(57)【要約】  本発明は、化学式Ｉの化合物、この薬学的に許容可能な塩またはこの水和物、これを有効成分として含有する癌治療または予防用薬学組成物、および化学式Ｉの化合物の製造方法に関する。【選択図】図４
2013530251.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化Ｉ】
2013530251.tif 000073
（式中、置換基Ｒは、Ｃ２Ｈ５またはＣ２Ｈ３である）
前記化学式Ｉの化合物、この薬学的に許容可能な塩またはこの水和物。
【請求項２】
請求項１に記載の化学式Ｉの化合物、この薬学的に許容可能な塩またはこの水和物を有効成分として含有する、癌治療または予防用薬学組成物。
【請求項３】
前記癌が、乳房癌、前立腺癌、肺癌、肝癌、膵臓癌、皮膚癌、大腸癌、骨肉腫、脳腫瘍、子宮頸部癌、甲状腺癌または胃癌であることを特徴とする請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項４】
非経口、局所、経口、直腸または鼻腔経路で投与されることを特徴とする請求項２または３に記載の薬学組成物。
【請求項５】
ａ）（ｉ）２−メチル酪酸および（ｉｉ）アルクチゲニン−４−Ｏ−グルコシド、３、５、７、９−テトラインまたはアラニンを２：１の重量比で反応させるステップと、
ｂ）３：１の重量比で混合した（ｉ）コッパーおよび（ｉｉ）ルテオリン−７−ラムノグルコシド、サポニン、ピネン、トランス−ゲラニオール、リナロールまたはクロロゲン酸を前記ａ）ステップにおいて得られた生成物と反応させるステップと、
ｃ）１：１の重量比で混合した（ｉ）ビテキシカルピンまたはヘスペリジンおよび（ｉｉ）３’−ヒドロキシフォルモノネチン、ケンフェロールまたは水を前記ｂ）ステップにおいて得られた生成物と反応させるステップと、
ｄ）前記ｃ）ステップにおいて得られた生成物にシニグリンを反応させるステップと、
ｅ）前記ｄ）ステップにおいて得られた生成物にバリンを反応させて、請求項１に記載の化学式Ｉの化合物を生成するステップとを含む請求項１に記載の化学式Ｉの化合物の製造方法。
【請求項６】
前記ａ）ステップにおける反応は、８０〜１２０℃で１０〜３０分間行うことを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ｂ）ステップにおける反応は、１２０〜１７０℃で１０分間行うことを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項８】
前記ｃ）ステップにおける反応は、８０〜１２０℃で５〜８分間行うことを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ｄ）ステップにおける反応は、１００〜１４０℃で５〜１０分間行うことを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記ｅ）ステップにおける反応は、−３０〜３０℃で１０〜２０分間行うか、あるいは、８０〜２３０℃で５〜３０分間行うことを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ｅ）ステップにおける反応は、−３０〜３０℃で１０〜２０分間行い、次いで、８０〜２３０℃で５〜３０分間行うことを特徴とする請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記ａ）ステップからｅ）ステップにおいて、溶媒として水（Ｈ２Ｏ）を用いることを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記ｅ）ステップにおいて得られた生成物を−５〜３０℃の水に溶解してろ過する精製ステップをさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記ｅ）ステップにおいて得られた生成物を１００〜１５０℃の水に溶解してろ過する精製ステップをさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記精製ステップ後に、得られた生成物を７０〜１００℃の水に溶解してろ過する精製ステップをさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記精製ステップ後に、得られた生成物を４０〜６０℃の水に溶解してろ過する精製ステップをさらに含むことを特徴とする請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記精製ステップ後に、得られた生成物を１５〜３０℃の水に溶解してろ過する精製ステップをさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記精製ステップ後に、得られた生成物を−１〜１５℃の水に溶解してろ過する精製ステップをさらに含むことを特徴とする請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記精製ステップ後に、得られた生成物を３０〜１００℃の水に溶解してろ過する精製ステップをさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記精製ステップ後に、得られた生成物を−５〜３０℃の水に溶解してろ過する精製ステップをさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記ろ過に用いられるフィルターは、網目が１０−６ｍ以下であることを特徴とする請求項１３から２０のうちのいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学式Ｉの化合物、この薬学的に許容可能な塩またはこの水和物、これを有効成分として含有する癌治療または予防用薬学組成物、および前記化学式Ｉの化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、全世界的にますます増加傾向にある深刻な疾病の一つである。癌は、非正常細胞の調節されない成長および拡散を特徴として有し、身体の全ての器官および組織に副作用を及ぼす虞があり、場合によって死に至らせる。癌の発病および進行には多数の因子が作用し、これは癌の治療を困難にする要因の一つである。また、近年、子供の癌の発病率が高まりつつある。米国において、癌は、２００７年度に約１、４４４、０００個の新たなケースが診断されており、ここには、膀胱を除く任意の部位の非浸透性癌が含まれておらず、基底および扁平上皮細胞皮膚癌が含まれていない。
【０００３】
癌の分子診断は、正常細胞よりも癌細胞においてさらに高いレベルで発現される抗原またはたんぱく質であるバイオマーカー分子、または、新規に合成されたバイオマーカー分子に依存する。これらのバイオマーカーは、腫瘍細胞により直接的に製造されるか、あるいは、癌の存在に反応する身体により製造される。患者のサンプルにおいて、バイオマーカーの探知は癌診断において重要な段階として位置付けられ、また、癌の初期段階において癌を検診するといった能力は癌患者の生存率の増加につながる。現在、癌治療に用いられる多数のタイプの抗癌剤があり、これは、多数の種々のカテゴリーに分類される。最も多用される抗癌剤のカテゴリー分類およびその一例としては、下記のものが挙げられる。
【０００４】
（１）ＤＮＡ損傷剤：ドキソルビシンは、隣り合うヌクレオチドに挿入されてＲＮＡとＤＮＡの合成を遮断する働きをするアントラサイクリン抗生物質である。このような作用をたっせいするために、ドキソルビシンは、ＤＮＡと薬物との間の強い相互作用を形成し、また、ＤＮＡの合成に欠かせない酵素ポイソメラーゼＩＩを抑制する。ドキソルビシンの物質代謝は脂質膜の過酸化を引き起こす自由酸素ラジカルを生成し、カルシウムは心臓組織から排出されるが、これは心筋毒性を引き起こす。ドキソルビシンの主な臨床問題点は薬物耐性である。このような副作用にも拘わらず、ドキソルビシンは広範囲な癌に用いられており、最も汎用されるアントラサイクリンである。
【０００５】
（２）アルキル化剤：シクロホスファミドは、最も汎用されるアルキル化剤である。シトクロムＰ−４５０の作用によりシクロホスファミドはヒドロキシル化中間体に変換されて活性ホスホルアミドマスタードおよびアクロレインを形成する。ホスホルアミドマスタードは、鎖内／鎖間ＤＮＡ架橋結合を引き起こし、これは、広範な癌細胞の細胞死滅をもたらす。シクロホスファミドは発癌性を有しているため、これは、他の癌が進行する危険性を増加させ、免疫系を抑制する。
【０００６】
（３）微細小管抑制剤（ＭＩ）：ＭＩは紡錘微細小管の役割を妨げ、細胞周期の阻止および細胞自滅を引き起こす。タキサン類（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、微細小管重合製剤であり、ビンカアルカロイドは微細小管脱重合製剤である。タキサン類は、乳房癌治療に最も適切な活性剤である。パクリタキセルは、β−チューブリンに結合し、微細小管の重合および安定性をもたらし、中期から後期への進行を抑制し、細胞の自滅を誘導する。ドセタキセルは２世代タキサンであり、パクリタキセルと同じ結合部位を有し、親和度がさらに高い。ドセタキセルは、パクリタキセルよりも細胞毒性が２倍から４倍ほどさらに高いことが立証されている。
【０００７】
（４）ビンカアルカロイド：ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ポドフィロトキシンおよびノコダゾールは微細小管末端に高い親和度を有してそこに結合され、動原体に微細小管が付着することを妨げる。これは、微細小管の接合の抑制を引き起こし、微細小管を不安定化させ、細胞自滅を誘導する。こえｒは、タキサン類と結合部位を共有しない。このようなＭＩは、一般的に、ドキソルビシン、シクロホスファミド治療に対して補助治療剤として用いられる。
【０００８】
（５）アロマターゼ抑制剤（ＡＩ）：アロマターゼはアンドロゲンをエストロゲンに転換させ、これにより、局部エストロゲン濃度が増加する。これは、乳房癌に対して発癌剤の役割を果たす。アロマターゼ抑制剤はアロマターゼを抑制するものの、卵巣においてエストロゲンを生成することは遮断せず、これは閉経期後の女性にしか作用しない。アロマターゼ抑制剤は、心血管系および骨におけるエストロゲンの減少を引き起こす虞がある。このため、心臓問題および骨多孔症が主な副作用として現れる。
【０００９】
（６）非ステロイド性ホルモン治療剤：タモキシフェンは、ＥＲ−陰性乳房癌患者を除いて、骨、子宮およびコレステロールレベルにおいてエストロゲン性効果を有する一方、乳房における正常信号の伝達体系を破壊し、ＥＲα／βに直接的に結合することにより抗エストロゲン性効果を示す選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）として働く。子宮に対するプロエストロゲン効果は、タモキシフェンにより治療された乳房癌患者の子宮癌の進行可能性を増加させる。ラロキシフェンは次世代のＳＥＲＭであり、乳房および子宮の両方において抗エストロゲン効果を有する。このため、子宮内膜の成長に刺激を与えることはない。ラロキシフェンは２００７年度にＦＤＡから承認が得られたものであり、危険来歴が高い閉経期後の女性における侵襲性乳房癌の危険および骨多孔症を予防する。ラロキシフェンは骨および心臓において全エストロゲン効果を有し、これは骨密度を高めるとともに、コレステロールを下げる。
【００１０】
上述した治療剤はいずれも癌細胞を死滅させ、正常細胞も同様に死滅させるという点において一つの共通性を有する。なお、患者のライフの質を大幅に減少させるという副作用が存在する。
【００１１】
