(57)【要約】  生物学的試料中の複数の標的を検出するための方法が提供される。本方法は、生物学的試料を複数の標的結合性プローブに接触させて複数の標的結合プローブを形成する段階、標的結合プローブの１以上を生物学的試料に共有結合させる段階、及び標的結合プローブからのシグナルを順次に観測する段階を含んでいる。複数の標的を検出するための関連キット及び装置も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中の複数の標的を検出する方法であって、
（ａ）生物学的試料を複数の標的結合性プローブに接触させて複数の標的結合プローブを形成する段階、
（ｂ）標的結合プローブの１以上を生物学的試料に共有結合させる段階、
（ｃ）複数の標的結合プローブの第１組からの第１組のシグナルを観測する段階、
（ｄ）観測されたシグナルを修飾する段階、
（ｅ）複数の標的結合プローブの第２組から第２組のシグナルを発生させる段階、及び
（ｆ）第２組のシグナルを観測する段階
を含んでなる方法。
【請求項２】
さらに、複数の標的結合プローブの第３組、第４組及び第ｎ組に関して段階（ｄ）乃至段階（ｆ）を複数回繰り返して第３組、第４組及び第ｎ組のシグナルを観測することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらに、観測されたシグナルを複数の標的の検出と相関させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
複数の標的結合プローブのすべてが生物学的試料に共有結合される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
標的結合プローブが、標的それ自体を介して又は標的の近傍に位置する分子を介して生物学的試料に共有結合される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
標的結合性プローブが、標的結合部分から導かれる単位及び独立に検出可能な部分を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
複数の標的結合プローブの第１組の独立に検出可能な部分がシグナル発生部分を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
シグナル発生部分が発蛍光団、発色団、ラマンタグ、ＳＥＲＳタグ又はこれらの組合せからなる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
標的結合部分が開裂可能なリンカーを介して独立に検出可能な部分にカップリングされている、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
独立に検出可能な部分が特異な核酸配列、ハプテン、酵素又はこれらの組合せからなる、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
独立に検出可能な部分がマスクされたシグナル発生部分からなる、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
マスクされたシグナル発生部分が、マスクされた発蛍光団、マスクされた発色団、マスクされたラマンタグ、マスクされたＳＥＲＳタグ又はこれらの組合せからなる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
マスクされたシグナル発生部分をアンマスキングすることで、シグナルが複数の標的結合プローブから発生される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
シグナル発生部分を標的結合プローブの各々と結合することで、シグナルが複数の標的結合プローブから発生される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
さらに、接触段階後、標的と結合していない標的結合性プローブを除去する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
さらに、生物学的試料を複数の標的結合性プローブに接触させるのに先立ち、生物学的試料をイメージングしてバックグラウンドシグナルシグナチュアを得る段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
複数の標的の検出が、複数の標的の存在、不存在、位置又は量を確認することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
複数の標的が、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド、タンパク質、ホルモン、受容体、多糖、脂質及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
複数の標的が複数のリボ核酸から本質的になる、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
複数の標的が複数のタンパク質から本質的になる、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
生物学的試料中の複数の標的を検出する方法であって、
（ａ）生物学的試料を複数の標的結合性プローブに接触させて複数の標的結合プローブを形成する段階、
（ｂ）標的結合プローブの１以上を生物学的試料に共有結合させる段階、
（ｃ）複数の標的結合プローブの第１組から第１組のシグナルを発生させる段階、
（ｄ）第１組のシグナルを観測する段階、
（ｅ）観測されたシグナルを修飾する段階、
（ｆ）複数の標的結合プローブの第２組から第２組のシグナルを発生させる段階、及び
（ｇ）第２組のシグナルを観測する段階
を含んでなる方法。
【請求項２２】
さらに、複数の標的結合プローブの第３組、第４組及び第ｎ組に関して段階（ｄ）乃至段階（ｇ）を繰り返して第３組、第４組及び第ｎ組のシグナルを観測することを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ｎの整数値が５〜１００の範囲内にある、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
さらに、観測されたシグナルを複数の標的の検出と相関させることを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
さらに、第１組のシグナルを発生させるのに先立ち、生物学的試料をイメージングしてバックグラウンドシグナルシグナチュアを得る段階を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
さらに、相関段階に先立ち、続くシグナル観測段階で観測されたシグナルからバックグラウンドシグナルシグナチュアを減算する段階を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
生物学的試料中の複数の標的を検出する方法であって、
（ａ）試料を複数の標的結合性プローブに接触させて複数の標的結合プローブを形成する段階、
（ｂ）標的結合プローブの１以上を生物学的試料に共有結合させる段階、
（ｃ）複数の標的結合プローブを、複数の標的結合プローブの第１組と結合しかつ第１組のシグナルを発生させることができる第１組のシグナル発生プローブに接触させる段階、
（ｄ）第１組のシグナルを観測することで複数の標的の第１組を検出する段階、
（ｅ）観測された第１組のシグナルを修飾する段階、及び
（ｆ）複数の標的結合プローブの以後の組と結合しかつ以後の組のシグナルを発生させることができる以後の組のシグナル発生プローブを用いて段階（ｃ）乃至段階（ｅ）を複数回繰り返すことで複数の標的の以後の組を検出する段階
を含んでなる方法。
【請求項２８】
観測された第１組のシグナルが、化学薬剤を適用することで修飾される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
さらに、標的結合プローブを第１組のシグナル発生プローブに接触させるのに先立ち、複数の標的と結合していない標的結合性プローブを除去する段階を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
さらに、複数の標的の第１組を検出するのに先立ち、複数の標的結合プローブの第１組と結合していない第１組のシグナル発生プローブを除去する段階を含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
複数の標的結合プローブのすべてが、標的それ自体又は標的の近傍に位置する分子に共有結合される、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
段階（ｃ）乃至段階（ｆ）が最大１００回まで繰り返される、請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
複数の標的が、デオキシリボ核酸、リボ核酸、タンパク質及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
複数の標的が複数のリボ核酸から本質的になる、請求項２７記載の方法。
【請求項３５】
生物学的試料中の複数の多重標的を検出するためのキットであって、
複数の標的結合性プローブであって、各々の標的結合性プローブがシグナルを発生することができかつ１以上の標的結合性プローブが標的又は標的の近傍に位置する分子に対して架橋することができる、標的結合性プローブ、及び
１以上の標的結合性プローブから発生されるシグナルを修飾することができる１種以上の化学薬剤
を含んでなるキット。
【請求項３６】
生物学的試料中の複数の標的を検出するための装置であって、
試料取扱いシステム、
試薬分配システム、
プローブ架橋システム、及び
シグナル検出システム
を含んでなる装置。
【請求項３７】
試薬分配システムが、１以上の標的結合性プローブを含む１種以上の試薬溶液を分配する、請求項３６記載の装置。
【請求項３８】
試料取扱いシステム、試薬分配システム、プローブ架橋システム及びシグナル検出システムの１以上がオペレーターの介入なしに動作可能である、請求項３６記載の装置。
【請求項３９】
（ａ）生物学的試料を複数の標的結合性プローブに接触させて複数の標的結合プローブを形成する段階、
（ｂ）複数の標的結合プローブの第１組からの第１組のシグナルを観測する段階、
（ｃ）観測されたシグナルを修飾する段階、
（ｄ）複数の標的結合プローブの第２組から第２組のシグナルを発生させる段階、及び
（ｅ）第２組のシグナルを観測する段階
を含む方法を用いて生物学的試料中の複数の標的を検出するように動作可能である、請求項３６記載の装置。
【請求項４０】
（ａ）生物学的試料を複数の標的結合性プローブに接触させて複数の標的結合プローブを形成する段階、
（ｂ）標的結合プローブの１以上を生物学的試料に共有結合させる段階、
（ｃ）複数の標的結合プローブの第１組からの第１組のシグナルを観測する段階、
（ｄ）観測されたシグナルを修飾する段階、
（ｅ）複数の標的結合プローブの第２組から第２組のシグナルを発生させる段階、及び
（ｆ）第２組のシグナルを観測する段階
を含む方法を用いて生物学的試料中の複数の標的を検出するように動作可能である、請求項３６記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、生物学的試料中の複数の標的を検出するための方法、キット及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的試料を分析してその特性を確認すること及び様々な生物学的標的に関する情報を得ることは、生物学及び医学の両方において要求されている。とりわけ、生物学的標的の存在、不存在、濃度及び／又は空間分布を検出するために生物学的試料を分析するには、各種の方法が使用できる。例えば、組織学的切片又は細胞学的標本におけるタンパク質の検出は、組織化学、免疫組織化学（ＩＨＣ）又は免疫蛍光法を用いて実施できる。
【０００３】
しかし、生物学的試料中の標的を検出するための既存技法の多くには、感度、精度及び／又は多重化能力の点で制約がある。特に、単一の生物学的試料中の複数の標的の検出は、多くの場合、一度にほんのわずかな数の標的（約４〜５の標的）を検出することに限定される。例えば、免疫蛍光アッセイに際して単一の組織試料中で正確に検出できる標的の数は、重なり合ったシグナルを分解するための蛍光ベース検出システムの感度によって制限される。したがって、すべての関連標的に関する情報を得るためには、供給源からの追加の生物学的試料がしばしば必要となることがある。
【０００４】
複数の生物学的試料の分析は、生物学的試料中の複数の異なる標的の相対特性（例えば、存在、不存在、濃度及び／又は空間分布）を正確に決定する能力を制限する。その上、場合によっては、分析のために限られた量の試料しか利用できないことがある。したがって、個々の生物学的試料を分析して生物学的試料中の複数の異なる標的を検出できる方法、薬剤及び装置が要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
国際公開第２００８／０６４０６７号パンフレット
【発明の概要】
【０００６】
生物学的試料中の複数の標的を検出するための方法は、一般に、生物学的試料を複数の標的結合性プローブに接触させて複数の標的結合プローブを形成する段階、標的結合プローブの１以上を生物学的試料に共有結合させる段階、及び複数の標的結合プローブの第１組からの第１組のシグナルを観測する段階を含んでいる。本方法はさらに、観測されたシグナルを修飾する段階、続いて複数の標的結合プローブの第２組から第２組のシグナルを発生させる段階、及び第２組のシグナルを観測する段階を含んでいる。
【０００７】
生物学的試料中の複数の標的を検出するための方法の追加の例は、一般に、生物学的試料を複数の標的結合性プローブに接触させて複数の標的結合プローブを形成する段階、標的結合プローブの１以上を生物学的試料に共有結合させる段階、複数の標的結合プローブの第１組から第１組のシグナルを発生させる段階、及び第１組のシグナルを観測する段階を含んでいる。本方法はさらに、観測されたシグナルを修飾する段階、複数の標的結合プローブの第２組から第２組のシグナルを発生させる段階、及び第２組のシグナルを観測する段階を含んでいる。
【０００８】
生物学的試料中の複数の標的を検出するための方法の他の例は、生物学的試料を複数の標的結合性プローブに接触させて複数の標的結合プローブを形成する段階、標的結合プローブの１以上を生物学的試料に共有結合させる段階、標的結合プローブを、複数の標的結合プローブの第１組と結合しかつ第１組のシグナルを発生させることができる第１組のシグナル発生プローブに接触させる段階、及び第１組のシグナルを観測することで複数の標的の第１組を検出する段階を含んでいる。本方法はさらに、観測された第１組のシグナルを修飾する段階を含んでいる。複数の標的結合プローブの以後の組と結合しかつ以後の組のシグナルを発生させることができる以後の組のシグナル発生プローブを用いて接触段階、検出段階及び修飾段階を複数回繰り返すことで複数の標的の以後の組を検出することができる。
【０００９】
