(57)【要約】  本発明は、上皮及び内皮のバリア機能を安定化させることが可能な化合物、特にペプチドに関する。本発明のペプチド及び他の化合物は、上皮及び内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患又は障害の治療及び予防に有用である。本明細書で提供されるペプチド又は他の化合物、方法及び使用により治療及び／又は予防される特定の疾患及び障害は、火傷、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）又は浮腫である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
ＧＸ１ＲＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＧＧＸ６（配列番号１）
（ここで、
Ｘ１はＲ及びＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は除外されるか、又はＬ及びＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は除外されるか、又は１個〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、
Ｘ４は除外されるか、又はＧＧからなるアミノ酸配列であり、
Ｘ５はＡ、Ｉ及びＳからなる群から選択される２つのアミノ酸であり、
Ｘ６は除外されるか、又は１個〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である）を含むか又はこれからなるペプチド。
【請求項２】
Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼの活性を阻害することが可能である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記配列のＣ末端にＸ７を更に含み、Ｘ７がＮＨ２、アルブミン、ポリエチレングリコール、デキストラン、フェリチン、ヒドロキシエチルデンプン及び抗体のＦｃ部分からなる群から選択される部分である、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｘ１がＲである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘ２がＬ又はＶである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
Ｘ２がＬである、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｘ３がＰＰＰである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｘ４がＧＧである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
Ｘ５がＩＳ又はＡＳである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０】
Ｘ５がＩＳである、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
Ｘ６が除外される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
Ｘ１がＲであり、Ｘ２がＬであり、Ｘ３が除外され、Ｘ５がＩＳであり、Ｘ６が除外されるか、又はＸ１がＲであり、Ｘ２がＶであり、Ｘ３が除外され、Ｘ５がＩＳであり、Ｘ６が除外される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１３】
上記ペプチドが、
ＧＲＲＰＬＧＧＩＳＧＧ（配列番号３）、
ＧＲＲＰＶＧＧＩＳＧＧ（配列番号６）、
ＧＲＲＰＬＩＳＧＧ（配列番号４）、
ＧＲＲＰＶＩＳＧＧ（配列番号７）、
ＧＲＲＰＬＰＰＰＩＳＧＧ（配列番号８）、
ＧＲＲＰＶＰＰＰＩＳＧＧ（配列番号９）、
ＧＲＲＰＬＧＧＡＡＧＧ（配列番号１０）、
ＧＲＲＰＶＧＧＡＡＧＧ（配列番号１１）、
ＧＲＲＰＬＰＰＰＡＡＧＧ（配列番号１２）、
ＧＲＲＰＶＰＰＰＡＡＧＧ（配列番号１３）、
ＧＲＲＰＬＧＧＡＳＧＧ（配列番号１４）、
ＧＲＲＰＶＧＧＡＳＧＧ（配列番号１５）、
ＧＲＲＰＬＰＰＰＡＳＧＧ（配列番号１６）、
ＧＲＲＰＶＰＰＰＡＳＧＧ（配列番号１７）、
ＧＲＲＰＬＧＧＩＡＧＧ（配列番号１８）、
ＧＲＲＰＶＧＧＩＡＧＧ（配列番号１９）、
ＧＲＲＰＬＰＰＰＩＡＧＧ（配列番号２０）、
ＧＲＲＰＶＰＰＰＩＡＧＧ（配列番号２１）、
ＧＡＲＰＬＧＧＩＳＧＧ（配列番号２２）、
ＧＡＲＰＶＧＧＩＳＧＧ（配列番号２３）、
ＧＡＲＰＬＰＰＰＩＳＧＧ（配列番号２４）、
ＧＡＲＰＶＰＰＰＩＳＧＧ（配列番号２５）、
ＧＡＲＰＬＧＧＡＡＧＧ（配列番号２６）、
ＧＡＲＰＶＧＧＡＡＧＧ（配列番号２７）、
ＧＡＲＰＬＰＰＰＡＡＧＧ（配列番号２８）、
ＧＡＲＰＶＰＰＰＡＡＧＧ（配列番号２９）、
ＧＡＲＰＬＧＧＡＳＧＧ（配列番号３０）、
ＧＡＲＰＶＧＧＡＳＧＧ（配列番号３１）、
ＧＡＲＰＬＰＰＰＡＳＧＧ（配列番号３２）、
ＧＡＲＰＶＰＰＰＡＳＧＧ（配列番号３３）、
ＧＡＲＰＬＧＧＩＡＧＧ（配列番号３４）、
ＧＡＲＰＶＧＧＩＡＧＧ（配列番号３５）、
ＧＡＲＰＬＰＰＰＩＡＧＧ（配列番号３６）、及び
ＧＡＲＰＶＰＰＰＩＡＧＧ（配列番号３７）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はこれからなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
医薬品として使用される請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１〜１３若しくは１５のいずれか一項に記載のペプチド及び／又は請求項１４若しくは１５に記載のポリヌクレオチドを含み、必要に応じて薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を更に含む、医薬組成物。
【請求項１７】
上皮又は内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患又は障害を治療又は予防するのに使用される、請求項１〜１３若しくは１５のいずれか一項に記載のペプチド、請求項１４若しくは１５に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
急性肺障害（ＡＬＩ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、火傷及び多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）からなる群から選択される疾患又は障害を治療及び／又は予防するのに使用される、請求項１〜１３若しくは１５のいずれか一項に記載のペプチド、請求項１４若しくは１５に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
有効用量の請求項１〜１３、１５若しくは１７のいずれか一項に記載のペプチド、請求項１４、１５若しくは１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１６若しくは１７に記載の医薬組成物を被験体に投与することにより、上皮又は内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患又は障害を治療又は予防する方法。
【請求項２０】
有効用量の請求項１〜１３、１５若しくは１８のいずれか一項に記載のペプチド、請求項１４、１５若しくは１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１６若しくは１８に記載の医薬組成物を被験体に投与することにより、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、火傷及び多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）からなる群から選択される疾患又は障害を治療又は予防する方法。
【請求項２１】
投与経路が非経口経路又は経口経路である、請求項１〜１３、１５、１７若しくは１８のいずれか一項に記載のペプチド、請求項１４、１５、１７若しくは１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１６、１７若しくは１８のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項１９若しくは２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮及び内皮のバリア機能を安定化させることが可能な化合物、特にペプチドに関する。本発明のペプチド及び他の化合物は、上皮及び内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患又は障害の治療及び予防に有用である。本明細書で提供されるペプチド又は他の化合物、方法及び使用により治療及び／又は予防される特定の疾患及び障害は、火傷、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）又は浮腫である。
【背景技術】
【０００２】
Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼは、細胞骨格の組織化、細胞遊走、細胞周期の進行、細胞増殖、細胞分化、遺伝子発現、細胞の生存及びアポトーシス等の細胞挙動の多くの状況を制御する（非特許文献１、非特許文献２）。それらの機能の主な特徴は、血管（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）及び上皮表面（非特許文献６、非特許文献７）の透過性の制御である。Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼの活性化は、透過性を調節する上でのその中心的な役割のために、上皮及び内皮のバリア機能の破壊に関連する多くの病態生理プロセスにとって決定的な役割を担う。かかる病理プロセスは、火傷、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７）又は浮腫、特に進行性の組織浮腫に関連する疾患（非特許文献１８）を含む障害及び疾患であり得る。これらの疾患の治療には、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ、及び続くＲｈｏキナーゼの薬理学的阻害が有望なアプローチである（非特許文献１９）。スタチン及びビスホスホネートは、イソプレノイドの生合成に作用し、これにより以下で記載されるようなＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの活性化に必要であるＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの脂質修飾を妨げる物質である。スタチン及びビスホスホネートは、がん及び心臓疾患に対する医薬品として、並びに血管及び上皮のバリア機能障害を改善するそれらの能力に関して臨床研究において試験されている。例えば、ファスジルは脳動脈の血管攣縮及び肺高血圧で用いられるＲｈｏキナーゼ阻害剤である。さらに、ＶＥ−カドヘリン結合フィブリン由来タンパク質であるＢβ１５−４２が、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼであるＲｈｏＡの阻害を介して内皮バリアを安定化させることが記載されている（非特許文献２０）。
【０００３】
