素は、細菌からのタンパク質の分泌、細菌内へのタンパク質の蓄積、及び／又は細菌からタンパク質を放出するための細菌のプログラム化された溶解を促進するものも包含する。また、標的配列は、所望のタンパク質が特定の細胞受容体又はチャンネルに結合できるようにして、タンパク質の特定細胞への送達を促進するように利用できる。上で参照されているような多くの配列要素は当業者に公知である（例えば、参照により本明細書に取り込まれている、Hodgson, Bio/Technology 11:887 (1993) を参照されたい）。
【０１４５】
例えば、熱誘導、ガラクトース誘導、ウィルスプロモーター誘導及び熱ショックタンパク質誘導システムは当該技術分野で十分に記載されており当業者に容易に理解される。さらなる誘導発現システムは、ストレス、金属イオン、その他の代謝産物及び異化代謝産物に応答する遺伝子発現システムを包含する。本発明で有用なその他の要素は、用いられる細菌の型、発現するタンパク質の型及び動物の標的部位の型によって決まる。このような要素は、本開示を見れば当業者に容易に明らかになるだろう。
【０１４６】
例えば、本発明はさらに、ある特定の細胞、組織又はＧＩ管の領域への微生物の指向又は結合可能性を加える、変化する又は増強するように微生物を遺伝子操作できるということも意図している。このような修正は公知の組み換え方法を用いて作製することができる。
【０１４７】
本発明は、薬理学的に活性なタンパク質、例えば、ＩＬ−２７或いはその生物活性断片又は変異体を生産する能力がある微生物を包含する。薬理学的に活性なタンパク質は、微生物内で生産されて、この溶解によって放出できる。本発明は、タンパク質が微生物によって排出又は分泌され得るか（例えば、分泌シグナルの使用を介して）、或いは胞子形成によって、又は胞子を発芽し栄養細胞を形成して、又は溶解によって放出され得るということも意図している。
【０１４８】
一実施態様では、本発明のＩＬ−２７は、ポリペプチドを細菌送達システム（例えば、L. lactis システム）から分泌又は放出できるようにするのに適しているリーダー配列を包含できる。ある特定の実施態様では、ＩＬ−２７の分泌を可能にするために、L. lactis 中で用いるのに適している分泌リーダーをコードする断片は、個々のα及び／又はβ鎖の、又はα及びβ鎖が結合している配列のＩＬ−２７配列の５’末端又は３’末端に付加することができる。これはＮ−末端又はＣ末端分泌リーダー延長を有する、ＩＬ−２７α−β融合タンパク質又はＩＬ−２７αとＩＬ−２７βの融合タンパク質をもたらす。この断片はｕｓｐ４５遺伝子（van Asseldonk et al., Gene 95:155-160 (1990)、参照により本明細書に取り込まれている）由来の、配列Ｎ−ＭＫＫＫＩＩＳＡＩＬＭＳＴＶＩＬＳＡＡＡＰＬＳＧＶＹＡ−Ｃを有するが、本発明で用いられる微生物媒体（例えば、L. lactis 又は E. faecium）中で機能するその他の分泌リーダーのいずれであってもよい、周知の L. lactis 分泌リーダー配列をコードできる。                             
【０１４９】
本発明で有用な微生物のタイプは、これに限定されないが、酵母、真菌、及び細菌を包含する。本発明で用いるのに適している真菌は、Candida、Saccharomyces、Aspergillus又は Penicillium の真菌属の何れかに属する真菌種を包含する。本発明に適している酵母微生物は、これに限定されないが、Hansenula polymorpha、Kluiveromyces lactis、Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae 及び Schizosaccharomyces pobe を包含する。
【０１５０】
本発明で用いるのに適している細菌性微生物は、これに限定されないが、枯草菌及びその他の適切な胞子形成細菌；これに限定されないが、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium angulatum、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium catenulatum、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium longum、及び Bifidobacterium pseudocatenulatum を包含する、ビフィズス菌属のメンバー；これに限定されないが、Brevibacterium epidermis 及び Brevibacterium lactofermentum を包含する、ブレビバクテリウム属のメンバー；これに限定されないが、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae を包含する、エンテロバクター属のメンバー；これに限定されないが、Enterococcus faecalis を包含する、エンテロコッカス属のメンバー；これに限定されないが、Escherichia coli を包含する、エシェリキア属のメンバー；これに限定されないが、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus brevis、Lactobacillus casei、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii subspecies lactis、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus reuterii、Lactobacillus sake 及び Lactobacillus vaginalis を包含する、乳酸菌属のメンバー；これに限定されないが、Lactococcus lactis、Lactococcus lactis subspecies cremoris 及び Lactococcus lactis subspecies lactis を包含する、ラクトコッカス属のメンバー；これに限定されないが、 Propionibacterium jesenii を包含する、プロピオニバクテリウム属のメンバー；これに限定されないが、Staphylococcus epidermidis を包含する、ブドウ球菌属のメンバー；これに限定されないが、Streptococcus lactis、Streptococcus foecalis、Streptococcus gordonii、Streptococcus pyogenes、Streptococcus mutans、Streptococcus thermophilus 及び Streptococcus salivarius subspecies thermophilus を包含する、連鎖球菌属のメンバー；及びこれに限定されないが、Enterococcus faecalis、及び Enterococcus faecium を包含する、腸球菌属のメンバーを包含する。
【０１５１】
ある実施態様では、組み換え微生物は、これに限定されないが、Bacteroides ovatus、Clostridium、Fusobacterium、Eubacterium、Ruminococcus、Peptococcus、Eschericia、又は Lactobacillus を包含する、バクテロイデスの細菌属に属している種を包含する、組み換え微小植物種である。別の実施態様では、組み換え微小植物種は、Candida、Saccharomyces、Aspergillus 又は Penicillium の真菌属の何れかに属する真菌種である。
【０１５２】
実施態様では、本発明の微生物は、細菌 Lactococcus lactis 又は細菌 Enterococcus faecium である。
【０１５３】
本発明において有用なその他の微生物の例は、それぞれが口腔粘膜に定着して、歯肉及び歯の炎症性疾患を改善できる抗炎症性タンパク質を発現及び放出できる、Streptococcus pyogenes、Streptococcus mutans 又は Streptococcus gordonii を包含する。
【０１５４】
同様に、特に例として、潰瘍性大腸炎及びクローン病を包含する腸疾患の治療のために、治療用タンパク質を身体のこの領域内へ導入するために、例えば、Escherichia coli の腸粘膜に定着する能力を利用することができる。このような細菌を経口又は直腸内の何れかで動物に投与することができる。腸粘膜の高い吸収能力を考慮して、本発明の方法に従って、腸粘膜内の組み換え細菌による組み換えタンパク質の発現は、粘膜表面を超えて血流中への生産された組み換えタンパク質の送達をもたらすことができる。従って、組み換えタンパク質を発現できる組み換え微生物を用いる、組み換えタンパク質の全身送達も本発明で意図されている。
【０１５５】
胞子形成細菌（すなわち、クロストリジウム属及びバチルス属）を使用することもでき、これらは、胞子形態にあるとき、生来非常に厳しい環境に耐えるので、これらは胃酸の影響に耐性を示すために特に経口投与に適している。このような細菌は、動物に経口投与すると、無傷で、未変化の状態で腸粘膜に到達するはずである。発芽すると、次いでこれらの細菌は所望の活性タンパク質を腸粘膜内に産生し、こうしないとこのタンパク質は胃酸の影響に耐えて生き残れない。
【０１５６】
胞子形成細菌は、胞子を形成してそれによってタンパク質を体内の標的粘膜部位に送達するそれらの能力をさらに有効に利用することができる。この場合、所望のタンパク質をコードする植物状態の胞子形成細菌は経口投与又は直腸内投与に適している製剤中に調製することができる。腸粘膜に到達すると、このような生物は胞子を形成するように誘導され、そこで栄養細胞が溶解することによって発現されたタンパク質を粘膜内に放出する。この方法で、明確に定められた用量の所望タンパク質が粘膜内に放出される。腸内細菌による胞子形成の誘導又は胞子発芽の誘導は、このような事象を制御するこれらの生物の遺伝子をさらに操作することによって達成される。重要なことは、胞子形成細菌が、胞子形成の過程を開始するよう誘導されるが胞子を形成できないように遺伝子操作される。この場合は、所望の発現されたタンパク質を含有している細胞が溶出し、それによってタンパク質を放出する；しかし、胞子は実際には形成されないので、生きている細菌は宿主内に残っていない。
【０１５７】
その遺伝子が適切な発現ベクターに挿入されている、治療用タンパク質は非毒性で非病原性、非ワクチン原性（non-vaccinogenic）であることが好ましい。すなわち、このタンパク質自体に対して宿主を保護する著しい免疫応答を誘導すべきではない。さらに、治療用タンパク質は活性形態で発現されるか、或いは少なくとも微生物によって発現されると活性形態に変換され得ることが好ましい。実施態様では、本発明の望ましい治療用タンパク質はＩＬ−２７或いはその生物活性断片又は変異体である。関連する実施態様では、ＩＬ−２７はヒト由来であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号５のポリペプチドリンカーによって結合しているヒト１Ｌ−２７のα及びβ鎖を含んでいるキメラポリペプチドである。関連する実施態様では、ＩＬ−２７はマウス由来であって、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号５のポリペプチドリンカーによって結合しているマウス１Ｌ−２７のα及びβ鎖を含んでいるキメラポリペプチドである。両方の実施態様では、アミノ酸配列は所望の組み換え微生物媒体、L.lactis 又は E.faecium 中での発現に対して最適化されている。
