(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）の化合物（式中、ＡＬＫは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキレン基であり、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、以下の基：−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＯＣＯＮＲ−、−ＮＲＣＯＯ−、−ＮＲＣＯＮＲ’−、−ＮＲ−、−Ｓ（Ｏ）ｎ（ｎ＝０、１または２）またはＯ−のうちの１つであり、ＲおよびＲ’は、独立して、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基であり、Ｉは、１から４０、好ましくは１から２０、より好ましくは１から１０の整数であり、ｊは、Ｘ２が−ＣＨ＝ＣＨ−の場合、１に相当する整数であり、Ｘ２が−ＣＨ＝ＣＨ−でない場合、２に相当する整数であり、Ｚｂは、単一の結合、−Ｏ−または−ＮＨ−であり、ＲｂはＨまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは（Ｃ３−Ｃ７）ヘテロシクロアルキル基であり、またはＺｂは、一重結合であり、ＲｂはＨａｌである。）に関する。本発明は、腫瘍細胞に対して親和性を有する、抗体とのコンジュゲートを調製するための前記メイタンシノイドの使用に関する。2013506653.tif 000072
2013506653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2013506653.tif 000065
（式中、
ＡＬＫは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキレン基であり、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、以下の基：−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＯＣＯＮＲ−、−ＮＲＣＯＯ−、−ＮＲＣＯＮＲ’−、−ＮＲ−、−Ｓ（０）ｎ（ｎ＝０、１または２）または−Ｏ−のうちの１つであり、
ＲおよびＲ’は、独立して、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基であり、
ｉは、１から４０、好ましくは１から２０、より好ましくは１から１０の整数であり、
ｊは、Ｘ２が−ＣＨ＝ＣＨ−の場合、１に相当する整数であり、Ｘ２が−ＣＨ＝ＣＨ−でない場合、２に相当する整数であり、
Ｚｂは、単一結合、−Ｏ−または−ＮＨ−であり、Ｒｂは、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは（Ｃ３−Ｃ７）ヘテロシクロアルキル基であり、またはＺｂは一重結合であり、ＲｂはＨａｌである。）。
【請求項２】
Ｘ２が−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＯＮＲ−であり、前記ＣＯ基が、−Ｘ１−ＡＬＫ−基に連結されており、ＲがＨまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
−Ｘ１−ＡＬＫ−が−Ｓ−ＣＨ２−である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
ｉが３、４、５、６、７、８、９または１０である、請求項１から３に記載の化合物。
【請求項５】
式（ＩＩ）：
【化２】
2013506653.tif 000066
である、請求項１から４に記載の化合物。
【請求項６】
以下の化合物：
【化３】
2013506653.tif 000067
の中から選択される化合物。
【請求項７】
−ＣＯＺｂＲｂが、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−ＣＯＯＭｅ、ＣＯＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【化４】
2013506653.tif 000068
基
【化５】
2013506653.tif 000069
（式中、Ｇｌは、少なくとも１つの誘導基−ＮＯ２、−Ｈａｌまたは−Ｆを表す。）、または
【化６】
2013506653.tif 000070
である、請求項１から６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
塩基もしくは塩、または前記塩基もしくは前記塩の溶媒和物もしくは水和物の形態の、請求項１から７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
（ｉ）場合によって緩衝されている抗体水溶液と、請求項１から８に記載の化合物の溶液を接触させるステップ、ならびに
（ｉｉ）次いで、（ｉ）で形成したコンジュゲートを、未反応の試薬および溶液中に存在し得るいかなる凝集体からも場合によって分離させるステップ
を含む、コンジュゲートの調製方法。
【請求項１０】
反応温度が、通常２０から４０℃の範囲で変動し、および／または反応時間が１から２４時間の範囲で変動する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｉ）または（ｉｉ）の後、コンジュゲート含有溶液に、追加のステップ（ｉｉｉ）である限外ろ過法および／または膜分離法を施す、請求項９から１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗体が、ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合し、少なくとも１つの重鎖および少なくとも１つの軽鎖を含む抗体またはこのエピトープ結合フラグメントであり、前記重鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２および３で表されるアミノ酸配列を有する３つの連続した相補性決定領域を含み、前記軽鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５および６で表されるアミノ酸配列を有する３つの連続した相補性決定領域を含む、請求項９から１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗体またはエピトープ結合フラグメントが、ヒト化抗体もしくは再表面化抗体またはこのエピトープ結合フラグメントである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記重鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２からなるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４からなるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記重鎖が、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８にあり、前記軽鎖がアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６にある、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
請求項９から１５に記載の方法を用いて入手可能なコンジュゲート。
【請求項１７】
ＵＶ分光光度計で測定した平均ＤＡＲが、４より上、より具体的には４と１０の間、さらにより具体的には４と７の間にあり、前記ＤＡＲが、
ｃＤ＝［（εＡ２８０×Ａ２５２）−（εＡ２５２×Ａ２８０）］／［（εＤ２５２×εＡ２８０）］−（εＡ２５２×εＤ２８０）］
ｃＡ＝［Ａ２８０−（ｃＤ×εＤ２８０）］／εＡ２８０
εＤ２５２＝２６，１５９Ｍ−１ｃｍ−１
εＤ２８０＝５，１８０Ｍ−１ｃｍ−１
εＡ２８０＝２２４，０００Ｍ−１ｃｍ−１
εＡ２５２＝８２，８８０Ｍ−１ｃｍ−１
Ａ２５２およびＡ２８０は、それぞれ２５２および２８０ｎｍにおいて、ＵＶ分光光度計で測定されたコンジュゲートの吸光度である
という条件で、方程式ＤＡＲ＝ｃＤ／ｃＡから求められる、請求項１６に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
ＤＡＲが、５と８の間、より具体的には５．５と８の間、さらにより具体的には５．９と７．５の間にある、請求項１７に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
請求項１６から１８に記載のコンジュゲートを含む水溶液。
【請求項２０】
抗癌剤として使用するための、請求項１から８に記載の生成物。
【請求項２１】
抗癌剤として使用するための、請求項１６または１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
式：
【化７】
2013506653.tif 000071
のメイタンシノイドフラグメントが抗体に共有結合で連結している、コンジュゲートを調製するための請求項１から８に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規メイタンシノイド、および抗体とのコンジュゲートを調製するための前記メイタンシノイドの使用に関する。本発明はまた、前記メイタンシノイドおよび前記コンジュゲートを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体−薬物コンジュゲートを用いて、腫瘍細胞を特異的に対象とする試みについて多くの論文が出現した（Ｓｅｌａら、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、１８９−２１６頁（Ｃ．Ｖｏｇｅｌ編．１９８７年）；Ｇｈｏｓｅら、Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇｓ、１−２２頁（Ｅ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ編、１９８３年）；Ｄｉｅｎｅｒら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ、１−２３頁（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ編、１９８８年）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ、２５−５３頁（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ編、１９８８年）；Ｂｕｍｏｌら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ、５５−７９頁（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ編、１９８８年）。また以下も参照されたい：Ｍｏｎｎｅｒｅｔ  Ｃら、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｄｕ  Ｃａｎｃｅｒ、２０００年、８７（１１）、８２９−３８頁；Ｒｉｃａｒｔ  Ａ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２００７年、４、２４５−２５５頁；Ｓｉｎｇｈ  Ｒ．およびＲｉｃｋｓｏｎ  Ｈ．Ｋ．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００９年、５２５、４４５−４６７頁。タキサン誘導体（ＷＯ０６０６１２５８）、レプトマイシン誘導体（ＷＯ０７１４４７０９）、ＣＣ−１０６５および類似体（ＷＯ２００７１０２０６９）など、またはメトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシルなどの異なるファミリーの細胞毒性薬が、抗体との結合に使用されてきた。
【０００３】
腫瘍細胞に対する親和性を有する標的抗体の使用は、細胞毒性薬を腫瘍細胞の近くに直接または腫瘍細胞内に直接送達することを可能にし、したがって、細胞毒性薬に通常伴う副作用を最小限に抑えながら、細胞毒性薬の効率を増加させる。
【０００４】
メイタンシノイドは、キャストアフリカンシュラブ、メイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ）から単離した天然物であるメイタンシンから誘導される細胞毒性薬である（ＵＳ３８９６１１１）。多くのメイタンシノイドが調製されてきた。以下を参照：ＵＳ４１５１０４２；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９７８年、２１、３１−３７頁；Ｎａｔｕｒｅ、１９７７年、２７０、７２１−７２２頁、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９８４年、３４４１−３４５１頁；ＵＳ４２４８８７０；ＵＳ４１３７２３０；Ｃｈｅｍ．Ｂｕｌｌ．１９８４年、３４４１頁。
【０００５】
従来技術
ＵＳ５２０８０２０、ＵＳ５４１６０６４、およびＲ．Ｖ．Ｊ．Ｃｈａｒｉ、３１  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、８９−１０４頁（１９９８年）は、Ｌ−ＤＭ１（Ａ）またはＬ−ＤＭ４（Α’）：
【０００６】
【化１】
2013506653.tif 000003
などのメイタンシノイドのコンジュゲートについて記載している。
【０００７】
メイタンシノイドのコンジュゲートは、ＥＰ０４２５２３５およびＷＯ２００４／１０３２７２で記載されている。ＥＰ０４２５２３５において、式（Ｂ１）、（Ｂ２）または（Ｂ３）の以下のメイタンシノイドが記載されている：
【０００８】
【化２】
2013506653.tif 000004
（式中、Ｚ０、Ｚ１またはＺ２は、ＨまたはＳＲを表す。）。
【０００９】
ＷＯ２００４／１０３２７２では、式（Ｃ）のメイタンシノイドが記載されている：
【００１０】
【化３】
2013506653.tif 000005
（式中、Ｙ’は、
（ＣＲ７ＣＲ８）ｉ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐＣ≡ＣｑＡｒ（ＣＲ５ＣＲ６）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ３ＣＲ４）ｕＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、Ａ、ＢおよびＤは、場合によって置換されているシクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキル基を表す。）。
【００１１】
ＷＯ０３／０６８１４４では、式（Ｄ）の化合物が記載されている。
【００１２】
【化４】
2013506653.tif 000006
（式中、Ｚは、細胞毒性薬であり、Ｑは、Ｒ２ＣＯＯ、Ｒ２Ｒ３ＮＣＯＯ、Ｒ２ＯＣＯＯ、Ｒ２Ｏ、Ｒ２ＣＯＮＲ３、Ｒ２Ｒ３Ｎ、Ｒ２ＯＣＯＮＲ３またはＳである。Ｒ２は、ＳＣＲ４Ｒ５Ｒ６である。）。Ｚは、以下のメイタンシノイド誘導体の中から選択されるメイタンシノイド誘導体であってよい。
【００１３】
【化５】
2013506653.tif 000007
【００１４】
さらに具体的には、以下の化合物（Ｄ）が開示されている：
【００１５】
【化６】
2013506653.tif 000008
したがって化合物（Ｄ）は、ペグ化リンカーの中に内部ジスルフィド結合を含有している。
【００１６】
Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．はまた、２００８年１２月８日、ＧｅｎｅｖａのＥｕｒｏｐｅａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓにおいて、式（Ｅ）のコンジュゲートを開示し、
【００１７】
【化７】
2013506653.tif 000009
Ｇｅｎｅｖａで２００８年１０月に開催された、第２０回シンポジウムＥＯＲＴＣ−ＮＣＩ−ＡＡＣＲにおいて、式（Ε’）のコンジュゲートを開示した。
【００１８】
【化８】
2013506653.tif 000010
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第０６０６１２５８号
【特許文献２】国際公開第０７１４４７０９号
【特許文献３】国際公開第２００７１０２０６９号
【特許文献４】米国特許第４１５１０４２号明細書
【特許文献５】米国特許第４２４８８７０号明細書
【特許文献６】米国特許第４１３７２３０号明細書
【特許文献７】米国特許第５，２０８，０２０号明細書
【特許文献８】米国特許第５，４１６，０６４号明細書
【特許文献９】欧州特許第０４２５２３５号明細書
【特許文献１０】国際公開第２００４／１０３２７２号
【特許文献１１】国際公開第０３／０６８１４４号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｓｅｌａら、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、１８９−２１６頁（Ｃ．Ｖｏｇｅｌ編．１９８７年）
【非特許文献２】Ｇｈｏｓｅら、Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇｓ、１−２２頁（Ｅ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ編、１９８３年）
【非特許文献３】Ｄｉｅｎｅｒら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ、１−２３頁（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ編、１９８８年）
【非特許文献４】Ｐｉｅｔｅｒｓｚら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ、２５−５３頁（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ編、１９８８年）
【非特許文献５】Ｂｕｍｏｌら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ、５５−７９頁（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ編、１９８８年）
【非特許文献６】Ｍｏｎｎｅｒｅｔ  Ｃら、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｄｕ  Ｃａｎｃｅｒ、２０００年、８７（１１）、８２９−３８頁
【非特許文献７】Ｒｉｃａｒｔ  Ａ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２００７年、４、２４５−２５５頁
【非特許文献８】Ｓｉｎｇｈ  Ｒ．およびＲｉｃｋｓｏｎ  Ｈ．Ｋ．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００９年、５２５、４４５−４６７頁
【非特許文献９】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９７８年、２１、３１−３７頁
【非特許文献１０】Ｎａｔｕｒｅ、１９７７年、２７０、７２１−７２２頁
