(57)【要約】  本発明は、ポリマー粒子およびその使用に関する。特に本発明は、細胞媒介性免疫応答を引き出すに際しての、ならびに細胞内病原体により引き起こされるものを含めて疾患または症状の処置または防止における、機能性ポリマー粒子、その産生方法および使用に関する。【選択図】なし
2013500329.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、前記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む方法。
【請求項２】
被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、前記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが被験者における免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む方法。
【請求項３】
病原体に対して被験者を免疫化する方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、前記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む方法。
【請求項４】
病原体に対して被験者を免疫化する方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、前記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが被験者における免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む方法。
【請求項５】
前記免疫応答が細胞媒介性免疫応答を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫応答が体液性応答を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記被験者が病原体に感染するかまたは病原体に対して免疫化されている請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る前記結合ドメインが内因性抗原と結合する請求項２または４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子。
【請求項１０】
免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子。
【請求項１１】
前記抗原が細胞媒介性免疫応答を引き出し得る請求項９または請求項１０記載のポリマー粒子。
【請求項１２】
前記抗原が体液性免疫応答を引き出し得る請求項９〜１１のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項１３】
前記ポリマー粒子が２つ以上の異なる融合ポリペプチドを含む請求項９〜１２のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項１４】
前記ポリマー粒子が、２つ以上の異なる抗原、または抗原を結合し得る２つ以上の異なる結合ドメインを含む請求項９〜１３のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項１５】
前記ポリマー粒子が、免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原ならびに細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメインを含む請求項９〜１４のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項１６】
前記ポリマー粒子がさらに、前記ポリマー粒子に結合されるかまたは組み入れられる少なくとも１つの物質を含む請求項９〜１５のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項１７】
前記物質が抗原、アジュバントまたは免疫刺激分子、あるいはその任意の２つ以上の組合せである請求項１６記載のポリマー粒子。
【請求項１８】
多価である請求項９〜１７のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項１９】
前記物質が架橋によりポリマー粒子と結合される請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項２０】
それを必要とする被験者における免疫応答を引き出すための、または病原体に対して被験者を免疫化するための、またはそれを必要とする被験者における病原体からの感染を診断するための、免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子。
【請求項２１】
それを必要とする被験者における免疫応答を引き出すための、または病原体に対して被験者を免疫化するための、またはそれを必要とする被験者における病原体からの感染を診断するための、免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子。
【請求項２２】
前記抗原が、マイコバクテリウム属（例えば、ウシ型結核菌、ヒト型結核菌、ライ菌、カンサシ菌、鳥結核菌、ヨーネ菌、マイコバクテリウム種）、リステリア属（例えば、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア種）、サルモネラ属（例えば、チフス菌）、エルシニア属（例えば、ペスト菌、エルシニア・エンテロコリチカ、仮性結核菌）、炭疽菌Bacillus anthracis、レジオネラ属（例えば、レジオネラ・ニューモフィラ、レジオネラ・ロングビーチェ、レジオネラ・ボゼマニ、レジオネラ種）、リケッチア属（例えば、ロッキー山紅斑熱リケッチア、リケッチア痘菌、ボタン熱菌、シベリアチックチフス菌、オーストラリアチックチフス菌、日本紅斑熱菌、アフリカダニ熱菌、発疹チフス菌、発疹熱菌、リケッチア種）、クラミジア属（肺炎クラミジア菌、クラミジア・トラコマチス、クラミジア種）、クラミドフィラ属（例えば、クラミドフィラ・シタッシ、クラミドフィラ流産菌）、連鎖球菌属（例えば、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌）、ブドウ球菌属（黄色ブドウ球菌）、例えばメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、エーリキア属（例えば、エーリキア・シャフェンシス、エーリキア・ファゴサイトフィラ・ゲノ群、エーリキア種）、コクシエラ・バーネッティCoxiella burnetii、リーシュマニア種、トキソプラズマ・ゴンジイ、トリパノソーマ・クルージ、ヒストプラズマ種、野兎病菌Francisella tularensis、ならびにウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、ピコルナウイルス、例えばコクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、例えばエプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヘパドナウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルス、フラビウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、レトロウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、オルトミクソウイルス、例えばインフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、例えば麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス属、例えばパピローマウイルス、ラブドウイルス、例えば狂犬病ウイルス、トガウイルス、例えば風疹ウイルス、ならびにその他のウイルス、例えばワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、修飾ワクシニアウイルスアンカラ株、セムリキ森林ウイルス、天然痘ウイルスおよびコロナウイルス、あるいは上記抗原のいずれかの少なくとも１つの抗原性部分またはＴ細胞エピトープからなる群から選択される生物体からの抗原である請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのポリマー粒子が請求項９〜２２のいずれか一項に記載のポリマー粒子である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項９〜２２のいずれか一項に記載のポリマー粒子を含む組成物。
【請求項２５】
それを必要とする被験者における免疫応答を引き出すための、またはそれを必要とする被験者にワクチン接種するための、または病原体に対してそれを必要とする被験者を免疫化するための、またはそれを必要とする被験者における病原体からの感染を診断するための、請求項２５記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物がワクチンである請求項２５または請求項２６記載の組成物。
【請求項２７】
それを必要とする被験者における免疫応答を引き出すために、またはそれを必要とする被験者にワクチン接種するために、または病原体に対してそれを必要とする被験者を免疫化するために、またはそれを必要とする被験者における病原体からの感染を診断するために適した医薬剤の製造における請求項９〜２２のいずれか一項に記載のポリマー粒子の使用。
【請求項２８】
前記医薬剤がワクチンである請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに
免疫応答を引き出し得る抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列、あるいは免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む発現構築物。
【請求項３０】
前記粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列、ならびに免疫応答を引き出し得る抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列、または免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列が、単一オープンリーディングフレームとして存在する請求項２９記載の発現構築物。
【請求項３１】
粒子形成タンパク質、ならびに免疫応答を引き出し得る抗原、または免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする請求項２９または３０記載の発現構築物。
【請求項３２】
以下の：
ｉ．  少なくとも１つのチオラーゼ、または
ｉｉ．  少なくとも１つのレダクターゼ、または
ｉｉｉ．  （ｉ）および（ｉｉ）の両方
をコードする核酸をさらに含む請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項３３】
以下の：
ｉ．  少なくとも１つのチオラーゼ、または
ｉｉ．  少なくとも１つのレダクターゼ、または
ｉｉｉ．  少なくとも１つのポリマーシンターゼ、または
ｉｖ．  免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原、または
ｖ．  免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメイン、または
ｖｉ．  前記ｉ）〜ｖ）のうちの１つ以上を含む融合タンパク質、または
ｖｉｉ．  前記ｉ）〜ｖｉ）の任意の組合せ
をコードする核酸を含む請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項３４】
前記抗原が細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原である請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項３５】
ポリマー粒子の産生方法であって、少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞（ここで、前記少なくとも１つの発現構築物は、免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む）を提供すること、ならびに前記発現構築物の発現に適した条件下で前記宿主細胞を保持すること、ならびに前記宿主細胞から前記ポリマー粒子を分離することを包含する方法。
【請求項３６】
病原体からの感染の診断方法であって、請求項９〜２２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリマー粒子を被験者に投与すること、そして前記病原体の存在を示す応答を検出することを包含する方法。
【請求項３７】
前記病原体の存在を示す前記応答が遅延型過敏応答である請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記病原体の存在を示す前記応答が、前記被験者から得られる試料中の前記病原体に対する抗体の存在の検出である請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記病原体の存在を示す前記応答が、前記試料中の前記病原体に応答性の免疫細胞の存在の検出である請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞を提供すること（ここで、前記少なくとも１つの発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列、および
ヒト型結核菌抗原またはヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む）；
前記発現構築物の発現に適した条件下で前記宿主細胞を保持すること；そして
前記宿主細胞から前記ポリマー粒子を分離すること
を包含する方法。
【請求項４１】
前記発現構築物が高コピー数ベクター中である請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
粒子形成タンパク質をコードする前記少なくとも１つの核酸配列が強プロモーターと操作可能的に連結される請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
前記宿主細胞が、ポリマーシンターゼの基質、または基質混合物、例えば単量体基質、または宿主により代謝されてポリマーシンターゼの基質を形成し得る前駆体基質の存在下で保持される請求項４０記載の方法。
【請求項４４】
前記宿主細胞が、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのヒト型結核菌抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物；または
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
アジュバントをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
少なくとも１つのヒト型結核菌抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物
からなる群から選択される少なくとも２つの異なる発現構築物を含む請求項４０記載の方法。
【請求項４５】
ヒト型結核菌抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列がＥＳＡＴ−６をコードする請求項４０記載の方法。
【請求項４６】
ヒト型結核菌抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列がＡｇ８５Ａをコードする請求項４０記載の方法。
【請求項４７】
ヒト型結核菌抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列がＥＳＡＴ−６およびＡｇ８５Ａをコードする請求項４０記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも１つのヒト型結核菌抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子。
【請求項４９】
少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子。
【請求項５０】
２つ以上の異なる融合ポリペプチドを含む請求項４８または請求項４９記載のポリマー粒子。
【請求項５１】
２つ以上の異なるヒト型結核菌抗原または２つ以上の異なるヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む請求項５０記載のポリマー粒子。
【請求項５２】
少なくとも１つのヒト型結核菌抗原および少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む請求項５０または請求項５１記載のポリマー粒子。
【請求項５３】
前記ポリマー粒子に結合されるかまたは組入れられる少なくとも１つの物質またはその組合せをさらに含む請求項４８〜５２のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項５４】
前記物質が抗原、アジュバントまたは免疫刺激分子である請求項５３記載のポリマー粒子。
【請求項５５】
多価である請求項４８〜５４のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項５６】
前記物質が架橋により前記ポリマー粒子に結合される請求項５３〜５５のいずれか一項に記載のポリマー。
【請求項５７】
ヒト型結核菌ＥＳＡＴ−６抗原を含む請求項４８〜５６のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項５８】
ヒト型結核菌Ａｇ８５Ａ抗原を含む請求項４８〜５７のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項５９】
融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つがＥＳＡＴ−６抗原およびＡｇ８５Ａ抗原を含む請求項５８記載のポリマー粒子。
【請求項６０】
以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに
ヒト型結核菌抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列、あるいはヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む発現構築物。
【請求項６１】
前記粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列、ならびにヒト型結核菌抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列、またはヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列が、単一オープンリーディングフレームとして存在する請求項６０記載の発現構築物。
【請求項６２】
粒子形成タンパク質、ならびにヒト型結核菌抗原またはヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする請求項６０または６１記載の発現構築物。
【請求項６３】
以下の：
ｉ．  少なくとも１つのチオラーゼ、または
ｉｉ．  少なくとも１つのレダクターゼ、または
ｉｉｉ．  （ｉ）および（ｉｉ）の両方
をコードする核酸をさらに含む請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項６４】
以下の：
ｉ．  少なくとも１つのチオラーゼ、または
ｉｉ．  少なくとも１つのレダクターゼ、または
ｉｉｉ．  少なくとも１つのポリマーシンターゼ、または
ｉｖ．  細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原、または
ｖ．  細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメイン、または
ｖｉ．  前記ｉ）〜ｖ）のうちの１つ以上を含む融合タンパク質、または
ｖｉｉ．  前記ｉ）〜ｖｉ）の任意の組合せ
をコードする核酸を含む請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項６５】
結核に対して被験者を免疫化する方法であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を、それを必要とする被験者に投与することを包含する方法であり、前記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つのヒト型結核菌抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む方法。
【請求項６６】
結核に対して被験者を免疫化する方法であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を、それを必要とする被験者に投与することを包含する方法であり、前記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む方法。
【請求項６７】
被験者における免疫応答を引き出す方法であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子を、それを必要とする被験者に投与することを包含する方法であり、前記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つのヒト型結核菌抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む方法。
【請求項６８】
被験者における免疫応答を引き出す方法であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子を、それを必要とする被験者に投与することを包含する方法であり、前記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む方法。
【請求項６９】
前記被験者が結核に感染する請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記被験者が結核に対して免疫化されている請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ヒト型結核菌抗原結合ドメインが内因性ヒト型結核菌抗原と結合する請求項６６または６８〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ポリマー粒子のうちの少なくとも１つが２つ以上の異なる融合ポリペプチドを含む請求項６５〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ポリマー粒子のうちの少なくとも１つが、２つ以上の異なるヒト型結核菌抗原または２つ以上の異なるヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む請求項６５〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記ポリマー粒子のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原および少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む請求項６５〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ポリマー粒子のうちの少なくとも１つが、前記ポリマー粒子に結合されるかまたは組入れられる少なくとも１つの物質またはその組合せをさらに含む請求項６５〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記物質が抗原、アジュバントまたは免疫刺激分子である請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
前記ポリマー粒子が多価である請求項６５〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記物質が架橋により前記ポリマー粒子に結合される請求項７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ポリマー粒子のうちの少なくとも１つがヒト型結核菌ＥＳＡＴ−６抗原を含む請求項６５〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ポリマー粒子のうちの少なくとも１つがヒト型結核菌Ａｇ８５Ａ抗原を含む請求項６５〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ポリマー粒子のうちの少なくとも１つがＥＳＡＴ−６抗原およびＡｇ８５Ａ抗原を含む融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む請求項６５〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記ポリマー粒子のうちの少なくとも１つが、Ａｇ８５Ｂ（ＭＰＴ５９）、Ａｇ８５Ｂ、Ａｇ８５Ｃ、ＭＰＴ３２、ＭＰＴ５１、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ６３、ＭＰＴ６４、ＭＰＴ８３、ＭＰＢ５、ＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＴＣ２８、Ｍｔｂ２、Ｍｔｂ８．４、Ｍｔｂ９．９、Ｍｔｂ３２Ａ、Ｍｔｂ３９、Ｍｔｂ４１、ＴＢ１０．４、ＴＢ１０Ｃ、ＴＢ１１Ｂ、ＴＢ１２．５、ＴＢ１３Ａ、ＴＢ１４、ＴＢ１５、ＴＢ１５Ａ、ＴＢ１６、ＴＢ１６Ａ、ＴＢ１７、ＴＢ１８、ＴＢ２１、ＴＢ２０．６、ＴＢ２４、ＴＢ２７Ｂ、ＴＢ３２、ＴＢ３２Ａ、ＴＢ３３、ＴＢ３８、ＴＢ４０．８、ＴＢ５１、ＴＢ５４、ＴＢ６４、ＣＦＰ６、ＣＦＰ７、ＣＦＰ７Ａ、ＣＦＰ７Ｂ、ＣＦＰ８Ａ、ＣＦＰ８Ｂ、ＣＦＰ９、ＣＦＰ１０、ＣＦＰ１１、ＣＦＰ１６、ＣＦＰ１７、ＣＦＰ１９、ＣＦＰ１９Ａ、ＣＦＰ１９Ｂ、ＣＦＰ２０、ＣＦＰ２１、ＣＦＰ２２、ＣＦＰ２２Ａ、ＣＦＰ２３、ＣＦＰ２３Ａ、ＣＦＰ２３Ｂ、ＣＦＰ２５、ＣＦＰ２５Ａ、ＣＦＰ２７、ＣＦＰ２８、ＣＦＰ２８Ｂ、ＣＦＰ２９、ＣＦＰ３０Ａ、ＣＦＰ３０Ｂ、ＣＦＰ５０、ＣＷＰ３２、ｈｓｐＸ（アルファ−結晶）、ＡＰＡ、ツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ＳＴ−ＣＦ、ＰＰＥ６８、ＬｐｐＸ、ＰｓｔＳ−１、ＰｓｔＳ−２、ＰｓｔＳ−３、ＨＢＨＡ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＬ２、ＧｒｐＥＳ、ＬＨＰ、１９ｋＤａ  リポタンパク質、７１ｋＤａ、ＲＤ１−ＯＲＦ２、ＲＤ１−ＯＲＦ３、ＲＤ１−ＯＲＦ４、ＲＤ１−ＯＲＦ５、ＲＤ１−ＯＲＦ８、ＲＤ１−ＯＲＦ９Ａ、ＲＤ１−ＯＲＦ９Ｂ、Ｒｖ１９８４ｃ、Ｒｖ０５７７、Ｒｖ１８２７、ＢｆｒＢ、Ｔｐｘ．  Ｒｖ１３５２、Ｒｖ１８１０、ＰｐｉＡ、Ｃｕｔ２、ＦｂｐＢ、ＦｂｐＡ、ＦｂｐＣ、ＤｎａＫ、ＦｅｃＢ、Ｓｓｂ、ＲｐｌＬ、ＦｉｘＡ、ＦｉｘＢ、ＡｈｐＣ２、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ１２１１、Ｍｄｈ、Ｒｖ１６２６、Ａｄｋ、ＣｌｐＰ、ＳｕｃＤ（Belisle et al、2005；ＵＳ  ７，０３７，５１０；ＵＳ  ２００４／００５７９６３；ＵＳ  ２００８／０１９９４９３；  ＵＳ  ２００８／０２６７９９０)、あるいは前記抗原のいずれかの少なくとも１つの抗原性部分またはＴ細胞エピトープからなる群から選択されるヒト型結核菌抗原を含む請求項６５〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
肝炎またはインフルエンザに対して被験者を免疫化する方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、前記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原と融合される粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼを含む方法。
【請求項８４】
肝炎またはインフルエンザに対して被験者を免疫化する方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、前記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原と結合し得る結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼを含む方法。
【請求項８５】
被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、前記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原と融合される粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼを含む方法。
【請求項８６】
被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、前記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原を結合し得る結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼを含む方法。
【請求項８７】
前記免疫応答が細胞媒介性免疫応答である請求項８３〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
肝炎またはインフルエンザからの感染の診断方法であって、請求項９〜２２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリマー粒子を被験者に投与すること、そして前記肝炎またはインフルエンザウイルスの存在を示す応答を検出することを包含する方法。
【請求項８９】
前記肝炎またはインフルエンザウイルスの存在を示す前記応答が、遅延型過敏応答である請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
前記肝炎またはインフルエンザウイルスの存在を示す前記応答が、前記試料中の前記肝炎抗原またはインフルエンザ抗原に対する抗体の存在の検出である請求項８８記載の方法。
【請求項９１】
前記肝炎またはインフルエンザウイルスの存在を示す前記応答が、前記試料中の前記肝炎またはインフルエンザウイルスに応答性の免疫細胞の存在の検出である請求項８８記載の方法。
【請求項９２】
前記被験者が肝炎またはインフルエンザに感染する請求項８８〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記被験者が肝炎またはインフルエンザに対して免疫化されている請求項８８〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
肝炎抗原またはインフルエンザ抗原を結合し得る前記結合ドメインが内因性肝炎抗原またはインフルエンザ抗原と結合する請求項８９または９１〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記ポリマー粒子のうちの少なくとも１つが２つ以上の異なる融合ポリペプチドを含む請求項８８〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記ポリマー粒子のうちの少なくとも１つが、２つ以上の異なる肝炎抗原、または２つ以上のインフルエンザ抗原、あるいは肝炎抗原またはインフルエンザ抗原を結合し得る２つ以上の異なる結合ドメインを含む請求項８８〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記ポリマー粒子のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原、および肝炎抗原またはインフルエンザ抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメインを含む請求項８８〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記ポリマー粒子のうちの少なくとも１つが、前記ポリマー粒子に結合されるかまたは組入れられる少なくとも１つの物質またはその組合せをさらに含む請求項８８〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記物質が抗原、アジュバントまたは免疫刺激分子である請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
前記ポリマー粒子のうちの少なくとも１つが多価である請求項８８〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記物質が架橋により前記ポリマー粒子に結合される請求項９８〜１００のいずれか一項に記載のポリマー。
【請求項１０２】
前記ポリマー粒子のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つの抗原、または少なくとも１つの抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメインを含む請求項８８〜１０１のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗原が、ウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、ピコルナウイルス、例えばコクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、例えばエプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヘパドナウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルス、フラビウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス、オルトミクソウイルス、例えばインフルエンザウイルス、あるいは上記抗原のいずれかの少なくとも１つの抗原性部分またはＴ細胞エピトープからなる群から選択される生物体からである方法。
【請求項１０３】
ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞を提供すること（ここで、前記少なくとも１つの発現構築物は、以下の：
肝炎抗原またはインフルエンザ抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列、あるいは
肝炎抗原またはインフルエンザ抗原を結合し得る結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む）；
前記発現構築物の発現に適した条件下で前記宿主細胞を保持すること；そして
前記宿主細胞から前記ポリマー粒子を分離すること
を包含する方法。
【請求項１０４】
少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子。
【請求項１０５】
肝炎抗原またはインフルエンザ抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子。
【請求項１０６】
２つ以上の異なる融合ポリペプチドを含む請求項１０４または請求項１０５記載のポリマー粒子。
【請求項１０７】
２つ以上の異なる肝炎抗原または２つ以上の異なるインフルエンザ抗原、あるいは肝炎抗原またはインフルエンザ抗原を結合し得る２つ以上の異なる結合ドメインを含む請求項１０６記載のポリマー粒子。
【請求項１０８】
少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原、ならびに肝炎抗原またはインフルエンザ抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメインを含む請求項１０６または請求項１０７記載のポリマー粒子。
【請求項１０９】
前記ポリマー粒子に結合されるかまたは組入れられる少なくとも１つの物質またはその組合せをさらに含む請求項１０４〜１０８のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項１１０】
前記物質が抗原、アジュバントまたは免疫刺激分子である請求項１０９記載のポリマー粒子。
【請求項１１１】
多価である請求項１０４〜１１０のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項１１２】
前記物質が架橋により前記ポリマー粒子に結合される請求項１０９〜１１１のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項１１３】
それを必要とする被験者における細胞媒介性免疫応答を引き出すための、あるいは肝炎またはインフルエンザに対して被験者を免疫化するための、あるいはそれを必要とする被験者における肝炎またはインフルエンザからの感染を診断するための、少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子。
【請求項１１４】
それを必要とする被験者における細胞媒介性免疫応答を引き出すための、あるいは肝炎またはインフルエンザに対して被験者を免疫化するための、あるいはそれを必要とする被験者における肝炎またはインフルエンザからの感染を診断するための、肝炎抗原またはインフルエンザ抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子。
【請求項１１５】
それを必要とする被験者における細胞媒介性免疫応答を引き出すために、あるいは肝炎またはインフルエンザに対して被験者を免疫化するために、あるいはそれを必要とする被験者における肝炎またはインフルエンザからの感染を診断するために適切である医薬剤の製造における請求項１０４〜１１４のいずれか一項に記載のポリマー粒子の使用。
【請求項１１６】
以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに
肝炎抗原またはインフルエンザ抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列、あるいは肝炎抗原またはインフルエンザ抗原を結合し得る結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む発現構築物。
【請求項１１７】
前記粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列、ならびに肝炎抗原またはインフルエンザ抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列、あるいは肝炎抗原またはインフルエンザ抗原を結合し得る結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列が、単一オープンリーディングフレームとして存在する請求項１１６記載の発現構築物。
【請求項１１８】
前記粒子形成タンパク質ならびに肝炎抗原またはインフルエンザ抗原、あるいは肝炎抗原またはインフルエンザ抗原を結合し得る結合ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする請求項１１６または１１７記載の発現構築物。
【請求項１１９】
以下の：
ｉ．  少なくとも１つのチオラーゼ、または
ｉｉ．  少なくとも１つのレダクターゼ、または
ｉｉｉ．  （ｉ）および（ｉｉ）の両方
をコードする核酸をさらに含む請求項１１６〜１１８のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項１２０】
以下の：
ｉ．  少なくとも１つのチオラーゼ、または
ｉｉ．  少なくとも１つのレダクターゼ、または
ｉｉｉ．  少なくとも１つのポリマーシンターゼ、または
ｉｖ．  少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原、または
ｖ．  少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメイン、または
ｖｉ．  前記ｉ）〜ｖ）のうちの１つ以上を含む融合タンパク質、または
ｖｉｉ．  前記ｉ）〜ｖｉ）の任意の組合せ
をコードする核酸を含む請求項１１６〜１１９のいずれか一項に記載の発現構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質および関連の構造および方法、ならびに、ポリマー粒子およびその使用に関する。特に本発明は、免疫応答を引き出すに際しての、ならびに細胞内または細胞外病原体により引き起こされるものを含めて疾患または症状の処置または防止における、機能性ポリマー粒子、その産生方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の記述は、本発明を理解するのに有用である情報を包含する。本明細書中で提供される情報のいずれかが従来技術でありあるいは本発明で記載されまたは特許請求される発明に関連するということ、もしくは具体的にまたは言外に言及される任意の出版物または文書が従来技術であるということは、承認事項というわけではない。
【０００３】
細胞内および細胞外病原体を含めた病原体は、ヒトにおける多数の有害な疾患、例えば結核、肝炎、インフルエンザ、ライ病、リステリア症、腸チフス、赤痢、ペスト、肺炎、チフス、クラミジア、炭素病および髄膜炎等を引き起こすことが知られている。伝統的ワクチン接種戦略により引き出される頑強な細胞媒介性免疫応答および体液性応答を生じる能力はともに、本明細書中に包含される。
【０００４】
例えば結核（Ｔｂ）は、毎年２００万人を超える人々が死亡していると概算される。結核を処置または防止するための最新方法は、ヒト型結核菌の多薬剤耐性菌株の出現により脅かされている（Anderson, 2007；Mustafa, 2001）。Ｔｂの処置または予防は、宿主の免疫系への細胞内細菌の到達し難さにより複雑にされる。
【０００５】
慣用的ワクチン送達系の欠点の多くを克服する標的化ワクチン接種を送達するための安全且つ効率的方法を開発することが望ましい。欠点としては、経費増大、そしてしばしば、長時間に亘る効力減少のための反復投与の必要性が挙げられる。免疫応答、特に細胞媒介性免疫応答の生成も、例えば癌を含めた種々の他の疾患および症状を処置する一方法として提案されている。したがって、頑強な免疫応答を引き出し得るワクチン組成物、特に、細胞媒介性免疫応答または体液性免疫応答またはその両方を引き出し得る組成物が必要とされている。
【０００６】
医療、製薬および食品産業用途における薬剤および他の活性作用物質の運搬のためのマトリックスとしての使用のほかに、バイオプラスチックにおけるその用途に関して、ポリヒドロキシアルキルカルボキシレート、特にポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の特性が研究されてきた。ＰＨＡ分子の生体工学により、ＰＨＡ分子の組成物および発現は、特定の機能を満たすよう操作され得る。
【０００７】
例えば免疫化またはワクチン接種により、種々の疾患および症状の処置または防止に用いるためのポリマー粒子を提供すること、それを必要とする被験者における有効な免疫応答を引き出すための方法および組成物を提供すること、あるいは少なくとも有用な選択肢を公衆に提供することは、本発明の一目的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本明細書中に記載され、特許請求される本発明は、多数の属性および実施態様、例えば、この概要で記述されるかまたは記載され、あるいは言及されるものを有するが、これらに限定されない。それは全包括的であるよう意図されず、本明細書中に記載され、特許請求される本発明は、この概要で確認される特徴または非限定例（例証のためのみに含まれ、限定するためではない）にあるいはそれらにより限定されない。
【０００９】
ポリマー粒子の産生方法であって、少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞を提供すること（ここで、前記少なくとも１つの発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列、および
免疫応答を引き出し得る抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列、または
免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む）；
前記発現構築物の発現に適した条件下で前記宿主細胞を保持すること；そして
前記宿主細胞から前記ポリマー粒子を分離すること
を包含する方法が、本明細書中で開示される。
【００１０】
一実施形態では、当該方法は、少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞を提供すること（ここで、前記少なくとも１つの発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列、および
例えば、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列、または
例えば、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む）；
前記発現構築物の発現に適した条件下で前記宿主細胞を保持すること；そして
前記宿主細胞から前記ポリマー粒子を分離すること
を包含する。
【００１１】
一実施形態では、粒子形成タンパク質はポリマーシンターゼである。
【００１２】
一実施形態では、発現構築物は高コピー数ベクター中である。
【００１３】
一実施形態では、粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列は、強プロモーターと操作可能的に連結される。
【００１４】
一実施形態では、強プロモーターはウイルスプロモーターまたはファージプロモーターである。
【００１５】
一実施形態では、プロモーターは、ファージプロモーター、例えばＴ７ファージプロモーターである。
【００１６】
一実施形態では、前記宿主細胞は、ポリマーシンターゼの基質、好ましくは、存在する場合ポリマーシンターゼの基質、または基質混合物、例えば単量体基質、または宿主により代謝されて粒子形成タンパク質の基質を形成し得る前駆体基質の存在下で保持される。
【００１７】
一実施形態では、宿主細胞は少なくとも２つの異なる発現構築物を含む。
【００１８】
宿主細胞が少なくとも２つの異なる発現構築物を含むいくつかの実施形態では、発現構築物のうちの少なくとも１つは、以下の：
粒子形成タンパク質、および免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物、あるいは
粒子形成タンパク質、および免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインをコードする核酸配列を含む発現構築物、あるいは
粒子形成タンパク質、および細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物、あるいは
粒子形成タンパク質、および細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインをコードする核酸配列を含む発現構築物、
アジュバントをコードする核酸配列を含む発現構築物、あるいは
免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物、あるいは
細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物
からなる群から選択される。
【００１９】
宿主細胞が少なくとも２つの異なる発現構築物を含む他の実施形態では、発現構築物のうちの１つは、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする核酸配列を含む発現構築物、または
粒子サイズ決定タンパク質をコードする核酸配列を含む発現構築物、または
ポリマー調節因子をコードする核酸配列を含む発現構築物
からなる群から選択される。
【００２０】
宿主細胞が少なくとも２つの異なる発現構築物を含む他の実施形態では、発現構築物のうちの１つは、粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼ、免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインをコードする核酸配列を含み、そして少なくとも１つの発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質、および免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物、あるいは
粒子形成タンパク質、および免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインをコードする核酸配列を含む発現構築物、あるいは
粒子形成タンパク質、および細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物、あるいは
粒子形成タンパク質、および細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインをコードする核酸を含む発現構築物、あるいは
アジュバントをコードする核酸配列を含む発現構築物、あるいは
免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物、あるいは
細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物
からなる群から選択される。
【００２１】
一実施形態では、宿主細胞は発現構築物の混合集団を含み、この場合、各発現構築物は、融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含無が、融合ポリペプチドは、以下の：
少なくとも１つの粒子形成タンパク質、および
免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原、または
免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメイン
を含む。
【００２２】
種々の実施形態において、抗原は、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原である。
【００２３】
本発明の別の態様は、以下のものを含む発現構築物に関する：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列；および
免疫応答を引き出し得る抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列。
【００２４】
一実施形態では、核酸は、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原をコードする。
【００２５】
本発明の別の態様は、以下のものを含む発現構築物に関する：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列；および
免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列。
【００２６】
種々の実施形態において、抗原は細胞媒介性免疫応答を引き出し得るし、あるいは結合ドメインは細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る。
【００２７】
一実施形態では、発現構築物は、粒子形成タンパク質、ならびに免疫応答を引き出し得る抗原を含む融合ポリペプチドをコードする。
【００２８】
一実施形態では、発現構築物は、粒子形成タンパク質、ならびに免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする。
【００２９】
一実施形態では、粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列、ならびに免疫応答を引き出し得る抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列は、単一オープンリーディングフレームとして存在する。
【００３０】
一実施形態では、粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列、ならびに免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列は、単一オープンリーディングフレームとして存在する。
【００３１】
一実施形態では、粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列は、強プロモーターと操作可能的に連結される。
【００３２】
一実施形態では、発現構築物は、付加的ポリペプチドをコードするすくむ１つの核酸配列を含む。
【００３３】
一実施形態では、発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質、および免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに
融合ポリペプチドの免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインを結合する付加的ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む。
【００３４】
一実施形態では、付加的ポリペプチドは、粒子形成タンパク質、ならびに免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を含む融合ポリペプチドである。
【００３５】
一実施形態では、構築物は、さらに、以下の：
ｉ．  少なくとも１つのチオラーゼ、または
ｉｉ．  少なくとも１つのレダクターゼ、または
ｉｉｉ．  （ｉ）および（ｉｉ）の両方
をコードする核酸を含む。
【００３６】
一実施形態では、構築物は、以下の：
ｉ．  少なくとも１つのチオラーゼ、
ｉｉ．  少なくとも１つのレダクターゼ、
ｉｉｉ．  少なくとも１つのポリマーシンターゼ、
ｉｖ．  免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原、または
ｖ．  免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメイン、
ｖｉ．  上記ｉ）〜ｖ）のうちの１つ以上を含む融合タンパク質、
ｖｉｉ．  上記ｉ）〜ｖｉ）の任意の組合せ
をコードする核酸を含む。
【００３７】
一実施形態では、発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質、および免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに
免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインを含む付加的ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む。
【００３８】
一実施形態では、発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質、および細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに
細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインを含む付加的ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む。
【００３９】
一実施形態では、付加的ポリペプチドは、粒子形成タンパク質、ならびに免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインを含む融合ポリペプチドである。
【００４０】
本発明の別の態様は、本発明の発現構築物を含むベクターに関する。
【００４１】
一実施形態では、ベクターは高コピー数ベクターである。
【００４２】
一実施形態では、ベクターは低コピー数ベクターである。
【００４３】
本発明の別の態様は、上記のような発現構築物またはベクターを含む宿主細胞に関する。
【００４４】
一実施形態では、宿主細胞は、以下の：
粒子形成タンパク質、および免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物、あるいは
粒子形成タンパク質、および免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインをコードする核酸配列を含む発現構築物、あるいは
粒子形成タンパク質、および細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物、あるいは
粒子形成タンパク質、および細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインをコードする核酸を含む発現構築物、あるいは
アジュバントをコードする核酸配列を含む発現構築物、あるいは
免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物、あるいは
細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物
からなる群から選択される発現構築物を含む。
【００４５】
本発明の別の態様は、免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関する。
【００４６】
本発明の別の態様は、免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関する。
【００４７】
一実施形態では、ポリマー粒子は、２つ以上の異なる融合ポリペプチドを含む。
【００４８】
一実施形態では、ポリマー粒子は、ポリマー粒子表面上の２つ以上の異なる融合ポリペプチドを含む。
【００４９】
一実施形態では、ポリマー粒子は、３つ以上の異なる融合ポリペプチド、例えばポリマー粒子表面上の３つ以上の異なる融合ポリペプチドを含む。
【００５０】
一実施形態では、ポリマー粒子は、免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る２つ以上の異なる抗原を含む。
【００５１】
一実施形態では、ポリマー粒子は、免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも２つ以上の異なる抗原の結合ドメインを含む。
【００５２】
一実施形態では、ポリマー粒子は、ポリマー粒子に結合されるかまたは組入れられる、あるいはその組合せの少なくとも１つの物質をさらに含む。
【００５３】
一実施形態では、物質は、抗原またはアジュバントまたは免疫刺激分子である。
【００５４】
一実施形態では、物質は架橋により結合される。
【００５５】
一実施形態では、少なくとも１つのポリマー粒子は、ヒト型結核菌抗原、Ｃ型肝炎抗原、インフルエンザ抗原、野兎病菌抗原、ウシ流産菌抗原、髄膜炎菌抗原、炭疽菌抗原、デング熱ウイルス抗原、エボラ熱ウイルス抗原、西ナイル熱ウイルス抗原（本明細書中に記載される抗原のうちの１つを含めて）からなる群から選択される少なくとも１つの抗原を含む。
【００５６】
本発明の別の態様は、上記の方法に従って産生されるポリマー粒子に関する。
【００５７】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の組成物であって、ポリマー粒子が、免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含む組成物に関する。
【００５８】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の組成物であって、ポリマー粒子が、免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含む組成物に関する。
【００５９】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の組成物であって、ポリマー粒子が、上記の方法に従って産生される組成物に関する。
【００６０】
種々の実施形態において、組成物はワクチン組成物である。種々の実施形態において、ワクチン組成物は、１つ以上のアジュバントまたは免疫刺激分子をさらに含む。
【００６１】
本発明の別の態様は、上記のようなポリマー粒子の組成物を含む診断試薬に関する。
【００６２】
本発明の別の態様は、上記のようなポリマー粒子の組成物を含む診断キットに関する。
【００６３】
一実施形態では、組成物はポリマー粒子の均質集団を含む。
【００６４】
一実施形態では、組成物は、ポリマー粒子の混合集団を含む。
【００６５】
一実施形態では、組成物は、以下の：
免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る１つ以上の抗原
免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る１つ以上の抗原の１つ以上の結合ドメイン、
１つ以上のアジュバント、または
１つ以上の免疫調節物質または分子
のうちの１つ以上をさらに含む。
【００６６】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、前記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが被験者における免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む方法に関する。
【００６７】
一実施形態では、免疫応答は細胞媒介性免疫応答である。一実施形態では、抗原は、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原である。
【００６８】
一実施形態では、免疫応答は体液性免疫応答である。一実施形態では、抗原は、体液性免疫応答を引き出し得る抗原である。
【００６９】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、前記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが被験者における免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含み、免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインが免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原に結合されるか、被験者が免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を含むか、または被験者が免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を投与される方法に関する。
【００７０】
一実施形態では、免疫応答は細胞媒介性免疫応答である。一実施形態では、結合ドメインは、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る。
【００７１】
一実施形態では、当該方法は、結核に対して被験者を免疫化する方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、融合タンパク質のうちの少なくとも１つが細胞媒介性または他の免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む方法に関する。
【００７２】
一実施形態では、当該方法は、結核に対して被験者を免疫化する方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、融合タンパク質のうちの少なくとも１つが細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含み、細胞媒介性または他の免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインが細胞媒介性または他の免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原に結合されるか、被験者が細胞媒介性または他の免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を含むか、あるいは被験者が細胞媒介性または他の免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を投与される方法に関する。
【００７３】
一実施形態では、少なくとも１つのポリマー粒子は、被験者における免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を含む組成物、例えば、被験者における細胞媒介性または他の免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を含む組成物中に存在する。
【００７４】
一実施形態では、本発明は、結核に感染した被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、例えばヒト型結核菌抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼを含むポリマー粒子を投与することを包含する方法に関する。
【００７５】
一実施形態では、ヒト型結核菌抗原結合ドメインは、例えば内因性ヒト型結核菌抗原と結合する。
【００７６】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出すためのポリマー粒子に関するが、この場合、ポリマー粒子が１つ以上の融合ポリペプチドを含み、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが被験者における免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原と融合される粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼを含む。
【００７７】
