(57)【要約】本発明は、保存安定性抗ＴＮＦＲ１抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂ）、アンタゴニスト及び多重特異性リガンド、並びに方法及びこれらの使用に関する。抗ＴＮＦＲ１ポリペプチド、抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂ）、アンタゴニスト及び多重特異性リガンドは、関節炎又はＣＯＰＤ等の炎症性疾患の治療及び／又は予防に加えて、肺投与、経口投与、肺への送達、及び患者のＧＩ管への送達にも有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８、又は９９％同一である（又は１００％同一である）アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、４０℃で４０時間ＰＢＳ中にてインキュベートした後＜１．０、＜０．９、＜０．８、＜０．７、＜０．６、＜０．５又は＜０．４のＯＤ３２０を有する、免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインと、任意で、血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインとを含む、多重特異性リガンド。
【請求項３】
（ｉ）請求項１に記載の抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインと、（ｉｉ）血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ７ｈ−１１−３の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一である（又は１００％同一である）アミノ酸配列を含む抗ＳＡ単一可変ドメインとを含み、（ｉｉｉ）任意で、前記抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと前記抗ＳＡ単一可変ドメインとの間にリンカーが設けられる、請求項２に記載の多重特異性リガンド。
【請求項４】
前記リンカーが、アミノ酸配列ＡＳＴ（任意でＡＳＴＳＧＰＳ）を含むか、又は前記リンカーがＡＳ（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、又は８である）、例えば、ＡＳ（Ｇ４Ｓ）３である、請求項３に記載のリガンド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単一可変ドメイン又は多重特異性リガンドを含む、ＴＮＦＲ１アンタゴニスト。
【請求項６】
経口送達、患者のＧＩ管への送達、肺送達、患者の肺への送達、又は全身送達のための請求項５に記載のＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
【請求項７】
炎症性病状を治療及び／又は予防するための請求項５又は６に記載のＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニスト。
【請求項８】
炎症性病状を治療及び／又は予防するための薬剤の製造における請求項５又は６に記載のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用。
【請求項９】
請求項５又は６に記載のアンタゴニストを患者に投与することを含む、患者における炎症性病状を治療及び／又は予防する方法。
【請求項１０】
ＤＭＳ５５３５、ＤＭＳ５５４１、ＤＭＳ５５４２又はＤＭＳ５５４４を含むか又はそれからなる多重特異性リガンド。
【請求項１１】
ＤＭＳ５５３５、ＤＭＳ５５４１、ＤＭＳ５５４２又はＤＭＳ５５４４のヌクレオチド配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％同一である（又は１００％同一である）ヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ヌクレオチド配列が、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のヌクレオチド配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％同一である（又は１００％同一である）核酸。
【請求項１４】
請求項１１、１２、又は１３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞（任意で、非ヒト胚細胞）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍壊死因子１（ＴＮＦＲ１、ｐ５５、ＣＤ１２０ａ、Ｐ６０、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）ポリペプチド、免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメイン及びこれらを含むアンタゴニストに関する。本発明は、更に、このような抗ＴＮＦＲ１リガンドを含むか又は用いる方法、使用、製剤、組成物、及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦＲ１
ＴＮＦＲ１は、リガンドに結合する細胞外領域と、固有のシグナル伝達活性は欠いているがシグナル伝達分子に会合することができる細胞内ドメインとを含有する膜貫通受容体である。ＴＮＦＲ１と、結合しているＴＮＦとの複合体は、３本のＴＮＦＲ１鎖及び３本のＴＮＦ鎖を含有する（Ｂａｎｎｅｒら，Ｃｅｌｌ，７３（３）４３１−４４５（１９９３年））。ＴＮＦリガンドは、３本のＴＮＦＲ１鎖によって結合されているトリマーとして存在する（Ｂａｎｎｅｒら，Ｃｅｌｌ，７３（３）４３１−４４５（１９９３年））。３本のＴＮＦＲ１鎖は、受容体−リガンド複合体において緊密にクラスタを形成しており、このクラスタ形成がＴＮＦＲ１媒介シグナル伝達にとって必須である。実際には、抗ＴＮＦＲ１抗体等のＴＮＦＲ１に結合する多価剤は、ＴＮＦが存在しなくてもＴＮＦＲ１のクラスタ形成及びシグナル伝達を誘導することができ、一般的にはＴＮＦＲ１アゴニストとして用いられる（例えば、Ｂｅｌｋａら，ＥＭＢＯ，１４（６）：１１５６−１１６５（１９９５年）；Ｍａｎｄｉｋ−Ｎａｙａｋら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６７：１９２０−１９２８（２００１年）を参照されたい）。したがって、ＴＮＦＲ１に結合する多価剤は、一般的に、ＴＮＦαのＴＮＦＲ１への結合をブロックする場合でさえも、ＴＮＦＲ１の有効なアンタゴニストではない。
【０００３】
この段落に示す配列番号は、国際公開第ＷＯ２００６０３８０２７号パンフレットで用いられている番号を指す。ＴＮＦＲ１の細胞外領域は、１３アミノ酸のアミノ末端セグメント（配列番号６０３（ヒト）のアミノ酸１−１３；配列番号６０４（マウス）のアミノ酸１−１３）、ドメイン１（配列番号６０３（ヒト）のアミノ酸１４−５３；配列番号６０４（マウス）のアミノ酸１４−５３）、ドメイン２（配列番号６０３（ヒト）のアミノ酸５４−９７；配列番号６０４（マウス）のアミノ酸５４−９７）、ドメイン３（配列番号６０３（ヒト）のアミノ酸９８−１３８；配列番号６０４（マウス）のアミノ酸９８−１３８）及び膜近位領域（配列番号６０３（ヒト）のアミノ酸１６８−１８２；配列番号６０４（マウス）のアミノ酸１６８−１８３）に続くドメイン４（配列番号６０３（ヒト）のアミノ酸１３９−１６７；配列番号６０４（マウス）のアミノ酸１３９−１６７）を含む（Ｂａｎｎｅｒら，Ｃｅｌｌ，７３（３）４３１−４４５（１９９３年）及びＬｏｅｔｓｃｈｅｒら，Ｃｅｌｌ  ６１（２）３５１−３５９（１９９０年）を参照されたい）。ドメイン２及び３は、結合しているリガンド（ＴＮＦβ、ＴＮＦα）と接触する。（Ｂａｎｎｅｒら，Ｃｅｌｌ，７３（３）４３１−４４５（１９９３年））。また、ＴＮＦＲ１の細胞外領域は、プレリガンド結合アセンブリドメイン、すなわちＰＬＡＤドメイン（配列番号６０３（ヒト）のアミノ酸１−５３；配列番号６４（マウス）のアミノ酸１−５３）と呼ばれる領域を含有する（国際公開第ＷＯ０１／５８９５３号パンフレット（米国政府）；Ｄｅｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ１３０４（２００５年））。
【０００４】
ＴＮＦＲ１は、ドメイン４又は膜近位領域（配列番号６０３のアミノ酸１６８−１８２；配列番号６０４のアミノ酸１６８−１８３）におけるＴＮＦＲ１のタンパク質分解を含むプロセスを通してインビボにおいて細胞の表面から脱落して、可溶型のＴＮＦＲ１が生じる。可溶性ＴＮＦＲ１は、ＴＮＦαに結合する能力を保持しているので、ＴＮＦαの活性の内因性阻害剤として機能する。
【０００５】
国際公開第ＷＯ２００６０３８０２７号パンフレット、国際公開第ＷＯ２００８１４９１４４号パンフレット、国際公開第ＷＯ２００８１４９１４８号パンフレットは、抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメイン及びこれを含むアンタゴニストについて開示している。また、これら文書は、ＴＮＦαの媒介する病状の治療及び／又は予防のためのこのようなドメイン及びアンタゴニストの使用について開示している。保存安定性の改善された抗ヒトＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、リガンド、及びこれらを含む製品を提供することが望ましい。これらの目的は、サンプル中のヒトＴＮＦＲ１を検出するための改善された診断試薬、これに加えて又はこれに代えて、ヒト又は他の哺乳類におけるＴＮＦＲ１の媒介する病状及び疾患を治療及び／又は予防するための改善された療法を提供することである。ＴＮＦＲ１、特にヒトＴＮＦＲ１の強力な中和剤である抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、リガンド、及びこれらを含む製品を提供することが特に望ましい。
【０００６】
本発明の様々な態様は、これら望ましい特徴を満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又は  ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８、又は９９％同一である（又は１００％同一である）アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、４０℃で４０時間ＰＢＳ中にてインキュベートした後＜１．０、＜０．９、＜０．８、＜０．７、＜０．６、＜０．５又は＜０．４のＯＤ３２０を有する単一可変ドメインを提供する。
【０００８】
１つの実施形態では、前記単一可変ドメインは、以下の試験によって測定したとき＜１．０、＜０．９、＜０．８、＜０．７、＜０．６、＜０．５、又は＜０．４のＯＤ３２０を有する：
ａ）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中１ｍｇ／ｍＬの単一可変ドメイン１００μＬをＰＣＲプレートに分配する；
ｂ）前記プレートを４０℃で４０時間インキュベートする；そして、
ｃ）５０μＬのアリコートを取り出し、例えば、マイクロプレートリーダー（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製のもの）においてＯＤ３２０を測定する。
【０００９】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８又は９９％同一である（又は１００％同一である）アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００１０】
１つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３及びＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４から選択されるアミノ酸配列と同一であるか、又は前記選択されたアミノ酸配列と比べて１若しくは２つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００１１】
１つの態様では、本発明は、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記可変ドメインが、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８又は９９％同一である（又は１００％同一である）アミノ酸配列を含む核酸を提供する。
【００１２】
１つの態様では、本発明は、抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記核酸配列が、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のヌクレオチド配列と少なくとも７０、７５、８０、７５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％同一である（又は１００％同一である）核酸を提供する。
【００１３】
１つの態様では、本発明は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインと、任意で、血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインとを含む多重特異性リガンドに関する。１つの実施形態では、多重特異性リガンドは、本明細書に開示する「ＤＭＳ」と名付けられた任意のコンストラクト、例えば、ＤＭＳ５５３５、５５４１、５５４２及び５５４４のうちの任意の１つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列であるか、又は前記アミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、多重特異性リガンドは、本明細書に開示される任意のＤＭＳのヌクレオチド配列、例えば、ＤＭＳ５５３５、５５４１、５５４２及び５５４４のヌクレオチド配列のうちの任意の１つによってコードされているアミノ酸配列であるか、又は前記アミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、本発明は、抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメイン及び抗ＳＡ単一可変ドメインを含む多重特異性リガンドをコードする核酸であって、本明細書に開示する任意のＤＭＳのヌクレオチド配列、例えば、ＤＭＳ５５３５、５５４１、５５４２及び５５４４のヌクレオチド配列のうちの任意の１つを含む核酸を提供する。このような核酸を含むベクター、及びこのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。
【００１４】
１つの態様では、本発明は、（ｉ）ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８又は９９％同一である（又は１００％同一である）アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインと、（ｉｉ）血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ７ｈ−１１−３の配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む抗ＳＡ単一可変ドメインとを含み、（ｉｉｉ）任意で前記抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと前記抗ＳＡ単一可変ドメインとの間にリンカーが設けられる多重特異性リガンドを提供する。
【００１５】
１つの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＡＳＴ、任意でＡＳＴＳＧＰＳを含む。あるいは、前記リンカーは、ＡＳ（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎは、２、３、４、５、６、７又は８である）、例えばＡＳ（Ｇ４Ｓ）３である。
【００１６】
１つの態様では、本発明は、本発明の任意の前述の態様の単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は多重特異性リガンドを含むＴＮＦＲ１アンタゴニストを提供する。
【００１７】
１つの態様では、本発明は、経口送達、患者のＧＩ管への送達、肺送達、患者の肺への送達、又は全身送達のために、本発明のＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストを提供する。
【００１８】
１つの態様では、本発明は、炎症性病状を治療及び／又は予防するための本発明のＴＮＦＲ１アンタゴニストを提供する。
【００１９】
１つの態様では、本発明は、炎症性病状を治療及び／又は予防するための薬剤の製造における本発明のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用を提供する。
【００２０】
本発明の別の態様は、ＤＭＳ５５３５、５５４１、５５４２及び５５４４を含むか又はこれらからなる多重特異性リガンドを提供する。本発明の態様は、いずれかの多重特異性リガンドをコードする核酸を提供する。本発明の別の態様は、ＤＭＳ５５３５、５５４１、５５４２又は５５４４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。更に、本発明は、前記核酸を含むベクター、及び前記ベクターを含む宿主、任意で非ヒト胚細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１．安定性についての選択から得られ、特性評価のために精製されたｄＡｂのアミノ酸配列のアラインメント。前記配列は、安定性についての選択のための出発ｄＡｂとして用いられるものの代表的なｄＡｂであるＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６に対してアラインメントされる。特定の位置における「．」は、その位置においてＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６でみられるものと同じアミノを示す。ＣＤＲは、下線及び太字によって示される（最初の下線配列はＣＤＲ１であり、２番目の下線配列はＣＤＲ２であり、３番目の下線配列はＣＤＲ３である）。
【図１Ｂ】図１Ａの続きである。
【図１Ｃ】図１Ｂの続きである。
【図１Ｄ】図１Ｃの続きである。
【図１Ｅ】図１Ｄの続きである。
【図１Ｆ】図１Ｅの続きである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書中では、本発明は、記載される説明を明確且つ簡潔にすることができる方法で、実施形態を参照して記載される。実施形態は、本発明から逸脱することなく様々に組合せたり分離したりできることを意図し、またそのように理解されるべきである。
【００２３】
特に定義しない限り、本発明で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術、及び生化学の）当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。分子遺伝学及び生化学的方法（一般的に、参照することによって本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版．（１９８９年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９年）第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい）及び化学的方法の標準的な技術が用いられる。
【００２４】
本明細書に記載される免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含有する。ＣＤＲ及びフレームワーク（ＦＲ）領域の位置、並びに番号付けシステムは、Ｋａｂａｔらにより定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１年）））。本明細書に記載されるＶＨ及びＶＬ（ＶＫ）ｄＡｂのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）のアミノ酸配列は、周知のＫａｂａｔのアミノ酸番号付けシステム及びＣＤＲの定義に基づいて当業者に容易に明らかになるであろう。Ｋａｂａｔの番号付けシステムによれば、重鎖ＣＤＲ−Ｈ３は、様々な長さを有し、挿入物は、Ｋまでの文字を用いて残基Ｈ１００とＨ１０１との間で番号付けされる（すなわち、Ｈ１００、Ｈ１００Ａ・・・Ｈ１００Ｋ、Ｈ１０１）。あるいは、ＣＤＲは、ＡｂＭに従って、又は以下のようなＣｏｎｔａｃｔ法に従って、Ｃｈｏｔｈｉａのシステム（Ｃｈｏｔｈｉａら，（１９８９年）Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ；Ｎａｔｕｒｅ３４２，ｐ８７７−８８３）を用いて求めることもできる。ＣＤＲを求めるための好適な方法についてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照されたい。
【００２５】
各残基が番号付けされたら、次いで、以下のＣＤＲの定義を適用することができる（「−」は、Ｋａｂａｔについて示されるのと同じ残基番号を意味する）。
【００２６】
Ｋａｂａｔ−配列の変動に基づく最も一般的に用いられる方法
（Ｋａｂａｔの番号付けを用いて）：
ＣＤＲ  Ｈ１：３１−３５／３５Ａ／３５Ｂ
ＣＤＲ  Ｈ２：５０−６５
ＣＤＲ  Ｈ３：９５−１０２
ＣＤＲ  Ｌ１：２４−３４
ＣＤＲ  Ｌ２：５０−５６
ＣＤＲ  Ｌ３：８９−９７
Ｃｈｏｔｈｉａ−構造的ループ領域の位置に基づく
（Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けを用いて）
ＣＤＲ  Ｈ１：２６−３２
ＣＤＲ  Ｈ２：５２−５６
ＣＤＲ  Ｈ３：９５−１０２
ＣＤＲ  Ｌ１：２４−３４
ＣＤＲ  Ｌ２：５０−５６
ＣＤＲ  Ｌ３：８９−９７
ＡｂＭ−ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの折衷案
（Ｋａｂａｔの番号付けを用いて）：          （Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けを用いて）
ＣＤＲ  Ｈ１：２６−３５／３５Ａ／３５Ｂ  ２６−３５
ＣＤＲ  Ｈ２：５０−５８                  −
ＣＤＲ  Ｈ３：９５−１０２                −
ＣＤＲ  Ｌ１：２４−３４                  −
ＣＤＲ  Ｌ２：５０−５６                  −
ＣＤＲ  Ｌ３：８９−９７                  −
Ｃｏｎｔａｃｔ−結晶構造及び抗原との接触残基の予測に基づく
（Ｋａｂａｔの番号付けを用いて）：          （Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けを用いて）
ＣＤＲ  Ｈ１：３０−３５／３５Ａ／３５Ｂ  ３０−３５
ＣＤＲ  Ｈ２：４７−５８                  −
ＣＤＲ  Ｈ３：９３−１０１                −
ＣＤＲ  Ｌ１：３０−３６                  −
ＣＤＲ  Ｌ２：４６−５５                  −
ＣＤＲ  Ｌ３：８９−９６                  −
本発明で使用する用語「腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１）のアンタゴニスト」又は「抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト」等は、ＴＮＦＲ１に結合し、ＴＮＦＲ１の（すなわち１以上の）機能を阻害することができる剤（例えば分子、化合物）を指す。例えば、ＴＮＦＲ１のアンタゴニストは、ＴＮＦαのＴＮＦＲ１への結合を阻害することができる及び／又はＴＮＦＲ１を通じて媒介されるシグナル伝達を阻害することができる。したがって、ＴＮＦＲ１の媒介するプロセス及び細胞応答（例えば、標準的なＬ９２９細胞毒性アッセイにおけるＴＮＦα誘導性細胞死）は、ＴＮＦＲ１のアンタゴニストを用いて阻害することができる。
【００２７】
本発明で使用する「ペプチド」は、ペプチド結合を介して互いに接合される約２〜約５０個のアミノ酸を指す。
【００２８】
本発明で使用する「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して互いに接合される少なくとも約５０個のアミノ酸を指す。ポリペプチドは、一般的に、三次構造を含み、機能的ドメインに折り畳まれる。
【００２９】
本発明で使用する「プロテアーゼ分解に対して耐性である」ペプチド又はポリペプチド（例えば、ドメイン抗体（ｄＡｂ））は、プロテアーゼ活性に好適な条件下でプロテアーゼと共にインキュベートしたとき、プロテアーゼによって実質的に分解されない。ポリペプチド（例えばｄＡｂ）は、プロテアーゼ活性に好適な温度、例えば、３７又は５０℃で約１時間プロテアーゼと共にインキュベートした後、プロテアーゼによって分解されるタンパク質が、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１４％以下、約１３％以下、約１２％以下、約１１％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下であるか、又はタンパク質が実質的に全く分解されない場合、実質的に分解されない。タンパク質分解は、本明細書に記載される任意の好適な方法、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は機能アッセイ（例えば、リガンド結合）を用いて評価することができる。
【００３０】
本発明で使用する「ディスプレイシステム」は、ポリペプチド又はペプチドのコレクションを物理的、化学的、又は機能的な特徴等の所望の特徴に基づいて選択しやすい系を指す。ディスプレイシステムは、（例えば、溶液中の、好適な支持体に固定化されている）ポリペプチド又はペプチドの好適なレパートリーであってもよい。また、ディスプレイシステムは、細胞発現系（例えば、形質転換された、感染した、トランスフェクトされた、又は形質導入された細胞における核酸のライブラリの発現、及びコードされているポリペプチドの細胞の表面におけるディスプレイ）を使用する系であってもよく、無細胞発現系（例えば、エマルションコンパートメンタリゼーション及びディスプレイ）を使用する系であってもよい。代表的なディスプレイシステムは、核酸のコード化機能と、前記核酸によってコードされているポリペプチド又はペプチドの物理的、化学的、及び／又は機能的特徴とを関連づける。このようなディスプレイシステムを使用すると、所望の物理的、化学的、及び／又は機能的特徴を有するポリペプチド又はペプチドを選択することができ、選択されるポリペプチド又はペプチドをコードする核酸を容易に単離又は回収することができる。核酸のコード化機能と、前記核酸によってコードされているポリペプチド又はペプチドの物理的、化学的、及び／又は機能的特徴とを関連づける多くのディスプレイシステムが当技術分野において公知であり、例えば、バクテリオファージディスプレイ（ファージディスプレイ、例えば、ファージミドディスプレイ）、リボソームディスプレイ、エマルションコンパートメンタリゼーション及びディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミドにおけるディスプレイ、共有ディスプレイ等である。（例えば、欧州特許第０４３６５９７号明細書（Ｄｙａｘ）、米国特許第６，１７２，１９７号明細書（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら）、米国特許第６，４８９，１０３号明細書（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら）を参照されたい）。
