(57)【要約】本発明は、ＨＲＥ、Ｅ２Ｆ及びＴＥＲＴの組み合わせからなる遺伝子発現調節配列及びこれを利用した選択的腫瘍細胞退縮活性が大きく改善された遺伝子伝達システム、特に組換えアデノウイルスに関する。また、前記組換えアデノウイルスを含む薬剤学的抗腫瘍組成物に関する。本発明の組換えアデノウイルスは、本発明特有の遺伝子発現調節配列により腫瘍特異的に複製が調節されることにより、選択的腫瘍細胞退縮活性又は枯死能の改善された効果を奏し、特に、低酸素条件で大きく向上された抗腫瘍効果を示す。また、癌細胞内で組換えアデノウイルスの特異的発現により、体内における安定性が増大し、さらに改善された抗腫瘍効果を誘導することができる。【選択図】図１
2013543386.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）低酸素応答配列（ＨＲＥ）エンハンサー配列と、
（ｉｉ）Ｅ２Ｆプロモーター配列とを含み、
前記Ｅ２Ｆプロモーターが、前記ＨＲＥエンハンサー配列の下流に位置し、前記ＨＲＥエンハンサー配列及び前記Ｅ２Ｆプロモーターが、協同的に同一の遺伝子の発現を促進することを特徴とする遺伝子発現調節配列。
【請求項２】
Ｅ２Ｆプロモーター配列が、２回〜１０回繰り返される請求項１に記載の遺伝子発現調節配列。
【請求項３】
ＨＲＥエンハンサー配列が、２回〜２０回繰り返される請求項１に記載の遺伝子発現調節配列。
【請求項４】
遺伝子発現調節配列が、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）プロモーター配列を更に含む請求項１に記載の遺伝子発現調節配列。
【請求項５】
遺伝子発現調節配列が、組み換えアデノウイルスベクターのＥ１領域に挿入され、５’から３’方向にＨＲＥ配列、Ｅ２Ｆプロモーター配列及びＴＥＲＴプロモーター配列を含む請求項４に記載の遺伝子発現調節配列。
【請求項６】
ＨＲＥ配列が６回繰り返され、かつＥ２Ｆ配列が２回繰り返される請求項５に記載の遺伝子発現調節配列。
【請求項７】
（ａ）請求項１から６のいずれかに記載の遺伝子発現調節配列と、
（ｂ）前記遺伝子発現調節配列に作動的に連結された、発現させようとする目的遺伝子と、
を含むことを特徴とする腫瘍特異的発現の改善された遺伝子伝達システム。
【請求項８】
遺伝子伝達システムが、プラスミド、組換えアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリマー、リポソーム又はニオソームである請求項７に記載の遺伝子伝達システム。
【請求項９】
遺伝子伝達システムが、組換えアデノウイルスベクターである請求項８に記載の遺伝子伝達システム。
【請求項１０】
（ａ）アデノウイルスの末端逆位配列（ＩＴＲ）配列と、
（ｂ）（ｉ）低酸素応答配列（ＨＲＥ）エンハンサー配列と、（ｉｉ）Ｅ２Ｆプロモーター配列とを含み、前記Ｅ２Ｆプロモーターが、前記ＨＲＥエンハンサー配列の下流に位置し、前記ＨＲＥエンハンサー配列及びＥ２Ｆプロモーターが、協同的に同一の遺伝子の発現を促進する遺伝子発現調節配列と、
（ｃ）前記遺伝子発現調節配列に作動的に連結された、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、アポトーシス遺伝子及び抗血管新生遺伝子から構成された群から選択される治療学的トランス遺伝子と、
を含むことを特徴とする癌細胞特異的退縮活性の改善された組換えアデノウイルス。
【請求項１１】
遺伝子発現調節配列内のＥ２Ｆプロモーター配列が、２回〜１０回繰り返される請求項１０に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１２】
遺伝子発現調節配列内のＨＲＥエンハンサー配列が、２回〜２０回繰り返される請求項１０に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１３】
遺伝子発現調節配列が、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）プロモーター配列を更に含む請求項１０に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１４】
遺伝子発現調節配列が、組み換えアデノウイルスベクターのＥ１領域に挿入され、５’から３’方向にＨＲＥ配列、Ｅ２Ｆプロモーター配列及びＴＥＲＴプロモーター配列を含む請求項１３に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１５】
ＨＲＥ配列が６回繰り返され、かつＥ２Ｆ配列が２回繰り返される請求項１４に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１６】
治療学的トランス遺伝子が、アポリポタンパク質Ｋｌｉｎｇｌｅ８（ＬＫ８）遺伝子、シトシンキナーゼ（ＣＤ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子及びデコリン遺伝子から構成された群から選択される一つ又は二つ以上の遺伝子である請求項１０に記載のアデノウイルス。
【請求項１７】
（ａ）請求項１０から１６のいずれかに記載の組換えアデノウイルスの治療学的有効量と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、を含むことを特徴とする抗腫瘍組成物。
【請求項１８】
組成物が、有効成分としてガンシクロビル（ＧＣＶ）を更に含む請求項１７に記載の抗腫瘍組成物。
【請求項１９】
請求項１０から１６のいずれかに記載の組換えアデノウイルスの治療学的有効量を含む抗腫瘍組成物を哺乳動物対象に投与する工程を含むことを特徴とする癌治療方法。
【請求項２０】
組成物が、有効成分としてガンシクロビル（ＧＣＶ）を更に含む請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換えられた遺伝子発現調節配列を有する腫瘍特異的発現の改善された遺伝子伝達システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍の成長は、栄養分及び酸素の供給により大きく左右される。特に、酸素は、癌細胞において適切なエネルギー代謝のために絶対的に必要な物質である。
【０００３】
一般に、癌細胞の急速な成長速度により、腫瘍の中心部に低酸素（ハイポキシア）がよく現れる。癌細胞が成長しつつ現れる低酸素は、癌治療と癌進行において、非常に重要な要素である。固形癌内の低酸素領域は、癌細胞の生存と転移のための運動性及び血管形成を促進させることにより、癌の進行に有利な作用をするようになる。また、最近の研究によると、癌細胞が低酸素を経ると、抗アポトーシス物質の発現が増加し、アポトーシスが抑制され、また、放射線治療療法と抗癌化学治療療法に対する耐性を有するようになることが報告されている。癌細胞が有するこのような特性により引き起こされる抗癌治療の限界点を克服するために、新しい抗癌治療法の開発が切実である。したがって、癌治療のための効果的な治療法として、現在ウイルスを利用した方法が多く開発されている。代表的な方法として、現在アデノウイルスを利用した臨床試験が活発に進められている。組換えアデノウイルスは、細胞の分裂状態に関係なく多様な種類の細胞に対する優れた遺伝子伝達効率を示し、高い力価のウイルスを容易に生産し、容易に濃縮することができるだけではなく、生体内でも遺伝子伝達が容易である。また、癌を遺伝子療法で治療する場合、治療遺伝子を長期的あるいは持続的に発現する必要がない。また、治療用ウイルスそのものにより誘導される宿主の免疫反応もあまり問題視されず、かえって利点とされる。そのため、アデノウイルスが癌治療用遺伝子伝達システムとして脚光を浴びている。このような長所に基づいて、最近癌を対象とする遺伝子治療に組換えアデノウイルスを利用する頻度が持続的に増加している。特に、癌細胞でのみ選択的に増殖し、癌細胞を退縮させる腫瘍細胞特異増殖及び退縮組換えアデノウイルスに対する研究が多様に進行されている。癌細胞でのみ特異的に増殖して癌細胞を退縮させる腫瘍退縮アデノウイルスは、ウイルスの増殖により一次感染細胞だけではなく周辺の腫瘍細胞にも二次的に感染することができ、治療効果を著しく増大させることができる。周辺の正常細胞では、腫瘍退縮アデノウイルスの増殖が抑制されるため、アデノウイルスによる毒性が減少される利点もある。また、癌特異的遺伝子調節部位をＥ１遺伝子部位に挿入し、癌組織でのみさらに選択的に増殖するように製作された組換えアデノウイルスも開発されている。これにより、腫瘍特異的退縮アデノウイルスの臨床応用可能性が徐々に増加すると予想されている。癌細胞で現れる低酸素環境下でＨＩＦ−１α（低酸素誘導因子１−α）とｐ２１ｃｉｐ１（サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ａ）が活性化され、その発現が増加することにより細胞周期が抑制され、これにより、自分の全生活史を宿主細胞に依存して生きているウイルスの増殖が抑制される現象が現れる。これがウイルスを利用した持続的な癌治療に対する限界とされている。しかし、これを逆に利用して、低酸素により調節される遺伝子のプロモーターやエンハンサーを利用すると、癌細胞に対する特異性をより増加させることができる。
【０００４】
遺伝子治療による抗癌治療のアプローチとして、癌細胞特異的なプロモーターによりウイルスの複製が調節され、癌細胞のみを選択的に死滅させることができる腫瘍選択的退縮ウイルスを利用する方法と共に、癌細胞内にアポトーシスを誘導可能な治療遺伝子を伝達できるアプローチもある。
【０００５】
多様な種類の癌細胞で高発現することが知られているＥ２Ｆは、癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）の一種であって、ｐＲｂ（網膜芽細胞腫タンパク質）と結合し、その活性が抑制される。ｐＲｂから解離したＥ２Ｆは、転写因子としてアデノウイルスのＥ２プロモーターの活性化を促進させるだけではなく、細胞周期の進行を主管する多様な遺伝子の転写も同時に促進させることが知られている。一方、大部分の固形主要内には、低酸素部位が存在し、このような低酸素症は、解糖系酵素や血管新生促進因子のような生存因子の生産を引き起こすことにより、低酸素状態の多くの腫瘍が放射線治療や化学抗癌治療に抵抗性を有するようになる。特に、低酸素症状態の腫瘍は、低酸素症に反応してＨＩＦを生産し、ＨＩＦは、低酸素応答配列（ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＨＲＥ）に結合し、下流に存在するＶＥＧＦのような血管新生遺伝子の転写を活性化させる。このような事実に着目し、本発明者らは、Ｅ２ＦプロモーターとＨＲＥエンハンサーによりアデノウイルスのＥ１の発現が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスを製作するために、既に本発明者らで開発、癌細胞退縮効果を検証したＥ−Ｒｄ１９腫瘍選択的退縮アデノウイルスと共に、修飾されたＥ２Ｆプロモーターを有した腫瘍選択的退縮アデノウイルスのＥＥ−Ｒｄ１９とＨＥ−Ｒｄ１９を製作した。
【０００６】
本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照され、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、優れた腫瘍選択的遺伝子伝達効率を通じて腫瘍特異的な退縮活性がさらに向上した遺伝子治療剤を開発するために鋭意研究した。その結果、ＨＲＥエンハンサー、Ｅ２Ｆプロモーター及びＴＥＲＴプロモーターから構成される発現調節配列を含むアデノウイルスを利用する場合、腫瘍選択的退縮活性が大いに向上することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、腫瘍特異的発現の改善された遺伝子伝達システムを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、癌細胞特異的退縮活性の改善された組換えアデノウイルスを提供することにある。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、本発明の組換えアデノウイルスの治療的有効量を含む抗腫瘍組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一様態によると、本発明は、（ｉ）低酸素応答配列（ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＨＲＥ）エンハンサー配列と、（ｉｉ）Ｅ２Ｆプロモーター配列とを含み、前記Ｅ２Ｆプロモーターが、前記ＨＲＥエンハンサー配列の下流に位置し、前記ＨＲＥエンハンサー配列及びＥ２Ｆプロモーターが、協同的に同一の遺伝子の発現を促進する遺伝子発現調節配列を提供する。
【００１３】
本発明者らは、優れた腫瘍選択的遺伝子伝達効率を通じて腫瘍特異的な退縮活性がさらに向上した遺伝子治療剤を開発するために鋭意研究した。その結果、ＨＲＥエンハンサー、Ｅ２Ｆプロモーター及びＴＥＲＴプロモーターから構成される発現調節配列を含むアデノウイルスを利用する場合、腫瘍選択的退縮活性が大いに向上することを見出した。
【００１４】
本明細書において、用語‘Ｅ２Ｆプロモーター配列’は、アデノウイルスのＥ２プロモーターの活性化を促進させ、細胞周期の進行を主管する多様な遺伝子の転写も同時に促進させる転写因子であるＥ２Ｆ遺伝子のプロモーターを意味する。Ｅ２は、癌遺伝子であって、ｐＲｂ（網膜芽細胞腫タンパク質）と結合してその活性が抑制される。
