(57)【要約】  外科的切除後の肺癌の再発に好ましくない予後を有する早期非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者を同定するための方法が開示される。本方法は、Ｃｈｒ１９、３４．７Ｍｂ−３５．６Ｍｂにおける染色体のコピー数獲得を予後の分類のために用いることができるという発見に一部で基づいている。好ましくは、本方法は、蛍光で標識された核酸プローブによる蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを用いて、サイクリンＥ１遺伝子を含むこの遺伝子座の染色体のコピー数を定量化するために患者サンプルにハイブリダイズする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌の治療を受けている患者における疾患転帰を予測する方法であって、
ａ）患者から得られた試験サンプルを提供するステップと；
ｂ）試験サンプル中のサイクリンＥ１遺伝子のコピー数を決定するステップと；
ｃ）２つのベースラインコピー数に対する試験サンプル中のサイクリンＥ１遺伝子のコピー数を比較し、それによって、試験サンプルにおけるサイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得の有無を決定するステップと；
ｄ）試験サンプル中のサイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得の有無に基づいて、サイクリンＥ１遺伝子におけるコピー数獲得を有さない患者において疾患転帰のベースライン測度と比較したとき、疾患転帰不良のリスクの増加を有するものとして患者を同定するステップを含み、前記サイクリンＥ１遺伝子におけるコピー数獲得の存在は、疾患転帰不良を予測するものである、
方法。
【請求項２】
疾患転帰不良が、サイクリンＥ１遺伝子についてのコピー数獲得を有さない患者の全生存期間と比べたときの全生存期間の減少およびサイクリンＥ１遺伝子についてのコピー数獲得を有さない患者の全生存期間と比較したときの再発までのより短い期間の少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
肺癌の治療を受けている患者における疾患転帰を予測する方法であって、
ａ）患者から得られた試験サンプルを提供するステップと；
ｂ）サイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得の有無を決定するステップと；
ｃ）サイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得の有無に基づいて、患者が、サイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得を有さない患者の全生存期間と比較したとき、全生存期間の減少または再発までのより短い期間のリスクがより高いか否かを決定するステップを含む、
方法。
【請求項４】
サイクリンＥ１遺伝子が、染色体１９、３４．７Ｍｂ−３５．６Ｍｂに位置する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
試験サンプルが、組織サンプルを含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
組織サンプルが、血液サンプル、腫瘍組織もしくは疑われる腫瘍組織、薄層細胞学的なサンプル、細針吸引サンプル、肺洗浄サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプルまたは末梢血サンプルのいずれかから生成した抽出物もしくは処理済みのサンプルを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
組織サンプルが、肺組織サンプルまたは循環腫瘍細胞を含む末梢血サンプルを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
決定するステップ（ｂ）が、インサイチューハイブリダイゼーションによって行われる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
インサイチューハイブリダイゼーションが、蛍光で標識される核酸プローブで行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
インサイチューハイブリダイゼーションが、少なくとも２つの核酸プローブで行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
インサイチューハイブリダイゼーションが、ペプチド核酸プローブで行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
決定するステップ（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応で行われる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
決定するステップ（ｂ）が、核酸配列決定アッセイによって行われる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
決定するステップ（ｂ）が、核酸マイクロアレイアッセイによって行われる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
肺癌が、非小細胞肺癌である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
癌が、有棘細胞癌、大細胞癌および腺癌からなる群から選択される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
患者が、化学療法、放射線、手術またはそのいずれかの併用による治療を受けている、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
肺癌に罹患した患者のための治療を選択する方法であって、
ａ）患者から得られた試験サンプルを提供するステップである、化学療法薬剤を有する治療が患者のために少なくとも１種の治療オプションであるステップと；
ｂ）試験サンプル中のサイクリンＥ１遺伝子のコピー数を決定するステップと；
ｃ）試験サンプル中のサイクリンＥ１遺伝子のコピー数を２つのベースラインコピー数と比較し、それによって、試験サンプルにおけるサイクリンＥ１のためのコピー数獲得の有無を決定するステップと；
ｄ）ステップｃ）における比較に基づいた化学療法治療レジメンを決定するステップを含む、
方法。
【請求項１９】
コピー数の変化が癌転帰マーカーのために存在するとき、ステップｃ）における比較に基づいた治療レジメンを決定することが、化学療法薬剤を選択するステップおよび化学療法治療の頻度を決定するステップを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項２０】
試験サンプルが、組織サンプルを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
組織サンプルが、血液サンプル、腫瘍組織もしくは疑われる腫瘍組織、薄層細胞学的なサンプル、細針吸引サンプル、肺洗浄サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプルまたは末梢血サンプルのいずれかから生成した抽出物もしくは処理済みのサンプルを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
組織サンプルが、肺組織サンプルまたは循環腫瘍細胞を含む末梢血サンプルを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
決定するステップ（ｂ）が、インサイチューハイブリダイゼーションによって行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
インサイチューハイブリダイゼーションが、蛍光で標識される核酸プローブで行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
インサイチューハイブリダイゼーションが、少なくとも２つの核酸プローブで行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
インサイチューハイブリダイゼーションが、ペプチド核酸プローブで行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
決定するステップ（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応で行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
決定するステップ（ｂ）が、核酸配列決定アッセイによって行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
決定するステップ（ｂ）が、核酸マイクロアレイアッセイによって行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
肺癌が、非小細胞肺癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
癌が、有棘細胞癌、大細胞癌および腺癌からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
患者が、放射線、または手術またはその併用による治療も受けている、請求項１８に記載の方法。
【請求項３３】
治療に抵抗性である肺癌を有するものとして患者を分類する方法であって、
ａ）患者から得られた試験サンプルを提供するステップ；
ｂ）サイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数を決定するステップ；
ｃ）患者においてサイクリンＥ１遺伝子のコピー数獲得の有無を決定するために、サイクリンＥ１遺伝子のための２つのベースラインコピー数に対して試験サンプルにおけるサイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数を比較するステップと；
ｄ）サイクリンＥ１遺伝子のコピー数獲得の存在に基づいた治療に抵抗性である肺癌を有するものとして患者を分類するステップを含む、
方法。
【請求項３４】
試験サンプルが、組織サンプルを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
