(57)【要約】本発明は、Ａａｅピロホスファターゼタンパク質であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または４の酵素タンパク質をコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または３の核酸を含む核酸、および単離したＡａｅピロホスファターゼタンパク質を用いる配列決定方法を提供する。【選択図】図２
2013529896.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａａｅピロホスファターゼ酵素をコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または３の核酸を含む核酸。
【請求項２】
核酸がＨｉｓタグをコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
核酸がＢＣＣＰビオチニル化部位をコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
単離したピロホスファターゼタンパク質を用いる配列決定方法であって、アクイフェックス・エオリカス(Aquifex aeolicus)種に由来するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または４の酵素タンパク質を含む反応環境で配列決定反応を実施する工程を含み、ここで、前記酵素タンパク質がピロホスファターゼ活性を含む、
前記方法。
【請求項５】
酵素タンパク質はビーズに結合されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
酵素タンパク質はビオチン連結によりビーズに結合されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
インビボプロセスによりビオチンは作動可能な状態でタンパク質にカップリングされている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酵素タンパク質が熱安定性である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
複数の反応環境で同時に複数の配列決定反応を実施する、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無機ピロホスファターゼ酵素を精製および使用するためのシステム、方法、試薬およびキットを提供する。より具体的には、本発明は、無機ピロホスファターゼ酵素の効率的な単離、ならびに核酸の増幅および配列決定方法におけるそれの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの増幅および配列決定方策は、新たに合成された核酸分子にヌクレオチド種を付加するためにポリメラーゼ酵素を用いる。ポリメラーゼが取り込む各ヌクレオチド種について、ピロホスフェート分子（一般にＰＰｉとも呼ばれる）および水素分子が環境中へ放出されることは認識されている。これは、ごく小さな反応環境を用いる増幅および配列決定方策においてきわめて重要な考慮事項である可能性がある；ポリメラーゼによる多数の取込み事象にわたってＰＰｉ分子が環境に蓄積し、ポリメラーゼがヌクレオチド種を取り込む能力に対してＰＰｉが阻害作用をもつ濃度に達するからである。
【０００３】
さらに、ＰＰｉの放出を検出する能力に依存する配列決定方法がある。たとえば、放出されたＰＰｉの相対量またはＰＰｉ濃度の変化の測定を採用して、鋳型分子中のある配列位置のヌクレオチド種に相補的であるヌクレオチド種の取込みの指標とすることができる。この検出または測定の様式は、反応環境のｐＨの変化、または取り込まれた各ヌクレオチド分子につき光子を発生する酵素カスケードによるもの（一般に“ピロシーケンシング(pyrosequencing)”と呼ばれる）を含めることができる。本発明の例では、測定されたＰＰｉの量は取り込まれたヌクレオチド分子の数に正比例するので、本明細書に記載する配列決定方策については、あるヌクレオチド導入工程（すなわち、後記にさらに考察するヌクレオチドフロー）で検出されたＰＰｉはその工程でその特定のヌクレオチドの取込みから放出された結果であって前の工程からの残留分子ではないということがきわめて重要である。
【０００４】
したがって、前記の増幅および配列決定の状況では、ＰＰｉの濃度を低下させるかまたはそれを反応環境から完全に除くための方策がきわめて望ましい。一般に、これはＰＰｉ分子と反応して特異的に分解するＰＰｉ−ａｓｅ酵素の使用により達成できる。これまでに同定された型の単離ＰＰｉ−ａｓｅ酵素試薬にはテルモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)細菌に由来する種が含まれ、これはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（ＮＥＢとも呼ばれる，マサチュセッツ州イプソビッチ）から入手できる。しかし、増幅および配列決定方策に使用するために望ましい特性を示す、さらに他の単離されたＰＰｉ−ａｓｅ試薬種がなお求められている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の態様は、核酸配列の決定に関する。より具体的には、本発明の態様は、sequencing by synthesis（合成による配列決定法）（ＳＢＳ）によって核酸を配列決定する際に得られるデータのエラーを補正する方法およびシステムに関する。
【０００６】
Ａａｅピロホスファターゼタンパク質をコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または３の核酸を含む態様の核酸を記載する。好ましい態様において、核酸はＨｉｓタグをコードする。さらに好ましい態様において、核酸はＢＣＣＰビオチニル化部位をコードする。
【０００７】
さらに、単離したピロホスファターゼタンパク質を用いる配列決定方法の態様であって、アクイフェックス・エオリカス(Aquifex aeolicus)種に由来するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または４の酵素タンパク質を含む反応環境で配列決定反応を実施する工程を含み、その際、酵素タンパク質がピロホスファターゼ活性を含む方法を提供する。好ましい態様において、酵素タンパク質をビーズに結合させる。さらに好ましい態様において、酵素タンパク質をビオチン連結によりビーズに結合させる。よりさらに好ましい態様において、インビボプロセスによりビオチンを作動可能な状態でタンパク質にカップリングさせる。よりさらに好ましい態様において、酵素タンパク質は熱安定性である。よりさらに好ましい態様において、複数の反応環境で同時に複数の配列決定反応を実施する。
【０００８】
上記の態様および実施形態は必ずしも包括的または相互排他的ではなく、それらが同一または異なる態様または実施形態に関連して提示されるかどうかにかかわらず、矛盾しない様式および他の可能ないずれかの様式で組み合わせることができる。ある態様または実施形態の記載は、他の態様および／または実施形態に関する限定とするためのものではない。同様に、本明細書のいずれかの箇所に記載するいずれか１以上の機能、工程、操作、または手法を、別の実施形態において、発明の概要に記載するいずれか１以上の機能、工程、操作、または手法と組み合わせることができる。したがって、前記の態様および実施形態は限定ではなく説明のためのものである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
上記およびさらに他の特徴は、添付の図面と合わせて考慮すると、以下の詳細な記載から、より明らかに認識されるであろう。図面において、同様な参照番号は同様な構造、構成部品、または工程を示し、参照番号の最も左の数字はその参照構成部品が最初に現われる図面の番号を示す（たとえば、構成部品１６０は最初に図１に現われる）。ただし、これらの取決めはすべて、限定ではなく例示または説明のためのものである。
【図１】図１は、コンピューター制御下にある配列決定機器および反応支持体の１態様の機能ブロック図である。
【図２】図２は、アクイフェックス・エオリカスピロホスファターゼ融合分子の１態様の略図例である。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、１態様のテルモコッカス・リトラリスのおよび１態様のアクイフェックス・エオリカスのＰＰｉ−ａｓｅ酵素の活性レベルを比較した略図例である。
【図４】図４は、１態様のアクイフェックス・エオリカスＰＰｉ−ａｓｅが示す熱安定性の略図例である。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ビーズに結合した１態様のテルモコッカス・リトラリスおよび１態様のアクイフェックス・エオリカスのＰＰｉ−ａｓｅ酵素を用いて、ビーズ上の大腸菌(E. coli)から得た配列決定結果を比較した略図例である。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ビーズに結合した１態様のテルモコッカス・リトラリスおよび１態様のアクイフェックス・エオリカスのＰＰｉ−ａｓｅ酵素を用いて、ビーズ上のカンピロバクター-ジェジュニ(C. jejuni)から得た配列決定結果を比較した略図例である。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ビーズに結合した１態様のテルモコッカス・リトラリスおよび１態様のアクイフェックス・エオリカスのＰＰｉ−ａｓｅ酵素を用いて、ビーズ上のサーマス・サーモフィラス(T. thermophilus)から得た配列決定結果を比較した略図例である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
より詳細に以下に記載するように、本明細書に記載する発明は、アクイフェックス・エオリカス細菌に由来するＰＰｉ−ａｓｅの単離した核酸配列、タンパク質配列、および／または精製のための製品、発現系、方法およびキット、ならびに使用を含む。特に、本発明の態様は、ＰＰｉ−ａｓｅ酵素をコードする単離したＰＰｉ−ａｓｅ核酸配列、ならびにそれから誘導した、精製および／またはビオチニル化などの処理工程を可能にしかつ核酸鋳型分子の増幅およびハイスループット核酸配列決定方法における使用に特に有用な１以上のエレメントを含む融合配列に関する。
【００１１】
ａ．全般
用語“フローグラム(flowgram)”は、一般にＳＢＳ法、特にピロホスフェートに基づく配列決定方法（“ピロシーケンシング”とも呼ばれる）により得られた配列データを図示したものを表わし、より具体的には“ピログラム(pyrogram)”と呼ぶことができる。
