(57)【要約】  本発明は、腫瘍を有する患者への投与に好適なＴ細胞をプライミングするためのインビトロ法に関する。本発明はまた、本方法によって得られる組成物およびその使用に関する。【選択図】図８【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する患者への投与に好適な抗原特異的Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）をプライミングするためのインビトロ法であって、前記方法は、治療すべき前記患者由来の標的Ｔ細胞と、自己単球由来樹状細胞と、自己もしくは同種の腫瘍物質または腫瘍関連タンパク質もしくはペプチドと、前記患者由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原に対して、または治療すべき前記患者由来のＡＰＣ表面に発現したＭＨＣクラスＩＩ抗原と同一の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する無関係な血液ドナー由来のＡＰＣに対して感作された同種リンパ球とを共培養することを含む、インビトロ法。
【請求項２】
前記感作は、不活化した同種抗原提示細胞を健常ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とともに培養することを含む混合白血球反応により誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原提示細胞は、ＰＢＭＣおよび単球由来樹状細胞からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単球由来樹状細胞は、前記患者由来のものであるかまたは前記患者の前記ＨＬＡ−ＤＲ抗原とマッチするＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）抗原を有する健常ドナー由来のものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記単球由来樹状細胞は、単球をまずＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む組成物中で約１〜７日間培養して、未成熟樹状細胞を得、その後、少なくとも約１２時間培養することによって前記未成熟樹状細胞を成熟樹状細胞にするのを可能にする第２の組成物を添加することにより得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の組成物は、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、インターフェロンγ、インターフェロンαもしくはβおよびＴＬＲ３リガンド、例えば、ポリ−Ｉ：Ｃならびに／またはＴＬＲ４リガンドを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の組成物は、ＴＮＦα、インターフェロンγ、ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ４リガンドならびにＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＬＲ３リガンドはポリ−Ｉ：Ｃであり、かつ前記ＴＬＲ８アゴニストはＲ８４８である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍物質または腫瘍関連タンパク質もしくはペプチドは、前記患者由来の死滅した腫瘍細胞、前記患者の腫瘍と同じタイプの同種腫瘍細胞、ならびに既知の単離および精製された腫瘍タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍関連ペプチドは、ＨＥＲ−２タンパク質、ＰＳＡタンパク質、ＭＡＲＴ−１タンパク質、ｐ５３タンパク質および／またはサバイビンに由来するペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍物質は、前記腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのトランスフェクションにより前記成熟樹状細胞に負荷された腫瘍タンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞を約４〜２０日間培養する、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
外因性ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／またはＩＬ−２１を前記細胞培養物に添加する、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記プライミングされた抗原特異的Ｔｈ１細胞またはＣＴＬは、前記細胞を新しい単球由来樹状細胞、感作した新しい同種リンパ球と一緒に培養し、場合によっては、外因性ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／またはＩＬ−２１を前記細胞培養物に添加することにより再刺激される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により得られる抗原特異的ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬ。
【請求項１６】
患者への投与に好適な抗原特異的ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬ、ここで、前記ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬは、
−増殖する能力を有し、
−前記細胞の４０％までしかアネキシン−Ｖの陽性染色を示さないはずであり、かつ／または
−その細胞表面でＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ２７および／またはＣＤ２８を発現する。
【請求項１７】
腫瘍の治療においてまたはヒトの抗腫瘍免疫応答を誘発するために使用される請求項１５または１６に記載の抗原特異的ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬ。
【請求項１８】
腫瘍を治療するためのまたはヒトの抗腫瘍免疫応答を誘発するための医薬品を製造するための請求項１５または１６に記載の抗原特異的ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬの使用。
【請求項１９】
前記ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬは治療的癌ワクチンと組み合わせて投与される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬは１回目の刺激の後に投与される、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬは再刺激の後に投与される、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学および癌治療の分野に関するものであり、より具体的には、抗原特異的Ｔ細胞の活性化方法および該方法により産生されるＴ細胞に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞は、腫瘍または感染細胞を認識し、これらの標的細胞を死滅させることにより疾患の発症を防ぐ。しかしながら、特異的Ｔ細胞の存在下で発症する癌または慢性感染症が証明しているように、腫瘍または病原体と免疫系の相互作用は複雑であり、そのため、病原体または腫瘍がＴ細胞の監視を逃れることができるのは明らかである。
【０００３】
ほとんど全ての病原性侵入者を検出するＴ細胞の能力は、その並外れて多様な受容体レパートリーによって与えられており、そのおかげで、Ｔ細胞プールは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子による提示を受けたときに、膨大な数のペプチドを認識することができる。それでも、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介するシグナル伝達（シグナル１）は、適切なＴ細胞活性化には十分でない。なぜなら、共刺激分子が、増殖、生存、および分化のための不可欠なシグナル（シグナル２）を提供するからである。実際、シグナル１のみを受容して、シグナル２を受容しないナイーブＴ細胞は、アネルギー（無応答）状態にされるか、またはアポトーシスによって死ぬ。シグナル１とシグナル２の統合は完全なＴ細胞活性化に必要であり、これらのシグナルの強度が、その後のＴ細胞プールのサイズを決める。さらに、エフェクターＴ細胞への完全な分化は、通常、第３のシグナルに依存する。この第３のシグナルは、可溶型の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって供給され、必要なエフェクターＴ細胞のタイプについての指示的シグナルを提供する。この「３シグナル」概念によって、ナイーブＴ細胞の活性化とその後のエフェクターＴ細胞の形成のモデルが描かれている。しかし、免疫系は、多様な共刺激分子を大量に提供しており、これらの様々なタイプのシグナル２およびシグナル３は全て、それおれ独自の様式でＴ細胞応答の品質に貢献している。共刺激シグナルおよび可溶型のシグナル３は、生存、細胞周期進行、発生させるべきエフェクター細胞のタイプ、およびエフェクター細胞かまたはメモリー細胞かのどちらかへの分化などの、Ｔ細胞活性化の特定の局面で作用することができる。
