(57)【要約】   本明細書において、ＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドを含むペプチドの組み合わせを提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドの組み合わせを組成物（例えば医薬組成物）として提供し、別の実施形態では、ペプチドの組み合わせをキットとして提供する。さらに別の実施形態では、ペプチドの組み合わせを結合（例えば融合ペプチド、ヘテロ二量体）として提供する。特定の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、天然ヒトグルカゴンの類似体である。特定の態様において、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、天然ヒトグルカゴンの類似体である。いくつかの実施形態では、ＧＩＰアゴニストペプチドは、リンカーを介してグルカゴンアンタゴニストペプチドと共有結合する。本明細書に記載のペプチド組成物を投与することを含む、例えば代謝障害疾患（糖尿病、肥満症等）を治療する方法をさらに提供する。 【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＩＰ受容体において天然ＧＩＰの少なくとも０．１％の活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドと、グルカゴン受容体においてグルカゴンが達成する最大反応の少なくとも６０％の阻害を示すグルカゴンアンタゴニストペプチドと、を含むペプチドの組合せ。
【請求項２】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドおよび前記グルカゴンアンタゴニストペプチドが組成物の構成要素である、請求項１に記載のペプチドの組合せ。
【請求項３】
前記組成物は、薬剤的に許容可能な担体をさらに含む医薬組成物である、請求項２に記載のペプチドの組合せ。
【請求項４】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドおよび前記グルカゴンアンタゴニストペプチドがキットの構成要素である、請求項１に記載のペプチドの組合せ。
【請求項５】
前記キットは、哺乳動物を治療するための前記ＧＩＰペプチドおよびグルカゴンアンタゴニストペプチドの使用上の指示をさらに含む、請求項４に記載のペプチド組成物。
【請求項６】
前記キットにおいて、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは前記グルカゴンアンタゴニストペプチドとは別個に包装される、請求項４または５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項７】
前記キットにおいて、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは前記グルカゴンアンタゴニストペプチドと併せて包装される、請求項４または５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項８】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、前記グルカゴンアンタゴニストペプチドと結合して複合体を形成する、請求項１に記載のペプチドの組合せ。
【請求項９】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは前記グルカゴンアンタゴニストペプチドと共有結合する、請求項８に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１０】
前記複合体は、前記ＧＩＰアゴニストペプチドおよび前記グルカゴンアンタゴニストペプチドを含む融合ペプチドである、請求項９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１１】
前記複合体は、前記グルカゴンアンタゴニストペプチドと結合した前記ＧＩＰアゴニストペプチドを含むヘテロ二量体である、請求項９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１２】
前記ヘテロ二量体は、前記グルカゴンアンタゴニストペプチドと結合した前記ＧＩＰアゴニストペプチドを結合するリンカーを含む、請求項１１に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１３】
前記リンカーは二官能性リンカーである、請求項１２に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１４】
前記二官能性リンカーはポリエチレングリコールを含む、請求項１３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１５】
前記二官能性リンカーのいずれか一方の端は、前記ＧＩＰアゴニストペプチドおよびグルカゴンアンタゴニストペプチドのいずれか一方のＬｙｓと結合し、前記二官能性リンカーの他方の端は、前記ペプチドの他方のＣｙｓと結合する、請求項１３または１４に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１６】
前記Ｌｙｓは前記ＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端に位置する、請求項１５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１７】
前記Ｃｙｓは前記グルカゴンアンタゴニストペプチドのＣ末端または位置２４に位置する、請求項１５または１６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１８】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、前記ＧＩＰ受容体において天然ＧＩＰの活性の少なくとも１０％を示す、請求項１〜１７のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１９】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、前記グルカゴン受容体において天然グルカゴンの活性の１％以下を示す、請求項１〜１８のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２０】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、前記グルカゴン受容体においてグルカゴンが達成する最大反応の少なくとも８０％の阻害を示す、請求項１〜１９のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２１】
前記ＧＩＰ受容体に対する前記ＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０は、前記グルカゴン受容体に対する前記グルカゴンアンタゴニストペプチドのＩＣ５０の約５００倍以内である、請求項１〜２０のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２２】
（ｉ）前記ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＬＰ−１受容体を活性化するか；（ｉｉ）前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは該ＧＬＰ−１受容体を活性化するか；または、（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方である、請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２３】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、天然ヒトＧＩＰ（配列番号２）の類似体であり、最大１５個のアミノ酸修飾を有する、請求項１〜２２のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２４】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、天然ヒトＧＩＰ（配列番号２）のアミノ酸３〜２８を含む、請求項２３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２５】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、天然ヒトＧＩＰのアミノ酸３〜２８のＮ末端にアルファ−アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）を含む、請求項２４に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２６】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、前記ＡＩＢのＮ末端に小型の脂肪族アミノ酸を含む、請求項２５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２７】
（ｉ）前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、天然ヒトグルカゴン（配列番号１）の類似体であり、最大１５個のアミノ酸修飾を有するか；（ｉｉ）前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、該天然ヒトグルカゴン（配列番号１）の類似体であり、最大１５個のアミノ酸修飾を有するか；または、（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方である、請求項１〜２２のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２８】
請求項２７に記載のペプチドの組合せであって、
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、天然ヒトグルカゴン（配列番号１）の類似体であり、
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１のアミノ酸修飾と、
（ｂ）以下の（ｉ）と（ｉｉ） からなる群より選ばれる修飾と：
（ｉ）位置ｉと位置ｉ＋４のアミノ酸の側鎖間、または、位置ｊと位置ｊ＋３のアミノ酸の側鎖間のラクタム架橋（ここで、ｉは１２、１３、１６、１７、２０、または２４であり、ｊは１７である）；および
（ｉｉ）前記類似体の位置１６、２０、２１、および２４のアミノ酸の１つ、２つ、３つ、または全部が、α，α−二置換アミノ酸で置換される；
（ｃ）１〜１０個のさらなるアミノ酸修飾と、を含み、
（ｄ）任意でＣ末端アミドを含む、
ペプチドの組合せ。
【請求項２９】
前記位置１のアミノ酸修飾は、Ｈｉｓを、イミダゾール側鎖が欠如しているアミノ酸で置換することである、請求項２８に記載のペプチドの組合せ。
【請求項３０】
前記イミダゾール側鎖が欠如しているアミノ酸は大型の芳香族アミノ酸である、請求項２９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項３１】
前記大型の芳香族アミノ酸はＴｙｒである、請求項３０に記載のペプチドの組合せ。
【請求項３２】
前記イミダゾール側鎖が欠如しているアミノ酸は小型の脂肪族アミノ酸である、請求項３０に記載のペプチドの組合せ。
【請求項３３】
前記小型の脂肪族アミノ酸はＡｌａである、請求項３２に記載のペプチドの組合せ。
【請求項３４】
前記ラクタム架橋は位置１６と位置２０のアミノ酸の間にあり、該位置１６と位置２０のアミノ酸のいずれか一方はＧｌｕで置換され、該位置１６と位置２０のアミノ酸の他方はＬｙｓで置換される、請求項２８〜３３のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項３５】
前記α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢである、請求項２８〜３４のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項３６】
前記位置１６または位置２０のアミノ酸はα，α−二置換アミノ酸で置換される、請求項２８〜３５のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項３７】
前記位置２０のアミノ酸はＡＩＢであり、前記位置１６のアミノ酸は正に帯電したアミノ酸である、請求項３６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項３８】
前記正に帯電したアミノ酸は、式ＩＶ：
【化１】
2013518115.tif 000064
［式中、ｎは１〜７であり、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＯＨ、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＮＨ２ 、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＳＨ、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ３ −Ｃ６ ）シクロアルキル、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ２ −Ｃ５ ヘテロ環）、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ６ −Ｃ１０ アリール）Ｒ７ 、および（Ｃ１ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ３ −Ｃ９ ヘテロアリール）からなる群より選ばれ、Ｒ７ はＨまたはＯＨであり、該式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含む］
のアミノ酸である、請求項３７に記載のペプチドの組合せ。
【請求項３９】
前記式ＩＶのアミノ酸はホモＬｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、または２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）である、請求項３８に記載のペプチドの組合せ。
【請求項４０】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置２７、２８、および２９の１つ、２つ、または全部におけるアミノ酸修飾を含む、請求項２７〜３９のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項４１】
請求項４０に記載のペプチドの組合せであって、
（ａ）前記ＧＩＰアゴニストペプチドの位置２７のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸（任意でＬｅｕ）で置換され、
（ｂ）前記ＧＩＰアゴニストペプチドの位置２８のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸（任意でＡｌａ）で置換され、
（ｃ）前記ＧＩＰアゴニストペプチドの位置２９のＴｈｒは、小型の脂肪族アミノ酸（任意でＧｌｙ）で置換され、または、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のいずれか２つまたは全部が組み合わされる、
ペプチドの組合せ。
【請求項４２】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置２７にＬｅｕ、位置２８にＡｌａ、および位置２９にＧｌｙまたはＴｈｒを含む、請求項４１に記載のペプチドの組合せ。
【請求項４３】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置２８または２９のアミノ酸に、アミノ酸１〜２１個のＣ末端伸長部を含む、請求項２７〜４２のいずれに記載のペプチドの組合せ。
【請求項４４】
前記延長部は、配列番号３または４のアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項４５】
前記延長部の１〜６個のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸である、請求項４３または４４に記載のペプチドの組合せ。
【請求項４６】
請求項４５に記載のペプチドの組合せであって、前記１〜６個の正に帯電したアミノ酸は、Ａｒｇ、または式ＩＶのアミノ酸：
【化２】
2013518115.tif 000065
［式中、ｎは１〜７であり、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＯＨ、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＮＨ２ 、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＳＨ、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ３ −Ｃ６ ）シクロアルキル、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ２ −Ｃ５ ヘテロ環）、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ６ −Ｃ１０ アリール）Ｒ７ 、および（Ｃ１ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ３ −Ｃ９ ヘテロアリール）からなる群より選ばれ、Ｒ７ はＨまたはＯＨであり、該式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含む］
を含む、ペプチドの組合せ。
【請求項４７】
前記式ＩＶのアミノ酸はホモＬｙｓ、ｄ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、またはＤａｂである、請求項４６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項４８】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、アシル基またはアルキル基と共有結合した側鎖を含むアミノ酸を含み、該アシル基またはアルキル基は、天然由来のアミノ酸に対して外来性である、請求項２７〜４７のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項４９】
前記アシル基またはアルキル基と結合した前記アミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩのアミノ酸である、請求項４８に記載のペプチドの組合せ。
【請求項５０】
前記式Ｉのアミノ酸はＬｙｓである、請求項４９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項５１】
前記アシル基またはアルキル基と結合した前記アミノ酸は、配列番号１に照らして前記ＧＩＰアゴニストペプチドの位置１０に位置する、請求項４８〜５０のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項５２】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドが、位置２８または位置２９のアミノ酸に、アミノ酸１〜２１個のＣ末端伸長部を含む場合、前記アシル基またはアルキル基と結合する前記アミノ酸は、位置３７〜４３のいずれかに対応する位置に位置する、請求項４８〜５１のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項５３】
前記アシル基またはアルキル基と結合する前記アミノ酸は位置４０に位置する、請求項５２に記載のペプチドの組合せ。
【請求項５４】
前記アシル基またはアルキル基は、スペーサーを介して前記アミノ酸の側鎖と共有結合する、請求項４８〜５３のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項５５】
前記スペーサーの長さは３〜１０個の原子である、請求項５４に記載のペプチドの組合せ。
【請求項５６】
前記スペーサーはアミノ酸またはジペプチドである、請求項５５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項５７】
前記スペーサーは６−アミノヘキサン酸である、請求項５６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項５８】
前記スペーサーは、２つの酸性アミノ酸を含むジペプチドである、請求項５６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項５９】
前記スペーサーと前記アシル基との全長は、原子約１４〜約２８個の長さである、請求項５４〜５８のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項６０】
前記アシル基はＣ１２〜Ｃ１８の脂肪族アシル基である、請求項４８〜５９のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項６１】
前記アシル基はＣ１４またはＣ１６の脂肪族アシル基である、請求項６０に記載のペプチドの組合せ。
【請求項６２】
請求項２７〜６１のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、以下からなる群：
（ａ）位置２のＳｅｒの、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸による置換；
（ａ）位置１０のＴｙｒの、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌによる置換；
（ｂ）位置１０でのアシル基とＬｙｓの結合；
（ｃ）位置１２のＬｙｓの、Ａｒｇによる置換；
（ｄ）位置１６のＳｅｒの、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡＩＢによる置換；
（ｅ）位置１７のＡｒｇの、Ｇｌｎによる置換；
（ｆ）位置１８のＡｒｇの、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙによる置換；
（ｇ）位置２０のＧｌｎの、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはＡＩＢによる置換；
（ｈ）位置２１のＡｓｐの、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸による置換；
（ｉ）位置２３のＶａｌの、Ｉｌｅによる置換；
（ｊ）位置２４のＧｌｎの、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢによる置換；および
（ｋ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、および２９のいずれかでの保存的置換；
より選ばれる修飾を含む、ペプチドの組合せ。
【請求項６３】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、グルカゴン（配列番号１）の類似体であり、該類似体はアシル基を含み、該アシル基はスペーサーに結合している、請求項１〜２２のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、
（ｉ）前記スペーサーは、前記類似体の位置１０のアミノ酸の側鎖と結合し；または、
（ｉｉ）前記類似体は、位置２９のアミノ酸にアミノ酸１〜２１個のＣ末端伸長部を含み、前記スペーサーは、配列番号１に照らして位置３７〜４３のいずれか１つと対応するアミノ酸の側鎖と結合し；
前記類似体は、前記ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの少なくとも１％の活性を示す、ペプチドの組合せ。
【請求項６４】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載のペプチドの組合せであって、（ｉ）ＧＩＰアゴニスト活性を与えるアミノ酸修飾を位置１に有し、（ｉｉ）以下の（Ａ）および（Ｂ）のうちの少なくとも一方または両方であり：
（Ａ）前記類似体は、位置ｉと位置ｉ＋４のアミノ酸の側鎖間、または位置ｊと位置ｊ＋３のアミノ酸の側鎖間のラクタム架橋を含む（ここで、ｉは１２、１３、１６、１７、２０、または２４であり、ｊは１７である）；
（Ｂ）前記類似体の位置１６、２０、２１、および２４のアミノ酸の１つ、２つ、３つ、または全部が、α，α−二置換アミノ酸で置換される；
かつ、（ｉｉｉ）最大６個のさらなるアミノ酸修飾を有する、
ペプチドの組合せ。
【請求項６５】
請求項６４に記載のペプチドの組合せであって、前記類似体は、（ｉ）式ＩＶのアミノ酸：
【化３】
2013518115.tif 000066
［式中、ｎは１〜７であり、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＯＨ、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＮＨ２ 、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＳＨ、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ３ −Ｃ６ ）シクロアルキル、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ２ −Ｃ５ ヘテロ環）、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ６ −Ｃ１０ アリール）Ｒ７ 、および（Ｃ１ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ３ −Ｃ９ ヘテロアリール）からなる群より選ばれ、Ｒ７ はＨまたはＯＨであり、該式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含む］
による位置１６のＳｅｒのアミノ酸修飾と、（ｉｉ）アルファ，アルファ−二置換アミノ酸による、位置２０のＧｌｎのアミノ酸修飾を含む、ペプチドの組合せ。
【請求項６６】
位置２７、２８、および２９の１つ、２つ、または全部におけるアミノ酸修飾を含む、請求項６３〜６５のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項６７】
位置２７にＬｅｕ、位置２８にＡｌａ、および位置２９にＧｌｙまたはＴｈｒを含む、請求項６６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項６８】
前記延長部は配列番号３または４のアミノ酸配列を含む、請求項６３〜６７のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項６９】
前記スペーサーは、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩのアミノ酸の側鎖と結合する、請求項６３〜６８のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項７０】
前記式Ｉのアミノ酸はＬｙｓである、請求項６９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項７１】
前記スペーサーの長さは３〜１０個の原子である、請求項６３〜７０のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項７２】
前記スペーサーはアミノ酸またはジペプチドである、請求項７１に記載のペプチドの組合せ。
【請求項７３】
前記スペーサーは６−アミノヘキサン酸である、請求項７２に記載のペプチドの組合せ。
【請求項７４】
前記スペーサーは、２つの酸性アミノ酸を含むジペプチドである、請求項７２に記載のペプチドの組合せ。
【請求項７５】
前記スペーサーと前記アシル基との全長は、原子約１４〜約２８個の長さである、請求項６３〜７４のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項７６】
前記アシル基はＣ１２〜Ｃ１８の脂肪酸である、請求項６３〜７５のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項７７】
前記アシル基はＣ１４またはＣ１６である、請求項７６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項７８】
請求項１〜２２のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドはグルカゴン（配列番号１）の類似体であり、以下の修飾：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１のアミノ酸修飾、
（ｂ）位置ｉと位置ｉ＋４のアミノ酸の側鎖間、または位置ｊと位置ｊ＋３のアミノ酸の側鎖間のラクタム架橋（ここで、ｉは１２、１３、１６、１７、２０、または２４であり、ｊは１７である）、
（ｃ）位置２７、２８、および２９の１つ、２つ、または全部におけるアミノ酸修飾、
（ｄ）１〜６個のさらなるアミノ酸修飾、
を有し、ＧＩＰ受容体活性に対する前記類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である、ペプチドの組合せ。
【請求項７９】
前記位置１のアミノ酸修飾は、Ｈｉｓを、イミダゾール側鎖が欠如しているアミノ酸で置換することである、請求項７８に記載のペプチドの組合せ。
【請求項８０】
請求項７８または７９に記載のペプチドの組合せであって、
（ａ）前記位置１のアミノ酸修飾は、Ｈｉｓを、大型の芳香族アミノ酸（任意でＴｙｒ）で修飾することであり、
（ｂ）前記ラクタム架橋は前記位置１６と位置２０のアミノ酸の間にあり、該位置１６と位置２０のアミノ酸のいずれか一方はＧｌｕで置換され、該位置１６と位置２０のアミノ酸の他方はＬｙｓで置換され、
（ｃ）前記位置２７のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸（任意でＬｅｕ）で置換され、
（ｄ）前記位置２８のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸（任意でＡｌａ）で置換され、
（ｅ）前記位置２９のＴｈｒは、小型の脂肪族アミノ酸（任意でＧｌｙ）で置換される、
ペプチドの組合せ。
【請求項８１】
請求項７８〜８０のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、以下の修飾：
（ａ）位置１２のアミノ酸修飾（任意でＩｌｅによる置換）、
（ｂ）位置１７および１８のアミノ酸修飾（任意で、位置１７はＱによる置換、位置１８はＡによる置換）、
（ｃ）Ｃ末端へのＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１９５）の付加
のうちの１つ以上を含む、ペプチドの組合せ。
【請求項８２】
請求項７８〜８１のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、以下の修飾：
（ｌ）位置２のＳｅｒの、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸による置換；
（ｍ）位置１０のＴｙｒの、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌによる置換；
（ｎ）位置１０でのアシル基とＬｙｓの結合；
（ｏ）位置１２のＬｙｓの、Ａｒｇによる置換；
（ｐ）位置１６のＳｅｒの、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡＩＢによる置換；
（ｑ）位置１７のＡｒｇの、Ｇｌｎによる置換；
（ｒ）位置１８のＡｒｇの、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙによる置換；
（ｓ）位置２０のＧｌｎの、Ａｌａ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはＡＩＢによる置換；
（ｔ）位置２１のＡｓｐの、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸による置換；
（ｕ）位置２３のＶａｌの、Ｉｌｅによる置換；
（ｖ）位置２４のＧｌｎの、Ａｓｎ、Ａｌａ、またはＡＩＢによる置換；および
（ｗ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、および２９のいずれかでの保存的置換；
のうちの１つ以上、またはこれらの任意の組み合わせを含む、ペプチドの組合せ。
【請求項８３】
請求項１〜２２のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、グルカゴン（配列番号１）の類似体であり、以下の修飾：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１のアミノ酸修飾、
（ｂ）前記類似体の位置１６、２０、２１、および２４のうちの１つ、２つ、３つ、または全部のアミノ酸が、α，α−二置換アミノ酸で置換される、
（ｃ）位置２７、２８、および２９の１つ、２つ、または全部の位置のアミノ酸修飾、および
（ｄ）１〜６個のさらなるアミノ酸修飾、
を有し、ＧＩＰ受容体活性に対する前記類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である、ペプチドの組合せ。
【請求項８４】
前記位置１のアミノ酸修飾は、Ｈｉｓを、イミダゾール側鎖が欠如しているアミノ酸で置換することである、請求項８３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項８５】
請求項８３または８４に記載のペプチドの組合せであって、
（ａ）前記位置１のアミノ酸修飾は、Ｈｉｓを、大型の芳香族アミノ酸（任意でＴｙｒ）で修飾することであり、
（ｂ）α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢであり、
（ｃ）前記位置２７のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸（任意でＬｅｕ）で置換され、
（ｄ）前記位置２８のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸（任意でＡｌａ）で置換され、
（ｅ）前記位置２９のＴｈｒは、小型の脂肪族アミノ酸（任意でＧｌｙ）で置換される、
ペプチドの組合せ。
【請求項８６】
請求項８３〜８５のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、以下の修飾：
（ａ）位置１２のアミノ酸修飾（任意でＩｌｅによる置換）、
（ｂ）位置１７および１８のアミノ酸修飾（任意で、位置１７はＱによる置換、位置１８はＡによる置換）、
（ｃ）Ｃ末端へのＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）の付加、
のうちの１つ以上を含む、ペプチドの組合せ。
【請求項８７】
請求項８３〜８６のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、以下の修飾：
（ａ）位置２のＳｅｒの、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸による置換；
（ｂ）位置１０のＴｙｒの、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌによる置換；
（ｃ）位置１０でのアシル基とＬｙｓの結合；
（ｄ）位置１２のＬｙｓの、Ａｒｇによる置換；
（ｅ）位置１６のＳｅｒの、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡＩＢによる置換；
（ｆ）位置１７のＡｒｇの、Ｇｌｎによる置換；
（ｇ）位置１８のＡｒｇの、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙによる置換；
（ｈ）位置２０のＧｌｎの、Ａｌａ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはＡＩＢによる置換；
（ｉ）位置２１のＡｓｐの、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸による置換；
（ｊ）位置２３のＶａｌの、Ｉｌｅによる置換；
（ｋ）位置２４のＧｌｎの、Ａｓｎ、Ａｌａ、またはＡＩＢによる置換；および
（ｌ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、および２９のいずれかでの保存的置換；
のうちの１つ以上、またはこれらの任意の組み合わせを含む、ペプチドの組合せ。
【請求項８８】
請求項１〜２２のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、グルカゴン（配列番号１）の類似体であり、以下の修飾：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１のアミノ酸修飾、
（ｂ）位置１６のＳｅｒの、式ＩＶのアミノ酸：
【化４】
2013518115.tif 000067
［式中、ｎは１〜７であり、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＯＨ、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＮＨ２ 、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＳＨ、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ３ −Ｃ６ ）シクロアルキル、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ２ −Ｃ５ ヘテロ環）、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ６ −Ｃ１０ アリール）Ｒ７ 、および（Ｃ１ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ３ −Ｃ９ ヘテロアリール）からなる群より選ばれ、Ｒ７ はＨまたはＯＨであり、該式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含む］
による修飾、
（ｃ）位置２０のＧｌｎの、アルファ，アルファ−ニ置換アミノ酸によるアミノ酸修飾、
（ｄ）位置２７、２８、および２９の１つ、２つ、または全部の位置のアミノ酸修飾、および
（ｅ）１〜６個のさらなるアミノ酸修飾
を有し、ＧＩＰ受容体活性に対する前記類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である、ペプチドの組合せ。
【請求項８９】
前記位置１のアミノ酸修飾は、Ｈｉｓを、イミダゾール側鎖が欠如しているアミノ酸で置換することである、請求項８８に記載のペプチドの組合せ。
【請求項９０】
前記イミダゾール側鎖が欠如しているアミノ酸は大型の芳香族アミノ酸である、請求項８９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項９１】
前記大型の芳香族アミノ酸はＴｙｒである、請求項９０に記載のペプチドの組合せ。
【請求項９２】
前記（ｂ）中の式ＩＶのアミノ酸はホモＬｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、または２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）である、請求項８８〜９１のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項９３】
前記アルファ，アルファ−二置換アミノ酸はＡＩＢである、請求項８８〜９２のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項９４】
（ｉ）前記位置２７のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸（任意でＬｅｕ）で置換され、（ｉｉ）前記位置２８のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸（任意でＡｌａ）で置換され、もしくは（ｉｉｉ）前記位置２９のＴｈｒは、小型の脂肪族アミノ酸（任意でＧｌｙ）で置換され、または、前記類似体は（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の組み合わせを含む、請求項８８〜９３のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項９５】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置２９のアミノ酸のＣ末端に、アミノ酸配列ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号４）を含む、請求項８８〜９４のいずれに記載のペプチドの組合せ。
【請求項９６】
請求項８８〜９５のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、以下の修飾：
（ａ）位置２のＳｅｒの、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸による置換；
（ｂ）位置３のＧｌｎの、Ｇｌｕによる置換；
（ｃ）位置１０のアミノ酸Ｔｙｒの、アシル基またはアルキル基と共有結合した側鎖を含むアミノ酸による置換；
（ｄ）前記類似体のＣ末端アミノ酸としての、アシル基またはアルキル基と共有結合した側鎖を含むアミノ酸の付加；
（ｅ）位置１２のＬｙｓの、Ｉｌｅによる置換；
（ｆ）位置１７のＡｒｇの、Ｇｌｎによる置換；
（ｇ）位置１８のＡｒｇの、Ａｌａによる置換；
（ｈ）位置２１のＡｓｐの、Ｇｌｕによる置換；および
（ｉ）位置２４のＧｌｎの、Ａｓｎによる置換；
の１つ以上を含む、ペプチドの組合せ。
【請求項９７】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、（ａ）ＤＰＰ−ＩＶに対する耐性を与える位置２のアミノ酸修飾と、（ｂ）アシル基またはアルキル基と共有結合した位置４０のアミノ酸と、を含む、請求項９５または９６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項９８】
位置２４のアミノ酸と結合した親水性部分を含む、請求項９７に記載のペプチドの組合せ。
【請求項９９】
請求項１〜２２のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、グルカゴン（配列番号１）の類似体であり、以下の修飾：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１のアミノ酸修飾、および
（ｂ）位置２９のアミノ酸へのアミノ酸１〜２１個のＣ末端伸長部（ここで、配列番号１に照らして位置３７〜４３に対応する該延長部のアミノ酸のうち、少なくとも１つはアシル化またはアルキル化される）、
を含み、ＧＩＰ受容体活性に対する該類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である、ペプチドの組合せ。
【請求項１００】
請求項９９に記載のペプチドの組合せであって、前記類似体は、以下の修飾のいずれか１つ：
（Ａ）前記類似体は、位置ｉと位置ｉ＋４のアミノ酸の側鎖間、または位置ｊと位置ｊ＋３のアミノ酸の側鎖間のラクタム架橋を含む（ここで、ｉは１２、１３、１６、１７、２０、または２４であり、ｊは１７である）；
（Ｂ）前記類似体の位置１６、２０、２１、および２４のアミノ酸の１つ、２つ、３つ、または全部が、α，α−二置換アミノ酸で置換される；または
（Ｃ）前記類似体は、
（ｉ）位置１６のＳｅｒの、式ＩＶのアミノ酸によるアミノ酸修飾と：
【化５】
2013518115.tif 000068
［式中、ｎは１〜７であり、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＯＨ、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＮＨ２ 、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＳＨ、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ３ −Ｃ６ ）シクロアルキル、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ２ −Ｃ５ ヘテロ環）、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ６ −Ｃ１０ アリール）Ｒ７ 、および（Ｃ１ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ３ −Ｃ９ ヘテロアリール）からなる群より選ばれ、Ｒ７ はＨまたはＯＨであり、該式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含む］
（ｉｉ）位置２０のＧｌｎの、アルファ，アルファ−二置換アミノ酸によるアミノ酸修飾、を含む；
をさらに含む、ペプチドの組合せ。
【請求項１０１】
位置２７および２８のいずれか一方または両方でのさらなるアミノ酸修飾を含む、請求項９９または１００に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１０２】
前記位置１のアミノ酸修飾は、Ｈｉｓを、イミダゾール側鎖が欠如しているアミノ酸で置換することである、請求項９９〜１０１のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１０３】
前記イミダゾール側鎖が欠如しているアミノ酸は大型の芳香族アミノ酸である、請求項１０２に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１０４】
前記大型の芳香族アミノ酸はＴｙｒである、請求項１０３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１０５】
前記１〜２１個のアミノ酸は、アミノ酸配列ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（アミノ酸配列４）（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸、または配列番号３もしくは４に照らして１つ以上の保存的置換を含むアミノ酸配列である）を含む、請求項９９〜１０４のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１０６】
前記１〜２１個のアミノ酸は、アミノ酸配列ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号４）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含む、請求項７６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１０７】
前記アシル化またはアルキル化されるアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩのアミノ酸である、請求項９９〜１０６のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１０８】
前記アシル化またはアルキル化されるアミノ酸はＬｙｓである、請求項１０７に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１０９】
前記アシル化またはアルキル化されるアミノ酸は、前記類似体の位置３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３のいずれかに位置する、請求項９９〜１０８のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１１０】
前記アシル化またはアルキル化されるアミノ酸は、前記類似体の位置４０に位置する、請求項１０９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１１１】
前記類似体は、位置１６と位置２０のアミノ酸の間のラクタム架橋を含み、該位置１６と位置２０のアミノ酸のいずれか一方はＧｌｕで置換され、該位置１６と位置２０のアミノ酸の他方はＬｙｓで置換される、請求項９９〜１１０のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１１２】
前記類似体は、位置１６、２０、２１、または２４のアミノ酸の１つ、２つ、３つ、または全部が、α，α−二置換アミノ酸であるＡＩＢに置換されたものを含む、請求項９９〜１１１のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１１３】
前記類似体は位置２０にＡＩＢを含む、請求項１１２に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１１４】
前記類似体は、位置１６にホモＬｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、または２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）を含み、位置２０にＡＩＢを含む、請求項９９〜１１３のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１１５】
請求項９９〜１１４のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、以下の修飾：
（ａ）位置２のＳｅｒの、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸による置換；
（ｂ）位置３のＧｌｎの、Ｇｌｕによる置換；
（ｃ）位置１０のアミノ酸Ｔｙｒの、アシル基またはアルキル基と共有結合した側鎖を含むアミノ酸による置換；
（ｅ）位置１２のＬｙｓの、Ｉｌｅによる置換；
（ｆ）位置１７のＡｒｇの、Ｇｌｎによる置換；
（ｇ）位置１８のＡｒｇの、Ａｌａによる置換；
（ｈ）位置２１のＡｓｐの、Ｇｌｕによる置換；および
（ｉ）位置２４のＧｌｎの、Ａｓｎによる置換；
の１つ以上を含む、ペプチドの組合せ。
【請求項１１６】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶに対する耐性を与える位置２のアミノ酸修飾を含む、請求項９９〜１１５のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１１７】
前記位置２のアミノ酸は、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸からなる群より選ばれる、請求項１１６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１１８】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、最大６個のさらなるアミノ酸修飾を含む、請求項９９〜１１７のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１１９】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号３２７、３２８、３２９、または３３０のいずれか１つに従うアミノ酸配列と、位置２９のアミノ酸へのアミノ酸１〜２１個のＣ末端伸長部とを含むグルカゴン類似体であり、ＧＩＰ受容体活性に対する該類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である、請求項１〜２２のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１２０】
前記アミノ酸１〜２１個の延長部は、アミノ酸配列ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（アミノ酸配列４）（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸、または配列番号３もしくは４に照らして１つ以上の保存的置換を含む任意のアミノ酸配列である）を含む、請求項１１９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１２１】
前記アミノ酸１〜２１個の延長部は、アミノ酸配列ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号４）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含む、請求項１１９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１２２】
前記延長部のアミノ酸の少なくとも１つは、位置３７〜４３のいずれかに対応する位置でアシル化またはアルキル化される、請求項１１９〜１２１のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１２３】
前記アシル化またはアルキル化されるアミノ酸は、前記類似体の位置４０に位置する、請求項１２２に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１２４】
前記類似体は、アミノ酸位置２４で親水性部分と共有結合する、請求項１１９〜１２３のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１２５】
前記親水性部分は、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンと共有結合する、請求項１２４に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１２６】
前記親水性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１２４または１２５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１２７】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、最大６個のさらなるアミノ酸修飾をさらに含む、請求項１１９〜１２６のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１２８】
請求項１２７に記載のペプチドの組合せであって、以下の修飾：
（ａ）位置２のアミノ酸は、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸のいずれか１つである；
（ａ）位置１０のアミノ酸は、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌである；
（ｂ）位置１０でのアシル基とＬｙｓの結合；
（ｃ）位置１２のアミノ酸は、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇである；
（ｄ）位置１６のアミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡＩＢのいずれか１つである；
（ｅ）位置１７のアミノ酸は、ＧｌｎまたはＡｒｇである；
（ｆ）位置１８のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙのいずれか１つである；
（ｇ）位置２０のアミノ酸は、Ａｌａ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、もしくはＡＩＢ、または別のアルファ，アルファ−二置換アミノ酸である；
（ｈ）位置２１のアミノ酸は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸のいずれか１つである；
（ｉ）位置２３のアミノ酸は、ＶａｌまたはＩｌｅである；
（ｊ）位置２４のアミノ酸は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、またはＡＩＢのいずれか１つである；
（ｋ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、および２９のいずれかでの１つ以上の保存的置換；
のうちの１つ以上を含む、ペプチドの組合せ。
【請求項１２９】
請求項１〜１２８のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは：
（ａ）配列番号１９９〜２４１、２４４〜２６４、２６６、２９２〜３０７、３０９〜３２１、および３２３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む類似体であり、
（ｂ）配列番号２６７〜２６９、２７３〜２７８、および３２５からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む類似体であり；
（ｃ）配列番号１０５〜１９４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む類似体である、
ペプチドの組合せ。
【請求項１３０】
前記アシル基はスペーサーを介して前記Ｌｙｓと結合する、請求項８２または８７に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１３１】
前記アシル基またはアルキル基はスペーサーを介して前記アミノ酸側鎖と結合する、請求項９６〜９８、１１５、および１２８のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１３２】
配列番号１に照らして位置３７〜４３のいずれかでアシル化またはアルキル化される前記アミノ酸は、スペーサーを介してアシル基またはアルキル基と共有結合する、請求項９９、１２２、および１２３のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１３３】
アシル化またはアルキル化される前記アミノ酸は、配列番号１に照らして位置４０に位置する、請求項１３５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１３４】
前記類似体がアシル基またはアルキル基を含む場合、該アシル基またはアルキル基はスペーサーを介して該類似体と結合する、請求項１２９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１３５】
前記スペーサーの長さは３〜１０個の原子である、請求項１３０〜１３４のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１３６】
前記スペーサーはアミノ酸またはジペプチドである、請求項１３５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１３７】
前記スペーサーは６−アミノヘキサン酸である、請求項１３６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１３８】
前記スペーサーは、２つの酸性アミノ酸を含むジペプチドである、請求項１３６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１３９】
前記スペーサーと前記アシル基との全長は、原子約１４〜約２８個の長さである、請求項１３０〜１３８のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１４０】
前記アシル基はＣ１２〜Ｃ１８の脂肪族アシル基である、請求項１３０〜１３９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１４１】
前記アシル基はＣ１４またはＣ１６の脂肪族アシル基である、請求項１４０に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１４２】
ＧＩＰ受容体活性化に対する前記ＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０は約１ｎＭ以下である、請求項１〜１４１のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１４３】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、前記ＧＩＰ受容体に対する野生型ＧＩＰ（配列番号２）の活性の少なくとも約４％を有する、請求項１〜１４２のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１４４】
ＧＬＰ−１受容体活性化に対する前記ＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０は約１ｎＭ以下である、請求項１〜１４３のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１４５】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、前記ＧＬＰ−１受容体においてＧＬＰ−１の活性の少なくとも約４％を有する、請求項１〜１４４のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１４６】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置３のアミノ酸修飾を含み、前記グルカゴン受容体においてグルカゴンの活性の１％未満を有する、請求項１２０を除く請求項１〜１４５のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１４７】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置７のアミノ酸修飾を含み、前記ＧＬＰ−１受容体においてＧＬＰ−１の活性の約１０％未満を有する、請求項１４４と１４５を除く請求項１〜１４６のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１４８】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、アミノ酸位置１９、２０、２３、２４、２７、３２、４３またはＣ末端のいずれかで親水性部分と共有結合する、請求項１〜１４７のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１４９】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、アミノ酸位置２７または４３で親水性部分と共有結合する、請求項１４８に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１５０】
前記親水性部分は、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンと共有結合する、請求項１４８または１４９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１５１】
前記親水性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１４８〜１５０のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１５２】
前記ＰＥＧは、約１，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１５１に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１５３】
前記ＰＥＧは、約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１５１に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１５４】
ＧＩＰ受容体活性化に対する前記類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である、請求項１４８〜１５３のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１５５】
前記類似体は、前記ＧＩＰ受容体において野生型ＧＩＰ（配列番号２）の活性の少なくとも約０．４％を有する、請求項１４８〜１５３のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１５６】
ＧＬＰ−１受容体活性化に対する前記ＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である、請求項１４８〜１５５のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１５７】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、前記ＧＬＰ−１受容体においてＧＬＰ−１の活性の少なくとも約０．４％を有する、請求項１４８〜１５５のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１５８】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号１０５〜１９４、１９９〜２６９、２７３〜２７８、２９２〜３０７、３０９〜３２１、３２３、および３２５のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２７〜１５７のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１５９】
請求項１〜２２のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、下記：
（ｉ）１個以上かつ最大で１０個のアミノ酸修飾を有する配列番号１（ここで、該アミノ酸修飾の少なくとも１つは、前記ＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端部分における安定したアルファヘリックス構造を与える）；
（ｉｉ）位置２９のアミノ酸へのアミノ酸１〜２１個のＣ末端伸長部；および
（ｉｉｉ）以下の（ａ）〜（ｄ）のうち少なくとも１つ：
（ａ）位置３７〜４３（配列番号１の番号付けによる）のいずれかに位置する延長部のアミノ酸の少なくとも１つは、天然由来のアミノ酸に対して外来性のアシル基またはアルキル基を含み、
（ｂ）前記延長部の１〜６個のアミノ酸は正に帯電したアミノ酸であり、
（ｃ）前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、該ＧＩＰアゴニストペプチドの位置１０に、アシル基またはアルキル基を含むアミノ酸を含み、該アシル基またはアルキル基は、天然由来のアミノ酸に対して外来性であり、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の組み合わせ；
を含み、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、親水性部分が欠如しているとき、前記ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの少なくとも０．１％の活性を示す、
ペプチドの組合せ。
【請求項１６０】
請求項１５９に記載のペプチドの組合せであって、（ｉ）前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置ｉのアミノ酸と位置ｉ＋４のアミノ酸の側鎖間、または位置ｊと位置ｊ＋３のアミノ酸の側鎖間の分子内架橋を含むか（ここで、ｉは１２、１３、１６、１７、２０、もしくは２４であり、ｊは１７である）、（ｉｉ）前記ＧＩＰアゴニストペプチドの位置１６、２０、２１、もしくは２４の１つ、２つ、もしくは３つ以上はα，α−二置換アミノ酸で置換されるか、または、（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方である、ペプチドの組合せ。
【請求項１６１】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１６にＧｌｕおよび位置２０にＬｙｓを含み、任意で、ラクタム架橋により該Ｇｌｕと該Ｌｙｓが結合する、請求項１５９または１６０に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１６２】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、以下のうちの１つ以上：位置１７にＧｌｎ、位置１８にＡｌａ、位置２１にＧｌｕ、位置２３にＩｌｅ、および位置２４にＡｌａもしくはＣｙｓ、または、これらの１つ以上の保存的アミノ酸置換、を含む、請求項１６１に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１６３】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドはＣ末端アミドを含む、請求項１５９〜１６２のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１６４】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１、位置２、または位置１と２にアミノ酸修飾を含み、該アミノ酸修飾はＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を達成する、請求項１５９〜１６３のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１６５】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドの位置１のＨｉｓは、以下からなる群：Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、およびホモ−ヒスチジン、より選ばれるアミノ酸で置換される、請求項１６４に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１６６】
位置２のＳｅｒは、以下からなる群：Ｄ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、およびアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）、より選ばれるアミノ酸で置換される、請求項１６４または１６５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１６７】
前記類似体の位置１のアミノ酸は大型の芳香族アミノ酸ではない、請求項１５９〜１６４のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１６８】
前記類似体の位置１のアミノ酸はＴｙｒではない、請求項１６７に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１６９】
請求項１５９〜１６８のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、以下の修飾：
ａ．位置２のＳｅｒの、Ａｌａによる置換；
ｂ．位置３のＧｌｎの、Ｇｌｕまたはグルタミン類似体による置換；
ｃ．位置７のＴｈｒの、Ｉｌｅによる置換；
ｄ．位置１０のＴｙｒの、Ｔｒｐによる、または天然由来アミノ酸に対して外来性のアシル基もしくはアルキル基を含むアミノ酸による置換；
ｅ．位置１２のＬｙｓの、Ｉｌｅによる置換；
ｆ．位置１５のＡｓｐの、Ｇｌｕによる置換；
ｇ．位置１６のＳｅｒの、Ｇｌｕによる置換；
ｈ．位置２０のＧｌｎのＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡＩＢによる置換；
ｉ．位置２４のＧｌｎの、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡＩＢによる置換；
ｊ．位置２７のＭｅｔの、ＬｅｕまたはＮｌｅによる置換；
ｋ．位置２９のＡｓｎの、荷電アミノ酸（任意でＡｓｐまたはＧｌｕ）による置換；および
ｌ．位置２９のＴｈｒの、Ｇｌｙまたは荷電アミノ酸（任意でＡｓｐまたはＧｌｕ）による置換；
のうちの１つ以上を含む、ペプチドの組合せ。
【請求項１７０】
請求項１５９〜１６９のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、（ｉ）ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号４）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号３または配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する（ｉ）もしくは（ｉｉ）のアミノ酸配列であって、前記ＧＩＰアゴニストペプチドの位置２９のアミノ酸のＣ末端であるアミノ酸配列、を含む、ペプチドの組合せ。
【請求項１７１】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドの位置２９のアミノ酸のＣ末端に、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号４）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）のアミノ酸配列を含む、請求項１７０に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１７２】
前記アシル基またはアルキル基を含むアミノ酸は式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩのアミノ酸である、請求項１５９〜１７１のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１７３】
前記アシル基またはアルキル基を含むアミノ酸はＬｙｓである、請求項１７２に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１７４】
前記アシル基またはアルキル基を含むアミノ酸は、前記ＧＩＰアゴニストペプチドの位置３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３のいずれかに位置する、請求項１５９〜１７３のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１７５】
前記アシル基またはアルキル基を含むアミノ酸は前記ＧＩＰアゴニストペプチドの位置４０に位置する、請求項１７４に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１７６】
前記アシル基はＣ４〜Ｃ３０の脂肪族アシル基である、請求項１５９〜１７５のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１７７】
前記アシル基またはアルキル基は、スペーサーを介して前記アミノ酸の側鎖と共有結合する、請求項１５９〜１７６のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１７８】
前記スペーサーの長さは３〜１０個の原子である、請求項１７７に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１７９】
前記スペーサーはアミノ酸またはジペプチドである、請求項１７８に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１８０】
前記スペーサーは６−アミノヘキサン酸である、請求項１７９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１８１】
前記スペーサーは、２つの酸性アミノ酸を含むジペプチドである、請求項１７９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１８２】
前記スペーサーと前記アシル基との全長は、原子約１４〜約２８個の長さである、請求項１７７〜１８１のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１８３】
前記アシル基はＣ１２〜Ｃ１８の脂肪族アシル基である、請求項１５９〜１８２のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１８４】
前記アシル基はＣ１４またはＣ１６の脂肪族アシル基である、請求項１８３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１８５】
前記１〜６個の正に帯電したアミノ酸は、前記ＧＩＰアゴニストペプチドの位置３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３（配列番号１の番号付けによる）のいずれかに位置する、請求項１５９〜１８４のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１８６】
位置４０に正に帯電したアミノ酸を含む、請求項１８５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１８７】
請求項１５９〜１８６のいずれに記載のペプチドの組合せであって、前記正に帯電したアミノ酸は、式ＩＶの構造：
【化６】
2013518115.tif 000069
［式中、ｎは１〜１６、もしくは１〜１０、もしくは１〜７、もしくは１〜６、もしくは２〜６、もしくは２、もしくは３、もしくは４、もしくは５であり、Ｒ１ とＲ２ はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＯＨ、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＮＨ２ 、（Ｃ１ −Ｃ１８ アルキル）ＳＨ、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ３ −Ｃ６ ）シクロアルキル、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ２ −Ｃ５ ヘテロ環）、（Ｃ０ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ６ −Ｃ１０ アリール）Ｒ７ 、および（Ｃ１ −Ｃ４ アルキル）（Ｃ３ −Ｃ９ ヘテロアリール）からなる群より選ばれ、Ｒ７ はＨまたはＯＨであり、該式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含む］
を含む、ペプチドの組合せ。
【請求項１８８】
前記式ＩＶのアミノ酸はＯｒｎ、Ｄａｂ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、またはホモＬｙｓである、請求項１８７に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１８９】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、アミノ酸位置１９、２０、２３、２４、２７、３２、４３、またはＣ末端のいずれかで親水性部分と共有結合する、請求項２７〜１８８のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１９０】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、アミノ酸位置２４または４０で親水性部分と共有結合する、請求項１８９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１９１】
前記親水性部分は、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンと共有結合する、請求項１８９または１９０に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１９２】
前記親水性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１８９〜１９１のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１９３】
前記ＰＥＧは、約１，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１９２に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１９４】
前記ＰＥＧは、約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１９２に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１９５】
前記位置１のアミノ酸は欠失するか、または小型の脂肪族アミノ酸で置換される、請求項２７〜１９４のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１９６】
前記小型の脂肪族アミノ酸はＡｌａである、請求項１９５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項１９７】