【００１５】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用するＥ２Ｆプロモーター配列は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、Ｅ２Ｆプロモーター配列による腫瘍選択的発現を向上させるために、Ｅ２Ｆプロモーター反復配列を利用する。本発明の反復配列は、同一な配列が連続的に反復されるか（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ａｄｊａｃｅｎｔ）、又はプロモーターやエンハンサーの活性に影響を与えない範囲内で適切な長さのリンカーヌクレオチドを介在して不連続的に反復される（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｒｅｐｅａｔｅｄ）。
【００１６】
さらに好ましくは、本発明で利用するＥ２Ｆ配列は、配列番号１のヌクレオチド配列が２回〜１０回繰り返された配列、よりさらに好ましくは、２回〜７回繰り返された配列、最も好ましくは、２回繰り返された配列を有する。
【００１７】
本明細書において、用語‘ＨＲＥエンハンサー配列’は、低酸素応答エンハンサー配列を意味する。低酸素条件で細胞の特定遺伝子の発現が調節される（Ｂｕｎｎ  ａｎｄ  Ｐｏｙｔｏｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７６：８３９−８８５（１９９６）；Ｄａｃｈｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７４：５１２６−５１３２（１９９６）；Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ  ａｎｄ  Ｋｒａｓｎｏｗ  Ｃｅｌｌ  ８９：９−１２（１９９７））。大部分の腫瘍細胞は、不十分な血液供給を受けるようになるが、これは、腫瘍細胞が一般的に血管を形成させる内皮細胞より速く成長するからであって、これは、腫瘍で低酸素状態を誘発するようになる。大部分の固形主要内で引き起こされるこのような低酸素状態は、解糖系酵素や血管新生誘発前駆因子のような生存因子の生産を引き起こすことにより、放射線治療や化学抗癌治療に抵抗性を有するようになる。これに本発明者らは、Ｅ２ＦプロモーターとＨＲＥエンハンサーによりアデノウイルスのＥ１の発現が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスを開発した。
【００１８】
低酸素反応の主要な媒介者は、転写複合体ＨＩＦ−１α（低酸素誘導因子−１α）であり、これは、多様な遺伝子の調節部位にあるＨＲＥと相互作用して、前記遺伝子は、例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）遺伝子、及びエノラーゼ−１とＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素）のような解糖系酵素のコーディング遺伝子を含む。本発明は、このように低酸素条件で遺伝子の発現を調節して、ＨＩＦ−１αと相互作用する配列であるＨＲＥを利用する。ＨＲＥは、遺伝子伝達システム、特に、組換えアデノウイルスの腫瘍細胞選択性を大きく向上させる作用をする。
【００１９】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用するＨＲＥ配列は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、ＨＲＥ配列による転写活性を向上させるために、ＨＲＥ反復配列を利用する。さらに好ましくは、本発明で利用するＨＲＥ配列は、配列番号２のヌクレオチド配列が２回〜２０回繰り返された配列、よりさらに好ましくは、３回〜８回繰り返された配列、最も好ましくは、６回繰り返された配列を有する。
【００２０】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の遺伝子発現調節配列は、テロメラーゼ逆転写酵素（ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ＴＥＲＴ）プロモーター配列を更に含む。
【００２１】
ＴＥＲＴは、染色体複製の間、テロメアーの長さを一定に維持することに関与する酵素であるテロメラーゼの構成要素であって、細胞老化、癌、細胞不滅に関与することが知られている（Ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１１，１９２１−２９（１９９２），Ｋｉｍ．Ｎ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１：２０１１−５（１９９４），Ｈａｒｌｅｙ，Ｃ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４５：４５８−６０（１９９０））。
【００２２】
テロメラーゼの活性は、人間の場合、卵巣と睾丸の生殖細胞及びリンパ球で観察されるが、その他、正常体細胞では観察されていない（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｗ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３−９（１９９６））。したがって、正常体細胞は、制限された回数の細胞分裂後にはテロメアーの長さが一定長さ以下に減少し、それ以上分裂できず死滅する（Ｙａｓｕｍｏｔｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．３：４３３−９（１９９６））。その反面、癌進行前段階である陽性腫瘍細胞及び癌細胞では、テロメラーゼの活性が増加される（Ｂｒｏｃｃｏｌｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：９０８２−６（１９９５）。卵巣癌でテロメラーゼの活性増加が最初に報告された後、血液癌、胃癌、肺癌、肝癌、大腸癌、脳癌、前立腺癌、頭頸部癌、乳癌など、ほぼ全ての癌でテロメラーゼの活性増加が観察されている（Ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：２９００−４（１９９４））。テロメラーゼの機能に必須的な役割をするＴＥＲＴの発現は、テロメラーゼの活性と関連しており、最近は、テロメラーゼの発現がＴＥＲＴプロモーターの活性、即ち、ＴＥＲＴのｍＲＮＡの量によって調節されること、及びＴＥＲＴの活性を調節するための最小のプロモーターの大きさが１８１ｂｐであることが明らかにされた。本発明の遺伝子伝達システムにおいて、ＴＥＲＴは、腫瘍細胞に対する特異性を向上させる作用をする。好ましくは、本発明で利用するＨＲＥ配列は、配列番号３のヌクレオチド配列である。
【００２３】
本発明のより好ましい具現例によると、本発明の遺伝子発現調節配列は、組み換えアデノウイルスベクターのＥ１領域に挿入され、５’から３’方向にＨＲＥ配列、Ｅ２Ｆプロモーター配列及びＴＥＲＴプロモーター配列を含む。
【００２４】
最も好ましくは、前記ＨＲＥ配列が６回繰り返され、かつ前記Ｅ２Ｆ配列が２回繰り返される。
【００２５】
本発明の他の様態によると、本発明は、（ａ）本発明の遺伝子発現調節配列と、（ｂ）前記遺伝子発現調節配列に作動的に連結された、発現させようとする目的遺伝子と、を含む腫瘍特異的発現の改善された遺伝子伝達システムを提供する。
【００２６】
本発明の遺伝子発現調節配列は、上述の遺伝子発現調節配列と同一であるため、過度なる重複を避けるためにその記載を省く。
【００２７】
本明細書において、用語‘作動的に結合された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）’は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列間の機能的な結合を意味し、これにより前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節するようになる。
【００２８】
本発明の遺伝子発現調節配列に作動的に連結された発現対象の遺伝子は、特に制限されない。
【００２９】
例えば、発現しようとする遺伝子は、遺伝子伝達システムのゲノム由来の遺伝子（例えば、アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子）又は治療学的トランス遺伝子を含む。治療学的トランス遺伝子は、下記に詳細に説明されている。
【００３０】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の遺伝子伝達システムは、プラスミド、組換えアデノウイルス、アデノ関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ，ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリマー、リポソーム又はニオソームである。
【００３１】
本発明の遺伝子発現調節配列と前記遺伝子発現調節配列に作動的に結合された、伝達しようとする遺伝子配列は、通常的な遺伝子治療に利用される全ての遺伝子伝達システムに適用でき、好ましくは、プラスミド、アデノウイルス（Ｌｏｃｋｅｔｔ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３：２０７５−２０８０（１９９７））、アデノ−関連ウイルス（Ｌａｓｈｆｏｒｄ  ＬＳ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｅｄ．Ａ．Ｍｅａｇｅｒ  （１９９９））、レトロウイルス（Ｇｕｎｚｂｕｒｇ  ＷＨ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｅｄ．Ａ．Ｍｅａｇｅｒ，（１９９９））、レンチウイルス（Ｗａｎｇ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（１１）：Ｒ５５−６２（１９９９））、ヘルペスシンプレックスウイルス（Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１４１１−１４１５（１９９５））、ワクシニアウイルス（Ｐｕｈｌｍａｎｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：６４９−６５７（１９９９））、ポックスウイルス（ＧＣＥ，ＮＪＬ，Ｋｒｕｐａ  Ｍ，Ｅｓｔｅｂａｎ  Ｍ．，Ｔｈｅ  ｐｏｘｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ＭＶＡ  ａｎｄ  ＮＹＶＡＣ  ａｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８（２）：９７−１２０（２００８））、ポリマー（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ  Ｇｅｎｅ  ｕｓｉｎｇ  Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ．，Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｅｔａｂ．１３（２）：１１９−１２８（２００６））、リポソーム（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １９９，Ｓ．Ｃ．Ｂａｓｕ  ａｎｄ  Ｍ．Ｂａｓｕ  （Ｅｄｓ．），Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  ２００２）又はニオソームに適用できる。最も好ましくは、本発明の遺伝子伝達システムは、組換えアデノウイルスに適用して製造される。
【００３２】
ｉ．アデノウイルス
アデノウイルスは、中間程度のゲノムサイズ、操作の便宜性、高い力価、広範囲のターゲット細胞、及び優れた感染性から、遺伝子伝達ベクターとしてよく利用されている。ゲノムの両末端は、１００ｂｐ〜２００ｂｐの末端逆位配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）を含み、これは、ＤＮＡ複製及びパッケージングに必須のシスエレメントである。ゲノムのＥ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）は、転写及び宿主細胞遺伝子の転写を調節するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）は、ウイルスＤＮＡ複製に関与するタンパク質をコードする。
【００３３】
現在開発されたアデノウイルスベクターの中で、Ｅ１領域が欠如した複製不能アデノウイルスがよく利用されている。一方、Ｅ３領域は、通常的なアデノウイルスベクターから除去され、外来遺伝子が挿入される座を提供する（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３１：５４３−５５１（１９８２）；Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：１０６６−１０７３（１９８９））。したがって、本発明の遺伝子発現調節配列は、Ｅ１Ａ遺伝子プロモーター配列位置に挿入され、Ｅ１Ａ遺伝子の発現を調節することができる。また、本発明の遺伝子発現調節配列−発現遺伝子カセットは、欠失したＥ１領域（Ｅ１Ａ領域及び／又はＥ１Ｂ領域、好ましくは、Ｅ１Ｂ領域）、又はＥ３領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、欠失したＥ１領域に挿入される。また、本発明の遺伝子発現調節配列−発現遺伝子カセットは、欠失したＥ４領域にも挿入できる。本明細書において、ウイルスゲノム配列と関連して使用される用語、‘欠失’は、該当配列が完全に欠失したものだけではなく、部分的に欠失したものも含む意味を有する。
【００３４】
