(57)【要約】  プロバイオティックおよび可食性単離タンパク質から構成されるタンパク質豊富な栄養食品製品。プロバイオティック成分は、Lactobacillus属菌、Bacillus属菌、Streptococcus属菌、Bifidobacterium属菌、Saccharomyces属菌またはLeuconostoc属菌を含んでもよい。単離タンパク質成分は、ホエータンパク質、ホエー成長因子抽出物、グルタミンペプチド、卵白、大豆タンパク質、またはカゼイナートを含んでよい。この栄養組成物は、摂取後に、健康的な腸内微生物環境を促進し、タンパク質の供給源を提供し、および循環血液中に濃縮して蓄積し得る窒素含有老廃物の排泄を支援する食品製品、栄養補助食品、または医療食品の形態とすることができる。老廃物の増加した濃度は、個体の生理機能に悪影響を及ぼし、幸福感の減退および全身倦怠感の一因となる。本発明の栄養製品を用いて、窒素含有老廃物を血液から除去する方法および腎不全を改善する方法もまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のプロバイオティック成分および少なくとも１種の単離された可食性タンパク質を含む、タンパク質豊富な栄養製品。
【請求項２】
プロバイオティック成分が、Lactobacillus属菌、Bacillus属菌、Streptococcus属菌、Bifidobacterium属菌、Saccharomyces属菌またはLeuconostoc属菌である、請求項１に記載の栄養製品。
【請求項３】
少なくとも１種の単離されたタンパク質が、ホエータンパク質またはその単離物、濃縮物もしくは加水分解物；乳タンパク質またはその単離物、濃縮物もしくは加水分解物；ホエー成長因子抽出物；グルタミンペプチド；卵白；大豆タンパク質またはその単離物、濃縮物もしくは加水分解物；あるいはカゼイナートを含む、請求項１に記載の栄養製品。
【請求項４】
血液から窒素含有老廃物を除去する方法であって、請求項１に記載の栄養製品の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、それにより窒素含有老廃物を対象の血液から除去する、前記方法。
【請求項５】
腎不全を改善する方法であって、請求項１に記載の栄養製品の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、それにより腎不全を改善する、前記方法。
【請求項６】
対象が、タンパク質欠乏症を有する、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この特許出願は、2010年9月27日に出願された米国特許出願番号第１２／８９０，９５１号の優先権の利益を主張し、その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
その調節的、内分泌的、および代謝的な機能に加えて、正常で健康な腎臓の主要な機能の１つは、老廃物の処分である。排出機能のいかなる損傷も、尿素、クレアチニンおよび尿酸を含む、様々な窒素含有老廃物の蓄積へと導き得る。血流中の高濃度の老廃物は、腎不全を悪化させ、腎臓結石を促進させ得る。さらに、循環血液中の窒素含有溶質は、腸壁を隔てた濃度勾配のために、その内腔への浸透拡散を促進する。この拡散メカニズムが、消化管ベースの窒素含有老廃物のクリアランスを増強するための経口吸着剤のコンセプトへと導いた。吸着剤または微生物は、大腸内の様々な化合物および窒素含有老廃物を除去するその能力を実証している。
【０００３】
合成ポリマーおよび修飾多糖などの尿素特異的吸着剤は、消化管を通じた尿素および他の窒素含有老廃物の除去について評価されてきた。酸化デンプン、活性炭およびイナゴマメ粉などの他の吸着剤もまた、in vivoの尿毒症毒素の排除について研究されてきており、いくらか成功している。Prakash & Chang（(1996) Nature Medicine 2:883-88）は、マイクロカプセル化された遺伝子操作E. coli ＤＨ５がin vitro系において尿素およびアンモニアの除去に有効であることを実証した。同じ研究者は、尿毒症ラット動物モデルへのE. coli ＤＨ５の経口投与において同様の結果を得た。Bliss et al.（(1996) Am. J. Clin. Nutr. 63:392-398）は、低タンパク食を消費する慢性腎不全の患者において、補給したアラビア・ゴムの繊維が、糞便中の窒素含有排出物を増加させ、尿素窒素の濃度を低下させることを実証した。Reinhart et al.（(1998) Rec. Adv. In Canine and Feline Nutr. Iams Nutrition Symposium Proceedings. Vol. II:395-404）は、発酵性繊維ブレンドを含む食事を給餌された腎臓病罹患イヌが、臨床的に末期の腎疾患状態を改善したことを見出し、このことは特定の栄養的変化で、大腸内発酵またはさらなる細菌増殖により、窒素排出を腎臓から離して糞便中に再分配することができることを提示する。
【０００４】
プレバイオティック成分は、消化管内でのプロバイオティック成分の作用を増強する食品構成要素である。この相乗関係において、Bifidobacterium属菌などのプロバイオティック成分は、食物繊維、オリゴ糖などの未消化の炭水化物を代謝し、アセテート、プロピオナートおよびブチラートなどの短鎖脂肪酸を産生する。これらの短鎖脂肪酸は腸細胞の生育を促進し、水およびミネラル吸収を増進し、酵母、かびおよび病原制裁金の生育を妨げ得る。加えて、プロバイオティック成分は、サイトカインおよび酪酸などの抗微生物性および抗菌性化合物の産生を通じて病原体と直接拮抗させ(De Vuyst and Vandamme. Antimicrobial potential of lactic acid bacteria. In: De Vuyst L, Vandamme EL, eds. Bacteriocins of lactic acid bacteria. Glasgow, United Kingdom: Blackie Academic and Professional; 1994:91-142; Dodd and Gasson. Bacteriocins of lactic acid bacteria.   