生物学的試料中の複数の多重標的を検出するためのキットは、一般に、複数の標的結合性プローブであって、各々の標的結合性プローブがシグナルを発生することができる標的結合性プローブ、及び１以上の標的結合性プローブから発生されるシグナルを修飾することができる１種以上の化学薬剤を含んでいる。複数の標的結合性プローブの１以上は、さらに標的又は標的の近傍に位置する分子に対して架橋することができる。
【００１０】
生物学的試料中の複数の標的を検出するための装置は、一般に、試料取扱いシステム、試薬分配システム、プローブ架橋システム及びシグナル検出システムを含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本発明の上記その他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読んだ場合に一層よく理解されよう。添付の図面中では、図面全体を通じて類似の部分は同一の符号で示されている。
【図１】図１は、本発明の一実施形態を示す流れ図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態を示す流れ図である。
【図３】図３は、ストレプトアビジン被覆プレートに対するシアニン色素標識ＤＮＡオリゴマー（Ｃｙ３−Ｔ２０−ＳＦＡＤ又はＣｙ３−Ｔ２０−ＳＤＡＤ）の架橋を示している。
【図４】図４は、細胞に対するシアニン色素標識ＤＮＡオリゴマー（Ｃｙ３−Ｔ２０−ＮＨ２又はＣｙ３−Ｔ２０−ＳＡＮＰＡＨ）の相互作用を示している。
【図５】図５は、プローブの同時添加及びそれに続く標的結合プローブの順次検出による組織試料中のポリ（Ａ）ｍＲＮＡ及びＵ６  ｓｎＲＮＡプローブの多重化検出を示す画像である。
【図６】図６は、プローブの同時添加及びそれに続く架橋と標的結合プローブの順次検出による組織試料中のｂ−アクチン及びＵ６プローブの多重化検出を示している。
【図７】図７は、本発明の一実施形態に係る例示的な装置を模式的に示すブロック図である。
【図８】図８は、本発明の一実施形態に係る例示的な組織病理学システムを模式的に示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
特許請求される発明の主題を一層明確で簡潔に記載しかつ指摘するため、以下の説明及び添付の特許請求の範囲中で使用される特定の用語に関して以下に定義を示す。明細書全体を通じ、特定の用語の例示は非限定的な例と見なすべきである。
【００１３】
“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”を伴う単数形で記載したものであっても、前後関係から明らかでない限り、複数の場合も含めて意味する。本明細書及び特許請求の範囲の全体を通じて使用される概略表現用語は、それが関係する基本機能の変化を生じることなしに変動することが許容される任意の数量表現を修飾するために適用できる。したがって、「約」のような用語で修飾された値は、明記された厳密な値に限定すべきでない。場合によっては、概略表現用語は値を測定するための計器の精度に対応することがある。同様に、「含まない（ｆｒｅｅ）」という語句はある用語と組み合わせて使用することができるが、これは修飾された用語を含まないと見なされる限りは実質的でない数又は微小な量を含み得る。必要な場合には範囲が示されているが、これらの範囲はその中に入るすべての部分範囲を包含する。
【００１４】
本明細書中で使用する「生物学的試料」という用語は、生物学的由来の試料又はかかる生物学的由来の試料から導かれる試料をいう。生物学的試料は、インビボ試料又はインビトロ試料であり得る。生物学的試料は、原核生物由来のものでも真核生物由来のものでもよい。例えば、生物学的試料は、細菌、真菌、原生動物、昆虫、魚類、鳥類、爬虫類、哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ロバ、モルモット又はウサギ）或いは霊長類（例えば、チンパンジー又はヒト）のような生物学的被験体に由来し得る。
【００１５】
生物学的試料は、各種の方法によって生物学的被験体から得るか又は導くことができる。例えば、生物学的試料は、哺乳動物（例えば、ヒト）から分離された組織又は細胞、生物学的試料の切片（例えば、器官又は組織の断片部分）、或いは生物学的試料からの抽出物（例えば、血液、血漿、血清又は尿のような体液から抽出される抗原）を含み得る。生物学的試料の非限定的な例には、細胞、細胞破片、組織、組織切片、器官又は体液がある。生物学的試料は、例えばブロット又はアッセイにおいて、固体担体上に固定化することができる。例えば、生物学的試料は膜、紙、ガラススライド、マイクロタイタープレート又はＥＬＩＳＡプレート上に固定化することができる。
【００１６】
「核酸」という用語は、任意のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）（例えば、染色体核酸、ミトコンドリア核酸、ウイルス核酸又は細菌核酸）或いはこれらの類似体を含むものとする。「核酸」という用語は、二本鎖核酸分子のいずれかの鎖又は両方の鎖を包含する。核酸は天然核酸でも合成核酸でもよい。
【００１７】
本明細書中で使用する「標的」という用語は、一般に、生物学的試料中に存在する場合に検出又は分析できる生物学的試料の成分（例えば、タンパク質又は核酸のような生物学的分子、エピトープのような生物学的分子の一部、或いは生物学的構造）をいう。標的は、それに対する天然の標的結合成分（例えば、標的抗原に対する抗体）が存在するか、或いはそれに対する標的結合成分（例えば、標的受容体に対するリガンドのような合成小分子結合剤）を製造できる任意の物質であり得る。好適な標的の非限定的な例には、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、多糖（例えば、レクチン又は糖類）、脂質、リガンド、受容体、抗体、アフィボディ、抗原、アプタマー、ハプテン、ホルモン、酵素、酵素基質及びこれらの組合せがある。
【００１８】
本明細書中で使用する「複数の標的」又は「複数の異なる標的」という用語は、２以上の異なる標的をいう。例えば、生物学的試料中の複数の標的は生物学的試料中の複数の抗原をいうことがあり、この場合の複数の抗原は２以上の抗原（例えば、抗原Ａ及び抗原Ｂの混合物）を含む。一般に、複数の標的は２組以上の異なる標的を含み、各組の異なる標的は１以上の標的を含んでいる。２組の異なる標的は、同じタイプのバイオマーカー（例えば、２組の異なる抗原であって、第１組は抗原Ａからなり、第２組は抗原Ｂからなるもの）を含んでいてもよいし、或いは異なるタイプのバイオマーカー（例えば、第１組はＲＮＡからなり、第２組はＤＮＡからなるもの）を含んでいてもよい。各組の異なる標的は、しばしば２以上の標的を含み得る。
【００１９】
本明細書中で使用する「標的結合性プローブ」という用語は、標的と特異的に結合し得る成分をいう。標的結合性プローブは、標的が生物学的試料中に存在する場合、標的を検出又は分析するために使用できる。標的結合性プローブは、１以上の標的結合部分を含む。標的結合部分は、標的に対する天然の特異的結合剤、天然の特異的結合剤から導かれる部分、又は標的と特異的に結合する合成部分であり得る。例えば、標的抗原を検出するための標的結合性プローブは、標的抗原に対して特異的な抗体から導くことができる。標的結合性プローブはさらに、シグナル発生部分、マスクされたシグナル発生部分、架橋部分、又は標的結合部分と（共有的又は非共有的に）結合した独立に検出可能な部分を含み得る。多くの場合、標的結合性プローブは、標的の離散化学部分又は標的の構造成分の分子認識（例えば、タンパク質の特異的三次元構造の分子認識）によって標的と結合する。標的結合性プローブの好適な例には、特に限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、修飾塩基、修飾糖部分又は修飾リン酸部分を有するオリゴヌクレオチド）、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、アフィボディ、ハプテン、リガンド及びアプタマーがある。
【００２０】
本明細書中で使用する「特異的結合」という用語は、他の非パートナー分子に対する認識が実質的に低いのに比べ、２種の分子（パートナー分子）の一方が他方を特異的に認識することをいう。一般に、結合事象の特異性は、パートナー分子中の特異的分子認識部位に由来する。かかる分子は、２種のパートナー分子間の特異的認識を引き起こす認識部位をその表面上又はそのキャビティ内に有し得る。分子認識は、静電相互作用、水素結合、疎水的相互作用又はこれらの相互作用の組合せによって生じ得る。特異的結合相互作用の例には、特に限定されないが、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、相補的核酸配列ハイブリダイゼーション、リガンド−受容体相互作用などがある。標的結合性プローブは、それぞれの標的に対して特異的に結合するように選択される。
【００２１】
本明細書中で使用する「シグナルジェネレーター」又は「シグナル発生部分」という用語は、検出可能なシグナルを提供又は発生する分子をいう。シグナルジェネレーターは、（例えば、発蛍光団からの蛍光シグナルのように）検出可能なシグナルを発生させるために予め何らかの化学的又は構造的修飾を必要とすることなしに検出可能なシグナルを本質的に提供し得るか、或いは（例えば、酵素−基質反応によって酵素から発生されるシグナルのように）他の適当な成分との相互作用によって検出可能なシグナルを発生し得る。検出可能なシグナルとしては、光学信号、電気信号、音響信号及び放射性信号が挙げられる。検出可能なシグナルは、分光測定、分光分析又は目視検査のような１以上の検出技法を用いて観測できる。好適なシグナルジェネレーターの例には、特に限定されないが、発色団、発蛍光団、ラマン活性タグ、放射性標識、酵素及びこれらの組合せがある。
【００２２】
本明細書中で使用する「マスクされたシグナルジェネレーター」という用語は、シグナルジェネレーターの検出可能なシグナルがマスクされている前駆体シグナルジェネレーター（プロ−シグナルジェネレーター）をいう。マスキングは、シグナル特性の１以上を変化させることがある。マスキングは、シグナルの完全／部分的な除去、シグナルピークのシフト、シグナル強度の低下、又はシグナル周波数のシフトをもたらすことがある。マスクされたシグナル発生部分は、アンマスキングすればシグナルジェネレーターに転化させることができる。例えば、マスクされたシグナル発生部分を有する標的結合性プローブは、消光された発蛍光団（マスクされたシグナル発生部分）とカップリングされた抗体（標的結合性プローブ）を含むことができる。マスクされたシグナル発生部分（マスクされた発蛍光団）としてドナー−アクセプター発蛍光団ペア（例えば、発蛍光団−消光剤ペア）をしようすることができ、この場合にはドナーの蛍光はアクセプターへの共鳴エネルギー移行によって消光される。ドナーとアクセプターとの距離の変更又はアクセプターの除去によってドナー発蛍光団をアンマスキングすることができ、次いでドナーからの蛍光を観測することができる。
【００２３】
本明細書中で使用する「独立に検出可能な部分」という用語は、直接アッセイ又は間接アッセイによって検出できる部分をいう。直接アッセイによって検出するためには、独立に検出可能な部分はシグナルジェネレーターを含むべきである（即ち、それは検出可能なシグナルを提供／発生すべきである）。独立に検出可能な部分が単独で検出可能なシグナルを生じない場合、又はそれがマスクされたシグナル発生部分を含む場合には、独立に検出可能な部分を検出するために間接アッセイを使用する必要がある。そのような場合、独立に検出可能な部分は、例えば、それをシグナル発生部分と結合するか、或いはシグナル発生部分をアンマスキングすることで検出できる。
【００２４】
本明細書中で使用する「相関させる」という用語は、性能及び／又は成績を何らかの方法で比較又は分析はることで、相関させるべき事象間の相互関係又は相反関係を確定することをいう。
【００２５】
「インサイチュ」という用語は、元の場所又は自然のままの場所で起こる事象をいう。例えば、インサイチュは、インタクトな器官又は組織で、或いは器官又は組織の代表的な部分で起こる事象を表すことができる。標的のインサイチュ分析は、多くの場合、標的がその起源部位から取り除かれた場合に失われることがある文脈情報を提供する。標的のインサイチュ分析は、生物、器官、組織試料又は細胞培養物を含む各種の源に由来する細胞、組織又は組織切片に関して実施できる。したがって、細胞又は組織における標的のインサイチュ分析とは、全細胞又は組織試料中にある標的結合プローブの分析であって、標的結合プローブが細胞内に残存している場合を述べている。インサイチュ分析を実施する際、細胞膜は完全にインタクトであっても部分的にインタクトであってもよい。さらに、本方法を使用すれば、固定、未固定又は凍結状態の細胞又は組織試料中において標的をインサイチュで分析できる。
【００２６】
「シグナルを観測する」という用語は、シグナルを検出、特性決定又はモニタリングすることをいう。シグナルジェネレーターからのシグナルは、検出システム又はイメージングシステムを用いて観測できる。例えば、生物学的試料からのシグナルの観測は、生物学的試料の画像を捕獲することで実施できる。使用する検出システム又はイメージングシステムの性質は、シグナルジェネレーターによって発生されるシグナルの性質に依存する。シグナルを観測するために使用できる検出／イメージングシステムの非限定的な例には、電子スピン共鳴（ＥＳＰ）システム、電荷結合素子（ＣＣＤ）システム（例えば、放射性同位体用）、光学システム（例えば、光学イメージング、蛍光イメージング、共焦点イメージング）、電気システム、写真フィルムシステム、化学発光システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）システム、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、近赤外視野システム及び全内部反射（ＴＩＲ）システムがある。シグナルの観測には、シグナルの目視観察も含まれる。
【００２７】
本方法の１以上は、特に限定されないが、検体検出、疾患検出、疾患モニタリング、治療モニタリング、疾患予測、組織化学、細胞化学、免疫化学、免疫組織化学又は免疫蛍光法のような分析、診断又は予後診断用途で使用することができる。例えば、本方法は組織化学、免疫組織化学又は免疫蛍光法の分野で特に有用であり得る。
【００２８】
本方法は、単一の生物学的試料中の複数の標的を検出するために使用できる。複数の標的の検出は、複数の標的の存在、不存在、位置及び／又は量を確認することを含み得る。本方法は、複数の標的を検出するために単一の検出チャンネルを使用できる。若干の実施形態では、本方法は生物学的試料のインビトロ分析のために使用できる。若干の実施形態では、本方法は生物学的試料のインビボ分析のために使用できる。
【００２９】
本方法は、同一の生物学的試料中における複数の標的の検出を可能にする。同一の生物学的試料中の標的の検出はまた、生物学的試料中の標的に関する空間情報を求めるためにも使用できる。本方法は、分析のために限られた量の生物学的試料しか利用できない場合、或いは同一試料を複数の分析のために処理しなければならない場合の分析用途において有用である。同一試料中の異なる標的を検出するために同一の検出チャンネルを複数回使用し、複数の標的の分析のための化学要件を少なくすることができる。本方法はまた、重なり合ったシグナルを分解するのに制約があるため、通常の検出方法では限られた数の標的しか検出できない場合にも有用である。例えば、通常の蛍光ベース検出アッセイでは、同時に検出できる標的の数は約４に限定されることがある。これは、励起波長及び発光波長特性に基づいて４を超える蛍光シグナルを分解することはできないからである。本発明の方法はこの制約を克服するために役立ち、複数の標的（例えば、４を超える標的）の検出を可能にする。本方法は、異なるタイプの細胞又は組織の比較、異なる発生段階の比較、疾患又は異常の存在の検出、或いは疾患又は異常のタイプの決定に役立ち得る複数の標的を検出するために使用できる。
