(57)【要約】本明細書では、複数のモノクローナル抗体、単一特異性抗体、または免疫沈降抗体を含みうる、抗体のライブラリーが提供される。本明細書ではまた、抗体のライブラリーを作製および使用する方法も提供される。本明細書ではまた、標的を検出する方法であって、（ａ）標的を、抗体のライブラリー、または抗体のライブラリーを含むアレイと接触させるステップと、（ｂ）前記標的と、前記複数の抗体との結合の存在または非存在を決定するステップと、（ｃ）標的が、ライブラリーの少なくとも１つの抗体に結合する場合に、標的を検出するステップとを含む方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なる抗体を含む抗体のライブラリーであって、前記複数の異なる抗体のうちの少なくとも１０％が、同じプラットフォームにより作製される、抗体のライブラリー。
【請求項２】
前記複数の異なる抗体のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、前記同じプラットフォームにより作製される、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項３】
前記同じプラットフォームにより作製される前記複数の抗体のうちの各抗体が単一特異性抗体である、請求項１から２に記載のライブラリー。
【請求項４】
前記同じプラットフォームにより作製される前記複数の抗体のうちの各抗体の、その標的タンパク質に対する結合アフィニティーが少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である、請求項１から３に記載のライブラリー。
【請求項５】
前記結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍである、請求項４に記載のライブラリー。
【請求項６】
前記同じプラットフォームにより作製される前記複数の抗体のうちの各抗体がその標的タンパク質の天然形態に結合する、請求項１から５に記載のライブラリー。
【請求項７】
前記複数の異なる抗体が少なくとも５０の異なる抗体を含む、請求項１から６に記載のライブラリー。
【請求項８】
前記複数の異なる抗体が少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なる抗体を含む、請求項７に記載のライブラリー。
【請求項９】
前記複数の異なる抗体がヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％に結合する、請求項１から８に記載のライブラリー。
【請求項１０】
前記複数の異なる抗体が、ヒトプロテオームのうちの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合する、請求項９に記載の抗体のライブラリー。
【請求項１１】
前記複数の異なる抗体が表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合する、請求項１から１０に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記同じプラットフォームにより作製される前記複数の抗体のうちの各抗体が有する、その標的に対する結合アフィニティーが、前記同じプラットフォームにより作製される前記複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも２０％以内である、請求項１から１１に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記同じプラットフォームにより作製される前記複数の抗体のうちの各抗体が有する、その標的に対する結合アフィニティーが、前記同じプラットフォームにより作製される前記複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内である、請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項１４】
前記同じプラットフォームにより作製される前記複数の抗体のうちの各抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から１３に記載のライブラリー。
【請求項１５】
前記同じプラットフォームにより作製される前記複数の抗体のうちの各抗体が免疫沈降抗体である、請求項１から１４に記載のライブラリー。
【請求項１６】
前記同じプラットフォームにより作製される前記複数の抗体のうちの各抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１から１５に記載のライブラリー。
【請求項１７】
請求項１から１６に記載の抗体のライブラリーを含むアレイであって、各抗体が基材上に固定化されているアレイ。
【請求項１８】
前記基材が平面である、請求項１７に記載のアレイ。
【請求項１９】
前記基材が粒子である、請求項１７に記載のアレイ。
【請求項２０】
前記基材が固体材料を含む、請求項１７から１９に記載のアレイ。
【請求項２１】
前記基材が多孔性材料を含む、請求項１７から１９に記載のアレイ。
【請求項２２】
前記固定化が可逆性である、請求項１７から２１に記載のアレイ。
【請求項２３】
前記固定化が不可逆性である、請求項１７から２１に記載のアレイ。
【請求項２４】
請求項１から１６に記載のライブラリーを作製する方法であって、
ａ）動物を、複数の抗原で免疫化するステップと、
ｂ）抗体生成細胞を、前記動物から単離するステップと、
ｃ）複数の抗体を、前記抗体生成細胞から単離するステップと、
ｄ）ステップｃ）の前記複数の抗体を、ヒトプロテオームアレイによりスクリーニングするステップと、
ｅ）前記プロテオームアレイ上の単一の標的に単一特異性である抗体を、前記ライブラリーのために選択するステップと
を含む方法。
【請求項２５】
ステップｃ）の前に、前記抗体生成細胞に由来する前記複数の抗体をプレスクリーニングするステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プレスクリーニングするステップが、免疫細胞化学を実施することによる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プレスクリーニングするステップが、前記抗体生成細胞に由来する抗体の、１または複数の標的抗原を含む混合物との結合を決定することによる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記混合物が、粗溶解物、細胞、タンパク質、ペプチド、または核酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記混合物が生物学的試料を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の抗原が、粗溶解物、細胞、タンパク質、ペプチド、または核酸を含む、請求項２４から２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数の抗原が生物学的試料を含む、請求項２４から２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記生物学的試料が、組織、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液、尿道球腺液、女性射精液、汗、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹腔液、心膜液、リンパ、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、経血、膿、皮脂、膣分泌物、粘膜分泌物、糞便水分、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞液、または臍帯血である、請求項２９および３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数の抗原が、少なくとも１１，０００の異なる抗原を含む、請求項２４から３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記複数の抗原が、少なくとも１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００の異なる抗原を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数の抗原が、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％を含む、請求項２４から３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数の抗原が、ヒトプロテオームのうちの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体生成細胞がＢ細胞である、請求項２４から３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体を基材へと固定化するステップをさらに含む、請求項２４から３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記基材が平面である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記基材が粒子である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記基材が固体材料を含む、請求項３８から４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記基材が多孔性材料を含む、請求項３８から４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記固定化が可逆性である、請求項３８から４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記固定化が不可逆性である、請求項３８から４２に記載の方法。
【請求項４５】
ヒトタンパク質に単一特異性である抗体を同定する方法であって、
ａ）複数の抗体を、ヒトプロテオームアレイと接触させるステップと、
ｂ）前記複数の抗体と、前記ヒトプロテオームアレイ上に存在する標的との結合を決定するステップと、
ｃ）抗体が前記プロテオームアレイ上の単一の標的に結合する場合に、前記抗体を単一特異性と同定するステップと
を含む方法。
【請求項４６】
前記ヒトプロテオームアレイが、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％を含む、請求項２４から４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ヒトプロテオームアレイが、ヒトプロテオームのうちの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ヒトプロテオームアレイが、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含む、請求項２４から４７に記載の方法。
【請求項４９】
標的に対する抗体を同定する方法であって、
ａ）標的を、請求項１から１６に記載の抗体のライブラリーと接触させるステップと、
ｂ）前記標的と、前記複数の抗体との結合を決定するステップと、
ｃ）前記標的が、前記ライブラリーの抗体に結合する場合に、前記標的に対する抗体を同定するステップと
を含む方法。
【請求項５０】
標的に対する抗体を同定する方法であって、
ａ）標的を、請求項１７から２３に記載のアレイと接触させるステップと、
ｂ）前記標的と、前記複数の抗体との結合を決定するステップと、
ｃ）前記標的が、前記アレイの抗体に結合する場合に、前記標的に対する抗体を同定するステップと
を含む方法。
【請求項５１】
標的を同定する方法であって、
ａ）標的を、請求項１から１６に記載の抗体のライブラリーと接触させるステップと、
ｂ）前記標的と、前記複数の抗体との結合を決定するステップと、
ｃ）前記標的が、前記ライブラリーの抗体に結合する場合に、前記標的を同定するステップと
を含む方法。
【請求項５２】
標的を同定する方法であって、
ａ）標的を、請求項１７から２３に記載のアレイと接触させるステップと、
ｂ）前記標的と、前記複数の抗体との結合を決定するステップと、
ｃ）前記標的が、前記アレイの抗体に結合する場合に、前記標的を同定するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１０年６月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／３５５，３２９号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府支援の研究に対する陳述
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＲＲ０２０８３９およびＧＭ０７６１０２の下、合衆国政府の支援により成された。政府は本発明に一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
背景
生物医学コミュニティーには、可能な最高度の品質を伴い再現可能な抗体試薬を作製する信頼できる技術を求める重要な必要性が存在する。現在進行しているこの技術パイプラインの改善は、保健研究コミュニティーと、それより大きな生物医学コミュニティーとの両方に直接的な利益をもたらすであろう。
【０００４】
エピトープ、抗原、またはタンパク質の結合または検出は、研究製品業界の大きな構成要素であり、学界および製薬業界の両方に用いられるほか、診断業界および治療剤業界でも用いられる。エピトープ、抗原、またはタンパク質を検出するための抗体の使用は、新たなバイオマーカーの同定および多くのアッセイの実施に用いることができる。例えば、抗体はまた、臨床医学などのための診断適用にも広く用いられる（例えば、ＥＬＩＳＡシステムおよびラジオイムノアッセイシステム）。病理学検査室における細胞および組織の解析は、組織切片およびフローサイトメトリー解析における抗体の使用を包含する。抗体はまた、治療剤としても有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
抗体の作製は、費用がかかり、時間もかかる可能性があり、このため、ハイスループットの抗体作製法、特に、より費用効果が高く、時間もそれほどかからない、特異性の高い抗体を作製する方法が望ましい。本開示は、これらの必要を満たし、関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
本発明は一般に、抗体を作製し、生成させ、特徴付け、使用する方法およびシステムを含めた、抗体のライブラリーに関する。抗体は、高度に特異性でありうる。一部の実施形態では、抗体がモノクローナル抗体である。ライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、抗体は同じプラットフォーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）により作製される。ライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、複数の異なる抗体内または複数の異なる抗体のサブセット内では、各抗体が単一特異性抗体であるか、その標的タンパク質の天然形態に結合するか、モノクローナル抗体であるか、免疫沈降抗体であるか、ＩｇＧ抗体もしくはＩｇＧアイソタイプ抗体であるか、その標的に対する結合アフィニティーが複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーと同様である（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０％以内である）か、その標的に対する結合アフィニティーが少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）（例えば、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど）であるか、またはこれらの任意の組合せである。
【０００７】
抗体のライブラリーは、高い再現性で作製することができる。例えば、第１の抗体のライブラリーおよび第２の抗体のライブラリーでは、第１および第２のライブラリーが、異なる抗体の同じセットを含み、第１のライブラリーの各抗体が有する結合アフィニティーが、第２のライブラリーの同じ抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０％以内である。
【０００８】
本発明の一態様は、複数の異なる抗体を含み、複数の異なる抗体のうちの少なくとも１０％が、同じプラットフォームにより作製される、抗体のライブラリーである。一実施形態では、ライブラリーが、複数の異なる抗体を含み、複数の異なる抗体のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、同じプラットフォームにより作製される。
【０００９】
同じプラットフォームにより作製される複数の抗体のうちの各抗体は、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態（ｎａｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ）に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００１０】
同じプラットフォームにより作製される抗体は、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なる抗体を含むことが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００１１】
さらに別の実施形態では、同じプラットフォームにより作製される抗体は、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合し、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍである場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００１２】
同じプラットフォームにより作製される抗体は、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００１３】
本発明の別の態様は、複数の異なる抗体を含み、前記複数の異なる抗体のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％など、少なくとも１０％が単一特異性抗体である、抗体のライブラリーである。複数の異なる抗体のうちの各単一特異性抗体は、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００１４】
ライブラリーのうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を含む単一特異性抗体は、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なる抗体を含むことが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０％の複数の単一特異性抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００１５】