前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号１０５７〜１０６９のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１５９〜１９６のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１９８】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、配列番号１１４２の配列、またはそのオキシ誘導体を含む、請求項１〜１９７のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項１９９】
配列番号１１４２の配列を含む、請求項１９８に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２００】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドのＣ末端アミノ酸は、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基の代わりにアミド基を有する、請求項１９８または１９９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２０１】
位置４のアミノ酸はアスパラギン酸である、請求項１９８または１９９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２０２】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、配列番号１１４２のカルボキシ末端アミノ酸と融合した配列番号１１１９のアミノ酸を含む、請求項１９８または１９９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２０３】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、配列番号１１４２の位置１１、１６、もしくは１９、または該グルカゴンアンタゴニストペプチドのＮもしくはＣ末端アミノ酸の位置でアミノ酸残基と共有結合した親水性部分、および該グルカゴンペプチドの薬剤的に許容可能な塩を含む、請求項１９８または１９９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２０４】
前記親水性部分は血漿タンパク質、または免疫グロブリンのＦｃ部分である、請求項２０３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２０５】
前記親水性部分はポリエチレングリコールである、請求項２０３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２０６】
前記ポリエチレングリコールの鎖は少なくとも約２０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項２０５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２０７】
前記ポリエチレングリコールの鎖は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選ばれる分子量を有する、請求項２０５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２０８】
前記アンタゴニストは、配列番号１１０９、配列番号１１１０、配列番号１１１１、配列番号１１１２、配列番号１１１６、配列番号１１１７、配列番号１１１８、配列番号１１４３、配列番号１１４４、または配列番号１１４５の配列を含む、請求項２０５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２０９】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、配列番号１１４６または配列番号１１４７の配列を含む、請求項１９８または１９９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２１０】
請求項１９８または１９９に記載のペプチドの組合せであって、
（ａ）位置２３のアミノ酸がＡｓｎの場合、位置２４のアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸からなる群より選ばれ、かつ
（ｂ）位置２４のアミノ酸がＴｈｒの場合、位置２３のアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸からなる群より選ばれる、
ペプチドの組合せ。
【請求項２１１】
請求項１９８または１９９に記載のペプチドの組合せであって、前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、配列番号１１４２の前記グルカゴンアンタゴニストペプチドのカルボキシ末端に付加された１〜２個のアミノ酸をさらに含み、該カルボキシ末端に付加された該アミノ酸は、独立して、アスパラギン酸またはグルタミン酸からなる群より選ばれる、ペプチドの組合せ。
【請求項２１２】
配列番号１１４２の位置１０のアミノ酸は、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸、またはホモシステイン酸からなる群より選ばれる、請求項１９８または１９９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２１３】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、配列番号１１０７、配列番号１１０８、配列番号１１３６、配列番号１１３７、配列番号１１３８、配列番号１１３９、配列番号１１４０、および配列番号１１４１の配列を含む、請求項１９８または１９９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２１４】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、該グルカゴンアンタゴニストのカルボキシ末端アミノ酸と融合した配列番号１１１９または配列番号１１５３のアミノ酸を含む、請求項２１３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２１５】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、配列番号１１４２の位置１１、１６、もしくは１９のアミノ酸残基、または該グルカゴンアンタゴニストのＮもしくはＣ末端アミノ酸と共有結合する親水性部分、および該グルカゴンペプチドの薬剤的に許容可能な塩を含む、請求項２１３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２１６】
前記親水性部分はポリエチレングリコールである、請求項２１５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２１７】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは配列番号１１４１の配列を有し、該配列の位置４のアミノ酸はアスパラギン酸であり、位置１０はグルタミン酸である、請求項２１６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２１８】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、配列番号１１０８、配列番号１１３７、または配列番号１１３８の配列を含む、請求項２１３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２１９】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、該グルカゴンアンタゴニストのカルボキシ末端アミノ酸と融合する配列番号１１１９のアミノ酸をさらに含む、請求項２１８に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２２０】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、位置１１、１６、または１９のアミノ酸残基と共有結合する親水性部分をさらに含む、請求項２１８に記載のペプチドの組合せ、および該グルカゴンペプチドの薬剤的に許容可能な塩。
【請求項２２１】
前記ペプチドは、配列番号１１４２のペプチドの誘導体を含み、該グルカゴンペプチドは、位置５、６、８、９、１２、１３、および１４から選ばれる１〜３個のアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含む点で配列番号１１４２のペプチドとは異なる、請求項１９８または１９９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２２２】
前記オキシ誘導体は、配列番号１１４２のエステルまたはエーテルである、請求項１〜２２１のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２２３】
請求項１〜１９７のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、修飾された天然グルカゴンのアミノ酸配列を含み、該修飾は、配列番号１のＮ末端からの２〜５個のアミノ酸残基の欠失、および配列番号１の位置９のアスパラギン酸残基の、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体、または、以下の式を有するシステインのアルキルカルボン酸誘導体：
【化７】
2013518115.tif 000070
［式中、Ｘ５ はＣ１ −Ｃ４ アルキル、Ｃ２ −Ｃ４ アルケニル、またはＣ２ −Ｃ４ アルキニルである］
による置換である、ペプチドの組合せ。
【請求項２２４】
前記のシステインのスルホン酸誘導体はホモシステイン酸である、請求項２２３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２２５】
Ｘ５ はＣ１ アルキルまたはＣ２ アルキルである、請求項２２３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２２６】
前記天然グルカゴンのアミノ酸配列は、最大３個のアミノ酸修飾でさらに修飾される、請求項２２３〜２２５のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２２７】
請求項２２６に記載のペプチドの組合せであって、以下からなる群：
Ａ．前記グルカゴンアンタゴニストの位置１０、２０、および２４（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の１つまたは２つのアミノ酸またはＮもしくはＣ末端のアミノ酸の、アシル基またはアルキル基を含むアミノ酸による置換；
Ｂ．前記グルカゴンアンタゴニストペプチドの位置１６、１７、２０、２１、および２４（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の１つまたは２つのアミノ酸またはＮもしくはＣ末端のアミノ酸の、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン、ホモシステイン、およびアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選ばれるアミノ酸（ここで、該群のアミノ酸は親水性部分と共有結合している）による置換；
Ｃ．親水性部分と共有結合しているアミノ酸の、前記グルカゴンアンタゴニストペプチドのＮもくしはＣ末端への付加；
Ｄ．位置１５（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐの、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸による置換；
Ｅ．位置１６（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のＳｅｒの、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸による置換；
Ｆ．配列番号１のアミノ酸番号付けによる位置１６、２０、２１、および２４の１つ以上の位置の、ＡＩＢによる置換；
Ｇ．配列番号１のアミノ酸番号付けによる位置２９のアミノ酸または位置２８と２９のアミノ酸の欠失；
Ｈ．位置２８のＡｓｎと位置２９のＴｈｒ（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の各々または両方の、荷電アミノ酸による置換；および／または、配列番号１のＣ末端への１〜２個の荷電アミノ酸の付加；
Ｉ．位置２７（配列番号１の番号付けによる）のＭｅｔの、Ｌｅｕまたはノルロイシンによる置換；
Ｊ．配列番号１１１９〜１１２１および１１５３のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドの、配列番号１のＣ末端への付加（ここで、位置２９（配列番号１の番号付けにより）のＴｈｒはＴｈｒまたはＧｌｙである）；および
Ｋ．Ｃ末端カルボン酸基の、アミドまたはエステルによる置換；
より最大３個の修飾が選ばれる、ペプチドの組合せ。
【請求項２２８】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、請求項２２７に記載のアミノ酸修飾Ａ、Ｂ、もしくはＣ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項２２７に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２２９】
請求項２２７に記載のアミノ酸修飾Ｄ〜Ｋのいずれか、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項２２８に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２３０】
請求項１〜１９７のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含み、ここでＡは、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群：
（ｉ）フェニル乳酸（ＰＬＡ）；
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体；
（ｉｉｉ）アミノ酸２〜６個のペプチドであって、このうちの連続した２個のアミノ酸がエステル結合またはエーテル結合を介して結合しているペプチド；
より選ばれ；
Ｂは、配列番号１のｉ〜２６のアミノ酸を表し（ここでｉは３、４、５、６、または７である）、任意で、以下の（ｉｖ）〜（ｉｘ）からなる群：
（ｉｖ）位置９（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐが、Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、または以下の構造：
【化８】
2013518115.tif 000071
［式中、Ｘ５ はＣ１ −Ｃ４ アルキル、Ｃ２ −Ｃ４ アルケニル、またはＣ２ −Ｃ４ アルキニルである］
を有するシステインのアルキルカルボン酸誘導体で置換される；
（ｖ）位置１０、２０、および２４（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の１つまたは２つのアミノ酸が、アシル基またはアルキル基とエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合、またはアルキルアミン結合で共有結合しているアミノ酸で置換される；
（ｖｉ）位置１６、１７、２０、２１、および２４（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の１つまたは２つのアミノ酸が、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン、ホモシステイン、およびアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選ばれるアミノ酸（ここで、該群のアミノ酸は親水性部分と共有結合している）で置換される；
（ｖｉｉ）位置１５（配列番号１の番号付けによる）のＡｓｐが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸で置換される；
（ｖｉｉｉ）位置１６（配列番号１の番号付けによる）のＳｅｒが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸で置換される；
（ｉｘ）配列番号１のアミノ酸番号付けによる位置１６、２０、２１、および２４の１つ以上が、ＡＩＢで置換される；
より選ばれる１つ以上のアミノ酸修飾を含み；
ならびにＣは、以下の（ｘ）〜（ｘｉｖ）からなる群：
（ｘ）Ｘ；
（ｘｉ）Ｘ−Ｙ；
（ｘｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ；および
（ｘｉｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０；
［ここでＸは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、またはＮｌｅであり；Ｙは、Ａｓｎまたは荷電アミノ酸であり；Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）、または荷電アミノ酸であり；Ｒ１０は、配列番号１１１９〜１１２１および１１５３からなる群より選ばれる］
（ｘｉｖ）Ｃ末端カルボン酸基がアミドまたはエステルと置き換わった、（ｘ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか；
より選ばれる、ペプチドの組合せ。
【請求項２３１】
分子内架橋、またはアルファ，アルファ二置換アミノ酸、または位置１６（配列番号１の番号付けによる）のアミノ酸を含む、請求項２３０に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２３２】
位置１７のＡｒｇはＧｌｎで置換され、位置１８のＡｒｇはＡｌａで置換され、位置２１のＡｓｐはＧｌｕで置換され、位置２３のＶａｌはＩｌｅで置換され、位置２４のＧｌｎはＡｌａで置換される（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）、請求項２３０または２３１に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２３３】
位置１６のＳｅｒはＧｌｕで置換され、位置２０のＧｌｎはＧｌｕで置換され、または位置２４のＧｌｎはＧｌｕで置換される（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）、請求項２３０〜２３２のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２３４】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、配列番号１１６２、１１６４〜１１６７、および１１７１のいずれか、または表Ｄ〜Ｌのいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１９８〜２３３のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２３５】
前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、配列番号１２５１の配列を含むグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストであり、配列番号１２５１の位置４と７、位置７と１１、位置１１と１５、位置１５と１９、または位置１９と２３のアミノ酸は、ラクタム架橋を介して、または該グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのオキシ誘導体を介して結合する、請求項１〜１９７のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２３６】
前記グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、該グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのアミノ酸２４と結合する配列番号１２５０の配列をさらに含む、請求項２４０に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２３７】
前記グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、位置１６または１９のアミノ酸残基と共有結合する親水性部分、および該グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストの薬剤的に許容可能な塩をさらに含む、請求項２３５または２３６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２３８】
前記親水性部分はポリエチレングリコールである、請求項２３７に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２３９】
前記グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１２１２、配列番号１２１３、および配列番号１２１４からなる群より選ばれる配列を含む、請求項２３５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２４０】
前記ポリエチレングリコールの鎖は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選ばれる分子量を有する、請求項２３８に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２４１】
前記ポリエチレングリコールの鎖は少なくとも約２０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項２３８に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２４２】
前記親水性部分は血漿タンパク質、または免疫グロブリンのＦｃ部分である、請求項２３５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２４３】
前記グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのアミノ酸２４と結合する配列番号１２２１の配列をさらに含む、請求項２３５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２４４】
位置４のアミノ酸はアスパラギン酸であり、位置２２のアミノ酸はメチオニンであり、位置１０のアミノ酸はアスパラギン酸である、請求項２３８に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２４５】
前記グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのＣ末端アミノ酸は、前記天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミド基を含む、請求項２３５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２４６】
前記グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１２０５、配列番号１２０６、配列番号１２０７、配列番号１２０８、配列番号１２０９、配列番号１２２２、配列番号１２２３、配列番号１２２４、および配列番号１２２５からなる群より選ばれる配列を含む、請求項２３５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２４７】
前記グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１２２２、配列番号１２２３、配列番号１２２４、および配列番号１２２５からなる群より選ばれる配列を含み、該配列の位置４と１０のアミノ酸は両方ともアスパラギン酸である、請求項２４６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２４８】
前記グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１２１６、配列番号１２１７、配列番号１２１８、および配列番号１２１９からなる群より選ばれる配列を含む、請求項２４６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２４９】
位置１６または１９のアミノ酸は、該アミノ酸の残基と共有結合するポリエチレングリコール鎖をさらに含む、請求項２４７に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２５０】
前記グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、該グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストのアミノ酸２４と結合する配列番号１２２１の配列をさらに含む、請求項２４９に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２５１】
前記ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選ばれる分子量を有する、請求項２５４または２５５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２５２】
前記ポリエチレングリコール鎖は少なくとも約２０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項２５４または２５５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２５３】
前記グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、配列番号１２４５および配列番号１２４６からなる群より選ばれる配列を含む、請求項２４７に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２５４】
配列番号１２５１の位置７と１１、または１１と１５のアミノ酸はラクタム架橋を介して結合する、請求項１〜２５３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２５５】
請求項１〜１９７のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストペプチドであり、該ペプチドは、前記ＧＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１の最大アゴニスト作用の少なくとも９０％を示し、かつ、インビトロアッセイでのｃＡＭＰ産生で測定して、グルカゴン受容体による最大グルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を少なくとも約８０％低減するグルカゴンアンタゴニスト活性を示す、ペプチドの組合せ。
【請求項２５６】
前記ペプチドは、配列番号１２５１のペプチドの誘導体を含み、該グルカゴンペプチドは、位置１、５、６、８、９、１２、１３、および１４から選ばれる１〜３個のアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含む点で配列番号１２５１のペプチドとは異なる、請求項２５５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２５７】
前記置換は保存的アミノ酸置換である、請求項２６３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２５８】
前記ペプチドは、配列番号１２４７または配列番号１２４８の配列を含む、請求項２６３に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２５９】
位置４のアミノ酸はグルタミン酸である、請求項２５８に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２６０】
請求項１〜２５９のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、
（１）分子内架橋、またはアルファ，アルファ−二置換アミノ酸、または位置１６（配列番号１の番号付けによる）の酸性アミノ酸、またはこれらの組み合わせ、（２）Ｃ末端カルボン酸基の代わりのＣ末端アミドまたはエステル、および（３）一般構造Ａ−Ｂ−Ｃ、を含み、
ここで、Ａは、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選ばれ：
（ｉ）ＰＬＡ；
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体；および
（ｉｉｉ）アミノ酸２〜６個のペプチドであって、このうちの連続した２個のアミノ酸がエステル結合またはエーテル結合を介して結合しているペプチド；
Ｂは、配列番号１のｐ〜２６のアミノ酸を表し（ここでｐは、３、４、５、６、または７である）、任意で、以下の（ｉｖ）〜（ｘ）からなる群より選ばれる１つ以上のアミノ酸修飾を含み：
（ｉｖ）位置９（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐが、Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、または以下の構造：
【化９】
2013518115.tif 000072
［式中、Ｘ５ はＣ１ −Ｃ４ アルキル、Ｃ２ −Ｃ４ アルケニル、またはＣ２ −Ｃ４ アルキニルである］
を有するシステインのアルキルカルボン酸誘導体で置換される；
（ｖ）位置１０、２０、および２４（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の１つまたは２つのアミノ酸が、アシル基またはアルキル基とエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合、またはアルキルアミン結合で共有結合しているアミノ酸で置換される；
（ｖｉ）位置１６、１７、２０、２１、および２４（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の１つまたは２つのアミノ酸が、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン、ホモシステイン、およびアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選ばれるアミノ酸（ここで、該群のアミノ酸は親水性部分と共有結合している）で置換される；
（ｖｉｉ）位置１５（配列番号１の番号付けによる）のＡｓｐが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸で置換される；
（ｖｉｉｉ）位置１６（配列番号１の番号付けによる）のＳｅｒが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸で置換される；
（ｉｘ）位置１７のＡｒｇはＧｌｎで置換され、位置１８のＡｒｇはＡｌａで置換され、位置２１のＡｓｐはＧｌｕで置換され、位置２３のＶａｌはＩｌｅで置換され、位置２４のＧｌｎはＡｌａで置換される（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）；
（ｘ）位置１６のＳｅｒはＧｌｕで置換され、位置２０のＧｌｎはＧｌｕで置換され、または位置２４のＧｌｎはＧｌｕで置換される（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）；
Ｃは、以下の（ｖｉｉ）〜（ｘ）からなる群：
（ｖｉｉ）Ｘ；
（ｖｉｉｉ）Ｘ−Ｙ；
（ｉｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ；
（ｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０；
［ここでＸは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、またはＮｌｅであり；Ｙは、Ａｓｎまたは荷電アミノ酸であり；Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）、または荷電アミノ酸であり；Ｒ１０は、配列番号１２２１、１２２６、１２２７、および１２５０からなる群より選ばれる］
より選ばれる、ペプチドの組合せ。
【請求項２６１】
前記酸性アミノ酸は、側鎖スルホン酸または側鎖カルボン酸を含むアミノ酸である、請求項２６０に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２６２】
請求項２６１に記載のペプチドの組合せであって、前記酸性アミノ酸は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホモグルタミン酸、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、システイン酸、ホモシステイン酸、Ａｓｐ、または以下の構造を有するＣｙｓのアルキル化誘導体：
【化１０】
2013518115.tif 000073
［式中、Ｘ５ はＣ１ −Ｃ４ アルキル、Ｃ２ −Ｃ４ アルケニル、またはＣ２ −Ｃ４ アルキニルである］
からなる群より選ばれる、ペプチドの組合せ。
【請求項２６３】
前記ＰＬＡのオキシ誘導体はＰＬＡのエステルまたはＰＬＡのエーテルである、請求項２６０〜２６２のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２６４】
前記ＰＬＡのオキシ誘導体は、エステル結合またはエーテル結合を介してアミノ酸、ペプチド、親水性ポリマー、アシル基、またはアルキル基と結合するＰＬＡである、請求項２６０〜２６３のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２６５】
前記ＰＬＡのオキシ誘導体は、エステル結合を介してアミノ酸またはペプチドと共有結合するＰＬＡを含むデプシペプチドである、請求項２６４に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２６６】
請求項２６５に記載のペプチドの組合せであって、前記アミノ酸はＸａａ３であるか、または、前記ペプチドはＸａａ２−Ｘａａ３もしくはＸａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３を含む（ここで、Ｘａａ３は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；Ｘａａ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、およびアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選ばれ；Ｘａａ１は、Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、およびホモ−ヒスチジンからなる群より選ばれる）、ペプチドの組合せ。
【請求項２６７】
請求項２６０〜２６２のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、前記（ｉｉｉ）のペプチドは、配列番号１のアミノ酸ｑ〜６（ここで、ｑは１、２、３、４、または５である）を含む、ペプチドの組合せ。
【請求項２６８】
請求項２６０〜２６７のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、Ｂは配列番号１のアミノ酸７〜２６を表す、ペプチドの組合せ。
【請求項２６９】
請求項２６０〜２６８のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、Ｂは、（ｖ）もしくは（ｖｉ）として指定されているアミノ酸修飾、またはこれらの組み合わせを含む、ペプチドの組合せ。
【請求項２７０】
請求項２６９に記載のペプチドの組合せであって、Ｂは、（ｉｖ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘ）、およびこれらの組み合わせからなる群より選ばれる１つ以上のアミノ酸修飾をさらに含む、ペプチドの組合せ。
【請求項２７１】
請求項２６０〜２７０のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、ＹまたはＺが荷電アミノ酸である場合、該荷電アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、およびＧｌｕからなる群より選ばれる、ペプチドの組合せ。
【請求項２７２】
請求項２６０〜２７１のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、ＣがＸ−Ｙ−Ｚを含む場合、前記グルカゴンアンタゴニストがＺのＣ末端側に荷電アミノ酸１〜２個を含む、ペプチドの組合せ。
【請求項２７３】
前記グルカゴンアンタゴニストは、位置１６、２１、もしくは２４（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸残基または前記ペプチドのＣ末端残基と共有結合する親水性部分を含む、請求項２６０〜２７２のいずれかに記載の ペプチドの組合せ。
【請求項２７４】
前記グルカゴンアンタゴニストは、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合、またはアルキルアミン結合を介してアシル基またはアルキル基と共有結合するアミノ酸を含み、該アミノ酸は位置１０、２０、もしくは２４（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）に位置するか、または前記ペプチドのＮもしくはＣ末端残基である、請求項２６０〜２７３のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２７５】
前記分子内架橋はラクタム架橋である、請求項２６０〜２７４のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２７６】
前記グルカゴンアンタゴニストは、位置９と１２のアミノ酸の間、位置１２と１６のアミノ酸の間、位置１６と２０のアミノ酸の間、位置２０と２４のアミノ酸の間、または位置２４と２８のアミノ酸の間（配列番号１のアミノ酸の番号付けによる）にラクタム架橋を含む、請求項２７５に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２７７】
前記グルカゴンアンタゴニストは、位置１２と１６のアミノ酸の間、または位置１６と２０のアミノ酸の間にラクタム架橋を含む、請求項２７６に記載のペプチドの組合せ。
【請求項２７８】
前記グルカゴンアンタゴニストは、位置１６、２０、２１、または２４（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）にＡＩＢを含む、請求項２６０〜２７７のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２７９】
前記グルカゴンアンタゴニストは、配列番号１２６０〜１２７０、１２７３〜１２７８、１２８０〜１２８８、１２９０〜１２９６、１３０３、１３０４、１３０６、および１３１４〜１３１８のいずれかのアミノ酸配列を含み、または、表Ａのペプチド２〜６、表Ｂのペプチド１〜８、表Ｃのペプチド２〜６、８、および９のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２６０〜２７８のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２８０】
請求項１〜２７９のいずれかに記載のペプチドの組合せであって、
（ｉ）前記ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号１０５〜１９４、１９９〜２６９、２７３〜２７８、２９２〜３０７、３０９〜３２１、３２３、および３２５のいずれか、または配列番号１０５７〜１０６９のいずれかのアミノ酸配列を含み；
（ｉｉ）前記グルカゴンアンタゴニストペプチドは、配列番号１１６２、１１６４〜１１６７、および１１７１のいずれか、もしくは表Ｄ〜Ｌのいずれかに記載のアミノ酸配列、または配列番号１２６０〜１２７０、１２７３〜１２７８、１２８０〜１２８８、１２９０〜１２９６、１３０３、１３０４、１３０６、および１３１４〜１３１８のいずれかのアミノ酸配列を含み、または、表Ａのペプチド２〜６、表Ｂのペプチド１〜８、表Ｃのペプチド２〜６、８、および９のいずれかのアミノ酸配列を含み；または
（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方である；
ペプチドの組合せ。
【請求項２８１】
前記複合体は、薬剤的に許容可能な担体と混合して医薬組成物を形成する、請求項８〜２８０のいずれかに記載のペプチドの組合せ。
【請求項２８２】
患者の糖尿病を治療する方法であって、請求項３または２８１のいずれかの医薬組成物の有効量を該患者に投与することを含む、方法。 
【請求項２８３】
患者の腸管の一時的麻痺を引き起こす方法であって、請求項３または２８１の医薬組成物の有効量を該患者に投与することを含む、方法。 
【請求項２８４】
患者の体重増加を低減するか体重減少を誘発する方法であって、請求項３または２８１の医薬組成物の有効量を該患者に投与することを含む、方法。
【請求項２８５】
配列番号１０〜３６のいずれかのアミノ酸配列を含む、グルカゴン類似体ペプチド。
【請求項２８６】
患者の糖尿病を治療すること、患者の腸管の一時的麻痺を引き起こすこと、または患者の体重増加を低減するか体重減少を誘発することのための医薬品の製造における、請求項２８６に記載の前記グルカゴン類似体ペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出される資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出される、２０１０年１月２７日に作成された名称が「３１１３５−４５０９７＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」である７２３，０００バイトのＡＣＩＩ（テキスト）ファイルと特定されるコンピュータで読み込み可能な（本明細書に記載されるように配列表１〜５にまとめられる）ヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
グルコース依存的インシュリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）及びグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は摂食の後に分泌されるインシュリンの量を調節するインクレチンである(Kim and Egan, Pharm Rev 60:470-512 (2008))。具体的には、ＧＩＰはグルコース依存的刺激性作用をインシュリン分泌におよぼし、それによってインシュリンに仲介されたグルコースの組織への即時の取り込みを確実にし、そして、ＧＬＰ−１はインシュリン合成及び分泌、グルカゴン分泌の抑制、並びに、食物摂取の抑制を促す。両インクレチンのアゴニストペプチド類似体が作成され、試験されてきたが、ＧＬＰ−１アゴニストがＩＩ型糖尿病のような代謝疾患の治療に関する中心的な研究開発課題であり続けている。ＩＩ型糖尿病においてＧＩＰはもはやグルコース依存的インシュリン分泌を調節せず、一方、ＧＬＰ−１がＩＩ型糖尿病の患者においてもインシュリン分泌性活性を保持することから、このことは驚くに値しない。また、あるグループによる研究であるMcLean et al., 米国生理学内分泌学及び代謝誌（Am J Physiol Endocrinol Metab） 296(6): E1746-1755 (epub 2007)により、糖尿病の治療にＧＩＰアゴニストではなくＧＩＰアンタゴニストを使用することが示唆されてきている。
【０００３】
血中グルコースレベルが低下し始めるとき、グルカゴンが膵臓によって生産され、このホルモンのその受容体への結合によりグリコーゲンを分解しグルコースを放出するように信号が肝臓に送られる。グルカゴンの作用により、血中グルコースレベルの正常レベルへの上昇が引き起こされる。グルカゴンはインクレチンと反対の作用をおよぼすので、ＩＩ型糖尿病を含む代謝疾患の治療のために多くのグルカゴンアンタゴニストが作成され、試験されている。
【発明の概要】
【０００４】
代謝疾患（例えば、糖尿病や肥満）のような疾病の治療に有効なペプチドの組合せが本明細書において提供される。ペプチドの組合せは、ＧＩＰ受容体においてアゴニスト活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴン受容体においてアンタゴニスト活性、又は、阻害活性を示すグルカゴンアンタゴニストペプチドを含む。特定の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰ受容体において天然のＧＩＰの少なくとも０．１％（例えば、少なくとも０．５％、少なくとも０．７５％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％）の活性を示し、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴン受容体においてグルカゴンによって達せられる最大の反応の少なくとも６０％を抑制することを示す。特定の態様において、グルカゴンアンタゴニストペプチドのグルカゴン受容体でのＩＣ５０（５０％抑制濃度）は、ＧＩＰアゴニストペプチドのＧＩＰ受容体でのＥＣ５０（５０％有効濃度）の約１０倍（高い、又は、低い）以内の範囲である。例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストのどちらか、又は、両方はさらにＧＬＰ−１受容体でのアゴニスト活性を示す。
【０００５】
いくつかの実施形態において、ペプチドの組合せは、例えば、医薬組成物のような組成物として提供される。 いくつかの態様において、組成物はグルカゴンアンタゴニストペプチドとの混合物の状態でＧＩＰアゴニストを含み、その二つのペプチドはお互いと結合されていない。
【０００６】
いくつかの実施形態において、ペプチドの組合せは、ＧＩＰアゴニストペプチドがグルカゴンアンタゴニストペプチドと共有結合、又は、非共有結合（又は、両方のタイプの結合の混合）を介して結合する複合体として提供される。ある実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはペプチド結合を介してグルカゴンアンタゴニストペプチドに共有結合する。 いくつかの態様において、前記複合体はＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドを含む単一のポリペプチド鎖（例えば、融合ペプチド）である。特定の態様において、前記融合ペプチドは組換え技術により生産され得る。別の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチド、及び／又は、グルカゴンアンタゴニストペプチドの１つ以上のアミノ酸の側鎖官能基を介してグルカゴンアンタゴニストペプチドと結合する。 いくつかの態様において、前記複合体は、お互いに結合するＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドを含むヘテロ二量体（又は、多量体）である。上述の態様のいずれかのような、特定の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドはグルカゴンアンタゴニストペプチドとリンカー、例えば、二官能性リンカーを介して結合する。 いくつかの態様において、二官能性リンカーは親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールである。ある特定の態様において、前記二官能性リンカーはＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドのうちの１つのシステイン残基を他方のペプチドのリシン残基に連結する。本開示のある実施形態において、システイン残基とリシン残基の各々はペプチドのＣ末端に、又は、ペプチドのＣ末端領域内に位置する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、ペプチドの組合せはキットとして提供される。 いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドはグルカゴンアンタゴニストペプチドと共にパッケージに入れられる。別の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドはグルカゴンアンタゴニストペプチドとは別々にパッケージに入れられる。 いくつかの態様におけるキットはＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドを投与することについての説明書を含む。 いくつかの態様において、キットはＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドを共投与することについての説明書を含む。
【０００８】
本開示は、それ故、それぞれＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドを含む組成物（例えば、医薬組成物）、複合体（例えば、融合ペプチド、ヘテロ二量体）、及び、キットを提供する。そのような組成物、複合体、キットを使用する方法がさらに本明細書において提供される。例えば、本開示は、患者の代謝疾患を治療するのに有効な量の本明細書に記載される組成物、又は、複合体のどれかを患者に投与することを含む、患者の代謝疾患（例えば、糖尿病、肥満）を治療する方法を提供する。その他の疾病の治療がさらに本明細書において企図される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】賦形剤のみ（黒塗り上向き三角形）を、ＧＬＰ−１Ｅ１６アゴニストを１０ｎｍｏｌ／ｋｇ（黒塗り下向き三角形）若しくは３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（白抜き正方形）で、トリアゴニストペプチドＭＴ−１７０を１０ｎｍｏｌ／ｋｇ（白抜き下向き三角形）若しくは３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（黒塗り菱形）で、又は、ＧＬＰ−１／ＧＩＰ共アゴニストペプチドＭＴ−１７８を１０ｎｍｏｌ／ｋｇ（灰色下向き三角形）若しくは３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（灰色正方形）で投与した後の時間（日数）の関数として、マウス体重の増減率（％）のグラフを表す。
【図２】賦形剤のみ（黒色の棒）を、ＧＬＰ−１Ｅ１６アゴニストを１０ｎｍｏｌ／ｋｇ（白色の棒）若しくは３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（灰色の棒）で、トリアゴニストペプチドＭＴ−１７０を１０ｎｍｏｌ／ｋｇ（横縞の棒）若しくは３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（縦縞の棒）で、又は、ＧＬＰ−１／ＧＩＰ共アゴニストペプチドＭＴ−１７８を１０ｎｍｏｌ／ｋｇ（右上から左下への斜線付きの棒）若しくは３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（左上から右下への斜線付きの棒）で投与した後、７日目のマウスにおける血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）の変化のグラフを表す。
【図３】賦形剤による対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチドによる対照、ラクタム含有（環状）ＰＥＧ化ＧＩＰ活動性グルカゴン類似体（「ｍｔ−１７８」）、又は、ラクタム非含有（線状）ＰＥＧ化ＧＩＰ活動性グルカゴン類似体（「ｍｔ−２７４」）を１、３、又は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週の割合で（−６０時点で）注射されたマウスへの（０時点で投与される）グルコース注射の前、及び、後の時間の関数としての血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。攻撃的な行動とかなりの体重喪失を示した４匹のマウスのデータはこの図のデータより排除されている。
【図４】賦形剤による対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチドによる対照、ｍｔ−１７８、又は、ｍｔ−２７４を１、３、又は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週の割合で（グルコース注射の２４時間前に）注射されたマウスへの（０時点で投与される）グルコース注射の前、及び、後の時間の関数としての血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。攻撃的な行動とかなりの体重喪失を示した４匹のマウスのデータはこの図のデータより排除されている。
【図５】賦形剤による対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチドによる対照、ｍｔ−１７８、又は、ｍｔ−２７４を１、３、又は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週で注射した後の０日目、又は、７日目でのマウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。攻撃的な行動とかなりの体重喪失を示した４匹のマウスのデータはこの図のデータより排除されている。
【図６】賦形剤による対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチドによる対照、ｍｔ−１７８、又は、ｍｔ−２７４を１、３、又は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週で注射した後の０、１、３、５、及び、７日目でのマウスの体重における増減率（％）のグラフを表す。攻撃的な行動とかなりの体重喪失を示した４匹のマウスのデータはこの図のデータより排除されている。
【図７】賦形剤による対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチドによる対照、ｍｔ−１７８、ｍｔ−１７８（ＴＥ）、ｍｔ−２７４、又は、ｍｔ−２７４（ＴＥ）を１０、又は、３５ｎｍｏｌ／ｋｇ／週で注射した後の０、又は、７日目でのマウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。「ＴＥ」は位置４０のシステイン残基に結合したＰＥＧ基を示す。
【図８】賦形剤による対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチドによる対照、ｍｔ−１７８、ｍｔ−１７８（ＴＥ）、ｍｔ−２７４、又は、ｍｔ−２７４（ＴＥ）を１０、又は、３５ｎｍｏｌ／ｋｇ／週で注射した後の７日目でのマウスの血中グルコース量（ｍｇ／ｄＬ）における変化のグラフを表す。「ＴＥ」は位置４０のシステイン残基に結合したＰＥＧ基を示す。
【図９】賦形剤による対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチドによる対照、ｍｔ−１７８、ｍｔ−１７８（ＴＥ）、ｍｔ−２７４、又は、ｍｔ−２７４（ＴＥ）を１０、又は、３５ｎｍｏｌ／ｋｇ／週で注射した後の０、１、３、５、７、及び、１０日目でのマウスの体重における増減率（％）のグラフを表す。「ＴＥ」は位置４０のシステイン残基に結合したＰＥＧ基を示す。
【図１０】賦形剤による対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチドによる対照、ｍｔ−１７８、ｍｔ−１７８（ＴＥ）、ｍｔ−２７４、又は、ｍｔ−２７４（ＴＥ）を１０、又は、３５ｎｍｏｌ／ｋｇ／週で注射した後の７日目でのマウスの体重における増減率（％）のグラフを表す。「ＴＥ」は位置４０のシステイン残基に結合したＰＥＧ基を示す。
【図１１】賦形剤による対照、リラグルチド（アシル化ＧＬＰ−１類似体）、炭素数１４の脂肪酸でアシル化され、ＰＥＧ化されていない線状ペプチド（「ｍｔ−２６０」）、炭素数１６の脂肪酸でアシル化され、ＰＥＧ化されていない線状ペプチド（「ｍｔ−２６１」）、又は、炭素数１８の脂肪酸でアシル化され、ＰＥＧ化されていない線状ペプチド（「ｍｔ−２６２」）を２５、又は、１２５ｎｍｏｌ／ｋｇの割合で７日間、毎日注射した後の０、又は、７日目のマウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）における変化のグラフを表す。
【図１２】賦形剤による対照、リラグルチド、ｍｔ−２６０、ｍｔ−２６１、又は、ｍｔ−２６２を２５、又は、１２５ｎｍｏｌ／ｋｇで注射した後の０、１、３、５、及び、７日目のマウスの体重における増減率（％）のグラフを表す。
【図１３】賦形剤による対照、リラグルチド、ｍｔ−２６０、ｍｔ−２６１、又は、ｍｔ−２６２を２５、又は、１２５ｎｍｏｌ／ｋｇで注射した後の７日目のマウスの体重における増減率（％）のグラフを表す。
【図１４】賦形剤による対照、リラグルチド（３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）、又は、ｍｔ−２６１（０．３、１、３、１０、又は、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）を初めて注射した後の０、１、３、５、及び、７日目のマウスの体重（ｇ）における変化のグラフを表す。
【図１５】賦形剤による対照、リラグルチド（３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）、又は、ｍｔ−２６１（０．３、１、３、１０、又は、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）を初めて注射した後の７日目のマウスの体脂肪量のグラフを表す。
【図１６】賦形剤による対照、リラグルチド（３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）、又は、ｍｔ−２６１（０．３、１、３、１０、又は、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）を初めて注射した後の０、及び、７日目のマウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。
【図１７】括弧内に示される用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）でｍｔ−２６３、エキセンジン−４、又は、賦形剤による対照を注射されたマウスの時間の関数としての体重における変化（増減率（％））の線グラフを表す。
【図１８】括弧内に示される用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）でｍｔ−２６３、エキセンジン−４、又は、賦形剤による対照を注射されたマウスの（０日目との比較で７日目に測定された）総体重変化（％）の棒グラフを表す。
【図１９】括弧内に示される用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）でｍｔ−２６３、エキセンジン−４、又は、賦形剤による対照を注射されたマウスの（０日目との比較で７日目に測定された）血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）における変化の棒グラフを表す。
【図２０】賦形剤による対照、リラグルチド、ｍｔ−２７７、ｍｔ−２７８、又は、ｍｔ−２７９を初めて注射された後の０、１、３、５、及び、７日目のマウスの体重における増減率（％）のグラフを表す。
【図２１】賦形剤による対照、リラグルチド、ｍｔ−２７７、ｍｔ−２７８、又は、ｍｔ−２７９を初めて注射された後の０、及び、７日目のマウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。
【図２２】ｍｔ−３３１、ｍｔ−３１１、又は、賦形剤による対照の投与後、７日目に測定されたマウスの総体重変化（％）のグラフを表す。用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）は括弧内に示される。
【図２３】ｍｔ−３３１、ｍｔ−３１１、又は、賦形剤による対照の投与後、７日目に測定されたマウスによる総食物摂取量（ｇ）のグラフを表す。用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）は括弧内に示される。
【図２４】ｍｔ−３３１、ｍｔ−３１１、又は、賦形剤による対照の投与後、７日目に測定されたマウスにおける血中グルコースレベルにおける総変化のグラフを表す。用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）は括弧内に示される。
【図２５】括弧内に示される用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）でのｍｔ−３３１、ｍｔ−３５３、又は、賦形剤による対照の投与後、７日目に測定されたマウスの総体重変化のグラフを表す。
【図２６】括弧内に示される用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）でのｍｔ−３３１、ｍｔ−３５３、又は、賦形剤による対照の投与後、７日目に測定されたマウスの総食物摂取量（ｇ）のグラフを表す。
【図２７】括弧内に示される用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）でのｍｔ−３３１、ｍｔ−３５３、又は、賦形剤による対照の投与後、７日目に測定されたマウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）の変化のグラフを表す。
【図２８】ｍｔ−２７７、ｍｔ−２７８、ｍｔ−２７９、又は、賦形剤による対照の最初の投与の後、７日目に測定されたマウスの総体重変化（％）のグラフを表す。
【図２９】ｍｔ−２６１、ｍｔ−３０９、又は、賦形剤による対照の最初の投与の後、６日目に測定されたマウスの総体重変化（％）のグラフを表す。
【図３０】ｍｔ−２６１、ｍｔ−３０９、又は、賦形剤による対照の最初の投与の後、６日目に測定されたマウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。同じ模様の棒の各対のうちの第一の棒は０日目に測定された血中グルコースレベルであり、各対の第二の棒は６日目でのレベルである。
【図３１】賦形剤による対照、又は、本明細書においてさらに説明されるｍｔ−２６１を注射されたマウスの（投与初日に測定された体重との比較で）ｍｔ−２６１の最初の投与後６日目に測定された体重における総変化（％）の棒グラフを表す。
【図３２】異なるアシル化ペプチド（ＭＴ−２６１、ＭＴ−３６７、ＭＴ−２７０、及び、ＭＴ−３６９）を注射されたマウスの、７日目での体重から０日目の体重を引き算することにより計算される総体重変化（％）のグラフを表す。
【図３３】異なるアシル化ペプチド（ＭＴ−２６１、ＭＴ−３６７、ＭＴ−２７０、及び、ＭＴ−３６９）を注射されたマウスの、７日目での血中グルコースレベルから０日目の血中グルコースレベルを引き算することにより計算される血中グルコースレベルの総変化のグラフを表す。
【図３４】ＭＴ−３６７、ＭＴ−３６９、ＭＴ−３６８、ＭＴ−３８４、ＭＴ−３８５、又は、ＭＴ−３６４を注射されたマウスの、７日目での体重から０日目の体重を引き算することにより計算される総体重変化（％）のグラフを表す。
【図３５】ＭＴ−３６７、ＭＴ−３６９、ＭＴ−３６８、ＭＴ−３８４、ＭＴ−３８５、又は、ＭＴ−３６４を注射されたマウスの、７日目での血中グルコースレベルから０日目の血中グルコースレベルを引き算することにより計算される血中グルコースレベルの総変化のグラフを表す。
【図３６】エキセンジン−４様ペプチドを注射された、又は、ＭＴ−２６３、ＭＴ−２８０、ＭＴ−３５６、若しくは、ＭＴ−３５７を注射された、又は、賦形剤による対照を注射されたマウスの体重変化（％）を時間（日）の関数としてのグラフを表す。
【図３７】エキセンジン−４様ペプチドを注射された、又は、ＭＴ−２６３、ＭＴ−２８０、ＭＴ−３５６、若しくは、ＭＴ−３５７を注射された、又は、賦形剤による対照を注射されたマウスの、本研究の０日目と７日目に測定された血中グルコースレベル（ｍｌ／ｄＬ）を表すグラフのグラフである。
【図３８】賦形剤のみ（１日１回、若しくは、３日に１回）、又は、ＭＴ−２６３（１日１回、２日に１回、若しくは、３日に１回）を注射されたマウスの体重における増減率（％）のグラフを表す。
【図３９】賦形剤のみ（１日１回、若しくは、３日に１回）、又は、ＭＴ−２６３（１日１回、２日に１回、若しくは、３日に１回）を注射されたマウスの本研究の１日目と６日目に測定された血中グルコースレベルのグラフを表す。
【図４０】本明細書においてさらに説明されるアシル化された化合物、又は、ＰＥＧ化された化合物を投与して、マウスで観察された総体重変化のグラフを表す。
【図４１】本明細書においてさらに説明されるアシル化された化合物、又は、ＰＥＧ化された化合物を投与して、マウスで観察された血中グルコース量の変化のグラフを表す。
【図４２】本明細書においてさらに説明されるＭＴ−２６１、又は、ＭＴ−２７８を投与して、マウスで観察された総体重変化のグラフを表す。
【図４３】本明細書においてさらに説明されるＭＴ−２６１、又は、ＭＴ−２７８を投与して、マウスで観察された血中グルコース量の変化のグラフを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
本明細書で使用される「約」という用語は言及された数値、又は、数値の範囲より１０％まで大きい、又は、小さいことを意味するが、その用語でどのような数値、又は数値の範囲をもこの比較的広い定義のみに指定する意図はない。「約」という用語が前に来る数値、又は、数値の範囲のそれぞれにはまた、言及された絶対値、又は、絶対的な数値の範囲の具体例を包含することが意図される。
【００１１】
本明細書では、「薬剤的に許容可能な担体」という用語はリン酸緩衝生理食塩水、水、水中油型乳濁液、若しくは、油中水型乳濁液のような乳濁液、及び、様々なタイプの湿潤剤のような標準的な医薬担体のうちのいずれをも含む。この用語はまた、ヒトを含む動物での使用について米国連邦政府の規制当局により承認された、又は、米国薬局方に掲載された薬剤のいずれをも包含する。
【００１２】
本明細書では、「薬剤的に許容可能な塩」という用語は、親化合物の生物学的活性を保持し、生物学的に、又は、その他の点で好ましくないということがない化合物の塩を意味する。本明細書において開示される化合物の多くは、アミノ基、及び／又は、カルボキシル基、又は、それに類似した基の存在のおかげで、酸性塩、及び／又は、塩基性塩を形成することができる。
【００１３】
薬剤的に許容可能な塩基付加塩は、無機塩基及び有機塩基から調製され得る。無機塩基に由来する塩には、例としてのみ挙げると、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、及び、マグネシウム塩が挙げられる。有機塩基に由来する塩には、限定されないが、第１級アミン、第２級アミン、及び、第３級アミンの塩が挙げられる。薬剤的に許容可能な酸付加塩は、無機酸及び有機酸から調製され得る。無機酸に由来する塩は塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などを含む。有機酸に由来する塩は酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエン−スルホン酸、サリチル酸などを含む。
【００１４】
本明細書では、「治療する」という用語には、特定の疾患、若しくは、状態の予防、又は、特定の疾患、若しくは、状態に関連する症状の緩和、及び／又は、前記症状の防止、若しくは、除去が含まれる。例えば、本明細書では、「糖尿病を治療する」という用語は、一般に、血中グルコースレベルを正常レベルの方向に変化させることを意味するであろう。そして、その用語には、与えられた状況に応じて血中グルコースレベルを上げること、又は、下げることが含まれ得る。
【００１５】
本明細書では、「有効」量の、又は、「治療上有効量」のグルカゴンペプチドは非毒性だが望みの作用をもたらすのに十分な量の前記ペプチドを意味する。例えば、１つの望ましい作用は、例えば、血中グルコースレベルの上昇によって判断される低血糖症の防止、又は、治療であろう。本開示のグルカゴンペプチドの別の望ましい作用は、例えば、血中グルコースレベルの正常レベル近くへの変化によって判断される高血糖症の治療を含み、例えば、体重の低減によって判断される体重減少の促進、若しくは、体重増加の防止を含み、又は、体重の減少、若しくは、増加を防止することを含み、又は、体脂肪分布を正常化することを含むであろう。「有効」である量は、個人の年齢と全般的な状態、投与形態などに応じて対象ごとに変わるであろう。したがって、正確な「有効量」を細かく指定することは常に可能であるわけではない。しかしながら、どのような個々の場合でも、適切な「有効」量は日常の実験作業を用いて当業者により決定することができる。
【００１６】
「非経口の」という用語は消化管を通してではなく、その他の経路、例えば、皮下経路、筋肉内経路、脊髄内経路、又は、静脈内経路によるということを意味する。
【００１７】
本明細書で使用される「単離された」という用語は、その自然環境から外されたことを意味する。 いくつかの実施形態において、類似体は組換え法を通じて作成され、宿主細胞より単離される。
【００１８】
本明細書で使用される「精製された」という用語は、分子、又は、化合物が、天然の、又は、自然の環境で通常その分子、又は、化合物に付随する夾雑物が実質的に存在しない形態で単離されることに関連し、そして、もともとの組成物の他の構成物から分離された結果、純度が上昇したことを意味する。「精製されたポリペプチド」という用語は、限定されないが、核酸分子、脂質、及び、炭水化物を含む他の構成物から分離されたポリペプチドを説明するために本明細書において使用される。
【００１９】
本明細書では、「ペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸で典型的には５０アミノ酸未満で、天然の、若しくは、コードされる、若しくは、非天然の、若しくは、コードされないアミノ酸の配列を包含する。非天然のアミノ酸はインビボでは自然に生じないにもかかわらず、本明細書に記載されるペプチド構造に取り込まれ得るアミノ酸を指す。本明細書で使用される「コードされない」アミノ酸は次の２０アミノ酸、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、チロシンのいずれのＬ−異性体でもないアミノ酸を指す。
【００２０】
本明細書では、「ポリペプチド」、及び、「タンパク質」という用語は、ポリマーの長さに関係なく、アミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される用語である。典型的には、ポリペプチドとタンパク質は、ペプチドよりも大きいポリマー長を持つ。 いくつかの例において、タンパク質は、共有結合で、又は、非共有結合でお互いに結合する１つを超える数のポリペプチド鎖を含む。
【００２１】
本明細書では、「ペプチドの組合せ」はＧＩＰアゴニストペプチド及びグルカゴンアンタゴニストペプチドを含む組成物、複合体、又は、キットを包含する。ＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドは分離することができ、若しくは、一緒に混合することができ、又は、共有結合で、若しくは、非共有結合で結合することができる。ペプチドが共有結合で、若しくは、非共有結合で結合される場合、ペプチドの組合せは「複合体」と称される。
【００２２】
本出願を通じて、数による特定のアミノ酸位置（例えば、位置２８）についての言及のすべては、天然のグルカゴン（配列番号１）においてその位置にあるアミノ酸、又は、その任意の類似体において対応するアミノ酸位置を意味する。例えば、本明細書において、「位置２８」についての言及は、配列番号１の１番目のアミノ酸が欠質したグルカゴン類似体については対応する位置２７を指すであろう。同様に、本明細書において、「位置２８」についての言及は、配列番号１のＮ末端の前に１アミノ酸が付加されたグルカゴン類似体については対応する位置２９を指すであろう。
【００２３】
本明細書では、「アミノ酸修飾」は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸の別のアミノ酸（天然の、又は、コードされる、又は、コードされない、又は、非天然のアミノ酸）による置換、若しくは、交換、（ｉｉ）配列番号１へのアミノ酸（天然の、又は、コードされる、又は、コードされない、又は、非天然のアミノ酸）の付加、又は、（ｉｉｉ）配列番号１の１つ以上のアミノ酸の欠質を指す。
【００２４】
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換、又は、交換は保存的アミノ酸置換、例えば、位置２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、又は、２９のうち１つ以上での保存的アミノ酸置換である。本明細書では、「保存的アミノ酸置換」という用語はあるアミノ酸が類似の特質、例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性、及び／又は、芳香族性を持つ別のアミノ酸で取り換えられることであり、そして、次の５グループのうちの１グループの中での交換を含む。
Ｉ．  小脂肪族で非極性の、又は、わずかに極性の残基
アラニン、セリン、トレオニン、グリシン
ＩＩ．極性負荷電残基とそのアミド及びエステル
アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、及び、
ホモシステイン酸
ＩＩＩ．極性正荷電残基
ヒスチジン、アルギニン、リシン、オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．大脂肪族非極性残基
メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、
ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．  大芳香族残基
フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アセチルフェニルアラニン
【００２５】
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換ではなく、例えば、非保存的アミノ酸置換である。
【００２６】
本明細書では、「荷電アミノ酸」という用語は、生理学的なｐＨの水溶液中で負に荷電した（すなわち、脱プロトン化された）、又は、正に荷電した（すなわち、プロトン化された）側鎖を含むアミノ酸を指す。例えば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、及び、ホモグルタミン酸を含み、一方、正に荷電したアミノ酸はアルギニン、リシン、及び、ヒスチジンを含む。荷電アミノ酸は２０種のコードされるアミノ酸、並びに、非典型的な、又は、非天然の、又は、コードされないアミノ酸の中の荷電アミノ酸を含む。
【００２７】
本明細書では、「酸性アミノ酸」は、（アミノ酸のαカルボン酸の他に）第２酸性部分、例えば、側鎖のカルボン酸基、又は、スルホン酸基を含むアミノ酸を指す。
【００２８】
本明細書では、「システインのスルホン酸誘導体」は次の一般構造で、Ｘ６は炭素数１〜４のアルキル基、炭素数２〜４のアルケニル基、又は、炭素数２〜４のアルキニル基である化合物を指す。
【化１】
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【００２９】
本明細書で使用されるｎが１から６であり得る「炭素数１〜ｎのアルキル基」という用語は、１から特定された数の炭素原子を有する分枝アルキル基、又は、直鎖アルキル基を表す。典型的な炭素数１〜６のアルキル基は、限定されないが、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などを含む。
【００３０】
本明細書で使用されるｎが２から６であり得る「炭素数２〜ｎのアルケニル基」という用語は、２から特定された数の炭素原子と少なくとも１つの二重結合を有するオレフィン性不飽和分枝基、又は、直鎖基を表す。そのような基の例には、限定されないが、１−プロペニル基、２−プロペニル基（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、１，３−ブタジエニル基（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ２）、１−ブテニル基（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３）、ヘキセニル基、ペンテニル基などが挙げられる。
【００３１】
ｎが２から６であり得る「炭素数２〜ｎのアルキニル基」という用語は、２個からｎ個の炭素原子と少なくとも１つの三重結合を有する不飽和分枝基、又は、直鎖基を表す。そのような基の例には、限定されないが、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、１−ペンチニル基などが挙げられる。
【００３２】
本明細書では、「ｐＨ安定化グルカゴンアンタゴニスト」という用語は、薬理学的な目的で使用される最も広いｐＨ範囲内の水性緩衝液中で天然のグルカゴンと比較して優れた安定性と可溶性を示すグルカゴンアンタゴニストを指す。
【００３３】
本明細書では、第２受容体と比較した第１受容体への分子の「選択性」という用語は次の比率、すなわち、第１受容体におけるその分子のＥＣ５０で除算された第２受容体におけるその分子のＥＣ５０を指す。例えば、第１受容体において１ｎＭのＥＣ５０と第２受容体において１００ｎＭのＥＣ５０を持つ分子は第２受容体と比較して第１受容体について１００倍の選択性を有する。
【００３４】
本明細書では、「天然のグルカゴン」という用語は配列番号１の配列からなるペプチドを指し、「天然のＧＬＰ−１」という用語はＧＬＰ−１（７〜３６）アミド、ＧＬＰ−１（７〜３７）酸、又は、これら二つの化合物の混合物を指し示す総称である。本明細書では、「天然のＧＩＰ」は配列番号２からなるペプチドを指す。
【００３５】
本明細書では、ある分子の「ＧＩＰ効力」又は「天然のＧＩＰと比較した効力」は、ＧＩＰ受容体における天然のＧＩＰのＥＣ５０で除算されたＧＩＰ受容体におけるその分子のＥＣ５０の比率を指す。
【００３６】
本明細書では、ある分子の「グルカゴン効力」又は「天然のグルカゴンと比較した効力」は、グルカゴン受容体における天然のグルカゴンのＥＣ５０で除算されたグルカゴン受容体におけるその分子のＥＣ５０の比率を指す。
【００３７】
本明細書では、ある分子の「ＧＬＰ−１効力」又は「天然のＧＬＰ−１と比較した効力」は、ＧＬＰ−１受容体における天然のＧＬＰ−１のＥＣ５０で除算されたＧＬＰ−１受容体におけるその分子のＥＣ５０の比率を指す。
【００３８】
「ＧＩＰアゴニストペプチド」という用語は、ＧＩＰ受容体に結合し、その下流のシグナル伝達を活性化する化合物を指す。しかしながら、この用語は、ＧＩＰ受容体のみにおいて活性を有すると化合物を限定すると解釈されてはならない。むしろ、本開示のＧＩＰアゴニストペプチドは、本明細書でさらに考察するように、その他の受容体で付加的な活性を示すことができる。例えば、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＬＰ−１受容体において活性（例えば、アゴニスト活性）を示すことができる。同様に、「ＧＩＰアゴニストペプチド」という用語はペプチドのみに化合物を限定すると解釈されてはならない。むしろ、ペプチド以外の化合物がこの用語に包含される。したがって、 いくつかの態様におけるＧＩＰアゴニストペプチドは複合体の形態（ヘテロ二量体、多量体、融合ペプチド）をとるペプチド、化学的に誘導体化されたペプチド、ペプチドの医薬的塩、ペプチド擬似物などである。
【００３９】
「グルカゴンアンタゴニストペプチド」という用語は、グルカゴン活性を打ち消す、又は、グルカゴンの機能を妨害する化合物を指す。例えば、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンによって達せられる最大の反応の少なくとも６０％の抑制（例えば、少なくとも７０％の抑制）、及び、好ましくは少なくとも８０％の抑制を示す。ある実施形態において、グルカゴンアンタゴニストはグルカゴン受容体においてグルカゴンによって達せられる最大の反応の少なくとも９０％の抑制を示す。ある特定の実施形態において、グルカゴンアンタゴニストはグルカゴン受容体においてグルカゴンによって達せられる最大の反応の１００％の抑制を示す。さらに、約１μＭの濃度のグルカゴンアンタゴニストはグルカゴン受容体においてグルカゴンによって達せられる最大のアゴニスト活性の約２０％より小さい活性を示す。ある実施形態において、グルカゴンアンタゴニストはグルカゴン受容体においてグルカゴンによって達せられる最大のアゴニスト活性の約１０％より小さい活性を示す。ある特定の実施形態において、グルカゴンアンタゴニストはグルカゴン受容体においてグルカゴンによって達せられる最大のアゴニスト活性の約５％より小さい活性を示す。さらに別の特定の実施形態において、グルカゴンアンタゴニストはグルカゴン受容体においてグルカゴンによって達せられる最大のアゴニスト活性の０％の活性を示す。