【００３１】
本発明で使用する「レパートリー」は、アミノ酸配列の多様性を特徴とするポリペプチド又はペプチドのコレクションを指す。レパートリーの個々のメンバーは、共通の構造上の特徴（例えば共通のコア構造構造）及び／又は共通の機能的特徴（例えば共通のリガンド（例えば、ジェネリックリガンド又は標的リガンド、ＴＮＦＲ１）に結合する能力）等の共通の特徴を有することができる。
【００３２】
本発明で使用する「機能的」とは、特異的結合活性等の生物活性を有するポリペプチド又はペプチドを説明する。例えば、用語「機能的ポリペプチド」は、その抗原結合部位を通して標的抗原に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
【００３３】
本発明で使用する「ジェネリックリガンド」は、所与のレパートリーの機能的なメンバーの実質的な部分（例えば、実質的に全て）に結合するリガンドを指す。ジェネリックリガンド（例えば、共通のジェネリックリガンド）は、メンバーが共通の標的リガンドに対する結合特異性を有していない可能性がある場合でさえも、所与のレパートリーの多くのメンバーに結合することができる。一般に、（ジェネリックリガンドに結合する能力によって示される通り）ポリペプチドに機能的ジェネリックリガンド結合部位が存在することは、ポリペプチドが正確に折り畳まれ、機能することを示す。ジェネリックリガンドの好適な例としては、超抗原、レパートリーの機能メンバーの実質的な部分において発現するエピトープに結合する抗体等が挙げられる。
【００３４】
「超抗原」は、これらのタンパク質の標的リガンド結合部位とは異なる部位で免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーと相互作用するジェネリックリガンドを指す当技術分野の用語である。ブドウ球菌腸毒素は、Ｔ細胞受容体と相互作用する超抗原の例である。抗体に結合する超抗原としては、ＩｇＧの接触領域に結合するプロテインＧ（Ｂｊｏｒｃｋ及びＫｒｏｎｖａｌｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：９６９（１９８４年））；ＩｇＧ定常領域及びＶＨドメインに結合するプロテインＡ（Ｆｏｒｓｇｒｅｎ及びＳｊｏｑｕｉｓｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９７：８２２（１９６６年））；及びＶＬドメインに結合するプロテインＬ（Ｂｊｏｒｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：１１９４（１９８８年））が挙げられる。
【００３５】
本発明で使用する「標的リガンド」は、ポリペプチド又はペプチドが特異的又は選択的に結合するリガンドを指す。例えば、ポリペプチドが抗体又はその抗原結合断片であるとき、標的リガンドは、任意の所望の抗原又はエピトープであってもよい。標的抗原に対する結合は、ポリペプチド又はペプチドが機能的であることに依存する。
【００３６】
本発明で使用する抗体は、天然に抗体を産生する任意の種に由来していようと組換えＤＮＡ技術によって作製されようと、血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母、又は細菌から単離されようと、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ若しくはＩｇＥ、又は断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合したＦｖ、ｓｃＦｖ、閉構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合したｓｃＦｖ、ダイアボディ等）を指す。
【００３７】
本発明で使用する「抗体フォーマット」、「フォーマット化された」又は類似の用語は、任意の好適なポリペプチド構造において抗原に結合特異性を付与するために１以上の抗体可変ドメインを組み込むことができる構造を指す。様々な好適な抗体フォーマットが当技術分野において公知であり、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／又は軽鎖のホモダイマー及びヘテロダイマー、前述のいずれかの抗原結合断片（例えば、Ｆｖ断片（例えば単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合したＦｖ）、ＦＡｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）、単一抗体可変ドメイン（例えばｄＡｂ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、及び（例えば、ポリエチレングリコール又は他の好適なポリマー又はヒト化ＶＨＨの共有結合によって改変された）前述のいずれかの改変体である。
【００３８】
語句「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、他のＶ領域又はドメインとは独立に、抗原又はエピトープに特異的に結合する抗体の可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬを指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の領域又はドメインが単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要ではない場合（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインが更なる可変ドメインとは独立に抗原に結合する場合）、他の可変領域又は可変ドメインとのフォーマット（例えば、ホモ又はヘテロ多量体）で存在してもよい。「ドメイン抗体」又は「ｄＡｂ」は、本発明で使用される用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。「単一免疫グロブリン可変ドメイン」は、本発明で使用される「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じ用語である。「単一抗体可変ドメイン」又は「抗体単一可変ドメイン」は、本発明で使用される「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じ用語である。免疫グロブリン単一可変ドメインは、１つの実施形態では、ヒト抗体可変ドメインであるが、げっ歯類（例えば、参照することによってその全文が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ００／２９００４号パンフレットに開示されている）、テンジクザメ、及びラクダ科のＶＨＨｄＡｂ等の他の種に由来する単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ科のＶＨＨは、天然に軽鎖が欠けている重鎖抗体を産生するラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ及びグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインのポリペプチドである。ＶＨＨは、ヒト化してもよい。
【００３９】
「ドメイン」は、タンパク質の残りとは無関係の三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。一般的に、ドメインは、タンパク質の別個の機能特性に関与しており、多くの場合、タンパク質及び／又はドメインの残りの機能を失うことなく付加、除去、又は他のタンパク質に転移することができる。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインの配列の特徴を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。したがって、それは、完全な抗体可変ドメイン及び改変された可変ドメインを含み、例えば、前記改変された可変ドメインでは、１以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的ではない配列、あるいは切頭されているか又はＮ末端若しくはＣ末端に伸長を含む抗体可変ドメイン、並びに完全長ドメインの少なくとも結合活性及び特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片によって置換されている。
【００４０】
用語「ライブラリ」とは、異種ポリペプチド又は核酸の混合物を指す。ライブラリは、各々が単一のポリペプチド又は核酸配列を有するメンバーで構成される。この点で、「ライブラリ」は、「レパートリー」と同義である。ライブラリに存在する多様性は、ライブラリのメンバー間の配列の差に起因する。ライブラリは、ポリペプチド又は核酸の単純な混合物の形態をとってもよく、核酸のライブラリで形質転換された生物又は細胞、例えば、細菌、ウイルス、動物、又は植物の細胞等の形態であってもよい。１つの実施形態では、各個々の生物又は細胞は、１つのみ又は制限された数のライブラリメンバーを含有する。１つの実施形態では、核酸によってコードされているポリペプチドを発現させるために、核酸が発現ベクターに組み込まれる。したがって、ライブラリが宿主生物の集団の形態をとり得る態様では、各生物は、発現してその対応するポリペプチドメンバーを生成することができる核酸形態である、ライブラリの単一メンバーを含有する発現ベクターのうちの１以上のコピーを含有する。したがって、宿主生物の集団は、多様なポリペプチドの大きなレパートリーをコードする能力を有する。
【００４１】
「ユニバーサルフレームワーク」は、Ｋａｂａｔ（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）によって定義される順序で保存された抗体の領域に対応するか、又はＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ，（１９８７年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９１０−９１７）によって定義されるヒト生殖細胞系免疫グロブリンのレパートリー又は構造に対応する単一抗体フレームワーク配列である。ライブラリ及びレパートリーは、超可変領域のみの変異を通じた事実上任意の結合特異性の誘導を許容することが見出されている単一のフレームワーク又はこのようなフレームワークのセットを使用することができる。
【００４２】
本発明で使用する用語「用量」は、全てが１度に被験体に投与される（単位用量）、又は規定の時間間隔で２回以上被験体に投与されるリガンドの量を指す。例えば、用量は、１日間（２４時間）（日用量）、２日間、１週間、２週間、３週間、又は１ヶ月以上にわたって（例えば、単回投与、又は２回以上の投与によって）被験体に投与されるリガンド（例えば、標的抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンド）の量を指すことができる。用量間の間隔は、任意の所望の時間量であってもよい。
【００４３】
本発明で使用する「流体力学的」サイズは、水溶液を通じた分子の拡散に基づいた分子（例えば、タンパク質分子、リガンド）のみかけのサイズを指す。溶液を通じたタンパク質の拡散又は移動を処理してタンパク質のみかけのサイズを導くことができ、前記サイズは、タンパク質粒子の「ストークス半径」又は「流体力学的半径」によって求められる。タンパク質の「流体力学的サイズ」は、質量及び形状（立体構造）に依存するので、タンパク質の全体の立体構造に基づいて同じ分子量を有する２つのタンパク質が様々な流体力学的サイズを有する場合がある。
【００４４】
本発明で言及する用語「競合する」は、そのコグネート標的結合ドメインに対する第１の標的の結合が、コグネート標的に対して特異的な第２の結合ドメインの存在下で阻害されることを意味する。例えば、標的に対するそのアフィニティ又はアビディティが低下するように、例えば、結合ドメインの物理的に遮断することによって、又は結合ドメインの構造若しくは環境を変化させることによって、結合を立体的に阻害することができる。第１の結合ドメインと及び第２結合ドメインとの間の競合を決定するために競合ＥＬＩＳＡ及び競合Ｂｉａｃｏｒｅ実験を実施する方法の詳細については、国際公開第ＷＯ２００６０３８０２７号パンフレットを参照されたい。
【００４５】
２つの配列間の「相同性」又は「同一性」又は「類似性」（これら用語は、本発明において互換的に使用される）の計算は、以下の通り実施される。最適に比較する目的のために配列のアラインメントをとる（例えば、最適なアラインメントのために第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列のうちの一方又は両方にギャップを導入したり、比較のために非相同配列を無視したりしてもよい）。１つの実施形態では、比較のためにアラインメントをとるレファレンス配列の長さは、前記レファレンス配列の長さのうちの少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められている場合、分子は、その位置において同一である（本発明で使用するアミノ酸又は核酸の「相同性」は、アミノ酸又は核酸の「同一性」に等しい）。２つの配列間の同一性の割合は、前記２つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要のあるギャップ数及び各ギャップの長さを考慮した、前記配列が共有している同一の位置の数の関数である。本発明で定義されるアミノ酸及び核酸配列のアラインメント、並びに相同性、類似性、又は同一性は、デフォルトのパラメータを用いてアルゴリズムＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓを用いて作成し、求めることができる（Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔ．Ａ．ら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，１７４：１８７−１８８（１９９９年））。
【００４６】
本発明の任意の態様の１つの実施形態では、抗ＴＮＦＲ１単一可変、アンタゴニスト、リガンド、又はポリペプチドは、ＴＮＦα誘導性ＩＬ−８分泌の阻害によって求めるとき、標準的なＭＲＣ５アッセイにおいて５、４、３、２、又は１ｎＭ以下（又は約５、４、３、２、又は１ｎＭ以下）のＮＤ５０でＴＮＦＲ１（例えば、ヒトＴＮＦＲ１）を中和する。
【００４７】
本発明の任意の態様の１つの実施形態では、抗ＴＮＦＲ１単一可変、アンタゴニスト、リガンド又はポリペプチドは、ＴＮＦα誘導性細胞毒性の阻害によって求めるとき、標準的なＬ９２９アッセイにおいて１５０、１００、５０、４０、３０若しくは２０ｎＭ以下；又は（約）１５０〜１０ｎＭ；又は（約）１５０〜２０ｎＭ；又は（約）１１０〜１０ｎＭ；又は（約）１１０〜２０ｎＭのＮＤ５０でＴＮＦＲ１（例えば、マウスＴＮＦＲ１）を中和する。
【００４８】
本発明の任意の態様の１つの実施形態では、抗ＴＮＦＲ１単一可変、アンタゴニスト、リガンド、又はポリペプチドは、ＴＮＦα誘導性ＩＬ−８分泌の阻害によって求めるとき、標準的なカニクイザルＫＩアッセイにおいて５、４、３、２、又は１ｎＭ以下；又は（約）５〜（約）１ｎＭのＮＤ５０でＴＮＦＲ１（例えば、カニクイザルＴＮＦＲ１）を中和する。
【００４９】
本発明の任意の態様の１つの実施形態では、単一可変ドメインは、末端、任意でＣ末端にシステイン残基を含む。例えば、システイン残基は、例えば、マレイミド結合を用いてＰＥＧを可変ドメインに結合させるために用いることができる（例えば、国際公開第ＷＯ０４０８１０２６号パンフレットを参照されたい）。本発明の任意の態様の１つの実施形態では、単一可変ドメインは、ポリアルキレングリコール部分、任意でポリエチレングリコール部分に連結する。好適なＰＥＧ部分、並びにコンジュゲーション方法及び試験については、例えば、国際公開第ＷＯ０４０８１０２６号パンフレットを参照されたい。これら開示は、例えば、以下の特許請求の範囲に含まれる特定のＰＥＧに関する開示を提供するために本明細書に組み込まれる。
【００５０】
１つの態様では、本発明は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びエフェクター基又は抗体定常ドメイン、任意で抗体Ｆｃ領域を含むポリペプチドであって、前記ＦｃのＮ末端が可変ドメインのＣ末端に連結（任意で、直接連結）するポリペプチドに関する。国際公開第ＷＯ０４０５８８２０号パンフレットに記載されている任意の「エフェクター基」は、本発明のこの態様で用いることができ、国際公開第ＷＯ０４０５８８２０号パンフレットにおけるエフェクター基の記載及びこの刊行物に開示されているエフェクター基の可変ドメインへの連結方法は、例えば、特許請求の範囲において用いることができる本発明の説明を提供するために参照することによって明示的に本明細書に組み込まれる。
【００５１】
１つの態様では、本発明は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインと、任意で、血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインとを含む多重特異性リガンドに関する。１つの実施形態では、多重特異性リガンドは、ＴＮＦＲ１モノマーのＫＤよりも少なくとも２倍低いＫＤでＴＮＦＲ１（例えば、ヒトＴＮＦＲ１）に結合する。これに加えて又はこれに代えて、１つの実施形態では、多重特異性リガンドは、モノマーの少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００倍の半減期を有する。これに加えて又はこれに代えて、１つの実施形態では、多重特異性リガンドは、例えば、抗ＳＡドメインがヒトのＳＡと動物由来のＳＡとの間で交差反応する場合、（例えば、ヒトのボランティアにおいて実験的に求めたとき、あるいはマウス、イヌ、及び／又は非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、ヒヒ、アカゲザル）等の動物系においてリガンドの半減期を基に推定することによって当業者によく知られた従来の技術を用いて計算したとき）、ヒトにおいて少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５日間の終末半減期を有する。
【００５２】
本発明の多重特異性リガンドの１つの実施形態では、リガンドは、ＴＮＦＲ１（例えば、ヒトＴＮＦＲ１）の、任意でＴＮＦＲ１の媒介するシグナル伝達のアンタゴニストである。
【００５３】
１つの実施形態では、本発明は、（約）２．５時間以上の範囲のｔβ半減期を有する本発明に係る可変ドメイン、多重特異性リガンド、又はアンタゴニストを提供する。１つの実施形態では、前記範囲の下限は、（約）３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間、又は１２時間である。これに加えて又はこれに代えて、ｔβ半減期は、（約）２１又は２５日間以下である。１つの実施形態では、前記範囲の上限は、（約）１２時間、２４時間、２日間、３日間、５日間、１０日間、１５日間、１９日間、２０日間、２１日間又は２２日間である。例えば、本発明に係る可変ドメイン又はアンタゴニストは、１２〜６０時間（又は約１２〜６０時間）の範囲のｔβ半減期を有する。更なる実施形態では、ｔβ半減期は１２〜４８時間（又は約１２〜４８時間）の範囲である。更なる実施形態では、ｔβ半減期は１２〜２６時間（又は約１２〜２６時間）の範囲である。
【００５４】
２コンパートメントモデリングを用いる代わりに、当業者は、ノンコンパートメンタルモデリングの使用についてよく知っているので、これを用いて終末半減期を求めることができる（これに関して、本発明で使用する用語「終末半減期」は、ノンコンパートメンタルモデリングを用いて求められる終末半減期を意味する）。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ分析パッケージ、例えばバージョン５．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ９４０４０，ＵＳＡから入手可能）を用いて、例えば、この方法で曲線をモデル化することができる。この場合、１つの実施形態では、単一可変ドメイン、多重特異性リガンド又はアンタゴニストは、少なくとも（又は少なくとも約）８時間、１０時間、１２時間、１５時間、２８時間、２０時間、１日間、２日間、３日間、７日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、又は２５日間の終末半減期を有する。１つの実施形態では、この範囲の上限は、（約）２４時間、４８時間、６０時間又は７２時間、又は１２０時間である。例えば、終末半減期は、例えば、ヒトにおいて、８時間〜６０時間、又は８時間〜４８時間、又は１２時間〜１２０時間である。
【００５５】
上記基準に加えて又は上記基準に代えて、本発明に係る可変ドメイン又はアンタゴニストは、（約）１ｍｇ．分／ｍＬ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する。１つの実施形態では、範囲の下限は、（約）５、１０、１５、２０、３０、１００、２００又は３００ｍｇ．分／ｍＬである。これに加えて又はこれに代えて、本発明に係る可変ドメイン、多重特異性リガンド、又はアンタゴニストは、（約）６００ｍｇ．分／ｍＬ以下の範囲のＡＵＣを有する。１つの実施形態では、範囲の上限は、（約）５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５、又は５０ｍｇ．分／ｍＬである。有利なことに、可変ドメイン又はアンタゴニストは、以下からなる群より選択される範囲のＡＵＣを有する：（約）１５〜１５０ｍｇ．分／ｍＬ、１５〜１００ｍｇ．分／ｍＬ、１５〜７５ｍｇ．分／ｍＬ、及び１５〜５０ｍｇ．分／ｍＬ。
【００５６】
血清アルブミン、例えば、マウス及び／又はヒトの血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合するＰＥＧ又は単一可変ドメイン（又は結合部分）のいずれかに連結する１以上の抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメイン（又は本明細書に定義される他の結合部分）を提供することによって、ヒト及び／又は動物（例えば、マウス又は非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、アカゲザル、カニクイザル）において、本明細書に引用されるｔα、ｔβ、及び終末半減期、並びにＡＵＣのうちの１以上を得ることができる。ＰＥＧのサイズは、少なくとも（約）２０ｋＤａ、例えば、３０、４０、５０、６０、７０、又は８０ｋＤａであってよい。１つの実施形態では、ＰＥＧは、４０ｋＤａ、例えば、２×２０ｋＤａのＰＥＧである。１つの実施形態では、本明細書に引用されるｔα、ｔβ及び終末半減期、又はＡＵＣを得るために、抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメインに連結している抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含むアンタゴニストを提供する。１つの実施形態では、ＰＥＧは、４０ｋＤａ、例えば、２×２０ｋＤａのＰＥＧである。例えば、前記アンタゴニストは、このような抗ＴＮＦＲ１可変ドメインを１つしか含まない、例えば、１つのこのようなドメインが唯１つの抗ＳＡ可変ドメインに連結している。１つの実施形態では、本明細書に引用されるｔα、ｔβ及び終末半減期、又はＡＵＣを得るために、ＰＥＧ、例えば、４０〜８０ｋＤａのＰＥＧ、例えば、４０ｋＤａのＰＥＧに連結している抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含むアンタゴニストを提供する。例えば、前記アンタゴニストは、このような抗ＴＮＦＲ１可変ドメインを１つしか含まない、例えば、１つのこのようなドメインが４０ｋＤａのＰＥＧに連結している。
【００５７】
本発明の多重特異性リガンドの１つの実施形態では、リガンドは、ＤＯＭ７ｈ−１１、ＤＯＭ７ｈ−１１−３、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５、ＤＯＭ７ｈ−１４、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０、ＤＯＭ７ｈ−１４−１８又は、ＤＯＭ７ｍ−１６の配列と同一であるか、あるいは少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む抗ＳＡ（例えば、ＨＳＡ）単一可変ドメインを含む（例えば、具体的に抗血清アルブミンｄＡｂの配列を含む２００９年３月２７日出願の米国特許出願第６１／１６３，９８７号及び同第６１／１６３，９９０号を参照されたい、これらの開示は本明細書に組み込まれる）。これに加えて又はこれに代えて、１つの実施形態では、多重特異性リガンドは、抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと抗ＳＡ単一可変ドメインとの間に設けられるリンカーを含み、前記リンカーは、アミノ酸配列ＡＳＴ、任意でＡＳＴＳＧＰＳを含む。あるいは、前記リンカーは、ＡＳ（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７又は８である）、例えばＡＳ（Ｇ４Ｓ）３である。例えば、前記リガンドは、（Ｎ末端からＣ末端方向に）ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６−ＡＳＴ−ＤＯＭ７ｈ−１１；又はＤＯＭ１ｈ−５７４−７２−ＡＳＴＳＧＰＳ−ＤＯＭ７ｍ−１６；又はＤＯＭ１ｈ−５７４−７２−ＡＳＴＳＧＰＳ−ＤＯＭ７ｈ−１１−１２を含む。
【００５８】
１つの態様では、本発明は、（ｉ）ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のアミノ酸配列と同一であるか、あるいは少なくとも９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインと、（ｉｉ）ＳＡに特異的に結合する少なくとも１つの抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ７ｈ−１１−３の配列と同一であるか、あるいは少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む抗ＳＡ単一可変ドメインと、（ｉｉｉ）任意で、前記抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと前記抗ＳＡ単一可変ドメインとの間に設けられるリンカーであって、アミノ酸配列ＡＳＴ、任意でＡＳＴＳＧＰＳを含むリンカーとを含む多重特異性リガンドを提供する。あるいは、リンカーは、ＡＳ（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７又は８である）、例えばＡＳ（Ｇ４Ｓ）３である。例えば、リガンドは、ＡＳＴ又はＡＳＴＳＧＰＳによって任意で連結されるＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６及びＤＯＭ７ｈ−１１−３を含む。あるいは、リンカーは、ＡＳ（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎは、２、３、４、５、６又は８である）、例えばＡＳ（Ｇ４Ｓ）３である。この例又は態様では、リガンドは、任意で、血管内に、皮下に、筋肉内に、腹腔に、又は吸入によって患者に投与するために適合される。１つの例では、リガンドは、（任意で、投与前に希釈剤と混合される）乾燥粉末又は凍結乾燥組成物として提供される。
【００５９】