一実施形態では、免疫応答は細胞媒介性免疫応答である。一実施形態では、抗原は細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原である。
【００７８】
一実施形態では、免疫応答は体液性免疫応答である。一実施形態では、抗原は、体液性免疫応答を引き出し得る抗原である。
【００７９】
本発明の別の態様は、それを必要とする被験者における免疫応答を引き出すためのポリマー粒子に関するが、この場合、少なくとも１つのポリマー粒子は１つ以上の融合ポリペプチドを含み、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが被験者における免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含み、免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインが免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原と結合されるか、被験者が免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を含むか、または被験者が免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を投与される。
【００８０】
一実施形態では、免疫応答は細胞媒介性免疫応答である。一実施形態では、結合ドメインは、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る。一実施形態では、免疫応答は、体液性免疫応答である。一実施形態では、抗原は体液性免疫応答を引き出し得る抗原である。
【００８１】
一実施形態では、少なくとも１つのポリマー粒子は、免疫応答、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を含む組成物中に存在する。
【００８２】
一実施形態では、少なくとも１つのポリマー粒子は、例えば少なくとも１つのヒト型結核菌抗原を含む組成物中に存在する。
【００８３】
一実施形態では、例として、少なくとも１つのポリマー粒子は、ヒト型結核菌抗原、Ｃ型肝炎抗原、インフルエンザ抗原、野兎病菌抗原、ウシ流産菌抗原、髄膜炎菌抗原、炭疽菌抗原、デング熱ウイルス抗原、エボラ熱ウイルス抗原、西ナイル熱ウイルス抗原（本明細書中に記載される抗原のうちの１つを含めて）からなる群から選択される少なくとも１つの抗原を含む組成物中に存在する。
【００８４】
一実施形態では、被験者は、例えば細胞内病原体に感染しているか、または細胞内病原体に感染する危険がある。別の実施形態では、被験者は、例えば主に細胞内生活環を有する病原体に感染しているかまたは感染する危険がある。
【００８５】
種々の実施形態では、被験者は肝炎、インフルエンザまたは結核に感染している。
【００８６】
別の実施形態では、被験者は、例えば細胞内病原体に対して免疫化されている。例えば、被験者はカルメット・グラン桿菌（ＢＣＧ）をワクチン接種されている。
【００８７】
一実施形態では、例えば、被験者は細胞外病原体に感染しているか、または細胞外病原体に感染する危険がある。別の実施形態では、被験者は、例えば主に細胞外生活環を有する病原体に感染しているかまたは感染する危険がある。
【００８８】
本発明の別の態様は、細胞内病原体に感染したまたはそれに対して免疫化された被験者における免疫応答を引き出すためのポリマー粒子に関するが、この場合、少なくとも１つのポリマー粒子は、少なくとも１つのポリマー粒子は、免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼを含む。
【００８９】
細胞内病原体に対して被験者を免疫化するための、あるいは被験者、例えば細胞内病原体に感染したまたは細胞内病原体に対して免疫化される被験者における免疫応答を引き出すための、医薬剤の調製における上記のようなポリマー粒子の使用も、意図される。
【００９０】
本発明の別の態様は、例えば細胞外病原体に感染した、または細胞外病原体に対して免疫化される被験者における免疫応答を引き出すためのポリマー粒子に関するが、この場合、少なくとも１つのポリマー粒子は、免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼを含む。
【００９１】
例えば、細胞外病原体に対して被験者を免疫化するための、あるいは被験者、例えば細胞外病原体に感染したまたは細胞内病原体に対して免疫化される被験者における免疫応答を引き出すための、医薬剤の調製における上記のようなポリマー粒子の使用も、意図される。
【００９２】
本発明はさらに、それを必要とする被験者のワクチン接種のための、本明細書中に記載されるようなポリマー粒子を提供する。したがって、それを必要とする被験者をワクチン接種するための医薬剤の調製における本明細書中に記載されるようなポリマー粒子の使用が、意図される。
【００９３】
本発明の別の態様は、病原体からの感染の診断方法であって、本発明の少なくとも１つのポリマー粒子を被験者に投与すること、そして病原体の存在を示す応答を検出することを包含する方法に関する。
【００９４】
一実施形態では、病原体は細胞内病原体である。別の実施形態では、病原体は細胞外病原体である。
【００９５】
一実施形態では、病原体、例えば細胞内病原体の存在を示す応答は、遅延型過敏応答である。
【００９６】
本発明の別の態様は、病原体からの感染の診断方法であって、被験者から得られる試料を本発明のポリマー粒子と接触すること、そして病原体の存在を示す応答を検出することを包含する方法に関する。
【００９７】
さらにまた、ある実施形態では、病原体は細胞内病原体、細胞外病原体、例えば主に細胞内生活環を有する病原体、または例えば主に細胞外生活環を有する病原体である。
【００９８】
一実施形態では、病原体の存在を示す応答は、上記被験者における病原体に対する抗体の存在の検出である。
【００９９】
一実施形態では、病原体の存在を示す応答は、上記試料中の病原体に応答性の免疫細胞の存在の検出である。
【０１００】
一実施形態では、病原体に対する抗体の存在の検出は、イムノアッセイによる。
【０１０１】
一実施形態では、病原体に対する抗体の存在の検出は、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ検定またはウエスタンブロットによる。
【０１０２】
一実施形態では、病原体の存在を示す応答は、上記被験者における病原体に応答性である免疫細胞の存在の検出である。
【０１０３】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞を提供すること（ここで、前記少なくとも１つの発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列、および
ヒト型結核菌抗原またはヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む）；
上記発現構築物の発現にならびにポリマー粒子の形成に適した条件下で宿主細胞を保持すること；そして
上記宿主細胞からポリマー粒子を分離すること
を包含する方法を提供する。
【０１０４】
宿主細胞が少なくとも２つの異なる発現構築物を含むいくつかの実施形態では、発現構築物のうちの少なくとも１つは、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのヒト型結核菌抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物；または
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
アジュバントをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
少なくとも１つのヒト型結核菌抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物
からなる群から選択される。
【０１０５】
宿主細胞が少なくとも２つの異なる発現構築物を含む他の実施形態では、発現構築物のうちの１つは、粒子形成タンパク質および少なくとも１つのヒト型抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含み、そして少なくとも１つの発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのヒト型結核菌抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物；または
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
アジュバントをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
少なくとも１つのヒト型結核菌抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物
からなる群から選択される。
【０１０６】
一実施形態では、宿主細胞は、発現構築物の混合集団を含み、この場合、各発現構築物は融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、融合ポリペプチドは、以下の：
少なくとも１つの粒子形成タンパク質、および
少なくとも１つのヒト型結核菌抗原または少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメイン
を含む。
【０１０７】
本発明の別の態様は、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列；および
ヒト型結核菌抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む一発現構築物に関する。
【０１０８】
本発明の別の態様は、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列；および
ヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む一発現構築物に関する。
【０１０９】
一実施形態では、発現構築物は、粒子形成タンパク質およびヒト型結核菌抗原を含む融合ポリペプチドをコードする。
【０１１０】
一実施形態では、発現構築物は、粒子形成タンパク質およびヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする。
【０１１１】
一実施形態では、粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列およびヒト型結核菌抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列は、単一オープンリーディングフレームとして存在する。
【０１１２】
一実施形態では、粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列およびヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列は、単一オープンリーディングフレームとして存在する。
【０１１３】
一実施形態では、発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに
融合ポリペプチドのヒト型結核菌抗原結合ドメインを結合する少なくとも１つのポリペプチドを含む付加的ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む。
【０１１４】
一実施形態では、付加的ポリペプチドはヒト型結核菌抗原であるか、または少なくとも１つのヒト型結核菌抗原を含む。
【０１１５】
一実施形態では、付加的ポリペプチドは、粒子形成タンパク質および少なくとも１つのヒト型結核菌抗原を含む融合ポリペプチドである。
【０１１６】
一実施形態では、発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのヒト型結核菌抗原を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに
少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む付加的ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む。
【０１１７】
一実施形態では、付加的ポリペプチドは、粒子形成タンパク質および少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドである。
【０１１８】
一実施形態では、宿主細胞は、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのヒト型結核菌抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物；または
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
アジュバントをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
少なくとも１つのヒト型結核菌抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物
からなる群から選択される発現構築物を含む。
【０１１９】
本発明の別の態様は、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関する。
【０１２０】
本発明の別の態様は、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関する。
【０１２１】
一実施形態では、ポリマー粒子は、２つ以上の異なるヒト型結核菌抗原を含む。
【０１２２】
一実施形態では、ポリマー粒子は、２つ以上の異なるヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む。
【０１２３】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の組成物であって、前記ポリマー粒子が、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含む組成物に関する。
【０１２４】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の組成物であって、前記ポリマー粒子が、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含む組成物に関する。
【０１２５】
一実施形態では、組成物は、さらに、以下の：
１つ以上のヒト型結核菌抗原、
１つ以上のヒト型結核菌抗原結合ドメイン、
１つ以上のアジュバント、あるいは
１つ以上の免疫調節因子または分子
のうちの１つ以上を含む。
【０１２６】
本発明の別の態様は、結核に対して被験者を免疫化する方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、上記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つのヒト型結核菌抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む方法に関する。
【０１２７】
本発明の別の態様は、結核に対して被験者を免疫化する方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、上記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む方法であり、ヒト型結核菌抗原結合ドメインが少なくとも１つのヒト型結核菌抗原と結合され、被験者が少なくとも１つのヒト型結核菌抗原を含み、または被験者が少なくとも１つのヒト型結核菌抗原を投与される方法に関する。
【０１２８】
一実施形態では、ポリマー粒子は、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原を含む組成物中に存在する。
【０１２９】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つのヒト型結核菌抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む方法に関する。
【０１３０】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む方法であり、ヒト型結核菌抗原結合ドメインが少なくとも１つのヒト型結核菌抗原と結合され、被験者が少なくとも１つのヒト型結核菌抗原を含み、または被験者が少なくとも１つのヒト型結核菌抗原を投与される方法に関する。
【０１３１】
一実施形態では、少なくとも１つのポリマー粒子は、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原を含む組成物中に存在する。
【０１３２】
一実施形態では、被験者は結核に感染している。
【０１３３】
別の実施形態では、被験者は結核に対して免疫化されている。一実施形態では、被験者はカルメット・グラン桿菌（ＢＣＧ）をワクチン接種されている（World Health Organisation - http://www.who.int）。
【０１３４】
本発明の別の態様は、結核に感染した被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、ヒト型結核菌抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法に関する。
【０１３５】
一実施形態では、ヒト型結核菌抗原結合ドメインは、内因性ヒト型結核菌抗原と結合する。
【０１３６】
本発明の別の態様は、結核に対して被験者を免疫化するためのポリマー粒子であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関するが、この場合、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つは少なくとも１つのヒト型結核菌抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む。
【０１３７】
本発明の別の態様は、結核に対して被験者を免疫化するためのポリマー粒子であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関するが、この場合、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つは少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む。
【０１３８】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答を引き出すためのポリマー粒子であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関するが、この場合、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つは少なくとも１つのヒト型結核菌抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む。
【０１３９】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答を引き出すためのポリマー粒子であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関するが、この場合、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つは少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む。
【０１４０】
一実施形態では、ポリマー粒子は、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原を含む組成物中に存在する。
【０１４１】
一実施形態では、被験者は結核に感染している。
【０１４２】
別の実施形態では、被験者は結核に対して免疫化されている。例えば、被験者はカルメット・グラン桿菌（ＢＣＧ）をワクチン接種されている。
【０１４３】
本発明の別の態様は、結核に感染しているかまたは結核に対して免疫化される被験者における免疫応答を引き出すためのポリマー粒子であって、ヒト型結核菌抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含むポリマー粒子に関する。
【０１４４】
結核に対して被験者を免疫化するための、あるいは被験者、例えば結核に感染したまたは結核に対して免疫化される被験者における免疫応答を引き出すための、医薬剤の調製における上記のようなポリマー粒子の使用も、意図される。
【０１４５】
本発明の別の態様は、被験者における結核の診断方法であって、本発明の少なくとも１つのポリマー粒子を被験者に投与すること、そしてヒト型結核菌の存在を示す応答を検出することを包含する方法に関する。
【０１４６】
一実施形態では、ヒト型結核菌の存在を示す応答は、遅延型過敏応答である。
【０１４７】
本発明の別の態様は、被験者における結核の診断方法であって、被験者から得られる試料を本発明のポリマー粒子と接触させること、そしてヒト型結核菌の存在を示す応答を検出することを包含する方法に関する。
【０１４８】
一実施形態では、ヒト型結核菌の存在を示す応答は、上記試料中のヒト型結核菌に対する抗体の存在である。
【０１４９】
一実施形態では、ヒト型結核菌抗原に対する抗体の存在は、イムノアッセイにより検出される。
【０１５０】
一実施形態では、ヒト型結核菌抗原に対する抗体の存在の検出は、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ検定またはウエスタンブロットによる。
【０１５１】
一実施形態では、細胞内病原体の存在を示す応答は、上記試料中のヒト型結核菌抗原に応答性である免疫細胞の存在である。
【０１５２】
一実施形態では、ヒト型結核菌抗原に応答性である免疫細胞の存在は、細胞増殖検定、細胞選別検定、例えばＦＡＣＳ、またはin situハイブリダイゼーション検定により検出される。
【０１５３】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞を提供すること（ここで、少なくとも１つの発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列、および
肝炎抗原または肝炎抗原結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む）；
発現構築物の発現に、ならびにポリマー粒子の形成に適した条件下で宿主細胞を保持すること；そして
宿主細胞からポリマー粒子を分離すること
を包含する方法を提供する。
【０１５４】
宿主細胞が少なくとも２つの異なる発現構築物を含む一実施形態では、発現構築物のうちの少なくとも１つは、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つの肝炎抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物；または
粒子形成タンパク質および少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
アジュバントをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
少なくとも１つの肝炎抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物
からなる群から選択される。
【０１５５】
宿主細胞が少なくとも２つの異なる発現構築物を含む他の実施形態では、発現構築物のうちの少なくとも１つは、粒子形成タンパク質および少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含み、そして少なくとも１つの発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つの肝炎抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物；または
粒子形成タンパク質および少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
アジュバントをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
少なくとも１つの肝炎抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物
からなる群から選択される。
【０１５６】
一実施形態では、宿主細胞は、発現構築物の混合集団を含み、この場合、各発現構築物は融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、融合ポリペプチドは、以下の：
少なくとも１つの粒子形成タンパク質、および
少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメイン
を含む。
【０１５７】
本発明の別の態様は、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列；および
肝炎抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む一発現構築物に関する。
【０１５８】
本発明の別の態様は、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列；および
肝炎抗原結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む一発現構築物に関する。
【０１５９】
一実施形態では、発現構築物は、粒子形成タンパク質および肝炎抗原を含む融合ポリペプチドをコードする。
【０１６０】
一実施形態では、発現構築物は、粒子形成タンパク質および肝炎抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする。
【０１６１】
一実施形態では、粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列および肝炎抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列は、単一オープンリーディングフレームとして存在する。
【０１６２】
一実施形態では、粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列および肝炎抗原結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列は、単一オープンリーディングフレームとして存在する。
【０１６３】
一実施形態では、発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに
融合ポリペプチドの肝炎抗原結合ドメインを結合する少なくとも１つのポリペプチドを含む付加的ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む。
【０１６４】
一実施形態では、付加的ポリペプチドは肝炎抗原であるか、または少なくとも１つの肝炎抗原を含む。
【０１６５】
一実施形態では、付加的ポリペプチドは、粒子形成タンパク質および少なくとも１つの肝炎抗原を含む融合ポリペプチドである。
【０１６６】
一実施形態では、発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つの肝炎抗原を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに
少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインを含む付加的ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む。
【０１６７】
一実施形態では、付加的ポリペプチドは、粒子形成タンパク質および少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドである。
【０１６８】
一実施形態では、宿主細胞は、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つの肝炎抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物；または
粒子形成タンパク質および少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
アジュバントをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
少なくとも１つの肝炎抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物
からなる群から選択される発現構築物を含む。
【０１６９】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの肝炎抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関する。
【０１７０】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関する。
【０１７１】
一実施形態では、ポリマー粒子は、２つ以上の異なる肝炎抗原を含む。
【０１７２】
一実施形態では、ポリマー粒子は、２つ以上の異なるヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む。
【０１７３】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の組成物であって、前記ポリマー粒子が、少なくとも１つの肝炎抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含む組成物に関する。
【０１７４】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の組成物であって、前記ポリマー粒子が、少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含む組成物に関する。
【０１７５】
一実施形態では、組成物は、さらに、以下の：
１つ以上の肝炎抗原、
１つ以上の肝炎抗原結合ドメイン、
１つ以上のアジュバント、あるいは
１つ以上の免疫調節因子または分子
のうちの１つ以上を含む。
【０１７６】
本発明の別の態様は、肝炎に対して被験者を免疫化する方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、上記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つの肝炎抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む方法に関する。
【０１７７】
本発明の別の態様は、肝炎に対して被験者を免疫化する方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、上記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む方法であり、肝炎抗原結合ドメインが少なくとも１つの肝炎抗原と結合され、被験者が少なくとも１つの肝炎抗原を含み、または被験者が少なくとも１つの肝炎抗原を投与される方法に関する。
【０１７８】
一実施形態では、ポリマー粒子は、肝炎抗原を含む組成物中に存在する。
【０１７９】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つの肝炎抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む方法に関する。
【０１８０】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが肝炎抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む方法であり、肝炎抗原結合ドメインが少なくとも１つの肝炎抗原と結合され、被験者が少なくとも１つの肝炎抗原を含み、または被験者が少なくとも１つの肝炎抗原を投与される方法に関する。
【０１８１】
一実施形態では、少なくとも１つのポリマー粒子は、少なくとも１つの肝炎抗原を含む組成物中に存在する。
【０１８２】
一実施形態では、被験者は肝炎に感染している。
【０１８３】
別の実施形態では、被験者は肝炎に対して免疫化されている。
【０１８４】
本発明の別の態様は、肝炎に感染した被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、肝炎抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法に関する。
【０１８５】
一実施形態では、肝炎抗原結合ドメインは、内因性肝炎抗原と結合する。
【０１８６】
本発明の別の態様は、肝炎に対して被験者を免疫化するためのポリマー粒子であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関するが、この場合、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つは少なくとも１つの肝炎抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む。
【０１８７】
本発明の別の態様は、肝炎に対して被験者を免疫化するためのポリマー粒子であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関するが、この場合、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つは少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む。
【０１８８】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答を引き出すためのポリマー粒子であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関するが、この場合、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つは少なくとも１つの肝炎抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む。
【０１８９】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答を引き出すためのポリマー粒子であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関するが、この場合、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つは少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む。
【０１９０】
一実施形態では、ポリマー粒子は、少なくとも１つの肝炎抗原を含む組成物中に存在する。
【０１９１】
一実施形態では、被験者は肝炎に感染している。
【０１９２】
別の実施形態では、被験者は肝炎に対して免疫化されている。
【０１９３】
本発明の別の態様は、肝炎に感染しているかまたは肝炎に対して免疫化される被験者における免疫応答を引き出すためのポリマー粒子であって、肝炎抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含むポリマー粒子に関する。
【０１９４】
肝炎に対して被験者を免疫化するための、あるいは被験者、例えば肝炎に感染したまたは肝炎に対して免疫化される被験者における免疫応答を引き出すための、医薬剤の調製における上記のようなポリマー粒子の使用も、意図される。
【０１９５】
本発明の別の態様は、被験者における肝炎の診断方法であって、本発明の少なくとも１つのポリマー粒子を被験者に投与すること、そしてウイルス性肝炎の存在を示す応答を検出することを包含する方法に関する。
【０１９６】
一実施形態では、ウイルス性肝炎の存在を示す応答は、遅延型過敏応答である。
【０１９７】
本発明の別の態様は、被験者における肝炎の診断方法であって、被験者から得られる試料を本発明のポリマー粒子と接触させること、そしてウイルス性肝炎の存在を示す応答を検出することを包含する方法に関する。
【０１９８】
一実施形態では、ウイルス性肝炎の存在を示す応答は、上記試料中のウイルス性肝炎に対する抗体の存在である。
【０１９９】
一実施形態では、肝炎抗原に対する抗体の存在は、イムノアッセイにより検出される。
【０２００】
一実施形態では、ウイルス性肝炎抗原に対する抗体の存在の検出は、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ検定またはウエスタンブロットによる。
【０２０１】
一実施形態では、細胞内病原体の存在を示す応答は、上記試料中の肝炎抗原に応答性である免疫細胞の存在である。
【０２０２】
一実施形態では、ウイルス性肝炎抗原に応答性である免疫細胞の存在は、細胞増殖検定、細胞選別検定、例えばＦＡＣＳ、またはin situハイブリダイゼーション検定により検出される。
【０２０３】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞を提供すること（ここで、少なくとも１つの発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列、および
インフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む）；
発現構築物の発現に、ならびにポリマー粒子の形成に適した条件下で宿主細胞を保持すること；そして
宿主細胞からポリマー粒子を分離すること
を包含する方法を提供する。
【０２０４】
宿主細胞が少なくとも２つの異なる発現構築物を含むいくつかの実施形態では、発現構築物のうちの少なくとも１つは、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのインフルエンザ抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物；または
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
アジュバントをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
少なくとも１つのインフルエンザ抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物
からなる群から選択される。
【０２０５】
宿主細胞が少なくとも２つの異なる発現構築物を含む他の実施形態では、発現構築物のうちの少なくとも１つは、粒子形成タンパク質および少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含み、そして少なくとも１つの発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのインフルエンザ抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物；または
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
アジュバントをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
少なくとも１つのインフルエンザ抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物
からなる群から選択される。
【０２０６】
一実施形態では、宿主細胞は、発現構築物の混合集団を含み、この場合、各発現構築物は融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、融合ポリペプチドは、以下の：
少なくとも１つの粒子形成タンパク質、および
少なくとも１つのインフルエンザ抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメイン
を含む。
【０２０７】
本発明の別の態様は、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列；および
インフルエンザ抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む一発現構築物に関する。
【０２０８】
本発明の別の態様は、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列；および
インフルエンザ抗原結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む一発現構築物に関する。
【０２０９】
一実施形態では、発現構築物は、粒子形成タンパク質およびインフルエンザ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする。
【０２１０】
一実施形態では、発現構築物は、粒子形成タンパク質およびインフルエンザ抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする。
【０２１１】
一実施形態では、粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列およびインフルエンザ抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列は、単一オープンリーディングフレームとして存在する。
【０２１２】
一実施形態では、粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列およびインフルエンザ抗原結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列は、単一オープンリーディングフレームとして存在する。
【０２１３】
一実施形態では、発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに
融合ポリペプチドのインフルエンザ抗原結合ドメインを結合する少なくとも１つのポリペプチドを含む付加的ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む。
【０２１４】
一実施形態では、付加的ポリペプチドはインフルエンザ抗原であるか、または少なくとも１つのインフルエンザ抗原を含む。
【０２１５】
一実施形態では、付加的ポリペプチドは、粒子形成タンパク質および少なくとも１つのインフルエンザ抗原を含む融合ポリペプチドである。
【０２１６】
一実施形態では、発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのインフルエンザ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに
少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインを含む付加的ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む。
【０２１７】
一実施形態では、付加的ポリペプチドは、粒子形成タンパク質および少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドである。
【０２１８】
一実施形態では、宿主細胞は、以下の：
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのインフルエンザ抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物；または
粒子形成タンパク質および少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
アジュバントをコードする核酸配列を含む発現構築物；または
少なくとも１つのインフルエンザ抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物
からなる群から選択される発現構築物を含む。
【０２１９】
本発明の別の態様は、少なくとも１つのインフルエンザ抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関する。
【０２２０】
本発明の別の態様は、少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関する。
【０２２１】
一実施形態では、ポリマー粒子は、２つ以上の異なるインフルエンザ抗原を含む。
【０２２２】
一実施形態では、ポリマー粒子は、２つ以上の異なるヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む。
【０２２３】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の組成物であって、前記ポリマー粒子が、少なくとも１つのインフルエンザ抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含む組成物に関する。
【０２２４】
本発明の別の態様は、ポリマー粒子の組成物であって、前記ポリマー粒子が、少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む１つ以上の融合ポリペプチドを含む組成物に関する。
【０２２５】
一実施形態では、組成物は、さらに、以下の：
１つ以上のインフルエンザ抗原、
１つ以上のインフルエンザ抗原結合ドメイン、
１つ以上のアジュバント、あるいは
１つ以上の免疫調節因子または分子
のうちの１つ以上を含む。
【０２２６】
本発明の別の態様は、インフルエンザに対して被験者を免疫化する方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、上記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つのインフルエンザ抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む方法に関する。
【０２２７】
本発明の別の態様は、インフルエンザに対して被験者を免疫化する方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、上記融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む方法であり、インフルエンザ抗原結合ドメインが少なくとも１つのインフルエンザ抗原と結合され、被験者が少なくとも１つのインフルエンザ抗原を含み、または被験者が少なくとも１つのインフルエンザ抗原を投与される方法に関する。
【０２２８】
一実施形態では、ポリマー粒子は、インフルエンザ抗原を含む組成物中に存在する。
【０２２９】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つが少なくとも１つのインフルエンザ抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む方法に関する。
【０２３０】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、１つ以上の融合ポリペプチドを含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法であり、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つがインフルエンザ抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む方法であり、インフルエンザ抗原結合ドメインが少なくとも１つのインフルエンザ抗原と結合され、被験者が少なくとも１つのインフルエンザ抗原を含み、または被験者が少なくとも１つのインフルエンザ抗原を投与される方法に関する。
【０２３１】
一実施形態では、少なくとも１つのポリマー粒子は、少なくとも１つのインフルエンザ抗原を含む組成物中に存在する。
【０２３２】
一実施形態では、被験者はインフルエンザに感染している。
【０２３３】
別の実施形態では、被験者はインフルエンザに対して免疫化されている。
【０２３４】
本発明の別の態様は、インフルエンザに感染した被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、インフルエンザ抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む少なくとも１つのポリマー粒子を投与することを包含する方法に関する。
【０２３５】
一実施形態では、インフルエンザ抗原結合ドメインは、内因性インフルエンザ抗原と結合する。
【０２３６】
本発明の別の態様は、インフルエンザに対して被験者を免疫化するためのポリマー粒子であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関するが、この場合、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つは少なくとも１つのインフルエンザ抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む。
【０２３７】
本発明の別の態様は、インフルエンザに対して被験者を免疫化するためのポリマー粒子であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関するが、この場合、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つは少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む。
【０２３８】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答を引き出すためのポリマー粒子であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関するが、この場合、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つは少なくとも１つのインフルエンザ抗原と融合される粒子形成タンパク質を含む。
【０２３９】
本発明の別の態様は、被験者における免疫応答を引き出すためのポリマー粒子であって、１つ以上の融合ポリペプチドを含むポリマー粒子に関するが、この場合、融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つは少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含む。
【０２４０】
一実施形態では、ポリマー粒子は、少なくとも１つのインフルエンザ抗原を含む組成物中に存在する。
【０２４１】
一実施形態では、被験者はインフルエンザに感染している。
【０２４２】
別の実施形態では、被験者はインフルエンザに対して免疫化されている。
【０２４３】
本発明の別の態様は、インフルエンザに感染しているかまたはインフルエンザに対して免疫化される被験者における免疫応答を引き出すためのポリマー粒子であって、インフルエンザ抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含むポリマー粒子に関する。
【０２４４】
インフルエンザに対して被験者を免疫化するための、あるいは被験者、例えばインフルエンザに感染したまたはインフルエンザに対して免疫化される被験者における免疫応答を引き出すための、医薬剤の調製における上記のようなポリマー粒子の使用も、意図される。
【０２４５】
本発明の別の態様は、被験者におけるインフルエンザの診断方法であって、本発明の少なくとも１つのポリマー粒子を被験者に投与すること、そしてインフルエンザウイルスの存在を示す応答を検出することを包含する方法に関する。
【０２４６】
一実施形態では、インフルエンザウイルスの存在を示す応答は、遅延型過敏応答である。
【０２４７】
本発明の別の態様は、被験者におけるインフルエンザの診断方法であって、被験者から得られる試料を本発明のポリマー粒子と接触させること、そしてインフルエンザウイルスの存在を示す応答を検出することを包含する方法に関する。
【０２４８】
一実施形態では、インフルエンザウイルスの存在を示す応答は、上記試料中のインフルエンザに対する抗体の存在である。
【０２４９】
一実施形態では、インフルエンザ抗原に対する抗体の存在は、イムノアッセイにより検出される。
【０２５０】
一実施形態では、インフルエンザ抗原に対する抗体の存在の検出は、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ検定またはウエスタンブロットによる。
【０２５１】
一実施形態では、細胞内病原体の存在を示す応答は、上記試料中のインフルエンザ抗原に応答性である免疫細胞の存在である。
【０２５２】
一実施形態では、インフルエンザ抗原に応答性である免疫細胞の存在は、細胞増殖検定、細胞選別検定、例えばＦＡＣＳ、またはin situハイブリダイゼーション検定により検出される。
【０２５３】
以下の実施形態は、上記の態様のいずれかに関連し得る。
【０２５４】
種々の実施形態において、粒子形成タンパク質はポリマーシンターゼである。
【０２５５】
種々の実施形態において、ポリマー粒子は、ポリ−ベータ−アミノ酸、ポリラクテート、ポリチオエステルおよびポリエステルから選択されるポリマーを含む。最も好ましくは、ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、好ましくはポリ（３−ヒドロキシブチラート）（ＰＨＢ）を含む。
【０２５６】
種々の実施形態において、ポリマー粒子は、リン脂質単層により被包されるポリマー粒子である。
【０２５７】
種々の実施形態において、ポリマー粒子は、２つ以上の異なる融合ポリペプチドを含む。
【０２５８】
種々の実施形態において、ポリマー粒子は、ポリマー粒子表面上の２つ以上の異なる融合ポリペプチドを含む。
【０２５９】
種々の実施形態において、ポリマー粒子は、３つ以上の異なる融合ポリペプチド、例えばポリマー粒子表面上の３つ以上の異なる融合ポリペプチドを含む。
【０２６０】
種々の実施形態において、ポリマー粒子は、ポリマー粒子に結合されるかまたは組入れられる、あるいはその組合せの少なくとも１つの物質をさらに含む。
【０２６１】
種々の実施形態において、物質は、抗原またはアジュバントまたは免疫刺激分子である。
【０２６２】
種々の実施形態において、物質は架橋によりポリマー粒子に結合される。
【０２６３】
種々の実施形態において、ポリマーシンターゼは、ポリマー粒子と、またはリン脂質単層と結合されるか、あるいはその両方と結合される。
【０２６４】
種々の実施形態において、ポリマーシンターゼは、それが形成するポリマー粒子と共有的にまたは非共有的に結合される。
【０２６５】
種々の実施形態において、ポリマーシンターゼは、クラス１属  アシネトバクター属、ビブリオ属、アエロモナス属、クロモバクテリウム属、シュードモナス属、ズーグレア属、アルカリゲネス属、デルフチア属、ブルクホルデリア属、ラルストニア属、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ロドバクター属、パラコッカス属、リケッチア属、カルロバクター属、メチロバクテリウム属、アゾリゾビウム属、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、シノリゾビウム属、リケッチア属、クレンアーケオータ属、シネコシスチス属、エコチオロドスピラ属、チオカプサ属、チオシスチス属およびアロクロマチウム属、クラス２属  ブルクホルデリア属およびシュードモナス、あるいはクラス４属  バシラス属から、さらに好ましくはクラス１  アシネトバクター種  ＲＡ３８４９、コレラ菌、腸炎ビブリオ、アエロモナス・プンクタータ  ＦＡ４４０、アエロモナス・ヒドロフィラ、クロモバクテリウム・ビオラセウム、シュードモナス種  ６１−３、ズーグレア・ラミゲラ、アルカリゲネス・ラツス、アルカリゲネス種  ＳＨ−６９、デルフチア・アシドボランス、ブルクホルデリア種  ＤＳＭＺ９２４２、ラルストニア・ユートロフィア  Ｈ１６、ブルクホルデリア・セパシア、ロドコッカス・ラバー  ＰＰ２、ゴルドニア・ルブリペルチンクツス、発疹チフスリケッチア  ９１１１、アロクロマチウム・ビノスムＤ、チオシスチス・ビオラセア  ２３１１、ロドバクター・スフェロイデス、脱窒菌、光合成細菌、カウロバクター・クレセンツス、メチロバクテリウム・エクストルクエンス、アゾリゾビウム・カウリノダンス、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、シノリゾビウム・メリロチ  ４１、ロドスピリルム・ルブルム  ＨＡおよびロドスピリルム・ルブルム  ＡＴＣＣ２５９０３、クラス２  ブルクホルデリア・カリオフィリ、シュードモナス・クロラフィス、シュードモナス種  ６１−３、シュードモナス・プチダ  Ｕ、シュードモナス・オレオボランス、緑膿菌、シュードモナス・レシノボランス、シュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・メンドシナ、シュードモナス・シュードルカリゲネス、シュードモナス・プチダ  ＢＭ０１、シュードモナス・ニトロレデュッシンス、シュードモナス・クロラフィス、およびクラス４  バシラス・メガテリウムおよびバシラス種  ＩＮＴ００５からなる群からのＰＨＡシンターゼである。
【０２６６】
他の実施形態では、ポリマーシンターゼは、グラム陰性およびグラム陽性真正細菌から、または古細菌からのＰＨＡポリマーシンターゼである。
【０２６７】
種々の例において、ポリマーシンターゼは、クプリアビダス・ネカトール、緑膿菌、紅色硫黄光合成細菌、巨大菌Bacillus megaterium、ハロアルクラ・マリスモルツイ、シュードモナス・アウレオファシエンスまたはシュードモナス・プチダ（これらは、それぞれ、寄託番号ＡＹ８３６６８０、ＡＥ００４０９１、ＡＢ２０５１０４、ＡＦ１０９９０９、ＹＰ１３７３３９、ＡＢ０４９４１３およびＡＦ１５０６７０を有する）からのＰＨＡポリマーシンターゼを含み得る。
【０２６８】
本発明に用い易い他のポリマーシンターゼとしては、各々、その寄託番号により同定される以下の生物体からのポリマーシンターゼが挙げられる：ラルストニア・ユートロファ（Ａ３４３４１）、チオコッカス・フェニジイ（Ｘ９３５９９）、アエロモナス・プンクタータ（Ｏ３２４７２）、シュードモナス種  ６１−３（ＡＢ０１４７５７およびＡＢ０１４７５８）、ロドバクター・スフェロイデス（ＡＡＡ７２００４）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（ＡＡＣ６９６１５）、アルカニボラックス・ボルクメンシス  ＳＫ２（ＣＡＬ１７６６２）、アルカニボラックス・ボルクメンシス  ＳＫ２（ＣＡＬ１６８６６）、ロドバクター・スフェロイデス  ＫＤ１３１（ＡＣＭ０１５７１およびＹＰ００２５２６０７２）、ロドコッカス・オパクス  Ｂ４（ＢＡＨ５１８８０およびＹＰ００２７８０８２５）、ブルクホルデリア・マルチボランス  ＡＴＣＣ  １７６１６（ＹＰ００１９４６２１５およびＢＡＧ４３６７９）、アルカニボラックス・ボルクメンシス  ＳＫ２（ＹＰ６９３９３４およびＹＰ６９３１３８）、ロドスピリルム・ルブルム（ＡＡＤ５３１７９）、ガンマプロテオバクテリア  ＨＴＣＣ５０１５（ＺＰ０５０６１６６１およびＥＤＹ８６６０６）、アゾアルクス種  ＢＨ７２（ＹＰ９３２５２５）、クロモバクテリウム・ビオラセウム  ＡＴＣＣ  １２４７２（ＮＰ９０２４５９）、リムノバクター種  ＭＥＤ１０５（ＺＰ０１９１５８３８およびＥＤＭ８２８６７）、マリノバクター・アルギコーラ  ＤＧ８９３（ＺＰ０１８９５９２２およびＥＤＭ４６００４）、ロドバクター・スフェロイデス（ＣＡＡ６５８３３）、クロモバクテリウム・ビオラセウム  ＡＴＣＣ  １２４７２（ＡＡＱ６０４５７）、アルカリゲネス・ラツス（ＡＡＤ１０２７４、ＡＡＤ０１２０９およびＡＡＣ８３６５８）、ステノトロホモナス・マルトフィリア  Ｋ２７９ａ（ＣＡＱ４６４１８およびＹＰ００１９７２７１２）、ラルストニア・ソラナセラム  ＩＰＯ１６０９（ＣＡＱ５９９７５およびＹＰ００２２５８０８０）、ブルクホルデリア・マルチボランス  ＡＴＣＣ  １７６１６（ＹＰ００１９４１４４８およびＢＡＧ４７４５８）、シュードモナス種  ｇｌ１３（ＡＣＪ０２４００）、シュードモナス種  ｇｌ０６（ＡＣＪ０２３９９）、シュードモナス種  ｇｌ０１（ＡＣＪ０２３９８）、Ｒ．種  ｇｌ３２（ＡＣＪ０２３９７）、リゾビウム・レグミノサルム  ｂｖ．ビシアエ  ３８４１（ＣＡＫ１０３２９およびＹＰ７７０３９０）、アゾアルクス種  ＢＨ７２（ＣＡＬ９３６３８）、シュードモナス種  ＬＤＣ−５（ＡＡＶ３６５１０）、ルチエラ・ニトロフェルム  ２００２（ＺＰ０３６９８１７９）、サウエラ種  ＭＺ１Ｔ（ＹＰ００２８９００９８およびＡＣＲ０１７２１）、メチロバクテリウム・ラジオトレランス  ＪＣＭ  ２８３１（ＹＰ００１７５５０７８およびＡＣＢ２４３９５）、メチロバクテリウム種  ４−４６（ＹＰ００１７６７７６９およびＡＣＡ１５３３５）、ルチエラ・ニトロフェルム  ２００２（ＥＥＧ０８９２１）、脱窒菌（ＢＡＡ７７２５７）、マグネトスピリルム・グリフィスワルデンス（ＡＢＧ２３０１８）、シュードモナス種  ＵＳＭ４−５５（ＡＢＸ６４４３５およびＡＢＸ６４４３��）、アエロモナス・ヒドロフィラ（ＡＡＴ７７２６１およびＡＡＴ７７２５８）、バシラス種  ＩＮＴ００５（ＢＡＣ４５２３２およびＢＡＣ４５２３０）、シュードモナス・プチダ（ＡＡＭ６３４０９およびＡＡＭ６３４０７）、ゴルドニア・ルブリペルチンクツス（ＡＡＢ９４０５８）、巨大菌（ＡＡＤ０５２６０）、デルフチア・アシドボランス（ＢＡＡ３３１５５）、パラコッカス・セリニフィルス（ＡＣＭ６８６６２）、シュードモナス種  １４−３（ＣＡＫ１８９０４）、シュードモナス種  ＬＤＣ−５（ＡＡＸ１８６９０）、シュードモナス種  ＰＣ１７（ＡＢＶ２５７０６）、シュードモナス種  ３Ｙ２（ＡＡＶ３５４３１、ＡＡＶ３５４２９およびＡＡＶ３５４２６）、シュードモナス・メンドシナ（ＡＡＭ１０５４６およびＡＡＭ１０５４４）、シュードモナス・ニトロレデュッシンス（ＡＡＫ１９６０８）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（ＡＡＫ１９６０５）、シュードモナス・レシノボランス（ＡＡＤ２６３６７およびＡＡＤ２６３６５）、シュードモナス種  ＵＳＭ７−７（ＡＣＭ９０５２３およびＡＣＭ９０５２２）、シュードモナス・フルオレッセンス（ＡＡＰ５８４８０）、ならびにその他の非培養細菌（ＢＡＥ０２８８１、ＢＡＥ０２８８０、ＢＡＥ０２８７９、ＢＡＥ０２８７８、ＢＡＥ０２８７７、ＢＡＥ０２８７６、ＢＡＥ０２８７５、ＢＡＥ０２８７４、ＢＡＥ０２８７３、ＢＡＥ０２８７２、ＢＡＥ０２８７１、ＢＡＥ０２８７０、ＢＡＥ０２８６９、ＢＡＥ０２８６８、ＢＡＥ０２８６７、ＢＡＥ０２８６、ＢＡＥ０２８６５、ＢＡＥ０２８６４、ＢＡＥ０２８６３、ＢＡＥ０２８６２、ＢＡＥ０２８６１、ＢＡＥ０２８６０、ＢＡＥ０２８５９、ＢＡＥ０２８５８、ＢＡＥ０２８５７、ＢＡＥ０７１４６、ＢＡＥ０７１４５、ＢＡＥ０７１４４、ＢＡＥ０７１４３、ＢＡＥ０７１４２、ＢＡＥ０７１４１、ＢＡＥ０７１４０、ＢＡＥ０７１３９、ＢＡＥ０７１３８、ＢＡＥ０７１３７、ＢＡＥ０７１３６、ＢＡＥ０７１３５、ＢＡＥ０７１３４、ＢＡＥ０７１３３、ＢＡＥ０７１３２、ＢＡＥ０７１３１、ＢＡＥ０７１３０、ＢＡＥ０７１２９、ＢＡＥ０７１２８、ＢＡＥ０７１２７、ＢＡＥ０７１２６、ＢＡＥ０７１２５、ＢＡＥ０７１２４、ＢＡＥ０７１２３、ＢＡＥ０７１２２、ＢＡＥ０７１２１、ＢＡＥ０７１２０、ＢＡＥ０７１１９、ＢＡＥ０７１１８、ＢＡＥ０７１１７、ＢＡＥ０７１１６、ＢＡＥ０７１１５、ＢＡＥ０７１１４、ＢＡＥ０７１１３、ＢＡＥ０７１１２、ＢＡＥ０７１１１、ＢＡＥ０７１１０、ＢＡＥ０７１０９、ＢＡＥ０７１０８、ＢＡＥ０７１０７、ＢＡＥ０７１０６、ＢＡＥ０７１０５、ＢＡＥ０７１０４、ＢＡＥ０７１０３、ＢＡＥ０７１０２、ＢＡＥ０７１０１、ＢＡＥ０７１００、ＢＡＥ０７０９９、ＢＡＥ０７０９８、ＢＡＥ０７０９７、ＢＡＥ０７０９６、ＢＡＥ０７０９５、ＢＡＥ０７０９４、ＢＡＥ０７０９３、ＢＡＥ０７０９２、ＢＡＥ０７０９１、ＢＡＥ０７０９０、ＢＡＥ０７０８９、ＢＡＥ０７０８８、ＢＡＥ０７０５３、ＢＡＥ０７０５２、ＢＡＥ０７０５１、ＢＡＥ０７０５０、ＢＡＥ０７０４９、ＢＡＥ０７０４８、ＢＡＥ０７０４７、ＢＡＥ０７０４６、ＢＡＥ０７０４５、ＢＡＥ０７０４４、ＢＡ��０７０４３、ＢＡＥ０７０４２、ＢＡＥ０７０４１、ＢＡＥ０７０４０、ＢＡＥ０７０３９、ＢＡＥ０７０３８、ＢＡＥ０７０３７、ＢＡＥ０７０３６、ＢＡＥ０７０３５、ＢＡＥ０７０３４、ＢＡＥ０７０３３、ＢＡＥ０７０３２、ＢＡＥ０７０３１、ＢＡＥ０７０３０、ＢＡＥ０７０２９、ＢＡＥ０７０２８、ＢＡＥ０７０２７、ＢＡＥ０７０２６、ＢＡＥ０７０２５、ＢＡＥ０７０２４、ＢＡＥ０７０２３、ＢＡＥ０７０２２、ＢＡＥ０７０２１、ＢＡＥ０７０２０、ＢＡＥ０７０１９、ＢＡＥ０７０１８、ＢＡＥ０７０１７、ＢＡＥ０７０１６、ＢＡＥ０７０１５、ＢＡＥ０７０１４、ＢＡＥ０７０１３、ＢＡＥ０７０１２、ＢＡＥ０７０１１、ＢＡＥ０７０１０、ＢＡＥ０７００９、ＢＡＥ０７００８、ＢＡＥ０７００７、ＢＡＥ０７００６、ＢＡＥ０７００５、ＢＡＥ０７００４、ＢＡＥ０７００３、ＢＡＥ０７００２、ＢＡＥ０７００１、ＢＡＥ０７０００、ＢＡＥ０６９９９、ＢＡＥ０６９９８、ＢＡＥ０６９９７、ＢＡＥ０６９９６、ＢＡＥ０６９９５、ＢＡＥ０６９９４、ＢＡＥ０６９９３、ＢＡＥ０６９９２、ＢＡＥ０６９９１、ＢＡＥ０６９９０、ＢＡＥ０６９８９、ＢＡＥ０６９８８、ＢＡＥ０６９８７、ＢＡＥ０６９８６、ＢＡＥ０６９８５、ＢＡＥ０６９８４、ＢＡＥ０６９８３、ＢＡＥ０６９８２、ＢＡＥ０６９８１、ＢＡＥ０６９８０、ＢＡＥ０６９７９、ＢＡＥ０６９７８、ＢＡＥ０６９７７、ＢＡＥ０６９７６、ＢＡＥ０６９７５、ＢＡＥ０６９７４、ＢＡＥ０６９７３、ＢＡＥ０６９７２、ＢＡＥ０６９７１、ＢＡＥ０６９７０、ＢＡＥ０６９６９、ＢＡＥ０６９６８、ＢＡＥ０６９６７、ＢＡＥ０６９６６、ＢＡＥ０６９６５、ＢＡＥ０６９６４、ＢＡＥ０６９６３、ＢＡＥ０６９６２、ＢＡＥ０６９６１、ＢＡＥ０６９６０、ＢＡＥ０６９５９、ＢＡＥ０６９５８、ＢＡＥ０６９５７、ＢＡＥ０６９５６、ＢＡＥ０６９５５、ＢＡＥ０６９５４、ＢＡＥ０６９５３、ＢＡＥ０６９５２、ＢＡＥ０６９５１、ＢＡＥ０６９５０、ＢＡＥ０６９４９、ＢＡＥ０６９４８、ＢＡＥ０６９４７、ＢＡＥ０６９４６、ＢＡＥ０６９４５、ＢＡＥ０６９４４、ＢＡＥ０６９４３、ＢＡＥ０６９４２、ＢＡＥ０６９４１、ＢＡＥ０６９４０、ＢＡＥ０６９３９、ＢＡＥ０６９３８、ＢＡＥ０６９３７、ＢＡＥ０６９３６、ＢＡＥ０６９３５、ＢＡＥ０６９３４、ＢＡＥ０６９３３、ＢＡＥ０６９３２、ＢＡＥ０６９３１、ＢＡＥ０６９３０、ＢＡＥ０６９２９、ＢＡＥ０６９２８、ＢＡＥ０６９２７、ＢＡＥ０６９２６、ＢＡＥ０６９２５、ＢＡＥ０６９２４、ＢＡＥ０６９２３、ＢＡＥ０６９２２、ＢＡＥ０６９２１、ＢＡＥ０６９２０、ＢＡＥ０６９１９、ＢＡＥ０６９１８、ＢＡＥ０６９１７、ＢＡＥ０６９１６、ＢＡＥ０６９１５、ＢＡＥ０６９１４、ＢＡＥ０６９１３、ＢＡＥ０６９１２、ＢＡＥ０６９１１、ＢＡＥ０６９１０、ＢＡＥ０６９０９、ＢＡＥ０６９０８、ＢＡＥ０６９０７、ＢＡＥ０６９０６、ＢＡＥ０６９０５、ＢＡＥ０６９０４、ＢＡＥ０６９０３、ＢＡＥ０６９０２、ＢＡＥ０６９０１、ＢＡＥ０６９００、ＢＡＥ０６８９９、ＢＡＥ０６８９８、ＢＡＥ０６８９７、ＢＡＥ０６８９６、ＢＡＥ０６８９５、ＢＡＥ０６８９４、ＢＡＥ０６８９３、ＢＡＥ０６８９２��ＢＡＥ０６８９１、ＢＡＥ０６８９０、ＢＡＥ０６８８９、ＢＡＥ０６８８８、ＢＡＥ０６８８７、ＢＡＥ０６８８６、ＢＡＥ０６８８５、ＢＡＥ０６８８４、ＢＡＥ０６８８３、ＢＡＥ０６８８２、ＢＡＥ０６８８１、ＢＡＥ０６８８０、ＢＡＥ０６８７９、ＢＡＥ０６８７８、ＢＡＥ０６８７７、ＢＡＥ０６８７６、ＢＡＥ０６８７５、ＢＡＥ０６８７４、ＢＡＥ０６８７３、ＢＡＥ０６８７２、ＢＡＥ０６８７１、ＢＡＥ０６８７０、ＢＡＥ０６８６９、ＢＡＥ０６８６８、ＢＡＥ０６８６７、ＢＡＥ０６８６６、ＢＡＥ０６８６５、ＢＡＥ０６８６４、ＢＡＥ０６８６３、ＢＡＥ０６８６２、ＢＡＥ０６８６１、ＢＡＥ０６８６０、ＢＡＥ０６８５９、ＢＡＥ０６８５８、ＢＡＥ０６８５７、ＢＡＥ０６８５６、ＢＡＥ０６８５５、ＢＡＥ０６８５４、ＢＡＥ０６８５３  ａｎｄ  ＢＡＥ０６８５２）。
