(57)【要約】  本発明は、マイクロイメージングシステムを備えたFTIR分光計によって、被験対象の皮膚上にある病変の皮膚黒色腫を同定および分類する方法に関する。
2013500464.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚黒色腫を同定および分類する方法であって、a)マイクロイメージングシステムを備えたFTIR分光計によって被験対象の皮膚上にある病変を走査するステップと、b)病変に対する一連のデジタルイメージの赤外スペクトルを取得し保存するステップと、c)K-平均分類アルゴリズムを使用する多変量統計アナライザーなど、統計学に基づいたクラスタリングアルゴリズムによって赤外スペクトルをクラスタリングするステップと、d)クラスターメンバーシップの情報を様々な組織型の皮膚黒色腫のスペクトルライブラリーと比較して、各組織型の皮膚黒色腫のスペクトルマーカーを同定するステップと、e)異なる個々のクラスターに色を割り当てることによりスペクトルマーカーをマッピングするステップとを含む方法。
【請求項２】
病変の赤外スペクトルが、リアル組織特異的分光学的フィンガープリントである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
色分けされたマッピングが、染色せずに組織構造を明らかにする、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍領域を正常表皮から識別する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
皮膚黒色腫の組織学的サブタイプを識別する、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
各デジタルイメージが、約10,000〜約100,000のスペクトルからなる、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
各デジタルイメージが、約30,000のスペクトルからなる、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
各スペクトルが、1,000〜50,000の吸光度値を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
各吸光度が、720〜4000cm-1である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
各吸光度が、900〜1800cm-1である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
K-平均クラスターの中心が、スキンド領域全体にわたって標準化され、Savitsky-Golayスムージングを使用して、標準化されたスペクトルに関して二次導関数が計算される、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
赤外スペクトルのクラスタリングにより様々な型の間質反応を同定する、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍周囲の間質および腫瘍内の間質が、正常な間質反応から識別される、請求項12に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロイメージングシステムを備えたFTIR分光計によって、被験対象の皮膚上にある病変の皮膚黒色腫を同定および分類する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性黒色腫は、報告された皮膚癌の5%未満を占めるが、その発生率および死亡率が上昇傾向にあるように、最も悪性度の高い皮膚癌である(ACS.「Cancer Facts and Figures」2007、Atlanta: American Cancer Society、2007)。ABCDEニーモニック(非対称、境界、色、直径、および進行度)は、臨床診断の助けとなり得るが、黒色腫の最終的な診断は病変の組織学的な評価に基づいている。(Marghoob AA、Scope A.「the complexity of diagnosing melanoma」、J Invest Dermatol 2009;129;11〜13)。形態学的な解釈は、特に表皮内病変に対しては、多少主観的であるので、診断におけるいくらかの不一致が報告されており、その結果、この解釈は皮膚病理学者の専門的意見に頼る。(Urso C、Rongioletti F、Innocenzi Dら、「histological features used in the diagnosis of melanoma are frequently found in benign melanocytic naevi」、J Clin Pathol 2005;58;409〜412; Urso C、Rongioletti F、Innocenzi Dら、「interobserver reproducibility of histological features in cutaneous malignant melanoma」、J Clin Pathol 2005;58;1194〜1198; Farmer ER、Gonin R、Hanna MP、「discordance in the histopathologic diagnosis of melanoma and melanocytic nevi between expert pathologists」、Hum Pathol 1996;27;528〜531;およびGlusac EJ、「under the microscope:doctors, lawyers, and melanocytic neoplasms」、J Cutan Pathol 2003;30;287〜293)。客観的な自