In: Gasson MJ, de Vos WM, eds. Genetics and biotechnology of lactic acid bacteria. Glasgow, United Kingdom: Blackie Academic and Professional; 1994:211-51; Kailasapathy and Chin (2000) Immunol. Cell. Biol. 78(1):80-8)、乳酸産生微生物叢を刺激することにより腸のｐＨを下げ（Langhendries et al. (1995) J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 21:177-81）、病原体が占める受容体部位への結合を競合し（Kailasapathy and Chin (2000) Immunol. Cell. Biol. 78(1):80-8; Fujiwara et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol.   63:506-12）、免疫機能を改善および免疫調節細胞を刺激し（Isolauri et al. (1991) Pediatrics 88:90-97; Isolauri et al. (1995) Vaccine 13:310-312; Rolfe (2000) J. Nufr. 130(2S):396S-402S）、利用可能な栄養および他の成長因子について病原体と競合し（Rolfe (2000) J. Nufr. 130(2S):396S-402S）、またはラクトースの消化に役立つラクターゼを産生し得る。
【０００５】
米国特許第4,022,883号は、腎不全を患っている人に、尿素分解細菌、クレアチン分解細菌、クレアチニン分解細菌、および尿酸分解細菌からなる群から選択される非病原性土壌細菌、ここで尿素分解細菌はSerratia属菌の種であり、クレアチニン分解細菌は非蛍光のPseudomonas属菌、Rhizobium属菌、Agrobacterium属菌、Corynebacterium ureafaciens、Artherobacter ureafaciens、E. coliまたはPseudomonas aeruginosaであり、尿酸分解細菌は、Bacillus subtilis、非蛍光のPseudomonas属菌、Bacillus fastidosus、Micrococcus dentrificans、Mycobacterium phlei、Aerobacter aerogenesである、の細胞集団の有効用量を経口で投与することを含む、その人らにおける尿毒症の症状を緩和する方法を開示する。
【０００６】
米国特許第4,218,541号は、尿素を無害な生成物に変換する方法を教示する。該方法は、Enterobacter agglomerans、Ｄ群Streptococcus属菌、Bacillus属菌、およびPseudomonas属菌からなる群から選択される少なくとも１種の微生物または前記微生物の混合物の培養物を得ること、ならびに、該培養物を、尿素を含有する組成物に添加することを伴う。
【０００７】
米国特許第4,970,153号は、Lactobacillus fermentum TK 1214の培養により、ウレアーゼを産生する方法、より詳細には、酸性ウレアーゼを産生する方法を開示する。この特許はさらに、かかる酸性ウレアーゼの使用または発酵食品生産物に含まれる尿素の分解を教示する。
【０００８】
米国特許第5,116,737号は、乳製品用培養物（dairy culture）などの酸産生細菌培養物を生育する方法、ここで該培養物が、ウレアーゼ産生菌株の細菌を含有するように選択され、培養に用いられる培地が添加された尿素を含有する、を教示する。Streptococcus thermophilusおよびBifidobacterium属菌であるウレアーゼ産生菌株もまた開示されている。
【０００９】
米国特許第5,716,615号は、Streptococcus thermophilus、Lactobacillus属菌およびBifidobacterium属菌を含む、数種の異なる細菌を含有する医薬組成物、ここで該細菌がグラムあたり１×１０１１から１×１０１３の総濃度で組成物中に存在する、を開示する。マルトデキストリン、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン、レブロース、ラクトースまたはデキストロースからなる賦形剤もまた教示されている。胃腸疾患および高コレステロール血症の処置または宿主の免疫応答を調節することを含む、該医薬組成物を使用する方法もまた開示されている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、少なくとも１種のプロバイオティックおよび少なくとも１種の単離された可食性タンパク質から構成される、タンパク質豊富な栄養製品である。一態様において、プロバイオティック成分はLactobacillus属菌、Bacillus属菌、Streptococcus属菌、Bifidobacterium属菌、Saccharomyces属菌またはLeuconostoc属菌からなる群から選択される。他の態様において、少なくとも１種の単離されたタンパク質は、ホエータンパク質またはその単離物、濃縮物もしくは加水分解物；乳タンパク質またはその単離物、濃縮物もしくは加水分解物；ホエー成長因子抽出物；グルタミンペプチド；卵白；大豆タンパク質またはその単離物、濃縮物もしくは加水分解物；あるいはカゼイナートからなる群から選択される。
【００１１】
この栄養組成物は、摂取後に、健康的な腸内微生物環境を促進し、タンパク質の供給源を提供し、および循環血液中に濃縮して蓄積し得る窒素含有老廃物の排泄を支援するであろう、食品製品、栄養補助食品、または医療食品の形態とすることができる。老廃物の増加した濃度は、個体の生理機能に悪影響を及ぼし、幸福感の減退および全身倦怠感の一因となる。本発明の栄養製品を用いて、窒素含有老廃物を血液から除去し、腎不全を改善する方法もまた提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
