(57)【要約】  本発明は、ヘプシン抗体、及びこれら抗体を含む組成物とこれら抗体を使用する方法を提供する。
2013507966.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗ヘプシン抗体であって、抗体の一価形態が１０ｎＭ以下又はそれより良い親和性でヒトヘプシンに結合し、抗体の一価形態が３３０ｎＭ以下の親和性でマウスヘプシンに結合し、ヘプシンとヒトヘプシンＳ１サブサイトに結合するセリンプロテアーゼ阻害剤を含む複合体として存在しているヘプシンに結合する抗体。
【請求項２】
セリンプロテアーゼ阻害剤が３，４−ジクロロ−イソクマリン（ＤＣＩ）である請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ヘプシンのＫｕｎｉｔｚドメイン結合領域に結合する請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ヘプシンサブサイト２及び／又はヘプシンサブサイト３への基質結合を遮断する請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）のヘプシン媒介活性化を阻害する請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
ラミニン依存性細胞遊走を阻害する請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
（ａ）配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＡＶＡ（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｂ）配列ＳＡＳＳＬＹＳ（配列番号２）を含むＨＶＲ−Ｌ２；
（ｃ）配列ＱＱＹＹＳＳＹＹＬＬＴ（配列番号３）を含むＨＶＲ−Ｌ３；
（ｄ）配列ＧＦＮＦＳＹＳＹＭＨ（配列番号４）を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｅ）配列ＡＳＩＹＳＹＹＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び
（ｆ）配列ＡＲＳＤＳＷＳＹＫＳＧＹＴＱＫＩＹＳＫＧＬＤＹ（配列番号６）を含むＨＶＲ−Ｈ３
からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５及び／又は６の高頻度可変領域（ＨＶＲ）を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
（ａ）配列ＡＲＳＤＳＷＳＹＫＳＧＹＴＱＫＩＹＳＫＧＬＤＹ（配列番号６）を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｂ）配列ＱＱＹＹＳＳＹＹＬＬＴ（配列番号３）を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び配列ＡＳＩＹＳＹＹＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
（ａ）配列ＧＦＮＦＳＹＳＹＭＨ（配列番号４）を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列ＡＳＩＹＳＹＹＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列ＡＲＳＤＳＷＳＹＫＳＧＹＴＱＫＩＹＳＫＧＬＤＹ（配列番号６）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
（ａ）配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＡＶＡ（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列ＳＡＳＳＬＹＳ（配列番号２）を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列ＱＱＹＹＳＳＹＹＬＬＴ（配列番号３）を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
（ａ）配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＡＶＡ（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列ＳＡＳＳＬＹＳ（配列番号２）を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列ＱＱＹＹＳＳＹＹＬＬＴ（配列番号３）を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む請求項７に記載の抗体。
【請求項１２】
図３、４、５、又は６に示された重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインフレームワークを更に含む請求項９又は１１に記載の抗体。
【請求項１３】
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するか；又は配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；又は（ｃ）（ａ）におけるＶＨ配列及び（ｂ）におけるＶＬ配列を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
配列番号１０のＶＨ配列を含む請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
配列番号９のＶＬ配列を含む請求項１３に記載の抗体。
【請求項１６】
配列番号１０のＶＨ配列と配列番号９のＶＬ配列を含む請求項１３に記載の抗体。
【請求項１７】
完全長ＩｇＧ１抗体である請求項１から１６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
ヒトκサブグループコンセンサスフレームワーク配列を含む請求項１から１７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
重鎖ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークを含む請求項１から１８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
請求項１から１９の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の宿主細胞を抗体が産生されるように培養することを含む抗体の作製方法。
【請求項２３】
宿主細胞培養物から抗体を回収することを更に含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の抗体と細胞傷害剤とを含む免疫コンジュゲート。
【請求項２５】
請求項１に記載の抗体と薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的製剤。
【請求項２６】
更なる治療剤を更に含有する請求項２５に記載の薬学的製剤。
【請求項２７】
医薬として使用される請求項１に記載の抗体。
【請求項２８】
癌の治療に使用される請求項１に記載の抗体。
【請求項２９】
免疫疾患の治療に使用される請求項１に記載の抗体。
【請求項３０】
細胞遊走の阻害に使用される請求項１に記載の抗体。
【請求項３１】
ヘプシン酵素活性の阻害に使用される請求項１に記載の抗体。
【請求項３２】
医薬の製造における請求項１に記載の抗体の使用。
【請求項３３】
医薬が癌の治療のためのものである請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
医薬が免疫疾患の治療のためのものである請求項３２に記載の使用。
【請求項３５】
医薬が細胞遊走の阻害又はヘプシン酵素活性の阻害のためのものである請求項３２に記載の使用。
【請求項３６】
（ａ）セリンプロテアーゼ；及び（ｂ）Ｓ１サブサイトに結合するセリンプロテアーゼ阻害剤を含む複合体として存在するセリンプロテアーゼに結合する抗体を選択することを含む、抗セリンプロテアーゼ抗体を作製する方法。
【請求項３７】
セリンプロテアーゼがヘプシンである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
セリンプロテアーゼ阻害剤が３，４−ジクロロ−イソクマリンである請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
セリンプロテアーゼ阻害剤がヘプシン触媒アミノ酸残基Ｓｅｒ１９５及びＨｉｓ５７に結合し、それによってヘプシンが不活化される請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
抗体の選択前に、抗体をセリンプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼ阻害剤と主にインキュベートされる請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
Ｋｕｎｉｔｚドメインとヘプシン結合について競合する抗体を選択することを更に含む請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
ＫｕｎｉｔｚドメインがＫＤ１である請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願とのクロスリファレンス
この出願は、その内容が出典明示によりここに援用される２００９年１０月２２日出願の米国仮出願第６１／２５３９５３号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、抗ヘプシン抗体及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヘプシンは、上皮細胞の表面に発現されるＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）である。４１７アミノ酸タンパク質は、短いＮ末端細胞質ドメインと、膜貫通ドメインと、Ｃ末端プロテアーゼドメインに対して強く充填されている単一のスカベンジャーレセプターシステインリッチドメインから構成される（Somoza等(2003) Structure 11(9), 1123-1131）。ヘプシンの生理学的機能はよく分かっていない。胚形成の非常に初期の段階に発現するにも関わらず（Vu等(1997) J Biol Chem 272 (50), 31315-31320）、ヘプシン欠乏マウスは生存可能で、正常に発達した（Yu等(2000) Thromb Haemost 84(5), 865-870；Wu等(1998) J Clin Invest 101(2), 321-326）。ヘプシンは肝臓再生及び凝固関連の生理学的機能に必須ではないことが判明した（同上）。最近の研究では、ヘプシンノックアウトマウスが聴力を損なったことが証明された。Guipponi等(2007) Am J Pathol 171:608-616。しかしながら、ヘプシンは、卵巣癌［（Tanimoto等(1997) Cancer Res 57(14), 2884-2887）；国際公開第２００１／６２２７１号］及び前立腺癌に関連付けられている。数件の遺伝子発現に関する研究により、ヘプシンは、前立腺癌において最も高いレベルで誘導される遺伝子の一つであると特定された（Dhanasekaran等(2001) Nature 412, 822-826; Luo等(2001) Cancer Res 61(12), 4683-4688；Magee等(2001) Cancer Res 61(15), 5692-5696；Stamey等(2001) J Urol 166(6), 2171-2177；Stephan等(2004) J Urol 171(1), 187-191；Welsh等(20010) Cancer Res 61(16), 5974-5978）。ヘプシンのＲＮＡレベルは正常な前立腺及び良性の過形成では低いが、前立腺癌の、特に進行段階で強く増大することが判明した（Dhanasekaran等(2001) Nature 412, 822-826；Luo等(2001) Cancer Res 61(12), 4683-4688；Magee等(2001) Cancer Res 61(15), 5692-5696；Stamey等(2001) J Urol 166(6), 2171-2177；Stephan等(2004) J Urol 171(1), 187-191；Welsh等(20010) Cancer Res 61(16), 5974-5978）。モノクローナル抗ヘプシン抗体によるヘプシンタンパク質の染色により、ヘプシンの発現レベルが骨転移部位及び後期の原発腫瘍において高いことが示されており（Xuan等(2006) Cancer Res 66(7), 3611-3619）、これは、増加したヘプシンＲＮＡレベルが、高いグリーソン段階及び腫瘍の進行と相関しているという知見と一致している（Luo等(2001) Cancer Res 61(12), 4683-4688；Magee等(2001) Cancer Res 61(15), 5692-5696；Stamey等(2001) J Urol 166(6), 2171-2177；Stephan等(2004) J Urol 171(1), 187-191；Chen等(2003) J Urol 169(4), 1316-1319）。
【０００４】
前立腺癌におけるヘプシンの役割の実験上の証拠は、非転移性前立腺癌のマウスモデルにおいて、ヘプシンの過剰発現が原発腫瘍の進行と転移を生じることを証明しているKlezovitch等による最近の研究から得られた（Klezovitch等(2004) Cancer Cell 6(2), 185-195）。興味深いことに、ヘプシンの過剰発現は基底膜の破壊と関連しており（同文献）、これはヘプシンの活性が基底膜の成分の劣化と何らかのつながりを有している可能性を示唆するものである。インビトロでは、ヘプシンは、不顕性の増殖因子であるプロ肝細胞増殖因子（プロ−ＨＧＦ）をその活性な二本鎖型（ＨＧＦ）に転換することができ、これによりＭｅｔレセプターシグナル伝達が誘導される（Herter等(2005) Biochem J 390 (Pt 1), 125-136；Kirchhofer等(2005) FEBS Lett 579(9), 1945-1950；国際公開第２００６／０１４９２８号）。ヘプシンはまたプロ−ｕＰＡをその活性型に転換し（Moran等, (2006) J Biol Chem. 281(41):30439-46）、インビトロでラミン切断することがまたできる（Tripathi等(2008) J Biol Chem. 283:30576）。ＨＧＦ／Ｍｅｔ経路は浸潤性の腫瘍の増殖及び転移に関連付けられているので、ヘプシンの過剰発現が前立腺癌におけるＨＧＦ／Ｍｅｔ軸を活性化している可能性がある（Herter等(2005) Biochem J 390 (Pt 1), 125-136；Kirchhofer等(2005) FEBS Lett 579(9), 1945-1950；国際公開第２００６／０１４９２８号）。ヘプシンはまた、インビトロで他の基質、主に凝固関連タンパク質を切断することが示されている（同上のHerter等；Kazama等(1995) J Biol Chem 270(1), 66-72）。しかしながら、腫瘍形成におけるその役割は知られていない。
【０００５】
治療剤としての開発に対して最適である臨床的特質を有している薬剤の必要性が継続して存在していることは明らかである。ここに開示される発明はこの必要性を満たし、他の利点をもたらす。
【０００６】
特許出願及び刊行物を含む、ここで引用する全ての文献は、出典明示によりその全体を援用する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は部分的には様々なヘプシン結合剤（例えば抗体、及びその断片）の同定に基づく。ヘプシンは重要で有利な治療標的を提示し、本発明はヘプシンへの薬剤の結合に基づく組成物及び方法を提供する。ここに記載されるヘプシン結合剤は、発現及び／又はヘプシンシグナル伝達経路の活性に関連した病理症状を標的として使用される重要な治療及び診断薬剤を提供する。従って、本発明はヘプシン結合に関連した方法、組成物、キット、及び製造品を提供する。
【０００８】
例えばヘプシンのようなトリプシン様セリンプロテアーゼの活性部位は、幾つかの本来的に移動性のループによって形成される（「活性化ドメイン」）（Huber及びBode, 1978）。特に、２２０-ループがＳ１ポケットの一部を形成し、幾つかのセリンプロテアーゼにおいて様々な高次構造状態を採用しうる（Johnson等, 2005；Shia等, 2005；Spraggon等, 2009；Wilken等, 2004）。しかしながら、活性部位阻害剤とのセリンプロテアーゼの共結晶構造は、多分阻害剤によって加えられる安定化力のために適切に形成された活性部位を示した（Arni等, 1994；Shia等, 2005；Spraggon等, 2009）。セリンプロテアーゼ阻害剤によるＳ１ポケットの占有がセリンプロテアーゼ活性部位ループ柔軟性に安定化力を適用し、セリンプロテアーゼ活性部位の抗体認識を容易にする。よって、ヘプシン酵素活性を遮断する抗ヘプシン抗体を同定するために、Ｓ１ポケットを占有するセリンプロテアーゼ阻害剤、つまり３，４−ジクロロ−イソクマリン（ＤＣＩ）と複合化してヘプシンに結合する抗体を得た。
【０００９】
本発明は、ヘプシンに結合する抗体を提供する。一態様では、本発明はヘプシンに結合する単離された抗体を特徴とする。
【００１０】
一態様では、本発明は、抗体の一価形態（例えばＦａｂ型）が約１０ｎＭ又はそれより良い結合親和性でヒトヘプシンに特異的に結合する単離された抗ヘプシン抗体を提供する。幾つかの実施態様では、抗体は約６ｎＭ又はそれより良い結合親和性でヒトヘプシンに特異的に結合する。当該技術分野で十分に確立されているように、リガンドのそのレセプターに対する結合親和性は、様々なアッセイの何れかを使用して決定し、様々な定量値によって表すことができる。従って、一実施態様では、結合親和性はKd値として表され、固有の結合親和性（例えば最小のアビディティー効果を伴う）を反映する。一般に、好ましくは、無細胞設定であろうと細胞付随設定であろうと、インビトロで測定される。例えばビアコア、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及びＥＬＩＳＡを含む、ここに記載されたものを含む当該技術分野で知られた多くのアッセイの何れかを使用して、結合親和性測定値を得ることができる。
【００１１】
他の態様では、本発明はヘプシンのＫｕｎｉｔｚドメイン結合領域に結合する抗ヘプシン抗体を提供する。一態様では、本発明はヘプシンへの結合に対してＫｕｎｉｔｚドメインと競合する単離された抗ヘプシン抗体を提供する。一実施態様では、上記Ｋｕｎｉｔｚドメイン配列はＨＡＩ−１又はＨＡＩ−１ＢのＫｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）である。一実施態様では、Ｋｕｎｉｔｚドメイン配列は、ヒトＨＡＩ−１の野生型ＫＤ１と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する変異体ＫＤ１配列であり、ここで、該変異体配列はヘプシン活性の阻害において野生型ＫＤ１と少なくとも匹敵する能力を有している。一実施態様では、上記Ｋｕｎｉｔｚドメイン配列はＨＡＩ−２のＫｕｎｉｔｚドメインの一又は両方である。一実施態様では、変異体ＨＡＩ−２Ｋｕｎｉｔｚドメイン配列は、野生型ヒトＨＡＩ−２の対応するＫｕｎｉｔｚドメインと約７０％から９９％、約７５％から９８％、約８０％から９７％、８５％から９５％の配列同一性を有しており、ここで、該配列はヘプシン活性の阻害において野生型ＨＡＩ−２と少なくとも匹敵する能力を有している。
【００１２】
一態様では、本発明はヘプシン触媒部位に結合する抗ヘプシン抗体を提供する。
一態様では、本発明はｓ１サブサイトの外側でヘプシンに結合する抗ヘプシン抗体を提供する。ある実施態様では、抗体はヘプシンｓ２及び／又はｓ３サブサイトに結合する。
【００１３】
一態様では、本発明は触媒的に不活化されたヘプシンに結合する抗ヘプシン抗体を提供する。
一態様では、本発明はヘプシンタンパク質分解に耐性である抗ヘプシン抗体を提供する。ある実施態様では、抗体はヘプシン基質のヘプシン切断を可能にする条件下で２４時間ヘプシンに曝露される。
【００１４】
一態様では、本発明は、ヘプシンＳ１サブサイトに結合するセリンプロテアーゼ阻害剤を含む複合体中に存在するヘプシンに結合する抗ヘプシン抗体を提供する。ある実施態様では、複合体中に存在するヘプシンは不活化される。ある実施態様は、セリンプロテアーゼ阻害剤は３，４−ジクロロ−イソクマリン（ＤＣＩ）である。ある実施態様では、セリンプロテアーゼ阻害剤はヘプシン触媒性アミノ酸残基Ｓｅｒ１９５及びＨｉｓ５７に結合し、それによってヘプシンが不活化される。
【００１５】
一態様では、本発明は、ヒトヘプシンに特異的に結合し、実質的にインビボ及び／又はインビトロヘプシン酵素活性を阻害する抗ヘプシン抗体を提供する。一実施態様では、酵素活性はヘプシンのポリペプチド基質の切断を含む。一実施態様では、ヘプシンのポリペプチド基質は、プロ−マクロファージ刺激タンパク質（プロ−ＭＳＰ）、プロ−ｕＰＡ、因子ＶＩＩ及びプロ−ＨＧＦの一又は複数である。プロ−ＭＳＰのヘプシン活性化は、２００９年１０月２２日に出願した同時係属で、本出願人の米国仮特許出願第６１／２５３９９０号に記載されている。一実施態様では、酵素活性はヘプシンの合成基質の切断を含む。ある実施態様では、ヘプシン合成基質は表１に示された基質である。
【００１６】
一態様では、本発明は、ヒト及び／又はマウスのヘプシン触媒活性を実質的に阻害する抗ヘプシン抗体を提供する。ある実施態様では、抗ヘプシン抗体の一価型は、約４ｎＭ（ある実施態様では、それ以下）のＫｉでヒトヘプシン触媒活性を阻害する。ある実施態様では、抗ヘプシン抗体の一価型は、約３３０ｎＭ（ある実施態様では、それ以下）のＫｉでマウスヘプシン触媒活性を阻害する。
【００１７】
一態様では、本発明は、プロ−ｕＰＡのヘプシン切断を実質的に阻害する抗ヘプシン抗体を提供する。ある実施態様では、抗ヘプシン抗体は、約３ｎＭ又はより強いＩＣ５０でプロ−ｕＰＡのヘプシン切断を阻害する。
一態様では、本発明は、ラミニン依存性細胞遊走を実質的に阻害する抗ヘプシン抗体を提供する。
【００１８】
一態様では、本発明は抗ヘプシン抗体を提供し、ここで、該抗体は、（ａ）ヘプシンと（ｂ）ヘプシンＳ１サブサイトに結合するセリンプロテアーゼ阻害剤を含む複合体に結合する抗体を選択することを含む方法によって産生された。ある実施態様では、複合体中に存在するヘプシンは不活化されている。ある実施態様では、セリンプロテアーゼ阻害剤は３，４−ジクロロ−イソクマリン（ＤＣＩ）である。ある実施態様では、セリンプロテアーゼ阻害剤はヘプシン触媒性アミノ酸残基Ｓｅｒ１９５及びＨｉｓ５７に結合し、よってヘプシンが不活化される。ある実施態様では、抗体の選択の前に、抗体がヘプシン及びセリンプロテアーゼ阻害剤と共にインキュベートされる。ある実施態様では、該方法はＫｕｎｉｔｚドメインとヘプシン結合について競合する抗体を選択する工程を更に含む。ある実施態様では、ＫｕｎｉｔｚドメインはＫＤ１である。
【００１９】
一態様では、本発明は抗ヘプシン抗体を提供し、ここで、該抗体は、ヘプシン結合についてＫｕｎｉｔｚドメインと競合する抗体を選択する（同定する）ことを含む方法によって産生された。ある実施態様では、ＫｕｎｉｔｚドメインはＫＤ１である。
【００２０】
一態様では、本発明はヘプシンによって実質的に切断されない抗ヘプシン抗体を提供する。ある実施態様では、抗ヘプシン抗体はヘプシン切断に対して実質的に耐性である。
【００２１】
一般に、本発明の抗ヘプシン抗体はアンタゴニスト抗体である。
【００２２】
一態様では、本発明は、
（ａ）配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＡＶＡ（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｂ）配列ＳＡＳＳＬＹＳ（配列番号２）を含むＨＶＲ−Ｌ２；
（ｃ）配列ＱＱＹＹＳＳＹＹＬＬＴ（配列番号３）を含むＨＶＲ−Ｌ３；
（ｄ）配列ＧＦＮＦＳＹＳＹＭＨ（配列番号４）を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｅ）配列ＡＳＩＹＳＹＹＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び
（ｆ）配列ＡＲＳＤＳＷＳＹＫＳＧＹＴＱＫＩＹＳＫＧＬＤＹ（配列番号６）を含むＨＶＲ−Ｈ３
からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５及び／又は６の高頻度可変領域（ＨＶＲ）を含む抗ヘプシン抗体を提供する。
【００２３】
一態様では、本発明は、（ｉ）配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＡＶＡ（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列ＳＡＳＳＬＹＳ（配列番号２）を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＱＱＹＹＳＳＹＹＬＬＴ（配列番号３）を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖；及び／又は（ｂ）（ｉ）配列ＧＦＮＦＳＹＳＹＭＨ（配列番号４）を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列ＡＳＩＹＳＹＹＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＳＤＳＷＳＹＫＳＧＹＴＱＫＩＹＳＫＧＬＤＹ（配列番号６）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖を含む抗ヘプシン抗体を提供する。
【００２４】
一態様では、本発明は配列番号１の配列を含むＨＶＲ−Ｌ１を含む抗ヘプシン抗体 を提供する。一態様では、本発明は配列番号２の配列を含むＨＶＲ−Ｌ２を含む抗ヘプシン抗体 を提供する。一態様では、本発明は配列番号３の配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗ヘプシン抗体 を提供する。一態様では、本発明は配列番号４の配列を含むＨＶＲ−Ｈ１を含む抗ヘプシン抗体を提供する。一態様では、本発明は配列番号５の配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む抗ヘプシン抗体を提供する。一態様では、本発明は配列番号６の配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む抗ヘプシン抗体を提供する。
【００２５】
一態様では、抗ヘプシン抗体は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域で、それぞれが順に、配列ＲＡＳＱＤＶＮ／ＳＴＡＶＡ（配列番号７）、配列番号２、３を含むもの、及び／又はＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域で、それぞれが順に配列番号４、５、６を含むものを含む。
【００２６】
一態様では、抗ヘプシン抗体は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域で、それぞれが順に、配列ＲＡＳＱＤＶＮ／ＳＴＡＶＡ（配列番号７）、配列番号１、配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号８）、配列番号３を含むもの、及び／又はＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域で、それぞれが順に配列番号４、５、６を含むものを含む。
【００２７】
一態様では、抗ヘプシン抗体は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域で、それぞれが順に、配列番号７、８、３を含むもの、及び／又はＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域で、それぞれが順に配列番号４、５、６を含むものを含む。
【００２８】
配列番号：１−６のアミノ酸配列は図１に示すように個々のＨＶＲ(すなわち、Ｈ１、Ｈ２又はＨ３)について番号付けされたもので、該番号付けは以下に記載のカバット番号付けシステムと一致する。
【００２９】
本発明の抗体は、ヘプシンに対する結合活性が実質的に保持されていると仮定して、任意の適切なフレームワーク可変ドメイン配列を含みうる。例えば、幾つかの実施態様では、本発明の抗体は、ヒトサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体の幾つかの実施態様では、位置７１はＡであり、７３はＴであり、及び／又は７８はＡである。一実施態様では、これらの抗体はｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ハーセプチン(登録商標), Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA）（米国特許第６４０７２１３号及び第５８２１３３７号、及びLee等, J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-1093においても言及）の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む。一実施態様では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。幾つかの実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は６６位に置換を含む。幾つかの実施態様では、６６位はＧである。特定の実施態様では、これらの抗体は米国特許第６４０７２１３号及び第５８２１３３７号に記載されたｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の軽鎖ＨＶＲ配列を含む。一実施態様では、これらの抗体はｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ハーセプチン(登録商標), Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA）（米国特許第６４０７２１３号及び第５８２１３３７号、及びLee等, J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-1093においても言及）の軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００３０】
一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインを含み、ここでフレームワーク配列は図２Ａ−Ｂに開示された配列を含み、ＨＶＲ Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号４、５、及び／又は６である。
【００３１】
一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインを含み、ここでフレームワーク配列は配列番号１４−１５、４８、及び／又は１６の配列を含み、ＨＶＲ Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号４、５、及び／又は６である。他の実施態様では、フレームワーク配列は配列番号１４−１５、４３、及び／又は１６の配列を含み、ＨＶＲ Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号４、５、及び／又は６である。
【００３２】
特定の実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、ここで、フレームワーク配列はそれぞれ配列番号１７−２０；４９−５１及び２０；５２−５４及び２０；及び／又は５５−５７及び２０の配列を含み、ＨＶＲ Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３配列はそれぞれ配列番号１、２、及び／又は３である。他の実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、ここで、フレームワーク配列は配列番号１７−１８、５８及び／又は２０の配列を含み、ＨＶＲ Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３配列はそれぞれ配列番号１、２、及び／又は３である。他の実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、ここで、フレームワーク配列は、配列番号１７、１８、１９及び／又は２０の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３配列はそれぞれ配列番号１、２、及び／又は３である。
【００３３】
一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインを含み、ここで、フレームワーク配列は配列番号１４−１５、４３及び／又は１６の配列を含み、ＨＶＲ Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号４、５、及び／又は６であり、また軽鎖可変ドメインを含み、ここで、フレームワーク配列は配列番号１７−１８、５８及び／又は２０の配列を含み、ＨＶＲ Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３配列はそれぞれ配列番号１、２、及び／又は３である。
【００３４】
他の態様では、本発明の抗体は、配列番号１０の配列を含む重鎖可変ドメイン及び／又は配列番号９の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
他の態様では、本発明の抗体は、配列番号１０の配列を含む重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインを含む。
他の態様では、本発明の抗体は、配列番号9の配列を含む軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインを含む。
【００３５】
本発明の抗体の幾つかの実施態様は、以下に配列番号１１で示したようなヒト化4D5抗体（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８）（ハーセプチン(登録商標), Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA）（米国特許第６４０７２１３号及びLee等, J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-1093においても言及）の軽鎖可変ドメインを含む。
2013507966.tif 000003
【００３６】
一実施態様では、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８軽鎖可変ドメイン配列は位置３０、６６及び９１（それぞれ上の太字／イタリックで示したＡｓｎ、Ａｒｇ及びＨｉｓ）の一又は複数で修飾される。一実施態様では、修飾されたｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８配列は３０位にＳｅｒ、６６位にＧｌｙ及び／又は９１位にＳｅｒを含む。従って、一実施態様では、本発明の抗体は以下の配列番号４５に示した配列を含む軽鎖可変ドメインを含む：
2013507966.tif 000004
【００３７】
一態様では、本発明は、ヘプシンへの結合に対して上述の抗体の何れかと競合する抗ヘプシン抗体を提供する。一態様では、本発明は上述の抗体の何れかと同じか又は類似のヘプシン上のエピトープに結合する抗ヘプシン抗体を提供する。
【００３８】
当該技術分野で知られているように、また、以下により詳細に記載するように、抗体の高頻度可変領域を示すアミノ酸位置／境界域は、(以下に記載のように)当該技術分野で知られている様々な定義及び状況によって変わりうる。可変ドメイン内のある位置は、ある基準セットの下で高頻度可変領域内と判断されうるが、異なる基準セットの下では高頻度可変領域外であると判断されうる点でハイブリッド高頻度可変位置とみなされうる。これらの位置の一又は複数は、拡張された高頻度可変領域にまた見出されうる(更に以下に定義する)。
【００３９】
幾つかの実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。幾つかの実施態様では、抗体はポリクローナル抗体である。幾つかの実施態様では、抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択される。ある実施態様では、抗体は抗体断片である。幾つかの実施態様では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆ(ａｂ')２又はｓｃＦｖである。
【００４０】
一実施態様では、抗体はキメラ抗体、例えば、異種性の非ヒト、ヒト、又はヒト化配列（例えば、フレームワーク及び／又は定常ドメイン配列）に移植した非ヒトドナーからの抗原結合配列を含む抗体である。一実施態様では、非ヒトドナーはマウスである。更なる実施態様では、抗原結合配列は合成のもの、例えば突然変異誘発（例えばファージディスプレイスクリーニングなど）によって、得られるものである。特定の実施態様では、本発明のキメラ抗体は、マウスＶ領域とヒトＣ領域を有する。一実施態様では、マウス軽鎖Ｖ領域は、ヒトカッパ軽鎖に融合する。他の実施態様では、マウス重鎖Ｖ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｃ領域に融合する。
【００４１】
本発明のヒト化抗体は、フレームワーク領域（ＦＲ）内にアミノ酸置換を有するものと移入されたＣＤＲ内に変化を有する親和性成熟変異体を含む。ＣＤＲ又はＦＲ内の置換されたアミノ酸は、ドナー又はレシピエント抗体に存在するものには限定されない。他の実施態様では、本発明の抗体は、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ機能及びＢ細胞死滅化の亢進を含む、エフェクター機能の改善を生じるＦｃ領域内のアミノ酸残基に変化を更に含む。本発明の他の抗体は、安定性を改善する特定の変化を有するものを含む。他の実施態様では、本発明の抗体は、エフェクター機能の低減、例えばＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ機能の低減及び／又はＢ細胞死滅化の低減を生じるＦｃ領域内のアミノ酸残基に変化を含む。幾つかの実施態様では、本発明の抗体は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上のヒトＦｃレセプター及び／又はヒト補体因子Ｃ１ｑへの結合の減少（例えば結合の欠如）を特徴とする。幾つかの実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の減少（例えば結合の欠如）を特徴とする。幾つかの実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧクラスのもの（例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４）であり、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｇ２３６、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ａ３２７、Ａ３３０、Ｐ３３１、及び／又はＰ３２９（ＥＵインデックスに従った番号付け）の少なくとも一つの変異を含む。幾つかの実施態様では、抗体は、変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａを含む。