動イメージ解析ソフトウェアの開発に向けた多大な努力が報告されているが、通常、組織切片中の構造が複雑であるため、その結果はまだ確証的なものにはなっていない。(Gerger A、Smolle J. Diagnostic imaging of melanocytic skin tumors. J Cutan Pathol 2003;30;247〜252)。
【０００３】
フーリエ変換赤外(FTIR)分光法が、この限界に取り組むために選択される1つの方法のように思われる。赤外(IR)スペクトルは、組織の組織病理学的状態に特徴的な固有の分子組成および相互作用を探索し、リアル組織特異的分光学的フィンガープリント(real tissue-specific spectroscopic fingerprint)と見なすことができる。分光学的システムにおける最近の進歩を考えれば、組織切片を二次元的に走査してスペクトルイメージを記録することが可能である。従来のヘマトキシリン‐エオジン(HE)組織染色とは異なり、スペクトルイメージングは、アーカイブの固定されたパラフィン包埋組織に対して、染色せずに直接実施することができ、さらに、化学的脱蝋が引き起こす組織変化の可能性を回避することもできる。(Tfayli A、Piot O、Durlach A、Bernard P、Manfait M.、「discriminating nevus and melanoma on paraffin-embedded skin biopsies using FTIR microspectroscopy」、Biochim Biophys Acta 2005;1724;262〜269; Ly E、Piot O、Wolthuis R、Durlach A、Bernard P、Manfait M.、「combination of FTIR spectral imaging and chemometrics for tumour detection from paraffin-embedded biopsies.」Analyst 2008;133;197〜205; Wolthuis R、Travo A、Nicolet Cら、「IR spectral imaging for histopathological characterization of xenografted human colon carcinomas」、Anal Chem 2008;80;8461〜8469;およびLy E、Piot O、Durlach A、Bernard P、Manfait M.、「differential diagnosis of cutaneous carcinomas by infrared spectral micro-imaging combined with pattern recognition」、Analyst 2009;DOI:10.1039/B820998G)。いくつかの報告により、皮膚病変に関しては、組織型に特異的なIRマーカーに基づいて、正常表皮から黒色腫を診断すること、または黒色腫と良性母斑とを見分けることが可能であることが示されている。(Mordechai S、Sahu RK、Hammody Zら「possible common biomarkers from FTIR microspectroscopy of cervical cancer and melanoma」、J Microsc 2004;215;86〜91およびHammody Z、Argov S、Sahu RK、Cagnano E、Moreh R、Mordechai S.、「distinction of malignant melanoma and epidermis using IR micro-spectroscopy and statistical methods」、Analyst 2008;133;372〜378)。現在まで、様々な型の黒色腫が識別できる可能性にも、患者の転帰に関連する予後マーカーにアクセスできる可能性にもスペクトル研究は頼っていない。しかし、黒色腫の予後が診断時における病期と密接に関連しているので、現在、できるだけ早期に患者をスクリーニングすることが主要な課題である。したがって、その診断及び処置を容易にする様々な方法が、未だ対処されていないニーズに取り組むために必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ACS.「Cancer Facts and Figures」2007、Atlanta: American Cancer Society、2007
【非特許文献２】Marghoob AA、Scope A.「the complexity of diagnosing melanoma」、J Invest Dermatol 2009;129;11〜13
【非特許文献３】Urso C、Rongioletti F、Innocenzi Dら、「histological features used in the diagnosis of melanoma are frequently found in benign melanocytic naevi」、J Clin Pathol 2005;58;409〜412
【非特許文献４】Urso C、Rongioletti F、Innocenzi Dら、「interobserver reproducibility of histological features in cutaneous malignant melanoma」、J Clin Pathol 2005;58;1194〜1198
【非特許文献５】Farmer ER、Gonin R、Hanna MP、「discordance in the histopathologic diagnosis of melanoma and melanocytic nevi between expert pathologists」、Hum Pathol 1996;27;528〜531
