(57)【要約】本明細書では豊胸または再建手順のために移植可能なプロステーシスが開示される。プロステーシスは、セリシン抽出天然フィブロイン繊維から構成される１つ以上の個々の織糸を含む、生体適合性および生分解性ファブリック構造を含み、織糸はより合わされファブリック構造を生成する。ファブリック構造は少なくとも第１の次元で延在し、患者体内の天然乳房組織またはプロステーシス乳房インプラントに係合し、これをサポートするように適合させた、少なくとも第１の表面を有する。プロステーシスを患者の皮膚と患者体内の乳房組織および／または乳房インプラントの間に挿入することにより、患者体内で乳房組織または乳房インプラントをサポートする方法もまた開示される。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリシン抽出天然フィブロイン繊維から構成される１つ以上の個々の織糸を含む、生体適合性および生分解性ファブリック構造を含み、前記織糸（複数可）は、より合わされファブリック構造を生成する、豊胸または再建手順のための移植可能なプロステーシスであって、
前記ファブリック構造は第１の次元で延在し、患者体内の天然乳房組織またはプロステーシス乳房インプラントに係合し、これをサポートするように適合させた第１の表面を有する、プロステーシス。
【請求項２】
前記ファブリック構造が、前記患者の胸腔の周囲の組織に固定されるように適合させた部分を含む、請求項１に記載のプロステーシス。
【請求項３】
前記ファブリック構造が、乳房組織またはプロステーシス乳房インプラントの周囲の軟組織に固定されるように適合させた部分を含む、請求項１に記載のプロステーシス。
【請求項４】
前記ファブリック構造が、乳房組織またはプロステーシス乳房インプラントに隣接する骨構造に固定されるように適合させた部分を含む、請求項１に記載のプロステーシス。
【請求項５】
前記ファブリック構造が、天然乳房組織または乳房インプラントの領域の少なくとも一部に一致するように適合させた所定の形状で形成される、請求項１に記載のプロステーシス。
【請求項６】
前記所定の形状が、円形形状、楕円形状、三日月形状、カップ形状および細長いストリップからなる群より選択される、請求項１に記載のプロステーシス。
【請求項７】
前記ファブリック構造が、乳房組織の内殖を促進するための因子を含む、請求項１に記載のプロステーシス。
【請求項８】
前記ファブリック構造が、移植されると、少なくとも部分的に乳房結合組織にとって代わる、請求項１に記載のプロステーシス。
【請求項９】
前記ファブリック構造が、スリング形状で形成され、ファブリック構造が患者に移植されると、乳房または乳房インプラントのためのサポートを提供する、請求項１に記載のプロステーシス。
【請求項１０】
前記ファブリック構造が細長い形状で形成され、ファブリック構造が患者に移植されると、乳房の乳房下部領域においてサポートを提供する、請求項１に記載のプロステーシス。
【請求項１１】
前記ファブリック構造がカップ形状で形成され、ファブリック構造が患者に移植されると、乳房の乳房下部領域内で下方サポートを提供する、請求項１に記載のプロステーシス。
【請求項１２】
前記ファブリック構造がカップ形状で形成され、ファブリック構造が患者に移植されると、乳房に対し内側または外側サポートを提供する、請求項１に記載のプロステーシス。
【請求項１３】
前記ファブリック構造が、ツイスト、編組、編み、織り、ステッチ貼り合わせ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のプロステーシス。
【請求項１４】
患者において乳房組織または乳房インプラントをサポートする方法であって、
セリシン抽出天然フィブロイン繊維から構成される１つ以上の個々の織糸を含む生体適合性および生分解性ファブリック構造を提供する（織糸（複数可）は、より合わされファブリック構造を生成する）こと、および
前記ファブリック構造を患者の皮膚と乳房組織または乳房インプラントの間に挿入すること
を含む、方法。
【請求項１５】
さらに、前記ファブリック構造を患者の胸腔の周囲の組織に固定することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
さらに、前記ファブリック構造を乳房組織またはプロステーシス乳房インプラントの周囲の軟組織に固定することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ファブリック構造を乳房組織またはプロステーシス乳房インプラントに隣接する骨構造に固定することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、前記ファブリック構造を天然乳房組織または乳房インプラントの一領域の少なくとも一部に一致するように適合させた所定の形状に形成することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記所定の形状が、円形形状、楕円形状、三日月形状、カップ形状および細長いストリップからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、前記ファブリック構造を、乳房組織の内殖を促進するための因子で処理することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ファブリック構造が、乳房の乳房下部領域に挿入され、乳房の垂直位置決めを提供し、乳房の垂直下方変位を減少させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記ファブリック構造が、乳房の内側に挿入され、乳房の内側位置決めを提供し、乳房の内側変位を減少させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記ファブリック構造が、乳房の外側に挿入され、乳房の外側位置決めを提供し、乳房の外側変位を減少させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記ファブリック構造が、ツイスト、編組、編み、織り、ステッチ貼り合わせ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
セリシン抽出天然フィブロイン繊維から構成される１つ以上の個々の織糸を含む生体適合性および生分解性ファブリックであって、織糸（複数可）は、より合わされ、ツイスト、編組、編み、織り、ステッチ貼り合わせ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるファブリック構造を生成する、ファブリック。
【請求項２６】
前記ファブリックが均質である、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項２７】
前記ファブリックが、女性乳房の結合組織の１つ以上の生体力学特性を有する、請求項２６に記載のファブリック。
【請求項２８】
前記１つ以上の生体力学特性が、最大引張強度、線形剛性、降伏点、破壊時の伸長パーセント、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２７に記載のファブリック。
【請求項２９】
前記ファブリックが２次元メッシュである、請求項２７に記載のファブリック。
【請求項３０】
前記結合組織が女性乳房皮下筋膜系の浅筋膜または筋肉筋膜である、請求項２９に記載のファブリック。
【請求項３１】
前記ファブリックが不均質である、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項３２】
前記ファブリックが、その中に１つ以上の追加のコンストラクトを有する２次元メッシュを含む、請求項３１に記載のファブリック。
【請求項３３】
前記２次元メッシュが、女性乳房の結合組織の１つ以上の生体力学特性を有する、請求項３２に記載のファブリック。
【請求項３４】
前記結合組織が女性乳房皮下筋膜系の浅筋膜または筋肉筋膜である、請求項３３に記載のファブリック。
【請求項３５】
前記追加のコンストラクト（複数可）が、ツイストコンストラクト、並列コンストラクト、および編組コンストラクトからなる群より選択される、請求項３２に記載のファブリック。
【請求項３６】
前記追加のコンストラクト（複数可）が、女性乳房の結合組織の１つ以上の生体力学特性を有する、請求項３２に記載のファブリック。
【請求項３７】
前記結合組織が、乳房筋膜、線維支帯、および横線維層板からなる群より選択される、請求項３６に記載のファブリック。
【請求項３８】
前記結合組織が乳房下部支帯である、請求項３６に記載のファブリック。
【請求項３９】
前記１つ以上の生体力学特性が、最大引張強度、線形剛性、降伏点、破壊時の伸長パーセント、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３６に記載のファブリック。
【請求項４０】
前記ファブリックが、乳房内の軟組織の１つ以上の生体力学特性を有する、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項４１】
前記フィブロイン繊維が、２０重量％未満のセリシンを含む、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項４２】
前記フィブロイン繊維が、１０重量％未満のセリシンを含む、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項４３】
前記フィブロイン繊維が、１重量％未満のセリシンを含む、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項４４】
１つ以上の織糸が、並列またはより合わされたフィブロイン繊維を含む、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項４５】
１つ以上の織糸が、編組、織られた織糸、ツイストされた織糸、ケーブル化された織糸、またはそれらの組み合わせである、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項４６】
１つ以上の織糸が、織糸（複数可）を形成するために並列またはより合わされた繊維の群を含む単一レベル階層組織を有する、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項４７】
１つ以上の織糸が、より合わされた群の束を含む２レベル階層組織を有し、群が並列またはより合わされた繊維を含む、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項４８】
１つ以上の織糸が、より合わされた束のストランドを含む３レベル階層組織を有し、束がより合わされた群を含み、群が並列またはより合わされた繊維を含む、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項４９】
１つ以上の織糸がより合わされたストランドのコードを含む４レベル階層組織を有し、ストランドがより合わされた束を含み、束がより合わされた群を含み、群が並列またはより合わされた繊維を含む、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項５０】
１つ以上の織糸が、セリシン抽出フィブロイン繊維および、コラーゲン、ポリ乳酸またはそのコポリマー、ポリグリコール酸またはそのコポリマー、ポリ無水物、エラスチン、グリコサミノグリカン、および多糖からなる群より選択される１つ以上の分解性ポリマーの複合物を含む、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項５１】
コート、ドビー織、積層され、またはそれらの組み合わせである、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項５２】
さらに薬物を含む、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項５３】
さらに細胞接着因子を含む、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項５４】
前記細胞接着因子がＲＧＤである、請求項２９に記載のファブリック。
【請求項５５】
１つ以上の織糸が気体プラズマで処理される、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項５６】
さらに、その中に播種された生体細胞を含む、請求項２５に記載のファブリック。
【請求項５７】
個体の乳房内で結合組織を生成させるための方法であって、請求項２５に記載のファブリック（前記ファブリックは結合組織の１つ以上の生体力学特性を有する）を、移植されたファブリックから結合組織の発生に適切な生理的環境を提供する個体の乳房内の解剖学的位置で個体に移植することを含み、前記ファブリックは、セリシン抽出天然フィブロイン繊維から構成される１つ以上の個々の織糸から構成される、方法。
【請求項５８】
前記結合組織が、浅筋膜、筋肉筋膜、乳房筋膜、線維支帯、および横線維層板からなる群より選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ファブリックが、損傷組織を置き換えるまたは修復するために個体に移植される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記解剖学的位置が、外科的切開または組織再建の部位である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記ファブリックが均質である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記ファブリックが不均質である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
１つ以上の個々の織糸が、単一レベル階層組織、２レベル階層組織、３レベル階層組織、および４レベル階層組織からなる群より選択される階層組織を有する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
請求項２５に記載のファブリックを個体の乳房内の、乳房構造に関するサポート位置に移植することを含む、個体内で乳房構造をサポートするための方法。
【請求項６５】
前記乳房構造が天然乳房組織を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記乳房構造が乳房プロステーシスを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記乳房構造が、組織拡張器を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記ファブリックが２次元メッシュを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記ファブリックがさらに、１つ以上の追加のコンストラクトをその中に含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ファブリックが乳房内の、当該サポート位置で自然に存在する結合組織の１つ以上の生体力学特性を有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
前記結合組織が、浅筋膜、筋肉筋膜、乳房筋膜、線維支帯、および横線維層板からなる群より選択される、請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年６月１１日に出願された米国特許出願第１２／８１４，０３７号の恩典および優先権を主張し、これは、２００４年３月１１日に出願された、係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／８００，１３４の一部継続出願であり、これは、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２００３年３月１１日に出願された米国特許仮出願第６０／４５３，５８４号の恩典を主張し、２００１年１１月１６日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／００８，９２４号、現在米国特許第６，９０２，９３２号の一部継続出願であり、これらの各々内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
疾患、加齢、外傷または慢性疲労はしばしば、組織または臓器不全につながる。そのような不全を治療する場合、多くの臨床手順の目標は機能の回復である。患者はしばしば、身体自体の治癒手段を超えて、追加のサポート、例えば手術または医療機器の移植を必要とする。そのような手順はしばしば、永久的な能力障害および死とすら戦うために必要とされる。生体材料および組織工学の分野は現在、障害を受けた組織または臓器を最初にサポートするが、最終的に身体自体の生物学的および機械的に機能的な組織の発生およびリモデリングを可能にする一時的な足場、マトリクス、およびコンストラクト(すなわち、装置)の研究および開発により、天然組織および臓器機能を徐々に回復させる新規選択を提供している。
【０００３】
そのような足場の責任または設計要求としては下記が挙げられる：（ｉ）損傷または患部組織への即時型機械的安定化を提供する能力、（ｉｉ）装置内への細胞および組織内殖をサポートする、（ｉｉｉ）身体の機械環境を発生組織に連絡させる；そのようなものは装置の適正な機械的および生物学的設計により達成される、（ｉｖ）内殖細胞および組織が再建するのに十分な時間を有するような速度で分解し、よって、患者の生命を存続させることができる新しい自己機能組織が生成する。場合によっては、装置は、サポートしようと企図された組織の正確な三次元構造（例えば、骨足場）を模倣すべきである。他の場合では、装置は三次元組織（ヘルニアの場合腹壁筋）への一時的な結紮糸（例えば、ヘルニア修復のためのフラットメッシュまたは出血のための止血剤）として機能し得る。用途に関係なく、医療機器分野の現在の方向性は、自己組織発生のサポートによる、身体機能の完全な回復である。
【０００４】
不運にも、今日入手可能なほとんどの生体材料は、高荷重要求用途の機械的完全性（例えば、骨、靱帯、腱、筋肉）または適切な生物学的機能性を有さず；ほとんどの生体材料は、分解が速すぎるか（例えば、コラーゲン、ＰＬＡ、ＰＧＡ、または関連コポリマー）または非分解性（例えば、ポリエステル、金属）であり、いずれにしても、機能的な自己組織は発生することができず患者は能力障害に苦しむ。場合によっては、生体材料は組織分化および発生を間違う可能性があり（例えば、自然骨形成、腫瘍）、というのも周囲の細胞および組織との生体適合性を欠くからである。その上、典型的に分解できない生体材料は、慢性炎症と関連し、ここで、そのような応答は実際には周囲の組織にとって有害である（すなわち、衰弱させる）。
【０００５】
適正に設計されると、絹はしばしば、新規クラスの医療機器、足場およびマトリクスの設計に対し新しい選択肢を提供し得る。絹は、あらゆる天然繊維での最高強度を有することが示されており、合成高性能繊維の機械的特性に匹敵する。絹はまた、高い生理的温度で、広範囲のｐＨにおいて安定であり、ほとんどの水性および有機溶媒中で不溶である。絹は合成ポリマーではなくタンパク質であり、分解生成物（例えば、ペプチド、アミノ酸）は生体適合性である。絹は非哺乳類由来であり、他の相当する天然生体材料（例えば、ウシまたはブタ由来コラーゲン）よりもずっと少ないバイオバーデンを有する。
【０００６】
絹は、当技術分野で一般的に知られている用語であり、生物、例えばカイコまたはクモにより分泌された糸状繊維生成物を意味する。昆虫、すなわち（ｉ）ボンビックスモリカイコ、および（ｉｉ）クモ、典型的にはネフィリアグラビペスの腺から生成される絹は、最も頻繁に研究された材料形態であり；しかしながら、何百〜何千もの絹の自然変異体が自然に存在する。フィブロインはカイコの２つの絹糸腺により生成され、分泌される。フィブロインが腺から出て行く時に、セリシンという接着剤様物質でコートされる。しかしながら、クモ絹は免疫原性汚染物質、例えばセリシンのない単一フィラメントとして生成されるので、価値がある（およびカイコ絹とは区別される）。
【０００７】
不運にも、クモ絹は、クモを飼い慣らすことができないため、大量生産することができず；しかしながら、クモ絹、ならびに他の絹は、クローン化させ、および組換えで生成させることができるが、結果は変動が非常に大きい。しばしば、これらのプロセスはバイオバーデンを導入し、費用がかかり、有意な量で材料を得ることができず、材料特性に非常にばらつきがあり、きっちり制御することができず、再現性もない。
【０００８】
結果としてカイコ絹のみが生物医学的用途において１，０００年以上もの間使用されている。ボンビックスモリ種のカイコは、絹繊維（「繭糸」として知られている）を生成し、繊維をその繭を構築するために使用する。繭糸は生成時、２つのフィブロインフィラメントまたは「ブロイン（ｂｒｏｉｎ）」を含み、これらは、セリシンとして知られているガムのコーティングで取り囲まれ−絹フィブロインフィラメントは、著しい機械的完全性を有する。絹繊維が、織糸または織物、例えば縫合糸を生成させるために収穫される場合、複数の繊維が共に整列され、セリシンが部分的に溶解され、その後再固化されセリシンコーティング中に相互に埋め込まれた２つ超のブロインを有するより大きな絹繊維構造が生成される。
【０００９】
本明細書では、「フィブロイン」はカイコフィブロイン（すなわち、ボンビックスモリ由来）およびクモから得られるフィブロイン様繊維（すなわち、ネフィリアグラビペス由来）を含む。また、本発明において使用するのに好適な絹タンパク質は、例えば細菌、酵母、哺乳類細胞、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物由来の遺伝子改変絹を含む溶液から得ることができる。例えば、ＷＯ９７／０８３１５号および米国特許第５，２４５，０１２号を参照されたい。
【００１０】
織物および縫合糸用途のために商業市場で伝統的に入手可能なカイコ絹繊維はしばしば、「精錬」されており、共に撚られた複数のブロインから構成され、より大きな単一のマルチフィラメント繊維が形成される。精錬はここでは、熱せっけん水での洗浄または抽出による２つのブロインの周囲のセリシンコートのルースニングを示す。そのようなルースニングは、ブロインの撚りを可能にし、より大きなマルチフィラメント単一繊維が生成される。しかしながら、完全抽出はしばしば到達されず、望まれてもいない。精錬された絹はしばしば、セリシンを含み、またはセリシンで再コートされ、および／またはセリシン不純物がマルチフィラメント単一繊維を凝結させるために撚り中に導入される。セリシンコートは脆いフィブロインフィラメント（約直径５μｍにすぎない）を、高スループット処理が要求される従来の織物用途中にぼろぼろにならないように保護する。よって、精錬された絹は、明確にセリシンを含まないと述べられない限り、典型的には１０−２６（重量）％のセリシンを含む（表１および２を参照されたい）。
【００１１】
典型的には、文献で「絹」というと、その発言は、何世紀もの間、織物および医薬において使用されている天然由来およびそれでしか入手できない「絹」（すなわち、セリシンコートフィブロイン繊維）に焦点が合わせられていることが推測される。医療グレードカイコ絹は、伝統的に２つの形態でのみ使用される：（ｉ）バージンシルク縫合糸、この場合セリシンは除去されている、および（ｉｉ）従来のより一般的な絹縫合糸、または一般に黒編組絹縫合糸と呼ばれる、この場合、セリシンは完全に除去されているが、ワックスまたはシリコーンコーティングで置換され絹フィブロインと体組織および細胞の間でバリアが提供される。現在、絹が依然として使用される唯一の医学的応用は、縫合糸結紮においてであり、これは特に、絹が手術における機械的特性（例えば、結節強さおよび操作性）のために依然として価値があるからである。
【００１２】
何千年もの間のバージンシルクの縫合糸材料としての用途にもかかわらず、新規生体材料（コラーゲン、合成物）の出現は材料間の比較を可能にし、セリシンの問題を同定した。絹、またはより明確には、ボンビックスモリカイコ絹として規定される、は非生体適合性である。セリシンは抗原性であり、強い免疫、アレルギーまたはハイパーＴ細胞型（対標準の軽度の「異物」応答）応答を誘発する。セリシンは絹フィブロインから除去（洗浄／抽出）され得る；しかしながら、絹からのセリシンの除去は、フィブロイン繊維の超微細構造を変化させ、それらを露出させ、機械的強度の損失が起こり、脆弱構造へとつながる。
【００１３】
抽出された絹構造（すなわち、織糸、マトリクス）はとりわけ、より小さな直径（約５ｕｍ）フィブロインフィラメントのマルチフィラメント性質のために、標準の織物手順中にほつれおよび機械的不全を受けやすい。抽出されたフィブロインの脆性が、抽出後に、絹を医療機器の設計および開発において使用する場合、標準の方法を使用して絹を溶解し、再建して使用可能な生体材料を得なければならない（米国特許第５，２５２，２８５号）ことが典型的には教示されている(Perez-Rigueiro, J. Appl. Polymer Science, 70, 2439-2447, 1998)理由である。抽出された絹フィブロインが今日の織物方法および機械類で取り扱うことができないことが、溶解されていないセリシンを含まないフィブロインの使用を医療機器として研究することを妨げている。
【００１４】
絹フィブロインの追加の制限としては、カイコ絹から抽出され、溶解され、再建され、またはカイコ以外のクモまたは昆虫から生成されたかに関係なく、下記が挙げられる：（ｉ）絹の疎水性、絹にその強度を提供するコアフィブロインタンパク質のβシート結晶立体構造の直接的な結果、（ｉｉ）哺乳類細胞外マトリクスタンパク質中で典型的には見いだされる細胞結合ドメインの欠乏（例えば、ペプチド配列ＲＧＤ）、および（ｉｉｉ）絹フィブロインの滑らかな表面。結果として炎症性および宿主組織応答と関連する細胞（例えば、マクロファージ、好中球）は分解可能な材料として絹フィブロインを認識することができない。よって、これらの細胞は、異物を封入し、遮断することを選び（図１８Ａを参照されたい）、よって（ｉ）絹フィブロイン分解、（ｉｉ）組織内殖、および（ｉｉｉ）組織リモデリングが制限される。よって、絹フィブロインフィラメントはしばしば、慢性炎症、末梢肉芽腫および瘢痕封入と関連する強い異物応答（ＦＢＲ）を誘導する（図１８Ａ）。
【００１５】
絹の生物学的不利益に加えて、絹のマルチフィラメント性質（例えば、縫合糸として）ならびにフィブロインフィラメントの小さなサイズは、密接に充填された構造につながる可能性がある。そのようなものとして、絹はあまりに速く分解する可能性がある。末梢封入内で見られる刺激された細胞から生成されるプロテアーゼ（酵素）は、移植構造に浸透することができる（図１１Ａおよび図１１Ｂを参照されたい）が、正常な組織リモデリング中に装置（この場合、黒編組縫合糸）を強化し得る新規組織沈着細胞（例えば、線維芽細胞）は可能ではない。よって、未処置または非修正フィブロイン装置の内部は、宿主異物応答および組織（線維芽細胞により導かれ、生成される）と接触せず、結果として、装置が組織リモデリングに向かわせる能力が制限される。宿主細胞および組織増殖は制限され、分解は通常可能ではない。
【００１６】
