(57)【要約】本発明は、亜鉛−α２−糖タンパク質またはその機能的断片を、単独で、またはβアドレナリン受容体作動薬、βアドレナリン受容体拮抗薬、および／もしくは血糖制御薬等の追加薬剤と併せて投与することによって、悪液質、低血糖、肥満、糖尿病等の代謝異常に関連する症状を改善するための製剤および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）、ＺＡＧ変異型、修飾されたＺＡＧ、またはその機能的断片を含む、製剤。
【請求項２】
前記ＺＡＧが、哺乳類由来である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記ＺＡＧが、ヒト由来である、請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
前記ＺＡＧが、配列番号１に記載のアミノ酸配列から成る、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
前記ＺＡＧが、非タンパク質ポリマーに結合している、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
前記ＺＡＧが、溶解性または安定性を増加させるように、シアル酸付加、ＰＥＧ化、または修飾されている、請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
前記ＺＡＧが、組み換えまたは合成である、請求項１に記載の製剤。
【請求項８】
前記修飾されたＺＡＧが、欠失、付加、または保存的置換から選択される、アミノ酸配列に対する１つまたは複数の変異を有する、野生型ＺＡＧアミノ酸配列から成る、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
前記ＺＡＧが、リーダー配列および後続配列のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１０】
前記ＺＡＧが、グリコシル化されている、請求項５に記載の製剤。
【請求項１１】
前記ＺＡＧが、翻訳後修飾の結果としてグリコシル化されている、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１２】
前記機能的断片が、タンパク質分解、化学分解、または折り畳みドメイン保存断片化によって生成される、請求項１に記載の製剤。
【請求項１３】
少なくとも５、１０、２５、５０、１００ｍｇのＺＡＧを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１４】
製薬上許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１５】
β３作動薬およびβ−アドレナリン受容体（β−ＡＲ）拮抗薬から成る群から選択される、１つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１６】
前記β−ＡＲ拮抗薬が、β２−アドレナリン受容体（β２−ＡＲ）拮抗薬、β１−アドレナリン受容体（β１−ＡＲ）拮抗薬、およびβ３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）拮抗薬から成る群から選択される、請求項１５に記載の製剤。
【請求項１７】
前記β３作動薬が、エピネフリン（アドレナリン）、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、［（シアノ）ピンドロール］、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、３'−ヨードトリメトキノロール、３'，５'−ヨードトリメトキノロール、アミベグロン（Ａｍｉｂｅｇｒｏｎ）、ソラベグロン（Ｓｏｌａｂｅｇｒｏｎ）、ネビボロール（Ｎｅｂｉｖｏｌｏｌ）、ＡＤ−９６７７、ＡＪ−９６７７、ＡＺ−００２、ＣＧＰ−１２１７７、ＣＬ−３１６２４３、ＣＬ−３１７４１３、ＢＲＬ−３７３４４、ＢＲＬ−３５１３５、ＢＲＬ−２６８３０、ＢＲＬ−２８４１０、ＢＲＬ−３３７２５、ＢＲＬ−３７３４４、ＢＲＬ−３５１１３、ＢＭＳ−１９４４４９、ＢＭＳ−１９６０８５、ＢＭＳ−２０１６２０、ＢＭＳ−２１０２８５、ＢＭＳ−１８７２５７、ＢＭＳ−１８７４１３、ＢＭＳ−１８７４１３のＳＯ３ＨのＣＯＮＨ２置換、ＢＭＳ−１８１４１３のラセミ化合物、ＣＧＰ−２０７１２Ａ、ＣＧＰ−１２１７７、ＣＰ−１１４２７１、ＣＰ−３３１６７９、ＣＰ−３３１６８４、ＣＰ−２０９１２９、ＦＲ−１６５９１４、ＦＲ−１４９１７５、ＩＣＩ−１１８５５１、ＩＣＩ−２０１６５１、ＩＣＩ−１９８１５７、ＩＣＩ−Ｄ７１１４、ＬＹ−３７７６０４、ＬＹ−３６８８４２、ＫＴＯ−７９２４、ＬＹ−３６２８８４、ＬＹ−７５０３５５、ＬＹ−７４９３７２、ＬＹ−７９７７１、ＬＹ−１０４１１９、Ｌ−７７１０４７、Ｌ−７５５５０７、Ｌ−７４９３７２、Ｌ−７５０３５５、Ｌ−７６００８７、Ｌ−７６６８９２、Ｌ−７４６６４６、Ｌ−７５７７９３、Ｌ−７７０６４４、Ｌ−７６００８１、Ｌ−７９６５６８、Ｌ−７４８３２８、Ｌ−７４８３３７、Ｒｏ−１６−８７１４、Ｒｏ−４０−２１４８、（−）−ＲＯ−３６３、ＳＢ−２１５６９１、ＳＢ−２２０６４８、ＳＢ−２２６５５２、ＳＢ−２２９４３２、ＳＢ−２５１０２３、ＳＢ−２３６９２３、ＳＢ−２４６９８２、ＳＲ−５８８９４Ａ、ＳＲ−５８６１１、ＳＲ−５８８７８、ＳＲ−５９０６２、ＳＭ−１１０４４、ＳＭ−３５０３００、ＺＤ−７１１４、ＺＤ−２０７９、ＺＤ−９９６９、ＺＭ−２１５００１、およびＺＭ−２１５９６７から成る群から選択される、請求項１５に記載の製剤。
【請求項１８】
前記β３−ＡＲ拮抗薬が、ＳＲ５９２３０Ａである、請求項１６に記載の製剤。
【請求項１９】
前記β−ＡＲ拮抗薬が、プロプラノロール、（−）−プロプラノロール、（＋）−プロプラノロール、プラクトロール、（−）−プラクトロール、（＋）−プラクトロール、ＣＧＰ−２０７１２Ａ、ＩＣＩ−１１８５５１、（−）−ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールから成る群から選択される、請求項１５に記載の製剤。
【請求項２０】
インスリン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、またはその類似体から選択される、血糖降下薬をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項２１】
液体、ペースト、粉末、乳剤、懸濁液、または固形の形態である、請求項１に記載の製剤。
【請求項２２】
噴霧剤、錠剤、凍結乾燥粉末、半固形ゲル、舌下製剤、即時融解型製剤、口腔製剤、液体製剤、トローチ剤、フィルム、咀嚼製剤、矯味製剤、または発泡製剤としての経口投与に好適な形態である、請求項１に記載の製剤。
【請求項２３】
噴霧剤、液体、ペースト、乳剤、懸濁液、凍結乾燥粉末、または半固形ゲルを含む、鼻腔内または肺投与に好適な形態である、請求項１に記載の製剤。
【請求項２４】
噴霧剤、液体、ペースト、乳剤、懸濁液、凍結乾燥粉末、クリーム、軟膏、または半固形ゲルを含む、局所投与に好適な形態である、請求項１に記載の製剤。
【請求項２５】
自己注射器、ポンプ圧送装置、充填済みシリンジ、および無針技術による注射に好適である、請求項１に記載の製剤。
【請求項２６】
前記製剤が押し出される、請求項１に記載の製剤。
【請求項２７】
食物繊維源をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項２８】
タンパク質源をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項２９】
微量栄養素、栄養補助食品、栄養素、食用化合物、および香味料のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項３０】
リン酸塩、トリス、アルギニン、グリシン、Ｔｗｅｅｎ８０、スクロース、トレハロース、マンニトール、カゼインタンパク質、およびそれらの誘導体から成る群から選択される、１つまたは複数の賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項３１】
存在する場合、リン酸塩、トリス、アルギニン、およびグリシンの濃度が、約１５ｍＭ〜３００ｍＭである、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３２】
リン酸塩、トリス、アルギニン、およびグリシンの濃度が、独立して、２０ｍＭ、１５０ｍＭ、または２５０ｍＭである、請求項３１に記載の製剤。
【請求項３３】
存在する場合、前記Ｔｗｅｅｎ８０の濃度が、約０．０１％〜０．１％である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３４】
前記Ｔｗｅｅｎ８０の濃度が、０．０１％、０．０５％、または０．１％である、請求項３３に記載の製剤。
【請求項３５】
存在する場合、前記スクロース、トレハロース、およびマンニトールの濃度が、約０．１％〜５％である、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３６】
前記スクロース、トレハロース、およびマンニトールの濃度が、独立して、０．１％、１．０％、または５．０％である、請求項３５に記載の製剤。
【請求項３７】
前記１つまたは複数の賦形剤が、カゼインである、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３８】
前記栄養補助食品が、Ａ１およびＡ２βカゼインから成る群から選択される、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３９】
前記ＺＡＧ、ＺＡＧ変異型、修飾されたＺＡＧ、またはその機能的断片が、ポリマーとして存在する、請求項１に記載の製剤。
【請求項４０】
請求項１に記載の製剤を含む、食品添加物または栄養補助食品。
【請求項４１】
請求項１に記載の製剤と併せて、消費可能な担体を含む、食品または栄養補助食品。
【請求項４２】
前記消費可能な担体が、クッキー、ブラウニー、クラッカー、朝食バー、エナジーバー、シリアル、またはケーキである、請求項４０に記載の食品添加物または栄養補助食品。
【請求項４３】
前記消費可能な担体が、飲料である、請求項４０に記載の食品添加物または栄養補助食品。
【請求項４４】
前記消費可能な担体が、肉製品である、請求項４０に記載の食品添加物または栄養補助食品。
【請求項４５】
前記肉製品が、培養肉である、請求項４０に記載の食品添加物または栄養補助食品。
【請求項４６】
製剤を哺乳類対象に送達するための方法であって、請求項１〜３９または１〜４５のいずれか１項に記載の製剤を、前記哺乳類対象に投与することを含む、方法。
【請求項４７】
前記対象が、ヒトである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記製剤が、静脈内、経口、頬側、舌下、鼻腔内、経皮、皮下、筋肉内、局所投与されるか、または吸入によって投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記製剤が、少なくとも１０日間連日投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記製剤が、少なくとも２１日間連日投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記製剤が、１年を超えて連日投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記製剤が、２年を超えて連日投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記製剤が、１日２回投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記製剤が、３日に１回投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
前記製剤が、週１回投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
前記製剤が、月１回投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
前記製剤が、β３作動薬およびβ−アドレナリン受容体（β−ＡＲ）拮抗薬から成る群から選択される、１つまたは複数の薬剤と併せて投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５８】
前記β−ＡＲ拮抗薬が、β２−アドレナリン受容体（β２−ＡＲ）拮抗薬、β１−アドレナリン受容体（β１−ＡＲ）拮抗薬、およびβ３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）拮抗薬から成る群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記β３作動薬が、エピネフリン（アドレナリン）、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、［（シアノ）ピンドロール］、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、３'−ヨードトリメトキノロール、３'，５'−ヨードトリメトキノロール、アミベグロン、ソラベグロン、ネビボロール、ＡＤ−９６７７、ＡＪ−９６７７、ＡＺ−００２、ＣＧＰ−１２１７７、ＣＬ−３１６２４３、ＣＬ−３１７４１３、ＢＲＬ−３７３４４、ＢＲＬ−３５１３５、ＢＲＬ−２６８３０、ＢＲＬ−２８４１０、ＢＲＬ−３３７２５、ＢＲＬ−３７３４４、ＢＲＬ−３５１１３、ＢＭＳ−１９４４４９、ＢＭＳ−１９６０８５、ＢＭＳ−２０１６２０、ＢＭＳ−２１０２８５、ＢＭＳ−１８７２５７、ＢＭＳ−１８７４１３、ＢＭＳ−１８７４１３のＳＯ３ＨのＣＯＮＨ２置換、ＢＭＳ−１８１４１３のラセミ化合物、ＣＧＰ−２０７１２Ａ、ＣＧＰ−１２１７７、ＣＰ−１１４２７１、ＣＰ−３３１６７９、ＣＰ−３３１６８４、ＣＰ−２０９１２９、ＦＲ−１６５９１４、ＦＲ−１４９１７５、ＩＣＩ−１１８５５１、ＩＣＩ−２０１６５１、ＩＣＩ−１９８１５７、ＩＣＩ−Ｄ７１１４、ＬＹ−３７７６０４、ＬＹ−３６８８４２、ＫＴＯ−７９２４、ＬＹ−３６２８８４、ＬＹ−７５０３５５、ＬＹ−７４９３７２、ＬＹ−７９７７１、ＬＹ−１０４１１９、Ｌ−７７１０４７、Ｌ−７５５５０７、Ｌ−７４９３７２、Ｌ−７５０３５５、Ｌ−７６００８７、Ｌ−７６６８９２、Ｌ−７４６６４６、Ｌ−７５７７９３、Ｌ−７７０６４４、Ｌ−７６００８１、Ｌ−７９６５６８、Ｌ−７４８３２８、Ｌ−７４８３３７、Ｒｏ−１６−８７１４、Ｒｏ−４０−２１４８、（−）−ＲＯ−３６３、ＳＢ−２１５６９１、ＳＢ−２２０６４８、ＳＢ−２２６５５２、ＳＢ−２２９４３２、ＳＢ−２５１０２３、ＳＢ−２３６９２３、ＳＢ−２４６９８２、ＳＲ−５８８９４Ａ、ＳＲ−５８６１１、ＳＲ−５８８７８、ＳＲ−５９０６２、ＳＭ−１１０４４、ＳＭ−３５０３００、ＺＤ−７１１４、ＺＤ−２０７９、ＺＤ−９９６９、ＺＭ−２１５００１、およびＺＭ−２１５９６７から成る群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記β３−ＡＲ拮抗薬が、ＳＲ５９２３０Ａである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記β−ＡＲ拮抗薬が、プロプラノロール、（−）−プロプラノロール、（＋）−プロプラノロール、プラクトロール、（−）−プラクトロール、（＋）−プラクトロール、ＣＧＰ−２０７１２Ａ、ＩＣＩ−１１８５５１、（−）−ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールから成る群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記製剤および前記β３−ＡＲ作動薬が、同時に投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記製剤および前記β３−ＡＲ拮抗薬が、同時に投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６４】
前記製剤が、前記β３作動薬の投与前または投与後に投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
前記製剤が、前記β３−ＡＲの投与前または投与後に投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６６】
前記製剤が、インスリン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、またはその類似体から選択される血糖降下薬と併せて、任意の順序で、または同時に投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項６７】
前記対象が、筋委縮、筋肉減弱症、糖尿病、悪液質、筋力低下、リポジストロフィー、または肥満と関連付けられる１つまたは複数の症状を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６８】
前記対象が、インスリン抵抗、低血糖、血漿中高値の遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）、トリグリセリド、またはグルコースと関連付けられる１つまたは複数の症状を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６９】
前記対象の代謝が変調している、請求項４６に記載の方法。
【請求項７０】
亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）を哺乳類対象に送達するための方法であって、請求項１〜３９または１〜４５のいずれか１項に記載の製剤を、経口投与によって前記対象に送達することを含む、方法。
【請求項７１】
前記対象が、ヒトである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記製剤が、少なくとも１０日間連日投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記製剤が、少なくとも２１日間連日投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記製剤が、１年を超えて連日投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記製剤が、２年を超えて連日投与される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記製剤が、１日２回投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
前記製剤が、３日に１回投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７８】
前記製剤が、週１回投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７９】
前記製剤が、月１回投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項８０】
前記製剤が、β３作動薬およびβ−アドレナリン受容体（β−ＡＲ）拮抗薬から成る群から選択される、１つまたは複数の薬剤と併せて投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項８１】
前記β−ＡＲ拮抗薬が、β２−アドレナリン受容体（β２−ＡＲ）拮抗薬、β１−アドレナリン受容体（β１−ＡＲ）拮抗薬、およびβ３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）拮抗薬から成る群から選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記β３作動薬が、エピネフリン（アドレナリン）、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、［（シアノ）ピンドロール］、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、３'−ヨードトリメトキノロール、３'，５'−ヨードトリメトキノロール、アミベグロン、ソラベグロン、ネビボロール、ＡＤ−９６７７、ＡＪ−９６７７、ＡＺ−００２、ＣＧＰ−１２１７７、ＣＬ−３１６２４３、ＣＬ−３１７４１３、ＢＲＬ−３７３４４、ＢＲＬ−３５１３５、ＢＲＬ−２６８３０、ＢＲＬ−２８４１０、ＢＲＬ−３３７２５、ＢＲＬ−３７３４４、ＢＲＬ−３５１１３、ＢＭＳ−１９４４４９、ＢＭＳ−１９６０８５、ＢＭＳ−２０１６２０、ＢＭＳ−２１０２８５、ＢＭＳ−１８７２５７、ＢＭＳ−１８７４１３、ＢＭＳ−１８７４１３のＳＯ３ＨのＣＯＮＨ２置換、ＢＭＳ−１８１４１３のラセミ化合物、ＣＧＰ−２０７１２Ａ、ＣＧＰ−１２１７７、ＣＰ−１１４２７１、ＣＰ−３３１６７９、ＣＰ−３３１６８４、ＣＰ−２０９１２９、ＦＲ−１６５９１４、ＦＲ−１４９１７５、ＩＣＩ−１１８５５１、ＩＣＩ−２０１６５１、ＩＣＩ−１９８１５７、ＩＣＩ−Ｄ７１１４、ＬＹ−３７７６０４、ＬＹ−３６８８４２、ＫＴＯ−７９２４、ＬＹ−３６２８８４、ＬＹ−７５０３５５、ＬＹ−７４９３７２、ＬＹ−７９７７１、ＬＹ−１０４１１９、Ｌ−７７１０４７、Ｌ−７５５５０７、Ｌ−７４９３７２、Ｌ−７５０３５５、Ｌ−７６００８７、Ｌ−７６６８９２、Ｌ−７４６６４６、Ｌ−７５７７９３、Ｌ−７７０６４４、Ｌ−７６００８１、Ｌ−７９６５６８、Ｌ−７４８３２８、Ｌ−７４８３３７、Ｒｏ−１６−８７１４、Ｒｏ−４０−２１４８、（−）−ＲＯ−３６３、ＳＢ−２１５６９１、ＳＢ−２２０６４８、ＳＢ−２２６５５２、ＳＢ−２２９４３２、ＳＢ−２５１０２３、ＳＢ−２３６９２３、ＳＢ−２４６９８２、ＳＲ−５８８９４Ａ、ＳＲ−５８６１１、ＳＲ−５８８７８、ＳＲ−５９０６２、ＳＭ−１１０４４、ＳＭ−３５０３００、ＺＤ−７１１４、ＺＤ−２０７９、ＺＤ−９９６９、ＺＭ−２１５００１、およびＺＭ−２１５９６７から成る群から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記β３−ＡＲ拮抗薬が、ＳＲ５９２３０Ａである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記β−ＡＲ拮抗薬が、プロプラノロール、（−）−プロプラノロール、（＋）−プロプラノロール、プラクトロール、（−）−プラクトロール、（＋）−プラクトロール、ＣＧＰ−２０７１２Ａ、ＩＣＩ−１１８５５１、（−）−ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールから成る群から選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
前記製剤および前記β３−ＡＲ作動薬が、同時に投与される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
前記製剤および前記β３−ＡＲ拮抗薬が、同時に投与される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８７】
前記製剤が、前記β３作動薬の投与前または投与後に投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８８】
前記製剤が、前記β３−ＡＲの投与前または投与後に投与される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８９】
前記製剤が、インスリン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、またはその類似体から選択される血糖降下薬と併せて、任意の順序で、または同時に投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項９０】
前記対象が、筋委縮、筋肉減弱症、糖尿病、悪液質、筋力低下、リポジストロフィー、または肥満と関連付けられる１つまたは複数の症状を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項９１】
前記対象が、インスリン抵抗、低血糖、血漿中高値の遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）、トリグリセリド、またはグルコースと関連付けられる１つまたは複数の症状を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項９２】
前記対象の代謝が変調している、請求項７０に記載の方法。
【請求項９３】
対象の内因性亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）値を増加させるための方法であって、請求項１〜３９または１〜４５のいずれか１項に記載の前記製剤を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項９４】
前記対象が、ヒトである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記製剤が、静脈内、経口、頬側、舌下、鼻腔内、経皮、皮下、筋肉内、局所投与されるか、または吸入によって投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記製剤が、少なくとも１０日間連日投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記製剤が、少なくとも２１日間連日投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
前記製剤が、１年を超えて連日投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
前記製剤が、２年を超えて連日投与される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記製剤が、１日２回投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０１】
前記製剤が、３日に１回投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０２】
前記製剤が、週１回投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０３】
前記製剤が、月１回投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０４】
前記製剤が、β３作動薬およびβ−アドレナリン受容体（β−ＡＲ）拮抗薬から成る群から選択される、１つまたは複数の薬剤と併せて投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記β−ＡＲ拮抗薬が、β２−アドレナリン受容体（β２−ＡＲ）拮抗薬、β１−アドレナリン受容体（β１−ＡＲ）拮抗薬、およびβ３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）拮抗薬から成る群から選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記β３作動薬が、エピネフリン（アドレナリン）、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、［（シアノ）ピンドロール］、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、３'−ヨードトリメトキノロール、３'，５'−ヨードトリメトキノロール、アミベグロン、ソラベグロン、ネビボロール、ＡＤ−９６７７、ＡＪ−９６７７、ＡＺ−００２、ＣＧＰ−１２１７７、ＣＬ−３１６２４３、ＣＬ−３１７４１３、ＢＲＬ−３７３４４、ＢＲＬ−３５１３５、ＢＲＬ−２６８３０、ＢＲＬ−２８４１０、ＢＲＬ−３３７２５、ＢＲＬ−３７３４４、ＢＲＬ−３５１１３、ＢＭＳ−１９４４４９、ＢＭＳ−１９６０８５、ＢＭＳ−２０１６２０、ＢＭＳ−２１０２８５、ＢＭＳ−１８７２５７、ＢＭＳ−１８７４１３、ＢＭＳ−１８７４１３のＳＯ３ＨのＣＯＮＨ２置換、ＢＭＳ−１８１４１３のラセミ化合物、ＣＧＰ−２０７１２Ａ、ＣＧＰ−１２１７７、ＣＰ−１１４２７１、ＣＰ−３３１６７９、ＣＰ−３３１６８４、ＣＰ−２０９１２９、ＦＲ−１６５９１４、ＦＲ−１４９１７５、ＩＣＩ−１１８５５１、ＩＣＩ−２０１６５１、ＩＣＩ−１９８１５７、ＩＣＩ−Ｄ７１１４、ＬＹ−３７７６０４、ＬＹ−３６８８４２、ＫＴＯ−７９２４、ＬＹ−３６２８８４、ＬＹ−７５０３５５、ＬＹ−７４９３７２、ＬＹ−７９７７１、ＬＹ−１０４１１９、Ｌ−７７１０４７、Ｌ−７５５５０７、Ｌ−７４９３７２、Ｌ−７５０３５５、Ｌ−７６００８７、Ｌ−７６６８９２、Ｌ−７４６６４６、Ｌ−７５７７９３、Ｌ−７７０６４４、Ｌ−７６００８１、Ｌ−７９６５６８、Ｌ−７４８３２８、Ｌ−７４８３３７、Ｒｏ−１６−８７１４、Ｒｏ−４０−２１４８、（−）−ＲＯ−３６３、ＳＢ−２１５６９１、ＳＢ−２２０６４８、ＳＢ−２２６５５２、ＳＢ−２２９４３２、ＳＢ−２５１０２３、ＳＢ−２３６９２３、ＳＢ−２４６９８２、ＳＲ−５８８９４Ａ、ＳＲ−５８６１１、ＳＲ−５８８７８、ＳＲ−５９０６２、ＳＭ−１１０４４、ＳＭ−３５０３００、ＺＤ−７１１４、ＺＤ−２０７９、ＺＤ−９９６９、ＺＭ−２１５００１、およびＺＭ−２１５９６７から成る群から選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記β３−ＡＲ拮抗薬が、ＳＲ５９２３０Ａである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
前記β−ＡＲ拮抗薬が、プロプラノロール、（−）−プロプラノロール、（＋）−プロプラノロール、プラクトロール、（−）−プラクトロール、（＋）−プラクトロール、ＣＧＰ−２０７１２Ａ、ＩＣＩ−１１８５５１、（−）−ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールから成る群から選択される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
前記製剤および前記β３−ＡＲ作動薬が、同時に投与される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１０】
前記製剤および前記β３−ＡＲ拮抗薬が、同時に投与される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１１】
前記製剤が、前記β３作動薬の投与前または投与後に投与される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１２】
前記製剤が、前記β３−ＡＲの投与前または投与後に投与される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１３】
前記製剤が、インスリン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、またはその類似体から選択される血糖降下薬と併せて、任意の順序で、または同時に投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項１１４】
前記対象が、筋委縮、筋肉減弱症、糖尿病、悪液質、筋力低下、リポジストロフィー、または肥満と関連付けられる１つまたは複数の症状を有する、請求項９３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記対象が、インスリン抵抗、低血糖、血漿中高値の遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）、トリグリセリド、またはグルコースと関連付けられる１つまたは複数の症状を有する、請求項９３に記載の方法。
【請求項１１６】
前記対象の代謝が変調している、請求項９３に記載の方法。
【請求項１１７】
対象において悪液質の症状を改善する方法であって、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドの阻害剤の治療上有効な薬用量を、そのような治療を必要とする前記対象に投与することを含み、治療後に、悪液質に関連する症状の改善がある、方法。
【請求項１１８】
前記症状の改善が、治療前の体重減少と比較して、体重減少の減少または低減を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記阻害剤が、連日投与される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
前記阻害剤が、１日２回投与される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
前記阻害剤が、週１回投与される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２２】
前記阻害剤が、月１回投与される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２３】
前記阻害剤が、静脈内、皮下、舌下、鼻腔内、経口、頬側投与されるか、または吸入によって投与される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２４】
前記阻害剤が、β３拮抗薬、β２拮抗薬、β１拮抗薬、およびβ３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）拮抗薬から成る群から選択される、１つまたは複数の薬剤と併せて投与される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２５】
前記β３−ＡＲ拮抗薬が、ＳＲ５９２３０Ａである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記抗体が、グリコシル化されている、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２７】