【００４２】
一態様では、本発明は、ここに提供された抗原結合配列の何れかを含むヘプシン結合ポリペプチドを提供し、ここで、ヘプシン結合ポリペプチドはヘプシン、例えばヒト及び／又はサイノ及び／又はマウスヘプシンに特異的に結合する。
【００４３】
本発明の抗体は、ヘプシンに結合し（例えば特異的に結合し）、幾つかの実施態様では、ヘプシン活性の一又は複数の側面(例えばヘプシン酵素活性）を調節（例えば阻害）し、及び／又は任意の生物学的に関連するヘプシン及び／又はヘプシンポリペプチド基質生物学的経路を破壊し、及び／又は腫瘍、細胞増殖性疾患又は癌を治療及び／又は予防し、及び／又はヘプシン発現及び／又は活性(例えば増加したヘプシン発現及び／又は活性)を伴う疾患を治療又は予防しうる。ある実施態様では、ヘプシン抗体は、ヘプシン（例えばヒト及び／又はマウスヘプシン）からなるか又はそれから本質的になるポリペプチドに特異的に結合する。一実施態様では、ヘプシン酵素活性はヘプシンのポリペプチド基質の開劣を含む。一実施態様では、ヘプシンのポリペプチド基質はプロ−マクロファージ刺激タンパク質（プロ−ＭＳＰ）、プロ−ｕＰＡ、ＶＩＩ因子及びプロ−ＨＧＦの一又は複数である。
【００４４】
一実施態様では、本発明の抗体は、２００６年出版のCancer Research, Volume 66, 3611-3619頁に記載されている抗ヘプシン抗体（例えば、図４に例示されている抗体１Ａ１２、８５Ｂ１１、９４Ａ７、Ａ６、Ａ１７４、Ａ２１及び／又はＡ２４）、又はＰＣＴ公報国際公開第２００４／００３３６３０号に開示されている単離されたヘプシン抗体（例えば、９３頁及び図１５Ａ−Ｄにおいて言及されている抗体４７Ａ５、１４Ｃ７、４６Ｄ１２、３８Ｅ２、３７Ｇ１０、３１Ｃ１、１１Ｃ１及び／又は７２Ｈ６）、又はXuan等(2006) Cancer Res 66(7), 3611に開示されている単離されたヘプシン抗体、又は国際公開第２００７／１４９９３２号に開示されているヘプシン抗体ではない。
【００４５】
一実施態様では、本発明の抗体は、２００６年出版のCancer Research, Volume 66, 3611-3619頁に記載されている抗ヘプシン抗体（例えば、図４に例示されている抗体１Ａ１２、８５Ｂ１１、９４Ａ７、Ａ６、Ａ１７４、Ａ２１及び／又はＡ２４）、又はＰＣＴ公報国際公開第２００４／００３３６３０号に開示されている単離されたヘプシン抗体（例えば、９３頁及び図１５Ａ−Ｄにおいて言及されている抗体４７Ａ５、１４Ｃ７、４６Ｄ１２、３８Ｅ２、３７Ｇ１０、３１Ｃ１、１１Ｃ１及び／又は７２Ｈ６）、又はXuan等(2006) Cancer Res 66(7), 3611に開示されている単離されたヘプシン抗体、又は国際公開第２００７／１４９９３２号に開示されているヘプシン抗体とヒトペプシンへの結合に対して競合しない。
【００４６】
一実施態様では、本発明の抗体は、２００６年出版のCancer Research, Volume 66, 3611-3619頁に記載されている抗ヘプシン抗体（例えば、図４に例示されている抗体１Ａ１２、８５Ｂ１１、９４Ａ７、Ａ６、Ａ１７４、Ａ２１及び／又はＡ２４）、又はＰＣＴ公報国際公開第２００４／００３３６３０号に開示されている単離されたヘプシン抗体（例えば、９３頁及び図１５Ａ−Ｄにおいて言及されている抗体４７Ａ５、１４Ｃ７、４６Ｄ１２、３８Ｅ２、３７Ｇ１０、３１Ｃ１、１１Ｃ１及び／又は７２Ｈ６）、又はXuan等(2006) Cancer Res 66(7), 3611に開示されている単離されたヘプシン抗体、又は国際公開第２００７／１４９９３２号に開示されているヘプシン抗体と同じヒトヘプシン上のエピトープに結合しない。
【００４７】
一態様では、本発明は、一又は複数の本発明の抗体と担体を含有する組成物を提供する。一実施形態では、担体は薬学的に許容可能である。
【００４８】
他の態様では、本発明は、本発明のヘプシン抗体をコードする核酸を提供する。
更に他の態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
【００４９】
更なる態様では、本発明は一又は複数の本発明の核酸と担体を含有する組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に許容可能である。
【００５０】
一態様では、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。ベクターは如何なる種類のものでもよく、例えば発現ベクター等の組換えベクターでもよい。様々な宿主細胞の任意のものを使用することができる。一実施態様では、宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌である。他の実施態様では、宿主細胞は原核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞である。
【００５１】
更なる態様では、本発明は、本発明の抗体を作製する方法を提供する。例えば、本発明は抗ヘプシン抗体（これは、ここで定義される通り、完全長抗体とその断片を含む）の作製方法を提供し、該方法は、ヒト化抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、核酸が発現されるように培養することを含む。幾つかの実施態様では、該方法は宿主細胞培養物から抗体を回収することを更に含む。幾つかの実施態様では、抗体は宿主細胞培地から回収される。幾つかの実施態様では、該方法は、回収された抗体を、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は担体と組み合わせて、ヒト化抗体を含有する薬学的製剤を調製することを更に含む。幾つかの実施態様では、本発明は抗ヘプシン抗体を作製する方法を提供し、該方法は、(a) ヘプシンと (b)ヘプシン S1 サブサイトに結合するセリンプロテアーゼ阻害剤を含む複合体に結合する抗体を選択することを含む。幾つかの実施態様では、複合体中に存在するヘプシンは不活性化される。幾つかの実施態様では、セリンプロテアーゼ阻害剤は3,4-ジクロロ-イソクマリン(DCI)である。幾つかの実施態様では、セリンプロテアーゼ阻害剤はヘプシン触媒性アミノ酸残基Ｓｅｒ１９５及びＨｉｓ５７に結合し、それによってヘプシンが不活化される。幾つかの実施態様では、抗体の選択の前に、抗体はヘプシン及びセリンプロテアーゼ阻害剤と共にインキュベートされる。幾つかの実施態様では、該方法はＫｕｎｉｔｚドメインとのヘプシン結合について競合する抗体を選択する工程を更に含む。幾つかの実施態様では、ＫｕｎｉｔｚドメインｈｓKD1である。
【００５２】
一態様では、本発明は、容器；及び容器内に収容された組成物を含む製造品を提供し、ここで、組成物は一又は複数の本発明のヘプシン抗体を含む。一実施態様では、組成物は本発明の核酸を含む。他の実施態様では、本発明の抗体を含有する組成物は更に担体を含み、該担体は、幾つかの実施態様では薬学的に許容可能である。一実施態様では、本発明の製造品は、個体に組成物（例えば抗体）を投与するための指示書（例えばここに記載の方法の何れかに対する指示書）を更に含む。
【００５３】
他の態様では、本発明は、一又は複数の本発明の抗ヘプシン抗体を含有する組成物を収容する第１の容器と；バッファーを含む第２の容器を備えるキットを提供する。一実施形態では、バッファーは薬学的に許容可能である。一実施態様では、抗体を含有する組成物は更に担体を含み、該担体は、幾つかの実施態様において薬学的に許容可能である。他の実施態様では、キットは、個体に組成物（例えば抗体）を投与するための指示書を更に含む。
【００５４】
ヘプシン経路は、例えば、ＨＧＦ／ｃ−ｍｅｔ経路の活性化、ＭＳＰ／Ｒｏｎ経路の活性化、基底膜の破壊／分解、基質分解等を含む複数の生物学的及び生理学的機能に関与している。ついで、これらの機能が癌のような疾患においてしばしば調節不全となる。よって、他の態様では、本発明は基底膜の破壊／分解を阻害する方法を提供し、該方法は細胞又は組織を本発明のアンタゴニストに接触させることを含み、それによって、基底膜の破壊／分解及び／又は基質分解が阻害される。更に他の態様では、本発明は基底膜の破壊／分解を阻害する方法を提供し、該方法は基底膜の異常な破壊／分解及び／又は基質分解を伴う細胞、組織、及び／又は被験者に本発明のアンタゴニストを投与することを含み、 それによって、基底膜の破壊／分解及び／又は基質分解が阻害される。
【００５５】
一態様では、本発明は増加したヘプシン活性を伴う疾患を治療又は予防する方法を提供し、該方法は、有効量の本発明のアンタゴニストをそのような治療を必要とする被験者に投与することを含み、それによって上記疾患が効果的に治療又は予防される。一実施態様では、上記疾患は癌である。
【００５６】
更なる態様では、本発明は疾患、例えば癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の抗ヘプシン抗体の使用を提供する。幾つかの実施態様では、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患は前立腺癌である。幾つかの実施態様では、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患は卵巣又は腎癌である。
【００５７】
一態様では、本発明は疾患、例えば癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の核酸の使用を提供する。幾つかの実施態様では、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患は前立腺癌である。幾つかの実施態様では、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患は卵巣又は腎癌である。
【００５８】
他の態様では、本発明は疾患、例えば癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の発現ベクターの使用を提供する。幾つかの実施態様では、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患は前立腺癌である。幾つかの実施態様では、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患は卵巣又は腎癌である。
【００５９】
また他の態様では、本発明は疾患、例えば癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の宿主細胞の使用を提供する。幾つかの実施態様では、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患は前立腺癌である。幾つかの実施態様では、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患は卵巣又は腎癌である。
【００６０】
更なる態様では、本発明は疾患、例えば癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の製造品の使用を提供する。幾つかの実施態様では、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患は前立腺癌である。幾つかの実施態様では、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患は卵巣又は腎癌である。
【００６１】
一態様では、本発明は疾患、例えば癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明のキットの使用を提供する。幾つかの実施態様では、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患は前立腺癌である。幾つかの実施態様では、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患は卵巣又は腎癌である。
【００６２】
本発明は、ヘプシンの発現及び／又はシグナル伝達、例えば増加した発現及び／又はシグナル伝達又は望まれない発現及び／又はシグナル伝達を伴う疾患を調節するのに有用な方法及び組成物を提供する。
【００６３】
本発明の方法を使用して任意の適切な病理状態に影響を及ぼすことができる。例示的な疾患はここに記載され、非小細胞肺癌、卵巣癌、甲状腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、頭頸部癌（例えば頭頸部扁平上皮癌）、脳癌（例えば神経芽細胞腫又は髄膜腫）、皮膚癌（例えばメラノーマ、基底細胞癌、又は扁平上皮癌）、膀胱癌（例えば移行上皮癌）、乳癌、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、肝細胞癌、子宮頸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、及び腎癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される癌を含む。
【００６４】
一実施態様では、本発明の方法において標的とされる細胞は癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞（例えば非小細胞肺癌細胞）、甲状腺癌細胞、多発性骨髄腫細胞、精巣癌細胞、乳頭癌細胞、結腸癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨肉腫細胞、腎癌細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞（例えば移行上皮癌）、胃癌細胞、頭頸部扁平上皮癌細胞、メラノーマ細胞、白血病細胞、子宮内膜癌細胞、及び結腸腺腫細胞からなる群から選択されるものでありうる。一実施態様では、本発明の方法において標的とされる細胞は過剰増殖性及び／又は過形成細胞である。他の実施態様では、本発明の方法において標的とされる細胞は異形成細胞である。更に他の実施態様では、本発明の方法において標的とされる細胞は転移性細胞である。
【００６５】
本発明の方法は更なる処置工程を更に含みうる。例えば、一実施態様では、方法は、標的細胞及び／又は組織（例えば癌細胞）が放射線処置又は化学療法剤に曝露される工程を更に含む。
【００６６】
一態様では、本発明は、有効量の他の治療剤（例えば抗血管新生剤、他の抗体、化学療法剤、細胞傷害剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、細胞傷害性放射線療法、コルチコステロイド、制吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤、又は増殖阻害剤）との組み合わせで有効量の抗ヘプシン抗体の投与を含む方法を提供する。例えば、抗ヘプシン抗体は様々な腫瘍性又は非腫瘍性症状を治療するために抗癌剤又は抗血管新生剤と組み合わせて使用される。
【００６７】
治療される特定の癌の徴候に応じて、本発明の併用療法は、更なる治療剤、例えば化学療法剤、又は付加的な治療法、例えば放射線療法又は手術と組合せることができる。多くの既知の化学療法剤が本発明の併用療法で使用可能である。好ましくは、特定の徴候の治療に対して標準的な化学療法剤が使用されるであろう。組合せて使用される各治療剤の用量又は頻度は、他の薬剤を使用しない場合の対応する薬剤の用量又は頻度と同じか、又はそれ未満であることが好ましい。
【００６８】
他の態様では、本発明はここに記載の抗ヘプシン抗体の何れかを提供し、ここで、 抗ヘプシン抗体は検出可能な標識を含む。
【００６９】
他の態様では、本発明はここに記載の抗ヘプシン抗体の何れかとヘプシンの複合体を提供する。幾つかの実施態様では、複合体はインビボ又はインビトロである。幾つかの実施態様では、複合体は癌細胞を含む。幾つかの実施態様では、抗ヘプシン抗体は検出可能に標識される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】抗ヘプシン抗体の重鎖及び軽鎖ＨＶＲループ配列。該図は重鎖ＨＶＲ配列Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３と軽鎖ＨＶＲ配列Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を示す。配列番号付けは次の通りである：クローン２５（ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号４；ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号５；ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号６；ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号１；ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号２；ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号３である）；アミノ酸位置は以下に記載のようにカバット番号付けシステムに従って番号付けされる。
【図２Ａ】次の通り、配列識別子を用いて本発明を実施する際に使用するための例示的アクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す：可変重鎖（ＶＨ）コンセンサスフレームワーク（図２Ａ、２Ｂ）：ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナスカバットＣＤＲｓ（それぞれ配列番号２１−２３及び１６）；ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークマイナス伸展高頻度可変領域（それぞれ配列番号２４−２５、２３及び１６；２４−２６及び１６；及び２４−２５、２７及び１６）；ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナスカバットＣＤＲｓ（それぞれ配列番号２８−３０及び１６）：ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸展高頻度可変領域（それぞれ配列番号３１−３２、３０及び１６；３１−３３及び１６；及び３１−３２、３４及び１６）；ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸展；ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナスカバットＣＤＲｓ（それぞれ配列番号３５−３７及び１６）；ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークマイナス伸展高頻度可変領域（それぞれ配列番号１４−１５、３７及び１６；１４−１５、３８及び１６；及び１４−１５、４３及び１６）；ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナスカバットＣＤＲｓ（それぞれ配列番号３９、３６、４０及び１６）；ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナス伸展高頻度可変領域（それぞれ配列番号１４−１５、４０及び１６；及び１４−１５、４１及び１６）；ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナスカバットＣＤＲｓ（それぞれ配列番号３９、３６、４２及び１６）；ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナス伸展高頻度可変領域（それぞれ配列番号１４−１５、４２及び１６；１４−１５、４４及び１６；及び１４−１５、４８及び１６）
【図２Ｂ】次の通り、配列識別子を用いて本発明を実施する際に使用するための例示的アクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す：
【図３】次の通り、配列識別子を用いて本発明を実施する際に使用するための例示的アクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す：可変軽鎖（ＶＬ）コンセンサスフレームワーク（図３）：ヒトＶＬカッパサブグループＩコンセンサスフレームワーク（それぞれ配列番号１７−２０）；ヒトＶＬカッパサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク（それぞれ配列番号４９−５１及び２０）；ヒトＶＬカッパサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク（それぞれ配列番号５２−５４及び２０）；ヒトＶＬカッパサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク（それぞれ配列番号５５−５７及び２０）
【図４】ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８軽鎖（出現順にそれぞれ配列番号１７−１８、５８及び２０）及び重鎖（出現順にそれぞれ配列番号１４−１５、４８及び１６）のフレームワーク領域配列を示す。上付き／太字の数字はカバットによるアミノ酸位置を示す。
【図５】ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８軽鎖（出現順にそれぞれ配列番号１７−２０）及び重鎖（出現順にそれぞれ配列番号１４−１５、４３及び１６）の修飾／変異フレームワーク領域配列を示す。上付き／太字の数字はカバットによるアミノ酸位置を示す。
【図６】抗ヘプシン抗体ｍａｂ２５重鎖可変領域（配列番号１０）及び軽鎖可変領域（配列番号９）を示す。
【図７】天然ヒトペプシンのアミノ酸配列の一実施態様。
【図８Ａ】天然ヒトペプシンのアミノ酸配列の他の実施態様。
【図８Ｂ】天然ヒトペプシンのアミノ酸配列の他の実施態様。
【図９】３，４−ジクロロ−イソクマリン（ＤＣＩ）によるヘプシンの不活性化。Ａ．増加するＤＣＩ濃度でのヘプシンの４０分のインキュベーション後のＳ２７６５基質に対する酵素活性の濃度依存性阻害。Ｂ．（Powers等, 1989）によるＤＣＩ及びそのヘプシンとの潜在的な付加物の化学構造。
【図１０】ＫＤ１はヘプシンへの結合について抗ヘプシンＦａｂ−ファージと競合する。増加する濃度のＫＤ１の存在下でのヘプシンに対するＦａｂ２５−ファージの結合。
【図１１】Ｆａｂ２５によるヒト及びマウスヘプシン酵素活性の阻害。ヒト（ｈｕ）及びマウス（ｍｕ）ヘプシンを、Ｓ２７６５基質の添加前に４０分間、Ｆａｂ２５又はコントロールＦａｂ（ｃｔｒｌ Ｆａｂ）と共にインキュベートした。初期線形速度を動態マイクロプレートリーダーで測定し、酵素活性を活性比（ｖｉ／ｖｏ）として表した。
【図１２】Ｆａｂの特異性。Ｆａｂ（１μＭ）をヘプシン及び９つのトリプシン様セリンプロテアーゼと共に４０分間インキュベートした後、合成パラ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）基質を添加した。初期線形速度を動態マイクロプレートリーダーで測定し、酵素活性を活性比（ｖｉ／ｖｏ）として表した。
【図１３Ａ】ヘプシンによる高分子基質のプロセシングのＦａｂ２５による阻害。Ａ．Ｆａｂ２５によるプロ−ｕＰＡ活性化の阻害。プロ−ｕＰＡのヘプシン媒介性プロセシングに対するＦａｂ２５の効果を２段階酵素アッセイにおいて決定した。初期線形速度を動態マイクロプレートリーダーで測定し、酵素活性を活性比（ｖｉ／ｖｏ）として表した。ｕＰＡ標準曲線を使用して、ヘプシンによるｕＰＡ生成の非阻害速度は０．８１±０．２２μＭのｕＰＡ／分（ｎ＝３）と決定された。Ｆａｂ２５によるヘプシン基質プロセシングの阻害が３つの既知の基質に対して実施された。
【図１３Ｂ】Ｂ．ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）。ヘプシンによるＶＩＩ因子の切断をＦａｂ２５及びコントロールＦａｂ（ｃｔｒｌ Ｆａｂ）の存在下又は不在下で０．５時間と２．０時間の間、実施した。反応アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件）によって分析し、ゲルを染色した。
【図１３Ｃ】Ｃ．プロ−ＨＧＦ。プロ−ＨＧＦ切断実験は３０分間、実施した。反応アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件）によって分析し、ゲルを染色した。
【図１３Ｄ】Ｄ．プロ−ＭＳＰ。プロ−ＭＳＰは３０分間、実施した。反応アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件）によって分析し、ゲルを染色した。
【図１４】ヘプシンへの延長された曝露後の完全性の効果。Ｆａｂ２５中のＣＤＲ−Ｈ３ループは３つのリジンと１つのアルギニンを含んでおり、これが潜在的にヘプシンにより切断されうるが、ｐＨ６．０又はｐＨ８．０の何れかで２４時間インキュベートしたときヘプシンによるＦａｂ２５のタンパク分解プロセシングは観察されなかった。タンパク質分解は、４−２０％（ｗ／ｖ）のポリアクリルアミドゲル勾配ゲルでのゲル移動度シフトによってモニターし、クーマシーブリリアントブルーで染色した。
【図１５】ＤＵ１４５細胞のラミニン依存性遊走のＦａｂ２５による阻害。Ａ．無血清ダルベッコ変法イーグル培地中のＤＵ１４５細胞（２×１０４）をフルオロブロックインサートの前処理がされた上部チャンバーに加え、３７℃で５時間、遊走させた。インキュベーション後、非遊走性細胞及び培地を洗浄し、フィルターの底部まで遊走した細胞を固定し、ＹＯ−ＰＲＯ−Ｉで染色し、倒立顕微鏡を使用して撮像した。代表的な画像を固定細胞を含む前処理フィルターから取った（ラミニン、ヘプシンと共インキュベートしたラミニン、ヘプシン：Ｆａｂ２５複合体又はＰＢＳコントロールと共インキュベートしたラミニン）。Ｂ．ＰＢＳ−ウェルに対して引き算した参照であるＹＯ−ＰＲＯ基質で染色した細胞からの相対蛍光単位（Ｒ．Ｆ．Ｕ）の測定。ヘプシンプロセシングされたラミニンで処理したＤＵ１４５細胞は、ラミニン単独で処理される細胞と比較して遊走の増加が顕著であった。Ｆａｂ２５の存在下でのヘプシンによるラミニンプロセシングの欠如はＤＵ１４５の遊走性を少なくする。
【図１６】Ａ．ＬｎＣａｐ−３４細胞における細胞表面発現ヘプシンによるプロ−ＭＳＰの活性化。ヘプシンを過剰発現するＬｎＣａｐ−３４細胞を血清枯渇させ、１２５Ｉ−プロ−ＭＳＰ単独で又は異なった阻害剤と組み合わせて３時間処理した。組換えヘプシン（１０ｎＭ）をポジティブコントロールとして使用した。プロ−ＭＳＰプロセシングにおける有意な増加が、実験開始時と比較して３時間後に観察された。阻害剤ＫＱＬＲ（配列番号１２）、ＫＤ１及び抗ヘプシン抗体Ｆａｂ２５はプロ−ＭＳＰの活性化を効果的にブロックした。Ｂ．ＬｎＣａｐ−３４細胞における細胞表面発現ヘプシンによるプロ−ＨＧＦの活性化。ＬｎＣａｐ−３４細胞を様々なＦａｂ２５濃度（２０ｎＭ−０．１５ｎＭ）の存在下で１２５Ｉ−プロ−ＨＧＦで処理し、３時間インキュベートした。組換えヘプシン（１０ｎＭ）をポジティブコントロールとして使用した。プロ−ＨＧＦプロセシングにおける有意な増加が、実験開始時と比較して３時間後に観察された。抗ヘプシン抗体Ｆａｂ２５はプロ−ＨＧＦの活性化を濃度依存的な形で効果的にブロックした。
【図１７】Ａ．表面プラズモン共鳴法を使用して活性なヒトヘプシンとのＡｂ２５の結合親和性を測定した。ヘプシンの段階希釈物（０．３９ｎＭから２００ｎＭ）を捕捉Ａｂ２５と共に３分間、ＣＭ５バイオセンサーチップに注入し、解離を１５分間モニターした。実験データのフィッティングにより１０．６ｎＭの平衡解離速度（ＫＤ）が得られた。Ｂ．プロ−ヘプシンへのＡｂ２５の結合が速い動態を示したので、結合親和性を定常状態親和性測定によって測定した。プロ−ヘプシンの段階希釈物（１９５ｎＭから８０μＭ）を捕捉Ａｂ２５と共に２分間、ＣＭ５バイオセンサーチップに注入した。平衡解離速度（ＫＤ＝５．５２μＭ）を、プロ−ヘプシンの濃度に対するＲｅｑのプロットから定常状態分析によって決定した。
【図１８】活性なヘプシンへのＦａｂ２５結合の等温滴定熱量測定実験。会合反応は発熱性であり、結合の化学量論が予想された通り、１：１である。ＩＴＣからの解離定数（ＫＤ）は６．１ｎＭで、ビアコアからの過去のデータと良好に相関している。結合のエンタルピー（ΔＨ）及びエントロピー（ＴΔＳ）は−２７．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ及び−１６．３ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、結合が好ましくないエントロピーでエンタルピー的に駆動される。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
ここでの発明は、例えばヘプシンの発現及び／又は活性、例えば増加した発現及び／又は活性又は望まれない発現及び／又は活性に関連した疾患状態の治療又は予防に有用である抗ヘプシン抗体を提供する。幾つかの実施態様では、本発明の抗体、腫瘍、癌、及び／又は細胞増殖性疾患を治療するために使用される。
【００７２】
他の態様では、本発明の抗ヘプシン抗体は、ヘプシンの検出及び／又は単離、例えば様々な組織及び細胞タイプにおけるヘプシンの検出のための試薬としての有用性が見出される。
【００７３】
本発明は抗ヘプシン抗体及び抗ヘプシン抗体をコードするポリヌクレオチドを作製し使用する方法を更に提供する。
【００７４】
一般技術
ここに記載され又は引用される技術及び手順は、一般に十分に理解されるものであり、例えば、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3版 (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel等編, (2003))；シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames及びG. R. Taylor編(1995)), Harlow及びLane編 (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney編(1987))に記載された広く利用されている方法論のような常套的方法論を使用して当業者によく用いられるものである。
【００７５】
定義
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、（１）ローリー法で測定して９５重量％を越え、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分な程度まで、あるいは、（３）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を使用する非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）により均一になるまで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００７６】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然源に通常は伴う少なくとも一種の汚染核酸分子から同定され分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、それが天然に見出される形態又は設定以外のものである。従って、単離された核酸分子は、それが天然細胞中に存在している核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞の位置とは異なる染色体位置にある核酸（例えば抗体をコードする核酸）を通常は発現する細胞中に含まれる核酸分子を含む。
【００７７】
「カバットにおける可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットにおけるアミノ酸位置番号付け」なる用語とその変形は、カバット等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)における抗体の編集の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについて使用される番号付けシステムを意味する。この番号付けシステムを使用すると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲを短くするか、又はそこに挿入される対応のより少ないか又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（カバットに従い残基５２ａ）と、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えば、カバットに従い残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含む。残基のカバット番号付けは、「標準」カバット番号の配列を有する抗体の配列を相同領域で整列させることにより、与えられた抗体について決定されうる。
【００７８】
ここで使用される「実質的に類似する」、又は「実質的に同じ」なる語句は、当業者が２つの数値の間の差が、該値（例えばＫｄ値）によって測定される生物学的特性の文脈内でわずかに又は全く生物学的及び／又は統計学的有意ではないと認めるほど、２つの数値（一般には本発明の抗体に関連するものと、参照／比較抗体に関連する他のもの）間の十分に高い度合いの類似性を示している。上記２つの値間の差は、参照／比較抗体の値の関数として好ましくは約５０％未満、好ましくは約４０％未満、好ましくは約３０％未満、好ましくは約２０％未満、好ましくは約１０％未満である。
【００７９】
「結合親和性」は、一般には分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有的相互作用の合計の強度を意味する。特に示さない限り、ここで使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を意味する。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。望ましくは、Ｋｄは１×１０−７、１×１０−８、５×１０−８、１×１０−９、３×１０−９、５×１０−９、又は１×１０−１０又はより強い。親和性は、ここに開示されたものを含む、当該技術分野で知られている一般的な方法により測定することができる。低親和性抗体は一般に抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向がある一方、高親和性抗体は一般により素早く抗原に結合し、より長く結合したまま残る傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野で知られており、その何れかを本発明の目的に使用することができる。特定の例示的実施態様を以下に記載する。
【００８０】
一実施態様では、この発明による「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、所定の滴定シリーズの非標識抗原の存在下で最小濃度の(１２５Ｉ)標識抗原でＦａｂを平衡にし、ついで抗Ｆａｂ抗体被覆プレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する次のアッセイで記載される（Chen等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881)、対象抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。アッセイの条件を樹立するために、マイクロタイタープレート（Dynex）を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Cappel Labs）を含む５０ｍＭの炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)で一晩被覆し、ついでＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンで室温（およそ２３℃）で２から５時間、ブロックする。非吸着プレート（Nunc#269620）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した対象Ｆａｂと混合する（例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致）。ついで対象Ｆａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達することを担保するために長時間（例えば６５時間）継続する場合がある。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。ついで、溶液を取り除き、プレートをＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ２０で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（MicroScint-20; Packard）を加え、プレートをTopcountγカウンター（Packard）で１０分間計数する。最大結合の２０％以下となる濃度の各Ｆａｂを選択して競合結合アッセイに用いる。他の実施態様によると、〜１０応答単位(ＲＵ)の固定抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000（BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）を使用して表面プラズモン共鳴アッセイを用いてＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5, BIAcore Inc.）を、供給者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈した後、結合したタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流量で注入する。抗原の注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動態測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を２５℃、およそ２５μｌ／分の流量で０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。幾つかの実施態様では、次の変更を表面プラズモン共鳴アッセイ法に使用する：抗体をＣＭ５バイオセンサーチップに固定して、およそ４００ＲＵを達成し、動態測定のために、２倍の段階希釈の標的タンパク質（例えば ヘプシン-ＩＩＩｂ又は-ＩＩＩｃ）（６７ｎＭから開始）を約３０ｕｌ／分の流量で２５℃でＰＢＳＴバッファーで注入する。結合速度（Ｋｏｎ）と解離速度（Ｋｏｆｆ）は、会合及び解離のセンサーグラムを同時フィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（BIAcore評価ソフトウェアバージョン3.2）を使用して計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen, Y等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、結合速度は、分光計、例えば、ストップフローを備えた分光光度計（Aviv Instruments）又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計（ThermoSpectronic）で測定される、増加濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃で、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて決定されうる。
