(57)【要約】本発明はアッセイを行うための方法及び装置に関する。詳細には、本発明は、アッセイ（特に多工程アッセイ）を行うために用いることができる回転可能プラットフォームに関する。本発明は、回転可能プラットフォームであって、その表面の一以上の個別領域に第１の結合パートナーを固定化するようになっているか、又は該個別領域に第２の結合パートナーを選択的に固定化するようになっているプラットフォームを提供する。また、本発明は、アッセイを行うための方法、装置、キット及び該回転可能プラットフォームの使用にも関する。特に、本発明は、主にパイロシークエンシングによる核酸の配列決定に用いるために開発されたものであるが、本発明はこの分野に限定されない。
2013500021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アッセイを行うための回転可能プラットフォームであって、その表面の一以上の個別領域に第１の結合パートナーを固定化するようになっている回転可能プラットフォーム。
【請求項２】
前記プラットフォームの上面全体は、前記第１の結合パートナーを固定化するようになっている請求項１に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項３】
前記プラットフォームの前記表面に複数の個別領域が配列されている請求項１に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項４】
前記個別領域は、実質的に平坦である請求項３に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項５】
前記個別領域は、浅いウェルである請求項３に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項６】
前記浅いウェルは、体積が約０．５〜１００μＬであるか、又はウェルの深さが約０．５〜３ｍｍである請求項５に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項７】
前記個別領域は、前記回転可能プラットフォームの表面に対して相対的に隆起した部分である請求項３に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項８】
前記個別領域は、直径が約１〜５ｍｍである請求項３〜７のいずれか１項に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項９】
前記プラットフォームは実質的に円形ディスクであり、該ディスクの厚さは約１〜４ｍｍである請求項３〜８のいずれか１項に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項１０】
前記個別領域は、前記ディスクの外周囲に配置されている請求項９に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項１１】
前記ディスクの外周囲に約２〜５００個の個別領域が配置されている請求項１０に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項１２】
前記ディスクの直径は、約５０〜５００ｍｍである請求項９〜１１のいずれか１項に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項１３】
前記プラットフォームは、ポリカーボネート、ポリスチレン、高衝撃ポリスチレン、ポリエチレン及びポリプロピレンからなる群から選択されるプラスチック材料で形成されているか、又はガラス又は石英から形成されている先の請求項のいずれか１項に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項１４】
前記一以上の個別領域は、前記プラットフォーム上の被覆であり、前記被覆は前記第１の結合パートナーを固定化するようになっている先の請求項のいずれか１項に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項１５】
前記第１の結合パートナーは、前記プラットフォームの前記表面に化学的に吸着されるか、又は共有結合、イオン結合又は水素結合され、又は、ファンデルワールス力によって該第１の結合パートナーが該プラットフォームの該表面に固定化される先の請求項のいずれか１項に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項１６】
前記回転可能プラットフォームの回転時に、その表面から除去又は遠心分離される廃棄流体を受けるための該プラットフォームの外周に配置されたトラフを更に有する先の請求項のいずれか１項に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項１７】
アッセイを行うための方法であって、次の各工程：
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のプラットフォームを用意する工程と、
該プラットフォームの前記表面の一以上の個別領域に第１の結合パートナーを結合又は固定化させる工程と、
該各個別領域に一連の試薬を逐次的に接触させる工程とを含む方法であって、該接触工程の一以上又は全ての間に、該試薬のいかなる残存分又は未反応分も該各個別領域から実質的に遠心力で除去されるように該プラットフォームを回転させる方法。
【請求項１８】
一連の試薬の最初には第１の結合パートナーに対する第２の結合パートナーが含まれており、次の試薬は洗浄試薬又はリンス試薬から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記各接触工程時及び／又はその後にアッセイを解析する工程を更に含む請求項１７又は請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記試薬を分注しながら前記回転可能プラットフォームを約１０〜２００ｒｐｍの速度で回転させる工程と、該回転可能プラットフォームを約４００〜１０００ｒｐｍの速度で回転させて前記標的部位から該試薬を実質的に遠心力で除去する工程とを更に含む請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
アッセイを行うための請求項１〜１６のいずれか１項に記載のプラットフォームの使用。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のプラットフォームと、前記アッセイのための一以上の試薬とを含むキット。
【請求項２３】
アッセイを行うための装置であって、
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の前記プラットフォームを所定の制御可能でユーザが選択可能な回転速度で回転させる装置と、
必要に応じて、該プラットフォームの前記表面の前記一以上の個別領域に前記第１の結合パートナーを分注して、該第１の結合パートナーを該個別領域に固定化する装置と、
試薬を分注して該個別領域に接触させる装置と、
必要に応じて、洗浄試薬を分注する装置とを含む装置。
【請求項２４】
前記プラットフォームを回転させる前記装置はモータであり、所定の回転速度は約１０〜１０００ｒｐｍから選択可能である請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
前記回転可能プラットフォームから除去される廃棄試薬を抜き出す真空抽出システムを更に有する請求項２３又は請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記プラットフォームの外周に隣接して配置されたトラフを更に有し、回転可能プラットフォームの回転時に、その表面から除去される廃棄流体を該トラフが受けるようになっている請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２７】
アッセイを行うための回転可能プラットフォームであって、その表面の一以上の個別領域に第２の結合パートナーを選択的に固定化するようになっているプラットフォーム。
【請求項２８】
前記第２の結合パートナーは、前記プラットフォームの前記表面に既に結合している第１の結合パートナーに対して結合可能又は反応可能である請求項２７に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項２９】
前記プラットフォームの上面全体は、前記第２の結合パートナーを選択的に固定化するようになっている請求項２７又は請求項２８に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項３０】
前記プラットフォームの前記表面に複数の個別領域が配列されている請求項２７又は請求項２８に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項３１】
前記個別領域は、実質的に平坦である請求項３０に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項３２】
前記個別領域は、浅いウェルである請求項３０に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項３３】
前記浅いウェルは、体積が約０．５〜１００μＬであるか、又はウェルの深さが約０．５〜３ｍｍである請求項３２に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項３４】
前記個別領域は、前記回転可能プラットフォームの表面に対して相対的に隆起した部分である請求項３０に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項３５】
前記個別領域は、直径が約１〜５ｍｍである請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項３６】
前記プラットフォームは、実質的に円形ディスクであり、前記ディスクの厚さは約１〜４ｍｍである請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項３７】
前記個別領域は、前記ディスクの外周囲に配置されている請求項３６に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項３８】
前記ディスクの外周囲に約２〜５００個の個別領域が配置されている請求項３７に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項３９】
前記ディスクの直径は、約５０〜５００ｍｍである請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項４０】
前記プラットフォームは、ポリカーボネート、ポリスチレン、高衝撃ポリスチレン、ポリエチレン及びポリプロピレンからなる群から選択されるプラスチック材料で形成されているか、又はガラス又は石英から形成されている請求項２７〜３９のいずれか１項に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項４１】
前記一以上の個別領域は、前記プラットフォーム上の被覆であり、前記被覆は前記第１の結合パートナーを固定化するようになっている請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項４２】
前記第１の結合パートナーは、前記プラットフォームの前記表面に化学的に吸着されるか、又は共有結合、イオン結合又は水素結合され、又は、ファンデルワールス力によって該第１の結合パートナーが該プラットフォームの該表面に固定化される請求項２８〜４１のいずれか１項に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項４３】
前記回転可能プラットフォームの回転時に、その表面から除去又は遠心分離される廃棄流体を受けるための該プラットフォームの外周に配置されたトラフを更に有する請求項２９〜４２のいずれか１項に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項４４】
アッセイを行うための方法であって、次の各工程：
請求項２７〜４３のいずれか１項に記載のプラットフォームを用意する工程と、
該プラットフォームの前記表面の一以上の個別領域に第２の結合パートナーを選択的に結合又は固定化させる工程と、
前記各標的部位に一連の試薬を逐次的に接触させる工程とを含む方法であって、該接触工程の一以上又は全ての間に、該試薬のいかなる残存分又は未反応分も該標的部位から実質的に遠心力で除去されるように該プラットフォームを回転させる方法。
【請求項４５】
前記第２の結合パートナーは、前記プラットフォームの前記表面に既に結合している第１の結合パートナーに対して結合可能又は反応可能である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
次の試薬は、洗浄試薬又はリンス試薬から選択される請求項４４又は請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記各接触工程時及び／又はその後にアッセイを解析する工程を更に含む請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記試薬を分注しながら前記回転可能プラットフォームを約１０〜２００ｒｐｍの速度で回転させる工程と、該回転可能プラットフォームを約４００〜１０００ｒｐｍの速度で回転させて前記標的部位から試薬を実質的に遠心力で除去する工程とを更に含む請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
アッセイを行うための請求項２７〜４３のいずれか１項に記載のプラットフォームの使用。
【請求項５０】
請求項２７〜４３のいずれか１項に記載のプラットフォームと、前記アッセイのための一以上の試薬とを含むキット。
【請求項５１】
アッセイを行うための装置であって、
請求項２７〜４３のいずれか１項に記載の前記プラットフォームを所定の制御可能でユーザが選択可能な回転速度で回転させる装置と、
必要に応じて、該プラットフォームの前記表面の前記一以上の個別領域に前記第２の結合パートナーを分注して、該第２の結合パートナーを該個別領域に選択的に固定化する装置と、
試薬を分注して該個別領域に接触させる装置と、
必要に応じて、洗浄試薬を分注する装置とを含む装置。
【請求項５２】
前記プラットフォームを回転させる前記装置はモータであり、所定の回転速度は約１０〜１０００ｒｐｍから選択可能である請求項５１に記載の装置。
【請求項５３】
前記回転可能プラットフォームから除去される廃棄試薬を抜き出すための真空抽出システムを更に有する請求項５１又は請求項５２に記載の装置。
【請求項５４】
前記プラットフォームの外周に隣接して配置されたトラフを更に有し、回転可能プラットフォームの回転時にその表面から除去される廃棄流体を該トラフが受けるようになっている請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５５】
核酸鎖の配列決定を行う回転可能プラットフォームであって、その表面の一以上の個別領域に核酸鎖結合パートナーを固定化するようになっているプラットフォーム。
【請求項５６】
前記核酸鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその改変体である請求項５５に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項５７】
核酸鎖はビオチン化されており、核酸鎖結合パートナーは、ビオチン化核酸鎖を結合させるためのアビジン、ストレプトアビジン又はそのアナログを含む請求項５５又は請求項５６に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項５８】