【０２６９】
種々の実施形態において、ポリマーシンターゼは、基質（Ｒ）−ヒドロキシアシル−ＣｏＡまたは他のＣｏＡチオエステルまたはその誘導体を重合するかまたは重合を助長することにより、ポリマー粒子のin vitro産生のために用いられ得る。
【０２７０】
種々の実施形態において、基質または基質混合物は、少なくとも１つの任意置換アミノ酸、ラクテート、エステル、あるいは飽和または不飽和脂肪酸、好ましくはアセチル−ＣｏＡを含む。
【０２７１】
種々の実施形態において、発現構築物は高コピー数ベクター中である。
【０２７２】
種々の実施形態において、発現構築物は、付加的ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。
【０２７３】
種々の実施形態において、構築物は、以下の：
ｉ．  少なくとも１つのチオラーゼ、または
ｉｉ．  少なくとも１つのレダクターゼ、または
ｉｉｉ．  （ｉ）および（ｉｉ）の両方
をコードする核酸をさらに含む。
【０２７４】
種々の実施形態において、構築物は、以下の：
ｉ．  少なくとも１つのチオラーゼ、または
ｉｉ．  少なくとも１つのレダクターゼ、または
ｉｉｉ．  少なくとも１つのポリマーシンターゼ、または
ｉｖ．  免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原、または
ｖ．  免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメイン、または
ｖｉ．  上記ｉ）〜ｖ）のうちの１つ以上を含む融合タンパク質、または
ｖｉｉ．  上記ｉ）〜ｖｉ）の任意の組合せ
をコードする核酸を含む。
【０２７５】
種々の実施形態において、構築物は、以下の：
ｉ．  少なくとも１つのチオラーゼ、または
ｉｉ．  少なくとも１つのレダクターゼ、または
ｉｉｉ．  少なくとも１つのポリマーシンターゼ、または
ｉｖ．  細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原、または
ｖ．  細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る少なくとも１つの結合ドメイン、または
ｖｉ．  上記ｉ）〜ｖ）のうちの１つ以上を含む融合タンパク質、または
ｖｉｉ．  上記ｉ）〜ｖｉ）の任意の組合せ
をコードする核酸を含む。
【０２７６】
種々の実施形態において、粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列は、強プロモーターと操作可能的に連結される。
【０２７７】
種々の実施形態において、強プロモーターは、ウイルスプロモーターまたはファージプロモーターである。
【０２７８】
種々の実施形態において、プロモーターは、ファージプロモーター、例えばＴ７ファージプロモーターである。
【０２７９】
種々の実施形態において、宿主細胞は、粒子形成タンパク質の基質、好ましくは、存在する場合、ポリマーシンターゼの基質、または基質混合物、例えば単量体基質、または宿主により代謝されて粒子形成タンパク質の基質を形成し得る前駆体基質の存在下で保持される。
【０２８０】
種々の実施形態において、宿主細胞は、少なくとも２つの異なる発現構築物を含む。
【０２８１】
宿主細胞が少なくとも２つの異なる発現構築物を含む種々の実施形態において、発現構築物のうちの１つは、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする核酸配列を含む発現構築物；または
粒子細部決定タンパク質をコードする核酸配列を含む発現構築物；または
ポリマー調節因子をコードする核酸配列を含む発現構築物
からなる群から選択される。
【０２８２】
種々の実施形態において、融合ポリペプチドをコードする核酸配列は、以下の：
被験者における細胞媒介性応答を引き出し得る抗原、または被験者における細胞媒介性応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする核酸配列（粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼをコードする核酸配列の５’または３’末端と連続する）；あるいは
被験者における細胞媒介性応答を引き出し得る抗原、または被験者における細胞媒介性応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする核酸配列（粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼをコードする核酸配列の５’または３’末端と、所望の長さのポリヌクレオチドリンカーまたはスペーサー配列を介して間接的に融合される）；あるいは
被験者における細胞媒介性応答を引き出し得る抗原、または被験者における細胞媒介性応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする核酸配列（粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼをコードする核酸配列中に、任意に、所望の長さのポリヌクレオチドリンカーまたはスペーサー配列を介して挿入される）；あるいは
被験者における細胞媒介性応答を引き出し得る抗原、または被験者における細胞媒介性応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする核酸配列と、粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼをコードする核酸配列との間に間隔を置いて配置されるプロテアーゼ切断部位をコードする核酸配列；あるいは
細胞媒介性応答を引き出し得る抗原、または細胞媒介性応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする核酸配列と、粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼをコードする核酸配列との間に間隔を置いて配置される自己スプライシング素子をコードする核酸配列；あるいは
２つ以上のその任意の組合せ
を含む。
【０２８３】
種々の実施形態において、少なくとも１つの融合ポリペプチドは、以下の：
細胞媒介性応答を引き出し得る抗原を含むか、または細胞媒介性応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインを含むアミノ酸配列（粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼを含むアミノ酸配列のＮまたはＣ末端と連続する）；あるいは
細胞媒介性応答を引き出し得る抗原を含むか、または細胞媒介性応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインを含むアミノ酸配列（粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼを含むアミノ酸配列のＮまたはＣ末端と、所望の長さのペプチドリンカーまたはスペーサー配列を介して間接的に融合される）；あるいは
細胞媒介性応答を引き出し得る抗原、または細胞媒介性応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインを含むアミノ酸配列（粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼを含むアミノ酸配列中に、所望の長さのペプチドリンカーまたはスペーサー配列を介して挿入される）；あるいは
細胞媒介性応答を引き出し得る抗原、または細胞媒介性応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインを含むアミノ酸配列と、粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼをコードするアミノ酸配列との間に間隔を置いて配置されるプロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸配列；あるいは
細胞媒介性応答を引き出し得る抗原、または細胞媒介性応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインを含むアミノ酸配列と、粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼをコードするアミノ酸配列との間に間隔を置いて配置される自己スプライシング素子を含むアミノ酸配列；あるいは
２つ以上のその任意の組合せ
を含む。
【０２８４】
種々の実施形態において、融合ポリペプチドをコードする核酸配列は、以下の：
ヒト型結核菌抗原、またはヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする核酸配列（粒子形成タンパク質をコードする核酸配列の５’または３’末端と連続する）；あるいは
ヒト型結核菌抗原、またはヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする核酸配列（粒子形成タンパク質をコードする核酸配列の５’または３’末端と、所望の長さのポリヌクレオチドリンカーまたはスペーサー配列を介して間接的に融合される）；あるいは
ヒト型結核菌抗原、またはヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする核酸配列（粒子形成タンパク質をコードする核酸配列中に、任意に、所望の長さのポリヌクレオチドリンカーまたはスペーサー配列を介して挿入される）；あるいは
ヒト型結核菌抗原、またはヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする核酸配列と、粒子形成タンパク質をコードする核酸配列との間に間隔を置いて配置されるプロテアーゼ切断部位をコードする核酸配列；あるいは
ヒト型結核菌抗原、またはヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする核酸配列と、粒子形成タンパク質をコードする核酸配列との間に間隔を置いて配置される自己スプライシング素子をコードする核酸配列；あるいは
２つ以上のその任意の組合せ
を含む。
【０２８５】
種々の実施形態において、少なくとも１つの融合ポリペプチドは、以下の：
ヒト型結核菌抗原、またはヒト型結核菌抗原結合ドメインを含むアミノ酸配列（粒子形成タンパク質を含むアミノ酸配列のＮまたはＣ末端と連続する）；あるいは
ヒト型結核菌抗原、またはヒト型結核菌抗原結合ドメインを含むアミノ酸配列（粒子形成タンパク質を含むアミノ酸配列のＮまたはＣ末端と、所望の長さのペプチドリンカーまたはスペーサー配列を介して間接的に融合される）；あるいは
ヒト型結核菌抗原、またはヒト型結核菌抗原結合ドメインを含むアミノ酸配列（粒子形成タンパク質を含むアミノ酸配列中に、所望の長さのペプチドリンカーまたはスペーサー配列を介して挿入される）；あるいは
ヒト型結核菌抗原、またはヒト型結核菌抗原結合ドメインを含むアミノ酸配列と、粒子形成タンパク質をコードするアミノ酸配列との間に間隔を置いて配置されるプロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸配列；あるいは
ヒト型結核菌抗原、またはヒト型結核菌抗原結合ドメインを含むアミノ酸配列と、粒子形成タンパク質をコードするアミノ酸配列との間に間隔を置いて配置される自己スプライシング素子を含むアミノ酸配列；あるいは
２つ以上のその任意の組合せ
を含む。
【０２８６】
種々の実施形態において、発現構築物は、構成性または調節可能プロモーター系を含む。
【０２８７】
種々の実施形態において、調節可能プロモーター系は、誘導可能または抑制可能プロモーター系である。
【０２８８】
種々の実施形態において、調節可能プロモーター系は、ＬａｃＩ、Ｔｒｐ、ファージγおよびファージＲＮＡポリメラーゼから選択される。
【０２８９】
一実施形態では、プロモーターは、当業者に既知の任意の強プロモーターである。適切な強プロモーターは、アデノウイルスプロモーター、例えばアデノウイルス主要後期プロモーター；または異種プロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター；誘導可能プロモーター、例えばＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；ヒト成長ホルモンプロモーター；ファージプロモーター、例えばＴ７、ＳＰ６およびＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ならびにカリフラワーモザイク３５Ｓ（ＣａＭＶ  ３５Ｓ）プロモーターを含む。
【０２９０】
種々の実施形態において、プロモーターは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えばＰＣＴ／ＮＺ２００６／０００２５１に記載され、ＷＯ  ２００７／０３７７０６として公開されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。
【０２９１】
種々の実施形態において、細胞は、各々が異なる融合ポリペプチドをコードする２つ以上の異なる発現構築物を含む。
【０２９２】
種々の実施形態において、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原は、細胞内病原体由来の抗原である。
【０２９３】
種々の実施形態において、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原は、マイコバクテリウム属（例えば、ウシ型結核菌、ヒト型結核菌、ライ菌、カンサシ菌、鳥結核菌、ヨーネ菌、マイコバクテリウム種）、リステリア属（例えば、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア種）、サルモネラ属（例えば、チフス菌）、エルシニア属（例えば、ペスト菌、エルシニア・エンテロコリチカ、仮性結核菌）、炭疽菌Bacillus anthracis、レジオネラ属（例えば、レジオネラ・ニューモフィラ、レジオネラ・ロングビーチェ、レジオネラ・ボゼマニ、レジオネラ種）、リケッチア属（例えば、ロッキー山紅斑熱リケッチア、リケッチア痘菌、ボタン熱菌、シベリアチックチフス菌、オーストラリアチックチフス菌、日本紅斑熱菌、アフリカダニ熱菌、発疹チフス菌、発疹熱菌、リケッチア種）、クラミジア属（肺炎クラミジア菌、クラミジア・トラコマチス、クラミジア種）、クラミドフィラ属（例えば、クラミドフィラ・シタッシ、クラミドフィラ流産菌）、連鎖球菌属（例えば、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌）、ブドウ球菌属（黄色ブドウ球菌）、例えばメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、エーリキア属（例えば、エーリキア・シャフェンシス、エーリキア・ファゴサイトフィラ・ゲノ群、エーリキア種）、コクシエラ・バーネッティCoxiella burnetii、リーシュマニア種、トキソプラズマ・ゴンジイ、トリパノソーマ・クルージ、ヒストプラズマ種、野兎病菌Francisella tularensis、ならびにウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、ピコルナウイルス、例えばコクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、例えばエプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、水痘帯状疱疹ウイルス、ヘパドナウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルス、フラビウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、レトロウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、オルトミクソウイルス、例えばインフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、例えば麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス属、例えばパピローマウイルス、ラブドウイルス、例えば狂犬病ウイルス、トガウイルス、例えば風疹ウイルス、ならびにその他のウイルス、例えばワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、修飾ワクシニアウイルスアンカラ株、セムリキ森林ウイルス、天然痘ウイルスおよびコロナウイルスからなる病原体の群から得られる抗原、あるいは前記抗原のいずれかの少なくとも１つの抗原性部分またはＴ細胞エピトープから選択される。
【０２９４】
種々の実施形態において、ヒト型結核菌抗原は、早期分泌抗原標的（ＥＳＡＴ）−６、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ（ＭＰＴ５９）、Ａｇ８５Ｂ、Ａｇ８５Ｃ、ＭＰＴ３２、ＭＰＴ５１、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ６３、ＭＰＴ６４、ＭＰＴ８３、ＭＰＢ５、ＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＴＣ２８、Ｍｔｂ２、Ｍｔｂ８．４、Ｍｔｂ９．９、Ｍｔｂ３２Ａ、Ｍｔｂ３９、Ｍｔｂ４１、ＴＢ１０．４、ＴＢ１０Ｃ、ＴＢ１１Ｂ、ＴＢ１２．５、ＴＢ１３Ａ、ＴＢ１４、ＴＢ１５、ＴＢ１５Ａ、ＴＢ１６、ＴＢ１６Ａ、ＴＢ１７、ＴＢ１８、ＴＢ２１、ＴＢ２０．６、ＴＢ２４、ＴＢ２７Ｂ、ＴＢ３２、ＴＢ３２Ａ、ＴＢ３３、ＴＢ３８、ＴＢ４０．８、ＴＢ５１、ＴＢ５４、ＴＢ６４、ＣＦＰ６、ＣＦＰ７、ＣＦＰ７Ａ、ＣＦＰ７Ｂ、ＣＦＰ８Ａ、ＣＦＰ８Ｂ、ＣＦＰ９、ＣＦＰ１０、ＣＦＰ１１、ＣＦＰ１６、ＣＦＰ１７、ＣＦＰ１９、ＣＦＰ１９Ａ、ＣＦＰ１９Ｂ、ＣＦＰ２０、ＣＦＰ２１、ＣＦＰ２２、ＣＦＰ２２Ａ、ＣＦＰ２３、ＣＦＰ２３Ａ、ＣＦＰ２３Ｂ、ＣＦＰ２５、ＣＦＰ２５Ａ、ＣＦＰ２７、ＣＦＰ２８、ＣＦＰ２８Ｂ、ＣＦＰ２９、ＣＦＰ３０Ａ、ＣＦＰ３０Ｂ、ＣＦＰ５０、ＣＷＰ３２、ｈｓｐＸ（アルファ−結晶）、ＡＰＡ、ツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ＳＴ−ＣＦ、ＰＰＥ６８、ＬｐｐＸ、ＰｓｔＳ−１、ＰｓｔＳ−２、ＰｓｔＳ−３、ＨＢＨＡ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＬ２、ＧｒｐＥＳ、ＬＨＰ、１９ｋＤａ  リポタンパク質、７１ｋＤａ、ＲＤ１−ＯＲＦ２、ＲＤ１−ＯＲＦ３、ＲＤ１−ＯＲＦ４、ＲＤ１−ＯＲＦ５、ＲＤ１−ＯＲＦ８、ＲＤ１−ＯＲＦ９Ａ、ＲＤ１−ＯＲＦ９Ｂ、Ｒｖ１９８４ｃ、Ｒｖ０５７７、Ｒｖ１８２７、ＢｆｒＢ、Ｔｐｘ．  Ｒｖ１３５２、Ｒｖ１８１０、ＰｐｉＡ、Ｃｕｔ２、ＦｂｐＢ、ＦｂｐＡ、ＦｂｐＣ、ＤｎａＫ、ＦｅｃＢ、Ｓｓｂ、ＲｐｌＬ、ＦｉｘＡ、ＦｉｘＢ、ＡｈｐＣ２、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ１２１１、Ｍｄｈ、Ｒｖ１６２６、Ａｄｋ、ＣｌｐＰ、ＳｕｃＤ（Belisle et al、2005；ＵＳ  ７，０３７，５１０；ＵＳ  ２００４／００５７９６３；ＵＳ  ２００８／０１９９４９３；  ＵＳ  ２００８／０２６７９９０)、あるいは前記抗原のいずれかの少なくとも１つの抗原性部分またはＴ細胞エピトープからなる群から選択される。
【０２９５】
一例では、ヒト型結核菌抗原は、早期分泌抗原標的（ＥＳＡＴ）−６、Ａｇ８５Ａ、ＥＳＡＴ−６の少なくとも１つの抗原性部分、Ａｇ８５Ａの少なくとも１つの抗原性部分、または例えばＥＳＡＴ−６およびＡｇ８５Ａの両方といったような２つ以上のその任意の組合せである。
【０２９６】
種々の実施形態において、免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメイン、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインは、タンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えばＶＨＨ）、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、あるいはその組合せから選択される。
【０２９７】
例えば、種々の実施形態において、ヒト型結核菌抗原結合ドメインは、タンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えばＶＨＨ）、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、あるいはその組合せから選択される。
【０２９８】
種々の実施形態において、組成物は、ポリマー粒子の均質集団を含む。
【０２９９】
種々の実施形態において、組成物は、ポリマー粒子の混合集団を含む。
【０３００】
免疫応答は、細胞媒介性免疫応答であるか、または体液性免疫応答であるか、または細胞媒介性免疫応答および体液性免疫応答の両方の組合せである。
【０３０１】
例えば、免疫応答は、細胞媒介性免疫応答であって、有意の体液性応答を伴わない。例えば、免疫応答は、例えば、有意のＩｇＡ応答の非存在下での、または有意のＩｇＥ応答の非存在下での、または有意のＩｇＧ応答の非存在下での、例えば有意のＩｇＧ１応答の非存在下での、または有意のＩｇＧ２応答の非存在下での、あるいは有意のＩｇＭ応答の非存在下での、ＩＦＮ−γ応答により示されるような細胞媒介性免疫応答である。
【０３０２】
別の例では、免疫応答は、体液性応答であって、有意の細胞媒介性応答を伴わない。
【０３０３】
本発明の主眼は、本明細書中に記載される疾患または症状の処置または防止に有効であるように免疫応答を引き出すことである、と理解されるであろう。同様に、免疫応答の性質を考えると、細胞媒介性免疫応答を引き出すことは、本発明の方法に対する被験者の応答が、実際、細胞媒介性免疫応答と体液性免疫応答の両方の組合せであり得る、といったように、体液性応答も引き出し得ると理解される。
【０３０４】
本明細書中に開示される一連の数字（例えば、１〜１０）への言及は、その範囲内のすべての有理数（例えば１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９および１０）への言及も、ならびにその範囲内の有理数の任意の範囲（例えば２〜８、１．５〜５．５および３．１〜４．７）も組入れ、したがって、本明細書中に明白に開示されるすべての範囲のすべての亜範囲が、それにより明白に開示される、と意図される。これらは、具体的に意図されるものの単なる例であって、列挙される最低値と最高値との間の数値の考え得るすべての組合せは、同様の方法で本出願で明白に記述されるものであるとみなされるべきである。
【０３０５】
本発明のさらなる態様および利点は、例としてのみ示される記述を保証することから明らかになる。
【０３０６】
特許明細書、その他の外部文書、または他の情報源に言及した本明細書において、これは、一般的に、本発明の特徴を考察するための状況を提供する目的のためである。別記しない限り、このような外部文書への言及は、このような文書またはこのような情報源が、如何なる権限においても、従来技術であるか、または当該技術分野で共通の一般的知識の一部を構成するということを容認するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０３０７】
本発明のさらなる態様は、例としてのみ示される以下の記述から、添付の図面を参照しながら、明らかになるであろう。
【図１】抗Ｈｅｐ  Ｃ抗体とＨｅｐ  Ｃポリマー粒子との結合を示す。本明細書中の実施例４を参照。
【図２】Ｃ型肝炎に対して種々のポリマー粒子ワクチンで免疫化されたマウスにおけるＩｇＧ１抗体応答を示す。ＥＣ５０は、半最大光学密度を示す相互血清力価を指す。検出レベルは２５である。*は、他の群に対する有意差を示す（ｐ＜０．０５）。バーは、ＳＥＭを示す。本明細書中の実施例４を参照。
【図３】Ｃ型肝炎に対して種々のポリマー粒子ワクチンで免疫化されたマウスにおけるＩｇＧ２ｃ抗体応答を示す。ＥＣ５０は、半最大光学密度を示す相互血清力価を指す。検出レベルは２５である。*は、他の群に対する有意差を示す（ｐ＜０．０５）。バーは、ＳＥＭを示す。本明細書中の実施例４を参照。
【図４】肝炎に対して種々のポリマー粒子ワクチンで免疫化されたマウスにおけるＩＦＮ−γ応答を示す。*は、他の群に対する有意差を示す（ｐ＜０．０５）。バーは、ＳＥＭを示す。本明細書中の実施例４を参照。
【図５】Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６を表示する０〜９０μｇのポリマー粒子または３０μｇの組換えＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６で３回免疫化されたマウスにおける抗体応答を示す。*は、ＰＢＳ免疫化対照群より有意に大きい応答を示す（ｐ＜０．０１）。**は、すべての他のワクチン群より有意に大きい応答を示す（ｐ＜０．０１）。本明細書中の実施例５を参照。
【図６】３０μｇの野生型ポリマー粒子、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子、エマルシゲンを伴うＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子で３回免疫化された、あるいは免疫化されないマウスにおける抗体応答を示す。*は、ＰＢＳ免疫化対照群より有意に大きい応答を示す（ｐ＜０．０１）。**は、すべての他のワクチン群より有意に大きい応答を示す（ｐ＜０．０１）。本明細書中の実施例５を参照。
【図７】Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６を表示する０〜９０μｇのポリマー粒子または３０μｇの組換えＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６で３回免疫化されたマウスにおけるＩＦＮ−γ応答を示す。*は、ＰＢＳ免疫化対照群より有意に大きい応答を示す（ｐ＜０．０１）。**は、すべての他のワクチン群より有意に大きい応答を示す（ｐ＜０．０１）。本明細書中の実施例５を参照。
【図８】３０μｇの野生型ポリマー粒子、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子、エマルシゲンを伴うＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子で３回免疫化された、あるいは免疫化されないマウスにおけるＩＦＮ−γ応答を示す。*は、ＰＢＳ免疫化対照群より有意に大きい応答を示す（ｐ＜０．０１）。**は、すべての他のワクチン群より有意に大きい応答を示す（ｐ＜０．０１）。本明細書中の実施例６を参照。
【図９】抗ＥＳＡＴ−６抗体とＡｇ８５ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子との結合を示す。本明細書中の実施例５参照。
【図１０】種々のポリマー粒子ワクチンをマウスに接種した後、ウシ型結核菌で攻撃誘発した肺培養結果を示す。*は、非ワクチン摂取群に対する統計学的差を示す（ｐ＜０．０５）。バーは、ＳＥＭを示す。本明細書中の実施例６を参照。
【図１１】種々のポリマー粒子ワクチンをマウスに接種した後の脾臓培養結果を示す。*は、非ワクチン摂取群に対する統計学的差を示す（ｐ＜０．０５）。バーは、ＳＥＭを示す。本明細書中の実施例６を参照。
【図１２】種々のポリマー粒子ワクチンで免疫化された後、ウシ型結核菌で攻撃誘発されたマウスにおけるＩｇＧ１抗体応答を示す。ＥＣ５０は、半最大光学密度を示す相互血清力価を指す。検出レベルは２５である。*は、他の群に対する有意差を示す（ｐ＜０．０５）。バーは、ＳＥＭを示す。本明細書中の実施例６を参照。
【図１３】種々のポリマー粒子ワクチンで免疫化された後、ウシ型結核菌で攻撃誘発されたマウスにおけるＩｇＧ２ｃ抗体応答を示す。ＥＣ５０は、半最大光学密度を示す相互血清力価を指す。検出レベルは２５である。*は、他の群に対する有意差を示す（ｐ＜０．０５）。バーは、ＳＥＭを示す。本明細書中の実施例６を参照。
【発明を実施するための形態】
【０３０８】
本発明は、ポリマー粒子およびその使用に関する。特に本発明は、本明細書で同定されるかまたは記載されるものを含めて、病原体により引き起こされるかまたは関連する種々の疾患および症状の処置または防止における、機能性ポリマー粒子、その産生方法およびその使用に関する。
【０３０９】
本発明の機能性ポリマー粒子は、１つ以上の表面結合融合ポリペプチドを含み得るし、ならびにポリマー粒子コア中に組入れられるかまたは吸着される１つ以上の物質、表面結合融合ポリペプチドと結合される１つ以上の物質、またはその組合せも含み得る。
１．定義
【０３１０】
「コード領域」または「オープン・リーディング・フレーム」（ＯＲＦ）という用語は、適切な調節配列の制御下で転写産物および／またはポリペプチドを産生し得るゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列のセンス鎖を指す。コード配列は、５’翻訳開始コドンおよび３’翻訳停止コドンの存在により同定される。遺伝子構築物中に挿入される場合、「コード配列」は、それがプロモーターおよびターミネーター配列と操作可能的に連結されると、発現され得る。
【０３１１】
「〜を含む」という用語は、本明細書中で用いる場合、「少なくとも一部は〜からなる」ということを意味する。「〜を含む」という用語を包含する本明細書中の各記述を解釈する場合、当該用語以外の特徴、または当該用語を前置きされたものも存在し得る。
【０３１２】
「カップリング試薬」という用語は、本明細書中で用いる場合、少なくとも１つの物質を結合するのに適している無機または有機化合物を指し、あるいは一側でカップリング試薬を、他側で少なくとも１つの物質を結合するのに適切であるさらなるカップリング試薬を指す。適切なカップリング試薬の例、ならびにそれらの使用のための例示的方法、例えば本発明の粒子または融合タンパク質の化学修飾のために適切な方法は、ＰＣＴ／ＤＥ２００３／００２７９９に示されており、ＷＯ  ２００４／０２０６２３（Bernd Rehm）として公開されている（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）。
【０３１３】
「発現構築物」という用語は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写し、そして任意に、転写物をポリペプチドに翻訳することを可能にする素子を含む遺伝子構築物を指す。発現構築物は、典型的には、５’−３’方向に、以下の：
（１）構築物が導入されるであろう宿主細胞中で機能性であるプロモーター、
（２）発現されるべきポリヌクレオチド、および
（３）構築物が導入されるであろう宿主細胞中で機能性であるターミネーター
を含む。
【０３１４】
本発明の発現構築物は、クローニングのために、または発現のために、複製可能ベクター中に挿入されるか、あるいは宿主ゲノム中に組み入れられる。
【０３１５】
本発明で用いるための適合に応じ易い発現構築物の例は、ＰＣＴ／ＤＥ２００３／００２７９９（ＷＯ  ２００４／０２０６２３（Bernd Rehm）として公開されている）およびＰＣＴ／ＮＺ２００６／０００２５１（ＷＯ  ２００７／０３７７０６（Bernd Rehm）として公開されている）で提供されている（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）。
【０３１６】
「ポリマー粒子を形成する」および「ポリマー粒子の形成」という用語は、本明細書中で用いる場合、本明細書中で考察されるような粒子形成タンパク質の活性を指す。
【０３１７】
ポリペプチドの「断片」は、酵素および／または結合活性に必要とされる、および／またはポリペプチドの三次元構造を提供する一機能を実施するポリペプチドの亜配列である。
【０３１８】
「融合ポリペプチド」という用語は、本明細書中で用いる場合、ペプチド結合によりそれぞれのアミノおよびカルボキシル残基を介して融合されて、単一連続ポリペプチドを形成する２つ以上のアミノ酸配列、例えば２つ以上のポリペプチドドメインを含むポリペプチドを指す。２つ以上のアミノ酸配列は、直接的に融合されるか、あるいは、リンカーまたはスペーサーまたは付加的ポリペプチドを介して、それらのそれぞれのアミノおよびカルボキシル末端により間接的に融合され得る、と理解されるべきである。
【０３１９】
一実施形態では、融合ポリペプチドを含むアミノ酸配列のうちの１つは、粒子形成タンパク質を含む。
【０３２０】
一実施形態では、融合ポリペプチドを含むアミノ酸配列のうちの１つは、ヒト型結核菌抗原、またはヒト型結核菌抗原結合ドメイン、または融合相手を含む。
【０３２１】
「融合相手」という用語は、本明細書中で用いる場合、ポリペプチド、例えばタンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えばＶＨＨ）、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン（例えばＺＺドメイン）、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、アブザイム、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、阻害剤、ホルモン、レクチン、ポリヒスチジン、カップリングドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ＦＬＡＧエピトープ、システイン残基、ライブラリーペプチド、受容体ペプチド、アフィニティー精製ペプチド、または任意の２つ以上のその任意の組合せを指す。
【０３２２】
上記の２つ以上のポリペプチドは融合相手を形成し得る、と理解されるべきである。
【０３２３】
一実施形態では、融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、リンカーまたはスペーサーを介して、例えば、ポリマーシンターゼ−リンカー−免疫応答を引き出し得る抗原、免疫応答を引き出し得る抗原−リンカー−ポリマーシンターゼ、またはポリマーシンターゼ−リンカー−免疫応答を引き出し得る抗原の結合ドメイン、または免疫応答を引き出し得る抗原の結合ドメイン−リンカー−ポリマーシンターゼの順序で整列される上記融合ポリペプチドのアミノ酸配列と、間接的に融合される。他の実施形態では、融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリマーシンターゼ−付加的ポリペプチド−免疫応答を引き出し得る抗原、またはポリマーシンターゼ−付加的ポリペプチド−免疫応答を引き出し得る抗原の結合ドメイン、またはポリマーシンターゼ−リンカー−免疫応答を引き出し得る抗原−付加的ポリペプチド、またはポリマーシンターゼ−リンカー−免疫応答を引き出し得る抗原の結合ドメイン−付加的ポリペプチドの順序で整列される付加的ポリペプチドを介して間接的に融合されるか、またはそれらを含む。さらにまた、ポリマーシンターゼのＮ末端伸長は、本明細書中で明白に意図される。
【０３２４】
免疫応答としては、細胞媒介性および体液性免疫応答が挙げられる。
【０３２５】
一実施形態では、融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、リンカーまたはスペーサーを介して、例えば、ポリマーシンターゼ−リンカー−ヒト型結核菌抗原、またはヒト型結核菌抗原−リンカー−ポリマーシンターゼ、またはポリマーシンターゼ−リンカー−ヒト型結核菌抗原結合ドメイン、またはヒト型結核菌抗原結合ドメイン−リンカー−ポリマーシンターゼの順序で整列される上記融合ポリペプチドのアミノ酸配列と、間接的に融合される。他の実施形態では、融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリマーシンターゼ−付加的ポリペプチド−ヒト型結核菌抗原、またはポリマーシンターゼ−付加的ポリペプチド−ヒト型結核菌抗原結合ドメイン、またはポリマーシンターゼ−リンカー−ヒト型結核菌抗原−付加的ポリペプチド、またはポリマーシンターゼ−リンカー−ヒト型結核菌抗原結合ドメイン−付加的ポリペプチドの順序で整列される付加的ポリペプチドを介して間接的に融合されるか、またはそれらを含む。さらにまた、ポリマーシンターゼのＮ末端伸長は、本明細書中で明白に意図される。
【０３２６】
本発明による融合ポリペプチドは、別のポリペプチドの配列内に挿入される１つ以上のポリペプチド配列も含み得る。例えば、プロテアーゼ認識配列のようなポリペプチド配列は、粒子結合ドメインを含むタンパク質の可変領域に挿入される。
【０３２７】
都合よく、本発明の融合ポリペプチドは単一核酸配列によりコードされるが、この場合、核酸配列は、各々がポリペプチドまたはポリペプチドドメインをコードする少なくとも２つの亜配列を含む。ある実施形態では、少なくとも２つの亜配列は、単一オープン・リーディング・フレームを含むよう「イン・フレーム」で存在し、したがって、本明細書中で意図されるような融合ポリペプチドをコードする。他の実施形態では、少なくとも２つの亜配列は、「アウトオブ・フレーム」で存在し、そして翻訳時に融合ポリペプチドが形成されるよう、リーディングフレームにおけるシフトを促進するリボソームフレームシフト部位または他の配列により分離される。ある実施形態では少なくとも２つの亜配列が連続的である。他の実施形態では、上記のように、少なくとも２つのポリペプチドまたはポリペプチドドメインが付加的ポリペプチドを介して間接的に融合される場合、少なくとも２つの亜配列は連続的でない。
【０３２８】
「結合ドメイン」または「結合し得るドメイン」への言及は、相補的結合対の半分を意味するよう意図され、そして上記の一覧からの結合対を含み得る。例えば、抗体−抗原、抗体−抗体結合ドメイン、ビオチン−ストレプトアビジン、受容体−リガンド、酵素−阻害剤対。標的−結合ドメインは、試料中の標的分子を結合し、例えば抗体または抗体断片である。ポリペプチド−結合ドメインは、ポリペプチドを結合し、例えば抗体または抗体断片、あるいは受容体またはシグナル伝達タンパク質からの結合ドメインである。
【０３２９】
結合ドメインにより結合される物質の例としては、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、ポリペプチド、ポリペプチド断片、抗体、抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原断片、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、製薬上許容可能な活性作因、生物学的活性作因、アジュバント、または２つ以上のその任意の組合せが挙げられる。このような物質は、本発明の方法に従って分析される試料中の「標的構成成分」である。
【０３３０】
したがって、「免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得るドメイン」および文法的等価物は、相補的結合対中の一構成成分を指すと理解されるが、この場合、他の構成成分は免疫応答を引き出し得る抗原である。
【０３３１】
同様に、「細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得るドメイン」および文法的等価物は、相補的結合対中の一構成成分を指すと理解されるが、この場合、他の構成成分は細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原である。例えば、ヒト型結核菌抗原結合ドメインとしても言及され得るヒト型結核菌抗原を結合し得るドメインは、１つ以上のヒト型結核菌抗原を結合し得るドメインである。
【０３３２】
したがって、「ヒト型結核菌抗原結合ドメイン」は、１つ以上のヒト型結核菌抗原を結合し得るドメインである。
【０３３３】
「ヒト型結核菌抗原」は、本明細書中で用いる場合、ヒト型結核菌由来の抗原である。同様に、他の抗原は、それらが由来する生物体により同定される。
【０３３４】
「免疫応答を引き出し得る抗原」という語句は、免疫系の１つ以上の作因、例えば１つ以上の抗体または１つ以上の細胞と接触される場合、免疫系の応答性を引き出すかまたは上方調節し得る、例えば１つ以上のＴ細胞集団を上方調節する、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞の活性または数を増大するか、あるいは１つ以上のＢ細胞集団を上方調節する、例えば抗原に特異的な抗体を産生し得るかまたは抗原を結合し得る１つ以上のＢ細胞集団を上方調節する、あるいは抗体の１つ以上の集団の量または活性を増大し得る抗原を指す。
【０３３５】
「細胞媒介性応答を引き出し得る抗原」という語句は、免疫系の１つ以上の細胞と接触される場合、免疫系の応答性を引き出すかまたは上方調節し得る、例えば１つ以上のＴ細胞集団を上方調節する、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞の活性または数を増大し得る抗原を指す。
【０３３６】
「遺伝子構築物」という用語は、ポリヌクレオチド分子、通常は、別のポリヌクレオチド分子（挿入ポリヌクレオチド分子）中に挿入された二本鎖ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ分子（これに限定されない）を指す。遺伝子構築物は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写すること、任意に転写体をポリペプチドに翻訳することを可能にする必要な素子を含有する挿入ポリヌクレオチド分子は、宿主細胞に由来し、あるいは異なる細胞または生物体に由来し、および／または組換えポリヌクレオチドである。一旦、宿主細胞内に入ると、遺伝子構築物は宿主染色体ＤＮＡ中に組み込まれるようになる。一例では、遺伝子構築物は、ベクターに連結される。
【０３３７】
「宿主細胞」という用語は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞、例えば哺乳動物宿主細胞を指し、これは、１）天然ＰＨＡ粒子産生宿主細胞、または２)少なくともチオラーゼおよびレダクターゼを、そして任意にファシンをコードする核酸配列を含む発現構築物を保有する宿主細胞である。宿主細胞がポリマー粒子形成のために欠いているものを増大するためにどの遺伝子が必要であるかは、宿主細胞の遺伝子構成に、ならびにどの物質が培地中に提供されるかによって決まる。
【０３３８】
「リンカーまたはスペーサー」という用語は、本明細書中で用いる場合、２つ以上のポリペプチド、または２つ以上のポリペプチドをコードする２つ以上の核酸配列を間接的に融合するアミノ酸またはヌクレオチド配列に関する。いくつかの実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または約１００アミノ酸長またはヌクレオチド長である。他の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または約１０００アミノ酸長またはヌクレオチド長である。さらに他の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、約１〜約１０００アミノ酸長またはヌクレオチド長、約１０〜約１０００、約５０〜約１０００、約１００〜約１０００、約２００〜約１０００、約３００〜約１０００、約４００〜約１０００、約５００〜約１０００、約６００〜約１０００、約７００〜１０００、約８００〜約１０００、または約９００〜１０００アミノ酸長またはヌクレオチド長である。
【０３３９】
一実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、制限酵素認識部位を含み得る。別の実施形態ではリンカーまたはスペーサーは、プロテアーゼ切断認識配列、例えばエンテロキナーゼ、トロンビンまたはＸａ因子認識配列、あるいは自己スプライシング素子、例えばインテインを含み得る。別の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、融合ポリペプチドの個々のフォールディングを助長する。
【０３４０】
「混合集団」という用語は、本明細書中で用いる場合、存在物の２つ以上の集団を指し、混合集団内の存在物の各集団は、いくつかの点で混合集団内の存在物の別の集団と異なる。田と、発現構築物の混合集団に関して用いられる場合、これは、発現構築物の２つ以上の集団を指し、この場合、発現構築物の各集団は、その集団の成員によりコードされる融合ポリペプチドに関して、あるいは構築物のいくつかの他の態様、例えば構築物中に存在するプロモーターの同一性に関して異なる。代替的には、融合ポリペプチドの混合集団に関して用いられる場合、これは、融合ポリペプチドの２つ以上の集団を指し、この場合、融合ポリペプチドの各集団は、ポリペプチド、例えばポリマーシンターゼ、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原、または細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメイン（集団が含有する成員）に関して異なる。例えば、結核の処置に用いる状況では、融合ポリペプチドの混合集団は、融合ポリペプチドの２つ以上の集団を指すが、この場合、融合ポリペプチドの各集団は、ポリペプチド、例えばポリマーシンターゼ、ヒト型結核菌抗原、またはヒト型結核菌抗原結合ドメイン（集団が含有する成員）に関して異なる。同様に、肝炎またはインフルエンザの状況では、融合ポリペプチドの混合集団は、融合ポリペプチドの２つ以上の集団を指し、この場合、融合ポリペプチドの各集団は、ポリペプチド、例えばポリマーシンターゼ、肝炎抗原、肝炎抗原結合ドメイン、インフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原結合ドメイン（集団が含有する成員）に関して異なる。さらに、ポリマー粒子の混合集団に関して用いられる場合、これは、ポリマー粒子の２つ以上の集団を指し、この場合、ポリマー粒子の各集団は、単数または複数の融合ポリペプチド（その集団が保有する成員）に関して異なる。
【０３４１】
「核酸」という用語は、本明細書中で用いる場合、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド塩基または天然ヌクレオチドの既知の類似体、あるいはその混合物の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。当該用語は、別記しない限り、特定配列、ならびにそれと相補的な配列への言及を包含する。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で互換的に用いられる。
【０３４２】
「操作可能的に連結される」は、発現されるべき配列が、プロモーター、組織特異的調節因子、一時性調節因子、エンハンサー、抑制因子およびターミネーターを包含する調節因子の制御下に置かれる、ということを意味する。
【０３４３】
「過剰発現」という用語は、一般的に、正常または非形質転換化宿主細胞における産生のレベルを超える宿主細胞における遺伝子産物の産生を指す。「過剰発現」という用語は、メッセンジャーＲＮＡのレベルに関連して用いられる場合、好ましくは、対照または非形質転換化細胞における宿主細胞で観察される典型的に観察されるよりも約３倍高い発現レベルを示す。さらに好ましくは、発現レベルは、対照宿主細胞または非形質転換化細胞において典型的に観察されるよりも少なくとも約５倍より高く、約１０倍より高く、約１５倍より高く、約２０倍より高く、約２５倍より高く、約３０倍より高く、約３５倍より高く、約４０倍より高く、約４５倍より高く、約５０倍より高く、約５５倍より高く、約６０倍より高く、約６５倍より高く、約７０倍より高く、約７５倍より高く、約８０倍より高く、約８５倍より高く、約９０倍より高く、約９５倍より高く、または約１００倍より高いかまたはそれ以上である発現レベルを示す。
【０３４４】
ｍＲＮＡのレベルは、当業者に既知の多数の技法のうちのいずれか、例えばノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲ、例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲ（これらに限定されない）を用いて測定される。
【０３４５】
「粒子形成タンパク質」という用語は、本明細書中で用いる場合、粒子の形成に関与するタンパク質を指す。それは、例えば、ポリマーデポリメラーゼ、ポリマー調節因子、ポリマーシンターゼおよび粒子サイズ決定タンパク質を含むタンパク質の群から選択され得る。好ましくは、粒子形成タンパク質は、チオラーゼ、レダクターゼ、ポリマーシンターゼおよびファシンからなる群から選択される。粒子形成タンパク質、例えばシンターゼは、基質または基質の誘導体を重合してポリマー粒子を形成することによりポリマー粒子の形成を触媒し得る。代替的には、粒子形成タンパク質、例えばチオラーゼ、レダクターゼまたはファシンは、重合を助長することにより、ポリマー粒子の形成を促し得る。例えば、チオラーゼまたはレダクターゼは、ポリメラーゼのための適切な基質の産生を触媒し得る。ファシンは、形成されるポリマー粒子のサイズを制御し得る。好ましくは、粒子形成タンパク質は、粒子結合ドメインおよび粒子形成ドメインを含む。
【０３４６】
本明細書中で用いる場合、「粒子形成反応混合物」という用語は、宿主細胞または発現構築物がシンターゼ触媒ドメインまたはポリマーシンターゼを含む場合は、少なくともポリマーシンターゼを指し、そして宿主細胞または発現構築物が、別の粒子形成タンパク質またはポリマーシンターゼ触媒ドメインでない粒子結合ドメインを含む場合は、その基質を指す。
【０３４７】
「粒子サイズ決定タンパク質」は、ポリマー粒子のサイズを制御するタンパク質を指す。それは、例えば、好ましくは、ラルストニア属、アルカリゲネス属およびシュードモナス属から選択されるファシン様タンパク質のファミリーから得られ、さらに好ましくは、ラルストニア・ユートロファからのファシン遺伝子ｐｈａＰ、およびシュードモナス・オレオボランスからのファシン遺伝子ｐｈａＦである。ファシンは、１４〜２８ｋＤａの分子量を有する両親媒性タンパク質であって、これはポリマー粒子の疎水性表面としっかり結合する。それは、粒子を結合し、粒子サイズに影響を及ぼす他の宿主細胞タンパク質も含み得る。
【０３４８】
「病原体」または「細胞内病原体」または「微生物」という用語は、その生殖周期または生活環の少なくとも一部のために、宿主細胞内に、細胞質中または空胞内に存在する任意の生物体を指す。細胞内病原体としては、ウイルス（例えばＣＭＶ、ＨＩＶ）、細菌（マイコバクテリウム、リステリア、サルモネラ、赤痢菌、エルシニア、ブルセラ、バシラス、レジオネラ、リケッチア、クラミジア、クラミドフィリア、連鎖球菌、ブドウ球菌、エーリキア、フランシセラ、腸病原性大腸菌、腸出血性大腸菌）、原生動物（例えば、トキソプラズマ）、真菌および細胞内寄生生物（例えばプラスモジウム）が挙げられる。
【０３４９】
病原体は、典型的には宿主特異性である、と理解されるであろう。したがって、本発明の方法および組成物は、特定の病原体に対して、例えば種特異的病原体に対して特定の種を免疫化するに際して修飾（使用）に応じ易い。例えば、ヒトは、病原体、例えばヒト特異的病原体、例えばマイコバクテリウム属（例えば、ウシ型結核菌、ヒト型結核菌、ライ菌、カンサシ菌、鳥結核菌、ヨーネ菌、マイコバクテリウム種）、リステリア属（例えば、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア種）、サルモネラ属（例えば、チフス菌）、エルシニア属（例えば、ペスト菌、エルシニア・エンテロコリチカ、仮性結核菌）、炭疽菌Bacillus anthracis、レジオネラ属（例えば、レジオネラ・ニューモフィラ、レジオネラ・ロングビーチェ、レジオネラ・ボゼマニ、レジオネラ種）、リケッチア属（例えば、ロッキー山紅斑熱リケッチア、リケッチア痘菌、ボタン熱菌、シベリアチックチフス菌、オーストラリアチックチフス菌、日本紅斑熱菌、アフリカダニ熱菌、発疹チフス菌、発疹熱菌、リケッチア種）、クラミジア属（肺炎クラミジア菌、クラミジア・トラコマチス、クラミジア種）、クラミドフィラ属（例えば、クラミドフィラ・シタッシ、クラミドフィラ流産菌）、連鎖球菌属（例えば、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌）、ブドウ球菌属（黄色ブドウ球菌）、エーリキア属（例えば、エーリキア・シャフェンシス、エーリキア・ファゴサイトフィラ・ゲノ群、エーリキア種）、コクシエラ・バーネッティCoxiella burnetii、リーシュマニア種、トキソプラズマ・ゴンジイ、トリパノソーマ・クルージ、ヒストプラズマ種、野兎病菌Francisella tularensis、ならびにアデノウイルス、ワクシニア、アビポックス、アデノ随伴ウイルス、修飾ワクシニアウイルスアンカラ株、セムリキ森林ウイルス、天然痘ウイルスおよびヘルペスウイルスに対して免疫化される。
【０３５０】
細胞内病原体の他の属は広範な宿主特異性を有し、例としてはブルセラ種が挙げられる。ブルセラは、グラム陰性、非自動性、非被包性球状桿菌の一属である。異なるブルセラ種の例としては、ブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・アボルツス（ウシ流産菌）、ブルセラ・スイス（ブタ流産菌）、ブルセラ・オビス、ブルセラ・ピンニペディアおよびブルセラ・ネオトメが挙げられる。
【０３５１】
他の例では、非ヒト被験体は、病原体、例えば種特異性病原体に対して免疫化される。例えば、ウシ、カラスおよびヒツジ被験体は、マイコバクテリウム種、例えばウシ型結核菌、ヒト型結核菌、ライ菌、カンサシ菌、鳥結核菌、ヨーネ菌およびその他のマイコバクテリウム種に対して免疫化される。
【０３５２】
したがって、「被験体」は、動物、例えば哺乳動物、例えば哺乳類伴侶動物またはヒトである。代表的伴侶動物としては、ネコ、ウマおよびイヌが挙げられる。代表的農耕動物としては、ウシ、ヒツジ、シカおよびブタが挙げられる。一実施形態では、ヒトは成人、小児または乳児、例えば免疫無防備状態成人、小児または乳児、あるいは病原体に対してワクチン接種された、感染したまたは曝露された、あるいは感染または曝露の危険がある成人、小児または乳児である。
【０３５３】
「処置する」という用語およびその派生語（例えば「処置」）は、それらの最も広い考え得る状況で解釈されるべきである。当該用語は、完全回復まで被験体が処置されるということを意味すると解されるべきでない。したがって、「処置する」は、広範に、特定症状の症候または重症度の開始の改善および／または防止を包含する。
【０３５４】
「ポリマー調節因子」は、本明細書中で用いる場合、ポリマー粒子の形成に関与する遺伝子ｐｈａＡ、ｐｈａＢおよびｐｈａＣの転写を調節するタンパク質を指す。それは、粒子表面と結合することにより、転写調節から引き離される。このような調節因子の一例は、ラルストニア・ユートロファ  ＹＰ＿７２５９４３からのファシン抑制因子（ｐｈａＲ）であって、これはファシン様遺伝子のプロモーターと結合し、その発現生成物は、形成されるポリマー粒子のサイズを調節し、遺伝子が読取られないようにする。ファシン抑制因子は形成されるポリマー粒子の表面に結合されるため、プロモーター上のこの部位は放出され、下にある遺伝子の転写が開始し得る。「ポリマーシンターゼ」は、本明細書中で用いる場合、基質または基質の誘導体を重合して、ポリマー粒子を形成することにより、ポリマー粒子の形成を触媒し得るタンパク質を指す。一次構造、基質特異性およびサブユニット組成が異なる＞４５の異なる細菌からの８８のＰＨＡシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列が得られている（Rehm, 2007）。
【０３５５】
ポリマーシンターゼは、ポリマーの重合ならびに粒子コアへのシンターゼタンパク質の付着を媒介するシンターゼタンパク質のＣ末端に少なくともシンターゼ触媒ドメインを含む。本発明に用いるためのポリマーシンターゼは、Rehm, 2003（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に詳細に記載されている。例えばポリマーシンターゼは、クラス１属  アシネトバクター属、ビブリオ属、アエロモナス属、クロモバクテリウム属、シュードモナス属、ズーグレア属、アルカリゲネス属、デルフチア属、ブルクホルデリア属、ラルストニア属、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ロドバクター属、パラコッカス属、リケッチア属、カルロバクター属、メチロバクテリウム属、アゾリゾビウム属、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、シノリゾビウム属、リケッチア属、クレンアーケオータ属、シネコシスチス属、エコチオロドスピラ属、チオカプサ属、チオシスチス属およびアロクロマチウム属、クラス２属  ブルクホルデリア属およびシュードモナス、あるいはクラス４属  バシラス属から、さらに好ましくはクラス１  アシネトバクター種  ＲＡ３８４９、コレラ菌、腸炎ビブリオ、アエロモナス・プンクタータ  ＦＡ４４０、アエロモナス・ヒドロフィラ、クロモバクテリウム・ビオラセウム、シュードモナス種  ６１−３、ズーグレア・ラミゲラ、アルカリゲネス・ラツス、アルカリゲネス種  ＳＨ−６９、デルフチア・アシドボランス、ブルクホルデリア種  ＤＳＭＺ９２４２、ラルストニア・ユートロフィア  Ｈ１６、ブルクホルデリア・セパシア、ロドコッカス・ラバー  ＰＰ２、ゴルドニア・ルブリペルチンクツス、発疹チフスリケッチア  ９１１１、アロクロマチウム・ビノスムＤ、チオシスチス・ビオラセア  ２３１１、ロドバクター・スフェロイデス、脱窒菌、光合成細菌、カウロバクター・クレセンツス、メチロバクテリウム・エクストルクエンス、アゾリゾビウム・カウリノダンス、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、シノリゾビウム・メリロチ  ４１、ロドスピリルム・ルブルム  ＨＡおよびロドスピリルム・ルブルム  ＡＴＣＣ２５９０３、クラス２  ブルクホルデリア・カリオフィリ、シュードモナス・クロラフィス、シュードモナス種  ６１−３、シュードモナス・プチダ  Ｕ、シュードモナス・オレオボランス、緑膿菌、シュードモナス・レシノボランス、シュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・メンドシナ、シュードモナス・シュードルカリゲネス、シュードモナス・プチダ  ＢＭ０１、シュードモナス・ニトロレデュッシンス、シュードモナス・クロラフィス、およびクラス４  バシラス・メガテリウムおよびバシラス種  ＩＮＴ００５からのＰＨＡシンターゼである。
【０３５６】
本発明に用い易い他のポリマーシンターゼとしては、各々、その寄託番号により同定される以下の生物体からのポリマーシンターゼが挙げられる：クプリアビダス・ネカトール（ＡＹ８３６６８０）、緑膿菌（ＡＥ００４０９１）、紅色硫黄光合成細菌（ＡＢ２０５１０４）、巨大菌Bacillus megaterium（ＡＦ１０９９０９）、ハロアルクラ・マリスモルツイ（ＹＰ１３７３３９）、シュードモナス・アウレオファシエンス（ＡＢ０４９４１３）、シュードモナス・プチダ（ＡＦ１５０６７０）、ラルストニア・ユートロファ（Ａ３４３４１）、チオコッカス・フェニジイ（Ｘ９３５９９）、アエロモナス・プンクタータ（Ｏ３２４７２）、シュードモナス種  ６１−３（ＡＢ０１４７５７およびＡＢ０１４７５８）、ロドバクター・スフェロイデス（ＡＡＡ７２００４）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（ＡＡＣ６９６１５）、アルカニボラックス・ボルクメンシス  ＳＫ２（ＣＡＬ１７６６２）、アルカニボラックス・ボルクメンシス  ＳＫ２（ＣＡＬ１６８６６）、ロドバクター・スフェロイデス  ＫＤ１３１（ＡＣＭ０１５７１およびＹＰ００２５２６０７２）、ロドコッカス・オパクス  Ｂ４（ＢＡＨ５１８８０およびＹＰ００２７８０８２５）、ブルクホルデリア・マルチボランス  ＡＴＣＣ  １７６１６（ＹＰ００１９４６２１５およびＢＡＧ４３６７９）、アルカニボラックス・ボルクメンシス  ＳＫ２（ＹＰ６９３９３４およびＹＰ６９３１３８）、ロドスピリルム・ルブルム（ＡＡＤ５３１７９）、ガンマプロテオバクテリア  ＨＴＣＣ５０１５（ＺＰ０５０６１６６１およびＥＤＹ８６６０６）、アゾアルクス種  ＢＨ７２（ＹＰ９３２５２５）、クロモバクテリウム・ビオラセウム  ＡＴＣＣ  １２４７２（ＮＰ９０２４５９）、リムノバクター種  ＭＥＤ１０５（ＺＰ０１９１５８３８およびＥＤＭ８２８６７）、マリノバクター・アルギコーラ  ＤＧ８９３（ＺＰ０１８９５９２２およびＥＤＭ４６００４）、ロドバクター・スフェロイデス（ＣＡＡ６５８３３）、クロモバクテリウム・ビオラセウム  ＡＴＣＣ  １２４７２（ＡＡＱ６０４５７）、アルカリゲネス・ラツス（ＡＡＤ１０２７４、ＡＡＤ０１２０９およびＡＡＣ８３６５８）、ステノトロホモナス・マルトフィリア  Ｋ２７９ａ（ＣＡＱ４６４１８およびＹＰ００１９７２７１２）、ラルストニア・ソラナセラム  ＩＰＯ１６０９（ＣＡＱ５９９７５およびＹＰ００２２５８０８０）、ブルクホルデリア・マルチボランス  ＡＴＣＣ  １７６１６（ＹＰ００１９４１４４８およびＢＡＧ４７４５８）、シュードモナス種  ｇｌ１３（ＡＣＪ０２４００）、シュードモナス種  ｇｌ０６（ＡＣＪ０２３９９）、シュードモナス種  ｇｌ０１（ＡＣＪ０２３９８）、Ｒ．種  ｇｌ３２（ＡＣＪ０２３９７）、リゾビウム・レグミノサルム  ｂｖ．ビシアエ  ３８４１（ＣＡＫ１０３２９およびＹＰ７７０３９０）、アゾアルクス種  ＢＨ７２（ＣＡＬ９３６３８）、シュードモナス種  ＬＤＣ−５（ＡＡＶ３６５１０）、ルチエラ・ニトロフェルム  ２００２（ＺＰ０３６９８１７９）、サウエラ種  ＭＺ１Ｔ（ＹＰ００２８９００９８およびＡＣＲ０１７２１）、メチロバクテリウム・ラジオトレランス  ＪＣＭ  ２８３１（ＹＰ００１７５５０７８およびＡＣＢ���４３９５）、メチロバクテリウム種  ４−４６（ＹＰ００１７６７７６９およびＡＣＡ１５３３５）、ルチエラ・ニトロフェルム  ２００２（ＥＥＧ０８９２１）、脱窒菌（ＢＡＡ７７２５７）、マグネトスピリルム・グリフィスワルデンス（ＡＢＧ２３０１８）、シュードモナス種  ＵＳＭ４−５５（ＡＢＸ６４４３５およびＡＢＸ６４４３４）、アエロモナス・ヒドロフィラ（ＡＡＴ７７２６１およびＡＡＴ７７２５８）、バシラス種  ＩＮＴ００５（ＢＡＣ４５２３２およびＢＡＣ４５２３０）、シュードモナス・プチダ（ＡＡＭ６３４０９およびＡＡＭ６３４０７）、ゴルドニア・ルブリペルチンクツス（ＡＡＢ９４０５８）、巨大菌（ＡＡＤ０５２６０）、デルフチア・アシドボランス（ＢＡＡ３３１５５）、パラコッカス・セリニフィルス（ＡＣＭ６８６６２）、シュードモナス種  １４−３（ＣＡＫ１８９０４）、シュードモナス種  ＬＤＣ−５（ＡＡＸ１８６９０）、シュードモナス種  ＰＣ１７（ＡＢＶ２５７０６）、シュードモナス種  ３Ｙ２（ＡＡＶ３５４３１、ＡＡＶ３５４２９およびＡＡＶ３５４２６）、シュードモナス・メンドシナ（ＡＡＭ１０５４６およびＡＡＭ１０５４４）、シュードモナス・ニトロレデュッシンス（ＡＡＫ１９６０８）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（ＡＡＫ１９６０５）、シュードモナス・レシノボランス（ＡＡＤ２６３６７およびＡＡＤ２６３６５）、シュードモナス種  ＵＳＭ７−７（ＡＣＭ９０５２３およびＡＣＭ９０５２２）、シュードモナス・フルオレッセンス（ＡＡＰ５８４８０）、ならびにその他の非培養細菌（ＢＡＥ０２８８１、ＢＡＥ０２８８０、ＢＡＥ０２８７９、ＢＡＥ０２８７８、ＢＡＥ０２８７７、ＢＡＥ０２８７６、ＢＡＥ０２８７５、ＢＡＥ０２８７４、ＢＡＥ０２８７３、ＢＡＥ０２８７２、ＢＡＥ０２８７１、ＢＡＥ０２８７０、ＢＡＥ０２８６９、ＢＡＥ０２８６８、ＢＡＥ０２８６７、ＢＡＥ０２８６、ＢＡＥ０２８６５、ＢＡＥ０２８６４、ＢＡＥ０２８６３、ＢＡＥ０２８６２、ＢＡＥ０２８６１、ＢＡＥ０２８６０、ＢＡＥ０２８５９、ＢＡＥ０２８５８、ＢＡＥ０２８５７、ＢＡＥ０７１４６、ＢＡＥ０７１４５、ＢＡＥ０７１４４、ＢＡＥ０７１４３、ＢＡＥ０７１４２、ＢＡＥ０７１４１、ＢＡＥ０７１４０、ＢＡＥ０７１３９、ＢＡＥ０７１３８、ＢＡＥ０７１３７、ＢＡＥ０７１３６、ＢＡＥ０７１３５、ＢＡＥ０７１３４、ＢＡＥ０７１３３、ＢＡＥ０７１３２、ＢＡＥ０７１３１、ＢＡＥ０７１３０、ＢＡＥ０７１２９、ＢＡＥ０７１２８、ＢＡＥ０７１２７、ＢＡＥ０７１２６、ＢＡＥ０７１２５、ＢＡＥ０７１２４、ＢＡＥ０７１２３、ＢＡＥ０７１２２、ＢＡＥ０７１２１、ＢＡＥ０７１２０、ＢＡＥ０７１１９、ＢＡＥ０７１１８、ＢＡＥ０７１１７、ＢＡＥ０７１１６、ＢＡＥ０７１１５、ＢＡＥ０７１１４、ＢＡＥ０７１１３、ＢＡＥ０７１１２、ＢＡＥ０７１１１、ＢＡＥ０７１１０、ＢＡＥ０７１０９、ＢＡＥ０７１０８、ＢＡＥ０７１０７、ＢＡＥ０７１０６、ＢＡＥ０７１０５、ＢＡＥ０７１０４、ＢＡＥ０７１０３、ＢＡＥ０７１０２、ＢＡＥ０７１０１、ＢＡＥ０７１００、ＢＡＥ０７０９９、ＢＡＥ０７０９８、ＢＡＥ０７０９７、ＢＡＥ０７０９６、ＢＡＥ０７０９５、Ｂ���Ｅ０７０９４、ＢＡＥ０７０９３、ＢＡＥ０７０９２、ＢＡＥ０７０９１、ＢＡＥ０７０９０、ＢＡＥ０７０８９、ＢＡＥ０７０８８、ＢＡＥ０７０５３、ＢＡＥ０７０５２、ＢＡＥ０７０５１、ＢＡＥ０７０５０、ＢＡＥ０７０４９、ＢＡＥ０７０４８、ＢＡＥ０７０４７、ＢＡＥ０７０４６、ＢＡＥ０７０４５、ＢＡＥ０７０４４、ＢＡＥ０７０４３、ＢＡＥ０７０４２、ＢＡＥ０７０４１、ＢＡＥ０７０４０、ＢＡＥ０７０３９、ＢＡＥ０７０３８、ＢＡＥ０７０３７、ＢＡＥ０７０３６、ＢＡＥ０７０３５、ＢＡＥ０７０３４、ＢＡＥ０７０３３、ＢＡＥ０７０３２、ＢＡＥ０７０３１、ＢＡＥ０７０３０、ＢＡＥ０７０２９、ＢＡＥ０７０２８、ＢＡＥ０７０２７、ＢＡＥ０７０２６、ＢＡＥ０７０２５、ＢＡＥ０７０２４、ＢＡＥ０７０２３、ＢＡＥ０７０２２、ＢＡＥ０７０２１、ＢＡＥ０７０２０、ＢＡＥ０７０１９、ＢＡＥ０７０１８、ＢＡＥ０７０１７、ＢＡＥ０７０１６、ＢＡＥ０７０１５、ＢＡＥ０７０１４、ＢＡＥ０７０１３、ＢＡＥ０７０１２、ＢＡＥ０７０１１、ＢＡＥ０７０１０、ＢＡＥ０７００９、ＢＡＥ０７００８、ＢＡＥ０７００７、ＢＡＥ０７００６、ＢＡＥ０７００５、ＢＡＥ０７００４、ＢＡＥ０７００３、ＢＡＥ０７００２、ＢＡＥ０７００１、ＢＡＥ０７０００、ＢＡＥ０６９９９、ＢＡＥ０６９９８、ＢＡＥ０６９９７、ＢＡＥ０６９９６、ＢＡＥ０６９９５、ＢＡＥ０６９９４、ＢＡＥ０６９９３、ＢＡＥ０６９９２、ＢＡＥ０６９９１、ＢＡＥ０６９９０、ＢＡＥ０６９８９、ＢＡＥ０６９８８、ＢＡＥ０６９８７、ＢＡＥ０６９８６、ＢＡＥ０６９８５、ＢＡＥ０６９８４、ＢＡＥ０６９８３、ＢＡＥ０６９８２、ＢＡＥ０６９８１、ＢＡＥ０６９８０、ＢＡＥ０６９７９、ＢＡＥ０６９７８、ＢＡＥ０６９７７、ＢＡＥ０６９７６、ＢＡＥ０６９７５、ＢＡＥ０６９７４、ＢＡＥ０６９７３、ＢＡＥ０６９７２、ＢＡＥ０６９７１、ＢＡＥ０６９７０、ＢＡＥ０６９６９、ＢＡＥ０６９６８、ＢＡＥ０６９６７、ＢＡＥ０６９６６、ＢＡＥ０６９６５、ＢＡＥ０６９６４、ＢＡＥ０６９６３、ＢＡＥ０６９６２、ＢＡＥ０６９６１、ＢＡＥ０６９６０、ＢＡＥ０６９５９、ＢＡＥ０６９５８、ＢＡＥ０６９５７、ＢＡＥ０６９５６、ＢＡＥ０６９５５、ＢＡＥ０６９５４、ＢＡＥ０６９５３、ＢＡＥ０６９５２、ＢＡＥ０６９５１、ＢＡＥ０６９５０、ＢＡＥ０６９４９、ＢＡＥ０６９４８、ＢＡＥ０６９４７、ＢＡＥ０６９４６、ＢＡＥ０６９４５、ＢＡＥ０６９４４、ＢＡＥ０６９４３、ＢＡＥ０６９４２、ＢＡＥ０６９４１、ＢＡＥ０６９４０、ＢＡＥ０６９３９、ＢＡＥ０６９３８、ＢＡＥ０６９３７、ＢＡＥ０６９３６、ＢＡＥ０６９３５、ＢＡＥ０６９３４、ＢＡＥ０６９３３、ＢＡＥ０６９３２、ＢＡＥ０６９３１、ＢＡＥ０６９３０、ＢＡＥ０６９２９、ＢＡＥ０６９２８、ＢＡＥ０６９２７、ＢＡＥ０６９２６、ＢＡＥ０６９２５、ＢＡＥ０６９２４、ＢＡＥ０６９２３、ＢＡＥ０６９２２、ＢＡＥ０６９２１、ＢＡＥ０６９２０、ＢＡＥ０６９１９、ＢＡＥ０６９１８、ＢＡＥ０６９１７、ＢＡＥ０６９１６、ＢＡＥ０６９１５、ＢＡＥ０６９１４、ＢＡＥ０６９１３、ＢＡＥ０６９１２、ＢＡＥ０６９１１、ＢＡＥ０６９１０、ＢＡＥ０６９０���、ＢＡＥ０６９０８、ＢＡＥ０６９０７、ＢＡＥ０６９０６、ＢＡＥ０６９０５、ＢＡＥ０６９０４、ＢＡＥ０６９０３、ＢＡＥ０６９０２、ＢＡＥ０６９０１、ＢＡＥ０６９００、ＢＡＥ０６８９９、ＢＡＥ０６８９８、ＢＡＥ０６８９７、ＢＡＥ０６８９６、ＢＡＥ０６８９５、ＢＡＥ０６８９４、ＢＡＥ０６８９３、ＢＡＥ０６８９２、ＢＡＥ０６８９１、ＢＡＥ０６８９０、ＢＡＥ０６８８９、ＢＡＥ０６８８８、ＢＡＥ０６８８７、ＢＡＥ０６８８６、ＢＡＥ０６８８５、ＢＡＥ０６８８４、ＢＡＥ０６８８３、ＢＡＥ０６８８２、ＢＡＥ０６８８１、ＢＡＥ０６８８０、ＢＡＥ０６８７９、ＢＡＥ０６８７８、ＢＡＥ０６８７７、ＢＡＥ０６８７６、ＢＡＥ０６８７５、ＢＡＥ０６８７４、ＢＡＥ０６８７３、ＢＡＥ０６８７２、ＢＡＥ０６８７１、ＢＡＥ０６８７０、ＢＡＥ０６８６９、ＢＡＥ０６８６８、ＢＡＥ０６８６７、ＢＡＥ０６８６６、ＢＡＥ０６８６５、ＢＡＥ０６８６４、ＢＡＥ０６８６３、ＢＡＥ０６８６２、ＢＡＥ０６８６１、ＢＡＥ０６８６０、ＢＡＥ０６８５９、ＢＡＥ０６８５８、ＢＡＥ０６８５７、ＢＡＥ０６８５６、ＢＡＥ０６８５５、ＢＡＥ０６８５４、ＢＡＥ０６８５３  ａｎｄ  ＢＡＥ０６８５２）。