【００４０】
「グルカゴンアンタゴニストペプチド」という用語は、グルカゴン受容体のみにおいて活性を有すると化合物を限定すると解釈されてはならない。むしろ、本開示のグルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴン受容体において付加的な活性（例えば、部分的な受容体活性化作用）を、又は、その他の受容体で付加的な活性を示すことができる。例えば、グルカゴンアンタゴニストペプチドはＧＬＰ−１受容体において活性（例えば、アゴニスト活性）を示すことができる。また、「グルカゴンアンタゴニストペプチド」という用語はペプチドのみに化合物を限定すると解釈されてはならない。むしろ、ペプチド以外の化合物がこの用語に包含される。したがって、 いくつかの態様におけるＧＩＰアゴニストペプチドは複合体の形態をとるペプチド、化学的に誘導体化されたペプチド、ペプチドの医薬的塩、ペプチド擬似物などである。
【００４１】
「純粋なグルカゴンアンタゴニスト」は、実施例２で記載されるもののような、妥当であると認められたインビトロモデルアッセイを用いてｃＡＭＰ生産により判定される、グルカゴン受容体活性、又は、ＧＬＰ−１受容体活性の検出される刺激を少しももたらさないグルカゴンアンタゴニストである。例えば、純粋なグルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンによって達せられる最大アゴニスト活性の５％未満の活性（例えば、４％未満の活性、３％未満の活性、２％未満の活性、１％未満の活性、約０％の活性）を示し、ＧＬＰ−１受容体においてＧＬＰ−１によって達せられる最大アゴニスト活性の５％未満の活性（例えば、４％未満の活性、３％未満の活性、２％未満の活性、１％未満の活性、及び、約０％の活性）を示す。
【００４２】
実施形態
ペプチドの組合せ
本開示は、ＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドを含むペプチドの組合せを提供する。ＧＩＰアゴニストペプチドのＧＩＰ受容体における活性は本明細書で示される教示のいずれかと一致することができる。同様に、グルカゴンアンタゴニストペプチドのグルカゴン受容体における活性は本明細書で示される教示のいずれかと一致することができる。特定の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰ受容体において天然ＧＩＰの少なくとも０．１％の活性を示し、グルカゴンアンタゴニストペプチドはグルカゴン受容体においてグルカゴンによって達せられる最大反応の少なくとも６０％の抑制を示す。
【００４３】
特定の態様において、グルカゴン受容体におけるグルカゴンアンタゴニストペプチドのＩＣ５０は、ＧＩＰ受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０の約５０倍の範囲（例えば、約４０倍の範囲、約３０倍の範囲、約２０倍の範囲、約１０倍の範囲、約５倍の範囲、約２倍の範囲）にある。 いくつかの実施形態において、ＧＩＰ受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０はグルカゴン受容体におけるグルカゴンアンタゴニストペプチドのＩＣ５０よりも大きい。別の態様において、ＧＩＰ受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０はグルカゴンペプチドにおけるグルカゴンアンタゴニストペプチドのＩＣ５０よりも小さい。ある態様において、ＧＩＰ受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０で除算されたグルカゴン受容体におけるグルカゴンアンタゴニストペプチドのＩＣ５０は、約１００以下、約７５以下、約６０以下、約５０以下、約４０以下、約３０以下、約２０以下、約１５以下、約１０以下、又は約５以下であり、かつ１以上である。ある態様において、グルカゴン受容体におけるグルカゴンアンタゴニストペプチドのＩＣ５０で除算されたＧＩＰ受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０は、約１００以下、約７５以下、約６０以下、約５０以下、約４０以下、約３０以下、約２０以下、約１５以下、約１０以下、又は約５以下であり、かつ１以上である。
【００４４】
例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドのどちらか、又は、それら両方はＧＬＰ−１受容体においてアゴニスト活性をさらに示す。ＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドのどちらか、又は、それら両方のＧＬＰ−１受容体での活性は本明細書に記載される教示のいずれかと一致することができる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ペプチドの組合せは、例えば、医薬組成物のような組成物として提供される。 いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドはグルカゴンアンタゴニストペプチドと混合されている。 いくつかの態様における医薬組成物は薬剤的に許容可能な担体を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ペプチドの組合せは、ＧＩＰアゴニストペプチドが共有結合、又は、非共有結合（又は、両方のタイプの結合の混合）を介してグルカゴンアンタゴニストペプチドに結合されている複合体として提供される。ある実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはペプチド結合を介してグルカゴンアンタゴニストペプチドに共有結合により結合される。 いくつかの態様において、複合体はＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドを含む単一のポリペプチド鎖（例えば、融合ペプチド）である。特定の態様において、その融合ペプチドは組換え技術により生産され得る。別の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチド、及び／又は、グルカゴンアンタゴニストペプチドの１つ以上のアミノ酸の１つ以上の側鎖官能基を介してグルカゴンアンタゴニストペプチドに結合される。 いくつかの態様において、前記複合体は互いに結合するＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドを含むヘテロ二量体（又は、多量体）である。特定の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドはリンカー、例えば、二官能性リンカーを介してグルカゴンアンタゴニストペプチドに結合される。 いくつかの態様において、前記二官能性リンカーは親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールである。ある特定の態様において、前記二官能性リンカーはＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドのうちの１つのシステイン残基を他方のペプチドのリシン残基に連結する。本開示のある実施形態において、システインとリシンの各々は前記ペプチドのＣ末端に、又は、Ｃ末端領域内に位置する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ペプチドの組合せはキットとして提供される。 いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドはグルカゴンアンタゴニストペプチドと共にパッケージに入れられる。別の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドはグルカゴンアンタゴニストペプチドとは別々にパッケージに入れられる。 いくつかの態様におけるキットはＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドの投与についての説明書を含む。
【００４８】
ＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドは一緒に、又は、別々に、同時に、又は、（両方のペプチドが重なり合う時期に望ましい活性を及ぼす限り）逐次的に共投与され得る。ＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドの治療目的の共投与の方法が本明細書において提供される。また、グルカゴンアンタゴニストペプチドとの共投与のための薬剤の製剤におけるＧＩＰアゴニストペプチドの利用、及び、ＧＩＰアゴニストペプチドとの共投与のための薬剤の製剤におけるグルカゴンアンタゴニストペプチドの利用が提供される。
【００４９】
ＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドを含む前述したペプチドの組合せの各々、並びに、それらの使用方法が本明細書においてさらに記載される。
【００５０】
ＧＩＰアゴニストペプチドの活性
ＧＩＰ受容体活性化作用
本開示の いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰ受容体における天然ＧＩＰの少なくとも０．１％又は約０．１％の活性を示す。例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰ受容体における天然ＧＩＰの活性の少なくとも０．２％若しくは約０．２％の、少なくとも０．３％若しくは約０．３％の、少なくとも０．４％若しくは約０．４％の、少なくとも０．５％若しくは約０．５％の、少なくとも０．６％若しくは約０．６％の、少なくとも０．７％若しくは約０．７％の、少なくとも０．８％若しくは約０．８％の、少なくとも０．９％若しくは約０．９％の、少なくとも１％若しくは約１％の、少なくとも５％若しくは約５％の、少なくとも１０％若しくは約１０％の、少なくとも２０％若しくは約２０％の、少なくとも３０％若しくは約３０％の、少なくとも４０％若しくは約４０％の、少なくとも５０％若しくは約５０％の、少なくとも６０％若しくは約６０％の、少なくとも７０％若しくは約７０％の、少なくとも７５％若しくは約７５％の、少なくとも８０％若しくは約８０％の、少なくとも９０％若しくは約９０％の、少なくとも９５％若しくは約９５％の、又は、少なくとも１００％若しくは約１００％の活性を示す。
【００５１】
本開示の いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰ受容体において天然ＧＩＰよりも大きい活性を示す。例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰ受容体における天然ＧＩＰの活性の少なくとも１０１％若しくは約１０１％の、少なくとも１０５％若しくは約１０５％の、少なくとも１１０％若しくは約１１０％の、少なくとも１２５％若しくは約１２５％の、少なくとも１５０％若しくは約１５０％の、少なくとも１７５％若しくは約１７５％の、少なくとも２００％若しくは約２００％の、少なくとも３００％若しくは約３００％の、少なくとも４００％若しくは約４００％の、少なくとも５００％若しくは約５００％の、又は、より高いパーセントの活性を示す。 いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＧＩＰアゴニストペプチドは天然ＧＩＰと比較して、ＧＩＰ受容体において１０００％以下、１０，０００％以下、１００，０００％以下、又は、１，０００，０００％以下の活性を示す。ＧＩＰ受容体における天然ＧＩＰに比較したペプチドの活性は、天然ＧＩＰに対するＧＩＰアゴニストペプチドについてのＥＣ５０の反比として計算される。 いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰ受容体活性化についてナノモル濃度の範囲であるＥＣ５０を示す。例示的な実施形態において、ＧＩＰ受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０は１０００ｎＭ未満、９００ｎＭ未満、８００ｎＭ未満、７００ｎＭ未満、６００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満である。 いくつかの実施形態において、ＧＩＰ受容体における前記ペプチドのＥＣ５０は約１００ｎＭ以下、例えば、約７５ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ若以下、約１０ｎＭ以下、約８ｎＭ以下、約６ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、又は、約１ｎＭ以下である。 いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰ受容体活性化についてピコモル濃度の範囲であるＥＣ５０を示す。例示的な実施形態において、ＧＩＰ受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０は１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満である。 いくつかの実施形態において、ＧＩＰ受容体における前記ペプチドのＥＣ５０は約１００ｐＭ以下、例えば、約７５ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約２５ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約８ｐＭ以下、約６ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約４ｐＭ以下、約３ｐＭ以下、約２ｐＭ以下、又は、約１ｐＭ以下である。受容体の活性化は、ＧＩＰ受容体を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰ誘導を測定するインビトロアッセイによって、例えば、実施例２に記載されるように前記受容体をコードするＤＮＡとｃＡＭＰ応答配列に連結されたルシフェラーゼ遺伝子で共形質移入されたＨＥＫ２９３細胞をアッセイして測定され得る。
【００５２】
グルカゴン受容体における活性
本開示の多数の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、グルカゴン受容体をいかなる検出できる程度にまでにも活性化することはない。したがって、 いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、グルカゴン受容体における天然グルカゴンの活性の約１０％以下（例えば、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下）の活性を示すＧＩＰアゴニストである。
【００５３】
共受容体活性化作用
本開示のいくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰ受容体に加えてＧＩＰ受容体とは異なる第２の受容体を活性化する限りにおいて、共アゴニストペプチドである。例として挙げると、いくつかの態様におけるＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰ受容体とＧＬＰ−１受容体の両方において活性を示す（「ＧＬＰ−１受容体／ＧＩＰ受容体共アゴニスト」）。いくつかの実施形態において、ＧＩＰ受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０は、ＧＬＰ−１受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０の約５０倍以下（高い、又は、低い）の範囲内である。いくつかの実施形態において、ＧＩＰ受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０は、ＧＬＰ−１受容体におけるそのＥＣ５０から約４０倍、約３０倍、約２０倍（高い、又は、低い）の範囲内である。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドのＧＩＰ効力は、そのＧＬＰ−１効力から約２５倍以下、約２０倍以下、約１５倍以下、約１０倍以下、又は、約５倍以下異なる（高い、又は、低い）。いくつかの実施形態において、ＧＬＰ−１受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０で除算されたＧＩＰ受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０の比率は約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、又は、約５未満であり、かつ１以上である。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドのＧＬＰ−１効力と比較したＧＩＰ効力の比率は約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、又は、約５未満であり、かつ１以上である。いくつかの実施形態において、ＧＩＰ受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０で除算されたＧＬＰ−１受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０の比率は約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、又は、約５未満であり、かつ１以上である。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドのＧＩＰ効力と比較したＧＬＰ−１効力の比率は約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、又は、約５未満であり、かつ１以上である。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドの選択性はＧＩＰ受容体に対してヒトＧＬＰ−１受容体へ少なくとも１００倍の選択性を持つことはない。例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドのＧＩＰ受容体に対してヒトＧＬＰ−１受容体への選択性は１００倍未満（例えば、約９０倍以下、８０倍以下、７０倍以下、約６０倍以下、約５０倍以下、約４０倍以下、約３０倍以下、約２０倍以下、約１０倍以下、約５倍以下）である。
【００５４】
本開示のいくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＬＰ−１受容体における天然ＧＬＰ−１の少なくとも０．１％の若しくは約０．１％の活性を示す。例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＬＰ−１受容体における天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも０．２％の若しくは約０．２％の、少なくとも０．３％の若しくは約０．３％の、少なくとも０．４％の若しくは約０．４％の、少なくとも０．５％の若しくは約０．５％の、少なくとも０．６％の若しくは約０．６％の、少なくとも０．７％の若しくは約０．７％の、少なくとも０．８％の若しくは約０．８％の、少なくとも０．９％の若しくは約０．９％の、少なくとも１％の若しくは約１％の、少なくとも５％の若しくは約５％の、少なくとも１０％の若しくは約１０％の、少なくとも２０％の若しくは約２０％の、少なくとも３０％の若しくは約３０％の、少なくとも４０％の若しくは約４０％の、少なくとも５０％の若しくは約５０％の、少なくとも６０％の若しくは約６０％の、少なくとも７０％の若しくは約７０％の、少なくとも７５％の若しくは約７５％の、少なくとも８０％の若しくは約８０％の、少なくとも９０％の若しくは約９０％の、少なくとも９５％の若しくは約９５％の、少なくとも１００％の若しくは約１００％の活性を示す。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰ受容体のみにおいて活性を示し、ＧＬＰ−１受容体においては活性を示さない。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、グルカゴンＧＬＰ−１における天然ＧＬＰ−１の活性の約１０％以下（例えば、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下）の活性を示すＧＩＰアゴニストである。
【００５６】
複合体の活性
いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドが、本明細書においてさらに記載されるように、異種部分（例えば、親水性部分）に複合体化されるとき、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチドが遊離形態である、又は、未複合体化形態であるときよりも減少した活性（例えば、より低い効力、又は、より高いＥＣ５０）を示す。いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドが遊離している、又は、複合体化されていないとき、ＧＩＰアゴニストペプチドは異種部分（例えば、親水性部分）に複合体化されるときのＧＩＰアゴニストペプチドの効力よりも約１０倍以上の効力をＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰ受容体において示す。いくつかの態様において、複合体化されていないとき、ＧＩＰアゴニストペプチドは、異種部分に複合体化されているときのＧＩＰアゴニストペプチドの効力よりも約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約１００倍、又は、それ以上高い効力をＧＩＰ受容体において示す。いくつかの態様において、複合体化されていないとき、ＧＩＰアゴニストペプチドは、グルカゴンアンタゴニストペプチドに複合体化されているときのＧＩＰアゴニストペプチドの効力よりも約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約１００倍、又は、それ以上高い効力をＧＩＰ受容体において示す。
【００５７】
ＧＩＰアゴニストペプチドの構造
天然ヒトＧＩＰの類似体
本開示のいくつかの実施形態において、ＧＩＰ受容体アゴニストは、配列番号２として本明細書においてそのアミノ酸配列が提供される天然ヒトＧＩＰの類似体である。したがって、いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは配列番号２のアミノ酸配列に基づくアミノ酸配列を含むが、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、及び、いくつかの例において、１６個以上（例えば、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個など）のアミノ酸修飾で改変される。いくつかの実施形態において、ＧＩＰ類似体は、天然ヒトＧＩＰ配列（配列番号２）に関して総計で１個の、２個までの、３個までの、４個までの、５個までの、６個までの、７個までの、８個までの、９個までの、又は、１０個までのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾は本明細書において記載されるもののうちのいずれかであり、例えば、アシル化、アルキル化、ＰＥＧ化、Ｃ末端短縮、位置１、２、３、７、１０、１２、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２７、２８、及び、２９の中の１つ以上でのアミノ酸置換のいずれかである。例示的なＧＩＰ受容体アゴニストは当該技術分野において公知である。例えば、Irwin et al., 薬学及び実験治療学誌（J Pharm and Expmt Ther） 314(3): 1187-1194 (2005)、Salhanick et al., 生物有機化学及び医薬化学短報（Bioorg Med Chem Lett） 15(18): 4114-4117 (2005)、Green et al., 糖尿病誌（Dibetes） 7(5): 595-604 (2005)、O’Harte et al., 内分泌学誌（J Endocrinol） 165(3): 639-648 (2000)、O’Harte et al., 糖尿病学誌（Diabetologia） 45(9): 1281-1291 (2002)、Gault et al., Biochem J 367 (Pt3): 913-920 (2002)、Gault et al., 内分泌学誌（J Endocrin） 176: 133-141 (2003)、Irwin et al., 糖尿病、肥満、及び、代謝誌（Diabetes Obes Metab.） 11(6): 603-610 (epub 2009)を参照のこと。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本開示のＧＩＰアゴニストペプチドは、天然ヒトＧＩＰ（配列番号２）のアミノ酸配列に対し少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号２に対して少なくとも３０％の、少なくとも４０％の、少なくとも５０％の、少なくとも６０％の、少なくとも７０％の、少なくとも８０％の、少なくとも８５％の、少なくとも９０％の配列同一性であり、又は、９０％より大きい配列同一性を持つアミノ酸配列含む。いくつかの実施形態において、先述の配列同一性パーセントを有するＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸配列はＧＩＰアゴニストペプチドの全長のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、先述の配列同一性パーセントを有するＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸配列はＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸配列の一部でしかない。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号２の少なくとも５個の連続するアミノ酸（例えば、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９個の、少なくとも１０個のアミノ酸）であり、配列番号２の位置Ｃのアミノ酸で始まり配列番号２の位置Ｄのアミノ酸で終わる基準アミノ酸配列に対して約Ａ％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。Ａは２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９であり、Ｃは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は、２８であり、Ｄは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は、２９である。限定されないが、Ａが９０％でありＣとＤが１と２７、又は、６と２７、又は、８と２７、又は、１０と２７、又は、１２と２７、又は、１６と２７であるような、前述のパラメーターのあらゆる可能な組合せが考えられる。
【００５９】
特定の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１、位置２、又は、位置１と位置２の両方の位置にアミノ酸修飾を含み、そのアミノ酸修飾がペプチドにＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ切断に対する抵抗性の増大をもたらす、天然ＧＩＰの類似体である。いくつかの態様において、ペプチドにＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ切断に対する抵抗性の増大をもたらすアミノ酸修飾は、天然ヒトグルカゴンの類似体に関して本明細書に記載されるアミノ酸修飾のいずれかである。例えば、アミノ酸修飾は、Ｄ−ヒスチジン、α、α−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、α−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、及び、ホモヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸による配列番号２の位置１にあるチロシンの置換であり得る。あるいは、又は、さらに、アミノ酸修飾は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、及び、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択されるアミノ酸で配列番号２の位置２にあるアラニンの置換である。いくつかの特定の態様において、天然ＧＩＰの類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドは１〜２１アミノ酸を含むＣ末端伸長部を含む、又は、さらに含む。そのような伸長部は当該技術分野において公知であり、グルカゴン類似体の融合ペプチドに関して本明細書において記載されるものを含む。特定の態様において、前記伸長部は配列番号３から配列番号９のいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号４、配列番号６、又は、配列番号７のＸａａは小脂肪族残基、例えば、グリシンである。いくつかの実施形態において、Ｃ末端伸長部は１〜６個の正に荷電したアミノ酸、例えば、アルギニン、アルギニン類似体、例えば、リシン、ｄ−リシン、オルニチン、Ｄａｂなどの式ＩＶのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰの類似体であり、ＧＩＰ受容体におけるアゴニスト活性を、例えば、ＧＩＰ受容体でのＥＣ５０がペプチドの組合せの中のグルカゴンアンタゴニストペプチドのＩＣ５０の１０倍以内の範囲であるようなレベルにまで低下させるアミノ酸修飾を含む。ＧＩＰアゴニスト活性を低下させる適切なアミノ酸修飾は、例えば、小脂肪族アミノ酸、例えば、アラニン、グリシンによる、又は、例えばヒスチジン、若しくは、その類似体のようなイミダゾール含有アミノ酸による位置１にあるチロシンの置換を含む。いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニスト活性を低下させるアミノ酸修飾は位置１のアミノ酸の欠質、又は、位置１と位置２のアミノ酸の欠質である。天然グルカゴンの類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドに関して本明細書において教示される修飾のいずれもが、例えば、ＧＩＰ受容体、ＧＬＰ−１受容体、及び／又は、グルカゴン受容体における活性に影響を与え、安定性、可溶性、半減期、作用時間などを増加させると教示される修飾のいずれかのような天然ＧＩＰアミノ酸配列（配列番号２）のさらなる修飾が企図される。
【００６０】
天然のヒトグルカゴンの類似体
いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは天然のヒトグルカゴン（配列番号１）に構造的に類似しており、例えば、天然のヒトグルカゴンの類似体（又は、「グルカゴン類似体」）である。ＧＩＰ受容体アゴニスト活性を示すグルカゴンのそのような類似体は当該技術分野において公知である。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ  ＵＳ２００９／４７４４７号（２００９年６月１６日に出願）、米国特許出願第６１／０７３，２７４号（２００８年６月１７日に出願）、米国特許出願第６１／０７８，１７１号（２００８年７月３日に出願）、米国特許出願第６１／０９０，４４８号（２００８年８月２０日に出願）、米国特許出願第６１／１５１，３４９号（２００９年２月１０日に出願）、米国特許出願第６１／１８７，５７８号を参照のこと。これらの内容は参照によりその全体が組み入れられる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に基づくアミノ酸配列を含むが、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、及び、いくつかの例では、１６個以上（例えば、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個など)のアミノ酸修飾で改変される天然のヒトグルカゴン（配列番号１）の類似体である。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、天然のヒトグルカゴン配列（配列番号１）に関して総計で１個、２個まで、３個まで、４個まで、５個まで、６個まで、７個まで、８個まで、９個まで、又は、１０個までのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、前記修飾は本明細書に記載される修飾のいずれか、例えば、アシル化、アルキル化、ＰＥＧ化、Ｃ末端短縮、位置１、位置２、位置３、位置７、位置１０、位置１２、位置１５、位置１６、位置１７、位置１８、位置１９、位置２０、位置２１、位置２３、位置２４、位置２７、位置２８、及び、位置２９のうちの１つ以上の位置にあるアミノ酸の置換である。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本開示のＧＩＰアゴニストペプチドは天然のヒトグルカゴン（配列番号１）のアミノ酸配列に対し少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号１に対して少なくとも３０％の、少なくとも４０％の、少なくとも５０％の、少なくとも６０％の、少なくとも７０％の、少なくとも８０％の、少なくとも８５％の、少なくとも９０％の配列同一性であり、又は、９０％より大きい配列同一性を持つアミノ酸配列含む。いくつかの実施形態において、先述の配列同一性パーセントを有するＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸配列はＧＩＰアゴニストペプチドの全長のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、先述の配列同一性パーセントを有するＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸配列はＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸配列の一部でしかない。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号１の少なくとも５個の連続するアミノ酸（例えば、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９個の、少なくとも１０個のアミノ酸）であり、配列番号１の位置Ｃのアミノ酸で始まり配列番号１の位置Ｄのアミノ酸で終わる基準アミノ酸配列に対して約Ａ％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。Ａは２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９であり、Ｃは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は、２８であり、Ｄは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は、２９である。限定されないが、Ａが９０％でありＣとＤが１と２７、又は、６と２７、又は、８と２７、又は、１０と２７、又は、１２と２７、又は、１６と２７であるような、前述のパラメーターのあらゆる可能な組合せが考えられる。
【００６３】
本明細書に記載される天然のヒトグルカゴン（配列番号１）の類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドは任意の数のアミノ酸のペプチド骨格を含むことができる、すなわち、任意のペプチド長であることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＧＩＰアゴニストペプチドは配列番号１と同じ長さであり、すなわち、２９アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは２９アミノ酸よりも長く、例えば、ＧＩＰアゴニストペプチドは、本明細書においてさらに記載されるように、１〜２１アミノ酸のＣ末端伸長部を含む。したがって、ある実施形態におけるＧＩＰアゴニストペプチドは３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は、５０アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは５０アミノ酸までの長さである。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、別のペプチドとの融合のため、２９アミノ酸よりも長く、例えば５０アミノ酸よりも長い（例えば、少なくとも若しくは約６０アミノ酸長、少なくとも若しくは約７０アミノ酸長、少なくとも若しくは約８０アミノ酸長、少なくとも若しくは約９０アミノ酸長、少なくとも若しくは約１００アミノ酸長、少なくとも若しくは約１５０アミノ酸長、少なくとも若しくは約２００アミノ酸長、少なくとも若しくは約２５０アミノ酸長、少なくとも若しくは約３００アミノ酸長、少なくとも若しくは約３５０アミノ酸長、少なくとも若しくは約４００アミノ酸長、少なくとも若しくは約４５０アミノ酸長、少なくとも若しくは約５００アミノ酸長）である。別の実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは２９アミノ酸よりも短く、例えば、２８アミノ酸、２７アミノ酸、２６アミノ酸、２５アミノ酸、２４アミノ酸、２３アミノ酸である。
【００６４】
前述したことに従って、いくつかの態様において、本開示のＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰ活性、グルカゴン活性、及び／又は、ＧＬＰ−１活性に影響を与え、例えば、ペプチドの分解を低下させることにより（例えば、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼへの抵抗性を改善することにより）安定性を増強し、可溶性を高め、半減期を増加させ、作用開始時期を遅らせ、ＧＩＰ受容体、グルカゴン受容体、若しくは、ＧＬＰ−１受容体、若しくは、前述の受容体のいずれかの組合せにおける作用の期間を延長する１つ以上のアミノ酸修飾で改変される配列番号１を含む天然のヒトグルカゴン（配列番号１）の類似体である。そのようなアミノ酸修飾は、その他の修飾に加えて、本明細書においてさらに記載される。
【００６５】
グルカゴン類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドの例示的実施形態
本開示のいくつかの実施形態に従って、グルカゴン（配列番号１）の類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドは、（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１でのアミノ酸修飾、（ｂ）ＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端部分（１２〜位置２９アミノ酸）のαヘリックスを安定化する修飾、及び、（ｃ）任意選択で、１個から１０個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個）のさらなるアミノ酸修飾を有する配列番号１を含む。いくつかの実施形態において、前記類似体はＧＩＰ受容体における天然ＧＩＰの活性の少なくとも若しくは約０．１％の（例えば、少なくとも若しくは約０．２５％の、少なくとも若しくは約０．５％の、少なくとも若しくは約０．７５％の、少なくとも若しくは約１％の）活性、又は、本明細書に記載されるＧＩＰ受容体におけるその他の任意の活性レベルを示す。
【００６６】
ある実施形態において、αヘリックス構造を安定化する修飾は、本明細書に記載されるもののいずれかのような、例えば、共有結合による分子内架橋を含む分子内架橋を提供し、又は、導入する修飾である。いくつかの実施形態における共有結合による分子内架橋はラクタム架橋である。これらの実施形態のＧＩＰアゴニストペプチドのラクタム架橋は本明細書に記載されるラクタム架橋であり得る。例えば、「αヘリックス構造の安定化」節内のラクタム架橋についての教示を参照のこと。例えば、ラクタム架橋は、ｉが１２、１３、１６、１７、２０若しくは２４であり、ｊが１７である、位置ｉと位置ｉ＋４のアミノ酸の側鎖の間の架橋であり得るし、又は、位置ｊと位置ｊ＋３のアミノ酸の側鎖の間の架橋であり得る。ある実施形態において、ラクタム架橋は、位置１６と位置２０のアミノ酸の間に存在することができ、位置１６と位置２０のアミノ酸の一つがグルタミン酸で置換され、位置１６と位置２０の他方のアミノ酸がリシンで置換される。
【００６７】
別の実施形態において、αヘリックス構造を安定化する修飾は、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置１６、位置２０、位置２１、及び、位置２４における１個、２個、３個、又は、４個のα，α二置換アミノ酸の導入である。いくつかの実施形態において、α，α二置換アミノ酸はアミノイソ酪酸である。ある態様において、α，α二置換アミノ酸（例えば、アミノイソ酪酸）は位置２０にあり、位置１６にあるアミノ酸は、例えば、本明細書に記載される式ＩＶのアミノ酸のような正に荷電したアミノ酸で置換される。式ＩＶのアミノ酸はホモリシン、リシン、オルニチン、又は、２，４−ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）であり得る。
【００６８】
上述した例示的な実施形態のいずれかにおいて、ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１でのアミノ酸修飾は、イミダゾール側鎖を欠くアミノ酸によるヒスチジンの置換であり得る。例えば、位置１でのアミノ酸修飾は大芳香族アミノ酸によるヒスチジンの置換であり得る。いくつかの実施形態において、大芳香族アミノ酸は、例えば、チロシンを含む本明細書に記載されるもののいずれかである。
【００６９】
ＧＩＰアゴニストペプチドがＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１でのアミノ酸修飾とＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９）のαヘリックス構造を安定化する修飾を含むある態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置２７、位置２８、及び、位置２９の内の１つ、２つ、又は、全ての位置でアミノ酸修飾をさらに含む。いくつかの態様において、位置２７のメチオニンは大脂肪族アミノ酸、任意選択で、ロイシンで置換され、位置２８のアスパラギンは小脂肪族アミノ酸、任意選択で、アラニンで置換され、位置２９のトレオニンは小脂肪族アミノ酸、任意選択で、グリシンで置換され、又は、前述したうちの２つ、若しくは、３つの組合せである。特定の実施形態において、グルカゴン類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドは、位置２７にロイシンを、位置２８にアラニンを、位置２９の位置にグリシン若しくはトレオニンを含む。
【００７０】
ＧＩＰアゴニストペプチドがＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１でのアミノ酸修飾とＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９）のαヘリックス構造を安定化する修飾を含む本開示のある実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは位置２９のアミノ酸のＣ末端側に１から２１アミノ酸の伸長部をさらに含む。いくつかの態様における前記伸長部は、例えば、配列番号３、又は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。さらに、又は、あるいは、いくつかの態様におけるＧＩＰアゴニストペプチドは、伸長部の１〜６アミノ酸が正に荷電したアミノ酸である伸長部を含む。いくつかの実施形態における正に荷電したアミノ酸は、限定されないが、リシン、ｄ−リシン、ホモリシン、オルニチン、及び、Ｄａｂを含む式ＩＶのアミノ酸である。いくつかの実施形態において、正に荷電したアミノ酸はアルギニン、又は、その類似体である。いくつかの態様において、前記伸長部は、負に荷電したアミノ酸、例えば、アスパラギン酸やグルタミン酸である１〜６アミノ酸を含む。
【００７１】
ＧＩＰアゴニストペプチドがＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１でのアミノ酸修飾とＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９）のαヘリックス構造を安定化する修飾を含むいくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは本明細書に記載されるようにアシル化される、又は、アルキル化される。いくつかの態様において、本明細書においてさらに記載されるように、アシル基、又は、アルキル基はＧＩＰアゴニストペプチドの位置１０、又は、位置４０に、スペーサー有り若しくは無しで、ＧＩＰアゴニストペプチドに結合する。さらなる態様、又は、別の態様におけるＧＩＰアゴニストペプチドは本明細書においてさらに記載される親水性部分を含むよう修飾される。さらに、いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは次の修飾のうちのどれか一つ、又は、次の修飾の組合せを含む。
（ａ）Ｄ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、アミノイソ酪酸，バリン、又は、α−アミノ−Ｎ−酪酸で置換された位置２のセリン
（ｂ）トリプトファン、リシン、オルニチン、グルタミン酸、フェニルアラニン、又は、バリンで置換された位置１０のチロシン
（ｃ）位置１０のリシンへのアシル基の結合
（ｄ）アルギニン、又は、イソロイシンで置換された位置１２のリシン
（ｅ）グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、トレオニン、グリシン、又は、アミノイソ酪酸で置換された位置１６のセリン
（ｆ）グルタミンで置換された位置１７のアルギニン
（ｇ）アラニン、セリン、トレオニン、又は、グリシンで置換された位置１８のアルギニン
（ｈ）セリン、トレオニン、アラニン、リシン、シトルリン、アルギニン、オルニチン、又は、アミノイソ酪酸で置換された位置２０のグルタミン
（ｉ）グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換された位置２１のアスパラギン酸
（ｊ）イソロイシンで置換された位置２３のバリン
（ｋ）アスパラギン、セリン、トレオニン、アラニン、又は、アミノイソ酪酸で置換された位置２４のグルタミン
（ｌ）及び、位置２、位置５、位置９、位置１０、位置１１、位置１２、位置１３、位置１４、位置１５、位置１６、位置８、位置１９、位置２０、位置２１、位置２４、位置２７、位置２８、及び、位置２９のいずれかでの保存的置換
【００７２】
例示的な実施形態において、グルカゴン（配列番号１）の類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドは次の修飾、
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１でのアミノ酸修飾、
（ｂ）ｉが１２、１３、１６、１７、２０、又は、２４でありｊが１７である、位置ｉと位置ｉ＋４のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋、又は、位置ｊと位置ｊ＋３のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋、
（ｃ）位置２７、位置２８、及び、位置２９の１つ、２つ、又は、全てでのアミノ酸修飾、例えば、位置２７、及び／又は、位置２８でのアミノ酸修飾、並びに、
（ｄ）１〜９個の、又は、１〜６個のさらなるアミノ酸修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は、９個のさらなるアミノ酸修飾を含み、そして、ＧＩＰ受容体活性化について前記類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
【００７３】
これらの実施形態のＧＩＰアゴニストペプチドのラクタム架橋は本明細書に記載されるラクタム架橋であり得る。例えば、「αヘリックス構造の安定化」節のもとにあるラクタム架橋についての教示を参照のこと。例えば、ラクタム架橋は、位置１６と位置２０のアミノ酸の間に存在することができ、位置１６と位置２０のアミノ酸の一つがグルタミン酸で置換され、位置１６と位置２０の他方のアミノ酸がリシンで置換される。
【００７４】
これらの実施形態に従って、前記類似体は、例えば、配列番号１０５〜１９４のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１のアミノ酸がアラニンで置換されている、又は、欠質されている配列番号１０５〜１９４の修飾されたアミノ酸配列を含む。
【００７５】
別の例示的な実施例において、グルカゴン（配列番号１）の類似体であり、ＧＩＰアゴニスト活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドは次の修飾、
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１でのアミノ酸修飾、
（ｂ）前記類似体の位置１６、位置２０、位置２１、及び、位置２４の１つ、２つ、３つ、又は、全てでのアミノ酸のα，α−二置換アミノ酸による置換、
（ｃ）位置２７、位置２８、及び、位置２９の１つ、２つ、又は、全てでのアミノ酸修飾、例えば、位置２７、及び／又は、位置２８でのアミノ酸修飾、並びに、
（ｄ）１〜９個の、又は、１〜６個のさらなるアミノ酸修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は、９個のさらなるアミノ酸修飾を含み、そして、ＧＩＰ受容体活性化について前記類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
【００７６】
これらの実施形態のＧＩＰアゴニストペプチドのα，α−二置換アミノ酸は、限定されないが、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）、メチル基、エチル基、プロピル基、及び、ｎ−ブチル基から選択される同じ、若しくは、異なる基で二置換されるアミノ酸、又は、シクロオクタン基、若しくは、シクロヘプタン基で二置換されるアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）を含む任意のα，α−二置換アミノ酸であり得る。ある実施形態において、α，α−二置換アミノ酸はアミノイソ酪酸である。ある実施形態において、位置２０のアミノ酸はα，α−二置換アミノ酸、例えば、アミノイソ酪酸で置換される。
【００７７】
これらの実施形態に従って、前記類似体は、例えば、配列番号１９９〜２４１、配列番号２４４〜２６４、配列番号２６６〜２６９、及び、配列番号２７３〜２７８のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１のアミノ酸がアラニンで置換されている、又は、欠質されている配列番号１９９〜２４１、配列番号２４４〜２６４、配列番号２６６〜２６９、及び、配列番号２７３〜２７８の修飾されたアミノ酸配列を含む。
【００７８】
さらに別の例示的な実施形態において、グルカゴン（配列番号１）の類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドは次の修飾、
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１でのアミノ酸修飾、
（ｂ）式ＩＶのアミノ酸による位置１６のセリンのアミノ酸置換
【化２】
2013518115.tif 000003
［式中、ｎは１から１６、又は、１から１０、又は、１から７、又は、１から６、又は、２から６であり、Ｒ１とＲ２の各々は互いに独立して水素、Ｃ１−Ｃ１８アルキル基、Ｃ１−Ｃ１８アルキルアルコール基、Ｃ１−Ｃ１８アルキルアミノ基、Ｃ１−Ｃ１８アルキルチオール基、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル基、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ２−Ｃ５ヘテロサイクリック）基、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ６−Ｃ１０アリル）Ｒ７基、及び、（Ｃ１−Ｃ４アルキル）（Ｃ３−Ｃ９ヘテロアリル）基からなる群より選択され、Ｒ７は水素又はヒドロキシル基であり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含む。］
（ｃ）α，α−二置換アミノ酸による位置２０のグルタミンのアミノ酸置換
（ｄ）位置２７、位置２８、及び、位置２９の１つ、２つ、又は、全てでのアミノ酸修飾、例えば、位置２７の位置、及び／又は、位置２８でのアミノ酸修飾、並びに、
（ｅ）１〜９個の、又は、１〜６個のさらなるアミノ酸修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は、９個のさらなるアミノ酸修飾を含み、そして、ＧＩＰ受容体活性化について前記類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
【００７９】
これらの実施形態の類似体に含まれる式ＩＶのアミノ酸は、例えば、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０，１１、１２、１３、１４、１５、又は、１６である式ＩＶのアミノ酸のような任意のアミノ酸であり得る。ある実施形態において、ｎは２、３、４、又は、５であり、その場合、そのアミノ酸は、それぞれ、Ｄａｂ、オルニチン、リシン、又は、ホモリシンである。
【００８０】
これらの実施形態のＧＩＰアゴニストペプチドのα，α−二置換アミノ酸は、限定されないが、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）、メチル基、エチル基、プロピル基、及び、ｎ−ブチル基から選択される同じ、若しくは、異なる基で二置換されるアミノ酸、又は、シクロオクタン基、若しくは、シクロヘプタン基で二置換されるアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）を含む任意のα，α−二置換アミノ酸であり得る。ある実施形態において、α，α−二置換アミノ酸はアミノイソ酪酸である。
【００８１】
これらの実施形態に従って、例えば、前記類似体は配列番号１９９〜２６５のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１のアミノ酸がアラニンで置換されている、又は、欠質されている配列番号１９９〜２６５の修飾されたアミノ酸配列を含む。
【００８２】
さらに別の例示的な実施形態において、グルカゴン（配列番号１）の類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドは、
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１でのアミノ酸修飾、及び、
（ｂ）位置２９のＣ末端側に約１から約２１アミノ酸の伸長部であり、伸長部のアミノ酸の少なくとも１つがアシル化、又は、アルキル化されているものを含み、ＧＩＰ受容体活性化について前記類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
【００８３】
いくつかの実施形態において、アシル化される、又は、アルキル化されるアミノ酸は式Ｉ、式ＩＩ、又は、式ＩＩＩのアミノ酸である。より特定の実施形態において、式Ｉのアミノ酸はＤａｂ、オルニチン、リシン、又は、ホモリシンである。また、いくつかの実施形態において、約１から約２１アミノ酸の伸長部はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）のアミノ酸配列、又は、ＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号４）のアミノ酸配列でＸは任意のアミノ酸であるもの、又は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号５）のアミノ酸配列、又は、Ｘはグリシン、若しくは、小脂肪族の、若しくは、非極性の、若しくは、わずかに極性を有するアミノ酸であるＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号６）のアミノ酸配列、又は、ＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、約１から約２１のアミノ酸は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は、配列番号７に関して１つ以上の保存的な置換を含む配列を包含することができる。いくつかの実施形態において、アシル化、又は、アルキル化されるアミノ酸はＣ末端が伸長した類似体の３７番、位置３８、位置３９、４０番、４１番、位置４２、又は、４位置３に位置する。ある実施形態において、アシル化、又は、アルキル化されるアミノ酸はＣ末端が伸長した類似体の位置４０に位置する。
【００８４】
いくつかの実施形態において、グルカゴン（配列番号１）の類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドは位置２７、位置２８、及び、位置２９の内の１つ、２つ、又は、全てでのアミノ酸修飾、例えば、位置２７の位置、及び／又は、位置２８でのアミノ酸修飾をさらに含む。
【００８５】
前述の例示的な実施形態のいずれかにおいて、ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１でのアミノ酸修飾はイミダゾール側鎖を欠くアミノ酸によるヒスチジンの置換であり得る。例えば、位置１でのアミノ酸修飾は大芳香族アミノ酸によるヒスチジンの置換であり得る。いくつかの実施形態において、大芳香族アミノ酸は、例えば、チロシンを含む本明細書に記載されるもののうちのいずれかである。
【００８６】
また、前述した例示的な実施形態に関して、位置２７、位置２８、及び、位置２９の内の１つ、２つ、又は、全てでのアミノ酸修飾は、本明細書に記載されるこれらでの修飾のいずれかであり得る。例えば、位置２７のメチオニンは大脂肪族アミノ酸により、任意選択で、ロイシンにより置換されることができ、位置２８のアスパラギンは小脂肪族アミノ酸により、任意選択で、アラニンにより置換されることができ、そして／又は、位置２９のトレオニンは小脂肪族アミノ酸により、任意選択で、グリシンにより置換することができる。あるいは、前記類似体は位置２７、及び／又は、位置２８にそのようなアミノ酸修飾を含むことができる。
【００８７】
前述の例示的な実施形態のＧＩＰアゴニストペプチドは、１〜９個の、又は、１〜６個のさらに付加的なアミノ酸修飾をさらに含むことができ、例えば、ＧＩＰ受容体、ＧＬＰ−１受容体、及び、グルカゴン受容体のいずれかにおいて活性を増大させ、若しくは、低下させ、可溶性を改善し、作用期間、若しくは、循環半減期を改善し、作用開始時期を遅らせ、又は、安定性を増大させる本明細書に記載される修飾のいずれかのような、例えば、さらに１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は、９個のアミノ酸修飾をさらに含むことができる。例えば、前記類似体は位置１２でのアミノ酸修飾、任意選択で、イソロイシンでの置換、及び／又は、位置１７及び位置１８でのアミノ酸修飾、任意選択で、位置１７でのグルタミンでの置換及び位置１８でのアラニンでの置換、及び／又は、Ｃ末端へのＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）の付加、若しくは、ＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号４）の付加、若しくは、配列番号３若しくは配列番号４に関して１つ以上の保存的置換を含む配列の付加をさらに包含することができる。したがって、いくつかの態様におけるグルカゴン（配列番号１）の類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドは次の修飾のうちの１つ以上を含む。
（ａ）Ｄ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、アミノイソ酪酸，バリン、又は、α−アミノ−Ｎ−酪酸で置換された位置２のセリン、
（ｂ）トリプトファン、リシン、オルニチン、グルタミン酸、フェニルアラニン、又は、バリンで置換された位置１０のチロシン、
（ｃ）位置１０のリシンへのアシル基の結合
（ｄ）アルギニンで置換された位置１２のリシン
（ｅ）グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、トレオニン、グリシン、又は、アミノイソ酪酸で置換された位置１６のセリン
（ｆ）グルタミンで置換された位置１７のアルギニン
（ｇ）アラニン、セリン、トレオニン、又は、グリシンで置換された位置１８のアルギニン
（ｈ）アラニン、セリン、トレオニン、リシン、シトルリン、アルギニン、オルニチン、又は、アミノイソ酪酸で置換された位置２０のグルタミン
（ｉ）グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換された位置２１のアスパラギン酸
（ｊ）イソロイシンで置換された位置２３のバリン
（ｋ）アスパラギン、アラニン、セリン、トレオニン、又は、アミノイソ酪酸で置換された位置２４のグルタミン、並びに、
（ｌ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、及び、２９のいずれかでの保存的置換
【００８８】
いくつかの実施形態におけるＧＩＰアゴニストペプチドは（ａ）から（ｌ）までの修飾の組合せを含む。あるいは、又は、さらに、ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号１の位置３でのアミノ酸修飾（例えば、グルタミン酸によるグルタミンの置換）でグルカゴン受容体においてグルカゴンの活性の１％未満の活性をＧＩＰアゴニストペプチドが持つようなアミノ酸修飾を含むことができる。あるいは、又は、さらに、ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号１の位置７でのアミノ酸修飾（例えば、ヒドロキシル基を欠くアミノ酸、例えば、Ａｂｕ、又は、イソロイシンによるトレオニンのアミノ酸置換）を含むことができ、前記ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＬＰ−１受容体においてＧＬＰ−１の活性の約１０％未満の活性を持つ。
【００８９】
前記の例示的な実施形態に関して、グルカゴン（配列番号１）の類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドは親水性部分と共有結合で結合され得る。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０、又は、Ｃ末端のアミノ酸位置のいずれかで親水性部分と共有結合で結合する。ある実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、Ｃ末端伸長部（例えば、配列番号３のアミノ酸配列）、及び、位置４０でＧＩＰアゴニストペプチドに共有結合で結合するように親水性部分を含むアミノ酸の付加を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、親水性部分はＧＩＰアゴニストペプチドのリシン、システイン、オルニチン、ホモシステイン、又は、アセチルフェニルアラニンに共有結合で結合する。リシン、システイン、オルニチン、ホモシステイン、又は、アセチルフェニルアラニンはグルカゴン配列（配列番号１）に本来備わっているアミノ酸であり得る、又は、配列番号１の本来のアミノ酸を置換するアミノ酸であり得る。親水性部分がシステインに結合するいくつかの実施形態において、親水性部分への結合は次の構造、
【化３】
2013518115.tif 000004
【化４】
2013518115.tif 000005
【００９１】
親水性部分を含むＧＩＰアゴニストペプチドに関して、親水性部分は本明細書に記載されるもののいずれかであり得る。例えば、「親水性部分の結合」節内の教示を参照のこと。いくつかの実施形態において、親水性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ある実施形態におけるＰＥＧは約１，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの、例えば、約２０，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
【００９２】
前述した例示的な実施形態のいずれかに関して、グルカゴン（配列番号１）の類似体であり、いくつかの実施形態においてＧＩＰアゴニスト活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドは、側鎖がアシル基、又は、アルキル基（例えば、天然のアミノ酸には本来備わっていないアシル基、又は、アルキル基）と共有結合で結合する修飾型アミノ酸を含む。アシル化類似体、又は、アルキル化類似体は「アシル化とアルキル化」節に記載されるアシル化ペプチド、又は、アルキル化ペプチドと一致し得る。いくつかの実施形態において、アシル基は、例えば、炭素数１０の脂肪アシル基若しくはアルキル基、炭素数１２の脂肪アシル基若しくはアルキル基、炭素数１４の脂肪アシル基若しくはアルキル基、炭素数１６の脂肪アシル基若しくはアルキル基、炭素数１８の脂肪アシル基若しくはアルキル基、炭素数２０のアシル基若しくはアルキル基、又は、炭素数２２のアシル基若しくはアルキル基のような炭素数４から３０の脂肪アシル基である。アシル基、又は、アルキル基は、前記類似体の、限定されないが、位置１０、又は、位置４０のアミノ酸、又は、Ｃ末端のアミノ酸を含む任意のアミノ酸に共有結合で結合され得る。ある実施形態において、前記類似体はＣ末端伸長部（例えば、配列番号３のアミノ酸配列）と位置４０で前記類似体とアシル基、又は、アルキル基が共有結合で結合するようにアシル基、又は、アルキル基を含むアミノ酸の付加を包含する。いくつかの実施形態において、アシル基、又は、アルキル基は、式Ｉ、式ＩＩ、又は、式ＩＩＩのアミノ酸、例えば、リシン残基の側鎖に共有結合で結合する。アシル基、又は、アルキル基はグルカゴン配列（配列番号１）に本来備わるアミノ酸に共有結合で結合することができ、又は、配列番号１の配列に付加されるアミノ酸、若しくは、配列番号３が（Ｎ末端に、又は、Ｃ末端に）続く配列番号１の配列に付加されるアミノ酸に結合することができ、又は、本来のアミノ酸、例えば、配列番号１の位置１０のチロシンを置換するアミノ酸に結合することができる。
【００９３】
ＧＩＰアゴニストペプチドがアシル基、又は、アルキル基を含む前述の例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、本明細書に記載されるように、スペーサーを介してアシル基、又は、アルキル基に結合することができる。例えば、前記スペーサーは、その長さが３から１０原子であることができ、例えば、アミノ酸（例えば、６−アミノヘキサン酸、本明細書に記載される任意のアミノ酸）、ジペプチド（例えば、アラニン−アラニン、βアラニン−βアラニン、ロイシン−ロイシン、プロリン−プロリン、γグルタミン酸−γグルタミン酸）、トリペプチド、又は、親水性、若しくは、疎水性二官能性スペーサーであることができる。ある態様において、スペーサーとアシル基、又は、アルキル基の総計の長さは約１４から約２８原子である。
【００９４】
さらに例示的な実施形態において、グルカゴン（配列番号１）の類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドは次の修飾、
（ａ）任意選択で、ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１でのアミノ酸修飾、
（ｂ）位置２９のアミノ酸のＣ末端側の約１から約２１アミノ酸の伸長で、その伸長部のアミノ酸の少なくとも１つがアシル化、又は、アルキル化されるもの、並びに、
（ｄ）さらに６個までのアミノ酸修飾をさらに含む、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３２９、又は、配列番号３３０のどれか１つに一致するアミノ酸配列を包含し、ＧＩＰ受容体活性化についてのその類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
【００９５】
いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１のアミノ酸がアラニンで置換されている、又は、欠質されている配列番号３２７〜３３０を含む。
【００９６】
いくつかの態様において、アシル化されるアミノ酸、又は、アルキル化されるアミノ酸は式Ｉ、ＩＩ、又は、ＩＩＩのアミノ酸である。より特定の実施形態において、式Ｉのアミノ酸はＤａｂ、オルニチン、リシン、又は、ホモリシンである。また、いくつかの実施形態において、約１から約２１のアミノ酸はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）のアミノ酸配列、又は、ＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号４）のアミノ酸配列でＸは任意のアミノ酸であるもの、又は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号５）のアミノ酸配列、又は、Ｘはグリシン、若しくは、小脂肪族の、若しくは、非極性の、若しくは、わずかに極性を有するアミノ酸であるＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号６）のアミノ酸配列、又は、ＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、約１から約２１のアミノ酸は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は、配列番号７に関して１つ以上の保存的な置換を含む配列を包含することができる。いくつかの実施形態において、アシル化、又は、アルキル化されるアミノ酸はＣ末端が伸長した類似体の位置３７、位置３８、位置３９、４０、４１、位置４２、又は、４３に位置する。ある実施形態において、アシル化、又は、アルキル化されるアミノ酸はＣ末端が伸長した類似体の位置４０に位置する。
【００９７】
上述した例示的実施形態のいずれかにおいて、ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１のアミノ酸はイミダゾール側鎖を欠くアミノ酸であり得る。例えば、位置１のアミノ酸は、大芳香族アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、大芳香族アミノ酸は、例えば、チロシンを含む本明細書に記載されるアミノ酸のいずれかである。
【００９８】
上述した例示的実施形態のＧＩＰアゴニストペプチドは、例えば、ＧＩＰ受容体、ＧＬＰ−１受容体、及び、グルカゴン受容体のいずれかにおいて活性を増大させ、若しくは、減少させ、可溶性を改善し、作用期間、若しくは、循環半減期を改善し、作用開始時期を遅らせ、又は、安定性を増大させる本明細書に記載される修飾のいずれかのような、さらに１〜６個のアミノ酸修飾をさらに含むことができる。
【００９９】
ある態様において、上述した例示的実施に記載されるＧＩＰアゴニストペプチドは位置２７、２８、及び、２９のうちの１つ、２つ、又は、全ての位置で更なるアミノ酸修飾を含む。これらの位置における修飾は、これらの位置に関して本明細書において記載される修飾のいずれかであり得る。例えば、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３２９、又は、配列番号３３０に関して、位置２７は大脂肪族アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、又は、ノルロイシン）若しくはメチオニンで置換されることができ、位置２８は別の小脂肪族アミノ酸（例えば、グリシン、又は、アラニン）若しくはアスパラギンで置換されることができ、そして／又は、位置２９は別の小脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、又は、グリシン）若しくはトレオニンで置換することができる。あるいは、類似体はそのようなアミノ酸修飾を位置２７、及び／又は、位置２８に含むことができる。
【０１００】
類似体は次のさらなる修飾の１つ以上をさらに含むことができる。
（ａ）位置２のアミノ酸はＤ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、アミノイソ酪酸，バリン、又は、α−アミノ−Ｎ−酪酸のいずれかで一つある。
（ｂ）位置１０のアミノ酸はチロシン、トリプトファン、リシン、オルニチン、グルタミン酸、フェニルアラニン、又は、バリンである。
（ｃ）位置１０のリシンへのアシル基の結合
（ｄ）１位置２のアミノ酸はイソロイシン、リシン、又は、アルギニンである。
（ｅ）位置１６のアミノ酸はセリン、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、トレオニン、グリシン、又は、アミノイソ酪酸のいずれか一つである。
（ｆ）位置１７のアミノ酸はグルタミン、又は、アルギニンである。
（ｇ）位置１８のアミノ酸はアラニン、アルギニ、セリン、トレオニン、又は、グリシンのいずれか一つである。
（ｈ）位置２０のアミノ酸はアラニン、セリン、トレオニン、リシン、シトルリン、アルギニン、オルニチン、又は、アミノイソ酪酸、又は、別のα，α−二置換アミノ酸のいずれか一つである。
（ｉ）位置２１のアミノ酸はグルタミン酸、アスパラギン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸のいずれか一つである。
（ｊ）位置２３のアミノ酸はバリン、又は、イソロイシンである。
（ｋ）位置２４のアミノ酸はグルタミン、アスパラギン、アラニン、セリン、トレオニン、又は、アミノイソ酪酸のいずれか一つである。並びに、
（ｌ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、及び、２９のいずれかでの一つ以上の保存的置換
【０１０１】
いくつかの実施形態におけるＧＩＰアゴニストペプチドは（ａ）から（ｌ）までの修飾の組合せを含む。あるいは、又は、加えて、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチドがグルカゴン受容体においてグルカゴン活性の１％未満の活性を持つような、配列番号１の位置３のアミノ酸修飾（例えば、グルタミンのグルタミン酸での置換）を含むことができる。あるいは、又は、加えて、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチドがＧＬＰ−１受容体においてＧＬＰ−１活性の１０％未満の活性を持つような、配列番号１の位置７におけるアミノ酸修飾（例えば、トレオニンのヒドロキシル基を欠くアミノ酸、例えば、Ａｂｕ、又は、イソロイシンによるアミノ酸置換）を含むことができる。
【０１０２】
例示的な実施形態に関して、類似体は親水性部分と共有結合で結合することができる。いくつかの実施形態において、類似体は、位置１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０、又は、Ｃ末端のアミノ酸のいずれかにおいて親水性部分と共有結合で結合することができる。ある実施形態において、類似体は位置２４で類似体に共有結合で結合する親水性部分を含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、親水性部分は前記類似体のリシン、システイン、オルニチン、ホモシステイン、又は、アセチルフェニルアラニンと共有結合で結合する。リシン、システイン、オルニチン、ホモシステイン、又は、アセチルフェニルアラニンは、配列表２の配列番号１、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、又は、配列番号２３０に本来備わるアミノ酸であり得る、又は、それは置換されたアミノ酸であり得る。親水性部分がシステインに結合するいくつかの実施形態において、前記結合は構造
【化５】
2013518115.tif 000006
【化６】
2013518115.tif 000007
【０１０４】
親水性部分を含むＧＩＰアゴニストペプチドに関して、親水性部分は本明細書に記載されるもののいずれかであり得る。例えば、「親水性部分の結合」節における教示を参照のこと。いくつかの実施形態において、親水性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ある実施形態におけるＰＥＧは約１，０００ダルトンから約４０，０００ダルトン、例えば、２０，０００ダルトンから４０，０００ダルトンの分子量を有する。
【０１０５】
例示的な実施形態に関して、ＧＩＰアゴニストペプチドは、アシル基、又は、アルキル基に側鎖が共有結合で結合するＣ末端伸長部内に修飾型アミノ酸を含むことができる。アシル化類似体、又は、アルキル化類似体は、「アシル化及びアルキル化」節において記載されるアシル化ペプチド、又は、アルキル化ペプチドと一致し得る。いくつかの実施形態において、アシル基は、例えば、炭素数１０の脂肪アシル基若しくはアルキル基、炭素数１２の脂肪アシル基若しくはアルキル基、炭素数１４の脂肪アシル基若しくはアルキル基、炭素数１６の脂肪アシル基若しくはアルキル基、炭素数１８の脂肪アシル基若しくはアルキル基、炭素数２０の脂肪アシル基若しくはアルキル基、又は、炭素数２２の脂肪アシル基若しくはアルキル基のような炭素数４から３０の脂肪アシル基である。アシル基、又は、アルキル基は、限定されないが、位置１０、又は、位置４０のアミノ酸、又は、Ｃ末端のアミノ酸を含む前記類似体の任意のアミノ酸に共有結合で結合され得る。いくつかの実施形態において、アシル基、又は、アルキル基は、式Ｉ、式ＩＩ、又は、式ＩＩＩのアミノ酸、例えば、リシン残基の側鎖に共有結合で結合する。アシル基、又は、アルキル基は配列番号１、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３２９、又は、配列番号３３０に本来備わるアミノ酸に共有結合で結合され、又は、アシル基、又は、アルキル基は置換されたアミノ酸に結合することができる。アシル基、又は、アルキル基は配列番号３、配列番号４、配列番号６、又は、配列番号７に本来備わるアミノ酸に共有結合で結合し、又は、アシル基、又は、アルキル基は置換されたアミノ酸に結合することができる。
【０１０６】
ＧＩＰアゴニストペプチドがアシル基、又は、アルキル基を含む上述の例示的な実施例において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、本明細書に記載されるように、スペーサーを介してアシル基、又は、アルキル基に結合することができる。例えば、前記スペーサーは、長さが３から１０原子であることができ、例えば、アミノ酸（例えば、６−アミノヘキサン酸、本明細書に記載される任意のアミノ酸）、ジペプチド（例えば、アラニン−アラニン、βアラニン−βアラニン、ロイシン−ロイシン、プロリン−プロリン、γグルタミン酸−γグルタミン酸）、トリペプチド、又は、親水性、若しくは、疎水性二官能性スペーサーであることができる。ある態様において、スペーサーとアシル基、又は、アルキル基の総計の長さは約１４から約２８原子である。
【０１０７】
いくつかの非常に特定の実施形態において、本開示のＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号１９９〜２４１、配列番号２４４〜２６４、配列番号２６６、配列番号２９２〜３０７、配列番号３０９〜３２１、及び、配列番号３２３からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は、配列番号２６７〜２６９、配列番号２７３〜２７８、及び、配列番号３２５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号１９９〜２４１、配列番号２４４〜２６４、配列番号２６６、配列番号２９２〜３０７、配列番号３０９〜３２１、及び、配列番号３２３のいずれかの、又は、配列番号２６７〜２６９、配列番号２７３〜２７８、及び、配列番号３２５のいずれかの位置１のアミノ酸がアラニンで置換されている、又は、欠質されている改変アミノ酸配列を含む。
【０１０８】
さらに、本開示のＧＩＰアゴニストペプチドの特定の例は、限定されないが、配列番号１０５〜１９４、配列番号１９９〜２４６、配列番号２４８〜２５０、及び、配列番号２５３〜２７８のいずれかを含む。
【０１０９】