縫合糸の場合、これらの問題は、フィブロイン縫合糸を架橋剤で処理することにより、または縫合糸をワックス、シリコーンまたは合成ポリマーでコートすることにより、よって、材料を身体からシールドすることにより対処することができると考えられる。機械的安定性をフィブロインに追加する（身体とフィブロインの間にバリアを提供しながらその脆性と戦う）ように設計されたコーティング、例えばセリシン、ワックスまたはシリコーンは、細胞接着、認識および浸潤ならびに組織内殖ならびにフィブロイン分解を制限する。結果として、絹は、伝統的に非分解性材料と考えられる。
【００１７】
非分解性としての分類は、絹が従来の縫合糸結紮装置として使用するためのものである、すなわち、装置内への細胞および組織内殖が望ましくない場合、望ましい可能性がある。よって、細胞接着および内殖（マトリクス分解および活性組織リモデリングにつながる）は、絹の生物学的性質および構造の機械的設計の両方により伝統的に防止される。実際、絹は免疫系からシールドされなければならないという一般的な考えおよび絹は非生分解性であるという知見が絹の手術での使用を制限してきた。縫合糸の分野においてさえ、絹はほとんどの用途において生分解性であるか永久的であるかに関係なく、合成材料に取って代われている。
【００１８】
よって、生体適合性であり、細胞の内殖を促進し、生分解性であるセリシン抽出カイコフィブロイン繊維を生成させる必要がある。
【発明の概要】
【００１９】
本明細書で開示される天然絹フィブロイン繊維コンストラクトは、高い強度、延長された疲労寿命、および剛性および破壊時の伸長特性の組み合わせを提供し、これらは生物学的組織（例えば、特定的にそれらを模倣するように設計された組織）のものと厳密に一致する。コンストラクト中の繊維は、非ランダムに整列され、１つ以上の織糸とされる。繊維コンストラクトは生体適合性（カイコ絹繊維からのセリシンの抽出により）であり、実質的にセリシンを含まない。繊維コンストラクトはさらに、非免疫原性であり；すなわち、実質的なアレルギー、抗原性、またはハイパーＴ細胞応答を宿主から誘発せず、周囲の生物学的組織に対する傷害性効果、例えば他の状況では免疫系応答に伴って起こり得るものを減少させる。さらに、繊維コンストラクトは、前記フィブロイン繊維の周囲の細胞の内殖を促進し、生分解性である。
【００２０】
繊維コンストラクトはセリシンを「実質的に含まない」という指示は、セリシンが２０重量％未満のセリシンを含むことを意味する。好ましくは、セリシンは１０重量％未満のセリシンを含む。最も好ましくは、セリシンは１重量％未満のセリシンを含む（表２を参照されたい）。さらに、セリシンを「実質的に含まない」は、宿主から実質的なアレルギー、抗原性、ハイパーＴ細胞応答を誘発しないセリシン量として機能的に規定され得る。同様に、第２の抽出後に３％未満の質量の変化があるという指示は、第１の抽出により、コンストラクトからセリシンが「実質的に除去された」こと、得られたコンストラクトが、第１の抽出後にセリシンを「実質的に含まない」ことを意味するであろう（表２および図１Ｆを参照されたい）。
【００２１】
本開示の方法は、非外科的用途のための絹織物の生成のための従来の処理実行を特徴づける典型的な「精錬」手順よりもずっと徹底的にコンストラクトからセリシンを抽出する（定義については上記を参照されたい）。図１Ａは、精錬された繊維の画像を示し、ここでは、フィブロインフィラメントが共に撚られ、セリシンで再び包まれた、より大きな繊維を形成している。この「精錬された」繊維は約２６重量％のセリシンを含む。好ましい実施形態では、セリシン抽出カイコフィブロイン繊維は、それらの天然タンパク質構造を保持し、溶解および再建されていない。
【００２２】
「天然」絹フィブロイン繊維は、昆虫、例えばカイコまたはクモにより生成され、形成時にはそれらの天然のタンパク質構造を有する。好ましくは、絹フィブロイン繊維コンストラクトは非組換え型であり（すなわち、遺伝子改変されていない）、溶解および再建されていない。好ましい実施形態では、セリシン抽出フィブロイン繊維は、ボンビックスモリカイコから得られたフィブロイン繊維を含んだ。さらに、「生分解性」という用語は、本明細書では、繊維が、体組織と連続して接触すると１年以内に分解されることを意味するために使用される。さらに、我々のデータは、分解速度は、フィブロインの表面修飾（図１３Ａ−Ｄおよび図１８Ａ−Ｃ）ならびに織糸および／またはファブリックの幾何学的構成（図１９Ａ−Ｄ）により影響され、増強され得ることを示唆する（図１３Ａ−Ｅ、図１８Ａ−Ｃおよび図１９Ａ−Ｄ）。１つの実施形態では、絹フィブロイン織糸は、移植視界によって、インビボ移植後２週間以内にその最大引張強度の５０％（図１２）および約３０〜９０日以内にインビボでその質量の５０％を失った（図１３Ａ−Ｄ）。インビボでの移植部位の選択（例えば、筋肉内対皮下）は、分解速度に著しく影響することが示された（図１３Ａ−Ｄ）。
【００２３】
「織物グレード絹」は、繊維の１９重量％−２８重量％を超えるセリシンコーティングを含む天然由来絹である。「縫合糸絹」は、セリシン（「バージンシルク縫合糸」）を含む、または疎水性組成物、例えば蜜蝋、パラフィンワックス、シリコン、または合成ポリマーコーティング（「黒編組絹縫合糸」）でコートされた絹である。疎水性組成物は細胞を忌避し、または細胞がコート繊維に接着するのを阻止する。黒編組絹は縫合糸絹であり、セリシンが抽出され、追加のコーティングに取って代われている。縫合糸絹は、典型的には非生分解性である。
【００２４】
繊維上に保護ワックスまたは他の疎水性コーティングが存在しないため、記載される絹フィブロインコンストラクトは、体組織に移植した時に、織物グレード絹または縫合糸絹に比べ、細胞浸潤の増加を促進するように生物学的（細胞結合ドメインのカップリング）および／または機械的（絹表面積を増加させ、充填密度を減少させる）に設計される。結果として、絹フィブロインコンストラクトは、細胞内殖／浸潤および細胞接着および拡散の改善をサポートし、これは絹フィブロインコンストラクトの分解につがながり、よって本質的に、医療機器および組織工学用途において使用するための新規生分解性生体材料が作成される。繊維コンストラクトの細胞接着およびコンストラクト内への細胞および組織内殖／浸潤をサポートする能力は、見返りとして分解をサポートし、さらに、フィブロイン表面修飾（ＲＧＤを使用するペプチドカップリング、化学種修飾および気体プラズマ処理による親水性の増加）および／またはコンストラクトの機械的設計により、材料表面積を増加させ、よって、絹を分解する能力を有するそれらの細胞および酵素へのその感受性を増加させることにより、増強され得る。絹繊維は、任意で親水性組成物、例えば、コラーゲンまたはペプチド組成物でコートされ、または、細胞および組織内殖をサポートし、複合構造を形成させる生体材料と機械的に組み合わされる。生体材料、量および機械的相互作用（例えば、絹フィブロインのコア周りで包む、または編組）の選択を使用して、細胞内殖およびコンストラクト分解の速度を変化および／または改善させることができる。
【００２５】
コンストラクト中の繊維は、互いに非ランダムに整列され、１つ以上の織糸とされる。そのような構造は、並列、編組、織られ、またはらせん状に組織化された（ツイストされ、ケーブル化され（例えば、ワイヤーロープ））配列で織糸を形成することができる。織糸は、少なくとも１つのフィブロイン繊維から構成されるとして規定され得る。好ましくは、織糸は少なくとも３つの整列されたフィブロイン繊維から構成される。織糸は、ツイストされ、または別のやり方により連続ストランドで共に保持された繊維のアセンブリである。ほとんど無限の織糸が繊維を生成および結合させる様々な手段により作成され得る。絹繊維は上記で記載されている；しかしながら、繊維という用語は、構造がその直径よりも１００倍大きな長さを有することを示す一般名称である。
【００２６】
繊維がツイストされまたは別のやり方でより合わされて織糸を形成する場合、それらは、本質的に相対的な繊維位置で固定し、緩みを除去するのに十分ツイストされ／より合わされ、塑性的に繊維を変形させるほどではないが（すなわち、材料の降伏点を超えない）、これによりそれらの疲労寿命が危険にさらされる（すなわち、不全までの応力サイクルの数が減少する）。セリシンを含まないフィブロイン繊維コンストラクトは、少なくとも０．５２Ｎ／繊維の乾燥最大引張強度（ＵＴＳ）（表１、４）、および約０．２７〜約０．５Ｎ／ｍｍ／繊維の剛性を有することができる。繊維組織および階層によって、我々は、フィブロインコンストラクトＵＴＳは０．５２Ｎ／繊維〜約０．９Ｎ／繊維の範囲とすることができることを示している。本明細書で記載されるフィブロインコンストラクトは、湿試験されると、それらの乾燥ＵＴＳの約８０％およびそれらの乾燥剛性の約３８％を保持した（表５）。約１０％〜約５０％の破壊時の伸長は、乾および湿状態の両方で試験されたフィブロインコンストラクトでは典型的であった。フィブロインコンストラクトは典型的にはそれらのＵＴＳの約４０〜５０％で降伏し、織糸最大引張強度の約２０％の荷重で少なくとも１００万サイクルの疲労寿命を有した。
【００２７】
本発明の１つの実施形態では、整列されたセリシン抽出カイコフィブロイン繊維は、０〜１１．８ツイスト／ｃｍで互いについてツイストされる（表６および７を参照されたい）。
【００２８】
繊維コンストラクトの幾何学構造中の階層数ならびに一階層レベル内の繊維／群／束／ストランド／コードの数、異なるレベルでのより合わせ様式、レベルの数および各レベルでの繊維の数はすべて変動させ、繊維コンストラクト（すなわち、織糸）、よって、ファブリックの機械的特性を変化させることができる（表４および８）。本発明の１つの実施形態では、繊維コンストラクト（すなわち、織糸）は、単一レベル階層組織化において組織化され、前記単一レベル階層組織化は、並列のまたはより合わされた織糸の群を含む。また、繊維コンストラクト（すなわち、織糸）は組織化され、２レベル階層組織とされ、前記２レベル階層組織は、より合わされた群の束を含む。本発明の別の実施形態では、繊維コンストラクト（すなわち、織糸）は、組織化され３レベル階層組織化とされ、前記３レベル階層組織は、より合わされた束のストランドを含む。最後に、本発明の別の実施形態では、繊維コンストラクト（すなわち、織糸）は組織化され、４レベル階層組織とされ、前記４レベル階層組織は、より合わされたストランドのコードを含む。
【００２９】
セリシンは、整列させて織糸とする前に、または繊維コンストラクトの階層ジオメトリにおけるより高いレベルで、フィブロイン繊維から除去することができる。織糸は、セリシンが除去された後、低張力で、一般的配慮をもって穏やかに、取り扱われる（すなわち、コンストラクトに適用される力はいずれの処理工程中でも、決して材料の降伏点を超えない）。処理装置は同様に、処理中織糸に接触し、脆弱フィブロイン繊維を損傷から保護するように誘導するガイドフィクスチャにおける摩損性および鋭角を減少させるように構成され；１時間の抽出滞留時間は、セリシンを抽出するには十分であるが、暴露されたフィラメントを損傷させないようにするには十分遅い。興味深いことに、並列に組織化された複数の繊維から構成される絹繊維コンストラクトは、これらの条件下で抽出された場合、「単一の」より大きなセリシンを含まない織糸が得られた（すなわち、個々の繊維は、抽出中に暴露されるとすぐに、より小さなフィブロインフィラメント間の機械的相互作用によりコンストラクトから分離して戻り得ない）。さらに、セリシンを含まないマイクロフィラメント間の機械的相互作用の結果として、ツイストされまたはケーブル化された織糸の抽出により、典型的には「伸縮性」の低い織糸および構造が得られた。この現象の結果として、より大きな程度のフレキシビリティが織糸の設計および得られたファブリックに存在した；例えば、より高いツイスト／インチ（ＴＰＩ）レベルを使用することができ、これは通常伸縮性の高い織糸を生成させ、これはファブリックを形成するのが困難であろう。より高いＴＰＩの追加の利益は、織糸およびファブリック剛性の減少であった（すなわち、マトリクス弾性を増加させることができる）（表６および７；図６Ａおよび図６Ｂ）。
【００３０】
複数の織糸は、より合わされファブリックを形成する。ファブリックは、１つ以上の個々の織糸を合体させることにより生成され、これにより個々の織糸は織物および医療機器ファブリックに変換される。本発明の１つの実施形態では、織糸は、３０ツイスト／インチ以下でツイストされる。ファブリックは、非ランダムに織糸を結合させることにより生成または形成され：織り、編み、またはステッチ貼り合わせにより完成したファブリックが生成する。１つの実施形態では、この織糸を結合させてファブリックを形成させることは、機械で実施される。しかしながら、最終ファブリック製品は製造するのに使用した織糸の型に基づいて異なっており、よって織糸設計が臨床的必要性を満たすのに大きな力を持つことに注意することは非常に重要である。ファブリックは、織り、編み、縦編み、貼り合わせ、コート、ドビー織、積層、メッシュ、またはそれらの組み合わせとすることができるが、これらに限定されない。
【００３１】
注目すべきことに、編組する、さらに織糸を製造する織物方法はまた、ファブリック、例えば平編組ファブリックまたはより大きな丸編組を製造するために使用することができる（図４Ａ）。逆に、織りおよび編み、２つのファブリック形成方法は、通常使用されないが、これらもまた織糸を製造するために使用することができる。そのような場合、「織糸」と「ファブリック」の間の区別は完全には明白ではなく、明確な区別をつけるためには均質性が使用されるべきであり、すなわち、織糸は典型的には組成および構造がファブリックよりも均質である。
【００３２】
本発明の１つの実施形態では、複数のカイコ絹繊維がらせん状に（例えば、ツイストされまたはケーブル化され）または並列で、単一階層レベルでまたは複数のレベルで組織化され、抽出され、組織結紮のための編組縫合糸を生成させるために使用され得る。別の実施形態では、抽出後、ツイストされまたはケーブル化された構成における抽出されたフィブロインフィラメントの機械的相互作用は、医療用縫合糸として使用することができる。
【００３３】
不織ファブリックは、複数の織糸をランダムに組織化することにより、または多くの小さな長さのピースに切断された単一の織糸により形成させてもよい。非制限的な例としては、止血剤または骨足場のためのファブリックが挙げられる。全てのファブリックは、単一の織糸コンストラクト（均質）または複数の織糸コンストラクト（不均質）のいずれかに由来することができる。様々な絹フィブロイン織糸構造を設計する能力は、下記で詳細に記載されるように、不均質ファブリック構造を考慮した場合、ファブリック設計の可能性を劇的に増加させる。
【００３４】
本発明の１つの実施形態では、ファブリックは、セリシン抽出フィブロイン繊維または織糸および、コラーゲン、ポリ乳酸またはそのコポリマー、ポリグリコール酸またはそのコポリマー、ポリ無水物、エラスチン、グリコサミノグリッカンド、および多糖からなる群より選択される１つ以上の分解性ポリマーの複合物である。さらに、本発明のファブリックは、ファブリックと関連する薬物または細胞接着因子（すなわち、ＲＧＤ）を含むように修飾され得る。本発明の１つの実施形態では、ファブリックは気体プラズマで処理され、または生体細胞が播種される。
【００３５】
本開示の追加の態様は、特定の体組織の修復、例えばヘルニア修復、膀胱組織およびスリング、骨盤底再建、腹膜壁組織、血管（例えば、動脈）、筋肉組織（腹部平滑筋、心臓）、止血剤、ならびに膝および／または肩の靱帯および腱ならびに外傷または慢性疲労によりしばしば損傷する他の構造に関連する。生成させることができる靱帯または腱の例としては前十字靱帯、後十字靱帯靱帯、回旋筋腱板腱、肘および膝の内側側副靱帯、手の屈筋腱、足首の外側靱帯ならびに顎または顎関節の腱および靱帯が挙げられる。本開示の方法により生成され得る他の組織としては、軟骨（関節および半月板の両方）、骨、皮膚、血管、血管サポートおよび／または修復のためのステント、および全身の軟結合組織が挙げられる。
【００３６】
他の態様では、織糸またはより大きな織糸のコンストラクトの形態のカイコフィブロイン繊維は、ここでは装置と呼ばれ、セリシンが取り去られ、ファブリックとされ（例えば、織り、編み、不識ウェットレイド、編組、ステッチ貼り合わせ、など）、滅菌され、制御可能な寿命（すなわち、分解速度）および制御可能なコラーゲンおよび／または細胞外マトリクス沈着の程度を提供する移植可能なサポートまたは修復材料として使用される。サポートまたは修復材料は、任意のそのような目的のために体内で使用することができ、特にヘルニア修復、特に胸部および腹腔内の体壁の再建、および内臓、例えば、限定はされないが、膀胱、子宮、腸、尿道、および尿管のサポート、位置決めまたは固定化のために使用することができる。また、カイコフィブロイン繊維はセリシンが取り去られ、組織化され不織ファブリックにされ得る。そのような不織ファブリックは上記のような移植可能なサポートまたは修復材料として使用することができるが、より特定的には、スポンジ形成が有用である用途のために使用することができる。
【００３７】
精製される絹は、天然原繊維中に見られるセリシンタンパク質を除去する様々な処理のいずれかにより精製させることができる。精製された絹のインプラントが、抗原性（Ｂ細胞、Ｔ細胞）応答なしで軽度の一過性の異物反応しか誘発しない、すなわち、生体適合性である場合、セリシンは十分除去されている。異物反応は、線維芽細胞および結合組織の二次ゾーンを有するマクロファージおよび／または巨細胞の内層により特徴づけられる。異物応答の程度は、フィブロイン修飾（図１３Ａ−Ｄおよび図１８Ａ−Ｃ）および織糸設計（図１９Ａ−Ｄ）により制御可能であることが示されている。セリシンは、個々のカイコフィブロイン繊維、組織化された配向（例えば、並列またはツイスト）を有するカイコフィブロイン繊維の群（すなわち、織糸）、または複数の織糸を含むファブリックもしくは他のコンストラクトから除去することができる。コンストラクトはその後、滅菌され、生物内に医療機器として移植させることができる。
【００３８】
本発明の態様は、豊胸または再建手順のための移植可能なプロステーシスに関し、これは、セリシン抽出天然フィブロイン繊維から構成される１つ以上の個々の織糸を含む生体適合性および生分解性ファブリック構造を含み、ここで、織糸（複数可）は、より合わされファブリック構造を生成し、ファブリック構造は第１の次元で延在し、患者体内の天然乳房組織またはプロステーシス乳房インプラントに係合し、これをサポートするように適合させた第１の表面を有する。１つの実施形態では、ファブリック構造は、患者の胸腔の周囲の組織に固定されるように適合させた部分を含む。１つの実施形態では、ファブリック構造は乳房組織またはプロステーシス乳房インプラントの周囲の軟組織に固定されるように適合させた部分を含む。１つの実施形態では、ファブリック構造は乳房組織またはプロステーシス乳房インプラントに隣接する骨構造に固定されるように適合させた部分を含む。１つの実施形態では、ファブリック構造は、天然乳房組織または乳房インプラントの一領域の少なくとも一部に一致するように適合させた所定の形状で形成される。１つの実施形態では、所定の形状は、円形形状、楕円形状、三日月形状、カップ形状および細長いストリップからなる群より選択される。１つの実施形態では、ファブリック構造は乳房組織の内殖を促進するための因子を含む。１つの実施形態では、ファブリック構造は、移植されると、少なくとも部分的に乳房結合組織に取って代わる。１つの実施形態では、ファブリック構造は、スリング形状で形成され、ファブリック構造が患者に移植されると、乳房または乳房インプラントのためのサポートを提供する。１つの実施形態では、ファブリック構造は、細長い形状で形成され、ファブリック構造が患者に移植されると、乳房の乳房下部領域内でサポートを提供する。１つの実施形態では、ファブリック構造はカップ形状で形成され、ファブリック構造が患者に移植されると、乳房の乳房下部領域内で下方サポートを提供する。１つの実施形態では、ファブリック構造はカップ形状で形成され、ファブリック構造が患者に移植されると、乳房に対し内側または外側サポートを提供する。１つの実施形態ではファブリック構造はツイスト、編組、編み、織り、ステッチ貼り合わせ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００３９】
本発明の態様は、患者において乳房組織または乳房インプラントをサポートする方法に関し、これは、セリシン抽出天然フィブロイン繊維から構成される１つ以上の個々の織糸を含む生体適合性および生分解性ファブリック構造を提供すること（ここで、織糸（複数可）は、より合わされファブリック構造を生成する）、およびファブリック構造を患者の皮膚と乳房組織または乳房インプラントの間に挿入することを含む。１つの実施形態では、方法はさらに、ファブリック構造を患者の胸腔の周囲の組織に固定することを含む。１つの実施形態では、方法はさらに、ファブリック構造を乳房組織またはプロステーシス乳房インプラントの周囲の軟組織に固定することを含む。１つの実施形態では、方法はさらにファブリック構造を乳房組織またはプロステーシス乳房インプラントに隣接する骨構造に固定することを含む。１つの実施形態では、方法はさらにファブリック構造を、天然乳房組織または乳房インプラントの一領域の少なくとも一部に一致するように適合させた所定の形状に形成することを含む。１つの実施形態では、所定の形状は、円形形状、楕円形状、三日月形状、カップ形状および細長いストリップからなる群より選択される。１つの実施形態では、方法はさらにファブリック構造を、乳房組織の内殖を促進するための因子で処理することを含む。１つの実施形態では、ファブリック構造は、乳房の乳房下部領域に挿入され、乳房の垂直位置決めを提供し、乳房の垂直下方変位を減少させる。１つの実施形態では、ファブリック構造は、乳房の内側に挿入され、乳房の内側位置決めを提供し、乳房の内側変位を減少させる。１つの実施形態では、ファブリック構造は乳房の外側に挿入され、乳房の外側位置決めを提供し、乳房の外側変位を減少させる。１つの実施形態ではファブリック構造はツイスト、編組、編み、織り、ステッチ貼り合わせ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００４０】
本発明の態様は、セリシン抽出天然フィブロイン繊維から構成される１つ以上の個々の織糸を含む生体適合性および生分解性ファブリックに関し、ここで、織糸（複数可）は、より合わされ、ツイスト、編組、編み、織り、ステッチ貼り合わせ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるファブリック構造を生成する。１つの実施形態では、ファブリックは均質である。１つの実施形態では、ファブリックは、女性乳房の結合組織の１つ以上の生体力学特性を有する。１つの実施形態では、１つ以上の生体力学特性は、最大引張強度、線形剛性、降伏点、破壊時の伸長パーセント、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。１つの実施形態では、ファブリックは２次元メッシュである。１つの実施形態では、結合組織は女性乳房皮下筋膜系の浅筋膜または筋肉筋膜である。１つの実施形態では、ファブリックは不均質である。１つの実施形態では、ファブリックは、その中に１つ以上の追加のコンストラクトを有する２次元メッシュを含む。１つの実施形態では、２次元メッシュは、女性乳房の結合組織の１つ以上の生体力学特性を有する。１つの実施形態では、結合組織は女性乳房皮下筋膜系の浅筋膜または筋肉筋膜である。１つの実施形態では、追加のコンストラクト（複数可）は、ツイストコンストラクト、並列コンストラクト、および編組コンストラクトからなる群より選択される。１つの実施形態では、追加のコンストラクト（複数可）は、女性乳房の結合組織の１つ以上の生体力学特性を有する。１つの実施形態では、結合組織は乳房筋膜、線維支帯、および横線維層板からなる群より選択される。１つの実施形態では、結合組織は乳房下部支帯である。１つの実施形態では、１つ以上の生体力学特性は、最大引張強度、線形剛性、降伏点、破壊時の伸長パーセント、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。１つの実施形態では、ファブリックは、乳房内の軟組織の１つ以上の生体力学特性を有する。１つの実施形態では、フィブロイン繊維は、２０重量％未満のセリシンを含む。１つの実施形態では、フィブロイン繊維は、１０重量％未満のセリシンを含む。１つの実施形態では、フィブロイン繊維は１重量％未満のセリシンを含む。１つの実施形態では、１つ以上の織糸は並列である、またはより合わされたフィブロイン繊維を含む。１つの実施形態では、１つ以上の織糸は、編組、織られた織糸、ツイストされた織糸、ケーブル化された織糸、またはそれらの組み合わせである。１つの実施形態では、１つ以上の織糸は、織糸（複数可）を形成するために並列またはより合わされた繊維の群を含む単一レベル階層組織を有する。１つの実施形態では、１つ以上の織糸は、より合わされた群の束を含む２レベル階層組織を有し、ここで群は並列またはより合わされた繊維を含む。１つの実施形態では、１つ以上の織糸は、より合わされた束のストランドを含む３レベル階層組織を有し、ここで、束はより合わされた群を含み、群は並列またはより合わされた繊維を含む。１つの実施形態では、１つ以上の織糸はより合わされたストランドのコードを含む４レベル階層組織を有し、ここで、ストランドはより合わされた束を含み、束はより合わされた群を含み、群は並列またはより合わされた繊維を含む。１つの実施形態では、１つ以上の織糸は、セリシン抽出フィブロイン繊維および、コラーゲン、ポリ乳酸またはそのコポリマー、ポリグリコール酸またはそのコポリマー、ポリ無水物、エラスチン、グリコサミノグリカン、および多糖からなる群より選択される１つ以上の分解性ポリマーの複合物を含む。１つの実施形態では、ファブリックはコート、ドビー織、積層され、またはそれらの組み合わせである。１つの実施形態では、ファブリックはさらに薬物を含む。１つの実施形態では、ファブリックはさらに細胞接着因子を含む。１つの実施形態では、細胞接着因子はＲＧＤである。１つの実施形態では、１つ以上の織糸は気体プラズマで処理される。１つの実施形態では、ファブリックはさらに、その中に播種された生体細胞を含む。
【００４１】
本発明の態様は、個体の乳房内で結合組織を生成させるための方法に関し、本方法は、本明細書で開示されるファブリック（ファブリックは結合組織の１つ以上の生体力学特性を有する）を、移植されたファブリックから結合組織の発生に適切な生理的環境を提供する個体の乳房内の解剖学的位置で個体に移植することを含み、ファブリックは、セリシン抽出天然フィブロイン繊維から構成される１つ以上の個々の織糸から構成される。１つの実施形態では、結合組織は、浅筋膜、筋肉筋膜、乳房筋膜、線維支帯、および横線維層板からなる群より選択される。１つの実施形態では、ファブリックは、損傷組織を置き換えるまたは修復するために個体に移植される。１つの実施形態では、解剖学的位置は、外科的切開または組織再建の部位である。１つの実施形態では、ファブリックは均質である。１つの実施形態では、ファブリックは不均質である。１つの実施形態では、１つ以上の個々の織糸は、単一レベル階層組織、２レベル階層組織、３レベル階層組織、および４レベル階層組織からなる群より選択される階層組織を有する。
【００４２】
本発明の態様はさらに、本明細書で開示されるファブリックを個体の乳房内の、乳房構造に関するサポート位置に移植することを含む、個体内で乳房構造をサポートするための方法に関する。１つの実施形態では、乳房構造は天然乳房組織を含む。１つの実施形態では、乳房構造は乳房プロステーシスを含む。１つの実施形態では、乳房構造は、組織拡張器を含む。１つの実施形態では、ファブリックは２次元メッシュを含む。１つの実施形態では、ファブリックはさらに、１つ以上の追加のコンストラクトをその中に含む。１つの実施形態では、ファブリックは乳房内の、そのようなサポート位置で自然に存在する結合組織の１つ以上の生体力学特性を有する。１つの実施形態では、結合組織は、浅筋膜、筋肉筋膜、乳房筋膜、線維支帯、および横線維層板からなる群より選択される。