【非特許文献１１】Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９８４年、３４４１−３４５１頁
【非特許文献１２】Ｃｈｅｍ．Ｂｕｌｌ．１９８４年、３４４１頁
【非特許文献１３】Ｒ．Ｖ．Ｊ．Ｃｈａｒｉ、３１  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、８９−１０４頁（１９９８年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
定義
「アルキル」は、１から２０個の炭素原子を鎖内に有する直鎖もしくは分枝、または３から１０個の炭素原子を有する環状であってよい脂肪族の炭化水素基を意味する。好ましいアルキル基は、鎖内に１から１２個の炭素原子を有する。代表的アルキル基として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、２，２−ジメチルプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−ペンチル、オクチル、ノニル、デシルが挙げられる。
「シクロアルキル」は、３から１０個の炭素原子を有する環式の脂肪族炭化水素基を意味する。好ましいシクロアルキル基は、環状の鎖内に３から８個の炭素原子を有する。代表的なシクロアルキル基として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが挙げられる。
「アリール」は、６から１４個の炭素原子、好ましくは６から１０個の炭素原子の芳香族単環式または多環式炭化水素環系を意味する。代表的なアリール基として、フェニルまたはナフチルが挙げられる。
「ヘテロアリール」は、不飽和の安定した３から１４員、好ましくは５から１０員の単環式、二環式または多環式の環を意味し、この環の少なくとも１つのメンバーはヘテロ原子である。通常、ヘテロ原子は、これらに限定されないが、酸素、窒素、硫黄、セレンまたはリン原子である。ヘテロ原子は、酸素、窒素または硫黄原子が好ましい。代表的なヘテロアリール基として、ピリジル、ピロリル、チエニル、フリル、ピリミジニルおよびトリアゾリルが挙げられる。
「ヘテロシクロアルキル」は、少なくとも１個のヘテロ原子を含有するシクロアルキル基を意味し、この環の少なくとも１つのメンバーはヘテロ原子である。
「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル基を意味し、アルキルは上記のように定義される。
「アルコキシルオキシ」は、−Ｏ−ＣＯ−アルキル基を意味し、アルキルは上記のように定義される。
「アルキレン」は、直鎖または分枝のアルカンから２個の水素原子を除去することにより形成される一般式−ＣｍＨ２ｍ−のアルキル基を意味する。代表的アルキレン基として、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、プロピレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ブチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソブチレン
【００２２】
【化９】
2013506653.tif 000011
、ヘキシレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）が挙げられる。直鎖アルキレン基は、具体的には式−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍは、１から２０の整数である。）で表すことができる。
「ＥｐｈＡ２受容体」は、Ｅｐｈ受容体ファミリーに属するチロシンキナーゼ（Ｐａｓｑｕａｌｅ、Ｅ．Ｂ．ら、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、６、４６２−４７５頁で概説されている）を指し、例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４３１（ヒトＥｐｈＡ２）、ＮＭ＿０１０１３９（マウスＥｐｈＡ２）またはＮＸＭ＿３４５５９６（ラットＥｐｈＡ２）などのアミノ配列を含む。ヒトＥｐｈＡ２は、好ましいＥｐｈ受容体である。「ＥｐｈＡ２リガンド」という用語は、本明細書で使用する場合、ＥｐｈＡ２受容体に結合し、場合によってはこれを活性化する（例えば、この自己リン酸化を刺激する）タンパク質を指す。本明細書中の好ましいＥｐｈＡ２リガンドは、「エフリンＡ１」であり、これは、ＥｐｈＡ２受容体に結合し、例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４２８（ヒトエフリンＡ１）などのようなアミノ配列を含む。
「ポリクローナル抗体」とは、１つ以上の他の、非同一の抗体の間でまたはそれらの存在下で産生された抗体である。一般的に、多クローン性抗体は、非同一の抗体を産生する他のいくつかのＢ−リンパ球の存在下でＢ−リンパ球から産生される。通常、多クローン性抗体は免疫された動物から直接得る。
「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種の抗体の集団、すなわち微量で存在することがある、自然発生で起こり得る変異を除いて、基本的に同一であるこの集団を形成する抗体から得られる抗体である。これらの抗体は、単一のエピトープを対象とし、したがって極めて特異的である。
「裸の抗体」とは、メイタンシノイドと結合していない抗体である。
「エピトープ」とは、抗体が結合する抗原上の部位である。これは、抗原タンパク質のフォールディングにより近接近させられる隣接する残基または隣接しない残基で形成することができる。隣接するアミノ酸で形成されるエピトープは通常、非変性溶媒へ曝露されたまま保持されるが、隣接しないアミノ酸で形成されるエピトープは通常、前記曝露下で失われる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１の脱グリコシル化コンジュゲートの逆畳み込み後のＨＲＭＳスペクトルを示す図である。
【図２】実施例２の脱グリコシル化コンジュゲートの逆畳み込み後のＨＲＭＳスペクトルを示す図である。
【図３】実施例３の脱グリコシル化コンジュゲートの逆畳み込み後のＨＲＭＳスペクトルを示す図である。
【図４】実施例４の脱グリコシル化コンジュゲートの逆畳み込み後のＨＲＭＳスペクトルを示す図である。
【図５】実施例５の脱グリコシル化コンジュゲートの逆畳み込み後のＨＲＭＳスペクトルを示す図である。
【図６Ａ】配列を示す記号である。
【図６Ｂ】配列を示す記号である。
【図６Ｃ】配列を示す記号である。
【図７】様々なＤＡＲにおける、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４コンジュゲートに対するＰＫパラメータ：ＨＧＳ中のコンジュゲート２０ｍｇ／ｋｇをオスのＣＤ−１マウス（ｎ＝４）に、単回投与の静脈内投与をした後、（ＡＵＣ（Ｏ−ｉｎｆ）；左）への曝露およびいくつかのコンジュゲートのクリアランス（ＣＩ；右）を、ＤＡＲの関数として棒グラフにより説明するグラフである。グラフにおいて、２Ｈ１１−ＤＭ４（底部）は、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートを指す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
これらの図は、各コンジュゲートについて、０から１０のメイタンシノイド（Ｄ０：メイタンシノイドなし；Ｄｘ：ｘ個のメイタンシノイド）を保持するコンジュゲートの分布が存在することを示している。
【００２５】
新規メイタンシノイド
本発明は、式（Ｉ）の化合物
【００２６】
【化１０】
2013506653.tif 000012
（式中、
ＡＬＫは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキレン基であり、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、以下の基：−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＯＣＯＮＲ−、−ＮＲＣＯＯ−、−ＮＲＣＯＮＲ’−、−ＮＲ−、−Ｓ（Ｏ）ｎ（ｎ＝０、１または２）または−Ｏ−のうちの１つであり；
ＲおよびＲ’は、独立して、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基であり；
ｉは、１から４０、好ましくは１から２０、より好ましくは１から１０の整数であり、
ｊは、Ｘ２が−ＣＨ＝ＣＨ−の場合、１に対応する整数であり、Ｘ２が−ＣＨ＝ＣＨ−でない場合、２に対応する整数であり、
Ｚｂは、単一結合、−Ｏ−または−ＮＨ−であり、Ｒｂは、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールもしくは（Ｃ３−Ｃ７）ヘテロシクロアルキル基であり、またはＺｂは、一重結合であり、ＲｂはＨａｌである。）に関する。
【００２７】
より具体的には、Ｘ２は、−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＯＮＲ−であり、ＣＯ基は、−Ｘ１−ＡＬＫ−基に連結し、Ｒは、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基である。より具体的には、−Ｘ１−ＡＬＫ−は−Ｓ−ＣＨ２−である。より具体的には、ｌは、３、４、５、６、７、８、９または１０である。
【００２８】
式（ＩＩ）の化合物を区別することができる。
【００２９】
【化１１】
2013506653.tif 000013
【００３０】
式（ＩＩ）は、以下の化合物を、さらに正確には網羅する。
【００３１】
【化１２】
2013506653.tif 000014
【００３２】
化合物は、塩基もしくは塩の形態で、または前記塩基もしくは前記塩の溶媒和物もしくは水和物の形態で存在することができる。
【００３３】
本発明の化合物は、抗体上に存在する反応性化学基（ＧＣＲ２）に対して反応性のある、反応性化学基−Ｃ（＝Ｏ）ＺｂＲｂ（ＧＣＲ１）を含む。ＧＣＲ１とＧＣＲ２の間の反応により、共有結合を介して抗体上に細胞毒性薬が結合できるようになる。したがって、この化合物は、抗体に結合する傾向がある。より具体的には、ＺｂはＯである。このような場合、ＧＣＲ１は、カルボン酸官能基（Ｒｂ＝Ｈ）またはエステル官能基である。より具体的には、−Ｃ（＝Ｏ）ＺｂＲｂは、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、例えば−ＣＯＯＣＨ３または−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である。エステル官能基の中でも、抗体（リジン基など）のアミノ基に対して優れた反応性を示す「活性化された」ものが好ましい。例えば活性化エステルは、以下のエステルであってよい：
【００３４】
【化１３】
2013506653.tif 000015
または基
【００３５】
【化１４】
2013506653.tif 000016
（式中、ＧＩは、少なくとも１つの誘導性の基、例えば−ＮＯ２または−Ｈａｌ、例えば−Ｆなどを表す。）。このような活性化エステルの例は、以下のエステルである。
【００３６】
【化１５】
2013506653.tif 000017
別の−Ｃ（＝０）ＺｂＲｂは、
【００３７】
【化１６】
2013506653.tif 000018
である。
【００３８】
ＧＣＲ２は、例えば抗体の表面のリジン残基の側面上のリジン、ヒンジ領域のサッカライド基または鎖内Ｓ−Ｓ結合の還元後のシステインのチオール基により生じるε−アミノ基であってよい（Ｇａｒｎｅｔｔ  Ｍ．Ｃ．ら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００１年、５３、１７１−２１６頁）。さらに最近になって、新規な手法は、変異によりシステインを導入すること（Ｊｕｎｕｔｕｌａ  Ｊ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００８年、２６、９２５−９３２頁；ＷＯ０９０２６２７４）または新しいタイプのタンパク質の化学的性質の開発を可能とする非天然アミノ酸を導入すること（ｄｅ  Ｇｒａａｆ  Ａ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００９年、２００９年２月３日、（Ｒｅｖｉｅｗ）；ＤＯＩ：１０．１０２１／ｂｃ８００２９４ａ；ＷＯ２００６／０６９２４６およびＣｈｉｎ  Ｊ．Ｗ．ら、ＪＡＣＳ、２００２年、１２４、９０２６−９０２７頁（ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＲｅＣｏｄｅ（登録商標）））を目標とした。
【００３９】
本発明の化合物は、式：
【００４０】
【化１７】
2013506653.tif 000019
の少なくとも１つのメイタンシノイドフラグメントに共有結合で付加しているコンジュゲートを調製するために使用することができる。
【００４１】
したがって、式（Ｉ）の化合物を、メイタンシノイドフラグメントが抗体に共有結合で連結しているコンジュゲートを調製するために使用することができる。
【００４２】
式（Ｉ）の化合物を調製するための一般的スキーム
式（Ｉ）の化合物をスキーム１に従い調製することができる：
【００４３】
【化１８】
2013506653.tif 000020
【００４４】
中間体Ｐ１は、中間体Ｐ２を含有するＰＥＧに付加している反応性基ＲＧ２と反応することによって、Ｘ１を形成することができるＲＧ１反応性基を含有する。例えば、Ｘ１＝Ｓの形成は、ＤＩＥＡなどの塩基の存在下、求核置換によるＰ１とＲＧ１＝−ＳＨの反応ならびにＰ２とＲＧ２＝−Ｂｒの反応を介して行うことができる。この反応の例は、実施例１．２において示されている。
【００４５】
ＲＧ１＝−ＳＨでのＰ１の例は、Ｌ−ＤＭ１およびＬ−ＤＭ４であり、またＥＰ１３１３７３８の化合物１１ａ、ｃ、ｄ、ｇでもある。
Ｌ−ＤＭ１：ＡＬＫ−ＳＨ＝−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ；
Ｌ−ＤＭ４：ＡＬＫ−ＳＨ＝−ＣＨ２ＣＨ２ＣＭｅ２−ＳＨ；
１１ａ：ＡＬＫ−ＳＨ＝−ＣＨ２−ＳＨ；
１１ｃ：ＡＬＫ−ＳＨ＝−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ；
１１ｄ：ＡＬＫ−ＳＨ＝−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ；
１１ｇ：ＡＬＫ−ＳＨ＝−ＣＨＭｅ−ＣＨ２−ＳＨ
【００４６】
反応の他の例が、表Ｉに示されている。
【００４７】
【表１】
2013506653.tif 000021
【００４８】
いくつかの式（Ｉ）の化合物については、Ｐ１とＰ２を反応させた後で、別の−ＺｂＲｂ基の少なくとも１つを変換後、所望する最終の−ＺｂＲｂ基を得てもよい。変換−ＺｂＲｂ＝−Ｏ−アリル→
【００４９】
【化１９】
2013506653.tif 000022
と共に、スキーム１’で一例を示す。
【００５０】
【化２０】
2013506653.tif 000023
【００５１】
同様に、Ｐ１とＰ２との間の反応の前に、−ＺｂＲｂ基を保持する中間体に対して少なくとも１つの変換を使用することもできる。
【００５２】
別の例は、例えばＳＯＣｌ２などのアシル化剤を必要とする、変換−ＺｂＲｂ＝−ＯＨ→ＺｂＲｂ＝Ｈａｌである。
【００５３】
Ｐ１の調製
メイタンシノールから開始して、スキーム２に従いＰ１を調製することができる。
【００５４】
【化２１】
2013506653.tif 000024
【００５５】
メイタンシノールを、反応性アシル基−ＣＯＯＺ（式中、Ｚは、Ｈまたはハロゲン原子である。）を含有する中間体Ｐ３と、エステル化反応により反応させる。この反応は、ＷＯ２００４／１０３２７２の図３ａ−ｄに記載され、ＷＯ２００７／０２１６７４にも記載されている。ＺがＨの場合、酸官能基の反応性を強化するカップリング剤の助けを借りてエステル化を行うことができる。
【００５６】
Ｐ２の調製
Ｐ２を調製するための出発物質は、市販のＰＥＧ化合物または当業者に既知の少なくとも１つの化学反応を介して、前記市販のＰＥＧ化合物を用いて調製することができるＰＥＧ化合物である。ＰＥＧ化合物は、例えばＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．、２０３３  Ｗ．ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  Ｄｒ．Ｓｕｉｔｅ  ３２０  ＃１８８、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ  ７５０１３−４６７５、ＵＳＡから、市販されている。
【００５７】
例えば、Ｐ２（式中、Ｘ２＝−ＣＯＮＲ−であり、ＲＧ２＝Ｈａｌ（Ｐ２＝Ｈａｌ−ＡＬＫ−ＣＯＮＲ−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ−ＣＯＺｂＲｂ））の調製が、市販の化合物ＨＯＯＣＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２を用いて以下に記載されている：
Ｒ＝Ｈ
【００５８】
【化２２】
2013506653.tif 000025
【００５９】
ステップ（ｉ）：アミド結合の形成および酸性基の活性化；２つのステップを、ＤＣＭなどの極性の非プロトン性溶媒中で別々に行う：アミン基と、ハロゲノアルカン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジンエステル（例えば、ハロゲノ酢酸）とを反応させ、次いでＤＩＣなどのカップリング剤をその場で添加する。
Ｒ≠Ｈ
【００６０】
【化２３】
2013506653.tif 000026
【００６１】
ステップ（ｉｉ）：エステルの形態でのカルボン酸の保護およびトリフルオロアセトアミドの形態でのアミンの保護；この反応は、ＤＣＭなどの極性の非プロトン性溶媒中、２つの別々のステップで行う：メタノールを用いて、トリメチルシリルジアゾメタンでの処理により酸を保護し、次いでＴＦＡＡおよびＴＥＡの添加によりアミンを保護する。
【００６２】
ステップ（ｉｉｉ）：アミンのアルキル化およびエステルのアルカリ加水分解；この反応は、ＴＨＦなどの極性の非プロトン性溶媒中、２つの別々のステップで行う：ハロゲン化アルキルＲＨａｌなどの脱離基を保持する反応体の存在下、ＮａＨでの処理によりアミンをアルキル化し、水中でＬｉＯＨを添加する。
【００６３】
ステップ（ｉｖ）：ステップ（ｉｉｉ）に続いて、ステップ（ｉ）の反応（式中、Ｒ＝Ｈ）を行う。
【００６４】
同様に、Ｐ２（式中、Ｘ２＝−ＣＨ＝ＣＨ−およびＲＧ２＝Ｈａｌ（Ｐ２＝Ｈａｌ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ−ＣＯＺｂＲｂ））の調製が、市販の化合物Ｈａｌ−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ−ＣＯＯｔＢｕを用いて以下に記載されている：
【００６５】
【化２４】
2013506653.tif 000027
【００６６】
コンジュゲートの調製方法
コンジュゲートは、以下のステップを含む方法により得ることができる：
（ｉ）場合によって緩衝させた抗体水溶液を式（Ｉ）の化合物の溶液と接触させるステップ、