【０１５８】
他の活性薬剤との併用投与に関連する別の実施態様では、組み換え微生物の戦略はこのような追加薬剤を１つの経路で併用投与することも意図している。このような薬剤は、他の治療用サイトカインのような、他のタンパク質を包含する。追加のタンパク質活性薬剤の例は、これに限定されないが、以下の遺伝子を包含する：これに限定されないが、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０，ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４及びＩＬ−１５並びにこれらの受容体アンタゴニストをコードする遺伝子を包含する、遺伝子のインターロイキンファミリーのメンバー；これに限定されないが、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、幹細胞因子（stem sell factor）、白血病抑制因子及びトロンボポエチンを包含する、造血成長因子をコードする遺伝子；神経成長因子、脳由来神経栄養因子及び毛様体神経栄養因子を包含する、神経栄養因子をコードする遺伝子；及びこれに限定されないが、ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β及びＩＦＮ-γを包含する、インターフェロンをコードする遺伝子。
【０１５９】
このような追加のタンパク質活性薬剤は、サイトカインのＣ−Ｃファミリー及びＣ−Ｘ−Ｃファミリーのような、ケモカインをコードする遺伝子；プロインスリン及び成長ホルモンのような、ホルモンをコードする遺伝子；並びに組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ又はトリプシンインヒビタ−のような、その他の酵素を包含する、血栓溶解酵素をコードをする遺伝子も包含できる。本発明はさらに、これに限定されないが、オンコスタチンＭ、血小板由来増殖）因子、線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、骨形態形成タンパク質、インスリン様増殖因子、カルシトニン並びに形質転換成長因子α及びβのような、組織修復因子、生育及び調節因子をコードする遺伝子を包含する。
【０１６０】
グリコキシル化形態においてのみ活性であるタンパク質は酵母のような微生物中で発現させなければならないということは周知である。従って、本発明は、このような場合には、このようなタンパク質を酵母からなる組み換え微生物媒体を用いて投与することを意図している。ＩＬ−２７の使用を包含する別の実施態様では、コードされるタンパク質は、これらをL. lactis、B, subtilis，又は E. coli のような、細菌送達媒体中で発現できるように、非グリコキシル化形態で活性化させてもよい。
【０１６１】
例えば、ＩＬ−２７を発現するように遺伝子操作された組み換え L. lactis を包含する、本発明の組み換え微生物は、治療される疾患、例えば、クローン病又は潰瘍性大腸炎を含む、炎症性腸疾患を有しているヒト又は動物に投与するために適切な薬学的に許容される何れかの製剤中に懸濁できる。
【０１６２】
このような製剤は生きている微生物及び投与に適している薬学的に許容される担体を含有することができる。組み換え微生物は、通常の賦形剤、例えば、乳糖、その他の糖類、アルカリ及び／又はアルカリ土類ステアリン酸塩、炭酸塩、及び／又は硫酸塩（例えば、ステアリン酸マグネシウム、炭酸ナトリウム及び硫酸ナトリウム）、カオリン、シリカ、香味剤及び芳香剤などの存在下で凍結乾燥できる。このように凍結乾燥された微生物は、カプセル、錠剤、顆粒剤及び粉末剤の形態に調製でき、これらはそれぞれ経口投与できる。或いは、いくつかの組み換え細菌、又はその胞子さえも、適切な媒体中で水性懸濁液として調製でき、又は凍結乾燥された細菌又は胞子を使用直前に適切な媒体中に懸濁できて、そのような媒体は本明細書で参照された賦形剤、及びグルコース、グリシン、及びサッカリンナトリウムのようなその他の賦形剤、又は当業者に公知のその他の適切な媒体を包含する。
【０１６３】
経口投与に関しては、腸溶性剤形を製剤化することができ、この剤形は、微生物の制御放出をもたらす化合物を包含でき、それによりそこでコードされる所望のタンパク質の制御放出をもたらす。例えば、経口投与剤形（錠剤、ペレット、顆粒剤、粉末剤を包含する）は、胃内で溶解又は崩壊しないが、腸内で溶解又は崩壊するので、崩壊しやすい胃を通過して、腸内での溶解及び吸収を可能にするような、賦形剤（通常、ポリマー、セルロースの誘導体及び／又は親油性物質）の薄層でコーティングできる。経口剤形は、微生物の及びその組み換えタンパク質の徐放を可能にするように、例えば、制御放出、持続放出、長期放出、持続作用錠剤又はカプセルに設計することができる。
【０１６４】
これらの剤形は従来の周知の賦形剤、例えば、親油性、高分子性、セルロース性、不溶性、膨潤性の賦形剤などを含むことができる。本発明の組成物を直腸内に投与すべき場合は、医薬組成物は坐薬及びクリームを包含することができる。この場合は、微生物を脂肪を含む通常の賦形剤の混合物中に懸濁してもよい。
【０１６５】
上記製剤のそれぞれは当該技術分野で周知であって、例えば、Hansel et al.; Chien; 及び Cazzaniga et al. に記載されている。従って、本発明によれば、所望の遺伝子をコードする組み換え微生物を何れかの適切な投与経路、例えば、経口で動物又はヒトに投与することができる。
【０１６６】
投与する微生物の用量は、細菌及びそれによってコードされる遺伝子の型、治療する疾患の型及び重症度、並びに用いる投与経路を包含する様々な因子によって変動するだろう。従って、本発明のありとあらゆる実施態様に対する正確な用量を特定することはできないが、本発明を目にすれば、当業者には容易に明らかになるだろう。例えば、ＥＬＩＳＡのような公知方法などの周知方法を用いて、又は Biacore システム（GE Healthcare、この製品マニュアル又は文献の何れの内容も参照により組み込まれている）を用いて、規定数の細胞投与後の組み換えタンパク質の血清濃度を測定することによる個別的な分析及び方法で用量を決定することができる。動力学的プロファイルの分析及び送達された組み換えタンパク質の半減期が、形質転換微生物についての有効な用量範囲の確定を可能にする十分な情報を提供する。例として、ＩＬ−２７をコードする L. lactis は、およそ１０９コロニー形成ユニット（ｃｆｕ）／体重ｋｇ／日、或いは１０１０、１０１１、又は１０１２コロニー形成ユニット（ｃｆｕ）／体重ｋｇ／日までの用量で動物に投与できる。
【０１６７】
ある特定の別の実施態様では、本発明の組み換え微生物を含有している医薬組成物は、例えば、カテーテルシステム、結腸鏡、内視鏡、又は本発明の医薬組成物を送達するためのその他の同様な手段を包含する、何れかの適切な非侵襲性技術によって、胃腸管内の特定部位（例えば、クローン病病変部又は炎症のＩＢＤ関連部位）へ局所送達することもできる。このような技術は当該技術分野で周知であって、例えば、米国特許第７，５９１，７８３号；同第７，５８２，０５５号；同第７，５７８，７８６号；同第７，５４４，１６３号；同第７，５３０，９４８号；同第７，４４８，９９５号；同第７，４１３，５４３号；同第７，２５８，６６３号；同第７，２３５，０４５号；同第７，２２９，４０７号；同第７，０７４，１８１号；同第７，０４２，４８８号；同第６，９７４，４１１号；同第６，９０２，５２７号；同第６，８６９，３９７号；同第６，５３７，２１１号；同第６，４２５，５３５号；同第５，７４６，６９２号；同第５，７０４，８９９号；同第５，１７０，７７４号；同第５，１１０，６４５号；同第４，９４６，４４２号；同第４，８５７，０５７号；又は同第３，９４１，１２１号公報にさらに記載されていることがわかり、これらはそれぞれが参照により本明細書に取り込まれている。実施態様では、本発明は、ＩＬ−２７或いはその生物活性断片又は変異体を、例えば、クローン病の病変部又は炎症部位を包含する、胃腸管内の組織又は部位に発現して放出するように遺伝子操作された L. lactis 又は E. faecium の、結腸の内部に又は治療部位に直接的なその他の部位に医薬組成物を貯留できるようにするカテーテル送達システムを用いることによる局所送達を提供する。
【０１６８】
（ＩＬ−２７ポリペプチド又は核酸分子の投与）
本発明は、胃腸管へ局所送達するための何れか適切な投与法、例えば、経口制御送達、病変への直接送達、又は炎症部位への直接送達による、ＩＬ−２７又はその生物活性断片若しくは変異体の何れか及び／又はこれをコードする核酸分子の何れかの投与を意図している。ＩＬ−２７ポリペプチド及びＩＬ−２７をコードする核酸分子のための適切な送達システムを作製する方法及び技術は当該技術分野で周知であって、以下の部分に記載されている。
【０１６９】
脂質に基づいたミクロスフェア送達システムを本発明のポリペプチド及び／又は核酸分子を送達するために用いることができる。任意に、このようなシステムを胃腸管の細胞及び／又は組織をこれが特異的に標的にするように、修正できる。このようなシステムを作製する方法は当業者に周知である。例えば、ＩＬ−２７又はＩＬ−２７をコードする核酸分子を含有しているミクロスフェアを、ミクロスフェアが胃腸管の標的細胞又は組織上の受容体又はその他の標的と特異的に結合及び／又は相互作用できるようにする１つ又はそれ以上のリガンド又は標的部位を含むように修正できる。
【０１７０】
従って、一態様では、本発明は、胃腸管の１つ又はそれ以上の細胞又は組織を標的にできる部位を含むように任意に修正されていてもよい、安定化した核酸−脂質粒子、カチオン性脂質又はリポソーム核酸複合体（すなわち、リポプレックス）、リポソーム、ミセル、ウィロゾーム、又はこれらの混合物のような、脂質に基づいた搬送システムからなるＩＬ−２７又はＩＬ−２７をコードする核酸の製剤を提供する。
別の実施態様では、搬送システムは、胃腸管の１つ又はそれ以上の細胞又は組織を標的にできる部位を含むように任意に修正されていてもよい、カチオン性ポリマー−核酸複合体（すなわち、ポリプレックス）のような、ポリマーに基づいた搬送システムである。
追加の実施態様では、搬送システムは、胃腸管の１つ又はそれ以上の細胞又は組織を標的にできる部位を含むように任意に修正されていてもよい、シクロデキストリンポリマー−核酸複合体のような、シクロデキストリンに基づいた搬送システムである。