【００４３】
本発明の他の特徴および利点は、その好ましい実施形態の下記説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１Ａ−図１Ｇは写真およびグラフ表示を含む。図１Ａはセリシンコーティングを有する単一の天然の、精錬され、撚られた２０／２２デニール絹繊維の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。図１Ｂは６０分間３７℃で抽出された図１Ａの絹繊維のＳＥＭを示す。図１Ｃは、６０分９０℃で抽出された図１Ａの絹繊維のＳＥＭを示し、セリシンコーティングの完全な除去が示される。図１Ｄは、最大引張強度（ＵＴＳ）および剛性（３ｃｍ長さのマトリクスに対するＮ／ｍｍ）を抽出条件の関数として示すチャートである。図１Ｅは、生絹フィブロインのＳＥＭを示す。図１Ｆは、９０°で６０分の第１の抽出を示す。図１Ｇは同一の条件下での第２の抽出を示す。これらの図は、第２の抽出後、典型的な３％質量損失となるフィラメントに対する機械的損傷を示す。よって、％質量損失が第１から第２の抽出まで３％を超えて変化しない限り（９０℃、１時間、標準の洗剤および塩）、完全抽出が達成されたと仮定される。総質量損失の３％損失の有用性は、測定、アッセイおよび第２の抽出後の織糸の質量損失となる機械的損傷の変動性から反映されている。
【図２】図２Ａ−図２Ｄは写真および描画を含む。図２Ａは、（ケーブルまたはツイストされた）織糸の代表的な３−Ｄモデルであり、その５レベルの階層が示される（単一繊維レベルは図示せず）。各レベルで使用される繊維の数によって、コードは、ヘルニア修復メッシュを編むための織糸またはＡＣＬマトリクスを形成するために他のコードと並列で使用されるコードとして機能することができる。図２Ｂは、３６繊維を含む２レベル階層ツイストまたはケーブル化織糸の作成の概略図であり、その後、並列で撚られＡＣＬマトリクスを形成し、または組織工学および組織修復のための織りまたは編みファブリック（例えば、ヘルニアメッシュ）を作成するために使用される。略図は視覚的に２つの非常に一般的なファブリック形成形態を規定する：「織り」および「編み」。図２Ｃは中心軸についてらせん状に組織化され、２レベルのツイスト階層から構成されるジオメトリを有する織糸の単一コードを示す。６つのコードが並列で使用された場合（例えば、マトリクス１）、織糸は天然靱帯と同様の機械的特性を有する。図２Ｄは、中心軸についてらせん状に組織化され、３レベルのツイスト階層から構成されるジオメトリを有する織糸の単一コードを示す。６つのコードが並列で使用された場合（例えば、マトリクス２）、マトリクスは天然靱帯と同様の機械的特性を有する。
【図３】図３Ａ−図３Ｄは一連のグラフである。図３Ａは、図２Ａで示される６つの並列絹フィブロインコードから形成されたマトリクス１の５つの試料（ｎ＝５）に対する荷重−伸長曲線を示す。図３ＢはＵＴＳ、１６８０Ｎ、および１２００Ｎ荷重での不全までのサイクルのチャートであり（各荷重に対しｎ＝５）、マトリクス１の疲労データを示す。インビボでの不全までのサイクル数を予測するために生理的荷重レベル（４００Ｎ）まで外挿させた場合のマトリクス１疲労データの回帰分析は、３３０万サイクルのマトリクス寿命を示す。図３Ｃは図２Ｂで示される６つの並列絹フィブロインコードから形成されたマトリクス２（ｎ＝３）の３つの試料（ｎ＝３）に対する荷重−伸長曲線を示す。図３ＤはＵＴＳ、２２８０Ｎ、２１００Ｎおよび１８００Ｎ荷重での不全までのサイクルのチャートであり（各荷重に対しｎ＝３）、マトリクス２の疲労データを示す。インビボでの不全までのサイクル数を予測するために生理的荷重レベル（４００Ｎ）まで外挿させた場合のマトリクス２疲労データの回帰分析は、１０００万サイクルを超えるマトリクス寿命を示す。
【図４】図４Ａ−図４Ｃは写真およびグラフである。図４Ａは、我々の研究所で作成された複数の織糸およびファブリック形態の画像を示す。いくつかの異なる織糸構造、例えば様々な型の編組（ｉ、ｉｉ、ｉｖ）、平編組（ｉｉｉ）、変動直径またはテーパ編組（ｖ）、より大きな（約２５０繊維）ケーブル化された２レベル束（ｖｉ）、２４−１２繊維で織られた織糸から構成される並列撚りおよび貼り合わせ（スエージ加工）織糸（ｖｉｉ）、様々なツイスト織糸（ｖｉｉｉ−ｘｉ）、および２４−１２繊維２レベルケーブル化織糸から構成される並列撚りおよび貼り合わせ（スエージ加工）織糸（ｘｉｉ）。図４Ｂは、下記に対する荷重−伸長曲線のチャートである：（Ｉ）編組（４８繊維、ツイストされ抽出された１２繊維織糸を使用する４キャリアブレーダー）および織られた織糸（総４８繊維）および（ＩＩ）ツイスト織糸とケーブル化織糸の比較、総１２繊維−試料は全て３ｃｍの長さとした。図４Ｃは、（Ｉ）３６繊維の小ケーブルおよび（ＩＩ）６０繊維の小さな織られた織糸に対する、３Ｂおよび３Ｄと比較される、小さな織糸、長さ３ｃｍに対する疲労データのチャートである。
【図５】図５Ａ−図５Ｂは表およびグラフである。図５Ａは、３６繊維織糸に対する強度および剛性データを試験した６つの異なるひずみ速度の関数として提供する（Ｎ＝５／群）。図５Ｂは６つの異なるひずみ速度のうちの２つで試験した３６−繊維織糸、３ｃｍ長に対する荷重−伸長曲線を示す。データは、試験手順（ここでは、具体的にはひずみ速度）の織糸構造の報告された機械的特性（例えば、ＵＴＳ）に対する影響を表す。
【図６】図６Ａ−図６Ｂはグラフである。図６Ａは、ツイスト／インチ（ＴＰＩ）の関数としてのＵＴＳのチャートであり；傾向線を作成して、データを４次多項式まで外挿した０−１５のＴＰＩを示す。個々のフィラメントが調和して働く秩序構造を示す最大が観察された。図６Ｂは剛性の（３ｃｍ長の試料に対する）ツイスト／インチ（ＴＰＩ）の関数としてのチャートであり；傾向線を作成して、データを５次多項式まで外挿した０−１５のＴＰＩを示す。最大が観察され、ＴＰＩは、特定のＵＴＳまたは剛性のために設計するツールとして使用することができるであろうことが示される。
【図７】図７Ａ−図７Ｄは写真である。図７Ａは細胞を播種する前の抽出された絹フィブロインのＳＥＭを示す。図７Ｂは、播種直後の絹フィブロインに播種され、接着された骨髄間質細胞のＳＥＭを示す。図７Ｃは、播種後１日の絹フィブロインに接着され、拡散された骨髄細胞のＳＥＭを示す。図７Ｄは、播種後１４日の、無傷の細胞−細胞外マトリクスシートを形成する絹フィブロインに播種された骨髄間質細胞のＳＥＭを示す。
【図８】図８Ａ−図８Ｂは写真である。図８Ａは、図２Ｃで示され、骨髄間質細胞が播種され、１４日間静的環境で培養され、ＭＴＴで染色された３ｃｍの長さの絹フィブロインコードを示し、増殖期間後のマトリクスの均一な細胞被覆が示される。図８Ｂは、ＭＴＴで染色された３ｃｍの長さの絹フィブロインコードの対照ストランドを示す。
【図９】図９Ａ−図９Ｂはデータのグラフである。図９Ａは２１日の培養期間にわたる総細胞ＤＮＡにより決定される絹フィブロインマトリクス１上での骨髄間質細胞増殖を示すチャートであり、２１日の培養後、細胞増殖が著しく増加することが示されている。図９Ｂは１４日の培養期間にわたる総細胞ＤＮＡにより決定される絹フィブロインマトリクス２上での骨髄間質細胞増殖を示す棒グラフであり、１４日の培養後、細胞増殖が著しく増加することが示されている。
【図１０】図１０は生理的増殖条件での２１日の培養にわたる、骨髄間質細胞が播種された、または播種されていない、３０絹繊維抽出コンストラクトの最大引張強度を示す。
【図１１】図１１Ａ−図１１Ｂはデータのグラフである。図１１Ａはインビトロ酵素分解の関数としてのＵＴＳのチャートである；陰性対照、ＰＢＳでは強度損失は観察されなかった。絹は、２１日の培養後、その強度の５０％を失った。Ｓｉｇｍａ製のプロテアーゼＸＩＶの１ｍｇ／ｍｌ溶液を使用した。図１１Ｂは、インビトロ酵素分解の関数としての質量損失のチャートである；陰性対照、ＰＢＳでは強度損失は観察されなかった。４１日の培養後、５０％質量損失が観察された。
【図１２】図１２は１０、２０および３０日間の非荷重皮下ラットモデルへのＲＧＤ修飾マトリクス移植後のインビボ分解の関数としてのＵＴＳ損失のチャートである。５０％強度損失がインビボで、非荷重環境で約１０日後に観察された。
【図１３】図１３Ａ−図１３Ｅは写真、グラフおよび表である。図１３Ａは、Ｌｅｗｉｓラットに皮下移植した後３０日の、１２（０）ｘ３（８）非修飾およびＲＧＤ修飾のセリシンを含まない絹フィブロインマトリクスの組織切片を示す。列Ｉは４０ＸでのＨ＆Ｅ染色であり、列ＩＩは１２８ＸでのＨ＆Ｅ染色であり、列ＩＩＩは１２８Ｘでのコラーゲントリクローム染色であり、列ＩＶは列ＩＩＩ画像から取り消されたコラーゲンであり、コラーゲン内殖定量が可能であり、列Ｖは取り消された残りの絹フィブロインの断面と関連する画素であり分解の定量が可能になる。定性的評価では、皮下環境において、未処理および修飾群のどちらも、マトリクス自体内での細胞内殖およびコラーゲン沈着をサポートし、末梢封入は制限された。図１３Ｂは、定量的に３０日の皮下移植後のＲＧＤ修飾絹断面積の３６％の減少を表し、未処理対照に比べて、表面修飾絹フィブロインマトリクスを分解する宿主の能力の著しい改善が示される。図１３Ｃは定量的に未処理対照に比べて、ＲＧＤ修飾フィブロインマトリクス内のコラーゲン沈着の著しい６３％の増加を示し、再び、修飾絹マトリクスの宿主細胞および組織内殖をサポートする能力が証明される。図１３ＤはＬｅｗｉｓラットの腹腔内で筋肉内に移植された、抽出された３６繊維フィブロイン織糸のＨ＆Ｅ染色を示す。画像は、非修飾およびＲＧＤ修飾マトリクスの両方に対し４０Ｘおよび１２８Ｘで示される。結果は、定性的に、ＲＧＤ修飾が３０日以内にインビボで細胞および組織浸潤を劇的に増加させたことを示す。黒編組絹縫合糸またはバージンシルク縫合糸とは異なり、末梢封入またはプラズマ細胞は観察されなかった。皮下インプラントに比べ、細胞浸潤およびコラーゲン沈着が未処理対照ではほぼ〜全く観察されず、表面修飾に加えて移植部位の効果が示される。図１３Ｅは、未処理対照と比較した２つの異なる修飾群由来のインビボ質量損失の数値表示である。ＲＧＤ修飾、続いて気体プラズマ修飾は、９０日の筋肉内移植後の分解の程度を著しく（ｐ＜０．０５）増加させた。しかしながら、予測されたように、分解は筋肉内環境に比べ皮下環境でより積極的であったと考えられる。
【図１４】図１４は時間経過に伴う選択されたマーカーのＲＴ−ＰＣＲ増幅のゲル電気泳動分析を示す。ゲルは、１４日の培養にわたりマトリクス２上で増殖した骨髄間質細胞によりハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨに対して正規化された、コラーゲンＩおよびＩＩＩ型発現レベルの両方における上方制御を示す。コラーゲンＩＩ型（軟骨に対するマーカーとして）および骨シアロタンパク質（骨組織形成のマーカーとして）は検出されず、マトリクス２と培養させた場合、ＢＭＳＣによる靱帯特異的分化応答が示される。
【図１５】図１５Ａ−図１５Ｂはウサギモデルにおいて内側側副靱帯（ＭＣＬ）を再建するために使用された、６週間のインビボ移植後のマトリクス１の単一コード（移植時には播種されず）を示す。図１５Ａはヘマトキシリンおよびエオシン染色により可視化された、前駆宿主細胞により囲まれたマトリクス１フィブロイン繊維およびマトリクス中および個々のフィブロイン繊維の周囲への組織内殖を示す。図１５Ｂは、トリクローム染色により可視化されたマトリクス中および個々のフィブロイン繊維の周囲へのコラーゲン組織内殖を示す。
【図１６】図１６Ａ−図１６Ｃはコラーゲン繊維上で播種され、１日（図１６Ａ）および２１日（図１６Ｂ）間に増殖した骨髄間質細胞を示す；ＲＴ−ＰＣＲ（図１６Ｃ）およびコラーゲンＩおよびＩＩＩ発現対ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのゲル電気泳動分析：ａ＝コラーゲンＩ、１４日；ｂ＝コラーゲンＩ、１８日；ｃ＝コラーゲンＩＩＩ、１４日；ｄ＝コラーゲンＩＩＩ、１８日；ｅ＝ＧＡＰＤＨ、１４日；ｆ＝ＧＡＰＤＨ、１８日。コラーゲンＩＩ型（軟骨のためのマーカーとして）および骨シアロタンパク質（骨組織形成のマーカーとして）は検出されず、靱帯特異的分化応答が示される。
【図１７】図１７は８．９：１のコラーゲンＩ対コラーゲンＩＩＩ（ＧＡＰＤＨに対し正規化）の転写比が得られた、１４日での実時間定量的ＲＴ−ＰＣＲを示す。
【図１８】図１８Ａ−図１８Ｃは写真である。図１８Ａおよび図１８Ｂはそれぞれ、筋肉内移植後３０日の、６束の（Ａ）２−０黒編組絹縫合糸および（Ｂ）ＲＧＤ−表面修飾絹（３６繊維／束）のＨ＆Ｅ染色断面である。図１８Ｃは、移植前４週間ＢＭＳＣを前播種させたＲＧＤ修飾絹である。図１８Ａは、市販（Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｉｎｃ．）の黒編組絹縫合糸に対する典型的および広範な異物反応を示し、ここでは内殖または細胞浸潤は観察されない。図１８Ｂは、操作された絹の、細胞および組織内殖を促進する能力を示す。図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃはワックス中でコートされた（図１８Ａ）、セリシンが取り去られ、ＲＧＤでコートされた（図１８Ｂ）、およびセリシンが取り去られ前駆成体幹細胞が播種された（図１８Ｃ）、絹繊維コンストラクトに対する組織応答を示す。
【図１９】図１９Ａ−図１９Ｄはラットモデルに３０日間移植した後の、２つの織糸（４ｘ３ｘ３および１２ｘ３）の４０Ｘ（上列、図１９Ａ＆図１９Ｂ）および１２８Ｘ（底列、図１９Ｃおよび１９Ｄ）でのＨ＆Ｅ染色断面画像を示し、それぞれ、同じ繊維数を含むが、特定の階層により異なって組織化されている。結果から、織糸設計および構造は、細胞および組織内殖の程度に影響を与えることができることが示され、１２ｘ３織糸コンストラクトは内殖を可能にしたが、４ｘ３ｘ３は阻止したようである。
【図２０】図２０Ａ−図２０Ｃは（Ａ）ファブリック形成後に抽出された、単一繊維がウェットレイドされた不織ファブリック（繊維は最初に抽出され、不織に形成することができる−データ図示せず）、（Ｂ）ファブリック形成後に抽出された１２繊維織糸を用いたチェーンステッチの形態から生成された編みファブリック、（Ｃ）ウエフト方向に走る３６繊維の前抽出された織糸を有する前抽出された１２繊維織糸から生成された織ファブリックの写真である。
【図２１】図２１は生体適合性および生分解性絹フィブロインマトリクスを生成するために使用することができる様々な方法および配列のフローチャートである。例えば、単一繊維を抽出し、ツイストして織糸とし、編んでファブリックとし、または織糸を撚り、撚られた織糸をツイストし、ファブリックを形成させ、その後抽出する。ほとんど無限の組み合わせが存在するが、全て、表４、６、７、および８に示されるように、織糸の階層、１レベルあたりの繊維数および１レベルあたりのＴＰＩに依存する。
【図２２】図２２Ａ−図２２Ｂは本発明による、豊胸または再建手順のための移植可能なプロステーシスの線図を示す。
【図２３】図２３Ａ−図２３Ｂは描画である。図２３Ａは、本発明の１つの実施形態による、垂直サポートを提供する移植位置での、図２２Ａおよび２２Ｂの移植可能なプロステーシスの線図を示す。図２３Ｂは、本発明の別の実施形態による、内側または外側サポートを提供する移植位置での、図２２Ａおよび２２Ｂの移植可能なプロステーシスの線図を示す。
【図２４】図２４は本発明の１つの実施形態による、三日月形状を有する、豊胸または再建手順のための移植可能なプロステーシスの線図を示す。
【図２５】図２５は本発明の１つの実施形態による、細長いまたは楕円形状を有する、豊胸または再建手順のための移植可能なプロステーシスの線図を示す。
【図２６】図２６は本発明の１つの実施形態による、スリング形態の、豊胸または再建手順のための移植可能なプロステーシスの線図を示す。
【図２７】図２７は本発明の１つの実施形態による、移植可能なストリップまたはテープの形態の、豊胸または再建手順のための移植可能なプロステーシスの線図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
下記でより詳細に記載される方法では、絹フィブロイン繊維は、並列配向で整列される；繊維は厳密に並列配向のままとすることができ、ツイストされもしくは別の方法でより合わされ織糸を形成することができる。織糸は繊維レベルで始まり、束、ストランド、コード、などのレベルまで拡張する任意の階層数を含むことができる。より合わせは、各レベルで提供することができる。さらに、セリシンは、繊維数が、抽出溶液が織糸全体に浸透することができるのを超える点までの階層の任意の点で、絹繊維から抽出される。組み合わせて、うまく抽出させることができるカイコフィブロイン繊維の最大数は（購入時２０／２２デニール）、約５０である（表４）。これらの織糸はその後、例えば、靱帯または組織再建のための繊維コンストラクトとして使用することができ、あるいは例えば、修復、例としてヘルニア修復、腹腔底再建および膀胱スリングのための軟組織メッシュの生成において使用するためのファブリックに組み込むことができる。繊維コンストラクトの形成は、下記で、例示的な適用との関連で記載する。
【００４６】
下記記載の多くは、前十字靱帯（ＡＣＬ）の生成のための絹繊維ベースマトリクス（すなわち、コンストラクト、足場）に向けられているが、様々な他の組織、例えば他の靱帯および腱、軟骨、筋肉、骨、皮膚および血管が、新規絹繊維ベースマトリクスを使用して形成させることができる。ＡＣＬの場合、複数のより合わせ階層レベルおよび関連する生理的特性を有する大きな織糸（５４０−３９００繊維／織糸、並列で撚る前；表８および１１を参照されたい）が説明された。絹繊維ベースＡＣＬマトリクスに加えて、並列で、または特定のファブリック形成になるように組み合わせた後、関連する生理的特性を有する複数のより小さな織糸構成（１−５０絹繊維）（表１、４および５）は、誘導組織形成のための組織マトリクスとして機能することができる（図２Ａ−Ｂ）。誘導組織形成または操作のための絹マトリクスに加えて、この研究は、特に直接的に、誘導組織修復のための様々な絹繊維ベースマトリクス組織サポート構造の生成に向けられる（例えば、ヘルニア修復、腹圧性尿失禁のための膀胱スリング）（図２Ａ−Ｂおよび図２０Ａ−Ｃ）。
【００４７】
コンストラクト（すなわち、ファブリックまたは織糸）は表面修飾することができ、または適切な細胞を播種することができ（図７Ａ−Ｄ、図８Ａ−Ｂおよび図１６Ａ−Ｃ）、および、必要であれば、上記技術に従い増殖させ、および所望の靱帯、腱または他の組織に分化させるために適切な機械的刺激に暴露させることができる。
【００４８】
さらに、本発明は、繊維コンストラクト上に播種するための骨髄間質細胞の使用に限定されず、他の前駆、多能性および幹細胞、例えば骨、筋肉および皮膚中のものなどもまた、靱帯および他の組織に分化させるために使用され得る。
【００４９】
ファブリックはまた、精製フィラメントの同様のコンストラクトから形成させることができ、様々な用途で使用することができる。ファブリックは、様々なクラスに分類することができ、織り、不織、編みファブリック、およびステッチ貼り合わせファブリックが挙げられ、それぞれ多くのサブタイプを有する。これらの型の各々が特定の環境においてインプラントとして有用であり得る。これらの絹ベースファブリックについての記載では、我々は、天然絹（例えば、ボンビックスモリの）を「フィブロイン繊維」として記載する。繊維は、少なくとも１ｍ長でなければならず、この長さは処理中の取扱およびファブリックへの組み込みを促進するために、プロセスを通して維持されなければならない。織糸はツイストされまたは別の方法で連続ストランド中で共に保持された繊維のアセンブリとして規定され得て、また上記で規定される単一フィブロイン繊維は、時として複数の繭由来の複数の撚られたブロインから構成されると仮定すると、単一のフィブロイン繊維は、「織糸」と称され得る。同様に、フィブロイン繊維は共にツイストされ、または別の方法でより合わされ「織糸」を形成する。織糸は、本発明の用途のために、ファブリックを織るまたは編むために用いられる。別の手順では、絹織糸は脱凝集され、より短い（５ｍｍ〜１００ｍｍ）の長さ、または絹フィブロインフィラメントとされる。これらのフィラメントはその後、（ウェット）レイドされ、不織ファブリック（図２０Ａ）が形成され得る。
【００５０】
織糸はファブリックに形成されると、織糸に（典型的には、機械類を介して）及ぼされる張力（力）は、織糸の降伏点未満である（図３Ａ−Ｄ）。したがって、ファブリックを形成する場合、織糸は、典型的には、例えば、織物製造において使用される織糸よりも低い速度で、小さな荷重の下で取り扱われ、暴露された脆弱フィブロイン繊維の完全性が保存される。同様に、取扱機械類と織糸の間の接触点は、鋭角および高摩擦相互作用を避けるように設計され、織糸の周囲の繊維のルージング（ｌｏｕｓｉｎｇ）およびほつれが防止される（図４Ａ−Ｃ）。
【００５１】
ファブリックのインプラントとしての多くの用途が、医学および外科技術分野で知られている。１つの例はヘルニア修復におけるサポートとしてである。そのような修復のために、ファブリック、最も典型的には所望のステッチ（例えば、カッティング中のメッシュの解体を防止するように設計されたアトラスステッチ）を有する縦編みが、腹腔壁の内側に、従来の縫合糸で修復した後に、縫いつけられ（または時として、ステープルでとめられ、または糊付けされる）または単に定位置に引っ張りなしで配置される。縦編みファブリックの１つの機能は、修復のための短期サポートを提供することである。本発明の好ましい実施形態では、ファブリック内のフィブロイン繊維は、細胞の内殖、およびその後のファブリック自体内への（図１３Ａおよび１３Ｄ）、ならびに編み中に形成されたファブリックの隙間を介する、修復の必要な領域中への組織増殖を促進する。この実施形態は、絹マトリクスが分解するにつれ、損傷領域を機能的な組織内殖およびリモデリングにより、永久的に強化することを目的とする（図１３Ａ、ＢおよびＣ）。
【００５２】
修復強化用ファブリックは、腹腔壁の任意の部分の修復またはサポートに対する同様の状況において、特にヘルニア修復および腹腔底再建において、または、体内、例えば胸部、または心臓もしくは膀胱などの臓器の、特に手術または腫瘍除去後の他の壁および隔壁の修復またはサポートにおいて使用される。移植可能なファブリックはまた、膀胱または他の内臓（腸、尿管または尿道、および子宮を含むがそれらに限定されない）をサポートし、それらを、手術、損傷または加齢もしくは妊娠の結果としての自然摩耗後に正常な位置に保持する、または適切な位置に配置するために使用することができる。本明細書では、「臓器」は、「固形」臓器、例えば肝臓、および管状臓器、例えば腸または尿管の両方を含む。ファブリック、とりわけ嵩高いファブリック、例えばいくつかの不織型または３次元編みまたは編組により生成させることができるもの（図４Ａ−Ｃ）は、手術により残った空洞を充填するのに使用することができ、細胞が移動することができ、または細胞を予め接着させることができる（例えば、修復速度を改善するため）繊維コンストラクトが提供される。使用部位としては、軟組織および骨などの硬組織中の空洞が挙げられる。他の場合では、ファブリックは、癒着を防止するため、または細胞の接着および／または内殖を防止するために使用され；これは、絹フィブロインマトリクスの表面修飾により、または薬物または因子のマトリクスへの付着により達成され得る。
【００５３】
本発明の絹フィブロインベースファブリックはいくつかの様式で容易に修飾することができ、その部位での治癒または修復が増強される。これらの修飾は単独でまたは組み合わせて使用され得る。本発明の絹フィブロインベースファブリックは、ＲＧＤペプチドカップリングまたは気体プラズマ照射の使用により、細胞接着および拡散、細胞および組織内殖およびリモデリング、および装置生分解をサポートするために表面修飾することができる（図１３Ａ−Ｅ）。ファブリックは、細胞接着因子、例えばよく知られたペプチド「ＲＧＤ」（アルギニン・グリシン・アスパラギン酸）または多くの天然および合成接着促進材料、例として文献で知られている血清、血清因子およびタンパク質、例えばフィブロネクチン、血液、骨髄、基、決定基、などのいずれかを有するように修飾することができる。そのような材料は、そのような材料の通常の生物化学クラスのいずれか、例えば、限定はされないがタンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、プロテオグリカン、核酸、脂質、小さな（約２０００ダルトン未満）有機分子およびこれらの組み合わせで存在することができる。そのようなプラズマ修飾はファブリックの表面機能性および／または電荷を、材料バルク機械的特性に影響せずに改善することができる。ファブリックは、セリシン抽出後、セリシン抽出絹フィブロイン繊維の完全性を損なうことなく、気体プラズマ照射させることができる（表９）。
【００５４】
さらに、ファブリックは、薬物を送達するように処理することができる。薬物のファブリックへの付着は、共有結合、または分解性結合を介する共有結合とすることができ、または任意の種類の結合（例えば、電荷引力）または吸収によるものとすることができる。任意の薬物を潜在的に使用することができる；薬物の非制限的な例としては、抗生物質、増殖因子、例えば骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）または増殖分化因子（ＧＤＦ）、成長抑制物質、化学誘引物質、形質転換のための核酸が挙げられ、封入材料を有し、または有さない。
【００５５】
別の修飾では、細胞は移植前にファブリックに追加することができる（図７Ａ−Ｄ、図８Ａ−Ｂ、および図９Ａ−Ｂ）。細胞はファブリック上または中に播種／吸収させることができる。細胞はまた、あるいはさらに第１の工程として組織置換または増強に向けて、ファブリック上で培養させることができる。細胞は任意の型とすることができるが、同種細胞であり、好ましくは「免疫保護され」、「免疫特権をもち」、または幹細胞型が好ましく、自己細胞が特に好ましい。細胞は、繊維コンストラクト上または中で増殖して要求される細胞型となることができるように選択される（図９Ａ−Ｂ）。
【００５６】
別のクラスの修飾は、他のポリマー（例えば、繊維またはゲル形態）をファブリック中へ組み込み、特定の構造特性を提供し、または絹フィブロインの天然表面およびその生物学的特性を修飾する（図１６Ａ−Ｃを参照されたい：コラーゲン繊維のＢＭＳＣによる播種）。１つの型の組み込みでは、絹および他の材料の繊維または織糸が、ファブリックを製造するプロセスでブレンドされる。別の型では、絹ベース繊維、織糸またはファブリックは、別のポリマーの溶液または繊維でコートまたはオーバーラップされる。ブレンディングは、（ｉ）ランダムに、例えば絹およびポリマーの両方を一緒に並列で撚り（１または複数の繊維）、その後ツイストすることにより、または（ｉｉ）組織化された様式で、例えば編組において（繊維および織糸はより大きな織糸またはファブリックにインプットされ、機械供給位置を交互にし、予測可能な結果を生成させる）実施され得る。コーティングまたはラッピングは、中心コア上で編組する、またはケーブル化することにより実施してもよく、ここでコアは、所望の効果によって、ポリマー、絹フィブロインまたは両方の複合物とすることができる。また、１つの織糸は制御された様式で他のポリマー上にラッピングさせることができ、この場合ラッピング織糸は、構造を安定化するために使用することができる。任意の生体適合性ポリマーが潜在的に使用可能である。好適なポリマーの例としては、タンパク質、特に構造タンパク質、例えばコラーゲンおよびフィブリン、および強度提供分解性合成ポリマー、例えば無水物、ヒドロキシ酸、および／または炭酸塩を含むポリマーが挙げられる。コーティングは、ゲル、特に、天然ポリマーまたは分解性合成ポリマーから形成される分解性ゲルとして提供され得る。フィブリン、コラーゲン、および／または基底膜タンパク質を含むゲルを使用することができる。ゲルは、細胞または栄養分を送達するために、または表面を細胞接着からシールドするために使用することができる。さらに、タンパク質またはペプチドは、共有結合により繊維に付着させることができ、または繊維は荷電ガス（例えば、窒素）中でプラズマ修飾することができ、アミン基が堆積され；絹は通常疎水性であるが、これらのコーティングが繊維をより親水性にするので、これらのコーティングの各々が細胞接着および内殖をサポートする。