組織サンプルが、血液サンプル、腫瘍組織もしくは疑われる腫瘍組織、薄層細胞学的なサンプル、細針吸引サンプル、肺洗浄サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋した組織サンプルまたは末梢血サンプルのいずれかから生成した抽出物もしくは処理済みのサンプルを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
組織サンプルが、肺組織サンプルまたは循環腫瘍細胞を含む末梢血サンプルを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
決定するステップ（ｂ）が、インサイチューハイブリダイゼーションによって行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
インサイチューハイブリダイゼーションが、蛍光で標識される核酸プローブで行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
インサイチューハイブリダイゼーションが、少なくとも２つの核酸プローブで行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
インサイチューハイブリダイゼーションが、ペプチド核酸プローブで行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
決定するステップ（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応で行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
決定するステップ（ｂ）が、核酸配列決定アッセイによって行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
決定するステップ（ｂ）が、核酸マイクロアレイアッセイによって行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
肺癌が、非小細胞肺癌である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４５】
癌が、有棘細胞癌、大細胞癌および腺癌からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４６】
患者が、化学療法、放射線、手術またはそのいずれかの併用による治療を受けている、請求項３３に記載の方法。
【請求項４７】
ａ）サイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得の有無を決定するための試薬；および
ｂ）試験を行うための指示を含む、
キット。
【請求項４８】
コピー数獲得の有無を決定するための試薬が、サイクリンＥ１遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズする検出可能な程度に標識されたポリヌクレオチドを含む、請求項４７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年１０月２６日出願の米国特許仮出願第６１／２５４，９５５号からの優先権を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、患者の予後を決定するための肺癌患者から得られた組織サンプルのインビトロ診断検査に関し、特に、病期Ｉまたは病期ＩＩ非小細胞肺癌と診断された患者など、早期患者の予後を決定するためのインビトロアッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
肺癌は、２００５年に米国の癌死亡者のほぼ３分の１を占め、大まかに２つのタイプ、すなわち非小細胞肺癌および小細胞肺癌に分類される。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、米国における肺癌症例の８０−８５％を占める。ＮＳＣＬＣのタイプは、癌において見出された細胞の種類について命名され、および顕微鏡下でのその細胞の見え方に由来する。ＮＳＣＬＣは、主な３つのタイプ、すなわち、（ｉ）魚の鱗のように見える薄く平らな細胞である扁平上皮細胞中で開始する有棘細胞癌。有棘細胞癌は、類表皮癌とも呼ばれる。；（ｉｉ）大型肺細胞のいくつかのタイプで開始する大細胞癌；（ｉｉｉ）肺の肺胞の内側を覆い、粘液などの物質を作る細胞中で開始する腺癌、を含む。ＮＳＣＬＣの一般的ではない他のタイプには、多形癌、カルチノイド腫瘍および未分類癌が含まれる。
【０００４】
ＮＳＣＬＣの診断は、生検サンプルなど、疑われる組織の病理学者の検査により行われる。ＮＳＣＬＣ診断後、患者の疾患は、患者の全体的な健康および年齢、咳嗽および呼吸困難などの症状の重症度、ＮＳＣＬＣの個々のタイプおよび癌の病期分類を用いて予後（回復の変化）が割り当てられる。病期分類は、腫瘍のサイズおよび腫瘍が肺だけに存在するのか身体の他の位置に分散しているのかを考慮に入れる。次いで、ＮＳＣＬＣ患者に対する個々の治療オプションは、こうした考慮に基づいて選択され、癌の病期分類は、治療選択のための重要な構成要素である。早期ＮＳＣＬＣの患者は、腫瘍を除去するために外科的切除により潜在的に治癒させることができるが、現在の治療様式は、患者が手術後に再発することを予測することができない。癌は、しばしば治癒率が低い致命的な疾患であり、そのため、治療の大部分は、生活の質および寿命を改善することに向けられる。癌細胞が、比較的少数の遺伝子異常またはタンパク質突然変異の蓄積によってのみしばしば区別されるヒトの細胞であるため、癌細胞を死滅させるのに有用である薬物療法は、多くの正常なヒト細胞にやはり一般的に有害であり、治療される患者において通常重大な毒性を引き起こす。さらに、癌がしばしば局所的に再発するまたはこれらの原発組織から離れた組織および臓器に転移するため、早期癌の患者が、これらの原発腫瘍の外科的除去後に薬物治療を必要とすることを知ることは重大な意味を持つ。これは、腫瘍が早期に検出され外科的に除去された早期ＮＳＣＬＣの患者、具体的には、病期ＩおよびＩＩＡ疾患の患者において特に重大な問題である。これらの患者を抗癌薬で治療することは、再発性または転移性疾患を発症する患者が許容できないほど高い比率につながり、最終的に、罹患率および死亡率の増加をもたらす。この母集団を治療し終わることは、薬物療法を必要とせず、投与された薬物からの毒性副作用を経験する患者が許容できないほど高い比率につながる。
【０００５】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋインターネットウェブサイトは、以下の通りＮＳＣＬＣ病期分類を記載している。「非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の増殖および分散を記載するために米国の診療で最もよく用いられる系は、ＴＮＭ病期分類系であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）系としても知られている。ＴＮＭ病期分類では、腫瘍（Ｔ）、近隣のリンパ節への任意の分散（Ｎ）および任意の離れた臓器転移（Ｍ）に関する情報は組み合わされ、病期は、特定のＴＮＭグループ化に割り当てられる。グループ化された病期は、番号０およびローマ数字ＩからＩＶを用いて記載される。
【０００６】
「Ｔカテゴリーは、肺癌のサイズ、肺内のその分散および位置、ならびに近隣の組織への分散に基づいている。Ｔｉｓカテゴリーにおいて、癌は、通気道の内側を覆う細胞の層においてのみ見出される。これは、他の肺組織に分散していない。このカテゴリーはまた、上皮内癌としても知られている。
【０００７】
「Ｔ１カテゴリーにおいて、癌は、３センチメートルより大きくなく（わずかに１から１  １／４インチをわずかに下回る）、肺胸膜（肺を取り囲む膜）に分散しておらず、気管支の主枝に影響を与えない。
【０００８】
「Ｔ２カテゴリーにおいて、癌は、以下の特徴の１つまたは複数を有する。すなわち、（ｉ）３ｃｍよりも大きい；（ｉｉ）これは、肺の主枝を含むが、気管（喉笛）が左側および右側の主な気管支に分かれる点に２ｃｍ（約３  １／４から４インチ）よりも近くない；または（ｉｉｉ）肺胸膜に分散している。癌は、気道を部分的に遮断し得るが、これは、肺全体に虚脱させていないまたは肺炎を発症させていない。
【０００９】
「Ｔ３カテゴリーにおいて、癌は、以下の特徴の１つまたは複数を有する。すなわち、（ｉ）癌は、胸壁、横隔膜（胸部を腹部から区別する呼吸筋（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ  ｍｕｓｃｌｅ））、縦隔胸膜（２つの肺の間の空間を取り囲む膜）、または壁側心膜（心臓を取り囲む嚢の膜）に分散している；（ｉｉ）癌は、肺の主な気管支を含み、気管（または喉笛）が左側および右側の主な気管支に枝分かれするが、この領域を含まない点に２ｃｍ（約３  １／４から４インチ）より近い；または（ｉｉｉ）１つの肺を完全に虚脱させるまたは肺全体の肺炎を引き起こすのに十分なほど気道に増殖している。
【００１０】
「Ｔ４カテゴリーにおいて、癌は、以下の特徴の１つまたは複数を有する：（ｉ）癌は、縦隔（胸骨の後方のおよび心臓の前側の空間）、心臓、気管（喉笛）、食道（咽頭を胃に連結する管）、背骨、または気管が左側および右側の主な気管支に枝分かれする点に分散している；（ｉｉ）２つ以上に分かれる腫瘍小結節は、同じ葉中に存在する；または（ｉｉｉ）肺を取り囲む空間中で癌細胞を含む液体の存在である、悪性胸水が存在する。
【００１１】
「Ｎカテゴリーは、肺の近くのリンパ節のいずれかが、癌によって影響される場合、これに依存する。Ｎ０カテゴリーにおいて、癌は、いかなるリンパ節にも分散されていない。Ｎ１カテゴリーにおいて、癌は、肺内または肺門リンパ節（気管支が肺に入る領域の周りに位置するもの）中のリンパ節に分散されている。Ｎ１カテゴリーにおいて、冒されたリンパ節は、癌性の肺と同じ側のみにある。Ｎ２カテゴリーにおいて、癌は、気管分岐部のリンパ節（気管が左側および右側の気管支に枝分かれする点の周りにあるもの）または縦隔（胸骨の後方のおよび心臓の前側の空間）中のリンパ節に分散している。Ｎ２カテゴリーにおいて、冒されたリンパ節は、癌性の肺の同じ側にある。Ｎ３カテゴリーにおいて、癌は、片側の鎖骨の近くのリンパ節および／または癌性の肺の反対側の肺門もしくは縦隔のリンパ節に分散している。
【００１２】
「Ｍカテゴリーは、癌が任意の遠隔組織および臓器に転移し分散しているか否かに依存している。Ｍ０カテゴリーにおいて、遠隔の癌の分散がない。Ｍ１カテゴリーにおいて、癌は、１カ所または複数カ所の遠隔部位に分散している。遠隔とみなされる部位には、癌のＮカテゴリーおよび肝臓、骨もしくは脳などの他の臓器または組織を決定するために用いるものより遠い肺の他の葉、リンパ節が含まれる。
【００１３】