（ｉｉ）次いで、反応していない試薬および溶液中に存在し得るいかなる凝集体から（ｉ）において形成されたコンジュゲートを場合によって分離するステップ。
【００６７】
細胞結合剤の水溶液は、少なくとも１つの緩衝液、例えばリン酸カリウムまたはＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ緩衝液）など、または緩衝液混合物、例えば以下の実施例において開示されている緩衝液Ａなどを用いて緩衝させることができる。緩衝液は、抗体の性質に依存する。式（Ｉ）の化合物は、有機極性溶媒（または極性溶媒の混合物）、例えばＤＭＳＯまたはＤＭＡ中で溶液である。
【００６８】
反応の温度は通常、２０から４０℃の範囲で変動する。反応時間は、１から２４時間の範囲で変動し得る。抗体と細胞毒性薬との間の反応は、屈折率検出器および／またはＵＶ検出器を備えたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）でモニターすることができる。コンジュゲートの収率が低すぎる場合、反応時間を延長することができ、および／または式（Ｉ）の化合物を添加することができる。
【００６９】
当業者であれば、多数の異なるクロマトグラフィー法を使用することによって、ステップ（ｉｉ）の分離を実施することができる：コンジュゲートは、例えばＳＥＣ、吸着クロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、ＩＥＣなど）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、アフィニティクロマトグラフィー、混合担持クロマトグラフィー、例えばハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなど、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製することができる。透析法または膜分離法による精製もまた使用することができる。
【００７０】
使用することができる方法の例が、実施例１に記載されている。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「凝集体」という用語は、２つ以上の抗体の間に形成し得る連結を意味し、前記抗体は、改質されているまたは改質されていない。凝集体は、多数のパラメータ、例えば、溶液中の高濃度の抗体、溶液のｐＨ、高い剪断力、結合したダイマーの数およびこれらの疎水性の性質、温度などの影響下で形成し得る（Ｗａｎｇ  ＆  Ｇｏｓｈ、２００８年、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉ．、３１８：３１１−３１６頁および本明細書中に引用された参考文献を参照）；これらパラメータのうちのいくつかの相対的影響は、明確に確立されていないことに注意されたい。タンパク質および抗体の場合、当業者であれば、Ｃｒｏｍｗｅｌｌら（２００６年、ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ、８（３）：Ｅ５７２−Ｅ５７９）を参照することになる。凝集体中の含量は、当業者に周知の技法、例えばＳＥＣ（Ｗａｌｔｅｒら、１９９３年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１２（２）：４６９−４８０頁を参照）などを用いて求めることができる。
【００７２】
ステップ（ｉ）または（ｉｉ）の後、コンジュゲート含有溶液に、限外ろ過法および／または膜分離法の追加のステップ（ｉｉｉ）を施すことができる。
【００７３】
コンジュゲートは、これらのステップの終わりに水溶液として回収される。
【００７４】
抗体
「抗体」という用語は、もっとも広範な意味において本明細書中で使用され、任意のイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥなどのモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、多クローン性抗体、多特異的抗体、キメラ抗体および抗体フラグメントを具体的に網羅する。特定の抗原に反応する抗体は、組換え型の方法、例えばファージまたは類似ベクターにおける組換え型抗体のライブラリーの選択などによって、または抗原もしくは抗原をコードする核酸で動物に免疫性を与えることによって生成することができる。
【００７５】
典型的な抗体は、ジスルフィド結合で結合されている２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖から構成される。各重鎖および軽鎖は、一定の領域および可変領域を含有する。本明細書で使用する場合、「ＶＨ」または「ＶＨ」は、抗体のイムノグロブリン重鎖の可変領域を指し、これには、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２フラグメントの重鎖が含まれる。「ＶＬ」または「ＶＬ」の言及は、抗体のイムノグロブリン軽鎖の可変領域を指し、これには、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２フラグメントの軽鎖が含まれる。各可変領域は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）または「超可変領域」と呼ばれる３つのセグメントを含有し、これらの領域は、抗原のエピトープを結合することに主に関与している。これらは通常、Ｎ−末端から連番で、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる。可変領域のさらに高度に保護された部分は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれる。ネイティブの重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域を含み、これらの領域は、βシート配置を広く採用し、３つのＣＤＲで結合されており、これら３つのＣＤＲは、βシート構造を結合しているループを形成し、場合によってβシート構造の一部を形成する。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲ領域により近接近で一緒にまとめて保持され、他の鎖からのＣＤＲにより、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１年を参照）。
【００７６】
抗体（さらなる詳細については、Ｊａｎｅｗａｙら、「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第５版、２００１年、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）は、例えばＷＯ０４０４３３４４、ＷＯ０８０１０１０１、ＷＯ０８０４７２４２またはＷＯ０５００９３６９（抗−ＣＡ６）などに記述されている抗体の中から選択することができる。
【００７７】
クラスＡのＥｐｈレセプターファミリーメンバー、例えば好ましくはヒトのＥｐｈＡ２受容体などを認識し、前記受容体のアンタゴニストとして機能する抗体またはこのフラグメントもまた考慮することができる。この抗体には、いかなるアゴニスト活性もない。抗体またはこのエピトープ結合フラグメントは、請求項１２から１５に記載ものであってよい。
【００７８】
ヒト化抗体またはこのエピトープ結合フラグメントは、ＥｐｈＡ２受容体を発現する癌細胞の増殖を阻害する追加の能力を有することが好ましい。ヒト化抗体またはこのエピトープ結合フラグメントは、ＥｐｈＡ２受容体を発現する転移性癌細胞の遊走を阻害する追加の能力を有することが好ましい。
【００７９】
ヒト化抗体は、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこのエピトープ結合フラグメントをヒト化することができる。ヒト化抗体は、ｈｕ５３．２Ｈ１１（ＷＯ２００８／０１０１０１）をコードしているポリヌクレオチド配列の部位特異的突然変異誘発により得ることができる。好ましくは、再表面化またはヒト化した型の２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体が提供され、この抗体またはこのフラグメントの表面曝露された残基が、軽鎖と重鎖の両方において置き換えられることによって、既知のヒト抗体の表面にさらによく類似する。ヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこのエピトープ結合フラグメントは、改善された特性を有する。例えば、ヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこのエピトープ結合フラグメントは、ＥｐｈＡ２受容体を特異的に認識する。より好ましくは、ヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこのエピトープ結合フラグメントは、ＥｐｈＡ２受容体発現細胞の増殖を阻害する追加の能力を有する。
【００８０】
ヒト化型２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体はまた、軽鎖と重鎖の両可変領域のこれらのそれぞれのアミノ酸配列、軽鎖と重鎖の可変領域に対する遺伝子のＤＮＡ配列、ＣＤＲの同定、これら表面アミノ酸の同定、ならびに組換え型の形態でのこれらの発現のための手段の開示に関して本明細書中で完全に特徴づけられている。しかし範囲はこれら配列を含む抗体およびフラグメントに限定されない。代わりに、ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合するすべての抗体およびフラグメントも考慮される。ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合する抗体およびフラグメントは、受容体の生物活性をアンタゴナイズすることが好ましい。このような抗体はさらに、アゴニスト活性が実質的にはないことがより好ましい。したがって、抗体およびエピトープ結合抗体フラグメントは、これらの骨格、ＣＤＲ、ならびに／または軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこのヒト化誘導体とは異なってもよく、これらは依然として本発明の範囲内に含まれる。
【００８１】
２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体のＣＤＲは、モデリングにより同定され、これらの分子構造が予測されてきた。ここでもまたＣＤＲはエピトープ認知に対して重要であるが、これらは本発明の抗体およびフラグメントには必須ではない。したがって、例えば本発明の抗体の親和性の成熟により生じる改善された特性を有する抗体およびフラグメントが提供される。
【００８２】
５３．２Ｈ１１が誘導される可能性のある、マウス軽鎖ＩｇＶｋおよびＪＫ生殖細胞系列遺伝子および重鎖ＩｇＶｈおよびＪｈ生殖細胞系列遺伝子が同定され、ＷＯ２００８／０１０１０１で開示された。前記生殖細胞系列の配列の受託番号は、それぞれＭＭＵ２３１１９６およびＡＦ３０３８３３である。このような生殖細胞系列遺伝子配列は、ＣＤＲ内のものを含めて、抗体内の体細胞変異を同定するのに有用である。
【００８３】
２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の配列ならびにこれらのＣＤＲの配列は本出願の中に記載されている。このような情報は、ヒト化型の２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体を産生するために使用することができる。本発明のヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体をｈｕ５３．２Ｈ１１の部位特異的突然変異誘発により得ることもできる。これらヒト化抗−ＥｐｈＡ２抗体またはこれらの誘導体も本発明のコンジュゲートの細胞結合剤として使用することができる。
【００８４】
したがって、一実施形態では、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含むヒト化抗体またはこのエピトープ結合フラグメントを提供する。好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体は、少なくとも１つの重鎖と少なくとも１つの軽鎖とを含み、前記重鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２および３で表されるアミノ酸配列を有する３つの連続したＣＤＲを含み、前記軽鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５および６で表されるアミノ酸配列を有する３つの連続したＣＤＲを含む。
【００８５】
ヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこのフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２からなるアミノ酸配列を有するＶＨを含むことが好ましい。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１４からなるアミノ酸配列を有するＶＬを含むヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこのフラグメントもまた好ましい。ヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体は、少なくとも１つの重鎖および少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２および３で表されるアミノ酸配列を有する３つの連続したＣＤＲを含み、前記軽鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５および６で表されるアミノ酸配列を有する３つの連続したＣＤＲを含み、前記重鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２からなるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４からなるアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００８６】
コンジュゲート
コンジュゲートは、抗体に共有結合で付加しているメイタンシノイドの１から１０個の分子を全般的に含む（いわゆる「薬物／抗体比」または「ＤＡＲ」）。この数は、結合に対して使用される実験条件（例えば、メイタンシノイドと、抗体、反応時間、溶媒の性質および（存在する場合）共溶媒との比）と共に、抗体の性質および使用されるメイタンシノイドにより異なり得る。したがって、抗体とメイタンシノイドの接触により、異なる薬物／抗体比により互いに異なるものとなるいくつかのコンジュゲート、場合によって裸の抗体、場合によって凝集体を含む混合物が生成される。したがって求められるＤＡＲは、平均値である。
【００８７】
したがって本発明はまた、請求項１から８の一項で定義された、抗体に共有結合で付加している１つ以上の化合物を含むコンジュゲートに関係している。この付加は、アミド結合を介しているのが好ましい。抗体は、請求項１２から１５のいずれか一項で定義された通りであることが好ましい。
【００８８】
ＤＡＲを求めるために本明細書中で使用される方法は、実質的に精製されたコンジュゲート溶液の２５２ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度の比率を分光光度法により測定することからなる（これは、ステップ（ｉｉ）の後である）。特に、前記ＤＡＲは、抗体に対してそれぞれ２８０および２５２ｎｍで測定された吸光係数：εΑ２８０＝２２４，０００Ｍ−１ｃｍ−１およびεΑ２５２＝８２，８８０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、抗体に対して平均１６０，０００分子量と仮定して、ならびにメイタンシノイドに対して、εＤ２８０＝５，１８０Ｍ−１ｃｍ−１およびεＤ２５２＝２６，１５９Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、分光光度法により求めることができる）。計算の方法は、Ａｎｔｏｎｙ  Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ（編）、ＬＬＣ、２００９年、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ｖｏｌ５２５、４４５、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅに基づき、以下でさらに詳細に記載されている：
２５２ｎｍ（Ａ２５２）および２８０ｎｍ（Ａ２８０）でのコンジュゲートに対する吸光度は、ＳＥＣ分析の単量体ピーク（「ＤＡＲ（ＳＥＣ）」パラメータの計算を可能にする）に対して、または従来の分光光度計装置（「ＤＡＲ（ＵＶ）」パラメータの計算を可能にする）を用いて測定される。吸光度は、以下の通り表現することができる：
Ａ２５２＝（ｃＤ×εＤ２５２）＋（ｃＡ×εＡ２５２）
Ａ２８０＝（ｃＤ×εＤ２８０）＋（ｃＡ×εＡ２８Ｏ）
（式中、
ｃＤおよびｃＡは、それぞれ、メイタンシノイドの溶液中および抗体の溶液中の濃度である。
εＤ２５２およびεＤ２８０は、それぞれ２５２ｎｍおよび２８０ｎｍでのメイタンシノイドのモル吸光係数である。
εＡ２５２およびεΑ２８０は、それぞれ、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍでの抗体のモル吸光係数である。）。
２つの未知数があるこれら２つの方程式を解くことによって、以下の方程式が導かれる：
ｃＤ＝［（εΑ２８０×Ａ２５２）−（εＡ２５２×Ａ２８０）］／［（εＤ２５２×εΑ２８０）−（εＤ２５２×εＤ２８０）］
ｃＡ＝［Ａ２８０−（ｃＤ×εＤ２８０）］／εΑ２８０ο
【００８９】
次いで平均ＤＡＲを、薬物濃度と抗体の濃度との比から計算する：
ＤＡＲ＝ｃＤ／ｃＡ
【００９０】
ＵＶ分光光度計（ＤＡＲ（ＵＶ））で測定した平均ＤＡＲは、より具体的には４より上、より具体的には４と１０の間、さらにより具体的には４と７の間である。
【００９１】
コンジュゲートおよび式（Ｉ）の化合物も、抗癌剤として使用することができる。有利なことに、抗体は、腫瘍細胞に対して選択的な薬剤を有することを可能にし、したがってメイタンシノイドを前記細胞に極めて接近させ、またはメイタンシノイドが直接これら内部に狙いを定めるようにさせる（「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．２００８年、１４、１５４−１６９頁；「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｔｏ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ」Ｃｈａｒｉ  Ｒ．、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２００８年、４１、９８−１０７頁を参照）。固体または液性腫瘍を治療することができる。
【００９２】