さらに例示的な実施形態において、グルカゴン（配列番号１）の類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドは、アシル基、又は、アルキル基（例えば、天然のアミノ酸には本来備わらないアシル基、又は、アルキル基）を含み、アシル基、又は、アルキル基はスペーサーに結合し、（ｉ）スペーサーは類似体の位置１０のアミノ酸の側鎖に結合し、又は、（ｉｉ）類似体は位置２９のアミノ酸のＣ末端側に１から２１アミノ酸の伸長部を含み、そして、スペーサーは配列番号１について位置３７から４３の１つに相当するアミノ酸の側鎖に結合し、ＧＩＰ受容体活性化について類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
【０１１０】
そのような実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、（ｉ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１でのアミノ酸修飾、（ｉｉ）位置２７、２８、及び、２９のうちの１つ、２つ、又は、全てでのアミノ酸修飾、（ｉｉｉ）項目（Ａ）、（Ｂ）、及び、（Ｃ）のうちの少なくとも一つを有する配列番号１のアミノ酸配列を含むことができる。
（Ａ）前記類似体は位置ｉと位置ｉ＋４の位置にあるアミノ酸の側鎖の間に、若しくは、位置ｊと位置ｊ＋３の位置にあるアミノ酸の側鎖の間にラクタム架橋を含み、ｉは１２、１３、１６、１７、２０、若しくは、２４であり、ｊは１７であり、
（Ｂ）前記類似体の位置１６、２０、２１、及び、２４のアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つ、若しくは、全てのアミノ酸がα，α−二置換アミノ酸で置換される、又は、
（Ｃ）前記類似体は（ｉ）位置１６のセリンの式ＩＶのアミノ酸によるアミノ酸置換、
【化７】
2013518115.tif 000008
［式中、ｎは１から７であり、Ｒ１とＲ２の各々は互いに独立して水素、Ｃ１−Ｃ１８アルキル基、Ｃ１−Ｃ１８アルキルアルコール基、Ｃ１−Ｃ１８アルキルアミノ基、Ｃ１−Ｃ１８アルキルチオール基、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル基、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ２−Ｃ５ヘテロサイクリック）基、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ６−Ｃ１０アリル）Ｒ７基、及び、（Ｃ１−Ｃ４アルキル）（Ｃ３−Ｃ９ヘテロアリル）基からなる群より選択され、Ｒ７は水素又はヒドロキシル基であり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含む。］
及び、（ｉｉ）位置２０のグルタミンのα，α−二置換アミノ酸によるアミノ酸置換、及び、（ｉｉｉ）さらに６個までのアミノ酸修飾を含む。
【０１１１】
これらの実施形態のＧＩＰアゴニストペプチドのα，α−二置換アミノ酸は、限定されないが、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）、メチル基、エチル基、プロピル基、及び、ｎ−ブチル基から選択される同じ、若しくは、異なる基で二置換されるアミノ酸、又は、シクロオクタン基、若しくは、シクロヘプタン基で二置換されるアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）を含む任意のα，α−二置換アミノ酸であり得る。ある実施形態において、α，α−二置換アミノ酸はアミノイソ酪酸である。
【０１１２】
これらの実施形態のＧＩＰアゴニストペプチドの式ＩＶのアミノ酸は、例えば、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は、１６である式ＩＶのアミノ酸のような任意のアミノ酸であり得る。ある実施形態において、ｎは２、３、４、又は、５であり、その場合、前記アミノ酸は、それぞれ、Ｄａｂ、オルニチン、リシン、又は、ホモリシンである。
【０１１３】
上述の例示的な実施形態のいずれかにおいて、ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１でのアミノ酸修飾はイミダゾール側鎖を欠くアミノ酸によるヒスチジンの置換であり得る。例えば、位置１でのアミノ酸修飾は大芳香族アミノ酸によるヒスチジンの置換であり得る。いくつかの実施形態において、前記の大芳香族アミノ酸は、例えば、チロシンを含む本明細書に記載されるもののいずれかである。
【０１１４】
また、上述の例示的な実施形態に関して、位置２７、２８、及び、２９のうちの１つ、２つ、又は、全ての位置におけるアミノ酸修飾は本明細書において記載されるこれらの位置における修飾のいずれかであり得る。例えば、位置２７のメチオニンは大脂肪族アミノ酸により、任意選択で、ロイシンにより置換されることができ、位置２８のアスパラギンは小脂肪族アミノ酸で、任意選択で、アラニンで置換されることができ、そして／又は、位置２９のトレオニンは小脂肪族アミノ酸で、任意選択で、グリシンで置換することができる。あるいは、ＧＩＰアゴニストペプチドは位置２７、及び／又は、位置２８にそのようなアミノ酸修飾を含むことができる。
【０１１５】
上述の例示的な実施形態のＧＩＰアゴニストペプチドは、さらに１〜９個の、又は、１〜６個の付加的なアミノ酸修飾をさらに含むことができ、例えば、ＧＩＰ受容体、ＧＬＰ−１受容体、及び、グルカゴン受容体のいずれかにおいて活性を増大させ、若しくは、低下させ、可溶性を改善し、作用期間、若しくは、循環半減期を改善し、作用開始時期を遅らせ、又は、安定性を増大させる本明細書に記載される修飾のいずれかのような、例えば、さらに１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は、９個のアミノ酸修飾をさらに含むことができる。例えば、ＧＩＰアゴニストペプチドは位置１２でのアミノ酸修飾、任意選択で、イソロイシンによる置換、及び／又は、位置１７及び位置１８でのアミノ酸修飾、任意選択で、位置１７でのグルタミンによる置換及び位置１８でのアラニンによる置換、及び／又は、Ｃ末端へのＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）の付加、若しくは、ＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号４）の付加、若しくは、配列番号３若しくは配列番号４に関して１つ以上の保存的置換を含む配列の付加をさらに包含することができる。したがって、いくつかの態様において、グルカゴン（配列番号１）の類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドは次の修飾のうちの１つ以上を含む。
（ａ）Ｄ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、アミノイソ酪酸，バリン、又は、α−アミノ−Ｎ−酪酸で置換された位置２のセリン、
（ｂ）トリプトファン、リシン、オルニチン、グルタミン酸、フェニルアラニン、又は、バリンで置換された位置１０のチロシン、
（ｃ）位置１０のリシンへのアシル基の結合
（ｄ）アルギニンで置換された位置１２のリシン
（ｅ）グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、トレオニン、グリシン、リシン、又は、アミノイソ酪酸で置換された位置１６のセリン
（ｆ）グルタミンで置換された位置１７のアルギニン
（ｇ）アラニン、セリン、トレオニン、又は、グリシンで置換された位置１８のアルギニン
（ｈ）アラニン、セリン、トレオニン、リシン、シトルリン、アルギニン、オルニチン、又は、アミノイソ酪酸で置換された位置２０のグルタミン
（ｉ）グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換された位置２１のアスパラギン酸
（ｊ）イソロイシンで置換された位置２３のバリン
（ｋ）アスパラギン、アラニン、セリン、トレオニン、又は、アミノイソ酪酸で置換された位置２４のグルタミン、並びに、
（ｌ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、及び、２９のいずれかでの保存的置換
【０１１６】
いくつかの実施形態におけるＧＩＰアゴニストペプチドは（ａ）から（ｌ）までの修飾の組合せを含む。あるいは、又は、加えて、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチドがグルカゴン受容体におけるグルカゴンの活性の１％未満の活性を有するような配列番号１の位置３でのアミノ酸修飾（例えば、グルタミン酸によるグルタミンのアミノ酸置換）を含むことができる。あるいは、又は、加えて、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチドがＧＬＰ−１受容体におけるＧＬＰ−１の活性の１０％未満を有するような配列番号１の７番でのアミノ酸修飾（例えば、Ａｂｕ、又は、イソロイシンによるトレオニンのアミノ酸置換）、位置２７、若しくは、位置２８の位置におけるアミノ酸のＣ末端側にあるアミノ酸の欠質を含むことができ、欠質により２７アミノ酸のペプチド、若しくは、２８アミノ酸のペプチド、若しくは、それらの組合せが生じる。
【０１１７】
例示的な実施形態に関して、ＧＩＰアゴニストペプチドは親水性部分に共有結合で結合することができる。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０、又は、Ｃ末端のアミノ酸のいずれかにおいて親水性部分に共有結合で結合する。ある実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＣ末端伸長部（例えば、配列番号３のアミノ酸配列）、及び、親水性部分が位置４０においてＧＩＰアゴニストペプチドに共有結合で結合するように親水性部分を含むアミノ酸の付加を包含する。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、親水性部分はＧＩＰアゴニストペプチドのリシン、システイン、オルニチン、ホモシステイン、又は、アセチルフェニルアラニンに共有結合で結合する。リシン、システイン、オルニチン、ホモシステイン、又は、アセチルフェニルアラニンはグルカゴン配列（配列番号１）に本来備わっているアミノ酸であり得る、又は、配列番号１の本来のアミノ酸を置換するアミノ酸であり得る。親水性部分がシステインに結合するいくつかの実施形態において、親水性部分への結合は次の構造、
【化８】
2013518115.tif 000009
【化９】
2013518115.tif 000010
【０１１９】
親水性部分を含むＧＩＰアゴニストペプチドに関して、親水性部分は本明細書に記載されるもののいずれかであり得る。例えば、「親水性部分の結合」節内の教示を参照のこと。いくつかの実施形態において、親水性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ある実施形態におけるＰＥＧは約１，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの、例えば、約２０，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
【０１２０】
ＧＩＰアゴニストペプチドが、スペーサーを介して前記類似体に結合するアシル基、又は、アルキル基を含む例示的な実施形態において、スペーサーは本明細書に記載される任意のスペーサーであり得る。例えば、前記スペーサーは、その長さが３から１０原子であることができ、例えば、アミノ酸（例えば、６−アミノヘキサン酸、本明細書に記載される任意のアミノ酸）、ジペプチド（例えば、アラニン−アラニン、βアラニン−βアラニン、ロイシン−ロイシン、プロリン−プロリン、γグルタミン酸−γグルタミン酸）、トリペプチド、又は、親水性、若しくは、疎水性二官能性スペーサーであることができる。ある態様において、スペーサーとアシル基、又は、アルキル基の総計の長さは約１４から約２８原子である。
【０１２１】
アシル基、又は、アルキル基は、天然のアミノ酸に本来は備わっていないアシル基、又は、アルキル基のような本明細書に記載される任意のアシル基、又は、アルキル基である。いくつかの実施形態におけるアシル基、若しくは、アルキル基は、例えば、炭素数１０の脂肪アシル基若しくはアルキル基、炭素数１２の脂肪アシル基若しくはアルキル基、炭素数１４の脂肪アシル基若しくはアルキル基、炭素数１６の脂肪アシル基若しくはアルキル基、炭素数１８の脂肪アシル基若しくはアルキル基、炭素数２０の脂肪アシル基若しくはアルキル基、又は、炭素数２２の脂肪アシル基若しくはアルキル基のような炭素数４から３０の脂肪アシル基、又は、炭素数４から３０のアルキル基である。特定の実施形態において、アシル基は炭素数１２から１８の脂肪アシル基（例えば、炭素数１４の脂肪アシル基、又は、炭素数１６の脂肪アシル基）である。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置２９のアミノ酸のＣ末端側にある約１から約２１のアミノ酸の伸長部はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）のアミノ酸配列、又は、ＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号４）のアミノ酸配列でＸは任意のアミノ酸であるもの、又は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号５）のアミノ酸配列、又は、Ｘはグリシン、若しくは、小脂肪族の、若しくは、非極性の、若しくは、わずかに極性を有するアミノ酸であるＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号６）のアミノ酸配列、又は、ＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、約１から約２１のアミノ酸は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は、配列番号７に関して１つ以上の保存的な置換を含む配列を包含することができる。いくつかの実施形態において、アシル化、又は、アルキル化されるアミノ酸はＣ末端が伸長したＧＩＰアゴニストペプチドの位置３７、３８、３９、４０、４１、４２、又は、４３の位置に位置する。ある実施形態において、アシル化、又は、アルキル化されるアミノ酸はＣ末端が伸長したＧＩＰアゴニストペプチドの位置４０に位置する。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、グルカゴン（配列番号１）の類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドは、アミノ酸配列、例えば、配列番号１０５〜１９４のいずれかのアミノ酸配列で、任意選択で、ＧＩＰアゴニスト活性を保持するさらに１個、２個、３個、４個、又は、５個の修飾を有するアミノ酸配列を含むペプチドである。ある実施形態において、グルカゴン（配列番号１）の類似体であり、ＧＩＰアゴニスト活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号１９９〜３６２のいずれかのアミノ酸を含む。いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１のアミノ酸がアラニンで置換されている、又は、欠質されている配列番号１９９〜３６２の修飾型アミノ酸配列を含む。
【０１２４】
本開示のいくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸修飾（任意選択で、１５個までのアミノ酸修飾）を有する配列番号１のアミノ酸配列とＧＩＰアゴニストペプチドの位置２９のアミノ酸のＣ末端側に１から２１アミノ酸の伸長部を含む。ある態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸修飾を含み、そして、１５個までのアミノ酸修飾を（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個のアミノ酸修飾、１０個までのアミノ酸修飾）を含む。ある実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、１０個までのアミノ酸修飾において少なくとも１個のアミノ酸修飾を含み、そして、付加的な保存的アミノ酸修飾を含む。保存的なアミノ酸修飾は本明細書に記載される。
【０１２５】
いくつかの態様において、少なくとも１つのアミノ酸修飾によりＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端部分にあるαヘリックス構造が安定化される。安定化されたαヘリックス構造を達成する修飾は本明細書に記載される。例えば、「αヘリックスの安定化」という題名の節内の教示を参照のこと。いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチドの二つのアミノ酸の側鎖の間に分子内架橋（例えば、共有結合による分子内架橋、非共有結合による分子内架橋）を含む。ある態様において、分子内架橋は位置ｉと位置ｉ＋４のアミノ酸の側鎖を連結し、ｉは１２、１３、１６、１７、２０、又は、２４である。別の態様において、分子内架橋は位置ｊと位置ｊ＋３のアミノ酸の側鎖を連結し、ｊは１７である。又は、分子内架橋は位置ｋと位置ｋ＋７のアミノ酸の側鎖を連結し、ｋは１２と２２の間の任意の整数である。ある実施形態において、分子内架橋は共有結合による分子内架橋、例えば、ラクタム架橋である。特定の態様において、ラクタム架橋は位置１６と位置２０のアミノ酸の側鎖を連結する。特定の態様において、位置１６と位置２０のアミノ酸のうちの一つは正に荷電したアミノ酸であり、他方は負に荷電したアミノ酸である。例えば、ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１６のグルタミン酸と位置２０のリシンの側鎖を連結するラクタム架橋を含むことができる。別の態様において、負に荷電したアミノ酸と正に荷電したアミノ酸は塩橋を形成する。この例において、分子内架橋は非共有結合による分子内架橋である。
【０１２６】
特定の態様において、αヘリックスを安定化するアミノ酸修飾は配列番号１のアミノ酸のα，α−二置換アミノ酸での挿入、又は、置換である。αヘリックスの安定化の目的に適切なα，α−二置換アミノ酸は本明細書に記載され、例えば、アミノイソ酪酸を含む。いくつかの態様において、配列番号１の位置１６、２０、２１、及び、２４のアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つ、又は、それ以上のアミノ酸がα，α−二置換アミノ酸、例えば、アミノイソ酪酸で置換される。特定の実施形態において、位置１６のアミノ酸はアミノイソ酪酸である。
【０１２７】
いくつかの態様におけるＧＩＰアゴニストペプチドは、本明細書に記載される修飾のいずれかのような付加的な修飾を含む。例えば、前記のアミノ酸修飾はＧＬＰ−１受容体における活性を増大させ、若しくは、低下させることができ、又は、グルカゴン受容体における活性を低下させることができる。前記のアミノ酸修飾はペプチドの安定性を増大させることができ、例えば、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼによる分解に対する抵抗性を増大させ、位置１５と位置１６のアミノ酸間の結合を安定化することができる。前記のアミノ酸修飾はペプチドの可溶性を高めることができ、及び／又は、ＧＩＰ受容体、グルカゴン受容体、及び、ＧＬＰ−１受容体のいずれかにおけるＧＩＰアゴニストペプチドの作用時間を変化させることができる。これらのタイプの修飾のいずれの組合せもＧＩＰ受容体においてアゴニスト活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドに存在し得る。
【０１２８】
したがって、いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１７にグルタミン、位置１８にアラニン、位置２１にグルタミン酸、位置２３にイソロイシン、及び、位置２４の位置にアラニン、アスパラギン、若しくは、システイン、又は、それらの保存的アミノ酸置換のうちの１つ以上を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、Ｃ末端αカルボン酸の位置にＣ末端アミドを含む。ある実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１、位置２、又は、位置１と位置２にアミノ酸置換を含み、その置換によりＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ抵抗性が達成される。適切なアミノ酸置換は本明細書に記載される。例えば、位置１のＤＭＩＡ、及び／又は、位置２のｄ−セリン、又は、アミノイソ酪酸。
【０１２９】
加えて、又は、あるいは、ＧＩＰアゴニストペプチドは、（ａ）アラニンで置換された位置２のセリン、（ｂ）グルタミン酸、又は、グルタミンＧＩＰアゴニストペプチドで置換された位置３のグルタミン、（ｃ）イソロイシンで置換された位置７のトレオニン、（ｄ）トリプトファン、又は、天然のアミノ酸には本来備わっていないアシル基、若しくは、アルキル基を含むアミノ酸で置換された位置１０のチロシン、（ｅ）イソロイシンで置換された位置１２のリシン、（ｆ）グルタミン酸で置換された位置１５のアスパラギン酸、（ｇ）グルタミン酸で置換された位置１６のセリン、（ｈ）セリン、トレオニン、アラニン、アミノイソ酪酸で置換された位置２０のグルタミン、（ｉ）セリン、トレオニン、アラニンン、アミノイソ酪酸で置換された位置２４のグルタミン、（ｊ）ロイシン、又は、ノルロイシンで置換された位置２７のメチオニン、（ｋ）荷電アミノ酸、任意選択で、アスパラギン酸、又は、グルタミン酸で置換された位置２９のアスパラギン、及び、（ｌ）グリシン、又は、荷電アミノ酸、任意選択で、アスパラギン酸、若しくは、グルタミン酸で置換された位置２９のトレオニンのうちの１つ、又は、１つの組合せを含むことができる。
【０１３０】
例示的な態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは少なくとも１個のアミノ酸修飾（任意選択で、１５個までのアミノ酸修飾）を有する配列番号１のアミノ酸配列、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置２９のアミノ酸のＣ末端側に位置する１から２１アミノ酸の伸長部、及び、ＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１のアミノ酸修飾を含む。別の例示的な態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰアゴニスト活性を与える位置１でのアミノ酸修飾を含まない。いくつかの態様において、位置１のアミノ酸は大芳香族アミノ酸、例えば、チロシンではない。いくつかの実施形態において、位置１のアミノ酸はイミダゾール環を含むアミノ酸、例えば、ヒスチジン、ヒスチジン類似体である。ある実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、米国特許６１／１５１，３４９で開示された化合物のいずれでもない。ある態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号１０５７〜１０６９のいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号４０２〜１０５６のいずれかのグルカゴンベースの配列のいずれかの修飾されたアミノ酸配列を含む。そのグルカゴンベースの配列おいて、基準のアミノ酸配列は、以下を（もしすでに有していなければ）有するように修飾される：（ｉ）ペプチドのＣ末端部分（例えばアミノ酸１２〜２９）にある、例えば、本明細書に記載される分子内架橋（例えば、ラクタム架橋、塩橋）を介して安定化された、又は、例えば、ペプチドの位置１６、２０、位２、２４の位置における１つ以上のα，α−二置換アミノ酸、例えば、アミノイソ酪酸の組み込みより安定化されたαヘリックス、（ｉｉ）位置２７のロイシン、位置２８のアラニン、位置２９のグリシン、又は、それらの保存的アミノ酸置換、（ｉｉｉ）位置１２のイソロイシン、又は、その保存的アミノ酸置換、及び、任意選択で（ｉｖ）例えば、大芳香族アミノ酸、例えば、チロシンで置換される位置１のヒスチジンのような、本明細書に記載されるようにＧＩＰ活性を与える位置１でのアミノ酸修飾。いくつかの態様において、α，α−二置換アミノ酸は位置２０の位置にあり、位置１６の位置は正に荷電したアミノ酸、例えば、式ＩＶのアミノ酸、例えば、リシンである。
【０１３１】
１〜２１アミノ酸（例えば、５〜１９のアミノ酸、７〜１５のアミノ酸、９〜１２のアミノ酸）の伸長部を含むＧＩＰアゴニストペプチドに関して、ＧＩＰアゴニストペプチドの伸長部は、伸長部が１から２１のアミノ酸であるという条件で、任意のアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、伸長部は７から１５アミノ酸であり、別の態様において、伸長部は９から１２アミノ酸である。いくつかの実施形態において、伸長部は（ｉ）配列番号４２６、若しくは、配列番号１０７４のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号４２６、若しくは、配列番号１０７４のアミノ酸配列と高い配列同一性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）を有するアミノ酸配列、又は、（ｉｉｉ）１つ以上の保存的アミノ酸修飾を有する（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、前記伸長部の少なくとも１つのアミノ酸はアシル化される、又は、アルキル化される。アシル基、又は、アルキル基を含むアミノ酸はＧＩＰアゴニストペプチドの伸長部の任意の位置に位置することができる。ある実施形態において、アシル化、又は、アルキル化される伸長部のアミノ酸はＧＩＰアゴニストペプチドの（配列番号１の番号付けに従って）位置３７、３８、３９、４０、４１、又は、４２の１つに位置する。ある実施形態において、アシル化、又は、アルキル化されるアミノ酸はＧＩＰアゴニストペプチドの位置４０に位置する。
【０１３３】
例示的な実施形態において、アシル基、又は、アルキル基は天然のアミノ酸には本来備わっていないアシル基、又は、アルキル基である。例えば、アシル基、又は、アルキル基は炭素数４から３０の（例えば、炭素数１２から１８の）脂肪アシル基、又は、炭素数４から３０の（例えば、炭素数１２から１８の）アルキル基であり得る。アシル基、又は、アルキル基は本明細書に記載されるもののいずれかであり得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、アシル基、又は、アルキル基は直接アミノ酸に、例えば、アミノ酸の側鎖を介して結合する。別の実施形態において、アシル基、又は、アルキル基はアミノ酸にスペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、疎水性二官能性スペーサー）を介して結合する。ある態様において、スペーサーは長さが３から１０原子である。いくつかの実施形態において、スペーサーは６−アミノヘキサン酸、アラニン、プロリン、ロイシン、βアラニン、γグルタミン酸のうちの１つ、又は、２つを含むアミノ酸、又は、ジペプチド（例えば、γグルタミン酸−γグルタミン酸）である。特定の態様において、前記スペーサーの全長は１４から２８原子である。
【０１３５】
また、例示的な実施形態において、アシル基、又は、アルキル基が結合するアミノ酸は、例えば、式Ｉ、式ＩＩ、又は、式ＩＩＩのアミノ酸を含む、本明細書に記載されるアミノ酸のいずれかであり得る。アシル化、又は、アルキル化されるアミノ酸は、例えば、リシンであり得る。アシル基、又は、アルキル基を含む適切なアミノ酸、並びに、適切なアシル基、アルキル基、及び、スペーサーは本明細書に記載される。例えば、「アシル化とアルキル化」節内の教示を参照のこと。
【０１３６】
別の実施形態において、前記伸長部の１〜６アミノ酸（例えば、１〜２アミノ酸、１〜３アミノ酸、１〜４アミノ酸、１〜５アミノ酸）は正に荷電したアミノ酸、例えば、アルギニン、例えば、リシン、Ｄ−リシンのような式ＩＶのアミノ酸である。本明細書では、「正に荷電したアミノ酸」という用語は、生理的なｐＨでその側鎖の原子上に正電荷を含む天然の、又は、非天然の任意のアミノ酸を意味する。ある態様において、正に荷電したアミノ酸は位置３７、３８、３９、４０、４１、４２、及び、４３のいずれかに位置する。特定の実施形態において、正に荷電したアミノ酸は位置４０に位置する。
【０１３７】
別の実施形態において、前記伸長部の１〜６アミノ酸（例えば、１〜２アミノ酸、１〜３アミノ酸、１〜４アミノ酸、１〜５アミノ酸）は負に荷電したアミノ酸、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸である。本明細書では、「負に荷電したアミノ酸」という用語は、生理的なｐＨでその側鎖の原子上に負電荷を含む天然の、又は、非天然の任意のアミノ酸を意味する。ある態様において、負に荷電したアミノ酸は位置３７、３８、３９、４０、４１、４２、及び、４３のいずれかに位置する。特定の実施形態において、負に荷電したアミノ酸は位置４０に位置する。
【０１３８】
別の例において、前記伸長部は本明細書に記載されるようにアシル化、又は、アルキル化され、本明細書に記載される１〜６の正に荷電したアミノ酸を含む。
【０１３９】
さらに別の実施形態において、ＧＩＰ受容体においてアゴニスト活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドは、（ｉ）少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する配列番号１、（ｉｉ）ＧＩＰアゴニストペプチドの位置２９のアミノ酸のＣ末端側にある１から２１アミノ酸（例えば、５から１８アミノ酸、７から１５アミノ酸、９から１２アミノ酸）の伸長部、及び、（ｉｉｉ）Ｃ末端伸長部の外側に位置する（例えば、１〜位置２９のいずれかに位置する）天然のアミノ酸には本来備わっていないアシル基、又は、アルキル基を含むアミノ酸を包含する。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１０にアシル化アミノ酸、又は、アルキル化アミノ酸を含む。特定の態様において、アシル基、又は、アルキル基は炭素数４から３０の脂肪アシル基、又は、炭素数４から３０のアルキル基である。いくつかの実施形態において、アシル基、又は、アルキル基はスペーサー、例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、疎水性二官能性スペーサーを介して結合する。ある態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１６のグルタミン酸と位置２０のリシンの間の塩橋、又は、位置１６、２０、２１、及び、２４のうちの１つ、２つ、３つ、又は、それ以上の位置におけるα，α−二置換アミノ酸のような、αヘリックスを安定化するアミノ酸修飾を含む。特定の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ抵抗性を与えるアミノ酸修飾、例えば、位置１でＤＭＩＡ、位置２でアミノイソ酪酸をさらに含む。さらにアミノ酸修飾を含むＧＩＰアゴニストペプチドが本明細書において考慮される。
【０１４０】
ある実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドが親水性部分、例えば、ＰＥＧを欠くとき、ＧＩＰ受容体活性を有するＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰ受容体において天然ＧＩＰの活性の少なくとも０．１％（例えば、少なくとも、０．５％、１％、２％、５％、１０％、１５％、又は、２０％）の活性を示す。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰ受容体において然ＧＩＰの活性の１０％超（例えば、２０％超、５０％超、７５％超、１００％超、２００％超、３００％超、５００％超）の活性を示す。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＬＰ−１受容体、及び、グルカゴン受容体のうちの１つ、又は、両方においてかなりのアゴニスト活性を示す。いくつかの態様において、これらの受容体（ＧＩＰ受容体、及び、ＧＬＰ−１受容体、及び／又は、グルカゴン受容体）への効力、及び／又は、選択性は１０００倍以内、７５０倍以内、５００倍以内、２５０倍以内、１００倍以内（高い、又は、低い）である。例えば、ＧＩＰ受容体活性を持つＧＩＰアゴニストペプチドのＧＬＰ−１受容体についての選択性は、ＧＩＰ受容体、及び／又は、グルカゴン受容体への選択性の１０００倍未満、５００倍未満、１００倍未満、５０倍以内、２５倍以内、１５倍以内、１０倍以内（高い、又は、低い）であり得る。
【０１４１】
先述したことに従って、いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは天然グルカゴン（配列番号１）の類似体であり、そのペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に記載される安定化されたαヘリックス（例えば、ラクタム架橋、又は、α，α−二置換アミノ酸）、位置２７〜２９としてロイシン−アラニン−グリシン、位置１２にイソロイシン、ペプチドにＧＩＰ活性を与える位置１でのアミノ酸、又は、ＧＩＰ活性を低下させるアミノ酸を有する配列番号１である。先述したことに従って、いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは天然グルカゴン（配列番号１）の類似体であり、ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に記載される位置１６に式ＩＶのアミノ酸、位置２０にα，α−二置換アミノ酸（例えば、アミノイソ酪酸）、位置２７〜２９にロイシン−アラニン−グリシン、位置１２にイソロイシン、ペプチドにＧＩＰ活性を与える位置１でのアミノ酸、又は、ＧＩＰ活性を低下させるアミノ酸を有する配列番号１である。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは位置１にＧＩＰ受容体における活性を低下させる修飾を含む。ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰ受容体での活性レベル（例えば、ＧＩＰ受容体でのＥＣ５０、又は、効力）が前記ペプチドの組合せのグルカゴンアンタゴニストのＩＣ５０の約５０倍以内、約４０倍以内、約３０倍以内、約２０倍以内、約１０倍以内、又は、約５倍以内であるようにそのようなアミノ酸修飾を含むことができる。ある態様において、ＧＩＰアゴニスト活性を低下させるアミノ酸修飾は位置１のヒスチジンの小脂肪族アミノ酸、例えば、アラニン、グリシンによる置換である。いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニスト活性を低下させるアミノ酸修飾は位置１のアミノ酸の欠質、又は、位置１と位置２のアミノ酸の欠質である。特定の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは配列表２に記載されるチロシンが位置１にあるアミノ酸配列のいずれかの、チロシンの代わりに位置１に小脂肪族残基を含む、又は、これらのアミノ酸配列の位置１、若しくは、位置１と位置２のアミノ酸を欠く類似体である。
【０１４３】
「ＧＩＰアゴニストペプチドの例示的実施例」という表題の上述した節と「グルカゴンアンタゴニストペプチドの付加的な修飾」という表題の節において引用されるアミノ酸修飾をさらに説明するために、「グルカゴンアンタゴニストペプチドの活性」という表題の節に先行する次の段落が提供される。
【０１４４】
ＧＩＰ活性に影響をあたえる修飾
正常な環境下で、天然のヒトグルカゴンは人体においてＧＩＰ受容体を活性化しない。ＧＩＰ受容体においてかなりの活性を示すようにこのホルモンを変化させる天然のヒトグルカゴンのアミノ酸配列の修飾が本明細書に記載される。
【０１４５】
特定の態様において、（天然のグルカゴンと比較して）ＧＩＰ受容体において増強された活性を示す本開示のＧＩＰアゴニストペプチドは位置１にアミノ酸修飾を含む。例えば、天然のグルカゴンの位置１のヒスチジンは、ＧＩＰアゴニストペプチドにおいて、大芳香族アミノ酸、任意選択で、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アミノフェニルアラニン、ニトロフェニルアラニン、クロロフェニルアラニン、スルホフェニルアラニン、４−ピリジルアラニン、メチルチロシン、又は、３−アミノチロシンで置換される。
【０１４６】
別の実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰ受容体における活性を低下させる位置１での修飾を含む。ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰ受容体での活性レベル（例えば、ＧＩＰ受容体でのＥＣ５０、又は、効力）が前記のペプチドの組合せのグルカゴンアンタゴニストのＩＣ５０の約５０倍以内、約４０倍以内、約３０倍以内、約２０倍以内、約１０倍以内、又は、約５倍以内であるように、そのようなアミノ酸修飾を含むことができる。ある態様において、ＧＩＰアゴニスト活性を低下させるアミノ酸修飾は位置１のヒスチジンの小脂肪族アミノ酸、例えば、アラニン、グリシンによる置換である。いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニスト活性を低下させるアミノ酸修飾は位置１のアミノ酸の欠質、又は、位置１と位置２のアミノ酸の欠質である。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、（天然のグルカゴンと比較して）ＧＩＰ受容体において増強された活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドは位置２７、２８、及び、２９のうちの１つ、又は、すべてにおいてアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、（ｉ）天然グルカゴンのアミノ酸配列の位置２７のメチオニンが大脂肪族アミノ酸、任意選択で、ロイシンで置換され、（ｉｉ）天然グルカゴンのアミノ酸配列の位置２８のアスパラギンが小脂肪族アミノ酸、任意選択で、アラニンで置換され、（ｉｉｉ）天然グルカゴンのアミノ酸配列の位置２９のトレオニンが小脂肪族アミノ酸、任意選択で、グリシンで置換される天然グルカゴンの、又は、（ｉ）と（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の任意の組合せである天然のグルカゴンのアミノ酸配列を含む。位置２７〜２９でのロイシン−アラニン−グリシンによる置換はこれらの位置における天然のヒトグルカゴンのメチオニン−アスパラギン−トレオニン配列と比較して増大したＧＩＰ活性を提供する。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、（天然のグルカゴンと比較して）ＧＩＰ受容体において増強された活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドは位置１２にアミノ酸修飾を含む。例えば、いくつかの態様において、天然のグルカゴンアミノ酸配列の位置１２のアミノ酸は大脂肪族の非極性アミノ酸、任意選択で、イソロイシンで置換される。
【０１４９】
ある態様において、（天然のグルカゴンと比較して）ＧＩＰ受容体において増強された活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドは位置１７、及び／又は、位置１８にアミノ酸修飾を含む。例えば、位置１７は極性残基、任意選択で、グルタミンで置換され、位置１８は小脂肪族アミノ酸、任意選択で、アラニンで置換される。位置１７と位置１８でのグルタミン−アラニンによる置換はそれらの位置における天然のアルギニン−アルギニン配列と比較して増大したＧＩＰ活性を提供する。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、（天然のグルカゴンと比較して）ＧＩＰ受容体において増大した活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドは位置１２から位置２９のうちの任意の位置にある２つのアミノ酸の側鎖間に分子内架橋を含む。いくつかの態様において、分子内架橋は、ヒトグルカゴンの天然のアミノ酸配列に存在しない２つのアミノ酸の間に形成される。従って、いくつかの態様におけるＧＩＰアゴニストペプチドはアミノ酸修飾、例えば、架橋形成を可能にする天然のヒトグルカゴン配列のアミノ酸置換を含む。例えば、いくつかの態様において、分子内架橋は位置ｉと位置ｉ＋４にある２つのアミノ酸の側鎖間の、又は、位置ｊと位置ｊ＋３の間の、又は、位置ｋと位置ｋ＋７の間の共有結合により形成される。例示的な実施形態において、前記架橋は位置１２と位置１６の間、位置１６と位置２０の間、位置２０と位置２４の間、位置２４と位置２８の間、又は、位置１７と位置２０の間にある。別の実施形態において、塩橋のような非共有結合による相互作用がこれらの位置にある正に荷電したアミノ酸と負に荷電したアミノ酸の間に形成され得る。グルカゴンベースのペプチドのＣ末端領域内の分子内架橋はさらに本明細書において記載される。「αヘリックス構造の安定化」を参照のこと。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、グルカゴンペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９の辺り）内のαヘリックス構造の安定化は、望みの活性を保持する位置での１つ以上のα，α−二置換アミノ酸の目的のある導入により達成される。いくつかの実施形態において、グルカゴンペプチド、又は、その類似体の位置１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、又は、２９の１つ、２つ、３つ、４つ、又は、それ以上の位置がα，α−二置換アミノ酸で置換される。例えば、グルカゴンペプチド、又は、その類似体の位置１６のアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）による置換は塩橋、又は、ラクタムの不在下にαヘリックスの安定化をもたらす。そのようなペプチドは、本明細書において分子内架橋を欠くペプチドとみなされる。特定の態様において、αヘリックスの安定化は、共有結合による分子内架橋、例えば、ラクタム架橋、ジスルフィド架橋を導入せず、１つ以上のα，α−二置換アミノ酸を導入することにより達成される。そのようなペプチドは本明細書において共有結合による分子内架橋を欠くペプチドとみなされる。いくつかの実施形態において、位置１６、２０、２１、又は、２４の１つ、２つ、３つ、又は、それ以上の位置がアミノイソ酪酸で置換される。このタイプのアミノ酸置換のさらなる考察が本明細書において提供される。「αヘリックス構造の安定化」を参照のこと。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは位置２９のアミノ酸のＣ末端側にある１〜２１アミノ酸の伸長部を含む。いくつかの態様における伸長部は、例えば、配列番号３、又は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。前記伸長部が配列番号４を含むいくつかの態様において、Ｘａａは小脂肪族残基、例えば、グリシンである。いくつかの態様において、前記伸長部は１〜６つの荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、前記の１〜６つのアミノ酸は負に荷電したアミノ酸、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸である。いくつかの実施形態において、前記の１〜６つのアミノ酸は正に荷電したアミノ酸、例えば、アルギニン、式ＩＶのアミノ酸（例えば、Ｄａｂ、オルニチン、リシン、ｄ−リシン、ホモリシン）である。荷電アミノ酸は位置３７、３８、３９、４０、４１、４２、及び、４３のいずれかに位置することができる。いくつかの態様において、荷電アミノ酸は位置４０に位置する。さらなる態様において、荷電アミノ酸は、本明細書において、「アシル化とアルキル化」において記載されるアシル基、又は、アルキル基で修飾される。いくつかの態様において、前記伸長部は位置４０にリシンを含まない。
【０１５３】
ＧＩＰ受容体活性の増強をもたらす上述した修飾のいずれも、別々に、又は、組み合わせて応用され得る。ＧＩＰ受容体活性を増大させる修飾の組合せは一般に、そのような修飾のいずれかが単独で取られた場合よりも高いＧＩＰ活性を提供する。
【０１５４】
グルカゴン活性に影響を与える修飾
本開示のいくつかの態様において、天然のヒトグルカゴンの類似体であるＧＩＰアゴニストペプチドはグルカゴン受容体活性を選択的に低下させるアミノ酸修飾を含む。特定の実施形態において、グルカゴン受容体活性を低下させる修飾は位置３にあるアミノ酸の修飾、例えば、位置３にある天然のグルタミンの酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、又は、疎水性アミノ酸による置換である。例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは位置３にあるアミノ酸がグルタミン酸、オルニチン、又は、ノルロイシンで置換される天然のヒトグルカゴンアミノ酸配列を含む。そのような修飾がグルカゴン受容体活性を実質的に低下させる、又は、失わせることが見出されている。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、そのような３番のアミノ酸置換は、最終的にグルカゴン受容体における活性が低下するように、又は、失われるように、グルカゴン受容体活性を増強するその他の任意のアミノ酸修飾に対して優勢となる。
【０１５５】
ＧＬＰ−１活性に影響を与える修飾
正常な環境下では、天然のヒトグルカゴンは人体においてＧＬＰ−１受容体を活性化しない。ＧＬＰ−１受容体においてかなりの活性を示すようにこのホルモンを変化させる天然のヒトグルカゴンのアミノ酸配列の修飾が本明細書に記載される。
【０１５６】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示のＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰ受容体とＧＬＰ−１受容体の両方において（これらの受容体での天然グルカゴンの活性と比較して）増強された活性を示す。この点で、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰ／ＧＬＰ−１共アゴニストペプチドとみなすことができる。いくつかの実施形態においてＧＬＰ−１受容体での増強された活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドはＣ末端アミノ酸のαカルボン酸の代わりにアミド、又は、エステルのような電荷中性基を含む。したがって、いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＣ末端アミド化を含む、又は、Ｃ末端残基のαカルボン酸の代わりにＣ末端アミドを含む。
【０１５７】
いくつかの態様において、ＧＬＰ−１受容体において増強された活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドは、本明細書においてさらに記載されるように、例えば、２つのアミノ酸の側鎖の間にある分子間架橋の形成、又は、位置１２〜２９の周りのアミノ酸のαヘリックス安定化アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）による置換、及び／又は、挿入を通して安定化されたαヘリックス構造をグルカゴンのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９の辺り）に含む。例示的な実施例において、位置１２と位置１６のアミノ酸対、位置１３と位置１７のアミノ酸対、位置１６と位置２０のアミノ酸対、位置１７と位置２１のアミノ酸対、位置２０と位置２４のアミノ酸対、又は、位置２４と位置２８のアミノ酸対（ｉ＝１２、１６、２０、又は、２４のアミノ酸対）の側鎖が互いに結合し、そうしてグルカゴンのαヘリックスを安定化する。いくつかの実施形態において、特に架橋、又は、リンカーは、特に架橋が位置ｉと位置ｉ＋４の間にあるとき、約８（又は、約７〜９）原子の長さである。いくつかの実施形態において、架橋、又は、リンカーは、特に架橋が位置ｊと位置ｊ＋３の間にあるとき、約６（又は、約５〜７）原子の長さである。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、分子内架橋は、（ａ）位置１６の天然のセリンをグルタミン酸で、又は、４原子の長さを有する側鎖を持つ負に荷電した別のアミノ酸で、又は、代わりにグルタミン、ホモグルタミン酸、若しくは、ホモシステイン酸のいずれか一つ、若しくは、少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、窒素、酸素、硫黄、リン）を含む側鎖を持ち、側鎖の長さが約４（又は、３〜５）原子の荷電アミノ酸で置換すること、及び、（ｂ）位置２０の天然のグルタミンを荷電しているか、若しくは、水素結合する能力を有するかのどちらかであり、少なくとも約５（又は、約４〜６）原子の長さである側鎖を持つ別の親水性アミノ酸、例えば、リシン、シトルリン、アルギニン、若しくは、オルニチンで置換することによって形成される。位置１６及び位置２０の位置にあるそのようなアミノ酸の側鎖は塩橋を形成することができる、又は、共有結合で結合することができる。いくつかの実施形態において、前記の２つのアミノ酸はお互いに結合してラクタム環を形成する。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端部分にあるαヘリックス構造の安定化はラクタム架橋以外の分子内架橋の形成を通して達成される。例えば、適切な共有結合形成方法にはオレフィンメタセシス、ランチオニンベースの環化、ジスルフィド架橋形成、若しくは、修飾型含硫架橋形成、α，ω−ジアミノアルカンテザーの使用、金属原子架橋の形成のいずれか１つ以上が含まれ、そして、その他のペプチド環化方法がαヘリックスを安定化するために使用される。
【０１６０】
さらに別の実施形態において、１つ以上のα，α−二置換アミノ酸が、望みの活性を保持する位置においてこのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９）に挿入される、又は、置換される。例えば、位置１６、２０、位２１又は、２４のうちの１つ、２つ、３つ、又は、全ての位置がα，α−二置換アミノ酸、例えば、アミノイソ酪酸で置換される。
【０１６１】
いくつかの態様において、ＧＬＰ−１受容体において増大した活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドは、本明細書に記載されるように位置２０にアミノ酸修飾を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、ＧＬＰ−１受容体において増大した活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドはＣ末端にＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）、又は、ＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号４）を含む。そのような類似体におけるＧＬＰ−１活性は、本明細書に記載されるように、位置１８、２８、若しくは、２９の、又は、位置１８と位置２９のアミノ酸を修飾することでさらに増強することができる。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、ＧＬＰ−１受容体において増大した活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドは、大芳香族アミノ酸残基、任意選択で、トリプトファンを位置１０の位置に含む。
【０１６４】
ＧＩＰアゴニストペプチドがＧＬＰ−１受容体で増大した活性を示すいくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ヒトグルカゴンアミノ酸配列に本来備わるアルギニンの代わりに位置１８にアラニンを含む。
【０１６５】
増大したＧＬＰ−１受容体活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドに関して上述した修飾のいずれも別々に、又は、組み合わせて応用され得る。ＧＬＰ−１受容体活性を増大させる修飾の組合せは一般に、そのような修飾のいずれかが単独で取られた場合よりも高いＧＬＰ−１活性を提供する。例えば、本開示は、位置１６、２０、及び、Ｃ末端カルボン酸基に修飾を含み、任意選択で、位置１６と位置２０のアミノ酸の間に共有結合を有するＧＩＰアゴニストペプチド、位置１６、及び、Ｃ末端カルボン酸基に修飾を含むＧＩＰアゴニストペプチド、位置１６と位置２０に修飾を含み、任意選択で、位置１６と位置２０のアミノ酸の間に共有結合を有するＧＩＰアゴニストペプチド、並びに、位置２０、及び、Ｃ末端カルボン酸基に修飾を含むＧＩＰアゴニストペプチドを提供する。
【０１６６】
ＧＬＰ−１活性が望まれないいくつかの実施形態において、ＧＬＰ−１活性は特定のアミノ酸修飾により低下させることができる。この点で、いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、（ｉ）Ｃ末端αカルボン酸基、（ｉｉ）位置７のトレオニンのヒドロキシル基を欠くアミノ酸、例えば、Ａｂｕ若しくはイソロイシンでの置換、（ｉｉｉ）２７アミノ酸、若しくは、２８アミノ酸の長さのペプチドを産生するための位置２７、若しくは、位置２８のアミノ酸のＣ末端側にあるアミノ酸の欠質（例えば、位置２８のアミノ酸の欠質、位置２８と位置２９のアミノ酸の欠質）、又は、（ｉｖ）それらの組合せを含む。いくつかの態様において、ＧＬＰ−１受容体活性を失わせるのでなくても低下させる７番でのアミノ酸置換は、その修飾によりＧＬＰ−１受容体においては活性が最終的に低下するように、又は、失われるように、ＧＬＰ−１受容体活性を増強するものとして本明細書に記載される他のいかなるアミノ酸修飾に対しても優勢となる。
【０１６７】
ＧＩＰ受容体、ＧＬＰ−１受容体、及び、グルカゴン受容体の各々において活性に影響を与える修飾
いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは（ｉ）位置１６のセリンの式ＩＶのアミノ酸での置換、
【化１０】
2013518115.tif 000011
［式中、ｎは１から１６、又は、１から１０、又は、１から７、又は、１から６、又は、２から６、又は、２、又は、３、又は、４、又は、５であり、Ｒ１とＲ２の各々はたがいに独立して水素、Ｃ１−Ｃ１８アルキル基、Ｃ１−Ｃ１８アルキルアルコール基、Ｃ１−Ｃ１８アルキルアミノ基、Ｃ１−Ｃ１８アルキルチオール基、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル基、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ２−Ｃ５ヘテロサイクリック）基、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ６−Ｃ１０アリル）Ｒ７基、及び、（Ｃ１−Ｃ４アルキル）（Ｃ３−Ｃ９ヘテロアリル）基からなる群より選択され、Ｒ７は水素又はヒドロキシル基であり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含む。］
及び、（ｉｉ）位置２０のグルタミンのα，α−二置換アミノ酸、例えば、アミノイソ酪酸でのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、位置１６のアミノ酸はオルニチン、Ｄａｂ、リシン、又は、ホモリシンであり、位置２０のアミノ酸はアミノイソ酪酸である。特定の実施形態において、位置１６のアミノ酸はリシンであり位置２０のアミノ酸はアミノイソ酪酸である。
【０１６８】
位置１６の位に式ＩＶのアミノ酸を、そして、位置２０にα，α−二置換アミノ酸を含むＧＩＰアゴニストペプチドのグルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、及び、グルカゴン受容体の各々における活性は、ペプチドの長さを伸長することにより、例えば、Ｃ末端伸長ペプチド、例えば、約１〜２１アミノ酸長の、約９から２１アミノ酸長の、約６〜１８アミノ酸長の、約９〜１２アミノ酸長の、又は、１０アミノ酸長の、又は、１１アミノ酸長のペプチドとの融合によりさらに増強することができる。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）、又は、Ｘがグリシン、若しくは、小脂肪族の、若しくは、非極性、若しくは、わずかに極性のアミノ酸であるＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号４）との融合によって伸長される。別の実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）との融合により伸長され、１〜１１アミノ酸がＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）のＣ末端に融合される。例えば、前記類似体のＣ末端伸長部はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）とそれに引き続いて配列番号３のＣ末端に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又は、１１個の付加的なアミノ酸を含むことができる。例えば、１〜１１個の付加的なアミノ酸はアラニンのような小脂肪族アミノ酸であり得る。この点で、いくつかの実施形態におけるＧＩＰアゴニストペプチドは、例えば、ｍが１から１１であるＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＡｍのアミノ酸配列を含むＣ末端伸長部を包含する。
【０１６９】
位置１６に式ＩＶのアミノ酸を、そして、位置２０にα，α−二置換アミノ酸を含むＧＩＰアゴニストペプチドのグルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、及び、ＧＩＰ受容体の各々における活性の増強は、Ｃ末端伸長部内に位置するアミノ酸、又は、Ｃ末端アミノ酸（例えば、Ｃ末端伸長部のＣ末端に付加されるアミノ酸）がアシル化、又は、アルキル化されてさらに達成することができる。アシル化、又は、アルキル化は、例えば、Ｃ末端が伸長したＧＩＰアゴニストペプチドの位置３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び、５０のいずれかの位置にあるアミノ酸のアシル化、又は、アルキル化であり得る。いくつかの実施形態において、アシル化される、又は、アルキル化されるアミノ酸は、Ｃ末端が伸長したＧＩＰアゴニストペプチドの位置３７、３８、３９、４０、４１、４２、又は、４３に位置する。いくつかの実施形態において、アシル化されたアミノ酸、又は、アルキル化されたアミノ酸は、アシル基、又は、アルキル基、例えば、炭素数１０から２２のアシル基、又は、アルキル基と結合する式Ｉ、式ＩＩ、又は、式ＩＩＩのアミノ酸、例えば、リシンである。ある実施形態において、前記リシンは、リシン、Ｄａｂ、オルニチン、又は、ホモリシンが前記類似体の位置に位置するように、配列番号３を含むＣ末端伸長部のＣ末端に位置する。任意選択で、Ｃ末端が伸長したペプチドはまた、例えば、本明細書においてＰＥＧ化に適すると記載される位置のいずれか（例えば、位置２４）においてＰＥＧ化される。
【０１７０】
ＧＩＰ活動性ＧＩＰアゴニストペプチドのグルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、及び、ＧＩＰ受容体の各々における活性の増強は、スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、疎水性二官能性スペーサー）を介したアミノ酸のアシル化、又は、アルキル化によってさらに達成することができる。いくつかの実施形態において、ＧＩＰ活動性ＧＩＰアゴニストペプチドは、前記類似体の位置１０にあるアミノ酸の側鎖に結合するスペーサーを介してアシル基、又は、アルキル基を含む。別の実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置２９にあるアミノ酸のＣ末端側に１から２１アミノ酸のＣ末端伸長部（例えば、配列番号３、又は、配列番号４のアミノ酸配列を含む伸長部）を含み、アシル基、又は、アルキル基に共有結合で結合するスペーサーは配列番号１に関して位置３７〜４３のうちの１つに相当する位置において前記伸長部のアミノ酸に結合する。特定の実施形態において、スペーサーは配列番号１に関して位置４０にあるアミノ酸に結合する。ある実施形態において、スペーサーは３から１０原子の長さである。特定の態様において、スペーサーとアシル基、又は、スペーサーとアルキル基の全長は約１４から約２８原子の長さである。例えば、スペーサーは、限定されないが、本明細書に記載されるもののいずれかを含むアミノ酸であり得る。また、例えば、スペーサーは本明細書に記載されるアミノ酸を含むジペプチド、又は、トリペプチド、例えば、酸性アミノ酸を含むジペプチド、又は、トリペプチドであり得る。特定の態様におけるスペーサーは次のジペプチド、アラニン−アラニン、βアラニン−βアラニン、又は、γグルタミン酸−γグルタミン酸のうちの１つである。グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、及び、ＧＩＰ受容体のうちの１つ以上において活性を増大させる目的のために適したその他のスペーサーは本明細書にさらに記載される。
【０１７１】
本開示の特定の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、グルカゴン活性を低下させるアミノ酸修飾、例えば、位置３にあるグルタミン酸に加えてＧＩＰ受容体、ＧＬＰ−１受容体、及び、グルカゴン受容体の各々において活性の増強を達成する上述した修飾のいずれかを含む。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、グルカゴン受容体活性を失わせなくとも低下させる３番でのアミノ酸置換は、グルカゴン受容体においては活性が最終的に低下するように、又は、失われるように、グルカゴン受容体活性を増強するその他の任意のアミノ酸修飾に対して優勢となる。したがって、例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは位置１６に式ＩＶのアミノ酸を、位置２０にα，α−二置換アミノ酸を、上述の教示に従って位置４０にアシル化リシン残基を含むＣ末端伸長部を、そして、位置３にグルタミン酸を含む。そのようなペプチドはグルカゴン受容体活性をほとんど、又は、全く示さない。
【０１７２】
αヘリックス構造の安定化
ＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９の辺り）内のαヘリックス構造の安定化は増強されたＧＬＰ−１活性、及び／又は、ＧＩＰ活性を提供し、位置１、及び／又は、２のアミノ酸修飾により低下したグルカゴン活性を復活させる。αヘリックス構造は、例えば、共有結合による、又は、非共有結合による分子内架橋の形成、又は、１２〜位置２９の辺りのアミノ酸のαヘリックス安定化アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）での置換、及び／又は、挿入により安定化され得る。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、分子内架橋は２つのアミノ酸側鎖の間に形成され、ＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端部分（例えば、アミノ酸１２〜２９）の３次元構造を安定化する。２つのアミノ酸側鎖は、非共有結合、例えば、水素結合、塩橋の形成のようなイオン性相互作用を通して、又は、共有結合によりお互いに結合することができる。２つのアミノ酸側鎖が１つ以上の共有結合を通してお互いに結合するとき、そのペプチドは共有結合による分子内架橋を含むと本明細書においてみなされ得る。２つのアミノ酸側鎖が非共有結合、例えば、水素結合、イオン性相互作用を通してお互いに結合するとき、そのペプチドは非共有結合による分子内架橋を含むと本明細書においてみなされ得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、分子内架橋は、３アミノ酸離れた２つのアミノ酸、例えば、ｉが１２と２５の間の任意の整数（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、及び、２５）である、位置ｉと位置ｉ＋４にあるアミノ酸の間に形成される。特に、位置１２と位置１６のアミノ酸対、位置１６と位置２０のアミノ酸対、位置２０と位置２４のアミノ酸対、又は、位置２４と位置２８のアミノ酸対（ｉ＝１２、１６、２０、又は、２４のアミノ酸対）の側鎖がお互いに結合し、そうしてグルカゴンのαヘリックスを安定化する。あるいは、ｉは１７であり得る。
【０１７５】
位置ｉと位置ｉ＋４の位置にあるアミノ酸が分子内架橋で結合されるいくつかの特定の実施形態において、リンカーのサイズは約８原子、又は、７〜９原子である。
【０１７６】
別の実施形態において、分子内架橋は、２アミノ酸離れた２つのアミノ酸、例えば、ｊが１２と２６の間の任意の整数（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び、２６）である、位置ｊと位置ｊ＋３にあるアミノ酸の間に形成される。いくつかの特定の実施形態において、ｊは１７でる。
【０１７７】
位置ｊと位置ｊ＋３にあるアミノ酸が分子内架橋により結合されるいくつかの特定の実施形態において、リンカーのサイズは約６原子、又は、約５から７原子である。
【０１７８】
さらに別の実施形態において、分子内架橋は、６アミノ酸離れた２つのアミノ酸、例えば、ｋが１２と２２の間の任意の整数（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、及び、２２）であり、位置ｋと位置ｋ＋７にあるアミノ酸の間に形成される。いくつかの特定の実施形態において、ｋは１２、１３、又は、１７である。例示的な実施形態において、ｋは１７でる。
【０１７９】
６原子連結架橋を形成するための共有結合が可能であるアミノ酸の対形成の例はオルニチンとアスパラギン、グルタミン酸とｎが２である式Ｉのアミノ酸、及び、ホモグルタミン酸とｎが１である式Ｉのアミノ酸を含み、式Ｉは
【化１１】
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【０１８０】
７原子連結架橋を形成するための共有結合が可能であるアミノ酸の対形成の例はオルニチン−グルタミン酸（ラクタム環）、リシン−アスパラギン酸（ラクタム）、又は、ホモセリン−ホモグルタミン（ラクトン）を含む。８原子リンカーを形成することができるアミノ酸の対形成の例はリシン−グルタミン酸（ラクタム）、ホモリシン−アスパラギン酸（ラクタム）、オルニチン−ホモグルタミン酸（ラクタム）、４−アミノフェニルアラニン−アスパラギン酸（ラクタム）、又は、チロシン−アスパラギン酸（ラクトン）を含む。９原子リンカーを形成することができるアミノ酸の対形成の例はホモリシン−グルタミン酸（ラクタム）、リシン−ホモグルタミン酸（ラクタム）、４−アミノフェニルアラニン−グルタミン酸（ラクタム）、又は、チロシン−グルタミン酸（ラクトン）を含む。これらのアミノ酸上の側鎖のいずれも、αヘリックスの３次元構造が破壊されない限り、付加的な化学基でさらに置換することができる。当業者は、同様のサイズと望みの作用をもつ安定化構造を作り出すであろう、代わりの対形成、又は、化学的に修飾された誘導体を含む代わりのアミノ酸類似体を考えることができる。例えば、ホモシステイン−ホモシステインジスルフィド架橋は６原子の長さであり、望みの作用を提供するためにさらに修飾することができる。共有結合がなくても、上述のアミノ酸の対形成、又は、当業者が考えることができる類似の対形成はまた、非共有結合、例えば、塩橋の形成、又は、水素結合相互作用を通してαヘリックスに安定性を与えることができる。
【０１８１】
ラクタム環のサイズはアミノ酸側鎖の長さに応じて変化することができ、ある実施形態において、ラクタムはリシンアミノ酸の側鎖をグルタミン酸の側鎖に連結することで形成される。さらなる例示的な実施形態は、任意選択でラクタム架橋を有する、次の対形成を含む：位置１２のグルタミン酸と位置１６のリシン、位置１２の天然のリシンと位置１６のグルタミン酸、位置１６のグルタミン酸と位置２０のリシン、位置１６のリシンと位置２０のグルタミン酸、位置２０のグルタミン酸と位置２４のリシン、位置２０のリシンと位置２４のグルタミン酸、位置２４のグルタミン酸と位置２８のリシン、位置２４のリシンと位置２８のグルタミン酸。あるいは、ラクタム環中のアミド結合の順序は逆になり得る（例えば、ラクタム環は位置１２のリシンと位置１６のグルタミン酸の側鎖の間に、又は、代わりに位置１２のグルタミン酸と位置１６のリシンの間に形成することができる）。
【０１８２】
ラクタム架橋以外の分子内架橋がＧＩＰアゴニストペプチドのαヘリックスを安定化するために用いられ得る。ある実施形態において、その分子内架橋は疎水性架橋である。この例において、分子内架橋はＧＩＰアゴニストペプチドのαヘリックスの疎水性面の部分である２つのアミノ酸の側鎖の間に任意選択的に存在する。例えば、疎水性架橋によって結合されるアミノ酸の１つは位置１０、１４、及び、１８のアミノ酸であり得る。
【０１８３】
ある特定の態様において、全炭化水素架橋システムを用いてＧＩＰアゴニストペプチドのαヘリックスの１ターン、又は、２ターンを架橋するためにオレフィンメタセシスが用いられる。この例におけるＧＩＰアゴニストペプチドは様々な長さのオレフィン性側鎖を持ち、そして、ＲかＳのどちらかの立体化学で形成されるα−メチル化アミノ酸を位置ｉと位置ｉ＋４、若しくは、位置ｉ＋７番に含むことができる。例えば、前記のオレフィン性側鎖は、ｎが１と６の間の任意の整数である（ＣＨ２）ｎを含むことができる。ある実施形態において、８原子の長さの架橋のためにｎは３である。そのような分子内架橋の形成の適切な方法は当該技術分野において記述されている。例えば、Schafmeister et al., アメリカ化学学会誌（J. Am. Chem. Soc.） 122: 5891-5892 (2000)、及び、Walensky et al., サイエンス誌（Science） 305: 1466-1470 (2004)を参照のこと。あるいは、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ルテニウムによって触媒される閉環メタセシスを介して一緒に架橋される隣接するらせん状ターンに位置するＯ−アリルセリン残基を含むことができる。そのような架橋の方法は、例えば、Blackwell et al., 応用化学誌国際版（Angew, Chem., Int. Ed.） 37: 3281-3284 (1998)に記載される。
【０１８４】
別の特定の態様において、システインのペプチド模倣物として広く採用されていう非天然のチオ−ジアラニンアミノ酸であるランチオニンの使用がαヘリックスの１つのターンを架橋するために用いられる。ランチオニンベースの環化の適切な方法は当該技術分野において公知である。例えば、Matteucci et al., 四面体短報（Tetrahedron Letters） 45: 1399-1401 (2004)、Mayer et al., ペプチド研究誌（J. Peptide Res.） 51: 432-436 (1998)、Polinsky et al., 医薬化学誌（J. Med. Chem.） 35: 4185-4194 (1992)、Osapay et al., 医薬化学誌（J. Med. Chem.） 40: 2241-2251 (1997)、Fukase et al., 日本化学会紀要（Bull. Chem. Soc. Jpn.） 65: 2227-2240 (1992)、Harpp et al., 有機化学誌（J. Org. Chem.） 36: 73-80 (1971)、Goodman and Shao, 純正化学及び応用化学誌（Pure Appl. Chem.） 68: 1303-1308 (1996)、及び、Osapay and Goodman, 化学学会化学コミュニケーション誌（J. Chem. Soc. Chem. Commun.） 1599-1600 (1993)を参照のこと。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、位置ｉと位置ｉ＋７にある２つのグルタミン酸残基の間のα，ω−ジアミノアルカンテザー（例えば、１，４−ジアミノプロパン、及び、１，５−ジアミノペンタン）がＧＩＰアゴニストペプチドのαヘリックスを安定化するために使用される。そのようなテザーは、ジアミノアルカンテザーの長さに応じて、９原子以上の長さの架橋を形成することになる。そのようなテザーで架橋されたペプチドを産生する適切な方法は当該技術分野において記述される。例えば、Phelan et al., アメリカ化学会誌（J. Am. Chem. Soc.） 119: 455-460 (1997)を参照のこと。
【０１８６】
本開示のさらに別の実施形態において、ジスルフィド架橋はＧＩＰアゴニストペプチドのαヘリックスの１ターン、又は、２ターンを架橋するために用いられる。あるいは、等配電子性大環状化という結果になる、１つの、又は、両方の硫黄原子がメチレン基によって置換される修飾型ジスルフィド架橋がＧＩＰアゴニストペプチドのαヘリックスを安定化するために用いられる。ジスルフィド架橋、又は、硫黄ベースの環化によるペプチドを修飾する適切な方法は、例えば、Jackson et al., アメリカ化学会誌（J. Am. Chem. Soc.） 113: 9391-9392 (1991)、及び、Rudinger and Jost, エクスペリエンティア誌（Experientia） 20: 570-571 (1964)に記載される。
【０１８７】
さらに別の実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドのαヘリックスは、位置ｉと位置ｉ＋４にある２つのヒスチジン残基、又は、ヒスチジンとシステインのアミノ酸対による金属原子の結合を介して安定化される。その金属原子は、例えば、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、又は、Ｃｄ（ＩＩ）であり得る。金属結合ベースのαヘリックス安定化のそのような方法は当該技術分野において公知である。例えば、Andrews and Tabor, 四面体誌（Tetrahedron） 55: 11711-11743 (1999); Ghadiri et al., アメリカ化学会誌（J. Am. Chem. Soc.） 112: 1630-1632 (1990)、及び、Ghadiri et al., アメリカ化学会誌（J. Am. Chem. Soc.） 119: 9063-9064 (1997)を参照のこと。
【０１８８】
あるいは、ＧＩＰアゴニストペプチドのαヘリックスは、Davies, ペプチド科学誌（J. Peptide. Sci.） 9: 471-501 (2003)において概説されるペプチド環化の他の方法を通して安定化され得る。αヘリックスはアミド架橋、チオエーテル架橋、チオエステル架橋、尿素架橋、カルバメート架橋、スルホンアミド架橋などの形成を介して安定化され得る。例えば、チオエステル架橋はＣ末端とシステイン残基の側鎖の間に形成され得る。あるいは、チオエステルはチオールを有するアミノ酸（システイン）とカルボン酸を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）の側鎖を介して形成され得る。別の方法において、ジカルボン酸、例えば、スベリン酸（オクタン二酸）などのような架橋剤を、遊離アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、及び、その組合せのようなアミノ酸側鎖の２つの官能基の間に連結を導入することができる。
【０１８９】
ある実施形態に従って、ＧＩＰアゴニストペプチドのαヘリックスは位置ｉと位置ｉ＋４に疎水性のアミノ酸を組み込むことを通して安定化される。例えば、ｉはチロシンでｉ＋４はバリン若しくはロイシンのどちらかであることができ、ｉはフェニルアラニンでｉ＋４はシステイン若しくはメチオニンあることができ、ｉはシステインでｉ＋４はメチオニンであることができ、又は、ｉはフェニルアラニンでｉ＋４はイソロイシンであることができる。本明細書における目的のため、上述のアミノ酸の対形成は、位置ｉの位置に示されるアミノ酸が代わって位置ｉ＋４に位置することができるよう、一方、位置ｉ＋４のアミノ酸が位置ｉに位置することができるように、逆転することができる。
【０１９０】
本開示の別の実施形態に従って、αヘリックスは、ＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９の辺り）における１つ以上のαヘリックス安定化アミノ酸の（アミノ酸置換、又は、挿入のどちらかによる）組み込みを通して安定化される。特定の実施形態において、αヘリックス安定化アミノ酸は、限定されないが、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）、メチル基、エチル基、プロピル基、及び、ｎ−ブチル基から選択される同じ、若しくは、異なる基で二置換されるアミノ酸、又は、シクロオクタン基、若しくは、シクロヘプタン基で二置換されるアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）のいずれかを含むα，α−二置換アミノ酸である。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、又は、２９のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又は、それ以上の位置がα，α−二置換アミノ酸で置換される。特定の実施形態において、位置１６、２０、２１、及び、２４の位置うちの１つ、２つ、３つ、又は、全部の位置がα，α−二置換アミノ酸、例えば、アミノイソ酪酸で置換され、ＧＩＰアゴニストペプチドは、任意選択だが、意図的に導入される任意の分子内架橋を欠く。例えば、ＧＩＰアゴニストペプチドは分子内架橋、例えば、非共有結合による分子内架橋（例えば、塩橋）又は、共有結合による分子内架橋（例えば、ラクタム）が無い状態で位置１６、又は、位置２０のアミノイソ酪酸による置換を含むことができる。そのような分子内架橋を欠くペプチドは好都合なことに調製が容易である。
【０１９１】
いくつかの実施形態に従って、分子内架橋を欠くＧＩＰアゴニストペプチドは、α，α−二置換アミノ酸、及び、ＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸、例えば、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置１０、又は、位置４０にあるアミノ酸の側鎖に共有結合で結合するアシル基、又は、アルキル基による１つ以上の置換を位置１２〜２９のアミノ酸内に含む。特定の実施形態において、前記のアシル基、又は、アルキル基は天然のアミノ酸には本来備わっていない。ある態様において、前記のアシル基、又は、アルキル基は位置１０にあるアミノ酸に本来備わっていない。そのような分子内架橋を欠くアシル化ＧＩＰアゴニストペプチド、又は、アルキル化ＧＩＰアゴニストペプチドは、アシル化されていない対応するペプチドと比較して、ＧＬＰ−１受容体、及び、グルカゴン受容体において増強された活性を示す。アシル基、又は、アルキル基とペプチドの位置１０、又は、位置４０にあるアミノ酸の側鎖の間にスペーサーを組み込むことにより、分子内架橋を欠くアシル化ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＬＰ−１受容体、及び、グルカゴン受容体における活性のさらなる増強を達成することができる。スペーサーが組み込まれる、又は、組み込まれないアシル化及びアルキル化は本明細書にさらに記載される。
【０１９２】
特定の実施形態において、アシル化ＧＩＰアゴニストペプチド、若しくは、アルキル化アゴニストペプチド、又は、その類似体はＧＬＰ−１受容体における活性を選択的に低下させる修飾をさらに含む。例えば、アシル化ＧＩＰアゴニストペプチド、若しくは、アルキル化アゴニストペプチド、又は、その類似体は、Ｃ末端αカルボン酸、位置２７、又は、位置２８にあるアミノ酸のＣ末端側のアミノ酸の欠質（例えば、位置２９にあるアミノ酸の欠質、位置２８と位置２９にあるアミノ酸の欠質）、位置７にあるトレオニンの大脂肪族非極性アミノ酸、例えば、イソロイシンでの置換のうちの１つ、又は、１つの組合せを含む。いくつかの態様において、本開示のＧＩＰアゴニストペプチドはグルカゴン受容体活性を選択的に低下させるアミノ酸修飾を含む。そのような修飾は本明細書においてさらに記載される。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、位置１６、又は、位置２０がα，α−二置換アミノ酸、例えば、アミノイソ酪酸で置換される。いくつかの実施形態において、位置２０がα，α−二置換アミノ酸、例えば、アミノイソ酪酸で置換される。ある実施形態において、位置２０がα，α−二置換アミノ酸、例えば、アミノイソ酪酸で置換され、そして、位置１６が式ＩＶのアミノ酸で置換される。
【化１２】