【非特許文献６】Glusac EJ、「under the microscope:doctors, lawyers, and melanocytic neoplasms」、J Cutan Pathol 2003;30;287〜293
【非特許文献７】Gerger A、Smolle J. Diagnostic imaging of melanocytic skin tumors. J Cutan Pathol 2003;30;247〜252
【非特許文献８】Tfayli A、Piot O、Durlach A、Bernard P、Manfait M.、「discriminating nevus and melanoma on paraffin-embedded skin biopsies using FTIR microspectroscopy」、Biochim Biophys Acta 2005;1724;262〜269
【非特許文献９】Ly E、Piot O、Wolthuis R、Durlach A、Bernard P、Manfait M.、「combination of FTIR spectral imaging and chemometrics for tumour detection from paraffin-embedded biopsies.」Analyst 2008;133;197〜205
【非特許文献１０】Wolthuis R、Travo A、Nicolet Cら、「IR spectral imaging for histopathological characterization of xenografted human colon carcinomas」、Anal Chem 2008;80;8461〜8469
【非特許文献１１】Ly E、Piot O、Durlach A、Bernard P、Manfait M.、「differential diagnosis of cutaneous carcinomas by infrared spectral micro-imaging combined with pattern recognition」、Analyst 2009;DOI:10.1039/B820998G
【非特許文献１２】Mordechai S、Sahu RK、Hammody Zら「possible common biomarkers from FTIR microspectroscopy of cervical cancer and melanoma」、J Microsc 2004;215;86〜91
【非特許文献１３】Hammody Z、Argov S、Sahu RK、Cagnano E、Moreh R、Mordechai S.、「distinction of malignant melanoma and epidermis using IR micro-spectroscopy and statistical methods」、Analyst 2008;133;372〜378
【非特許文献１４】Lasch Pら「imaging of colorectal adenocarcinoma using FT-IR microspectroscopy and cluster analysis」、Biochim Biophys Acta 2004;1688;176〜186
【非特許文献１５】「Smoothing and Differentiation of Data by Simplified Least Squares Procedures」、Analytical Chemistry 1964;36;1627〜1639
【非特許文献１６】Baker MJ、Gazi E、Brown MD、Shanks JH、Gardner P、Clarke NW. FTIR-based spectroscopic analysis in the identification of clinically aggressive prostate cancer. Br J Cancer 2008;99;1859〜1866
【非特許文献１７】「Pathological findings suggestive of interclonal stabilization in a case of cutaneous melanoma」、Clin Exp Metastasis 1996;14;215〜218
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、様々な型の黒色腫を特徴づけるためのFTIRマイクロイメージングを向上させて、原発性黒色腫におけるIRスペクトルマーカーと有力な予後因子と認められているいくつかの皮膚病理学的パラメーターとの間の相関を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は皮膚黒色腫を同定および分類する方法に関する。この方法は、a)マイクロイメージングシステムを備えたFTIR分光計によって被験対象の皮膚上にある病変を走査するステップと、b)病変に対する一連のデジタルイメージの赤外スペクトルを取得し保存するステップと、c)K-平均分類アルゴリズムを使用する多変量統計アナライザーなど、統計学に基づいたクラスタリングアルゴリズムによって赤外スペクトルをクラスタリングするステップと、d)クラスターメンバーシップの情報を様々な組織型の皮膚黒色腫のスペクトルライブラリーと比較して、各組織型の皮膚黒色腫のスペクトルマーカーを同定するステップと、e)異なる個々のクラスターに色を割り当てることによりスペクトルマーカーをマッピングするステップとを含む。
【０００７】
一実施形態では、本発明の方法による病変の赤外スペクトルは、リアル組織特異的分光学的フィンガープリントである。