【０００４】
現在、寿命の長いメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するためには、成熟した抗原提示樹状細胞（ＤＣ）が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞をはじめとする、他のリンパ球によって「援助される」必要があることが一般的に認められている。この「援助」は、成熟ＤＣをさらに分化するよう誘導する。これは、ライセンシングとして知られる過程である。「ヘルパー」シグナルは、共刺激分子の上方調節、サイトカインの分泌、およびいくつかの抗アポトーシス分子の上方調節を含む、ＤＣに対する複数の効果を有するが、これらは全て、コグネートなＴ細胞、とりわけ、ＣＤ８＋Ｔ細胞を最適に活性化するＤＣの能力を累積的に強化する。さらに、「ヘルパー」リンパ球は、Ｔ細胞生存、細胞周期進行、発生させるべきエフェクター細胞のタイプ、およびエフェクター細胞かまたはメモリー細胞かのどちらかへの分化に直接影響を及ぼす因子を発現または分泌することもできる。
【０００５】
慢性感染症または侵襲性の強い癌と戦うための１つの戦略は養子Ｔ細胞療法であり、これは、宿主の特異的Ｔ細胞応答を回復させるためのエフェクターＴ細胞の移植を伴う。望ましい特異性のＴ細胞を得るための最近の技術的発達は、様々な臨床状況で養子Ｔ細胞療法を用いることへの関心を高めた。養子細胞移植療法とは、エクスビボで活性化および拡大された自己腫瘍反応性Ｔ細胞の投与のことである。癌治療で養子細胞移植療法を使用する場合、いくつかの潜在的な利点がある。腫瘍の免疫特性とは無関係に、腫瘍特異的Ｔ細胞をエクスビボで活性化して、大量に拡大することができ、かつＴ細胞の機能および表現型に関する品質をその養子移植の前に選択することができる。
【０００６】
養子移植後、確立した腫瘍の退縮を引き起こすためには、Ｔ細胞についていくつかの事象が起こらなければならない。より具体的には、Ｔ細胞は、抗原特異的再刺激によりインビボで活性化されなければならない。次に、Ｔ細胞は、顕著な腫瘍負荷の消滅を引き起こすことができるレベルまで拡大されなければならない。抗腫瘍細胞は、全腫瘍細胞の根絶を達成できるほど長く生存しなければならない。
【０００７】
これまで、固形腫瘍を有する患者への養子移植用の細胞を選択するために用いられた基準は、共培養したときにＩＦＮ−γを放出し、腫瘍細胞を死滅させる抗腫瘍Ｔ細胞の能力であった。しかしながら、現在、これらの基準だけでは、インビボ効力が予測されないことが明らかである。Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：１６１６−１６２６（２００５））は、完全なエフェクター特性を獲得し、インビトロでの増大した抗腫瘍反応性を示すＣＤ８＋Ｔ細胞が、インビボでの腫瘍の退縮を誘発し、治癒するのに効果が低いことを見出した。先行技術による方法は、臨床的に意味のある腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞レベルに達するのに、１回以上の再刺激を必要とする。例えば、Ｈｏら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３１０（２００６），４０−５０）およびＧｒｉｔｚａｐｉｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８；１８１；１４６−１５４）を参照されたい。これらの文献中では、約１９％の腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞レベルに達するのに、１〜２回の再刺激が必要であった。再刺激は、細胞の活性を弱め、アポトーシスを受けやすくする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
結果として、その活性化の間に、抗原特異的Ｔ細胞の増殖および生存を増大させる、養子免疫療法で用いられるＴ細胞集団の調製方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、腫瘍を有する患者への投与に好適な抗原特異的Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のプライミングのためのインビトロ法に関する。本方法は、治療すべき患者由来の標的Ｔ細胞と、自己単球由来樹状細胞と、自己または同種の腫瘍物質または腫瘍関連タンパク質もしくはペプチドと、同種リンパ球を共培養することを含む。同種リンパ球は、患者由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面のＭＨＣクラスＩおよび／もしくはＭＨＣクラスＩＩ抗原に対して、または治療すべき患者由来のＡＰＣ表面に発現したＭＨＣクラスＩＩ抗原と同一の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する無関係な血液ドナー由来のＡＰＣに対して感作される。
【００１０】
本発明はまた、本方法により入手可能な抗原特異的ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬならびにその使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】従来のＭＬＲで放射線照射同種末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）表面に発現したＭＨＣ抗原に対して感作されたリンパ球（＝同種感作同種リンパ球；ＡＳＡＬ）が、ＡＳＡＬのプライミングに用いた放射線照射ＰＢＭＣに対して自己の共培養された単球由来成熟ＤＣ表面でのＣＤ７０発現を顕著に増強することを示す。
【図２】γ線照射ＡＳＡＬが、ＡＳＡＬのプライミングに用いた放射線照射ＰＢＭＣに対して自己の共培養された単球由来成熟ＤＣ表面でのＣＤ７０発現を増強することを示す。
【図３】ＡＳＡＬと、ＡＳＡＬのプライミングに用いた放射線照射ＰＢＭＣに対して自己の単球由来ＤＣとの共培養によって、大幅なＩＬ−１２産生が誘導されることを示す。
【図４】ＡＳＡＬと、ＡＳＡＬのプライミングに用いた放射線照射ＰＢＭＣに対して自己の単球由来ＤＣとの共培養によって、大幅なＩＦＮ−γ産生が誘導されることを示す。
【図５】ＡＳＡＬと、ＡＳＡＬのプライミングに用いた放射線照射ＰＢＭＣに対して自己の単球由来ＤＣとの共培養によって、大幅なＩＬ−２産生が誘導されることを示す。
【図６】単球由来成熟ＤＣと、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋またはＣＤ５６＋リンパ球が除去されたＡＳＡＬとの共培養の結果としてのＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの産生を示す。
【図７】ＡＳＡＬと、ＡＳＡＬのプライミングに用いた放射線照射ＰＢＭＣに対して自己の単球由来ＤＣとの共培養によって、未感作同種ＣＤ８＋Ｔ細胞における増殖応答が増大することを示す。
【図８】フローサイトメトリーで決定したときの腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球のパーセンテージを示す。Ａ：右上隅は、ＨＥＲ−２陽性乳癌を有する患者由来のＨＥＲ−２特異的細胞傷害性リンパ球の誘導を示す。（ＣＤ８＋標的細胞に対して）自己の抗原負荷ＤＣと放射線照射ＡＳＡＬとを共培養した９日後、全ＣＤ８＋標的細胞の２５．２％が腫瘍特異的ＣＴＬになった。Ｂ：右上隅は、ＤＣにＨｅｒ２−ペプチドを負荷しない対照実験におけるＨｅｒ２特異的細胞傷害性リンパ球の頻度を示す。培養９日後、全ＣＤ８＋Ｔ細胞の０．４％しか腫瘍特異的ＣＴＬにならなかった（右上隅と右下隅をあわせて、全ＣＤ８Ｔ細胞集団を表す）。
【図９】同種ＣＤ８＋標的細胞の一次刺激時に、ＡＳＡＬのプライミングに用いた放射線照射ＰＢＭＣに対して自己の単球由来ＤＣに放射線照射ＡＳＡＬを添加すると、一次標的細胞刺激に用いたＤＣに対して自己のＢ細胞でＣＤ２７発現同種反応性ＣＤ８＋標的細胞を再刺激したとき、これらの標的細胞の数が増加することを示す。
【図１０】同種ＣＤ８＋標的細胞の一次刺激時に、ＡＳＡＬのプライミングに用いた放射線照射ＰＢＭＣに対して自己の放射線照射ＰＢＭＣに放射線照射ＡＳＡＬを添加すると、一次標的細胞刺激に用いたＤＣに対して自己のＢ細胞でアポトーシス性（アネキシン−Ｖ陽性）標的細胞を再刺激したとき、これらの標的細胞の数が減少することを示す。
【図１１】同種ＣＤ８＋標的細胞の一次刺激時に、ＡＳＡＬのプライミングに用いた放射線照射ＰＢＭＣに対して自己の放射線照射単球由来ＤＣに放射線照射ＡＳＡＬを添加すると、これらの同種反応性ＣＤ８＋標的細胞を一次標的細胞刺激に用いたＤＣに対して自己のＢ細胞で再刺激したときに、より強い（６倍の）二次増殖応答をもたらすことを示す。