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［式中、ｎは１から１６、又は、１から１０、又は、１から７、又は、１から６、又は、２から６、又は、２、又は、３、又は、４、又は、５であり、Ｒ１とＲ２の各々はたがいに独立して水素、Ｃ１−Ｃ１８アルキル基、Ｃ１−Ｃ１８アルキルアルコール基、Ｃ１−Ｃ１８アルキルアミノ基、Ｃ１−Ｃ１８アルキルチオール基、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル基、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ２−Ｃ５ヘテロサイクリック）基、（Ｃ０−Ｃ４アルキル）（Ｃ６−Ｃ１０アリル）Ｒ７基、及び、（Ｃ１−Ｃ４アルキル）（Ｃ３−Ｃ９ヘテロアリル）基からなる群より選択され、Ｒ７は水素又はヒドロキシル基であり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含む。］
特定の実施形態において、式ＩＶのアミノ酸は２，３−ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）、２，４−ジアミノ酪酸（ＤＡＢ）、オルニチン、リシン、又は、ホモリシンである。位置１６の式ＩＶのアミノ酸とα，α−二置換アミノ酸の組合せは好都合なことにグルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、及び、ＧＩＰ受容体の各々において向上した活性を提供する。いくつかの態様において、このペプチドは、グルカゴン受容体における活性を選択的に低下させるアミノ酸修飾、例えば、位置３にあるグルタミンのグルタミン酸での置換をさらに含む。
【０１９４】
アシル化、及び、アルキル化
いくつかの実施形態に従って、本開示のＧＩＰアゴニストペプチドはアシル基、又は、アルキル基、例えば、天然のアミノ酸には本来備わっていないアシル基、又は、アルキル基を含むために修飾される。アシル化、又は、アルキル化はＧＩＰアゴニストペプチドの循環半減期を増加させることができる。アシル化、又は、アルキル化は好都合なことにグルカゴン受容体、及び／若しくは、ＧＬＰ−１受容体において作用開始時期を遅らせることができ、並びに／又は、作用期間を延長することができ、並びに／又は、ＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する抵抗性を改善することができ、並びに／又は、可溶性を改善することができる。ＧＩＰアゴニストペプチドのグルカゴン受容体、及び／又は、ＧＬＰ−１受容体、及び／又は、ＧＩＰ受容体における活性はアシル化の後も維持され得る。いくつかの実施形態において、アシル化ＧＩＰアゴニストペプチドの効力はアシル化されていないＧＩＰアゴニストペプチドに匹敵する。別の実施形態において、アシル化ＧＩＰアゴニストペプチドの効力はアシル化されていないＧＩＰアゴニストペプチドと比較して増大する。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置１０にあるアミノ酸に共有結合で結合するアシル基、又は、アルキル基を含むために修飾される。ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置１０のアミノ酸とアシル基、又は、アルキル基との間にスペーサーを含む。いくつかの実施形態において、アシル基は脂肪酸、又は、胆汁酸、又は、その塩、例えば、炭素数４から３０の脂肪酸、炭素数８から２４の脂肪酸、コール酸、炭素数４から３０のアルキル基、炭素数８から２４のアルキル基、又は、胆汁酸のステロイド部分を含むアルキル基である。前記スペーサーは、アシル基、又は、アルキル基を結合するために適切な反応基を有する任意の部分である。例示的な実施形態において、前記スペーサーはアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、又は、疎水性二官能性スペーサーを含む。いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、トリプトファン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、及び、ｍが１から６の任意の整数であり、ｎが２から１２の任意の整数であるＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨを含むスペーサーからなる群より選択される。そのようなアシル化ＧＩＰアゴニストペプチド、又は、アルキル化ＧＩＰアゴニストペプチドは親水性部分、任意選択で、ポリエチレングリコールをさらに含む。前述のＧＩＰアゴニストペプチドのいずれも、２つのアシル基、若しくは、２つのアルキル基、又は、その組合せを含むことができる。
【０１９６】
ＧＩＰ活性（及び、任意選択的にＧＬＰ−１活性、及び／又は、グルカゴン活性）が増強されなくとも維持されるという条件で、位置１〜２９のいずれか、Ｃ末端伸長部内の位置、又は、Ｎ末端、若しくは、Ｃ末端アミノ酸を含むＧＩＰアゴニストペプチド内の任意の位置においてアシル化を行うことができる。例えば、アミノ酸配列（配列番号１）に付加される任意のアミノ酸、例えば、Ｎ末端、又は、Ｃ末端においてアシル化を起こすことができる。非限定的な例として、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は、５０が挙げられる。アシル基はＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸に直接的に共有結合で結合されることができ、又は、ＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸とアシル基の間に位置するスペーサーを介してＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸に間接的に共有結合で結合することができる。親水性部分が結合するのと同じアミノ酸の位置、又は、異なるアミノ酸の位置においてＧＩＰアゴニストペプチドをアシル化することができる。非限定的な例として、位置１０、又は、位置４０でのアシル化、及び、ＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端部分内の１つ以上の位置、例えば、Ｃ末端伸長部内の位置２４、２８、若しくは、２９、又は、Ｃ末端での（例えば、Ｃ末端にシステインを付加することによる）ＰＥＧ化が挙げられる。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは配列番号１のＧＩＰアゴニストペプチド、又は、その類似体のＣ末端に約１から約２１の伸長部を含むために修飾され、そして、その伸長部のアミノ酸の少なくとも１つがアシル化、又は、アルキル化される。例えば、修飾型ＧＩＰアゴニストペプチドは配列番号１のＧＩＰアゴニストペプチド、又は、その類似体の位置２９のアミノ酸のＣ末端側に約１から約２１アミノ酸の伸長部を含むことができる。あるいは、ＧＩＰアゴニストペプチド、又は、その類似体が１、又は、２アミノ酸だけ短縮されるとき、約１から約２１アミノ酸の伸長部はそのＧＩＰアゴニストペプチド、又は、その類似体の位置２７、又は、位置２８のアミノ酸のＣ末端側にあることができる。したがって、Ｃ末端伸長部内のアシル化されるアミノ酸、又は、アルキル化されるアミノ酸は、例えば、Ｃ末端が伸長したＧＩＰアゴニストペプチドの位置２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は、５０のアミノ酸のいずれかであり得る。いくつかの実施形態におけるＣ末端伸長部は配列番号３、又は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と配列番号３のＣ末端に本明細書に記載されるようにアシル化、又は、アルキル化される１個から１１個の付加的なアミノ酸を含むＣ末端伸長部を包含する。特定の実施形態において、アシル化されるアミノ酸、又は、アルキルされる化アミノ酸はＤａｂ残基、オルニチン残基、リシン残基、又は、ホモリシン残基であり、Ｃ末端が伸長したＧＩＰアゴニストペプチド、又は、その類似体の位置４０に位置する。
【０１９８】
ある実施形態に従って、ＧＩＰアゴニストペプチドは、循環半減期を延長し、及び／又は、作用開始時期を遅らせ、及び／又は、作用期間を延長し、及び／又は、ＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する抵抗性を改善することを目的として、エステル結合、チオエステル結合、又は、アミド結合を介してＧＩＰアゴニストペプチドに結合するアシル基を含むために修飾される。
【０１９９】
本開示の特定の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸側鎖のアミン、ヒドロキシル基、又は、チオール基を直接アシル化することにより修飾されてアシル基を含む。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル基、又は、チオール基を介して直接的にアシル化される。いくつかの実施形態において、アシル化は位置１０、２０、２４、２９、又は、４０にある。この点で、アシル化ＧＩＰアゴニストペプチドは配列番号１のアミノ酸配列、又は、位置１０、２０、２４、２９、及び、４０にあるアミノ酸の少なくとも１つが側鎖アミン、ヒドロキシル基、又は、チオール基を含む任意のアミノ酸に修飾される本明細書に記載のアミノ酸修飾の１つ以上を含むそれの修飾型アミノ酸配列を包含することができる。本開示のいくつかの特定の実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドの直接的なアシル化は位置１０、又は、位置４０にあるアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル基、又は、チオール基を介して起きる。
【０２００】
いくつかの実施形態において、側鎖にアミンを含むアミノ酸は、ｎが１から４の式Ｉのアミノ酸である。
【化１３】
2013518115.tif 000014
【０２０１】
いくつかの例示的な実施形態において、式Ｉのアミノ酸はｎが４のアミノ酸（リシン）、又は、ｎが３のアミノ酸（オルニチン）である。
【０２０２】
別の実施形態において、側鎖にヒドロキシル基を含むアミノ酸は、ｎが１から４の式ＩＩのアミノ酸である。
【化１４】
2013518115.tif 000015
【０２０３】
いくつかの例示的な実施形態において、式ＩＩのアミノ酸はｎが１のアミノ酸（セリン）である。
【０２０４】
さらに別の実施形態において、側鎖にチオール基を含むアミノ酸は、ｎが１から４の式ＩＩＩのアミノ酸である。
【化１５】
2013518115.tif 000016
【０２０５】
いくつかの例示的な実施形態において、式ＩＩのアミノ酸はｎが１のアミノ酸（システイン）である。
【０２０６】
さらに別の実施形態において、側鎖アミン、ヒドロキシル基、又は、チオール基を含むアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩ、又は、式ＩＩＩのアミノ酸のα炭素に結合する水素が第２の側鎖で置換されることを除いて、式Ｉ、式ＩＩ、又は、式ＩＩＩと同じ構造を含む二置換アミノ酸である。
【０２０７】
本開示のある実施形態において、アシル化ＧＩＰアゴニストペプチドはペプチドとアシル基の間にスペーサーを含む。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、アシル基に共有結合で結合するスペーサーに共有結合で結合する。
【０２０８】
スペーサーが結合するアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能にする部分を含む任意のアミノ酸（例えば、α−一置換アミノ酸、又は、α−二置換アミノ酸）であり得る。例えば、側鎖アミン、ヒドロキシル基、又は、カルボキシル基を含むアミノ酸（例えば、リシン、オルニチン、セリン、アスパラギン酸、又は、グルタミン酸）が適切である。この点で、アシル化ＧＩＰアゴニストペプチドは配列番号１のアミノ酸配列、又は、位置１０、２０、２４、２９、及び、４０にあるアミノ酸の少なくとも１つが側鎖アミン、ヒドロキシル基、又は、カルボン酸基を含む任意のアミノ酸に修飾される本明細書に記載のアミノ酸修飾の１つ以上を含むそれの修飾型アミノ酸配列を包含することができる。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、スペーサーは側鎖アミン、ヒドロキシル基、若しくは、チオール基を含むアミノ酸、又は、側鎖アミン、ヒドロキシル基、若しくは、チオール基を含むジペプチド、若しくは、トリペプチドである。
【０２１０】
スペーサーのアミン基を介してアシル化が起きるとき、アシル化はアミノ酸のα−アミン、又は、側鎖アミンを介して起こり得る。α−アミンがアシル化される例において、スペーサーアミノ酸は任意のアミノ酸であり得る。例えば、スペーサーアミノ酸は疎水性アミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、及び、８−アミノオクタン酸であり得る。あるいは、スペーサーアミノ酸は酸性残基、例えば、アスパラギン酸、及び、グルタミン酸であり得る。
【０２１１】
スペーサーアミノ酸の側鎖がアシル化される例において、スペーサーアミノ酸は側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば、式Ｉのアミノ酸（例えば、リシン、又は、オルニチン）である。この例において、ＧＩＰアゴニストペプチドがジアシル化されるように、スペーサーアミノ酸のα−アミンと側鎖アミンの両方がアシル化されることが可能である。本開示の実施形態はそのようなジアシル化分子を含む。
【０２１２】
アシル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して起きるとき、アミノ酸、又は、ジペプチド、若しくは、トリペプチドのアミノ酸のうちの１つは式ＩＩのアミノ酸であり得る。具体的で例示的な実施形態において、そのアミノ酸はセリンである。
【０２１３】
アシル化がスペーサーのチオール基を介して起きるとき、アミノ酸、又は、ジペプチド、若しくは、トリペプチドのアミノ酸のうちの１つは式ＩＩＩのアミノ酸であり得る。具体的で例示的な実施形態において、そのアミノ酸はシステインである。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、スペーサーは親水性二官能性スペーサーである。ある実施形態において、親水性二官能性スペーサーは２つ以上の反応基、例えば、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基、及び、カルボキシル基、又は、その任意の組合せを含む。ある実施形態において、親水性二官能性スペーサーはヒドロキシル基とカルボン酸基を含む。別の実施形態において、親水性二官能性スペーサーはアミン基とカルボン酸基を含む。別の実施形態において、親水性二官能性スペーサーはチオール基とカルボン酸基を含む。特定の実施形態において、スペーサーはアミノポリ（アルキルオキシ）カルボン酸基を含む。この点で、スペーサーは、例えば、ｍが１から６の任意の整数であり、ｎが２から１２の任意の整数であるＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨ、例えば、ペプチドインターナショナル（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）  Ｉｎｃ．（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ケンタッキー州）から市販されている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸のようなものを含むことができる。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、前記スペーサーは疎水性二官能性スペーサーである。疎水性二官能性スペーサーは当該技術分野において公知である。例えば、Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996)を参照のこと。この文献は参照によりその全体が組み込まれる。ある実施形態において、疎水性二官能性スペーサーは２つ以上の反応基、例えば、アミン、ヒドロキシル基、チオール基、及び、カルボキシル基、又は、それらの任意の組合せを含む。ある実施形態において、疎水性二官能性スペーサーはヒドロキシル基とカルボン酸基を含む。別の実施形態において、疎水性二官能性スペーサーはアミン基とカルボン酸基を含む。別の実施形態において、疎水性二官能性スペーサーはチオール基とカルボン酸基を含む。カルボン酸基とヒドロキシル基、若しくは、チオール基を含む適切な疎水性二官能性スペーサーは当該技術分野において公知であり、例えば、８−ヒドロキシオクタン酸、及び、８−メルカプトオクタン酸を含む。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、二官能性スペーサーはカルボン酸基の間に１〜７炭素原子の非分枝メチレン基を含むジカルボン酸ではない。いくつかの実施形態において、二官能性スペーサーはカルボン酸基の間に１〜７炭素原子の非分枝メチレン基を含むジカルボン酸である。
【０２１７】
特定の実施形態におけるスペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、又は、疎水性二官能性スペーサー）は３から１０原子（例えば、６から１０原子、（例えば、６、７、８、９、又は、１０原子））の長さである。より特定の実施形態において、スペーサーとアシル基の全長が１４から２８原子、例えば、約１４原子、１５原子、１６原子、１７原子、１８原子、１９原子、２０原子、２１原子、２２原子、２３原子、２４原子、２５原子、２６原子、２７原子、又は、２８原子であるように、スペーサーは約３から１０原子（例えば、６から１０原子）の長さであり、アシル基は炭素数１２から１８の脂肪アシル基、例えば、炭素数１４のアシル基、炭素数１６のアシル基である。いくつかの実施形態において、スペーサーとアシル基の長さは１７から２８原子（例えば、１９から２６原子、１９から２１原子）である。
【０２１８】
ある前述の実施形態に従って、二官能性スペーサーは、３から１０原子の長さのアミノ酸骨格を含む（限定されないが、本明細書に記載されるアミノ酸のいずれかを含む）合成アミノ酸、又は、天然アミノ酸（例えば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、及び、８−アミノオクタン酸）であり得る。あるいは、スペーサーは３から１０原子（例えば、６から１０原子）の長さのペプチド骨格を持つジペプチド、又は、トリペプチドであり得る。ジペプチドスペーサー、又は、トリペプチドスペーサーの各アミノ酸はジペプチド、又は、トリペプチドのそれ以外のアミノ酸と同じ、又は、異なることができ、そして、例えば、天然アミノ酸（アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン）のＤ異性体、若しくは、Ｌ異性体のいずれかを含み、又は、β−アラニン（β−Ａｌａ）、Ｎ−α−メチル−アラニン（Ｍｅ−Ａｌａ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、γ−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、アミノメチルピロールカルボン酸、アミノピペリジンカルボン酸、アミノセリン（Ａｍｓ）、アミノテトラヒドロピラン−４−カルボン酸、アルギニンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、β−アスパラギン酸（β−Ａｓｐ）、アゼチジンカルボン酸、３−（２−ベンゾチアゾリル）アラニン、α−ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アミノ−５−ウレイド−ｎ−吉草酸（シトルリン、Ｃｉｔ）、β−シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、アセタミドメチル−システイン、ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ジメチルチアゾリジン（ＤＭＴＡ）、γ−グルタミン酸（γ−Ｇｌｕ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、イソロイシンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、メチル−イソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、イソニペコチン酸（Ｉｓｎ）、メチル−ロイシン（ＭｅＬｅｕ）、メチル−リシン、ジメチル−リシン、トリメチル−リシン、メタノプロリン、メチオニン−スルホキシド（Ｍｅｔ（Ｏ））、メチオニン−スルホン（Ｍｅｔ（Ｏ２））、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチル−ノルロイシン（Ｍｅ−Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））、４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＯ２））、４−シアノフェニルアラニン（（Ｐｈｅ（４−ＣＮ））、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシン、３，４−デヒドロプロリン、ピロリジニルアラニン、サルコシン（Ｓａｒ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、Ｏ−ベンジル−ホスホセリン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（Ｓｔａ）、４−アミノ−５−シクロヘキシル−３−ヒドロキシペンタン酸（ＡＣＨＰＡ）、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸（ＡＨＰＰＡ）、１，２，３，４，−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、テトラヒドロピラングリシン、チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、Ｏ−ベンジル−ホスホチロシン、Ｏ−ホスホチロシン、メトキシチロシン、エトキシチロシン、Ｏ−（ビス−ジメチルアミノ−ホスホノ）−チロシン、チロシン硫酸テトラブチルアミン、メチル−バリン（ＭｅＶａｌ）、及び、アルキル化３−メルカプトプロピオン酸からなる群より選択される非天然アミノ酸の任意のＤ異性体、若しくは、Ｌ異性体を含む天然アミノ酸、並びに／又は、非天然アミノ酸からなる群よりジペプチドスペーサー、又は、トリペプチドスペーサーの各アミノ酸は独立して選択され得る。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、スペーサーは全体的な負電荷、例えば、１つ、又は、２つの負に荷電したアミノ酸を、例えば、１つ、又は、２つの酸性残基を含む。いくつかの実施形態において、ジペプチドは、Ａはグリシン、グルタミン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、及び、プロリンからなる群より選択され、Ｂはリシン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群より選択される、Ａ−Ｂの一般的な構造を持つジペプチドのいずれでもない。
【０２２０】
いくつかの例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置１０、２０、２４、２９、若しくは、４０にあるアミノ酸の、又は、Ｃ末端アミノ酸におけるアミノ酸の側鎖に結合されるスペーサーのアミン、ヒドロキシル基、又は、チオール基のアシル化により修飾されてアシル基を含む。
【０２２１】
さらにより特定の実施形態において、アシル基はＧＩＰアゴニストペプチドの位置１０、又は、位置４０にあるアミノ酸に結合し、任意選択で、スペーサーとアシル基の長さは１４から２８原子である。いくつかの態様において、位置１０、又は、位置４０にあるアミノ酸は式Ｉのアミノ酸、例えば、リシン、又は、式Ｉに関連する二置換アミノ酸である。より特定の実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは分子内架橋、例えば、共有結合による分子内架橋を欠く。例えば、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ペプチドのαヘリックスを安定化するために１つ以上のα，α−二置換アミノ酸、例えば、アミノイソ酪酸を含むペプチドであり得る。本明細書において示されるように、位置４０にあるアミノ酸の側鎖に共有結合で結合するアシル化スペーサーを含むそのようなペプチドはＧＩＰ受容体、ＧＬＰ−１受容体、及び、グルカゴン受容体において増強された効力を示す。グルカゴン受容体における活性を選択的に低下させるアミノ酸修飾（例えば、グルタミン酸の位置３のグルタミンによる置換）をさらに含むことを除外して同じ構造を含むペプチドがさらに本明細書において企図される。
【０２２２】
アミン、ヒドロキシル基、及び、チオール基を介したペプチドアシル化の適切な方法は当該技術分野において公知である。例えば、（アミンを介したアシル化の方法について）実施例１９、（ヒドロキシル基を介したアシル化の方法について）Miller, 生化学生物物理研究コミュニケーション（Biochem Biophys Res Commun） 218: 377-382 (1996)、Shimohigashi and Stammer, ペプチド及びタンパク質研究国際誌（Int J Pept Protein Res） 19: 54-62 (1982)、及び、（チオール基を介したアシル化の方法について）Previero et al., 生化学及び生物物理会報（Biochim Biophys Acta） 263: 7-13 (1972)、及び、San and Silvius, ペプチド研究誌（J Pept Res） 66: 169-180 (2005)、Bioconjugate Chem. “Chemical Modifications of Proteins: History and Applications” pages 1, 2-12 (1990)、Hashimoto et al., 医薬品研究誌（Pharmacuetical Res.） "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989)を参照のこと。
【０２２３】
アシル化ＧＩＰアゴニストペプチドのアシル基は任意のサイズ、例えば、任意の長さの炭素鎖であることができ、直鎖状、又は、分枝状であることができる。本開示のいくつかの特定の実施形態において、アシル基は炭素数４から３０の脂肪酸である。例えば、アシル基は炭素数４の脂肪酸、炭素数６の脂肪酸、炭素数８の脂肪酸、炭素数１０の脂肪酸、炭素数１２の脂肪酸、炭素数１４の脂肪酸、炭素数１６の脂肪酸、炭素数１８の脂肪酸、炭素数２０の脂肪酸、炭素数２２の脂肪酸、炭素数２４の脂肪酸、炭素数２６の脂肪酸、炭素数２８の脂肪酸、又は、炭素数３０の脂肪酸のいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、アシル基は炭素数８から２０の脂肪酸、例えば、炭素数１４の脂肪酸、又は、炭素数１６の脂肪酸である。
【０２２４】
別の実施形態において、アシル基は胆汁酸である。胆汁酸は、限定されないが、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、及び、コレステロール酸を含む任意の適切な胆汁酸であり得る。
【０２２５】
本開示のいくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰアゴニストペプチドによる長鎖アルカンのアシル化により修飾されてアシル基を含む。特定の態様において、その長鎖アルカンは、ＧＩＰアゴニストペプチドのカルボキシル基と、又は、その活性化された形態と反応するアミン、ヒドロキシル基、又は、チオール基を含む（例えば、オクタデシルアミン、テトラデカノール、及び、ヘキサデカンチオール）。ＧＩＰアゴニストペプチドのカルボキシル基、又は、その活性化された形態はＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）の側鎖の部分であることができ、又は、ペプチド骨格の部分であることができる。
【０２２６】
ある実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰアゴニストペプチドに結合するスペーサーによる長鎖アルカンのアシル化により修飾されてアシル基を含む。特定の態様において、その長鎖アルカンは、スペーサーのカルボキシル基と、又は、その活性化された形態と反応するアミン、ヒドロキシル基、又は、チオール基を含む。カルボキシル基、又は、その活性化された形態を含む適切なスペーサーは本明細書に記載され、例えば、二官能性スペーサー、例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、及び、疎水性二官能性スペーサーを含む。
【０２２７】
本明細書では、「カルボキシル基の活性化された形態」という用語は、Ｘは脱離基であり、ＲはＧＩＰアゴニストペプチド、又は、スペーサーである一般式Ｒ（Ｃ＝Ｏ）Ｘを有するカルボキシル基を意味する。例えば、カルボキシル基の活性化された形態は、限定されないが、塩化アシル類、酸無水物類、及び、エステル類を含むことができる。いくつかの実施形態において、活性化されたカルボキシル基はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）脱離基を有するエステルである。
【０２２８】
長鎖アルカンがＧＩＰアゴニストペプチド、又は、スペーサーによりアシル化される本開示のこれらの態様に関して、長鎖アルカンは任意のサイズであることができ、任意の長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは直鎖状、又は、分枝状であり得る。ある態様において、長鎖アルカンは炭素数４から３０のアルカンである。例えば、長鎖アルカンは炭素数４のアルカン、炭素数６のアルカン、炭素数８のアルカン、炭素数１０のアルカン、炭素数１２のアルカン、炭素数１４のアルカン、炭素数１６のアルカン、炭素数１８のアルカン、炭素数２０のアルカン、炭素数２２のアルカン、炭素数２４のアルカン、炭素数２６のアルカン、炭素数２８のアルカン、又は、炭素数３０のアルカンのいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、長鎖アルカンは炭素数８から２０のアルカン、例えば、炭素数１４のアルカン、炭素数１６のアルカン、または、炭素数１８のアルカンを含む。
【０２２９】
また、いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドのアミン、ヒドロキシル基、又は、チオール基はコレステロール酸によりアシル化される。特定の実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは修飾されたシステインスペーサーを介してコレステロール酸に連結する。
【０２３０】
本明細書に記載されるアシル化ＧＩＰアゴニストペプチドは親水性部分を含むためにさらに修飾することができる。いくつかの特定の実施形態において、その親水性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載される方法のいずれかのような任意の適切な方法を通して達成することができる。この点で、アシル化ＧＩＰアゴニストペプチドは、位置１０、２０、２４、２９、及び、４０にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つがアシル基を含み、そして、位置１６、１７、２１、２４、２９、若しくは、Ｃ末端伸長部内の位置である位置４０にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つ、又は、Ｃ末端アミノ酸がシステイン、リシン、オルニチン、ホモシステイン、若しくは、アセチルフェニルアラニンに修飾され、そして、そのアミノ酸の側鎖が親水性部分（例えば、ＰＥＧ）と共有結合で結合する本明細書に記載の修飾のいずれかを含む配列番号１を包含することができる。いくつかの実施形態において、アシル基は位置１０、又は、位置４０に、任意選択的ではあるが、システイン、リシン、オルニチン、ホモシステイン、又は、アセチルフェニルアラニンを含むスペーサーを介して結合し、親水性部分は位置２４のシステイン残基に組み込まれる。
【０２３１】
あるいは、アシル化ＧＩＰアゴニストペプチドは、同時にアシル化され、そして、修飾されて親水性部分を含むスペーサーを包含することができる。適切なスペーサーの非限定的な例として、システイン、アセチルシステイン、リシン、オルニチン、ホモシステイン、及び、アセチルフェニルアラニンからなる群より選択される１つ以上のアミノ酸を含むスペーサーが挙げられる。
【０２３２】
本開示の特定の態様において、アシル化ＧＩＰアゴニストペプチドは配列番号２０１〜２０６、配列番号２１３〜２１５、配列番号２１７〜２１９、配列番号２２３〜２２５、配列番号２２８〜２３０、配列番号２３２〜２３４、配列番号２３６〜２３８、配列番号２４１〜２４５、配列番号２４８、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号３３１、配列番号３３４−３３９、配列番号３５７、及び、配列番号３５８のいずれかのアミノ酸配列を含み、任意選択で、グルカゴン受容体における活性を選択的に低下させるアミノ酸修飾、例えば、位置３のグルタミンのグルタミン酸による置換をさらに含む。
【０２３３】
いくつかの実施形態に従って、ＧＩＰアゴニストペプチドは修飾されてアルキル基、例えば、アミノ酸に自然に生じることがないアルキル基（例えば、天然のアミノ酸には本来備わらないアルキル基）を含む。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、本開示のＧＩＰアゴニストペプチドのアルキル化は、ＧＩＰアゴニストペプチドのアシル化と同じでなくても同様の作用を、例えば、循環半減期の延長、作用開始時期の遅滞、作用期間の延長、ＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する抵抗性の改善、並びに、ＧＬＰ−１受容体、ＧＩＰ受容体、及び、グルカゴン受容体における効力の増大を達成すると考えられている。
【０２３４】
ＧＩＰ活性（及び、任意選択で、ＧＬＰ−１活性、及び／又は、グルカゴン活性）が増強されなくても保持されるという条件で、位置１〜２９のいずれか、Ｃ末端伸長部のある位置、又は、Ｎ末端、若しくは、Ｃ末端アミノ酸を含むＧＩＰアゴニストペプチド内の任意の位置においてアルキル化を行うことができる。例えば、アミノ酸配列（配列番号１）に付加される任意のアミノ酸において、例えば、Ｎ末端、又は、Ｃ末端においてアルキル化を起こすことができる。非限定的な例として、位置１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は、５０の位置が挙げられる。アルキル基はＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸に直接的に共有結合で結合することができ、又は、ＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸とアルキル基の間に位置するスペーサーを介してＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸に間接的に共有結合で結合することができる。ＧＩＰアゴニストペプチドは親水性部分が結合するのと同じアミノ酸の位置において、又は、異なるアミノ酸の位置においてアルキル化することができる。非限定的な例として、位置１０、又は、位置４０でのアルキル化とＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端部分内の１つ以上の位置、例えば、Ｃ末端伸長部内の位置２４、２８、２９、若しくは、４０、又は、Ｃ末端での（例えば、Ｃ末端のシステインを付加することによる）ＰＥＧ化が挙げられる。
【０２３５】
本開示の特定の態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドはＧＩＰアゴニストペプチドのアミノ酸側鎖のアミン、ヒドロキシル基、又は、チオール基を直接アルキル化することにより修飾されてアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル基、又は、チオール基を介して直接アルキル化される。いくつかの実施形態において、アルキル化は位置１０、２０、２４、２９、又は、４０に存在する。この点で、アルキル化ＧＩＰアゴニストペプチドは配列番号１のアミノ酸配列、又は、位置１０、２０、２４、２９、及び、４０にあるアミノ酸の少なくとも１つが側鎖アミン、ヒドロキシル基、又は、チオール基を含む任意のアミノ酸に修飾される本明細書に記載のアミノ酸修飾の１つ以上を含むそれの修飾型アミノ酸配列を包含することができる。本開示のいくつかの特定の実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドの直接的なアルキル化は位置１０のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル基、又は、チオール基を介して起きる。
【０２３６】
いくつかの実施形態において、側鎖にアミンを含むアミノ酸は式Ｉのアミノ酸である。いくつかの例示的な実施形態において、式Ｉのアミノ酸はｎが４のアミノ酸（リシン）、又は、ｎが３のアミノ酸（オルニチン）である。
【０２３７】
別の実施形態において、側鎖にヒドロキシル基を含むアミノ酸は式ＩＩのアミノ酸である。いくつかの例示的な実施形態において、式ＩＩのアミノ酸はｎが１のアミノ酸（セリン）である。
【０２３８】
さらに別の実施形態において、側鎖にチオール基を含むアミノ酸は式ＩＩＩのアミノ酸である。いくつかの例示的な実施形態において、式ＩＩＩのアミノ酸はｎが１のアミノ酸（システイン）である。
【０２３９】
さらに別の実施形態において、側鎖アミン、ヒドロキシル基、又は、チオール基を含むアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩ、又は、式ＩＩＩのアミノ酸のα炭素に結合する水素が第２の側鎖で置換されることを除いて、式Ｉ、式ＩＩ、又は、式ＩＩＩと同じ構造を含む二置換アミノ酸である。
【０２４０】
本開示のある実施形態において、アルキル化ＧＩＰアゴニストペプチドはペプチドとアルキル基の間にスペーサーを含む。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、アルキル基に共有結合で結合するスペーサーに共有結合で結合する。いくつかの例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置１０、２０、２４、２９、又は、４０にあるアミノ酸の側鎖に結合するスペーサーのアミン、ヒドロキシル基、又はチオール基のアルキル化により修飾されてアルキル基を含む。スペーサーが結合するアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能にする部分を含む任意のアミノ酸（例えば、α−一置換アミノ酸、又は、α−二置換アミノ酸）であり得る。例えば、側鎖アミン、ヒドロキシル基、又は、カルボキシル基を含むアミノ酸（例えば、リシン、オルニチン、セリン、アスパラギン酸、又は、グルタミン酸）が適切である。この点で、アルキル化ＧＩＰアゴニストペプチドは配列番号１のアミノ酸配列、又は、位置１０、２０、２４、２９、及び、４０にあるアミノ酸の少なくとも１つが側鎖アミン、ヒドロキシル基、又は、カルボン酸基を含む任意のアミノ酸に修飾される本明細書に記載のアミノ酸修飾の１つ以上を含むそれの修飾型アミノ酸配列を包含することができる。
【０２４１】
いくつかの実施形態において、スペーサーは側鎖アミン、ヒドロキシル基、若しくは、チオール基を含むアミノ酸、又は、側鎖アミン、ヒドロキシル基、若しくは、チオール基を含むジペプチド、若しくは、トリペプチドである。
【０２４２】
スペーサーのアミン基を介してアルキル化が起きるとき、アルキル化はアミノ酸のα−アミン、又は、側鎖アミンを介して起こり得る。α−アミンがアルキル化される例において、スペーサーアミノ酸は任意のアミノ酸であり得る。例えば、スペーサーアミノ酸は疎水性アミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、及び、８−アミノオクタン酸であり得る。あるいは、スペーサーアミノ酸は、アルキル化が酸性残基のα−アミンに起きるという条件で、酸性残基、例えば、アスパラギン酸、及び、グルタミン酸であり得る。スペーサーアミノ酸の側鎖がアルキル化される例において、スペーサーアミノ酸は側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば、式Ｉのアミノ酸（例えば、リシン、又は、オルニチン）である。この例において、ＧＩＰアゴニストペプチドがジアルキル化されるように、スペーサーアミノ酸のα−アミンと側鎖アミンの両方がアルキル化されることが可能である。本開示の実施形態はそのようなジアルキル化分子を含む。
【０２４３】
アルキル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して起きるとき、アミノ酸、又は、ジペプチド、若しくは、トリペプチドのアミノ酸のうちの１つは式ＩＩのアミノ酸であり得る。具体的で例示的な実施形態において、そのアミノ酸はセリンである。
【０２４４】
アシル化がスペーサーのチオール基を介して起きるとき、アミノ酸、又は、ジペプチド、若しくは、トリペプチドのアミノ酸のうちの１つは式ＩＩＩのアミノ酸であり得る。具体的で例示的な実施形態において、そのアミノ酸はシステインである。
【０２４５】
いくつかの実施形態において、スペーサーは親水性二官能性スペーサーである。ある実施形態において、親水性二官能性スペーサーは２つ以上の反応基、例えば、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基、及び、カルボキシル基、又は、その任意の組合せを含む。ある実施形態において、親水性二官能性スペーサーはヒドロキシル基とカルボン酸基を含む。別の実施形態において、親水性二官能性スペーサーはアミン基とカルボン酸基を含む。別の実施形態において、親水性二官能性スペーサーはチオール基とカルボン酸基を含む。特定の実施形態において、スペーサーはアミノポリ（アルキルオキシ）カルボン酸基を含む。この点で、スペーサーは、例えば、ｍが１から６の任意の整数であり、ｎが２から１２の任意の整数であるＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨ、例えば、ペプチドインターナショナル（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）  Ｉｎｃ．（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ケンタッキー州）から市販されている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸のようなものを含むことができる。
【０２４６】
いくつかの実施形態において、前記スペーサーは疎水性二官能性スペーサーである。ある実施形態において、疎水性二官能性スペーサーは２つ以上の反応基、例えば、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基、及び、カルボキシル基、又は、それらの任意の組合せを含む。ある実施形態において、疎水性二官能性スペーサーはヒドロキシル基とカルボン酸基を含む。別の実施形態において、疎水性二官能性スペーサーはアミン基とカルボン酸基を含む。別の実施形態において、疎水性二官能性スペーサーはチオール基とカルボン酸基を含む。カルボン酸基とヒドロキシル基、若しくは、チオール基を含む適切な疎水性二官能性スペーサーは当該技術分野において公知であり、例えば、８−ヒドロキシオクタン酸、及び、８−メルカプトオクタン酸を含む。
【０２４７】
特定の実施形態におけるスペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、又は、疎水性二官能性スペーサー）は３から１０原子（例えば、６から１０原子、（例えば、６、７、８、９、又は、１０原子））の長さである。より特定の実施形態において、スペーサーとアルキル基の全長が１４から２８原子、例えば、約１４原子、１５原子、１６原子、１７原子、１８原子、１９原子、２０原子、２１原子、２２原子、２３原子、２４原子、２５原子、２６原子、２７原子、又は、２８原子であるように、スペーサーは約３から１０原子（例えば、６から１０原子）の長さであり、アルキル基は炭素数１２から１８の脂肪アシル基、例えば、炭素数１４のアルキル基、炭素数１６のアルキル基である。いくつかの実施形態において、スペーサーとアルキル基の長さは１７から２８原子（例えば、１９から２６原子、１９から２１原子）である。
【０２４８】
ある前述の実施形態に従って、二官能性スペーサーは、３から１０原子の長さのアミノ酸骨格を含む合成アミノ酸、又は、非天然アミノ酸（例えば、６−アミノヘキサンン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、及び、８−アミノオクタン酸）であり得る。あるいは、スペーサーは３から１０原子（例えば、６から１０原子）の長さのペプチド骨格を持つジペプチド、又は、トリペプチドであり得る。ジペプチドスペーサー、又は、トリペプチドスペーサーは、例えば、本明細書において教示されるアミノ酸のいずれかを含む天然アミノ酸、及び／又は、非天然アミノ酸から構成され得る。いくつかの実施形態において、スペーサーは全体的な負電荷、例えば、１つ、又は、２つの負に荷電したアミノ酸を、例えば、１つ、又は、２つの酸性残基を含む。いくつかの実施形態において、ジペプチドは、アラニン−アラニン、βアラニン−βアラニン、ロイシン−ロイシン、プロリン−プロリン、γアミノ酪酸−γアミノ酪酸、及び、γグルタミン酸−γグルタミン酸からなる群より選択される。
【０２４９】
アミン、ヒドロキシル基、及び、チオール基を介したペプチドアルキル化の適切な方法は当該技術分野において公知である。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎエーテル合成がＧＩＰアゴニストペプチドのヒドロキシル基とアルキル基の間にエーテル結合を形成するために用いられ得る。また、前記ペプチドのハロゲン化アルキルとの求核置換反応の結果、エーテル結合、チオエーテル結合、又は、アミノ結合のいずれかが生じることができる。
【０２５０】
アルキル化ＧＩＰアゴニストペプチドのアルキル基は任意のサイズ、例えば、任意の長さの炭素鎖であることができ、直鎖状、又は、分枝状であることができる。本開示のいくつかの実施形態において、アルキル基は炭素数４から３０のアルキル基である。例えば、アルキル基は炭素数４のアルキル基、炭素数６のアルキル基、炭素数８のアルキル基、炭素数１０のアルキル基、炭素数１２のアルキル基、炭素数１４のアルキル基、炭素数１６のアルキル基、炭素数１８のアルキル基、炭素数２０のアルキル基、炭素数２２のアルキル基、炭素数２４のアルキル基、炭素数２６のアルキル基、炭素数２８のアルキル基、又は、炭素数３０のアルキル基のいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、アルキル基は炭素数８から２０のアルキル基、例えば、炭素数１４のアルキル基、又は、炭素数１６のアルキル基である。
【０２５１】
いくつかの特定の実施形態において、アルキル基は胆汁酸、例えば、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、及び、コレステロール酸のステロイド部分を含む。
【０２５２】
本開示のいくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、求核置換に適した脱離基を含むＧＩＰアゴニストペプチドと求核性長鎖アルカンを反応させることにより修飾されてアルキル基を含む。特定の態様において、その長鎖アルカンの求核基は、アミン基、ヒドロキシル基、又は、チオール基を含む（例えば、オクタデシルアミン、テトラデカノール、及び、ヘキサデカンチオール）。ＧＩＰアゴニストペプチドの脱離基はアミノ酸の側鎖の部分であることができ、又は、ペプチド骨格の部分であることができる。適切な脱離基には、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ハロゲン類、及び、スルホン酸エステル類が挙げられる。
【０２５３】
ある実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドに結合し、脱離基を含むスペーサーと求核性長鎖アルカンを反応させることによりＧＩＰアゴニストペプチドは修飾されてアルキル基を含む。特定の態様において、長鎖アルカンはアミン基、ヒドロキシル基、チオール基を含む。ある実施形態において、脱離基を含むスペーサーは本明細書において考察される任意のスペーサー、例えば、適切な脱離基をさらに含むアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、及び、疎水性二官能性スペーサーであり得る。
【０２５４】
長鎖アルカンがＧＩＰアゴニストペプチド、又は、スペーサーによりアルキル化される本開示のこれらの態様に関して、長鎖アルカンは任意のサイズであることができ、任意の長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは直鎖状、又は、分枝状であり得る。ある態様において、長鎖アルカンは炭素数４から３０のアルカンである。例えば、長鎖アルカンは炭素数４のアルカン、炭素数６のアルカン、炭素数８のアルカン、炭素数１０のアルカン、炭素数１２のアルカン、炭素数１４のアルカン、炭素数１６のアルカン、炭素数１８のアルカン、炭素数２０のアルカン、炭素数２２のアルカン、炭素数２４のアルカン、炭素数２６のアルカン、炭素数２８のアルカン、又は、炭素数３０のアルカンのいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、長鎖アルカンは炭素数８から２０のアルカン、例えば、炭素数１４のアルカン、炭素数１６のアルカン、又は、炭素数１８のアルカンを含む。
【０２５５】
また、いくつかの実施形態において、アルキル化はＧＩＰアゴニストペプチドとコレステロール部分の間に起こり得る。例えば、コレステロールのヒドロキシル基は長鎖アルカン上の脱離基を置換することができ、コレステロール−ＧＩＰアゴニストペプチド産物を形成する。
【０２５６】
本明細書に記載されるアルキル化ＧＩＰアゴニストペプチドは親水性部分を含むためにさらに修飾することができる。いくつかの特定の実施形態において、その親水性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載される方法のいずれかのような任意の適切な方法を通して達成することができる。この点で、アルキル化ＧＩＰアゴニストペプチドは配列番号１、又は、位置１０、２０、２４、２９、及び、４０にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つがアルキル基を含み、そして、位置１６、１７、２１、２４、２９、及び、Ｃ末端伸長部内の位置である位置４０にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つ、若しくは、Ｃ末端アミノ酸がシステイン、リシン、オルニチン、ホモシステイン、又は、アセチルフェニルアラニンに修飾され、そして、そのアミノ酸の側鎖が親水性部分（例えば、ＰＥＧ）と共有結合で結合する本明細書に記載されるアミノ酸修飾の１つ以上を含む配列番号１の修飾型アミノ酸配列を包含することができる。いくつかの実施形態において、アルキル基は位置１０、又は、位置４０に、任意選択で、システイン、リシン、オルニチン、ホモシステイン、又は、アセチルフェニルアラニンを含むスペーサーを介して結合し、親水性部分は位置２４のシステイン残基に組み込まれる。
【０２５７】
あるいは、アルキル化ＧＩＰアゴニストペプチドは、アルキル化され、そして、修飾されて親水性部分を含むスペーサーを包含することができる。適切なスペーサーの非限定的な例として、システイン、リシン、オルニチン、ホモシステイン、及び、アセチルフェニルアラニンからなる群より選択される１つ以上のアミノ酸を含むスペーサーが挙げられる。
【０２５８】
ＤＰＰ−ＩＶに対する抵抗性を改善する修飾
本開示のいくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ）による切断に対するそのペプチドの抵抗性を増大させる１番、及び／又は、位置２の位置における１つ、又は、２つの修飾を含む。例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置２のアミノ酸はＤ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、又は、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）のうちの１つにより置換される。例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置１にあるアミノ酸はＤ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−メチルヒスチジン、α−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、又は、α，α−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）のうちの１つにより置換される。いくつかの態様において、ＤＰＰ  ＩＶに対する抵抗性を増大させるアミノ酸修飾を含むＧＩＰアゴニストペプチドは分子内架橋、又は、α，α−二置換アミノ酸を含み、そして、任意選択で、例えば、位置３のグルタミンのグルタミン酸による置換のようなグルカゴン受容体における活性を選択的に低下させるアミノ酸修飾を含む。
【０２５９】
分解を低減させる修飾
例示的な実施形態において、本開示のＧＩＰアゴニストペプチドのいずれかは、配列番号１の位置１５、及び／又は、位置１６のアミノ酸を修飾することによりさらに修飾されてペプチドの安定性を改善することができ、時間経過によるペプチドの分解、特に、酸性緩衝液、又は、アルカリ性緩衝液における分解が低下する。そのような修飾は位置１５のアスパラギンと位置１６のセリン間の結合の切断を低減させる。例示的な実施形態において、位置１５におけるアミノ酸修飾は欠質、又は、アスパラギン酸のグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、又は、ホモシステイン酸による置換である。別の例示的な実施形態において、位置１６におけるアミノ酸修飾は欠質、又は、セリンのトレオニン、若しくは、アミノイソ酪酸による置換である。別の、又は、追加の実施形態において、位置１６のセリンはグルタミン酸、若しくは、４原子の長さの側鎖を持つ負に荷電した別のアミノ酸により置換され、又は、代わりにグルタミン、ホモグルタミン酸、若しくは、ホモシステイン酸のいずれか１つにより置換される。そのような修飾は、ｐＨ５．５から８の範囲で分解、又は、切断を低減させることができ、例えば、２５℃で２４時間保温した後、元々のペプチドの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は、９９％、１００％までを保持する。そのような修飾は位置１５のアスパラギン酸と位置１６のセリンの間のペプチド結合の切断を低減させる。
【０２６０】
いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはペプチドの酸化分解を防ぐ修飾を含む。いくつかの態様において、天然グルカゴンペプチドの位置２７のメチオニンは、例えば、欠質、又は、置換により修飾される。いくつかの実施形態において、位置２７のメチオニンはロイシン、イソロイシン、又は、ノルロイシンによって置換される。いくつかの特定の実施形態において、位置２７のメチオニンはロイシン、又は、ノルロイシンによって置換される。
【０２６１】
いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドはグルタミンの脱アミド化による分解を低減させる１つ以上の修飾を含む。いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置２０、及び／又は、位置２４のグルタミンは、例えば、欠質、又は、置換により修飾される。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置２０、及び／又は、位置２４のグルタミンはセリン、トレオニン、アラニン、又は、アミノイソ酪酸により置換される。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置２０、及び／又は、位置２４のグルタミンはリシン、アルギニン、オルニチン、又は、シトルリンにより置換される。
【０２６２】
いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、環状スクシンイミド中間物を形成し、引き続いてイソアスパラギン酸へ異性化するアスパラギン酸の脱水による分解を低減させるアミノ酸修飾を含む。したがって、いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置２１にあるアスパラギン酸は、例えば、欠質、又は、置換により修飾される。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドの位置２１にあるアスパラギン酸はグルタミン酸、ホモグルタミン酸、又は、ホモシステイン酸により置換される。いくつかの特定の実施形態において、位置２１はグルタミン酸により置換される。
【０２６３】
可溶性を高める修飾
別の実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドのいずれの可溶性も、そのペプチドのＣ末端部分に、好ましくは、配列番号１の位置２７の位置に対してＣ末端側にある位置に荷電アミノ酸を導入する１つ以上のアミノ酸置換、及び／又は、アミノ酸付加により改善される。任意選択で、１つ、２つ、又は、３つの荷電アミノ酸がＣ末端部分、好ましくは、位置２７の位置に対してＣ末端側の部分に導入される。本開示のいくつかの実施形態において、位置２８、及び／若しくは、位置２９の天然アミノ酸は１つ、又は、２つの荷電アミノ酸により置換され、並びに／又は、さらなる実施形態において、１つから３つの荷電アミノ酸がまたＧＩＰアゴニストペプチドのＣ末端に付加される。例示的な実施形態において、前記荷電アミノ酸の１つ、２つ、又は、全てが負に荷電したアミノ酸、又は、酸性アミノ酸である。いくつかの実施形態において、負に荷電したアミノ酸、又は、酸性アミノ酸はアスパラギン酸、又は、グルタミン酸である。別の実施形態において、前記荷電アミノ酸の１つ、２つ、又は、全てが正に荷電される。そのような修飾は可溶性を高め、例えば、２５℃で２４時間保温した後に測定すると、５．５と８の間のｐＨ、例えば、ｐＨ７で天然グルカゴンと比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、３０倍、又は、それ以上の可溶性をもたらす。
【０２６４】
親水性部分の付加もまたＧＩＰアゴニストペプチドの可溶性を高めることができる。親水性部分とペプチドへのその結合は本明細書においてさらに記載される。「複合体」を参照のこと。例示的な実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは親水性部分、例えば、ポリエチレングリコールをＧＩＰアゴニストペプチドの位置１６、１７、２０、２１、２４、又は、２９の位置に、Ｃ末端伸長部内に、及び／又は、そのペプチドのＣ末端アミノ酸に結合する。そのような修飾はまた、作用期間、又は、ペプチドの循環半減期を増加させる。
【０２６５】
その他の修飾
ＧＩＰアゴニストペプチドがＧＩＰ活性（及び、任意選択で、ＧＬＰ−１活性、及び／又は、グルカゴン活性）を保持することをなお可能にするさらなる修飾、例えば、保存的置換がＧＩＰアゴニストペプチドになされ得る。例示的な修飾として、限定されないが、次のものが挙げられる。
【０２６６】
実質的に活性に影響を与えない非保存的、若しくは、保存的置換、付加、又は、欠質、例えば、位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、若しくは、２９のうちの１つ以上における保存的置換、これらの１つ以上のアラニンによる置換、位置２７、２８、若しくは、２９の内の１つ以上でのアミノ酸欠質、又は、Ｃ末端カルボン酸基の代わりのＣ末端アミド、若しくは、エステルと任意選択的に組み合わされる位置２９のアミノ酸の欠質、位置１２のリシンのアルギニンによる置換、位置１０のチロシンのバリン、若しくは、フェニルアラニンによる置換
【０２６７】
ＰＥＧ化の後の活性の保持は、Ｃ末端へのＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）の付加によりもたらされる。
【０２６８】
いくつかの実施形態において、位置１８がアラニン、セリン、又は、トレオニンからなる群より選択されるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態において、位置２０のアミノ酸がセリン、トレオニン、リシン、アルギニン、オルニチン、シトルリン、又は、アミノイソ酪酸で置換される。いくつかの実施形態において、位置２１がグルタミン酸、ホモグルタミン酸、又は、ホモシステイン酸で置換される。いくつかの実施形態において、ＧＩＰアゴニストペプチドは位置１６、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７、２８、及び、２９から選択される１個から１０個のアミノ酸修飾を含む。例示的な実施形態において、その修飾は位置１７のグルタミン、位置１８のアラニン、位置２１のグルタミン酸、位置２３のイソロイシン、位置２４のアラニン、位置２７のバリン、及び、位置２９のグリシンからなる群より選択される１つ以上のアミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、１７〜２６番の位置から選択される１個から５個のアミノ酸がもとのペプチドと異なる。別の実施形態において、位置１７〜２４の位置から選択される１個から５個のアミノ酸がもとのペプチドと異なる。さらに別の実施形態において、その修飾は位置１７のグルタミン、位置１８のアラニン、２位置１のグルタミン酸、位置２３のイソロイシン、位置２４のアラニンである。
【０２６９】
いくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸がＧＩＰアゴニストペプチドのカルボキシ末端に付加される。そのアミノ酸は２０個の一般的なアミノ酸のうちの１つから典型的に選択され、そして、いくつかの実施形態において、そのアミノ酸は天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミド基を有する。例示的な実施形態において、付加されたアミノ酸はグルタミン酸、及び、アスパラギン酸、及び、グリシンからなる群より選択される。
【０２７０】
活性を失わせることがないその他の修飾は位置１０のトリプトファン、又は、位置２０のアルギニンを含む。
【０２７１】
いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるＧＩＰアゴニストペプチドは１アミノ酸、又は、２アミノ酸のＣ末端短縮により修飾されるが、それでもグルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、及び／又は、ＧＩＰ受容体において同様の活性と効力を保持する。この点で、位置２９、及び／又は、位置２８のアミノ酸が欠質することができる。
【０２７２】
グルカゴンアンタゴニストペプチドの活性
グルカゴン受容体拮抗作用
本開示のいくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの最大反応の少なくとも約６０％の阻害を示す。代表的な実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの最大反応の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％の阻害を示す。したがって、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴン受容体と結合して、グルカゴン活性を阻害するかグルカゴン機能を防止する。
【０２７３】
本開示のいくつかの態様において、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴン受容体に対してマイクロモル範囲のＩＣ５０値を有する。代表的な実施形態では、グルカゴン受容体に対するグルカゴンアンタゴニストペプチドのＩＣ５０は、１０００μＭ未満、９００μＭ未満、８００μＭ未満、７００μＭ未満、６００μＭ未満、５００μＭ未満、４００μＭ未満、３００μＭ未満、２００μＭ未満、である。いくつかの実施形態では、グルカゴン受容体に対するグルカゴンアンタゴニストペプチドのＩＣ５０は約１００μＭ以下であり、例えば、約７５μＭ以下、約５０μＭ以下、約２５μＭ以下、約１０μＭ以下、約８μＭ以下、約６μＭ以下、約５μＭ以下、約４μＭ以下、約３μＭ以下、約２μＭ以下、または約１μＭ以下である。
【０２７４】
本開示のいくつかの態様において、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴン受容体に対してナノモル範囲のＩＣ５０値を有する。代表的な実施形態では、グルカゴン受容体に対するグルカゴンアンタゴニストペプチドのＩＣ５０は、１０００ｎＭ未満、９００ｎＭ未満、８００ｎＭ未満、７００ｎＭ未満、６００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、である。いくつかの実施形態では、グルカゴン受容体に対するグルカゴンアンタゴニストペプチドのＩＣ５０は約１００ｎＭ以下であり、例えば、約７５ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約８ｎＭ以下、約６ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下である。いくつかの態様において、グルカゴン受容体に対するグルカゴンアンタゴニストのＩＣ５０は、０．１ｎＭと５００ｎＭの間にある。いくつかの態様において、ＩＣ５０は約０．１ｎＭまたは約５００ｎＭである。いくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴン受容体活性に対して、ピコモル範囲のＩＣ値を示す。代表的な実施形態では、グルカゴン受容体に対するグルカゴンアンタゴニストペプチドのＩＣ５０は、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、である。いくつかの実施形態では、グルカゴン受容体に対するグルカゴンアンタゴニストペプチドのＩＣ５０は約１００ｐＭ以下であり、例えば、約７５ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約２５ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約８ｐＭ以下、約６ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約４ｐＭ以下、約３ｐＭ以下、約２ｐＭ以下、または約１ｐＭ以下である。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、約１μＭの濃度において、グルカゴンがグルカゴン受容体に対して達成する最大アゴニスト活性の約２０％以下を示す、グルカゴンアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、約１μＭの濃度で存在するとき、グルカゴン受容体に対してグルカゴンが達成する最大アゴニスト活性の約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、または約０％を示すグルカゴンアンタゴニストである。
【０２７６】
いくつかの態様では、グルカゴンアンタゴニストペプチドはグルカゴン受容体に対して「完全アンタゴニスト」であり、他のいくつかの態様では、グルカゴンアンタゴニストペプチドはグルカゴン受容体に対して「部分アンタゴニスト」である。本明細書で使用する「完全アンタゴニスト」は、受容体と結合して、拮抗の対象である受容体に対してアゴニスト活性をまったく示さないアンタゴニストを意味する。本明細書で使用する「部分アンタゴニスト」は、「部分アゴニスト」と同義である。部分アゴニストとは、受容体に対して完全アゴニストより少量のアゴニスト活性を示す化合物である。しかし、部分アゴニストは受容体を占有して完全アゴニストの結合を妨げるので、アンタゴニストの働きをする。これにより、完全アゴニストがすべての受容体と結合する場合の受容体活性レベルと比べて、受容体活性の正味のレベルは減少する。
【０２７７】
本開示のいくつかの態様において、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、１つの受容体でのみ活性（アゴニストまたはアンタゴニスト）を示す。したがって、いくつかの態様におけるグルカゴンアンタゴニストペプチドは、「純粋なグルカゴンアンタゴニスト」であり、グルカゴン受容体、または、例えばＧＬＰ−１受容体、ＧＩＰ受容体を含む他の受容体に対して、いかなる検出される刺激も発生しない。このことは、実施例２に記述するように、検証済みインビトロモデルアッセイを使用したｃＡＭＰ産生で測定される。例えば、純粋なグルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体に対してグルカゴンが達成する最大アゴニスト活性の約５％未満（例えば約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０％）を示し、ＧＬＰ−１受容体に対してＧＬＰ−１が達成する最大アゴニスト活性の約５％未満（例えば約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０％）を示し、かつ／または、ＧＩＰ受容体に対してＧＩＰが達成する最大アゴニスト活性の約５％未満（例えば約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０％）を示す。
【０２７８】
本開示の他のいくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、１つより多くの受容体で活性（アゴニストまたはアンタゴニスト）を示す。このような実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、別の受容体にと比較したある受容体に対する選択性を失っている。例えば、いくつかの実施形態におけるグルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴン受容体のアンタゴニストであり、別の受容体、例えばＧＬＰ−１受容体および／またはＧＩＰ受容体に対しては、アンタゴニストまたはアゴニストである。いくつかの実施形態におけるグルカゴンアンタゴニストペプチドは、このペプチドがグルカゴン受容体に対するアンタゴニスト活性と、別の受容体、例えばＧＬＰ−１受容体やＧＩＰ受容体に対するアゴニスト活性を示す限りにおいて、混合性の特性を示す。例を挙げると、いくつかの態様におけるグルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴン受容体に対するアンタゴニスト活性と、ＧＬＰ−１受容体に対するアゴニスト活性の両方を示す（「グルカゴン受容体アンタゴニスト／ＧＬＰ−１受容体アゴニスト」）。いくつかの態様において、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴン受容体に対する本明細書に記載のＩＣ５０値のいずれかを有し、ＧＬＰ−１受容体に対する本明細書に記載のＥＣ５０値のいずれかを有する。いくつかの実施形態では、グルカゴン受容体にする対するグルカゴンアンタゴニストのＩＣ５０は、ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０と比べて、約５０倍以下、約４０倍以下、約３０倍以下、または約２０倍以下の差がある（より高いか低い）。いくつかの実施形態では、グルカゴン受容体に対するグルカゴンアンタゴニストペプチドのＩＣ５０を、ＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴンアンタゴニストペプチドのＥＣ５０で割った比率は、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、または約５未満、かつ１以上である。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴンアンタゴニストペプチドのＥＣ５０を、グルカゴン受容体に対するグルカゴンアンタゴニストペプチドのＩＣ５０で割った比率は、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、または約５未満、かつ１以上である。
【０２７９】
複合体の活性
いくつかの実施形態では、本明細書に記述するグルカゴンアンタゴニストペプチドは、上記のように、グルカゴン受容体に対する阻害活性および／またはＧＬＰ−１受容体に対するアゴニスト活性を示し、かつ、グルカゴンアンタゴニストペプチドが複合体の一部であるときには（例えば、異種部分（例えばポリエチレングリコール等の親水性部分）と結合しているとき）、このグルカゴンアンタゴニストペプチドは、複合体の一部でないときよりも低い活性を示す（つまり、阻害効力が低い、すなわちＩＣ５０が高い）。いくつかの態様において、複合体の一部でないときのグルカゴンアンタゴニストペプチドは、複合体の一部となっているときのグルカゴンアンタゴニストペプチドと比べて、グルカゴン受容体に対する約１０倍以上の阻害効力を示す。いくつかの態様において、複合体化していないときのグルカゴンアンタゴニストペプチドは、複合体化しているときのグルカゴンアンタゴニストペプチドと比べて、グルカゴン受容体に対する約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約１００倍、あるいはそれ以上の阻害効力を示す。
【０２８０】
グルカゴンアンタゴニストペプチドの構造
本開示のいくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、指示された受容体に対して上記活性（効力またはＥＣ５０）のいずれかを示すグルカゴンアンタゴニストであり、構造的には天然ヒトグルカゴン（配列番号１）に類似しており、例えば、天然ヒトグルカゴンの類似体（またはグルカゴン類似体）である。グルカゴン受容体アンタゴニスト活性を示すこうしたグルカゴン類似体は、当該技術分野では公知である。例えば、天然ヒトグルカゴンアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸が欠失するか置換されたグルカゴンアンタゴニストには、［ｄｅｓ  Ｈｉｓ１ ］［Ｇｌｕ９ ］−グルカゴンアミド（Ｕｎｓｏｎら，（１９８９）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １０，１１７１；Ｐｏｓｔら，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，１６６２），ｄｅｓ  Ｈｉｓ１ ，Ｐｈｅ６ ［Ｇｌｕ９ ］−グルカゴンアミド（Ａｚｉｚｈら，（１９９５）Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１６，１８４９）、およびＮｌｅ９ ，Ａｌａ１１，１６ −グルカゴンアミド（Ｕｎｓｏｎら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１７），１２５４８）が含まれる。他の類似体には、グルカゴン配列の４番の位置（Ａｈｎ  Ｊ  Ｍら（２００１）Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５８（２）：１５１−８），位置１（Ｄｈａｒａｎｉｐｒａｇａｄａ，Ｒ．ら（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．４２（１）：６８−７７）、ならびに位置４、５、１２、１７、および１８（Ｇｙｓｉｎ  Ｂら  １９８６．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２５（２５）：８２７８−８４））に置換のあるものが含まれる。さらに、天然ヒトグルカゴンと構造が似たグルカゴンアンタゴニストは、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０５８６６２号およびＷＯ２００９／０５８７３４号、ならびに米国特許出願第６０／９８３，７８３号；第６０／９８３，７６６号；および第６１／０９０，４４１号にも記述されている。これらの内容は、参照によりその全部が組み込まれる。
【０２８１】
よって、いくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、天然ヒトグルカゴン（配列番号１）の類似体であり、配列番号１に基づくアミノ酸配列を含むが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、場合によって１６個以上（例えば１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個等）のアミノ酸修飾で修飾されている。いくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、天然ヒトグルカゴン配列（配列番号１）に対するアミノ酸修飾を計１個、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、最大６個、最大７個、最大８個、最大９個、または最大１０個含む。いくつかの実施形態では、これらの修飾は、本明細書に記述する修飾のいずれかである。例えば、Ｎ末端での短縮、デプシペプチドの形成、位置９での置換、アシル化、アルキル化、ＰＥＧ化、Ｃ末端での短縮、位置１、位２、３、７、１０、１２、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３番、２４、２７、２８、および２９の１つ以上でのアミノ酸の置換等である。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、本開示のグルカゴンアンタゴニストペプチドは、天然ヒトグルカゴンのアミノ酸配列（配列番号１）と少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、配列番号１との配列同一性が少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または９０％超であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記の配列同一性％値を有するグルカゴンアンタゴニストペプチドのアミノ酸配列は、グルカゴンアンタゴニストペプチドの全長アミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、上記の配列同一性％値を有するグルカゴンアンタゴニストペプチドのアミノ酸配列は、グルカゴンアンタゴニストペプチドのアミノ酸配列の一部分のみである。いくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、配列番号１の少なくとも５つの連続したアミノ酸（例えば、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０のアミノ酸）の基準アミノ酸配列の、約Ａ％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ここで、この基準アミノ酸配列は、配列番号１の位置Ｃのアミノ酸で始まり、配列番号１の位置Ｄのアミノ酸で終わり、Ａは２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９であり、Ｃは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８であり、Ｄは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９である。前述のパラメーターのあらゆる可能な組み合わせが想定されている。例えば、Ａは９０％であり、ＣとＤは１と２７である、または６と２７である、または８と２７である、または１０と２７である、または１２と２７である、または１６と２７である等が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８３】
天然ヒトグルカゴン（配列番号１）の類似体である本明細書に記載のＧＩＰアゴニストペプチドは、任意の数のアミノ酸のペプチド骨格を含むことができる。すなわち、任意のペプチド長にできる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＧＩＰアゴニストペプチドは、配列番号１と同じ長さである。すなわち、アミノ酸２９個の長さである。いくつかの実施形態では、ＧＩＰアゴニストペプチドの長さはアミノ酸２９個より長い。例えば、ＧＩＰアゴニストペプチドは、後で詳述するように、アミノ酸１〜２１個のＣ末端伸長部を含む。したがって、いくつかの実施形態におけるＧＩＰアゴニストペプチドの長さは、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＧＩＰアゴニストペプチドの長さは、別のペプチドとの融合のため、アミノ酸２９個より長く、例えばアミノ酸５０個より長い（例えば、アミノ酸の個数が少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、または少なくとも約５００の長さである）。他のいくつかの実施形態では、ＧＩＰアゴニストペプチドの長さはアミノ酸２９個未満であり、例えば、アミノ酸の個数が２８、２７、２６、２５、２４、２３の長さである。