【０３５７】
ＰＨＡシンターゼタンパク質のＮ末端断片（ほぼアミノ酸１〜２００、または１〜１５０、または１〜１００）は、高度に可変性であり、いくつかの例では、欠失されるか、あるいは抗原、抗原結合ドメインまたは別の融合相手により置き換えられ、酵素を不活性することはなく、またはポリマー粒子結合ドメイン（即ち、Ｃ末端断片）を介したポリマーコアとのシンターゼの共有結合を防止することはない。シンターゼを結合し得るポリマー粒子結合ドメインは、ポリマーコアの重合およびポリマー粒子の形成を媒介するシンターゼタンパク質の少なくとも触媒ドメインを含む。
【０３５８】
いくつかの実施形態では、ＰＨＡシンターゼタンパク質のＣ末端断片は、修飾され、部分的に欠失され、または免疫応答を引き出し得る抗原、免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメイン、または別の融合相手により置き換えられ、酵素を不活性化すくことなく、あるいはポリマー粒子とのシンターゼの共有結合を防止することはない。
【０３５９】
ある場合には、免疫応答を引き出し得る抗原、免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメイン、または別の融合相手は、酵素を不活性化すくことなく、あるいはポリマー粒子とのシンターゼの共有結合を防止することなく、ＰＨＡシンターゼタンパク質のＮ末端またはＣ末端と融合される。同様に、他の場合には、免疫応答を引き出し得る抗原、免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメイン、または別の融合相手は、ＰＨＡシンターゼタンパク質内に、または実際には粒子形成タンパク質内に挿入される。ＰｈａＣ融合の例は、当該技術分野で既知であり、本明細書中に示されている。
【０３６０】
一例では、ＰＨＡシンターゼタンパク質のＮ末端断片（ほぼアミノ酸１〜２００、または１〜１５０、または１〜１００）は、高度に可変性であり、欠失されるか、あるいはヒト型結核菌抗原、ヒト型結核菌抗原結合ドメイン、肝炎抗原、肝炎抗原結合ドメイン、インフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原結合ドメイン、または別の融合相手により置き換えられ、酵素を不活性することはなく、またはポリマー粒子結合ドメイン（即ち、Ｃ末端断片（このドメインは疎水性相互作用により結合する））を介したポリマー粒子とのシンターゼの共有結合（共有結合は、初期のポリエステルが突き出る活性部位により起きる）を防止することはない。シンターゼのポリマー粒子結合ドメインは、ポリマー粒子の重合およびポリマー粒子の形成を媒介するシンターゼタンパク質の少なくとも触媒ドメインを含む。
【０３６１】
ＰＨＡシンターゼタンパク質のＣ末端断片は、修飾され、部分的に欠失され、または、例えばヒト型結核菌抗原、ヒト型結核菌抗原結合ドメイン、肝炎抗原、肝炎抗原結合ドメイン、インフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原結合ドメイン、または別の融合相手により部分的に置き換えられ、酵素を不活性化すくことなく、あるいはポリマー粒子とのシンターゼの共有結合を防止することもない。
【０３６２】
ある場合には、ヒト型結核菌抗原、ヒト型結核菌抗原結合ドメイン、肝炎抗原、肝炎抗原結合ドメイン、インフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原結合ドメイン、または別の融合相手は、酵素を不活性化すくことなく、あるいはポリマー粒子とのシンターゼの共有結合を防止することなく、ＰＨＡシンターゼタンパク質のＮ末端またはＣ末端と融合される。同様に、他の場合には、ヒト型結核菌抗原、ヒト型結核菌抗原結合ドメイン、肝炎抗原、肝炎抗原結合ドメイン、インフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原結合ドメイン、または別の融合相手は、ＰＨＡシンターゼタンパク質内に、または実際には粒子形成タンパク質内に挿入される。ＰｈａＣ融合の例は、当該技術分野で既知であり、本明細書中に示されている。
【０３６３】
「ポリマーデポリメラーゼ」は、本明細書中で用いる場合、存在するポリマー、例えばポリマー粒子中に見出されるものを、水溶性モノマーまたはオリゴマーに加水分解し得るタンパク質を指す。ポリマーデポリメラーゼの例は、広範な種々のＰＨＡ分解細菌および真菌中に生じ、例えば、パウシモナス・レモイグネイからのＰｈａＺ１〜ＰｈａＺ７細胞外デポリメラーゼ、アシドボラックス種、アルカリゲネス・フェカリス（ＡＥ１２２およびＴ１株）、デルフチア（コマモナス）・アシドボランスＹＭ１０６９株、コマモナス・テストステロニ、コマモナス種、レプトトリックス種  ＨＳ株、シュードモナス種  ＧＭ１０１株（寄託番号ＡＦ２９３３４７）、シュードモナス・フルオレッセンス  ＧＫ１３株、シュードモナス・スツッツェリ、ラルストニア・ピケッティ（Ａ１およびＫ１株、寄託番号ＪＯ４２２３、Ｄ２５３１５）、ストレプトミセス・エクスフォリアツス  Ｋ１０およびストレプトミセス・ヒグロスコピクスからのＰｈａＺデポリメラーゼが挙げられる（Jendrossek D., and Handrick, R., Microbial Degredation of Polyhydroxyalkanoates, Annual Review of Microbiology, 2002, 56: 403-32参照）。
【０３６４】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で用いる場合、任意長のアミノ酸鎖、しかし好ましくは少なくとも５アミノ酸（全長タンパク質を含む）を包含し、この場合、アミノ酸残基は共有ペプチド結合により連結される。本発明のポリペプチドは、精製天然産物であるか、あるいは、一部または全部が、組換えまたは合成技法を用いて産生される。当該用語は、ポリペプチド、ポリペプチドの集合体、例えば二量体または他の多量体、融合ポリペプチド、ポリペプチド変異体またはその誘導体を指すこともある。
【０３６５】
「プロモーター」という用語は、遺伝子転写を調節するコード領域の上流の非転写シス調節因子を指す。プロモーターは、転写開始部位および保存ボックス、例えばＴＡＴＡボックス、ならびに転写因子により結合されるモチーフを特定するシス−イニシエーター因子を含む。
【０３６６】
「ターミネーター」という用語は、転写を終結する配列を指し、これは、翻訳配列の下流の遺伝子の３’非翻訳末端に見出される。ターミネーターは、ｍＲＮＡ安定性の重要な決定因子であり、いくつかの場合には、空間的調節機能を有することが見出されている。
【０３６７】
「物質」という用語は、ポリマー粒子に結合されるか、またはポリマー粒子中に吸収されるかまたはポリマー粒子内に組入れられることに関連して言及される場合、融合相手により結合される物質、あるいはポリマー粒子中に吸収されるかまたはポリマー粒子内に組入れられ得る物質を意味するよう意図される。
【０３６８】
「変異体」という用語は、本明細書中で用いる場合、特定的に同定される配列とは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、この場合、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が欠失され、置換されまたは付加される。変異体は、天然対立遺伝子変異体または非天然変異体である。変異体は、同一種または他の種からであり、そしてホモログ、パラログおよびオルソログを包含し得る。ある実施形態では、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体は、野生型ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのものと同一であるかまたは類似する生物学的活性を保有する。「変異体」という用語は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関しては、本明細書中で定義されるようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドのすべての型を包含する。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド変異体
【０３６９】
「ポリヌクレオチド（単数または複数）」という用語は、本明細書中で用いる場合、任意長の、しかし好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、例としては、遺伝子のコードおよび非コード配列、センスおよびアンチセンス配列相補体、エキソン、イントロン、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、組換えポリペプチド、単離および精製天然ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ配列、核酸プローブ、プライマーおよび断片が挙げられるが、これらに限定されない。多数の核酸類似体は当該技術分野で周知であり、これらも意図される。
【０３７０】
本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列の「断片」は、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長である連続ヌクレオチドの亜配列である。本発明の断片は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも２０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも６０連続ヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチド配列の断片は、アンチセンス、遺伝子サイレンシング、三重らせんまたはリボザイム技術で、あるいはプライマー、プローブとして用いられ得るし、マイクロアレイ中に含まれ得るし、あるいはポリヌクレオチドベースの選択方法で用いられ得る。
【０３７１】
「断片」という用語は、プロモーターポリヌクレオチド配列に関しては、断片が操作可能的に連結されるポリヌクレオチド配列の発現を調節し得るプロモーターポリヌクレオチド配列のシス因子および領域を含む配列を包含するよう意図される。
【０３７２】
好ましくは、本発明のプロモーターポリヌクレオチド配列の断片は、本発明のプロモーターポリヌクレオチドの少なくとも２０、さらに好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、さらに好ましくは少なくとも５０、さらに好ましくは少なくとも１００、さらに好ましくは少なくとも２００、さらに好ましくは少なくとも３００、さらに好ましくは少なくとも４００、さらに好ましくは少なくとも５００、さらに好ましくは少なくとも６００、さらに好ましくは少なくとも７００、さらに好ましくは少なくとも８００、さらに好ましくは少なくとも９００、さらに好ましくは少なくとも１０００連続ヌクレオチドを含む。
【０３７３】
「プライマー」という用語は、鋳型とハイブリダイズされ、鋳型と相補的なポリヌクレオチドの重合を起動するために用いられる、通常は遊離３’ＯＨ基を有する短いポリヌクレオチドを指す。このようなプライマーは、好ましくは、少なくとも５、さらに好ましくは少なくとも６、されに好ましくは少なくとも７、さらに好ましくは少なくとも９、さらに好ましくは少なくとも１０、さらに好ましくは少なくとも１１、さらに好ましくは少なくとも１２、さらに好ましくは少なくとも１３、さらに好ましくは少なくとも１４、さらに好ましくは少なくとも１５、さらに好ましくは少なくとも１６、さらに好ましくは少なくとも１７、さらに好ましくは少なくとも１８、さらに好ましくは少なくとも１９、さらに好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長である。
【０３７４】
「プローブ」という用語は、ハイブリダイゼーションベースの検定において、プローブと相補的であるポリヌクレオチド配列を検出するために用いられる短いポリヌクレオチドを指す。プローブは、本明細書中で定義されるようなポリヌクレオチドの「断片」からなる。好ましくは、このようなプローブは、少なくとも５、さらに好ましくは少なくとも１０、さらに好ましくは少なくとも２０、さらに好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、さらに好ましくは少なくとも５０、さらに好ましくは少なくとも１００、さらに好ましくは少なくとも２００、さらに好ましくは少なくとも３００、さらに好ましくは少なくとも４００、最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチド長である。
【０３７５】
「変異体」という用語は、本明細書中で用いる場合、特定的に同定される配列とは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、この場合、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が欠失され、置換されまたは付加される。変異体は、天然対立遺伝子変異体または非天然変異体である。変異体は、同一種または他の種からであり、そしてホモログ、パラログおよびオルソログを包含し得る。ある実施形態では、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体は、野生型ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのものと同一であるかまたは類似する生物学的活性を保有する。「変異体」という用語は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関しては、本明細書中で定義されるようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドのすべての型を包含する。
ポリヌクレオチド変異体
【０３７６】
変異体ポリヌクレオチド配列は、好ましくは、特定ポリヌクレオチド配列と少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示す。同一性は、少なくとも２０ヌクレオチド位置、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド位置、少なくとも１００ヌクレオチド位置の比較ウインドウに亘って、あるいは特定ポリヌクレオチド配列の全長に亘って見出される。
【０３７７】
ポリヌクレオチド配列同一性は、以下のようにして決定され得る。被験体ポリヌクレオチド配列は、ＢＬＡＳＴＮ（プログラムのＢＬＡＳＴ組、バージョン２．２．１０［Oct 2004］から）を用いて、ｂｌ２ｓｅｑ（Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250）（これは、ＮＣＢＩ（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）から公的に利用可能である）で、候補ポリヌクレオチド配列と比較される。ｂｌ２ｓｅｑのデフォルトパラメーターが利用されるが、但し、低複雑性部分のフィルタリングは止められるべきである。
【０３７８】
ポリヌクレオチド配列の同一性は、以下のｕｎｉｘコマンド行パラメーターを用いて調べられ得る：
bl2seq -i nucleotideseq1 -j nucleotideseq2 -F F -p blastn
【０３７９】
パラメーター  −ＦＦは、低複雑性区分のフィルタリングを止める。パラメーター  −ｐは、配列の対に関する適切なアルゴリズムを選択する。ｂｌ２ｓｅｑプログラムは、行「同一性＝」における同一ヌクレオチドの数およびパーセンテージの両方として配列同一性を報告する。
【０３８０】
ポリヌクレオチド配列同一性は、全体的配列アラインメントプログラム（例えば、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453）を用いて、候補および被験体ポリヌクレオチド配列間の重複の全長に亘っても算定され得る。Needleman-Wunsch全体的アラインメントアルゴリズムの完全履行は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（Rice,P. Longden,I. and Bleasby,A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics June 2000, vol 16, No 6. pp.276-277）（これは、http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/から利用可能）におけるニードルプログラムに見出される。欧州バイオインフォーマティクス研究所のサーバーも、http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/でのライン上の２つの配列間のＥＭＢＯＳＳ−ニードル全体的アラインメントを実施するための設備を提供する。
【０３８１】
代替的には、末端ギャップにペナルティを課すことなく、２つの配列の最適全体的アラインメントを計算するＧＡＰプログラムが用いられ得る。ＧＡＰは、以下の論文に記載されている：Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235。
【０３８２】
本発明のポリヌクレオチド変異体は、その配列の機能的等価物を保存すると思われる特定的に同定される配列のうちの１つ以上との類似性を示すもの、そして無作為見込みにより生じたと合理的に予測され得ないものも包含する。ポリペプチドに関するこのような配列類似性は、ＮＣＢＩ（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）からのプログラムのＢＬＡＳＴ組(バージョン２．２．１０［Oct 2004］)からの公的に利用可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを用いて決定する。
【０３８３】
ポリヌクレオチド配列の類似性は、以下のｕｎｉｘコマンド行パラメーターを用いて調べられ得る：
bl2seq -i nucleotideseq1 -j nucleotideseq2 -F F -p tblastx
【０３８４】
パラメーター  −ＦＦは、低複雑性区分のフィルタリングを止める。パラメーター  −ｐは、配列の対に関する適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列間の類似性の領域を見出し、各々のこのような領域に関して、「Ｅ値」（これは、無作為配列を含有する固定参照サイズのデータベースにおいて偶然このような整合を観察すると予測され得る予測回数である）を報告する。このデータベースのサイズは、ｂｌ２ｓｅｑプログラムにおけるデフォルトにより設定される。１よりはるかに低い小Ｅ値に関しては、Ｅ値はこのような無作為整合のおよその確率である。
【０３８５】
変異体ポリヌクレオチド配列は、好ましくは、特定的に同定される配列のいずれか１つと比較した場合、１ｘ１０−１０未満、さらに好ましくは１ｘ１０−２０未満、１ｘ１０−３０未満、１ｘ１０−４０未満、１ｘ１０−５０未満、１ｘ１０−６０未満、１ｘ１０−７０未満、１ｘ１０−８０未満、１ｘ１０−９０未満、１ｘ１０−１００未満、１ｘ１０−１１０未満、１ｘ１０−１２０未満または１ｘ１０−１２３未満のＥ値を示す。
【０３８６】
代替的には、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、緊縮条件下で、特定ポリヌクレオチド配列またはその相補体とハイブリダイズする。
【０３８７】
「緊縮条件下でハイブリダイズする」という用語およびその文法的等価物は、温度および塩濃度の限定条件下で、標的ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡブロット、例えばサザンブロットまたはノーザンブロット上に固定化される標的ポリヌクレオチド分子）とハイブリダイズするポリヌクレオチド分子の能力を指す。緊縮ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする能力は、低緊縮条件下で最初にハイブリダイズし、次いで、所望の緊縮度に緊縮性を増大することにより決定され得る。
【０３８８】
約１００塩基長より大きいポリヌクレオチド分子に関しては、典型的緊縮ハイブリダイゼーション条件は、ネイティブ二重鎖の融点（Ｔｍ）よりせいぜい２５〜３０℃（例えば１０℃）低い（一般的に、Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press；Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing参照）。約１００塩基より大きいポリヌクレオチド分子に関するＴｍは、式  Ｔｍ＝８１．５＋０．４１％（Ｇ＋Ｃ−ｌｏｇ（Ｎａ＋）により算定される(Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press；Bolton and McCarthy, 1962, PNAS 84:1390)。１００塩基長より大きいポリヌクレオチドに関する典型的緊縮条件は、６ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの溶液中での予備洗浄；６５°Ｃ、６ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで一晩ハイブリダイゼーション；その後、１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５°Ｃで、各々３０分間、２回洗浄、そして０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、６５°Ｃで各々３０分間、２回洗浄といったようなハイブリダイゼーション条件であろう。
【０３８９】
１００塩基未満の長さを有するポリヌクレオチド分子に関しては、例示的緊縮ハイブリダイゼーション条件は、融点より５〜１０℃低い。平均で、１００ｂｐ未満長のポリヌクレオチドのＴｍは、約（５００／オリゴヌクレオチド長）℃だけ低減される。
【０３９０】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）として既知のＤＮＡ模倣物（Nielsen et al., Science. 1991 Dec 6;254(5037):1497-500）に関しては、Ｔｍ値は、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに関する値より高く、Giesen et al., Nucleic Acids Res. 1998 Nov 1;26(21):5004-6に記載された式を用いて算定され得る。１００塩基未満の長さを有するＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドに関する例示的緊縮ハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍより５〜１０℃低い。
【０３９１】
本発明の変異体ポリヌクレオチドは、本発明の配列と異なるが、しかし遺伝子コードの縮重の結果として、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと類似の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも包含する。ポリペプチドのアミノ酸配列を変えない配列変更は、「サイレント変異」である。ＡＴＧ（メチオニン）およびＴＧＧ（トリプトファン）を除いて、いくつかの例では、同一アミノ酸に関する他のコドンは、当該技術分野で認識された技法により、例えば特定の宿主生物におけるコドン発現を最適化するよう変えられる。
【０３９２】
その生物学的活性を有意に変更することなくコードポリペプチド配列中の１つまたは数個のアミノ酸の保存的置換を生じるポリヌクレオチド配列変更も、本発明に包含される。表現型的サイレントアミノ酸置換の作製方法を、当業者は承知している（例えばBowie et al., 1990, Science 247, 1306参照）。
【０３９３】
コード化ポリペプチド配列におけるサイレント変異および保存的置換による変異体ポリヌクレオチドは、ＮＣＢＩ（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）からのプログラムのＢＬＡＳＴ組(バージョン２．２．１０［Oct 2004］)からの公的に利用可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを用いて決定し得る。
ポリペプチド変異体
【０３９４】
「変異体」という用語は、ポリペプチドに関しては、天然、組換えおよび合成的産生ポリペプチドを包含する。変異体ポリペプチド配列は、好ましくは、本発明の配列と少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示す。同一性は、少なくとも２０アミノ酸位置、好ましくは少なくとも５０アミノ酸位置、少なくとも１００アミノ酸位置の比較ウインドウに亘って、あるいは本発明のポリペプチドの全長に亘って見出される。
【０３９５】
ポリペプチド配列同一性は、以下のようにして決定され得る。被験体ポリペプチド配列は、ＢＬＡＳＴＰ（プログラムのＢＬＡＳＴ組、バージョン２．２．１０［Oct 2004］から）を用いて、ｂｌ２ｓｅｑ（これは、ＮＣＢＩ（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）から公的に利用可能である）で、候補ポリペプチド配列と比較される。ｂｌ２ｓｅｑのデフォルトパラメーターが利用されるが、但し、低複雑性部分のフィルタリングは止められるべきである。
【０３９６】
ポリペプチド配列同一性は、全体的配列アラインメントプログラムを用いて、候補および被験体ポリヌクレオチド配列間の重複の全長に亘っても算定され得る。上記のようなＥＭＢＯＳＳニードル（http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/から利用可能）およびＧＡＰ（Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235）は、ポリペプチド配列同一性を算定するための適切な全体的配列アラインメントプログラムでもある。
【０３９７】
本発明のポリペプチド変異体は、その配列の機能的等価物を保存すると思われる特定的に同定される配列のうちの１つ以上との類似性を示すもの、そして無作為見込みにより生じたと合理的に予測され得ないものも包含する。ポリペプチドに関するこのような配列類似性は、ＮＣＢＩ（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）からのプログラムのＢＬＡＳＴ組(バージョン２．２．１０［Oct 2004］)からの公的に利用可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを用いて決定し得る。ポリペプチド配列の類似性は、以下のｕｎｉｘコマンド行パラメーターを用いて調べられ得る：
bl2seq -i peptideseq1 -j peptideseq2  -F F -p blastp
【０３９８】
変異体ポリペプチド配列は、好ましくは、特定的に同定される配列のいずれか１つと比較した場合、１ｘ１０−１０未満、さらに好ましくは１ｘ１０−２０未満、１ｘ１０−３０未満、１ｘ１０−４０未満、１ｘ１０−５０未満、１ｘ１０−６０未満、１ｘ１０−７０未満、１ｘ１０−８０未満、１ｘ１０−９０未満、１ｘ１０−１００未満、１ｘ１０−１１０未満、１ｘ１０−１２０未満または１ｘ１０−１２３未満のＥ値を示す。
【０３９９】
パラメーター  −ＦＦは、低複雑性区分のフィルタリングを止める。パラメーター  −ｐは、配列の対に関する適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列間の類似性の領域を見出し、各々のこのような領域に関して、「Ｅ値」（これは、無作為配列を含有する固定参照サイズのデータベースにおいて偶然このような整合を観察すると予測され得る予測回数である）を報告する。１よりはるかに低い小Ｅ値に関しては、これはこのような無作為整合のおよその確率である。
【０４００】
その生物学的活性を有意に変更することなく記載されたポリペプチド配列の１つまたは数個のアミノ酸の保存的置換も、本発明に包含される。表現型的サイレントアミノ酸置換の作製方法を、当業者は承知している（例えばBowie et al., 1990, Science 247, 1306参照）。
【０４０１】
本発明のポリペプチド変異体は、ポリペプチドをコードする拡散から産生されるが、しかしそれが、変更されたアミノ酸配列を有するよう異なって産生されるという点で野生型ポリペプチドと異なるものも包含する。例えば、変異体は、野生型ポリペプチドを産生するものに対して代替的な一次ＲＮＡ転写物スプライシングパターンにより産生される。
【０４０２】
「ベクター」という用語は、宿主細胞中に遺伝子構築物を運搬するために用いられる、通常は二本鎖のＤＮＡであるポリヌクレオチド分子を指す。ある例では、ベクターは、少なくとも１つの付加的宿主系、例えば大腸菌中での複製が可能である。
２．病原体
【０４０３】
本発明のポリマー粒子、方法および組成物は、一部は、細胞内病原体を含めた病原体により引き起こされる疾患の防止または処置に関する、と理解される。したがって、細胞内病原体由来の抗原は、本発明において用い易く、当業者により選択され得る。代表的細胞内病原体は、以下でさらに詳細に記載されるが、しかし、本発明は、例えば、標的細胞内病原体からの１つ以上の抗原、あるいは標的細胞内病原体からの抗原を結合し得る１つ以上の結合ドメインを選択することにより、本明細書中に記載される方法に従って、細胞内病原体に関連した任意の疾患または症状の処置または防止における用途を有する、と当業者は理解する。
【０４０４】
マイコバクテリウムは、放線菌綱の一属である。この属は、哺乳動物における重篤な疾患、例えば結核およびハンセン病を引き起こすことが知られている病原体を含む。病原体種の例としては、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、マイコバクテリウム・アフリカナム、ネズミ型結核菌、ライ菌（ハンセン病）、ヨーネ菌（ヒトにおけるクローン病および羊におけるジョンズ病に関連）が挙げられる。
【０４０５】
リステリア種は、グラム陽性桿菌である。この属の最も既知の病原体は、リステリア・モノサイトゲネスであって、リステリア症の原因作因である。リステリア・イバノビは反芻動物の病原体であって、稀にヒト疾患の原因であるに過ぎない。
【０４０６】
赤痢菌属は、大腸菌およびサルモネラ属に密接に関連するグラム陰性、非胞子形成棒形細菌の一属である。赤痢菌属は、ヒト赤痢（下痢）の原因作因であって、霊長類にのみ感染するが、他の哺乳動物には感染しない。
【０４０７】
エルシニア属は、グラム陰性、棒形細菌である。具体的ヒト病原体としては、エルシニア・エンテロコリチカ（エルシニア症を引き起こす）、ペスト菌（ペストの原因作因）、および最小一般病原体である仮性結核菌が挙げられる。エルシニア属は、反応性関節炎の病因の１つとして包含される。
【０４０８】
ブルセラ属は、グラム陰性、非自動性、非被包性球状桿菌の一属である。ブルセラ属は、ブルセラ症の病因である。異なるブルセラ種の例としては、ブルセラ・メリテンシスおよびブルセラ・オビス（ヒツジ種に感染する）、ブルセラ・アボルツス（畜牛に感染する）、ブルセラ・スイス（ブタ種に感染する）、ブルセラ・ピンニペディア（海洋哺乳動物から単離）およびブルセラ・ネオトメが挙げられる。ヒトは、典型的には、感染動物（ヒツジ、畜牛またはブタ）からの、または非殺菌ミルクおよびチーズのような食品から抽出される流体と接触することにより感染するようになる。
【０４０９】
レジオネラ属は、グラム陰性細菌である。最も顕著な種であるレジオネラ・ニューモフィラは、レジオネラ症またはレジオネラ病を引き起こす。
【０４１０】
リケッチア属は、自動性、グラム陰性、非胞子形成細菌の一属である。リケッチア種は、多数のダニ、ノミおよびシラミにより寄生生物として保有されて、ロッキー山紅斑熱（R. rickettsii）、リケッチア痘（R. akari）、ボタン熱（R. conorii）、シベリアチックチフス（R. siberica）、オーストラリアチックチフス（R. australis）、日本紅斑熱（R. japonica）、アフリカダニ熱（R. africae）、発疹チフス（R. prowazekii）、および発疹熱（R. typhi）のような疾患を引き起こす。
【０４１１】
サルモネラ属は、棒形、グラム陰性、非胞子形成、自動性腸内細菌の一属であって、ヒトおよび多数の動物における疾病、例えば腸チフス、パラチフス熱およびサルモネラ症を引き起こす。
【０４１２】
クラミジア属は、ヒト病原体クラミジア・トラコマチスを含む細菌の一属を指す。クラミドフィラ属は関連細菌であって、ヒト病原体クラミドフィラ・ニューモニエ（肺炎を引き起こす）、クラミドフィラ・シタッシ（オーム病を引き起こす）およびクラミドフィラ流産菌（ヒトにおける流産に関連する）を含む。
【０４１３】
連鎖球菌属は、球形グラム陽性細菌の一属であって、多数のヒト疾患、例えば、髄膜炎、細菌性肺炎（肺炎連鎖球菌）、心内膜炎、丹毒および壊死性筋膜炎（化膿連鎖球菌）を引き起こすことが知られている。
【０４１４】
ブドウ球菌属は、グラム陽性細菌の一属であって、食中毒の一般的原因である。
【０４１５】
プラスモジウム属は、寄生性原生動物の一属である。この寄生生物に感染すると、マラリアを引き起こすことが知られている（P. falciparum）。
２．１  結核
【０４１６】
結核は重篤な世界的規模の健康問題であって、年間、全世界で２００万人以上が死亡している。この疾患は、ヒト型結核菌により引き起こされる。細菌は、一般的に、吸入により肺に侵入して、肺に感染を引き起こし、これは終には身体の他の部分、例えば中枢神経系、リンパ系、循環系、尿生殖系、消化管系、骨、関節および皮膚に蔓延し得る（Dietrich, 2006；Mustafa, 2001）。農耕動物における種々の型の結核、例えばウシ型結核およびヨーネ病も、生産に及ぼす有意の負の作用を有する。
【０４１７】
ヒト型結核菌による感染の蔓延は、免疫系により限定される。多数の個体が、咳および発熱以外の症候をほとんど示さない。しかしながら、個体の約３０％は、感染を十分に制御できず、一次疾患を発症する。これにもかかわらず、疾患は個体中に休眠して、それらは、数年後あるいは数十年後でさえ、再び感染し得る。この理由のために、ヒト型結核菌は、免疫応答を免れて、長期間、難治性の非または緩徐複製相で生存するので、感染性細菌の中でも独特である。
【０４１８】
結核感染は、３相でそれ自体発現する。第一急性段階は、身体の器官における細菌の増殖により同定される。免疫応答が迅速に後に続いて、感染を制御し、終には、細菌負荷の減少を生じる。急性相の後、第二潜伏相が確立される。この第二段階中、細菌負荷は安定且つ低レベルで保持される。ヒト型結核菌は、急性相の活性増加状態から、潜伏相の休眠状態に変わる。第三の再活性化相が起こり、それにより細菌は再び複製し始める。この第三段階に影響を及ぼす因子は、依然として大部分は不明である（Barnes and Cave, 2003）。
【０４１９】
細菌は、活性複製から休眠への遷移中の遺伝子発現を調整し得るので、免疫応答の抗原特異性の変化は、感染の異なる段階全体を通して起こる、と考えられる。
２．２  肝炎
【０４２０】
肝炎は、種々の肝炎ウイルスにより一般に引き起こされる疾患に関する集合的名称である。肝炎の他の要因としては、アルコール、毒素、薬剤および自己免疫疾患が挙げられる。肝炎は、肝臓の炎症であって、ある場合には、倦怠感、筋肉および関節痛、食欲喪失、ならびに横断および最終的肝不全を含めた症候を伴う。肝炎は、急性および慢性の両方があって、疾患の慢性罹患者では肝硬変が観察される。
２．３  インフルエンザ
【０４２１】
インフルエンザ（より一般的には「フル」と呼ばれる）は、オルソミクソウイルス科のＲＮＡウイルスにより引き起こされる。インフルエンザで、年間２５０，０００〜５００，０００人が死亡する。共通する症候としては、寒気、発熱、咽頭痛、筋肉痛および疼痛、頭痛、咳、衰弱および疲労感が挙げられる。重篤症例では、インフルエンザは、空気を解して、あるいは感染鳥の糞または鼻水と直接接触することにより、伝染され得る。
【０４２２】
インフルエンザウイルスの３つのクラス（Ａ、ＢおよびＣ）が存在し、すべて、類似の構造を共有する。２つの大型糖タンパク質、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼが、ウイルス粒子の表面に表示され、そしてウイルスと標的細胞との結合、標的細胞中へのウイルスゲノムの移入、ならびに感染細胞からのウイルス子孫の放出に関与する。ヘマグルチニンの１６の既知のサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１６）およびノイラミニダーゼの９つのサブタイプ（Ｎ１〜Ｎ９）が存在する。
２．４  最新処置戦略
【０４２３】
細胞内病原体に対する防御のための最新処置戦略としては、既知の抗原に対する特異的ワクチン、または細胞内細菌病原体に感染した患者における抗生物質処置が挙げられる。
【０４２４】
細胞内病原体の再活性化に対して防御するための適切なワクチンの欠如は、感染前に予防的に、または感染開始後に治療的に、細胞内病原体に対する新規の且つ改善された処置戦略に対する必要性を促してきた。
【０４２５】
例えば、結核のための唯一の一般に利用可能なワクチンは、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）であって、これは、ウシ型結核菌の生弱毒化菌株を含有する。結核感染の制御におけるＢＣＧの効力は、限定される。ワクチンは一次疾患に対して小児を防御すると思われるが、しかし成人型の疾患（潜伏期間後に再活性化）に対するその防御効力は低減される（World Health Organisation - http://www.who.int）。ＢＣＧの効力は、結核が流行している多数の第三世界の国々においては限定される、ということも報告されている。さらに、ＢＣＧワクチンは生ワクチンであるので、それは、免疫無防備状態である患者への投与には適していない。ＢＣＧワクチンは、報告によれば、脾臓（およびその他の器官）へのヒト型結核菌の伝播を低減するが、一方、それは、肺における細菌増殖を防止しない。
【０４２６】
再活性化に対して防御するために適切なワクチンの欠如は、感染前に予防的に、または感染開始後に治療的に、生ワクチンと関連した他の問題とともに、結核、肝炎またはインフルエンザを含めた細胞内病原体に対する新規の且つ改善された処置戦略に対する必要性を促してきた。
３．免疫応答
３．１．  細胞媒介性応答
【０４２７】
細胞媒介性免疫は、主にＴリンパ球により媒介される。病原体抗原は、主要組織適合性ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子と結合される抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、Ｂリンパ球および樹状細胞）の表面に発現される。ＭＨＣクラスＩＩと連結される病原体抗原の提示は、ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞応答を活性化する。Ｔ細胞と抗原−ＭＨＣ  ＩＩ複合体との結合時に、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は増殖し、サイトカイン、例えばインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）およびインターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４、ＩＬ−７およびＩＬ−１２を放出する。
【０４２８】
ＭＨＣクラスＩ分子と結合される病原体抗原の例示は、細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞応答を活性化する。Ｔ細胞と抗原−ＭＨＣ  Ｉ複合体との結合時に、ＣＤ８＋細胞はパーフォリンを分泌して、病原体細胞溶解、腫脹および死を生じる。代替的には、ＣＤ８＋細胞は、プログラムされた細胞死またはアポトーシスを誘導する。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ４＋Ｔ細胞による特異的サイトカインの放出により増幅される。
【０４２９】
細胞媒介性免疫応答は、種々の病原体、例えば細胞内病原体、例えばヒト型結核菌に対する免疫性にとって重要であると考えられる。
【０４３０】
被験体における細胞媒介性応答の開始または進行を査定し、監視するための方法は、当該技術分野で周知である。好都合な例示的方法としては、本明細書中で同定されるもののような細胞媒介性応答に関連した１つ以上のサイトカインの存在またはレベルが査定されるものが挙げられる。同様に、細胞媒介性応答の開始および進行を査定しまたは監視するための細胞ベースの方法は、本発明において用い易く、例えば、細胞増殖または活性化検定、例えば、Ｔリンパ球のような免疫細胞の１つ以上の集団の活性化または拡張の同定時に標的化される検定が挙げられ得る。
【０４３１】
ある実施形態では、細胞媒介性免疫応答および体液性応答の両方を引き出す本発明の方法が好ましい。
【０４３２】
他の実施形態では、主に細胞媒介性応答を引き出す本発明の方法が好ましい。このような方法は、有意の体液性応答を伴わずに、または任意の検出可能な体液性応答を伴わずに、細胞媒介性免疫応答を引き出すものを包含し得る。一例では、免疫応答は、細胞媒介性免疫応答、例えば有意のＩｇＡ応答の非存在下で、または有意のＩｇＥ応答の非存在下で、または有意のＩｇＧ応答の非存在下で、例えば有意のＩｇＧ１応答の非存在下で、または有意のＩｇＧ２応答の非存在下で、または有意のＩｇＭ応答の非存在下で、ＩＦＮ−γ応答により示されるものである。
３．２．  体液性応答
【０４３３】
体液性免疫応答は、Ｂ細胞により産生される分泌抗体により媒介される。分泌抗体は、侵襲病原体の表面に提示される抗原と結合して、撲滅のためにそれらを弱らせる。
【０４３４】
組合せ細胞媒介性および体液性応答（例えば開始細胞媒介性応答の結果としてのもの）はより高い感受性免疫応答を達成するために、または細胞内病原体に対する防御のレベルを増強するために有益である、ということが示唆されている。
【０４３５】
さらにまた、体液性応答の開始または進行を査定し、監視するための方法は、当該技術分野で周知である。これらは、抗体結合検定、ＥＬＩＳＡ、皮膚プリックテスト等を包含する。
４．  抗原
【０４３６】
種々の病原性生物からの非常に多くの抗原が特性化されており、本発明で用いるのに適している、と理解される。目下特性化されているか否かにかかわらず、免疫応答を引き出し得る抗原はすべて、意図される。
４．１．  結核抗原
【０４３７】
非常に多くのヒト型結核菌抗原が特性化されており、本発明で用いるのに適している、と理解される。目下特性化されているか否かにかかわらず、免疫応答を引き出し得るヒト型結核菌抗原はすべて、意図される。
【０４３８】
本発明で用いるのに適しているヒト型結核菌抗原の例としては、早期分泌抗原標的（ＥＳＡＴ）−６、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ（ＭＰＴ５９）、Ａｇ８５Ｂ、Ａｇ８５Ｃ、ＭＰＴ３２、ＭＰＴ５１、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ６３、ＭＰＴ６４、ＭＰＴ８３、ＭＰＢ５、ＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＴＣ２８、Ｍｔｂ２、Ｍｔｂ８．４、Ｍｔｂ９．９、Ｍｔｂ３２Ａ、Ｍｔｂ３９、Ｍｔｂ４１、ＴＢ１０．４、ＴＢ１０Ｃ、ＴＢ１１Ｂ、ＴＢ１２．５、ＴＢ１３Ａ、ＴＢ１４、ＴＢ１５、ＴＢ１５Ａ、ＴＢ１６、ＴＢ１６Ａ、ＴＢ１７、ＴＢ１８、ＴＢ２１、ＴＢ２０．６、ＴＢ２４、ＴＢ２７Ｂ、ＴＢ３２、ＴＢ３２Ａ、ＴＢ３３、ＴＢ３８、ＴＢ４０．８、ＴＢ５１、ＴＢ５４、ＴＢ６４、ＣＦＰ６、ＣＦＰ７、ＣＦＰ７Ａ、ＣＦＰ７Ｂ、ＣＦＰ８Ａ、ＣＦＰ８Ｂ、ＣＦＰ９、ＣＦＰ１０、ＣＦＰ１１、ＣＦＰ１６、ＣＦＰ１７、ＣＦＰ１９、ＣＦＰ１９Ａ、ＣＦＰ１９Ｂ、ＣＦＰ２０、ＣＦＰ２１、ＣＦＰ２２、ＣＦＰ２２Ａ、ＣＦＰ２３、ＣＦＰ２３Ａ、ＣＦＰ２３Ｂ、ＣＦＰ２５、ＣＦＰ２５Ａ、ＣＦＰ２７、ＣＦＰ２８、ＣＦＰ２８Ｂ、ＣＦＰ２９、ＣＦＰ３０Ａ、ＣＦＰ３０Ｂ、ＣＦＰ５０、ＣＷＰ３２、ｈｓｐＸ（アルファ−結晶）、ＡＰＡ、ツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ＳＴ−ＣＦ、ＰＰＥ６８、ＬｐｐＸ、ＰｓｔＳ−１、ＰｓｔＳ−２、ＰｓｔＳ−３、ＨＢＨＡ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＬ２、ＧｒｐＥＳ、ＬＨＰ、１９ｋＤａ  リポタンパク質、７１ｋＤａ、ＲＤ１−ＯＲＦ２、ＲＤ１−ＯＲＦ３、ＲＤ１−ＯＲＦ４、ＲＤ１−ＯＲＦ５、ＲＤ１−ＯＲＦ８、ＲＤ１−ＯＲＦ９Ａ、ＲＤ１−ＯＲＦ９Ｂ、Ｒｖ１９８４ｃ、Ｒｖ０５７７、Ｒｖ１８２７、ＢｆｒＢ、Ｔｐｘ．  Ｒｖ１３５２、Ｒｖ１８１０、ＰｐｉＡ、Ｃｕｔ２、ＦｂｐＢ、ＦｂｐＡ、ＦｂｐＣ、ＤｎａＫ、ＦｅｃＢ、Ｓｓｂ、ＲｐｌＬ、ＦｉｘＡ、ＦｉｘＢ、ＡｈｐＣ２、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ１２１１、Ｍｄｈ、Ｒｖ１６２６、Ａｄｋ、ＣｌｐＰ、ＳｕｃＤ（Belisle et al、2005;ＵＳ  ７，０３７，５１０；ＵＳ  ２００４／００５７９６３；ＵＳ  ２００８／０１９９４９３；ＵＳ  ２００８／０２６７９９０）、あるいは上記抗原のいずれかの少なくとも１つの抗原性部分またはＴ細胞エピトープが挙げられる。
【０４３９】
本発明は、単一ヒト型結核菌抗原の使用を意図する。しかしながら、２つ以上のヒト型結核菌抗原の使用に依存する実施形態も、具体的に意図される。
【０４４０】
種々の例において、２つ以上の抗原は、２つ以上のヒト型結核菌抗原、例えば上記抗原から選択される２つ以上のヒト型結核菌抗原を含む融合タンパク質として産生される。
４．２．  肝炎抗原
【０４４１】
多数の肝炎抗原が特性化されており、本発明で用いるのに適している。Ｃ型肝炎抗原の例としては、Ｃ−ｐ２２、Ｅ１−ｇｐ３５、Ｅ２−ｇｐ７０、ＮＳ１−ｐ７、ＮＳ２−ｐ２３、ＮＳ３−ｐ７０、ＮＳ４Ａ−ｐ８、ＮＳ４Ｂ−ｐ２７、ＮＳ５Ａ−ｐ５６／５８およびＮＳ５Ｂ−ｐ６８が挙げられ、各々が（単独でも、組合せても）、本発明における適用に適している。目下特性化されているか否かにかかわらず、免疫応答を引き出し得る肝炎抗原はすべて、意図される。
４．３  インフルエンザ抗原
【０４４２】
非常に多くのインフルエンザ抗原が特性化されており、本発明で用いるのに適している。本発明で用いるのに適したインフルエンザ抗原の例としては、ＰＢ、ＰＢ２、ＰＡ、ヘマグルチニン（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質のいずれか、ＮＰ、ＭおよびＮＳが挙げられ、各々が（単独でも、組合せても）、本発明における適用に適している。目下特性化されているか否かにかかわらず、免疫応答を引き出し得るインフルエンザ抗原はすべて、意図される。
４．４  炭疽抗原
【０４４３】
多数の炭疽菌抗原がワクチン開発のための潜在的候補として同定されており、本発明において有用である。例えば、ＰＡ８３は、ワクチン開発のためのこのような抗原の１つである。一般に、炭疽に関する唯一のＦＤＡ認可ワクチンが利用可能であり、「吸着炭疽ワクチン」（ＡＶＡ）またはバイオ・ソラックス（登録商標）と呼ばれている。このワクチンは、アルミニウムアジュバントに吸着された炭疽菌の非被包性菌株の無細胞上清に由来する。ＰＡは、ＡＶＡ中の一次免疫原である。本発明で用いるのに適した他の炭疽抗原の例としては、防御抗原（ＰＡまたはＰＡ６３）、ＬＦおよびＥＦ（タンパク質）、ポリ−ガンマ−（Ｄ−グルタメート）カプセル、胞子抗原（内生胞子特異性成分）、ＢｃｌＡ（エキソスポリウム特異性タンパク質）、ＢｘｐＢ（胞子関連タンパク質）、ならびに分泌タンパク質が挙げられる。目下特性化されているか否かにかかわらず、免疫応答を引き出し得る炭疽抗原はすべて、意図される。
４．５  野兎病抗原
【０４４４】
多数の野兎病菌抗原がワクチン開発のための潜在的候補として同定されており、本発明において有用である。例えば、ＡｃｐＡおよびＩｇｌＣは、ワクチン開発のために適した抗原である。本発明で用いるのに適した他の野兎病抗原の例としては、Ｏ−抗原、ＣＰＳ、外膜タンパク質（例えばＦｏｐＡ）、リポタンパク質（例えばＴｕｌ４）、分泌タンパク質およびリポ多糖が挙げられる。目下特性化されているか否かにかかわらず、免疫応答を引き出し得る野兎病抗原はすべて、意図される。
４．６  ブルセラ症抗原
【０４４５】
多数のブルセラ・アボルツス（ウシ流産菌）抗原がワクチン開発のための潜在的候補として同定されており、本発明において有用である。例えば、Ｏｍｐ１６は、ワクチン開発のためのこのような抗原の１つである。本発明で用いるのに適した他のブルセラ症抗原の例としては、Ｏ−抗原、リポ多糖、外膜タンパク質（例えばＯｍｐ１６）、分泌タンパク質、リボソームタンパク質（例えばＬ７およびＬ１２）、バクテリオフェリチン、ｐ３９（推定周辺質結合タンパク質）、ｇｒｏＥＬ（熱ショックタンパク質）、ルマジンシンターゼ、ＢＣＳＰ３１表面タンパク質、ＰＡＬ１６．５ＯＭリポタンパク質、カタラーゼ、２６ｋＤａ周辺質タンパク質、３１ｋＤａ  Ｏｍｐ３１、２８ｋＤａ  Ｏｍｐ、２５ｋＤａ  Ｏｍｐおよび１０ｋＤａ  Ｏｍリポタンパク質が挙げられる。目下特性化されているか否かにかかわらず、免疫応答を引き出し得るブルセラ症抗原はすべて、意図される。
４．７  髄膜炎抗原
【０４４６】
多数の髄膜炎菌抗原がワクチン開発のための潜在的候補として同定されており、本発明において有用である。例えば、Ｃｙｓ６、ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＦｅｔＡおよびＺｎｕＤは、ワクチン開発のために適した抗原である。本発明で用いるのに適した他の髄膜炎抗原の例としては、Ｏ−抗原、因子Ｈ結合タンパク質（ｆＨｂｐ）、ＴｂｐＢ、ＮｓｐＡ、ＮａｄＡ、外膜タンパク質、Ｂ群ＣＰＳ、分泌タンパク質およびリポ多糖が挙げられる。目下特性化されているか否かにかかわらず、免疫応答を引き出し得る髄膜炎抗原はすべて、意図される。
４．８  デング熱抗原
【０４４７】
多数のフラビウイルス抗原がデング熱を処置するためのワクチン開発のための潜在的候補として同定されており、本発明において有用である。例えば、デングウイルスエンベロープタンパク質Ｅ１〜Ｅ４および膜タンパク質Ｍ１〜Ｍ４は、ワクチン開発のために適した抗原である。本発明で用いるのに適した他のデング熱抗原の例としては、Ｃ、ｐｒｅＭ、１、２Ａ、２Ｂ、３、４Ａ、４Ｂおよび５が挙げられる。目下特性化されているか否かにかかわらず、免疫応答を引き出し得るデング熱抗原はすべて、意図される。
４．９  エボラ熱抗原
【０４４８】
多数のエボラウイルス抗原がエボラ熱感染を処置するためのワクチン開発のための潜在的候補として同定されており、本発明において有用である。例えば、フィロウイルス科ザイール型エボラウイルスおよびスーダン型エボラウイルス・ビリオンスパイク糖タンパク質前駆体抗原（それぞれ、ＺＥＢＯＶ−ＧＰおよびＳＥＢＯＶ−ＧＰ）は、ワクチン開発のために適した抗原である。本発明で用いるのに適した他のエボラ熱抗原の例としては、ＮＰ、ｖｐ３５、ｖｐ４０、ＧＰ、ｖｐ３０、ｖｐ２４およびＬが挙げられる。目下特性化されているか否かにかかわらず、免疫応答を引き出し得るエボラ熱抗原はすべて、意図される。
４．１０  西ナイル熱抗原
【０４４９】
多数の西ナイル熱ウイルス抗原が感染を処置するためのワクチン開発のための潜在的候補として同定されており、本発明において有用である。例えば、西ナイル熱ウイルス（ＷＮＶ）からのフラビウイルスエンベロープ抗原（Ｅ）はＷＮＶビリオンの表面に発現される非毒性タンパク質（ＷＮＶＥ）であって、ワクチン開発のために適した抗原である。本発明で用いるのに適した他のＷＮＶ抗原の例としては、Ｃｐ、Ｐｒｍ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５が挙げられる。目下特性化されているか否かにかかわらず、免疫応答を引き出し得る西ナイル熱抗原はすべて、意図される。
上記または参照抗原は本発明の例示であって、本発明を限定するものではない。
５．  発現構築物
【０４５０】
微生物、植物細胞または動物細胞（細胞性発現系）における、あるいは無細胞発現系における融合ポリペプチドの発現のための発現構築物の産生および使用方法、ならびに本発明で用いるためのポリマー粒子を形成するために有用な発現構築物を含む宿主細胞は、当該技術分野で周知である（例えば、Sambrook et al., 1987；Ausubel et al., 1987）。
【０４５１】
本発明の方法に用いるための発現構築物は、一実施形態では、クローニングのために、または発現のために、複製可能ベクター中に挿入され、あるいは別の実施形態では、宿主ゲノム中に組入れられる。種々のベクターは、公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子またはファージの形態である。適切な核酸配列が、種々の手法によりベクター中に挿入され得る。概して、ＤＮＡが、当該技術分野で既知の技法を用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）中に挿入される。ベクター構成成分としては、一般的に、シグナル配列、複製の起点、１つ以上の選択可能マーカー遺伝子、エンハンサー因子、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。これらの構成成分のうちの１つ以上を含有する適切なベクターの構築は、当該技術分野で既知の標準結紮技法を用いる。
【０４５２】
発現およびクローニングベクターはともに、１つ以上の選択宿主細胞中でベクターを複製させる核酸配列を含有する。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスに関してよく知られている。
【０４５３】
一実施形態では、発現構築物は高コピー数ベクター上に存在する。
【０４５４】
一実施形態では、高コピー数ベクターは、２０〜３０００コピー／宿主細胞で存在するものから選択される。
【０４５５】
一実施形態では、高コピー数ベクターは、高コピー数の複製起点（ｏｒｉ）、例えばＣｏｌＥ１またはＣｏｌＥ１由来複製起点を含有する。例えば、ＣｏｌＥ−１由来複製起点は、ｐＵＣ１９複製起点を含み得る。
【０４５６】
本発明のベクターに用いるのに適した多数の高コピー数複製起点は、当業者に既知である。これらの例としては、ｐＢＲ３２２およびその誘導体からのＣｏｌＥ１由来複製起点、ならびに他の高コピー数複製起点、例えばＭ１３  ＦＲ  ｏｒｉまたはｐ１５Ａ  ｏｒｉが挙げられる。２μプラスミド・オリジンは酵母に適しており、そして種々のウイルス・オリジン（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターのために有用である。
【０４５７】
好ましくは、高コピー数複製起点は、ＣｏｌＥ１由来ｐＵＣ１９複製起点を含む。
【０４５８】
制限部位中への挿入物のクローニングがその起点を不活性化し、それがベクターの複製を指図できなくさせるよう、制限部位は複製の起点に配置される。代替的には、制限部位への挿入物のクローニングが、ベクターの低または単一コピー数複製のみを支持し得るよう、少なくとも１つの制限部位が当該起点内に配置される。
【０４５９】
発現およびクローニングベクターは、典型的には、形質転換化宿主細胞中のベクターの存在を検出するために、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有する。典型的選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補足し、あるいは（ｃ）天然培地から利用可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えば桿菌に関するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
【０４６０】
植物形質転換に一般に用いられる選択可能マーカーとしては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ＮＰＴ  ＩＩ）（カナマイシン耐性を付与する）、ａａｄＡ遺伝子（スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン耐性を付与する）、イグナイト（AgrEvo）およびバスタ（Hoechst）耐性に関するホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（バー遺伝子）、ならびにヒグロマイシン耐性に関するヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）が挙げられる。
【０４６１】
哺乳動物細胞に関する適切な選択可能マーカーの例は、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼのような発現構築物を取り上げる応答能がある細胞の同定を可能にするものである。適切な宿主細胞は、野生型ＤＨＦＲが用いられる場合、ＤＨＦＲ活性を欠くＣＨＯ細胞株であって、これは、Urlaub et al.,1980に記載されているように調製され、増殖する。酵母で用いるための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb et al., 1979；Kingsman et al., 1979；Tschemper et al., 1980）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異体株に関する選択マーカーを提供する（例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１[Jones, Genetics, 85:12 (1977)]）。
【０４６２】
ポリマー粒子を形成するために有用な発現構築物は、好ましくは、ポリマーシンターゼ、粒子形成タンパク質または融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸の発現を制御するプロモーターを包含する。
【０４６３】
種々の潜在的宿主細胞により認識されるプロモーターは、よく知られている。原核生物宿主とともに用いるのに適したプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、[Chang et al., 1978; Goeddel et al., 1979]、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)；ＥＰ  ３６，７７６]、ならびにハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター[deBoer et al., 1983]が挙げられる。細菌系で用いるためのプロモーターも、ポリマーシンターゼ、粒子形成タンパク質または融合ポリペプチドをコードする核酸と操作可能的に連結されるシャイン・ダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。
【０４６４】
酵母宿主とともに用いるための適切な促進配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ[Hitzeman et al., 1980]または他の解糖酵素[Hess et al., 1968; Holland, 1978]、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼに関するプロモーターが挙げられる。
【０４６５】
増殖条件により制御される転写の付加的利点を有する誘導可能プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連した分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のためのプロモーター領域である。
【０４６６】
単子葉または双子葉植物の組織または器官を含めた植物宿主細胞に用いるための適切なプロモーターの例としては、細胞−、組織−および器官特異性プロモーター、細胞周期特異性プロモーター、一過性プロモーター、誘導可能プロモーター、ほとんどの植物組織中で活性である構成性プロモーター、ならびに組換えプロモーターが挙げられる。プロモーターの選択は、そのように所望されるクローン化ポリヌクレオチドの時間的および空間的発現によって決まる。プロモーターは、宿主細胞からのもの、または他の植物、ウイルスおよび植物病原性細菌および真菌の遺伝子に由来するプロモーターである。本発明のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を用いて発現構築物を修飾し、調整するのに用いるのに適しているプロモーターを、過度の実験をすることなく、当業者は選択し得る。構成性植物プロモーターの例としては、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーターおよびオクトピンシンターゼプロモーター、ならびにトウモロコシからのＵｂｉ  １プロモーターが挙げられる。特定組織中で活性であり、内部発達シグナルあるいは外部非生物的または生物的応力に応答する植物プロモーターは、科学文献に記載されている。例示的プロモーターは、例えばＷＯ  ０２／００８９４（これの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【０４６７】
哺乳動物宿主細胞に用いるための適切なプロモーターの例は、ウイルス、例えばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、ならびに熱ショックプロモーターから得られるものを含むが、但し、このようなプロモーターは宿主細胞系と適合性である。
【０４６８】
高等真核生物による発現構築物の転写は、いくつかの例では、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは、その転写を増大するためにプロモーターに作用する通常は約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性因子である。多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質およびインスリン）から知られている。しかしながら、典型的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを用いる。例としては、複製起点（ｂｐ１００〜２７０）の後期側におけるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側におけるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。典型的には、エンハンサーは、ポリマーシンターゼ、粒子形成タンパク質または融合ポリペプチドコード配列に対して位置５’または３’でベクター中でスプライシングされる。