【００１２】
本明細書中で用いる用語“読み”または“配列の読み”は、一般に単一の核酸鋳型分子または複数の実質的に同一コピーの核酸鋳型分子の集団から得られた全配列データを表わす。
【００１３】
本明細書中で用いる用語“行程(run)”または“配列決定行程(sequencing run)”は、１以上の鋳型核酸分子の配列決定操作中に行なわれる一連の配列決定反応を表わす。
本明細書中で用いる用語“フロー(flow)”は、一般に、鋳型核酸分子を含む環境への一連のまたは反復したサイクルでの溶液の添加を表わし、その際、溶液は未完成分子に付加するためのヌクレオチド種、あるいは他の試薬、たとえば緩衝液もしくは酵素であって配列決定反応に使用できるかまたは前のフローサイクルからのヌクレオチド種のキャリーオーバーもしくはノイズ作用を減らすために使用できるものを含有することができる。
【００１４】
本明細書中で用いる用語“フローサイクル”は、一般に、連続した一連のフローを表わし、その際、あるヌクレオチド種はそのサイクルを一回通過する（すなわち、フローサイクルはＴ、Ａ、Ｃ、Ｇのヌクレオチド種を順に連続添加することを含むが、他の配列組合わせもこの定義の一部とみなされる）。一般に、フローサイクルはサイクル毎に同じシーケンスのフローをもつ反復サイクルである。
【００１５】
本明細書中で用いる用語“読取り長さ”は、一般に、信頼性をもって配列決定できる鋳型分子の長さの上限を表わす。システムおよび／または方法の読取り長さに関与する多数の要因があり、これには鋳型核酸分子のＧＣ含有度が含まれるが、これに限定されない。
【００１６】
本明細書中で用いる用語“検定フラグメント(test fragment)”または“ＴＦ”は、一般に、既知の配列組成をもつ核酸エレメントであって、品質管理、検量、または他の関連目的に使用できるものを表わす。
【００１７】
本明細書中で用いる用語“プライマー”は、一般に、適宜な緩衝液中で適切な温度においてある核酸鎖に相補的なプライマー延長生成物の合成が誘導される条件下で、ＤＮＡ合成の開始点として作用するオリゴヌクレオチドを表わす。プライマーは、好ましくは一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。
【００１８】
本明細書中で用いる用語“未完成分子(nascent molecule)”は、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、鋳型分子中の対応するヌクレオチド種に相補的なヌクレオチド種の取込みによって延長されつつあるＤＮＡ鎖を表わす。
【００１９】
本明細書中で用いる用語“鋳型核酸”、“鋳型分子”、“標的核酸”、または“標的分子”は、一般に、配列決定反応の対象であってそれから配列のデータまたは情報が得られる核酸分子を表わす。
【００２０】
本明細書中で用いる用語“ヌクレオチド種”は、一般に、未完成核酸分子に一般的に取り込まれるプリン類（アデニン、グアニン）およびピリミジン類（シトシン、ウラシル、チミン）を含めた核酸モノマーの素性を表わす。
【００２１】
本明細書中で用いる用語“モノマー反復配列”または“ホモポリマー”は、一般に、同一ヌクレオチド種を含む２以上の配列位置（すなわち、反復ヌクレオチド種）を表わす。
本明細書中で用いる用語“均一延長”は、一般に、実質的に同一の鋳型分子の集団の各メンバーがその反応で均一に同じ延長工程を行なっている延長反応の関係または時期を表わす。
【００２２】
本明細書中で用いる用語“完成効率”は、一般に、そのフローに際して適正に延長した未完成分子のパーセントを表わす。
本明細書中で用いる用語“不完全延長率”は、一般に、すべての未完成分子の数に対する適正に延長できない未完成分子の数の比率を表わす。
【００２３】
本明細書中で用いる用語“ゲノムライブラリー”または“ショットガンライブラリー”は、一般に、生物または個体の全ゲノム（すなわち、ゲノムの全領域）に由来する、および／または全ゲノムを提示する、分子集合体を表わす。
【００２４】
本明細書中で用いる用語“アンプリコン”は、一般に、選択された増幅生成物、たとえばポリメラーゼ連鎖反応法またはリガーゼ連鎖反応法から生成したものを表わす。
本明細書中で用いる用語“変異体(variant)”または“対立遺伝子”は、一般に、それぞれが類似の配列組成をコードするけれども互いにある程度の相異をもつ複数の種のうちのいずれかを表わす。この相異には、当業者に既知であるいずれかのタイプの遺伝子変異を含めることができ、これには多型、たとえば一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入または欠失（挿入／欠失(insertion/deletion)事象の組合わせは“インデル（挿入／欠失）(indel)”とも呼ばれる）、反復配列（タンデムリピートとも呼ばれる）数の相異、および構造変異が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書中で用いる用語“対立遺伝子頻度(allele frequencyまたはallelic frequency)”は、一般に、集団中の全変異体のうち特定の変異体から構成される割合を表わす。
本明細書中で用いる用語“鍵配列”または“キーエレメント”は、一般に、鋳型核酸分子に既知のロケーションで（すなわち、一般にライゲートしたアダプターエレメント中に含まれる）付随する既知の配列組成を含む核酸配列エレメント（一般に、約４つの配列位置、すなわちＴＧＡＣ、または他の組合わせのヌクレオチド種）であって、鋳型分子から得られる配列データについての品質管理基準として用いられるものを表わす。その配列データが適正ロケーションにあるキーエレメントに付随する既知の配列組成を含むならば、それは品質管理に合格する。
【００２６】
本明細書中で用いる用語“キーパス(keypass)”または“キーパスウェル(keypass well)”は、一般に、反応ウェルにおける既知の配列組成をもつ全長核酸検定配列（すなわち、前記に述べた“検定フラグメント”または“ＴＦ”）の配列決定を表わし、その際、ＴＦ配列および／またはＴＦ配列に付随する鍵配列に由来する配列、あるいは標的核酸に付随するアダプター中の配列の精度を、ＴＦおよび／または鍵の既知の配列組成と比較し、そしてその配列決定の精度の尺度として、また品質管理のために用いる。一般的な態様において、配列決定行程中のウェルの総数のうちある割合がキーパスウェルであり、それらはある態様において分散した領域にあってもよい。
【００２７】
本明細書中で用いる用語“平滑末端”は、当業者の理解と一致して解釈され、一般に一対の相補的ヌクレオチド塩基種で終わる線状二本鎖核酸分子を表わし、その際、一対の平滑末端は一般に互いにライゲーションに適合する。
【００２８】
本明細書中で用いる用語“粘着末端”または“オーバーハング”は、当業者の理解と一致して解釈され、一般に、分子の一方の鎖の末端に１以上の非対合ヌクレオチド種をもつ線状二本鎖核酸分子を表わし、その際、非対合ヌクレオチド種はいずれかの鎖に存在し、単一の塩基位置または複数の塩基位置を含む（時には“付着末端”とも呼ばれる）。
【００２９】
本明細書中で用いる用語“ＳＰＲＩ”は、当業者の理解と一致して解釈され、一般に、特許権をもつ技術用語“Solid Phase Reversible Immobilization（固相可逆固定化）”を表わし、その場合、標的核酸は特定の緩衝液条件下でビーズの存在下において選択的に沈殿し、それらのビーズはしばしばカルボキシル化されており、かつ常磁性である。沈殿した標的核酸はビーズに固定化されており、オペレーターの要望に従って溶離用緩衝液により除去されるまで結合したままである(DeAngelis, Margaret M. et al: Solid-Phase Reversible Immobilization for the Isolation of PCR Products. Nucleic Acids Res (1995), Vol. 23:22; 4742-4743)。
【００３０】
本明細書中で用いる用語“カルボキシル化”は、当業者の理解と一致して解釈され、一般に、物質、たとえばマイクロ粒子を少なくとも１つのカルボキシル基の付加により修飾することを表わす。カルボキシル基はＣＯＯＨまたはＣＯＯ−である。
【００３１】
本明細書中で用いる用語“常磁性”は、当業者の理解と一致して解釈され、一般にその材料の磁性が外部印加磁界の存在下でのみ生じ、外部印加磁界が除かれると磁化作用が全く残留しない材料特性を表わす。
【００３２】
本明細書中で用いる用語“ビーズ”または“ビーズ支持体”は、一般に、いずれかのタイプのマイクロ粒子を表わし、その際、用語“マイクロ粒子”は、不規則または規則的な形状をもついずれか好都合なサイズのいずれかの材料を表わし、それは任意数の既知材料、たとえば下記のものから作成される：セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドのコポリマー、ジビニルベンゼンなどと架橋したポリスチレン(たとえば、Merrifield, Biochemistry 1964, 3, 1385-1390に記載)、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、ケイ素、プラスチック、ニトロセルロース、天然スポンジ、シリカゲル、制御多孔ガラス、金属、架橋デキストラン(たとえば、Sephadex（商標）)、アガロースゲル(Sepharose（商標）)、および当業者に既知である他の固相ビーズ支持体。
【００３３】
本明細書中で用いる用語“反応環境”は、一般に、反応を行なうことができるある体積の空間を表わし、一般にそこに反応体を少なくとも一時的に収容または拘束して、少なくとも１種類の反応生成物を検出することができる。反応環境の例にはキュベット、チューブ、ボトル、および平面または非平面支持体上の１以上の窪み、ウェルまたはチャンバーが含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
試料の調製および処理、配列データの作成、および配列データの分析に関連するシステムおよび方法の若干の例示態様を全般的に以下に記載する；それらの一部または全部を、本明細書に記載する発明の態様に使用できる。特に、鋳型核酸分子の調製、鋳型分子の増幅、標的特異的アンプリコンおよび／またはゲノムライブラリーの作成のためのシステムおよび方法の例示態様、配列決定の方法および機器、ならびにコンピューターシステムを記載する。
【００３５】