コンジュゲートは、緩衝水溶液の形態で、好ましくは１と１０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で製剤化することができる。溶液は、そのまま投与することができ、または溶液を希釈することによって、潅流用の溶液を形成することができる。
【実施例】
【００９３】
方法Ａ：高圧液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）
スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ−ＳＱＤシステム上で、正および／または負のエレクトロスプレーモード（ＥＳ＋／−）で得た。クロマトグラフィーの条件は以下の通り：カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ−２．１×３０ｍｍ；溶媒：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸）；カラム温度：４５℃；流速：０．６ｍｌ／分；勾配（２分）：５から５０％のＢ、１分；１．３分：１００％のＢ；１．４５分：１００％のＢ；１．７５分：５％のＢ。
【００９４】
方法Ｂ：高圧液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）
スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  ＺＱシステム上で、正および／または負のエレクトロスプレーモード（ＥＳ＋／−）で得た。クロマトグラフィーの条件は以下の通り：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ２．５μｍ  ３×５０ｍｍ；溶媒：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸；カラム温度：７０℃；流速：０．９ｍｌ／分；勾配（７分）：５から１００％のＢ、５．３分；５．５分：１００％のＢ；６．３分：５％のＢ。
【００９５】
方法Ｃ：質量分析（ＭＳ）
スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ−ＳＱＤシステム上で、正および／または負のエレクトロスプレーモード（ＥＳ＋／−）で得た。クロマトグラフィーの条件は以下の通り：カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ−２．１×５０ｍｍ；溶媒：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸）；カラム温度：５０℃；流速：１ｍｌ／分；勾配（２分）：５から５０％のＢ、０．８分；１．２分：１００％のＢ；１．８５分：１００％のＢ；１．９５：５％のＢ。
【００９６】
方法Ｄ：高圧液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）
スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ−ＳＱＤシステム上で、正および／または負のエレクトロスプレーモード（ＥＳ＋／−）で得た。クロマトグラフィーの条件は以下の通り：カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ−２．１×５０ｍｍ；溶媒：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸）；カラム温度：５０℃；流速：１ｍｌ／分；勾配（２分）：５から５０％のＢ、０．８分；１．２分：１００％のＢ；１．８５分：１００％のＢ；１．９５：５％のＢ。
【００９７】
方法Ｇ：コンジュゲートの脱グリコシル化および高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）
脱グリコシル化は、グリコシダーゼを用いた酵素消化の技法である。脱グリコシル化は、５００μｌのコンジュゲート＋１００μｌのトリス緩衝液ＨＣｌ  ５０ｍＭ＋１０μｌのグリカナーゼ−Ｆ酵素（１００単位の凍結乾燥した酵素／１００μｌの水）から生じる。培地をボルテックスし、一晩３７℃で維持する。この脱グリコシル化した試料は、これでいつでもＨＲＭＳで分析を受けられる状態にある。Ｗａｔｅｒｓ  Ｑ−Ｔｏｆ−２システム上で、エレクトロスプレー正モード（ＥＳ＋）において質量スペクトルを得た。クロマトグラフィーの条件は、以下の通り：カラム：４μｍ  ＢｉｏＳｕｉｔｅ  ２５０  ＵＲＨ  ＳＥＣ  ４．６×３００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）；溶媒：Ａ：ギ酸アンモニウム２５ｍＭ＋１％ギ酸：Ｂ：ＣＨ３ＣＮ；カラム温度：３０℃；流速０．４ｍｌ／分；定組成溶離７０％Ａ＋３０％Ｂ（１５分）。
【００９８】
方法Ｈ：分析用のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬ  ５μｍカラム、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、ＴＯＳＯＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ、ＬＬＣパーツ＃０８５４１
移動相：ＫＣｌ（０．２Ｍ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．０５２Ｍ）、Ｋ２ＨＰＯ４（０．１０７Ｍ）、ｉＰｒＯＨ（量：２０％）
分析条件：０．５ｍｌ／分で３０分の定組成溶離
分光光度計検出器Ｌ２４５５ＤＡＤを用いて、Ｌａｃｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ  ＨＰＬＣシステム（Ｍｅｒｃｋ）上で分析を実施。
【００９９】
緩衝液の含量
緩衝液Ａ（ｐＨ６．５）：ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（２ｍＭ）
緩衝液ＨＧＳ（ｐＨ５．５）：ヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、ショ糖５％（ｗ／ｖ）、ＨＣＩ（８ｍＭ）
【０１００】
使用されている略語
ＡｃＯＥｔ：酢酸エチル；ＡＬＫ：（Ｃ１−Ｃ１２）アルキレン基、特に（Ｃ１−Ｃ６）アルキレン；ＤＡＲ：薬物抗体比；ＤＢＵ：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン；ＤＣＣ：Ν，Ν’−ジシクロヘキシルカルボジイミド；ＤＣＭ：ジクロロメタン；ＤＥＡＤ：アゾジカルボン酸ジエチル；ＤＩＣ：Ν，Ν’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＩＰＥＡ：Ν，Ν−ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＡ：ジメチルアセトアミド；ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン；ＤＭＥ：ジメトキシエタン；ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；ε：モル吸光係数；ＥＥＤＱ：２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン；ＥＤＣＩ：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド；ＥＤＴＡ：エチレンジアミン−テトラ酢酸；Ｆｍｏｃ：フルオレニルメトキシカルボニル；Ｈａｌ：ハロゲン原子；ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸；ＨＲＭＳ：高分解能質量分析；ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ｉＰｒＯＨ：イソプロピルアルコール；ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリジノン；Ｒｆ：保持因子；ＲＰ：減圧；ＲＴ：室温；ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー；ＴＢＤＭＳ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル；ＴＥＡ：トリエチルアミン；ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸；ＴＦＡＡ：トリフルオロ酢酸無水物；ＴＦＦ：タンジェンシャルフローフィルトレーション；ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；ＴＩＰＳ：トリイソプロピルシリル；ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー；ｔＲ：保持時間。
【０１０１】
実施例で使用されている抗体
以下の２つの抗体を使用してコンジュゲートを調製した。
ｈｕ２Ｈ１１：（ＷＯ２００８０１０１０１では、ｈｕ５３２Ｈ１１としても参照されている）：この抗体は、アメリカ培養細胞系統保存機関で、受託番号ＰＴＡ−７６６２、ブダペスト条約下で預けられたハイブリドーマにより産生し、ＰＣＴ出願ＷＯ２００８／０１０１０１に記載されている。
ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４：このヒト化抗体は、ＥｐｈＡ２受容体に結合し、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の重鎖およびＳＥＱ  ＮＯ：１６の軽鎖からなるｈｕ５３２Ｈ１１の部位特異的突然変異誘発により得られる。
【０１０２】
［実施例１］
【０１０３】
【化２５】
2013506653.tif 000028
１．１．コンジュゲートｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４の調製
磁気撹拌下、ＲＴで、９ｍｌのｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４（緩衝液Ａ中１４．３６ｍｇ／ｍｌ）を添加し、次いで１６．８５ｍｌの緩衝液Ａ、３．２３ｍｌのＨＥＰＥＳ  １Ｍ、１．５９ｍｌのＤＭＡ、続いてＬ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの、１．６４ｍｌの１０ｍＭ  ＤＭＡ溶液を添加する。ＲＴで１時間３０分後、Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの追加の０．０８５ｍｌの１０ｍＭ  ＤＭＡ溶液を添加する。ＲＴで１時間４５分後、粗製の結合培地を６０ｍｌのＨＧＳ緩衝液で希釈し、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３カセット上のＴＦＦで精製する。約１０の試料容量のＨＧＳ緩衝液に対して試料を透析ろ過し、次いで収集する。ＴＦＦタンクおよびラインを追加の１０ｍｌのＨＧＳ緩衝液で洗浄する。２つの溶液を混合し、０．２２μｍのＰＶＤＦを介してろ過滅菌し、Ａｍｉｃｏｎ１５上で濃縮し、０．２２μｍＰＶＤＦを介してろ過滅菌する。１７ｍｌのｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４コンジュゲート（ｃ＝５．７６ｍｇ／ｍｌ）をこのようにして得た。次いで最終の薬剤含有量および単量体の純度についてこのコンジュゲートを分析する。ＳＥＣ分析（方法Ｈ）：ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝５．４；ＲＴ＝１６．７５７分；単量体の純度＝９９．５％；ＨＲＭＳデータ：図１を参照。
【０１０４】
１．２．Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの調製
ＲＴでの磁気撹拌下、１５４．３ｍｇのＬ−ＤＭ４（ＷＯ０４／１０３２７２に従い調製−化合物４ｂを参照）をガラスバイアル中に導入する。次いで、９０ｍｇの３−［２−（２−｛２−［２−（２−ブロモ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルの、０．９４ｍｌのＤＭＡ中溶液を添加し、続いて３６μｌのＤＩＥＡを添加する。ＲＴで２３時間後、この反応培地を５ｍｌのＡｃＯＥｔで希釈し、７ｍｌの水で洗浄する。水相を５ｍｌのＡｃＯＥｔで抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で脱水し、ＲＰ下で濃縮乾燥させる。２２８ｍｇの淡黄色の粘性油を得る。この生成物を最小量のＤＭＡで希釈し、３０ｇのＣ１８−グラフトシリカゲル（水：アセトニトリル９５：５から５：９５（容量）の勾配溶出）上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。ＲＰ下で画分２および３を濃縮後、無色の粘性の油を得る。この生成物を最小量のＤＭＡで希釈し、３０ｇのＣ１８−グラフトシリカゲル（水：アセトニトリル９５：５から５：９５（容量）の勾配溶出）上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。画分３３から３５をＲＰ下で濃縮後、４１ｍｇのＬ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルを白色メレンゲのような生成物の形態で得る。質量スペクトル（Ｂ）：ＲＴ＝４．０６分；［Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ］＋：ｍ／ｚ  １１６４；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １１８２；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ  １２２６；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，δ：ｐｐｍ，クロロホルム−ｄ）：０．８０（ｓ，３Ｈ）；１．２１（ｓ，３Ｈ）；１．２２（ｓ，３Ｈ）；１．２５（ｍ，１Ｈ）；１．２９（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ）；１．４６（ｍ，１Ｈ）；１．５７（ｄ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ，１Ｈ）；１．６４（ｓ，３Ｈ）；１．７６から１．８３（ｍ，１Ｈ）；１．８８から１．９６（ｍ，１Ｈ）；２．１８（ｄｄ，Ｊ＝２．５および１４．３Ｈｚ，１Ｈ）；２．３６（ｍ，１Ｈ）；２．５３（ｍ，１Ｈ）；２．６１（ｄｄ，Ｊ＝１２．５および１４．３Ｈｚ，１Ｈ）；２．８２から２．９２（ｍ，１０Ｈ；２．９８（ｄ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ，１Ｈ）；３．０３（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ）；３．１５（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ）；３．２２（ｓ，３Ｈ）；３．３２（ｓ  広幅，１Ｈ）；３．３６（ｓ，３Ｈ）；３．４２（ｍ，２Ｈ）；３ｖ５０（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）；３．５３（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）；３．５８から３ｖ６７（ｍ，１３Ｈ）；３．８４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；３．９９（ｓ，３Ｈ）；４．２７（ｍ，１Ｈ）；４．７７（ｄｄ，Ｊ＝２．９および１１．９Ｈｚ，１Ｈ）；５．４２（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ）；５．６６（ｄｄ，Ｊ＝９．１および１５．４Ｈｚ，１Ｈ）；６．２３（ｓ，１Ｈ）；６．４３（ｄｄ，Ｊ＝１１．３および１５．４Ｈｚ，１Ｈ）；６．６４（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，１Ｈ）；６．７４（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ）；６．８５（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，１Ｈ）；７．０８（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）
【０１０５】
１．３．３−［２−（２−｛２−［２−（２−ブロモ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルの調製
磁気撹拌下、ＲＴで、６７１．４ｍｇの３−（２−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸（ＣＡ（ＰＥＧ）４、Ｐｉｅｒｃｅ）をガラスバイアル内に導入する。次いで、５９７．４ｍｇのブロモ−酢酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルの、１４ｍｌのＤＣＭ中溶液を添加する。ＲＴで１５分後、０．３９６ｍｌのＤＩＣを添加する。１時間３０分後、粗製の反応培地を焼結ガラス上でろ過し、１００ｇのＣＮ−グラフトシリカゲル（勾配溶出、ｎヘプタン／ｉＰｒＯＨ／ＡｃＯＥｔ、ｉＰｒＯＨ部分を増加）上で、フラッシュクロマトグラフィーにより濾液を精製する。画分３０から４５をＲＰ下で濃縮後、７６１ｍｇの３−［２−（２−｛２−［２−（２−ブロモ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルを無色の油の形態で得る。質量スペクトル（Ａ）：ＲＴ＝０．７４分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ４８３／４８５（Ｂｒの２つの同位体による２つのピーク）；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ５２７／５２９（Ｂｒの２つの同位体による２つのピーク）。
【０１０６】
ブロモ−酢酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルは、公開プロトコル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７４年、４８１頁）に従い調製することができた。
【０１０７】
［実施例２］
【０１０８】
【化２６】
2013506653.tif 000029
２．１．コンジュゲートｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＭｅＡｃ−ＤＭ４の調製