【００３０】
本方法はさらに、既にイメージング可能である標識を有する標的結合性プローブと共に、イメージングのために活性化し得る活性化可能な標識（例えば、シグナルジェネレーター）を有する標的結合性プローブを使用することで標的の検出の多重度を高める手段を提供する。これは、２種以上の標的結合剤／検出剤の同時使用を可能にする。その一方が直接に検出されるのに対し、他方は活性化後においてのみ検出可能であり、これは同じ検出チャンネルを検出のために再使用することを可能にする。本方法は、既に活性な標識をイメージングした後に活性化し得る活性化可能な標識を活性な標識と共に使用することを記載している。また、標識が異なる検出チャンネルで検出されるならば同じ条件下で、或いは検出のために同一の検出チャンネルが使用されるならば異なる条件下でそれぞれ活性化し得る複数の活性化可能な標識を使用することも可能である。既にイメージング可能な標識は、適当なリンカー及び保護基化学を用いて、活性化可能な標識が活性化される前又はそれと同時に開裂除去すればよい。本発明はさらに、様々な濃度で存在し得る複数の特異的分子を検出するためにシグナルを増幅する方法を記載している。様々な増幅レベルを達成するため、複数の増幅方法を同時に使用することができる。本発明の別の特徴は、多重標識オリゴヌクレオチド又はポリマー及び／又はインサイチュ重合を用いる多重化フォーマットでのシグナル増幅である。
【００３１】
生物学的試料には、特に限定されないが、血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳、リンパ液、痰、精液、尿、糞、涙液、唾液、注射針吸引物、皮膚や気道や腸管や尿生殖路の外部切片、腫瘍、器官、細胞培養物、細胞培養物成分、組織試料、組織切片、全細胞、細胞成分、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）及び細胞塗抹標本がある。生物学的試料は固体又は液体の形態で存在していてよく、凍結試料、固定試料、染色試料又は前処理試料からなり得る。生物学的試料はさらに、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質などの化合物をを含んでいてもよく、これらは天然状態の試料中に本来混在していないものであってもよい。生物学的試料はそのままで（即ち、検査対象標的の回収及び／又は単離なしに）分析してもよいし、或いは分析に先立って標的の回収及び／又は単離に付してもよい。
【００３２】
生物学的試料は全細胞からなり得る。細胞は一次細胞、培養細胞又は細胞株であり得る。生物学的試料は、幹細胞（例えば、成体幹細胞又は胚性幹細胞）、脱分化体細胞、再プログラム化細胞又は誘導多能性細胞からなり得る。幹細胞は全能性、多分化能性又は多能性であり得る。
【００３３】
生物学的試料は組織試料からなり得る。組織試料は、類似の機能を有し得る、生物学的被験体から得られた類似細胞（必ずしも同一の細胞ではないが、同じ起源からの細胞である）の集合体を含んでいる。例えば、ヒト組織には、特に限定されないが、上皮組織（例えば、皮膚、気道若しくは生殖路の表面、又は消化管の内層）、結合組織（例えば、血管、骨又は軟骨）、筋肉組織（内臓筋若しくは平滑筋、骨格筋又は心筋）及び神経組織（例えば、脳、脳神経又は脊髄）がある。組織試料は、生物学的被験体の妊娠中（出生前）又は発育中の任意の時点において、新鮮な又は保存された（例えば、固定又は凍結された）器官、吸引物、生検材料、血液、血液成分或いは体液（例えば、脳脊髄液、羊水、腹膜液又は間質液）から得ることができる。
【００３４】
組織試料は組織の薄片スライス又はその一部（組織切片）であってよく、これらは正常組織（例えば、結腸、乳房又は前立腺の組織切片）又は罹患組織（例えば、結腸腺癌）から得ることができる。組織切片は、約１〜約１００マイクロメートル（μｍ）、又は約１〜約５０μｍ、又は約２〜約２５μｍ、又は約３〜約５μｍの範囲内の厚さを有し得る。組織試料の同一切片を採取して分析に付することで、形態学的レベル又は分子レベルで異なる２組以上の標的を検出することができる。若干の実施形態では、組織試料の複数の切片を分析することで複数の標的を検出できる。組織試料は、マイクロアレイ（例えば、乳房マイクロアレイ）の形態で供給できる。
【００３５】
若干の実施形態では、生物学的試料中の複数の標的を検出する方法は、生物学的試料中の複数の標的の順次検出を含んでいる。最初に、複数の標的結合性プローブを生物学的試料に同時に添加して複数の標的結合プローブを形成する。次いで、１以上の標的結合プローブを生物学的試料に共有結合させる。次いで、標的結合プローブを検出することで複数の標的を順次に検出する。１以上の方法は、試料を複数の標的結合性プローブに接触させて複数の標的結合プローブを形成する段階、標的結合プローブの１以上を生物学的試料に共有結合させる段階、複数の標的結合プローブの第１組からの第１組のシグナルを観測する段階、観測されたシグナルを修飾する段階、複数の標的結合プローブの第２組から第２組のシグナルを発生させる段階、及び第２組のシグナルを観測する段階を含み得る
本方法は、一般に、複数の多重組の標的結合性プローブを生物学的試料に適用する段階、標的結合プローブの１以上を生物学的試料に共有結合させる段階、複数の標的の第１組からの第１組のシグナルを観測することで生物学的試料中の複数の標的の第１組を検出する段階、観測された第１組のシグナルを修飾する段階、及び（複数の標的の第２組から第２組のシグナルを発生させ、第２組のシグナルを観測することで）生物学的試料中の複数の標的の第１組を検出する段階を含んでいる。本方法はさらに、複数の標的の第２組からの観測されたシグナル（即ち、第２組のシグナル）を修飾し、続いて生物学的試料中の複数の標的の第３組を検出する段階を繰り返すことを含み得る。上記の方法段階を（複数の標的の第４組、第５組及び第ｎ組を検出するために）複数回繰り返すことで、生物学的試料中の複数の標的の大部分又は全部を検出することができる。若干の実施形態では、かかる段階を約１００回繰り返すことで約１００組（即ち、ｎ＝１００）の標的が検出される。第１組のシグナル及び以後の組のシグナルはいずれも同じタイプのもの（例えば、蛍光シグナル）であってもよいし、或いは相異なるタイプのものであってもよい（例えば、第１組は蛍光シグナルであり、第２組は吸収シグナルであってよい）。第１組のシグナル及び以後の組のシグナルは単一の検出チャンネルを使用してもよいし、或いは複数の検出チャンネルを使用してもよい。
【００３６】
若干の実施形態では、生物学的試料中の複数の標的は２組以上の異なる標的を含み、各組の異なる標的は１以上の標的を含んでいる。２組の異なる標的は、同じタイプのバイオマーカー（例えば、２組の異なる抗原であって、第１組は抗原Ａからなり、第２組は抗原Ｂからなるもの）を含んでいてもよいし、或いは異なるタイプのバイオマーカー（例えば、第１組は抗原Ａからなり、第２組はＤＮＡからなるもの）を含んでいてもよい。若干の実施形態では、複数の標的は複数組の異なる標的を含み得る。標的は生物学的試料の表面上（例えば、組織学的切片、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、懸濁状態の細胞、細胞学的塗抹標本又は固体支持体（例えば、ゲル、ブロット、ガラススライド、ビーズ又はＥＬＩＳＡプレート）の表面上）に存在していてもよいし、或いは内部に埋め込まれていてもよい（例えば、インサイチュ検出用細胞中のＲＮＡ又はＤＮＡ標的）。標的は、特定の細胞タイプ（例えば、未分化幹細胞に対する分化幹細胞）に特有のものであってもよいし、或いは特定の疾患状態又は医学的状態に特有のものであってもよい。好適な標的には、特に限定されないが、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ））、多糖（例えば、レクチン又は糖類）、脂質、リガンド、受容体、抗体、アフィボディ、抗原、アプタマー、ハプテン、脂質、ホルモン、酵素、酵素基質及びこれらの組合せがある。
【００３７】
本方法は、特に限定されないが、予後診断標的、ホルモン又はホルモン受容体標的、リンパ系標的、腫瘍組織標的、細胞周期関連標的、神経組織標的又は分化クラスター（ＣＤ）標的或いはこれらの組合せを含む複数の異なる標的を検出するために使用できる。標的の非限定的な例には、セントロメアタンパク質Ｆ（ＣＥＮＰ−Ｆ）、ギアンチン、インボルクリン、ラミンＡ＆Ｃ（ＸＢ  １０）、ＬＡＰ−７０、ムチン、核膜孔複合タンパク質、ｐｌ８０ラメラ体タンパク質、ラン（ｒａｎ）、カテプシンＤ、Ｐｓ２タンパク質、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ、Ｐ５３、Ｓ１００、上皮標的抗原（ＥＭＡ）、ＴｄＴ、ＭＢ２、ＭＢ３、ＰＣＮＡ及びＫｉ６７がある。
【００３８】
腫瘍組織標的の非限定的な例としては、乳癌バイオマーカー（例えば、ＥＲ、ＰＲ、Ｈｅｒ２、ＣＡ  １５−３、ＣＡ  ２７．２９、ＣＥＡ、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１又はＫｉ−６７）、結腸直腸癌バイオマーカー（例えば、ＣＥＡ、ＣＡ  １９−９、チミジル酸シンターゼ又はＣＡ１２５）、肺癌バイオマーカー（例えば、ＮＳＥ、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ  ２１−１、ＩＭＰ３、ＴＰＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＴＴＦ、Ｄ２−４０、ポドプラニン、サイトケラチン２０、クロモグラニンＡ又は血清アミロイドＡ）、前立腺癌バイオマーカー（例えば、ＰＳＡ、ＰＣＡ３、ｕＰＭ３、ｈｋ２又はＰＳＭＡ）或いは肝臓癌バイオマーカー（例えば、ＡＦＰ）のようなバイオマーカーが挙げられる。
【００３９】
予後診断標的の好適な例としては、特に限定されないが、ガラクトシルトランスフェラーゼII、ニューロン特異的エノラーゼ、プロトンＡＴＰアーゼ２及び酸性ホスファターゼが挙げられる。ホルモン、ホルモン調節性及びホルモン受容体標的としては、特に限定されないが、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、副腎皮質刺激ホルモン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ｇＣ１ｑ−Ｒ／ｐ３３補体受容体、ＩＬ−２受容体、ｐ７５ニューロトロフィン受容体、ＰＴＨ受容体、甲状腺ホルモン受容体及びインスリン受容体が挙げられる。
【００４０】
リンパ系標的の好適な例としては、特に限定されないが、α−１−アンチキモトリプシン、α−１−アンチトリプシン、Ｂ細胞標的、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｂリンパ球抗原３６ｋＤ、ＢＭ１（骨髄標的）、ＢＭ２（骨髄標的）、ガレクチン−３、グランザイムＢ、ＨＬＡクラスＩ抗原、ＨＬＡクラスII（ＤＰ）抗原、ＨＬＡクラスII（ＤＱ）抗原、ヒト好中球デフェンシン、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、κ軽鎖、κ軽鎖、λ軽鎖、リンパ球／組織球抗原、マクロファージ標的、ムラミダーゼ（リゾチーム）、ｐ８０未分化リンパ腫キナーゼ、プラズマ細胞標的、分泌性白血球プロテアーゼインヒビター、Ｔ細胞抗原受容体（ＪＯＶＩ１）、Ｔ細胞抗原受容体（ＪＯＶＩ３）、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ及び非クラスター化Ｂ細胞標的が挙げられる。
【００４１】
腫瘍組織標的としては、特に限定されないが、αフェトプロテイン、アポリポプロテインＤ、ＢＡＧ−１（ＲＡＰ４６タンパク質）、ＣＡ１９−９（シアリルルイスＡ）、ＣＡ５０（癌腫関連ムチン抗原）、ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）、ＣＡ２４２（腫瘍関連ムチン抗原）、クロモグラニンＡ、クラスタリン（アポリポタンパク質Ｊ）、上皮膜抗原、上皮関連抗原、上皮特異的抗原、グロス嚢胞症体液タンパク質−１５、肝細胞特異的抗原、ヘレグリン、ヒト胃ムチン、ヒト乳脂肪球、ＭＡＧＥ−１、マトリックスメタロプロテイナーゼ、メランＡ、黒色腫標的（ＨＭＢ４５）、メソセリン、メタロチオネイン、小眼球症転写因子（ＭＩＴＦ）、Ｍｕｃ−１コア糖タンパク質、Ｍｕｃ−１糖タンパク質、Ｍｕｃ−２糖タンパク質、Ｍｕｃ−５ＡＣ糖タンパク質、Ｍｕｃ−６糖タンパク質、ミエロペルオキシダーゼ、Ｍｙｆ−３（横紋筋肉腫標的）、Ｍｙｆ−４（横紋筋肉腫標的）、ＭｙｏＤ１（横紋筋肉腫標的）、ミオグロビン、ｎｍ２３タンパク質、胎盤アルカリホスファターゼ、プレアルブミン、前立腺特異的抗原、前立腺酸ホスファターゼ、前立腺インヒビンペプチド、ＰＴＥＮ、腎細胞癌腫標的、小腸ムチン抗原、テトラネクチン、甲状腺転写因子−１、マトリックスメタロプロテイナーゼ１の組織インヒビター、マトリックスタロプロテイナーゼ２の組織インヒビター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１、ビリン及びフォンビルブラント因子が挙げられる。
【００４２】
細胞周期関連標的の非限定的な例には、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子−１、ｂｃｌ−ｗ、ｂｃｌ−ｘ、ブロモデオキシウリジン、ｃｄｋ活性化キナーゼ（ＣＡＫ）、細胞アポトーシス感受性タンパク質（ＣＡＳ）、カスパーゼ２、カスパーゼ８、ＣＰＰ３２（カスパーゼ３）、ＣＰＰ３２（カスパーゼ３）、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリンＡ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、サイクリンＤ３、サイクリンＥ、サイクリンＧ、ＤＮＡ断片化因子（Ｎ末端）、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質、Ｆａｓリガンド、Ｆｅｎ−１、ＩＰＯ−３８、Ｍｃｌ−１、ミニ染色体維持タンパク質、ミスマッチ修復タンパク質（ＭＳＨ２）、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ、増殖細胞核抗原、ｐ１６タンパク質、ｐ２７タンパク質、ｐ３４ｃｄｃ２、ｐ５７タンパク質（Ｋｉｐ２）、ｐ１０５タンパク質、Ｓｔａｔ  １α、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼIIα、トポイソメラーゼIIIα及びトポイソメラーゼIIβがある。
【００４３】
