(57)【要約】  治療用途および化粧用途ならびにいくつかの全身性、皮膚科的、歯周科的、眼科的、および泌尿器科的炎症性疾患の治療のための、部分的および完全硫酸化ヒアルロナンまたはその薬学的に許容可能な塩もしくはエステルの使用が本明細書に記載される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験対象の炎症を低減または予防するための方法であって、前記被験対象に部分的もしくは完全硫酸化ヒアルロナンまたはその薬学的に許容可能な塩もしくはエステルを有効量投与することを含む方法。
【請求項２】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン残基の少なくとも１つの一級Ｃ−６水酸基プロトンが、硫酸基で置換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒアルロナンの前記Ｎ−アセチルグルコサミン残基の一級Ｃ−６水酸基プロトンの少なくとも１％が、硫酸基で置換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ヒアルロナンの前記Ｎ−アセチルグルコサミン残基の一級Ｃ−６水酸基プロトンの１％〜１００％が、硫酸基で置換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ウロン酸残基の少なくとも１つのＣ−２水酸基プロトンもしくはＣ−３水酸基プロトンまたはＮ−アセチルグルコサミン残基の少なくとも１つのＣ−４水酸基プロトンが、硫酸基で置換されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ウロン酸残基の少なくとも１つのＣ−２水酸基プロトンおよびＣ−３水酸基プロトンならびにＮ−アセチルグルコサミン残基の少なくとも１つのＣ−４水酸基プロトンが、硫酸基で置換されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物が、二糖単位当たり０．１〜４．０の硫酸化度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記部分的または完全硫酸化ヒアルロナンが、１０ｋＤａ未満の平均分子サイズを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記部分的または完全硫酸化ヒアルロナンが、０．５ｋＤａ〜１０ｋＤａの平均分子サイズを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒアルロナンが、動物源に由来しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬学的に許容可能なエステルが、プロドラッグである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記部分的もしくは完全硫酸化ヒアルロナンまたはその薬学的に許容可能な塩もしくはエステルが、医薬組成物として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、カプセル剤、錠剤、チューインガム、ロゼンジ剤、散剤、または飲料を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、静脈内、筋肉内、皮下、関節内、眼、膣、直腸、鼻腔内、摂取により、口腔粘膜に局所的にもしくは直接適用して、歯肉、または歯周ポケットに投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、抗炎症薬、解熱薬、抗炎症用途のステロイド性および非ステロイド性薬物、ホルモン、増殖因子、避妊薬、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗真菌薬、鎮痛薬、催眠薬、鎮静薬、トランキライザ、抗痙攣薬、筋弛緩薬、局所麻酔薬、鎮痙薬、抗潰瘍薬、ペプチドアゴニスト、交感神経作動薬、心血管作動薬、抗腫瘍薬、またはオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬学的に許容可能な塩が、有機塩、金属塩、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬学的に許容可能な塩が、ＮＨ４＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２、Ｆｅ＋２、Ｆｅ＋３、Ｃｕ＋２、Ａｌ＋３、Ｚｎ＋２、２−トリメチルエタノールアンモニウム陽イオン（コリン）、またはイソプロピルアミンの四級塩、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記部分的または完全硫酸化ヒアルロナンが、ヒアルロナンをピリジン−三酸化イオウと反応させることにより生成し、かつ前記部分的または完全硫酸化ヒアルロナンが、ピリジニウム付加物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ピリジニウム付加物を含む前記部分的または完全硫酸化ヒアルロナンが、１０ｋＤａ以下の分子量を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記炎症が、癌、多発性硬化症、骨関節炎、慢性関節リウマチ、アルツハイマー型ベータアミロイドペプチド、歯周疾患、歯肉炎、インプラント周囲炎、糖尿病性腎症、炎症性腸疾患、喘息、鼻炎、副鼻腔炎、慢性閉塞性肺疾患、急性肺障害、嚢胞性繊維症、鎌状赤血球貧血、心血管の炎症性疾患、肺の炎症性疾患、眼の炎症性疾患、大脳の炎症性疾患、または腸管の炎症性疾患により発症する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
眼科的症状、尿生殖器症状、呼吸器系症状、心血管症状、胃腸疾患、リウマチ性および免疫学的疾患、腎疾患、退行性骨関節症、歯牙もしくは口腔疾患、または神経系疾患を治療または予防するための、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの使用。
【請求項２２】
歯科外科、歯周外科、および口腔外科における部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの使用。
【請求項２３】
皮膚疾患を治療または予防するための方法であって、前記皮膚の表面上に部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを有効量適用することを含む方法。
【請求項２４】
前記皮膚疾患が、酒さ、アトピー性皮膚炎（湿疹）、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、疱疹状皮膚炎、座瘡、糖尿病性皮膚潰瘍および他の糖尿病性損傷、熱傷、日焼け、瘢痕化の予防、光線性角化症、昆虫刺傷からの炎症、漆かぶれ、放射線誘発皮膚炎／熱傷、間質性膀胱炎、光線性皮膚老化、または脂漏性皮膚炎を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
部分的もしくは完全硫酸化ヒアルロナンまたはその薬学的に許容可能な塩もしくはエステルを有効量含む口腔ケア製品。
【請求項２６】
前記製品が、ゲル、ペースト、リンス、または部分的または完全硫酸化ヒアルロナンのコーティングを含む器具を含む、請求項２５に記載の製品。
【請求項２７】
前記器具が、フロス、歯周囲ブラシ、または歯肉消息子である、請求項２６に記載の製品。
【請求項２８】
眼疾患を治療または予防するための方法であって、前記眼に部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを有効量投与することを含む方法。
【請求項２９】
前記眼疾患が、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、眼球乾燥症候群、結膜炎、虹彩炎、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、または角膜の炎症および瘢痕化を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物が、眼内または眼表面に投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
被験対象の泌尿器科的炎症を治療または予防するための方法であって、前記被験対象に部分的もしくは完全硫酸化ヒアルロナンまたはその薬学的に許容可能な塩もしくはエステルを有効量投与することを含む方法。
【請求項３２】
前記泌尿器科的炎症が、膀胱、尿道、尿路上皮裏層、腎臓、前立腺、膣、子宮、またはそれらの任意の組合せの炎症を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物が、静脈内、筋肉内、皮下、摂取により、または口腔粘膜に投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物が口腔粘膜に投与され、前記口腔粘膜投与が、頬貫通、舌下腺、経口、膣、鼻腔内、直腸、または膀胱内注入による、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
Ｐ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンの活性を低減または阻害するための、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの使用。
【請求項３６】
種々のリガンドの１つによるＲＡＧＥの活性化を低減または阻害するための、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの使用。
【請求項３７】
前記リガンドが、ＡＧＥ生成物、ＨＭＧＢ１、またはＳ１００ファミリーリガンドである、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
ヒト白血球エラスターゼの活性を低減または阻害するための、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの使用。
【請求項３９】