ＲＴでの磁気撹拌下、４ｍｌのｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４（緩衝液Ａ中１４．３６ｍｇ／ｍｌ）を添加し、次いで７．５ｍｌの緩衝液Ａ、１．４５ｍｌのＨＥＰＥＳ  １Ｍ、１．０５ｍｌのＤＭＡ、続いてＬ−ＤＭ４−ＡｃＮＭｅ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの、０．３９ｍｌの１０ｍＭ  ＤＭＡ溶液を添加する。ＲＴで３０分後、Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＭｅ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの、追加の０．１９ｍｌの１０ｍＭ  ＤＭＡ溶液を添加する。ＲＴで３時間後、粗製の結合培地を６５ｍｌのＨＧＳ緩衝液で希釈し、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３カセット上でＴＦＦにより精製する。約１０の試料容量のＨＧＳ緩衝液に対して試料を透析ろ過し、次いで収集する。ＴＦＦタンクおよびラインを追加の１０ｍｌのＨＧＳ緩衝液で洗浄する。この２つの溶液を混合し、Ａｍｉｃｏｎ１５上で濃縮し、０．２２μｍＰＶＤＦを介してろ過滅菌する。８．５ｍｌのｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＭｅＡｃ−ＤＭ４コンジュゲート（ｃ＝６．０１ｍｇ／ｍｌ）をこのようにして得た。次いで最終の薬剤含有量および単量体の純度についてコンジュゲートを分析する。ＳＥＣ分析（Ｈ）：ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝５．５；ＲＴ＝１６．７分；単量体の純度＝９９．４％；ＨＲＭＳデータ：図２を参照。
【０１０９】
２．２．Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＭｅ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの調製
ＲＴでの磁気撹拌下、１３３．４ｍｇのＬ−ＤＭ４をガラスバイアル内に導入する。次いで、８５ｍｇの３−｛２−［２−（２−｛２−［（２−ブロモ−アセチル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルの、０．２ｍｌのＤＭＡ中溶液を添加し、続いて３２．９μｌのＤＩＥＡを添加する。ＲＴで１時間後、この反応培地を、３０ｇのＣ１８−グラフトシリカゲル（水：アセトニトリル９５：５から５：９５（容量）の勾配溶出）上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。所望の生成物を含有する画分をＲＰ下で濃縮後、７１．３ｍｇのＬ−ＤＭ４−ＡｃＮＭｅ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルを無色ガラスのような生成物の形態で得る。質量スペクトル（Ｄ）：ＲＴ＝０．９８分；［Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ］＋：ｍ／ｚ  １１７８（主要シグナル）；［Ｍ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ  １２１８；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ  １２４０；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，δ：ｐｐｍ，クロロホルム−ｄ）：０．８１（ｓ，３Ｈ）；１．２０から１．３３（ｍ，１３Ｈ）；１．４２から１．５２（ｍ，１Ｈ）；１．５６から１．６１（ｍ，１Ｈ）；１．６５（ｓ，３Ｈ）；１．７３から１．８３（ｍ，１Ｈ）；１．９６から２．０４（ｍ，１Ｈ）；２．１９（ｄｄ，Ｊ＝２．８および１４．４Ｈｚ，１Ｈ）；２．２９から２．４１（ｍ，１Ｈ）；２．５５から２．６６（ｍ，２Ｈ）；２．８３から２．９３（ｍ，１２Ｈ）；３．０４（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ）；３．１２（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ）；３．１８から３．２５（ｍ，５Ｈ）；３．３７（ｓ，３Ｈ）；３．４７から３．５４（ｍ，３Ｈ）；３．５７から３．６８（ｍ，１５Ｈ）；３．８５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ）；３．９９（ｓ，３Ｈ）；４．２９（ｍ，１Ｈ）；４．７９（ｄｄ，Ｊ＝２．８および１２．２Ｈｚ，１Ｈ）；５．４１（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ）；５．６８（ｄｄ，Ｊ＝９．３および１５．２Ｈｚ，１Ｈ）；６．２３（ｓ，１Ｈ）；６．４３（ｄｄ，Ｊ＝１１．０および１５．２Ｈｚ，１Ｈ）；６．６６（ｓ，１Ｈ）；６．７４（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ）；６．８３（ｓ，１Ｈ）。
【０１１０】
２．３．３−｛２−［２−（２−｛２−［（２−ブロモ−アセチル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸２−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルの調製
【０１１１】
【化２７】
2013506653.tif 000030
磁気撹拌下、ＲＴで、１１５．１ｍｇの３−（２−｛２−［２−（２−メチルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸、１．５ｍｌのＤＣＭ、９７．３ｍｇのブロモ−酢酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルを丸底フラスコ内に逐次的に導入する。２時間後、７２μｌのＤＩＥＡを添加し、ＲＴでさらに１時間後、７０．２μｌのＤＩＣを添加する。粗製の反応培地をＲＴで４時間保持し、−２０°Ｃで１６時間保持し、次いで３０ｇのシリカゲル（ＤＣＭ：メタノール０：１００から３：９７（容量）の勾配溶出）上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。所望の生成物を含有する画分をＲＰ下で濃縮後、８５．８ｍｇの３−｛２−［２−（２−｛２−［（２−ブロモ−アセチル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルを白色固体の形態で得る。質量スペクトル（Ａ）：ＲＴ＝０．８４分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ４９７／４９９
【０１１２】
２．４．３−（２−｛２−［２−（２−メチルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸の調製
【０１１３】
【化２８】
2013506653.tif 000031
アルゴンの不活性雰囲気下、丸底フラスコ内で、磁気撹拌しながら、１２０．１ｍｇの３−［２−（２−｛２−［２−（２，２，２−トリフルオロ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸メチルエステル、１ｍｌの無水ＴＨＦおよび５９．８μｌのＣＨ３ｌを逐次的に導入する。この反応培地を氷／水槽を用いて約０℃で冷却し、１６．１ｍｇのＮａＨ（油中、純度５０％）を少しずつゆっくりと添加する。０°Ｃで１５分およびＲＴで１時間後、粗製の反応培地をＲＰ下で濃縮乾燥し、０．５ｍｌのＴＨＦおよび０．８ｍｌの水で希釈する。次いでＲＴで、３０．６ｍｇのＬｉＯＨをこの反応物培地に添加する。粗製の反応培地をＲＴで２時間保持し、−２０℃で１６時間保持し、次いで３０ｇのＣ１８−グラフトシリカゲル（水：アセトニトリル９５：５から５：９５（容量）の勾配溶出）上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。所望の生成物を含有する画分をＲＰ下で濃縮後、１１５．３ｍｇの３−（２−｛２−［２−（２−メチルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸を黄色油の形態で得る。
【０１１４】
２．５．３−［２−（２−｛２−［２−（２，２，２−トリフルオロ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸メチルエステルの調製
【０１１５】
【化２９】
2013506653.tif 000032
アルゴンの不活性雰囲気下、磁気撹拌しながら、２３０ｍｇの３−（２−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸（ＣＡ（ＰＥＧ）４、Ｐｉｅｒｃｅ）、２ｍｌのＤＣＭおよび１ｍｌのメタノールを、丸底フラスコ内に、逐次的に導入する。ＲＴで、１ｍｌのトリメチルシリルジアゾメタン（ヘキサン中２Ｍ溶液）をこの反応物培地にゆっくりと添加する。ＲＴで２時間後、過剰なトリメチルシリルジアゾメタンを、酢酸の添加により中和する。次いでＲＰ下で粗製物を蒸発乾燥させる。得た残渣を２ｍｌのＤＣＭで希釈し、水−氷浴を用いて０℃に冷却し、次いで３６３μｌのＴＥＡおよび３００μｌのＴＦＡＡを逐次的に添加する。ＲＴで２時間３０分間および−２０℃で１９時間後、３６３μｌのＴＥＡおよび３００μｌのＴＦＡＡを逐次的に添加する。ＲＴで４時間３０分後、粗製物を−２０℃でストックし、次いで３０ｇのＣ１８−グラフトシリカゲル（水：アセトニトリル９５：５から５：９５（容量）の勾配溶出）上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。所望の生成物を含有する画分をＲＰ下で濃縮後、１２３ｍｇの３−［２−（２−｛２−［２−（２，２，２−トリフルオロ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸メチルエステルを淡黄色の油の形態で得る。質量スペクトル（Ａ）：ＲＴ＝０．９０分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ３７６；［Ｍ−Ｈ］−：ｍ／ｚ３７４。
【０１１６】
［実施例３］
【０１１７】
【化３０】
2013506653.tif 000033
３．１．ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ８−ＮＨＡｃ−ＤＭ４のコンジュゲートの調製
ＲＴでの磁気撹拌下、４ｍｌのｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４（緩衝液Ａ中１４．３６ｍｇ／ｍｌ）を添加し、次いで７．５ｍｌの緩衝液Ａ、１．４５ｍｌのＨＥＰＥＳ  １Ｍ、１．０５ｍｌのＤＭＡを添加し、続いてＬ−ＤＭ４−ＡｃＮＭｅ−ＰＥＧ８−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの０．４０５ｍｌの１０ｍＭ  ＤＭＡ溶液を添加する。ＲＴで３０分後、Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＭｅ−ＰＥＧ８−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの追加の０．１ｍｌの１０ｍＭＤＭＡ溶液を添加する。ＲＴで１時間４５分後、粗製の結合培地を６０ｍｌのＨＧＳ緩衝液で希釈し、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３カセット上で、ＴＦＦで精製する。約１０の試料容量のＨＧＳ緩衝液に対して試料を透析ろ過し、次いで収集する。ＴＦＦタンクおよびラインを追加の１０ｍｌのＨＧＳ緩衝液で洗浄する。２つの溶液を混合し、Ａｍｉｃｏｎ１５上で濃縮し、０．２２μｍＰＶＤＦを介してろ過滅菌する。７．０ｍｌのｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ８−ＡｃＮＭｅ−ＤＭ４コンジュゲート（ｃ＝６．９５ｍｇ／ｍｌ）をこのようにして得た。次いで最終の薬剤含有量および単量体の純度についてコンジュゲートを分析する。ＳＥＣ分析（Ｈ）：ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝５．０；ＲＴ＝１６．５９３分；単量体純度＝９９．５％：ＨＲＭＳデータ：図３を参照。
【０１１８】
３．２．Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ８−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの調製
ＲＴでの磁気撹拌下、６５ｍｇの３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（３−ブロモ−プロピオニルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルをガラスバイアル内に導入し、続いて６７．７ｍｇのＬ−ＤＭ４の、０．８５ｍｌのＤＭＡおよび１６．５μｌのＤＩＥＡ中溶液を導入する。ＲＴで４８時間後、１０ｇのシリカゲル（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  １００：０から９０：１０（容量）の勾配溶出）上でフラッシュクロマトグラフィーによりこの反応培地を精製する。画分１８から２６をＲＰ下で濃縮後、１７ｍｇのＬ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ８−ＣＯＮＨＳ活性化エステルを無色のガラスの形態で得る。質量スペクトル（Ｂ）：：ＲＴ＝４．０８分；［Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ］＋：ｍ／ｚ  １３４０（主要シグナル）；［Ｍ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ  １３８０；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ  １４０２；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，δ：ｐｐｍ，クロロホルム−ｄ）：０．８１（ｓ，３Ｈ）；１．２２（ｓ，３Ｈ）；１．２３（ｓ，３Ｈ）；１．２６（ｍ，１Ｈ）；１．３０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）；１．４１から１．５２（ｍ，１Ｈ）；１  ．６５（ｓ，３Ｈ）；１．８０（ｍ，１Ｈ）；１．８９から１．９９（ｍ，１Ｈ）；２．１９（ｍ，１Ｈ）；２．３７（ｍ，１Ｈ）；２．４７から２．６７（ｍ，２Ｈ）；２．８１から２．９３（ｍ，１０Ｈ）；２．９９（ｄ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ，１Ｈ）；３．０４（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ）；３．１６（ｄ  広幅，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，１Ｈ）；３．２３（ｓ，３Ｈ）；３．３２（ｓ  広幅，１Ｈ）；３．３７（ｓ，３Ｈ）；３．４４（ｍ，２Ｈ）；３．５１（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）；３．５４（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ）；３．５９から３．７３（ｍ，２９Ｈ）；３．８６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ）；４．００（ｓ，３Ｈ）；４．２２から４．３３（ｍ，１Ｈ）；４．７８（ｄｄ，Ｊ＝２．９および１２．２Ｈｚ，１Ｈ）；５．４３（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）；５．６７（ｄｄ，Ｊ＝９．０および１５．２Ｈｚ，１Ｈ）；６．２３（ｓ，１Ｈ）；６．４４（ｄｄ，Ｊ＝１１．２および１５．２Ｈｚ，１Ｈ）；６．６５（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ）；６．７５（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ）；６．８６（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ）；７．０２から７．１３（ｍ，１Ｈ）。
【０１１９】
３．３．３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（３−ブロモ−プロピオニルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルの調製：
【０１２０】
【化３１】
2013506653.tif 000034
ＲＴでの磁気撹拌下、１００ｍｇの３−（２−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸（ＣＡ（ＰＥＧ）４、Ｐｉｅｒｃｅ）、２ｍｌのＤＣＭおよび５３．５ｍｇのブロモ−酢酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルをガラスバイアル内に逐次的に導入する。ＲＴで１時間後、３５．１μｌのＤＩＣを添加する。１時間後、粗製の反応培地を焼結ガラス上でろ過し、ＲＰ下で濃縮乾燥させ、１０ｍｌのＡｃＯＥｔで希釈し、焼結ガラス上でろ過し、ＲＰ下で濃縮乾燥する。７６．５ｍｇの３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（３−ブロモ−プロピオニルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルを無色の油の形態で得る。質量スペクトル（Ａ）：ＲＴ＝０．８０分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ６５９／６６１；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ７０３／７０５
【０１２１】
［実施例４］
【０１２２】
【化３２】
2013506653.tif 000035
４．１．コンジュゲートｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−アリル−ＤＭ４の調製
ＲＴでの磁気撹拌下、４ｍｌのｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４（緩衝液Ａ中１４．３６ｍｇ／ｍｌ）を添加し、次いで７．５ｍｌの緩衝液Ａ、１．４５ｍｌのＨＥＰＥＳ  １Ｍ、１．１４ｍｌのＤＭＡを添加し、続いてＬ−ＤＭ４−アリル−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの、０．３ｍｌの１０ｍＭ  ＤＭＡ溶液を添加する。ＲＴで３０分後、Ｌ−ＤＭ４−アリル−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの追加の０．１２５ｍｌの１０ｍＭ  ＤＭＡ溶液を添加する。ＲＴで１時間２５分後、粗製の結合培地を６５ｍｌのＨＧＳ緩衝液で希釈し、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３カセット上で、ＴＦＦで精製する。約１０の試料容量のＨＧＳ緩衝液に対して試料を透析ろ過し、次いで収集する。ＴＦＦタンクおよびラインを追加の１０ｍｌのＨＧＳ緩衝液で洗浄する。２つの溶液剤を混合し、Ａｍｉｃｏｎ１５上で濃縮し、０．２２μｍのＰＶＤＦを介してろ過滅菌する。８．０ｍｌのｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−アリル−ＤＭ４コンジュゲート（ｃ＝５．２２ｍｇ／ｍｌ）を得た。次いで、最終の薬剤含有量および単量体の純度についてコンジュゲートを分析する。ＳＥＣ分析（Ｈ）：ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝５．３；ＲＴ＝１６．７６７分；単量体の純度＝９９．４％；ＨＲＭＳデータ：図４を参照。