１つの態様では、本発明は、（ｉ）ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のアミノ酸配列と同一であるか、あるいは少なくとも９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）免疫グロブリン単一可変ドメインと、（ｉｉ）ＳＡに特異的に結合する少なくとも１つの抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０の配列と同一であるか、あるいは少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む抗ＳＡ単一可変ドメインと、（ｉｉｉ）任意で、前記抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインと前記抗ＳＡ単一可変ドメインとの間に設けられるリンカーであって、アミノ酸配列ＡＳＴ、任意でＡＳＴＳＧＰＳを含むリンカーとを含む多重特異性リガンドを提供する。あるいは、リンカーは、ＡＳ（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７又は８である）、例えばＡＳ（Ｇ４Ｓ）３である。この例又は態様では、リガンドは、任意で、血管内に、皮下に、筋肉内に、腹腔に、又は吸入によって患者に投与するために適合される。１つの例では、リガンドは、（任意で、投与前に希釈剤と混合される）乾燥粉末又は凍結乾燥組成物として提供される。
【００６０】
本発明は、本発明の任意の態様又は実施形態の単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は多重特異性リガンドを含むＴＮＦＲ１アンタゴニストを提供する。例えば、本発明のアンタゴニスト又は可変ドメインは、ＴＮＦＲ１結合に対して一価である。例えば、本発明のアンタゴニスト又は可変ドメインは、標準的なＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって決定されるとき一価であるか、又は実質的に一価である。好適な一価性は、標準的なＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって決定されるとき、可変ドメイン又はアンタゴニストのうちの５、４、３、２、又は１％以下しか非一価形態で存在しないことによって示される。
【００６１】
１つの実施形態では、本発明のアンタゴニストは、第１及び第２の抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、各可変ドメインは、本発明の任意の態様又は実施形態に係る。第１及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインは、１つの例では同一である。別の例では、第１の免疫グロブリン単一可変ドメインと第２の免疫グロブリン単一可変ドメインとは異なる。
【００６２】
１つの例では、本発明のアンタゴニストのアミノ酸配列又は本発明のアンタゴニストにおける各抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメインのアミノ酸配列は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のアミノ酸配列と同一である。
【００６３】
１つの態様では、本発明は、経口送達、患者のＧＩ管への送達、肺送達、患者の肺への送達、又は全身送達のために、本発明の任意の態様に係る抗ＴＮＦＲ１可変ドメインを含むＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストを提供する。別の態様では、本発明は、経口送達するための薬剤の製造における本発明の任意の態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用を提供する。別の態様では、本発明は、患者のＧＩ管に送達するための薬剤の製造における本発明の任意の態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用を提供する。１つの例では、アンタゴニスト又は可変ドメインは、トリプシン、エラスターゼ、及び／又はパンクレアチンに対して耐性である（国際公開第ＷＯ２００８１４９１４３号パンフレットを参照されたい）。
【００６４】
１つの態様では、本発明は、肺送達するための薬剤の製造における本発明の任意の態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用を提供する。別の態様では、本発明は、患者の肺に送達するための薬剤の製造における本発明の任意の態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用を提供する。１つの例では、アンタゴニスト又は可変ドメインは、ロイコザイム（ｌｅｕｃｏｚｙｍｅ）に対して耐性である。
【００６５】
１つの態様では、本発明は、経口送達するための、あるいは患者のＧＩ管又は患者の肺若しくは肺組織に薬剤を送達するための方法であって、治療上有効な量の本発明のＴＮＦＲ１アンタゴニストを患者に投与することを含む方法を提供する。
【００６６】
１つの態様では、本発明は、ヒト、マウス、又はカニクイザルのＴＮＦＲ１に結合するための抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストであって、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のＣＤＲ１配列と同一であるか、あるいは少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９８％同一であるＣＤＲ１配列を有するアンタゴニストを提供する。また、前記アンタゴニストは、任意で、選択された配列のＣＤＲ２配列と同一であるか、あるいは少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９８％同一であるＣＤＲ２配列を有する。これに加えて又はこれに代えて、前記アンタゴニストは、任意で、選択された配列のＣＤＲ３配列と同一であるか、あるいは少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９８％同一であるＣＤＲ３配列を有する。
【００６７】
１つの態様では、本発明は、ヒト、マウス、又はカニクイザルのＴＮＦＲ１に結合するための抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストであって、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のＣＤＲ２配列と同一であるか、あるいは少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９８％同一であるＣＤＲ２配列を有するアンタゴニストを提供する。また、前記アンタゴニストは、任意で、選択された配列のＣＤＲ３配列と同一であるか、あるいは少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９８％同一であるＣＤＲ３配列を有する。
【００６８】
１つの態様では、本発明は、ヒト、マウス、又はカニクイザルのＴＮＦＲ１に結合するための抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストであって、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のＣＤＲ３配列と同一であるか、あるいは少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９８％同一であるＣＤＲ３配列を有するアンタゴニストを提供する。
【００６９】
１つの態様では、本発明は、ヒト、マウス、又はカニクイザルのＴＮＦＲ１に結合するための抗ＴＮＦα受容体１型（ＴＮＦＲ１；ｐ５５）アンタゴニストであって、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８のアミノ酸配列、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４から選択される単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３の配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを含むアンタゴニストを提供する。
【００７０】
本発明は、炎症性病状を治療及び／又は予防するための任意の態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストを提供する。本発明は、炎症性病状を治療及び／又は予防するための薬剤の製造における任意の態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用を提供する。アンタゴニスト又は使用の１つの実施形態では、前記病状は、関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患及び慢性閉塞性肺疾患からなる群より選択される。１つの例では、関節炎は、関節リウマチ又は若年性関節リウマチである。１つの例では、炎症性腸疾患は、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択される。１つの例では、慢性閉塞性肺疾患は、慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎及び気腫からなる群より選択される。１つの例では、肺炎は細菌性肺炎である。１つの例では、細菌性肺炎はブドウ球菌性肺炎である。
【００７１】
本発明は、呼吸器疾患を治療及び／又は予防するための任意の態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストを提供する。本発明は、呼吸器疾患を治療及び／又は予防するための薬剤の製造における任意の態様のＴＮＦＲ１アンタゴニストの使用を提供する。１つの例では、呼吸器疾患は、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性肺炎、好酸球増加症を伴う肺浸潤、環境肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓性塞栓症、胸膜の障害、縦隔の障害、横隔膜の障害、低換気、換気亢進、睡眠無呼吸、急性呼吸窮迫症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿肺、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、気腫、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性抗酸菌、胸水、塵肺症、ニューモシスチス症、肺炎、肺放線菌症、肺胞たんぱく症、肺炭疽、肺水腫、肺塞栓、肺の炎症、肺ヒスチオサイトーシスＸ、肺高血圧症、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈閉塞性疾患、リウマチ性肺疾患、サルコイドーシス及びヴェーゲナー肉芽腫症からなる群より選択される。
【００７２】
ポリペプチド、ｄＡｂ、及びアンタゴニスト
ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、リガンド又はアンタゴニストは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、又はピチア属の種（例えば、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ））で発現することができる。１つの実施形態では、リガンド又はｄＡｂモノマーは、大腸菌、又はピチア属の種（例えば、ピキア・パストリス）で発現するとき、少なくとも約０．５ｍｇ／Ｌの量で分泌される。本明細書に記載するリガンド及びｄＡｂモノマーは、大腸菌、又はピチア属の種（例えば、ピキア・パストリス）で発現するとき分泌可能であるが、大腸菌、又はピチア属の種を使用しない合成化学法又は生物学的産生法等の任意の好適な方法を用いて生成してもよい。
【００７３】
幾つかの実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、又はアンタゴニストは、ラクダ科の免疫グロブリン可変ドメインを含まないか、あるいは、例えば、１０８、３７、４４、４５、及び／又は４７の位置においてラクダ科の生殖系抗体遺伝子セグメントによってコードされている免疫グロブリン単一可変ドメインに固有の１以上のフレームワークアミノ酸を含まない。１つの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦＲ１可変ドメインは、Ｋａｂａｔによれば４４位にＧ残基を含み、任意で、例えば、３７又は１０３位等の他の位置に１以上のラクダ科特異的アミノ酸を含む。
【００７４】
本発明に係るＴＮＦＲ１のアンタゴニストは、一価であってもよく、多価であってもよい。幾つかの実施形態では、アンタゴニストは、一価であり、ＴＮＦＲ１と相互作用する１つの結合部位を含有し、前記結合部位は、本発明のポリペプチド又はｄＡｂによって提供される。一価のアンタゴニストは、１つのＴＮＦＲ１に結合し、受容体及びシグナル伝達の活性化を導くことができる細胞の表面上においてＴＮＦＲ１の架橋又はクラスタ形成を誘導することができない。本発明に係る一価のアンタゴニストは、ＴＮＦＲ１のドメイン１、ドメイン２、ドメイン３、又はドメイン４に結合することができる。１つの実施形態では、一価のアンタゴニストは、ＴＮＦＲ１のドメイン４に結合する。他の実施形態では、一価のアンタゴニストは、ＴＮＦＲ１の１超のドメインに及ぶエピトープに結合する。したがって、１つの実施形態では、一価のアンタゴニストは、ＴＮＦＲ１のドメイン１及び２、ドメイン１及び３、ドメイン１及び４、ドメイン２及び３、ドメイン２及び４、ドメイン３及び４、ドメイン１、２、及び３、ドメイン１、２、及び４、又はドメイン１、３、及び４に結合することができる。
【００７５】
他の実施形態では、ＴＮＦＲ１のアンタゴニストは、多価である。ＴＮＦＲ１の多価アンタゴニストは、ＴＮＦＲ１の特定の結合部位を２コピー以上含有してもよく、ＴＮＦＲ１に結合する２以上の異なる結合部位であって、そのうちの少なくとも１つが本発明のポリペプチド又はｄＡｂによって提供される結合部位を含有してもよい。例えば、本明細書で記載するとき、ＴＮＦＲ１のアンタゴニストは、ＴＮＦＲ１に結合する本発明の特定のポリペプチド又はｄＡｂを２コピー以上含むか、あるいはＴＮＦＲ１に結合する本発明の２以上の異なるポリペプチド又はｄＡｂを含むダイマー、トリマー、又はマルチマーであってもよい。１つの実施形態では、ＴＮＦＲ１の多価アンタゴニストは、標準的な細胞アッセイにおいて実質的にＴＮＦＲ１を作動させない（ＴＮＦＲ１のアゴニストとして作用しない）（すなわち、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１０００μＭ、又は５，０００μＭの濃度で存在するとき、前記アッセイにおいてＴＮＦα（１００ｐｇ／ｍＬ）によって誘導されるＴＮＦＲ１の媒介する活性のうちの約５％以下しか生じない）。
【００７６】
特定の実施形態では、ＴＮＦＲ１の多価アンタゴニストは、ＴＮＦＲ１の望ましいエピトープ又はドメインに対して２以上の結合部位を含有する。例えば、ＴＮＦＲ１の多価アンタゴニストは、ＴＮＦＲ１のドメイン１における同一エピトープに結合するか、又はＴＮＦＲ１のドメイン４における同一エピトープに結合する１以上の結合部位を含んでもよい。
【００７７】
他の実施形態では、ＴＮＦＲ１の多価アンタゴニストは、ＴＮＦＲ１の異なるエピトープ又はドメインに結合する本発明のポリペプチド又はｄＡｂによって提供される２以上の結合部位を含有する。例えば、ＴＮＦＲ１の多価アンタゴニストは、ＴＮＦＲ１のドメイン１及び２、ドメイン１及び３、ドメイン１及び４、ドメイン２及び３、ドメイン２及び４、ドメイン３及び４、ドメイン１、２、及び３、ドメイン１、２、及び４、又はドメイン１、３、及び４に対する結合部位を含んでもよい。１つの実施形態では、このような多価アンタゴニストは、国際公開第ＷＯ２００６０３８０２７号パンフレットに記載されている標準的なＬ９２９細胞毒性アッセイ又は標準的なＨｅＬａ  ＩＬ−８アッセイにおいて、約１ｎＭ、又は１０ｎＭ、又は１００ｎＭ、又は約１μＭ、又は約１０μＭの濃度で存在するとき、ＴＮＦＲ１を作動させない。
【００７８】
ＴＮＦＲ１の他のアンタゴニストは、ＴＮＦαのＴＮＦＲ１への結合を阻害しない。このようなリガンド（及びアンタゴニスト）は、診断剤としての有用性を有している可能性があり、その理由は、これらを用いて、サンプル中のＴＮＦＲ１に結合させ、それを検出、定量、又は測定することができ、且つＴＮＦＲ１への結合について前記サンプル中のＴＮＦと競合しないためである。したがって、ＴＮＦＲ１がサンプル中に存在するかどうか又はどのくらい存在するかを正確に求めることができる。
【００７９】
他の実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、又はアンタゴニストは、ＴＮＦＲ１に結合し、標準的な細胞アッセイにおいて≦１００ｎＭのＮＤ５０でＴＮＦＲ１の活性に拮抗し、前記ｄＡｂは、≦１０μＭのｄＡｂ濃度で前記アッセイにおいてＴＮＦＲ１の活性を≦５％作動させる。
【００８０】
特定の実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、又はアンタゴニストは、標準的な細胞アッセイにおいて実質的にＴＮＦＲ１を作動させない（ＴＮＦＲ１のアゴニストとして作用しない）（すなわち、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１０００μＭ、又は５，０００μＭの濃度で存在するとき、前記アッセイにおいてＴＮＦα（１００ｐｇ／ｍＬ）によって誘導されるＴＮＦＲ１の媒介する活性のうちの約５％以下しか生じない）。
【００８１】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、又はアンタゴニストは、有効な量が投与されるとき、慢性炎症性疾患のモデルにおいて効果的である。一般的に、前記有効な量とは、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、又は約１０ｍｇ／ｋｇ）である。慢性炎症性疾患のモデル（国際公開第ＷＯ２００６０３８０２７号パンフレットに記載されているモデルを参照されたい）は、ヒトにおける治療有効性を予測すると当業者に認識されている。
【００８２】
特定の実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストは、標準的なマウスのコラーゲン誘導性関節炎モデル（モデルの詳細については国際公開第ＷＯ２００６０３８０２７号パンフレットを参照されたい）において効果的である。例えば、有効な量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストの投与は、標準的なマウスのコラーゲン誘導性関節炎モデルにおける四肢の合計の平均関節炎スコアを、例えば、好適な対照と比べて、約１〜約１６、約３〜約１６、約６〜約１６、約９〜約１６、又は約１２〜約１６低下させることができる。別の例では、有効な量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストの投与は、標準的なマウスのコラーゲン誘導性関節炎モデルにおける関節炎の症状の発現を、例えば、好適な対照と比べて、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約１０日間、約１４日間、約２１日間、又は約２８日間遅らせることができる。別の例では、有効な量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストの投与は、標準的なマウスのコラーゲン誘導性関節炎モデルにおける四肢の合計の平均関節炎スコアを、０〜約３、約３〜約５、約５〜約７、約７〜約１５、約９〜約１５、約１０〜約１５、約１２〜約１５、又は約１４〜約１５にすることができる。
【００８３】
他の実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストは、関節炎のマウスΔＡＲＥモデル（モデルの詳細については国際公開第ＷＯ２００６０３８０２７号パンフレットを参照されたい）において効果的である。例えば、有効な量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストの投与は、マウスの関節炎のΔＡＲＥモデルにおける平均関節炎スコアを、例えば、好適な対照と比べて、約０．１〜約２．５、約０．５〜約２．５、約１〜約２．５、約１．５〜約２．５、又は約２〜約２．５低下させることができる。別の例では、有効な量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストの投与は、関節炎のマウスΔＡＲＥモデルにおける関節炎の症状の発現を、例えば、好適な対照と比べて、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約１０日間、約１４日間、約２１日間、又は約２８日間遅らせることができる。別の例では、有効な量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストの投与は、関節炎のマウスΔＡＲＥモデルにおける平均関節炎スコアを、０〜約０．５、約０．５〜約１、約１〜約１．５、約１．５〜約２、又は約２〜約２．５にすることができる。
【００８４】
他の実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のマウスΔＡＲＥモデル（モデルの詳細については国際公開第ＷＯ２００６０３８０２７号パンフレットを参照されたい）において効果的である。例えば、有効な量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストの投与は、ＩＢＤのマウスΔＡＲＥモデルにおける平均急性及び／又は慢性炎症スコアを、例えば、好適な対照と比べて、約０．１〜約２．５、約０．５〜約２．５、約１〜約２．５、約１．５〜約２．５、又は約２〜約２．５低下させることができる。別の例では、有効な量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストの投与は、ＩＢＤのマウスΔＡＲＥモデルにおけるＩＢＤの症状の発現を、例えば、好適な対照と比べて、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約１０日間、約１４日間、約２１日間、又は約２８日間遅らせることができる。別の例では、有効な量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストの投与は、ＩＢＤのマウスΔＡＲＥモデルにおける平均急性及び／又は慢性炎症スコアを、０〜約０．５、約０．５〜約１、約１〜約１．５、約１．５〜約２、又は約２〜約２．５にすることができる。
【００８５】
他の実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストは、ＩＢＤのマウスデキストラン硫酸ナトリウム誘導モデル（モデルの詳細については国際公開第ＷＯ２００６０３８０２７号パンフレットを参照されたい）において効果的である。例えば、有効な量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストの投与は、ＩＢＤのマウスＤＳＳモデルにおける平均重篤度スコアを、例えば、好適な対照と比べて、約０．１〜約２．５、約０．５〜約２．５、約１〜約２．５、約１．５〜約２．５、又は約２〜約２．５低下させることができる。別の例では、有効な量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストの投与は、ＩＢＤのマウスＤＳＳモデルにおけるＩＢＤの症状の発現を、例えば、好適な対照と比べて、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約１０日間、約１４日間、約２１日間、又は約２８日間遅らせることができる。別の例では、有効な量のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストの投与は、ＩＢＤのマウスＤＳＳモデルにおける平均重篤度スコアを、０〜約０．５、約０．５〜約１、約１〜約１．５、約１．５〜約２、又は約２〜約２．５にすることができる。
【００８６】
特定の実施形態では、ポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストは、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のマウスタバコ煙モデル（モデルの詳細については国際公開第ＷＯ２００６０３８０２７号パンフレット及び国際公開第ＷＯ２００７０４９０１７号パンフレットを参照されたい）において効果的である。例えば、有効な量のリガンドの投与は、好適な対照と比較して、ＣＯＰＤの症状の発現を低減するか遅らせることができる。
【００８７】
疾患からの保護又は疾患の治療においてＴＮＦＲ１のアンタゴニスト（例えば、リガンド、抗体、又はこれらの結合タンパク質）の有効性をスクリーニングするために用いることができる動物モデル系が利用可能である。易発性マウスにおける全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を試験するための方法は、当技術分野において公知である（Ｋｎｉｇｈｔら．（１９７８年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４７：１６５３；Ｒｅｉｎｅｒｓｔｅｎら（１９７８年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２９９：５１５）。重症筋無力症（ＭＧ）は、別の種に由来する可溶性ＡｃｈＲタンパク質で疾患を誘導することによってＳＪＬ／Ｊメスマウスにおいて試験される（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら（１９８８年）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２：２３３）。関節炎は、ＩＩ型コラーゲンを注射することによってマウスの易発性系列において誘導される（Ｓｔｕａｒｔら（１９８４年）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２：２３３）。マイコバクテリアの熱ショックタンパク質を注射することによって易発性マウスにおいてアジュバント関節炎が誘導されるモデルが報告されている（Ｖａｎ  Ｅｄｅｎら（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ，３３１：１７１）。甲状腺炎は、記載の通り、チログロブリンの投与によってマウスにおいて誘導される（Ｍａｒｏｎら（１９８０年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５２：１１１５）。インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）は自然に生じるか、又はＫａｎａｓａｗａら（１９８４年）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２７：１１３に記載されているもの等の特定の系列のマウスにおいて誘導することができる。マウス及びラットにおけるＥＡＥは、ヒトにおけるＭＳのモデルとして機能する。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパク質を投与することによって脱髄性疾患が誘導される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９８６年）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｍｉｓｃｈｅｒら編，Ｇｒｕｎｅ及びＳｔｒａｔｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１７９−２１３；ＭｃＦａｒｌｉｎら（１９７３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７９：４７８：及びＳａｔｏｈら（１９８７年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：１７９を参照されたい）。