一般的な態様において、実験試料または診断試料に由来する核酸分子を、それの原型から調製および処理して、ハイスループット配列決定法に適応する鋳型分子にすべきである。処理方法が用途毎に異なり、その結果、種々の特性を含む鋳型分子が得られるという可能性がある。たとえば、ハイスループット配列決定法のある態様において、少なくとも特定の配列決定法によって精確に配列データが得られる長さに匹敵する配列または読取り長さをもつ鋳型分子を作成することが好ましい。本発明の例には、約２５〜３０塩基対、約５０〜１００塩基対、約２００〜３００塩基対、約３５０〜５００塩基対、約５００〜１０００塩基対の範囲、１０００塩基対より長いもの、または特定の配列決定用途に適合する他の長さを含むことができる。ある態様において、当業者に既知である多数の方法を用いて、ゲノム試料などの試料に由来する核酸をフラグメント化する。好ましい態様において、核酸をランダムにフラグメント化する（すなわち、特定の配列または領域を選択しない）方法には、ネブライゼーション法またはソニケーション法と呼ばれるものを含めることができる。しかし、他のフラグメント化方法、たとえば制限エンドヌクレアーゼを用いる消化をフラグメント化の目的に採用できることは認識されるであろう。同様に本発明の例において、ある処理方法では希望する長さの核酸フラグメントを選択的に単離するために当技術分野で既知のサイズ選択法を採用できる。
【００３６】
同様に、ある態様においては追加の機能性エレメントをそれぞれの鋳型核酸分子と関連づけることが好ましい。これらのエレメントは多様な機能を得るために使用でき、下記のものを含むが、これらに限定されない：増幅および／または配列決定方法のためのプライマー配列、品質管理エレメント（すなわち、たとえばキーエレメントまたは他のタイプの品質管理エレメント）、起源試料もしくは患者試料との種々の関連性をコードするユニーク識別子（多重識別子(multiplex identifier)または“ＭＩＤ”とも呼ばれる）、または他の機能性エレメント。
【００３７】
たとえば、本発明のある態様は、既知の同定可能な配列組成をもつ１以上の態様のＭＩＤエレメントを試料と関連づけ、その態様のＭＩＤエレメントを関連試料に由来する鋳型核酸分子とカップリングさせることを含む。多数の異なる試料に由来するＭＩＤカップリングした鋳型核酸分子をプールして単一の“多重”試料または組成物とし、それを次いで効率的に処理して、ＭＩＤカップリングした鋳型核酸分子それぞれについて配列データを得ることができる。鋳型核酸分子それぞれについての配列データを逆たたみ込みして(de-convoluted)、カップリングしたＭＩＤエレメントの配列組成を同定し、起源試料との関連性を同定する。本発明の例において、多重組成物は約３８４の試料、約９６の試料、約５０の試料、約２０の試料、約１６の試料、約１２の試料、約１０の試料、または他の数の試料からの代表例を含むことができる。研究に関して、各試料を、種々の実験条件、処理法で、種々の種、または個体と関連づけることができる。同様に、診断に関して、各試料を、種々の組織、細胞、個体、条件、薬物または他の処理法と関連づることができる。以上に挙げた多数の試料は例示のためのものであって限定とみなすべきでないことは当業者に認識されるであろう。
【００３８】
好ましい態様において、各ＭＩＤエレメントの配列組成は容易に同定でき、配列決定プロセスから導入されるエラーを阻止できる。ＭＩＤエレメントのある態様は、天然に存在する配列に対して最小の配列類似性をもつユニークな配列組成の核酸種を含む。あるいは、ＭＩＤエレメントの態様は、天然に存在する配列に対してある程度の配列類似性を含んでもよい。
【００３９】
同様に好ましい態様において、ある特徴をもつ鋳型核酸分子および／または鋳型分子にカップリングしたアダプターエレメントに対する各ＭＩＤの位置が既知である。各ＭＩＤの位置が既知であることは、配列データ中にＭＩＤエレメントを見出して、エラーの可能性についてそのＭＩＤ配列組成を解釈し、その後に起源試料と関連づけるために有用である。
【００４０】
たとえば、ＭＩＤエレメントに対する位置関係に関する手掛かりとして有用なある特徴には、鋳型分子の長さ（すなわち、ＭＩＤエレメントは５’または３’末端からどの位の配列位置にあるかが分かっている）、認識できる配列マーカー、たとえばＭＩＤエレメントに隣接するキーエレメントおよび／または１以上のプライマーエレメントを含めることができるが、これらに限定されない。本発明の例において、キーエレメントおよびプライマーエレメントは一般に多重組成物において試料毎に変動しない既知の配列組成を含み、ＭＩＤエレメントを探査するための位置基準として採用できる。アプリケーション１３５により実現した分析アルゴリズムをコンピューター１３０上で実行して、ＭＩＤカップリングした鋳型それぞれについて得られた配列データを分析し、より容易に認識できるキーエレメントおよび／またはプライマーエレメントを同定し、それらの位置から補外してＭＩＤエレメントの配列を含むと推定される配列領域を同定することができる。アプリケーション１３５は次いでこの推定領域およびおそらくフランキング領域内のある距離の配列組成を処理して、ＭＩＤエレメントおよびそれの配列組成を確実に同定することができる。
【００４１】
前記の機能性エレメントの一部または全部を組み合わせてアダプターエレメントにし、これらを特定の処理工程でヌクレオチド配列にカップリングさせることができる。たとえば、ある態様は、増幅および／または配列決定のために用いるプライマー配列に相補的な配列組成を含むプライミング配列エレメントまたは領域を会合させることができる。さらに、この同じエレメントを、“鎖選択(strand selection)”と呼ぶことができるもの、および固相支持体への核酸分子の固定化のために採用できる。ある態様において、２組のプライミング配列領域（以下、プライミング配列Ａ、およびプライミング配列Ｂと呼ぶ）を鎖選択に使用でき、その場合、１コピーのプライミング配列Ａおよび１コピーのプライミング配列Ｂをもつ一本鎖のみを選択し、生成試料として含めることができる。別態様において、アダプターエレメントのデザイン特性により鎖選択の必要性が除かれる。同じプライミング配列領域を増幅および固定化のための方法に採用でき、その場合、たとえばプライミング配列Ｂを固相支持体に固定化し、増幅生成物をそれから延長させることができる。
【００４２】
フラグメント化、鎖選択、ならびに機能性エレメントおよびアダプターの付加のための試料処理の他の例は、下記に記載されている：U.S. Patent Application Serial No. 10/767,894, 表題“Method for preparing single-stranded DNA libraries”, 2004年1月28日出願; U.S. Patent Application Serial No. 12/156,242, 表題“System and Method for Identification of Individual Samples from a Multiplex Mixture”, 2008年5月29日出願;およびU.S. Patent Application Serial No. 12/380,139, 表題“System and Method for Improved Processing of Nucleic Acids for Production of Sequencable Libraries”, 2009年2月23日出願。
【００４３】
鋳型核酸分子の増幅を実施して実質的に同一コピーの集団を作成するためのシステムおよび方法の種々の例を記載する。１以上のヌクレオチド種を鋳型分子のコピーと会合した未完成分子それぞれに取り込ませる際に、より強い信号を発生させるためには、ＳＢＳのある態様において核酸エレメントそれぞれの多数コピーを作成するのが望ましいことは当業者に認識されるであろう。核酸分子のコピーを作成するための当技術分野で既知の多数の手法がある：たとえば、細菌ベクターと呼ばれるものを用いる増幅法、“Rolling Circle（ローリングサークル）”増幅法(U.S. Patent No. 6,274,320および7,211,390に記載)、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法；これらの手法をそれぞれ本発明に使用するために適用できる。ハイスループット用途に特に適応するＰＣＲ法には、エマルジョンＰＣＲ法と呼ばれるもの（ｅｍＰＣＲ（商標）法とも呼ばれる）が含まれる。
【００４４】
エマルジョンＰＣＲ法の代表的態様は、２種類の非混和性物質の安定なエマルジョンを調製して、その中で反応を行なわせることができる水性液滴を形成することを含む。特に、ＰＣＲ法における使用に適応するエマルジョンの水性液滴は、第１流体、たとえば水性流体が液滴として（不連続相とも呼ばれる）、他の流体、たとえば疎水性流体（連続相とも呼ばれる）（一般に、あるタイプの油を含む）内に懸濁または分散したものを含むことができる。使用できる油の例には、鉱油、シリコーン系の油、またはフッ素化された油が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
さらに、ある態様のエマルジョンはエマルジョンを安定化する作用をもつ界面活性剤を使用でき、これはＰＣＲなど特定の処理方法に特に有用である。ある態様の界面活性剤には、１種類以上のシリコーンまたはフッ素化された界面活性剤を含めることができる。たとえば１種類以上の非イオン界面活性剤を使用でき、これには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ（商標）８０とも呼ばれる）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（商標）８０とも呼ばれる）、またはある好ましい態様においては、ジメチコンコポリオール(dimethicone copolyol)（Ａｂｉｌ（登録商標）ＥＭ９０とも呼ばれる）、ポリシロキサン、ポリアルキルポリエーテルコポリマー、ポリグリセロールエステル、ポロキサマー(poloxamer)類、およびＰＶＰ／ヘキサデカンコポリマー（Ｕｎｉｍｅｒ  Ｕ−１５１とも呼ばれる）、またはより好ましい態様においては、シクロペンタシロキサン中の高分子量シリコーンポリエーテル（ＤＣ  ５２２５Ｃとも呼ばれ、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇから入手できる）。
【００４６】