複数の異なる抗体のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を含む単一特異性抗体は、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０％の複数の単一特異性抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００１６】
複数の異なる抗体のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を含む単一特異性抗体は、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００１７】
本明細書ではまた、複数の異なる抗体を含み、複数の異なる抗体のうちの少なくとも１０％の、その標的である、その標的タンパク質に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である、抗体のライブラリーも提供される。その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である複数の抗体のうちの各抗体は、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００１８】
その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である抗体は、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なる抗体を含むことが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００１９】
その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である抗体は、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００２０】
その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である抗体は、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００２１】
本発明の別の態様は、複数の異なる抗体を含み、前記複数の異なる抗体のうちの少なくとも１０％が、その標的タンパク質の天然形態に結合する、抗体のライブラリーである。一実施形態では、ライブラリーが、複数の異なる抗体を含み、複数の異なる抗体のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、その標的タンパク質の天然形態に結合する。その標的タンパク質の天然形態に結合する複数の異なる抗体のうちの各抗体は、単一特異性抗体である場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００２２】
その標的タンパク質の天然形態に結合する抗体は、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なる抗体を含むことが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００２３】
さらに別の実施形態では、その標的タンパク質の天然形態に結合する抗体は、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００２４】
その標的タンパク質の天然形態に結合する抗体は、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００２５】
本発明の別の態様は、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なるモノクローナル抗体など、少なくとも５０の異なるモノクローナル抗体を含む、抗体のライブラリーである。ライブラリーの各抗体は、単一特異性である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００２６】
さらに別の実施形態では、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なる抗体など、少なくとも５０の異なるモノクローナル抗体を含む抗体のライブラリーが、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合し、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のサブセットが単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００２７】
少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なるモノクローナル抗体など、少なくとも５０の異なるモノクローナル抗体を含む抗体のライブラリーが、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能であり、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のサブセットが単一特異性である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００２８】
本発明のさらに別の態様は、ヒトプロテオームのうちの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％など、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％に結合する複数の異なる抗体を含む、抗体のライブラリーである。複数の異なる抗体の各抗体は、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００２９】
ヒトプロテオームのうちの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％など、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％に結合する複数の異なる抗体を含む抗体のライブラリーは、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なる抗体を含むことが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００３０】
ヒトプロテオームのうちの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％など、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％に結合する複数の異なる抗体を含む抗体のライブラリーは、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００３１】
本発明の別の態様は、複数の異なる抗体を含み、前記複数の異なる抗体のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％など、少なくとも１０％の、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の異なる抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である、抗体のライブラリーである。複数の異なる抗体のうちの各抗体は、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍである場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００３２】
複数の異なる抗体を含み、前記複数の異なる抗体のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％など、少なくとも１０％の、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の異なる抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である抗体のライブラリーは、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なる抗体を含むことが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００３３】
さらに別の実施形態では、複数の異なる抗体を含み、前記複数の異なる抗体のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％など、少なくとも１０％の、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の異なる抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である抗体のライブラリーは、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合し、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００３４】
複数の異なる抗体を含み、前記複数の異なる抗体のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％など、少なくとも１０％の、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の異なる抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である抗体のライブラリーは、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００３５】
本明細書ではまた、複数の異なる抗体を含み、前記複数の異なる抗体のうちの少なくとも１０％が、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である、抗体のライブラリーも提供される。一実施形態では、ライブラリーが、複数の異なる抗体を含み、複数の異なる抗体のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、同じプラットフォームにより作製されるＩｇＧ抗体（例えば、ＩｇＧアイソタイプ抗体）である。各ＩｇＧ抗体（例えば、ＩｇＧアイソタイプ抗体）は、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００３６】
ＩｇＧ抗体（例えば、ＩｇＧアイソタイプ抗体）は、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なる抗体を含むことが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００３７】
さらに別の実施形態では、ＩｇＧ抗体（例えば、ＩｇＧアイソタイプ抗体）は、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合し、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００３８】
ＩｇＧ抗体（例えば、ＩｇＧアイソタイプ抗体）は、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００３９】
本発明の別の態様は、抗体のライブラリーおよび基材を含むアレイであり、抗体、または抗体のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％などのサブセットが、基材上に固定化されている。基材は、平面の場合もあり、粒子の場合もあり、固体材料を含む場合もあり、多孔性材料を含む場合もある。固定化は、可逆性の場合もあり、不可逆性の場合もある。
【００４０】
アレイは、複数の異なる抗体を含む抗体のライブラリーを含むことが可能であり、複数の異なる抗体のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、同じプラットフォームから作製される場合もあり、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００４１】
アレイは、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なる抗体を含む抗体のライブラリーを含むことが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、同じプラットフォームから作製される場合もあり、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍである場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００４２】
アレイは、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合する抗体のライブラリーを含むことが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、同じプラットフォームから作製される場合もあり、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００４３】
アレイは、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能な抗体のライブラリーを含むことが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、同じプラットフォームから作製される場合もあり、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００４４】
本明細書ではまた、抗体のライブラリーを作製する方法であって、（ａ）動物を、複数の抗原で免疫化するステップと、（ｂ）抗体生成細胞を、前記動物から単離するステップと、（ｃ）複数の抗体を、前記抗体生成細胞から単離するステップと、（ｄ）ステップｃ）の前記複数の抗体を、ヒトプロテオームアレイによりスクリーニングするステップであって、ヒトプロテオームアレイが、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％、または表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％を含むことが可能であるステップと、（ｅ）プロテオームアレイに単一特異性である抗体を選択するステップとを含む方法も提供される。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）で選択された抗体を、ライブラリーに付加するが、この場合、ライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、複数の異なる抗体のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、同じプラットフォームから作製される場合もあり、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００４５】
方法は、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なる抗体を含むことが可能な抗体のライブラリーを作製することが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、同じプラットフォームから作製される場合もあり、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、その標的タンパク質の変性形態には結合せず、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００４６】
方法は、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能な抗体のライブラリーを作製することが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、同じプラットフォームから作製される場合もあり、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００４７】
方法は、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能な抗体のライブラリーを作製することが可能であり、抗体または抗体のサブセットは、同じプラットフォームから作製される場合もあり、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００４８】
抗体のライブラリーを作製する方法は、免疫細胞化学を実施すること、または前記抗体生成細胞に由来する抗体の、天然タンパク質など、１または複数の標的抗原を含む混合物との結合を決定することなどを介して、ステップｃ）の前に、抗体生成細胞に由来する複数の抗体をプレスクリーニングするステップをさらに含みうる。混合物は、粗溶解物、１もしくは複数の細胞、１もしくは複数のタンパク質、１もしくは複数のペプチド、または１もしくは複数の核酸、あるいは生物学的試料を含み、生物学的試料は、細胞混合物、組織、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ）、精液、前立腺液、カウパー液（Ｃｏｗｐｅｒ’ｓ  ｆｌｕｉｄ）、尿道球腺液（ｐｒｅ−ｅｊａｃｕｌａｔｏｒｙ  ｆｌｕｉｄ）、女性射精液（ｆｅｍａｌｅ  ｅｊａｃｕｌａｔｅ）、汗、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹腔液、心膜液、リンパ、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、経血（ｍｅｎｓｅｓ）、膿、皮脂、膣分泌物、粘膜分泌物、糞便水分、膵液、副鼻腔（ｓｉｎｕｓ  ｃａｖｉｔｙ）からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞液（ｂｌａｓｔｏｃｙｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｆｌｕｉｄ）、または臍帯血でありうるがこれらに限定されない。
【００４９】
抗体のライブラリーを作製する方法は、動物を複数の抗原で免疫化するステップを含む場合があり、複数の抗原は、粗溶解物、１もしくは複数の細胞、１もしくは複数のタンパク質、１もしくは複数のペプチド、または１もしくは複数の核酸を含みうる。複数の抗原はまた、生物学的試料も含む場合があり、生物学的試料は、細胞混合物、組織、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液、尿道球腺液、女性射精液、汗、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹腔液、心膜液、リンパ、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、経血、膿、皮脂、膣分泌物、粘膜分泌物、糞便水分、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞液、または臍帯血でありうるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、複数の抗原が、少なくとも１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００の異なる抗原など、少なくとも１１，０００の異なる抗原を含む。一部の実施形態では、複数の抗原が、ヒトプロテオームのうちの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％など、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％を含む。