前記対象が、癌、ＡＩＤＳ、敗血症、ＣＯＰＤ、腎不全、関節炎、鬱血性心不全、筋ジストロフィー、糖尿病、または加齢性筋肉減弱症を有する、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２８】
体重減少の低減をもたらすように対象を治療する方法であって、配列番号１に示される配列を有する前記ポリペプチドの阻害剤の治療上有効な薬用量を、単独で、またはβアドレナリン受容体（β−ＡＲ）拮抗薬およびβ３アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）拮抗薬から成る群から選択される１つまたは複数の薬剤と併せて、そのような治療を必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１２９】
前記β３−ＡＲ拮抗薬が、ＳＲ５９２３０Ａである、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ポリペプチドが、グリコシル化されている、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
哺乳類対象において、糖尿病または肥満の症状を改善する方法であって、請求項１〜３９または１〜４５のいずれか１項に記載の治療上有効な薬用量の製剤を、インスリン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、またはその類似体から選択される血糖降下薬と併せて、任意の順序で、または同時に、そのような治療を必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１３２】
前記対象がヒトである、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記製剤が、静脈内、経口、頬側、舌下、鼻腔内、経皮、皮下、筋肉内、局所投与されるか、または吸入によって投与される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
前記製剤が、β３作動薬およびβ−アドレナリン受容体（β−ＡＲ）拮抗薬から成る群から選択される、１つまたは複数の薬剤と併せて投与される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３５】
前記β−ＡＲ拮抗薬が、β２−アドレナリン受容体（β２−ＡＲ）拮抗薬、β１−アドレナリン受容体（β１−ＡＲ）拮抗薬、およびβ３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）拮抗薬から成る群から選択される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記β３作動薬が、エピネフリン（アドレナリン）、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、［（シアノ）ピンドロール］、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、３'−ヨードトリメトキノロール、３'，５'−ヨードトリメトキノロール、アミベグロン、ソラベグロン、ネビボロール、ＡＤ−９６７７、ＡＪ−９６７７、ＡＺ−００２、ＣＧＰ−１２１７７、ＣＬ−３１６２４３、ＣＬ−３１７４１３、ＢＲＬ−３７３４４、ＢＲＬ−３５１３５、ＢＲＬ−２６８３０、ＢＲＬ−２８４１０、ＢＲＬ−３３７２５、ＢＲＬ−３７３４４、ＢＲＬ−３５１１３、ＢＭＳ−１９４４４９、ＢＭＳ−１９６０８５、ＢＭＳ−２０１６２０、ＢＭＳ−２１０２８５、ＢＭＳ−１８７２５７、ＢＭＳ−１８７４１３、ＢＭＳ−１８７４１３のＳＯ３ＨのＣＯＮＨ２置換、ＢＭＳ−１８１４１３のラセミ化合物、ＣＧＰ−２０７１２Ａ、ＣＧＰ−１２１７７、ＣＰ−１１４２７１、ＣＰ−３３１６７９、ＣＰ−３３１６８４、ＣＰ−２０９１２９、ＦＲ−１６５９１４、ＦＲ−１４９１７５、ＩＣＩ−１１８５５１、ＩＣＩ−２０１６５１、ＩＣＩ−１９８１５７、ＩＣＩ−Ｄ７１１４、ＬＹ−３７７６０４、ＬＹ−３６８８４２、ＫＴＯ−７９２４、ＬＹ−３６２８８４、ＬＹ−７５０３５５、ＬＹ−７４９３７２、ＬＹ−７９７７１、ＬＹ−１０４１１９、Ｌ−７７１０４７、Ｌ−７５５５０７、Ｌ−７４９３７２、Ｌ−７５０３５５、Ｌ−７６００８７、Ｌ−７６６８９２、Ｌ−７４６６４６、Ｌ−７５７７９３、Ｌ−７７０６４４、Ｌ−７６００８１、Ｌ−７９６５６８、Ｌ−７４８３２８、Ｌ−７４８３３７、Ｒｏ−１６−８７１４、Ｒｏ−４０−２１４８、（−）−ＲＯ−３６３、ＳＢ−２１５６９１、ＳＢ−２２０６４８、ＳＢ−２２６５５２、ＳＢ−２２９４３２、ＳＢ−２５１０２３、ＳＢ−２３６９２３、ＳＢ−２４６９８２、ＳＲ−５８８９４Ａ、ＳＲ−５８６１１、ＳＲ−５８８７８、ＳＲ−５９０６２、ＳＭ−１１０４４、ＳＭ−３５０３００、ＺＤ−７１１４、ＺＤ−２０７９、ＺＤ−９９６９、ＺＭ−２１５００１、およびＺＭ−２１５９６７から成る群から選択される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３７】
前記β３−ＡＲ拮抗薬が、ＳＲ５９２３０Ａである、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３８】
前記β−ＡＲ拮抗薬が、プロプラノロール、（−）−プロプラノロール、（＋）−プロプラノロール、プラクトロール、（−）−プラクトロール、（＋）−プラクトロール、ＣＧＰ−２０７１２Ａ、ＩＣＩ−１１８５５１、（−）−ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールから成る群から選択される、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３９】
前記製剤および前記β３−ＡＲ作動薬が同時に投与される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４０】
前記製剤および前記β３−ＡＲ拮抗薬が同時に投与される、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４１】
前記製剤が、前記β３作動薬の投与前または投与後に投与される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４２】
前記製剤が、前記β３−ＡＲの投与前または投与後に投与される、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４３】
哺乳類対象において、亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）活性を監視する方法であって、
ａ）請求項１〜３９または１〜４５のいずれか１項に記載の製剤を、前記対象に経口投与することと、
ｂ）ＺＡＧ活性のレベルを検出し、
それによって前記対象のＺＡＧ活性を監視することと、を含む、方法。
【請求項１４４】
前記対象がヒトである、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
ＺＡＧ活性が、体温、血糖値、尿中グルコース値、および／もしくは血漿ＺＡＧ値、またはグリセロール、脂質、トリグリセリド、および／もしくは他の血糖管理パラメータの測定を含む、ＺＡＧ活性の他の測定値から成る群から選択される１つまたは複数のパラメータの変化または絶対値を測定することによって検出される、請求項１４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、医薬製剤および栄養補助食品に関し、より具体的には、対象の代謝を改変するとともに、悪液質、肥満、糖尿病、およびインスリン抵抗等の障害を改善するための製剤および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
成人、小児、および青年における肥満の罹患率は、過去３０年にわたって米国において、かつ世界的に急速に増加しており、上昇し続けている。肥満は、古典的に、体脂肪率、またはより近年では、ケトレー指数とも呼ばれる体格指数（ＢＭＩ）に基づいて定義される（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｂｅｓｉｔｙ，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１６０：８９８−９０４（２０００）（非特許文献１）、Ｋｈａｏｄｈｉａｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｏｒｎｅｒｓｔｏｎｅ，２：１７−３１（１９９９）（非特許文献２））。ＢＭＩは、身長（メートル）の２乗で割った体重（ｋｇ）の比率と定義される。
【０００３】
過体重および肥満は、米国において見られる多くの加齢に伴う慢性疾患を発症するリスクの増大と関連付けられる。そのような共存症には、２型糖尿病、高血圧、冠動脈性心疾患および脂質異常症、胆石および胆嚢摘出、変形性関節炎、癌（乳房、大腸、子宮内膜、前立腺、および胆嚢）、ならびに睡眠時無呼吸が挙げられる。毎年約３２５，０００人が肥満に起因して死亡していると推定される。疾患の重篤度を低減するための鍵は、効果的に減量することである。約３０〜４０％が、減量を試みているか、または減量した体重を維持していると主張するが、現在の治療は機能していないようである。食事療法の他に、薬理学的管理、および極端な例では、手術が、過体重および肥満患者を治療するための承認された補助療法である（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ，ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，１−４２（Ｊｕｎｅ  １９９８）（非特許文献３）、Ｂｒａｙ，Ｇ．Ａ．，Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｂｅｓｉｔｙ，２４６−２７３（１９９８）（非特許文献４））。薬物には副作用があり、手術は有効であるが、過激な手段であるため、病的肥満の場合にのみ用いられる。
【０００４】
悪液質は、疾患によってもたらされる脂肪および骨格筋量の両方の消耗である。それは、寛解または管理に失敗すると、多くの条件で生じ、多くの癌に共通である。進行癌、ＡＩＤＳ、およびいくつかの他の主要な慢性進行性疾患を有する患者は、悪液質を呈する場合がある。悪液質は、十分に食べているが、栄養素を吸収できない人に生じ得る。悪液質は、腫瘍細胞および宿主細胞によって組織塊内で産生される、所定のサイトカイン、特に腫瘍壊死因子−α、ＩＬ−１ｂ、およびＩＬ−６によって媒介され得るが、現在、悪液質に対する広く受け入れられている治療法は存在しない。
【０００５】
糖尿病は、疾病率および死亡率の主な原因である。慢性的に上昇した血糖値は、多くの場合、透析または腎移植を必要とする腎症、末梢神経障害、失明に至る網膜症、切断に至る下肢の潰瘍、肝硬変に進行する場合がある脂肪肝疾患、ならびに冠動脈疾患および心筋梗塞に対する脆弱性等の消耗性合併症をもたらす。
【０００６】
糖尿病には２つの主な型がある。Ｉ型またはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、膵島におけるインスリン産生β細胞の自己免疫破壊に起因する。この疾患は、通常、小児期または青年期に発症する。過剰なインスリンが、低血糖を引き起こし、結果として脳および他の機能の障害をもたらし得るため、治療法は、主に１日複数回のインスリン注射と併せて、頻繁に血糖値を検査してインスリン投与量の調整指導で構成される。この型の糖尿病の発生、進行、および治療管理に対するインスリン抵抗の役割が、ますます注視されている。
【０００７】
ＩＩ型または非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、典型的に、成人期に発症する。ＮＩＤＤＭは、脂肪組織、筋肉、および肝臓等のグルコース利用組織のインスリン作用に対する抵抗と関連付けられる。最初に、膵島β細胞は、過剰なインスリンを分泌することによって代償する。結果として起こる膵島不全は、代償不全および慢性高血糖をもたらす。逆に、中度の膵島不全は、末梢インスリン抵抗に先行するか、または一致し得る。ＮＩＤＤＭの治療に有用ないくつかの薬物群がある：１）インスリン放出薬（インスリン放出を直接刺激し、低血糖のリスクを伴う）、２）食事インスリン放出薬（グルコース誘発性インスリン分泌を増強する、各食事の前に摂取しなければならない）、３）メトホルミンを含む、ビグアニド（糖尿病において逆説的に上昇する、肝臓でのグルコース新生を減衰させる）、４）インスリン増感剤、例えば、チアゾリジンジオン誘導体ロシグリタゾンおよびピオグリタゾン（インスリンに対する末梢応答性を改善するが、体重増加、浮腫、および偶発的な肝毒性等の副作用を有する）、５）インスリン注射（膵島が慢性過刺激下で障害を起こす、ＮＩＤＤＭの後期において必要な場合がある）。
【０００８】
インスリン抵抗は、顕著な高血糖が見られなくても生じる場合があり、一般に、アテローム性動脈硬化、肥満、高脂血症、および本態性高血圧と関連付けられる。この異常のクラスタは、「メタボリック症候群」または「インスリン抵抗症候群」を構成する。インスリン抵抗は、慢性炎症（ＮＡＳＨ、非アルコール性脂肪性肝炎）に進行し得る脂肪肝、線維症、および肝硬変とも関連付けられる。累積的に、糖尿病を含むがこれに限定されないインスリン抵抗症候群は、４０歳を超える人々の疾病率および脂肪の主な原因の多くの根底にある。
【０００９】
そのような薬物の存在にも関わらず、糖尿病は、依然として主要かつ深刻さを増す公衆の健康問題である。糖尿病の後期の合併症は、国民の医療資源の大部分を消費する。インスリン抵抗および膵島不全の原発性欠損に効果的に対処し、既存の薬物よりも副作用が少ないか、または軽度の新しい経口的に有効な治療薬の必要性が存在する。
【００１０】
亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）は、癌悪液質において脂肪消失を誘発する能力を有する、脂質動員因子（ＬＭＦ）として同定された。ＺＡＧは、β３−アドレナリン受容体との相互作用によって、白色脂肪細胞中の脂肪分解を誘発することが示されたが、インビボでは、茶色脂肪組織（ＢＡＴ）中の脱共役タンパク質−１（ＵＣＰ−１）の発現を増加させ、体脂肪の消失を誘発した。いくつかの腫瘍に加えて、ＺＡＧは、白色脂肪組織（ＷＡＴ）およびＢＡＴによっても産生され、その発現は、悪液質中で亢進される。対照的に、肥満のヒトの脂肪組織におけるＺＡＧの発現は、肥満ではない対象において見られる発現の３０％に過ぎなかった。これは、ＷＡＴにおけるＺＡＧ発現の消失が、肥満の特徴のいくつかを説明し得ることを示唆する。確実に、マウスにおける両方のＺＡＧ対立遺伝子の不活性化は、体重の増加につながり、動物に高脂肪食を与えたときにより顕著であった。様々な薬剤に対する脂肪分解応答は、ＺＡＧ欠乏動物由来の脂肪細胞において著しく減少した。
【００１１】
これまで、ＺＡＧの脂質動員作用に関する研究は、ヒトおよびマウスＺＡＧを使用して、マウスおよびラットの両方で行われた。研究は、ＺＡＧが、革新的に保存され、かつ異種間活性を呈すること、例えば、マウスＺＡＧは、ヒトにおいて実質的に同一の活性を呈し、その逆もまた同様であることを示す。
【００１２】
代謝を改変するため、ならびに肥満、糖尿病、および悪液質等の代謝性疾患の治療のための有効かつ安全な代替案が依然として欠如している。したがって、そのような用途のための新しい製剤の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｂｅｓｉｔｙ，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１６０：８９８−９０４（２０００）
【非特許文献２】Ｋｈａｏｄｈｉａｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｏｒｎｅｒｓｔｏｎｅ，２：１７−３１（１９９９）
【非特許文献３】Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ，ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，１−４２（Ｊｕｎｅ  １９９８）
【非特許文献４】Ｂｒａｙ，Ｇ．Ａ．，Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｂｅｓｉｔｙ，２４６−２７３（１９９８）
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、亜鉛−α２−糖タンパク質が、成体の肥満高血糖（ｏｂ／ｏｂ）マウスおよび成熟したウィスター系ラットにおいて、体重およびインスリン応答性に影響を及ぼすこと、ならびに抗ＺＡＧ抗体が、悪液質状況において体重減少を防ぐという所見に一部基づいている。そのような所見は、体重を調節するか、インスリン応答性を向上させるか、または悪液質に関連する症状もしくは筋委縮と関連付けられる疾患を改善するための方法において有用である。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）、ＺＡＧ変異体、修飾されたＺＡＧ、またはその機能性断片を含む製剤を提供する。一態様において、ＺＡＧは哺乳類（例えば、ヒト）由来であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含んでよい。ＺＡＧペプチドは、非タンパク質ポリマーに結合してよい。ＺＡＧペプチドは、溶解性または安定性を増加させるように、シアル酸付加化、ＰＥＧ化、または修飾されてよい。ＺＡＧペプチドは、組み換えまたは合成であってよい。種々の態様において、ＺＡＧペプチドは、修飾されたＺＡＧであってよく、欠失、付加、または同類置換から選択される、アミノ酸配列に対する１つまたは複数の変異を有する、野生型ＺＡＧアミノ酸配列を含んでもよい。種々の態様において、ＺＡＧペプチドは、リーダー配列および後続配列のうちの１つまたは複数を含んでよい。ＺＡＧペプチドは、例えば、翻訳語修飾の結果として、グリコシル化されてもよい。さらに、様々な実施形態において、製剤は、製薬上許容される担体をさらに含んでよい。製剤は、β３作動薬ならびにβ２−アドレナリン受容体（β２−ＡＲ）拮抗薬、β１−アドレナリン受容体（β１−ＡＲ）拮抗薬、およびβ３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）拮抗薬等のβ−アドレナリン受容体（β−ＡＲ）拮抗薬を含む、１つまたは複数の薬剤を含んでもよい。いくつかの態様において、請求項１に記載の製剤は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはその類似体をさらに含んでよい。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される本発明の製剤を含む、食品添加物または栄養補助食品を提供する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、製剤を哺乳類対象に送達するための方法であって、本明細書に記載される製剤を哺乳類対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）を哺乳類対象に送達するための方法であって、本明細書に記載される製剤を経口投与によって対象に送達することを含む、方法を提供する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）を、本明細書に記載される投与されたＺＡＧの全身吸収を必要とする大用量経口インスリンと同様に大用量で、哺乳類対象に経口送達するための方法を提供する。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）を、ＺＡＧの静脈内投与と同様に驚くほど効果的な低用量で、驚くべきことに本明細書に記載される投与されたＺＡＧの全身吸収を必要としない製剤で哺乳類対象に経口送達するための方法を提供する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、対象の亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）の内因性レベルを増加させるための方法であって、本明細書に記載される製剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００２２】
本発明は、対象において悪液質の症状を改善する方法をさらに提供する。この方法は、治療上有効な薬用量の、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドの生物活性阻害剤を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含み、結果として、治療後の悪液質と関連付けられた症状の改善をもたらす。一実施形態において、阻害剤は、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドに少なくとも８０％相同の配列を含む、ポリペプチドを結合する、モノクローナル抗体である。別の実施形態において、治療は、１０日間の連日投与を含む。別の実施形態において、阻害剤は、連日、１日おき、２日おき、または３日おきに最長１０日間以上投与される。別の実施形態において、抗体は、１日２回投与される。抗体は、静脈内、皮下、舌下、鼻腔内、経口投与されるか、または吸入によって投与されてよい。別の実施形態において、阻害剤は、β３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）拮抗薬から成る群から選択される、１つまたは複数の薬剤と併せて投与される。一実施形態において、β３−ＡＲ拮抗薬は、ＳＲ５９２３０Ａである。別の実施形態において、抗体はグリコシル化される。別の実施形態において、相同ポリペプチドを阻害する薬剤は、非抗体薬であり、例えばアプタマーを含むがこれに限定されない。
【００２３】
別の態様において、本発明は、体重減少の低減をもたらすように対象を治療する方法を提供する。この方法は、治療上有効な薬用量の配列番号１に示される配列を有するポリペプチドの阻害剤を、β３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）拮抗薬から成る群から選択される、１つまたは複数の薬剤と併せて、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。一実施形態において、阻害剤は、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドに少なくとも８０％相同の配列を含む、ポリペプチドを結合する、モノクローナル抗体である。別の実施形態において、β３−ＡＲ拮抗薬は、ＳＲ５９２３０Ａである。別の実施形態において、抗体はグリコシル化される。別の実施形態において、相同ポリペプチドを阻害する薬剤は、非抗体薬であり、例えばアプタマーを含むがこれに限定されない。
【００２４】
別の態様において、本発明は、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドを結合する、抗体またはその機能的断片、ならびにβ３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）拮抗薬およびβ３拮抗薬から成る群から選択される薬剤を含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、β３−ＡＲ拮抗薬は、ＳＲ５９２３０Ａである。別の実施形態において、抗体はグリコシル化される。
【００２５】
本開示は、ヒトまたは動物の食事を補足するための材料および方法を提供する。一態様において、本開示は、栄養補助製剤を提供する。本発明の栄養補助製剤は、亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）またはその機能的断片を含み得る。本開示は、１つまたは複数の栄養補助製剤、例えば、ＺＡＧまたはその機能的断片を含む栄養補助製剤を含む、キット等の材料も提供する。別の態様において、本開示は、β３作動薬を経口投与される治療薬と併せて投与することを含む、経口投与される治療薬の送達方法を提供する。
【００２６】
本明細書に記載の製剤、キット、および方法は、ヒトの健康を向上させるため、および／または体重減少を促進するか、または体重減少から独立して、インスリン抵抗を向上させ、高血糖を低減させるために有用であり得る。したがって、これらの製剤、キット、および方法は、肥満および／または高血糖と関連付けられる疾患の治療における利用が認められ得る。
【００２７】
別の態様において、本発明は、消費可能な担体と併せて、本発明の製剤を含む食品を提供する。例示の消費可能な担体には、これらに限定されないが、クッキー、ブラウニー、クラッカー、朝食バー、エナジーバー、シリアル、ケーキ、パン、飲料、肉製品、および肉の代用製品が挙げられる。
【００２８】
別の態様において、本発明は、ヒトの食事を補足する方法を提供する。この方法は、亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）またはその機能的断片を含む製剤を摂取することを含む。一実施形態において、ＺＡＧは哺乳類由来、例えば、配列番号１に示される配列を有するヒトＺＡＧポリペプチド、またはその断片である。この方法は、１０日間連日行われてよい。別の実施形態において、製剤は、連日、１日おき、２日おき、または３日おきに最長１０日間以上摂取される。別の実施形態において、製剤は、１日２回摂取される。別の実施形態において、製剤は、β３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）作動薬、βＡＲ作動薬、およびβ３−ＡＲ拮抗薬から成る群から選択される、１つまたは複数の薬剤と併せて摂取される。一実施形態において、β３−ＡＲ拮抗薬は、ＳＲ５９２３０Ａである。別の実施形態において、β３−ＡＲ作動薬は、ＡＭＮＩ−ＢＲＬ３７３４４（ＢＲＬ３７３４４）である。別の実施形態において、製剤は、血糖管理を向上させるように使用される１つまたは複数の薬剤と併せて、任意の順序で連続的または同時に摂取もしくは送達される。一実施形態において、血糖管理薬は、インスリンまたはその任意の誘導体もしくは類似体である。別の実施形態において、血糖管理薬は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはその任意の誘導体もしくは類似体である。
【００２９】
別の態様において、本発明は、経口投与される治療薬の送達方法を提供し、治療薬は、β３作動薬と併せて送達される。別の実施形態において、β３作動薬および治療薬は、同時に送達される。さらに別の実施形態では、β３作動薬は、治療薬の投与前または投与後に投与される。ある実施形態において、治療薬はＺＡＧである。他の実施形態において、治療薬には、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、血小板凝集阻害剤、ストレプトキナーゼ、ヘパリン、ウロキナーゼ、レニン阻害剤、抗生物質、および睡眠誘導ペプチドが挙げられる。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、体重減少または肥満の減少をもたらすように対象を治療する方法を提供する。この方法は、治療上有効な薬用量の配列番号１に示される配列を有するポリペプチド、またはその断片を含む栄養補助製剤を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、哺乳類対象における亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）活性を監視する方法を提供する。この方法は、ａ）本発明の製剤を対象に経口投与することと、ｂ）ＺＡＧ活性のレベルを検出することによって、対象におけるＺＡＧ活性を監視することと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
（図１Ａ）ＺＡＧの特性化およびｏｂ／ｏｂマウスの脂肪分解および体重に対するその効果を示す、画像図である。２９３細胞培地および記載のとおり精製されたＺＡＧにおける総タンパク量を示す、１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクマシー染色。
（図１Ｂ）培養培地および精製されたＺＡＧにおけるＺＡＧの発現を示す、ウェスタンブロットの結果を示す画像図である。
（図１Ｃ）体重が減少しているＭＡＣ１６マウスの脂肪組織および肝組織内のＺＡＧ  ｍＲＮＡレベルを示すグラフ図である。Ｐ＜０．０１
（図１Ｄ）イソプレナリン（Ｉｓｏ）およびＺＡＧに応答して、非肥満（■）およびｏｂ／ｏｂマウス（□）から得た精巣上体脂肪細胞における脂肪分解の結果を示すグラフ図である。非肥満マウスとの差は、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、および***ｐ＜０．００１として示される。
（図１Ｅ）無処置（■）であるか、イソプレナリン（１０μＭ）（□）またはＺＡＧ（０．４６μＭ）
2013530981.tif 000002
のいずれかで処置した肥満（ｏｂ／ｏｂ）および非肥満（非ｏｂ）マウスの精巣上体（ｅｐ）、皮下（ｓ．ｃ．）、および内臓（ｖｉｓ）沈着物から得た脂肪細胞における脂肪分解の結果を示すグラフ図である。精巣上体脂肪細胞との差は、**ｐ＜０．０１として示される。
（図１Ｆ）方法に記載されるＰＢＳ（◆）と比較して、ｏｂ／ｏｂマウスの体重に対するＺＡＧ（■）の効果を示すグラフ図である。ゼロ時間からの体重とＰＢＳ対照の体重差は、***ｐ＜０．００１として示される。
（図１Ｇ）ＰＢＳ対照（■）と比較して、ｅで示されるマウスの体温に対するＺＡＧ（□）の効果を示すグラフ図である。対照との差は、***ｐ＜０．００１として示される。
（図２Ａ）ＺＡＧで処置されたｏｂ／ｏｂマウスのグルコース耐性を示すグラフ図である。グルコース（２ｇ／ｋｇ）の静脈内投与後、ＺＡＧ（■）またはＰＢＳ（◆）のいずれかで３日間処置された給餌状態のｏｂ／ｏｂマウスの血漿グルコース値。ＰＢＳの場合ｐ＜０．００１。グルコース投与後間隔を置いて、血液試料を尾静脈から採取し、グルコースおよびインスリンの測定に使用した。
（図２Ｂ）グルコース（１ｇ／ｋｇ）の経口投与後のＺＡＧで処置されたｏｂ／ｏｂマウスの血漿インスリン値を示すグラフ図である。ＰＢＳの場合ｐ＜０．００１。
（図２Ｃ）０（■）、１（□）、または１０ｎＭインスリン
2013530981.tif 000003
の存在下で、ＺＡＧで５日間処置されたｏｂ／ｏｂマウスの精巣上体（ｅｐ）、内臓（ｖｉｓ）、および皮下（ｓ．ｃ．）脂肪細胞へのグルコースの取り込みを示すグラフ図である。ＺＡＧの存在の差は、***ｐ＜０．００１として示される。
（図２Ｄ）インスリン（１００ｎＭ）の非存在または存在下で、ＺＡＧまたはＰＢＳのいずれかで５日間処置されたｏｂ／ｏｂマウスの腓腹筋への２−デオキシ−Ｄ−グルコースの取り込みを示すグラフ図である。インスリンの存在の差は、*ｐ＜０．０５または**ｐ＜０．０１として示されるが、ＺＡＧの存在の差は、***ｐ＜０．００１として示される。
（図２Ｅ）ｏｂ／ｏｂマウスの骨格筋におけるＧＬＵＴ４グルコース輸送体の発現に対するＺＡＧの効果を示す画像図である。ｏｂ／ｏｂマウスを５日間処置した後、骨格筋を除去し、ＧＬＵＴ４の発現についてウェスタンブロット分析した。
（図３Ａ）ｏｂ／ｏｂマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するＺＡＧの効果を示すグラフ図である。ｏｂ／ｏｂマウスを５日間処置した後、骨格筋を除去し、タンパク質合成の測定に使用した。ＰＢＳ対照または非肥満動物との差は、***ｐ＜０．００１として示される。
（図３Ｂ）ｏｂ／ｏｂマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するＺＡＧの効果を示すグラフ図である。ｏｂ／ｏｂマウスを５日間処置した後、骨格筋を除去し、タンパク質分解の測定に使用した。ＰＢＳ対照または非肥満動物との差は、***ｐ＜０．００１として示される。
（図３Ｃ）ｏｂ／ｏｂマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するＺＡＧの効果を示すグラフ図である。ｏｂ／ｏｂマウスを５日間処置した後、骨格筋を除去し、キモトリプシン様酵素活性の測定に使用した。ＰＢＳ対照または非肥満動物との差は、***ｐ＜０．００１として示される。
（図３Ｄ）ｏｂ／ｏｂマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するＺＡＧの効果を示すグラフ図である。ｏｂ／ｏｂマウスを５日間処置した後、骨格筋を除去し、２０Ｓ−プロテアソームα−サブユニットについてウェスタンブロットを行った。
（図３Ｅ）ｏｂ／ｏｂマウスの骨格筋におけるシグナル伝達経路に対するＺＡＧの効果を示す画像図である。ｏｂ／ｏｂマウスを５日間処置した後、骨格筋を除去し、ｐ４２マウスの発現についてウェスタンブロットを行った。
（図３Ｆ）ｏｂ／ｏｂマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するＺＡＧの効果を示す画像図である。ｏｂ／ｏｂマウスを５日間処置した後、骨格筋を除去し、ミオシンの発現についてウェスタンブロットを行った。
（図３Ｇ）ｏｂ／ｏｂマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するＺＡＧの効果を示す画像図である。ｏｂ／ｏｂマウスを５日間処置した後、骨格筋を除去し、対照としてアクチンの発現についてウェスタンブロットを行った。
（図４Ａ）ＰＢＳまたはＺＡＧのいずれかで５日間処置した後、ｏｂ／ｏｂマウスの腓腹筋におけるリン酸ＰＫＲのウェスタンブロットによって、骨格筋における異化シグナル伝達経路に対するＺＡＧの効果を示す画像図である。タンパク質の全形態がローディングコントロールとして役立つ。ＰＢＳ対照との差は、***ｐ＜０．００１として示されるが、非肥満マウスとの差は、＃ｐ＜０．００１として示される。
（図４Ｂ）ＰＢＳまたはＺＡＧのいずれかで５日間処置した後、ｏｂ／ｏｂマウスの腓腹筋におけるリン酸ｅＩＦ２ａのウェスタンブロットによって、骨格筋における異化シグナル伝達経路に対するＺＡＧの効果を示す画像図である。タンパク質の全形態がローディングコントロールとして役立つ。ＰＢＳ対照との差は、***ｐ＜０．００１として示されるが、非肥満マウスとの差は、＃ｐ＜０．００１として示される。