【０１２３】
４．２．Ｌ−ＤＭ４−アリル−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの調製
ＲＴでの磁気撹拌下、７０ｍｇのＬ−ＤＭ４、４５ｍｇの３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（ブロモ−アリル−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ）、０．５ｍｌのＤＭＡおよび２３．５μｌのＤＩＥＡをガラスバイアル内に逐次的に導入する。ＲＴで２時間および−２０℃で１７時間後、５０μｌのＤＩＥＡを添加する。ＲＴで２４時間後、この反応培地を、３０ｇのＣ−１８グラフトシリカゲル（水：アセトニトリル９５：５から５：９５（容量）の勾配溶出）上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。所期の生成物を含有する画分をＲＰで濃縮後、４７．１ｍｇのＬ−ＤＭ４−アリル−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルを白色固体の形態で得る。質量スペクトル（Ｄ）：ＲＴ＝１．０６分；［Ｍ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ  １１７３；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，δ：ｐｐｍ，クロロホルム−ｄ）：０．８１（ｓ，３Ｈ）；１．１８から１．３９（ｍ，１３Ｈ）；１．４２から１．５２（ｍ，１Ｈ）；１．５８（ｄ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ，１Ｈ）；１．６５（ｓ，３Ｈ）；１．７３から１．８２（ｍ，１Ｈ）；１．８６から１．９５（ｍ，１Ｈ）；２．１９（ｄ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ，１Ｈ）；２．４０（ｍ，１Ｈ）；２．５１から２．６５（ｍ，２Ｈ）；２．８２から２．９５（ｍ，９Ｈ）；２．９８から３．０７（ｍ，２Ｈ）；３．１２（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ）；３．１８から３．２７（ｍ，１Ｈ）；３．２３（ｓ，３Ｈ）；３．３６（ｓ，３Ｈ）；３．５１（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）；３．５４から３．８２（ｍ，１３Ｈ）；３．８６（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；３．９１から３．９５（ｍ，２Ｈ）；３．９９（ｓ，３Ｈ）；４．２８（ｔ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ）；４．７８（ｄｄ，Ｊ＝２．６および１１．９Ｈｚ，１Ｈ）；５．４４（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ）；５．４９から５．６３（ｍ，２Ｈ）；５．６８（ｄｄ，Ｊ＝９．１および１５．０Ｈｚ，１Ｈ）；６．２４（ｓ，１Ｈ）；６．４３（ｄｄ，Ｊ＝１１．１および１５．０Ｈｚ，１Ｈ）；６．６６（ｓ，１Ｈ）；６．７７（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，１Ｈ）；６．８３（ｓ，１Ｈ）。
【０１２４】
４．３．３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルの調製
【０１２５】
【化３３】
2013506653.tif 000036
ＲＴで、２００ｍｇの３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸、４ｍｌのＤＣＭおよび２３２．３ｍｇの担持されたＤＣＣ（２当量）をガラスバイアル内に逐次的に導入する。ＲＴで１時間後、６４．８ｍｇのＮＨＳを添加する。ＲＴで５時間後、粗製物を焼結ガラスろ過し、固体をＤＣＭで洗浄し、合わせた濾液をＲＰ下で濃縮乾燥させる。１５ｇのシリカゲル（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ  ０：１００から１０：９０（容量）の勾配溶出）上でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製および所期の生成物を含有する画分のＲＰ下での濃縮により、生成した４６ｍｇの３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（ブロモ−アリル−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ）を淡黄色の油の形態で得る。質量スペクトル（Ａ）：ＲＴ＝１．０２分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ４５４／４５６；［Ｍ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ４７６／４７８；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ４９８／５００。
【０１２６】
４．４．３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸の調製
【０１２７】
【化３４】
2013506653.tif 000037
ＲＴで、１ｇの３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（市販のもの）、６ｍｌのＴＦＡおよび３ｍｌのＤＣＭの溶液を３時間撹拌し、次いでＲＰ下で濃縮乾燥させる。油性の残渣をトルエンで希釈し、ＲＰ下で濃縮乾燥させて、褐色油の形態で８５３ｍｇの３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸を生成する。
【０１２８】
［実施例５］
５．１．コンジュゲートｈｕ２Ｈ１１−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４の調製
コンジュゲートｈｕ２Ｈ１１−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４は、実施例１と類似の方法で調製することができた。撹拌下、ＲＴで、１ｍｌのｈｕ２Ｈ１１（緩衝液Ａ中８．５２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、次いで０．７ｍｌの緩衝液Ａ、０．２１３ｍｌのＨＥＰＥＳ  １Ｍ、０．７ｍｌのＤＭＡ、続いて０．０８５ｍｌのＬ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの１０ｍＭ  ＤＭＡ溶液を０．１２８ｍｌのＤＭＡで希釈する。ＲＴで２時間後、粗製の培地をＡｍｉｃｏｎ４上で、７０００Ｇで濃縮し、Ｎａｐ−１０カラム上で緩衝液をＨＧＳ緩衝液と交換し、最後に５ｍｌ  Ｚｅｂａカラム上で精製する。１．１５ｍｌのｈｕ２Ｈ１１−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４コンジュゲート（ｃ＝３．７８ｍｇ／ｍｌ）をこのようにして得た。最終の薬剤含有量および単量体の純度についてコンジュゲートを分析する。ＳＥＣ分析（方法Ｈ）：ＤＡＲ（ＵＶ）＝６．６；ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝５．６；ＲＴ＝１５．３８７分；単量体の純度＝９９．７％；ＨＲＭＳデータ：図５を参照。
【０１２９】
同様に、ｈｕ２Ｈ１１の関与する他のコンジュゲートおよび実施例６から８に記載されたものを調製した（表ＩＩａを参照）。
【０１３０】
［実施例９］
ＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍細胞の増殖の阻害（ＥＣＡＡＣ  ｒｅｆ．＃９２０２０４２４から）
指数増殖期の細胞をトリプシン処理し、適切な培地内に再懸濁させた（ＤＭＥＭ／Ｆ１２  Ｇｉｂｃｏ  ＃２１３３１；１０％ＳＶＦ  Ｇｉｂｃｏ  ＃１０５００−０５６；２ｎＭグルタミン  Ｇｉｂｃｏ  ＃２５０３０）。完全な血清含有培地の中、５０００細胞／ウェルの密度で、細胞懸濁液を９６−ウェルＣｙｔｏｓｔａｒ培養プレート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ、＃ＲＰＮＱ０１６３）に分配した。４時間のコーティング後、三連のウェルに、１０−７から１０−１２Ｍの間の範囲の濃度でコンジュゲートの段階希釈を添加した。コンジュゲートの存在下、３７℃／５％ＣＯ２で３日間細胞を培養した。第４日目、１０μｌの１４Ｃ−チミジン溶液（０．１μＣｉ／ウェル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ＃  ＮＥＣ５６８２５０００））を各ウェルに添加した。ｍｉｃｒｏｂｅｔａ放射性カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、実験が開始されてから９６時間、１４Ｃ−チミジンの取り込みを測定した。無細胞の試薬ブランクを試験ウェルの記録から引き算し、コンジュゲートで処理した細胞の記録を、ビヒクル処理した細胞の対照ウェルからの記録の平均値で割ることによって得た、残存する画分として、このデータをプロットした。これら実験において、実験開始時に、１μΜの濃縮で、裸の抗体（ｈｕ２Ｈ１１またはｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４）を添加し、増殖の阻害を以前に述べた通り測定した。
【０１３１】
表ＩＩａおよびＩＩｂで報告された結果は、裸のｈｕ２Ｈ１１または／ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４の存在下で実施された競合実験によると、コンジュゲートは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞に対して強力なインビトロの増殖阻害特性を示し、抗原への結合を介して作用することを示唆している。
【０１３２】
【表２】
2013506653.tif 000038
【０１３３】
【表３】
2013506653.tif 000039
【０１３４】
［実施例１０］
Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ４−ＣＯＯＭｅ
【０１３５】
【化３５】
2013506653.tif 000040
１０．１．遊離薬物Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ４−ＣＯＯＭｅの調製
【０１３６】
【化３６】
2013506653.tif 000041
磁気撹拌下、ＲＴで、Ａｒの不活性雰囲気下、ガラスバイアル内に、５７．４ｍｇの３−［２−（２−｛２−［２−（２−ブロモ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸メチルエステル、８０ｍｇのＬ−ＤＭ４の、０．４４ｍｌのＤＭＡ中溶液、最後に１９．６μｌのＤＩＰＥＡを逐次的に導入する。ＲＴで１８時間後、粗製物を１０ｍｌの水で希釈し、３×７ｍｌのＡｃＯＥｔで抽出する。有機相を集め、ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、ＲＰ下で濃縮乾燥する。１２４ｍｇの無色の油を得る。この生成物を最小量のＤＭＡで希釈し、Ｃ１８−グラフトシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ、Ｃ１８、５ｇ、２５−４０μｍ、１８ｍｌ／分、水：アセトニトリル１００：０から５：９５（容量）の勾配溶出）上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。予想された化合物を含有する画分をＲＰ下で濃縮後、１２．８ｍｇのメチルエステルＬ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ４−ＣＯＯＭｅを、無色の被膜の形態で得る。質量スペクトル（Ｃ）：ｔＲ＝０．９７分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ  １０９９；［Ｍ−Ｈ］−：ｍ／ｚ  １０９７；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｐｐｍ単位，クロロホルム−ｄ）：０．８０（ｓ，３Ｈ）；１．２１（ｓ，３Ｈ）；１．２２（ｓ，３Ｈ）；１．２４から１．３５（ｍ，７Ｈ）；１．４６（ｔｄ，Ｊ＝６．４および１０．２Ｈｚ，１Ｈ）；１．５７（ｄ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ，１Ｈ）；１．６４（ｓ，３Ｈ）；１．８０（ｄｄｄ，Ｊ＝４．９および１１．５および１４．６Ｈｚ，１Ｈ）；１．９２（ｍ，１Ｈ）；２．１８（ｄｄ，Ｊ＝２．３および１４．７Ｈｚ，１Ｈ）；２．３６（ｄｄｄ，Ｊ＝４．８および１１．４および１６．２Ｈｚ，１Ｈ）；２．５２（ｄｄｄ，Ｊ＝５．１および１１．３および１６．３Ｈｚ，１Ｈ）；２．５９（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；２．６３（ｍ，１Ｈ）；２．８６（ｓ，３Ｈ）；２．８８（ｍ，１Ｈ）；２．９８（ｄ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ，１Ｈ）；３．０３（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ）；３．１５（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ）；３．２３（ｓ，３Ｈ）；３．３６（ｓ，３Ｈ）；３．４２（ｍ，２Ｈ）；３．５０（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）；３．５４（ｍ，２Ｈ）；３．６３（ｍ，１３Ｈ）；３．６８（ｓ，３Ｈ）；３．７５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；３．９９（ｓ，３Ｈ）；４．２７（ｔ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ）；４．７８（ｄｄ，Ｊ＝２．２および１２．１Ｈｚ，１Ｈ）；５．４２（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ）；５．６６（ｄｄ，Ｊ＝９．１および１５．４Ｈｚ，１Ｈ）；６．２１（ｓ，１Ｈ）；６．４３（ｄｄ，Ｊ＝１１．０および１５．４Ｈｚ，１Ｈ）；６．６４（ｓ，１Ｈ）；６．７４（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ）；６．８５（ｓ，１Ｈ）；７．０５（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１３７】
１０．２．３−［２−（２−｛２−［２−（２−ブロモ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸メチルエステルの調製
【０１３８】
【化３７】
2013506653.tif 000042
磁気撹拌下、ＲＴで、１００ｍｇの３−（２−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸（ＣＡ（ＰＥＧ）４、Ｐｉｅｒｃｅ）、８９ｍｇのブロモ−酢酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルおよび２ｍｌのＤＣＭをガラスバイアル内に逐次的に導入する。ＲＴで１時間後、０．７ｍｌのＭｅＯＨおよび０．３８ｍｌの２Ｍトリメチルシリルジアゾメタンのヘキサン中溶液を添加する。ＲＴで１時間後、粗製の反応混合物をＲＰ下で濃縮乾燥し、次いで最小量のＤＭＡで希釈し、Ｃ１８−グラフトシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ、Ｃ１８、５ｇ、２５−４０μｍ、１８ｍｌ／分、水：アセトニトリル１００：０から５：９５（容量）の勾配溶出）上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。予想された化合物を含有する画分をＲＰ下で濃縮後、５８ｍｇの３−［２−（２−｛２−［２−（２−ブロモ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸メチルエステルを無色の油の形態で得る。質量スペクトル（Ａ）：ｔＲ＝０．７５分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ４００／４０２
ブロモ−酢酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルは、公開プロトコル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７４年、４８１頁）に従い調製することができた。
【０１３９】
［実施例１１］
Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＭｅ−ＰＥＧ４−ＣＯＯＭｅ
【０１４０】
【化３８】
2013506653.tif 000043
１１．１．遊離薬物Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＭｅ−ＰＥＧ４−ＣＯＯＭｅの調製
【０１４１】
【化３９】
2013506653.tif 000044