近年、２種類のさらなる有望な抗腫瘍剤が開発された。トラスツズマブ（ハーセプチン）は、ｅｒｂＢ−２（ｈｅｒ２／ｎｅｕ）受容体に結合するように特異的に設計されたモノクローナル抗体である。これは、リガンドおよび受容体の結合を妨げることにより、細胞外成長信号を抑制する。トラスツズマブは、抗体依存性細胞毒性を誘起する虞がある。しかしながら、トラスツズマブ耐性は細胞質信号伝達のレベルにおいて発見され、ペルツズマブなどのさらなるモノクローナル抗体がｅｒｂＢ受容体信号を相乗的に遮断するために必要である。有望な他の薬物としては、チロシンキナーゼ抑制剤グリベック（メシル酸イマチニブ）がある。イマチニブは、多数のチロシンキナーゼ酵素の特異的抑制剤として働く２−フェニルアミノピリミジン誘導体である。これは、ＴＫ活性部位を占めることにより機能し、活性の減少を引き起こす。イマチニブはａｂｌ（アベルソン原腫瘍遺伝子）、ｃ−ｋｉｔおよびＰＤＧＦ−Ｒ（血小板−誘導成長因子受容体）においてＴＫドメインに対して特異的である。イマチニブはｂｃｒ−ａｂｌのＡＴＰ結合部位に結合し、たんぱく質の酵素活性を競争的に抑制することにより作用する。イマチニブはｂｃｒ−ａｂｌに対して選択的であり、また、上述した他のターゲット（ｃｋｉｔおよびＰＤＧＦ−Ｒ）を抑制する。しかしながら、グリベックにより治療された患者に心臓問題、貧血および他の副作用を生じさせた。
【００１２】
このため、たとえ細胞を死滅させる数多くの方法を知っているとしても、標的癌細胞を特異的に死滅させながら副作用および細胞毒性を大幅に減少させる抗癌剤の開発が依然として望まれている。
【００１３】
以上から明らかのように、これまで開発されている抗癌剤は、抗癌効果に優れている場合は、毒性が強すぎて身体機能が弱い子供、労弱者または末期癌患者に適切ではないという問題点があり、毒性が低い場合は抗癌効果が低下したり、抗癌効果を早期に発現しないという問題点がある。また、ほとんどの従来の抗癌剤は、血液毒性、胃臓毒性、神経毒性、皮膚毒性、脱毛、不妊などの副作用を伴う。これらに加えて、従来の抗癌剤は、癌細胞と正常細胞を区別することができないため、癌細胞に加えて正常細胞までも破壊させる。特に、パクリタキセルは全世界的に広く用いられている抗癌剤の一つであるが、これは、難溶性物質であり、蒸留水にほとんど分散されないため、注射剤として用いるためには他の物質を混合して用いることを余儀なくされ、臨床的にこのような物質の過量投与は心臓毒性および過敏反応を生じさせることが報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は従来の抗癌剤の問題点を解消するためになされたものであり、その目的は、癌細胞などの異常増殖された変異細胞のみを除去し、むしろ正常細胞を活性化させ、損傷された正常細胞を修復することができ、毒性がなく、末期癌患者などの身体機能が弱いヒトにも好適に適用可能であり、穏やかな条件下で製造可能であり、既存の有機溶媒を用いる製造方法に比べて遥かに安全であり、親水性薬物であるため注射剤および経口剤として利用可能であり、薬の効果が現れる速度が非常に早い薬学組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、下記化学式Ｉの化合物、この薬学的に許容可能な塩またはこの水和物に関するものである。
【００１６】
（化Ｉ）
2013530251.tif 000003
【００１７】
（式中、置換基Ｒは、Ｃ２Ｈ５またはＣ２Ｈ３である）。
【００１８】
また、本発明は、上記化学式Ｉの化合物、この薬学的に許容可能な塩またはこの水和物を有効成分として含有する癌治療または予防用薬学組成物に関するものである。前記癌としては、乳房癌、前立腺癌、肺癌、肝癌、膵臓癌、皮膚癌、大腸癌、骨肉腫、脳腫瘍、子宮頸部癌、甲状腺癌または胃癌などが挙げられるが、本発明はこれらに何ら制限されるものではなく、本発明に係る組成物はあらゆる癌に効き目がある。
【００１９】
本発明に係る薬学組成物は、化学式Ｉの化合物、この薬学的に許容可能な塩またはこの水和物と共に薬学的に許容可能な担体を含有していてもよく、化学式Ｉの化合物、この薬学的に許容可能な塩またはこの水和物の有効性を減少させない限り、他の成分をさらに含有していてもよい。前記薬学的に許容可能な担体は当業界に既に知られており、当業者であれば、特定の投与経路に適した担体を容易に選択することができる。
【００２０】
本発明に係る薬学組成物は、精製水１ｍｌ当たりに化学式Ｉの化合物、この薬学的に許容可能な塩またはこの水和物を０．３ｍｇ以上含み、本発明が達成しようとする効果を得ることができる。また、本発明に係る薬学組成物は、１回につき５０ｍｌ〜５００ｍｌの量で体内に投与可能であり、投与間隔は１日につき１回から１２回であってもよく、１日につき１２回投与する場合には２時おきに１回ずつ投与することができる。
【００２１】
また、本発明に係る薬学組成物は、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、胸膜内、小胞内または包膜内）、局所、経口、直腸または鼻腔経路で投与可能である。本発明の薬学組成物の投与量および投与間隔は、治療対象となる癌の類型、患者の年齢、患者の体重などの様々な因子による。
【００２２】
また、本発明は、下記のステップを含む化学式Ｉの化合物の製造方法に関するものである。
【００２３】
ａ）（ｉ）２−メチル酪酸および（ｉｉ）アルクチゲニン−４−Ｏ−グルコシド、３、５、７、９−テトラインまたはアラニンを２：１の重量比で反応させるステップと、
ｂ）３：１の重量比で混合した（ｉ）コッパー(copper)および（ｉｉ）ルテオリン−７−ラムノグルコシド、サポニン、ピネン、トランス−ゲラニオール、リナロール(linalol)またはクロロゲン酸を前記ａ）ステップにおいて得られた生成物と反応させるステップと、
ｃ）１：１の重量比で混合した（ｉ）ビテキシカルピンまたはヘスペリジンおよび（ｉｉ）３’−ヒドロキシフォルモノネチン、ケンフェロールまたは水を前記ｂ）ステップにおいて得られた生成物と反応させるステップと、
ｄ）前記ｃ）ステップにおいて得られた生成物にシニグリンを反応させるステップと、
ｅ）前記ｄ）ステップにおいて得られた生成物にバリンを反応させて、化学式Ｉの化合物を生成するステップ。
【００２４】
本発明の一実施形態によれば、前記ａ）ステップにおける反応は、８０〜１２０℃で１０〜３０分間行われ、前記ｂ）ステップにおける反応は、１２０〜１７０℃で１０分間行われ、前記ｃ）ステップにおける反応は、８０〜１２０℃で５〜８分間行われ、前記ｄ）ステップにおける反応は、１００〜１４０℃で５〜１０分間行われ、前記ｅ）ステップにおける反応は、−３０〜３０℃で１０〜２０分間行われた後、８０〜２３０℃で５〜３０分間行われる。
【００２５】
本発明の一実施形態によれば、前記ａ）ステップからｅ）ステップにおいて、溶媒としては水（Ｈ２Ｏ）を用いる。
【００２６】
本発明の一実施形態によれば、前記ｅ）ステップにおいて得られた化合物を−５〜３０℃の水に溶解してろ過することにより精製する。
【００２７】
本発明の一実施形態によれば、前記ｅ）ステップにおいて得られた化合物を下記のステップに従い精製する：
（ｉ）１００〜１５０℃の水に前記ｅ）ステップにおいて得られた化合物を溶解してろ過するステップ、
（ｉｉ）７０〜１００℃で前記（ｉ）ステップにおいて得られた溶液をろ過するステップ、
（ｉｉｉ）４０〜６０℃で前記（ｉｉ）ステップにおいて得られた溶液をろ過するステップ、
（ｉｖ）１５〜３０℃で前記（ｉｉｉ）ステップにおいて得られた溶液をろ過するステップ、
（ｖ）−１〜１５℃で前記（ｉｖ）ステップにおいて得られた溶液をろ過するステップ、
（ｖｉ）前記（ｖ）ステップにおいて得られた溶液を乾燥させて固体化合物を得るステップ。
【００２８】
本発明の一実施形態によれば、前記ｅ）ステップにおいて得られた化合物を下記のステップに従い精製する：
（ｉ）１００〜１５０℃の水に前記ｅ）ステップにおいて得られた化合物を溶解してろ過するステップ、
（ｉｉ）３０〜１００℃で前記（ｉ）ステップにおいて得られた溶液をろ過するステップ、
（ｉｉｉ）−５〜３０℃で前記（ｉｉ）ステップにおいて得られた溶液をろ過するステップ、
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）ステップにおいて得られた溶液を乾燥させて固体化合物を得るステップ。
【００２９】
本発明の一実施形態によれば、前記ろ過に用いられるフィルターは、網目が１０−６ｍ以下である。
【００３０】
本発明に係る薬学組成物は、人体内に投与したときに、神経伝達物質を全体的に活性化させ、脾臓機能を向上させ、血液を浄化することが明らかになった。すなわち、身体の神経伝達物質とホルモンの分泌を促進し且つ活性化させ、これにより、脾臓活動が促進されて体熱が下がる。なお、本発明に係る薬学組成物は、人体内のリンパ機能を全体的に向上させ、脾臓内のリンパ球と大食細胞を増殖させることにより、リンパと血液が浄化されることが判明された。癌患者は、全体的に身体機能が低下されているか、あるいは、合併症を発症している場合が多いため、毒性が強い従来の抗癌剤に耐え難いが、本発明に係る組成物は毒性がなくて正常細胞を損なうことなく、むしろ患者の低下された身体機能を向上させて抗癌治療に有利な身体状態を形成することが判明された。したがって、本発明に係る組成物は、末期癌患者にも副作用や薬物などによるショックを生じさせることなく用いることができる。
【００３１】
さらに、本発明に係る組成物は、人体内に投与したときに癌細胞が一時的に活動を止め、黒色の縁部を有する多角形状に組織の構造が変化しながら細胞が引き裂けて死滅することが判明された。なお、本発明に係る組成物は、骨髄を刺激してＮＫおよびＮＫＴ細胞を生成し、これは、Ｔ細胞、Ｂ細胞に分化されて血液が及ぼす全ての範囲内にある癌細胞を除去するということが見出された。
【発明の効果】
【００３２】
本発明に係る化学式Ｉの化合物、この薬学的に許容可能な塩またはこの水和物を有効成分として含有する薬学組成物は、全ての癌を治療または予防することができるという効果を示す。特に、本発明に係る薬学組成物は、癌細胞と正常細胞との区別ができない従来の抗癌剤とは異なり、癌細胞などの異常増殖された変異細胞のみをターゲットとして除去し、正常細胞には細胞毒性がなく、むしろ正常細胞を活性化させて損傷された正常細胞を修復させる。また、本発明に係る化学式Ｉの化合物は水溶性であるため、注射剤および経口剤などの剤形で使用可能である。さらに、本発明に係る薬学組成物は、薬の効き目が早く、癌または合併症により弱化された身体機能を修復させる働きをするので、末期癌患者に対して有用性が非常に高いだけではなく、子供、労弱者への投与にも適している。さらに、本発明に係る薬学組成物は、体内に潜伏している腫瘍を除去し、血液内免疫細胞を強化させるので、癌ワクチンとして働いて癌の発病を予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本明細書に添付されている図面において、実験群は、下記の実施例において得られた化合物ＩＩおよびＩＩＩを含有する本発明に係る組成物により処理した群を示し、対照群は、下記の実施例においてタキソールまたはシスプラチンにより処理した群を示し、非処理群は、下記の実施例において特定の物質による処理を施さなかった群を示す。
【図１】図１は、化学式ＩＩの化合物のＮＭＲデータを示す。
【図２】図２は、化学式ＩＩＩの化合物のＮＭＲデータを示す。
【図３】図３は、化学式ＩＩＩの化合物の質量スペクトル（Mass Spectrum）を示す。
【図４】図４は、細胞株ＨＣＣ１４１９に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数と２週目（修復期）に測定した細胞数をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数の１／２０の値を示す。
【図５】図５は、細胞株ＨＣＣ１４１９に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、１週目（ＬＣ５０）の生存度と２週目（修復期）の生存度をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）の１／１００の値を示す。
【図６】図６は、細胞株ＨＣＣ１４１９に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、１週目（ＬＣ５０）の細胞毒性と２週目（修復期）の細胞毒性をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞毒性（％）の１／１００の値を示す。