（図４Ｃ）ＰＢＳまたはＺＡＧのいずれかで５日間処置した後、ｏｂ／ｏｂマウスの腓腹筋におけるリン酸ＰＬＡ２のウェスタンブロットによって、骨格筋における異化シグナル伝達経路に対するＺＡＧの効果を示す画像図である。タンパク質の全形態がローディングコントロールとして役立つ。ＰＢＳ対照との差は、***ｐ＜０．００１として示されるが、非肥満マウスとの差は、＃ｐ＜０．００１として示される。
（図４Ｄ）ＰＢＳまたはＺＡＧのいずれかで５日間処置した後、ｏｂ／ｏｂマウスの腓腹筋におけるリン酸ｐ３８ＭＡＰＫのウェスタンブロットによって、骨格筋における異化シグナル伝達経路に対するＺＡＧの効果を示す画像図である。タンパク質の全形態がローディングコントロールとして役立つ。ＰＢＳ対照との差は、***ｐ＜０．００１として示されるが、非肥満マウスとの差は、＃ｐ＜０．００１として示される。
（図４Ｅ）ＰＢＳまたはＺＡＧのいずれかで５日間処置した後、ｏｂ／ｏｂマウスの腓腹筋におけるカスパーゼ３（■）およびカスパーゼ−８（□）の活性によって、骨格筋の異化シグナル伝達経路に対するＺＡＧの効果を示すグラフ図である。
（図５Ａ）ＺＡＧに応答するＨＳＬの発現を示す画像図である。ウェスタンブロットは、無処置（Ｃｏｎ）、イソプレナリン（１０μＭ）もしくはＺＡＧ（０．４６μＭ）単独での処置、またはＺＡＧで５日間処置した後、ＰＤ９８０５９（２５μＭ）の存在下で３時間後の非肥満マウスの脂肪細胞におけるリン酸ＨＳＬの発現を示す。
（図５Ｂ）ＺＡＧで５日間処置した後の精巣上体（ｅｐ）脂肪細胞におけるＨＳＬの発現を免疫ブロット法によって示す画像図である。
（図５Ｃ）ＺＡＧで５日間処置した後の皮下（ｓｃ）脂肪細胞におけるＨＳＬの発現を免疫ブロット法によって示す画像図である。
（図５Ｄ）ＺＡＧで５日間処置した後の内臓（ｖｉｓ）脂肪細胞におけるＨＳＬの発現を免疫ブロット法によって示す画像図である。
（図５Ｅ）ＺＡＧで５日間処置した後の精巣上体脂肪細胞におけるＡＴＧＬの発現を示す画像図である。
（図５Ｆ）ＺＡＧで５日間処置した後の皮下脂肪細胞におけるＡＴＧＬの発現を示す画像図である。
（図５Ｇ）ＺＡＧで５日間処置した後の内臓脂肪細胞におけるＡＴＧＬの発現を示す画像図である。
（図５Ｈ）ＺＡＧで５日間処置した後の精巣上体脂肪細胞におけるｐＥＲＫの発現を示す画像図である。
（図５Ｉ）ＺＡＧで５日間処置した後の皮下脂肪細胞におけるｐＥＲＫの発現を示す画像図である。
（図５Ｊ）ＺＡＧで５日間処置した後の内臓脂肪細胞におけるｐＥＲＫの発現を示す画像図である。
（図５Ｋ）ＰＢＳまたはＺＡＧのいずれかで５日間処置したｏｂ／ｏｂマウスの精巣上体（ｅｐ）、皮下（ｓｃ）、および内臓（ｖｉｓ）沈着物から得た脂肪細胞のＢＲＬ３７３４４の脂肪分解効果に対する応答を示すグラフ図である。ＰＢＳ対照との差は、***ｐ＜０．０１として示されるが、ＰＤ９８０５９の存在下での差は、＃ｐ＜０．００１として示される。
（図６Ａ）ＷＡＴにおけるＺＡＧの発現に対する、ＺＡＧで５日間処置したｏｂ／ｏｂマウスの処置の効果を示す画像図である。ウェスタンブロットは、ｅｐ、ｓｃ、およびｖｉｓ脂肪細胞におけるＺＡＧの発現を示す。０日目は、脂肪細胞がマウスから除去された日を表す。
（図６Ｂ）方法に記載のとおりＲＭＰＩ培地に懸濁された精巣上体脂肪細胞におけるＺＡＧの発現を示す画像図である。次いで試料を１日ごとに採取し、ＺＡＧ発現についてウェスタンブロットを行った。０日目は、脂肪細胞がマウスから除去された日を表す。
（図６Ｃ）方法に記載のとおりＲＭＰＩ培地に懸濁された精巣上体脂肪細胞におけるＨＳＬの発現を示す画像図である。次いで試料を１日ごとに採取し、ＨＳＬ発現についてウェスタンブロットを行った。０日目は、脂肪細胞がマウスから除去された日を表す。
（図６Ｄ）マウスから除去されたＢＡＴにおけるＵＣＰ１の発現を示す画像図である。ＰＢＳで処置されたマウスとの差は、***ｐ＜０．００１として示される。
（図６Ｅ）マウスから除去されたＢＡＴにおけるＵＣＰ３の発現を示す画像図である。ＰＢＳで処置されたマウスとの差は、***ｐ＜０．００１として示される。
（図６Ｆ）マウスから除去された腓腹筋におけるＵＣＰ３の発現を示す画像図である。ＰＢＳで処置されたマウスとの差は、***ｐ＜０．００１として示される。
（図７Ａ）２１日研究の間のｏｂ／ｏｂマウスの体重減少を示すグラフ図である。ＺＡＧは、１、４、５、８、１３、１６、１８、および１９日目に注射され、ＰＢＳは、同一時点で注射された。
（図７Ｂ）ＺＡＧでの処置中のｏｂ／ｏｂマウス（体重８０〜９０ｇ）の体重変化（ｇ）を示すグラフ図である。
（図７Ｃ）２１日研究の間のｏｂ／ｏｂマウスの体温上昇を示すグラフ図である。ＺＡＧは、１、４、５、８、１３、１６、１８、および１９日目に注射され、ＰＢＳは、同一時点で注射された。
（図８Ａ）処置の最初の５日間の尿中グルコース分泌の段階的減少を示すグラフ図である。
（図８Ｂ）２１日研究の間の尿中グルコース分泌の段階的減少を示すグラフ図である。
（図９）ＺＡＧで処置されたｏｂマウスおよびＺＡＧなしで処置されたｏｂマウスから採取し、最長５日間培養されたイソプレナリン（ｉｓｏ）単離された脂肪細胞によって刺激されたグリセロール放出を示すグラフ図である。
（図１０）Ｔ．Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）″Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  Ｚｎ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｔｉｇｅｎｓ″によって公開されるように、ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質の完全アミノ酸配列（配列番号１）を示す画像図である。
（図１１）ＳＲ５９２３０Ａ（１０μＭ）または抗ＺＡＧ抗体（１：１０００）（ＩｇＧ）の非存在または存在下で、イソプレナリン（１０μＭ）と比較して、単離されたラット精巣上体脂肪細胞におけるヒトＺＡＧの脂肪分解活性を示すグラフ図である。それぞれの値は、５つの別個の研究の平均である。対照との差は、ｂ、ｐ＜０．０１またはｃ、ｐ＜０．００１として示されるが、ＺＡＧ単独との差は、ｅ、ｐ＜０．０１またはｆ、ｐ＜０．００１として示される。
（図１２Ａ）１０日間にわたる、雄ウィスターラットの体重に対する、１００μＬ  ＰＢＳ中のＺＡＧ（■）（体重１００ｇあたり５０μｇ）またはＰＢＳ単独（◆）のいずれかの静脈内連日投与の効果を示すグラフ図である。実験のプロトコルは、方法のセクションで示される。
（図１２Ｂ）図１２Ａに示される、ＺＡＧ（■）またはＰＢＳ（◆）のいずれかを投与した雄ウィスターラットの体温を示すグラフ図である。
（図１２Ｃ）インスリン（６０μＵ／ｍＬ）の非存在または存在下で、図１２Ａに示される、ＺＡＧ（白抜きのボックス）またはＰＢＳ（黒塗りのボックス）のいずれかで１０日処置した後の雄ウィスターラットの精巣上体脂肪細胞への２−デオキシ−Ｄ−グルコースの取り込み（１０日間）を示すグラフ図である。
（図１２Ｄ）インスリン（６０μＵ／ｍＬ）の非存在または存在下で、ＺＡＧまたはＰＢＳのいずれかで１０日処置した後の雄ウィスターラットの腓腹筋およびＢＡＴへのグルコースの取り込みを示すグラフ図である。ＺＡＧで処置された動物とＰＢＳで処置された動物との差は、ａ、ｐ＜０．０５、ｂ、ｐ＜０．０１、またはｃ、ｐ＜０．００１として示されるが、インスリンの存在下での差は、ｆ、ｐ＜０．００１として示される。
（図１２Ｅ）ＺＡＧを投与したｏｂ／ｏｂマウスにおける組織Ｒｇを示すグラフ図である。ＰＢＳの場合ｃ、ｐ＜０．００１。
（図１３Ａ）図１２に示される、ＰＢＳまたはＺＡＧのいずれかで１０日間処置された雄ウィスターラットのＢＡＴ（図１３Ａ）、ＷＡＴ（図１３Ｂ）、および腓腹筋（図１３Ｃ）におけるＧＬＵＴ４の発現を示すウェスタンブロットの画像図である。ＺＡＧで処置された動物とＰＢＳで処置された動物との差は、ｃ、ｐ＜０．００１として示される。
（図１３Ｂ）同上。
（図１３Ｃ）同上。
（図１４）図１２に示される、ＰＢＳまたはＺＡＧのいずれかで１０日間処置された雄ウィスターラットのＢＡＴ（図１４Ａ）およびＷＡＴ（図１４Ｂ）におけるＵＣＰ１およびＵＣＰ３の発現を示すウェスタンブロットの画像図である。ＺＡＧで処置された動物とＰＢＳで処置された動物との差は、ｃ、ｐ＜０．００１として示される。
（図１５）図１２に示される、ＰＢＳまたはＺＡＧのいずれかで１０日間処置された雄ウィスターラットのＡＴＧＬ（図１５Ａ）およびＨＳＬ（図１５Ｂ）の発現を示すウェスタンブロットの画像図である。ＺＡＧで処置された動物とＰＢＳで処置された動物との差は、ｃ、ｐ＜０．００１として示される。
（図１６）腓腹筋（図１６Ａ）、ＷＡＴ（図１６Ｂ）、およびＢＡＴ（図１６Ｃ）におけるＺＡＧの発現を示すウェスタンブロットの画像図である。図１２に示される、ＰＢＳまたはＺＡＧのいずれかで１０日間処置された雄ウィスターラットから組織を摘出した。ＺＡＧで処置された動物とＰＢＳで処置された動物との差は、ｃ、ｐ＜０．００１として示される。
（図１７）図１２に示される、ＰＢＳまたはＺＡＧのいずれかで１０日間処置された雄ウィスターラットの腓腹筋におけるｐＰＫＲ（図１７Ａ）およびｐｅＩＦ２α（図１７Ｂ）のリン酸化形態および全形態の発現を示すウェスタンブロットの画像図である。濃度測定分析は、リン酸形態対全形態の比であり、ＰＢＳで処置したラットの値のパーセンテージとして表される。
（図１８）様々な濃度のグルコースの存在下、４時間ＺＡＧの存在および非存在下で処置されたＣ２Ｃ１２筋管におけるフェニルアラニン放出（図１８Ａ）およびタンパク質合成（図１８Ｂ）を示すグラフ図である。統計的有意性は、対照の場合ｃ、Ｐ＜０．００１、グルコース単独の場合ｆ、Ｐ＜０．００１である。
（図１９）様々な濃度のグルコースの存在下、ＳＲ５９２３０Ａの存在および非存在下で、ＺＡＧの存在および非存在下で処置されたＣ２Ｃ１２筋管におけるフェニルアラニン放出を示すグラフ図である。統計的有意性は、対照の場合ｂ、Ｐ＜０．０１およびｃ、Ｐ＜０．００１、グルコース単独の場合ｅ、Ｐ＜０．０５およびｆ、Ｐ＜０．００１である。
（図２０）様々な濃度のグルコースの存在下、ＳＲ５９２３０Ａの存在および非存在下で、ＺＡＧの存在および非存在下で処置されたＣ２Ｃ１２筋管におけるタンパク質合成を示すグラフ図である。統計的有意性は、対照の場合ｂ、Ｐ＜０．０１およびｃ、Ｐ＜０．００１、グルコース単独の場合ｅ、Ｐ＜０．０５およびｆ、Ｐ＜０．００１、グルコース＋ＳＲの場合Ｉ、Ｐ＜０．００１である。
（図２１）ＺＡＧの存在および非存在下、様々な濃度のグルコースで処置されたＣ２Ｃ１２筋管におけるＲＯＳ活性を示すグラフ図である。統計的有意性は、対照の場合ｃ、Ｐ＜０．００１、グルコース単独の場合ｆ、Ｐ＜０．００１である。
（図２２Ａ）ＺＡＧの存在および非存在下、グルコースで処置されたＣ２Ｃ１２筋管におけるｐＰＫＲを示すウェスタンブロットの画像図である。統計的有意性は、対照の場合ｃ、Ｐ＜０．００１、グルコース単独の場合ｆ、Ｐ＜０．００１である。
（図２２Ｂ）ＺＡＧの存在および非存在下、グルコースで処置されたＣ２Ｃ１２筋管におけるｐｅＩＦ２αを示すウェスタンブロットの画像図である。統計的有意性は、対照の場合ｃ、Ｐ＜０．００１、グルコース単独の場合ｆ、Ｐ＜０．００１である。
（図２３）ＺＡＧの存在および非存在下で処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるインスリン耐性試験の結果を示すグラフ図である。統計的有意性は、ＺＡＧの存在下でｂ、Ｐ＜０．０５およびｃ、Ｐ＜０．００１である。
（図２４）ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＤ−［Ｕ−１４Ｃグルコース］の１４ＣＯ２への酸化を示すグラフ図である。
（図２５）ｏｂ／ｏｂマウスにおける［１４Ｃカルボキシ］トリオレインからの１４ＣＯ２の産生を示すグラフ図である。
（図２６）ＢＲＬ３７３４４を投与されたマウス（悪液質モデル）と比較して、抗ＺＡＧを投与されたマウスの体重減少の低減を示すグラフ図である。
（図２７）抗ＺＡＧ抗体の非存在および存在下で、β３作動薬、ＢＲＬ３７３４４で処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるグルコース耐性を示すグラフ図である。
（図２８）イソプレナリン（Ｉｓｏ）、ＺＡＧ、および抗ＺＡＧ抗体に応答する、マウス精巣上体脂肪細胞における脂肪分解の結果を示すグラフ図である。
（図２９）抗ＺＡＧの非存在または存在下で、ＢＲＬで処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおける体重変化を示すグラフ図であり、ＢＲＬは、抗ＺＡＧから２４時間前または同時に付加された。
（図３０）ＺＡＧ処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるタンパク質分解の減少および筋合成の増加を示すグラフ図である。
（図３１）ＺＡＧありおよびなしで処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおける体重変化を示すグラフ図である。
（図３２）ＺＡＧありおよびなしで処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおける体温を示すグラフ図である。
（図３３）ＺＡＧありおよびなしで処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおける尿中グルコース値を示すグラフ図である。
（図３４）経口投与後のｏｂ／ｏｂマウスにおけるＺＡＧを示すウェスタンブロットの画像図である。経口投与されたｒｈＺＡＧによる処置は、血漿中の内因性発現マウスＺＡＧを増加させる。
（図３５）ヒトＺＡＧ（経口）の存在および非存在下で処置されたｏｂ／ｏｂマウスから得たＷＡＴにおけるＺＡＧ発現を示すウェスタンブロットの画像図である。経口投与されたｒｈＺＡＧによる処置は、ＷＡＴにおける内因性発現マウスＺＡＧを増加させる。
（図３６）プロプラノロール、一般的なβ−ＡＲ拮抗薬の非存在または存在下、ＺＡＧ（経口）の存在および非存在下で処置されたｏｂ／ｏｂマウスの体重変化を示す、グラフ図である。プロパノロールは、３日目に２０〜４０ｍｇ／ｋｇ増加し、その後、体重減少の変化は、ＺＡＧで処置された動物の負の傾斜から未処置の動物の正の傾斜に変化した。
（図３７）プロプラノロールの非存在または存在下、ＺＡＧ（経口）の存在および非存在下で処置されたｏｂ／ｏｂマウスの体温変化を示すグラフ図である。プロプラノロールは、３日目に２０〜４０ｍｇ／ｋｇ増加し、その後、ＺＡＧ＋Ｐｒｏｐで処置された動物の体温は、未処置の動物の体温を追跡した。
（図３８）プロプラノロールの非存在または存在下、ＺＡＧの存在および非存在下で処置されたマウスから得たマウス血漿中の抗マウスＺＡＧを使用するＺＡＧを示すウェスタンブロットの画像図である。内因性マウスＺＡＧは、経口投与されたｒｈＺＡＧによる処置に伴って増加し、そのような増加は、プロプラノロールによって遮断される。
（図３９）プロプラノロールの非存在または存在下、ＺＡＧの存在および非存在下で処置されたマウスから得たマウス血清に対して、抗ヒトＺＡＧを使用するＺＡＧを示すウェスタンブロットの画像図である。ヒトＺＡＧは、プロプラノロールの存在または非存在下、マウス血清において検出されない。
（図４０）プロプラノロールの非存在または存在下、ＺＡＧ（経口）の存在および非存在下で処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるブドウ糖負荷試験中のグルコース値を示すグラフ図である。
（図４１）経口投与後のｏｂ／ｏｂマウスにおけるＺＡＧを示すウェスタンブロットの画像図である。ｒｈＺＡＧの経口投与による処置は、血漿中の内因性発現マウスＺＡＧを増加させる。
（図４２）ヒトＺＡＧ（経口）の存在および非存在下で処置されたｏｂ／ｏｂマウスから得たＷＡＴにおけるＺＡＧ発現を示すウェスタンブロットの画像図である。
（図４３）ｏｂ／ｏｂマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するＺＡＧの効果を示す画像図である。
（図４４）ｏｂ／ｏｂマウスの骨格筋におけるシグナル伝達経路に対するＺＡＧの効果を示す画像図である。
（図４５）ｏｂ／ｏｂマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するＺＡＧの効果を示す画像図である。
（図４６）経口処置されたｏｂ／ｏｂマウスから得たＺＡＧの胃内および血漿内値を示す１４Ｃ  ＺＡＧオートラジオグラフの画像図であり、試料は処置から２４時間後に採取した。
（図４７）５０μｇ  ＺＡＧ（経口／強制）の存在および非存在下で処置されたｏｂ／ｏｂマウスの体重変化を示すグラフ図である。
（図４８）５０μｇ  ＺＡＧ（経口／強制）の存在および非存在下で処置されたｏｂ／ｏｂマウスの尿中グルコース値を示すグラフ図である。
（図４９）ウェスタンブロットの画像図である。抗ＺＡＧは、インビボでＢＲＬ３７３４４によってもたらされる作用を低下させる。抗ＺＡＧの非存在または存在下、ＢＲＬの存在および非存在下で処置されたｏｂ／ｏｂマウスのＢＡＴにおけるＵＣＰ３のウェスタンブロット。ＢＲＬ３７３４４によるｏｂ／ｏｂマウスの処置は、ＢＡＴにおけるＵＣＰ３を増加させ、その効果は、抗ＺＡＧ抗体の投与によって遮断される。
（図５０）ウェスタンブロットの画像図である。ｏｂ／ｏｂマウスに対するＺＡＧの経口投与は、血漿およびＷＡＴにおける内因性マウスＺＡＧの上方調節をもたらす。血漿（上）およびＷＡＴ（下）の経口ｒｈＺＡＧ投与した試料におけるマウスＺＡＧのウェスタンブロット。
（図５１）ウェスタンブロットの画像図である。プロプラノロールは、経口ｒｈＺＡＧによる処置に起因して、マウス血清ＺＡＧの増加を遮断するが、投与されたヒトＺＡＧは、血漿中に認められない。プロプラノロール（上）の非存在または存在下、ＺＡＧの存在および非存在下で処置されたマウスから得たマウス血清において、抗マウスＺＡＧを使用するＺＡＧのウェスタンブロット。ヒトＺＡＧは、マウス血清において検出されない。プロプラノロール（下）の非存在または存在下、ＺＡＧの存在および非存在下で処置されたマウスから得たマウス血清において、抗ヒトＺＡＧを使用するＺＡＧのウェスタンブロット。
（図５２Ａ）β１−ＡＲ（■）、β２−ＡＲ（□）、およびβ３−ＡＲ（ハッシュ）で形質転換されたＣＨＯ細胞におけるサイクリックＡＭＰ産生に対するＺＡＧ濃度の効果を示すグラフ図である。
（図５２Ｂ）ＳＲ５９２３０Ａ（１０μＭ）の非存在または存在下、β１−（■）、β２−（□）、およびβ３−ＡＲ（ハッシュ）で形質転換されたＣＨＯ細胞におけるサイクリックＡＭＰ産生に対するイソプレナリン（１０μＭ）の効果を示すグラフ図である。サイクリックＡＭＰの基礎値との差は、ａ、ｐ＜０．０５またはｃ、ｐ＜０．００１のいずれかとして示される。
（図５２Ｃ）ｍＲＮＡ値を示すグラフ図である。全ＲＮＡのβ−ＡＲ  ｍＲＮＡ分子／μｇの絶対数として、それぞれのヒト遺伝子で形質転換されたＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるβ１−、β２−、およびβ３−ＡＲの発現は、同一試料（白抜きのボックス）におけるＧＡＰＤＨの発現と比較して、ＲＴ−リアルタイムＰＣＲ（黒塗りのボックス）によって測定された。
（図５２Ｄ）基礎値（白抜きのボックス）に関して、ホルスコリン（２０μＭ）に応答する、ヒトβ１−、β２−、およびβ３−ＡＲで形質転換されたＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるサイクリックＡＭＰ産生（黒塗りのボックス）を示すグラフ図である。
（図５２Ｅ）１００μＭ  非標識ＺＡＧの非存在（■）または存在（▲）下、ヒトβ１−（図５２Ｅ）、β２−（図５２Ｆ）、およびβ３−ＡＲ（図５２Ｇ）で形質転換されたＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するＺＡＧの特異的結合を示すグラフ図である。同様濃度の凍結／解凍されたＺＡＧの結合（Ｘ）も示される。
（図５２Ｆ）同上。
（図５２Ｇ）同上。
（図５２Ｈ）マウス精巣上体脂肪細胞におけるイソプレナリン（Ｉｓｏ、１０μＭ）（黒塗り）と比較して、新鮮（白抜き）または一度凍結／解凍された（点線）ＺＡＧ（０．５８μＭ）の脂肪分解活性を示すグラフ図である。対照との差は、ｃ、ｐ＜０．００１として示されるが、ＳＲ５９２３０Ａの存在下での新鮮なＺＡＧと凍結されたＺＡＧとの間の差は、ｆ、ｐ＜０．００１として示される。
（図５３Ａ）ＺＡＧで処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおける体重（５３Ａ）、体温（５３Ｂ）、および尿グルコース分泌（５３Ｃ）に対するプロパノロールの効果を示すグラフ図である。動物を４群に分けて（ｎ＝５／群）、ＺＡＧ（５０ｍｇ、ｉｖ）（■）、ＺＡＧ＋プロパノロール（４０ｍｇｋｇ-1、ｐｏ）（▲）を連日投与する一方、対照は、ＰＢＳ（◆）またはＰＢＳおよびプロパノロール（Ｘ）のいずれかを受けた。ＰＢＳとの差は、ｃ、ｐ＜０．００１として示されるが、ＺＡＧとの差は、ｆ、ｐ＜０．００１として示される。
（図５３Ｂ）同上。
（図５３Ｃ）同上。
（図５３Ｄ）対照処置およびＺＡＧ処置された試料切片を比較する、６０日後の肝組織学の画像図である。
（図５４Ａ）ＰＢＳ（□）と比較して、ＺＡＧ（■）の開始から３日後のブドウ糖負荷試験中の任意単位におけるグルコース曲線（ＡＵＣ）下の総面積および血漿グルコース値を示すグラフ図である。
（図５４Ｂ）（図５４Ａ）に記載されるブドウ糖負荷試験中の血漿インスリンレベルを示すグラフ図である。
（図５４Ｃ）インスリン（１００ｎＭ）の非存在または存在下で、ｏｂ／ｏｂマウスの単離腓腹筋へのグルコースの取り込みを示すグラフ図である。ｏｂ／ｏｂマウスは、筋肉を摘出する前に７日間、プロパノロールの存在または非存在下、ＺＡＧで処置された。
（図５４Ｄ）インスリン（１０ｎＭ）の非存在または存在下で、ｏｂ／ｏｂマウスの精巣上体脂肪細胞へのグルコース取り込みを示すグラフ図である。動物は、ＷＡＴを摘出する前に７日間、表示される処置を受けた。
（図５４Ｅ）プロプラノロールの存在または非存在下で７日間、ＰＢＳまたはＺＡＧで処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるＴＧ（図５４Ｅ）およびＮＥＦＡ（図５４Ｆ）の値を示すグラフ図である。
（図５４Ｆ）同上。
（図５４Ｇ）ＺＡＧもしくはインスリンまたは両方の存在下で、ｏｂ／ｏｂマウスから得た腓腹筋（５４Ｇ）およびＷＡＴ（５４Ｈ）におけるＧｌｕｔ４の発現を示すウェスタンブロットの画像図である。対照との差は、ｂ、ｐ＜０．０１またはｃ、ｐ＜０．００１として示されるが、ＺＡＧ単独との差は、ｄ、ｐ＜０．０５またはｆ、ｐ＜０．００１として示される。図５５Ａは、ウェスタンブロットの画像図である。
（図５４Ｈ）同上。
（図５５）ｏｂ／ｏｂマウスをＺＡＧ（３５μｇ、ｉｖ、日−１）で５日間処置した後のβ３−ＡＲの発現を示す画像図である。ウェスタンブロットは、ＰＢＳまたはＺＡＧのいずれかで処置されたｏｂ／ｏｂマウスの腓腹筋（５４Ａ）、ＢＡＴ（５４Ｂ）、およびＷＡＴ（５４Ｃ）におけるβ３−ＡＲの発現を示す。濃度測定分析は、３つの別個のウェスタンブロットの平均である。対照との差は、ｃ、ｐ＜０．００１として示される。
（図５６Ａ）ｏｂ／ｏｂマウスをＺＡＧ（３５μｇ、ｉｖ、連日）で５日間処置した後の腓腹筋（５６Ａ）、ＷＡＴ（５６Ｂ）、および心臓（５６Ｃ）におけるβ１−およびβ２−ＡＲの発現を示す画像図である。ＰＢＳ処置された動物との差は、ａ、ｐ＜０．０５として示される。図５７Ａ、５７Ｂ、５７Ｃ、および５７Ｄは、脱共役タンパク質の発現に対するＺＡＧの効果を示す画像図である。ウェスタンブロットは、ＰＢＳまたはＺＡＧ（３５μｇ、ｉｖ、連日）のいずれかで５日間処置した後のｏｂ／ｏｂマウスのＢＡＴ（５７Ａ）およびＷＡＴ（５７Ｂ）におけるＵＣＰ１の発現、ならびにＷＡＴ（５７Ｃ）におけるＵＣＰ３および腓腹筋（５７Ｄ）におけるＡＭＰＫの発現を示す。濃度測定分析は、３つの別個のブロットの平均である。ＰＢＳ処置された動物との差は、ｃ、ｐ＜０．００１として示される。
（図５６Ｂ）同上。
（図５６Ｃ）同上。
（図５７Ａ）脱共役タンパク質の発現に対するＺＡＧの効果を示す画像図である。ウェスタンブロットは、ＰＢＳまたはＺＡＧ（３５μｇ、ｉｖ、連日）のいずれかで５日間処置した後のｏｂ／ｏｂマウスのＢＡＴ（５７Ａ）およびＷＡＴ（５７Ｂ）におけるＵＣＰ１の発現、ならびにＷＡＴ（５７Ｃ）におけるＵＣＰ３および腓腹筋（５７Ｄ）におけるＡＭＰＫの発現を示す。濃度測定分析は、３つの別個のブロットの平均である。ＰＢＳ処置された動物との差は、ｃ、ｐ＜０．００１として示される。
（図５７Ｂ）同上。
（図５７Ｃ）同上。
（図５７Ｄ）同上。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、抗ヒト亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）抗体が、悪液質のモデルにおいて体重減少を低減するという観測に基づく。そのようにして、本発明は、対象の悪液質状態において、体重減少を防ぐための方法を提供する。悪液質の対象において、体重減少の低減をもたらす複合処置法も提供される。
【００３４】
本明細書では、哺乳類を処置する、および／またはヒトもしくは動物の食事を補助するための製剤および方法が提供される。この方法は、記載される製剤のうちの１つまたは複数を、所定の期間および／または所定の順序で摂取することを含み得る。製剤のうちの１つまたは複数を含むキットも提供される。そのようにして、本発明は、組み換え亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）が、食事の摂取に影響することなく、対象において体重の減少およびインスリン応答性の増加を生じさせるという観測に基づく。 
【００３５】
本組成物および方法について説明する前に、そのような組成物、方法、および条件は変化し得るため、本発明は、記載される特定の組成物、方法、および実験条件に限定されないことを理解されたい。また本発明の範囲は、添付の請求項においてのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的とし、限定するものではないことも理解されたい。
【００３６】
本明細書および添付の請求項において使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明示的に別段の指示がない限り、複数形の照応を含む。したがって、例えば、「方法」に関する言及は、本明細書に記載される種類の１つまたは複数の方法、および／またはステップを含み、本開示等を読むことによって当業者に明らかとなるであろう。
【００３７】
別段の定めがない限り、本明細書で使用するすべての技術的および化学的用語は、本発明が属する技術分野において通常の技術を有する者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものに類似または相当する任意の方法および材料は、本発明の実践または試験において使用することができ、好適な方法および材料についてここで説明する。
【００３８】
ＺＡＧの完全アミノ酸配列は、Ｔ．Ａｒａｋｉら（１９８８）による「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  Ｚｉｎｃ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｔｉｇｅｎｓ」という表題の論文（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８５，６７９〜６８３）において報告され、糖タンパク質は、３つの個別のドメイン構造（Ａ、Ｂ、およびＣ）を有し、３つのグリコシル化部位において、Ｎ結合型グリカンと一緒に２つのジスルフィド結合を含む、２７６アミノ酸残基の単一ポリペプチド鎖で構成されるものとして示された。ポリペプチド成分のこのアミノ酸配列は、添付の図面の図１０に示される。いくつかの後次出版物は、ヒトＺＡＧの組成物が、異なる体液または組織から単離されると、いくらか変化し得ることを示したが、この材料の全調製物は、実質的に同一の免疫学的特性を有する。Ｈ．Ｕｅｙａｍａら（１９９１）によって「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｚｉｎｃ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃＤＮＡ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｇｅｎｅ」（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７７，６９６−７０３）において報告されるように、ＺＡＧのｃＤＮＡは、ヒト肝臓および前立腺ライブラリから単離され、またＵｅｙａｍａら（１９９３）によって「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｚｉｎｃ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ」（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２，１２９６８〜１２９７６）において報告されるように、遺伝子も単離された。Ｈ．Ｕｅｙａｍａらは、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９４）１１６，６７７〜６８１において、ラットおよびマウス肝臓から得たＺＡＧ  ｃＤＮＡに関する研究についても説明し、対応するｍＲＮＡによって発現された糖タンパク質と一緒に、配列決定し、ヒト材料と比較した。異なる種から予想されるように、詳細な差が認められたが、高度のアミノ酸配列相同は、ヒト対照物と５０％を超える同一性（糖タンパク質のドメインＢ内で７０％を超える同一性）を有することがわかった。再度、ヒトとラットおよびマウスＺＡＧとの間に共通の免疫学的特性が観測された。
【００３９】
上述の精製されたＺＡＧは、実質的にＯｈｋｕｂｏらによって説明される方法に従って、新鮮なヒト血漿から調製された（Ｏｈｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）″Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｚｉｎｃ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ″（Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８，４１３−４３０）。当然のことながら、場合によっては、ＺＡＧまたは抗ＺＡＧ抗体の単離された脂質動員因子の断片は、活性を失うことなく産生されてよく、この活性に実質的に影響しない様々な付加、削除、または置換が行われてよい。そのようにして、本発明の方法は、抗ＺＡＧ抗体の機能的断片の使用も含む。これらの治療用途で使用される抗体またはその断片は、例えば、恐らく亜鉛−α２−糖タンパク質の既知のｃＤＮＡ配列に基づいて、当該技術分野においてよく知られている、組み換えＤＮＡ技術によってさらに産生されてよく、例えば、その技術は、Ｈ．Ｕｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）″Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｔ  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ  ｍＲＮＡｓ  ｆｏｒ  Ｚｎ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ″Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１６，６７７−６８１において公開されている。さらに、これらの治療用途で使用される抗体または断片は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、リン酸化等、ならびに自然発生および非自然発生に関わらず、当該技術分野において知られている他の修飾をさらに含んでよい。
【００４０】
本明細書で使用するとき、ＺＡＧポリペプチドまたはタンパク質は、それらの生物学的機能を保持する、野生型タンパク質の変異体を含む。そのようにして、ＺＡＧタンパク質の残基のうちの１つまたは複数は、変異体がその天然の生物活性を保持する限り、変異体または短縮タンパク質を産出するように改変することができる。同類アミノ酸置換には、例えば、酸性アミノ酸としてアスパラギン酸−グルタミン酸、塩基性アミノ酸としてリシン／アルギニン／ヒスチジン、疎水性アミノ酸としてロイシン／イソロイシン、メチオニン／バリン、アラニン／バリン、親水性アミノ酸としてセリン／グリシン／アラニン／トレオニンが挙げられる。同類アミノ酸置換は、側鎖に基づく分類も含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリンの置換、アスパラギン酸とグルタミン酸の置換、トレオニンとセリンの置換、またはアミノ酸と構造的に関連するアミノ酸の置換は、得られる変異型ポリペプチドの特性に大きな影響を及ぼさないと予想することは妥当である。
【００４１】
本発明の範囲内であるアミノ酸置換は、一般に、（ａ）置換領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクの維持に対するそれらの効果が著しく異ならない置換を選択することによって達成される。しかしながら、本発明は、非同類置換を有する変異型も包含する。
【００４２】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すという別段の区別がない限り、本明細書において同義的に使用される。これらの用語は、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化を含む反応を通して翻訳後に修飾されるタンパク質も含む。
【００４３】
上述されるように、本発明は、ＺＡＧポリペプチドまたはタンパク質の機能的断片の使用を含む。機能的断片は、体重減少と関連付けられた活性を有するか、または影響を及ぼすこと、血糖値を低下させること、体温を上昇させること、グルコース組織の取り込みを改善すること、Ｂｅｔ３受容体の発現を増加させること、ＺＡＧの発現を増加させること、Ｇｌｕｔ４の発現を増加させること、および／またはＵＣＰ１およびＵＣＰ３の発現を増加させることによって、一部特性化される。したがって、用語「機能的断片」は、本明細書で使用するとき、ＺＡＧの１つまたは複数の生物学的機能を保持するポリペプチドを指す。そのようなＺＡＧポリペプチドの機能的断片を同定するための方法は、当該技術分野において一般に知られている。 