細胞生物学におけるその中心的な役割のために、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼの活性は厳密に制御されている。Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼは不活性型のＧＤＰ結合状態と活性型のＧＴＰ結合状態との間で循環する。Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼは、そのエフェクター分子と相互作用し、ＧＴＰ結合形態でのみその機能に影響を及ぼすことができる。活性形態のほとんどのＧＴＰアーゼが細胞膜と結合している。この膜標的化は、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼのＣ末端多塩基領域及び翻訳後イソプレニル化により媒介される。その活性はＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの加水分解活性のために限られた期間のみ存在し、結合したＧＴＰは迅速にＧＤＰへと変換される。ＧＤＰ結合状態がより安定であり、そのため細胞のＲｈｏＧＴＰアーゼの大部分は不活性である。いわゆるグアニジン解離阻害剤（ＧＤＩ）は、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼの膜標的化配列を覆い隠し、ＧＤＰ結合配座を安定化させる。ＲｈｏＧＴＰアーゼの活性化は、ＧＤＰからＧＴＰへの交換を触媒する特定のグアニン−ヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）により媒介される。本明細書の下記も参照されたい。ＧＥＦはＧＤＰの解離の速度を向上させ、ヌクレオチド無含有形態のＲｈｏ  ＧＴＰアーゼを安定化させる。ＧＴＰが高度な分子過剰（high molecular excess）で細胞に存在するため、ＧＴＰの結合が支持される。ＧＴＰ結合がＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの配座変化を誘起し、これによりＧＥＦが解離する。活性型ＲＨＯ  ＧＴＰアーゼと不活性型ＲＨＯ  ＧＴＰアーゼとのバランスは、別の群の調節タンパク質であるＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）により更に調節される。ＧＡＰはＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの内因性Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ加水分解活性を増大し、このようにしてその不活性化を支持する（非特許文献１９）。その活性形態では、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼが幾つかの下流エフェクターのうちの１つと高い親和性を伴って相互作用する。活性状態は非常に一時的なものであり、その活性状態は、ＧＡＰにより刺激される反応であるＧＴＰからＧＤＰへの加水分解によって終了する。加えて、グアニンヌクレオチド解離因子は、不活性形態のＲｈｏ  ＧＴＰアーゼを安定化させる（非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３）。
【０００４】
背景特異的なＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性を制御する可能性の１つがグアニン−ヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）を介するものである。ＧＥＦはＲｈｏＧＴＰアーゼ活性の上流の調節因子である。ＧＥＦは時空間特異的に及び部分的に背景特異的にＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性を制御する（非特許文献２４）。換言すると、ＧＥＦは所与の細胞内において規定の時間及び場所でのＲｈｏの活性化を可能にする。ＧＥＦは複数の外部シグナルを統合及び処理し、それ自体が厳密に制御される。ＧＥＦは入力シグナルを或る特定のＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ駆動性の細胞生物学的応答と結び付ける橋渡しのような作用がある（非特許文献１９）。ＧＥＦの調節特性はそのマルチドメイン構造によるものである。第１のＲｈｏ  ＧＥＦは形質転換遺伝子としてリンパ腫細胞から単離され、Ｄｂｌと名付けられた（非特許文献２５）。また、Ｄｂｌ相同ファミリーは７０個を超えるタンパク質を含む。ほとんどのＧＥＦは、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼにおけるＧＤＰとＧＴＰとの交換を媒介する、約２００個のアミノ酸の高度に保存された相同ドメインを含有する。このドメインはＤＨ−ドメインと称される。単一のＧＴＰアーゼ又はＧＴＰアーゼの群に対するＧＥＦの特異性はこのＤＨドメインによって与えられる。Ｎ末端ドメインは自己阻害性であり、すなわち不活性状態では、Ｎ末端がリン酸化されており、ＤＨ−ドメインと相互作用する。脱リン酸化すると、自己阻害は消失する（非特許文献１９、非特許文献２６）。さらに、ＤＨドメインを保有しない１１個の成員を含むＧＥＦの第２のサブファミリーが存在する。ＤＨドメインの代わりに、これらは２つの相同領域、すなわちＤＨＲ１及びＤＨＲ２（ｄｏｃｋ相同領域１及びｄｏｃｋ相同領域２）を含有する（非特許文献１９、非特許文献２７、非特許文献２５）。ＧＥＦはその相同ドメイン（複数も可）を介してＲｈｏ  ＧＴＰアーゼと結合して、このようにしてＧＤＰのＧＴＰへの交換を助ける。
【０００５】
ＧＥＦは、ＤＨドメインの近くにプレクストリン−ドメイン（ＰＨ−ドメイン）を含む。ＰＨドメインは触媒活性及びタンパク質間相互作用の媒介にかかわる。まとめると、ＤＨドメイン及びＰＨドメインはＧＴＰアーゼ活性化に必要とされる最小構造を提供する。ＰＨ−ドメインはＧＥＦの細胞内分布及び活性の調節にかかわる（非特許文献２８、非特許文献２５）。例えば、ＧＥＦ−Ｈ１は、それが微小管及び密着結合と結び付く場合には不活性である。活性状態では、ＧＥＦ−Ｈ１は細胞質へと再配置される（非特許文献２９、非特許文献３０）。
【０００６】
ＧＥＦ活性は分子内阻害によって制御される。ＧＥＦのＮ末端ドメインは自己阻害因子として機能し、ここでは分子内相互作用はリン酸化によって中和される。このため、標的ＧＴＰアーゼはＤＨドメインと相互作用し得る。特定の細胞内領域でのＲｈｏ  ＧＥＦの標的化はＧＥＦ活性の重要な制御機構でもある。例えば、それが内膜と結合する場合、不活性型ＧＥＦ−Ｈ１は微小管と結び付く。活性状態では、ＧＥＦ−Ｈ１が解離し、細胞質に再局在化する（非特許文献１９）。
【０００７】
ＧＥＦ／ＲｈｏＧＴＰアーゼの経路は、細胞骨格の組織化、遺伝子発現、細胞周期の進行及び細胞分化、並びにアポトーシス性及び非アポトーシス性のプロセス及び細胞運動性、抗原提示、上皮及び内皮の透過性等の多くの主要な細胞生物学的プロセスを調節する（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。細胞生理学におけるその主要な役割のために、ＧＥＦ／ＲｈｏＧＴＰアーゼ経路の調節異常が、炎症性疾患、内皮及び上皮のバリア機能障害並びにがんにおける病態生理シグナル伝達の主要素である。
【０００８】
ＧＥＦ−Ｈ１／ＲｈｏＡ経路は、アクチン及びミオシンからなる細胞収縮装置を活性化し、結合の解離に必要とされる（非特許文献３１）。これとは対照的に、ｐ１１４ＲｈｏＧＥＦ誘導性のＲｈｏＡ活性化は、密着結合の集合化に必要とされる（非特許文献２４）。ＲｈｏＡの部位特異的及び背景特異的な調節は、上皮層及び内皮層等の生理学的バリアの維持に対して決定的な役割を担う。内皮細胞及び上皮細胞は、それぞれ血管の内腔又は内臓腔を覆う連続層を形成する。これらの層は半透性バリアを形成し、隣接組織同士の流体及び栄養素の交換を調節する。均衡したＲｈｏＡ活性は生理学的な上皮及び内皮のバリア機能に極めて重要である。静止状態の内皮細胞及び上皮細胞が基礎ＲｈｏＡ活性を示し、アクチン線維及びミオシン束は細胞境界に限定され、組織を安定化させる（非特許文献３２、非特許文献３３）。炎症誘発剤又は血栓誘発剤による刺激がＧＥＦ／ＲｈｏＡ経路の活性化をもたらし、それから細胞骨格の活性化を誘導する（非特許文献３３）。アクチンとミオシンとが細胞を拡散させる収縮束を形成し、その結果として細胞が収縮し、隣接細胞同士がその接触を失う。細胞間の境界が離れることが、例えば組織増殖及び炎症プロセスにおいて炎症細胞の遊走を促進するのに重要な生理学的プロセスである。しかし異常なＧＥＦ／ＲｈｏＡの過剰活性化は、上皮及び／又は内皮のバリアの破壊をもたらし、また多くの重篤な疾患の病態生理に対する主要な要因である（非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献１９）。例えば、ＧＥＦ−Ｈ１阻害は、マウスモデルにおいて機械通気により引き起こされる急性肺障害（ＡＬＩ）を防ぐ（非特許文献３６）。
【０００９】
急性肺障害（ＡＬＩ）は両側肺の浸潤及び低酸素状態により規定される重篤な病態である（非特許文献３７、非特許文献３８）。急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）はＡＬＩの重症型である。１０００００人当たり７９人の罹患率及び４０％の死亡率により、ＡＬＩは集中治療室（ＩＣＵ）における主要な問題である。ＡＬＩは肺に対する影響（例えば肺炎、酸吸引、煙吸入、機械通気）により誘導されるか、又は敗血症及び外傷に続発して発症する。ＡＬＩが異なる病因から発症したとしても、全ての患者が肺において高タンパク質浮腫及び炎症細胞の浸潤等の一般症状を示す（非特許文献３９、非特許文献４０）。齧歯動物におけるＬＰＳ吸入モデルはＡＬＩにおける治療介入の可能性の調査に広く用いられる。ＬＰＳ吸入は内皮及び上皮のバリアの破壊により高タンパク質浮腫及び細胞性炎症を誘導する（非特許文献４１、非特許文献４２、非特許文献４３）。ＧＥＦ−Ｈ１阻害は人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）のマウスモデルにおける肺損傷を低減し（非特許文献３６）、内皮バリア機能障害を改善する（非特許文献４４）。
【００１０】
表面積全体の１５％超を襲う重度の皮膚火傷（熱傷及び化学火傷）によって、局所的な組織損傷だけでなく、火傷部位より遠位にある臓器系の損傷を引き起こす全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）等の広範な全身性炎症も起こる。ＳＩＲＳは、浮腫、微小血管過透過性、乏血性ショック及び多臓器不全（多臓器機能障害症候群）及びＡＲＤＳも含む（非特許文献４５）。火傷障害の最も損傷の大きい影響の１つは、発生後の初めの３時間以内にピークに達し、その後の２４時間〜４８時間にわたって下降する全身性炎症である（非特許文献４６、非特許文献４７）。
【００１１】
重度の火傷等の障害の病態生理におけるＧＥＦ／ＲｈｏＡ経路の役割を調査している研究の数はごく限られている。しかし、火傷後のＳＩＲＳ及び毛細血管漏出の発症に対するミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）及びＲｈｏキナーゼの寄与を示唆している研究は存在する。ＭＬＣＫ及びＲｈｏキナーゼの両方の分子がＲｈｏＡの下流エフェクターである。火傷を負ったラットから単離された血漿と再インキュベートした際に、内皮細胞はそのバリア機能を失うことが示されている。内皮の過透過性は、内皮細胞をＭＬＣＫ阻害剤で処理することにより元に戻すことができる（非特許文献４８）。熱湯火傷傷害後のＭＬＣＫの薬理学的阻害はｉｎ  ｖｉｖｏでの転帰を改善する（非特許文献４９）。マウスにおけるＭＬＣＫ−２１０のノックアウトは毛細血管漏出を低減し、火傷のマウスモデルにおける生存を改善する（非特許文献５０）。Ｒｈｏキナーゼの阻害はｉｎ  ｖｉｖｏでの熱湯火傷傷害後の血管漏出を低減する（非特許文献１７）。
【００１２】
したがって、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性の低減は、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼの高い活性に関連する障害及び疾患を治療するのに有用な戦略であり得る。Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼを低減するためにＧＥＦ機能を阻害することを目的とする場合、主な問題点は、時間及び場所における特異性を達成し、タンパク質間相互作用部位を標的とすることである。しかしながら、これらの相互作用部位の複雑な性質は依然として完全には理解されていない。実際、既知のＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ阻害剤及びＲｈｏキナーゼ阻害剤は全身に作用し、すなわちこれらが健常な細胞／組織のＲｈｏ−ＧＴＰアーゼ及びＲｈｏキナーゼにも影響を及ぼし、これにより中毒性筋疾患（スタチンでは）等の重度の副作用を示唆する可能性があり、また低血圧（ファスジル）を引き起こす可能性がある（非特許文献５１）。その上、スタチンは予防的治療として供給されなければならず、すなわち入院前治療が必要とされる（非特許文献５２）。これは動物モデルにおいて前治療が必要とされていたファスジルにも当てはまる（非特許文献５３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
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【非特許文献３】Cardiovasc Res (2010), 87(2): 243-253