エマルジョンの液滴は、コンパートメント、マイクロカプセル、マイクロリアクター、微小環境、または関連技術分野で一般に用いられる他の名称でも呼ぶことができる。水性液滴は、エマルジョンの成分または組成物の組成、それに収容される内容物、および採用する調製法に応じたサイズ範囲にあってよい。前記エマルジョンは、その中で化学反応、たとえばＰＣＲを実施できる微小環境を形成する。たとえば、希望するＰＣＲ反応を実施するのに必要な鋳型核酸およびすべての試薬をエマルジョンの液滴内に封入し、化学的に隔離することができる。ある態様においては追加の界面活性剤または安定剤を用いて、前記の液滴の安定性をさらに増強することができる。液滴を用いてＰＣＲ法に一般的なサーモサイクリング操作を実行し、封入された核酸鋳型を増幅して、多数の実質的に同一の鋳型核酸のコピーを含む集団を作成することができる。ある態様において、液滴内の集団を“クローン隔離された”、“コンパートメント化された”、“封鎖された”、“封入された”、または“局在化した”集団と呼ぶことができる。同様に本発明の例において、前記の液滴の一部または全部はさらに、鋳型および鋳型の増幅コピー、鋳型に相補的な増幅コピー、またはその組合わせを付着させるための、ビーズなどの固体支持体を封入することができる。さらに固体支持体は、他のタイプの核酸、試薬、標識、または関係する分子を付着できるようにすることができる。
【００４７】
本明細書に記載する発明に有用なエマルジョンの態様は、きわめて高い密度の液滴またはマイクロカプセルを含むことができ、前記の化学反応を多量に並行して実施できる。増幅のために使用するエマルジョンの他の例および配列決定用途のためのそれらの使用は、U.S. Patent No. 7,638,276; 7,622,280; 7,842,457; および7,927,797に記載されている。
【００４８】
時にUltra-Deep Sequencing（ウルトラディープシーケンシング）と呼ばれる、配列決定のための標的特異的アンプリコンを作成する態様も本明細書に記載する発明に使用でき、これは、標的核酸を含む試料に由来する選択した標的領域（単数または複数）を増幅するための一組の特異的核酸プライマーの使用を含む。さらに試料は、研究または診断上の有用性を伴う配列組成を含む配列バリアントを含むことが分かっているかまたはその疑いがある核酸分子の集団を含有してもよく、その場合、プライマーを用いてその試料中の配列バリアント増幅してその分布を洞察することができる。たとえば、核酸試料中の多数の対立遺伝子を特異的に増幅して配列決定することにより配列バリアントを同定するための方法を実施できる。関係する領域を囲む領域またはその核酸集団に共通のセグメントを増幅するように設計された一対のＰＣＲプライマーにより、核酸をまず増幅する。その後、ＰＣＲ反応の生成物（第１アンプリコン）をそれぞれ個々に別個の反応器、たとえば前記のエマルジョンに基づく反応器内で、さらに増幅する。それぞれ第１アンプリコン集団の１メンバーに由来する生成アンプリコン（本明細書中で第２アンプリコンと呼ぶ）を配列決定し、この配列集合体を用いて、存在する１以上のバリアントの対立遺伝子頻度を決定することができる。重要なことに、この方法は存在するバリアントの予備知識を必要とせず、一般に核酸分子の集団中に＜１％の頻度で存在するバリアントを同定することができる。
【００４９】
前記の標的特異的な増幅および配列決定法がもつある利点には、これまでに達成されたものより高いレベルの感度が含まれる。さらに、ハイスループット配列決定機器を用いる態様、たとえば４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが提供するＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ（登録商標）アレイ（時には、ＰＴＰ（商標）プレートまたはアレイとも呼ばれる）のウェルと呼ばれるものを用いる態様では、前記の方法を用いて、行程または実験当たり１００，０００以上、３００，０００以上、５００，０００以上、または１，０００，０００以上の核酸領域について配列組成を得ることができ、これは少なくとも一部はユーザーの好み、たとえばガスケットなどの使用により可能になるレーン構造(lane configuration)に依存するであろう。また前記の方法は、対立遺伝子バリアントが１％以下であってもよい低い存在度の対立遺伝子を検出する感度を提供する。前記方法の他の利点には、分析領域の配列を含むデータが得られることが含まれる。重要なことに、分析される遺伝子座の配列の予備知識をもつ必要がない。
【００５０】
配列決定のための標的特異的アンプリコンの他の例は、下記に記載されている：U.S. Patent Application Serial No. 11/104,781 , 表題“Methods for determining sequence variants using ultra-deep sequencing”, 2005年4月12日出願; PCT Patent Application Serial No. US 2008/003424, 表題“System and Method for Detection of HIV Drug Resistant Variants”, 2008年3月14日出願;およびU.S. Patent No. 7,888,034, 表題“System and Method for Detection of HIV Tropism Variants”, 2009年6月17日出願。
【００５１】
さらに、配列決定の態様は、サンガー(Sanger)タイプの方法、一般にSequencing by Hybridization（ハイブリダイゼーションによる配列決定法）（ＳＢＨ）、Sequencing by Ligation（ライゲーションによる配列決定法）（ＳＢＬ）、またはSequencing by Incorporation（取込みによる配列決定法）（ＳＢＩ）と呼ばれるものを含むことができる。さらに、配列決定法にはポロニー(polony)配列決定法；ナノポア、導波路、および他の単分子検出法；または可逆ターミネーター法を含めることができる。前記に述べたように、好ましい手法にはSequencing by Synthesis法（合成による配列決定法）を含めることができる。たとえば、あるＳＢＳ態様は、実質的に同一の核酸鋳型のコピーの集団を配列決定し、一般に試料鋳型分子の予め定めた相補的位置にアニールするように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプライマー、または鋳型分子に付着した１以上のアダプターを用いる。このプライマー／鋳型複合体に、核酸ポリメラーゼ酵素の存在下でヌクレオチド種を提示する。そのヌクレオチド種がオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に隣接する試料鋳型分子上の配列位置に対応する核酸種に相補的であれば、ポリメラーゼはプライマーをそのヌクレオチド種で延長するであろう。あるいは、ある態様において、プライマー／鋳型複合体に複数の関係ヌクレオチド種（一般に、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ）を一度に提示すると、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に隣接する試料鋳型分子上の対応する配列位置に相補的であるヌクレオチド種が取り込まれる。上記のいずれの態様においても、それ以上の延長を阻止するためにヌクレオチド種を化学的にブロックすることができ（たとえば、３’−０の位置で）、そして次の合成ラウンドの前に脱ブロックする必要がある。未完成分子の末端にヌクレオチド種を付加するプロセスがプライマーの末端への付加について前記に述べたものと実質的に同じであることも認識されるであろう。
【００５２】
前記のように、ヌクレオチド種の取込みは、当技術分野で既知の多様な方法により、たとえば光を発生する酵素反応プロセスを用いてピロホスフェート（ＰＰｉ）の放出を検出することにより、またはｐＨ変化の検出により(U.S. Patent No. 6,210,891; 6,258,568;および6,828,100に記載された例)、またはヌクレオチドに結合した検出可能な標識により検出できる。検出可能な標識の若干例には、質量タグ、および蛍光または化学発光標識が含まれるが、これらに限定されない。一般的態様においては、取り込まれなかったヌクレオチドを、たとえば洗浄により除去する。さらに、ある態様においては、取り込まれなかったヌクレオチドを、酵素分解、たとえば下記に記載されるようにアピラーゼ(apyrase)またはピロホスファターゼ酵素を用いる分解で処理することができる：U.S. Patent Application Serial No. 12/215,455, 表題“System and Method for Adaptive Reagent Control in Nucleic Acid Sequencing”, 2008年6月27日出願;および12/322,284, 表題“System and Method for Improved Signal Detection in Nucleic Acid Sequencing”, 2009年1月29日出願。
【００５３】
検出可能な標識を用いる態様において、それらは一般に後続の合成サイクルの前に不活性化されなければならないであろう（たとえば、化学的開裂または光漂白）。鋳型／ポリメラーゼ複合体中の次の配列位置を、次いで前記のように関係する他のヌクレオチド種または複数のヌクレオチド種で問うことができる。ヌクレオチド付加、延長、信号取得、および洗浄の反復サイクルにより、鋳型鎖のヌクレオチド配列が決定される。信頼性のある検出に十分なほど強い信号を得るために、この例を継続して実質的に同一の多数の鋳型分子または集団（たとえば、１０３、１０４、１０５、１０６または１０７個の分子）をいずれか１つの配列決定反応で一般に同時に分析する。
【００５４】
さらに、ある態様においては、“対合末端(paired-end)”配列決定方策と呼ぶことができるものの採用により配列決定法の読取り長さの能力および質を改善することが有利な場合がある。たとえば、配列決定方法のある態様は、高品質かつ高信頼性の読みを得ることができる分子の全長に制限がある。言い換えると、高信頼性の読取り長さを得るための配列位置の総数は、採用する配列決定法の態様によっては２５、５０、１００、または５００塩基を超えない場合がある。対合末端配列決定方策は、各末端が中央でリンカー配列により連結して元の鋳型核酸分子のフラグメントを構成する分子の末端（時には“タグ”末端と呼ばれる）それぞれを個別に配列決定することによって、高信頼性の読取り長さを延長する。鋳型フラグメントの元の位置関係が既知であり、したがって配列読取りからのデータを再結合して、より長い高品質の読取り長さをもつ単一読みにすることができる。対合末端配列決定法の態様の他の例は、U.S. Patent No. 7,601 ,499, 表題“Paired end sequencing”;およびU.S. Patent Application Serial No. 12/322,119, 表題“Paired end sequencing”, 2009年1月28日出願に記載されている。
【００５５】