【図１２】同種ＣＤ８＋標的細胞の一次刺激時に、ＡＳＡＬのプライミングに用いた放射線照射ＰＢＭＣに対して自己の放射線照射単球由来ＤＣに放射線照射ＡＳＡＬを添加すると、これらの同種反応性ＣＤ８＋標的細胞を一次標的細胞刺激に用いたＤＣに対して自己のＢ細胞で再刺激したときに、ＩＦＮ−γ産生が大幅に増加することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
本発明を説明する前に、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるため、本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を単に説明する目的で用いられるのであって、限定することを意図したものではないことが理解されるべきである。
【００１３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【００１４】
また、「約」という用語は、適用可能な場合、所与の値の±２％、好ましくは±５ ％、および最も好ましくは数値の±１０％の偏差を示すために用いられる。
【００１５】
本発明の文脈において、「抗原特異的」という用語は、固有のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による自己ＭＨＣ分子に提示された短い固有のペプチド配列の特異的な認識／結合に関するものである。
【００１６】
本発明の文脈において、「プライミング」および「活性化」という用語は、「ヘルパー」細胞が同時に存在するかしないかに関わらず、抗原提示細胞によって刺激されるようになるナイーブな抗原特異的Ｔ細胞内で起こるプログラムされた活性化過程に関するものである。
【００１７】
本発明の文脈において、「レスポンダー細胞」という用語は、活性化および／または増殖によって、共培養した同種ＰＭＢＣに応答する、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を含むが、これらに限定されない、様々なリンパ球亜集団に関するものである。
【００１８】
本発明の文脈において、「感作された細胞」という用語は、共培養した同種細胞（ＰＢＭＣを含む）によって予め活性化されたＴ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を含む、様々なリンパ球亜集団に関するものである。
【００１９】
本発明の文脈において、「標的細胞」という用語は、同種ＡＰＣかまたは抗原提示自己ＡＰＣかのどちらかによってプライミング／活性化されるようになるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞に関するものである。患者リンパ球（標的細胞）採取の部位は、例えば、末梢血、腫瘍、腫瘍流入領域リンパ節または骨髄とすることができる。
【００２０】
本発明の文脈において、単球由来ＤＣに関連する「成熟」という用語は、微生物産物（例えば、ＬＰＳ）または炎症メディエーター（例えば、ＴＮＦ−αおよび／もしくはＩＬ−１β）による未成熟ＤＣの刺激によって誘導される、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ８３およびＣＣＲ７を含むが、これらに限定されない、その「成熟マーカー」発現に関するものである。
【００２１】
未成熟ＤＣは、高いエンドサイトーシス活性と低いＴ細胞活性化能を特徴とする細胞である。未成熟ＤＣは、ウイルスや細菌などの病原体の周辺環境を絶えずサンプリングしている。未成熟ＤＣは、病原体を貪食し、そのタンパク質を分解して小片にし、成熟したときに、ＭＨＣ分子を用いて、これらの断片をその細胞表面に提示する。同時に、未成熟ＤＣは、Ｔ細胞を活性化するその能力を大いに増強する、Ｔ細胞活性化において共受容体として働く細胞表面受容体（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ４０）を上方調節する。未成熟ＤＣは、ＣＣＲ７も上方調節する。ＣＣＲ７は、血流から脾臓にまたはリンパ系からリンパ節に移行するように樹状細胞を誘導する走化性受容体である。ここで、未成熟ＤＣは、抗原提示細胞として働き、非抗原特異的共刺激シグナルとともに、病原体由来の抗原をヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞ならびにＢ細胞に提示することにより、これらの細胞を活性化する。成熟ＤＣはおそらく、単球や白血球から生じる。これらは、体中を循環し、正しいシグナルに応じて、ＤＣかまたはマクロファージかのどちらかになることができる。単球は、骨髄内の幹細胞から形成される。単球由来ＤＣは、インビトロで末梢血単球から生成することができる。
【００２２】
本発明の文脈において、細胞の「不活化」という用語は、細胞が細胞分裂して子孫を形成することができなくなったことを示すために用いられる。それでも、細胞は、刺激に応答するか、またはサイトカインなどの細胞産物を生合成および／もしくは分泌することができる場合がある。不活化の方法は当技術分野で公知である。不活化の好ましい方法は、毒素（例えば、マイトマイシンＣ）、または放射線照射（例えば、γ線照射）による処理である。固定または透過処理されて分裂できない細胞もまた、不活化細胞の例である。
【００２３】
本発明の文脈において、「混合リンパ球反応」、「混合リンパ球培養」、「ＭＬＲ」、および「ＭＬＣ」という用語は、アロタイプが異なる最低２つの異なる細胞集団を含む混合物を指すために互換的に用いられる。アロタイプが異なる細胞の少なくとも１つはリンパ球である。これらの細胞を、しばらくの間、好適な条件の下で一緒に培養すると、リンパ球の刺激がもたらされる。ＭＬＲを頻回にする目的は、リンパ球の増殖を開始することができるような同種刺激を提供することであるが、示されていない限り、培養中の増殖は必要ではない。適切な文脈において、これらの用語は、また別に、そのような培養物に由来する細胞の混合物を指すことができる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「治療」という用語は、治療を受けている個体または細胞の自然の経過を変化させる試みにおける臨床的介入を指し、予防のためにまたは臨床病理経過中に実施することができる。望ましい効果としては、疾患の発症または再発の防止、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の低減、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が挙げられる。
【００２５】
「抗原提示細胞」、「ＡＰＣ」または「ＡＰＣｓ」という用語は、好ましくはクラスＩ  ＭＨＣ分子と関連した１以上の抗原の提示を誘導することができる無傷の全細胞および他の分子（全て同種起源）と、同種免疫応答を誘導することができる全てのタイプの単核細胞の両方を含む。生きた全細胞をＡＰＣとして用いることが好ましい。好適なＡＰＣの例は、単球、マクロファージ、ＤＣ、単球由来ＤＣ、マクロファージ由来ＤＣ、Ｂ細胞および骨髄性白血病細胞（例えば、細胞株ＴＨＰ−１、Ｕ９３７、ＨＬ−６０またはＣＥＭ−ＣＭ３）などの全細胞であるが、これらに限定されない。骨髄性白血病細胞は、いわゆる前単球を提供すると言われている。
【００２６】
「癌」、「新生物」および「腫瘍」という用語は、互換的に、かつ本明細書および特許請求の範囲で見られるように、単数形または複数形のいずれかで用いられ、悪性形質転換を経た細胞を指す。この悪性形質転換のために、細胞は、宿主生物にとって病的なものとなる。原発性癌細胞（すなわち、悪性形質転換部位の近くから得られる細胞）は、十分に確立した技術、特に、組織学的検査によって、非癌性細胞と容易に区別することができる。本明細書で使用するような癌細胞の定義には、原発性癌細胞だけでなく、癌細胞祖先に由来する任意の細胞も含まれる。これには、転移性癌細胞、ならびに癌細胞に由来するインビトロ培養物および細胞株が含まれる。通常、固形腫瘍として現われるタイプの癌に言及するとき、「臨床的に検出可能な」腫瘍とは、例えば、ＣＡＴスキャン、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波または触診のような処置により、腫瘍塊に基づいて検出可能な腫瘍のことである。本発明に関連する腫瘍／癌の非限定的な例は、乳癌、神経膠腫、膠芽細胞腫、線維芽細胞腫、神経肉腫、肺癌、子宮癌、リンパ腫、前立腺癌、メラノーマ、精巣腫瘍、星状細胞腫、異所性ホルモン産生腫瘍、卵巣癌、膀胱癌、ウィルムス腫瘍、膵癌、骨癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、膣癌、滑膜肉腫、血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍、膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、口腔癌、口腔白板症、食道癌、胃癌、または転移性癌、白血病である。前立腺癌および乳癌が特に好ましい。
【００２７】