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【非特許文献３９】N Engl J Med (2000); 342(18): 1334-1349
【非特許文献４０】Am J Respir Cel Mol Biol (2005), 33(4): 319-327
【非特許文献４１】Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2008), 295(3): L379-L399
【非特許文献４２】Jama (2003), 289(16): 2104-2112
【非特許文献４３】Nature (2005), 436: 112-116
【非特許文献４４】Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2006), 290(3): L540-L548
【非特許文献４５】J Am Coll Surg (2001), 192: 241-254
【非特許文献４６】Clin Plast Surg (2000), 27: 11-22
【非特許文献４７】World J Surg (1992), 16: 2-9
【非特許文献４８】AM J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2004), 286: L841-L847
【非特許文献４９】Shock (2003), 20: 363-368
【非特許文献５０】Shock (2007), 28: 589-595
【非特許文献５１】Surg Neurol (2007), 68(2): 126-131
【非特許文献５２】Crit Care Med (2011), 39(6): 1343-1350
【非特許文献５３】Life Sci (2011), 88(1-2): 104-109
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
このため、特定のＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ阻害剤が必要とされる。
【００１５】
この技術的課題は、本明細書で与えられる実施の形態により並びに添付の実施例及び特許請求の範囲で与えられるように解決された。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、アミノ酸配列：
ＧＸ１ＲＰＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＧＧＸ６（配列番号１）
（ここで、
Ｘ１はＲ及びＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は削除されるか、又はＬ及びＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は除外されるか、又は１個〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、
Ｘ４は除外されるか、又はＧＧからなるアミノ酸配列であり、
Ｘ５はＡ、Ｉ及びＳからなる群から選択される２つのアミノ酸であり、
Ｘ６は除外されるか、又は１個〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である）を含むか又はこれからなるペプチドを記載及び提供する。
【００１７】
或る特定の状況では、Ｘ６は本明細書の下記に記載されるように５個を超えるアミノ酸も含み得るか、又はこれからなり得る。
【００１８】
本発明のペプチドは好ましくは、１９個以下のアミノ酸、より好ましくは１４個以下のアミノ酸、最も好ましくは１１個以下のアミノ酸、又は９個以下のアミノ酸を含むか、又はこれからなる。１つの実施の形態では、本発明のペプチドは１１個のアミノ酸を含むか、又はこれからなる。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、当該技術分野で既知の任意のアミノ酸を表し、当該技術分野で知られるようなタンパク質を構成するアミノ酸及びタンパク質を構成しないアミノ酸を含む。タンパク質を構成するアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ、Ｕ）及びピロリジン（Ｐｙｌ、Ｏ）を含む。タンパク質を構成しないアミノ酸の非限定的な例は、ヒドロキシプロリン、セレノメチオニン、カルニチン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ランチオニン、デヒドロアラニン、オルニチン、又はシトルリンである。当業者であれば容易に気付くように、幾つかの場合ではタンパク質を構成しないアミノ酸がタンパク質の一部であり得る可能性もある。アミノ酸は本明細書では、当該技術分野で一般的に用いられるように及び上記にも記載されているように、一文字コード又は三文字コードにより略記される。
【００２０】
驚くべきことに本発明に関連して見出されるように、本明細書で記載及び提供されるペプチドはＧＴＰアーゼを阻害することが可能である。このことはＲｈｏＡに関して添付の実施例で例示的に実証されている。特に、本明細書で記載及び例示されるように、これらの本発明のペプチドは、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼの異常な活性化により引き起こされる疾患又は障害を治療又は予防するのに有用である。かかる疾患及び障害は、特に内皮及び／又は上皮のバリア機能の喪失に関連する炎症性疾患を含む。例えば、本発明のペプチドは肺炎症を低減し、このことが肺損傷の低下と相関し、肺浮腫を低減することが示された。図１を参照されたい。内皮及び／又は上皮のバリアの破壊は、上皮又は内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患又は障害の病態生理の主要素である。本発明の手段及び方法により治療可能又は予防可能な疾患又は障害は、火傷、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）又は浮腫を特に含む。先に言及されるように、本発明によれば、ＳＩＲＳは浮腫、微小血管過透過症及び乏血性ショックも含む。本発明との関連では、本明細書で提供される手段及び方法により治療可能及び／又は予防可能な浮腫は特に、当該技術分野で知られるような及び例えば非特許文献１８に記載されるような進行性の組織浮腫に関連する疾患であり得る。本明細書で提供されるペプチドは、内皮及び上皮のバリアを安定化させ、浮腫形成及び炎症を低減し、それにより臓器機能を改善するその能力を介して作用する。したがって、本明細書で記載及び提供される手段及び方法は、上皮又は内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患又は障害を治療及び／又は予防するのに特に有用である。特に、本発明のペプチド及び方法は、火傷、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）又は浮腫を治療及び／又は予防するのに有用である。
【００２１】
本発明で記載及び提供されるペプチドは、既知のＧＥＦ−Ｈ１阻害剤であるシングリンから誘導される（NY Acad Sci (2009), 1165: 88-98、非特許文献３０、Dev Cell (2007), 12: 699-712）。
【００２２】
さらに、本明細書で記載及び提供されるペプチドは、ＶＥ−カドヘリン結合ＲｈｏＡ阻害タンパク質Ｂβ１５−４２と配列類似性を示す（非特許文献２０）。Ｂβ１５−４２の活性は初めの４つのアミノ酸に強く依存すると繰り返し記載されている（Int J Cancer (2009), 125: 577-584）。特にＢβ１５−４２のＨｉｓ１６（Ｂβ１５−４２の２番目の位置）及びＡｒｇ１７（Ｂβ１５−４２の３番目の位置）が、Ｂβ１５−４２の機能性に重要であると記載されている（Biochemistry (2002), 41: 4107-4116）。これとは対照的に、本発明で記載及び提供されるペプチドは、２番目の位置にＨｉｓを有しないが、それにもかからわず強いＲｈｏＡ阻害効果を有することが示されている。また、本明細書に記載のペプチドは内皮細胞及び上皮細胞を標的とする（上皮細胞はＶＥ−カドヘリンを欠いている）。その上、ＡＬＩに関して動物モデルを使用して例示的に実証されるように、本明細書で記載及び提供されるペプチドがＢβ１５−４２よりも著しく効果的であることが本発明で見出されたことは驚くべきことであった（例えば実施例６を参照されたい）。
【００２３】
本明細書で記載及び提供されるペプチドは、Ｃ末端にＸ７を更に含み得る（ここでＸ７は本明細書で提供されるペプチドの初回腎臓濾過を遅らせるのに、血清半減期を延ばすのに、及び／又はタンパク質分解（特にペプチダーゼ）から保護するのに好適な部分である）。かかる部分は当該技術分野で既知である。かかる部分の非限定的な例は、ＮＨ２、アルブミン、ポリエチレングリコール、デキストラン、フェリチン、ヒドロキシエチルデンプン及び抗体のＦｃ部分である。Ｘ７は、例えば国際公開第０８／１５５１３４号に記載されるような血清半減期を延ばすことが可能なアミノ酸ストレッチ、又は国際公開第０７／１０３５１５号に若しくはNat Biotechnol (2009), 27: 1186-1190に記載されるようなアミノ酸配列でもあり得るか、又はこれも含み得る。
【００２４】
以下において、本明細書で記載及び提供されるペプチドの包括的な配列の可変要素Ｘ１〜Ｘ６の非限定的な例が記載されている。本発明のペプチドは、可変要素の以下の具体例のうちの１つ又はそれらの２つ、３つ若しくはそれ以上の組合せを含み得る。Ｘ１は例えばＲである。Ｘ２はＬ又はＶ、例えばＬであり得る。Ｘ３は除外され得るか又はＰＰＰであり得る（例えば除外され得る）。Ｘ４はＧＧであり得る。Ｘ５はＩＳ又はＡＳ、例えばＩＳであり得る。Ｘ６は除外され得るか又は付加的なアミノ酸又はアミノ酸ストレッチであり得る。Ｘ６の上記の１個〜５個のアミノ酸は本明細書で記載される任意のアミノ酸から選択され得る。さらに或る特定の状況では、Ｘ６は５個を超えるアミノ酸を含み得るか又はこれからなり得る。Ｘ６はより長いアミノ酸ストレッチ、更には１５個のアミノ酸より長いアミノ酸ストレッチを含み得ることも想定される。かかるストレッチは、国際公開第０８／１５５１３４号に記載される「ＰＡＳ」配列のような、上記のＸ７で記載される血清半減期を延ばすアミノ酸ストレッチ、又は国際公開第０７／１０３５１５号若しくはNat Biotechnol (2009), 27: 1186-1190で提供されるペプチド配列も含み得る。しかしながら、Ｘ６は除外されていてもよい。１つの実施の形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸配列ＧＲＲＰＬＸ４ＩＳＧＧ（配列番号２）、例えばＧＲＲＰＬＧＧＩＳＧＧ（配列番号３）又はＧＲＲＰＬＩＳＧＧ（配列番号４）を含むか又はこれからなる。別の実施の形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸配列ＧＲＲＰＶＸ４ＩＳＧＧ（配列番号５）、例えばＧＲＲＰＶＧＧＩＳＧＧ（配列番号６）又はＧＲＲＰＶＩＳＧＧ（配列番号７）を含むか又はこれからなる。特定の実施の形態では、本発明のペプチドはアミノ酸配列ＧＲＲＰＬＧＧＩＳＧＧ（配列番号３）を含むか又はこれからなる。
【００２５】
本発明は、本明細書で記載及び提供されるペプチドの以下の非限定的な具体例に関する。特に本発明のペプチドは、以下の配列：
ＧＲＲＰＬＧＧＩＳＧＧ（配列番号３）、
ＧＲＲＰＶＧＧＩＳＧＧ（配列番号６）、
ＧＲＲＰＬＩＳＧＧ（配列番号４）、
ＧＲＲＰＶＩＳＧＧ（配列番号７）、
ＧＲＲＰＬＰＰＰＩＳＧＧ（配列番号８）、
ＧＲＲＰＶＰＰＰＩＳＧＧ（配列番号９）、
ＧＲＲＰＬＧＧＡＡＧＧ（配列番号１０）、
ＧＲＲＰＶＧＧＡＡＧＧ（配列番号１１）、
ＧＲＲＰＬＰＰＰＡＡＧＧ（配列番号１２）、
ＧＲＲＰＶＰＰＰＡＡＧＧ（配列番号１３）、
ＧＲＲＰＬＧＧＡＳＧＧ（配列番号１４）、
ＧＲＲＰＶＧＧＡＳＧＧ（配列番号１５）、
ＧＲＲＰＬＰＰＰＡＳＧＧ（配列番号１６）、
ＧＲＲＰＶＰＰＰＡＳＧＧ（配列番号１７）、
ＧＲＲＰＬＧＧＩＡＧＧ（配列番号１８）、
ＧＲＲＰＶＧＧＩＡＧＧ（配列番号１９）、
ＧＲＲＰＬＰＰＰＩＡＧＧ（配列番号２０）、
ＧＲＲＰＶＰＰＰＩＡＧＧ（配列番号２１）、
ＧＡＲＰＬＧＧＩＳＧＧ（配列番号２２）、
ＧＡＲＰＶＧＧＩＳＧＧ（配列番号２３）、
ＧＡＲＰＬＰＰＰＩＳＧＧ（配列番号２４）、
ＧＡＲＰＶＰＰＰＩＳＧＧ（配列番号２５）、
ＧＡＲＰＬＧＧＡＡＧＧ（配列番号２６）、
ＧＡＲＰＶＧＧＡＡＧＧ（配列番号２７）、
ＧＡＲＰＬＰＰＰＡＡＧＧ（配列番号２８）、
ＧＡＲＰＶＰＰＰＡＡＧＧ（配列番号２９）、
ＧＡＲＰＬＧＧＡＳＧＧ（配列番号３０）、