【００５０】
抗体のライブラリーを作製するときの抗体生成細胞は、Ｂ細胞でありうる。抗体のライブラリーを作製する方法は、抗体を基材へと固定化するステップをさらに含む場合があり、基材は、平面の場合もあり、粒子の場合もあり、固体材料を含む場合もあり、多孔性材料を含む場合もあり、これらの任意の組合せの場合もある。抗体は、基材上に可逆的に固定化することもでき、不可逆的に固定化することもできる。
【００５１】
本明細書ではまた、ヒトタンパク質に単一特異性である抗体を同定する方法であって、（ａ）複数の抗体を、ヒトプロテオームアレイと接触させるステップと、（ｂ）前記複数の抗体と、ヒトプロテオームアレイ上に存在する標的との結合を決定するステップと、（ｃ）抗体がプロテオームアレイ上の単一に単一特異性である場合に、前記抗体を単一特異性と同定するステップであって、ヒトプロテオームアレイが、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％、または表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％を含むことが可能であるステップとを含む方法も提供される。
【００５２】
本明細書ではまた、標的に対する抗体を同定する方法であって、（ａ）標的を、抗体のライブラリー、または抗体のライブラリーを含むアレイと接触させるステップと、（ｂ）前記標的と、前記複数の抗体との結合を決定するステップと、（ｃ）標的が、ライブラリーの抗体に結合する場合に、標的に対する抗体を同定するステップとを含む方法も提供される。ライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、複数の異なる抗体のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、同じプラットフォームから作製される場合もあり、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００５３】
標的に対する抗体を同定する方法は、標的を、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なる抗体を含む、抗体のライブラリー、または抗体のライブラリーを含むアレイと接触させるステップを含む場合があり、抗体または抗体のサブセットは、同じプラットフォームから作製される場合もあり、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００５４】
標的に対する抗体を同定する方法は、標的を、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能な抗体のライブラリー、または抗体のライブラリーを含むアレイと接触させるステップを含む場合があり、抗体または抗体のサブセットは、同じプラットフォームから作製される場合もあり、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００５５】
標的に対する抗体を同定する方法は、標的を、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合することが可能な抗体のライブラリー、または抗体のライブラリーを含むアレイと接触させるステップを含む場合があり、抗体または抗体のサブセットは、同じプラットフォームから作製される場合もあり、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。
【００５６】
本明細書ではまた、標的を検出する方法であって、（ａ）標的を、抗体のライブラリー、または抗体のライブラリーを含むアレイと接触させるステップと、（ｂ）前記標的と、前記複数の抗体との結合の存在または非存在を決定するステップと、（ｃ）標的が、ライブラリーの少なくとも１つの抗体に結合する場合に、標的を検出するステップとを含む方法が提供される。ライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、複数の異なる抗体のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、同じプラットフォームから作製される場合もあり、単一特異性抗体である場合もあり、その標的タンパク質の天然形態に結合する場合もあり、モノクローナル抗体である場合もあり、免疫沈降抗体である場合もあり、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、同じプラットフォームにより作製された複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９％以内など、少なくとも２０％以内である場合もあり、その標的に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）である場合もあり、またはこれらの任意の組合せである場合もある。一部の実施形態では、方法が、複数の標的を検出するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法が、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なる標的を検出するステップを含む。一部の実施形態では、方法が、１または複数の標的のレベルを検出するステップを含む。
【００５７】
参照による組込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが明確かつ個別に示されたと仮定した場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５８】
本発明の新規の特徴は、付属の特許請求の範囲において、具体的に示される。本発明の原理が用いられる例示的な実施形態と、付属の図面とを示す以下の詳細な記載を参照することにより、本発明の特徴および利点についてのより良い理解が得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】図１は、Ａ．動物を免疫化し、動物からハイブリドーマを生成させ、ハイブリドーマを播種し、作製された抗体をライブラリーに対してプロービングし、所望のプロファイルを伴う抗体を選択することにより、抗体を選択する方法を示す図であり、Ｂ．生細胞の免疫化、ハイブリドーマの選択、ＭＡｂの同定、および検証により、超特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製および検証する方法を示す図である。
【図１Ｂ】図１は、Ａ．動物を免疫化し、動物からハイブリドーマを生成させ、ハイブリドーマを播種し、作製された抗体をライブラリーに対してプロービングし、所望のプロファイルを伴う抗体を選択することにより、抗体を選択する方法を示す図であり、Ｂ．生細胞の免疫化、ハイブリドーマの選択、ＭＡｂの同定、および検証により、超特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製および検証する方法を示す図である。
【図２】図２は、３Ｄプーリング戦略を示す図である。
【図３】図３は、８，０６４のクローンのＢｓｒＧＩ消化を伴う、目的とするベクターへのＬＲ組換えクローニングのフローチャートを示す図である。
【図４】図４は、ヒトプロテオームチップの作製を示す図である。Ａ．１７，０００のヒトタンパク質を、Ｎ末端ＧＳＴ−Ｈｉｓ×６融合タンパク質の形態で精製し、銀染色および免疫ブロット解析により品質をモニタリングしたことを示す図である。Ｂ．１７，０００の精製されたヒトタンパク質および対照を、単一のスライドガラス上に２連でスポットしたことを示す図である。固定化されたタンパク質は、抗ＧＳＴで可視化した。Ｃ．Ｂ．の高倍率画像により、アレイが高品質であることを示す図である。
【図５】図５は、ヒトタンパク質チップ上のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の品質プロファイリングを示す図である。Ａ．１，０５８のタンパク質によるヒトタンパク質チップのＧＳＴ画像を示す図である。Ｂ．ピリンに対して生成させたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、チップ上の１，０５８のタンパク質に対して試験したところ、ピリンだけが認識されたことを示す図である。紫色のボックスは、マウスＩｇＧランドマークを示す。Ｃ．他の４つのｍＡｂもまた、抗ピリンｍＡｂと同様の特異性を示したことを示す図である。
【図６】図６は、プーリング戦略により、ｍＡｂの特異性についてのタンパク質マイクロアレイ解析が容易となることを示す図である。ハイブリドーマの上清（Ａ〜Ｌ）を、「垂直方向」のプールおよび「水平方向」のプールに組み合わせ、次いで、ヒトタンパク質マイクロアレイを用いて、これらの結合特異性を試験した。マイクロアレイ上のどのタンパク質には、垂直方向のプールと水平方向のプールとのどのような組合せが結合するのかを決定することにより、個別のｍＡｂの特異性を同定する。本明細書で示される例では、特定のタンパク質を認識するｍＡｂプールを、Ｘにより示す。結果は、「Ｄ」のｍＡｂを含有するプールだけが、抗原を認識することを示す。
【図７】図７は、細菌について開発された、ハイスループットのタンパク質精製プロトコールを示す図である。Ａ．プロトコールの概略を示す図である。Ｂ．１．５ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ培養物から精製されたタンパク質についてのクーマシー染色を示す図である。Ｃ．Ｅ．ｃｏｌｉによるプロテオームチップの作製を示す図である。
【図８】図８は、ＩＣＣを用いる、４つのヒトタンパク質の細胞内局在化を示す図である。それらの細胞内局在化について公知でないＣ１１ｏｒｆ６８、ＣＮＴＤ１、ＤＹＤＣ２、およびＴＸＮＤＣ９が、今や、それぞれ、ミトコンドリア、細胞質ゾル、細胞膜、および小胞体／ゴルジ装置に局在化されている。
【図９】図９は、ｍＭＡｂ（単一特異性モノクローナル抗体）の検証および特徴付けを示す図である。細胞を、Ｖ５でタグ付けした抗原構築物（レーン１）、もしくは空ベクター（レーン２）でトランスフェクトするか、またはそれらの対応するｓｈＲＮＡ構築物を伴う抗原構築物で共トランスフェクトした（レーン３）。トランスフェクションの２日後、細胞を溶解させ、対応する各ｍＭＡｂで免疫ブロッティングした（上パネル）。比較として、同じブロットをストリッピングし、抗Ｖ５抗体で再プロービングした（下パネル）。
【図１０】図１０は、多くのｍＭＡｂが、ＩＰグレードであることを示す図である。Ｖ５でタグ付けした抗原構築物でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、それらの対応するｍＭＡｂで免疫沈降させ、抗Ｖ５抗体で免疫ブロッティングした。レーン１：投入された：レーン２：ｍＭＡｂにより免疫沈降した抗原、レーン３：ＩｇＧによる陰性対照、レーン４：抗Ｖ５抗体による陽性対照。
【図１１】図１１は、抗ＨＮＲＰＣ  ｍＭＡｂの特徴付けを示す図である。Ａ．抗ＨＮＲＰＣを用いるＩＣＣ解析により、異なる核内局在化が明確に示されることを示す図である。Ｂ．トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞が、抗ＨＮＲＰＣによりＩＰ処理され、抗Ｖ５により免疫ブロッティングされた後で、Ｖ５でタグ付けされたＨＮＲＰＣの単一バンドが可視化されることを示す図である。抗マウスＩｇＧおよび抗Ｖ５抗体を、それぞれ、陰性対照および陽性対照として用いた。Ｃ．使用してＣｈＩＰを実施して成功したことを示す図である。
【図１２】図１２は、斜入射反射率差（ＯＩＲＤ）法を用いるｍＡｂアフィニティーの逐次測定を示す図である。赤色、青色、および黒色の曲線は、それぞれ、抗ウサギ二次抗体、抗マウス二次抗体、および抗ヒト二次抗体でパイロットＩｇＧマイクロアレイをプロービングすることにより得た、なめらかに平均されたＩｍ｛ＯＩＲＤ｝値を表す。赤色の点線は、飽和相の推定される出発点を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明は一般に、抗体を作製し、生成させ、特徴付け、使用する方法およびシステムを包含する抗体のライブラリーに関する。抗体は、高度に特異性でありうる。ライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、抗体は同じプラットフォームにより作製される。ライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、複数の異なる抗体内または複数の異なる抗体のサブセット内では、各抗体が単一特異性抗体であるか、その標的タンパク質の天然形態に結合するか、モノクローナル抗体であるか、免疫沈降抗体であるか、ＩｇＧ抗体もしくはＩｇＧアイソタイプ抗体であるか、その標的に対する結合アフィニティーが複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーと同様であるか、その標的に対する結合アフィニティーが少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）であるか、またはこれらの任意の組合せである。
【００６１】
プラットフォーム
抗体のライブラリーは、同じプラットフォームにより作製される複数の異なる抗体を含みうる。一実施形態では、抗体のライブラリーが、複数の異なる抗体を含み、前記複数の異なる抗体のうちの少なくとも１０％が、同じプラットフォームにより作製される。例えば、ライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、前記複数の異なる抗体のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、同じプラットフォームにより作製される。
【００６２】
第１の抗体と第２の抗体とが同じプロトコールにより作製される場合、抗体は、同じプラットフォームにより作製されると考えられる。例えば、複数の抗体は、図１Ａおよび／またはＢに示されるプラットフォームにより作製することができる。図１Ａのステップ１０２で示される通り、一実施形態では、動物を、複数の抗原で免疫化することができる。動物は、ウシ、ニワトリ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、または霊長動物など、ヒト以外の動物でありうる。動物は、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、またはヤギなど、哺乳動物でありうる。
【００６３】
複数の抗原は、精製された細胞、タンパク質、ペプチド、または核酸など、精製された試料を含む場合もあり、精製されていない細胞、タンパク質、ペプチド、または核酸など、精製されていない試料を含む場合もある。別の実施形態では、複数の抗原が、粗溶解物、または精製されていない細胞、タンパク質、ペプチド、もしくは核酸試料など、精製されていない試料を含む場合もある。
【００６４】
複数の抗原は、生物学的試料を含みうる。例えば、複数の抗原は、生物に由来する単一の細胞もしくは複数の細胞、タンパク質、代表的なペプチド、または組織を含みうる。生物は、ヒトの場合もあり、ヒト以外の場合もある。ヒト以外の生物は、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、またはヤギなど、哺乳動物でありうる。生物学的試料は、組織、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液、尿道球腺液、女性射精液、汗、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹腔液、心膜液、リンパ、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、経血、膿、皮脂、膣分泌物、粘膜分泌物、糞便水分、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞液、または臍帯血でありうる。一実施形態では、生物学的試料から、アルブミンまたはＩｇＧなどであるがこれらに限定されない、一般的な血清タンパク質を実質的に枯渇させることができる。枯渇は、濾過、画分化、またはアフィニティー精製を含みうる。
【００６５】
生物学的試料は、幹細胞、未分化細胞、分化細胞、または疾患を患う対象もしくは特定の状態を伴う対象に由来する細胞などの細胞を含みうる。疾患または状態は、がん、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染性疾患、代謝性疾患、または周産期状態でありうる。例えば、がんは、乳がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、結腸直腸がん、前立腺がん、黒色腫、膵臓がん、脳腫瘍、血液腫瘍、肝細胞癌、子宮頸がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、食道がん、消化器間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、または胃がんでありうる。
【００６６】
複数の抗原はまた、生物により過剰発現されるタンパク質など、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉなどであるがこれに限定されない）細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞において生成した試料も含みうる。対象の抗原を発現する過剰発現細胞または過剰発現細胞混合物の形態などにおける、精製された抗原または精製されていない抗原を用いて、動物を免疫化することができる。
【００６７】
複数の抗原は、少なくとも１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００の異なる抗原など、少なくとも１１，０００の異なる抗原を含みうる。
【００６８】
次いで、ステップ１０４では、複数の抗体を作製するために、動物に由来するリンパ球様細胞などの抗体生成細胞を単離することができる。抗体生成細胞を用いて、ハイブリドーマを生成させることができる。抗体生成細胞は、Ｂ細胞でありうる。Ｂ細胞を骨髄腫細胞に融合させて、ハイブリドーマを創出することができる。骨髄腫細胞の例には、ＮＳ−１細胞、Ｐ３Ｕ１細胞、ＳＰ２／０細胞、ＡＰ−１細胞などの細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【００６９】
次いで、ステップ１０６では、ハイブリドーマ細胞などの抗体生成細胞を用いて、クローン系を生成させることができる。例えば、ハイブリドーマ細胞を半固体培地上に置いて、クローン系を迅速に生成させることができる。蛍光タグ付けした抗原またはアイソタイプ特異的プローブを用いて、特徴付けおよび増殖のための対象のクローンを単離することができる。
【００７０】
ステップ１０８では、対象のクローンを抗原のライブラリーに対してプロービングし、各抗体が認識する抗原を検出し、同時に、抗体がどの抗原には反応しないかについての情報を得る（偽陽性を排する）。抗原のライブラリーは、生物のプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を代表しうる。抗原のライブラリーは、細菌プロテオーム、ウイルスプロテオーム、真菌プロテオームなど、生物プロテオームの実質的部分または全体を代表しうる。抗原のライブラリーは、昆虫のプロテオームの実質的部分または全体を代表する場合もあり、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ヤギ、またはヒトなど、哺乳動物のプロテオームの実質的部分または全体を代表する場合もある。例えば、抗原のライブラリーは、少なくとも１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００の異なる抗原を含みうる。抗原のライブラリーは、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含みうる。抗原のライブラリーはまた、過剰発現細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または他の生物の細胞）のコレクションなど、精製されていない形態において生物のプロテオームを代表する、融合タンパク質ライブラリーも含みうる。