また、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％までパッケージングすることができるため、約２ｋｂを更にパッケージングすることができる（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：１７３３−１７３９（１９８７））。したがって、アデノウイルスに挿入される上述の外来配列は、アデノウイルスの野生型ゲノムに更に結合させることもできる。
【００３５】
アデノウイルスにより運搬される外来遺伝子は、エピソームと同一の方式により複製され、そのため、宿主細胞に対して遺伝的毒性が非常に低い。したがって、本発明のアデノウイルス遺伝子伝達システムを利用した遺伝子治療が非常に安全であると判断される。
【００３６】
ｉｉ．レトロウイルス
レトロウイルスは、自分の遺伝子を宿主のゲノムに挿入し、大量の外来遺伝物質を運搬することができ、感染できる細胞のスペクトルが広いため、遺伝子伝達ベクターとしてよく利用されている。
【００３７】
レトロウイルスベクターを構築するために、運搬しようする目的ヌクレオチド配列は、レトロウイルスの配列の代わりにレトロウイルスゲノムに挿入され、複製不能のウイルスを生産する。ビリオンを生産するために、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含むが、末端反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ，ＬＴＲ）とΨ配列は含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１５３−１５９（１９８３））。運搬しようとする目的ヌクレオチド配列、ＬＴＲ及びΨ配列を含む組み換えプラスミドを前記細胞株に移入すると、Ψ配列は組み換えプラスミドのＲＮＡ転写体の生産を可能にし、この転写体はウイルスにパッケージングされ、ウイルスは培地に排出される（Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ”Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ，”  Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ  （ｅｄｓ．），Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４９４−５１３（１９８８））。組み換えレトロウイルスを含有する培地を収集して濃縮し、遺伝子伝達システムに利用する。
【００３８】
次世代レトロウイルスベクターを利用した遺伝子伝達が発表された。Ｋａｓａｈａｒａら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１３７３−１３７６（１９９４））は、モロニーマウス白血病ウイルス（ｍｏｌｏｎｅｙ−ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）の変異体を製造して、ここで、ＥＰＯ（エリスロポエチン）配列をエンベロープ部位に挿入し、新しい結合特性を有するキメラタンパク質を生産した。本発明の遺伝子伝達システムも、このような次世代レトロウイルスベクターの構築戦略により製造することができる。
【００３９】
ｉｉｉ．ＡＡＶベクター
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、非分裂細胞を感染させることができ、多様な種類の細胞に感染できる能力を有しているため、本発明の遺伝子伝達システムに適している。ＡＡＶベクターの製造及び用途に対する詳細な説明は、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に詳細に開示されている。
【００４０】
遺伝子伝達システムとしてのＡＡＶに対する研究は、ＬａＦａｃｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｏｌｏｇｙ，１６２：４８３４８６（１９８８），Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（ＮＹ），２１：９２８−９３３（１９９３），Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９４：１４４０−１４４８（１９９４）、及びＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２：２９−３７（１９９５）に開示されている。最近、ＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症の治療剤としてヒト臨床試験の第Ｉ相試験を実施している。
【００４１】
典型的に、ＡＡＶウイルスは、二つのＡＡＶ末端リピートが両側に位置されている目的の遺伝子配列（リラクシン遺伝子及び運搬しようとする目的ヌクレオチド配列）を含むプラスミド（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３−１９７３（１９８８）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８（１９８９））及び末端リピートのない野生型ＡＡＶコーディング配列を含む発現プラスミド（ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：２９３６−２９４５（１９９１））を同時形質転換させて製造される。
【００４２】
ｉｖ．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本発明の遺伝子伝達システムとして利用することができる。ワクシニアウイルス（Ｐｕｈｌｍａｎｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：６４９−６５７（１９９９）；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，”Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ，”  Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４６７−４９２（１９８８）；Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，”Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｇｅｎｅｓ，”  Ｉｎ：Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  Ｒ，ｅｄ．Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１１７−１４８（１９８６）及びＣｏｕｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６８：１−１０（１９８８））、レンチウイルス（Ｗａｎｇ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（１１）：Ｒ５５−６２（１９９９））、又は単純ヘルペスウイルス（Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１４１１−１４１５（１９９５））、ポックスウイルス（ＧＣＥ，ＮＪＬ，Ｋｒｕｐａ  Ｍ，Ｅｓｔｅｂａｎ  Ｍ．，Ｔｈｅ  ｐｏｘｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ＭＶＡ  ａｎｄ  ＮＹＶＡＣ  ａｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８（２）：９７−１２０（２００８））由来のベクターも、目的ヌクレオチド配列を細胞内に運搬可能な運搬システムとして利用することができる。
【００４３】
ｖ．ポリマー
非ウイルス性遺伝子伝達システムとして幅広く使用されるポリマー系伝達システムとしては、ゼラチン、キトサン（Ｃａｒｒｅｎｏ  ＧＢ，Ｄｕｎｃａｎ  Ｒ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ａｎｄ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  １４８：２３１−２４０（１９９７））、ＰＬＬ（ポリ−Ｌリジン）（Ｍａｒｕｙａｍａ  Ａ，Ｉｓｈｉｈａｒａ  Ｔ，Ｋｉｍ  ＪＳ，Ｋｉｍ  ＳＷ，Ａｋａｉｋｅ  Ｔ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ＤＮＡ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）ｇｒａｆｔｅｄ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ａｎｄ  ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌｌａｃｔｉｄｅ）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ８：７３５−７４２（１９９７））及びＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅａｍｉｎｅ）（Ａｂｄａｌｌａｈ  Ｂ，Ｈａｓｓａｎ  Ａ，Ｂｅｎｏｉｓｔ  Ｃ，Ｇｏｕｌａ  Ｄ，Ｂｅｈｒ  ＪＰ，Ｄｅｍｅｎｅｉｘ  ＢＡ．Ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７：１９４７−１９５４（１９９６））などが利用されている。ポリマー系遺伝子伝達システムの長所は、免疫反応と急性毒性の発現率が低く、製造法が簡単であり、大量生産が可能であるという点である。
【００４４】
ｖｉ．リポソーム及びニオソーム
リポソームは、水相に分散された燐脂質により自然に形成される。外来ＤＮＡ分子をリポソームにより成功的に細胞内に運搬した例は、Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０（１９８２）、及びＮｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６（１９８７）に開示されている。一方、リポソームを利用した動物細胞の形質転換に最もよく利用される試薬としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）がある。運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を内包したリポソームは、エンドサイトーシス、細胞表面への吸着又はプラズマ細胞膜との融合などのメカニズムを通じて細胞と相互作用し、細胞内に運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を運搬する。
【００４５】
リポソームがリン脂質を利用して生成されるのに対し、ニオソームは、非イオン性界面活性剤及びコレステロールの混合物から構成された二重膜輸送体により極性及び非極性物質を封入することができ、浸透圧的に活性があり、リン脂質などによる脂質微粒子の運搬体のリポソームに比べ安定し、また製造時に使用される界面活性剤が、保管及び取り扱い時に特別な条件が必要ないという長所を有する。
【００４６】
一方、上述の本発明の遺伝子伝達システムを細胞内に導入する方法は、当業界に公知された多様な方法を通じて実施することができる。本発明において、遺伝子伝達システムがウイルスベクターに基づいて製作された場合は、当業界に公知されたウイルス感染方法により実施される。ウイルスベクターを利用した宿主細胞の感染は、上記に引用した文献に記載されている。
【００４７】
本発明において、遺伝子伝達システムがネイキッド（ｎａｋｅｄ）組み換えＤＮＡ分子又はプラスミドの場合は、微細注入法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ，２２：４７９（１９８０）；及びＨａｒｌａｎｄとＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０１：１０９４−１０９９（１９８５））、リン酸カルシウム沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３）；及びＣｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−２７５２（１９８７））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１：８４１（１９８２）；及びＴｕｒ−Ｋａｓｐａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：７１６−７１８（１９８６））、リポソーム媒介トランスフェクション法（Ｗｏｎｇ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：８７（１９８０）；Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０（１９８２）；及びＮｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６（１９８７））、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０（１９８５））、及び遺伝子銃（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：９５６８−９５７２（１９９０））などの方法により、遺伝子を細胞内に移入させることができる。