Ｔ、ＮおよびＭカテゴリーが、個々のＮＳＣＬＣについて割り当てられた後、この情報は組み合わされて（病期グループ化）、０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの全病期を割り当てられる（表１を参照のこと）。ＴおよびＮカテゴリーの様々な併用は病期に組み合わされる。これらの病期は、類似の予後を有し、類似のやり方で治療される腫瘍タイプを同定する。表１に示される通り、遠隔の分散を有する腫瘍（すなわち、Ｍ１カテゴリー癌）は、リンパ節の関与の腫瘍サイズに関わらず、病期ＩＶとみなされる。ＮＣＣＮインターネットウェブサイトからの以下の表は、合わせたカテゴリーおよびＮＳＣＬＣについての病期分類を示す。
【００１４】
【表１】
2013507988.tif 000002
【００１５】
病期番号の低いＮＳＣＬＣ患者は、一般により良好な予後および生存の見通しを有し、これらの患者は、腫瘍の外科的切除によって治療される。しかし、さらに病期１Ｂ、病期ＩＩＡもしくはＩＩＢのＮＳＣＬＣを有する患者など、早期患者の場合、これらの患者はかなりの割合で、より侵攻性疾患を有し、外科的切除後再発し、死亡する。現在の臨床の診断方法は、再発する可能性が高い患者に対して、より積極的な治療を方向づける十分な精度を有する早期ＮＳＣＬＣ予後を同定することができない。したがって、ネオアジュバントもしくはアジュバント化学療法を受け取るべきである、さらに、外科的切除を完全に差し控えるべきである、より高いリスクの早期のＮＳＣＬＣ患者を同定するためのより優れたインビトロ診断方法が必要とされる。
【００１６】
染色体異常を同定するために蛍光で標識されたＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを用いた蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に基づいた分子のインビトロ診断検査は、ＮＳＣＬＣ患者用の化学療法の選択における使用を開示している（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８８７９、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｔｏ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｂｙ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ（癌患者による上皮増殖因子阻害薬への臨床成績を予測するための方法）」、Ｍ．Ｇａｒｃｉａら）。ＦＩＳＨアッセイは、ＮＳＣＬＣについての初期の診断検査として、２００６年３月２３日に公開された米国特許出願第２００６００６３１９４号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ（癌の検出のための方法およびプローブ）」（以下、「Ｍｏｒｒｉｓｏｎ‘１９４」と称される。）、Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎらにおいて記載されており、この開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ‘１９４出願は、スクリーニングおよびＮＳＣＬＣの診断に有用な複数のＦＩＳＨプローブセットを記載しており、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ‘１９４に記載されている１つのプローブセットは、臨床診断検査を示すために臨床検査室により使用するためにＡＳＲ（分析物特異的試薬（Ａｎａｌｙｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅａｇｅｎｔ））標識化に基づいて、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｉｎｃ．（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）からＬＡＶｙｓｉｏｎ（商標）プローブセットとして市販されている。米国食品医薬品局ＡＳＲ標識化必要条件に基づいて、ＡＳＲ標識化は、ＡＳＲの医学的な有用性に関していかなる請求をも含まれてはならない。ＬＡＶｙｓｉｏｎ  ＡＳＲプローブセットは、４つのＦＩＳＨプローブを含む。すなわち、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ緑色フルオロフォアで標識された染色体５ｐ１５座特異的プローブ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ黄色フルオロフォアで標識された染色体８ｑ２４座特異的プローブ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ青色フルオロフォアで標識された第６染色体計数プローブ（ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ）およびＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ赤色フルオロフォアで標識された染色体７ｐ１２座特異的プローブである。ＬＡＶｙｓｉｏｎプローブセットを用いて行われた研究は、記載されており、例えば、Ｋ．Ｈａｌｌｉｎｇら、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ（細胞診における蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）」、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈ．（２００７年）３８巻：１１３７−１１４４頁にその総説がある。
【００１７】
サイクリンＥの過剰発現は、以前は肺癌における転帰不良に関連している（Ｓｉｎｇｈａｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００５年、１１巻、３９７４−３９８６頁にその総説がある。）。サイクリンＥの増幅はまた、卵巣癌に関連している（Ｍ．Ｍａｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔ’ｌ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９８年、７５巻、３４−３９頁）。しかし、サイクリンＥ座におけるコピー数の変動は、予測マーカーとして確立していない。さらに、ＮＳＣＬＣのためのＦＩＳＨアッセイに関する以前の報告は、早期ＮＳＣＬＣの予後、具体的には、病期Ｉまたは病期ＩＩとして分類されるものの予後をより正確に同定するためにＦＩＳＨプローブの使用を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／００１８８７９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／００６３１９４号明細書
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｋ．Ｈａｌｌｉｎｇら、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ（細胞診における蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）」、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈ．（２００７年）３８巻：１１３７−１１４４頁
【非特許文献２】Ｓｉｎｇｈａｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００５年、１１巻、３９７４−３９８６頁
【非特許文献３】Ｍ．Ｍａｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔ’ｌ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９８年、７５巻、３４−３９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の要旨）
一態様では、本開示は、ａ）患者から得られた試験サンプルを提供するステップと；
ｂ）試験サンプル中のサイクリンＥ１遺伝子のコピー数を決定するステップと；ｃ）２つのベースラインコピー数に対する試験サンプル中のサイクリンＥ１遺伝子のコピー数を比較し、それによって、試験サンプルにおけるサイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得の有無を決定するステップと；およびｄ）試験サンプル中のサイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得の有無に基づいて、サイクリンＥ１遺伝子におけるコピー数獲得を有さない患者において疾患転帰のベースライン測度と比較したとき、疾患転帰不良のリスクの増加を有するものとして患者を同定するステップを含み、サイクリンＥ１遺伝子におけるコピー数獲得の存在は、疾患転帰不良を予測するものである、肺癌の治療を受けている患者における疾患転帰を予測する方法を提供する。疾患転帰不良は、サイクリンＥ１遺伝子についてのコピー数獲得を有さない患者の全生存期間と比較したとき、全生存期間の減少およびサイクリンＥ１遺伝子についてのコピー数獲得を有さない患者の全生存期間と比較したとき、再発までのより短い時間の少なくとも１つである。
【００２１】
他の態様では、本開示は、ａ）患者から得られた試験サンプルを提供するステップと；ｂ）サイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得の有無を決定するステップと；およびｃ）サイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得の有無に基づいて、患者が、サイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得を有さない患者の全生存期間と比較したとき、全生存期間の減少または再発までのより短い期間のリスクがより高いか否かを決定するステップを含み、肺癌の治療対象となる患者における疾患転帰を予測する方法を提供する。
【００２２】