【図７】図７は、細胞株ＨＣＣ１４１９に対して、実験群、対照群および非処理群をそれぞれ１週目（ＬＣ５０）の４８時間目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡（inverted microscope）により倍率ｘ２００で撮影した写真である。
【図８】図８は、細胞株ＨＣＣ１４１９に対して、実験群、対照群および非処理群をそれぞれ１週目（ＬＣ５０）の４日目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真であり、上の写真は倍率ｘ４０で観察したものであり、下の写真は倍率ｘ２００で観察したものである。
【図９】図９は、細胞株ＨＣＣ１４１９に対して、実験群、対照群および非処理群をそれぞれ１週目（ＬＣ５０）の７日目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真であり、上の写真は倍率ｘ４０で観察したものであり、下の写真は倍率ｘ２００で観察したものである。
【図１０】図１０は、細胞株ＨＣＣ１４１９に対して、実験群および対照群を１週目（ＬＣ５０）の７日目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。ここで、実験群は細胞が単一群集を形成しているのに対し、対照群は細胞がウェルの全体に亘って広がっている。
【図１１】図１１は、細胞株ＭＣＦ−７に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数と２週目（修復期）に測定した細胞数をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、１週目（ＬＣ５０）の縦軸は細胞数を、２週目（修復期）の縦軸は細胞数の１／２０の値を示す。
【図１２】図１２は、細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数と２週目（修復期）に測定した細胞数をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数を示す。
【図１３】図１３は、細胞株ＳＫＢＲ３に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。
【図１４】図１４は、細胞株ＳＫＢＲ３に対して細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーで染色して測定した、１週目（ＬＣ５０）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）値を示す。
【図１５】図１５は、細胞株ＳＫＢＲ３に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。
【図１６】図１６は、細胞株ＳＫＢＲ３に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、１週目（ＬＣ５０）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）の１／１００の値を示す。
【図１７】図１７は、細胞株ＳＫＢＲ３に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、１週目（ＬＣ５０）の細胞毒性を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞毒性（％）の１／１００の値を示す。
【図１８】図１８は、細胞株ＳＫＢＲ３に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、２週目（修復期）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）の１／１００の値を示す。
【図１９】図１９は、細胞株ＳＫＢＲ３に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、２週目（修復期）の細胞毒性を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞毒性（％）の１／１００の値を示す。
【図２０】図２０は、細胞株ＰＣ３に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数と２週目（修復期）に測定した細胞数をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数の１／２０の値を示す。
【図２１】図２１は、細胞株ＰＣ３に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、１週目（ＬＣ５０）の生存度と２週目（修復期）の生存度をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）の１／１００の値を示す。
【図２２】図２２は、細胞株ＰＣ３に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、１週目（ＬＣ５０）の細胞毒性と２週目（修復期）の細胞毒性をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞毒性（％）の１／１００の値を示す。
【図２３】図２３は、細胞株ＨＴ１２９９に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数と２週目（修復期）に測定した細胞数をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数の１／２０の値を示す。
【図２４】図２４は、細胞株ＨＴ１２９９に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、１週目（ＬＣ５０）の生存度と２週目（修復期）の生存度をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）の１／１００の値を示す。
【図２５】図２５は、細胞株ＨＴ１２９９に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、１週目（ＬＣ５０）の細胞毒性と２週目（修復期）の細胞毒性をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞毒性（％）の１／１００の値を示す。
【図２６】図２６は、細胞株ＨＴ１２９９に対して、実験群および対照群をそれぞれ１週目（ＬＣ５０）の７日目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図２７】図２７は、細胞株ＨＴ１２９９に対して、実験群および対照群をそれぞれ２週目（修復期）の２４時間目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図２８】図２８は、細胞株ＨＴ１２９９に対して、実験群および対照群をそれぞれ２週目（修復期）の４日目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図２９】図２９は、細胞株Ｓａｏｓ−２に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数と２週目（修復期）に測定した細胞数をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数の１／２０の値を示す。
【図３０】図３０は、細胞株Ｓａｏｓ−２に対して、実験群および対照群をそれぞれ２週目（修復期）の２４時間目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図３１】図３１は、細胞株Ｓａｏｓ−２に対して、実験群および対照群をそれぞれ２週目（修復期）の４日目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図３２】図３２は、細胞株Ｓａｏｓ−２に対して、実験群および対照群をそれぞれ２週目（修復期）の７日目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図３３】図３３は、細胞株Ｃ−６に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数の１／２０の値を示す。
【図３４】図３４は、細胞株Ｃ−６に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数の１／２０の値を示す。
【図３５】図３５は、細胞株Ｃ−６に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、１週目（ＬＣ５０）の生存度と２週目（修復期）の生存度をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）の１／１００の値を示す。
【図３６】図３６は、細胞株Ｃ−６に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、１週目（ＬＣ５０）の細胞毒性と２週目（修復期）の細胞毒性をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞毒性（％）の１／１００の値を示す。
【図３７】図３７は、細胞株ＡｓＰｃに対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数と２週目（修復期）に測定した細胞数をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数の１／２０の値を示す。
【図３８】図３８は、細胞株ＡｓＰｃに対して、実験群および対照群をそれぞれ１週目（ＬＣ５０）の７日目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図３９】図３９は、細胞株ＡｓＰｃに対して、実験群および対照群をそれぞれ２週目（修復期）の２４時間目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図４０】図４０は、細胞株ＡｓＰｃに対して、実験群および対照群をそれぞれ２週目（修復期）の４日目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図４１】図４１は、細胞株ＡｓＰｃに対して、実験群および対照群をそれぞれ２週目（修復期）の７日目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図４２】図４２は、細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。
【図４３】図４３は、細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対して細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した、１週目（ＬＣ５０）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）値を示す。
【図４４】図４４は、細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。
【図４５】図４５は、細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対して細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した、２週目（修復期）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）値を示す。
【図４６】図４６は、細胞株ＲＫＯに対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。
【図４７】図４７は、細胞株ＲＫＯに対して細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した、１週目（ＬＣ５０）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）値を示す。