【００８１】
また、この発明による「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、〜１０応答単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5, BIAcore Inc.）を、供給者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化させる。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈した後、結合したタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流量で注入する。抗原の注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動態測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を２５℃、およそ２５μｌ／分の流量で０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。幾つかの実施態様では、次の変更を表面プラズモン共鳴アッセイ法に使用する：抗体をＣＭ５バイオセンサーチップに固定して、およそ４００ＲＵを達成し、動態測定のために、２倍の段階希釈の標的タンパク質（例えば ヘプシン-ＩＩＩｂ又は-ＩＩＩｃ）（６７ｎＭから開始）を約３０ｕｌ／分の流量で２５℃でＰＢＳＴバッファーで注入する。結合速度（Ｋｏｎ）と解離速度（Ｋｏｆｆ）は、会合及び解離のセンサーグラムを同時フィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（BIAcore評価ソフトウェアバージョン3.2）を使用して計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例えば、Chen, Y等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。しかしながら、上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、結合速度は、分光計、例えば、ストップフローを備えた分光光度計（Aviv Instruments）又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計（ThermoSpectronic）で測定される、増加濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃で、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて決定されうる。
【００８２】
ここで使用される「ベクター」なる用語は、それが結合している他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合されうる円形の二重鎖ＤＮＡループを意味する。他の型のベクターはファージベクターである。他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムへ結合されうる。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。更に、所定のベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは「組換え発現ベクター」（又は単に「組換えベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に使用する場合がある。
【００８３】
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらのアナログ、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込まれうる任意の基質でありうる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらのアナログを含みうる。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されうる。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識との結合により、更に修飾されうる。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、アナログとの自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結（例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）及び荷電連結（ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するもの、ペンダント部分を含むもの、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ-Ｌ-リジン等）、インターカレータを有するもの（例えばアクリジン、ソラレン等）、キレート剤を含むもの（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等）、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの（例えばアルファアノマー核酸等）、並びにポリヌクレオチドの未修飾形態が含まれる。更に、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスフェート基で置き換えられ、標準的な保護基で保護され、又は付加的なヌクレオチドへの更なる連結を調製するように活性化され得、もしくは固体又は半固体支持体にコンジュゲートされうる。５'及び３'末端ＯＨはホスホリル化され得、又はアミンもしくは１から２０の炭素原子の有機キャップ基部分で置換されうる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されうる。ポリヌクレオチドはまた当該技術分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態をまた含み、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ-又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖アナログ、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、及び非塩基性ヌクレオシドアナログ、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル結合は代替の連結基で置き換えることができる。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスフェートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオエート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオエート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミデート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様が含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は、独立してＨ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジルである。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００８４】
ここで使用される「オリゴヌクレオチド」は、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長の、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述の記載はオリゴヌクレオチドに対して等しく完全に当てはまる。
【００８５】
ペプチド又はポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないで、配列を整列させ、最大パーセントの配列同一性を達成するために必要なら間隙を導入した後の、特定のペプチド又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られ、ここで、ＡＬＩＧＮ-２プログラムの完全なソースコードは以下の表Ａに提供される。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社により著作され、ソースコードはユーザードキュメンテーションと共に米国著作権庁（Washington D.C., 20559）に提出されており、そこで米国著作権登録番号第ＴＸＵ５１００８７号として登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ジェネンテック社（South San Francisco, California）により公に入手可能であり、又は例えば国際公開第２００７／００１８５１号に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーションシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用に対してコンパイルされなければならない。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ-２によって設定されており、変動しない。
【００８６】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対し、ある程度の％アミノ酸配列同一性を持つか又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であるとスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと同一ではない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは等しくないことが理解されるであろう。
【００８７】
幾つかの実施態様では、二以上のアミノ酸配列が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％同一である。幾つかの実施態様では、二以上のアミノ酸配列が少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％でさえ同一である。別段の記載が特にない場合、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載したようにして得られる。
【００８８】
ここで使用される「ヘプシン」なる用語は、特に又は文脈的に他の定義を示すものでない限り、任意の天然又は変異体ヘプシンポリペプチドを意味する。「天然配列」なる用語は、天然に生じる切断型（例えば細胞外ドメイン配列又は膜貫通サブユニット配列）、天然に生じる変異体型（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に包含する。「野生型ヘプシン」なる用語は、天然に生じるヘプシンタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを一般に意味する。「野生型ヘプシン配列」なる用語は天然に生じるヘプシンに見出されるアミノ酸配列を一般に意味する。一実施態様では、天然配列ヘプシンポリペプチドは配列番号４６のアミノ酸配列を含む（図７を参照）。一実施態様では、天然配列ヘプシンポリペプチドは配列番号４７のアミノ酸配列を含む（図８を参照）。
【００８９】
「ヘプシンポリペプチド変異体」又はその変形は、ここに開示された天然配列ヘプシンポリペプチド配列の何れかと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するとここに定義されたヘプシンポリペプチド、一般には活性ヘプシンポリペプチドを意味する。このようなヘプシンポリペプチド変異体には、例えば、天然アミノ酸配列のＮ又はＣ端で、一又は複数のアミノ酸残基が付加、又は欠失されたヘプシンポリペプチドが含まれる。通常、ヘプシンポリペプチド変異体は、ここに開示された天然配列ヘプシンポリペプチド配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。通常、ヘプシン変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０のアミノ酸長、あるいは少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００のアミノ酸長又はそれ以上である。場合によっては、ヘプシン変異体ポリペプチドは、天然ヘプシンポリペプチド配列と比較して１以下の保存アミノ酸置換、あるいは天然ヘプシンポリペプチド配列と比較して２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以下の保存アミノ酸置換を有するであろう。
【００９０】
「チロシンキナーゼ阻害剤」は、ヘプシンレセプターなどのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を有る程度阻害する分子である。
【００９１】
「阻害する」ことは、参照物質と比較して、活性、機能及び／又は量を減少させるか又は低減させることである。
【００９２】
タンパク質「発現」は、遺伝子にコード化される情報のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転換と、ついでタンパク質への転換を意味する。
【００９３】
ここで、対象のタンパク質（例えばヘプシン）を「発現する」試料又は細胞は、タンパク質をコード化しているｍＲＮＡ又はその断片を含むタンパク質が試料又は細胞に存在することが決定されるものである。
【００９４】
「イムノコンジュゲート」（「抗体-薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と交換可能に称される）は、一又は複数の細胞傷害剤、例えば化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物由来の酵素的に活性な毒素、又はその断片）、又は放射性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート）にコンジュゲートした抗体を意味する。
【００９５】
「阻止(ブロック)」抗体又は抗体「アンタゴニスト」とは、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低下させるものである。好ましい阻止抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を完全に阻害する。
【００９６】
「ネイキッド抗体」は、細胞傷害性部分又は放射標識のような異種性分子にコンジュゲートしていない抗体である。
【００９７】
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体は、同じ抗原に結合する他の抗体からそれを区別するその抗体の生物学的特性の一又は複数を保有するものである。
【００９８】
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするためには、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow及びDavid Lane編 (1988)に記載されたもののような常套的な交差ブロックアッセイ法を実施することができる。
【００９９】
この発明のアミノ酸配列を含む抗体又はポリペプチドの半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体（特に抗体断片）へサルベージレセプター結合エピトープ接着させることができる。例えば、サルベージレセプター結合エピトープをコードする核酸分子は、操作した核酸分子によって発現される融合タンパク質がこの発明のポリペプチド配列とサルベージレセプター結合エピトープを含むように、この発明のポリペプチド配列をコードする核酸にインフレームで連結させることができる。ここで使用される場合、「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを意味する（例えば、Ghetie, V等, (2000) Ann. Rev. Immunol. 18:739-766, 表１）。Ｆｃ領域内に置換を有し血清半減期が増大した抗体については、国際公開第００／４２０７２号、国際公開第０２／０６０９１９号； Shields等, JBC 276(9):6591-6604(2001)；Hinton, JBC 279(8):6213-6216(2004)）にも記載されている。他の実施態様では、例えば他のポリペプチド配列に接着させることによっても血清半減期が増大しうる。例えば、本発明の方法に有用な抗体又は他のポリペプチドを、血清アルブミンが抗体又はポリペプチドに結合するように、ＦｃＲｎレセプター又は血清アルブミン結合ペプチドに結合する血清アルブミン又は血清アルブミンの一部に接着させることができ、例えば、そのようなポリペプチド配列は国際公開第０１／４５７４６号に開示されている。好ましい一実施態様では、接着される血清アルブミンペプチドはＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、Ｆａｂの半減期はこれらの方法によって増大する。血清アルブミン結合ペプチド配列については、Dennis等, JBC 277(38):35035-35043(2002)も参照のこと。
【０１００】
「断片」とは、好ましくは、参照核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上を含むポリペプチド又は核酸分子の一部を意味する。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００、２００、３００、４００、５００、６００又はそれ以上のヌクレオチド、あるいは１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、１９０、２００のアミノ酸又はそれ以上を含みうる。
【０１０１】
「抗体」及び「免疫グロブリン」なる用語は、最も広い意味で交換可能に使用され、モノクローナル抗体（例えば全長又はインタクトなモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限りにおいて二重特異性抗体）を含み、またある種の抗体断片（ここにより詳細に記載）もまた含む。抗体は、ヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟でありうる。
【０１０２】
「可変」なる用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広範囲に相違しているという事実を意味し、それぞれの特定の抗体のその特定の抗原への結合性及び特異性において使用される。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均一に分布しているのではない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの双方において、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲによって連結された、βシート配置を大部分は採る４つのＦＲ領域をそれぞれ含む。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域により、また他の鎖からのＣＤＲと共に極近傍に一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)を参照）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性への抗体の関与を示す。
【０１０３】
抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を持つ「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片と、その名前が直ぐに結晶化するその能力を反映する残留「Ｆｃ」断片を生じる。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を持ち、尚も抗原に交差結合することができるＦ(ａｂ')２断片を生じる。
【０１０４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。二本鎖Ｆｖ種では、この領域は緊密に非共有的に結合した一つの重鎖と一つの軽鎖の二量体からなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインが、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種におけるものに類似した「二量体」構造で結合できるように可撓性ペプチドリンカーによって共有的に結合されうる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を定めるのはこの配置においてである。まとめると、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲしか含まないＦｖの半分）でさえも抗原を認識しそれに結合する能力を持つが、結合部位全体よりは低い親和性でである。
【０１０５】
Ｆａｂ断片はまた軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数残基が付加されている点でＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここでは定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ'を示すものである。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、元々は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合もまた知られている。
【０１０６】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。
【０１０７】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体には異なるクラスが割り当てられる。免疫グロブリンの５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは更に例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス（アイソタイプ）に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体構造はよく知られている。「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部のみを含み、その部分は、インタクトな抗体中に存在する場合にその部分に通常伴う機能の少なくとも一、好ましくは殆ど又は全てを保持する。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。一実施態様では、抗体断片は、インタクトな抗体の抗原結合部位を含み、よって抗原結合能を保持する。他の実施態様では、抗体断片、例えばＦｃ領域を含むものは、インタクトな抗体に存在する場合Ｆｃ領域に通常伴う少なくとも一の生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合を保持する。一実施態様では、抗体断片は、インタクトな抗体と実質的に同じインビボ半減期を有する一価抗体である。例えばそのような抗体断片は、該断片にインビボ安定性を付与し得るＦｃ配列に結合した抗原結合アーム上に含みうる。
【０１０８】
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は６つの高頻度可変領域を含み；ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。多数の高頻度可変領域の描写が使用され、ここに包含される。カバット相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している（Chothia 及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。ＡｂＭ高頻度可変領域は、カバットＣＤＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複合体結晶構造の解析に基づく。これらの高頻度可変領域のそれぞれからの残基を以下に示す。
ループ  カバット   AbM        Chothia       接触
----     -----      ---         -------        -------
L1     L24-L34     L24-L34     L26-L32      L30-L36
L2     L50-L56     L50-L56     L50-L52      L46-L55
L3     L89-L97     L89-L97     L91-L96      L89-L96
H1     H31-H35B    H26-H35B    H26-H32      H30-H35B
(Kabat番号付け)
H1     H31-H35     H26-H35     H26-H32      H30-H35 
(Chothia番号付け)
H2     H50-H65     H50-H58     H53-H55      H47-H58
H3     H95-H102    H95-H102    H96-H101     H93-H101
【０１０９】
高頻度可変領域は、次のような「拡大高頻度可変領域」を含みうる：ＶＬの２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７又は８９−９６（Ｌ３）、及びＶＨの２６−３５又は２６−３５Ａ（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々について、上掲のKabat等に従って番号が付されている。
【０１１０】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここに定義される高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１１１】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含むであろう。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。また次の概説論文とそこに引用された文献を参照のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
【０１１２】
「キメラ」抗体（免疫グロブリン）は特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列に一致するか又は相同の重鎖及び／又は軽鎖の一部を有するものであり、残りの鎖は、他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列に一致するか又は相同であるもの、並びに所望の生物学的活性を示す限り、該抗体の断片である（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで用いられるヒト化抗体はキメラ抗体のサブセットである。
【０１１３】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドはｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨ及びＶＬドメイン間に更に含む。ｓｃＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。
【０１１４】
「抗原」は、抗体が選択的に結合することができる予め定まった抗原である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、又は他の天然に生じるか又は合成の化合物でありうる。好ましくは、標的抗原はポリペプチドである。
【０１１５】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を意味し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ-ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が不可能なリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、例えば、欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)に更に十分に記載されている。
【０１１６】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有しており、及び／又はここにおいて開示されたヒト抗体を作製する任意の技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に排除する。
【０１１７】
「親和成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じさせる、その一又は複数のＣＤＲにおいて一又は複数の改変を持つものである。好ましい親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該技術分野において知られている手順によって生産される。Marks等, Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和成熟について記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169：147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
【０１１８】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【０１１９】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」又は「ＡＤＣＣ」は、ある種の細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)に結合した分泌Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を、抗原担持標的細胞に特異的に結合せしめ、ついで細胞毒で標的細胞を殺すという細胞傷害性の形態を意味する。抗体は細胞傷害性細胞を「備え」ており、そのような死滅化に絶対に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。関心ある分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は同５８２１３３７号、又は米国特許第６７３７０５６号(Presta)に記載されているもののようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は付加的に、関心ある分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 95:652-656(1998)に開示されたもののような動物モデルにおいてインビボで評価されうる。
【０１２０】
「ヒトエフェクター細胞」は、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実施する白血球である。好ましくは、細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実施する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球を含み；ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、天然源、例えば血液から単離することができる。
【０１２１】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記述する。好ましいＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性化レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシン−ベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)を有する。（例えばM. Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)を参照）。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)に概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける用語「ＦｃＲ」に包含される。該用語はまた胎児への母のＩｇＧの移動(Guyer等, J. Immunol. 117:587(1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249(1994))、及び免疫グロブリンの恒常性維持の調節の原因となる、新生児レセプターＦｃＲｎを含む。国際公開第００／４２０７２号（Presta）はＦｃＲへの結合が改善され又は減少された抗体変異体を記述している。その特許公報の内容は出典明示により特にここに援用する。またShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照のこと。
【０１２２】
ＦｃＲｎへの結合性を測定する方法は知られている（例えば、Ghetie 1997, Hinton 2004を参照）。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質移入ヒト細胞株において、又はＦｃ変異体ポリペプチドを投与した霊長類においてアッセイすることができる。
【０１２３】
「補体依存性細胞傷害性」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を意味する。古典的な補体経路の活性化は、補体系(Ｃｌｑ)の第１成分が、その同族抗原と結合した抗体(適切なサブクラスのもの)に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163(1996)に記載されているように実施することができる。
【０１２４】
Ｆｃ領域アミノ酸配列が改変され、Ｃ１ｑ結合能力が増加又は低下させられたポリペプチド変異体は、米国特許第６１９４５５１号及び国際公開第１９９９／５１６４２号に記載されている。また、Idusogie等, J. Immunol. 164:4178-4184(2000)を参照。
【０１２５】
「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」なる用語は、Ｆｃ領域を含む抗体もしくはイムノアドヘンシンのようなポリペプチドを指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムに従うと残基４４７)は、例えば、ポリペプチドの精製中又はポリペプチドをコードする核酸を組換え操作することによって除去してもよい。従って、この発明のＦｃ領域を有するポリペプチドを含んでなる組成物は、Ｋ４４７を有するポリペプチド、全てのＫ４４７が除去されたポリペプチド、又はＫ４４７残基を有するポリペプチドとＫ４４７残基を有さないポリペプチドの混合物を含みうる。
【０１２６】
ここでの目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから誘導されるＶＬ又はＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から誘導される」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むか、又は既存のアミノ酸配列変化を含んでいてもよい。既存のアミノ酸変化が存在する場合、好ましくは５以下、好ましくは４以下、又は３以下の既存のアミノ酸変化が存在する。既存のアミノ酸変化がＶＨ中に存在する場合、好ましくは、それらの変化は位置７１Ｈ、７３Ｈ及び７８Ｈの内の３つ、２つ又は１つのみである；例えば、それらの位置のアミノ酸残基は、７１Ａ、７３Ｔ及び／又は７８Ａでありうる。一実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【０１２７】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選別は、可変ドメイン配列のサブグループからする。一般に、配列のサブグループはKabat等におけるようなサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、サブグループはKabat等におけるようなサブグループκＩである。一実施態様では、ＶＨについて、サブグループは上掲のKabat等におけるようなサブグループＩＩＩである。
【０１２８】
「ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変重鎖サブグループＩＩＩのアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。一実施態様では、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は次の配列のそれぞれの少なくとも一部又は全てを含む：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１４）−Ｈ１−ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号１５）−Ｈ２−ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号４３）−Ｈ３−ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）。