本発明の文脈において、「培養する」という用語は、様々な種類の培地中での細胞または生物のインビトロ増殖を指す。培養で増殖した細胞の子孫は、（形態、遺伝型、または表現型の点で）親細胞と完全には同一でない場合があることが理解される。好適な培養培地は、当業者が選択することができ、そのような培地の例は、ＲＰＭＩ培地またはイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）である。
【００２８】
「主要組織適合性複合体」および「ＭＨＣ」という用語は、Ｔ細胞への抗原提示と迅速な移植片拒絶とに必要な細胞表面分子をコードする遺伝子群を指す。ヒトでは、ＭＨＣ複合体は、ＨＬＡ複合体としても知られている。ＭＨＣ複合体によってコードされるタンパク質は、「ＭＨＣ分子」として知られ、クラスＩ  ＭＨＣ分子およびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に分類される。クラスＩ  ＭＨＣ分子は、β２−ミクログロブリンと非共有結合的に関連する、ＭＨＣにコードされた鎖から構成されるヘテロ二量体膜タンパク質を含む。クラスＩ  ＭＨＣ分子は、ほぼ全ての有核細胞により発現されており、ＣＤ８＋Ｔ細胞への抗原提示において機能することが示されている。クラスＩ分子は、ヒトでは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃを含む。クラスＩ分子は、通常、８〜１０アミノ酸長のペプチドに結合する。クラスＩＩＭＨＣ分子もヘテロ二量体膜タンパク質を含む。
【００２９】
クラスＩＩ  ＭＨＣは、ＣＤ４＋Ｔ細胞への抗原提示に関与することが知られており、ヒトでは、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲを含む。クラスＩＩ分子は、通常、１２〜２０アミノ酸残基長のペプチドに結合する。「ＭＨＣ拘束性」という用語は、抗原がプロセッシングされ、結果として生じた抗原性ペプチドが、自己クラスＩ  ＭＨＣ分子または自己クラスＩＩ  ＭＨＣ分子のいずれかと関連して提示されて初めて抗原を認識することが可能となるＴ細胞の特徴を指す。
【００３０】
「ワクチン」、「免疫原」、または「免疫原性組成物」という用語は、本明細書では、ヒトまたは動物対象に投与したときに、ある程度の特異的免疫を付与することができる化合物または組成物を指すために用いられる。本開示で使用する場合、「細胞性ワクチン」または「細胞性免疫原」という用語は、場合により不活化されている少なくとも１つの細胞集団を活性成分として含む組成物を指す。本発明の免疫原、および免疫原性組成物は活性があるが、これは、そのような免疫原、および免疫原性組成物が、少なくとも一部は、宿主の免疫系によって仲介される特異的免疫学的応答（例えば、抗腫瘍抗原応答または抗癌細胞応答）を刺激することができることを意味する。免疫学的応答は、抗体、免疫反応性細胞（例えば、ヘルパー／インデューサーもしくは細胞傷害性細胞）、またはそれらの任意の組合せを含むことができ、かつ治療が向けられている腫瘍の表面に存在する抗原に対して向けられることが好ましい。この応答は、単回用量または複数回用量のいずれかの投与により、対象において誘発または再刺激することができる。
【００３１】
化合物または組成物は、ａ）未感作の個体において、抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する免疫応答を発生させることができるか；またはｂ）個体において、化合物もしくは組成物を投与しない場合に生じる程度を超えて、免疫応答を再構築するか、強化（ｂｏｏｓｔ）するか、もしくは維持することができるかのいずれかである場合、「免疫原性」である。組成物は、単回用量または複数回用量で投与したときに、これらの基準のいずれかを達成することができる場合、免疫原性である。
【００３２】
説明
本発明は、樹状細胞（ＤＣ）を含む自己抗原提示細胞によるその活性化の間に、抗原特異的Ｔ細胞の増殖および生存の増大を促進する同種感作同種リンパ球（ＡＳＡＬ）の産生に関する。
【００３３】
本発明は、ヒト健常血液ドナー、および抗原特異的ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導におけるＡＳＡＬの正の調節的役割が示された乳癌患者に由来するＰＢＭＣおよびその亜集団を用いたインビトロ研究に基づいている。同種インビトロモデルを用いて、ＡＳＡＬの存在下での同種反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および生存を追跡すると、増殖能は５倍を超えて増大し、アポトーシス細胞死は１０％から５％に低下した。
【００３４】
ＡＳＡＬの添加は、抗原提示ＤＣ表面での共刺激分子ＣＤ７０の発現を強く上方調節し、かつＴ細胞の１型ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞へのコミットメントに正の影響を及ぼすことがよく知られているＩＬ−１２およびＩＦＮ−γという２つの因子の産生をもたらす。さらに、ＡＳＡＬの添加は、周知のＴ細胞増殖因子であるＩＬ−２の産生ももたらす。特に、ＣＤ７０を介する相互作用は、連続して行なわれる分裂を通して活性化Ｔ細胞の生存を促進し、それにより、エフェクターＴ細胞の蓄積に寄与することも最近示された。
【００３５】
本発明は、腫瘍を有する患者への投与に好適な抗原特異的Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のプライミングのためのインビトロ法に関する。本方法は、治療すべき患者由来の標的Ｔ細胞を、自己単球由来ＤＣ、自己または同種の腫瘍物質または腫瘍関連タンパク質もしくはペプチド、ならびに患者由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面のＭＨＣクラスＩおよび／もしくはＭＨＣクラスＩＩ抗原に対して、または治療すべき患者由来のＡＰＣ表面に発現したＭＨＣクラスＩＩ抗原と同一の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する無関係な血液ドナー由来のＡＰＣに対して感作された同種リンパ球と共培養することを含む。
【００３６】
ＡＳＡＬは、混合白血球反応から得られるレスポンダー細胞であり、単球由来ＤＣおよび標的細胞と一緒に培養される。ＡＳＡＬは、患者に対して同種であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、末梢血リンパ球からなる群から選択される。標的細胞は、単球由来ＤＣに対して自己のＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。単球由来ＤＣに、腫瘍物質または腫瘍関連タンパク質もしくはペプチドまたはウイルス由来抗原を負荷する。
【００３７】
ＡＳＡＬの添加はさらに、高レベルのＣＤ２７を発現する標的ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団の濃縮をもたらす。ＣＤ２７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗原で誘起される自己分泌性の増殖シグナルを提供することができるので、養子免疫療法にとって潜在的により効果的なＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）である。そのようなヘルパー非依存的ＣＤ８  Ｔ細胞であれば、生存および拡大のために、ＩＬ−２またはＣＤ４＋Ｔ細胞の形態の外因性の援助を必要としないであろう。したがって、本発明は、さらなるサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）、またはＣＤ４＋Ｔ細胞が存在しないときまたはそれらの存在量が少ないときに強力な細胞傷害活性を示すようにプログラムされているＣＤ８＋Ｔ細胞集団を対象に提供することによって、免疫介在性疾患を治療する方法を提供する。本方法は、細胞溶解性の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のエクスビボ拡大に特に有用であるが、腫瘍特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大に用いることもできる。
【００３８】
ＣＤ８＋Ｔリンパ球の総数のパーセンテージとして表される細胞溶解性抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、好ましくは少なくとも約５％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、および最も好ましくは少なくとも約２５％である。
【００３９】
より具体的には、本発明の方法は、腫瘍を有する患者への投与に好適な抗原特異的Ｔｈ１細胞またはＣＴＬのプライミングのためのインビトロ法に関するものであり、該方法は、以下の工程を含む：
ａ）患者由来の不活化した抗原提示細胞を健常ドナー由来の末梢血単核細胞と一緒に培養すること、
ｂ）単球が成熟ＤＣに成熟するのを可能にする組成物中で、患者由来の単球を培養すること（組成物については、以下でさらに記載する）および
ｃ）限定するものではないが、工程ａ）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む同種感作リンパ球を、工程ｂ）由来の成熟ＤＣとともに培養すること。
