(57)【要約】  本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）による哺乳動物細胞の感染後に放出されるウイルス粒子であって、ａ）粒子が、ウイルス糖タンパク質が包埋されている脂質膜によって包まれ、ｂ）粒子がウイルスＤＮＡまたはキャプシドのいずれも含まず、かつ、ｃ）粒子が、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５の１つ以上の部分と少なくとも１つの異種ペプチドとを含有する融合タンパク質を含み、そして少なくとも１つの異種ペプチドがＴ細胞抗原ｐｐ６５のアミノ酸配列のアミノ酸位置Ｗ１７５またはＡ５３４に挿入されている、ウイルス粒子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）による哺乳動物細胞の感染後に放出されるウイルス粒子であって、
ａ）該粒子が、ウイルス糖タンパク質が包埋されている脂質膜によって包まれ、
ｂ）該粒子が、ウイルスＤＮＡまたはキャプシドのいずれも含まず、かつ、
ｃ）該粒子が、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５の１つ以上の部分と、少なくとも１つの異種ペプチドとを含有する融合タンパク質を含み、
前記少なくとも１つの異種ペプチドが、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５のアミノ酸配列のアミノ酸位置Ｗ１７５またはＡ５３４に挿入されているウイルス粒子。
【請求項２】
前記少なくとも１つの異種ペプチドが、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５のアミノ酸配列のアミノ酸位置Ｗ１７５に挿入されている、請求項１に記載のウイルス粒子。
【請求項３】
前記Ｔ細胞抗原ｐｐ６５の前記アミノ酸配列が、配列番号１に従うアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のウイルス粒子。
【請求項４】
前記粒子が高度に抗原性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項５】
前記粒子が中和抗体の形成を誘導することができる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項６】
前記粒子がＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を誘導することができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項７】
前記少なくとも１つの異種ペプチドがＭＨＣクラスＩ提示抗原である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項８】
前記少なくとも１つの異種ペプチドが、ｐｐ６５とは異なる１つ以上のタンパク質の１つ以上の部分を含む、または、１つ以上の部分から形成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項９】
前記少なくとも１つの異種ペプチドが、ＨＣＭＶ糖タンパク質の１つ以上の部分を含む、または、１つ以上の部分である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの異種ペプチドが、ＨＣＭＶ糖タンパク質ｇＢの１つ以上の部分を含む、または、１つ以上の部分である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの異種ペプチドが、ＨＣＭＶ糖タンパク質ｇＨの１つ以上の部分を含む、または、１つ以上の部分である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの異種ペプチドが、異なるＨＣＭＶ株からの特定の糖タンパク質の変異体である少なくとも２つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含む、または、前記少なくとも２つのＨＣＭＶ糖タンパク質から成る、請求項１〜９のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項１３】
前記特定の糖タンパク質の少なくとも２つの変異体の一方が、ＨＣＭＶのＴｏｗｎｅ株の変異体であり、前記特定の糖タンパク質の少なくとも２つの変異体の他方が、ＨＣＭＶのＡｄ１６９株の変異体である、請求項１２に記載のウイルス粒子。
【請求項１４】
前記糖タンパク質が、ＨＣＭＶのｇＢタンパク質である、請求項１２または１３に記載のウイルス粒子。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの異種ペプチドが、ＨＣＭＶタンパク質ＩＥ１の１つ以上の部分を含む、または、１つ以上の部分である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの異種ペプチドが、ＨＣＭＶ糖タンパク質の１つ以上の部分と、前記ＨＣＭＶタンパク質ＩＥ１の１つ以上の部分とを含む、または、１つ以上の部分である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの異種ペプチドが、ＨＣＭＶ以外のヒト病原体の部分であるタンパク質の１つ以上の部分である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項１８】
ＨＣＭＶ以外のヒト病原体の部分である前記タンパク質が、ＨＣＭＶ以外の前記ヒト病原体によるヒトの自然感染時に、それに対する細胞傷害性Ｔリンパ球がヒトにおいて形成されるタンパク質である、請求項１７に記載のウイルス粒子。
【請求項１９】
ＨＣＭＶ以外の前記ヒト病原体が、ＨＩＶ−１、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびインフルエンザを含む群から選択される前記ヒト病原体である、請求項１８に記載のウイルス粒子。
【請求項２０】
前記融合タンパク質が、完全長Ｔ細胞抗原ｐｐ６５と、少なくとも１つの異種ペプチドとを含む前記融合タンパク質である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項２１】
疾患の治療および／または予防のための薬剤を製造するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のウイルス粒子または複数のウイルス粒子。
【請求項２２】
疾患の治療および／または予防のための方法における使用のための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のウイルス粒子または複数のウイルス粒子。
【請求項２３】
前記疾患が、前記少なくとも１つの異種ペプチドもしくはその誘導体に対する中和抗体の形成によって、または、前記少なくとも１つの異種ペプチドもしくはその誘導体に対するＣＤ８＋Ｔリンパ球応答の誘導によって治療および／または予防することができる疾患である、請求項２１または２２に記載のウイルス粒子。
【請求項２４】
ワクチンの製造のための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のウイルス粒子または複数のウイルス粒子。
【請求項２５】
前記ワクチンが、ＨＣＭＶ感染の治療および／または予防のためである、請求項２４に記載のウイルス粒子。
【請求項２６】
前記ワクチンが、移植の副作用の治療および／または予防のためである、請求項２４に記載のウイルス粒子。
【請求項２７】
前記移植が、固形臓器または造血幹細胞の移植である、請求項２６に記載のウイルス粒子。
【請求項２８】
前記副作用が、ＨＣＭＶ感染によって引き起こされるまたはＨＣＭＶ感染に付随している、請求項２６または２７に記載のウイルス粒子。
【請求項２９】
前記疾患または副作用の治療および／または予防のための薬剤を製造するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のウイルス粒子の使用であって、該疾患または副作用が前記請求項のいずれか一項で定義される疾患または副作用である、ウイルス粒子の使用。
【請求項３０】