【００４４】
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、特定の抗原と免疫学的に反応する免疫グロブリン分子に対する言及を含み、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含む。この用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロ共役抗体（例えば、二重特異性抗体）等の遺伝子工学的形態も含む。用語「抗体」は、抗体の抗原結合形態も含み、抗原結合能力を有する断片（例えば、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびｒＩｇＧを含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）も参照されたい。例えば、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３．ｓｕｐ．ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）も参照されたい。この用語は、組み換え単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）も指す。用語「抗体」は、二価または二特異性分子、二量体、三量体、および四量体も含んでよい。二価および二特異性分子は、例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１５４７，Ｐａｃｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１５７９，Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ｓｕｐｒａ，Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ：５３６８，Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ６：７８１，Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０５５，Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：４０２６，ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：３０１において説明される。
【００４５】
特定の抗原と免疫学的に反応する抗体は、ファージまたは類似するベクターにおける組み換え抗体のライブラリの選択等の組み換え法によって（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）、およびＶａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９−３１４（１９９６）を参照）、または抗原もしくは抗原をコードするＤＮＡを用いて動物に免疫付与することによって生成することができる。
【００４６】
典型的に、免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖を有する。各重鎖および軽鎖は、退場領域および可変領域を含有する（領域は「ドメイン」としても知られる）。軽鎖および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる、３つの超可変領域によって中断される、４つの「フレームワーク」領域を含む。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲が定義される。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種ないで比較的保存される。組成軽鎖および重鎖の複合フレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域は、３次元空間においてＣＤＲを配置および整列させるように機能する。
【００４７】
ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、典型的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称され（Ｎ末端を発端として連続的に付番される）、典型的に特定のＣＤＲが位置付けられる鎖によっても同定される。したがって、ＶＨ  ＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置付けられるが、ＶＬ  ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインから得たＣＤＲ１である。
【００４８】
「ＶＨ」または「ＶＨ」に対する言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはＦａｂの重鎖を含む、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」に対する言及または「ＶＬ」は、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指し、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂの軽鎖を含む。
【００４９】
自然発生するクラスのＩｇＧ抗体定常領域に実質的に同一の定常領域を有する抗体は、存在する任意の定常領域が、自然発生するクラスのＩｇＧ抗体の定常領域のアミノ酸配列に対して、実質的に同一である、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは少なくとも９５％同一である抗体を指す。
【００５０】
本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を介して産生される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、それが産生される方法ではなく、任意の真核、原核、またはファージクローンを含む単一クローンに由来する、抗体を指す。本発明に有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、およびファージ表示技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該技術分野における多様な技術を使用して調製されてよい。例えば、モノクローナル抗体は、当業者を含むハイブリドーマ技術を使用して産生することができ、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，″Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，″Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：″Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，″Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８１），ｐｐ．５６３−６８１（いずれも参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）において教示される。
【００５１】
したがって、いくつかの実施形態では、発明の抗体がキメラ化、霊長類化、ヒト化、またはヒト抗体であり得る。
【００５２】
「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子であり、（ａ）定常領域もしくはその一部は、抗原結合部位（可変領域）が異なるか、もしくは改変されたクラス、エフェクタ機能および／もしくは種、あるいはキメラ抗体に新しい特性を付与する全体的に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物等に結合するように改変、置換、または交換されるか、または（ｂ）可変領域もしくはその一部は、異なるか、もしくは改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置換、または交換される。キメラ抗体を産生するための方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７（１９８５）、Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４−２２１（１９８６）、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２（１９８９）、米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、および同第４，８１６，３９７号を参照されたい（参照によりそれら全体が本明細書に援用される）。
【００５３】
用語「ヒト化抗体」または「ヒト化免疫グロブリン」は、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体から少なくとも１つ、好ましくはすべての相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む免疫グロブリンを指し、存在する任意の定常領域は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち少なくとも約８５〜９０％、好ましくは少なくとも９５％同一である。したがって、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分は、恐らくＣＤＲを除いて、１つまたは複数の天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。したがって、そのようなヒト化抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、実質的に製上でないヒト可変ドメインは、非ヒト種の対応する配列によって置換されている。多くの場合、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体の対応する残基と置換されて、抗原結合を改変、好ましくは改善する。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野においてよく知られる方法、例えば、ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリングによって同定され、抗原結合および配列比較に重要なフレームワーク残基を同定して、特定位置における異常なフレームワーク残基を同定する。例えば、米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、同第６，１８０，３７０号を参照されたい（それぞれ参照によりその全体が援用される）。抗体は、例えば、ＣＤＲグラフト化（欧州特許第ＥＰ２３９，４００号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０９９６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤまたは再舗装（欧州特許第ＥＰ５９２，１０６号、第ＥＰ５１９，５９６号、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：４８９−４９８（１９９１）、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：８０５−８１４（１９９４）、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９６９−９７３（１９９４）、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当該技術分野において知られる多様な技術を使用してヒト化され得る（すべて参照によりそれら全体が本明細書に援用される）。
【００５４】
ある実施形態において、完全な「ヒト」抗体が、ヒト患者の治療的処置に望ましい場合がある。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを使用する、上述のファージ提示法を含む、当該技術分野において知られる多様な方法によって製造され得る。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９８／４６６４５号、同第ＷＯ９８／５０４３３号、同第ＷＯ９８／２４８９３号、同第ＷＯ９８／１６６５４号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、同第ＷＯ９６／３３７３５号、および同第ＷＯ９１／１０７４１号を参照されたい（それぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される）。ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できる、遺伝子導入マウスを使用して産生することもできる。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術、ならびにそのような抗体を産生するためのプロトコルに関する詳細な論考については、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／２４８９３号、同第ＷＯ９２／０１０４７号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、同第ＷＯ９６／３３７３５号、欧州特許第０５９８８７７号、米国特許第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８８５，７９３号、同第５，９１６，７７１号、および同第５，９３９，５９８号を参照されたい（参照によりそれら全体が本明細書に援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）およびＭｅｄａｒｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）等の企業は、上述の技術に類似する技術を使用して、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに関与し得る。
【００５５】
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「誘導選択」と称される技術を使用して生成され得る。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を使用して、同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。
【００５６】
用語「霊長類化抗体」は、サル可変領域およびヒト定常領域を含む抗体を指す。霊長類化抗体を産生するための方法は、当該技術分野において知られている。例えば、米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６８１，７２２号、および同第５，６９３，７８０号を参照されたい（参照によりそれら全体が本明細書に援用される）。
【００５７】
本明細書で使用するとき、用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープはいずれも、隣接アミノ酸またはタンパク質の三次折り畳みによって並列された非隣接アミノ酸から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的に、変性溶媒への曝露により保たれるが、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的に、変性溶媒での処置により失われる。エピトープは、典型的に、少なくとも３個、より通常は少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を固有の空間構造に含む。エピトープの空間構造を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ（１９９６）を参照されたい。
【００５８】
「ＩｇＧクラス」の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の抗体を指す。重鎖および軽鎖におけるアミノ酸残基の付番は、ＥＵインデックスのものである（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，″Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ″，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、ＥＵ付番スキームが本明細書で使用される）。
【００５９】
ポリクローナル抗体を調製する方法は、熟練者に知られている。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫剤および必要に応じてアジュバントを１回または複数回注射することによって、哺乳動物において生育され得る。典型的に、免疫剤および／またはアジュバントは、複数の皮下または腹腔内注射によって哺乳類に注射される。免疫剤は、核酸またはその機能的断片によってコードされる、配列番号１に示されるポリペプチド等のタンパク質を含んでよい。免疫付与される哺乳類において免疫原性であることが知られるタンパク質に免疫剤を共役させるために有用であり得る。そのような免疫原性タンパク質の例には、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、および大豆トリプシン阻害剤を含むが、それらに限定されない。用いられ得るアジュバントの例には、フロイントの完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバントが挙げられる（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）。免疫付与プロトコルは、過度の実験を行うことなく、当業者によって選択され得る。
【００６０】
あるいは、抗体はモノクローナル抗体であってよい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）に記載のものを使用して調製されてよい。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、典型的に、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生可能なリンパ球を誘発するように、免疫剤で免疫付与される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫付与されてよい。免疫剤は、典型的に、配列番号１またはその機能的断片に示されるポリペプチドを含む。
【００６１】
ヒト抗体は、ファージ提示ライブラリを含む、当該技術分野において知られる様々な技術を使用して産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））。Ｃｏｌｅら、およびＢｏｅｒｎｅｒらの技術は、ヒトモノクローナル抗体の調製にも使用可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６−９５（１９９１））。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を形質転換動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的または完全に不活性化されたマウスに導入することによって製造され得る。惹起時に、遺伝子再配置、アセンブリ、および抗体レパートリーを含むあらゆる観点において、ヒトに見られるものに極めて類似する、ヒト抗体産生が観測される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、および以下の科学出版物、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ＆  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）において説明されている。
【００６２】
いくつかの実施形態では、抗体は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖ抗体のＶＨおよびＶＬ領域は、折り畳まれて２つの鎖抗体に見られるものに類似する抗原結合部位を形成する単鎖を含む。一旦折り畳まれると、非共有相互作用が単鎖抗体を安定させる。いくつかの抗体実施形態のＶＨおよびＶＬ領域は、一緒に直接結合することができ、当業者であれば、これらの領域が１つまたは複数のアミノ酸から成るペプチドリンカーによって分離され得ることを理解するであろう。ペプチドリンカーおよびそれらの使用は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８：５８７９（１９８８）、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３６（１９８８）、Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１３６２（１９９０）、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，１３２，４０５号、およびＳｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：２５６−２６５（１９９３）を参照されたい。概して、ペプチドリンカーは、領域を結合するか、またはＶＨとＶＬの間のいくらかの最小距離もしくは他の空間関係を保存することを除いて、特異的な生物活性を有しない。しかしながら、ペプチドリンカーの構成アミノ酸は、折り畳み、正味電荷、または疎水性等の分枝のいくつかの特性に影響するように選択されてよい。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体は、５０個を超えないアミノ酸、一般に４０個を超えないアミノ酸、好ましくは３０個を超えないアミノ酸、およびより好ましくは２０個を超えないアミノ酸の長さのペプチドリンカーを随意に含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：７）、好ましくは２、３、４、５、または６個のそのような配列のコンカテマーである。しかしながら、当然のことながら、リンカー内でいくつかのアミノ酸置換が行われ得る。例えば、バリンはグリシンと置換することができる。
【００６３】
ｓｃＦｖ抗体を製造する方法は説明されている。Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（上記）、およびＶａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）を参照されたい。つまり、免疫付与された動物のＢ細胞から得たｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを調製する。ｃＤＮＡは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域に特異的なプライマーを使用して増幅される。ＰＣＲ生成物を精製し、核酸配列を結合する。リンカーペプチドが所望される場合、ペプチドをコードする核酸配列を重鎖核酸配列と軽鎖核酸配列との間に挿入される。ｓｃＦｖをコードする核酸がベクターに挿入され、適切な宿主細胞において発現される。所望の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖは、典型的にファージ提示ライブラリのパニングによって見出される。パニングは、いくつかの方法のうちのいくつかによって行われ得る。パニングは、所望の抗原をそれらの表面上に発現する細胞を使用するか、または所望の抗原で被覆された固体表面を使用して便宜的に行われ得る。便宜上、表面は磁気ビーズであり得る。非結合ファージは、固体表面から洗い流され、結合ファージは溶出される。
【００６４】
ＺＡＧおよび／またはその断片は、米国特許第６，８９０，８９９号および同第７，５５０，４２９号、ならびに米国公開第２０１０／０１７３８２９号において開示されるように、哺乳類における体重減少または肥満の減少をもたらすことが以前に示されている（それぞれの全体内容は、参照により本明細書に援用される）。一実施形態において、本発明は、抗ＺＡＧ抗体および／またはその機能的断片が、悪液質のモデルにおける体重減少を低減することを証明する。したがって、本発明の方法は、悪液質に関連する症状および／または筋肉消耗疾患と関連付けられる疾患に対して検出可能な効果を提供すると考えられる。
【００６５】
したがって、一態様では、本発明は、対象における悪液質の症状を改善する方法を提供する。この方法は、治療上有効な薬用量の配列番号１に示される配列を有するポリペプチドの生物活性の阻害剤を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。一実施形態において、治療レジメンは、数ヶ月（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月）または数年であってよい。別の実施形態において、ポリペプチドは、最長２１日またはそれ以上の期間投与される。別の実施形態において、症状の改善は、治療開始から数日（例えば、１、２、３、４、５、６、もしくは７日）、数週間（例えば、１、２、３、もしくは４週間）、または数ヶ月（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月）以内に検出可能である。別の実施形態において、治療レジメンは、約１０日であり、治療後に悪液質に関連する症状の改善が見られる。別の実施形態において、治療レジメンは、約２１日であり、治療後に悪液質に関連する症状の改善が見られる。
【００６６】
さらに、米国公開出願第２００６／０１６０７２３号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されるように、ＺＡＧおよび／またはその断片の類似特徴を有する脂質動員薬も使用して、哺乳類の体重減少または肥満の減少をもたらすことが観測された。最後に、ＺＡＧおよび／またはその機能的断片は、脂肪細胞および骨格筋のインスリン応答性を増加させ、治療中に体重減少または肥満の減少が観測されるか否かに関わらず、タンパク質分解の減少と併せて、タンパク質合成の増加を通して、筋肉量の増加をもたらす（米国第１２／６１４，２８９号、参照により本明細書に援用される）。
【００６７】
さらに、β３作動薬は、齧歯類において有効なインスリン感作薬であると報告され、それらがヒトにおいて血糖値を減少させる能力は、調査の対象となっている。β３作動薬アドレナリン受容体の活性は、脂肪酸化を刺激し、それによって、インスリンシグナル伝達を調節する脂肪アシルＣｏＡおよびジアシルグリセロールを含む代謝物の細胞内濃度を低下させる。さらに、本明細書では、これらの薬剤に対して使用可能なあるカテゴリーのβ３受容体が、消化系、特に口、咽頭、食道、および胃に位置することを前提として、所定のβ３受容体作動薬は、臨床試験において成功していない可能性があり、結果として作動薬は、これらの受容体の大部分に対して、あるとしても最小限に曝露されると考えられる。この理論は、β３作動薬治療薬のいくつかが有用であるが、血漿空間におけるバイオアベイラビリティが制限されることが認められたという観測によって支持される。
【００６８】
本明細書において多数の製剤が提供される。製剤は、例えば、液体、固体、ゲル、乳化剤、粉末、錠剤、カプセル、またはゲルキャップ（例えば、ソフトまたはハードゲルキャップ）等の任意の形態であり得る。製剤は、典型的に、精製、単離、または抽出（例えば、植物から）、または合成された１つまたは複数の組成物を含み、食事の補助食品として使用されるとき、複合されて利点を提供する（例えば、栄養的利点に加えて健康効果）。
【００６９】
所定の実施形態において、製剤または製剤に提供される材料の１日当たりまたは１食当たりの推奨量は、本明細書に記載され得る。場合によっては、当業者によって認識されるように、そのような製剤の１日当たりまたは１食当たりの推奨量を提供するために、例えば、粉末をカプセルに、錠剤をカプセルに、ゲルキャップを錠剤に、ゲルキャップをカプセルに、粉末をゲルキャップに、または任意のそのような組み合わせで置換することによって、製剤の形態を変えることができる。
【００７０】
いずれの製剤も、当業者によってよく知られている方法を使用して、例えば、列挙される材料を適量で混合することによって調製することができる。製剤に含める材料は、一般に市販されている。
【００７１】
したがって、一態様において、本発明は、ＺＡＧまたはその機能的断片を含む製剤を提供する。例えば、ＺＡＧは、哺乳類ＺＡＧ（例えば、配列番号１に示されるヒトＺＡＧ）またはその断片であってよい。しかしながら、ＺＡＧが野生型ＺＡＧの活性を保持することを前提として、ＺＡＧは任意の源に由来し得ることを理解されたい。一実施形態において、さらには、１つまたは複数の補助材料から成る、製薬上許容される担体を含む。
【００７２】
用語「対象」は、本明細書で使用するとき、対象方法が行われる任意の個人または患者を指す。一般に、対象はヒトであるが、当業者には理解されるように、対象は動物であってよい。したがって、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等を含む農場動物、および霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む）他の動物は、対象の定義内に含まれる。
【００７３】
悪液質は、一般に、多数の疾患状態と関連付けられ、重傷疾患および慢性炎症性疾患と関連付けられる急性炎症過程、癌、ＡＩＤＳ、敗血症、ＣＯＰＤ、腎不全、関節炎、鬱血性心不全、筋ジストロフィー、糖尿病、加齢性筋肉減弱症、重症外傷（例えば、下肢の整形外科的固定化）、代謝性アシドーシス、脱神経萎縮、および体重減少を含む。
【００７４】
用語「治療上有効な薬用量」または「有効量」は、研究者、獣医、医師、または他の臨床家が求める組織、システム、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する、化合物または医薬組成物の量を意味する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本発明の製剤は、連日経口投与されるものである。しかしながら、他の投与形態も等しく包含される。本明細書で使用するとき、用語「投与」または「投与すること」は、本発明の化合物または医薬組成物を、治療を必要とする対象に提供する動作を含むと定義される。本明細書で使用するとき、フレーズ「非経口投与」および「非経口投与される」は、腸内および局所投与以外の、通常、経口または注射による投与モードを意味し、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜内、被膜内、眼球内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、および胸骨内注射および注入を含む。本明細書で使用するとき、フレーズ「全身投与」、「全身的に投与される」、「末梢投与」および「末梢投与される」は、中枢神経系への直接投与を除いて、化合物、薬物、または他の材料が対象の体系に入るように投与することを意味し、したがって代謝および他の類似過程、例えば、皮下投与を対象とする。そのようにして、一実施形態において、抗ＺＡＧ抗体、その断片、および／または本発明の製剤は、吸入、鼻腔内、頬側、舌下、静脈内、筋肉内、および／または経口によって対象に投与される。別の実施形態において、抗体またはその組成物は、即時融解型組成物、持続放出型組成物、および同類のもので製剤される。
【００７６】
本明細書で使用するとき、用語「改善する」または「治療する」は、行われる動作の結果として、悪液質と関連付けられる臨床兆候および／または症状が低減することを意味する。監視される兆候または症状は、悪液質の特徴であって、熟練した臨床医によく知られており、それらの兆候および状態を監視するための方法も同様である。脂肪／筋肉量の減少に加えて、悪液質と関連付けられる例示の症状には、これらに限定されないが、健常な対照または悪液質を有しない対象と比較して、熱、頭痛、慢性痛、体の不快感、失神、熱と関連付けられる発作、ショック、動悸、心雑音、壊疽、鼻出血、喀血、咳、呼吸困難、喘鳴、過呼吸および低換気、口呼吸、しゃっくりおよび胸痛、腹痛、吐き気または嘔吐、胸焼け、口臭および鼓腸が挙げられる。そのようにして、悪液質に関連する症状の改善は、これらに限定されないが、対象の体重減少を減少または低減すること、および上に列挙された症状のうちの１つまたは複数を改善することを含む。
【００７７】
場合によっては、減少は特定アッセイの検出レベルを下回って低減され得るため、本明細書で使用するとき、用語「低減する」および「阻害する」は一緒に使用される。そのようにして、発現レベルまたは活性が、アッセイの検出レベルを下回って「低減」されるか、または完全に「阻害される」か、は必ずしも明らかでない場合がある。それにも関わらず、本方法に従って治療した後、対象の体重減少量が治療前のレベルから少なくとも低減されたことは明らかに決定可能となる。
【００７８】