さらなる実施態様では、搬送システムはカチオン性ペプチド−核酸複合体のような、タンパク質に基づいた搬送システムである。核酸−脂質及び／又はタンパク質−脂質粒子及びそれらの作製方法は、例えば、米国特許第５，７５３，６１３号；同第５，７８５，９９２号；同第５，７０５，３８５号；同第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，１１０，７４５号；及び同第６，３２０，０１７号；並びにＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４０９６４号公報に開示されており、これらは全て参照により本明細書に取り込まれている。
【０１７１】
本発明のリポプレックスは、安定な複合体を生産することができる多種の中性非荷電の、両性イオン、又はアニオン性脂質の何れかを包含する、本発明の製剤で用いられる非カチオン性脂質を包含できる。このような非カチオン性脂質は中性か負に荷電していてよい。非カチオン性脂質の例は、限定されないが、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、及びステアロイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）を包含する。コレステロールのような非カチオン性脂質又はステロールも存在する。リンを含有していない脂質は、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミチン酸、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン−ラウリル硫酸、アルキル−アリール硫酸ポリエチルオキシ化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロマイド、セラミド、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、等を包含する。リゾホスファチジルコリン及びリゾホスファチジルエタノールアミンのような、別の脂質も存在する。非カチオン性脂質は、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、及び米国特許出願第０８／３１６，４２９号に記載されているような、リン脂質又はセラミドとコンジュゲートしているポリエチレングリコール（ＰＥＧ−Ｃｅｒと呼ぶ）のような、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に基づいたポリマーも包含する。
【０１７２】
ある特定の実施態様では、非カチオン性脂質は、ジアシルホスファチジルコリン（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びジリノレオイルホスファチジルコリン）、ジアシルホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン及びパルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン）、セラミド、又はスフィンゴミエリンである。
【０１７３】
本発明の製剤のカチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシプロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２，−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎｄＭＡ）、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＭＲＩＥ又はこれらの混合物であってよい。
【０１７４】
これらの脂質及び関連する類縁体の多くは米国特許出願公開第２００６００８３７８０号；米国特許第５，２０８，０３６号；同第５，２６４，６１８号；同第５，２７９，８３３号；同第５，２８３，１８５号；同第５，７５３，６１３号；及び同第５，７８５，９９２号；並びにＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９０号公報に記載されている。また、ＤＮＡ／ＲＮＡ送達用のカチオン性脂質の多くの市販製剤を入手できて本発明で使用できる。これらは、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（GEBCO/BRL, Grand Island, N.Y., USA から市販されているＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含有するカチオン性リポソーム）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（GIBCO/BRL から市販されているＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含有するカチオン性リポソーム）；及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（Promega Corp., Madison, Wis., USA から市販されているＤＯＧＳを含有するカチオン性リポソーム）を包含する。
【０１７５】
本発明の製剤はさらにコレステロールを含有してもよい。存在する場合は、コレステロールは一般に、製剤中に存在する総脂質の約０モル％〜約１０モル％、約２モル％〜約１０モル％、約１０モル％〜約６０モル％、約１２モル％〜約５８モル％、約２０モル％〜約５５モル％、約３０モル％〜約５０モル％、又は約４８モル％含まれる。
【０１７６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質複合体、ポリアミド（ＡＴＴＡ）−脂質複合体、カチオン性ポリマー−脂質複合体（ＣＰＬ）、又はこれらの混合物を包含する、複合脂質も本発明の製剤に含まれる。ある特定の実施態様では、本発明の核酸−脂質製剤は、ＰＥＧ−脂質複合体又はＡＴＴＡ−脂質複合体の何れかを含んでいる。任意に、ＰＥＧ−脂質複合体又はＡＴＴＡ−脂質複合体をＣＰＬと一緒に用いる。本発明の製剤の複合脂質は、例えば、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、又はこれらの混合物を含む、ＰＥＧ−脂質を含有できる。ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体はＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、又はＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）であってよい。任意に、複合脂質は、式：Ａ−Ｗ−Ｙ（式中のＡは脂質部分であり、Ｗは親水性ポリマーであり、そしてＹはポリカチオン性部分である）を有するＣＰＬである。Ｗは、ＰＥＧ、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体、又はそれらの組合わせよりなる群から選ぶことができ、ポリマーは約２５０〜約７０００ダルトンの分子量を有している。ある実施態様では、Ｙは選択されたｐＨにおいて少なくとも４正電荷を有している。ある実施態様では、Ｙはリジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、それらの誘導体、又はそれらの組合わせであってよい。ある特定の実施態様では、複合脂質は、製剤中に存在している総脂質の０モル％〜約２０モル％又は約２モル％で、本発明の製剤中に存在する。
【０１７７】
カチオン性及び非カチオン性脂質に加えて、本発明の製剤は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／０２６３７２号公報に記載されているような、ジアルキルオキシプロピルに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＡ）、例えば、米国特許出願公開第２００３００７７８２９号及び同第２００５００８６８９号公報に記載されているような、ジアシルグリセロールに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミンのようなリン脂質に結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）、セラミドに結合したＰＥＧ、又はそれらの混合物（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号公報を参照されたい）のようなＡＴＴＡ-脂質又はＰＥＧ-脂質などの安定化成分（ＳＣ）を含有してもよい。ある特定の実施態様では、ＳＣは製剤粒子の凝集を防ぐ複合脂質である。適切な複合脂質は、これに限定されないが、ＰＥＧ−脂質複合体、ＡＴＴＡ−脂質複合体、カチオン性ポリマー−脂質複合体（ＣＰＬｓ）、及びこれらの混合物を包含する。さらなる実施態様では、製剤粒子はＣＰＬと共にＰＥＧ−脂質複合体又はＡＴＴＡ−脂質複合体の何れかを含んでいる。
【０１７８】
ＰＥＧは、２つの末端水酸基を有する、エチレンＰＥＧ繰り返し単位の線状、水溶性ポリマーである。ＰＥＧはそれらの分子量で分類され、例えば、ＰＥＧ２０００は約２，０００ダルトンの平均分子量を有し、そしてＰＥＧ５０００は約５，０００ダルトンの平均分子量を有している。ＰＥＧは、Sigma Chemical Co. 及びその他の会社から市販されていて、例えば、以下のものを包含する：モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−コハク酸エステル（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジル−コハク酸エステル（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、及びモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）。また、モノメトキシポリエチレングリコール−酢酸（ＭｅＰＥＧ−ＣＨ２ＣＯＯＨ）は、例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体を包含するＰＥＧ−脂質複合体を製造するために特に有用である。
【０１７９】
ある特定の実施態様では、本発明の製剤で用いられるＰＥＧは、約５５０ダルトン〜約１０，０００ダルトン、任意に約７５０ダルトン〜約５，０００ダルトン、任意に約１，０００ダルトン〜約５，０００ダルトン、任意に約１，５００ダルトン〜約３，０００ダルトン、そして任意に約２，０００ダルトン又は約７５０ダルトンの平均分子量を有している。ＰＥＧは任意に、アルキル、アルコキシ、アシル、又はアリール基で置換されていてもよい。ＰＥＧは脂質と直接コンジュゲートしていても又はリンカー部分を介して脂質と結合していてもよい。例えば、エステル非含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分を包含している、ＰＥＧを脂質に結合するのに適しているリンカー部分を用いることができる。
【０１８０】