神経組織標的としては、特に限定されないが、αＢクリスタリン、α−インターネキシン、αシヌクレイン、アミロイド前駆体タンパク質、βアミロイド、カルビンジン、コリンアセチルトランスフェラーゼ、興奮性アミノ酸トランスポーター１、ＧＡＰ４３、グリア原線維酸性タンパク質、グルタミン酸受容体２、ミエリン塩基性タンパク質、神経成長因子受容体（ｇｐ７５）、神経芽細胞腫標的、ニューロフィラメント６８ｋＤ、ニューロフィラメント１６０ｋＤ、ニューロフィラメント２００ｋＤ、ニューロン特異的エノラーゼ、ニコチン性アセチルコリン受容体α４、ニコチン性アセチルコリン受容体β２、ペリフェリン、タンパク質遺伝子産物９、Ｓ−１００タンパク質、セロトニン、ＳＮＡＰ−２５、シナプシンＩ、シナプトフィジン、タウ、トリプトファンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ及びユビキチンが挙げられる。
【００４４】
クラスター分化標的の好適な例には、特に限定されないが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｒ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤｗ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤｗ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤｗ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤｗ１２８ａ、ＣＤｗ１２８ｂ、ＣＤ１３０、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤｗ１３６、ＣＤｗ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤｗ１４９、ＣＤｗ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６及びＴＣＲ−ζがある。
【００４５】
生物学的試料中の複数の標的は、標的結合部分を介して標的と結合し得る複数のプローブ（標的結合性プローブ）を使用することで検出される。複数の標的結合性プローブは複数組のプローブを含んでいて、各組のプローブは別の組から構造的又は機能的に異なるものであり得る。標的結合性プローブは、標的結合性プローブを生物学的試料に接触させ、続いてこれらをインキュベートすることで標的に結合される。標的結合性プローブの結合のために標的をアクセス可能にするため、生物学的試料の予備的な処理（例えば、抗原の回収）が必要となることがある。標的結合性プローブが標的に結合した場合、標的の検出は標的結合プローブを検出することで達成できる。標的結合性プローブはシグナルジェネレーターを含んでいてもよいし、或いは含まなくてもよい。標的結合性プローブがシグナルジェネレーターを含む場合には、標的の検出はシグナルジェネレーターからのシグナルを観測することで達成できる。標的結合性プローブがシグナルジェネレーターを含まない場合には、標的の検出を可能にするため、標的結合プローブと特異的に結合するシグナル発生部分を標的結合プローブに結合すればよい。
【００４６】
若干の実施形態では、標的結合性プローブは標的結合部分から導かれる単位及び独立に検出可能な部分を含んでいる。独立に検出可能な部分は、発蛍光団、発色団、ラマンタグ、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）タグ、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）タグ又は放射性同位体のようなシグナルジェネレーターであり得る。若干の実施形態では、独立に検出可能な部分は、直接アッセイを用いて検出できる部分からなる。例えば、独立に検出可能な部分は、特異な核酸配列、ハプテン、酵素又はこれらの組合せであり得る。若干の実施形態では、独立に検出可能な部分はマスクされたシグナル発生部分からなる。マスクされたシグナル発生部分の例には、特に限定されないが、マスクされた発蛍光団、マスクされた発色団、マスクされたラマンタグ、マスクされたＳＥＲＳタグ、マスクされたＳＥＲＲＳタグ及びこれらの組合せがある。マスクされた発蛍光団は、ドナー−アクセプター発蛍光団ペア（例えば、フルオレセイン−ローダミンペア）、消光された発蛍光団（例えば、金属又は有機部分によって消光されたもの）又は極性感受性発蛍光団（例えば、Ｐｒｏｄａｎ（６−プロピオニル−２−ジメチルアミノナフタレン）、Ｐａｌｄａｎ（６−パルミトイル−２−ジメチルアミノナフタレン）又はＬａｕｅｄａｎ（６−ドデカノイル−２−ジメチルアミノナフタレン））からなり得る。
【００４７】
独立に検出可能な部分は、共有結合（リンカー部分なしの直接結合又はリンカー部分を介しての結合）或いは非共有的相互作用（例えば、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、双極子−双極子相互作用、水素結合又はこれらの組合せ）によって標的結合部分に結合できる。若干の実施形態では、独立に検出可能な部分は、開裂可能なリンカーを介して標的結合部分に結合される。開裂可能なリンカーは、（例えば、酸化、求核置換、還元又はｐＨ変化によって）開裂し得る開裂可能な共有結合（例えば、Ｓ−Ｓ結合）を含むか、或いは適当な条件下で解離し得る結合ペア（例えば、相補的核酸又はデチオアビジン−アビジンペア）を含み得る。
【００４８】
若干の実施形態では、標的結合性プローブは、標的結合部分、架橋部分及び独立に検出可能な部分を含んでいる。例えば、ＲＮＡ標的用の標的結合性プローブは３つの領域を含み得る。これらの領域は、標的ＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチド（即ち、標的結合部分）からなる第１の領域、標的オリゴヌクレオチド（即ち、シグナルジェネレーター）に対して相補的であり得るオリゴヌクレオチド（即ち、独立に検出可能な部分、ジップコード）からなる第２の領域、及び標的結合性プローブを標的ＲＮＡの近傍に位置する分子に対して架橋することができる架橋部分を有するオリゴヌクレオチドからなる第３の領域である。架橋部分は、リンカー部分を介して第３の領域中のオリゴヌクレオチドに結合し得る。標的結合性プローブの架橋は、標的結合性プローブを適当な開始剤（例えば、光又は化学薬剤）に暴露することで開始させることができる。標的結合部分、架橋部分及び独立に検出可能な部分は、標的結合性プローブ中に任意の順序で配置することができる。例えば、若干の実施形態では、標的結合部分を架橋部分及び独立に検出可能な部分の両方に直接結合することができる。他の例では、標的結合部分を架橋部分に直接結合し、次いで架橋部分を独立に検出可能な部分に直接結合することができる。別の例では、標的結合部分を独立に検出可能な部分に直接結合し、次いで独立に検出可能な部分を架橋部分に直接結合することができる。
【００４９】
標的結合プローブは、独立に検出可能な部分の性質に応じて直接又は間接に検出できる。例えば、独立に検出可能な部分が単独で検出可能なシグナル（例えば、光学信号又は放射性信号）を与える場合には、直接検出方法が使用できる。独立に検出可能な部分が単独で検出可能なシグナルを与えない場合には、標的結合プローブを検出するために予備的なシグナル発生段階が必要となることがある（間接検出）。例えば、独立に検出可能な部分が核酸配列である場合には、それを標識された相補的核酸配列とハイブリダイズし、次いで標識からのシグナルを観測することでハイブリダイゼーション複合体を検出すればよい。
【００５０】
若干の実施形態では、生物学的試料中の複数の標的は、標的結合性プローブを同時に適用し、続いて標的結合プローブを順次に検出することで検出される。複数の標的は２組以上の異なる標的を含み、各組の異なる標的は１以上の標的を含んでいる。複数の標的結合プローブは２組以上の異なる標的結合プローブを含み、各組の異なる標的結合プローブは１以上の標的結合プローブを含んでいる。一例では、本方法は、生物学的試料を複数の標的結合性プローブに接触させて複数の標的結合プローブを形成する段階を含んでいる。次いで、標的結合プローブの１以上が生物学的試料に共有結合される。次いで、複数の異なる組の標的結合プローブが一度に１組ずつ順次に検出される。最初に、複数の標的結合プローブの第１組からの第１組のシグナルを観測すればよい。この第１組のシグナルは、互いに識別できないシグナルを含んでいてもよいし、或いはスペクトル差又はシグナルタイプに基づいて互いに識別できるシグナルを含んでいてもよい。次いで、観測されたシグナルが修飾される。シグナルは、漂白（例えば、光漂白又は化学漂白）のような任意のシグナル修飾方法を用いて修飾できる。次に、複数の標的結合プローブの第２組から第２組のシグナルを発生させ、続いて第２組のシグナルを観測すればよい。本方法はさらに、観測されたシグナル（即ち、第２組のシグナル）を修飾し、複数の標的結合プローブから第３組のシグナルを発生させ、続いて第３組のシグナルを観測する段階を含み得る。「観測されたシグナルを修飾する」段階及び以後の組のシグナルを「発生させ、続いて観測する」段階を複数の標的結合プローブの第４組、第５組及び第ｎ組に関して複数回繰り返すことで、第４組、第５組及び第ｎ組のシグナルを観測することができる。潜在的には、この方法を用いることで、無限数（この場合、ｎの整数値はｎ＝６からｎ＝∞にまでわたり得る。）の標的を順次に検出することができる。観測されたシグナルの修飾に際しては、観測されたシグナルのすべてを修飾することは必要でない場合がある。観測されたシグナルの１以上を修飾せずに保存してもよい。その場合、１以上の保存されたシグナルは同時記録又は比較分析のために利用できる。本方法はさらに、観測されたシグナルを生物学的試料中の複数の標的の検出と相関させる段階を含み得る。
【００５１】
複数組の標的結合プローブが（例えば、スペクトル差又はシグナルタイプに基づいて）互いに分解できる互いに識別可能なシグナルを生じる場合、本方法は複数組の標的結合プローブのバッチを順次に検出できる。例えば、蛍光シグナルを発生する標的結合プローブの順次検出は、４組の異なる標的結合プローブの各々からの蛍光が互いに分解可能であれば、（例えば、４チャンネル検出を用いて）４組の異なる標的結合プローブの第１バッチを一度に検出することで実施できる。４組の異なる標的結合プローブの第１バッチからのシグナルを観測した後、観測されたシグナルが修飾される。これに続いて、４組の異なる標的結合プローブの第２バッチからシグナルを発生させ、発生されたシグナルを観測することで、４組の異なる標的結合プローブの第２バッチを検出できる。一般に、各バッチにおいて一度に検出できる異なる標的結合プローブの組数は、シグナルを観測し、各組のシグナルを互いに分解するために使用される装置の能力に依存する。シグナルは、重なり合わないスペクトル特性、適切なシグナルタイプ（例えば、蛍光シグナル及び放射性シグナル）又は生物学的試料中での異なる局在（例えば、細胞質からのシグナル及び核からのシグナル）のため、互いに分解可能である場合がある。これらの段階は、異なる標的結合プローブのすべてが順次に検出されるまで繰り返すことができる。
【００５２】
若干の実施形態では、標的結合性プローブを生物学的試料に接触させた後、生物学的試料を標的に対する標的結合性プローブの特異的結合のために十分な時間にわたってインキュベートすることができる。インキュベーションは、室温で約５分間乃至約１６時間実施するか、或いは４℃で約１６時間実施すればよい。インキュベーション温度及びインキュベーション時間は、主として、使用する標的結合性プローブの機能的及び／又は構造的特性（例えば、オリゴヌクレオチドプローブの融解温度（Ｔm））に依存する。標的結合部分は、特に限定されないが、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、双極子−双極子相互作用又は水素結合を含む非共有的相互作用によって標的に結合し得る。本方法は、任意には、さらに標的に結合し得なかった標的結合性プローブを除去する段階を含み得る。非結合プローブの除去は、生物学的試料を適当な緩衝液で洗浄することで達成できる。
【００５３】
複数の標的結合性プローブは、生物学的試料に共有結合し得る１以上の標的結合性プローブを含み得る。若干の実施形態では、複数の標的結合性プローブのすべてが生物学的試料に共有結合し得る。生物学的試料に対する標的結合性プローブの共有結合は、標的それ自体を介して又は標的の近傍に位置する分子を介して行うことができる。一般に、複数の標的結合性プローブを生物学的試料に接触させてインキュベートする。多くの場合、複数の標的結合性プローブは最初は物理的相互作用（即ち、水素結合、ファンデルワールス相互作用などの非共有的相互作用）により標的に結合して複数の標的結合プローブを生成する。適当な条件下では、複数の標的結合プローブの１以上が次いで標的それ自体に共有結合し得るか、或いは標的の近傍に位置する分子に共有結合し得る。標的又は標的の近傍に位置する分子に対する標的結合性プローブの共有結合は、直接カップリング（例えば、タンパク質又は核酸の架橋）によって達成し得るか、或いはリンカー部分を介して（例えば、二官能性リンカー部分を介して）達成し得る。共有結合がリンカー部分を介して実施される場合、リンカーの長さは、生物学的細胞の寸法に比べて微小（例えば、約５〜約５０Å）となるように選択される。かくして、たとえ標的結合性プローブが標的の近傍に位置する分子に対して架橋しても、結合プローブの位置は標的の位置と事実上同じであり得る。共有カップリングは、不可逆的な共有結合（例えば、Ｃ−Ｃ結合）、可逆的な結合（例えば、Ｓ−Ｓ結合の形成）又は開裂可能な結合（例えば、開裂可能なリンカーを介してのカップリング）からなり得る。共有カップリングは、光架橋或いはエステル、アミド又はチオエーテル結合形成を介しての化学架橋によって達成し得る。標的に対する標的結合性プローブの共有結合は、複数の標的を検出するための次の方法段階を実施しながら標的のシグナチュアを保持するために役立ち得る。シグナチュアという用語は、標的が後続の操作において破壊されても、最初に標的と選択的に結合して所定の場所に架橋された標的結合プローブの存在から試料中におけるその存在が推論できることを意味する。標的に対する標的結合性プローブの共有結合は、標的がシグナル発生及びシグナル修飾のために使用されることがある化学薬剤に対して感受性を有し得る場合に特に重要である。例えば、ＲＮＡ標的は観測されたシグナルの修飾のために使用されることがある化学薬剤に対して感受性を有し得る。そのため、複数のＲＮＡ結合プローブからのシグナルを観測することで複数の異なるＲＮＡ標的を検出する際、第１組及び／又は第２組のＲＮＡ標的からシグナルを発生させ又は観測されたシグナルを修飾する場合に以後の組のＲＮＡ標的が破壊される可能性が存在する。しかし、ＲＮＡ結合性プローブが標的ＲＮＡ又は標的ＲＮＡの近傍の分子に対して架橋されれば、後続の操作においてＲＮＡ標的が破壊されても、最初に標的ＲＮＡと選択的に結合して所定の場所に架橋された結合プローブ（標的ＲＮＡに結合したもの又は生物学的試料に結合したもの）の存在から、試料中におけるその存在が推論できる。実際、若干の例では、標的結合プローブを生物学的試料に架橋した後に生物学的試料をＲＮアーゼで処理してすべての細胞ＲＮＡを破壊することが有益であり得る。その上、標的結合性プローブが生物学的試料に架橋されていれば、一層厳しい洗浄条件を用いて未結合の標的結合性プローブを除去することができる。このような手順は、生物学的試料中の複数のＲＮＡ標的を検出しながらシグナル−ノイズ比を高める。
【００５４】