ＺＡＧは、多数の生物学的役割が考えられるが、脂肪動員および利用を調節するアジポカインとしてのその役割は、身体組成を調節することにおいて最も重要である。以前の研究は、タンパク質合成の増加が、β−アドレナリン受容体との相互作用による循環ＡＭＰの増加に起因するが、タンパク質分解の減少は、ユビキチン−プロテアソームタンパク質分解経路の活性の低減に起因することを示唆した。ｄｂ／ｄｂマウスにおける研究は、インスリン耐性が、ユビキチン−プロテアソーム経路の活性の増加を通して筋肉消耗を引き起こすことを示す。ＰＫＲおよびｅＩＦ２αの両方のリン酸化の増加は、翻訳開始を遮断することによってタンパク質合成を低減するが、ＰＫＲの活性は、核因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性を通してタンパク質分解を増加させ、プロテアソームサブユニットの発現を増加させる。高細胞外グルコースの存在下で筋管を使用するインビトロ研究は、ＰＫＲの活性がｐ３８ＭＡＰＫの活性および活性酸素種（ＲＯＳ）の形成をもたらすことを示した。ｐ３８ＭＡＰＫは、Ｓｅｒ−５０５においてｃＰＬＡ２をリン酸化および活性し、ＲＯＳの源であるアラキドン酸の放出をもたらす。骨格筋におけるｐ３８ＭＡＰＫの過反応は、食餌性肥満のモデルにおいて観測された。さらに、カスパーゼ−３活性は、糖尿病の動物の骨格筋において増加することが示され、これはＰＫＲを開裂して活性に至り得るため、シグナル伝達系の一部であり得る。理論に縛られることなく、ＺＡＧがこれらのシグナル伝達経路を減衰させる能力は、筋肉量を増加させるその能力に関する説明を提供する。そのようにして、抗ＺＡＧ抗体は、悪液質状況において筋肉量の減少を抑えることが証明される。
【００７９】
したがって、別の態様において、本発明は、ヒトまたは動物の食事を補足する方法を提供する。この方法は、ＺＡＧポリペプチドまたはその断片を対象に投与することを含む。別の実施形態において、方法は、ＺＡＧポリペプチド、例えば、配列番号１に記載のヒトＺＡＧポリペプチドを含む製剤を摂取することを含む。製剤は、単独で、または任意の他の既知の製剤と併せて、任意の順序かつ異なる相対期間で摂取され得る。所定の実施形態では、所定の製剤を他の製剤の前に使用するが、他の製剤は同時に摂取される。
【００８０】
したがって、ＺＡＧは、脂肪分解ホルモンによって誘発されるものに類似して、ＧＴＰに依存する過程において、マウスの白色脂肪細胞の脂肪分解を誘発することができる脂質動員因子として同定される。本明細書に提示されるデータは、ラットＺＡＧとヒトＺＡＧとの間の配列相同がわずか５９．４％であるという事実にも関わらず、ＺＡＧがラット脂肪細胞において同様の使用分解作用を有し、さらに成熟雄ラットにおいて体重および屠体脂肪の減少をもたらすことを示すことによって、これらの所見を支持する。
【００８１】
ＺＡＧは、ブドウ糖負荷試験において、血漿インスリン値の低減および応答の向上を含む、糖尿病状態の代謝特徴の一部にも対抗する。したがって、別の態様において、本発明は、対象の血漿インスリン値を減少させる方法を提供する。この方法は、治療上有効な薬用量の配列番号１に示される配列を有するポリペプチド、またはその断片を対象に投与することを含む。一実施形態において、血漿インスリンの減少は、治療開始から３日以内に起こる。別の実施形態において、治療レジメンは、１０日またはそれ以上投与される。別の実施形態において、治療レジメンは、２１日またはそれ以上投与される。
【００８２】
さらに、ＺＡＧは、成体雄マウスにおけるグルコース酸化の増加および組織グルコース代謝率の増加を示した。このグルコース利用の増加は、ＺＡＧ投与されたｏｂ／ｏｂマウスの血糖およびインスリン値の両方の低下を説明する。トリグリセリドの利用もまた、ＺＡＧ投与されたマウスにおいて増加し、これは脂肪分解の増加を示す血漿グリセロールの増加に関わらず、血漿非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）およびトリグリセリド（ＴＧ）の低下を説明する。脂質利用の増加は、ＢＡＴにおけるＵＣＰ１およびＵＣＰ３、ならびに骨格筋におけるＵＣＰ３の発現の増加から予想され、結果として体温の上昇をもたらす。したがって、ＺＡＧは、脂肪分解ホルモンによって誘発されるものと同様に、ＧＴＰに依存する過程において、マウスの白色脂肪細胞の脂肪分解を誘発することができる脂質動員因子として同定される。そのようにして、一実施形態において、高血糖に関連する症状の改善は、治療中に約０．５℃〜約１℃の体温上昇も含む。一実施形態において、体温の上昇は、治療開始から４日以内に起こる。別の実施形態において、ＺＡＧの存在の結果として、血糖を管理する必要があるインスリンがより少量であるため、高血糖と関連付けられた症状の改善は、治療前の膵インスリン値と比較して、膵インスリンの増加も含む。
【００８３】
ＺＡＧは、血漿インスリン値の減少およびブドウ糖負荷試験における応答の向上を含む、糖尿病状態の代謝特徴の一部に対抗することも示される。さらに、ＺＡＧは、β３−アドレナリン刺激剤の脂肪分解作用に対する精巣上体脂肪細胞の応答性を高める。ＺＡＧは、肥満インスリン抵抗状態において低減することが認められた精巣上体脂肪組織におけるＨＳＬおよびＡＴＧＬの発現も増加させる。ＨＳＬおよびＡＴＧＬの発現を調節する因子は知られていない。しかしながら、特定のＥＲＫ阻害剤であるＰＤ９８０５９は、ＺＡＧに応答してＨＳＬ発現を下方調節し、この過程におけるＭＡＰＫの役割を示唆している。ＭＡＰＫホスファターゼ−１を欠失するマウスは、ＷＡＴにおけるＥＲＫおよびｐ３８ＭＡＰＫの活性を増加させ、エネルギー消費の増強に起因して、食餌性肥満に耐性がある。以前の研究は、骨格筋のＵＣＰ３のＺＡＧ誘発性の発現におけるＭＡＰＫの役割を示唆した。ＥＲＫ活性は、ＨＳＬのセリン残基、例えばＳｅｒ−６００、タンパク質キナーゼＡによってリン酸化された部位の１つをリン酸化することによって、脂肪細胞における脂肪分解を調節し得る。
【００８４】
本明細書に提示される結果は、ラットへのＺＡＧ投与が、ラットにおけるＡＴＧＬおよびＨＳＬの発現も増加させることを示す。ＡＴＧＬノックアウトマウスは、正常なインスリン感受性を示したが、大きな脂肪沈着を有し、イソプロテレノールに応答して、ＷＡＴからのＮＥＦＡ放出を減少させるため、ＡＴＧＬは肥満の過剰な脂肪貯蔵において重要であり得る。対照的に、ＨＳＬヌルマウスは、通常の食事を与えられると、野生型動物に類似する体重を有した。しかしながら、ＡＴＧＬおよびＨＳＬの両方の発現は、インスリン感受性状態と比較して、肥満のインスリン抵抗状態のヒトＷＡＴにおいて低減し、体重減少はｍＲＮＡおよびタンパク質値も減少させた。
【００８５】
エネルギーシンクなしで遊離ＮＥＦＡは、脂肪細胞内のトリグリセリドに再合成されるため、脂肪分解の刺激単独では、体脂肪貯蔵を消耗しない。体脂肪を低減するために、ＺＡＧは、血漿グリセロールの増加によって示されるように、脂肪分解を高めるだけでなく、トリグリセリドおよびＮＥＦＡの血漿値の減少によって示されるように、脂質利用も増加する。ＺＡＧで処置されたラットの体温が０．４℃上昇したことから明らかなように、このエネルギーは、熱に向けられる。エネルギー利用の増加は、ＵＣＰ１の発現の増加から生じる可能性が最も高く、ＺＡＧの投与後のＢＡＴおよびＷＡＴ両方において示された。ＵＣＰ１の発現の増加は、ＢＡＴにおける熱発生の一次基質であるため、ＮＥＦＡの血漿レベルを減少させると予想される。ＢＡＴは、グルコース利用のための高い能力も有し、これは血糖の減少を部分的に説明し得る。さらに、骨格筋およびＷＡＴにおいてＧＬＵＴ４の発現が増加し、インスリンの存在下で、グルコースの取り込みの増加を媒介する助けとなる。ＺＡＧで処置されたマウスにおいて、脳、心臓、ＢＡＴ、および腓腹筋によるグルコース利用／参加が増加し、Ｄ−［Ｕ−１４Ｃ］グルコースならびに［１４Ｃカルボキシ］トリオレイン（図２４）からの１４ＣＯ２の産生も増加した。ＺＡＧ投与後、ｏｂ／ｏｂマウスのＢＡＴによる酸素の取り込みも３倍増加した。
【００８６】
ＺＡＧは、精巣上体脂肪細胞におけるＨＳＬの発現を増加させたが、皮下または内臓脂肪細胞のいずれかにおいて増加はなかった。同様の状況は、脂肪トリグリセリドリパーゼ（ＡＴＧＬ）の発現とともに観測された。ＨＳＬおよびＡＴＧＬの発現は、ＥＲＫの活性（リン酸）形態の発現と相関した。脂肪分解の増加と相関する精巣上体脂肪細胞におけるＨＳＬおよびＡＴＧＬの発現は、β３作動薬、ＢＲＬ３７３４４に応答する。この結果は、ＺＡＧがβ３作動薬と相乗的に作用し得ることを示唆し、また抗ＺＡＧ抗体がβ３拮抗薬と相乗的に作用し得ることを示唆する。
【００８７】
本明細書で使用する、用語「作動薬」は、完全または部分的薬理反応を誘発することができる薬剤または類似体を指す。例えば、作動薬は、生産的に受容体に結合し、それに対する生理的反応を模倣し得る。本明細書で使用する、用語「拮抗薬」は、受容体に結合する際に生物学的反応事態を誘発しないが、作動薬媒介性反応を遮断または抑制する、薬剤または類似体を指す。本発明の方法および製剤は、抗ＺＡＧ抗体、またはその機能的断片を、例えばＢＲＬ３７３４４であるが、それに限定されないβ３拮抗薬、またはβ３作動薬と併せて投与することを含んでよい。
【００８８】
本発明において使用され得るβ３作動薬の例には、これらに限定されないが、エピネフリン（アドレナリン）、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、［（シアノ）ピンドロール］、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、３'−ヨードトリメトキノロール、３'，５'−ヨードトリメトキノロール、アミベグロン、ソラベグロン、ネビボロール、ＡＤ−９６７７、ＡＪ−９６７７、ＡＺ−００２、ＣＧＰ−１２１７７、ＣＬ−３１６２４３、ＣＬ−３１７４１３、ＢＲＬ−３７３４４、ＢＲＬ−３５１３５、ＢＲＬ−２６８３０、ＢＲＬ−２８４１０、ＢＲＬ−３３７２５、ＢＲＬ−３７３４４、ＢＲＬ−３５１１３、ＢＭＳ−１９４４４９、ＢＭＳ−１９６０８５、ＢＭＳ−２０１６２０、ＢＭＳ−２１０２８５、ＢＭＳ−１８７２５７、ＢＭＳ−１８７４１３、ＢＭＳ−１８７４１３のＳＯ３ＨのＣＯＮＨ２置換、ＢＭＳ−１８１４１３のラセミ化合物、ＣＧＰ−２０７１２Ａ、ＣＧＰ−１２１７７、ＣＰ−１１４２７１、ＣＰ−３３１６７９、ＣＰ−３３１６８４、ＣＰ−２０９１２９、ＦＲ−１６５９１４、ＦＲ−１４９１７５、ＩＣＩ−１１８５５１、ＩＣＩ−２０１６５１、ＩＣＩ−１９８１５７、ＩＣＩ−Ｄ７１１４、ＬＹ−３７７６０４、ＬＹ−３６８８４２、ＫＴＯ−７９２４、ＬＹ−３６２８８４、ＬＹ−７５０３５５、ＬＹ−７４９３７２、ＬＹ−７９７７１、ＬＹ−１０４１１９、Ｌ−７７１０４７、Ｌ−７５５５０７、Ｌ−７４９３７２、Ｌ−７５０３５５、Ｌ−７６００８７、Ｌ−７６６８９２、Ｌ−７４６６４６、Ｌ−７５７７９３、Ｌ−７７０６４４、Ｌ−７６００８１、Ｌ−７９６５６８、Ｌ−７４８３２８、Ｌ−７４８３３７、Ｒｏ−１６−８７１４、Ｒｏ−４０−２１４８、（−）−ＲＯ−３６３、ＳＢ−２１５６９１、ＳＢ−２２０６４８、ＳＢ−２２６５５２、ＳＢ−２２９４３２、ＳＢ−２５１０２３、ＳＢ−２３６９２３、ＳＢ−２４６９８２、ＳＲ−５８８９４Ａ、ＳＲ−５８６１１、ＳＲ−５８８７８、ＳＲ−５９０６２、ＳＭ−１１０４４、ＳＭ−３５０３００、ＺＤ−７１１４、ＺＤ−２０７９、ＺＤ−９９６９、ＺＭ−２１５００１、およびＺＭ−２１５９６７が挙げられる。
【００８９】
本発明において使用され得るβ−ＡＲ拮抗薬の例には、これらに限定されないが、プロプラノロール、（−）−プロプラノロール、（＋）−プロプラノロール、プラクトロール、（−）−プラクトロール、（＋）−プラクトロール、ＣＧＰ−２０７１２Ａ、ＩＣＩ−１１８５５１、（−）−ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールが挙げられる。
【００９０】
ＺＡＧによるラット脂肪細胞における脂肪分解の誘発は、β３−ＡＲを通して媒介されることが示唆され、脂肪組織および除脂肪体重に対するＺＡＧの効果もまた、β３−ＡＲを刺激する能力に起因し得る。ＺＡＧによるＵＣＰ１発現の誘発は、β３−ＡＲとの相互作用を通して媒介されることが示された。ＷＡＴにおけるＵＣＰ１の発現の増加は、β３−ＡＲ作動薬ＣＬ３１６，２４３によって生じるとき、茶色脂肪細胞前駆体のリモデリングによるβ３−ＡＲの効果でもあり得る。ノックアウトマウスを使用して、β３−ＡＲ刺激の抗肥満効果は、主にＢＡＴにおけるＵＣＰ１に主に起因し、ＷＡＴから放出されたＮＥＦＡのＵＣＰ１依存性分解によるＵＣＰ２およびＵＣＰ３によるところは少ない。動物の末梢組織へのグルコース取り込みは、寒冷暴露によって刺激され、この効果もまたβ３−ＡＲによって媒介される。しかしながら、β３−ＡＲは、ヒト皮下腹部脂肪組織内の脂肪分解および栄養血流の管理において、β１およびβ２−ＡＲサブタイプよりも目立たない役割を果たすため、β３−ＡＲを標的とすることは、齧歯類よりもヒトにおいてより困難であった。しかしながら、このβ３−ＡＲ作動薬に関わらず、ＣＬ３１６，２４３は、健康な若い雄候補対象において脂肪酸化の増加を示した。これは、ＢＡＴから得た血漿膜におけるβ３−ＡＲの数を増加させるβ−アドレナリン受容体の能力に起因し得る。
【００９１】
したがって、別の態様において、本発明は、悪液質または筋肉消耗と関連付けられる疾患に起因する体重減少の低減をもたらすように対象を治療する方法を提供する。この方法は、治療上有効な薬用量のβ３拮抗薬を、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドに結合する抗体、またはその断片と併せて、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。別の実施形態において、治療上有効な薬用量のβ３−ＡＲ拮抗薬を、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドに結合する抗体、またはその断片と併せて、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。
【００９２】
脂肪組織におけるＺＡＧ発現は、パラクリン様式で作用することによって、循環するＺＡＧよりも局所的により重要であり得る。したがって、ヒトでは、内臓脂肪および皮下脂肪におけるＺＡＧのｍＲＮＡ値は、ＢＭＩと負の相関を持つが、ＥＬＩＳＡによって決定される脂肪量およびインスリン抵抗、血清値、は、脂肪症のパラメータ（ＢＭＩおよび腰囲）およびインスリン抵抗と正に相関した。したがって、ＺＡＧが腓腹筋、ＷＡＴ、およびＢＡＴにおいてそれ自体の発現を誘発する能力は、脂肪分解およびエネルギー利用を増加させる能力に重要であり得る。
【００９３】
発明の様々な実施形態において、ＺＡＧ、β３−ＡＲ作動薬、およびβ−ＡＲ拮抗薬を複合する目的は、対象の治療目的および状態に応じて異なる。
【００９４】
β３−ＡＲ機構を活性化して、所望の脂肪分解、グルコース消費、インスリン感作、タンパク質合成、エネルギー消費の増加等を達成することが望ましい一実施形態では、肥満または糖尿病の治療を伴う。この状況において、一部の対象では、投与されたＺＡＧ、またはどちらかといえばβ−３ＡＲ作動薬が、β−１ＡＲまたはβ−２ＡＲの１つまたは複数において、いくらかの望ましくない活性を呈し、副作用または所望の有効性の消失をもたらすことが観測され得る。次いで、この状況は、β−１ＡＲまたはβ−２ＡＲにおける望ましくない活性を防ぐように、「古典β遮断薬」と称されることもあるβ−ＡＲ拮抗薬の追加投与を必要とする。これらのβ−ＡＲ拮抗薬を選択して、必須ではないが、好ましくは、副作用または有効性の軽減と関連付けられる、受容体サブタイプ（β−１ＡＲまたはβ−２ＡＲの１つ）を遮断する。
【００９５】
別の実施形態は、悪液質の治療を伴う。異なる疾患によって引き起こされる悪液質において、および所与の疾患を有する対象の集団内で、異なる程度の悪液質が異なる比率の筋肉減少および脂肪減少とともに観測される。
【００９６】
別の態様において、悪液質対象は、筋肉量の減少を被っているが、脂肪の減少はないか、またはある程度の脂肪減少を伴う場合がある。筋肉減少は、典型的に、より臨床的に望ましくない転帰であり、ＺＡＧを利用して、ＺＡＧで処置された悪液質動物において起こる筋肉構築の一部を引き起こす一方で、ある程度の脂肪減少を引き起こすことが所望され得る。したがって、そのような対象をＺＡＧ、β−３ＡＲ作動薬、および任意に上述のβ−ＡＲ拮抗薬で処置することは、筋肉量を増加させ得る。 
【００９７】
別の態様において、悪液質対象は、脂肪量の減少を被っているが、筋肉の減少はないか、またはある程度の筋肉減少を伴う場合がある。この場合、臨床的観点から、脂肪の減少を遮断することが望ましい場合があるため、ＺＡＧによって引き起こされる作用を遮断し、したがってβ−３ＡＲの下流作用を減少させるために、ＺＡＧに特異的な抗体の投与が使用される。
【００９８】
別の実施形態において、脂肪量が対象の正常分布に不均衡であり、脂肪量の減少が所望される、リポジストロフィーの治療を伴う。この場合、最初の状況に類似する理由から、ＺＡＧ、β−３ＡＲ作動薬、およびβ−ＡＲ拮抗薬のうちの１つまたは複数の投与が所望される。
【００９９】
すべての方法は、１つまたは複数の付属材料で構成される、製薬上許容される担体と活性成分とを関連付けるステップをさらに含んでよい。そのようにして、本発明は、悪液質に関連する症状を有する対象を治療する際に使用するための医薬組成物も提供する。一実施形態において、組成物は、治療上有効な薬用量の上述の抗ＺＡＧ抗体、またはその機能的断片を、製薬上許容される担体、賦形剤の希釈液とともに、活性組成として含む。
【０１００】
対象に投与するための組成物を製剤するための製薬上許容される担体は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、水等の水溶液、生理活性生理食塩水、または他の溶媒もしくは媒体（例えば、グリコール、グリセロール、オリーブオイル等の油、または注射可能な有機エステル）等の水溶液を含む。製薬上許容される担体は、例えば、複合体の吸収を安定化または増加させるように作用する、生理学的に許容される化合物を含有し得る。そのような生理学的に許容される化合物には、例えば、炭水化物（グルコース、スクロース、またはデキストラン等）、抗酸化剤（アスコルビン酸またはグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定化剤もしくは賦形剤が挙げられる。さらに、そのような生理学的に許容される化合物は、担体が所望の投与経路（例えば、静脈内、皮下、経口等）と適合することを条件として、さらに塩形態であってよい（すなわち、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、ＮＨ４＋等の対イオンと均衡される）。当業者であれば、生理学的に許容される化合物を含む、製薬上許容される担体の選択は、例えば、治療薬の物理化学的特徴、および組成物の投与経路（例えば、経口または静脈内等の非経口、および注射、挿管、または当該技術分野において知られる他のそのような方法）に依存することがわかるであろう。医薬組成物は、診断試薬、付加的栄養物質、毒素、または治療薬、例えば、癌の化学療法薬および／またはビタミン等の第２の（またはそれ以上の）化合物を含有することもできる。
【０１０１】
本発明の製剤は、１つまたは複数の賦形剤を含んでもよい。製剤に含まれ得る製薬上許容される賦形剤は、クエン酸緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、および重炭酸緩衝液、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質等の干渉液、血清アルブミン、コラーゲン、およびゼラチン等のタンパク質、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ、および塩化ナトリウム等の塩、リポソーム、ポリビニルピロリドン、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロール等の糖、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００、ＰＥＧ−６０００）、グリセロール、およびグリシンまたは他のアミノ酸である。製剤とともに使用するための緩衝液系には、クエン酸塩、酢酸塩、重炭酸塩、およびリン酸塩緩衝液が挙げられる。
【０１０２】
経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル、カシェット、錠剤、またはトローチ等の個別の単位として提示されてよく、それぞれ既定量の活性化合物を粉末または顆粒の形態で、またはシロップ、エリキシル、ドラフトの乳液等の水溶液または非水溶液中の活性化合物の懸濁液として含有する。
【０１０３】
栄養補助製剤は、健康および／または体重減少を促進することが知られている、任意の数の追加材料をさらに含むことができる。例示の追加材料には、これらに限定されないが、低血糖材料、例えば、炭水化物源、タンパク質源、および食物繊維源が挙げられる。そのような低血糖材料は、食欲を減退させ、１日のカロリー摂取の減少をもたらすことが示された。
【０１０４】
栄養補助剤の重要なマクロ栄養素は、満腹および後次の体重減少に最大の影響を有するため、炭水化物である。本明細書で使用するとき、飽満とは、食事間の満腹感を指し、満腹は、食事の進行中に発展し、食事の終了に寄与する満腹感を指す。低血糖インデックスの食事は、血糖およびインスリンのわずかな上昇、ならびにより高いグルカゴン濃度を引き起こして、飽満を促進し、高血糖インデックスの炭水化物よりも消化および吸収に時間がかかるため、より高い血糖インデックスの炭水化物を含有する食品よりも良好に体重増加を防ぐ。
【０１０５】
「血糖インデックス」は、炭水化物を含有する食品の摂取後の血糖における後次上昇を予測するシステムである（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ｃｈ．７０：１２５９−８６（１９９４）、Ｗｏｌｅｖｅｒ，Ｔ．Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，５４：８４６−５４（１９９１）、Ｗｏｌｅｖｅｒ，Ｔ．Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂ．Ｃａｒｅ，１２：１２６−３２（１９９０））。血糖インデックスは、食後の炭水化物の吸収率を特性化する。白いパンまたはグルコースのいずれかである、試験食品から得た５０ｇの炭水化物の消費後２時間の血糖反応下の面積を標準曲線下の面積で割ったものとして定義される。血糖インデックス炭水化物は、食品の消化後２時間以内に最高ピーク循環グルコースを有する。逆に、低血糖インデックス炭水化物は、より低いピークグルコースおよびより小さい曲線下面積をもたらす。
【０１０６】
多くの要因が、食品の血糖インデックスを決定する。これらには、炭水化の種類、線維、タンパク質、および脂肪含有物、ならびに調製方法（過度に調理した食品はより高い反応を引き起こす）。一般に、高血糖インデックス炭水化物は、高度に精製され、ラクトース、スクロース、またはフルクトースと比較して、比較的多量のグルコースまたはスターチを有する。またそれらは、可溶性繊維において低い。繊維の包含は、繊維が胃内の食物でゲルを形成することによって、体重減少を促進する方法に起因して重要である。このゲル化作用は、胃内容排出率、したがって飽満を促進する消化率を減少させる。飽満に影響する他の要因は、炭水化物の量、炭水化物の複雑性、および炭水化物と同時に食べられる食品（例えば、繊維、タンパク質、脂肪）である（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｄ．Ｓ．，Ｊ  Ｎｕｔｒ．，１３０：２８０Ｓ−３Ｓ（２０００）、Ｗｏｌｅｖｅｒ，Ｔ．Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，５４：８４６−５４（１９９１）、Ｗｏｌｅｖｅｒ，Ｔ．Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂ．Ｃａｒｅ，１２：１２６−３２（１９９０））。パンおよびジャガイモは、豆よりも血糖を上昇させる。炭水化物と同時に摂取される、炭水化物を含まないか、または消化不可能な炭水化物を含む他の食品（例えば、脂肪、繊維、およびタンパク質）は、食後の血糖およびインスリン値を低減する（Ｗｏｌｅｖｅｒ，Ｔ．Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，５４：８４６−５４（１９９１））。
【０１０７】
低血糖インデックスの炭水化物源は、単一の炭水化物または複合によって提供され得る。炭水化物源は、繊維源をさらに提供することができ、天然甘味料、フルクトース、大麦、コンニャクマンナン、オオバコ、およびそれらの組み合わせであってよい。タンパク質源は、高い生物価であり、以下のうちの少なくとも１つから選択される（乳清タンパク質濃度、カゼイン、大豆、ミルク、卵、およびそれらの複合）。さらに、栄養補助食品は、ミクロ栄養素、ビタミン、ミネラル、栄養補助食品（例えば、ハーブ）、栄養素、乳化剤、香味剤、および食用化合物を含んでよい。
【０１０８】
一実施形態において、栄養補助製剤は、栄養補助製剤を甘くするための炭水化物をさらに含んでよい。栄養補助製剤を甘くするために有用な例示の炭水化物には、これらに限定されないが、フルクトース、蒸発サトウキビジュース、イヌリン、アガヴェ、ハチミツ、メープルシロップ、玄米シロップ、麦芽シロップ、デーツ糖、果汁濃縮液、および混合果汁濃縮液が挙げられる。
【０１０９】
本発明における使用に適切であり得る食物繊維には、これらに限定されないが、セルロース、シード、半セルロース（例えば、ブラン、ホールグレイン）、ポリフルクトース（例えば、イヌリンおよびオリゴフルクタン）、ポリサッカリドガム（例えば、ラーチアラビノガラクタン）、オートミール、バーリー、ペクチン、リグニン、難消化性デンプンが挙げられる。適切な繊維源の例には、これらに限定されないが、麦ブラン、セルロース、コーンブラン、グアー、ペクチン、およびサイリウムが挙げられる。
【０１１０】
タンパク質源は、栄養製剤において利用される任意の適切なタンパク質であってよく、乳清タンパク質濃縮、乳清粉末、卵、大豆タンパク質、大豆タンパク質単離体、カゼイン酸塩（例えば、カゼインナトリウム、カゼインカルシウムナトリウム、カゼインカルシウム、およびカゼインカリウム）、動物および植物タンパク質、ならびにそれらの混合物を含み得る。タンパク質源を選択するとき、タンパク質の生物価を最初に考慮すべきであり、最高の才物値がカゼイン酸、乳清、ラクトアルブミン、大豆、脱ラクトース乳固形分、卵アルブミン、および全卵タンパク質において見出される。これらのタンパク質は、高い生物価を有し、つまり高比率の必須アミノ酸を有する。
【０１１１】
栄養補助剤は、他のビタミン、ミネラル、抗酸化剤、繊維（例えば、イチョウ、朝鮮人参）、および他の栄養補助剤のうちの１つまたは組み合わせを含有することもできる。これらの材料の１つまたはいくつかを選択することは、製剤設計、消費者、および末端ユーザの選好の問題である。本発明の栄養補助剤に添加されるこれらの材料の量は、当業者には容易にわかり、そのような量の指針は、小児および成人のＲＤＡおよびＤＲＩ（食事基準摂取量）用量によって提供され得る。添加され得るビタミンおよびミネラルには、これらに限定されないが、リン酸カルシウムまたは酢酸塩、三塩基、リン酸カリウム、二塩基、硫酸マグネシウムまたはオキシド、塩（塩酸ナトリウム）、塩酸カリウムまたは酢酸塩、アスコルビン酸、オルトリン酸鉄、ナイアシンアミド、硝酸亜鉛またはオキシド、パントテン酸カルシウム、グルコン酸銅、リボフラビン、β−カロテン、塩酸ピリドキシン、一硝酸チアミン、葉酸、ビオチン、塩化クロミウムまたはピコリン酸塩、ヨウ化カリウム、セレニウム、セレン酸ナトリウム、モリブデンさんナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３、シアノコバラミン、亜セレン酸ナトリウム、硫酸銅、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＢ６およびその塩酸塩、ビタミンＣ、イノシトール、ビタミンＢ１２、ヨウ化カリウムが挙げられる。
【０１１２】
単位供給当たりの他の材料の量は、設計の問題であり、患者に連日投与される栄養補助剤の単位供給の総数に依存する。他の材料の総量は、部分的に、患者の状態にも依存する。好ましくは、他の材料の量は、ＲＤＡまたはＤＲＩ量の分数または倍数である。例えば、栄養補助製剤は、単位用量当たりのビタミンおよびミネラルの５０％ＲＤＩ（１日の基準摂取量）を含み、患者は１日当たり２単位を消費する。
【０１１３】
香味剤、着色剤、スパイス、ナッツ等を生成物に組み込むことができる。香味剤は、香味付けされた抽出物、揮発油、チョコレート味（例えば、非カフェインココアもしくはチョコレート、キャロブ等のチョコレート代用物）、ピーナッツバター味、クッキークラム、クリスプライス、バニラまたは任意の市販の香味剤の形態であり得る。香味剤は、混合されたトコフェロールで保護され得る。有用な香味剤の例には、これらに限定されないが、純粋なアニス抽出物、模造バナナ抽出物、模造チェリー抽出物、チョコレート抽出物、純粋なレモン抽出物、純粋なオレンジ抽出物、純粋なペパーミント抽出物、模造パイナップル抽出物、模造ラム抽出物、模造イチゴ抽出物、もしくは純粋なバニラ抽出物、または揮発油（例えば、ヤシ油、ベイ油、ベルガモット油、シーダー油、チェリー油、クルミ油、シナモン油、クローブ油、またはペパーミント油、ピーナッツ油、チョコレート香味剤、バニラクッキークラム、バタースコッチもしくはトフィーが挙げられる。好適な実施形態において、栄養補助製剤は、ベリーまたは他の果実フレーバーを含有する。食物組成物は、例えば、バーとして製造される場合、ヨーグルトコーティングでさらにコーティングされてよい。
【０１１４】
乳化剤は、最終製品の安定性のために添加されてよい。適切な乳化剤の例には、これらに限定されないが、レシチン（例えば、卵または大豆由来）、ならびに／またはモノグリセリドおよびジグリセリドが挙げられる。他の乳化剤は、当業者に容易に明らかであり、適切な乳化剤の選択は、部分的に製剤および最終製品に依存する。 
【０１１５】
製品の貯蔵寿命を延長するために、保存剤が栄養補助剤に添加されてもよい。好ましくは、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸ナトリウム、安息香酸カリウム、安息香酸ナトリウム、または二ナトリウムカルシウムＥＤＴＡ等の保存剤が使用される。 
【０１１６】
上述の炭水化物に加えて、栄養補助食品は、人工甘味料、例えば、サッカリド、シクラメート、アスパルタミン、アスパルテーム、アセスルファームＫ、および／またはソルビトールを含有し得る。そのような人工甘味料は、栄養補助食品が過体重または肥満の個人、または高血糖になりやすいＩＩ型糖尿病の個人を対象とする場合に望ましいことがある。
【０１１７】
本発明の栄養補助食品は、製薬上許容される形態のビタミン、ミネラル、および上述される他の栄養素（それらの塩を含む）を使用して製剤されてよい。それらは、任意で、水、ミルク、ジュース、ソーダ、スターチ、植物油、塩溶液、ヒドロキシメチルセルロース、炭水化物等であるが、それらに限定されない生理学的に許容される担体を含む、カプセル、錠剤、粉末、懸濁液、ゲル、または液体に製剤されてよい。一実施形態において、栄養補助食品は、例えば、消費可能な液体（ミルク、ジュース、ソーダ、水等）と混合するための粉末、または他の栄養液または食品に混合するための消費可能なゲルもしくはシロップとして製剤されてよい。粉末形態は、特に消費者の興味をそそり、投与および日常レジメンに組み込むことが容易であるため、患者コンプライアンスの機会を給える。本発明の栄養補助食品は、他の食品または液体とともに製剤されて、前処理した補助食品（例えば、１回分の朝食バー、エナジーバー、パン、クッキー、ブラウニー、クラッカー、シリアル、ケーキ、または飲料等）を提供し得る。
【０１１８】
したがって、栄養補助製剤は、栄養補助食品として、または食品等の消費可能な担体に対する添加物として投与されてよい。組成物は、後に調理されるか、または焼かれる食品に組み込まれてもよい。組成物の成分は、非酸化状態を維持するために構造的に安定し、焼くかまたは調理するために必要な温度で熱安定性である。
【０１１９】
そのような飲料を製造するために、材料を乾燥させ、水または上述される他の消費可能な液体に容易に溶解できるようにする。飲料は、少なくとも食事の１時間半前に消費される場合、満腹感を助ける能力に起因して、好ましい栄養補助形態である。
【０１２０】
そのような食品バーを製造するために、ミキサー内で乾燥材料を液体材料に添加し、生地段階に到達するまで混合して、生地を押出機に入れて押し出し、押し出された生地を適切な長さにカットして、製品を冷蔵する。
【０１２１】
他の食品または飲料を製造するために、本発明の栄養補助食品を含む材料を伝統的な製剤に添加することができるか、またはそれらを伝統的な材料の代わりに使用することができる。食品製造における当業者であれば、本発明の目的を考慮して、適切な食品／飲料を設計することができるであろう。
【０１２２】
栄養補助食品は、プディング、砂糖菓子（すなわち、飴）、栄養飲料、アイスクリーム、冷凍菓子およびノベルティ、または焼かれるか、もしくは焼かれていない押出食品（例えば、バー）等の多様な形態で製造することができる。一実施形態において、栄養補助食品は、飲料用の粉末または焼かれていない押出栄養バーの形態である。
【０１２３】
一実施形態において、消費可能な担体は、肉製品、例えば、天然または培養肉である。培養肉としても知られるインビトロ生成肉は、完全な生きた動物の一部ではない動物の肉である。インビトロ生成肉を開発する過程は、筋肉細胞を採取し、細胞が肉の大部分に成長するのを助けるタンパク質を適用することを伴う。初期細胞が得られると、ヨーグルト培養の産生と同様に、追加の動物は必要とされない。一実施形態において、インビトロ生成肉の産生において、構造化筋肉の産生は、弛緩筋肉細胞よりもはるかに困難である。筋肉は、筋線維、複数核を有する長細胞から成る。そのような細胞は、それ自体によって増殖しないが、前駆体細胞が溶解すると生じる。前駆体細胞は、胚性幹細胞または衛星細胞、筋組織内の特化された幹細胞であり得る。理論的に、それらをバイオリアクターにおいて培養した後、それらを溶解することは比較的単純である。しかしながら、実際の筋肉の増殖の場合、細胞は、「その場で」増殖しなければならず、増殖細胞付近に栄養および酸素を送達するとともに、老廃物を除去するための血液供給に類似する還流システムを必要とする。さらに、脂肪細胞等の他の細胞型は増殖する必要がなく、化学伝達物質は、構造に関する手掛かりを増殖組織に提供する必要がある。最後に、筋肉組織は、適切に発育するために、物理的に伸長されるか、または「運動」する必要がある（例えば、米国特許第６，８３５，３９０号、および公開国際出願第ＷＯ９９／３１２２２を参照されたい（いずれも参照により本明細書に援用される））。さらに別の実施形態において、本発明は、組み換えＺＡＧの付加が不要であるように、十分な量のＺＡＧを発現させるように設計される培養肉を含む。