【０１２９】
「ＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変軽鎖カッパサブグループＩのアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。一実施態様では、ＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク アミノ酸配列は次の配列のそれぞれの少なくとも一部又は全てを含む：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）−Ｌ１−ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）−Ｌ２−ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号１９）−Ｌ３−ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）。
【０１３０】
ここで使用される場合、「抗体突然変異体」又は「抗体変異体」は、種依存性抗体のアミノ酸配列変異体を称し、ここで種依存性抗体の一又は複数のアミノ酸残基は修飾されている。このような変異体は、種依存性抗体と１００％の配列同一性又は類似性を有する必要はない。一実施態様では、抗体突然変異体は、種依存性抗体の重鎖又は軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％、また更に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むであろう。この配列に関する同一性又は類似性は、最大パーセント配列同一性を達成するために、必要であるならば、配列を整列させ、間隙を導入した後に、種依存性抗体残基と同一（すなわち同じ残基）又は類似（すなわち、共通の側鎖特性に基づく同じ群からのアミノ酸残基、以下参照）である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。可変ドメインの外側への抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸長、欠失又は挿入は、配列の同一性又は類似性に影響を与える場合に構築されない。
【０１３１】
「疾病」又は「疾患」は、本発明の物質／分子又は方法を用いた治療によって利益を得る任意の症状である。これには、問題とする疾患に哺乳動物がかかりやすくなる病理学的症状を含む慢性及び急性の疾病又は疾患を含む。ここで治療される疾患の非限定的な例には、悪性及び良性の腫瘍；癌腫、芽細胞腫及び肉腫が含まれる。
【０１３２】
「治療」は、治療的処置及び予防的又は防止的な処置を指す。治療を必要とするものには、既に良性、前癌性、又は非転移性の腫瘍を有するもの、並びに癌の発生又は再発を予防すべきものが含まれる。
【０１３３】
「治療的有効量」という用語は、哺乳動物の疾患又は疾病を治療又は予防するための治療剤の量を指す。癌の場合、治療的に有効量の治療剤は、癌細胞の数を減じ；原発腫瘍の大きさを減じ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速、好ましくは停止）し；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速及び好ましくは停止）し；腫瘍増殖をある程度まで阻害し；及び／又は疾病に関連する一又は複数の症状をある程度まで緩和する。既存の癌細胞の増殖を妨げ及び／又は死滅させる程度まで、薬剤は、細胞分裂停止及び／又は細胞傷害性であり得る。癌治療の場合、インビボでの効能は、生存期間、無増悪期間（ＴＴＰ）、奏効率（ＲＲ）、奏効期間、及び／又は生活の質を評価することにより測定することができる。
【０１３４】
「癌」及び「癌性」なる用語は、典型的には調節されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すか又は記述する。この定義には、良性及び悪性の癌が含まれる。「初期癌」又は「初期腫瘍」とは、侵襲性又は転移性でない癌を意味するか、あるいはステージ０、Ｉ、又はＩＩとして分類される癌を意味する。癌の例には、限定するものではないが、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽腫及び網膜芽細胞腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫及び滑膜細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリン産生腫瘍、及び島細胞癌を含む）、中皮腫、シュワン腫（聴神経腫瘍を含む）、髄膜腫、腺癌、メラノーマ、及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌（例えば上皮の扁平細胞癌）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃(gastric、stomach)癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌（転移性乳癌を含む）、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮細胞腫、唾液腺細胞腫、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞腫、肛門癌、陰茎細胞腫、精巣癌、食道癌、胆道癌、並びに頭頚部癌及び多発性骨髄腫が含まれる。
【０１３５】
「前癌性」は、典型的には癌に先行又は進行する状態又は増殖を指す。「前癌性」の増殖は、異常な細胞周期制御、増殖、又は分化を特徴とする細胞を有し、細胞周期制御、細胞増殖、又は分化のマーカーにより決定することができる。
【０１３６】
「異形成」とは、組織、器官、又は細胞のあらゆる異常な増殖又は発達を意味する。好ましくは、異形成は高悪性度又は前癌性である。
【０１３７】
「転移」とは、癌が原発部位から身体の他の場所へ広がることを意味する。癌細胞は、原発腫瘍を離れてリンパ管及び血管に侵入し、血流により循環し、身体の他の部分の正常組織中の遠隔病巣内で増殖（転移）しうる。転移は、局所性又は遠隔でありうる。転移は、連続的プロセスであり、原発腫瘍を離れた腫瘍細胞に随伴性であり、血流によって移動し、遠隔部位で停止する。新規部位において、細胞は血液供給を確立し、成長して致命的な腫瘤を形成しうる。
【０１３８】
腫瘍細胞内部の刺激性及び抑制性の分子経路は共にこのような挙動を制御し、遠隔部位における腫瘍細胞と宿主細胞との間の相互作用もまた顕著である。
【０１３９】
「非転移性」とは、良性である癌又は原発部位に留まっており、リンパ管又は血管に、あるいは原発部位以外の組織中に浸潤していない癌を意味する。一般に、非転移性癌は、ステージ０、Ｉ、又はＩＩの何れかの癌であり、希にステージＩＩＩの癌である。
【０１４０】
「原発腫瘍」又は「原発癌」とは、最初の癌を意味し、患者の身体の別の組織、器官、又は位置にある転移性の病変を意味しない。
【０１４１】
「良性腫瘍」又は「良性癌」とは、最初の部位に局在性に留まり、遠隔部位に湿潤、浸潤、又は転移する能力を持たない腫瘍を意味する。
【０１４２】
「腫瘍組織量」とは、身体における癌細胞の数、腫瘍の大きさ、又は癌の量を意味する。腫瘍組織量（tumor burden）は腫瘍量（tumor load）とも呼ばれる。
【０１４３】
「腫瘍数」とは腫瘍の数を意味する。
【０１４４】
「被検体」とは、限定しないが、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、又はネコを含む哺乳動物を意味する。好ましくは、被検体はヒトである。
【０１４５】
「抗癌治療」は、癌の治療に有用な治療法を指す。抗癌治療剤の例には、限定しないが、例えば、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害剤、放射線治療に使用される薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、及び癌を治療するための他の薬剤、抗ＣＤ２０抗体、血小板由来増殖因子阻害剤（例えば、グリベックＴＭ（イマチニブメシル酸塩））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、次の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ又はＶＥＧＦレセプター、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、及びその他の生理活性有機化学薬品などのうちの一又は複数に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）が含まれる。これらの組み合わせも本発明にまた含まれる。
【０１４６】
ここで用いられる「細胞傷害剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制し、及び／又は細胞破壊を生じさせる物質を意味する。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はその断片を意味する。
【０１４７】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、癌の治療に有用な化学化合物が含まれる。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロスホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；カンプトセシン(合成類似体トポテカン（topotecan）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin）合成アナログを含む）；クリプトフィシン(cryptophycin）(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin）；デュオカルマイシン(duocarmycin ）（合成アナログ、KW-2189及びCBI-TM1を含む）；エリュテロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin）；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin）；ナイトロジェンマスタード、例えばクロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、クロロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード；ニトロスレア(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、及びラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；クロドロネート(clodronate)などのビスホスホネート(bisphosphonates)；エスペラマイシン(esperamicin）；並びにネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins）、ミコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸アナログ；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジンアナログ；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ラソキサントロン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイジン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、ABRAXANE(登録商標)クレモフォール(Cremophor)を含まない、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)及びタキソテア(登録商標）ドキセタキセル、（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナアナログ；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イホスファミド；ミトキサント��ン；ビンクリスチン；NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロネート(ibandronate)；イリノテカン(Camptosar、CPT-11)(５-ＦＵとロイコボリンを用いたイリノテカンの治療レジメを含む)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；コンブレタスタチン；ロイコボリン(ＬＶ)；オキサリプラチン治療レジメン(FOLFOX)を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（Tykerb(登録商標)）；例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、Ｈ-Ｒａｓ、ＥＧＦＲ(例えば、エルロチニブ(タルセバ（商標））及び細胞増殖を低減するＶＥＧＦ-Ａ及び上述したものの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
【０１４８】
また、この定義に含まれるものは、腫瘍に対するホルモン作用を調節し又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）であり、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標)タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン(onapristone)、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ・トレミフェン；副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ(登録商標)酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標)ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標)アナストロゾール；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)（１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関連したシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｌｆ、及びＨ-Ｒａｓ；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＺＩＯＺＹＭＥ(登録商標)リボザイム）及びＨＥＲ２発現阻害剤；遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、及びＶＡＸＩＤ(商品名)ワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ(登録商標)ｒＩＬ-２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標)トポイソメラーゼＩ阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標)ｒｍＲＨ；ビノレルビン(Vinorelbine)及びエスペラミシン(Esperamicins)(米国特許第４６７５１８７号を参照)、及び上記のものの何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体である。
【０１４９】
この出願において使用される「プロドラッグ」なる用語は、親薬剤と比較して腫瘍細胞にそれほど細胞傷害性でなく、酵素的に活性化され得るか又はより活性な親形態に変換され得る薬学的に活性な物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)及びStella等, “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery, Borchardt等(編.), pp. 247-267, Humana Press (1985)を参照のこと。本発明のプロドラッグとしては、限定しないが、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、置換されていてもよいフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は置換されていてもよいフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性な細胞傷害性の遊離薬物に転換され得る５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグが挙げられる。本発明において使用されるプロドラッグ形態に誘導体化され得る細胞傷害性薬物の例としては、上述の化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
「放射線治療」とは、定方向γ線又はβ線を使用して細胞に十分な損傷を誘発することにより、細胞の正常に機能する能力を制限すること、又は細胞全体を破壊することを意味する。この治療の線量及び継続期間を決定する多数の方法が当該技術分野で知られている。典型的な治療は、一回の照射で行われ、典型的な線量範囲は一日当たり１０から２００単位（Grays）である。
【０１５１】
「生物学的試料」（「試料」又は「組織又は細胞試料」と交換可能に呼ばれる）は、個体から得られた様々な試料タイプを包含し、診断又はモニタリングアッセイに使用されうる。該定義は、血液及び生物学的由来の他の液体試料、固形組織試料、例えばバイオプシー標本又は組織培養物又はそれから誘導される細胞、及びその子孫を包含する。該定義はまた、例えば試薬での処理、可溶化、又はタンパク質又はポリヌクレオチドのようなある種の成分の濃縮、又は切片化目的のための半個体又は個体マトリックスへの包埋など、その獲得後に何らかの形で操作されている試料を含む。「生物学的試料」なる用語は臨床試料を包含し、また培養中の細胞、細胞上清、細胞可溶化物、血清、血漿、生物学的体液及び組織試料を包含する。生体試料の供給源は、新鮮な、凍結及び／又は保存された器官又は組織試料又はバイオプシー又は吸引物；血液又はあらゆる血液成分；生体体液、例えば脳脊髄液、羊水、腹膜体液又は間質液；個体の妊娠又は発生の任意の時期からの細胞でありうる。幾つかの実施態様では、生体試料は、原発性又は転移性の腫瘍から得られる。生物学的試料は、例えば保存料、抗凝固剤、バッファー、固定液、栄養分、抗生物質等の天然には組織と混合されない化合物を含みうる。
【０１５２】
ここでの目的に対して、組織試料の「切片」は、組織試料の一部又は断片、例えば、組織試料から切断された組織の薄片又は細胞を意味する。組織試料の複数の切片を得て、本発明に係る分析に供することができることが理解される。幾つかの実施態様では、組織試料の同じ切片が形態学的及び分子レベルの双方で分析され、あるいはタンパク質及び核酸の両方に関して分析される。
【０１５３】
「標識」なる語は、ここで使用される場合、例えば核酸プローブ又は抗体のような試薬に直接的に又は間接的にコンジュゲート又は融合され、それがコンジュゲートされ又は融合される試薬の検出を容易にする化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身が検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変化を触媒してもよい。
【０１５４】
本発明の組成物及びこれを作製し使用する方法
この発明は、抗ヘプシン抗体を含有する、薬学的組成物を含む組成物；及び抗ヘプシン抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。ここで使用される場合、組成物は、ヘプシンに結合する一又は複数の抗体、及び／又はヘプシンに結合する一又は複数の抗体をコードする配列を含む一又は複数のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は適切な担体、例えば、当該技術分野でよく知られている薬学的に許容可能な賦形剤を更に含有しうる。
【０１５５】
本発明はまた単離された抗体及びポリヌクレオチドの実施態様を包含する。本発明はまた実質的に純粋な抗体及びポリヌクレオチドの実施態様を包含する。
【０１５６】
本発明はまた（ここに記載された又は当該技術分野で知られている）抗ヘプシン抗体を使用して、例えば前立腺癌のような疾患を治療する方法を包含する。
【０１５７】
組成物
本発明の抗ヘプシン抗体は好ましくはモノクローナルである。また、本発明の範囲にまた包含されるのはここに提供された抗ヘプシン抗体のＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'-ＳＨ及びＦ(ａｂ')２断片である。これらの抗体断片は、伝統的な手段、例えば酵素消化により作製されるか、又は組換え技術により産生されうる。このような抗体断片は、キメラでもよいし、ヒト化のものでもよい。これらの断片は、以下に記載の診断目的及び治療目的のために有用である。
【０１５８】
モノクローナル抗体は実質的に相同の抗体の集団から得られる、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、僅かな量で存在しうる天然に生じる可能な突然変異を除いて同一のものである。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。
【０１５９】
本発明の抗ヘプシンモノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製でき、又は組換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号）によって作製することができる。
【０１６０】
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを免疫化し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を誘導する。ヘプシンに対する抗体は、ヘプシンとアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)に注射することにより動物内に生じせしめうる。ヘプシンは当該技術分野でよく知られている方法を用いて調製され得、その方法の幾つかはここに更に記載される。例えば、ヒト及びマウスヘプシンの組換え産生は以下に記載される。一実施態様では、動物を、免疫グロブリン重鎖のＦｃ部位に融合したヘプシンで免疫化する。好ましい実施態様では、動物を、ヘプシン-ＩｇＧ１融合タンパク質で免疫化する。通常、動物は、一リン酸化リピドＡ(ＭＰＬ)／トレハロースジクリノミコレート(trehalose dicrynomycolate)(ＴＤＭ) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT)によりヘプシンの免疫原性コンジュゲート又は誘導体に対して免疫化され、該溶液は複数部位に皮内的に注射される。２週後に、動物を追加免役する。７から１４日後、動物から採血して、血清を抗ヘプシン力価について検定する。力価がプラトーになるまで動物を追加免役する。
【０１６１】
別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986)）。
【０１６２】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう（ＨＡＴ培地）。
【０１６３】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、San Diego, California USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍から誘導されたもの、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, Rockville, Maryland USAから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞である。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【０１６４】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、ヘプシンに対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【０１６５】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson等, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０１６６】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986)）。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が含まれる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【０１６７】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
【０１６８】
本発明の抗ヘプシン抗体は、所望される活性を有する合成抗体クローンをスクリーニングするために、コンビナトリアルライブラリーを用いて同定することができる。原理的には、合成抗体クローンを、ファージコートタンパク質と融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の様々な断片をディスプレイするファージを含むファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリーは、所望される抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによってパニングされる。所望される抗原と結合することができるＦｖ断片を発現するクローンが抗原に吸着され、よって、ライブラリーの非結合クローンから分離される。ついで、結合クローンは、抗原から溶出させられ、抗原吸着／溶出の更なるサイクルによって更に濃縮されうる。本発明の抗ヘプシン抗体の任意のものは、対象のファージクローンを選択するために適切な抗原スクリーニング手法を設計し、続いて対象のファージクローンからのＦｖ配列、及びKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3に記載の適切な定常領域（Ｆｃ）配列を用いて全長抗ヘプシン抗体クローンを構築することによって得ることができる。抗ヘプシン抗体の産生の例示的な方法は実施例に開示する。
【０１６９】
抗体の抗原結合ドメインは、約１１０アミノ酸の２つの可変（Ｖ）領域で、それぞれ一つが軽鎖（ＶＬ）及び重（ＶＨ）鎖からのもので、双方が３つの超可変ループ又は相補性決定領域(ＣＤＲ)を提示するものから形成される。可変ドメインは、Winter等，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように、ＶＨ及びＶＬが短くて柔軟なペプチドを介して共有結合している一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又は定常ドメインと融合して非共有的に相互作用しているＦａｂ断片の何れかとしてファージ上に機能的にディスプレイされうる。ここで使用される場合、ｓｃＦｖコード化ファージクローン及びＦａｂコード化ファージクローンは、総称して「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と呼ぶ。
【０１７０】
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングし、ファージライブラリーでランダムに組換えることが可能であり、それは、ついで、Winter等，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように抗原結合クローンについて探索されうる。免疫化した供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要がなく、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブなレパートリーをクローニングして、Griffiths等，EMBO J, 12: 725-734(1993)に記載のように如何なる免疫化もなしに、幅広い非自己及びまた自己抗原に対するヒト抗体の単一源を提供することができる。最後に、天然ライブラリーは、また、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、幹細胞からの未再配列Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用して高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配列を達成させることによって合成的に作製することができる。
【０１７１】
繊維状ファージは、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合によって、抗体断片をディスプレイするのに使用される。抗体断片は、例えばMarks等，J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載のように、ＶＨ及びＶＬドメインが柔軟なポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖上に連結されている一本鎖Ｆｖ断片として、又は例えば、Hoogenboom等, Nucl. Acids. Res., 19: 4133-4137(1991)に記載のような、一つの鎖がｐＩＩＩと融合し、他方が細菌宿主細胞のペリプラズムへ分泌されるＦａｂ断片としてディスプレイされ得、Ｆａｂコートタンパク質構造のアセンブリーが幾つかの野生型コートタンパク質を置換することによってファージ表面上にディスプレイされるようになる。
【０１７２】
一般に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒト又は動物から収集した免疫細胞から得られる。抗ヘプシンクローンに有利になるように偏ったライブラリーが望ましい場合には、個体をヘプシンで免疫化して抗体応答を生成させ、脾臓細胞及び／又は他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である循環Ｂ細胞を、ライブラリー構築のために回収する。好ましい実施態様では、ヘプシン免疫化により、ヘプシンに対するヒト抗体を産生するＢ細胞が生成するように、抗ヘプシンクローンに有利になるように偏ったヒト抗体遺伝子断片ライブラリーが、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを有する（及び機能的な内因性抗体産生系を欠く）トランスジェニックマウスにおける抗ヘプシン抗体応答を生成することによって得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製は以下に記載する。
【０１７３】
抗ヘプシン反応性細胞集団の更なる濃縮は、適切なスクリーニング手法を使用してヘプシン特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞を、例えば、ヘプシンアフィニティクロマトグラフィーによる細胞分離、又は蛍光色素標識ヘプシンへの細胞の吸着とその後の蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）によって単離することによって得ることができる。
【０１７４】
あるいは、非免疫化ドナーからの脾臓細胞及び／又はＢ細胞又は他のＰＢＬの使用によって可能な抗体レパートリーのより良い提示が提供され、またヘプシンが免疫原ではない任意の動物（ヒト又は非ヒト）種を利用した抗体ライブラリーの構築が可能となる。インビトロの抗体遺伝子コンストラクトを取り込むライブラリーに関しては、幹細胞を個体から収集して非再配列の抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。対象の免疫細胞は、様々な動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ目、オオカミ、犬科、ネコ科、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得ることができる。
【０１７５】
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコードする核酸を、対象の細胞から回収して増幅させる。再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーの場合では、その所望するＤＮＡは、Orlandi等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)に記載されているように、リンパ球からのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子の５'及び３'末端と一致するプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行うことによって得ることが可能であり、よって発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することができる。Ｖ遺伝子は、Orlandi等, (1989)及びWard等, Nature, 341: 544-546(1989)に記載のように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５'末端のバックプライマーとＪセグメントに基づいた順方向プライマーにより、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅させることができる。しかしながら、ｃＤＮＡからの増幅のためには、バックプライマーは、また、Jones等, Biotechnol., 9:88-89(1991)に記載のようにリーダーエクソンに、前方向プライマーは、Sastry等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:5728-5732(1989)に記載のように定常領域内に基づくことが可能である。相補性を最大にするために、Orlandi等(1989)又はSastry等(1989)に記載のように、縮重をプライマーへ取り込むことが可能である。好ましくは、例えば、Marks等, J. Mol. Biol., 222: 581-597(1991)の方法に記載のように、又はOrum等, Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498(1993)の方法に記載のように、免疫細胞の核酸試料に存在する全ての入手可能なＶＨ及びＶＬ配列を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的にしたＰＣＲプライマーを用いて、そのライブラリーの多様性を最大にする。発現ベクターへの増幅ＤＮＡのクローニングに関しては、希な制限部位を、Orlandi等(1989)に記載のように、又はClackson等, Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにタグ付加したプライマーによる更なるＰＣＲ増幅によって、ＰＣＲプライマー内の１つの末端へタグとして導入することができる。
【０１７６】
合成的に再配列したＶ遺伝子のレパートリーは、Ｖ遺伝子セグメントからインビトロで誘導することができる。殆どのヒトＶＨ遺伝子セグメントはクローニングされ配列決定されており（Tomlinson等, J. Mol. Biol. 227: 776-798(1992)に報告されている)、マッピングがされている（Matsuda等, Nature Genet., 3: 88-94(1993))；これらクローニングされたセグメント（Ｈ１及びＨ２ループの全ての主要なコンホメーションを含む）は、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、多様な配列と長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーによる多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作製するのに用いられる。ＶＨレパートリーは、また、Barbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461(1992)に記載されているように、単一の長さの長いＨ３ループに焦点を合わせた全ての配列多様性を伴って作製することができる。ヒトＶκ及びＶλセグメントはクローニングされ、配列決定がなされ（Williams及びWinter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461(1993)に報告されている）、合成軽鎖レパートリーを作製するのに使用されうる。ＶＨ及びＶＬフォールドの範囲及びＬ３及びＨ３の長さに基づく合成的Ｖ遺伝子レパートリーは、相当に構造的多様性を有する抗体をコードする。ＤＮＡをコードするＶ遺伝子の増幅に続いて、生殖系のＶ遺伝子セグメントを、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)の方法に従ってインビトロで再配列させることができる。
【０１７７】
抗体断片のレパートリーは、幾つかの方法でＶＨ及びＶＬ遺伝子レパートリーを共に組み合わせることによって構築することができる。各レパートリーを異なるベクターで作製し、そのベクターを、例えばHogrefe等, Gene, 128: 119-126(1993)に記載のようにインビトロで、又はコンビナトリアル・インフェクション、例えばWaterhouse等, Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266(1993)に記載のｌｏｘＰ系によってインビボで作製することが可能である。このインビボの組換え手法では、大腸菌の形質転換効率によって強いられるライブラリーの大きさの限界を克服するために、二本鎖種のＦａｂ断片を利用する。ナイーブなＶＨ及びＶＬレパートリーは、１つはファージミドへ、他はファージベクターへと別個にクローニングされる。この２つのライブラリーは、その後、各細胞が異なる組み合わせを含み、そのライブラリーの大きさが、存在する細胞の数（約１０１２クローン）によってのみ限定されるように、ファージミド含有細菌のファージ感染によって組合わせられる。双方のベクターは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコンへ組換えられ、ファージビリオンへ共にパッケージされるように、インビボの組換えシグナルを含む。これら巨大なライブラリーは、良好な親和性（約１０−８ＭのＫｄ−１)の多数の多様な抗体を提供する。