核酸鎖の配列決定方法であって、次の各工程：
請求項５５〜５７のいずれか１項に記載のプラットフォームを用意する工程と、
前記個別領域に核酸鎖結合パートナーを結合又は固定化した後、該個別領域に核酸鎖を選択的に結合又は固定化する工程と、
必要に応じて、任意の相補核酸鎖を変性及び除去し、配列決定用プライマーを個別領域にアニーリングさせる工程と、
Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチド又はそれぞれの適切なヌクレオチドアナログを含む一連の試薬を該各個別領域に逐次的に接触させる工程とを含む方法であって、該接触工程の各々又はいずれかの間に、実質的にいかなる残存試薬又は未反応試薬も該個別領域から実質的に遠心力で除去されるように、該プラットフォームを回転させる方法。
【請求項５９】
Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチドを含む一連の試薬を前記各個別領域に逐次的に接触させる請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記逐次的な接触工程は、
ａ）各ヌクレオチド又はそのアナログを所望又は所定の順序で別々に逐次的に添加すること、又は
ｂ）Ａ＋Ｔ＋Ｇ＋Ｃヌクレオチド又はこれらの所定又は所望のサブセットを混合物として添加し、該混合物を再度添加する等を含む請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記各接触工程時及び／又はその後に前記核酸鎖を解析する工程を更に含む請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記解析は、光の出力を前記核酸鎖に結合したヌクレオチドの数と関連付けることによって該核酸鎖内の次の塩基対を検出することを含む請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
試薬及び前記酵素を分注しながら前記回転可能プラットフォームを約１０〜２００ｒｐｍで回転させて前記標的部位に添加した試薬が除去されないようにし、次いで前記洗浄試薬を分注しながら該プラットフォームを約４００〜１０００ｒｐｍで回転させる請求項５８〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記変性工程は、前記核酸鎖を加熱して変性させること、又は該核酸鎖を高ｐＨに曝露することを含む請求項５８〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記核酸鎖を変性した後に、リンス試薬を用いたリンス工程で該相補鎖を除去する工程を含む請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
試薬による前記標的部位の汚染を実質的になくすように、前記プラットフォームを回転させていかなる残存試薬も遠心力で除去することにより該標的部位を実質的に乾燥させることによって、該各標的部位を前記次の試薬の各々に対して準備する、請求項５８〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
核酸鎖の配列決定を行うための請求項５５〜５７のいずれか１項に記載のプラットフォームの使用。
【請求項６８】
請求項２７〜４３のいずれか１項に記載のプラットフォームと、核酸鎖の配列決定を行うための一以上の試薬とを含むキット。
【請求項６９】
核酸鎖の配列決定装置であって、
請求項５５〜５７のいずれか１項に記載のプラットフォームを所定の制御可能でユーザが選択可能な回転速度で回転させる装置と、
必要に応じて、前記個別領域に核酸鎖結合パートナーを分注して、該核酸鎖結合パートナーを該個別領域に固定化する装置と、
必要に応じて、該個別領域に核酸鎖を分注して、該核酸鎖を該個別領域に選択的に固定化する装置と、
必要に応じて、任意の相補核酸鎖を変性し、必要に応じて除去する装置と、
Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチド、該ヌクレオチドのそれぞれのアナログ、又はその組合せを分注して該個別領域に接触させる装置と、
洗浄試薬を分注する装置と、
必要に応じて、一以上の酵素溶液を分注する装置とを含む装置。
【請求項７０】
核酸鎖の配列決定を行う回転可能プラットフォームであって、その表面の一以上の個別領域に核酸鎖を選択的に固定化するようになっているプラットフォーム。
【請求項７１】
前記核酸鎖は、前記プラットフォームの前記表面に既に結合している第１の結合パートナーに対して結合可能又は反応可能である請求項５８に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項７２】
前記核酸鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその改変体である請求項７０又は請求項７１に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項７３】
核酸鎖はビオチン化されており、第１の結合パートナーは、ビオチン化核酸鎖を結合させるためのアビジン、ストレプトアビジン又はそのアナログを含む請求項７１又は請求項７２に記載の回転可能プラットフォーム。
【請求項７４】
核酸鎖の配列決定方法であって、次の各工程：
請求項７０〜７３のいずれか１項に記載のプラットフォームを用意する工程と、
前記個別領域に核酸鎖を選択的に結合又は固定化する工程と、
必要に応じて、任意の相補核酸鎖を変性及び除去し、配列決定用プライマーを該個別領域にアニーリングさせる工程と、
Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチド又はそれぞれの適切なヌクレオチドアナログを含む一連の試薬を該各個別領域に逐次的に接触させる工程とを含む方法であって、該接触工程の各々又はいずれかの間に、該試薬のいかなる残存分又は未反応分も該個別領域から実質的に遠心力で除去されるように該プラットフォームを回転させる方法。
【請求項７５】
前記個別領域には核酸鎖結合パートナーが既に固定化されており、前記核酸鎖は、該核酸鎖結合パートナーに選択的に結合する請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
核酸鎖の配列決定のための請求項７０〜７３のいずれか１項に記載のプラットフォームの使用。
【請求項７７】
核酸鎖の配列決定のための請求項７０〜７３のいずれか１項に記載のプラットフォームを含むキット。
【請求項７８】
核酸鎖の配列決定装置であって、
請求項７０〜７３のいずれか１項に記載の前記プラットフォームを所定の制御可能でユーザが選択可能な回転速度で回転させる装置と、
必要に応じて、前記個別領域に核酸鎖を分注して、該核酸鎖を該個別領域に選択的に固定化する装置と、
必要に応じて、任意の相補核酸鎖を変性し、必要に応じて除去する装置と、
Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチド、該ヌクレオチドのそれぞれのアナログ、又はその組合せを分注して該個別領域に接触させる装置と、
洗浄試薬を分注する装置と、
必要に応じて、一以上の酵素溶液を分注する装置とを含む装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアッセイを行うための方法及び装置に関する。詳細には、本発明は、アッセイ（特に多工程アッセイ）を行うために用いることができる回転可能プラットフォームに関する。本発明は、主にパイロシークエンシングによる核酸の配列決定に用いるために開発されたものである。以下、この用途に関して説明するが、本発明はこの特定の使用分野に限定されるものではない。
【背景技術】
【０００２】
以下、本発明の技術分野を適切に特定し、本発明の利点がより十分に理解できるようにするために先行技術の説明を行う。しかし、本明細書全体における如何なる先行技術の説明も、このような先行技術が広く知られている、又は当該分野における通常の一般知識の一部を構成するという明示又は暗黙の了解として理解されるべきではない。
【０００３】
ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定することは、最近ますます重要となっている。従来、ＤＮＡ配列決定には、酵素的連鎖停止方法及び化学的切断技法の二種が最も一般的に用いられてきており、いずれの方法も、大型のＤＮＡセグメントから生じたＤＮＡ断片をそのサイズに応じて分離するゲル電気泳動による手法である。電気泳動工程や分離ＤＮＡ断片の検出は煩雑な処置である。しかし、自動電気泳動ユニットが市販されてはいるものの、電気泳動は、ハイスループットの比較的費用対効果が高いユニットを必要とする臨床的配列決定や大規模のゲノムプロジェクトには適していない。従って、配列決定における非電気泳動方法の必要性は大きい。
【０００４】
単一のＤＮＡ塩基変化の迅速な検出を可能にする技法も遺伝子解析においては重要なツールである。固相原理に基づくミニ配列決定プロトコールが既に開示されているが、そのプロトコールにおいては、放射標識ヌクレオチドの取り込みが測定され、ヒトアポリポタンパク質Ｅ遺伝子の３種の対立遺伝子多型の解析に用いられている。しかし、放射標識による方法は通常の臨床用途には適していないため、迅速なＤＮＡ配列解析用の簡易な非放射性方法の開発も注目されている。
【０００５】
ポリメラーゼ反応時に放出される無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を検出する概念に基づく配列決定方法が既に開示されており（特許文献１及び２参照）、通常、パイロシークエンシングと称される。ポリメラーゼ反応時に成長核酸鎖に各ヌクレオチドを添加すると、ピロリン酸分子が放出される。このような条件下で放出されたピロリン酸は酵素的に（例えばルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光の発生によって）検出できることが見出されている。このような方法によって標的位置で塩基を同定することができ、ＤＮＡの配列決定を容易且つ迅速に行うことができると共に、電気泳動及び有害な放射標識を使用する必要性を回避することができる。
【０００６】
パイロシークエンシングを行うための初期の先行技術法では、０．２ｍＬの微量遠心チューブ（又は類似物）を用い、チューブに試薬を逐次的に添加してチューブ内に存在するＤＮＡの配列を決定している。この方法は比較的簡易ではあるが、ヌクレオチド試薬の各々の添加によって反応が弱まり、及び／又は反応副生物が蓄積し、反応がこれ以上進行しないポイントまで反応状態が到達するため、リード長が短いという問題を有する。例えば、この方法で確実に配列決定できるのは通常約８０塩基でしかない。
【０００７】
パイロシークエンシングを用いた市販装置も開発されている。このようなシステムではフローセルを用いて標的ＤＮＡ／ＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションを行う。すなわち、フローセル内に配置された固定ビーズに一本鎖ＤＮＡを固定化するが、通常は、二本鎖ＤＮＡを固定化し、相補鎖を変性させることによって行う。ヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ）を含む試薬をビーズに流し、ヌクレオチドが取り込まれた場合には光を検出する。光のシグナル強度は単一反応で取り込まれたヌクレオチドの数に比例する。ビーズを異なるヌクレオチドに曝露する間には洗浄工程も行い、このプロセスを繰り返して次のヌクレオチドの取り込みを検出する。
【０００８】
合成による他の配列決定方法（例えば、蛍光標識ヌクレオチドを用いた方法）も知られている。このような方法においては、ＤＮＡサンプルを先ず断片化し、ＤＮＡ二重らせんを融解して一本鎖にする。単一ＤＮＡ分子は、フローセル内の表面に捕捉され、合成プロセスによる配列決定の鋳型として機能する。蛍光標識ヌクレオチドを一個ずつ添加し、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって成長相補鎖に取り込ませる。未使用のヌクレオチドは洗い流される。レーザー照射の際、取り込まれたヌクレオチドは、検出される光を発する。蛍光標識を除去した後、次のヌクレオチドを添加してサイクルを継続する。ヌクレオチドの取り込みを追跡することによって、個々のＤＮＡ分子の正確な配列が決定される。
【０００９】
ライゲーションによる配列決定も知られている。このＤＮＡ配列決定方法では、ＤＮＡリガーゼ酵素を用いてＤＮＡ配列の所定位置に存在するヌクレオチドを同定する。ＤＮＡリガーゼ酵素のミスマッチ感受性を用いて標的ＤＮＡ分子の基礎配列を決定する。例えば、特許文献３及び４を参照することができる。
【００１０】
種々の化学及び検出方法で使用可能な、アッセイ及び解析を行うための装置が必要であり、特に、核酸の配列決定に用いるような複数の反応及び洗浄工程を伴うアッセイを行うための装置が必要である。また、フロースルー環境を必要とするアッセイに代わる、あるいは、核酸配列決定の際に希釈作用によって最大配列リード長が制限される固定反応容器アッセイに代わる簡便な手段として使用可能な装置が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９３／２３５６４号
【特許文献２】国際公開第８９／０９２８３号
【特許文献３】米国特許第５，７５０，３４１号
【特許文献４】米国特許第４，８８３，７５０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、上述の先行技術の一以上の問題点を克服又は改善すること、又は有用な代替手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、その第１の態様において、アッセイを行うための回転可能プラットフォームであって、その表面の一以上の個別領域（discrete area）に第１の結合パートナーを固定化するようになっているプラットフォームを提供する。
【００１４】
本発明は、その第２の態様において、アッセイを行うための回転可能プラットフォームであって、その表面の一以上の個別領域に第２の結合パートナーを選択的に固定化するようになっているプラットフォームを提供する。
【００１５】
一実施形態においては、プラットフォームの上面全体は、第１の結合パートナーを固定化するか、又は第２の結合パートナーを選択的に固定化するようになっている。しかし、他の実施形態においては、複数の個別領域、所定部位又は標的部位をプラットフォームの表面、あるいは、プラットフォームの表面に比較的容易に結合する二次的表面（例えば、ビーズ）に設けて、第１の結合パートナーを固定化するか、又は第２の結合パートナーを選択的に固定化する。他の例においては、個別領域は回転可能プラットフォーム上の被覆であって、当該被覆は第１の結合パートナーを固定化するようになっている。
【００１６】
幾つかの実施形態においては、第１の結合パートナーはプラットフォームの表面に化学的に吸着される。他の実施形態においては、第１の結合パートナーはプラットフォームの表面に共有結合、イオン結合又は水素結合され、更に他の実施形態においては、ファンデルワールス力によって第１の結合パートナーがプラットフォームの表面に保持される。プラットフォームの表面に既に結合している第１の結合パートナーに対し、第２の結合パートナーが結合可能又は反応可能であることは理解されるであろう。
【００１７】
本発明は、特に核酸配列決定法（例えば、パイロシークエンシング）等の方法やアッセイに関する。例えば、第１及び第２の結合パートナーは結合パートナー対（必要に応じて、その内の一方を検出可能に標識することができる）であり、アビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアクチン又はそのアナログ、及びビオチン又はそのアナログから選択することが好ましい。