血流中に集積される窒素含有老廃物は、健康に悪影響を与える。大腸への迂回による窒素含有老廃物の除去は、個体の生理機能への老廃物の集積が有する悪影響を減少させる実行可能なやり方である。本発明はプロバイオティックおよび可食性タンパク質の特性を組み合わせて製品とし、該製品は、タンパク質の供給源を提供するとともに、窒素含有老廃物の血中濃度を効果的に低減するものである。
【００１３】
本発明のプロバイオティック成分は、人間または動物に適用されたときに、未消化の炭水化物を代謝し、個体に有益なBifidobacterium属生物などの常在の微生物叢の特性を改善することによって宿主に好影響を与える、生きたままの、または凍結乾燥した微生物の単一または混合培養物を指す。本発明のプロバイオティック成分は、宿主に有益な効果を発揮する能力、消化管を通過し生存する能力、腸内側の上皮細胞に接着する能力、病原体に対する抗微生物物質を産生する能力、および／または、腸内微生物叢を安定化する能力について選択される。さらに、プロバイオティック成分は、適した有効期間を有するべきである。本発明の製品は一般的に、消費の時点で多数の生細胞を含んでおり、非病原性および無毒性である。プロバイオティック成分の例としては、限定されるものではないが、Bifidobacterium spp.（例えば、bifidum、longum、infantis）、Lactobacillus spp.（例えば、bulgaricus、acidophilus、lactis、helveticus、casei、plantarum、reuteri、delbrueckii、chamnosus、johnsonii、paracasei）Streptococcus spp.（例えば、thermophilus、diacetilactis、cremoris、durans、faecalis）、Saccharomyces spp.（例えば、pombe、boulardii）、Leuconostoc spp.（例えば、citrovorum、dextranicum）およびBacillus spp.（例えばpasteurii）が挙げられる。一態様において、プロバイオティック成分は、Bifidobacterium属、Lactobacillus属、Streptococcus属、Saccharomyces属、Leuconostoc属およびBacillus属からの、少なくとも１種、少なくとも２種、または少なくとも３種の微生物から構成される。他の態様において、プロバイオティック成分は、Bifidobacterium属、Streptococcus属またはLactobacillus属からの、少なくとも１種の微生物から構成される。さらなる態様において、プロバイオティック成分は、Bifidobacterium属、Streptococcus属またはLactobacillus属からの、少なくとも２種の微生物から構成される。特定の態様において、プロバイオティック成分は、Bifidobacterium longum、Streptococcus thermophilusおよびLactobacillus acidophilusから構成される。
【００１４】
本発明に有用な微生物はまた、自然選択を通してか、または遺伝子操作のいずれかにより、１種もしくは２種以上の同種異化酵素を発現または過剰発現することによって様々な窒素含有化合物（例えば、尿素、クレアチニン、尿酸およびアンモニア）を異化する能力を有するものでもある。例示的な微生物は、上昇したレベルのウレアーゼまたはクレアチニナーゼ分泌を有するものである。
【００１５】
上昇したレベルの異化酵素分泌を示す微生物は、増大した量の目的とする代謝物（例えば、尿素、クレアチニン、尿酸およびアンモニア）に選択微生物を曝露することにより、選択または養成できる。例えば、Streptococcus thermophilesの標準的な菌株は、例えば、０．５％の尿素で生育した単一コロニーを選択し１．０％の尿素を含有する培地に適用する、１．０％の尿素で生育した単一コロニーを選択し２．０％の尿素を含有する培地に適用するなど、増大した量の尿素での連続的継代により、上昇したレベルのウレアーゼを発現するように養成できることが見出されている。かかる方法を用いて、５．０％の尿素において生育する能力を有するS. thermophiles菌株が単離された。この菌株は、大腸環境の特徴である、５．５から７．５のｐＨ範囲中の人工腸液（ＡＩＦ、米国薬局方）中で増殖し、唯一の窒素源として尿素を用い、他の窒素源の存在下で尿素を異化した。尿素の加水分解は生育依存性およびｐＨ依存性であること、ならびに、１０９ｃｆｕ／ｍＬの初期密度でＡＩＦに植菌した場合、尿素濃度はこの菌株により、ｐＨ６．３で２４時間以内に３００ｍｇ／ｄＬから２０ｍｇ／ｄＬまで低減できることが見出された。さらに、この菌株は酸性ｐＨ３．０中で、ｃｆｕにおいてたった１ｌｏｇの損失で３時間生存し、胆液を通過することができた。加えて、この菌株は通常用いられている８種の抗生物質に対し、いかなる耐性も示さないと思われた。したがって、これらのデータは特異的に選択または養成された微生物単離物が、本発明の製品において尿素標的化成分として用いることができることを示唆する。
【００１６】
