(57)【要約】  本発明は、懸濁物中の細胞培養物の連続灌流培養によって、止血タンパク質を生産するための方法に関し、前記細胞培養物が、前記培養物の懸濁物中に前記止血タンパク質を発現し、前記細胞培養物が、フィルターモジュールを通過して流動し、前記フィルターモジュールが、回収ポートに通じ、前記フィルターモジュールが、前記止血タンパク質の通過を可能とする０．１から２．９μｍまでのメッシュサイズを有し、且つ前記フィルターモジュールを通過する前記流動が、交互のタンジェンシャルフローである。本発明はまた、本発明の方法によって生産されるタンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
懸濁物中の細胞培養物の連続灌流培養によって、止血タンパク質を生産するための方法であって、前記細胞培養物が、前記培養物の懸濁物中に前記止血タンパク質を発現し、
前記細胞培養物が、フィルターモジュールを通過して流動し、前記フィルターモジュールが、回収ポートに通じ、前記フィルターモジュールが、前記止血タンパク質の通過を可能とする０．１から２．９μｍまでのメッシュサイズを有し、且つ
前記フィルターモジュールを通過する前記流動が、交互のタンジェンシャルフローである、
止血タンパク質を生産するための方法。
【請求項２】
前記止血タンパク質が、第ＩＸ因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記止血タンパク質が、第ＶＩＩＩ因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記止血タンパク質が、第ＶＩＩ因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
大規模発酵（少なくとも５００Ｌ）において行われる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記灌流の速度が、１日当たり０．７から１０容量までである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ろ過されていない細胞培養物の懸濁物が、１日当たり０から０．５容量の速度で取り除かれる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ろ過されていない細胞培養物の懸濁物が、１日当たり０．０１から０．２容量の速度で取り除かれる、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
ろ過されていない細胞培養物の懸濁物が、連続的にまたは不連続的に取り除かれる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞の濃度が、８０×１０６細胞／ｍｌ未満に、好ましくは５０×１０６細胞／ｍｌ未満に維持される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法によって生産される組換えタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、懸濁物中の細胞培養物の連続灌流培養によって、止血タンパク質を生産するための方法に関し、前記細胞培養物が、前記培養物の懸濁物中に前記止血タンパク質を発現し、前記細胞培養物が、フィルターモジュールを通過して流動し、前記フィルターモジュールが、回収ポートに通じ、前記フィルターモジュールが、前記止血タンパク質の通過を可能とする０．１から２．９μｍまでのメッシュサイズを有し、且つ前記フィルターモジュールを通過する前記流動が、交互のタンジェンシャルフローである。本発明はまた、本発明の方法によって生産されるタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
止血タンパク質は、凝固カスケードの構成要素である。これらのタンパク質のいずれか一つの欠乏は、健康上の合併症から生命を脅かす疾患までに及ぶ。これらのタンパク質の欠乏は、動物源由来の止血タンパク質の供給によって初期には治療されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０１６６９１５号公報
【特許文献２】国際公開第２００４／０００３６６号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／０１３００６０号公報
【特許文献４】国際公開第２００６／０１８２０４号公報
【特許文献５】国際公開第２００９／１３０１９８号公報
【特許文献６】米国特許第４，７７０９９９号公報
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１００１２００９４号公報
【特許文献８】国際公開第９７／４３４３６号公報
【特許文献９】国際公開第８８／０８０３５号公報