ＳＢＳ装置のある例は、前記方法の一部または全部を実行でき、１以上の検出デバイス、たとえば電荷結合デバイス（すなわち、ＣＣＤカメラ）または共焦点型アーキテクチャー、微小流体チャンバーもしくはフローセル、反応支持体、および／またはポンプおよび流動弁を含むことができる。ピロホスフェートに基づく配列決定法の例をとれば、ある装置の態様は、生じるバックグラウンドノイズのレベルが本来低い化学発光検出方策を採用できる。
【００５６】
ある態様において、配列決定のための反応支持体は平面支持体、たとえばスライド型支持体、イオン感応性電界効果トランジスタ(Ion-Sensitive Field Effect Transistor)（“ＩＳＦＥＴ”とも呼ばれる）、またはある態様においてはウェル型構造体から構成できる導波型反応支持体を含むことができる。さらに、反応支持体には前記のように４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できるＰＴＰ（商標）アレイと呼ばれるものを含めることができる；これは、実質的に同一の鋳型分子の集団をそれぞれが保持できる状態にした何百何千またはそれ以上のきわめて小さなウェルを得るために酸エッチングされた光ファイバーフェースプレートから形成される（すなわち、ある好ましい態様は、約３３０万個のウェルを７０×７５ｍｍのＰＴＰ（商標）アレイ上に３５μｍのウェル間ピッチで含む）。ある態様において、実質的に同一の鋳型分子の集団それぞれを、固体支持体、たとえばビーズ上に配置し、そのそれぞれを前記のウェルの１つに配置することができる。たとえば、ある装置は、流体試薬をＰＴＰプレートホルダーへ供給するための試薬送達素子、およびＰＴＰプレート上の各ウェルから放出される光の光子を集めることが可能なＣＣＤ型検出デバイスを含むことができる。信号認識を改善するための特性を含む反応支持体の例は、U.S. Patent No. 7,682,816, 表題“THIN-FILM COATED MICROWELL ARRAYS AND METHODS OF MAKING SAME”, 2005年8月30日出願に記載されている。ＳＢＳ型配列決定およびピロホスフェート配列決定を実施するための装置および方法の他の例は、U.S. Patent No. 7,323,305および7,575,865に記載されている。
【００５７】
さらに、１以上の試料調製プロセスを自動化するシステムおよび方法、たとえば前記のｅｍＰＣＲ（商標）法を採用できる。たとえば、自動システムを用いて、ｅｍＰＣＲ処理のためのエマルジョンを調製し、ＰＣＲサーモサイクリング操作を実施し、調製に成功した配列決定用の核酸分子集団を富化するための、効果的な解決策を得ることができる。自動試料調製システムの例は、U.S. Patent No. 7,927,797, 表題“Nucleic acid amplification with continuous flow emulsion”, 2005年1月28日出願に記載されている。
【００５８】
同様に、本明細書に記載する発明の態様のシステムおよび方法には、コンピューターシステムで実行するために記憶させたコンピューター可読媒体を用いるある種の設計、分析、または他の操作の実現を含めることができる。たとえば、ＳＢＳシステムおよび方法を用いて得られた検出信号を処理し、および／またはデータを分析するための幾つかの態様であって、処理および分析の態様をコンピューターシステムで実現できるものを、以下に詳細に記載する。
【００５９】
本明細書に記載する発明に使用するためのコンピューターシステムの例示態様は、いずれかの型のコンピュータープラットホーム、たとえばワークステーション、パーソナルコンピューター、サーバー、または他のいずれかの現在もしくは将来のコンピューターを含むことができる。ただし、本明細書に記載する上記のコンピュータープラットホームは本発明の特殊な操作を実施するために特別に構築され、汎用コンピューターとはみなされないことは、当業者に認識されるであろう。コンピューターは一般に、既知の構成部品、たとえばプロセッサー、オペレーティングシステム、システムメモリー、メモリー記憶デバイス、入出力コントローラー、入出力デバイス、およびディスプレーデバイスを含む。可能性のある多数のコンピューターの構造および構成部品があり、キャッシュメモリー、データバックアップユニット、および多数の他のデバイスを含むことができることも、業者に理解されるであろう。
【００６０】
ディスプレーデバイスには視覚情報を提供するディスプレーデバイスを含めることができ、この情報はピクセルのアレイとして一般に論理的および／または物理的に組織化できる。入出力インターフェースを提供するための多様な既知または将来のソフトウェアプログラムのいずれかを含むインターフェースコントローラーも含めることができる。たとえば、インターフェースには、１以上の図形表現をユーザーに提供する、一般に“図形ユーザーインターフェース(Graphical User Interface)”（しばしば、ＧＵＩと呼ばれる）と呼ばれるものを含むことができる。インターフェースは、一般に、当業者に既知の選択または入力の手段を用いたユーザー入力の受け入れが可能である。
【００６１】
同じまたは別の態様において、コンピューターのアプリケーションには、“コマンドラインインターフェース(command line interface)”（しばしば、ＣＬＩと呼ばれる）と呼ばれるものを含むインターフェースを採用できる。ＣＬＩは一般に、アプリケーションとユーザーの間のテキストに基づく対話を提供する。一般にコマンドラインインターフェースは、ディスプレーデバイスによるテキストのラインとして、出力を提示し、かつ入力を受け取る。たとえば、ある実現は、“シェル(shell)”と呼ばれるもの、たとえば当業者に既知のＵｎｉｘ  Ｓｈｅｌｌ、またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ．ＮＥＴフレームワークなどのオブジェクト指向型プログラミングアーキテクチャーを用いるＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｐｏｗｅｒｓｈｅｌｌを含むことができる。
【００６２】
インターフェースが１以上のＧＵＩ、ＣＬＦ、またはその組合わせを含むことができることは当業者に認識されるであろう。
プロセッサーには、市販のプロセッサー、たとえばＣｅｌｅｒｏｎ（登録商標）、Ｃｏｒｅ（商標）、またはＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）プロセッサー（Ｉｎｔｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）、ＳＰＡＲＣ（登録商標）プロセッサー（Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、Ａｔｈｌｏｎ（商標）、Ｓｅｍｐｒｏｎ（商標）、Ｐｈｅｎｏｍ（商標）、またはＯｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサー（ＡＭＤ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を含めることができ、あるいはそれは入手可能であるかまたは入手可能になるであろう他の１以上のプロセッサーであってもよい。プロセッサーのある態様には、多重コア(Multi-core)プロセッサーと呼ばれるもの、および／または単一もしくは多重コア構造で並列処理法の採用が可能なものを含めることができる。たとえば、多重コアアーキテクチャーは、一般に２以上のプロセッサー“実行コア(execution core)”を含む。この例では、それぞれの実行コアは多重スレッド(multiple thread)の並列実行を可能にする独立したプロセッサーとして作動できる。さらに、プロセッサーを一般に３２もしくは６４ビットアーキテクチャーと呼ばれるもの、または未知であるかもしくは将来開発される可能性のある他のアーキテクチャーの構成で構築できることは当業者に認識されるであろう。
【００６３】
プロセッサーは一般にオペレーティングシステムを実行し、これは、たとえば下記のものであってもよい：Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）型オペレーティングシステム（たとえば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＸＰ、Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｖｉｓｔａ（登録商標）、またはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）＿７）；Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．からのＭａｃ  ＯＳ  Ｘオペレーティングシステム（たとえば、Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘ  ｖｌ０．６  “Ｓｎｏｗ  Ｌｅｏｐａｒｄ”オペレーティングシステム）；多数の業者から入手できるＵｎｉｘ（登録商標）またはＬｉｎｕｘ型オペレーティングシステム、またはいわゆるオープンソースと呼ばれるもの；他の、または将来のオペレーティングシステム；あるいはその組合わせ。オペレーティングシステムは周知の様式でファームウェアおよびハードウェアとインターフェース接続し、多様なプログラミング言語で書き込むことができる各種コンピュータープログラムの機能をプロセッサーが協調して実行するのを容易にする。オペレーティングシステムは、一般にプロセッサーと協同で、コンピューターの他の構成部品の機能を協調して実行する。オペレーティングシステムは、スケジューリング、入出力制御、ファイルおよびデータの管理、メモリー管理、ならびにコミュニケーション制御および関連のサービスも、すべて既知の手法に従って提供する。
【００６４】
システムメモリーには、多様な既知または将来のメモリー記憶デバイスを含めることができる。例には、いずれかの一般的に入手できるランダムアクセスメモリー(random access memory)（ＲＡＭ）、磁気媒体、たとえば常駐ハードディスクもしくはテープ、光学媒体、たとえば読出し書込み型コンパクトディスク、または他のメモリー記憶デバイスが含まれる。メモリー記憶デバイスには多様な既知または将来のデバイスのいずれかを含めることができ、これにはコンパクトディスクドライブ、テープドライブ、着脱式ハードディスクドライブ、ＵＳＢもしくはフラッシュドライブ、またはディスケットドライブが含まれる。そのような型のメモリー記憶デバイスは、一般にプログラム記憶媒体（示していない）、たとえばそれぞれコンパクトディスク、磁気テープ、着脱式ハードディスク、ＵＳＢもしくはフラッシュドライブ、またはフロッピーディスケットから読み出し、および／またはそれに書き込む。これらのいずれかのプログラム記憶媒体、あるいは現在使用されているかまたは将来開発される可能性のある他のものは、コンピュータープログラムプロダクトとみなすことができる。自明のとおり、これらのプログラム記憶媒体は一般にコンピューターソフトウェアプログラムおよび／またはデータを記憶する。コンピューターソフトウェアプログラム（コンピューター制御ロジックとも呼ばれる）は、一般に、メモリー記憶デバイスと併せて使用されるシステムメモリーおよび／またはプログラム記憶デバイス中に記憶される。