【０１２４】
材料は、単一製剤で投与され得るか、または別個に投与することができる。例えば、苦味のある材料は、栄養組成自体（例えば、粉末またはバー）に組み込むよりも、その味を隠す形態（例えば、カプセルまたはピル形態）で投与することが望ましい場合がある。したがって、本発明は、発明の栄養組成の材料のうちの１つまたは複数を充填した１つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。任意に、そのような容器と、医薬品または栄養補助食品の製造、使用、または販売に関する政府機関の規定に基づく形態における通知を関連付けることができ、この通知は、ヒト投与に対する製造、使用、または販売に関する機関の承認を範囲する。パックまたはキットには、投与の形態、投与の順序（例えば、別個、連続、または同時）等に関する情報をラベル付けすることができる。パックまたはキットは、患者に治療を受けるように思い出させるための手段も含んでよい。パックまたはキットは、複合療法の単会投与であり得るか、または複数の単位用量であり得る。特に、薬剤は、別個であるか、任意の組み合わせで一緒に混合されるか、製剤または錠剤で提示され得る。ブリスターパックまたは他の分注手段に組み立てられた薬剤が好適である。
【０１２５】
一実施形態において、製剤は、約１．０ｍｇ〜１０００ｍｇのＺＡＧを含む。別の実施形態において、製剤は、約１．０ｍｇ〜約５００ｍｇのＺＡＧを含む。別の実施形態において、製剤は、約１．０ｍｇ〜約１００ｍｇのＺＡＧを含む。別の実施形態において、製剤は、約１．０ｍｇ〜約５０ｍｇのＺＡＧを含む。別の実施形態において、製剤は、約１．０ｍｇ〜約１０ｍｇのＺＡＧを含む。別の実施形態において、製剤は、約５．０ｍｇのＺＡＧを含む。
【０１２６】
したがって、別の態様において、本発明は、本明細書に定義されるように、悪液質または筋肉消耗疾患と関連付けられる疾患に関連する症状および／または状態を治療するためのヒト薬剤において有用な薬剤を製造するための、抗ＺＡＧ抗体またはその機能的断片を提供する。
【０１２７】
一実施形態において、本発明の製剤は、経口投与される。そのような実施形態において、製剤は、任意の他の投与経路として少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％有効である。
【０１２８】
本発明の方法を実践する際に投与される製剤の総量は、単回投与として、ボーラスとして、または比較的短期間の摂取によって対象に投与することができるか、または複数容量が長期間にわたって投与される（例えば、１日１回、１日２回等）、分画治療プロトコルを使用して投与され得る。当業者であれば、製剤の量が、対象の年齢および一般健康状態、ならびに投与経路および投与される処置数を含む多くの要素に依存することがわかるであろう。これらの要素に照らして、熟練者は、必要に応じて特定用量を調整する。一般に、医薬組成物の製剤ならびに投与経路および頻度は、第Ｉ相および第ＩＩ相臨床試験を使用して決定される。
【０１２９】
したがって、所定の実施形態において、本発明の方法は、間隔治療レジメンを含み得る。ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＺＡＧの長期連日投与は、連続的な体重減少をもたらすことが観測された。そのようにして、一実施形態において、ＺＡＧまたは抗ＺＡＧ抗体の単独治療または１もしくは複数のβ−ＡＲ拮抗薬もしくはβ３−ＡＲ作動薬との併用治療は、１日おきに投与される。別の実施形態において、治療は２日おきに投与される。別の実施形態において、治療は３日おきに投与される。別の実施形態において、治療は４日おきに投与される。
【実施例】
【０１３０】
以下の実施例は、本発明の利点および特徴をさらに示すために提供されるが、本発明の範囲を制限するものではない。それらは使用され得るものの典型であるが、当業者に知られている他の手順、方法、または技術も代替として使用されてよい。
【０１３１】
実施例１
亜鉛−α２−糖タンパク質は高血糖を減衰させる
亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）が肥満および高血糖を減衰させる能力を評価するために、ｏｂ／ｏｂマウスに投与したところ、体重減少を誘発し、体温が上昇した（エネルギー消費の増加を示唆する）。茶色脂肪組織における非共役タンパク質−１および−３の発現が増加する一方で、脂肪分解の増加を示す、グリセロールの増加にも関わらず、グルコース、トリグリセリド、および非エステル化脂肪酸の血清レベルが減少した。血漿インスリンは減少し、静脈内グルコースに対する応答が改善するとともに、脂肪細胞および骨格筋へのグルコースの取り込みが増加した。精巣上体脂肪細胞におけるホルモン感受性リパーゼの発現が増加した。タンパク質合成の増加および分解の減少に起因して、骨格筋量が増加した。これは、ＺＡＧが高血糖の治療において有効であり得ることを示唆する。
【０１３２】
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびフリースタイル培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）から購入し、ウシ胎仔血清は、Ｂｉｏｓｅｒａ（Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）から購入した。２−［１−１４Ｃ］デオキシ−Ｄ−グルコース（ｓｐ．ａｃｔ．１．８５ＧＢｑ  ｍｍｏｌ−１）およびＬ−［２，６−３Ｈ］フェニルアラニン（ｓｐ．ａｃｔ．３７Ｂｑ  ｍｍｏｌ−１）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃａｒｄｉｆｆ，ＵＫ）から購入した。リン酸（Ｔｈｒ−２０２）および全ＥＲＫ１、全ｐ３８ＭＡＰＫ、リン酸ＨＳＬ（Ｓｅｒ−５５２）、グルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）、脂肪トリグリセリドリパーゼ、ホルモン感受性リパーゼ、およびリン酸ＰＬＡ２（Ｓｅｒ−５０５）ならびにヒトＡＴＧＬに対するウサギポリクローナル抗体は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入した。完全長ヒトＺＡＧに対するマウスモノクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入し、ミオシン重鎖ＩＩ型に対するマウスモノクローナル抗体は、Ｎｏｖａｃａｓｔｒａ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを介して、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，ＵＫ）から購入した。２０Ｓプロテアソームα−サブユニットおよびｐ４２に対するマウスモノクローナル抗体は、Ａｆｆｉｎｉｔｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｅｘｅｔｅｒ，ＵＫ）から購入した。リン酸（Ｔｈｒ−１８０／Ｔｙｒ−１８２）ｐ３８ＭＡＰＫに対するマウスモノクローナル抗体、全およびリン酸（Ｔｈｒ−４５１）ＰＫＲに対するウサギポリクローナル抗血清、全ｅＩＦ２αに対するリン酸（Ｓｅｒ−１６２）ｅＩＦ２αは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈｅｒｔｓ，ＵＫ）から購入した。ＵＣＰ１、ＵＣＰ３、および全ＰＫＲに対するポリクローナルウサギ抗体、ならびにＰＨＯＳＰＨＯＳＡＦＥ（商標）抽出試薬は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓを介して、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）から購入した。ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ウサギ抗体およびウサギ抗マウス抗体は、Ｄａｋｏ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入した。マウスβ−アクチンに対するポリクローナルウサギ抗体およびトリグリセリドアッセイキットは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）から購入した。Ｈｙｂｏｎｄ  Ａニトロセルロース膜および強化化学発光（ＥＣＬ）開発キットは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）から購入した。ＮＥＦＡのＷＡＫＯ色分析キットは、Ａｌｐｈａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から購入し、マウスインスリンＥＬＩＳＡキットは、ＤＲＧ（Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。グルコース測定は、Ｂｏｏｔｓ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）血漿グルコースキットを使用して行った。
【０１３３】
組み換えＺＡＧの産生
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、発現ベクトルｐｃＤＮＡ３．１において、完全長ヒトＺＡＧ  ｃＤＮＡで形質転換され、空気中５％ＣＯ２の雰囲気下３７℃で、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地内で維持された。採取されたＺＡＧを培地に分泌し、最大タンパク質値（１６μｇｍＬ−１）を培養の１４日後に得た。ＺＡＧを精製するために、培地（２００ｍＬ）を７００ｇで１５分間遠心分離して細胞を除去し、１０ｋＤａカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離フィルタを使用して、体積１ｍＬの滅菌ＰＢＳに濃縮した。濃度（約２ｍｇタンパク質）を、２０ｍＬの１０ｍＭトリス（ｐＨ８．８）に懸濁された２ｇ  ＤＥＡＥセルロースに添加し、２時間４℃で攪拌した。ＤＥＡＥセルロースはＺＡＧに結合し、遠心分離（１５００ｇで１５分間）によって沈降させて、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＬ１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）とともに、３０分間４℃で攪拌してＺＡＧを溶出した。溶出液を洗浄し、Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルタを使用して、滅菌ＰＢＳ中体積１ｍＬに濃縮した。精製されたＺＡＧは、ＬＡＬ  Ｐｙｒｏｇｅｎｔ単一試験キット（Ｌｏｎｚａ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）を用いて決定されるように、内毒素を含まない。
【０１３４】
細胞培養およびＺＡＧの精製
白色脂肪細胞の単一セル懸濁液を、前述のように９５％酸素：５％ＣＯ２の雰囲気下、１．５ｍｇｍＬ−１コラゲナーゼおよび４％ウシ血清アルブミンを含有するＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ生物源炭酸塩緩衝液中、３７℃で２時間培養することによって、粉砕した脂肪沈着物から調製した。経時的研究の場合、脂肪細胞は、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ中、１０５細胞ｍＬ−１の濃度で懸濁され、大気中１０％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で維持された。プラスミド含有ヒトＺＡＧで形質転換されたヒト２９３細胞を、１０５細胞ｍＬ−１の濃度で、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地に播種し、大気中５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で維持した。最大タンパク質値（１６μｇｍＬ−１）は、１４日間の培養後に得られた。次いで培地（２００ｍＬ）を７００ｇで１５分間遠心分離して細胞を除去し、１０ｋＤａカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離フィルタを使用して、体積１ｍＬの滅菌ＰＢＳに濃縮した。試料（約２ｍｇ）のタンパク質濃度を測定した後、２０ｍＬの１０ｍＭトリス（ｐＨ８．８）に懸濁した２ｇ  ＤＥＡＥセルロースに加え、４℃で２時間攪拌した。負に電荷されたＺＡＧは、ＤＥＡＥセルロースに結合し、遠心分離（１５００ｇで１５分間）によって沈殿させ、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＬの１０ｍＭトリス（ｐＨ８．８）とともに、４℃で３０分間攪拌することによって溶出した。上澄みを洗浄し、Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルタを使用して、滅菌ＰＢＳ中で体積１ｍＬに濃縮した。
【０１３５】
動物−マウス
本研究では、アストン大学で維持されたコロニーからの同型肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウスを使用した。アストンｏｂ／ｏｂマウスの起源および特徴は、以前に説明されている。雄マウス（２０〜２１週齢、体重９０〜１００ｇ）を、２２±２℃に空調管理された１２時間：１２時間の明暗周期の部屋において、ケージ当たり３匹に分類し、ラットおよびマウス飼育餌（Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｄｉｅｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗｉｔｈａｍ，ＵＫ）および水道水を不断給餌した。それらは、ＰＢＳ（１００μＬ）中のＺＡＧ（３５μｇ）を１日２回静脈内投与によってマウスに投与し、体重および食物／水の摂取を連日監視した。対照マウスは、ＰＢＳを単独投与された。直腸体温計（ＲＳ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，Ｎｏｒｔｈａｎｔｓ，ＵＫ）を使用することによって、体温を連日測定した。すべての動物実験は、英国動物科学的処置法１９８６に従って行った。ＺＡＧの投与後に悪影響は認められなかった。
【０１３６】
動物−ラット
体重５４０±８２．５ｇの成熟雄ウィスターラット（独自のコロニーから得た１年齢）を個別に収容し、１日１回静脈注射により、ＰＢＳ（１００μＬ）中のＺＡＧ（体重１００ｇ当たり５０μｇ）、または対照としてＰＢＳ（１００μＬ）で処置した。食餌および水の摂取ならびに体重の両方を連日測定した。動物は、食餌（Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｄｉｅｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ）および水への自由なアクセスを不断で付与した。Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅによって付与された快適な条件下で動物実験を行った。１０日間の処置後に、動物を絶命させて身体組成を測定した。一定体重が得られるまで、８０〜９０℃で７日間、動物を加熱した。次いで湿重量と乾燥重量との差から含水量を測定した。Ｌｕｎｄｈｏｌｍら（１４）によって記載される、クロロホルム：メタノール（１：１）、エタノール／アセトン（１：１）、およびジエチルエーテル（それぞれ１２０ｍＬ）の配列を使用して、乾燥屠体から脂質を抽出した。溶媒を蒸発させて脂肪を計量した。非脂肪屠体量は、屠体の初期重量と水／脂肪重量との差として計算した。
【０１３７】
脂肪分解アッセイ
アッセイされる試料は、１ｍＬのＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で２時間、１０５〜２×１０５脂肪細胞で培養した。放出されたグリセロールの濃度は、Ｗｉｅｌａｎｄの方法によって酵素的に測定した（Ｗｉｅｌａｎｄ，Ｏ．Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ＵＶ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ｅｄ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｕ．）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，ｐｐ  １４０４−１４０９，１９７４））。脂肪細胞を単独で含有する対照試料を分析して、同時グリセロール放出を測定した。活性は、放出されたグリセロールμｍｏｌ／１０５脂肪細胞／２時間として表した。
【０１３８】
血清代謝産生物の測定
非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）を、Ｗａｋｏ−ＡＳＣ−ＡＣＯＤキット（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＧｍｂＨ、Ｎｅｕｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。トリグリセリドは、トリグリセリドキット（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｐｏｏｌｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）および３−ヒドロキシブチラートを使用して、定量酵素測定キット（Ｓｉｇｍａ）によって測定した。グルコースは、グルコースアナライザを使用して測定し（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆ．）、グリセロールは、″Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ″（Ｅｄ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｕ．）Ｖｏｌ．３，ｐｐ１４０４−１４０９，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９７４）に記載される、Ｗｉｅｌａｎｄの方法を使用して酵素的に測定した。
【０１３９】
マウス脂肪細胞血漿膜の単離
典型的な手順において、白色脂肪細胞は、２５０ｍＭスクロース、２ｍＭ  エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'（ＥＧＴＡ）、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で細胞を洗浄したことを除いて、上記のとおりマウスの精巣上体脂肪パッドから単離した。脂肪細胞は、２０ｍＬの上記緩衝液中に懸濁し、少なくとも１０回、Ｓｗｉｎｎｙフィルタを通して吸引することによって均質化した。次いで、細胞ホモジネートを３００ｇで５分間遠心分離し、脂肪ケーキを表面から除去して、残りのペレットおよび遊泳物を清潔な管に移した。これらを３０，０００ｇで１時間、４℃で遠心分離し、形成された膜ペレットをスクロース緩衝液（２００〜４００μＬ）中に懸濁した。血漿膜は、自己形成勾配のＰＥＲＣＯＬＬ（商標）コロイドシリカ粒子上の他のオルガネラ膜から分離した。組成は、２５０ｍＭスクロース、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）、および２Ｍスクロース、８ｍＭ  ＥＧＴＡ、８０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）であり、３２：７：１の比で、膜懸濁液と一緒に混合した（総容積８ｍＬ）。この混合液を１０，０００ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。勾配を０．７５ｍＬ部分に分画し、コハク酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨ−サイトクロームｃ還元酵素、乳酸デヒドロゲナーゼ、および５'−ヌクレオチダーゼの存在について各部分を分析し、血漿膜分画を位置付けた。膜分画は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中に再懸濁し、１０，０００ｇ、４℃で２分間遠心分離した。このプロセスを２回繰り返した。次いで、線状された血漿膜を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭスクロース、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、および４μＭフェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）中、１〜２ｍｇ／ｍＬで希釈し、液体窒素中で急速冷凍して、使用するまで−７０℃で保存した。
【０１４０】
ラット脂肪細胞における脂肪分解活性
白色脂肪細胞は、記載されるように、コラゲナーゼ消化を使用して、雄ウィスターラット（４００ｇ）の微粉砕された精巣上体脂肪組織から調製した（Ｂｅｃｋ  ＳＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｂｙ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃａｃｈｅｘｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４７：５９１９−５９２３，１９８７）。脂肪分解活性は、１０５−２×１０５脂肪細胞を２時間、１ｍＬ  Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸緩衝液（ｐＨ７．２）を培養することによって測定し、脂肪分解の程度は、放出されたグリセロールを測定することによって決定した（Ｗｉｅｌａｎｄ  Ｏ．Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ＵＶ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ  ＨＵ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ  １４０４−１４０９，１９７４）。同時グリセロール放出は、脂肪細胞単独を培養することによって測定した。脂肪分解活性は、放出されたグリセロールμｍｏｌ／１０５脂肪細胞／２時間として表した。
【０１４１】
ゲル電気泳動
ゲルは、Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従って調製し、一般に５％濃縮ゲルおよび１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ溶解ゲル（変性もしくは還元状態）、または１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ溶解ゲル（非変性もしくは非還元状態）で構成される。試料は、１〜５μｇ／レーンで負荷した。バンドは、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０またはシルバーのいずれかで洗浄することによって可視化した。試料は、５分間１００℃で、０．０６２５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、１％  ＳＤＳ、０．０１％ブロモフェノールブルー、および５％  ２−メルカプトエタノール中で加熱することによって、還元状態のために調製した。
【０１４２】
脂肪細胞へのグルコース取り込み
単離した脂肪細胞（５×１０４）を、１ｍＬのＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸緩衝液（ｐＨ７．２）（ＫＲＢＳ）中で２回洗浄し、１０分間室温で、１８．５ＭＢｑ  ２−［１−１４Ｃ］デオキシ−Ｄ−グルコースおよび非放射性２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含有する０．５ｍＬのＫＲＢＳ中で、最終濃度０．１ｍＭになるまでさらに培養した。取り込みは、１ｍＬの氷冷された無グルコースＫＲＢＳを添加することによって終了させ、細胞を１ｍＬのＫＲＢＳで３回洗浄し、０．５ｍＬ  １Ｍ  ＮａＯＨの添加によって溶解して、液体シンチレーションカウントによって放射性を測定する前に、少なくとも１時間室温で放置した。
【０１４３】
腓腹筋へのグルコースの取り込み
腓腹筋は、Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ重炭酸緩衝液中で４５分間、３７℃で培養し、次いでさらに１０分間、１８５ＭＢｑ  ２−［１−１４Ｃ］デオキシ−Ｄ−グルコースおよび非放射性２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含有する５ｍＬのＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液中で、最終濃度０．１ｍＭになるまで培養した。次いで、筋肉を除去し、０．９％  ＮａＣｌ中で５分間洗浄した後、０．５ｍＬ  １Ｍ  ＮａＯＨに溶解し、液体シンチレーションカウントによって放射性を測定した。
【０１４４】
ヒラメ筋へのグルコースの取り込み
ヒラメ筋は、Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ重炭酸緩衝液中で４５分間、３７℃で培養した後、さらに１０分間、１８５ＭＢｑ  ２−［１−１４Ｃ］デオキシ−Ｄ−グルコースおよび非放射性２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含有する５ｍＬのＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液中で、最終濃度０．１ｍＭになるまで培養した。次いで、筋肉を除去し、０．９％  ＮａＣｌ中で５分間洗浄した後、０．５ｍＬ  １Ｍ  ＮａＯＨに溶解し、液体シンチレーションカウントによって放射性を測定した。
【０１４５】
筋肉内のタンパク質合成および分解
筋肉におけるタンパク質合成および分解を測定するための方法は、以前に説明されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｌ．＆  Ｔｉｓｄａｌｅ，Ｍ．Ｊ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃａｃｈｅｘｉａ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６７，６８０−６８５（１９９３））。結紮を使用して腓腹筋を切除し、フェノールレッドを欠失するＲＰＭＩ１６４０培地中で３０分間、３７℃で培養し、Ｏ２：ＣＯ２（１９：１）で飽和させた後、ＰＢＳで洗浄した。Ｌ−［２，６−３Ｈ］フェニルアラニン（６４０ＭＢｑ）を酸不溶性材料に組み込むことによって、２時間の期間を使用してタンパク質合成を測定し、筋肉を３７℃でＲＰＭＩ／６４０中、フェノールレッドの非存在下で培養し、Ｏ２：ＣＯ２（１９：１）で飽和させた。次いで、筋肉を非放射性培地中で洗浄し、ブロットして、２％過塩酸中で均質化した。タンパク質合成率は、タンパク質結合放射能の量を酸可溶性放射能の量で割ることによって計算した。タンパク質分解は、５ｍＭグルコースおよび０．５ｍＭシクロヘキシミドを含有する、３ｍＬの酸化Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液（ｐＨ７．４）中で２時間にわたる腓腹筋からのチロシンの放出によって測定した。
【０１４６】
プロテアソームおよびカスパーゼ活性の測定
プロテアソームの「キモトリプシン様」活性は、筋管に関して以前に説明されるように蛍光発生基質Ｎ−スクシニルＬｙｓ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ．ＡＭＣ（配列番号２）からの励起波長３６０ｎｍ、および放出波長４６０ｎｍにおいて、７−アミド−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）の放出を測定することによって、経口分析的に測定した（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ａ．Ｓ．＆  Ｔｉｓｄａｌｅ，Ｍ．Ｊ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｙｏｔｕｂｅｓ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＩＦ）ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＮＦ−κＢ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８９，１１１６−１１２２（２００３））。腓腹筋は、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．５）２ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および５０ｍＭ  ＤＴＴ中、４℃で均質化し、超音波分解して、１８，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離して、不溶性材料をペレット化し、得られた上澄みを使用して、プロテアソーム阻害剤ラクタシスチン（１０μＭ）の存在または非存在下で「キモトリプシン様」酵素活性を測定した。ラクタシスチン抑制性活性のみが真のプロテアソーム活性であると見なされた。カスパーゼ−３の活性は、ＡｃＡｓｐ．Ｇｌｙ．Ｖａｌ．Ａｓｐ．ＡＭＣ（配列番号３）の放出によって測定し、カスパーゼ−８の活性は、特定基質Ｚ−Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ−ＡＦＣ（配列番号４）からの７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）の放出によって、上記からの上澄み（５０μｇタンパク質）、およびカスパーゼ−３または−８基質（１０μＭ）のいずれかを使用して、１時間３７℃で、カスパーゼ−３（ＡｃＡｓｐＧｌｕＶａｌＡｓｐ−ＣＨＯ）（配列番号５）またはカスパーゼ−８（Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ−ＣＨＯ）（配列番号６）阻害剤（１００μＭ）の存在または非存在下で測定した。ＡＦＣに起因する蛍光の増加は、上記のとおり測定したが、ＡＦＣに起因する蛍光の増加は、励起波長４００ｎｍおよび放出波長５０５ｎｍで測定した。カスパーゼ阻害剤の存在および非存在下での値の差は、活性の測定値であった。
【０１４７】
ウェスタンブロット分析
新しく切除された腓腹筋をＰＢＳ中で洗浄し、ＰＨＯＳＰＨＯＳＡＦＥ（商標）抽出試薬中で５分間、室温で溶解した後、４℃で超音波処理した。溶解物を１８，０００ｇで５分間、４℃で遠心分離することによって取り除き、サイトゾルタンパク質（５μｇ）の試料を１２％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上、１８０Ｖで約１時間溶解した。この後、０．４５μｍのニトロセルロース膜への転移が続き、次いで、トリス緩衝食塩水中の５％Ｍａｒｖｅｌ（ｐＨ７．５）を用いて、４℃で一晩遮断した。一次および二次抗体の両方を、抗ミオシン（１：２５０）を除いて、１：１０００の希釈で使用した。室温で１時間培養し、ＥＣＬによって展開した。ブロットを密度計によって走査して差を定量した。
【０１４８】
ＺＡＧまたはＰＢＳで５日間処置されたラットから切除した精巣上体ＷＡＴ、ＢＡＴ、および腓腹筋の試料を、０．２５Ｍスクロース、１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、および０．２Ｍ  ＥＤＴＡ中で均質化した後、１０分間４，５００ｒｐｍで遠心分離した。サイトゾルタンパク質（１０μｇ）の試料は、１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動上で溶解し、次いでトリス緩衝食塩水中の５％Ｍａｒｖｅｌ（ｐＨ７．５）を用いて、４℃で一晩遮断された、０．４５μｍニトロセルロース膜の上にタンパク質を移し、ＰＢＳ中０．１％  Ｔｗｅｅｎによる１５分の洗浄を４回行った後、二次抗体を用いた培養を１時間室温で行った。ＥＣＬによって展開した。
【０１４９】
統計解析
結果は、少なくとも３回の複製実験の平均±ＳＥＭとして示される。群間平均の差は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて、テューキー−クレーマー多重比較試験によって決定した。０．０５未満のＰ値が有意であると見なされた。
【０１５０】
結果−マウス
ＺＡＧの精製は、９５％を超える純度の生成物を生じ（図１Ａ）、免疫ブロットによってＺＡＧとして確認された（図１Ｂ）。ＺＡＧは、精巣上体脂肪細胞において脂肪分解を刺激したが（図１Ｄ）、脂肪分解効果は、基礎値よりは著しく上昇したが、皮下および内臓沈着物の両方から得た脂肪細胞において大幅に低減した（図１Ｅ）。任意の脂肪細胞群において、イソプレナリンとＺＡＧとの間の脂肪分解の刺激の程度に有意な差は認められなかったが、ＺＡＧは、モルベースでイソプレナリンよりも強力に脂肪分解を誘発した。５日間にわたるｏｂ／ｏｂマウスの体重に対するＺＡＧの効果は、図１Ｆに示される。対照動物は、体重が安定したままであったが、ＺＡＧで処置された動物は、進行性の体重減少を示し、実験の間に等しい食餌（ＰＢＳ３２±３．１ｇ、ＺＡＧ３０±２．５ｇ）および水（ＰＢＳ１４０±８．２ｍＬ、ＺＡＧ１３５±３．２ｍＬ）を摂取したにも関わらず、５日後、群間に３．５ｇの重量差が見られた。ＺＡＧ投与から４日後、０．４℃の著しい体温上昇が見られ（図１Ｇ）、基礎代謝率の増加を示す。血漿代謝産生物価の測定は、ＺＡＧ処置された動物における大社基質の利用の増加を示唆する（表１）。したがって、ＺＡＧ処置された動物において、脂肪分解の増加を示すグリセロール濃度の増加が見られたにも関わらず、血漿グルコース、トリグリセリド（ＴＧ）および非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）が著しく減少した。血漿インスリン値が３６％減少したことは、ＺＡＧが糖尿病状態を低減することにおいて有効であることを示唆する。様々な組織におけるＺＡＧ  ｍＲＮＡ値は図１Ｃに示される。