【００１８】
しかし、更に後述するように、本発明の利点は、洗浄工程を比較的迅速且つ比較的簡易にして、付随する洗浄溶液や試薬の廃棄量を削減することにある。
【００１９】
本発明をパイロシークエンシングの場合について説明するが、本発明はこのアッセイに限定されるものではない。
【００２０】
第１の態様においては、プラットフォームは、第１の結合パートナー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアクチン又はそのアナログとすることができる）を固定化するようになっており、次のプロセシング工程でアビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアクチン又はそのアナログを例えば、ビオチン化ＤＮＡと反応させることができる。また、第２の態様においては、プラットフォームは既に第１の結合パートナーを有しており、プラットフォームは第２の結合パートナーを選択的に固定化するようになっている。従って、第１の態様に記載のプラットフォームは「機能化されていない」と見なすことができ、第２の態様に記載のプラットフォームは「機能化されている」又は「予備機能化されている」と見なすことができる。
【００２１】
本発明は、その第３の態様において、アッセイを行うための方法であって、次の各工程：
第１の態様に記載のプラットフォームを用意する工程と、
前記プラットフォームの前記表面又は前記プラットフォームの表面に埋め込まれた表面（例えば、ビーズ）の一以上の個別領域に第１の結合パートナーを結合又は固定化させる工程と、
前記各個別領域に一連の試薬を逐次的に接触させる工程とを含む方法であって、前記接触工程の一以上又は全ての間に、前記試薬のいかなる残存分又は未反応分も前記各個別領域から実質的に遠心力で除去されるように前記プラットフォームを回転させる方法を提供する。
【００２２】
最初の一連の試薬は第１の結合パートナーに対する第２の又は相補的結合パートナーを含み、次の試薬は、更に後述するように、例えば、洗浄試薬やリンス試薬から選択することが好ましい。
【００２３】
本発明は、その第４の態様において、アッセイを行うための方法であって、次の各工程：
第２の態様に記載のプラットフォームを用意する工程と、
前記プラットフォームの前記表面又は該プラットフォームに埋め込まれた表面の一以上の個別領域に第２の結合パートナーを選択的に結合又は固定化させる工程と、
前記各標的部位に一連の試薬を逐次的に接触させる工程とを含む方法であって、前記接触工程の一以上又は全ての間に、前記試薬のいかなる残存分又は未反応分も前記標的部位から実質的に遠心力で除去されるように前記プラットフォームを回転させる方法を提供する。
【００２４】
本発明の方法は、前記各接触工程時及び／又はその後にアッセイを解析する工程を更に含むことが好ましい。好ましい実施形態においては、個別領域に次の試薬を接触させる前に、前記各個別領域を洗浄試薬を用いた洗浄工程又はリンス工程に付す。洗浄試薬は、先の接触工程からの残存溶液を実質的に洗い流すことができるか、又は残存溶液の量及び前記溶液に存在する成分の量を削減することが可能ないかなる試薬（例えば、副生物を分解するか、又は副生物の濃度を低下させるアピラーゼや他の適切な酵素等の活性剤）であってもよい。
【００２５】
洗浄試薬は、先の接触工程からの残存溶液を実質的に洗い流すことができるか、又は残存溶液の量及び前記溶液に存在する成分の量を削減することが可能ないかなる試薬であってもよく、アピラーゼ等の活性剤もよく、他の実施形態においては、マシャエキ（Mashayekhi）Ｆ．及びロナギ（Ronaghi）Ｍ．、パイロシークエンシング化学におけるリード長制限因子の解析、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００７）、３６３（２）：２７５〜２８７に詳述のように、余分な核酸を除去するための洗浄工程ではアピラーゼを用いないことが好ましい（該文献の全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する）。マシャエキ（Mashayekhi）らによって詳述されているように、前記洗浄工程をアピラーゼを用いない洗浄工程に置き換えることによって、パイロシークエンシングのリード長が改善されることが示されている。
【００２６】
試薬を分注しながら回転可能プラットフォームを低速度（例えば、約１０〜２００ｒｐｍ）で回転させて標的部位に添加した試薬が除去されないようにし、また、試薬を分注しながら回転可能プラットフォームを高速度（例えば、約４００〜１０００ｒｐｍ）で回転させることが好ましい。しかし、他の回転速度も可能である。
【００２７】
好ましい実施形態においては、前記プラットフォームを回転させていかなる残存試薬も遠心力で除去することにより、前記個別領域を実質的に「乾燥する」ことによって、前記各個別領域を次の前記各試薬に向けて準備する。こうすることによって、前工程からの試薬で前記個別領域が汚染されることを実質的に抑制する（好ましくは実質的になくす）。
【００２８】
本発明は、その第５の態様において、アッセイを行うための第１又は第２の態様に記載のプラットフォームの使用を提供する。
【００２９】
本発明は、その第６の態様において、第１又は第２の態様に記載のプラットフォームと、前記アッセイのための一以上の試薬とを含むキットを提供する。
【００３０】
本発明は、その第７の態様において、アッセイを行うための装置であって、
前記第１又は第２の態様に記載の前記プラットフォームを所定の制御可能でユーザが選択可能な回転速度で回転させる装置と、
必要に応じて、前記プラットフォームの前記表面の前記一以上の個別領域に前記第１の結合パートナーを分注して、前記第１の結合パートナーを前記個別領域に固定化する装置、又は前記プラットフォームの前記表面の前記一以上の個別領域に前記第２の結合パートナーを分注して、前記第２の結合パートナーを前記個別領域に選択的に固定化する装置と、
試薬を分注して前記個別領域に接触させる装置と、
必要に応じて、洗浄試薬を分注する装置とを含む装置を提供する。
【００３１】
プラットフォームを回転させる装置はモータであり、所定の回転速度はユーザが選択可能であり、約１０〜１０００ｒｐｍであることが好ましい。また、その装置には、回転可能プラットフォームから除去される廃棄試薬を抜き出す真空抽出システムを設けることも好ましい。
【００３２】
別の設計においては、回転可能プラットフォームは、必ずしもディスク自体である必要はなく、回転フォーマットに各個別反応ウェルを保持するクレードル内にロードされた複数の個別反応ウェルから構成されることも可能である。例えば、改造された０．２ｍＬの微量遠心チューブを回転可能クレードル状のプラットフォームに４５度で取り付けることができる。この構成においては、微量遠心チューブのキャップは開いており、水平面に置かれている（キャップの内部表面は上方を向いている）。キャップは、低ｒｐｍでキャップ内／上に分注された試薬が高ｒｐｍでそのチューブ内に注入されるように改造されている。また、微量遠心チューブのプラスチックヒンジがチャネルとして作用し、廃棄試薬がキャップからチューブに向かうように改造されていることも好ましい。キャップは、第１の結合パートナーを受けて固定化する個別領域、又は第２の結合パートナーを受けて選択的に固定化させた後、次の試薬を受ける個別領域として機能し、チューブ自身は廃棄槽（トラフ）／容器として機能する。この利点は、オペレータが所望の数のチューブをクレードル内に挿入して一個のサンプル又は多数のサンプルをロードできることにある。
【００３３】
本発明は、その第８の態様において、アッセイを行うための装置であって、
第１の結合パートナーを固定化するようになっているか、又は第２の結合パートナーを選択的に固定化するようになっている個別領域を有するプレートと、
フランジによって前記プレートに接続された容器とを含む装置であって、前記フランジは、前記プレートから前記容器へ流体を通過させるチャネルを有する装置を提供する。
【００３４】
該容器は開口上部を有し、該プレートは、容器の開口上部と選択的に係合して流体を密封するようになっているフランジを有するのが好ましい。プレートは容器用のキャップであることが好ましい。
【００３５】
該容器は、ホルダ（例えば、カルーセル）内に容器を支持するための径方向外側に向かって放射状に延在する環状フランジを有することが好ましい。該容器は実質的に円筒状であることが好ましい。前記容器は使い捨てで、プラスチック材料からなることが好ましい。
【００３６】
第７の態様に記載のアッセイを行うための装置は、改造された微量遠心チューブ（例えば、改造されたエッペンドルフ（Eppendorf（登録商標）））であることが好ましい。
【００３７】
本発明は、その第９の態様において、二以上のプレートを受けるようになっている回転可能クレードルであって、各プレートは、第１の結合パートナーを固定化するようになっているか、又は第２の結合パートナーを選択的に固定化するようになっている個別領域を有するクレードルを提供する。また、回転可能クレードルは二以上の容器を受けるようにもなっており、各容器はフランジによって各プレートに接続されており、前記フランジは、前記プレートから前記容器へ流体を通過させるためのチャネルを有することが好ましい。前記プレートは改造された微量遠心チューブのキャップであり、前記容器は該微量遠心チューブ自体であることが好ましい。第９の態様は、第８の態様に記載の装置を用いることが好ましい。
【００３８】
本発明は、その第１０の態様において、アッセイを行うための方法であって、次の各工程：
第９の態様に記載の回転可能クレードルと第８の態様に記載の装置を用意する工程と、
少なくとも１個のプレートを前記プラットフォームに係合させる工程と、
前記個別領域に第１の結合パートナーを結合又は固定化するか、又は前記個別領域に第２の結合パートナーを選択的に結合又は固定化する工程と、
前記各個別領域に一連の試薬を逐次的に接触させる工程とを含む方法であって、前記接触工程の各々又はいずれかの間に、前記試薬の如何なる残存分又は未反応分も前記個別領域から実質的に遠心力で除去されるように前記回転可能クレードルを回転させる方法を提供する。
【００３９】
本発明は、その第１１の態様において、アッセイを行うための第９の態様に記載の回転可能クレードルの使用、又は、アッセイを行うための第８の態様に記載の装置の使用を提供する。
【００４０】
本発明は、その第１２の態様において、第８の態様に記載の装置と、前記アッセイのための一以上の試薬とを含むキットを提供する。
【００４１】
本発明は、その第１３の態様において、第９の態様に記載の回転可能クレードルと、前記アッセイのための一以上の試薬とを含むキットを提供する。
【００４２】
本発明は、その第１４の態様において、アッセイを行うための装置であって、
第９の態様に記載の前記回転可能クレードルを所定の制御可能でユーザが選択可能な回転速度で回転させる装置と、
必要に応じて、前記個別領域上に第１の結合パートナー又は第２の結合パートナーを分注する装置と、
一以上の試薬を分注して前記個別領域に接触させる装置とを含む装置を提供する。
【００４３】
本発明の他の態様は、アッセイを並行して行うことに関する。例えば、本発明は、その第１５の態様において、少なくとも１個の円周方向に延在するレーンを有する、アッセイを行うための回転可能シリンダであって、前記各レーンは、第１の結合パートナーを固定化するようになっているか、又は第２の結合パートナーを選択的に固定化するようになっている一以上の個別領域を有するシリンダを提供する。本発明は、この態様において、回転可能になっている（又は構成されている）、アッセイを行うためのシリンダを提供する。当業者であれば、この実施形態によって多数のサンプルを同時に又は並行して実行することができることは理解されよう。
【００４４】
結合パートナーや試薬等の個別領域上への分注を可能とする長手方向に延在する開口部を有する容器内に回転可能シリンダを収容できることは理解されよう。当然のことながら、該シリンダを高速度で回転させる場合には、検出要素が廃棄流体の接線経路内にある。従って、遠心分離時に長手方向に延在する開口部を閉じるためのシャッタを用いることによってこのような問題を回避できる。
【００４５】
本発明は、その第１６の態様において、アッセイを行うための方法であって、次の各工程：
第１５の態様に記載の回転可能シリンダを用意する工程と、
一以上の個別領域に前記第１の結合パートナーを結合又は固定化するか、又は一以上の個別領域に第２の結合パートナーを選択的に結合又は固定化する工程と、
前記各個別領域に一連の試薬を逐次的に接触させる工程とを含む方法であって、前記接触工程の各々又はいずれかの間に、前記試薬のいかなる残存分又は未反応分も前記個別領域から実質的に遠心力で除去されるように前記回転可能シリンダを回転させる方法を提供する。
【００４６】
本発明は、その第１７の態様において、前記アッセイの第１５の態様に記載の回転可能シリンダの使用を提供する。
【００４７】
本発明は、その第１８の態様において、第１５の態様に記載の回転可能シリンダと、前記アッセイのための一以上の試薬とを含むキットを提供する。
【００４８】
本発明は、その第１９の態様において、アッセイを行うための装置であって、
前記第１５の態様に記載の前記回転可能シリンダを所定の制御可能でユーザが選択可能な回転速度で回転させるための装置と、
必要に応じて、一以上の個別領域上に前記第１又は第２の結合パートナーを分注し、前記結合パートナーをそれぞれ前記個別領域に固定化又は選択的に固定化するための装置と、
試薬を分注して前記個別領域に接触させるための装置とを含む装置を提供する。
【００４９】
本発明をパイロシークエンシングの場合について説明するが、本発明はこのアッセイに限定されるものではない。
【００５０】
[パイロシークエンシング]
第２０の態様においては、アッセイはパイロシークエンシングであり、本発明は、核酸鎖の配列決定を行うための回転可能プラットフォームであって、その表面又は前記表面に埋め込まれたビーズ上の一以上の個別領域に核酸鎖結合パートナーを固定化するようになっているプラットフォームを提供する。
【００５１】
第２１の態様においては、アッセイはパイロシークエンシングであり、本発明は、核酸鎖の配列決定を行うための回転可能プラットフォームであって、その表面又は前記表面に埋め込まれたビーズ上の一以上の個別領域に核酸鎖を選択的に固定化するようになっているプラットフォームを提供する。
【００５２】
用いる配列決定方法はパイロシークエンシングであることが好ましい。しかし、更に後述するように、他の核酸鎖配列決定方法を用いることもできる。
【００５３】
前記核酸鎖はＤＮＡ、ＲＮＡ又はその改変体（例えば、亜硫酸水素塩処理や天然の核酸に存在しない更なる塩基の被覆による）であることが好ましい。核酸鎖のコピーは一以上の個別領域の各々に保持される。
【００５４】
回転可能プラットフォームは実質的に円形で、直径が約５０〜５００ｍｍであることが好ましい。回転可能プラットフォームは、その中心から等距離で配置された約２〜５００個の個別領域を有することが好ましい。直径は、いかなる値とすることもでき、直径は所定数の個別領域（２個以上とすることができる）を収容するように選択できる。好ましい実施形態においては、回転可能プラットフォームの外周囲に個別領域を実質的に均等に配置（分布）させて実質的に円形の配列を形成する。
【００５５】
個別領域は、核酸鎖（例えば、配列決定用鋳型や配列決定用プライマー）を選択的に結合、捕捉又は固定化するようになっていることが好ましい。例えば、いくつかの好ましい実施形態においては、核酸鎖はビオチン化されており、個別領域はビオチン化核酸鎖を結合させるためのアビジン（好ましくはストレプトアビジン又はそのアナログ）を含む。あるいは、個別領域又はビーズは、アビジン（好ましくはストレプトアビジン）を結合、捕捉又は固定化するようになっており、次の工程において、ビオチン化核酸鎖は個別領域に結合したアビジン／ストレプトアビジンに選択的に固定化される。しかし、核酸鎖を個別領域に固定化するための他の化学も利用可能である。本発明は、核酸鎖を個別領域に固定化するために用いることができる化学に限定されない。