ＧＡＲＰＶＧＧＡＳＧＧ（配列番号３１）、
ＧＡＲＰＬＰＰＰＡＳＧＧ（配列番号３２）、
ＧＡＲＰＶＰＰＰＡＳＧＧ（配列番号３３）、
ＧＡＲＰＬＧＧＩＡＧＧ（配列番号３４）、
ＧＡＲＰＶＧＧＩＡＧＧ（配列番号３５）、
ＧＡＲＰＬＰＰＰＩＡＧＧ（配列番号３６）、又は
ＧＡＲＰＶＰＰＰＩＡＧＧ（配列番号３７）
のうちのいずれか１つを含み得るか又はこれからなり得る。
【００２６】
既に述べたように、本発明によれば、上記の特定の配列のうちのいずれか１つを含むか又はこれからなるペプチドは、本明細書に規定されるようにＣ末端にＸ７部分を更に含んでいてもよい。
【００２７】
ペプチドを合成する方法は当該技術分野で既知であり、例えば文献に記載されるような標準的なＦＭＯＣ合成（例えば固相ペプチド合成、すなわちE. Atherton, R.C. Sheppard, Oxford University press 1989による「実用的アプローチ（A practical approach）」）、又は液相合成（ここではペプチドは文献に記載されるようにＢＯＣ化学及び断片縮合による混合戦略を用いて集合化させる（E. Wunsch, "Synthese von peptiden" in "Methoden der organischen Chemie" (Houben-Weyl), 15 Ausg. 4, Teil 1 und 2 Thieme, Stuttgart, 1974））を含む。
【００２８】
本明細書で記載及び提供されるペプチドは、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ、例えばＲｈｏＡの活性を阻害することが可能であり得る。Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性を評価する方法は当該技術分野で既知であり、本明細書で記載及び例示されるようなものである。Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性を評価するのに好適な方法の非限定的な例としては、J Biol Chem (2004), 279: 7169-7179に記載されるような全体的なＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性の決定が挙げられる。かかるアッセイを、ＧＳＴでタグ付けされたＲｈｏ基質（例えばＲｈｏｔｅｋｉｎ）を用いて、これを細胞溶解物に混合させ、その後の抗ＧＳＴ抗体を用いたプルダウンにより行うことができる。検出を、当該技術分野で知られるような、抗Ｒｈｏ抗体を用いたゲル電気泳動及びウェスタンブロットにより実施することができる。Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性を評価する別の好適な方法は、Basic Res Cardiol (2009), 104: 333-340に記載されるようなＧ−ＬＩＳＡアッセイである。Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性を評価する更に別の方法は、所与の細胞でトランスフェクトした又は組換えにより発現した、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性化バイオセンサ、例えばＧＦＰ−エフェクターセンサ又は単分子若しくは二分子のＦＲＥＴセンサを用いることによる、所与の細胞内の部位及び時空間的なＲｈｏ活性化の決定であり得る。これらのバイオセンサは個々の活性Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼの時空間的なｉｎ  ｖｉｖｏ画像化を可能にする（J Cell Science (2010), 123: 1841-1850）。また、例えばCytoskeleton, Inc製の「ＲｈｏＧＥＦ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ａｓｓａｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｋｉｔ」等のＲｈｏＧＴＰアーゼ活性を評価するための市販のキットが入手可能である。例えば、所与のペプチドは、（１）該ペプチドが本明細書で規定される配列を含むか又はこれからなる場合、及び（２）該ペプチドが、該ペプチドで処理していない参照細胞（同じ細胞系に属する）のそれぞれのＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ（例えばＲｈｏＡ）活性と比較して、試験細胞のＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ（例えばＲｈｏＡ）活性を少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍又は少なくとも３倍低減する場合、本発明のペプチドとみなすことができる。
【００２９】
本発明は本明細書で記載及び提供されるペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。これらのポリヌクレオチドは、例えばＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、オリゴヌクレオチドチオホスフェート、置換リボオリゴヌクレオチド、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＧＮＡ（グリコール核酸）分子、ＴＮＡ（トレオース核酸）分子又はモルホリノポリヌクレオチド等の核酸類似物であり得る。さらに、「ポリヌクレオチド」という用語は、本発明との関連では「核酸分子」という用語と同等に解釈するものとし、特にＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ若しくはＬＮＡ、若しくはそれらのハイブリッド、又は当該技術分野で既知のそれらの任意の修飾（例えば修飾の例に関しては、米国特許第５，５２５，７１１号、米国特許第４，７１１，９５５号、米国特許第５，７９２，６０８号又は欧州特許第３０２１７５号を参照されたい）を表し得る。本明細書で記載及び提供されるポリヌクレオチドが含む核酸残基は自然発生的な核酸残基又は人工的に生成された核酸残基であり得る。核酸残基の例は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、キサンチン（Ｘ）及びヒポキサンチン（ＨＸ）である。当業者によって理解されるように、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）はポリヌクレオチドのそれぞれのタイプに従って交換可能に使用することができる。例えば、当業者が認識しているように、ＤＮＡの一部であるチミン（Ｔ）は対応する転写ｍＲＮＡの一部であるウラシル（Ｕ）に対応する。本明細書で記載及び提供されるポリヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖、直鎖又は環状、天然又は合成のものであり得る。
【００３０】
さらに本発明によれば、本明細書で記載及び提供されるポリヌクレオチドをベクターへとクローニングすることができる。このため、本発明は本明細書で記載及び提供されるポリヌクレオチドを含むベクターにも関する。「ベクター」という用語は特に本明細書で使用される場合、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ及び遺伝子操作で一般的に用いられる他のベクターを表す。好ましい実施の形態では、これらのベクターは真菌細胞、酵母細胞又は原核細胞等の微生物の細胞のような細胞の形質転換に好適である。特に好ましい実施の形態では、かかるベクターは、例えば本発明のポリヌクレオチドを発現するための、細菌細胞の安定した形質転換に好適である。
【００３１】
したがって本発明の一態様では、提供されるベクターは発現ベクターである。一般的に、発現ベクターは文献に広く記載されている。通例、発現ベクターは、選択マーカー遺伝子及び選択された宿主において確実に複製を行う複製起点だけでなく、プロモータ及びほとんどの場合で転写のための終結シグナルも含有し得る。プロモータと終結シグナルとの間には、発現するのが望まれる核酸配列／分子の挿入を可能にする少なくとも１つの制限部位又はポリリンカーが存在するのが好ましい。
【００３２】
本明細書で記載及び提供されるベクターが、本発明との関連で用いるのに好適なプロモータを既に含んでいる当該技術分野で既知の発現ベクター、例えば上で記載されるポリヌクレオチドの発現を利用することにより生成される場合、得られるベクターが本発明との関連で用いるのに好適なプロモータを１つだけ含むように、核酸構築物がそのベクターに挿入されることを理解すべきである。当業者はどのようにすればかかる挿入を実現することができるかを認識している。例えば、プロモータをライゲーション前に核酸構築物又は発現ベクターのいずれかから取り除くことができる。
【００３３】
本明細書で記載及び提供されるポリヌクレオチドがクローニングされるベクターの非限定的な例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター、又は非ウイルス性の小環ベクターである。本発明のポリヌクレオチドを含むことで、本明細書で記載されるベクターを形成するのに好適なベクターの更なる例は当該技術分野で既知であり、例えば細菌発現系及び真核生物発現系に関する他のベクターである。
【００３４】
さらに、本発明との関連では、本明細書で記載及び提供されるポリヌクレオチド及び／又はベクターを、宿主細胞に形質導入するか、形質転換するか、又はトランスフェクトするか若しくはそうでなければ導入することができる。このため、本発明は本明細書で記載及び提供されるポリヌクレオチド及び／又はベクターを含む宿主細胞にも関する。例えば、宿主細胞は原核細胞、例えば細菌細胞である。非限定的な例としては、宿主細胞は哺乳動物細胞であってもよい。本明細書で記載される宿主細胞は、本明細書で記載及び提供されるペプチドを生成するのに特に有用であることが意図される。概して、本明細書で記載される宿主細胞は、本明細書で記載及び提供されるポリヌクレオチド若しくはベクターを含む原核細胞若しくは真核細胞、又はかかる細胞から誘導され、核酸構築物若しくはベクターを含有する細胞であり得る。１つの実施の形態では、宿主細胞は、該宿主細胞がゲノムに組み込まれたポリヌクレオチドを含有するように、本明細書で記載及び提供されるポリヌクレオチド又はベクターを含む、すなわちこれらで遺伝子組換えが行われている。例えば本明細書で記載されるかかる宿主細胞は細菌細胞、酵母細胞又は真菌細胞であり得る。１つの特定の態様では、宿主細胞は本発明のポリヌクレオチドを発現することが可能であり得るか、又はこれを発現する。本明細書で記載される宿主細胞を生成するのに用いられる様々な対応する発現系の例の概要は例えば、Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516に、Bitter （Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544）に、Sawers（Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9）に、Billman-Jacobe（Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4）に、Hockney（Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463）に、及びGriffiths（Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440）に含まれている。本明細書で記載及び提供されるポリヌクレオチド又はベクターによる宿主細胞の形質転換又は遺伝子操作を、例えばSambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA、Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990に記載されるような標準的な方法によって実施することができる。
【００３５】