カチオン性ポリペプチドの活性を低減または阻害するための、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年６月８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５２，５５０号および２０１１年３月２３日に出願された米国非仮出願第１３／０６９，８６０号に基づき優先権を主張するものである。これらの出願の教示内容全体は参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症などの全身性炎症性疾患、慢性関節リウマチ、骨関節炎、糖尿病性腎症、多くの肺疾患、歯周疾患、および乾癬、皮膚炎、座瘡、酒さ、光線性皮膚老化などの慢性炎症性皮膚疾患は、ＲＡＧＥを媒介としたシグナル伝達および世界中の疫病患者と関連している。これらの疾患を眺めると、National Psoriasis Foundationの報告によれば、乾癬のみでも、世界人口の２〜３％、すなわち約１億２５００万人が罹患している。これらの炎症性症状は見た目が悪く、治療せずに放置すると重大な健康問題が生じることがある。
【０００３】
これらの症状の従来から容認された治療には、ＵＶ光線療法、コルチコステロイドおよびグルココルチコイド、アシトレチン、シクロスポリン、ならびにメトトレキサートが含まれ得る。しかしながら、これらの治療のそれぞれは、免疫抑制および肝疾患から皮膚薄層化および先天性欠損の発生に至るまでの重度の副作用を引き起こし得る。部分的にまたは完全に効果がないために、これらの治療は、患者が結果に満足しないままとなる場合が多い。
【０００４】
上述の治療に加えて、ヘパリン治療も実験的に探究されてきた。硫酸化多糖であるヘパリンは、従来的には、抗凝固剤としてほとんどもっぱら使用されてきたが、その抗炎症性もよく知られている。ヘパリンおよびその誘導体は、これらの炎症性疾患の治療に有望な点があることが示されてきた。具体的には、ヘパリンおよびその誘導体は、炎症性カスケードの少なくとも３つの重要なイベントを中断する。第１に、ヘパリンは白血球インテグリンであるＰ−セレクチンおよびＬ−セレクチンに結合し、それを遮断する。第２に、ヘパリンおよびその誘導体は、カチオン性ＰＭＮプロテアーゼであるヒト白血球エラスターゼおよびカテプシンＧに結合し、それを阻害することにより炎症性カスケードを減弱させ、それによって、第１のセレクチン阻害によるヘパリン障壁を逃れるＰＭＮによるタンパク質分解性組織損傷が低減する。第３に、ヘパリンおよびその誘導体は、最終糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）とそのリガンドとの相互作用を阻害する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ヘパリンおよびその誘導体は、これらの炎症性疾患の治療に有望であることが示されてきたが、ヘパリンおよびその誘導体による治療にはいくつかの重大な欠点がある。第１に、ヘパリンおよびその誘導体は、ブタに由来し、そのためウイルスの異種間の移動が懸念される。第２に、ヘパリンの抗凝固特性のために、この化合物を用いて治療される糖尿病患者、癌患者、および凝固状態が悪い他の患者には、過度の出血が起こる危険性がある。第３に、ヘパリンとカチオン性タンパク質血小板第４因子（ＰＦ−４）の複合体に対する抗体を生成する特定の個体に血小板減少症をヘパリンが誘発することがあり、その結果、破局的な血小板凝集および全身にわたる逆説的な動脈および静脈の凝固が生じる。したがって、重要で未だ対処されていない必要性として、他の治療で見られる種々の副作用を回避しながら、炎症性疾患を治療するために使用することができる化合物を製剤化することがある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
治療用途および化粧用途ならびにいくつかの炎症性疾患および皮膚疾患の治療のための、部分的および完全硫酸化ヒアルロナンまたはその薬学的に許容可能な塩もしくはエステルの使用が本明細書に記載される。本発明の利点は、以下の説明に部分的に記載され、その説明から部分的に明らかになるか、または下記の態様の実施により知ることができる。下記の利点は、特に添付の特許請求の範囲において指定される要素および組合わせを用いて、実現および達成されよう。前述の概要および以下の詳細な説明の両方は、例示的で説明的なものにすぎず、かつ限定するものでないことを理解されたい。
【０００７】
添付の図面は、本明細書に組み込まれ、その一部を構成するものであり、下記のいくつかの態様を図示する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（１）制御された加水分解的鎖切断による部分的な解重合、（２）トリブチルアンモニウム塩への変換、および（３）部分的硫酸化ヒアルロナンを生成するための硫酸化により、部分的硫酸化ヒアルロナンを作製するための例示的な合成手順を示す。
【図２】ＬＬ−３７誘発膀胱炎のマウスモデルにおける、完全硫酸化ヒアルロナンの保護効果を示す。ＦＯＳＨＡ(Kewpie)またはＦＯＳＨＡ（ＮＶＺ）のいずれかを前注入されたマウス膀胱では、ＭＰＯ値の顕著な低下が示される。破線は、生理食塩水で処置されかつ炎症のない対照膀胱中のＭＰＯ値に相当する（１００％）。値は、生理食塩水対照と比較した、ＭＰＯの平均パーセント値である。＊ｐ＜０．０５（ｎ＝３または４）。エラーバーは標準誤差を示す。
【図３Ａ】（Ａ）ＦＯＳ  ＨＡ（２）１０ｋＤａ、（Ｂ）ＦＯＳ  ＨＡ（１）１０ｋＤａ、（Ｃ）ＦＯＳ  ＢＨＡ、および（Ｄ）ＰＯＳ  ＢＨＡの天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析を示す。各試料の１０μｇアリコートを、Novex（登録商標）Tris-Glycine１８％ゲル(Invitrogen, Carlsbad, CA)上で、天然条件下で１２５Ｖにて１．５時間泳動して分離した。
【図３Ｂ】（Ｅ）ピリジン−三酸化イオウ複合体を使用して、Kewpie's Hyalo Oligo HAで製造されたＦＯＳ  ＨＡ、（Ｆ）ピリジン−三酸化イオウ複合体を使用して、Novozymes HAで製造されたＦＯＳ  ＨＡ、（Ｇ）ピリジン−三酸化イオウ複合体を使用して、Novozymes HAで製造されたＰＯＳ  ＨＡ、および（Ｈ）三酸化イオウＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド複合体から製造されたＦＯＳ  ＨＡ  １０ｋＤａの天然ＰＡＧＥ分析を示す。各試料のアリコート（１５μｇ）を、２０％アクリルアミドIDSmart Gel(Boca Scientific, Boca Raton, FL)上で、天然条件下で１２５Ｖにて７５分間泳動して分離した。ゲルを０．０８％のアズールＡ水溶液中で染色した。
【図４】三酸化イオウ−ピリジン複合体を使用した、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの生成に付随した副生成物を生成するためのヒアルロナンの硫酸化およびＣ−ピリジニル化を示す。
【図５】FOSHA-Kewpie-Pyr.SO3の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。このスペクトルにはピリジニウム付加物のピリジニウムプロトンを表わす８．００ｐｐｍと９．１０ｐｐｍとの間の３つのピークが示される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本化合物、本組成物、および／または本方法の開示または説明の前に、下記の態様が、それ自体当然変形可能な特定の化合物、合成方法、または使用に限定されるものではないことを理解されたい。本明細書で使用する用語が、特定の態様のみを説明することを目的とし、限定することを意図しないことも理解されたい。
【００１０】
以下の本明細書および特許請求の範囲においては、いくつかの用語に対して言及がなされることになるが、それらは以下の意味を有するように定義されるものとする。
【００１１】
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、文脈上他に明示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意する必要がある。したがって、例えば、「医薬担体(a pharmaceutical carrier)」への言及は、２つ以上のこの種の担体の混合物等を含む。
【００１２】
「任意選択の(optional)」または「任意選択により(optionally)」は、その後に説明される事象または状況が生じる場合も生じない場合もあること、および事象または状況が生じる事例も生じない事例もその説明が含むことを意味する。例えば、語句「任意選択により置換される低級アルキル」は、低級アルキル基が置換される場合も置換されない場合もあること、および非置換低級アルキルおよび置換がある低級アルキルの両方をその説明が含むことを意味する。
【００１３】
本明細書および結びの特許請求の範囲において、組成物または物品における特定の要素または成分の重量部に言及する場合、重量部で表わされる組成物または物品における、要素または成分と任意の他の要素または成分との間の重量関係を意味する。したがって、２重量部の成分Ｘおよび５重量部の成分Ｙを含有する化合物において、ＸおよびＹは２：５の重量比で存在し、かつさらなる成分がその化合物中に含有されるか否かにかかわらず、この比で存在する。
【００１４】
成分の重量パーセントは、これに反することが他に具体的に述べられない限り、成分が含まれる調合物または組成物の総重量を基準とする。
【００１５】
本明細書および結びの特許請求の範囲で使用される場合、化学種の残基は、その部分が化学種から実際に得られるか否かにかかわらず、特定の反応スキームまたはその後の製剤もしくは化学製品中の化学種から得られる生成物である部分を指す。例えば、少なくとも１つの−ＯＨ基を含有するヒアルロナンは、式Ｙ−ＯＨにより表わすことができ、ここでＹはヒアルロナン分子の残部（すなわち、残基）である。
【００１６】
本明細書で使用される用語「治療する」は、既存症状の徴候を維持または軽減させることとして定義される。本明細書で使用される用語「予防する」は、疾患または障害の１つまたは複数の徴候が発症する可能性を除去または低減することとして定義される。本明細書で使用される用語「阻害する」は、その化合物の非存在下での活性と比較した場合に、同じ活性を完全に除去するかまたはその活性を低減する、本明細書に記載の化合物の能力である。
【００１７】