上昇した分泌レベルはまた、Bifidobacterium属菌、Lactobacillus属菌、Streptococcus属菌、Leuconostoc属菌もしくはBacillus属菌などの目的とする原核微生物またはSaccharomyces属菌などの真核微生物中での、目的とする遺伝子の過剰発現（例えば、多重コピーまたは高レベルで発現させるプロモーターを通じて）により得ることもできる。目的とする遺伝子は、誘導性のまたは構成的なプロモーターの調節管理下とすることができる。原核生物の組換え発現ベクターに用いられるプロモーターは当該技術分野において確立されており、ベータ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーターシステム（Chang et al. (1978) Nature 275:615、Goeddel et al. (1979), Nature 281:544）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Goeddel et al. (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057、欧州特許出願公開第３６，７７６号公報）ならびにｔａｃプロモーターシステム（De Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21）を含むことができる。これらは通常用いられる市販のプロモーターであるが、当業者は他の好適な微生物プロモーターを同様に用いることができることをよく理解できる。好適な原核生物のプロモーターをコードする核酸配列は公表されており、したがって当業者はそれらのプロモーターを、プラスミドまたはウィルスベクターにクローニングするために、（例えば標準的なクローニングまたはＰＣＲの技法により）容易に単離することができる（Siebenlist et al. (1980) Cell 20:269）。プロモーターおよび（原核生物宿主発現のための）シャイン・ダルガノ配列は、目的とする遺伝子をコードするＤＮＡと作動可能に(operably)リンクしている、すなわち、ＤＮＡからのメッセンジャーＲＮＡ転写を促進するために配置され、その後好適な宿主細胞内に導入される。
【００１７】
酵母培養物などの真核微生物もまた、好適なタンパク質をコードするベクターにより形質転換できる。例えば米国特許第４，７４５，０５７号参照。多くの他の系統も一般に入手可能であるが、Saccharomyces cerevisiaeが、低級真核宿主微生物の中でも最も一般に用いられるものである。酵母ベクターは、２ミクロン酵母プラスミドまたは自己複製配列（ＡＲＳ）からの複製開始点、プロモーター、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終止のための配列、ならびに選択マーカーをコードする遺伝子を含むことができる。例示的なプラスミドはＹＲｐ７である（Stinchcomb et al. (1979) Nature 282:39、Kingsman et al. (1979) Gene 7:141、Tschemper et al. (1980) Gene 10:157）。このプラスミドは、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Jones, (1979) Genetics, 85:12）などのトリプトファン中で生育する能力が欠如した酵母の変異菌株の選択マーカーを提供する、ｔｒｐ１遺伝子を含む。酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１が破壊されていると、トリプトファンを欠く中で生育させることにより、形質転換を検出するための効果的な環境が提供される。
【００１８】
酵母ベクター中の好適なプロモーター配列は、メタロチオネイン、３−ホスホグリセラートキナーゼ（Hitzeman et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:2073）またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼ、へキソキナーゼ、ピルバートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスファートイソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルバートキナーゼ、トリオースホスファートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどの他の糖分解酵素（Hess et al. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149、Holland et al. (1978) Biochemistry 17:4900）のためのプロモーターを含む。酵母発現に用いるための好適なベクターおよびプロモーターは、商業的に入手可能であり、さらにHitsman et al., ＥＰ第７３，６５７号に記載されている。
【００１９】
当業者には理解されるであろうように、目的とする分解酵素、例えばウレアーゼまたはクレアチニナーゼ、をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核または真核の細胞膜を通過して、目的とする酵素を分泌させるシグナル配列を含むように設計することができる。かかるシグナル配列は当該技術分野において確立されており、細胞外環境に分泌されることが知られている他の酵素／タンパク質から得ることができる。
【００２０】
本明細書で定義される微生物を形質転換することは、外因性のＤＮＡをレシピエントである細胞に導入し、変化させるプロセスをいう。それは、当該技術分野において公知の様々な方法を用いて、天然のまたは人工的な状況下で起こり得る。形質転換は、外来性核酸配列を原核または真核の宿主細胞に挿入するための任意の公知の方法に依拠することができる。当該方法は、形質転換される宿主細胞のタイプに基づいて選択され、限定されるものではないが、ウィルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、および粒子衝突などを含むことができる。かかる「形質転換された」細胞は、挿入ＤＮＡが自己複製プラスミドとしてかまたは宿主染色体の一部として複製可能である、安定的に形質転換された細胞を含む。これはまた、挿入ＤＮＡまたはＲＮＡを限定された期間で一過的に発現する細胞を含む。
【００２１】
当業者には理解されるであろうように、微生物はまた、上昇したレベルの目的とする異化酵素を発現するように、該生物の遺伝子構造に変化を引き起こす変異原に曝露されることもできる。
【００２２】