複数の標的結合プローブの第１組からの第１組のシグナルは、直接又は間接に観測することができる。直接アッセイを使用する場合、複数の標的結合性プローブの第１組（即ち、複数の標的の第１組と結合して第１組の標的結合プローブを形成するプローブの組）は、標的結合部分から導かれる単位及び独立に検出可能な部分を含んでいる。この場合、独立に検出可能な部分は単独で観測可能なシグナルを生じることができる（即ち、独立に検出可能な部分はシグナルジェネレーターを含んでいる）。
【００５５】
若干の実施形態では、第１組の標的結合性プローブは、シグナルジェネレーター（例えば、発蛍光団、発色団、放射性同位体、酵素又はラマン活性部分）で標識された標的結合部分（例えば、抗体、核酸、アプタマー、アフィボディ又はハプテン）を含み得る。シグナルジェネレーターは、直接に検出又は可視化できる観測可能なシグナルを生じる。例えば、第１組の標的結合性プローブが標的結合性プローブに結合された発蛍光団を有する場合、標的に結合すると、発蛍光団からの蛍光シグナルを観測することで標的結合プローブを検出できる。シグナルジェネレーターは、観測可能なシグナルを本質的に生じるか（例えば、蛍光発生シグナルジェネレーター）、或いは適当な基質との相互作用（例えば、酵素系シグナルジェネレーターに関する酵素−基質反応）によって生じることができる。
【００５６】
第１組の標的結合プローブの間接検出は、第１組の標的結合性プローブが単独で観測可能なシグナルを提供しない場合に使用される。若干の実施形態では、これはシグナル発生部分を第１組の標的結合プローブに結合することで達成できる。例えば、第１組の標的結合性プローブは未標識の一次プローブ（例えば、一次抗体）からなり得るが、これを用いて生物学的試料中の第１組の標的（例えば、抗原）に結合することができる。次いで、標識二次プローブ（例えば、標識二次抗体）を用いて標的結合一次プローブを標識することができる。次いで、（一次プローブに結合された）標識二次プローブからのシグナルを観測することで、標識された標的結合一次プローブを検出すればよい。次いで、標識一次プローブの検出を生物学的試料中の第１組の標的の存在と相関させることができる。一次プローブを複数の二次プローブで標識することでシグナル−ノイズ比を向上させることができるので、間接アッセイは検出の感度を高めるため効果的に使用できる。
【００５７】
第１組の標的結合プローブからの第１組のシグナルを直接又は間接に観測した後、観測されたシグナルを修飾する。シグナル修飾は、１以上のシグナル特性の変化を含み得る。例えば、シグナル修飾としては、特に限定されないが、シグナル強度の減少、シグナルピークのシフト、共鳴周波数の変化、及びシグナルの除去（シグナル破壊）が挙げられる。観測されたシグナルの修飾は、以後の組の標的結合プローブの検出に際してシグナル（既に観測されたシグナル及び観測すべきシグナル）が重なり合うのを回避するために役立つ。
【００５８】
観測されたシグナルを修飾するためには、漂白（例えば、光漂白又は化学漂白）、消光（例えば、蛍光を消光するための金属イオン）又は金属イオン封鎖（例えば、キレーターの使用）のような任意のシグナル修飾方法が使用できる。若干の実施形態では、化学薬剤を適用することで観測されたシグナルが修飾される。観測されたシグナルを修飾するために有用である好適な化学薬剤には、特に限定されないが、ｐＨを変更する薬剤（例えば、酸又は塩基）、求核試薬、求電子試薬、酸化剤、還元剤及びこれらの組合せがある。例えば、塩基性ｐＨにおいて２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ3中の３％Ｈ2Ｏ2を使用することで、シアニン（例えば、Ｃｙ３又はＣｙ５）色素の蛍光を修飾できる。
【００５９】
第１組の標的結合プローブからの第１組のシグナルを観測し、続いてそれを修飾した後、第２組及び以後の組の標的結合プローブからのシグナルを観測することができる。第２組及び以後の組の標的結合プローブは間接アッセイによって検出される。これは、第２組及び以後の組の標的結合性プローブが、本質的に観測可能なシグナルを生じないように選択されているからである。そのため、第２組及び以後の組の標的結合プローブからのシグナルを発生させるためには、先行するシグナル発生段階が必要となる。これは、第２組及び以後の組の標的結合プローブにシグナル発生部分を結合し、シグナル発生部分からのシグナルを観測することで達成できる。
【００６０】
若干の実施形態では、第２組及び以後の組の標的結合性プローブは、標的結合部分から導かれる単位及び独立に検出可能な部分を含んでいる。この場合、独立に検出可能な部分は単独で観測可能なシグナルを生じない。例えば、独立に検出可能な部分は、特異な核酸配列、ハプテン、酵素又はこれらの組合せからなり得る。標的結合プローブは、シグナル発生部分（例えば、標識）を独立に検出可能な部分に結合することで間接にアッセイできる。例えば、独立に検出可能な部分としてハプテンを有する標的結合プローブは、標識された抗ハプテンを（ハプテン−抗ハプテン相互作用によって）標的結合プローブに結合し、次いで標識からのシグナルを観測することで検出できる。
【００６１】
若干の実施形態では、標的結合性プローブの同時適用及びそれに続く順次検出は、２組の標的を検出するために使用できる。しかし、本方法を繰り返して使用すれば、同一の生物学的試料（例えば、同一の組織切片）中の３組以上の標的を検出できる。検出できる標的数（即ち、異なる標的の組数）の上限は、多くの場合、使用する生物学的試料のタイプ、並びにシグナル発生及びシグナル修飾のために使用する化学に依存する。苛酷な方法は、方法段階を数回繰り返した後には生物学的試料の健全性に影響を及ぼすことがある。しかし、適当な（苛酷でない）温和な条件を選択すれば、生物学的試料の健全性を損なうことなく、方法段階を効果的に使用して多数の標的（例えば、１０〜１００組の標的）を検出できる。
【００６２】
観測されたシグナルは、複数の標的の検出と相関させることができる。若干の実施形態では、コンピューター支援手段を用いて観測段階及び相関段階の１以上を実施することができる。相関は、（例えば、目視相関のように）手動的に実施してもよく、（例えば、多少のユーザー介入を伴いながら相関アルゴリズムを用いて）半自動化してもよく、或いは（例えば、いかなるユーザー介入も伴わないコンピューター／ロボットによってコンピューター読取り可能な媒体中の相関アルゴリズムを用いて）完全に自動化してもよい。シグナルが観測されてデジタル画像の形態で記憶される実施形態では、画像のコンピューター支援分分析を行うことができる。コンピューター支援スーパーインポジションを用いて画像（例えば、標結合性プローブからのシグナル及び形態学的染色）を重ね合わせることで、生物学的試料の完全な情報（例えば、トポロジー情報及び／又は相関情報）を得ることができる。
【００６３】
観測されたシグナル（例えば、第１組、第２組又は以後の組のシグナル及び／又はこれらの組合せ）を分析することで、生物学的試料に関する様々な情報を得ることができる。例えば、第１組のシグナルの有無は生物学的試料中における（第１組の標的結合性プローブと結合し得る）第１組の標的の有無を表すことができる。同様に、第２組のシグナルの有無は生物学的試料中における（第２組の標的結合性プローブと結合し得る）第２組の標的の有無を表すことができる。複数の標的結合性プローブを用いて複数の標的を分析し得る用途に関しては、特定組の標的結合性プローブに対する特定シグナルの有無は生物学的試料中における対応標的の有無を表すことができる。
【００６４】
若干の実施形態では、シグナルの強度値（例えば、蛍光強度）を観測し、測定し、生物学的試料中の標的の量と相関させることができる。標的の量とシグナル強度との相関は、較正標準を用いて決定できる。若干の実施形態では、第１及び第２のシグナルの強度値を測定し、それぞれの標的量と相関させることができる。２つのシグナル強度を比較することで、第１の標的及び第２の標的の（お互いの又は対照に対する）相対量を確かめることもできる。同様に、複数の標的結合性プローブを用いて複数の標的を分析する場合には、複数の標的結合性プローブの各々からのシグナルの異なる強度を測定して相関させることで、生物学的試料中の異なる標的の相対量を決定できる。
【００６５】
若干の実施形態では、１以上の対照試料を使用し、対照試料に関連した生物学的試料中のシグナルの有無を観測する（即ち、検査対象の生物学的試料と対照に対して観測する）ことで、生物学的試料に関する特定の情報を得ることができる。例えば、罹患組織試料を正常組織試料と比較することで、罹患組織試料中にのみ存在する（又は存在しない）標的に関する情報を得ることができる。同様に、検査対象試料と１以上の対照との間でシグナル強度を比較することで、検査対象試料中における標的の差別的発現に関する情報を得ることができる。
【００６６】
若干の実施形態では、例えば形態学的染色又は区画染色を用いて、生物学的試料中におけるシグナルの位置又は２以上のシグナルの相対位置を求めることができる。シグナルの位置を生物学的試料中における標的の位置と相関させれば、生物学的試料中における複数の異なる標的の局在に関する情報を得ることができる。シグナルの強度値及びシグナルの位置を相関させれば、生物学的試料中における異なる標的の局在及び濃度に関する情報を得ることができる。例えば、ある種の標的は核内よりも細胞質中で多く発現されることがあり、或いはその逆のこともある。標的の相対的な局在及び量に関する情報は、２以上のシグナルの位置及び強度値を比較して得ることができる。
【００６７】
若干の実施形態では、生物学的試料を複数の標的結合性プローブに接触させるのに先立って生物学的試料を観測する（例えば、イメージングする）ことで、バックグラウンドシグナルシグナチュアに関する情報を得ることができる。バックグラウンドシグナルシグナチュアは、標的結合プローブ（例えば、第１組、第２組及び／又は第ｎ組の標的結合プローブ）から観測されたシグナルを標的の検出と相関させる前に観測されたシグナルからを差し引けばよい。本方法はさらに、１以上のシグナル修飾段階後に生物学的試料を観測することで残留シグナルシグナチュアに関する情報を得る段階を含み得る。生物学的試料は、各シグナル修飾段階後に観測してもよい。残留シグナルシグナチュアを用いてシグナル修飾効率（例えば、漂白効率）を特徴づけ、シグナル修飾剤の選択、インキュベーション時間及び／又はインキュベーション温度についてシグナル修飾段階を微調整することができる。残留シグナルシグナチュアはまた、以後の標的結合プローブから観測されるシグナルを基準化するためにも使用できる。残留シグナルシグナチュアは、以後の標的結合プローブから観測されたシグナルを標的の検出と相関させる前に観測されたシグナルからを差し引けばよい。
【００６８】
若干の実施形態では、複数の標的結合性プローブを用いることで生物学的試料中の複数の標的を検出できるが、この場合に複数の標的結合性プローブのすべてを間接アッセイによって検出することができる。一例では、本方法は、試料を複数の標的結合性プローブに接触させて複数の標的結合プローブを形成する段階、複数の標的結合プローブの第１組から第１組のシグナルを発生させる段階、第１組のシグナルを観測する段階、観測されたシグナルを修飾する段階、複数の標的結合プローブの第２組から第２組のシグナルを発生させる段階、第２組のシグナルを観測する段階、及び観測されたシグナルを複数の標的の検出と相関させる段階を含んでいる。本方法はさらに、観測されたシグナルを修飾する段階、複数の標的結合プローブの第３組、第４組及び第ｎ組に関して新しい組のシグナルを複数回発生させ、発光された第３組、第４組及び第ｎ組のシグナルを観測する段階を含み得る。上述した方法における標的結合性プローブは、単独でシグナルを生じることができない。したがって、標的結合性プローブが標的に結合した後、標的結合プローブからのシグナルを観測する前に先行するシグナル発生段階が必要となる。
【００６９】
若干の実施形態では、シグナルは生物学的試料をイメージングすることで観測される。試料を複数の標的結合性プローブに接触させるのに先立って、又は複数の標的結合プローブの第１組から第１組のシグナルを発生させるのに先立って、生物学的試料をイメージングすることでバックグラウンドシグナルシグナチュアを得ることができる。若干の実施形態では、本方法はシグナル処理段階を含み得る。例えば、バックグラウンドシグナルシグナチュアは以後のシグナル観測段階で観測されるシグナルから差し引くことができる。シグナル処理段階は、観測されたシグナルを複数の標的の検出と相関させる段階に先立って又はその進行中に実施できる。
【００７０】
若干の実施形態では、生物学的試料中の複数の核酸標的を検出できる。複数の核酸標的は、少なくとも２組（第１組及び第２組）の異なる標的を含み得る。複数の標的は、２組のＤＮＡ標的、２組のＲＮＡ標的、或いは１組のＤＮＡ標的及び１組のＲＮＡ標的を含み得る。若干の実施形態では、１組の標的は２以上の異なる標的の混合物（例えば、２種のＤＮＡの混合物、２種のＲＮＡの混合物、又はＤＮＡ標的とＲＮＡ標的との混合物）からなり得る。
【００７１】
複数の標的結合性プローブと接触させる場合、第１組の標的は第１組のプローブと結合する。この場合、第１組のプローブは第１組の条件下で第１組のシグナルを発生できる。例えば、生物学的試料中のＲＮＡ標的を（第１組のＲＮＡ標的と結合する）第１組のＲＮＡ結合性プローブを含む複数のプローブと接触させることで、第１組のＲＮＡ標的結合プローブを生成することができる。この第１組のＲＮＡ結合プローブ全体は、第１組の条件下で第１組のシグナルを発生できる。本方法はさらに、標的結合プローブからシグナルを発生させるのに先立ち、標的に結合していない標的結合性プローブを除去する段階を含み得る。若干の実施形態では、標的それ自体又は標的の近傍に位置する分子若しくは構造への共有カップリングにより、標的結合プローブの１以上を生物学的試料に共有結合させることができる。このような場合には、標的結合プローブを生物学的試料に共有結合させるのに先立ち、標的に結合していない標的結合性プローブの除去を実施すればよい。第１組のＲＮＡ結合性プローブは、標的結合部分及び独立に検出可能な部分を含む核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ又はＰＮＡ）プローブであり得る。例えば、標的結合性プローブは、（第１組の標的中の）標的ＲＮＡ配列の少なくとも一部に対して相補的な配列及び間接アッセイで独立に検出できる特異な配列を含むＤＮＡプローブであり得る。ＤＮＡプローブは生物学的試料と共に、適当なハイブリダイゼーション条件下で、ＤＮＡプローブ配列と相補的な標的ＲＮＡ配列との選択的ハイブリダイゼーションのために十分な時間にわたってインキュベートすればよい。本方法はさらに、ハイブリダイズしたＤＮＡプローブを、標的ＲＮＡ配列又は標的ＲＮＡ配列の近傍に位置する分子／構造に対して架橋する段階を含み得る。標的結合プローブは、特異な配列を分析することで検出できる。例えば、特異な配列に対して相補的である十分な配列を有する標識核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はＬＮＡ）を用いて標的結合プローブを標識すればよい。標識は、生物学的試料を標識された相補的核酸配列と共にハイブリダイゼーション条件下で、順次ハイブリダイゼーションのために十分な時間にわたってインキュベートすることで実施できる。標識としては、特に限定されないが、発色団、発蛍光団、ナノ粒子、ラマン活性部分、ＳＥＲＳ活性部分、ＳＥＲＲＳ活性部分などがある。次いで、標識からのシグナルを観測する（例えば、イメージングする）ことで標的結合プローブを検出すればよい。特異な核酸配列はまた、シグナル増幅方法（例えば、多数の独立に検出可能な部分（例えば、核酸配列）を含み、独立に検出可能な部分の各々からシグナルを発生するナノ粒子とのハイブリダイゼーション）を含む間接アッセイによっても分析できる。