【００４８】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、（ａ）アデノウイルスの末端逆位配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）配列と、（ｂ）（ｉ）低酸素応答配列（ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＨＲＥ）エンハンサー配列と、（ｉｉ）Ｅ２Ｆプロモーター配列とを含み、前記Ｅ２Ｆプロモーターは、前記ＨＲＥエンハンサー配列の下流に位置し、前記ＨＲＥエンハンサー配列及びＥ２Ｆプロモーターは、協同的に同一の遺伝子の発現を促進する遺伝子発現調節配列と、（ｃ）前記遺伝子発現調節配列に作動的に連結された、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、アポトーシス遺伝子及び抗血管新生遺伝子から構成された群から選択される治療学的トランス遺伝子とを含む、癌細胞特異的退縮活性の改善された組換えアデノウイルスを提供する。
【００４９】
本発明の遺伝子発現調節配列は、上述の遺伝子伝達システムで利用される遺伝子発現調節配列と同一であるため、過度なる重複を避けるためにその記載を省く。
【００５０】
本発明の遺伝子発現調節配列は、組換えアデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子の上流、欠失したＥ３遺伝子領域、又はＥ１Ａ遺伝子の上流と欠失したＥ３遺伝子領域の両方に位置することができる。
【００５１】
本発明の遺伝子発現調節配列がＥ１Ａ遺伝子の上流に位置する場合、即ち、Ｅ１Ａ遺伝子に本発明の遺伝子発現調節配列が作動的に連結された場合（ＨＲＥ−Ｅ２Ｆ−ＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ）、組換えアデノウイルスの複製が本発明の遺伝子発現調節配列により調節される。本発明の遺伝子発現調節配列が欠失したＥ３遺伝子領域に位置する場合は、‘遺伝子発現調節配列−トランス遺伝子−ポリＡ’発現カセット形態で欠失したＥ３遺伝子領域に挿入できる。
【００５２】
本発明の明細書において、用語‘治療学的トランス遺伝子（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）’は、癌細胞内で発現して、治療学的効果を示すヌクレオチド配列を意味する。
【００５３】
本発明の明細書において、用語‘腫瘍抑制因子遺伝子（ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ）’は、標的細胞内で発現し、腫瘍表現型を抑制できるかアポトーシスを誘導できるヌクレオチド配列を意味する。本発明の実施に有用な腫瘍抑制因子遺伝子には、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＤＰＣ−４／Ｓｍａｄ４遺伝子、ＢＲＣＡ−１遺伝子、ＢＲＣＡ−２遺伝子、ＷＴ−１遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３２９：６４２（１９８７））、ＭＭＡＣ−１遺伝子、大腸腺腫症タンパク質（米国特許第５，７８３，６６６号）、大腸癌欠失遺伝子（ＤＣＣ遺伝子）、ＭＭＳＣ−２遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、染色体３ｐ２１．３に位置した鼻咽喉腫瘍抑制因子遺伝子（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：３０４２−３０４７（１９９８））、ＭＴＳ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、ＮＦ−２遺伝子及びＶＨＬ遺伝子が含まれる。
【００５４】
本明細書において、用語‘抗原性遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅ）’は、ターゲット細胞内で発現し、免疫システムで認識できる細胞表面抗原性タンパク質を生産するヌクレオチド配列を意味する。このような抗原性遺伝子の例には、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ，ＣＥＡ）、ＨＥＲ−２、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）及びｐ５３（Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．，ＷＯ９４／０２１６７）が含まれる。免疫システムが容易に認識するようにするために、前記抗原性遺伝子をＭＨＣ第Ｉ型抗原に結合させることができる。
【００５５】
本明細書において、用語“細胞毒性遺伝子（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｇｅｎｅ）”は、細胞内で発現して毒性効果を示すヌクレオチド配列を意味する。このような細胞毒性遺伝子の例には、シュードモナス外毒素（ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、リシン毒素、ジフテリア毒素、ＣＤ（シトシンデアミナーゼ）、ＴＫ（チミジンキナーゼ）などをコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【００５６】
本明細書において、用語“細胞増殖抑制遺伝子（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ  ｇｅｎｅ）”は、細胞内で発現されて、細胞周期途中に細胞周期を停止させるヌクレオチド配列を意味する。このような細胞増殖抑制遺伝子の例には、ｐ２１、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質遺伝子、サイクリン依存性キナーゼ抑制因子をコードする遺伝子（例えば、ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８及びｐ１９）、成長停止特異性ホメオボックス（ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ，ＧＡＸ）遺伝子（ＷＯ９７／１６４５９及びＷＯ９６／３０３８５）などがあるが、これに限定されるものではない。
【００５７】
本明細書において、用語“アポトーシス遺伝子（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ）”は、発現されて、プログラムされた細胞死を誘導するヌクレオチド配列を意味する。このようなアポトーシス遺伝子の例には、ｐ５３、アデノウイルスＥ３−１１．６Ｋ（Ａｄ２及びＡｄ５由来）又はアデノウイルスＥ３−１０．５Ｋ（Ａｄ由来）、アデノウイルスＥ４遺伝子、ｐ５３経路遺伝子及びカスパーゼをコードする遺伝子が含まれる。
【００５８】
本発明の明細書において、用語“抗血管新生遺伝子（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅ）”は、発現し、抗血管新生因子を細胞外に放出するヌクレオチド配列を意味する。抗血管新生因子には、アンジオスタチン、Ｔｉｅ２（ＰＮＡＳ，１９９８，９５，８７９５−８００）のような血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の抑制因子、エンドスタチンなどが含まれる。
【００５９】
組換えアデノウイルスに挿入されるトランス遺伝子は、プロモーター−トランス遺伝子−ポリＡ配列の発現カセットで挿入されることが好ましい。この場合、前記プロモーターとして、本発明の遺伝子発現調節配列（ＨＲＥ−ＴＥＲＴ，ＨＲＥ−Ｅ２Ｆ，ＨＲＥ−ＴＥＲＴＥ２Ｆ又はＨＲＥ−Ｅ２Ｆ−ＴＥＲＴ）又は通常的なプロモーターを利用することができる。トランス遺伝子に結合される通常的なプロモーターは、好ましくは動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞で作動し、トランス遺伝子の転写を調節できるものであって、哺乳動物ウイルス由来のプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーターを含み、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ  ｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子プロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子プロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子プロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子プロモーター、ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子プロモーター、誘導性プロモーター、癌細胞特異的プロモーター（例えば、ＴＥＲＴプロモーター、ＰＳＡプロモーター、ＰＳＭＡプロモーター、ＣＥＡプロモーター、Ｅ２Ｆプロモーター及びＡＦＰプロモーター）及び組織特異的プロモーター（例えば、アルブミンプロモーター）を含むが、これに限定されるものではない。
【００６０】
トランス遺伝子を発現させるための発現コンストラクトにおいてトランス遺伝子の下流にポリアデニル化配列が結合されていることが好ましい。前記ポリアデニル化配列は、牛成長ホルモンターミネーター（Ｇｉｍｍｉ，Ｅ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：６９８３−６９９８（１９８９））、ＳＶ４０由来のポリアデニル化配列（Ｓｃｈｅｋ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：５３８６−５３９３（１９９２））、ＨＩＶ−１  ｐｏｌｙＡ（Ｋｌａｓｅｎｓ，Ｂ．Ｉ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１８７０−１８７６（１９９８））、β−グロビンｐｏｌｙＡ（Ｇｉｌ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ４９：３９９−４０６（１９８７））、ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｏｌｙＡ（Ｃｏｌｅ，Ｃ．Ｎ．ａｎｄ  Ｔ．Ｐ．Ｓｔａｃｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２１０４−２１１３（１９８５））、又はポリオマーウイルスｐｏｌｙＡ（Ｂａｔｔ，Ｄ．Ｂ  ａｎｄ  Ｇ．Ｇ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４７８３−４７９０（１９９５））を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
最も好ましくは、本発明の治療学的トランス遺伝子は、アポリポタンパク質Ｋｌｉｎｇｌｅ８（ＬＫ８）遺伝子、シトシンキナーゼ（ＣＤ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、リラクシン遺伝子、及びデコリン遺伝子から構成された群から選択される一つ又は二つ以上の遺伝子である。
【００６２】
デコリンは、ＴＧＦ（ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）−βの活性を抑制させることにより、コラーゲンの繊維化を防ぎ、細胞外基質の構成（ｍａｔｒｉｘ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）に関与して、腫瘍細胞成長を抑制し、腫瘍の形成と成長に拮抗剤として作用する。
【００６３】
アポリポタンパク質Ｋｌｉｎｇｌｅ８（ＬＫ８）は、血管内皮細胞の増殖を阻害することにより、腫瘍の成長及び増殖を阻害することが知られている。
【００６４】
チミジンキナーゼ（ＴＫ）は、チミジンだけではなく、ヌクレオチド類似体でありながら抗ウイルス製剤として利用されるガンシクロビルもリン酸化させることができ、リン酸化されたガンシクロビル−トリホスフェートは、ＤＮＡ合成時、ＤＮＡ鎖に挿入され、ＤＮＡ鎖形成を中断させ、結果的にＤＮＡ合成を抑制する。ＴＫが移入されなかった癌細胞にもガンシクロビル−トリホスフェートが入って細胞死を起こし傍観者効果（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ）を誘導することができ、癌細胞退縮による癌細胞特異的免疫反応が誘導されることによっても傍観者効果を誘導することができる。
【００６５】
シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）は、毒性のない５−ＦＣ（５−ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）を強力な細胞毒性を有する５−ＦＵ（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）に転換させて、癌細胞退縮効果があることが報告された。
【００６６】
本発明の他の様態によると、本発明は、（ａ）前記本発明の組換えアデノウイルスの治療学的有効量と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体とを含む抗腫瘍組成物を提供する。
【００６７】
本発明の他の様態によると、本発明は、前記本発明の組換えアデノウイルスの治療学的有効量を含む抗腫瘍組成物を哺乳動物対象に投与する工程を含む癌治療方法を提供する。
【００６８】