【００４０】
単球由来ＤＣは、単球をまずＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む組成物中で約２〜７日間、好ましくは約５日間培養して未成熟ＤＣを得、その後、少なくとも約１２〜７２時間、好ましくは約２４〜４８時間培養することによって未成熟ＤＣを成熟ＤＣにするのを可能にする第２の組成物を添加することにより得られる。第２の組成物は、未成熟ＤＣを単球由来成熟ＤＣにするのを可能にする成分を含み、この単球由来成熟ＤＣを用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することができる。一実施形態では、第２の組成物は、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、インターフェロンγ、インターフェロンβおよびＴＬＲ３リガンド（例えば、ポリＩ：Ｃ）を含む（Ｍａｉｌｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｐｈａ−ｔｙｐｅ−１  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ＤＣｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＣＴＬ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４：５９３４−５９３７．）。別の実施形態では、第２の組成物は、インターフェロンγ、ＴＬＲ３リガンドおよび／またはＴＬＲ４リガンドならびにＴＬＲ７リガンドおよび／またはＴＬＲ８リガンドおよび／またはＴＬＲ９リガンドを含む。ＴＬＲ３リガンドの非限定的な例はポリＩ：Ｃであり、ＴＬＲ７／８リガンドの非限定的な例はＲ８４８であり、ＴＬＲ９リガンドの非限定的な例はＣｐＧである。
【００４１】
同種リンパ球の感作は、不活化した同種抗原提示細胞を健常ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とともに培養することを含む従来の混合白血球反応（ＭＬＲまたはＭＬＣ−混合白血球培養）により誘導される。ＭＬＲの実施は当業者に周知である（Ｊｏｒｄａｎ  ＷＪ，Ｒｉｔｔｅｒ  ＭＡ．Ｏｐｔｉｍａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００２；２６０：１−１４）。ＭＬＲでは、２個体由来のＰＢＭＣ（主にリンパ球）を組織培養液中で数日間一緒に培養する。不適合個体由来のリンパ球は互いに刺激し合って、大いに増殖するが（例えば、トリチウム化チミジンの取込みにより測定される）、適合性個体由来のリンパ球はそうならない。一方向ＭＬＣでは、これらの個体の一方に由来するリンパ球を（通常、マイトマイシンなどの毒素またはγ線照射などの照射による処理によって）不活化し、それにより、残りの未処理の細胞集団だけが異種の組織適合性抗原に応答して増殖することを可能にする。
【００４２】
ＭＬＲで用いられる抗原提示細胞は、ＰＢＭＣおよび単球由来ＤＣからなる群から選択される。単球由来ＤＣは、患者由来のものまたは患者のＨＬＡ−ＤＲ抗原と一致するＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）抗原を有する健常ドナー由来のものである。
【００４３】
腫瘍物質または腫瘍関連タンパク質もしくはペプチドは、患者由来の死滅した腫瘍細胞、患者の腫瘍と同じタイプの同種腫瘍細胞、ならびに単離および精製された腫瘍タンパク質またはペプチドからなる群から選択される。単離および精製された腫瘍タンパク質またはペプチドは当業者に周知である。一実施形態では、腫瘍物質は、腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのトランスフェクションによって単球由来ＤＣ中に負荷された腫瘍タンパク質である。
【００４４】
腫瘍関連ペプチドの例は、ＨＥＲ−２タンパク質（乳癌と関連する）に由来するペプチド、ＰＳＡ（前立腺癌と関連する前立腺特異的抗原）に由来するペプチド、ＭＡＲＴ−１タンパク質（悪性メラノーマと関連する）に由来するペプチド、ならびに「普遍的」腫瘍関連タンパク質であるサバイビンおよびｐ５３に由来するペプチドである。腫瘍関連ペプチド／タンパク質のさらなる例は、当業者に周知である。
【００４５】
本発明の方法では、細胞を、約２０日間、好ましくは約４〜２０日間、好ましくは６〜２０日間、より好ましくは７〜１４日間、および最も好ましくは約９〜１４日間共培養する。
【００４６】
本発明の方法の一実施形態では、細胞の増殖および生存を最適化するために、外因性のＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／またはＩＬ−２１を細胞培養物に添加する。
【００４７】
該細胞を新しい単球由来ＤＣ、感作した新しい同種リンパ球と一緒に培養し、場合により、外因性のＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／またはＩＬ−２１を細胞培養物に添加することにより、プライミングした抗原特異的Ｔｈ１細胞またはＣＴＬを再刺激することも可能である。
【００４８】
本発明はまた、上記の方法により入手可能な免疫原性組成物ならびに上記の方法により入手可能な抗原特異的Ｔｈ１細胞および／またはＣＴＬに関するものである。
【００４９】
抗原特異的ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬは、患者への投与に好適であり、好ましくは、以下の特徴のうちの少なくとも１つを含む：
−増殖する能力
−記憶マーカーのＣＤ４５  ＲＯを発現する
−アポトーシスマーカーのアネキシン−Ｖを低レベルに発現する（すなわち、ＦＡＣＳによる測定で、細胞の４０％、好ましくは２０％しか、アネキシン−Ｖの陽性染色を示さないはずである）
−その細胞表面でＣＤ２７および／またはＣＤ２８を発現する。
【００５０】
本発明の方法により入手可能な特異的ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬのさらなる能力は、インビトロで腫瘍細胞を死滅させる能力である。
【００５１】
さらに、本発明は、腫瘍の治療においてもしくはヒトの抗腫瘍免疫応答を誘発するために使用される、および腫瘍の治療のためのもしくはヒトの抗腫瘍免疫応答を誘発するための医薬品の製造に使用される、本発明の方法により入手可能であるかまたは上で定義したような、抗原特異的ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬの使用に関するものである。ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬは、１回目の刺激の後に、またはあるいは再刺激の後に投与することができる。一実施形態では、ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬは、治療的癌ワクチンと組み合わせて投与する。
【００５２】
ヒト対象の治療で養子細胞療法にＴ細胞集団を用いる方法は、当技術分野の臨床医には公知である。本明細書に記載のかつ当技術分野で公知の方法に従って調製されるＴ細胞集団をそのような方法で用いることができる。例えば、ＭＡＲＴ−Ｉ抗原特異的Ｔ細胞とともに腫瘍浸潤リンパ球を用いる養子細胞療法が臨床で試験されている（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０５：２４１−２５０，２００５）。腎細胞癌を有する患者に対し、放射線照射自己腫瘍細胞のワクチンが接種されている。採取された細胞は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体とＩＬ−２とで二次的に活性化され、患者に再投与された（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２１：８８４−８９０，２００３）。
【００５３】
抗原によってプライミングされたＴ細胞は、ＤＣによるインビトロでの初期プライミングの間にＡＳＡＬに曝露されると、再刺激によって増殖の増大とアポトーシスの低下を経験する。したがって、ワクチンを接種する前および／またはワクチンを接種している間に、患者に養子的に戻される場合、ワクチン接種によって二次性のＴ細胞応答を増強する方法も、本発明によって想定されている。
【００５４】
本発明はまた、標的抗原を認識するＴ細胞受容体またはキメラＴ細胞受容体を発現するように（ウイルスによる形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたは遺伝物質を導入する他の方法によって）改変されたＴ細胞を含む、養子免疫療法で用いられるＴ細胞集団を調製し；これらの改変されたＴ細胞を、感作された同種リンパ球の存在下で、抗原負荷ＤＣにより活性化し；これらの細胞を培養で拡大し；かつこれらの細胞を再導入して患者に戻す方法を提供する。
【００５５】