本発明は、本明細書で記載及び提供されるペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター及び／又は宿主細胞を含む組成物に更に関する。かかる組成物を、医学的介入を必要とする被験体に体重１ｋｇ当たり約１ｎｇ〜体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇの量で投与することができる。かかる被験体は、治療の必要がある、又は本明細書で記載される異常なＧＴＰアーゼ活性に関連する障害が予防される哺乳動物、例えばヒトであり得る。上述のように、本発明の関連では、異常なＧＴＰアーゼ活性に関連する疾患又は障害の例は、上皮又は内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患である。これに関連して治療及び／又は予防される特定の疾患及び障害は、火傷、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）又は浮腫である。本明細書で記載及び提供される組成物は、１日に体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜体重１ｋｇ当たり約４０ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約３０ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約２０ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１５ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１５ｍｇの量で本発明のペプチドを含み得る。
【００３６】
本発明の関連では、本明細書で記載及び提供されるペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター及び／又は宿主細胞を含む組成物は薬学的に許容される担体を更に含み得る。したがって、本発明は、本明細書で記載及び提供されるペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター及び／又は宿主細胞を含み、必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を更に含む医薬組成物にも関する。概して好適な医薬担体の例が当該技術分野で既知であり、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、エマルション、例えば油／水エマルション、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液等を含む。かかる担体を含む組成物を既知の従来方法により配合することができる。これらの医薬組成物を被験体に、好適な用量、すなわち１日に体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜体重１ｋｇ当たり約４０ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約３０ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約２０ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１５ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１５ｍｇで投与することができる。（医薬）組成物の投与を、種々の方法により、例えば非経口で（例えば静脈内に、皮下に、経皮で、筋肉内に又は腹腔内に）、吸入により（例えば気管支内に）、生分解性ポリマー（例えばポリラクテート又はポリグリコレート）でできた侵食性のインプラントとして、経腸で（例えばピル、錠剤（頬側（buccal）錠、舌下錠、口腔錠、崩壊錠、カプセル、薄膜、液体溶液又は懸濁液）、粉末、固体結晶又は液体）、直腸で（例えば坐剤、浣腸剤）、経皮で、局所で、経膣で、皮膚上で、又は鼻腔内で達成するか又は該組成物を投与することができる。投与計画は担当医及び臨床的因子により決定される。医療分野で知られるように、任意の一人の患者に対する投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身健康状態、及び同時に投与される他の薬剤を含む多くの因子によって決まる。本明細書で記載及び提供されるペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター及び／又は宿主細胞を含む（医薬）組成物を局所に又は全身に投与することができる。本発明のペプチドの投与は非経口投与、例えば静脈内投与又は皮下投与であるのが好ましい。本明細書で記載及び提供されるペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター及び／又は宿主細胞を含む（医薬）組成物を、標的部位に直接、例えば微粒子銃による送達により内部若しくは外部の標的部位に又はカテーテルにより動脈内の特定部位に投与することもできる。非経口投与のための調製物としては、滅菌した水溶液又は非水溶液、懸濁液及びエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射用の有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール溶液／水溶液、エマルション又は懸濁液（生理食塩水及び緩衝媒体を含む）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、デキストロースリンゲル液、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液又は���定油が挙げられる。静脈注射用ビヒクルとしては、流体及び栄養素の補充液、電解質補充液（例えばデキストロースリンゲル液をベースとするもの）等が挙げられる。例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤及び不活性ガス等の保存剤及び他の添加剤が存在し得る。さらに、特に上述の因子を考慮して、本明細書の上記に記載される例示的な範囲を下回る又は上回る用量も想定される。本発明のペプチドを本明細書で提供される２つ以上のペプチドと組み合わせて使用することもできる。したがって、本発明の組成物は、必要に応じて本明細書で記載及び提供される他の化合物とも組み合わせて、本明細書で提供される２つ以上のペプチドを含み得る。その上、本発明のペプチドを、一酸化窒素、プロスタサイクリン、外因性界面活性剤、抗凝固剤等の血管作用薬、組織因子活性を標的とする作用物質、β２−アゴニスト等の肺胞液クリアランスを改善する働きがある作用物質、ＴＮＦ作用を阻害する作用物質、抗ＩＬ−８及び抗ＣＤ４０Ｌによる治療法（Curr Med Chem (2008), 15(19): 1911-1924）、吸入活性化タンパク質Ｃ（Crit Care (2010), 14(2): R70）、糖質コルチコステロイド又はシクロスポリン等の免疫抑制剤、抗生物質、ＨＥＳ溶液、体積膨張に用いられるコロイド（Emerg Med J (2003), 20: 306-315）、又はレニン・アンギオテンシン系の病的不均衡を標的とする作用物質と併せた併用療法に用いることができる。
【００３７】
当業者は、個体に投与される医薬組成物の有効量が特に化合物の性質によって決まることを認識している。例えば、上記化合物が本明細書で記載されるペプチドである場合、用量当たりの非経口投与される医薬組成物の薬学的に有効な総量は、１日に患者の体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜１日に患者の体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり１μｇ〜体重１ｋｇ当たり約４０ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約３０ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約２０ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１５ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ、又は１日に体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１５ｍｇの範囲であり得るが、上述のようにこれは治療裁量に委ねられる。しかしながら、特に或る特定の脂質を併用して適用する場合、又はペプチドに或る特定の化学修飾が施される場合、この用量は治療裁量に委ねられ、更に低減又は増大することができる。特定の量を当業者にとって既知の従来試験により決定することができる。
【００３８】
本明細書で記載及び提供される医薬組成物を持続放出系により好適に投与することもできる。持続放出組成物の好適な例としては、成形加工品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリクスが挙げられる。持続放出マトリクスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許出願公開第５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Biopolymers (1983), 22: 547-556）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（J Biomed Mater Res (1981), 15: 167-277、Langer, Chem Tech (1982), 12: 98-105）、エチレンビニルアセテート（Langer, loc. cit.）又はポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３９８８号）が挙げられる。持続放出医薬組成物はリポソーム封入化合物も含み得る。医薬組成物を含有するリポソームを、独国特許第３２１８１２１号、Proc Natl Acad Sci USA (1985), 82: 3688-3692、Proc Natl Acad Sci USA 77: 4030-4034 (1980)、欧州特許出願公開第５２３２２号、欧州特許出願公開第３６６７６号、欧州特許出願公開第８８０４６号、欧州特許出願公開第１４３９４９号、欧州特許出願公開第１４２６４１号、特願昭５８−１１８００８号、米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号、並びに欧州特許出願公開第１０２３２４号に記載のような当該技術分野で既知の方法により調製することができる。
【００３９】
本発明との関連では、本明細書で記載される剤形を、医薬組成物の成分を液体担体又は微粉化した固体担体又はその両方と均一にかつ密接に接触させることにより調製することができる。それから必要に応じて、生成物を所望の剤形へと成形することができる。担体は非経口担体、例えばレシピエントの血液と等張の溶液であり得る。かかる担体ビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液が挙げられる。固定油及びオレイン酸エチル等の非水性ビヒクル並びに本明細書で記載されるリポソームも本明細書で有用であり得る。担体は等張性及び化学安定性を高める物質等の添加剤を微量含有するのが好適であり得る。かかる材料は用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であるのが好ましく、緩衝液、例えばホスフェート、シトレート、スクシネート、酢酸及び他の有機酸、若しくはそれらの塩；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）の（ポリ）ペプチド、例えばポリアルギニン若しくはトリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸若しくはアルギニン；単糖、二糖及びセルロース若しくはその誘導体、グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の糖質；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール若しくはソルビトール；対イオン、例えばナトリウム；並びに／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート、ポロキサマー若しくはＰＥＧを含み得る。
【００４０】
本発明との関連では、治療的投与に用いられる医薬組成物の成分は滅菌されているのが好ましい。滅菌状態は例えば滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロン膜）を通した濾過により容易に達成することができる。医薬組成物の治療成分を、滅菌アクセスポートを備えた容器、例えば皮下注射針により貫通可能なストッパーを備えた静脈注射用溶液バッグ又はバイアルに入れることができる。通常、医薬組成物の成分は、ユニット若しくは複数回投与用容器、例えば封入アンプル若しくはバイアルに、水溶液として、又は再構成のために凍結乾燥させた剤形として保存することができる。凍結乾燥させた剤形の非限定的な例として、１０ｍｌ容のバイアルに５ｍｌの滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）水溶液を充填することができ、得られたものを凍結乾燥することができる。注入溶液を、静菌性の注射用水を用いて凍結乾燥させた化合物（複数も可）を再構成することにより調製することができる。