治療用途および化粧用途ならびにいくつかの炎症性疾患および皮膚疾患の治療のための、部分的および完全硫酸化ヒアルロナンまたはその薬学的に許容可能な塩もしくはエステルの使用が本明細書に記載される。本明細書で使用される用語「部分的硫酸化ヒアルロナン」は、ヒアルロナンが二糖単位当たり３．５未満の硫酸化度を有する場合である。本明細書で使用される用語「完全硫酸化ヒアルロナン」は、ヒアルロナンが二糖単位当たり３．５〜４．０の硫酸化度を有する場合である。用語「低分子ヒアルロナン」および「ヒアルロナンオリゴ糖」は、下記に定義される。適切な対イオンの例は、下記に示される。
【００１８】
ヒアルロナン出発原料は、遊離酸またはその塩として存在することができる。ヒアルロナン出発原料の誘導体も、本明細書で使用することができる。誘導体は、硫酸化の前にヒアルロナンの任意の修飾を含む。広範囲の分子量のヒアルロナンを、解重合工程のために本明細書で使用することができる。一態様では、ヒアルロナンは、解重合前に、１，０００ｋＤａを超える分子量を有する。別の態様では、ヒアルロナンは、解重合前に、１０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの分子量を有することができる。また、広範囲のヒアルロナン分子量を、硫酸化工程のために使用することができる。一態様では、ヒアルロナン出発原料を、低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖に変換してから、硫酸化して部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを生成することができる。下記でさらに詳細に論述されるように、低分子量ヒアルロナンは、酸または塩基を用いて分解されたヒアルロナンである。あるいは、ヒアルロナンオリゴ糖は、例えば、ヒアルロナンシンターゼまたはヒアルロニダーゼなどの酵素を制御しながら用いて、ヒアルロナンを分解することにより生成される。その後に、異なる分子量を有するヒアルロナンオリゴ糖は、ＧＰＣまたはイオン交換分離により分離することができる。図１に、ヒアルロナンから低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖を生成するための例示的な手順を示す。
【００１９】
一態様では、硫酸化低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖は、１ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの分子量を有する。別の態様では、硫酸化低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖は、５ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１０ｋＤ〜２００ｋＤａ、または２０ｋＤａ〜１００ｋＤａの分子量を有する。低分子量ヒアルロナンを調製するための例示的な手順は実施例に示される。上記に論述されたように、ヒアルロナンの分子量を、酸または塩基を用いるヒアルロナンの切断により改変して、低分子量ヒアルロナンを生成することができる。特定の態様では、ヒアルロナン出発原料またはその誘導体は、動物源に由来しない。これらの態様では、ヒアルロナンは、細菌などの他の供給源に由来することができる。例えば、組換え枯草菌(B. subtilis)発現系を、ヒアルロナン出発原料を生成するために使用することができる。
【００２０】
低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖を塩基で処理した後、それと硫酸化剤を反応させて、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを生成する。有機合成で一般に使用される硫酸化剤は、本明細書で使用することができる。硫酸化剤の例には、これらに限定されないが、ピリジン−三酸化イオウ複合体またはトリエチルアミン−三酸化イオウ複合体が含まれる。部分的硫酸化ヒアルロナンを作製するための例示的な合成手順は、図１に示される。図１を参照すると、低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖を、トリブチルアミン塩に変換して、凍結乾燥し、ジメチルホルムアミドに再懸濁した後、硫酸化剤（例えば、ピリジン−三酸化イオウ複合体）で処理して、１つまたは複数の水酸基プロトンを硫酸化する。完全硫酸化ヒアルロナンは、十分量の塩基および硫酸化剤を加えて、すべての水酸基を硫酸化することにより生成することができる。
【００２１】
一態様では、硫酸化剤がピリジン−三酸化イオウ複合体の場合に、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンのピリジニウム付加物が生成する。これは図４に示されるが、そこでは、ピリジンは、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンに共有結合している。理論に拘束されるものではないが、ヒアルロナンを、例えばＤＭＦなどの溶媒中でピリジン−三酸化イオウ複合体と反応させる場合、少量の酸がその場に存在する微量の水から生成し、それにより部分的な解重合が起こって、遊離還元末端基（例えば、図４における水酸基）が生じる。ヘミケタールの水酸基は、最終的に硫酸化されて、硫酸化中間体を生成することができ、その後に、この中間体はその場で生成した遊離ピリジンと反応して、ピリジニウム付加物を生成する。一態様では、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンのピリジニウム付加物の分子量は、１０ｋＤａ以下である。他の態様では、分子量は、０．１ｋＤａ、０．５ｋＤａ、１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、または１０ｋＤａであり、分子量範囲の下端および上端の間の任意の値を取り得る。
【００２２】
一態様では、硫酸化度は、部分的硫酸化ヒアルロナンの二糖単位当たり、０．１から、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５未満まで、またはその任意の範囲である。一態様では、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの平均分子量は、１００ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満、１０ｋＤａ未満、または５ｋＤａ未満である。別の態様では、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの平均分子サイズは、０．５ｋＤａ〜５０ｋＤａ未満、２Ｄａ〜２０ｋＤａ、または３ｋＤａ〜１０ｋＤａである。さらなる態様では、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの平均分子サイズは、０．５ｋＤａ〜１０ｋＤａまたは１ｋＤａ〜５ｋＤａである。反応条件に応じて、低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖に存在する１つまたは複数の異なる水酸基を硫酸化することができる。一態様では、低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖のＮ−アセチルグルコサミン残基の一級Ｃ−６水酸基プロトンが硫酸化される。別の態様では、ヒアルロナンのＮ−アセチルグルコサミン残基の一級Ｃ−６水酸基プロトンおよびウロン酸残基の少なくとも１つのＣ−２水酸基プロトンもしくはＣ−３水酸基プロトンまたはＮ−アセチルグルコサミン残基の少なくとも１つのＣ−４水酸基プロトンが、硫酸基で置換される。別の態様では、低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖のＮ−アセチルグルコサミン残基の一級Ｃ−６水酸基プロトンならびにウロン酸残基の少なくとも１つのＣ−２水酸基プロトンおよびＣ−３水酸基プロトン、およびＮ−アセチルグルコサミン残基の少なくとも１つのＣ−４水酸基プロトンが、硫酸基で置換される。別の態様では、低分子ヒアルロナンまたはヒアルロナンオリゴ糖上に存在する水酸基プロトンの０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％未満、またはそれらの任意の範囲が脱プロトン化され、次いで硫酸化され得る。
【００２３】
本明細書に記載の部分的または完全硫酸化ヒアルロナンは、その薬学的に許容可能な塩またはエステルであってもよい。一部の態様では、薬学的に許容可能なエステルはプロドラッグであってもよい。例えば、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの遊離水酸基を、塩化パルミトイルで部分的にエステル化して、内因性エステラーゼにより加水分解されて、遊離の部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを遊離する両親媒性化合物を得ることができる。当業者によく知られている無毒な副産物を遊離する他の補欠分子団を使用してもよい。薬学的に許容可能な塩は、遊離酸を適量の薬学的に許容可能な塩基で処理することによって調製される。例示的な薬学的に許容可能な塩基は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化亜鉛、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ベンザルコニウム、コリン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、リジン、アルギニン、ヒスチジン等である。一態様では、反応は、室温など、約０℃〜約１００℃の温度で、単独でまたは不活性の水溶性有機溶媒と組み合わせて、水中で行われる。部分的または完全硫酸化ヒアルロナンと使用する塩基とのモル比は、任意の特定の塩に対して所望される比を与えるように選択される。例えば遊離酸出発原料のアンモニウム塩の調製については、出発原料を約１当量の薬学的に許容可能な塩基で処理して、中性塩を得ることができる。他の態様では、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンのコリン塩を調製して、本明細書で使用することができる。
【００２４】