本発明の組成物に含まれる組み換えアデノウイルスは、上述のように、多様な腫瘍細胞に対して退縮効能を示すため、本発明の薬剤学的組成物は、腫瘍に係る様々な疾病又は疾患、例えば、胃癌、肺癌、乳房癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌、子宮頸部癌などの治療に利用できる。本明細書において、‘治療’は、（ｉ）腫瘍細胞形成の予防；（ｉｉ）腫瘍細胞の除去による、腫瘍に係る疾病又は疾患の抑制；及び（ｉｉｉ）腫瘍細胞の除去による、腫瘍に係る疾病又は疾患の軽減を意味する。したがって、本明細書における用語‘治療学的有効量’は、上記した薬理学的効果を達成するに十分な量を意味する。
【００６９】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを更に含むことができる。
【００７０】
本発明の薬剤学的組成物は、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、又は、局部投与を利用して投与することができる。卵巣癌で腹腔内に投与する場合及び肝癌で門脈に投与する場合は、注入方法により投与することができ、乳房癌の場合は、腫瘍塊に直接注射して投与することができ、結腸癌の場合は、浣腸で直接注射して投与することができて、膀胱癌の場合は、カテーテル内に直接注射して投与することができる。
【００７１】
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、疾病症状の程度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって様々であり、普通に熟練した医者は、目的する治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。一般に、本発明の薬剤学的組成物は、１×１０５〜１×１０１５ｐｆｕ／ｍＬの組換えアデノウイルスをを含み、通常的に、１×１０１０ｐｆｕを二日に一回、２週間注射する。
【００７２】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造する。この際、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エリキシル剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態でもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができるが、これらに限定されない。
【００７３】
本発明の薬剤学的組成物は、単独療法として利用してもよいが、他の通常的な化学療法又は放射療法と共に利用してもよく、このような並行療法を実施する場合は、より効果的に癌治療をすることができる。本発明の組成物と共に利用できる化学療法剤は、シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチナ、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びメトトレキサートなどを含む。本発明の組成物と共に利用できる放射療法は、Ｘ線照射及びγ線照射などである。
【００７４】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物は、有効成分としてガンシクロビル（ＧＣＶ）を更に含む。ＧＣＶは、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）感染の予防及び治療のための抗ウイルス剤として使用されるフリン系化合物であって、ＨＳＶ−ＴＫによりリン酸化されることにより、活性化されたガンシクロビルトリホスフェート形態に転換される。このようなリン酸化されたＧＣＶは、ヌクレオチド類似体として作用し、ＤＮＡ合成時ＤＮＡ鎖に挿入されることにより、ＤＮＡ合成を抑制するようになる。したがって、本発明の組成物をＧＣＶと共に併用投与する場合、ＨＳＶ−ＴＫを発現する腫瘍特異的ウイルスに感染された癌細胞でのみＧＣＶのリン酸化が誘導されて、癌細胞を死滅させることができるようになる。また、ＨＳＶ−ＴＫが移入されなかった癌細胞においても、リン酸化されたＧＣＶが細胞間の間隙結合（ｇａｐ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を通じて入り、細胞死を起こす傍観者効果を通じて極大化された細胞退縮を誘導することができるため、非常に極大化された抗腫瘍活性を有する抗癌組成物として有用に利用できる。
【００７５】
本発明の組成物は、上述の遺伝子伝達システムとＧＣＶとを同時に含めて、一つの製剤として構成することもでき、遺伝子伝達システム組成物とＧＣＶをそれぞれ別途の製剤として併用投与することもできる。
【発明の効果】
【００７６】
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下の通りである：
（ａ）本発明は、ＨＲＥ、Ｅ２Ｆ及びＴＥＲＴの組み合わせからなる遺伝子発現調節配列及び選択的腫瘍細胞退縮活性の大きく改善された遺伝子伝達システムを提供する。
（ｂ）本発明は、特に低酸素条件で更に向上した抗腫瘍効果を示し、ＴＫ遺伝子の挿入及びＧＣＶの併用投与により、現在癌の遺伝子治療療法の最も大きい制限である、全ての癌細胞に治療遺伝子を移入することができないという欠点を大きく改善する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、ＨＲＥ６コピーとＥ２Ｆプロモーターが合体した転写調節部位により複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＥ−Ｒｄ１９，ＥＥ−Ｒｄ１９，ＨＥ−Ｒｄ１９及びＨＥＥ−Ｒｄ１９の模式図を示す図である。
【図２ａ】図２ａは、Ｅ２Ｆプロモーターが組み換えられたアデノウイルスの癌細胞選択的退縮活性を比較した結果を示す図である。
【図２ｂ】図２ｂは、Ｅ２Ｆプロモーターが組み換えられたアデノウイルスの癌細胞選択的退縮活性を比較した結果を示す図である。
【図３】図３は、ＭＴＴ分析を通じてＥ２Ｆプロモーターが組み換えられたアデノウイルスの癌細胞選択的退縮活性を比較した結果を示す図である。
【図４】図４は、Ｅ２Ｆプロモーターが組み換えられ、ＬＫ８を発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫの模式図を示す図である。
【図５】図５は、プロモーターが組み換えられ、ＬＫ８を発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫの癌細胞退縮効果を示す図である。
【図６】図６は、ＭＴＴ分析を通じてＥ２Ｆプロモーターが組み換えられ、ＬＫ８を発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫの癌細胞退縮活性の検証結果を示す図である。
【図７】図７は、ＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫ腫瘍選択的複製可能アデノウイルスの生体内抗腫瘍効果を検証するために、ヒト肺癌細胞株であるＡ５４９細胞株をヌードマウスの腹部皮下に注射して形成された腫瘍に１×１０１０  ＶＰのＲｄ１９又はＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫアデノウイルスを陰性対照群であるＰＢＳと共に二日間隔で３回腫瘍内に投与した後、腫瘍の成長を観察した結果を示す図である。
【図８】図８は、ＨＲＥ６、Ｅ２Ｆ、及びＴＥＲＴが組み換えられたプロモーターによりＧＦＰ発現が調節される複製不能アデノウイルスであるｄＥ１−ＨｍＴＥ−ｋ３５／ＧＦＰ及びｄＥ１−ＨＥｍＴ−ｋ３５／ＧＦＰの模式図を示す図である。
【図９ａ】図９ａは、様々な癌細胞株においてｄＥ１−ＨｍＴＥ−ｋ３５／ＧＦＰ及びｄＥ１−ＨＥｍＴ−ｋ３５／ＧＦＰアデノウイルスの遺伝子伝達効率を比較した結果を示す図である（ボックス内の数字は、平均蛍光強度である）。
【図９ｂ】図９ｂは、様々な癌細胞株においてｄＥ１−ＨｍＴＥ−ｋ３５／ＧＦＰ及びｄＥ１−ＨＥｍＴ−ｋ３５／ＧＦＰアデノウイルスの遺伝子伝達効率を比較した結果を示す図である（ボックス内の数字は、平均蛍光強度である）。
【図１０】図１０は、ＣＭＶプロモーター又はＨＥｍＴ組換えプロモーターによるＧＦＰ発現能を比較した結果を示した図である。
【図１１】図１１は、ＨＲＥ６コピーとＥ２Ｆ、及びＴＥＲＴが組み換えられたプロモーターにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５及びＨｍＴＥ−Ｒｄ１９−ｋ３５の模式図を示した図である。
【図１２】図１２は、ＨＥｍＴプロモーターにより複製が調節されてデコリンを発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮの模式図を示した図である。
【図１３】図１３は、デコリンとＣＤＴＫを発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスの模式図を示した図である。
【図１４】図１４は、ＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮ腫瘍選択的退縮アデノウイルスによるデコリン発現検証結果を示した図である。
【図１５】図１５は、ＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＤＣＮ腫瘍選択的退縮アデノウイルスの癌細胞選択的退縮活性の比較検証結果を示した図である。ａは、アデノウイルスに感染された脳癌細胞株、ｂは、アデノウイルスに感染された頭頸部癌細胞株、ｃは、アデノウイルスに感染されたその他の種々の癌細胞株、ｄは、アデノウイルスに感染された正常細胞株である。
【図１６ａ】図１６ａは、デコリンを発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＲｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮ及びＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮの癌細胞退縮活性を比較検証した結果を示した図である。
【図１６ｂ】図１６ｂは、デコリンを発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＲｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮ及びＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮの癌細胞退縮活性を比較検証した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【００７９】
Ｅ−Ｒｄ１９，ＥＥ−Ｒｄ１９，ＨＥ−Ｒｄ１９及びＨＥＥ−Ｒｄ１９の製作
Ｅ２Ｆプロモーター２コピーによりアデノウイルスの腫瘍選択的退縮活性がさらに向上したアデノウイルスを製作するために、ｐＳＰ７２−Ｅ２ＦクローニングベクターからＳａｌＩ／ＮｈｅＩでＥ２ＦプロモーターＤＮＡを切り取った後、ｐ△Ｅ１ｓｐ１Ｂ−Ｅ２ＦクローニングベクターのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ位置に挿入してｐ△Ｅ１ｓｐ１Ｂ−Ｅ２Ｆ−Ｅ２Ｆベクターを製作し、このベクターのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ部位にＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切り取ったＲｂ７△１９  ＤＮＡをサブクローニングして、Ｅ２Ｆプロモーター２コピーを有したｐ△Ｅ１ｓｐ１Ｂ−Ｅ２Ｆ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂ７△１９アデノウイルスＥ１シャトルベクターを製作した。製作したｐ△Ｅ１ｓｐ１Ｂ−Ｅ２Ｆ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂ７△１９シャトルベクターを、アデノウイルストータルベクターであるｄｌ３２４  ＢｓｔのＥ１部分に相同組み換えさせて、腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＥＥ−Ｒｄ１９を製作した。
【００８０】
また、低酸素症の腫瘍においてより活性を有する腫瘍選択的退縮アデノウイルスを開発するために、ＨＲＥ６コピーとＥ２Ｆプロモーターを合体させて、合体したプロモーターにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスを製作した。まず、ＨＲＥ６コピーとＥ２Ｆプロモーターとが合体したＥ１アデノウイルスシャトルベクターを製作するために、Ｅ１シャトルベクターであるｐ△Ｅ１ｓｐ１ＡのＸｈｏＩ部位に、ｐＳＰ  ７２−ＨＲＥ６をＳａｌＩ／ＸｈｏＩで切断して得たＨＲＥ６コピーＤＮＡを挿入してｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ−ＨＲＥ６アデノウイルスＥ１シャトルベクターを製作した。
【００８１】