【図４８】図４８は、細胞株ＲＫＯに対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。
【図４９】図４９は、細胞株ＲＫＯに対して細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した、２週目（修復期）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）値を示す。
【図５０】図５０は、ＨｅＬａ細胞に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。
【図５１】図５１は、ＨｅＬａ細胞に対して細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した、１週目（ＬＣ５０）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）値を示す。
【図５２】図５２は、ＨｅＬａ細胞に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。
【図５３】図５３は、ＨｅＬａ細胞に対して細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した、２週目（修復期）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）値を示す。
【図５４】図５４は、ＴＴ細胞に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。
【図５５】図５５は、ＴＴ細胞に対して細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した、１週目（ＬＣ５０）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）値を示す。
【図５６】図５６は、ＴＴ細胞に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。
【図５７】図５７は、ＴＴ細胞に対して細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した、２週目（修復期）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）値を示す。
【図５８】図５８は、ＴＴ細胞に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、１週目（ＬＣ５０）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）の１／１００の値を示す。
【図５９】図５９は、ＴＴ細胞に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、１週目（ＬＣ５０）の細胞毒性を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞毒性（％）の１／１００の値を示す。
【図６０】図６０は、ＴＴ細胞に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、２週目（修復期）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）の１／１００の値を示す。
【図６１】図６１は、ＴＴ細胞に対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、２週目（修復期）の細胞毒性を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞毒性（％）の１／１００の値を示す。
【図６２】図６２は、ＨｅｐＧ２細胞に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数の１／１００の値を示す。
【図６３】図６３は、ＨｅｐＧ２細胞に対して、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した、１週目（ＬＣ５０）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）値を示す。
【図６４】図６４は、ＨｅｐＧ２細胞に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。
【図６５】図６５は、ＨｅｐＧ２細胞に対して、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した、２週目（修復期）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）値を示す。
【図６６】図６６は、ＨｅｐＧ２細胞に対して、実験群、対照群および非処理群をそれぞれ１週目（ＬＣ５０）の４日目に倍率２００の顕微鏡により撮影した写真である。
【図６７】図６７は、Ｎ８７細胞に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数の１／１００の値を示す。
【図６８】図６８は、Ｎ８７細胞に対して、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した、１週目（ＬＣ５０）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）値を示す。
【図６９】図６９は、Ｎ８７細胞に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。
【図７０】図７０は、Ｎ８７細胞に対して、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した、２週目（修復期）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）値を示す。
【図７１】図７１は、細胞株ＨＭＥ５０ＨＴに対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数と２週目（修復期）に測定した細胞数をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数を示す。
【図７２】図７２は、細胞株ＨＭＥ５０ＨＴに対して、実験群および対照群をそれぞれ１週目（ＬＣ５０）の４８時間目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図７３】図７３は、細胞株ＨＭＥ５０ＨＴに対して、実験群および対照群をそれぞれ１週目（ＬＣ５０）の７日目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図７４】図７４は、細胞株ＨＭＥ５０ＨＴに対して、実験群および対照群をそれぞれ２週目（修復期）の０日目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図７５】図７５は、細胞株ＨＭＥ５０ＨＴに対して、実験群および対照群をそれぞれ２週目（修復期）の７日目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図７６】図７６は、細胞株ＢＪに対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数と２週目（修復期）に測定した細胞数をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、１週目（ＬＣ５０）の縦軸は細胞数の値、２週目（修復期）の縦軸は細胞数の１／１０００の値を示す。
【図７７】図７７は、細胞株ＢＪに対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、１週目（ＬＣ５０）の生存度と２週目（修復期）の生存度をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）の１／１００の値を示す。
【図７８】図７８は、細胞株ＢＪに対して波長５００ｎｍにおいてＸＴＴ分析法を実施して、１週目（ＬＣ５０）の細胞毒性と２週目（修復期）の細胞毒性をそれぞれ示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞毒性（％）の１／１００の値を示す。
【図７９】図７９は、細胞株ＢＪに対して、実験群、対照群および非処理群をそれぞれ１週目（ＬＣ５０）の７日目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図８０】図８０は、細胞株ＢＪに対して、実験群および対照群をそれぞれ２週目（修復期）の４日目にオリンパス社製ＩＸ７０倒立顕微鏡により撮影した写真である。
【図８１】図８１は、細胞株ＣＣＤ−１０７４ｓｋに対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。但し、図８２の縦軸は細胞数の５倍の値を示す。
【図８２】図８２は、細胞株ＣＣＤ−１０７４ｓｋに対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。但し、図８２の縦軸は細胞数の５倍の値を示す。
【図８３】図８３は、細胞株ＣＣＤ−１０７４ｓｋに対して細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した、１週目（ＬＣ５０）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）値を示す。
【図８４】図８４は、細胞株ＣＣＤ−１０７４ｓｋに対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。
【図８５】図８５は、細胞株ＣＣＤ−１０７４ｓｋに対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は細胞数値を示す。
【図８６】図８６は、細胞株ＣＣＤ−１０７４ｓｋに対して細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した、２週目（修復期）の生存度を示すグラフである。ここで、横軸は培養時間を示し、縦軸は生存度（％）値を示す。
【図８７】図８７は、ヌードマウスにＷＭ−２６６−４（ヒト悪性黒色腫）を投与した後に非処理群、実験群および対照群の時間経過による腫瘍の大きさを比較したグラフである。
【図８８】図８８は、雌雄のＳＤラット（Sprague-Dawley rat）に本発明に係る組成物を投与した後、時間経過による体重（ｇ）の変化を示すグラフである。
【図８９】図８９は、ヌードマウスにおいて、本発明に係る組成物が投与された後に現れる発毛現象を撮影した写真である。
【図９０】図９０は、ＨＭＥ５０ＨＴ正常細胞株に対してそれぞれ実験群および対照群を１週目（ＬＣ５０）の４日目に撮影した写真（上の２枚の写真）およびＢＪ正常細胞株に対してそれぞれ実験群および対照群を１週目（ＬＣ５０）の４日目に撮影した写真（下の２枚の写真）である。
【図９１】図９１は、ＨＴ１２９９癌細胞株に対してそれぞれ実験群および対照群を１週目（ＬＣ５０）の７日目に撮影した写真（上の２枚の写真）およびＡｓＰｃ癌細胞株に対してそれぞれ実験群および対照群を２週目（修復期）の４８時間目に撮影した写真（下の２枚の写真）である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明に係る化学式Ｉの化合物の製造方法および前記化合物を有効成分として含有する薬学組成物の効果について実施例および図面に基づいて説明する。但し、本発明を実施例および図面に限定する意図はなく、当業者であれば、本発明の範囲内において種々の変形により本発明を実施することができるはずである。
【００３５】
（実施例１）