疾患または副作用の前記治療および／または予防のためのワクチンを製造するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のウイルス粒子の使用であって、該疾患または副作用が前記請求項のいずれか一項で定義される疾患または副作用である、ウイルス粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）による哺乳動物細胞の感染後に放出されるウイルス粒子であって、
ａ）粒子が、ウイルス糖タンパク質が包埋されている脂質膜によって包まれ、
ｂ）粒子が、ウイルスＤＮＡまたはキャプシドのいずれも含まず、かつ、
ｃ）粒子が、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５の１つ以上の部分と、少なくとも１つの異種ペプチドとを含有する融合タンパク質を含む、
ウイルス粒子ならびにそのようなウイルス粒子または複数のそのようなウイルス粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）による感染は、固形臓器移植または造血幹細胞移植後の患者における疾患の主要原因である［１〜９］。さらに、妊娠中のウイルスの伝染は、西半球における新生児の永続的な後遺症の最も多い原因の１つである［１０；１１］。ＨＣＭＶワクチンの開発は、したがって、最優先の目標とみなされてきた［１２］。
【０００３】
そのようなワクチンの１つの目的としては、母体における感染を予防することまたは、少なくとも経胎盤伝染を予防することが挙げられる。これを達成するには中和抗体の誘導が不可欠と考えられる。これに対し、移植受容者における再活性化からの防護および感染の制御は、細胞応答、特にＣＤ８Ｔ細胞を通して媒介される細胞応答によってもたらされると考えられる［１３〜１５］。場合により養子Ｔ細胞移入と組み合わせた、リンパ球応答を対象とする移植受容者における治療的ワクチン接種は、移植後の期間のＨＣＭＶのウイルス再活性化の影響を改善するために望ましい。
【０００４】
ＨＣＭＶワクチンを開発するための有望なアプローチであっても、いまだ認可された使用可能な製剤はない［１０；１７〜１９］。防護を与える免疫エフェクターを対象とした数多くの試験から、ＨＣＭＶに対する理想的なワクチンは抗ウイルス中和抗体およびＴリンパ球の両方を誘導すべきであることは明白と思われる［１０；１７；１８〜３８］。しかし、そもそもそのような万能のＨＣＭＶワクチンが確立できるのかという懸念がある。最近の臨床試験は、ＨＣＭＶタンパク質を発現するアルファウイルスレプリコンが良好に耐容され、持続的な細胞性および体液性応答を誘導することを示した［１９］。別の試験は、精製ｇＢをワクチンとして使用し、有意のレベルのＨＣＭＶ中和抗体を誘導できたことから、有望な結果を提供した［１８］。これらのワクチンは、先天性ＨＣＭＶ感染の予防のために使用されることが期待される。
【０００５】
マウスにおける以前の試験で、いわゆる高密度体（本明細書ではＤＢとも称する）が驚くほど免疫原性であることが証明された［２０］。当分野で一般的に理解されているように、かつ本明細書でも使用されるように、高密度体は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）による哺乳動物細胞の感染後に放出されるウイルス粒子であって、
ａ）粒子が、ウイルス糖タンパク質が包埋されている脂質膜によって包まれ、
ｂ）粒子が、ウイルスＤＮＡまたはキャプシドのいずれも含まない、
ウイルス粒子である。
【０００６】
好ましくは、そのような高密度体はまた、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５の１つ以上の部分と少なくとも１つの異種ペプチドとを含有する融合タンパク質を含む。高密度体およびそれらの作製は、国際公開第００／５３７２９号にも記載されている。
【０００７】
それらの驚くべき免疫原性を考慮して、ＤＢをＨＣＭＶワクチンとして開発するための努力が為されてきた。最近の実験では、ＤＢをそれらの抗原含量に関して改変できるという実験的証拠を提供した［２１；２２］。これは、主要なＤＢ成分であるｐｐ６５および組換えＨＣＭＶによるウイルスＩＥ１タンパク質からの異種ＭＨＣ−クラスＩ提示ペプチドから成る融合タンパク質を発現することによって達成された。これは、感染ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）における組換えＤＢ（ｒｅｃＤＢ）の形成を生じさせた。融合タンパク質を含むｒｅｃＤＢは感染ＨＦＦから放出された［２１］。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックＨＨＤマウスへのこれらの粒子の適用はＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を誘導し、これは、単離されたＴ細胞のインビトロでのペプチド刺激後に明らかになった［２２］。しかし、ＣＤ８＋Ｔ細胞画分をＥｌｉｓｐｏｔ分析によってエクスビボで直接試験した場合、ＨＣＭＶ特異的Ｔ細胞を直ちに検出することはできなかった。これは、原則として治療適用に適するが、これらの粒子に関してプライミングは望ましいほど顕著ではないことを指した。それに加えて、感染ＨＦＦ培養物からのこれらのｒｅｃＤＢの収率は低かった。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明の根本的な課題は、ワクチンとして適切なウイルス高密度体を提供することであり、ウイルス高密度体は、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５の１つ以上の部分と少なくとも１つの異種ペプチドとを含有する融合タンパク質を含み、好ましくは、ワクチンは少なくとも１つの異種ペプチドに対する免疫応答を惹起することができる。
【０００９】
本発明のさらなる根本的な課題は、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５の１つ以上の部分と少なくとも１つの異種ペプチドとを含有する融合タンパク質を含み、好ましくは、中和抗体の形成および／またはＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を誘導することができる、ウイルス高密度体を提供することであった。
【００１０】
本発明の尚さらなる根本的な課題は、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５の１つ以上の部分と少なくとも１つの異種ペプチドとを含有する融合タンパク質を含み、高い収率で作製することができる、ウイルス高密度体を提供することであった。
【００１１】
これらや他の課題は、添付の独立請求項の主題によって解決される。好ましい実施形態も、添付の従属請求項から導くことができる。
【００１２】
より具体的には、本発明の根本的な課題は、最初の態様の最初の実施形態でもある、最初の態様において、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）による哺乳動物細胞の感染後に放出されるウイルス粒子であって、
ａ）粒子が、ウイルス糖タンパク質が包埋されている脂質膜によって包まれ、
ｂ）粒子が、ウイルスＤＮＡまたはキャプシドのいずれも含まず、かつ、
ｃ）粒子が、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５の１つ以上の部分と少なくとも１つの異種ペプチドとを含有する融合タンパク質を含み、
少なくとも１つの異種ペプチドが、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５のアミノ酸配列のアミノ酸位置Ｗ１７５またはＡ５３４に挿入されているウイルス粒子によって解決される。
【００１３】
最初の態様の最初の実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の２番目の実施形態では、少なくとも１つの異種ペプチドは、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５のアミノ酸配列のアミノ酸位置Ｗ１７５に挿入されている。
【００１４】