製作したｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ−ＨＲＥ６アデノウイルスＥ１シャトルベクターのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ部位に、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切り取ったＲｂ７△１９  ＤＮＡを挿入してｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ−ＨＲＥ６−Ｒｂ７△１９を製作した。最後に、ｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ−ＨＲＥ６−Ｒｂ７△１９のＸｂａＩ／ＥｃｏＲＶ部位に、ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＶで切り取ったＥ２Ｆ  ＤＮＡをサブクローニングして、ＨＲＥ６コピーとＥ２Ｆプロモーターとが合体したプロモーターを有したＥ１シャトルベクターであるｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ−ＨＲＥ６−Ｅ２Ｆ−Ｒｂ７△１９を製作した。製作したｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ−ＨＲＥ６−Ｅ２Ｆ−Ｒｂ７△１９アデノウイルスＥ１シャトルベクターを、アデノウイルストータルベクターでありｄｌ３２４  ＢｓｔのＥ１部分に相同組み換えさせて腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＨＥ−Ｒｄ１９を製作完了した。
【００８２】
さらに、Ｅ２Ｆプロモーター２コピーのプロモーターとＨＲＥ６とを同時に合体することにより、Ｅ２Ｆプロモーター２コピーによりさらに向上した腫瘍選択的退縮活性と共に低酸素症の腫瘍で活性をさらに増加した、より改善された腫瘍選択的退縮アデノウイルスを製作するために、ｐＳＰ７２−Ｅ２ＦクローニングベクターからＳａｌＩ／ＮｈｅＩでＥ２Ｆプロモーターを切り取った後、ｐ△Ｅ１ｓｐ１Ｂ−Ｅ２ＦクローニングベクターのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ位置に挿入してｐ△Ｅ１ｓｐ１Ｂ−Ｅ２Ｆ−Ｅ２Ｆベクターを製作し、ｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ−ＨＲＥ６をＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ制限酵素で切断し、ｐ△Ｅ１ｓｐ１Ｂ−Ｅ２ＦＥ２ＦをＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩ制限酵素で切断した後、ライゲーションして、ｐ△Ｅ１ｓｐ１Ｂ−ＨＲＥ６−Ｅ２Ｆ−Ｅ２Ｆを製作した。このように製作したＥ１シャトルベクターをアデノウイルストータルベクターであるｄｌ３２４  ＢｓｔのＥ１部分に相同組み換えさせて腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＨＥＥ−Ｒｄ１９を製作した。
【００８３】
Ｅ−Ｒｄ１９，ＥＥ−Ｒｄ１９，ＨＥ−Ｒｄ１９及びＨＥＥ−Ｒｄ１９プロモーターを有する腫瘍選択的退縮アデノウイルスの癌細胞退縮活性検証−ＭＴＴ分析
前記製作したＥ−Ｒｄ１９、ＥＥ−Ｒｄ１９、及びＨＥＥ−Ｒｄ１９腫瘍選択的退縮アデノウイルスの癌細胞特異的退縮活性を検証するために、それぞれのウイルスを様々な濃度の力価で、種々の癌細胞と、ＢＪ及びＭＲＣ５のような正常細胞に感染させた後、細胞退縮の程度を比較観察した。図２から分かるように、ＨＲＥ−Ｅ２Ｆ−Ｅ２Ｆプロモーターにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルス（ＨＥＥ−Ｒｄ１９）の癌細胞退縮活性は、Ｅ２Ｆ，ＨＲＥ−Ｅ２Ｆ又はＥ２Ｆ−Ｅ２Ｆにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルス（Ｅ−Ｒｄ１９，ＨＥ−Ｒｄ１９，ＥＥ−Ｒｄ１９）より優れた癌細胞退縮力を示すことを確認し、特に、本発明に使用された全ての癌細胞株において組み換えられたＨＲＥＥ２Ｆ−Ｅ２Ｆプロモーターにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルス（ＨＥＥＲｄ１９）の癌細胞退縮活性が、対照群であるＲｄ１９又は野生型アデノウイルス（ＸＣ）と比較して類似しているか、より向上したことが観察されたのに対し、正常細胞株では、野生型アデノウイルスに比べ、細胞退縮力が減少することを確認することができ、癌細胞特異性にも優れていることを確認した。癌細胞退縮活性をより定量化するためのＭＴＴ分析結果においても、組み換えられたＨＲＥ−Ｅ２Ｆ−Ｅ２Ｆプロモーターにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルス（ＨＥＥ−Ｒｄ１９）の癌細胞退縮活性が、対照群であるＡｄ−Ｒｂ７△１９又は野生型アデノウイルスと比較して類似しているか、より向上したことを確認し、ＨＥＥ−Ｒｄ１９の癌細胞退縮活性がＨＲＥにより、正常条件に比べ低酸素条件でさらに増加したことを確認した（図３）。これと同様に、ＨＲＥ６が組み合わされたＨＥ−Ｒｄ１９の癌細胞退縮活性がＥ−Ｒｄ１９に比べて低酸素症状態で増加することを確認することができ、低酸素症状態でＨＲＥ６がエンハンサーとして作用することが分かった。
【００８４】
Ｅ２Ｆプロモーターが組み換えられてＬＫ８を発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスの製作
血管内皮細胞の増殖を阻害するＬＫ８が挿入されたＥ１シャトルベクターを製作するために、ｐｃＤＮＡに挿入されているＬＫ８遺伝子をＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで切り取った後、ＮｈｅＩ／ＳａｌＩを処理したｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ−ＨＲＥ−Ｅ２Ｆ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂ７△１９に挿入してＥ１アデノウイルスシャトルベクターとしてｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ−ＬＫ８−ＨＲＥ−Ｅ２Ｆ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂ７△１９を製作した。アデノウイルストータルベクターであるｄｌ３２４−３５ＫのＥ１部分をＢｓｔＢＩ制限酵素で切断した後、ＸｍｎＩで切断したＬＫ８を発現するＥ１シャトルベクターｐ△Ｅ１ｓｐ１Ａ−ＬＫ８−ＨＲＥ−Ｅ２Ｆ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂ７△１９を相同組み換えてＥ１にＬＫ８を発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫを製作した（図４）。
【００８５】
製作したアデノウイルスを、Ａ５４９細胞株で増殖させ、制限力価分析（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｔｉｔｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）で、生産されたアデノウイルスの力価（プラーク形成単位；ＰＦＵ）を算出した（図４）。
【００８６】
Ｅ２Ｆプロモーターが組み換えられてＬＫ８を発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫの癌細胞退縮活性検証
ＬＫ８を発現する組み換えられたＥ２Ｆプロモーターにより複製が調節されるアデノウイルスであるＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫの癌細胞退縮活性を検証するために、それぞれのウイルスを様々な濃度の力価で癌細胞に感染させた後、癌細胞退縮程度を比較観察した（図５）。図５から分かるように、ＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫの癌細胞退縮活性力は、対照群であるＲｄ１９又は野生型アデノウイルスであるＸＣと比較し、非常に向上したことを観察することができた。また、ＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫの癌細胞退縮効果をより定量化するためにＭＴＴ分析を行った結果、種々のヒト肺癌細胞株（Ａ５４９，Ｈ３５８，Ｈ２００９，Ｈ５９６，Ｈ２１７２，ＨＣＣ８２７）に、陰性対照群である複製不能アデノウイルスのｄＥ１、ファイバーを置換しなかった対照群複製可能アデノウイルスのＲｄ１９、修飾されたＥ２Ｆプロモーターにより複製が調節されてアデノウイルスタイプ３５のファイバーで置換された腫瘍選択的退縮アデノウイルスのＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫウイルスを０．１−０．５ＭＯＩ力価で感染させた後、時間帯別に生き残った細胞の生存率をＭＴＴ分析を通じて測定した（図６）。図６から分かるように、本実験に利用された全ての肺癌細胞株において、対照群ウイルスであるＲｄ１９に比べ、ＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫの細胞退縮活性が増加したことを観察することができた。特に、Ｈ３２２細胞株では、ファイバーが置換されなかった対照群ウイルスであるＲｄ１９が、アデノウイルスタイプ３５のファイバーで置換された腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫと類似したウイルス複製能と癌細胞退縮活性を確認し、このような結果は、Ｈ３２２がアデノウイルス細胞受容体であるＣＡＲ（コクサッキーウイルス・アデノウイルス受容体）の発現が高く、タイプ３５ファイバーのレセプターであるＣＤ４６の発現が低いことと一致する結果である。上記の結果を要約すると、本研究で製作した修飾されたＥ２Ｆプロモーターにより複製が調節され、アデノウイルスタイプ３５ファイバーで置換した改善された腫瘍選択的退縮アデノウイルスのＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫは、プロモーターの組み換えとファイバーの置換による癌細胞感染能が増加し、これにより、効果的な癌細胞退縮活性を誘導することを検証することができた。
【００８７】
Ｅ２Ｆプロモーターが組み換えられてＬＫ８を発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫの抗腫瘍効果検証
ＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫ腫瘍選択的複製可能アデノウイルスの生体内抗腫瘍効果を検証するために、ヒト肺癌細胞株であるＡ５４９細胞株をヌードマウスの腹部皮下に注射して、形成された腫瘍に、１×１０１０  ＶＰのＲｄ１９又はＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫアデノウイルスを陰性対照群のＰＢＳと共に二日間隔で３回腫瘍内に投与した後、腫瘍の成長を観察した（図７）。対照群のＰＢＳを投与したマウスの場合、ウイルス投与後２５日頃に腫瘍の容積が約５００ｍｍ３に急激に成長したが、腫瘍特異的退縮アデノウイルスであるＲｄ１９又はＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫを投与した場合は、腫瘍の成長が非常に遅延されることを確認した。即ち、Ｒｄ１９又はＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫアデノウイルスを投与したマウスの場合、ウイルス投与後２５日頃に腫瘍の容積が約３００ｍｍ３又は１００ｍｍ３で、それぞれ対照群に比べて６０％と２０％に大いに減少することを確認した。また、現在商品化された遺伝子治療剤であるゲンディシンを投与したマウスの場合、ウイルス投与後２５日に腫瘍の容積が約３５０ｍｍ３であって、ＨＥＥ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＬＫは、ゲンディシンに比べても著しく優れた抗腫瘍効果が誘導されることを確認することができた。
【００８８】
Ｅ２ＦとＴＥＲＴプロモーターが組み換えられた複製不能アデノウイルス（ＨＲＥ６−ＴＥＲＴ−Ｅ２Ｆ又はＨＲＥ６−Ｅ２Ｆ−ＴＥＲＴ）の製作
ＨＲＥ６コピー、修飾されたＴＥＲＴプロモーター及びＥ２Ｆプロモーターを合体させたプロモーターによるアデノウイルスの複製能の差を確認するために、まず、ＨＲＥ６コピーと修飾されたＴＥＲＴプロモーター及びＥ２ＦプロモーターをＨＲＥ６／ＴＥＲＴ／Ｅ２Ｆ順に組み換えたプロモーターによりＧＦＰの発現が調節される複製不能アデノウイルスを製作した。まず、本発明者らが製作したｐＳＰ７２−ｍＴＥＲＴのＳｆｕＩ，ＳａｌＩ部位に、ｐＳＰ７２−Ｅ２ＦベクターからＣｌａＩ，ＳａｌＩ制限酵素で切り取ったＥ２ＦプロモーターをクローニングしてｐＳＰ７２−ＴＥＲＴ−Ｅ２Ｆを製作し、ＣｌａＩ部位にｐＧＬ３−ＨＲＥ６−ＡＰＦベクターからＣｌａＩ制限酵素で切り取ったＨＲＥ６コピーをクローニングしてｐＳＰ７２−ＨＲＥ６／ＴＥＲＴ／Ｅ２Ｆを製作した。次いで、アデノウイルスＥ１シャトルベクターであるｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）をＸｈｏＩ，ＥｃｏＲＩで切り取って、ｐＳＰ７２−ＨＲＥ６／ＴＥＲＴ／Ｅ２ＦをＳａｌＩ，ＥｃｏＲＩで切り取った組み換えプロモーターＨＲＥ６／ＴＥＲＴ／Ｅ２ＦをクローニングしたｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−ＨＲＥ６／Ｅ２Ｆ／ＴＥＲＴを製作した。
【００８９】
ｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−ＨＲＥ６／Ｅ２Ｆ／ＴＥＲＴをＥｃｏＲＩ，ＸｂａＩで切断し、ｐＣＤＮＡ３．１／ｚｅｏ−ＥＧＦＰをＥｃｏＲＩ，ＮｈｅＩで切断して得たＥＧＦＰをクローニングして、ｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−ＨＲＥ６／ＴＥＲＴ／Ｅ２Ｆ−ＥＧＦＰシャトルベクターを完成した。