【０００８】
別の実施形態では、本発明の色分けされたマッピングは、染色せずに組織構造を明らかにする。
【０００９】
本発明の方法は、腫瘍領域を正常表皮から識別する。さらに、本発明の方法は、皮膚黒色腫の組織学的サブタイプを識別する。
【００１０】
本発明によれば、各デジタルイメージは約10,000〜約100,000のスペクトルからなる。各デジタルイメージは約30,000のスペクトルからなることが好ましい。さらに、各スペクトルは、1,000〜50,000の吸光度値を含む。
【００１１】
さらに、本発明によれば、各吸光度は、720〜4000cm-1である。各吸光度は900〜1800cm-1であることが好ましい。
【００１２】
さらに別の実施形態では、K-平均クラスターの中心はスキンド領域(skinned area)全体にわたって標準化され、Savitsky-Golayスムージングを使用して、標準化されたスペクトルに関して二次導関数は計算される。
【００１３】
本発明によれば、この方法は、赤外スペクトルのクラスタリングにより様々な型の間質反応を同定する。さらに、腫瘍周囲の間質および腫瘍内の間質を正常な間質の反応と識別する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】表在拡大型黒色腫から得られたスペクトル組織構造を示す図である。A、11のクラスターで構築された、K-平均の色分けされたイメージ、スケールバー:200μm。B、K-平均クラスターの中心に関してHCAを使用して得られたデンドログラム。C、パネルA中の枠内領域のHE染色イメージ、スケールバー:5μm。
【図２】潰瘍化した結節型黒色腫から得られたスペクトル組織構造を示す図である。A、11のクラスターで構築された、K-平均の色分けされたイメージ、スケールバー:200μm。B、K-平均クラスターの中心に関してHCAを使用して得られたデンドログラム。C、パネルA中の枠内領域のHE染色イメージ、スケールバー:5μm。
【図３】母斑上の浸潤性の黒色腫から得られたスペクトル組織構造を示す図である。A、11のクラスターで構築された、K-平均の色分けされたイメージ、スケールバー:200μm。B、K-平均クラスターの中心に関してHCAを使用して得られたデンドログラム。C、パネルA中の枠内領域のHE染色イメージ、スケールバー:5μm。
【図４】紡錘黒色腫細胞(青)および類上皮黒色腫細胞(赤)からの二次導関数を示す図である。Aは920〜1110cm-1の領域、Bは1120〜1320cm-1の領域における平均(太線)+/-標準偏差のスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、皮膚黒色腫を同定および分類する方法を提供する。本方法は、マイクロイメージングシステムを備えたFTIR分光計によって被験対象の皮膚上にある病変を走査するステップと、病変に対する一連のデジタルイメージの赤外スペクトルを取得し保存するステップとを含む。本発明によれば、赤外透過スペクトルイメージは、FTIR分光計に備えられたイメージングシステムを使用して収集することができる。場合によっては、イメージング用の窒素冷却水銀カドミウム検出器およびコンピュータ制御ステージをこの装置にさらに装備することができる。取得に先立って、試料の可視イメージを記録することができ、それに対応するHE染色切片と比較することによって対象領域を選択することができる。
【００１６】
スペクトルイメージを記録することができ、各デジタルイメージは約10,000〜約100,000のスペクトルからなる。各デジタルイメージは約30,000のスペクトルからなることが好ましい。さらに、各スペクトルは、1,000〜50,000の吸光度値を含む。
【００１７】
さらに、本発明によれば、各吸光度は、720〜4000cm-1である。各吸光度は900〜1800cm-1であることが好ましい。
【００１８】
本発明の方法はまた、K-平均分類アルゴリズムを使用する多変量統計アナライザーなど、統計学に基づいたクラスタリングアルゴリズムによって赤外スペクトルをクラスタリングするステップを含む。
【００１９】
例えば、各イメージについて、類似のスペクトル特性、したがって類似の生体分子特性を示すスペクトルを再編成するためにK-平均クラスタリングを使用することができる。この分類法は、Lasch Pら「imaging of colorectal adenocarcinoma using FT-IR microspectroscopy and cluster analysis」、Biochim Biophys Acta 2004;1688;176〜186、に記載されており、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。K-平均マップを数回計算して安定した解が得られたことを確認することができる。
【００２０】
本発明の方法は、クラスターメンバーシップの情報を様々な組織型の皮膚黒色腫のスペクトルライブラリーと比較して、各組織型の皮膚黒色腫のスペクトルマーカーを同定するステップと、異なる個々のクラスターに色を割り当てることによりスペクトルマーカーをマッピングするステップとをさらに含む。
【００２１】
クラスターメンバーシップの情報は、異なる個々のクラスターに色を割り当てることにより色分けされたマップとしてプロットすることができる。色分けされたマップはそれぞれ、それに対応するHE染色切片との顕微鏡レベルでの比較のために、共同研究の病理学者に提供することができる。一実施形態では、本発明の色分けされたマッピングは、染色せずに組織構造を明らかにする。
【００２２】