【００４１】
本発明との関連では、本明細書で記載及び提供されるペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、組成物及び医薬組成物を、異常なＧＴＰアーゼ活性に関連する疾患又は障害を治療又は予防するのに使用することができる。異常なＧＴＰアーゼ活性に関連する疾患及び障害の非限定的な例は、上皮又は内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患である。特定の疾患及び障害は、火傷、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）又は浮腫を含む。
【００４２】
例えば、本発明は、上皮又は内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患からなる群から選択される疾患又は障害を治療又は予防するのに使用される配列ＧＲＲＰＬＧＧＩＳＧＧ（配列番号３）を含むか又はこれからなるペプチドに関する。本明細書で提供される手段及び方法により治療及び／又は予防される特定の疾患及び障害は、火傷、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）又は浮腫を含む。
【００４３】
本発明は、上皮又は内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患又は障害を治療又は予防する方法に更に関する。本発明との関連では、本明細書で提供される方法により又は本明細書で提供される化合物により治療及び／又は予防される特定の疾患及び障害特に、火傷、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）又は浮腫を含む。かかる方法は、被験体への有効用量の本明細書で記載及び提供される（ａ）ペプチド（複数も可）、ポリヌクレオチド（複数も可）、ベクター（複数も可）、宿主細胞（複数も可）、組成物（複数も可）及び／又は医薬組成物（複数も可）の投与を特に含む。１つの実施の形態では、被験体がヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）。総細胞数、好中球数、タンパク質及びＩｇＭの含有量はバリア機能障害を評価する代理パラメータとしての役割を果たした（＊ｐ＞０．０５；＊＊ｐ＞０．０１；＊＊＊ｐ＞０．００１）。略語は以下のとおりである：ＬＰＳ：ＬＰＳ吸入；ＬＶｔ：低容量の通気流；ＨＶｔ：高容量の通気流、ｓｃ：スクランブルペプチドＧＧＧＧＧＳＲＲＩＰＬ（配列番号３８）；ＸＩＢ１−ｂ：ＧＲＲＰＬＧＧＩＳＧＧ（配列番号３）。図１はｓｃ又はＸＩＢ１−ｂで処理した動物における気管支肺胞洗浄液内の総細胞数、好中球数、総タンパク質含量及びＩｇＭ含量に対するＬＰＳチャレンジ、その後のＬＶｔ又はＨＶｔの効果を比較する。全ての群で、ＸＩＢ１−ｂが全てのパラメータを低減する。有意性はアスタリスクで示されるように得られた（＊ｐ＜０．５、＊＊＊ｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下の実施例は本発明を説明する。
【実施例】
【００４６】
実施例１：ペプチド
以下の例示的な研究では、アミノ酸配列ＧＲＲＰＧＧＡＳＧＧ（配列番号３９、ＸＩＢ１−ａと呼ばれる）及びＧＲＲＰＬＧＧＩＳＧＧ（配列番号３、ＸＩＢ１−ｂと呼ばれる）を有する本発明のペプチドを活性剤として使用した。対照目的で、アミノ酸配列ＧＧＧＧＧＬＳＲＲＩＰ（配列番号４０）を有するランダムペプチド又は溶媒対照（０．９％  ＮａＣｌ）を使用した。これらのペプチド及び特許請求される全ての他のペプチドを、文献に記載されるような標準的なＦＭＯＣ合成（例えば固相ペプチド合成、すなわちE. Atherton, R.C. Sheppard, Oxford University press 1989による「実用的アプローチ」）により、又は液相合成（ここではペプチドは文献に記載されるようにＢＯＣ化学及び断片縮合による混合戦略を用いて集合化させる（E. Wunsch, "Synthese von peptiden" in "Methoden der organischen Chemie" (Houben-Weyl), 15 Ausg. 4, Teil 1 und 2 Thieme, Stuttgart, 1974））により合成した。
【００４７】
実施例２：ＧＥＦ活性の阻害
ＧＥＦ阻害効果を測定するために、以下の細胞系を使用した：Ｃａｃｏ−２（腺癌由来の上皮細胞）、ＥＣＶ３０４（膀胱癌由来の上皮細胞）及びＨｐＭｅｃ（内皮細胞、不死化肺微小血管細胞）。全ての細胞を標準条件（３７℃、５％  ＣＯ２及び９５％相対湿度（ｒＨ））で成長させた。Ｃａｃｏ−２で使用した培養培地：ＤＭＥＭ＋１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム＋２０％  ＦＣＳ＋１％  ペニシリンストレプトマイシン；ＥＣＶ  ３０４で使用した培養培地：ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％  ＦＣＳ＋１％  ペニシリンストレプトマイシン；及びＨｐＭｅｃで使用した培養培地：ＩＭＤＭ＋２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ＋１０％  ヒト血清＋１％  ペニシリンストレプトマイシン＋１％  Ｌ−グルタミン＋ＥＣＧＳ／ヘパリン  ２ｍｌ。実験の４時間前、細胞を血清枯渇により欠乏状態にした。ＧＥＦ活性を誘導するために、細胞を５０μｇ／ｍｌのＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂの存在下又は非存在下で指定された時間、トロンビン、リポ多糖（ＬＰＳ）又はＰＭＡで刺激した。刺激後、膜画分をBiochain Institutes製の市販の「Ｃｏｍｐａｒｔｅｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」を使用することにより調製した。膜画分を製造業者の取扱説明書に従って調製した。膜溶解物のＧＥＦ活性を、製造業者の取扱説明書に従ってCytoskeleton Inc.製の「ＲｈｏＧＥＦ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ａｓｓａｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｋｉｔ」を使用することにより決定した。ＧＥＦ活性をThermo Electron Corporation製のＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ  ２．６を使用して蛍光として測定した。励起フィルターの波長を３５５ｎｍに、また発光フィルターの波長を４６０ｎｍに設定した。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
表１から分かるように、ＥＣＶ３０４細胞では、トロンビン及びＬＰＳ刺激が非処理の対照細胞と比較したＧＥＦ活性の増大をもたらした。ＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂの存在下でトロンビン又はＬＰＳで刺激したＥＣＶ  ３０４細胞はトロンビン又はＬＰＳ単独による処理と比較したＧＥＦ活性の有意な低減を示す。
【００５０】
ＣａＣｏ−２細胞では、１分間のＰＭＡ刺激が２．５倍のＧＥＦ活性の増大をもたらした。ＧＥＦ活性化の程度は、ＣａＣｏ−２細胞をＰＭＡとＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂとで同時に処理した場合に有意に低減した。
【００５１】
ＨｅｐＭｅｃ細胞では、トロンビンが１分間の刺激後にＧＥＦ活性の３．５倍の増大、及び５分間の刺激後にＧＥＦ活性の３倍の増大を誘導した。ＸＩＢ１−ｂによる細胞の同時処理は１分後及び５分後のＧＥＦ活性の程度を有意に低減した。ＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂ単独による処理は基礎ＧＥＦ活性を変えなかった。
【００５２】
結果は、ＸＩＢ１−ａ及びＸＩＢ１−ｂ等の本発明のペプチドは上皮細胞及び内皮細胞において様々な刺激因子により誘導されるＧＥＦ活性を低減するが、非刺激細胞では基礎ＧＥＦ活性を変えないことを実証している。このことは、本発明のペプチドが異常なＧＴＰアーゼ活性に関連する疾患又は障害の治療又は予防に有用であることを示している。これに関連して、特定の障害及び疾患は、火傷、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）又は浮腫であり得る。
【００５３】
実施例３：ＧＴＰ関連ＲｈｏＡの低減
ＧＴＰ関連活性型ＲｈｏＡを測定するために、以下の細胞系を使用した：Ｃａｃｏ−２、ＥＣＶ３０４及びＨｐＭｅｃ。全ての細胞を標準条件（３７℃、５％  ＣＯ２及び９５％  ｒＨ）で成長させた。実験の４時間前、細胞を血清枯渇により欠乏状態にした。ＧＥＦ活性を誘導するために、細胞を５０μｇ／ｍｌのＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂの存在下又は非存在下で指定された時間、トロンビン、ＬＰＳ又はＰＭＡで刺激した。刺激後、膜画分をBiochain Institutes製の市販の「Ｃｏｍｐａｒｔｅｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」を使用することにより調製した。膜画分を製造業者の取扱説明書に従って調製した。膜画分をゲル電気泳動の標準的な手順に従って１５％  ポリアクリルアミドゲル上で分離した。その後、ゲルをウェスタンブロット法の標準的な手順に従ってニトロセルロース膜上でブロッティングした。ＧＴＰ結合ＲｈｏＡを、１：５０００の希釈率でNewEast Inc.製のＲｈｏＡ−ＧＴＰモノクローナル抗体を用いて検出した。タンパク質のバンドをＤｏｌｐｈｉｎ−１Ｄ  Ｇｅｌ分析系（Wealtec）を用いて分析した。
【００５４】
【表２】
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【００５５】
表２から分かるように、ＥＣＶ３０４細胞では、トロンビン及びＬＰＳ刺激が非処理の対照細胞と比較したＲｈｏＡ活性の増大をもたらした。ＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂの存在下でトロンビン又はＬＰＳで刺激したＥＣＶ  ３０４細胞はトロンビン又はＬＰＳ単独による処理と比較したＲｈｏＡ活性の有意な低減を示す。
【００５６】
ＣａＣｏ−２細胞では、ＰＭＡ刺激が１分間の刺激後にＲｈｏＡ活性の２．３倍の増大、及び５分間の刺激後にＲｈｏＡ活性の２倍の増大をもたらした。１分後及び５分後のＲｈｏＡ活性化の程度は、ＣａＣｏ−２細胞をＰＭＡとＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂとで同時に処理した場合に有意に低減した。
【００５７】
ＨｅｐＭｅｃ細胞では、トロンビンが１分間の刺激後にＲｈｏＡ活性の３．８倍の増大、及び５分間の刺激後にＲｈｏＡ活性の３．２倍の増大を誘導した。ＸＩＢ１−ｂによる細胞の同時処理は１分後及び５分後のＲｈｏＡ活性の程度を有意に低減した。ＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂ単独による処理は基礎ＲｈｏＡ活性を変えなかった。
【００５８】
これらの結果は、ＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂ等の本発明のペプチドは上皮細胞及び内皮細胞において様々な刺激因子により誘導されるＲｈｏＡ活性を低減するが、非刺激細胞では基礎ＧＥＦ活性を変えないことを実証している。ＲｈｏＡ活性は上で記載されるようにＧＥＦ活性化により制御される。結果はＸＩＢ１−ａ及び／又はＸＩＢ１−ｂがＧＥＦ活性を阻害することによりＲｈｏＡ活性を低減させ、このため上皮又は内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患又は障害の治療及び／又は予防に有用であることを実証している。特に、本明細書で提供されるペプチドは、火傷、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）又は浮腫等の疾患及び障害を治療及び／又は予防するのに有用である。