【００６５】
ある態様において、制御ロジック（プログラムコードを含めたコンピューターソフトウェアプログラム）が記憶されたコンピューター使用可能媒体を含むコンピュータープログラムプロダクトを記載する。制御ロジックは、プロセッサーにより実行されると、本明細書に記載する機能をプロセッサーに行なわせる。他の態様において、ある機能は主にハードウェアで、たとえばハードウェア状態マシーン(hardware state machine)を用いて実現される。本明細書に記載する機能を行なうようにハードウェア状態マシーンを実現させることは、当業者に認識されるであろう。
【００６６】
入出力コントローラーは、ローカルまたはリモートのいずれであっても、ユーザー（ヒトまたはマシーンのいずれであっても）からの情報の受入れおよび処理のための多様な既知のデバイスを含むことができる。そのようなデバイスには、たとえばモデムカード、ワイヤレスカード、ネットワークインターフェースカード、サウンドカード、または既知の入力デバイスのいずれかのための他の型のコントローラーが含まれる。出力コントローラーには、ローカルまたはリモートのいずれであっても、ユーザー（ヒトまたはマシーンのいずれであっても）に情報を提示するための多様な既知のディスプレーデバイス用のコントローラーを含めることができる。本明細書に記載する態様において、コンピューターの機能素子はシステムバス(system bus)を介して相互にコミュニケートする。ある態様のコンピューターは、ネットワークまたは他の型のリモートコミュニケーションを利用して、ある機能素子とコミュニケートすることができる。
【００６７】
当業者に認識されるように、機器制御および／またはデータ処理アプリケーションは、ソフトウェアで実現する場合、システムメモリーおよび／またはメモリー記憶デバイスに装填してそれから実行することができる。機器制御および／またはデータ処理アプリケーションの全部または一部がメモリー記憶デバイスの読出し専用メモリーまたはこれに類するデバイス中にあってもよく、そのようなデバイスは機器制御および／またはデータ処理アプリケーションを最初に入出力コントローラーにより装填する必要がない。機器制御および／またはデータ処理アプリケーションあるいはその一部を、実行に有利なように、プロセッサーによって既知の様式でシステムメモリー、キャッシュメモリー、または両方に装填してもよいことは、当業者に理解されるであろう。
【００６８】
同様に、コンピューターは、システムメモリーに記憶された１以上のライブラリーファイル、実験データファイルおよびインターネットクライアントを含むことができる。たとえば、実験データは１以上の実験またはアッセイに関係するデータ、たとえば１以上のＳＢＳ実験またはプロセスに関連する検出信号値または他の数値を含むことができる。さらに、インターネットクライアントは、他のコンピューター上のリモートサービスにネットワークを利用してアクセスできるアプリケーションを含むことができ、たとえば一般に“ウェブブラウザー(Web Browser)”と呼ばれるものを含むことができる。本発明の例において、一般に採用されるあるウェブブラウザーには、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できるＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ８、Ｍｏｚｉｌｌａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＭｏｚｉｌｌａ  Ｆｉｒｅｆｏｘ（登録商標）３．６、Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．からのＳａｆａｒｉ  ４、Ｇｏｏｇｌｅ（商標）  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＧｏｏｇｌｅ  Ｃｈｒｏｍｅ、あるいは当技術分野で既知であるかまたは将来開発される他の型のウェブブラウザーが含まれる。同様に、同じまたは他の態様において、インターネットクライアントは、ネットワークを介してリモート情報にアクセスできる特殊なソフトウェアアプリケーション、たとえば生物学的アプリケーションのためのデータ処理アプリケーションの素子を含むことができ、あるいはそれであってもよい。
【００６９】
ネットワークには、当業者に周知の多種多様な型のネットワークのうち１以上を含めることができる。たとえば、ネットワークには、一般にＴＣＰ／ＩＰプロトコルスイートと呼ばれるものを用いてコミュニケートするための、ローカルまたは広域ネットワークを含めることができる。ネットワークには、一般にインターネットと呼ばれる世界共通の相互接続コンピューターネットワークシステムを含めることができ、あるいは各種のインターネットアーキテクチャーも含めることができる。ネットワーク接続環境にいるあるユーザーが一般に“ファイアウォール(firewall)”(時には、パケットフィルター(Packet Filter)またはボーダー保護デバイス(Border Protection Devices)とも呼ばれる)ものを用いてハードウェアおよび／またはソフトウェアシステムとの情報トラフィックを制御するのを好む場合があることも、当業者には認識されるであろう。たとえば、ファイアウォールはハードウェアもしくはソフトウェア素子またはその何らかの組合わせを含むことができ、一般にたとえばネットワーク管理者などのユーザーが導入したセキュリティーポリシーを実施するように設計される。
【００７０】
ｂ．本明細書に記載する発明の態様
前記のように、本明細書に記載する発明の態様は、アクイフェックス・エオリカス（時には“Ａａｅ”とも呼ばれる）ＰＰｉ−ａｓｅに関連する改良されたシステム、方法、およびキット、ならびにその使用に関する。アクイフェックス・エオリカスが一般に水温８５〜９５℃に達する可能性のある海底火山またはホットスプリング付近にみられる好熱性細菌であることは、当業者に認識されるであろう。アクイフェックス・エオリカスが産生する単離されたＰＰｉ−ａｓｅ酵素は、Hoeらにより記載され(Hyang-Sook Hoe, Hyun-Kyu Kim, Suk-Tae Kwon, Expression in Escherichia coli of the Thermostable Inorganic Pyrophosphatase from the Aquifex aeolicus and Purification and Characterization of the Recombinant Enzyme, Protein Expression and Purification, Vol 23, Issue 2, Nov 2001, Pages 242-248)、高い温度できわめて高いレベルの熱安定性および有効性を示した；これは、ＰＣＲおよび特定の配列決定用途に有利であることが一般に認められている形質である。本明細書に記載する発明は、アクイフェックス・エオリカスから単離されたＰＣＲおよび配列決定法に一般に用いられる温度で変性に耐えかつその温度で有意の酵素活性をもつＰＰｉ−ａｓｅ酵素をコードするヌクレオチド配列およびタンパク質配列を含む。そのタンパク質をさらに修飾するのを可能にし、および／または処理効率を改善する、１以上の追加の機能性エレメントを含む本発明の態様も記載する。
【００７１】
一般的な配列決定態様において、１以上のプロセス工程を自動化する１以上の機器素子を使用できる。たとえば、一部または全部のプロセス工程を自動化および実施するための機器を用いて、配列決定方法の態様を実行できる。図１は、配列決定機器１００の具体例を提示する；これは、光学信号の捕獲を必要とする配列決定プロセスについて、一般に、反応支持体１０５上で行なわれる配列決定反応の実行およびデータ取得のための光学サブシステムおよび流体サブシステムを含む。しかし、他のモードのデータ取得（すなわち、ｐＨ、温度、電気化学など）を必要とする配列決定プロセスには、そのモードのデータ取得のための当業者に既知のサブシステムを採用できることは認識されるであろう。たとえば、ユーザー１０１または何らかの自動化された態様が鋳型分子の試料を反応支持体１０５に装填し、次いで配列決定機器１００を用いて多量に並行様式で配列決定して、鋳型分子それぞれの配列組成を提示するデータを得ることができる。重要なことに、ユーザー１０１は独立した研究者、技術者、臨床医、大学、または共同体を含めた（これらに限定されない）いかなるユーザーも含むことができる。
【００７２】
配列決定プロセスを実行するために用いる配列決定機器１００の態様は、種々の流体成分を流体サブシステム中に、種々の光学構成部品を光学サブシステム中に含むことができ、また図１に示していない追加の構成部品を含むことができ、それには、ある機能のローカル制御のためのマイクロプロセッサーおよび／またはマイクロコントローラー構成部品を含めることができる。ある態様において、配列決定機器１００を用いる配列決定に必要な調製の一部または全部を実施するように構築された試料調製機器１８０を用いて、自動または部分自動方式で試料を配列決定用に任意に調製できる。さらに図１に示すように、配列決定機器１００を１以上の外付けコンピューター構成部品、たとえばコンピューター１３０に作動可能な状態で接続させることができ、これはたとえばシステムソフトウェアまたはファームウェア、たとえばアプリケーション１３５を実行でき、これは１以上の機器、たとえば配列決定機器１００もしくは試料調製機器１８０の指示制御、および／またはデータ分析機能を備えていてもよい。コンピューター１３０はさらに他のコンピューターまたはサーバーにネットワーク１５０を介して作動可能な状態で接続させることができ、これにより機器システムのリモート操作を可能にすることができ、かつ記憶および処理が可能なシステムへ大量のデータを送出することができる。本発明の例において、配列決定機器１００および／またはコンピューター１３０は、前記に全般的に述べた態様の構成部品および特性の一部または全部を含むことができる。
【００７３】