２−メチル酪酸およびアラニンを２：１の重量比で１２０℃および３．０ａｔｍにおいて３０分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物に３：１の重量比で混合されたコッパー(copper)およびクロロゲン酸を添加した後、１２０〜１７０℃および２．６〜３．０ａｔｍにおいて１０分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物に１：１の重量比で混合されたヘスペリジンおよび水を添加した後、８０〜１２０℃および２．７〜３．５ａｔｍにおいて８分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物にシニグリンを添加した後、１００℃および２．０ａｔｍにおいて１０分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物にバリンを添加した後、−１０〜３０℃および２〜７ａｔｍにおいて１０分間反応させ、次いで、２００〜２３０℃および１ａｔｍにおいて１０分間反応させた。前記全体の反応において、溶媒としては水を用いた。
【００３６】
前記反応により得られた生成物に対して、第１精製方法として、前記生成物を１１５〜１２５℃の水に溶解した後、網目が０．２μｍの２５ｍｍナイロンシリンジフィルター（ＶＷＲ社製）を用いてろ過した。次いで、７５〜８５℃、５５〜６５℃、２７〜３３℃、２〜２２℃で順次にそれぞれ同じフィルターを用いてろ過した。その後、前記ろ過された溶液を真空乾燥させて固体化合物を得た。
【００３７】
また、前記反応により得られた生成物に対して、第２精製方法として、前記生成物を１１０〜１３０℃の水に溶解した後、網目が０．２μｍの２５ｍｍナイロンシリンジフィルター（ＶＷＲ社製）を用いてろ過した。次いで、７０〜９０℃、２３〜２７℃で順次にそれぞれ同じフィルターを用いてろ過した。その後、前記ろ過された溶液を真空乾燥させて固体化合物を得た。
【００３８】
前記第１精製方法および第２精製方法により得られた固体化合物を分析した所、両方とも図１のＮＭＲを示し、これより得られた化合物は下記化学式ＩＩを有するということが確認された。
【００３９】
（化ＩＩ）
2013530251.tif 000004
【００４０】
（実施例２）
２−メチル酪酸およびアラニンを２：１の重量比で８０〜１２０℃および２．７〜３．０ａｔｍにおいて１０分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物に３：１の重量比で混合されたコッパーおよびクロロゲン酸を添加した後、１２０〜１７０℃および２．６〜３．０ａｔｍにおいて１０分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物に１：１の重量比で混合されたヘスペリジンおよび水を添加した後、８０〜１２０℃および２．７〜３．５ａｔｍにおいて８分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物にシニグリンを添加した後、１２０〜１４０℃および３．０〜５．０ａｔｍにおいて５分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物にバリンを添加した後、−１０〜３０℃および２〜７ａｔｍにおいて１０分間反応させ、次いで８０〜１３０℃および２〜７ａｔｍにおいて５分間反応させた。前記全体の反応において、溶媒としては水を用いた。
【００４１】
前記反応により得られた生成物を実施例１に示す２種類の精製方法によりそれぞれ精製した。なお、これにより得られた固体化合物を分析した所、両方とも図２のＮＭＲおよび図３の質量スペクトル(Mass Spectrum)を示し、これにより得られた化合物は下記化学式ＩＩＩを有するということが確認された。
【００４２】
（化ＩＩＩ）
2013530251.tif 000005
【００４３】
図３の質量スペクトルのｍ／ｚ＝１９１．２において主な頂点（矢印にて示す）が現れるということが観察される。この頂点は、化学式ＩＩＩの化合物に２つの水分子が水和された形を示すということと解釈される。
【００４４】
（実施例３）
２−メチル酪酸およびアラニンを２：１の重量比で８０〜１２０℃および２．７〜３．０ａｔｍにおいて１０分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物に３：１の重量比で混合されたコッパーおよびクロロゲン酸を添加した後、１２０〜１７０℃および２．６〜３．０ａｔｍにおいて１０分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物に１：１の重量比で混合されたヘスペリジンおよびケンフェロールを添加した後、８０〜１２０℃および１．３ａｔｍにおいて８分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物にシニグリンを添加した後、１２０〜１４０℃および３．０〜５．０ａｔｍにおいて５分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物にバリンを添加した後、−１０〜３０℃および２〜７ａｔｍにおいて１０分間反応させ、次いで、８０〜１３０℃および２〜７ａｔｍにおいて５分間反応させた。前記全体の反応において、溶媒としては水を用いた。
【００４５】
前記反応により得られた生成物を実施例１に示す２種類の精製方法によりそれぞれ精製した。なお、これにより得られた固体化合物は両方とも化学式ＩＩＩを有するということが確認された。
【００４６】
（実施例４）
２−メチル酪酸およびアラニンを２：１の重量比で８０〜１２０℃および２．７〜３．０ａｔｍにおいて１０分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物に３：１の重量比で混合されたコッパーおよびクロロゲン酸を添加した後、１２０〜１７０℃および２．６〜３．０ａｔｍにおいて１０分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物に１：１の重量比で混合されたヘスペリジンおよび３’−ヒドロキシフォルモノネチンを添加した後、１２０℃および２．７ａｔｍにおいて５分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物にシニグリンを添加した後、１２０〜１４０℃および３．０〜５．０ａｔｍにおいて５分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物にバリンを添加した後、−１０〜３０℃および２〜７ａｔｍにおいて１０分間反応させ、次いで、８０〜１３０℃および２〜７ａｔｍにおいて５分間反応させた。前記全体の反応において、溶媒としては水を用いた。
【００４７】
前記反応により得られた生成物を実施例１に示す２種類の精製方法によりそれぞれ精製した。なお、これにより得られた固体化合物は両方とも化学式ＩＩＩを有するということが確認された。
【００４８】
（実施例５）
２−メチル酪酸およびアルクチゲニン−４−Ｏ−グルコシドを２：１の重量比で８０〜１２０℃および２．７〜３．０ａｔｍにおいて１０分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物に３：１の重量比で混合されたコッパーおよびルテオリン−７−ラムノグルコシドを添加した後、１２０〜１７０℃および２．７ａｔｍにおいて１０分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物に１：１の重量比で混合されたビテキシカルピンおよび３’−ヒドロキシフォルモノネチンを添加した後、１２０℃および２．７ａｔｍにおいて５分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物にシニグリンを添加した後、１２０〜１４０℃および３．０〜５．０ａｔｍにおいて５分間反応させた。次いで、前記反応により得られた生成物にバリンを添加した後、−１０〜３０℃および２〜７ａｔｍにおいて１０分間反応させ、次いで、８０〜１３０℃および２〜７ａｔｍにおいて５分間反応させた。前記全体の反応において、溶媒としては水を用いた。
【００４９】
前記反応により得られた生成物を実施例１に示す２種類の精製方法によりそれぞれ精製した。なお、これにより得られた固体化合物は両方とも化学式ＩＩＩを有するということが確認された。
【００５０】
（実施例６）
−試験管内（in vitro）実験−
下記に、本発明に係る組成物の値は実施例１に従い得られた化学式ＩＩの化合物を含有する本発明に係る組成物により処理した群の値と、実施例２乃至５において得られた化学式ＩＩＩの化合物を含有する本発明に係る組成物により処理した群の値との平均値を示す。
【００５１】
癌細胞株に属するＨＣＣ１４１９、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫＢＲ３、ＰＣ３、ＨＴ１２９９、Ｓａｏｓ−２、Ｃ−６、ＡｓＰｃ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＲＫＯ、ＨｅＬａ、ＴＴ、ＨｅｐＧ２およびＮ８７細胞と正常細胞株に属するＨＭＥ５０ＨＴ、ＢＪおよびＣＣＤ−１０７４ｓｋに対して、物質代謝（ＸＴＴ分析法）および細胞死滅（セルカウント）の変化の度合いをそれぞれ実験した。それぞれの細胞株に対しては、下記表１に示す培養培地において培養した。
【００５２】
【表１】
2013530251.tif 000006
【００５３】
前記表１において、ＤＭＥＭは、Dulbecco’sMinimum Essential Mediumの略字であり、ＩＭＤＭは、Iscove’s Modified Dulbecco’s Mediumの略字であり、ＥＭＥＭは、Eagle’s Minimum Essential Mediumの略字である。
【００５４】
正常細胞株に対しては２０、０００個の細胞の密度で、癌細胞株に対しては１０、０００−２０、０００個の細胞の密度で、４８−ウェルCorning Cell Bind(登録商標)プレートに細胞を播種し、播種から２４から４８時間後に、本発明に係る組成物を４．５ｅ−２Ｍの濃度で前記培養細胞に添加し、本発明に係る組成物が最初に投与された時間を０ｈとした。本発明に係る組成物が最初に投与されたときから３日目になる日に、細胞培養液を交換しながら本発明に係る組成物を同じ濃度で培養培地に添加した。
【００５５】
これに対し、陽性対照群としてタキソールを播種から２４から４８時間後に２．２ｅ−７Ｍの濃度で２４時間かけて並行して培養細胞に添加し、陰性対照群として培養培地にいかなる物質も添加しなかった。
【００５６】
細胞数の測定（セルカウント）：
各時点において、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を採取した。それぞれのウェルにおいて総細胞数をBeckman-Coulter Z１ Particle CharacterizationUnitを用いて測定した場合には、本明細書に添付された図面のグラフにおいて縦軸に細胞数の１／２０の値が表示され、総細胞数をBeckman-Coulter Vi-Cellを用いて測定した場合には、縦軸に細胞数の値が表示された。細胞株に対してそれぞれ２つの４８−ウェルプレートを用い、ウェル内における生存細胞の細胞数を０ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、４ｄおよび７ｄにおいて測定した。最初のプレートにおいて、細胞を０ｈおよび３ｄにおいて本発明に係る組成物により処理し、培地を交換し、タキソールは２４時間処理した。これにより、１週目のＬＣ−５０曲線が得られた。２番目のプレートにおいて、ＬＣ−５０７ｄは修復期０ｈと同様である。修復期０ｈにおいて、ＬＣ−５０７ｄの残余物に対して培地を非処理培地に交換した。非処理群は１週目の末期に過剰生産されるため修復期において測定しなかった。これにより、２週目の修復曲線が得られた。
【００５７】
ＸＴＴ細胞生存度の分析（ＸＴＴCell Viability Assay）：