【００７２】
生物学的試料中の複数の標的を検出するための方法の別の例は、生物学的試料を複数の標的結合性プローブに接触させて複数の標的結合プローブを形成する段階、標的結合プローブの１以上を生物学的試料に共有結合させる段階、標的結合プローブを、複数の標的結合プローブの第１組と結合することができかつ第１組のシグナルを発生することができる第１組のシグナル発生プローブに接触させる段階、第１組のシグナルを観測することで複数の標的の第１組を検出する段階、観測された第１組のシグナルを修飾する段階、並びに以後の組のシグナル発生プローブを用いてシグナルを発生させる段階及び観測されたシグナルを修飾する段階を複数回繰り返すことで複数の標的の以後の組を検出する段階を含んでいる。観測されたシグナルを修飾するためには化学薬剤を適用すればよい。以後の組のシグナル発生プローブは、複数の標的結合プローブの以後の組と結合することができかつ以後の組のシグナルを発生することができる。若干の実施形態では、これらの段階を１０回、２５回、５０回又は１００回繰り返すことで、１０組の標的、２５組の標的、５０組の標的、又は１００組の標的を検出することができる。
【００７３】
複数の標的は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質又はこれらの組合せからなり得る。若干の実施形態では、複数の標的は複数の異なるＲＮＡからなる。検出できる標的ＲＮＡの非限定的な例には、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、転移メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、ｐｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、非コーディングＲＮＡ、調節ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ＲＮアーゼ−Ｐ−ＲＮＡ、ＰＵＴ  ＲＮＡ、リボザイム及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）がある。若干の実施形態では、複数の標的はインサイチュで検出される。本方法は、例えば、新生ＲＮＡ転写物のインサイチュイメージングによって転写開始部位又は差別的遺伝子調節を検出するために使用できる。
【００７４】
生物学的試料中の複数の標的を検出するための上述した方法は、複数の標的の複数バッチを検出するために使用できる。この場合、複数の標的の各バッチは複数の標的の多重組を含んでいる。例えば、生物学的試料中の複数の核酸（多重組の異なる核酸）及び複数のタンパク質（多重組の異なるタンパク質）は、複数の標的の２つのバッチを構成し得る。最初に、標的結合性プローブの同時添加及びそれに続く標的結合プローブの順次検出により、生物学的試料中の複数の核酸（例えば、第１組のＤＮＡ及び第２組のＲＮＡのような２組の異なる核酸）を検出できる。次いで、複数のタンパク質の検出（例えば、第１組のタンパク質Ａ及び第２組のタンパク質Ｂの検出）を実施できる。例えば、複数の核酸結合性プローブ（即ち、ＤＮＡ結合性プローブ及びＲＮＡ結合性プローブ）を生物学的試料に適用して複数の標的核酸結合プローブ（第１組のＤＮＡ結合プローブ及び第２組のＲＮＡ結合プローブ）を形成すればよい。次いで、第１組のＤＮＡ結合プローブからのシグナルを（ＤＮＡ結合プローブが単独でシグナルを発生するか否かに応じて直接アッセイ又は間接アッセイにより）検出すればよい。次いで、観測されたシグナルを修飾し、続いて複数のＲＮＡ結合プローブからの第２組のシグナルを発生させればよい。（第２組の核酸とハイブリダイズする標的結合性プローブは単独では検出可能なシグナルを生じないように選択されているので、かかるシグナルは第２組の標的結合プローブから発生させる必要がある。）次いで、ＲＮＡ結合プローブから発生したシグナルを観測すればよい。複数の多重組の核酸標的の検出を実施した後、本方法を用いて複数の多重組のタンパク質を検出することができる。標的タンパク質Ａ及びＢに結合し得る複数の標的結合性プローブ（例えば、抗体Ａ及び抗体Ｂ）を適用すればよい。次いで、抗体Ａからのシグナルを観測することで、タンパク質Ａに結合した抗体Ａを直接又は間接アッセイによって検出すればよい（第１組のタンパク質）。次いで、観測されたシグナルを修飾すればよい。次に、タンパク質Ｂに結合した抗体Ｂからのシグナルを発生させ、続いて発生されたシグナルを観測する。次いで、観測されたシグナルをタンパク質Ａの組及びタンパク質Ｂの組の検出と相関させることができる。
【００７５】
１以上の方法段階は手動的に実施してもよいし、或いは自動化し、自動システムを用いて実施してもよい。若干の実施形態では、すべての方法段階が自動システムを用いて実施できる。
【００７６】
若干の実施形態では、本発明の方法を使用して生物学的試料中の複数の標的を検出するための装置が提供される。本装置は、試料取扱いシステム、試薬分配システム、プローブ架橋システム、及びシグナル検出システムを含んでいる。本装置は、生物学的試料を複数の標的結合性プローブに接触させて複数の標的結合プローブを形成する段階、任意には複数の標的結合プローブの１以上を共有結合によって生物学的試料に結合させる段階、複数の標的結合プローブの第１組からの第１組のシグナルを観測する段階、観測されたシグナルを修飾する段階、複数の標的結合プローブの第２組から第２組のシグナルを発生させる段階、及び第２組のシグナルを観測する段階を含む方法を用いて生物学的試料中の複数の標的を検出するように動作可能であり得る。試料取扱いシステムは、試料を保持するためのプラットホーム（例えば、組織切片スライドを保持するための顕微鏡ステージ）、及び１種以上の試薬を試料に入出力するためのポートを含み得る。試料取扱いシステムはさらに、インキュベーションパラメーター（例えば、温度、圧力）を制御するために使用できるインキュベーションシステムを含み得る。試料取扱いシステムは、一体化された試料保持プラットホーム、一体化された試薬流入流出用ポート及び／又は一体化されたインキュベーションシステムを有するフローセルとして構成できる。試薬分配システムは、１種以上の試薬を収容できる１以上の試薬リザーバー、及び試料取扱いシステムに位置する試料に試薬を分配する手段を含み得る。試薬は、スライドホルダー上のポートへのピペット注入、又はスライドホルダーと試薬分配システムとを連結するチューブを通してのポンプ輸送によって試料に分配することができる。シグナル検出システムは、光源（例えば、顕微鏡光源）及びシグナルキャプチャリングシステムを含み得る。例えば、シグナル検出システムは、光源を有する顕微鏡、及び生物学的試料の画像のデジタルキャプチャリングのためのカメラ（例えば、ＣＣＤカメラ）を含み得る。プローブ架橋システムは、規定の時間にわたって規定波長の光を放射するように制御できる光源を含み得る。シグナル検出システムが光源を含む場合、プローブ架橋システムは同じ光源を使用するように構成できる。若干の実施形態では、プローブ架橋システムはシグナル検出システムの一部として構成できる。
【００７７】
本装置は、（いかなるオペレーターの介入もなくして）完全に自動化することができ、或いは試料取扱いシステム、プローブ架橋システム、試薬分配システム及びシグナル検出システムの１以上がオペレーターの介入なしに動作可能であるように半自動化することができる。本装置は、中央処理ユニット、メモリー、コントローラーユニット及び／又はディスプレイデバイスを含み得る。ディスプレイデバイスは、観測されたシグナル（例えば、生物学的試料の画像）を表示するために使用できる。コントローラーユニットは、中央処理ユニット、試料取扱いシステム、試薬分配システム、プローブ架橋システム及びシグナル検出システムの１以上と通信可能であり得る。通信は一方向通信又は二方向通信であり得る。コントローラーユニットは、（アルゴリズムによる）所定の命令セットを用いて動作可能であり得る。二方向通信を使用する場合、所定の命令セットは、中央処理ユニット、試料取扱いシステム、試薬分配システム、プローブ架橋システム及びシグナル検出システムのいずれかからのフィードバックに応じて調整すればよい。
【００７８】
試料取扱いシステムは、生物学的試料を保持するためのプラットホームを含み得る。プラットホームは、静止していてもよいし、或いは生物学的試料を輸送するためにある位置から別の位置まで移動してもよい。試薬分配システムは、試薬分配システムが、１以上の標的結合性プローブを含む１種以上の試薬溶液を生物学的試料に分配するために使用できる。例えば、試薬分配システムを用いて複数の標的結合性プローブを含む試薬溶液を生物学的試料上に分配することで、生物学的試料を複数の標的結合性プローブに接触させることができる。若干の実施形態では、試薬分配システムは、それぞれが１以上の標的結合性プローブを含む複数の試薬溶液を（同時に又は順次に）分配するために使用できる。試薬分配システムはまた、標的に結合されない標的結合性プローブを除去するために使用できる洗浄溶液、生物学的試料を非特異的結合からブロックするためのブロッキング溶液、或いはプローブ架橋、洗浄及び／又はシグナル検出のために必要となることがある他の試薬を分配するためにも使用できる。若干の実施形態では、試薬分配システムは、１組の標的に関する観測されたシグナルを修飾するための化学薬剤を含む試薬溶液を分配するために使用できる。
【００７９】
若干の実施形態では、生物学的試料中の複数の多重標的を検出するためのキットが提供される。本キットは、一緒にパッケージされている、上述した方法を実施するために必要となることがある１種以上の試薬を含み得る。例えば、本キットは、複数の標的結合性プローブ及び未結合の標的結合性プローブを洗浄するための緩衝液を含み得る。本キットは、シグナルを発生することができかつ標的又は標的の近傍に位置する分子に対して架橋することができる標的結合性プローブ、及び発生されるシグナルを修飾することができる化学薬剤を含み得る。一例では、本キットは、生物学的試料に架橋することができる蛍光標識標的結合性プローブ（例えば、蛍光標識抗体）、及び蛍光標識からの蛍光を破壊することができる化学薬剤を含んでいる。本キットはまた、架橋反応のために必要となることがある試薬も含み得る。本キットはさらに、キット中に存在する成分及び／又はキット中に存在する成分を用いて必要な方法段階を実施するためのプロトコルを詳述した使用説明書を含み得る。
【００８０】
一例では、生物学的試料中の複数の多重標的を検出するためのキットは、複数の標的結合性プローブであって、各々の標的結合性プローブがシグナルを発生することができかつ１以上の標的結合性プローブが標的又は標的の近傍に位置する分子に対して架橋することができる標的結合性プローブ、及び１以上の標的結合性プローブから発生されるシグナルを修飾することができる１種以上の化学薬剤を含んでいる。複数の標的結合性プローブは、２つの異なる標的に結合し得る２組以上の異なる標的結合性プローブを含み得る。例えば、本キットは、区画バイオマーカー（例えば、核内に存在するバイオマーカー）と特異的に結合する第１組の標的結合性プローブ、及び疾患マーカー（例えば、癌バイオマーカー）と特異的に結合する第２組の標的結合性プローブを含み得る。若干の実施形態では、ただ１種の化学薬剤を用いてすべての標的結合性プローブから発生されるシグナルを修飾することができる。しかし、本キットは、キット中の各標的結合性プローブから発生されるシグナルを修飾するための複数の化学薬剤を含むことも可能である。
【００８１】
本方法は、同一の生物学的試料からの複数（例えば、潜在的には無限数）の標的（例えば、疾患マーカー）の正確で信頼可能な分析を容易にする。複数の標的の検出は、生物学及び医学における分析、診断、治療又は予後診断用途で有用であり得る。例えば、患者からの細胞又は組織試料を分析するための方法は、診断的に（例えば、特定の疾患を有する患者、特定の毒素に暴露された患者、又は特定の治療若しくは臓器移植によく応答している患者を同定するために）及び予後診断的に（例えば、特定の疾患を発症する可能性がある患者、特定の治療によく応答する患者、又は特定の臓器移植を受容する患者を同定するために）使用することができる。
【実施例】
【００８２】
特記しない限り、実施例中に記載される薬剤は、一般の化学薬品供給業者から商業的に入手可能である。実施例セクションで使用される若干の略語は、以下に示すような意味を有する。「ｍｇ」：ミリグラム、「ｎｇ」：ナノグラム、「ｐｇ」：ピコグラム、「ｆｇ」：フェムトグラム、「ａｇ」：アットグラム、「ｚｇ」：ゼプトグラム、「μＬ」：マイクロリットル、「ｍＬ」：ミリリットル、「ｍｇ／ｍＬ」：ミリグラム／ミリリットル、「ｍＭ」：ミリモル濃度、「μＭ」：マイクロモル濃度、「ｐＭ」：ピコモル濃度、「ｎｍｏｌ」：ナノモル、「ｍｍｏｌ」：ミリモル、「ｐｍｏｌ」：ピコモル、「ｍｓ」：ミリ秒、「ｍｉｎ」：分、「ｈ」：時間、及び「℃」：摂氏温度。
【００８３】
図１は、本発明の一実施形態に係る方法段階を模式的に示す流れずである。図は、２組の標的結合性プローブの同時適用及びそれに続く各組の標的結合プローブの順次検出による２組の異なる標的の検出を示している。本方法は、複数の異なる標的結合性プローブを生物学的試料に適用する段階（１２）を含んでいる。複数の標的結合性プローブは、順次に検出できる複数組の標的結合性プローブ（例えば、２組の標的結合性プローブ）を含んでいる。接触及びそれに続くインキュベーションの後、複数の標的結合性プローブは複数の異なる標的に結合する。次いで、標的結合性プローブを生物学的試料に架橋する（共有結合させる）（１４）。生物学的試料に対する標的結合プローブの共有結合は、標的を介して行ってもよいし（即ち、プローブを標的に対して架橋する）、或いは標的の近傍に位置する分子を介して行ってもよい（例えば、プローブを近くのタンパク質に対して架橋する）。複数の標的結合性プローブを複数の異なる標的（例えば、２組の標的）に結合した後、複数の標的結合プローブを順次に検出することで複数の標的を順次に検出できる。複数の標的結合プローブの第１組がシグナルジェネレーターを含むならば、追加のシグナル発生段階の必要なしにシグナルジェネレーターからのシグナルを観測することができる（２０）。しかし、複数の標的結合プローブの第１組が単独でシグナルを放出しなければ、追加のシグナル発生段階が必要となることがある。一実施形態では、これはシグナルジェネレーターを複数の標的結合プローブの第１組に結合することで達成される（１８）。次いで、複数の標的結合プローブの第１組からのシグナルを観測すればよい（２０）。第１組の標的結合プローブからのシグナルを（例えば、イメージングによって）観測した後、観測されたシグナルを修飾する（例えば、除去する）（２２）。第１組の標的結合プローブからの観測されたシグナルを修飾した後、複数の標的結合プローブの第２組からシグナルを発生させる（２４）。次いで、発生されたシグナルを観測して第２組の標的結合プローブを検出すればよい（２６）。
【００８４】