本明細書に記載の部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを、生体系または生物実体が許容することができる、任意の賦形剤の中に製剤化して、医薬組成物を製造することができる。そのような賦形剤の例には、これらに限定されないが、水、水性ヒアルロン酸、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、および他の生理平衡塩類水溶液が含まれる。不揮発性油、オリーブ油、およびゴマ油などの植物油、トリグリセリド、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルなど、非水性媒体も使用することができる。他の有用な製剤には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランなどの粘性促進剤を含有する懸濁液が含まれる。賦形剤は、等張性および化学的安定性を高める物質など、微量の添加物を含有することもできる。緩衝液の例には、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、およびトリス緩衝液が含まれ、一方、防腐剤の例には、チメロソール（thimerosol）、クレゾール、ホルマリン、およびベンジルアルコールが含まれる。特定の態様では、投与方法に応じて、ｐＨを修正することができる。例えば、組成物のｐＨは約５〜約６であり、このｐＨは局所適用に適している。さらに、医薬組成物は、本明細書に記載の化合物に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、防腐剤、界面活性剤等を含むことができる。
【００２５】
医薬組成物はまた、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンと併用される１つまたは複数の有効成分を含むことができる。得られる医薬組成物は、適用部位から近位または遠位の組織に薬物および他の生理活性物質を持続的かつ連続的に送達するシステムを提供することができる。生理活性物質は、それが適用される生体系に、局所的または全身的な生物学的、生理学的、または治療的効果を提供することができる。例えば、薬剤は、様々な機能の中で、感染または炎症の制御および／または予防、細胞増殖および組織再生の増強、腫瘍増殖の制御、鎮痛薬としての作用、抗細胞接着の促進、歯槽骨および歯牙欠損の低減、軟骨および荷重関節の変性の阻害、ならびに骨成長の増強のために作用することができる。さらに、本明細書に記載のいずれの化合物も、２種以上の薬学的に許容可能な化合物の組合せを含有することができる。そのような化合物の例には、これらに限定されないが、抗微生物薬、抗炎症薬、麻酔薬等が含まれる。
【００２６】
医薬組成物は、当技術分野で公知の手法を使用して調製することができる。一態様では、組成物は、本明細書の部分的または完全硫酸化ヒアルロナンと薬学的に許容可能な化合物および／または担体とを混合することにより調製される。用語「混合(admixing)」は、化学反応も物理的相互作用もないように、２つの成分を一緒に混合することとして定義される。用語「混合」はまた、化合物と薬学的に許容可能な化合物との間の化学反応または物理的相互作用を含む。反応性の治療薬（例えば、求核基を有するもの）への共有結合形成が化合物上で起こり得る。第２に、架橋された多糖の中に薬理活性物質を非共有結合的に包含させることも可能である。第３に、静電的または疎水的相互作用により、本明細書に記載の化合物の中への薬学的に許容可能な化合物の保持が容易になり得る。
【００２７】
具体的な場合に、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの実際の好適量は、使用する特定の化合物、製剤化された特定の組成物、適用方法、および治療する特定の部位および被験対象により、異なることは認識されたい。所与の被験対象に対する投薬量は、従来の検討事項を考慮して、例えば、本化合物と公知薬剤との活性の相違についての従来からの比較によって、例えば、従来の適正な薬理学的プロトコールによって決定することができる。医薬品化合物の用量設定の技術に熟練した医師および処方者にとって、標準の推奨規格(Physicians Desk Reference, Barnhart Publishing (1999))に従って用量を決定することは、難しくないであろう。
【００２８】
本明細書に記載の医薬組成物は、局所療法または全身療法のいずれが望ましいかに応じて、かつ治療する部位に応じていくつかの方法で投与することができる。投与は、局所的（点眼、経膣、経腸、経鼻、経口、または皮膚に直接を含む）であってもよい。歯周疾患または歯肉炎のための投与は、病的な歯茎または歯周ポケットにゲル、ペースト、またはリンスを送達することによって局所的に行うことができる。さらに、有効成分は、フロス、歯周囲ブラシ、歯肉消息子、または他の口腔ヘルスケア器具上のコーティングとして製剤化することができる。局所投与のための製剤は、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、および粉剤を含むことができる。従来の医薬担体、水性、粉末、または油性基剤、増粘剤等が必要または所望され得る。エアロゾルまたは乾燥微粉末の吸入による肺の中への直接投与も可能である。炎症を起こしているかまたは変性している関節窩の中に直接注入する投与も可能である。
【００２９】
投与用の調製物には、滅菌の水性溶液または非水性溶液、懸濁液、および乳剤が含まれる。非水性担体の例には、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、乳剤、または懸濁液が含まれる。開示の組成物および方法の副次的使用に必要とされる場合、非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。開示の組成物および方法の副次的使用に必要とされる場合、静脈投与用媒体には、体液および栄養素の補液、電解質補液（リンゲルデキストロースをベースとしたものなど）等が含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの防腐剤および他の添加剤が存在してもよい。
【００３０】
投薬は、治療される病態の重症度および応答性に依存するが、通常は１日当たり１回または複数回であり、治療過程は、数日から数ヶ月、または当業者が送達を中止すべきであると判断するまで継続される。当業者は、最適投薬量、投薬方法、および反復率を容易に決定することができる。
【００３１】
部分的または完全硫酸化ヒアルロナンは、炎症性皮膚疾患の治療、炎症性歯牙疾患の治療、炎症性呼吸器疾患の治療、炎症性眼疾患の治療、熱傷治癒、および組織再生／工学に関連した種々の用途に使用することができる。一態様では、本明細書に記載の部分的または完全硫酸化ヒアルロナンおよび組成物は、そのような改善を必要とする被験対象の創傷治癒を改善することができる。本明細書に記載の部分的または完全硫酸化ヒアルロナンおよび医薬組成物は、生体適合材料から構成されているので、精製することなく、任意の生体系の中またはその上に直接置くことができる。部分的硫酸化ヒアルロナンを置くことができる部位の例には、これらに限定されないが、筋肉または脂肪などの軟組織；骨または軟骨などの硬組織；組織再生領域；歯周ポケットなどの空所；外科的切開または他の形成されたポケットまたは空洞；口腔、膣、直腸または鼻腔、関節窩、眼の盲嚢などの天然の空洞；内部に含有される腹膜腔および器官、および切傷、擦傷、または熱傷領域などの皮膚表面の障害部位を含む、その中または上に化合物を置くことができる他の部位が含まれる。組織は負傷または変性症状により損傷され得ると考えられるが、別の考えでは、本明細書に記載の部分的または完全硫酸化ヒアルロナンおよび組成物を損傷されていない組織に適用して、組織の損傷を予防することができる。部分的または完全硫酸化ヒアルロナンは、生分解性になり得るものであり、天然の酵素は長時間にわたってそれらを分解するように作用することができる。部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの成分は、分解され、例えば細胞、組織等によって生体系内部に吸収される点で、「生体吸収性」となり得る。さらに、部分的または完全硫酸化ヒアルロナン、特に再水和されていないものを生体系に適用して、対象領域から体液を吸収することができる。
【００３２】
乾癬、座瘡、アトピー性皮膚炎、酒さ、または紫外線依存性光線老化（すなわち、光線性皮膚老化）などの炎症性皮膚疾患の場合には、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを皮膚軟化剤の一部として局所的に適用して、対象症状を予防または治療することができる。喘息、慢性閉塞性肺疾患、急性肺障害、または嚢胞性線維症などの呼吸器疾患の場合には、部分的硫酸化ヒアルロナンを、気道被覆液(airway lining fluid)と適合する水溶性等張媒体の中に溶解し、吸入エアロゾルとして肺または鼻通路に送達することができる。あるいは、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを、微粉末に製剤化し、乾燥粉末として肺に吸入させることができる。眼疾患の場合には、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを水性媒体に入れて、点滴薬として眼に局所適用するか、または注射針によってもしくは埋め込まれた持続的な薬物送達装置を使用して眼に直接注入することができる。歯周疾患などの歯牙疾患の場合には、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを、口内洗浄液の成分として添加するかまたはクリーム剤または歯肉充填剤に製剤化して、歯肉溝に直接適用することができる。
【００３３】
さらに、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを、静脈内、筋肉内、または皮下のいずれかに非経口的に注射して、糖尿病性血管もしくは腎疾患または炎症性胃腸疾患などの全身性炎症性疾患を治療または予防することができる。同様に、部分的硫酸化ヒアルロナンを関節内に注射して、炎症性および変性関節炎を治療することができる。さらに、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを、カプセル剤で経口投与するか、または浣腸内に製剤化して、炎症性腸疾患の治療として直腸内に送達することができる。