これらの方法のいずれかにおいて、サイクリンＥ１遺伝子は、第１９番染色体の領域内で３４．７Ｍｂ−３５．６Ｍｂに位置している。方法のいずれかにおいて、試験サンプルは、例えば、血液サンプル、腫瘍組織または疑われる腫瘍組織などの腫瘍細胞、薄層細胞学的なサンプル、細針吸引サンプル、肺洗浄サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプルまたは前述のいずれかから生成した抽出物もしくは処理済みのサンプルを含むことができる組織サンプルとなり得る。模範的な実施形態では、組織サンプルは、肺組織サンプルまたは循環腫瘍細胞を含む末梢血サンプルである。決定するステップ（ｂ）は、例えば、少なくとも２つの核酸プローブを用いて蛍光で標識される核酸プローブ、またはペプチド核酸プローブなどのインサイチューハイブリダイゼーションによって行うことができる。決定するステップ（ｂ）は、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列決定アッセイ、または核酸マイクロアレイアッセイによって行うことができる。模範的な実施形態では、肺癌は、例えば、有棘細胞癌、大細胞癌および腺癌のいずれかなど、非小細胞肺癌である。患者は、化学療法、放射線、手術またはそのいずれかの併用で治療することができる。
【００２３】
他の態様では、本開示は、肺癌に罹患した患者のための治療を選択する方法を提供し、方法は、ａ）患者から得られた試験サンプルを提供するステップであって、化学療法薬剤を有する治療が患者のために少なくとも１種の治療オプションであるステップと；ｂ）試験サンプル中のサイクリンＥ１遺伝子のコピー数を決定するステップと；ｃ）試験サンプル中のサイクリンＥ１遺伝子のコピー数を２つのベースラインコピー数と比較し、それによって、試験サンプルにおけるサイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数の変化の有無を決定するステップと；およびｄ）ステップｃ）における比較に基づいた化学療法治療レジメンを決定するステップを含む。ステップｃ）における比較に基づいた治療レジメンを決定するステップには、例えば、化学療法薬剤を選択するステップおよびコピー数の変化が癌転帰マーカーについて存在するとき化学療法治療の頻度を決定するステップが含まれる。試験サンプルは、例えば、血液サンプル、腫瘍組織もしくは疑われる腫瘍組織、薄層細胞学的なサンプル、細針吸引サンプル、肺洗浄サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋した組織サンプルまたは末梢血サンプルのいずれかから生成した抽出物もしくは処理済みのサンプルなどの腫瘍細胞を含み得る組織サンプルであり、模範的な実施形態では、肺組織サンプルまたは循環腫瘍細胞を有する末梢血サンプルである。決定するステップ（ｂ）は、例えば、少なくとも２つの核酸プローブを用いて蛍光で標識される核酸プローブまたはペプチド核酸プローブなどでインサイチューハイブリダイゼーションによって行うことができる。決定するステップ（ｂ）は、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列決定アッセイまたは核酸マイクロアレイアッセイによって行うことができる。模範的な実施形態において、肺癌は、例えば、有棘細胞癌、大細胞癌および腺癌のいずれかなどの非小細胞肺癌である。患者はまた、放射線または手術またはその併用で治療することができる。
【００２４】
他の態様では、本開示は、ａ）患者から得られた試験サンプルを提供するステップ；ｂ）サイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数を決定するステップ；ｃ）患者においてサイクリンＥ１遺伝子のコピー数獲得の有無を決定するために、サイクリンＥ１遺伝子のための２つのベースラインコピー数に対して試験サンプルにおけるサイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数を比較するステップと；およびｄ）サイクリンＥ１遺伝子のコピー数獲得の存在に基づいた治療に抵抗性である肺癌を有するものとして患者を分類するステップを含む、治療に抵抗性である肺癌を有するものとして患者を分類する方法を提供する。試験サンプルは、例えば、血液サンプル、腫瘍組織もしくは疑われる腫瘍組織、薄層細胞学的なサンプル、細針吸引サンプル、肺洗浄サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋した組織サンプルまたは末梢血サンプルのいずれかから生成した抽出物もしくは処理済みのサンプルなどの組織サンプルであり、模範的な実施形態では、肺組織サンプルまたは循環腫瘍細胞を有する末梢血サンプルである。決定するステップ（ｂ）は、例えば、少なくとも２つの核酸プローブを用いて蛍光で標識される核酸プローブまたはペプチド核酸プローブなどでインサイチューハイブリダイゼーションによって行うことができる。決定するステップ（ｂ）は、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列決定アッセイまたは核酸マイクロアレイアッセイによって行うことができる。模範的な実施形態において、肺癌は、例えば、有棘細胞癌、大細胞癌および腺癌のいずれかなどの非小細胞肺癌である。患者は、化学療法、放射線、手術またはそのいずれかの併用で治療することができる。
【００２５】
他の態様では、本開示は、ａ）サイクリンＥ１遺伝子についてのコピー数獲得の有無を決定する試薬；およびｂ）試験を行うための指示を含むキットを提供する。キットの模範的な実施形態において、コピー数獲得の有無を決定する試薬には、サイクリンＥ１遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズする検出可能な程度に標識されたポリヌクレオチドが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】Ｃｈｒ１９、３４．７Ｍｂ−３５．６Ｍｂにおけるコピー数獲得の有無によって分類された、早期ＮＳＣＬＣを有する７８名の患者コホートのための日数における全生存（ＯＳ）を示すカプラン−マイヤープロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
癌における転帰不良の前もって記載された発現に基づくマーカーは、十分に確立された臨床診断手段である、ＦＩＳＨで測定することができない。現在まで、遺伝子増幅／欠失は、疾患転帰を予測できるものが同定されていない。本発明者らは、第１９番染色体のおよそ３５Ｍｂの染色体配列のコピー数獲得を発見しており、これは、細胞周期の最重要な制御因子であるサイクリンＥについての遺伝子コーディングを含む。さらに、本発明者らは、コピー数獲得が、ＮＳＣＬＣのＩ期−ＩＩ期におけるより短い全生存期間と統計的に有意に関連することを決定している。
【００２８】
したがって、本開示は、Ｃｈｒ１９、３４．７Ｍｂ−３５．６Ｍｂ（ヒトのゲノムアセンブリｈｇ１８（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６；「Ｍ１」）におけるＣｈｒ１９、開始位置：３４７２２４１８；終了位置３５６４３９３３）における染色体ＤＮＡのコピー数を評価することにより、ヒトにおける早期非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の予後を決定する方法を提供する。ＤＮＡのこの伸展は、とりわけ、遺伝子配列コード化サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）を含むことが知られている。より不良な予後は、ＣＣＮＥ１を含めたマーカーの、正常なベースラインコピー数、すなわち、２つのコピーを有する患者に対して評価された。より不良な予後は、全生存および再発までの期間の測度を用いたマーカーにおいてコピー数獲得と関連することが判明した。この方法は、早期ＮＳＣＬＣ患者についての改善された予後の情報を示すために特に有益であり、癌再発のリスクがより高いこうした早期ＮＳＣＬＣ患者のための治療選択の改善を可能にする。
【００２９】
この方法には、早期癌として分類されたＮＳＣＬＣ患者、具体的には、広く用いられるＴＮＭ病期分類系を用いてＩＡ期、ＩＢ期、ＩＩＡ期またはＩＩＢ期（ＩＩＡ期およびＩＩＢ期は、集合的にＩＩ期と称される。）として分類されるものの予後を決定するための方法が包含される。他の診断上の分類に基づいた代替のＮＳＣＬＣ病期分類系は、組織サンプルが本方法によってアッセイすることができる患者を同定するために用いることができる。本明細書では、早期ＮＳＣＬＣは、２つ以上のリンパ節に分散しておらず、他のいかなる臓器にも転移していないＮＳＣＬＣ腫瘍を意味する。早期ＮＳＣＬＣ患者は、完全な腫瘍除去を求める外科的切除によってほとんど治療されるが、腫瘍が完全に切除されると考えられる場合でも、再発の重大なリスクは、これらの早期患者に存在する。現在の診断様式では、これらの早期癌が、再発のリスクが高く、したがって、アジュバント化学療法で切除前に治療するべきであるまたはネオアジュバント化学療法を用いた切除前に治療するべきであるという正確な予測が可能でない。本方法は、患者サンプル中で染色体のコピー数を決定することにより、リスクがより高いこうした早期患者の予後の同定を提供する。
【００３０】
したがって、一態様では、本方法は、肺癌の治療対象となる患者において疾患転帰を予測する方法を包含する。患者から得られた生物サンプルである試験サンプルは、提供され、試験サンプル中のサイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数は決定される。試験サンプルから得られたコピー数は、２つのベースラインコピー数に対して比較され、それによって、サイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得の有無を決定する。試験サンプル中のサイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得の有無に基づいて、患者は、サイクリンＥ１遺伝子におけるコピー数獲得を有さない患者において疾患転帰のベースライン測度と比較したとき、疾患転帰不良のリスクの増加を有するものとして同定される。サイクリンＥ１遺伝子におけるコピー数獲得の存在、すなわち、増幅は、疾患転帰不良を予測するものである。疾患転帰不良は、サイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得を有さない患者の全生存期間と比較したときの全生存期間の減少およびサイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得を有さない患者の再発までの期間と比較したときの再発までのより短い期間の少なくとも１つである。本方法はまた、サイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得の有無に基づいたものにおいて、肺癌の治療対象となる患者における疾患転帰を予測する方法を包含し、サイクリンＥ１遺伝子のためのコピー数獲得を有さない患者の全生存期間と比較したとき、患者が全生存期間の減少または再発までのより短い期間のリスクがより高いか否かについて決定がなされる。