前記のように、本発明の１観点は、Ａａｅ  ＰＰｉ−ａｓｅをコードする核酸配列および対応するアミノ酸配列を含む。前記のように、ある態様において、酵素タンパク質の処理および単離を改善するための他の機能性エレメントを付加することも有利である。特に有用な方策は、インビボでの酵素タンパク質のビオチニル化を可能にするエレメントを含有させることである。核酸、タンパク質、基質などの目的要素を優先的に単離するためにビオチンがきわめて有用な分子生物学ツールであること、さらに、１以上のビオチンエレメントをタンパク質または核酸と会合させるために一般的にはインビトロに基づく方法が用いられ、それは本明細書に記載するインビボ法より一般に多くの処理工程を必要とし、したがってより効率が低いことは、当業者に認識されるであろう。ある態様において、ビオチンの使用は、標的分子、たとえばＡａｅ  ＰＰｉ−ａｓｅ酵素タンパク質を支持体に捕捉するために有用であり、これを複数の個々の反応環境を含む支持体、たとえば前記のＰＴＰ支持体上で実行される配列決定プロセスに使用できる。たとえば、ＪＳＲ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できるＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ  ＭＳ３００ストレプトアビジンコートしたビーズなどのビーズ支持体と相互作用させて結合させるために、Ａａｅ  ＰＰｉ−ａｓｅをビオチニル化することが好ましい。
【００７４】
しかし、ある用途についてビオチニル化が望ましくない場合があることは認識されるであろう。たとえば、前記のｅｍＰＣＲプロセスには、または配列決定フローサイクル中にフローに導入する試薬を使用するためには、ビオチニル化ＰＰｉ−ａｓｅを用いるのは望ましくない可能性がある。しかし、本発明の例において、ビオチニル化ＰＰｉ−ａｓｅ酵素をそれらのプロセスになお使用できる可能性はある。
【００７５】
インビボビオチニル化を可能にする１手段は、ビオチンカルボキシルキャリヤータンパク質(biotin carboxyl carrier protein)（ＢＣＣＰとも呼ばれる）ドメインを融合配列に取り込ませることにより達成できる。アフィニティーカラム（すなわち、Ｎｉ２＋アフィニティーカラムなど）を用いる“１工程”精製をさらに可能にする他のエレメント、たとえば６−ヒスチジン部分（Ｈｉｓタグとも呼ばれる）も含有させることができる。図２は、Ａａｅ  ＰＰｉ−ａｓｅと他の機能性エレメントの可能な１構造の具体例、たとえばＰＰｉ−ａｓｅ２０５、ＢＣＣＰ  ２０７、およびＨｉｓ  ２０９を提示する。たとえば、当業者に認識されるように、大腸菌によるインビボでのタンパク質の発現およびビオチニル化のための部位を提供するＢＣＣＰドメインの使用により、アフィニティータグを分子と会合させることができる。本発明の例において、Ａａｅ  ＰＰｉ−ａｓｅおよび会合した機能性エレメントをコードする核酸配列を含むプラスミドを大腸菌細胞内へ形質転換し、培地中で増殖させて、多数のコピーを産生させることができる。次いで細胞を収穫し、溶解し、Ｈｉｓタグを認識するアフィニティーカラムを用いて発現タンパク質を採集することができる。
【００７６】
ある態様において、ＢＣＣＰドメインは、単一の配列位置に生成タンパク質のビオチニル化を阻害する“点変異”をも含むことができる。たとえば、ＢＣＣＰドメインはリジンアミノ酸をアラニンに置き換える点変異を含むことができ、これはビオチニル化を阻止して、溶液相ＰＰｉ−ａｓｅの方が望ましい態様における使用に対してより適応するタンパク質を産生する。
【００７７】
図３Ａおよび３Ｂは、インビトロでビオチニル化したテルモコッカス・リトラリスＰＰｉ−ａｓｅの酵素活性をインビボでビオチニル化されたＡａｅ  ＰＰｉ−ａｓｅの態様と比較した具体例を提示する；その場合、ビーズ支持体に固定化したＡａｅ  ＰＰｉ−ａｓｅタンパク質の比活性は、ビーズ固定化したテルモコッカス・リトラリスＰＰｉ−ａｓｅタンパク質の比活性と同等またはそれ以上である。
【００７８】
本発明の態様は下記のうち１以上を含むことができる：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：Ａａｅ−ＢＣＣＰ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００７９】
【化１】
2013529896.tif 000003
【００８０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：Ａａｅ−ＢＣＣＰ融合タンパク質のアミノ酸配列。
【００８１】
【化２】
2013529896.tif 000004
【００８２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：Ａａｅ−ＢＣＣＰ変異体融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【００８３】
【化３】
2013529896.tif 000005
【００８４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：Ａａｅ−ＢＣＣＰ変異体融合タンパク質のアミノ酸配列。
【００８５】
【化４】
2013529896.tif 000006
【００８６】
前記のように、本明細書に記載するＡａｅ  ＰＰｉ−ａｓｅタンパク質のきわめて望ましい特性はそれの熱安定性であり、その例を図４に示す；その際、ビーズ支持体上に固定化されたＡａｅ  ＰＰｉ−ａｓｅを含む多数のウェル反応環境を含むアレイ支持体に、ＰＰｉを、光の発生のために要求される他の必要な反応体（たとえば、スルフリラーゼ、ＡＰＳ、ルシフェラーゼ、およびＤ−ルシフェリン）と共に導入した。図４の例に示されるように、固定化されたＡａｅ  ＰＰｉ−ａｓｅを含まない（すなわち、“無効”）ビーズは、２２６を超えるフローについて、固定化されたＡａｅ  ＰＰｉ−ａｓｅを含むビーズを４℃および７０℃でインキュベートしたものより有意に高い検出光信号を示した。言い換えると、固定化されたＡａｅ  ＰＰｉ−ａｓｅを高い温度でインキュベートしたものはそれの酵素活性を保持し、少なくとも２２６回は導入されたＰＰｉ−ａｓｅを効率的に分解し、したがって各フロー後には光の発生に利用されるＰＰｉが相対的に少なかった。
【００８７】
さらに、図５〜７は、ビーズ固定化したテルモコッカス・リトラリスおよびＡａｅ  ＰＰｉ−ａｓｅをＰＴＰアレイのウェル反応環境内で用いて、それぞれ異なる配列組成特性をもつ大腸菌（図５）、カンピロバクター−ジェジュニ（図６）、およびサーマス・サーモフィラス（図７）について得られた配列決定結果の具体例を提示する。数値はテルモコッカス・リトラリスに正規化したものであり（すなわち、テルモコッカス・リトラリスの数値は各カテゴリーにおいて１である）、それぞれの場合にＡａｅ  ＰＰｉ−ａｓｅがテルモコッカス・リトラリスＰＰｉ−ａｓｅと実質的に同じレベルの性能を提供することに注目するのが重要であることは当業者に認識されるであろう。
【００８８】
互いに近接した多数のウェル型反応環境を含むアレイ支持体においてビーズ結合したＡａｅ  ＰＰｉ−ａｓｅを使用する態様が、一般に、US Patent Application Serial No 12/322,284に記載されるようにウェル内でのＰＰｉ−ａｓｅ使用ではない態様よりウェル間ＰＰｉ反応生成物の拡散が少ないことことも、当業者に認識されるであろう。
【実施例】
【００８９】
実施例１−大腸菌におけるアクイフェックス・エオリカス由来の熱安定性無機ホスファターゼの発現
１日目：新たに形質転換した細胞の調製
ｐＲＳＥＴ−６ＨＩＳ−ＢＣＣＰ−ＡａｅプラスミドをｄＨ２Ｏ中に１００倍希釈し（たとえば、１μＬの原液プラスミド＋９９μＬの水）、次いで渦撹拌して溶液を混合した。Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ化学コンピテント細胞のチューブ３本を−８０℃から取り出して氷に乗せ、そこで１０分間、氷上融解させた。希釈したプラスミド（１μＬ）を２本のチューブに添加した。３本目のチューブは対照チューブであった。チューブを平面上で軽く叩き、氷上で３０分間インキュベートした。１．７ｍＬミクロ遠心チューブに適したホルダーを収容した熱ブロックを４２℃に設定し、３本のチューブ全部（２本はプラスミド入り、１本は対照）を熱ブロック内において４２℃で３０秒間インキュベートすることによりチューブに熱ショックを与えた。次いで細胞を氷上で２分間インキュベートした。
【００９０】
２５０μＬの室温ＳＯＣ培地を各チューブに添加し、水平振とうに対してチューブを保護するためにそれらの蓋にテープ片を施してチューブラックに入れた。チューブを３７℃、２５０ｒｐｍのオービタルシェーカー内で１時間インキュベートした。細胞（１００μＬ）をＬＢ＋Ａｍｐ＋Ｃａｍプレート上に各チューブから細胞スプレッダーで播種した。各チューブの細胞につき１つのプレートを用いた。次いでプレートを反転させて３７℃で一夜インキュベートした。
【００９１】
２日目：一夜培養
１Ｌのエルレンマイヤーフラスコに、２００ｍＬの室温ＬＢ、２００μＬの１００ｍｇ／ｍＬ  Ａｍｐおよび２００μＬの３４ｍｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールを添加した。無菌の爪楊枝を用いて、個々のコロニーを培地入りの各フラスコ内へ移した。ある場合には、接種ループを用いて細胞をグリセロール原液から培地入りエルレンマイヤーフラスコ（１Ｌ）内へ移した。エルレンマイヤーフラスコを３７℃、２５０ｒｐｍのオービタルシェーカー内で一夜インキュベートした。
【００９２】
３日目：スターター培養
適宜なサイズのエルレンマイヤーフラスコに、９００ｍＬの室温ＬＢ、１ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬ  Ａｍｐ、１ｍＬの３４ｍｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールを添加した。９００ｍＬの室温ＬＢ、１ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬ  Ａｍｐ、１ｍＬの３４ｍｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールを第２エルレンマイヤーフラスコに添加した。各エルレンマイヤーフラスコに１００ｍＬの一夜培養物を接種し、ラベルを付けた。次いでエルレンマイヤーフラスコを３７℃、２５０ｒｐｍのオービタルシェーカー内で、ＯＤ６００が約０．７になるまで（約３時間）インキュベートした。誘導前にＯＤ６００が１．０を超えないようにした。
【００９３】
誘導
エルレンマイヤーフラスコから１ｍＬを取り出し、予め“ｔ＝０”および親エルレンマイヤーフラスコ番号をマークした個々の１．５ｍＬミクロ遠心チューブへ移した。１ｍＬの１Ｍ  ＩＰＴＧおよび１２ｍｇのビオチン粉末を各エルレンマイヤーフラスコに添加することにより誘導を開始した。各１Ｌ培養におけるビオチン（ＦＷ  ２４４．３ｇ／ｍｏｌ）の最終濃度は５０μΜであった。エルレンマイヤーフラスコを３７℃、２５０ｒｐｍのオービタルシェーカー内でさらに３時間インキュベートした。この間に、ＰＰｉａｓｅ精製用の緩衝液を調製した。誘導が完了した後、各培養物のＯＤ６００を測定した。１ｍＬの溶液を各エルレンマイヤーフラスコから取り出し、予め“ｔ＝３”および親エルレンマイヤーフラスコ番号をマークした個々の１．５ｍＬミクロ遠心チューブへ移した。