【００８８】
一般に、本リガンド（例えば、アンタゴニスト）は、薬理学的に適切な担体と共に純粋な形態で利用される。典型的には、これら担体としては、水溶液又はアルコール／水溶液、エマルション又は坐剤が挙げられ、これらは全て生理食塩水及び／又は緩衝媒体を含む。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、及び塩化ナトリウム、及び乳酸加リンゲル液を挙げることができる。懸濁剤中でポリペプチド複合体を維持するのに必要な場合、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン及びアルギン酸塩等の増粘剤から好適な生理学的に許容できる佐剤を選択してもよい。
【００８９】
静脈内用ビヒクルとしては、流体及び栄養補充液及び電解質補充液、例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの等が挙げられる。また、保存剤、並びに抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、及び不活性ガス等の他の添加剤が存在してもよい（Ｍａｃｋ（１９８２年）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版）。持続放出製剤等の様々な好適な製剤を用いてもよい。
【００９０】
本発明のリガンド（例えば、アンタゴニスト）は、別々に投与される組成物として用いてもよく、他の剤と併用してもよい。これらとしては、シクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシン又はシスプラチン等の様々な免疫療法薬及び免疫毒素を挙げることができる。医薬組成物は、本発明のリガンドと併用される様々な細胞毒性剤又は他の剤の「カクテル」を含んでもよく、又は更には投与前にプールされようとされまいと、異なる標的抗原又はエピトープを用いて選択されるリガンド等の異なる特異性を有する本発明に係るリガンドの組み合わせを含んでもよい。
【００９１】
本発明に係る医薬組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られているもののいずれであってもよい。制限なく免疫療法を含む療法については、標準的な技術に従って本発明の選択されたリガンドを任意の患者に投与することができる。
【００９２】
投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮を含む任意の適切な方式によってもよく、肺経路を介してもよく、又は適切にカテーテルにより直接注入することによってもよい。投薬量及び投与頻度は、患者の年齢、性別、及び症状、他の薬物の同時投与、使用禁忌、及び医師が考慮すべき他のパラメータに依存する。投与は、指示の通り、局所的（例えば、肺投与による肺への局所送達、例えば、鼻腔内投与）であってもよく、全身的であってもよい。
【００９３】
本発明のリガンドは、保存用に凍結乾燥させ、使用前に好適な担体で再構成してもよい。この技術は、従来の免疫グロブリンで有効であることが示されており、当技術分野において公知である凍結乾燥及び再構成技術を使用することができる。当業者は、凍結乾燥及び再構成が抗体の活性喪失の程度を変化させる場合があり（例えば、従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体よりも活性の喪失が大きい傾向がある）、それを補うために使用レベルを上方に調節しなければならない場合があることを認識する。
【００９４】
本リガンド（例えば、アンタゴニスト）又はそのカクテルを含有する組成物を予防的及び／又は治療的処置のために投与することができる。特定の治療的用途では、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅、又は他の幾つかの測定可能なパラメータを達成するのに適切な量を「治療上有効な量」と定義する。この投薬量を達成するために必要とされる量は、疾患の重篤度及び患者自身の免疫系の一般的な状態に依存するが、一般には、体重１ｋｇ当たり０．００５〜１０．０ｍｇのリガンド、例えば、ｄＡｂ又はアンタゴニストであり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般的に用いられる。予防的適用では、疾患の発症を予防する、妨げる、又は遅らせるために（例えば、寛解又は静止状態を維持したり急性相を防いだりするために）、同程度又は僅かに低い投薬量の本リガンド又はそのカクテルを含有する組成物を投与してもよい。当業者は、疾患を治療、抑制、又は予防するための適切な投薬間隔を求めることができる。慢性炎症性疾患を治療、抑制、又は予防するためにＴＮＦＲ１（例えば、アンタゴニスト）のリガンドを投与する場合、１日当たり４回以下、１週間に２回、１週間に１回、２週間毎に１回、１ヶ月に１回、又は２ヶ月毎に１回、約１０μｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態では、ＴＮＦＲ１（例えば、アンタゴニスト）のリガンドは、慢性炎症性疾患を治療、抑制、又は予防するために２週間毎に１回又は１ヶ月間に１回、約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、又は約１０ｍｇ／ｋｇ）投与される。
【００９５】
本発明に記載する組成物を用いて実施される治療又は療法は、治療前に存在するこのような症状に対して、又はこのような組成物若しくは他の好適な対照で治療されていない個体（ヒト又はモデル動物）におけるこのような症状に対して、１以上の症状が（例えば、少なくとも１０％、又は臨床評価尺度において少なくとも１ポイント）低減される場合「有効」であると考えられる。症状は、標的とされる疾患又は障害に依存して明らかに変化するが、当業者又は技術者によって測定することができる。このような症状は、例えば、疾患又は障害の１以上の生化学的指標（例えば、その疾患に関連する酵素又は代謝産物のレベル、罹患した細胞数等）のレベルをモニターすることにより、身体的発現（例えば炎症、腫瘍サイズ等）をモニターすることにより、又は認められている臨床的評価尺度、例えば（多発性硬化症用の）総合障害度評価尺度、アーヴィン炎症性腸疾患質問表（３２ポイントの評価によって、腸機能、全身症状、社会的機能及び情動状態に関して生活の質を評価する−スコアの範囲は３２〜２２４、スコアが高いほど生活の質が高い）、生活の質関節リウマチ尺度、又は当技術分野において公知である他の認められている臨床的評価尺度によって測定することができる。所与の臨床的スケールにおいて疾患又は障害の症状の低減が少なくとも１０％又は１ポイント以上持続的に（例えば、１日以上）維持されることが、「有効な」治療の指標である。同様に、本発明に記載する組成物を用いて実施される予防は、前記組成物で治療されていない同様の個体（ヒト又はモデル動物）におけるこのような症状に対して、１以上の症状の発症又は重篤度が遅延、低減、又は消滅した場合「有効」である。
【００９６】
本発明に係るリガンド（例えば、アンタゴニスト）を含有する組成物は、哺乳類における選択された標的細胞集団の変化、不活化、死滅、又は除去に役立つ予防的及び治療的設定において利用することができる。更に、本明細書に記載するポリペプチドの選択されたレパートリーは、細胞の異質なコレクションから標的細胞集団を死滅、枯渇、又は別の方法で効率的に除去するために体外で又はインビトロで選択的に用いることができる。哺乳類由来の血液を体外でリガンドと組み合わせ、標準的な技術に従って哺乳類に戻すために望ましくない細胞を死滅させるか、又は別の方法で血液から除去してもよい。
【００９７】
本発明に係るリガンド（例えば、アンタゴニスト）又はそのカクテルを含有する組成物は、哺乳類における選択された標的細胞集団の変化、不活化、死滅、又は除去に役立つ予防的及び治療的設定において利用することができる。
【００９８】
リガンド（例えば、抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト、ｄＡｂモノマー）は、１以上の更なる治療剤又は活性剤と共に投与又は製剤化してもよい。更なる治療剤と共にリガンド（例えば、ｄＡｂ）を投与する場合、リガンドは、更なる剤の投与前に投与してもよく、更なる剤と同時に投与してもよく、更なる剤の投与後に投与してもよい。一般的に、リガンド及び更なる剤は、治療効果が重複するように投与される。
【００９９】
１つの実施形態では、本発明は、治療上有効な用量又は量の本発明に係るＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、又はアンタゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含む、慢性炎症性疾患を治療、抑制、又は予防する方法である。
【０１００】
１つの実施形態では、本発明は、治療上有効な用量又は量の本発明に係るＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、又はアンタゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含む、関節炎（例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎）を治療、抑制、又は予防する方法である。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明は、治療上有効な用量又は量の本発明に係るＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、又はアンタゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含む、乾癬を治療、抑制、又は予防する方法である。
【０１０２】
別の実施形態では、本発明は、治療上有効な用量又は量の本発明に係るＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、又はアンタゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含む、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）を治療、抑制、又は予防する方法である。
【０１０３】
別の実施形態では、本発明は、治療上有効な用量又は量の本発明に係るＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、又はアンタゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含む、慢性閉塞性肺疾患（例えば、慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎、肺気腫）を治療、抑制、又は予防する方法である。
【０１０４】
別の実施形態では、本発明は、治療上有効な用量又は量の本発明に係るＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、又はアンタゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含む、肺炎（例えば、ブドウ球菌性肺炎等の細菌性肺炎）を治療、抑制、又は予防する方法である。
【０１０５】
本発明は、慢性閉塞性肺疾患及び肺炎に加えて、他の肺疾患を治療、抑制、又は予防する方法を提供する。本発明に従って治療、抑制、又は予防することができる他の肺疾患としては、例えば、嚢胞性線維症及び喘息（例えば、耐ステロイド性喘息）が挙げられる。したがって、別の実施形態では、本発明は、治療上有効な用量又は量の本発明に係るＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、又はアンタゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含む、肺疾患（例えば、嚢胞性線維症、喘息）を治療、抑制、又は予防する方法である。
【０１０６】
特定の実施形態では、ＴＮＦＲ１のアンタゴニストは、例えば、吸入（例えば、気管支内、鼻腔内又は経口吸入、鼻腔内点滴）、又は全身送達（例えば、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）等によって肺送達を介して投与される。
【０１０７】
別の実施形態では、本発明は、治療上有効な用量又は量の本発明に係るＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、又はアンタゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含む、敗血性ショックを治療、抑制、又は予防する方法である。
【０１０８】
本発明の更なる態様では、本発明に係るポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ又はアンタゴニストと、薬学的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤とを含む組成物を提供する。
【０１０９】
更に、本発明は、本発明に係るＴＮＦＲ１のポリペプチド、リガンド、ｄＡｂ、若しくはアンタゴニスト、又は組成物を使用して疾患を治療する方法を提供する。１つの実施形態では、前記疾患は、癌又は炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、喘息又はクローン病である。
【０１１０】
本発明の更なる態様では、本発明に係るポリペプチド、単一可変ドメイン、リガンド、又はアンタゴニストと、薬学的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤とを含む組成物を提供する。
【０１１１】
特定の実施形態では、ポリペプチド、リガンド、単一可変ドメイン、アンタゴニスト、又は組成物は、例えば、吸入（例えば、気管支内、鼻腔内又は経口吸入、鼻腔内点滴）、又は全身送達（例えば、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）等によって肺送達を介して投与される。
【０１１２】
本発明の態様は、本発明に係るポリペプチド、単一可変ドメイン、リガンド、組成物又はアンタゴニストを含有する肺送達装置を提供する。前記装置は、吸入器又は鼻腔内投与装置であってよい。
【０１１３】
他の実施形態では、本明細書に記載するリガンドのいずれか（例えば、アンタゴニスト又は単一可変ドメイン）は、ポリアルキレングリコール部分、血清アルブミン又はその断片、トランスフェリン受容体又はそのトランスフェリン結合部分、あるいはインビボにおける半減期を延長させるポリペプチドに対する結合部位を含む部分等の半減期延長部分を更に含む。幾つかの実施形態では、半減期延長部分は、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ＳｐＡドメイン、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、ＥＧＦドメイン、及びアビマーからなる群より選択される、インビボにおける半減期を延長させるポリペプチドに対する結合部位を含む部分である。
【０１１４】
他の実施形態では、半減期延長部分は、ポリエチレングリコール部分である。１つの実施形態では、アンタゴニストは、ポリエチレングリコール部分（任意で、前記部分は、約２０〜約５０ｋＤａ、任意で約４０ｋＤａのサイズの直鎖又は分枝ＰＥＧを有する）に連結している本発明の単一可変ドメインを含む（任意で、からなる）。ｄＡｂ及び結合部分のペグ化の更なる詳細については、国際公開第ＷＯ０４０８１０２６号パンフレットを参照する。１つの実施形態では、アンタゴニストは、ＰＥＧに連結しているｄＡｂモノマーからなり、前記ｄＡｂモノマーは、本発明に係る単一可変ドメインである。このアンタゴニストは、炎症性疾患、肺の病状（例えば喘息、インフルエンザ又はＣＯＰＤ）又は癌を治療するために提供することができ、あるいは任意で静脈内投与用に提供することができる。
【０１１５】
他の実施形態では、半減期延長部分は、血清アルブミン又は新生児Ｆｃ受容体に対する結合部位を含む抗体又は抗体断片（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）である。
【０１１６】
また、本発明は、本発明のリガンド（例えば、アンタゴニスト又は単一可変ドメイン）と生理学的に許容できる担体とを含む組成物（例えば、医薬組成物）に関する。幾つかの実施形態では、組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、鞘内、関節内、皮下投与、肺、鼻腔内、膣、直腸投与用のビヒクルを含む。
【０１１７】
また、本発明は、本発明の組成物（例えば、医薬組成物）を含む薬物送達装置に関する。幾つかの実施形態では、薬物送達装置は、複数の治療上有効な用量のリガンドを含む。他の実施形態では、薬物送達装置は、非経口送達装置、静脈内送達装置、筋肉内送達装置、腹腔内送達装置、経皮送達装置、肺送達装置、動脈内送達装置、鞘内送達装置、関節内送達装置、皮下送達装置、鼻腔内送達装置、膣送達装置、直腸送達装置、注射器、経皮送達装置、カプセル剤、錠剤、噴霧器、吸入器、アトマイザ、エアロゾル化装置、霧吹き、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、定量噴霧器、定量霧吹き、定量アトマイザ及びカテーテルからなる群より選択される。
【０１１８】
本発明のリガンド（例えば、単一可変ドメイン、アンタゴニスト、又は多重特異性リガンド）は、本明細書に記載する通りフォーマット化してもよい。例えば、本発明のリガンドは、インビボにおける血清半減期を調整するためにフォーマット化してもよい。必要に応じて、リガンドは、本明細書に記載する毒素又は毒素部分を更に含んでもよい。幾つかの実施形態では、リガンドは、フリーラジカル生成元（例えば、セレニウム含有毒素）又は放射性核種等の表面活性毒素を含む。他の実施形態では、毒素又は毒素部分は、細胞内標的に対する結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチドドメイン（例えば、ｄＡｂ）である。特定の実施形態では、リガンドは、ＴＮＦＲ１（例えば、ヒトＴＮＦＲ１）に対する結合特異性を有するＩｇＧ様フォーマットである。
【０１１９】
１つの態様では、本発明は、本発明の単一可変ドメインを含む融合タンパク質を提供する。可変ドメインは、例えば、ペプチド又はポリペプチド又はタンパク質に融合することができる。１つの実施形態では、可変ドメインは、抗体又は抗体断片、例えば、モノクローナル抗体に融合する。一般的に、融合は、単一核酸配列から融合生成物を発現させることによって、又は単一可変ドメインを含むポリペプチドを発現させ、次いで、従来の技術を用いてこのポリペプチドをより大きなタンパク質又は抗体フォーマットにアセンブリすることによって、行うことができる。
【０１２０】
１つの実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、又は融合タンパク質は、抗体定常ドメインを含む。１つの実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、又は融合タンパク質は、抗体Ｆｃを含み、任意で、前記ＦｃのＮ末端は、可変ドメインのＣ末端に連結（任意で直接連結）する。１つの実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、又は融合タンパク質は、半減期延長部分を含む。半減期延長部分は、ポリエチレングリコール部分、血清アルブミン又はその断片、トランスフェリン受容体又はそのトランスフェリン結合部分、あるいはインビボにおける半減期を延長させるポリペプチドに対する結合部位を含む抗体又は抗体断片であってよい。半減期延長部分は、血清アルブミン又は新生児Ｆｃ受容体に対する結合部位を含む抗体又は抗体断片であってもよい。半減期延長部分は、ｄＡｂ、抗体又は抗体断片であってもよい。１つの実施形態では、可変ドメイン（あるいは、アンタゴニスト又は融合タンパク質によって含まれる可変ドメイン）がポリアルキレングリコール部分を更に含むように、免疫グロブリン単一可変ドメイン又はアンタゴニスト又は融合タンパク質を提供する。ポリアルキレングリコール部分は、ポリエチレングリコール部分であってもよい。更なる議論を以下に提供する。
【０１２１】
抗ＴＮＦＲ１免疫グロブリン単一可変ドメインについて開示している国際公開第ＷＯ２００６０３８０２７号パンフレットを参照する。この文書の開示は、その全体が本明細書に組み込まれ、具体的には、本発明の状況においてこれら開示を具体的且つ明確に適用できるように、抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメイン、リガンド、アンタゴニスト等の使用、フォーマット、選択方法、生成方法、製剤化方法、及びアッセイを提供するため、例えば、本開示の特許請求の範囲に重要性についての明示的な記載を提供するためである。
【０１２２】
本発明の抗ＴＮＦＲ１は、任意でヒト可変ドメインであるか、あるいはヒトフレームワーク領域（例えば、ＤＰ４７又はＤＰＫ９フレームワーク領域）を含むか又はそれに由来する可変ドメインである免疫グロブリン単一可変ドメインである。特定の実施形態では、可変ドメインは、本明細書に記載するユニバーサルフレームワークに基づく。
【０１２３】
特定の実施形態では、ＴＮＦＲ１に対する結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチドドメイン（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、凝集に対して耐性であり、可逆的に展開する（国際公開第ＷＯ０４１０１７９０号パンフレットを参照されたい、この教示は参照することによって本明細書に組み込まれる）。
【０１２４】
核酸分子、ベクター及び宿主細胞
また、本発明は、本明細書に記載するリガンド（単一可変ドメイン、融合タンパク質、ポリペプチド、二重特異性リガンド、及び多重特異性リガンド）をコードする単離及び／又は組換え核酸分子を提供する。
【０１２５】
１つの態様では、本発明は、本発明に係る免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする単離又は組換え核酸を提供する。１つの実施形態では、核酸配列は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のヌクレオチド配列を含む。１つの態様では、本発明は、単離又は組換え核酸であって、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のヌクレオチド配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、且つＴＮＦＲ１に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供する。１つの態様では、本発明は、単離又は組換え核酸であって、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のヌクレオチド配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、ＴＮＦＲ１に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供する。１つの態様では、本発明は、単離又は組換え核酸であって、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ５７４−２０１  ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のヌクレオチド配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、ＴＮＦＲ１に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供する。１つの態様では、本発明は、単離又は組換え核酸であって、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のヌクレオチド配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、ＴＮＦＲ１に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【０１２６】
１つの態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。１つの態様では、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを生成する方法であって、核酸又はベクターの発現に好適な条件下で宿主細胞を維持し、それによって、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを生成する方法を提供する。任意で、前記方法は、ポリペプチドを単離する工程と、任意で、標準的なＭＲＣ５、Ｌ９２９、又はカニクイザルＫＩアッセイにおいてＴＮＦＲ１の中和について単離ポリペプチドよりも改善された親和性（ＫＤ）；ＮＤ５０を有する変異体、例えば、突然変異体を生成する工程とを更に含む。
【０１２７】
本明細書で「単離」と称する核酸は、その起源（例えば、細胞内に又はライブラリ等の核酸の混合物中に存在するとき）のゲノミックＤＮＡ又は細胞ＲＮＡの核酸から分離されている核酸であり、本質的に純粋な核酸、化学合成によって生成される核酸、生物学的方法と化学的方法との組み合わせによって生成される核酸、及び単離されている組換え核酸を含む、本明細書に記載する方法又は他の好適な方法によって得られる核酸を含む（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｂ．Ｌ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９（９）：２４７１−２４７６（１９９１年）；Ｌｅｗｉｓ，Ａ．Ｐ．及びＪ．Ｓ．Ｃｒｏｗｅ，Ｇｅｎｅ，１０１：２９７−３０２（１９９１年）を参照されたい）。
【０１２８】
本明細書で「組換え」と称する核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び／又は制限酵素を用いるベクターへのクローニング等の人工的な組換え方法に依存する手順によって生成される核酸を含む、組換えＤＮＡ方法によって生成された核酸である。
【０１２９】
特定の実施形態では、単離又は組換え核酸は、本明細書に記載するリガンドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記リガンドは、本明細書に開示するＴＮＦＲ１に結合するｄＡｂ、例えば、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３又はＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。ヌクレオチド配列の同一性は、選択された抗ＴＮＦＲ１のｄＡｂをコードするヌクレオチド配列の全長に対して求めることができる。
【０１３０】
また、本発明は、本発明の組換え核酸分子を含むベクターを提供する。特定の態様では、ベクターは、本発明の組み換え核酸に機能的に連結する１以上の発現制御エレメント又は配列を含む発現ベクターである。また、本発明は、本発明の組換え核酸分子又はベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。好適なベクター（例えば、プラスミド、ファージミド）、発現制御エレメント、宿主細胞、及び本発明の組換え宿主細胞を生成する方法は、当技術分野において公知であり、その例について本明細書に更に記載する。
【０１３１】