【０２８４】
上記に従い、いくつかの態様において、本開示のグルカゴンアンタゴニストペプチドは、天然ヒトグルカゴン（配列番号１）の類似体であり、配列番号１に対する１つ以上のアミノ酸修飾を含む。これらのアミノ酸修飾は、グルカゴン活性を低減または破壊し、ＧＬＰ−１活性またはＧＩＰ活性を増加または増強し、例えばペプチドの分解を低減するなどして安定性を増強し（例えばＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼに対する耐性を向上させ）、溶解度を増強し、半減期を増加し、作用開始を遅らせ、ＧＩＰ受容体、グルカゴン受容体、もしくはＧＬＰ−１受容体に対する作用の持続時間を延長させ、または、これらのいずれかの組み合わせを行う。このようなアミノ酸修飾については、他の修飾に加えて、本明細書でさらに説明する。
【０２８５】
グルカゴンアンタゴニストペプチドの代表的な実施形態
通常の状況下では、天然ヒトグルカゴンは、人体のグルカゴン受容体を活性化する。本明細書では、天然ヒトグルカゴンのアミノ酸配列（配列番号１）の修飾を説明する。こうした修飾により、このホルモンが変質して、グルカゴン受容体に拮抗作用を及ぼす（例えば、受容体に結合はするが、下流のシグナル伝達を活性化させない）。
【０２８６】
本開示のいくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、天然ヒトグルカゴンの配列（配列番号１）に基づくアミノ酸配列を含むが、Ｎ末端から最初の２〜５個のアミノ酸残基が欠失し、天然タンパク質（配列番号１）の位置９のアスパラギン酸がグルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体、または以下の構造を有するシステインのアルキルカルボン酸誘導体：
【化１６】
2013518115.tif 000017
［式中、Ｘ５ はＣ１ −Ｃ４ アルキル、Ｃ２ −Ｃ４ アルケニル、またはＣ２ −Ｃ４ アルキニルである］
で置換されることにより、アミノ酸配列が修飾される。
【０２８７】
特定の態様において、グルカゴンアンタゴニスト活性を示し、かつＮ末端からの２〜５個のアミノ酸残基の欠失と、天然グルカゴンの位置９のアスパラギン酸の置換を含むグルカゴンアンタゴニストペプチドは、さらに、最大３個のアミノ酸修飾により修飾される。例えば、いくつかの態様におけるグルカゴンアンタゴニストペプチドは、１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸修飾を含む。これに代替または追加して、いくつかの態様におけるグルカゴンアンタゴニストペプチドは、以下からなる群より選ばれる１つ以上のアミノ酸修飾を含む。
Ａ．グルカゴンアンタゴニストの位置１０、２０、および２４（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の１つまたは２つのアミノ酸、またはＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸が、アシル基またはアルキル基にエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合、またはアルキルアミン結合で共有結合しているアミノ酸で置換される；
Ｂ．グルカゴンアンタゴニストの位置１６、１７、２０、２１、および２４の位置（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の１つまたは２つのアミノ酸、またはＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸が、システイン、リシン、オルニチン、ホモシステイン、およびアセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選ばれるアミノ酸で置換される（ここで、この群のアミノ酸は親水性部分と共有結合している）；
Ｃ．親水性部分と共有結合しているアミノ酸が、グルカゴンアンタゴニストのＮ末端またはＣ末端に付加する；
Ｄ．位置１５（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のアスパラギン酸が、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸で置換される；
Ｅ．位置１６（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のセリンが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸で置換される；
Ｆ．配列番号１のアミノ酸番号付けによる位置１６、２０、２１、および２４の１つ以上の位置がＡＩＢで置換される；
Ｇ．配列番号１のアミノ酸番号付けによる位置２９のアミノ酸または位置２８と位置２９のアミノ酸が欠失する；
Ｈ．位置２８のアスパラギンと位置２９（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のトレオニンのいずれか一方または両方が、荷電アミノ酸で置換される；および／または、１〜２個の荷電アミノ酸が配列番号１のＣ末端に付加する；
Ｉ．位置２７（配列番号１の番号付けによる）のメチオニンが、ロイシンまたはノルロイシンで置換される；
Ｊ．配列番号１１１９〜１１２１および１１５３のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドが、配列番号１のＣ末端に付加する（ここで、位置２９（配列番号１の番号付けによる）のトレオニンはトレオニンまたはグリシンである）；および
Ｋ．Ｃ末端カルボン酸基がアミドまたはエステルに置き換わる。
【０２８８】
本開示の特定の態様において、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、上記Ａ、Ｂ、もしくはＣのアミノ酸修飾、またはこれらの組み合わせを含む。さらに別の特定の実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、アミノ酸修飾Ａ、Ｂ、および／またはＣに加えて、上記Ｄ〜Ｋのいずれかのアミノ酸修飾またはこれらの組み合わせをさらに含む。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、天然ヒトグルカゴンのアミノ酸配列を含むが、この場合、最初の５個のアミノ酸がＮ末端から欠失し、残りのＮ末端α−アミノ基はヒドロキシル基で置換される。これらの実施形態のＮ末端残基は、フェニル乳酸（ＰＬＡ）である。
【０２９０】
最初のアミノ酸５個がＮ末端から欠失し、残りのＮ末端アミノ基がヒドロキシル基で置換される、本開示のいくつかの態様では、位置４（天然グルカゴンの位置９）のアスパラギン酸残基を、以下の一般構造：
【化１７】
2013518115.tif 000018
［式中、Ｘ６ はＣ１ −Ｃ３ アルキル、Ｃ２ −Ｃ３ アルケニル、またはＣ２ −Ｃ３ アルキニルである］
で置換することにより、位置９の位置（配列番号１の番号付けによる）のアミノ酸を修飾する。いくつかの実施形態では、ＸはＣ１ −Ｃ３ アルキルであり、他のいくつかの実施形態では、ＸはＣ２ アルキルである。いくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは配列番号１を含むが、最初のアミノ酸５個はＮ末端から欠失し、４番の位置（天然グルカゴンの位置９）のアスパラギン酸残基はシステイン酸またはホモシステイン酸で置換される。しかし、ＰＬＡがＮ末端残基である実施形態では、位置９（配列番号１の番号付けによる）の置換は任意とみなされる。なぜなら、位置９の修飾はグルカゴン受容体でのアンタゴニスト活性に不要だからである。
【０２９１】
本開示のいくつかの態様において、グルカゴンアンタゴニストペプチドは配列番号１を含み、この配列の最初のアミノ酸５個はＮ末端から欠失し、配列番号１の６番目の残基（グルカゴンアンタゴニストペプチドの１番目のアミノ酸）は、ＰＬＡまたは他のフェニルアラニン類似体、例えば、３，４−２Ｆ−フェニルアラニン（３，４−２Ｆ−Ｐｈｅ）、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）、Ｎ−アシルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）、α−メチルヒドロケイ皮酸（ＭＣＡ）、ベンジルマロン酸（ＢＭＡ）である。しかし、国際公開第２００９／０５８６６２号に示されているように、位置６（配列番号１の番号付けによる）をＰＬＡで置換すると、より効力の高いグルカゴンアンタゴニストが得られる。
【０２９２】
本開示のいくつかの態様において、グルカゴンアンタゴニストペプチドは一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含む。ここで、Ａは、以下からなる群より選ばれる：
（ｉ）フェニル乳酸（ＰＬＡ）；
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体；
（ｉｉｉ）アミノ酸２〜６個のペプチドであって、このうちの連続した２個のアミノ酸がエステル結合またはエーテル結合を介して結合しているペプチド。
Ｂは、配列番号１のｉ〜２６のアミノ酸を表し（ここでｉは３、４、５、６、または７である）、任意で、以下からなる群から選ばれる１つ以上のアミノ酸修飾を含む：
（ｉｖ）位置９（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のアスパラギン酸が、グルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、または以下の構造：
【化１８】
2013518115.tif 000019
［式中、Ｘ５ はＣ１ −Ｃ４ アルキル、Ｃ２ −Ｃ４ アルケニル、またはＣ２ −Ｃ４ アルキニルである］
を有するシステインのアルキルカルボン酸誘導体で置換される；
（ｖ）位置１０、２０、および２４（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の１つまたは２つのアミノ酸が、アシル基またはアルキル基とエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合、またはアルキルアミン結合で共有結合しているアミノ酸で置換される；
（ｖｉ）位置１６、１７、２０、２１、および２４（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の１つまたは２つのアミノ酸が、システイン、リシン、オルニチン、ホモシステイン、およびアセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選ばれるアミノ酸（ここで、この群のアミノ酸は親水性部分と共有結合している）で置換される；
（ｖｉｉ）位置１５（配列番号１の番号付けによる）のアスパラギン酸が、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸で置換される；
（ｖｉｉｉ）位置１６（配列番号１の番号付けによる）のセリンが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸で置換される；
（ｉｘ）配列番号１のアミノ酸番号付けによる位置１６、２０、２１、および２４の１つ以上が、ＡＩＢで置換される。
Ｃは、以下からなる群から選ばれる：
（ｘ）Ｘ；
（ｘｉ）Ｘ−Ｙ；
（ｘｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ；および
（ｘｉｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０；
［ここでＸは、メチオニン、ロイシン、またはノルロイシンであり；Ｙは、アスパラギンまたは荷電アミノ酸であり；Ｚは、トレオニン、グリシン、システイン、リシン、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）、または荷電アミノ酸であり；Ｒ１０は、配列番号１１１９〜１１２１および１１５３からなる群より選ばれる］
（ｘｉｖ）（ｘ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれかであって、Ｃ末端カルボン酸基がアミドに置き換わったもの。
【０２９３】
特定の態様において、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、本明細書に記載の一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含み、かつＧＬＰ−１受容体に対するアゴニスト活性を示す。したがって、いくつかの態様では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは以下の（１）〜（３）を含む：（１）本明細書に記載の手段、例えば分子内架橋、もしくは１つ以上のα，α−二置換アミノ酸の組み込み、もしくは位置１６（配列番号１の番号付けによる）の酸性アミノ酸の組み込み、またはこれらの組み合わせによる、安定化したαヘリックス；（２）Ｃ末端カルボン酸基と置き換わったＣ末端アミドまたはエステル；および（３）一般構造Ａ−Ｂ−Ｃ。
ここで、Ａは、以下からなる群から選ばれる：
（ｉ）ＰＬＡ；
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体；および
（ｉｉｉ）アミノ酸２〜６個のペプチドであって、このうちの連続した２個のアミノ酸がエステル結合またはエーテル結合を介して結合しているペプチド。
Ｂは、配列番号１のｐ〜２６のアミノ酸を表し（ここでｐは３、４、５、６、または７である）、任意で、以下からなる群より選ばれる１つ以上のアミノ酸修飾を含む：
（ｉｖ）位置９（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のアスパラギン酸が、グルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、または以下の構造：
【化１９】
2013518115.tif 000020
［式中、Ｘ５ はＣ１ −Ｃ４ アルキル、Ｃ２ −Ｃ４ アルケニル、またはＣ２ −Ｃ４ アルキニルである］
を有するシステインのアルキルカルボン酸誘導体で置換される；
（ｖ）位置１０、２０、および２４（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の１つまたは２つのアミノ酸が、アシル基またはアルキル基とエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合、またはアルキルアミン結合で共有結合しているアミノ酸で置換される；
（ｖｉ）位置１６、１７、２０、２１、および２４の位置（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）の１つまたは２つのアミノ酸が、システイン、リシン、オルニチン、ホモシステイン、およびアセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選ばれるアミノ酸（ここで、この群のアミノ酸は親水性部分と共有結合している）で置換される；
（ｖｉｉ）位置１５（配列番号１の番号付けによる）のアスパラギン酸が、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸で置換される；
（ｖｉｉｉ）位置１６（配列番号１の番号付けによる）のセリンが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸で置換される；
（ｉｘ）位置１７のアルギニンはグルタミンで置換され、位置１８のアルギニンはアラニンで置換され、２位置１のアスパラギン酸はグルタミン酸で置換され、位置２３のバリンはイソロイシンで置換され、位置２４のグルタミンはアラニンで置換される（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）；
（ｘ）位置１６のセリンはグルタミン酸で置換され、位置２０のグルタミンはグルタミン酸で置換され、または位置２４のグルタミンはグルタミン酸で置換される（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）。
Ｃは、以下からなる群より選ばれる：
（ｖｉｉ）Ｘ；
（ｖｉｉｉ）Ｘ−Ｙ；
（ｉｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ；
（ｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０；
［ここでＸは、メチオニン、ロイシン、またはノルロイシンであり；Ｙは、アスパラギンまたは荷電アミノ酸であり；Ｚは、トレオニン、グリシン、システイン、リシン、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）、または荷電アミノ酸であり；Ｒ１０は、配列番号１２２１、１２２６、１２２７、および１２５０からなる群より選ばれる］。
【０２９４】
グルカゴンアンタゴニストペプチドが一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含む特定の態様において、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、ＰＬＡのオキシ誘導体を含む。本明細書で使用する「ＰＬＡのオキシ誘導体」という語は、ＰＬＡの修飾構造を含む化合物であって、ヒドロキシル基がＯ−Ｒ１１ （Ｒ１１ は化学的部分である）で置換された化合物を意味する。この点で、ＰＬＡのオキシ誘導体は、例えばＰＬＡのエステルまたはＰＬＡのエーテルとなることができる。
【０２９５】
ＰＬＡのオキシ誘導体の製造方法は、当該技術分野において公知である。例えば、オキシ誘導体がＰＬＡのエステルである場合、ＰＬＡのヒドロキシル基と、求核剤を有するカルボニルとの反応によりエステルを形成できる。求核剤は任意の好適な求核剤でよく、例えばアミンまたはヒドロキシル基が含まれるが、これらに限定されない。したがって、ＰＬＡのエステルは、式Ｖの構造を含むことができる：
【化２０】
2013518115.tif 000021
［式中、Ｒ７は、ＰＬＡのヒドロキシル基と、求核剤を有するカルボニルとの反応により形成されるエステルである］
【０２９６】
求核成分を有するカルボニル基（ＰＬＡのヒドロキシル基と反応してエステルを形成するカルボニル基）は、例えば、カルボン酸、カルボン酸誘導体、またはカルボン酸の活性化エステルであり得る。カルボン酸誘導体は、塩化アシル、酸無水物、アミド、エステル、またはニトリルであり得るが、これらに限定されない。カルボン酸の活性化エステルは、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、トシレート（Ｔｏｓ）、カルボジイミド、またはヘキサフルオロホスフェートであり得る。いくつかの実施形態では、カルボジイミドは、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、または１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣＤ）である。いくつかの実施形態では、ヘキサフルオロホスフェートは、ヘキサフルオロホスフェート  ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル  ウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、およびｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ）からなる群より選ばれる。
【０２９７】
ヒドロキシル基（例えばＰＬＡのヒドロキシル基）との反応からエーテルを製造する方法も、当該技術分野では公知となっている。例えば、ＰＬＡのヒドロキシル基を、ハロゲン化アルキルまたはトシル化アルキルアルコールと反応させて、エーテル結合を形成できる。
【０２９８】
一般に、Ｒ１１ の化学的部分は、グルカゴンアンタゴニストペプチドの活性を減少させない化学的部分である。いくつかの実施形態では、この化学的部分は、グルカゴンアンタゴニストペプチドの活性、安定性、および／または溶解性を増強する。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、酸素含有結合を介して（例えばエステル結合またはエーテル結合を介して）ＰＬＡに結合している化学的部分は、ポリマー（例えばポリアルキレングリコール）、炭水化物、アミノ酸、ペプチド、または脂質、例えば脂肪酸もしくはステロイドである。
【０３００】
特定の実施形態では、この化学的部分はアミノ酸であり、任意で、式Ｖがデプシペプチドとなるように、この化学的部分はペプチドの一部であってもよい。この点で、ＰＬＡは、グルカゴンアンタゴニストペプチドがＰＬＡ残基の１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６個またはそれ以上）のアミノ酸Ｎ末端を含むように、グルカゴンアンタゴニストペプチドのＮ末端アミノ酸残基以外の位置にあってよい。例えば、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴンアンタゴニストペプチドの位置ｎにＰＬＡを含むことができる（ここでｎは２、３、４、５、または６である）。
【０３０１】
ＰＬＡ残基のＮ末端のアミノ酸は、合成アミノ酸であってもよく、あるいは天然由来のアミノ酸であってもよい。特定の実施形態では、ＰＬＡのＮ末端であるアミノ酸は、天然由来のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＰＬＡのＮ末端であるアミノ酸は、天然グルカゴンのＮ末端アミノ酸である。例えば、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、Ｎ末端に下記配列番号１１５４〜１１５８のいずれかのアミノ酸配列を含むことができ、この場合、ＰＬＡは、エステル結合を介してトレオニンと結合する。
配列番号１１５４  ヒスチジン−セリン−グルタミン−グリシン−トレオニン−ＰＬＡ
配列番号１１５５  セリン−グルタミン−グリシン−トレオニン−ＰＬＡ
配列番号１１５６  グルタミン−グリシン−トレオニン−ＰＬＡ
配列番号１１５７  グリシン−トレオニン−ＰＬＡ
配列番号１１５８  トレオニン−ＰＬＡ
【０３０２】
代替の実施形態では、Ｎ末端アミノ酸の１つ以上を、天然グルカゴンのアミノ酸以外のアミノ酸で置換してよい。例えば、グルカゴンアンタゴニストペプチドが位置５または位置６のアミノ酸としてＰＬＡを含む場合、位置１および／または位置２のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するアミノ酸であってよい。より詳細には、いくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドの位置１は、Ｄ−ヒスチジン、α，α−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、α−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、およびホモ−ヒスチジンからなる群より選ばれるアミノ酸である。より詳細には、いくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドの位置２の位置は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、およびアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選ばれるアミノ酸である。また、例えば、グルカゴンアンタゴニストペプチドが４番、５、または６のアミノ酸としてＰＬＡを含む場合、グルカゴンアンタゴニストペプチドの位置３のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然グルタミン残基とは対照的に、グルタミン酸であってよい。本開示の代表的な実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、Ｎ末端に、配列番号１１５９〜１１６１のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【０３０３】
式Ｖの化合物を含むグルカゴンアンタゴニストペプチドに関して、ＰＬＡと結合する化学的部分であるポリマーは、ＰＬＡのヒドロキシル基と反応できる限り、任意のポリマーでよい。このポリマーは、求核剤を有するカルボニルを、自然にまたは通常は含むものであってよい。あるいは、このポリマーは、カルボニルを有するカルボニルを含むように誘導体化されたものでもよい。このポリマーは、以下のいずれかを誘導体化したポリマーであってよい：ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、およびその誘導体（ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレートを含む）；ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、およびポリ（オクタデシルアクリレート）を含むアクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルのポリマー；ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハロゲン化物、ポリ（酢酸ビニル）、およびポリビニルピロリドンを含むポリビニルポリマー；ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、およびそのコポリマー；アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシルエチルセルロース、三酢酸セルロース、およびセルロース硫酸ナトリウム塩を含むセルロース；ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、およびポリ（エチレンテレフタレート）を含むポリエチレン、ならびにポリスチレン。
【０３０４】
ポリマーは、生分解性ポリマーであることができ、具体的には、合成の生分解性ポリマー（例えば、乳酸とグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コカプロラクトン））および天然の生分解性ポリマー（例えば、アルギン酸、およびデキストラン等の他の多糖類、セルロース、コラーゲン、これらの化学的誘導体（例えばアルキル、アルキレン等の化学基の置換、付加、およびヒドロキシル化、酸化、その他、当業者が日常的に行っている修飾）、アルブミンおよび他の親水性タンパク質（例えば、ゼイン、他のプロラミン、および疎水性タンパク質））、ならびに、これらの任意のコポリマーまたは混合物であることができる。一般に、これらの物質は、インビボでの酵素加水分解または水への露出によって、表面浸食またはバルク侵食により分解される。
【０３０５】
ポリマーは、生体接着性ポリマーであることができ、例えば、Ｈ．Ｓ．Ｓａｗｈｎｅｙ，Ｃ．Ｐ．Ｐａｔｈａｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｈｕｂｂｅｌｌ  ｉｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９３，２６，５８１−５８７に記述されている生体侵食性ヒドロゲル（この教示内容は本明細書に組み込まれる）、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、およびポリ（オクタデシルアクリレート）であることができる。
【０３０６】
いくつかの態様において、ポリマーは水溶性ポリマーである。好適な水溶性ポリマーは、当該技術分野で公知となっており、例として、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ；Ｋｌｕｃｅｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；Ｍｅｔｈｏｃｅｌ）、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルブチルセルロース、ヒドロキシプロピルペンチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース（Ｅｔｈｏｃｅｌ）、ヒドロキシエチルセルロース、種々のアルキルセルロースおよびヒドロキシアルキルセルロース、種々のセルロースエーテル、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、酢酸ビニル／クロトン酸コポリマー、ポリ−ヒドロキシアルキルメタクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、メタクリル酸コポリマー、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、無水マレイン酸／メチルビニルエーテルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウムおよびカルシウム、ポリアクリル酸、酸性カルボキシポリマー、カルボキシポリメチレン、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポリメチルビニルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸、カルボキシメチルアミド、カリウムメタクリレートジビニルベンゼンコポリマー、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ならびにこれらの誘導体、塩、および組み合わせが挙げられる。
【０３０７】
特定の実施形態では、ポリマーは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリアルキレングリコールである。
【０３０８】
（Ａ−Ｂ−Ｃの）ＡがＰＬＡのオキシ誘導体である態様では、ＰＬＡと結合する化学的部分は炭水化物である。炭水化物は、α脱離基を有するカルボニルを含むか、または含むように構成されている限り、任意の炭水化物でよい。炭水化物は、例えば、α脱離基を有するカルボニルを含むように誘導体化されていてよい。この点で、炭水化物は、単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース）、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース）、オリゴ多糖（例えば、ラフィノース、スタキオース）、多糖（デンプン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナン）から誘導体化された形態でよい。
【０３０９】
（Ａ−Ｂ−Ｃの）ＡがＰＬＡのオキシ誘導体である態様において、ＰＬＡと結合する化学的部分は脂質であり得る。脂質は、α脱離基を有するカルボニルを含む任意の脂質でよい。例えば、カルボニルを含むように誘導体化された脂質でよい。この点で、脂質は、以下の誘導体であってよい：脂肪酸（例えば、Ｃ４−Ｃ３０脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ−アシルエタノールアミン）、グリセロ脂質（例えば、一置換、二置換、三置換グリセロール）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴシン、セラミド）、ステロール脂質（例えば、ステロイド、コレステロール）、プレノール脂質、サッカロ脂質またはポリケチド油、ロウ、コレステロール、ステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、Ｒ７は、約１００ｋＤａ以下の分子量、例えば９０ｋＤａ以下、約８０ｋＤａ以下、約７０ｋＤａ以下、約６０ｋＤａ以下、約５０ｋＤａ以下、約４０ｋＤａ以下の分子量を有する。したがって、Ｒ７は、約３５ｋＤａ以下、３０ｋＤａ以下、約２５ｋＤａ以下、約２０ｋＤａ以下、約１５ｋＤａ以下、約１０ｋＤａ以下、約５ｋＤａ以下、または約１ｋＤａの分子量を有し得る。
【０３１１】
代替の実施形態では、構造Ａ−Ｂ−Ｃのグルカゴンアンタゴニストペプチドは、Ａとして、アミノ酸２〜６個のペプチドであって、このうちの連続した２個のアミノ酸がエステル結合またはエーテル結合を介して結合しているペプチドを含む。エステル結合またはエーテル結合は、例えば、アミノ酸２と３、３と４、４と５、または５と６の間にあってよい。任意で、このペプチドを、他の化学的部分との共有結合により修飾してもよい（ポリマー（例えば親水性ポリマー）との結合、アルキル化、またはアシル化を含む）。
【０３１２】
ペプチドの少なくとも２つの連続したアミノ酸が、エステル結合またはエーテル結合を介して結合する限り、このペプチドは、合成または天然由来の任意のアミノ酸を含むことができる。特定の実施態様では、このペプチドは天然グルカゴンのアミノ酸を含む。例えば、このペプチドは天然グルカゴン（配列番号１）のｊから６を含むことができる（ここでｊは、１、２、３、４、または５である）。あるいは、このペプチドは、１つ以上のアミノ酸修飾を有する、配列番号１のＮ末端に基づくアミノ酸配列を含むことができる。１および／または位置２のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するアミノ酸であってよい。例えば、このペプチドは、Ｄ−ヒスチジン、α，α−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、α−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、およびホモヒスチジンからなる群より選ばれるアミノ酸を、グルカゴンアンタゴニストペプチド（グルカゴンアンタゴニスト）の位置１に含むことができる。より詳細には、いくつかの実施形態では、アンタゴニストペプチドの位置２の位置は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、およびアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選ばれるアミノ酸である。また、例えば、グルカゴンアンタゴニストの位置３のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然グルタミン残基とは対照的に、グルタミン酸であってよい。したがって、グルカゴンアンタゴニストは以下のアミノ酸配列：
Ｘａａ１ −Ｘａａ２ −Ｘａａ３ −トレオニン−グリシン−Ｐｈｅ（配列番号１１６８）；
Ｘａａ２ −Ｘａａ３ −トレオニン−グリシン−Ｐｈｅ（配列番号１１６９）；または
Ｘａａ３ −トレオニン−グリシン−Ｐｈｅ（配列番号１１７０）を含むことができ；
ここで、Ｘａａ１ は、ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、α，α−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、α−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、およびホモヒスチジンからなる群より選ばれ；Ｘａａ２ は、セリン、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、およびアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選ばれ；Ｘａａ３ は、グルタミンまたはグルタミン酸であり；配列番号１１６８、１１６９、または１１７０のアミノ酸間の少なくとも１つの結合は、エステル結合またはエーテル結合である。
【０３１３】
一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むグルカゴンアンタゴニストペプチドに関して、Ｂは、天然グルカゴンのアミノ酸、例えば配列番号１のアミノ酸ｉ〜２６を表し（ここでｉは、３、４、５、６、または７である）、任意で、１つ以上のアミノ酸修飾を含む。特定の実施形態では、Ｂは、配列番号１のアミノ酸７〜２６を表し、任意で修飾される。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、Ｂは、最大３個のアミノ酸修飾により修飾される。例えば、配列番号１の天然アミノ酸配列を表すＢは、１つ以上の保存的アミノ酸修飾で修飾される。
【０３１５】
他の実施形態では、Ｂは、本明細書に記載の（ｉｖ）〜（ｉｘ）からなる群より選ばれる１つ以上のアミノ酸修飾を含む。特定の実施形態では、Ｂは、アミノ酸修飾（ｖ）と（ｖｉ）のいずれか一方または両方を含む。さらなる特定の実施形態では、Ｂは、（ｖ）と（ｖｉ）に加えて、（ｉｖ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、および（ｉｘ）からなる群より選ばれるアミノ酸修飾のいずれか１つまたは組み合わせを含む。ペプチドが、（１）本明細書に記載の手段、例えば分子内架橋、もしくは１つ以上のα，α−二置換アミノ酸の組み込み、もしくは位置１６の位置（配列番号１の番号付けによる）の酸性アミノ酸の組み込み、またはこれらの組み合わせによる、安定化したαヘリックス；（２）Ｃ末端カルボン酸基と置き換わったＣ末端アミドまたはエステル；および（３）一般構造Ａ−Ｂ−Ｃ、を含むさらなる特定の実施形態では、Ｂは、（ｖ）と（ｖｉ）に加えて、（ｉｖ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、および（ｘ）からなる群より選ばれるアミノ酸修飾のいずれか１つまたは組み合わせを含む。
【０３１６】
別の特定の実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、Ｃ末端に１つ以上の荷電アミノ酸を含む。例えば、Ｙおよび／またはＺは、例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の荷電アミノ酸になり得る。さらに別の実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、ＺのＣ末端に１〜２個の荷電アミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸）を含む。特定の態様において、後ろに１〜２個の荷電アミノ酸が続くＺは、Ｒ１０を含まない。いくつかの態様において、Ｙはアスパラギン酸である。
【０３１７】
いくつかの実施形態におけるグルカゴンアンタゴニストペプチドは、本明細書に記述するように、グルカゴンアンタゴニストのアミノ酸残基と共有結合する親水性部分を含む。例えば、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴンアンタゴニストペプチドの位置１、１６、２０、２１、または２４（配列番号１の番号付けによる）のアミノ酸、またはＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸と共有結合する親水性部分を含むことができる。別の実施形態では、親水性部分は、グルカゴンアンタゴニストペプチドのＣ末端のアミノ酸に結合しており、このアミノ酸は、いくつかの場合、ＺのＣ末端から１または１１個目である。さらに別の実施形態では、ＡがＰＬＡ、ＰＬＡ−Ｐｈｅ、またはＰＬＡ−トレオニン−Ｐｈｅのとき、親水性部分はＰＬＡに結合し、ＰＬＡは修飾されて親水性部分を含む。さらに別の実施形態では、親水性部分を含むアミノ酸は、グルカゴンアンタゴニストのＮ末端またはＣ末端に付加される。
【０３１８】
特定の実施形態では、親水性部分は、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むグルカゴンアンタゴニストペプチドのシステイン残基に結合する。この点で、位置１６、２１、２４、または２９（天然グルカゴンの番号付けによる）のアミノ酸またはＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸は、システイン残基で置換されてよい。あるいは、例えば、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドがＣ末端伸長部を含む場合のように、親水性部分を含むシステイン残基が、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドのＣ末端に、位置３０または位置４０として付加されてもよい（位置番号は配列番号１のアミノ酸番号付けによる）。あるいは、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドのＰＬＡに、ＰＬＡのヒドロキシル部分を介して親水性部分が結合されてもよい。この親水性部分は、本明細書に記載のいずれかの親水性部分、例えばポリエチレングリコールであり得る。
【０３１９】
特定の態様において、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むグルカゴンアンタゴニストペプチドは、本明細書の「αヘリックス構造の安定化」で教示する修飾を含むことにより、安定化したαヘリックスを含む。したがって、いくつかの態様におけるグルカゴンアンタゴニストペプチドは、ペプチドのＣ末端部分（配列番号１の番号付けによる残基１２〜２９）内に、分子内架橋および／または１つ以上のα，α−二置換アミノ酸を含む。いくつかの態様では、グルカゴンアンタゴニストペプチドに分子内架橋を組み込むことにより、安定したαヘリックスを提供する。一実施形態では、この分子内架橋はラクタム架橋である。このラクタム架橋は、位置９と位置１２のアミノ酸の間、位置１２と位置１６の アミノ酸の間、位置１６と位置２０のアミノ酸の間、位置２０と位置２４のアミノ酸の間、または位置２４と位置２８のアミノ酸の間にあってよい（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）。特定の実施形態では、位置１２と位置１６のアミノ酸、または位置１６と位置２０のアミノ酸（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）は、ラクタム架橋で結合される。他の位置のラクタム架橋も企図される。
【０３２０】
加えて、または代替して、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、例えば位置１６、２０、２１、または２４のいずれか（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）にα，α−二置換アミノ酸を含めることにより、安定したαヘリックスを含むことができる。一実施形態では、このα，α−二置換アミノ酸はＡＩＢである。特定の態様において、このＡＩＢは位置１６（配列番号１の番号付けによる）に位置する。
【０３２１】
代替または追加して、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むグルカゴンアンタゴニストペプチドは、位置１６（配列番号１の番号付けによる）に酸性アミノ酸を含むように修飾してもよく、この修飾はαヘリックスの安定性を増強する。一実施形態では、この酸性アミノ酸は、側鎖スルホン酸または側鎖カルボン酸を含むアミノ酸である。より特定の実施形態では、この酸性アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体、システイン酸、ホモシステイン酸、アスパラギン酸、および以下の構造：
【化２１】
2013518115.tif 000022
［式中、Ｘ５ はＣ１ −Ｃ４ アルキル、Ｃ２ −Ｃ４ アルケニル、またはＣ２ −Ｃ４ アルキニルである］
を有するシステインのアルキル化誘導体からなる群より選ばれる。
【０３２２】
ある特定の実施形態では、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストであるグルカゴンアンタゴニストペプチドは、配列番号１２６０〜１２７０、１２７３〜１２７８、１２８０〜１２８８、１２９０〜１２９６、１３０３、１３０４、１３０６、および１３１４〜１３１８のいずれかのアミノ酸配列、または、表Ａのペプチド２〜６、表Ｂのペプチド１〜８、および表Ｃのペプチド２〜６、８、および９のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
【表１】
2013518115.tif 000023
【表２】
2013518115.tif 000024
【表３】
2013518115.tif 000025
【表４】
2013518115.tif 000026
【０３２３】
ある実施形態では、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むグルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストであり、ＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１が達成する最大アゴニスト作用の少なくとも約５０％を示し、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンが達成する最大反応の少なくとも約５０％の阻害を示す。他の特定の実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１が達成する最大アゴニスト作用の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または約１００％を示す。代替または追加して、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンが達成する最大反応の少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０約％、少なくとも約９５％、または約１００％の阻害を示すことができる。
【０３２４】
他の実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、本明細書に記述するアシル基またはアルキル基を含む。例えば、アシル化またはアルキル化は、位置１０、２０、または２４（配列番号１の番号付けによる）のアミノ酸の側鎖を離れて発生し得る。別の実施形態では、アシル化またはアルキル化は、グルカゴンアンタゴニストのＣ末端アミノ酸の側鎖を離れて発生し、いくつかの場合、このアミノ酸は、ＺのＣ末端から１または１１個目のアミノ酸である。さらに別の実施形態では、ＡがＰＬＡ、ＰＬＡ−フェニルアラニン、またはＰＬＡ−トレオニン−フェニルアラニンである場合、ＰＬＡは、アシル基またはアルキル基を含むように修飾される。
【０３２５】
本開示のいくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストは、配列番号１１６２、１１６４〜１１６７、および１１７１のいずれか、または表Ｄ〜Ｌに示すペプチドのいずれかの構造のアミノ酸配列を含む。
【表５】
2013518115.tif 000027
【表６】
2013518115.tif 000028
【表７】
2013518115.tif 000029
【表８】
2013518115.tif 000030
【表９】
2013518115.tif 000031
【表１０】
2013518115.tif 000032
【表１１】
2013518115.tif 000033
【表１２】
2013518115.tif 000034
【表１３】
2013518115.tif 000035
【０３２６】
さらに別の実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴンアンタゴニスト活性とＧＬＰ−１アゴニスト活性の両方（例えば、グルカゴンアンタゴニスト、ＧＬＰ−１アゴニスト）を示し、以下の修飾を含む。
（１）グルカゴンアンタゴニスト活性を与える修飾。具体的には以下の修飾が含まれるが、これらに限定されない。
（ａ）位置６（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のフェニルアラニンのＰＬＡによる置換。任意で、野生型グルカゴンのＮ末端から１〜５個のアミノ酸の欠失；または
（ｂ）野生型グルカゴンのＮ末端から２〜５個のアミノ酸の欠失；任意で、野生型グルカゴンの位置９のアスパラギン酸の、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、またはシステインのスルホン酸誘導体による置換（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）；
および
（２）ＧＬＰ−１アゴニスト活性を与える修飾。具体的には以下の修飾が含まれるが、これらに限定されない。
（ａ）野生型グルカゴンのアミノ酸１２〜２９の範囲内、例えば位置１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、もしくは２９（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のうちの１個、２個、３個、４個、またはそれ以上での、α，α−二置換アミノ酸の挿入もしくは置換；または
（ｂ）野生型グルカゴンのアミノ酸１２〜２９の範囲内への分子内架橋の導入、例えば塩架橋、ラクタム架橋、その他の種類の共有結合の導入；または
（ｃ）位置２、３、１７、１８、２１、２３、または２４（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の１つ以上のアミノ酸の、対応するＧＬＰ−１のアミノ酸による置換。例えば、セリン２をアラニンで置換する、グルタミン３をグルタミン酸で置換する、アルギニン１７をグルタミンで置換する、位置１８のアルギニンをアラニンで置換する、位置２１のアスパラギン酸をグルタミン酸で置換する、位置２３のバリンをイソロイシンで置換する、および／もしくは位置２４のグルタミンをアラニンで置換するなど；または
（ｄ）アミノ酸位置１２〜２９（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）周辺のαヘリックス構造を安定化させる、他の修飾。
および
（３）ＧＬＰ−１アゴニスト活性を増強する他の修飾、例えば、
（ａ）Ｃ末端カルボン酸基のＣ末端アミドまたはエステルによる置き換え；
任意で、以下の修飾を含む。
（４）以下の修飾の１つ以上：
（ａ）例えば、Ｎ末端、または位置６、１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０、またはＣ末端アミノ酸での、親水性部分（例えばポリエチレングリコール）との共有結合；および／または
（ｂ）アシル化もしくはアルキル化；さらに任意で、
（５）以下の追加の修飾の１つ以上：
（ａ）アミノ酸とＮ末端の共有結合、例えば、１〜５個のアミノ酸とＮ末端の共有結合。この結合は、位置６（野生型グルカゴンの番号付けによる）のＰＬＡとのエステル結合を介してもよい。任意で、位置１または位置２において、例えば本明細書に記載のようなＤＰＰ−ＩＶ切断に対する耐性を向上させる修飾を伴ってもよい；
（ｂ）位置２９および／または位置２８のアミノ酸の欠失。任意で、位置２７のアミノ酸の欠失（野生型グルカゴンの番号付けによる）；
（ｃ）アミノ酸とＣ末端との共有結合；
（ｄ）所望の活性を保持しながらの、非保存的置換、保存的置換、付加、または欠失。例えば、位置２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、または２９の１つ以上での保存的置換、位置１０のチロシンのバリンまたはフェニルアラニンによる置換、位置１２のリシンのアルギニンによる置換、これらの位置の１つ以上のアラニンによる置換；
（ｅ）位置１５のアスパラギン酸の修飾、例えば、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、もしくはホモシステイン酸による置換（この修飾は分解を低減する可能性がある）；または、位置１６のセリンの修飾、例えば、トレオニン、ＡＩＢ、グルタミン酸、もしくは長さ４原子の側鎖を有する別の負に荷電したアミノ酸による置換、あるいは代替として、グルタミン、ホモグルタミン酸、もしくはホモシステイン酸のいずれか１つによる置換（この修飾も同様に、アスパラギン酸１５−セリン１６の切断による分解を低減する可能性がある）；
（ｆ）酸化分解を低減するための、位置２７のメチオニンの修飾、例えば、ロイシンまたはノルロイシンによる置換；
（ｇ）グルタミンの脱アミド化を介して生じる分解を低減するための、位置２０または位置２４のグルタミンの修飾、例えば、アラニンまたはＡＩＢによる置換；
（ｈ）アスパラギン酸の脱水により環状スクシンイミド中間体を形成し、続いて異性化によりイソアスパラギン酸塩を形成することにより生じる分解を低減するための、位置２１のアスパラギン酸の修飾、例えば、グルタミン酸による置換；
（ｊ）本明細書に記述するホモ二量体化またはヘテロ二量体化；
（ｋ）上記の組み合わせ。
【０３２７】
同じ分類内の修飾のいずれかを一緒に組み合わせてよく、かつ／または、異なる分類の修飾が組み合わされるものと理解される。例えば、（１）（ａ）の修飾を（２）（ａ）および（３）と組み合わせてよく；（１）（ａ）を、（２）（ｂ）（例えばラクタム架橋または塩架橋）および（３）と組み合わせてよく；（１）（ａ）を（２）（ｃ）および（３）と組み合わせてよく；（１）（ｂ）を（２）（ａ）および（３）と組み合わせてよく；（１）（ｂ）を、（２）（ｂ）（例えばラクタム架橋または塩架橋）および（３）と組み合わせてよく；（１）（ｂ）を（２）（ｃ）および（３）と組み合わせてよく；上記のいずれかを（４）（ａ）および／または（４）（ｂ）と組み合わせてよく；かつ上記のいずれかを（５）（ａ）〜（５）（ｋ）のいずれかと組み合わせてよい。
【０３２８】
代表的な実施形態では、α，α−二置換アミノ酸であるＡＩＢは、位置１６、２０、２１または２４（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のうちの１つ、２つ、３つ、または全部の位置で置換される。
【０３２９】
代表的な実施形態では、分子内架橋は塩架橋である。
【０３３０】
他の代表的な実施形態では、分子内架橋は、共有結合、例えばラクタム架橋である。いくつかの実施形態では、このラクタム架橋は、位置９と位置１２のアミノ酸の間、位置１２と位置１６のアミノ酸の間、位置１６と位置２０のアミノ酸の間、位置２０と位置２４のアミノ酸の間、または位置２４と位置２８のアミノ酸の間にある（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）。
【０３３１】
代表的な実施形態では、アシル化またはアルキル化は、位置６、１０、２０、もしくは２４、またはＮ末端もしくはＣ末端に存在する（野生型グルカゴン（配列番号１）のアミノ酸番号付けによる）。
【０３３２】
代表的な実施形態では、修飾には以下が含まれる。
（ｉ）位置１５（配列番号１の番号付けによる）のアスパラギン酸の、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸による置換；
（ｉｉ）位置１６（配列番号１の番号付けによる）のセリンの、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸による置換；
（ｉｉｉ）位置２８のアスパラギンの、荷電アミノ酸による置換；
（ｉｖ）位置２８のアスパラギンの、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群より選ばれる荷電アミノ酸による置換；
（ｖ）位置２８の、アスパラギン、アスパラギン酸、もしくはグルタミン酸による置換；
（ｖｉ）位置２８の、アスパラギン酸による置換；
（ｖｉｉ）位置２８の、グルタミン酸による置換；
（ｖｉｉｉ）位置２９のトレオニンの、荷電アミノ酸による置換；
（ｉｘ）位置２９のトレオニンの、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群より選ばれる荷電アミノ酸による置換；
（ｘ）位置２９の、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはリシンによる置換；
（ｘｉ）位置２９の、グルタミン酸による置換；
（ｘｉｉ）位置２９の後ろへの１〜３個の荷電アミノ酸の挿入；
（ｘｉｉｉ）位置２９の後ろへのグルタミン酸もしくはリシンの挿入；
（ｘｉｖ）位置２９の後ろへのグリシン−リシンもしくはリシン−リシンの挿入；
または、これらの組み合わせ。
【０３３３】
グルカゴンアンタゴニストペプチドの追加の修飾
本開示のいくつかの態様において、上記実施形態のいずれかのグルカゴンアンタゴニストペプチド（例えば、構造Ａ−Ｂ−Ｃのグルカゴンアンタゴニストペプチド、配列番号１のアミノ酸１〜５個の欠失および配列番号１の位置６のフェニルアラニンのＰＬＡによる置換を含むグルカゴンアンタゴニストペプチド、配列番号１の位置９の置換およびＮ末端残基の欠失を含むグルカゴンアンタゴニストペプチド）は、（配列番号１に照らして）１つ以上のさらなるアミノ酸修飾を含む。例えば、本明細書の「分解を低減する修飾」、「可溶性を高める修飾」、「その他の修飾」、「アシル化およびアルキル化」の各セクション内で教示しているアミノ酸修飾のいずれかを含む。これらの教示はＧＩＰアゴニストペプチドの文脈で行っているが、これらの修飾は、本開示のグルカゴンアンタゴニストペプチドに適用可能である。上記セクションのアミノ酸位置の番号付けについては、配列番号１の番号付けによると理解すべきである。
【０３３４】
したがって、いくつかの態様では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、分解を低減するアミノ酸修飾を含む。代表的な態様では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴンアンタゴニスト活性を提供する修飾を含み、ＧＩＰアゴニストペプチドに関する本明細書の記述にあるように、位置１５および／または位置１６における１つまたは２つのアミノ酸修飾をさらに含む。「分解を低減する修飾」を参照のこと。したがって、いくつかの態様において、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴンアンタゴニスト活性を与える修飾のいずれかを含み、かつ、天然グルカゴンペプチドの位置１５のアスパラギン酸を、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、およびホモシステイン酸からなる群より選ばれるアミノ酸で置換したものをさらに含む。
【０３３５】
いくつかの実施形態によれば、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴンアンタゴニスト活性を与える修飾のいずれかを含み、かつ、位置１６（天然グルカゴンの番号付けによる）のセリンを、グルタミン酸、システイン酸、ホモグルタミン酸、またはホモシステイン酸で置換したものをさらに含む。ある特定の実施形態では、位置１６（天然グルカゴン配列の番号付けによる）のセリンは、グルタミン酸で置換される。より特定の態様において、こうした修飾を含むグルカゴンアンタゴニストは、Ｃ末端カルボン酸基を含み、アミド化されていない。
【０３３６】
いくつかの態様において、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴンアンタゴニスト活性を与える修飾のいずれかを含み、かつ、ペプチドの酸素分解を防止するため、位置２７（配列番号１の番号付けによる）のメチオニンを、ロイシンまたはノルロイシンで置換したものをさらに含む。
【０３３７】
いくつかの態様において、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、グルカゴンアンタゴニスト活性を与えるいずれかの修飾を含み、かつ、ＧＩＰアゴニストペプチドに関する本明細書の記述にあるように、位置２０のグルタミン、位置２１のアスパラギン酸、もしくは位置２４のグルタミン（またはこれらの組み合わせ）（位置番号は配列番号１の番号付けによる）を、別のアミノ酸で置換したものをさらに含む。いくつかの態様において、位置２０および／または位置２４のアミノ酸（配列番号１の番号付けによる）は、セリン、トレオニン、アラニン、またはＡＩＢで置換される。他のいくつかの実施形態では、位置２０および／または位置２４のアミノ酸（配列番号１の番号付けによる）は、リシン、アルギニン、Ｏｒｎ、またはシトルリンで置換される。いくつかの実施形態では、位置２１のアミノ酸（配列番号１の番号付けによる）は、グルタミン酸で置換される。
【０３３８】
本開示のさらに別のいくつかの態様では、可溶性の増強のためにグルカゴンアンタゴニストペプチドを修飾する。例えば、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、本明細書の「可溶性を高める修飾」での教示内容に従って修飾することができる。代表的な実施形態では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、位置２８と位置２９（配列番号１の番号付けによる）に１個または２個の荷電アミノ酸を含み、かつ／または、位置２９（配列番号１の番号付けによる）のＣ末端側に追加の荷電アミノ酸を含む。
【０３３９】
追加の態様におけるグルカゴンアンタゴニストペプチドは、本明細書の「その他の修飾」で教示する修飾のいずれかを含む。例えば、いくつかの態様におけるグルカゴンアンタゴニストペプチドは、位置１２（配列番号１の番号付けによる）のリシンをアルギニンで置換したものを含む。いくつかの態様では、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、Ｃ末端残基のαカルボン酸基と置き換わった電荷中性基を含む。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニスト活性を示すグルカゴンアンタゴニストペプチドは、本明細書の「アシル化およびアルキル化」に記載の教示内容に従ってアシル化またはアルキル化される。
【０３４１】
ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性、グルカゴン受容体アンタゴニスト活性、ペプチドの可溶性、および／またはペプチドの安定性を増加させる上記修飾のいずれも、個別に適用することも、組み合わせて適用することもできる。
【０３４２】
グルカゴン類似体ペプチド
ＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドを含むペプチドの組み合わせに加えて、本開示は、本明細書に記述するグルカゴン類似体ペプチド（例えば、ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド）のいずれかを、遊離型（ｆｒｅｅ  ｆｏｒｍ）で（例えば、別の種類のペプチドと組み合わされず、別のペプチドと結合せずに）追加的に提供する。ただし、これらは、本明細書で引用する参照文献、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４４７号、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０５８６６２号および第ＷＯ２００９／０５８７３４号、または米国特許出願第６０／０７３，２７４号；第６１／０７８，１７１号；第６１／０９０，４４８号；第６１／１５１，３４９号；第６１／１８７，５７８号；第６０／９８３，７８３号；第６０／９８３，７６６号；第６１／０９０，４４１号のいずれにも開示されていない。したがって、代表的な実施形態では、グルカゴン類似体ペプチドは、グルカゴンアンタゴニストペプチドと組み合わされていない（例えば、複合体化していない）ＧＩＰアゴニストペプチドである。代替の実施形態では、グルカゴン類似体ペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチドと組み合わされていない（例えば、複合体化していない）グルカゴンアンタゴニストペプチドである。
【０３４３】
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、本明細書の記述に従うＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチドのいずれか一方であり、グルカゴン（配列番号１）の類似体であり、さらに、本明細書で引用する参照文献（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４４７号、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０５８６６２号および第ＷＯ２００９／０５８７３４号、または米国特許出願第６０／０７３，２７４号；第６１／０７８，１７１号；第６１／０９０，４４８号；第６１／１５１，３４９号；第６１／１８７，５７８号；第６０／９８３，７８３号；第６０／９８３，７６６号；第６１／０９０，４４１号を含むが、これらに限定されない）のいずれかに開示されているペプチドの類似体であり、これらの参照文献で引用されている類似体の１つ以上のアミノ酸残基は、本明細書に記載の教示内容に従って変更される。例えば、本開示のグルカゴン類似体ペプチドは、配列がチロシンで開始する配列表２または配列表３の中に見られるアミノ酸配列の類似体である場合があり、この類似体は、本明細書に記載するようなＧＩＰ活性を低減するアミノ酸修飾を含む。例えば、この類似体は、配列表２または３の配列と配列は同一である場合があるが、位置１のチロシンの代わりに小型の脂肪族残基（例えばアラニン、グリシン）を含むか、または位置１、もしくは、位置１と位置２のアミノ酸が欠失している。
【０３４４】
グルカゴンアンタゴニストペプチドがＧＩＰアゴニストペプチドであるいくつかの実施形態では、グルカゴン類似体ペプチドは、ＧＩＰ受容体に対する活性に加えて、グルカゴン受容体に対する活性も示すことができる（さらに任意で、ＧＬＰ−１受容体に対する活性も示す）。代表的な実施形態では、ＧＩＰアゴニストペプチドは、グルカゴン受容体、ＧＩＰ受容体、およびＧＬＰ−１受容体の各々に対するトリアゴニスト作用（ｔｒｉ−ａｇｏｎｉｓｍ）、または、グルカゴン受容体とＧＩＰ受容体の各々に対するコアゴニスト作用（ｃｏ−ａｇｏｎｉｓｍ）を示す。このような実施形態では、グルカゴン類似体ペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの少なくとも約０．１％の活性を示す。代表的な実施形態では、ＧＩＰアゴニストペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．８％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％を示す。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０は、グルカゴン受容体に対するＥＣ５０と比べて、約５０倍以下、約４０倍以下、約３０倍以下、または約２０倍以下の差がある（より高いか低い）。いくつかの実施形態では、ＧＩＰアゴニストペプチドのＧＩＰ効力は、そのグルカゴン効力と比べて、約２５倍以下、約２０倍以下、約１５倍以下、約１０倍以下、または約５倍以下の差がある（より高いか低い）。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−１受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０を、グルカゴン受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０で割った比率は、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、または約５未満、かつ１以上である。いくつかの実施形態では、ＧＩＰアゴニストペプチドのグルカゴン効力に対する、ＧＩＰアゴニストペプチドのＧＩＰ効力の比率は、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、または約５未満、かつ１以上である。いくつかの実施形態では、グルカゴン受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０を、ＧＩＰ受容体におけるＧＩＰアゴニストペプチドのＥＣ５０で割った比率は、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、または約５未満、かつ１以上である。いくつかの実施形態では、ＧＩＰアゴニストペプチドのＧＩＰ効力に対する、ＧＩＰアゴニストペプチドのグルカゴン効力の比率は、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、または約５未満、かつ１以上である。
【０３４６】
グルカゴン類似体ペプチドがＧＩＰアゴニストペプチドであり、かつＧＩＰアゴニストペプチドがＧＩＰ受容体およびＧＬＰ−１受容体に対するアゴニスト作用を示すいくつかの実施形態では、ＧＩＰアゴニストペプチドのヒトＧＬＰ−１受容体に対する選択性は、ヒトＧＩＰ受容体に対する選択性の１００倍以上ではない。代表的な実施形態では、ＧＩＰアゴニストペプチドのヒトＧＬＰ−１受容体に対する選択性は、ＧＩＰ受容体に対する選択性の１００倍未満である（例えば、約９０倍以下、約８０倍以下、約７０倍以下、約６０倍以下、約５０倍以下、約４０倍以下、約３０倍以下、約２０倍以下、約１０倍以下、約５倍以下）。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記述するペプチドは、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、環化（例えばジスルフィド架橋を介する）、または塩への変換（例えば酸付加塩、塩基付加塩）が行われ、かつ／または任意で、二量体化、多量体化、もしくは重合、又は、複合体化が行われる。
【０３４８】
本開示のペプチドは、当該技術分野で公知となっている方法で取得できる。ペプチドのデノボ合成の好適な方法については、例えば、Ｃｈａｎら，Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００５；Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｅｄ．Ｒｅｉｄ，Ｒ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２０００；Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ，ｅｄ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄら，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，２０００；および米国特許第５，４４９，７５２号に記述されている。
【０３４９】
また、本開示のペプチドが非コード化アミノ酸も非天然アミノ酸も含まない例では、標準の組み換え方法を使用することにより、類似体のアミノ酸配列をコードする核酸を使用した組み換えで当該ペプチドを産生できる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１；およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４を参照のこと。
【０３５０】
いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは単離される。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは精製される。「純度」とは相対的な語であり、絶対的純度、絶対的濃縮、あるいは絶対的選択とは必ずしも解釈されないものと認識される。いくつかの態様において、純度は少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％）である。
【０３５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、シンペップ（カリフォルニア州ダブリン）、ペプチドテクノロジーズ社（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）（メリーランド州ゲーサーズバーグ）、マルチプルペプチドシステムズ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（カリフォルニア州サンディエゴ）等の会社により商業的に合成されたものである。この点で、ペプチドは合成ペプチド、組み換えペプチド、単離ペプチド、および／または精製ペプチドであり得る。
【０３５２】
本開示はさらに、ペプチドを含む複合体および医薬組成物を提供する。表題「複合体」および「組成物、医薬組成物」以下の教示内容が、これらの実施形態に該当する。
【０３５３】
本開示はさらに、グルカゴン類似体であり、かつＧＩＰアゴニストペプチドまたはグルカゴンアンタゴニストペプチドである、ペプチドの使用方法を提供する。ペプチドがＧＩＰアゴニストペプチドである場合、このペプチドは、本明細書で記述する治療方法、具体的には、糖尿病、肥満症等の代謝異常の治療方法を含む治療方法のいずれにも使用してよい。ペプチドがグルカゴンアンタゴニストである場合、このペプチドは、低血糖症の治療方法、あるいは、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０５８７３４号および第ＷＯ２００９／０５８６６２号の教示内容に記載されている方法のいずれかで使用できる。
【０３５４】
複合体
本開示はさらに、複合体を提供する。いくつかの態様において、この複合体は、グルカゴンアンタゴニストペプチドと結合したＧＩＰアゴニストを含む。いくつかの態様において、この複合体は、異種部分と結合したＧＩＰアゴニストペプチドおよびグルカゴンアンタゴニストペプチドのうちの、少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、この複合体は、グルカゴンアンタゴニストペプチドと結合したＧＩＰアゴニストを含み、かつ、ペプチドのうち少なくとも１つは、異種部分と結合している。
【０３５５】
２つのペプチドの間、またはペプチドと異種部分の間の複合体化は、共有結合、非共有結合、または両タイプの結合を伴ってよい。いくつかの態様において、共有結合は、本明細書に記述する共有結合のいずれかである（例えば、ジスルフィド結合、ラクタム架橋、オレフィンメタセシス等）。いくつかの態様において、共有結合はペプチド結合である。複合体化がペプチド結合を伴ういくつか特定の実施形態では、この複合体は融合ペプチドであってよく、この融合ペプチドは、ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチドのいずれか一方または両方を含み、さらに任意で、異種部分、例えばＦｃ受容体またはその一部分を含む。
【０３５６】
代替の実施形態では、ＧＩＰアゴニストペプチドは、非共有結合を通じてグルカゴンアンタゴニストペプチドと結合する。非共有結合とは、例えば、静電相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、塩架橋、疎水性相互作用等である。
【０３５７】
ペプチドと他方のペプチドとの複合体化、および／または異種部分との複合体化は、間接的でも直接的でもよく、前者の場合、リンカーまたはスペーサーを伴ってよい。好適なリンカーおよびスペーサーは、当該技術分野において公知である。具体的には、本明細書の「アシル化およびアルキル化」および「結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」以下に記載されているリンカーまたはスペーサーのいずれかが含まれるが、これらに限定されない。
【０３５８】
異種部分
本明細書で使用する「異種部分」という語は、「複合体部分」と同義であり、結合するＧＩＰアゴニストペプチドまたはグルカゴンアンタゴニストペプチドとは異なる、任意の（化学的または生化学的な、天然由来またはコードされていない）分子をいう。本明細書に記載の類似体のいずれかと結合可能な、代表的な複合体部分の例として、異種ペプチドもしくは異種ポリペプチド（例えば、血漿タンパク質を含む）、標的化薬剤、免疫グロブリンもしくはその一部分（例えば、可変領域、ＣＤＲ、もしくはＦｃ領域）、診断標識（例えば、放射性同位元素、フルオロフォア、もしくは酵素標識）、ポリマー（水溶性ポリマーを含む）、または、その他の治療剤または診断剤が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態で提供する複合体は、ペプチドの組み合わせで構成されたペプチドと血漿タンパク質を含み、この血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノーゲン、およびグロブリンからなる群より選ばれる。いくつかの実施形態では、複合体の血漿タンパク質部分は、アルブミンまたはトランスフェリンである。いくつかの実施形態における複合体は、本明細書に記載のペプチドの組み合わせで構成されたペプチドを１つ以上含み、かつ、以下の１つ以上：ペプチド（本明細書に記載のＧＩＰアゴニストペプチドおよびグルカゴンアンタゴニストペプチドとは異なるペプチド）、ポリペプチド、核酸分子、抗体またはその断片、ポリマー、量子ドット、小分子、毒素、診断剤、炭水化物、アミノ酸、を含む。
【０３５９】
いくつかの実施形態では、異種部分は、本明細書に記載のＧＩＰアゴニストペプチドおよびグルカゴンアンタゴニストペプチドとは異なるペプチドであり、複合体は、融合ペプチドまたはキメラペプチドである。いくつかの実施形態では、異種部分は、アミノ酸１〜２１個のペプチド延長部である。特定の実施形態では、この延長部は、グルカゴン類似体のＣ末端、例えば位置２９のアミノ酸と結合する。いくつかの実施形態では、この延長部は、配列番号３（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号４（ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号８（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、または配列番号９（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列を含む。特定の態様において、このアミノ酸配列は、ペプチドのＣ末端アミノ酸、例えば位置２９のアミノ酸を通じて結合する。いくつかの実施形態では、配列番号３、４、８、および９のアミノ酸配列は、ペプチド結合を通じてペプチドの位置２９のアミノ酸と結合する。いくつか特定の実施形態では、グルカゴン類似体の位置２９のアミノ酸はグリシンであり、このグリシンは、配列番号３、４、８、および９のアミノ酸配列のいずれか１つと融合する。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、異種部分はポリマーである。いくつかの実施形態では、このポリマーは、以下からなる群から選ばれる：ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、およびその誘導体（ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレートを含む）；ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、およびポリ（オクタデシルアクリレート）を含むアクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルのポリマー；ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハロゲン化物、ポリ（酢酸ビニル）、およびポリビニルピロリドンを含むポリビニルポリマー；ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、およびそのコポリマー；アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシエチルセルロース、三酢酸セルロース、およびセルロース硫酸ナトリウム塩を含むセルロース；ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、およびポリ（エチレンテレフタレート）を含むポリエチレン、ならびにポリスチレン。
【０３６１】
いくつかの態様では、このポリマーは生分解性ポリマーであり、具体的には、合成の生分解性ポリマー（例えば、乳酸とグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コカプロラクトン））、および天然の生分解性ポリマー（例えば、アルギン酸および他の多糖類（デキストランを含む）、ならびにセルロース、コラーゲン、これらの化学的誘導体（例えばアルキル、アルキレン等の化学基の置換、付加、およびヒドロキシル化、酸化、その他、当業者が日常的に行っている修飾）、アルブミンおよび他の親水性タンパク質（例えば、ゼイン、他のプロラミン、および疎水性タンパク質））、ならびに、これらの任意のコポリマーまたは混合物が含まれる。一般に、これらの物質は、インビボでの酵素加水分解または水への露出によって、表面浸食またはバルク侵食により分解される。
【０３６２】
いくつかの態様では、このポリマーは生体接着性ポリマーであり、例えば、Ｈ．Ｓ．Ｓａｗｈｎｅｙ，Ｃ．Ｐ．Ｐａｔｈａｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｈｕｂｂｅｌｌ  ｉｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９３，２６，５８１−５８７に記述されている生体侵食性ヒドロゲル（この教示内容は本明細書に組み込まれる）、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、およびポリ（オクタデシルアクリレート）である。
【０３６３】