最初の態様の第一および第二実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の３番目の実施形態では、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５のアミノ酸配列は、配列番号：１に従うアミノ酸配列を含む。
【００１５】
最初の態様の第一、第二および第三実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の４番目の実施形態では、粒子は高度に抗原性である。
【００１６】
最初の態様の第一、第二、第三および第四実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の５番目の実施形態では、粒子は中和抗体の形成を誘導することができる。
【００１７】
最初の態様の第一、第二、第三、第四および第五実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の６番目の実施形態では、粒子はＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を誘導することができる。
【００１８】
最初の態様の第一、第二、第三、第四、第五および第六実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の７番目の実施形態では、少なくとも１つの異種ペプチドはＭＨＣクラスＩ提示抗原である。
【００１９】
最初の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六および第七実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の８番目の実施形態では、少なくとも１つの異種ペプチドは、ｐｐ６５とは異なる１つ以上のタンパク質の１つ以上の部分を含む、または、１つ以上の部分から形成される。
【００２０】
最初の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七および第八実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の９番目の実施形態では、少なくとも１つの異種ペプチドは、ＨＣＭＶ糖タンパク質の１つ以上の部分を含む、または、１つ以上の部分である。
【００２１】
最初の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八および第九実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の１０番目の実施形態では、少なくとも１つの異種ペプチドは、ＨＣＭＶ糖タンパク質ｇＢの１つ以上の部分を含む、または、１つ以上の部分である。
【００２２】
最初の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八および第九実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の１１番目の実施形態では、少なくとも１つの異種ペプチドは、ＨＣＭＶ糖タンパク質ｇＨの１つ以上の部分を含む、または、１つ以上の部分である。
【００２３】
最初の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八および第九実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の１２番目の実施形態では、少なくとも１つの異種ペプチドは、異なるＨＣＭＶ株からの特定の糖タンパク質の変異体である少なくとも２つのＨＣＭＶ糖タンパク質を含む、または、少なくとも２つのＨＣＭＶ糖タンパク質から成る。
【００２４】
最初の態様の１２番目の実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の１３番目の実施形態では、特定の糖タンパク質の少なくとも２つの変異体の一方はＨＣＭＶのＴｏｗｎｅ株の変異体であり、特定の糖タンパク質の少なくとも２つの変異体の他方はＨＣＭＶのＡｄ１６９株の変異体である。
【００２５】
最初の態様の１２番目および１３番目の実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の１４番目の実施形態では、糖タンパク質はＨＣＭＶのｇＢタンパク質である。
【００２６】
最初の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七および第八実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の１５番目の実施形態では、少なくとも１つの異種ペプチドは、ＨＣＭＶタンパク質ＩＥ１の１つ以上の部分を含む、または、１つ以上の部分である。
【００２７】
最初の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七および第八実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の１６番目の実施形態では、少なくとも１つの異種ペプチドは、ＨＣＭＶ糖タンパク質の１つ以上の部分およびＨＣＭＶタンパク質ＩＥ１の１つ以上の部分を含む、または、１つ以上の部分である。
【００２８】
最初の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七および第八実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の１７番目の実施形態では、少なくとも１つの異種ペプチドは、ＨＣＭＶ以外のヒト病原体の部分であるタンパク質の１つ以上の部分である。
【００２９】
最初の態様の１７番目の実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の１８番目の実施形態では、ＨＣＭＶ以外のヒト病原体の部分であるタンパク質は、ＨＣＭＶ以外のヒト病原体によるヒトの自然感染時に、それに対する細胞傷害性Ｔリンパ球がヒトにおいて形成されるタンパク質である。
【００３０】
最初の態様の１８番目の実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の１９番目の実施形態では、ＨＣＭＶ以外のヒト病原体は、ＨＩＶ−１、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびインフルエンザを含む群から選択されるヒト病原体である。
【００３１】
最初の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八および第十九実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の２０番目の実施形態では、融合タンパク質は、完全長Ｔ細胞抗原ｐｐ６５と少なくとも１つの異種ペプチドとを含む融合タンパク質である。
【００３２】
最初の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九および第二十実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の２１番目の実施形態では、ウイルス粒子または複数のそのような粒子は、疾患の治療および／または予防のための薬剤を製造するためである。
【００３３】
最初の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九および第二十実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の２２番目の実施形態では、ウイルス粒子または複数のそのような粒子は、疾患の治療および／または予防のための方法における使用のためのものである。
【００３４】
最初の態様の第二十一および第二十二実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の２３番目の実施形態では、疾患は、少なくとも１つの異種ペプチドもしくはその誘導体に対する中和抗体の形成によって、または、少なくとも１つの異種ペプチドもしくはその誘導体に対するＣＤ８＋Ｔリンパ球応答の誘導によって治療および／または予防することができる疾患である。
【００３５】