【００５７】
これらの実施形態のいくつかの非制限的な例を、下記実施例において記載する。
【００５８】
ウェットレイダウン（ｗｅｔ  ｌａｙｄｏｗｎ）をファブリック形成のプロトタイプのために選択した。最も単純な手順であるからである。不織製品（図２０Ａ）を単一絹フィブロイン繊維から生成させ、その後、ファブリックレベルで抽出した。製品は、それに応じて比較的安価な材料であり、その低い引張強度で十分である用途で使用することができる。より大きな引張強度が必要とされる場合、不織材料は、ファブリックおよび紙に対しよく知られているように共に貼り合わせられ、または骨修復のためにはミネラル化されるであろう。また、セリシンの抽出により生成された絹織糸材料は、上記で記載されるように、様々なより複雑な織糸に形成させることができる。織糸のサイズおよび設計を使用して、不織機械能力に関係なく、多孔度を制御することができる。織糸はまた、編み（図２０Ｂ）また織って（図２０Ｃ）、ファブリックとすることができる。興味深い１つの型のファブリックは、ガーゼに類似する単純なメッシュであり、これはそれ自体（例えば、止血剤として）、細胞または薬物（例えば、凝固因子）をある部位に送達するために、フレキシビリティが重要である状況で使用することができる。
【００５９】
強度が重要である場合、ファブリック中で使用される織糸のらせん設計により制御することができる弾性、および典型的には実質的な引張強度を有する、縦編みファブリック（図２０Ｂ）、例えばよく知られたトリコットおよびジャージがかなりの長さの時間、例えば数ヶ月機械的サポートの提供を必要とする用途（例えば、ヘルニア修復、膀胱スリング、骨盤底再建、など）に対し非常に有用となり得る。
【００６０】
他の用途では、材料はほとんど弾性を有さず、大きな強度を有するべきである。そのようなファブリックでは、太い織糸の高密度織りが適切であり、標準の織ファブリック（図２０Ｃ）と同様の材料が生成される。そのような材料は任意でコーティング処理または熱処理により補完することができ、織糸セグメントの交差点が貼り合わせられ、よってほぐれおよびストレッチの両方が防止される。熱処理は絹タンパク質を完全に変性させてはならない。ファブリックは任意で、ポリプロピレンメッシュで現在実施されているように、所定の位置に縫いつけられ、糊付けされまたはステープルでとめることができる。インプラントは、記載される他の型のいずれかのように、局所治癒および組織内殖過程を増強させる様々な材料で、および／または修復部位の内蔵への癒着を防止するコーティングでコートすることができる。
【００６１】
別の代替案では、ファブリック、メッシュ、不織物、編物または他の修復材料は未抽出絹から製造することができ、その後、完成ファブリックは本明細書で記載されるように抽出することができ（図２１）（例えば、高温のアルカリせっけん溶液を用いて）、免疫調節性セリシンが材料から除去される。さらなる代替案として、セリシンの抽出、例えば、形成された織糸、束、またはストランドの抽出は、繊維数が、抽出溶液が繊維全体に浸透することができるものを超えない限りにおいて、中間段階で実施することができる（非制限的な選択肢については図２１を参照されたい）。
【００６２】
上記記載は、織糸から構成されるファブリックの製造を記載しており、上記ファブリック形成物中の最も典型的な形態の織糸は、カイコフィブロイン繊維を共に組織的にツイストし、セリシンを抽出することに由来する。多くの織糸ジオメトリおよび織糸形成方法もまた、記載されるように使用され得る（表４、５、６、７および８）。そのような方法は、上記で記載されるように束を絹または別の材料でラッピングすることにより共に結合させた、フィブロイン繊維のツイストされていない束の形成を含み得る。これらの織糸のいずれも、上記で記載されるように、絹繊維を他の材料とブレンドすることにより形成させることができる。さらに、繊維はより合わされ、例えばケーブル化され、ツイストされ、編組され、メッシュとされ、編まれ、などすることができる（図２ＡおよびＢならびに２１を参照されたい）。「より合わされ」という用語は、本明細書では、どのように繊維が互いに接触し、結合するかの観点から、組織化された（すなわち、非ランダム）繰り返し構造を示すために使用される。
【００６３】
ブレンディングはまた、より高いレベルの組織化、例えば、より太い織糸を形成するための異なる材料のフィラメントの使用、または織りまたは編みにおける異なる材料の織糸を使用して実施することができる。各場合において、最終材料は精製された、本質的にセリシンを含まない絹を、その強度および生体適合性および（例えば、長期）分解特性の１つまたは全てのために使用される重要な成分として含む（図１１Ａ−Ｂ）。他の１つまたは複数のポリマーは、それらの生体適合性、細胞接着のサポート（または所望の局所での急速な組織形成による阻止）または浸潤（図１６Ａ−Ｃ）、インビボでの分解プロファイル、および機械的特性のために選択される。生分解性ポリマーは、知られている生分解性ポリマーのいずれも含み、例えば天然物、例としてタンパク質、多糖、グリコサミノグリカン、および誘導体化された天然ポリマー、例えば、セルロース；および生分解性合成ポリマーおよびコポリマー、例えばポリヒドロキシ酸、ポリカーボネート、ポリ無水物、いくつかのポリアミド、およびコポリマーおよびそれらのブレンドが挙げられる。特に、コラーゲンおよびエラスチンが好適なタンパク質である。
【００６４】
組織修復のために使用される絹含有ファブリックコンストラクト／マトリクスは、移植時に細胞を含むように処理することができ（図７Ａ−Ｄ、図８Ａ−Ｂ、図９Ａ−Ｂ、および図１８Ｃ）インビボでの組織転帰が改善される。細胞は異種であってもよく、より好ましくは同種、および最も好ましくは自己であってもよい。任意の型の細胞がインプラントの位置および意図された機能によって潜在的に使用される。その環境で適切な分化キューが存在し、または提供される場合、多能性細胞が好ましい。他の細胞型としては、骨原性細胞、線維芽細胞、および移植部位の組織型の細胞が挙げられる。
【００６５】
ボンビックスモリおよび他の従来のカイコ由来の絹について記載してきたが、任意の絹原または絹由来のタンパク質は、移植で軽度の異物反応しか引き起こさない限り、本発明で使用することができる（すなわち、生体適合性である）（図１８ＢおよびＣを参照されたい）。これらとしては、限定はされないが、カイコ、クモ、および培養細胞、特に遺伝子改変細胞、ならびにトランスジェニック植物および動物由来の絹が挙げられる。クローニングにより生成された絹は、天然絹系遺伝子の全または部分配列、または絹様配列をコードする合成遺伝子由来とすることができる。
【００６６】
多くの場合、医療機器またはプロステーシスの形成には単一のファブリック型のみが使用されるが、場合によっては、２つ以上の型のファブリックを単一の装置において使用するのが有用であり得る。例えば、ヘルニア修復では、修復ファブリックの組織に面する側は細胞を誘引することが望ましく、腹膜面は細胞を忌避し、癒着を防止するべきである。この効果は、細胞を誘引しない絹の１つの層、および誘引する別の層（例えば、下記実施例におけるように、未処理層およびＲＧＤ含有層）を有することにより達成することができる。別の例は、膀胱スリングの形成を含む。基本的なスリングは適合し、幾分弾力があり、長い推定寿命を有するべきである。しかしながら、膀胱に最も近いスリングの面は、実現可能限り少ないテクスチャーを有するべきである。これは、本発明の、小さな直径を有する織糸（例えば、単一繊維）から作製された、薄いが堅く織られた、不織または編まれたファブリックの層を、スリング内の、膀胱と接触する場所に配置することにより達成することができる。不織ファブリックは、実現可能な限り小さなゲージ（デニール）を有するべきである。２つ以上の型のファブリックを必要とする多くの他の状況がありうる。
【００６７】
上記構造の例を作製し、一連の試験で評価した。第１の例では、ファブリックを精製された絹原繊維から形成させた。最初に、生絹を処理して、精製されたフィブロイン原繊維とした。生カイコ繊維を、０．０２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３の水溶液および０．３％ｗ／ｖ  ＩＶＯＲＹせっけん溶液中で、６０分９０℃で抽出した。抽出した繊維を水ですすぎ、接着剤様セリシンタンパク質の抽出を完了した。得られた原繊維の懸濁液をスクリーン上にウェットレイドさせ、ニードルパンチし、乾燥させた（図２０Ａ）。得られたフリース材料は幾分羊毛のような感触であり、非常に多孔性であった。これを、絡み合いおよびニードリングにより十分インターボンドさせ、取扱、および所望の形状への切断が容易になった。
【００６８】
別の例では、精製された絹フィブロイン原繊維を細胞誘引剤（表９）で処理した。最初に、織糸を、絹フィブロインの精製された繊維を共にツイストすることにより生成させた。いくらかの織糸は、Sofia et al, J. Biomed. Mater. Res. 54: 139-148, 2001において記載される手順を使用して、細胞を誘引するためにペプチドＲＧＤで誘導体化されたフィラメントから作製した。処理済みおよび未処理（黒編組絹縫合糸）織糸の切片をラットの腹腔壁に移植した（図１８Ａ−Ｃ）。３０日の移植後、黒編組縫合糸は緻密な原繊維束を含み、原繊維束間で細胞浸潤があったが、その内部にはなかった。対照的に、ＲＧＤ処理原繊維束は、宿主細胞により広範に浸潤され、膨潤し、緻密ではなくなった（図１３Ａ−Ｅ、１８Ｂ）が、依然として有意に分解されなかった（図１３Ａ−Ｅ）。
【００６９】
この例は移植される絹フィブロイン原繊維の分解速度を制御するための誘導体化の使用を示し、ならびに、誘導体化された原繊維は細胞をファブリック様構造に漸加することができることを説明する。明らかにより特異的な誘引剤を使用することにより、より大きな漸加特異性が得られ得る。同様の技術（化学誘導体化）またはより簡単な方法、例えば吸収、吸着、コーティング、および含浸を使用して、移植部位に他の材料を提供することができる。
【００７０】
下記表で報告される試料の各々を、上記説明に従い調製し、ここで、セリシンは、６０分にわたり、９０°＋／−２℃の温度で除去した。この範囲内の温度を十分な期間使用すると、セリシンが実質的に除去された繊維が生成することが見いだされている（図１Ａ−Ｃ、表１、２、３）（有意の免疫応答を生成させず、繊維の生分解性を著しく妨害しないように、実質的にセリシンを含まない繊維コンストラクトが生成される）が、フィブロインの機械的完全性は実質的に保存される（表１）。温度が９４℃に達すると（表１）、ＵＴＳは劇的には影響されなかったことに注意されたい；しかしながら、剛性は著しく減少し、絹は９４℃以上の温度で感熱性であることが示される。各群における繊維を手操作で、繊維の端を引っ張ることによりまっすぐにした（すなわち、並列にした）；また、歪み矯正は自動化プロセスを介して容易に実施することができる。適用された力は群をまっすぐにするのに要求されるものよりわずかに大きかった。
【００７１】
全ての表における試料ジオメトリ指定は下記コンストラクトを反映する：繊維数（Ｓ方向の繊維レベルでのｔｐｉ）ｘ群数（Ｚ方向での群レベルでのｔｐｉ）ｘ束数（Ｓ方向での束レベルでのｔｐｉ）ｘストランド数（Ｚ方向でのストランドレベルでのｔｐｉ）ｘなど、この場合、試料は別記されない限りレベル間でツイストされる。ツイスト／インチ指定、例えば１０ｓｘ９ｚ  ｔｐｉは、（群内の繊維のツイスト数／インチ）ｘ（束内の群のツイスト数／インチ）を反映する。各試料において、ツイストのピッチは、単に繊維を共に保持するように意図された低ピッチでツイストされる従来の織糸で通常見られるものよりも、実質的に高い。ツイストのピッチを増加させる（すなわち、ツイスト／インチを増加させる）と、引張強度が減少するが、またさらに、剛性が減少し、コンストラクトの破壊時の伸長が増加する。
【００７２】
最大引張強度（ＵＴＳ）、破壊時の伸長パーセント（％Ｅｌｏｎｇ）、および剛性は全て、ＦＡＳＴ−ＴＲＡＣＫソフトウエアを有するＩＮＳＴＲＯＮ  ８５１１油圧材料試験機械を用いて測定し、これは、不全までの引っ張り（ｐｕｌｌ−ｔｏ−ｆａｉｌｕｒｅ）分析において約１００％試料長／秒の高速で試料を歪ませた。言い換えれば、不全点まで、試料を刻々とその長さが２倍になるように伸長させ、これは試料が不全前に緩み、はね返る能力を大きく制限する。しかしながら、図５Ａ−Ｂは、ひずみ速度が、絹マトリクスＵＴＳおよび剛性に対して劇的な効果を有すると示された（図６Ａ−Ｂ）と同様に、観察された機械的特性に対して効果を有することを証明する。データセット間で比較する場合、一貫性が必要である。得られたデータをＩｎｓｔｒｏｎ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＸソフトウエアを用いて解析した。最大引張強度は、得られた応力／歪み曲線のピーク応力であり、剛性は降伏点までの応力／歪みプロットの傾きである。規定がなければ、試験した全ての群に対し、少なくともＮ＝５を使用し、平均および標準偏差を生成させた。標準の統計学的方法、例えば、スチューデントｔ検定、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、群間に統計学的に有意の差が存在したかを決定した。
【００７３】
上記表および図の全てにおける（および本開示全体における）試料中のフィブロイン繊維は天然であり（すなわち、繊維は溶解されず、再編成されていない）；繊維の溶解および再構築により、再編成後に異なる機械的特性を有する異なる繊維構造が得られる。驚いたことに、これらの試料は、セリシンが完全にまたはほぼ完全に除去された絹フィブロイン繊維の織糸は、高い強度および、織糸を様々な生物医学的用途（表４、図２Ａ−Ｄおよび図２０Ａ−Ｃ）、例えば靱帯置換、ヘルニア修復または骨盤底再建のための繊維コンストラクトまたはサポートの形成に好適なものとする他の機械的特性を有することができることを証明する。以前は、所望の機械的特性を提供するには、フィブロインは、溶解され、押し出されて再構築繊維とされる必要があると考えられていた。疲労強度は一般にそのような再編成フィブロイン繊維では悪くなることが見いだされている。本発明の方法は、強度の著しい損失なくセリシン除去を可能にする（表１および４；図３Ａ−Ｄおよび４Ａ−Ｂ）。
【００７４】
表８では、試料１および２は、３繊維群（試料１）の特性を４繊維群（試料２）と比較する。試料２は、正方形構成の繊維を有し、一方、試料１の繊維は三角形構成を有した。表に示されるように、試料２に余分な繊維を追加すると、試料の繊維あたりの剛性が低下し、階層設計により織糸およびファブリック特性を制御できる可能性が証明される。
【００７５】
表４は、ケーブル化された繊維コンストラクトおよびツイストされた繊維ジオメトリの異なる構成の効果を示す。特に、試料７および８は同じ繊維数および同じ幾何学的レベルの数を含むことに注意されたい。試料８のツイストされた繊維ジオメトリは、より大きなＵＴＳおよびより大きな剛性を提供するが、試料７のケーブル化されたジオメトリはより低い強度およびより低い剛性を有する。試料７−９のうち、試料７のケーブル化されたジオメトリは、最も高い強度対剛性比を有し；ＡＣＬ繊維コンストラクトとしての使用に対し、高い強度対剛性比は望ましい（すなわち、高い強度および低い剛性を有する）。
【００７６】
表１および４は繊維に対するセリシン抽出の効果を証明する。試料をすべて、表１に記載されるように、抽出溶液に浸漬させた。試料１−５を、室温、３３℃および３７℃の浴に浸漬させた。これらの温度は、有意なセリシン抽出を提供するには低すぎると考えられる。試料６−９を９０℃で抽出し、この場合、完全なセリシン抽出が達成可能であると考えられるが、時間は変動する。同様に、試料１０を、９４℃のわずかに高い温度で抽出した。データから、９０℃で３０〜６０分は、セリシンを著しく除去するのに十分である（表２および３を参照されたい）こと、９４℃は、剛性の劇的減少により示されるように絹のタンパク質構造を損傷する可能性があることが示唆される。
【００７７】
最後に、試料１１〜１６は、同等のケーブル化されたジオメトリを有し；試料１２、１４、および１６の繊維は抽出され、一方試料１１、１３、および１５の繊維は抽出されなかった。表で見られるように、抽出は（高い）最大引張強度／繊維にほとんど影響しなかったように思われる。
【００７８】
表４の試料１０の繊維を、カール−収縮手順に供し、この場合、繊維を１方向に、その後、直ちに反対方向にツイストさせ；その後、繊維を加熱し、ツイスト構造を固定させ、抽出せずに試験した。得られた織糸の強度および剛性は試験した他の抽出されていない織糸の多くよりも比較的低かった。しかしながら、表６および７は、抽出後、３０ＴＰＩまで耐えることができるフィブロインの顕著な能力を示す。表６は、ＴＲＩが絹マトリクスに対して有するオーダリング効果は、抽出後のマルチフィラメント構造のオーダリングによる可能性があることを示す。
【００７９】
図１０は培養条件において２１日間播種した、および播種しなかった３０並列フィブロイン繊維の群の特性を証明する。これらの３つの試料は非常に類似する機械的特性を示し、よって、その上での細胞増殖による、またはインビトロでの時間による絹マトリクスの分解があったとしてもほとんど影響しない。剛性値は、機械的試験前に２１日の湿インキュベーションの結果として、他の試料と比較して、この実験ではおそらくずっと低い（表５を参照されたい）。
【００８０】
表４、試料１４−１６はすべて編組試料である。試料１４の繊維を、８つのキャリア（各キャリア上に１つの糸巻きが載置）から編組させ、この場合２の繊維を各糸巻きから引き出した。試料１５の繊維を１６のキャリア（各キャリア上に１つの糸巻きが載置）から引き出し；再び、２繊維を各糸巻きから引き出した。最後に、試料１６を４の織糸から形成させ、各織糸は４繊維からなるツイストされた群を３つ含む（織糸あたり合計１２繊維を提供する）；織糸の各々を別々の糸巻きおよびキャリアから引き出した。
【００８１】
表９は表面修飾の効果を証明する。「ＰＢＳ」指定は、試料が試験前に約２４時間リン酸緩衝食塩水溶液に浸漬されたことを反映する。試料を生理食塩水に暴露させる効果を測定し、繊維コンストラクトはその機械的特性を維持し、生理食塩水環境（例えば、ヒト体内）で固有のタンパク質構造を実質的に保存することができることが示された。「ＲＧＤ」指定は、試料が試験前に約２４時間ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ（ＲＧＤ）生理食塩水に浸漬されたことを反映する。ＲＧＤは、コンストラクトに適用することができ、細胞がコンストラクトに誘引され、よって、その上での細胞増殖が促進される。したがって、コンストラクトの機械的特性に対するＲＧＤのいずれの効果も興味深いが、コンストラクトの著しい分解は明らかにはならなかった。したがって、これらの試料により、生理食塩水またはエチレンオキシドガス滅菌またはＲＧＤ溶液への長期暴露は、繊維コンストラクトの材料特性の劣化を、あったとしてもほとんど起こさないという証拠が提供される。しかし、試料２８および２９（幾何学的階層がより高いレベルまで拡張されている）に関連するデータは、ＵＴＳ／繊維は、より高いレベル（全体の繊維数の増加）に到達するにつれ降下することを明らかにする。これは、表面修飾ではなく階層設計（表８）の効果である。
【００８２】
表４、試料１８〜２３を、６ポンドの一定の力の下、それぞれ、１、２、３、４、５および６日間引っ張り、その後、試験して、時間に伴う張力の機械的特性に対する効果を評価した。データから、プレテンション手順をより長い期間にわたって拡張してもコンストラクトの材料特性の変化はあったとしてもそれほど大きくないように思われる。試料２５もまた、６ポンドの力で１日「プレテンションし」（ツイスト後）、その後試験した；比較のために、試料２４（同一の幾何学的形態を有した）はプレテンションしなかった。したがって、試料２４および２５は、構造内の緩みを除去するためのコンストラクトのプレテンションの効果を明らかにし、コンストラクトのＵＴＳおよびその破壊時のその伸長がわずかに減少する。
【００８３】
絹繊維ベースコンストラクトは、細胞を浸潤させるための、またはすでに細胞が浸潤または播種されたマトリクスとして機能し、細胞は、例えば前駆、靱帯または腱線維芽細胞または筋肉細胞であり、これらは増殖および／または分化し、前十字靱帯（ＡＣＬ）またの他の所望の組織型を形成することができる。新規絹繊維ベースコンストラクトは、繊維を、様々な織糸ジオメトリ、例えばケーブル、またはより合わせ構造、例えばツイスト織糸、編組、メッシュ様織糸または編物様織糸のいずれかで有するように設計される。織糸は、天然組織、例えば前十字靱帯（表４、１を参照されたい、以下）のものと同一またはほぼ同一である機械的特性を示し；繊維コンストラクト組織化およびジオメトリの単純なバリエーションから、任意の所望の組織型の形成が得られる（表１０を参照されたい、以下）。また、複数の織糸をファブリックまたは他のコンストラクトに形成させることができ、これは移植され、臓器を配置させまたはサポートする。さらに、コンストラクトは、手術後の内部空洞を満たす、または組織癒着を防止する、または細胞の接着または内殖を促進するために使用することができる。
【００８４】
下記実施例で記載されるように単離し、培養させた多能性骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）を、絹繊維コンストラクト上に播種し、バイオリアクター中、静的条件下で培養することができる。繊維コンストラクト上に播種された細胞は、適正に誘導されれば、靱帯および腱特異的分化を受け、生存可能なおよび機能的な組織を形成する。さらに、繊維コンストラクト内の多能性細胞から作製されたインビトロで生成された生体工学操作された組織の組織形態学的特性は、組織作製中の繊維コンストラクトへの機械力の直接適用により影響される。この発見は、機械的応力、生物化学および細胞固定化方法および細胞分化の間の関係について重要な新規見識を与え、多能性細胞からインビトロで様々な靱帯、腱および組織を生成させるのに適用される。
【００８５】
ケーブルジオメトリを有する絹繊維を含む繊維コンストラクトを、図２Ｃおよび２Ｄに示す。繊維コンストラクトは下記の観点から階層を含む：繊維を並列で集団化し、ツイストさせる様式およびどのように、得られた群が階層内の複数のレベルにわたって集団化やツイストなどされるか、（下記で、さらに説明される）。絹繊維を最初、例えば、繊維用のアンカーとして機能するバネ仕掛けの留め具を有するラックを用いて並列で引っ張る。ラックは、セリシン−抽出溶液に浸漬させることができ、よって、留め具は抽出、すすぎおよび乾燥を通して繊維上で一定張力を維持することができる。
【００８６】
抽出溶液はアルカリせっけん溶液または洗剤とすることができ、約９０℃で維持される。ラックを、繊維から全ての（残り＋／−０．４重量％）または実質的に全てのセリシン（微量残留物の可能性あり）を除去するのに十分な期間（例えば、少なくとも０．５〜１時間、溶液流および混合条件による）、溶液中に浸漬させる。抽出後、ラックを溶液から取り出し、繊維をすすぎ、乾燥させる。コンピュータ制御のツイスト機械はそれぞれ、繊維または繊維のコンストラクトをディスクの周囲に載置し、ディスクを中心軸の周りに回転させ、織物業界で使用される標準のプロセスに従い、典型的に従来の織糸で生成されるものより、ツイストに対し高いピッチ速度（例えば、約０〜約１１．８ツイスト／ｃｍ）で、繊維（すなわち、ケーブル化）またはツイストされた繊維のコンストラクトを互いに対しツイストさせる。しかしながら、ケーブル化またはツイスト速度は、織糸がツイストまたはケーブル化前に送り糸巻きから送り出される時に生成されるバルーン張力の結果として繊維の塑性変形を引き起こすほど高いものであってはならない。
【００８７】
溶液が、コンストラクト全体に浸透し、全ての繊維からセリシンが除去されるならば、抽出はコンストラクトのいずれのレベルでも実施することができる。溶液が依然として完全に浸透することができる緻密な配列中の繊維数の上限は約２０−５０繊維であると考えられる。しかしながら、当然、それらの繊維は２０並列繊維の１つの群として、または、例えば、５並列繊維の４群として配列させることができ、この場合、群はツイストされ、またはさらに高いレベル、例えば５繊維の２群の２束を含むコンストラクトとして配列させることができ、この場合、群および束はツイストされ得る。構造内の階層レベル数を増加させると、空間も増加させることができ、よって、潜在的にセリシンが完全に抽出され得る最大繊維数が２０から５０繊維に増加される。
【００８８】
セリシンは、場合によっては、繊維を集団化させた後、またはより高いレベルのコンストラクトが形成された後に、コンストラクトから除去されるので、ワックスまたは任意の他の型の機械的保護コーティングを繊維上に適用する必要はなく、または繊維上のセリシンとの接触を防止するためにバリアを形成することも必要なく；コンストラクトは全く、コーティングを含まないようにすることができる（特に身体により完全に分解されないまたは炎症性応答を引き起こすコーティングを含まない）。
【００８９】
下記実施例で記載されるように、絹フィブロインの機械的特性（図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃにおいて図示）は特徴付けられており、ＡＣＬ操作のための適用可能なマトリクスを形成するためのジオメトリを、理論的計算モデル（図１Ｄを参照されたい）を使用して誘導した。６コードコンストラクトをＡＣＬ置換として使用するために選択し、マトリクス表面積を増加させ、組織内殖のためのサポートを増強させた。ＡＣＬ修復のための２つのコンストラクト幾何学的階層は下記を含む：
マトリクス１：１ＡＣＬ織糸＝６並列コード；１コード＝３ツイストストランド（３ツイスト／ｃｍ）；１ストランド＝６ツイスト束（３ツイスト／ｃｍ）；１束＝３０並列洗浄繊維；および
マトリクス２：１ＡＣＬ織糸＝６並列コード；１コード＝３ツイストストランド（２ツイスト／ｃｍ）；１ストランド＝３ツイスト束（２．５ツイスト／ｃｍ）；１束＝３群（３ツイスト／ｃｍ）；１群＝１５並列抽出絹フィブロイン繊維。
【００９０】
マトリクス１およびマトリクス２に対する繊維数およびジオメトリは、絹プロステーシスが最大引張強度、線形剛性、降伏点および破壊時の％伸長においてＡＣＬ生体力学特性に類似するように選択し、組織工学操作されたＡＣＬの発生の確かな開始点として機能するようにした。これらの生体力学特性の各々に対する繊維数、レベル数、およびツイスト量の増加の効果を、それぞれ、表８ならびに表６および７に示す。
【００９１】