【特許文献１０】国際公開第８７／０４１８７号公報
【特許文献１１】国際公開第９０／０２１７５号公報
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００５０２２７９１３号公報
【特許文献１３】欧州特許出願公開第１７０７６３４号公報
【特許文献１４】米国特許第６，５４４，４２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
典型的には、組換え止血タンパク質が、連続灌流発酵方法または繰り返されるバッチ発酵方法のいずれかによって生産されている。これらの発酵方法は、質の高い生成物をもたらす。しかしながら、質的水準を低下させることなく、より大量の生成物を生産する方法を提供する継続的な必要性が存在する。本発明は、そのような方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明の第一の態様は、懸濁物中の細胞培養物の連続灌流培養によって、止血タンパク質を生産するための方法を提供し、前記細胞培養物が、前記培養物の懸濁物中に前記止血タンパク質を発現し、前記細胞培養物が、フィルターモジュールを通過して流動し、前記フィルターモジュールが、回収ポートに通じ、前記フィルターモジュールが、前記止血タンパク質の通過を可能とする０．１から２．９μｍまでのメッシュサイズを有し、且つ前記フィルターモジュールを通過する前記流動が、交互のタンジェンシャルフローである。前記フィルターモジュール内に含有される前記メッシュのサイズが、前記止血タンパク質を前記フィルターモジュールに通過させるが、前記細胞または細胞残屑を通過させないことを可能とする。
【０００６】
本発明の第一の態様の方法は、従来的に使用されている方法より、顕著に高い力価で、質の高い止血タンパク質の生産を可能とする。
【０００７】
さらに、増殖を損なうことのないより高い力価、生産性、および生成物の質という利点は、実験室規模の発酵（約５Ｌ）から大規模発酵（少なくとも５００Ｌ）まで得られる。本発明は、生成物の質を損なうことのない、従来技術の方法の最大１０倍の量の、所望のタンパク質の生産を可能とする。
【０００８】
本発明は、処理パラメータの慎重な制御を可能とし、バイオリアクターの物理特徴内において、高濃度で質の高い生成物をもたらすために、ある特定の細胞の密度で、方法を実行することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】出液（bleed）を伴って行われるＡＴＦを使用する、実験室規模およびパイロットプラント規模（＞５００Ｌ）での、第ＩＸ因子に関する生細胞の濃度および生存率を示す図である。
【図２】第ＩＸ因子に関する従来の方法（「半連続方法」）とＡＴＦ方法との間における、大規模（＞５００Ｌ）の収量比較（相対的尺度における）を示す図である。
【図３】出液を伴わずに行われるＡＴＦを使用する、実験室規模での、第ＩＸ因子の細胞株に関する生細胞の濃度および生存率を示す図である。
【図４】ＡＴＦを使用する、実験室規模での、第ＶＩＩＩ因子に関する生細胞の濃度および生存率を示す図である。
【図５】ＡＴＦを使用する、実験室規模での、第ＶＩＩ因子に関する生細胞の濃度および生存率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の方法では、前記止血タンパク質は、好ましくは、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）または第ＩＸ因子（ＦＩＸ）のうちの一つである。当該技術分野においては、前記止血タンパク質、例えばＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸの生産を記載する多数の文献が存在する。細胞株、細胞培養物およびタンパク質生産技術は、周知であり、ＦＶＩＩについては特許文献１および特許文献２、ＦＶＩＩおよびＦＩＸについては特許文献３および特許文献４、ＦＩＸについては特許文献５および特許文献６、ならびにＦＶＩＩＩについては特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２および特許文献１３等の文献に記載されている。これらの文献の全てが、参照によって援用され、止血タンパク質生産に関する周知の原理を記載しており、これらの方法の工程を、本発明によって使用することができる。本発明によって組換え的に前記タンパク質を生産するために、培養時に（適当な条件下で）前記タンパク質を発現する細胞株が使用される。そのような細胞株（ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ等の止血タンパク質をコードする組換え核酸を含む）、例えばベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、不死化ヒト細胞（例えばＰＥＲ．Ｃ６細胞）を含むヒト細胞、ラット細胞およびマウス細胞は、当該技術分野において既知である。本発明によれば、前記細胞培養物は、好ましくは、培養物中に目的の止血タンパク質を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株の培養物である。より好ましくは、前記培養物はＣＨＯ−ＫＩ細胞株である。