【００３１】
本方法は、肺癌に罹患した患者のための治療を選択する問題に適用することもできる。例えば、本方法は、患者から得られた試験サンプルを提供するステップ（化学療法薬は、患者のための少なくとも１つの治療オプションである）、サイクリンＥ１についてのコピー数獲得が、サンプル中に存在するか否かを決定するステップおよび患者が、コピー数獲得が存在するか否かに基づいて化学療法薬で治療するべきか否かを決定するステップを含むことができる。あるいは、本方法は、ステップｃ）における比較に基づいた化学療法治療レジメンを決定することを含むことができる。ステップｃ）における比較に基づいた治療レジメンを決定するステップには、コピー数獲得がＣｈｒ１９、３４．７Ｍｂ−３５．６Ｍｂ（具体的にはヒトのゲノムアセンブリｈｇ１８（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６）におけるＣｈｒ１９、開始位置：３４７２２４１８；終了位置３５６４３９３３）におけるＭ１配列内のＣＣＮＥ１に存在するとき、例えば、化学療法薬剤を選択するステップおよび化学療法治療の頻度を決定するステップが含まれる。例えば、より強力な化学療法薬および／またはより頻度の高い治療を含めたより積極的な化学療法レジメンは、コピー数獲得がＣＣＮＥ１について存在するとき、選択することができる。本方法は、治療に抵抗する肺癌を有するものとして患者を分類するために用いることもできる。例えば、コピー数獲得が患者から得られたサンプル中に存在することが決定されると仮定すると、患者は、さらなる治療に抵抗する肺癌を有するものとして分類される。患者は、現在、化学療法、放射線、手術またはそのいずれかの併用で治療することができる、または、化学療法、放射線、手術治療またはそのいずれかの併用のいずれか１つについて考慮に入れることができる。
【００３２】
決定するステップ（ｂ）は、例えば、インサイチューハイブリダイゼーションを用いて、より好ましくは、蛍光で標識された核酸プローブまたは核酸類似体を含む蛍光で標識されたプローブによる蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて行う。好ましくは、少なくとも２つの核酸プローブが用いられる。ペプチド核酸プローブは用いることができる。決定するステップ（ｂ）は、当技術分野で公知の通りポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列決定アッセイ、または核酸マイクロアレイアッセイによって行うこともできる。
【００３３】
早期ＮＳＣＬＣの試験は、患者から得られた適当な生物サンプル上で、インサイチューハイブリダイゼーションによって好ましくは行われる。一般に、インサイチューハイブリダイゼーションには、生物サンプルを固定化するステップと、１種または複数の染色体プローブを固定サンプル内に含まれた標的ＤＮＡとハイブリダイズするステップと、洗浄して非特異的に結合したプローブを除去するステップと、ハイブリダイズしたプローブを検出するステップが含まれる。インサイチューハイブリダイゼーションはまた、液体懸濁液中の生物サンプルから得られた検体細胞で行うこともでき、その後、フローサイトメトリーにより検出する。本方法は、好ましくは、Ｃｈｒ１９、３４．７Ｍｂ−３５．６Ｍｂに特異的なプローブを含む２つのプローブセットによるＦＩＳＨアッセイを用いて、患者から得られた生物サンプル中の染色体コピー数異常を評価する。本方法で用いるための好ましいＦＩＳＨプローブは、Ｃｈｒ１９、３４．７Ｍｂ−３５．６Ｍｂに特異的な１対のプローブを含み、ＣＣＮＥ１をコード化する配列の任意の部分を含むことができる。
【００３４】
開示された方法によるＮＳＣＬＣ予後の同定は、Ｍ１マーカー領域でコード化されることが公知の適当なタンパク質ＣＣＮＥ１および他のタンパク質の患者サンプル中での発現を評価することなど、他の予後のインビトロ診断検査で用いることもできる。サンプルが好ましくない転帰（予後不良）に関連する異常な染色体コピー数パターンと併せて、かかるタンパク質の発現で見出される患者は、化学療法などのより積極的な手術後の治療に適格となり得る。
【００３５】
通常、肺癌患者の場合、生物サンプルは、循環腫瘍細胞、または肺腫瘍組織生検もしくは切除を含む末梢血サンプルなどの組織サンプルである。他の適当な組織サンプルには、例えば、薄層細胞学的なサンプル、細針吸引サンプル、肺洗浄サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプルまたは末梢血サンプルのいずれかから生成した抽出物もしくは処理済みのサンプルが含まれる。好ましくは、サンプルは、例えば、ＴＮＭ病期分類系を用いて、ＩＡ期、ＩＢ期、ＩＩＡ期またはＩＩＢ期のいずれかなど、早期癌として分類されている。
【００３６】
本明細書に記載されるような癌転帰マーカーＭ１（ヒトのゲノムアセンブリｈｇ１８（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６）におけるＣｈｒ１９、開始位置：３４７２２４１８；終了位置３５６４３９３３）のポリヌクレオチド配列に従って構成されるプローブは、分析の様々なタイプを提供するために様々なアッセイ方法で用いることができる。例えば、かかるプローブは、コピー数プロファイリングを含めて、染色体分析を行うために蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）技術で用いることができ、癌転帰マーカーにおける癌特異的コピー数の変化を同定するために用いることができる。プローブはまた、ラジオアイソトープ、直接もしくは間接的に検出可能なハプテン、または蛍光分子で標識することができ、組織検体もしくは細胞中で癌転帰マーカーのコピー数を評価するためにインサイチューハイブリダイゼーション研究に利用することができる。
【００３７】
プローブは、標的ポリヌクレオチド配列に選択的に結合し、これは本明細書に記載した通りＭ１の配列の少なくとも一部分、すなわち、ある特定の個体において増幅される染色体領域である。本明細書で提供される癌転帰マーカーのヌクレオチド配列、またはその任意の部分は、試験サンプル中のコピー数プロファイリングのための様々なアッセイに用いることができるプローブを生成するために用いることができる。プローブは、Ｍ１の保存されたヌクレオチド領域から設計されてもよく、Ｍ１の保存されないヌクレオチド領域、またはその中に含まれる遺伝子およびそれらの部分を含めたそれらの任意の部分から設計されてもよい。アッセイにおける最適化のためのかかるプローブの設計は、当技術分野の平均的な技術者によって容易に達成される。一般に、核酸プローブは、最大の特異性が望まれるとき、保存されないまたは独特の領域から発生し、例えば、多重遺伝子ファミリーの異なるメンバーにまたはマウスおよびヒトのような近縁種中で密接に関連するヌクレオチド領域についてアッセイするとき、核酸プローブは、保存される領域から発生する。
【００３８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸またはその混合物中に含まれる所望の核酸配列（標的）を増幅するための技法である。ＰＣＲでは、１対のプライマーは、標的核酸の相補的なストランドにハイブリダイズするために過剰に用いられる。プライマーは、鋳型として標的核酸を用いたポリメラーゼによってそれぞれ拡張される。拡張生成物は、標的配列自体になり、その後、元の標的ストランドから解離する。次いで、新規なプライマーは、ハイブリダイズされ、ポリメラーゼによって拡張され、周期は、標的配列分子の数を幾何学的に増加するために繰り返される。ＰＣＲは、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号に開示され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００３９】
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、核酸増幅のための代替方法である。ＬＣＲでは、プローブ対は、２つの一次（第１および第２）プローブおよび２つの二次（第３および第４）プローブを含むものが用いられ、そのすべては、標的に送るためにモル過剰で用いられる。第１のプローブは標的ストランドの第１のセグメントにハイブリダイズし、第２のプローブは、標的ストランドの第２のセグメントにハイブリダイズし、第１および第２のセグメントは、一次プローブが５’リン酸−３’ヒドロキシ関係で互いに隣接するように、およびリガーゼが２つのプローブを縮合した生成物に共有結合的に縮合することも結合することもできるように近接する。さらに、第３の（二次）プローブは、第１のプローブの一部にハイブリダイズすることができ、第４の（二次）プローブは、類似の結合のやり方で第２のプローブの一部にハイブリダイズすることができる。もちろん、標的が最初に二重鎖である場合、第２のプローブはまた、最初の事例において標的補体にハイブリダイズする。一次プローブの結合したストランドが標的ストランドから分離されてから、それは、相補的な、二次結合生成物を形成するために結合することができる第３および第４のプローブでハイブリダイズする。結合生成物が標的またはその補体に機能的に相当することを実現することが重要である。ハイブリダイゼーションおよび連結反応の繰り返し周期によって、標的配列の増幅は達成される。この技法は、１９８９年６月１６日に公開されたＫ．ＢａｃｋｍａｎのＥＰ−Ａ−３２０  ３０８および１９９１年７月３１日に公開されたＫ．ＢａｃｋｍａｎらのＥＰ−Ａ−４３９  １８２に、より完全に記載されており、その両方は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
ｍＲＮＡの増幅について、これは、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うこと；または、参照により本明細書に組み込む米国特許第５，３２２，７７０号に記載される通り両方のステップのために単一の酵素を用いること；またはｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後、やはり参照により本明細書に組み込まれるＲ．Ｌ．Ｍａｒｓｈａｌｌら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ４：８０−８４頁（１９９４年）によって記載される通り、非対称性ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）を行うことは本開示の範囲内である。
【００４１】