K-平均クラスターの中心は全タンパク質含量(アミドIおよびアミドIIの振動)にわたって標準化することができ、Savitsky-Golayスムージング(15点、二次)を使用して、標準化されたスペクトルに関して二次導関数を計算することができる。Savitsky-Golayスムージングは、「Smoothing and Differentiation of Data by Simplified Least Squares Procedures」、Analytical Chemistry 1964;36;1627〜1639に十分に記載されており、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２３】
一実施形態では、病変の赤外スペクトルは、リアル組織特異的分光学的フィンガープリントである。その結果として、本発明の方法は、腫瘍領域を正常表皮から識別する。さらに、本方法の方法は、皮膚黒色腫の組織学的サブタイプを識別する。
【実施例】
【００２４】
材料および方法
患者
原発性皮膚黒色腫の4つのサブタイプ、すなわち、表在拡大型黒色腫(4例)、結節型黒色腫(3例)、末端黒子型黒色腫(1例)、および母斑上黒色腫(2例)の1つに罹患した10人の患者をこの研究で分析した。良性母斑の1試料および皮下黒色腫転移の1試料も含めた。調べたこれらの患者は、男性5人、女性5人、年齢36〜82歳であった。これらの症例は、American joint Committee on Cancer (AJCC) Melanoma Staging Committee(表1)によって発表された、皮膚黒色腫に対する、証拠に基づいた病期分類システムに従って分類した。4例は、厚さ1mm未満の黒色腫に相当し、この深度カテゴリーでは、潰瘍化を示す症例はなかった。5例の厚さは1〜4mmであり、そのうち2例は潰瘍化を伴っていた。1例の厚さは、4mm超であり、潰瘍化を伴っていた。
【００２５】
【表１】
2013500464.tif 000003
【００２６】
試料調製
組織標本を10%緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋した。各試料について、厚さ10ミクロンの3つの連続切片を切り出した。最初の切片および最後の切片は、ヘマトキシリン‐エオジン(HE)染色および病理学者による組織学的診断のためにスライドガラス上に載せた。2番目の切片は、それ以上処理せずにスペクトル取得用のフッ化カルシウム(CaF2)ウィンドウ(Crystran Ltd.、Dorset、UK)にマウントした。この切片を一滴の蒸留水で固定し、次いで、水が完全に蒸発して、パラフィンが融解し、ウィンドウに付着するまで、CaF2ウィンドウをスライド加温器上に置いた。パラフィンの赤外シグナルに対するレファレンスとして使用するために、パラフィン切片も含めた。
【００２７】
皮膚病理学的パラメーター
潰瘍化、ブレスロー厚さ、浸潤のクラークのレベル、有糸分裂、退縮、細胞型、母斑の存在に対応する7つの皮膚病理学的パラメーターを評価した。
【００２８】
FTIRデータ収集
赤外透過スペクトルイメージは、Spectrum One FTIR分光計に備えられたSpectrum Spotlight 300イメージングシステム(両方ともPerkin Elmer、Courtaboeuf、France製)によって、イメージモードを用いて収集した。この装置は、イメージング用の窒素冷却水銀テルル化カドミウム16-ピクセルライン検出器およびコンピュータ制御ステージを備えている。取得に先立って、試料の可視イメージを記録し、それに対応するHE染色切片と比較することによって対象領域を選択した。スペクトルイメージは、2cm-1の分解能(1cm-1のデータ点間隔)を用いて8回の積算で記録した。各イメージピクセルは、試料切片の6.25μm×6.25μm領域をサンプリングしており、詳細な組織構造の記録が可能となった。バックグラウンドスペクトルをCaF2ウィンドウ上で収集し(240回積算、2cm-1分解能)、単一ビームスペクトルに対する比率とした。通気孔のあるプレキシグラスハウジングの中に顕微鏡を隔離することによって、乾燥空気による浄化を可能にして、大気による妨害を除去した。各スペクトルイメージは約3万のスペクトルからなり、各スペクトルは3282の吸光度値を含み、そのスペクトル範囲は720〜4000cm-1に及んでいた。
【００２９】
データ処理
スペクトルイメージは、Perkin Elmer Spotlightソフトウェアの組み込み機能によって、大気の水蒸気およびCO2の吸収バンドの寄与を補正した。さらなるデータ処理はすべて、PLSツールボックス2.0(Eigenvector Research Inc.、Manson、WA)と共に提供されたMatlab 7.2(The Mathworks、Natick、MA)の中に記述されたプログラムを使用して、スペクトルイメージ上で直接実行した。スペクトルの分析は、生体試料のIR分析にとって最も豊富な情報があることが判明しているフィンガープリント領域(900〜1800cm-1)で行った。
【００３０】
パラフィンによる寄与の除去
パラフィン包埋試料は、いかなる前処理もせずに直接分析した。FTIRスペクトルにおけるパラフィンの寄与を補正するために、我々は、拡張多重シグナル補正(Extended Multiplicative Signal Correction)に基づく自動処理方法を開発してきた。この方法は、皮膚癌および結腸癌の試料への適用に成功してきた。この方法の詳細な説明は、以下の出版物に見つけることができ、その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。Ly E、Piot O、Durlach A、Bernard P、Manfait M.、「differential diagnosis of cutaneous carcinomas by infrared spectral micro-imaging combined with pattern recognition」Analyst 2009;DOI:10.1039/B820998G; Ly E、Piot O、Wolthuis R、Durlach A、Bernard P、Manfait M.