【００７１】
プロービングは、融合タンパク質などの抗原を過剰発現する細胞、または異なる細胞系（がん細胞系など）の細胞をアレイし、ハイブリドーマ上清を、アレイされた細胞に対して試験することにより実施することができる。アレイされた細胞は、透過処理することができる。プロービングはまた、蛍光フローサイトメトリーを介して実施することもでき、標的は、ＰＣＲまたは細胞内の組換えＤＮＡの配列解析を介して同定することができる。
【００７２】
ステップ１１０では、抗体が所望のプロファイルを有する。選択される抗体は、その生物のプロテオームライブラリー内の１つの標的だけを認識し、他の標的とは交差反応しない、高度に特異的なモノクローナル抗体でありうる。これらのモノクローナル抗体を分泌する細胞系は、増殖させることができる。同じプラットフォームまたはプロトコールにより作製される抗体を用いて、抗体のライブラリーを作製または形成することができる。
【００７３】
抗体がライブラリーを作製する方法において、以下でさらに記載される方法またはプロトコールなど、同じ方法またはプロトコールにより作製される場合、抗体はまた、同じプラットフォームによっても作製することができる。
単一特異性
抗体のライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、各抗体は、その標的に対する特定の結合特異性を有する。例えば、抗体のライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、抗体は単一特異性である。一実施形態では、抗体のライブラリーが、複数の異なる抗体を含み、複数の抗体のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、単一特異性である。
【００７４】
抗体は、表５に列挙される抗原を含むアレイ上でインキュベートする場合、タンパク質または抗原に対して、Ａ値が６を超え、Ｓ値が３を超える場合に、単一特異性である。ある抗体について、アレイ全体にわたる平均シグナル強度を超える標準偏差の数を、Ａ値と称する。ある抗体について、シグナル強度を、アレイ全体に対してランク付けする場合、アレイ上の最大のシグナルと、２番目に大きなシグナルとの差を、Ｓ値とする。例えば、抗体生成細胞またはハイブリドーマに由来する個別の上清を、１２×１２の二次元プールのセットへと組み合わせ、これらのプールをアレイ（ヒトプロテオームマイクロアレイなど）上でインキュベートし、抗体を標識化する（Ｃｙ５を結合させた抗ＩｇＧ二次抗体、または抗体を検出する任意の他の方法などを介して）ことにより、計算することができる。洗浄および走査の後、各スポットのシグナル強度（アレイ上におけるタンパク質または抗原に対する抗体の結合を表す）を、バックグラウンドシグナルに対するフォアグラウンドシグナルの比として検出する。アレイ全体にわたる平均シグナル強度を超える標準偏差の数を、Ａ値と称する。Ａ＞３である二連スポット（タンパク質または抗原の各二連対について）を標識付けし、結果をデコンボリュートして、単一の水平方向プールと単一の垂直方向プールとの交点に存在し、したがって、個別のモノクローナル抗体により認識されるタンパク質または抗原を同定する。高度に特異的な各候補モノクローナル抗体（すなわち、Ａ＞３）を、アレイ全体に対して個別に試験し、スポットされた各タンパク質についてＡを測定する。次いで、シグナル強度を、ランク付けし、アレイ上の最大のシグナルと、２番目に大きなシグナルとの差を計算し、Ｓ値をもたらす。Ａ＞６かつＳ＞３であるモノクローナル抗体を、単一特異性モノクローナル抗体（ｍＭＡｂ）として同定する。二重特異性モノクローナル抗体（ｄＭＡｂ）は、アレイ上の２つの異なるタンパク質に強く結合し、Ａ＞６かつＳ＜３である。
【００７５】
一部の実施形態では、ｍＭＡｂは、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００を超えるＡ値を、かつ／または、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００を超えるＳ値を有することができる。
【００７６】
一実施形態では、抗体の単一特異性を決定するためのアレイが、生物のプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％など、生物のプロテオームライブラリーを含む。抗原のライブラリーは、細菌プロテオーム、ウイルスプロテオーム、真菌プロテオームなど、生物プロテオームの実質的部分または全体を代表しうる。抗原のライブラリーは、昆虫のプロテオームの実質的部分または全体を代表する場合もあり、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ヤギ、またはヒトなど、哺乳動物のプロテオームの実質的部分または全体を代表する場合もある。例えば、生物のプロテオームライブラリーは、少なくとも１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００の異なる抗原を含みうる。生物のプロテオームライブラリーは、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含みうる。
結合アフィニティー
抗体のライブラリーは、その標的に対する特定の結合アフィニティーを有する、複数の異なる抗体を含みうる。例えば、ライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、複数の異なる抗体のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、特定の結合アフィニティーを有する。例えば、複数の抗体は、その解離定数（ＫＤ）により決定される、その標的タンパク質に対する結合アフィニティーが、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど、少なくとも１０−７Ｍでありうる。
【００７７】
複数の抗体の結合アフィニティーは、その会合速度定数（ｋｏｎ）により測定することができ、この場合、複数の抗体の結合アフィニティーは、少なくとも１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１である。複数の抗体の結合アフィニティーは、その解離速度定数（ｋｏｆｆ）により測定することができ、この場合、複数の抗体の結合アフィニティーは、１０３Ｍ−１ｓ−１未満、５×１０３Ｍ−１ｓ−１未満、１０４Ｍ−１ｓ−１未満、５×１０４Ｍ−１ｓ−１未満、１０５Ｍ−１ｓ−１未満、５×１０５Ｍ−１ｓ−１未満、１０６Ｍ−１ｓ−１未満、５×１０６Ｍ−１ｓ−１未満、１０７Ｍ−１ｓ−１未満、５×１０７Ｍ−１ｓ−１未満、または１０８Ｍ−１ｓ−１未満、５×１０７Ｍ−１ｓ−１未満、１０８Ｍ−１ｓ−１未満、５×１０８Ｍ−１ｓ−１未満、１０９Ｍ−１ｓ−１未満、５×１０９Ｍ−１ｓ−１未満、または１０１０Ｍ−１ｓ−１未満である。
【００７８】
結合アフィニティーは、表面プラズモン共鳴、クロマトグラフィー、または当技術分野で公知の他の任意の方法により決定することができる。結合アフィニティーはまた、生体分子間相互作用を検出するリアルタイム法および／または無標識法などを用いることによって、光学的にも決定することができる。一実施形態では、斜入射反射率差（ＯＩＲＤ）法を用いる。
【００７９】
抗体のライブラリーは、その標的タンパク質の天然形態に結合する複数の異なる抗体を含みうる。例えば、ライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、複数の異なる抗体のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％は、その標的タンパク質の天然形態に結合する。一実施形態では、その標的タンパク質の天然形態に結合する複数の抗体が同じ結合条件下において、その標的タンパク質の変性形態には結合しない。
【００８０】
抗体のライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、ライブラリーのうちの１または複数の抗体のその標的に対する結合アフィニティーが、複数の異なる抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーと同様である。例えば、抗体のライブラリーは、第１の抗体および第２の抗体を含むことが可能であり、第１のタンパク質に対する第１の抗体の結合アフィニティーは、第２のタンパク質に対する第２の抗体の結合アフィニティーと同様である。ライブラリーのうちの１つの抗体のその標的に対する結合アフィニティーは、ライブラリーのうちの１または複数の他の抗体の結合アフィニティーの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％以内でありうる。ライブラリーの第１の抗体のその標的に対する結合アフィニティーは、ライブラリーのうちの１または複数の他の抗体の結合アフィニティーの少なくとも２０％以内でありうる。一実施形態では、抗体のライブラリーが、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、異なる抗体のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の、その標的タンパク質に対する結合アフィニティーが、複数の異なる抗体のうちの残りの抗体の、それらの各標的タンパク質に対する結合アフィニティーの少なくとも２０％以内である。
プロテオーム
本明細書ではまた、生物のプロテオームの一部に結合する複数の異なる抗体を含みうる抗体のライブラリーも提供される。複数の異なる抗体は、生物のプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合しうる。例えば、複数の異なる抗体は、生物の少なくとも１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００のタンパク質に結合しうる。プロテオームは、細菌プロテオーム、ウイルスプロテオーム、真菌プロテオームでありうる。プロテオームは、昆虫のプロテオームの場合もあり、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ヤギ、またはヒトなど、哺乳動物のプロテオームの場合もある。一部の実施形態では、プロテオームが、ヒトプロテオームである。
【００８１】
例えば、複数の異なる抗体がヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％に結合しうる。一実施形態では、複数の異なる抗体がヒトプロテオームのうちの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合しうる。複数の異なる抗体は、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合しうる。
他の抗体の特徴
抗体のライブラリーはまた、複数の異なる抗体も含むことが可能であり、抗体は、ＩｇＧ抗体（例えば、ＩｇＧアイソタイプ抗体）である。例えば、抗体のライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、抗体のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％は、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ抗体である。
【００８２】
抗体のライブラリーはまた、複数の異なる抗体も含むことが可能であり、抗体は、免疫沈降抗体である。例えば、抗体のライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、抗体のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％は、免疫沈降抗体である。免疫沈降抗体とは、抗体を含まない陰性対照および抗Ｖ５抗体による陽性対照と比較して、細胞ホモジネートに由来する標的タンパク質を免疫沈降させうる抗体である。免疫沈降した標的の検出は、ウェスタンブロットを介して可能となる。免疫沈降は、清明化された細胞溶解物および約２μｇの抗体の後で、４℃で２時間にわたりインキュベーションし、次いで、基材を添加して、任意の抗体−タンパク質複合体（プロテインＧによるＤｙｎａｂｅａｄなど）に結合させ、次いで、４℃でさらに２時間にわたるインキュベーションにより実施することができる。インキュベーション後、基材を、氷冷ＴＢＳＴなどで２回にわたり洗浄し、基材を新たな反応容器へと移し、氷冷ＴＢＳＴで再び洗浄してから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット解析にかける。
生物学的経路
一態様では、本発明が、共通経路の抗原に特異的な複数の抗体を含む抗体のライブラリーに関する。抗原は、明確な特徴を遺伝子のセットおよびそれらの産物に割り当てるコレクションである遺伝子オントロジーにおいて、１または複数の属性を共有する場合に、共通経路に属する。Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（「ＧＯ」）Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍにより運営されている上記オントロジーは、この点で特に有用である。共通経路に属する抗原は、１または複数の属性を共有する遺伝子について、ＧＯなどの遺伝子オントロジーを検索することにより同定することができる。共通の属性は、例えば、共通の構造的特徴、共通の場所、共通の生物学的過程、または共通の分子的機能でありうるであろう。
【００８３】
ヒト遺伝子およびヒトタンパク質の機能に関する、論評される公表文献において存在する情報の豊かさは、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／）により運営されている、管理された語彙の共同システムを用いて構成および維持されている。ヒトゲノムにおける約４０，０００の転写単位のうち、約２０，０００は、注記のあるタンパク質をコードし、これらのタンパク質のうちの約１４，０００は、ＧＯデータベースにおいて機能が注記されている。ＧＯデータベースに包含される機能の注記は、階層的に構成されており、この情報にはＧＯデータベースからアクセスし、同じ生物学的過程に関与するか、同じ細胞成分中に存在するか、または同じ分子的機能を果たすことが注記されている、ヒトゲノム内の全ての遺伝子について検索することが可能である。
【００８４】
一部の実施形態では、共通経路内の抗原が、遺伝子オントロジーにより注記される同じ生物学的過程または同じ分子的機能に関与する遺伝子の発現産物である。この１つの例は、ＤＮＡ損傷に対する応答に関与する遺伝子である。別の例は、特定の組織、細胞型、または器官の転写因子の遺伝子産物など、転写因子の遺伝子産物である。一例は、脳の転写因子の遺伝子産物である。
【００８５】
一部の実施形態では、共通経路内の抗原が、全て同じ転写因子タンパク質、転写因子タンパク質の複合体、他の核酸結合タンパク質、または他の分子が結合する遺伝子の遺伝子産物である。これらの相互作用は、生細胞において（ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて）生じる場合もあり、精製された分子の溶液中で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて）生じる場合もある。例えば、低酸素症誘導転写因子タンパク質が結合する遺伝子の全ての遺伝子産物である。
【００８６】
一部の実施形態では、共通経路内の抗原が、それらの転写物レベルまたはタンパク質レベルが、処置または同じ刺激に対する曝露に際して変化し、このため、共制御される遺伝子の遺伝子産物である。例えば、ＵＶ照射に対する曝露時に誘導または抑制される全ての抗原である。
【００８７】
一部の実施形態では、共通経路内の抗原が、類似の配列特徴を含有する抗原である。これらの特徴は、ＤＮＡ配列モチーフの場合もあり、ＤＮＡ配列モチーフのコレクションの場合もあり、ランダムゲノム配列のバックグラウンドモデルから識別可能な高次の配列特徴の凝縮の場合もある。本明細書で用いられる配列モチーフとは、２つ以上の核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）の連なりである。ＤＮＡ配列モチーフは、コンセンサス配列により規定することもでき、モチーフの各位置における各塩基の識別を確率として定義する確率行列により規定することもできる。
【００８８】
一部の実施形態では、共通経路内の抗原が、それらの配列、転写物、またはタンパク質が、代謝性形質転換および／または物理的なタンパク質間相互作用、タンパク質−ＤＮＡ間相互作用、およびタンパク質−化合物間相互作用を介して連結される遺伝子の遺伝子産物でもありうるであろう。酵素がこれらの反応を触媒し、適正に機能するには、食餌中のミネラル、ビタミン、および他の共因子を必要とすることが多い。関与しうる化学物質が多いために、経路は、極めて精密でありうる。
【００８９】
一部の実施形態では、経路のメンバーが、共通の構造または機能的属性を共有する。例えば、タンパク質は、亜鉛フィンガーまたは膜貫通領域などの共通配列モチーフを共有しうるであろう。
【００９０】
一部の実施形態では、共通経路内の抗原が、同じシグナル伝達経路に属する。生物学において、シグナル伝達とは、細胞が、１つの種類のシグナルまたは刺激を、酵素により実行され、第２のメッセンジャーにより活性化され、その結果、シグナル伝達経路として考えられる経路をもたらす、細胞内部の生化学的反応の順序付けられた連鎖を伴うことが極めて多い別のシグナルまたは刺激へと変換する任意の過程を指すことが典型的である。通常、シグナル伝達は、細胞外のシグナル伝達分子（またはリガンド）が、細胞膜から外部に面し、細胞内部のイベントを誘発する、細胞表面受容体に結合することを伴う。加えて、細胞内のシグナル伝達カスケードは、細胞外マトリックス内に見出されるリガンドに結合するインテグリンの場合のように、細胞−底質間相互作用を介して誘発されうる。ステロイドは、それらの親油性または疎水性の性質のために、細胞膜を透過しうる細胞外シグナル伝達分子の別の例を代表する。その全てではないが、多くのステロイドは、細胞質内に受容体を有し、通常、それらの受容体が、ステロイド応答性遺伝子に結合することを刺激することにより作用する。多細胞生物内には、全体としての生物の文脈における細胞の個別の生物学的活性を協調させるのに用いられる、多様な数の低分子およびポリペプチドが存在する。これらの分子の例には、ホルモン（例えば、メラトニン）、増殖因子（例えば、上皮増殖因子）、細胞外マトリックス成分（例えば、フィブロネクチン）、サイトカイン（例えば、インターフェロン−ガンマ）、ケモカイン（例えば、ＲＡＮＴＥＳ）、神経伝達物質（例えば、アセチルコリン）、および神経栄養物質（例えば、神経増殖因子）が包含される。
【００９１】
上記で列挙した多くの通常のシグナル伝達刺激に加えて、複雑な生物ではまた、シグナル伝達過程を開始する、さらなる環境的刺激の例も存在する。環境的刺激はまた、分子的な性質の場合もあり、眼の網膜内の細胞に当たる光、鼻腔上皮内の嗅覚受容体に結合する匂い物質、味覚芽内の味覚受容体を刺激する苦味および甘味、細胞内のＤＮＡを変化させるＵＶ光、ならびに細胞における一連のイベントを活性化する低酸素症など、より物理的な性質の場合もある。ある種の微生物分子、例えば、ウイルスのヌクレオチド、細菌のリポ多糖、またはタンパク質抗原は、シグナル伝達過程を介して媒介される、進入する病原体に対する免疫系の応答を誘発することが可能である。