どちらもＡＣＬの特性を模倣する機械的特性が得られる、異なるジオメトリを有する２つのマトリクスを作製することができることは、所望の機械的特性を達成する広範囲にわたる幾何学的形態が存在することを示す。任意の所望の靱帯または腱組織のための別のジオメトリは、コード、ストランド、束、群および繊維の任意の数、組み合わせまたは組織化を含むことができ（表１０を参照されたい、以下）、要求される靱帯または腱の機械的特性を模倣する適用可能な機械的特性を有する繊維コンストラクトが得られる。例えば、１つの（１）ＡＣＬプロステーシスは任意の数のコードを並列で有することができ、ただし、最終繊維コンストラクトをインビトロまたはインビボで固定するための手段があることを条件とする。さらに、一定のジオメトリに対して様々な数のツイストレベル（単一レベルは１つの群、束、ストランドまたはコードとして規定される）を使用することができ、ただし、繊維コンストラクトが所望の機械的特性となることを条件とする。さらに、ＡＣＬプロステーシスの操作において繊維コンストラクトジオメトリおよび組織を設計する際に大きな自由度が存在する；したがって、開発された理論的計算モデルを使用して、所望の靱帯または腱組織の繊維コンストラクト設計を予測することができる（実施例を参照されたい、以下）。例えば、内殖を促進するために２レベルの階層のみを有する、複数のより小さなマトリクス束が要求される場合（例えば、合計３６繊維）８−１１のＴＰＩまたは約３−４ツイスト／ｃｍが必要とされ、モデルにより予測することができ、経験的研究は必要ない。
【００９２】
結果として、ジオメトリのバリエーション（すなわち、プロステーシスを製造するために使用されるコード数または群内の繊維数）を使用して、ほとんどの靱帯および腱に適用可能なマトリクスを作製することができる。例えば、手のより小さな靱帯または腱に対しては、マトリクス１の単一コード（または２つのコードもしくは３つのコード、など）を作製するために使用されるジオメトリおよび組織化は、繊維コンストラクトの組織化により特定の生理環境に対して好適な機械的特性が得られる場合、適切であるとすることができる。具体的には、マトリクス１またはマトリクス２に比べより小さな靱帯または腱を提供するためには、より少ない繊維／レベルが使用されより小さな束またはストランドが作製されるであろう。その後、複数の束を並列で使用することができる。より大きな靱帯、例えばＡＣＬの場合、剛性を減少させ、内殖を促進するためには、より高いＴＰＩでツイストされたより多くのより小さな束を有することが望ましく、内殖を起こすことができず、マトリクスの分解が制限される場合、より少ない、より大きな束を有することが望ましい。
【００９３】
しかしながら、本発明は、記載されるケーブルジオメトリに関して制限されず、任意のジオメトリまたはジオメトリの組み合わせ（例えば、並列、ツイスト、編組、メッシュ様）を使用することができ、ＡＣＬに類似する繊維コンストラクト機械的特性（すなわち、天然ＡＣＬまたは普通に使用される置換グラフト、例えば２６−３０ｍｍの長さを有する膝蓋腱に対して、２０００Ｎ最大引張強度より大きい、１００−６００Ｎ／ｍｍの間の線形剛性）が得られ、または所望の靱帯および腱が生成される。マトリクス１およびマトリクス２の両方の繊維数およびジオメトリは、機械的に適切なＡＣＬマトリクス、または他の所望の靱帯もしくは腱マトリクス［例えば、後十字靱帯（ＰＣＬ）］が生成されるように選択した。例えば、６コードマトリクス１コンストラクトの単一コードを使用して、ウサギにおいて内側側副靱帯（ＭＣ）を再建した（図１５Ａおよび図１５Ｂを参照されたい）。マトリクス１およびマトリクス２の絹６コードコンストラクトの機械的特性を表１０および図３Ａ−３Ｄに記載し、以下、実施例でさらに説明する。追加のジオメトリおよびそれらの関連する機械的特性を、本明細書で記載される方法によりＡＣＬ組織工学において適用可能な繊維コンストラクトが得られる、大きな設計自由度の例として表１１に列挙する。
【００９４】
好都合なことに、絹繊維ベース繊維コンストラクトは、絹だけで構成させることができる。絹の型および源としては下記が挙げられる：カイコ、例えばボンビックスモリおよび関連種由来の絹；クモ、例えばネフィリアグラビペス由来の絹；遺伝子改変細菌、酵母哺乳類細胞、昆虫細胞、およびトランスジェニック植物および動物由来の絹；カイコまたはクモ由来の培養細胞から得られる絹；天然絹；クローン化された天然絹の完全または部分配列；および絹または絹様配列をコードする合成遺伝子から得られる絹。それらの生形態では、ボンビックスモリカイコから得られる天然絹フィブロインは、セリシンと呼ばれる接着剤様タンパク質でコートされ、これは完全にまたは本質的に完全に繊維から抽出され、その後、繊維コンストラクトを構成する繊維に、細胞が播種される。
【００９５】
繊維コンストラクトは下記の複合物を含むことができる：（１）絹およびコラーゲン繊維；（２）絹およびコラーゲンフォーム、メッシュ、またはスポンジ；（３）絹フィブロイン繊維および絹フォーム、メッシュ、またはスポンジ；（４）絹および生分解性ポリマー［例えば、セルロース、綿、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリグリコール、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリ無水物、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、タンパク質、分解性ポリウレタン、多糖、ポリシアノアクリレート、グリコサミノグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、など）、多糖（天然、再加工または遺伝子改変バージョン：例えば、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタン、ペクチン、キトサン、キチン、など）、エラスチン（天然、再加工または遺伝子改変および化学バージョン）、およびコラーゲン（天然、再加工または遺伝子改変バージョン］、または（５）絹および非生分解性ポリマー（例えば、ポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、またはニトロセルロース材料。複合物は一般に、繊維コンストラクト特性、例えば多孔度、分解性を増強し、また細胞播種、増殖、分化または組織発生を増強する。図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃは、コラーゲン繊維のＢＭＳＣ増殖および靱帯特異的分化をサポートする能力を示す。
【００９６】
繊維コンストラクトはまた、その上での細胞増殖および／または組織分化を増強させるように処理することができる。細胞増殖および組織分化を増強させるための例示的な繊維コンストラクト処理としては、金属、照射、架橋、化学表面修飾［例えば、ＲＧＤ（ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ）ペプチドコーティング、フィブロネクチンコーティング、カップリング増殖因子］、および物理表面修飾が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
本開示の第２の態様は、新規絹繊維ベース繊維コンストラクトおよび繊維コンストラクト上に播種された自己または同種（組織のレシピエントによる）骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）から形成された機械的および生物学的に機能的なＡＣＬに関する。絹繊維ベース繊維コンストラクトは、靱帯系列への間質細胞分化を誘導し、バイオリアクター培養中にいずれの機械的刺激も必要としない。絹繊維ベース繊維コンストラクト上に播種され、ペトリ皿中で増殖されたＢＭＳＣは、接着し、拡散し始め（図７Ａ−Ｄを参照されたい）；細胞は、増殖して繊維コンストラクトを覆い（図８Ａ−Ｂ、図９Ａおよび図９Ｂを参照されたい）、靱帯特異的マーカーの発現により示されるように分化する（図１４を参照されたい）。軟骨（コラーゲンＩＩ型）および骨（骨シアロタンパク質）のためのマーカーは発現されなかった（図１４を参照されたい）。靱帯特異的マーカーの発現を示すデータは、実施例で、以下説明する。
【００９８】
本開示の別の態様は、エクスビボでＡＣＬを生成させるための方法に関する。靱帯細胞に分化することができる細胞は、胚発生から成熟靱帯機能への過程を介してインビボでＡＣＬにより経験される運動および力を模倣する条件下で増殖される。具体的には、滅菌条件下、多能性細胞を、細胞が接着することができ、好都合なことに円筒形状である三次元絹繊維ベース繊維コンストラクト内に播種する。この方法において使用される三次元絹繊維ベース繊維コンストラクトは予備繊維コンストラクトとして機能し、分化細胞により生成される細胞外繊維コンストラクト構成要素により補充され、おそらく置換される。新規絹繊維ベース繊維コンストラクトの使用は、ＡＣＬの発生を増強または加速し得る。例えば、新規絹繊維ベース繊維コンストラクトは、特定の機械的特性（例えば、増加した引張強度）を有するように設計することができ、そのため、細胞外（例えば、コラーゲンおよびテネイシン）繊維コンストラクト構成要素からの補強前の強い力に耐えることができる。新規絹繊維ベース予備繊維コンストラクトの他の有利な特性としては、生体適合性および生分解に対する感受性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
多能性細胞は、使用される特定の繊維コンストラクトおよび繊維コンストラクト形成方法によって、繊維コンストラクト形成前または後のいずれかで、予備繊維コンストラクト内に播種することができる。均一播種が通常好ましい。理論的には、播種される細胞の数は、生成される最終的な靱帯を制限しない；しかしながら、最適播種は、生成速度を増加させ得る。最適播種量は、特定の培養条件による。繊維コンストラクトは、天然靱帯の生理的細胞密度の約０．０５〜５倍で播種させることができる。
【０１００】
１つ以上の型の多能性細胞が本方法で使用される。そのような細胞は、適正な分化シグナルに応じて広範囲の細胞型に分化する、および靱帯特異的マーカーを発現する能力を有する。より具体的には、本方法では、靱帯および腱組織の細胞に分化する能力を有する細胞、例えば骨髄間質細胞が使用される。得られた生体工学操作された靱帯が患者に移植される場合、細胞は、対象とするレシピエントと適合する源に由来しなければならない。レシピエントは一般にヒトであるが、獣医学での適用もまた存在する。細胞は、レシピエント（自己）から得ることができるが、適合するドナー細胞もまた、同種靱帯を製造するために使用され得る。例えば、同種靱帯を作製する場合（例えば、別のヒト由来の細胞、例えば提供された骨髄から単離された骨髄間質細胞または提供されたＡＣＬ組織から単離されたＡＣＬ線維芽細胞を使用する）、無傷のドナーＡＣＬ組織から単離されたヒト前十字靱帯線維芽細胞（例えば、屍体または全膝移植から）、破裂ＡＣＬ組織（例えば、ＡＣＬ再建を受ける患者から手術時に収集される）または骨髄間質細胞が使用され得る。適合性の決定は、熟練した実践者の手段の範囲内である。
【０１０１】
ＡＣＬ以外の、後十字靱帯、回旋筋腱板腱、肘および膝の内側側副靱帯、手の屈筋腱、足首の外側靱帯ならびに顎または顎関節の腱および靱帯を含むがこれに限定されない靱帯または腱、軟骨、骨および他の組織は、本開示の方法により繊維コンストラクトで操作することができる。このように、繊維コンストラクト上に播種される細胞は、生成される組織（例えば、多能性または他の所望の組織型）に従い選択される。本明細書で記載されるように、繊維コンストラクト上に播種される細胞は自己または同種とすることができる。自己細胞の使用は、レシピエントにおける移植のための同種移植片または自家移植片を効果的に作製する。
【０１０２】
記載されるように、ＡＣＬを形成するために、細胞、例えば骨髄間質細胞を繊維コンストラクト上に播種する。骨髄間質細胞は多能性細胞の型であり、また、当技術分野では、間葉系幹細胞または単に間質細胞と呼ばれる。記載されるように、これらの細胞源は、自己または同種とすることができる。さらに、成体または胚性幹または多能性細胞は適正な環境（インビボかインビトロ）であれば使用され、絹繊維ベース繊維コンストラクト上に播種することができ、ＡＣＬまたは任意の他の所望の靱帯または組織を細胞外繊維コンストラクト組成物（例えば、タンパク質、糖タンパク質内容物）、組織、構造または機能において再現することができる。
【０１０３】
線維芽細胞はまた、本発明の繊維コンストラクト上に播種することができる。線維芽細胞はしばしば多能性細胞と称されないので、線維芽細胞は、ＡＣＬ組織から単離された成熟ヒトＡＣＬ線維芽細胞（自己または同種）、他の靱帯組織由来の線維芽細胞、腱組織由来、新生児包皮由来、臍帯血由来、または、成熟または多能性、成熟脱分化、あるいは遺伝子改変されたかに関係なく、任意の細胞由来の線維芽細胞を含むことが意図され、そのため、適正な環境（インビボかインビトロ）で培養され、絹繊維ベース繊維コンストラクト上に播種された場合、ＡＣＬまたは任意の他の所望の靱帯または組織を細胞外繊維コンストラクト組成物（例えば、タンパク質、糖タンパク質内容物）、組織、構造または機能において再現することができる。
【０１０４】
繊維コンストラクトシリンダの面がそれぞれ、アンカーに付着され、これを介して、ある範囲の力が繊維コンストラクトに適用される。繊維コンストラクトへの力送達を促進するために、繊維コンストラクトの各それぞれの面の全表面は、個々のアンカーの面に接触することができる。付着部位を反映する形状（例えば、円筒）を有するアンカーはこの方法で使用するのに最も好適である。組み立てられた時点で、固定された繊維コンストラクト中の細胞は、細胞増殖および再生に適切な条件下で培養される。繊維コンストラクトは、付着されたアンカーを介して（例えば、付着されたアンカーの１つまたは両方の移動を介して）適用される１つ以上の機械力を培養過程中に受ける。機械力は、天然ＡＣＬまたは他の組織がインビボで経験する条件を模倣するように培養期間にわたって適用される。
【０１０５】
アンカーは、繊維コンストラクト付着に好適な材料で製造されなければならず、得られた付着は適用される機械力の応力に耐えるのに十分強くなければならない。さらに、アンカーは、分化細胞により生成される細胞外繊維コンストラクトの付着に好適な材料製とすることができる。アンカーは、骨組織内殖（インビトロかインビボ）をサポートしながら、発生靱帯を固定する。好適なアンカー材料のいくつかの例としては、ヒドロキシアパタイト、Ｇｏｉｎｏｐｒａサンゴ、脱灰骨、骨（同種または自己）が挙げられるが、これらに限定されない。アンカー材料としてはまた、チタン、ステンレス鋼、高密度ポリエチレン、ＤＡＣＲＯＮおよびＴＥＦＬＯＮが挙げられる。
【０１０６】
また、アンカー材料は、選択された材料に靱帯繊維コンストラクト結合または骨繊維コンストラクト結合のどちらかまたは両方を促進する因子を注入することにより作製することができ、またはさらに増強することができる。注入するという用語は、適切に因子をアンカー上に分配させる（例えば、コーティング、浸透、接触）任意の適用方法を含むと考えられる。そのような因子の例としては、ラミニン、フィブロネクチン、癒着を促進する任意の細胞外繊維コンストラクトタンパク質、絹、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド結合領域を含む因子またはＲＧＤペプチド自体が挙げられるが、これらに限定されない。増殖因子または骨形態形成タンパク質もまた、アンカー付着を増強するために使用することができる。さらに、アンカーは、アンカーに接着し、繊維コンストラクトに結合する細胞（例えば、幹細胞、靱帯細胞、骨芽細胞、骨原性前駆細胞）を前もって播種することができ、インビトロおよびインビボの両方での繊維コンストラクト付着が増強される。
【０１０７】
例示的なアンカーシステムは、出願人の共に係属中の出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／９５０，５６１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される。繊維コンストラクトは、アンカー面との接触を介して、またはアンカー材料を通る繊維コンストラクト材料の実際の侵入によりアンカーに付着される。アンカーを介して繊維コンストラクトに適用される力は、生成される最終的な靱帯を決定するので、生成される最終的な靱帯のサイズは、一部、アンカーの付着部位のサイズにより決定される。所望の最終的な靱帯に適切なサイズのアンカーが使用されるべきである。ＡＣＬの形成のためのアンカー形状の一例は、円筒である。しかしながら、他のアンカー形状およびサイズもまた、十分機能するであろう。例えば、アンカーは、生体工学操作された靱帯のレシピエントの大腿骨および脛骨における骨トンネルへの直接挿入に適切なサイズおよび組成を有することができる。
【０１０８】
また、アンカーは、繊維コンストラクトのみがインビボで移植される時に、インビトロ培養中一時的にのみ使用し、その後除去することができる。
【０１０９】
さらに、新規絹繊維ベース繊維コンストラクトは、ＢＭＳＣを播種し、バイオリアクター内で培養させることができる。本開示の方法によって使用することができる２つの型の増殖環境が、現在存在する：（１）インビトロバイオリアクター装置システム、および（２）インビボ膝関節、これは、適正な生体適合性および機械的特性を有する繊維コンストラクトが与えられると、生存可能なＡＣＬの発生に必要な前駆細胞および刺激（化学的および物理的の両方）を含む生理的環境を提供するので、「バイオリアクター」として機能する。バイオリアクター装置は、分化および細胞外繊維コンストラクト（ＥＣＭ）生成の観点から靱帯形成に対し最適培養条件を提供し、よって、レシピエントへの移植前に靱帯に最適な機械的および生物学的特性を提供する。さらに、絹繊維ベース繊維コンストラクトが、インビトロで細胞播種され、培養された場合、ペトリ皿は、細胞増殖および再生に適切な条件、すなわち、静的環境が存在するバイオリアクターであると考えることができる。
【０１１０】
細胞はまた、繊維コンストラクト上で、いずれの機械力も適用せず、すなわち、静的環境で培養することができる。例えば、絹繊維ベース繊維コンストラクトは単独で、インビトロで適用される機械力または刺激なしで、ＢＭＳＣが播種され、培養された場合、細胞が、増殖し、靱帯および腱特異的マーカーを発現するように誘導する（本明細書で記載される実施例を参照されたい）。膝関節は、細胞および正しい環境シグナル（化学および物理）を繊維コンストラクトに適用することができ、よって、ＡＣＬが技術的に発生する生理的増殖および発生環境として機能することができる。よって、膝関節（それ自体バイオリアクターの形態として）＋繊維コンストラクト（播種なし、播種、インビトロで分化なし、または移植前にインビトロで播種および分化）により、ＡＣＬ、または、繊維コンストラクト上に播種された細胞型および繊維コンストラクト移植の解剖学的位置によって、他の所望の組織の発生が得られる。図１５Ａ−Ｂは、適切なＭＣＬ機械的特性を有する播種されていない絹ベース繊維コンストラクトのみが６週間インビボで移植された場合の、内側側副膝関節環境の内側側副靱帯（ＭＣＬ）発生への効果を示す。細胞が機械的刺激が適用されない静的環境、または動的環境、例えばバイオリアクター装置で培養されるかに関係なく、細胞増殖および再生に適切な条件は、好都合なことに所望の靱帯または組織の操作に対し存在する。
【０１１１】
下記実施例で記載される実験では、適用された機械的刺激は、得られた組織内の前駆細胞の形態、および細胞組織に影響することが示された。細胞によって分泌された細胞外繊維コンストラクト構成要素および組織全体にわたる細胞外繊維コンストラクトの組織化もまた、組織生成中に繊維コンストラクトに適用された力によって著しく影響された。インビトロ組織生成中、細胞および細胞外繊維コンストラクトは荷重軸に沿って整列し、天然ＡＣＬのインビボ組織化を反映し、これもまた天然膝関節運動および機能から生成される様々な荷重軸に沿って存在する。これらの結果から、組織、例えばＡＣＬを発生する細胞が実際経験する物理刺激は、前駆細胞分化および組織形成において重要な役割を果たすことが示唆される。さらに、この役割は、同様の組織を生成させる機械的操作によって、インビトロで効果的に繰り返され得ることが示される。機械的操作により生成される力がＡＣＬインビボにより経験される力により厳密に類似するほど、得られた組織はより厳密に天然ＡＣＬに類似する。
【０１１２】
機械的刺激が、インビトロで繊維コンストラクトにバイオリアクターを介して適用される場合、他のアンカーに関して１つのアンカーに適用される繰り返しおよび回転歪みの両方に対する独立しているが、同時の制御が存在する。また、繊維コンストラクトは単独で、インビボで移植し、患者由来のＡＣＬ細胞を播種し、インビボで患者を介して機械的シグナルに暴露させることができる。
【０１１３】
繊維コンストラクトに、移植前に細胞を播種させる場合、細胞は、繊維コンストラクト内で、細胞増殖および分化に適切な条件下で培養される。培養過程中、繊維コンストラクトは、１つ以上の機械力を、付着されたアンカーの１つまたは両方の移動を介して受けてもよい。引っ張り、圧縮、ねじりおよびせん断、およびそれらの組み合わせの機械力が、ＡＣＬによりインビボで経験される機械的刺激を模倣するように適切な組み合わせ、大きさ、および周波数で適用される。
【０１１４】
様々な因子が繊維コンストラクトにより許容される力の量に影響する（例えば、繊維コンストラクト組成、細胞密度）。繊維コンストラクト強度は、組織発生過程を通じて変化することが予測される。よって、適用された機械力または歪みは靱帯生成期間にわたり、大きさ、期間、周波数および種類が増加、減少し、または一定のままとなり、適用時の繊維コンストラクト強度に適切に対応する。
【０１１５】
ＡＣＬを生成させる場合、組織発生中に繊維コンストラクトに適用される刺激の強度および組み合わせが正確なほど、得られた靱帯が天然ＡＣＬによりいっそう類似する。インビボ環境を厳密に模倣するインビトロ機械力レジメンを考案する場合、ＡＣＬの天然機能に関し、２つの問題を考慮しなければならない：（１）ＡＣＬが経験する動きの異なる型およびＡＣＬの膝関節運動に対する応答ならびに（２）靱帯が経験する機械的応力の程度。機械的刺激の特定の組み合わせは、膝構造の天然の動きから発生し、天然ＡＣＬに伝達される。
【０１１６】
膝の動きを簡単に説明するために、脛骨および大腿骨のＡＣＬによる結合は、２つの骨の互いに関する動きを考慮すると、６自由度を提供する。脛骨は３方向に移動することができ、これらの３方向の各々の軸に関して回転することができる。膝は、靱帯およびｃａｐｕｌａｒ繊維および膝表面自体の存在のために、これらの６自由度の全範囲の達成は制限される(Biden et al., “Experimental Methods Used to Evaluate Knee Ligament Function,” Knee Ligaments: Structure, Function, Injury and Repair, Ed. D. Daniel et al., Raven Press, pp.135-151, 1990)。小さな並進移動もまた可能である。ＡＣＬの付着部位は、膝関節でのその安定化する役割に関与する。ＡＣＬは、前脛骨並進運動の第１安定器として、および外反−内反角形成、および脛骨回転の第２安定器として機能する(Shoemaker et al., “The Limits of Knee Motion,” Knee Ligaments: Structure, Function, Injury and Repair, Ed. D. Daniel et al., Raven Press, pp.1534-161, 1990)。よって、ＡＣＬは、６のうちの３つの自由度での膝の安定化に関与する。結果として、ＡＣＬは、安定化機能を実行するために特異的な繊維組織化および全体構造を発生させた。これらの条件は、インビトロでシミュレートされ、同様の構造および繊維組織化を有する組織が生成される。
【０１１７】
ＡＣＬにより経験される機械的応力の程度は同様に要約することができる。ＡＣＬは、１〜２００万サイクル／年の間に約４００Ｎの繰り返し荷重を受ける(Chen et al., J. Biomed. Mat. Res. 14: 567-586, 1980)。また、ＡＣＬ外科的置換を行う場合、線形剛性（約１８２Ｎ／ｍｍ）、限界変形（１００％のＡＣＬ）および不全時に吸収されるエネルギー（１２．８Ｎ−ｍ）も考慮される(Woo et al., The tensile properties of human anterior cruciate ligament (ACL) and ACL graft tissues, Knee Ligaments: Structure, Function, Injury and Repair, Ed. D. Daniel et al. Raven Press, pp.279-289, 1990)。
【０１１８】
下記、実施例セクションは、プロトタイプの生体工学操作された前十字靱帯（ＡＣＬ）のエクスビボでの生成を詳述する。天然ＡＣＬがインビボで経験する機械的刺激のサブセットを模倣する機械力（回転変形および線形変形）を、組み合わせて適用し、得られた形成靱帯を、組織発生に対する適用された力の効果を決定するために研究した。インビトロ形成中に、発生靱帯を生理的荷重に暴露すると、細胞が荷重軸に沿って規定された配向を採用し、同様に、その軸に沿って細胞外マトリクスを生成させるように誘導された。これらの結果から、複雑な多次元機械力を、天然ＡＣＬの環境を模倣する、より複雑な荷重軸ネットワークを生成させる体制に組み込むと、天然ＡＣＬにより厳密に類似する生体工学操作された靱帯が生成されることが示される。
【０１１９】
適用され得る異なる機械力としては、引っ張り、圧縮、ねじりおよびせん断が挙げられるが、これらに限定されない。これらの力は、天然膝関節運動および機能の過程においてＡＣＬが経験する力をシミュレートする組み合わせで適用される。これらの運動としては、冠状および矢状面において規定される膝関節伸展および屈曲、および膝関節屈曲が挙げられるが、これらに限定されない。最適に、適用された力の組み合わせは、実験的に可能な限り正確に、前十字靱帯によりインビボで経験される機械的刺激を模倣する。靱帯生成過程を通しての力適用の特定のレジメンの変更は組織発生の速度および転帰に影響すると予測され、最適条件は実験的に決定される。レジメンにおける潜在的な変数としては下記が挙げられるが、これらに限定されない：（１）ひずみ速度、（２）歪みパーセント、（３）歪みの型（例えば、並進および回転）、（４）周波数、（５）所定の体制内のサイクル数、（６）異なる体制の数、（７）靱帯変形の極値点での期間、（８）力レベル、および（９）異なる力の組み合わせ。多種多様なバリエーションが存在する。適用された機械力のレジメンは下記で記載される、天然靱帯のものと同様のらせん状に組織化された繊維を生成させることができる。
【０１２０】
天然靱帯の繊維束は配列されらせん状組織とされる。付着様式および膝関節が回転して約１４０°の屈曲をする必要性により、９０°ツイストを引き継ぐ天然ＡＣＬが得られ、末梢繊維束は、らせん状組織を発生する。この独特な生体力学特徴により、ＡＣＬは非常に高い荷重を維持することができる。機能的ＡＣＬでは、繊維のこのらせん状組織化により、前−後および後−前繊維は全ての屈曲度に対し互いに関して比較的等尺性を維持することができ、よって、荷重はいずれの膝関節屈曲度でもすべての繊維束に均等に分配させることができ、あらゆる範囲の関節の動き全体にわたって膝が安定化される。膝関節屈曲および膝関節伸展の組み合わせをシミュレートする機械力を発生靱帯に適用することができ、この同じらせん状組織を有する人工ＡＣＬが生成される。下記実施例で示される、実験で使用した機械装置は、歪みおよびひずみ速度（並進および回転の両方）が制御できる。機械装置は増殖する靱帯により経験される実際の荷重をモニタし、荷重体制をモニタし、増加させることにより、時間経過と共に靱帯に「教示する」ように機能する。
【０１２１】