ＸＴＴ分析は、抗癌剤または他の薬学化合物の生存度／細胞毒性に対する分析方法として知られている。正常細胞株に対しては１０、０００個の細胞の密度で、癌細胞株に対しては５、０００個の細胞の密度で、９６−ウェル組織培養プレートに細胞を播種した。培養期間中に形成されたホルマザン(formazan)塩を、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて定量した。最適な波長として５００ｎｍを用い、０ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、４ｄおよび７ｄにおいてそれぞれ測定した。これにより定量された値はソフトウェＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ４．８を用いて得られた。
【００５８】
ＸＴＴ分析による細胞毒性（cytotoxicity）の測定：
製造社の指示による式を用いて、実験群および対照群のそれぞれに対して下記のように細胞生存度を計算した（ブランクは、培地に対してのみＸＴＴにより測定した値を示す）：
［処理群（本発明に係る組成物またはタキソール）−ブランク］／非処理群ｘ１００％。
【００５９】
細胞毒性は、製造社の指示に従い、下記のようにして細胞毒性を計算した：
［非処理群の吸収値−（処理群（本発明に係る組成物またはタキソール）−ブランク）］／非処理群ｘ１００％。
【００６０】
上記の実験方法を実験群、対照群、非処理群に対して同様に行い、且つ、測定した。下記には、個別細胞株に対してそれぞれ得られた値を具体的に示す。
【００６１】
（１）ＨＣＣ１４１９
細胞株ＨＣＣ１４１９は原発性乳管上皮癌細胞株であり、この細胞は低分化型であり、Ｈｅｒ２−ｎｅｕを過剰発現し、ｐ５３を発現しない。ＨＣＣ１４１９は上皮細胞特定マーカーである上皮糖たんぱく質２（ＥＧＰ２：epithelial glycoprotein２）とシトケラチン１９を表現するのに対し、エストロゲンリセプターおよびプロゲステロンリセプターを表現しない。
【００６２】
細胞株ＨＣＣ１４１９に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表に示す（図４）。
【００６３】
【表２】
2013530251.tif 000007
【００６４】
細胞株ＨＣＣ１４１９に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表に示す（図４）。
【００６５】
【表３】
2013530251.tif 000008
【００６６】
前記結果から、実験群においては癌細胞数が急減した後に修復されなかったものの、対照群においては癌細胞数が所定値以下には減少せず、その個体数を維持していることが分かる。
【００６７】
細胞株ＨＣＣ１４１９に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した吸光度、生存度および細胞毒性を下記表に示す（図５および図６）。
【００６８】
【表４】
2013530251.tif 000009
【００６９】
細胞株ＨＣＣ１４１９に対して、２週目（修復期）に測定した吸光度、生存度および細胞毒性を下記表に示す（図５および図６）。
【００７０】
【表５】
2013530251.tif 000010
【００７１】
前記結果から、実験群においては細胞生存度が０に近く、ウェル内に残存している癌細胞数がほとんどないことが分かる。
【００７２】
また、ＨＣＣ１４１９実験において下記の現象が観察された。本発明に係る組成物により処置した細胞は群集を形成してまるで１枚の紙のように固まっており、これらはいずれもウェルから落ちた死滅細胞であり、細胞数の測定のためにウェルを洗浄する場合に洗い取られた。これに対し、タキソールを処置した細胞株はウェルの全体に広がって散在して成長していた。これは、本発明に係る組成物が癌細胞の転移性質を抑制するということを示す（図７から図１０）。
【００７３】
（２）ＭＣＦ−７
細胞株ＭＣＦ−７は乳房癌細胞株であり、３−アイソフォームのエストロゲンリセプターを表現し、このエストロゲンリセプターにより成長が調節される。
【００７４】
この細胞株に対して１週目において本発明に係る組成物により処理した群はタキソール処理群に比べて細胞死滅の違いが大きくないが、２週目には全細胞が死滅されていかなる修復も観察されなかった。この結果は、かなりの修復を示し、少ない個体数を維持し続けているタキソール処理群とは対照的である。
【００７５】
細胞株ＭＣＦ−７に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表に示す（図１１）。
【００７６】
【表６】
2013530251.tif 000011
【００７７】
細胞株ＭＣＦ−７に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表に示す（図１１）。
【００７８】
【表７】
2013530251.tif 000012
【００７９】
（３）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８
細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８は転移性腺癌を有する患者から摘出した組織から得られた。細胞あたりに１×１０６個のＥＧＦリセプターが表現される。
【００８０】
この細胞株の場合、ウェルに細胞がほとんど残っておらず、残っている細胞は非常にストレスを感じたか、あるいは、死滅したように見える。実験群の結果を対照群の結果と比較したとき、本発明に係る組成物はＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株に否定的な影響を及ぼしたことが明らかであるのに対し、タキソールにより処置した細胞株は次第に修復していることが分かる。本発明に係る組成物により処置した細胞数は減少し続けているのに対し、タキソールを処置した細胞数は増加している。本発明に係る組成物が正常細胞にはいかなる毒性も示さなかったということを考慮したとき、本発明に係る組成物をさらに長期間処置したり、さらに高濃度で処置すれば、癌細胞の死滅に一層効果的であると考えられる。
【００８１】
細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表に示す（図１２）。
【００８２】
【表８】
2013530251.tif 000013
【００８３】
細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表に示す（図１２）。
【００８４】
【表９】
2013530251.tif 000014
【００８５】
前記結果から、実験群においては癌細胞の数が減少し続けているが、対照群においては２週目に癌細胞の数がさらに修復していることが分かる。
【００８６】
（４）ＳＫＢＲ３
細胞株ＳＫＢＲ３は、転移性胸膜滲出症を発症している患者から摘出された乳房癌細胞株である。
【００８７】
細胞株ＳＫＢＲ３に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表１０に示し、生存度を下記表１１に示す（図１３および図１４）。ここで、生存度は、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した。
【００８８】
【表１０】
2013530251.tif 000015
【００８９】
【表１１】
2013530251.tif 000016
【００９０】
細胞株ＳＫＢＲ３に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表１２に示す（図１５）。
【００９１】
【表１２】
2013530251.tif 000017
【００９２】
細胞株ＳＫＢＲ３に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数、ＸＴＴ分析法による生存度および細胞毒性を下記表１３に示す（図１６および図１７）。
【００９３】
【表１３】
2013530251.tif 000018
【００９４】
細胞株ＳＫＢＲ３に対して、２週目（修復期）に測定した吸光度、ＸＴＴ分析法による生存度および細胞毒性を下記表１４に示す（図１８および図１９）。
【００９５】
【表１４】
2013530251.tif 000019
【００９６】
（５）ＰＣ−３
細胞株ＰＣ−３は前立腺癌の骨転移から分離された細胞株である。ＰＣ−３細胞株は、低酸性リン酸分解酵素とテストステロン−５−α（男性ホルモンの一種）還元酵素活性を示す。ＰＣ−３人体前立腺癌細胞株は典型的な前立腺癌細胞株であり、高い転移可能性を有し、ｐ５３およびｐ６３を表現しない。他の研究においても、ＰＣ−３細胞がタキソールに比較的に耐性があるという点が証明されたが、本発明に係る組成物はＰＣ−３細胞を死滅するのに非常に効果的であり、なお、ＰＣ−３細胞の修復が観察されなかった。
【００９７】
細胞株ＰＣ−３に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表に示す（図２０）。
【００９８】
【表１５】
2013530251.tif 000020
【００９９】
細胞株ＰＣ−３に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表に示す（図２０）。
【０１００】
【表１６】
2013530251.tif 000021
【０１０１】
細胞株ＰＣ−３に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した吸光度、生存度および細胞毒性を下記表に示す（図２１および図２２）。
【０１０２】
【表１７】
2013530251.tif 000022
【０１０３】
細胞株ＰＣ−３に対して、２週目（修復期）に測定した吸光度、生存度および細胞毒性を下記表に示す（図２１および図２２）。
【０１０４】
【表１８】
2013530251.tif 000023
【０１０５】
（６）ＨＴ１２９９
細胞株ＨＴ１２９９は、非小細胞肺癌細胞株である。ＨＴ１２９９細胞は部分的に削除されたｐ５３たんぱく質同種接合を有しており、ｐ５３たんぱく質の表現が少ない。本実験において、本発明に係る組成物により処置した後に生存しているＨＴ１２９９細胞を発見することが困難であった。
【０１０６】
細胞株ＨＴ１２９９に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表に示す（図２３）。
【０１０７】
【表１９】
2013530251.tif 000024
【０１０８】
細胞株ＨＴ１２９９に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表に示す（図２３）。
【０１０９】
【表２０】
2013530251.tif 000025
【０１１０】
細胞株ＨＴ１２９９に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した吸光度、生存度および細胞毒性を下記表に示す（図２４および図２５）。
【０１１１】
【表２１】
2013530251.tif 000026
【０１１２】
細胞株ＨＴ１２９９に対して、２週目（修復期）に測定した吸光度、生存度および細胞毒性を下記表に示す（図２４および図２５）。
【０１１３】
【表２２】
2013530251.tif 000027
【０１１４】
また、対照群においては、タキソールの毒性により細胞の細胞膜が破裂された後に核が破壊されて黒変する一般的な死滅様子を示すのに対し、実験群においては細胞膜が黒変し、先ず核が破裂された後に細胞膜が崩れるといった実験群ならではのユニークな死滅現象が観察された（図２６から図２８）。
【０１１５】
（７）Ｓａｏｓ−２
細胞株Ｓａｏｓ−２は、骨癌細胞株である。
【０１１６】
細胞株Ｓａｏｓ−２に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表に示す（図２９）。
【０１１７】
【表２３】
2013530251.tif 000028
【０１１８】
細胞株Ｓａｏｓ−２に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表に示す（図２９）。
【０１１９】
【表２４】
2013530251.tif 000029
【０１２０】