形質転換されたまたは変異化された菌株は、続いて、目的とする異化酵素により分解される代謝物の存在下で生育する能力について選択される。例示の目的で、ウレアーゼをコードする核酸配列により形質転換された菌株は、前記菌株を高レベルの尿素上で生育することにより、高レベルのウレアーゼ分泌について選択される。ウレアーゼ分泌のレベルはまた、標準的な酵素アッセイを用いても検出できる。本明細書に開示されるように、菌株は、ウレアーゼ分泌をさらに増強させるため、増大する尿素レベル上で連続的に継代培養されてよい。本発明の一態様は、Bacillus pasteurii、Streptococcus thermophilusまたはSaccharomyces pombeのウレアーゼ分泌菌株を提供する。別の態様において、ウレアーゼ分泌菌株は、少なくとも２種または少なくとも３種の微生物から構成されるプロバイオティック成分の少なくとも１種の微生物である。さらなる態様において、ウレアーゼ分泌菌株は、少なくとも３種の微生物から構成されるプロバイオティック成分の少なくとも２種の微生物である。
【００２３】
本発明によるプロバイオティクスは、発酵により得られ、発酵後および本発明の組成物への添加前に、プロバイオティックのｃｆｕの実質的損失を妨げる時間および温度で貯蔵できる。例えば、プロバイオティック組成物は、最終濃度が発酵培地１ｍＬあたり１０６から５×１０１０、または１０７から１０１０、または１０８から１０９ｃｆｕが達成されるまで発酵させることができる。
【００２４】
プロバイオティック成分が単一培養である場合、該単一培養は１００％のプロバイオティック成分である。プロバイオティック成分が少なくとも２種の微生物から構成される場合、お互いの微生物はプロバイオティック成分の１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％であり得、ここで、全微生物の合計は１００％である。典型的なプロバイオティック成分は、約１０〜１５％のL. acidophilus、約１０〜１５％のB. longumおよび約７０〜８０％のS. thermophilus（例えば、それぞれ約１：１：８の比率）から構成される。
【００２５】
プロバイオティック成分またはウレアーゼ分泌微生物は、液体として添加される場合は１０８ｃｆｕ／ｍＬ、１０９ｃｆｕ／ｍＬ、１０１０ｃｆｕ／ｍＬ、１０１１ｃｆｕ／ｍＬまたは１０１２ｃｆｕ／ｍＬの濃度で、または凍結乾燥させた粉末として添加される場合は１０８ｃｆｕ／ｇ、１０９ｃｆｕ／ｇ、１０１０ｃｆｕ／ｇ、１０１１ｃｆｕ／ｇまたは１０１２ｃｆｕ／ｇの濃度で含まれる。１つの態様において、プロバイオティック成分は、総製品重量の約２０％から約７０％である。特定の態様において、プロバイオティック成分は総製品重量の約５０％である。
【００２６】
可食性栄養タンパク質およびその誘導体は、特に、顕著なタンパク質損失を示すステージ５の腎不全を有する対象において、特段の利益を提供する。例えばホエータンパク質単離物（ＷＰＩ）および乳タンパク質単離物（ＭＰＩ）が、除脂肪筋肉重量の増加を効果的に提供することが示される。ＷＰＩは、分枝鎖アミノ酸が高度である。ＭＰＩは主としてカゼインであり、筋肉成長の促進における有効性を示す。卵タンパク質（卵白）もまたアミノ酸含有量が高い。ホエータンパク質加水分解物（ＷＰＨ）は、ラットにおける改善された窒素保持および成長と結びついている。したがって、特定の態様において、本発明の可食性タンパク質は、ホエータンパク質またはその単離物、濃縮物もしくは加水分解物；乳タンパク質またはその単離物、濃縮物もしくは加水分解物；ホエー成長因子抽出物；グルタミンペプチド；卵白；大豆タンパク質またはその単離物、濃縮物もしくは加水分解物；あるいはカゼイナートである。本組成物において、タンパク質は構成要素それ自体として添加され、ピーナッツ片などの他の構成要素から供給されない。この点において、タンパク質は単離されている、すなわち、抽出物または精製タンパク質として（例えば、脂肪および炭水化物が除去されたタンパク質と９０％を超えて相同であるなど）、その天然源から得られたものである。
【００２７】
タンパク質が単一の可食性タンパク質である場合、該タンパク質はタンパク質成分の１００％である。タンパク質成分が２種または３種以上のタンパク質から構成される場合、各タンパク質はタンパク質成分の５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％であることができ、ここでタンパク質成分の合計が１００％である。
【００２８】
本発明の組成物に添加されるタンパク質成分の量は、一人前あたり１０から５０グラムの範囲で提供される。一態様において、タンパク質成分は、一人前当たり１０グラム以上および１００グラム以下である。一態様において、タンパク質成分は総製品重量の約２０％から約７０％である。特定の態様において、タンパク質成分は総製品重量の約５０％である。製品がさらに付加的な添加物を含む場合、タンパク質の割合は該付加的な添加物に合わせて減少させることができる。
【００２９】
いくつかの態様において、本発明の組成物はさらにプレバイオティック成分を含む。プレバイオティックは、大腸において１種または２種以上の非病原性細菌の生育および／または活性を選択的に刺激することにより、宿主に有益に影響する非消化性食品を指す。本発明のプレバイオティック成分は、抗発癌性活性、抗菌性活性、脂質低下活性およびグルコース調節活性を有すると考えられている。またそれらは、ミネラル吸収およびバランスを改善することもできる。さらに、Bifidobacterium属およびLactobacillus属のファミリーの一員である細菌は、プレバイオティック成分の存在により刺激され、増殖する。薬物動態学的に、プレバイオティック成分は、ほぼ元のままで大腸に到達する。例示的なプレバイオティック成分としては、限定されるものではないが、フルクトオリゴ糖もしくはイヌリン、イソマルトースオリゴ糖、トランス−ガラクトオリゴ糖、キシロ−オリゴ糖、または大豆オリゴ糖などのオリゴ糖、アラビノガラクタン、ラクチトール、ラクトスクロース、もしくはラクツロースなどのピロデキストリン、あるいはエンバクガム（oat gum）、エンドウ繊維（pea fiber）、リンゴ繊維（apple fiber）、ペクチン、グアーガム、オオバコ種皮、グルコマンナンもしくはグアーガム加水分解物（BENEFIBER、Novartis Pharmaceuticals）などの繊維源が挙げられる。