【０４６９】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの有核細胞）で用いられる発現ベクターは、転写の終結のために、ならびにｍＲＮＡを安定化するために必要な配列も含有する。このような配列は、一般に、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域から、時としては３’非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、ポリマーシンターゼ、粒子形成タンパク質または融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。
【０４７０】
一実施形態では、発現構築物は、上流誘導可能プロモーター、例えばＢＡＤプロモーター（アラビノースにより誘導される）を含む。
【０４７１】
一実施形態では、発現構築物は構成性または調節可能プロモーター系を含む。
【０４７２】
一実施形態では、調節可能プロモーター系は、誘導可能または抑制可能プロモーター系を含む。
【０４７３】
組換えタンパク質の酸性においては強プロモーターを用いることが望ましいが、一方、異種タンパク質の構成的過剰産生は、増殖速度、プラスミド安定性および培養生存度における低減をもたらすため、これらのプロモーターの調節は不可欠である。
【０４７４】
多数のプロモーターは、レプレッサータンパク質とオペレーター（プロモーターから下流の領域）の相互作用により調節される。最も良く知られたオペレーターは、ｌａｃオペロンから、ならびにバクテリオファージＡからのものである。大腸菌における調節されたプロモーターの大要は、Friehs & Reardon, 1991の表１に示されている。
【０４７５】
標準細菌培養法と組換え大腸菌に関連するものとの間の大きな差異は、増殖および産生または誘導相の分離である。組換えタンパク質産生は、しばしば、調節されたプロモーターを利用して、増殖相における高細胞密度（プロモーターが「オフ」であり、宿主細胞上の代謝負荷がわずかである場合）を、次いで、誘導相における高率の異種タンパク質産生（プロモーターを「オン」に切り替えるための誘導後）を達成する。
【０４７６】
一実施形態では、調節可能プロモーター系は、ＬａｃＩ、Ｔｒｐ、ファージγおよびファージＲＮＡポリメラーゼから選択される。
【０４７７】
一実施形態では、プロモーター系は、ｌａｃまたはＰｔａｃプロモーター、およびｌａｃＩレプレッサー、あるいはｔｒｐプロモーターおよびＴｒｐＲレプレッサーから選択される。
【０４７８】
一実施形態では、ＬａｃＩレプレッサーは、活性レプレッサーと結合するイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の付加により不活性化され、オペレーターからの解離を引き起こして、発現を可能にする。
【０４７９】
一実施形態では、濃度が閾値レベルを下回ると、系が自己誘導性になるよう、ｔｒｐプロモーター系は、限定トリプトファン濃度を有する合成培地を用いる。一実施形態では、３−β−インドール−アクリル酸が付加されて、ＴｒｐＲレプレッサーを不活性化する。
【０４８０】
一実施形態では、プロモーター系は、バクテリオファージγレプレッサー  ｃＩを使用し得る。このレプレッサーはγプロファージを用い、そしてＯＬおよびＯＲと呼ばれる２つのオペレーターと相互作用することにより、溶解遺伝子すべての発現を防止する。これらのオペレーターは、それぞれ２つの強プロモーターＰＬおよびＰＲと重複する。ｃＩレプレッサーの存在下では、ＲＮＡポリメラーゼの結合が妨げられる。ｃＩレプレッサーは、ＵＶ照射またはマイトマイシンＣを用いた細胞の処置により、不活性化され得る。組換えポリペプチドの発現を可能にするためのさらに便利な方法は、ｃＩレプレッサー  ｃＩ８５７の温度感受性バージョンの適用である。γベースの発現系を保有する宿主細胞は、低温で中央指数相に増殖され、次いで、高温に移されて、組換えポリペプチドの発現を誘導し得る。
【０４８１】
広範に用いられる発現系は、Ｔ７  ＤＮＡ上に見出されるプロモーターのみを認識し、宿主細胞染色体上に存在するプロモーターを認識しないファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用する。したがって、発現構築物は、組換え遺伝子が融合されるＴ７プロモーター（普通は、遺伝子１０の前面に存在するプロモーター）のうちの１つを含有し得る。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、発現構築物上、第二の互換性発現構築物上に存在するか、または宿主染色体中に組み込まれる。３つの場合すべてにおいて、遺伝子は誘導可能プロモーターと融合されて、発現相中のその転写および翻訳を可能にする。
【０４８２】
大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Invitrogen, CA）は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有する宿主細胞の例である（例えばＫＲＸおよびＸＪのようなＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有する２〜３の非常に適切な、市販の大腸菌株がある（自己溶解性））。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有する他の細胞株、例えば、緑膿菌ＡＤＤ１９７６（ゲノム中に組み込まれたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有）（Brunschwig & Darzins, 1992)およびカプリアビダス・ネカトール(以前はラスストニア・ユートロファ)（ｐｈａＰプロモーター制御下でゲノム中に組み込まれたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有）(Barnard et al., 2004)が、当該技術分野で既知である。
【０４８３】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、宿主細胞酵素を上回る３つの利点を提供する：第一に、それは１つのサブユニットのみからなり、第二に、それはより高い処理能力を発揮し、そして第三に、それはリファンピシンに対して非感受性である。後者の特質は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の誘導の約１０分後にこの抗生物質を付加することにより、特に融合ポリペプチドの量を増強するために用いられ得る。その時間中、融合ポリペプチドの高レベル発現を可能にするのに十分なポリペプチドが合成され、そして手九種細胞酵素の抑制は、プラスミドおよび染色体の両方に存在する他の遺伝子すべてのさらなる発現を防止する。細菌ＲＮＡポリメラーゼを抑制するが、しかしＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを抑制しない他の抗生物質、例えばストレプトリジジンおよびストレプトバリシンが、当該技術分野で既知である。
【０４８４】
プロモーター系はすべて漏出性であるため、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の低レベル発現は、組換えポリペプチドが毒性タンパク質をコードする場合、細胞に有害であり得る。増殖相中に存在するこれらのポリメラーゼ分子は、ライソザイムに関するＴ７コード遺伝子を発現することにより抑制され得る。この酵素は、宿主細胞の細胞壁における結合を切断し、それと結合することによりＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを選択的に抑制する二機能性タンパク質である（Ｔ７感染中の転写の制御されたバーストを保証するフィードバック機序）。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳは、Ｔ７ライソザイムを構成的に発現するプラスミドｐＬｙｓＳを保有する宿主細胞の一例である。
【０４８５】
一実施形態では、プロモーター系は、誘導周期を開始するために、温度シフトにより、例えば温度を約３０〜３７℃から４２℃に上げることにより、誘導周期を開始するよう誘導されるかまたは「スイッチオン」される、ＡＰＩまたはＡＰＲのようなプロモーターを用いる。
【０４８６】
強プロモーターは、in vivo産生中、粒子の表面の融合ポリペプチド密度を増強し得る。
【０４８７】
好ましい融合ポリペプチドは、
ポリマーシンターゼ、ならびに以下の：
（ｉ）免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原、または
（ｉｉ）免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメイン、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方
を含む融合相手
を含む。
【０４８８】
本明細書中で用いるための（ｉ）および（ｉｉ）の両方をコードする核酸配列は、ポリマーシンターゼをコードする核酸、ならびに細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原をコードする核酸、または細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする核酸を含む。一旦発現されると、融合ポリペプチドは、ポリマー粒子を形成するかまたは形成を助長し得る。
【０４８９】
一実施形態では、少なくともポリマーシンターゼをコードする核酸配列は、粒子形成タンパク質をコードする核酸配列、および細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原または粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼをコードする核酸、ならびに細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする核酸と、所望長のポリヌクレオチドリンカーまたはスペーサー配列を介して、間接的に融合される。
【０４９０】
一実施形態では、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原または細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインをコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリマーシンターゼを含むアミノ酸配列のＣ末端と連続している。
【０４９１】
一実施形態では、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原または細胞免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインを含む融合タンパク質のアミノ酸配列は、融合ポリペプチドの個々のフォールディングを助長する所望長のペプチドリンカーまたはスペーサーを介して、ポリマーシンターゼ断片を含むアミノ酸配列のＮ末端と間接的に融合される。
【０４９２】
一実施形態では、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原または細胞免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼまたはＣ末端シンターゼ断片を含むアミノ酸配列のＮ末端と連続する。
【０４９３】
一実施形態では、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原または細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする融合タンパク質のアミノ酸配列は、所望長のペプチドリンカーまたはスペーサーを介して、粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼまたはＮ末端ポリマーシンターゼ断片を含むアミノ酸配列のＣ末端と間接的に融合されて、融合ポリペプチドの個々のフォールディングを助長する。
【０４９４】
一実施形態では、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原または細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインをコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、デポリメラーゼまたはＣ末端デポリメラーゼ断片をコードするアミノ酸配列のＮ末端と連続する。
【０４９５】
結核の処置または防止に関する種々の実施形態では、例示的融合ポリペプチドは、
ポリマーシンターゼ、ならびに以下の：
（ｉ）少なくとも１つのヒト型結核菌抗原、または
（ｉｉ）少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメイン、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方
を含む融合相手
を含む。
【０４９６】
本明細書中で用いるための（ｉ）および（ｉｉ）の両方をコードする核酸配列は、ポリマーシンターゼをコードする核酸、ならびにヒト型結核菌抗原をコードする核酸、またはポリマーシンターゼをコードする核酸配列、ならびにヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする核酸を含む。一旦発現されると、融合ポリペプチドは、ポリマー粒子を形成するかまたは形成を助長し得る。
【０４９７】
一実施形態では、少なくともポリマーシンターゼをコードする核酸配列は、粒子形成タンパク質をコードする核酸配列、およびヒト型結核菌抗原または粒子形成タンパク質をコードする核酸、ならびにヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする核酸と、所望長のポリヌクレオチドリンカーまたはスペーサー配列を介して、間接的に融合される。
【０４９８】
一実施形態では、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原または少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリマーシンターゼを含むアミノ酸配列のＣ末端と連続している。
【０４９９】
一実施形態では、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原または少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む融合タンパク質のアミノ酸配列は、融合ポリペプチドの個々のフォールディングを助長する所望長のペプチドリンカーまたはスペーサーを介して、ポリマーシンターゼ断片を含むアミノ酸配列のＮ末端と間接的に融合される。
【０５００】
一実施形態では、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原または少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、粒子形成タンパク質、またはＣ末端シンターゼ断片を含むアミノ酸配列のＮ末端と連続する。
【０５０１】
一実施形態では、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原または少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする融合タンパク質のアミノ酸配列は、所望長のペプチドリンカーまたはスペーサーを介して、粒子形成タンパク質、またはＮ末端ポリマーシンターゼ断片を含むアミノ酸配列のＣ末端と間接的に融合されて、融合ポリペプチドの個々のフォールディングを助長する。
【０５０２】
一実施形態では、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原または少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、デポリメラーゼまたはＣ末端デポリメラーゼ断片をコードするアミノ酸配列のＮ末端と連続する。
【０５０３】
肝炎の処置または防止に関する種々の実施形態では、例示的融合ポリペプチドは、
ポリマーシンターゼ、ならびに以下の：
（ｉ）少なくとも１つの肝炎抗原、または
（ｉｉ）少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメイン、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方
を含む融合相手
を含む。
【０５０４】
本明細書中で用いるための（ｉ）および（ｉｉ）の両方をコードする核酸配列は、ポリマーシンターゼをコードする核酸、ならびに肝炎抗原をコードする核酸、またはポリマーシンターゼをコードする核酸配列、ならびに肝炎抗原結合ドメインをコードする核酸を含む。一旦発現されると、融合ポリペプチドは、ポリマー粒子を形成するかまたは形成を助長し得る。
【０５０５】
一実施形態では、少なくともポリマーシンターゼをコードする核酸配列は、粒子形成タンパク質をコードする核酸配列、および肝炎抗原または粒子形成タンパク質をコードする核酸、ならびに肝炎抗原結合ドメインをコードする核酸と、所望長のポリヌクレオチドリンカーまたはスペーサー配列を介して、間接的に融合される。
【０５０６】
一実施形態では、少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインをコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリマーシンターゼを含むアミノ酸配列のＣ末端と連続している。
【０５０７】
一実施形態では、少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインを含む融合タンパク質のアミノ酸配列は、融合ポリペプチドの個々のフォールディングを助長する所望長のペプチドリンカーまたはスペーサーを介して、ポリマーシンターゼ断片を含むアミノ酸配列のＮ末端と間接的に融合される。
【０５０８】
一実施形態では、少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインをコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、粒子形成タンパク質、またはＣ末端シンターゼ断片を含むアミノ酸配列のＮ末端と連続する。
【０５０９】
一実施形態では、少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインをコードする融合タンパク質のアミノ酸配列は、所望長のペプチドリンカーまたはスペーサーを介して、粒子形成タンパク質、またはＮ末端ポリマーシンターゼ断片を含むアミノ酸配列のＣ末端と間接的に融合されて、融合ポリペプチドの個々のフォールディングを助長する。
【０５１０】
一実施形態では、少なくとも１つの肝炎抗原または少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインをコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、デポリメラーゼまたはＣ末端デポリメラーゼ断片をコードするアミノ酸配列のＮ末端と連続する。
【０５１１】
インフルエンザの処置または防止に関する種々の実施形態では、例示的融合ポリペプチドは、
ポリマーシンターゼ、ならびに以下の：
（ｉ）少なくとも１つのインフルエンザ抗原、または
（ｉｉ）少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメイン、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方
を含む融合相手
を含む。
【０５１２】
本明細書中で用いるための（ｉ）および（ｉｉ）の両方をコードする核酸配列は、ポリマーシンターゼをコードする核酸、ならびにインフルエンザ抗原をコードする核酸、またはポリマーシンターゼをコードする核酸配列、ならびにインフルエンザ抗原結合ドメインをコードする核酸を含む。一旦発現されると、融合ポリペプチドは、ポリマー粒子を形成するかまたは形成を助長し得る。
【０５１３】
一実施形態では、少なくともポリマーシンターゼをコードする核酸配列は、粒子形成タンパク質をコードする核酸配列、およびインフルエンザ抗原または粒子形成タンパク質をコードする核酸、ならびにインフルエンザ抗原結合ドメインをコードする核酸と、所望長のポリヌクレオチドリンカーまたはスペーサー配列を介して、間接的に融合される。
【０５１４】
一実施形態では、少なくとも１つのインフルエンザ抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインをコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリマーシンターゼを含むアミノ酸配列のＣ末端と連続している。
【０５１５】
一実施形態では、少なくとも１つのインフルエンザ抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインを含む融合タンパク質のアミノ酸配列は、融合ポリペプチドの個々のフォールディングを助長する所望長のペプチドリンカーまたはスペーサーを介して、ポリマーシンターゼ断片を含むアミノ酸配列のＮ末端と間接的に融合される。
【０５１６】
一実施形態では、少なくとも１つのインフルエンザ抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインをコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、粒子形成タンパク質、またはＣ末端シンターゼ断片を含むアミノ酸配列のＮ末端と連続する。
【０５１７】
一実施形態では、少なくとも１つのインフルエンザ抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインをコードする融合タンパク質のアミノ酸配列は、所望長のペプチドリンカーまたはスペーサーを介して、粒子形成タンパク質、またはＮ末端ポリマーシンターゼ断片を含むアミノ酸配列のＣ末端と間接的に融合されて、融合ポリペプチドの個々のフォールディングを助長する。
【０５１８】
一実施形態では、少なくとも１つのインフルエンザ抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインをコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、デポリメラーゼまたはＣ末端デポリメラーゼ断片をコードするアミノ酸配列のＮ末端と連続する。
【０５１９】
本発明による融合ポリペプチドの一利点は、ポリマー粒子の表面に結合するタンパク質の修飾がポリマー粒子の形成に関与するタンパク質の機能性に影響を及ぼさない、という点である。例えば、ポリマーシンターゼの機能性は、組換えポリペプチドがそのＮ末端と融合されて、粒子の表面に組換えポリペプチドの産生を生じる場合に保持される。それにもかかわらず、タンパク質の機能性は融合により減損されることがあれば、この欠点は、同一機能を実施，活性状態で存在する付加的粒子形成タンパク質の存在により相殺される。
【０５２０】
このようにして、粒子形成タンパク質を介してポリマー粒子と結合される組換えポリペプチドの安定結合を保証することができる。
【０５２１】
融合ポリペプチドにおけるタンパク質の配置は、プラスミド中に含入される核酸中の遺伝子配列の順序によって決まる、と理解されるべきである。
【０５２２】
例えば、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原または細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインがポリマーシンターゼと間接的に融合される融合ポリペプチドを産生することが所望され得る。「間接的に融合される」という用語は、粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼ、ならびに細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原、または細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインを含む融合ポリペプチドであって、融合ポリペプチド中で発現されることが所望される任意のタンパク質であり得る付加的タンパク質により分離される融合ポリペプチドを指す。
【０５２３】
結核の処置に用いるための粒子の状況で用いられる場合、ヒト型結核菌抗原または少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインがポリマーシンターゼと間接的に融合される融合ポリペプチドを産生することが所望され得る。同様に、肝炎またはインフルエンザの処置に用いられる場合、肝炎抗原またはインフルエンザ抗原あるいは少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインまたは少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインがポリマーシンターゼと間接的に融合される融合ポリペプチドを産生することが所望され得る。「間接的に融合される」という用語は、粒子形成タンパク質、および少なくともヒト型結核菌抗原、または少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドであって、融合ポリペプチド中で発現されることが所望される任意のタンパク質であり得る付加的タンパク質により分離される融合ポリペプチドを指す。同様に、当該用語は、粒子形成タンパク質、および少なくとも１つの肝炎抗原、または少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドであって、融合ポリペプチド中で発現されることが所望される任意のタンパク質であり得る付加的タンパク質により分離される融合ポリペプチドを指す。代替的には、当該用語は、粒子形成タンパク質、および少なくとも１つのインフルエンザ抗原、または少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインを含む融合ポリペプチドであって、融合ポリペプチド中で発現されることが所望される任意のタンパク質であり得る付加的タンパク質により分離される融合ポリペプチドを指す。
【０５２４】
一実施形態では、付加的タンパク質は、上記のような融合ポリペプチドの個々のフォールディングを助長するために、粒子形成タンパク質または融合ポリペプチド、あるいはリンカーまたはスペーサーから選択される。この実施形態では、融合ポリペプチドの所望の配置を反映するためにプラスミド中の遺伝子の配列を順序良く並べる必要がある。
【０５２５】
一実施形態では、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原または細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインは、ポリマーシンターゼと直接的に融合され得る。「直接的に融合される」という用語は、２つ以上のペプチドがペプチド結合により連結される場合を示すために本明細書中で用いられる。
【０５２６】
結核の処置または防止に関する種々の実施形態において、例えばヒト型結核菌抗原または少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインは、ポリマーシンターゼと直接的に融合され得る。
【０５２７】
「直接的に融合される」という用語は、２つ以上のペプチドがペプチド結合により連結される場合を示すために本明細書中で用いられる。
【０５２８】
肝炎の処置または防止に関する種々の実施形態において、肝炎抗原または少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインは、ポリマーシンターゼと直接的に融合され得る。
【０５２９】
インフルエンザの処置または防止に関する種々の実施形態において、インフルエンザ抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインは、ポリマーシンターゼと直接的に融合され得る。
【０５３０】
「直接的に融合される」という用語は、２つ以上のペプチドがペプチド結合により連結される場合を示すために本明細書中で用いられる。
【０５３１】
ポリマー粒子と結合される少なくとも２つの別個の融合ポリペプチドを含む粒子を形成することも可能であり得る。例えば、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原または細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメインを含み、ポリマーシンターゼと融合される第一の融合ポリペプチドが、ポリマー粒子と結合され得る。結核の処置に用いるための粒子の状況で用いられる場合、粒子は、例えばヒト型結核菌抗原を含む第一の融合ポリペプチドを含み、あるいはポリマーシンターゼと融合される少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインがポリマー粒子と結合され得る。肝炎の処置に用いるための粒子の状況で用いられる場合、粒子は、肝炎抗原を含む第一融合ポリペプチドを含み、あるいはポリマーシンターゼと融合される少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインがポリマー粒子と結合され得る。インフルエンザの処置に用いるための粒子の状況で用いられる場合、粒子は、インフルエンザ抗原を含む第一融合ポリペプチドを含み、あるいはポリマーシンターゼと融合される少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインがポリマー粒子と結合され得る。
【０５３２】
一実施形態では、発現構築物は、in vivoで発現される。好ましくは、発現構築物は、微生物、好ましくは大腸菌中で発現されるプラスミドである。
【０５３３】
一実施形態では、発現構築物は、in vitroで発現される。好ましくは、発現構築物は、無細胞発現系を用いてin vitroで発現される。
【０５３４】
一実施形態では、１つ以上の遺伝子が単一発現構築物中に挿入され得るし、あるいは１つ以上の遺伝子が宿主細胞ゲノム中に組み入れられ得る。すべての場合、発現は、上記のようなプロモーターにより制御され得る。
【０５３５】
一実施形態では、発現構築物は、さらに、上記のように、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原または細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を結合し得る結合ドメイン、ならびに粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼを含む少なくとも１つの付加的融合ポリペプチドをコードする。
【０５３６】
一実施形態では、発現構築物はさらに、上記のようにヒト型結核菌抗原または少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインおよび粒子形成タンパク質を含む少なくとも１つの付加的融合ポリペプチドをコードする。
【０５３７】
一実施形態では、発現構築物はさらに、上記のように肝炎抗原または少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインおよび粒子形成タンパク質を含む少なくとも１つの付加的融合ポリペプチドをコードする。
【０５３８】
一実施形態では、発現構築物はさらに、上記のようにインフルエンザ抗原または少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインおよび粒子形成タンパク質を含む少なくとも１つの付加的融合ポリペプチドをコードする。
【０５３９】
本明細書中で有用なプラスミドは、実施例で示されており、そしてＰＣＴ／ＤＥ２００３／００２７９９（ＷＯ  ２００４／０２０６２３(Bernd Rehm)として公開）およびＰＣＴ／ＮＺ２００６／０００２５１（ＷＯ  ２００７／０３７７０６(Bernd Rehm)として公開）（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）に詳細に記載されている。
【０５４０】
細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原の結合ドメインは、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原、例えば、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインが投与される被験者に、または免疫応答が引き出されるべきである被験者に存在する細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る、と理解される。
【０５４１】
結核の処置のために用いる状況では、ヒト型結核菌抗原結合ドメインは、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原、例えば、ヒト型結核菌抗原結合ドメインが投与される被験者に、または免疫応答が引き出されるべきである被験者に存在するヒト型結核菌抗原を結合し得る、と理解される。同様に、肝炎の処置のための使用においては、肝炎抗原結合ドメインは、少なくとも１つの肝炎抗原、例えば、肝炎抗原結合ドメインが投与される被験者に、または免疫応答が引き出されるべきである被験者に存在する肝炎抗原を結合し得る、と理解される。インフルエンザの処置のための使用においては、インフルエンザ抗原結合ドメインは、少なくとも１つのインフルエンザ抗原、例えば、インフルエンザ抗原結合ドメインが投与される被験者に、または免疫応答が引き出されるべきである被験者に存在するインフルエンザ抗原を結合し得る、と理解される。
６．  粒子産生のための宿主
【０５４２】
本発明の粒子は、本明細書中に記載されるような１つ以上の発現構築物を用いて、宿主細胞中で好都合に産生される。本発明のポリマー粒子は、宿主細胞に発現構築物を発現させることにより産生され得る。これは、先ず、宿主細胞または宿主細胞の前駆体細胞中に発現構築物を導入することにより、例えば、宿主細胞または宿主細胞の前駆体細胞を発現構築物で形質転換するかまたはトランスフェクトすることにより、あるいは別のやり方で発現構築物が宿主細胞中に存在することを保証することにより、達成され得る。
【０５４３】
形質転換後、形質転換化宿主細胞は、発現構築物からの融合ポリペプチドの発現のために、そしてポリマー粒子の形成のために適した条件下で保持される。このような条件は、当該技術分野で既知であるように、適切な生物体中のプラスミドのような選択発現構築物の発現に適した条件を含む。例えば、そして特に、高収率または過剰発現が所望される場合、培地中に適切な基質を提供すると、融合ポリペプチドの粒子形成タンパク質成分がポリマー粒子を形成し得る。
【０５４４】
したがって、本発明は、ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞を提供すること（ここで、前記発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼをコードする少なくとも１つの核酸配列、および
細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原または細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む）；
前記発現構築物の発現に、ならびにポリマー粒子の形成に適した条件下で前記宿主細胞を保持すること；そして
前記宿主細胞から前記ポリマー粒子を分離すること
を包含する方法を提供する。
【０５４５】
一実施形態では、本発明は、ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞を提供すること（ここで、前記発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列；および
ヒト型結核菌抗原またはヒト型結核菌抗原結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む）；
前記発現構築物の発現に、ならびにポリマーシンターゼによるポリマー粒子の形成に適した条件下で前記宿主細胞を保持すること；そして
前記宿主細胞から前記ポリマー粒子を分離して、ポリマー粒子を含む組成物を産生すること
を包含する方法を提供する。
【０５４６】
一実施形態では、本発明は、ポリマー粒子の産生方法であって、以下の：
少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞を提供すること（ここで、前記発現構築物は、以下の：
粒子形成タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列；および
肝炎抗原または肝炎抗原結合ドメイン、あるいはインフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む）；
前記発現構築物の発現に、ならびにポリマーシンターゼによるポリマー粒子の形成に適した条件下で前記宿主細胞を保持すること；そして
前記宿主細胞から前記ポリマー粒子を分離して、ポリマー粒子を含む組成物を産生すること
を包含する方法を提供する。
【０５４７】
好ましくは、宿主細胞は、例えば細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞、好ましくは、単離または非ヒト宿主細胞である。組換えポリマー粒子の産生のための当該技術分野で周知の方法（例えば、Sambrook et al., 1987；Ausubel et al., 1987）に有用な宿主細胞は、しばしば、本発明の方法に用いるのに適しており、本明細書中で考察されるその考えを心に留めている。
【０５４８】
適切な原核生物宿主細胞は、例えば、真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば腸内細菌科、例えば大腸菌を含む。種々の大腸菌株、例えば大腸菌  Ｋ１２  菌株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）；大腸菌  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）；大腸菌  菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）およびＫ５  ７７２（ＡＴＣＣ  ５３，６３５）が公的に入手可能である。他の適切な原核生物宿主細胞としては、腸内細菌科、例えばエシェリキア種、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスカンス、および赤痢菌属、ならびにバシラス属、例えば枯草菌およびバシラス・リケニフォルミス、シュードモナス属、例えば緑膿菌、およびアクチノミセス類、例えばストレプトミセス属、ロドコッカス属、コリネバクテリウム属およびマイコバクテリウム属が挙げられる。
【０５４９】
いくつかの実施形態では、例えば大腸菌Ｗ３１１０株は、組換えＤＮＡ産物発光のための一般的宿主株であるため、用いられ得る。好ましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、菌株Ｗ３１１０は、宿主に対して内因性であるタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子突然変異を実行するよう修飾され得る。このような宿主の例としては、大腸菌Ｗ３１１０株  １Ａ２（完全遺伝子型ｔｏｎＡ）；大腸菌  Ｗ３１１０株  ９Ｅ４（これは、完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する）；大腸菌  Ｗ３１１０株  ２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）（これは、完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎｒを有する）；大腸菌Ｗ３１１０株  ３７Ｄ６（これは、完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎｒを有する）；大腸菌Ｗ３１１０株  ４０Ｂ４（これは、非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失突然変異を有する菌株３７Ｄ６である）が挙げられる。
【０５５０】
いくつかの好ましい実施形態では、例えば、リポ多糖内毒素を産生しないラクトコッカス・ラクチス株が用いられ得る。ラクトコッカス・ラクチス株の例としては、ＭＧ１３６３およびラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリスＮＺ９０００が挙げられる。
【０５５１】
原核生物のほかに、真核生物微生物、例えば糸状真菌または酵母は、本発明の方法に用いるための適切なクローニングまたは発現宿主である。例としては、一般に用いられる下等真核生物宿主微生物である出芽酵母が挙げられる。他の例としては、分裂酵母類のシゾサッカロミセス・ポンベ（Beach and Nurse, 1981；ＥＰ  １３９，３８３）、クリュイベロミセス属宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Fleer et al., 1991）、例えばＫ．ラクチス（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Louvencourt et al., 1983）、Ｋ．フラジリス（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ウイケラミイ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ワルチイ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ  ３６，９０６；Van den Berg et al, 1990）、Ｋ．テルモトレランスおよびＫ．マルキシアヌス；ヤロウイア属（ＥＰ  ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（ＥＰ  １８３，０７０；Sreekrishna et al., 1988）；カンジダ属；トリコデルマ・リーシア（ＥＰ  ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ（Case et al., 1979）；シュワニオミセス属、例えばシュワニオミセス・オクシデンタリス（ＥＰ  ３９４，５３８（１９９０年１０月３１日公開））；および糸状真菌、例えばニューロスポラ属、ペニシリウム属、トリポクラジウム属（ＷＯ  ９１／００３５７（１９９１年１月１０日公開））、およびアスペルギルス属宿主、例えばＡ．ニデュランス（Ballance et al., 1983；Tilburn et al., 1983；Yelton et al., 1984）およびクロカビ（Kelly and Hynes, 1985）が挙げられる。メタノール資化酵母は、本明細書中で適しており、そしてハンセヌラ属、カンジダ属、クロエケラ属、ピキア属、サッカロミセス属、トルロプシス属およびロドトルラ属からなる属から選択されるメタノール上で増殖し得る酵母を含む。酵母のこのクラスの例である特定の種の一覧は、Anthony, 1982に見出される。
【０５５２】
無脊椎動物宿主細胞の例としては、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ  Ｓ２およびスポドプテラ  Ｓｆ９、ならびに植物細胞、例えばワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの細胞培養が挙げられる。ヨトウガ（蛾の幼虫）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）およびカイコガからの多数のバキュロウイルス株および変異体ならびに対応する許容昆虫宿主細胞が、同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えばアウトグラファ・カリフォルニカ  ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコガ  ＮＰＶのＢｍ−５株は公的に入手可能であり、このようなウイルスは、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従って本明細書中のウイルスとして用いられ得る。
【０５５３】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０により形質転換されるサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓系統（懸濁液培養中での増殖のためにサブクローニングされる２９３または２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)）；ハムスター乳仔腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub et al., 1980）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, 1980）；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., 1982）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌系統（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０５５４】
例えば、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原、または細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメイン、あるいはヒト型結核菌抗原またはヒト型結核菌抗原結合ドメイン、あるいは肝炎抗原または肝炎抗原結合ドメイン、あるいはインフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原結合ドメインが、１つ以上の翻訳後修飾、例えば糖化を要する場合、真核生物細胞株、特に哺乳動物細胞株が選択される。例えば、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る１つ以上の抗原は、免疫原性または最適に免疫原性である翻訳後修飾を要し得るし、したがって、このような翻訳後修飾をし得る発現宿主中で有用に発現され得る。
【０５５５】
一実施形態では、宿主細胞は、酸化サイトゾルを有する細胞、例えば大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ株（Novagen）である。
【０５５６】
別の実施形態では、宿主細胞は、還元サイトゾルを有する細胞、好ましくは大腸菌である。
【０５５７】
例えば宿主細胞は、ラルストニア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属およびハロビフォルマ属からなる属から選択され得る。好ましくは、用いられる微生物は、例えばラルストニア・ユートロファ、アルカリゲネス・ラツス、大腸菌、シュードモナス・フラギ、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・オレオボランス、緑膿菌Pseudomonas aeruginosa、シュードモナス・フルオレッセンスおよびハロビフォルマ・ハロテレストリスからなる群から選択される。この群は、生体適合性、生分解性粒子を天然で産生し得る微生物、ならびにそれらの遺伝子構成のために、そのようになし得ない微生物、例えば大腸菌の両方を含む。後者状態の微生物に粒子を産生させるために必要とされる遺伝子は、上記のように導入される。
【０５５８】
例示的好塩性古細菌は、タンパク質の低レベルの非特異的結合を有して、細胞からの粒子の単離および精製を容易にするポリマー粒子を産生する。
【０５５９】
原則として、異なる機序のためにポリマー粒子を形成するために必要とされる基質を宿主細胞が産生できない場合でも、任意の培養可能宿主細胞が、上記工程により、ポリマー粒子の産生のために用いられ得る。このような場合、必要な基質は培地に付加されて、次いで、細胞中に導入された遺伝子により発現されたタンパク質によりポリマー粒子に転化される。
【０５６０】
後者状態宿主細胞にポリマー粒子を産生させるために利用される遺伝子としては、例えば、ラルストニア・ユートロファからのチオラーゼ、レダクターゼまたはポリマーシンターゼ、例えばｐｈａＡチオラーゼ、ｐｈａＢケトアシルレダクターゼまたはｐｈａＣシンターゼが挙げられる。どの遺伝子を用いて、ポリマー粒子形成に関して宿主細胞が欠いているものを増大するかは、宿主細胞の遺伝子構成、ならびに培地中にどの基質が提供されるかによって決まる。
【０５６１】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）粒子の形成に関与する遺伝子およびタンパク質、ならびに粒子形成に関する一般的考え方は、Madison, et al, 1999；公開済みＰＣＴ国際出願ＷＯ  ２００４／０２０６２３(Bernd Rehm)；ならびにRehm, 2003； Brockelbank JA. et al., 2006；Peters and Rehm, 2006；Backstrom et al, (2006)およびRehm, (2006)（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中で援用される）で報告されている。
【０５６２】
ポリマーシンターゼ単独は、基質として（Ｒ）−ヒドロキシアシル−ＣｏＡまたは他のＣｏＡチオエステルあるいはその誘導体とともに、宿主細胞中で用いられ得る。
【０５６３】
ポリマー粒子は、in vitroでも形成され得る。好ましくは、例えば無細胞発現系が用いられる。このような系では、ポリマーシンターゼが提供される。精製ポリマーシンターゼ、例えば組換え体産生から得られるもの、またはタンパク質翻訳しうる無細胞系において、ポリマーシンターゼをコードする発現構築物の導入によりそれ自体無細胞系中で得られるものが選択される。in vitroでの粒子形成を可能にするための環境を作るために、ポリマー粒子形成に必要な基質が培地中に含まれるべきである。
【０５６４】
ポリマーシンターゼは、例えば、基質として（Ｒ）−ヒドロキシアシル−ＣｏＡまたは他のＣｏＡチオエステルを用いて、機能性ポリマー粒子のin vitro産生のために用いられ得る。
【０５６５】
融合ポリペプチドは、in vitroポリマー粒子産生に用いる前に、細胞選別機、遠心分離、濾過またはアフィニティークロマトグラフィーを用いて、溶解細胞から精製され得る。
【０５６６】
in vitroポリマー粒子形成は、融合ポリペプチド適用範囲、リン脂質組成等を含めた表面組成の最適制御を可能にする。
【０５６７】
ポリマー粒子の特質はポリマー粒子が産生される条件を制御することにより、影響を及ぼされるかまたは制御され得る、と理解される。これは、例えば、宿主細胞の遺伝子構成、例えばPeters and Rehm, 2005で考察されたように、大型粒子を産生する細胞分裂突然変異体を包含し得る。宿主細胞が保持される条件は、例えば温度、基質の存在、１つ以上の粒子形成タンパク質、例えば粒子サイズ決定タンパク質の存在、ポリマー調節因子の存在等である。
【０５６８】
一実施形態では、ポリマー粒子の望ましい特質は、それが持続性であることである。「持続性」という用語は、選択された環境で分解に耐えるポリマー粒子の能力を指す。ポリマー粒子の付加的な望ましい特質は、それがポリマーシンターゼまたは粒子形成タンパク質から形成され、そして粒子集合中にポリマーシンターゼまたは粒子形成タンパク質のＣまたはＮ末端と結合するということである。
【０５６９】
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞中の発現構築物の過剰発現を達成することが望ましい。特定の発現構築物の過剰発現に関する機序は当該技術分野で周知であり、構築物それ自体、それが発現されるべき宿主、ならびに他の因子、例えば所望されるかまたは必要とされる過剰発現の程度によって決まる。例えば、過剰発現は、ｉ)原核生物宿主における強プロモーター系、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター系の使用；ｉｉ)高コピー数プラスミド、例えばｃｏｌＥ１複製起点を含有するプラスミドの使用、あるいはｉｉｉ）例えば融合配列の使用によるメッセンジャーＲＮＡの安定化、あるいはｉｖ）例えばリボソーム結合部位または終結部位等のコドン使用頻度の最適化による翻訳の最適化により達成され得る。過剰発現の利益は、所望される場合、より小さい粒子の産生を、そしてより多数のポリマー粒子の産生を可能にし得る。
【０５７０】
ポリマー粒子を形成するポリマーの組成は、ポリマー粒子の機械的または物理化学的特性に影響を及ぼし得る。例えば、そのポリマー組成が異なるポリマー粒子は、半減期が異なり得るか、あるいは生物学的活性物質、特に薬学的活性成分を、異なる割合で放出し得る。例えばＣ６〜Ｃ１４  ３−ヒドロキシ脂肪酸からなるポリマー粒子は、ポリマーの低結晶度のために、より高い比率のポリマー分解を示す。ポリマー主鎖上に相対的に大きい側鎖を有するポリマー構成物質のモル比の増大は、通常は結晶度を低減し、より顕著なエラストマー特性を生じる。本発明に記載される工程に従ってポリマー組成を制御することにより、ポリマー粒子の生分解性に影響を及ぼし、したがって、ポリマー粒子（存在する場合、粒子上の細胞媒介性免疫応答を引き出し得る１つ以上の抗原または細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原の結合ドメイン、あるいは粒子上の１つ以上のヒト型結核菌抗原またはヒト型結核菌抗原結合ドメイン、あるいは肝炎抗原または肝炎抗原結合ドメイン、あるいはインフルエンザ抗原またはインフルエンザ抗原結合ドメイン）が、例えば、それらが投与される被験者において保持される持続期間に影響を及ぼすこと、あるはポリマー粒子上または中に存在する生物学的活性物質、特に薬学的活性作因または皮膚ケア成分に関する放出比率に影響を及ぼすことが出来る。
【０５７１】
機能性側鎖基を有する少なくとも１つの脂肪酸は、好ましくは、ポリマー粒子の形成のための基質として培地中に導入され、少なくとも１つのヒドロキシ脂肪酸および／または少なくとも１つのメルカプト脂肪酸および／または少なくとも１つのβ−アミノ脂肪酸が、特に好ましくは、導入される。「機能性側鎖基を有する脂肪酸」は、飽和または不飽和脂肪酸を意味すると解釈されるべきである。これらは、メチル基、アルキル基、ヒドロキシル基、フェニル基、スルフヒドリル基、第一級、第二級および第三級アミノ基、アルデヒド基、ケト基、エーテル基、カルボキシル基、Ｏ−エステル基、チオエステル基、カルボン酸アミド基、ヘミアセタル基、アセタル基、ホスフェートモノエステル基およびホスフェートジエステル基からなる群から選択される機能性側鎖基を含有する脂肪酸も包含する。基質の使用は、ポリマー粒子の所望の組成および所望の特性により決定される。
【０５７２】
基質または基質混合物は、少なくとも１つの任意置換アミノ酸、ラクテート、エステル、あるいは飽和または不飽和脂肪酸、好ましくはアセチル−ＣｏＡを含み得る。
【０５７３】
一実施形態では、アジュバント、免疫調節作因または分子、例えば免疫刺激作因または分子、あるいはワクチンの調製に有用な他の化合物が、基質混合物中に提供され、ポリマー粒子形成中にポリマー粒子中に組入れられるし、あるいはポリマー粒子中に拡散される。
【０５７４】
ポリマー粒子は、例えばポリ−ベータ−アミノ酸、ポリラクテート、ポリチオエステルおよびポリエステルから選択されるポリマーを含み得る。最も好ましくは、ポリマーは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、好ましくはポリ（３−ヒドロキシブチラート）（ＰＨＢ）を含む。
【０５７５】
ポリマーシンターゼまたはポリマー粒子は、好ましくは、ポリマー粒子を被包するリン脂質単層を含む。好ましくは、上記粒子形成タンパク質は、上記脂質単層に及ぶ。
【０５７６】
ポリマーシンターゼまたは粒子形成タンパク質は、好ましくは、ポリマー粒子と、またはリン脂質単層と結合されるか、あるいは両方と結合される。
【０５７７】
粒子形成タンパク質は、好ましくは、それが形成するポリマー粒子と共有的にまたは非共有的に結合される。
【０５７８】
好ましくは、ポリマー粒子の表面積の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％が、融合ポリペプチドにより被覆される。
【０５７９】
ある環境では、本発明の方法で産生される粒子のサイズを制御して、例えば、特に所定の用途に適合される粒子を産生することが望ましい。例えば、強固な細胞媒介性免疫応答を引き出すために、相対的に大きいサイズの細胞媒介性免疫応答を引き出し得る１つ以上の抗原を含むポリマー粒子を産生することが望ましい。例えば、結核の処置における使用のための粒子の状況では、例えば、強固な細胞媒介性免疫応答を引き出すために、相対的に大きいサイズの１つ以上のヒト型結核菌抗原を含むポリマー粒子を産生することが望ましい。同様の条件は、肝炎またはインフルエンザの処置のために適用可能であり得るが、この場合、例えば、強固な細胞媒介性免疫応答を引き出すために、相対的に大きいサイズの１つ以上の肝炎抗原または１つ以上のインフルエンザ抗原を含むポリマー粒子を産生することが望ましい。ポリマー粒子のサイズを制御するための方法は、ＰＣＴ／ＤＥ２００３／００２７９９（ＷＯ  ２００４／０２０６２３として公開）およびＰＣＴ／ＮＺ２００６／０００２５１（ＷＯ  ２００７／０３７７０６として公開）に記載されている。
【０５８０】
いくつかの実施形態では、粒子サイズは、粒子形成タンパク質の発現を制御することにより、あるいは例えば存在する場合、粒子サイズ決定タンパク質の発現を制御することにより、制御される。
【０５８１】
本発明の他の実施形態では、例えば粒子サイズは、基質の利用能、例えば培地中の基質の利用能を制御することにより達成され得る。ある例では、基質は、それがポリマー粒子のサイズの制御を保証するのに十分であるような量で、培地中に付加され得る。
【０５８２】
このような方法の組合せを用いて、粒子サイズ全体のさらなる有効な制御を発揮するための実現性を可能にする、と理解される。
【０５８３】
種々の実施形態において、例えば粒子サイズは、約１０ｎｍ〜３μｍ、好ましくは約１０ｎｍ〜約９００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約８００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約７００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約６００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約４００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍ、特に好ましくは約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの直径を有する粒子を産生するよう制御され得る。
【０５８４】
他の実施形態では、例えば、粒子サイズは、約１０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約３０ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約２０ｎｍの直径を有する粒子を産生するよう制御され得る。
【０５８５】
平均ポリマーサイズの他の範囲、例えば上記範囲内の範囲が具体的に意図され、例えばポリマー粒子は、約５０〜約５００ｎｍ、約１５０〜約２５０ｎｍ、または約１００〜約５００ｎｍ等の直径を有する。
【０５８６】
種々の実施形態において、例えば産生される粒子の９０％は約２００ｎｍ以下の直径を有し、８０％は約１５０ｎｍ以下の直径を有し、６０％は約１００ｎｍ以下の直径を有し、４５％は約８０ｎｍ以下の直径を有し、４０％は約６０ｎｍ以下の直径を有し、２５％は約５０ｎｍ以下の直径を有し、そして５％は約３５ｎｍ以下の直径を有する。
【０５８７】
種々の実施形態において、例えば、当該方法は、約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満または約１１０ｎｍ未満の平均直径を有するポリマー粒子を産生する。
７．  組成物および処方物
【０５８８】
本発明のポリマー粒子は、多数の異なる用途のために本発明の方法に用いるのに適した組成物として処方され、例えば、特定の経路による投与のために処方され、あるいは貯蔵のために処方され得るし、それらを産生した宿主細胞の外側で粒子として安定的に保持され得るし、これらの粒子は多数の用途に適合するよう設計され得る。
【０５８９】
一実施形態では、例えば、本明細書中で有用な組成物は、任意の選択される経路により、例えば経口または非経口（例えば、局所、皮下、筋肉内および静脈内）投与（これらに限定されない）により被験者への投与を可能にするよう処方される。
【０５９０】
したがって、例えば本発明による有用な薬学的組成物は、意図される投与経路および標準薬学的実行に関して選択される適切な製薬上許容可能な担体（例えば賦形剤、希釈剤、補助剤およびその組合せ）とともに処方され得る。例えば、ワクチン接種のために意図される薬学的組成物は、当該技術分野で周知であるように、１つ以上のアジュバントまたは免疫刺激剤を含有する。例えば、本発明による有用な組成物は、粉末、液体、錠剤またはカプセルとして経口投与され、あるいは軟膏、クリームまたはローションとして局所投与され得る。適切な処方物は、必要な場合、付加的作用物質、例えば乳化剤、酸化防止剤、風味剤または着色剤を含有し得るし、即時−、遅延−、調整−、持続−、パルス−、または制御−放出のために適合され得る。
【０５９１】
したがって、本発明は、ヒトおよびその他の哺乳動物における疾患、障害および／または症状、ならびに本明細書中に開示されるような他の障害の治療のために有用な、本明細書中に開示されるものを含めて本発明の１つ以上のポリマー粒子を含む用量、剤形、処方物、組成物および／または装置にも関する。本発明の１つ以上のポリマー粒子を含むこれらの剤形、処方物、組成物および／または装置の使用は、これらの症状の有効な処置を可能にする。本発明は、例えば、本発明の１つ以上のポリマー粒子、例えばＴｂ抗原を含む１つ以上のポリマー粒子を含有するかまたは含む剤形、処方物、装置および／または組成物を提供する。本発明の剤形、処方物、装置および／または組成物は、生物学的利用能、免疫原性を最適化し、あるいは血漿、血液または組織濃度を免疫原または治療範囲に、延長期間を含めて、保持するよう処方され得る。例えば作用部位での抗原濃度を最適化するために、制御送達調製物も用いられ得る。
【０５９２】
本発明の剤形、処方物、装置および／または組成物は、周期的投与のために、例えば、本発明の１つ以上のポリマー粒子への継続曝露を提供するために、処方され得る。有益な免疫学的応答を引き出すための戦略、例えば１回以上の「追加免疫」ワクチン接種を用いる戦略が当該技術分野で周知であり、このような戦略は、本発明の実行において適合され得る。
【０５９３】
薬学的組成物および剤形は非経口経路により投与され得るが、この経路は、本明細書中に記載されるような免疫応答を引き出す方法のある実施形態のために選択される。非経口剤形の例としては、活性作用物質の水溶液、等張生理食塩水または５％グルコース、あるいは他の周知の製薬上許容可能な賦形剤が挙げられる。例えばシクロデキストリン、または当業者に周知のその他の可溶化剤が、治療薬の送達のための薬学的賦形剤として利用され得る。
【０５９４】
経口投与に適した剤形の例としては、治療的有効量の本発明のポリマー粒子を提供し得る錠剤、カプセル、ロゼンジまたは同様の形態、あるいは任意の液体形態、例えばシロップ、水溶液、乳濁液等が挙げられるが、これらに限定されない。カプセルは、任意の標準的製薬上許容可能な物質、例えばゼラチンまたはセルロースを含有し得る。錠剤は、活性成分と固体担体および滑剤との混合物を圧縮することにより、慣用的手法に従って処方され得る。固体担体の例としては、デンプンおよび糖ベントナイトが挙げられる。活性成分は、結合剤、例えばラクトースまたはマンニトール、慣用的充填剤および錠剤成形剤を含有する硬質外被錠剤またはカプセルの形態でも投与され得る。
【０５９５】
経皮投与に適した剤形の例としては、経皮パッチ、経皮絆創膏等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物および処方物の局所投与に適した剤形の例は、皮膚に直接適用されるにせよ、あるいはパッド、パッチ等のような媒介手段を介して適用されるにせよ、任意のローション、スティック、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ゲル等である。
【０５９６】
本発明の組成物および処方物の坐薬投与に適した剤形の例としては、身体開口部に挿入される任意の固体剤形、特に直腸、膣および尿道に挿入されるものが挙げられる。
【０５９７】
本発明の組成物および処方物の注射に適した剤形の例としては、ボーラスによる送達、例えば静脈内注射、皮下、真皮下および筋肉内投与または経口投与による単回または多数回投与が挙げられる。
【０５９８】
本発明の組成物および処方物のデポー投与に適した剤形の例としては、本発明のポリマー粒子のペレットまたは小円筒、あるいは、本発明のポリマー粒子が生分解性ポリマー、マイクロエマルション、リポソームのマトリックス中に閉じ込められるかまたはマイクロカプセル封入される固体形態が挙げられる。
【０５９９】
本発明の組成物および処方物のための注入装置の例としては、所望回数の用量投与または定常状態投与のために所望量で本発明の１つ以上のポリマー粒子を含有する注入ポンプ、例えば埋込み型薬剤ポンプが挙げられる。
【０６００】
本発明の組成物および処方物のための埋込み型注入装置の例としては、本発明のポリマー粒子が生分解性ポリマーまたは合成ポリマー、例えばシリコーン、シリコンゴム、シリコン剤または類似のポリマーの中に被包されるかまたは全体に分散される。
【０６０１】
本発明の組成物および処方物の経粘膜送達に適した剤形の例としては、活性成分のほかに、適切であることが当該技術分野で既知である担体を含有する浣腸、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡体、霧状化溶液、粉末および類似の処方物のためのdepositories溶液が挙げられる。本発明の組成物および処方物、例えば製薬上許容可能な水性または有機溶媒あるいはその混合物中の溶液および／または懸濁液および／または粉末を含む組成物の吸入または吹送に適した剤形が、具体的に意図される。本発明の組成物および処方物の経粘膜投与は、任意の粘膜を利用するが、しかし一般に鼻、頬、膣および直腸組織を利用する。本発明の組成物および処方物の鼻投与に適した処方物は、液体形態で、例えば鼻スプレー、鼻滴下液で、あるいは、ポリマー粒子の水性または油性溶液を含めたネブライザーによるエーロゾル投与により投与され得る。担体が固体である場合の鼻投与のための処方物としては、例えば、約１００ミクロン未満、好ましくはそれ以下、最も好ましくは約５０μ未満の粒子サイズを有する粗粉末が挙げられるが、これは、嗅ぎ薬が摂取されるようにして、すなわち、鼻に近づけて保持される粉末の容器から鼻通路を通して迅速に吸入することにより、投与される。本発明の処方物は、例えば整理食塩水中の水溶液、ベンジルアルコールまたは他の適切な防腐剤、生物学的利用能を増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当該技術分野で既知のその他の可溶化剤または分散剤を用いる溶液として調製され得る。