【００９２】
遺伝子の活性化、代謝における変化、細胞増殖の持続および細胞死、ならびに移動の刺激または抑制は、シグナル伝達を必要とする細胞外刺激に対する細胞応答の一部である。多くの応答遺伝子のタンパク質産物は、酵素および転写因子自体を包含するので、遺伝子の活性化は、さらなる細胞効果をもたらす。シグナル伝達カスケードの結果としてもたらされる転写因子は、なおさらなる遺伝子を活性化しうる。したがって、初期刺激は、遺伝子の全コホートの発現を誘発することが可能であり、これは、任意の数の複合的な生理学的イベントの活性化をもたらしうる。これらのイベントには、例えば、インスリンにより刺激される、血流からのグルコースの取込みの増大、および細菌性産物により刺激される、感染部位への好中球の遊走が包含される。
【００９３】
大半の哺乳動物細胞は、細胞分裂だけではなく、細胞存続も制御するための刺激を必要とする。増殖因子の刺激が存在しない場合、大半の細胞では、プログラム細胞死が引き続き生じる。細胞外刺激に対するこのような要請は、単細胞生物の文脈および多細胞生物の文脈のいずれにおいても細胞挙動を制御するのに必要である。シグナル伝達経路は、生物学的過程にとって極めて重要であるため、多くの疾患が、それらの制御異常に帰せられているのは驚くにあたらない。
【００９４】
一部の実施形態では、本発明が、オンコロジー経路の一部である抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを包含する方法および組成物を提供する。オンコロジー経路における抗原は、過形成、新組織形成、および／またはがんの発症に関与する遺伝子の遺伝子産物である。オンコロジー経路の例には、低酸素症経路、ＤＮＡ損傷経路、アポトーシス経路、細胞周期経路、およびｐ５３経路が包含されるがこれらに限定されない。
【００９５】
一部の実施形態では、本発明が、膜経路の一部である抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを包含する方法および組成物を提供する。膜経路の例には、輸送タンパク質経路、Ｇ結合受容体経路、イオンチャネル経路、細胞接着タンパク質経路、および受容体経路が包含されるがこれらに限定されない。
【００９６】
一部の実施形態では、本発明が、核受容体経路の一部である抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを包含する方法および組成物を提供する。核受容体経路内の抗原の例には、グルココルチコイド受容体タンパク質経路、エストロゲン受容体タンパク質経路、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体タンパク質経路、アンドロゲン受容体タンパク質経路、ならびに、ＡＢＣ輸送体およびＳＬＣ輸送体を包含する、輸送体タンパク質経路により制御される遺伝子産物が包含されるがこれらに限定されない。
【００９７】
一部の実施形態では、本発明が、神経経路の一部である抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを包含する方法および組成物を提供する。神経経路内の抗原の例には、神経伝達物質など、ニューロン内で発現する遺伝子の遺伝子産物、および細胞接着タンパク質が包含されるがこれらに限定されない。
【００９８】
一部の実施形態では、本発明が、血管経路の一部である抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを包含する方法および組成物を提供する。血管経路内の抗原の例には、血管新生、脂質代謝、および炎症に関与する抗原が包含されるがこれらに限定されない。
【００９９】
一部の実施形態では、本発明が、シグナル伝達経路の一部である抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを包含する方法および組成物を提供する。シグナル伝達経路内の抗原の例には、細胞間シグナル伝達に関与する遺伝子産物、ホルモン、ホルモン受容体、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質、およびサイトカインが包含されるがこれらに限定されない。
【０１００】
一部の実施形態では、本発明が、酵素経路の一部である抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを包含する方法および組成物を提供する。酵素経路内の抗原の例には、解糖、嫌気性呼吸、クレブス回路／クエン酸回路、酸化的リン酸化、脂肪酸の酸化（β−酸化）、糖新生、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ経路、ペントースリン酸経路、ポルフィリン合成（またはヘム合成）経路、尿素回路、光合成（植物、藻類、シアノバクテリア）、および化学合成（一部の細菌）に関与する遺伝子の遺伝子産物が包含されるがこれらに限定されない。
【０１０１】
本発明はまた、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、共通経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーも提供する。
【０１０２】
一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、オンコロジー経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、低酸素症経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、ＤＮＡ損傷経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、アポトーシス経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、細胞周期経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、ｐ５３経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、低酸素症経路、ＤＮＡ損傷経路、アポトーシス経路、細胞周期経路、およびｐ５３経路からなる群から異なる形で選択される、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。
【０１０３】
一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、膜結合経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。
【０１０４】
一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、核受容体経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、グルココルチコイド受容体経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、エストロゲン受容体経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、アンドロゲン受容体経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、チトクロームＰ４５０受容体経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、輸送体受容体経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、グルココルチコイド受容体経路、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体経路、エストロゲン受容体経路、アンドロゲン受容体経路、チトクロームＰ４５０経路、および輸送体経路からなる群から異なる形で選択される、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。
【０１０５】
一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、血管経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、神経経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、転写因子経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％が、シグナル伝達経路の一部である、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。
【０１０６】
本発明はまた、ゲノム内の共通経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーも提供する。一部の実施形態では、本発明が、ゲノム内のオンコロジー経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、ゲノム内の低酸素症経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、ゲノム内のＤＮＡ損傷経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、ゲノム内のアポトーシス経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、ゲノム内の細胞周期経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、ゲノム内のｐ５３経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。
【０１０７】
一部の実施形態では、本発明が、ゲノム内の膜結合経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。
【０１０８】
一部の実施形態では、本発明が、ゲノム内の核受容体経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、ゲノム内のグルココルチコイド受容体経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、ゲノム内のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、ゲノム内のエストロゲン受容体経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、ゲノム内のアンドロゲン受容体経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、ゲノム内のチトクロームＰ４５０受容体経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、本発明が、ゲノム内の輸送体受容体経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーを提供する。
【０１０９】
本発明はまた、ゲノム内の神経経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーも提供する。本発明はまた、ゲノム内のシグナル伝達経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーも提供する。本発明はまた、ゲノム内の血管経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーも提供する。本発明はまた、ゲノム内の転写因子経路の一部である全ての抗原のうちの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％を代表する、複数の抗原に特異的な複数の抗体を含むライブラリーも提供する。
抗体のライブラリーを作製する方法
本明細書ではまた、抗体のライブラリーを作製する方法も提供される。一実施形態では、方法が、（ａ）動物を、複数の抗原で免疫化するステップと、（ｂ）抗体生成細胞を、動物から単離するステップと、（ｃ）複数の抗体を、抗体生成細胞から単離するステップと、（ｄ）ステップｃ）の複数の抗体を、タンパク質アレイ（ヒトプロテオームアレイなど）によりスクリーニングするステップと、（ｄ）プロテオームアレイ上の単一の標的に単一特異性である抗体を選択するステップとを含む。一実施形態では、方法が、ステップｃ）の前に、抗体生成細胞に由来する複数の抗体をプレスクリーニングするステップをさらに含みうる。
【０１１０】
動物は、ウシ、ニワトリ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、または霊長動物など、ヒト以外の動物でありうる。動物は、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、またはヤギなど、哺乳動物でありうる。
【０１１１】
動物は、精製された細胞、タンパク質、ペプチド、または核酸など、精製された試料を含む場合もあり、精製されていない細胞、タンパク質、ペプチド、または核酸など、精製されていない試料を含む場合もある、複数の抗原で免疫化することができる。別の実施形態では、複数の抗原が、粗溶解物、または精製されていない細胞試料、タンパク質試料、ペプチド試料、もしくは核酸試料など、精製されていない試料を含む場合もある。複数の抗原は、生物学的試料を含みうる。例えば、複数の抗原は、ウシ、ニワトリ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、または霊長動物など、生物に由来する単一の細胞もしくは複数の細胞、タンパク質、代表的なペプチド、または組織を含みうる。生物は、ヒトの場合もあり、ヒト以外の場合もある。ヒト以外の生物は、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、またはヤギなど、哺乳動物でありうる。
【０１１２】
生物学的試料は、組織、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液、尿道球腺液、女性射精液、汗、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹腔液、心膜液、リンパ、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、経血、膿、皮脂、膣分泌物、粘膜分泌物、糞便水分、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞液、または臍帯血でありうる。一実施形態では、生物学的試料から、アルブミンまたはＩｇＧなどであるがこれらに限定されない、一般的な血清タンパク質を実質的に枯渇させることができる。枯渇は、濾過、画分化、またはアフィニティー精製を含みうる。
【０１１３】
生物学的試料は、幹細胞、未分化細胞、分化細胞、または疾患を患う対象もしくは特定の状態を伴う対象に由来する細胞などの細胞を含みうる。疾患または状態は、がん、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染性疾患、代謝性疾患、または周産期状態でありうる。例えば、がんは、乳がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、結腸直腸がん、前立腺がん、黒色腫、膵臓がん、脳腫瘍、血液腫瘍、肝細胞癌、子宮頸がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、食道がん、消化器間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、または胃がんでありうる。
【０１１４】
複数の抗原はまた、生物により過剰発現されるタンパク質など、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉなどであるがこれに限定されない）細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞において生成した試料も含みうる。対象の抗原を発現する過剰発現細胞または過剰発現細胞混合物の形態などにおける、精製された抗原または精製されていない抗原を用いて、動物を免疫化することができる。
【０１１５】
複数の抗原は、少なくとも１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００の異なる抗原など、少なくとも１１，０００の異なる抗原を含みうる。一部の実施形態では、前記複数の抗原が、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％を含む。複数の抗原は、生物のプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含みうる。複数の抗原は、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含みうる。複数の抗原は、表５に列挙されるタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含みうる。抗原のライブラリーはまた、過剰発現細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または他の生物の細胞）のコレクションなど、精製されていない形態において生物のプロテオームを代表する融合タンパク質ライブラリーも含みうる。
【０１１６】
動物に由来する抗体生成細胞は、Ｂ細胞などのリンパ球様細胞でありうる。抗体生成細胞を用いて、ハイブリドーマを生成させることができる、例えば、抗体生成細胞を骨髄腫細胞などの不死細胞に融合させて、ハイブリドーマを創出することができる。
【０１１７】
一実施形態では、プレスクリーニングするステップを実施するが、この場合、複数の抗体を抗体生成細胞から単離する前に、抗体生成細胞に由来する複数の抗体をスクリーニングする。プレスクリーニングは、血清または抗体生成細胞の上清を用いて、前記抗体生成細胞に由来する抗体の、天然抗原またはタンパク質など、１または複数の標的抗原を含む混合物との結合を決定することにより実施することができる。プレスクリーニングは、免疫組織化学、免疫細胞化学、ＥＬＩＳＡ、クロマトグラフィー、または結合を決定するのに適することが当技術分野において公知である他の任意の方法を用いて実施することができる。プレスクリーニングを用いて、本明細書で記載されるプロテオームアレイなどを介するさらなるスクリーニングのために、抗体生成細胞（これらには、ハイブリドーマなど、不死化細胞に融合させた抗体分泌細胞が包含されうる）を選択することができる。
【０１１８】
混合物は、粗溶解物、細胞、タンパク質、ペプチド、または核酸を含みうる。混合物は、組織、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液、尿道球腺液、女性射精液、汗、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹腔液、心膜液、リンパ、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、経血、膿、皮脂、膣分泌物、粘膜分泌物、糞便水分、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞液、または臍帯血など、生物学的試料を含みうる。一実施形態では、生物学的試料から、アルブミンまたはＩｇＧなどであるがこれらに限定されない、一般的な血清タンパク質を実質的に枯渇させることができる。枯渇は、濾過、画分化、またはアフィニティー精製を含みうる。生物学的試料は、幹細胞、未分化細胞、分化細胞、または疾患を患う対象もしくは特定の状態を伴う対象に由来する細胞などの細胞を含みうる。