【００１１】
前記細胞培養物は、懸濁物中に存在する。前記培養物および目的のタンパク質の組換え生産に有用な培地の例は、周知である。好適な例は、上述の特許出願を含む従来技術、およびこの文献の実施例の節において、見出すことができる。
【００１２】
本発明は、細胞を培養するための連続灌流方法である。細胞を培養するための灌流方法という用語は、当該技術分野における従来の意味を有しており、培養中に、分離装置によって細胞が保持されることを意味する。すなわち、分離前よりも低い細胞の密度を有する（前記培養物からの）液体の流出が存在し、細胞培養培地の（前記培養物への）流入が存在する。本発明は、所望のタンパク質の生産に関する。前記方法から回収される清澄化された液体は、前記細胞培養物と同じ範囲の所望のタンパク質の濃度を有する。本発明では、前記細胞培養培地の少なくとも一つの成分が連続的に添加されることが好ましい。前記培地の他の成分を、連続的に、半連続的に、またはその他の様式で添加しても良い。
【００１３】
本発明に係る分離装置は、フィルターモジュールである。前記フィルターモジュールは、好ましくは、管状膜の形態の中空繊維フィルターである。そのようなフィルター／膜は、当該技術分野において広く知られており、例えばGeneral Electric（以前はAmershamであった）から入手することができる。前記フィルターは、前記メッシュサイズが０．１から２．９μｍまでとなるように選択される。このメッシュサイズは、細胞残屑が前記フィルターを通過することをできる限り防止するために選択されるため、このことは、本発明の重要な特徴である。本発明に従って使用するための好ましいフィルターは、ＰＳ（ポリスルホン）またはＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）から作製されるフィルターを含む。
【００１４】
交互のタンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）が、２０００年というかなり前から記載されている。ＡＴＦシステムは、一般的に、任意の種類のバイオリアクター（ステンレス鋼、ガラス、単回使用バイオリアクター等）と連結することができる（上述のような）前記フィルターに加えて、ダイアフラムから構成される。前記フィルターのポアサイズを変化させることによって、生産される生成物を、前記バイオリアクター内に高度に濃縮する（up-concentrated）ことができるか、または連続的に取り出すことができる。ＡＴＦは、前記フィルターモジュールにおいて発生する交互のタンジェンシャルフローが存在すること、すなわち、前記フィルターモジュールの膜の表面と同じ方向の（すなわち、接線方向の）ある流動が存在すること、および前記フィルター表面と実質的に垂直の方向の別の流動が存在することを意味する。タンジェンシャルフローは、その内容が参照によって援用される特許文献１４に記載されるもののような、当該技術分野において既知の方法によって得ることができる。
【００１５】
好ましいバイオリアクターは、出液ポート、ＡＴＦポート（回収ポート）、培地ポート、塩基ポート、気体ポート、および他の添加のための更なるポートを備える古典的な撹拌型バイオリアクター装置である。
【００１６】
他の方法を使用して生産される物質は、顕著に低い収量、例えば１日生産レベルもしくは容量生産レベルまたはバルク生成物濃度を有するので、他の方法で生産した場合と同様の質（例えば、ＧＬＡプロファイル、または活性化形態、またはグリコールプロファイル、または重鎖等の質）を有する止血タンパク質を生産するための方法に、ＡＴＦを使用することができることは、従来は考えられていなかった。
【００１７】
前記システムのパラメータは、一般的に、当該技術分野において記載されるようなものである。前記細胞培養培地のｐＨ、温度、溶存酸素濃度、浸透圧は、原理上重要ではなく、選択される細胞、および生産される生成物に依存する。前記パラメータは、生成物の質および量を最大化するために変化させることができる。バランスが通常は必要とされる。本発明によれば、前記灌流の速度は、好ましくは１日当たり０．７から１０容量まで、より好ましくは１日当たり０．９から４容量までである。
【００１８】