いくつかの実施形態では、このポリマーは、水溶性ポリマーまたは親水性ポリマーである。親水性ポリマーについては、本明細書の「親水性部分」以下で詳述している。好適な水溶性ポリマーは当該技術分野で公知となっており、例として、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ；Ｋｌｕｃｅｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；Ｍｅｔｈｏｃｅｌ）、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルブチルセルロース、ヒドロキシプロピルペンチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース（Ｅｔｈｏｃｅｌ）、ヒドロキシエチルセルロース、種々のアルキルセルロースおよびヒドロキシアルキルセルロース、種々のセルロースエーテル、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、酢酸ビニル／クロトン酸コポリマー、ポリ−ヒドロキシアルキルメタクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、メタクリル酸コポリマー、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、無水マレイン酸／メチルビニルエーテルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウムおよびカルシウム、ポリアクリル酸、酸性カルボキシポリマー、カルボキシポリメチレン、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポリメチルビニルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸、カルボキシメチルアミド、カリウムメタクリレートジビニルベンゼンコポリマー、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ならびにこれらの誘導体、塩、および組み合わせが挙げられる。
【０３６４】
特定の実施形態では、このポリマーは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリアルキレングリコールである。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、異種部分は炭水化物である。いくつかの実施形態では、この炭水化物は、単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース）、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース）、オリゴ多糖（例えば、ラフィノース、スタキオース）、多糖（デンプン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナン）である。
【０３６６】
いくつかの実施形態では、異種部分は脂質である。この脂質は、いくつかの実施形態では、脂肪酸（エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ−アシルエタノールアミン）、グリセロ脂質（例えば、一置換、二置換、三置換グリセロール）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴシン、セラミド）、ステロール脂質（例えば、ステロイド、コレステロール）、プレノール脂質、サッカロ脂質、またはポリケチド、油、ロウ、コレステロール、ステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質である。
【０３６７】
Ｆｃ融合
上記の通り、いくつかの実施形態では、ペプチドは免疫グロブリンまたはその一部分（例えば可変領域、ＣＤＲ、またはＦｃ領域）と結合（例えば融合）する。免疫グロブリン（Ｉｇ）の公知の種類には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭが含まれる。Ｆｃ領域は、Ｉｇ重鎖のＣ末端領域であり、再循環（半減期を長期化する）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）といった活性を実行するＦｃ受容体と結合することを担う。
【０３６８】
例えば、いくつかの定義によると、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、重鎖のシステイン２２６からＣ末端まで伸びている。「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のグルタミン酸２１６からプロリン２３０まで伸びている（他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、システイン結合に関わるシステインを整列させることにより、ＩｇＧ１配列と整列することができる）。ＩｇＧのＦｃ領域には、ＣＨ２、ＣＨ３という２つの定常ドメインが含まれる。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインは、通常、アミノ酸２３１からアミノ酸３４１まで伸びている。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、通常、アミノ酸３４２から４４７まで伸びている。免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの断片もしくは領域のアミノ酸番号付けに関する参照は、すべて、Ｋａｂａｔら  １９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．に基づいている。関連の実施形態において、Ｆｃ領域は、ＣＨ１を除く、免疫グロブリン重鎖の１つ以上の天然定常部領域または修飾定常部領域、例えばＩｇＧとＩｇＡのＣＨ２領域とＣＨ３領域、またはＩｇＥのＣＨ３領域とＣＨ４領域を含むことができる。
【０３６９】
好適な複合体部分としては、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン配列の一部分が含まれる。ＦｃＲｎはサルベージ受容体であり、免疫グロブリンを再循環させ、血液循環に戻すことを担う。ＦｃＲｎ受容体と結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域については、Ｘ線結晶学に基づいて説明されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら  １９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３７９）。ＦｃＲｎと接触するＦｃの主要接触領域は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの接合部の近くにある。Ｆｃ−ＦｃＲｎの接触部はすべて、単一のＩｇ重鎖内にある。主要接触部位には、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、および３１４、ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、および４３３〜４３６が含まれる。
【０３７０】
いくつかの複合体部分は、ＦｃγＲ結合部位を含んでも含まなくてもよい。ＦｃγＲは、ＡＤＣＣとＣＤＣを担っている。ＦｃγＲと直接接触するＦｃ領域内の位置の例は、アミノ酸２３４〜２３９（下方ヒンジ領域）、アミノ酸２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７〜２９９（Ｃ’／Ｅループ）、およびアミノ酸３２７〜３３２（Ｆ／Ｇ）ループである（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：２６７−２７３，２０００）。ＩｇＥの下方ヒンジ領域は、ＦｃＲＩ結合にも関係している（Ｈｅｎｒｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１５５６８−１５５７８，１９９７）。ＩｇＡ受容体結合に関わる残基については、Ｌｅｗｉｓらにより説明されている（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：６６９４−７０１，２００５）。ＩｇＥ受容体結合に関わるアミノ酸残基については、Ｓａｙｅｒｓらにより説明されている（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７９（３４）：３５３２０−５，２００４）。
【０３７１】
免疫グロブリンのＦｃ領域に対して、アミノ酸修飾を行ってよい。このようなＦｃ領域変異体は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン（残基３４２〜４４７）に少なくとも１つのアミノ酸修飾、および／またはＦｃ領域のＣＨ２ドメイン（残基２３１〜３４１）に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。ＦｃＲｎに対して親和性を増加させると考えられる突然変異には、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａが含まれる（Ｓｈｉｅｌｄｓら  ２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１）。他の突然変異は、ＦｃＲｎの親和性を有意に低減することなく、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、および／またはＦｃγＲＩＩＩＡとのＦｃ領域の結合を低減できる。例えば、Ｆｃ領域の位置２９７のアスパラギンをアラニンまたは別のアミノ酸で置換することにより、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を除去し、その結果、Ｆｃ領域の半減期の延長に付随して免疫原性を低減し、また、ＦｃγＲｓとの結合を低減することができる（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら．１９９５，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６０：８４７；Ｆｒｉｅｎｄら  １９９９，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：１６３２；Ｓｈｉｅｌｄｓら  １９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１）。ＩｇＧ１の位置２３３〜２３６番で、ＦｃγＲｓとの結合を低減するアミノ酸修飾が行われている（Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｇｈｅｔｉｅ  １９９５，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：７７およびＡｒｍｏｕｒら  １９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３）。米国特許第７，３５５，００８号および第７，３８１，４０８号に、代表的なアミノ酸修飾がいくつか記述されている（これらの文献の各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３７２】
親水性部分
本明細書に記載のＧＩＰアゴニストペプチドおよび／またはグルカゴンアンタゴニストペプチドをさらに修飾して、天然グルカゴンの高生物活性を保持しながら、生理的ｐＨ時の水溶液の可溶性と安定性を向上させることができる。タンパク質を活性ポリマー分子と反応させる際に使われる任意の好適な条件下で、ＰＥＧ基のような親水性部分を類似体に結合することができる。当該技術分野において公知となっている任意の方法を使用できる。具体的には、アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化、その他、ＰＥＧ部分の反応基（例えば、アルデヒド基、アミノ基、エステル基、チオール基、α−ハロアセチル基、マレイミド基、またはヒドラジノ基）を通じた、標的化合物の反応基（例えば、アルデヒド基、アミノ基、エステル基、チオール基、α−ハロアセチル基、マレイミド基、またはヒドラジノ基）との化学選択的複合体化／連結方法等の方法を使用できる。水溶性ポリマーを１つ以上のタンパク質に結合するのに使用できる活性化基には、スルホン基、マレイミド基、スルフヒドリル基、チオール基、トリフレート基、トレシレート基、アジリジン基、オキシラン基、５−ピリジル基、およびα−ハロゲン化アシル基（例えば、α−ヨード酢酸、α−ブロモ酢酸、α−クロロ酢酸）が含まれるが、これらに限定されない。還元的アルキル化により類似体に結合する場合、選択されるポリマーは、重合の程度が制御されるように単一の反応性アルデヒドを有するべきである。例えば、Ｋｉｎｓｔｌｅｒら，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．５４：４７７−４８５（２００２）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．５４：４５９−４７６（２００２）；およびＺａｌｉｐｓｋｙら，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１６：１５７−１８２（１９９５）を参照のこと。
【０３７３】
特定の態様において、チオール基を有する類似体のアミノ酸残基は、ＰＥＧ等の親水性部分で修飾される。いくつかの実施形態では、このチオール基はマイケル付加反応においてマレイミド活性化ＰＥＧで修飾され、以下に示すチオエーテル結合を含むＰＥＧ化類似体をもたらす。
【化２２】
2013518115.tif 000036
【０３７４】
いくつかの実施形態では、このチオール基は求核置換反応においてハロアセチル活性化ＰＥＧで修飾され、以下に示すチオエーテル結合を含むＰＥＧ化類似体をもたらす。
【化２３】
2013518115.tif 000037
【０３７５】
好適な親水性部分の例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばＰＯＧ）、ポリオキシエチレン化ソルビトール、ポリオキシエチレン化グルコース、ポリオキシエチレン化グリセロール（ＰＯＧ）、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（ベータ−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）および他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、コロン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）または他の多糖ポリマー、フィコールまたはデキストラン、ならびにこれらの混合物が含まれる。デキストランは、主にα１−６結合により結合しているグルコースサブユニットの多糖ポリマーである。デキストランは、多くの分子量範囲、例えば１ｋＤ〜約１００ｋＤの範囲、または約５、１０、１５もしくは２０ｋＤから約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０もしくは９０ｋＤの範囲で入手することができる。直鎖状または分枝状のポリマーが企図される。得られる複合体の調製物は、実質的に単分散または多分散であってよく、類似体１つ当たり約０．５、０．７、１、１．２、１．５、または２つのポリマー部分を有することができる。
【０３７６】
いくつかの実施形態では、この複合体のペプチドは、グルカゴン類似体のアミノ酸の側鎖と親水性部分の間の共有結合を介して、親水性部分と結合する。いくつかの実施形態では、グルカゴン類似体は、位置１６、１７、２１、２４、もしくは２９のアミノ酸、Ｃ末端伸長部内の位置のアミノ酸、またはＣ末端のアミノ酸、またはこれらの位置の組み合わせのアミノ酸の側鎖を介して、親水性部分と結合する。いくつかの態様では、親水性部分と共有結合するアミノ酸（例えば、親水性部分を含むアミノ酸）はシステイン、リシン、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはＡｃ−フェニルアラニンであり、このアミノ酸の側鎖が親水性部分（例えばＰＥＧ）と共有結合する。
【０３７７】
ｒＰＥＧ
いくつかの実施形態では、本開示の複合体は、アクセサリー類似体（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ａｎａｌｏｇ）と融合するペプチドを含む。アクセサリー類似体は、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０２３２７０号および米国特許出願公開第ＵＳ２００８０２８６８０８号に記述されているように、化学的ＰＥＧ（例えば、組み換えＰＥＧ（ｒＰＥＧ）分子）に似た伸長配座（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を形成できる。いくつかの態様におけるｒＰＥＧ分子は、グリシン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、プロリンの１つ以上を含むポリペプチドである。いくつかの態様において、ｒＰＥＧはホモポリマー、例えば、ポリ−グリシン、ポリ−セリン、ポリ−グルタミン酸、ポリ−アスパラギン酸、ポリ−アラニン、またはポリ−プロリンである。他の実施形態では、ｒＰＥＧは２種類のアミノ酸の繰り返しを含む。例えば、ポリ（グリシン−セリン）、ポリ（グリシン−グルタミン酸）、ポリ（グリシン−アラニン）、ポリ（グリシン−アスパラギン酸）、ポリ（グリシン−プロリン）、ポリ（セリン−グルタミン酸）等を含む。いくつかの態様において、ｒＰＥＧは、３種類のアミノ酸、例えばポリ（グリシン−セリン−グルタミン酸）を含む。特定の態様において、ｒＰＥＧは、グルカゴンおよび／またはＧＬＰ−１アゴニスト類似体の半減期を増加する。いくつかの態様において、ｒＰＥＧは、正味の正電荷または正味の負電荷を含む。いくつかの態様のｒＰＥＧは、二次構造を欠いている。いくつかの実施形態では、ｒＰＥＧはアミノ酸１０個以上の長さであり、いくつかの実施形態では、アミノ酸約４０個〜約５０個の長さである。いくつかの態様におけるアクセサリーペプチドは、ペプチド結合またはプロテイナーゼ切断部位を通じて、本開示の類似体のＮ末端またはＣ末端と融合する。あるいは、本開示の類似体のループに挿入される。いくつかの態様におけるｒＰＥＧは、親和性タグ（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇ）を含むか、または５ｋＤａ超のＰＥＧと結合する。いくつかの実施形態では、ｒＰＥＧは、本開示の類似体に対して、流体力学半径、血清中半減期、プロテアーゼ耐性、または溶解性の増大を与え、かつ、いくつかの態様では、この類似体に免疫原性の低減を与える。
【０３７８】
多量体
ＧＩＰアゴニストペプチドがグルカゴンアンタゴニストペプチドと複合体化し、この複合体が融合ペプチドではない場合のいくつかの実施形態では、この複合体は、ペプチド組み合わせのペプチドを含む多量体または二量体である。この複合体は、グルカゴンアンタゴニストペプチドに結合したＧＩＰアゴニストペプチドを含む、ヘテロ多量体またはヘテロ二量体であってよい。ある実施形態では、２つ（またはそれ以上）のペプチドを結合するリンカーはＰＥＧ、例えば５ｋＤａのＰＥＧ、２０ｋＤａのＰＥＧ等である。いくつかの実施形態では、このリンカーはジスルフィド結合である。例えば、二量体の各単量体はシステイン残基（例えば、末端または内部に位置するシステイン）を含むことができ、各システイン残基の硫黄原子が、ジスルフィド結合の形成に関与する。いくつかの態様において、単量体の結合は、末端アミノ酸（例えばＮ末端またはＣ末端）を介するか、内部アミノ酸を介するか、または、少なくとも１つの単量体の末端アミノ酸と少なくとも１つの他の単量体の内部アミノ酸を介する。特定の態様において、単量体の結合は、Ｎ末端アミノ酸を介さない。いくつかの態様において、多量体の単量体は、各単量体のＣ末端アミノ酸が互いに結合する「尾−尾」配向で互いに結合している。
【０３７９】
結合（ｌｉｎｋａｇｅ）
結合に関する以下の２つのセクションでは、ペプチドと異種部分との結合、あるいは二量体または多量体の形成について記述する。当業者であれば、複合体の一方のタイプの教示内容を、他方の種類に適用できることを認識するであろう。
【０３８０】
結合−ペプチドと異種部分の結合
いくつかの実施形態では、複合体の複合体化を、類似体の標的アミノ酸残基を有機誘導体化剤（標的アミノ酸の選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応することのできる薬剤）と反応させることにより、直接の共有結合を介して複合体部分に結合する。類似体または複合体部分の反応基の例として、アルデヒド基、アミノ基、エステル基、チオール基、α−ハロアセチル基、マレイミド基、またはヒドラジノ基が挙げられる。誘導体化剤の例としては、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する複合体化）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、その他、当該技術分野で公知の薬剤が挙げられる。あるいは、例えば多糖やポリペプチド担体等の中間体担体を介して間接的に、複合体部分を類似体と結合することもできる。多糖担体の例としては、アミノデキストランが挙げられる。好適なポリペプチド担体の例には、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、これらのコポリマー、およびこれらのアミノ酸の混合ポリマー、その他、得られる装填担体に望ましい可溶性特性を付与するもの、例えばセリンが挙げられる。
【０３８１】
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸やクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチルの誘導体を与える。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、 α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることによっても誘導体化される。
【０３８２】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化される。その理由は、この試薬がヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるからである。また、パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、反応は、好ましくはｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行う。
【０３８３】
リシニルおよびアミノ末端残基を、無水コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試薬を用いた誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆にする効果がある。α−アミノ含有残基を誘導体化するのに適した他の試薬の例として、メチルピコリンイミデート、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン等のイミドエステル、およびグリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応物が挙げられる。
【０３８４】
アルギニル残基は、１つまたはいくつかの従来の試薬、中でもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応で修飾される。グアニジン官能基はｐＫａが高いため、アルギニン残基を誘導体化するには、アルカリ条件下で反応させる必要がある。さらに、これらの試薬をリジンの基およびアルギニンε−アミノ基と反応させることもできる。
【０３８５】
チロシル残基の特定的な修飾については、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応により、スペクトル標識をチロシル残基に導入することに特に関心を払って修飾することができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成する。
【０３８６】
カルボニル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾される［式中、ＲとＲ’は異なるアルキル基であり、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド、または１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである］。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
【０３８７】
他の修飾として、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化、（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、アスパラギンまたはグルタミンの脱アミド化、Ｎ末端アミンのアセチル化、および／またはＣ末端カルボン酸基のアミド化もしくはエステル化が挙げられる。
【０３８８】
別のタイプの共有結合修飾としては、グリコシドと類似体の化学的または酵素的なカップリングが含まれる。糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基（例えばシステインの基）、（ｄ）遊離ヒドロキシル基（例えばセリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンの基）、（ｅ）芳香族残基（例えばチロシンもしくはトリプトファンの基）、または（ｆ）グルタミンのアミド基、に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開された国際公開第ＷＯ８７／０５３３０号およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記述されている。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、グルカゴン類似体のアミノ酸の側鎖と異種部分の間の共有結合を介して、異種部分と結合する。いくつかの実施形態では、グルカゴン類似体は、位置１６、１７、２１、２４、もしくは２９のアミノ酸、Ｃ末端伸長部内の位置のアミノ酸、またはＣ末端のアミノ酸、またはこれらの位置の組み合わせのアミノ酸の側鎖を介して、異種部分と結合する。いくつかの態様において、異種部分と共有結合するアミノ酸（例えば、異種部分を含むアミノ酸）はシステイン、リシン、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはＡｃ−Ｐｈｅであり、このアミノ酸の側鎖が異種部分と共有結合する。
【０３９０】
いくつかの実施形態では、複合体は、グルカゴン類似体と異種部分とを連結するリンカーを含む。いくつかの態様において、このリンカーは、長さが原子１〜約６０個、または１〜３０個以上、２〜５個、２〜１０個、５〜１０個、または１０〜２０個の原子鎖を含む。いくつかの実施形態では、鎖原子はすべて炭素原子である。いくつかの実施形態では、リンカーの主鎖の鎖原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、およびＳからなる群より選ばれる。より可溶性の高い複合体を提供できるようにするため、予想される可溶性（親水性）に従って鎖原子およびリンカーを選択してよい。いくつかの実施形態では、リンカーは官能基を提供し、この官能基は、酵素その他の触媒により分解されるか、または、標的の組織もしくは器官もしくは細胞に見られる加水分解条件にさらされる。いくつかの実施形態では、リンカーの長さは、立体障害の可能性を低減するのに十分な長さである。リンカーが共有結合またはペプチジル結合であり、複合体がポリペプチドである場合、複合体全体が融合タンパク質になり得る。このようなペプチジルリンカーは、任意の長さであってよい。代表的なリンカーは、長さがアミノ酸約１〜５０個であり、アミノ酸５〜５０個、３〜５個、５〜１０個、５〜１５個、または１０〜３０個の長さである。あるいは、当業者に対して公知となっている組み換え遺伝子操作法により、このような融合タンパク質を産生してもよい。
【０３９１】
いくつかの実施形態では、異種部分は、非共有結合または共有結合を介して本開示の類似体と結合する。いくつかの態様において、異種部分は、リンカーを介して本開示の類似体と結合する。共有化学結合、物理的力、例えば、静電気、水素、イオン、ファンデルワールス等、または疎水的もしくは親水的な相互作用により、結合を達成できる。種々の非共有カップリング系を使用することもでき、その例としては、ビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞接着分子パートナー、または互いに親和性を有する任意の結合パートナーもしくはその断片が挙げられる。
【０３９２】
結合−二量体および多量体
いくつかの実施形態では、標準の連結剤および当該技術分野で公知の手順を使用して、複合体の２つのペプチドを互いに連結する。例えば、いくつかの態様では、スペーサー（例えば、ペプチドスペーサーまたはアミノ酸スペーサー）を伴って、または伴わずに、１つ以上のペプチド結合を介して、複合体の２つのペプチドを融合する。こうした例の場合、複合体の２つのペプチドは融合ペプチドとみなされる。代替の実施形態では、化学的複合体化を通じて、複合体の２つのペプチドを互いに結合する。いくつかの実施形態では、連結部分を通じて、複合体の２つのペプチドを互いに化学的に結合する。いくつかの態様では、連結部分が各ペプチドと直接結合し、別の態様では、スペーサーを通じて間接的に各ペプチドと結合する。
【０３９３】
いくつかの態様では、複合体のＧＩＰアゴニストペプチドおよびグルカゴンアンタゴニストペプチドは、両ペプチドのＣ末端アミノ酸が互いに結合する「尾−尾」配向で互いに結合する。いくつかの態様では、複合体のＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドは、各ペプチドの内部アミノ酸の側鎖を介して互いに結合する。いくつかの態様では、複合体のＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドは、一方のペプチドのＣ末端アミノ酸および別のペプチドの内部アミノ酸を介して互いに結合する。
【０３９４】
いくつかの実施形態では、複合体の２つのペプチドは互いに直接結合し、連結部分を含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの反応基を含む単一の連結部分（例えば、二官能性リンカー、二官能性スペーサー）に両ペプチドを結合することにより、複合体の２つのペプチドを互いに結合する。いくつかの実施形態では、複合体の２つのペプチドのいずれか一方または両方を、スペーサーを通じて間接的に単一の連結部分と結合することにより、両ペプチドを互いに結合する。
【０３９５】
いくつかの実施形態では、複合体のＧＩＰアゴニストペプチドおよびグルカゴンアンタゴニストペプチドの１つ以上のＣ末端を修飾することにより、本明細書の上記式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表すアミノ酸のように（「アシル化およびアルキル化」を参照）、求核性側鎖を有する天然または非天然のアミノ酸を含める。代表的な実施形態では、１つ以上のＧＩＰアゴニストペプチドおよびグルカゴンアンタゴニストペプチドのＣ末端アミノ酸は、リジン、オルニチン、セリン、システイン、およびホモシステインからなる群より選ばれる。いくつかの実施形態では、複合体の１つ以上のペプチドのＣ末端アミノ酸を修飾することにより、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸のように、求電子性側鎖を有する天然または非天然のアミノ酸を含める。いくつかの実施形態では、複合体の両ペプチドのＣ末端アミノ酸は、求核性の側鎖を含む。いくつかの実施形態では、両ペプチドのＣ末端アミノ酸は、求電子性の側鎖を含む。いくつかの実施形態では、複合体の一方のペプチドのＣ末端アミノ酸は求核性の側鎖を含み、複合体の他方のペプチドのＣ末端アミノ酸は求電子性の側鎖を含む。
【０３９６】
いくつかの実施形態では、両ペプチドのＣ末端アミノ酸を連結部分を用いて互いに直接結合することにより、複合体の２つのペプチドを互いに結合する。いくつかの実施形態では、一方のペプチドのＣ末端アミノ酸側鎖を他方のペプチドのＣ末端アミノ酸側鎖と直接結合することにより、複合体の２つのペプチドを結合する。こうした実施形態のいくつかでは、一方のペプチドのＣ末端アミノ酸は求核性の側鎖を含み、他方のペプチドのＣ末端アミノ酸は求電子性の側鎖を含む。こうした実施形態のいくつかでは、両方のＣ末端アミノ酸はチオール側鎖を含み、ジスルフィド結合を通じて結合が生じる。いくつかの実施形態では、一方のペプチドのＣ末端アミノ酸の求核性側鎖から、他方のペプチドのＣ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を介して、複合体の２つのペプチドを結合する。
【０３９７】
いくつかの実施形態では、ペプチドとの複合体化の前の連結部分は少なくとも２つの反応基を含んでおり、この連結部分に両ペプチドのＣ末端アミノ酸側鎖を結合することにより、複合体の２つのペプチドを互いに結合する。いくつかの実施形態では、連結部分は二官能性リンカーであり、ペプチドとの複合体化の前は反応基２つのみを含んでいる。組成物の２つのペプチドの両方が、求電子性側鎖の付いたＣ末端アミノ酸を有する実施形態では、連結部分は、ペプチドとの複合体化の前は、２つの同一または異なる求核基（例えばアミン、ヒドロキシル基、チオール基）を含んでいる。組成物の２つのペプチドの両方が、求核性側鎖の付いたＣ末端アミノ酸を有する実施形態では、連結部分は、ペプチドとの複合体化の前は、２つの同一または異なる求電子基（例えばカルボキシル基、活性型カルボキシル基、脱離基を有する化合物）を含んでいる。組成物の一方のペプチドは求核性側鎖の付いたＣ末端アミノ酸を有し、組成物の他方のペプチドは求電子性側鎖の付いたＣ末端アミノ酸を有する実施形態では、連結部分は、ペプチドとの複合体化の前は、１つの求核基と１つの求電子基を含んでいる。組成物の２つのペプチドの１つ以上が、それぞれのＣ末端α−カルボキシル基を通じて互いに結合するいくつかの実施形態では、連結部分は、ペプチドとの複合体化の前は、２つの求核基を含んでいる。
【０３９８】
連結部分の組成
連結部分は、組成物のペプチドと反応できる少なくとも２つの反応基を（ペプチドとの複合体化の前に）持つ任意の分子でよい。いくつかの実施形態では、連結部分は２つの反応基のみを有し、二官能性である。（ペプチドとの複合体化の前の）連結部分は、式ＶＩで表すことができる。
【化２４】
2013518115.tif 000038
式中、ＸとＹは独立して、求核反応基または求電子反応基である。
いくつかの実施形態では、ＸとＹは、両方とも求核基または両方とも求電子基である。いくつかの実施形態では、ＸとＹのいずれか一方は求核基であり、ＸとＹの他方は求電子基である。ＸとＹの非制限的な組み合わせを以下に示す。
【表１４】
2013518115.tif 000039
2013518115.tif 000040
2013518115.tif 000041
反応基の他の非限定的な例として、ピリジルジチオール基、アリールアジド基、ジアジリン基、カルボジイミド基、およびヒドラジド基が挙げられる。いくつかの実施形態では、ペプチドとの複合体化の前の連結部分の少なくとも１つの反応基は、チオール基であり、ジスルフィド結合を通じて組成物の１つ以上のペプチドと結合する。
【０３９９】
いくつかの実施形態では、連結部分は、例えばポリアルキレングリコールのように親水性である。この親水性の連結部分は、組成物のペプチドとの複合体化の前は、本明細書の上記および下記に示すように、少なくとも２つの反応基（ＸとＹ）を含む。
【化２５】
2013518115.tif 000042
特定の実施形態では、連結部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態におけるＰＥＧは、約２００ダルトン〜約１０，０００ダルトン、例えば約５００ダルトン〜約５０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態におけるＰＥＧは、約１０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
【０４００】
いくつかの実施形態では、親水性の連結部分は、反応基として、マレイミド基またはヨードアセチル基および活性カルボン酸（例えば、ＮＨＳエステル）を含む。マレイミド基とＮＨＳ活性化基を含む親水性の連結部分の一例を、以下に示す。
【化２６】
2013518115.tif 000043
【０４０１】
いくつかの実施形態では、親水性の連結部分は、反応基として、マレイミド基またはヨードアセチル基およびカルボン酸を含む。これらの実施形態では、カップリング試薬を使用するか使用せずに、マレイミド基またはヨードアセチル基をペプチドのチオール部分（例えば、システインの側鎖）にカップリングでき、カルボン酸をペプチドの遊離アミン（例えば、リジンの側鎖）にカップリングできる。カルボン酸を遊離アミンとカップリングするためのカップリング剤としては、例えばＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、およびＴＢＴＵ等、当業者に対して公知となっている任意の適切なカップリング剤を使用できる。例えば、親水性の連結部分は、以下の構造を含むことができる：
【化２７】
2013518115.tif 000044
代表的な実施形態では、連結部分は、マレイミド−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＣＯＯＨ、ヨードアセチル−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＣＯＯＨ、マレイミド−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＮＨＳ、またはヨードアセチル−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＮＨＳである。
【０４０２】
いくつかの実施形態では、連結部分は疎水性である。疎水性のリンカーは当該技術分野で公知となっている。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６）を参照のこと。この文献は、参照により全体が組み込まれる。好適な疎水性連結部分は当該技術分野において公知であり、例として、８−ヒドロキシオクタン酸および８−メルカプトオクタン酸が挙げられる。特定の実施形態では、疎水性の連結部分は、メチレン基２〜１００個の脂肪族鎖を含む。この疎水性の連結部分は、組成物のペプチドとの複合体化の前は、本明細書の上記および下記に示すように、少なくとも２つの反応基（ＸとＹ）を含む。
【化２８】
2013518115.tif 000045
【０４０３】
いくつか特定の実施形態では、疎水性の連結部分は、反応基として、マレイミド基またはヨードアセチル基および活性カルボン酸（例えば、ＮＨＳエステル）を含む。マレイミド反応基とＮＨＳエステル反応基を含む疎水性リンカーの一例を、以下に示す。
【化２９】
2013518115.tif 000046
【０４０４】
いくつか特定の実施形態では、疎水性の連結部分は、マレイミド基またはヨードアセチル基およびカルボン酸を含む。これらの実施形態では、カップリング試薬を使用するか使用せずに、マレイミド基またはヨードアセチル基をペプチドのチオール部分（例えば、システインの側鎖）にカップリングでき、カルボン酸をペプチドの遊離アミン（例えば、リジンの側鎖）にカップリングできる。カルボン酸を遊離アミンとカップリングするためのカップリング剤としては、例えばＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、およびＴＢＴＵ等、当業者に対して公知となっている任意のカップリング剤を使用できる。例えば、疎水性の連結部分は、以下の構造を含むことができる：
【化３０】
2013518115.tif 000047
【０４０５】
いくつかの実施形態では、連結部分はアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、またはポリペプチドで構成され、このアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、またはポリペプチドは、本明細書に記述するように少なくとも２つの活性化基を含む。
【０４０６】
スペーサー
いくつかの実施形態では、連結部分は、スペーサーを通じて間接的に、組成物の１つ以上のペプチド（例えば第１のペプチドおよび／または第２のペプチド）と結合する。複合体化の前は、スペーサーは二官能性であり、２つの反応基を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーの両方の反応基は、同一または異なる求核基である（例えばアミン、ヒドロキシル基、チオール基）。いくつかの実施形態では、スペーサーの両方の反応基は同一または異なる求電子基である（例えばカルボキシル基、活性型カルボキシル基、脱離基を有する化合物）。いくつかの実施形態では、スペーサーの一方の反応基は求核性であり、スペーサーの他方の反応基は求電子性である。複合体化前のスペーサーの反応基の非限定的組み合わせを以下に示す。
【表１５】
2013518115.tif 000048
2013518115.tif 000049
2013518115.tif 000050
反応基の他の非限定的な例として、ピリジルジチオール基、アリールアジド基、ジアジリン基、カルボジイミド基、およびヒドラジド基が挙げられる。
【０４０７】
いくつかの実施形態では、二官能性スペーサーは親水性である。いくつかの実施形態では、親水性の二官能性スペーサーに付いている反応基は、ヒドロキシル基とカルボン酸基である。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーに付いている反応基は、アミノとカルボン酸基である。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーに付いている反応基は、チオール基とカルボン酸基である。特定の実施形態では、スペーサーはアミノポリ（アルキルオキシ）カルボン酸基を含む。この点で、スペーサーは、例えばＮＨ２ （ＣＨ２ ＣＨ２ Ｏ）ｎ （ＣＨ２ ）ｍ ＣＯＯＨを含むことができ（ここでｍは１〜６の任意の整数であり、ｎは２〜１２の任意の整数である）、その例として、ペプチドインターナショナル社（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）（ケンタッキー州ルイビル）から市販されている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸が挙げられる。
【０４０８】
いくつかの実施形態では、スペーサーは疎水性である。疎水性の二官能性スペーサーは当該技術分野で公知となっている。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６）を参照のこと。この文献は、参照により全体が組み込まれる。いくつかの実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーに付いている反応基は、ヒドロキシル基とカルボン酸基である。他の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーに付いている反応基は、アミノ基とカルボン酸基である。他の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーに付いている反応基は、チオール基とカルボン酸基である。カルボン酸基およびヒドロキシル基またはチオール基を含む好適な疎水性の二官能スペーサーは、当該技術分野において公知であり、例として、８−ヒドロキシオクタン酸および８−メルカプトオクタン酸が挙げられる。
【０４０９】
いつかの実施形態では、スペーサーは、上記の通り（「アシル化およびアルキル化」を参照）、側鎖アミン、ヒドロキシ基、もしくはチオール基を含むアミノ酸であるか、または、側鎖アミン、ヒドロキシ基、もしくはチオール基を含むアミノ酸を含むジペプチドもしくはトリペプチドである。特定の実施形態におけるスペーサー（例えばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性または疎水性の二官能性スペーサー）は、長さが原子３〜１０個である（例えば原子６〜１０個（例えば原子６、７、８、９、または１０個））。より特定の実施形態では、スペーサーの長さは原子約３〜１０個である（例えば原子６〜１０個）。
【０４１０】
いくかの態様において、複合体の１つ以上のペプチド（例えば第１のペプチドおよび／または第２のペプチド）は、内部アミノ酸の側鎖を介して、組成物の別のペプチドと結合する。いくつかの実施形態では、この内部アミノ酸は、求核性の側鎖を含む。例えば、本明細書で上述したように（「アシル化およびアルキル化」を参照）、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで表されるアミノ酸である。いくつかの実施形態では、この内部アミノ酸は、リジン、オルニチン、セリン、システイン、およびホモシステインからなる群より選ばれる。代表的な実施形態では、この内部アミノ酸はシステインである。いくつかの実施形態では、この内部アミノ酸は、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸等の求電子性の側鎖を含む。
【０４１１】
いくつかの実施形態では、組成物の一方のペプチド（例えば第１のペプチド）の内部アミノ酸と、組成物の他方のペプチド（例えば第２のペプチド）のＣ末端アミノ酸とが結合する。いくつかの実施形態では、組成物の一方のペプチド（例えば第１のペプチド）の内部アミノ酸と、組成物の他方のペプチド（例えば第２のペプチド）の内部アミノ酸とが結合する。
【０４１２】
いくつかの実施形態では、組成物の一方のペプチドの内部アミノ酸は、直接的に（例えば、連結部分なしに）、組成物の別のペプチドの内部アミノ酸またはＣ末端アミノ酸と結合する。いくつかの実施形態では、組成物の一方のペプチドの内部アミノ酸は、本明細書で記述する連結部分を通じて、組成物の別のペプチドの内部アミノ酸またはＣ末端アミノ酸と結合する。いくつかの実施形態では、組成物の一方のペプチドの内部アミノ酸は、本明細書に記述するように、連結部分と直接結合する。いくつかの実施形態では、組成物の一方のペプチドの内部アミノ酸は、本明細書に記述するように、スペーサーを通じて間接的に連結部分と結合する。
【０４１３】
いくつかの実施形態では、組成物の第１のペプチドと第２のペプチドが互いに結合して、ヘテロ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、第１のペプチドの２つの類似体、および／または第２のペプチドの２つの類似体が互いに結合して、ホモ二量体を形成する。代表的な実施形態では、第１ペプチドのＣ末端にあるシステイン残基の側鎖は、ポリエチレングリコールで構成される親水性のリンカーを介して、第２ペプチドのＣ末端にあるリジン残基の側鎖と結合する。いくつかの代表的な実施形態では、第１ペプチドの位置２４のシステイン残基の側鎖は、以下に示すように、ポリエチレングリコールで構成される親水性のリンカーを介して、第２ペプチドのＣ末端にあるリジン残基の側鎖と結合する。
【化３１】
2013518115.tif 000051
【０４１４】
いくつかの代表的な実施形態では、第１ペプチドの位置２４のシステイン残基の側鎖は、以下に示すように、脂肪族鎖で構成される疎水性のリンカーを介して、第２ペプチドのＣ末端にあるリジン残基の側鎖と結合する。
【化３２】
2013518115.tif 000052
【０４１５】
組成物、医薬組成物
本開示は、本明細書に記載のＧＩＰアゴニストペプチドのいずれかと本明細書に記載のグルカゴンアンタゴニストペプチドのいずれかを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、この組成物は、ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの活性の少なくとも０．１％を示すＧＩＰアゴニストペプチドと、グルカゴン受容体に対してグルカゴンが達成する最大反応の少なくとも６０％の阻害を示すグルカゴンアンタゴニストペプチドを含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、哺乳動物、例えばヒトにおける治療上の使用を対象にしている。
【０４１６】
薬剤用の塩
いくつかの実施形態では、本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）は、塩の形態、例えば薬剤的に許容可能な塩の形態の組成物（または複合体）として存在する。本明細書で使用する「薬剤的に許容可能な塩」という語は、親化合物の生物活性を保持する化合物の塩であり、かつ、生物学的にもその他の面でも望ましくないものではない化合物の塩をいう。このような塩は、類似体の最終の単離および精製時にその場で生成でき、あるいは、遊離塩基官能基（ｆｒｅｅ  ｂａｓｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）と好適な酸とを反応させることにより、個別に調製することもできる。本明細書で開示する化合物の多くは、アミノ基および／もしくはカルボキシル基または類似の基が存在するため、酸性塩および／または塩基性塩を形成できる。
【０４１７】
薬剤的に許容可能な酸付加塩は、無機酸および有機酸から調製してよい。代表的な酸付加塩の例として、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イソチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびウンデカン酸塩が含まれるが、これらに限定されない。無機酸から誘導される塩の例として、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等が挙げられる。有機酸から誘導される塩の例として、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエン−スルホン酸、サリチル酸等が挙げられる。薬剤的に許容可能な酸付加塩の形成に使用できる酸の例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸、および、例えばシュウ酸、マレイン酸、コハク酸、クエン酸等の有機酸が挙げられる。
【０４１８】
塩基付加塩も、サリチル酸原料の最終の単離および精製時にその場で調製でき、あるいは、カルボン酸含有部分と好適な塩基、例えば、薬剤的に許容可能な金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、もしくは重炭酸塩と反応させるか、またはアンモニアもしくは有機第一級、第二級、もしくは第三級アミンと反応させることにより、調製できる。薬剤的に許容可能な塩の例としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属をベースにしたカチオン（例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウムの塩等）、ならびに無毒性の第四級アンモニアおよびアミンカチオン（中でもアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、およびエチルアンモニウムを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。塩基付加塩の形成に有用な他の代表的な有機アミンの例として、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジン等が挙げられる。有機塩基から誘導された塩の例としては、第一級アミン、第二級アミン、および第三級アミンの塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１９】
さらに、塩基性窒素含有基を、本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）を用いて、低級アルキルハロゲン化物、例えば、エチル、プロピル、ブチルの塩化物、臭化物、およびヨウ化物；長鎖ハロゲン化物、例えばデシル、ラウリル、ミリスチル、ステアリルの塩化物、臭化物、およびヨウ化物；アリールアルキルハロゲン化物、例えば臭化ベンジル、臭化フェネチル等として、四級化することができる。これにより、水溶性、脂溶性、または分散性の生成物が得られる。
【０４２０】
製剤
いくつかの実施形態によれば、本開示の組成物は医薬組成物であり、薬剤的に許容可能な担体をさらに含む。医薬組成物には、例えば以下のような、薬剤的に許容可能な任意の成分を含むことができる：酸化剤、添加剤、吸着剤、エアゾール噴射剤、排気剤、アルカリ化剤、凝結防止剤、抗凝結剤、抗菌性保存剤、酸化防止剤、消毒剤、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、被覆剤、着色剤、乾燥剤、洗剤、希釈剤、殺菌剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、染料、軟化剤、乳化剤、乳化安定剤、充填剤、皮膜形成剤、風味強化剤、風味剤、流動促進剤、ゲル化剤、造粒剤、保湿剤、滑沢剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏、油性賦形剤、有機基剤、香錠基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定剤、坐薬基剤、表面活性剤、界面活性剤、懸濁剤、甘味剤、治療剤、増粘剤、等張化剤、毒性剤、粘度増加剤、吸水剤、水混和性共溶媒、硬水軟化剤、または湿潤剤。
【０４２１】
いくつかの実施態様では、医薬組成物は、以下の構成成分のうちの任意の１つまたは組み合わせを含む。アカシア、アセサルフェームカリウム、クエン酸アセチルトリブチル、クエン酸アセチルトリエチル、寒天、アルブミン、アルコール、無水アルコール、変性アルコール、希アルコール、アロイリチン酸、アルギニン酸、脂肪族ポリエステル、アルミナ、水酸化アルミニウム、ステアリン酸アルミニウム、アミロペクチン、α−アミロース、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、アスパルテーム、注射用静菌性水、ベントナイト、ベントナイトマグマ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、ブロノポール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチルパラベン、ブチルパラベンナトリウム、アルギン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、炭酸カルシウム、シクラミン酸カルシウム、無水第二リン酸カルシウム、脱水第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸カルシウム半水和物、カノーラ油、カルボマー、二酸化炭素、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、β−カロテン、カラゲナン、ヒマシ油、硬化ヒマシ油、カチオン性乳化ロウ、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、粉末セルロース、ケイ化微結晶性セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、セトステアリルアルコール、セトリミド、セチルアルコール、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、コレステロール、酢酸クロルヘキシジン、グルコン酸クロルヘキシジン、塩酸クロルヘキシジン、クロロジフルオロエタン（ＨＣＦＣ）、クロロジフルオロメタン、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）クロロフェノキシエタノール、クロロキシレノール、コーンシロップ固形物、無水クエン酸、クエン酸一水和物、カカオ脂、着色剤、トウモロコシ油、綿実油、クレゾール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、シクラミン酸、シクロデキストリン、デトストレート、デキストリン、デキストロース、デキストロース無水物、ジアゾリジニル尿素、フタル酸ジブチル、セバシン酸ジブチル、ジエタノールアミン、フタル酸ジエチル、ジフルオロエタン（ＨＦＣ）、ジメチル−β−シクロデキストリン、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）等のシクロデキストリン型化合物、ジメチルエーテル、フタル酸ジメチル、エデト酸二カリウム、エデト酸二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、ドクサートカルシウム、ドクサートカリウム、ドクサートナトリウム、没食子酸ドデシル、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸、エグルミン、エチルアルコール、エチルセルロース、没食子酸エチル、ラウリン酸エチル、エチルマルトール、オレイン酸エチル、エチルパラベン、エチルパラベンカリウム、エチルパラベンナトリウム、エチルバニリン、フルクトース、フルクトース液、粉砕フルクトース、発熱物質非含有フルクトース、粉末フルクトース、フマル酸、ゼラチン、グリコール、液状グルコース、飽和植物性脂肪酸のグリセリド混合物、グリセリン、ベヘン酸グリセリル、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、自己乳化グリセリルモノステアレート、グリセリルパルミトステアレート、グリシン、グリコール、グリコフロール、グアーガム、ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＣ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、高級フルクトースシロップ、ヒト血清アルブミン、炭化水素（ＨＣ）、希塩酸、ＩＩ型硬化植物油、ヒドロキシエチルセルロース、２−ヒドロキエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、イミド尿素、インジゴカルミン、イオン交換体、酸化鉄、イソプロピルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、等張食塩水、カオリン、乳酸、ラクチトール、ラクトース、ラノリン、ラノリンアルコール、脱水ラノリン、レクチン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、炭酸マグネシウム、規定炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム無水物、炭酸マグネシウム水酸化物、水酸化マグネシウム、ラウリル硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム無水物、リンゴ酸、モルト、マルチトール、マルチトール溶液、マルトデキストリン、マルトール、マルトース、マンニトール、中鎖トリグリセリド、メグルミン、メントール、メチルセルロース、メタクリル酸メチル、オレイン酸メチル、メチルパラベン、メチルパラベンカリウム、メチルパラベンナトリウム、微結晶性セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、鉱油、軽鉱油、鉱油およびラノリンアルコール、油、オリーブ油、モノエタノールアミン、モンモリロナイト、没食子酸オクチル、オレイン酸、パルミチン酸、パラフィン、ラッカセイ油、ワセリン、ワセリンおよびラノリンアルコール、製剤釉薬、フェノール、液状フェノール、フェノキシエタノール、フェノキシプロパノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、ポラクリリン、ポラクリリンカリウム、ポロキサマー、ポリデキストロース、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリアクリレート、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリメタクリレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンステアレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルギン酸カリウム、安息香酸カリウム、重炭酸カリウム、重亜硫酸カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、クエン酸カリウム無水物、リン酸水素カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、プロピオン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、ポビドン、プロパノール、プロピオン酸、プロピレンカーボネート、プロピレングリコール、アルギン酸プロピレングリ��ール、没食子酸プロピル、プロピルパラベン、プロピルパラベンカリウム、プロピルパラベンナトリウム、硫酸プロタミン、ナタネ油、リンゲル液、サッカリン、サッカリンアンモニウム、サッカリンカルシウム、サッカリンナトリウム、ベニバナ油、サポナイト、血清タンパク質、ゴマ油、コロイドシリカ、コロイド二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、無水クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム脱水物、塩化ナトリウム、シクラミン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、硫酸ドデシルナトリウム、硫酸ラウリルナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、三塩基性無水プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、フマル酸ステアリルナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビタンエステル（ソルビタン脂肪エステル）、ソルビトール、７０％ソルビトール溶液、ダイズ油、鯨ロウ、デンプン、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルファ化デンプン、滅菌トウモロコシデンプン、ステアリン酸、精製ステアリン酸、ステアリルアルコール、スクロース、糖、圧縮性糖、粉糖、糖球体、転化糖、Ｓｕｇａｒｔａｂ、サンセットイエローＦＣＦ、合成パラフィン、タルク、酒石酸、タートラジン、テトラフルオロエタン（ＨＦＣ），カカオ脂、チメロサール、二酸化チタン、アルファトコフェロール、酢酸トコフェリル、アルファトコフェリル酸スクシネート、ベータ−トコフェロール、デルタ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール、トラガカント、トリアセチン、クエン酸トリブチル、トリエタノールアミン、クエン酸トリエチル、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチルテトラデシルアンモニウムブロミド、トリス緩衝液、エデト酸三ナトリウム、バニリン、Ｉ型硬化植物油、水、軟水、硬水、二酸化炭素非含有水、発熱物質非含有水、注射用水、吸入用滅菌水、注射用滅菌水、潅注用滅菌水、ロウ、アニオン性乳化ロウ、カルナウバロウ、カチオン性乳化ロウ、セチルエステルロウ、微結晶性ロウ、非イオン性乳化ロウ、坐剤用ロウ、白ロウ、黄ロウ、白色ワセリン、羊毛脂、キサンタンガム、キシリトール、ゼイン、プロピオン酸亜鉛、亜鉛塩、ステアリン酸亜鉛、またはＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２０００）に記載の任意の賦形剤（この文献は参照により全体が組み込まれる）。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）（この文献は参照により全体が組み込まれる）は、薬剤的に許容可能な組成物の調剤に使用される種々の構成成分を開示し、それらの調製に関する公知の手法を記述している。従来のいずれの薬剤も、医薬組成物と不適合でない限り、医薬組成物で使用されること���企図される。補助的な活性成分を組成物に組み込むこともできる。
【０４２２】
いくつかの実施形態では、上記の構成成分は、任意の濃度、例えば少なくともＡの濃度で医薬組成物に存在することができ、ここでＡは、０．０００１％ｗ／ｖ、０．００１％ｗ／ｖ、０．０１％ｗ／ｖ、０．１％ｗ／ｖ、１％ｗ／ｖ、２％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖ、２０％ｗ／ｖ、３０％ｗ／ｖ、４０％ｗ／ｖ、５０％ｗ／ｖ、６０％ｗ／ｖ、７０％ｗ／ｖ、８０％ｗ／ｖ、または９０％ｗ／ｖである。いくつかの実施形態では、上記の構成成分は、任意の濃度、例えば最大でＢの濃度で医薬組成物に存在することができ、ここでＢは、９０％ｗ／ｖ、８０％ｗ／ｖ、７０％ｗ／ｖ、６０％ｗ／ｖ、５０％ｗ／ｖ、４０％ｗ／ｖ、３０％ｗ／ｖ、２０％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ、２％ｗ／ｖ、１％ｗ／ｖ、０．１％ｗ／ｖ、０．００１％ｗ／ｖ、または０．０００１％である。他の実施形態では、上記の構成成分は、例えば約Ａから約Ｂの任意の濃度範囲で医薬組成物に存在することができる。いくつかの実施形態では、Ａは０．０００１％であり、Ｂは９０％である。
【０４２３】
医薬組成物は、生理学的に適合するｐＨを達成するように調剤できる。いくつかの実施形態では、医薬組成物のｐＨは、製剤および投与経路に応じて、少なくとも５、少なくとも５．５、少なくとも６、少なくとも６．５、少なくとも７、少なくとも７．５、少なくとも８、少なくとも８．５、少なくとも９、少なくとも９．５、少なくとも１０、または少なくとも１０．５、最大ｐＨ１１（１１を含む）とすることができる。いくつかの実施形態では、生理学的に適合するｐＨを達成するため、医薬組成物に緩衝剤を含めてよい。緩衝剤には、所望のｐＨで緩衝できる任意の化合物、例えば、リン酸緩衝液（例えばＰＢＳ）、トリエタノールアミン、トリス、ビシン、ＴＡＰＳ、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、ＭＥＳその他の化合物が含まれていてよい。いくつかの実施形態では、緩衝液の強度は、少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも６０ｍＭ、少なくとも７０ｍＭ、少なくとも８０ｍＭ、少なくとも９０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１２０ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、または少なくとも２００ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液の強度は、３００ｍＭ以下（例えば、最大で２００ｍＭ、最大で１００ｍＭ、最大で９０ｍＭ、最大で８０ｍＭ、最大で７０ｍＭ、最大で６０ｍＭ、最大で５０ｍＭ、最大で４０ｍＭ、最大で３０ｍＭ、最大で２０ｍＭ、最大で１０ｍＭ、最大で５ｍＭ、最大で１ｍＭ）である。
【０４２４】
投与経路
投与経路に関する以下の考察は、単に代表的な実施形態を例示するに過ぎず、決して範囲を制限するものとは解釈すべきでない。
【０４２５】
経口投与に適した製剤は、（ａ）例えば、本開示の有効量のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）を水、食塩水、オレンジジュース等の希釈液に溶解させた溶液；（ｂ）固形物または顆粒として所定量の活性成分を各々含有するカプセル剤、小袋、錠剤、ロゼンジ剤、およびトローチ剤；（ｃ）散剤；（ｄ）適切な液体中の懸濁液；ならびに（ｅ）好適な乳剤で構成し得る。液体製剤には、水およびアルコール類、例えばエタノール、ベンジルアルコール、ポリエチレンアルコール等の希釈剤が含まれていてよく、薬剤的に許容可能な界面活性剤が添加されても、添加されていなくてもよい。カプセル剤形は、例えば界面活性剤、滑沢剤、および不活性充填剤（例えばラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、およびコーンスターチ）を含有した、通常のハードまたはソフトシェルのゼラチン型にできる。錠剤剤形は、ラクトース、ストロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイド二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、防腐剤、風味剤、および他の薬理学的に適合可能な賦形剤の１つ以上を含むことができる。ロゼンジ剤形は、風味剤（通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント）内に含まれる本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）を含むことができ、また、当該技術分野において公知の賦形剤に加えて、ゼラチン、グリセリン、またはスクロースおよびアカシア、乳剤、ゲル等の不活性基剤内に含まれる本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）を含む香錠を含むこともできる。
【０４２６】
本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）は、単独で、または他の好適な構成成分と組み合わせて、経肺投与により送達でき、吸入投与するようにエアロゾル製剤にすることができる。こうしたエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容可能な噴霧剤中に配置できる。また、ネブライザー、アトマイザー等の非加圧調剤用の医薬品として製剤してもよい。このようなスプレー製剤を使用して粘膜に噴霧してもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）は、粉体混合物またはマイクロ粒子もしくはナノ粒子に製剤される。好適な経肺製剤は当該技術分野で公知となっている。例えば、Ｑｉａｎら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ３６６：２１８−２２０（２００９）；Ａｄｊｅｉ  ａｎｄ  Ｇａｒｒｅｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７（６）：５６５−５６９（１９９０）；Ｋａｗａｓｈｉｍａら，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６２（１−２）：２７９−２８７（１９９９）；Ｌｉｕら，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １０（２）：２２８−２３２（１９９３）；国際特許出願公開第ＷＯ２００７／１３３７４７号および第ＷＯ２００７／１４１４１１号を参照のこと。
【０４２７】
非経口投与に好適な製剤の例としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および対象レシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有できる水溶性および非水溶性の等張滅菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含むことのできる水溶性および非水溶性の滅菌懸濁液が挙げられる。「非経口」という語は、消化管を通過するのでなく、皮下、筋肉内、脊髄内、静脈内等の他の経路を通過することを意味する。本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）は、医薬担体中の生理学的に許容可能な希釈剤と共に投与することができる。希釈剤の例としては、滅菌液または液体（水、食塩水、水溶性ブドウ糖および関係する糖の溶液）の混合物、アルコール（例えば、メタノールもしくはヘキサデシルアルコール）、グリコール（例えば、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ケタール類（例えば２，２−ジメチル−ｌ５３−ジオキソラン−４−メタノール）、エーテル類、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリド、またはアセチル化脂肪酸グリセリドであり、こうした希釈剤には、薬剤的に許容可能な界面活性剤（例えば、石鹸もしくは洗剤）、懸濁剤（例えば、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロース）、または乳化剤、および他の医薬品補助剤が添加されているか無添加である。
【０４２８】
非経口製剤で使用できる油の例として、石油、動物油、植物油、または合成油が挙げられる。油の具体例には、ラッカセイ油、ダイズ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ワセリン、および鉱油が含まれる。非経口製剤で使用する好適な脂肪酸の例としては、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、好適な脂肪酸エステルの例である。
【０４２９】
非経口製剤での使用に好適な石鹸の例としては、脂肪酸アルカリ金属塩、アンモニウム塩、およびトリエタノールアミン塩が含まれ、好適な洗剤の例としては、（ａ）陽イオン洗剤、例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハロゲン化物、およびアルキルピリジニウムハロゲン化物、（ｂ）陰イオン洗剤、例えば、アルキル、アリール、およびオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル、およびモノグリセリド硫酸塩、ならびにスルホコハク酸塩、（ｃ）非イオン性洗剤、例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー、（ｄ）両性洗剤、例えば、アルキル−β−アミノプロピオネート、および２−アルキル−イミダゾリン四級アンモニウム塩、ならびに、（ｅ）これらの混合物が挙げられる。
【０４３０】
非経口製剤は、通常、溶液中に本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）を約０．５重量％〜約２５重量％含有する。防腐剤および緩衝剤を使用してよい。注射部位の刺激を最小化または排除するため、このような組成物は、約１２〜約１７の親水親油バランス（ＨＬＢ）値を有する１つ以上の非イオン性界面活性剤を含有してよい。このような製剤中の界面活性剤の量は、通常、約５重量％〜約１５重量％の範囲にある。好適な界面活性剤の例として、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル（例えばソルビタンモノオレート）、およびプロピレンオキシドとプロピレングリコールの縮合によって形成された疎水性塩基を有する酸化エチレンの高分子量付加物が挙げられる。非経口製剤は、単位用量または複数用量の密封容器（例えばアンプルおよびバイアル）で提供でき、かつ、使用直前に滅菌液状賦形剤（例えば、注射用の水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保管することができる。即時注射溶液および懸濁液を、前述した種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【０４３１】
注射製剤は本発明に合致する。注射組成物の有効な医薬担体に関する要求事項については、当業者に周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ  ２３８−２５０（１９８２）、およびＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，ｐａｇｅｓ  ６２２−６３０（１９８６）を参照）。
【０４３２】
加えて、本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）は、種々の基剤、例えば乳化基剤や水溶性基剤と混合することにより、直腸内投与用の坐剤として製造できる。膣内投与に適した製剤としては、活性成分に加えて、当該技術分野で適切なものとして知られる担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレーの処方薬として提示できる。
【０４３３】
当業者であれば、本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）は、上記の医薬組成物に加えて、包接錯体（例えば、シクロデキストリン包接錯体）またはリポソームとして製剤できることを認識するであろう。
【０４３４】
用量
本明細書に記述するＧＩＰアゴニストペプチドおよびグルカゴンアンタゴニストペプチドを含む本開示の組成物は、グルカゴン受容体拮抗作用およびＧＩＰ受容体のアゴニスト作用（さらに、任意でＧＬＰ−１受容体アゴニスト作用）が何らかの役割を果たす疾患または病状の治療方法において、有効であると確信される。本開示の目的のために、本開示の組成物の投与量すなわち用量は、ある妥当な期間中、対象または動物に効果（例えば、治療反応または予防反応）を与えるのに十分な量であるべきである。例えば、本開示の組成物の用量は、投与時から約１〜４分間、１〜４時間、もしくは１〜４週間、またはそれ以上の期間、例えば５〜２０週以上の間、本明細書に記載のように細胞からのｃＡＭＰの分泌を刺激するのに十分な量であるべきであり、あるいは、これらの期間の間、哺乳動物の血糖値、脂肪レベル、食物摂取レベル、または体重を減少させるのに十分な量であるべきである。ある実施形態では、この時間はさらに長期間になり得る。具体的用量は、本開示の特定の組成物の効力および動物（例えば、ヒト）の状態、ならびに治療対象の動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。
【０４３５】
投与量を決定するための多くのアッセイが、当該技術分野で公知となっている。本明細書の目的のために、哺乳動物に投与する開始用量を決定するためのアッセイとして、哺乳動物群の各動物に本開示の組成物を異なる用量で与え、各動物に所定用量を投与した時点で血糖値または体重が低下する程度を比較することを含むアッセイを使用することができ得る。ある用量を投与した時点で血糖値または体重が低下する程度を評価するには、例えば本明細書の実施例７〜１１に記述する方法を含む、当該技術分野で公知の方法を使用できる。
【０４３６】
通常は、各患者の治療に用いる本開示の組成物の用量は、種々の要因、例えば年齢、体重、全体的な健康、食餌、性別、投与する本開示の組成物、投与経路、治療する病状の重症度、および達成すべき臨床効果を考慮して、主治医が決定する。また、本開示の特定のペプチドの投与に伴って発生する可能性のある有害な副作用の存在、性質、および程度によっても、本開示の組成物の用量が決定される。
【０４３７】
標的とされる形態
当業者であれば、本開示の組成物のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）の治療効力または予防効力が修飾により増大するように、当該ペプチドを任意の数の方法で修飾できることを容易に理解するであろう。例えば、本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）は、直接的に、またはリンカーを介して間接的に、標的指向化部分（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）と結合できる。例えば本明細書に記載のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）等の化合物を実際に標的指向化部分に結合する作業は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｗａｄｈｗａら，Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，３，１１１−１２７（１９９５）ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，０８７，６１６を参照のこと。本明細書で使用する「標的指向化部分」という語は、細胞表面の受容体を特異的に認識して、この受容体と結合する分子または媒介物をいう。これにより、標的指向化部分は、本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）の送達を、表面に受容体（グルカゴン受容体、ＧＩＰ受容体、ＧＬＰ−１受容体）が発現している細胞集団に向かわせる。標的指向化部分の例としては、抗体またはその断片、ペプチド、ホルモン、成長因子、サイトカイン、および細胞表面の受容体と結合する他の任意の天然または非天然のリガンド（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＣＤ２８、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦ）、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）等）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用する「リンカー」という語は、２つの別個の実体を互いに結合する結合、分子、または分子団をいう。リンカーは、２つの実体の最適なスペーシングを提供でき、さらに、２つの実体を互いに分離させる不安定な結合を供給できる。不安定な結合の例として、光切断性の基、酸に不安定な部分、塩基に不安定な部分、および酵素切断性の基が挙げられる。いくつかの実施形態では、「リンカー」という語は、本開示のペプチドと標的指向化部分とを架橋する任意の媒介物または分子をいう。当業者であれば、本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）の部位のうち、本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）の機能に不要な部位が、リンカーおよび／または標的指向化部分と結合する部位として理想的であることを認識している。ただし、リンカーおよび／または標的指向化部分が本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）に結合した後、本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）の機能、すなわち糖尿病または肥満症を治療するために細胞からのｃＡＭＰ分泌を刺激する能力を妨げないことを条件とする。