【０１１９】
抗体生成細胞に由来する複数の抗体は、生物のプロテオームの全体または一部によるスクリーニングにかける前に、先行するプレスクリーニングステップを伴って単離することもでき、これを伴わずに単離することもできる。例えば、単離された抗体は、生物のプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％によりスクリーニングすることができる。例えば、単離された抗体は、生物の少なくとも１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００のタンパク質によりスクリーニングすることができる。プロテオームは、細菌プロテオーム、ウイルスプロテオーム、真菌プロテオームでありうる。プロテオームは、昆虫のプロテオームの場合もあり、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ヤギ、またはヒトなど、哺乳動物のプロテオームの場合もある。一部の実施形態では、プロテオームが、ヒトプロテオームである。
【０１２０】
例えば、単離された抗体は、ヒトプロテオームのうちの少なくとも０．５％によりスクリーニングすることができる。一実施形態では、単離された抗体がヒトプロテオームのうちの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％によりスクリーニングされる。単離された抗体は、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％によりスクリーニングすることができる。抗体をスクリーニングするのに用いられるプロテオームまたはその一部は、アレイ上に存在させることができる。
【０１２１】
スクリーニングの後は、抗体を、その結合プロファイルに基づき選択することができる。例えば、抗体がヒトプロテオームアレイの単一の標的など、プロテオームの単一の標的に結合する場合は、抗体を、本明細書で記載されるライブラリーのために選択することができる。
【０１２２】
方法を用いて、抗体のハイスループットの作製を実施することができる。例えば、マウスを免疫化するための抗原は、ハイスループットで作製することができる。これは、組換えタンパク質を、遺伝子発現ライブラリーから誘導的に作製することにより行うことができ、この場合、対象のタンパク質は、必要に応じて発現させることもでき、全異種細胞、組織、標的種からの粗細胞抽出物または濃縮細胞抽出物を介して発現させることもでき（非誘導的手法）、異種タンパク質を発現するように操作された全哺乳動物細胞を介して発現させることもできる（誘導的手法）。注射のための抽出物は、細胞および細胞内膜、細胞内小器官、細胞内粒子、または細胞内のタンパク質複合体などの細胞内成分を包含する場合があり、示差的遠心分離または他の周知の方法を用いて調製することができる。タンパク質の複合混合物によるこれらの免疫化は、最終的に、最高度に免疫原性であるタンパク質に対する抗体をもたらす可能性があるが、この場合、抗原供給源は、とりわけ抗原性である任意のタンパク質を除去するために既に単離された抗体を用いて免疫枯渇させることができる。加えて、可溶性タンパク質および膜タンパク質の両方を、サイズ除外クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、もしくはアフィニティークロマトグラフィーにより、または個別に回収された小画分を用いて、数千のタンパク質ではなく、数十〜数百のタンパク質で免疫化することにより、それらの天然状態（複数可）または変性状態（複数可）においてクロマトグラフィー処理することができる。同様に、抽出物の単純な硫酸アンモニウム画分により、多種多様な抗原サブセットがもたらされる。タンパク質の特定のクラスを標的とする特異的な技法を用いることができる。例えば、ＳＮＯシグナル伝達に関与するタンパク質は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製することができ、次いで、溶出された金属を含まないタンパク質を免疫化のための抗原として用いることもでき、リンタンパク質をＴｉＯ２によるアフィニティーマトリックスへと結合させ、これにより大幅に濃縮することもできる。生細胞または固定細胞から直接単離されるか、または直接得られた天然タンパク質は、免疫原の好ましい供給源でありうる。
【０１２３】
ハイスループット法はまた、抗体分泌リンパ球様細胞をもたらすための、短い時間スケールの免疫化も含みうる。例えば、動物は、後足の足蹠を介して、複数の抗原および付加投与調製物により免疫化することができる。免疫化の７〜２１日後に、膝窩リンパ節を回収する。免疫化された動物におけるリンパ節は、足蹠にＥｖａｎｓ  ｂｌｕｅを注射することにより直接明示する。
【０１２４】
ハイスループット法はまた、ＧＳＴ忍容性マウスにおいて抗体を生成させるステップも含みうる。多くの抗原は、ＧＳＴ融合体として発現するので、ＧＳＴ発現マウス系列（Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍに由来するＧＳＴを活発に発現するマウス）を用いて、融合タンパク質のＧＳＴ以外の成分に対する特異的抗体の収量を増大させ、抗ＧＳＴ抗体の生成を消失させることができる。
【０１２５】
抗体を作製するためのハイスループット法はまた、抗体作製のための細胞融合体／ハイブリドーマの創出も含みうる。プライミングされたリンパ球様細胞と骨髄腫細胞とを融合させ、融合生成物を、免疫グロブリン分子の所望のサブクラスを認識する蛍光タグ付けされた抗体を含有する半固体培地（メチルセルロース培地）上、または所望の抗体を分泌するコロニーを有徴化する蛍光タグ付けされた抗原を含有する半固体培地中に播種する。上記の方法の組合せもまた用いることができる。倒立蛍光顕微鏡を、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ製の毛細管およびＤｒｕｍｍｏｎｄ  ＷｉｒｅＴｒｏｌデバイスを用いる、手作業による採取と組み合わせて用いた後で、個別のクローンを増殖させて、蛍光により有徴化したコロニーを、半固体培地から液体培地へと移す。
【０１２６】
組換えタンパク質または天然タンパク質を用いるハイスループット法において生成させたモノクローナル抗体の場合、原因抗原は、タンパク質マイクロアレイのデコンボリューションにより同定することができる。単一ステップのデコンボリューションを実施することができる。
【０１２７】
例えば、全細胞または細胞溶解物を用いてハイブリドーマを生成させる場合は、二次元のプーリング戦略を用いて、各モノクローナル抗体が認識する抗原の識別を明示する。ハイブリドーマの上清を二次元のグリッドにアレイして、３×３〜１００×１００のプールサイズで水平方向および垂直方向の両方にプールする。ハイブリドーマを、プレートセットにアレイして、プレートプールならびに３×３×３〜１００×１００×１００のフォーマットによる水平方向および垂直方向のプールを生成させる、三次元のプーリング戦略もまた実施することができる。結果として得られるプールは、タンパク質マイクロアレイと個別にハイブリダイズさせ、マイクロアレイ解析ソフトウェアを用いてスコア付けする。水平方向および垂直方向の各対の共通の陽性（ヒット）、またはプレートの三方向の各交点における共通の陽性（ヒット）、二次元デザインおよび三次元デザインのそれぞれにおける水平方向のプールおよび垂直方向のプール（トリオと称する）の共通の陽性（ヒット）を、同じ対またはトリオの交点においてモノクローナル抗体により認識される抗原として同定する。必要な場合は、同定された抗原を、対応する抗体でマイクロアレイをプロービングすることにより検証する。アレイの費用は高価であり、例えば、１０×１０のプールは、１００のクローンを解析するのに必要とされるアレイ数を、１００から２０へと削減し、２０×２０のプールでは、必要とされるアレイ数が、４００から４０へと削減されるため、プーリング戦略は、抗体を特徴付けるかまたは作製する費用を削減しうる。例えば、三次元プールは４０９６のハイブリドーマのプールをスクリーニングしうるが、１６×１６×１６の３Ｄ戦略が必要とするアレイは４８に過ぎない。１０×１０の戦略を用いると、８２０のアレイを用いることができる。９６ウェルプレートに基づく３Ｄプーリング戦略（１２×８×１２）を、図２に示す。
【０１２８】
ハイスループット法で生成させたモノクローナル抗体の特徴付けは、全プロテオームマイクロアレイを用いて実施することができる。マイクロアレイを用いて、所与のモノクローナル抗体が結合する特異的抗原を決定することができる。モノクローナル抗体のアフィニティー、他の抗原との潜在的な交差反応性、または他の抗原との交差反応性の欠如についての重要品質情報は全て、アレイ解析により示される。
【０１２９】
ハイスループット法におけるモノクローナル抗体の作製は、融合クローンにより可能である。モノクローナル抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、所望の量で作製される。十分に確立された多様な方法を用いて、これらを精製することができる。
【０１３０】
タンパク質マイクロアレイを用いるモノクローナル抗体の特徴付けに基づき、高品質（例えば、高アフィニティーおよび低交差反応性）のモノクローナル抗体を選択し、これらを用いて抗体アレイを作製することができる。抗体を選択し、それらの濃度を、同様の力価へと標準化する。マイクロアレイロボット（例えば、Ｎａｎｏｐｒｉｎｔ、ＡｒｒａｙＩｔ，Ｉｎｃ．）を用いて、選択された抗体を、適正な陽性対照（例えば、希釈したヒトＩｇＧ）および陰性対照（例えば、ヒトＩｇＭおよびＢＳＡ）と共にマルチウェルフォーマット（例えば、９６ウェルフォーマット、３８４ウェルフォーマット、または１５６２ウェルフォーマット）でアレイして、抗体マイクロアレイを作製することができる。異なるマイクロアレイ構成におけるモノクローナル抗体の配列をカスタマイズして、広範なプロテオーム規模の研究を容易にすることができる。
抗体のライブラリーを用いる方法
本明細書ではまた、標的に対する抗体を同定する方法であって、標的を、抗体のライブラリーと接触させるステップと、標的と、複数の抗体との結合を決定するステップと、標的が、ライブラリーの抗体に結合する場合に、標的に対する抗体を同定するステップとを含む方法も提供される。また、標的を同定する方法であって、標的を、抗体のライブラリーと接触させるステップと、標的と、複数の抗体との結合を決定するステップと、標的が、ライブラリーの抗体に結合する場合に、標的を同定するステップとを含む方法も提供される。標的を、抗体のライブラリーを含むアレイと接触させるように、抗体のライブラリーを基材に付けることができる。
【０１３１】
ライブラリーは、上記で記載された複数の異なる抗体など、複数の異なる抗体を含みうる。例えば、抗体のライブラリーは、同じプラットフォームにより作製される抗体を含みうる。ライブラリーは、複数の異なる抗体を含むことが可能であり、複数の異なる抗体内または複数の異なる抗体のサブセット（複数の異なる抗体のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％など）内では、抗体が同じプラットフォームにより作製されるか、単一特異性抗体であるか、その標的タンパク質の天然形態に結合するか、モノクローナルであるか、免疫沈降抗体であるか、ＩｇＧ抗体（例えば、ＩｇＧアイソタイプ抗体）であるか、その標的に対する結合アフィニティーが、複数の抗体のうちの別の抗体の結合アフィニティーと同様である（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０％以内である）か、各抗体がその標的に対する結合アフィニティーが少なくとも１０−７Ｍ（ＫＤ）（例えば、少なくとも１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍ、または１０−１６Ｍなど）であるか、またはこれらの任意の組合せである。ライブラリーは、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、または１０００の異なるモノクローナル抗体を含む場合もあり、生物のプロテオーム（例えば、ヒトプロテオーム）のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合する場合もあり、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に結合する場合もあり、またはこれらの任意の組合せの場合もある。
【０１３２】
本明細書ではまた、ヒトタンパク質などのタンパク質に単一特異性である抗体を同定する方法であって、複数の抗体を、ヒトプロテオームアレイなどのプロテオームアレイと接触させるステップと、複数の抗体と、プロテオームアレイ上に存在する標的との結合を決定するステップと、抗体を単一特異性と同定するステップとを含む方法も提供される。アレイは、生物のプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含む複数の抗原またはタンパク質を含みうる。例えば、プロテオームアレイは、生物の少なくとも１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００のタンパク質を含みうる。生物は、細菌の場合もあり、ウイルスの場合もあり、または真菌の場合もある。生物は、昆虫の場合もあり、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ヤギ、またはヒトなど、哺乳動物の場合もある。例えば、プロテオームは、ヒトプロテオームの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含みうる。プロテオームアレイは、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含みうる。
【０１３３】
結合は、当技術分野で公知の技法（例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ））、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ（例えば、金コロイド標識、酵素標識、または放射性同位元素標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイなど）、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ）により検出することができる。
【０１３４】
抗体の結合は、一次抗体上の標識を検出することにより検出することができる。代替的に、一次抗体は、二次抗体または試薬の一次抗体への結合を検出することにより検出する。例えば、二次抗体を標識化することができる。一部の実施形態では、自動検出アッセイまたはハイスループットシステムを用いる。例えば、捕捉マイクロ酵素結合免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）では、抗体を固定化し、その後、結合した標識化抗原を直接的または間接的に比色検出、蛍光検出、発光検出、または放射性検出することにより、抗体／抗原反応を測定可能とする。例えば、ビオチン、または下流における検出を可能とする他の標識により、抗原を標識化することができる。
【０１３５】
固定化された抗体は一般に、存在する単一の抗原決定基に結合する。抗原決定基は、抗原決定基を含むバイオマーカーを標識化することなどを介して標識化することができる。この反応の特異性は、ＥＬＩＳＡ測定における定量化を可能とする。ＥＬＩＳＡ反応をハイスループットフォーマットで用いて、後続のステップによりすべてのハイブリドーマ上清をスクリーニングすることができる。ＥＬＩＳＡ以外の原理により構築されるスクリーニングアッセイ（例えば、抗体マイクロアレイ、ＭＡＬＤＩ／ＭＳおよび／またはマルチチャネルキャピラリー電気泳動に基づくハイスループットスクリーニング）も行うことができる。ＥＬＩＳＡデータまたはマイクロアレイデータは、例えば、公表された方法により評価する。データ解析工程の目標は、重要な臨床パラメータを伴う最良のコレクションを示し、解析物群のうちの１つに特異的である、ハイブリドーマ上清の選択である。
【０１３６】
マイクロアレイ基材
一部の実施形態では、本発明が、抗体のライブラリーと基材とを含むアレイ（またはマイクロアレイ）を提供する。一部の実施形態では、各抗体を基材上に固定化する。抗体は、基材上に可逆的に固定化することもでき、不可逆的に固定化することもできる。基材は、平面の場合もあり、粒子の場合もあり、固体材料を含む場合もあり、多孔性材料を含む場合もある。基材は、有機材料の場合もあり、無機材料の場合もあり、生物学的材料の場合もあり、非生物学的材料の場合もあり、またはこれらの材料の任意の組合せの場合もある。
【０１３７】
一実施形態では、基材が透明または半透明である。パッチを留置する基材表面の部分は、平坦で、硬質または半硬質であることが好ましい。多くの材料が、基材としての使用に適する。基材は、ケイ素、シリカ、ガラス、またはポリマーを含みうる。例えば、基材は、ケイ素、シリカ、石英、ガラス、孔径制御ガラス、炭素、アルミナ、二酸化チタン、ゲルマニウム、窒化ケイ素、ゼオライト、およびヒ化ガリウムからなる群から選択される材料を含みうる。金、白金、アルミニウム、銅、チタン、およびこれらの合金などの多くの金属もまた、アレイ基材の選択肢である。加えて、多くのセラミックスおよびポリマーもまた、基材として用いることができる。基材として用いうるポリマーには、以下：ポリスチレン、ポリ（テトラ）フルオロエチレン（ｐｏｌｙ（ｔｅｔｒａ）ｆｌｕｏｒｅｔｈｙｌｅｎｅ）、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ（エーテルエーテル）ケトン、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリビニルフェノール、ポリラクチド、ポリメタクリルイミド（ＰＭＩ）、ポリアルケンスルホン（ＰＡＳ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリイミド、コブロックポリマー、およびＥｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）が包含されるがこれらに限定されない。本発明ではまた、フォトレジスト、重合化ラングミュア−ブロジェット膜、およびＬＩＧＡ構造も基材として用いることができる。
【０１３８】
一実施形態では、異なる抗体によるマイクロアレイを、ポリカチオン性ポリマーでコーティングしたスライドガラスに結合させる。基材は、本発明の別の態様により形成し、標的分子の、１または複数の異なる抗体への結合を検出するときの使用を意図する。一実施形態では、基材に、その表面上にポリカチオン性ポリマー、好ましくは、ポリリシンまたはポリアルギニンなど、カチオン性ポリペプチドのコーティングを形成しているガラス製基材が包含される。ポリカチオン性コーティング上では、各々が、選択された公知のアレイ領域に配置された異なる生体ポリマーのマイクロアレイが形成される。
【０１３９】
均一の厚さのポリカチオン性ポリマーの膜、例えば、ポリ−ｌ−リシンの膜を、スライド表面に配置し、膜を乾燥させて乾燥コーティングを形成することにより、スライドをコーティングすることができる。添加されるポリカチオン性ポリマーの量は、ガラス表面上にポリマーの少なくとも単層を形成するのに十分である。ポリマー膜は、表面における負のシリル−ＯＨ基と、ポリマー中の荷電したアミン基との静電結合を介して表面に結合する。ポリ−ｌ−リシンでコーティングしたスライドガラスは、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から市販され入手できる。