前記方法は、回収される液体の体積と前記培養物に添加される液体の体積とのバランスをとることを目的として、ろ過されていない細胞培養物の懸濁物を取り除くために「出液」させても良い。この出液の速度は、変化させることができる。前記ろ過されていない液体は、好ましくは、１日当たり０から０．２容量（前記方法の総体積）の速度で前記方法から取り除かれる。前記ろ過されていない細胞培養物の懸濁物を、前記方法から連続的に取り除いても良い（連続出液）。別法として、前記ろ過されていない細胞培養物の懸濁物を、前記方法から不連続的に取り除いても良い（パルス出液）。第ＩＸ因子に関しては、好ましい出液の速度は、１日当たり０．０１から０．２容量（前記方法の総体積）である。この出液は、以下に示すように、例えば８０％を超える高い細胞生存率を維持するために、生産段階中に適用される。
【００１９】
所望の止血タンパク質は、前記回収ポートを介して前記システムから回収される。所望の止血タンパク質は、最も好ましくは、下流処理において精製される。複数の下流処理工程を、組み合わせても良い。本発明のタンパク質の典型的な下流処理が、上記参照される特許出願を含むこれらの従来技術等の当該技術分野において、記載されている。本発明の方法では、前記フィルターモジュールを通過する液体は、所望のタンパク質を含有し、このタンパク質は、前記フィルターを通過することによって、懸濁物の培養物中の前記細胞および細胞残屑から分離される。この液体は、清澄化され、ろ過される懸濁物であり、この懸濁液は、前記生産された止血タンパク質を含有する。前記ろ過される懸濁物は、好ましくは、１日当たり０．７から１０容量（前記方法の総体積）まで、好ましくは１日当たり０．７から１．０容量、または０．８から１．４容量、または１．０から１．２容量の速度で回収される。
【００２０】
前記方法の生産性は、前記方法のパラメータにある程度依存し、さもなければ、前記止血タンパク質を分泌する（exposing）細胞クローンに依存する。本発明の利益は、同じ細胞クローンを使用する非ＡＴＦ方法における生産量と比較して、より大きな生産量である。
【００２１】
開始時および前記方法の実施中における前記細胞の生存率は、８０％より大きく、好ましくは９０％より大きいべきである。前記細胞の生存率は、前記方法の実施中に測定されるべきであり、前記細胞の生存率が所望のレベル未満に低下したならば、全ての培養物において同様に条件が調節される。
【００２２】
前記細胞の密度は変化し得る。好適な接種量は、３〜６×１０５細胞／ｍｌの範囲である。
【００２３】
前記培養物中の標的となる細胞の密度は、８０×１０６細胞／ｍｌ未満である。より高い細胞の密度は、より低い生成物の量および／または質をもたらす。ＦＩＸに関する一つの好ましい実施形態では、前記培養物中の前記細胞の密度は、８×１０６細胞／ｍｌ未満である。
【００２４】
前記懸濁物の温度は、好ましくは、約３５．５から３７．５℃、最も好ましくは約３６．５℃に維持される。前記懸濁物のｐＨは、好ましくは、約６．９５±０．４５に維持される。
【００２５】
前記懸濁物中の溶存酸素の濃度は重要である。好ましくは、前記懸濁物中の溶存酸素の濃度は、約２０から１２０％、好ましくは約３０から７０％、好ましくは約４５から５５％、好ましくは約５０％である。曝気は、任意の手段によって達成することができる。典型的且つ好ましい手段は、ヘッドスペースに一定の空気流を保持した状態での、スパージャによる、空気と酸素との混合物、好ましくは１００％の酸素を使用する曝気を含む。
【００２６】
特に、本発明は、第ＶＩＩ因子タンパク質または第ＶＩＩＩ因子タンパク質または第ＩＸ因子タンパク質を生産するための、請求項１に記載の方法に関する。
【００２７】
本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様に係る方法によって生産されるＦＶＩＩタンパク質、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＦＩＸタンパク質を提供する。第一の態様の全ての好ましい特徴は、また、第二の態様に適用される。
【００２８】
止血タンパク質は当該技術分野において既知であるため、前記タンパク質の質は、そのタンパク質に関する基準に従って測定することができる。ＦＶＩＩおよびＦＩＸの質の測定は、通常、ＧＬＡプロファイル（Ｇｌａ１０からＧｌａ１２）に関する。ＦＶＩＩＩの質の測定は、通常、重鎖および軽鎖（heavy and light claims）の組合せに関する。
【実施例】
【００２９】
実施例１
実施例１は、５Ｌバイオリアクター（実験室規模）でのＡＴＦ灌流装置において、本発明の方法を使用して行われる、第ＩＸ因子タンパク質に関する培養を記載する。前記培養は、ＡＴＦ灌流装置を使用して実施した。前記培養は、安定な細胞の密度、生存率、および生成物の収量をもたらした。出液の範囲は、０から２０％まで変化させた。
【００３０】