様々な鎖長及び飽和度の多種アシル鎖基を有しているホスファチジルエタノールアミンをＰＥＧとコンジュゲートして安定化成分を形成することができる。このようなホスファチジルエタノールアミンは市販されているか、又は当業者に公知の従来の技術を用いて単離又は合成することができる。典型的なホスファチジルエタノールアミンはＣ１０〜Ｃ２０の範囲の炭素鎖長を有する飽和又は不飽和脂肪酸を含有している。モノ又はジ不飽和脂肪酸並びに飽和及び不飽和脂肪酸の混合物を有しているホスファチジルエタノールアミンも用いることができる。適切なホスファチジルエタノールアミンは、これに限定されないが、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）を包含する。
【０１８１】
上記成分に加えて、本発明の製剤粒子又はリポプレックス（本発明のＩＬ−２７又はＩＬ−２７をコードする核酸を含んでいる）はさらに、正電荷を与えるために脂質二重層内に挿入できるように設計されているカチオン性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質又はＣＰＬを含有できる（例えば、Chen et al., Bioconj. Chem., 11:433-437 (2000)を参照されたい）。本発明の製剤中で用いることができる典型的なＳＰＬＰ及びＳＰＬＰ−ＣＰＬ、及びＳＰＬＰ及びＳＰＬＰ−ＣＰＬを製造及び使用する方法は、例えば、米国特許第６，８５２，３３４号公報及びＰＣＴ公開第ＷＯ００／６２８１３号公報に開示されている。本発明において本発明の製剤中で用いることもできる、カチオン性ポリマー脂質（ＣＰＬ）は以下の構造上の特徴を有している：（１）ＣＰＬを脂質二重層に取り込むための、疎水性脂質のような、脂質アンカー；（２）脂質アンカーをカチオン性頭部基に結合するための、ポリエチレングリコールのような、親水性スペーサー；及び（３）プロトン化可能なカチオン性頭部基を産生するための、天然アミノ酸のような、ポリカチオン性部分。
【０１８２】
上記のように、ある特定の例では、本発明のリポプレックス製剤は、胃腸管の特定標的細胞又は組織に結合するあめの標的リガンドのような、リガンドを含んでいる。ある特定の例では、製剤のリガンドは正電荷を有している。典型的なリガンドは、これに限定されないが、反応性官能基を有していて、脂質、両親媒性脂質、担体化合物、生体親和性化合物、生体材料、生体ポリマー、生体医療用デバイス、分析的に検出可能な化合物、治療活性化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫刺激剤、放射標識、蛍光発生物質、ビオチン、薬物、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖類、リポソーム、ウィロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、その他の標的部分、又はトキシンを包含する、化合物又はリガンドを包含する。
【０１８３】
本発明で用いるのに適しているさらなる脂質に基づく担体システムの限定されない例は、リポプレックス（例えば、米国特許出願公開第２００３０２０３８６５号公報及び Zhang et al., J. Control Release, 100:165-180 (2004) を参照されたい）、ｐＨ感受性リポプレックス（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１９２２７５号公報を参照されたい）、可逆的にマスクされたリポプレックス（例えば、米国特許出願公開第２００３／１８０９５０号公報を参照されたい）、カチオン性脂質に基づく組成物（例えば、米国特許第６，７５６，０５４号公報及び米国特許出願公開第２００５／０２３４２３２号公報を参照されたい）、カチオン性リポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００３，／０２２９０４０号、同第２００２／０１６００３８号、及び同第２００２／００１２９９８号公報；米国特許第５，９０８，６３５号公報；及びＰＣＴ公開第ＷＯ０１／７２２８３号公報を参照されたい）、アニオン性リポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００３／００２６８３１号公報を参照されたい）、ｐＨ感受性リポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１９２２７４号公報；及びオーストラリア特許出願公開第２００３／２１０３０３号公報を参照されたい）、抗体コーティングリポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１０８５９７号公報；及びＰＣＴ公開第ＷＯ００／５０００８号公報を参照されたい）、細胞型特異的リポソーム（米国特許出願公開第２００３／０１９８６６４号公報を参照されたい）、核酸及びペプチドを含有しているリポソーム（例えば、米国特許第６，２０７，４５６号公報を参照されたい）、放出可能な親水性ポリマーで誘導体化した脂質を含有しているリポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００３／００３１７０４号公報を参照されたい）、脂質封入核酸（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０５７１９０号及び同第ＷＯ０３／０５９３２２号公報を参照されたい）。脂質被包性核酸（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９２２１号公報；及び米国特許第５，７５６，１２２号公報を参照されたい）。その他のリポソーム組成物（例えば、米国特許出願公開第２００３／００３５８２９号、及び同第２００３／００７２９４号公報；並びに米国特許第６，２００，５９９号公報を参照されたい）。リポソームと乳剤の安定化した混合物（例えば、ヨーロッパ特許第１３０４１６０号を参照されたい）、乳剤組成物（例えば、米国特許第６，７４７，０１４号公報を参照されたい）、及び核酸マイクロエマルション（例えば、米国特許出願公開第２００５／００３７０８６号公報を参照されたい）を包含する。
【０１８４】
本発明で用いるのに適しているポリマーに基づく担体システムの例は、これに限定されないが、カチオン性ポリマー−核酸複合体（すなわち、ポリプレックス）を包含する。ポリプレックスを形成するために、輸送物（例えば、ＩＬ−２７又はＩＬ−２７をコードする核酸）を通常は、細胞表面でアニオン性プロテオグリカンと相互作用してエンドサイトシスによって細胞に入ることができる正に荷電した粒子内に輸送物を凝集する、線状、分岐状、星状、又は樹状ポリマー構造を有するカチオン性ポリマーと複合体化する。
ある実施態様では、ポリプレックスはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（例えば、米国特許第６，０１３，２４０号公報を参照されたい；In vivo jetPEI（登録商標）として Qiagan, Inc. (Carlsbad, Calif,) から市販されている、ＰＥＩの線状形態）、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン、ｐｏｌｙ（β−アミノエステル）（ＰＡＥ）ポリマー（例えば、Lynn et al., J. Am. Chem. Soc., 123:8155-8156 (2001) を参照されたい）、キトサン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デントリマー（樹状高分子）（例えば、Kukowska-Latallo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:4897-4902 (1996) を参照されたい）、プロフィリン（例えば、米国特許第６，６２０，８０５号公報を参照されたい）、ポリビニルエーテル（例えば、米国特許出願公開第２００４０１５６９０９号公報を参照されたい）、ポリサイクリックアミジニウム（例えば、米国特許出願公開第２００３０２２０２８９号公報を参照されたい）、１級アミン、イミン、グアニジン、及び／又はイミダゾール基を含有するその他のポリマー（例えば、米国特許第６，０１３，２４０号公報、ＰＣＴ公開第ＷＯ／９６０２６５５号公報；ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／２１９３１号公報； Zhang et al., J. Control Release, 100:165-180 (2004); 及び Tiera et al., Curr. Gene Ther., 6:59-71 (2006) を参照されたい）及びその混合物のような、カチオン性ポリマーと複合体化した核酸を含んでいる。
別の実施態様では、ポリプレックスは、米国特許出願公開第２００６／０２１１６４３号、同第２００５／０２２２０６４号、同第２００３／０１２５２８１号、及び同第２００３／０１８５８９０号公報、並びにＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０６６０６９号公報に記載されているようなカチオン性ポリマー−核酸複合体；米国特許出願公開第２００４／００７１６５４号公報に記載されているような生物分解性のポリ（β−アミノエステル）ポリマー−核酸複合体；米国特許出願公開第２００４／０１４２４７５号公報に記載されているようなポリマーマトリックスを含有している微小粒子；米国特許出願公開第２００３／０１５７０３０号公報に記載されているようなその他の微小粒子組成物；米国特許出願公開第２００５／０１２３６００号公報に記載されているような凝縮核酸複合体；オーストラリア特許出願公開第２００２３５８５１４号公報及びＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０９６５５１号公報に記載されているようなナノカプセル及びミクロカプセル組成物を含有している。
【０１８５】
ある特定の例では、輸送物（例えば、ＩＬ−２７又はＩＬ−２７をコードするＤＮＡ）はシクロデキストリン又はそのポリマーとの複合体であってよい。シクロデキストリンに基づく担体システムの限定ではない例は、米国特許出願公開第２００４／００８７０２４号号に記載されている線状シクロデキストリン−修飾ポリマー−核酸複合体；米国特許第６，５０９，３２３号、同第６，８８４，７８９号、及び同第７，０９１，１９２号に記載されているシクロデキストリンコーポリマー−核酸複合体；及び米国特許第７，０１８，６０９号に記載されているシクロデキストリンポリマー−複合体形成物質−核酸複合体を包含する。
その他のある特定の例では、輸送物（例えば、ＤｓｉＲＮＡのような核酸）はペプチド又はポリペプチドとの複合体であってよい。タンパク質に基づく担体システムの例は、これに限定されないが、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／２１９３１号公報に記載されているカチオン性オリゴペプチド−核酸複合体を包含する。
【０１８６】
（その他の胃腸送達システムによるＩＬ−２７の投与）
当該技術分野で公知であるか、又は先に記載されている適切な胃腸送達システムの何れかは、本発明のＩＬ−２７ポリペプチド及び／又は核酸分子及び／又は脂質に基づく製剤及び／又は組み換え微生物送達システムを、炎症性腸疾患を有している対象の胃腸管の罹患領域又は部位に送達するために利用するか或いは修飾して用いることができる。