本発明はまた、癌ワクチン療法を改善する方法を提供する。多くの腫瘍は、免疫系による破壊の標的として潜在的に働くことができる異種抗原を発現している。癌ワクチンは、液性成分と細胞性成分の両方を含む全身性の腫瘍特異的免疫応答を対象内で発生させる。この応答は、腫瘍から離れた部位でまたは局在化した腫瘍の部位でワクチン組成物を投与することによって、対象自身の免疫系から誘発される。抗体または免疫細胞は腫瘍抗原に結合し、腫瘍細胞を溶解させる。しかしながら、癌患者のワクチン接種によるＴ細胞応答性の増大は必要とされ続けている。したがって、ワクチン接種前またはワクチン接種時点で、高い増殖能を有する、予め活性化されたアポトーシス抵抗性の腫瘍特異的Ｔ細胞を養子移植することにより、ワクチン介在性の免疫応答をインビボで増強することができる。
【００５６】
本発明による組成物は、治療的癌ワクチンと組み合わせて投与することもできる。そのような治療的癌ワクチンの非限定的な例は、エクスビボで増幅され、かつ腫瘍負荷されたＤＣ、サイトカイン産生腫瘍細胞、ＤＮＡワクチン接種、および腫瘍抗原と組み合わせてＴＬＲリガンドを用いるワクチンである。
【００５７】
本発明の方法により入手可能な細胞をヒトなどの生物に直接投与して、その活性化の間に抗原特異的Ｔ細胞の増殖および生存を増大させることができる。多くの場合、医薬として許容される担体を伴うこれらの細胞の投与は、細胞を導入して、最終的に哺乳動物の血液または組織細胞と接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによる。
【００５８】
例えば、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下および腫瘍内経路および担体によるものなどの非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含むことができる水性等張滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。静脈内投与は、本発明のＴＨ１細胞およびＣＴＬの好ましい投与方法である。
【００５９】
本発明の文脈における、患者に投与されるＴＨ１細胞およびＣＴＬの用量は、患者の免疫応答を増強するのに十分なものであるべきである。したがって、腫瘍抗原に対する効果的な免疫応答を誘発し、かつ／または疾患の症状および／もしくは疾患による合併症を緩和するか、軽減するか、治癒させるかもしくは少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で、細胞を患者に投与する。これを達成するのに十分な量を「治療的有効用量」と定義する。この用量は、産生される細胞の活性および患者の状態、ならびに治療すべき患者の体重または表面積により決定される。癌などの疾患の治療または予防で投与すべき細胞の有効量を決定する際に、医師は、疾患の進行および任意の関連腫瘍抗原に対する免疫応答の誘導を評価する必要がある。
【００６０】
先行技術の方法と比較して、本発明の大きな利点がいくつかある。本発明は、再刺激を必要とせずに、高レベルの腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を提供する。再刺激は、細胞の活性を弱め、アポトーシスを受けやすくする。したがって、再刺激を必要とせずに腫瘍特異的Ｔ細胞を効率的に拡大する方法は好都合である。さらに、細胞を再刺激する必要がなければ、腫瘍特異的Ｔ細胞をより短期間のうちに患者に戻すことができ、費用効率がより高くなる。さらに、本発明による方法を使用すれば、サプレッサー細胞の除去または非常に費用がかかる過程である外因性増殖因子の添加の必要がない。
【実施例】
【００６１】
本発明を以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
実施例１ 
材料および方法：健常血液ドナー由来のγ線照射ＰＢＭＣを（健常血液ドナーに対して）同種のドナー由来の放射線非照射ＰＢＭＣと、無血清Ｘ−ＶＩＶＯ  １５培地を含む組織培養フラスコ中、１：１の比で、５〜７日間共培養することにより、標準的な一方向混合白血球反応（ＭＬＲ）で同種感作同種リンパ球（ＡＳＡＬ）を生成させた。未成熟ＤＣの増殖のために、健常血液ドナーから得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を密度勾配で単離した（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ，Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）。単離したＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）に再懸濁し、２４ウェルプラスチック培養プレート中に１ウェル当たり２．５×１０６細胞でプレーティングし、２時間付着させておいた。付着していない細胞を除去し、付着している残りの単球を、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ；両方とも１，０００Ｕ／ｍＬ）を補充したＡＩＭ−Ｖ培地中で４〜６日間培養した。インキュベーションの最後の２４時間、培養培地にＩＦＮ−α（３，０００Ｕ／ｍＬ）、ＩＦＮ−γ（１，０００Ｕ／ｍＬ）、ＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１β（２５ｎｇ／ｍＬ）（全てＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）およびｐ−Ｉ：Ｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；２０μｇ／ｍＬ）を補充することにより、未成熟ＤＣの成熟を誘導した。
【００６２】
ＦＡＣＳ解析で決定したとき、成熟ＤＣ集団は全て、７０％を超えるＣＤ８３＋ＤＣを含んでいた。
【００６３】
洗浄後、成熟ＤＣを、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５培地中で２４時間、放射線非照射またはγ線照射（２５グレイ）ＡＳＡＬと共培養し、ＦＡＣＳで解析した。γ線照射ＰＢＭＣをスティミュレーター細胞として、かつ放射線非照射ＰＢＭＣをレスポンダー細胞として用いて、無血清培養培地（Ｘ−ＶＩＶＯ  １５）中で、５〜６日間、一次の一方向ＭＬＲを実施することにより、同種反応性リンパ球の感作を行なった。ＰＥ−コンジュゲート抗ヒトＣＤ７０をＦＡＣＳ研究に用いた。
【００６４】
結果：図１に示すように、ＡＳＡＬは、ＡＳＡＬのプライミングに用いた放射線照射ＰＢＭＣに対して自己の単球由来成熟ＤＣ表面でのＣＤ７０の発現を顕著に増強する。
【００６５】
図２に示すように、γ線照射ＡＳＡＬも同様に、ＡＳＡＬのプライミングに用いた放射線照射ＰＢＭＣに対して自己の単球由来成熟ＤＣ表面でのＣＤ７０の発現を顕著に増強する。
【００６６】
図３、４および５に示すように、ＡＳＡＬと、ＡＳＡＬのプライミングに用いた放射線照射ＰＢＭＣに対して自己の成熟ＤＣとの共培養は、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の大幅な産生を誘導する。
【００６７】
実施例２ 
材料および方法：放射線照射同種ＰＢＭＣをスティミュレーターとして用いて、従来のＭＬＲにおいて７日間、ＡＳＡＬを生成させた（実施例１参照）。採取および照射の後、バルクのＡＳＡＬ集団（「ＭＬＲ」）またはＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞もしくはＣＤ５６＋（ＮＫ／ＮＫＴ）細胞を除去したＡＳＡＬを（ＡＳＡＬのプライミングに用いたＰＢＭＣに対して自己の）同種単球由来成熟ＤＣと共培養した。共培養上清を２４時間後に回収し、その後、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの産生についてアッセイした。
【００６８】
結果：ＩＬ−２産生は完全にＣＤ４依存的であることが分かったが（図６Ａ）、その一方で、ＩＬ−１２産生（図６Ｂ）はＡＳＡＬ依存性を全く示さず、ＩＦＮ−γ産生（図６Ｃ）は、共培養され、同種プライミングされた、ＡＳＡＬ集団内のＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ５６＋（ＮＫ／ＮＫＴ）に対する部分的な依存性を示した。
【００６９】
実施例３ 
材料および方法：単球をプラスチックに付着させることにより、未成熟ＤＣを生成させた。単球を、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＦＳ（両方とも１０００Ｕ／ｍＬ）を補充したＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＤＣ中で７日間培養した。５０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β、５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ、３０００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−αおよび２０μｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃをインキュベーションの最後の２日間添加することにより、ＤＣの成熟を誘導した。