【００３４】
本明細書に記載の部分的または完全硫酸化ヒアルロナンおよび組成物は、薬学的に許容可能な化合物を受容することができる少なくとも１つの組織に本明細書に記載の１つまたは複数の組成物を接触させることを含む、そのような送達を必要とする患者に少なくとも１つの薬学的に許容可能な化合物を送達することができる。部分的または完全硫酸化ヒアルロナンは、ヒトまたは非ヒト動物に対して治癒的または治療的価値を有する多種多様な放出可能生理活性物質のための担体として使用することができる。部分的または完全硫酸化ヒアルロナンにより担持され得るこれらの物質の多くが上記に論述されている。本発明のゲルの中に組み込むのに適した生理活性物質の中には、例えば、抗炎症薬、解熱薬、抗炎症用途のステロイド性および非ステロイド性薬物、ホルモン、増殖因子、避妊薬、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗真菌薬、鎮痛薬、催眠薬、鎮静薬、精神安定薬、抗痙攣薬、筋弛緩薬、局所麻酔薬、鎮痙薬、抗潰瘍薬、ペプチドアゴニスト、交感神経作動薬、心血管作動薬、抗腫瘍薬、オリゴヌクレオチド、およびそれらの類似体などの治療薬が含まれる。生理活性物質は、薬学的に有効な量で加えられる。
【００３５】
一態様では、本明細書に記載の部分的または完全硫酸化ヒアルロナンは、最終糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、ヒト白血球エラスターゼ、またはそれらの任意の組合せの活性を阻害することができる。別の態様では、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンは、カチオン性ポリペプチドの活性を低減または阻害することができる。ＲＡＧＥは、ヒト皮膚に高度に発現し、そこでは皮膚の繊維芽細胞、樹状細胞、角化細胞、内皮細胞、および単球上に存在する。ＲＡＧＥは、最終糖化産物（ＡＧＥ）およびサイトカイン腫瘍壊死因子αにより、太陽に露出した皮膚の中で発現上昇する。ＲＡＧＥは、ＵＶ誘発光線老化（すなわち、光線性皮膚老化）において顕著な役割を果たし、そこではＵＶ誘発カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）などのＡＧＥ生成物によるその連結反応が、皮膚繊維芽細胞による細胞外マトリックス産生を刺激することにより皮膚老化を促進する。ＲＡＧＥの役割は乾癬において一層顕著に見える。その理由は、この疾患が炎症を開始する活性化Ｔリンパ球に決定的に依存するためである。Ｔリンパ球はまた、座瘡およびアトピー性皮膚炎において機構的に重要となり得る。座瘡の場合には、皮膚における高レベルのＣＤ３＋およびＣＤ４＋Ｔリンパ球ならびにマクロファージが、濾胞管中の角化細胞の過剰増殖を刺激し、座瘡面皰の形成をもたらす塞がれた濾胞管が生成する。アトピー性皮膚炎の場合には、皮膚抗原が、インターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン１３（ＩＬ−１３）などのサイトカインを分泌するＴＨ２リンパ球を活性化し、それによって皮膚の中への好酸球の動員が引き起こされる。次いで、好酸球が主要塩基性タンパク質などのカチオン性毒素を放出し、それによりアレルギー性皮膚疾患が発症する。したがって、本明細書に記載の化合物の有効なＲＡＧＥ阻害活性により、これらに限定されないが、座瘡、湿疹、アトピー性皮膚炎、乾癬、または光線性皮膚老化を含む、種々の皮膚疾患を治療するのにこれらの化合物が有用になる。
【００３６】
ＲＡＧＥは、内皮、繊維芽細胞、および単核食細胞を含む一連の細胞上で発現される細胞表面受容体である。糖尿病患者では、高血糖によりタンパク質および脂質の非酵素的糖化および酸化がもたらされ、最終糖化産物（ＡＧＥ）が形成される。喫煙者では、ＡＧＥ生成物は口の前面、肺、および全身に蓄積する。さらに、喫煙者は、限局性歯周病、歯膜炎、および炎症性疾患による歯牙欠損に極めて罹りやすい。ＡＧＥはＲＡＧＥ受容体のリガンドであり、連結反応が炎症性カスケードを誘導する。マウス糖尿病モデルでは、この連結反応が、口腔感染症、過大な炎症性応答、および歯牙欠損をもたらす歯槽骨の破壊に中心的な役割を果たすことが示されている。歯肉組織におけるＲＡＧＥ発現が、２型糖尿病に罹患した慢性歯膜炎患者およびそれに罹患していない慢性歯膜炎患者で実証されている。歯周囲のＲＡＧＥを遮断する努力の成果は、局所送達によって最もよく得られる可能性がある。
【００３７】
本明細書に記載の部分的または完全硫酸化ヒアルロナンは、ＲＡＧＥを媒介とした炎症に対するアンタゴニストである。ＲＡＧＥ連結反応が、炎症性シグナル伝達を永続させる基本的に重要な機構であるので、ＲＡＧＥの連結反応を阻害すること、したがってＲＡＧＥの上方制御を抑制することは、この形式の炎症性細胞の撹乱を低減させる効果的な処置である。本明細書に記載の化合物は、ＲＡＧＥ受容体を遮断し、リガンド結合およびＲＡＧＥ炎症性機構の活性化を阻止する。低分子量かつ水溶性の硫酸化ヒアルロナンは、抗凝固活性を欠損しているため、全身的かつ局所的使用に対して安全であると一般に考えられる。歯肉炎、歯膜炎、およびインプラント材の埋め込み後の場合、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンの局所投与により、歯肉組織および骨の保存が達成されるであろう。
【００３８】
成熟した状態では、ＲＡＧＥは、生体にとって必ずしも常に完璧に有用とは限らない。悪性腫瘍は、オートクリン因子としてアンフォテリン（すなわち高泳動度ボックス群タンパク質−１(high mobility box group protein-1)、ＨＭＧＢ−１）を分泌し、アンフォテリンとＲＡＧＥとの相互作用を使用して、原発腫瘍の増殖および転移を促進する。組換えデコイ（可溶性ＲＡＧＥまたはｓ−ＲＡＧＥ）によりＲＡＧＥを遮断すると、腫瘍増殖は低下し、転移は阻害される。敗血症の間、単球およびマクロファージは、血管および他の炎症性細胞上のＲＡＧＥと相互作用するアンフォテリンを分泌し、細菌性ショックの重症度を増強する。ＲＡＧＥに対する抗体を用いてこの相互作用を遮断すると、重度の敗血症における器官損傷が防止される。成熟した状態では、ＲＡＧＥは、ＰＭＮ、単球、およびリンパ球の炎症部位への動員を促進する血管接着受容体としても機能する。ＲＡＧＥを遮断すると、炎症性細胞の流入が鈍化する。このことは、多発性硬化症の動物モデルでこれまでに実証されてきており、このモデルでは、ｓ−ＲＡＧＥによる血管内皮ＲＡＧＥの拮抗的遮断により、活性化された脳炎誘発性Ｔリンパ球の中枢神経系への流入が防止され、神経系の炎症および変性の発症および進行が遅延する。
【００３９】
ＲＡＧＥはまた、Ｓ１００カルグラニュリンと呼ばれるカルシウム結合タンパク質のファミリーと相互作用するが、このタンパク質は、強力な炎症促進因子として、ＰＭＮ、単球、およびリンパ球により分泌される。高レベルのＳ１００カルグラニュリンは、急性肺障害のＰＭＮ炎症および嚢胞性繊維症患者の気道分泌物中の卓越したマーカーである。眼では、Ｓ１００カルグラニュリンとＲＡＧＥとの相互作用は、加齢黄斑変性症における失明に顕著な役割を果たす。ＲＡＧＥはまた、アルツハイマー型β−アミロイドペプチドおよびアミロイドタンパク質のβシートに結合する。ＲＡＧＥが関与する神経細胞死および炎症誘導を介して、ＲＡＧＥ−βシート原繊維相互作用が全身性アミロイドーシスでのアルツハイマー型認知症および器官損傷を媒介する。
【００４０】
さらに、ＲＡＧＥは真性糖尿病においても顕著である。血糖が上昇すると、グルコースのアルデヒド基が細胞タンパク質のアミンに無作為に結合し、共有結合性付加物が形成される。ＰＭＮにより産生される酸化物質である次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）などの酸化物質の存在下では、次に、このグルコース部分が酸化され得る。これらの酸化およびグリコシル化されたタンパク質は、最終糖化産物（ＡＧＥ）として知られている。ＡＧＥはさらに、ＲＡＧＥ受容体に強く結合し、ＲＡＧＥを媒介としたシグナル伝達を誘発する。ＡＧＥ−ＲＡＧＥシグナル伝達は、血管内皮細胞機能不全、創傷治癒遅延、および制御しにくい糖尿病に特徴的なアテローム性動脈硬化症の増悪の原因となる。眼では、ＡＧＥ−ＲＡＧＥシグナル伝達は、糖尿病性網膜症および失明をもたらす網膜微細血管の増殖を引き起こす。腎臓では、ＡＧＥ−ＲＡＧＥシグナル伝達は、初期腎肥大、次いで糖尿病性腎不全（糖尿病性腎症）を引き起こす繊維症の原因となる。ＡＧＥ−ＲＡＧＥシグナル伝達は、内皮のアポトーシスを同様に引き起こし、血管増殖を阻害し、皮膚の糖尿病性潰瘍の治癒を遅延させる。
【００４１】
部分的または完全硫酸化ヒアルロナンがＲＡＧＥを遮断する能力は、このヒアルロナンを炎症の治療薬として特に価値あるものにする。ＲＡＧＥは、増殖促進核タンパク質アンフォテリンすなわち高泳動度ボックスタンパク質−１（ＨＭＧＢ−１）を結合する受容体として子宮内で機能する。そこで、アンフォテリン−ＲＡＧＥ相互作用は神経系分化にとって重要な増殖シグナル伝達を誘発する。成熟した状態では、ＲＡＧＥは、血管壁細胞、神経組織、心筋細胞、単球およびマクロファージ、Ｔリンパ球、腎糸球体間質細胞、ならびに皮膚の繊維芽細胞、樹状細胞、および角化細胞で発現する。したがって、一態様では、本明細書に記載の部分的または完全硫酸化ヒアルロナンおよび組成物は、これらに限定されないが、癌、多発性硬化症、骨関節炎、嚢胞性繊維症、鎌状赤血球貧血、心血管の炎症性疾患、または心血管の炎症性疾患、または糖尿病合併症を含むＲＡＧＥ関連疾患に起因する多種多様な疾病により引き起こされる、被験対象の炎症を安全に低減または予防するために使用することができる。
【００４２】
他の態様では、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンおよび組成物は、負に荷電した実体として投与されて、カテリシジンに由来するカチオン性皮膚ペプチドに結合および阻害し、それによって皮膚疾患を治療または予防することもできる。例えば、活性カテリシジンペプチドの過剰皮膚発現から発症すると知られている、酒さ性座瘡として知られる皮膚状態を、本明細書に記載の部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを使用して治療または予防することができる。部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを使用して、治療または予防することができる皮膚疾患の例には、これらに限定されないが、酒さ、アトピー性皮膚炎（湿疹）、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、疱疹状皮膚炎、座瘡、糖尿病性皮膚潰瘍および他の糖尿病性損傷、熱傷（熱傷の疼痛を緩和することを含む）、日焼け（日焼けの疼痛を緩和することを含む）、形成外科後の瘢痕化の予防、光線性角化症、昆虫刺傷からの炎症、漆かぶれ、放射線誘発皮膚炎／熱傷、皮膚治癒の促進、ケロイド瘢痕化の予防および治療、光線性皮膚老化、または脂漏性皮膚炎の治療が含まれる。