【０１８７】
例えば、米国特許第６，５３１，１５２号公報は、水不溶性或いは相対的水不溶性のコーティング物質で覆われている膨潤性のコア物質を有し、その中に微粒子の水不溶性物質が取り込まれていてその中に目的の活性剤が含まれている、胃腸送達システムを記載している。送達デバイスが胃腸管に入ると、微粒子物質が液体を取り込んで、よって薬剤含有コアと送達デバイスの外側とを相互連結するチャンネルを形成する。これらのチャンネルを通って液体がコアに入り、次いでコーティングが破れるまでコアが膨潤する。コーティングの保全性が破壊されると、コアが崩壊して直ちに全ての或いは殆どの薬剤を特定部位に放出する。コア物質、コーティング中の担体物質、及び特定の物質のような、デバイス中の制御パラメータによって、薬剤の放出位置を綿密に制御できる。このようなシステムは、ＩＬ−２７又はＩＬ−２７をコードする核酸を位置及び時間依存的方法で胃腸管に送達するために用いることができる。
【０１８８】
米国特許第５，６８６，１０５号及び同第５，６８６，１０６号（両方とも Kelm, G.R.）公報には結腸へ送達するために活性薬物をコーティングするポリマーの使用が記載されている。ポリマーは剤形が小腸と結腸の間の入り口に到達するのとほぼ同時に、又はその後結腸で、分解する。このようなポリマーの例は、酢酸フタル酸セルロースを包含する。このようなシステムは、本発明のＩＬ−２７又はＩｌ−２７をコードする核酸分子を胃腸管の局所病変部に投与するために利用できる。
【０１８９】
米国特許第５，４６４，６３３号公報（Conte, U., et al.）は、活性物質を含有しているコア、及び活性物質の即時放出を阻止することができる外層からなる錠剤を記載している。外層は水性媒体中で浸食可能及び／又はゲル化可能及び／又は可溶性の親水性ポロマー及びアジュバント物質の類に属する天然及び／又は合成ポリマー物質である。最後に、この層は胃液抵抗性で腸溶性のコーティングで覆われている。このようなシステムは、本発明のＩＬ−２７又はＩｌ−２７をコードする核酸分子を胃腸管の局所罹患部に投与するために利用できる。
【０１９０】
キトサンのような生体材料に関するシステムも本発明のＩＬ−２７を送達するために用いることができる。例えば、Borchard et al., Adv. Drug Deliv Rev. 52145-150 (2001); 及び Lee et al., Pharm. Res. 18:427-431 (2001) を参照されたい）。その他の薬剤の経口送達システムを用いることができ、そして、例えば、Novel Drug Delivery Systems, Ch.3, Oral Drug Delivery and Delivery Systems, Ed. Yie W. Chien, 2nd Edition, Drugs and Pharmaceutical Sciences, Vol. 50, New York, 1992 （この内容は参照により取り込まれている）を包含する、当該技術に記載されていることが分かる。
【０１９１】
胃腸管の至るところに制御送達するための方法、メカニズム、及び製剤は当該技術分野で周知である。Singh, Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 1:53-63 (2007)を参照されたい。この全内容は参照により本明細書に取り込まれている。このように、当業者は容易に、適切な製剤を調製して胃腸管の至るところへの活性物質の放出を制御することができる。例えば、小腸内への活性物質の放出は、腸溶性ポリマーコーティング（例えば、胃の中で見られる高い酸性ｐＨでは安定であるが、小腸のアルカリ性環境では溶解するコーティングを用いて達成できる。例えば、米国特許出願公開第２００３０１５２６２７号及び同第２００３０１５２６２７号公報を参照されたい。これらは参照により本明細書に取り込まれている。コーティング技術は結腸内への活性物質の放出をもたらすためにも利用できる。このような製剤はｐＨ依存性メカニズムに依存してもよく、或いは遅延放出製剤であってもよい。上記送達システムの何れかにおいて、送達システムは持続放出送達システムであってもよい。当業者は送達する所望の標的部位に基づいて製剤を容易に改変することができる。
【０１９２】
本発明の範囲内のさらに別の胃腸送達システムは、例えば、米国特許第５，８４０，３３２号、同第６，９４９，２５８号、同第６，２１４，３７８号、同第６，４５１，３４５号及びＰＣＴ公開第ＷＯ／２００８／０６８５８４号に記載されているものを包含できる。これらはそれぞれ参照により本明細書に取り込まれている。
【０１９３】
（治療方法）
本明細書に詳細に記載されているように、ＩＬ−２７の局所送達、例えば、胃腸管へのＩＬ−２７の制御された送達をもたらす組み換え微生物送達システム又は微小粒子、は炎症性腸疾患を効果的に治療する。
【０１９４】
そのように、本発明は、それを必要としている対象の炎症性腸疾患、粘膜の炎症性病変又は腸の炎症性病変を治療する方法を包含する。
【０１９５】
本発明の別の態様は、それを必要としている対象におけるＩＬ−２７に感受性のある疾患を治療する方法を包含する。
【０１９６】
本明細書に記載されている何れかの方法で、ある実施態様は、ＩＬ−２７並びにその治療用変異体又は断片の治療有効量を対象の腸粘膜への局所投与を包含する。
【０１９７】
関連する実施態様では、ＩＬ−２７は胃腸送達システムを用いて投与される。
【０１９８】
ある実施態様では、胃腸送達システムは対象の腸粘膜内にＩＬ−２７をin situで産生するのに有効な組み換え微生物である。実施態様では、組み換え微生物は、これに限定されないが、細菌、酵母、及び真菌を包含する、微小植物種である。
【０１９９】
典型的な細菌は、これに限定されないが、Bacteriodes、Clostridium、Fusobacterium、Eubacterium、Ruminococcus、Peptococcus、Eschericia、Lactobacillus、Enterococcus 又は Lactococcus 属由来の細菌を包含する。実施態様では、細菌はグラム陽性細菌である。関連する実施態様では、細菌はLactococcus lactis 又は Enterococcus faecium である。Lactococcus lactis の例は、Lactococcus lactis ssp. cremoris SK11、Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363、又は Lactococcus lactis ssp lactis IL1403 を包含する。
【０２００】
典型的な真菌は、これに限定されないが、Candida、Saccharomyces、Aspergillus 又は Penicillium  属由来の真菌を包含する。
【０２０１】
典型的な酵母は、これに限定されないが、Hansenula、Kluiveromyces、Pichia、Saccharomyces 及び Schizosaccharomyces属由来の酵母を包含する。
【０２０２】
別の実施態様では、胃腸送達システムはＩＬ−２７を含有している微小粒子である。関連する実施態様では、微小粒子はさらに、ＩＬ−２７を胃腸管内へ制御放出できるコーティングを含有している。コーティングは胃腸管内へのＩＬ−２７の連続又は持続放出も可能である。
【０２０３】
実施態様では、炎症性腸疾患がクローン病である。
【０２０４】
実施態様では、炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である。
【０２０５】
実施態様では、疾患が結腸癌又は胃腸管組織のその他の癌である。
【０２０６】
実施態様では、疾患が、腸、胃、肝臓、膵臓又は腹膜の炎症を包含する、胃腸管組織の炎症性疾患である。
【０２０７】
実施態様では、ＩＬ−２７の治療有効量は、胃腸管の非特異的炎症を少なくとも１０〜９９％減少させるのに十分である。関連する実施態様では、ＩＬ−２７の治療有効量は、胃腸管の非特異的炎症を少なくとも１０〜２５％、２５〜５０％、１０〜５０％、５０〜９０％、５０〜７５％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９０〜９９％、又は９５〜９９％減少させるのに十分である。
【０２０８】
本発明の別の態様では、本明細書に記載されている方法は何れもさらに第２治療薬の投与を含む。実施態様では、第２治療薬はコルチコステロイド、スルファサラジン、スルファサラジンの誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、サイトカイン又はサイトカイン拮抗薬である。関連する実施態様では、サイトカイン又はサイトカイン拮抗薬は腫瘍壊死因子α拮抗薬、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３５である。別の実施態様では、第２治療薬は静脈内に、経口で又は経皮で投与される。関連する実施態様では、第２治療薬は組み換え微生物によって送達される。
【０２０９】
（キット）
別の態様では、本発明は、本発明のＩＬ−２７又はＩＬ−２７をコードする核酸分子、又は本発明の組み換え微生物送達システムを炎症性腸疾患を治療するために投与する際に用いるためのキットを提供する。
【０２１０】
キットを如何に操作するかにもよるが、キットは、本発明のＩＬ−２７（又はその生物活性断片又は変異体）を発現するように遺伝子組み換えするか又は既に遺伝子組み換えされている組み換え微生物宿主細胞を含むことができる。特定の組み換え微生物宿主は、例えば、適切な酵母、真菌、又は細菌の何れかを包含できる。本発明で使用するのに適している真菌は、これに限定されないが、Candida、Saccharomyces、Aspergillus 又は Penicillium の真菌属の何れかに属する真菌種を包含する。本発明に適している酵母微生物は、これに限定されないが、Hansenula polymorpha、Kluiveromyces lactis、Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae 及び Schizosaccharomyces pobe を包含する。
【０２１１】