一態様において、プレバイオティック成分は少なくとも１種、少なくとも２種、または少なくとも３種の非消化性食品（例えばオリゴ糖、ピロデキストリン、または繊維源など）から構成される。別の態様において、オリゴ糖が、少なくとも２種または少なくとも３種の非消化性食品から構成されるプレバイオティック成分の、少なくとも１種の非消化性食品である。さらに別の態様において、繊維源が、少なくとも２種または少なくとも３種の非消化性食品から構成されるプレバイオティック成分の、少なくとも１種の非消化性食品である。さらなる態様において、繊維源が、少なくとも３種の非消化性食品から構成されるプレバイオティック成分の、少なくとも２種の非消化性食品である。よりさらなる態様において、プレバイオティック成分は、以下の非消化性食品、ラクツロース、オオバコ種皮およびグアーガム加水分解物の少なくとも１種で構成される。特定の態様において、プレバイオティック成分はラクツロース、オオバコ種皮およびグアーガム加水分解物から構成される。
【００３０】
プロバイオティックおよび可食性食品タンパク質の有益な特性を組み合わせた栄養製品は、食品製品、栄養補助食品、調理済み医療食品または医薬製品を含む。前記製品の摂取は、タンパク質源を提供するとともに、循環血中に集積する窒素含有老廃物の血中濃度を低減させる。本発明のこれらの老廃物は、正常なもしくは異常な代謝ルートなどの内在性由来であるか、または微生物腐敗であり得る。さらに、老廃物は、タンパク質およびアミノ酸の食事摂取などの外因性由来であり得る。さらに本製品の繰り返し摂取は、健康的な腸内微生物環境を促進することが知られている微生物の大腸内への局在化および生着により、腸内微生物叢に高度に有益な効果を有するであろう。
【００３１】
本発明の製品は、限定されるものではないが、ヘルスバー（health bar）、健康飲料、ヨーグルト、ダヒ（dahi）、アイスクリーム、フローズンヨーグルトまたは他の冷凍食品製品を含む、食品製品の形態を取ることができる。タンパク質およびプロバイオティック成分を含むことに加えて、本発明の製品はさらに様々な充填剤または添加物を含むことができる。
【００３２】
本発明の組成物の任意の添加物は、限定することなく、ステアリン酸マグネシウムなどの薬学的賦形剤、タルク、デンプン、糖、脂肪、抗酸化剤、アミノ酸、タンパク質、核酸、電解質、ビタミン、それらの誘導体またはそれらの組み合わせを含む。一態様において、本製品の添加物は、例えばローカストビーンガムなどのイナゴマメ粉である。別の態様において、添加物はAgaricus bisporusからのキノコ抽出物である。特定の態様において、ジェルカップはステアリン酸マグネシウム、タルクおよびデンプンなどの充填剤を含む。
【００３３】
さらに、タンパク質およびプロバイオティックを含む食品製品のおいしさを増すために、フレーバー、甘味剤、結合剤または膨化剤を添加するのが望ましくあり得る。
【００３４】
本発明の組成物に任意に添加してよいフレーバーは、当該技術分野に周知である。例としては、限定されるものではないが、合成フレーバー油および／または植物の葉、花、果実などからの油が挙げられ、それらの組み合わせが有用である。フレーバー油の例としては、限定されるものではないが、スペアミント油、ペパーミント油、シナモン油、およびウィンターグリーンの油（サリチル酸メチル）を含む。同様に有用なのは、レモン、オレンジ、ブドウ、ライムおよびグレープフルーツなどの柑橘油およびリンゴ、イチゴ、サクランボ、パイナップル等を含む果実エッセンスなどの人工の、天然のまたは合成の果実フレーバーである。
【００３５】
甘味剤は、限定することなく、水溶性甘味剤、水溶性人工甘味剤およびジペプチドベースの甘味剤、それらの塩およびそれらの混合物を含む、などの広範な材料から選択することができる。
【００３６】
結合剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、または他の好適なセルロース誘導体、ポビドン、アクリル酸もしくはメタクリル酸のコポリマー、薬学的グレーズ（pharmaceutical glaze）、ガム（例えばガムトラガカント）、乳誘導体（例えばホエー）、デンプン（例えばコーンスターチ）またはゼラチン、および誘導体、ならびに当業者に周知な従来の他の結合剤などの広範な材料から選択することができる。膨化物の例としては、限定されるものではないが、糖、ラクトース、ゼラチン、でんぷんおよび二酸化シリコンが挙げられる。
【００３７】
上記の添加物が本発明の製品に含まれる場合、それらは一般的に総製品重量の１５％未満である。特定の態様において、それらは総製品重量の５〜１０％未満である。
【００３８】
製品がヒトの成人、小児または動物（例えばコンパニオンアニマルまたは家畜）により消費されるかどうかによって、意図されたレシピエントにとって好適な様々なサイズおよび様々な構成要素で製造することができる。さらに、本発明のプロバイオティックおよびタンパク質成分は一般的に安全であると認識されるため、それらは毎日１、２または３回あるいはそれ以上で消費されることができる。
【００３９】
本発明はまた、窒素含有老廃物を、上昇したレベルの窒素含有老廃物を有する個体の血液から除去する方法にも関する。本方法は、血中の窒素含有老廃物のレベルを、望ましくは正常な範囲まで、減少または低減させるように、有効量の本発明の製品を投与することを伴う。例えば、正常なレベルの血中クレアチニンは、０．６〜１．２ｍｇ／ｄＬである一方、正常な血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルは７〜１８ｍｇ／ｄＬの範囲および男性および女性における正常な尿酸レベルは、それぞれ２．１から８．５ｍｇ／ｄＬおよび２．０から７．０ｍｇ／ｄＬである。さらに、５〜３５のＢＵＮ／クレアチニン比率が、血中窒素含有老廃物の正常レベルの指標である。当業者は、窒素含有老廃物のレベルを決定するやり方が習熟した研究者（skilled laboratory clinician）に公知であることを理解できる。
【００４０】