【００９０】
また、ＨＲＥ６コピー、Ｅ２Ｆプロモーター及び修飾されたＴＥＲＴプロモーターをＨＲＥ６／Ｅ２Ｆ／ＴＥＲＴ順に組み換えたプロモーターによりＧＦＰの発現が調節される複製不能アデノウイルスを製作するために、本発明者らが製作したｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｅ２ＦＴＥＲＴ−Ｒｂ７Δ１９をＥｃｏＲＩ，ＣｌａＩで切断して得たＥ２Ｆ−ＴＥＲＴを、Ｅ１シャトルベクターであるｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）のＥｃｏＲＩ，ＣｌａＩ部位に挿入してｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｅ２Ｆ−ＴＥＲＴを製作した。ｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｅ２Ｆ−ＴＥＲＴのＣｌａＩ部位にｐＧＬ３−ＨＲＥ６−ＡＰＦベクターからＣｌａＩ制限酵素で切り取ったＨＲＥ６をクローニングしてｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−ＨＲＥ６／Ｅ２Ｆ／ＴＥＲＴを製作した。次いで、ｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−ＨＲＥ６／Ｅ２Ｆ／ＴＥＲＴをＥｃｏＲＩ，ＸｂａＩで切断して、ｐＣＤＮＡ３．１／ｚｅｏ−ＥＧＦＰをＥｃｏＲＩ，ＮｈｅＩで切断して得たＥＧＦＰを挿入してｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−ＨＲＥ６／Ｅ２Ｆ／ＴＥＲＴ−ＥＧＦＰシャトルベクターを完成した。
【００９１】
このように製作したｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−ＨＲＥ６／ＴＥＲＴ／Ｅ２Ｆ−ＥＧＦＰ又はｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−ＨＲＥ６／Ｅ２Ｆ／ＴＥＲＴ−ＥＧＦＰアデノウイルスＥ１シャトルベクターをアデノウイルストータルベクターであるｄＥ１−ｋ３５のＥ１部分に相同組み換えさせてｄＥ１−ＨｍＴＥ−ｋ３５／ＧＦＰとｄＥ１−ＨＥｍＴｋ３５／ＧＦＰアデノウイルスを製作した（図８）。
【００９２】
ｄＥ１−ＨｍＴＥ−ｋ３５／ＧＦＰとｄＥ１−ＨＥｍＴ−ｋ３５／ＧＦＰアデノウイルスの遺伝子伝達効率の比較
製作した組み換えプロモーターの活性を比較するために、種々の癌細胞に、製作した複製不能アデノウイルスを感染させて、３６時間後ＦＡＣＳを利用してＧＦＰの発現を確認した（図９）。図９から分かるように、ＨＲＥエンハンサーがプロモーターに挿入されている二種類のｄＥ１−ＨＥｍＴ−ｋ３５／ＧＦＰとｄＥ１−ＨｍＴＥ−ｋ３５／ＧＦＰウイルスにより、低酸素条件におけるＧＦＰ発現が正常条件に比べ大きく増加することを確認した。このことは、ＨＲＥが低酸素条件でエンハンサーとして作用し、ウイルス（ｄＥ１−ＨＥｍＴ−ｋ３５／ＧＦＰ，ｄＥ１−ＨｍＴＥ−ｋ３５／ＧＦＰ）の遺伝子の伝達効率を増加させることができることを意味する。また、脳癌細胞株であるＵ３４３とその他の癌細胞株（Ｈｅｐ１，ＭＤＡ  ＭＢ２３１）においてｄＥ１−ＨＥｍＴｋ３５／ＧＦＰとｄＥ１−ＨｍＴＥ−ｋ３５／ＧＦＰによる遺伝子伝達効率が優れており、特に、ｄＥ１−ＨＥｍＴ−ｋ３５／ＧＦＰが感染した細胞のＧＦＰ発現が、ｄＥ１−ＨｍＴＥ−ｋ３５／ＧＦＰが感染した細胞と比較して著しく増加することを確認した。このような結果を通じて、癌細胞におけるＨＥｍＴ組み換えプロモーターの活性が、ＨｍＴＥ組み換えプロモーターの活性に比べて大きく増加することを確認した。図１０から分かるように、ＣＭＶプロモーターによりＧＦＰの発現が調節されるｄＥ１−ＣＭＶ−ｋ３５／ＧＦＰのＧＦ発現が、癌細胞株であるＵ３７３ＭＧと正常細胞であるＢＪ，ＣＢＨＥＬ，ＩＭＲ９０の両方において高い。これに対して、ｄＥ１−ＨＥｍＴ−ｋ３５／ＧＦＰによるＧＦＰ発現は、癌細胞株であるＵ３７３ＭＧではｄＥ１−ＣＭＶ−ｋ３５／ＧＦＰによるＧＦＰ発現と類似していた。したがって、プロモーター活性が非常に高いことを確認した。また、ｄＥ１−ＨＥｍＴ−ｋ３５／ＧＦＰによるＧＦＰ発現は、正常細胞では、何の処理もしなかった陰性対照群と類似しており、したがって、ＨＥｍＴプロモーターの癌細胞特異性が非常に高いことを確認した。
【００９３】
ＨＲＥ６コピー，Ｅ２Ｆプロモーター，及び修飾されたＴＥＲＴプロモーターが組み換えられたプロモーターにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＨＥｍＴＲｄ１９−ｋ３５とＨｍＴＥ−Ｒｄ１９−ｋ３５の製作
ＨＲＥ６コピー、Ｅ２Ｆプロモーター、及び修飾されたＴＥＲＴプロモーター順に合体された組み換えプロモーターにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５を製作するために、まず、本発明者らが製作したＥ１シャトルベクターのΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｒｂ７△１９をＣｌａＩ，ＳａｌＩで切断し、ｐＳＰ７２−Ｅ２ＦにＣｌａＩ，ＳａｌＩで切断して得たＥ２Ｆプロモーターを挿入してｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｒｂ７△１９−Ｅ２Ｆを製作した。これを再びＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ部位で切断した後、ｐｃＤＮＡ３．１−ｍＴＥＲＴをＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ制限酵素で切断して得た修飾されたＴＥＲＴプロモーターとクローニングし、そして、ｐＳＰ７２−Ｅ２ＦベクターからＣｌａＩ，ＳａｌＩ制限酵素で切り取ったＥ２ＦプロモーターをクローニングしてｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｒｂ７△１９−Ｅ２Ｆ−ＴＥＲＴを製作した。最後に、ｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｒｂ７△１９−Ｅ２Ｆ−ＴＥＲＴのＣｌａＩ部位にｐＧＬ３−ＨＲＥ６−ＡＰＦベクターからＣｌａＩ制限酵素で切り取ったＨＲＥ６をクローニングして、アデノウイルスＥ１シャトルベクターであるｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｒｂ７△１９−ＨＲＥ６／Ｅ２Ｆ／ｍＴＥＲＴを製作した。
【００９４】
一方、ＨＲＥ６コピーと修飾されたＴＥＲＴプロモーター、及びＥ２Ｆプロモーター順に組み換えられたプロモーターにより複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＨｍＴＥ−Ｒｄ１９−ｋ３５を製作するために、まず、本発明者らが製作したアデノウイルスＥ１シャトルベクターのｐΔＥ１ｓｐ１Ａ（Ψ）をＥｃｏＲＶ，ＨｉｎｄＩＩＩで切断して、ｐＳＰ７２−Ｅ２ＦをＥｃｏＲＶ，ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得たＥ２Ｆプロモーターを挿入してｐΔＥ１ｓｐ１Ａ（Ψ）−Ｅ２Ｆを製作した。
【００９５】
Ｅ１シャトルベクターのｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）をＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ部位で切断した後、ｐｃＤＮＡ３．１−ｍＴＥＲＴをＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ制限酵素で切断して得たＴＥＲＴプロモーターとクローニングしてｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−ＴＥＲＴを製作した。ｐΔＥ１ｓｐ１Ａ（Ψ）−Ｅ２ＦのＣｌａＩ，ＥｃｏＲＶ部位にΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−ＴＥＲＴをＣｌａＩ，ＥｃｏＲＶで切断して得た修飾されたＴＥＲＴを挿入してｐΔＥ１ｓｐ１Ａ（Ψ）−ＴＥＲＴ−Ｅ２Ｆを製作した。このように製作したｐΔＥ１ｓｐ１Ａ（Ψ）−ＴＥＲＴ−Ｅ２ＦをＣｌａＩ，ＳａｌＩで切断して、本発明者らが製作したＥ１シャトルベクターであるｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｒｂ７△１９のＣｌａＩ，ＳａｌＩ部位に挿入したｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｒｂ７△１９−ＴＥＲＴ−Ｅ２Ｆを製作した。最後に、ｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｒｂ７△１９−ＴＥＲＴ−Ｅ２ＦのＣｌａＩ部位にｐＧＬ３−ＨＲＥ６−ＡＰＦベクターからＣｌａＩ制限酵素で切り取ったＨＲＥ６をクローニングしてアデノウイルスＥ１シャトルベクターであるΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｒｂ７△１９−ＨＲＥ６／ＴＥＲＴ／Ｅ２Ｆを製作した。このように製作したアデノウイルスＥ１シャトルベクターであるｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｒｂ７△１９−ＨＲＥ６／ＴＥＲＴ／Ｅ２Ｆ，ｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｒｂ７△１９−ＨＲＥ６／ＴＥＲＴ／Ｅ２Ｆを、アデノウイルストータルベクターであるｄｌ３２４−３５ＫのＥ１部分に相同組み換えさせて、組み換えられたプロモーターによりウイルスの複製が調節される腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＨＥｍＴＲｄ１９−ｋ３５とＨｍＴＥ−Ｒｄ１９−ｋ３５の製作を完了した。
【００９６】
ＨＥｍＴプロモーターにより複製が調節されて、細胞外基質を分解することができるデコリン遺伝子を発現するＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮ腫瘍選択的退縮アデノウイルスの製作
デコリン（Ｄｅｃｏｒｉｎ）は、ＳＬＲＰ（スモールロイシンリッチプロテオグリカン）分類に属するタンパク質であって、１０個〜１２個のロイシンリッチな反復配列から構成されており、コア部位は、アーチ状になっており、細胞外基質に存在する種々の成長因子あるいはデコリン受容体との結合が容易な構造に形成されている。デコリンは、ＴＧＦ（ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）−βの活性を抑制させることにより、コラーゲンの繊維化を防ぎ、細胞外基質アセンブリーに関与し、腫瘍細胞成長を抑制し、腫瘍の形成と成長に天然の拮抗剤として作用すると知られている。また、デコリンは、成長因子や金属イオンのような細胞外基質の構成成分と反応し、ＭＭＰ−１のような様々な種類のＭＭＰの発現を促進させ細胞外基質を分解させる。最近の研究結果によると、デコリンを、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）の新しい生物学的リガンドとして、様々な種類の癌細胞に処理すると、ＥＧＦＲと結合することにより、ＥＧＦＲの役割を不活性化させると共に、内在性のサイクリン依存性ｐ２１ＷＡＦ１の発現が促進され、細胞周期Ｇ１停止誘導により細胞退縮を誘導することが報告された。したがって、デコリンを発現するアデノウイルスは、ウイルスの拡散を増加させることにより、アデノウイルスを利用した治療遺伝子の伝達効率を高めることができるだけではなく、デコリンそのものによる癌細胞退縮効果も誘導することができる。
【００９７】
これらの事実に基づいて、アデノウイルスのＥ１部位にデコリンを発現するウイルスを製作するために、ｐＣＡ１４クローニングベクターのＢａｍＨＩ部位に切断されたデコリンＤＮＡをサブクローニングしてｐＣＡ１４−デコリンを製作した。ｐＣＡ１４／ＤＣＮＧプラスミドにＢｇｌＩＩ制限酵素を処理してＤＣＮの発現カセットを獲得し、本発明者らが製作したｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｒｂ７△１９にＢａｍＨＩ制限酵素でクローニングして、ｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｒｂ７△１９−ＤＣＮを製作した。
【００９８】
一方、プロモーターをクローニングするために、ｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｅ２Ｆ−ＴＥＲＴをＣｌａＩとＥｃｏＲＩ制限酵素を処理してＥ２Ｆ−ＴＥＲＴを獲得した後、ｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｒｂ７Δ１９−ＤＣＮＧシャトルベクターにクローニングして、ｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｅ２Ｆ−ｍＴＥＲＴ−Ｒｂ７Δ１９−ＤＣＮを製作した。ＰＧＬ３−ＨＲＥ６−ＡＦＰプラスミドで制限酵素ＣｌａＩを処理してＨＲＥ６コピーを獲得した後、ｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−Ｅ２Ｆ−ｍＴＥＲＴ−Ｒｂ７Δ１９−ＤＣＮプラスミドにＣｌａＩ制限酵素でクローニングし、ｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ψ）−ＨＲＥ６／Ｅ２Ｆ／ＴＥＲＴ−Ｒｂ７Δ１９−ＤＣＮアデノウイルスシャトルベクターを製作した。製作したアデノウイルスシャトルベクターは、ＸｍｎＩを利用して線形化した後、トータルベクターであるｄＥ１−ｋ３５と相同組み換えてＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮウイルスを製作した。以後、製作したアデノウイルスは、Ａ５４９細胞株で増殖させて大量生産した。生産されたウイルスの力価を、制限力価分析で算出した（図１２）。