また、対照群においては、タキソールの毒性により細胞の細胞膜が破裂された後に核が破壊されて黒変する一般的な死滅様子を示すのに対し、実験群においては細胞膜が黒変し、先ず核が破裂された後に細胞膜が崩れるといった実験群ならではのユニークな死滅現象が観察された（図３０から図３２）。
【０１２１】
（８）Ｃ−６
細胞株Ｃ−６膠芽腫は最もよく見られる悪性神経膠種であり、種々の治療方法に抵抗力を示し、ほとんどの患者は診断１年以内に死亡する。ラットＣ−６神経芽膠種細胞株はＮ、Ｎ’−ニトロソ−メチルウレアに露出されたウィスターパースラットにおいて生成され、ラットの脳に注入したときに形態学的にＧＢＭと類似していて、この種の腫瘍の研究のための生体内、試験管内の研究にいずれも用いられている。
【０１２２】
本実験において、前記細胞はタキソールに抵抗力を示すのに対し、本発明に係る組成物により処置した細胞は４日後に死滅し、修復できなかった。
【０１２３】
細胞株Ｃ−６に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表に示す（図３３）。
【０１２４】
【表２５】
2013530251.tif 000030
【０１２５】
細胞株Ｃ−６に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表に示す（図３４）。
【０１２６】
【表２６】
2013530251.tif 000031
【０１２７】
細胞株Ｃ−６に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した吸光度、生存度および細胞毒性を下記表に示す（図３５および図３６）。
【０１２８】
【表２７】
2013530251.tif 000032
【０１２９】
細胞株Ｃ−６に対して、２週目（修復期）に測定した吸光度、生存度および細胞毒性を下記表に示す（図３５および３６）。
【０１３０】
【表２８】
2013530251.tif 000033
【０１３１】
（９）ＡｓＰｃ
細胞株ＡｓＰｃは、膵臓癌細胞株である。
【０１３２】
細胞株ＡｓＰｃに対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表に示す（図３７）。
【０１３３】
【表２９】
2013530251.tif 000034
【０１３４】
細胞株ＡｓＰｃに対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表に示す（図３７）。
【０１３５】
【表３０】
2013530251.tif 000035
【０１３６】
実験群においては、癌細胞の細胞膜が黒変して死滅していくことが観察され、このような癌細胞は再生する可能性は非常に低い（図３８）。
【０１３７】
また、対照群においては、タキソールの毒性により細胞の細胞膜が破裂された後に核が破壊されて黒変する一般的な死滅様子を示すのに対し、実験群においては細胞膜が黒変し、先ず核が破裂された後に細胞膜が崩れるといった実験群ならではのユニークな死滅現象が観察された（図３９から図４１）。
【０１３８】
（１０）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１
乳房癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、本発明に係る組成物により有意的な影響を受けている。実験群の結果を対照群の結果と比較したときに、１週目（ＬＣ５０）の４日目に実験群の細胞数が対照群の細胞数よりも小さいということがわかった。したがって、１週目（ＬＣ５０）の４日目が細胞死滅の重要な転換点となる。
【０１３９】
また、対照群において、１週目（ＬＣ５０）に生存した細胞は２週目（修復期）に成長して修復されるのに対し、実験群において、１週目（ＬＣ５０）に生存した細胞は２週目（修復期）に成長できず、全て死滅した。
【０１４０】
細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表３１に示し、生存度を下記表３２に示す（図４２および図４３）。ここで、生存度は、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した。
【０１４１】
【表３１】
2013530251.tif 000036
【０１４２】
【表３２】
2013530251.tif 000037
【０１４３】
細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表３３に示し、生存度を下記表３４に示す（図４４および図４５）。ここで、生存度は、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した。
【０１４４】
【表３３】
2013530251.tif 000038
【０１４５】
【表３４】
2013530251.tif 000039
【０１４６】
（１１）ＲＫＯ
大腸癌細胞株であるＲＫＯは、本発明に係る組成物に対して明らかな敏感度を示す。実験群において、１週目（ＬＣ５０）の４８時間目が本発明に係る組成物により細胞死滅が早く現れ始める重要な転換点となる。なお、２週目（修復期）を通じて、実験群において生存した細胞の数は対照群において生存した細胞の数よりも少なかった。
【０１４７】
細胞株ＲＫＯに対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表３５に示し、生存度を下記表３６に示す（図４６および図４７）。ここで、生存度は、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した。
【０１４８】
【表３５】
2013530251.tif 000040
【０１４９】
【表３６】
2013530251.tif 000041
【０１５０】
細胞株ＲＫＯに対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表３７に示し、生存度を下記表３８に示す（図４８および図４９）。ここで、生存度は、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した。
【０１５１】
【表３７】
2013530251.tif 000042
【０１５２】
【表３８】
2013530251.tif 000043
【０１５３】
（１２）ＨｅＬａ細胞
子宮頸部癌細胞株であるＨｅＬａ細胞に対する実験において、本発明に係る組成物により処理された１週目（ＬＣ５０）の細胞数が有意的に減少した。１週目（ＬＣ５０）の４８時間目に本発明に係る組成物がタキソールよりも多くの細胞死滅をもたらした。
【０１５４】
細胞株ＨｅＬａ細胞に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表３９に示し、生存度を下記表４０に示す（図５０および図５１）。ここで、生存度は、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した。
【０１５５】
【表３９】
2013530251.tif 000044
【０１５６】
【表４０】
2013530251.tif 000045
【０１５７】
細胞株ＨｅＬａ細胞に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表４１に示し、生存度を下記表４２に示す（図５２および図５３）。ここで、生存度は、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した。
【０１５８】
【表４１】
2013530251.tif 000046
【０１５９】
【表４２】
2013530251.tif 000047
【０１６０】
（１３）ＴＴ細胞
甲状腺癌細胞株であるＴＴ細胞に対する実験において、本発明に係る組成物により処理された場合の細胞数は非常に急減された。細胞数と生存率は両方とも１週目（ＬＣ５０）の４８時間目に有意的に減少した。なお、本発明に係る組成物により処理された細胞は、２週目（修復期）にも修復できなかったことが分かる。これに対し、タキソールにより処理された細胞は実験群よりも多数生存した。
【０１６１】
ＴＴ細胞に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表４３に示し、細胞数から計算した生存度（％）を下記表４４に示す（図５４および図５５）。ここで、生存度は、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した。
【０１６２】
【表４３】
2013530251.tif 000048
【０１６３】
【表４４】
2013530251.tif 000049
【０１６４】
ＴＴ細胞に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表４５に示し、細胞数から計算した生存度（％）を下記表４６に示す（図５６および図５７）。ここで、生存度は、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した。
【０１６５】
【表４５】
2013530251.tif 000050
【０１６６】
【表４６】
2013530251.tif 000051
【０１６７】
ＴＴ細胞に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した吸光度、ＸＴＴ分析法による生存度および細胞毒性を下記表４７に示す（図５８および図５９）。
【０１６８】
【表４７】
2013530251.tif 000052
【０１６９】
ＴＴ細胞に対して、２週目（修復期）に測定した吸光度、ＸＴＴ分析法による生存度および細胞毒性を下記表４８に示す（図６０および図６１）。
【０１７０】
【表４８】
2013530251.tif 000053
【０１７１】
（１４）ＨｅｐＧ２細胞
ＨｅｐＧ２肝腫瘍細胞株（ＡＴＣＣＨＢ−８０６５）は、タキソール処理に対して強い耐性を示すだけではなく、本発明に係る組成物に対しても非常に弱化された反応を示す。しかしながら、タキソールと同様に、本発明に係る組成物による効果は遅延されたものの、処理後４８時間後に効果が現れることが観察された（図６６）。
【０１７２】
非処理群は細胞成長を保証し、処理群に有意性があるか否かを確認するために２週目（修復期）に１回行われた。本発明に係る組成物が培地に存在しない２週目（修復期）には４８時間目に非処理群とタキソール処理群に対して有意差を示す。この時点から、本発明に係る組成物により処理された細胞は修復できなかったが、タキソールにより処理された細胞は耐性がさらに強くなることが分かった。
【０１７３】
ＨｅｐＧ２細胞に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表４９に示し、細胞数から計算した生存度（％）を下記表５０に示す（図６２および図６３）。ここで、生存度は、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した。 
【０１７４】
【表４９】
2013530251.tif 000054
【０１７５】
【表５０】
2013530251.tif 000055
【０１７６】
ＨｅｐＧ２細胞に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表５１に示し、細胞数から計算した生存度（％）を下記表５２に示す（図６４および図６５）。ここで、生存度は、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した。
【０１７７】
【表５１】
2013530251.tif 000056
【０１７８】
【表５２】
2013530251.tif 000057
【０１７９】
（１５）Ｎ８７細胞
Ｎ８７細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ−５８２２）は、胃癌腫の肝転移部位に由来したものである。この細胞は、処置に対する反応パターンがＲＫＯ細胞とほとんど同様であった。すなわち、４８時間後に細胞数および細胞生存度の側面において有意的な減少が観察され、このような減少は持続的に維持され、細胞は修復できなかった。