好適な発現ベクターは、多数の構成要素、例えば、複製起点、選択可能マーカー遺伝子、１以上の発現制御エレメント、例えば、転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサ、ターミネータ）及び／又は１以上の翻訳シグナル、シグナル配列又はリーダー配列等を含有してもよい。発現制御エレメント及びシグナル配列は、存在する場合、ベクター又は他の起源により提供することができる。例えば、抗体鎖をコードしているクローニングされた核酸の転写及び／又は翻訳制御配列を用いて発現を導くことができる。
【０１３２】
所望の宿主細胞において発現させるためにプロモーターを提供してもよい。プロモーターは、恒常性であっても誘導性であってもよい。例えば、プロモーターは、核酸の転写を導くように、抗体、抗体鎖、又はその一部をコードする核酸に機能的に連結することができる。原核生物（例えば、大腸菌用のｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）及び真核生物（例えばシミアンウイルス４０初期又は後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモーター、サイトメガロウィルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター）の宿主に好適な様々なプロモーターが利用可能である。
【０１３３】
更に、発現ベクターは、典型的に、ベクターを保有する宿主細胞を選択するための選択可能マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合、複製起点を含む。抗生物質又は薬剤抵抗性を付与する生成物をコードする遺伝子が一般的な選択マーカーであり、原核生物（例えば、ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性用のＴｅｔ遺伝子）及び真核細胞（例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８又はジェネテシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン又はヒグロマイシン耐性遺伝子）において使用することができる。ジヒドロ葉酸還元酵素マーカー遺伝子は、様々な宿主においてメトトレキセートで選別することを可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）は、酵母において選択可能マーカーとして使用されることが多い。ウイルス（例えば、バキュロウイルス）又はファージベクター、及びレトロウイルスベクター等の宿主細胞のゲノムに組み込むことができるベクターの使用も考えられる。哺乳類細胞及び原核生物細胞（大腸菌）、昆虫細胞（ショウジョウバエのＳｃｈｎｉｅｄｅｒ  Ｓ２細胞、Ｓｆ９）及び酵母（ピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・パストリス、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））において発現させるのに好適な発現ベクターは、当技術分野において公知である。
【０１３４】
好適な宿主細胞は、大腸菌、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及び／又は他の好適な細菌等の細菌細胞を含む原核生物細胞であってもよく；真菌又は酵母細胞（ピキア・パストリス、アスペルギウス属の種、出芽酵母、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ））又は他の低級真核細胞、及び昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエのＳｃｈｎｉｅｄｅｒ  Ｓ２細胞、Ｓｆ９昆虫細胞（国際公開第ＷＯ９４／２６０８７号パンフレット（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ））、哺乳類（例えば、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１６５０）及びＣＯＳ−７（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１６５１）、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−９０９６、ＣＨＯＣＨＯ  ＤＧ４４（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，ＬＡ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７（７）：４２１６−４２２０（１９８０年）））、２９３（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ−２）、ＣＶ１（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ−７０）、ＷＯＰ（Ｄａｉｌｅｙ，Ｌ．，ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５４：７３９−７４９（１９８５年）、３Ｔ３、２９３Ｔ（Ｐｅａｒ，Ｗ．Ｓ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：８３９２−８３９６（１９９３年））、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０、ＨｕＴ  ７８細胞等、又は植物（例えば、タバコ）等に由来する細胞等の高級真核生物の細胞等の真核生物細胞であってもよい。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９３年）を参照されたい）。幾つかの実施形態では、宿主細胞は、単離宿主細胞であり、多細胞生物（例えば、植物又は動物）の一部ではない。特定の実施形態では、宿主細胞は、非ヒト宿主細胞である。
【０１３５】
また、本発明は、本発明のリガンド（例えば、二重特異性リガンド、多重特異性リガンド）を生成する方法であって、組換え核酸の発現に好適な条件下で本発明の組換え核酸を含む組換え宿主細胞を維持し、それによって、前記組換え核酸が発現し、リガンドが生成されることを含む方法を提供する。幾つかの実施形態では、前記方法はリガンドを単離する工程を更に含む。
【０１３６】
本発明の実施形態に適用可能な開示の詳細については、国際公開第ＷＯ２００６０３８０２７号パンフレットを参照する。例えば、関連する開示は、免疫グロブリン単一可変ドメインに基づくリガンドの調製、ライブラリベクター系、ライブラリ構築、単一可変ドメインの組合せ、リガンドの特性評価、リガンドの構造、骨格、タンパク質スカフォールド、標準配列の多様化、アッセイ、治療用及び診断用の組成物、並びに使用に加えて、「機能的に連結される」、「ナイーブ」、「予防」、「抑制」、「治療」及び「治療上有効な用量」の定義に関する。
【０１３７】
フォーマット
半減期の延長は、免疫グロブリン、特に抗体、更には小さなサイズの抗体断片のインビボ適用において有用である。このような断片（Ｆｖ、ジスルフィド結合したＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ）は、体内から急速にクリアランスされるという問題があり、したがって、体の大部分に速やかに到達することができ、速やかに生成され、且つ取扱も容易であるが、インビボ適用では、インビボで短時間しか持続しないという制限がある。本発明の１つの実施形態は、インビボにおけるリガンドの半減期を延長させることによってこの問題を解決し、その結果、リガンドの機能活性を体内においてより長時間持続させる。リガンドの半減期の薬理学的分析及び測定の方法は、当業者によく知られている。詳細は、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ａら：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ及びＰｅｔｅｒｓら，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６年）に見出すことができる。「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」，Ｍ  Ｇｉｂａｌｄｉ及びＤ  Ｐｅｒｒｏｎ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ発行，第２旧版（１９８２年）も参照する。これには、ｔα及びｔβ半減期等の薬物動態パラメータ及び曲線下面積（ＡＵＣ）について記載されている。半減期及びＡＵＣの定義は、上に提供されている。
【０１３８】
１つの実施形態では、本発明は、１５分間以上の範囲のｔα半減期を有する本発明に係るリガンド（例えば、ポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニスト、多重特異性リガンド）又はリガンドを含む組成物を提供する。１つの実施形態では、前記範囲の下限は、３０分間、４５分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間又は１２時間である。これに加えて又はこれに代えて、本発明に係るリガンド又は組成物は、１２時間以下の範囲のｔα半減期を有する。１つの実施形態では、前記範囲の上限は、１１、１０、９、８、７、６又は５時間である。好適な範囲の例は、１〜６時間、２〜５時間又は３〜４時間である。
【０１３９】
１つの実施形態では、本発明は、約２．５時間以上の範囲のｔβ半減期を有する本発明に係るリガンド（例えば、ポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニスト、多重特異性リガンド）又はリガンドを含む組成物を提供する。１つの実施形態では、前記前記範囲の下限は、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約１０時間、約１１時間、又は約１２時間である。これに加えて又はこれに代えて、本発明に係るリガンド又は組成物は、２１日間以下の範囲のｔβ半減期を有する。１つの実施形態では、前記前記範囲の上限は、約１２時間、約２４時間、約２日間、約３日間、約５日間、約１０日間、約１５日間、又は約２０日間である。１つの実施形態では、本発明に係るリガンド又は組成物は、約１２〜約６０時間の範囲のｔβ半減期を有する。更なる実施形態では、ｔβ半減期は約１２〜約４８時間の範囲である。更なる実施形態では、ｔβ半減期は約１２〜２６時間の範囲である。
【０１４０】
上記基準に加えて又は上記基準に代えて、本発明は、約１ｍｇ・分／ｍＬ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する本発明に係るリガンド又はリガンドを含む組成物を提供する。１つの実施形態では、前記範囲の下限は、約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約１００、約２００、又は約３００ｍｇ・分／ｍＬである。これに加えて又はこれに代えて、本発明に係るリガンド又は組成物は、約６００ｍｇ・分／ｍＬ以下の範囲のＡＵＣを有する。１つの実施形態では、前記範囲の上限は、約５００、約４００、約３００、約２００、約１５０、約１００、約７５、又は約５０ｍｇ・分／ｍＬである。１つの実施形態では、本発明に係るリガンドは、約１５〜約１５０ｍｇ・分／ｍＬ、約１５〜約１００ｍｇ・分／ｍＬ、約１５〜約７５ｍｇ・分／ｍＬ、及び約１５〜約５０ｍｇ・分／ｍＬからなる群より選択される範囲のＡＵＣを有する。
【０１４１】
本発明のポリペプチド及びｄＡｂ及びこれらを含むアンタゴニストは、例えば、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体又はその少なくともトランスフェリン結合部分、抗体のＦｃ領域を結合させることによって、又は抗体ドメインにコンジュゲートさせることによって、より大きな流体力学的サイズを有するようフォーマット化されてもよい。例えば、ポリペプチドｄＡｂ及びアンタゴニストは、抗体のより大きな抗原結合断片として又は抗体としてフォーマット化されてもよい（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖとしてフォーマット化される）。
【０１４２】
本発明のリガンド（例えば、ｄＡｂモノマー及びマルチマー）の流体力学的サイズは、当技術分野において周知の方法を用いて求めることができる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用してリガンドの流体力学の大きさを求めることができる。架橋アガロースマトリクス等の、リガンドの流体力学的サイズを求めるための好適なゲル濾過マトリクスは、周知であり且つ容易に入手可能である。
【０１４３】
リガンドフォーマットのサイズ（例えば、ｄＡｂモノマーに結合しているＰＥＧ部分のサイズ）は、所望の用途によって変動してもよい。例えば、リガンドが循環に残り末梢組織に入ることを意図する場合、リガンドの流体力学的サイズを小さく維持して血流からの血管外遊走を促進することが望ましい。あるいは、リガンドを長期間全身循環に留めておくことが望ましい場合、例えば、Ｉｇ様タンパク質としてフォーマット化することによってリガンドのサイズを大きくしてもよい。
【０１４４】
インビボにおける半減期を延長させる抗原又はエピトープを標的とすることによる半減期の延長
また、リガンドの流体力学的サイズ及びその血清半減期は、本明細書に記載する通り、本発明のＴＮＦＲ１結合ポリペプチド、ｄＡｂ、又はアンタゴニストを、インビボにおける半減期を延長させる抗原又はエピトープと結合する結合ドメイン（例えば、抗体又は抗体断片）とコンジュゲート化又は結合させることによっても延長させることができる。例えば、ＴＮＦＲ１結合剤（例えば、ポリペプチド）は、抗血清アルブミン又は抗新生児Ｆｃ受容体抗体若しくは抗体断片、例えば、抗ＳＡ又は抗新生児Ｆｃ受容体ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はｓｃＦｖに、あるいは抗ＳＡアフィボディ又は抗新生児Ｆｃ受容体アフィボディ又は抗ＳＡアビマーに、あるいはＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＳｐＡ、アフィボディ、アビマー、ＧｒｏＥＩ、及びフィブロネクチンからなる群より選択されるがこれらに限定されないスカフォールドを含む又は抗ＳＡ結合ドメインにコンジュゲート化又は連結することができる（これら結合ドメインの開示については国際公開第ＷＯ２００８０９６１５８号パンフレットを参照されたい、このドメイン及びその配列は、参照することによって本明細書に組み込まれ、本文書の開示の一部を形成する）。コンジュゲート化とは、血清アルブミンに結合する結合ドメインに（共有的に又は非共有的に）結合している本発明のポリペプチド、ｄＡｂ、又はアンタゴニストを含む組成物を指す。
【０１４５】
インビボにおける血清半減期を延長させる好適なポリペプチドとしては、例えば、トランスフェリン受容体特異的リガンド−神経薬学的剤融合タンパク質（例えば、米国特許第５，９７７，３０７号を参照されたい、この教示は参照することによって本明細書に組み込まれる）、脳毛細血管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体（例えば、可溶性トランスフェリン受容体）、インスリン、インシュリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）受容体、インシュリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）受容体、インスリン受容体、血液凝固因子Ｘ、α１−抗トリプシン及びＨＮＦ１αが挙げられる。また、血清半減期を延長させる好適なポリペプチドとしては、アルファ−１糖タンパク質（オロソムコイド；ＡＡＧ、アルファ−１抗キモトリプシン（ＡＣＴ）、アルファ−１ミクログロブリン（タンパク質ＨＣ；ＡＩＭ）、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ  ＩＩＩ）、アポリポタンパク質Ａ−１（Ａｐｏ  Ａ−１）、アポリポタンパク質Ｂ（Ａｐｏ  Ｂ）、セルロプラスミン（Ｃｐ）、補体成分Ｃ３（Ｃ３）、補体成分Ｃ４（Ｃ４）、Ｃ１エステラーゼ阻害因子（Ｃ１  ＩＮＨ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン（ＦＥＲ）、凝血酵素（ＨＰＸ）、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ミオグロビン（Ｍｙｏ）、プレアルブミン（トランスサイレチン；ＰＡＬ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）及びリウマチ因子（ＲＦ）が挙げられる。
【０１４６】
細胞外マトリックス由来の好適なタンパク質としては、例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリン及びフィブロネクチンが挙げられる。コラーゲンが、細胞外マトリクスの主なタンパク質である。約１５種類のコラーゲン分子が現在知られており、体の様々な部分で見出されており、例えば、硬骨、皮膚、腱、靭帯、角膜、内部臓器でみられるＩ型コラーゲン（体内のコラーゲンの９０％を占める）又は軟骨、椎骨円板、脊索及び目の硝子体液でみられるＩＩ型コラーゲンである。
【０１４７】
血液由来の好適なタンパク質としては、例えば、血漿タンパク質（例えば、フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノゲン（例えば、フィブリノゲンＡ、フィブリノゲンＢ）、血清アミロイドタンパク質Ａ、ハプトグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリン及びβ−２ミクログロブリン）、酵素及び酵素阻害剤（例えば、プラスミノゲン、リゾチーム、シスタチンＣ、α１−抗トリプシン及び膵臓トリプシン阻害剤）、免疫グロブリンタンパク質（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、免疫グロブリン軽鎖（カッパ／ラムダ））等の免疫系のタンパク質、輸送タンパク質（例えば、レチノール結合タンパク質、α−１ミクログロブリン）、デフェンシン（例えば、ベータ−デフェンシン１、好中球デフェンシン１、好中球デフェンシン２及び好中球デフェンシン３）等が挙げられる。
【０１４８】
脳血液関門又は神経組織中でみられる好適なタンパク質としては、例えば、メラノコルチン受容体、ミエリン、アルコルビン酸塩輸送体等が挙げられる。
【０１４９】
また、インビボにおける半減期を延長させる好適なポリペプチドとしては、腎臓に局在するタンパク質（例えば、ポリシスチン、ＩＶ型コラーゲン及び有機アニオン輸送体Ｋｌ（エイマン抗原）、肝臓に局在するタンパク質（例えば、アルコール脱水素酵素、Ｇ２５０）、肺に局在するタンパク質（例えば、ＩｇＡに結合する分泌成分）、心臓に局在するタンパク質（例えば、拡張型心筋症に関係しているＨＳＰ２７）、皮膚に局在するタンパク質（例えば、ケラチン）、骨形成活性を示すタンパク質の形質転換増殖因子βスーパーファミリーのサブセットである形態形成タンパク質（ＢＭＰ）等の骨特異的タンパク質（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８）、腫瘍特異的タンパク質（例えば、栄養芽層抗原、ハーセプチン受容体、エストロゲン受容体、カテプシン（例えば、肝臓及び脾臓で見出すことができるカテプシンＢ）が挙げられる。
【０１５０】
好適な疾患特異的タンパク質としては、例えば、活性化Ｔ細胞のみで発現する抗原が挙げられ、例えば、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ；Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，３０４−３０９（１９９９年）を参照されたい）、ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバー、活性化Ｔ細胞において発現し、ヒトＴ細胞白血球ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）産生細胞においてアップレギュレートされる；Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（１）：２６３−７０（２０００年）を参照されたい）。また、好適な疾患特異的タンパク質としては、例えば、ＣＧ６５１２ショウジョウバエ、ヒトパラプレジン、ヒトＦｔｓＨ、ヒトＡＦＧ３Ｌ２、マウスｆｔｓＨを含む金属プロテアーゼ（関節炎／癌に関係）；並びに酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、血管内皮細胞増殖因子／血管透過因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、アンジオジェニン、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、血小板由来内皮成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、胎盤成長要因（Ｐ１ＧＦ）、ミッドカイン血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ）、及びフラクタルカインを含む脈管形成成長因子が挙げられる。
【０１５１】
また、インビボにおける半減期を延長させる好適なポリペプチドとしては、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）等のストレスタンパク質が挙げられる。ＨＳＰは、通常、細胞内にみられる。ＨＳＰが細胞外にみられる場合、細胞が死に、その内容物が溢れ出たことを示す。このプログラムされていない細胞死（壊死）は、外傷、疾患、又は損傷の結果として、細胞外ＨＳＰが免疫系からの応答をトリガーするときに生じる。細胞外ＨＳＰに結合することによって、本発明の組成物は疾患部位に局在することができる。
【０１５２】
Ｆｃ輸送に関与する好適なタンパク質としては、例えば、ブランベル（Ｂｒａｍｂｅｌｌ）受容体（ＦｃＲＢとしても知られている）が挙げられる。このＦｃ受容体は、２つの機能を有しており、その両方が送達に有用である可能性がある。その機能とは、（１）胎盤を通して母から子へＩｇＧを輸送する機能、（２）分解からＩｇＧを保護し、それによって、血清半減期を延長させる機能である。受容体はエンドソームからＩｇＧを再利用すると考えられる。（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１５（７）：６３２−６（１９９７年）を参照されたい）。
【０１５３】
血清アルブミンに結合するｄＡｂ
本発明は、１つの実施形態において、リガンド、ポリペプチド又はアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦＲ１に結合する抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ（第１のｄＡｂ）と、血清アルブミン（ＳＡ）に結合する第２のｄＡｂとを含む二重特異性リガンド）を提供し、前記第２のｄＡｂは、表面プラズモン共鳴によって測定するとき、約１ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約１００、約２００、約３００、約４００、又は約５００μＭ（すなわち、×１０−９〜５×１０−４Ｍ）、あるいは約１００ｎＭ〜約１０μＭ、又は約１〜約５μＭ、又は約３〜約７０ｎＭ、又は約１０ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、若しくは約５μＭのＫＤでＳＡに結合する。例えば、表面プラズモン共鳴によって測定するとき、約３０〜約７０ｎＭである。１つの実施形態では、第１のｄＡｂ（又はｄＡｂモノマー）は、表面プラズモン共鳴によって測定するとき、およそ約１、約５０、約７０、約１００、約１５０、約２００、約３００ｎＭ、又は約１、約２、若しくは約３μＭのＫＤでＳＡ（例えばＨＳＡ）に結合する。１つの実施形態では、第１の抗ＳＡ  ｄＡｂとＴＮＦＲ１に対する第２のｄＡｂとを含む二重特異性リガンドについて、その標的に対する第２のｄＡｂの親和性（表面プラズモン共鳴によって、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて測定するとき、ＫＤ及び／又はＫｏｆｆ）は、ＳＡに対する第１のｄＡｂの親和性の約１〜約１０００００倍（例えば、約１００〜約１０００００倍、又は約１０００〜約１０００００倍、又は約１００００〜約１０００００倍）である。１つの実施形態では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。例えば、第１のｄＡｂは、およそ約１０μＭの親和性でＳＡに結合するが、第２のｄＡｂは、約１００ｐＭの親和性でその標的に結合する。１つの実施形態では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。１つの実施形態では、第１のｄＡｂは、およそ約５０、例えば、約７０、約１００、約１５０、又は約２００ｎＭのＫＤでＳＡ（例えばＨＳＡ）に結合する。二重特異性リガンドについての詳細は、国際公開第ＷＯ０３００２６０９号パンフレット、国際公開第ＷＯ０４００３０１９号パンフレット、国際公開第ＷＯ２００８０９６１５８号パンフレット、及び国際公開第ＷＯ０４０５８８２１号パンフレットに見出すことができる。
【０１５４】
本発明のリガンドは、１つの実施形態において、表面プラズモン共鳴によって測定するとき、約１ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約１００、約２００、約３００、約４００、又は約５００μＭ（すなわち、×約１０−９〜約５×１０−４Ｍ）、あるいは約１００ｎＭ〜約１０μＭ、又は約１〜約５μＭ、又は約３〜約７０ｎＭ、又は約１０ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、若しくは約５μＭのＫＤで血清アルブミン（ＳＡ）に結合するｄＡｂを含む。例えば、表面プラズモン共鳴によって測定するとき、約３０〜約７０ｎＭである。１つの実施形態では、第１のｄＡｂ（又はｄＡｂモノマー）は、表面プラズモン共鳴によって測定するとき、およそ約１、約５０、約７０、約１００、約１５０、約２００、約３００ｎＭ、あるいは約１、約２、又は約３μＭのＫＤでＳＡ（例えばＨＳＡ）に結合する。１つの実施形態では、第１及び第２のｄＡｂは、リンカー、例えば、１〜４アミノ酸、又は１〜３アミノ酸、又は３アミノ酸超、又は４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０アミノ酸超のリンカーによって連結される。１つの実施形態では、効力（アンタゴニストにおける一方又は両方のｄＡｂのＫＤ）を高めるために、より長いリンカー（３アミノ酸超）が用いられる。
【０１５５】
リガンド及びアンタゴニストの特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、ＤＯＭ７ｈ−１１、ＤＯＭ７ｈ−１１−３、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５、ＤＯＭ７ｈ−１４、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０、ＤＯＭ７ｈ−１４−１８及びＤＯＭ７ｍ−１６からなる群より選択されるｄＡｂと、アルブミンに対する結合について競合する。
【０１５６】
リガンド及びアンタゴニストの特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、以下からなる群より選択されるｄＡｂと、アルブミンに対する結合について競合する：
ＭＳＡ−１６、ＭＳＡ−２６（これらの配列の開示については国際公開第ＷＯ０４００３０１９号パンフレットを参照されたい、これらの配列及びその核酸相当物は、参照することによって本明細書に組み込まれ、本文書の開示の一部を形成する）、
ＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号４７３）、ＤＯＭ７ｍ−１２（配列番号４７４）、ＤＯＭ７ｍ−２６（配列番号４７５）、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４７６）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号４７７）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号４７８）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号４７９）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号４８０）、ＤＯＭ７ｒ−８（配列番号４８１）、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号４９９）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号５００）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号５０１）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号５０２）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号５０３）、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号５０４）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号５０５）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号５０６）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号５０７）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号５０８）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号５０９）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号５１０）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号５１１）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５１２）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１３）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５１４）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号１５１）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５１６）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５１７）（これらの配列の開示については国際公開第ＷＯ２００７０８０３９２号パンフレットを参照されたい、これらの配列及びその核酸相当物は、参照することによって本明細書に組み込まれ、本文書の開示の一部を形成する；この段落中の配列番号は、国際公開第ＷＯ２００７０８０３９２号パンフレットに記載されているものである）、
ｄＡｂ８（ｄＡｂ１０）、ｄＡｂ１０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｒ２０（ＤＯＭ７ｒ２０）、ｄＡｂ７ｒ２１（ＤＯＭ７ｒ２１）、ｄＡｂ７ｒ２２（ＤＯＭ７ｒ２２）、ｄＡｂ７ｒ２３（ＤＯＭ７ｒ２３）、ｄＡｂ７ｒ２４（ＤＯＭ７ｒ２４）、ｄＡｂ７ｒ２５（ＤＯＭ７ｒ２５）、ｄＡｂ７ｒ２６（ＤＯＭ７ｒ２６）、ｄＡｂ７ｒ２７（ＤＯＭ７ｒ２７）、ｄＡｂ７ｒ２８（ＤＯＭ７ｒ２８）、ｄＡｂ７ｒ２９（ＤＯＭ７ｒ２９）、ｄＡｂ７ｒ２９（ＤＯＭ７ｒ２９）、ｄＡｂ７ｒ３１（ＤＯＭ７ｒ３１）、ｄＡｂ７ｒ３２（ＤＯＭ７ｒ３２）、ｄＡｂ７ｒ３３（ＤＯＭ７ｒ３３）、ｄＡｂ７ｒ３３（ＤＯＭ７ｒ３３）、ｄＡｂ７ｈ２２（ＤＯＭ７ｈ２２）、ｄＡｂ７ｈ２３（ＤＯＭ７ｈ２３）、ｄＡｂ７ｈ２４（ＤＯＭ７ｈ２４）、ｄＡｂ７ｈ２５（ＤＯＭ７ｈ２５）、ｄＡｂ７ｈ２６（ＤＯＭ７ｈ２６）、ｄＡｂ７ｈ２７（ＤＯＭ７ｈ２７）、ｄＡｂ７ｈ３０（ＤＯＭ７ｈ３０）、ｄＡｂ７ｈ３１（ＤＯＭ７ｈ３１）、ｄＡｂ２（ｄＡｂ４、７、４１）、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２（ｄＡｂ７ｍ１２）、ｄＡｂ１３（ｄＡｂ１５）、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６（ｄＡｂ２１、ｄＡｂ７ｍ１６）、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５（ｄＡｂ２６、ｄＡｂ７ｍ２６）、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０（ｄＡｂ３５）、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８（ｄＡｂ５４）、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６（ｄＡｂ４７、５２及び５６）、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｍ１２、ｄＡｂ７ｍ１６、ｄＡｂ７ｍ２６、ｄＡｂ７ｒ１（ＤＯＭ７ｒ１）、ｄＡｂ７ｒ３（ＤＯＭ７ｒ３）、ｄＡｂ７ｒ４（ＤＯＭ７ｒ４）、ｄＡｂ７ｒ５（ＤＯＭ７ｒ５）、ｄＡｂ７ｒ７（ＤＯＭ７ｒ７）、ｄＡｂ７ｒ８（ＤＯＭ７ｒ８）、ｄＡｂ７ｒ１３（ＤＯＭ７ｒ１３）、ｄＡｂ７ｒ１４（ＤＯＭ７ｒ１４）、ｄＡｂ７ｒ１５（ＤＯＭ７ｒ１５）、ｄＡｂ７ｒ１６（ＤＯＭ７ｒ１６）、ｄＡｂ７ｒ１７（ＤＯＭ７ｒ１７）、ｄＡｂ７ｒ１８（ＤＯＭ７ｒ１８）、ｄＡｂ７ｒ１９（ＤＯＭ７ｒ１９）、ｄＡｂ７ｈ１（ＤＯＭ７ｈ１）、ｄＡｂ７ｈ２（ＤＯＭ７ｈ２）、ｄＡｂ７ｈ６（ＤＯＭ７ｈ６）、ｄＡｂ７ｈ７（ＤＯＭ７ｈ７）、ｄＡｂ７ｈ８（ＤＯＭ７ｈ８）、ｄＡｂ７ｈ９（ＤＯＭ７ｈ９）、ｄＡｂ７ｈ１０（ＤＯＭ７ｈ１０）、ｄＡｂ７ｈ１１（ＤＯＭ７ｈ１１）、ｄＡｂ７ｈ１２（ＤＯＭ７ｈ１２）、ｄＡｂ７ｈ１３（ＤＯＭ７ｈ１３）、ｄＡｂ７ｈ１４（ＤＯＭ７ｈ１４）、ｄＡｂ７ｐ１（ＤＯＭ７ｐ１）、及びｄＡｂ７ｐ２（ＤＯＭ７ｐ２）（これらの配列の開示については国際公開第ＷＯ２００８０９６１５８号パンフレットを参照されたい、これらの配列及びその核酸相当物は、参照することによって本明細書に組み込まれ、本文書の開示の一部を形成する）。ｄＡｂの後ろの括弧内に別名を示す、例えば、ｄＡｂ８は、ｄＡｂ１０という別名を有する、すなわちｄＡｂ８（ｄＡｂ１０）である。
【０１５７】
特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、ＤＯＭ７ｈ−１１、ＤＯＭ７ｈ−１１−３、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５、ＤＯＭ７ｈ−１４、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０、ＤＯＭ７ｈ−１４−１８及びＤＯＭ７ｍ−１６からなる群より選択されるｄＡｂのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくともは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５８】
特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、以下からなる群より選択されるｄＡｂのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくともは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＭＳＡ−１６、ＭＳＡ−２６、
ＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号４７３）、ＤＯＭ７ｍ−１２（配列番号４７４）、ＤＯＭ７ｍ−２６（配列番号４７５）、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４７６）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号４７７）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号４７８）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号４７９）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号４８０）、ＤＯＭ７ｒ−８（配列番号４８１）、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号４９９）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号５００）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号５０１）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号５０２）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号５０３）、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号５０４）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号５０５）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号５０６）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号５０７）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号５０８）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号５０９）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号５１０）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号５１１）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５１２）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１３）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５１４）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号１５１）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５１６）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５１７）（この段落中の配列番号は、国際公開第ＷＯ２００７０８０３９２号パンフレットに記載されているものである）、
ｄＡｂ８、ｄＡｂ１０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｒ２０、ｄＡｂ７ｒ２１、ｄＡｂ７ｒ２２、ｄＡｂ７ｒ２３、ｄＡｂ７ｒ２４、ｄＡｂ７ｒ２５、ｄＡｂ７ｒ２６、ｄＡｂ７ｒ２７、ｄＡｂ７ｒ２８、ｄＡｂ７ｒ２９、ｄＡｂ７ｒ３０、ｄＡｂ７ｒ３１、ｄＡｂ７ｒ３２、ｄＡｂ７ｒ３３、ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、Ａｂ７ｈ２４、Ａｂ７ｈ２５、Ａｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２、ｄＡｂ１３、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５、ｄＡｂ２６、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｍ１２、ｄＡｂ７ｍ１６、ｄＡｂ７ｍ２６、ｄＡｂ７ｒ１、ｄＡｂ７ｒ３、ｄＡｂ７ｒ４、ｄＡｂ７ｒ５、ｄＡｂ７ｒ７、ｄＡｂ７ｒ８、ｄＡｂ７ｒ１３、ｄＡｂ７ｒ１４、ｄＡｂ７ｒ１６、ｄＡｂ７ｒ１７、ｄＡｂ７ｒ１８、ｄＡｂ７ｒ１９、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３、ｄＡｂ７ｈ１４、ｄＡｂ７ｐ１及びｄＡｂ７ｐ２。
【０１５９】
例えば、ヒト血清アルブミンに結合するｄＡｂは、ＤＯＭ７ｈ−１１−３又はＤＯＭ７ｈ−１４−１０と少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくともは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【０１６０】
例えば、ヒト血清アルブミンに結合するｄＡｂは、以下と少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくともは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、又はＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）（この段落中の配列番号は、国際公開第ＷＯ２００７０８０３９２号パンフレットに記載されているものである）、あるいは
ｄＡｂ８、ｄＡｂ１０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、Ａｂ７ｈ２４、Ａｂ７ｈ２５、Ａｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２、ｄＡｂ１３、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５、ｄＡｂ２６、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３又はｄＡｂ７ｈ１４。
【０１６１】
特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、以下からなる群より選択されるｄＡｂのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくともは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、又はＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）（この段落中の配列番号は、国際公開第ＷＯ２００７０８０３９２号パンフレットに記載されているものである）、あるいは
ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、Ａｂ７ｈ２４、Ａｂ７ｈ２５、Ａｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３及びｄＡｂ７ｈ１４。
【０１６２】
より具体的な実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合するＶκｄＡｂであり、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）（この段落中の配列番号は、国際公開第ＷＯ２００７０８０３９２号パンフレットに記載されているものである）、
ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３及びｄＡｂ７ｈ１４。
【０１６３】
より具体的な実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合するＶＨｄＡｂであり、ｄＡｂ７ｈ３０及びｄＡｂ７ｈ３１から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１６４】
より具体的な実施形態では、ｄＡｂは、ｄＡｂ７ｈ１１又はｄＡｂ７ｈ１４である。一例では、ｄＡｂはＤＯＭ７ｈ−１１−３である。別の例では、ｄＡｂはＤＯＭ７ｈ−１４−１０である。
【０１６５】
他の実施形態では、ｄＡｂ、リガンド又はアンタゴニストは、ヒト血清アルブミンに結合し、前述のアミノ酸配列のうちのいずれかのＣＤＲのうちの１つ、２つ又は３つ、例えば、ＤＯＭ７ｈ−１１−３、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０、ｄＡｂ７ｈ１１又はｄＡｂ７ｈ１４のＣＤＲのうちの１つ、２つ又は３つを含む。
【０１６６】
血清アルブミンに結合する好適なラクダ科ＶＨＨとしては、国際公開第ＷＯ２００４／０４１８６２号パンフレット（Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．）及び国際公開第ＷＯ２００７０８０３９２号パンフレットに開示されているものが挙げられ（これらのＶＨＨ配列及びその核酸相当物は、参照することによって本明細書に組み込まれ、本文書の開示の一部を形成する）、例えば、配列Ａ（配列番号５１８）、配列Ｂ（配列番号５１９）、配列Ｃ（配列番号５２０）、配列Ｄ（配列番号５２１）、配列Ｅ（配列番号５２２）、配列Ｆ（配列番号５２３）、配列Ｇ（配列番号５２４）、配列Ｈ（配列番号５２５）、配列Ｉ（配列番号５２６）、配列Ｊ（配列番号５２７）、配列Ｋ（配列番号５２８）、配列Ｌ（配列番号５２９）、配列Ｍ（配列番号５３０）、配列Ｎ（配列番号５３１）、配列Ｏ（配列番号５３２）、配列Ｐ（配列番号５３３）、配列Ｑ（配列番号５３４）である。これらの配列番号は、国際公開第ＷＯ２００７０８０３９２号パンフレット又は国際公開第ＷＯ２００４／０４１８６２号パンフレット（Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．）に記載されている番号に対応する。特定の実施形態では、ラクダ科のＶＨＨはヒト血清アルブミンに結合し、国際公開第ＷＯ２００７０８０３９２号パンフレットに開示されているＡＬＢ１又は配列番号５１８〜５３４のいずれか１つと少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくともは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。これらの配列番号は、国際公開第ＷＯ２００７０８０３９２号パンフレット又は国際公開第ＷＯ２００４／０４１８６２号パンフレットに記載されている番号に対応する。
【０１６７】
幾つかの実施形態では、リガンド又はアンタゴニストは、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に対する結合について、本明細書に開示する任意の抗血清アルブミンｄＡｂと競合する抗血清アルブミンｄＡｂを含む。
【０１６８】
別の実施形態では、アンタゴニスト又はリガンドは、ＳＡ（例えば、ヒトのＳＡ）に対して特異的な結合部分を含み、前記部分は、国際公開第ＷＯ２００８０９６１５８号パンフレットに記載されている通り非免疫グロブリン配列を含み、これら結合部分、これらの生成及び（例えば、多様なライブラリからの）選択方法、及びこれらの配列についての開示は、本文書の開示の一部として参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
半減期延長部分（例えば、アルブミン）へのコンジュゲート化
１つの実施形態では、（１以上の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリン、並びにこれらの断片及び類似体）は、本発明のＴＮＦＲ１結合ポリペプチド、ｄＡｂ、又はアンタゴニストとコンジュゲート化又は結合する。ＴＮＦＲ１結合フォーマットにおいて使用するための好適なアルブミン、アルブミン断片、又はアルブミン変異体の例は、国際公開第ＷＯ２００５０７７０４２号パンフレットに記載されており、この開示は、参照することによって本明細書に組み込まれ、本文書の開示の一部を形成する。具体的には、以下のアルブミン、アルブミン断片又はアルブミン変異体を本発明で用いることができる：
・配列番号１（国際公開第ＷＯ２００５０７７０４２号パンフレットに開示されている通り、この配列は参照することによって本開示に明示的に組み込まれる）；
・国際公開第ＷＯ２００５０７７０４２号パンフレットにおける配列番号１のアミノ酸１〜３８７を含むか又はこれらからなるアルブミン断片又は変異体；
・以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むアルブミン、又はその断片若しくは変異体：（ａ）国際公開第ＷＯ２００５０７７０４２号パンフレットにおける配列番号１のアミノ酸５４〜６１；（ｂ）国際公開第ＷＯ２００５０７７０４２号パンフレットにおける配列番号１のアミノ酸７６〜８９；（ｃ）国際公開第ＷＯ２００５０７７０４２号パンフレットにおける配列番号１のアミノ酸９２〜１００；（ｄ）国際公開第ＷＯ２００５０７７０４２号パンフレットにおける配列番号１のアミノ酸１７０〜１７６；（ｅ）国際公開第ＷＯ２００５０７７０４２号パンフレットにおける配列番号１のアミノ酸２４７〜２５２；（ｆ）国際公開第ＷＯ２００５０７７０４２号パンフレットにおける配列番号１のアミノ酸２６６〜２７７；（ｇ）国際公開第ＷＯ２００５０７７０４２号パンフレットにおける配列番号１のアミノ酸２８０〜２８８；（ｈ）国際公開第ＷＯ２００５０７７０４２号パンフレットにおける配列番号１のアミノ酸３６２〜３６８；（ｉ）国際公開第ＷＯ２００５０７７０４２号パンフレットにおける配列番号１のアミノ酸４３９〜４４７；（ｊ）国際公開第ＷＯ２００５０７７０４２号パンフレットにおける配列番号１のアミノ酸４６２〜４７５；（ｋ）国際公開第ＷＯ２００５０７７０４２号パンフレットにおける配列番号１のアミノ酸４７８〜４８６；及び（ｌ）国際公開第ＷＯ２００５０７７０４２号パンフレットにおける配列番号１のアミノ酸５６０〜５６６。
【０１７０】
ＴＮＦＲ１結合フォーマットにおいて使用するための好適なアルブミン、断片及び類似体の更なる例は、国際公開第ＷＯ０３０７６５６７号パンフレットに記載されており、この開示は、参照することによって本明細書に組み込まれ、本文書の開示の一部を形成する。具体的には、以下のアルブミン、アルブミン断片又は変異体を本発明で用いることができる：
・国際公開第ＷＯ０３０７６５６７号パンフレットの例えば図３に記載されているようなヒト血清アルブミン（この配列情報は、参照することによって本開示に明示的に組み込まれる）；
・式分子量６６，５００を有する５８５アミノ酸の単一非グリコシル化ポリペプチド鎖からなるヒト血清アルブミン（ＨＡ）（Ｍｅｌｏｕｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８：１３６（１９７５年）；Ｂｅｈｒｅｎｓら，Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．３４：５９１（１９７５年）；Ｌａｗｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９：６１０２−６１１４（１９８１年）；Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６７４７（１９８６年）を参照されたい）；
・Ｗｅｉｔｋａｍｐら，Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３７：２１９（１９７３年）に記載されているようなアルブミンの多形変異体又は類似体又は断片；
・欧州特許第３２２０９４号明細書に記載されているようなアルブミン断片又は変異体、例えば、ＨＡ（１−３７３、ＨＡ（１−３８８）、ＨＡ（１−３８９）、ＨＡ（１−３６９）、及びＨＡ（１−４１９）、並びに１〜３６９と１〜４１９との間の断片；
・欧州特許第３９９６６６号明細書に記載されているようなアルブミン断片又は変異体、例えば、ＨＡ（１−１７７）及びＨＡ（１−２００）、並びにＨＡ（１−Ｘ）間の断片（Ｘは、１７８〜１９９の任意の数である）。
【０１７１】
（１以上の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリン、並びにこれらの断片及び類似体）を用いて本発明のＴＮＦＲ１結合ポリペプチド、ｄＡｂ、及びアンタゴニストをフォーマット化する場合、例えば、ＴＮＦＲ１結合部分（例えば、抗ＴＮＦＲ１ｄＡｂ）に直接融合させることによる等の任意の好適な方法を用いて、例えば、ＴＮＦＲ１結合部分のＮ末端又はＣ末端に位置する半減期延長部分を有する単一ポリペプチド鎖としてコードされている融合タンパク質をコードする単一ヌクレオチドコンストラクトを用いることによってコンジュゲート化させることができる。あるいは、コンジュゲート化は、部分間にペプチドリンカー、例えば、国際公開第ＷＯ０３０７６５６７号パンフレット又は国際公開第ＷＯ２００４００３０１９号パンフレット（これらリンカーの開示は、本発明において使用するための例を提供するために本開示において参照することによって組み込まれる）に記載されているようなペプチドリンカーを用いることによって行うことができる。典型的に、インビボにおいて血清半減期を延長させるポリペプチドは、インビボで自然に生じ、且つ生物（例えば、ヒト）から望ましくない物質を除去する内因性機序による分解又は除去に対して耐性であるポリペプチドである。例えば、インビボにおいて血清半減期を延長させるポリペプチドは、細胞外マトリックス由来のタンパク質、血液でみられるタンパク質、脳血液関門又は神経組織でみられるタンパク質、腎臓、肝臓、肺、心臓、皮膚又は硬骨に局在するタンパク質、ストレスタンパク質、疾患特異的なタンパク質、又はＦｃ輸送に関与するタンパク質から選択することができる。
【０１７２】
この開示全体を通して記載される本発明の実施形態では、本発明のアンタゴニスト又はリガンドにおける抗ＴＮＦＲ１単一可変ドメイン（「ｄＡｂ」）を使用する代わりに、当業者は、ＴＮＦＲ１に結合する本発明のｄＡｂのＣＤＲのうちの１以上又は３つ全てを含むポリペプチド又はドメイン（例えば、好適なタンパク質スカフォールド又は骨格、例えば、アフィボディ、ＳｐＡスカフォールド、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、又はＥＧＦドメインにグラフト化されるＣＤＲ）を使用できると考えられる。したがって、開示は全体として、ｄＡｂの代わりにこのようなドメインを用いるアンタゴニストの開示を提供すると解釈される。これに関して、タンパク質スカフォールドに基づく多様なライブラリを作成する方法、並びにこのようなライブラリからドメインの選択及び特性評価を行う方法の詳細については国際公開第ＷＯ２００８０９６１５８号パンフレットを参照されたい（この開示は参照することによって組み込まれる）。
【０１７３】
したがって、１つの実施形態では、本発明のアンタゴニストは、ＴＮＦＲ１に対する結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン又はドメイン抗体（ｄＡｂ）、又は好適なフォーマットのこのようなｄＡｂの相補性決定領域を含む。アンタゴニストは、このようなｄＡｂからなるか、又はこのようなｄＡｂから本質的になるポリペプチドであってよい。アンタゴニストは、抗体フォーマット（例えば、ＩｇＧ様フォーマット、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）等の好適なフォーマットのｄＡｂ（又はｄＡｂのＣＤＲ）を含むポリペプチド、あるいはＴＮＦＲ１に結合するｄＡｂと、別の標的タンパク質、抗原、又はエピトープ（例えば、血清アルブミン）に結合する第２のｄＡｂとを含む二重特異性リガンドであってよい。