【００５６】
回転可能プラットフォームの個別領域は、ストレプトアビジンをそこへ選択的に結合又は付着させる処理（又は上述のような同等の化学）を必要とし得ることも当業者には理解されよう。例えば、回転可能プラットフォームを形成する材料がポリカーボネートの場合、ストレプトアビジンはこのポリマーに結合しにくいか又は全く結合しない。従って、個別領域にはストレプトアビジンが結合する材料（例えば、ポリスチレン）のコーティングが必要となる場合がある。当然のことながら、ポリスチレン以外の材料を用いてストレプトアビジンが結合する個別領域を形成し、最終的にはビオチン化核酸鎖を個別領域に固定化することができることは当業者には理解されよう。個別領域には核酸を選択的に固定化することができるような処理を施すことが好ましい。
【００５７】
一実施形態においては、本発明のプラットフォームは使い捨て品であるが、別の実施形態においては、該プラットフォームは、例えば核酸を「除去」し、更なるアッセイで再利用するのに適している。例えば、該プラットフォームはセラミック又はガラスで形成することができる。
【００５８】
一実施形態においては、個別領域は、核酸鎖又はアビジン／ストレプトアビジンを受け、選択的に保持するようになっている回転可能プラットフォームの表面のゾーン（領域）に過ぎない。個別領域を実質的に平坦とするか、又は回転可能プラットフォームと同じ表面形状とすることができる。しかし、他の好ましい実施形態においては、個別領域は浅いウェルとすることができ、体積を約０．５〜１００μＬとすることができる。浅いウェルは、いかなる形状とすることもでき、該ウェルは、いかなる体積とすることもできる。しかし、通常のパイロシークエンシング解析／アッセイで用いる試薬の量を比較的少なくするという観点から、ウェルの体積をごく小さくする（例えば、約０．５〜１０μＬ）。他の実施形態においては、個別領域を回転可能プラットフォームの表面に対して相対的に隆起した部分とすることも可能であることが意図されている。
【００５９】
好ましい実施形態においては、個別領域は直径が約１〜５ｍｍである。しかし、個別領域は平面視で、いかなる直径や形状とすることもできる。
【００６０】
回転可能プラットフォームは簡便にプラスチック材料で形成されることが好ましいが、他の材料（例えば、ガラスや石英）も可能であることは当業者には理解されよう。プラスチック材料は、ポリカーボネート、ポリスチレン及びポリプロピレンからなる群から選択されることが好ましい。また、回転可能プラットフォームをラミネート構造とすることができることも意図されている。回転可能プラットフォームを形成する材料が何であろうと、該プラットフォームは、変形せずに回転に耐え得ることが必要であり、また、更に後述するように、核酸を変性させるための熱的作用に耐え得ることが必要である。
【００６１】
いくつかの好ましい実施形態においては、回転可能プラットフォーム（実質的に円形ディスクとすることができる）は、更に、回転可能プラットフォームの回転時にその表面から除去又は遠心分離される廃棄流体を受けるためのトラフを該プラットフォームの外周に有する。パイロシークエンシング反応の各工程又は複数の工程が一旦終了すれば、長いリード長を得るには個別領域に接触している未使用試薬又は廃棄試薬を除去する必要がある。回転可能プラットフォームの回転による遠心力によって廃棄流体がプラットフォームから除去されるが、廃棄流体の処理を改善するためにトラフを設ける。
【００６２】
あるいは、該プラットフォームからの廃棄試薬の除去は、ヌクレオチド添加を５０サイクル実施する毎に行ってもよく、試薬が十分に希釈されて反応を阻害する直前に行ってもよい。
【００６３】
この実施形態においては、個別領域に更なるパイロシークエンシング試薬を添加し、各パイロシークエンシング反応の終了後に回転可能プラットフォームから該試薬を除去すると、該プラットフォームの総質量が増加する。従って、別の一実施形態においては、回転可能プラットフォームにはトラフを設けず、回転可能プラットフォームが内部に配置された筐体を、トラフが該プラットフォームの外周に隣接する位置に設けられるように構成し、回転可能プラットフォームの回転時にその表面から除去される廃棄流体がこの「固定」トラフに捕捉されるようにすることが望ましい。
【００６４】
パイロシークエンシングの背景にある技法や化学に精通している当業者であれば、個別領域に固定化された核酸鎖を変性して相補核酸鎖を除去する必要があり得ることは理解されよう。変性は、いかなる方法でも行うことができるが、好ましい例としては、個別領域又は回転可能プラットフォーム全体を変性に十分な温度（例えば、９４〜９９℃）まで加熱することや、個別領域を９４℃超まで加熱した溶媒（例えば、バッファー）に曝露することが挙げられる。あるいは、個別領域を変性用組成物（例えば、ＮａＯＨを含む組成物）に曝露することもできる。他の方法としては、赤外線や同等の放射線による加熱が挙げられる。回転可能プラットフォームは、このような変性条件に耐え得る材料で形成される必要がある。
【００６５】
また、回転可能プラットフォームは、捕捉した核酸標的又は捕捉した配列決定用プライマーに対してＤＮＡをハイブリダイズ又は融解するように加熱及び冷却が行われることもできる。パイロシークエンシングの場合、一旦、ｄｓＤＮＡ標的を捕捉し、変性すれば、配列決定用プライマーを添加してｓｓＤＮＡにハイブリダイズさせるか、あるいは、ｓｓＤＮＡを捕捉した配列決定用プライマーにハイブリダイズさせる。この場合、回転可能プラットフォームを加熱してｓｓＤＮＡ中の任意の三次構造を除去した後、冷却して配列決定用プライマーを固定化標的にハイブリダイズすることができる。
【００６６】
比較的少量の試薬を用いた場合、チャンバを適切な手段で封止するため、チャンバを加熱することによってデバイスは多少複雑になり得る。あるいは、オイルオーバーレイを用いて加熱段階時の蒸発を抑制することができる。他の適切な手段は当業者にはよく知られている。あるいは、捕捉したｓｓＤＮＡ及び配列決定用プライマーに変性試薬を添加した後、低ｐＨのバッファーを添加して標的部位のｐＨを低下させ、配列決定用プライマーをＤＮＡ標的にアニーリングさせることができる。一旦アニーリングさせれば、ｐＨバッファーを除去して廃棄することができる。
【００６７】
当業者であれば、本発明が種々の実施形態において提供することができる多くの利点を理解するであろう。例えば、本発明では、先行技術のデバイスや方法と比べて塩基リード長を向上することができる。すなわち、先行技術の方法では０．２ｍＬの微量遠心チューブ（又は類似物）にてパイロシークエンシングを行い、試薬をチューブに逐次的に添加してチューブ内に存在するＤＮＡの配列を検出する。反応バッファー中のＤＮＡ、全ての酵素及び基質を含む反応にヌクレオチドを逐次的に添加する。反応は９６又は２４ウェルプレートにて行う。反応時にプレートを加熱（２８℃）し、振盪する。従って、添加するヌクレオチドの量は蒸発する量とほぼ等しくなり、その結果、反応混合物は希釈されず、副生物が蓄積する。先行技術の方法はリード長が比較的短いという問題を有するが、これは、分解生成物（例えば、アピラーゼの活性によって生成する）の蓄積による可能性が最も高い。本発明の場合、固定化した核酸鎖をヌクレオチドに接触させ、次いで残ったヌクレオチドと共に全ての反応生成物及び副生物を上述のように実質的に個別領域から除去し、また、必要に応じて、個別領域を次のヌクレオチド試薬と接触させる前に洗浄するため、従来技術における問題を有さない。３００又は４００塩基を超える塩基リード長が可能であり、化学的改善によっては、１０００塩基を超える塩基リード長の可能性もあることが意図されている。
【００６８】
更なる利点も当業者には明らかであろうが、明確には、本発明は、先行技術のフロースルーセルよりも比較的簡易な装置を提供する。更なる利点は、先行技術の方法やデバイスよりも比較的迅速に行える可能性のある配列決定に関すると共に、先行技術に比べて必要とする試薬の量が少なくなる可能性に関する。先行技術の方法（特にパイロシークエンシングを行う方法）の更なる限界は、１反応サイクル（すなわち、１ヌクレオチドの添加）に必要な時間が非常に長いことである。１反応サイクルに必要な時間は通常、約６０秒又はそれ以上であるが、これは先の反応サイクルで残ったヌクレオチド全てが分解するために必要な時間に基づく。先の反応サイクルで残ったヌクレオチドの実質的に全てが完全に分解して初めて、次のヌクレオチドを添加する。本明細書に記載の装置によって、残ったヌクレオチドを遙かに高速で（すなわち、遠心分離工程、洗浄工程によって）除去することができる。この結果、１塩基を取り込むためのサイクル時間が遙かに短くなり（大概、約１５秒）、これによって実行時間を少なくとも約１／４に低減する。
【００６９】
また、本発明によって、いくつかの先行技術のデバイスと比べて流体の処理を改善することもできる。ＣＣＤアレイの代わりに高速光電子増倍管を用いることができれば、本発明によって、先行技術のデバイスと比べて感度を向上させることも可能である。
【００７０】
パイロシークエンシングは「合成による配列決定」の原理に基づくＤＮＡ配列決定方法であり、これは、ジデオキシヌクレオチドによる連鎖停止ではなく、ヌクレオチド取り込みによるピロリン酸放出の検出に依存する。「合成による配列決定」は、配列決定対象のＤＮＡ一本鎖を得た後、その相補鎖を酵素的に合成することを伴う。「合成による配列決定」方法は、ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド付加反応の反応副生物を検出してＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ合成酵素）の活性を検出することに基づく（ＤＮＡ＋ｘｄＮＴＰ→ＤＮＡ+1＋ＰＰｉ又はｘに応じた異なる副生物。ｘはＡＴＰでもあり得る）。パイロシークエンシング反応においては、ＰＰｉは、光を発生させる酵素カスケードを用いて定量する。
１．スルフリラーゼ：ＡＰＳ＋ＰＰｉ→ＡＴＰ＋ＳＯ4
２．ルシフェラーゼ：ルシフェリン＋ＡＴＰ→オキソルシフェリン＋ＰＰｉ＋光
３．アピラーゼ：残ったｄＮＴＰ及びＡＴＰの分解
【００７１】
また、副生物を定量するために用いることができる当該技術分野で公知の反応が数種類ある（例えば、ＰＰＤＫ（ホスホエノールピルビン酸ジキナーゼ）を用いたＰＰｉ＋ＰＥＰ＋ＡＭＰからピルビン酸＋ＡＴＰ＋Ｐｉへの転換）。また、例えば、ｐＨの変化又は他の検出可能パラメータの変化によって副生物を検出することができる。あるいは、「合成による配列決定」方法は、ＤＮＡリガーゼのプライマー付加反応の反応副生物を検出するＤＮＡリガーゼの活性の検出に基づくことができる。適切な方法は当業者にはよく知られている。
【００７２】
本質的には、上述の方法におけるＤＮＡの一本鎖の配列決定は、それに沿った相補鎖を合成し（一度に１塩基対）、各工程で実際に添加した塩基を検出することによって行う。鋳型ＤＮＡ又は配列決定用プライマーを固定化し、Ａ、Ｃ、Ｇ及び／又はＴヌクレオチドの溶液を順次添加し、反応後に除去する。添加したヌクレオチドが鋳型の最初の不対塩基を補完した場合にのみ光が発生する。検出可能シグナル（例えば、化学発光シグナル）を発生させる添加ヌクレオチドの配列によって鋳型の配列が決定する。ｓｓＤＮＡ鋳型を配列決定用プライマーにハイブリダイズするか又はその逆を行い、ＤＮＡポリメラーゼ（更に必要に応じてＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ及び／又はアピラーゼ）と共にインキュベートし、更に、例えば、基質であるアデノシン５’ホスホ硫酸（ＡＰＳ）及びルシフェリンと共にインキュベートする。検出可能シグナルをもたらす他のカスケード反応は当業者にはよく知られている。
【００７３】
概して、パイロシークエンシングは以下の通常の各工程に従う。
１．  ４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の内の１種又はその適切な誘導体を核酸鎖鋳型に添加する。ＤＮＡポリメラーゼによって正しい相補ｄＮＴＰ又はその誘導体が鋳型に取り込まれると、ピロリン酸（ＰＰｉ）が化学量論的に放出される。
２．  ＡＴＰスルフリラーゼによってＰＰｉがＡＴＰに定量的に転化する。このＡＴＰによって、ルシフェラーゼ介在によるルシフェリンからオキシルシフェリンへの転化が引き起こされ、ＡＴＰの量に比例する量の可視光が発生する。ルシフェラーゼ触媒反応で生じた光を検出し、解析する。
３．  次に、取り込まれなかったヌクレオチド及びＡＴＰをアピラーゼ又は他の適切な酵素で分解する。
【００７４】
古典的なパイロシークエンシングプロトコールに対する、いくつかの変形例が当該技術分野ではよく知られており、本発明に係る装置上で行うのに適している。ヌクレオチド取り込みの各工程で発生する光は、取り込まれたヌクレオチドの量に比例するため、適切なソフトウェアを用いて、発生した光の情報を特定のヌクレオチド配列パターンに変換することができる。古典的なパイロシークエンシングにおいては、この光パターンを「パイログラム」と称する。また、前記ソフトウェアによって、特定位置における混合集団の取り込み比率を定量できることが好ましい。
【００７５】
本発明は、配列決定対象の核酸鋳型又は配列決定用プライマーを固定化する工程と、段階的なヌクレオチド添加サイクルとを含む配列決定方法を意図している。本発明をパイロシークエンシングに関して説明してきたが、本発明は他の核酸配列決定化学（特に、フロースルー環境や固相から利益を得るような化学）にも有用である。また、本発明は、上述の工程のいくつかを回避する、又は該工程を少なくともより簡便にすることもできる。パイロシークエンシングにはｓｓＤＮＡ鋳型が存在することが必要である。必要に応じて、回転可能プラットフォームは、ｄｓＤＮＡを捕捉し、例えば、パイロシークエンシングに備えてアニーリングされた配列決定用プライマーを用いて前記ｄｓＤＮＡを変性してｓｓＤＮＡを残すようにも機能して、別の単離工程の必要性を排除する。本発明の一実施形態においては、回転可能プラットフォームを用い、例えば、ｄｓＤＮＡ鎖の１種を優先的に分解する酵素又は酵素混合物を添加してｓｓＤＮＡを発生させることができる。
【００７６】
具体的には、当業者であれば、「フロースルーＤＮＡ配列決定」には、例えば、核酸鋳型又は配列決定用プライマーを固定化し、該プライマーを該鋳型にハイブリダイズするか又はその逆を行い、ヌクレオチド（この場合、ヌクレオチドには、例えば、必要に応じてジデオキシ部分等の鎖伸長停止部分が含まれ、また、必要に応じて検出可能標識が含まれる）の存在下で段階的にプライマー介在合成を行う方法（例えば、サンガー配列決定）が含まれることは理解されよう。更なる核酸配列決定方法の実施形態は、次の各工程、すなわち、標識ヌクレオチドを伸長プライマー鎖に取り込む工程と、取り込まれたヌクレオチドを同定する工程と、該伸長鎖を次のヌクレオチドの取り込みに備えるように鎖伸長停止部分及び標識を除去する工程とを含む。
【００７７】
また、当業者であれば、「フロースルーＤＮＡ配列決定」には、例えば、ライゲーションによる核酸配列決定が含まれることも理解されよう。「ライゲーションによる核酸配列決定」には、核酸鋳型又は配列決定用プライマーを固定化することと、該プライマーを該鋳型にハイブリダイズするか又はその逆を行うことと、それに続く、例えば、標識ヌクレオチドや短い標識プローブのＤＮＡライゲーションラウンドとが含まれることは明らかであろう。
【００７８】
また、本発明が核酸固定化工程と段階的なヌクレオチド添加及び検出とを含む、いかなるＤＮＡ配列決定方法をも意図していることは当業者には明らかであろう。
【００７９】