本開示の別の態様は、上記方法により生成された、生体工学操作された前十字靱帯に関する。これらの方法により生成された、生体工学操作された靱帯は、細胞配向および／または生成中に適用された機械力の方向の繊維コンストラクトひだパターンにより特徴付けられる。靱帯はまた、培養中に経験する機械的荷重の軸に沿った細胞外繊維コンストラクト構成要素（例えば、コラーゲンＩ型およびＩＩＩ型、フィブロネクチン、およびテネイシン−Ｃタンパク質）の生成／存在により特徴付けられる。靱帯繊維束は上記にように、配列させてらせん状組織とすることができる。
【０１２２】
新規絹繊維ベース繊維コンストラクトを使用する上記方法は、ＡＣＬの生成に限定されず、膝（例えば、後十字靱帯）または他の身体部分（例えば、手、手首、足首、肘、顎および肩）で見いだされる他の靱帯および腱、例えば、例として、限定はされないが、後十字靱帯、回旋筋腱板腱、肘および膝の内側側副靱帯、手の屈筋腱、足首の外側靱帯ならびに顎または顎関節の腱および靱帯を生成させるためにも使用することができる。ヒト体内の全ての運動可能な関節は、関節内の骨の関節末端を結合する特定化された靱帯を有する。体内の各靱帯は、その機能および環境により指示された特定の構造および組織を有する。身体の様々な靱帯、それらの位置および機能はAnatomy, Descriptive and Surgical (Gray, H., Eds. Pick, T. P., Howden, R., Bounty Books, New York, 1977)に列挙され、その関連する内容は、参照により本明細書に組み込まれる。所定の靱帯または腱により経験される物理刺激を決定し、これらの刺激を模倣する力を組み込むことにより、ＡＣＬをエクスビボで生成させるための上記方法は、体内のいずれかの靱帯または腱をシミュレートする、生体工学操作された靱帯および腱をエクスビボで生成させるように適合させることができる。
【０１２３】
生成される特定の型の靱帯または腱は、組織生成前に予め決定される。というのも、方法のいくつかの態様は、天然の靱帯または腱によりインビボで経験される特定の条件と共に変動するからである。発生する靱帯または腱が細胞培養中に受ける機械力は、特定の培養される靱帯または腱型に対して決定される。特定の条件は天然靱帯または腱およびその環境および機能を研究することにより決定することができる。靱帯または腱がインビボで経験する１つ以上の機械力が、繊維コンストラクト中の細胞の培養中に繊維コンストラクトに適用される。熟練した実践者であれば、現在入手可能なものより優れている靱帯または腱が、天然の靱帯または腱により経験される力のサブセットの適用により生成させることができることを認識するであろう。しかしながら、最適に、全範囲のインビボ力が、適切な大きさおよび組み合わせで繊維コンストラクトに適用され、天然の靱帯または腱に最も厳密に類似する最終生成物が生成されるであろう。これらの力としては、ＡＣＬの生成のために上記で記載される力が挙げられるが、これに限定されない。適用される機械力は、靱帯または腱型と共に変動し、および靱帯または腱の最終サイズは、使用されるアンカーにより影響されるので、最適アンカー組成、サイズおよび繊維コンストラクト付着部位は、靱帯または腱の各型に対し熟練した実践者により決定されるべきである。繊維コンストラクト上に播種される細胞の型は、生成される靱帯または腱の型に基づいて明確に決定される。
【０１２４】
他の組織型は、エクスビボで、靱帯または腱のエクスビボでの生成のために上記で記載されるものと同様の方法を用いて生成させることができる。上記方法はまた、それらの機能の大部分として機械的変形を伴うある範囲の人工組織製品、例えば筋肉（例えば、平滑筋、骨格筋、心筋）、骨、軟骨、椎骨板、およびいくつかの型の血管を生成させるのに適用することができる。骨髄間質細胞は、分化して、これらならびに他の組織になる能力を有する。絹ベース繊維コンストラクトまたは複合繊維コンストラクトのジオメトリは、所望の組織型の正確な解剖学的幾何学的形態に容易に適合させることができる。例えば、絹フィブロイン繊維は、円筒管に再編成させることができ、動脈が再作成される。
【０１２５】
下記実施例で提供される結果から、所定の組織型の特定の機械環境を模倣する環境における増殖は、適切な細胞分化を誘導し、天然組織に著しく類似する、生体工学操作された組織が生成されることが示される。繊維コンストラクトの機械的変形の範囲および型は、拡張させることができ、広範囲の組織構造構成が生成される。細胞培養環境は、天然組織およびそれに含まれる細胞が経験するインビボ環境を、天然組織内の細胞の胚発生から成熟機能までの過程を通して、できるだけ正確に反映することができる。所定の組織を生成させる特定の培養条件を設計する際に考慮すべき因子としては、繊維コンストラクト組成、細胞固定化方法、繊維コンストラクトまたは組織の固定方法、適用される特定の力、および細胞培地が挙げられるが、これらに限定されない。機械的刺激の特定のレジメンは、生成される組織型に依存し、機械力の適用（例えば、張力のみ、ねじりのみ、張力およびねじりの組み合わせ、せん断ありまたはなし、など）、力振幅（例えば、角度または伸長）、適用周波数および期間、刺激および静止期間の時間を変動させることにより確立される。
【０１２６】
特定の組織型をエクスビボで生成させるための方法は、ＡＣＬを生成するための上記方法の適合である。関連する構成要素としては、多能性細胞、細胞が接着することができる三次元繊維コンストラクト、および繊維コンストラクト付着に好適な面を有する複数のアンカーが挙げられる。多能性細胞（例えば、骨髄間質細胞）は、細胞を繊維コンストラクト内に均一に固定するための手段により、三次元繊維コンストラクト内に播種される。播種される細胞数もまた、制限的とみなされないが、しかしながら、高密度の細胞を繊維コンストラクトに播種すると、組織生成が加速され得る。
【０１２７】
適用される特定の力は、天然組織の検査およびインビボで経験する機械的刺激により、生成される各組織型に対し決定されるべきである。所定の組織型は、組織の体内での位置および機能により決定される特有の力を経験する。例えば、軟骨は、せん断および圧縮／引っ張りの組み合わせをインビボで経験することが知られており；骨は圧縮を経験する。
【０１２８】
追加の刺激（例えば、化学刺激、電磁刺激）もまた、生体工学操作された靱帯、腱および他の組織を生成させるために、上記方法に組み込むことができる。細胞分化は、しばしば周囲の細胞により生成される、環境からの化学刺激、例えば、２〜３例を挙げると分泌された増殖または分化因子、細胞−細胞接触、化学勾配、および特定のｐＨレベルに影響されることが知られている。他のより独特な刺激は、より特殊な型の組織が経験する（例えば、心筋の電気刺激）。そのような組織特異的刺激（例えば、１−１０ｎｇ／ｍｌトランスフォーミング増殖因子β−１（ＴＧＦ−β１）を独立して、または適切な機械力に合わせて適用すると、細胞の、特定の天然組織により厳密に近似する組織への分化を促進すると予測される。
【０１２９】
上記方法により生成される組織により、適合性レシピエントへの外科的移植、特に損傷組織の置換または修復のための組織等価物の無制限のプールが可能になる。人工組織はまた、正常または病的組織機能のインビトロ研究、例えば、分子、機械的、または遺伝子操作に対する細胞および組織−レベル応答のインビトロ試験のために使用され得る。例えば、正常またはトランスフェクト細胞に基づく組織は、生物化学的または機械的刺激への組織応答を評価し、過剰発現またはノックアウトされ得る特定の遺伝子または遺伝子産物の機能を同定する、または薬理作用のある物質の効果を研究するために使用することができる。そのような研究はおそらく、靱帯、腱および組織発生、正常および病的機能に関するより多くの見識を提供し、最終的には、すでに確立された組織工学アプローチ、細胞分化および組織発生に関する新規見識、および構造的および機能的な組織特性を改善するための細胞由来および外因性の生物化学的因子と合わせた機械的制御シグナルの使用に一部基づいて、完全に機能的な組織工学操作された置換に導くであろう。
【０１３０】
人工組織、例えば靱帯および腱の生成はまた、損傷前の組織損傷（例えば、ＡＣＬ破裂）のリスクが高い個体から骨髄間質細胞を収集するなどの用途に対し可能性がある。これらの細胞は必要となるまで保存することができ、または適切な繊維コンストラクト中に播種し、インビトロで機械的刺激下培養し分化させ、様々な生体工学操作されたプロステーシス組織を生成させ、ドナーにより必要とされるまで蓄えておくことができる。インビボで生物環境によりよく適合する、および、例えば、正常な、完全に機能的な靱帯の動的平衡を維持するのに要求される生理的荷重を提供する生体工学操作された生体組織プロステーシスの使用は、特に組織が予め増殖され、保存されている場合、プロステーシスのレシピエントのためのリハビリテーション時間を数ヶ月から数週間に減少させるはずである。利点としては、機能活性のより迅速な回復、より短い病院滞在、および組織拒絶および不全に関して問題点より少ないことが挙げられる。
【０１３１】
本明細書で記載されるファブリックは、患者における乳房の膨らみのサイズ、形状、位置または外観を変更するために実施される外科的手順における移植可能なプロステーシスとして使用するために設計することができる。１つの実施形態では、本明細書で記載されるファブリックは、周囲の組織をサポートする、同時に患者の乳房内のそのような支持組織のインビボ生成のための足場として機能するための移植可能なプロステーシス装置として使用される。
【０１３２】
そのようなものとして、本明細書で記載されるファブリックは乳房固定術、豊胸、および乳房切除後乳房再建などの手順における移植のために有用である。
【０１３３】
１つの実施形態では、ファブリックはさらに、インビボでの新しい乳房組織内殖のための部位を提供する。
【０１３４】
ファブリック形状および組成
本明細書で記載される方法は、患者への移植時に経験される荷重に耐え、よって、隣接する組織にサポートを提供するのに十分な強度を有するファブリックを生成させるために使用することができる。使用されるファブリックは乳房組織（例えば、軟組織、例として結合組織）の１つ以上の生体力学特性を有し、十分な荷重抵抗を与えるように設計することができる。さらに、ファブリックは、細胞の内殖をサポートし、細胞は、インプラントの環境において、分化するように刺激され、よって天然組織が生成され、これは最終的に移植されたファブリックに、これが生分解するにつれとって代わる。より厳密にファブリックが天然組織の生体力学を模倣するほど、より厳密に生成された組織は天然組織に類似する。
【０１３５】
本発明のファブリックは、各特定の外科的用途を満たすために、様々なサイズ、形状および階層組織で生成させることができる。乳房手術手順において有用なファブリックは、必要な形状および／またはサポートを周囲の組織に適用するように設計される。さらに、そのようなファブリックはまた、細胞の内殖のための適切な足場を提供することができ、その形状およびサポートを維持するために適切な生体力学特性を有する新しい組織が生成される。特に有用なファブリック設計は、移植部位に通常存在する健康な組織の分析により決定することができる。所望の生体力学特性を有する適切なサイズおよび形状のファブリックがその後、本明細書で記載されるように、適切な組み合わせの織糸（適切なジオメトリを有する）をより合わせることにより生成させることができる。
【０１３６】
１つの実施形態では、ファブリックはまた、乳房内の移植部位での組織生成のための足場として機能する。ファブリックにとって代わる生成された新しい組織は、乳房修復／豊胸の不可欠な構成要素、および／または手術（例えば、乳房再建、豊胸、乳房固定術）中に作られた切り込みからの回復の補助として機能することができる。ファブリックの特定のサイズ、形状、および繊維組織は、手順の型およびその手順におけるファブリックの特定用途に関し変動し、熟練した実践者により各個々の患者に対し決定され得る。１つの実施形態では、ファブリックは、少なくとも部分的に患者における乳房結合組織（例えば、外科的除去により失われたまたはそうでなければ損傷された組織）にとって代わることができるように設計される。
【０１３７】
ファブリックは、本明細書で記載される、乳房内の天然組織構成要素に類似する、これにとって代わるように設計された１つ以上の構成要素の形態をとることができる。ファブリックは、１つの特定の組織構造にとって代わるように設計することができ、または複数の組織構造（例えば、乳房内で密接に関連するまたは相互接続されることが通常見いだされるもの）に類似することができる。
【０１３８】
１つの実施形態では、ファブリックは、乳房領域に広がる、および筋膜および／または皮膚を結合させる結合組織にとって代わる、またはこれを再現するように設計される（例えば、結合支帯、乳房筋膜、線維性ラメラ）。１つの実施形態では、ファブリックは２次元ウェブまたはメッシュである。ウェブまたはメッシュは、乳房の筋膜（例えば、浅筋膜、筋肉筋膜）の１つ以上の生体力学特性を有するように設計することができる。
【０１３９】
ウェブまたはメッシュの形態のファブリックはさらに、乳房内の天然組織構成要素（例えば、靱帯または靱帯様構造）に類似する１つ以上の構成要素を含み得る。例えば、より厚い靱帯様構造がメッシュボディ全体に散在したウェブまたはメッシュ。そのような厚い構造は、ウェブの長さに沿って、ウェブの中心を通って走ることができ、それらは様々なパターンで分散させる、例えば、中心から放射状に直線および／または分枝線で走ることができる。それらは、円形／楕円形態（例えば、同じ中心を有するように配列された異なるサイズの円）を有し得る。１つの実施形態では、構造は、乳房の結合組織に類似するウェブ全体にわたるパターンで配列される。そのような構造は、ウェブまたはメッシュの不可欠な構成要素として設計および生成させることができ、または別々に生成させウェブまたはメッシュの生成後に、付着により追加することができる。乳房のそのような構造構成要素は、当技術分野で知られている。
【０１４０】
ファブリックは、より合わされた織糸（例えば、織り、編み、またはステッチ貼り合わせにより、より合わされる）から構成される。織糸は、本明細書で記載されるセリシン抽出フィブロイン繊維から製造される。フィブロイン繊維は、本明細書で記載されるように、１、２、３または４レベル階層組織化により織糸に組織化させることができる。例えば、並列またはより合わされた繊維は、共に集団化され、単一レベル階層組織の織糸が形成される。第２レベルの階層組織化は、複数の群が共により合わされる場合に追加され、織糸内に存在する１つ以上の束が形成される。第３のレベルの階層組織化は、複数の束が共により合わされる場合に追加され、織糸内に存在する１つ以上のストランドが形成される。第４レベルの階層組織化は、複数のストランドが共により合わされる場合に追加され、織糸内に存在する１つ以上のコードが形成される。より合わせは、並列、らせん状、または織り組織化により、互いに非ランダムに整列させることから構成される。そのような組織化は任意の階層レベルで起きてもよく、所望の特性（生体力学、多孔度、など）を有するファブリックが生成される。当業者であれば、これらのレベルの階層組織化の様々な組み合わせを使用して、異なる全体構造（例えば、ツイスト、編組、編み、織り、ステッチ貼り合わせ）を有するファブリックを生成させることができることを認識するであろう。さらに、これらの構造の任意の組み合わせを有するファブリックを生成させることができる。
【０１４１】
１つの実施形態では、ファブリックが乳房構造および／または乳房内に配置されたプロステーシスをサポートするように設計され、移植される。ファブリックの構造は、少なくとも１つの次元（第１の次元）に延在し、得られた乳房（天然乳房組織および／またはプロステーシス乳房インプラントを含む）に係合するように適合させた少なくとも１つの表面（第１の表面）を有する。患者体内にファブリックを適切に配置することにより、得られた乳房構造は、ファブリックにより成形される。
【０１４２】
ファブリックは、様々な異なる全体形状を有する（例えば、移植された場合乳房組織と一致する）ように設計することができる。例えば、ウェブまたはメッシュであるファブリックは、平面であってもよく、または凹面を有してもよい。ファブリックは、患者体内の天然乳房組織または乳房インプラントの一領域の少なくとも一部分に一致するように適合させた所定の形状を有することができる。１つの実施形態では、ファブリックは三日月形状、または楕円形状を有する。円形、半円、楕円、カップ形状、または半月形状もまた使用することができる。細長いストリップもまた使用することができる。１つの実施形態では、ファブリックは、乳房プロステーシスまたは乳房組織の下方および／または外側セクションを完全にまたは部分的に覆うのに十分大きい。そのような形状により、例えば、ファブリックは、乳房プロステーシスおよび／または天然乳房組織の下極をサポートすることができ下方および外側乳房ひだをまねる。しかしながら、ファブリックの配置は、乳房内のいずれの特定の位置または整列にも限定されず、特定の手順および組織構築の最終目的に依存する。１つの実施形態では、ファブリックは、スリング形状で形成される（例えば、患者体内で乳房または乳房インプラントのためのサポートを提供するため）。１つの実施形態では、ファブリックは細長い形状で形成される（例えば乳房、患者体内で乳房の乳房下部領域においてサポートを提供するため）。１つの実施形態では、ファブリックはカップ形状で形成される（例えば、患者体内で乳房のための内側または外側サポートを提供するため）。
【０１４３】
ファブリックはさらに、患者の組織に固定されるように適合させた部分を含み得る。これにより、移植が促進される。そのように適合させた部分の構造は、付着手段および／または患者への付着場所に依存する。１つの実施形態では、患者の胸腔の周囲の組織に付着される。１つの実施形態では、乳房組織の周囲のまたはプロステーシス乳房インプラントの周囲の軟組織に付着される。１つの実施形態では、乳房組織に隣接する、またはプロステーシス乳房インプラントに隣接する骨構造に対して付着される。
【０１４４】
ファブリックはさらに、細胞の内殖を促進し、これによって、新しい乳房組織を生成させる１つ以上の作用物質を含み得る。そのような作用物質としては、本明細書で記載される細胞接着因子、増殖因子、付着促進材料、薬物、化学誘引物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
図２２Ａおよび２２Ｂは、ファブリック構造２００は、乳房組織または乳房インプラントの一領域の一部分に一致するように形成または成形することができる。本発明のこの実施形態では、ファブリック構造は、図２２Ａで示されるように円形または楕円形状に切断することができ、任意で、図２２Ｂで示される所望の外形を提供する形態に成型またはプレスすることができる。形態は、乳房インプラントまたは乳房インプラントの外形を模倣するように意図された装置とすることができる。図２２Ａで示されるように、ファブリック構造は、強化領域、例えば、例として、乳房組織、胸腔の周囲の組織または骨組織への縫合２１０またはタッキングによる固定を促進するための周辺端部２０２を含むことができる。強化領域、例えば周辺端部２０２は、ファブリック構造の複数の層を共に貼り付け、ファブリック構造をそれ自体の上に折り重ね、または追加の繊維または織糸を織り込むことにより形成することができ、ファブリック構造の構造完全性が増加する。同様に、ファブリック構造はまた、縫合またはタッキングを促進するための強化穴２０４を含むことができる。
【０１４６】
図２３Ａおよび２３Ｂは、図２２Ａおよび２２Ｂのプロステーシスファブリック構造２００が、本発明に従い、どのように皮膚と乳房組織または乳房インプラントの間に移植され得るかを示す線図である。図２３Ａは、乳房の乳房下部領域に移植され、乳房再建手順、例えば乳房固定術の一部として、または疾患乳房組織の除去、例えば、乳房切除後に下方変位または下垂を修正する、本発明によるプロステーシスファブリック構造を示す。プロステーシスファブリック構造はまた、乳房インプラント手順の一部として、インプラントのためのサポートを提供し、下方変位および下垂のリスクを減少させるために、移植することができる。図２３Ｂは、乳房の内側または外側に移植され、外側サポートを提供し、内側または外側変位のリスクを減少させる本発明によるプロステーシスファブリック構造を示す。
【０１４７】
図２４および２５は、ファブリック構造を形成または切断させて作ることができる可能な形状の例を示す。図２４は、三日月形状プロステーシスファブリック構造を示し、これは、乳房の下側および外側半球においてサポートを提供するために使用することができる。図示されていないが、三日月形状プロステーシスファブリック構造は、図２２Ａおよび２２Ｂに関して記載された強化部分を含むことができる。図２５は、細長いまたは楕円形状プロステーシスファブリック構造を示し、これは、乳房の下側および外側半球においてサポートを提供するために使用することができる。図示されていないが、細長いまたは楕円形状プロステーシスファブリック構造は、図２２Ａおよび２２Ｂに関して記載された強化部分を含むことができる。
【０１４８】
本発明の１つの実施形態によれば、外科医が、彼または彼女の裁量で、手順に適合するように必要とされるサイズ形状に切断することできるプロステーシスファブリック構造のシートまたは長さ（例えば、テープ）が外科医に提供され得る。ファブリック構造を形状に切断し、ファブリック端をシールし、ほつれおよび解体を減少させるために専用工具が提供され得る。プロステーシスファブリック構造は、組織内殖を助長し、強化する作用物質または因子を含むことができる。本発明の１つの実施形態では、作用物質または因子は、乳房の結合組織の内殖を助長し、サポートを促進する。さらに、サポート的ファブリック構造は時間と共に分解するので、乳房組織またはインプラントのためのサポートを提供し続ける内殖結合組織により取って代わられる。
【０１４９】
図２６は、スリング形態のプロステーシスファブリック構造の一例を示す。本発明のこの実施形態では、プロステーシスファブリック構造は、細長いストリップまたはテープの形態をとることができ、これは乳房または乳房インプラントを取り囲んで移植することができ、サポートを提供し、定位置に保持することができる。スリングの端は、胸腔の周囲の組織または骨組織（例えば、肋骨または胸骨）に縫合またはタッキングすることができ、さらなるサポートが提供される。
【０１５０】
図２７は、乳房の乳房下部領域に移植されるテープの形態のプロステーシスファブリック構造の一例を示す。この実施形態では、１つ以上の層のテープを移植することができ、構造サポートが提供され、移植部位で固定されない。この実施形態によれば、プロステーシスファブリック構造は、組織内殖を促進または増強する作用物質または因子を含むことができ、プロステーシスファブリック構造が、移植部位の適切な位置に、縫合またはタッキングなしで固定される。本発明によれば、プロステーシスファブリック構造は、プロステーシスファブリック構造が分解するにつれ、追加のサポートを提供する結合または支持組織内殖を促進する作用物質または因子を含むことができる。この手順を使用して、損傷し、罹患しまたは手術中に切除された乳房中の結合組織を回復させることができる。
【０１５１】
本発明によるプロステーシスファブリック構造は、患者の要求に合うように、あるサイズに切断し、ある形状に形成させることができる。包括的でない例のリストが本明細書で提供されるが、そのリストは制限することを意図しない。本発明のプロステーシスファブリック構造は他の形状、例えば米国特許第７，４７６，２４９号および米国特許出願公開第ＵＳ２００８／００９７６０１号（どちらも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものに形成することができる。
【０１５２】
乳房解剖学的形態
乳房下部ひだは、乳房の下の、乳房および胸部が出会う、胸部の自然な境界である。乳房下部ひだは、第５−第６肋骨に位置する。最低部分は、第６肋間腔まで延在する。このひだは、定位置を有する。
【０１５３】
乳房下部領域は、浅筋膜と深部筋膜の間で伸長された多くの厚いコラーゲン繊維を含む。浅筋膜は、コラーゲンおよび弾性繊維の両方から構成される。女性乳房皮下筋膜系の浅筋膜は、例外的に厚い。浅筋膜は、胸骨に沿った肥硬支帯を介して深部筋膜（筋肉筋膜）に結合する。前乳房被膜（乳房筋膜）として知られている結合バンドは浅筋膜から脱離する。この筋膜、および鎖骨下領域の筋膜は、それらの線維支帯（Ｃｏｏｐｅｒ靱帯）により乳腺をサポートする。Ｃｏｏｐｅｒ靱帯およびまた、乳房筋膜は、浅筋膜から脱離し、皮膚（深部真皮）に結合する。乳房下部支帯は浅筋膜から生じ、合併する高密度結合支帯から構成される。浅筋膜は、筋肉筋膜から薄い深部皮下層を介して分離され、そこでは、結合支帯はほぼ水平である。それらは脂肪小葉を含む弾性隔壁により連結される。この女性では、これらがほんの少ししかなく、それらは小さく、より深部の筋肉筋膜に固定される。浅筋膜のより深い筋膜との、胸骨に沿った融合が存在する。内側に、浅筋膜は合体して胸骨の前膜となり、胸鎖入突筋および胸筋主要筋肉の腱装置から来る繊維から構成される。
【０１５４】
横線維層はほとんど第６肋骨の筋膜から生じ、乳房下部ヒダの全長に延在する。この構造は、異なるテクスチャー、および浅筋膜からより密な一貫性を有する。浅および深部筋膜間では、線維疎性組織および時々、線維脂肪組織からなる層が存在する。乳腺下領域では、組織は、第６肋骨−第６肋間腔でより線維性である。浅筋膜は、深部乳房下部皮下層でより厚い支帯により、より深部の筋肉筋膜と結合する。ここで、浅筋膜は、深部面（筋肉筋膜）に接着され、牽引に対しより抵抗性がある。接着は、組織学的に複数の、短い、線維性結合から構成され、これらは線維筋性面を通過しない。
【０１５５】
乳房靱帯は、乳房の周りに周囲靱帯を形成し、浅筋膜と深部筋膜の間に周囲融合を形成する。この結合靱帯は、完全に乳房を取り囲み、浅筋膜と深部筋膜の間の間隙に対する円形境界を形成し、しばしば、周囲乳房靱帯と呼ばれる。周囲乳房靱帯は２つの組織層を結合する天然境界を形成し、層間で切開する外科医は、切開の程度を規定し、限定するためにこれを使用し得る。これらの規定された層はまた、米国特許出願公開第２００８／０３００６８１号で開示されるように、組織増殖のための領域を提供する。
【０１５６】
ファブリックの追加の構成要素
ファブリックはさらに、移植前に、その中に播種され、培養された哺乳類細胞を含み得る。ファブリック上に播種し、培養することができる細胞は、本明細書で記載される。１つの実施形態では、細胞は患者に由来する。そのような細胞としては、骨髄細胞、幹細胞、間葉系幹細胞、滑膜由来幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血細胞、臍帯Ｗｈａｒｔｏｎ膠様質細胞、脂肪組織由来の前駆細胞、骨髄由来前駆細胞、末梢血液前駆細胞、成体組織から単離した幹細胞および遺伝的トランスフォーム細胞または上記細胞の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、移植直前に短期間（＜１日）ファブリック上で播種することができ、または、移植前に播種されたファブリック内で、より長い期間（＞１日）培養して、細胞増殖および細胞外マトリクス合成を可能にすることができる。
【０１５７】
１つの実施形態では、幹細胞を開示したファブリック上に播種し、培養する。ファブリック内の幹細胞から調製した軟組織のデノボ合成は、軟組織の修復、増強または再建ためのコンストラクトを提供する。成体幹細胞は、全ての結合組織形成細胞系列、例えば脂肪組織に分化することができる。幹細胞は低侵襲手順により骨髄または体内の他の起源から入手することができ、培養において非常に拡張可能であり、確立した脂肪生成誘導サプリメントへの暴露後、脂肪組織形成細胞に分化するように容易に誘導することができる((Pittenger et al., Caplan, 2003)。