【０１７４】
ＩｇＧ様フォーマット、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／又は軽鎖のホモダイマー及びヘテロダイマー、前述のいずれかの抗原結合断片（例えば、Ｆｖ断片（例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合したＦｖ）、ＦＡｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＬ）、ｄＡｂ、並びに（ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール）又は他の好適なポリマーの共有結合により修飾される）前述のいずれかの修飾体等の当技術分野において公知である様々な好適な抗体フォーマットとして、本発明に係るポリペプチド、ｄＡｂ、及びアンタゴニストをフォーマット化してもよい。
【０１７５】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩｇＧ様フォーマットであるリガンド（例えば、抗ＴＮＦＲ１アンタゴニスト）を提供する。このようなフォーマットは、ＩｇＧ分子の従来の４鎖構造（２本の重鎖と２本の軽鎖）を有し、可変領域のうちの１以上（ＶＨ及び／又はＶＬ）は、本発明のｄＡｂに置換されている。１つの実施形態では、可変領域（２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域）のそれぞれが、ｄＡｂ又は単一可変ドメインで置換されており、そのうちの１つが本発明に係る抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂである。ＩｇＧ様フォーマットに含まれるｄＡｂ又は単一可変ドメインは、同じ特異性を有していてもよく、異なる特異性を有していてもよい。幾つかの実施形態では、ＩｇＧ様フォーマットは、四価であり、一重（抗ＴＮＦＲ１のみ）、二重（例えば、抗ＴＮＦＲ１と抗ＳＡ）、三重、又は四重の特異性を有することができる。例えば、ＩｇＧ様フォーマットは、一重特異的であり得、同じ特異性を有する４つのｄＡｂを含み；二重特異性であり得、同じ特異性を有する３つのｄＡｂと異なる特異性を有する別のｄＡｂとを含み；二重特異性であり得、同じ特異性を有する２つのｄＡｂと、共通であるが異なる特異性を有する２つのｄＡｂとを含み；三重特異的であり得、同じ特異性を有する第１及び第２のｄＡｂと、異なる特異性を有する第３のｄＡｂと、第１、第２、及び第３のｄＡｂと異なる特異性を有する第４のｄＡｂとを含んでもよく；あるいは、四重特異的であり得、それぞれ異なる特異性を有する４つのｄＡｂを含む。ＩｇＧ様フォーマット（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦＶ）の抗原結合断片を調製することができる。１つの実施形態では、ＩｇＧ様フォーマット又は抗原結合断片は、ＴＮＦＲ１に対して一価であってよい。補体活性化及び／又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能が望ましい場合、リガンドは、ＩｇＧ１様フォーマットであってもよい。必要に応じて、ＩｇＧ様フォーマットは、Ｆｃ受容体に対する結合及び／又は補体を固定する能力を最小化するために突然変異定常領域（変異体ＩｇＧ重鎖定常領域）を含んでもよい。（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら．，英国特許第２，２０９，７５７Ｂ号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，国際公開第ＷＯ８９／０７１４２号パンフレット；Ｍｏｒｇａｎら，国際公開第ＷＯ９４／２９３５１号パンフレット，１９９４年１２月２２日）を参照されたい）。
【０１７６】
本発明のリガンド（例えば、ポリペプチド、ｄＡｂ、及びアンタゴニスト）は、第２の免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合する第１の免疫グロブリン単一可変ドメインを含有する融合タンパク質としてフォーマット化されてもよい。必要に応じて、このようなフォーマットは、半減期延長部分を更に含んでもよい。例えば、リガンドは、血清アルブミンに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合する第２の免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合する第１の免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
【０１７７】
一般的に、標的に対する結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチドドメインの配向は、リガンドがリンカーを含んでいようといまいと、設計上の選択の問題である。しかし、幾つかの配向は、リンカーを用いて又は用いずに、他の配向よりも優れた結合特性を提供することができる。本発明に包含される全ての配向（例えば、ｄＡｂ１−リンカー−ｄＡｂ２；ｄＡｂ２−リンカー−ｄＡｂ１）は、スクリーニングによって容易に同定することができる所望の結合特性を提供する配向を含有するリガンドである。
【０１７８】
ｄＡｂモノマー、ダイマー、及びトリマーを含む本発明に係るポリペプチド及びｄＡｂは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの一方又は両方と、任意でヒンジ領域とを含む、抗体Ｆｃ領域に連結することができる。例えば、単一ヌクレオチド配列としてＦｃ領域に連結するリガンドをコードするベクターを用いて、このようなポリペプチドを調製することができる。
【０１７９】
更に、本発明は、前述のｄＡｂモノマーのダイマー、トリマー、及びポリマーを提供する。
【実施例】
【０１８０】
抗体断片の生物物理学的特性は、抗体断片が治療薬として開発可能であるかどうかの判定において重要な役割を果たす。これら生物物理学的特性のうちの１つは、保存したときの沈殿に対する抗体断片の安定性である。加速安定性試験は、長期間高温でタンパク質をインキュベートし、次いで、沈殿のレベルを判定することによって、安定性をより速やかに評価するために用いられる技術である。したがって、加速安定性について７つの抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂを特性評価した。研究される個々のｄＡｂの特性が非常に異なるので（特に、Ｔｍが異なる）、これらｄＡｂの加速安定性実験は全て４０℃で行った。
【０１８１】
加速安定性について試験するために用いたプロトコールは、以下の通りである：全てのタンパク質をＰＢＳでバッファ交換し、１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整する。４つのアリコート（４つの時点に対応する；０時間、２時間、２３時間、及び４７時間）２５０μＬを０．５ｍＬのエッペンドルフ内で調製した。第１のサンプル（４７時間の時点）を４０℃に設定されたオーブンに入れ；２４時間後に第２のアリコート（２３時間の時点）２５０μＬを前記オーブンに入れ；更に２０時間後、第３のアリコート（２時間の時点）２５０μＬを前記オーブンに入れ；０時間のアリコートは、この実験中４℃で維持した。全てのアリコートは、４０℃のオーブンに入れるまで４℃で維持された。合計４７時間後、全てのアリコートを前記オーブンから取り出し、１０分間１６，１００×ｇで遠心分離した。９６ウェルＵＶプレートリーダーを用いて、各サンプルのＡ２８０を測定して、溶液中に残存するタンパク質の量をモニターした。このデータを用いて各時点における各タンパク質のタンパク質濃度を計算し、次いで、経時的なタンパク質の減少をモニターするために時間に対してプロットした。
【０１８２】
実施例１：抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂの加速安定性についての試験
抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂｓについては、６つの関連する抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ、すなわちＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０に加えて、無関係な抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂであるＤＯＭ１ｈ−１３１−２０６を評価した。ＳａｌＩ／ＮｏｔＩでｐＤＯＭ１３にクローニングされたこれらｄＡｂ全ての遺伝的コンストラクト（ｐＢＲ３２２由来発現ベクター）を大腸菌ＨＢ２１５１に形質転換し、次いで、上清中でタンパク質を発現させた。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７−１２８１−０３）を用いて上清からｄＡｂを一段階精製で精製し、次いで、１００ｍＭのグリセリン（ｐＨ２．０）で溶出し、２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）で中和した。濃縮後、透析によってｄＡｂをＰＢＳにバッファ交換し、１ｍｇ／ｍＬで加速安定性について試験した。加速安定性の結果を表１に示す。表１は、ｔ＝０ｈにおいて存在するｄＡｂの量の百分率として、各時点における溶液中のｄＡｂの量を提示する。
【表１】
2013507978.tif 000002
【０１８３】
ＤＯＭ１ｈ−５７４系列の抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３を除いて、最初の４７時間以内に沈殿する傾向があり、この時点において溶液中のタンパク質の量は実質的に減少する。対照的に、抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ  ＤＯＭ１ｈ−１３１−２０６は、この期間溶液中にとどまる。したがって、加速安定性試験における沈殿に対する耐性をより高めるためにｄＡｂの安定化は有益である。
【０１８４】
実施例２：抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ系列ＤＯＭ１ｈ−５７４の生物物理学特性の改善についての選択及びスクリーニング
高温でインキュベートした後の沈殿に対して改善された耐性を有する新規ｄＡｂを同定するために、以下の５つの抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂに基づいてエラープローンＰＣＲライブラリを構築した：ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２及びＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０。テンプレートとしてｐＤＯＭ１３におけるこれらクローンを用いてエラープローンライブラリを作製し、次いで、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  カタログ番号２００５５０）を用いて２ラウンドのエラープローンＰＣＲに供した。第１のラウンドでは、オリゴヌクレオチドＡＳ９及びＡＳ３３９、並びに以下の増幅プロファイルを用いて５０ｎｇのベクターを体積５０μＬ中にて３０サイクル増幅させた：２分間９５℃、次いで、１５秒間９５℃、３０秒間５０℃、１分間７２℃を３０サイクル；そして、最後に１０分間７２℃。
【０１８５】
第２のラウンドでは、ネステッドプライマーＡＳ６３９及びＡＳ６５、並びに以下の増幅プロファイルを用いるＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）２００μＬによる突然変異誘発の第２のラウンドにおいて、第１のエラープローンＰＣＲ反応産物０．４μＬをテンプレートとして用いた：２分間９５℃、次いで、１５秒間９５℃、３０秒間５０℃、１分間７２℃を３５サイクル；そして、最後に１０分間７２℃。
【０１８６】
Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて２％のＥ−ＧｅｌにおいてＰＣＲ産物を精製し、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ（ＮＥＢ）で切断した。切断反応産物を２％のＥ−Ｇｅｌに流し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いてＥ−ＧｅｌからｄＡｂをコードしているＤＮＡインサートを精製した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼキット（ＮＥＢ）を用いて、精製されたインサートをｐＤＯＭ３３ファージディスプレイにライゲーションした。
【０１８７】
３０ｎＭの０．７μｇ／μＬのＳａｌＩ／ＮｏｔＩで切断されたｐＤＯＭ３３ベクター  ４０μＬ
３００ｎＭのインサート  ３０μＬ
Ｈ２Ｏ  ４００μＬ
１０×バッファ  ５０μＬ
４００Ｕ／μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ  １５μＬ。
【０１８８】
反応物を１８時間１６℃でインキュベートした。反応産物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させ、５０μＬのＨ２Ｏに溶解させ、４００μＬのエレクトロコンピーテントＴＢ１大腸菌細胞に添加し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩを用いて１００μＬの体積で電気穿孔処理した後、テトラサイクリン−２×ＴＹアガロースプレートにプレーティングした。５つのライブラリのそれぞれについて、平均して、約２．４×１０８の個々の形質転換体が得られた。平均して、１遺伝子当たり約３つのアミノ酸が突然変異していた。
【０１８９】
生物物理学的特性の改善についての選択を開始する前に、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，カタログ番号２１３２７）を用いてビオチン化されている可溶性ヒトＴＮＦＲ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて５つのエラープローンファージライブラリを予選択して、ＴＮＦＲ１結合特性を有する機能的ファージを濃縮した。前記予選択は、以下のプロトコールを用いて行った：
１．  室温で１時間、ＰＢＳ中にて、２％のＭａｒｖｅｌでＭ２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍＬをブロッキングする。
【０１９０】
２．  室温で１時間、２％のＭａｒｖｅｌでＰＢＳ０．５ｍＬ中のライブラリの各々について、約１０１１形質転換単位（Ｔｕ）のファージをブロッキングする。
【０１９１】
３．  ４７μＭのビオチン化ヒト可溶性ＴＮＦＲ１  ０．５３μＬをブロッキングされたファーに０．５ｍＬに添加する。室温で１時間インキュベートする。
【０１９２】
４．  ブロッキングされたＤｙｎａｂｅａｄ２００μＬをファージ溶液に添加する。室温で１０分間インキュベートする。
【０１９３】
５．  ＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で５回洗浄する。
【０１９４】
６．  ０．１Ｍのグリシン（ｐＨ＝２）５００μＬで、結合しているファージを溶出する。
【０１９５】
７．  １ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）１００μＬで、溶出されたファージを中和する。
【０１９６】
各ライブラリについて予選択ラウンドの最後に約２％のインプットＴｕファージを回収した。予選択後、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２及びＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のリードクローンのライブラリをプールし、ライブラリＡを形成する。ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６のライブラリＢは、別々に維持した。
【０１９７】
この段階で、４つのファージディスプレイ選択ストラテジを採用して、これらエラープローンＰＣＲライブラリから生物物理学的特性の改善されているＤＯＭ１ｈ−５７４変異体を濃縮した。
【０１９８】
１）高温（６５℃）における動力学的安定性
２）熱変性の可逆性（８０℃）
３）タンパク質分解に対する耐性
４）低ｐＨ誘導性変性の可逆性
ファージディスプレイ選択ラウンド１
ファージディスプレイ選択の第１のラウンドでは、ライブラリＡ及びＢをＰＢＳで５×１０１１Ｔｕ／ｍＬに希釈し、次いで、１００μＬのアリコートを熱、プロテアーゼ、又は低ｐＨ前処理に供した。熱選択については（サンプル１〜４、表２）、５０〜８０℃の温度を用い、インキュベート時間は２時間又は１０分間のいずれかであった。表２に示す通り、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｖ５１１）選択（サンプル５〜７）は、ＰＢＳ中３７℃で２時間、１０〜１００μｇ／ｍＬのトリプシンを用いて行い、対照インキュベートは、ＰＢＳ中で２時間、室温にて行った（サンプル８及び９）。インキュベーション後、５０μＬの２×完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  ０４  ６９３  １１６  ００１）をサンプル５〜９のそれぞれに添加した。サンプル１０〜１３の酸選択については、４２０μＬのＨＮＣバッファ（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ＝３．２）を用いてファージ原液からファージを１０倍希釈した。インキュベーションの最後に（各サンプルの酸インキュベーションの長さは、表２に示す）、サンプルを８０μＬのＴｒｉｓバッファで中和した。
【０１９９】
これらストレス条件でインキュベートした後、予選択工程で上記した通り、ビオチン化ヒト可溶性ＴＮＦＲ１と共にインキュベートすることにより機能的に活性であるｄＡｂについてファージライブラリを選択した。用いたプロトコールに対して、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒを用いて１０回の洗浄工程を実施した点を唯一変更した。ライブラリＡ及びＢの両方を用いた全ての選択について、回収されたファージ数を求め、表２に示す。次いで、次の選択ラウンドのためにファージを増幅させた。
【０２００】
表２：特性の改善についてのラウンド１選択。用いた選択条件及び選択後に２つのライブラリのそれぞれから回収されたＴｕファージを示す。全ての選択についてのインプットは、５×１０１０Ｔｕファージであった。
【表２】
2013507978.tif 000003
【０２０１】
回収量に基づいて、両方のライブラリの選択３、４、５、及び１２（並びにライブラリＡからは選択６も）からのアウトプットを第２の選択ラウンドに進めた。大腸菌感染のラウンドによってファージのアウトプットを増幅させ、次いで、精製し、２×１０１４Ｔｕ／ｍＬに濃縮した。
【０２０２】
ファージディスプレイ選択ラウンド２
ライブラリＡ及びＢから得られた第１の選択ラウンドのアウトプットをＰＢＳで５×１０１１Ｔｕ／ｍＬに希釈し、それぞれの１００μＬのアリコートを第２の選択ラウンドに用いた。同じプロトコールを使用したが、表３に要約されるように選択条件を変更した。
【０２０３】
表３：ラウンド２選択のインプット、条件、及び回収。インプットとは、ラウンド１で用いられる選択条件レファレンスを指す。ライブラリＡについては、ラウンド１における条件５及び６の選択アウトプットをプールし、「＊」の印のついたプールを用いた。選択条件は、リガンドの非存在下におけるバックグラウンド結合についてのネガティブコントロールを含んでいた。全ての選択についてのインプットは、５×１０１０Ｔｕファージであった。
【表３】
2013507978.tif 000004
【０２０４】
ファージのアウトプットを精製し、１×１０１３Ｔｕ／ｍＬに濃縮した。両方のライブラリについて選択１、４、９、及び１２からのアウトプットを次の選択ラウンドに進めた。ファージのアウトプットを大腸菌感染のラウンドによって増幅させ、次いで、精製し、２×１０１４Ｔｕ／ｍＬに濃縮した。
【０２０５】
ファージディスプレイ選択ラウンド３
ライブラリＡ及びＢから得られた第２の選択ラウンドのアウトプットをＰＢＳで５×１０１１Ｔｕ／ｍＬに希釈し、それぞれの１００μＬのアリコートを第３の選択ラウンドに用いた。同じプロトコールを使用したが、表４に要約されるように選択条件を変更した。
【０２０６】
表４：ラウンド３の選択インプット、条件、及び回収。インプットとは、ラウンド２で用いられる選択条件レファレンスを指す。選択条件は、リガンドの非存在下におけるバックグラウンド結合についてのネガティブコントロールを含んでいた。すべての選択についてのインプットは、５×１０１０Ｔｕのファージであり、０．５ｍＬの体積が回収された。結果はＴｕ／ｍｌで表す。
【表４】
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【０２０７】
ラウンド２及びラウンド３からのファージアウトプットを増幅させ、次いで、精製し、１×１０１３Ｔｕ／ｍＬに濃縮した。選択アウトプットから得られたファージを感染させた細菌培養物（１００ｍＬ）を増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉ  ＤＮＡ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて二本鎖ファージＤＮＡを回収するために用いた。
【０２０８】
ラウンド２から得られたｄＡｂインサート、ライブラリＡ及びＢの選択１及び４、並びにラウンド３のライブラリＡの選択２、５、９、１２、１３に加えて、ライブラリＢの選択１、２、５、８、９、１２、及び１３を、プライマーＣＥ２及びＣＥ３と共にＴａｑポリメラーゼを用いてそれぞれのファージ調製アリコートからＰＣＲで増幅させた。増幅産物をゲル精製し、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で切断した後、シークエンシング及び発現のためにｐＤＯＭ１３ベクターにクローニングした。
【０２０９】
選択結果の分析：
上述のファージ選択を用いてライブラリＢからラウンド３後に選択されたＤＯＭ１ｈ−５７４変異体のＤＮＡ配列のプールの分析から、表５に要約する通り、異なる選択圧によって異なるセットの突然変異が優先的に濃縮されていることが明らかになった。観察された特定の突然変異は、選択の出発点として用いられたｄＡｂにも存在する、すなわち、３０Ｖ及び６２Ａは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０に存在し、３０Ｖは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９に存在し、１００Ａは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８に存在する。
【０２１０】
表５：各選択条件について最も頻繁にみられる位置及び変化を示す要約。「＋」の数は、アミノ酸残基の相対度数の指標である。Ｋａｂａｔに従って番号付けする。
【表５】
2013507978.tif 000006
【０２１１】
実施例３：選択されたｄＡｂの特性評価
ＤＮＡ配列分析から得られた情報を用いて、抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂのサブセットを選択し、表６に要約する。これらは、図１に示す通り様々な突然変異が組み合わせられていた。更なる特性評価のために、これらｄＡｂを大腸菌で発現させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅに対するバッチ結合を用いて上清から精製し、ＰＢＳでバッファ交換した。スクリーニングプロセスを促進するために、既に記載した方法から加速安定性試験を僅かに変化させた。
【０２１２】
加速安定性試験については、望ましい時間、サーマルサイクラー内にてインキュベートしたＰＣＲプレートで反応を実施させた：
ｄ）ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬのｄＡｂ  １００μＬをＰＣＲプレートのウェルに分配する。
【０２１３】
ｅ）４０℃又は５０℃で４０時間、タンパク質をインキュベートする。
【０２１４】
ｆ）５０μＬのアリコートを除去し、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）においてＯＤ３２０を測定し、測定後、反応容器に戻す。読み取り値が高いほど、凝集形成されていることを示す。ＯＤ３２０の測定は、これが沈殿及び凝集を求めるのに最も適しているので用いたが、溶液中のタンパク質濃度を求めるためにはＯＤ２８０が最もよく用いられる。
【０２１５】
このスクリーニングの結果を表６に要約する。この分析は、４０℃で測定したとき、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６と比較して多数のｄＡｂの加速安定性が有意に上昇したことを強調する。出発クローンであるＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６は、４０℃で４０時間後、３２０ｎｍにおける吸光度が１．０８であり、これは、かなりの量のタンパク質が沈殿したことを示すが、新規ｄＡｂの多くは低い読み取り値（＜０．５）を有し、これは、大部分のタンパク質が未だ溶液中に存在することを示す。４０℃で４０時間における加速安定性の最も顕著な上昇は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６、及びＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８で観察される。
【０２１６】
表６：加速安定性について試験した新規ｄＡｂ。各ｄＡｂについて、そのライブラリが何に由来するか、及びこのｄＡｂを同定するために用いられた選択条件を示す。ＰＣＲプレートにて４０時間４０℃又は５０℃でインキュベートすることによって、精製ｄＡｂ（１ｍｇ／ｍＬ）を加速安定性について試験した。インキュベート後、各ｄＡｂについてＯＤ３２０を求め、各ウェルにおける沈殿のレベルを確定した。数が小さいほど、ｄＡｂはより安定である。
【表６】
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【０２１７】
ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７をＴｒｉｓ−グリセリンバッファ中で試験した。それは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６よりも安定であった。
【０２１８】
実施例４：安定な抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂは、機能的に活性である
加速安定性の上昇を確認するために、実施例１に記載したより広範囲に及ぶプロトコールに従って４つの新規ｄＡｂの特性評価も行った。このプロトコールでは、ｄＡｂを４０℃で最高４８時間インキュベートし、遠心分離し、ＯＤ２８０を用いて溶液中に残存するｄＡｂを定量する。試験したｄＡｂは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８、及びＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４であった。結果を表７に要約する。４０℃で最初の４８時間にタンパク質の喪失が観察されなかったので、明らかに、これらｄＡｂは、出発ｄＡｂであるＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６（過去のデータ）に比べて著しく安定である。安定性の上昇がｄＡｂの機能的抗ＴＮＦＲ１活性を犠牲にしたものではないことを確認するために、ｄＡｂのＴＮＦＲ１に対する結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＡチップに捕捉したビオチン化ＴＮＦＲ１を用いてＢＩＡｃｏｒｅによって測定した。これら新規ｄＡｂのヒトＴＮＦＲ１に対する親和性はＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６  ｄＡｂについて既に記載した親和性（１５０ｐＭ）よりもわずかに低いが、親ｄＡｂの４倍以内に留まっている。したがって、これらｄＡｂは、ＴＮＦＲ１に対するｄＡｂの親和性の多くを損なうことなく、高い加速安定性を兼ね備えている。