当業者であれば、「フロースルーＤＮＡ配列決定」には上述の技法の全てが含まれることも理解されよう。更なる一実施形態においては、本明細書に記載の「フロースルーＤＮＡ配列決定」方法は、プラットフォームの表面に固定化された酵素の使用、及び／又はプラットフォームの表面に結合又は固定化された更なる表面（例えば、前記酵素を結合することができるように改変されたビーズ）に固定化された酵素の使用を含むことができる。
【００８０】
本発明は、その第２２の態様において、核酸鎖の配列決定方法であって、次の各工程：
第２０の態様に記載のプラットフォームを用意する工程と、
前記個別領域に核酸鎖結合パートナーを結合又は固定化した後、前記個別領域に核酸鎖を選択的に結合又は固定化する工程と、
必要に応じて、任意の相補核酸鎖をも変性及び除去し、配列決定用プライマーを個別領域にアニーリングさせる工程と、
Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチド又はそれぞれの適切なヌクレオチドアナログを含む一連の試薬を前記各個別領域に逐次的に接触させる工程とを含む方法において、前記接触工程の各々又はいずれかの間に、実質的にいかなる残存試薬又は未反応試薬も前記個別領域から実質的に遠心力で除去されるように、前記プラットフォームを回転させる方法を提供する。
【００８１】
必要に応じて行う洗浄工程又は酵素処理によって、残存試薬又は未反応試薬の除去を改善することができる。
【００８２】
本発明は、その第２３の態様において、核酸鎖の配列決定方法であって、次の各工程：
第２１の態様に記載のプラットフォームを用意する工程と、
前記個別領域に核酸鎖を選択的に結合又は固定化する工程と、
必要に応じて、任意の相補核酸鎖を変性及び除去し、配列決定用プライマーを個別領域にアニーリングさせる工程と、
Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチド又はそれぞれの適切なヌクレオチドアナログを含む一連の試薬を前記各個別領域に逐次的に接触させる工程とを含む方法であつて、前記接触工程の各々又はいずれかの間に、前記試薬の、いかなる残存分又は未反応分も前記個別領域から実質的に遠心力で除去されるように前記プラットフォームを回転させる方法を提供する。
【００８３】
この態様においては、個別領域には核酸鎖結合パートナーが既に固定化されており、核酸鎖は、この核酸鎖結合パートナーに対して選択的に結合される。
【００８４】
必要に応じて行う洗浄工程又は酵素処理によって、残存試薬又は未反応試薬の除去を改善することができる。
【００８５】
一実施形態においては、逐次的な接触工程は、
ａ）Ａの後にＴ、Ｔの後にＧ、Ｇの後にＣヌクレオチドを添加し、それに続いてＡを再度添加する等、又は
ｂ）Ａ＋Ｔ＋Ｇ＋Ｃヌクレオチドを混合物として添加し、該混合物を再度添加する等の一方を含む。
【００８６】
他の実施形態においては、前記各個別領域にＡ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチドを含む一連の試薬を逐次的に接触させる。逐次的な接触工程は、
ａ）各ヌクレオチド又はそのアナログを所望又は所定の順序で別々に逐次的に添加すること、及び
ｂ）Ａ＋Ｔ＋Ｇ＋Ｃヌクレオチド又はこれらの所定又は所望のサブセットを混合物として添加し、該混合物を再度添加する等の内の一方を含むことができる。
【００８７】
逐次的接触工程ａ）はパイロシークエンシング方法には特に有用であり、逐次的接触工程ｂ）は、標識ヌクレオチド（例えば、各々が異なる色素で標識された蛍光標識ヌクレオチド）を用いる場合に特に有用である。
【００８８】
一連のヌクレオチドを所定の順序及び／又は所定の組合せで添加することができ、核酸鋳型の配列決定に必要な十分の回数だけ配列決定が反復されるという点で、該方法全体が反復を有する。例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣを公知の変異部位にのみ添加することができる。この実施形態の利点は、この手続きによって、必要な塩基添加を少なくしつつ公知の変異検出の速度を向上させることにある。
【００８９】
本発明の方法は、前記各接触工程時及び／又はその後に核酸鎖を解析する工程を更に含むことが好ましい。解析は、いかなる解析とすることもできるが、パイロシークエンシングの場合においては、解析工程は、前記解析の各工程において、光の出力を核酸鎖に取り込まれたヌクレオチドの数と関連付けることによって核酸鎖内の次の塩基対を同定することを含む。ヌクレオチドの取り込みを検出する全ての適切な技術的手段を当業者は採用できる。例えば、反応によって生じた光を検出するための適切な検出器は光電子増倍管である。回転可能プラットフォームが回転する際に、サンプルが検出器を通過する（好ましくは、全てのサンプルが検出器を通過する）。
【００９０】
好ましい実施形態においては、個別領域に次の試薬を接触させる前に、前記各個別領域を洗浄試薬を用いた洗浄工程又はリンス工程に付す。洗浄試薬は、先の接触工程からの残存溶液を洗い流す（好ましくは、先の接触工程からの実質的に全ての残存溶液を洗い流す）のに適した、いかなる試薬とすることもできる。しかし、好ましい一実施形態においては、洗浄試薬は、次の反応工程を行うバッファーである。また、洗浄試薬は洗浄促進剤（例えば、アピラーゼやホスファターゼ等）を含むこともできる。適切な洗浄試薬は当業者にはよく知られている。
【００９１】
試薬及び前記酵素を分注しながら回転可能プラットフォームを低速度（例えば、約１０〜２００ｒｐｍ）で回転させて個別領域に添加した試薬が除去されないようにし、また、洗浄試薬を分注しながら該プラットフォームを高速度（例えば、約４００〜１０００ｒｐｍ）で回転させることが好ましい。しかし、他の回転速度も可能である。
【００９２】
上述のように、変性工程は、核酸鎖を加熱して変性させること、又は核酸鎖を高ｐＨに曝露すること、又は核酸鎖を適切な酵素又は酵素混合物に曝露することを含むことができる。
【００９３】
本発明の方法に係る好ましい実施形態においては、核酸鎖を変性した後にリンス試薬を用いたリンス工程で該相補鎖を除去する工程を含む。
【００９４】
好ましくは、前記プラットフォームを回転させていかなる残存試薬も遠心力で除去することにより、前記個別領域を実質的に乾燥させることによって、前記各個別領域を前記次の試薬の各々に対して準備する。こうすることによって、試薬による前記個別領域の汚染を実質的に低減する、好ましくは、試薬による前記個別領域の汚染を実質的になくす。
【００９５】
本発明は、その第２４の態様において、核酸鎖の配列決定のための第２０又は第２１の態様に記載のプラットフォームの使用を提供する。
【００９６】
本発明は、その第２５の態様において、第２０又は第２１の態様に記載のプラットフォームと、核酸鎖の配列決定のための一以上の試薬とを含むキットを提供する。
【００９７】
本発明は、その第２６の態様において、核酸鎖の配列決定装置であって、
第２０の態様に記載の前記プラットフォームを所定の制御可能でユーザが選択可能な回転速度で回転させる装置と、
必要に応じて、前記個別領域に核酸鎖結合パートナーを分注して、前記核酸鎖結合パートナーを前記個別領域に固定化する装置と、
必要に応じて、前記個別領域に核酸鎖を分注して、前記核酸鎖を前記個別領域に選択的に固定化する装置と、
必要に応じて、任意の相補核酸鎖を変性し、必要に応じて除去する装置と、
Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチド、該ヌクレオチドのそれぞれのアナログ、又はその組合せを分注して前記個別領域に接触させる装置と、
洗浄試薬を分注する装置と、
必要に応じて、一以上の酵素溶液を分注する装置とを含む装置を提供する。
【００９８】
本発明は、その第２７の態様において、核酸鎖の配列決定装置であって、
第２１の態様に記載の前記プラットフォームを所定の制御可能でユーザが選択可能な回転速度で回転させる装置と、
必要に応じて、前記個別領域に核酸鎖を分注して、前記核酸鎖を前記個別領域に選択的に固定化する装置と、
必要に応じて、任意の相補核酸鎖を変性し、必要に応じて除去する装置と、
Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチド、該ヌクレオチドのそれぞれのアナログ、又はその組合せを分注して前記個別領域に接触させる装置と、
洗浄試薬を分注するための装置と、
必要に応じて、一以上の酵素溶液を分注する装置とを含む装置を提供する。
【００９９】
プラットフォームを回転させる装置はモータであり、所定の回転速度はユーザが選択可能であり、約１０〜１０００ｒｐｍであることが好ましい。前記核酸鎖を分注し、Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチドを分注し、洗浄試薬を分注する装置は、いかなる装置とすることもできるが、インクジェット式技術、圧電作動型又は空気パルス駆動型に類似した装置であることが好ましい。また、該装置には、回転可能プラットフォームから除去される廃棄試薬を抜き出すための真空抽出システムを設けることも好ましい。また、該装置には、パイロシークエンシング反応によって生じた光を検出する適切な検出手段／装置も設けられる。適切な検出器は当業者には知られていようが、例えば、光電子増倍管を回転可能プラットフォームの下方又は上方に取り付けることができる。
【０１００】
任意の相補核酸鎖を変性し、必要に応じて除去する装置は、プラットフォームを９４℃まで加熱する装置を含むことができ、あるいは、加熱された試薬や他の変性用化学品を分注する更なるシリンジ又は蠕動ディスペンサを含むことができる。
【０１０１】
別の設計においては、回転可能プラットフォームは必ずしもディスク自体である必要はなく、回転フォーマットに各個別反応ウェルを保持するためのクレードル内にロードされた複数の個別反応ウェルから構成することができる。例えば、改造された０．２ｍＬの微量遠心チューブを回転可能クレードル状のプラットフォームに４５度で取り付けることができる。この構成においては、キャップは開いており、水平面上にある（キャップの内部表面は上方を向いている）。キャップは、低ｒｐｍでキャップ内に分注された試薬が高ｒｐｍで該チューブ内に注入されるように改変されている。また、微量遠心チューブのプラスチックヒンジがチャネルとして作用し、廃棄試薬がキャップからチューブに向かうように改変されている。キャップは、配列決定反応を行う個別領域として機能し、チューブ自身は廃棄トラフとして機能する。この利点は、オペレータが所望の数のチューブをクレードル内に挿入して一個のサンプル又は多数のサンプルをロードできることである。
【０１０２】
本発明の他の態様は、核酸鎖の配列決定を並行して行うこと（すなわち、多重配列決定）に関する。例えば、本発明は、少なくとも１個の円周方向に延在するレーンを有する、核酸鎖の配列決定を行うための回転可能シリンダであって、前記各レーンは、第１の結合パートナーを固定化するようになっているか、又は第２の結合パートナーを選択的に固定化するようになっている一以上の個別領域を有するシリンダを提供する。当業者であれば、この実施形態によって多数のサンプルを同時に又は並行して処理できることを理解できるであろう。
【０１０３】
当業者であれば、本発明には本明細書で開示された実施形態及び特徴が含まれると共に、開示された実施形態及び特徴のあらゆる組合せも含まれることを理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１Ａ】本発明の回転可能プラットフォームの平面図である。
【図１Ｂ】図１Ａに示す回転可能プラットフォームの側面図である。
【図１Ｃ】図１Ｂの線１Ｃ−１Ｃにおける断面図である。
【図２Ａ】図１に示す回転可能プラットフォームの一実施形態の斜視図である。
【図２Ｂ】図１に示す回転可能プラットフォームの一実施形態の断面斜視図である。
【図３Ａ】図１に示す回転可能プラットフォームの一実施形態の斜視図である。
【図３Ｂ】図１に示す回転可能プラットフォームの一実施形態の断面斜視図である。
【図４Ａ】外周トラフを有する図１に示す回転可能プラットフォームの別の実施形態の平面図である。
【図４Ｂ】外周トラフを有する図１に示す回転可能プラットフォームの別の実施形態の側面図である。
【図５】図１Ａに示す回転可能プラットフォームが内部に設置された装置の断面図である。
【図６】反応をモニターするための焦点レンズを用いた光学検出装置を示す。
【図７】反応をモニターするための直接画像化を用いた光学検出装置を示す。
【図８】プラットフォーム上の個別領域を加熱するためのヒータリングを示す。
【図９】図８に示すヒータリングを組み込んだ装置を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、核酸の配列決定を行うための少なくとも１個の微量遠心チューブを受けるようになっているクレードル状の回転可能プラットフォームの平面図である。
【図１０Ｂ】図４Ａに示す回転可能クレードルの側面図である。
【図１０Ｃ】図１０Ｂの線１０Ｃ−１０Ｃにおける断面図である。
【図１０Ｄ】回転可能クレードル状の本発明の回転可能プラットフォームと共に用いる改変微量遠心チューブの斜視図である。
【図１１】ＥＤＣの存在下でストレプトアビジンをコートしたポリスチレンウェルに関するパイログラムの結果である。
【図１２】ストレプトアビジンに結合した鋳型のみがシグナルを発生し得ることを示すストレプトアビジン陰生対照ウェルに関するパイログラムである。
【図１３】配列決定時にシグナルを示さないＥＤＣ陰性対照ウェルに関するパイログラムである。
【図１４】配列決定−洗浄−配列決定戦略を用いたＳＥＱ−ＯＬＩＧＯ−３０ＢＰ合成オリゴヌクレオチド配列のパイログラムである。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
以下、本発明の好ましい実施形態を添付図面を参照しつつ、あくまでも一例として説明する。
【０１０６】
[定義]
本発明の説明及び特許請求の範囲において、以下の専門用語は後述の定義に従って用いられる。また、本明細書における専門用語は、本発明の特定の実施形態を説明する目的にのみ用いており、限定を意図しないことも理解されたい。特に明記しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。
【０１０７】
特に文脈にて明確に定められない限り、本明細書及び特許請求の範囲全体において、「〜を含む（comprise）」や「〜を含んでいる（comprising）」等の単語は排他的又は網羅的ではなく包含的な意味、すなわち、「〜を含んでいるが、それに限定されない」という意味に解釈されるものとする。
【０１０８】
以下、特に明記しない限り、「％」は「重量％」を意味し、「比」は「重量比」を意味し、「部」は「重量部」を意味する。
【０１０９】
本発明の広い範囲を説明する数値範囲やパラメータは近似値であるものの、具体例に記載の数値はできる限り正確に報告する。しかし、いかなる数値も、各試験測定値に存在する標準偏差に必然的に起因するある種の誤差を本質的に含む。
【０１１０】
説明をより簡潔にするため、本明細書に記載の量的表現の幾つかには「約」という語を付していない。「約」を明確に用いようが用いまいが、本明細書に記載のあらゆる量は実際の所定値を指すことを意味し、更には、当該技術分野における通常の技術に基づいて合理的に推測される該所定値に対する近似値（例えば、該所定値に関する実験条件及び／又は測定条件に起因する近似値）を指すことも意味する。
【０１１１】
特に明記しない限り、本明細書に記載の「主に」及び「実質的に」は５０重量％以上多く含むことを意味する。
【０１１２】
終点を用いた数値範囲の列挙には、その範囲内に含まれる全ての数が含まれる（例えば、「１〜５」の場合には１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等が含まれる）。
【０１１３】
「好ましい」及び「好ましくは」は、ある状況下で一定の有益性をもたらし得る本発明の実施形態を意味する。しかし、同一の状況下又は他の状況下で他の実施形態が好ましい場合もある。また、一以上の好ましい実施形態を列挙した場合、他の実施形態が有用でないことを意味するのではなく、また、本発明の範囲から他の実施形態を排除することを意図するものでもない。