、「combination of FTIR spectral imaging and chemometrics for tumour detection from paraffin-embedded biopsies」、Analyst 2008;133;197〜205;およびWolthuis R、Travo A、Nicolet C.、「IR spectral imaging for histopathological characterization of xenografted human colon carcinomas」、Anal Chem 2008;80;8461〜8469。この補正のために、パラフィンの主成分の数は9、多項式の次数は4に設定した。各イメージに対して、フィッティング係数および残余をプロットすることにより、アウトライアースペクトル(outlier spectra)を決定した。
【００３１】
K-平均クラスタリング
各イメージについて、類似のスペクトル特性、したがって類似の生体分子特性を示すスペクトルを再編成するためにK-平均クラスタリングを使用した。この分類法によって、癌組織のIRデータを処理することができることはすでに判明している(Lasch P、Haensch W、Naumann D、Diem M.、「imaging of colorectal adenocarcinoma using FT-IR microspectroscopy and cluster analysis」、Biochim Biophys Acta 2004;1688;176〜186を参照されたい)。この方法は、操作者が決定するクラスター数を除いて、教師なしと見なされる。K-平均マップを数回計算して安定した解が得られたことを確認した。収束のパーセンテージは99.99%に設定し、クラスターの数は11に設定したが、これらの設定は、本研究および以前の研究で分析された皮膚組織の組織学に合うと考えられた。次いで、クラスターメンバーシップの情報を、個々の異なるクラスターに色を割り当てることにより色分けされたマップとしてプロットした。その後、色分けされたマップはそれぞれ、それに対応するHE染色切片との顕微鏡レベルでの比較のために、共同研究の病理学者に提供した。
【００３２】
教師なし階層的クラスター分析(HCA)
各イメージについて、11のクラスター中心(11のK-平均クラスターの平均スペクトル)に対してHCAを実施して、K-平均クラスターの中心間のスペクトル距離を数量化した。HCAは、最小距離基準に基づいてスペクトルを群へ再編成する。このようなクラスタリングの結果は、デンドログラムと呼ばれる樹状図で表示される。隣接するスペクトルは同じ群へグループ分けされる。形成された群の間の距離により、それらのスペクトルの差が評価される。したがって、デンドログラム中の同じ群に属するK-平均クラスター中心は、類似した生体分子組成を表す。ウォードアルゴリズム(Ward's algorithm)を用いるユークリッド距離およびHCAクラスタリングは、Statisticalツールボックスの組み込みMatlab機能を使用して計算した。
【００３３】
誘導体化
K-平均クラスター中心を全タンパク質含量(アミドIおよびアミドIIの振動)にわたって標準化し、Savitsky-Golayスムージング(15点、二次)を使用して、標準化されたスペクトルに関して二次導関数を計算した。Savitsky-Golayスムージングは、「Smoothing and Differentiation of Data by Simplified Least Squares Procedures」、Analytical Chemistry 1964;36;1627〜1639に十分に記載されており、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３４】
結果
IRマイクロイメージングが示す組織学的構造
色分けされた各イメージでは、同じクラスターに割り当てられたピクセルは、類似した生化学的組成の領域を表わす。クラスタリングは各試料に対して別々に実施したため、あるイメージと別のイメージとの間に色の対応はないことに留意されたい。分析した10の黒色腫試料に関して、コントラストを強調したイメージとそれに隣接した対応するHE切片との間で1対1で相関させることができた。したがって、HE染色切片上に見られる組織構造にイメージクラスターを正確に割り当てることが実現可能であった。血管およびリンパ球など極めて詳細な組織学的構造を再現することが可能であった。すべての症例において、腫瘍領域は、境界が明確であり、表皮とはっきり区別できた。例えば、ブレスロー厚さが薄い(0.35mm)表在拡大型黒色腫(症例番号5)から得られた、色分けされたイメージを図1Aに示す。この例では、腫瘍細胞(クラスター6、黄)は、表皮ペグ(epidermal peg)中に位置していたが、浸潤性成分中にも位置していた。角質層(クラスター2、紫)および正常表皮(クラスター7、ピンク)もまた、極めて明確に見える。さらに、分析した各試料では、教師なしHCAが示すように、腫瘍のIRスペクトルと表皮のIRスペクトルは、異なる生化学的プロフィールを明確に保持していた。実際、このクラスタリング分析を、各擬似カラーイメージのクラスター中心(K-平均クラスターの平均IRスペクトル)について実施し、K-平均クラスター間のスペクトルの差を評価した。デンドログラムのカラーコードは、K-平均イメージの中で使用したカラーコードに対応する。IRスペクトルに関して図1Aから得られたデンドログラムを、図1Cに示す。この図から、クラスター7はクラスター6と全く異なる(スペクトル距離の観点から)ことがわかる。
【００３５】
IRクラスターと皮膚病理学的パラメーターとの間の相関