本発明で用いるのに適切な細菌性微生物は、これに限定されないが、枯草菌及びその他の適切な胞子形成細菌；これに限定されないが、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium angulatum、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium catenulatum、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium longum、及び Bifidobacterium pseudocatenulatum を包含する、ビフィズス菌属のメンバー；これに限定されないが、Brevibacterium epidermis 及び Brevibacterium lactofermentum を包含する、ブレビバクテリウム属のメンバー；これに限定されないが、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae を包含する、エンテロバクター属のメンバー；これに限定されないが、Enterococcus faecalis 及び Enterococcus faecium を包含する、エンテロコッカス属のメンバー；これに限定されないが、Escherichia coli を包含する、エシェリキア属のメンバー；これに限定されないが、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus brevis、Lactobacillus casei、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii subspecies lactis、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus reuterii、Lactobacillus sake 及び Lactobacillus vaginalis を包含する、乳酸菌属のメンバー；これに限定されないが、Lactococcus lactis、Lactococcus lactis subspecies cremoris 及び Lactococcus lactis subspecies lactis を包含する、ラクトコッカス属のメンバー；これに限定されないが、 Propionibacterium jesenii を包含する、プロピオニバクテリウム属のメンバー；これに限定されないが、Staphylococcus epidermidis を包含する、ブドウ球菌属のメンバー；これに限定されないが、Streptococcus lactis、Streptococcus foecalis、Streptococcus gordonii、Streptococcus pyogenes、Streptococcus mutans、Streptococcus thermophilus 及び Streptococcus salivarius subspecies thermophilus を包含する、連鎖球菌属のメンバーを包含する。
【０２１２】
実施態様では、組み換え微生物は、これに限定されないが、Bacteroides ovatus、Clostridium、Fusobacterium、Eubacterium、Ruminococcus、Peptococcus、Eschericia、又は Lactobacillus を包含する、バクテロイデスの細菌属に属している種を包含する、組み換え微小植物種である。
【０２１３】
実施態様では、本発明の微生物は、細菌 Lactococcus lactis 又は細菌 Enterococcus faecium である。
【０２１４】
本発明において有用なその他の微生物の例は、それぞれが口腔粘膜に定着して、歯肉及び歯の炎症性疾患を改善できる抗炎症性タンパク質を発現及び放出できる、Streptococcus pyogenes、Streptococcus mutans 又は Streptococcus gordonii を包含する。
【０２１５】
実施態様では、キットは組み換え微生物宿主によるＩＬ−２７の発現を検出するための免疫検出試薬又は標識も包含することができる。適切な検出試薬は、抗原／抗体に関連して又は第１抗体に対する特異性を有する第２抗体に関連して一般に用いられる、放射活性、酵素的、あるいは発色性リガンドのような、当該技術分野で周知のものである。従って、標識を検出又は定量する手段によって反応を検出又は定量する。本発明の新規な方法に関する適用に適している免役検出試薬及び方法は一般に当該技術分野で周知である。
【０２１６】
試薬は、緩衝剤及びタンパク質安定化剤、例えば多糖類等補助剤を含むこともできる。 診断用キットは、必要に応じ、さらに試験においてバックグラウンド干渉を減少させる試薬、シグナルを増大させる試薬、試験を実施するための器具、校正曲線及び図、標準曲線及び図等を含むことができる。
【０２１７】
さらなる実施態様では、このようなキットは、ラベル又は折り込みの形態で操作パラメータに関する説明書を含むことができる。
【０２１８】
上の開示は本発明を一般的に記載している。以下の具体的な実施例を参照することによってより完全な理解が得られる。実施例は説明のみを目的として提供されており、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【０２１９】
本明細書に記載されている原料、組成物、及び方法は本発明の代表的な例であることを意図しており、そして当然のことながら、実施例の範囲によって本発明の範囲は限定されない。当業者は、開示されている原料、組成物及び方法を変更して本発明を実施できるということを認識するだろう、そしてこのような変更は本発明の範囲内である。
【０２２０】
実施例１．マウスＩＬ−２７核酸分子の構築（図１２Ａ）
配列Ｎ−ＳＲＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＧＫＬ−Ｃ（配列番号５）を含有するペプチドリンカーによって結合しているｍＩＬ−２７α鎖及びβ鎖をコードする合成ｍＩＬ−２７ハイパーカイン（１４０７ｂｐ、配列番号３、図１０）を、L. lactis のための選択的コドン使用頻度及び二次構造回避に倣って設計し、そして５’末端を、L. lactis ｕｓｐ４５（ＧｅｎｅＩＤ：４７９７２１８）の分泌リーダーのａａ１８〜２７に対するコード情報を用いて延長して、及び５’さらに３’末端両方にＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を適切に位置付けた（図１１を参照されたい）。遺伝子の合成は GENEART, Inc. (Burlingame, CA) によって行われた。合成ｍＩＬ−２７遺伝子を、オリゴヌクレオチドｏＡＧＸ２２５２（５’ＣＣＴＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＧ３’）（配列番号８）及び ｏＡＧＸ２２５３（５’ＡＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣ３’）（配列番号９）を用いるＰＣＲ反応で、鋳型ＤＮＡとして用いた。１３９４ｂｐのＰＣＲ断片を精製しＰｓｔＩ制限酵素で消化して、１３８０ｂｐの断片を得た。クローニングベクターｐＴ１ＮＸをＰｓｔＩ制限酵素で消化して５１２２ｂｐの断片を得た。両断片をライゲーションしてｐＡＧＸ０７６６（ActoGeniX strain collection nr １０４６）を得た。このプラスミドにおいて、ｍＩＬ−２７は L. lactis Ｐ１プロモータの下流に位置していて（Waterfield et al., Gene 165:9-15 (1995)）、５’ＰｓｔＩ部位のライゲーションがｍＩＬ−２７の L. lactis ｕｓｐ４５の分泌リーダーとの融合をもたらす（灰色）。発現断片Ｐ１＞＞ｕｓｐ４５分泌リーダー＞＞ｍＩＬ-２７のＤＮＡ配列を検証して、予測したものと１００％同一を示した。
【０２２１】
合成ｍＩＬ−３５ハイパーカイン（図１３Ａ及び１３Ｂ）を上記と同様に合成した。
【０２２２】
実施例２．ヒトＩＬ−２７核酸分子の構築（図１２Ｂ）
合成ｈＩＬ−２７を設計して、同様な方法でサブクローンした。配列Ｎ−ＳＲＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＧＫＬ−Ｃ （配列番号５）を含有するペプチドリンカーによって結合しているｈＩＬ−２７α鎖及びβ鎖をコードする合成ｈＩＬ−２７ハイパーカイン（１４２８ｂｐ、配列番号１，図８）を、L. lactis のための選択的コドン使用頻度及び二次構造回避に基づいて設計し、そして５’末端を、L. lactis ｕｓｐ４５（ＧｅｎｅＩＤ：４７９７２１８）の分泌リーダーのａａ１８〜２７に対するコード情報を用いて延長して、及び５’さらに３’末端両方にＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を適切に位置付けた（図９を参照されたい）。遺伝子の合成は GENEART, Inc. (Burlingame, CA) によって行われた。合成ｈＩＬ−２７遺伝子を、オリゴヌクレオチドｏＡＧＸ２２５２（５’ＣＣＴＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＧ３’）（配列番号８）及び ｏＡＧＸ２２５３（５’ＡＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣ３’）（配列番号９）を用いるＰＣＲ反応で、鋳型ＤＮＡとして用いた。１４１８ｂｐのＰＣＲ断片を精製しＰｓｔＩ制限酵素で消化して、１４０４ｂｐの断片を得た。クローニングベクターｐＴ１ＮＸをＰｓｔＩ制限酵素で消化して５１２２ｂｐの断片を得た。両断片をライゲーションしてｐＬＬｈＩＬ−２７を得る。このプラスミドにおいて、ｍＩＬ−２７は L. lactis Ｐ１プロモータの下流に位置していて（Waterfield et al.）、５’ＰｓｔＩ部位のライゲーションがｍＩＬ−２７の L. lactis ｕｓｐ４５の分泌リーダーとの融合をもたらす（灰色）。発現断片Ｐ１＞＞ｕｓｐ４５分泌リーダー＞＞ｈＩＬ-２７のＤＮＡ配列を検証して、予測したものと１００％同一を示した。
【０２２３】
実施例３．ＩＬ−２７を発現する L. lactis：ＩＢＤのマウスモデルにおける炎症性腸疾患の治療
腸粘膜に対する治療の正確な標的を開発することは炎症性腸疾患治療（「ＩＢＤ」）の進歩にとって非常に重要なことである。従って、この実施例の目的は、慢性ＩＢＤを抑制し、そして結腸癌の進展を予防するために、食品グレードの微生物、例えば、Lactococcus lactics(L. lactis) によってin situで活発に合成される免疫抑制サイトカインの費用効果が高い、局所的な送達の開発を証明することである。L. lactis は、胃腸管に安全に治療用タンパク質を送達するように遺伝子操作して経口用に製剤化できる、非病原性、コロニー非形成性乳酸細菌である。以下に述べるように、ＩＬ−２７又はＩＬ−３５分泌 L. lactis の経口投与は抗炎症性タンパク質の結腸への局所送達、ＩＢＤマウスモデルにおける炎症の減少、及びそれにより結腸癌の進展の妨害をもたらす。理論に縛られるつもりはないが、細菌は、遠位臓器（例えば、肺）を有害に通過することなく、腸を通過する際に、その組み換えタンパク質を分泌して、次いでそれが腸内で局所的に作用すると思われる。
【０２２４】
実施例では、ＩＬ−２７を発現する遺伝子操作されたL. lactis の治療的適用は、ヒトにおけるＩＢＤの効果的で安全な管理、さらに癌予防をもたらすことが証拠付けられている。このデータは、ＩＬ−３５の免疫抑制効果を示している刊行物の報告（例えば、Bettini et al., Curr. Opin. Immun. 21:612-618 (2009)を参照されたい）に反して、ＩＬ−３５は治療的有用性を有していないことも明らかにしている。
【０２２５】