【０１５８】
１つの実施形態では幹細胞は骨髄細胞由来である。さらに、脂肪組織は、とりわけ豊富な幹細胞源である。ヒトおよび動物研究の両方において、処理された吸引脂肪組織（ＰＬＡ）は、少なくとも０．１％、より典型的には０．５％超の頻度で幹細胞を含む。場合によっては、約２−１２％の幹細胞を含むＰＬＡが得られる。ＰＬＡから得られた幹細胞の量は、骨髄からの１００，０００に１（０．００１％）の公開された頻度よりも実質的に大きいものとすることができる。さらに、脂肪組織の収集は、同様の体積の骨髄の収集よりも低い罹患率と関連する。さらに、脂肪組織は内皮前駆細胞を含み、これらは患者に治療を施すことができる。
【０１５９】
幹細胞源として使用される場合、脂肪組織は、当業者に知られている任意の方法により得ることができる。例えば、脂肪組織は、吸引援用造膣術、超音波援用造膣術、および切除脂肪吸引により患者から除去することができる。さらに、手順は、そのような手順の組み合わせを含むことができる。吸引援用造膣術は、脂肪組織を患者から除去するのに望ましい。というのも、幹細胞損傷の可能性が最初に抑えられ、他の技術、例えば超音波援用造膣術と組み合わせることができる、組織を収集する低侵襲方法を提供するからである。脂肪組織は、細胞構成要素の生存率を保存し、潜在的な感染性生物、例えば細菌および／またはウイルスによる組織の汚染の可能性を最小に抑えるように収集されるべきである。
【０１６０】
いくつかの用途では、活性細胞集団の調製は、脂肪組織の成熟脂肪蓄積脂肪細胞構成要素の欠乏が要求され得る。これは、典型的には、一連の洗浄および脱凝集工程により達成され、これらの工程では、組織を最初にすすぎ、遊離脂質（破裂した脂肪細胞から放出）および末梢血液要素（組織収集中に切断された血管から放出）の存在を減少させ、その後、脱凝集させ、無傷脂肪細胞および他の細胞集団を結合組織マトリクスから解放させる。
【０１６１】
脱凝集は任意の従来技術または方法、例えば、機械力（刻むまたはせん断力）、単一または組み合わせのタンパク質分解酵素、例えばコラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、リベラーゼＨ１およびペプシンによる酵素消化、または機械的および酵素方法の組み合わせにより達成することができる。例えば、無傷の組織断片の細胞構成要素は、当業者に知られているように、脂肪組織中の毛細血管内皮細胞を収集するための方法に類似する、脂肪組織のコラゲナーゼ媒介解離を用いる方法により脱凝集させることができる。使用することができるコラゲナーゼを使用する追加の方法はまた当業者に知られている。さらに、方法は酵素の組み合わせ、例えばコラゲナーゼおよびトリプシンの組み合わせまたは酵素、例えばトリプシン、と機械的解離の組み合わせを使用することができる。
【０１６２】
活性細胞集団（処理済み吸引脂肪組織）はその後、脱凝集された組織断片から、成熟脂肪細胞の存在を減少させることにより得ることができる。細胞の分離は、浮遊密度沈降、遠心分離、水簸、固相部分への接着およびそれからの溶離の差、抗体媒介選択、電荷の差；免疫磁気ビーズ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または他の手段により達成することができる。
【０１６３】
前記に加えて、活性細胞集団をさらに精製するために適用することができる多くの洗浄後方法が存在する。これらは両方のポジティブ選択（標的細胞の選択）、ネガティブ選択（不要な細胞の選択的除去）、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、細胞ペレットは再懸濁され、連続または不連続密度勾配となるように形成された流体材料上（または下）で層とされ、遠心分離機に入れられ、細胞密度に基づいて細胞集団が分離される。同様の実施形態では、連続流アプローチ、例えばアフェレーシスおよび水簸（向流ありまたはなし）を使用することができる。プラスチックへの接着後、短期間の細胞増殖もまた、骨髄由来成体幹細胞集団において適用されている。このアプローチは優先的に１つの集団を拡大させるが、他の集団は維持される（よって、増殖する選択された細胞による希釈のため減少する）または必要とされる増殖条件がないため失われる培養条件を使用する。濃縮され、培養されおよび／または拡大された活性細胞は、開示されるマトリクスに組み込むことができる。
【０１６４】
１つの実施形態では、幹細胞が収集され、収集された細胞は、脂肪生成培地と、脂肪細胞への分化を誘導するのに十分な時間接触され、脂肪細胞は、移植される生体適合性マトリクスに負荷される。追加の実施形態では、少なくともいくらかの幹細胞が脂肪細胞に分化され、よって両方の細胞型の混合物が最初に存在し、時間と共に変化し、実質的に脂肪細胞のみとなり、幹細胞は少量〜検出不能量で存在する。脂肪組織は、幹細胞によりインビボで作製され、またはエクスビボで幹細胞により調製される。
【０１６５】
細胞は開示されるファブリックと、様々な方法を用いてと統合することができる。例えば、ファブリックは、対象の細胞のための適切な増殖培地に浸し、その後、直接細胞に暴露することができる。細胞がファブリックの表面および隙間上で増殖される。その後、ファブリックは増殖培地から除去され、必要であれば洗浄され、移植される。また、細胞は好適な緩衝液または液体増殖培地に入れることができ、真空濾過を用いてファブリックを通して引き込むことができる。
【０１６６】
細胞はまた、ファブリックの前駆体と混合することができ、その後、ファブリックは細胞の周りに構築させることができ、少なくともいくらかの細胞がファブリックネットワーク内に捕獲される。
【０１６７】
１つの実施形態では、ファブリックは生体適合性および吸収性であり、骨髄および／または脂肪組織由来の幹細胞を含む。この実施形態はまた、ファブリック内に分散された脂肪生成作用物質を含むことができる。脂肪生成作用物質は、プログリタゾン（ｐｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、β−ファミリーの増殖因子、プロスタグランジン、シグリタゾン、デキサメタゾンまたはそれらの組み合わせとすることができるが、これらに限定されない。
【０１６８】
開示されるファブリックはまた、治療薬、または薬物、放出デポーとして使用することができる。開示されるファブリックと共に使用することができる異なる治療薬の種類は、膨大である。一般に、開示されるファブリックを介して投与することができる治療薬としては、下記が挙げられるが、これらに限定されない：抗拒絶反応薬、鎮痛薬、抗酸化剤、抗アポトーシス薬、例えばエリスロポエチン、抗炎症剤、例えば抗腫瘍壊死因子α、およびそれらの組み合わせ。
【０１６９】
そのような放出デポーを形成するために、ファブリックを形成する前に、絹フィブロインを治療薬と混合することができる。また、治療薬は、ファブリック上に、１つの実施形態では薬学的に許容される担体と共にコートさせることができる。治療薬は液体、微粉固体、または任意の他の適切な物理的形態として存在することができる。典型的には、しかしながら任意で、デポーは、１つ以上の添加物、例えば希釈剤、担体、賦形剤、安定剤などを含むことができる。
【０１７０】
治療薬の量は、使用される特定の作用物質および治療薬を提供する特定の目的に依存し得る。典型的には、作用物質の量は、デポーの約０．００１重量パーセント〜約７０重量パーセント、約０．００１重量パーセント〜約５０重量パーセント、または約０．００１重量パーセント〜約２０重量パーセントを表すことができる。治療薬送達デポー中に組み込まれるポリマーの量および型は、要求される放出プロファイルおよび使用される作用物質の量によって変化し得る。
【０１７１】
別の実施形態では、開示される細胞が播種されたファブリックは、徐々に分解し、同時に、分散された治療薬が持続したまたは延長された期間の間、放出される。これにより、例えば、約１〜約５，０００時間にわたる、または約２〜約８００時間にわたる、有効量、例えば約０．０００１ｍｇ／ｋｇ／時間〜約１０ｍｇ／ｋｇ／時間の治療薬の長期の送達が得られる。この剤形は、必要に応じ、目の前の特定の状況によって、投与することができる。このまたは同様の手順に従い、当業者は、様々な製剤を調製することができる。
【０１７２】
１つの実施形態では、ファブリックの構造は、組織内殖を促進するのに有効である。１つの実施形態では、ファブリックは、細胞がその中で増殖するのに十分なサイズの開口を有する。有効な開口サイズは、開口が約１０〜約１，０００μｍ、または約２０〜約９０μｍの範囲の平均直径を有するものである。
【０１７３】
１つの実施形態では、ファブリックは骨髄および／または脂肪組織由来の１つ以上の幹細胞、脂肪生成作用物質、栄養培地、任意で増殖因子、および少なくとも１つの抗生物質を含む。例示的な脂肪生成作用物質、栄養分および抗生物質としては、アンホテリシンＢ、シグリタゾン、ビオチン、デキサメタゾン、ゲンタマイシン、インスリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、Ｌ−チロキシンまたはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７４】
乳房手術におけるファブリックの使用
組織サポートおよび／または乳房再建のための足場として機能するように設計されたファブリックは、豊胸または乳房固定術を含む広範囲の手順で、例えば、例として、乳房リフト手順、豊胸手順、乳房切除後再建で使用することができる。
【０１７５】
本発明の１つの態様は、患者体内で乳房構造をサポートする方法における、本明細書で記載されるファブリックの使用に関する。方法は、患者体内の、乳房構造に対するサポート位置に（例えば、サポートおよび新しい組織内殖のための足場として構成された）ファブリックを配置することを含む。乳房構造は、天然乳房組織（例えば、乳腺）、または乳房プロステーシス（例えば、乳房インプラント）、またはその組み合わせを含み得る。一般的に、これは、ファブリック構造を、乳房組織を覆う皮膚と患者体内でサポートされる乳房組織および／または乳房インプラントの間の解剖学的位置に移植することを含む。皮膚とサポートされる組織の間の特定の位置（例えば、深さ）は、実際の手順によって変化し、熟練した実践者により決定することができる。１つの実施形態では、ファブリックの配置は、乳房領域の下側および外側セクションを被覆することを含む。１つの実施形態では、ファブリックは乳房の内側に挿入され、乳房および／またはインプラントの内側位置がサポートされ、乳房および／またはインプラントの内側変位が減少される。１つの実施形態では、ファブリックは、乳房の外側に挿入され、乳房および／またはインプラントの外側位置がサポートされ、乳房および／またはインプラントの外側変位が減少される。１つの実施形態では、ファブリックは、天然に乳房内の、そのようなサポート位置に存在する組織の１つ以上の生体力学特性を含む。そのような組織は、本明細書で記載される。
【０１７６】
手術道具として支持マトリクスを使用する方法は、当技術分野でよく知られており、熟練した実践者により本明細書で記載されるファブリックに適用することができる。ファブリックの移植は、典型的にはファブリック構造を挿入し、マトリクスを所望の位置に固定することを含む。そのような方法は、典型的には所望の位置に（例えば、乳房プロステーシス／乳房組織の下極をサポートするために、乳房の下側および外側セクションを横切って、または外側または内側変位を防止するために乳房の外側または内側に）マトリクスを固定することを含む。固定または付着は、当技術分野で知られている任意の好適な方法を使用して、例えば、縫合糸またはステープルの配置により、またはタッキング装置の使用により、達成され得る。移植手順中での、本明細書で記載されるファブリックの付着に適切な方法は、熟練した実践者により決定されるべきである。本明細書で記載されるファブリックは、骨（例えば、１つ以上の肋骨）、筋肉、または軟組織に付着させることができる。１つの実施形態では、ファブリックは、本明細書で記載される、乳房領域内の１つ以上の軟組織に付着される。様々な付着方法が当技術分野で知られており、例えば、縫合、ステープリング、接着、および定位置での配置が挙げられるが、これらに限定されない。様々な付着方法が米国特許第５，５８４，８８４号で記載される。
【０１７７】
付着の正確な位置は、実施される特定の手順により変化し、熟練した技術者により決定され得る。１つの実施形態では、ファブリックの付着または固定は患者の胸腔の周囲の組織に対して行われる。１つの実施形態では、付着または固定は患者体内の乳房組織および／またはプロステーシスインプラントの周囲の軟組織に対して行われる。ファブリックはまた患者体内の乳房組織および／またはプロステーシスインプラントに隣接する骨構造に付着または固定させることができる。
【０１７８】
熟練した実践者がファブリック構造を、患者体内の天然乳房組織および／またはプロステーシスインプラントの一領域、または少なくとも一部分に一致するように適合させた所定の形状に形成することは有利または必要である可能性がある。そのような有用な形状としては、円形形状、楕円形状、三日月形状、カップ形状、および細長いストリップが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７９】
本明細書で記載されるように、ファブリック構造を、細胞内殖を促進する１つ以上の作用物質で処理することは有利であり得る。
【０１８０】
豊胸
１つの実施形態では、本明細書で記載されるファブリックは、豊胸における手術道具として使用される。本明細書では、「豊胸」という用語は、乳房サイズを増加させることを示し、例えば、プロステーシスインプラントの挿入により一般に達成される。
【０１８１】
本発明のファブリックは、外科的切開部位（例えば、乳房インプラント挿入部位）で強度および被覆を提供することにより、創傷治癒および軟組織再建を促進するために使用することができる。これは、切開部位または軟組織再建／増強部位に即時強度を提供することができ、また、新しい組織内殖のための基質を提供することができる。１つの実施形態では、ファブリックは、切開部位の閉鎖および保護を提供するのに十分な強度を有する相互接続する細胞または線維性ネットワークを含む。
【０１８２】
１つの実施形態では、本明細書で記載されるファブリックは、乳房プロステーシスの配置または再配置において使用される。ファブリックは、例えば、乳房インプラントの下極位置をサポートするために使用することができ、または乳房インプラントの部分または完全被覆として使用することができる。ファブリック内のインプラントの被覆は、宿主組織との有利な界面を提供し位置異常または被膜拘縮の可能性を減少させる。インプラントの被覆はまた、インプラントへの組織癒着を減少させ、または防止する。最終的にファブリックは、浸潤組織に吸収され、とって代わられ得る。そのようなものとして、ファブリックは、それがもはや必要なくなるまで、一時的な足場および明確な構造を提供することができる。
【０１８３】
本発明のファブリックは、フォローアップ矯正手術において乳房インプラントを再配置するために使用することができ、または最初のインプラント配置時に、変位を防止するために予防的に使用することができる。ファブリックは、乳房インプラントを患者体内の所望の位置に配置するように構成され、移植され得る（例えば、完全に筋肉下、部分筋肉下、または腺下配置）。
【０１８４】
インプラントは典型的には胸部内の、３つの位置の１つに配置される：（１）大胸筋上および乳房組織下のインプラント（腺下）；（２）部分的に筋肉下のインプラント（部分筋肉下）；および（３）完全に筋肉下のインプラント（筋肉下）。腺下配置は、インプラントを直接乳房組織および乳腺の後、大胸筋の前に置く。この配置は、最も複雑でない手術を必要とするにすぎず、最速の回復が得られる。この配置の下側では、被膜拘縮の確率が増加し、インプラントに対する可視性および脆弱性が大きくなる。これは、皮膚および乳房組織のみが、インプラントを外界から分離しているからである。有効な乳房組織の量によって、インプラントは、皮膚を通して「波打って」見える。
【０１８５】
部分筋肉下配置は、インプラントを大胸筋下に置くことを含む。この筋肉の構造のために、インプラントは部分的に被覆されるのみである。この代替案は、被膜拘縮および目に見えるインプラントの波打ちを減少させるが、この配置からの回復時間は典型的には長く、より有痛性であり、というのも、外科医が手術中に筋肉を操作しなければならないからである。また、膨潤の増加のために、インプラントが手術後に天然位置に落ちるのにより長い時間がかかる可能性がある。完全筋肉下配置は、インプラントを胸部筋肉壁の後にしっかりと置く。インプラントは、大胸筋の後に、および支持筋膜（結合組織）および胸筋ではない筋肉群の全ての後に配置される。この配置は、いっそう長い回復時間、下極膨満の潜在的損失を有し、より外傷性の外科的手順を含む。
【０１８６】
インプラントの配置に関係なく、豊胸の場合、手術は長期瘢痕を最小に抑えるように配置された切開を介して実施される。切開は、３つの領域の１つに形成される：（１）乳輪周囲切開；（２）乳房下部ひだ切開；および（３）軸横断切開。乳輪周囲切開は、外科医に腺下、部分筋肉下または完全に筋肉下配置でインプラントを配置させることを可能にし、インプラントは切開を通して挿入され、または除去される。乳輪周囲切開のように、乳房下部ひだ切開は、３つ全ての配置型および切開を介したインプラントの挿入および除去の両方を提供する。切開は乳房下のヒダで実施され、目立たない瘢痕が可能になる。切開されるとすぐに、インプラントが挿入され、垂直に所定の位置まで動かされる。
【０１８７】
現在、美容または再建外科的手順の一部として、インプラントの位置を確実に維持する技術はほとんどない。インプラント位置異常は、いくつかの因子、外科的技術の低さ、すなわち、インプラントポケットが大きすぎるか、小さすぎる；インプラント重量；または軟組織サポートの欠如の結果である可能性がある。さらに、再建患者では、癌治療、例えば化学療法が軟組織を弱くし、手術は一般に、軟組織の天然の解剖学的平原を妨害する。これらの因子は、過剰量の重量を失った患者においてより重大である。そのような状況は、典型的には非常に悪い軟組織サポートを提供し、乳房内の通常のサポート構造、例えば乳房下部ひだは、インプラントの重量をサポートできない。
【０１８８】
１つの実施形態では、本明細書で記載されるファブリックは、患者体内の乳房インプラントの最初の配置のために患者体内に移植される。そのような実施形態では、ファブリックは、乳房インプラントを受理するための受理領域を形成するように構成され得る。ファブリックはさらに、組織付加のための１つ以上の領域を含み得る。領域の１つは、第１の縫合糸を用いて、または従来のもしくは内視鏡的タッキングにより、ファブリックを乳房インプラントの周囲の軟組織または患者体内の骨構造、例えば胸腔の骨膜に付着させるように適合させ得る。
【０１８９】
インプラント配置または再配置手順中、外科医は、ファブリックを挿入するために作られた最初の切開を使用して、インプラントをファブリックとアクセスさせて、配置することができるが、ただし、最初の切開は、乳輪周囲または乳房下部ひだ内であったことを条件とする。しかしながら、ある特定の状況では、例えば、最初の切開が軸横断位置にある場合、新しい切開を生成させることが必要である可能性がある。切開が作られた時点で、ファブリック（例えば、巻かれている）は、体内に切開を介して挿入され得る。ファブリックは遠位端に縫合糸またはタックを含むことができ、これは除去することができ、移植するのに望ましい位置に置かれた時点で、端が広げられ得る。
【０１９０】
本発明のファブリックは、患者体内に、治療される、または防止される特定の状況によって様々な配向で移植されるように構成することができる。例えば、インプラントの内側変位（シムマスチア（ｓｙｍｍａｓｔｉａ）)または外側変位を矯正するために使用される場合、ファブリックは、それぞれ、インプラントの内側または外側に実質的に垂直な位置に配置される。ファブリックがインプラントの下方変位（そうでなければ、当技術分野で知られている最低位）を矯正するために使用される場合、ファブリックは、実質的に水平位置で配置され、インプラントを下からサポートする。最初のインプラント配置手順中のファブリックの適正な位置決めはインプラントの周囲の組織構造およびインプラントの患者体内での望ましい配置に依存する。
【０１９１】
ファブリックの固定は、例えば、切開の位置によって、組織付加領域を介して重要な位置に永久的縫合糸を配置することにより、またはタッキング装置、従来または内視鏡的を使用することにより達成される。乳房下部ひだ切開はファブリックの定位置での縫合を必要とする可能性があり、乳輪周囲切開は内視鏡的タッキング装置の使用を可能にする。
【０１９２】
ファブリックがインプラントを固定し、またはその内側変位を防止するために垂直位置で配向される場合、ファブリックは組織付加領域で下記構造および軟組織の１つ以上に固定され得る：１）胸壁の骨膜に対する後壁、２）胸壁の胸骨境界線に対する第１および第２の部分の上部交差点、３）胸壁の胸骨に対する第１および第２の部分の下部交差点、および４）胸筋筋膜の後面に対する前壁上。
【０１９３】
乳房固定術（乳房リフト）
乳房固定術、または乳房リフトは、垂れ下がったまたは下垂乳房の外見を改善するように設計された手順である。乳房固定術は、乳房外科医に最も大きな挑戦の１つを提示する。多くの技術が乳房の形状の改善を提供しているが、美的改善は、瘢痕という代償を払って生じるものである。さらに、乳房固定術におけるインプラントの使用は、特定のリスクおよび合併症を与える。切開の形状および得られる瘢痕に基づき、４つの主な型の乳房リフトが存在し、三日月乳房固定術、ドーナツ乳房固定術、ロリポップまたは垂直乳房固定術およびアンカー乳房固定術である。
【０１９４】
三日月乳房固定術は、垂れ下がりが軽度で、過剰の乳房皮膚が乳房の上半分にあり、下半分の皮膚の量は正常である患者のためのものであり、半円切開が乳輪の上部に形成される。三日月形状の皮膚片を除去し、皮膚の縁が元通りに縫合されると、乳首および乳輪がわずかに（１〜２インチ）持ち上げられる。三日月乳房固定術は、乳房下垂（垂れ下がり）が軽度にすぎない女性にとって最良である。
【０１９５】
ドーナツ乳房固定術は、Ｂｅｎｅｌｌｉ乳房固定術または切開が乳輪の周囲にあるので乳輪周囲乳房固定術とも呼ばれ、ドーナツ乳房固定術は、乳輪の外側から皮膚の輪を除去する。縫合糸がその後、乳輪の周りに置かれ、皮膚が巾着縫合糸のように締められ乳房がリフトする。皮膚のしわが生じる可能性があり、通常、数ヶ月以内に自然に消散する。ドーナツ乳房固定術はまた、突出する乳首／乳輪コンプレックス（時として魚雷またはミサイル形状乳房と呼ばれる）を有する女性に有用であり、同時に乳輪のサイズを減少させるためにも使用することができる。
【０１９６】
ロリポップまたは垂直乳房固定術は、その名称が意味するように、ロリポップ乳房固定術のための切開が乳輪の周囲に、その後、乳房の中心を下に、乳房下部ひだまで形成される。この技術は、軽度〜中程度の乳房下垂のために使用される。乳輪周囲またはドーナツリフトと同様に、乳輪のサイズが同時に減少され得る。
【０１９７】
アンカー乳房固定術は、Ｗｉｓｅパターン（または時として、Ｗｅｉｓｓパターン）乳房固定術、完全乳房リフト、または反転−Ｔ切開とも呼ばれ、乳房リフトのための従来の技術であると考えられる。切開は乳輪の周囲に形成され、乳房の下側部分の中心を下がって、その後、乳房下部ひだ内で乳房を横切る。ドーナツおよびロリポップ切開のように、乳輪は同時により小さくすることができる。生じた瘢痕は、アンカー形状である。Ｗｉｓｅパターンまたはアンカー乳房固定術は標準として使用されてきたが、現在は通常、中程度〜重度の乳房の垂れ下がりを有するものに対してのみ予定される。
【０１９８】
乳房固定術は、乳房サイズの対応する変化(乳房縮小または豊胸)ありまたはなしで実施することができる。
【０１９９】
本明細書で記載されるファブリックは、これらの型の手順のいずれにおいても使用することができる。１つの実施形態では、本明細書で記載されるファブリックは、手順における創傷治癒および／または組織サポートを促進するために使用される。ファブリックはまた、既存の乳房組織を増大または置換するために使用することができる。
【０２００】
１つの実施形態では、ファブリックは、乳房容積を減少させるための方法において使用される。非制限的な例として、方法は下記のように実施することができる：
１．乳房上乳輪周囲に４つの点にマークをつけ、新しい乳房の外側皮膚ライニングおよび皮膚フラップを内側皮膚ライニングのために使用するために乳輪周囲領域の過剰の皮膚の両方のために必要な皮膚の量を決定する。
２．中央椎弓根を保持するためにフラップを上皮除去する。
３．乳房皮下を胸筋筋膜のレベルまで移動させる。
４．上半球で斜めに皮膚を切開し、皮膚に近い皮下脂肪組織の厚さを次第に増加させる。
５．中心楔の組織を切除し、上半球半直線を短くする。
６．皮膚を乳房の下半球の実質組織から切開する。
７．任意で下半球において第２の中心楔の組織を切除する。
８．適切な形状のファブリックを、下半球内の皮膚フラップ上に適用し、乳房の下側をつるす。
９．ファブリックを胸筋筋膜に縫合し、乳房円錐の上昇および形状を促進する。
１０．外側皮膚ライニングを縫合して閉じ、乳輪皮膚を外側皮膚ライニングに固定する。
１１．浸出液のドレナージを可能にするサポート様式で乳房に包帯を巻く。
【０２０１】
別の実施形態では、ファブリックは、乳房組織をリフトさせるための方法において使用される。非制限的な例として、方法は下記のように実施することができる：
１．乳房上乳輪周囲に４つの点にマークをつけ、新しい乳房の外側皮膚ライニングおよび皮膚フラップを内側皮膚ライニングのために使用するために乳輪周囲領域の過剰の皮膚の両方のために必要な皮膚の量を決定する。
２．中央椎弓根を保持するためにフラップを上皮除去する。
３．乳房皮下を胸筋筋膜のレベルまで移動させる。
４．上半球で斜めに皮膚を切開し、皮膚に近い皮下脂肪組織の厚さを次第に増加させる。
５．皮膚を乳房の下半球の実質組織から切開する。
６．適切な形状のファブリックを、下半球内の皮膚フラップ上に適用し、乳房の下側をつるす。
７．ファブリックを胸筋筋膜に縫合し、乳房円錐の上昇および形状を促進する。
８．外側皮膚ライニングを縫合して閉じ、乳輪皮膚を外側皮膚ライニングに固定する。
９．浸出液のドレナージを可能にするサポート様式で乳房に包帯を巻く。
【０２０２】
別の実施形態では、ファブリックは豊胸を伴う乳房固定術処置方法において使用される。非制限的な例として、方法は下記のように実施することができる：
１．乳房インプラントを、インプラントが大きく、垂れ下がり程度がより大きい場合筋肉下の筋肉下ポケット内に、または、インプラントが小さい場合乳腺下の腺下ポケット内に挿入する。
２．乳房上乳輪周囲に４つの点にマークをつけ、新しい乳房の外側皮膚ライニングおよび皮膚フラップを内側皮膚ライニングのために使用するために乳輪周囲領域の過剰の皮膚の両方のために必要な皮膚の量を決定する。
３．中央椎弓根を保持するためにフラップを上皮除去する。
４．乳房皮下を胸筋筋膜のレベルまで移動させる。
５．上半球で斜めに皮膚を切開し、皮膚に近い皮下脂肪組織の厚さを次第に増加させる。
６．皮膚を乳房の下半球の実質組織から切開する。
７．乳房固定プロステーシスを、下半球内の皮膚フラップ上に適用し、乳房の他の下側をつるす。
８．乳房固定プロステーシスを胸筋筋膜に縫合し、乳房円錐の上昇および形状を促進する。
９．外側皮膚ライニングを縫合して閉じ、乳輪皮膚を外側皮膚ライニングに固定する。
１０．浸出液のドレナージを可能にするサポート様式で乳房に包帯を巻く。
【０２０３】
乳房再建