様々な腫瘍クラスターの存在と一部の皮膚病理学的パラメーター、特に、潰瘍化、ブレスロー厚さ、クラークのレベル、およびmm2当たりの有糸分裂の数との間に著しい関連性が観察された。興味深いことには、予後良好な黒色腫(3例)に対しては、1つの腫瘍クラスターのみが観察されたが、予後不良な黒色腫(7例)では、2つまたは3つの相異なる腫瘍クラスターが併存した。隣接して母斑が存在する腫瘍と存在しない腫瘍との間で、クラスター数に差は認められなかった。図2Aは、潰瘍化して結節型黒色腫(症例番号1)から得られた、色分けされたK-平均イメージに対応する。この試料では、3つのクラスター(9-10-11)が腫瘍メラノサイトに割り当てられた。HCA(図2C)では、これら3つのクラスターが類似した生体分子プロフィールを保持することが確認できる。図3Aに、先在する母斑(症例番号3)上に発生した浸潤性黒色腫からの切片に対して実施したスペクトル分析を示す。ここで2つのクラスター(10および11)に割り当てられた腫瘍細胞は、表皮の基底層(クラスター5)および粘膜層(クラスター6)とは明確にはっきり区別された。隣接した良性母斑(クラスター8)の残りの一部は、腫瘍に密に接触したままであった。この現象は、デンドログラムでも観察された(図3C)。
【００３６】
HE染色切片を高倍率で詳細に調べると、様々な腫瘍クラスターのそれぞれを腫瘍細胞の特異的形態学的特徴と関連づけることができた。潰瘍化した結節型黒色腫(症例番号1、図2A)では、クラスター9は腫瘍の表在領域に対応し、その領域は、類上皮腫瘍細胞からなり、mm2当たりの有糸分裂の数が多く、細胞形態学的に高度な不均質性を示した。クラスター11は紡錘形のメラニン細胞からなり、隣接のクラスター9より、細胞密度は高く、核大小不同は顕著ではなかった。腫瘍が周囲の間質に浸潤するにつれて、腫瘍細胞(クラスター10)は、小さな群にクラスター化するように見え、紡錘形ではなくなり、さらに、mm2当たりの有糸分裂の数が減少した。様々な腫瘍クラスターと細胞形態との間の同様な相関が、この研究で分析された他の試料にも見出された。
【００３７】
類上皮形態と紡錘形態との間の分子的な差を研究するために、我々はそれらに対応するスペクトルの特徴を比較した。この目的のために、これらの細胞形態に関連したクラスター中心を、各K-平均イメージから抽出した。得られた平均スペクトルおよび標準偏差スペクトルをプロットして、観察された差の有意性を評価した(図4)。スペクトルの差を明瞭にするために二次導関数を計算した。主要な差が観察されたIRバンドを、バンドの暫定的な割り当てと共に表2に載せた(Baker MJ、Gazi E、Brown MD、Shanks JH、Gardner P、Clarke NW. FTIR-based spectroscopic analysis in the identification of clinically aggressive prostate cancer. Br J Cancer 2008;99;1859〜1866)。スペクトルの主要な差はDNAおよびRNAの振動に起因していた。タンパク質含量およびタンパク質構造も少し変化していることが明らかになった(アミドIII振動)。これらの結果をまとめると、2つの型の黒色腫細胞間における生体分子の差は、主としてDNAおよびRNAに該当するものと考えられた。IRマイクロイメージングによって同定される、特徴的な腫瘍構造の間のこれらの差は、DNAおよびRNAの相対濃度の変化および/またはリン酸化度の差を反映することができた。
【００３８】
【表２】
2013500464.tif 000004
【００３９】
スペクトル分析が示す組織構成
教師なしHCA分析によって得られたデンドログラムを分析すると、生化学的構成に基づいて組織構成を明らかにすることができる。デンドログラム中でスペクトルクラスターが近接している組織構造は、必ずしも密に接触しているわけではないが、類似の生体分子情報を反映している。例えば、組織切片内に分散した血管、リンパ球、および赤血球は、同じHCAクラスターの中に概ねグループ分けされ、かつこれらすべては炎症反応プロセスで重要な役割を果たしている。腫瘍周囲の間質または腫瘍内の間質に対応するものと病理学者が定めたスペクトルは、図1に示すように、腫瘍のスペクトルと密接に関連していた。この例では、腫瘍周囲の真皮の中にある高密度間質(クラスター9〜10)、およびリンパ球(クラスター11)は、腫瘍細胞(クラスター6)と同じHCAクラスターの中にグループ分けされた。さらに、血管(クラスター5〜4)およびメラノファージ(クラスター8)も同じ群の中にクラスター化された。1症例のみであるが、腫瘍のクラスターが、表皮の粘膜層の1つにスペクトル的に接近していた。これらのスペクトルは、症例7の表皮内領域に位置した腫瘍領域に対応していた。
【００４０】
考察
現在まで、原発性皮膚黒色腫を診断するためのゴールドスタンダードは、病理組織学的診断に基づいている。黒色腫がいかに早期に診断されるかに患者の命が依存し得るため、臨床医が正確な診断をする能力が極めて重要となる。臨床的に疑わしい腫瘍を識別することができる信頼性のある方法としてイメージング技術を開発するために、多くの試みがなされてきた。したがって、予後不良の病変を早期診断するための特定のIR分光学的マーカーを同定すれば、治療方針を最適化する助けとなるであろう。
【００４１】