前記生成物の質に関しては、活性化型ＦＩＸ（「ＦＩＸａ」）は、前記方法において安定且つ小量に維持される。ＧＬＡ１１およびＧＬＡ１２に関するＧＬＡプロファイル（ＦＩＸのグルタミン酸に富むγ−カルボキシグルタミン酸ドメイン）は、ＦＩＸの濃度が増大するにつれて、９０〜９５％から８０〜８５％まで僅かに減少した。到達したＦＩＸの収量は、使用した現行の従来技術（非ＡＴＦ）方法の約１０倍であり、生成物の質を損なわない。
【００３１】
菌株の詳細
細胞型は、ＦＩＸを発現するＣＨＯ−Ｋ１株である。
【００３２】
培地：
使用した培地は、細胞の増殖および生成物の産生を支持する市販の培地であった。そのような培地には、通常、インスリン、ビタミンＫ１、グルタミンおよびグルコースが添加される。
【００３３】
方法の概略
ＦＩＸの培養のための方法の後に、本発明に係るＡＴＦ方法を設定した。前記方法は、細胞バンクのバイアルを解凍すること、およびＴ−フラスコまたは低撹拌（＜３０ｒｐｍ）を伴う振とうフラスコへの細胞の移行を含んでいた。５Ｌバイオリアクターに接種するために、十分な細胞がもたらされるまで、細胞増殖を振とうフラスコにおいて行った。全ての方法工程で、前記細胞は、無血清培地中の懸濁物において培養される。前記バイオリアクターでは、最初の２〜３日間、バッチモードで培養を行った。灌流、パルスおよび回収を開始するための前記基準が満たされると、培地を連続的に供給した。グルタミンおよびグルコースを、一度にまたは連続的に（必要に応じて）添加した。回収物を、遠心分離および／またはろ過によってＧＭＯ清澄化し、一次回収物に移した。
【００３４】
バイオリアクターのパラメータ：５ＬのＢｉｏｓｔａｔ  Ｂ  ｐｌｕｓの準備および試験
タンクを組み立てる前に、ｐＨ電極を、４．０緩衝液および７．４緩衝液を用いて較正し、７．０緩衝液を用いて検査した。前記タンクは、ＰＢＳ（９．６ｇ／ｌ）と共に滅菌し、ＰＢＳを、その後、培地と交換した。酸素電極を、ＰＢＳ溶液中の窒素（０％）および空気（１００％）を用いて較正した。
【００３５】
前記ｐＨ電極を、外部のｐＨ測定値に対して最終的に再較正した。タンク、配管およびフィルターを、漏れに関して試験した。
【００３６】
方法操作条件
前記方法のパラメータの設定点を、以下の表１に特定されるように調節した。
【００３７】
【表１】
2013538588.tif 000002
【００３８】
接種
播種する細胞の濃度は、３〜６×１０５細胞／ｍｌの範囲を標的とした。塩基は、接種の２日後まで接続した。
【００３９】
増殖期
前記細胞の濃度が実験的増殖期に到達した際に、灌流および出液を開始した。出液／回収の速度の比率は、１０／９０（％）であった。回収ボトルは、培養中、毎日交換した。
【００４０】
前記細胞の濃度が細胞の濃度の標的（６×１０６細胞／ｍｌ）より高くなると直ぐに、パルス出液ストラテジーを適用した。前記細胞の濃度に応じて、前記パルス出液の量を、前記バイオリアクターの実効体積の０から２０％まで変化させた。
【００４１】
回収速度は、一定に維持し、毎日検査した。
【００４２】
回収
前記細胞培養物を、前記タンクからブルーキャップフラスコへと回収した。前記培養物を、０．２２μｍのフィルターを使用して滅菌ろ過した。約１Ｌの回収物を、滅菌バッグ中に移し、凍結した。
【００４３】
結果
前記細胞の濃度は、約７〜８×１０６細胞／ｍｌで安定なままであった。
【００４４】
生存率は、前記培養に対して約８５％および９０％に維持された。これは、約０．０７％というＦＩＸａ含有量をもたらした。
【００４５】
ＧＬＡプロファイルに関しては、Ｇｌａ−１１およびＧｌａ−１２が８０％超に維持された。
【００４６】
高い生産性および安定な生成物が、また、連続出液内に得られた。
【００４７】
実施例２
実施例２は、大規模（＞５００Ｌ）でのＡＴＦ灌流装置において、本発明の方法を使用して行われる、第ＩＸ因子タンパク質に関する培養を記載する。大規模での方法（実施例２）は、実施例１において上述のものと同じ菌株、培地、および全体的な方法工程を使用して行った。方法のパラメータ（すなわち、バイオリアクターのパラメータ、操作条件等）に関しては、これらは、また、実施例１において上述のものと同様であった。
【００４８】
【表２】
2013538588.tif 000003
【００４９】
結果
表２は、生産された第ＩＸ因子の質が、従来の方法（「半連続方法」）と比較してＡＴＦ方法を使用した場合も、維持されることを示す。しかしながら、ＡＴＦ方法は、はるかに大きな量／収量をもたらす（図２に示されるように）。
【図１】
2013538588.tif 000004
【図２】
2013538588.tif 000005
【図３】
2013538588.tif 000006
【図４】
2013538588.tif 000007
【図５】
2013538588.tif 000008
【国際調査報告】
2013538588.tif 000009
2013538588.tif 000010
2013538588.tif 000011