【００５９】
実施例４：リン酸化されたミオシン軽鎖（ＭＬＣ）及びアクチンストレス線維の形成
ＭＬＣのリン酸化及びアクチンストレス線維の形成を測定するために、以下の細胞系を使用した：Ｃａｃｏ−２、ＥＣＶ３０４及びＨｐＭｅｃ。全ての細胞を標準条件（３７℃、５％  ＣＯ２及び９５％  ｒＨ）で成長させた。Ｃａｃｏ−２で使用した培養培地：ＤＭＥＭ＋１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム＋２０％  ＦＣＳ＋１％  ペニシリンストレプトマイシン；ＥＣＶ  ３０４で使用した培養培地：ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％  ＦＣＳ＋１％  ペニシリンストレプトマイシン；及びＨｐＭｅｃで使用した培養培地：ＩＭＤＭ＋２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ＋１０％  ヒト血清＋１％  ペニシリンストレプトマイシン＋１％  Ｌ−グルタミン＋ＥＣＧＳ／ヘパリン  ２ｍｌ。実験の４時間前、細胞を血清枯渇により欠乏状態にした。ＧＥＦ活性を誘導するために、細胞を５０μｇ／ｍｌのＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂの存在下又は非存在下で指定された時間、トロンビン、ＬＰＳ又はＰＭＡで刺激した。刺激後、４％  ＰＦＡを用いて細胞を固定した。ホスホＭＬＣを、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加したＰＢＳ（Gibco）中で３μｌ／ｍｌの濃度でChemicon製の「ウサギ抗ホスホミオシン軽鎖抗体」を使用することにより検出した。検出抗体として、Invitrogen製のＡｌｅｘａ  ４４８タグ付け「抗ウサギＩｇＧ抗体」を０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加したＰＢＳ（Gibco）中で０．５μｌ／ｍｌの濃度で使用した。アクチンを、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎを添加したＰＢＳ（Gibco）中で０．５μｌ／ｍｌの濃度でＴＲＩＴＣ標識ファロイジンを使用して検出した。染色細胞を、Zeissの走査型レーザー顕微鏡を使用することにより分析した。細胞骨格の活性化の評価は条件に対して盲検化した２人の独立した観察者により行われた。評価基準は以下のように設定した：
アクチン：平行アクチン束なし＝０、明らかな束形成＝１、顕著な並行束＝２、ホスホＭＬＣ：細胞極に存在＝０、アクチン束との僅かな共局在化＝１、アクチン束との顕著な共局在化＝２
【００６０】
【表３】
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【００６１】
表３から分かるように、ＥＣＶ３０４細胞では、トロンビン及びＬＰＳ刺激がＭＬＣのリン酸化及びアクチンストレス線維の形成を誘導した。ＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂの存在下でトロンビン又はＬＰＳで刺激したＥＣＶ  ３０４細胞はトロンビン又はＬＰＳ単独による処理と比較したＭＬＣのリン酸化及びアクチンストレス線維の形成の有意な低減を示す。
【００６２】
ＣａＣｏ−２細胞では、ＰＭＡ刺激が１分間の刺激後に及び５分間の刺激後にＭＬＣのリン酸化及びアクチンストレス線維の形成の増大を誘導した。１分間の刺激後及び５分間の刺激後の細胞骨格の活性化の程度は、ＣａＣｏ−２細胞をＰＭＡとＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂとで同時に処理した場合に有意に低減した。
【００６３】
ＨｅｐＭｅｃ細胞では、トロンビンが１分間の刺激後に及び５分間の刺激後にＭＬＣのリン酸化及びアクチンストレス線維の形成の増大を誘導した。ＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂによる細胞の同時処理は１分後及び５分後の細胞骨格の活性化の程度を有意に低減した。ＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂ単独による処理は基礎細胞骨格活性を変えなかった。
【００６４】
結果は、ＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂ等の本発明のペプチドが上皮細胞及び内皮細胞において様々な刺激因子により誘導されるＭＬＣのリン酸化及びアクチンストレス線維の形成を低減することを実証している。ＭＬＣのリン酸化及びアクチンストレス線維の形成は上で記載されるようにＲｈｏＡ活性により制御される。結果はＸＩＢ１−ａ及び／又はＸＩＢ１−ｂ等の本発明のペプチドがＧＥＦ活性、及び続くＲｈｏＡ活性を阻害することによりＭＬＣのリン酸化及びアクチンストレス線維の形成を低減させ、このため上皮又は内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患又は障害の治療及び／又は予防に有用であることを実証している。特定の疾患及び障害は、火傷、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）又は浮腫を含む。
【００６５】
実施例５：内皮及び上皮の透過性
内皮及び上皮のバリアに対する透過性を測定するために、以下の細胞系を使用した：Ｃａｃｏ−２、（ＥＣＶ３０４及びＨｐＭｅｃ。全ての細胞を、４μｍの孔径を有するトランスウェルシステム（Costar）において標準条件で密集状態になるまで成長させた。実験の開始時に、成長培地を取り除き、ハンクス緩衝塩溶液に置き換えた。上方のチャンバに２ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識デキストラン（Sigma Aldrich）を添加した。細胞を表４に示されるように刺激した。下方のチャンバから３０分サンプルを回収し、蛍光を求めた（Ｆｌｏｕｒｏｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ、Thermo Electron）。記載がある場合には５０μｇ／ｍｌのＸＩＢ１−ａ及びＸＩＢ１−ｂを添加した。
【００６６】
【表４】
2013529916.tif 000005
【００６７】
表４から分かるように、ＥＣＶ３０４細胞では、トロンビン及びＬＰＳ刺激がバリア透過性を増大する。ＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂの存在下でトロンビン又はＬＰＳで刺激したＥＣＶ  ３０４細胞はトロンビン又はＬＰＳ単独による処理と比較したバリア透過性の有意な低減を示す。
【００６８】
ＣａＣｏ−２細胞では、ＰＭＡ刺激がバリア透過性の増大を誘導した。バリア機能は、ＣａＣｏ−２細胞をＰＭＡとＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂとで同時に処理した場合に有意に改善した。
【００６９】
ＨｅｐＭｅｃ細胞では、トロンビンがバリア透過性の増大を誘導した。ＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂによる細胞の処理はトロンビン誘導性のバリア透過性を有意に低減した。ＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂ又は対照ペプチド単独による処理はバリア機能を変えなかった。
【００７０】
これらの結果は、ＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂ等の本発明のペプチドが上皮細胞及び内皮細胞において様々な刺激因子により誘導されるバリア透過性を低減することを実証している。バリア透過性及びバリア機能はアクチン線維及びミオシン線維により制御される。この細胞骨格成分の活性化が細胞収縮及び細胞円形化をもたらす。隣接細胞同士が接触を失い、これにより組織の透過性が増大する。したがってこれらの実験はＸＩＢ１−ａ及び／又はＸＩＢ１−ｂ等の本発明のペプチドが上皮細胞及び内皮細胞において種々の作用物質により誘導されるバリア透過性を低減し、このため上皮又は内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患又は障害の治療及び／又は予防に有用であることを実証している。特定の疾患及び障害は、火傷、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）又は浮腫を含む。
【００７１】
実施例６：ＬＰＳ誘導性の肺障害
Ｃ５７Ｂｌ／６雄マウス（Charles River, Germany）をウィーン医科大学の動物施設で飼育し、標準飼料及び水を含む食餌を自由に摂取させた。全ての実験介入はＡＡＡＬＡＣ（国際実験動物管理公認協会）のガイドラインに従って行った。全ての実験はウィーン医科大学の倫理委員会の承認を受けた。マウスをイソフルランを用いて麻酔し、１００ｎｇのＬＰＳ（大腸菌（E. coli）Ｏ５５：Ｂ５、Sigma Aldrich）で鼻腔内に処理した。ＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂを腹腔内に（２回×２ｍｇ／ｋｇ）又は吸入により（２回×４ｍｇ／ｋｇ）で適用し、１回目の適用はＬＰＳ投与と同時に行い、２回目の適用はＬＰＳ吸入の１時間後に行った。
【００７２】
気管支肺胞洗浄液
６時間後、マウスをケタミン（Pfizer, Vienna, Austria）を用いて麻酔し、下大静脈から血を抜くことにより屠殺した。正中切開により気管を露出させ、滅菌した２０ゲージのカテーテル（ＢＤ  Ｖｅｎｆｌｏｎ（商標）、Becton Dickinson Infusion Therapy, Helsingborg, Sweden）を挿入した（canulated）。両側気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を、滅菌生理食塩水のアリコート０．５ｍｌを２回注入することにより取得した。１匹のマウス当たりおよそ０．９ｍｌ〜１ｍｌのＢＡＬＦを採取した。総細胞数を血球計（Turckチャンバ）を用いてそれぞれのサンプルでカウントし、ＢＡＬＦ細胞分画のカウントを、ギムザで染色したサイトスピン調製物において行った。タンパク質測定のために、ＢＡＬＦを、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、及びペプスタチンＡ、ロイペプチン及びアプロチニン（全て２０ｎｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を含有する緩衝液で１：２に希釈した。ＢＡＬＦのタンパク質レベルを、ＢＣＡタンパク質キットを用いて製造業者の取扱説明書（Pierce, Rockford, IL）に従って測定した。
【００７３】
【表５】
2013529916.tif 000006
【００７４】
【表６】
2013529916.tif 000007
【００７５】
【表７】
2013529916.tif 000008
【００７６】
【表８】
2013529916.tif 000009
【００７７】
表５から分かるように、ＬＰＳによるマウスの鼻腔内処理が気管支肺胞空間における好中球の流入及びアルブミン集積の増大によって伝達される、肺におけるバリア機能障害を誘導した。ＸＩＢ１−ｂによるマウスの処理はバリア機能を大幅に改善し、マウスはＢＡＬＦ中の好中球の低下及びアルブミンの低減を示した。ＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂの有益な効果は腹腔内で処理した動物群と気管内で処理した動物群とで等しかった。
【００７８】
対照ペプチドによるマウスの処理はＢＡＬＦの好中球数及びアルブミン含量を変えなかった。
【００７９】
ＬＰＳ吸入モデルは、内皮細胞及び上皮細胞における透過性の変化、並びに続く気管支肺胞空間における好中球及びアルブミンの集積に関してヒト疾患と類似することから、ＡＬＩ／ＡＲＤＳを模倣するのに許容される動物モデルである（Lung Cell Mol Physiol (2008), 295: L379-L399）。ＬＰＳ吸入モデルにおけるＸＩＢ１−ａ又はＸＩＢ１−ｂの有益な効果は、上皮又は内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患又は障害を治療及び／又は予防するという本発明のペプチドの有用性を実証している。具体的には、本発明のペプチドは、例えば急性肺障害（ＡＬＩ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）等の疾患及び障害を治療及び／又は予防するのに有用である。