上で述べたように、ＩＢＤは、潰瘍性大腸炎（「ＵＣ」）及びクローン病（「ＣＤ」）を包含する慢性の炎症性胃腸疾患である。西洋諸国におけるＩＢＤの罹患率は約１／１０００である。また、ＵＣ患者は一般に結腸癌を発症する。ＩＢＤの原因は、腸に対する免疫系の異常な攻撃に起因していると考えられている。腸は細菌を含んでいて、正常な個人はこれら細菌から保護するのに過不足のない程度の免疫を保持しているのに対して、ＩＢＤ患者は非常に強い免疫応答を有していて、それら自身の組織を損傷する。ＩＢＤに対する最近の治療は全身免疫抑制及び／又は腸又は全結腸の外科的切除である。
【０２２６】
ＩＬ−２７及びＩＬ−３５の両方は、ＩＬ−１２サイトカインファミリーに属するヘテロ二量体性のサイトカインである。それぞれはα鎖（ＩＬ−２７：ｐ２８、ＩＬ−３５：ｐ３５）及びβ鎖（Ｅｂｉ３）からなっている。機構的に、ＩＬ−２７はＴｈ１７細胞の生育を抑制し、そしてＩＬ−１０産生Ｔ細胞生成を促進することにより、抗炎症剤として作用する。図１を参照されたい。従って、これは免疫抑制とともに、免疫刺激特性の両方を有している。ＩＬ−３５は、制御性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇｓ」）によって生成されて、Ｔｒｅｇ抑制活性を促進して、Ｔｒｅｇ生成を推進する。
【０２２７】
この実施例では、食品細菌、L. lactis は免疫抑制性サイトカイン、ＩＬ−２７を発現するように遺伝子を操作されている。組み換え細菌を経口強制投与によってマウスに送達した。これらの結果は、Ｔ細胞の移植によって誘発されたＩＢＤにおいてL. lactis−ＩＬ−２７の著しい治療的有用性を示している。結果は以下の通りである：
【０２２８】
図２は、実施例１に従って製造された、遺伝子組み換え L. lactis からのＩＬ−２７（マウス、配列番号２（ヌクレオチド配列）及び配列番号４（アミノ酸配列））及びＩＬ−３５（マウス、配列番号６（ヌクレオチド配列）及び配列番号７（アミノ酸配列））の発現の結果を示す。
図２Ａ：マウスＩＬ−２７又はマウスＩＬ−３５の何れかを発現する組み換えL.lactis の培養物から上澄液を採取して、そこに含まれているタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。検出可能な抗Ｅｂｉ３抗体（「Ｅｂｉ３」はＩＬ−２７及びＩＬ−３５両方のβ鎖成分である）を用いてＩＬ−２７及びＩＬ−３５をウェスタンブロットで検出した。
図２Ｂ：ＩＬ−２７の生物学的活性を、Ｓｔａｔ１（「ｐ−ＳＴＡＴ１検出」）及びＳｔａｔ３（「ｐ−ＳＴＡＴ３検出」）のリン酸化のウェスタンブロットによる検出によって測定した。Ｓｔａｔ１及びＳｔａｔ３は転写因子であり、これは多くのサイトカイン及び増殖因子受容体に対する重要なシグナル伝達分子である。ＩＬ−２７は、活性化すると、Ｓｔａｔ１とＳｔａｔ３のリン酸化をもたらす。
図２Ｃ：ＩＬ−２７の生物学的活性を、増大したＩＬ−１０及びＴｂｅｔ産生をＥＬＩＳＡで確認することによっても測定した。市販の組み換えＩＬ−２７（「ｒＩＬ−２７」）の評価では、組み換えＩＬ−２７（「ＬＬ-ＩＬ-２７」）を発現する L. lactis にはやや低い生物学的活性があることが示され、これは効率の悪いペプチド折り畳み又はインビトロ上澄液内の阻害因子の存在に起因しているのだろう。
【０２２９】
図３は、ＩＬ−２７を担持する L. lactis が消化管内に生存してＩＬ−２７の局所送達を可能にしていることを示す。ＬＬ−ＩＬ−２７を正常Ｃ５７Ｂ１／６雄性マウスに経口強制投与した。１２時間後に、腸の異なった領域を、エリスロマイシンに耐性を示すコロニーで検出して、生存している細菌について分析した。２つの個体において示されたように、有意な数のコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）が腸の至る所で検出された（図３Ａ）。生きている L.lactis を胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、及び近位、末端、且つ遠位の結腸中から回収した。強制投与６時間後に、ＩＬ−ベクターでコントロール（ＬＬ−ベクター）−処置マウス（Ｃで表した）と比較したＬＬ−ＩＬ−２７処置マウスの多様な領域の管腔内容物中のＩＬ−１０を検出した（Ｔで表した）。従って、経口強制投与されたＬＬ−ＩＬ−２７は標的臓器において局所的に作用可能であった。
【０２３０】
図４は、炎症性腸疾患のＴ細胞移植マウスモデルに対する L. lactis−ＩＬ−２７の治療効果を示す（本明細書でさらに検討する）。ＩＢＤのＴ細胞移植モデルを用いてＬＬ−ＩＬ−２７の潜在的な治療有用性を評価した。Ｒａｇｌ−１−宿主にＣＤ４５ＲＢ（ｈｉ）Ｔ細胞の移植後６週間である、症状発症時に処置を開始した。６９日目に、。ＬＬ−ＩＬ−２７で処置したマウス（ｎ＝５）は全て健常であったのに対して、L. lactis コントロールベクターで処置したマウス（ｎ＝５）はどれも最終時点まで生存しなかった。
【０２３１】
図５は、L. lactice−ＩＬ−２７が、絨毛の破壊及び炎症性浸潤から遠位結腸を保護するという組織学的証拠を提供する。ＬＬ−ベクターコントロール群又は L. lactis−ＩＬ−３５（ＬＬ−ＩＬ−３５）を投与された別の群における重度な病変と比較して、１匹のマウスに軽度の細胞浸潤が観察されたことを除いてＬＬ−ＩＬ−２７群の細胞に病変は観察されなかった。遠位結腸の切片（２ｃｍ）をホルマリンに固定し、パラフィンに包埋して、通常の手順に従いＨ＆Ｅ染色を実施した。
図５Ａ〜５Ｄ：非処置マウス。Ａ）４倍、炎症性浸潤及び過形成性腺窩を有する著しく肥厚した結腸粘膜。Ｂ）１０倍、杯細胞が枯渇した過形成性腺窩、腺窩膿瘍及び粘膜中の炎症性浸潤。Ｃ）１０倍、腸上皮内腫瘍、腺窩膿瘍及び粘膜中の炎症性浸潤。Ｄ）４０倍、単核細胞、好中球及び好酸球の炎症性浸潤。
図５Ｅ〜５Ｇ：L. lactis−ＩＬ−２７処置マウス。Ｅ）４倍、結腸粘膜は正常な組織構造を有している。Ｆ）１０倍、杯細胞を有する正常な結腸腺窩。Ｇ）４０倍、杯細胞を有し、炎症性浸潤がない、正常な結腸腺窩。
図５Ｈ〜５Ｊ：L. lactis−ＩＬ−３５処置マウス。Ｈ）１０倍、炎症性浸潤及び過形成性腺窩を有する著しく肥厚した結腸粘膜。Ｉ）１０倍、杯細胞が枯渇した過形成性腺窩及び粘膜中の炎症性浸潤。Ｊ）４０倍、単核細胞、好中球及び好酸球の炎症性浸潤。
【０２３２】
図６は、炎症性腸疾患の幾つかのパラメータによって測定して、そして疾患活動性インデックス（ＤＡＩ）（Ostanin et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296:G135-G146 (2009) を参照されたい。これは慢性大腸炎のＴ細胞移植モデルに関してより詳細に参照することにより、本明細書に取り込まれている）に反映させた、ＬＬ−ＩＬ−２７対非処置マウス、ＬＬ−ベクターマウス、及びＬＬ−ＩＬ−３５マウスによって生じた保護を表している。ＬＬ−ＩＬ−２７は便中の潜血の出現を完全に防止した。さらに、ＬＬ−ＩＬ−２７で処置したマウスはほぼ正常な便の硬さを伴い、そして体重減少がある程度緩和された。
【０２３３】
図７Ａ及び７Ｂは、上で試験した各群の３匹のマウスから得た遠位結腸内の炎症性サイトカインの転写レベルに対する効果のＰＣＲ分析の結果を示す。ＬＬ−ベクターコントロール群との同じ反応と比較して、ＬＬ−ＩＬ−２７群ではＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ‐γの減少が見られる。
【０２３４】
実施例４．ＩＬ−１０はＩＬ−２７の治療効果に必要である
Ｔ及びＢ細胞、ＮＫ細胞、単球、マスト細胞、内皮細胞、ランゲルハンス細胞並びに樹状細胞を包含する、幾つかの細胞型はＩＬ−２７に対する受容体複合体を発現して、応答可能である。この実施例では、Ｔ細胞がＬＬ−ＩＬ‐２７によって誘導される検出された腸ＩＬ−１０の起源であることを明らかにしている。
【０２３５】
図１４は、ＬＬ−ＩＬ−２７で処置したＲａｇ１−１−マウスがＩＬ−１０の発現を誘導しないことを示す。これらの結果は、ＩＬ−１０の誘導にはＴ細胞の存在が必要であることを示している。
【０２３６】
図１５は、ＬＬ−ＩＬ−２７で処理したＩＢＤマウスにおけるＩＬ−１０を産生するＴ細胞を確認している。上皮内細胞（ＩＥＬ）を、健常Ｃ５７Ｂ１／６マウス、非処置ＩＢＤＲａｇ−１−マウス（ＵＴ）、ＬＬ−ベクターで処置したＩＢＤマウス、及びＬＬ−ＩＬ−２７で処置したＩＢＤマウスから単離した。
図１５Ａ：ＩＥＬ細胞の分析がＬＬ−ＩＬ−２７ＩＢＤマウスにおいて顕著なＣＤ４＋ＣＤ８＋集団の存在を確認している。これに対して、健常Ｃ５７Ｂ１／６マウスはＣＤ８細胞の優位性を示し；ＩＢＤＲａｇ−１−非処置マウス及びＬＬ−ベクターで処置したＩＢＤマウスはＣＤ４浸潤を示した。
図１５Ｂ：ＩＬ−１０レポーターＴ‐細胞を用いてＩＢＤを誘発して、ＬＬ−ＩＬ−２７ＩＢＤマウスで観察された最も優位なレポーター発現はＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞であった。
【０２３７】
実施例５．炎症性腸疾患の治療においてＬＬ‐ＩＬ−２７はＬＬ‐ＩＬ−１０より効果的である。
ＩＬ−２７とＩＬ−１０の関係をさらに評価するために、この実施例はＩＢＤマウスに対するＩＬ−２７を発現する L.lactis （ＬＬ−ＩＬ−２７）とＩＬ−１０を発現するL.lactis （ＬＬ−ＩＬ−１０）の効果を比較する。図１６に示されるように、ＬＬ‐ＩＬ‐１０で処置したＩＢＤマウスは何れも生存しなかった。よくても、ＩＬ−ＬＬ−１０は処置マウスの死を遅延させた。驚いたことに、結果は、より多くのＬＬ−ＩＬ−２７マウスが生存し、そして死亡したマウスは長期間生存していたことを示した。
【０２３８】
実施例６．ＩＬ−２７を発現する E. faecium
この実施例は、ＩＢＤの治療に、更にはヒトにおける癌の予防に使用するために、微生物をＩＬ−２７を発現するように遺伝子組み換えできるという更なる証拠を提供する。
【０２３９】
Lactococcus lactis のｕｓｐ４５分泌リーダーの配列（ＳＳ）をコードするＤＮＡを、フレーム中で天然のヒトＩＬ−２７のＤＮＡ配列と融合した。構築物を Enterococcus faceium 内に導入して、ＩＬ−２７分泌をＥＬＩＳＡで定量した。図１７に示されるように、E. faecium はかなりの量の異種ヒトＩＬ−２７タンパク質を分泌できる。
【０２４０】
（要約）
今のところ、ＩＢＤの最新治療は、広範囲の免疫抑制剤の使用又は外科手術を含んでいる。外科手術は侵襲的であるので望ましい治療選択ではなく、そして広範な免疫抑制剤の使用は口腔カンジダ症及び帯状疱疹から、結核、ヒストプラスマ症及びコクシジオイデス症のようなより重症な合併症までの範囲の副作用を付随する。免疫抑制療法は内在性ウィルスの再活性化も可能にして、これはエプステンバールウィルスによって誘発されるリンパ腫及びＪＣウィルスによって誘発される進行性多巣性白質脳症の増加を引き起こす。ある特定の例では、このような療法は非メラノーマ性皮膚癌及び異常肝脾Ｔ細胞リンパ腫の増大をもたらすことが明らかにされている。従って、更なる治療法の発見が必要とされている。
【０２４１】
本明細書で報告したように、ＩＬ−２７の送達は上記の問題点に悩まされないＩＢＤに対する新規な治療戦略である。遺伝子組み換え L. lactis がＩＬ−２７又はＩＬ−３５タンパク質を発現すること、及び L. lactis−ＩＬ−２７が生物活性であるという結果をインビトロ試験で確認する。結果はさらにL. lactis−ＩＬ−２７によって産生されたＩＬ−２７／ｐ２８の濃度を確定した。