図２は、複数（例えば、第１組、第２組及び第ｎ組（「ｎ」の整数値は１〜１００の範囲内にあり得る。））の異なる標的を検出するための、本発明の一実施形態に係る方法段階を模式的に示している。本方法は、複数の異なる標的結合性プローブを生物学的試料に適用する段階（３２）を含んでいる。複数の標的結合性プローブは、順次に検出できる複数組（例えば、第１組、第２組及び第ｎ組（「ｎ」の整数値は１〜１００の範囲内にあり得る。））の標的結合性プローブを含んでいる。複数の標的結合性プローブを複数の異なる標的に結合した後、複数の標的結合プローブを順次に検出することで複数の標的を順次に検出できる。生物学的試料への接触及びそれに続くインキュベーションの後、複数の標的結合性プローブは複数の異なる標的に結合する。次いで、標的結合性プローブを生物学的試料に架橋すればよい（例えば、共有結合させればよい）（３４）。標的結合性プローブを生物学的試料に対して共有結合させるためには、任意の共有カップリング方法が使用できる。例えば、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、炭素−炭素結合などにより、標的結合性プローブを生物学的試料に対して共有カップリングさせることができる。複数の標的結合プローブの第１組がシグナルジェネレーターを含むならば、追加のシグナル発生段階の必要なしにシグナルジェネレーターからのシグナルを観測することができる（４０）。しかし、複数の標的結合プローブの第１組が単独でシグナルを放出しなければ、追加のシグナル発生段階が必要となることがある。一実施形態では、これはシグナルジェネレーターを複数の標的結合プローブの第１組に結合することで達成される（３８）。次いで、生物学的試料のイメージングにより、複数の標的結合プローブの第１組からのシグナルを観測すればよい（４０）。第１組の標的結合プローブからのシグナルをイメージングによって観測した後、観測されたシグナルを修飾する（４２）。次いで、複数の標的結合プローブの第２組から第２組のシグナルを発生させる（４４）。第２組のシグナルは、第１組のシグナルと同じであってもよいし、同じでなくてもよい。次いで、生物学的試料のイメージングにより、第２組のシグナルを観測する（４６）。観測後、この第２組のシグナルを修飾する（例えば、化学薬剤の適用によって破壊するか、又は光漂白する）（４７）。シグナル発生、修飾及び観測の方法段階を複数回繰り返すことで、以後の組の標的結合プローブからシグナルを発生させ、以後の組の標的結合プローブをイメージングすることができる（４８）。次いで、観測されたシグナルを生物学的試料中の複数の標的の検出と相関させればよい（４９）。相関段階は、各組の標的結合プローブからの各組のシグナルを観測した直後に実施してもよいし、或いはすべての標的結合プローブからのすべてのシグナルを観測した後に実施してもよい。
【００８５】
実施例１
架橋剤で修飾されたシアニン色素標識ＤＮＡオリゴマー（Ｃｙ３−Ｔ２０−ＳＦＡＤ）を次のようにして合成した。Ｃｙ３−Ｔ２０−ＮＨ２（３’−末端がアミノ修飾リンカーで標識されかつ５’−末端がＣｙ３（商標）色素で標識されたチミジン単位数２０のチミジンオリゴマー、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国）から商業的に入手した）を１０×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）に溶解した溶液１０μＬ（３１．９ｎｍｏｌ）を８０μＬの水及び１０μＬの１Ｍ  ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3緩衝液（ｐＨ８．４）で希釈した。これに、スルホスクシンイミジル−［ペンタフルオロアジドベンズアミド］エチル−１，３−ジチオプロピオネート（スルホ−ＳＦＡＤ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（米国イリノイ州）から商業的に入手した）の１０ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液（２０当量）を添加した。混合溶液を室温で約１〜２時間撹拌した。カラム供給業者から提供されたプロトコルを用いて、粗混合物をＮＡＰ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国））上で精製した。
【００８６】
スルホ−ＳＦＡＤは、１４．６Åの長さを有するジスルフィドスペーサーアームの両端にアミン反応性スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び光活性化可能なテトラフルオロフェニルアジドを含むヘテロ二官能性架橋剤である。ＮＨＳエステルは、ｐＨ７〜９の緩衝液中で第一アミノ基と効率的に反応して安定なアミド結合を形成する。ＵＶ光（３００〜３７０ｎｍ）に暴露された場合、ペルフルオロフェニルアジドは、活性炭素−水素結合（Ｃ−Ｈ）中に挿入し又は不飽和炭素鎖に付加することができる極めて反応性の高いニトレン基を生じる。ペルフルオロアリールニトレンは急速に反応し、非フッ素化アリールアジドより高い効率でＣ−Ｈ結合中に非特異的に挿入される。
【００８７】
実施例２
架橋剤で修飾されたシアニン色素標識ＤＮＡオリゴマー（Ｃｙ３−Ｔ２０−ＳＤＡＤ）を次のようにして合成した。Ｃｙ３−Ｔ２０−ＮＨ２（３’−末端がアミノ修飾リンカーで標識されかつ５’−末端がＣｙ３（商標）色素で標識されたチミジン単位数２０のチミジンオリゴマー、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国）から商業的に入手した）を１０×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）に溶解した溶液１０μＬ（３１．９ｎｍｏｌ）を８０μＬの水及び１０μＬの１Ｍ  ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3緩衝液（ｐＨ８．４）で希釈した。これに、スルホスクシンイミジル２−（［４，４’−アジペンタンアミド］エチル）−１，３’−ジチオプロピオネート（スルホ−ＳＤＡＤ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（米国イリノイ州）から商業的に入手した）の１０ｍＭ水溶液（２０当量）を添加した。混合溶液を室温で１〜２時間撹拌した。カラム供給業者から提供されたプロトコルを用いて、粗混合物をＮＡＰ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国））上で精製した。
【００８８】
スルホ−ＳＤＡＤは、１３．５Åの長さを有するジスルフィドスペーサーアームの両端にアミン反応性スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び光活性化可能なジアジリン部分を含むヘテロ二官能性架橋剤である。ＮＨＳエステルは、ｐＨ７〜９の緩衝液中で第一アミノ基と効率的に反応して安定なアミド結合を形成する。長波ＵＶ光（３３０〜３７０ｎｍ）によるジアジリンの光活性化は、反応性のカルベン中間体を生み出す。かかる中間体は、スペーサーアーム長さに相当する距離にあるアミノ酸側鎖又はペプチド主鎖との付加反応を通じて共有結合を形成し得る。
【００８９】
実施例３
架橋剤で修飾されたシアニン色素標識ＤＮＡオリゴマー（Ｃｙ３−Ｔ２０−ＳＡＮＰＡＨ）を次のようにして合成した。Ｃｙ３−Ｔ２０−ＮＨ２（３’−末端がアミノ修飾リンカーで標識されかつ５’−末端がＣｙ３（商標）色素で標識されたチミジン単位数２０のチミジンオリゴマー、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国）から商業的に入手した）を１０×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）に溶解した溶液１０μＬ（３１．９ｎｍｏｌ）を８０μＬの水及び１０μＬの１Ｍ  ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3緩衝液（ｐＨ８．４）で希釈した。これに、Ｎ−スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ−ＳＡＮＰＡＨ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（米国イリノイ州）から商業的に入手した）の２０ｍＭ水溶液（５０当量）を添加した。混合溶液を室温で１〜２時間撹拌した。カラム供給業者から提供されたプロトコルを用いて、粗混合物をＮＡＰ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国））上で精製した。
【００９０】
スルホ−ＳＡＮＰＡＨは、１８．２Åのスペーサーアーム長さを有する水溶性のヘテロ二官能性架橋剤である。スルホ−ＳＡＮＰＡＨ架橋試薬は、第一アミンと反応するＮＨＳエステル及び３２０〜３５０ｎｍで光反応性を示すニトロフェニルアジド基を含んでいる。
【００９１】
実施例４
タンパク質に対するＤＮＡプローブの架橋を調べるため、架橋官能基を有するシアニン色素標識ＤＮＡオリゴマー（Ｃｙ３−Ｔ２０−ＳＦＡＤ又はＣｙ３−Ｔ２０−ＳＤＡＤ）をストレプトアビジンと接触させた。Ｃｙ３−Ｔ２０−ＳＦＡＤ及びＣｙ３−Ｔ２０−ＳＤＡＤは、架橋官能基の点でのみ互いに異なっている。架橋官能基を有しないシアニン色素標識ＤＮＡオリゴマー（Ｃｙ３−Ｔ２０−ＮＨ２）を対照として使用した。反応は三重反復試験で実施し、各オリゴマーについて２組の実験を行った（即ち、２組の３ウェル／オリゴマー）。各反応に関し、マイクロタイタープレート（Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（高結合容量）プレート、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国イリノイ州）から商業的に入手した）のストレプトアビジン被覆ウェルにＣｙ３標識オリゴマー（１００μＬ／ウェル、１μＭ又は０．１μＭ）を添加した。（各オリゴマーについての三重反復試験で）１組はＵＶ光に２０分間暴露した一方、（各オリゴマーについての三重反復試験で）別の組は暗所に保った。反応後、過剰の試薬を除去し、ウェルを１×ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ウェルに１００μＬの１×ＰＢＳを補給し、Ｔｅｃａｎプレートリーダー上でマイクロタイタープレートを読んだ（励起波長は５４４ｎｍであり、発光波長は５９５ｎｍであった）。各組を各オリゴマーの２種の濃度（１μＭ及び０．１μＭ）について実施し、相対蛍光カウントを比較した。
【００９２】
図３は、Ｃｙ３−Ｔ２０−ＳＦＡＤ及びＣｙ３−Ｔ２０−ＳＤＡＤの２種の濃度において、各組に関する平均蛍光カウントを示している。図３は、ＵＶ光に暴露した場合、ストレプトアビジンに対するＣｙ３−Ｔ２０−ＳＦＡＤオリゴマーの顕著な架橋を示している。実験のために１μＭのＣｙ３−Ｔ２０−ＳＦＡＤを使用した場合、０．４４％のＣｙ３−Ｔ２０−ＳＦＡＤがストレプトアビジンに架橋した。０．１μＭの濃度を使用した場合、０．１５％のＣｙ３−Ｔ２０−ＳＦＡＤがストレプトアビジンに架橋した。暗所で実施した場合（対照）、Ｃｙ３−Ｔ２０−ＳＦＡＤの架橋はかなり減少した。対照オリゴマー及びＣｙ３−Ｔ２０−ＳＤＡＤはＵＶ露光試料と非露光試料との間で有意差を示さなかった。
【００９３】
実施例５
細胞に対するＤＮＡプローブの架橋を調べるため、シアニン色素標識ＤＮＡオリゴマー（Ｃｙ３−Ｔ２０−ＳＡＮＰＡＨ又はＣｙ３−Ｔ２０−ＮＨ２（対照））を細胞と共にインキュベートした。Ｃｙ３−Ｔ２０−ＳＡＮＰＡＨは、細胞タンパク質と反応する（かくしてプローブを架橋する）ことができるアジド官能基を含んでいる。対照プローブ（Ｃｙ３−Ｔ２０−ＮＨ２）はいかなる架橋官能基も含んでいない。
【００９４】
２５ｎＭ濃度の各オリゴマーに関し、２組の反応を実施した。脱パラフィン及び２段階媒体抗原回収プロトコルとしてＶｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙシステムのプロトコルを用いて、（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（米国マサチューセッツ州）から商業的に入手した）ＬＮＣａｐ（アンドロゲン感受性ヒト前立腺腺癌細胞）ペレットスライドを脱パラフィンし、抗原をＶｅｎｔａｎａ自動染色機上に回収した。スライドを洗浄剤（１回）、水（３回）及び１×ＰＢＳ（１回）で洗浄した。各反応に関し、３００μＬのオリゴマー溶液を各スライド上に配置し、スライドを暗所で１時間インキュベートした。（各オリゴマーに関して）１組はＵＶ光（トランスイルミネーター）に４０分間暴露した一方、（各オリゴマーに関して）別の組は暗所に放置した。反応後、過剰の試薬を除去し、スライドを１×ＰＢＳで１０分間洗浄した。さらに、スライドを１×ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍＬ、２．８６μＭ）で５分間染色した。次いで、スライドをＤＡＰＩ溶液から取り出し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを用いてマウントし、イメージングに付した。イメージングは、２０ｍｓのＣｙ３露光を用いてＺｅｉｓｓイメージャー上で実施した。
【００９５】
図４は、各組に関する平均蛍光カウントを示している。ＵＶ光下でＣｙ３−Ｔ２０−ＳＡＮＰＡＨと共にインキュベートしたスライドは、他のものに比べて高い蛍光カウントを示した。これは、オリゴマーＣｙ３−Ｔ２０−ＳＡＮＰＡＨがＵＶ露光下で細胞に架橋したことを明確に表している。他の組ではわずかな染色が認められた。スライドを１×ＰＢＳ中に配置することでカバースリップを取り除き、スライドを０．５×ＳＳＣと共に４０℃で一晩インキュベートした。１×ＰＢＳで洗浄（ＯＮ洗浄）した後、スライドをＺｅｉｓｓ上に装着してイメージングした。Ｃｙ３露光時間は２０ｍｓに保った。図４は、各組に関する平均蛍光カウントを示している。図４は、架橋剤とコンジュゲートしたオリゴマー及び露光を使用したスライドのみが良好なシグナルを生じることを明確に示している。これは定量分析によって確認される。
【００９６】
実施例６
標的結合性プローブの同時添加及びそれに続く標的結合プローブの順次検出により、組織試料中のポリ（Ａ）ｍＲＮＡ及びＵ６  ｓｎＲＮＡプローブの多重化検出を次のようにして実施した。全ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ及びＵ６  ｓｎＲＮＡプローブを検出するため、５’−ビオチン標識ＬＮＡ（商標）ｍＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションプローブＰｏｌｙＴ（２５）Ｖｎ（Ｅｘｉｑｏｎ社（米国）から商業的に入手した）及び５’−ジゴキシゲニン標識ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ（商標）検出プローブＵ６  ｈｓａ／ｍｍｕ／ｍｏ（Ｅｘｉｑｏｎ社（米国）から商業的に入手した）をそれぞれ使用した。ヒト結腸癌組織試料を含むスライドをヒストチョイス（ｈｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ）（ＡＭＲＥＳＣＯ社（米国）から商業的に入手した）中で脱パラフィンし、減少する量のエタノールで１５分間再水和化した。次いで、組織試料を１×ＰＢＳ、１×ＰＢＳ中の０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｗｔ／ｗｔ％）、続いて１×ＰＢＳで洗浄した。次いで、組織試料を５０％、７０％、９５％及び１００％エタノール（水中ｖ／ｖ％）の各々で１０分間脱水し、２０分間風乾した。ハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、５００μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中にＰｏｌｙＴ（２５）Ｖｎ及びＵ６  ｈｓａ／ｍｍｕ／ｍｏ（２５ｎＭ）を含む溶液を適用した。プローブを９５℃の温度ブロック中で１０分間加熱し、短時間遠心し、組織試料に適用した。次いで、組織試料をカバーガラスで覆い、密封した。次いで、スライドを加湿チャンバー内において３７℃で１２時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、組織試料を２×ＳＳＣで５分間、０．５×ＳＳＣで５分間、及び６７℃の０．５×ＳＳＣで１０分間洗浄した。