乳房再建は、乳房切除後の乳房の再現である。乳房切除は限局性乳癌の最も一般的な処置である。乳房再建は乳房切除時に実施することができるが、より良好な候補は、癌の除去を確認したものである。というのは、時として、インプラント材料および再建は再発の検出を妨害するからである。再建は通常２部プロセスを含み、第１の一連の手術では、組織拡張器が皮膚および胸筋の真下に挿入される。拡張器は空気または生理食塩水が充填されたバルーンであり、これは何ヶ月かにわたって、追加の生理食塩水が定期的に注入され、皮膚および筋肉を徐々に伸長させる。皮膚および筋肉が十分伸ばされると、インプラント（生理食塩水またはシリコーン）が挿入され、天然乳房構造が再現される。しかしながら、インプラントを適正に保持するために、患者の組織の追加の切片、自家移植片、通常、広背筋または腹直筋が、乳房の外側に沿って使用されなければならない。自家移植片組織は組織罹患のリスクを有し、インプラントまたは拡張器の乳房切除ポケット内の筋肉組織による総被覆およびサポートは挑戦である。適切な被覆がないと、インプラントは露出し、美容的結果が減少する可能性がある。
【０２０４】
本明細書で記載されるファブリックは、手順において創傷治癒および／または組織サポートを促進するために使用することができる。ファブリックはまた、既存の乳房組織を増大または置換するために使用することができる。ファブリックはさらに、乳房再建手順において本明細書で記載されるようにインプラント配置において使用することができる。１つの実施形態では、本明細書で記載されるファブリックは乳房再建手順において自家移植片組織の補足として、またはその代わりに使用される（例えば、乳房下極でインプラントまたは拡張器を被覆および／またはサポートするため）。
【０２０５】
１つの実施形態では、本発明のファブリックは、乳房切除手術により弱まった乳房筋膜および／または軟組織に強度を提供するために使用される。乳房切除中、乳房下部ひだ中の浅筋膜系の多くが可能な限り保存される。一般に、Ｃｏｏｐｅｒ靱帯が手術過程で切断される。１つの実施形態では、本発明のファブリックは、乳房切除後乳房下部ひだを再作成するするために使用される。１つの実施形態では、本発明のファブリックは、乳房切除過程中に損傷される乳房下部ひだ組織の１つ以上の生体力学特性を有するように設計される。このファブリックは、損傷組織の位置に移植することができる。そのような移植されたファブリックは再建された乳房をサポートし、また、体内のその部位の新しい組織の生成のための足場として機能する。
【０２０６】
１つの実施形態では、本発明のファブリックは、大網フラップの代わりに、またはこれと組み合わせて、乳房切除後乳房再建において使用することができる。１つのそのような手順は、ＧｏｅｓおよびＭａｃｅｄｏにより記載される(The Surgery of the Breast, Principles and Art, Lippincott Williams & Wilkins, Second Edition, Chapter 52, pages 786-793, 2006)。
【０２０７】
１つの実施形態では、本明細書で記載される使用のためのファブリックまたはマトリクス、あるいはその一部は、被験体の体内に移植されると、移植部位で構造的サポートを提供しながら、細胞内殖を促進するように設計される。好ましくは、マトリクスは生体適合性である（例えば、弱い、一過性の異物反応のみを誘発し、抗原性応答はない）。ファブリックまたはその一部はさらに、生分解性である。１つの実施形態では、マトリクスは、内殖過程中十分無傷のままであり、構造的サポートを提供し続け、ある速度で分解し、よって、マトリクスからのサポートの減少が、細胞内殖から発生する組織により実質的にとって代わられるように設計される。分解速度は、発生する組織の強度および完全性に影響するであろう。
【０２０８】
当業者は、移植部位で組織が経験する生体力学的応力を考慮し、その情報を使用してマトリクスの様々な特性（例えば、構造、化学）を調整することにより適切なマトリクスを設計し、要求される構造的サポートを提供し、適切な組織発生のための適切な分解速度を達成することができる。本明細書で開示されるように、マトリクスの様々な態様が、生分解速度に寄与する。非制限的な例として、そのような特性としては、マトリクス構成要素（例えば、フィブロイン繊維対繊維複合体）およびフィブロイン繊維自体の完全性（例えば、セリシン抽出方法により影響される）、およびまた、マトリクスの幾何学構造が挙げられる。別のそのような特性は、細胞内殖に影響する修飾の有無である（例えば、フィブロイン繊維または他のマトリクス構成要素のＲＧＤによる表面修飾）。そのような修飾は、組織内殖速度を制御する、例えば、組織内殖を増強するために使用することができ、よって、新しい浸潤組織がマトリクスの吸収前に発生する。そのようなものとして、本発明の態様は、本明細書で記載される１つ以上の特性を有するファブリックを含み、所望の組織発生のために、適切な構造的サポートを提供し、さらに、移植部位で適切な生分解速度を示するように設計された、移植可能なプロステーシスに関する。
【０２０９】
本明細書で別記されない限り、本出願との関連で使用される科学および技術用語は、当業者により普通に理解される意味を有する。さらに、文脈により別に要求されない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。
【０２１０】
本発明は、本明細書で記載される特定の方法、プロトコル、および試薬、などに限定されず、そのようなものとして変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される術語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、本発明の範囲を制限することを意図せず、これは、特許請求の範囲によってのみ規定される。
【０２１１】
１つの態様では、本発明は、本発明に必須なものとして、本明細書で記載される組成物、方法、およびその個々の構成要素（複数可）に関するが、特定されていない要素を、本質的かどうかに関係なく包含する（「含む」）余地がある。いくつかの実施形態では、組成物、方法またはその個々の構成要素の記載において含まれる他の要素は、本発明の基本的および新規特性（複数可）に実質的に影響しないものに限られる（「から本質的に構成される」）。これは同様に、記載される方法内の工程ならびにその中の組成物および構成要素に当てはまる。他の実施形態では、本明細書で記載される本発明、組成物、方法、およびその個々の構成要素は、構成要素、組成物または方法にとって本質的な要素であると考えられない任意の要素を排除することを意図する（「から構成される」）。
【０２１２】
特定された全ての特許、特許出願、および出版物は、例えば、本発明と共に使用され得る、そのような出版物に記載される方法を記載し、開示するために、参照により本明細書に明確に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日前の開示目的のためだけに提供される。この点で、先行発明のおかげで、または任意の他の理由のために、発明者らはそのような開示に先行する権限が与えられたと承認されたと解釈されるべきではない。日付についての声明またはこれらの文書の内容についての表明は全て、出願人が入手可能な情報に基づき、これらの文書の日付または内容の正確さに関する承認を構成するものではない。
【０２１３】
本発明の追加の態様が、下記実施例においてさらに例示される。材料および方法の両方に対する多くの修飾が、本発明から逸脱せずに実施可能であることは、当業者には明らかであろう。
【実施例】
【０２１４】
第１の実施例では、図１Ａで示される生ボンビックスモリカイコ繊維を、抽出し、セリシン、天然絹フィブロインをコートする接着剤様タンパク質を除去した（図１Ａ−Ｃを参照されたい）。適切な繊維数／群を並列で配列させ、０．０２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３水溶液および０．３％（ｗ／ｖ）  ＩＶＯＲＹせっけん溶液中で６０分、９０℃で抽出し、その後、水で完全にすすぎ、接着剤様セリシンタンパク質を抽出した。
【０２１５】
３ストランド、らせん状ロープジオメトリに対するＣｏｓｔｅｌｌｏ式を導きだし、絹繊維ベースコンストラクトの機械的特性を予測した。導き出したモデルは一連の式であり、これらは組み合わされると、抽出された絹繊維材料特性および望ましい繊維コンストラクト幾何学的階層を考慮し、繊維コンストラクトの全体の強度および剛性を、所定のレベルの幾何学的階層に対するピッチ角の関数として計算する。
【０２１６】
単一の絹繊維の材料特性としては、繊維直径、弾性係数、ポアソン比、および最大引張強度（ＵＴＳ）が挙げられる。幾何学的階層は、所定の繊維コンストラクトレベルにおけるツイストレベルの数として規定され得る。各レベル（例えば、群、束、ストランド、コード、靱帯）は、さらに、互いについてツイストされた繊維の群の数およびツイストされた第１のレベルの各群における繊維数により規定され、ここで、第１のレベルは群として、第２のレベルは束として、第３はストランドとして、第４はコードとして、第５は靱帯として規定される。
【０２１７】
モデルは、複数の繊維の各群が、個々の繊維の数およびそれらの固有の半径により決定される有効半径を有する単一繊維として機能すると仮定する、すなわち、モデルは、比較的高いピッチ角が与えられると、その制限された役割のために、個々の繊維間の摩擦を考慮しない。
【０２１８】
天然ＡＣＬのものを模倣する機械的特性を得るように計算された多くの繊維コンストラクト幾何学的形態（表１０を参照されたい、上記）の２つの適用可能なジオメトリ（マトリクス１およびマトリクス２）をより詳細な分析のために引き出した。６コードコンストラクトを、ＡＣＬ置換として使用するために選択した。マトリクス構成は下記の通りとする：マトリクス１：１ＡＣＬプロステーシス＝６並列コード；１コード＝３ツイストストランド（３ツイスト／ｃｍ）；１ストランド＝６ツイスト束（３ツイスト／ｃｍ）；１束＝３０並列洗浄繊維；およびマトリクス２：１ＡＣＬマトリクス＝６並列コード；１コード＝３ツイストストランド（２ツイスト／ｃｍ）；１ストランド＝３ツイスト束（２．５ツイスト／ｃｍ）；１束＝３群（３ツイスト／ｃｍ）；１群＝１５並列抽出絹フィブロイン繊維。繊維数およびジオメトリは、絹プロステーシスがＵＴＳ、線形剛性、降伏点および破壊時の％伸長（表１０を参照されたい、上記）におけるＡＣＬ生体力学特性に類似し、よって、組織工学操作されたＡＣＬの発生のための固体開始点として機能するように選択した。
【０２１９】
絹フィブロインの機械的特性は、Ｆａｓｔ−Ｔｒａｃｋソフトウエアと共に油圧Ｉｎｓｔｒｏｎ  ８５１１張力／圧縮システム（Ｉｎｓｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｎｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を用いて、特徴付けした（図１Ｄを参照されたい）。単一の不全までの引っ張りおよび疲労分析を単一の絹繊維、抽出されたフィブロインおよび組織化されたコードに対して実施した。キャラクタリゼーションのために、繊維およびフィブロインを組織化し、マトリクス１（図２Ｃを参照されたい）およびマトリクス２（図２Ｄを参照されたい）の並列らせん状ジオメトリの両方にした。単一の不全までの引っ張り試験を、１００％／ｓｅｃのひずみ速度で実施し；力伸長ヒストグラムを作成し、データをＩｎｓｔｒｏｎ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＸソフトウエアを用いて分析した。マトリクス１およびマトリクス２の両方で、ＵＴＳ、線形剛性、降伏点および破壊時の伸長パーセントにおいてＡＣＬに類似する機械的および疲労特性が得られた（表１０および図３Ａ−Ｄを参照されたい）。
【０２２０】
疲労分析を、Ｗａｖｅｍａｋｅｒソフトウエアと共に油圧Ｉｎｓｔｒｏｎ  ８５１１張力／圧縮システムを用いて、マトリクス１およびマトリクス２の両方の単一コードに対して実施した。データを外挿して、６コードＡＣＬプロステーシスを表すようにし、これを図３Ｂおよび３Ｄに示す。コード端を、エポキシモールドに埋め込み、アンカー間３ｃｍ長のコンストラクトを生成させた。マトリクス１では、１，６８０Ｎおよび１，２００Ｎ（各荷重に対しｎ＝５）のＵＴＳ（図３Ｂを参照されたい）で、マトリクス２では２２８０Ｎ、２１００Ｎおよび１８００Ｎ荷重（各荷重に対しｎ＝３）のＵＴＳ（図３Ｄを参照されたい）での不全までのサイクルを、Ｗａｖｅｍａｋｅｒ３２バージョン６．６ソフトウエア（Ｉｎｓｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）により生成された１ＨｚでのＨ−正弦波関数を用いて決定した。疲労試験を中性リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液中、室温で実施した。
【０２２１】
ＳＥＭにより決定されるように完全セリシン除去が６０分９０℃で観察された（図１Ａ−Ｃを参照されたい）。セリシンの絹繊維からの除去は、繊維の超微細構造を変化させ、より滑らかな繊維表面となり、基礎をなす絹フィブロインが明らかになり（図１Ａ−Ｃに図示）、平均直径は２０−４０μｍの範囲であった。フィブロインは、最大引張強度において著しい１５．２％の減少を示した（１．０３３＋／−０．０４２Ｎ／繊維から０．８７６＋／−０．１Ｎ／繊維）（ｐ＜０．０５、対応スチューデントｔ−検定）（図１Ｄを参照されたい）。最適化絹マトリクスの機械的特性（図２Ａ−Ｄおよび図３Ａ−Ｄを参照されたい）を上記表１１および図３Ａ（マトリクス１）および図３Ｃ（マトリクス２）にまとめて示す。これらの結果から、最適化絹マトリクスは天然ＡＣＬに匹敵する値を示したことが明らかであり、それは約２１００Ｎの平均最大引張強度（ＵＴＳ）、約２５０Ｎ／ｎｍの剛性、降伏点約２１００Ｎおよび３３％破壊時伸長を有することが報告されている(Woo, SL-Y, et al., The Tensile Properties of Human Anterior Cruciate Ligament (ACL) and ACL Graft Tissue in Knee Ligaments: Structure, Function, Injury and Repair, 279-289, Ed. D. Daniel et al., Raven Press 1990を参照されたい)。
【０２２２】
マトリクス１に対しては図３Ｂおよびマトリクス２に対しては図３Ｄに示される繊維コンストラクト疲労データの回帰分析は、生理的荷重レベル（４００Ｎ）まで外挿すると、インビボでの不全までのサイクル数を予測し、マトリクス１では３３００万サイクルの繊維コンストラクト寿命、およびマトリクス２では１０００万サイクルを超える寿命を示す。洗浄された絹繊維を使用するらせん状繊維コンストラクト設計では、生理的に等価な構造特性を有する繊維コンストラクトが得られ、靱帯組織工学のための足場としての適合性が確認された。
【０２２３】
細胞単離および培養が関係する別の例では、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）、骨原性、軟骨形成、腱形成、脂肪生成および筋原性系列に分化することができる多能性細胞を選択した。というのは、適切な条件を形成させると、所望の靱帯線維芽細胞細胞株へのそれらの分化を誘導することができるからである(Markolf et al., J. Bone Joint Surg. 71A: 887-893, 1989; Caplan et al., Mesenchymal stem cells and tissue repair, The Anterior Cruciate Ligament: Current and Future Concepts, Ed. D. W. Jackson et al., Raven Press, Ltd, New York, 1993; Young et al., J. Orthopaedic Res. 16: 406-413, 1998)。
【０２２４】
ヒトＢＭＳＣを、商業的ベンダー（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）による少なくとも２５歳の同意したドナーの腸骨稜由来の骨髄から単離した。２２ｍｌのヒト骨髄を、無菌で３ｍｌのヘパリン化（１０００単位／ｍｌ）生理食塩水を含む２５ｍｌシリンジ中に吸引した。ヘパリン化骨髄溶液を骨髄間質細胞単離および培養のために研究室まで一晩中、氷上で輸送した。ベンダーから到着した時点で、２５ｍｌの吸引液を１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、および１ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に再懸濁させ、８−１０μｌの吸引液／ｃｍ２で組織培養フラスコ中に蒔いた。新しい培地を骨髄吸引液に１週間に２回、９日の培養まで添加した。ＢＭＳＣはそれらの組織培養プラスチックに接着する能力に基づいて選択した；非接着造血細胞を、９−１２日の培養後、培地置換中に除去した。培地をその後、１週間に２回交換した。初代ＢＭＳＣが約コンフルエントになると（１２−１４日）、それらを０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡを使用して脱離させ、５ｘ１０３細胞／ｃｍ２で再び蒔いた。第１継代（Ｐ１）ｈＢＭＳＣをトリプシン処理し、８％  ＤＭＳＯ／１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で将来使うために凍結させた。
【０２２５】
凍結Ｐ１  ｈＢＭＳＣを解凍し、５ｘ１０３細胞／ｃｍ２（Ｐ２）で再び蒔き、集密度付近でトリプシン処理し、繊維コンストラクト播種のために使用した。滅菌された（エチレンオキシド）絹マトリクス（特定的には、マトリクス１および２の単一コード、３０並列抽出絹繊維の束、およびコラージュ繊維のらせん状ロープ）に、Ｔｅｆｌｏｎブロックで機械加工され、細胞−培地体積が最小に抑えられ、細胞−繊維コンストラクト接触が増加するようにされた専用播種チャンバ（総体積１ｍｌ）中で細胞を播種した。播種されたマトリクスは、細胞スラリ（３．３ｘ１０６  ＢＭＳＣ／ｍｌ）を用いた４時間のインキュベーション期間後、適切な量の細胞培地を含むペトリ皿中に、実験期間の間、移動させた。
【０２２６】
絹フィブロインの分解速度を決定するために、最大引張強度（ＵＴＳ）を、生理的増殖条件、すなわち、細胞培地での培養期間の関数として測定した。長さ３ｃｍの３０並列絹繊維の群を抽出し、ｈＢＭＳＣで播種し、フィブロイン上で２１日にわたり３７℃、５％ＣＯ２で培養した。播種されていない対照群を並列で培養した。絹フィブロインＵＴＳを、播種された、および播種されていない群に対し、培養期間の関数として決定した。
【０２２７】
骨髄間質細胞の絹繊維コンストラクトへの応答もまた調べた。
【０２２８】
ＢＭＳＣは、絹およびコラーゲンマトリクスに、１日の培養後容易に付着し増殖し（図７Ａ−Ｃおよび図１６Ａを参照されたい）、細胞伸展を形成し、隣接繊維を架橋した。図７Ｄおよび図１６Ｂに示されるように、コンストラクトを被覆する均一な細胞シートがそれぞれ、１４および２１日の培養で観察された。ＭＴＴ分析から、１４日の培養後、播種されたＢＭＳＣによる完全な繊維コンストラクト被覆が確認された（図８Ａ−Ｂを参照されたい）。マトリクス１（図９Ａを参照されたい）およびマトリクス２（図９Ｂを参照されたい）上で増殖させた細胞の総ＤＮＡ定量化により、ＢＭＳＣは、絹コンストラクト上で増殖し、成長し、最高量のＤＮＡが、それぞれ、２１および１４日の培養後に測定されたことが確認された。
【０２２９】
ＢＭＳＣが播種された、または播種されていない、３０繊維の抽出された対照絹フィブロイン群の両方は、２１日にわたり、培養期間の関数として機械的完全性を維持した（図１０を参照されたい）。
【０２３０】
マトリクス２のコード上に播種されたＢＭＳＣのＲＴ−ＰＣＲ分析は、コラーゲンＩおよびＩＩＩはどちらも１４日の培養にわたり上方制御されたことを示した（図１４）。コラーゲンＩＩ型および骨シアロタンパク質（それぞれ、軟骨および骨特異的分化の指標として）はどちらも、培養期間にわたって検出されず、またはわずかしか発現されなかった。１４日での実時間定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨに対して正規化された、８．９：１のコラーゲンＩ対コラーゲンＩＩＩの転写比が得られた（図１７を参照されたい）。コラーゲンＩ対コラーゲンＩＩＩの高い比は、応答が創傷治癒または瘢痕組織形成ではなく（高レベルのコラーゲンＩＩＩ型で観察される）、むしろ靱帯特異的であることを示し；天然ＡＣＬにおけるコラーゲンＩ対コラーゲンＩＩＩの相対比は約６．６：１である(Amiel et al., Knee Ligaments: Structure, Function, Injury, and Repair, 1990)。
【０２３１】
さらに、バイオリアクターシステムにおける骨髄間質細胞からの靱帯形成への、誘導された多次元機械的刺激の影響を理解するために研究が実施されている。バイオリアクターは、独立して、しかし同時に繰り返し多次元歪み（例えば、並進、回転）を発生する靱帯に適用することができる。７〜１４日の静的静止期間（播種後の時間）後、回転および並進ひずみ速度ならびに線形および回転変形を１〜４週間一定に維持する。並進歪み（３．３％−１０％、１−３ｍｍ）および回転歪み（２５％、９０°）を同時に、０．０１６７Ｈｚの周波数で（１つの完全サイクルの応力および緩和／分）ＢＭＳＣが播種された絹ベースマトリクスに適用する；播種されたマトリクスを有するが機械的荷重はない、その他は同一の組のバイオリアクターは対照として機能する。靱帯は、一定の繰り返し歪みに、実験日の期間の間暴露される。
【０２３２】
培養期間後、靱帯試料、機械的に誘発された、および対照（静的）の両方を下記に対し特徴付ける：（１）一般的な組織形態学的外観（目視検査による）；（２）細胞分布（組織およびＭＴＴ染色切片の画像処理）；（３）細胞形態および配向（組織分析）；ならびに（４）組織特異的マーカーの生成（ＲＴ−ＰＣＲ、免疫染色）。
【０２３３】
機械的刺激は、ＢＭＳＣおよび新しく発生した細胞外繊維コンストラクトの形態および組織化、繊維コンストラクトに沿った細胞の分布、および靱帯−特異的分化カスケードの上方制御に著しく影響する；ＢＭＳＣは繊維の長軸に沿って整列し、靱帯／腱線維芽細胞に類似する球状形態を呈し、靱帯／腱特異的マーカーを上方制御する。新しく形成された細胞外繊維コンストラクト（すなわち、細胞により生成されるタンパク質の組成物）は、荷重線および繊維コンストラクトの長軸に沿って整列すると予測される。誘導された機械的刺激は、新規絹ベース繊維コンストラクト上に播種されたＢＭＳＣから得られる、バイオリアクターにおけるインビトロでの靱帯発生および形成を増強させることが予測される。細胞および新しく形成された繊維コンストラクトの長軸配向は、ＡＣＬ内でインビボで見られる靱帯線維芽細胞に類似する(Woods et al., Amer. J. Sports Med. 19: 48-55, 1991)。さらに、機械的刺激は、コラーゲンＩ型転写物とコラーゲンＩＩＩ型転写物の間の正確な発現比（例えば、７：１超）を維持し、瘢痕組織形成に対する新しく形成された靱帯組織の存在が示される。上記結果は、機械的装置およびバイオリアクターシステムが、骨髄間質細胞および新規絹ベース繊維コンストラクトから開始する組織工学操作された靱帯のインビトロ形成のための好適な環境（例えば、多次元歪み）を提供することを示す。
【０２３４】
これらの予備実験で使用される培養条件はさらに、潜在的な臨床用途のための天然ＡＣＬの機能的な等価物のインビトロ作製のために、靱帯の生理環境（例えば、異なる型の機械力の増加）をより正確に反映するように拡張することができる。これらの方法は、生体工学操作されたＡＣＬの生成に限定されない。インビボで経験される適切な大きさおよび種類の力を適用することにより、体内の任意の型の靱帯および他の型の組織がエクスビボで本開示の方法で生成させることができる。
【０２３５】
他の実施形態は下記特許請求の範囲内にある。
【表１】
2013533761.tif 000003
【０２３６】
【表２】
2013533761.tif 000004
【０２３７】
【表３】
2013533761.tif 000005
【０２３８】
【表４−１】
2013533761.tif 000006
【０２３９】
【表４−２】
2013533761.tif 000007
【０２４０】
【表５】
2013533761.tif 000008
【０２４１】
【表６】
2013533761.tif 000009
【０２４２】
【表７】
2013533761.tif 000010
【０２４３】
【表８】
2013533761.tif 000011
【０２４４】
【表９】
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【０２４５】
【表１０】
2013533761.tif 000013
【０２４６】
【表１１】
2013533761.tif 000014
注：マトリクス１および２は、実施例で示されるように発生された；マトリクス３では、単一束プロステーシス、マトリクス４では、２ストランドプロステーシス、マトリクス５では３コードプロステーシス、マトリクス６では、６コードプロステーシスの別のバリエーション、およびマトリクス７では１２コードプロステーシスが得られる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2013533761.tif 000025
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
2013533761.tif 000046
【図１１Ｂ】
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【図１２】
2013533761.tif 000048
【図１３Ａ】
2013533761.tif 000049
【図１３Ｂ】
2013533761.tif 000050
【図１３Ｃ】
2013533761.tif 000051
【図１３Ｄ】
2013533761.tif 000052
【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
2013533761.tif 000055
【図１５Ｂ】
2013533761.tif 000056
【図１６Ａ】
2013533761.tif 000057
【図１６Ｂ】
2013533761.tif 000058
【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
2013533761.tif 000062
【図１８Ｃ】
2013533761.tif 000063
【図１９Ａ−１９Ｄ】
2013533761.tif 000064
【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
2013533761.tif 000069
【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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2013533761.tif 000079
2013533761.tif 000080
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