【０２４２】
本明細書に記載したインビボ試験は、ＩＢＤを治療するための治療剤としてのＬＬ−ＩＬ−２７の驚くべき劇的な効果を明らかにしている。ＩＬ−２７の局所投与は試験マウスの１００％生存率、低いＤＡＩ、及び正常な組織構造をもたらし、それに対してその他の処置群は低い〜０％生存率、高いＤＡＩ、重症な結腸炎症及び腺窩腫瘍を有していた。ＩＬ−２７の効果はＩＬ−１０産生の発現増加を介して仲介されてはいるが、本発明者らはＩＬ−２７の局所送達がＩＬ−１０を用いる治療より劇的により効果的であることを見出したので、これらの結果は、驚くべき予想外のものである。さらに、ＩＬ−２７が炎症促進性及び抗炎症性サイトカインの両方として知られているという事実を考慮すると、これらの結果はなおさらさらに予測不可能である。
【０２４３】
本明細書で報告された結果は、以下の方法及び材料を用いて得られた。
【０２４４】
（マウスＩＬ−２７／３５ハイパーカイン）
ＥＢＩ３とｐ２８（ＩＬ−２７）又はｐ３５（ＩＬ−３５）配列の間にリンカー配列（ＳＲＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＧＫＬ）を組み込むことによりマウスＩＬ−２７ハイパーカイン及びＩＬ−３５ハイパーカインを設計した。最適 L. lactis コドン使用頻度を有するＤＮＡ配列を Geneart (Burlingame, CA) によって合成した。L. lactis MG1363 株から分泌タンパク質をコードする、Ｕｓｐ４５分泌シグナルをlacctococcal P1 プロモーターの下流にハイパーカインと融合した。
【０２４５】
（細菌）
L. lactis MG1363 株並びに E. faecium sAGX0270 及び sAGX0317 株を本研究を通して用いた。細菌をＧＭ１７Ｅ培地、すなわち、０．５％のブドウ糖（Sigma, St. Louis, MO）を補完したＤｉｆｃｏ  Ｍ１７培地（BD, Franklin Lakes, NJ）中で培養した。L. lactisについて、培地をさらに５μ／ｍｌのエリスロマイシン(Sigma）で補完した。ストック懸濁液をＧＭ１７Ｅ中の５０％グリセロール（Sigma）中−８０℃で保管した。胃内植菌するためにストック懸濁液を新鮮なＧＭ１７Ｅで１０００倍に希釈し、３０℃で１６時間培養して、ｍｌ当り２×１０９ＣＦＵの飽和密度に到達させた。細菌を遠心分離で採取してＢＭ９培地で１０倍に濃縮した。処置用量はこの懸濁液１００μｌからなっていた。
【０２４６】
（タンパク質発現及び免疫ブロット）
L. lactis 株を３０℃の静置培養で普通に生育した。タンパク質発現及び分泌について分析するために、ＧＭ１７Ｅ中で生育した飽和培養物を１／１００に希釈して新鮮な緩衝化Ｍ９塩培地中で３時間生育した。細菌と培養上澄液を１５００ｇで１０分間遠心分離して分離させた。上澄液を、還元条件下で、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上に流した。Ｅｂｉ３発現を標準ウェスタンブロット法における一次抗体として抗Ｅｂｉ３（Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA）を用いて検出した。組み換えマウスＩＬ−２７（ｒｍＩＬ−２７）（R & D Systems, Inc., Minneapolis, MN）を陽性コントロールとして用いた。L. lactis 上澄液中のＩＬ−２７濃度を、Quantikine Mouse IL-27 p28 (R &D Systems)  （ＬＯＤ：１．５ｐｇ／ｍｌ）を用いるＥＬＩＳＡで確認した。
【０２４７】
E. faecium 株を、単一コロニーから２００μＭのチミジンを補完したＧＭ１７（ＧＭ１７Ｔ）１０ｍｌ中に植菌して、３０℃で１６時間生育した。ｈＩＬ２７分泌を定量するために、これらの飽和一晩培養物を新鮮なＧＭ１７Ｔ培地５ｍｌ中で１／２５に希釈して３０℃で４時間生育した。３２２０×ｇで１０分間遠心分離して細胞を採取し、同量のＢＭ９Ｔ培地に再懸濁して、３０℃でさらに３時間培養した。ＢＭ９Ｔは、Ｍ９塩、０．５％のカジトン、０．５％のブドウ糖、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、２５ｍＭのＮａ２ＣＯ３、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのＣａＣｌ２及び２００μＭのチミジンを含有している。細胞と培養上澄液を３２２０×ｇで１０分間遠心分離した。培養上澄液中の分泌されたヒトｈＩＬ−２７の量をサンドイッチｈＩＬ２７ＥＬＩＳＡ（R&D systems）で定量した。全ての菌株を並行して処理した。
【０２４８】
（L. lactis−ＩＬ−２７の生物活性）
L. lactis−ＩＬ−２７株の生物活性を、ＳＴＡＴ−１／３のリン酸化並びに出力としてＩＬ−１０及びＴ−ｂｅｔの誘導を用いて分析した。それぞれの生物活性アッセイについて、脾臓の未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣ５７Ｂ１／６マウスから単離した。ｐ−ＳＴＡＴ−１／３アッセイについて、細胞を抗ＣＤ３／２８（eBioscience, San Diego, CA）及びｒｍＩＬ−２７（５００ｐｇ／ｍｌ）（R&D, Mineapolis, MN）、L. lactis コントロールベクター、又はL. lactis−ＩＬ−２７（５００ｐｇ／ｍｌ）株で、３７℃で２０分間刺激した。作製されたた溶解物を４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上に流した。ｐ−ＳＴＡＴ−１／３発現を、一次抗体としてリン酸−ＳＴＡＴ１（Ｔｙｒ７０１）及びリン酸ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ−７０５）（Cell Signaling Technology, Danvers, MA）並びに負荷コントロールとしてＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３（１２４Ｈ６）（Cell Signaling Technology）抗体を用い、標準的なウェスタンブロッティング法で検出した。ＩＬ−１０タンパク質誘導アッセイについて、細胞を抗ＣＤ３／２８及びｒｍＩＬ−２７（３９０ｐｇ／ｍｌ）、L. lactis コントロールベクター、又は L. lactis−ＩＬ−２７（３９０ｐｇ／ｍｌ）株で７２時間刺激した。上澄液を、READY-SET-GO! マウスＩＬ−１０ＥＬＩＳＡ（eBioscience）（ＬＯＤ：３０ｐｇ／ｍｌ）を用いて分析した。ＩＬ−１０及びＴｂｅｔｍＲＮＡ誘導の分析について、細胞を抗ＣＤ３／２８及びｒｍＩＬ−２７（５００ｐｇ／ｍｌ）、L. lactis コントロールベクター、又は L. lactis−ＩＬ−２７（５００ｐｇ／ｍｌ）株で２時間刺激した。Qiagen RNeasy Mini Kit (Valencia, CA) を用い製造会社のプロトコールに従って細胞から全てのＲＮＡを抽出した。SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen; Carlsbad, CA) を用い製造会社のプロトコールに従って逆転写を実施した。 Platinum PCR  Supermix (Invitrogen)及びオリゴヌクレオチドプライマー (Integrated DNA Technologies; Coralville, LA)を用いてＰＣＲ増幅を達成した。増幅した産物を１．５％アガロースゲル上の電気泳動で分離して、SYBR Safe DNA ゲル染色 （Invitrogen)を用いてで可視化した。ｍＲＮＡ発現の誘導を半定量化するために、ImageJ 1.41 ソフトウェアによる濃度分析を用いて転写レベルをＨＰＲＴｍＲＮＡの発現に対して正規化した。
【０２４９】
（L. lactis 投与後のＩＬ−２７のインビボ送達）
ＬＬ−ＩＬ−２７を正常Ｃ５７Ｂ１／６雄性マウスに経口強制投与した。１２時間後に、腸の異なった領域を、エリスロマイシンに耐性のあるコロニーで検出して、生存している細菌について分析した。さらに、ＬＬ−ＩＬ−２７処置マウスの多種の領域の管腔内容物においてＩＬ−１０を検出した。
【０２５０】
（Ｔ細胞移植、L. lactis 投与による大腸炎の誘発）
Ｃ５７Ｂ１／６系列の免疫不全Ｒａｇ−１−雌性マウスをレシピエントとして用い、これに対して同数の雄性Ｃ５７Ｂ１／６マウスをドナーとして用いた。単個細胞懸濁液を採取した脾臓から作製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をMACS CD4+ T cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA) を用いて濃縮した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をanti-CD4-APC and anti-CD45RB-FITC (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ) を用いて蛍光標識した。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ細胞をフローサイトメトリーで選別してレシピエントマウスに注射した。細胞移植後約６週間で大腸炎が誘発された。処置群は、非処置、L. lactis コントロールベクター、L. lactis−ＩＬ−２７、L. lactis−ＩＬ−３５、及びL. lactis−ＩＬ−１０を含んでいた。L. lactis 投与は大腸炎誘発に続いて開始して１４日毎に強制投与が続いた。マウスを死亡時又は実験の６９日目（又は図に示したように）に捕獲した。
【０２５１】
（疾患活動性インデックス（ＤＡＩ））
細胞移植に続いて、マウスを L. lactis 投与前に週に２回、そして L. lactis 投与を開始したら毎日観察した。観察には、体重、便の硬さ、及び便中の潜血の分析を包含した。各パラメーターに対するスコアを以下のスケールに基づいて与えた。ＤＡＩは組合わせたパラメータースコアを示す。
【０２５２】
（組織学的分析）
結腸を取り出し、洗浄して、縦方向に開いた。遠位及び近位結腸からの２ｃｍ切片をホルマリン溶液に固定してパラフィンに埋包した。切片をヘマトキシリン及びエオシン（H&E）で染色して、Laboratory Animal Services Program, SAIC で分析した。
【０２５３】
本発明の実施態様をこのように詳細に記載したことが、上記段落で定義された発明は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなくその多くのバリエーションが可能であるように、上記記載で述べられている特定の詳細に限定されるものではない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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