【００９４】
細胞の収穫
ｔ＝０およびｔ＝３の時点の細胞をミクロ遠心チューブ内で卓上遠心機において１０，０００ＲＣＦ、１０分間、ペレット化した。ペレットを分散させずに上清を分離した。標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびに抗６ＨｉｓＧｌｙ一次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および適宜な二次抗体を用いるウェスタンブロット分析（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって後に分析するために、チューブを−８０℃に保存した。２〜４本の空の遠心ボトルの質量を求めた。エルレンマイヤーフラスコ当たり１または２本の遠心ボトルを用いて、４℃に予冷したＳＬＡ−３０００ローター内において５，０００ＲＣＦで１０分間、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−５Ｂ遠心機により、２Ｌの培養体積をペレット化した。透明な上清をデカントし、遠心ボトルにさらに培養物を添加することにより、すべての細胞がペレット化されるまで、採集をそれぞれ実施した。遠心ボトル＋細胞ペレットの質量を求めた。この質量と上記の工程２５で求めた質量との差が細胞の質量になる。培養物のリットル当たり約４．５ｇの細胞質量が得られた。次いで、日付、イニシャルおよび内容物を記入したカラーテープで遠心ボトルにマークした。酵素精製のために必要になるまでチューブを−８０℃に保存した。
【００９５】
実施例２−アクイフェックス・エオリカス由来のビオチニル化した熱安定性無機ホスファターゼの精製
カラムの装填および平衡化
適宜な配管を蠕動ポンプに接続した。蠕動ポンプ配管の出口末端を５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐキレート化ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ）の入口末端に接続した。蠕動ポンプ配管の入口末端を、約１ＬのｄＨ２Ｏ（周囲温度）で満たした大型ビーカーに入れた。配管をカラムの出口末端に接続し、廃液溜めに入れた。フローを１ｍＬ／分、１０ＣＶで開始した。２０ｍｌの０．１Ｍ  ＮｉＳＯ４を１ｍＬ／分でカラムに送入することにより、キレート化樹脂にＮｉ２＋を装填した。キレート化されなかったＮｉ２＋を１ｍＬ／分、５ＣＶのｄＨ２Ｏで洗浄除去した。カラムを４℃の冷蔵庫へ移し、いずれか追加のフローを開始する前、少なくとも１時間、平衡化させた。５ＣＶの緩衝液Ａを入れたアフィニティーカラムを流速１ｍＬ／分で平衡化した。
【００９６】
細胞溶解および澄明化
６Ｈｉｓ−ＢＣＣＰ−Ａａｅ  ＰＰｉａｓｅ発現操作からの凍結細胞ペレットの正味重量を測定した。ペレット（単数または複数）を氷上で３０分間融解した。この間に、ペレット化細胞１グラムにつき５ｍｌの量で、最大４０ｍＬの細胞溶解溶液を調製した。
【００９７】
細胞溶解溶液：
【００９８】
【表１】
2013529896.tif 000007
【００９９】
上記の試薬を合わせてｄＨ２ＯでＶｆ＝２０ｍｌに調整した。細胞溶解溶液は、１×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、１×ＰＢＳ、２５Ｕ／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅおよび１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有していた。この細胞溶解溶液を細胞に５ｍｌずつ添加し、塊を１０ｍｌのメスピペットにピペットエイドで穏やかに上下に通すことにより、ペレットを再懸濁した。塊を分散させ、すべての溶解溶液を添加した時点で、チューブに蓋をし、Ｎｕｔａｔｏｒに室温で１５分間置いた。ＳＬＡ−３０００ローターをＳｏｒｖａｌｌ遠心機に入れ、４℃に冷却した。
【０１００】
溶解物を３体積の緩衝液Ａ（緩衝液Ａは、１×ＰＢＳ、０．５ＭのＮａＣｌ、および１０ｍＭのイミダゾールを含有する）で４倍希釈した。成分を混合し、ｄＨ２ＯでＶｆ＝１Ｌに調整し、０．２μｍのＳｔｅｒｉｃｕｐで濾過し、４℃に保存した。遠心ボトルをバランスのとれた対（許容度＜０．２ｇ）で装填し、ＳＬＡ−３０００ローター内において９，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間、遠心した。
【０１０１】
遠心スピンの終了時に、すべてのチューブの上清（“澄明化した細胞溶解物”）を１つのフラスコまたはビーカー内へデカントした。上清は可溶性タンパク質を含有するのでそれを保持した。上清を合わせて回転させ、氷に乗せた。
【０１０２】
アフィニティー精製
澄明化した細胞溶解物を１ｍＬ／分の流速で蠕動ポンプによりアフィニティーカラムに装填した。フロースルーを単一画分として採集した。カラムを蠕動ポンプにより１ｍＬ／分の流速の７ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した。フロースルーを単一画分として採集した。カラムの入口を蠕動ポンプから離断し、適宜な溜めサイズをもつ勾配ミキサーの出口に接続した。勾配ミキサーの出口に接続したチャンバーに撹拌バーを入れた。勾配ミキサーを磁気撹拌プレートに乗せた。
【０１０３】
出口に接続したチャンバーに５ＣＶの緩衝液Ａを満たし、他のチャンバーに５ＣＶの緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂは、１×ＰＢＳ、０．５ＭのＮａＣｌ、および５００ｍＭのイミダゾールを含有する）を満たした。すべての成分を混合し、ｄＨ２ＯでＶｆ＝１Ｌに調整し、次いで０．２μｍのＳｔｅｒｉｃｕｐで濾過し、４℃に保存した。チャンバー内で緩衝液を効率的に混合するために撹拌プレートを用いた。
【０１０４】
次いで、勾配ミキサーの出口を開いて緩衝液をカラムに流すことにより、タンパク質をアフィニティーカラムから溶離した。１ｍＬ画分を採集した。カラムの入口を蠕動ポンプから離断し、新たな配管に接続した。蠕動ポンプの入口末端を、緩衝液Ｂで満たした大型ビーカーに入れ、１ｍＬ／分、４ＣＶのフローを開始した。１ｍＬ画分を採集した。
【０１０５】
タンパク質がカラムから溶出したことを確認した後、カラムを洗浄し、４℃に保存した。蠕動ポンプによる１ｍＬ／分でのアフィニティーカラムの洗浄を下記のとおり実施した：
ａ．５ＣＶのＣＩＰ
ｂ．１０ＣＶのｄＨ２Ｏ
ｃ．２ＣＶの２０％  ＥｔＯＨ
画分のプール、透析および貯蔵
画分を標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により分析した。６−Ｈｉｓ  ＢＣＣＰ−Ａａｅ  ＰＰｉａｓｅタンパク質は約３２ｋＤａの分子量をもつ。プールした画分を、ＰＰｉａｓｅ貯蔵用緩衝液で予め濡らした適宜な数の１０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析ユニットに装填した。
【０１０６】
ＰＰｉａｓｅ貯蔵用緩衝液：
【０１０７】
【表２】
2013529896.tif 000008
【０１０８】
透析および貯蔵用の緩衝液は、５０ｍＭのトリシン(Tricine)（ｐＨ７．８）、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴおよび５０％のグリセロールである。すべての成分を混合し、ｄＨ２ＯでＶｆ＝２Ｌに調整し、次いで０．２μｍのＳｔｅｒｉｃｕｐで濾過し、４℃に保存した。この１Ｍトリシン緩衝液（ｐＨ７．８）が低いＰＰｉバックグラウンドをもつことを確認した。Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析ユニットをカルーセル(carousel)に挿入し、４℃、２ＬのＰＰｉａｓｅ貯蔵用緩衝液に入れた。ユニットを４℃で一夜、撹拌しながらインキュベートした。翌日、透析用緩衝液を４℃、２Ｌの新鮮なＰＰｉａｓｅ貯蔵用緩衝液と交換し、次いで４℃で一夜、撹拌しながらインキュベートした。翌日、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析ユニット（単数または複数）の透析からの保持物（単数または複数）を回収した。
【０１０９】
溶液のタンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットにより、ＢＳＡを基準品として用いて測定した。この精製により合計で約９１ｍｇのタンパク質が得られた。標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびに抗６ＨｉｓＧｌｙ一次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および適宜な二次抗体を用いるウェスタンブロット分析（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、試料の純度を測定した。このタンパク質を−８０℃に保存した。
【０１１０】
種々の態様および実施形態を記載したが、以上は説明にすぎず、限定ではなく、例示により提示したにすぎないことは当業者に認識されるであろう。例示した態様の種々の機能性エレメントに機能を分布させるための他の多数の方式が可能である。いずれかのエレメントの機能を別態様の種々の方法で実施できる。
【符号の説明】
【０１１１】
１００  配列決定機器
１０５  反応支持体
１３０  コンピューター
１３５  アプリケーション
１５０  ネットワーク
１８０  試料調製機器
【図１】
2013529896.tif 000009
【図２】
2013529896.tif 000010
【図３】
2013529896.tif 000011
【図４】
2013529896.tif 000012
【図５】
2013529896.tif 000013
【図６】
2013529896.tif 000014
【図７】
2013529896.tif 000015
【配列表】
2013529896000001.app
【国際調査報告】
2013529896.tif 000016
2013529896.tif 000017
2013529896.tif 000018
2013529896.tif 000019
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