本概念実証研究の目的は、原発性皮膚黒色腫に罹患した患者にさらなる予後的価値を提供するFTIRイメージングの可能性を実証することであった。FTIRイメージングと多変量統計解析との組合せは、組織構造を再現するために他の組織型に対して以前より使用されていた((Lasch P、Haensch W、Naumann D、Diem M.、「imaging of colorectal adenocarcinoma using FT-IR microspectroscopy and cluster analysis」、Biochim Biophys Acta 2004;1688;176〜186; Ly E、Piot O、Wolthuis R、Durlach A、Bernard P、Manfait M.、「combination of FTIR spectral imaging and chemometrics for tumour detection from paraffin-embedded biopsies」、Analyst 2008;133;197〜205;およびWolthuis R、Travo A、Nicolet C.、「IR spectral imaging for histopathological characterization of xenografted human colon carcinomas」、Anal Chem 2008;80;8461〜8469を参照されたい)。我々は、意外にもIRスペクトルと組織構造との間の明確な関連づけを行ったので、各組織型のスペクトルマーカーを同定するために有用なスペクトルライブラリーを構築した。次いで、我々は、組織試料の客観的な診断のために、線形判別分析および人工ニューラルネットワークなどのパターン認識技術を使用する自動予測診断アルゴリズムを開発した。この方法論が、皮膚癌(基底細胞癌、扁平上皮癌、およびボーエン病)の鑑別診断および特徴づけに対して極めて効率が良いことを我々のグループが最近証明した。我々が知る限りでは、これは、様々な組織学的サブタイプを含む一連の原発性皮膚黒色腫全般のFTIRイメージング分析に関する最初の報告である。
【００４２】
我々の研究試料に含めた原発性皮膚黒色腫は、クラークのレベルIが1つ(10%)、レベルIIが2つ(20%)、レベルIIIが1つ(10%)、レベルIVが6つ(60%)であった。以前に報告したように、FTIRイメージングにより、正常表皮と比較して、黒色腫細胞の分光学的マーカーを同定することができた。我々の研究から得られた、コントラストを強調して色分けしたイメージは、表皮および良性の隣接母斑から黒色腫細胞を明確に分ける。さらに、我々の調査からの興味深い発見は、FTIRイメージングが示した様々な腫瘍クラスターが、細胞形態の差と関連していることであった。組織学的検査では、この不均質性は、結節型黒色腫、または高レベルの浸潤を伴った黒色腫において極めて顕著であるように見えた。これらの症例では、黒色腫細胞は密集し、類上皮形態または紡錘形態を示した。黒色腫細胞は様々な表現型を示すことがあり、同じ生検内で様々な腫瘍細胞形態が存在することが、転移のリスクと相関されてきた(「Pathological findings suggestive of interclonal stabilization in a case of cutaneous melanoma」、Clin Exp Metastasis 1996;14;215〜218を参照されたい)。同様に、この研究で分析した生検において、腫瘍の不均質性は予後不良な黒色腫にのみ検出された。そのため、IRイメージングおよびパターン認識技術の組合せは、ハイリスクの転移性黒色腫患者をスクリーニングする、革新的で、無標識で、迅速で、かつ自動的な技術になり得る。
【００４３】
興味深いことには、これらの同じ症例において、FTIRイメージングによって得られたクラスターは、黒色腫の厚さ、潰瘍化、浸潤レベル、および有糸分裂の割合など予後不良の有力な皮膚病理学的パラメーターと関連づけられた。我々は、隣接して母斑がある腫瘍と母斑がない腫瘍との間で差を見出さなかった。これらの予測アルゴリズムにより、多数の試料の分析から蓄積されたスペクトルデータバンクに基づいて、腫瘍領域を自動的に同定することが可能となる。
【００４４】
さらに、黒色腫腫瘍とその周囲の間質との間の相互作用が、腫瘍細胞の浸潤能を反映し得るものでもあるため、広く研究された。クラスターイメージは、様々な型の間質反応を容易に同定することを可能にする、コントラストを強調したカラーイメージを提供する。実際、腫瘍周囲の間質および腫瘍内の間質は、正常な間質反応と明確に識別することができた。HCAにより、これらの腫瘍周囲および腫瘍内の間質反応は、黒色腫細胞のものと関連し類似したIRバイオプロフィールを保持することが判明した。この分析により、腫瘍細胞とそれらのマトリックス環境との間には強い相互作用が存在するという仮説が確認される。腫瘍近傍での間質の再構築は、第1に炎症細胞(例えばリンパ球、線維芽細胞、およびマクロファージ)の高度な集積、第2に血管構造の変化と関係している。実際、黒色腫では、血管は密に密集した新生物の増殖を主に取り囲むが、正常真皮では、血管のネットワークは広く分布する。
【００４５】
結論
FTIRイメージングは、原発性皮膚黒色腫の診断において有望な用途を有する。パラフィン包埋した切片の直接分析は、溶媒によるパラフィン除去を行わずに実施することができ、多変量統計解析は、組織構造を自動的に再現し得る、コントラストを強調して色分けしたイメージを提供する。IRスペクトルのクラスターと皮膚病理学的パラメーターとの間の良好な相関が実現可能であり、この迅速で自動化された手順は原発性皮膚黒色腫の診断を改善し最適化する際に助けとなり、また新たな予後マーカーを提供することができることが示唆された。従来の検査法と本方法を統合することは実現可能であり、外科的処置のガイダンスの助けとなり得る。赤外イメージングシステムはますます効率的になっているので、数分以内で大きな組織試料からスペクトルイメージを記録することが現在可能であり、生検後1時間未満で診断を出すことができる。
【図１】
2013500464.tif 000005
【図２】
2013500464.tif 000006
【図３】
2013500464.tif 000007
【図４】
2013500464.tif 000008
【国際調査報告】
2013500464.tif 000009
2013500464.tif 000010