【表７】
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【０２１９】
実施例５：安定な抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂとＡｌｂｕｄＡｂとの遺伝的融合物の構築
抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂｓの血清半減期を延長させるために、アルブミン結合ｄＡｂであるＤＯＭ７ｈ−１１−３と融合させた。選択された４つの安定な抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８及びＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４であり、ＤＯＭ７ｈ−１１−３との融合にはＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒリンカー配列を使用した。これら融合分子の構築は、二段階で行った。まず、プライマーＡＳ９及びＰＡ１５４を用いてＰＣＲによって抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂを増幅させ、精製し、次いで、反応産物をＳａｌＩ／ＮｏｔＩで切断し、ゲル精製し、リンカー及びＤＯＭ７ｈ−１１−３を含有するＳａｌＩ／ＮｏｔＩで切断されたｐＤＯＭ１３ベクターにライゲーションした。ライゲーション後、ＤＮＡをＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞に形質転換し、配列解析のためにコロニーを取り出した。このコンストラクトの配列を確認した後、オリゴヌクレオチドＪＡＬ１０２及びＡＳ６５を使用して抗ＴＮＦＲ１／抗アルブミンカセットを増幅させることにより、構築の第２の工程を行った。反応産物を制限酵素ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩで切断し、アガロースゲルに流し、ゲル抽出によって精製した。次いで、融合産物を含有する精製ＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＮｏｔＩで切断されたｐＥＴ３０ａベクター（Ｍｅｒｃｋ）にクローニングした。発酵槽におけるＩＰＴＧ誘導を用いてタンパク質を発現させ、任意のアミノ酸残基を導くことなくｄＡｂを処理するために、このベクターへのクローニングを行った。これは、ｐＤＯＭ１３ベクターにおいて発現する全てのｄＡｂのＮ末端にＳｅｒ−Ｔｈｒを付加するｐＤＯＭ１３ベクターとは対照的である。以下の抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂ／ＤＯＭ７ｈ−１１−３融合物をｐＥＴ３０ａにおいて構築した：
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【０２２０】
発現させるために、Ａｏｎら．２００８年に記載の通りｐＥＣＯ−１ｐｇｌを含む大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にコンストラクトを形質転換した。次いで、２３℃における後誘導における増殖を用いて４つ全てのコンストラクトを発酵槽内で発現させ、０．０１ｍＭのＩＰＴＧで発現を誘導した。全ての発酵は、５Ｌのスケールで最低限の媒体において高い細胞密度になるまで行った。
【０２２１】
周辺質抽出物を以下の方法で調製した。凍結細胞ペーストを解凍し、３７℃で一晩、０．５ＭのＧｕＨｃｌ、２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１０ｍＭのＥＤＴＡと混合した後、４５００ｇで１時間遠心分離し、ペレットを廃棄した。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａにバッチ結合させ、次いで、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ２）で溶出し、２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）で中和することによって周辺質からの精製を行った。溶出されたタンパク質をＰＢＳでバッファ交換し、濃縮した後、機能の特性評価を行った。
【０２２２】
実施例６：抗ＴＮＦＲ１／抗アルブミン融合物の特性評価
次いで、一連の試験においてＤＭＳ５５３５、ＤＭＳ５５４１、ＤＭＳ５５４２及びＤＭＳ５５４４の精製タンパク質の特性評価を行って、これら分子が両方とも安定であり、且つ良好な抗ＴＮＦＲ１活性を有することを示した。
【０２２３】
加速安定性特性評価
分子の生物物理学的特性を評価するために、融合タンパク質を加速安定性について試験した。分子は著しく安定性が高いと予測されるので、加速安定性についての試験は、２日間の代わりに、４０℃で２８日間ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで実施した。試験結果を表８に要約する。結果から、全てのコンストラクトは、２８日間後ＯＤ２８０によって求めたとき、タンパク質を喪失することなく非常に安定であると結論付けることができる。観察されるタンパク質のわずかな増加は、この検出方法の誤差によるものである可能性が高く、有意ではない。
【０２２４】
表８：抗ＴＮＦＲ１／抗アルブミンの遺伝的融合物の加速安定性及び機能特性評価の要約。加速安定性は、ＯＤ２８０によって求めたとき、４０℃で２８日間後における溶液中の融合タンパク質の百分率として定量した。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）親和性（ＫＤ）は、少なくとも６つの異なる濃度の抗ＴＮＦＲ１／ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）を注入することによって求めた（ＡｌｂｕｄＡｂは、抗血清アルブミンｄＡｂである）。この手順は、２つの独立した実験で実施され、これら実験の値を平均し、引用した標準偏差（ＳＤ）を求めた。抗ＴＮＦＲ１／ＡｌｂｕｄＡｂ融合物の効力をＨＵＶＥＣ細胞アッセイで求めた。抗ＴＮＦＲ１／ＡｌｂｕｄＡｂ融合物についての合計７回の実験から平均ＥＣ５０値を計算した。Ｓ．Ｅ＝標準誤差。
【表８】
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【０２２５】
抗ＴＮＦＲ１／抗アルブミンタンパク質の機能特性評価
分子の機能的抗ＴＮＦＲ１活性が損なわれないことを確認するために、抗ＴＮＦＲ１／抗アルブミンの４つの遺伝的融合物を機能アッセイにおいて試験して、ＴＮＦＲ１に対する親和性とＴＮＦα誘導性シグナル伝達を阻害する効力との両方を求めた。
【０２２６】
ＴＮＦＲ１親和性−ＢＩＡｃｏｒｅ
ＢＩＡｃｏｒｅによって、ヒトＴＮＦＲ１に対する抗ＴＮＦＲ１／ＡｌｂｕｄＡｂ融合物の親和性を決定した。簡潔に述べると、抗ＴＮＦＲ１分子を、ビオチン化ヒトＴＮＦＲ１が固定化されているストレプトアビジンＢＩＡｃｏｒｅチップに注入した。様々な濃度の注入された抗ＴＮＦＲ１において会合及び解離を求めた。この特性評価の結果を表８に要約する。これは、この分子がヒトＴＮＦＲ１の高親和性結合剤であることを示す（ＫＤ＜２８０ｐＭ）。ＢＩＡｃｏｒｅによって求められるときのヒトＴＮＦＲ１に対する抗ＴＮＦＲ１／ＡｌｂｕｄＡｂ融合物の親和性は、組み合わせコンストラクトのそれぞれにおいて用いられる単一抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂについて求められた親和性よりもわずかに高い。
【０２２７】
ＨＵＶＥＣ細胞アッセイにおける効力
ｄＡｂの抗ＴＮＦＲ１活性を求めるための第２の機能アッセイは、ＨＵＶＥＣアッセイである。簡潔に述べると、このアッセイでは、ＨＵＶＥＣをｄＡｂと共に１時間プレインキュベートし、次いで、１ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαで刺激する。この刺激は、細胞におけるＶＣＡＭ発現の増加を導くので、求めることができる。ｄＡｂによって提供されるＴＮＦα誘導性ＶＣＡＭ発現の阻害レベルは、ＶＣＡＭ発現に対してｄＡｂ濃度をプロットすることによって求められる。
【０２２８】
表８に結果を要約する。これは抗ＴＮＦＲ１／ＡｌｂｕｄＡｂ融合物がこのＨＵＶＥＣアッセイにおいて１桁のｎＭ効力を有することを実証する。
【０２２９】
結論として、厳しい選択条件下で突然変異体ライブラリのファージディスプレイ選択を行うことによって、新規抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂｓを同定することができた。これらｄＡｂは、ＢＩＡｃｏｒｅによって求めるとき、ＴＮＦＲ１に対する高い親和性と高い加速安定性とを兼ね備えている。更に、ＤＯＭ７ｈ−１１−３  ＡｌｂｕｄＡｂによって例示されるように、別のタンパク質又はペプチドとこれらｄＡｂとが融合したときにも結合特性は維持され、安定性は更に上昇する。これらｄＡｂは、著しい改善を示し、ｄＡｂの新規特性は、治療剤としてのこれらｄＡｂの開発性を改善するはずである。
【０２３０】
ＢＩＡｃｏｒｅプロトコール
組換えヒトＴＮＦＲ１に対する結合についての結合親和性をＢＩＡｃｏｒｅ（商標）アッセイによって評価した。分析は、ストレプトアビジンでコーティングされた（ＳＡ）チップ（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−３２）を用いて実施した。ＳＡチップは、ビオチン化ｈＴＮＦＲ１を用いて低密度でコーティングされた。試験される分子は、７つの濃度、すなわち、３２、１６（２回）、８、４、２、１、及び０．５ｎＭで、５０μＬ／分の流速を用いてランダムな順序でこの表面に注入した。個々の注入と注入との間に、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ２．０）を用いて表面をベースラインまで再生した。ダブルレファレンスを用いて機器のアーチファクトについてデータを補正した。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００機器において実験を実施し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン４．１を用いてデータを解析し、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いてｋｏｎ及びｋｏｆｆを同時に適合させた。適合させる目的のために、モノマーについては濃度範囲１〜３２ｎＭを用いたが、ＡｌｂｕｄＡｂ融合分子については０．５〜１６ｎＭを用いた。結合データを全ての試験した分子について１：１モデルに良好に適合させた。ｋｏｎ及びｋｏｆｆ速度から全てのＫＤ値を計算した。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）の実験は、２５℃で実施した。
【０２３１】
ＨＵＶＥＣ細胞アッセイのプロトコール
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ＶＣＡＭ−１の発現をアップレギュレートすることによってＴＮＦα処理に応答する。抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂは、ＴＮＦαの作用を阻害するので、抗ＴＮＦＲ１  ｄＡｂの存在下におけるＨＵＶＥＣ細胞によるＶＣＡＭ−１発現の低下をみることができる。この阻害を評価するために、簡潔に述べると、正常なプールされたＨＵＶＥＣ細胞（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ＃Ｃ−１２２０３）を、ゼラチンでコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレート（ＶＷＲ＃７３４−０４０３）内の内皮細胞増殖培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ＃Ｃ−２２１１０）中にプレーティングした（４×１０４細胞／ウェル）。細胞を放置して一晩付着させた後（３７℃／５％ＣＯ２）、ある用量範囲のｄＡｂ又は培地のみを細胞に添加し、プレートを３７℃／５％ＣＯ２で１時間放置する。次いで、一定濃度のＴＮＦα（１ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ＃３００−０１Ａ）を細胞に添加し、これを更に２３時間インキュベートする（３７℃／５％ＣＯ２）。ネガティブコントロールとして、細胞を培地のみと共にインキュベートし、ポジティブコントロールとして、細胞をＴＮＦαのみと共にインキュベートする。
【０２３２】
インキュベート後、細胞培養上清を吸引し、細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄する。７５μＬ／ウェルの氷冷Ｔｒｉｓ−グリセロール溶解バッファ（１０ｍＬ当たり、４０ｍＭのＴｒｉｓ、２７４ｍＭのＮａＣｌ、２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、２０％のグリセロール、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１×プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ＃１１−８３６−１７０−００１））を添加することによって細胞を溶解させ、氷上で１５分間インキュベートする。次いで、細胞溶解物をＶＣＡＭ−１サンドイッチＥＬＩＳＡに移動させる。
【０２３３】
ＶＣＡＭ−１サンドイッチＥＬＩＳＡでは、Ｆ９６  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ＃４３９４５４）を、ＰＢＳ中１００μＬ／ウェルの抗ＶＣＡＭ−１  ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＭＡＢ８０９，２μｇ／ｍＬ）で４℃にて一晩コーティングする。次の日、プレートを洗浄し、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で１時間ブロッキングした後、ＨＵＶＥ細胞溶解物（５０μＬ／ウェル）を添加する。プレートを溶解物と共に２時間インキュベートし、再度洗浄した後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０中０．４μｇ／ｍＬのビオチン化抗ＶＣＡＭ−１ポリクローナルＡｂ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＢＡＦ８０９）を１００μＬ／ウェルで添加し、更に１時間インキュベートする。プレートを再度洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎで製造業者の説明書に従って希釈）を添加する（１００μＬ／ウェル）。Ｓｕｒｅｂｌｕｅ  ＴＭＢ−１ペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ−＃５２−００−００）を添加することによって結合したストレプトアビジン−ＨＲＰを可視化し、１ＭのＨＣｌを添加することによって反応を停止させる。４５０ｎｍにてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ｅプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で直接吸光度を読み取る。
【０２３４】
生のＯＤ値をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにエクスポートし、バックグラウンドＯＤ値（培地のみと共にインキュベートした細胞）を全てのデータ点から減じる。細胞によるＴＮＦα誘導性ＶＣＡＭ−１アップレギュレーションの阻害を計算するために、ｄＡｂの各濃度における最大ＶＣＡＭ−１発現（ポジティブコントロールによって示される）の阻害率を、以下の式を用いて計算する：
最大ＶＣＡＭ−１アップレギュレーションの阻害率＝１００−（特定のｄＡｂ希釈物におけるＯＤ値／ポジティブコントロールにおけるＯＤ値）×１００。
【０２３５】
次いで、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおける阻害率に対してｄＡｂ濃度値をプロットし、可変勾配のＳ字形用量応答曲線を用いて濃度効果曲線及び効力（ＥＣ５０）値を求める。
【０２３６】
細胞を刺激するために用いたＴＮＦαの濃度は、細胞によるＴＮＦαに対する最大応答の約７０％（ＥＣ７０）である。
【０２３７】
参照文献：
Ａｏｎ  ＪＣ，Ｃａｉｍｉ  ＲＪ，Ｔａｙｌｏｒ  ＡＨ，Ｌｕ  Ｑ，Ｏｌｕｂｏｙｅｄｅ  Ｆ，Ｄａｌｌｙ  Ｊ，Ｋｅｓｓｌｅｒ  ＭＤ，Ｋｅｒｒｉｇａｎ  ＪＪ，Ｌｅｗｉｓ  ＴＳ，Ｗｙｓｏｃｋｉ  ＬＡ，Ｐａｔｅｌ  ＰＳ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｇｌｕｃｏｎｏｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８年２月；７４（４）：９５０−８．電子出版  ２００７年１２月１４日．
配列表
ヌクレオチド配列は全て５’から３’に向かって記載されており、また、アミノ酸配列は全てＮ末端からＣ末端に向かって記載されている。
【０２３８】
ＤＯＭ１ｈ−１３１−２０６は、国際公開第ＷＯ２００８１４９１４８号パンフレットに開示されている（そのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、ＰＣＴ公開公報に開示されている通り、本発明で使用するために、本明細書に記載されているかのように参照することによって本明細書に明示的に組み込まれ、このような開示の任意の部分は本発明の１以上の請求項に組み込まれ得ると考えられる）。
【０２３９】
用いたオリゴヌクレオチド：
ＡＳ９：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
ＡＳ３３９：ＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴＴＧ
ＡＳ６３９：ＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＴＣ
ＡＳ６５：ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ
ＣＥ２：ＣＴＴＡＡＡＣＡＧＣＴＴＧＡＴＡＣＣＧ
ＣＥ３：ＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧ
ＯＡ１５４：ＴＴＣＴＴＴＴＧＣＴＡＧＣＧＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣ
ＪＡＬ１０２：ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧ
ヌクレオチド配列：
＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＡＡＧＴＡＴＴＣＡＡＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＴＡＴＡＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＴＧＧＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＴＡＴＡＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＣＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＴＡＴＡＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＴＴＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＣＧＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＴＡＴＡＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＴＧＧＧＴＧＣＣＡＴＴＴＧＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＴＡＴＡＴＡＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＴＡＴＡＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＡＡＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＣＴＣＡＣＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＴＡＴＡＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＴＧＧＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＴＡＴＡＴＡＣＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧＧＣＧＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＧＡＴＡＴＡＴＡＣＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧＧＣＧＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４
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＞ＤＭＳ５５３５
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２
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アミノ酸配列：
＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８８
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８９
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９０
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９１
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９２
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９３
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９４
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９５
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１９６
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０１
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０２
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０３
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０４
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０５
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０６
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０７
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０８
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２０９
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１１
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１２
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１３
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−２１４
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＞ＤＭＳ５５３５
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＞ＤＭＳ５５４１
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＞ＤＭＳ５５４２
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＞ＤＭＳ５５４４
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３３
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０
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＞ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２
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ＤＯＭ７ｈ−１１−３
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＲＰＩＧＴＴＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＬＷＮＳＲＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＡＧＴＨＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ
【図１Ａ】
2013507978.tif 000011
【図１Ｂ】
2013507978.tif 000012
【図１Ｃ】
2013507978.tif 000013
【図１Ｄ】
2013507978.tif 000014
【図１Ｅ】
2013507978.tif 000015
【図１Ｆ】
2013507978.tif 000016
【配列表】
2013507978000001.app
【国際調査報告】
2013507978.tif 000017
2013507978.tif 000018
2013507978.tif 000019
2013507978.tif 000020
2013507978.tif 000021
2013507978.tif 000022
2013507978.tif 000023