磁気撹拌下、ＲＴで、ガラスバイアル内に、３０ｍｇのＬ−ＤＭ４、２０．８ｍｇの３−｛２−［２−（２−｛２−［（２−ブロモ−アセチル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸メチルエステルの、０．３ｍｌのＤＭＡ中溶液、および７．４μｌのＤＩＰＥＡを逐次的に導入する。ＲＴで１８時間後、この反応培地を７ｍｌのＡｃＯＥｔで希釈し、５ｍｌの水で２回洗浄する。有機相をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、ＲＰ下で濃縮乾燥させる。３９ｍｇの無色のガラスを得る。この生成物を最小量のＤＭＡ／ＭｅＯＨ混合物で希釈し、Ｃ１８−グラフトシリカゲル（ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５μｍ、５０×３０ｍｍ、３０ｍｌ／分、水：アセトニトリル９５：５から５：９５（容量）の勾配溶出）上でクロマトグラフィーにより精製する。予想された化合物を含有する画分を減圧下で濃縮後、７．８ｍｇのメチルエステルＬ−ＤＭ４−ＡｃＮＭｅ−ＰＥＧ４−ＣＯＯＭｅを無色の固体の形態で得る。質量スペクトル（Ｃ）：ｔＲ＝１．００分；［Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ］＋：ｍ／ｚ１０９５；［Ｍ＋Ｎａ＋］＋：ｍ／ｚ  １１３５；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ  １１５７；［Ｍ−Ｈ］−：ｍ／ｚ  １１１１。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，δ：ｐｐｍ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：０．７８（ｓ，３Ｈ）；１．１２（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）；１．１６（ｍ，９Ｈ）；１．２６（ｍ，１Ｈ）；１．４０から１．５１（ｍ，２Ｈ）；１．５９（ｓ，３Ｈ）；１．６２（ｍ，１Ｈ）；１．８７（ｍ，１Ｈ）；２．０４（ｍ，１Ｈ）；２．２８（ｍ，１Ｈ）；２．４７から２．５８（ｍ：部分マスク，４Ｈ）；２．７３（ｓ，３Ｈ）；２．７６（ｓ，１Ｈ）；２．８０（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ）；２．９５（ｓ，２Ｈ）；３．１０（ｓ，３Ｈ）；３．１６から３．４８（ｍ：部分マスク，２１Ｈ）；３．２５（ｓ，３Ｈ）；３．５９（ｓ，３Ｈ）；３．６３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；３．９３（ｓ，３Ｈ）；４．０８（ｍ，１Ｈ）；４．５３（ｄｄ，Ｊ＝２．９から１１．９Ｈｚ，１Ｈ）；５．３２（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ）；５．５８（ｄｄ，Ｊ＝９．３から１５．１Ｈｚ，１Ｈ）；５．８９（ｓ，１Ｈ）；６．４９から６．５８（ｍ，２Ｈ）；６．６２（ｍ，１Ｈ）；６．８４（ｓ，１Ｈ）；７．１９（ｓ，１Ｈ）。
【０１４２】
１１．２．３−｛２−［２−（２−｛２−［（２−ブロモ−アセチル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸メチルエステルの調製
【０１４３】
【化４０】
2013506653.tif 000045
磁気撹拌下、ＲＴで、Ａｒの不活性雰囲気下、１２７ｍｇの３−（２−｛２−［２−（２−メチルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸メチルエステル、１０２．２ｍｇのブロモ−酢酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルおよび１．２ｍｌのＤＣＭを逐次的に添加する。４５分後、粗製物をＲＰ下で濃縮し、５ｇのＣＮ−グラフトシリカゲル（ｎ．ヘプタン／ｉＰｒＯＨ／ＡｃＯＥｔの勾配溶出、ｉＰｒＯＨ部分を増加させる）上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。予想された化合物を含有する画分をＲＰ下で濃縮後、１２２ｍｇの３−｛２−［２−（２−｛２−［（２−ブロモ−アセチル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸メチルエステルを無色の油の形態で得る。質量スペクトル（Ａ）：ｔＲ＝０．８４分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ４１４／４１６。
【０１４４】
ブロモ−酢酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルは、公開プロトコル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７４年、４８１頁）に従い調製することができた。
【０１４５】
１１．３．３−（２−｛２−［２−（２−メチルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸メチルエステルの調製
【０１４６】
【化４１】
2013506653.tif 000046
磁気撹拌下、ＲＴで、Ａｒの不活性雰囲気下で、２７１．７ｍｇの３−［２−（２−｛２−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル−アミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸メチルエステルを、ジオキサン中の２ｍｌの塩酸４Ｎ溶液の中で可溶化させる。１８時間後、粗製の反応培地をＲＰ下で濃縮し、４ｍｌのＭｅＯＨの中で可溶化させ、３ｇ  ＳＣＸ  ＳＰＥカラム（１０ｍｌのＭｅＯＨで調整、１０ｍｌのＭｅＯＨで洗浄およびＭｅＯＨ中アンモニア２Ｎで溶出）を通過させる。ＲＰ下で溶出画分の濃縮後、１４６ｍｇの無色の油を得る。この油をＡｃＯＥｔ中に溶解し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、ＲＰ下で蒸発させた。１２７ｍｇの３−（２−｛２−［２−（２−メチルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸メチルエステルを無色の油として得る。質量スペクトル（Ａ）：ｔＲ＝０．４０分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ２９４。
【０１４７】
１１．４．３−［２−（２−｛２−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル−アミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸メチルエステルの調製
【０１４８】
【化４２】
2013506653.tif 000047
磁気撹拌下、ＲＴで、Ａｒの不活性雰囲気下、２２７ｍｇの３−［２−（２−｛２−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル−アミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸の、０．６４４ｍｌのＤＣＭおよび０．６４４ｍｌのＭｅＯＨ中溶液を水−氷−塩化ナトリウムで約０℃まで冷却する。トリメチルシリルジアゾメタンの、０．４４９ｍｌのヘキサン中２Ｍ溶液を添加し、ＲＴで１７時間後、酢酸のＭｅＯＨ中０．５Ｍ溶液を添加することによって、５と６の間のｐＨを達成する。粗製物をＡｃＯＥｔ（３０ｍｌ）で希釈し、水（２×１５ｍｌ）で洗浄し、ブライン（１５ｍｌ）で洗浄し、有機相をＭｇＳＯ４上で脱水させ、ろ過し、ＲＰ下で蒸発させる。２０９．７ｍｇの３−［２−（２−｛２−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル−アミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸メチルエステルを無色の油として得る。質量スペクトル（Ａ）：ｔＲ＝１．１８分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ２９４、３３８、３９４。
【０１４９】
１１．５．３−［２−（２−｛２−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル−アミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸の調製
【０１５０】
【化４３】
2013506653.tif 000048
磁気撹拌下、ＲＴで、Ａｒの不活性雰囲気下、３３０ｍｇの市販の３−（２−｛２−［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸の、４ｍｌのＴＨＦ中溶液を、水−氷−塩化ナトリウムで、約０℃まで冷却する。７２．２ｍｇのＮａＨ（油中７０％）をゆっくりと添加し、２５分後、０．１７４ｍｌのＭｅｌを添加する。冷却槽を取り除き、ＲＴで３時間後、１２０ｍｇのＮａＨおよび０．２ｍｌのＭｅｌを添加する。ＲＴで１．５時間後、酢酸の希釈水溶液を添加することによって、５と６の間のｐＨを達成する。粗製の反応混合物をＡｃＯＥｔ（３０ｍｌ）で希釈し、水（２×２０ｍｌ）で洗浄し、ブライン（１０ｍｌ）で洗浄し、有機相をＭｇＳＯ４上で脱水させ、ろ過し、ＲＰ下で蒸発させる。２２７ｍｇの３−［２−（２−｛２−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル−アミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸を無色の油として得る。質量スペクトル（Ａ）：ｔＲ＝１．０２分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ２８０、３８０。
【０１５１】
［実施例１２］
Ｌ−ＤＭ４−アリル−ＰＥＧ４−ＣＯＯＭｅ
【０１５２】
【化４４】
2013506653.tif 000049
１２．１遊離薬物Ｌ−ＤＭ４−アリル−ＰＥＧ４−ＣＯＯＭｅの調製
【０１５３】
【化４５】
2013506653.tif 000050
磁気撹拌下、ＲＴで、ガラスバイアル内に、３６．７ｍｇのＬ−ＤＭ４、２０．８ｍｇの３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸メチルエステルの、０．３７ｍｌのＤＭＡ中溶液、最後に９．４μｌのＤＩＰＥＡを逐次的に導入する。ＲＴで１．５時間後および−１８℃で１８時間後、この反応培地を、Ｃ１８−グラフトシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ、Ｃ１８、５ｇ、２５−４０μｍ、１８ｍｌ／分、水：アセトニトリル１００：０から５：９５（容量）の勾配溶出）上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。予想された化合物を含有する画分をＲＰ下で濃縮後、１８．２ｍｇの白色固体を得て、これを、ＣＮ−グラフトシリカゲル（ｎ．ヘプタン／ｉＰｒＯＨ／ＡｃＯＥｔの勾配溶出、ＡｃＯＥｔ部分を増加させる）上で、フラッシュクロマトグラフィーにより精製する。４．０２ｍｇのメチルエステルＬ−ＤＭ４−アリル−ＰＥＧ４−ＣＯＯＭｅを白色固体の形態で得る。質量スペクトル（Ｃ）：ｔＲ＝１．０９分；［Ｍ−Ｈ  ＋  ＨＣＯＯＨ］−：ｍ／ｚ  １１１２；［Ｍ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ  １０９０。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｐｐｍ単位，クロロホルム−ｄ）：０．８０（ｓ，３Ｈ）；１．１８から１．２６（ｍ，７Ｈ）；１．２７から１．３１（ｍ，６Ｈ）；１．４０から１．５０（ｍ，１Ｈ）；１．５７（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，３Ｈ）；１．６４（ｓ，３Ｈ）；１．７７（ｄｄｄ，Ｊ＝４．８および１１．７および１４．５Ｈｚ，１Ｈ）；１．９１（ｄｄｄ，Ｊ＝４．８および１１．７および１４．５Ｈｚ，１Ｈ）；２．１８（ｄｄ，Ｊ＝２．５および１４．３Ｈｚ，１Ｈ）；２．３８（ｍ，１Ｈ）；２．５７（ｍ，４Ｈ）；２．８６（ｓ，２Ｈ）；２．８９（ｍ，１Ｈ）；３．００（ｍ，１Ｈ）；３．０４（ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，１Ｈ）；３．１１（ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，１Ｈ）；３．２３（ｓ，３Ｈ）；３．３５（ｓ，３Ｈ）；３．５０（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）；３．５５（ｍ，２Ｈ）；３．６３（ｍ，１０Ｈ）；３．６９（ｓ，３Ｈ）；３．７５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；３．９２（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）；３．９８（ｓ，３Ｈ）；４．２７（ｄｄｄ，Ｊ＝１．６および１０．４および１２．３Ｈｚ，１Ｈ）；４．７８（ｄｄ，Ｊ＝３．０および１１．８Ｈｚ，１Ｈ）；５．４３（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）；５．４８から５．６１（ｍ，２Ｈ）；５．６７（ｄｄ，Ｊ＝９．２および１５．２Ｈｚ，１Ｈ）；６．２０（ｄ，Ｊ＝０．５Ｈｚ，１Ｈ）；６．４２（ｄｄ，Ｊ＝１１．３および１５．４Ｈｚ，１Ｈ）；６．６５（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ）；６．７７（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ）；６．８２（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１５４】
１２．２．３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸メチルエステルの調製
【０１５５】
【化４６】
2013506653.tif 000051
磁気撹拌下、５０ｍｇの３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸の、１ｍｌのＤＣＭおよび０．２５ｍｌのＭｅＯＨ中冷却溶液（水−氷浴）に、０．１１ｍｌの２Ｍトリメチルシリルジアゾメタンのヘキサン中溶液を添加する。水−氷浴を取り除いた後、粗製の反応混合物をＲＴで１．５ｈｒ撹拌し、２滴の酢酸で中和し、ＲＰ下で濃縮乾燥する。トルエンで共沸蒸発後、４７ｍｇの３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸メチルエステルをアンバー油の形態で得る。質量スペクトル（Ａ）：ｔＲ＝１．１２分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ３６９／３７１。
【０１５６】
３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸の調製は実施例４で記載されている。
【０１５７】
［実施例１３］
Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ８−ＣＯＯＭｅ
【０１５８】
【化４７】
2013506653.tif 000052
１３．１．遊離薬物Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ８−ＣＯＯＭｅの調製
【０１５９】
【化４８】
2013506653.tif 000053
磁気撹拌下、ＲＴで、ガラスバイアル内に、６０ｍｇのＬ−ＤＭ４、１１．４ｍｇの炭酸カリウム、および７５ｍｇの３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ブロモ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸メチルエステルの、０．７ｍｌのＤＭＡ中溶液を逐次的に導入する。ＲＴで２２時間後、この反応培地を１２ｍｌの水で希釈し、２×１０ｍｌのＡｃＯＥｔで抽出する。有機相を集め、ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、ＲＰ下で濃縮乾燥させる。５０ｍｇの無色の油を得る。この生成物を最小量のＤＣＭで希釈し、５ｇのＣＮ−グラフトシリカゲル（ｎヘプタン／ｉＰｒＯＨ／ＡｃＯＥｔの勾配溶出、ｉＰｒＯＨ部分を増加させる）上で、フラッシュクロマトグラフィーにより精製する。予想された化合物を含有する画分を減圧下で濃縮後、残渣を最小量のＤＭＡで希釈し、Ｃ１８−グラフトシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ、Ｃ１８、５ｇ、２５−４０μｍ、１２ｍｌ／分、水：アセトニトリル１００：０から５：９５（容量）の勾配溶出）上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。予想された化合物を含有する画分をＲＰ下で濃縮後、３．３ｍｇのメチルエステルＬ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ８−ＣＯＯＭｅを無色の被膜の形態で得る。質量スペクトル（Ｃ）：ｔＲ＝０．９７分；［Ｍ−Ｈ］−  ＋  ＨＣＯＯＨ：ｍ／ｚ  １３１９。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｐｐｍ単位，クロロホルム−ｄ）：０．７３（ｓ，３Ｈ）；１．１０から１．１９（ｍ，７Ｈ）；１．２１（ｓ，３Ｈ）；１．２３（ｓ，３Ｈ）；１．３９（ｔｄ，Ｊ＝６．１および１０．１Ｈｚ，１Ｈ）；１．５０（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ）；１．５７（ｓ，３Ｈ）；１．７１（ｍ，１Ｈ）；１．８５（ｍ，１Ｈ）；２．１１（ｄｄ，Ｊ＝３．４および１４．２Ｈｚ，１Ｈ）；２．２９（ｄｄｄ，Ｊ＝５．１および１１．１および１６．０Ｈｚ，１Ｈ）；２．４５（ｄｄｄ，Ｊ＝５．４および１１．２および１６．１Ｈｚ，１Ｈ）；２．５２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）；２．７９（ｓ，３Ｈ）；２．８２（ｍ，１Ｈ）；２．９０（ｍ，１Ｈ）；２．９６（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）；３．０７（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ）；３．１５（ｓ，３Ｈ）；３．２８（ｓ，３Ｈ）；３．３５（ｍ，２Ｈ）；３．４４（ｍ，３Ｈ）；３．５６（ｓ，２９Ｈ）；３．６１（ｓ，３Ｈ）；３．６８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ）；３．９１（ｓ，３Ｈ）；４．２０（ｔ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ）；４．７０（ｄｄ，Ｊ＝３．２および１２．０Ｈｚ，１Ｈ）；５．３５（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）；５．５９（ｄｄ，Ｊ＝９．０および１５．４Ｈｚ，１Ｈ）；６．１３（ｓ，１Ｈ）；６．３５（ｄｄ，Ｊ＝１１．０および１５．４Ｈｚ，１Ｈ）；６．５７（ｄ，Ｊ＝１  ．５Ｈｚ，１Ｈ）；６．６７（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ）；６．７８（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ）；６．９６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１６０】
１３．２．３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ブロモ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸メチルエステルの調製
【０１６１】
【化４９】
2013506653.tif 000054