【００４３】
部分的または完全硫酸化ヒアルロナンがＲＡＧＥ活性および他の生物学的機構を阻害する能力により、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンには、皮膚疾患の治療または予防に加えて数多くの治療用途がある。一態様では、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンは、歯および口腔外科で使用して、歯肉炎（歯周疾患）およびアフタ性潰瘍を治療することができる。他の態様では、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンは、例えば、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、眼球乾燥症候群および他の炎症性結膜炎、虹彩炎、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎の治療、白内障手術における抗炎症支援、または角膜の炎症および瘢痕化の予防など、眼科用途に使用することができる。一態様では、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンは、眼内または眼表面に直接投与することができる。
【００４４】
さらなる態様では、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンは、尿生殖器用途で使用することができる（例えば、尿路感染症の予防、膀胱および尿路上皮系の移行細胞癌の治療；間質性膀胱炎の治療；および性感染症の感染を予防するための膣滑沢剤／保護剤としての使用）。
【００４５】
別の態様では、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンは、嚢胞性繊維症、気管支拡張症、鼻炎（アレルギー性および通年性の両方）、静脈洞炎、肺気腫および慢性気管支炎（ＣＯＰＤ）、急性肺障害／成人呼吸促迫症候群、間質性肺線維症、ＳＡＲＳ、喘息、および呼吸器合胞体ウイルスを含む、いくつかの呼吸器疾患を治療するために使用することができる。他の態様では、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンは、いびきおよび閉塞性睡眠無呼吸の予防および治療、ＨＩＶ陽性または造血性悪性腫瘍に罹患する被験対象などの免疫抑制宿主における、よくみられる呼吸器系病原体（肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、インフルエンザ菌(Hemophilus influenzae)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎クラミジア(Chlamydial pneumonia)、グラム陰性腸管感染症）による感染の予防、または中耳炎の予防または治療に使用することができる。
【００４６】
部分的または完全硫酸化ヒアルロナンは、心血管用途（例えば、急性冠動脈症候群またはアテローム性動脈硬化症の治療および予防）；血液／腫瘍用途（例えば、鎌状赤血球貧血の予防および治療；転移性疾患の予防および治療；および悪性腫瘍の過剰凝血状態（トルソー症候群）の予防）；感染症の治療（例えば、熱帯熱マラリアにおける脳血管閉塞性症候群および腎炎、黄熱病、デング熱、全身性敗血症、ならびに標的細胞とウイルスとの融合および標的細胞の感染を予防するためのＨＩＶの補助療法）；胃腸疾患の治療（例えば、潰瘍性大腸炎、腸クローン病、痔疾、ならびに胃および食道のストレス潰瘍の予防）；リウマチ性および免疫学的疾患の治療（例えば、骨関節炎の予防および治療、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、血管神経性浮腫の予防および治療、シェーグレン症候群、全身性硬化症、全身性アミロイドーシス、ならびに全身性肥満細胞症）；腎疾患（例えば、糖尿病性腎症および糸球体腎炎の予防および治療）；ならびに神経疾患（例えば、多発性硬化症およびアルツハイマー型認知症）で使用することができる。
【００４７】
一態様では、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンは、泌尿器科的炎症の治療または予防に使用することができる。本明細書で使用される用語「泌尿器科的炎症」は、泌尿生殖器系の任意の部分または領域に関連した炎症として定義される。泌尿器科的炎症には、これらに限定されないが、膀胱、尿道、尿路上皮裏層、腎臓、前立腺、膣、子宮、またはそれらの任意の組合せの炎症が含まれる。この態様では、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンを、非経口的に、静脈内、筋肉内、または皮下のいずれかに注射して、泌尿器科の全身性炎症性疾患を治療または予防することができる。同様に、修飾されたヒアルロナンまたは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンは、カプセル剤、錠剤、チューインガム、ロゼンジ剤、散剤、または飲料で経口的に投与することもできる。あるいは、修飾されたヒアルロナンまたは部分的／完全硫酸化ヒアルロナンは、膀胱内設置により（すなわち、カテーテルを介して）投与することができる。
【００４８】
一態様では、本明細書に記載の部分的および完全硫酸化ヒアルロナンは、被験対象のＬＬ−３７の活性を阻害することができる。ＬＬ−３７は、ｈＣＡＰ１８前駆体タンパク質のＣ末端から生成する宿主防御ペプチドであり、循環好中球、粘膜上皮細胞、角化細胞、骨髄性骨髄細胞、皮膚上皮細胞、胃腸管、精巣上体腺、および肺において産生される。ＬＬ−３７は、ヒトおよびマウスの両種において尿路の上皮細胞（尿路上皮細胞）により産生され、腎臓および／または膀胱の感染症（腎盂腎炎または膀胱炎）の症状発現の間、尿レベルが顕著に高い。微生物を根絶する際のＬＬ−３７の役割に加えて、ＬＬ−３７は免疫調節性を有し、白血球走化性の促進、血管新生、肥満細胞脱顆粒反応の刺激、好中球機能の増強、ＩＬ−８を含むケモカインの誘導、ＮＦ−κＢによる炎症性応答の制御、および細胞外マトリックス成分の発現増加を介して炎症を誘発する。ＬＬ−３７の下流の炎症性作用機序の詳細は、完全には理解されていないが、応答には、いくつかの細胞表面受容体およびシグナル伝達経路の活性化が関与している。
【００４９】
高レベルのＬＬ−３７と泌尿器科的炎症の発症との間にある関連に基づいて、被験対象の泌尿器科的炎症を治療または予防する化合物の能力を選別するための方法が本明細書に記載される。一態様では、この方法は、
被験対象に炎症を誘発するＬＬ−３７量を実験動物に投与すること、
工程（ａ）の前および／または工程（ａ）の後に、化合物を動物に投与すること、および
ＬＬ−３７は同量投与されるが、化合物は投与されない対照動物と、この動物の炎症量を比較すること
を含む。
【００５０】
一態様では、マウスモデルを使用して、ＬＬ−３７を阻害し、したがって、泌尿器科的炎症を治療または予防する種々の化合物の能力を選別することができる。泌尿器科的炎症の治療および予防に有用な化合物を選別するための例示的な手順が実施例に提供される。
【００５１】
本明細書に記載の部分的または完全硫酸化ヒアルロナンおよび組成物は他の関連する治療より安全である。例えば、ヘパリンおよび他の硫酸化多糖は、動物および臨床の両試験において糖尿病合併症を低減することができ、糖尿病性腎症に対して特に有効である。しかしながら、ヘパリンは、その抗凝固特性により出血の過度の危険性が存在するので、一般臨床設定で使用して糖尿病合併症を予防することができない。本明細書に記載の部分的または完全硫酸化ヒアルロナンおよび組成物は、長期間治療にとっては重要な注意事項である抗凝固活性が低い。このことは以下の実施例において実証される。さらに、部分的または完全硫酸化ヒアルロナンおよび組成物は毒性がほとんどない。これも実施例において実証される。
【実施例】
【００５２】
以下の実施例は、本明細書に記載され、特許請求の範囲にある化合物、組成物、および方法の作製方法および評価方法についての完全な開示および説明を当業者に提供するために示すものであり、純粋に例示的であるように意図するものであって、発明者がその発明であると見なすものの範囲を限定するように意図するものではない。数（例えば、量、温度等）に対する正確さを保証するために努力をしているが、一部の誤りや逸脱は考慮されるべきである。他に指示がない限り、部は重量部であり、温度は℃または周囲温度であり、圧力は大気圧またはその近傍である。反応条件、例えば、成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、ならびに上記プロセスから得られる生成物の純度および収率を最適化するのに使用可能な他の反応範囲および条件の数多くの変形および組み合わせがある。このようなプロセス条件を最適化するには、合理的かつ日常的な実験のみが必要となる。
【００５３】
Ｉ．塩基処理ヒアルロナンからの硫酸化低分子量ヒアルロナン（ＬＭＷ−ＨＡ）の調製
ａ．塩基処理ＬＭＷ  ＨＡ
ＨＡ（２ｇ、６７ｋＤａ）を１００ｍＬのビーカー中のＮａＯＨ（４０％ｗ／ｖ）２０ｍＬに溶解し、その混合物を室温で２時間撹拌して、鎖切断を誘導することによりＨＡを部分的に解重合させた。得られた粘稠液を、イソプロパノール１００ｍＬを含む４００ｍＬのビーカーに移し、室温で２４時間撹拌した。得られた溶液を自然落下で濾過（濾紙）し、粗生成物を集め、蒸留水２５０ｍＬに溶解し、ｐＨを７．０に調整した。水浴を４回交換しながら２４時間、この溶液を蒸留水に対して透析し、次いで凍結乾燥して塩基処理ＨＡ１．２ｇを得た。この生成物のサイズは、ＨＰＬＣ＜ＧＰＣまたは電気泳動により決定することができ、通常５ｋＤａ〜２０ｋＤａの範囲に入る。
【００５４】
ｂ．ＬＭＷの部分的Ｏ−硫酸化塩基処理ＨＡ