最初の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九および第二十実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の２４番目の実施形態では、ウイルス粒子または複数のそのような粒子はワクチンの製造のためのものである。
【００３６】
最初の態様の第二十四実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の２５番目の実施形態では、ワクチンはＨＣＭＶ感染の治療および／または予防のためのものである。
【００３７】
最初の態様の第二十四実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の２６番目の実施形態では、ワクチンは移植の副作用の治療および／または予防のためのものである。
【００３８】
最初の態様の第二十六実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の２７番目の実施形態では、移植は、固形臓器または造血幹細胞の移植である。
【００３９】
最初の態様の第二十六および第二十七実施形態の１つの実施形態でもある、最初の態様の２８番目の実施形態では、副作用は、ＨＣＭＶ感染によって引き起こされる、または、ＨＣＭＶ感染に付随している。
【００４０】
本発明の根本的な課題は、疾患または副作用の治療および／または予防のための薬剤を製造するための、最初の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九および第二十実施形態のいずれか１つに従うウイルス粒子の使用により、２番目の態様の第一実施形態でもある２番目の態様において解決され、疾患または副作用は、実施形態の各々およびいずれか、ならびに各々およびいずれかの態様において定義される疾患または副作用である。
【００４１】
本発明の根本的な課題は、疾患または副作用の治療および／または予防のためのワクチンを製造するための、最初の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九および第二十実施形態のいずれか１つに従うウイルス粒子の使用により、３番目の態様の第一実施形態でもある３番目の態様において解決され、疾患または副作用は、実施形態の各々およびいずれか、ならびに各々およびいずれかの態様において定義される疾患または副作用である。
【００４２】
ｐｐ６５への異種ペプチド配列の挿入部位がその後のＤＢ形成の効率にとって極めて重要であるという洞察に基づき、本発明者は、驚くべきことに、本発明のウイルス粒子中に含まれ、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５の１つ以上の部分と少なくとも１つの異種ペプチドとを含有する融合タンパク質が、異種ペプチドがｐｐ６５アミノ酸配列のアミノ酸位置Ｗ１７５またはアミノ酸位置Ａ５３４に挿入される場合、ＤＢに有益な特徴を付与することを見出した。これらの融合タンパク質の有益な特徴は、異種ペプチドに対する中和抗体の誘導、異種ペプチドに対するＣＤ８＋Ｔリンパ球応答の誘導、およびそのようなＤＢの高収率での生産を含む。さらに、ｐｐ６５におけるこれらの２つの遺伝子座は、前記融合タンパク質を含むＤＢの効率的な形成と放出を可能にした。これら２つの融合タンパク質に関して認められたＣＤ８＋Ｔリンパ球応答は、ＣＤ８Ｔ細胞画分のエクスビボＥｌｉｓｐｏｔ分析により容易に検出可能な、ＣＤ８Ｔ細胞応答をプライミングした。
【００４３】
当分野でＵＬ８３とも称される、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５は、Ｐａｎｄｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（Ｐａｎｄｅ，Ｈ，Ｌｅｅ，Ｔ．Ｄ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｚａｉａ，Ｊ．Ａ，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ６４−ｋＤａ  ｍａｊｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（Ｔｏｗｎｅ）：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  ｐｐ６５  ｏｆ  ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）」；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７８（１），６−１４（１９９０））によって記述されている。
【００４４】
ｐｐ６５の機能およびこのタンパク質の機能と正しい折りたたみのために重要なドメインについてはほとんど知られていない。その結果として、ｐｐ６５内の機能的に関連する領域を確実に保存する挿入部位選択のための論理的根拠はない。挿入部位の選択は、ベータヘルペスウイルスにおける保存された領域と、さらに予測される二次構造（αヘリックスおよびβシート）を回避するように実施した。これは、保存された領域、αヘリックスおよびβシートが構造的および機能的に重要であると考えられ、破壊されるべきではないと仮定して行った。しかし、これらの突然変異体の大部分はｒｅｃＤＢを効率的に形成することができず、この方法は適切な挿入部位を同定できないことを指した。それを考慮して本発明者は、驚くべきことに、ＲＶ−ＳＢ３およびＲＶ−ＳＢ６内の挿入部位がｒｅｃＤＢ形成のためにより適切であると判明したことを認めた。
【００４５】
本出願において示されるように、ＨＦＦへのＤＢ−ＳＢ３およびＤＢ−ＳＢ６によるキメラｐｐ６５の外因性導入は、ｐｐ６５ＮＬＶおよびＩＥ１ＴＭＹの効率的な提示を導いた。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックＨＨＤマウスへのこれらの粒子の適用は、両方のペプチドに対するＣＤ８Ｔ細胞応答をプライミングし、これは、コグネイトペプチドによるこれらのＴ細胞のインビトロ増殖後に検出することができた。ｒｅｃＤＢを用いてｐｐ６５の５４８位にＩＥ１ペプチドを挿入した以前の実験においても同様の結果が得られている［２１；２２］。しかし、後者のｒｅｃＤＢを使用すると、いずれのペプチドに対するＣＤ８Ｔ細胞もエクスビボでは直接検出することができず、プライミングが効率的でないことを示唆した。ＤＢ−ＳＢ３の適用は、これに対し、ｐｐ６５ＮＬＶ特異的およびＩＥ１ＴＭＹ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の容易に検出可能な頻度をもたらした。これは、これらのｒｅｃＤＢが高度に免疫原性であり、内因性および異種ペプチドの両方に対してＴ細胞を誘導したことを示す。
【００４６】
本発明の１つの実施形態では、異種ペプチドは抗原性ペプチドであり、より好ましくは抗原性異種ペプチドである。
【００４７】
本発明の１つの実施形態では、異種ペプチドは、ＨＣＭＶのＩＥ１タンパク質またはその部分とは異なる。
【００４８】
本発明の１つの実施形態では、ペプチドの長さは約４〜４０アミノ酸残基、好ましくは約６〜２５アミノ酸残基、より好ましくは約８〜１５アミノ酸残基、および最も好ましくは約８〜１２アミノ酸残基である。
【００４９】
好ましく使用される場合、範囲の限界を規定する任意の表現、例えば「１〜５」は、１から５までの任意の整数、すなわち１、２、３、４および５を意味する。言い換えると、２つの整数によって定義される範囲は、定義の前記限界を規定する２つの整数および前記範囲によって包含される、または、前記範囲内に含まれる任意の整数の両方を含む。
【００５０】
本発明の１つの実施形態では、本発明のウイルス粒子の抗原性は、先行技術の高密度体、より具体的には完全長Ｔ細胞抗原ｐｐ６５を含有する融合タンパク質を含む高密度体と比較して増大している。
【００５１】
本発明の１つの実施形態では、本発明のウイルス粒子の形成は、［２５］に記載されている高密度体の形成と比較して増大している。
【００５２】
好ましくは、ＨＣＭＶタンパク質ＩＥ１はｐｐＵＬ１２３とも称されることが当業者に認識される。
【００５３】
また、粒子に含まれる融合タンパク質は、好ましい実施形態ではキメラタンパク質であることも認識される。
【００５４】