【０６０２】
本発明の組成物および処方物の頬投与に適した剤形の例としては、ロゼンジ、錠剤等が挙げられ、組成物は、製薬上許容可能な水性または有機溶媒あるいはその混合物中の溶液および／または懸濁液、および／または粉末を含む。
【０６０３】
本発明の組成物および処方物の舌下投与に適した剤形の例としては、ロゼンジ、錠剤等が挙げられ、組成物は、製薬上許容可能な水性または有機溶媒あるいはその混合物中の溶液および／または懸濁液、および／または粉末を含む。
【０６０４】
本発明の組成物および処方物の眼投与に適した剤形の例としては、挿入物が挙げられ、組成物は、製薬上許容可能な水性または有機溶媒中の溶液および／または懸濁液を含む。
【０６０５】
本発明の組成物および処方物の送達のために有用な、ワクチンおよび制御薬剤処方物を含めた処方物および組成物の例は、例えば、Sweetman, S.  C. (Ed.).  Martindale.  The Complete Drug Reference, 33rd Edition, Pharmaceutical Press, Chicago, 2002, 2483 pp.；Aulton, M.  E. (Ed.) Pharmaceutics.  The Science of Dosage Form Design.  Churchill Livingstone, Edinburgh, 2000, 734 pp.；およびAnsel, H.  C., Allen, L.  V. and Popovich, N.  G.  Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed., Lippincott 1999, 676 ppに見出される。薬剤送達系の製造に用いられる賦形剤は、当業者に既知の種々の出版物、例えばKibbe, E.  H.  Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed., American Pharmaceutical Association, Washington, 2000, 665 ppに記載されている。ＵＳＰも、調整放出経口剤形の例、例えば錠剤またはカプセルとして処方されるものを提供する。例えば、The United States Pharmacopeia 23/National Formulary 18, The United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville MD, 1995 (本明細書中では、以後、「ＵＳＰ」)参照。これは、延長放出および遅延放出錠剤およびカプセルの薬剤放出能力を確定するための具体的試験を記載している。延長放出および遅延放出商品に関する薬剤放出に関するＵＳＰ試験は、所要試験時間に対する投与量単位からの薬剤溶解に基づいている。種々の試験装置および手法についての記述が、ＵＳＰに見出され得る。延長放出剤形の分析に関するさらなる指針は、Ｆ．Ｄ．Ａ．により提供されている（Guidance for Industry.  Extended release oral dosage forms: development, evaluation, and application of in vitro/in vivo correlations.  Rockville, MD: Center for Drug Evaluation and Research, Food and Drug Administration, 1997参照）。
【０６０６】
本発明の剤形のさらなる例としては、調整放出（ＭＲ）剤形、例えば遅延放出（ＤＲ）型；延長作用（ＰＡ）型；制御放出（ＣＲ）型；拡大放出（ＥＲ）型；時限放出（ＴＲ）型；および長期作用（ＬＡ）型が挙げられるが、これらに限定されない。ほとんどの部分に関しては、これらの用語は、経口投与剤形を記述するために用いられるが、しかしながら、これらの用語は、本明細書中に記載される剤形、処方物、組成物および／または装置のいずれかに適用可能であり得る。これらの処方物は、薬剤投与後の多少の時間の間の遅延総薬剤放出、および／または投与後断続的な小アリコート中での薬剤放出、および／または送達系により支配される制御速度でのゆっくりとした薬剤放出、および／または変化しない一定速度での薬剤放出、および／または通常処方物より有意に長い期間の間の薬剤放出を実行する。
【０６０７】
ある実施形態では、本発明の１つ以上のポリマー粒子の、あるいは本発明の１つ以上のポリマー粒子を含む１つ以上の抗原の治療的有効量は、約１ｕｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇである。治療的有効用量範囲の例としては、例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約７００μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約８００μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇまたは約４５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。
【０６０８】
他の治療的有効用量範囲としては、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約９５０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約９００ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約８５０ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約８００ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約７００ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜約６００ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇまたは約１５ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇが挙げられる。
【０６０９】
ヒト被験者を標的にする本発明のいくつかの実施形態では、本発明の１つ以上のポリマー粒子の、あるいは本発明の１つ以上のポリマー粒子を含む１つ以上の抗原の治療的有効量は、例えば約１０ｍｇ〜約１０ｇ／用量投与である。他の治療的有効用量範囲としては、例えば約２０ｍｇ〜約９ｇ、約３０ｍｇ〜約８ｇ、約４０ｍｇ〜約７ｇ、約５０ｍｇ〜約６ｇ、約６０ｍｇ〜約５ｇ、約７０ｍｇ〜約４ｇ、約８０ｍｇ〜約３ｇ、約１００ｍｇ〜約２ｇ、約１００ｍｇ〜約１．５ｇ、約２００ｍｇ〜約１４００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約１３００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約１２００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約１１００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約９００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約８００、約３００ｍｇ〜約７００ｍｇまたは約３００ｍｇ〜約６００ｍｇ／用量投与が挙げられる。
【０６１０】
本発明は、一部は、本発明の１つ以上のポリマー粒子を含む低用量の組成物、処方物および装置も提供する。例えば、低用量の組成物、処方物等は、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約３．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５−０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５−０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５−０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．０５−０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５−０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの投与量、および／または本発明の１つ以上のポリマー粒子または本発明の１つ以上のポリマー粒子を含む１つ以上の抗原の本明細書中に記述される範囲内の任意の他の用量または用量範囲を提供するのに十分な量で投与される。
【０６１１】
本明細書中に記載される用量は、単回用量投与で、または多数回用量投与で、または分割用量投与で投与され得る。例えば、用量投与は、免疫学の技術分野で周知であるような処置レジメン全体で、１回、２回、３回、４回またはそれ以上の回数で施され得る。
【０６１２】
本発明による有用な組成物の効力は、in vitroおよびin vivoの両方で評価され得る（例えば、以下の実施例を参照）。要するに、組成物は、細胞媒介性免疫応答を誘導するその能力に関して、in vitroまたはin vivoで試験され得る。in vivo試験に関しては、組成物は、動物（例えばマウス）に給餌されるかまたは注射されて、免疫応答を引き出すのに及ぼすその作用が次に査定される。結果に基づいて、適切な投与量範囲および投与経路が決定され得る。
【０６１３】
本発明のいくつかの実施形態では、治療的有効量は、免疫学的応答を引き出すのに有効な量、例えば約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約１５ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約９ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約８ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ〜約７ｎｇ／ｍＬまたは約３ｎｇ／ｍＬ〜約６ｎｇ／ｍＬの血中ＩＦＮ−ガンマの濃度である。
【０６１４】
感染後または長期感染中を含めて、いくつかの環境では、ＩＦＮ−ガンマ血中濃度上昇が観察されるが、このような濃度上昇は、本発明のポリマー粒子による有効な免疫学的応答を引き出すことが査定されるべきである基線を査定するに際して説明されるべきである。
８．  ポリマー粒子による処置
【０６１５】
ポリマー粒子、例えばポリヒドロキシアルキルポリマー粒子は、それらを産生した宿主細胞の外側に粒子として安定的に保持され得るし、これらの粒子は多数の用途に適合するよう設計され得る、ということが発見された。
【０６１６】
機能性ポリマー粒子は、細胞媒介性またはその他の免疫応答を引き出し得る１つ以上の表面結合抗原、細胞媒介性またはその他の免疫応答を引き出し得る抗原の結合ドメインと結合される１つ以上の物質、あるいはその組合せを含み得る。
【０６１７】
一実施形態では、例えば、物質は、粒子形成中に粒子表面に固定され、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインと結合されるか、あるいは負荷、拡散または組入れにより粒子中に組み込まれる。
【０６１８】
結核の処置での使用の状況では、例えばポリマー粒子は、１つ以上の表面結合ヒト型結核菌抗原、ヒト型結核菌抗原結合ドメインと結合される１つ以上の物質、またはその組合せを含み得る。
【０６１９】
一実施形態では、物質は、粒子形成中に粒子表面に固定され、例えばヒト型結核菌抗原結合ドメインと結合されるか、あるいは負荷、拡散または組入れにより粒子中に組み込まれる。例えば架橋によるポリマー粒子の表面との共有結合も、具体的に意図される。
【０６２０】
一実施形態では、物質は、例えばタンパク質またはタンパク質断片、ペプチド、ポリペプチド、抗体または抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原決定基、エピトープ、免疫原またはその断片、あるいはその任意の２つ以上の任意の組合せからなる一覧から選択される。
【０６２１】
一実施形態では、細胞内病原体からのＤＮＡは、断片化され、ポリマーシンターゼを含む融合ポリペプチドをコードする発現構築物中に挿入され得る。このようにして、細胞内病原体抗原決定基を表示するポリマー粒子が産生され、感染患者からの血清を用いてスクリーニングされ得るし、そして抗原提示粒子は、周知の且つ計量可能な細菌産生系を用いて同定され、単離され、再生される。
【０６２２】
一実施形態では、細胞媒介性（またはその他の）免疫応答を引き出し得る多数の抗原が、ポリマー粒子の表面に固定される。
【０６２３】
一実施形態では、例えばヒト型結核菌からのＤＮＡは、断片化され、ポリマーシンターゼを含む融合ポリペプチドをコードする発現構築物中に挿入され得る。このようにして、例えばヒト型結核菌抗原決定基を表示するポリマー粒子が産生され、感染患者からの血清を用いてスクリーニングされ得るし、そして抗原提示粒子は、周知の且つ計量可能な細菌産生系を用いて同定され、単離され、再生される。
【０６２４】
一実施形態では、例えば多数のヒト型結核菌または他の抗原がポリマー粒子の表面に固定される。
【０６２５】
同様に、種々の実施形態において、例えば肝炎ウイルスからの、またはインフルエンザウイルスからのＤＮＡは、断片化され、ポリマーシンターゼを含む融合ポリペプチドをコードする発現構築物中に挿入され得る。このようにして、肝炎抗原決定基またはインフルエンザ抗原決定基を表示するポリマー粒子が産生され、感染患者からの血清を用いてスクリーニングされ得るし、そして抗原提示粒子は、周知の且つ計量可能な細菌産生系を用いて同定され、単離され、再生される。
【０６２６】
一実施形態では、例えば多数の肝炎またはインフルエンザ抗原がポリマー粒子の表面に固定される。
【０６２７】
本発明の一態様は、免疫応答を引き出す１つ以上の抗原を保有するポリマー粒子の能力に関する。一実施形態では、ポリマー粒子は、ポリマービーズと融合される、細胞媒介性またはその他の免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を含む。ポリマー粒子は、抗原部分に対する最適免疫応答を刺激するために、その表面に、細胞媒介性またはその他の免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を表示する。
【０６２８】
一実施形態では、１つ以上の抗原を保有するポリマー粒子は免疫応答を引き出す。一実施形態では、ポリマー粒子は、例えばポリマービーズと融合される少なくとも１つのヒト型結核菌抗原を含む。ポリマー粒子は、例えば抗原部分に対する最適免疫応答を刺激するために、その表面に、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原を表示する。
【０６２９】
一実施形態では、１つ以上の抗原を保有するポリマー粒子は肝炎に対する免疫応答を引き出す。一実施形態では、ポリマー粒子は、例えばポリマービーズと融合される少なくとも１つの肝炎抗原を含む。ポリマー粒子は、例えば抗原部分に対する最適免疫応答を刺激するために、その表面に、少なくとも１つの肝炎抗原を表示する。一実施形態では、ポリマー粒子は、例えばポリマービーズと融合される少なくとも１つのインフルエンザ抗原を含む。ポリマー粒子は、例えば抗原部分に対する最適免疫応答を刺激するために、その表面に、少なくとも１つのインフルエンザ抗原を表示する。本明細書中に記載されるように、他の抗原が意図される。
【０６３０】
一実施形態では、例えば１つより多い抗原、あるいは抗原、アジュバントまたは他の免疫調節因子または分子、例えば免疫刺激因子または分子の組合せが、粒子中または粒子上に存在し、あるいは組成物中に存在する。典型的には、抗原、アジュバントあるいは他の免疫調節因子または分子の組合せの存在は、免疫応答をさらに増強するためである。
【０６３１】
一実施形態では、本発明は、例えば多相系ワクチン組成物を提供した。このハイブリッドワクチンは、結核感染の種々の段階に特異的な異なる抗原を表示する。例えば、早期抗原は、後期抗原と同時発現される。細胞内抗原を含めた種々の抗原に特異的な抗原は当該技術分野で周知であり、例示的病原体に関する代表的抗原は、本明細書中に記載されている。
【０６３２】
本発明は、被験者における細胞媒介性（および／またはその他の）免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、例えば、粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼを含み、例えば細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインと融合されるポリマー粒子を投与することを包含する方法にも関する。
【０６３３】
この実施形態では、被験者への投与時に、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインは、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る内因性抗原と結合し得る。細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原を結合し得る結合ドメインを含むポリマー粒子と、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る内因性抗原との結合は、被験者の免疫応答を引き出すかまたは増強し得る、と理解される。
【０６３４】
例えば、例えば少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む粒子の投与前に、被験者中に存在するがしかし被験者における有効な免疫応答を引き出し得ない細胞媒介性免疫応答を引き出し得る抗原は、粒子との結合時に有効な免疫応答を引き出し得るか、あるいは被験者の免疫応答を増強するために有効である。
【０６３５】
一実施形態では、本発明は、例えば結核に感染した、あるいは結核に対して予め免疫化された被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、例えばヒト型結核菌抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含むポリマー粒子を投与することを包含する方法を提供する。
【０６３６】
この実施形態では、例えば被験者への投与時に、ヒト型結核菌抗原結合ドメインは、内因性ヒト型結核菌抗原と結合し得る。例えば、ヒト型結核菌抗原結合ドメインを含むポリマー粒子と、内因性ヒト型結核菌抗原との結合は、被験者の免疫応答を引き出すかまたは増強し得る、と理解される。
【０６３７】
例えば、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原結合ドメインを含む粒子の投与前に被験者中に存在するが、しかし被験者における有効な免疫応答を引き出し得ない少なくとも１つのヒト型結核菌抗原は、粒子との結合時に有効な免疫応答を引き出し得るか、あるいは被験者の免疫応答を増強するために有効である。
【０６３８】
一実施形態では、本発明は、例えば肝炎に感染した、あるいは肝炎に対して予め免疫化された被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、肝炎抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含むポリマー粒子を投与することを包含する方法を提供する。
【０６３９】
この実施形態では、例えば被験者への投与時に、肝炎抗原結合ドメインは、内因性肝炎抗原と結合し得る。肝炎抗原結合ドメインを含むポリマー粒子と、内因性肝炎抗原との結合は、被験者の免疫応答を引き出すかまたは増強し得る、と理解される。
【０６４０】
例えば、少なくとも１つの肝炎抗原結合ドメインを含む粒子の投与前に被験者中に存在するが、しかし被験者における有効な免疫応答を引き出し得ない肝炎抗原は、粒子との結合時に有効な免疫応答を引き出し得るか、あるいは被験者の免疫応答を増強するために有効である。
【０６４１】
一実施形態では、本発明は、例えばインフルエンザに感染した、あるいはインフルエンザに対して予め免疫化された被験者における免疫応答を引き出す方法であって、それを必要とする被験者に、インフルエンザ抗原結合ドメインと融合される粒子形成タンパク質を含むポリマー粒子を投与することを包含する方法を提供する。
【０６４２】
この実施形態では、例えば被験者への投与時に、インフルエンザ抗原結合ドメインは、内因性インフルエンザ抗原と結合し得る。インフルエンザ抗原結合ドメインを含むポリマー粒子と、内因性インフルエンザ抗原との結合は、被験者の免疫応答を引き出すかまたは増強し得る、と理解される。
【０６４３】
例えば、少なくとも１つのインフルエンザ抗原結合ドメインを含む粒子の投与前に被験者中に存在するが、しかし被験者における有効な免疫応答を引き出し得ないインフルエンザ抗原は、粒子との結合時に有効な免疫応答を引き出し得るか、あるいは被験者の免疫応答を増強するために有効である。
【０６４４】
本発明は、それらが施される被験者における免疫応答を引き出す粒子、組成物および方法を提供する、と理解される。好ましくは、本発明の粒子、組成物および方法を用いて被験者に提示される１つ以上の抗原に応答して引き出される免疫応答の大きさは、抗原単独（すなわち、本発明の、または本明細書中に提示さえっるもの以外の方法により提示される粒子または組成物の非存在下）に応答して引き出されるものより大きい。免疫応答、特に細胞媒介性免疫応答の大きさを定量する方法は、当該技術分野で周知である。
９．  免疫応答の調節因子
【０６４５】
ある環境においては、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を含む融合タンパク質を表示するポリマー粒子を産生することが望ましい。代替的には、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つ以上の抗原を免疫応答のアジュバントまたは他の調節因子とともに含む融合タンパク質が、免疫応答を引き出すために望ましい。
【０６４６】
ある環境においては、体液性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つの抗原を含む融合タンパク質を表示するポリマー粒子を産生することが望ましい。代替的には、体液性免疫応答を引き出し得る少なくとも１つ以上の抗原を免疫応答のアジュバントまたは他の調節因子とともに含む融合タンパク質が、免疫応答を引き出すために望ましい。
【０６４７】
例えば、結核の処置においては、少なくとも１つのヒト型結核菌抗原を含む融合タンパク質を表示するポリマー粒子であって、免疫系の１つ以上のアジュバントまたは他の調節因子と一緒に投与されるポリマー粒子を産生することが望ましい。代替的には、例えば１つ以上のヒト型結核菌抗原、および免疫応答のアジュバントまたは他の調節因子を含む融合タンパク質を含むポリマー粒子が、免疫応答を引き出すために所望され得る。肝炎の処置においては、少なくとも１つの肝炎抗原を含む融合タンパク質を表示するポリマー粒子であって、免疫系の１つ以上のアジュバントまたは他の調節因子と一緒に投与されるポリマー粒子を産生することが望ましい。代替的には、１つ以上の肝炎抗原、および免疫応答のアジュバントまたは他の調節因子を含む融合タンパク質を含むポリマー粒子が、免疫応答を引き出すために所望され得る。インフルエンザの処置においては、少なくとも１つのインフルエンザ抗原を含む融合タンパク質を表示するポリマー粒子であって、免疫系の１つ以上のアジュバントまたは他の調節因子と一緒に投与されるポリマー粒子を産生することが望ましい。代替的には、１つ以上のインフルエンザ抗原、および免疫応答のアジュバントまたは他の調節因子を含む融合タンパク質を含むポリマー粒子が、免疫応答を引き出すために所望され得る。
【０６４８】
一例では、本発明のポリマー粒子は、１つ以上の抗原を、１つ以上のトル様受容体、例えばＬＰＳ、リポタンパク質、フラゲリン、二本鎖ＲＮＡ、非メチル化ＣｐＧアイランド、あるいは細菌またはウイルスＤＮＡまたはＲＮＡからなるリガンドの群のうちの１つ以上を結合し得る１つ以上のトル様受容体と一緒に含み得る。同様に、本発明の組成物は、１つ以上のＴｂ抗原を含むポリマー粒子の集団、ならびに１つ以上の免疫調節分子、例えば１つ以上のトル様受容体を含むポリマー粒子の集団を含み得る。
【０６４９】
１つ以上の免疫調節分子の存在は、体液特異的免疫応答または細胞媒介性特異的免疫応答を引き出すのに、あるいは体液性および細胞媒介性免疫応答の組合せを含む免疫応答を引き指すのに有用であり得る。
【０６５０】
上記のものならびに本明細書中で言及される文書中に記載されたものを含めて、任意の既知のヒト型結核菌抗原から、特定抗原が選択され得る。抗原は、早期感染に対して処置するかまたは免疫化するのに適したワクチンを産生するよう、選択され得る。代替的には、感染の早期および潜伏期からの抗原を含む多相ワクチンが提供される。例えば、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６融合タンパク質を表示するポリマー粒子を含むワクチン送達系が提供される。第二の例は、Ａｇ８５Ａ抗原を発現するポリマー粒子を、結核に対する免疫応答を刺激するのに適した既知のアジュバントとともに含み得る。
【０６５１】
上記のものならびに本明細書中で言及される文書中に記載されたものを含めて、細胞媒介性免疫応答を引き出し得る任意の既知の抗原から、特定抗原が選択され得る。抗原は、早期感染に対して処置するかまたは免疫化するのに適したワクチンを産生するよう、選択され得る。代替的には、感染の早期および潜伏期からの抗原を含む多相ワクチンが提供される。
【０６５２】
上記で本発明を説明してきたが、以下の実施例（単なる例示である）でも本発明を説明する。
【実施例】
【０６５３】
実施例１−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのプラスミドの構築およびＰＨＡポリマー粒子の産生
【０６５４】
本実施例は、結核抗原Ａｇ−８５ＡとＥＳＡＴ−６、Ｃ型肝炎コア抗原、およびインフルエンザ・ヘマグルチニン（ＨＡ）抗原のＨ１サブセットを表示するポリマー粒子を大腸菌中で産生するためのプラスミドの構築について、該ポリマー粒子の免疫原の分析とともに説明する。
材料および方法
１．大腸菌株の増殖
【０６５５】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５１α（Invitrogen）を、１％（ｗ／ｗ）グルコースおよび７５μｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＤｉｆｃｏ（登録商標）ＬＢ培地（表１を参照）で増殖した。大腸菌ＢＬ２１（Invitrogen）を、１％（ｗ／ｗ）グルコース、７５μｇ／ｍＬアンピシリン、および３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＤｉｆｃｏ（登録商標）ルリア（ＬＢ）培地で増殖した。
【０６５６】
【表１】
2013500329.tif 000003
【０６５７】
２．プラスミドの構築
本実施例で用いたすべてのプラスミドおよびオリゴヌクレオチドを表２に収載する。
【０６５８】
ＰｈａＡおよびＰｈａＢの酵素をプラスミドｐＭＣＳ６９によってコードした。結核抗原ポリマー粒子の場合、プラスミドＤＫ１．２−Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６は、Ａｇ８５Ａ（Ｎ末端成分）のコード領域（分泌シグナル配列を含まない）と、ＥＳＡＴ−６（Ｃ末端成分）のコード領域とから構成されるハイブリッド遺伝子を含んでいた。Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６融合タンパク質をコードし、且つ翻訳開始部位および開始コドンを含むＤＮＡ断片を、プライマーＡｇ８５Ａ−ＳｐｅＩ［配列番号３］およびＥＳＡＴ−６−ＳｐｅＩ［配列番号４］を用いるＰＣＲによってこのプラスミドから単離して、ＸｂａｌＩ、ＣｌａＩ−エンドヌクレアーゼ化ｐＨＡＳベクター中に連結して、プラスミドｐＨＡＳ−Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６を生成した。
【０６５９】
Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ６融合の３’ＯＨ末端断片に由来するコード配列を配列番号１として、由来アミノ酸配列を配列番号２として示す。
【０６６０】
Ｃ型肝炎ポリマー粒子の場合、ＤＮＡ２．０によってＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ断片として合成したＨｅｐ  Ｃ  ＤＮＡを、ｐＥＴ−１４ｂ−ｓｃＦＶ−ＰｈａＣベクターにサブクローニングして、ｐＥＴ−１４ｂ  Ｈｅｐ−ＰｈａＣの形成をもたらす。
【０６６１】
ＨｅｐＣ−ＰｈａＣ融合の３’ＯＨ末端断片に由来するコード配列を配列番号７として、由来アミノ酸配列を配列番号８として示す。
【０６６２】
ＨＡ抗原ポリマー粒子の場合、完全長ヘマグルチニン配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔでＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ断片として合成した。この断片をＰＥＴ−１４ｂ−ｓｃＦｖ−ＰｈａＣベクターにサブクローニングして、ｐＥＴ−１４ｂヘマグルチニン−ＰｈａＣ形成をもたらした。ヘマグルチニン抗原の短いＨ１部分を作製するために、表２に記載したプライマーを有する鋳型としてｐＥＴ−１４ｂヘマグルチニン−ＰｈａＣを用いてＨ１配列を増殖した。ＳｐｅＩ／ＳｕｎＩ断片を、ｐＥＴ−１４ｂヘマグルチニン−ＰｈａＣにサブクローニングして、Ｈ３−ＰｈａＣのｐＥＴ−１４ｂ  ＨＡ１の形成をもたらした。ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＥＴ−１４ｂ  ＰｈａＣ−リンカー−ＭａｌＥにサブクローニングして、Ｈ３のｐＥＴ−１４ｂ  ＰｈａＣ−リンカー−ＨＡ１の形成をもたらした。
【０６６３】
Ｈ３−ＰｈａＣ融合のＨＡ１の３’ＯＨ末端断片に由来するコード配列を配列番号１１として、由来アミノ酸配列を配列番号１２として示す。
【０６６４】
【表２】
2013500329.tif 000004
【０６６５】
３．ポリマー粒子を表示するＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６の産生
プラスミドｐＨＡＳ−Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６およびｐＨＡＳを、プラスミドｐＭＣＳ６９を保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に導入した。上述のように、これらの形質転換体をバイオポリエステルポリマー粒子の産生に適している条件下で培養した。次いで、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子、または野生型ポリマー粒子を産生する能力をそれぞれ以下のように評価した。
４．ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）
【０６６６】
種々のプラスミドを保有する細菌細胞のポリエステル含有量は、in vivoでのＰｈａＣシンターゼの活性に対応する。ｐｈａＣシンターゼ活性を決定するために、蓄積されたポリエステルの量をガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）法によって評価し、特に、ＰｈａＣ−Ｔｂ抗原融合が依然としてポリエステル合成を触媒し、且つ細胞内顆粒形成を媒介するかどうかを評価した。酸触媒メタノリシスによってポリエステルを３−ヒドロキシルメチルエステルに転換した後に、ポリエステル含有量をＧＣ−ＭＳで定量的に決定した。
結果
【０６６７】
ｐＨＡＳ−Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６とｐＭＣＳ６９、またはｐＨＡＳとｐＭＣＳ６９を保有する細胞をＧＣ−ＭＳで分析することで、ポリエステルポリヒドロキシ酪酸の存在を確認した。細胞内のポリエステル含有物の存在を、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ染色法を用いて蛍光顕微鏡でさらに確認した。
考察
【０６６８】
ｐＨＡＳ−Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６およびｐＭＣＳ６９を保有する細胞内にポリヒドロキシ酪酸が存在することで、三部融合タンパク質として存在するとき、ｐはＣポリエステルシンターゼドメインがポリマーシンターゼ活性を保持していたことを示した。
実施例２−Ｌ．ラクチス中でのプラスミドの構築およびＰＨＡポリマー粒子の産生
【０６６９】
本実施例は、結核抗原Ａｇ−８５ＡおよびＥＳＡＴ−６を表示するポリマー粒子をＬ．ラクチス中で産生するためのプラスミドの構築を説明する。
材料および方法
１．プラスミドの構築
【０６７０】
本実施例で用いたすべのてプラスミドおよびＬ．ラクチス菌株を表３に記載する。抗原（単数または複数）をコードする遺伝子Ａｇ８５Ａ／ＥＳＡＴ６は、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Piscataway, NJ）で合成された。コドン使用頻度は、Ｌ．ラクチスのコドン使用頻度バイアスに適していた。
【０６７１】
ｎｉｓＡプロモーター（ＰｎｉｓＡ）の一部を含むｐＵＣ５７−ＺＺの断片を、ｐＵＣ５７−ＺＺのＮｄｅＩ消化によって取得し、ｐＵＣ５７−ＥＳＡＴ６を消化したＮｄｅＩを用いて連結させて、ｐＵＣ５７−ｎｉｓＥＳＡＴ６を得た。次いで、ＰｎｉｓＡおよびＡｇ８５Ａ／ＥＳＡＴ６遺伝子の一部を含むｐＵＣ５７−ｎｉｓＥＳＡＴ６のＢＳＴＢＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＮＺ−ＡＢの対応する部位でｐｈａＢの上流に挿入して、ｐＮＺ−ＥＳＡＴ６−Ｂをもたらした。ｐＮＺ−ＣＡＢの断片を含むｐｈａＣおよびｐｈａＡをｐＮＺ−ＥＳＡＴ６−Ｂに導入するために、両プラスミドをＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで加水分解して、ｐＮＺ−ＣＡＢのｐｈａＣＡ断片をｐＮＺ−ＥＳＡＴ６−ＣＡＢに挿入し、ｐＮＺ−ＥＳＡＴ６−ＣＡＢをもたらした。
【０６７２】
ｎｉｓＡプロモーター（ＰｎｉｓＡ）の３’ＯＨ末端断片に由来するコード配列を配列番号３として、由来アミノ酸配列を配列番号４として示す。
【０６７３】
Ｃ型肝炎抗原ポリマー粒子の場合、Ｈｅｐ  Ｃ  ＤＮＡ配列は、Ｌ．ラクチス中での発現のために最適化され、且つＧｅｎＳｃｒｉｐｔでＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ断片として合成されたコドンであった。該断片を表３に記載したｐＮＺ−ＣＡＢプラスミドにサブクローニングして、ｐＮＺ−ＨｅｐＣ−ＰｈａＣＡＢの形成をもたらした。
【０６７４】
ＨｅｐＣ−ＰｈａＣ（ｐＮＺ）融合の３’ＯＨ末端断片に由来するコード配列を配列番号９として、由来アミノ酸配列を配列番号１０として示す。
【０６７５】
【表３】
2013500329.tif 000005
【０６７６】
実施例３−ポリエステルポリマー粒子の単離および該融合タンパク質の特徴づけ
本実施例は、その表面でＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６を表示するバイオポリエステルポリマー粒子の特性化を説明する。
材料および方法
１．ポリエステルポリマー粒子の単離
【０６７７】
細菌を破壊することによってポリエステル顆粒を単離し、次いで全細胞可溶化物を４℃、４０００ｇで１５分間遠心して、ポリエステルポリマー粒子を沈降させた。該ポリマー粒子をグリセロール勾配超遠心分離法で精製した。
２．タンパク質濃度決定
【０６７８】
ポリマー粒子に付着したタンパク質の濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて、製造業者の使用説明書（Bio-Rad）に従って決定した。濃度決定の後に、該タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Invitrogen）で染色した。
【０６７９】
ポリマー粒子に付着した総タンパク質の量と比べて、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６  ＰｈａＣ融合タンパク質の量を、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ(商標）ＸＲを用いて検出して、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（バージョン４．６．２、Bio-Rad Laboratories）を使用して分析した。対象のタンパク質を該ゲルから抽出して、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いてトリプシンペプチドフィンガープリントにかけた。
３．ＥＬＩＳＡ
【０６８０】
炭酸水素塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）（Sigma-Aldrich）に希釈した精製Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子または野生型ポリマー粒子で、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（Nunc）を４℃で一晩被覆した。１ｍｇ／ｍＬから０．０１５ｍｇ／ｍＬに亘るタンパク質濃度を該緩衝液の段階希釈で用いた。プレートを洗浄して２５℃で２時間ブロックした（表４を参照）。
【０６８１】
次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄して、ＥＳＡＴ−６に対するマウス抗体（Abcam）とともにインキュベートし、洗浄し、ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで希釈した抗マウスＩｇＧ：西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体（Sigma-Aldrich）とともに室温で１時間、さらにインキュベートした。さらに洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質（Sigma-Aldrich）を加えて、該プレートを室温で３０分間インキュベートした。
【０６８２】
０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させて、吸光度を４９５ｎｍで記録した。
４．フローサイトメトリー
【０６８３】
２５マイクログラムの精製したＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子または野生型ポリマー粒子を、氷冷のフローサイトメトリー緩衝液（表４を参照）で２回洗浄し、マウス抗ＥＳＡＴ−６抗体（Abcam）とともにインキュベートした。洗浄後、ポリマー粒子はラット抗マウスフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識した抗体（BD Pharmingen,CA,USA）で染色し、暗所の氷上で３０分間インキュベートして、再度洗浄した。ＢＤ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences,CA,USA）を用いて、各試料に対して少なくとも１０，０００イベントを収集して、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。
【０６８４】
【表４】
2013500329.tif 000006
【０６８５】
結果
Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６−ＰｈａＣおよびＰｈａＣに対してそれぞれ、みかけの分子量１０２ｋＤａおよび６３ｋＤａの顕著なタンパク質バンドで決定されたように、該ポリマー粒子は高レベルのタンパク質を表示した。これらのタンパク質の同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＰ−ＭＳを用いるトリプシンペプチドフィンガープリントによって確認した。Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子は、抗ＥＳＡＴ−６抗体に用量依存的様式で結合したが、野生型ポリマー粒子は該抗体に結合しなかったことをＥＬＩＳＡは示した。フローサイトメトリーは、＞９８％のＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ｐｏｒｉｍａ−粒子が抗ＥＳＡＴ−６抗体に結合したことを示した。
考察
【０６８６】
三部融合タンパク質Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６−ＰｈａＣをコードするハイブリッド遺伝子の組換え大腸菌での発現は成功し、ポリエステルポリマー粒子の表面で融合タンパク質を表示する該粒子の過剰産生を引き起こすことを本実施例の結果が示した。
実施例４−インフルエンザポリマー粒子ワクチンの免疫原性
【０６８７】
本実施例は、形質転換宿主（この場合は大腸菌）中で、インフルエンザ抗原ノイラミニダーゼ、Ｍ１インフルエンザコートタンパク質およびヘマグルチニンを同時に表示するポリマー粒子を産生するためのプラスミド構築を、該ポリマー粒子の免疫原性の分析とともに説明する。これらの抗原を有する粒子は、インフルエンザに対する予防ワクチンおよび治療ワクチンとして有効である。
１．材料および方法
【０６８８】
すべての動物実験は、ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｓｓｌａｎｄｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Palmerston North,New Zealand）の承認を得た。
１．大腸菌株の増殖
【０６８９】
１％（ｗ／ｗ）グルコースと７５μｇ／ｍＬアンピシリンとを補充した、実施例１の表１に詳述したＤｉｆｃｏ（商標）のＬＢ培地で大腸菌ＤＨ５α（Invitrogen）を増殖する。１％（ｗ／ｗ）グルコースと７５μｇ／ｍＬアンピシリンと、３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールとを補充した、Ｄｉｆｃｏ（商標）のＬＢ培地または限定培地で大腸菌ＢＬ２１（Invitrogen）を増殖する。
２．プラスミドの構築
【０６９０】
本実施例のプラスミドおよびオリゴヌクレオチドのすべてを表５に収載する。ＰｈａＡ酵素およびＰｈａＢ酵素は、プラスミドｐＭＣＳ６９によってコードされる。
【０６９１】
ノイラミニダーゼ抗原を表示するポリマー粒子を産生するために、ノイラミニダーゼをコードする遺伝子をコドン最適化して、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＩｎｃでＳｐｅＩ／ＳｕｎＩおよびＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩの断片として合成した。ＳｐｅＩ／ＳｕｎＩ断片をＨ３−ＰｈａＣプラスミドのｐＥＴ−１４ｂ  ＨＡ１に挿入して、プラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ＮＡ−ＰｈａＣをもたらした。該ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩの断片をｐＥＴ−１４ｂ−ＰｈａＣ−リンカー−Ｍａ１Ｅにサブクローニングして、プラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ＰｈａＣ−リンカー−ＮＡをもたらした。
【０６９２】
Ｍ１インフルエンザコートタンパク質を表示するポリマー粒子を産生するために、Ｍ１遺伝子配列をコドン最適化して、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔでＳｐｅＩ／ＳｕｎＩおよびＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩの断片として合成した。該ＳｐｅＩ／ＳｕｎＩ断片をＨ３−ＰｈａＣプラスミドのｐＥＴ−１４ｂ  ＨＡ１に挿入して、プラスミドｐＥＴ−１４ｂ−Ｍ１−ＰｈａＣをもたらした。該ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩの断片をｐＥＴ−１４ｂ−ＰｈａＣ−リンカー−Ｍａ１Ｅにサブクローニングして、プラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ＰｈａＣ−リンカー−Ｍ１をもたらした。
【０６９３】
３つのインフルエンザ抗原のすべてを同時に表示するポリマー粒子を産生するために、プラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ＮＡ−ＰｈａＣに由来するＸｂａＩ／ＮｏｔＩ断片をｐＥＴ−１４ｂ−ＰｈａＣ−リンカー−Ｍ１にサブクローニングして、プラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ＮＡ−ＰｈａＣ−リンカー−Ｍ１をもたらした。ヘマグルチニン−ＰｈａＣは、実施例１の表２に記載したＢａｍＨ１  Ｈ３プライマーを用いて増殖させる。それぞれのＢａｍＨ１／ＢｌｐＩ断片をプラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ＮＡ−ＰｈａＣ−リンカー−Ｍ１にサブクローニングし、プラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ＮＡ−ＰｈａＣ−リンカー−Ｍ１／ヘマグルチニン−ＰｈａＣをもたらす。
【０６９４】
ＮＡ−ＰｈａＣ融合およびＰｈａＣ−リンカー−ＮＡ融合のための構築物をそれぞれ配列番号１７および１９として示し、由来アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１８および２０として示す。Ｍ１−ＰｈａＣ融合およびＰｈａＣ−リンカー−Ｍ１融合のための構築物をそれぞれ配列番号２１および２３として示し、由来アミノ酸配列をそれぞれ配列番号２２および２４として示す。Ｎａ−ＰｈａＣ−リンカー−Ｍ１融合のための構築物を配列番号２５として、由来アミノ酸配列を配列番号２６として示す。ヘマグルチニン−ＰｈａＣ融合のための構築物を配列番号２７として、由来アミノ酸配列を配列番号２８として示す。
【０６９５】
【表５】
2013500329.tif 000007
【０６９６】
３．粒子を表示するＡｃｐＡ−ＩｇｌＣの産生
プラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ＰｈａＣ−リンカー−ＮＡ、ｐＥＴ−１４ｂ−ＰｈａＣ−リンカー−Ｍ１、ｐＥＴ−１４ｂ−ＮＡ−ＰｈａＣ−リンカー−Ｍ１／ヘマグルチニン−ＰｈａＣおよびｐＨＡＳを、プラスミドｐＭＣＳ６９を保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に導入する。実施例１に記述するように、バイオポリエステル粒子の産生に適している条件下でこれらの形質転換体を培養する。それぞれ、ＮＡ、Ｍ１もしくはＮＡ−Ｍ１−ヘマグルチニンの粒子または野生型粒子を産生する能力を後述するように評価する。
４．ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）
【０６９７】
種々のプラスミドを保有する細菌細胞のポリエステル含有量は、in vivoでのＰｈａＣシンターゼの活性に対応する。蓄積されたポリエステルの量をガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）法によって評価して、ｐｈａＣシンターゼ活性を決定し、且つ特に、ＰｈａＣ−ＮＡ、Ｐｈａ−Ｍ１およびＰｈａＣ−ＮＡ−Ｍ１−ＨＡの融合がポリエステル合成を触発し、細胞内顆粒形成を媒介することを確認する。酸触媒メタノリシスによるポリエステルの３−ヒドロキシメチルエステルへの転換の後に、ポリエステル含有量をＧＣ−ＭＳによって定量的に決定する。
５．ポリエステル粒子の単離
【０６９８】
細菌を破壊することによってポリエステル顆粒を単離し、次いで全細胞可溶化物を４℃、４０００ｇで１５分間遠心させて、ポリエステル粒子を沈降させる。該粒子をグリセロール勾配超遠心分離法で精製する。
６．タンパク質濃度決定
【０６９９】
粒子に付着したタンパク質の濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて、製造業者の使用説明書（Bio-Rad）に従って決定する。濃度決定の後に、該タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Invitrogen）で染色する。
【０７００】
該粒子に付着した総タンパク質の量と比べて、ＰｈａＣ−ＮＡ、ＰｈａＣ−Ｍ１およびＰｈａＣ−ＮＡ−Ｍ１−ＨＡ融合タンパク質の量を、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ(商標）ＸＲを用いて検出して、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（バージョン４．６．２、Bio-Rad Laboratories）を使用して分析した。対象のタンパク質を該ゲルから抽出して、融合タンパク質ドメインの同定を可能にするマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて、トリプシンペプチドフィンガープリントにかける。
７．ＥＬＩＳＡ
【０７０１】
炭酸水素塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）（Sigma-Aldrich）で希釈した精製ＰｏｒＡ−Ｃ−ＰｏｒＢ粒子もしくはＨＡ、Ｍ１、ＮＡ−Ｍ１−ＨＡの粒子または野生型粒子で、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（Nunc）を４℃で一晩被覆する。１ｍｇ／ｍＬから０．０１５ｍｇ／ｍＬに亘るタンパク質濃度を該緩衝液の段階希釈で用いる。プレートを洗浄して、２５℃で２時間ブロックする（表４を参照）。
【０７０２】
次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄して、種々の抗原に対して産生されたマウス抗体とともにインキュベートし、洗浄して、ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで希釈した抗マウスＩｇＧ：西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体（Sigma-Aldrich）とともに室温で１時間、さらにインキュベートする。さらに洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質（Sigma-Aldrich）を加えて、該プレートを室温で３０分間インキュベートする。
【０７０３】
０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させて、吸光度を４９５ｎｍで記録する。
８．フローサイトメトリー
【０７０４】
２５マイクログラムの種々の精製した抗原表示粒子または野生型粒子を、実施例３の表４に記載した氷冷のフローサイトメトリー緩衝液で２回洗浄し、マウス抗抗原抗体とともにインキュベートする。洗浄後、粒子はラット抗マウスフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識した抗体（BD Pharmingen,CA,USA）で染色し、暗所の氷上で３０分間インキュベートして、再度洗浄する。ＢＤ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences,CA,USA）を用いて、各試料に対して少なくとも１０，０００イベントを収集して、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析する。
９．マウスの免疫化
【０７０５】
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Malaghan Institute,Wellington,NZ）に２週間隔で３回筋肉内に免疫化する。３つの処置群は以下の通りである：
ａ）野生型粒子（すなわち、ｐＨＡＳおよびｐＭＣＳ６９を保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；
ｂ）単独の抗原粒子（すなわち、種々の抗原ＰｈａＣ融合タンパク質およびｐＭＣＳ６９をコードするプラスミドを保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；
ｃ）２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）と混合した
種々の抗原粒子で免疫化した個体。
非ワクチン接種した対照動物は、実験の各組に含まれる。
１０．免疫アッセイ
【０７０６】
最後の免疫化から３週間後に、マウスに麻酔して、採血する。該血液を遠心して、血清を収集し、アッセイまで−２０℃で凍結させる。
【０７０７】
次いで、マウスを安楽死させ、それらの脾臓を摘出し、８０ゲージワイヤメッシュ篩に通すことによって単細胞懸濁液を調製する。１７ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌと１４０ｍＭのＮＨ４Ｃｌの溶液を用いて、脾臓赤血球（ＲＢＣ）を溶解する。洗浄後、２ｍＭグルタミン（Invitrogen）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Invitrogen）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Invitrogen）、５×１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール（Sigma）および５％（ｗ／ｗ）ウシ胎仔血清（Invitrogen）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地で該ＲＢＣを培養する。
【０７０８】
該細胞を３７℃、１０％ＣＯ２、単独の培地で、またはそれぞれの抗原を含む培地でインキュベートする。
１１．ＩＦＮ−γの定量化
【０７０９】
インキュベーションから４日後、培養上清を取り出して、アッセイまで−２０℃で凍結させる。市販の抗体および標準物（BD Pharmingen）を用いて、ＥＬＩＳＡ（BD Biosciences）で製造業者の使用説明書に従って、上清中のＩＦＮ−γのレベルを測定する。
１２．血清抗体の定量化
【０７１０】
抗体捕捉用の粒子を表示する固定化抗原を用いてＥＬＩＳＡによって血清抗体を測定する。
１３．統計分析
【０７１１】
ＩＦＮ−γおよび抗体応答の分析をＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）で行う。
結果
【０７１２】
種々の抗原−ＰｈａＣ融合タンパク質をコードするそれぞれのハイブリッド遺伝子が組換え大腸菌中で発現することで、それらの表面で融合タンパク質を表示するポリエステル粒子の産生が可能になる。
【０７１３】
プラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ＰｈａＣ−リンカー−ＮＡ、ｐＥＴ−１４ｂ−ＰｈａＣ−リンカー−Ｍ１、ｐＥＴ−１４ｂ−ＮＡ−ＰｈａＣ−リンカー−Ｍ１／ヘマグルチニン−ＰｈａＣおよびｐＨＡＳを保有する細胞をすべてｐＭＣＳ６９の存在下でＧＣ−ＭＳ分析によって、ポリエステルポリヒドロキシ酪酸の存在を確認する。細胞内のポリエステル含有物の存在は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ染色法を用いて蛍光顕微鏡によって、さらに確認し得る。
【０７１４】
プラスミドｐＥＴ−１４ｂ−ＰｈａＣ−リンカー−ＮＡ、ｐＥＴ−１４ｂ−ＰｈａＣ−リンカー−Ｍ１、ｐＥＴ−１４ｂ−ＮＡ−ＰｈａＣ−リンカー−Ｍ１／ヘマグルチニン−ＰｈａＣおよびｐＨＡＳ（野生型対照）を保有する細胞中にポリヒドロキシ酪酸が存在することは、単一のまたは３部分からなる融合タンパク質として存在するとき、ｐｈａＣポリエステルシンターゼドメインがポリマーシンターゼ活性を保持していたことを示す。
【０７１５】
ポリマー粒子による高レベルタンパク質表示を、融合タンパク質配列から推定される分子量と直接整列するみかけの分子量による顕著なタンパク質バンドによって決定する。これらのタンパク質の同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いるトリプシンペプチドフィンガープリントで確認する。粒子を表示する種々の抗原は、用量依存的様式でそれぞれの抗抗原抗体に結合するが、野生型粒子が抗体に結合するのは有意に少ないことをＥＬＩＳＡの結果は示している。フローサイトメトリーの結果が、＞９８％の抗原粒子が抗抗原抗体に結合することを示しているのは好ましい。
【０７１６】
好ましくは、免疫化の後、明白な毒性はいずれの動物でも観察されず、実験の時間経過の間、マウスの体重は群間で有意差はなく、且つすべての群においてマウスの体重は増えた。ポリエステル粒子で免疫化したマウスは、免疫部位で小さいしこり（直径２．５ｍｍ）が発生するが、ほとんどの場合膿瘍または化膿はなく、典型的には、試験の間健康であり、行動は正常であり、且つ毛質は良好である。
【０７１７】
１０〜１００μｇ用量の抗原粒子は、マウスにおいて有意な抗体応答を生成する際に最適である。１０〜１００μｇ用量の単独の野生型粒子の場合と比較すると、この用量は、高抗体力価を明らかに誘導する。他の用量を試験して用いてもよい。非免疫化した対照マウスを含む第２の実験では、アジュバントを含むビーズ製剤と含まないビーズ製剤とを比較する。非ワクチン接種マウスと比較すると、抗原粒子を与えた両ワクチン群の場合、有意に高い抗原特異的血清抗体応答を評価した。最も高い抗体応答は、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ中の抗原粒子で免疫化したマウスにおいて観察され得る。ＩｇＧ１アイソタイプについての抗体応答は、典型的には、両実験でのＩｇＧ２についての応答よりも強いものになる。
【０７１８】
１０〜１００μｇ抗原粒子で免疫化したマウスの抗原に対する細胞媒介性応答も、単独の野生型粒子で、または単独のＰＢＳで免疫化したマウスの抗原と比較すると、有意に増強され、およびＰＢＳ免疫化した対照マウスと比較すると、単独の野生型粒子で免疫化したマウスの細胞媒介性応答において典型的には有意差はみられないはずである。
【０７１９】
１０〜１００μｇの野生型粒子（インフルエンザ抗原は含まない）で３回免疫化したマウスにおいてどちらかの抗原に対するＩＦＮ−γ応答は、ＰＢＳ免疫化した対照マウスの応答と典型的には有意に異なることはない。対照的に、各抗原に対する有意により大きいＩＦＮ−γ応答は、抗原粒子で３回免疫化したマウスにおいて、および抗原粒子とＥｍｕｌｓｉｇｅｎとで３回免疫化したマウスにおいて観察され得る。他のすべてのワクチン群よりも、抗原粒子およびＥｍｕｌｓｉｇｅｎで３回免疫化したマウスにおいて観察される各抗原に対するＩＦＮ−γ応答は有意により大きいと予想される。
【０７２０】
ノイラミニダーゼ、Ｍ１コートタンパク質またはヘマグルチニン抗原を表示する操作されたポリエステル粒子は、抗原特異的細胞媒介性応答を生成することができ、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体の産生を著しく増加させることができる。
【０７２１】
体液性および細胞媒介性の免疫応答の生成に加えて、体重減少などの有害な副作用の欠如、および注射部位での膿瘍および化膿の非存在は、ポリエステル粒子は耐容性がよく、安全、且つ非毒性であることを示す。
実施例５−野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｆｕｌａｒｅｎｓｉｓ）ポリマー粒子ワクチンの免疫原性
【０７２２】
本実施例は、形質転換宿主（この場合は大腸菌）中で、野兎病菌抗体のＡｃｐＡおよびＩｇ１Ｃを同時に表示するポリマー粒子を産生するためのプラスミド構築を、該ポリマー粒子の免疫原性の分析とともに説明する。これらの抗原を有する粒子は、野兎病に対する予防ワクチンおよび治療ワクチンとして有効である。
材料および方法
【０７２３】
すべての動物実験は、ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｓｓｌａｎｄｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Palmerston North,New Zealand）の承認を得た。
１．プラスミドの構築および大腸菌でのＰＨＡ粒子の産生
【０７２４】
本実施例のプラスミドおよびオリゴヌクレオチドのすべてを表６に収載する。ＰｈａＡ酵素およびＰｈａＢ酵素は、プラスミドｐＭＣＳ６９によってコードされる。
【０７２５】
２つの野兎病菌抗原を同時に表示するポリマー粒子を産生するために、抗原ＡｃｐＡおよびＩｇ１Ｃをコードする遺伝子をコドン最適化して、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．で合成し、ＰｈａＣポリマービーズ形成酵素とのＮ末端融合のためのｐＥＴ−１４ｂ−Ｍ−ＰｈａＣ−リンカー−ＭａｌＥ  Ｘｂａｌ−ＳｐｅＩ部位への、およびＣ末端融合のためのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位へのサブクローニングを可能にする。ＡｃｐＡコード遺伝子をＸｂａＩ−ＳｐｅＩ部位に、および同じプラスミド上のＩｇ１Ｃコード遺伝子をＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入する。両方の遺伝子挿入は、置換された元のプラスミドのＭおよびＭａｌＥのコード領域を有するフレーム内であり、プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−ＡｃｐＡ−Ｃ−Ｉｇ１Ｃをもたらす。
【０７２６】
ＡｃｐＡ−Ｃ−Ｉｇ１Ｃ融合のための構築物を、配列番号２９として、由来アミノ酸配列を列番号３０として示す。
【０７２７】
【表６】
2013500329.tif 000008
プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−ＡｃｐＡ−Ｃ−Ｉｇ１ＣおよびｐＨＡＳを、プラスミドｐＭＣＳ６９を保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に挿入する。実施例１に記述するように、バイオポリエステル粒子の産生に適している条件下でこれらの形質転換体を培養する。ＡｃｐＡ−Ｉｇ１Ｃ粒子または野生型粒子をそれぞれ産生する能力を後述するように評価する。
２．ポリエステル粒子の単離
【０７２８】
細菌を破壊することによってポリエステル顆粒を単離し、次いで全細胞可溶化物を４℃、４０００ｇで１５分間遠心させて、ポリエステル粒子を沈降させる。該粒子をグリセロール勾配超遠心分離法で精製する。
【０７２９】
粒子に付着したタンパク質の濃度は、実施例３に記述するように、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて決定する。
【０７３０】
該粒子に付着した総タンパク質の量と比べて、ＡｃｐＡ−ＰｈａＣ−Ｉｇ１Ｃ融合タンパク質の量を、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ(商標）ＸＲを用いて検出して、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（バージョン４．６．２、Bio-Rad Laboratories）を使用して分析し、次いで対象のタンパク質を実施例３に記述するように同定する。
３．ＥＬＩＳＡ
【０７３１】
実施例３に記述するように、野兎病菌ポリマー粒子の免疫反応性を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で決定する。簡単に言うと、炭酸水素塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）（Sigma-Aldrich）で希釈した精製ＰｏｒＡ−Ｃ−ＰｏｒＢ粒子またはＡｃｐＡ−Ｉｇ１Ｃ粒子または野生型粒子で、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（Nunc）を４℃で一晩被覆する。１ｍｇ／ｍＬから０．０１５ｍｇ／ｍＬに亘るタンパク質濃度を該緩衝液の段階希釈で用いる。
【０７３２】
プレートを洗浄して、２５℃で２時間ブロックする。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄して、種々の抗原に対して産生されたマウス抗体とともにインキュベートし、洗浄し、ＰＢＳ中１％（w/v）ＢＳＡで希釈した抗マウスＩｇＧ：西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体（Sigma-Aldrich）とともに室温で１時間、さらにインキュベートする。さらに洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質（Sigma-Aldrich）を加えて、該プレートを室温で３０分間インキュベートする。
【０７３３】
０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させて、吸光度を４９５ｎｍで記録する。
４．マウスの免疫化
【０７３４】
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Malaghan Institute,Wellington,NZ）に２週間隔で３回筋肉内に免疫化する。３つの処置群は以下の通りである：
ａ）野生型粒子（すなわち、ｐＨＡＳおよびｐＭＣＳ６９を保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；