本発明の製品は、慢性腎不全を有する哺乳動物の血中の窒素含有老廃物レベルを低減できるため、これらの組成物は腎不全を改善するための方法に有用である。本方法は、腎不全を有するまたは有するリスクのある対象に本発明の製品を投与することを伴う。腎不全を有するまたは有するリスクのある対象は、糖尿病性ネフロパシー、高血圧性腎硬化、糸球体腎炎、間質性腎炎、または多発性嚢胞腎を有し、ネフロン機能が損なわれることにより、糸球体ろ過率が減少しているものである。望ましくは、腎不全を改善する有効量の製品は、臨床結果を含む、有益なまたは望ましい結果に影響を及ぼすのに十分な量であり、腎不全と関連する１つまたは２つ以上の症状（例えば尿毒性溶質の蓄積）の緩和または改善、疾患の程度の後退、健康な腸機能を補助することによる疾患の安定状態（すなわち悪化しない）、疾患の進行の遅延または減速、あるいは疾患状態の改善または緩和の結果となる量のようなものである。改善はまた、治療を受けない場合の予測生存と比較した生存の延長を意味することもできる。特定の態様において、本組成物は、腎不全およびタンパク質欠乏症を有する対象に投与される。
【００４１】
さらに、タンパク質およびプロバイオティクスを含有する本発明の組成物は、がん治療を受けている対象に、エネルギーおよび健康全般および幸福を提供するというさらなる有用性を有し得ることが予期される。
【００４２】
例１：ヨーグルト食品製品
ヨーグルトまたはフローズンヨーグルトは、１ガロンの商業的に入手可能な、均質化され、殺菌された全乳から調製することができ、それを沸騰するまで加熱し、すぐに約４５℃まで冷却する。これに約１オンスの、Lactobacillus属、Streptococcus属、Bacillus属またはBifidobacterium属の乳酸菌を含有するヨーグルトの種培養物を添加する。混合物をよく混ぜ、３７℃で１０から１２時間発酵させる。１種または２種以上のタンパク質、プロバイオティクス、全果実添加物、フレーバリング剤、甘味剤、結合剤、または他の添加剤を組み合わせてヨーグルトに添加し、所望のかたさの製品を得る、または見込まれる消費者のパレット（the palette of the prospective consumer）に適合させることができる。本発明の一態様において、食品製品は、腎不全を有する個体の特別な食事のニーズに沿うような成分を含む。
【００４３】
例２：ヘルスバー
ヘルスバーは、プロバイオティック（例えばLactobacillus属菌、Streptococcus属菌、Bacillus属菌またはBifidobacterium属菌）および大豆タンパク質単離物などのタンパク質と共に、結合剤、添加物、フレーバリング剤、着色料など様々な賦形剤を組み合わせ、柔軟な塊のかたさとなるまで混合することにより調製できる。その後、塊を押し出すか型に入れて、「キャンディバー」の形に成型し、その後乾燥または固化させて最終製品を形成する。
【００４４】
例３：医療食品
医療食品は、ロールドオート、乾燥リンゴ、蜂蜜、イヌリン、イナゴマメ粉、シナモン、糖、バニラ抽出物、およびホエータンパク質単離物などのタンパク質ならびにL. acidophilusおよび／またはL.fermentum、Bifidobacterium属菌およびStreptococcus thermophiles（それぞれ１０８〜１０１０ｃｆｕ）の凍結乾燥した培養物を組み合わせて調製できる。これらの構成要素は適した比率でプレバイオティックと混合され、長さ約１２．５から１５センチメートル、幅３から４センチメートルおよび高さ１センチメートルの長方形の棒状に形成され、滅菌真空オーブン中に１２から２４時間おかれ、所望のかたさの可食性食品製品を得る。
【００４５】
例４：慢性尿毒症のミニブタモデル
ジェルカップ製品またはブタの食餌と混合した製剤の形態の本発明の組成物の効果を、Gottingen系統のミニブタにおける慢性尿毒症の確立されたモデル（Willis, et al. (1997) J. Endourol. 11(1):27-32）を用いて試験した。性的成熟期（３月齢）のこれらのブタは８〜１１ｋｇの重さであり、全ての他の系統のミニブタの半分のサイズである。このブタはゆっくり成長し、約６ヶ月で体重が２倍となる。
【００４６】
この尿毒症モデルにおいて、腎臓重量の５／６が両側の側腹切開により除去された（McKenna, et al. (1992) J. Urol. 148(2 Pt 2): 756-9）。１つの腎臓は完全に除去され、反対側の腎臓の両極を、電気メス（腎被膜および約２ｍｍの実質に切れ目を入れるため）、外科用ステープルおよび残余部分の露出した実質の上に縫合された発泡ゲルを用いて除去した。反対側の腎臓は、肉眼での切開ならびに腎動脈および静脈および尿管の結紮および切開により、同一の外科的手順の間に除去された。この分析に用いられたブタは、特徴として、血漿中のクレアチニンおよび血中尿素窒素（ＢＵＮ）の濃度の大きく急激な上昇を経験させ；その後ベースラインよりも十分上で安定された値まで、１〜２週間で下降させた。これらのブタは３〜６ヶ月の間食欲および安定した尿毒素を維持し続け、体重は維持または増量され、正常コントロールブタと何ら変わらない振る舞いをした。ヘマトクリットは尿毒症が進行するにつれてゆっくり下降し、ヘモグロビン濃度もまた時間につれて下降した。手術の後、組成物の投与の前に３〜４週間回復させた。
【００４７】
このモデルを用いて、ジェルカップの形態または豚の食餌に混合した形態の、数回の異なる盲検の製剤を、尿毒症の腸ベース療法として試験した。ブタの食餌と共に投与される製剤は、ＢＵＮ値においてもクレアチニン値においても、何ら有意な差異も実証しなかった。しかしながら、４種の微生物菌株（L. acidophilus、L. bulgaricus、B. longumおよびS. thermophilus；１０×１０９ＣＦＵ／ジェルカップ）を含む製剤を与えた５／６の腎摘出をしたミニブタ（ｎ＝６）は、約３１％の継続的な体重増加ならびにそれぞれ約１３％減少したＢＵＮおよびクレアチニンレベルを示した。同様に、３種の微生物菌株（L. acidophilus、B. longumおよびS. thermophilus；１０×１０１０ＣＦＵ／ジェルカップ）を含む製剤を与えた５／６の腎摘出をした２頭のミニブタもまた、１頭のミニブタは体重が増加し（６％）、他方は減少した（２０％）ものの、ＢＵＮ（平均２１％）およびクレアチニン（平均２９％）レベルの減少を示した。さらなる製剤を、ジェルカップの形態でまたは食品に混合して試験し、一般的に結果はプロバイオティック製剤による経口処置は、慢性腎不全の安定ブタモデルにおいて、効果的かつ有意に血漿クレアチニン濃度を２２．５±８．５％低減させた。小さいサンプルサイズは対応するＢＵＮの低減およびヘマトクリットの上昇の検出を妨げ得る。