【０１７８】
別法として、該レパートリーは、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982(1991)に記載のように同じベクターへ連続してクローニングされ得、又は例えばClakson等, Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにＰＣＲによって一緒に組み立てられ、ついでクローニングされる。ＰＣＲアセンブリーは、また柔軟なペプチドスペーサーをコードしているＤＮＡとＶＨ及びＶＬ ＤＮＡを連結させて、単鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成することに利用することができる。更に他の技術では、「細胞内でのＰＣＲアセンブリー」は、Embleton等, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837(1992)に記載のように、ＰＣＲによってリンパ球内のＶＨ及びＶＬ遺伝子を組合わせ、その後、連結した遺伝子のレパートリーをクローニングするのに利用される。
【０１７９】
ナイーブのライブラリー（天然又は合成の何れか）によって産生された抗体は中度の親和性（約１０６から１０７Ｍ−１のＫｄ−１）でありうるが、上掲のWinter等(1994)に記載のように第二番目のライブラリーから構築し再選択することによって、親和性成熟をもインビトロで模倣することが可能である。例えば、Hawkins等, J. Mol. Biol. 226: 889-896(1992)の方法、又はGram等, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580(1992)の方法においてエラー・プローンポリメラーゼ（Leung等, Technique, 1:11-15(1989)で報告されている）を利用することによって、突然変異をインビトロでランダムに導入することができる。加えて、一又は複数のＣＤＲをランダムに変異させることによって、例えば、選択した個々のＦｖクローンにおいて、対象のＣＤＲまで及ぶランダム配列を有するプライマーによるＰＣＲを利用して、より高い親和性クローンをスクリーニングすることで親和性成熟を行うことが可能である。国際公開第９６０７７５４号（１９９６年３月１４日に公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域へ突然変異誘発を誘導して軽鎖遺伝子のライブラリーを作製する方法を記載している。その他の効果的な手法は、Marks等, Biotechnol. 10: 779-783(1992)に記載のように、非免疫化ドナーから得られた天然に生じるＶドメイン変異体のレパートリーによるファージディスプレイによって選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組換え、数回の鎖再シャッフリングでより高い親和性についてスクリーニングするものである。この技術は、１０−９Ｍの範囲の親和性の抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
【０１８０】
ヘプシン核酸及びアミノ酸配列は当該技術分野で知られている。ヘプシンをコードする核酸配列は、ヘプシンの所望の領域のアミノ酸配列を使用して設計することができる。当該技術分野でよく知られているように、ヘプシンの二つの主要なスプライスアイソフォーム、ヘプシンＩＩＩｂ及びヘプシンＩＩＩｃが存在する。ヘプシン配列は当該技術分野でよく知られており、図７及び８に示される配列を含みうる。
【０１８１】
ヘプシンをコードする核酸は当該技術分野で知られている様々な方法によって調製することができる。これらの方法は、限定しないが、Engels等, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989)に記載された方法の何れかによる化学的合成、例えばトリエステル、亜リン酸エステル、ホスホラミダイト及びＨ-ホスホナート法を含む。一実施態様では、発現宿主細胞によって好まれるコドンがヘプシンコートＤＮＡの設計において使用される。あるいは、ヘプシンをコードするＤＮＡはゲノム又はｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。
【０１８２】
ヘプシンをコードするＤＮＡ分子の構築に続いて、そのＤＮＡ分子は、プラスミド等の発現ベクターの発現コントロール配列に作用可能に連結され、ここで、コントロール配列は、そのベクターで形質転換される宿主細胞によって認識される。一般に、プラスミドベクターは、宿主細胞と適合性のある種から誘導される複製及びコントロール配列を含む。該ベクターは、通常は、形質転換細胞において表現型の選択を提供することが可能なタンパク質をコードする配列だけでなく複製部位を有する。原核宿主細胞及び真核宿主細胞での発現に好適なベクターは当該技術分野で知られており、幾つかが更にここに記載される。酵母菌などの原核生物、又は哺乳動物などの多細胞生物由来の細胞が使用されうる。
【０１８３】
場合によっては、ヘプシンをコードしているＤＮＡは宿主細胞によって培地中への発現産物の分泌を生じさせる分泌リーダー配列に作用可能に連結される。分泌リーダー配列の例には、ｓｔＩＩ、エコチン、ｌａｍＢ、ヘルペスＧＤ、ｌｐｐ、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、及びアルファ因子が含まれる。ここでの使用にまた適しているのはプロテインＡの３６アミノ酸リーダー配列である（Abrahmsen等, EMBO J., 4:3901(1985)）。
【０１８４】
宿主細胞はこの発明の上述の発現又はクローニングベクターでトランスフェクトされ、好ましくは形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように変性された常套的な栄養培地で培養される。
【０１８５】
トランスフェクションとは、実際に任意のコード化配列が発現されようとされまいと、宿主細胞による発現ベクターに取り込まれることを意味する。トランスフェクションの多くの方法は、当業者に知られており、例えば、ＣａＰＯ４沈降法及び電気穿孔法がある。一般に成功したトランスフェクションは、宿主細胞内で該ベクターの働きの兆候が現れたときに認識される。トランスフェクションの方法は当該技術分野でよく知られており、その幾つかをここに更に記載する。
【０１８６】
形質転換とは、ＤＮＡが染色体外成分として又は染色体組み込みによっての何れかで複製可能となるように、生物にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞によって、その細胞に適した標準的な技術を用いて形質転換は行われる。形質転換法は当該技術分野でよく知られおり、その幾つかをここに更に記載する。
【０１８７】
ヘプシンを産生するために用いる原核生物宿主細胞は、一般に上掲のSambrook等に記載のようにして培養されうる。
【０１８８】
ヘプシンを産生するために使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地で培養することができ、その培地は当該技術分野でよく知られおり、その幾つかをここに記載する。
【０１８９】
この開示で言及している宿主細胞には、インビトロ培養物の細胞並びに宿主動物内にある細胞が含まれる。
【０１９０】
ヘプシンの精製は、当分野で認識される方法を用いて実施され、その幾つかをここに記載する。
【０１９１】
ファージディスプレイクローンのアフィニティークロマトグラフィー分離での利用のために、例えば、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、様々なアクリルコポリマー、ヒドロキシルメタクリレートゲル、ポリアクリル及びポリメタクリルコポリマー、ナイロン、中性及びイオン性担体等の適切な基質へ精製ヘプシンを付着させることが可能である。基質へのヘプシンタンパク質の付着は、Methods in Enzymology, ４４巻(1976)に記載されている方法によって達成することができる。アガロース、デキストラン又はセルロース等の多糖類基質へタンパク質リガンドを付着させるために一般に用いられている技術には、ハロゲン化シアンによる担体の活性化、それに続く、活性化基質へのペプチドリガンドの第１級脂肪族又は芳香族アミンのカップリングが含まれる。
【０１９２】
あるいは、ヘプシンは、吸着プレートのウェルをコーティングするために使用し、吸収プレートへ付着させた宿主細胞上で発現させ、又はセルソーティングで使用し、又はストレプトアビジン被覆ビーズでの捕獲のためにビオチンにコンジュゲートさせ、又はファージディスプレイライブラリーをパニングするための任意の他の当該技術分野で既知の方法に使用することができる。
【０１９３】
吸着剤とのファージ粒子の少なくとも一部分の結合に適した条件下で、ファージライブラリーの試料を固定化ヘプシンと接触させる。通常は、ｐＨ、イオン強度、温度等を含む条件を選択して、生理学的条件を模倣する。固相と結合したファージを洗浄した後、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982(1991)に記載されているように酸で、又は例えばMarks等, J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載にされているようにアルカリで、又は例えばClackson等, Nature, 352: 624-628(1991)の抗原競合法に類似の手法においてヘプシン抗原競合によって、溶出させる。ファージは、１回目の選択で２０−１０００倍に濃縮することが可能である。更に、濃縮ファージを細菌培養液で増殖させ、更なる回の選択に供することが可能である。
【０１９４】
選択の効率は、洗浄間の解離の動態、単一ファージ上の複数の抗体断片が同時に抗原と関われるかどうかを含む多くの要因に依存する。速い解離動態（及び弱い結合親和性）を有する抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ及び固相抗原の高い被覆密度の使用によって保持することが可能である。高密度は、多価相互作用を介してファージを安定化するだけでなく、解離したファージの再結合に有利に作用する。遅い解離動態（及び良好な結合親和性）を有する抗体の選択は、Bass等, Proteins, 8: 309-314(1990)及び国際公開第９２／０９６９０号に記載されているような長い洗浄と単価ファージディスプレイの使用と、Marks等, Biotechnol., 10: 779-783(1992)に記載されているような抗原の低被覆密度によって促進することが可能である。
【０１９５】
親和性に僅かな違いがあったとしても、ヘプシンに対する異なる親和性のファージ抗体の中で選択することは可能である。しかしながら、選択した抗体のランダム変異（例えば、上記の幾つかの親和性成熟の技術で行われているような）は、多くの変異を生じやすく、その殆どが抗原と結合し、僅かがより高い親和性である。ヘプシンに限定すると、希な高い親和性のファージが競合して除かれることが可能である。全てのより高い親和性の変異を保持するために、ファージは、過剰のビオチン化ヘプシンと共にインキュベートすることが可能であるが、ヘプシンに対する標的モル濃度親和定数よりも低いモル濃度のビオチン化ヘプシンとインキュベートできる。ついで、高親和性結合ファージをストレプトアビジン被覆常磁性体ビーズによって捕獲することが可能である。そのような「平衡捕獲」は、結合の親和性に従い、親和性の低い過度のファージから、僅かに２倍高い親和性の変異体クローンの単離を可能にする感度で抗体を選択することを可能にする。固相と結合したファージを洗浄するのに用いる条件をまた操作して、解離定数を元に識別することも可能である。
【０１９６】
ヘプシンクローンは活性選択されうる。そのようなヘプシン抗体に対応するＦｖクローンは、（１）上述のようなファージライブラリーからヘプシンクローンを単離し、適切な細菌宿主において集団を生育させることによりファージクローンの単離集団を場合によっては増幅させることにより；（２）ブロック及び非ブロック活性がそれぞれ望まれるヘプシンと第二タンパク質を選択することにより；（３）固定されたヘプシンに抗ヘプシンファージクローンを吸着させることにより；（４）過剰の第二タンパク質を使用して、第二タンパク質の結合決定基にオーバーラップし又はそれと共有されるヘプシン結合決定基を認識する任意の望まれないクローンを溶出させることにより；及び（５）工程（４）の後に吸着されて残っているクローンを溶出させることにより、選択することができる。場合によっては、所望のブロック／非ブロック特性を有するクローンは、ここに記載された選択手順を一又は複数回繰り返すことにより更に濃縮することができる。
【０１９７】
本発明のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ又はファージディスプレイＦｖクローンは、常法を用いて（例えば、ハイブリドーマの対象の領域をコードする重鎖及び軽鎖又はファージＤＮＡ鋳型を特異的に増幅するように設定したオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより）即座に分離され、配列決定される。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、その状況以外では免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞における所望のモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体コードＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
【０１９８】
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列（例えば好適なＤＮＡ配列は上掲のKabat等から得ることができる）と組み合わせて、完全長又は部分長の重鎖及び／又は軽鎖をコードするクローンを形成できる。このために、何れかのアイソタイプの定常領域、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を用いることができることが理解され、このような定常領域は任意のヒト又は動物種から得ることができる。ある動物（例えばヒト）種の可変ドメインＤＮＡから得て、ついで「ハイブリッド」である完全長重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成するために他の動物種の定常領域ＤＮＡに融合したＦｖクローンは、ここで使用される「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。好ましい実施態様では、ヒト可変ＤＮＡから得たＦｖクローンをヒト定常領域ＤＮＡに融合して、全てのヒト、完全長又は部分長の重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成する。
【０１９９】
また、本発明のハイブリドーマ由来の抗ヘプシン抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ハイブリドーマクローン由来の相同的マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を置換すること（例えばMorrison等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851(1984)の方法）によって修飾することができる。ハイブリドーマ又はＦｖクローン由来の抗体又は断片をコードするＤＮＡは、免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全て又は一部を共有結合させることによって更に修飾することができる。このように、「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体は、本発明のＦｖクローン又はハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有するように調製される。
【０２００】
抗体断片
本発明は抗体断片を包含する。所定の状況では、全抗体よりも抗体断片の利用に利点がある。より小さいサイズの断片によりクリアランスが速くなり、固形腫瘍へのアクセスが改善されうる。
【０２０１】
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた（例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)；及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照）。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は全て大腸菌で発現され、分泌されるため、これらの断片の大規模産生が可能になる。抗体断片は上で検討した抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有する、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片は米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦＶ）である（国際公開９３/１６１８５；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと）。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域が欠けている完全な結合部を有する唯一の種である；よって、それらは、インビボでの使用の間の非特異的結合を減らすために適する。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端の何れかで、エフェクタータンパク質の融合物を得るために構築されうる。上掲のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「線状抗体」であってもよい。このような直線状の断片は単一特異的又は二重特異的でありうる。
【０２０２】
ヒト化抗体
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は従来からよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することにより、ウィンターと共同研究者の方法（Jones等(1986) Nature, 321:522-525；Riechmann等(1988) Nature, 332:323-327；Verhoeyen等(1988) Science, 239:1534-1536）に従って実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には幾つかの高頻度可変領域残基と場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０２０３】
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を作製する際に使用されるヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」によれば、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域として受け入れる（Sims等(1993) J. Immunol., 151:2296 ；Chothia等(1987) J. Mol. Biol., 196:901）。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを数種の異なるヒト化抗体に使用できる（Carter等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 ；Presta等(1993) J. Immunol., 151:2623）。
【０２０４】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、一方法によれば、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これらの表示を調べることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する増加した親和性のような、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０２０５】
ヒト抗体
本発明のヒト抗ヘプシン抗体は、上記のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列を既知のヒト定常ドメイン配列と結合することによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗ヘプシン抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は、例えばKozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991)によって記載されている。
【０２０６】
免疫化することで、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を生産することが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の転移は、抗原の投与によってヒト抗体の生産を生じる。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255(1993)；Jakobovits等, Nature 362, 255-258(1993)を参照のこと。
【０２０７】
また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が開始非ヒト抗体と類似した親和性及び特性を有している場合、非ヒト、例えば齧歯類抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法により、上記のファージディスプレイ技術により得られた非ヒト抗体断片の重鎖可変領域遺伝子又は軽鎖可変領域遺伝子の何れかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖ又はＦａｂキメラの集団を作製する。抗原を選択することにより、ヒト鎖が初めのファージディスプレイクローンにおいて一致した非ヒト鎖の除去により破壊された抗原結合部位を回復する、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖないしＦａｂが単離される、つまり、エピトープがヒト鎖のパートナーの選択をつかさどる(インプリントする)。残りの非ヒト鎖を置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ国際公開第９３／０６２１３を参照）。伝統的なＣＤＲ移植による非ヒト抗体のヒト化と異なり、この技術により、非ヒト起源のＦＲ又はＣＤＲ残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
【０２０８】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒト抗体ないしヒト化抗体である。この場合、結合特異性の一つはヘプシンに対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。例示的な二重特異性抗体は、ヘプシンの２つの異なるエピトープに結合しうる。また、二重特異性抗体はヘプシンを発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はヘプシン結合アーム及び細胞傷害剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン）と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片（例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０２０９】
二重特異性抗体を作製する方法は当該技術分野で知られている。伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの重鎖は異なる特異性を持っている（Millstein等, Nature, 305:537-539(1983)）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ（四部雑種）は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が１９９３年５月１３日に公開の国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０２１０】
異なった更に好適なアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗原−抗体結合部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合体と、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、構築に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０２１１】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性をもたらす）とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照のこと。
【０２１２】
他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体のような不要の他の最終産物に対してヘテロ二量体の収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０２１３】
二特異性抗体は架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの一方の抗体がアビジンと結合され得、他方がビオチンと結合されうる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため（米国特許第４６７６９８０号）及びＨＩＶ感染の治療のため（国際公報９１／００３６０、国際公報９２／００３７３及び欧州特許第０３０８９号）に提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の簡便な架橋方法によって作製することができる。適切な架橋剤は当該技術分野でよく知られており、多くの架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【０２１４】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) はインタクトな抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０２１５】
最近の進歩により大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片を直接回収することが容易となっており、これにより化学的にカップリングされて二重特異性抗体にを形成する。Shalaby 等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全なヒト化二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の産生について記述している。各々のＦａｂ'断片は大腸菌から別々に分泌されて、インビトロで化学的にカップリングされて、二重特異性抗体を形成する。よって、形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞に結合するだけでなく、ヒト乳癌の標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を引き起こすことができた。
【０２１６】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作製し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモ二量体はヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロ二量体を形成する。この方法はまた抗体ホモ二量体の生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)二量体を使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと。
【０２１７】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J.Immunol. 147:60(1991)。
【０２１８】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早く内部移行（及び／又は異化）されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体（ＩｇＭクラス以外のもの）であり得（例えば四価抗体）、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する（又はそれらからなる）。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３から約８、しかし好ましくは４の抗原結合部位を有する（又はそれらからなる）。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは２つのポリペプチド鎖）を有し、ポリペプチド鎖（類）は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖（類）はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖（類）は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ（好ましくは４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２から約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
【０２１９】
抗体変異体
幾つかの実施態様では、ここに開示される抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性を向上することができれば望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望する特徴を有していれば、欠失、挿入又は置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、配列が作製される時点で対象の抗体アミノ酸配列に導入されうる。
【０２２０】
突然変異誘発に好ましい位置である抗体の特定の残基又は領域の同定に有益な方法は、Cunningham及びWells(1989) Science, 244:1081-1085 (1989年)に開示されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的となる残基又は残基の組が同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電した残基）、中性の、又は負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン)で置換され、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。ついで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において、又は置換の部位のために、更なる又は他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定する必要はない。例えば、任意の部位における突然変異の機能を分析するために、標的コドン又は領域においてａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を実行し、発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
【０２２１】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さにわたるアミノ末端融合及び／又はカルボキシ末端融合、並びに単一又は多重アミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体、又は細胞傷害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチド又は（例えばＡＤＥＰＴのための）酵素の抗体のＮ末端又はＣ末端への融合が含まれる。
【０２２２】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン（ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸）のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作製される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
【０２２３】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列（Ｎ結合グリコシル化部位のもの）を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）。
【０２２４】
抗体がＦｃ領域を含有する場合、それに接着する炭水化物を変更してもよい。例えば、抗体のＦｃ領域に接着するフコースを欠損する成熟炭水化物構造の抗体は、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)に記載される。米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)も参照のこと。抗体のＦｃ領域に接着した炭水化物内のＮ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)を二分する抗体は、国際公開第０３／０１１８７８号，Jean-Mairet等、及び米国特許第６６０２６８４号，Umana 等が参照される。抗体のＦｃ領域に接着するオリゴサッカライド内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公開第９７／３００８７号，Patel等に報告されている。また、抗体のＦｃ領域に接着する変更された炭水化物を有する抗体については、国際公開第９８／５８９６４号(Raju, S.)及び国際公開第９９／２２７６４号(Raju, S.)も参照のこと。また、修飾されたグリコシル化を有する抗原結合分子については、米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号(Umana 等)を参照のこと。
【０２２５】
ここでの好ましいグリコシル化変異体はＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域に結合された炭水化物構造がフコースを欠いている。このような変異体は改善されたＡＤＣＣ機能を有する。場合によって、Ｆｃ領域は、更にＡＤＣＣを改善する一つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の位置２９８、３３３及び／又は３３４の置換（Ｅｕ残基番号付け）を更に含む。「脱フコース化」又は「フコース欠失」抗体に関する文献の例には以下のものを含む：米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；Okazaki 等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)。脱フコース化抗体を産生する細胞株の例として、タンパク質フコース化欠失Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka 等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８, Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２号, Adams 等、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例としてα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)）などがある。
【０２２６】
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも一つ（少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ以上）のアミノ酸残基に異なる残基が挿入されている。置換突然変異誘発について最も関心ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ改変も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表Ａに示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表Ａに「例示的置換」と名前を付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入して、生成物をスクリーニングしてもよい。
【０２２７】
表Ａ
2013507966.tif 000005
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持するそれらの効果において顕著に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【０２２８】
あるタイプの置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般に、更なる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異を含む。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位（例えば６−７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
【０２２９】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた様々な方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）又は初期に調製された抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
【０２３０】