【００９９】
ＨｅｍＴ組み換えプロモーターが挿入され、Ｅ１部位でデコリン遺伝子を、Ｅ３部位でＣＤＴＫを発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスであるＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＣＤＴＫ（Ｅ３）とＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮ／ＣＤＴＫの製作
ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ）は、現在最も高い頻度で使用される薬剤感受性遺伝子であって、毒性のないプロドラッグであるガンシクロビル（ＧＣＶ）をリン酸化させ、感染された細胞のＤＮＡ合成を抑制し、分裂する細胞を選択的に退縮できる癌治療遺伝子である。チミジンキナーゼ（ＴＫ）は、ＤＮＡ合成時、サルベージ経路に利用される酵素である。ＨＳＶ−ＴＫは、チミジンだけではなく、ヌクレオチド類似体でありながら抗ウイルス製剤として利用されるガンシクロビルもリン酸化させることができる。リン酸化されたガンシクロビル−トリホスフェートは、ＤＮＡ合成時、ＤＮＡ鎖に挿入され、ＤＮＡ鎖形成を中断させ、結果的にＤＮＡ合成を抑制する。また、死んだ癌細胞のアポトーシスビヒクルを、隣接した生きている癌細胞が貪食（ファゴサイトーシス）することにより、ＨＳＶ−ＴＫが移入されなかった癌細胞にもガンシクロビル−トリホスフェートが入って細胞死を起こし傍観者効果を誘導することができる。癌細胞退縮による癌細胞特異的免疫反応が誘導されることによっても傍観者効果を誘導することができる。また、ＣＤ（シトシンデアミナーゼ）は、毒性のない５−ＦＣ（５−フルオロシトシン）を強力な細胞毒性と放射線感受性を有する５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）に転換させる作用をする。最近、このようなＣＤ遺伝子を移入させた遺伝子治療において、ＣＤ遺伝子の発現による癌細胞退縮効果が報告された。このようなことに着目し、癌細胞特異的活性に優れたＨｅｍＴ組み換えプロモーターにより複製が調節されるアデノウイルスのＥ１部位でデコリン遺伝子を、Ｅ３部位ではＣＤとＴＫを同時に発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスを製作した。
【０１００】
ＣＤとＴＫを発現するアデノウイルスのＥ３シャトルベクターを製作するために、ｐＣＫｈＴＫ−ＩＲＥＳ−ｈＣＤプラスミドを、ＢａｍＨＩ制限酵素を利用してヒト型のＣＤ−ＩＲＥＳ−ＴＫを獲得した後、ｐＳＰ７２／Ｅ３／ＣＭＶ−ＰｏｌＡベクターに挿入して、ｐＳＰ７２−Ｅ３／ＣＭＶ−ＣＤ−ＩＲＥＳ−ＴＫ−ＰｏｌＡアデノウイルスＥ３シャトルベクターを製作した。製作したベクターをＰｖｕＩで線形化した後、上記で製作したＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５，ＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮトータルベクターとＥ３部位に相同組み換えて、ＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＣＤＴＫ（Ｅ３）とＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮ／ＣＤＴＫアデノウイルスをそれぞれ製作した（図１３）。
【０１０１】
ＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮ腫瘍選択的退縮アデノウイルスのデコリン発現検証（ウエスタンブロットアッセイ）
上記の方法により製作したＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮ腫瘍選択的アデノウイルスがデコリンを十分発現するかどうか確認するために、ウエスタンブロットアッセイを行った（図１４）。図１４から分かるように、本研究に使用されたＲｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮ，ＨＥｍＴＲｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮアデノウイルスによりデコリンが正常に発現していることを確認した。
【０１０２】
ＨｅｍＴ組み換えプロモーターにより複製が調節され、デコリンを発現する腫瘍選択的退縮アデノウイルスの退縮活性検証（ＣＰＥアッセイ）
上記で製作したＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＤＣＮ腫瘍選択的退縮アデノウイルスの退縮活性を検証するために、それぞれのウイルスを様々な濃度の力価で脳癌細胞株（Ｕ３７３ＭＧ，Ｕ８７ＭＧ，Ｔ９８Ｇ，Ｕ３４３）と頭頸部癌細胞株（ＣＡＬ２７，ＩＭＲ９０，ＳＪＳＡ）、その他の種々の癌細胞株（Ｈ４６０，Ｈ３５８，Ｃ３３Ａ，Ｈｅｐ１）、そして正常細胞株（ＩＭＲ９０，ＢＪ，ＣＢＨＥＬ）に感染させた後、退縮程度を比較観察した（図１５）。図１５から分かるように、デコリンを発現するＲｄ１９−Ｋ３５／ＤＣＮ又はＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＤＣＮ腫瘍選択的退縮アデノウイルスの癌細胞退縮活性が、対照群のＲｄ１９−Ｋ３５又はＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−Ｋ３５に比べ、それぞれ増加したことを観察することができた。したがって、デコリン発現による癌細胞退縮活性増大効果を確認した。
【０１０３】
ＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−Ｋ３５／ＤＣＮ腫瘍選択的退縮アデノウイルスの退縮活性検証（ＭＴＴアッセイ）
デコリンを発現するＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮ腫瘍選択的退縮アデノウイルスの退縮活性をより定量的に検証するために、脳癌細胞株（Ｕ３４３，Ｕ８７ＭＧ）とその他の種々の癌細胞株（Ｈｕｈ７，Ｃ３３Ａ）にＲｄ１９−ｋ３５，ＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５，Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮ，ＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮをそれぞれ感染させた後、退縮程度を比較観察した（図１６）。図１６から分かるように、本研究に使用された全ての癌細胞株において、ＨＥｍＴプロモーターにより複製が調節されるＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５腫瘍選択的退縮アデノウイルスの癌細胞退縮活性が、対照群であるＲｄ１９−ｋ３５より優れていることを確認した。また、デコリンを発現するＲｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮ又はＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５／ＤＣＮ腫瘍選択的退縮アデノウイルスの癌細胞退縮活性が、各ウイルスの対照群であるＲｄ１９−ｋ３５，ＨＥｍＴ−Ｒｄ１９−ｋ３５に比べ、大きく増加したことを確認することができた。
【０１０４】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１】
2013543386.tif 000003
【図２ａ】
2013543386.tif 000004
【図２ｂ】
2013543386.tif 000005
【図３】
2013543386.tif 000006
【図４】
2013543386.tif 000007
【図５】
2013543386.tif 000008
【図６】
2013543386.tif 000009
【図７】
2013543386.tif 000010
【図８】
2013543386.tif 000011
【図９ａ】
2013543386.tif 000012
【図９ｂ】
2013543386.tif 000013
【図１０】
2013543386.tif 000014
【図１１】
2013543386.tif 000015
【図１２】
2013543386.tif 000016
【図１３】
2013543386.tif 000017
【図１４】
2013543386.tif 000018
【図１５】
2013543386.tif 000019
【図１６ａ】
2013543386.tif 000020
【図１６ｂ】
2013543386.tif 000021
【配列表】
2013543386000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年6月6日(2013.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）低酸素応答配列（ＨＲＥ）エンハンサー配列と、
（ｉｉ）Ｅ２Ｆプロモーター配列とを含み、
前記Ｅ２Ｆプロモーター配列が、前記ＨＲＥエンハンサー配列の下流に位置し、前記ＨＲＥエンハンサー配列及び前記Ｅ２Ｆプロモーター配列が、協同的に同一の遺伝子の発現を促進することを特徴とする遺伝子発現調節配列。
【請求項２】
Ｅ２Ｆプロモーター配列が、２回〜１０回繰り返される請求項１に記載の遺伝子発現調節配列。
【請求項３】
ＨＲＥエンハンサー配列が、２回〜２０回繰り返される請求項１に記載の遺伝子発現調節配列。
【請求項４】
遺伝子発現調節配列が、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）プロモーター配列を更に含む請求項１に記載の遺伝子発現調節配列。
【請求項５】
遺伝子発現調節配列が、組み換えアデノウイルスベクターのＥ１領域に挿入され、５’から３’方向にＨＲＥエンハンサー配列、Ｅ２Ｆプロモーター配列及びＴＥＲＴプロモーター配列を含む請求項４に記載の遺伝子発現調節配列。
【請求項６】
（ａ）請求項１から５のいずれかに記載の遺伝子発現調節配列と、
（ｂ）前記遺伝子発現調節配列に作動的に連結された、発現させようとする目的遺伝子と、
を含むことを特徴とする腫瘍特異的発現の改善された遺伝子伝達システム。
【請求項７】
遺伝子伝達システムが、プラスミド、組換えアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリマー、リポソーム又はニオソームである請求項６に記載の遺伝子伝達システム。
【請求項８】
（ａ）アデノウイルスの末端逆位配列（ＩＴＲ）配列と、
（ｂ）（ｉ）低酸素応答配列（ＨＲＥ）エンハンサー配列と、（ｉｉ）Ｅ２Ｆプロモーター配列とを含み、前記Ｅ２Ｆプロモーター配列が、前記ＨＲＥエンハンサー配列の下流に位置し、前記ＨＲＥエンハンサー配列及びＥ２Ｆプロモーター配列が、協同的に同一の遺伝子の発現を促進する遺伝子発現調節配列と、
（ｃ）前記遺伝子発現調節配列に作動的に連結された、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、アポトーシス遺伝子及び抗血管新生遺伝子から構成された群から選択される治療学的トランス遺伝子と、
を含むことを特徴とする癌細胞特異的退縮活性の改善された組換えアデノウイルス。
【請求項９】
遺伝子発現調節配列内のＥ２Ｆプロモーター配列が、２回〜１０回繰り返される請求項８に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１０】
遺伝子発現調節配列内のＨＲＥエンハンサー配列が、２回〜２０回繰り返される請求項８に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１１】
遺伝子発現調節配列が、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）プロモーター配列を更に含む請求項８に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１２】
遺伝子発現調節配列が、組み換えアデノウイルスベクターのＥ１領域に挿入され、５’から３’方向にＨＲＥエンハンサー配列、Ｅ２Ｆプロモーター配列及びＴＥＲＴプロモーター配列を含む請求項１１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１３】
（ａ）請求項８から１２のいずれかに記載の組換えアデノウイルスの治療学的有効量と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、を含むことを特徴とする抗腫瘍組成物。
【請求項１４】
組成物が、有効成分としてガンシクロビル（ＧＣＶ）を更に含む請求項１３に記載の抗腫瘍組成物。
【国際調査報告】
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