【００７０】
ＤＣドナーに対して同種のγ線照射ＰＢＭＣおよびＤＣドナーに対して自己の放射線非照射ＰＢＭＣを、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５中、１：１の比で、７日間共培養することにより、一方向混合リンパ球反応でＡＳＡＬを生成させた。
【００７１】
５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５を補充したＸ−ＶＩＶＯ  １５中、０．５×１０６リンパ球／ｍＬの最終濃度で７日間培養しておいた自己ＰＢＭＣからの陽性選択により、ＣＤ８＋Ｔリンパ球を単離した。ＰＢＭＣを遠心分離し、１×１０７／８０μｌの最終濃度でＰＢＳ−０．５％  ＢＳＡ−２Ｍ  ＥＤＴＡに再懸濁した。ＰＢＭＣを、ＣＤ８＋  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）とともに４℃で１５分間インキュベートし、洗浄し、再懸濁し、ＬＳ  ＭＡＣＳカラムに載せた。未標識細胞を洗浄して通過させ、ＣＤ８＋リンパ球を含む全流出物を回収した。単離したＣＤ８＋Ｔリンパ球を、予め温めておいたＰＢＳ−１％  ＢＳＡに１×１０６／ｍＬの濃度になるよう再懸濁し、１０μΜのＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、３７℃で１０分間染色した。５ｍＬの氷冷Ｘ−ＶＩＶＯ  １５培地を添加して染色を停止させ、氷上で５分間インキュベートした。細胞を培地中で２回洗浄し、１×１０６／ｍＬの最終濃度になるよう再懸濁した。染色されたＣＤ８＋Ｔリンパ球を、放射線照射した同種感作同種ＰＢＭＣおよび感作した自己ＤＣとともに、４：４：１の比で、４〜７日間共培養した。培養後、リンパ球を採取し、ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｈ７、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ２７−ＡＰＣおよびアネキシンＶで染色した。増殖しているＣＤ８＋Ｔリンパ球のパーセンテージをフローサイトメトリーで決定し、全リンパ球のパーセンテージとして表した。
【００７２】
結果：図７に示すように、放射線照射「同種ヘルパー」（＝ＡＳＡＬ）を添加すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞分裂が著しく増強される（蛍光強度の低い細胞がより多い）。したがって、ＡＳＡＬは、同種反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖応答を誘導する単球由来ＤＣの能力を強化する。
【００７３】
実施例４
材料および方法：単球をプラスチックに付着させることにより、未成熟ＤＣを生成させた。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＦＳ（両方とも１０００Ｕ／ｍＬ）を補充したＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＤＣ中で単球を７日間培養した。５０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β、５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ、３０００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−αおよび２０μｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃをインキュベーションの最後の２日間添加することにより、ＤＣの成熟を誘導した。付着していない細胞、すなわち、ＣＤ８＋リンパ球を洗浄し、０．５×１０６／ｍＬの最終濃度で、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５を補充したＸ−ＶＩＶＯ  １５中で７日間培養した。
【００７４】
ＤＣドナーに対して自己のγ線照射ＰＢＭＣとＤＣドナーに対して同種の放射線非照射ＰＢＭＣとを、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５中、１：１の比で、７日間共培養することにより、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で同種感作同種リンパ球を生成させた。
【００７５】
成熟ＤＣを採取し、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５中、３７℃で１時間、２０μｇ／ｍＬのＨＥＲ−２ペプチド（ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）を負荷した。ペプチド負荷した成熟ＤＣを用いて、ＤＣと放射線照射ＭＬＲと付着していないＰＢＭＣとを１：４：４の比で共培養することにより、自己ＨＥＲ２特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導した。細胞を、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７を含むＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＤＣならびにこれらを含まないＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＤＣの中で９日間培養した。培養後、細胞を採取し、洗浄し、ＨＥＲ−２特異的ＰＥ−コンジュゲートペンタマー（Ａ＊０２０１  ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）とともに暗所室温で１０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、その後、ＣＤ３−ＦＩＴＣおよびＣＤ８−ＡＰＣを用いて染色を行なった。ＨＥＲ−２陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球のパーセンテージをフローサイトメトリーで決定し、全ＣＤ８＋Ｔリンパ球数のパーセンテージとして表した。
【００７６】
結果：図８は、自己ＤＣ、本発明の同種感作同種リンパ球で刺激し、かつＨｅｒ−２ペプチドで刺激した腫瘍特異的ＣＴＬの拡大（Ａ）、および自己ＤＣ、本発明の同種感作同種リンパ球で刺激し、かつＨｅｒ−２ペプチドで刺激していない腫瘍特異的ＣＴＬの拡大（Ｂ）を示している。Ｈｅｒ２＋／ＣＤ８＋細胞は、各ドットプロットの右上の部分に示されている（ＰＢＭＣを同種プライミングしたが、ＤＣにＨｅｒ２ペプチドを負荷していない場合は０．４％、ＰＢＭＣを同種プライミングし、ＤＣにＨｅｒ２ペプチド（ＫＩＦＧ）を負荷した場合は２５．２％）。
【００７７】
先行技術における腫瘍特異的ＣＴＬの拡大と比較すると、１度しか刺激していないのにこのレベルの拡大が得られるのは、驚くべきことである。例えば、Ｈｏら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３１０（２００６），４０−５０）を参照されたい。この文献中では、腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞の１８．８％の拡大を得るのに、２回の再刺激が必要であった。同様に、Ｇｒｉｔｚａｐｉｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８；１８１；１４６−１５４）では、機能的に拡大された腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞を得るために再刺激が必要とされた。
【００７８】
実施例５
材料および方法：実施例１の材料および方法を参照されたい。
【００７９】
ＤＣ、（ＤＣに対して同種の）放射線照射ＡＳＡＬを６日間共培養した後、（抗体をコーティングした磁気ビーズによる陰性選択を用いて）ＣＤ８＋リンパ球を単離し、その後、（一次刺激で用いたＤＣに対して自己の）Ｂ細胞で再刺激し、ＣＤ２７およびアネキシン−Ｖの発現について染色した。その後の解析はＦＡＣＳで行なった。
【００８０】
結果：図９に示すように、一次刺激時にＡＳＡＬを添加すると、ＣＤ８＋細胞をＢ細胞再刺激したときのＣＤ２７の発現が大幅に増大した。
【００８１】
一次刺激時にＡＳＡＬを添加すると、ＣＤ８＋細胞をＢ細胞再刺激したときのアネキシン−Ｖ（アポトーシスマーカー）の発現が大幅に低下した（図１０参照）。
【００８２】
実施例６  
材料および方法：実施例５の材料および方法を参照されたい。
【００８３】
Ｂ細胞で再刺激する前に、プライミングし、単離したＣＤ８＋細胞に３Ｈ−チミジンをパルスした。
【００８４】
結果：図１１に示すように、一次刺激時にＡＳＡＬを添加すると、（３日目の３Ｈ−チミジンの取込み（ｃｐｍ／分）で測定したとき）再刺激後の同種反応性ＣＤ８＋細胞の増殖応答が著しく増強された。
【００８５】
実施例７  
材料および方法：実施例５の材料および方法を参照されたい。
【００８６】