ＬＭＷ  ＨＡのトリブチルアミン（ＴＢＡ）塩を得るために、ＴＢＡ０．２ｍＬを蒸留水２０ｍＬ中の塩基処理ＨＡ（０．２ｇ）に加えた。この混合物を激しく撹拌し、凍結乾燥した。得られた塩（ＬＭＷ  ＨＡ−ＴＢＡ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２０ｍＬに溶解し、それにピリジン−三酸化イオウ複合体（０．３２５ｇ）を必要な過剰量（６ｍｏｌ／ＨＡ中の総水酸基の当量、二糖当たり４）加えた。４０℃で３時間の後、水２０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール３０ｍＬを加えて、粗物質を沈殿させた。硫酸化粗生成物を濾過により集めて、蒸留水（３０ｍＬ）に溶解し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（溶液を６回交換）および水（水を２回交換）に対して２日間、１日に４回溶液を交換しながら透析し、凍結乾燥した。生成物の収率は６１％（０．２２ｇ）であった。１Ｈ  ＮＭＲにより、置換度は約０．５〜１であった。元素分析により、イオウ含量は４．１３％であった。平均分子量はＧＰＣにより６，１００であると測定され、多分散性は２．３であった。
【００５５】
ｃ．ＬＭＷの完全Ｏ−硫酸化塩基処理ＨＡ
ＨＡのトリブチルアミン（ＴＢＡ）塩を得るために、ＴＢＡ０．２ｍＬを蒸留水２０ｍＬ中の塩基処理ＨＡ（０．２ｇ）に加えた。この混合物を激しく撹拌し、凍結乾燥した。得られた塩（ＬＭＷ  ＨＡ−ＴＢＡ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２０ｍＬに溶解し、それにピリジン−三酸化イオウ複合体（１１．０ｇ）を必要な過剰量（１６ｍｏｌ／ＨＡ中の利用可能な水酸基の当量）加えた。４０℃で３時間の後、水２０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール３０ｍＬを加えて、粗生成物を沈殿させた。硫酸化生成物を濾過により集めて、蒸留水（３０ｍＬ）に溶解し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（溶液を６回交換）および水（水を２回交換）に対して２日間、１日に４回溶液を交換しながら透析して、凍結乾燥し、生成物０．２６ｇ（収率６０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲにより生成物を特徴づけしたところ、約３．５の近似置換度が得られた。元素分析により、イオウ含量は１３．２２％であった。平均分子量はＧＰＣにより５，９００であると測定され、多分散性は２．２であった。
【００５６】
ＩＩ．酸処理ヒアルロナンからの硫酸化低分子量ヒアルロナン（ＬＭＷ−ＨＡ）の調製
ａ．完全Ｏ−硫酸化低分子量ＨＡ（Ｆ−ＯＳＨＡ（１）−１０，０００）
ＨＡのトリブチルアミン（ＴＢＡ）塩を得るために、ＴＢＡ０．２ｍＬを、蒸留水２０ｍＬ中のＨＡ（０．２ｇ、約１０，０００Ｄａ、１．３ＭＤａのＨＡから分解されたもの）に加えた。この混合物を激しく混合し、凍結乾燥した。得られた塩（ＨＡ−ＴＢＡ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２０ｍＬに溶解し、それにピリジン−三酸化イオウ複合体（０．３２５ｇ）を必要な過剰量（６ｍｏｌ／ＨＡ中の利用可能な水酸基の当量）加えた。４０℃で３時間の後、水２０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール３０ｍＬを加えて、粗物質を沈殿させた。硫酸化生成物を濾過により集めて、蒸留水（３０ｍＬ）に溶解し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（溶液を６回交換）および水（水を２回交換）に対して２日間、１日に４回溶液を交換しながら透析して、凍結乾燥し、生成物０．１９ｇ（収率５８％）を得た。元素分析により、イオウ含量は１２．６２％であり、これは３．０〜３．５の硫酸化を示す。分子量は３，０００Ｄａ未満であり、これにより硫酸化および後処理の間の酸解重合が示唆された。
【００５７】
ｂ．完全Ｏ−硫酸化低分子量ＨＡ（Ｆ−ＯＳＨＡ（２）−１０，０００）
ＨＡのトリブチルアミン（ＴＢＡ）塩を得るために、ＴＢＡ０．２ｍＬを蒸留水２０ｍＬ中の酸修飾された１０，０００ＭＷ  ＨＡ（０．２ｇ）に加えた。この混合物を激しく混合し、凍結乾燥した。得られた塩（ＨＡ−ＴＢＡ）をＤＭＦ２０ｍＬに溶解し、それにピリジン−三酸化イオウ複合体（１．１ｇ）を必要な過剰量（１６ｍｏｌ／ＨＡ中の利用可能な水酸基の当量）加えた。４０℃で３時間の後、水２０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール３０ｍＬを加えて、粗物質を沈殿させた。硫酸化生成物を濾過により集めて、蒸留水（３０ｍＬ）に溶解し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（溶液を６回交換）および水（水を２回交換）に対して２日間、１日に４回溶液を交換しながら透析して、凍結乾燥し、生成物０．２３ｇ（収率６２％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲにより生成物を特徴づけしたところ、３．０〜３．５の置換度が得られた。元素分析により、イオウ含量は１２．１０％であった。分子量は３，０００Ｄａ未満であった。
【００５８】
ｃ．完全Ｏ−硫酸化低分子量ＨＡ(Kewpie Hyalo-Oligo-Pyr.SO3)
Kewpie Hyalo-Oligo ＨＡ（２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌｅ、８．４ｋＤａ）をＤＭＦ１０ｍＬに溶解した。ＴＢＡ（１当量  ０．５ｍｍｏｌｅ、０．１２ｍＬ）を撹拌しながら加え、さらに１０分間撹拌した。ピリジン−三酸化イオウ複合体（２４当量  １２ｍｍｏｌｅ、１．９１６ｇ）を必要な過剰量（６ｍｏｌ／ＨＡ中の利用可能な水酸基の当量）加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水１５ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール２５ｍＬを加えて、粗物質を沈殿させた。硫酸化生成物を濾過により集めて、蒸留水２５ｍＬに溶解し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（溶液を６回交換）および水（水を２回交換）に対して２日間、１日に４回溶液を交換しながら透析して、凍結乾燥し、生成物０．１７５ｇ（収率５１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲにより生成物を特徴づけしたところ、３．５を超える置換度が得られた。平均分子量はＧＰＣにより６，８００であると測定され、多分散性は１．８８であった。
【００５９】
ｄ．完全Ｏ−硫酸化低分子量ＨＡ(Novozymes-Pyr.SO3)
１１ｋＤａに分解されたNovozymes ＨＡ（２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌｅ)をＤＭＦ１０ｍＬに溶解した。ＴＢＡ（１当量  ０．５ｍｍｏｌｅ、０．１２ｍＬ）を撹拌しながら加え、混合物をさらに１０分間撹拌した。次いで、ピリジン−三酸化イオウ複合体（２４当量  １２ｍｍｏｌｅ、１．９１６ｇ）を必要な過剰量（６ｍｏｌ／ＨＡ中の利用可能な水酸基の当量）加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水１５ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール２５ｍＬを加えて、粗物質を沈殿させた。硫酸化生成物を濾過により集めて、蒸留水２５ｍＬに溶解し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（溶液を６回交換）および水（水を２回交換）に対して２日間、１日に４回溶液を交換しながら透析して、凍結乾燥し、生成物０．１９４ｇ（収率５７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲにより生成物を特徴づけしたところ、約３．０〜３．５の置換度が得られた。平均分子量はＧＰＣにより８，１００Ｄａであると測定され、多分散性は２．００であった。
【００６０】
ｅ．完全Ｏ−硫酸化低分子量ＨＡ(Novozymes-Pyr.SO3)
１１ｋＤａに分解されたNovozymes ＨＡ（４００ｍｇ、１．０ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ２５ｍＬに溶解した。ＴＢＡ（１当量  １．０ｍｍｏｌｅ、０．２４ｍＬ）を撹拌しながら加え、さらに１０分間撹拌した。ピリジン−三酸化イオウ複合体（１２当量  １２ｍｍｏｌｅ、１．９０８ｇ）を必要な過剰量（３ｍｏｌ／ＨＡ中の利用可能な水酸基の当量）加えた。４０℃で３時間撹拌した後、水３０ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール５０ｍＬを加えて、粗物質を沈殿させ、次いで濾過して集めた。得られた部分的Ｏ−硫酸化粗ＨＡを、蒸留水４０ｍＬに溶解し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（溶液を６回交換）および水（水を２回交換）に対して２日間、１日に４回溶液を交換しながら透析して、凍結乾燥し、生成物０．３８６ｇ（収率５６％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲにより生成物を特徴づけしたところ、２．０の置換度が得られた。平均分子量はＧＰＣにより９，５００Ｄａであると測定され、多分散性は１．７７であった。
【００６１】
ｅ．完全Ｏ−硫酸化低分子量ＨＡ(Novozymes-DMF.SO3)