本発明を、ここで、以下の図面および実施例を参照してさらに説明するが、これらからさらなる利点、特徴および実施形態を理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＨＣＭＶ組換え体に感染したＨＦＦの間接免疫蛍光分析の結果を示す。
【図２】図２Ａは、免疫ブロット分析の結果を示す。図２Ｂは、様々な融合タンパク質についての時間（感染後の日数（ｄ．ｐ．ｉ））の関数としてゲノムコピー数／ｍｌを示すダイアグラムとして、定量的ＤＮＡ／ＰＣＲ分析の結果を示す。図２Ｃは、さらなる免疫ブロット分析の結果を示す。
【図３】図３Ａは、ｐｐ６５ＮＬＶ−ＣＴＬを応答細胞として使用して、様々な融合タンパク質についての応答性ＣＤ８＋細胞の割合を示すダイアグラムとしてＩＦＮ−γ−Ｅｌｉｓｐｏｔ分析の結果を示す。図３Ｂは、ＩＥ１ＴＭＹ−ＣＴＬを応答細胞として使用して、様々な融合タンパク質についての応答性ＣＤ８＋細胞の割合を示すダイアグラムとしてＩＦＮ−γ−Ｅｌｉｓｐｏｔ分析の結果を示す。
【図４】ＲＭＡ−Ｓ細胞を刺激細胞として使用して、様々な融合タンパク質についての応答性ＣＤ８＋細胞の割合を示すダイアグラムとしてＩＦＮ−γ−Ｅｌｉｓｐｏｔ分析の結果を示す。
【図５】完全長ｐｐ６５のアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
図１は、ＨＣＭＶ組換え体に感染した、ＨＦＦの間接免疫蛍光分析の結果を示す。細胞を、示されているウイルスに４日間感染させ、その後免疫蛍光分析用に処理した。各々のウイルスによって発現される組換えｐｐ６５の形状を顕微鏡写真の下に示す。挿入部位に隣接するｐｐ６５のＮ末端アミノ酸を示す。
【００５７】
図２は、ｐｐ６５融合タンパク質の発現、組換えウイルスの複製、ならびに、ビリオンへの融合タンパク質およびＤＢへの融合タンパク質のパッケージングの効率を示す。（Ａ）２日間および４日間感染させたＨＦＦの免疫ブロット分析。細胞を感染多重度２で感染させ、分析のために指示されている時点で収集した。フィルタをｐｐ６５特異的モノクローナル抗体６５−３３でプローブした。各々のレーンのタンパク質の量をβ−アクチンに対して基準化した。（Ｂ）感染ＨＦＦの細胞培養上清中のウイルスゲノムの定量的ＤＮＡ−ＰＣＲ分析。細胞を１０ゲノム／細胞の感染多重度で感染させた。培養上清を指示されている時点で収集し、凍結した。ＰＣＲ分析を同じアッセイにおいて並行して実施した。（Ｃ）ｒｅｃＤＢまたはビリオンにパッケージングされたｐｐ６５の免疫ブロット分析。細胞を組換えウイルスまたは野生型ＲＶ−ＨＢ５に６〜７日間感染させた。上清をグリセロール−酒石酸勾配遠心分離に供し、ビリオン画分およびＤＢ画分を収集した。これらの画分を、モノクローナル抗体６５−３３を使用してまたは、内部標準としてウイルスｇＢに対するモノクローナル抗体を使用して、免疫ブロット法によって分析した。
【００５８】
図３は、ｒｅｃＤＢで処理した、ＨＬＡ−Ａ２陽性ＨＦＦによるＭＨＣクラスＩ提示のＩＦＮ−γ−Ｅｌｉｓｐｏｔ分析の結果を示す。細胞を指示されているＤＢで処理し、その後、ｐｐ６５ＮＬＶ−ＣＴＬ（Ａ）またはＩＥ１ＴＭＹ−ＣＴＬ（Ｂ）のいずれかを応答細胞として使用して、ＩＦＮ−γ−Ｅｌｉｓｐｏｔ分析における刺激細胞として用いた。
【００５９】
図４は、ｒｅｃＤＢＤで免疫したＨＨＤマウスからのＣＤ８＋富化脾細胞のエクスビボＩＦＮ−γ−Ｅｌｉｓｐｏｔ分析の結果を示す。コグネイトペプチドを負荷したＲＭＡ−Ｓ細胞を刺激細胞として用いた。バーの大きさは、Ｂｏｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ［３７］によって述べられている線形回帰分析によって決定された、ＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８Ｔ細胞の最も可能性の高い頻度を表す。誤差バーは９５％信頼区間を示す。
【実施例１】
【００６０】
＜実験材料および方法＞
１．細胞
一次ヒト包皮線維芽細胞、ＣＴＬ株、およびＴ２細胞を、以前に記述されているように［２３］培養した。ＲＭＡ−Ｓ細胞［２４］を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ｍｇゲンタマイシンＬ−１および５μＭのβ−メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｅｌｂｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で増殖させた。
【００６１】
２．プラスミドおよびウイルス
ウイルスＤＮＡの突然変異誘発のために、ＨＣＭＶ細菌人工染色体（ＢＡＣ）ｐＨＢ５［２５］を使用した。ｐＨＢ５の突然変異誘発を、別のところで記述されているように［２１］ｇａｌＫ陽性／陰性選択手順［２６］に従って実施した。ＵＬ８３オープンリーディングフレームに挿入したＤＮＡ配列は、正確なプロテアソームプロセシングを可能にするため付加的なアミノ酸によって隣接された、ＨＬＡ−Ａ２提示ペプチドＩＥ１ＴＭＹ［ＩＥ１２９７−３０５］をコードした。ｐｐ６５に融合した付加的なポリペプチドはＴＳＤＡＣＭＭＴＭＹＧＧＩＳＬＬＳＥＦＣであり、ＨＬＡ−Ａ２提示ノナペプチドに下線を付している。ＢＡＣクローンからのウイルス再構成をＨｏｂｏｍ  ｅｔ  ａｌ．［２７］に従って実施した。
【００６２】
ウイルスストックを作製し、力価を測定して、感染後４８時間目にＩＥ１陽性細胞を計数することによって、または、［２８］に記述されているように細胞外ウイルスゲノムのＴａｑＭａｎ  ＤＮＡ  ＰＣＲ分析によって定量化した。ＨＦＦを７日間感染させた。感染多重度０．１での感染により、おおよそ１０個の細胞内ウイルスゲノムが生じた。
【００６３】
３．高密度体の精製、間接免疫蛍光分析および免疫ブロット法
Ｉｒｍｉｅｒｅ  ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ［２９］によって最初に公表し、以前に記述されているように［２０］、グリセロール−酒石酸勾配超遠心分離法によって後期感染ＨＦＦからＤＢを精製した。間接免疫蛍光分析を［３０］に記述されているように実施した。モノクローナル抗体６５−３３（Ｗ．Ｂｒｉｔｔ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌａｂａｍａ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡの好意により提供された）およびＦＩＴＣ結合二次抗体（ＤＡＫＯ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してｐｐ６５を標識した。核をＤＡＰＩで対比染色した。Ａｘｉｏｐｈｏｔ−１顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を１０００倍の倍率で使用して免疫蛍光分析からのデータを収集した。免疫ブロット法のために、タンパク質試料を還元条件下で変性させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、４００ｍＡで１時間４５分間電気ブロッティングすることによってニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に転写した。膜をｐｐ６５、β−アクチン（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）および糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に対する抗体［３１］と共にインキュベートした。ウエスタンブロットを、ＡＬＥＸＡ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＩＲｄｙｅ  ８００（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）に結合した抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体でプローブした。ブロットしたタンパク質を検出し、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外画像システム（ＬＩ−ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ，ＵＳＡ）を用いて定量化した。