【００４８】
例５：動物への投与
表１は、コンパニオンアニマルなどの動物への投与についての、栄養製品の好適なおおよその１回分の投与量を与える。
【表１】
2013538827.tif 000002
【００４９】
例６：Streptococcus thermophilusのウレアーゼ分泌菌株
この例は、Streptococcus thermophilusの高レベルウレアーゼ分泌菌株の単離および選択を開示する。３種のグラム陽性、乳酸産生非病原性球菌のStreptococcus thermophilusの単離物を、様々な供給源から単離し、ＫＢ４、ＫＢ１９およびＫＢ２５と指定した。ＫＢ４はプロバイオティック製品から単離し、ＫＢ１９は市販のヨーグルト製品から、およびＫＢ２５は（インドからの）ダヒヨーグルトから単離した。
【００５０】
腸内ｐＨ範囲（ｐＨ５．５、６．３および７．５）におけるこれらの細菌の生育率および尿素加水分解を、ＫＢ１９、ＫＢ４およびＫＢ２５の指数増殖する培養物を、１００ｍｇ／ｄＬのろ過滅菌した尿素、１００μＭのＮｉＣｌ２、１０％のＭＲＳブロス、最終濃度１％としたデキストロース、および０．３％酵母抽出物を補充した改変人工腸液Ｍ２（ＡＩＦ、米国薬局方）に、開始細胞密度が１０９ｃｆｕ／ｍＬとなるように移し替えることにより、決定した。直接ＯＤ６００ｎｍを計測することにより細菌生育の評価ができるようにするため、パンクレアチンはレシピから省略した。上清中の尿素濃度（コントロールの％）および生育（ＯＤ６００ｎｍ）を、４時間毎に計測した。
【００５１】
細菌培養物の上清中の尿素の濃度を、Blood Urea Nitrogen Reagent Kit（535, SIGMA, St. Louis, MO）と共に供給されたプロトコルおよび標準書を用いて計測した。尿素加水分解は、細菌上清中の尿素窒素濃度と同一の条件でインキュベートした適切なコントロール培地のものとを比較することにより監視し、コントロールのパーセントとして表した。４回から９回の独立した実験を実施し、統計分析にはステューデントｔ検定を用いた。
【００５２】
類似のアッセイ条件下で、ＫＢ１９、ＫＢ４およびＫＢ２５の指数増殖する培養物を、１００ｍｇ／ｄＬの尿素を補充し、かつ１００μＭのＮｉＣｌ２を補充するか、または補充しないＡＩＦ  Ｍ２、ｐＨ６．３に、１０９ｃｆｕ／ｍＬの開始細胞密度で植菌し、生育およびこれらの菌株による尿素加水分解率は、添加されたＮｉ＋＋に依存するか否かを決定した。コントロールの％としての上清の尿素濃度および生育（ＯＤ６００ｎｍ）を、４時間毎に計測した。４回から９回の独立した実験が実施され、統計分析にはステューデントｔ検定を用いた。同様に、生育およびこれらの菌株による尿素加水分解率は、尿素濃度に依存するか否かを決定した。類似の生育条件下で、ＫＢ１９、ＫＢ４およびＫＢ２５の指数増殖する培養物を、１００μＭのＮｉＣｌ２および１００、２００または３００ｍｇ／ｄＬの尿素を補充したＡＩＦ  Ｍ２、ｐＨ６．３に植菌した。コントロールの％としての上清の尿素濃度および生育（ＯＤ６００ｎｍ）を、４時間毎に計測した。４回から９回の独立した実験が実施され、統計分析にはステューデントｔ検定を用いた。これらＫＢ１９、ＫＢ４およびＫＢ２５の生存性を、尿素およびデキストロースの有無の下、人工胃液中で決定した。人工胃液に曝露した後の生存細胞数の平均損失（ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬ）を表２に示す。
【表２】
2013538827.tif 000003
【００５３】
さらに、栄養成分およびアベイラビリティが、生育およびＫＢ１９、ＫＢ４およびＫＢ２５による尿素加水分解率に依存するか否かを決定した。各菌株は３７℃およびｐＨ６．０、１００ｍｇ／ｄＬの尿素ならびに窒素および炭素源の組み合わせの有無で、２４時間生育した。
【００５４】
S. thermophilus  ＫＢ１９は、この菌株が胃液、ｐＨ３．０、への３時間の曝露、その後の０．３％のオックスゴール、ｐＨ６．０への３時間の曝露に対し、バイアビリティにおいて、たった１ｌｏｇの損失で生存することができることを示唆した。残った生存細胞は、２３０ｍｇ／ｄＬの尿素を補充したＡＩＦ  Ｍ２、ｐＨ６．０中で増殖することができ、１８時間未満以内に尿素を完全に加水分解できた（ｎ＝４）。全ての試験溶液には２３０ｍｇ／ｄＬの尿素および１％のデキストロースを補充した。まとめて、これらの分析は、研究された３菌株全てが、大腸環境に特徴的な、ｐＨ範囲５．５から７．５の食餌状態のＡＩＦ培地中で増殖すること；これらがすべて尿素を単一の窒素源として用いることができること；およびこれらがそれぞれ他の窒素源の存在下で尿素を異化することを示唆した。尿素加水分解は生育およびｐＨ依存性であった。試験した条件下では、尿素加水分解の率は菌株依存的であり、ｐＨ安定性の試験：ＫＢ１９＝ＫＢ２５＞ＫＢ４；Ｎｉ要求試験：ＫＢ２５＞ＫＢ１９＞ＫＢ４；３００ｍｌ／ｄＬを超える尿素加水分解試験：ＫＢ１９＝ＫＢ２５＞ＫＢ４；および特定栄養成分試験：ＫＢ１９＞ＫＢ２５＞ＫＢ４であった。さらに、生存性に関係する菌株依存的な結果もあり、胃液安定性の試験：ＫＢ１９＞ＫＢ４＞ＫＢ２５；および胆液安定性試験：ＫＢ１９＞ＫＢ４＞ＫＢ２５であった。
【００５５】
S. thermophiles  ＫＢ１９により示された所望の遺伝形質という観点から、ディスク拡散試験を用いて、ＫＢ１９はスペクチノマイシン（１００μｇ）、カナマイシン（３０μｇ）、クロラムフェニコール（３０μｇ）、スペクチノマイシン（１００μｇ）、ペニシリン（１０ＩＵ）、カルベニシリン（１００μｇ）、ドキシサイクリン（３０μｇ）およびネオマイシン（３０μｇ）に感受性であることがさらに決定された。菌株ＫＢ１９により分泌されるウレアーゼレベルをさらに増強するため、この菌株を本明細書に記載されるように、増大したレベルの尿素で養成した。
【国際調査報告】
2013538827.tif 000004