【０１４０】
適切なマイクロアレイ基材はまた、ガラスを化学的に誘導体化することによっても作製することができる。末端のＳｉにおいて適切な脱離基を伴うシラン化合物は、ガラス表面に共有結合する。誘導体化分子は、ガラス基材表面に所望の化学反応性を付与するようにデザインすることができる。このような二官能性試薬の例が、アミノ−プロピル−トリ（エトキシ）シランであり、これは、この分子のトリ（エトキシ）シラン部分においてガラス表面と反応する一方で、この分子のアミノ部分は脱離させる。末端のアミノ基を有する表面は、ポリリシンでコーティングしたスライドと同様に、生体ポリマーの吸着に適する。末端表面基の内実は、さらなる化学反応により修飾することができる。例えば、上記の例における末端アミンの、グルタルアルデヒドとの反応は、結果として、末端アルデヒド基をもたらす。さらなる修飾層を適用して、所望の反応性を達成してから、シリル化させたガラスにプロテインＡ溶液またはプロテインＧ溶液を適用することなどにより、マイクロアレイをスポットすることができる。ポリペプチドに結合するさらなる表面は、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌから市販されている、ニトロセルロースでコーティングしたスライドガラス、およびポリスチレンなどのタンパク質に結合するプラスチックである。
【０１４１】
スポットした抗体は、吸着または共有結合を介して結合させることができる。吸着は、スポットされたポリペプチドとアレイ基材との静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または水素結合相互作用を介して生じる。水性環境において、ポリペプチド溶液を表面へと適用するだけで、ポリペプチドを吸着するのに十分である。共有結合は、ポリペプチド上の官能基の、化学的に活性化された表面との反応により達成される。例えば、表面が、アルデヒド基またはスクシンイミド基など、高度に反応性の求電子基により活性化されている場合、修飾されていないポリペプチドは、リシン残基または末端アミンなどのアミン基において反応し、共有結合を形成する。
【０１４２】
マイクロアレイを形成するには、当技術分野において公知である任意の適切な方法を用いて、規定容量の異なる生体ポリマーを、ポリマーでコーティングしたスライド上に沈着させる。基材の重要な特徴によれば、試料中の標識化されたリガンドの、基材アレイ中の同種の結合パートナーへの結合を可能とする条件下で、水性試料を基材に適用する場合、沈着した抗体は、コーティングされたスライド表面に対する非共有結合的な結合を維持する。
【０１４３】
一部の実施形態では、各マイクロアレイが、約１ｃｍ２未満の表面積当たりに少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００の異なる抗体を含有する。一実施形態では、マイクロアレイが、約１６ｍｍ２の面積中に５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、もしくは４００の領域、または２．５×１０３個／ｃｍ２の領域を含有する。また、好ましい実施形態では、各マイクロアレイ領域における抗体が約０．１フェムトモル〜１００ナノモルの規定量でも存在する。
【０１４４】
また、好ましい実施形態では、生体ポリマーの長さが、少なくとも約５０単位、例えば、５０アミノ酸、５０ヌクレオチドなどである、すなわち、多様なｉｎ  ｓｉｔｕにおける合成スキームによる高密度アレイにおいて形成されうるポリマーより実質的に長い。
マイクロアレイの使用
本発明のマイクロアレイは、医療的診断、薬物の発見、分子生物学、免疫学、および毒性学において用いることができる。
【０１４５】
本発明に従い調製される固定化された抗体のマイクロアレイは、多くの診断適用およびスクリーニング適用における大スケールの結合アッセイに用いることができる。多数の標的（例えば、タンパク質）のレベルにおける定量的な変化をマルチプレックスで測定することにより、複数〜多くの異なる標的（例えば、タンパク質）により規定されるパターンの認識が可能となる。多くの生理学的パラメータおよび疾患特異的パターンを同時に評価することができる。
【０１４６】
一実施形態は、生物学的試料中に存在するタンパク質の分離、同定、および特徴付けを伴う。例えば、疾患試料と対照試料とを比較することにより、「疾患特異的タンパク質」を同定することが可能となる。これらのタンパク質は、薬物開発または疾患の分子マーカーのための標的として用いることができる。
【０１４７】
抗体アレイを用いて、試料中のタンパク質の発現レベルをモニタリングすることができるが、この場合、このような試料には、対象の組織生検、培養細胞、微生物細胞集団、血液、血漿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、細胞溶解物、培養物上清、羊膜液などを包含する生物学的流体、およびこれらの派生物が包含されうる。特に重要なのは、血液およびその派生物、脳脊髄液、尿、唾液、リンパ液、滑液などを包含する生物学的流体の臨床試料である。このような測定は、定量的な場合もあり、半定量的な場合もあり、または定性的な場合もある。アッセイを、定量的または半定量的とする場合、アッセイは、例えば、標識化した試料と標識化されていない試料との競合型フォーマット、または示差的に標識化された試料間における競合型のフォーマットを含むことが好ましい。
【０１４８】
固定化されたポリペプチドに対する標的分子の存在を検出するアッセイは、以下の通りに実施することができるが、方法が、本明細書に示される方法に限定される必要はなく、当技術分野において公知である任意の適切な方法が包含される。
【０１４９】
試料、それらの画分、またはアリコートを、抗体を含むマイクロアレイに添加する。試料は、上記に記載した通り、多種多様な生物学的流体または生物学的抽出物を含みうる。公知濃度の対照リガンド（複数可）を含有する一連の基準物質を、試料またはそれらのアリコートと並列的にアッセイし、対照として用いる。インキュベーション時間は、標的分子がポリペプチドに結合するのに十分であるべきである。一般に、約０．１〜３時間であり、通常、１時間であるが、１日間以上の長さでもありうるであろう。
【０１５０】
一般に、インキュベーション後、不溶性の支持体から、結合しなかった成分を洗い流す。一般に、適切なｐＨ、一般にはｐＨ７〜８である非イオン性の希釈洗浄媒体を、洗浄媒体として用いる。試料中に存在する、非特異的に結合したタンパク質を完全に洗い流すのに十分な容量による、１〜６回の洗浄を用いることができる。
【０１５１】
結合した標的の存在を検出するには、多様な方法を用いることができる。これらは、３つの一般的な群に分かれる。標的自体は、検出可能な標識により標識化することができ、結合した標識の量は、直接測定することができる。代替的に、標識化した試料は、競合アッセイにおいて、示差的に標識化した試料または標識化されていない試料と共に混合することもできる。さらに別の実施形態では、試料自体は標識化しないが、存在するリガンドの量を定量化するために、第２段階の標識化試薬を添加する。
【０１５２】
リガンド結合の直接的な測定を可能とする標識の例には、３Ｈまたは１２５Ｉなどの放射性標識、蛍光物質、色素、ビーズ、化学発光物質、コロイド状粒子などが包含される。当技術分野では、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ロダミンおよびロダミン誘導体、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシ−Ｘ−ロダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシロダミン（ＴＡＭＲＡ）、スルホン化ロダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５などを包含する適切な蛍光色素が公知である。標識化される化合物は、リガンド上に存在する基、例えば、アミン基、チオール基、アルデヒド基などと反応する活性化色素と組み合わせることが好ましい。
【０１５３】
特に、例えば、標的を認識する標識化抗体の添加を介して第２段階の検出を実施する場合は、適切な基材を添加した後で、標識を、検出可能な生成物シグナルをもたらすことが可能な酵素に共有結合させることができる。コンジュゲートにおいて用いるのに適する酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどが包含される。市販されていない場合は、このような抗体−酵素コンジュゲートを、当業者に公知の技法により容易に作製される。第２段階の結合試薬は、それが、存在する他の成分から識別されうるように、十分な特異性で標的分子に結合する任意の化合物でありうる。好ましい実施形態では、第２段階の結合試薬が、モノクローナル血清またはポリクローナル血清、例えば、マウス抗ヒト抗体など、リガンドに特異的な抗体である。
【０１５４】
シグナルを増幅するには、リガンドを、ビオチン、ジゴキシゲニンなどの薬剤で標識化することができるが、この場合、第２段階の試薬は、標識に適切なアビジン、ストレプトアビジン、抗ジゴキシゲニン抗体などを含む。
【０１５５】
例えば、走査レーザー顕微鏡を用いることにより、蛍光測定、改変ＥＬＩＳＡプレートリーダーなどにより、マイクロアレイを走査して、リガンドの結合を検出することができる。例えば、走査レーザー顕微鏡は、用いられる各フルオロフォアに適切な励起線を用いて、個別の走査を実施することができる。次いで、走査により作成されるデジタル画像を、後続の解析のために組み合わせる。任意の特定のアレイエレメントについて、１つの標識による蛍光シグナルの比を、他の標識ＤＮＡに由来する蛍光シグナルと比較し、相対量を決定する。
【０１５６】
マイクロアレイおよび標的分子を検出する方法は、多くのスクリーニングアッセイ、探索アッセイ、および診断アッセイに用いることができる。一適用では、抗体アレイを、生物に由来する全タンパク質に結合させ、研究目的または診断目的のために、タンパク質の発現をモニタリングする。正常細胞に由来する全タンパク質を１つの色のフルオロフォアで標識化し、疾患細胞に由来する全タンパク質を別の色のフルオロフォアで標識化し、２つの試料を同じアレイに同時に結合させることにより、示差的なタンパク質発現を、２つのフルオロフォア強度の比として測定することが可能となる。この二色実験を用いて、異なる組織型、疾患状態、薬物に対する応答、または環境因子に対する応答における発現をモニタリングすることができる。
【０１５７】
例えば、１または複数のタンパク質が、疾患経路に関与しているかどうか、または疾患特異的な表現型と相関しているかどうかを決定するためのスクリーニングアッセイでは、培養細胞から測定値を求めることができる。このような細胞は、標的または対象の経路に作用する薬理学的な活性薬剤を添加することにより、実験的に操作することができる。この適用は、生物学的機能の解明または治療標的の発見に重要である。
【０１５８】
多くの診断目的および探索目的には、血液または血清中の標的分子、例えば、標的タンパク質のレベルを測定することが有用である。この適用は、特定の診断または予後診断と相関する臨床的に有用なマーカーの発見およびこれによる診断に重要である。例えば、抗体またはＴ細胞受容体の特異性の範囲を並行してモニタリングすることにより、自己免疫疾患、感染、移植片拒絶などにおける抗体のレベルおよび反応速度を決定することができる。代替的に、対象の疾患と関連する新規のタンパク質マーカーは、正常血液試料と疾患血液試料とを比較することにより開発することもでき、疾患の異なる病期における臨床試料を比較することにより開発することもできる。
【０１５９】
生物のゲノムにおけるタンパク質発現についての情報は、疾患の発生、発症、疾患の耐性、疾患の感受性、または薬物の応答などの表現型との関連により、個別化された形での疾患の診断および処置（また、「個別化医療」としても公知である）が包含されるがこれらに限定されない多種多様な適用を有しうる。また、細胞特異性または組織特異性との関連で、生物のゲノムにおける生物学的経路に対して関与性であるタンパク質を同定し、特徴付けることにより、治療効果が増強され、副作用が軽減された治療用のトランスジェニック発現構築物をデザインする一助ともなりうる。また、細胞特異性または組織特異性との関連でタンパク質の発現を同定し、特徴付けることにより、疾患を診断し、予防し、処置するための機能的なマーカーを開発する一助ともなりうる。「疾患」には、変化させることが望ましい、生物の任意の状態、形質、または特徴が包含されるがこれらに限定されない。例えば、状態は、物理的状態、生理学的状態、または心理学的状態である可能性があり、症候的な場合もあり、非症候的な場合もある。
【０１６０】
本発明の別の実施形態では、抗体アレイを用いて、シグナル伝達経路および細胞制御を研究するのに重要である、タンパク質における翻訳後修飾を検出する。翻訳後修飾は、タンパク質のリン酸化状態、グリコシル化状態、ファルネシル化状態など、タンパク質の特定の状態に特異的な抗体を用いて検出することができる。
【０１６１】
リガンドとポリペプチドとのこれらの相互作用を検出することにより、医学的診断をもたらすことができる。例えば、未知の病原体の試料を、公知の病原性抗原に特異的な多くの種類の抗体を含有するアレイに結合させることにより、病原性微生物の識別を明確に確立することができる。
キット
一実施形態では、抗体のライブラリーを含むキットが提供される。一部の実施形態では、抗体のライブラリーを、支持体、例えば、９６ウェルまたは３８４ウェルにアレイする。一実施形態では、キットが、抗体のマイクロアレイを含む。キットは、レポーターアッセイ基材、特定の生物学的経路を誘導もしくは抑制するための試薬（サイトカインまたは他の精製されたタンパク質、低分子、ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）、および／またはデータ解析ソフトウェアをさらに包含しうる。
【０１６２】
加えて、本発明の方法を実施するか、または本発明の組成物、ライブラリー、アレイ、もしくは製品アセンブリーのうちのいずれかを用いて試験またはアッセイを実施するための試薬および指示書を含むキットも提供される。キットは、緩衝液、酵素、アダプター、標識、二次抗体、および、場合によってトラブルシューティング情報を包含する、キットを用いるのに必要な指示書をさらに含みうる。
【０１６３】
さらに別の実施形態では、キットが、本明細書で記載のものなどの抗体のライブラリーと、生物のプロテオームなどの抗原のライブラリーとを含みうる。キットは、生物のプロテオームのうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含みうる。抗原のライブラリーは、細菌プロテオーム、ウイルスプロテオーム、真菌プロテオームなど、生物プロテオームの実質的部分または全体を代表しうる。抗原のライブラリーは、昆虫のプロテオームの実質的部分または全体を代表する場合もあり、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ヤギ、またはヒトなど、哺乳動物のプロテオームの実質的部分または全体を代表する場合もある。例えば、生物のプロテオームライブラリーは、少なくとも１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００の異なる抗原を含みうる。生物のプロテオームライブラリーは、表５に列挙されるヒトタンパク質のうちの少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を含みうる。
【実施例】
【０１６４】
（実施例１）
発現ベクター内への約１７，０００の全長ヒトＯＲＦのサブクローニング
さらなる１，０００の全長ヒトＯＲＦと共に得た、約１６，０００の固有のＯＲＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）によるＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＯＲＦコレクションをサブクローニングした。ガラクトースで誘導すると、酵母内でＮ末端６×Ｈｉｓ６：：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を生成させる、酵母に適合性であるＧａｔｅｗａｙ（登録商標）発現ベクター（ｐＥＧＨ−Ａ）を構築した（図３）。その後、約１７，０００の全ヒトＯＲＦを、制限消化により決定される９９％の成功率でサブクローニングした。とりわけ、コレクションの３つの複製配列を作製し、これらのうちの１つからエントリーＤＮＡを抽出し、アガロースゲル上でプラスミドＤＮＡの品質を点検した。次いで、結果として得られる組換え体を細菌へと形質転換し、Ａｍｐ含有プレート上で単一のコロニーを選択した。各ＬＲ組換えについて、４つの単一コロニーを採取して、グリセロールストックを生成させ、これらのうちの２つをさらに加工して、プラスミドＤＮＡを、９６ウェルフォーマットで抽出した。抽出されたプラスミドＤＮＡを制限酵素で消化して、挿入配列を放出し、アガロースゲル上で泳動させ、ベクターおよび挿入配列のサイズを、サブクローニングの成功の指標として検証した（図３）。各制限イベントを、予測される挿入配列のサイズに基づきスコア付けしたところ、成功率は９９．３％として決定された。
【０１６５】
＞２００のランダム発現クローンを配列決定したところ、配列の１００％が正確であることが示された。確認された発現構築物を再度アレイして、酵母用の発現クローンのマスターセットを生成させた。細菌発現ベクターでも、同様の大スケールクローニングを完了させた。
【０１６６】
（実施例２）
５０００のヒト抗原によるマイクロアレイのデザインおよび作製
マイクロアレイを作製するために、フォールディングが適正な組換えタンパク質を迅速に精製する能力について試験するために、パイロット実験を実施した。これらのタンパク質は、５つの異なる機能的範疇：転写因子および転写共制御因子、ＲＮＡ結合タンパク質、タンパク質キナーゼ、クロマチン関連タンパク質およびクロマチン修飾タンパク質、ならびにミトコンドリア内タンパク質へと分けられる。タンパク質は、一次配列、文献による注記、およびＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙによる注記に基づき、これらの範疇に分けられた。発現したＯＲＦは、関与性である機能的範疇における全てのヒトタンパク質のうちの最大８５％（転写因子の場合）を代表した。発現したタンパク質のうちの９０％超が、アレイの構築に十分なレベルで精製された（Ｈｏ，  Ｓ．Ｗ．ら、「Ｌｉｎｋｉｎｇ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、２００６年、１０３巻（２６号）：９９４０〜５頁）。
【０１６７】
複数の機能試験を実施して、発現したタンパク質が、固体表面上で固定された後でも機能的であることを確認した。酵母に由来する１１９の個別に精製されたタンパク質キナーゼを含有するキナーゼチップ上で自己リン酸化アッセイを実施し、キナーゼのうちの約８５％が、検出可能なキナーゼ活性を示すことを観察した（Ｚｈｕ，  Ｈ．ら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｉｐｓ」、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２０００年、２６巻（３号）、２８３〜９頁）。固体表面に共有結合的に結合させるにもかかわらず、これらのタンパク質キナーゼのうちの大半は、それらの酵素活性を維持することが明らかであった。約３００の酵母転写因子からなるタンパク質チップを用いて、多様なＤＮＡモチーフと転写因子との特異的な相互作用を同定およびプロファイリングした（Ｈｏ，  Ｓ．Ｗ．ら、「Ｌｉｎｋｉｎｇ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、２００６年、１０３巻（２６号）：９９４０〜５頁）。また、ＤＮＡモチーフとヒト転写因子との相互作用も研究したが、この場合、約１，０００のヒト転写因子からなるパイロットのタンパク質チップを用いて、公知のＤＮＡモチーフは、それらの記録されている転写因子に特異的に結合するが、逆に、これらのモチーフに点突然変異を施すと、それらの結合アフィニティーが劇的に低減されることを示した（Ｈｕ，  Ｓ．ら、「Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ  ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ＥＲＫ２  ａｓ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」、Ｃｅｌｌ、２００９年、１３９巻（３号）：６１０〜２２頁）。