Ｂ細胞と予め活性化しておいたＣＤ８＋細胞とを２日間共培養した後、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ産生について従来のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した
【００８７】
結果：図１２は、一次刺激時にＡＳＡＬを添加すると、再刺激後の同種反応性ＣＤ８＋細胞によるＩＦＮ−γ産生が大幅に増大したことを示している。
【００８８】
特定の実施形態を本明細書で詳細に開示したが、これは、説明する目的で例として行なわれているに過ぎず、以下に添付する特許請求の範囲に関して限定するものであることを意図するのではない。特に、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に対して様々な置換、変更、および修正を行なうことができることが本発明者らにより想定されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年6月28日(2012.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する患者への投与に好適な抗原特異的Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）をプライミングするためのインビトロ法であって、前記方法は、治療すべき前記患者由来の標的Ｔ細胞と、自己単球由来樹状細胞と、自己もしくは同種の腫瘍物質または腫瘍関連タンパク質もしくはペプチドと、前記患者由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ抗原に対して、または治療すべき前記患者由来のＡＰＣ表面に発現したＭＨＣクラスＩＩ抗原と同一の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する無関係な血液ドナー由来のＡＰＣに対して感作された同種リンパ球とを共培養することを含む、インビトロ法。
【請求項２】
前記感作は、不活化した同種抗原提示細胞を健常ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とともに培養することを含む混合白血球反応により誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原提示細胞は、ＰＢＭＣおよび単球由来樹状細胞からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単球由来樹状細胞は、前記患者由来のものであるかまたは前記患者の前記ＨＬＡ−ＤＲ抗原とマッチするＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）抗原を有する健常ドナー由来のものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記単球由来樹状細胞は、単球をまずＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む組成物中で約１〜７日間培養して、未成熟樹状細胞を得、その後、少なくとも約１２時間培養することによって前記未成熟樹状細胞を成熟樹状細胞にするのを可能にする第２の組成物を添加することにより得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の組成物は、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、インターフェロンγ、インターフェロンαもしくはβおよびＴＬＲ３リガンド、例えば、ポリ−Ｉ：Ｃならびに／またはＴＬＲ４リガンドを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の組成物は、ＴＮＦα、インターフェロンγ、ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ４リガンドならびにＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＬＲ３リガンドはポリ−Ｉ：Ｃであり、かつ前記ＴＬＲ８アゴニストはＲ８４８である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍物質または腫瘍関連タンパク質もしくはペプチドは、前記患者由来の死滅した腫瘍細胞、前記患者の腫瘍と同じタイプの同種腫瘍細胞、ならびに既知の単離および精製された腫瘍タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍関連ペプチドは、ＨＥＲ−２タンパク質、ＰＳＡタンパク質、ＭＡＲＴ−１タンパク質、ｐ５３タンパク質および／またはサバイビンに由来するペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍物質は、前記腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのトランスフェクションにより前記成熟樹状細胞に負荷された腫瘍タンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞を約４〜２０日間培養する、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
外因性ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／またはＩＬ−２１を前記細胞培養物に添加する、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記プライミングされた抗原特異的Ｔｈ１細胞またはＣＴＬは、前記細胞を新しい単球由来樹状細胞、感作した新しい同種リンパ球と一緒に培養し、場合によっては、外因性ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−４および／またはＩＬ−２１を前記細胞培養物に添加することにより再刺激される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により得られる抗原特異的ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬ。
【請求項１６】
患者への投与に好適な抗原特異的ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬ、ここで、前記ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬは、
−増殖する能力を有し、
−前記細胞の４０％までしかアネキシン−Ｖの陽性染色を示さないはずであり、かつ／または
−その細胞表面でＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ２７および／またはＣＤ２８を発現する。
【請求項１７】
腫瘍の治療においてまたはヒトの抗腫瘍免疫応答を誘発するために使用される請求項１５または１６に記載の抗原特異的ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬ。
【請求項１８】
腫瘍を治療するためのまたはヒトの抗腫瘍免疫応答を誘発するための医薬品を製造するための請求項１５または１６に記載の抗原特異的ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬの使用。
【請求項１９】
前記ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬは治療的癌ワクチンと組み合わせて投与される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬは１回目の刺激の後に投与される、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬは再刺激の後に投与される、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
腫瘍の治療においてまたはヒトの抗腫瘍免疫応答を誘発するために使用される請求項１５または１６に記載の抗原特異的ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬ。
【請求項２３】
前記ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬは治療的癌ワクチンと組み合わせて投与される、請求項２２に記載の抗原特異的ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬ。
【請求項２４】
前記ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬは１回目の刺激の後および／または再刺激の後に投与される、請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の抗原特異的ＴＨ１細胞および／またはＣＴＬ。
【国際調査報告】
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