【０１１４】
特に明記しない限り、「a」、「an」及び「the」は「一又はそれ以上」を意味する。特に明記しない限り、「実施形態」に関して用いられる次の各表現「an embodiment」、「embodiment」、「embodiments」、「the embodiment」、「the embodiments」、「an embodiment」、「some embodiments」、「an example embodiment」、「at least one embodiment」、「one or more embodiments」及び「one embodiment」は「本発明の一以上の実施形態（必ずしも全ての実施形態ではない）」を意味する。
【０１１５】
列挙された項目のリストは、該項目のいずれか又はその全てが互いに排他的であることを意味するのではない。特に明記しない限り、列挙された項目のリストは、該項目のいずれか又はその全てが全体として網羅的であることを意味するのではない。また、列挙された項目のリストは、該項目がその列挙された順番に従って順序付けられることを意味するのではない。
【０１１６】
本特許出願に記載の各セクションの見出し及び本特許出願の名称は便宜上用いられているに過ぎず、決して開示内容を限定するものとして解釈すべきではない。
【０１１７】
本明細書において、「結合パートナー」は、結合パートナー対（いかなるリガンド／受容体対であってもよい）の一方を意味するものと理解されたい。結合パートナー対の一方を「第１の結合パートナー」と称し、結合パートナー対の他方を「第２の結合パートナー」と称する。例えば、結合パートナー対をストレプトアビジン／アビジン及びビオチンとすることができる。結合パートナー対は、例えば、ストレプトアビジンとビオチン化核酸を含むことができる。
【０１１８】
本明細書において、「回転可能」は回転されるようになっていることを意味する。
【０１１９】
本願明細書には多くの実施形態が記載されているが、これらは説明の目的で提示されているに過ぎない。記載された実施形態は、いかなる意味においても限定することを意図していない。本明細書における開示から容易に明らかなように、本発明は多くの実施形態に広く適用可能である。これらの実施形態は当業者が本発明を実施できるように十分に詳細に記載されているが、他の実施形態を用いることができると共に、本発明の範囲を逸脱せずに他の変更をなし得ることは理解されたい。従って、当業者であれば、種々の改変や変更を伴って本発明を実施できることは理解されよう。以下、図面を参照するが、全体として同様の参照番号は同様の部分を指す。
【０１２０】
パイロシークエンシングに関連して本発明の好ましい一実施形態について説明する。パイロシークエンシングに関連して行う好ましい一実施形態の説明は、本発明がパイロシークエンシングアッセイに限定されるものとして解釈すべきではない。
【０１２１】
図１を参照すると、ポリカーボネートディスク１の形をとる回転可能プラットフォームは、核酸の配列決定を行うための核酸鎖を選択的に保持するようになっている２個以上の個別領域２を有する。個別領域２は直径が約２〜３ｍｍで、ストレプトアビジンで被覆されており、ディスク１の外周囲に等間隔で配置されていることが好ましい。例えば、ディスク１の直径が１２０ｍｍで円周が３７７ｍｍとすると、直径が３ｍｍの個別領域２をディスク１の中心から半径５５ｍｍの位置に６ｍｍ（個別領域／標的部位２の中心間の距離）ずつ離して配置した場合、約５７個の個別領域がディスク１の外周囲に設けられる。しかし、個別領域の数を少なくしてもよく、あるいは、より大きなディスク１を用いるか、より小さな個別領域（例えば、直径が０．５ｍｍで間隔を例えば１ｍｍとする）を用いるか、又はそのいかなる組合せを用いて個別領域の数を多くしてもよい。個別領域２は浅いウェルで、体積が約０．５〜１００μＬであることが好ましい。
【０１２２】
他の実施形態を図２及び３に示すが、ここでは同様の機構には同様の参照番号を付している。これらの例においては、回転可能プラットフォームは直径が１２０ｍｍであり、５０個のウェルが外周囲に等間隔で配置されている。ウェルは直径が約３ｍｍであり、ポリカーボネートや透明ポリスチレン、白色高衝撃ポリスチレン（ＨＩＰＳ）等の材料から形成することができる。プラットフォームの厚さは通常１ｍｍ〜３ｍｍであり、ウェルの深さは０．８ｍｍ〜２．８ｍｍである。
【０１２３】
いくつかの実施形態においては、図４に最もよく示されるように、回転可能プラットフォーム１は、更に、回転可能プラットフォーム１の回転時にその表面から除去又は遠心分離される廃棄流体を受けるためのトラフ３を該プラットフォームの外周に有する。トラフ３はプラットフォーム１の成形要素であることが好ましい。配列決定反応の各工程において廃棄試薬はプラットフォームから遠心分離され、廃棄流体の処理を改善するためにトラフ３が設けられる。しかし、別の実施形態においては、回転可能プラットフォーム１が内部に配置される筐体４をトラフ５が該プラットフォーム１の外周に隣接する位置に設けられるように構成し、回転可能プラットフォーム１の回転時にその表面から除去される廃棄流体を受けるようにすることができる。トラフ５内の流体は、汚染を最小限に抑えるため、プラットフォーム１から導管６を経由させて抜き出すことができる。真空システム（図示せず）を用いることが好ましい。
【０１２４】
用いる配列決定方法はパイロシークエンシングであることが好ましい。しかし、上述したように、核酸鎖の配列決定の他の方法も用いることができる。
【０１２５】
個別領域２は核酸鎖を選択的に固定化するようになっていることが好ましい。例えば、核酸鎖をビオチン化することができ、個別領域２はビオチン化核酸鎖を結合させるためのストレプトアビジンを含む。しかし、核酸鎖を個別領域２に固定化するために他の化学作用も利用可能である。
【０１２６】
核酸鎖の配列決定を行うための本発明の方法においては、回転可能プラットフォーム１を用意し、核酸鎖を個別領域２に固定化する。次に、例えば、プラットフォーム１を約９４℃まで加熱して、任意の相補核酸鎖を変性し、除去する。次に、個別領域２にＡ、Ｔ、Ｇ及びＣヌクレオチドを逐次的に接触させ、各接触工程の間に、いかなる残存ヌクレオチド又は未反応ヌクレオチドも個別領域２から実質的に遠心力で除去されるようにプラットフォーム１を回転させる。
【０１２７】
本発明の方法は、前記各接触工程時及び／又はその後に核酸鎖を解析する工程を更に含む。解析工程は、ヌクレオチドの取り込みによって生じた光の出力を核酸鎖に結合したヌクレオチドの数と関連付けることによって核酸鎖内の次の塩基対を検出することを含む。反応によって生じた光を検出するための適切な検出器は光電子増倍管である。回転可能プラットフォーム１が回転するにつれ、全てのサンプルが検出器を通過する。ヌクレオチドが取り込まれなかった場合には、光シグナルは発生しないため、遠心力によって反応混合物を除去（各サイクル毎、又は（例えば）１０〜５０サイクル毎（但し、８０サイクル未満）に行う）し、次のヌクレオチドを用いて他のラウンドを開始する。
【０１２８】
好ましい実施形態においては、個別領域２に次のヌクレオチドを接触させる前に、各標的部位２を洗浄試薬を用いた洗浄工程又はリンス工程に付す。洗浄試薬は、先の接触工程からの残存溶液を実質的に洗い流すことが可能な、いかなる試薬とすることもできるが、ＰＣＲバッファーであることが好ましい。
【０１２９】
ヌクレオチド試薬及び酵素を分注しながら回転可能プラットフォーム１を低速度（例えば、約１０〜２００ｒｐｍ）で回転させ、次いで洗浄試薬を分注しながらプラットフォーム１を高速度（例えば、約４００〜１０００ｒｐｍ）で回転させることが好ましい。
【０１３０】
本発明は、核酸鎖の配列決定のための回転可能プラットフォーム１の使用を提供すると共に、核酸鎖の配列決定のための回転可能プラットフォーム１と、一以上の試薬とを含むキットを提供する。
【０１３１】
図５を参照すると、本発明は更に、核酸鎖の配列決定のための回転可能プラットフォーム１を用いる装置を提供する。該装置は、所定の制御可能でユーザが選択可能な回転速度でプラットフォーム１を回転させるモータ（例えば、約１０〜１０００ｒｐｍの回転速度を伝えることが可能なモータ）を有する。また、核酸鎖を個別領域２上に分注し、個別領域２に核酸鎖を固定化する装置も設けられる。このような装置は、インクジェット式技術の形態をとってもよく、適切なディスペンサ７（例えば、シリンジポンプ）の形態をとってもよい。また、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣヌクレオチドを分注して個別領域２に接触させ、洗浄試薬を分注するための装置も設けられる。この場合も、このような装置はインクジェット式技術の形態をとることができる。また、任意の相補核酸鎖を変性し、除去するための装置も設けられるが、このような装置は、筐体４内に配置された加熱コイル（この図面には示さず）の形態をとることができる。
【０１３２】
また、パイロシークエンシング反応によって生じた光を検出するための適切な検出器８も設けられる。適切な検出器は当業者には知られていようが、例えば、光電子増倍管を回転可能プラットフォーム１の下方又は上方に取り付けることができる。特に図６及び７を参照すると、本発明に用いられる光電子増倍管検出器の種々の実施形態が示されている。一方の光学的構成では焦点レンズを用い（図６）、もう一方では直接画像化を用いている（図７）。図６は、焦点レンズ１０、開口部１１、感光表面１２、光電子増倍管１３及び検出電子機器１４を示す。図７は、開口部１５、感光表面１６、光電子増倍管検出器１７及び検出電子機器１８を示す。
【０１３３】
図８を参照すると、加熱コイル又はリング２０が示されている。ヒータリング２０は、ヒータＰＣＢ（プリント回路基板）に結合したアルミニウムリングからなる。ヒータＰＣＢには温度検知要素（図示せず）が組み込まれており、ヒータ温度の閉ループ制御を行うことができる。ヒータリング２０は、回転可能プラットフォーム１のウェル／個別領域の設計に応じて突起部２１を表面に有しても有さなくてもよい。突起部２１は、回転可能プラットフォームのウェルの底部のみがヒータリング２０に確実に接触するように設計されている。ヒータリング２０は、上方に移動して回転可能プラットフォーム１に接触し、下方に移動して回転可能プラットフォーム１を自由に回転させ、反応ウェルから熱を迅速に除去するように設計されることが好ましい。これは、ヒータリング２０をガイドポスト２３の上下に摺動させるソレノイド２２を用いて行うことができる。
【０１３４】
酵素及びヌクレオチド混合物を分注するために回転可能プラットフォーム１を低速度（すなわち、２００ｒｐｍ以下）で回転させることができるが、この場合、遠心力は、該混合物が個別領域２から移動せず、反応が進行し、光学検出が行える程度に低い。洗浄試薬は高いロータ速度（すなわち、４００ｒｐｍ）で添加することができるが、洗浄によって標的部位２から全ての試薬が除去され、個別領域２間の汚染は実質的になくなる。
【０１３５】
図１０Ａ〜１０Ｃを参照すると、別の設計においては、回転可能プラットフォーム１は、必ずしもディスク自体である必要はなく、回転フォーマットに各個別反応ウェル３０を保持するためのクレードル３１内にロードされた複数の個別反応ウェル３０から構成することができる。例えば、個別反応ウェル３０は、回転可能クレードル３１としてのプラットフォーム１に４５度で取り付けることができる、改造された０．２ｍＬの微量遠心チューブの形態とすることができる。この構成においては、キャップ３２は開いており、水平面上に存在する（キャップの内部表面は上方を向いている）。キャップ３２は、低ｒｐｍでキャップ内に分注された試薬が高ｒｐｍでチューブ３３内に注入されるように改造されている（点線矢印参照）。キャップ３２は、配列決定反応を行う標的部位２として機能し、チューブ３３自身は廃棄トラフ３として機能する。ヒンジ３４は、遠心分離された廃棄試薬をチューブ３３に運ぶチャネルとして作用するように改造され得る。
【実施例】
【０１３６】
上述のように、ＤＮＡ配列決定は、パイロシークエンシングを利用することによって行うことができる（アガー（Agah）Ａ．、アガジャン（Aghajan）Ｍ．、マシャエキ（Mashayekhi）Ｆ．、アミニ（Amini）Ｓ．、デイヴィス（Davis）Ｒ．、プルンマー（Plummer）Ｊ．Ｄ．、ロナギ（Ronaghi）Ｍ．、グリフィン（Griffin）Ｐ．Ｂ．、パイロシークエンシングのための多酵素モデル、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００４；３２：ｅ１６６参照）。配列決定は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって相補的な３’−デオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）が一本鎖鋳型に取り込まれた後のピロリン酸の放出を検出することによって行う。最初に、スルフリラーゼ酵素によってピロリン酸をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に転化する必要がある。ルシフェラーゼ酵素によるＡＴＰとルシフェリンとの反応によって光シグナルが発生し、これによってヌクレオチドの取り込みが示され、鋳型鎖の配列が示される。先に添加したヌクレオチドからの干渉をなくして次のヌクレオチドの取り込みと検出を行うためにアピラーゼ酵素を用いる。アピラーゼによって、次のヌクレオチドを添加する前に余分なヌクレオチドが分解する。
【０１３７】
パイロシークエンシングプロセス時には、ヌクレオチド硫酸やヌクレオチド二リン酸等の副生物が蓄積する。このような副生物は酵素を阻害し、配列決定の長さが長い場合にシグナル品質が低下する。例えば、アピラーゼの阻害によって、取り込まれていないヌクレオチドの除去が抑制され、これが塩基の非同期取り込みをもたらし、シグナル検出が弱くなる。その結果、パイロシークエンシングを利用した配列決定の長さが現在は６０ヌクレオチド以下に制限されている（マシャエキ（Mashayekhi）Ｆ．、ロナギ（Ronaghi）Ｍ．、パイロシークエンシング化学におけるリード長制限因子の解析、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００７；３６３：２７５〜２８７参照）。
【０１３８】
従って、副生物阻害の影響を抑制し、リード長を長くするため、本発明では、多くのヌクレオチド曝露を行った後に反応成分を洗い流すことができ、これによって、鋳型を支持体に確実に結合させたまま、新しい試薬を添加して配列決定の次のセクションを続けることができる。
【０１３９】
[配列決定標的]
セルフプライミングループ配列（下線で強調）を有する５’−ビオチン標識合成オリゴヌクレオチドを用い、本発明に係るプラットフォームで最大３０塩基対の配列決定を行った。合成オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ−ＯＬＩＧＯ−３０ＢＰ）の完全塩基対配列は次の通りであった。
５’−ビオチン−ＡＧＴＧＴＧＣＡＧＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＣＴＴＧＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣ−３’
【０１４０】