染色体プローブ。インサイチューハイブリダイゼーション技法のための適当なプローブは、３つの広範な群、すなわち、染色体領域にハイブリダイズし、染色体の有無を示す染色体計数プローブ；染色体領域にハイブリダイズし、染色体の腕の有無を示す染色体腕プローブ；および染色体上の特異的な座にハイブリダイズし、特異的な座の有無を検出する座特異的プローブに属する。染色体プローブおよびそれらの組み合わせは、本方法に用いられるとき、感受性および／または特異性について選択される。プローブセットには、任意の数のプローブ、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０個のプローブを含むことができる。個別のプローブおよびプローブセットの選択は、例えば、ＵＳ２００６００６３１９４に記載される通り、通常の当技術分野に従って行うことができ、その全体の開示は、参照により組み込まれる。かかる選択方法は、識別および／または組み合わせ分析を利用して、癌転帰マーカーのコピー数プロファイリングのために有用であるプローブおよびプローブセットを選択する。
【００４２】
異常なコピー数パターン（異数体性（ａｎｅｕｓｏｍｙ）または多染色体性）の検出のために本開示に従ってインサイチューハイブリダイゼーション方法において使用するための適当なプローブは、染色体計数プローブおよびＭ１配列の少なくとも一部にハイブリダイズ可能な染色体座特異的プローブの、他と区別できるように標識された各プローブとの組み合わせである。当技術分野で周知の通り、染色体計数プローブは、セントロメアの近くに位置するもしくはそれから除去された反復配列にハイブリダイズすることができる、または、染色体上の任意の位置に位置づけられた独特の配列にハイブリダイズすることができる。例えば、染色体計数プローブは、染色体のセントロメアに関連する反復ＤＮＡでハイブリダイズすることができる。霊長類染色体のセントロメアは、α−サテライトＤＮＡと称される約１７１塩基対のモノマー反復長からなるＤＮＡの長タンデム反復の複合体ファミリーを含む。特異的な染色体計数プローブの限定しない例としては、Ｖｙｓｉｓ  ＣＥＰ（登録商標）１０ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎプローブ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｉｎｃ．、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）である。例えば、第１９番染色体計数プローブを、Ｃｈｒ１９、３４．７Ｍｂ−３５．６Ｍｂにおけるコピー数異常を検出するために座特異的プローブと共に用いて、例えば、その中に含まれる座の欠失および／または多染色体性の状態を決定する。座特異的プローブは、染色体上で特異的な、非反復座にハイブリダイズし、したがって適当な座特異的プローブは、例えば、Ｍ１を含む任意の遺伝子の少なくとも一部、例えばＣＣＮＥ遺伝子の任意の一部を含む。座特異的プローブは、例えば、Ｖｙｓｉｓ  ＣＥＰ（登録商標）１０  ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎプローブと混合したプローブセットとして、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．から市販されている。
【００４３】
動原体ＤＮＡでハイブリダイズするプローブは、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）から市販されている。あるいは、プローブは、周知の技法を用いて非商業的に作製することができる。ＤＮＡプローブを構成するのに用いるためのＤＮＡの供給源には、ゲノムＤＮＡ、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）などのクローン化ＤＮＡ配列、宿主の正常な染色体補体と共にヒトの染色体の１本または一部を含む体細胞ハイブリッドおよびフローサイトメトリーまたは顕微解剖によって精製した染色体が含まれる。目的とする領域は、クローン化によってまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介した部位特異的な増幅によって単離することができる。例えば、Ｎａｔｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、１９９８年、７３巻（１号）：６−２２頁；Ｗｈｅｅｌｅｓｓら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１９９４年、１７巻：３１９−３２７頁；および米国特許第５，４９１，２２４号を参照のこと。有用な座特異的プローブを製造するために用いられる出発ヒトＤＮＡは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚによって維持されたものなどのヒトゲノムデータベースから座についての核酸配列を取得することにより、次いで、有用なＢＡＣクローンを同定するためにＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって維持されたものなどＢＡＣヒトＤＮＡライブラリを、コンピュータでスクリーニングするために配列決定するものを用いることにより得ることができる。合成されたオリゴマーＤＮＡプローブまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブなどの核酸類似体から作成されたプローブは用いることもできる。
【００４４】
本方法に従って使用されるプローブによって検出された染色体領域のサイズは、例えば、短い２００塩基対プローブ配列から９００，０００塩基の大型セグメントまで、サイズで変わり得る。直接標識される座−特異的なプローブは、複雑さにおいて好ましくは少なくとも１００，０００塩基であり、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７５６，６９６号に開示される通り、非標識の遮断核酸を用いて、プローブの非特異的な結合を避ける。遮断核酸としてのペプチド核酸などの非標識の、合成オリゴマー核酸または非標識の核酸類似体を用いることも可能である。
【００４５】
染色体プローブは、染色体にハイブリダイズしたとき、プローブの検出を容易にする任意の検出部分を含むことができる。有効な検出部分には、本明細書に記載した通り直接および間接標識が含まれる。検出可能な標識の例には、フルオロフォア（すなわち、光を吸収してから蛍光を発する有機分子）、放射活性同位体（例えば、３２Ｐおよび３Ｈ）ならびに発色団（例えば、視覚的に検出可能なマーカーを生成する酵素マーカー）が含まれる。フルオロフォアが好ましく、これは、ニックトランスレーション、ランダムプライミングおよびＰＣＲ標識化などの標準の技法で、標識されたヌクレオチドをプローブに取り込むことによりヌクレオチドへの共有結合後に直接標識することができる。あるいは、プローブ内のデオキシシチジンヌクレオチドは、リンカーでアミノ基転移することができる。次いで、フルオロフォアは、アミノ基転移したデオキシシチジンヌクレオチドに共有結合することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＢｉｔｔｎｅｒらについての米国特許第５，４９１，２２４号を参照のこと。有用なプローブ標識化技法は、参照により本明細書に組み込まれるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｙ．−Ｓ．Ｆａｎ、Ｅｄ．、Ｃｈａｐ．２、「Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ」、Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、２１−４０頁、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、（Ｃ）２００２年に記載されている。
【００４６】
本明細書に記載した方法において用いることができるフルオロフォアの例は、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；５−（および−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミンロダミンＢ、５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン；フルオレセイン−５−イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）；７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチルローダミン−５−（および−６）−イソチオシアナート；５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミン；７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸；６−［フルオレセイン５−（および−６）−カルボキシアミド］ヘキサン酸；Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａジアザ−３−インダセンプロピオン酸（ｉｎｄａｃｅｎｅｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）；エオシン−５−イソチオシアナート；エリスロシン−５−イソチオシアナート；５−（および−６）−カルボキシローダミン６Ｇ；およびＣａｓｃａｄｅ（商標）青色アセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）である。好ましいプローブセットでは、異なる色のフルオロフォアは、セット中の各染色体プローブが明瞭に視覚化することができるように用いられる。
【００４７】
ハイブリダイゼーション後、プローブは、蛍光顕微鏡および各フルオロフォアのための適当なフィルターで、または複数のフルオロフォアを観察するために二重もしくは三重バンドパスフィルターセットを用いることにより見ることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＢｉｔｔｎｅｒらの米国特許第５，７７６，６８８号を参照のこと。任意の適当な顕微鏡の画像処理方法は、ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇから入手可能なものなど、自動化されたデジタル画像処理系を含めて、ハイブリダイズしたプローブを可視化するために用いることができる。あるいは、フローサイトメトリーなどの技法は、染色体プローブのハイブリダイゼーションパターンを試験するために用いることができる。
【００４８】