【０１５１】
（表１）１２０時間のＺＡＧで処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおける血漿代謝産生物およびインスリン値
2013530981.tif 000004
【０１５２】
これを調査するために、ＺＡＧ投与から３日後、給餌された動物にブドウ糖負荷試験を行った（図２Ａ）。ＰＢＳ対照において血糖値が著しく上昇したが、ＺＡＧ処置された動物ではわずかに上昇したに過ぎず、研究の経過を通して、対照群よりも著しく低いままであった。さらに、血漿インスリン値は、研究の開始時に、ＺＡＧ処置された動物において著しく低く、６０分の観測中もそのままであった（図２Ｂ）。ＺＡＧ投与は、インスリンの非存在下で、精巣上体、内臓、および皮下脂肪細胞のグルコースの取り込みを増加させ、低（１ｎＭ）インスリンの存在下で、精巣上体および内臓脂肪細胞へのグルコースの取り込みも増加させた。（図２Ｃ）。腓腹筋へのグルコースの取り込みもまた、インスリン（１００ｎＭ）の非存在および存在下の両方で、ＺＡＧ処置された動物において著しく増強された（図２Ｄ）。ＺＡＧ処置されたマウスの腓腹筋におけるグルコースの取り込みは、非処置動物におけるインスリン応答よりも優れていた。
【０１５３】
ＺＡＧ投与は、骨格筋萎縮に対する高血糖の効果も減衰させた。したがって、ＺＡＧで処置されたｏｂ／ｏｂマウスは、腓腹筋およびヒラメ筋の両方の湿重量において著しい増加を示した（表１）。これは、ヒラメ筋におけるタンパク質合成の２倍以上の増加（図３Ａ）およびタンパク質分解の６０％減少と関連付けられる（図３Ｂ）。ＺＡＧで処置されたマウスから得た腓腹筋は、プロテアソーム「キモトリプシン様」酵素活性の減少を示し（図３Ｃ）（非肥満マウスにおいて認められるものと著しく異なっていなかった）、２０Ｓプロテアソームα−サブユニット（図３Ｄ）およびｐ４２、１９Ｓ調節因子のＡＴＰａｓｅサブユニット（図３Ｅ）の両方の発現の減少は、ユビキチン−プロテアソーム経路の活性の減少を示唆する。ミオシン値は、ＺＡＧ処置されたマウスにおいて増加したが（図３Ｆ）、アクチン値は、変化しなかった（図３Ｇ）。さらに、ｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）（図４Ａ）および真核開始因子２α（ｅＩＦ２α）（図４Ｂ）のリン酸化形態の値の減少が見られ、これは、腫瘍異化因子によって誘発された筋委縮および高い細胞外グルコース値に関与することが示された。ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）（図４Ｃ）、ｐ３８ミトゲン活性化タンパク質キナーゼ（図４Ｄ）、ならびにカスパーゼ−３および−８（図４Ｅ）を含む、この経路における他の酵素もまた、ＺＡＧで処置されたｏｂ／ｏｂマウスの腓腹筋において減衰された。これらの変化は、ＺＡＧに応答する筋肉内の異化シグナル伝達の減少に比例した。
【０１５４】
イソプレナリンではないＺＡＧは、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）阻害剤ＰＤ９８０５９１４によって完全に減衰された脂肪細胞において、リン酸ＨＳＬの発現を増加させた。ＺＡＧは、精巣上体脂肪細胞においてＨＳＬの発現を増加させたが、皮下または内臓脂肪細胞のいずれかにおいて増加は見られなかった（図５Ｂ〜５Ｄ）。同様の状況は、脂肪細胞トリグリセリドリパーゼ（ＡＴＧＬ）の発現とともに観測された（図５Ｅ〜５Ｇ）。ＨＳＬおよびＡＴＧＬの発現は、ＥＲＫの活性（リン酸）形態の発現と相関した（図５Ｈ〜５Ｊ）。精巣上体脂肪細胞におけるＨＳＬおよびＡＴＧＬの発現は、β３作動薬、ＢＲＬ３７３４４に対する脂肪分解反応の増加と相関した（図５Ｋ）。この結果は、ＺＡＧがβ３作動薬と相乗作用し得ることを示唆する。
【０１５５】
以前に報告されたように、ＺＡＧの投与は、脂肪組織におけるその発現を増加させた（図６Ａ）。ＺＡＧの発現は、ＺＡＧの非存在下でさらに３日間の組織培養中も上昇したままであった（図６Ｂ）。ＨＳＬの発現は、ＺＡＧの非存在下でさらに３日間の組織培養中も上昇した（図６Ｃ）。ＺＡＧの投与は、ＢＡＴ（図６Ｄ）におけるＵＣＰ１（図６Ｄ）およびＵＣＰ３（図６Ｅ）の発現、ならびに骨格筋（図６Ｆ）におけるＵＣＰ３の発現を増加させた。非共役タンパク質の発現の増加は、観測されるように、代謝基質を熱に変化させると予想された（図１Ｇ）。
【０１５６】
２１日後、ｏｂ／ｏｂマウスにおける血漿代謝産生物価が観測され（表２）、表３に示されるパラメータを監視した。血糖値のさらなる低下（２．０３〜１５．２ｍＭ）およびグリセロールの上昇が観測され、対照が以前よりも低いため、より多いように見える。５日目と比較して、２１日目に、ＮＥＦＡ、ＴＧ、またはインスリンの変化は観測されなかった（表１）。ＺＡＧ処置された動物の膵臓にははるかに多くのインスリンが存在することがわかり、インスリン産生の低下に起因しないが（例えば、膵臓β細胞に対する毒素によって起こる）、むしろＺＡＧ処置された動物の血糖を管理するために必要なインスリンはより少量であるという事実に起因する、血漿インスリンの低下を示す。
【０１５７】
（表２）２１日目のＺＡＧで処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおける血漿代謝産生物およびインスリン値
2013530981.tif 000005
【０１５８】
（表３）２１日目のＺＡＧで処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおいて監視されたパラメータ
2013530981.tif 000006
【０１５９】
さらに、ｏｂ／ｏｂマウスの体温は、４日以内に０．５℃〜１℃上昇し（図１Ｇ）、最大体重を喪失する直前に、３８．１℃でピークに達した（図７）。これは、茶色脂肪組織の重量と相関し、対照における０．３３±０．１２ｇからＺＡＧ処置された動物における０．５２±０．０８ｇに増加する（図７）。腓腹筋の重量もまた０．２±０．０５ｇから０．７±０．１ｇに増加したが、尿中グルコース分泌の進行性の減少が見られた（図８Ａおよび８Ｂ）。
【０１６０】
結果−ラット
イソプレナリンと比較して、ラット精巣上体脂肪細胞に対するヒトＺＡＧの脂肪分解効果は、図１１に示される。２３３〜７００ｎＭの濃度で、ＺＡＧはグリセロール放出の用量依存的な増加をもたらしたが、抗ＺＡＧモノクローナル抗体によって減衰され、作用の特異性を示す。ラット脂肪細胞における脂肪分解の程度は、マウスにおいて以前に報告されたものに類似していた。マウスの場合と同様に、ＺＡＧの脂肪分解効果は、β３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）拮抗薬ＳＲ５９２３０Ａによって完全に減衰され、ＺＡＧの作用がβ３−ＡＲによって媒介されたことを示唆する。これらの結果は、ＺＡＧがラットにおいて脂肪減少を誘発する際に有効であり得ることを示唆する。
【０１６１】
成体雄ウィスターラット（５４０±８３ｇ）の体重に対するＺＡＧ（５０μｇ／体重１００ｇ）の単回連日静脈内注射の効果は、図１２Ａに示される、同一容量の溶媒（ＰＢＳ）を投与された対照ラットと比較して、ＺＡＧを投与されたラットは、進行性の体重減少を示したが、１０日後、ＰＢＳで処置された白色ラットは、１３ｇの体重増加を示し、ＺＡＧで処置された動物は、５ｇの体重減少を示した（表４）。研究の経過中、２つの群間に食餌（ＺＡＧ：１０２±３２ｇ、ＰＢＳ：９８±２５ｇ）または水（ＺＡＧ：１３５±３５ｍＬ、ＰＢＳ：１２５±２５ｍＬ）の摂取に差は見られなかったが、ＺＡＧで処置された動物は、一定して０．４℃の対応上昇を示し、これはＺＡＧの最初の投与から２４時間以内に顕著であり（図１２Ｂ）、これはエネルギー消費の上昇を示す。身体組成分析（表４）は、ＺＡＧによって誘発された体重減少が、屠体脂肪の減少に起因するこおを示し、除脂肪体重の著しい増加によって部分的に相殺された。ＺＡＧで処置されたラットにおいて、血漿グリセロール濃度が５０％増加し（表５）、脂肪分解の増加を示したが、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）の血漿値は５５％減少し、利用の増加を示唆した。グルコースおよびトリグリセリドの血漿値もまた３６〜３７％減少し（表５）、これも利用の増加を示唆した。ＺＡＧで処置されたラットの精巣上体脂肪細胞への２−デオキシグルコースの取り込みは、１０日間で著しく増加したが、これはインスリンの存在下で増加した（図１２Ｃ）。しかしながら、インスリンの存在下、ＺＡＧまたはＰＢＳで処置された動物から得た脂肪細胞へのグルコースの取り込みには著しい差が見られなかった（図１２Ｃ）。ＰＢＳ対照と比較して、ＺＡＧで処置されたラットの腓腹筋およびＢＡＴへのグルコースの取り込みの増加はわずかで顕著ではなかったが、インスリンの存在下での取り込みは著しく増加した（図１２Ｄ）。これらの結果は、ＢＡＴ、ＷＡＴ、および骨格筋による利用の増加に起因することを示唆し、３つの組織すべてにおいてグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の発現が増加したことによって支持される（図１３）。
【０１６２】
（表４）ＰＢＳまたはＺＡＧのいずれかで処置した後の雄ラットの身体組成
2013530981.tif 000007
ＰＢＳで処置された動物との差は、ａ、ｐ＜０．０５またはｂ、ｐ＜０．０１として示される。
【０１６３】
（表５）ＰＢＳまたはＺＡＧのいずれかで１０日間処置されたラットの血漿代謝産生物およびインスリン値
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ＰＢＳで処置された動物との差は、ａ、ｐ＜０．０５、ｂ、ｐ＜０．０１、またはｃ、ｐ＜０．００１として示される。
【０１６４】
ＺＡＧの投与は、ＢＡＴおよびＷＡＴの両方において、非共役タンパク質（ＵＣＰ）−１および−３の発現を約２倍増加させ（図１３Ａおよび１３Ｂ）、基質利用の増加に寄与する。ＺＡＧで処置されたラットにおいて、精巣上体脂肪組織における脂肪分解酵素脂肪トリグリセリドリパーゼ（ＡＴＧＬ）およびホルモン感作リパーゼ（ＨＳＬ）の発現も２倍増加した（図１５）。ＡＴＧＬは、主にジアシルグリセロールを形成するトリアシルグリセロール分子において結合された第１のエステルの加水分解に関与するが、モノアシルグリセロールへのその変換は、ＨＳＬによって行われる。ＺＡＧの発現も、ＺＡＧで処置されたラットの骨格筋（図１６Ａ）、ＷＡＴ（図１６Ｂ）、およびＢＡＴ（図１６Ｃ）において１０日間に著しく増加し、外因性ＺＡＧが、末梢組織におけるそれ自体の産生を促進することを示す。
【０１６５】
ＺＡＧを投与されたラットの腓腹筋において、α−サブユニット上にｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）および真核開始因子２（ｅＩＦ２）の両方のリン酸化形態の発現が著しく減少したが、総量は変化しなかった（図１７Ａおよび１７Ｂ）。同様の変化は、ＺＡＧを投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおいて観測され（未公開の結果）、骨格筋におけるタンパク質分解の抑制およびタンパク質合成の増加と一致した。
【０１６６】
実施例２
亜鉛−α２−糖タンパク質の間隔投与
ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＺＡＧの長期連日投与は、体重減少の停止をもたらすことが観測された。そのようにして、３〜４日の中断後にＺＡＧを再注入することは、継続的な体重減少および高血糖に関連する症状の改善をもたらすことがわかった。
【０１６７】
理論に縛られるわけではないが、対象が過剰なＺＡＧを受容する場合があるか、またはＴＮＦの場合にみられるように、受容体脱感作が見られる。各群の２匹のマウスを用いてパイロット研究を行い、ＺＡＧ送達の最適スケジュールを決定した。約３週間で、９０ｇのマウスから８〜１０ｇの多重減少が観測された。 
【０１６８】
脂肪細胞は、ＺＡＧ投与から５日後にマウスから除去され、ＺＡＧの非存在下で培養した後、イソプレナリン（ｉｓｏ）に対するそれらの応答性を測定した（図９）。ｉｓｏに対する応答は、ＺＡＧで処置されたマウスにおいてより高く、これはさらに４日間継続した後（ＺＡＧおよびＨＳＬの発現が増加したとき）、５日目にＰＢＳ対照の値まで下降した（発現が増加しないとき）。
【０１６９】
実施例３
亜鉛−α２−糖タンパク質はｏｂ／ｏｂマウスにおける筋委縮を減衰させる
この実施例は、新しく発育されたインビトロモデルを使用して、ＺＡＧがｏｂ／ｏｂマウスの筋委縮を減衰させる機構を証明する（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．３１５，１６−２５，２００９）。これは、高濃度のグルコース（１０または２５ｍＭ）に供されるマウス筋管を利用する。図１８に示されるように、高グルコースは、タンパク質分解の増加を刺激し（図１８Ａ）、タンパク質合成を抑制するが（図１８Ｂ）、これらの効果はいずれもＺＡＧ（２５μｇ／ｍＬ）によって完全に減衰された。したがって、拮抗薬ＳＲ５９２３０Ａを使用して、ＺＡＧの効果がβ３−ＡＲによって媒介されるか否かを決定した。しかしながら、ＳＲ化合物（すなわち、ＳＲ５９２３０Ａ）は、β作動薬としても作動することができ、これらの実験においても同様であると思われた。したがって、１０および２５ｍＭグルコースによって誘発されるタンパク質分解は、ＺＡＧおよびＳＲ化合物の両方によって減衰され、その組み合わせは、拮抗薬よりも付加的であった（図１９）。タンパク質合成の場合（図２０）、ＳＲ化合物は、ＺＡＧと同様に好転の証拠がないように思われるが、１０ｍＭのグルコースを用いると、ＳＲ化合物はタンパク質合成の抑制の増加をもたらす。
【０１７０】
実施例４
亜鉛−α２−糖タンパク質はＲＯＳ形成を減衰させる
活性酸素種（ＲＯＳ）の製剤は、高い糖負荷によって誘発されるタンパク質分解において重要であることが示された。図２１のデータは、ＺＡＧが、タンパク質分解の減少に対応して、グルコースによって産生されるＲＯＳの増加を完全に減衰させることを示す（図１８Ａ）。高グルコースはまた、ｏｂ／ｏｂマウスの骨格筋において見られるように、ＰＫＲの活性（リン酸化）（図２２Ａ）、およびｅＩＦ２αの後次リン酸化（図２２Ｂ）も誘発し、これもＺＡＧによって減衰された。これらの結果は、インビトロモデルが、ＺＡＧが分子レベルで筋肉量に影響する様子を研究に有用となることを示唆する。
【０１７１】
実施例５
亜鉛−α２−糖タンパク質はインスリン抵抗を増加させる
インスリン抵抗試験もまた、ＺＡＧを３日間投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおいて行った（図２３）。２つの用量のインスリン（１０および２０Ｕ／ｋｇ）を腹腔内注射によって動物に投与し、血糖値を次の６０分間に測定した。図２３Ａに見られるように、ＺＡＧで処置された動物は、ＰＢＳを付与された動物よりもインスリン（１０Ｕ／ｋｇ）に対する高い感受性を示した。高濃度のインスリン（２０Ｕ／ｋｇ）において、この差は消失した（図２３Ｂ）。２０Ｕ／ｋｇ＋ＰＢＳのグルコース消失曲線は、１０Ｕ／ｋｇ＋ＺＡＧとほぼ同一であったが、この用量レベルで、ＺＡＧは、インスリンの必要性を５０％低減するが、これは、より多くのインスリンを付与することによって克服することができる。
【０１７２】
実施例６
抗−亜鉛−α２−糖タンパク質抗体は体重減少を低減する
図２６〜２９に示されるデータは、β３作動薬、ＢＲＬ３７３４４が単独で、および抗ＺＡＧ抗体と併せて、５０μｇ／日で連日投与された研究から得た。投与から２４時間以内に、抗体を投与されたマウスは、ＢＲＬ３７３４４を投与されたマウスと比較して、体重減少の低減を示した。 
【０１７３】
実施例７
５日間の亜鉛−α２−糖タンパク質投与
５日間の研究を行い、ＺＡＧを３５μｇ／日で５日間、連日静脈内投与した。実験の終了時に、組織を除去およびブロットするか、または単離された脂肪細胞を用いて機能的アッセイを行った。図６Ａに見られるように、ＺＡＧ投与は、精巣上体（ｅｐ）、皮下（ｓｃ）、および内臓（ｖｉｓ）脂肪におけるその発現を約２倍増加させた。ｅｐ脂肪細胞を調製し、組織培養（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％  ＦＣＳ）中で維持したとき、培養培地にＺＡＧが添加されなかった場合でさえも、ＺＡＧ発現がさらに３日間維持された（図６Ｂ）。さらに、ＺＡＧで処置したマウスから得た脂肪細胞は、イソプレナリン（１０μＭ）に対する反応の増加を示し、これもまたＺＡＧの非存在下、組織培養中で４日間維持された（図９）。イソプレナリンに対する反応の増加は、ＺＡＧによるＨＳＬの発現の増加に起因し、これもまた、ＺＡＧの非存在下で４日間、組織培養において維持された（図６Ｃ）。これらの結果は、ＺＡＧが取り除かれ、したがって連日投与する必要がない場合に、ＺＡＧの効果がさらに３日間維持されることを示す。実際に、上述されるように、過剰なＺＡＧは、反応の増加よりもむしろ抵抗をもたらす可能性が高い。
【０１７４】
ＨＳＬの発現の増加は、ＡＴＧＬと同様に（図５Ｅ〜５Ｇ）、５日後のｅｐ脂肪細胞ＺＡＧにおいてのみ見られた（図５Ｂ〜５Ｄ）。ｅｐ脂肪組織のみにおいて、ｐＥＲＫの発現の増加が見られ（図５Ｈ〜５Ｊ）、ｐＥＲＫの阻害剤（ＰＤ９８０５９  １０μＭ）は、ＺＡＧによって３時間培養されたｅｐ脂肪細胞において、ＨＳＬの発現の増加を減衰させた（図５Ａ）。ＺＡＧは、ＢＡＴ（図６Ｄおよび６Ｅ）ならびに筋肉（図６Ｆ）においてＵＣＰ１およびＵＣＰ３の発現を増加させ、これは体温の上昇を説明するものであり、脂肪分解の増加に関わらず、血清中のＴＧおよびＮＥＦＡは低下する。
【０１７５】
実施例８
亜鉛−α２−糖タンパク質の抗肥満および抗糖尿病効果におけるβ−アドレナリン受容体の役割
研究の目標は、β−アドレナリン受容体（β−ＡＲ）が、亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）の抗肥満および抗糖尿病効果において役割を果たすか否かを決定することである。これは、ヒトβ１−、β２−、β３−ＡＲで形質転換されたＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびｏｂ／ｏｂマウスにおいて調査された。β３−ＡＲで形質転換されたＣＨＯ−Ｋ１細胞において、サイクリックＡＭＰ産生を刺激するＺＡＧの最低濃度は、３５０ｎＭであったが、β２−ＡＲで形質転換された細胞には、より高い濃度（５８０ｎＭ）が必要とされ、β１−ＡＲで形質転換された細胞において、サイクリックＡＭＰの増加は見られなかった。これは、β３−ＡＲ（４６±４ｎＭ）およびβ２−ＡＲ（７１±２ｎＭ）に結合するためのＫｄ値と相関したが、β１−ＡＲへの結合は見られなかった。生物学的活性を破壊するＺＡＧの凍結−解凍は、β２−、およびβ３−ＡＲへの結合を排除した。ＺＡＧによるｏｂ／ｏｂマウスの処置は、腓腹筋、ならびに白色および茶色脂肪組織においてβ３−ＡＲのタンパク質発現を増加させたが、β１−、およびβ２−ＡＲの発現に対する効果を有しなかった。体重および尿中グルコース分泌の低減、体温の上昇、経口ブドウ糖負荷試験における最適血漿グルコースおよびインスリン値の低減、ならびに骨格筋および脂肪組織へのグルコース輸送の刺激に対するＺＡＧの効果は、非特異的β−ＡＲ拮抗薬プロパノロールによって完全に減衰された。これらの結果は、ｏｂ／ｏｂマウスにおける体重およびインスリン感受性に対するＺＡＧの効果が、β−３ＡＲまたは場合によってはβ２−ＡＲを通して呈されることを証明する。
【０１７６】
亜鉛−α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）は、癌悪液質における脂肪組織の喪失に関与すると考えられる、脂質動員因子（ＬＭＦ）のトリプシン断片が、ＺＡＧに対するアミノ酸配列において同一であることが示されたとき、脂質代謝において役割を果たすことが最初に認識された。ＺＡＧおよびＬＭＦはいずれも、免疫学的に同一であり、いずれもマウス脂肪細胞における脂肪分解を、同一量、同一濃度、およびＧＴＰ依存性過程におけるアデニリルシクラーゼの活性によって、刺激することが示された。初期研究は、悪液質を開始する腫瘍は、高レベルの発現を示したため、ＺＡＧが腫瘍から発生することを示唆したが、悪液質を誘発しなかった他の腫瘍は発現を示さなかった。その後の研究は、ＺＡＧが、肝臓、茶色脂肪組織（ＢＡＴ）および白色脂肪組織（ＷＡＴ）を含む正常組織においても産生されることを示したため、ＺＡＧはアジポカインとして分類することができる。さらに、悪液質マウスおよびヒトの両方において、ＷＡＴにおけるＺＡＧ  ｍＲＮＡの発現は、それぞれ１０倍および２．７倍増加することがわかった。悪液質患者において、ＺＡＧ  ｍＲＮＡは、体重指数（ＢＭＩ）との負の相関を示したが、体重減少および血清グリセロール値とは正の相関を示した。対照的に、ＷＡＴ中のＺＡＧ  ｍＲＮＡ値は、肥満において下方調整され、脂肪量、ＢＭＩ、血漿インスリンおよびレプチンと負の相関を持つことが示された。ＺＡＧによるｏｂ／ｏｂマウスの処置は、体重および脂肪量を減少させ、血漿グルコース値、インスリン、および非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）を減少させること、インスリン感作を向上させること、および筋肉量を増加させることを含む、インスリン抵抗のパラメータを向上させた。血清ＺＡＧ値は、肥満のヒトおよびマウスの場合と同様に、通常食を給餌されたマウスよりも高脂肪食を給餌されたマウスにおいて、著しく低いことがわかった。マウスにおけるＺＡＧの過剰発現は、体重および精巣上体脂肪の重量の両方を低減したが、ＺＡＧノックアウト動物は、特に高脂肪食を給餌されたとき、体重の増加を示した。これらの結果は、レプチン等のＺＡＧが、脂肪量と密接に関連することを示唆する。しかしながら、レプチンは、脂肪量と正の相関を持つが、ＺＡＧは負の相関を持つ。
【０１７７】
ＺＡＧの脂肪分解効果は、β３−アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）拮抗薬、ＳＲ５９２３０Ａによって減衰されることが示されたが、ＬＭＦは、高親和性部位（Ｋｄ７８±４．５ｎＭ）を介してβ３−ＡＲに結合することが示された。これらの結果は、ＺＡＧによって媒介された脂肪分解が、β３−ＡＲを介して呈されることを示唆する。この研究は、ＺＡＧの作用において、β３−ＡＲの役割を調べると同時に、β１−およびβ２−ＡＲへの結合、ならびにＺＡＧの抗肥満および抗糖尿病効果におけるβ−ＡＲの役割を決定する。
【０１７８】
ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）は、Ｂｉｏｓｅｒａ（Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）から取得し、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）は、ＰＡＡ（Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＵＫ）から取得し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）から購入した。２−［１−１４Ｃ］デオキシ−Ｄ−グルコースｓｐ．ａｃｔ．１．８５ＧＢｑ  ｍｍｏｌ−１）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃａｒｄｉｆｆ，ＵＫ）から購入した。Ｎａ［１２５Ｉ］（特異的放射能＞１７Ｃｉ  ｍｇ−１）は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｍｉｔｅｄから購入した。β３−ＡＲに対するニワトリポリクローナル抗体ならびにβ１−ＡＲおよびβ２−ＡＲに対するウサギポリクローナル抗体は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入し、ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ニワトリ抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（ＵＳＡ）から購入した。ＵＣＰ１およびＵＣＰ３に対するポリクローナルウサギ抗体は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓを経由して、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）から購入した。ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ウサギ抗体は、Ｄａｋｏ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から得た。マウスβ−アクチンに対するポリクローナルウサギ抗体、トリ試薬、およびプロパノロールは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）から得た。Ｈｙｂｏｎｄ  Ａニトロセルロース膜は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）から得た。パラメータサイクリックＡＭＰアッセイキットは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｈｉｔｃｈｉｎ，ＵＫ）から購入した。ヨードビーズおよび増強化学発光（ＥＣＬ）開発キットは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｎｏｒｔｈｕｍｂｅｒｌａｎｄ，ＵＫ）から購入した。マウスインスリンＥＬＩＳＡキットは、ＤＲＧ（Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、グルコース測定は、Ｂｏｏｔｓ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）血漿グルコースキットを使用して行った。逆転写のためのプライマーおよびＥａｓｙ−Ａ  単管ＲＴ．ＰＣＲシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から購入した。
【０１７９】
動物
平均体重７１ｇの肥満（ｏｂ／ｏｂ）高血糖マウスを飼育した。これらの動物の背景は、以前に説明され（Ｂａｉｌｅｙ  ＣＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ａｎｄ  ａｇｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｂｅｓｅ  ｈｙｐｅｒｇｌｙｃａｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  Ａｓｔｏｎ  ｏｂ／ｏｂ  ｍｉｃｅ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ  ６：１１−２１，１９８２）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ｏｂ／ｏｂマウスよりも重篤な形態の糖尿病を呈する。雄マウス（約２０週齢）は、ケージ当たり３匹に分類され、空調管理された部屋において２２±２℃で、ラットおよびマウス飼育食餌（Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｄｉｅｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗｉｔｈａｍ，ＵＫ）および水道水の不断給餌で維持された。ＺＡＧ（５０μｇ、静脈内、１００μＬ  ＰＢＳ中）またはＰＢＳを、プロパノロールの存在または非存在下で（４０ｍｇｋｇ−１、ｐｏ、連日）マウスに連日投与し、体重および食餌／水の摂取、ならびに尿中グルコース分泌を決定し、直腸体温計の使用によって体温を決定した（ＲＳ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，Ｎｏｒｔｈａｎｔｓ，ＵＫ）。ブドウ糖負荷試験は、３日目に行った。グルコース（１００μＬの体積中１ｇｋｇ−１）を、１２時間断食した動物に経口投与した。グルコース投与から１５、３０、６０、および１２０分後に、血液試料を尾静脈から採取し、グルコースおよびインスリンの測定に使用した。実験の最後に、動物を頸椎脱臼によって絶命させて、組織を除去し、液体窒素中で急速冷凍して、−８０℃で維持した。
【０１８０】
組み換えヒトＺＡＧの産生
ヒトＺＡＧを含有するｐｃＤＮＡ３．１で形質転換されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、ネオマイシン（５０μｇｍＬ−１）を含有するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地内で、大気中５％  ＣＯ２の雰囲気下で維持された。２週間の増殖後、遠心分離（７００ｇで１５分間）によって除去し、培地を１０ｋＤａカットオフＭ．Ｗ．を有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離フィルタを使用して、体積１ｍＬの滅菌ＰＢＳに濃縮した。ＺＡＧは、高い電気陰性度を有するため、説明されるとおり（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＳＴ  ａｎｄ  Ｔｉｓｄａｌｅ  ＭＪ，Ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｚｉｎｃ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｏｂ／ｏｂ  ｍｉｃｅ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １５１：９４８−９５７，２０１０）、ＤＥＡＥセルロースに結合することによってＺＡＧを精製し、０．３Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。この方法によって産生されるＺＡＧは、ＬＡＬ  Ｐｙｒｏｇｅｎｔ  試験キット（Ｌｏｎｚａ）によって測定されるように、純度が９５％を超え、内毒素を有しない。精製されたＺＡＧは、ＰＢＳ中４℃で保存した。
【０１８１】
ＺＡＧの［１２５Ｉ］標識
洗浄および乾燥した１つのヨードビーズを、ＰＢＳ中でＮａ［１２５Ｉ］（１ｍＣｉ／１００μｇ  タンパク質）を用いて５分間培養した後、ＺＡＧ（１００μｇ  タンパク質）を添加し、さらに１５分間放置した。ヨードビーズの除去によって反応を終了させる一方で、０．１Ｍ  ＮａＩで溶出されたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５を使用して、遊離Ｎａ［１２５Ｉ］を除去した。Ｍｒ１０，０００のフィルタカットオフを有するＭｉｃｒｏｃｏｎミクロ濃縮器を使用して、ＰＢＳに対して［１２５Ｉ］ＺＡＧを濃縮した。［１２５Ｉ］ＺＡＧの特異的活性は、８Ｃｉｍｇタンパク質１であった。
【０１８２】
結合研究およびサイクリックＡＭＰの測定
ヒトβ１−およびβ２−ＡＲで形質転換されたＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ノッティンガム大学（ＵＫ）から取得し、一方β３−ＡＲで形質転換されたＣＨＯＫ１細胞は、Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ（Ｍａｃｃｌｅｓｆｉｅｌｄ，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から取得した。遺伝子発現は、ハイグロマイシンの管理下にあり、β−ガルレポーター構成と一緒に、Ｇ４１８に対する抵抗のために選択された。それらは、２ｍＭグルタミン、ハイグロマイシンＢ（５０ｍｇｍＬ−１）、Ｇ４１８（２００ｍｇｍＬ−１）、および１０％ＦＣＳが捕捉されたＤＭＥＭ中、大気中１０％  ＣＯ２の雰囲気下で維持された。サイクリックＡＭＰ産生に対する作動薬の効果を決定するために、１ｍＬの栄養培地を含有する２４ウェルプレートにおいて細胞を増殖させた。図５１に示される濃度でＺＡＧまたはイソプロテレノールを細胞に添加し、培養を３０分間継続した。培地を除去し、０．５ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１ｍＭ  イソブチルメチルキサンチンと置換して、プレートを沸騰した湯浴上で５分間加熱し、氷で１０分間冷却した。サイクリックＡＭＰの濃度は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。
【０１８３】
結合研究の場合、細胞を０．５Ｍ  ＭｇＣｌ２を含有する２ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５中で超音波処理し、粗全体膜を遠心分離（１３，０００ｇ、１５分）によって４℃でペレット化した。結合研究は、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する０．４ｍＬの５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で膜（５００μｇタンパク質）を６０分間３７℃で、様々な濃度の［１２５Ｉ］ＺＡＧ（３，０００〜１５，０００ｃｐｍ）を用いて、１００μＭの非標識ＺＡＧの非存在または存在下で培養することによって行った。次いで膜は、１３，０００ｇで２０分間遠心分離することによって沈殿させ、上澄みを除去して、ペレットに結合される［１２５Ｉ］を、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｒｂｒａ  Ｍｏｄｅｌ５００５  Ａｕｔｏ−γカウンターを使用して定量した。結合は、非線形回帰分析を使用して分析した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０４）。特定の結合は、非放射性ＺＡＧによって置換される標識ＺＡＧの量として見なされた。
【０１８４】
ＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲ
３つのＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるβ１−、β２−、およびβ３−ＡＲに対するｍＲＮＡ転写の定量化は、既に説明されている方法論に基づく（Ｍｏｎｉｏｔｔｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｓｓａｎｇｅｒ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ３３：２１２１−２１３３，２００１）。全ＲＮＡをトリ試薬で抽出し、光度分析によって定量化して、８００±３４ｎｇの全ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素を使用し、４３℃で５０分間プライマーとして２０００ｐｍｏｌランダムヘキサマーと一緒に逆転写した。プローブ配列を選択して、マッチングプライマー対より約１０℃低いＴｍＳを得た。ＰＣＲは、製造者の指示にしたがって、Ｅａｓｙ−Ａ単管ＲＴ．ＰＣＲシステムを使用して行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間の変性、４２〜６５℃のアニーリングステップ、および６８℃で２分間の延長ステップ、および６８℃で１０分間の最終延長を含んだ。４０サイクルの増幅があった。β−ＡＲ  ｍＲＮＡの発現は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ  ＭｘＰｒｏ，ＱＰＣＲソフトウェアｖ３．００を使用して、Δ−ＣＴ法によって測定された。
【０１８５】
ウェスタンブロット分析
ＷＡＴ、ＢＡＴ，心臓、および腓腹筋を解凍し、ＰＢＳ中で洗浄して、室温で５分間、Ｐｈｏｓｐｈａｓａｆｅ（商標）抽出試薬に溶解した後、４℃で超音波処理した。１８，０００ｇで５分間、４℃で遠心分離することによって形成された上澄みをウェスタンブロットに使用した。サイトゾルタンパク質（ＵＣＰの場合５μｇ、β−ＡＲの場合２０μｇ）を、１８０Ｖで約１時間、電気泳動によって１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上で溶解し、４℃で一晩、トリス緩衝食塩水（ｐＨ７．５）中の５％（ｗ／ｖ）非脂肪粉乳（Ｍａｒｖｅｌ）で遮断された０．４５μｍニトロセルロース膜の上に移した。一次抗体を添加する前に、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０緩衝食塩水中で１５分間洗浄した。一次抗体および二次抗体の両方は、１：１０００の希釈で使用した。室温で１時間培養し、ＥＣＬによって発育した。濃度計によってブロットを走査し、差を定量化した。
【０１８６】
脂肪組織および骨格筋へのグルコースの取り込み
新たに単離された精巣上体脂肪細胞および腓腹筋への２−［１−１４Ｃ］デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）の取り込みは、以前に説明されるように測定した（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＳＴ  ａｎｄ  Ｔｉｓｄａｌｅ  ＭＪ，Ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｚｉｎｃ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｏｂ／ｏｂ  ｍｉｃｅ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １５１：９４８−９５７，２０１０）。
【０１８７】
統計解析
結果は、少なくとも３つの複製実験の平均±ＳＥＭとして示される。群間の平均の差は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて、テューキー−クレーマー多重比較試験によって決定した。０．０５未満のＰ値が有意であると見なされた。
【０１８８】
ヒトβ１、β２、およびβ３−ＡＲで形質転換されたＣＨＯ細胞におけるサイクリックＡＭＰ産生に対するヒトＺＡＧの効果は、図５１に示される。低濃度では（最高４６０ｎＭ）、β３−ＡＲで形質転換された細胞においてのみサイクリックＡＭＰ産生が特異的に刺激された（図５１Ａ）。しかしながら、５８０ｎＭでは、β２−ＡＲで形質転換されたＣＨＯ細胞におけるサイクリックＡＭＰ値の著しい増加も見られたが、変化の程度は、β３−ＡＲで形質転換された細胞の場合よりも少なかった。任意のＺＡＧ濃度において、β１−ＡＲで形質転換されたＣＨＯ細胞におけるサイクリックＡＭＰは増加しなかった（図５１Ａ）。対照的に、イソプレナリン（１０μＭ）は、β１−、β２−、およびβ３−ＡＲで形質転換されたＣＨＯ細胞におけるサイクリックＡＭＰ値の著しい増加を示し、β−ＡＲの３つのイソフォームに対する特異性の欠如を示す（図５１Ｂ）。β１−、β２−、およびβ３−ＡＲを通して、イソプレナリンによるサイクリックＡＭＰの増加は、ＳＲ５９２３０Ａによって減衰され、β３−ＡＲに対するこの薬剤の特異性の欠如を示す。
【０１８９】
β−ＡＲの発現が３つの細胞系において同一であるか否かを決定するために、説明されるＲＴ−ＰＣＲによって、β１−ＡＲ、β２−ＡＲ、およびβ３−ＡＲのｍＲＮＡ値を測定した（Ｍｏｎｉｏｔｔｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｓｓａｎｇｅｒ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ３３：２１２１−２１３３，２００１）。図５１Ｃのデータは、各β−ＡＲの発現レベルが、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに関して同一であることを示す。さらに、アデニル酸シクラーゼの値もまた、ホルスコリンの存在下でのサイクリックＡＭＰ産生によって決定されるように、３つの細胞系において同様であった（図５１Ｄ）。これらの結果は、３つの細胞系におけるβ−ＡＲの間の比較が有効であることを示唆する。
【０１９０】
３つのβ−ＡＲに対するＺＡＧの結合親和性は、１２５Ｉ  標識されたＺＡＧおよびＣＨＯ−Ｋ１、β１、β２、およびβ３細胞からの粗膜を使用して測定した（図５１Ｅ、Ｆ、およびＧ）。非線形回帰分析を使用してデータを評価し、ＫｄおよびＢｍａｘ値を示す。図５１Ａに示されるように、結合データは、ＺＡＧによるサイクリックＡＭＰ産生の刺激を反映する。したがって、ＺＡＧは、主にβ３−ＡＲ（高Ｂｍａｘおよび最低Ｋｄ）に結合し、β２−ＡＲ（Ｂｍａｘはβ３−ＡＲの２０％、Ｋｄはβ３−ＡＲの２倍）に対してはそれよりも少なく、β１−ＡＲに対してはまったく結合しなかった（Ｂｍａｘなし、高Ｋｄ）。非特異的結合は、１００μＭの非標識ＺＡＧの存在下で、［１２５Ｉ］ＺＡＧを結合することによって測定され、これらの値を総結合から控除して、特異的結合値を得た。ＺＡＧの脂肪分解活性は、恐らくタンパク質の構造変化に起因して、単一の凍結解凍サイクルによって破壊されることが示された（図５１Ｈ）。これがβ−ＡＲへの結合を破壊したか否かを決定するために、２つの実験を行った。（ｉ）凍結／解凍された［１２５Ｉ］ＺＡＧを結合研究に使用し、β２−およびβ３−ＡＲへの結合を完全に減衰した（図５１ＦおよびＧ）。（ｉｉ）上記非特異的結合の測定の場合と同様に、凍結／解凍された非標識ＺＡＧを［１２５Ｉ］ＺＡＧとの競合アッセイに使用した。新鮮な非標識ＺＡＧとは対照的に、これは、β２−ＡＲまたはβ３−ＡＲに結合するためのＫｄまたはＢｍａｘのいずれかに対する効果を有しない。これらの結果は、β−ＡＲへの結合を防ぐことによって、凍結／解凍ＺＡＧが生物活性を破壊することを示唆する。 
【０１９１】
体重およびインスリン感作に対するＺＡＧの効果がβ−ＡＲとの相互作用に起因するか否かを決定するために、以前に報告されているように（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＳＴ  ａｎｄ  Ｔｉｓｄａｌｅ  ＭＪ，Ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｚｉｎｃ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｏｂ／ｏｂ  ｍｉｃｅ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １５１：９４８−９５７，２０１０）、非特異性β−ＡＲ拮抗薬プロパノロール（４０ｍｇｋｇ−１、ｐｏ、連日）の非存在および存在下、ｏｂ／ｏｂマウスをＺＡＧ（５０μｇ、ｉｖ、連日）で処置した。β３−ＡＲ作動薬の効果に対抗するためにより高いレベルが必要とされるため、この用量レベルは、β２−ＡＲ作動薬とともに一般に用いられるレベルよりも高い（Ｌｉｕ  ＹＬ  ａｎｄ  Ｓｔｏｃｋ  ＭＪ，Ａｃｕｔｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ  ３−ａｄｒｅｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ，ＢＲＬ  ３５１３５，ｏｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１４：８８８−８９４，１９９５）。プロパノロールは、ＺＡＧによってもたらされた体重の減少を完全に減衰したが（図５２Ａ）、プロパノロール単独で処置された動物は、ＰＢＳ対照のような大幅な体重増加を示さなかった。以前に報告されているように（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＳＴ  ａｎｄ  Ｔｉｓｄａｌｅ  ＭＪ，Ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｚｉｎｃ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｏｂ／ｏｂ  ｍｉｃｅ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １５１：９４８−９５７，２０１０）、ＺＡＧで処置されたマウスは、体温の増加を示し（図５２Ｂ）、これは、尿中のグルコース分泌の減少に見られるように、プロパノロールによって完全に減衰された（図５２Ｃ）。ＺＡＧ単独では、肝脂肪に対する効果を有しなかったが、いくらかのグリコーゲンの増加が見られた（図５２Ｄ）。またプロパノロールは、ピーク血漿グルコース値、経口ブドウ糖負荷試験においてＺＡＧによって誘発されたグルコース曲線下の面積（ＡＵＣ）（図５３Ａ）、ならびに対応するピーク血漿インスリン値の減少（図５３Ｂ）も遮断した。ＺＡＧで処置された動物は、インスリンの存在下（１０ｎＭ）、腓腹筋へのグルコース取り込みの増加を示し（図５３Ｃ）、これは、プロパノロールを受容しているマウスから得た腓腹筋において完全に減衰された。ＺＡＧで処置されたマウスから得た精巣上体脂肪細胞は、インスリンの非存在および存在下で、グルコース取り込みの増強も示し（図５３Ｄ）、これもまたプロパノロールで処置された動物において完全に減衰された。ＺＡＧによってもたらされたトリグリセリド（ＴＧ）および非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）の血漿値の減少もプロプラノロールによって減衰された（図５３ＥおよびＦ）。これらの結果は、ＺＡＧの生物学的効果が、β−ＡＲを通して媒介されることを示唆する。ＺＡＧがインスリンシグナル伝達を増加し得るか否かを決定するために、Ｇｌｕｔ４発現に対する効果を測定した。インスリンおよびＺＡＧはいずれも、腓腹筋（図５３Ｇ）およびＷＡＴ（図５３Ｈ）においてＧｌｕｔ４の発現を増加させたが、この組み合わせは、インスリン単独でのそれを上回る増加���もたらさなかった。これらの結果は、ＺＡＧがインスリンと同一のシグナル伝達経路に影響するが、インスリンシグナル伝達を増加させないことを示唆する。
【０１９２】
多数のβ３−作動薬は、β３−ＡＲの発現を増加させることが知られている。ＺＡＧが同一の効果を有するか否かを決定するために、ＺＡＧによるｏｂ／ｏｂマウスの処置の５日後に、組織β３−ＡＲの発現をウェスタンブロットによって定量化した。図５４の結果は、腓腹筋におけるβ３−ＡＲ発現の２倍増加（図５４Ａ）、ＢＡＴにおける８９％の増加（図５４Ｂ）、およびＷＡＴにおける８５％の増加（図５４Ｃ）を示す。対照的に、腓腹筋（図５５Ａ）またはＷＡＴ（図５５Ｂ）のいずれかにおいてβ１−ＡＲまたはβ２−ＡＲの発現、および心臓におけるβ１−ＡＲの発現（図５５Ｃ）に変化はないが、β２−ＡＲにはわずかな増加が見られ、有意に達した（図５５Ｃ）。
【０１９３】
ＢＡＴおよびＷＡＴにおけるβ３−ＡＲの発現の増加（図５４）は、ＵＣＰ１の発現の増加に至ると予想され、ＺＡＧ投与後にＢＡＴ（図５６Ａ）およびＷＡＴ（図５６Ｂ）の両方において観測される。インビトロ実験は、ＺＡＧによるＵＣＰ３の発現の誘発が、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）阻害剤ＰＤ９８０５９によって減衰されたことを示し、この過程におけるＭＡＰＫの関与を示唆した。以前の研究は、ＺＡＧで処置したマウスのＷＡＴにおけるＥＲＫ発現の増加を示した。これは、観測されたように、ＷＡＴにおけるＵＣＰ３の発現の増加に至ると予想された（図５６Ｃ）。ＺＡＧ投与後のｏｂ／ｏｂマウスの骨格筋におけるＵＣＰ３の増加も以前に報告されている。ＵＣＰの発現の増加は、脂肪組織から放出されたＮＥＦＡのシンクを提供し、以前に報告されているように熱を発生する。
【０１９４】
さらに、ＺＡＧによる処置は、骨格筋におけるＡＭＰＫの発現の増加をもたらし（図５６Ｄ）、長鎖脂肪酸の酸化の増加に至り、トリグリセリドの合成に対するアベイラビリティを減少させるとともに、ＧＬＵＴ４の発現の増加を通してグルコースの取り込みを刺激する。
【０１９５】
この研究は、ＺＡＧが主にβ３−ＡＲに結合し、β２−ＡＲに対しては中間結合し、β１−ＡＲには結合しないことがわかった。ヒトβ３−ＡＲは、β１−ＡＲに対するアミノ酸配列において５１％相同であり、β２−ＡＲに対して４６％相同である。β３−ＡＲに結合するＺＡＧのＢｍａｘは、β２−ＡＲの約３倍であるが、Ｋｄは約半分である。β３−ＡＲに結合するためのＺＡＧのＫｄは、部分的作動薬であるＣＧＰ１２１７７よりも約１００倍低く、Ｂｍａｘはわずかに低い。これらの結果は、天然ＺＡＧに対する非等価結合活性を有し得る［１２５Ｉ］ＺＡＧを使用して得られ、Ｋｄの推定値以上または未満になり得る。ＺＡＧを用いる研究の大部分は、齧歯類において実行されたが、ヒトβ３−ＡＲと齧歯類β３−ＡＲとの間には差がある。したがって、ＢＲＬ３７３４４は、ヒトβ３−ＡＲを介してアデニリルシクラーゼを刺激することにおいて、齧歯類β３−ＡＲよりも有効性は低いが、ＣＧＰ１２１７７は、ヒトβ３−ＡＲにおいて有効な作動薬であるが、ラットβ３−ＡＲでは有効でない部分的作動薬である。ＺＡＧがどのようにβ３−ＡＲおよびβ２−ＡＲに結合する一方でβ１−ＡＲに結合しないかは知られていないが、結合は単一の冷凍／解凍サイクルによって破壊されるため、タンパク質の構造は非常に重要であり、マウス脂肪細胞における脂肪分解を刺激するＺＡＧの能力も同様である。Ｋｄ値は、脂肪分解の刺激およびＺＡＧによるサイクリックＡＭＰ産生に対する研究からいずれも予想される範囲内である。しかしながら、それらは、ＥＬＩＳＡを使用して報告されるヒト血漿濃度よりも１０倍以上低いが（６００ｎＭ）、質量分析を使用して報告されるものに相当する（８５ｎＭ）。前者の値が真である場合、ＺＡＧは、正常な血漿濃度でβ２−およびβ３−ＡＲを最大限に刺激しているというのは明らかに誤りである。抗ＺＡＧ抗体に結合する他の構成要素が存在し、明らかに高い濃度を付与し得るため、ＥＬＩＳＡを使用してＺＡＧの血漿濃度を解釈する際には、注意が必要である。したがって、ＺＡＧは、増加量の尿ＺＡＧを含有する試料において明らかに高い値を付与する、モノクローナル抗ヒトエリトロポエチン抗体に対して非特異的に結合することが示された。
【０１９６】
ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおける肥満および糖尿病に対するＺＡＧの効果は、β３−ＡＲに結合するその能力に起因し得る。したがって、β３−ＡＲ作動薬は、ＺＡＧに類似する齧歯類モデルにおいて抗肥満効果を示し、ＷＡＴデポーからのトリグリセリドの移動の増加、脂肪酸化の増加、およびＢＡＴ媒介性発熱の増加を誘発し、結果として体脂肪の選択的低減および除脂肪量の保存をもたらした。ＺＡＧと同様に、β３−ＡＲ作動薬の抗糖尿病効果は、抗肥満効果から独立し、体重減少を誘発しない投与量で発生する。β３−ＡＲ作動薬ＢＲＬ３５１３５によるｏｂ／ｏｂマウスの処置は、血漿グルコース値を正常化し、血漿インスリンおよび非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）値を著しく減少させた。ＺＡＧと同様に、ＢＲＬ３５１３５は、インスリンの作用から独立して、骨格筋、ＢＡＴ、ＷＡＴ、心臓および横隔膜の３種へのグルコース取り込みを刺激した。別のβ３−作動薬Ｌ−７９６５６８は、単回投与として投与されると、肥満のヒトにおける脂肪分解およびエネルギー消費を増加させた。しかしながら、２８日間の処置は、トリアシルグリセロール濃度を低下させたが、主要な脂肪分解または発熱効果を有しなかった。これは、ヒトにおけるβ３−ＡＲ反応組織の不十分な動員、または慢性投与に伴うβ３−ＡＲの下方調節に起因し得る。ヒト皮下腹部脂肪組織における研究は、β３−ＡＲが齧歯類において見られるよりも脂肪分解の管理において果たす役割が弱いこと、および脂質の動員が主にβ１およびβ２−ＡＲサブタイプを通してであることを示す。したがって、ＺＡＧは、ヒトにおいて、β３−ＡＲよりもβ２−ＡＲを介してその効果を発揮し得る。
【０１９７】
この研究は、プロパノロール、非特異的β−ＡＲ拮抗薬が、高用量で投与されると、体重および尿中グルコース分泌の減少、体温の上昇、経口ブドウ糖負荷試験におけるグルコースに対する反応の改善、およびｏｂ／ｏｂマウスの骨格筋およびＷＡＴへのグルコースの取り込みの増加において、ＺＡＧの効果を減衰させることを示した。さらに、ＷＡＴにおいて脂肪分解を誘発するＺＡＧの能力を破壊し、老齢の肥満マウスにおいて体脂肪を低減させる凍結−解凍もまた、ヒトβ２−およびβ３−ＡＲに結合するその能力を完全に減衰させる。これらの結果は、ＺＡＧの抗肥満および抗糖尿病効果が、β−ＡＲを通して媒介されることを確認する。
【０１９８】
この研究は、ｏｂ／ｏｂマウスに対するＺＡＧの投与が、ＢＡＴ、ＷＡＴ、および骨格筋において、β３−ＡＲタンパク質の発現を増加させることも示した。この効果は、他のβ３−ＡＲ作動薬を用いても見られる。したがって、β３−ＡＲ作動薬ＢＲＬ３５１３５によるｏｂ／ｏｂマウスの長期処置は、ＢＡＴにおいてβ３−ＡＲ  ｍＲＮＡの２倍増加をもたらした。同様の効果は、別のβ３−ＡＲ作動薬ＣＬ３１６２４３をザッカーｆａ／ｆａラット、および成人の脂肪細胞において用いた場合に報告された。したがって、ＺＡＧがβ３−ＡＲの発現を誘発する能力は、肥満および糖尿病に対するその効果を増強する。肥満対象に見られるβ−ＡＲ媒介性脂肪分解および脂肪酸化の低減は、低いＺＡＧ値に起因する場合があり、ＺＡＧの投与は感受性を向上させ得る。明らかに、ｏｂ／ｏｂマウスへのＺＡＧ投与は、β３−ＡＲ作動薬、ＢＲＬ３７３４４の脂肪分解効果に対する精巣上体脂肪細胞の感受性を高めた。β３−ＡＲの発現を誘発するＺＡＧの能力は、β３−ＡＲ作動薬ＣＬ３１６２４３の脂肪分解効果に対するＺＡＧ「ノックアウトマウス」から得た脂肪組織の反応の欠如を説明する。
【０１９９】
ノックアウトマウスを使用して、β３−ＡＲ刺激の抗肥満効果は、ＷＡＴから放出された脂肪酸のＵＣＰ−１依存性分解を経由することが示された。近年まで、ＢＡＴは、齧歯類およびヒト新生児に限定されると考えられていた。しかしながら、３つの独立した研究は、決定的に、主に下顎部および鎖骨の筋肉の背後にある成人のにおいて、ならびに胸部腹部の脊椎に沿ってＢＡＴを同定した。β３−ＡＲ作動薬は、ＢＡＴへのＷＡＴのリモデリングを刺激することが示され、組織学的に、またはＵＣＰ１の外観によって決定された。ＺＡＧに応答するＷＡＴ内のＵＣＰ１の外観は、同様の過程を開始することを示唆する。以前の研究は、ＺＡＧによるＵＣＰ１の誘発におけるβ３−ＡＲの役割を示唆した。β３−ＡＲ作動薬は、サイクリックＡＭＰ／タンパク質キナーゼＡの下流でｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ）の刺激を介して、ＢＡＴにおけるＵＣＰ１の上方調節を誘発して、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）γコアクチベータ１（ＰＣＧ−１α）、ならびにＡＴＦ−２の活性化（リン酸化）をもたらし、ＵＣＰ１増強剤のＣＲＥおよびＰＰＡＲ要素を従事させることが示された。
【０２００】
ＺＡＧは、β３−ＡＲに対して選択的作動薬活性を有する、自然発生するリガンドである。ごくわずかなタンパク質がそのような活性を示すが、降圧ペプチドアドレノメデュリンもβ３−ＡＲを活性化し、回腸筋の弛緩をもたらす。ＺＡＧは、正常なカテコールアミン作動薬よりもはるかに大きいため、活性がアロステリック調節を介して発生することが可能である。しかしながら、ＬＭＦを使用する以前の研究は、プロプラノロールによって完全に減衰されるように結合することが示され、β３−ＡＲとの直接相互作用を示唆する。証拠は、脂肪分解因子のトリプシン断片（Ｍｒ約５ｋＤａ）が依然として生物学的に活性であることを示唆したため、ＺＡＧ分子の一部のみが、結合に必要である可能性がある。セリンヒドロキシル等のアミノ酸の所定の群は、カテコールアミンとβ３−ＡＲとの間に見られる水素結合相互作用を模倣することが可能である。分子モデリング研究は、関与する相互作用に関するさらなる情報を提供し得る。ＢＲＬ３７３４４等のβ３−ＡＲ作動薬は、脂肪細胞におけるＺＡＧ発現の増加を示し、ＺＡＧによるＺＡＧ発現の誘発は、β３−ＡＲを介して発生することも示唆された。したがって、β３−ＡＲは、ＺＡＧの産生および生物学的効果の両方に重要であり、ＺＡＧは、β２−およびβ３−ＡＲの天然作動薬である。
【０２０１】
実施例９
悪液質の処置に対する骨格筋合成の亜鉛−α２−糖タンパク質
研究の目標は、ＺＡＧで処置されたとき、ｏｂ／ｏｂマウスにおける正味タンパク質獲得の機構を探索することである。いくつかのＺＡＧ処置実験において、ｏｂ／ｏｂマウスは、大幅に体脂肪が減少するが、同時に（相殺）量の筋肉量をタンパク質として得ることが観測される。
【０２０２】
タンパク質合成は、フェノールレッドの非存在下、３７℃で２時間培養することにより、酸不溶性材料へのＬ−［２，６−３Ｈ］フェニルアラニンの組み込みによって測定し、Ｏ２ＣＯ２（９５：５）で飽和した。タンパク質合成率は、タンパク質結合放射能の量を酸可溶性放射能の量で割ることによって計算した。
【０２０３】
タンパク質分解は、５ｍＭグルコースおよび０．５ｍＭシクロヘキシミドを含有する酸化Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｉｔ緩衝液中で２時間以上、腓腹筋からチロシン（２１）を放出することによって測定した。
【０２０４】
図３０に示される結果は、骨格筋における正味タンパク質獲得が、タンパク質分解の減速およびタンパク質合成の増加の両方の結果であることを示す。
【０２０５】
実施例１０
体重減少およびグルコース低減のための亜鉛−α２−糖タンパク質の経口投与
研究の目標は、長期にわたる脂肪減少ならびに血漿および尿中グルコース値の低下を介して、およびＺＡＧの経口投与によって体重減少を生じる、ＺＡＧの能力を探索することである。驚くべきことに、経口投与された組み換えヒトＺＡＧは、組み換えヒトＺＡＧの静脈内投与として同一の反応群を生じることができ、体内の消化空間から血漿空間に進入せずにそれを行うことができた。新規の作用機構は、消化空間に存在する組み換えヒトＺＡＧのシグナルを形質導入するように作動し、図３４および３５に見られるように、血漿空間、ＷＡＴ、および他の組織における内因性マウスＺＡＧの生成を引き起こす。
【０２０６】
５０μｇ／日のｒｈＺＡＧをアストンｏｂ／ｏｂマウスに経口投与した。経口投与は、水の消費を５ｍＬ／日と想定し、その想定に基づいて、５０μｇ／日用量を達成するようにＺＡＧを添加することによって得られた。所与の日における消費の変動を訂正する試みは為されなかった。
【０２０７】
ＺＡＧの経口投与は、概して、静脈投与によって得られた結果を複製する。この広範囲の効果には、大幅な体重減少（図３１、３６、４１、４７）、エネルギー消費の増加を象徴する体温のわずかな上昇（図３２、３７、４３）、尿および血漿グルコースの低下（図３３、４２）、および経口ブドウ糖負荷試験に対する反応の著しい向上（図４０、４８）が挙げられる。
【０２０８】
作用機構は、決定的な相違はあるが、静脈注射のそれを模倣する。これらの機構は、ＷＡＴ、ＢＡＴ、血漿、肝臓、および骨格筋における広範囲の同一の反応があるという点で類似している。決定的な差異は、経口投与されたｒｈＺＡＧは、血液および体内の臓器によって占拠される空間に決して進入しないことである。代わりに、投与されたｒｈＺＡＧは、消化系空間に滞留し、胃内に２４時間以上存続する。機構における驚くべき決定的な差異は、動物がその内因性ＺＡＧを形成することによって、ｒｈＺＡＧの経口投与に反応することであり、上に列挙された後続の反応群を媒介する。 
【０２０９】
３つの実験を以下に説明する。
【０２１０】
実験１（８日間の経口ＺＡＧ研究）：５０μｇのＺＡＧを飲料水に混ぜて連日経口投与した。体重減少、体温の上昇、および尿中グルコースの低下が起こったことが観測された。血清およびＷＡＴ中のマウスＺＡＧの増加は、血清中のｒｈＺＡＧの非存在下で、経口投与されたｒｈＺＡＧがマウスＺＡＧの発現を上方調節することを証明する。 
【０２１１】
実験２（８日間の経口ＺＡＧ＋プロプラノロール研究）：５０μｇのＺＡＧを、プロプラノロールの存在および非存在下で連日投与した。プロパノロールは、負荷試験において、体重および血糖の減少を含むＺＡＧの効果のすべてを遮断し、体温の上昇および血漿マウスＺＡＧの上昇も遮断して、これがβアドレナリン受容体を介して起こることを確認する。プロプラノロールは、ＺＡＧによる体重減少ならびに体温の上昇を完全に減衰する。ｒｈＺＡＧの経口投与後に、血清中のマウスＺＡＧの上昇を防ぐことによってこれを行うと考えられる。第２のブロットは、ｒｈＺＡＧが血流に移行することなく、消化管内に隔離されたままである場合に予想されるように、血清中にｒｈＺＡＧは存在しないことを示す。
【０２１２】
したがって、経口ＺＡＧは、消化管βアドレナリン受容体に結合することによって作用し、血清ＺＡＧの上昇、ならびに結果として起こる体重および血糖に対する効果をもたらす。図３８は、ｒｈＺＡＧによる経口処置に起因して、プロプラノロールがマウス血清ＺＡＧの増加を遮断することを示す。追加として、図３９は、ヒトＺＡＧがマウス血清において検出されないことを示す。
【０２１３】
実験３（経口研究）：ＺＡＧを長期間にわたって連日経口投与し、３０日目から始めて、処置群から回復群を分離した（データ図示せず）。
【０２１４】
体重減少、体温、および尿中グルコースの減少は、静脈内注射によって得られた結果を模倣および拡張する。動物は、研究の中間で１３．５％も体重が減少した。処置研究期間の半分が経過した後、処置された動物は以下を示した。尿中グルコースにおいて、１２日経過後に対照に対して５０％の回復が起こり、研究期間の終了までに尿中グルコースの対照値に対して完全な回復が起こった（データ図示せず）。体重減少は１３．５％に達し、研究の最終日に、動物は対照体重に対してわずか４６％回復した（データ図示せず）。静脈内投与されるときのＺＡＧの作用と同様に、経口投与されたＺＡＧは、体重減少を引き起こしたが、活性の（図示せず）、食餌の消費（データ図示せず）、または水の消費（データ図示せず）に変化は見られなかった。
【０２１５】
実施例１１
亜鉛−α２−糖タンパク質の投与は、体脂肪の減少および骨格筋の筋肉量の同時獲得を達成する。
いくつかの実験において、ｏｂ／ｏｂマウスは、大幅に体脂肪が減少するが、（相殺）量の筋肉量をタンパク質として同時に獲得することが観測された。これについて探索したところ、正味タンパク質獲得は、タンパク質分解の減速およびタンパク質合成の同時増加に起因する（図３０）。
【０２１６】
実施例１２
静脈内投与と比較した亜鉛−α２−糖タンパク質の経口投与
研究の目標は、様々な投与経路を介したＺＡＧの有効性を比較することである。５０μｇのＺＡＧまたはＰＢＳ（対照）をマウスに経口投与した。結果は、図３１、３２、３３（８日間の経口ＺＡＧ研究）、図３６、３７、４０（８日間の経口ＺＡＧ＋プロプラノロール研究）、および図４７、４８（強制経口ＺＡＧ研究）において示される。これらの反復研究で示されるように、ＺＡＧは、予想外に、投与されたＺＡＧの全身吸収を必要とすることなく、単にマウスの飲料水に低用量のＺＡＧを混合することによって経口投与されるとき、体重変化をもたらすことにおいて有効であることが示された。インスリン等のタンパク質の典型的な経口用量は、同一レベルの有効性を達成するために、静脈内用量の最高１０倍（またはメガ用量）を必要とする場合があり、そのような制限された有効性は、そのようなタンパク質の全身吸収を必要とする。
【０２１７】
追加のデータが生成され（表６）、驚くべきことに、ＺＡＧの経口投与が、正確に同一用量で静脈内投与の体重減少の有効性の７５％をも達成した。また投与の５日後に、尿中グルコースを低下させる有効性は、経口または静脈内投与されたときと等しく良好である。
【０２１８】
ｒｈＺＡＧによる経口投与は、図３４、３５、および３８に示されるように、それに応じて動物に内因性ＺＡＧを生成させる。プロプラノロールは、ｒｈＺＡＧの経口処置に起因して、マウス血清ＺＡＧの増加を遮断するが（図３８）、投与されたヒトＺＡＧは、血漿中に見出されない（図３９）。
【０２１９】
図３８は、プロプラノロールの非存在または存在下、ＺＡＧの存在および非存在下で処置されたマウスから得たマウス血清中の抗マウスＺＡＧを使用したＺＡＧのウェスタンブロットである。ヒトＺＡＧは、マウス血清において検出されない。図３９は、プロプラノロールの非存在または存在下、ＺＡＧの存在および非存在下で処置されたマウスから得たマウス血清中の抗ヒトＺＡＧを使用するＺＡＧのウェスタンブロットである（図３９）。
【０２２０】
（表６）８または２０日間のＲＯＡによる７０ｇのｏｂ／ｏｂマウスにおける５０μｇ／日のＺＡＧの連日投与に起因する体重減少（および同一期間にわたる静脈投与の場合の減少％）
2013530981.tif 000009
(1) 事実上飲料水
(2) 胃に至る消化系経路（口、咽頭、食道）をバイパスして、ＺＡＧ用量を胃内に直接強制配置する。
(3) カゼインは、ＺＡＧとともに飲料水中に含まれた。
【０２２１】
本発明は、上記実施例を参照して説明されたが、修正および変型が本発明の主旨および範囲内に包含されることを理解されたい。したがって、本発明は、以下の請求項によってのみ限定される。
【図１Ａ】
2013530981.tif 000010
【図１Ｂ】
2013530981.tif 000011
【図１Ｃ】
2013530981.tif 000012
【図１Ｄ】
2013530981.tif 000013
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
2013530981.tif 000016
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2013530981.tif 000018
【図２Ｃ】
2013530981.tif 000019
【図２Ｄ】
2013530981.tif 000020
【図２Ｅ】
2013530981.tif 000021
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2013530981.tif 000023
【図３Ｃ】
2013530981.tif 000024
【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
2013530981.tif 000027
【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５２Ｃ】
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【図５２Ｄ】
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【図５２Ｅ】
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【図５２Ｆ】
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【図５２Ｇ】
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【図５２Ｈ】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５３Ｃ】
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【図５３Ｄ】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５４Ｃ】
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【図５４Ｄ】
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【図５４Ｅ】
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【図５４Ｆ】
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【図５４Ｇ】
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【図５４Ｈ】
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【図５５】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５６Ｃ】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５７Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2013530981.tif 000134
2013530981.tif 000135
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