【０１８０】
Ｎ８７細胞に対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表５３に示し、細胞数から計算した生存度（％）を下記表５４に示す（図６７および図６８）。ここで、生存度は、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した。
【０１８１】
【表５３】
2013530251.tif 000058
【０１８２】
【表５４】
2013530251.tif 000059
【０１８３】
Ｎ８７細胞に対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表５５に示し、細胞数から計算した生存度（％）を下記表５６に示す（図６９および図７０）。ここで、生存度は、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した。
【０１８４】
【表５５】
2013530251.tif 000060
【０１８５】
【表５６】
2013530251.tif 000061
【０１８６】
（１６）ＨＭＥ５０ＨＴ−正常上皮細胞
人体乳房上皮細胞であるＨＭＥは、隣り合う正常組織に由来した細胞株である。本実験において、実験群においてはいかなる細胞毒性も観察されなかった。むしろ、ＨＭＥ５０ＨＴ細胞はよく成長し、修復期には細胞がすくすく成長し、非常に健やかであり、ストレスを感じなかった。
【０１８７】
細胞株ＨＭＥ５０ＨＴに対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表に示す（図７１）。
【０１８８】
【表５７】
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【０１８９】
細胞株ＨＭＥ５０ＨＴに対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表に示す（図７１）。
【０１９０】
【表５８】
2013530251.tif 000063
【０１９１】
前記結果から、実験群は非処理群とほとんど同様に成長することが分かり、これは、本発明に係る組成物が正常細胞に否定的な影響を及ぼさないということを示す。すなわち、実験群においては、一週間薬物に露出されているにも拘わらず、薬に露出された期間および修復期間の両方において固体数は増加している。これに対し、タキソールにより処置された群においては、一日間薬物に露出されたにも拘わらず、今後の２週間個体数が増加できず、その数を維持するだけであり、これは、正常細胞がタキソールにより受けるストレスが多いということを意味する。
【０１９２】
また、対照群においては、正常細胞の形態が破壊され、過多なストレスを感じることが観察されるのに対し、実験群においては正常細胞が非常に健やかに成長していることが観察された（図７２から図７５）。
【０１９３】
（１７）ＢＪ−正常繊維芽細胞
細胞株ＢＪは、新生児の正常表皮に由来したものであり、テロメラーゼを発現しない。本発明に係る組成物により処置した群において細胞毒性が現れず、細胞は非常に健やかであり、ストレスを受けず、強化された細胞成長が観察された。
【０１９４】
細胞株ＢＪに対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表に示す（図７６）。
【０１９５】
【表５９】
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【０１９６】
細胞株ＢＪに対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表に示す（図７６）。
【０１９７】
【表６０】
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【０１９８】
前記結果から、正常細胞は、実験群の方が非処理群よりもよく成長する様子を示しているのに対し、対照群においてはタキソールの毒性によるストレスのために細胞数が減少していて修復期の４日目が過ぎた後に修復される様子を示している。
【０１９９】
細胞株ＢＪに対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した吸光度、生存度および細胞毒性を下記表に示す（図７７および図７８）。
【０２００】
【表６１】
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【０２０１】
細胞株ＢＪに対して、２週目（修復期）に測定した吸光度、生存度および細胞毒性を下記表に示す（図７７および図７８）。
【０２０２】
【表６２】
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【０２０３】
前記結果から、実験群においては正常細胞の生存率が１に近い値、あるいは、それ以上の値を示しており、細胞毒性が０に近いということが分かる。
【０２０４】
また、実験群における正常細胞は非処理群と非常に同様の細胞成長様子が観察されたのに対し、対照群においては細胞の形態が完全に破壊された様子が観察された（図７９および図８０）。
【０２０５】
（１８）ＣＣＤ−１０７４ｓｋ
正常のヒト皮膚繊維芽細胞である細胞株ＣＣＤ−１０７４ｓｋは、１週目（ＬＣ５０）に本発明に係る組成物により処理したときにいかかる物質でも処理しなかったときと同じ程度に成長した。これに対し、タキソールにより処理された対照群においては、１週目（ＬＣ５０）の細胞の成長が阻害され、２週目（修復期）においても修復が非常に遅かった。
【０２０６】
細胞株ＣＣＤ−１０７４ｓｋに対して、１週目（ＬＣ５０）に測定した細胞数を下記表６３に示し、生存度を下記表６４に示す（図８１、図８２および図８３）。ここで、生存度は、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した。
【０２０７】
【表６３】
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【０２０８】
【表６４】
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【０２０９】
細胞株ＣＣＤ−１０７４ｓｋに対して、２週目（修復期）に測定した細胞数を下記表６５に示し、生存度を下記表６６に示す（図８４、図８５および図８６）。ここで、生存度は、細胞数測定ウェル内において細胞をトリプパンブルーにより染色して測定した。
【０２１０】
【表６５】
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【０２１１】
【表６６】
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【０２１２】
（実施例７）
−生体内（in vivo）実験−
（１）生体内抗癌効果
癌細胞株としては、ＷＭ−２６６−４（ヒト悪性黒色腫）を選択した。この細胞１０５個をＰＢＳに浮遊させ、Matrigel（ＢＤバイオサイエンス社製）と１：１で混合した。これにより製造された前記細胞株が含まれている混合液８０μｌを５週齢の雌性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕ）１４匹のそれぞれの右脇に皮下注射した。
【０２１３】
その後、腫瘍負荷量（tumor burden）の平均が１、０００となったとき、前記ヌードマウスのうち５匹にはいかなる処理もせず（非処理群）、他の５匹にはシスプラチン０．００２５ｍｇ／ｇ（試料の質量／マウスの体重）を投与し（対照群）、他の４匹には化学式ＩＩおよびＩＩＩの化合物をそれぞれ０．０００３５ｍｇ／ｇ（試料の質量／マウスの体重）の濃度で１日につき２回投与した（実験群）。ここで、腫瘍負荷量＝π／６×０．５×長さ×（幅）２により計算された。
【０２１４】
２日おきに前記マウスの腫瘍の大きさと体重を測定した。マウスが斃死された後には腫瘍を摘出して腫瘍の大きさと体重を測定した。これによる結果は、図面にグラフで示す。
【０２１５】
前記実験結果から、本発明に係る組成物により処理した群の方が、シスプラチンにより処理した群に比べて腫瘍の大きさが顕著に小さいということが分かる（図８７）。  （２）ヌードマウスのＴ細胞分化
５週齢の雌性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕ）３匹に１８日間ＰＢＳを経口投与し、他の３匹に１８日間１日につき２回化学式ＩＩの化合物を０．０００３３ｍｇ／ｇ（化合物の質量／マウスの体重）の濃度で経口投与した。その後、抹消血液単核細胞（ＰＢＭＣ）から血液を採取してＴ細胞数をＦＡＣＳにより分析した。このとき、１次抗体としては抗マウスＣＤ８を用い、２次抗体としてはＦＩＴＣ−コンジュゲートラット抗マウスＩｇＧ（ＦＩＴＣ−conjugated ratanti-mouse ＩｇＧ）を用いた。
【０２１６】
実験結果を下記表６７に示す。これより、本発明に係る組成物により処置した実験群のＴ細胞数が、ＰＢＳを投与した対照群のＴ細胞数の約２倍に達していることが分かる。なお、実験群において示すＴ細胞数は野生型の正常ラットのＴ細胞数に近いことが分かる。
【０２１７】
胸腺がないマウスにおけるＴ細胞の増加は、幹細胞によってのみ可能であるため、前記実験結果は、本発明に係る組成物が幹細胞の分化を誘導してＴ細胞を分化させるように働いたということを意味する。
【０２１８】
【表６７】
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【０２１９】
（実施例８）
−副作用の確認実験−
（１）齧歯類に対する毒性試験ＳＤラットに本発明に係る組成物を単回経口投与して毒性を試験した。対照群（水）に比べて、実験群（本発明に係る組成物）においては雌雄各５匹に試験物質を８０ｍｌ／ｋｇ（組成物の体積／ラットの重量）、すなわち、２８ｍｇ／ｋｇ（化合物の重量／ラットの重量）の容量で単回投与した。
【０２２０】
実験の結果、本発明に係る組成物を投与しても死亡した動物はなかった。また、一般症状において異常所見はなく、試験物質の投与と関わる体重の変化に異常がなく、剖検の結果、やはり異常所見はなかった。したがって、本発明に係る組成物の投与と関わる異常症状が全く観察されなかった（図８８）。
【０２２１】
（２）ヌードマウスの発毛
ヌードマウスに２週間１日につき２回本発明に係る組成物を投与した。
【０２２２】
その結果、図８９から、ヌードマウスにおいて発毛が起こるということを確認することができた。これは、ヌードマウスの非正常的な遺伝子が本発明に係る組成物の所定期間の投与により野生型白い生ラットの正常遺伝子に戻る変化過程において現れる症状である。したがって、本発明に係る組成物を抗癌剤として投与しても、脱毛の副作用が発生しない（図８９）。
【０２２３】
（３）正常細胞の成長形態
本発明に係る組成物により処置した正常細胞は、いかなる物質によっても処理されなかった正常細胞と非常に同様の細胞成長の様子を示す。しかしながら、タキソールにより処置した正常細胞は、タキソールの毒性によるストレスによって細胞の形態が破壊される様子を示す。すなわち、タキソールは、癌細胞だけではなく、正常細胞の正常な成長も妨げ、これは、細胞の種類に対するタキソールの選択性が非常に低いということを示す（図９０）。
【０２２４】
（４）癌細胞の死滅形態
試験管内において、本発明に係る組成物により処置した全ての癌細胞は生物学的なマーカーの表現とは無関係に、タキソールに比べて相対的にすっかり癌細胞を死滅させた。このようにすっかり癌細胞が死滅される場合、身体は残余物を処理するための負担を軽減するため、身体機能が低下された患者に好適に投与することができる（図９１）。したがって、本発明に係る組成物は、正常細胞に対しては毒性なしによく成長するように補助するのに対し、癌細胞に対してはすっかり死滅させることができるという選択的で且つ特異的な効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【国際調査報告】
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