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域内に一又は複数のアミノ酸修飾を導入してＦｃ領域変異型を生成することが望ましい。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステイン修飾を含む、一以上のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾（例えば、置換）を有するヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含みうる。
【０２３１】
この明細書と当該技術分野での教示に従って、幾つかの実施態様では、本発明の方法で使用される抗体は野生型の対応抗体と比較して例えばＦｃ領域内に一又は複数の変異を有しうることが考えられる。にもかかわらず、この抗体はその野生型対応物と比較して治療的有用性を示す実質的に同じ特徴を維持している。例えば国際公開第９９／５１６４２号に記載のように、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を変更する（すなわち改良又は減少する）結果となる所定の改変をＦｃ領域内に生じさせることが考えられる。また、Ｆｃ領域変異型の他の例に関するDuncan及びWinter Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号を参照。国際公開第００／４２０７２号(Presta)及び国際公開第２００４／０５６３１２号(Lowman)は、ＦｃＲへの結合が改善したか、減退した抗体変異体を開示している。これらの特許文献の内容は出典明示によってここに特に援用される。また、Shields 等 J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照のこと。胎児への母性ＩｇＧの移送を担う（Guyer 等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim 等, J. Immunol. 24:249 (1994)）増加した半減期と改善した新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）への結合性を有する抗体は米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Hinton等）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上させる一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含んでなる。Ｆｃ領域アミノ酸配列が変更されてＣ１ｑ結合能力が増加したか減少したポリペプチド変異体は、米国特許第６１９４５５１Ｂ１号、国際公開第９９／５１６４２に記載されている。その特許文献の内容は出典明示によって特にここに援用される。また、Idusogie 等, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
【０２３２】
抗体誘導体
抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーかランダムコポリマー）、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【０２３３】
所望の特性を有する抗体のスクリーニング
本発明の抗体は当該技術分野で知られている様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び生物学的機能について特徴付けることができる。幾つかの実施態様では、抗体は、ヘプシン結合、ヘプシン活性の低減又は遮断、ヘプシン及び／又はヘプシン基質（例えばプロ−ＭＳＰ、プロ−ｕＰＡ、ＶＩＩ因子、プロ−ＨＧＦ）下流分子のシグナル伝達の低減又は遮断、及び／又は腫瘍、細胞増殖性疾患又は癌の治療及び／又は予防；及び／又はヘプシンの発現及び／又は活性（例えばヘプシン発現及び／又は活性の増加）と関連する疾患の治療又は予防の何れか一又は複数に特徴がある。
【０２３４】
幾つかの実施態様では、ヘプシン活性ヘプシン酵素活性である。一実施態様では、酵素活性はヘプシンのポリペプチド基質の切断を含む。一実施態様では、ヘプシンのポリペプチド基質はプロ−マクロファージ刺激タンパク質（プロ−ＭＳＰ）、プロ−ｕＰＡ、ＶＩＩ因子及びプロ−ＨＧＦの一又は複数である。プロ−ＭＳＰのヘプシン活性は、２００９年１０月２２日出願の同時継続で共有に係る米国仮特許出願第６１／２５３９９０号に記載されている。一実施態様では、酵素活性はヘプシンの合成基質の切断を含む。幾つかの実施態様では、ヘプシン合成基質は表１に示した基質である。
【０２３５】
精製された抗体は、限定されるものではないが、Ｎ末端シークエンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む一連のアッセイによって更に特徴付けることができる。
【０２３６】
本発明の所定の実施態様では、ここで生産された抗体がその生物学的活性について分析される。幾つかの実施態様では、本発明の抗体はその抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、ここで使用することができる抗原結合アッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイのような技術を用いた任意の直接的又は競合的結合アッセイが制限なく含まれる。例示的抗原結合及び他のアッセイは以下の実施例セクションに提供される。
【０２３７】
細胞増殖を阻害する抗ヘプシン抗体が望まれる場合、候補抗体を、細胞増殖の阻害を測定するインビトロ及び／又はインビボアッセイで試験することができる。癌細胞の成長及び／又は増殖を検査する方法は当該技術分野でよく知られている。細胞成長及び／又は増殖及び／又はアポトーシスを決定するための例示的方法は、例えばＢｒｄＵ取り込みアッセイ、ＭＴＴ、［３Ｈ］−チミジン取り込み（例えばＴｏｐＣｏｕｎｔアッセイ（PerkinElmer)）、細胞生存率アッセイ（例えばＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Promega））等を含む。
【０２３８】
一実施態様では、本発明は抗体は、エフェクター機能を有する抗体を考える。所定の実施態様では、抗体のＦｃ活性が測定される。インビボ及び／又はインビトロ細胞傷害アッセイを実施して、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠損している（よってＡＤＣＣ活性を欠損している可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介する主要細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲIIIのみを発現する一方、単核細胞はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血系細胞でのＦｃＲ発現については、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデル内でインビボで評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できず、よってＣＤＣ活性を欠損していることを確認することもできる。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のようなＣＤＣアッセイを実施してもよい。また、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の測定を、当該技術分野で知られている方法を使用して実施することができる。
【０２３９】
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
抗体の組換え生産のためには、それをコードする核酸を単離し、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは一般的な手順で直ぐに単離し、配列決定される（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）。多くのベクターが利用可能である。使用される宿主細胞に部分的に依存してベクターを選択する。一般に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物（一般的に哺乳動物）由来の細胞である。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域をこの目的のために使用することができ、このような定常領域は任意のヒト又は動物種から得られうることは理解されるであろう。
【０２４０】
原核生物宿主細胞を使用する抗体の産生
ｉ．ベクター構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はＰＣＲ法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該技術分野において入手でき、知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能（異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現あるいはその両方）及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終結配列が含まれる。
【０２４１】
一般には、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種に由来するコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、これら宿主と関連して使用される。ベクターは、通常、複製開始点並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、大腸菌は、典型的には、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリン(Ａｍｐ)及びテトラサイクリン(Ｔｅｔ)耐性のコード遺伝子を含んでいるため、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージも外来性タンパク質を発現する微生物によって使用可能なプロモータを含むか、含むように変更される。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はCarter等の米国特許第５６４８２３７号に詳細に記載されている。
【０２４２】
また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ.ＴＭ.-１１のようなバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。
【０２４３】
本発明の発現ベクターは各ポリペプチド成分をコードする２又はそれ以上のプロモータ−シストロン対を含みうる。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流(５')に位置している非翻訳配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導性と構成的との二つのクラスのものがある。誘導性プロモーターは、例えば栄養分の有無又は温度の変化のような、培養条件の変化に応答してその調節下でシストロンの転写レベルを増大させるように誘導するプロモーターである。
【０２４４】
様々な潜在的宿主細胞によって認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモータを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモータを挿入することによって、軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を生じさせるために使用することができる。幾つかの実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現される標的遺伝子をより多く転写させ、収率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
【０２４５】
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能性である他のプロモーター（例えば他の既知の細菌又はファージプロモーター）も好適である。そのヌクレオチド配列は刊行されており、よって当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するリンカー又はアダプターを使用して標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを作用可能に結合させることができる（Siebenlist等 (1980) Cell 20:269）。
【０２４６】
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、又はベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる（つまりシグナルペプチダーゼにより切断される）ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。本発明の一実施態様では、発現系の双方のシストロンに使用されるシグナル配列はＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
【０２４７】
他の態様では、本発明に係る免疫グロブリンの生産は宿主細胞の細胞質内で起こりうるので、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は必要としない。この点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖が発現され、折り畳まれ、集合して細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ある種の宿主株（例えば大腸菌ｔｒｘＢ株）はジスルフィド結合形成に好ましい細胞質条件を提供し、それによって発現したタンパク質サブユニットの適切な折り畳み及び組み立てを可能にする。Proba及びPluckthun Gene, 159:203 (1995)。
【０２４８】
本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属（例えば大腸菌）、バシラス属（例えば枯草菌）、エンテロバクター属、シュードモナス種（例えば緑膿菌）、ネズミチフス菌、霊菌（Serratia marcescans）、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ（Vitreoscilla）又はパラコッカス（Paracoccus）が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR を有する３３Ｄ３株(米国特許第5639635号)を含むW3110株（Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁；ＡＴＣＣ寄託番号２７３２５）及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌λ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１６０８）など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義された遺伝子型を有する上述の細菌の何れかの誘導体を構築する方法は当該技術分野で知られており、例えばBass等, Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的には、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
【０２４９】
ｉｉ．抗体産生
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された一般的栄養培地中で培養する。
【０２５０】
形質転換とは、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用される更に別の方法はエレクトロポレーションである。
【０２５１】
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地(ＬＢ)プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。幾つかの実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
【０２５２】
炭素、窒素及び無機リン酸源の他に任意の必要なサプリメントを、単独で、又は複合窒素源のような他のサプリメント又は培地との混合物として導入される適切な濃度で含めさせうる。場合によっては、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含みうる。
【０２５３】
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、好適な温度は約２０℃から約３９℃、より好ましくは約２５℃から約３７℃の範囲、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５から約９の範囲の任意のｐＨでありうる。大腸菌に対しては、ｐＨは好ましくは約６．８から約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０２５４】
本発明の発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにＰｈｏＡプロモータが用いられる。従って、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸制限培地で培養する。好ましくは、リン酸制限培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Simmons等, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照）。当該技術分野で知られているように、様々な他の誘導因子を、用いるベクターコンストラクトに応じて使用してもよい。
【０２５５】
一実施態様では、本発明の発現されたポリペプチドは宿主細胞の周辺質に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、一般的には浸透圧ショック、超音波処理又は溶解のような手段によって、典型的には微生物を破壊することを含む。ひとたび細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞を遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質は、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製することができる。あるいは、タンパク質は培養培地に輸送しそこで分離することができる。細胞を培養物から除去することができ、培養上清は濾過され、生成したタンパク質の更なる精製のために濃縮される。発現されたポリペプチドを更に単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロットアッセイ法のような一般的に知られている方法を使用して同定することができる。
【０２５６】
本発明の一態様では、抗体産生は発酵法によって多量に実施される。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１０００から１０００００リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ１００リットル以下の容積で、約１リットルから約１００リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
【０２５７】
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下で、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約１８０−２２０のＯＤ５５０まで増殖したところで開始される。当該技術分野で知られ上述されたように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々な誘導因子を使用することができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させうる。細胞は通常約１２−５０時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
【０２５８】
本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの適切な組立てと折り畳みを改善するために、例えばＤｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス−イソメラーゼ）のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを使用して宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等, 米国特許第６０８３７１５号；Georgiou等, 米国特許第６０２７８８８号；Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
【０２５９】
発現された異種タンパク質（特にタンパク分解を受けやすいもの）のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998)；Georgiou等, 米国特許第５２６４３６５号；Georgiou等, 米国特許第５５０８１９２号；Hara等, Microbial Drug Resistance 2:63-72 (1996)に記載されている。
【０２６０】
一実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損し、一又は複数のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として使用する。
【０２６１】
ｉｉｉ．抗体精製
当該技術分野で知られている標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は適切な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び例えばSephadex G-75を用いたゲル濾過法。
【０２６２】
一態様では、固相に固定したプロテインＡを本発明の完全長抗体産物の免疫親和性精製に使用する。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌からの４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Lindmark等, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)。プロテインＡを固定した固相は、ガラス又はシリカ表面、より好ましくは孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムが好ましい。ある応用では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。
【０２６３】
精製の最初の工程として、上に記載のように細胞培養物から誘導された調製物をプロテインＡ固定固相に適応し、プロテインＡに対象の抗体を特異的に結合させる。ついで、固相を洗浄して、固相に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固相から除去する。
【０２６４】
ｂ．真核生物の宿主細胞を用いた抗体の産生
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、次の一又は複数を含む：シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー因子、プロモーター、及び転写終結因子。
【０２６５】
（ｉ）シグナル配列成分
真核生物宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、抗体をコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。
【０２６６】
（ｉｉ）複製開始点
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
【０２６７】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）関連がある場合は栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０２６８】
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
【０２６９】
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
【０２７０】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート（Ｍｔｘ）を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）株化細胞である（例えば、ATCC CRL-9096）。
【０２７１】
あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞（特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
【０２７２】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物のプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【０２７３】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
【０２７４】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０２７５】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０２７６】
（ｖｉ）転写終結成分
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【０２７７】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養（組織培養）中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ（ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；サルの腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（ＨｅｐＧ２）である。
【０２７８】
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【０２７９】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
この発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は様々な培地において培養することができる。市販培地、例えばハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第４７６７７０４号；同第４６５７８６６号；同第４９２７７６２号；同第４５６０６５５号；又は同第５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の増殖因子（例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ薬）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される）及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０２８０】
（ｉｘ）抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０２８１】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ＡＢＸＴＭ樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
【０２８２】
予備的精製工程に続いて、目的の抗体及び混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度（例えば、約０−０．２５Ｍ塩）の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィーを行う。
【０２８３】
イムノコンジュゲート
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）などの細胞毒性剤にコンジュゲートしたここに記載の抗ヘプシン抗体を含む、イムノコンジュゲート（「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と交換可能に称される）を考慮する。
【０２８４】
細胞傷害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局所的送達に抗体−薬剤コンジュゲートを用いると（Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第４９７５２７８号）、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、ここで、これら非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与は正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる（Baldwin等, (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera等編, pp. 475-506）。これによって、最小限の毒性で最大限の効果が求められる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は共にこの方策に有用であるとして報告されている（Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87）。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる（Rowland等, (1986)、上掲）。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン（Mandler等(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandler等(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandler等(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド（欧州特許出願公開第１３９１２１３号；Liu等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623）、及びカリケアマイシン（Lode等, (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等, (1993) Cancer Res. 53:3336-3342）などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞傷害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞傷害薬は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
【０２８５】
ゼバリン(ZEVALIN)(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン, Biogen/Idec)は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と１１１Ｉｎ又は９０Ｙ放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤によって結合させられた抗体−放射性同位体コンジュゲートである（Wiseman等, (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等, (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69）。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球（ＮＨＬ）に対して活性を有するが、投与によって殆どの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)(登録商標)(ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals)は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として２０００年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第４９７０１９８号；同第５０７９２３３号；同第５５８５０８９号；同第５６０６０４０号；同第５６９３７６２号；同第５７３９１１６号；同第５７６７２８５号；同第５７７３００１号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療用に第ＩＩ相治験へと進んでいる。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療の開発段階にある。オーリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ（ＡＥ）及びモノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）、ドラスタチンの合成アナログは、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌細胞上のルイスＹに特異的）及びｃＡＣ１０（血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的）（Doronina等, (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784）にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
【０２８６】
イムノコンジュゲートの生成に有用な化学療法剤はここに（例えば上記）記載されている。使用することのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。例えば１９９３年１０月２８日に公開の国際公開第９３／２１２３２を参照のこと。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞傷害性薬のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１,５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。
【０２８７】
抗体と一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、オーロスタチン(aurostatins)、トリコテシン及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体のコンジュゲートがまたここで考察される。
【０２８８】
ｉ．メイタンシン及びメイタンシノイド
幾つかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子とコンジュゲートされた抗体（完全長又は断片）を含んでなる。
【０２８９】
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することにより作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離された（米国特許第３８９６１１１号）。その後、ある種の微生物がまたメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された（米国特許第４１５１０４２号）。合成メイタンシノール及びその誘導体及びアナログは、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されている。
【０２９０】
メイタンシノイド薬剤部分は、（ｉ）発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化による調製が相対的に利用可能であり、（ｉｉ）抗体に対する非ジスルフィドリンカーによるコンジュゲーションに適した官能基を用いた誘導体化に受け入れられ、（ｉｉｉ）血漿中で安定であり、（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して効果的であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
【０２９１】
メイタンシノイドを含むイムノコンジュゲート、その製造方法、及びその治療用途は、例えば米国特許第５２０８０２０号、同５４１６０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典明示により明示的にここに援用される。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合したＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含むイムノコンジュゲートが記載されている。該コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞傷害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィドリンカーを介して、ヒト結腸癌株化細胞上の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合しているイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞傷害性は、細胞当たり３×１０５のＨＥＲ-２表面抗原を発現するヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞傷害度が達成され、これが、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加させられうる。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞傷害性を示した。