磁気撹拌下、Ａｒの不活性雰囲気下、ＲＴで、２００ｍｇの３−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸（ＣＡ（ＰＥＧ）８、Ｐｉｅｒｃｅ）、１．７ｍｌのＤＣＭ、０．９ｍｌのＭｅＯＨ、および０．３４ｍｌの２Ｍトリメチルシリルジアゾメタンのヘキサン中溶液をガラスバイアル内に逐次的に導入する。ＲＴで３０分後、０．１ｍｌの２Ｍトリメチルシリルジアゾメタンのヘキサン中溶液を添加する。ＲＴで２５分後、数滴の酢酸の添加により反応混合物を中和させ、ＲＰ下で濃縮乾燥させ、トルエンで共沸混合させる。こうして得た無色の油を、１０６．９ｍｇのブロモ−酢酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルの、０．７ｍｌのＤＣＭ中溶液で希釈する。ＲＴで３０分後および４℃で１６時間後、粗製物を、２０ｇのＣＮ−グラフトシリカゲル（ｎ．ヘプタン／ｉＰｒＯＨ／ＡｃＯＥｔの勾配溶出、ｉＰｒＯＨ部分を増加させる）上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。予想された化合物を含有する画分をＲＰ下で濃縮後、１７５ｍｇの３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ブロモ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸メチルエステルを無色の油の形態で得る。質量スペクトル（Ｂ）：ｔＲ＝２．７９分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ５７６／５７８。
【０１６２】
ブロモ−酢酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルは、公開プロトコル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７４年、４８１頁）に従い調製することができた。
【０１６３】
［実施例１４］
Ｌ−ＤＭ４−Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＣＯＯＭｅ
【０１６４】
【化５０】
2013506653.tif 000055
１４．１遊離薬物Ｌ−ＤＭ４−Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＣＯＯＭｅの調製
【０１６５】
【化５１】
2013506653.tif 000056
磁気撹拌下、ＲＴで、１６０ｍｇのＬ−ＤＭ４、１１５．８ｍｇの３−｛２−［２−（２−｛２−［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イル）−プロピオニルアミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（市販のもの、ＳＭ（ＰＥＧ）４、Ｐｉｅｒｃｅ）、０．６ｍｌのＤＭＡ、５５．１ｍｇの担持されたＤＩＰＥＡ（３．７２ｍｍｏｌ／ｇ）、０．３ｍｌの追加のＤＭＡおよび６μｌのＤＩＰＥＡを逐次的に添加する。ＲＴで１時間後および−２０℃で１６時間後、粗製の反応混合物をろ過し、ＤＣＭで洗浄し、２０ｇのシリカゲル（勾配溶出、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、ＭｅＯＨの分担を増加）上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。所期の生成物を含有する画分をＲＰ下で濃縮後、１１０ｍｇの無色の被膜を得て、これを１０ｇのシリカゲル（勾配溶出、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、ＭｅＯＨの分担を増加）上で精製する。所期の生成物を含有する画分をＲＰ下で濃縮後、１９．６ｍｇのメチルエステルＬ−ＤＭ４−Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＣＯＯＭｅを無色のガラスの形態で得る。質量スペクトル（Ａ）：ｔＲ＝１．３１／１．３２分（２つのジアステレオ異性体）；［Ｍ−Ｈ］−：ｍ／ｚ  １２０８。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｐｐｍ単位，クロロホルム−ｄ）：０．７３（ｓ，３Ｈ）；１．２２（ｍ，１３Ｈ）；１．３９（ｍ，１Ｈ）；１．５２（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，１Ｈ）；１．５７（ｓ，３Ｈ）；１．７８（ｍ，１Ｈ）；１．９９（ｍ，１Ｈ）；２．１１（ｄｄｄ，Ｊ＝１．８および１．９および１４．１Ｈｚ，１Ｈ）；２．２４（ｄｄｄ，Ｊ＝４．７および１１．５および１５．９Ｈｚ，１Ｈ）；２．３８（ｍ，３Ｈ）；２．４６（ｍ，１Ｈ）；２．５３（ｍ，３Ｈ）；２．６９（ｓ，１Ｈ）；２．８２（ｓ，３Ｈ）；２．９４（ｄｄ，Ｊ＝４．７および９．６Ｈｚ，１Ｈ）；３．０８（ｍ，３Ｈ）；３．１４（ｓ，３Ｈ）；３．２９（ｓ，３Ｈ）；３．３４（ｑ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ）；３．４３（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）；３．４８（ｔｄ，Ｊ＝１．８および５．１Ｈｚ，２Ｈ）；３．５８（ｓ，１３Ｈ）；３．６７（ｍ，７Ｈ）；３．９１（ｓ，３Ｈ）；４．２２（ｔ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ）；４．７０（ｍ，１Ｈ）；５．２９（ｍ，１Ｈ）；５．５９（ｍ，１Ｈ）；６．３０（ｓ  大，１Ｈ）；６．３５（ｄｄ，Ｊ＝１１．０および１５．４Ｈｚ，１Ｈ）；６．６１（ｍ，２Ｈ）；６．７６（ｓ，１Ｈ）。
【０１６６】
［実施例１５］
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨＣＴ１１６腫瘍細胞の増殖の阻害
指数増殖期の細胞をトリプシン処理し、これらのそれぞれの培地内に再懸濁させた（ＤＭＥＭ／Ｆ１２  Ｇｉｂｃｏ＃２１３３１；１０％ＳＶＦ  Ｇｉｂｃｏ＃１０５００−０５６；ＭＤＡ−ＭＢ２３１＆ＭＤＡ−Ａ１細胞に対して２ｎＭグルタミンＧｉｂｃｏ＃２５０３０；ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１１９６０）１０％ＳＶＦ  Ｇｉｂｃｏ＃１０５００−０５６；ＨＣＴ１１６細胞に対して２ｎＭグルタミンＧｉｂｃｏ＃２５０３０）。完全な血清含有培地の中で、５０００細胞／ウェルの密度で（ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＨＣＴ１１６）、細胞懸濁液を９６−ウェルＣｙｔｏｓｔａｒ培養物プレート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ、＃ＲＰＮＱ０１６３）に分配した。４時間のコーティング後、３連ウェルに段階希釈を添加した。薬物の存在下、３７°Ｃ／５％Ｃ０２で３日間細胞を培養した。第４日目、１０μｌの１４Ｃチミジン溶液（０．１μＣｉ／ウェル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ＃ＮＥＣ５６８２５０００）を各ウェルに添加した。ｍｉｃｒｏｂｅｔａ放射性カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、実験が開始してから９６時間、１４Ｃチミジンの取り込みを測定した。無細胞の試薬ブランクを試験ウェル記録から引き算し、コンジュゲート処理した細胞の記録を、ビヒクル処理した細胞の対照ウェルからの記録の平均で割ることによって得た、残存する画分として、このデータをプロットした。
【０１６７】
【表４】
2013506653.tif 000057
【０１６８】
これらから明白なように、エステル−ＣＯＯＭｅの形態で試験された生成物は、２つの異なる細胞株に対して強力なインビトロの増殖阻害特性を示す。
【０１６９】
［実施例１６］
ｈｕ２Ｈ１１およびｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４のコンジュゲートのインビボの評価
コンジュゲートの制癌活性の評価のため、動物を毎日秤量し、週に２回キャリパーで腫瘍を測定した。質量（ｍｇ）＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２］／２の式を用いて腫瘍の重量を計算した。抗腫瘍活性の評価は、最大非毒性用量（ＨＮＴＤ）で行った。
【０１７０】
最下点（グループの平均）での２０％の体重減（ｂｗｌ）または１０％以上の薬物死が生じる用量は、過剰に有毒な用量とみなされた。動物の体重には腫瘍の重量が含まれていた。主要評価項目は、ΔＴ／ΔＣ、メディアン退縮パーセント、部分退縮および完全退縮（ＰＲおよびＣＲ）および無腫瘍生存（ＴＦＳ）である。
【０１７１】
特定された観察日の腫瘍量から最初の処理日（ステージング日）の腫瘍量を引くことによって、処理した腫瘍（Ｔ）および対照（Ｃ）のそれぞれの腫瘍量の変化を各腫瘍に対して計算する。メディアンΔΤを処理したグループに対して計算し、メディアンΔＣを対照グループに対して計算する。次いで割合ΔΤ／ΔＣを計算し、パーセンテージで表現する。
【０１７２】
【数１】
2013506653.tif 000058
【０１７３】
用量は、ΔΤ／ΔＣが４０％より低い場合、治療的に活性があるとみなされ、ΔΤ／ΔＣが１０％よりも低い場合、非常に活性があるとみなされる。ΔΤ／ΔＣが０より低い場合、この用量は、高活性とみなされ、この退縮パーセンテージの日付を記録する（ｒｅｆ１）：
【０１７４】
％腫瘍退縮：これは、最初の処理の初日におけるこの量と比較した場合の、特定された観察日における処理したグループの腫瘍量の減少の％と定義される。特定の時間点および各動物に対して、％退縮を計算する。よって、グループに対するメディアン％退縮を計算する：％退縮（ｔにおいて）＝
【０１７５】
【数２】
2013506653.tif 000059
【０１７６】
部分退縮（ＰＲ）：退縮は、処理開始時の腫瘍量の５０％まで腫瘍量が低減した場合、部分的と定義される。
【０１７７】
完全退縮（ＣＲ）：完全退縮は、腫瘍量＝０ｍｍ３の場合達成される（腫瘍量が記録できない場合ＣＲが考慮される）。
【０１７８】
ＴＦＳ：無腫瘍とは、実験の終わりに、腫瘍が検出不能な動物と定義される。
【０１７９】
ｈｕ２Ｈ１１−コンジュゲートとｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートとの比較
ｈｕ２Ｈ１１−コンジュゲート＝
【０１８０】
【化５２】
2013506653.tif 000060
ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲート＝
【０１８１】
【化５３】
2013506653.tif 000061
メスのＳＣＩＤマウスにＳ．Ｃ．移植した、強力に発現するターゲットである、測定可能な原発性結腸腫瘍、ＣＲ−ＬＲＢ−００４Ｐに対して、ｈｕ２ｈ１１−コンジュゲートおよびｈｕ２ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートの抗腫瘍活性を２つの用量レベルで評価した。対照グループは未処理のままにしておいた。用量は、１キログラム中のタンパク質をミリグラムで表現した。ｈｕ２ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートを、４０および１０ｍｇ／ｋｇの量で、静脈内（ＩＶ）大量瞬時投与により、第１５日に投与した。等しい用量のＤＭ４を与えるため、ｈｕ２ｈ１１−コンジュゲート、４４および１１ｍｇ／ｋｇを投与した。結果を表ＩＶに示す。
【０１８２】
ＣＲ−ＬＲＢ−００４Ｐ腫瘍の単回投与スケジュールを用いて、ｈｕ２ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートは、４０および１０ｍｇ／ｋｇにおいて活性があり、ΔΤ／ΔΟがそれぞれ２８％および３９％であり、ｈｕ２ｈ１１−コンジュゲートは、４０ｍｇ／ｋｇにおいてのみ活性があり、ΔΤ／ΔΟは２６％であった。１０ｍｇ／ｋｇにおいて、ｈｕ２ｈ１１−コンジュゲートは、本モデルでは活性がなかった。これらの結果から、ｈｕ２ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートは、低用量では、ｈｕ２ｈ１１−コンジュゲートよりも良い活性を示した。
【０１８３】
コンジュゲートの最適化、最適な薬物抗体比ＤＡＲの選択−ＳＣＩＤメスのマウスにおける前立腺の腺癌ＰＣ−３に対するｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートの制癌活性に対するＤＡＲの影響
メスのＳＣＩＤにＳ．Ｃ．移植した、前立腺のＰＣ−３腫瘍について、６つの異なる薬物抗体比（ＤＡＲ）での、２つの低い有効用量を比較して、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートの抗腫瘍活性に対するＤＡＲの作用を評価した。対照グループは未処理のままにしておいた。用量は、１キログラム中のタンパク質をミリグラムで表現した。ＤＡＲをＵＶ法で求めた。ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートを、１０および５ｍｇ／ｋｇの量で、それぞれ３．４、４．４、５．９、６．２、７．４および８．４のＤＡＲで、静脈内（ＩＶ）大量瞬時投与により、第１６日に投与した。結果を表Ｖに示す。
【０１８４】
【表５】
2013506653.tif 000062
【０１８５】
【表６】
2013506653.tif 000063
【０１８６】
単回投与スケジュールを用いて、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートは、１０ｍｇ／ｋｇにおいて、ＤＡＲ４．４から８．４で活性を示し、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートは、５ｍｇ／ｋｇにおいて、ＤＡＲ５．９から４で活性を示した。結論として、ＤＡＲは、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートの腫瘍活性について効果を有する。これらの結果から、特定の腫瘍について、ＤＡＲ（ＵＶ）は、４より上であるべきである。最適なＤＡＲは、少なくとも５．９に等しいことになる。
【０１８７】
［実施例１７］
ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートのＰＫパラメータについてのＤＡＲの評価
異なる薬物−抗体比（ＤＡＲ）でのｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートの薬物動態学的特性を、２０ｍｇ／ｋｇのコンジュゲートを単回の静脈内（ＩＶ）投与後、オスのＣＤ−１マウスにおいて評価した。コンジュゲートの血漿レベルを測定することによって、標準的条件下での基本的な単回投与の薬物動態学的パラメータを確立した。ＰＫパラメータを裸の親抗体のものと比較した。コンジュゲートおよびこれらの抗体成分の血漿中濃度（全抗体、結合した抗体とあらゆる非結合の抗体の和）を特定のＥＬＩＳＡ技法で測定した。結果を図７に示す。
【０１８８】
結果は、ＤＡＲ値と全抗体成分への曝露との間の逆の相互関係を示し、ＡＵＣ０−∞値は、０、３．４、４．３、５．９、６．６および７．４のＤＡＲに対して、それぞれ８３，０００，０００、６１，０００，０００、４８，０００，０００、４６，０００，０００、４１，０００，０００および２７，０００，０００ｎｇ・ｈ／ｍＬであった。
【０１８９】
同様に、ＤＡＲ値とコンジュゲートへの曝露との間に逆の相互関係が存在し、ＡＵＣ０−∞値は、３．４、４．３、５．９、６．６および７．４のＤＡＲに対して、それぞれ３９，０００，０００、３０，０００，０００、２７，０００，０００、２９，０００，０００および２０，０００，０００ｎｇ・ｈ／ｍＬであった。
【０１９０】
ＤＡＲ値と、抗体成分の排除との間に完璧な相互関係が存在し、ＣＩ値は、０、３．４、４．３、５．９、６．６および７．４のＤＡＲに対して、それぞれ０．０００２４、０．０００３３、０．０００４２、０．０００４３、０．０００４９および０．０００７４Ｌ／ｈ／ｋｇであった。
【０１９１】
同様に、ＤＡＲ値とコンジュゲートの排除との間にほとんど完璧な相互関係が存在し、ＣＩ値は、３．４、４．３、５．９、６．６および７．４のＤＡＲに対してそれぞれ０．０００５１、０．０００６６、０．０００７５、０．０００６９、０．０００９９Ｌ／ｈ／ｋｇであった。
【０１９２】
結論として、ＤＡＲは、ＰＫパラメータに影響を及ぼし、ＤＡＲが増加すると、曝露が減少し、除去が増加する。効力およびＰＫの評価結果によると、最適なＤＡＲは、５．９と７．４の間に含まれていることになる。
【０１９３】
［実施例１８］
ＳＣＩＤメスのマウスにおける前立腺の腺癌ＰＣ−３に対するｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４コンジュゲートの評価
メスのＳＣＩＤマウスにＳ．Ｃ．移植した、強力に発現するターゲットである、測定可能な前立腺ＰＣ−３腫瘍に対して、ＤＡＲ＝５．９を有する抗体薬物コンジュゲートｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートの抗腫瘍作用を、８つの用量レベルで評価した。対照グループは、未処理のままにしておいた。用量は、１キログラム中のタンパク質をミリグラムで表現した。これらを、１６０、１２０、８０、４０、２０、１０、５および２．５ｍｇ／ｋｇの量で、静脈内（ＩＶ）大量瞬時投与により、第１７日に投与した。結果を表ＶＩに示す。
【０１９４】
単回投与スケジュールを用いて、体重減少および薬物に関連した死亡を誘発する有毒な量となる、試験したコンジュゲートの最大用量（１６０ｍｇ／ｋｇ）を発見した。ＨＮＴＤ（１２０ｍｇ／ｋｇ）および他の最小用量において、この化合物は高活性であった。２．５ｍｇ／ｋｇ以外のすべて用量に対して、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートは、部分退縮を誘発し、１２０、８０および２０ｍｇ／ｋｇに対して、完全退縮を誘発した。加えて、この腫瘍モデル悪液質であり、化合物の投与は、対照と比較して、最下点での体重減少を減少させた。結論として、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−コンジュゲートは、前立腺のＰＣ−３腫瘍モデルにおいて、優れた用量−効果を有する高い活性を示した。
【０１９５】
【表７】
2013506653.tif 000064
【図１】
2013506653.tif 000073
【図２】
2013506653.tif 000074
【図３】
2013506653.tif 000075
【図４】
2013506653.tif 000076
【図５】
2013506653.tif 000077
【図６Ａ】
2013506653.tif 000078
【図６Ｂ】
2013506653.tif 000079
【図６Ｃ】
2013506653.tif 000080
【図７】
2013506653.tif 000081
【配列表】
2013506653000001.app
【国際調査報告】
2013506653.tif 000082
2013506653.tif 000083
2013506653.tif 000084