【００６４】
２．４  インターフェロンγ−ｒｅｃＤＢと共にインキュベートしたＨＦＦのＥｌｉｓｐｏｔアッセイ
酵素結合免疫スポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）アッセイを以前に述べられているように［２３；３２］実施した。ＨＬＡ−Ａ０２０１（Ａ２）拘束性ＨＣＭＶ由来ペプチドｐｐ６５４９５−５０３（ｐｐ６５ＮＬＶ−ＣＴＬ）［３３；３４］およびＩＥ１２９７−３０５（ＩＥ１  ＴＭＹ−ＣＴＬ）［３５］に特異的なＣＴＬ株をこれらの分析において使用した。ＣＴＬ株は、ＨＬＡ−Ａ２／ｈｕＣＤ８二重トランスジェニック（ｔｇ）マウスを免疫することによって作製しておいた［２３］。
【００６５】
２．５  ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスモデル
８〜１２週齢のＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス（ＨＨＤマウス、［３６］）を、それぞれＲＶ−ＨＢ５（ＤＢ−ＨＢ５）、ＲＶ−ＳＢ３（ＤＢ−ＳＢ３）またはＲＶ−ＳＢ６（ＤＢ−ＳＢ６）のＤＢを６μｇ、またはＰＢＳにより腹腔内免疫した。リンパ球を免疫後７日目に脾臓から調製した。ＣＤ８Ｔ細胞をＭＡＣＳソーティングによって富化し、ＩＦＮ−γ分泌細胞の頻度を、ペプチド負荷したＲＭＡ−Ｓ  ＨＨＤまたはＴ２刺激細胞を使用してエクスビボで直接Ｅｌｉｓｐｏｔによって分析した。この設定で、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ／Ｔｓ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＥｌｉｓｐｏｔプレートを使用した。Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを製造者の推奨に従って実施した。応答細胞の頻度を、Ｂｏｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ［３７］によって述べられているように線形回帰分析によって決定した。
【実施例２】
【００６６】
＜挿入部位の選択は細胞質ＤＢの形成のために極めて重要である＞
この実施例で説明するように、異種ペプチドの挿入部位の選択は細胞質ＤＢの形成のために極めて重要である。
【００６７】
さらに開発すべきワクチン候補物の潜在的可能性は、さらなるスケールアップのために達成され得る収率に決定的に依存する。以前の研究において、異種ペプチド配列をテグメントタンパク質ｐｐ６５に融合することにより、ＤＢをその抗原含量に関して改変できるという証拠を提供することができた［２１］。しかし、ＨＣＭＶのそれぞれの組換え体に感染させた細胞は限られた量のｒｅｃＤＢしか放出しなかった。そこで、ｐｐ６５内の他の部位における異種ペプチドのアミノ酸配列などの異種配列の挿入がｒｅｃＤＢの収率を高めるという仮説を試験した。
【００６８】
分子の異なる部分の５つの部位を挿入のために選択した（図１）。挿入したペプチドは、ＨＣＭＶのＩＥ１タンパク質からのＨＬＡ−Ａ２提示ノナペプチドＴＭＹＧＧＩＳＬＬ（ＩＥ１ＴＭＹ）［３５］を包含する２０アミノ酸から成った。ｇａｌＫに基づく選択手順［２１；２２］を用いて、ＨＣＭＶ−ＢＡＣプラスミドｐＨＢ５［２５］を改変することによって組換えウイルスを作製した。組換えＢＡＣプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼ消化および挿入部位のヌクレオチド配列決定により、正確性に関して分析した（データには示されていない）。その後、ＢＡＣプラスミドのＨＦＦへのトランスフェクションによって組換えウイルスの再構成を実施した。生じたウイルスをＤＢ形成に関して試験した。ＨＦＦのＨＣＭＶ感染の１つの顕著な特徴はＤＢの細胞質蓄積であり、これは間接免疫蛍光分析（ＩＦＡ）によって視覚化することができる。続いて、ＨＦＦを新たに作製された突然変異体により感染させ、ｐｐ６５特異的抗体を使用して感染後（ｄ．ｐ．ｉ．）４日目にＩＦＡを実施した（図１）。突然変異体ＲＶ−ＳＢ３およびＲＶ−ＳＢ６に感染した細胞だけが、親ウイルス感染細胞の形成に匹敵するように細胞質ＤＢの形成を示した。これに対し、ＲＶ−ＳＢ２、ＲＶ−ＳＢ４およびＲＶ−ＳＢ５感染細胞ではＤＢの形成は全くまたはわずかしか認められなかった。これらの細胞では、後期感染ＨＦＦで典型的に見られる、ｐｐ６５の核−細胞質トランスロケーションが減少していたことに留意しなければならない。これらの結果は、ｐｐ６５内の異種ペプチド配列の挿入のための部位選択がｒｅｃＤＢ形成のために極めて重要であることを示した。ＩＦＡの結果に基づき、ウイルスＲＶ−ＳＢ３およびＲＶ−ＳＢ６をさらなる分析のために選択した。
【実施例３】
【００６９】
＜親株とＲＶ−ＳＢ３およびＲＶ−ＳＢ６の比較＞
この実施例で示すように、組換えウイルスＲＶ−ＳＢ３およびＲＶ−ＳＢ６は、ｐｐ６５発現、ビリオン放出、および粒子へのｐｐ６５のパッケージングに関して親株と同等である。
【００７０】
ＲＶ−ＳＢ３およびＲＶ−ＳＢ６感染ＨＦＦにおけるｐｐ６５の発現レベルを免疫ブロット分析によって試験した。細胞をウイルスまたは親ＲＶ−ＨＢ５にそれぞれ２または４日間感染させた。細胞溶解物を、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外画像システムを用いて定量的免疫ブロット分析に供した。細胞アクチンの量を内部標準とした（図２Ａ）。ＲＶ−ＳＢ３およびＲＶ−ＳＢ６感染細胞におけるｐｐ６５融合タンパク質の発現レベルは、親ＲＶ−ＨＢ５に感染させた細胞におけるｐｐ６５のレベルと比較して、感染後２日目に低下した。しかし、感染後４日目には、２つの融合タンパク質のレベルは、ＲＶ−ＨＢ５感染細胞におけるｐｐ６５のレベルよりもさらに高いと思われた。これは、ｒｅｃＤＢの合成を指令するのに十分なタンパク質がＲＶ−ＳＢ３およびＲＶ−ＳＢ６感染細胞において合成されることを指した。
【００７１】
ＨＦＦにおいて複製する組換え株の能力を試験するため、細胞を感染多重度０．１で感染させ、１０ゲノムコピー／細胞を生じさせて、培養上清を感染後７日目まで１日ごとに収集した。上清中に放出されたウイルスＤＮＡを、定量的ＰＣＲ分析を用いて定量化した（図２Ｂ）。ＲＶ−ＳＢ３およびＲＶ−ＳＢ６の両方が、親ＲＶ−ＨＢ５と同様のレベルに複製することが判明した。
【００７２】
最後に、グリセロール勾配遠心分離によって感染ＨＦＦ上清から収集した精製ビリオンおよびＤＢの免疫ブロット分析によって、融合タンパク質のパッケージングを分析した。この場合は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）を内部標準として用いて基準化を実施した。組換え株をそれらの親株と比較した場合、ビリオンまたはＤＢへのｐｐ６５のパッケージングに差は認められなかった（図２Ｃ）。合わせて考慮すると、これらの結果は、ＲＶ−ＳＢ３およびＲＶ−ＳＢ６の両方が、感染細胞における発現およびｐｐ６５のパッケージングならびに複製に関してＲＶ−ＨＢ５と同等であることを示した。
【実施例４】
【００７３】
＜ＤＢ−ＳＢ３またはＤＢ−ＳＢ６で処理したＨＦＦによるｐｐ６５ＮＬＶおよびＩＥ１ＴＭＹの両方の発現＞
この実施例は、ｐｐ６５ＮＬＶおよびＩＥ１ＴＭＹの両方がＤＢ−ＳＢ３またはＤＢ−ＳＢ６で処理したＨＦＦによって提示されることを示す。
【００７４】
ワクチン開発のためにｒｅｃＤＢを使用することの１つの目標は、移植後の患者における細胞傷害性Ｔ細胞の再構成を支持することである。これらの細胞は、ウイルスの再活性化および疾患の予防のために決定的に重要であることが示されている（［１３；１５］、［１６］において総説されている）。そこで、ｒｅｃＤＢがｐｐ６５由来のｐｐ６５ＮＬＶおよびＩＥ１由来のＩＥ１ＴＭＹの両方をＨＦＦのＭＨＣクラスＩ提示経路に導入することができるかどうかを試験した。
【００７５】