【０２９２】
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子の何れの生物学的活性も有意には低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第５２０８０２０号（この開示内容は出典明示により明示的にここに援用される）を参照。毒素／抗体のたとえ一分子でも、ネイキッド抗体の使用に対して細胞傷害性を高めることが予想されるが、抗体分子当たり平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞傷害性を向上させる効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、既知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号及び他の特許及び上述した非特許刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノールアナログである。
【０２９３】
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び２００４年１０月８日に出願の米国特許出願番号１０／９６０６０２（これらの開示内容は出典明示によりここに明示的に援用される）に開示されているもの等を含め、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術分野で知られている多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、２００４年１０月８日に出願の米国特許出願第１０／９６０６０２号に開示されるようにして調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているような、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基をここに記載し、例証する。
【０２９４】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物（例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート（ＳＰＰ）及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート（ＳＰＤＰ）(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737(1978))が含まれる。
【０２９５】
リンカーは結合のタイプに応じて、様々な位置でメイタンシノイド分子に結合されうる。例えば、一般的なカップリング技術を使用してヒドロキシル基との反応によりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じうる。好ましい実施態様では、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールアナログのＣ-３位に形成される。
【０２９６】
ｉｉ．オーリスタチン類及びドラスタチン類
幾つかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジルアナログ及び誘導体、オーリスタチン（米国特許第５６３５４８３号及び同第５７８０５８８号）にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ（Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584）、抗癌活性（米国特許第５６６３１４９号）及び抗真菌性活性（Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965）を有することが示されている。ドラスタチン又はオーリスタチン薬剤部分は、ペプチド薬剤部分のＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に結合されうる（国際公開第０２／０８８１７２号）。
【０２９７】
例示的なオーリスタチンの実施態様は、２００４年１１月５日に出願された"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、米国特許出願第１０／９８３３４０号に開示されたＮ末端連結モノメチルオーリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦを含み、この開示は出典明示によってその全体が明示的に援用される。
【０２９８】
典型的には、ペプチドベースの薬剤部分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間にペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野においてよく知られている液相合成方法に従って調製することができる（E. Schroder及びK. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照）。オーリスタチン／ドラスタチン薬剤部分は、米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号；Pettit 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725；及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863の方法に従って調製されうる。また、出典明示によってその全体がここに援用されるDoronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784；"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", ２００４年１１月５日に出願の米国特許出願第１０／９８３３４０号（例えば、リンカー及びリンカーにコンジュゲートされたＭＭＡＥ及びＭＭＡＦのようなモノメチルバリン化合物を調製する方法を開示している）も参照のこと。
【０２９９】
ｉｉｉ．カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じせしめることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号（全て、American Cyanamid Company）を参照のこと。使用されうるカリケアマイシンの構造アナログには、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１（Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許）が含まれる。抗体がコンジュゲートされうる他の抗腫瘍薬は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、細胞膜を容易には通過しない。従って、抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、その細胞傷害効果が大きく向上させられる。
【０３００】
ｉｖ．他の細胞傷害剤
本発明の抗体にコンジュゲートされうる他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として知られている薬剤ファミリー、並びにエスペラマイシン（米国特許第５８７７２９６号）が含まれる。
【０３０１】
使用されうる酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ）、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
【０３０２】
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物（例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ）との間に形成されるイムノコンジュゲートを更に考察する。
【０３０３】
腫瘍の選択的な破壊のために、抗体は高い放射性を有する原子を含んでいてもよい。放射性コンジュゲート抗体の生産には様々な放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像（磁気共鳴映像、ｍｒｉとしても知られている）用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含みうる。
【０３０４】
放射-又は他の標識が、既知の方法でコンジュゲートに導入されうる。例えば、ペプチドが生合成されうるか、又は水素の代わりに例えばフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成されうる。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合されうる。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合されうる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57）は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０３０５】
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは細胞中の細胞傷害剤の放出を容易にする「切断可能リンカー」でありうる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーを使用しうる（Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号）。
【０３０６】
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより）市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル-(４-ビニルスルホン)安息香酸塩）を用いて調製されるＡＤＣが明示的に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの４６７−４９８頁を参照。
【０３０７】
ｖ．抗体薬剤コンジュゲートの調製
本発明の抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）において、抗体（Ａｂ）を、リンカー（Ｌ）を介して、一又は複数の薬剤部分（Ｄ）、例えば抗体につき約１から約２０の薬剤部分にコンジュゲートさせる。式ＩのＡＤＣは、（１）抗体の求核基を二価リンカー試薬と反応せ、共有結合を介してＡｂ−Ｌを形成し、ついで薬剤部分Ｄと反応させること；及び（２）薬剤部分の求核基を二価のリンカー試薬と反応させ、共有結合を介してＤ−Ｌを形成し、ついで抗体の求核基と反応させることを含む、当業者に知られている有機化学反応、条件、及び試薬を用いて、幾つかの経路によって調製されうる。ＡＤＣを調製するための更なる方法はここに記載される。
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐ            Ｉ
リンカーは一又は複数のリンカー成分からなりうる。例示的なリンカー成分は、６-マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン-シトルリン（「ｖａｌ-ｃｉｔ」）、アラニン-フェニルアラニン（「ａｌａ-ｐｈｅ」）、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル（「ＰＡＢ」）、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル（「ＳＩＡＢ」）を含む。更なるリンカー成分は当該技術分野で知られており、その幾つかはここに記載される。また、その内容が出典明示によりここに援用される"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、２００４年１１月５日に出願した米国出願第１０／９８３３４０号を参照のこと。
【０３０８】
幾つかの実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドは、バリン-シトルリン（ｖｃ又はｖａｌ-ｃｉｔ）、アラニン-フェニルアラニン（ａｆ又はａｌａ-ｐｈｅ）を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン-バリン-シトルリン（ｇｌｙ-ｖａｌ-ｃｉｔ）及びグリシン-グリシン-グリシン（ｇｌｙ-ｇｌｙ-ｇｌｙ）を含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸アナログ、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設計され得、特定の酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化されうる。
【０３０９】
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖ヒドロキシル又はアミノ基。アミン、チオール及びヒドロキシル基は求核性であり、反応して、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基を含むリンカー試薬及びリンカー部分上の求電子基と共有結合を形成することができる。所定の抗体は、還元性鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ（ジチオトレイトール）での処理によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲーションに反応性にせしめうる。よって、各システイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。更なる求核基を２-イミノチオラン（トラウト試薬）とリジンの反応を介して抗体に導入し、チオールにアミンを転換させうる。反応性チオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する（例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含む変異体抗体を調製する）ことによって抗体に導入されうる。
【０３１０】
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して、リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応させることができる求電子部分を導入することによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化し、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応しうるアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定な結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元されうる。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤（Hermanson, Bioconjugate Techniques）上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル（アルデヒド及びケトン）基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含むタンパク質がナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一アミノ酸の代わりにアルデヒドの生産を生じる（Geoghegan及びStroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；米国特許第５３６２８５２号）。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応しうる。
【０３１１】
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、反応して、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基を含むリンカー試薬及びリンカー部分上の求電子基と共有結合を形成することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基を含む。
【０３１２】
別法として、抗体及び細胞傷害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製されうる。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードするそれぞれの領域を含みうる。
【０３１３】
更に他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために抗体を「レセプター」（例えばストレプトアビジン）にコンジュゲートされ得、ここで抗体-レセプターコンジュゲートが個体に投与され、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートが除去され、細胞傷害剤（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされる「リガンド」（例えばアビジン）が投与される。
【０３１４】
抗ヘプシン抗体を使用する方法
本発明は、該治療剤の活性から有益な効果をもたらすことが意図される特定の治療レジメンの一部としてヘプシン抗体の使用を特徴とする。本発明は、様々なステージの様々なタイプの癌を治療するのに特に有用である。
【０３１５】
癌なる用語は、増殖異常の集合を包含し、限定しないが、前癌性の増殖、良性腫瘍、及び悪性腫瘍を含んでいる。良性腫瘍は、原発部位に局在したままであり、遠隔部位への浸潤能、侵入能、又は転移能を有していない。悪性腫瘍は周辺の他の組織に侵入してそれらの組織を損傷する。悪性腫瘍はまた通常は血流を介して又はリンパ節が位置するリンパ系を介して、原発部位を離れて身体の他の部分へ広がる（転移する）能力を獲得しうる。原発腫瘍は、腫瘍が生じた組織の種類により分類され、転移性腫瘍は、癌細胞が由来する組織タイプによって分類される。時間の経過に伴い、悪性腫瘍の細胞はより異常になって、正常細胞とは外観を異にする。このような癌細胞の外観の変化は腫瘍悪性度と呼ばれ、癌細胞は、高分化型（低悪性度）、中程度に分化型、低分化型、又は未分化型（高悪性度）と記述される。高分化型細胞は、極めて正常な外観を有し、それらの細胞の起源である正常細胞に類似している。未分化細胞は、異常性が高いためにもはやそれら細胞の起源を決定することができない細胞である。
【０３１６】
癌ステージ分類システムは、解剖学的に癌が如何に遠くまで広がっているかを記述し、同じステージ群において患者に類似の予後及び治療を付与しようとするものである。幾つかの試験を実施することにより、胸部ｘ線、マンモグラフィー、骨スキャン、ＣＴスキャン、及びＭＲＩスキャンのような所定の画像処理試験及び組織診を含む癌のステージ分類を補助することができる。患者の全体的な健康状態を評価し、癌が特定の器官に広がっているかどうかを検出するために、血液検査及び臨床評価もまた使用される。
【０３１７】
癌のステージ分類を行うために、アメリカ癌合同委員会（American Joint Committee on Cancer）は、最初に癌、特に固形腫瘍を、ＴＮＭ分類システムを用いて文字により分類している。癌は、文字Ｔ（腫瘍の大きさ）、Ｎ（触知可能なリンパ節）、及び／又はＭ（転移）で標記される。Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、及びＴ４は、原発病巣の増加サイズを記述し；Ｎ０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３は、進行的にリンパ節関与が進んでいることを示し；Ｍ０及びＭ１は遠隔転移の有無を反映させている。
【０３１８】
全病期分類（Overall Stage Grouping）又はローマ数字式分類（Roman Numeral Staging）としても知られている第２のステージ分類法では、原発病巣の大きさとリンパ節への伝播と遠隔転移の存在を組み合わせて、癌を段階０からＩＶに分類するものである。このシステムでは、症例は、ローマ数字ＩからＩＶにより示される４つのステージにグループ分けされるか、又は「再発性」と分類される。乳癌の腺管上皮内癌又は非浸潤性小葉癌といった幾つかの症例の場合、ステージ０は「上皮内」又は「Ｔｉｓ」と呼ばれる。高悪性度の腺腫もステージ０に分類される。一般に、ステージＩの癌は通常は治癒可能である小さく局在化した癌であるが、ステージＩＶは、通常、手術不可能な癌又は転移性の癌を表わす。ステージＩＩ及びＩＩＩの癌は、通常、局所的に進行しており、及び／又は局所的リンパ節の関与を示す。一般に、ステージの番号が大きい程、腫瘍の大きさ、及び／又は近くのリンパ節及び／又は原発腫瘍に隣接する器官への伝播を含め、疾病が広範囲に亘ることを示す。これらのステージは正確に定義されるが、定義は、各種の癌によって異なっており、当業者に知られている。
【０３１９】
ＮＣＩの監視、疫学、及び遠隔成績プログラム（ＳＥＥＲ）のような多くの癌の記録では、略式のステージ分類を使用する。このシステムは、全ての種類の癌に使用されている。これは、癌の症例を以下の５つの主要なカテゴリにグループ分けするものである。
上皮内は、それが生じた細胞の層にのみ存在する早期癌である。
限局は、転移の証拠は無く、それが生じた器官に限定されている癌である。
隣接転移は、最初の（原発）部位を越えて近くのリンパ節又は器官及び組織に広がった癌である。
遠隔転移は、原発部位から遠隔器官又は遠隔リンパ節に広がった癌である。
不明は、ステージを示す十分な情報がない症例を記述するために使用される。
【０３２０】
加えて、原発腫瘍が除去されてから数か月又は数年後に、癌が再発することは珍しくない。可視の腫瘍が全て根絶された後に再発する癌は、再発性癌と呼ばれる。原発腫瘍の領域に再発する疾病は、局所的に再発性であり、転移として再発する癌は遠隔再発と呼ばれる。
【０３２１】
腫瘍は固形腫瘍であるか、あるいは非固形腫瘍又は軟組織腫瘍でありうる。軟組織腫瘍の例には、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ球性白血病、又はヘアリーセル白血病）、あるいはリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、又はホジキン病）が含まれる。固形腫瘍には、血液、骨髄、又はリンパ系以外の身体組織のあらゆる癌が含まれる。固形腫瘍は、更に、上皮細胞を起源とするものと、非上皮細胞を起源とするものとに分けられる。上皮細胞固形腫瘍の例には、胃腸管、結腸、乳房、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、頭頚部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、大陰唇、上咽頭、皮膚、子宮、雄性生殖器、尿路、膀胱、及び皮膚の腫瘍が含まれる。非上皮起源の固形腫瘍には、肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍が含まれる。腫瘍の他の例は定義のセクションに記載する。
【０３２２】
幾つかの実施態様では、ここでの患者に対し、例えば治療前、及び／又は治療中、及び治療後に診断検査を行う。一般に、診断検査が実施される場合、治療を必要とする患者から試料を採取することができる。被験者が癌に罹患している場合、試料は腫瘍試料、又はその他の生物学的試料であり得、例えば、限定しないが、血液、尿、唾液、腹水、又は血清及び血漿のような派生物などを含む生物学的流体である。
【０３２３】
ここにおける生物学的試料は、固定試料、例えばホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）試料であるか、又は凍結試料である。
【０３２４】
ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を決定するための様々な方法は、限定しないが、遺伝子発現プロファイリング、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マイクロアレイ分析、遺伝子発現の連続分析法（ＳＡＧＥ）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、大規模並行シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析、プロテオミクス、免疫組織化学（ＩＨＣ）などを含む。好ましくは、ｍＲＮＡが定量される。このようなｍＲＮＡ分析は、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技術を使用して、又はマイクロアレイ分析により実施される。ＰＣＲが用いられる場合、ＰＣＲの好ましい形態は定量的リアルタイムＰｃＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。一実施態様では、上記遺伝子のうちの一又は複数の発現は、例えば同じ腫瘍種類の他の試料と比較して、中央値以上である場合に陽性発現とみなされる。中央値発現レベルは、遺伝子発現の測定と本質的に同時に決定することができるか、又は事前に決定されていてもよい。
【０３２５】
ＲＮＡ源として固定パラフィン包埋組織を使用する遺伝子発現のプロファイリングの代表的なプロトコールのステップは、ｍＲＮＡの単離、精製、プライマーの伸張、及び増幅を含み、様々な出版されたジャーナル記事に記載されている（例えば、Godfrey等 J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000)；Specht等, Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)）。簡単に説明すると、代表的なプロセスは、厚さ約１０マイクログラムのパラフィン包埋腫瘍組織の試料を切断することで開始される。ついでＲＮＡを抽出し、タンパク質及びＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度の分析後、必要に応じてＲＮＡ修復ステップ及び／又は増幅ステップを含ませ、遺伝子特異的プロモーターを用いてＲＮＡを逆転写し、その後ＰＣＲを行う。最後に、データを分析することにより、試験した腫瘍試料において特定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づいて患者が受けることができる最善の治療オプションを特定する。
【０３２６】
遺伝子又はタンパク質発現の検出は、直接的に又は間接的に決定することができる。
（直接的に又は間接的に）癌におけるヘプシンの発現又は増幅を決定することができる。様々な診断／予後判定アッセイが、このために利用可能である。一実施態様では、ヘプシン過剰発現は、ＩＨＣによって分析することができる。腫瘍生検由来のパラフィン包埋組織切片に対してＩＨＣアッセイを行い、次のようなヘプシンタンパク質染色強度基準と合致させてもよい：
スコア０：染色が観察されないか、又は膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋：僅かに／弱く認知できる程度の膜染色が１０％を上回る腫瘍細胞に検出される。細胞はその膜の一部においてのみ染色される。
スコア２＋：弱いないしは中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
スコア３＋：中程度から強い完全な膜染色が１０％を上回る腫瘍細胞に観察される。
【０３２７】
幾つかの実施態様では、ヘプシンの過剰発現に関して０又は１＋スコアを呈する腫瘍は、ヘプシンを過剰発現しないことを特徴としうるものであるのに対し、２＋又は３＋スコアを呈する腫瘍は、ヘプシンの過剰発現を特徴としうる。
【０３２８】
あるいは、又は加えて、ＦＩＳＨアッセイを、ホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍組織について実施し、腫瘍における（ある場合には）ヘプシン増幅の存在及び／又は範囲を決定することができる。
【０３２９】
ヘプシン活性化は、直接的に（例えば、ホスホ−ＥＬＩＳＡ試験、又はリン酸化レセプターを検出する他の手段により）、あるいは間接的に（例えば、活性化した下流のシグナル伝達経路成分の検出、レセプター二量体（例えば、ホモ二量体、ヘテロ二量体）の検出、遺伝子発現プロファイルの検出等により、決定することができる。
【０３３０】
核酸突然変異の検出のための方法は当該技術分野でよく知られている。しばしば、必ずしもそうではないが、突然変異が存在するかどうかの決定のために望ましい量の材料を得るために、試料中の標的核酸が増幅される。増幅技術は当該技術分野でよく知られている。例えば、増幅産物が突然変異があると疑われる特定のアミノ酸配列位置／核酸配列位置を含む限り、対象とするタンパク質をコードする全ての核酸配列を包含してもよいし、包含しなくてもよい。
【０３３１】
標的核酸を含有する試料は、当該分野でよく知られており、腫瘍の特定のタイプ及び位置に適した方法により、得ることができる。組織バイオプシーはしばしば腫瘍組織の代表的な一片を得るために使用される。あるいは、腫瘍細胞は、関心ある腫瘍細胞を含むことが知られ又は含むと思われる組織／液体の形態で間接的に得ることができる。例えば、肺癌病変の試料は、切除、気管支鏡検査、穿刺吸引、気管支ブラッシングにより、又は痰、胸水又は血液から得ることができる。変異遺伝子又は遺伝子産物は、腫瘍、又は他の体試料、例えば尿、痰又は血清から検出することができる。腫瘍試料における変異標的遺伝子又は遺伝子産物の検出について、上で検討したものと同じ技術を他の体試料に適用することができる。癌細胞は腫瘍から脱落させられ、このような体試料に現れる。このような体試料をスクリーニングすることにより、癌等の疾患に対する簡単な初期診断が達成可能である。また、治療の進行を、変異標的遺伝子又は遺伝子産物についてこのような体試料を検査することにより、更に容易にモニターすることができる。
【０３３２】
腫瘍細胞に対して組織調製物を富ませる手段は、当該技術分野で知られている。例えば、組織はパラフィン又はクリオスタット切片から単離することができる。また、癌細胞は、フローサイトメトリー又はレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより、正常細胞から分離することができる。これら、並びに正常細胞から腫瘍を分離するための他の技術は、当該技術分野でよく知られている。腫瘍組織が正常細胞で高度に汚染されているならば、変異の検出はより困難でありうるが、但し、混入及び／又は偽のポジティブ／ネガティブな結果を最小にするための技術が知られており、その幾つかは以下に記載される。例えば、試料は、関心ある腫瘍細胞に結合するが、対応する正常細胞には結合しない、又はその逆であることが知られているバイオマーカー（変異を含む）の存在を評価することができる。
【０３３３】
場合によっては、癌はヘプシンを過剰発現するか又はしない。ヘプシン過剰発現は、（例えば免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣにより）細胞上に存在するヘプシンのレベルの上昇を評価することにより、診断又は予後判定アッセイにおいて決定することができる。あるいは又は加えて、例えば蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ、１９９８年１０月に公開の国際公開第９８／４５４７９号参照）、サザンブロッティング、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えばリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）によって、細胞内のヘプシンコード核酸のレベルを測定することができる。上記のアッセイとは別に、様々なインビボアッセイを熟練技師は利用できる。例えば、場合によっては検出可能な標識、例えば放射性同位体で標識した抗体に患者の体内の細胞を曝し、例えば放射能の外的スキャンによって、又は前もって抗体に曝される患者から採取した生検を分析することによって、患者の細胞に対する抗体の結合を評価してもよい。
【０３３４】
化学療法剤
本発明の併用療法は、更に、一又は複数の化学療法剤を含みうる。併用投与は、別個の製剤又は単一の医薬的製剤を用いた同時投与又は同時発生的投与と、好ましくは両方（又は全て）の活性剤の生物学的活性が同時に発揮される期間を提供する、何れかの順序での継続的投与とを含む。
【０３３５】
投与される場合、化学療法剤は、通常、そのような薬剤に既知の用量で投与されるか、又は場合によっては薬剤の併用作用又は代謝拮抗性の化学療法剤の投与に起因する有害な副作用により用量が低減される。このような化学療法剤の調製及び投与計画は、製造者の指示に従って、又は熟練した医師により経験的に決定された通りに、使用されうる。
併用可能な様々な化学療法剤はここに開示される。
【０３３６】
製剤、投薬量及び投与
本発明で使用される治療剤は、良好な医療行為と一致した様式で、処方され、用量決定され、投与されるであろう。この文脈で考慮される要因には、治療される特定の疾患、治療される特定の被験者、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、組合せられる薬剤の薬物-薬物相互作用、及び医師に知られている他の要因が含まれる。
【０３３７】
治療用製剤は、任意成分の生理学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と、所望の純度を有する活性成分を混合することにより、当該技術分野で知られている標準的な方法を使用して調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences(第20版), A. Gennaro編, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。許容可能な担体は、生理食塩水、又はバッファー、例えばホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭化水素；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばトゥイーン(TWEEN)ＴＭ、プルロニクス(PLURONICS)ＴＭ又はＰＥＧを含む。
【０３３８】
場合によっては、しかし好ましくは、製剤は薬学的に許容可能な塩、好ましくは塩化ナトリウムを、好ましくはおよそ生理学的濃度で含む。場合によっては、本発明の製剤は、薬学的に許容可能な保存料を含みうる。幾つかの実施態様では、保存料濃度は、典型的にはｖ／ｖで０．１〜２．０％の範囲である。適切な保存料には、製薬技術分野でよく知られているものが含まれる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ-クレゾール、メチルパラベン、及びプロピルパラベンが、好ましい保存料である。場合によっては、本発明の製剤は０．００５から０．０２％の濃度で薬学的に許容可能な界面活性剤を含むことができる。
【０３３９】
ここでの製剤は、治療される特定の徴候に応じて、必要ならば一を越える活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものをまた含みうる。このような分子は、意図される目的に対して効果的な量で組み合わされて適切に存在する。
【０３４０】
また、活性成分は、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルションにおいて、例えばコアセルベーション技術により、又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに包括されていてもよい。このような技術は、上掲のRemington's Pharmaceutical Sciencesに開示されている。
【０３４１】
徐放性調製物を調製することもできる。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは、例えばフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフェア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物活性の喪失及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、関与する機構に応じて安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の使用、及び特定のポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０３４２】
本発明の治療剤は、既知の方法、例えばボーラス、もしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路により、ヒトの患者に投与される。エクスビボストラテジーを治療用途に使用することもできる。エクスビボストラテジーは患者から得られた細胞を、ヘプシンアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドで形質移入又は形質導入することを含む。形質移入又は形質導入された細胞はついで患者に戻される。細胞は、広範なタイプの何れも可能であり、造血性細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞又はＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、又は筋細胞を含むが、これに限定されない。
【０３４３】
例えば、ヘプシンアンタゴニストが抗体である場合、抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内、及び局所免疫抑制治療が望まれるならば、病巣内投与を含む任意の適切な手段によって投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。また、抗体は、パルス注入によって、特に減少用量の抗体で適切に投与される。好ましくは、投薬は、投与が短期か慢性であるかどうかに部分的に依存して、最も好ましくは静脈内又は皮下注射のような、注射により与えられる。
【０３４４】
他の例では、ヘプシンアンタゴニスト化合物は、局所的、例えば疾患又は腫瘍の位置が可能であるならば、直接注射により投与され、注射は定期的に繰り返すことができる。また、局所的な再発又は変異を防止又は低減するために、ヘプシンアンタゴニストは、被験者に全身的に、又は腫瘍細胞、例えば腫瘍の外科的切除後の腫瘍又は腫瘍床に直接、送達させることができる。
【０３４５】
典型的には組合せられる治療剤の投与は、定められた期間（通常は、選択された組合せに応じて、数分、数時間、数日又は数週間）にわたって実施される。併用療法は、逐次的方法における、これらの治療剤の投与を包含することが意図されており、つまり、各治療剤が異なる時間で投与され、並びにこれらの治療剤、又は少なくとも２の治療剤の同時方法での投与がなされる。
【０３４６】