プローブはまた、例えば、当技術分野で周知の手段によってビオチンまたはジゴキシゲニンで間接的に標識することもできる。しかし、次いで、二次検出分子またはさらなるプロセシングは、標識されたプローブを可視化するために必要とされる。例えば、ビオチンで標識されたプローブは、検出可能なマーカー、例えば、フルオロフォアに結合したアビジン（例えば、ストレプトアビジン）によって検出することができる。さらに、アビジンは、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素マーカーに結合することができる。かかる酵素マーカーは、酵素のための基質を用いた標準の比色反応で検出することができる。アルカリホスファターゼのための基質には、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスファートおよびニトロ青色テトラゾリウムが含まれる。ジアミノベンジジンは、西洋ワサビペルオキシダーゼのための基質として用いることができる。
【００４９】
本方法で有用なプローブおよびプローブセットは、本明細書に開示した方法を実施するのに用いられるキットに他の試薬と共に包装することができる。
【００５０】
好ましいプローブセット。模範的なプローブ組成物は、直接標識されたＤＮＡ  ＦＩＳＨプローブの混合物を含む。例えば、このようなプローブセットには、Ｖｙｓｉｓ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅプローブおよびＶｙｓｉｓ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎプローブが含まれた。適当なプローブセットは、適当なハイブリダイゼーション緩衝液中で予め混合されたものを市販している。
【００５１】
サンプルの調製。生物サンプルは、患者サンプルから得られた細胞含有抽出物を含めて、細胞もしくは細胞の材料を含むサンプルである。例えば、肺サンプルは、通常、肺実質、細気管支、気管支の、気管支および気管を含むがそれだけには限らない細胞もしくは肺の構造に由来する細胞の材料である。肺癌の検出のために有用な生物サンプルの限定しない例には、気管支検体、切除された肺組織、肺生検および喀痰サンプルが含まれる。気管支検体の例には、気管支の分泌物、洗液、洗浄、吸引およびブラッシングが含まれる。肺生検は、手術、気管支鏡検査、穿刺吸引（ＦＮＡ）および経胸針生検を含めた方法によって得ることができる。一例では、タッチ調製物（ｔｏｕｃｈ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）は、肺生検から作製することができる。本発明のアッセイは、早期ＮＳＣＬＣ患者から得られた血液サンプルに由来する循環腫瘍細胞サンプルで行うこともできる。循環腫瘍細胞サンプルは、Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎから入手可能な免疫磁気分離技術を用いて調製することができる。
【００５２】
組織は、ホルムアルデヒドなどの固定液で固定し、次いで、パラフィンに包埋することができる。次いで、切片は、ミクロトームを用いて切断され、顕微鏡スライドに適用される。細胞診断検体は、ＦＮＡに由来する細胞懸濁液、気管支洗液、気管支洗浄、または喀痰、または播種状組織細胞から調製することができる。細胞診断検体は、細胞遠心分離（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、薄層沈着方法（例えば、ＴｈｉｎＰｒｅｐ、Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐ．）、スメア、または顕微鏡スライド上でのピペッティングと合わせてエタノールもしくはメタノール：酢酸中の細胞の固定によって調製することができる。さらに、生物サンプルは、滲出液、例えば、胸水、心嚢貯留液、または腹水を含むことができる。
【００５３】
ハイブリダイゼーション方法。任意の適当なインサイチューハイブリダイゼーション方法は用いることができる。インサイチューハイブリダイゼーション前に、それぞれ細胞内に含まれる染色体プローブおよび染色体ＤＮＡは変性される。染色体プローブが一本鎖の核酸として調製される場合、プローブの変性は必要とされない。変性は、通常、高いｐＨ、熱（例えば、約７０℃から約９５℃までの温度）の存在下で、ホルムアミドおよびテトラアルキルアンモニウムハロゲン化物などの有機溶媒、またはそれらの組み合わせをインキュベートすることにより行われる。例えば、染色体ＤＮＡは、７０℃を超える温度（例えば、約７３℃）および７０％ホルムアミドおよび２Ｘ  ＳＳＣ（０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）を含む変性緩衝液の組み合わせにより変性させることができる。変性条件は、通常、細胞形態が保存されるように確立される。例えば、染色体プローブは、熱によって、例えば、約５分間約７３℃までプローブを加熱することにより変性させることができる。
【００５４】
変性する化学薬品または条件を取り除いてから、プローブは、ハイブリダイズしている条件下で染色体ＤＮＡとアニーリングされる。「ハイブリダイズしている条件」は、プローブと標的染色体ＤＮＡとの間のアニーリングを容易にする条件である。ハイブリダイゼーション条件は、濃度、塩基組成物、複雑性およびプローブの長さ、ならびに塩濃度、温度およびインキュベーションの長さに応じて変わる。例えば、インサイチューハイブリダイゼーションは、１−２．Ｘ．ＳＳＣ、５０−５５％ホルムアミド、ハイブリダイゼーションアクセレラタント（ａｃｃｅｌｅｒａｔａｎｔ）（例えば、１０％硫酸デキストラン）および非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するための非標識の遮断ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で通常行われる。一般に、前述した通り、ハイブリダイゼーション条件は、約２５℃から約５５℃の温度および約０．５時間から約９６時間のインキュベーションの長さが含まれる。より具体的には、ハイブリダイゼーションは、約３２℃から約４５℃で約２時間から約１６時間行うことができる。
【００５５】
染色体プローブの標的領域の外側のＤＮＡへの非特異的な結合は、塩溶液による一連の洗浄により除去することができる。それぞれの洗浄における温度および塩の濃度は、所望の厳密さに依存する。例えば、厳密性が高い条件の場合、洗浄は、０．２．Ｘから約２．Ｘ．ＳＳＣおよびＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ４０）などの非イオン性界面活性剤の約０．１％から約１％を用いて約６５℃から約８０℃で行うことができる。厳密性は、洗浄の温度を下げることによりまたは洗浄中の塩の濃度を高めることにより低下させることができる。
【００５６】
プローブの組織サンプルへのハイブリダイゼーションは、手動で、またはＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅハイブリダイゼーションオーブン、ＶＰ  ２０００プロセッサ、またはＸＭａｔｒｉｘ（商標）プロセシング器具（すべてＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｉｎｃ．から市販されている）などの器具の補助で行うことができる。
【００５７】
細胞の予選択。細胞サンプルは、様々な方法によりおよび様々な基準を用いて予備的に評価することができる。本明細書に記載したプローブおよび方法は、ある特定のスクリーニング方法論による使用に制限されない。一例としては、例えば、ＤＡＰＩフィルターで見るなど、観察者が細胞学的な異常について数百から数千の細胞を走査する「走査法」である。評価した細胞数は、検体の細胞充実性に依存し、これは患者によって変わる。形成異常のおよび腫瘍性細胞に一般的であるが一定でなく関連した細胞学的な異常は、核増大、不規則な核および異常なＤＡＰＩ染色（しばしばまだらであり色が薄い。）が含まれる。走査ステップでは、観察者は、（ＦＩＳＨによって実証される通り）細胞学的な異常をも示すこれらの細胞の染色体異常についての細胞の評価を好ましくは焦点に絞る。さらに、明らかな細胞学的な異常を有さない細胞の割合は、染色体異常がまた、細胞学的な異常がない場合に起こるため評価することができる。この走査法は、参照により本明細書に組み込まれるＨａｌｌｉｎｇらの米国特許第６，１７４，６８１号にさらに詳細に記載されている。肺癌細胞は、参照により本明細書に組み込まれるＭｏｒｒｉｓｏｎによる米国特許公報第２００３／００８７２４８  Ａ１号に記載されている方法を用いて評価のために選択することができる。
【００５８】
検体の領域は、ヘマトキシリンおよびエオシンを含む染色など、従来の染色を用いて評価のために選択することもできる。例えば、病理学者は、パラフィン包埋検体の切片をヘマトキシリン／エオシン染色で染色し、組織形態および染色パターンにより恐らく癌性として領域を同定し、フェルトインクペンまたはガラススクライバーでその領域の輪郭を描くことができる。次いで、印の付いた領域は、ガラススクライバーでパラフィン包埋検体の連続切片上の対応する位置に移され、ＦＩＳＨは、そのスライド上で行われる。次いで、印を付けた領域内の細胞は、ＦＩＳＨシグナルについて評価される。
【００５９】
染色体異常の分類パターンの検出。異常細胞は、染色体のコピー数異常の１つまたは複数のパターンの存在を特徴とする。患者サンプルにおける細胞中のコピー数異常パターンの存在は、細胞中の染色体プローブ（例えば、各プローブのシグナルの数）のハイブリダイゼーションパターンを試験し、シグナルの数を記録することにより評価される。異数体性は、通常、全染色体または染色体上の座のいずれかの異常コピー数を意味するものである。異常なコピー数には、欠失とも称され、２コピーを超える、常染色体の一染色体性（１コピー）および零染色体性（ｎｕｌｌｓｏｍｙ）（０コピー）が含まれ、これは、ある特定の染色体の座の場合、時折、遺伝子増幅と称される（あるいは、増幅は、遺伝子コピー数が、それが含まれる染色体のコピー数を超える状態に確保されている。）。しかし、パラフィン包埋検体（通常４−６μｍ）の切片化は、一部の細胞についての細胞当たりのＦＩＳＨシグナルの数が、無傷の核の中の実際のコピーの数よりもいくぶん少なくなるように細胞核のトランケーションをもたらすことができる。各プローブ用の特定のＦＩＳＨプローブハイブリダイゼーションシグナルの絶対数は、決定され、次いで、様々な比率の比較に用いられる。
【００６０】
試験サンプルは、臨床診断に十分である任意の数の細胞を含むことができ、好ましいパラフィン包埋組織サンプルにおいて、ハイブリダイゼーションパターンは、通常、約２０細胞から約２００細胞中で評価される。サンプル当たり約４０細胞から約１２０細胞中のハイブリダイゼーションパターンを評価することが好ましい。