したがって、細胞をｒｅｃＤＢで処理し、その後インターフェロンγ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイに供した（図３）。応答細胞として、両方のペプチドに対するＣＴＬクローン（ｐｐ６５ＮＬＶ−ＣＴＬ；ＩＥ１ＴＭＹ−ＣＴＬ）を使用した［２３］。ＤＢ−ＳＢ３およびＤＢ−ＳＢ６処理細胞の両方がＩＥ１ＴＭＹおよびｐｐ６５ＮＬＶを提示した。ｐｐ６５ＮＬＶの提示はｒｅｃＤＢと野生型ＤＢの間で同等であり、ＩＥ１由来配列の挿入がＨＦＦにおけるｐｐ６５提示を損なわないことを指した。ＤＢ−ＳＢ３での細胞の処理は、応答性ＩＥ１ＴＭＹ−ＣＴＬの数をｐｐ６５特異的応答と同等のレベルにした。しかし、ＤＢ−ＳＢ６での細胞の処理は、ＩＥ１特異的アッセイにおいて著明に低い数の陽性スポットをもたらした。これは、ＤＢとのインキュベーション後にＩＥ１ペプチドを提示するＨＦＦの能力が、ペプチドがｐｐ６５に挿入される部位に感受性であることを示した。
【実施例５】
【００７６】
＜組換えＤＢ（ｒｅｃＤＢ）での免疫はＩＥ１ＴＭＹ特異的およびｐｐ６５ＮＬＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を生じさせる＞
この実施例は、組換えＤＢ（ｒｅｃＤＢ）での免疫が、有意の頻度のＩＥ１ＴＭＹ特異的ＣＤ８Ｔ細胞およびｐｐ６５ＮＬＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞をプライミングすることを示す。
【００７７】
以前の実験は、ｒｅｃＤＢがマウスにおいてＩＥ１ＴＭＹ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を誘導できることを示していた。しかし、これらの細胞は、免疫マウスからのＣＤ８Ｔ細胞画分をコグネイトペプチドによりインビトロ刺激した後にのみ検出可能であった。応答性ＣＤ８  Ｔ細胞はエクスビボでは直接検出されず、特異的細胞の総数、すなわちそれらのｒｅｃＤＢに対する全体的応答が低いことを指した［２１］。新たに確立されたｒｅｃＤＢの免疫学的潜在能を評価するため、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックＨＨＤマウスをアジュバントの不在下に異なるＤＢで免疫した。予想されたように、ＩＥ１ＴＭＹまたはｐｐ６５ＮＬＶに特異的な応答性ＣＤ８Ｔ細胞はインビトロ刺激後に検出可能であった（データには示されていない）。
【００７８】
免疫マウスからの細胞を直接エクスビボでも試験した。このために、脾細胞のＣＤ８＋画分をＭＡＣＳソーティングによって分離し、ペプチド負荷した抗原提示細胞を使用してＥｌｉｓｐｏｔ分析により試験した。ＩＥ１ＴＭＹに特異的なＣＤ８Ｔ細胞は、ＤＢ−ＳＢ３およびＤＢ−ＳＢ６のどちらによる免疫後も検出することができた（図４）。ＤＢ−ＳＢ３によってプライミングされたＩＥ１特異的応答は、ＤＢ−ＳＢ６によって誘導された応答よりも強力であると思われたが、どちらも明らかに検出可能なレベルに達した。ＤＢ−ＳＢ３での免疫後、ｐｐ６５ＮＬＶに対して反応性のＣＤ８Ｔ細胞は、野生型ＤＢと比較しておおよそ３倍のレベルで検出することができた。
【００７９】
驚くべきことに、しかし、この応答は、ＤＢ−ＳＢ６での免疫後に選択した実験設定では検出不能であり、ｐｐ６５ＮＬＶ特異的応答はエクスビボで検出することができなかった。この結果は２番目の実験において確認され、ＤＢ−ＳＢ６で免疫することにより免疫優性ｐｐ６５ＮＬＶペプチドに対してプライミングされるＣＤ８Ｔ細胞応答が効率的でないことを示した（図４）。同等の結果が、Ｔ２細胞を抗原提示のために選択した場合に得られた（データには示されていない）。さらに、これは、これらの細胞がアッセイの検出限界より低い頻度でしか誘導されなかったことを示す。それと一致して、インビトロでのｐｐ６５ＮＬＶ特異的Ｔ細胞の再刺激は、ＩＥ１ＴＭＹ特異的細胞と比較して遅延した（データには示されていない）。
【００８０】
合わせて考慮すると、これらの実験は、特に、異種抗原性ペプチドに対するＣＤ８  Ｔ細胞応答をプライミングするＤＢ−ＳＢ３の潜在能を証明した。
【００８１】
参考文献のリスト：
本出願では、以下のように様々な参考文献を引用する。
[1]   Mwintshi K, Brennan DC. Prevention and management of cytomegalovirus infection in solid-organ transplantation. Expert Rev Anti Infect Ther 2007; 5(2):295-304.
[2]   Rubin RH. The pathogenesis and clinical management of cytomegalovirus infection in the organ transplant recipient: the end of the 'silo hypothesis'. Curr Opin Infect Dis 2007; 20(4):399-407. 
[3]   Arthurs SK, Eid AJ, Pedersen RA, Dierkhising RA, Kremers WK, Patel R, et al. Delayed-onset primary cytomegalovirus disease after liver transplantation. Liver Transpl 2007; 13(12):1703-9. 
[4]   Arthurs SK, Eid AJ, Pedersen RA, Kremers WK, Cosio FG, Patel R, et al. Delayed-onset primary cytomegalovirus disease and the risk of allograft failure and mortality after kidney transplantation. Clin Infect Dis 2008; 46(6):840-6.
[5]   Peggs KS. Cytomegalovirus following stem cell transplantation: from pharmacologic to immunologic therapy. Expert Rev Anti Infect Ther 2004; 2(4):559-73.
[6]   Hebart H, Einsele H. Clinical aspects of CMV infection after stem cell transplantation. Hum Immunol 2004; 65(5):432-6.
[7]   Ljungman P. Risk assessment in haematopoietic stem cell transplantation: viral status. Best Pract Res Clin Haematol 2007; 20(2):209-17. 
[8]   Boeckh M, Nichols WG, Papanicolaou G, Rubin R, Wingard JR, Zaia J. Cytomegalovirus in hematopoietic stem cell transplant recipients: Current status, known challenges, and future strategies. Biol Blood Marrow Transplant 2003; 9(9):543-58.
[9]   Boeckh M, Nichols WG. The impact of cytomegalovirus serostatus of donor and recipient before hematopoietic stem cell transplantation in the era of antiviral prophylaxis and preemptive therapy. Blood 2004; 103(6):2003-8.
[10]   Plotkin SA. Cytomegalovirus vaccines. In: Plotkin SA, Orenstein WA, Offit PA, editors. Vaccines. 5 ed. Elsevier, 2008: p. 1147-54. 
[11]   Cheeran MC, Lokensgard JR, Schleiss MR. Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention. Clin Microbiol Rev 2009; 22(1):99-126, Table. 