治療剤は、同じ経路又は異なる経路で投与することができる。例えば、組合せにおいて、抗ヘプシン抗体は静脈注射により投与されうるが、組合せにおける化学療法剤は経口的に投与されうる。あるいは、特定の治療剤に応じて、例えば、双方の治療剤が経口的に投与され得、又は双方の治療剤が静脈注射により投与されうる。また、治療剤が投与される順序は、特定の薬剤に応じて変化する。
【０３４７】
例えば、一又は複数の別個の投与を行うか、又は連続注入を行うかに関係なく、疾病の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの各治療剤が患者に投与される初回の候補用量である。典型的な一日当たりの用量は、上述の要素に応じて、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であるかもしれない。数日間以上に亘って反復投与する場合、状態に応じて、上述の方法によって測定した場合に癌が治療されるまで、治療を持続する。しかしながら、他の投与計画も有用でありうる。
【０３４８】
本出願は、遺伝子治療によるヘプシン抗体の投与を考慮する。例えば、細胞内抗体を生じせしめるための遺伝子治療の使用に関して、１９９６年３月１４日に公開された国際公開第９６／０７３２１号を参照。
【０３４９】
製造品
本発明の他の態様では、上述の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と容器上又は容器に付随したラベル又はパッケージ挿入物を含む。適切な容器は、例えばビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成されうる。容器は、症状の治療、予防及び／又は診断に効果的な、それ自身であるか又は他の組成物と併用される組成物を収容し、滅菌のアクセスポートを有しうる（例えば容器は皮下注射針が突き通すことが可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルでありうる）。組成物中の少なくとも一種の活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が、例えば癌のような選択した症状の治療のために使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）組成物をそこに収容し、その組成物が本発明の抗体を含む第一の容器と；（ｂ）組成物をそこに収容し、その組成物が更なる細胞傷害性薬剤を含む第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二の抗体組成物を特定の症状、例えば癌を治療するのに使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含みうる。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の（又は第三の）容器を更に含んでいてもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０３５０】
次は本発明の方法及び組成物の実施例である。一般的な説明を上に与えたので、様々な他の実施態様を実施することができることが理解される。
【実施例】
【０３５１】
材料及び方法
試薬及びタンパク質：  合成パラ−ニトロアニリド基質Ｓ２７６５（＝DiaPharma FXa 基質）、Ｓ２２６６、Ｓ２２８８、Ｓ２３６６、Ｓ２４４４はDiaPharma （Westchester, OH）から、クロモザイムＴＨはRoche Diagnostics（Indianapolis, IN）から、スペクトロザイムｆＩＸａ(登録商標)(#299)及びスペクトロザイム(登録商標)FVIIaはAmerican Diagnostica （Greenwich, CT）から得た。３，４−ジクロロ−イソクマリン、ＢＳＡ及びＴｗｅｅｎ−２０はSigma-Aldrichから得た。
【０３５２】
プラスミン及びＸＩａ因子は、Haematologic Technologies Inc.（Essex Junction, VT）から、血漿カリクレンはCalbiochem（La Jolla, CA）から、ＶＩＩ因子及びＸＩＩａ因子はEnzyme Research（South Bend, IN）から、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）はAmerican Diagnosticaから、プロ−ｕＰＡはFitzgerald Industries Int.（Concord, MA）から得た。ラットラミニンはMillipore （Temecula, CA）から得た。ヘプシン（ヒト）、マトリプリターゼ、マラプシン、肝細胞増殖因子活性化因子（ＨＧＦＡ）、プロ肝細胞増殖因子（プロ−ＨＧＦ）、ＨＧＦＡ−インヒビター−１（ＨＡＩ−１）及びＨＡＩ−２から誘導されるＫｕｎｉｔｚドメインインヒビター−１（ＫＤ１）は過去に記載されているようにして組換え的に発現させ、精製した（Kirchhofer等, 2003；Kirchhofer等, 2005；Li等, 2009；Moran等, 2006；Peek等, 2002；Shia等, 2005）。コントロール抗体として我々は抗体ファージディスプレイから産生させた抗ＨＧＦＡ Ｆａｂ又はＩｇＧ（Ｆａｂ４０、Ｆａｂ５８、Ｆａｂ７５、ＩｇＧ７５）を使用した（Ganesan等, 2009；Wu等, 2007）。
【０３５３】
Ｍ１３−ＫＯ７ヘルパーファージはNew England Biolabsから得た。マキシソープイムノプレートのプレートはNalgen NUNC International (Naperville, IL)から得た。Dynabeads（登録商標）MyOneストレプトアビジンはInvitrogen (Carlsbad, CA)から得た。３，３’，５，５’-テトラメチル-ベンジジン／Ｈ２Ｏ２（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質はKirkegaard and Perry Laboratories, Incから、ニュートラアビジン及びストレプトアビジンはPierce Biotechnology, Incから得た。
【０３５４】
プロスタシンのクローニング、発現、及び精製：  Ｃ末端フラッグ−タグを有するヒトプロスタシン（Ａｌａ３３−Ｌｅｕ３２１）の細胞外ドメインをＴ．ｎｉ細胞を用いたバキュロウイルス発現系を使用して発現させた。７２時間のインキュベーション後、上清を集め、清澄にした培地を抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体−アガロースカラム（Sigma）に充填した。結合したタンパク質を１００ｍＭのグリシン，ｐＨ３．０で溶離させ、１ＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８．０で直ぐに中和させた。プロスタシンの得られたチモーゲン型を室温で１６時間、組換えマトリプリターゼを用いて活性化させた。その後、活性化された二本鎖プロスタシンを、Ｎｉ−ＮＴＡカラムで（Ｈｉｓ）８−タグ（配列番号５９として開示された「Ｈｉｓ８」）マトリプリターゼを除去することにより精製した。プロスタシンは、Ｓ−２００カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。
【０３５５】
ヘプシンのクローニング、発現、及び精製：  Ｃ末端Ｈｉｓ−タグを有するマウスヘプシン（Ｓｅｒ４５−Ｐｒｏ４１６）の細胞外ドメインを、ヒトヘプシン（Moran等, 2006）と同様の条件下で、Ｔ．ｎｉ細胞を用いたバキュロウイルス発現系を使用して発現させた。７２時間のインキュベーション後、上清を集め、清澄にした培地をＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）に充填し、これを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌを具くむバッファーで事前平衡化させた。結合したタンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ及び２５０ｍＭのイミダゾールを含むバッファーで溶離させた。
【０３５６】
ＭＳＰ及びＫＤ１のクローニング、発現、及び精製：  組換えＭＳＰは、記載されたようにして（Wahl等, 1997）チャイニーズハムスター卵巣細胞で発現させた。ＫＤ１は、記載されたようにして（Shia等, 2005）発現させ、精製した。
【０３５７】
Ｆａｂファージディスプレイのためのライブラリー構築：  ＹＳＧＸライブラリーと命名したライブラリーを、Ｆａｂ−ファージディスプレイ（ｐＦ１３５９）のファージミドを使用して過去に記載されているようにして（(Fellouse等, 2007)のLib D ）構築した。ライブラリーの多様性はおよそ２×１０１０である。
【０３５８】
ファージディスプレイ抗ヘプシンＦａｂｓの選択及び特徴付け：  ファージディスプレイ実験に対して、我々は、ビオチン化ヘプシン（＝ビオチン−ヘプシン）及び３，４−ジクロロ−イソクマリン（ＤＣＩ）との複合体としてビオチン化ヘプシン（＝ビオチン−ヘプシン：ＤＣＩ）を使用した。ヘプシンは、製造者の指示書に従ってスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンキット（Pierce, カタログ#21327）を使用してビオチン化した。ビオチン化ヘプシンの幾つかを使用して、１００μＭのＤＣＩと共にインキュベーションし、次のパニング実験中にこのＤＣＩ濃度を維持することによってビオチン−ヘプシン：ＤＣＩ複合体を形成した。ＤＣＩを用いた前の実験では、２５−５０μＭのＤＣＩへのヘプシンの４０分の曝露が、Ｓ２７６５基質を用いた酵素アッセイにおいてヘプシン活性を完全に阻害したことが示されていた。パニングの最初の実験では、１０μｇのビオチン−ヘプシン又はビオチン−ヘプシン：ＤＣＩを、それぞれ１００μＭのＤＣＩの不存在下又は存在下で４℃で１．５時間、１×１０１３ｐｆｕ／ｍｌの濃度で１ｍｌのＹＳＧＸライブラリーと共にインキュベートした。標的に結合したファージを、１００μｌのDynabeads(登録商標)MyOneストレプトアビジンを用いて１５分間捕捉した。結合したファージを０．１ＭのＨＣｌで溶離させ、直ぐに中和し、ついで標準的なプロトコール（Sidhu等, 2000）に従って増幅させた。第二回の実験から先は、２μｇのビオチン−ヘプシン又はビオチン−ヘプシン：ＤＣＩを、それぞれ１００μＭのＤＣＩを伴わないで又はこれを伴って、４００μｌの増幅ファージと共に４℃で１．５時間インキュベートした。ビオチン−ヘプシン又はビオチン−ヘプシン：ＤＣＩに結合したファージを、ニュートラアビジン又はストレプトアビジン（実験間で交互）を被覆したマキシソープイムノプレート（ＮＵＮＣ）で１５分間捕捉し、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ，０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）でブロックした。５回の選択後、９６ウェル形式で増殖させた個々のクローンからファージを製造し、培養上清をＰＢＳ、０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＴバッファー）で３倍に希釈した。希釈したファージ上清を、ニュートラアビジン被覆３８４ウェルマキシソープイムノプレート（ＮＵＮＣ）で固定したビオチン−ヘプシン又はビオチン−ヘプシン：ＤＣＩと共に１時間インキュベートした。ＴプレートをＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＴバッファー）で６回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体コンジュゲート（ＰＢＴバッファー中１：５０００希釈）（Pharmacia)と共に30分インキュベートした。プレートをＰＴバッファーで６回、ＰＢＳで２回洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチル−ベンジジン／Ｈ２Ｏ２ペルオキシダーゼ基質（Kirkegaard & Perry Laboratories）で１５分展開させ、１．０ＭのＨ３ＰＯ４でクエンチし、吸光度を４５０ｎｍで分光光度的に測定した。
【０３５９】
単一ポイントファージ競合ＥＬＩＳＡを使用して、ＫＤ１が結合するヘプシンの同じエピトープに結合するファージディスプレイＦａｂを同定した。個々のクローンを９６ウェル形式で増殖させ、培養上清を、２００ｎＭのＫＤ１と共に又はこれなしでＰＢＴバッファーで５倍に希釈し、ニュートラアビジン被覆３８４ウェルマキシソープイムノプレート（ＮＵＮＣ）に固定したビオチン−ヘプシンと共に１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、結合したファージを、上述のようにして抗Ｍ１３−ＨＲＰによって検出した。各クローンについて、２００ｎＭのＫＤ１の不在下又は存在下でのＡ４５０の比を計算した。２を越える比を持つあらゆるクローンをＫＤＩと同様のエピトープへのターゲティングとして考慮した。そのようなクローンをＫＤ１を用いた綿密なファージ競合ＥＬＩＳＡに供し、一連の濃度のＫＤ１（１０μＭから開始，１：３段階希釈）を使用してヘプシンへ結合したファージディスプレイＦａｂと競合させた。
【０３６０】
抗ヘプシンＦａｂ２５及びＩｇＧ２５発現及び精製：  一般に、この出願を通して、抗体２５のＩｇＧ型は接頭辞Ａｂで示され、抗体２５のＦａｂ型は接頭辞Ｆａｂで示される。停止コドンをＦａｂ２５をコードするファージミド上の遺伝子３と重鎖の間に導入した。得られたファージミドを大腸菌株３４Ｂ８に形質転換した。単一コロニーを、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補填した３０ｍｌのＬＢ培地中で３７℃で一晩増殖させた。５ｍｌの培養物を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を補填した５００ｍｌの完全Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．培地（１リットルにする：３．５７ｇ(ＮＨ４)２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸Ｎａ-２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇの酵母抽出物、５．３６ｇのＨｙｃａｓｅ ＳＦ。８７２ｍｌまで脱イオン水を加える。ｐＨをＫＯＨで７．３に調整。オートクレーブ。５５℃に冷却し、１１０ｍｌの１ＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．３）、１１ｍｌの５０％グルコース及び７ｍｌの１ＭのＭｇＳＯ４）に播種し、３０℃で２４時間増殖させた。Ｆａｂ２５タンパク質を、プロテインＡアガロース樹脂を使用して精製した。
【０３６１】
選択されたＦａｂの軽鎖及び重鎖の可変ドメインを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における一過性発現のためにヒト軽鎖又は重鎖（ヒトＩｇＧ１）定常ドメインを含むｐＲＫ５ベースプラスミド中にクローニングした。ＩｇＧ２５タンパク質をプロテインＡアガロースクロマトグラフィーの使用によって精製した。
【０３６２】
合成基質での酵素アッセイ：  Ｆａｂ２５、ＩｇＧ２５、コントロールＦａｂ、又はコントロールＩｇＧを、室温で４０分間、Ｈｅｐｅｓバッファー（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中でヘプシン（ヒトヘプシンに対して１ｎＭ、マウスヘプシンに対して２ｎＭ）と共にインキュベートした。３，４−ジクロロ−イソクマリン（ＤＣＩ）を用いた実験では、ヘプシン（１ｎＭ）を、０．５％のＤＭＳＯを含むＨｅｐｅｓバッファー中でＤＣＩと共に４０分間、インキュベートした。Ｓ２７６５を加え（０．２ｍＭの最終濃度）、４０５ｎｍでの吸光度の増加の線形速度を動態マイクロプレートリーダー（Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA）で測定した。データは酵素活性比（ｖｉ／ｖｏ）として表し、４パラメータ回帰曲線フィッティングプログラム（Kaleidagraph バージョン3.6, Synergy Software）にフィットさせてＩＣ５０値を決定した。値は３回の独立した実験の平均±ＳＤである。Ｆａｂ２５及びＩｇＧ２５に対するＫｉａｐｐ値は、データを密接結合阻害システムの式にデータをフィットさせて計算した（Morrison, 1969；Olivero等, 2005）。
【０３６３】
Ｆａｂ２５特異性を調べるために、９のトリプシン様セリンプロテアーゼのパネルを、Ｈｅｐｅｓバッファー中で４０分間、１μＭのＦａｂ２５と共にインキュベートした。適切な発色性基質を加え、４０５ｎｍでの吸光度の増加の線形速度を動態マイクロプレートリーダーで測定した。使用された各酵素と発色性基質の濃度は次の通りであった：１ｎＭのヘプシン−０．５ｍＭのＳ２７６５、０．５ｎＭのマトリプリターゼ−０．５ｍＭのＳ２７６５、５ｎＭのプロスタシン−０．５ｍＭのＳ２７６５、２ｎＭのプラスミン−０．５ｍＭのＳ２３６６、２ｎＭの血漿カリクレイン−０．５ｍＭのＳ２３６６、０．５ｎＭのＸＩａ因子−０．５ｍＭのＳ２３６６、５ｎＭのＦＸＩＩａ−０．５ｍＭのＳ２２８８、５ｎＭのｕＰＡ−０．５ｍＭのＳ２４４４、５０ｎＭのマラプシン−０．２ｍＭのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ（登録商標）ＦＶＩＩａ、１０ｎＭのＨＧＦＡ−０．２ｍＭのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ（登録商標）ＦＶＩＩａ。データは酵素活性比（ｖｉ／ｖｏ）として表し、３回の独立した実験の平均±ＳＤとした。
【０３６４】
全てＰ１ Ａｒｇ残基を有する市販のｐＮＡ基質のパネルを使用して、Ｆａｂ２５によるヘプシン阻害を調べた。８つの基質はＳ２７６５、Ｓ２２６６、Ｓ２２８８、Ｓ２３６６、Ｓ２４４４、Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ ＴＨ、Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ｆＩＸａ及びＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａであった。Ｆａｂ２５及びコントロールＦａｂの濃度を１００ｎＭに固定したことを除いて、アッセイを上述のようにして実施した。基質の濃度は０．５ｍＭであった。データは未阻害活性（Ｆａｂなし）の阻害パーセントとして表し、４回の独立した実験の平均±ＳＤである。
【０３６５】
高分子基質を用いた酵素アッセイ：ヘプシン媒介プロ−ｕＰＡ活性化を測定するために、Ｆａｂ２５をＨＢＳＡバッファー（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．５、１５０ｎＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）で段階希釈し、室温で３５分間、ヘプシンと共にインキュベートした。酵素反応はプロ−ｕＰＡの添加により開始させた。反応混合物中のヘプシン及びプロ−ｕＰＡの濃度はそれぞれ０．５ｎＭ及び１００ｎＭであった。４５秒間隔で、５０μｌのアリコートを、１５０μｌ／ウェルの停止試薬ＨＡＩ−２（６６７ｎＭ）を含む９６ウェルプレートに移した。Ｓ２４４４（０．５ｍＭ）の添加後、４０５ｎｍでの吸光度の増加の線形速度を動態マイクロプレートリーダーで測定した。データは酵素活性比（ｖｉ／ｖｏ）として表し、４パラメータ回帰曲線フィッティングプログラム（Kaleidagraph）にフィットさせてＩＣ５０値を決定した。
【０３６６】
ＶＩＩ因子活性化アッセイでは、ヘプシンをＨｅｐｅｓバッファー中で５分間Ｆａｂ２５又はコントロールＦａｂと共にインキュベートした後、ＶＩＩ因子を添加した。反応混合物中の濃度は、５０ｎＭのヘプシン、５００ｎＭのＦａｂ及び８μＭのＶＩＩ因子。３７℃での０．５時間及び２時間のインキュベーション後、アリコートを取り、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％勾配のゲル，InVitrogen）により分析した。ゲルをSimplyBlueTM（InVitrogen）で染色した。
【０３６７】
ヘプシンによるＦａｂ２５のインビトロタンパク分解プロセシング：  Ｆａｂ２５（３μＭ）を、低ｐＨバッファー（１００ｍＭのＭｅｓ（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）又は高ｐＨバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）の何れかにおいて室温で２４時間、１０ｎＭのヘプシンと共にインキュベートした。反応は、２０ｕＬの２Ｘ−試料バッファー（β−メルカプトエタノールを伴うか伴わないで）の添加により停止させ、９５℃で５分間、煮沸させた。タンパク質分解は、クーマシーブリリアントブルーで染色した４−２０％（ｗ／ｖ）のポリアクリルアミド勾配ゲルでのゲル移動度シフトによってモニターした。
【０３６８】
細胞遊走アッセイ：  細胞遊走アッセイを、２４ウェル、８．０μｍ孔径のFluoroBlok（商標）透過性支持体（BD Biosciences, Bedford, MA）を使用して、過去に記載されたようにして（Tripathi等, 2008）実施した。フィルターの下側に未処理又は処理したラットラミニン（１μｇ／ｍｌ）を被覆した。ラミニンをヘプシン又はヘプシン−Ｆａｂ２５複合体又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と共に４℃で一晩、共インキュベートした。ついで、インサートをスーパーブロックバッファーで１時間ブロックした。ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞をトリプシン処理し、無血清培地に再懸濁させ、無血清培地で２回洗浄し、細胞（２００００）をインサートの上部チャンバーに播種した。５％のＣＯ２及び３７℃での５時間のインキュベーション後、上部フィルターに残っている細胞を綿棒を使用して優しく拭い取り、インサートをＰＢＳで優しく洗浄した。下方チャンバーに遊走した細胞を５００μｌのメタノールで３０分間固定し、２０分空気乾燥させ、５００μｌの１０μＭのＹＯ−ＰＲＯ−Ｉ（Invitrogen, Carlsbad, CA）で１０分間染色した。プレートをＰＢＳで洗浄し、蛍光を、４８５ｎｍの励起波長と５５５ｎｍの発光波長を使用してプレートリーダー（Spectramax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA）で測定した。ついで、プレートを、１０×の対物レンズを備えたＣＣＤカメラに連結した倒立顕微鏡（IX81, Olympus）を用いて画像化した。
【０３６９】
ヘプシンに対するＦａｂ２５結合：  ストレプトアビジンＳＢＣバイオセンサーチップを備えたＯｃｔｅｔ−ＲＥＤシステムをＦｏｒｔｅＢｉｏ（Menlo Park, CA）から購入した。実験開始前に、センサーチップを、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％のｔｗｅｅｎ−２０を含むバッファー中において２５℃で１５分間、予め湿潤させた。ビオチン化ヘプシン（７．５μｇ／ｍｌ）を、１０００ｒｐｍで撹拌しながらストレプトアビジンセンサーに５分間捕捉させた。センサーをバッファーで簡単に洗浄した後、Ｆａｂ２５（２００ｎＭから始めて２倍段階希釈）とバッファーコントロールを含む試料ウェルにそれらを浸漬した。会合を１０分間モニターし、次に解離を３０分続けた。データは、Ｏｃｔｅｔ−ＲＥＤ解析ソフトウェアを使用して１：１結合モデルにフィットさせた。
【０３７０】
ＬｎＣａｐ細胞における細胞表面発現ヘプシンによるプロ−ＭＳＰ活性化：  ＬｎＣａＰ−３４細胞を記載されたようにして（Moran等, 2006）生成し、ヘプシンを安定に過剰発現させ、親ＬｎＣａＰ細胞と匹敵する比較的低いレベルで内因性ヘプシンのみを発現するＬｎＣａＰ−１７細胞と比較して、５倍の増加したヘプシン細胞表面発現及び３倍の増加したヘプシン酵素活性を生じた。２４ウェルプレートで培養された集密的なＬｎＣａＰ−１７及びＬｎＣａｐ−３４細胞を無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄し、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地中において３７℃で１５分間、単独の又は異なった抗ヘプシン阻害剤（１μＭの抗ヘプシン抗体Ｆａｂ２５／１μＭのＫＤ１／１μＭのＡｃ−ＫＱＬＲ−ｃｍｋ（配列番号１２として開示した「ＫＱＬＲ」））と共にインキュベートした後、１２５Ｉ−標識プロ−ＭＳＰ（２５μｇ／ｍｌ）を添加した。３７℃で３時間のインキュベーション後、アリコートを取り除き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％の勾配ゲル）（Invitrogen, Carlsbad, CA）によって分析し、ついでＸ線フィルムに露光した。
【０３７１】
ＬｎＣａｐ細胞における細胞表面発現ヘプシンによるプロ−ＨＧＦ活性化：  ２４ウェルプレートで培養された集密的なＬｎＣａｐ−３４細胞を無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄し、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地中において３７℃で１５分間、単独の又は組換えヘプシン（１０ｎＭ）と共に又は異なった濃度のＦａｂ２５（２０ｎＭ−０．１５ｎＭ）と共にインキュベートした後、１２５Ｉ−標識プロ−ＨＧＦ（２５μｇ／ｍｌ）を添加した。３７℃で３時間のインキュベーション後、アリコートを取り除き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％の勾配ゲル）（Invitrogen, Carlsbad, CA）によって分析し、ついでＸ線フィルムに露光した。
【０３７２】
表面プラズモン共鳴によるヘプシンへのＡｂ２５の結合：  表面プラズモン共鳴測定をＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００機器（GE Health Care, NJ）で実施して、Ａｂ２５の結合親和性を決定した。ウサギ抗ヒトＩｇＧをＣＭ５バイオセンサーチップに化学的に固定し（アミンカップリング）、Ａｂ２５を捕捉しておよそ３５０応答単位（ＲＵ）を与えた。動態測定では、活性ヘプシンの２倍段階希釈物（１ｎＭから５００ｎＭ）を３０μｌ／分の流量で２５℃でＨＢＳ−Ｐバッファーで注入した。結合速度（ｋａ）及び解離速度（ｋｄ）を、単純一対一ラングミュア結合モデル（BIA-Evaluation）を使用して得て、平衡解離定数（ＫＤ）を計算した（ｋｄ／ｋａ）。速い動態のため、定常状態測定を使用して、Ａｂ２５とのプロ−ヘプシンの親和性を決定した。プロ−ヘプシンの２倍段階希釈物（１９５ｎＭから１００ｍＭ）を捕捉抗体（Ａｂ２５）センサーチップに注入し、最大結合（Ｒｍａｘ）を達成し、定常状態平衡に到達させた。Ｒｅｑの値はＢＩＡ−Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを使用して計算して、Ｃ（プロ−ヘプシン濃度）に対して個々にプロットし、ＫＤを決定した。
【０３７３】
等温滴定熱量測定：  ＴＣ実験をＩＴＣ２００機器（GE healthcare）で実施した。Ｆａｂ２５及びヘプシンを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含むバッファーを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーカラム（Superdex S200, GE healthcare）で別個に精製した。試料細胞（２０４μｌ）にヘプシン（１４μＭ）を充填し、シリンジ中のＦａｂ２５濃度は１３８μＭであった。滴定実験は、典型的には、それぞれ２μＬ体積と１８０秒期間の２０の注入からなり、添加間に３分の間隔がある。撹拌速度は１０００ｒｐｍであった。生データを統合し、非特異的熱に対して修正し、濃度に対して正規化し、単一セットの同一の結合部位を仮定する１：１結合モデルに従って分析した。（等温滴定曲線を登録し、ＩＴＣ機器と共に提供されたＯＲＩＧＩＮソフトウェアを使用して分析した。データを統合して滴定曲線を提供し；非線形最小二乗フィットを使用して、結合定ＫＡ、結合熱（ΔＨ）、及び結合の化学量論を曲線から抽出した。
【０３７４】
結果／考察
ヘプシン酵素活性をブロックする抗ヘプシン抗体を同定するために、我々は、阻害剤なしでのビオチン化ヘプシンに対して（ビオチン−ヘプシン）、またＤＣＩと複合体化されたビオチン化ヘプシン（ビオチン−ヘプシン：ＤＣＩ）に対して溶液ソーティングを用いた。ＤＣＩは、触媒性Ｓｅｒ１９５及びＨｉｓ５７（キモトリプシノーゲン番号付け）と共有的モノアシル又はジアシル付加物を形成することによりＳ１ポケットを占有するメカニズムベースのセリンプロテアーゼ阻害剤である（図９Ａ）（Powers等, 1989）。Ｄ因子：ＤＣＩ複合体（ＰＤＢコード１ＤＩＣ）の結晶構造に基づくヘプシン：ＤＣＩ複合体の分子モデル（Cole等, 1998）は、ＤＣＩ阻害剤の芳香環がＳ１ポケットを占有するであろうことを示していた。我々の過去の知見（Wu等, 2007）は、我々のＦａｂファージディスプレイライブラリーから誘導された機能遮断抗ＨＧＦＡ抗体がＳ１ポケットを占有しないことを示していた。従って、ヘプシン結合ＤＣＩは抗体結合を妨害しない場合があるが、活性部位立体構造に対して有益な影響を与え、抗体との相互作用に好ましいものとなる。トリプシン様セリンプロテアーゼの活性部位は幾つかの本来的に移動性のループ（「活性化ドメイン」）（Huber及びBode, 1978）によって形成される。特に、２２０−ループがＳ１ポケットの一部を形成し、幾つかのセリンプロテアーゼで様々な立体構造状態を採用しうる（Johnson等, 2005；Shia等, 2005；Spraggon等, 2009；Wilken等, 2004）。アポ構造のみがそのような希なループ立体構造を明らかにしたのに対して、活性部位阻害剤との共結晶構造が、最もありそうには阻害剤により与えられる安定化力のために適切に形成された活性部位を示した（Arni等, 1994；Shia等, 2005；Spraggon等, 2009）。ヘプシンアポ構造は知られておらず、全ての発表されたヘプシン構造は活性部位阻害剤を含む共結晶構造である（Herter等, 2005；Somoza等, 2003）。従って、我々は、ＤＣＩによるＳ１ポケットの占有が潜在的なループの可撓性に安定化力を与え、抗体認識に好ましいものとしうる。酵素アッセイは、２０μＭを越えるＤＣＩ濃度が４０分のインキュベーション時間後に完全なヘプシン阻害を示した（図９）。従って、ビオチン化ヘプシン：ＤＣＩ複合体に対するファージソーティング実験を１００μＭのＤＣＩの存在下で実施した。
【０３７５】
ＹＳＧＸライブラリー（Fellhouse等, 2007）と命名された相補性決定領域（ＣＤＲ）に限られた化学的多様性を有する必要最低限度の合成抗体ライブラリーを使用して、溶液ソーティングによりヘプシンに対する阻害性抗体を検索し、そこでは、ビオチン−ヘプシン又はビオチン−ヘプシン：ＤＣＩ複合体をファージディスプレイＦａｂライブラリーと共にインキュベートした。ビオチン−ヘプシン：ＤＣＩに対するパニングは、ＨｐｓＦａｂ２５（「Ｆａｂ２５」とも呼ばれる）と命名された一つのヘプシン結合クローンを生じ、これが５回の選択後に優性になった。Ｆａｂ２５のＨＶＲ配列を図１に示す。ＨｐｓＦａｂ２５のＣＤＲ−Ｈ３は非常に長く（２１残基）、ＨｐｓＦａｂ２５は３つのＬｙｓ残基を含んでいた。
【０３７６】
Ｆａｂ２５結合が、ヘプシン活性部位に結合するヘプシン阻害剤であるＫＤ１によって阻害されたかどうかを試験するためにＥｌｉｓａ実験を実施した。図１０に示されるように、ＫＤ１が濃度依存的な形でヘプシンへのＦａｂ２５−ファージ結合を阻害しており、Ｆａｂ２５がヘプシンの活性部位領域又はその近くに結合し、よって酵素活性を妨害しうることを示唆している。
【０３７７】
ヒト及びマウス活性を阻害するＦａｂ２５の能力を、合成ヘプシン基質Ｓ２７６５を使用して試験した。図１１に示されるように、Ｆａｂ２５は濃度依存的な形でヒト及びマウスヘプシン活性を阻害し、試験した最も高い濃度で完全な阻害に達した。計算されたＫｉａｐｐはヒトヘプシンに対して４．１±１．０ｎＭ（ｎ＝３）、マウスヘプシンに対して３２９±５１ｎＭ（ｎ＝３）であった。ＩｇＧ２５での更なる実験は、それがヒトヘプシンを１１．３±１．７ｎＭ（ｎ＝３）のＫｉａｐｐで阻害する一方、コントロールＩｇＧは効果がなかった（データは示さず）ことを示している。その結果は、Ｆａｂ２５がマウスヘプシンよりも葯０倍より強力にヒトヘプシンを阻害したことを示している。これは、抗体結合部位がマウスヘプシンに完全には保存されていないことを示唆している。マウスヘプシンのプロテアーゼドメインがヒトヘプシンと比較して挿入も欠失も有していないので、Ｆａｂ２５の減少した効力は、おそらくＦａｂ２５との相互作用に重要であるアミノ酸変化のためであった。
【０３７８】
ヒトヘプシンに対するＦａｂ２５の結合親和性はＯｃｔｅｔ ＲＥＤ分析を使用して決定した。Ｋｄは２．５５＋／−０．４５ｎＭであった。
【０３７９】
Ｆａｂ２５の特異性は、それがトリプシン様セリンプロテアーゼのパネルの酵素活性を阻害したかどうかを問うことによって調べた。トリプシン様セリンプロテアーゼのパネルはヘプシンの最も近いプロテアーゼドメインホモログの幾つか、例えば血漿カリクレイン、プロスタシン、マラプシン及びプラスミンを含んでいた。結果（図１２）は、Ｆａｂ２５が、ヘプシンに対して決定されたＫｉａｐｐ値よりも２５０倍大きい濃度で調べたセリンプロテアーゼの酵素活性に影響を及ぼさなかったので、ヘプシンに対して排他的な特異性を有していたことを証明している。
【０３８０】
プロ−ｕＰＡ及びＶＩＩＩ因子のヘプシン媒介プロセシングに対するＦａｂ２５の効果を測定した。図１３Ａに示されるように、Ｆａｂ２５は、ｐＮＡアッセイにおけるその効力に匹敵した３．３±０．４ｎＭ（ｎ＝３）のＩＣ５０値でプロ−ｕＰＡに対するヘプシン活性を阻害した。１００ｎＭを越えるＦａｂ濃度では、阻害は完全で、ＶＩＩ因子活性化アッセイでの強い阻害に匹敵した（図１３Ｂ）。ＶＩＩ因子はヘプシンには比較的不良な基質で、アッセイでは高ヘプシン濃度を必要とする（５０ｎＭ）。従って、たとえＦａｂ２５を５００ｎＭで使用したとしても、これは、プロ−ｕＰＡ活性化実験（６００：１までの比）と比較して比較的低いＦａｂ２５：ヘプシン比（１０：１）を生じたが、これは拡張された２時間の実験中の阻害が完全ではなかったことを説明しうる。
【０３８１】
ヘプシンはＰ１ Ａｒｇ後で基質を優先的に切断するが（Herter等, 2005）、Ｐ１ Ｌｙｓで基質をまた認識する（Moran等, 2006）。従って、我々は、ヘプシンが、３つのＬｙｓ残基を含んでおり通常は長いＦａｂ ＣＤＲ−Ｈ３ループを切断しうる可能性を考えた。抗マトリプリターゼ抗体Ｅ２での最近の研究から先行例があり、これは、長いＣＤＲ−Ｈ３ループにおいてＰ１−Ａｒｇ残基後のマトリプリターゼにより切断を受けた（Farady等, 2008）。従って、Ｆａｂ２５を異なったｐＨ条件下で長い期間ヘプシンに曝露させた。Ｆａｂ２５は非還元下で５０ｋＤａバンドとして、還元条件下で２５ｋＤａバンドとして遊走し、低分子量分解産物は特定されなかった（図１４）。従って、Ｆａｂ２５は、長い期間ヘプシンに曝露されたときヘプシンタンパク質分解に耐性があった。この結論は、ビオチン−ヘプシン：ＤＣＩ複合体がＳ１ポケットの外側に結合するファージディスプレイＦａｂの選択を支持するという我々の仮定と一致している。
【０３８２】
ラミニンはヘプシンに対する基質であることが最近樹立された（Tripathi等）。その研究はまたヘプシンによるラミニンの開裂が前立腺癌細胞株ＤＵ１４５の遊走を生理学的に亢進させうることを示唆していた。我々はＦａｂがＤＵ１４５細胞のラミニン依存性遊走を阻害するかどうかを調べた。この実験の結果（図１５）は、Ｆａｂ２５がヘプシンのタンパク分解性活性を効果的に中和し、よってその基質ラミニンのプロセシングを阻止することを証明した。
【０３８３】
我々はまた合成基質のパネルに対してヘプシン活性を阻害するＦａｂの能力を試験した。表１に示された結果は、Ｆａｂ２５が全てのｐＮＡ基質のヘプシン媒介開裂を＞９０％阻害したことを証明した。ｐＮＡ基質がヘプシンのＳ１−Ｓ３サブサイトを占有するので、抗体がこれらのサブサイトでの基質相互作用を強く妨害したと結論付けることができる。ｐＮＡ基質のＰ２及びＰ３位置の化学的多様性にかかわらず、全ての基質に対して阻害が＞９０％であったという知見は、これらの部位における僅かな影響よりもＳ２及び／又はＳ３部位での強い抗体効果が主張される。これらの効果が性質的にアロステリックであるか又は直接の立体障害があるかないかがまだ解明される必要がある。更に、Ｆａｂ２５をＤＣＩ阻害ヘプシンに対して選択したので、ＦａｂがＳ１ポケットを直接占有することによってヘプシンを阻害する可能性は低い。
【０３８４】
表１．合成基質パネルに対するヘプシン活性のＦａｂ２５による阻害。ヘプシンを１００ｎＭのＦａｂ２５又はコントロールＦａｂと共に４０分インキュベートした後、８の異なったｐＮＡ基質を添加した。初期の線形速度を動態マイクロプレートリーダーで測定し、酵素活性を、Ｆａｂを伴わないヘプシン活性の割合として表した。
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【０３８５】
Ｆａｂ２５は、様々な合成及び巨大分子基質を使用する全ての機能的アッセイにおいて一貫してヘプシン活性を＞９０％阻害することを示した。
細胞表面上の自然に発現されたヘプシンによるプロ−ＭＳＰのタンパク分解プロセシングをＬｎＣａｐ−３４細胞株（Moran等, 2006）でモニターした。ヘプシンを発現するＬｎＣａｐ−３４細胞は１２５Ｉ−プロ−ＭＳＰをプロセシングすることができた（図１６）。３種全てのヘプシン阻害剤（Ａｃ−ＫＱＬＲ−クロロメチルケトン（配列番号１２として開示された「ＫＱＬＲ」）、ＫＤ１及びＦａｂ２５）がタンパク分解開裂を効果的にブロックしたので、プロ−ＭＳＰプロセシングのタンパク分解活性は主としてヘプシンのためであった。
【０３８６】
部分的文献リスト
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【０３８７】
上記発明は理解を明瞭にする目的から例示と実施例によってある程度詳細に説明したが、明細書と実施例は本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
【図１】
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【図２Ａ】
2013507966.tif 000008
【図２Ｂ】
2013507966.tif 000009
【図３】
2013507966.tif 000010
【図４】
2013507966.tif 000011
【図５】
2013507966.tif 000012
【図６】
2013507966.tif 000013
【図７】
2013507966.tif 000014
【図８Ａ】
2013507966.tif 000015
【図８Ｂ】
2013507966.tif 000016
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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