【００６１】
したがって、本開示は、早期疾患の患者が疾患の再発または転移のリスクが最も高いことおよび長期生存の機会を最大限にするために薬物（もしくは放射線などの代替）治療で決定的に治療されるべきである患者を決定する方法を提供することにより、認識される治療ジレンマを解決することができる新たな知見（Ｍ１のＤＮＡコピー数獲得、サイクリンＥを含むマーカー領域）を記載している。また、本開示は、発現サインが以前により不良な癌患者アウトカムに関連している遺伝子、サイクリンＥをコード化するヌクレオチド配列を含め一領域の染色体のコピー数獲得を検出する特異的なＤＮＡ試験が可能になる知見を記載している。その結果、サイクリンＥ１のコピー数獲得についての試験が陰性である、または正常なコピー数が存在するとき、これは、初期の腫瘍の切除後フォローアップ治療を必要としない疾患の再発または転移のリスクが低いまたはリスクがない患者を同定する。この試験戦略は、早期ＮＳＣＬＣの患者における罹患率および死亡率の両方にかなり影響を与え得る。本明細書に用いられる方法はまた、疾患進行までの期間および／または全生存と有意に関連するサイクリンＥ１のＤＮＡコピー数獲得を同様に検出するための他の癌への適用を示唆している。そのようなものとして、開示された方法は、早期ＮＳＣＬＣ患者が、手術後の薬物療法を受けるべきであるという問題を解決する潜在能力を有し、癌治療決定および患者転帰に広く影響を与えることができる。
【００６２】
キット。他の態様では、本開示はまた、ａ）サイクリンＥ１遺伝子についてのコピー数獲得の有無を決定するための試薬；およびｂ）試験を行うための指示を含むキットを提供する。キットの模範的な実施形態において、コピー数獲得の有無を決定する試薬には、Ｍ１（ヒトゲノムアセンブリｈｇ１８（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６）におけるＣｈｒ１９、開始位置：３４７２２４１８；終了位置３５６４３９３３）の少なくとも一部にハイブリダイズする検出可能な程度に標識されたポリヌクレオチドが含まれ、これは、ＣＣＮＥ１をコード化する領域のその部分のいずれかの部位を含んでも含まなくてもよい。例えば、適当なキットは、Ｍ１にハイブリダイズすることのできる前述のプローブのいずれかを含む。
【００６３】
本開示の詳細は、以下の例にさらに記載されており、これは、特許請求された本発明の範囲を制限するものではない。当業者は、本方法の変形形態および修正形態が、本発明の明細書を再検討した後明らかになり得ることを認識している。したがって、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、本明細書に記載した実施形態のかかる修正形態および変形形態を提供することが目的である。
【実施例】
【００６４】
実験方法：検体。合計１７８個のＮＳＣＬＣ臨床的にアノテートしたサンプルを、高密度ＳＮＰ遺伝子型判定マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ１００Ｋアレイセット）を用いて遺伝子コピー数変更についてプロファイルした。すべてのサンプルを注意深く解剖して腫瘍／正常組織比を最大限にし、病理組織学的なタイプおよび段階を検証した。Ｉ期およびＩＩ期サンプルを有する患者から得られたサンプルのみを分析した。これらのすべては、いかなるネオアジュバント化学療法もなく外科的切除で治療した患者からのものである。各患者について収集した臨床情報には、人種、年齢、生年月日、性別、臨床病期、病理学的段階、位置、外科的処置（ＳＰ）日、組織像、分化、診断日、結節陽性、喫煙状況、化学療法状態、放射線状態、再発状態、再発日、再発位置、再発までの期間、最後のフォローアップ日、最後のフォローアップ時の状態、生／死、全生存および死亡原因が含まれた。再発までの期間（ＴＴＲ）および全生存（ＯＳ）を、転帰のパラメータとして選択した。他の臨床パラメータ（結節状態、病期など）を、交絡変数とみなした。肺癌の再発までの期間を、患者カルテから得た。
【００６５】
表２および３は、研究された患者コホートについて、それぞれ全生存および再発までの全期間の図を提供する。
【００６６】
【表２】
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【００６７】
【表３】
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【００６８】
コピー数プロファイリング。各腫瘍から得られたおよそ３０ｍｇの組織を用いて、製造業者の指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて高分子量、ゲノムＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの品質を、アガロースゲル電気泳動によって点検した。ＤＮＡ２５０ナノグラムを、２３．６ｋｂの平均のマーカー間の距離を有するヒトゲノムにおいて、１１６，２０４個の一塩基多型（ＳＮＰ）座を覆う、Ｇｅｎｅｃｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋセット（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  Ｈ、Ｄｏｎｇ  Ｓ、Ｌｏｉ  Ｈら、Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｖｅｒ  １００，０００  ＳＮＰｓ  ｏｎ  ａ  ｐａｉｒ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００４年；１巻：１０９−１１頁）アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を含む、２つのマイクロアレイのそれぞれへのハイブリダイゼーションのために処理した。マイクロアレイを、製造業者の推奨（ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ）に従って処理した。コピー数を、４８個の正常な女性サンプルの平均値とチップシグナルを比較することにより算出した。正常組織の汚染を有するサンプルを、ＱＣによって除去した。
【００６９】
統計的方法。一変量分析を用いて、潜在的交絡因子としての以下のパラメータ、すなわち、病理学的段階、臨床病期、喫煙状況、年齢、性別、結節状態、組織像（腺癌対有棘細胞癌）を試験した。有意な効果を検出しなかった。生存時間解析において、臨床病期およびマーカー領域の相互作用を試験した。コピー数異常は、病期との重大な相互作用を有さなかった（ＦＤＲ＜０．０５）。
【００７０】
結果：図１は、７８個のサンプルについて、ヒトのゲノムアセンブリｈｇ１８（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６）におけるＭ１（Ｃｈｒ１９、開始位置：３４７２２４１８；終了位置３５６４３９３３）の増幅（すなわち、少なくとも１個のコピー数獲得）を有するおよび有さない患者間のＯＳにおける差を示すそれぞれのカプラン−マイヤープロットである。カプラン−マイヤープロットにおいて、ｘ−軸は、日単位の（生存）時間を表し、ｙ−軸は、患者生存の確率を表す。死亡が起こった場合は常に、曲線は下降する。増幅、すなわち、マーカーのコピー数獲得を有する患者のデータは、プロット上の下の（濃い）線によって示される。２つの正常なベースライン補体を有する患者についてのデータは、プロットの上側の（より薄い）線で示される。（ＦＤＲ補正ｐ値＝０．０２９９）。７８個のサンプルのうち、合計２７個がマーカーの増幅の証拠を示した。すなわち、１７個は、３コピー、３個のサンプルは、４コピーを有し、７個のサンプルは、５個を超えるコピーを有した。増幅したセグメントは、長さがおよそ０．９Ｍｂであり、Ｃ１９ｏｒｆ１２  第１９染色体オープンリーディングフレーム１２、Ｃ１９ｏｒｆ２  第１９染色体オープンリーディングフレーム２、ＰＬＥＫＨＦ１（（ＦＹＶＥドメインを有する）プレクストリン相同ドメイン含有、ファミリーＦ  メンバー１）、前駆体４のＰＯＰ４プロセシング、リボヌクレアーゼＰ／ＭＲＰサブユニット（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））；およびＺＮＦ５３６亜鉛フィンガータンパク質５３６の他に、サイクリンＥ１遺伝子（ＣＣＮＥ１）を含有するヌクレオチド配列を含む。図１中のカプラン−マイヤープロットから見てわかるように、増幅、すなわち、ＣＣＮＥ１を含めたマーカーにおけるコピー数獲得は、ＮＳＣＬＣのＩ期−ＩＩ期の患者においてより短いＯＳに関連する。表４は、Ｃｈｒ１９上のＭ１を含めたいくつかのマーカーについての全生存データを列挙する。（データが表４の最後の２つの線で示されるＣｈｒ６上のマーカーは、異なる臨床段階の間で共有される。）。
【００７１】
【表４】
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【００７２】
前もって同定された予測指標（発現サイン）とは違って、本明細書に記載した生物マーカーＭ１は、ＤＮＡ獲得（ＦＩＳＨによって測定可能な安定したイベント）を表す。ＦＩＳＨプローブは、マーカーのバリデーション／使用ができるようになるように用いることができ、マーカーは、臨床試験において層別化生物マーカーとして用いるための強力な候補である。これは、例えば、異なる転帰を有する疾患の分子サブグループを定義するために用いることができる。そのようなものとして、これは、薬物応答と相関する可能性がある。
【００７３】
これらのデータは、ＦＩＳＨによって測定され、適当な分類指標を使用するサイクリンＥ１遺伝子座を含む、Ｍ１のゲノムコピー数評価の使用が、早期ＮＳＣＬＣにおいて予後的に重要であることを示す。分類指標は、好ましいおよび好ましくない再発カテゴリー中でネオアジュバントまたはフォローアップ化学療法がない手術で治療されていた患者の統計的に有意な分類をもたらすことができた。本臨床インビトロ診断検査は、この能力を提供しない。したがって、早期ＮＳＣＬＣ生検検体または切除された腫瘍で行われた、サイクリンＥ１のためのゲノム配列を含む、Ｃｈｒ１９、３４．７Ｍｂ−３５．６Ｍｂに対するＦＩＳＨアッセイは、手術およびアジュバント治療に関係する決定に役立つと思われる。
【００７４】
前述の説明が、例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではないことを理解されるべきである。本発明の他の態様、利点および修正形態は、以下に記載する特許請求の範囲内である。
【図１】
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【国際調査報告】
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