セルフプライミングループ配列はその相補配列に折り重なるため、これによって、パイロシークエンシング反応を合成オリゴヌクレオチドの３’末端から開始することができた。従って、該反応によって認識された最初のヌクレオチドはアデノシン（Ａ）塩基（ボールド体で強調）であった。その結果、反応配列で用いた最初のヌクレオチドはその相補ヌクレオチドのチミジン（ｄＴＴＰ）であった。従って、ＳＥＱ−ＯＬＩＧＯ−３０ＢＰ反応のための完全配列は、ＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＡＣＴであった。パイロシークエンシング反応ではヘテロポリマーヌクレオチド（同一ヌクレオチドの多重伸長）を認識することができるため、配列決定のためのヌクレオチドの実際の分注順序は、Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｇ  Ａ  Ｃ  Ｔ  Ｃ  Ｇ  Ｔ  Ｃ  Ｔ  Ｇ  Ｃ  Ａ  Ｃ  Ａ  Ｃ  Ｔに短縮された。ＳＥＱ−ＯＬＩＧＯ−３０ＢＰオリゴヌクレオチドは０．２μｍｏｌの濃度まで希釈した。
【０１４１】
[ストレプトアビジン被覆ディスク]
高衝撃ポリスチレンディスクのストレプトアビジンによる被覆を、次の化学品１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）を用いた該タンパク質とポリマーとの共有結合によって行った。ウェルの準備は、２．５μＬのＥＤＣ（濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）と２．５μＬのストレプトアビジン（濃度：５ｍｇ／ｍＬ）を添加した後、反応物の蒸発を抑制するよう加湿ボックス中、室温で４時間インキュベートして行った。インキュベーション後、ウェルをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、更に水で洗浄した。ウェルを１時間空気乾燥させた後、乾燥剤を含む密封バッグ内に４℃で保存した。
【０１４２】
ストレプトアビジンをポリスチレンプラットフォームに共有結合できることは、キアゲンＧｍｂＨによって提供される対照オリゴヌクレオチドを用いた対照実験を数多く行うことによって示された。対照オリゴヌクレオチドの配列決定は、後述のように洗浄工程なしで行った。対照オリゴヌクレオチドの配列は、ＴＡ（Ｃ又はＴ）ＧＧＴＴＴＧＣであり、ヌクレオチド分注の順序は、Ｔ  Ａ  Ｃ  Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｇ  Ｃであった。対照ウェルにはＥＤＣ又はストレプトアビジンのいずれか一方が存在しない。陽性ディスクのパイロシークエンシングによって良好な強いシグナルが示された（図１１）。ストレプトアビジン陰性対照又はＥＤＣ陰性対照のいずれにおいても真のシグナルは認められなかった（図１２及び１３）。
【０１４３】
ＥＤＣの存在下でポリスチレンウェルをストレプトアビジンで被覆した場合のパイログラム結果を図１１に示す。この結果から、ビオチン−ストレプトアビジン結合によって鋳型を容器に結合させた場合には配列の同定が可能であることが見出される。
【０１４４】
図１２に示すストレプトアビジン陰性対照に関するパイログラム結果から、ストレプトアビジンに結合した鋳型のみがシグナルを発生させ得ることが見出される。従って、図１１の結果において、洗浄後の残存鋳型はシグナルの発生に寄与しなかった。
【０１４５】
ＥＤＣ陰性対照のパイログラム結果を図１３に示すが、配列決定時にはシグナルが現れない。この結果から、ストレプトアビジンはＥＤＣの存在下でのみポリスチレンウェルに結合したことが見出される。従って、プラットフォームへの結合は共有結合によってなされた。
【０１４６】
[アッセイセットアップ]
共有結合ストレプトアビジンで被覆したポリスチレンディスク／プラットフォームのウェル内に５μＬのオリゴヌクレオチドを分注し、１ｐｍｏｌの配列決定用標的を用意した。鋳型を室温で１０分間インキュベートしてビオチン−ストレプトアビジン結合を生じさせた。インキュベーション後、未結合の鋳型をピペットで除去し、ウェルを５μＬの脱イオン水で２回洗浄して残存する未結合の鋳型を確実に除去した。
【０１４７】
[配列決定−洗浄−配列決定]
ディスク１を装置内に配置した。手動でセットアップを行い、２μＬの水、１μＬの酵素混合物（ＤＮＡポリメラーゼ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ及びアピラーゼを含む）、及び１μＬの基質（ルシフェリンとバッファーからなる）を微量注入できるようにした。１０秒間ベースラインを安定化させた後、酵素と基質を添加し、その後、陰性対照ヌクレオチドであるｄＧＴＰ（１００ｎＬ）を微量注入し、実行時にランダムなシグナルが確実に発生しないようにした。グアノシンヌクレオチドは配列の最初の塩基ではないため、添加時にシグナルピークは生じない。次のヌクレオチドのセット（１００ｎＬ）を３０秒間隔でロードした（分注順序：Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｇ  Ｔ）。各ヌクレオチドを正確に添加した結果、光シグナルピークが生じた。ピーク値は連続する同一ヌクレオチドの数に応じて変化した。得られた該ピークのグラフをパイログラムと称する。
【０１４８】
これらの８個のヌクレオチドを添加した後、ディスクを１０００回転／分で５秒間回転させて反応内容物を除去した。高速度回転の終了時に、ロータ速度を６０回転／分まで戻し、同体積の水、酵素及び基質を添加して配列決定サイクルを再開した。次いで、次のヌクレオチドのセットをロードし、シグナルピークを測定した。２番目と３番目のヌクレオチドのセットにはＧＡＣＴＣＧＴＣとＴＧＴＣＡＣＡＴを用いた（下線を付したヌクレオチドは反応非特異性をモニターするための更なる陰性対照として用いた）。これらの２個の配列セットの間に洗浄工程を行った。全配列データを図１４に示す。
【０１４９】
図１４は、配列決定−洗浄−配列決定戦略を用いたＳＥＱ−ＯＬＩＧＯ−３０ＢＰ合成オリゴヌクレオチド配列のパイログラムを示す。セルフプライミングループ配列を有する５’−ビオチン標識ＳＥＱ−ＯＬＩＧＯ−３０ＢＰ鋳型をストレプトアビジン被覆高衝撃ポリスチレンディスクのウェル内にロードし、ビオチン−ストレプトアビジン結合によって標的をウェルに捕捉させた。未結合の鋳型を洗浄し、酵素と基質を添加して配列決定反応を開始した。最初に陰性対照ヌクレオチド（ｄＧＴＰ）をロードし、反応における非特異性をモニターした。公知配列の最初のヌクレオチドの内の７個を３０秒間隔で微量注入した（１００ｎＬ）。配列内の対応する塩基の各々に対してピークが発生した。ピーク値は配列内の同一ヌクレオチドの数に応じて変化した。最初のセットの全てのヌクレオチドを添加した際に、ロータ速度を１０００回転／分まで上昇させてウェルの液状内容物を除去し、鋳型をストレプトアビジン被覆ディスクの所定位置に結合させた。５秒後、速度を６０回転／分まで戻し、新しい酵素及び基質と次のヌクレオチドのセットを添加して配列決定プロセスを再開した。この結果から、本発明のストレプトアビジン被覆ディスクに対して配列決定−洗浄−配列決定が可能であることが見出される。
【０１５０】
現時点で本発明を実施するための最良の態様と考えられる実施形態を参照しつつ本発明について説明したが、本明細書に開示され、以下に続く特許請求の範囲によって把握されるより広い発明概念を逸脱することなく、本発明を様々な実施形態に適応させる上で種々の変更をなし得ることは理解されたい。
【図１Ａ】
2013500021.tif 000003
【図１Ｂ】
2013500021.tif 000004
【図１Ｃ】
2013500021.tif 000005
【図２Ａ】
2013500021.tif 000006
【図２Ｂ】
2013500021.tif 000007
【図３Ａ】
2013500021.tif 000008
【図３Ｂ】
2013500021.tif 000009
【図４Ａ】
2013500021.tif 000010
【図４Ｂ】
2013500021.tif 000011
【図５】
2013500021.tif 000012
【図６】
2013500021.tif 000013
【図７】
2013500021.tif 000014
【図８】
2013500021.tif 000015
【図９】
2013500021.tif 000016
【図１０Ａ】
2013500021.tif 000017
【図１０Ｂ】
2013500021.tif 000018
【図１０Ｃ】
2013500021.tif 000019
【図１０Ｄ】
2013500021.tif 000020
【図１１】
2013500021.tif 000021
【図１２】
2013500021.tif 000022
【図１３】
2013500021.tif 000023
【図１４】
2013500021.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成24年4月25日(2012.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アッセイを行うための方法であって、次の各工程：
その表面の一以上の個別領域に第１の結合パートナーを固定化するようになっている回転可能プラットフォームを用意する工程と、
該プラットフォームの該表面の該一以上の個別領域に該第１の結合パートナーを結合又は固定化させる工程と、
該プラットフォームの外部の位置から該各個別領域に一連の試薬を逐次的に分注する工程とを含み、
該分注工程の一以上又は全ての後に、該試薬のいかなる残存分又は未反応分も該各個別領域から実質的に遠心力で除去されるように該プラットフォームが回転され、
該アッセイがパイロシークエンシングである、方法。
【請求項２】
前記プラットフォームが実質的に円形である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個別領域が前記円形プラットフォームの外周囲に配置されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
２〜５００個の個別領域が前記プラットフォームの外周囲に配置されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記プラットフォームの直径が５０〜５００ｍｍであり、該プラットフォームの厚さが１〜４ｍｍである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記個別領域が実質的に平坦であるか、又は体積が０．５〜１００μＬであるか若しくは深さが０．５〜３ｍｍの実質的に浅いウェルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記個別領域が前記回転可能プラットフォームの表面に対して相対的に隆起した部分である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記個別領域は直径が１〜５ｍｍである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記プラットフォームが、ポリカーボネート、ポリスチレン、高衝撃ポリスチレン、ポリエチレン及びポリプロピレンからなる群から選択されるプラスチック材料で形成されているか、又はガラス若しくは石英から形成されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記一以上の個別領域は前記プラットフォーム上の被覆であり、該被覆は前記第１の結合パートナーを固定化するようになっている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プラットフォームの前記表面に、前記第１の結合パートナーが化学的に吸着されるか、又は共有結合、イオン結合若しくは水素結合されるか、あるいは、該プラットフォームの該表面に、該第１の結合パートナーがファンデルワールス力によって固定化される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記回転可能プラットフォームは、該プラットフォームの回転時に該プラットフォームの表面から除去又は遠心分離される廃棄流体を受けるための、該プラットフォームの外周に配置されたトラフを更に有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記一連の試薬の最初には前記第１の結合パートナーに対する第２の結合パートナーが含まれており、次の試薬は洗浄試薬及び／又はリンス試薬から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記各分注工程時及び／又はその後に前記アッセイを解析する工程を更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試薬を分注しながら前記回転可能プラットフォームを１０〜２００ｒｐｍの速度で回転させる工程と、該回転可能プラットフォームを４００〜１０００ｒｐｍの速度で回転させて前記個別領域から該試薬を実質的に遠心力で除去する工程とを更に含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法で使用される、アッセイを行うためのキットであって、その表面の一以上の個別領域に第１の結合パートナーを固定化するようになっている回転可能プラットフォームと、該アッセイのための一以上の試薬とを含み、該アッセイがパイロシークエンシングである、キット。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法で使用される、アッセイを行うための装置であって、
回転可能プラットフォームを所定の制御可能でユーザが選択可能な回転速度で回転させる装置であって、該回転可能プラットフォームは、その表面の一以上の個別領域に第１の結合パートナーを固定化するようになっている、装置と、
必要に応じて、該プラットフォームの該表面の該一以上の個別領域に該第１の結合パートナーを分注して、該第１の結合パートナーを該個別領域に固定化する装置と、
試薬を分注して該個別領域に接触させる装置と、
必要に応じて、洗浄試薬を分注する装置と
を含む装置。
【請求項１８】
アッセイを行うための方法であって、次の各工程：
その表面の一以上の個別領域に第２の結合パートナーを選択的に固定化するようになっているプラットフォームを用意する工程と、
該プラットフォームの該表面の該一以上の個別領域に該第２の結合パートナーを選択的に結合又は固定化させる工程と、
該プラットフォームの外部の位置から該各個別領域に一連の試薬を逐次的に分注する工程とを含み、
該分注工程の一以上又は全ての後に、該試薬のいかなる残存分又は未反応分も該個別領域から実質的に遠心力で除去されるように該プラットフォームが回転され、
該アッセイがパイロシークエンシングである、方法。
【請求項１９】
前記プラットフォームが実質的に円形である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記個別領域が前記円形プラットフォームの外周囲に配置されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