[12]   Stratton KR, Durch JS, Lawrence R.S. Vaccines for the 21st Century. A Tool for Decisionmaking. Washington, DC: National Academy Press, 2001.
[13]   Reddehase MJ, Mutter W, Munch K, Buhring HJ, Koszinowski UH. CD8-positive T lymphocytes specific for murine cytomegalovirus immediate-early antigens mediate protective immunity. J Virol 1987; 61:3102-8.
[14]   Wills MR, Carmichael AJ, Sissons JG. Adaptive Cellular Immunity to Human Cytomegalovirus. In: Reddehase MJ, editor. Cytomegalovirus: Molecular Biology and Immunology. Caister Academic Press, Wymondham, Norfolk, U.K., 2006: p. 341-65.
[15]   Walter EA, Greenberg PD, Gilbert MJ, Finch RJ, Watanabe KS, Thomas ED, et al. Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N Engl J Med 1995; 333(16):1038-44.
[16]   Herr W, Plachter B. Cytomegalovirus and varicella-zoster virus vaccines in hematopoietic stem cell transplantation. Expert Rev Vaccines 2009; 8(8):999-1021.
[17]   Schleiss MR. Cytomegalovirus vaccine development. Curr Top Microbiol Immunol 2008; 325:361-82.
[18]   Pass RF, Zhang C, Evans A, Simpson T, Andrews W, Huang ML, et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. N Engl J Med 2009; 360(12):1191-9.
[19]   Bernstein DI, Reap EA, Katen K, Watson A, Smith K, Norberg P, et al. Randomized, double-blind, Phase 1 trial of an alphavirus replicon vaccine for cytomegalovirus in CMV seronegative adult volunteers. Vaccine 2009; 28(2):484-93.
[20]   Pepperl S, Munster J, Mach M, Harris JR, Plachter B. Dense bodies of human cytomegalovirus induce both humoral and cellular immune responses in the absence of viral gene expression. J Virol 2000; 74(13):6132-46.
[21]   Mersseman V, Besold K, Reddehase MJ, Wolfrum U, Strand D, Plachter B, et al. Exogenous introduction of an immunodominant peptide from the nonstructural IE1 protein of human cytomegalovirus into the MHC class I presentation pathway by recombinant dense bodies. J Gen Virol 2008; 89(Pt2):369-79.
[22]   Mersseman V, Bohm V, Holtappels R, Deegen P, Wolfrum U, Plachter B, et al.
Refinement of strategies for the development of a human cytomegalovirus dense body vaccine. Med Microbiol Immunol 2008; 197(2):97-107.
[23]   Besold K, Frankenberg N, Pepperl-Klindworth S, Kuball J, Theobald M, Hahn G, et al. Processing and MHC class I presentation of human cytomegalovirus pp65-derived peptides persist despite gpUS2-11-mediated immune evasion. J Gen Virol 2007; 88(Pt 5):1429-39.
[24]   Townsend A, Ohlen C, Bastin J, Ljunggren HG, Foster L, Karre K. Association of class I major histocompatibility heavy and light chains induced by viral peptides. Nature 1989; 340(6233):443-8.
[25]   Borst EM, Hahn G, Koszinowski UH, Messerle M. Cloning of the human cytomegalovirus (HCMV) genome as an infectious bacterial artificial chromosome in Escherichia coli: a new approach for construction of HCMV mutants. J Virol 1999; 73(10):8320-9.
[26]   Warming S, Costantino N, Court DL, Jenkins NA, Copeland NG. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res 2005; 33(4):e36.
[27]   Hobom U, Brune W, Messerle M, Hahn G, Koszinowski UH. Fast screening procedures for random transposon libraries of cloned herpesvirus genomes: mutational analysis of human cytomegalovirus envelope glycoprotein genes.J Virol 2000; 74(17):7720-9.
[28]   Besold K, Wills M, Plachter B. Immune evasion proteins gpUS2 and gpUS11 of human cytomegalovirus incompletely protect infected cells from CD8 T cell recognition. Virology 2009; 391(1):5-19.
[29]   Irmiere A, Gibson W. Isolation and characterization of a noninfectious virionlike particle released from cells infected with human strains of cytomegalovirus. Virology 1983; 130:118-33.
[30]   Schmolke S, Drescher P, Jahn G, Plachter B. Nuclear targeting of the tegument protein pp65 (UL83) of human cytomegalovirus: an unusual bipartite nuclear localization signal functions with other portions of the protein to mediate its efficient nuclear transport. J Virol 1995; 69:1071-8.
[31]   Utz U, Britt W, Vugler L, Mach M. Identification of a neutralizing epitope on glycoprotein gp58 of human cytomegalovirus. J Virol 1989; 63:1995-2001.
[32]   Frankenberg N, Pepperl-Klindworth S, Meyer RG, Plachter B. Identification of a conserved HLA-A2-restricted decapeptide from the IE1 protein (pUL123) of human cytomegalovirus. Virology 2002; 295(2):208-16.
[33]   Wills MR, Carmichael AJ, Mynard K, Jin X, Weekes MP, Plachter B, et al. The human cytotoxic T-lymphocyte (CTL) response to cytomegalovirus is dominated by structural protein pp65: frequency, specificity, and T-cell receptor usage of pp65- specific CTL. J Virol 1996; 70:7569-79.
[34]   Diamond DJ, York J, Sun JY, Wright CL, Forman SJ. Development of a candidate HLA A*0201 restricted peptide-based vaccine against human cytomegalovirus infection. Blood 1997; 90(5):1751-67.
[35]   Gallez-Hawkins G, Villacres MC, Li X, Sanborn MC, Lomeli NA, Zaia JA. Use of transgenic HLA A*0201/Kb and HHD II mice to evaluate frequency of cytomegalovirus IE1-derived peptide usage in eliciting human CD8 cytokine response. J Virol 2003; 77(7):4457-62.
[36]   Pascolo S, Bervas N, Ure JM, Smith AG, Lemonnier FA, Perarnau B. HLAA2.1- restricted education and cytolytic activity of CD8(+) T lymphocytes from beta2 microglobulin (beta2m) HLA-A2.1 monochain transgenic H-2Db beta2m double knockout mice. J Exp Med 1997; 185(12):2043-51.
[37]   Bohm V, Simon CO, Podlech J, Seckert CK, Gendig D, Deegen P, et al. The immune evasion paradox: immunoevasins of murine cytomegalovirus enhance priming of CD8 T cells by preventing negative feedback regulation. J Virol 2008; 82(23):11637-50.
[38]   Pepperl-Klindworth S, Plachter B. Current perspectives in vaccine development. In: Reddehase MJ, editor. Cytomegaloviruses: Molecular Biology and Immunology. Caister Academic Press Ltd, Wymondham, Norfolk, U.K., 2006.
【００８２】
本明細書、特許請求の範囲、配列表および／または図面において開示される本発明の特徴は、本発明をその様々な形態で実現するために別々におよびそれらの任意の組合せの両方で具現化することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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