【０４３８】
放出制御製剤および投与時期
あるいは、本明細書に記載のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）をデポ剤の形態へと改変して、本開示のペプチドの投与先体内での放出方法を、時間と体内位置に関して制御することもできる（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号を参照）。本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）のデポ剤形態は、例えば、本開示のペプチド、多孔物質、または無孔物質、例えばポリマーを含む植え込み可能な組成物であり得る。この場合、本開示のペプチドは、当該物質で封入され、または当該物質中に拡散し、かつ／または無孔物質の分解により拡散する。次いで、このデポ剤は体内の所望の位置に埋め込まれ、本開示のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）は、所定の速度でこの埋め込み物から放出される。
【０４３９】
いくつかの態様において、医薬組成物は、任意の種類のインビボ放出プロファイルを有するように修飾される。いくつかの態様において、医薬組成物は、速放性、制御放出性、徐放性、延長放出性、遅延放出性、または二相放出性の製剤である。制御放出性ペプチドの製剤方法は、当該技術分野で公知となっている。例えば、Ｑｉａｎら，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ３７４：４６−５２（２００９）および国際特許出願公開第ＷＯ２００８／１３０１５８号、第ＷＯ２００４／０３３０３６号；第ＷＯ２０００／０３２２１８号；および第ＷＯ１９９９／０４０９４２号を参照のこと。
【０４４０】
本組成物はさらに、例えば、ミセルもしくはリポソーム、または他の何らかの封入形態を含んでもよく、あるいは、保存および／または送達効果を延長するために延長放出形態で投与してもよい。
【０４４１】
開示する医薬製剤は、任意の療法に従って、例えば、毎日（１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回）、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、１ヶ月ごと、または２ヶ月ごとに投与してよい。
【０４４２】
組み合わせ
本明細書に記述するペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）は、単独で投与してもよく、あるいは、本明細書に記述する疾患または病状のいずれかを治療または防止することを目的とした他の治療薬と組み合わせて投与してもよい。例えば、本明細書に記載のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）を、抗糖尿病薬または抗肥満薬と一緒に（同時または逐次的に）投与してよい。当該技術分野において公知または開発中の抗糖尿病薬の例としては、インシュリン、レプチン、ペプチド（ＰＹＹ）、パンクレアティックペプチド（ＰＰ）、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）、Ｙ２Ｙ４受容体アゴニスト、スルホニル尿素薬、例えばトルブタミド（Ｏｒｉｎａｓｅ）、アセトヘキサミド（Ｄｙｍｅｌｏｒ）、トラザミド（Ｔｏｌｉｎａｓｅ）、クロルプロパミド（Ｄｉａｂｉｎｅｓｅ）、グリピジド（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ）、グリブリド（Ｄｉａｂｅｔａ、Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ、Ｇｌｙｎａｓｅ）、グリメピリド（Ａｍａｒｙｌ）、グリクラジド（Ｄｉａｍｉｃｒｏｎ）；メグリチニド、例えばレパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ）、ナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ）；ビグアナイド薬、例えばメトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）、フェンホルミン；チアゾリジンジオン類、例えばロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）、ピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ）、トログリタゾン（Ｒｅｚｕｌｉｎ）、または他のＰＰＡＲγ阻害薬；炭水化物消化を阻害するアルファグルコシダーゼ、例えばミグリトール（Ｇｌｙｓｅｔ）、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ／Ｇｌｕｃｏｂａｙ）；エクセナチド（Ｂｙｅｔｔａ）、プラムリンチド；ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害薬、例えばビルダグリプチン、シタグリプチン；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコーストランスポーター１）阻害薬；グルコキナーゼ活性化薬（ＧＫＡ）；グルカゴン受容体アンタゴニスト（ＧＲＡ）；ＦＢＰａｓｅ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）阻害薬が挙げられる。
【０４４３】
当該技術分野において公知または開発中の抗肥満症薬の例としては、フェネチルアミン型刺激薬、フェンテルミン（任意でフェンフルラミンまたはデクスフェンフルラミンを有する）、ジエチルプロピオン（Ｔｅｎｕａｔｅ（登録商標））、フェンジメトラジン（Ｐｒｅｌｕ−２（登録商標）、Ｂｏｎｔｒｉｌ（登録商標））、ベンズフェタミン（Ｄｉｄｒｅｘ（登録商標））、シブトラミン（Ｍｅｒｉｄｉａ（登録商標）、Ｒｅｄｕｃｔｉｌ（登録商標））等の食欲抑制薬；リモナバン（Ａｃｏｍｐｌｉａ（登録商標））、その他のカンナビノイド受容体アンタゴニスト；オキシントモデュリン；塩酸フルオキセチン（Ｐｒｏｚａｃ）；Ｑｎｅｘａ（トピラメートおよびフェンテルミン）、Ｅｘｃａｌｉａ（ブプロピオンおよびゾニサミド）、Ｃｏｎｔｒａｖｅ（ブプロピオンおよびナルトレキソン）；ＸＥＮＩＣＡＬ（オルリスタット）またはセチリスタット（ＡＴＬ−９６２としても知られる）またはＧＴ３８９−２５５と類似のリパーゼ阻害薬が挙げられる。
【０４４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）を、非アルコール性脂肪肝疾患またはＮＡＳＨの治療剤と一緒に投与する。非アルコール性脂肪肝疾患の治療に使われる薬剤の例としては、ウルソデオキシコール酸（ａ．ｋ．ａ．、Ａｃｔｉｇａｌｌ、ＵＲＳＯ、Ｕｒｓｏｄｉｏｌ）、メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）、ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、ポリミキシンＢ、およびベタインが挙げられる。
【０４４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチド（ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方）を、パーキンソン病等の神経変性疾患の治療剤と一緒に投与する。さらに、抗パーキンソン病薬も当該技術分野において公知であり、例として、レボドパ、カルビドパ、抗コリン作動薬、ブロモクリプチン、プラミペキソール、ロピニロール、アマンタジン、およびラサギリンが含まれるが、これらに限定されない。
【０４４６】
上記に鑑みて、本開示はさらに、これらの他の治療剤のいずれか１つを追加的に含む医薬組成物およびキットを提供する。こうした追加的な治療薬は、本開示のペプチドと同時または逐次的に投与してよい。態様によっては、追加的な治療剤の前にペプチドを投与する場合もあれば、追加的な治療剤の後にペプチドを投与する場合もある。
【０４４７】
用途
本明細書で最初に提供した情報に基づき、本開示の組成物（例えば、関連の医薬組成物）は、疾患または病状の治療に有用であることが企図される。例えば、ＧＩＰ受容体、ＧＬＰ−１受容体、または両方の受容体の活性欠失が、疾患または病状の発症および／または進行の一要因となっている場合である。したがって、本開示は，患者の疾患または病状を治療または防止する方法を提供する。疾患または病状とは、ＧＩＰ受容体活性化および／またはＧＬＰ−１受容体活性化の欠失が、病状の疾患の発症および／または進行と関連している病状の疾患である。上記の方法は、本明細書に記載のいずれかに従う組成物または複合体を、当該疾患または病状の治療または防止に有効な量で患者に提供することを含む。
【０４４８】
いくつかの実施形態では、疾患または病状はメタボリック症候群である。メタボリック症候群は、代謝性シンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群、Ｒｅａｖｅｎ症候群とも呼ばれ、５，０００万人を超えるアメリカ人に波及している障害である。メタボリック症候群は一般に、以下の危険因子の３つ以上の集団により特徴付けられる：（１）腹部肥満（腹部内部および周辺の過剰肥満組織）、（２）アテローム性脂質異常症（動脈壁へのプラークの蓄積を増強する高トリグリセリド、低ＨＤＬコレステロール、および高ＬＤＬコレステロールを含む血中脂質障害）、（３）高血圧、（４）インスリン抵抗または耐糖能異常、（５）血栓形成促進状態（例えば、高濃度の血中フィブリノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化抑制因子−１）、（６）炎症促進状態（例えば、血中Ｃ反応性タンパクの上昇）。他の危険因子として、加齢、ホルモン不均衡、および遺伝的素因も含まれ得る。
【０４４９】
メタボリック症候群は、冠動脈心疾患、および血管プラークの蓄積に関連する他の障害、例えば、脳卒中や、アテローム性動脈硬化症（ＡＳＣＶＤ）と称される末梢血管疾患の危険性の増大に関連する。メタボリック症候群の患者は、インスリン抵抗性状態の初期段階から末期のＩＩ型糖尿病へと進行して、ＡＳＣＶＤの危険性をさらに増大させる可能性がある。特定の理論に拘束されることは意図しないが、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、および血管疾患の間の関係は、インスリン刺激血管拡張障害、増強された酸化ストレスに起因するＮＯ利用能のインスリン抵抗性関連の低減、およびアジポネクチン等の脂肪細胞誘導ホルモンの異常を含む、１つ以上の同時発病機構を伴い得る（Ｌｔｅｉｆ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｒ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２０（ｓｕｐｐｌ．Ｂ）：６６Ｂ−７６Ｂ（２００４））。
【０４５０】
２００１年全米コレステロール教育プログラムの成人治療委員会（ＡＴＰ  ＩＩＩ）によると、同じ個人における以下のいずれか３つの特徴がメタボリック症候群の基準を満たす：（ａ）腹部肥満（男性では１０２ｃｍを超え、女性では８８ｃｍを超える胴回り）；（ｂ）血清トリグリセリド（１５０ｍｇ／ｄｌ以上）；（ｃ）ＨＤＬコレステロール（男性では４０ｍｇ／ｄｌ以下、女性では５０ｍｇ／ｄｌ以下）；（ｄ）血圧（１３０／８５以上）；および（ｅ）空腹時血糖（１１０ｍｇ／ｄｌ以上）。世界保険機構（ＷＨＯ）によると、以下の少なくともいずれか２つの基準を有する高インスリンレベル（空腹時血糖の上昇または食後血糖のみの上昇）を有する個人は、メタボリック症候群の基準を満たす：（ａ）腹部肥満（胴回りと臀部の比が０．９超、肥満度指数が少なくとも３０ｋｇ／ｍ２、または胴回りの寸法が３７インチ超）；（ｂ）コレステロールパネルが少なくとも１５０ｍｇ／ｄｌのトリグリセリドレベルまたは３５ｍｇ／ｄｌより低いＨＤＬコレステロールを示す；（ｃ）血圧が１４０／９０以上、または高血圧の治療中（Ｍａｔｈｕｒ，Ｒｕｃｈｉ，“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，”  ｅｄ．  Ｓｈｉｅｌ，Ｊｒ．，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｃ．，ＭｅｄｉｃｉｎｅＮｅｔ．ｃｏｍ，Ｍａｙ  １１，２００９）。
【０４５１】
本明細書の目的では、ある個人が、２００１年全米コレステロール教育プログラムの成人治療委員会またはＷＨＯにより設定された基準のいずれか一方または両方を満たす場合、メタボリック症候群に罹患しているものとみなす。
【０４５２】
特定の理論に拘束されることなく、本明細書に記載の組成物および複合体は、メタボリック症候群の治療に有用である。したがって、本発明は、対象におけるメタボリック症候群を予防もしくは治療するか、またはその危険因子のうち１つ、２つ、３つ、もしくはそれ以上を低減する方法を提供する。この方法は、本明細書に記載の組成物を、メタボリック症候群またはその危険因子を予防または治療するのに有効な量で対象に提供することを含む。
【０４５３】
いくつかの実施形態では、この方法は、高血糖性の病状を治療する。いくつかの態様において、高血糖性の病状とは、インスリン依存性またはインスリン非依存性の、糖尿病、Ｉ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病、または妊娠糖尿病である。いくつかの態様において、上記の方法は、腎障害、網膜症、および血管疾患を含む１つ以上の糖尿病合併症を低減することにより、高血糖性の病状を治療する。
【０４５４】
いくつかの態様において、疾患または病状は肥満症である。いくつかの態様において、肥満症は薬剤誘発性の肥満である。いくつかの態様において、上記の方法は、患者の体重増加を防止もしくは低減するか、または体重減少を増大させることにより、肥満症を治療する。いくつかの態様において、上記の方法は、食欲の低減、食物摂取量の減少、患者の脂肪レベルの低下、または胃腸系内の食物の移動速度の低下により、肥満症を治療する。
【０４５５】
肥満症は他の疾患の発症または進行と関連しているため、肥満症の治療方法は、血管疾患（冠動脈疾患、脳卒中、末梢血管疾患、虚血再灌流障害等）、高血圧、ＩＩ型糖尿病発症、高脂血症、筋骨格系疾患を含む、肥満症と関連する合併症を低減する方法においてさらに有用である。したがって、本開示は、肥満症に関連するこれらの合併症を治療または防止する方法を提供する。
【０４５６】
いくつかの実施形態では、疾患または病状は非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。ＮＡＦＬＤとは、単純な脂肪肝（脂肪変性）から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、硬変（肝臓の不可逆性進行瘢痕化）に至る広範囲の肝疾患を指す。ＮＡＦＬＤのすべての病期は、共通して、肝臓の細胞（肝細胞）における脂肪の蓄積（脂肪浸潤）を有する。単純な脂肪肝とは、炎症、瘢痕化のない肝臓の細胞に、特定の種類の脂肪、トリグリセリドが異常蓄積することである。ＮＡＳＨでは、脂肪蓄積は、多様な程度の肝臓の炎症（肝炎）および瘢痕化（線維症）に関連する。炎症性細胞は肝臓細胞を破壊し得る（肝細胞壊死）。「脂肪性肝炎」および「脂肪壊死」という用語において、脂肪（ｓｔｅａｔｏ）は、脂肪浸潤を意味し、肝炎は、肝臓における炎症を意味し、壊死は、破壊された肝臓細胞を意味する。ＮＡＳＨは、最終的に、肝臓の瘢痕化（線維症）、次いで不可逆性で進行型の瘢痕化（硬変）をもたらし得る。ＮＡＳＨにより引き起こされる硬変は、ＮＡＦＬＤの範囲の中で最終的で最も重篤な病期である（Ｍｅｎｄｌｅｒ，Ｍｉｃｈｅｌ，“Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ：Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ（ＮＡＦＬＤ）ａｎｄ  Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ（ＮＡＳＨ），”ｅｄ．Ｓｃｈｏｅｎｆｉｅｌｄ，Ｌｅｓｌｉｅ  Ｊ．，ＭｅｄｉｃｉｎｅＮｅｔ．ｃｏｍ，Ａｕｇｕｓｔ  ２９，２００５）。
【０４５７】
アルコール性肝疾患またはアルコール誘発性肝疾患は、アルコールの過剰消費に関連または起因する、３つの病理的に異なる肝臓疾患、すなわち脂肪肝（脂肪変性）、慢性または急性の肝炎、および硬変、を包含する。アルコール性肝炎の範囲は、臨床検査における異常が疾患の唯一の指標である軽度の肝炎から、黄疸（ビリルビンの保持により引き起こされる黄色皮膚）、肝性脳症（肝不全により引き起こされる神経機能障害）、腹水症（腹部内の流体の蓄積）、出血性食道静脈瘤（食道の静脈瘤）、血液凝固異常、および昏睡等の合併症を伴う重篤な肝機能不全まで及び得る。組織学的には、アルコール性肝炎は、肝細胞の球状変性、好中球による、かつ時にはマロリ小体による炎症（細胞中間径フィラメントタンパク質の異常蓄積）による特徴的な外観を有する。解剖学的には、硬変は、線維症と組み合わされた、肝臓に広範囲に分布した小結節により特徴付けられる（Ｗｏｒｍａｎ，Ｈｏｗａｒｄ  Ｊ．，“Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｗｅｂｓｉｔｅ）。
【０４５８】
特定の理論に拘束されることなく、本明細書に記載の組成物および複合体は、例えば、脂肪変性、脂肪性肝炎、肝炎、肝臓炎症、ＮＡＳＨ、硬変、またはこれらの合併症を含む、アルコール性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、またはこれらの任意の病期の治療に有用である。したがって、本開示は、対象におけるアルコール性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、またはこれらの任意の病期を予防または治療する方法を提供する。この方法は、本明細書に記載の組成物を、アルコール性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、またはこれらの任意の病期を予防または治療するのに有効な量で対象に提供することを含む。このような治療方法には、以下のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の低減が含まれる：肝臓の脂肪含有量、硬変の発生または進行、肝細胞癌の発生、炎症の徴候、例えば異常な肝酵素レベル（例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡＳＴおよび／またはアラニンアミノトランスフェラーゼＡＬＴ、またはＬＤＨ）、血清フェリチンの上昇、血清ビリルビンの上昇、ならびに／または線維症の徴候、例えばＴＧＦ−ベータレベルの上昇。いくつかの実施形態では、単純な脂肪肝（脂肪変性）を超えて進行し炎症または肝炎の徴候を示している患者に対し、本組成物を使用して治療する。このような方法により、例えば、ＡＳＴおよび／またはＡＬＴレベルが低減する可能性がある。
【０４５９】
ＧＬＰ−１およびエキセンジン−４は、何らかの神経保護効果を有することがすでに示されている。本開示はまた、本明細書に記載の組成物を神経変性疾患の治療に使用する用途も提供する。神経変性疾患の例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、その他の脱髄関連の障害、老年認知症、皮質下認知症、動脈硬化性認知症症、エイズ随伴認知症、または他の認知症、中枢神経系の癌、外傷性脳損傷、脊髄損傷、脳卒中または脳虚血、脳血管炎、てんかん、ハンチントン病、トゥレット症候群、ギラン・バレー症候群、ウィルソン病、ピック病、神経炎症障害、脳炎、脳脊髄炎、またはウイルス由来、真菌由来、もしくは細菌由来の髄膜炎、または他の中枢神経系感染症、プリオン病、小脳失調症、小脳変性症、脊髄小脳変性症候群、フリードリッヒ失調症、毛細血管拡張性運動失調症、脊髄ジスミオトロフィー（ｄｙｓｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）、進行性核上麻痺、ジストニア、筋痙縮、振戦、網膜色素変性症、線条体黒質変性症、ミトコンドリア脳筋症、神経セロイドリポフスチン症、肝性脳症、腎性脳症、代謝性脳症、毒素誘発脳症、および放射線誘発脳損傷が含まれるが、これらに限定されない。
【０４６０】
いくつかの実施形態では、病院内の非糖尿病患者（例えば、非経口的栄養法または完全非経口栄養法を受けている患者）に投与される非経口的栄養素と併せて本組成物を使用する。非制限的例として、外科手術患者、昏睡状態の患者、消化管疾患もしくは機能していない胃腸管を有する患者（例えば外科的除去、遮断、または吸収容量の低下に起因する）、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃腸管閉塞、胃腸管瘻、急性膵炎、虚血腸管、消化管の大手術、ある特定の先天性消化管異常、長期間続く下痢、または手術により生じる短腸症候群を有する患者、ショック状態の患者、および、治癒過程にあり、脂質、電解質、ミネラル、ビタミン、およびアミノ酸の種々の組み合わせと共に炭水化物の非経口的投与を頻繁に受けている患者が含まれる。本明細書に記載のＧＩＰアゴニストペプチドおよびグルカゴンアンタゴニストペプチド、および非経口的栄養組成物を含む組成物は、同時に投与しても、異なる時間に投与してもよく、あるいは、いずれかを先にして逐次的に投与してもよい。ただし、非経口的栄養組成物が消化されるとき、本組成物が所望の生物学的効果を発揮することを条件とする。例えば、非経口的栄養は１日に１回、２回、または３回投与し、他方、本組成物は１日おき、１週間に３回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、または１ヶ月に１回投与してよい。
【０４６１】
本明細書で使用する「治療」および「予防」という語、ならびにこれらの派生語は、必ずしも１００％または完全な治療または予防を含意しない。むしろ、様々な程度の治療または予防があり、当業者はこのことを、潜在的な恩恵または治療効果を有するものと認識している。この点で、本開示の方法は、哺乳動物における疾患または病状を、任意のレベルの任意の量で治療または防止する。さらに、本方法が提供する治療または防止には、疾患または病状の１つ以上の状態または症状の治療または防止が含まれ得る。例えば、肥満症の治療方法に関して、本方法は、いくつかの実施形態では、患者の食物摂取量または脂肪レベルの減少を達成する。また本明細書では、「予防」という語は、疾患またはその症状もしくは状態の発症を遅延させることを包含し得る。
【０４６２】
上記の治療方法に関して、患者は任意の宿主である。いくつかの実施形態では、宿主は哺乳動物である。本明細書で使用する「哺乳動物」という語は、単孔類、有袋類、有胎盤類を含む、哺乳綱の任意の脊椎動物をいう。いくつかの実施形態では、哺乳動物はネズミ目の哺乳動物（例えばマウスおよびハムスター）のいずれかであり、ウサギ目の哺乳動物（例えばウサギ）である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ネコ科（ネコ）およびイヌ科（イヌ）を含む食肉目に由来する。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ウシ（牛）、ブタ（豚）を含む偶蹄目、またはウマ（馬）を含む奇蹄目に由来する。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、霊長目、セボイド目（Ｃｅｂｏｉｄｓ）、もしくはシモイド目（Ｓｉｍｏｉｄｓ）（サル）、または真猿亜目（ｏｒｄｅｒ  Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄｓ）（ヒトおよび類人猿）に属する。特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【０４６３】
キット
本開示はさらに、ＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドを含むキットを提供し、ＧＩＰアゴニストペプチドおよびグルカゴンアンタゴニストペプチドの各々は本明細書に記載の教示内容に従っている。したがって、いくつかの実施形態では、このキットは、ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの少なくとも０．１％の活性を示すＧＩＰアゴニストペプチドと、グルカゴン受容体に対してグルカゴンが達成する最大反応の少なくとも６０％の阻害を示すグルカゴンアンタゴニストペプチドを含む。
【０４６４】
いくつかの態様において、ＧＩＰアゴニストペプチドは、グルカゴンアンタゴニストペプチドとは別個に包装される。例えば、このキットは２つの別個の容器を含むことができ、容器の例としては、バイアル、チューブ、ボトル、単室または複室の充填済み注射器、カートリッジ、注入ポンプ（体外型または埋め込み型）、噴射式注射器、充填済みペン型注入器等が挙げられ、これらの容器の各々が、ＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドのいずれか一方を格納する。代替の態様においては、ＧＩＰアゴニストペプチドは、グルカゴンアンタゴニストペプチドと一緒に包装される。例えば、ＧＩＰアゴニストペプチドはグルカゴンアンタゴニストペプチドと結合し、この複合体が、上記の容器のような単一容器形態のキットに入って提供される。
【０４６５】
いくつかの実施形態では、ＧＩＰアゴニストペプチド、グルカゴンアンタゴニストペプチド、または両方は、凍結乾燥形態または水溶液としてキットに入って提供される。
【０４６６】
いくつかの実施形態では、キットは使用説明書を含む。 いくつかの態様において、この説明書には、ＧＩＰアゴニストペプチドとグルカゴンアンタゴニストペプチドの同時および別個の併用投与に関する指示が含まれる。
【０４６７】
一実施形態では、キットは、本組成物を患者に投与するための装置、例えば、注射針、ペン型装置、噴射式注射器、または他の無針注射器と共に提供される。一実施形態によれば、キットの装置はエアロゾルディスペンサーであり、本組成物はこのエアロゾル装置内に予め包装される。別の実施形態では、キットは注射器と針を含み、一実施形態では、無菌組成物が注射器内に予め包装される。
【０４６８】
いくつかの実施形態では、キットは、例えば上記担体等の薬剤的に許容可能な担体を含む。
【０４６９】
以下の実施例は、単に本発明を例示するために示すものであり、本発明の範囲を何ら制限しない。
【実施例】
【０４７０】
実施例１：  グルカゴンペプチド断片の合成
材料
本実施例に記載される全てのペプチドは、特に指定がなければ、アミド化された。
【０４７１】
ＭＢＨＡ樹脂（４−メチルベンズヒドリルアミンポリスチレンレジンがペプチド合成の間に使用された。ＭＢＨＡ樹脂、１００〜１８０メッシュ、１％ＤＶＢ架橋ポリスチレン、０．７〜１．０ｍｍｏｌ／ｇの割合での負荷）、Ｂｏｃ保護化アミノ酸、及び、Ｆｍｏｃ保護化アミノ酸をミッドウェストバイオテクより購入した。Ｂｏｃ保護化アミノ酸を使用する固相ペプチド合成はアプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）４３０Ａペプチドシンセサイザーで行われた。Ｆｍｏｃ保護化アミノ酸合成はアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）モデル４３３ペプチドシンセサイザーを用いて行われた。
【０４７２】
ペプチド合成（Ｂｏｃアミノ酸／フッ化水素切断）
これらの類似体の合成はアプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）４３０Ａペプチドシンセサイザーで行われた。合成ペプチドは、２ｍｍｏｌのＢｏｃ保護化アミノ酸を含むカートリッジへのアミノ酸の順次付加により構築された。具体的には、合成はＢｏｃ  ＤＥＰＢＴ活性化シングルカップリングを用いて行われた。カップリング工程の最後に、ペプチジルレジンをＮ末端Ｂｏｃ保護基を除去するためにＴＦＡで処理した。それを、繰返しＤＭＦで洗浄し、この繰り返しサイクルを望みの回数のカップリング工程について繰り返した。構築の後に、側鎖の保護、すなわち、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン処理により除去し、ＤＩＣを用いてアシル化を行った。合成全体の最後にペプチジルレジンをＤＣＭを用いて乾燥し、ペプチドを無水フッ化水素によってレジンから切断した。
【０４７３】
ラクタム化のために、直交性保護基をグルタミン酸、及び、リシンについて選択した（例えば、グルタミン酸（Ｆｍ）、リシン（Ｆｍｏｃ））。保護基の除去後とフッ化水素切断の前に、閉環反応を以前に記述されたように行った（例えば、国際特許出願公報第ＷＯ２００８／１０１０１７号を参照のこと。）。
【０４７４】
ぺプチジルレジンのフッ化水素処理
ぺプチジルレジンは無水フッ化水素で処理され、これにより約３５０ｍｇの（約５０％の収率）脱保護化粗ペプチドが典型的に生じた。具体的には、ペプチジルレジン（３０ｍｇから２００ｍｇ）を切断のためにフッ化水素（ＨＦ）反応容器中に置いた。５００μＬのｐ−クレゾールをカルボニウムイオン捕捉剤として容器に加えた。容器をフッ化水素システムに取り付け、メタノール／ドライアイス混合物中に沈めた。容器を真空ポンプで真空し、１０ｍｌのフッ化水素を蒸留されて反応容器に移した。ペプチジルレジンとフッ化水素の反応混合物を０℃で１時間撹拌し、その後、真空を確立し、フッ化水素を急速に取り除いた（１０〜１５分）。容器を慎重に取り出し、ペプチドを沈殿させるために、そして、ｐ−クレゾールとフッ化水素処理の結果生じた小分子有機保護基を抽出するために約３５ｍｌのエーテルで容器を満たした。この混合物をテフロンフィルターを利用して濾過し、過剰なクレゾールの全てを除去するために２回繰り返した。この濾過液を廃棄した。沈殿したペプチドは約２０ｍｌの１０％酢酸（水溶液）に溶解する。望みのペプチドを含むこの濾過液を回収し、凍結乾燥した。
【０４７５】
可溶化された粗ペプチドの分析ＨＰＬＣ解析は次の条件で行った：４．６×３０ｍｍ  Ｘｔｅｒｒａ  Ｃ８カラム，流速１．５０ｍＬ／分，検出波長  ２２０ｎｍ，Ａ緩衝液  ０．１％ＴＦＡ／１０％ＡＣＮ，Ｂ緩衝液  ０．１％ＴＦＡ／１００％ＡＣＮ，１５分間の５〜９５％Ｂ緩衝液の濃度勾配。抽出物を水で２倍に希釈し、２．２×２５ｃｍ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ４分取用逆相カラムに充填し、ウォータース（Ｗａｔｅｒｓ）ＨＰＬＣシステム上でアセトニトリルの濃度勾配（０．１％ＴＦＡ／１０％ＡＣＮのＡ緩衝液、０．１％ＴＦＡ／１０％ＣＡＮのＢ緩衝液、及び、１５．００ｍｌ／分の流速で１２０分間に０〜１００％までＢ緩衝液の比率が変化する濃度勾配）を用いて溶出した。精製されたペプチドのＨＰＬＣ解析により９５％超の純度が示され、エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー解析をペプチドが何であるかを確認するために使用した。
【０４７６】
ペプチドのアシル化
アシル化ペプチドを次のように調製した。ＣＳ  Ｂｉｏ４８８６ペプチドシンセサイザー、又は、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４３０Ａペプチドシンセサイザーのどちらかを用いてペプチドを固相支持レジン上で合成した。Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ペプチド及びタンパク質研究国際誌（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．）  ４０：１８０−１９３（１９９２）によって記述されるように、ｉｎ  ｓｉｔｕ中和化学を用いた。アシル化ペプチドについては、アシル化される標的アミノ酸残基（例えば、配列番号１のアミノ酸の位置を示す番号付けに関して、位置１０）をＮε−ＦＭＯＣリシン残基で置換した。完成したＮ末端Ｂｏｃ保護化ペプチドを２０％ピペリジンＤＭＦで３０分間処理することによりＦＭＯＣ／ホルミル基を除去した。リシン残基の遊離ε−アミノ基へのカップリングは、モル濃度で１０倍過剰のＦＭＯＣ保護化スペーサーアミノ酸（例えば、ＦＭＯＣ−グルタミン−ＯｔＢｕ）、又は、アシル鎖（例えば、ＣＨ３（ＣＨ２）１４−ＣＯＯＨ）のどちらかとＤＭＦ／ＤＩＥＡ中のＰｙＢＯＰカップリング試薬、又は、ＤＥＰＢＴカップリング試薬を結合させることにより達成した。その後に行われるスペーサーアミノ酸のＦＭＯＣ基の除去の後にアシル鎖との結合が再度行われる。１００％ＴＦＡでの最終的な処理により、側鎖保護基とＮ末端Ｂｏｃ基が除去される。ペプチドレジンを５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦで中和して、乾燥し、その後、９５：５のフッ化水素／ｐ−クレゾール混液を０℃で１時間用いて支持体から切断した。エーテル抽出に引き続いて、粗ペプチドを溶媒和するために５％酢酸溶液を用いた。前記溶液のサンプルはそれから、ＥＳＩ−ＭＳによって正しい分子量のペプチドを含むことが確認された。正しいペプチドを、１０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡから１００％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡまで変化する直線濃度勾配を用いるＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製のためにＶｙｄａｃ  Ｃ１８  ２２ｍｍ×２５０ｍｍタンパク質カラムを使用した。アシル化ペプチド類似体は一般的に、２０：８０の緩衝液比率で溶出を完了した。溶出部分をひとまとめにそ、分析ＲＰ−ＨＰＬＣで純度について検査した。純粋な画分を凍結乾燥し、白色の固形物のペプチドを生じた。
【０４７７】
ペプチドがラクタム架橋とアシル化される標的残基を含むとき、アシル化を上述したようにペプチド骨格へそのアミノ酸を付加する際に行う。
【０４７８】
ペプチドのＰＥＧ化
ペプチドのＰＥＧ化のために、４０ｋＤａのメトキシポリ（エチレングリコール）イドアセトアミド（ＮＯＦ）をモル当量の７Ｍ尿素、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液中のペプチドと、ペプチドとＰＥＧの両方を透明な溶液になるまで溶かすのに必要な最小量（一般に２〜３ｍｇのペプチドを使用する反応に２ｍＬ未満）の溶媒を用いて反応させた。室温での激しい撹拌が４〜６時間の間に始まり、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより反応を解析した。ＰＥＧ化産物は、保持時間の減少のために出発物質とまったく違うように見えた。精製を、最初のペプチド精製に用いられたのと同様の条件によりＶｙｄａｃ  Ｃ４カラムで行った。溶出は５０：５０の緩衝液比率の辺りで起こった。純粋なＰＥＧ化ペプチドの画分が見出され、凍結乾燥させた。反応ごとに変動するが、収率は５０％超であった。
【０４７９】
マススペクトロメトリーを用いる解析
標準的ＥＳＩイオン源を装備したＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ−ＩＩＩエレクトロスプレー四極マススペクトロメーターを用いてマススペクトルが得た。使用したイオン化条件は次の通りである。陽イオンモードのＥＳＩ、３．９ｋＶのイオンスプレー電圧、６０Ｖのオリフィス電位。使用した噴霧とカーテンガスは．９Ｌ／分の流速の窒素であった。マススペクトルを０．５  Ｔｈ／ステップと２ミリ秒の滞留時間において６００〜１８００トンプソンから記録した。サンプル（約１ｍｇ／ｍＬ）を１％酢酸を含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、５μＬ／分の速度で外部シリンジポンプによって注入した。
【０４８０】
ペプチドをＰＢＳ溶液中においてＥＳＩ  ＭＳにより解析する際、それらを最初に、製造業者により提供された説明書（ミリポアコーポレーション、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州、ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇｕｅ．ｎｓｆ／ｄｏｃｓ／Ｃ５７３７のミリポアのウェッブサイトを参照のこと。）に従って、０．６μＬのＣ４レジンを含むＺｉｐＴｉｐ固相抽出チップを用いて脱塩した。
【０４８１】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）解析
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液（ｐＨ７．２）でのこれら粗ペプチドの相対的な変換率の近似値を得るために、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）とＭＡＬＤＩ解析を用いて予備的な解析をそれらのペプチドを用いて行った。粗ペプチドサンプルを１ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解した。結果生じた溶液の１ｍｌを１．５ｍｌのＨＰＬＣバイアルに貯え、それから封をし、３７℃で保温した。１００μｌのアリコートを様々な時間間隔で取り出し、室温にまで冷却させ、ＨＰＬＣにより解析した。
【０４８２】
ＨＰＬＣ解析を、２１４ｎｍでのＵＶ検出器を使用するベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄクロマトグラフィーシステムを用いて行った。ＨＰＬＣ解析を１５０ｍｍ×４．６ｍｍ  Ｃ１８  Ｖｙｄａｃカラム上で行った。流速は１ｍｌ／分であった。Ａ溶媒は蒸留水中に０．１％ＴＦＡを含有し、そして、Ｂ溶媒は９０％アセトニトリル中に０．１％ＴＦＡを含有した。直線濃度勾配を用いた（１５分間に４０％から７０％にＢ溶媒の比率が変化する。）。Ｐｅａｋ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙソフトウェアを用いてデータが収集し解析した。
【０４８３】
各前駆薬剤の解離についての速度定数を測定するため、加水分解の初期速度を使用した。前駆薬剤と薬剤の濃度を、それぞれ、それらのピーク領域から推定した。前駆薬剤の一次解離速度定数を様々な時間間隔での前駆薬剤の濃度の対数をプロットすることにより決定した。このプロットの傾きから、速度定数「ｋ」が与えられる。様々な前駆薬剤の分解の半減期を、次いでｔ１／２＝．６９３／ｋの式を用いて計算した。
【０４８４】
特定の実施形態において、次の方法が使用され得る。
【０４８５】
Ｂｏｃ−化学戦略を用いる一般的なペプチド合成法
改造型アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）４３０Ａペプチドシンセサイザー上で０．２ｍｍｏｌのＭＢＨＡ樹脂、又は、第１アミノ酸結合Ｐａｍ樹脂から始まるＨＢＴＵ活性化「Ｆａｓｔ  Ｂｏｃ」シングルカップリングを用いてグルカゴン類似体を合成した。Ｂｏｃアミノ酸とＨＢＴＵはミッドウェストバイオテック（Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（Ｆｉｓｈｅｒｓ、インディアナ州）から入手した。使用した一般的な側鎖保護基はアルギニン（Ｔｏｓ）、アスパラギン（Ｘａｎ）、アスパラギン酸（ＯｃＨｅｘ）、システイン（ｐＭｅＢｚｌ）、ヒスチジン（Ｂｏｍ）、リシン（２Ｃｌ−Ｚ）、セリン（ＯＢｚｌ）、トレオニン（ＯＢｚｌ）、チロシン（２Ｂｒ−Ｚ）、及び、トリプトファン（ＣＨＯ）であった。Ｂｏｃ−グルタミン酸（ＯＦｍ）−ＯＨ、及び、Ｂｏｃ−リシン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ、Ｗｏｏｄ  ｄａｌｅ、イリノイ州）をラクタム架橋形成部位において使用した。Ｎ末端３−フェニル乳酸（ＰＬＡ）（アルドリッチ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ウィスコンシン州）を、自動化された固相合成の後、手作業でＢＥＰＢＴ（３−（ジエトキシ−ホスホリルオキシ）−３Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアジン−４−オン（シンケムＩｎｃ．，Ａｕｒｏｒａ，オハイオ州）により結合した。
【０４８６】
固相ペプチド合成の後、完成した各ペプチジルレジンをＦｍｏｃ基を除去するために２０％ピペリジン／ＤＭＦで処理した。ラクタム架橋形成のために、通常２９９ｍｇの（１ｍｍｏｌ、５倍）ＢＥＰＢＴを１０％ＤＩＥＡ／ＤＭＦに加え、ニンヒドリン検査が陰性と示されるまで２〜４時間反応させた。
【０４８７】
ペプチドを、ｐ−クレゾールとジメチルスルフィドの存在下で行われた液体フッ化水素切断により切断した。切断は氷浴中でフッ化水素装置（ペニンシュラ・ラブズ（Ｐｅｎｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｓ））を用いて１時間行われた。フッ化水素の蒸発の後、残留物をジエチルエーテルに懸濁し、固形物を濾過し、エーテルで洗浄した。各ペプチドを３０〜７０ｍｌの酢酸水溶液に抽出し、水で希釈し、凍結乾燥した。粗ペプチドを分析ＨＰＬＣで解析され、ペプチドの分子量をＥＳＩマススペクトロメトリー、又は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーで検査した。それからペプチドを一般的なＨＰＬＣ精製方法によって精製した。
【０４８８】
Ｆｍｏｃ化学戦略を用いる一般的なペプチド合成法
ペプチドを、ＡＢＩ４３３Ａ自動化ペプチドシンセサイザー上でカップリング試薬としてＤＩＣ／ＨＯＢＴを使用するＲｉｎｋ  ＭＢＨＡアミド樹脂、又は、第１アミノ酸結合Ｗａｎｇ樹脂（ノバビオケム、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）との標準的Ｆｍｏｃ化学を用いて合成した。自動化ペプチド合成の後、３−フェニル乳酸（ＰＬＡ）を手作業でＢＥＰＢＴにより結合した。Ｎα−Ｆｍｏｃ［Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル］アミノ酸の側鎖保護基は次の通りであった：アルギニン，Ｐｍｃ；アスパラギン酸，ＯｔＢｕ；システイン，Ｔｒｔ；グルタミン，Ｔｒｔ；ヒスチジン，Ｔｒｔ；リシン，Ｂｏｃ；セリン，ｔＢｕ，チロシン，ｔＢｕ；及び、トリプトファン，Ｂｏｃ（Ｐｍｃ＝２，２，５，７，８−ペンタメチルコマン−６−スルホニル基、ＯｔＢｕ＝ｔｅｒｔ−ブチルエステル基，Ｔｒｔ＝トリチル基，Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基、及び、ｔＢｕ＝ｔｅｒｔ−ブチルエステル基）。Ｆｍｏｃ−グルタミン酸（Ｏ−２−ＰｈｉＰｒ）−ＯＨ、及び、Ｆｍｏｃ−リシン（Ｍｍｔ）−ＯＨ（ノバビオケム、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州）をラクタム架橋部位に取り込んだ。
【０４８９】
固相合成の後、グルタミン酸上の２−フェニルイソプロピル（２−ＰｈｉＰｒ）基とリシン上の４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）基を、ペプチジル樹脂に１％ＴＦＡ／ＤＣＭを通すことにより除去した。ラクタム架橋形成のために、通常１５０ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ、５倍）のＢＥＰＢＴを１０％ＤＩＥＡ／ＤＭＦに加え、ニンヒドリン検査が陰性であると示されるまで２〜４時間反応させた。
【０４９０】
８５％ＴＦＡ、５％フェノール、５％水、及び、５％チオアニソール（ペプチドがシステインを含むとき、２．５％のＥＤＴを加えた。）を含む切断カクテルを用いてペプチドをレジンから切断させた。粗ペプチドをエーテル中に沈殿させ、遠心分離し、そして、凍結乾燥した。それから、ペプチドを分析ＨＰＬＣにより解析し、ＥＳＩマススペクトロメトリー、又は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより検査した。ペプチドを一般的なＨＰＬＣ精製方法により精製した。
【０４９１】
一般的な分析ＨＰＬＣ方法
分析ＨＰＬＣを、ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ８カラム（０．４６×５ｃｍ、５μｍ、アジレント）を装着されたベックマンＳｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ  ＨＰＬＣシステム上で１．０ｍＬ／分の流速での濃度勾配溶出を用いて行い、２１４ｎｍでモニターした。濃度勾配を１０分間に１０％から８０％までＢ緩衝液の比率が変化する濃度勾配とその後の５分間の１０％Ｂ緩衝液として設定した。緩衝液Ａ＝０．１％ＴＦＡ、及び、緩衝液Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル。
【０４９２】
一般的な分取ＨＰＬＣ精製方法
特別に言及がなければ、ペプチドは通常、２１４ｎｍ、又は、２３０ｎＭ
でモニターするセミ分取ＨＰＬＣカラム（ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ８、２１．２×２５０ｍｍ、７μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を装着したウォータース６００Ｅ連結４８６モニターシステムで精製した。緩衝液Ａ＝０．１％ＴＦＡ／１０％アセトニトリル、及び、緩衝液Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル。精製のために使用した濃度勾配は、特別に言及がなければ、１２ｍｌ／分の流速で、４０分間に０〜３０％まで緩衝液Ｂの比率が変化し、その後の３０分間に３０〜５０％まで緩衝液Ｂの比率が変化する濃度勾配であった。画分を分析ＨＰＬＣで解析され、マススペクトロメトリーにより検査した。９０％超の純度の画分を収集し、凍結乾燥し、保存した。純度が６０〜９０％の画分を合わせ、凍結乾燥し、再度、精製した。
【０４９３】
一般的ＰＥＧ化法：（システインマレイミド法）
グルカゴンシステイン類似体をリン酸緩衝生理食塩水に溶解し（５〜１０ｍｇ／ｍｌ）、０．０１Ｍエチレンジアミン四酢酸が加える（総容量の１０〜１５％）のが典型的である。過剰の（１．２〜２倍）メトキシポリエチレングリオールマレイミド（ＭＡＬ−ｍ−ｄＰＥＧ）試薬を加え、ＨＰＬＣで反応の進行をモニターしながら反応物を室温で撹拌する。２〜１２時間後、反応混合物を酸性化し、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルの濃度勾配を用いる精製のために分取逆相カラムに充填する。適切な画分を合わせ、凍結乾燥し、望みのＰＥＧ化誘導体を生じた。
【０４９４】
ＰＢＳ中で低い溶解性を示すペプチドについては、ペプチドを２５％アセトニトリル水溶液、又は、５０〜１００ｍＭトリス（ｐＨ８．０〜８．５に調節する）を含む４〜６Ｍ尿素緩衝液に溶解し、ＰＥＧ試薬と反応させた。
【０４９５】
上述の方法で合成された化合物の具体例は次のとおり提供される。
【０４９６】
［ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８］グルカゴン（６−２９）アミドの合成
ペプチド配列ＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＤＴ（配列番号１２４９）を、まず、カップリング試薬としてＤＩＣ／ＨＯＢＴを使用する、０．１ｍｍｏｌのＲｉｎｋ  ＭＢＨＡアミドレジンを用いる０．１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ／ＨＯＢＴ／ＤＣＣ化学プログラムを用いてＡＢＩ４３３Ａ自動化ペプチドシンセサイザーで固相合成した。次のＦｍｏｃアミノ酸を使用した。アラニン、アルギニン（Ｐｍｃ）、アスパラギン酸（ＯｔＢｕ）、アスパラギン（Ｔｒｔ）、グルタミン酸（Ｏ−２−ＰｈｉＰｒ）、グルタミン（Ｔｒｔ）、ロイシン、リシン（Ｂｏｃ）、リシン（Ｍｍｔ）、メチオニン、フェニル乳酸、セリン（ｔＢｕ）、トレオニン（ｔＢｕ）、トリプトファン（Ｂｏｃ）、チロシン（ｔＢｕ）、及び、バリン。自動化合成の後、ペプチジルレジンを手作業で３−フェニル乳酸（８３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）及びＤＥＰＢＴ（１５０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）と４ｍｌの５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ中で約２時間結合させ、次の配列のペプチジル樹脂を得た。ＨＯ−フェニル乳酸−トレオニン−セリン−アスパラギン酸−チロシン−セリン−リシン−チロシン−ロイシン−アスパラギン酸−グルタミン酸−アルギニン−アルギニン−アラニン−リシン−アスパラギン酸−フェニルアラニン−バリン−グルタミン−トリプトファン−ロイシン−メチオニン−アスパラギン酸−トレオニン−ＮＨ２（配列番号１２０６）。
【０４９７】
ペプチジル樹脂に５０ｍｌの１％ＴＦＡ／ＤＣＭを５〜１０分間通し、ＤＣＭ、５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ、及び、ＤＭＦで洗浄した。ペプチジル樹脂をそれから、１０％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ中の１５０ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ、５倍）のＤＥＰＢＴで２〜４時間、ニンヒドリン検査が陰性であると示されるまで処理した。
【０４９８】
ペプチジル樹脂を、室温で２時間、８．５ｍｌのＴＦＡに０．５ｇのフェノール、０．５ｍｌの水、及び、０．５ｍｌのチオアニソールを加えた混液で処理した。ＴＦＡに溶解されたペプチドを濾過し、４０ｍｌのエーテルを加えてペプチドを沈殿させた。粗ペプチドを遠心分離し、酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥して１５０〜２５０ｍｇの粗ペプチドを得た。精製の後、２０〜３０ｍｇ（総計で１０〜１５％の収率）の純度９５％のペプチドが得られた。ペプチドを一般的な分析ＨＰＬＣで解析し、７．６３分の保持時間を示し、ＥＳＩ−ＭＳ解析により、分子量２９９７．３のペプチドと一致する望みの質量である２９９７．０が示された。
【０４９９】
同様の方法を次のペプチドを合成するために用いた：分析ＨＰＬＣによる７．１７分の保持時間と計算上の分子量３８４５．２に相当するＥＳＩ−ＭＳによる質量３４４４．５を有する［ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム）］グルカゴン（６−３９）アミド；分析ＨＰＬＣによる７．７１分の保持時間と計算上の分子量２９９７．３に相当するＥＳＩ−ＭＳによる質量２９９７．０を有する［ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｋ１２Ｅ１６（ラクタム），Ｄ２８］グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣによる７．２７分の保持時間と計算上の分子量３８４５．２に相当するＥＳＩ−ＭＳによる質量３８４５．５を有する［ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｋ１２Ｅ１６（ラクタム）］グルカゴン（６−３９）アミド；分析ＨＰＬＣによる７．８５分の保持時間と計算上の分子量２９７２．３に相当するＥＳＩ−ＭＳによる質量２９７２．０を有する［ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｃ２４，Ｄ２８］グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣによる７．８３分の保持時間と計算上の分子量２９７２．３に相当するＥＳＩ−ＭＳによる質量２９７１．５を有する［ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｋ１２Ｅ１６（ラクタム），Ｃ２４，Ｄ２８］グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣによる７．１３分の保持時間と計算上の分子量３９３５．３に相当するＭＡＬＤＩ−ＭＳによる質量３９３５．７を有する［ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８，Ｃ４０］グルカゴン（６−４０）アミド。
【０５００】
［ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｃ２４（２０Ｋ），Ｄ２８］グルカゴン（６−２９）アミドの合成
１５ｍｇ（０．００５ｍｍｏｌ）の［ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｃ２４，Ｄ２８］グルカゴン（６−２９）アミドと１２０ｍｇ（０．００６ｍｍｏｌ）の２０Ｋ  ｍＰＥＧ−ＭＡＬ（分子量：約２０，０００、Ｃｈｉｒｏｔｅｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｓ  ＣＢ４  ０ＷＧ，ドイツの）を９ｍｌの２５％アセトニトリル水溶液と約０．５〜１ｍｌの１Ｍトリス塩基緩衝液（ｐＨを８．０〜８．５に調節する）に溶解した。反応物を室温で撹拌し、反応の進行を分析ＨＰＬＣによりモニターした。初期産物がＨＰＬＣで検出されなくなった後（２〜６時間）、反応混合物を分取ＨＰＬＣによって直接精製した。画分を分析ＨＰＬＣにより２１４ｎｍで検査し、また、２８０ｎｍの紫外線で測定した。９０％のＨＰＬＣによる純度を有し、また、紫外線測定で高吸収（Ａ２８０ｎｍ＝１．０〜２．０）を有する画分を合わせ、凍結乾燥した。分析ＨＰＬＣ解析により８．５〜８．６分の保持時間を示し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより２２Ｋ〜２４Ｋの広範なマススペクトロメトリーを示す、約６０〜８０ｍｇの［ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｃ２４（２０Ｋ），Ｄ２８］グルカゴン（６−２９）アミドを得ることができる。
【０５０１】
同様の方法を、［ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｋ１２Ｅ１６（ラクタム），Ｃ２４（２０Ｋ），Ｄ２８］グルカゴン（６−２９）アミド、及び、［ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８，Ｃ４０（２０Ｋ）］グルカゴン（６−４０）アミドを合成するために使用した。
【０５０２】
［ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｃ２４，Ｄ２８］グルカゴン（６−２９）アミド二量体の合成
２０ｍｇ（０．００６７３ｍｍｏｌ）の［ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｃ２４，Ｄ２８］グルカゴン（６−２９）アミドを６ｍｌのＰＢＳ緩衝液、０．５〜１ｍｌの１Ｍトリス塩基（ｐＨ８．０〜８．５に調節する）、及び、３ｍｌのＤＭＳＯの混液に溶解した。反応混合物を開放式容器の中で撹拌し、２時間ごとに分析ＨＰＬＣによりモニターした。初期産物（ＨＰＬＣの保持時間７．８５分）がなくなり、二量体産物（ＨＰＬＣの保持時間７．９６分）が優勢的な産物となった後（約２４時間）、混合物を０．１％ＴＦＡ１０％アセトニトリル水溶液で希釈し、分取ＨＰＬＣにより直接精製した。凍結乾燥されたのち、約６〜１０ｍｇの計算上の分子量５９４２．６に対応するＥＳＩ−ＭＳによる質量５９４２．０を有する［ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｃ２４，Ｄ２８］グルカゴン（６−２９）アミドが得られた
【０５０３】
ラクタム架橋デプシペプチド［Ａｉｂ２，Ｅ３，トレオニン５−Ｏ−ＰＬＡ６，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８］Ｇ（２−２９）アミドの合成
配列ＨＯ−ＰＬＡ−ＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＤＴ［ＰＬＡ６，Ｅ１６，Ｋ２０，Ｄ２８］グルカゴン（６−２９）を有するペプチジル樹脂を、０．２ｍｍｏｌのＭＢＨＡアミド樹脂とカップリング試薬としてＤＥＰＢＴを使用して、ＡＢＩ４３０Ａ自動化ペプチドシンセサイザーを用いる固相Ｂｏｃ化学により合成した。次のＢｏｃアミノ酸を使用した：位置１６のグルタミン酸をＢｏｃ−グルタミン酸（ＯＦｍ）−ＯＨと統合を、位置２０のリシンをＢｏｃ−リシン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨと統合することを除き、アラニン、アルギニン（Ｔｏｓ）、アスパラギン酸（ＯｃＨｘ）、アスパラギン（Ｘａｎ）、グルタミン酸（ＯｃＨｘ）、グルタミン（Ｘａｎ）、ロイシン、リシン（２−Ｃｌ−Ｚ）、メチオニン、フェニル乳酸、セリン（ＯＢｚｌ）、トレオニン（ＯＢｚｌ）、トリプトファン（ＣＨＯ）、チロシン（２．６−ｄｉ−Ｃｌ−Ｂｚｌ）、及び、バリン。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで位置１６と位置２０のＦｍ保護基、及び、Ｆｍｏｃ保護基を除去した後、ペプチジル樹脂を１０％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ中の３００ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＤＥＰＢＴと約４時間処理し、ラクタム架橋を形成した。このラクタム架橋ペプチジル樹脂に、ＤＣＭ中のＢｏｃ−トレオニン（ＯＢｚｌ）−ＯＨ（２ｍｍｏｌ）／ＤＩＣ（１ｍｍｏｌ）／ＤＭＡＰ（０．２ｍｍｏｌ）から構成される前もって活性化された対称酸無水物溶液を加え、１６時間、反応を進めた。残りのアミノ酸であるＢｏｃ−グリシン−ＯＨ、Ｂｏｃ−グルタミン酸（ＯｃＨｘ）−ＯＨ、及び、Ｂｏｃ−アミノイソ酪酸−ＯＨを、再度、標準的なＢｏｃ化学により結合させ、次の配列のデプシペプチジル樹脂を得た：アミノイソ酪酸−グルタミン酸−グリシン−トレオニン−Ｏ−フェニル乳酸−トレオニン−セリン−アスパラギン酸−チロシン−セリン−リシン−チロシン−ロイシン−アスパラギン酸−グルタミン酸＊−アルギニン−アルギニン−アラニン−リシン＊−アスパラギン酸−フェニルアラニン−バリン−グルタミン−トリプトファン−ロイシン−メチオニン−アスパラギン酸−トレオニン−ＮＨ２（＊はラクタム架橋された。）。
【０５０４】
ペプチジル樹脂を液体フッ化水素で処理し、粗ペプチドを固相支持体から切断させ、全ての保護基を除去した。デプシペプチドを分取ＨＰＬＣにより精製し、マススペクトロメトリーと分析ＨＰＬＣにより解析した。精製されたペプチドは分析ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて単一のピークを示し、ＥＳＩ−ＭＳ解析は、計算上の分子量３３６９．０ダルトンに一致する望みの質量３３６８．５をもたらした。
【０５０５】
同様の方法を、本特許において報告されるその他のラクタム架橋デプシペプチドを合成するために用いた。
【０５０６】
実施例２
各ペプチドのｃＡＭＰ誘導能をホタルルシフェラーゼベースのレポーターアッセイにおいて測定した。誘導されるｃＡＭＰ産生はグルカゴン断片のグルカゴン受容体、又は、ＧＩＰ受容体、又は、ＧＬＰ−１受容体への結合と正比例の関係にある。受容体、及び、ｃＡＭＰ応答配列と結合したルシフェラーゼ遺伝子で共形質移入されたＨＥＫ２９３細胞を前記生物アッセイのために用いた。
【０５０７】
前記細胞を、０．２５％ウシ成長血清（ハイクローン、Ｌｏｇａｎ、ユタ州）を添加されたダルベッコ変法最小必須培地（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）で１６時間培養することにより血清欠乏状態にさせ、その後、９６ウエルのポリ−Ｄ−リシンコート済み「バイオコート」プレート（ＢＤバイオサイエンス、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）中で、段階希釈したグルカゴン断片と共に５時間、３７℃、５％二酸化炭素の条件で培養した。培養の最後に１００μＬのＬｕｃＬｉｔｅ生物発光基質試薬（パーキンエルマー、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、マサチューセッツ州）を各ウエルに加えた。プレートを、少しの間、揺り動かし、暗闇で１０分培養し、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ−１４５０液体シンチレーションカウンター（パーキンエルマー、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、マサチューセッツ州）で光出力を測定した。５０％有効濃度（ＥＣ５０）と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）をＯｒｉｇｉｎソフトウェア（オリジン・ラブ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、マサチューセッツ州）を使用することにより計算した。全てのＥＣ５０とＩＣ５０は、別に指示がない限り、次に続く実施例でｎＭの単位で報告される。
【０５０８】
実施例３
表１に記載されるペプチドを本質的に実施例１において記述されるように作成し、グルカゴン受容体（アンタゴニスト活性について）、ＧＬＰ−１受容体（アゴニスト活性について）、及び、ＧＩＰ受容体（アゴニスト活性について）の各々におけるインビトロ活性について、本質的に実施例２において記述されるように試験した。
【表１６】
2013518115.tif 000053
【０５０９】
具体的には、表２に記載されるヘテロ二量体を、メチレン鎖に隣接するマレイミド反応基とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル反応基を持つ二官能性リンカーを用いて「Ａ」ペプチドの位置２４のシステインを「Ｂ」ペプチドの位置４０のリシンと結合させることにより作成した。「Ａ」ペプチドと「Ｂ」ペプチドが会合させられ、側鎖保護基（Ｆｍｏｃ）を２０％ピペリジンを用いて除去した後、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の存在下、４倍過剰の二官能性リンカーを用いて、二官能性リンカーを「Ｂ」ペプチド上の位置４０のリシンにアシル置換反応を通じて結合させた（工程１）。
【化３３】
2013518115.tif 000054
結果生じたペプチドをフッ化水素で処理し、逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。このマレイミド官能化ペプチドを（７Ｍ）尿素を含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、「Ａ」ペプチドを反応混合物に導入した。「Ａ」ペプチドの位置２４のシステインは官能化されたリシンの遊離マレイミド基とマイケル付加反応で反応し、下記のヘテロ二量体を生じた（工程２）。
【化３４】
2013518115.tif 000055
【０５１０】
いくつかの実施形態において、これらのヘテロ二量体は、マレイミド基の代わりにハロアセチル基を含むヘテロ二官能性リンカーを用いて合成されうる。いくつかの実施形態において、これらのヘテロ二量体は、ＮＨＳエステルのような活性化カルボン酸の代わりに、当業者に公知のカップリング剤（例えば、ＤＩＣ、ＴＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＤＣＣ、ＨＢＴＵ）と共にカルボン酸を使用して合成されうる。
【０５１１】
結果生じるヘテロ二量体を、グルカゴン受容体（アンタゴニスト活性について）、ＧＬＰ−１受容体（アゴニスト活性について）、及び、ＧＩＰ受容体（アゴニスト活性について）の各々におけるインビトロ活性について試験した。これらのインビトロ実験のデータを表２において提供する。
【表１７】
2013518115.tif 000056
【０５１２】
実施例４
次のペプチドを本質的に実施例１において記述されるように作成し、ＧＬＰ−１受容体、グルカゴン受容体、及び、ＧＩＰ受容体の各々におけるインビトロ活性について、本質的に実施例２において記述されるように試験した。
【０５１３】
ペプチドｍｔ−２６３は配列番号１の改変されたアミノ酸配列を含み、位置１はチロシン、位置２はアミノイソ酪酸、位置３はグルタミン酸、位置１２はイソロイシン、位置１６から位置１８は、それぞれ、リシン、グルタミン、アラニン、位置２０はアミノイソ酪酸、位置２１はグルタミン酸、位置２４はアスパラギン、位置２７から位置２９は、それぞれ、ロイシン、アラニン、及び、グリシン、３０番〜位置４０はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫであった。ペプチドｍｔ−２６３のアミノ酸配列は本明細書において配列番号２１１として提供される。
【０５１４】
ペプチドｍｔ−４０２は、位置１７のグルタミンがリシンに変更され、位置３のグルタミン酸がグルタミンに変更されたことを除いて、ｍｔ−２６３の配列と同じアミノ酸配列を含んだ。ペプチドｍｔ−４０２のアミノ酸配列は本明細書において配列番号２５として提供される。
【０５１５】
ペプチドｍｔ−４０３は、位置４０のリシンがそのε−アミンを介して炭素数１６の脂肪アシル基と共有結合で結合されたことを除いて、ｍｔ−４０２の配列と同じアミノ酸配列を含んだ。ｍｔ−４０３のアミノ酸配列は本明細書において配列番号２６として提供される。
【０５１６】
ペプチドｍｔ−４０４は、位置３のグルタミン酸がグルタミンに変更され、位置１７のグルタミンがリシンに変更され、そして、位置２０のアミノイソ酪酸がグルタミン酸に変更されたことを除いて、ｍｔ−２６３と同じアミノ酸配列を含んだ。ｍｔ−４０４のアミノ酸配列は本明細書において配列番号２７として提供される。
【０５１７】
ペプチドｍｔ−４０５は、位置４０のリシンがそのε−アミンを介して炭素数１６の脂肪アシル基と共有結合で結合されたことを除いて、ｍｔ−４０４と同じアミノ酸配列を含んだ。ｍｔ−４０５のアミノ酸配列は本明細書において配列番号２８として提供される。
【０５１８】
ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）、グルカゴン受容体（ＧＲ）、及び、ＧＩＰ受容体（ＧＩＰＲ）におけるＥＣ５０を表３において提供する。
【表１８】
2013518115.tif 000057
【０５１９】
前記データは、アシル化が三つの受容体の各々における活性を劇的に増大させることを示唆する。
【０５２０】
実施例５
ｍｔ−２６３の構造に基づくペプチドｍｔ−３９５（配列番号３３）、ペプチドｍｔ−３９６（配列番号３４）、ペプチドｍｔ−３９７（配列番号３５）、及び、ペプチドｍｔ−３９８（配列番号３６）を、本質的に実施例１において記述されるように作成し、本質的に実施例２において記述されるようにインビトロで試験した。これらのペプチドは、ｍｔ−２６３の位置４０のリシンがｍｔ−３９６ではグルタミン酸に、ｍｔ−３９７ではアルギニンに、ｍｔ−３９８ではｄ−リシンに変更され、又は、ｍｔ−３９５では完全に欠質されることを除いて、ｍｔ−２６３と同じ構造を含んだ。ＧＬＰ−１Ｒ、ＧＲ、及び、ＧＩＰＲの各々でのＥＣ５０を表４に示する。
【表１９】
2013518115.tif 000058
【０５２１】
これらのデータは、位置４０のリシンは負に荷電されるアミノ酸、若しくは、正に荷電されるアミノ酸であることができ、又は、完全に欠質されることができ、そして、なお、ＧＬＰ−１ＲとＧＩＰＲで強力な活性を示すことができることを示唆する。
【０５２２】
実施例６
次のペプチドを本質的に実施例１において記述されるように作成し、ＧＬＰ−１Ｒ、ＧＲ、及び、ＧＩＰＲの各々におけるアゴニスト活性について、本質的に実施例２において記述されるように試験した。
【０５２３】
ペプチドｍｔ−２１７（配列番号１９）、ペプチドｍｔ−２１８（配列番号２０）、ペプチドｍｔ−２１９（配列番号２１）、及び、ペプチドｍｔ−２２０（配列番号２２）の各々は配列番号１の改変されたアミノ酸配列を含み、その配列では次の置換がなされた：位置１ではチロシン、位置２ではアミノイソ酪酸、位置１２ではイソロイシン、位置１６ではグルタミン酸、位置１７ではグルタミン、位置１８ではアラニン、位置２０ではリシン、位置２１ではグルタミン酸、位置２４ではリシン、位置２５ではフェニルアラニン、２７〜位置２９ではロイシン−アラニン−グリシン、及び、位置３０〜３９ではＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）。位置１６と位置２０のアミノ酸はラクタムによって架橋された。これらのペプチドの位置２４のリシンはアミノ酸スペーサーと結合され、それは、次に、アセチル化システインに結合され、それは次に４０ｋＤａのＰＥＧに結合された。ペプチドｍｔ−２１７はアラニンをアミノ酸スペーサーとして持ち、ｍｔ−２１８はグルタミン酸をアミノ酸スペーサーとして持ち、ｍｔ−２１９はアルギニンをアミノ酸スペーサーとして持ち、そして、ｍｔ−２２０はフェニルアラニンをアミノ酸スペーサーとして持った。
【０５２４】
ペプチドｍｔ−２２５（配列番号３５９）、ペプチドｍｔ−２２６（配列番号２３）、ペプチドｍｔ−２２７（配列番号３６０）、及び、ペプチドｍｔ−２２８（配列番号２４）は、修飾型リシン残基が位置４０にあり、位置２４のアミノ酸がアスパラギンに変更されたことを除いて、それぞれ、ｍｔ−２１７、ｍｔ−２１８、ｍｔ−２１９、及び、ｍｔ−２２０と同じアミノ酸配列を含んだ。
【０５２５】
３つの受容体におけるインビトロのＥＣ５０を表５において示す。
【表２０】
2013518115.tif 000059
【０５２６】
実施例７
位置２にアミノイソ酪酸を、位置３にグルタミン酸を、位置１６にリシンを、そして、位置２０にアミノイソ酪酸を含む様々な用量のアシル化ペプチドをインビボで試験した。ペプチドは、アシル化スペーサーが有る場合と無い場合でペプチドの位置１０、又は、位置４０でアシル化された。より具体的には、６か月齢で４５ｇの初期体重を持つマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６）にペプチドｍｔ−２６１、ペプチドｍｔ−３６７、ペプチドｍｔ−２７０、及び、ペプチドｍｔ−３６９を１ｎｍｏｌ／ｋｇ又は１０ｎｍｏｌ／ｋｇの割合で１週間毎日皮下注射した。マウスは４か月間、糖尿病誘発性食で飼育されていた。本実験の間、体重、食物摂取量、血中グルコースレベル、及び、脂肪量を測定した。試験群と対照群のそれぞれは８匹のマウスから構成された。表６は、配列中のアミノ酸修飾のいくつかを示す各ペプチドの簡易表記、各ペプチドのアミノ酸配列の配列番号、及び、本質的に実施例２において記述されるインビトロアッセイにより決定されたＧＬＰ−１Ｒ、ＧＲ、及び、ＧＩＰＲの各々における相対活性パーセントを提供する。
【表２１】
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【０５２７】
図１に示されるように、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの割合でペプチドを注射されたマウスは少なくとも−１０％の（７日目の体重から０日目の体重を引き算することにより計算される）総体重変化（％）を示した。ペプチドＭＴ−３６９により劇的な効果が観察された。アシル化スペーサーの存在は、ペプチドが位置１０の位置でアシル化されているときに、ペプチドが位置４０でアシル化されているときと比較して、より大きな影響を結果（体重変化）に対して持った。
【０５２８】
図２に示されるように、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの割合でペプチドを注射されたマウスは少なくとも−４０ｍｇ／ｄＬの（７日目の血中グルコースレベルから０日目の血中グルコースレベルを引き算することにより計算される）血中グルコースレベルの総変化を示した。アシル化スペーサーを介して位置１０の位置でアシル化されたペプチドは血中グルコースレベルを１００ｍｇ／ｄＬ近く減らした。
【０５２９】
実施例８
位置１６にリシンを、そして、位置２０にアミノイソ酪酸を含む様々な用量のアシル化ペプチドをインビボで試験した。具体的には、約１０か月齢で５７．６ｇの初期体重を持つ食餌誘導性肥満マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６野生型）にペプチドＭＴ−３６７、ペプチドＭＴ−３６９、ペプチドＭＴ−３６８、ＭＴ−３８４、ＭＴ−３８５、及び、ペプチドＭＴ−３６４を１０ｎｍｏｌ／ｋｇの割合で１週間毎日皮下注射した。前記マウスは約脂肪食で飼育されていた。体重と食物摂取量を０日目、１日目、３日目、５日目、及び、７日目に測定し、一方、血中グルコースレベルを本実験の０日目と７日目に測定した。試験群と対照群のそれぞれは８匹のマウスから構成された。表７は、配列中のアミノ酸修飾のいくつかを示す各ペプチドの簡易表記、各ペプチドのアミノ酸配列の配列番号、及び、本質的に実施例２において記述されるインビトロアッセイにより決定されたＧＬＰ−１Ｒ、ＧＲ、及び、ＧＩＰＲの各々における相対活性パーセントを提供する。
【表２２】
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【０５３０】
図３に示すように、ＧＬＰ−１受容体においてインビトロ活性を示すペプチドを注射されたマウスは少なくとも１８％の総体重変化（％）を示し、一方、（ＧＬＰ−１Ｒ活性を低下させる位置７でのイソロイシンを含む）ＭＴ−３８５を注射されたマウスの群はより小さい体重変化を示し、これにより前記ペプチドのＧＬＰ−１アゴニストの局面の重要性が明らかにされた。
【０５３１】
図４に示されるように、ＭＴ−３８５、ＭＴ−３６４、ＭＴ−３８４、又は、ＭＴ−３６９を注射されたマウスは−５０ｍｇ／ｄＬよりも大きい血中グルコースレベルの総変化を示した。
【０５３２】
実施例９
位置３にグルタミン酸、若しくは、グルタミン、位置１６にリシン、位置１７にグルタミン、位置１８にアラニン、そして、位置２と位置２０にアミノイソ酪酸、加えて、位置２１にグルタミン酸、位置２４にアスパラギン、そして、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫのＣ末端伸長部を含むペプチドを、本質的に先述の実施例に記述されるように作成し、インビボで試験した。
【０５３３】
より具体的には、表８に示される配列番号のアミノ酸配列を有するペプチドを作成した。どのペプチドもアシル基を含まなかった。５５ｇの初期体重を持つＣ５７Ｂｌ／６マウスに３０ｎｍｏｌ／ｋｇの割合で一週間毎日皮下注射した。マウスは１０か月齢であり、糖尿病誘発性食で８か月飼育されていた。体重、食物摂取量、及び、脂肪量を、試験中にモニターした。
【０５３４】
表８は、配列中のアミノ酸修飾のいくつかを示す各ペプチドの簡易表記、各ペプチドのアミノ酸配列の配列番号、及び、本質的に実施例２において記述されるインビトロアッセイにより決定されたＧＬＰ−１Ｒ、ＧＲ、及び、ＧＩＰＲの各々における相対活性パーセントを提供する。
【表２３】
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【０５３５】
図５に示されるように、位置３にグルタミン酸を含むＭＴ−２６３を注射されたマウスは７日間の試験中にかなりの体重の喪失を示した。このペプチドはエキセンジン−４様の陽性対照のペプチドよりも実質的に大きいレベルの体重喪失を達成した。
【０５３６】
図６に示されるように、７日間の試験中に血中グルコースレベルの最大の変化がＭＴ−２６３により達成された。ＭＴ−２８０を注射されたマウスもまた、血中グルコースレベルのかなりの減少を示した。
【０５３７】
実施例１０
ペプチドＭＴ−２６３の薬物動態特性を様々に投与計画を変えることにより試験した。食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウス（Ｎ＝８、１群当たり１０匹のマウス）に次のように６日間の試験中に注射した。
【０５３８】
群Ａ及び群Ｂには賦形剤中のＭＴ−２６３を１０ｎｍｏｌ／ｋｇの割合で毎日注射した。
群Ｃには賦形剤中のＭＴ−２６３を２０ｎｍｏｌ／ｋｇの割合で１日おきに注射した。
群Ｄ及び群Ｅには賦形剤中のＭＴ−２６３を３０ｎｍｏｌ／ｋｇの割合で３日ごとに注射した。
【０５３９】
図７に示されるように、ペプチドを毎日注射されたマウスの体重の増減率（％）は６日間の実験中、一定の体重喪失を示した。
【０５４０】
図８に示されるように、ＭＴ−２６３を毎日注射されたマウスにおいて、最も大きい血中グルコースレベルの減少が観察された。
【０５４１】
実施例１１
アシル化された、又は、ＰＥＧ化された化合物を５７．４ｇの初期体重を有する食餌誘導性肥満マウス（Ｎ＝８、１群当たり７匹のマウス）に皮下注射した。アシル化された化合物は１０ｎｍｏｌ／ｋｇの割合で毎日注射した。一方、ＰＥＧ化された化合物は１０ｎｍｏｌ／ｋｇの割合で毎週注射した。体重、食物摂取量、及び、脂肪量を、試験中にモニターした。
【０５４２】
表９はこの試験で使用されたペプチドのインビトロ活性と構造上の特徴を提供する。
【表２４】
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【０５４３】
図４０、及び、図４１は前記ペプチドの投与による体重喪失と血中グルコースレベルの変化の結果を示す。
【０５４４】
実施例１２
ペプチドＭＴ−２６１（配列番号２０５）とペプチドＭＴ−２７８（配列番号２２４）を本質的に本明細書に記載されるように（０．３、１、３、又は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日の用量で）マウスに投与し、体重、食物摂取量、及び、血中グルコースレベルをモニターした。図４２、及び、図４３は、それぞれ、体重と血中グルコースレベルの変化の結果を示す。
【０５４５】
実施例１３
本質的に本明細書に記載されるようにいくつかのペプチドを作成した。それぞれの構造を配列表２に見出すことができる。各ペプチドのインビボの作用お本質的に本明細書に記載されるようにマウスにおいて試験した。図１〜３１はインビボアッセイの結果を提供する。
【０５４６】
本明細書において引用された刊行物、特許出願、及び、特許を含む全ての参照文献は、各参照文献が個々にそして具体的に参照により組み込まれると示され、その全体が本明細書に記載されているかのような程度と同程度にまで、参照により本明細書に組み込まれる。
【０５４７】
本発明の記述に関連して（特に次に続く請求項に関連して）「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語、並びに、類似の指示語の使用は、本明細書において特に示されない限り、又は、文脈と明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方に及ぶと解釈される。「包括する」、「有する」、「包含する」及び「含む」という用語は、特に言及されない限り、制限の無い用語（すなわち、「〜を含むが限定されない」という意味）と解釈される。
【０５４８】
本明細書における数値の範囲の列挙は、本明細書において特に示されない限り、単にその範囲内に該当する各数値と各終止点を個々に言及するための略記法として機能することだけを意図しており、各数値と各終止点は、本明細書において個々に列挙されたかのように、明細書に組み込まれる。
【０５４９】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において特に示されない限り、又は、特に文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われることができる。本明細書で用いられた、あらゆる例、又は、例示的な言い回し（例えば、「のような」）の使用は、特に主張されない限り、単に本発明をより明確に説明することを意図し、本発明の範囲に制限を与えるものではない。本明細書におけるいかなる言い回しも、本発明の実施に請求されていない任意の要素を必須であるものとして示すと解釈されることはない。
【０５５０】
本発明の好ましい実施形態が、本発明を実施するために本発明者が知っている最良の形態を含め、本明細書に記載される。前述の記述を読むと、それら好ましい実施形態の変形が当業者に明らかとなりうる。発明者らは当業者がそのような変形を必要に応じて用いることを予期し、そして、本発明者らは、本明細書において具体的に記載されるのとは別の方法で本発明が実施されることを意図する。従って、本発明は、準拠法で許されているように、本明細書に添付される請求項に列挙される内容の修正、及び、同等物をすべて含む。さらに、本明細書において特に示されない限り、又は、特に文脈と明確に矛盾しない限り、実施形態のあらゆる可能な変形における前述の要素の任意の組合せは本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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