２〜５００個の個別領域が前記プラットフォームの外周囲に配置されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記プラットフォームの直径が５０〜５００ｍｍであり、該プラットフォームの厚さが１〜４ｍｍである、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記個別領域が実質的に平坦であるか、又は体積が０．５〜１００μＬであるか若しくは深さが０．５〜３ｍｍの実質的に浅いウェルである、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記個別領域が前記回転可能プラットフォームの表面に対して相対的に隆起した部分である、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記個別領域は直径が１〜５ｍｍである、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記プラットフォームが、ポリカーボネート、ポリスチレン、高衝撃ポリスチレン、ポリエチレン及びポリプロピレンからなる群から選択されるプラスチック材料で形成されているか、又はガラス若しくは石英から形成されている、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記一以上の個別領域は前記プラットフォーム上の被覆であり、該被覆は第１の結合パートナーを固定化するようになっている、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記プラットフォームの前記表面に、前記第１の結合パートナーが化学的に吸着されるか、又は共有結合、イオン結合若しくは水素結合されるか、あるいは、該プラットフォームの該表面に、該第１の結合パートナーがファンデルワールス力によって固定化される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記回転可能プラットフォームは、該プラットフォームの回転時に該プラットフォームの表面から除去又は遠心分離される廃棄流体を受けるための、該プラットフォームの外周に配置されたトラフを更に有する、請求項１８〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の結合パートナーは、前記プラットフォームの前記表面に既に結合している第１の結合パートナーに対して結合可能又は反応可能である、請求項１８〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記一連の試薬のうちの少なくとも１つが、洗浄試薬及び／又はリンス試薬から選択される、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記各分注工程時及び／又はその後に前記アッセイを解析する工程を更に含む、請求項１８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記試薬を分注しながら前記回転可能プラットフォームを１０〜２００ｒｐｍの速度で回転させる工程と、該回転可能プラットフォームを４００〜１０００ｒｐｍの速度で回転させて前記個別領域から試薬を実質的に遠心力で除去する工程とを更に含む、請求項１８〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１８〜３３のいずれか１項に記載の方法で使用される、アッセイを行うためのキットであって、その表面の一以上の個別領域に第２の結合パートナーを選択的に固定化するようになっている回転可能プラットフォームと、該アッセイのための一以上の試薬とを含み、該アッセイがパイロシークエンシングである、キット。
【請求項３５】
請求項１８〜３３のいずれか１項に記載の方法で使用される、アッセイを行うための装置であって、
回転可能プラットフォームを所定の制御可能でユーザが選択可能な回転速度で回転させる装置であって、該回転可能プラットフォームは、その表面の一以上の個別領域に第２の結合パートナーを選択的に固定化するようになっている、装置と、
必要に応じて、該プラットフォームの該表面の該一以上の個別領域に該第２の結合パートナーを分注して、該第２の結合パートナーを該個別領域に選択的に固定化する装置と、
試薬を分注して該個別領域に接触させる装置と、
必要に応じて、洗浄試薬を分注する装置と
を含む装置。
【請求項３６】
核酸鎖の配列決定方法であって、次の各工程：
その表面の一以上の個別領域に核酸鎖結合パートナーを固定化するようになっている回転可能プラットフォームを用意する工程と、
該個別領域に該核酸鎖結合パートナーを結合又は固定化した後、該個別領域に核酸鎖を選択的に結合又は固定化する工程と、
必要に応じて、任意の相補核酸鎖を変性及び除去し、配列決定用プライマーを該個別領域にアニーリングさせる工程と、
Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチド又はそれぞれの適切なヌクレオチドアナログを含む一連の試薬を、該プラットフォームの外部の位置から該各個別領域に逐次的に分注する工程とを含み、
該分注工程の各々又はいずれかの後に、実質的にいかなる残存試薬又は未反応試薬も該個別領域から実質的に遠心力で除去されるように、該プラットフォームを回転させる、方法。
【請求項３７】
前記核酸鎖がＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらの改変体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記核酸鎖はビオチン化されており、前記核酸鎖結合パートナーは該ビオチン化核酸鎖を結合させるためのアビジン若しくはストレプトアビジン、又はそれらのアナログを含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチドを含む一連の試薬を前記各個別領域に逐次的に接触させる、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記逐次的な分注工程は、
ａ）各ヌクレオチド又はそのアナログを所望又は所定の順序で別々に逐次的に添加すること、又は
ｂ）Ａ＋Ｔ＋Ｇ＋Ｃヌクレオチド又はこれらの所定又は所望のサブセットを混合物として添加し、該混合物を再度添加すること、
を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記各分注工程時及び／又はその後に前記核酸鎖を解析する工程を更に含む、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記解析は、光の出力を前記核酸鎖に結合したヌクレオチドの数と関連付けることによって該核酸鎖内の次の塩基対を検出することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
試薬及び酵素を分注しながら前記回転可能プラットフォームを１０〜２００ｒｐｍで回転させて前記個別領域に添加した試薬が除去されないようにし、次いで洗浄試薬を分注しながら該プラットフォームを４００〜１０００ｒｐｍで回転させる、請求項３６〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記変性工程は、前記核酸鎖を加熱して変性させること、又は該核酸鎖を高ｐＨに曝露することを含む、請求項３６〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸鎖を変性した後に、リンス試薬を用いたリンス工程で該相補鎖を除去する工程を含む、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
試薬による前記個別領域の汚染を実質的になくすように、前記プラットフォームを回転させていかなる残存試薬も遠心力で除去することにより該個別領域を実質的に乾燥させることによって、該各個別領域を次の試薬に対して準備する、請求項３６〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記配列決定がパイロシークエンシングである、請求項３６〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
請求項３６〜４７のいずれか１項に記載の方法で使用される、核酸鎖の配列決定を行うためのキットであって、その表面の一以上の個別領域に核酸鎖結合パートナーを固定化するようになっている回転可能プラットフォームと、該核酸鎖の配列決定のための一以上の試薬とを含む、キット。
【請求項４９】
核酸鎖の配列決定を行うための請求項４８に記載のキットの使用。
【請求項５０】
前記配列決定がパイロシークエンシングである、請求項４９に記載のキットの使用。
【請求項５１】
請求項３６〜４７のいずれか１項に記載の方法で使用される、核酸鎖の配列決定装置であって、
回転可能プラットフォームを所定の制御可能でユーザが選択可能な回転速度で回転させる装置であって、該回転可能プラットフォームは、その表面の一以上の個別領域に核酸鎖結合パートナーを固定化するようになっている、装置と、
必要に応じて、該個別領域に核酸鎖結合パートナーを分注して、該核酸鎖結合パートナーを該個別領域に固定化する装置と、
必要に応じて、該個別領域に核酸鎖を分注して、該核酸鎖を該個別領域に選択的に固定化する装置と、
必要に応じて、任意の相補核酸鎖を変性し、必要に応じて除去する装置と、
Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチド、該ヌクレオチドのそれぞれのアナログ、又はその組合せを分注して該個別領域に接触させる装置と、
洗浄試薬を分注する装置と、
必要に応じて、一以上の酵素溶液を分注する装置と
を含む装置。
【請求項５２】
核酸鎖の配列決定方法であって、次の各工程：
その表面の一以上の個別領域に核酸鎖を選択的に固定化するようになっているプラットフォームを用意する工程と、
該個別領域に核酸鎖を選択的に結合又は固定化する工程と、
必要に応じて、任意の相補核酸鎖を変性及び除去し、配列決定プライマーを該個別領域にアニーリングさせる工程と、
Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチド又はそれぞれの適切なヌクレオチドアナログを含む一連の試薬を、該プラットフォームの外部の位置から該各個別領域に逐次的に分注する工程とを含み、
該分注工程の各々又はいずれかの後に、該試薬のいかなる残存分又は未反応分も該個別領域から実質的に遠心力で除去されるように、該プラットフォームを回転させる、方法。
【請求項５３】
前記個別領域には核酸鎖結合パートナーが既に固定化されており、前記核酸鎖は、該核酸鎖結合パートナーに選択的に結合する請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記核酸鎖がＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらの改変体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記核酸鎖はビオチン化されており、第１の結合パートナーは該ビオチン化核酸鎖を結合させるためのアビジン若しくはストレプトアビジン、又はそれらのアナログを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の方法で使用されるキットであって、その表面の一以上の個別領域に核酸鎖を選択的に固定化するようになっている回転可能プラットフォームと、該核酸鎖の配列決定のための一以上の試薬とを含む、キット。
【請求項５７】
核酸鎖の配列決定を行うための請求項５６に記載のキットの使用。
【請求項５８】
請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の方法で使用される、核酸鎖の配列決定装置であって、
回転可能プラットフォームを所定の制御可能でユーザが選択可能な回転速度で回転させる装置であって、該回転可能プラットフォームは、その表面の一以上の個別領域に核酸鎖を選択的に固定化するようになっている、装置と、
必要に応じて、該個別領域に核酸鎖を分注して、該核酸鎖を該個別領域に固定化する装置と、
必要に応じて、任意の相補核酸鎖を変性し、必要に応じて除去する装置と、
Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＣヌクレオチド、該ヌクレオチドのそれぞれのアナログ、又はその組合せを分注して前記個別領域に接触させる装置と、
洗浄試薬を分注する装置と、
必要に応じて、一以上の酵素溶液を分注する装置と
を含む装置。
【請求項５９】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法で使用されるプラットフォームであって、その表面の一以上の個別領域に第１の結合パートナーを固定化するようになっている、プラットフォーム。
【請求項６０】
請求項１８〜３３のいずれか１項に記載の方法で使用されるプラットフォームであって、その表面の一以上の個別領域に第２の結合パートナーを選択的に固定化するようになっている、プラットフォーム。
【請求項６１】
請求項３６〜４７のいずれか１項に記載の方法で使用されるプラットフォームであって、その表面の一以上の個別領域に核酸鎖結合パートナーを固定化するようになっている、プラットフォーム。
【請求項６２】
請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の方法で使用されるプラットフォームであって、その表面の一以上の個別領域に核酸鎖を選択的に固定化するようになっている、プラットフォーム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
[配列決定標的]
自己刺激ループ配列（下線で強調）を有する５’−ビオチン標識合成オリゴヌクレオチドを用い、本発明に係るプラットフォームで最大３０塩基対の配列決定を行った。合成オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ−ＯＬＩＧＯ−３０ＢＰ）の完全塩基対配列は次の通りであった。
５’−ビオチン−ＡＧＴＧＴＧＣＡＧＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＣＴＴＧＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣ−３’（配列番号１）
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
自己刺激ループ配列はその相補配列に折り重なるため、これによって、パイロシークエンシング反応を合成オリゴヌクレオチドの３’末端から開始することができた。従って、該反応によって認識された最初のヌクレオチドはアデノシン（Ａ）塩基（ボールド体で強調）であった。その結果、反応配列で用いた最初のヌクレオチドはその相補ヌクレオチドのチミジン（ｄＴＴＰ）であった。従って、ＳＥＱ−ＯＬＩＧＯ−３０ＢＰ反応のための完全配列は、ＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＡＣＴ（配列番号２）であった。パイロシークエンシング反応ではヘテロポリマーヌクレオチド（同一ヌクレオチドの多重伸長）を認識することができるため、配列決定のためのヌクレオチドの実際の分注順序は、Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｇ  Ａ  Ｃ  Ｔ  Ｃ  Ｇ  Ｔ  Ｃ  Ｔ  Ｇ  Ｃ  Ａ  Ｃ  Ａ  Ｃ  Ｔに短縮された。ＳＥＱ−ＯＬＩＧＯ−３０ＢＰオリゴヌクレオチドは０．２μｍｏｌの濃度まで希釈した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
ストレプトアビジンをポリスチレンプラットフォームに共有結合できることは、キアゲンＧｍｂＨによって提供される対照オリゴヌクレオチドを用いた対照実験を数多く行うことによって示された。対照オリゴヌクレオチドの配列決定は、後述のように洗浄工程なしで行った。対照オリゴヌクレオチドの配列は、ＴＡ（Ｃ又はＴ）ＧＧＴＴＴＧＣ（配列番号３）であり、ヌクレオチド分注の順序は、Ｔ  Ａ  Ｃ  Ｔ  Ｇ  Ｔ  Ｇ  Ｃであった。対照ウェルにはＥＤＣ又はストレプトアビジンのいずれか一方が存在しない。陽性ディスクのパイロシークエンシングによって良好な強いシグナルが示された（図１１）。ストレプトアビジン陰性対照又はＥＤＣ陰性対照のいずれにおいても真のシグナルは認められなかった（図１２及び１３）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013500021000001.app
【国際調査報告】
2013500021.tif 000025
2013500021.tif 000026
2013500021.tif 000027
2013500021.tif 000028
2013500021.tif 000029