ｂ）単独の抗原粒子（すなわち、種々の抗原ＰｈａＣ融合タンパク質およびｐＭＣＳ６９をコードするプラスミドを保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；
ｃ）２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）と混合した種々の抗原粒子で免疫化した個体。
非ワクチン接種した対照動物は、実験の各組に含まれる。
５．免疫アッセイ
【０７３５】
最後の免疫化から３週間後に、マウスに麻酔して、採血する。該血液を遠心して、血清を収集し、アッセイまで−２０℃で凍結させる。
【０７３６】
次いで、マウスを安楽死させ、それらの脾臓を摘出し、８０ゲージワイヤメッシュ篩に通すことによって単細胞懸濁液を調製する。実施例４に記述するように脾臓赤血球（ＲＢＣ）を処理する。
６．ＩＦＮ−γの定量化
【０７３７】
インキュベーションから４日後、培養上清を取り出して、アッセイまで−２０℃で凍結させる。市販の抗体および標準物（BD Pharmingen）を用いて、ＥＬＩＳＡ（BD Biosciences）で製造業者の使用説明書に従って、上清中のＩＦＮ−γのレベルを測定する。
７．血清抗体の定量化
【０７３８】
抗体捕捉用の粒子を表示する固定化抗原を用いてＥＬＩＳＡによって血清抗体を測定する。
８．統計分析
【０７３９】
ＩＦＮ−γおよび抗体応答の分析をＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）で行う。
結果
【０７４０】
プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−ＡｃｐＡ−Ｃ−Ｉｇ１ＣおよびｐＨＡＳを保有する細胞をすべてｐＭＣＳ６９の存在下でＧＣ−ＭＳ分析によって、ポリエステルポリヒドロキシ酪酸の存在を確認する。細胞内のポリエステル含有物の存在は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ染色法を用いて蛍光顕微鏡によって、さらに確認し得る。
【０７４１】
すべてｐＭＣＳ６９の存在下で、プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−ＡｃｐＡ−Ｃ−Ｉｇ１ＣおよびｐＨＡＳ（野生型対照）を保有する細胞中にポリヒドロキシ酪酸が存在することは、単一のまたは３部分からなる融合タンパク質として存在するとき、ｐｈａＣポリエステルシンターゼドメインがポリマーシンターゼ活性を保持していたことを示す。
【０７４２】
粒子による高レベルタンパク質表示を、融合タンパク質配列から推定される分子量と直接整列するみかけの分子量による顕著なタンパク質バンドによって決定する。これらのタンパク質の同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いるトリプシンペプチドフィンガープリントで確認する。粒子を表示する種々の抗原は、用量依存的様式でそれぞれの抗抗原抗体に結合するが、野生型粒子が抗体に結合するのは有意に少ないことをＥＬＩＳＡの結果は示している。フローサイトメトリーの結果が、＞９８％の抗原粒子が抗抗原抗体に結合することを示しているのは好ましい。
【０７４３】
種々の抗原−ＰｈａＣ融合タンパク質をコードするそれぞれのハイブリッド遺伝子が組換え大腸菌中で発現することで、それらの表面で融合タンパク質を表示するポリエステル粒子の産生が可能になる。
【０７４４】
好ましくは、免疫化の後、明白な毒性はいずれの動物でも観察されず、実験の時間経過の間、マウスの体重は群間で有意差はなく、且つすべての群においてマウスの体重は増えた。ポリエステル粒子で免疫化したマウスは、免疫部位で小さいしこり（直径２．５ｍｍ）が発生するが、ほとんどの場合膿瘍または化膿はなく、典型的には、試験の間健康であり、行動は正常であり、且つ毛質は良好である。
【０７４５】
１０〜１００μｇ用量の抗原粒子は、マウスにおいて有意な抗体応答を生成する際に最適である。１０〜１００μｇ用量の単独の野生型粒子の場合と比較すると、この用量は、高抗体力価を明らかに誘導する。他の用量を試験して用いてもよい。非免疫化した対照マウスを含む第２の実験では、アジュバントを含むビーズ製剤と含まないビーズ製剤とを比較する。非ワクチン接種したマウスと比較すると、抗原粒子を与えた両ワクチン群の場合、有意に高い抗原特異的血清抗体応答を評価した。最も高い抗体応答は、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ中の抗原粒子で免疫化したマウスにおいて観察され得る。ＩｇＧ１アイソタイプについての抗体応答は、典型的には両実験のでＩｇＧ２についての応答よりも強いものになる。
【０７４６】
１０〜１００μｇ抗原粒子で免疫化したマウスの抗原に対する細胞媒介性応答も、単独の野生型粒子で、または単独のＰＢＳで免疫化したマウスの抗原と比較すると、有意に増強され、およびＰＢＳ免疫化した対照マウスと比較すると、単独の野生型粒子で免疫化したマウスの細胞媒介性応答において典型的には有意差はみられないはずである。
【０７４７】
１０〜１００μｇの野生型粒子（野兎病菌抗原は含まない）で３回免疫化したマウスにおいてどちらかの抗原に対するＩＦＮ−γ応答は、ＰＢＳ免疫化した対照マウスの応答と典型的には有意に異なることはない。対照的に、各抗原に対する有意により大きいＩＦＮ−γ応答は、抗原粒子で３回免疫化したマウスにおいて、および抗原粒子とＥｍｕｌｓｉｇｅｎとで３回免疫化したマウスにおいて観察され得る。他のすべてのワクチン群よりも、抗原粒子およびＥｍｕｌｓｉｇｅｎで３回免疫化したマウスにおいて観察される各抗原に対するＩＦＮ−γ応答は有意により大きいと予想される。
【０７４８】
抗原ＡｃｐＡおよびＩｇ１Ｃを同時に表示する操作されたポリエステル粒子は、抗原特異的細胞媒介性応答を生成することができ、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体の産生を著しく増加させることができる。
【０７４９】
体液性および細胞媒介性の両免疫応答の生成に加えて、体重減少などの有害な副作用の欠如、および注射部位での膿瘍および化膿の非存在は、ポリエステル粒子は耐容性がよく、安全、且つ非毒性であることを示す。
実施例６−ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）ポリマー粒子ワクチンの免疫原性
【０７５０】
本実施例は、形質転換宿主（この場合は大腸菌）中で、ウシ流産菌抗体のＯｍｐ１６、免疫原性外膜タンパク質を表示するポリマー粒子を産生するためのプラスミド構築を、該ポリマー粒子の免疫原性の分析とともに説明する。本実施例で産生されるこれらの抗原を表示するポリマー粒子は、ブルセラ症に対する予防ワクチンおよび治療ワクチンとして有効である。
材料および方法
【０７５１】
すべての動物実験は、ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｓｓｌａｎｄｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Palmerston North,New Zealand)の承認を得た。
１．プラスミド構築物の過剰発現
【０７５２】
本実施例のプラスミドおよびオリゴヌクレオチドのすべてを表７収載する。β−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−補酵素Ａ還元酵素は、プラスミドｐＭＣＳ６９によってコードされ、アセチル補酵素Ａの３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａへの転換を触媒することによってポリマーシンターゼに対する基質を提供する。
【０７５３】
ポリマー粒子を表示するウシ流産菌Ｏｍｐ１６を産生するために、抗原Ｏｍｐ１６をコードする遺伝子をコドン最適化して、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．で合成し、ＰｈａＣポリマービーズ形成酵素とのＣ末端融合のためのｐＥＴ−１４ｂ−ＰｈａＣ−リンカー−ＧＦＰ  ＸｈｏｌＩ−ＢａｍＨＩ部位へのサブクローニングを可能にする。ｏｍｐ１６コード遺伝子をＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入する。この遺伝子挿入は、置換された元のプラスミドのＧＦＰコード領域を有するフレーム内であり、プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−Ｃ−ｏｍｐ１６をもたらす。
【０７５４】
ＰｈａＣ−ｏｍｐ１６融合のための構築物を配列番号３１として、由来アミノ酸配列を配列番号３２として示す。
【０７５５】
【表７】
2013500329.tif 000009
【０７５６】
２．Ｏｍｐ１６表示粒子の産生
プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−Ｃ−ｏｍｐ１６およびｐＨＡＳを、プラスミドｐＭＣＳ６９を保有する大腸菌ＫＲＸ細胞に導入する。実施例１に記述するように、バイオポリエステル粒子の産生に適している条件下でこれらの形質転換体を培養する。
３．ポリエステル粒子の単離
【０７５７】
実施例３に記述するように、ポリエステル顆粒を単離する。粒子に付着したタンパク質の濃度は、実施例３に記述するように、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて決定し、実施例３に記述するように対象のタンパク質をマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて同定する。
４．ＥＬＩＳＡ
【０７５８】
実施例３に記述するように、種々の抗原に対して産生されたマウス抗体を用いてウシ流産菌ポリマー粒子の免疫反応性を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で決定する。
４．マウスの免疫化
【０７５９】
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Malaghan Institute,Wellington,NZ）に２週間隔で３回筋肉内（i.p.）に免疫化する。３つの処置群は以下の通りである：
ａ）野生型粒子（すなわち、ｐＨＡＳおよびｐＭＣＳ６９を保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；
ｂ）単独の抗原粒子（すなわち、種々の抗原ＰｈａＣ融合タンパク質およびｐＭＣＳ６９をコードするプラスミドを保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；
ｃ）２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）と混合した種々の抗原粒子で免疫化した個体。
非ワクチン接種した対照動物は、実験の各組に含まれる。
６．免疫アッセイ
【０７６０】
最後の免疫化から３週間後に、マウスに麻酔して、採血する。該血液を遠心して、血清を収集し、アッセイまで−２０℃で凍結させる。次いで、マウスを安楽死させ、それらの脾臓を摘出し、８０ゲージワイヤメッシュ篩に通すことによって単細胞懸濁液を調製する。１７ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌおよび１４０ｍＭのＮＨ４Ｃｌの溶液を用いて、脾臓赤血球（ＲＢＣ）を溶解する。洗浄後、２ｍＭグルタミン（Invitrogen）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Invitrogen）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Invitrogen）、５×１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール（Sigma）および５％（w/w）ウシ胎仔血清（Invitrogen）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地で該ＲＢＣを培養する。該細胞を３７℃、１０％ＣＯ２、単独の培地で、またはそれぞれの抗原を含む培地でインキュベートする。
７．ＩＦＮ−γの定量化
【０７６１】
インキュベーションから４日後、培養上清を取り出して、アッセイまで−２０℃で凍結させる。市販の抗体および標準物（BD Pharmingen）を用いて、ＥＬＩＳＡ（BD Biosciences）で製造業者の使用説明書に従って、上清中のＩＦＮ−γのレベルを測定する。
８．血清抗体の定量化
【０７６２】
抗体捕捉用の粒子を表示する固定化抗原を用いてＥＬＩＳＡによって血清抗体を測定する。
９．統計分析
【０７６３】
ＩＦＮ−γおよび抗体応答の分析をＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）で行う。
結果
【０７６４】
プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−Ｃ−ｏｍｐ１６およびｐＨＡＳを保有する細胞をすべてｐＭＣＳ６９の存在下で、ＧＣ−ＭＳ分析によってポリエステルポリヒドロキシ酪酸の存在を確認する。細胞内のポリエステル含有物の存在は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ染色法を用いて蛍光顕微鏡によって、さらに確認し得る。
【０７６５】
すべてｐＭＣＳ６９の存在下で、プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−Ｃ−ｏｍｐ１６およびｐＨＡＳ（野生型対照）を保有する細胞中にポリヒドロキシ酪酸が存在することは、単一のまたは３部分からなる融合タンパク質として存在するとき、ＰｈａＣポリエステルシンターゼドメインがポリマーシンターゼ活性を保持していたことを示す。
【０７６６】
粒子による高レベルタンパク質表示を、それぞれ融合タンパク質配列から推定される分子量と直接整列するみかけの分子量による顕著なタンパク質バンドによって決定する。これらのタンパク質の同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いるトリプシンペプチドフィンガープリントで確認する。粒子を表示する種々の抗原は、用量依存的様式でそれぞれの抗抗原抗体に結合するが、野生型粒子が抗体に結合するのは有意に少ないことをＥＬＩＳＡの結果は示している。フローサイトメトリーの結果が、＞９５％の抗原粒子が抗抗原抗体に結合することを示しているのは好ましい。ＰｈａＣ抗原融合タンパク質をコードするそれぞれのハイブリッド遺伝子が組換え大腸菌中で発現することで、それらの表面で融合タンパク質を表示するポリエステル粒子の産生が可能になる。
【０７６７】
好ましくは、免疫化の後、明白な毒性はいずれの動物でも観察されず、実験の時間経過の間、マウスの体重は群間で有意差はなく、且つすべての群においてマウスの体重は増えた（データ不図示）。ポリエステル粒子で免疫化したマウスは、典型的には、試験の間健康であり、行動は正常であり、且つ毛質は良好である。
【０７６８】
約１０〜５０μｇ用量範囲の抗原粒子は、マウスにおいて有意な抗体応答を生成する際に最適である。１０〜５０μｇ用量の単独の野生型粒子の場合と比較すると、この用量は、高抗体力価を明らかに誘導する。他の用量、例えば５０〜５００μを試験して用いてもよい。非免疫化した対照マウスを含む第２の実験では、アジュバントを含むビーズ製剤と含まないビーズ製剤とを比較する。非ワクチン接種したマウスと比較すると、抗原粒子を与えた両ワクチン群の場合、有意に高い抗原特異的血清抗体応答を評価した。最も高い抗体応答は、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ中の抗原粒子で免疫化したマウスにおいて観察され得る。ＩｇＧ１アイソタイプについての抗体応答は、典型的には両実験でのＩｇＧ２についての応答よりも強いものになる。
【０７６９】
１０〜５０μｇ抗原粒子で免疫化したマウスの抗原に対する細胞媒介性応答も、単独の野生型粒子で、または単独のＰＢＳで免疫化したマウスの抗原と比較すると、有意に増強され、およびＰＢＳ免疫化した対照マウスと比較すると、単独の野生型粒子で免疫化したマウスの細胞媒介性応答において典型的には有意差はみられないはずである。
【０７７０】
１０〜５０μｇの野生型粒子（ウシ流産菌抗原は含まない）で２回免疫化したマウスにおいて該抗原に対するＩＦＮ−γ応答は、ＰＢＳ免疫化した対照マウスの応答と典型的には有意に異なることはない。対照的に、各抗原に対する有意により大きいＩＦＮ−γ応答は、抗原粒子で２回免疫化したマウスにおいて、および抗原粒子とＥｍｕｌｓｉｇｅｎとで２回免疫化したマウスにおいて観察され得る。他のすべてのワクチン群よりも、抗原粒子およびＥｍｕｌｓｉｇｅｎで２回免疫化したマウスにおいて観察される各抗原に対するＩＦＮ−γ応答は有意により大きいと予想される。
【０７７１】
抗原Ｏｍｐ１６を表示する操作されたポリエステル粒子は、抗原特異的細胞媒介性応答を生成することができ、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体の産生を著しく増加させることができる。
【０７７２】
体液性および細胞媒介性の両免疫応答の生成に加えて、体重減少などの有害な副作用の欠如、および注射部位での膿瘍および化膿の非存在は、ポリエステル粒子は耐容性がよく、安全、且つ非毒性であることを示す。
実施例７−髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））ポリマー粒子ワクチンの免疫原性
【０７７３】
本実施例は、形質転換宿主（この場合は大腸菌）中で、髄膜炎菌抗体のＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＦｅｔＡ、ＺｎｕＤ、ならびに化学的に架橋している、または非共有結合した髄膜炎菌Ｂ群莢膜多糖類（ＣＰＳ）を表示するポリマー粒子を産生するためのプラスミド構築を、該ポリマー粒子の免疫原性の分析とともに説明する。これらの抗原を有する粒子は、髄膜炎に対する予防ワクチンおよび治療ワクチンとして有効である。
材料および方法
【０７７４】
すべての動物実験は、ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｓｓｌａｎｄｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Palmerston North、New Zealand）の承認を得た。
１．プラスミドの構築物
【０７７５】
本実施例のためのプラスミドおよびオリゴヌクレオチドのすべてを表８に収載する。ＰｈａＡ酵素およびＰｈａＢ酵素は、プラスミドｐＭＣＳ６９によってコードされる。６−システイン−ＰｈａＣ融合タンパク質をコードし、翻訳開始部位および開始コドンを含むＤＮＡ断片を、鋳型としてプライマーＣｙｓ６−ＸｂａＩ［配列番号５５］およびＰｈａＣ−Ｃ−ＢａｍＨＩ［配列番号５６］を用いるＰＣＲによってラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）Ｈ１６から単離したゲノムＤＮＡから得る。ＰＣＲ産物をＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ−エンドヌクレアーゼ化ｐＥＴ１４Ｂベクターに連結させて、プラスミドｐＥＴ−１４ｂ−Ｃｙｓ６−ＰｈａＣを産生する。
【０７７６】
２つの髄膜炎菌抗原を同時に表示するポリマー粒子を産生するために、抗原ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＦｅｔＡ、ＺｎｕＤをコードする遺伝子をコドン最適化して、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．で合成し、ＰｈａＣポリマービーズ形成酵素とのＮ末端融合のためのｐＥＴ−１４ｂ−Ｍ−ＰｈａＣ−リンカー−ＭａｌＥ  Ｘｂａｌ−ＳｐｅＩ部位への、およびＣ末端融合のためのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位へのサブクローニングを可能にする。ＰｏｒＡコード遺伝子をＸｂａＩ−ＳｅＩ部位に挿入し、同じプラスミド上のＰｏｒＢコード]遺伝子をＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩに挿入する。両方の遺伝子挿入は、置換された元のプラスミドのＭおよびＭａｌＥのコード領域を有するフレーム内であり、プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−ＰｏｒＡ−Ｃ−ＰｏｒＢをもたらす。
【０７７７】
ＦｅｔＡコード遺伝子をＸｂａＩ−ＳｐｅＩ部位に、および同じプラスミド上のＺｎｕＤコード遺伝子をＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入する。両方の遺伝子挿入は、置換された元のプラスミドのＭおよびＭａｌＥのコード領域を有するフレーム内であり、プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−ＦｅｔＡ−Ｃ−ＺｎｕＤをもたらす。
【０７７８】
Ｃｙｓ６−ＰｈａＣ融合のための構築物を配列番号３３として、由来アミノ酸配列を配列番号３４として示す。ＰｏｒＡ−Ｃ−ＰｏｒＢ融合のための構築物を配列番号３５として、由来アミノ酸配列を配列番号３６として示す。ＦｅｔＡ−Ｃ−ＺｎｕＤ融合のための構築物を配列番号３７として、由来アミノ酸配列を配列番号３８として示す。
【０７７９】
【表８】
2013500329.tif 000010
【０７８０】
２．粒子を表示するＣｙｓ−６、ＰｒｏＡ／ＢおよびＦｅｔＡ／ＺｎｕＤの産生
プラスミドｐＥＴ−１４ｂ−Ｃｙｓ６−ＰｈａＣ、ｐＥＴ１４Ｂ−ＰｏｒＡ−Ｃ−ＰｏｒＢ、ｐＥＴ１４Ｂ−ＦｅｔＡ−Ｃ−ＺｎｕＤおよびｐＨＡＳを、プラスミドｐＭＣＳ６９を保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に導入する。実施例１に記述するように、バイオポリエステル粒子の産生に適している条件下でこれらの形質転換体を培養する。
３．ポリエステル粒子の単離
【０７８１】
細菌を破壊することによってポリエステル顆粒を単離し、次いで全細胞可溶化物を４℃、４０００ｇで１５分間遠心させて、ポリエステル粒子を沈降させる。該粒子をグリセロール勾配超遠心分離法で精製する。
【０７８２】
粒子に付着したタンパク質の濃度は、実施例３に記述するように、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて決定する。濃度決定の後に、該タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Invitrogen）で染色する。
【０７８３】
該粒子に付着した総タンパク質の量と比べて、Ｃｙｓ６−Ｃ、ＰｏｒＡ−Ｃ−ＰｏｒＢまたはＦｅｔＡ−Ｃ−ＺｎｕＤの融合タンパク質の量を、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ(商標）ＸＲを用いて検出して、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（バージョン４．６．２、Bio-Rad Laboratories）を使用して分析する。該タンパク質をマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて同定する。Ｃｙｓ６−Ｃの場合は、Ｎ末端の配列決定を用いて、ＰｈａＣのＮ末端で６つのシステイン残基の存在を確認する。
４．Ｃｙｓ６ポリエステル粒子への髄膜炎ＣＰＳの化学的架橋
【０７８４】
Ｃｙｓ６粒子との莢膜性多糖類（ＣＳＰ）の化学架橋は、精製された髄膜炎菌ＣＰＳを用いることで達成される。これまでにAnnunziatoらによって記述されたように、化学架橋リンカーＰＭＰＩ（Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアナート）は、ヒドロキシルがチオールに結合するヘテロ二官能性リンカーであり、それにより、ラルストニア・ユートロファから酵素、ＰＨＡシンターゼを形成するポリマー粒子のＮ末端に操作される、６つのシステイン残基を表示するポリマー粒子との髄膜炎菌ＣＰＳの共有結合が可能になる。
５．ポリエステル粒子を表示する特異抗体への髄膜炎菌ＣＰＳの非共有結合
【０７８５】
ウサギを免疫化することによってＣＰＳ特異抗体を産生する。単一特異性の多クローン性血清を、プロテインＡ親和性精製にかける。結果として生じる精製ＩｇＧを、ポリエステル粒子を表示するＺＺドメインに結合させる。次いで、乾燥重量ベースで１：１の比を用いて、これらの粒子を髄膜炎菌ＣＰＳとともに３０分間インキュベートする。これによって、ポリエステル粒子と特異的であるが非共有の結合が可能になる。
６．ＥＬＩＳＡ
【０７８６】
実施例３に記述するように、種々の抗原に対して産生されたマウス抗体を用いて髄膜炎菌ポリマー粒子の免疫反応性を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で決定する。
７．マウス免疫化
【０７８７】
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Malaghan Institute,Wellington,NZ）に２週間隔で３回筋肉内に免疫化する。３つの処置群は以下の通りである：
ａ）野生型粒子（すなわち、ｐＨＡＳおよびｐＭＣＳ６９を保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；
ｂ）単独の抗原粒子（すなわち、種々の抗原ＰｈａＣ融合タンパク質およびｐＭＣＳ６９をコードするプラスミドを保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；
ｃ）２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）と混合した種々の抗原粒子で免疫化した個体。
非ワクチン接種した対照動物は、実験の各組に含まれる。
８．免疫アッセイ
【０７８８】
最後の免疫化から３週間後に、マウスに麻酔して、採血する。該血液を遠心して、血清を収集し、アッセイまで−２０℃で凍結させる。
【０７８９】
次いで、マウスを安楽死させ、それらの脾臓を摘出し、８０ゲージワイヤメッシュ篩に通すことによって単細胞懸濁液を調製する。実施例４に記述するように脾臓赤血球（ＲＢＣ）を処理する。
９．ＩＦＮ−γの定量化
【０７９０】
インキュベーションから４日後、培養上清を取り出して、アッセイまで−２０℃で凍結させる。実施例４に記述するように上清中のＩＦＮ−γのレベルをＥＬＩＳＡ（BD Biosciences)で測定する。
１０．血清抗体の定量化
【０７９１】
抗体捕捉用の粒子を表示する固定化抗原を用いてＥＬＩＳＡによって血清抗体を測定する。
１１．統計分析
【０７９２】
ＩＦＮ−γおよび抗体応答の分析をＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）で行う。
結果
【０７９３】
プラスミドｐＥＴ１４ｂ−Ｃｙｓ６−ＰｈａＣ、ｐＥＴ１４Ｂ−ＰｏｒＡ−Ｃ−ＰｏｒＢ、ｐＥＴ１４Ｂ−ＦｅｔＡ−Ｃ−ＺｎｕＤおよびｐＨＡＳを保有する細胞をすべてｐＭＣＳ６９の存在下で、ＧＣ−ＭＳ分析によってポリエステルポリヒドロキシ酪酸の存在を確認する。細胞内のポリエステル含有物の存在は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ染色法を用いて蛍光顕微鏡によって、さらに確認し得る。
【０７９４】
すべてｐＭＣＳ６９の存在下で、プラスミドｐＥＴ１４−１４ｂ−Ｃｙｓ６−ＰｈａＣ、ｐＥＴ１４Ｂ−ＰｏｒｔＡ−Ｃ−ＰｏｒＢ、ｐＥＴ１４Ｂ−ＦｅｔＡ−Ｃ−ＺｎｕＤおよびｐＨＡＳ（野生型対照）を保有する細胞中にポリヒドロキシ酪酸が存在することは、単一のまたは３部分からなる融合タンパク質として存在するとき、ＰｈａＣポリエステルシンターゼドメインがポリマーシンターゼ活性を保持していたことを示す。
【０７９５】
粒子による高レベルタンパク質表示を、それぞれ融合タンパク質配列から推定される分子量と直接整列するみかけの分子量による顕著なタンパク質バンドによって決定する。これらのタンパク質の同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いるトリプシンペプチドフィンガープリントで確認する。粒子を表示する種々の抗原は、用量依存的様式でそれぞれの抗抗原抗体に結合するが、野生型粒子が抗体に結合するのは有意に少ないことをＥＬＩＳＡの結果は示している。フローサイトメトリーの結果が、＞９８％の抗原粒子が抗抗原抗体に結合することを示しているのは好ましい。
【０７９６】
種々のＰｈａＣ抗原融合タンパク質をコードするそれぞれのハイブリッド遺伝子が組換え大腸菌中で発現することで、それらの表面で融合タンパク質を表示するポリエステル粒子の産生が可能になる。
【０７９７】
好ましくは、免疫化の後、明白な毒性はいずれの動物でも観察されず、実験の時間経過の間、マウスの体重は群間で有意差はなく、且つすべての群においてマウスの体重は増えた。ポリエステル粒子で免疫化したマウスは、免疫部位で小さいしこり（直径２．５ｍｍ）が発生するが、ほとんどの場合膿瘍または化膿はなく、典型的には、試験の間健康であり、行動は正常であり、且つ毛質は良好である。
【０７９８】
５〜５０μｇ用量範囲の抗原粒子は、マウスにおいて有意な抗体応答を生成する際に最適である。５〜５０μｇ用量の単独の野生型粒子の場合と比較すると、この用量は、高抗体力価を明らかに誘導する。他の用量を試験して用いてもよい。非免疫化した対照マウスを含む第２の実験では、アジュバントを含むビーズ製剤と含まないビーズ製剤とを比較する。非ワクチン接種したマウスと比較すると、抗原粒子を与えた両ワクチン群の場合、有意に高い抗原特異的血清抗体応答を評価した。最も高い抗体応答は、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ中の抗原粒子で免疫化したマウスにおいて観察され得る。ＩｇＧ１アイソタイプについての抗体応答は、典型的には両実験でのＩｇＧ２についての応答よりも強いものになる。
【０７９９】
５〜５０μｇ抗原粒子で免疫化したマウスの抗原に対する細胞媒介性応答も、単独の野生型粒子で、または単独のＰＢＳで免疫化したマウスの抗原と比較すると、有意に増強され、およびＰＢＳ免疫化した対照マウスと比較すると、単独の野生型粒子で免疫化したマウスの細胞媒介性応答において典型的には有意差はみられないはずである。
【０８００】
４０μｇの野生型粒子（髄膜炎菌抗原は含まない）で３回免疫化したマウスにおいて該抗原に対するＩＦＮ−γ応答は、ＰＢＳ免疫化した対照マウスの応答と典型的には有意に異なることはない。対照的に、各抗原に対する有意により大きいＩＦＮ−γ応答は、抗原粒子で３回免疫化したマウスにおいて、および抗原粒子とＥｍｕｌｓｉｇｅｎとで３回免疫化したマウスにおいて観察され得る。他のすべてのワクチン群よりも、抗原粒子およびＥｍｕｌｓｉｇｅｎで３回免疫化したマウスにおいて各抗原に対するＩＦＮ−γ応答は有意により大きいと予想される。
【０８０１】
抗原ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＦｅｔＡ、ＺｎｕＤおよびＣＰＳを表示する操作されたポリエステル粒子は、抗原特異的細胞媒介性応答を生成することができ、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体の産生を著しく増加させることができる。
【０８０２】
体液性および細胞媒介性の両免疫応答の生成に加えて、体重減少などの有害な副作用の欠如、および注射部位での膿瘍および化膿の非存在は、ポリエステル粒子は耐容性がよく、安全、且つ非毒性であることを示す。
実施例８−炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）ポリマー粒子ワクチンの免疫原性
【０８０３】
本実施例は、形質転換宿主（この場合は大腸菌）中で、炭疽菌抗体ＰＡ８３、すなわち炭疽毒素の非毒性サブユニットを表示するポリマー粒子を産生するためのプラスミド構築を、該ポリマー粒子の免疫原性の分析とともに説明する。本実施例で産生されるこの抗原を表示するポリマー粒子は、炭疽に対する予防ワクチンおよび治療ワクチンとして有効である。
材料および方法
【０８０４】
すべての動物実験は、ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｓｓｌａｎｄｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（PalmerstonNorth,New Zealand)の承認を得た。
１．プラスミドの構築物
【０８０５】
本実施例でのプラスミドおよびオリゴヌクレオチドのすべてを、表９に収載する。ＰｈａＡ酵素およびＰｈａＢ酵素は、プラスミドｐＭＣＳ６９によってコードされる。
【０８０６】
炭疽菌ＰＡ８３抗原、すなわち炭疽毒素の非毒性サブユニットＰＡの切断型変異体を表示するポリマー粒子を産生するために、抗原ＰＡ８３をコードする遺伝子をコドン最適化して、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．で合成し、ＰｈａＣポリマービーズ形成酵素とのＣ末端融合のためのｐＥＴ−１４ｂ  ＰｈａＣ−リンカー−ＧＦＰ  ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位へのサブクローニングを可能にする。ＰＡ８３コード遺伝子をＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入する。この遺伝子挿入は、置換された元のプラスミドのＧＦＰコード領域を有するフレーム内であり、プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−ＰｈａＣ−ＰＡ８３をもたらす。
【０８０７】
ＰｈａＣ−ＰＡ８３融合のための構築物を、配列番号３９として、由来アミノ酸配列を配列番号４０として示す。
【０８０８】
【表９】
2013500329.tif 000011
【０８０９】
２．ＰＡ８３を表示する粒子の産生
プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−Ｃ−ＰＡ８３およびｐＨＡＳを、プラスミドｐＭＣＳ６９を保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に導入する。実施例１に記述するように、バイオポリエステル粒子の産生に適している条件下でこれらの形質転換体を培養する。
３．ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）
【０８１０】
種々のプラスミドを保有する細菌細胞のポリエステル含有量は、in vivoでのＰｈａＣシンターゼの活性に対応する。蓄積されたポリエステルの量をガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）法によって評価して、ｐｈａＣシンターゼ活性を決定し、且つ特に、ポリエステル合成のＰｈａＣ−炭疽菌抗原融合および細胞内顆粒形成の媒介による触媒作用を決定する。酸触媒メタノリシスによるポリエステルの３−ヒドロキシメチルエステルへの転換の後に、ポリエステル含有量をＧＣ−ＭＳによって定量的に決定する。
４．ポリマー粒子の単離
【０８１１】
実施例３に記述するようにポリエステル顆粒を単離し、および粒子に付着したタンパク質の濃度を、実施例３に記述するように、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて決定する。
５．ＥＬＩＳＡ
【０８１２】
実施例３に記述するように、種々の抗原に対して産生されたマウス抗体を用いて炭疽菌ポリマー粒子の免疫反応性を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で決定する。
６．フローサイトメトリー
【０８１３】
２５マイクログラムの種々の精製した抗原表示粒子または野生型粒子を、実施例３の表４に記載した氷冷のフローサイトメトリー緩衝液で２回洗浄し、マウス抗抗原抗体とともにインキュベートする。洗浄後、粒子は、ラット抗マウスフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識した抗体（BD Pharmingen,CA,USA）で染色し、暗所の氷上で３０分間インキュベートして、再度洗浄する。ＢＤ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences,CA,USA）を用いて、各試料に対して少なくとも１０，０００イベントを収集して、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析する。
７．マウスの免疫化
【０８１４】
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Malaghan Institute,Wellington,NZ）に２週間隔で３回筋肉内に免疫化する。３つの処置群は以下の通りである：
ａ）野生型粒子（すなわち、ｐＨＡＳおよびｐＭＣＳ６９を保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；
ｂ）単独の抗原粒子（すなわち、種々の抗原ＰｈａＣ融合タンパク質およびｐＭＣＳ６９をコードするプラスミドを保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；
ｃ）２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）と混合した種々の抗原粒子で免疫化した個体。
非ワクチン接種した対照動物は、実験の各組に含まれる。
８．免疫アッセイ
【０８１５】
最後の免疫化から３週間後に、マウスに麻酔して、採血する。該血液を遠心して、血清を収集し、アッセイまで−２０℃で凍結させる。
【０８１６】
次いで、マウスを安楽死させ、それらの脾臓を摘出し、８０ゲージワイヤメッシュ篩に通すことによって単細胞懸濁液を調製する。１７ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌおよび１４０ｍＭのＮＨ４Ｃｌの溶液を用いて、脾臓赤血球（ＲＢＣ）を溶解する。洗浄後、２ｍＭグルタミン（Invitrogen）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Invitrogen）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Invitrogen）、５×１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール（Sigma）および５％（w/w）ウシ胎仔血清（Invitrogen）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地で該ＲＢＣを培養する。
９．ＩＦＮ−γの定量化
【０８１７】
インキュベーションから４日後、培養上清を取り出して、アッセイまで−２０℃で凍結させる。市販の抗体および標準物（BD Pharmingen）を用いて、ＥＬＩＳＡ（BD Biosciences）で製造業者の使用説明書に従って、上清中のＩＦＮ−γのレベルを測定する。
１０．血清抗体の定量化
【０８１８】
抗体捕捉用の粒子を表示する固定化抗原を用いてＥＬＩＳＡによって血清抗体を測定する。
１１．統計分析
【０８１９】
ＩＦＮ−γおよび抗体応答の分析をＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）で行う。
結果
【０８２０】
プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−Ｃ−ＰＡ８３およびｐＨＡＳを保有する細胞をすべてｐＭＣＳ６９の存在下で、ＧＣ−ＭＳ分析によってポリエステルポリヒドロキシ酪酸の存在を確認する。細胞内のポリエステル含有物の存在は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ染色法を用いて蛍光顕微鏡によって、さらに確認し得る。
【０８２１】
すべてｐＭＣＳ６９の存在下で、プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−Ｃ−ＰＡ８３およびｐＨＡＳ（野生型対照）を保有する細胞中にポリヒドロキシ酪酸が存在することは、単一のまたは３部分からなる融合タンパク質として存在するとき、ＰｈａＣポリエステルシンターゼドメインがポリマーシンターゼ活性を保持していたことを示す。
【０８２２】
粒子による高レベルタンパク質表示を、それぞれ融合タンパク質配列から推定される分子量と直接整列するみかけの分子量による顕著なタンパク質バンドによって決定する。これらのタンパク質の同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いるトリプシンペプチドフィンガープリントで確認する。粒子を表示する種々の抗原は、用量依存的様式でそれぞれの抗抗原抗体に結合するが、野生型粒子が抗体に結合するのは有意に少ないことをＥＬＩＳＡの結果は示している。フローサイトメトリーの結果が、＞９６％の抗原粒子が抗抗原抗体に結合することを示しているのは好ましい。
【０８２３】
ＰｈａＣ抗原融合タンパク質をコードするそれぞれのハイブリッド遺伝子が組換え大腸菌中で発現することで、それらの表面で融合タンパク質を表示するポリエステル粒子の産生が可能になる。
【０８２４】
好ましくは、免疫化の後、明白な毒性はいずれの動物でも観察されず、実験の時間経過の間、マウスの体重は群間で有意差はなく、且つすべての群においてマウスの体重は増えた（データ不図示）。ポリエステル粒子で免疫化したマウスは、免疫部位で小さいしこり（直径２．５ｍｍ）が発生するが、ほとんどの場合膿瘍または化膿はなく、典型的には、試験の間健康であり、行動は正常であり、且つ毛質は良好である。
【０８２５】
４０μｇ用量の抗原粒子は、マウスにおいて有意な抗体応答を生成する際に最適である。４０μｇ用量の単独の野生型粒子の場合と比較すると、この用量は、高抗体力価を明らかに誘導する。他の用量を試験して用いてもよい。非免疫化した対照マウスを含む第２の実験では、アジュバントを含むビーズ製剤と含まないビーズ製剤とを比較する。非ワクチン接種したマウスと比較すると、抗原粒子を与えた両ワクチン群の場合、有意に高い抗原特異的血清抗体応答を評価した。最も高い抗体応答は、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ中の抗原粒子で免疫化したマウスにおいて観察され得る。ＩｇＧ１アイソタイプについての抗体応答は、典型的には両実験でのＩｇＧ２についての応答よりも強いものになる。
【０８２６】
４０μｇ抗原粒子で免疫化したマウスの抗原に対する細胞媒介性応答も、単独の野生型粒子で、または単独のＰＢＳで免疫化したマウスの抗原と比較すると、有意に増強され、およびＰＢＳ免疫化した対照マウスと比較すると、単独の野生型粒子で免疫化したマウスの細胞媒介性応答において典型的には有意差はみられないはずである。
【０８２７】
４０μｇの野生型粒子（炭疽菌抗原は含まない）で３回免疫化したマウスにおいて該抗原に対するＩＦＮ−γ応答は、ＰＢＳ免疫化した対照マウスの応答と典型的には有意に異なることはない。対照的に、各抗原に対する有意により大きいＩＦＮ−γ応答は、抗原粒子で３回免疫化したマウスにおいて、および抗原粒子とＥｍｕｌｓｉｇｅｎとで３回免疫化したマウスにおいて観察され得る。他のすべてのワクチン群よりも、抗原粒子およびＥｍｕｌｓｉｇｅｎで３回免疫化したマウスにおいて各抗原に対するＩＦＮ−γ応答は有意により大きいと予想される。
【０８２８】
抗原ＰＡ８３を表示する操作されたポリエステル粒子は、抗原特異的細胞媒介性応答を生成することができ、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体の産生を著しく増加させることができる。
【０８２９】
体液性および細胞媒介性の両免疫応答の生成に加えて、体重減少などの有害な副作用の欠如、および注射部位での膿瘍および化膿の非存在は、ポリエステル粒子は耐容性がよく、安全、且つ非毒性であることを示す。
実施例９−in vivoでのマウスにおけるＣ型肝炎ポリマー粒子ワクチンの免疫原性
【０８３０】
本実施例は、Ｃ型肝炎抗原を含むポリマー粒子による哺乳類モデルの免疫化を説明する。
材料および方法
【０８３１】
すべての動物実験は、ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｓｓｌａｎｄｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Palmerston North,New Zealand）の承認を得た。
１．プラスミドの構築およびポリエステルポリマー粒子の単離
【０８３２】
実施例１に記述するように、宿主として大腸菌を用いて、Ｃ型肝炎コア抗原を表示するポリマー粒子の産生のために、プラスミドを構築した。
【０８３３】
細菌を破壊することによってポリエステル顆粒を単離し、次いで全細胞可溶化物を４℃、６０００ｇで１５分間遠心させて、ポリエステル粒子を沈降させた。該粒子をグリセロール勾配超遠心分離法で精製する。タンパク質の濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて、製造業者の使用説明書（Bio-Rad）に従って決定した。該粒子に付着した総タンパク質の量と比べて、Ｈｅｐ  Ｃ：ＰｈａＣの融合タンパク質の量を、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ(商標）ＸＲを用いて検出して、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（バージョン４．６．２、Bio-Rad Laboratories）を使用して分析する。Ｈｅｐ  Ｃ抗原は、大腸菌中のポリマー粒子の総タンパク質のおよそ６．７％を占め、およびＬ．ラクチス中のポリマー粒子の総タンパク質の２５％を占めた。対象のタンパク質の同定を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて確認した。
２．ＥＬＩＳＡ
【０８３４】
実施例３に記述するように、Ｈｅｐ  Ｃポリマー粒子の免疫反応性を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で決定した。洗浄後、Ｈｅｐ  Ｃ（Devatal,USA）に対するマウス抗体とともにプレートをインキュベートし、ＰＢＳＴを用いて洗浄し、次いでＰＢＳ中１％（w/v）ＢＳＡで希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ（Sigma-Aldrich）とともに室温で１時間、インキュベートした。室温でさらに１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴを用いてプレートを洗浄して、ストレプトアビジン−ＨＲＰ抱合体を加えて、さらに１時間インキュベートした。さらに洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質（Sigma-Aldrich）を加えて、該プレートを室温で３０分間インキュベートした。
【０８３５】
ＶＥＲＳＡａｘマイクロプレートリーダーで、吸光度を４９０ｎｍで記録した。
３．マウスの免疫化
【０８３６】
市販の組換えＨｅｐ  Ｃ抗原処置群を除いて、６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Malaghan Institute,Wellington,NZ）に、週に１回の間隔で３回皮下に免疫化した。
Devatal Inc.（USA）から取得した市販の組換えＨｅｐ  Ｃ抗原（大腸菌由来）は、Ｃ型肝炎ウイルスのヌクレオカプシド免疫優性領域を含んでいた。サプライヤーが指示した１０％ＰＡＧＥ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色）で測定したところ、、該抗原は、＞９５％純度であった。
【０８３７】
６つの処置群（１群あたりｎ＝６）は以下のとおりであった：
ａ）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の市販のＨｅｐ  Ｃ抗原（３０μｇ）で免疫化した個体−ワクチン接種１回のみ；
ｂ）市販のＨｅｐ  Ｃ抗原（３０μｇ）とＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバンド（MVP Laboratories）とで免疫化した個体−ワクチン接種１回のみ；
ｃ）ＰＢＳと２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）（MVP Laboratories）とで免疫化した個体；
ｄ）Ｈｅｐ  Ｃポリマー粒子（１０μｇ）と２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）とを混合して免疫化した個体；
ｅ）Ｈｅｐ  Ｃポリマー粒子（３０μｇ）と２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）とを混合して免疫化した個体；
ｆ）野生型ポリマー粒子（大腸菌宿主）と２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）とを混合して免疫化した個体。
非ワクチン接種した対照動物は、実験の各組に含まれた。
４．免疫アッセイ
【０８３８】
最後の免疫化から３週間後に、体重１グラムあたり８７μｇのケタミン（Parnell Laboratories,australia）および２．６μｇのキシラジン塩酸塩（Bayer,Germany）を用いてマウスに麻酔した。血液を採取して、遠心し、次いで血清を収集してアッセイまで−２０℃で凍結させた。
【０８３９】
次いで、マウスを安楽死させ、それらの脾臓を摘出し、８０ゲージワイヤメッシュ篩に通すことによって単細胞懸濁液を調製する。実施例４に記述するように脾臓赤血球を処理した。該細胞を３７℃、１０％ＣＯ2、単独の培地で、または５μｇ／ｍＬの組換えＨｅｐ  Ｃ抗原を含む培地でインキュベートした。
５．ＩＦＮ−γの定量化
【０８４０】
インキュベーションから４日後、培養上清を取り出して、アッセイまで−２０℃で凍結させる。市販の抗体および標準物（BD Pharmingen）を用いて、ＥＬＩＳＡ（BD Biosciences）で製造業者の使用説明書に従って、上清中のＩＦＮ−γのレベルを測定した。
６．血清抗体の定量化
【０８４１】
製造業者の推奨に従って、モノクローナル抗Ｈｅｐ  Ｃ抗体（Devatal）を用いて、ＥＬＩＳＡで血清抗体を測定した。簡単に言うと、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（Nunc）を３μｇ／ｍＬの組換えＨｅｐ  Ｃで一晩被覆させて、１％ＢＳＡでブロックし、次いでＰＢＳＴで洗浄した。血清希釈物（１：５０〜１：１５６２５０）を加えて、インキュベートした。洗浄の後、抗マウスＩｇＧ１：ＨＲＰまたはＩｇＧ２ｃ：ＨＲＰ（ICL,USA）を加えて、該プレートをインキュベートした。ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダーで、４５０ｎｍで解読する前に、プレートを洗浄し、基質としてＴＭＢを用いた。
【０８４２】
ＩｇＧ１プレートの場合、陽性対照としてモノクローナル坑Ｈｅｐ  Ｃ抗体を滴定して、インキュベートした。結果は、１：５０で希釈した血清の場合、４５０ｎｍで光学濃度として発現した。
７．統計分析
【０８４３】
ＩＦＮ−γおよび抗体応答の分析を、Ｆｉｓｈｅｒ一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）で行い、有意水準はＰ＜０．０５であった。
結果
【０８４４】
Ｈｅｐ  Ｃポリマー粒子の反応性は、図１に示すように、Ｈｅｐ  Ｃ抗体に対して用量依存性応答を示した。
【０８４５】
３０μｇ／ｍＬ用量のＨｅｐ  Ｃポリマー粒子と比較すると、１０μｇ／ｍＬ用量のＨｅｐ  Ｃポリマー粒子は、より大きなＩｇＧ１抗体応答と、より大きなＩｇＧ２抗体応答とを引き出した（それぞれ、図２と３を参照）。単独の組換えＨｅｐ  Ｃ抗原と比較すると、両用量のＨｅｐ  Ｃポリマー粒子は、有意に減少したＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体応答を引き出した（それぞれ、図２と３を参照）。
【０８４６】
図４に示すように、野生型ポリマー粒子で免疫化したマウス（Ｐ＜０．０５）、単独の組換えＨｅｐ  Ｃ抗原で免疫化したマウス（Ｐ＜０．０５）、または単独のＰＢＳで免疫化したマウス（Ｐ＜０．０５）と比較すると、３０μｇのＨｅｐ  Ｃポリマー粒子で免疫化したマウスのＨｅｐ  Ｃコア抗原に対する細胞媒介性応答は有意に増強された。実際に、ＰＢＳで免疫化した対照マウスと比較すると、単独の抗原で免疫化したマウスの細胞媒介性応答において有意差はなかった。
考察
【０８４７】
大腸菌中で産生されたＨｅｐ  Ｃコア抗原を表示する操作されたポリエステル粒子は、Ｈｅｐ  Ｃ抗原投与に対して標的細胞媒介性応答をもたらすことができた。特に、単独の抗原による免疫化（すなわち、本発明のポリマー粒子を含まない抗原）は、強い体液性応答を引き出することができるにもかかわらず、細胞媒介性応答を引き出すことにおいては無効であった。
【０８４８】
本発明のＨｅｐ  Ｃポリマー粒子は、ＩｇＧ１応答と比較して、より強いＩｇＧ２体液性応答を引き出すことができた。ＩｇＧ２抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の刺激に関与しており、これらのデータは、Ｈｅｐ  Ｃポリマー粒子が細胞媒介性応答の相補的な面を直接的および間接的の双方で効果的に刺激することができるという考えを裏付ける。
【０８４９】
これらの結果は、免疫応答の異なる面を引き出すためのこのワクチン送達系の多用途性および可能性を示し、それによって、無効な体液性応答をあまり刺激せずに、細胞媒介性免疫応答は、効果的に引き出された。
【０８５０】
体重減少などの有害な副作用の欠如、および注射部位での膿瘍および化膿の非存在は、ポリエステル粒子は耐容性がよく、安全、且つ非毒性であることを示した。
実施例１０−デング熱（Ｄｅｎｇｕｅ）ウイルスポリマー粒子ワクチンの免疫原性
【０８５１】
本実施例は、形質転換宿主（この場合は大腸菌）中で、デング熱ウイルスの外被タンパク質（Ｅ）および膜タンパク質（Ｍ）（双方とも、ウイルス粒子表面で発現する免疫原性タンパク質）を表示するポリマー粒子を産生するためのプラスミド構築を、該ポリマー粒子の免疫原性の分析とともに説明する。本実施例で産生されるこの抗原を表示するポリマー粒子は、デング熱ウイルスに対する予防ワクチンおよび治療ワクチンとして有効である。
材料および方法
【０８５２】
すべての動物実験は、ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｓｓｌａｎｄｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Palmerston North,New Zealand）の承認を得た。
１．過剰発現プラスミドの構築
【０８５３】
本実施例のプラスミドおよびオリゴヌクレオチドのすべてを表１０に収載する。β−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−補酵素Ａ還元酵素は、プラスミドｐＭＣＳ６９によってコードされ、アセチルＣｏａの３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａへの転換を触媒することによってポリマーシンターゼのための基質をもたらす。
【０８５４】
ポリマー粒子を表示するデング熱ウイルス血清型１−４ＥおよびＭを産生するために、抗原ＥおよびＭをコードする遺伝子をコドン最適化して、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．で合成し、ＰｈａＣポリマービーズ形成酵素とのＮ末端融合のためのｐＥＴ−１４ｂ  Ｍ−ＰｈａＣ−リンカー−ＭａｌＥ  ＸｂａＩ−ＳｐｅＩ部位への、およびＣ末端融合のためのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位へのサブクローニングを可能にする。ｏｍｐ１６コード遺伝子をＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入する。この遺伝子挿入は、置換された元のプラスミドのＧＦＰコード領域を有するフレーム内であり、プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−Ｃ−ｏｍｐ１６をもたらす。
【０８５５】
Ｅ１−ＰｈａＣ−Ｍ１融合のための構築物を、配列番号４１として、由来アミノ酸配列を配列番号４２として示す。Ｅ２−ＰｈａＣ−Ｍ２融合のための構築物を、配列番号４３として、由来アミノ酸配列を配列番号４４として示す。Ｅ３−ＰｈａＣ−Ｍ３融合のためのコード配列を、配列番号４５として、由来アミノ酸配列を配列配列を配列番号４６として示す。Ｅ４−ＰｈａＣ−Ｍ１融合のための構築物を、配列番号４７として、由来アミノ酸配列を配列番号４８として示す。
【０８５６】
【表１０】
2013500329.tif 000012
【０８５７】
２．デング熱ウイルス血清型１−４  ＥおよびＭを表示する粒子の産生
プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−Ｅ１−Ｃ−Ｍ１、ｐＥＴ１４Ｂ−Ｅ２−Ｃ−Ｍ２、ｐＥＴ１４Ｂ−Ｅ３−Ｃ−Ｍ３またはｐＥＴ１４Ｂ−Ｅ４−Ｃ−Ｍ４およびｐＨＡＳを、ｐＭＣＳ６９を保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に導入する。実施例１に記述するように、バイオポリエステル粒子の産生に適している条件下でこれらの形質転換体を培養する。デング熱ウイルスＥ−ＰｈａＣ−Ｍ粒子または野生型粒子の産生をそれぞれ、後述のように評価する。
３．ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）
【０８５８】
種々のプラスミドを保有する細菌細胞のポリエステル含有量は、in vivoでのＰｈａＣシンターゼの活性に対応する。蓄積されたポリエステルの量をガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）法によって評価して、ｐｈａＣシンターゼ活性を決定し、且つＰｈａＣ−デング熱ウイルス血清型１−４ＥおよびＭ抗原融合がポリエステル合成を触媒して、細胞内顆粒形成を媒介することを確認する。酸触媒メタノリシスによるポリエステルの３−ヒドロキシメチルエステルへの転換の後に、ポリエステル含有量をＧＣ−ＭＳによって定量的に決定する。
４．ポリエステル粒子の単離
【０８５９】
細菌を破壊することによってポリエステル顆粒を単離し、次いで全細胞可溶化物を４℃、４０００ｇで１５分間遠心させて、ポリエステル粒子を沈降させる。該粒子をグリセロール勾配超遠心分離法で精製する。
【０８６０】
実施例３に記述するように、粒子に付着したタンパク質の濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて決定する。濃度決定の後に、該タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Invitrogen）で染色する。該粒子に付着した総タンパク質の量と比べて、Ｅ−ＰｈａＣ−Ｍ融合タンパク質の量を、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ(商標）ＸＲを用いて検出して、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（バージョン４．６．２、Bio-Rad Laboratories）を使用して分析する。対象のタンパク質をゲルから切除して、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いるトリプシンペプチドフィンガープリントにかける。これによって該融合タンパク質ドメインの同定が可能になる。
５．ＥＬＩＳＡ
【０８６１】
実施例３に記述するように、デング熱ウイルスポリマー粒子の免疫反応性を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で決定した。簡単に言うと、炭酸水素塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）（Sigma-Aldrich）で希釈した精製Ｅ−ＰｈａＣ−Ｍ粒子または野生型粒子で、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（Nunc）を４℃で一晩被覆する。１ｍｇ／ｍＬから０．０１５ｍｇ／ｍＬに亘るタンパク質濃度を該緩衝液の段階希釈で用いる。プレートを洗浄して、２５℃で２時間ブロックする（表４を参照）。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄して、種々の抗原に対して産生されたマウス抗体とともにインキュベートし、洗浄し、ＰＢＳ中１％（w/v）ＢＳＡで希釈した抗マウスＩｇＧ：西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体（Sigma-Aldrich）とともに室温で１時間、さらにインキュベートする。さらに洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質（Sigma-Aldrich）を加えて、該プレートを室温で３０分間インキュベートする。０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させて、吸光度を４９５ｎｍで記録する。
６．フローサイトメトリー
洗浄後、粒子は、ラット抗マウスフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識した抗体（BD Pharmingen,CA,USA）で染色し、暗所の氷上で３０分間インキュベートして、再度洗浄する。ＢＤ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences,CA,USA）を用いて、各試料に対して少なくとも１５，０００イベントを収集して、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析する。
７．マウスの免疫化
【０８６２】
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Malaghan Institute,Wellington,NZ）に２週間隔で３回筋肉内に免疫化する。３つの処置群は以下の通りである：
ａ）野生型粒子（すなわち、ｐＨＡＳおよびｐＭＣＳ６９を保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；
ｂ）単独の抗原粒子（すなわち、種々の抗原ＰｈａＣ融合タンパク質およびｐＭＣＳ６９をコードするプラスミドを保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；および
ｃ）２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）と混合した種々の抗原粒子とで免疫化した個体。
非ワクチン接種した対照動物は、実験の各組に含まれる。
８．免疫アッセイ
【０８６３】
最後の免疫化から３週間後に、マウスに麻酔して、採血する。該血液を遠心して、血清を収集し、アッセイまで−２０℃で凍結させる。次いで、マウスを安楽死させ、それらの脾臓を摘出し、８０ゲージワイヤメッシュ篩に通すことによって単細胞懸濁液を調製する。実施例４に記述するように、脾臓赤血球（ＲＢＣ）を処理する。
９．プラーク減少中和アッセイ
【０８６４】
プラーク減少中和試験によって、免疫化したマウスからの血清をデング熱ウイルス中和抗体の存在を検査する。連続希釈した血清を熱失活させて、１００プラーク形成単位のホモ血清型およびヘテロ血清型の両ウイルスと混合し、次いで３７℃で１時間インキュベートする。該血清ウイルス混合物を単層のＶｅｒｏ細胞とともに１時間インキュベートし、次いで培地を含むアガロースでその表面を覆う。アッセイの５日目にウイルスプラークを染色する。プラーク数が８０％減少する最大希釈は、Ｐｌａｑｕｅ減少中和８０（ＰＲＮＴ80）である。
１０．サイトカインおよびケモカインの定量化
【０８６５】
インキュベーションから４日後、培養上清を取り出して、アッセイまで−２０℃で凍結させる。市販の抗体および標準物（EBiosciene）を用いて、ＥＬＩＳＡおよび／またはＦＡＣＳ（EBioscience）で製造業者の使用説明書に従って、上清中のサイトカインおよびケモカインのレベルを測定する。
１１．マウスウイルスのプロテクションアッセイ
【０８６６】
マウスチャレンジモデルを用いて、アジュバントを含んで、および含まないで、デング熱ウイルスＥおよびＭの抗原を表示する粒子の製剤の有効性を確認する。上述の材料および方法の第１節に記述するように、１３日齢の離乳マウスに、５μｇと１０μｇの投薬を用いて免疫化する。免疫化の後に、１００  ＬＤ50のマウス適応型デング熱ウイルスを用いてマウスに頭蓋内（IC）に投与する。投与から２１日間、罹患率および死亡率をモニターする。
１２．血清抗体の定量化
【０８６７】
抗体捕捉用の粒子を表示する固定化抗原を用いてＥＬＩＳＡによって血清抗体を測定する。
１３．統計分析
【０８６８】
サイトカイン、ケモカインおよび抗体応答の分析をＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）で行う。
結果
【０８６９】
プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−Ｅ１−Ｃ−Ｍ１、ｐＥＴ１４Ｂ−Ｅ２−Ｃ−Ｍ２、ｐＥＴ１４Ｂ−Ｅ３−Ｃ−Ｍ３またはｐＥＴ１４Ｂ−Ｅ４−Ｃ−Ｍ４およびｐＨＡＳを保有する細胞を、すべてｐＭＣＳ６９の存在下でのＧＣ−ＭＳ分析によって、ポリエステルポリヒドロキシ酪酸の存在を確認する。細胞内のポリエステル含有物の存在は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ染色法を用いて蛍光顕微鏡によって、さらに確認し得る。すべてｐＭＣＳ６９の存在下で、プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−Ｅ１−Ｃ−Ｍ１、ｐＥＴ１４Ｂ−Ｅ２−Ｃ−Ｍ２、ｐＥＴ１４Ｂ−Ｅ３−Ｃ−Ｍ３またはｐＥＴ１４Ｂ−Ｅ４−Ｃ−Ｍ４およびｐＨＡＳ（野生型対照）を保有する細胞中にポリヒドロキシ酪酸が存在することは、単一のまたは３部分からなる融合タンパク質として存在するとき、ＰｈａＣポリエステルシンターゼドメインがポリマーシンターゼ活性を保持していたことを示す。
【０８７０】