【００８０】
ＸＩＢ１−ｂとＢβ１５−４２との比較
加えて、上で記載されるものと同じ設定を、ＸＩＢ１−ｂの影響を配列ＧＨＲＰＬＤＫＫＫＲＥＥＡＰＳＬＲＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＲ（配列番号４１）を有する、フィブリンから誘導されたペプチドであるＢβ１５−４２（非特許文献２０）の影響と比較するのに使用した。Ｂβ１５−４２はＸＩＢ１−ｂと同じように添加した。同様に、ＢＡＬＦのタンパク質含量及び細胞数を測定した。
【００８１】
【表９】
2013529916.tif 000010
【００８２】
【表１０】
2013529916.tif 000011
【００８３】
【表１１】
2013529916.tif 000012
【００８４】
【表１２】
2013529916.tif 000013
【００８５】
ＬＰＳ吸入モデルを用いて、ＢＡＬＦ中の好中球流入及びアルブミン集積に対するＸＩＢ１−ｂ及びＢβ１５−４２の効果を比較した。ＸＩＢ１−ｂ又はＢβ１５−４２によるマウスの腹腔内処理が、同等の範囲内でＢＡＬＦ中の好中球浸潤を低減した。さらに、驚くべきことに本明細書で見出されるように、ＸＩＢ１−ｂは、ＢＡＬＦのアルブミン含量を低減する上でＢβ１５−４２よりもかなり効果的であった。これは、ＸＩＢ１−ｂが本明細書で記載されるように上皮又は内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患又は障害を治療及び予防する上でより有効なものであることをはっきりと示している。特定の疾患及び障害は、火傷、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）又は浮腫を含む。
【００８６】
実施例７：人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）
実験を健常なＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢〜１０週齢、１９ｇ〜２５ｇの範囲の体重）を用いて行った。全ての実験介入はＡＡＡＬＡＣのガイドラインに従って行った。全ての実験はアムステルダム大学の倫理委員会の承認を受けた。
【００８７】
ＬＰＳによる事前チャレンジ
機械通気の開始の２時間前に、マウスにＬＰＳ（投与量：１匹のマウス当たり５０μｇ）（又は生理食塩水）を鼻腔内注射によりチャレンジし、肺障害を誘導した。
【００８８】
ＸＩＢ１−ｂ又はランダムペプチドの投与
機械通気の開始の１０分前に、ＸＩＢ１−１ｂ（又はランダムペプチド）を静脈内に投与した（投与量：４ｍｇ／ｋｇの負荷用量、１ｍｇ／ｋｇ／時間の静脈内注射の投与速度に従った）。
【００８９】
機械通気中の器具の使用（Instrumentation）及び麻酔
実験を通して、直腸温度は温浴を用いて３６．５℃〜３７．５℃に維持した。麻酔はケタミン、メデトミジン及びアトロピンの混合物の腹腔内注射により行った。
【００９０】
機械通気戦略
１．０ｍｍの外径及び０．６ｍｍの内径を有するＹ字管コネクタを全身麻酔下で気管に外科的に挿入した。マウスを仰臥位に配置し、人工呼吸器に繋いだ。マウスに１０ｃｍ  Ｈ２Ｏの吸気圧（ＶＴ  約７．５ｍＬ／ｋｇ、低ＶＴ（ＬＶＴ）となる）又は１８ｃｍ  Ｈ２Ｏの吸気圧（ＶＴ  約１５ｍＬ／ｋｇ、高ＶＴ（ＨＶＴ）となる）のいずれかに圧力を制御して通気した。両方のＭＶ戦略で、呼吸終末陽圧（ＰＥＥＰ）は２ｃｍ  Ｈ２Ｏに設定する。実験を通して吸気酸素分画を０．５に維持した。実験を通して吸気対呼気の比率を１：１に維持した。
【００９１】
流体支持戦略
マウスにＭＶの開始の１時間前に生理食塩水を腹腔内ボーラス投与し、その後３０分毎に腹腔内カテーテルにより生理食塩水をボーラス投与した。
【００９２】
血流動態及び通気のモニタリング
収縮期血圧及び心拍数を、完全実験を通して非侵襲的にモニタリングした。ＶＴは呼吸気流システムを用いて１時間毎にチェックした。
【００９３】
測定
ＢＡＬＦを、２２ゲージのＡｂｂｏｃａｔｈ−Ｔカテーテル（Abbott, Sligo, Ireland）により気管に生理食塩水のアリコート０．５ｍＬを３回注入することにより取得した。１匹のマウス当たりおよそ１．０ｍＬのＢＡＬＦを採取し、細胞数を血球計（Beckman Coulter, Fullerton, CA）を用いて求めた。続いて、分画のカウントを、変法ギムザ染色であるディフ・クイック染色（Dade Behring AG, Dudingen, Switzerland）を用いて染色したサイトスピン調製物において行った。上清を−８０℃で保存した。
【００９４】
アッセイ
ＢＡＬＦ中の総タンパク質レベルを、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（OZ Biosciences, Marseille, France）を使用して、標準としてウシ血清アルブミンを用いる製造業者の取扱説明書に従って求める。マウスＩｇＭを、抗マウスＩｇＭで感作した９６ストリップマイクロウェルプレートを製造業者の取扱説明書（ZeptoMetrix製のＩＭＭＵＮＯ−ＴＥＫキット）に従って使用することによりＥＬＩＳＡで求めた。
【００９５】
結果として、ＸＩＢ１−ｂは肺炎症を低減し、このことが肺損傷の低下と相関し、肺浮腫を低減することが示された。図１を参照されたい。
【００９６】
この実験では、肺障害はＬＰＳへのマウスの事前曝露、その後の高い又は低い通気量での機械通気により誘導された。マウスをＸＩＢ１−ｂ又はスクランブルペプチドのいずれかで処理した。ＸＩＢ１−ｂでのマウスの処理は、最も侵襲的な実験プロトコル（ＬＰＳ−ＨＴＶ）においてＢＡＬＦ中の総細胞数、好中球数、総タンパク質含量及びＩｇＭ含量の有意な低減をもたらした。スクランブルペプチドを用いることによる改善は観察されなかった。低い通気量の実験プロトコルを用いると、ＸＩＢ１−ｂ（ＬＰＳ＋ＬＴＶ）はスクランブルペプチドと比較してＢＡＬＦ中の総細胞数及び好中球数を有意に低減させた。低い通気量の処理プロトコルは総タンパク質含量及びＩｇＭ含量の顕著な増大を引き起こすことなく、このためＸＩＢ１−ｂの効果を観察することはできなかった。
【００９７】
本発明の動物モデルは肺炎に続発してＡＬＩ／ＡＲＤＳを発症する患者の臨床的状況を再現している。ＸＩＢ１−ｂで得られた陽性の結果は、上皮又は内皮のバリア機能の局所的な又は全身の破壊に関連する疾患又は障害を治療又は予防するのに本発明のペプチドが好適であることを実証している。特定の疾患及び障害は、火傷、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）又は浮腫を含む。
【配列表フリーテキスト】
【００９８】
配列番号１：／注記＝人工配列の説明：可変インサート
アミノ酸番号２のＸａａはＲ又はＡである
アミノ酸番号５のＸａａは除外されるか、又はＬ若しくはＶである
アミノ酸番号６のＸａａは除外されるか、又は１から５アミノ酸から成るアミノ酸配列である
アミノ酸番号７のＸａａは除外されるか、又はＧＧである
アミノ酸番号８のＸａａはＡ、Ｉ及びＳから成るグループから選択される２アミノ酸である
アミノ酸番号１１のＸａａは除外されるか、又は１から５アミノ酸から成るアミノ酸配列である
配列番号２：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
アミノ酸番号６のＸａａは除外されるか、又はＧＧである
配列番号３：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド：ＨＩＢ１−ｂ
配列番号４：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号５：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
アミノ酸番号６のＸａａは除外されるか、又はＧＧである
配列番号６：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号７：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号８：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号９：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号１０：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号１１：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号１２：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号１３：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号１４：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号１５：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号１６：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号１７：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号１８：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号１９：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号２０：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号２１：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号２２：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号２３：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号２４：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号２５：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号２６：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号２７：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号２８：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号２９：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号３０：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号３１：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号３２：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号３３：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号３４：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号３５：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号３６：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号３７：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド
配列番号３８：／注記＝人工配列の説明：可変インサート
配列番号３９：／注記＝人工配列の説明：シングリン由来ペプチド：ＸＩＢ１−ａ
配列番号４０：／注記＝人工配列の説明：可変インサート
配列番号４１：／注記＝人工配列の説明：ペプチドＢベータ１５−４２ 
【図１】
2013529916.tif 000014
【配列表】
2013529916000001.app
【国際調査報告】
2013529916.tif 000015
2013529916.tif 000016
2013529916.tif 000017