【００９７】
次いで、組織試料を１×ＰＢＳで洗浄し、３％ＢＳＡ  ＰＢＳ（ｗｔ／ｗｔ％）中のＣｙ３標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ社（米国））と共に室温で３０分間インキュベートし、Ｃｙ３フィルターキューブを用いてＺｅｉｓｓ顕微鏡上でイメージングした。図５（試料１）はＣｙ３チャンネル内に強いシグナルを示し、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡの検出を表している。ポリ（Ａ）ｍＲＮＡの検出後、スライドを２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ3中の塩基性３％Ｈ2Ｏ2（化学漂白溶液）で１５分間処理した。スライドを１×ＰＢＳですすぎ、もう一度２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ3中の３％Ｈ2Ｏ2で２０分間処理し、続いて１×ＰＢＳですすいだ。次いで、スライドをすべてのチャンネルでイメージングした。図５（試料２）は、化学漂白溶液での処理後に大部分のＣｙ３シグナルが漂白されたことを示している。最後に、スライドをローダミン標識抗ジゴキシゲニン抗体（Ｒｏｃｈｅ社（米国））と共にインキュベートすることでＵ６転写物を検出した。Ｃｙ３フィルターキューブを用いたイメージングによってスライドを観測した。図５（試料３）はＣｙ３チャンネル内に強いシグナルを示し（ローダミン蛍光がＣｙ３３蛍光に重なっている）、Ｕ６  ｓｎＲＮＡ転写物の検出を表している。ジゴキシゲニン標識Ｕ６  ｈｓａ／ｍｍｕ／ｍｏプローブは、組織試料に化学漂白を施した後にも試料中に保持された。
【００９８】
実施例７
架橋剤で修飾されたシアニン標識５’−Ｃｙ３−ｂ−アクチン−ＬＮＡ−ＡｍＭ−ＳＡＮＰＡＨ（構造１に示す、ヌクレオチド記号後の星印（*）はそのヌクレオチドがロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドであることを表す）を次のようにして合成する。
【００９９】
【化１】
2013507941.tif 000003
５’−Ｃｙ３−ｂ−アクチン−ＬＮＡ−ＡｍＭオリゴヌクレオチドを５×ＰＢＳに溶解した溶液２０μＬ（１４．１３ｎｍｏｌｅ）を７０μＬの水及び１０μＬの１Ｍ  ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3（ｐＨ８．４）緩衝液と混合した。２ｍｇのスルホ−ＳＡＮＰＡＨ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（米国イリノイ州））を２０３μＬの水に溶解することで、スルホ−ＳＡＮＰＡＨの２０ｍＭ溶液を調製した。この溶液３５．３μＬ（５０当量）を撹拌しながらオリゴヌクレオチド溶液に添加した。暗所で２時間撹拌した後、混合物を冷蔵庫内に１２時間貯蔵した。製造業者のプロトコルを用いて、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国））上で精製を行った。ピンク色の物質を（画分１中に）集め、ＨＰＬＣによって分析した。主ピークが生成物（純度約９１％）に相当し、非修飾オリゴヌクレオチドが主な不純物であった。
【０１００】
実施例８
架橋剤で修飾されたビオチン標識５’−ビオチン−Ｕ６−ＬＮＡ−ＡｍＭ−ＳＡＮＰＡＨ（構造２に示す、ヌクレオチド記号後の星印（*）はそのヌクレオチドがロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドであることを表す）を次のようにして合成する。
【０１０１】
【化２】
2013507941.tif 000004
５’−ビオチン−Ｕ６−ＬＮＡ−ＡｍＭオリゴヌクレオチドを５×ＰＢＳに溶解した溶液２０μＬ（２２．０４ｎｍｏｌｅ）を７０μＬの水及び１０μＬの１Ｍ  ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3（ｐＨ８．４）緩衝液と混合した。２ｍｇのスルホ−ＳＡＮＰＡＨ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（米国イリノイ州））を２０３μＬの水に溶解することで、スルホ−ＳＡＮＰＡＨの２０ｍＭ溶液を調製した。この溶液５５．１μＬ（５０当量）を撹拌しながらオリゴヌクレオチド溶液に添加した。暗所で２時間撹拌した後、混合物を冷蔵庫内に１２時間貯蔵した。製造業者のプロトコルを用いて、ＰＤ−１０カラム上で精製を行った。無色の物質を（画分１中に）集め、ＨＰＬＣによって分析した。１つのピークのみが認められ、それは所望の生成物に相当していた。
【０１０２】
実施例９
プローブ（５’−Ｃｙ３−ｂ−アクチン−ＬＮＡ−ＡｍＭ−ＳＡＮＰＡＨ及び５’−ビオチン−Ｕ６−ＬＮＡ−ＡｍＭ−ＳＡＮＰＡＨ）の同時添加及びそれに続くプローブの架橋と順次検出により、組織試料中のｂ−アクチン及びＵ６プローブの多重化検出を次のようにして実施した。ヒト扁桃組織を含むスライドをヒストチョイス（ＡＭＲＥＳＣＯ社（米国））中で脱パラフィンし、次いで減少する量のエタノール及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＰＢＳ中０．３％）で１５分間再水和化した。次いで、組織を１×ＰＢＳで洗浄した。ハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド／５％デキストラン硫酸）中に５’−Ｃｙ３−ｂ−アクチン−ＬＮＡ−ＡｍＭ−ＳＡＮＰＡＨ及び５’−ビオチン−Ｕ６−ＬＮＡ−ＡｍＭ−ＳＡＮＰＡＨプローブ（各２５ｎＭ）を含む溶液を適用した。ＤＲ１８０トランスイルミネーターを室温で用いて、プローブを組織に４０分間架橋した。次いで、スライドを１×ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩで染色し、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＤＡＰＩキューブを用いてＺｅｉｓｓ顕微鏡上でイメージングした。図６はＣｙ３チャンネル内に強いシグナルが認められたことを示していて、これはｂ−アクチンプローブの存在を表している（段階１）。予想される通り、Ｃｙ５チャンネル内には弱い試料自己蛍光以外のシグナルは存在しなかった。ｂ−アクチンプローブの観測後、スライドを２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ3中の塩基性３％Ｈ2Ｏ2で２０分間処理した。スライドをＰＢＳですすぎ、もう一度２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ3中の３％Ｈ2Ｏ2で２０分間処理し、続いてＰＢＳですすいだ。次いで、すべてのチャンネルで画像を記録した。画像は大部分のＣｙ３シグナルの漂白を示した（段階２）。多少の残留シグナルが認められたが、これは内因性の自己蛍光又は不完全な漂白に原因するものかもしれない。最後に、スライドをＣｙ５標識ストレプトアビジンと共にインキュベートすることで（Ｕ６結合ビオチニル化プローブである５’−ビオチン−Ｕ６−ＬＮＡ−ＡｍＭ−ＳＡＮＰＡＨプローブの検出を通じて）Ｕ６プローブを検出した。スライドをイメージングによって観測した。イメージングはＣｙ５チャンネル内に強いシグナルを示し（段階３）、これは試料に漂白サイクルを施した後にもビオチニル化プローブが試料中に保持されたことを表している。
【０１０３】
図７は、本発明の一実施形態に係る、生物学的試料中の複数の異なる標的を検出するための装置（５０）のブロック図である。本装置は、試料取扱いシステム（６２）、試薬分配システム（６４）、光源（６６）及びシグナル検出システム（６０）を含んでいる。光源は、プローブ架橋システム並びにシグナル検出システム容量光源として働く。図示された装置（５０）はさらに、メモリー及びプロセッサー（５４）を有するコンピューター（５２）、コントローラーユニット（５８）並びにディスプレイ（５６）を含んでいる。図中では、矢印は通信リンクを表し、双頭矢印は相互通信リンクを表し、点線矢印は任意の通信リンクを表す。
【０１０４】
コントローラーユニットは、コンピューター（５２）、試料取扱いシステム（６２）、試薬分配システム（６４）、光源（６６）及びシグナル検出システム（６０）の１以上と通信することができる。通信は一方向通信又は二方向通信であり得る。試料取扱いシステム（６２）、光源（６６）、試薬分配システム（６４）及びシグナル検出システム（６０）は、複数の標的を検出するためのシグナル／プロトコルを制御コントローラーユニット（５８）によって制御できる。その上、シグナル検出システム（６０）はコントローラー（５８）にカップリングされていて、後者はシグナルの取得を指令することができる。コントローラー（５８）はまた、試料取扱いシステム（６２）、光源（６６）などの初期調整のような各種の機能を実行することもできる。一般に、コントローラー（５８）は装置の動作を指令することで、複数の標的を検出するための方法の段階を実行し、取得されたデータを処理する。コントローラー（５８）はまた、通例は汎用又は特定用途向けデジタルコンピューターに基づくシグナル処理回路、コンピューターによって実行されるプログラム及びルーチンを記憶するための関連メモリー回路なども含み得る。
【０１０５】
通例、コンピューター（５２）はコントローラー（５８）にカップリングされているか、或いはそれを組み込んでいる。シグナル検出システム（６０）によって収集されたデータは、以後の処理及び再構成のため、直接に又はコントローラー（５８）を介してコンピューター（５２）に送信し得る。コンピューター（５２）は、コンピューター（５２）によって処理されたデータ又はコンピューター（５２）によって処理されるべきデータを記憶し得るメモリーを含むか、或いはそれを組み込むことができる。かかる例示的なシステ
ム５０では、大量のデータを記憶するための任意タイプのメモリー構成が使用できることを理解すべきである。その上、メモリーは装置内に位置していてもよいし、或いはデータ、処理パラメーター及び／又は方法実行用のルーチンを記憶するためのネットワークでアクセス可能なメモリー媒体のような遠隔部品を含んでいてもよい。
【０１０６】
図８は、生物学的試料中の複数の異なる標的を検出するための例示的な組織病理学装置（７０）のブロック図である。かかる組織病理学装置は、スライド（８６）及びステージング（８８）を有する試料取扱いシステム（８４）、試薬分配システム（９０）、架橋用光源（９４）並びに顕微鏡（８２）及びＣＣＤカメラ（８０）を含むシグナル検出システムを含んでいる。本装置はさらに、中央処理ユニット（７４）及びメモリーを有するコンピューター（７２）、コントローラーユニット（７８）並びにディスプレイデバイス（７９）を含み得る。コントローラーユニットは、中央処理ユニット、試料取扱いシステム、試薬分配システム、プローブ架橋システム及びシグナル検出システムの１以上と通信することができる。通信は一方向通信又は二方向通信であり得る。
【０１０７】
コンピューター（７２）は、コントローラー（７８）によって可能化される試薬分配、プローブ架橋及びシグナル検出のようなフィーチャーを制御するように構成し得る。さらに、コンピューター（７２）は、通例はキーボード及び他の入力装置（図示せず）を備えたオペレーターワークステーション（図示せず）を介してオペレーターから指令及び他のパラメーターを受信するように構成し得る。それにより、オペレーターは入力装置を介してシステム７０を制御できる。かくして、オペレーターは、再構成された画像／データ又はシステム（７０）に関連する他のデータの観察、イメージングの開始などを行うことができる。
【０１０８】
オペレーターワークステーション又はコンピューター（７２）にカップリングされたディスプレイ（７６）は、検出されたシグナル又は再構成画像を観察するために使用できる。さらに、再構成画像は、オペレーターワークステーションにカップリングされ得るプリンター（図示せず）によって印刷することもできる。ディスプレイ（７２）及びプリンターはまた、直接に又はオペレーターワークステーションを介して、コンピューター（７２）に接続してもよい。オペレーターワークステーションはまた、画像蓄積伝送システムにカップリングすることもできる。オペレーターワークステーションを組織病理学科情報システム又は病院情報システムのような遠隔システム或いは内部又は外部ネットワークにカップリングすれば、異なる場所にいる他者が再構成画像にアクセスできることに注意すべきである。
【０１０９】
さらに、コンピューター（７２）及びオペレーターワークステーションは、標準又は特殊目的のコンピューターモニター及び関連する処理回路を含み得る他の出力装置にカップリングしてもよいことに注意すべきである。さらに、システムパラメーターの出力、画像の観察などのため、１以上のワークステーションをシステム内でリンクすることもできる。一般に、本装置内に供給されるディスプレイ、プリンター、ワークステーション及び類似の装置は、本装置に対してローカルであってもよいし、或いは施設若しくは病院内の他の場所又は全く異なる場所にあって、１以上の構成可能なネットワーク（例えば、インターネット、仮想プライベートネットワークなど）を介してシグナル検出システムにリンクされたもののように、本装置に対してリモートであってもよい。
【０１１０】
上記の実施例及び実施形態は、本明細書中に記載された本発明を限定するものではなく、本発明の若干の特徴を例示的するものである。これらは、多数のあらゆる可能な実施形態又は実施例から選択された実施形態又は実施例である。本発明は、その技術思想又は本質的な特徴から逸脱することなしに他の特定の形態で実施できる。したがって、添付の特許請求の範囲は本発明の真の技術思想に含まれる修正及び変更のすべてを包含することを理解すべきである。
【符号の説明】
【０１１１】
１２  標的結合性プローブの適用
１４  標的結合性プローブの架橋
１６  シグナルジェネレーターの有無
１８  シグナルジェネレーターの結合
２０  第１組からのシグナルの観測
２２  第１組からのシグナルの修飾
２４  第２組からのシグナル発生
２６  第２組からのシグナルの観測
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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