粒子による高レベルタンパク質表示を、それぞれ融合タンパク質配列から推定される分子量と直接整列するみかけの分子量による顕著なタンパク質バンドによって決定する。これらのタンパク質の同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いるトリプシンペプチドフィンガープリントで確認する。粒子を表示する種々の抗原は、用量依存的様式でそれぞれの抗抗原抗体に結合するが、野生型粒子が抗体に結合するのは有意に少ないことをＥＬＩＳＡの結果は示している。フローサイトメトリーの結果が、＞９７％の抗原粒子が抗抗原抗体に結合することを示しているのは好ましい。ＰｈａＣ抗原融合タンパク質をコードするそれぞれのハイブリッド遺伝子が組換え大腸菌中で発現することで、それらの表面で融合タンパク質を表示するポリエステル粒子の産生が可能になる。
【０８７１】
好ましくは、免疫化の後、明白な毒性はいずれの動物でも観察されず、実験の時間経過の間、マウスの体重は群間で有意差はなく、且つすべての群においてマウスの体重は増えた（データ不図示）。ポリエステル粒子で免疫化したマウスは、典型的には、試験の間健康であり、行動は正常であり、且つ毛質は良好である。
【０８７２】
約１０〜約５０μｇの用量範囲の抗原粒子は、マウスにおいて有意な抗体応答を生成している。１０〜５０μｇ用量の単独の野生型粒子の場合と比較すると、この用量は、高抗体力価を明らかに誘導する。他の用量、例えば、５０〜１００μｇの各抗原を表示するビーズ（Ｅ１−Ｃ−Ｍ１、Ｅ２−Ｃ−Ｍ２、Ｅ３−Ｃ−Ｍ３およびＥ４−Ｃ−Ｍ４）を試験して用いてもよい。非免疫化した対照マウスを含み、且つアジュバントを含むビーズ製剤と含まないビーズ製剤とを比較する第２の実験では、非ワクチン接種したマウスと比較すると、抗原粒子を与えた両ワクチン群の場合、抗原特異的血清抗体応答が有意に高い。最も高い抗体応答は、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ中の抗原粒子で免疫化したマウスにおいて観察される。ＩｇＧ１アイソタイプについての抗体応答は、両実験でのＩｇＧ２についての応答よりも強い。
【０８７３】
１０〜５０μｇ抗原粒子で免疫化したマウスの抗原に対する細胞媒介性応答も、単独の野生型粒子で、または単独のＰＢＳで免疫化したマウスの抗原と比較すると、有意に増強され、およびＰＢＳ免疫化した対照マウスと比較すると、単独の野生型粒子で免疫化したマウスの細胞媒介性応答において典型的には有意差はみられないはずである。
【０８７４】
野生型粒子で免疫化したマウスに由来する血清は、プラーク減少中和アッセイにおいてＰＢＳで免疫化した対照マウスの血清と典型的には有意に異なることはない。プラーク減少中和アッセイにおいて、デング熱ウイルス血清型１−４  Ｅ−Ｍ粒子の１：１：１：１での混合物を含む製剤で免疫化したマウスに由来する血清の中和価は、単独の野生型粒子で免疫化したマウルの血清と比較して、有意に高い。プラーク減少中和アッセイにおいて、デング熱ウイルス血清型１−４  Ｅ−Ｍ粒子の１：１：１：１での混合物を含む製剤で免疫化したマウスに由来する血清の中和価は、デング熱ウイルスのヘテロ血清型に対してビーズを提示するデング熱ウイルス血清型ＥおよびＭ１つだけを含む製剤よりも、有意に高い。
【０８７５】
１０〜５０μｇの野生型粒子で２回免疫化したマウスにおいて該抗体に対するケモカインおよびサイトカインの応答は、ＰＢＳで免疫化した対照マウスのそれと典型的には有意差がない。対照的に、各抗原に対する有意により大きいケモカインおよびサイトカインの応答は、抗原粒子で２回免疫化したマウスにおいて、および抗原粒子とＥｍｕｌｓｉｇｅｎとで２回免疫化したマウスにおいて観察される。他のすべてのワクチン群よりも、抗原粒子およびＥｍｕｌｓｉｇｅｎで２回免疫化したマウスにおいて各抗原に対するサイトカインおよびケモカインの応答は有意により大きいと予想される。抗原デング熱ウイルス血清型１−４  ＥおよびＭのタンパク質を表示する操作されたポリエステル粒子は、抗原特異的細胞媒介性応答を生成することができ、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体の産生を著しく増加させることができる。
【０８７６】
ＰＢＳまたは野生型粒子のいずれかで免疫化したマウスは、これらの２群間で有意差なく、ウイルス投与後に死亡すると思われる。アジュバントを含む、および含まない、粒子を提示するデング熱ウイルス血清型１−４  ＥおよびＭで免疫化したマウスは、アジュバントを含む製剤から良好な保護を得て、保護されると思われる。
【０８７７】
体液性および細胞媒介性の両免疫応答の生成に加えて、体重減少などの有害な副作用の欠如、および注射部位での膿瘍および化膿の非存在は、ポリエステル粒子は耐容性がよく、安全、且つ非毒性であることを示す。
実施例１１−エボラウイルスポリマー粒子ワクチンの免疫原性
【０８７８】
本実施例は、大腸菌中で、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）のザイール型エボラウイルスおよびスーダン型エボラウイルスのビリオンスパイク糖タンパク質前駆体抗原（それぞれ、ＺＥＢＯＶ−ＧＰおよびＳＥＢＯＶ−ＧＰ）を別々にまたは同時に表示するポリマー粒子を産生するためのプラスミド構築を、該ポリマー粒子の免疫原性の分析とともに説明する。両抗原は、ワクチン開発にとって有用である。
材料および方法
【０８７９】
すべての動物実験は、ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｓｓｌａｎｄｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Palmerston North,New Zealand）の承認を得た。
１．融合タンパク質過剰産生を媒介するプラスミドの構築およびポリマービーズの形成
【０８８０】
本実施例で用いるプラスミドおよびオリゴヌクレオチドのすべてを表１１に収載する。
ポリヒドロキシ酪酸生合成酵素、β−ケトチオラーゼおよびＲ−特異的アセトアセチル−補酵素還元酵素は、プラスミドｐＭＣＳ６９によってコードされる。２つのエボラビリオンスパイク糖タンパク質前躯体抗原を同時に表示するポリマー粒子を産生するために、エボラウイルスザイール型およびエボラウイルススーダン型由来のビリオンスパイク糖タンパク質前躯体抗原をコードする遺伝子をコドン最適化して、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．で合成し、ＰｈａＣポリマービーズ形成酵素とのＮ末端融合のためのｐＥＴ−１４ｂ  Ｍ−ＰｈａＣ−リンカー−ＭａｌＥ  Ｘｂａｌ−ＳｐｅＩ部位への、およびＣ末端融合のためのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位へのサブクローニングを可能にする。ＺＥＢＯＶ−ＧＰコード遺伝子をＸｂａＩ−ＳｐｅＩ部位に挿入し、および同じプラスミド上のＳＥＢＯＶ−ＧＰコード遺伝子をＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入する。両遺伝子挿入は、フレーム内であり、且つ元のｐラスミドのＭおよびＭａｌＥコード領域の置換を必要とする。これは、プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−ＺＥＢＯＶＧＰ−Ｃ−ＳＥＢＯＶＧＰをもたらす。あるいは、ＳＥＢＯＶ−ＧＰコード遺伝子をＸｂａｌ−ＳｐｅＩ部位に挿入することができ、一方ＺＥＢＯＶ−ＧＰコード遺伝子を同じプラスミド上のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入することができ、プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−ＳＥＢＯＶＧＰ−Ｃ−ＺＥＢＯＶＧＰを産生する。
【０８８１】
ＺＥＢＯＶＧＰ−Ｃ−ＳＥＢＯＶＧＰ融合のための構築物を配列番号４９として、由来アミノ酸配列を配列番号５０として示す。ＳＥＢＯＶＧＰ−Ｃ−ＺＥＢＯＶＧＰ融合のための構築物を配列番号５１として、由来アミノ酸配列を配列番号５２として示す。
【０８８２】
【表１１】
2013500329.tif 000013
【０８８３】
２．ＺＥＢＯＶＧＰ−ＳＥＢＯＶＧＰを表示する粒子の産生
プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−ＺＥＢＯＶＧＰ−Ｃ−ＳＥＢＯＶＧＰまたはｐＥＴ１４Ｂ−ＺＥＢＯＶＧＰ−Ｃ−ＳＥＢＯＶＧＰのいすれかおよびｐＨＡＳを、プラスミドｐＭＣＳ６９を保有する大腸菌ＫＲＸ細胞に導入する。実施例１に記述するように、バイオポリエステル粒子の産生に適している条件下でこれらの形質転換体を培養する。ＺＥＢＯＶＧＰ−ＳＥＢＯＶＧＰ粒子または野生型粒子をそれぞれ産生する能力を後述するように評価する。
３．ポリエステル粒子の単離
【０８８４】
実施例３に記述するように、ポリエステル顆粒を単離する。実施例３に記述するように、粒子に付着したタンパク質の濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて決定する。濃度決定の後に、該タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Invitrogen）で染色する。該粒子に付着した総タンパク質の量と比べて、ＺＥＢＯＶＧＰ−ＰｈａＣ−ＳＥＢＯＶＧＰまたはＳＥＢＯＶＧＰ−ＰｈａＣ−ＺＥＢＯＶＧＰ融合タンパク質の量を、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ(商標）ＸＲを用いて検出して、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（バージョン４．６．２、Bio-Rad Laboratories）を使用して分析する。
【０８８５】
対象のタンパク質をマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて同定し、これによって該融合タンパク質ドメインの同定が可能になる。
４．ＥＬＩＳＡ
【０８８６】
実施例３に記述するように、エボラウイルスポリマー粒子の免疫反応性を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で決定した。簡単に言うと、炭酸水素塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）（Sigma-Aldrich）で希釈した精製ＳＥＢＯＶＧＰ−ＰｈａＣ−ＳＥＢＯＶＧＰ粒子、ＳＥＢＯＶＧＰ−ＰｈａＣ−ＺＥＢＯＶＧＰ粒子または野生型粒子で、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（Nunc）を４℃で一晩被覆する。１ｍｇ／ｍＬから０．０１５ｍｇ／ｍＬに亘るタンパク質濃度を該緩衝液の段階希釈で用いる。プレートを洗浄して、２５℃で２時間ブロックする（表４を参照）。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄して、種々の抗原に対して産生されたマウス抗体とともにインキュベートし、洗浄し、ＰＢＳ中１％（w/v）ＢＳＡで希釈した抗マウスＩｇＧ：西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体（Sigma-Aldrich）とともに室温で１時間、さらにインキュベートする。さらに洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質（Sigma-Aldrich）を加えて、該プレートを室温で３０分間インキュベートする。０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させて、吸光度を４９５ｎｍで記録する。
５．マウスの免疫化
【０８８７】
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Malaghan Institute,Wellington,NZ）に２週間隔で３回筋肉内に免疫化する。３つの処置群は以下の通りである：
ａ）野生型粒子（すなわち、ｐＨＡＳおよびｐＭＣＳ６９を保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；
ｂ）単独の抗原粒子（すなわち、種々の抗原ＰｈａＣ融合タンパク質およびｐＭＣＳ６９をコードするプラスミドを保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；および
ｃ）２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）と混合した種々の抗原粒子とで免疫化した個体。
非ワクチン接種した対照動物は、実験の各組に含まれる。
６．免疫アッセイ
【０８８８】
最後の免疫化から３週間後に、マウスに麻酔して、採血する。該血液を遠心して、血清を収集し、アッセイまで−２０℃で凍結させる。次いで、マウスを安楽死させ、それらの脾臓を摘出し、８０ゲージワイヤメッシュ篩に通すことによって単細胞懸濁液を調製する。１７ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌおよび１４０ｍＭのＮＨ４Ｃｌの溶液を用いて、脾臓赤血球（ＲＢＣ）を溶解する。洗浄後、２ｍＭグルタミン（Invitrogen）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Invitrogen）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Invitrogen）、５×１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール（Sigma）および５％（w/w）ウシ胎仔血清（Invitrogen）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地で該ＲＢＣを培養する。
７．プラーク減少中和アッセイ
【０８８９】
プラーク減少中和試験によって、免疫化したマウスからの血清をエボラウイルス中和抗体の存在を検査する。連続希釈した血清を熱失活させて、１００プラーク形成単位のホモ血清型およびヘテロ血清型の両ウイルスと混合し、次いで３７℃で１時間インキュベートする。該血清ウイルス混合物を単層のＶｅｒｏ細胞とともに１時間インキュベートし、次いで培地を含むアガロースでその表面を覆う。アッセイの１０〜１２日目にウイルスプラークを染色する。プラーク数が８０％減少する最大希釈は、Ｐｌａｑｕｅ減少中和８０（ＰＲＮＴ80）である。
８．サイトカインおよびケモカインの定量化
【０８９０】
インキュベーションから４日後、培養上清を取り出して、アッセイまで−２０℃で凍結させる。市販の抗体および標準物（EBiosciene）を用いて、ＥＬＩＳＡおよび／またはＦＡＣＳ（EBioscience）で製造業者の使用説明書に従って、上清中のサイトカインおよびケモカインのレベルを測定する。
９．マウスウイルスのプロテクションアッセイ
【０８９１】
マウスチャレンジモデルを用いて、ＺＥＢＯＶＧＰおよびＳＥＢＯＶＧＰの抗原を提示する粒子のアジュバントを含む製剤、および含まない製剤の有効性を確認する。上述の材料および方法の第１節に記述するように、Ｂ１０．ＢＲマウス（MHE H-2K）、The Jackson Laboratory,ME）5に、１、５および１０μｇの投薬を用いて免疫化する。免疫化の後に、１０００×ＬＤ50のマウス適応型ＺＥＢＯＶを用いてマウスに腹腔内（IP）に投与する。投与から１２〜１６日間、罹患率および死亡率をモニターする。
【０８９２】
粒子を提示するＺＥＢＯＶＧＰおよびＳＥＢＯＶＧＰ抗原のアジュバントを含む製剤、および含まない製剤の有効性を、１０００×ＬＤ50のＩＰ注射から３０分後に、ワクチン製剤の投与によって確認する。投与から１２〜１６日間、罹患率および死亡率をモニターする。
１０．血清抗体の定量化
【０８９３】
抗体捕捉用の粒子を表示する固定化抗原を用いてＥＬＩＳＡによって血清抗体を測定する。
１１．統計分析
【０８９４】
サイトカイン、ケモカインおよび抗体応答の分析をＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）で行う。
結果
【０８９５】
プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−ＺＥＢＯＶＧＰ−Ｃ−ＳＥＢＯＶＧＰまたはｐＥＴ１４Ｂ−ＳＥＢＯＶＧＰ−Ｃ−ＺＥＢＯＶＧＰおよびｐＨＡＳを保有する細胞を、すべてｐＭＣＳ６９の存在下でのＧＣ−ＭＳ分析によって、ポリエステルポリヒドロキシ酪酸の存在を確認する。細胞内のポリエステル含有物の存在は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ染色法を用いて蛍光顕微鏡によって、さらに確認する。すべてｐＭＣＳ６９の存在下で、プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−ＺＥＢＯＶＧＰ−Ｃ−ＳＥＢＯＶＧＰまたはｐＥＴ１４Ｂ−ＳＥＢＯＶＧＰ−Ｃ−ＺＥＢＯＶＧＰおよびｐＨＡＳ（野生型対照）を保有する細胞中にポリヒドロキシ酪酸が存在することは、単一のまたは３部分からなる融合タンパク質として存在するとき、ＰｈａＣポリエステルシンターゼドメインがポリマーシンターゼ活性を保持していたことを示す。
【０８９６】
それぞれ融合タンパク質配列から推定される分子量と直接整列するみかけの分子量による顕著なタンパク質バンドによって示されるように、該粒子は高レベルのタンパク質を表示する。これらのタンパク質の同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いるトリプシンペプチドフィンガープリントで確認する。粒子を表示する種々の抗原は、用量依存的様式でそれぞれの抗抗原抗体に結合するが、野生型粒子が抗体に結合するのは有意に少ないことをＥＬＩＳＡの結果は示している。フローサイトメトリーの結果は、＞９８％の抗原粒子が抗抗原抗体に結合することを示している。種々の抗原ＰｈａＣ融合タンパク質をコードするそれぞれのハイブリッド遺伝子が組換え大腸菌中で発現することで、それらの表面で融合タンパク質を表示するポリエステル粒子の産生がもたらされることを結果は、示すことになる。
【０８９７】
好ましくは、免疫化の後、明白な毒性はいずれの動物でも観察されない。実験の時間経過の間、マウスの体重は群間で有意差はなく、且つすべての群においてマウスの体重は増えた。ポリエステル粒子で免疫化したマウスは、典型的には、免疫部位で小さいしこり（直径２．５ｍｍ）が発生するが、膿瘍または化膿は観察されない。すべてのマウスは典型的には、試験の間健康であり、行動は正常であり、且つ毛質は良好である。
【０８９８】
５〜１００μｇの用量範囲の抗原粒子は、マウスにおいて有意な抗体応答を生成している。５〜１００μｇ用量の単独の野生型粒子の場合と比較すると、この用量は、高抗体力価を明らかに誘導する。非免疫化した対照マウスを含み、且つアジュバントを含むビーズ製剤と含まないビーズ製剤を比較する第２の実験では、非ワクチン接種したマウスと比較すると、抗原粒子を与えた両ワクチン群の場合、抗原特異的血清抗体応答が有意に高い。最も高い抗体応答は、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ中の抗原粒子で免疫化したマウスにおいて典型的には観察される。ＩｇＧ１アイソタイプについての抗体応答は、ＩｇＧ２についての応答よりも強い。
【０８９９】
５〜１００μｇ抗原粒子で免疫化したマウスの抗原に対する細胞媒介性応答も、単独の野生型粒子で、または単独のＰＢＳで免疫化したマウスの抗原と比較すると、有意に増強される。ＰＢＳ免疫化した対照マウスと比較すると、単独の野生型粒子で免疫化したマウスの細胞媒介性応答において典型的には有意差はみられない。１０〜５０μｇの野生型粒子で２回免疫化したマウスにおいて該抗原に対するケモカインおよびサイトカインの応答は、ＰＢＳで免疫化した対照マウスのそれと典型的には有意異はない。対照的に、各抗原に対する有意により大きいケモカインおよびサイトカインの応答は、抗原粒子で２回免疫化したマウスにおいて、および抗原粒子とＥｍｕｌｓｉｇｅｎとで２回免疫化したマウスにおいて観察される。他のすべてのワクチン群よりも、抗原粒子およびＥｍｕｌｓｉｇｅｎで２回免疫化したマウスにおいて各抗原に対するサイトカインおよびケモカインの応答は有意により大きいと予想される。抗原ＺＥＢＯＶＧＰおよびＳＥＢＯＶＧＰのタンパク質を表示する操作されたポリエステル粒子は、抗原特異的細胞媒介性応答を生成することができ、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体の産生を著しく増加させることができる。
【０９００】
野生型粒子で免疫化したマウスに由来する血清は、プラーク減少中和アッセイにおいてＰＢＳで免疫化した対照マウスの血清と典型的には有意異はない。プラーク減少中和アッセイにおいて、粒子を提示するＳＥＢＯＶＧＰおよびＺＥＢＯＶＧＰの製剤で免疫化したマウスに由来する血清の中和価は、単独の野生型粒子で免疫化したマウスの血清と比較して、有意に高い。プラーク減少中和アッセイにおいて、ＺＥＢＯＶＧＰおよびＳＥＢＯＶＧＰの粒子を含む製剤で免疫化したマウスに由来する血清の中和価は、同種および異種ウイルスに対して類似している。
【０９０１】
ＰＢＳまたは野生型粒子のいずれかで免疫化したマウスは、免疫時期および順番に関係なくこれらの２群間で有意差なく、ウイルス投与後に死亡すると思われる。ウイルス接種の前に、アジュバントを含んで、および含まないで、粒子を提示するＺＥＢＯＶＧＰおよびＳＥＢＯＶＧＰで免疫化したマウスは、アジュバントを含む製剤から良好な保護を得て、保護されると思われる。さらに、アジュバントを含んで、および含まないで、粒子を提示するＺＥＢＯＶＧＰおよびＳＥＢＯＶＧＰで免疫化したマウスは、保護されると思われる。
【０９０２】
ＺＥＢＯＶ−ＧＰおよびＳＥＢＯＶ−ＧＰの抗原を同時に表示する操作されたポリエステル粒子は、抗原特異的細胞媒介性応答を生成することができ、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体の産生を著しく増加させることができる。体重減少などの有害な副作用の欠如、および注射部位での膿瘍および化膿の非存在は、ポリエステル粒子が耐容性がよく、安全、且つ非毒性であることを示す。
実施例１２−西ナイルウイルスポリマー粒子ワクチンの免疫原性
【０９０３】
本実施例は、形質転換宿主（この場合は大腸菌）中で、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）に由来するフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）外被抗原（Ｅ）、すなわちＷＮＶビリオン（ＷＮＶＥ）の表面に発現される非毒性のタンパク質を表示するポリマー粒子を産生するためのプラスミド構築を、該ポリマー粒子の免疫原性の分析とともに説明する。この抗原は、ワクチン開発の主要な候補と考えられる。現在、いくつかのワクチンの製剤が試験されているが、承認されたＷＮＶワクチンはない。本実施例で産生されるこの抗原を表示するポリマー粒子は、ＷＮＶに対する予防ワクチンおよび治療ワクチンとして有効である。
材料および方法
【０９０４】
すべての動物実験は、ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｓｓｌａｎｄｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Palmerston North,New Zealand）の承認を得た。
１．プラスミドの構築
【０９０５】
本実施例で用いるプラスミドおよびオリゴヌクレオチドのすべてを表１２に収載さる。３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａの合成を媒介する酵素は、プラスミドｐＭＣＳ６９によってコードされる。
【０９０６】
ＷＮＶＥ抗原を表示するポリマー粒子を産生するために、外被（Ｅ）をコードする遺伝子をコドン最適化して、調和させ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．で合成し、ＰｈａＣポリマービーズ形成酵素とのＣ末端融合のためのｐＥＴ−１４ｂ  ＰｈａＣ−リンカー−ＧＦＰ  ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位へのサブクローニングを可能にする。該Ｅコード遺伝子をＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入する。この遺伝子挿入は、置換された元のプラスミドのＧＦＰコード領域を有するフレーム内であり、プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−Ｃ−ＷＮＶＥをもたらす。ＰｈａＣ−ＷＮＶＥ融合のための構築物を、配列番号５３として、由来アミノ酸配列を配列番号５４として示す。
【０９０７】
【表１２】
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【０９０８】
２．粒子を表示するＷＮＶＥの産生
プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−Ｃ−ＷＮＶＥおよびｐＨＡＳを、ｐＭＣＳ６９を保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に導入する。実施例１に記述するように、バイオポリエステル粒子の産生に適している条件下でこれらの形質転換体を培養する。
３．ガスクロマトグラフィー質量３.分析（ＧＣ−ＭＳ）
【０９０９】
種々のプラスミドを保有する細菌細胞のポリエステル含有量は、in vivoでのＰｈａＣシンターゼの活性に対応する。蓄積されたポリエステルの量をガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）法によって評価して、ｐｈａＣシンターゼ活性を決定し、且つＰｈａＣ−ＷＮＶＥ抗原融合がポリエステル合成を依然として触媒して、細胞内顆粒形成を媒介するかどうかを確認する。酸触媒メタノリシスによるポリエステルの３−ヒドロキシメチルエステルへの転換の後に、ポリエステル含有量をＧＣ−ＭＳによって定量的に決定する。
４．ポリエステル粒子の単離
【０９１０】
実施例３に記述するように、ポリエステル顆粒を単離する。
５．タンパク質濃度の決定
【０９１１】
実施例３に記述するように、粒子に付着したタンパク質の濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて決定する。
６．ＥＬＩＳＡ
【０９１２】
実施例３に記述するように、西ナイルウイルスポリマー粒子の免疫反応性を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で決定した。炭酸水素塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）（Sigma-Aldrich）で希釈した精製ＰｈａＣ−ＷＮＶＥ粒子または野生型粒子で、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（Nunc）を４℃で一晩被覆する。１ｍｇ／ｍＬから０．０１５ｍｇ／ｍＬに亘るタンパク質濃度を該緩衝液の段階希釈で用いる。プレートを洗浄して、２５℃で２時間ブロックする。
【０９１３】
次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄して、種々の抗原に対して産生されたマウス抗体とともにインキュベートし、洗浄し、ＰＢＳ中１％（w/v）ＢＳＡで希釈した抗マウスＩｇＧ：西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体（Sigma-Aldrich）とともに室温で１時間、さらにインキュベートする。さらに洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質（Sigma-Aldrich）を加えて、該プレートを室温で３０分間インキュベートする。
【０９１４】
０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させて、吸光度を４９５ｎｍで記録する。
７．マウスの免疫化
【０９１５】
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Malaghan Institute,Wellington,NZ）に２週間隔で３回筋肉内に免疫化する。３つの処置群は以下の通りである：
ａ）野生型粒子（すなわち、ｐＨＡＳおよびｐＭＣＳ６９を保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；
ｂ）単独の抗原粒子（すなわち、種々の抗原ＰｈａＣ融合タンパク質およびｐＭＣＳ６９をコードするプラスミドを保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；
ｃ）２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）と混合した種々の抗原粒子で免疫化した個体。
非ワクチン接種した対照動物は、実験の各組に含まれる。
８．免疫アッセイ
【０９１６】
最後の免疫化から３週間後に、マウスに麻酔して、採血する。該血液を遠心して、血清を収集し、アッセイまで−２０℃で凍結させる。
【０９１７】
次いで、マウスを安楽死させ、それらの脾臓を摘出し、８０ゲージワイヤメッシュ篩に通すことによって単細胞懸濁液を調製する。実施例４に記述するように、脾臓赤血球（ＲＢＣ）を処理する。
９．プラーク減少中和アッセイ
【０９１８】
免疫化したマウスからの血清を西ナイルウイルス中和抗体の存在を、プラーク減少中和試験によって検査する。連続希釈した血清を熱失活させて、１００プラーク形成単位（ＰＦＵ）のホモ血清型およびヘテロ血清型の両ウイルスと混合し、次いで３７℃で１時間インキュベートする。該血清ウイルス混合物を単層のＶｅｒｏ細胞とともに１時間インキュベートし、次いで培地を含むアガロースでその表面を覆う。アッセイから５日目にウイルスプラークを染色する。プラーク数が８０％減少する最大希釈は、Ｐｌａｑｕｅ減少中和８０（ＰＲＮＴ80）である。
１０．サイトカインおよびケモカインの定量化
【０９１９】
インキュベーションから４日後、培養上清を取り出して、アッセイまで−２０℃で凍結させる。市販の抗体および標準物（EBiosciene）を用いて、ＥＬＩＳＡおよび／またはＦＡＣＳ（EBioscience）で製造業者の使用説明書に従って、上清中のサイトカインおよびケモカインのレベルを測定する。
１１．マウスウイルスのプロテクションアッセイ
【０９２０】
マウスチャレンジモデルを用いて、西ナイルＥ抗原を提示する粒子のアジュバントを含含む製剤、および含まない製剤の有効性を確認する。上述の材料および方法の第１節に記述するように、１３日齢の離乳マウスに、１、５および１０μｇの投薬を用いて免疫化する。免疫化の後に、１００  ＬＤ50のマウス適応型西ナイルウイルスを用いてマウスに頭蓋内（IC）に投与する。投与から２１日間、罹患率および死亡率をモニターする。
１２．血清抗体の定量化
【０９２１】
抗体捕捉用の粒子を表示する固定化抗原を用いてＥＬＩＳＡによって血清抗体を測定する。
１３．統計分析
【０９２２】
サイトカイン、ケモカインおよび抗体応答の分析をＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）で行う。
結果
【０９２３】
プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−Ｃ−ＷＮＶＥおよびｐＨＡＳを保有する細胞を、すべてｐＭＣＳ６９の存在下でのＧＣ−ＭＳ分析によって、ポリエステルポリヒドロキシ酪酸の存在を確認する。細胞内のポリエステル含有物の存在は、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ染色法を用いて蛍光顕微鏡によって、さらに確認し得る。
【０９２４】
すべてｐＭＣＳ６９の存在下で、プラスミドｐＥＴ１４Ｂ−Ｃ−ＷＮＶＥおよびｐＨＡＳ（野生型対照）を保有する細胞中にポリヒドロキシ酪酸が存在することは、単一のまたは３部分からなる融合タンパク質として存在するとき、ＰｈａＣポリエステルシンターゼドメインがポリマーシンターゼ活性を保持していたことを示す。
【０９２５】
それぞれ融合タンパク質配列から推定される分子量と直接整列するみかけの分子量による顕著なタンパク質バンドによって、該粒子による高レベルのタンパク質の表示を決定する。これらのタンパク質の同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いるトリプシンペプチドフィンガープリントで確認する。粒子を表示する種々の抗原は用量依存的様式でそれぞれの抗抗原抗体に結合するが、野生型粒子が抗体に結合するのは著しく少ないことをＥＬＩＳＡの結果は示している。フローサイトメトリーの結果は、＞９７％の抗原粒子が抗抗原抗体に結合することを示している。
【０９２６】
種々の抗原ＰｈａＣ融合タンパク質をコードするそれぞれのハイブリッド遺伝子が組換え大腸菌中で発現することで、それらの表面で融合タンパク質を表示するポリエステル粒子の産生がもたらされることを結果は示すことになる。
【０９２７】
好ましくは、免疫化の後、明白な毒性はいずれの動物でも観察されず、および実験の時間経過の間、マウスの体重は群間で有意差はなく、且つすべての群においてマウスの体重は増えた（データ不図示）。ポリエステル粒子で免疫化したマウスは、典型的には、免疫部位で小さいしこり（直径２．５ｍｍ）が発生するが、膿瘍または化膿は観察されず、すべてのマウスは典型的には、試験の間健康であり、行動は正常であり、且つ毛質は良好である。５〜１００μｇの用量範囲の抗原粒子は、マウスにおいて有意な抗体応答を生成している。５〜１００μｇ用量の単独の野生型粒子の場合と比較すると、この用量は、高抗体力価を明らかに誘導する。他の用量を試験して用いてもよい。非免疫化したマウス（対照群）を含む第２の実験では、対照野生型粒子（ビーズ対照群）と、アジュバントを含んで、および含まずに製剤化したＷＮＶＥ提示粒子（試験群）との両方でマウスを免疫化した。非ワクチン接種した、または野生型ビーズで免疫化したマウスと比較すると、抗原提示粒子を与えた両マウス群の場合、有意に高い抗原特異的血清抗体応答についてマウスを評価した。最も高い抗体応答は、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎで製剤化された抗原粒子で免疫化したマウスにおいて典型的には観察され得る。ＩｇＧ１アイソタイプについての抗体応答は、両実験においてＩｇＧ２についての応答よりも強い。
【０９２８】
５〜１００μｇ抗原粒子で免疫化したマウスの抗原に対する細胞媒介性応答も、単独の野生型粒子で、または単独のＰＢＳで免疫化したマウスの抗原と比較すると、有意に増強される。ＰＢＳ免疫化した対照マウスと比較すると、単独の野生型粒子で免疫化したマウスの細胞媒介性応答において典型的には有意差はみられない。
【０９２９】
野生型粒子で免疫化したマウスに由来する血清は、プラーク減少中和アッセイにおいてＰＢＳで免疫化した対照マウスの血清と典型的には有意異はない。プラーク減少中和アッセイにおいて、ＷＮＶＥ粒子を含む製剤で免疫化したマウスに由来する血清の中和価は、単独の野生型粒子で免疫化したマウスの血清と比較して、有意に高い。好ましくは、ＷＮＶＥ粒子を含む製剤で免疫化したマウスに由来する血清の中和価は、同種および異種の西ナイルウイルス間で類似する。
【０９３０】
５〜１００μｇの野生型粒子で２回免疫化したマウスにおいて該抗原に対するケモカインおよびサイトカインの応答は、ＰＢＳで免疫化した対照マウスのそれと典型的には有意異はない。対照的に、有意により大きいケモカインおよびサイトカインの応答は、抗原粒子で２回免疫化したマウスにおいて、および抗原粒子とＥｍｕｌｓｉｇｅｎとで２回免疫化したマウスにおいて観察される。他のすべてのワクチン群よりも、抗原粒子およびＥｍｕｌｓｉｇｅｎで２回免疫化したマウスにおいて各抗原に対するサイトカインおよびケモカインの応答は有意により大きいと予想される。ＷＮＶＥ抗原を表示する操作されたポリエステル粒子は、抗原特異的細胞媒介性応答を生成することができ、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体の産生を著しく増加させることができる。
【０９３１】
ＰＢＳまたは野生型粒子のいずれかで免疫化したマウスは、これらの２群間で何らの有意差なく、ウイルス投与後に死亡すると思われる。アジュバントを含んで、および含まないで粒子を提示するＷＮＶＥで免疫化したマウスは、アジュバントを含む製剤から良好な保護を得て、保護されると思われる。
【０９３２】
ＷＮＶＥを表示する操作されたポリエステル粒子は、抗原特異的細胞媒介性応答を生成することができ、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体の産生を著しく増加させることができる。体液性および細胞媒介性の両免疫応答の生成に加えて、体重減少などの有害な副作用の欠如、および注射部位での膿瘍および化膿の非存在は、ポリエステル粒子は耐容性がよく、安全、且つ非毒性であることを示す。
実施例１３−マウスにおけるin vivoでの免疫研究
【０９３３】
本実施例は、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子による哺乳類モデル生物の免疫化を説明する。
材料および方法
【０９３４】
すべての動物実験は、ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｓｓｌａｎｄｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Palmerston North,New Zealand）の承認を得た。
１．プラスミドの構築ならびに大腸菌およびＬ．ラクチス中でのポリマー粒子の産生
【０９３５】
実施例１および２に記述するように、Ｌ．ラクチスおよび大腸菌中で、結核抗原を表示するポリマー粒子の産生のために、プラスミドを構築した。細菌を破壊することによってポリエステル顆粒を単離し、次いで全細胞可溶化物を４℃、６０００ｇで１５分間遠心させて、ポリエステル粒子を沈降させた。該粒子をグリセロール勾配超遠心分離法で精製した。タンパク質の濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて、製造業者の使用説明書（Bio-Rad）に従って決定した。ポリマー粒子に付着した総タンパク質の量と比べて、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６：ＰｈａＣの融合タンパク質の量を、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ(商標）ＸＲを用いて検出して、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（バージョン４．６．２、Bio-Rad Laboratories）を使用して分析した。結核抗原は、該ポリマー粒子の総タンパク質のおよそ２０％を占めた。対象のタンパク質の同定を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて確認した。
２．ＥＬＩＳＡ
【０９３６】
ポリマー粒子の活性を、実施例３に記述するように酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。ＶＥＲＳＡａｘマイクロプレートリーダーで、吸光度を４９０ｎｍで記録した。
３．マウスの免疫化
【０９３７】
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Malaghan Institute,Wellington,NZ）に、実施例１、２および３に記述するように構築し、単離した結核ポリマー粒子ワクチンを２週間隔で３回皮下に免疫化する。３つの処置群は以下の通りである：
ａ）野生型粒子（すなわち、ｐＨＡＳおよびｐＭＣＳ６９を保有する細菌細胞から調製した粒子）で免疫化した個体；
ｂ）単独のＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子（すなわち、ｐＨＡＳ−Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６およびｐＭＣＳ６９を保有する細菌細胞から調製したポリマー粒子）で免疫化した個体；
ｃ）２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）と混合したＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子で免疫化した個体。
非ワクチン接種した対照動物は、実験の各組に含まれた。
４．免疫アッセイ
【０９３８】
最後の免疫化から３週間後に、マウスに麻酔して、採血する。該血液を遠心して、血清を収集し、アッセイまで−２０℃で凍結させる。
【０９３９】
次いで、マウスを安楽死させ、それらの脾臓を摘出し、８０ゲージワイヤメッシュ篩に通すことによって単細胞懸濁液を調製する。１７ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌおよび１４０ｍＭのＮＨ４Ｃｌの溶液を用いて、脾臓赤血球（ＲＢＣ）を溶解する。洗浄後、２ｍＭグルタミン（Invitrogen）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Invitrogen）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Invitrogen）、５×１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール（Sigma）および５％（w/w）ウシ胎仔血清（Invitrogen）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地で該ＲＢＣを培養した。
【０９４０】
該細胞を３７℃、１０％ＣＯ２、単独の培地で、またはＡｇ８５Ａ、ＥＳＡＴ−６、または両抗原の組合せのいずれかを含む培地でインキュベートした。
５．ＩＦＮ−γの定量化
【０９４１】
インキュベーションから４日後、培養上清を取り出して、アッセイまで−２０℃で凍結させる。市販の抗体および標準物（BD Pharmingen）を用いて、ＥＬＩＳＡ（BD Biosciences）で製造業者の使用説明書に従って、上清中のＩＦＮ−γのレベルを測定する。
６．血清抗体の定量化
【０９４２】
製造業者の推奨に従って、モノクローナル抗ＥＳＡＴ−６または抗Ａｇ８５Ａ抗体（Abcam）を用いて、ＥＬＩＳＡによって血清抗体を測定した。
７．統計分析
【０９４３】
ＩＦＮ−γ応答および抗体応答の分析をＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）でおこなった。
結果
【０９４４】
免疫化の後、明白な毒性はいずれの動物でも観察されなかった。実験の時間経過の間、マウスの体重は群間で有意差はなく、且つすべての群においてマウスの体重は増えた（データ不図示）。ポリエステルポリマー粒子で免疫化したマウスは、免疫部位で小さいしこり（直径２．５ｍｍ）が発生したが、膿瘍または化膿は観察されなかった。すべてのマウスは、試験の間健康であり、行動は正常であり、且つ毛質は良好であった（データ不図示）。
【０９４５】
３０μｇのＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子の用量は、マウスにおいて有意な抗体応答を生成するのに最適であることを示した（図５を参照）。３０μｇ用量の単独の組換えＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６タンパク質と比較すると、この用量は、高抗体力価を有意に誘導した（Ｐ＜０．０１）。非免疫化した対照マウスを含み、且つアジュバントを含むビーズ製剤と含まないビーズ製剤とを比較した第２の実験では、非ワクチン接種したマウスと比較すると、抗原特異的血清抗体応答がＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子を与えた両ワクチン群の場合、有意に高かった（Ｐ＜０．０１、図６を参照）。最も高い抗体応答は、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ中のＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子で免疫化したマウスにおいて観察された。ＩｇＧ１アイソタイプについての抗体応答は、両実験においてＩｇＧ２についての応答よりも強かった。
【０９４６】
図７に示すように、１０μｇまたは３０μｇのＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子で免疫化したマウスのＥＳＡＴ−６およびＡｇ８５Ａに対する細胞媒介性応答は、単独の組換えＥＳＡＴ−６−Ａｇ８５Ａ抗原（Ｐ＜０．０１）で、または単独のＰＢＳ（ｐ＜０．０１）で免疫化したマウスのそれと比較すると、有意に増強された。ＰＢＳ免疫化した対照マウスと比較すると、単独の抗原で免疫化したマウスの細胞媒介性応答において典型的には有意差はみられなかった。
【０９４７】
図８に示すように、３０μｇの野生型ポリマー粒子（結核抗原を含まない）で３回免疫化したマウスにおいてＥＳＡＴ−６またはＡｇ８５Ａのいずれの抗原に対するＩＦＮ−γ応答は、ＰＢＳで免疫化した対照マウスのそれと有意異はなかった。対照的に、各抗原に対する有意により大きいＩＦＮ−γ応答は、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー]粒子で３回免疫化したマウス（ｐ＜０．０１）において、およびＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子とＥｍｕｌｓｉｇｅｎとで３回免疫化したマウス（ｐ＜０．０１）において観察された。実際に、他のすべてのワクチン群（ｐ＜０．０１、**）よりも、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子およびＥｍｕｌｓｉｇｅｎで３回免疫化したマウスにおいて、各抗原に対するＩＦＮ−γ応答は有意により大きく観察された。
考察
【０９４８】
Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６抗原融合を表示する操作されたポリエステルポリマー粒子は、抗原特異的細胞媒介性応答を生成することができ、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２の抗体の産生を顕著に増加させることができた。特に、単独の抗原による免疫化（すなわち、本発明のポリマー粒子を含まない抗原）は、細胞媒介性応答を引き出すことにおいて無効であった。
【０９４９】
これらの結果は、免疫応答の異なる面を引き出すためのこのワクチン送達系の多用途性および可能性を示し、それによって、体液性および細胞媒介性の両免疫応答が引き出されたことも示した。
【０９５０】
体重減少などの有害な副作用の欠如、および注射部位での膿瘍および化膿の非存在は、ポリエステル粒子は耐容性がよく、安全、且つ非毒性であることを示した。
実施例１４−in vivoで免疫化したマウスにおける病原体の投与
【０９５１】
本実施例は、ウシ型結核菌の病原体投与に曝露された、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子による哺乳類モデルの免疫化の有効性を説明する。
材料および方法
【０９５２】
すべての動物実験は、ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｓｓｌａｎｄｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Palmerston North、New Zealand)の承認を得た。
１．プラスミドの構築およびポリエステルポリマー粒子の単離
【０９５３】
実施例１および２に記述するように、Ｌ．ラクチスおよび大腸菌中で、結核抗原Ａｇ−８５ＡおよびＥＳＡＴ−６を表示するポリマー粒子の産生のために、プラスミドを構築した。
【０９５４】
細菌を破壊することによってポリマー顆粒を単離し、次いで全細胞可溶化物を４℃、６０００ｇで１５分間遠心させて、ポリマー粒子を沈降させた。該粒子をグリセロール勾配超遠心分離法で精製した。タンパク質の濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて、製造業者の使用説明書（Bio-Rad）に従って決定した。ポリマー粒子に付着した総タンパク質の量と比べて、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６：ＰｈａＣの融合タンパク質の量を、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ(商標）ＸＲを用いて検出して、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（バージョン４．６．２、Bio-Rad）を使用して分析した。結核抗原は、該ポリマー粒子の総タンパク質のおよそ２０％を占めた。対象のタンパク質の同定を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて確認した。
２．ＥＬＩＳＡ
【０９５５】
ポリマー粒子の活性を、実施例３に記述するように酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。ＶＥＲＳＡａｘマイクロプレートリーダーで、吸光度を４９０ｎｍで記録した。
３．マウスの免疫化
【０９５６】
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Malaghan Institute,Wellington,NZ）に、週に１回の間隔で３回皮下に免疫化した。７つの処置群（１群あたりｎ＝７）は以下のとおりであった：
ａ）ＰＢＳとＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）とで免疫化した個体；
ｂ）２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）と混合したＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子（大腸菌宿主）で免疫化した個体；
ｃ）２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）と混合した野生型ポリマー粒子（大腸菌宿主）で免疫化した個体；
ｄ）２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）と混合したＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子（Ｌ．ラクチス宿主）で免疫化した個体；
ｅ）２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）と混合した野生型ポリマー粒子（Ｌ．ラクチス宿主）で免疫化した個体；
ｆ）２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（商標）アジュバント（MVP Laboratories）と混合した組換えＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６抗原で免疫化した個体；
ｇ）ＢＣＧ  １０６ＣＦＵ用量で免疫化した個体。
非ワクチン接種した対照動物は、実験の各組に含まれた。
４．病原体の投与
【０９５７】
第１のワクチン接種から１５週後に、すべてのマウスに、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）を投与した。ウシ型結核菌を、Ｔｗｅｅｎアルブミンブロス（Ｔｗｅｅｎ８０、ブロス基礎培地およびオレイン酸−アルブミン−ブドウ糖、Ｄｉｆｃｏ）中の低通過種地から初期の中間対数期まで増殖させた。
培養物のアリコートを、必要とするまで−７０℃で凍結させた。
【０９５８】
低用量エアゾール曝露によってマウスを感染させるために、各マウスの肺におよそ５０細菌を送達するように調整したＭａｄｉｓｏｎチャンバーアエゾール発生装置を用いて、希釈したウシ型結核菌ストックを投与した。
５．免疫アッセイ
【０９５９】
病原体の投与から５週間後に、体重１ｇあたり８７μｇのケタミン（Parnell Laboratories,Australia）および２．６μｇの塩酸キジラジン（Bayer、Germany）を用いて、マウスの腹腔内に麻酔した。血液を採取して、遠心し、次いで血清を収集して、アッセイまで−２０℃で凍結させた。
【０９６０】
次いで、マウスを安楽死させ、それらの脾臓および肺を摘出した。その後の組織処理のために、先端の肺葉を肺から除去し、１０％ホルマリン中で保存した。切片をＺｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｏｎと、ヘマトキシリンおよびエオシン染料で染色した。
【０９６１】
Ｓｅｗａｒｄ  Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）８０（Seward、UK）を用いて脾臓および残りの肺の試料を、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０を含む３ｍＬＰＢＳ中で、機械的にホモジナイズし、次いで１０％のオレイン酸−アルブミン−ブドウ糖−カタラーゼ濃縮（BD）を補充した選択的Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１１寒天上で、１０倍希釈で播種した。計数する前に、プレートを加湿空気中３７℃で、３週間インキュベートした。
６．血清抗体の定量化
【０９６２】
製造業者の推奨に従って、モノクローナル抗ＥＳＡＴ−６（Abcam）を用いて、ＥＬＩＳＡによって血清抗体を測定した。簡単に言うと、Ｍｉｃｒｏｌｏｎ高結合プレート（Greiner）を、５μｇ／ｍＬのｒｅｃＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６で一晩被覆して、１％ＢＳＡでブロックし、次いでＰＢＳＴで洗浄した。５倍希釈の血清（１：５０〜１：６２５０）を加えてインキュベートした。洗浄の後に、抗マウスＩｇＧ１：ＨＲＰまたはＩｇＧ２ｃ：ＨＲＰ（ICL,USA）を加えて、該プレートをインキュベートした。ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダーで、４５０ｎｍで解読する前に、プレートを洗浄し、基質としてＴＭＢを用いた。
【０９６３】
ＩｇＧ１プレートの場合、陽性対照としてモノクローナル抗ＥＳＡＴ−６抗体を滴定して、インキュベートした。
７．統計分析
【０９６４】
ウシ型結核菌病原体の投与からの細菌数および抗体応答の分析を、Ｆｉｓｈｅｒ一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）で行い、有意水準はＰ＜０．０５であった。
結果
【０９６５】
Ｌ．ラクチス中で産生されたＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子の反応性は、ＥＳＡＴ−６抗体に対して用量依存性応答を示したが、野生型ポリマー粒子の場合、抗体結合は観察されなかった（図９）。
【０９６６】
肺の培養物において、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子によるワクチン接種は、ＰＢＳで免疫化した陰性対照群と比較して、有意に向上した感染抵抗性を示した（図１０、*＝ｐ＜０．０５）。この向上した抵抗性は、大腸菌またはＬ．ラクチスのいずれかの宿主中で合成された粒子によってもたらされた。また、大腸菌宿主中で合成されたＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子によるワクチン接種は、単独の抗原によってもたらされたワクチン接種と比較して、有意により良好な保護を示した。実際に、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子は、最も信頼できる基準であるＢＣＧワクチンに匹敵する保護を示した（図１０）。
【０９６７】
重要なことに、単独の組換えＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６抗原（すなわち、本発明のポリマー粒子を含まない抗原）によるワクチン接種は、ＰＢＳで免疫化した対照群と比較して、向上した感染抵抗性をもたらさなかった。
【０９６８】
脾臓培養物において、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子によるワクチン接種は、ＰＢＳで免疫化した陰性対照群と比較して、有意に向上した感染抵抗性を示した（図１１、*＝ｐ＜０．０５）。また、大腸菌宿主中で合成されたＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子によるワクチン接種は、単独の抗原によってもたらされたワクチン接種と比較して、有意により良好な保護を示した。野生型ポリマー粒子（すなわち、結核抗原を含まないポリマー粒子）による、または単独の組換えＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６抗原によるいずれの免疫化も、保護反応をもたらさなかった。
【０９６９】
図１２および１３は、特定の細胞媒介性反応に加えて、体液性応答も、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子でワクチン接種したマウスにおいて引き出されたことを示す。ＢＣＧワクチンと比較して、ＩｇＧ２ｃ抗体応答は、大腸菌中で産生されたＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６ポリマー粒子がより大きかった。
考察
【０９７０】
大腸菌中およびＬ．ラクチス中の両方で産生されたＡｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６抗原融合を表示するポリマー粒子による免疫化は、ウシ型結核菌を投与された動物に対して免疫学的防御をもたらすことができた。この防御は、そのようにワクチン接種された動物で、感染負荷の減少をもたらした。
【０９７１】
肺では、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６抗原融合を表示するポリマー粒子による免疫化によってもたらされた結核感染からの保護のレベルは、ＢＣＧワクチンの保護レベルに匹敵した。これは、本発明のポリマー粒子が、初感染およびコロニー形成を含む結核感染に対して防御免疫応答を引き出し得ることを示唆する。
【０９７２】
対照哺乳類と比較して、Ａｇ８５Ａ−ＥＳＡＴ−６抗原融合を表示するポリマー粒子で免疫化した哺乳類の脾臓で観察された感染の減少も、本発明のポリマー粒子による免疫化が結核浸潤および疾患進行からの保護をもたらすことを示唆する。
【０９７３】
また、副作用の欠如は、本発明のポリマー粒子は耐容性がよく、安全、且つ非毒性であることを示した。
産業上の用途
【０９７４】
本明細書中に記述する方法、ポリマー粒子および融合タンパク質を含む本発明の態様は、疾患の処置と防止、診断法、タンパク質産生、生体触媒固定化、および薬物送達において有用性を有する。
【０９７５】
当業者は、上記の説明が例証の目的で提供されるだけであり、且つ本発明がそれに限定されないことを理解する。
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Ｔｉｌｂｕｒｎ，Ｊ．ら“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ”Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：２０５−２２１
Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ，ＧおよびＣａｒｂｏｎ，Ｊ．“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｙｅａｓｔ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＴＲＰ１  ｇｅｎｅ”Ｇｅｎｅ（１９８０）１０：１５７−１６６
Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．およびＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ（１９８０）７７：４２１６−４２２０．
Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｇ．ら“Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ａｓ  ａ  ｈｏｓｔ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｃｈｙｍｏｓｉｎ”Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８：１３５−１３９
Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．Ｍ．ら“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｔｒｐＣ  ｐｌａｓｍｉｄ”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ（１９８４）８１：１４７０−１４７４
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【０９７６】
本明細書中に言及されるまたは記述されるすべての特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、および他の文書と材料は、本発明が関係する分野における当業者のレベルを表し、且つそのような言及される文書および材料のそれぞれは、その全体を個別に参照によって、またはその全体を本明細書中に記載することによって援用されたかのように同じ程度まで、参照によって援用される。出願者らは、そのような特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、電子的に入手可能な情報、および他の言及される材料または文書のいずれかに由来するありとあらゆる材料および情報を本明細書中に物理的に援用する権利を留保する。
【０９７７】
本特許の書面による明細は、すべての請求項を含む。さらに、最初のすべての請求項ならびにありとあらゆる優先権書類からのすべての請求項を含むすべての請求項は、参照によってそれら全体を本明細書の書面による明細部分に組み入れられる。出願者らは、書面による明細または出願書類の任意の他の部分、ありとあらゆるそのような請求項に物理的に援用する権利を留保する。このように、例えば、いかなる状況でも、本特許は、本請求項の的確な言葉遣いが本特許の書面による明細部分にこれらの言葉で記載されていないという断定で、ある請求項に対する文面による明細を示していないと申し立てにより解釈され得ない。
【０９７８】
本明細書中に開示される特徴のすべては、任意の組合せで組合せ得る。したがって、明示的に述べられない限り、開示される各特徴は、包括的な一連の同等または同様の特徴の一例にすぎない。
【０９７９】
本発明はその詳しい説明と組合せて記述されているが、前述の説明は本発明の範囲を示し、且つ限定しないように意図され、該範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定されると理解されるべきである。したがって、本発明の特定の非限定的実施形態は、例証を目的として本明細書中に記述されているが、種々の修正は本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ると前述から理解されることであろう。他の態様、利点および修正は、以下の請求項の範囲内であり、添付の特許請求の範囲による場合を除いて、本発明は限定されないものとする。
【０９８０】
本明細書中に記述される特定の方法および組成物は、好ましい非限定的実施形態を代表し、且つ好例であり、本発明の範囲を限定するとして意図されない。本明細書を考察すると他の目的、態様、および実施形態が、当業者に生じるであろう。これらは、特許請求の範囲によって規定されるように、本発明の精神内に包含される。さまざまな置換および修正が本発明の範囲および精神から逸脱することなく本明細書中に開示される本発明に対してなされ得ることは、当業者にとって容易に理解される。本明細書中に例示的に説明した本発明は、必須として本明細書中に具体的に開示されてない、任意の単数もしくは複数の要素、または単数もしくは複数の限定がない場合でも適切に実施され得る。このように、例えば、本明細書の各例、本発明の非限定的な実施形態または実施例において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、拡張的に且つ限定することなく読み取るべきである。本明細書中に例示的に説明される方法およびプロセスは、ステップの順番を変えて適切に実施されてもよく、該方法およびプロセスは、本明細書または特許請求の範囲に示されるステップの順番に必ずしも限定されない。
【０９８１】
使用されている用語および表現は、説明の表現として用いられており、限定としてではない。そのような用語および表現を使用する場合、示され且つ記述された特徴またはその部分のいずれか同等のものを除外する意図はなく、種々の修正が請求された本発明の範囲内で可能であると認識される。したがって、本発明は種々の非限定的実施形態および／または好ましい非限定的実施形態および随意的な特徴によって具体的に開示されているが、当業者によって頼られ得る、本明細書中に開示される概念のありとあらゆる修正および変形は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内であるとみなされると理解される。
【０９８２】
本発明は、広範囲に、且つ包括的に本明細書中に記述されている。包括的な開示に含まれる各々の下位種および亜種のグループ化も、本発明の一部を形成する。これには、本発明の包括的な説明が含まれるが、ただし、削除される材料が具体的に本明細書中に列挙されているか否かに関わらず、その種類から任意の対象を取り除いた消極的な限定が含まれない。
【０９８３】
また、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は文脈から判断し、明確にそうでない場合を除いて、複数の参照物が含まれる。用語「Ｘおよび／またはＹ」とは、「Ｘ」しくは「Ｙ」または「Ｘ」および「Ｙ」の両方を意味し、名詞の後の文字「ｓ」は、その名詞の複数形および単数形の両方を表すと理解されるべきである。加えて、本発明の特徴または態様がＭａｒｋｕｓｈグループの用語で説明される場合、本発明が、該Ｍａｒｋｕｓｈグループの任意の個別のメンバーおよび任意のメンバーのサブグループを包含し、且つそれによって説明されることを意図し、および当業者は認識する。出願者らは、該Ｍａｒｋｕｓｈグループの任意の個別のメンバーまたは任意のメンバーのサブグループを具体的に言及するために、本出願または特許請求の範囲を訂正する権利を留保する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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