１１ｋＤａに分解されたNovozymes ＨＡ（２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ１０ｍＬに溶解した。ＴＢＡ（１当量  ０．５ｍｍｏｌｅ、０．１２ｍＬ）を撹拌しながら加え、混合物をさらに１０分間撹拌した。ＤＭＦ−三酸化イオウ複合体（２４当量  １２ｍｍｏｌｅ、１．８３６ｇ）を必要な過剰量（６ｍｏｌ／ＨＡ中の利用可能な水酸基の当量）加えた。３０℃で３時間撹拌した後、水１５ｍＬを加えて反応を停止し、無水酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール２５ｍＬを加えて、粗物質を沈殿させ、次いで濾過して集めた。得られた完全Ｏ−硫酸化粗ＨＡを、蒸留水２５ｍＬに溶解し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（溶液を６回交換）および水（水を２回交換）に対して２日間、１日に４回溶液を交換しながら透析して、凍結乾燥し、生成物０．０５７ｇ（収率１７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲにより生成物を特徴づけしたところ、約３．０〜３．５の置換度が得られた。平均分子量はＧＰＣにより１，９００Ｄａであると測定され、多分散性は２．４８であった。
【００６２】
図３ａに、（Ａ）ＦＯＳ  ＨＡ（２）１０ｋＤａ、（Ｂ）ＦＯＳ  ＨＡ（１）１０ｋＤａ、（Ｃ）ＦＯＳ  ＢＨＡ、および（Ｄ）ＰＯＳ  ＢＨＡの天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析を示す。各試料１０μｇを、Novex（登録商標）Tris-Glycine１８％ゲル(Invitrogen, Carlsbad, CA)上で、天然条件下で１２５Ｖにて１．５時間泳動して分離した。図３ｂに、（Ｅ）ピリジン−三酸化イオウ複合体を使用して、Kewpie's Hyalo Oligo HAで製造されたＦＯＳ  ＨＡ、（Ｆ）ピリジン−三酸化イオウ複合体を使用して、Novozymes HAで製造されたＦＯＳ  ＨＡ、（Ｇ）ピリジン−三酸化イオウ複合体を使用して、Novozymes HAで製造されたＰＯＳ  ＨＡ、および（Ｈ）三酸化イオウＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド複合体から製造されたＦＯＳ  ＨＡ  １０ｋＤａの天然ＰＡＧＥ分析を示す。各試料１５μｇを、２０％アクリルアミドIDSmart Gel (Boca Scientific, Boca Raton, FL)上で、天然条件下で１２５Ｖにて７５分間泳動して分離した。ゲルを０．０８％のアズールＡ水溶液中で染色した。
【００６３】
ＩＩＩ．インビトロ試験
ａ．ヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）の阻害測定
白血球エラスターゼに対する硫酸化ＨＡの阻害効果を検討するために、７．５μｇ／ｍｌ  ＨＬＥ１００μｌを、０．００１〜１００μｇ／ｍＬの濃度範囲の硫酸化ＨＡ１００μｌと共にインキュベートした。この混合物にＨＬＥ基質suc-Ala-Ala-Val-pNA（１．５ｍＭ）を５０μｌ加えた後、２５℃で１０分間インキュベートした。活性なＨＬＥは基質を切断し、発色性のｐＮＡを生成する。ｐＮＡは、動力学的読み取りを使用して、４０５ｎｍの吸光度変化を測定することにより追跡した。Ｖｍａｘ（吸光速度）対硫酸化ＨＡ濃度に関し、４パラメーターのロジスティックス非線形回帰式を使用して、ＩＣ５０値を得た（表１）。
【００６４】
【表１】
2013529598.tif 000003
【００６５】
ｂ．ＣＭＬ−ＢＳＡ／ＲＡＧＥ複合体の阻害測定
ＣＭＬ−ＢＳＡとＲＡＧＥとの複合体の阻害測定は、ポリ塩化ビニルプレートを５μｇ／ｍｌ  ＣＭＬ−ＢＳＡ１００μｌでコーティングすることにより準備した。別に、ＰＢＳＴ−０．１％ＢＳＡ中の１μｇ／ｍｌＲＡＧＥ−Ｆｃキメラ溶液を、０．０００５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度範囲に連続希釈した硫酸化低分子量ヒアルロナンおよびＨＡオリゴ糖の等量と４℃で一晩インキュベートした。翌日、ＲＡＧＥ−硫酸化ＨＡ混合物５０μｌを各リガンドコーティングウェルにそれぞれ移し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した。結合したＲＡＧＥを検出するために、０．５μｇ／ｍｌ抗ＲＡＧＥ抗体５０μｌを各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、ウェルをＰＢＳＴでさらに４回洗浄した。ＨＲＰ結合二次抗体（ウェル当たり５０μｌ）を加え、ウェルを室温で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで４回洗浄した。比色定量反応をＴＭＢ１００μｌの添加により開始し、１Ｎ  ＨＣｌ５０μｌの添加で終了した。吸光度４５０ｎｍを硫酸化ＨＡ濃度に対してプロットし、４パラメーターのロジスティックス非線形回帰式を使用して、ＩＣ５０値を得た（表２）。
【００６６】
【表２】
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【００６７】
ｃ．ピリジニウム付加物の特徴づけ
ピリジン−三酸化イオウ複合体を使用して調製した硫酸化ＨＡ試料のピリジニウム含量を、ＵＶ吸収によって分析した。１−ブチルピリジニウムブロマイド(Sigma, St. Louis, MO)を使用して標準曲線を作成し、ＵＶ測定が標準曲線の範囲内に入る必要があるので、硫酸化ＨＡ試料を２〜０．０２５ｍｇ／ｍｌに希釈した。標準物質および試料に対して、石英セルにおける２５５ｎｍの吸光度を記録した。標準曲線から、各試料に対して重量パーセントピリジニウム値を計算し、表３に示す。FOSHA-Kewpie-Pyr.SO3のピリジニウム付加物はまた、１３Ｃ  ＮＭＲ分光法により特徴づけられ、公表データ(Hintze V, Moeller S, Schnabelrauch M, Beirbaum S, Viola M, Worch H, Scharnweber D. "Modifications of Hyaluronan Influence the Interaction with Human Bone Morphogenetic Protein-4 (hBMP-4)" Biomacromolecules 10:3290-3297, 2009)と比較された。１３Ｃ  ＮＭＲデータを表４に示す。最後に、図５に、FOSHA-Kewpie-Pyr.SO3の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。このスペクトルにはピリジニウム付加物のピリジニウムプロトンを表わす８．００ｐｐｍと９．１０ｐｐｍとの間の３つのピークが示される。
【００６８】
【表３】
2013529598.tif 000005
【００６９】
【表４】
2013529598.tif 000006
【００７０】
ＩＶ．インビボ試験
ａ．マウス膀胱炎症モデル
マウス膀胱は、ＬＬ−３７（カテリシジンペプチド）を含む種々の催炎物質に感受性があり、膀胱炎を含む炎症性疾患の潜在的な治療薬を試験するための優れた動物モデルとして寄与してきた。硫酸化ＨＡの抗炎症作用を検討するために、ＦＯＳＨＡ誘導体の保護効果をマウス膀胱炎モデルで測定した。最初に、Ｃ５７／ＢＬ６成熟雌マウスを麻酔し、尿道を通してカテーテルを膀胱に挿入した。０．９％滅菌生理食塩水を注入および排出して膀胱を洗浄した。次いで、膀胱に、生理食塩水、１０ｍｇ／ｍｌ  ＦＯＳＨＡ(Kewpie)、または１０ｍｇ／ｍｌ  ＦＯＳＨＡ(Novozymes)のいずれかを１５０μＬ、１時間、前注入した。膀胱を空にしてから、３２０μＭ  ＬＬ−３７を１５０μＬさらに１時間注入した。動物はすべて、合併症を伴わずに完全に回復した。手順完了の２４時間後に、膀胱を取り出し、撮影し、ＭＰＯ分析のために凍結した。
【００７１】
ｂ．ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の測定
催炎物質に対する主要な細胞応答は、種々の免疫細胞を標的部位に動員する、損傷細胞からの種々のサイトカインの分泌である。ＭＰＯは多核白血球において大量に発現されるペルオキシダーゼ酵素であるが、多核白血球が炎症の初期段階に炎症部位に動員される主たる細胞であるため、ＭＰＯは炎症の程度を定量的に測定する優れたマーカーになる。マウス膀胱炎モデルにおける完全硫酸化ＨＡの抗炎症作用を分析するために、硫酸化ＨＡで前処置された膀胱における、ＭＰＯの発現量を測定し、未処置膀胱および生理食塩水対照における、ＭＰＯの発現量と比較した。膀胱を秤量し、ホモジナイズした。ホモジナイズした試料を５，０００ｒｐｍで遠心分離して、組織デブリから可溶性画分を分離し、組織ホモジネート中のＭＰＯ濃度（ｎｇ／ｍｇ組織）を、マウスＭＰＯ  ＥＬＩＳＡキット(HK210, Hycult biotech, The Netherlands)を使用して測定し、生理食塩水注入対照（炎症のない正常な膀胱）とのパーセント差として表現した。結果を図２に示す。
【００７２】
硫酸化ＨＡの前処置が、注入されたＬＬ−３７により誘導される組織ＭＰＯ濃度を低減するか否かを決定するために、GraphPad InStatソフトウェア(Version 3.1, GraphPad Software, Inc.)を用い、一元配置分散分析とそれに続くTukey-Kramer多重比較検定を使用して、統計分析を実施した。統計的有意性をｐ＜０．０に設定した。
【００７３】
ｃ．結論
インビトロ試験の結果から、ＲＡＧＥアンタゴニスト活性に関して硫酸化度の重要性が実証される（表２）。部分的硫酸化（６％未満のイオウ）では、かなり弱い効力のＲＡＧＥアンタゴニストが生じる。ＭＷが２，０００Ｄａ未満の硫酸化ＨＡ化合物も、インビトロ測定で効力の低下を示した。１％ｗ／ｗを上回るピリジニウム付加物を有するものを含む完全硫酸化ＨＡ化合物は、マウス膀胱炎症モデルにおける炎症を低減する良好なインビボ効果を示した。
【００７４】
本出願全体を通して、種々の出版物が参照される。本明細書に記載の化合物、組成物、および方法をより完全に説明するために、これらの出版物の開示内容全体を、参照によって本明細書に組み込むものとする。
【００７５】
種々の修飾および変形が、本明細書に記載の化合物、組成物、および方法に対してなされ得る。本明細書に記載の化合物、組成物、および方法の他の態様は、本明細書の考察ならびに本明細書に開示の化合物、組成物、および方法の実施によって明らかになろう。本明細書および実施例は例示的なものと考えるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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