【０１６８】
（実施例３）
ヒト抗原タンパク質チップの作製
酵母細胞から１７，０００のヒトタンパク質抗原の完全なセットを精製するために、ヒトＯＲＦの全マスターセットを、ｐＥＧＨ−Ａにより酵母へとクローニングし、単一のコロニーを採取し、グリセロールストックを調製した。組換えタンパク質を作製するために酵母細胞を誘導し、−８０℃で保存した。誘導された培養物の品質をモニタリングするため、２４のランダム株を各培養物調製バッチにつき２連で接種し、それを、まず、タンパク質精製ステップにかけた。免疫ブロット法および銀染色法を用いて、培養物誘導の成功率を推定した（図４Ａ）。精製されたタンパク質のうちの少なくとも８５％が、免疫ブロット解析および銀染色解析のいずれにおいても、予測される分子量範囲に主要なバンドを示す場合に限り、成功が示された。成功が示されなかった場合は、失敗したバッチの培養物調製を繰り返した。この基準を用いて、１７，０００の抗原タンパク質全てを、８５％の成功率で精製した。マイクロアレイ作製装置を用いて、精製されたヒト抗原タンパク質を、多様なガラス表面（例えば、ＦＡＳＴ、Ｎｉ−ＮＴＡ、およびＦｕｌｌＭｏｏｎ）へとスポットし、ヒト抗原チップを作製した。スライドを抗ＧＳＴ抗体およびＣｙ３で標識化した二次抗体でプロービングすることにより、チップの品質をモニタリングした。チップを走査し、ＧｅｎｅＰｉｘソフトウェアを用いてシグナルを収集および解析した。結果は、チップが高品質であり、プリントされたタンパク質のうちの＞９０％が、バックグラウンドより著明に高値のシグナルをもたらすことを示した（図４Ｂ、Ｃ）。
【０１６９】
（実施例４）
抗原マイクロアレイにおける抗体品質のプロファイリング
従来の方法を用いて、肝臓において発現するヒトタンパク質に対するモノクローナル抗体のプロファイリングを実施した（Ｈｕ，  Ｓ．ら、「Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｉｐ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００７年、７巻（１３号）：２１５１〜６１頁）。大量のモノクローナル抗体を腹水から精製し、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中で１０，０００倍に希釈した。ｍＡｂの品質（例えば、アフィニティーおよび特異性）を評価するために、ヒト肝臓タンパク質チップを用いた。文献／データベース検索に基づき、ヒト肝臓において発現することが公知である１，０５８の全長ｃＤＮＡを、これらのタンパク質をＮ末端ＧＳＴ融合タンパク質として発現する発現ベクターへとクローニングした。ヒト肝臓タンパク質チップを作製するために、グルタチオンアフィニティークロマトグラフィーを用いて、これらの遺伝子を酵母細胞から発現させ、精製し、スライドガラス上にスポットした。また、マウスＩｇＧも、チップ上にスポットして、ランドマークとして用いた。抗ＧＳＴ抗体を用いて、抗原マイクロアレイ上に固定化されたヒト肝臓タンパク質の量を視覚化および定量化した（図５Ａ）。結論は、９８．５％（１，０４２／１，０５８）のタンパク質が、バックグラウンドを上回る著明なシグナルを示し、タンパク質チップが高品質であることを示した。
【０１７０】
異なるヒト肝臓タンパク質に対して生成させた複数のモノクローナル抗体の特異性を評価するため、自家製の加湿チャンバー内で静かに振とうしながら、室温（ＲＴ）で少なくとも１時間にわたり、ＰＢＳ緩衝液中に１％のＢＳＡでチップをブロッキングした。この間、腹水から精製したモノクローナル抗体を、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）緩衝液中で２０，０００倍に希釈した。ブロッキングの後、希釈したｍＡｂを異なるチップに添加し、静かに振とうしながら、ＲＴで３０分間にわたりインキュベートした。次いで、振とうしながら、４２℃で１０分間、ＰＢＳＴ（１％のＴｗｅｅｎ  ２０）緩衝液中で３回にわたり、チップを洗浄した。Ｃｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ、ＰＢＳ中で１１，０００倍の希釈率）で標識した抗マウスＩｇＧ抗体をチップに添加し、暗所においてＲＴで１時間にわたりインキュベートした。次いで、静かに振とうしながら、４２℃で１０分間、あらかじめ加熱したＰＢＳ＋０．１％  Ｔｒｉｔｏｎで３回にわたり、チップを洗浄した。フィルターで滅菌した二段脱イオン水で２回にわたりすすいだ後、チップをスピンして乾燥させた。結合プロファイルを可視化するため、本発明者らは、チップを、マイクロアレイスキャナーで走査し、ＧｅｎｅＰｉｘソフトウェアにより結合シグナルをさらに解析した。図５Ｂに示す通り、ピリンに対して生成させたｍＡｂの特異性を、スライド上にスポットした１，０５８のタンパク質に対して試験したところ、このｍＡｂは、ピリンだけを認識した。スポットされた各タンパク質の量が劇的に変化するわけではないため、この結果は、抗体が高度に特異性であることを示した。他の４つのヒトタンパク質に対して生成させたｍＡｂについてもまた、同様の結果が得られた（図５Ｃ）。
【０１７１】
（実施例５）
モノクローナル抗体の生成および特徴付け
組換えヒトタンパク質およびヒトがん生細胞系の両方による免疫化に応答する、２，０００を超える強力なＩｇＧ分泌モノクローナル抗体を生成させた。１７，０００のヒトタンパク質を含有するタンパク質マイクロアレイを用いて、これらのモノクローナル抗体のうちの８８の結合特異性を解析した。
【０１７２】
この解析に用いられるマイクロアレイの数を低減するため、最大７つの異なるハイブリドーマに由来する上清の均等な混合物を、図６に概略的に記載される交差解析において用いて、これらのプールされた抗体の特異性を探索した。マイクロアレイ上の単一のタンパク質だけが、これらのモノクローナル抗体により認識されるという点では、８８のうち１１のモノクローナル抗体だけが、真に単一特異性である。他の７つのモノクローナル抗体は、アレイ上の３つの異なるタンパク質だけに結合したことから、高度ではあるが限定的な特異性が示される。単一特異性モノクローナル抗体のうちの４つについては、いかなる種類の抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の）も市販されていないが、他の７つに対する市販抗体のうちのいずれかが単一特異性であるかどうかは公知ではない。これらのタンパク質を認識する、これらの単一特異性モノクローナル抗体、および市販抗体のリストを、表１に示す。１１の単一特異性モノクローナル抗体により認識される抗原を、Ｇｅｎｅ  Ｓｙｍｂｏｌ  ＩＤにより列挙する。カッコ内のこの抗原に対するモノクローナル抗体の数と共に、このタンパク質に対する全ての市販抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方）の数もまた列挙する。
【０１７３】
【表１】
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（実施例６）
ヒト脳で発現する転写因子に対するモノクローナル抗体
抗原の作製
Ｅ．ｃｏｌｉ内の準備的発現ベクターからヒトタンパク質を発現させた。既に記載した通り、ヒトタンパク質は、Ｎ末端にタグ付けしたＧＳＴ：Ｈｉｓ６融合タンパク質として発現させ、精製した。一部のヒトタンパク質は、他のヒトタンパク質より、細菌宿主から大量に発現させ、精製するのがはるかに容易であるので、どのヒト染色体タンパク質がこの範疇に入るかを決定するための大スケールのスクリーニングを実施する。図７に示す通り、１０時間以内にＥ．ｃｏｌｉから＞４，０００の個別のタンパク質の精製を可能とする、極めてハイスループットのタンパク質精製プロトコールを実施することができる（Ｃｈｅｎ，  Ｃ．Ｓ．ら、「Ａ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｃｈｉｐ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｅｗ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００８年、５巻（１号）：６９〜７４頁）。このプロトコールを用いると、精製が容易な約２００の候補タンパク質が同定される。菌株のうちの約３０％は、培養物２５０ｍＬ当たり２ｍｇのタンパク質をもたらし、６０％は、培養物２５０ｍＬ当たり０．５ｍｇのタンパク質をもたらし、４０％は、培養物２５０ｍＬ当たり＜０．１ｍｇのタンパク質をもたらすはずである。
【０１７４】
大量の細菌培養物から得られる「容易な」高収量タンパク質は精製される。略述すると、菌株を、小規模の一晩にわたる培養で活性化させ、２５０ｍＬの培地へと接種し、翌朝に約０．１の最終のＯＤ６００をもたらす。２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で０．７〜０．９のＯＤ６００へと細胞を増殖させた後で、最終濃度を１ｍＭとするイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で約３．５時間にわたりタンパク質の発現を誘導する。遠心分離により細胞を回収し、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｂ（Ｓｉｇｍａ）、１ｍｇ／ｍｌのライソザイム、５０単位／ｍｌのベンゾナーゼ、プロテイナーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）、および１ｍＭのＰＭＳＦと共に、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８を含有する溶解緩衝液中、４℃で再懸濁させる。氷上で３０分間にわたるインキュベーション後、遠心分離により細胞破砕物を除去し、あらかじめ洗浄したＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（ＱＩＡＧＥＮ）を、細胞溶解物に添加する。氷上で４０分間にわたるインキュベーション後、ニッケル樹脂を回収し、低温室において、洗浄緩衝液Ｉ（３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、２０ｍＭのイミダゾール、および０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴う、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８）で３回にわたり洗浄し、洗浄緩衝液ＩＩ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５％のグリセロール、２０ｍＭのノイミダゾール、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴う、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８）で３回にわたり洗浄した。精製されたタンパク質は、３Ｃプロテアーゼによる切断を介して溶出させ、ＧＳＴおよびＨｉｓ６タグを除去した。溶出させたタンパク質を混合およびアリコート分割し、これらのうちの小画分を、クーマシー染色を用いて、ＰＡＧＥゲル上でタンパク質の品質および量を決定するのに用いる。
【０１７５】
中程度の収量範疇に分けられるタンパク質については、培養容量を１Ｌまで増大させ、収量を２ｍｇに到達させる。細菌内で十分に発現しないタンパク質については、ＧＳＴアフィニティータグを用いて、タンパク質を、酵母培養物から精製する。既に記載した通り、ガラクトースを添加することにより、酵母におけるヒトタンパク質の発現を誘導することができる。これらの難しいタンパク質を精製するには、市販のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写／翻訳系（例えば、Ｒｏｃｈｅ社製のウサギ網状赤血球系）を用いてタンパク質を合成する。用いられるベクター系内ではＴ７プロモーターが既に組み込まれているので、さらなるサブクローニングは要請されない。まとめると、ヒトタンパク質のうちの少なくとも８５％は、約２ｍｇをもたらすことが予測される。この抗原量は、免疫化、モノクローナル抗体の作製、およびスクリーニングの目的に十分な量を超える。
【０１７６】
抗体の作製
最大４回にわたる抗原の背側皮下注射の単一ラウンドを用いる、複数部位における急速な免疫化（ＲＩＭＭＳ）の１４日間後における腹腔内（ＩＰ）追加投与、および３〜４日間後における脾臓細胞採取（Ｂｙｎｕｍ，  Ｊ．ら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ−ｓｗｉｔｃｈｅｄ，  ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｍａｔｕｒｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａ  ７−ｄａｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ  」、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９９９年、１８巻（５号）：４０７〜１１頁）か、または後足の足蹠への抗原／付加投与の１ラウンドの注射の７〜１４日間後における、追加投与注射を必要としない排出リンパ節（膝窩リンパ節および鼠径リンパ節）の採取（Ｍｉｒｚａ，  Ｉ．Ｈ．ら、「Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓｐｌｅｅｎ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｉｓｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｏｕｔｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８７年、１０５巻（２号）：２３５〜４３頁）を用いて、動物を免疫化する。
【０１７７】
２つの細胞型である免疫Ｂ細胞と、培養安定性の骨髄腫細胞系とを融合させることにより、ハイブリドーマを生成させる。これは、ＰＥＧなどの融合性化合物の存在下で実施する。ピリミジン／プリン合成経路、新規のスカベンジング経路の２つの代謝経路の存在を利用することにより、融合しなかった細胞から、所望のハイブリッド細胞生成物を選択することができる。一般的に用いられる骨髄腫細胞系は、８−アザグアニンまたは６−チオグアニンに対する耐性について選択され、したがって、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠損させているので、サルベージ経路を欠損させている。したがって、融合反応物をＨＡＴ培地へと播種すると、融合しなかった免疫細胞および骨髄腫細胞は除去されるが、ハイブリドーマの増殖は許容される。用いられる骨髄腫細胞系は、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞、ＮＳＯ／１細胞、またはＳｐ２／０−Ａｇ−１４細胞である。
【０１７８】
所望のハイブリドーマを同定するためのスクリーニングは、分散させた細胞融合反応物に由来する各マイクロ滴定ウェルの培養物上清のアリコートを解析することにより実施する。抗原をポリビニル製の９６ウェルプレート上に固定化し、次いで、コロニー含有ウェルの全てに由来する上清と共にインキュベートするＥＬＩＳＡ型のアッセイを、各個別の抗原について考案する。抗原結合抗体を生成させる培養物ウェル内の細胞を採取し、クローンコロニーを単離するために希釈形態で再播種する。個別の細胞を、アッセイ可能なコロニーへと増殖させるためには、この限界希釈によるクローニングステップに、最長約２週間のインキュベーションを要する。一般には、第２のスクリーンをＥＬＩＳＡアッセイに組み込むが、これにより、ハイブリドーマにより分泌される抗体のクラスが明らかとなる。
【０１７９】
モノクローナル抗体の単離における最後の２つのステップは、ハイブリドーマ系のクローン性を確立し、次いで、これらの系列を増殖させて、有用量の抗体を生成させることを伴う。標準的な方法を用いてハイブリドーマを作製した場合は、細胞系をクローニングして、非類縁抗体を生成させうる夾雑ハイブリドーマの存在を消失させる。これは、細胞をマイクロ滴定ウェルへと限界希釈播種した後で、抗原特異的ＥＬＩＳＡで上清を再スクリーニングすることにより実施することが典型的である。元の融合反応物を、ペトリディッシュ内の半固体培地（メチルセルロース）中に播種する場合は、細胞が初めから明確なクローンとして増殖するので、限界希釈クローニングを回避することができる（Ｄａｖｉｓ，  Ｊ．Ｍ．ら、「Ａ  ｓｉｍｐｌｅ，  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８２年、５０巻（２号）：１６１〜７１頁）。抗原に対する抗体を発現するクローンは、抗原を半固体培地中に組み入れ、事実上、抗原：抗体複合体をクローンの近傍に沈殿させるオクタロニー反応を実施することにより、同定することができる。次いで、第１の増殖ステップとして、クローンを、毛細管により１２ウェルプレートへと採取する。次いで、容量を増大させる培養器を用いて、いずれの種類のクローニング工程に由来する小スケールの培養物も増幅させる。ハイブリドーマを、２０〜１００ｍｇ／ｌをもたらすことが典型的な大容量の培養系（例えば、大型固定フラスコ、スピナーフラスコ、中空糸反応器）内に維持することにより、または５〜１０ｍｇ／ｍｌでありうるが、実質的に少量の全容量をもたらしうる、腹水生成のための、マウスへの細胞の注射により、有用量の抗体を採取する。
ヒト抗原マイクロアレイの作製
十分なヒト抗原チップをもたらすため、まず、確立されたハイスループットプロトコール（上記で論じた）を用いて、約１７，０００のヒト抗原を、酵母細胞に由来するＮ末端ＧＳＴ−Ｈｉｓ６融合タンパク質として精製する。まず、酵母菌株をＳＣ−Ｕｒａ寒天プレートに播種し、９６ウェル内に８００μｌのＳＣ−Ｕｒａ培地中で一晩にわたり培養する。次いで、飽和させた各培養物を、１２ｍｌのＳＣ−Ｕｒａへと接種し、培養物が０．７のＯ．Ｄ．に到達した後で、２％のガラクトースにより４時間にわたり誘導した。誘導された酵母細胞を回収し、−８０℃で保存した。誘導された培養物の品質をモニタリングするため、各培養物調製バッチにつき２４ずつのランダム株を２回にわたり接種し、まず、十分な誘導レベルを確認するために、タンパク質精製ステップにかける。免疫ブロット法および銀染色法を用いて、培養物誘導の成功率を推定し、＞８５％の成功率を示すバッチだけを、大スケールの精製にかける。ヒト抗原チップを作製するため、１５０チップ／日のスループットで、２つのマイクロアレイ作製装置であるＣｈｉｐＷｒｉｔｅｒ  Ｐｒｏ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）およびＮａｎｏＰｒｉｎｔ（ＴｅｌｅＣｈｅｍ、ＵＳＡ）を用いて、精製されたヒト抗原タンパク質と、陰性対照としてのＢＳＡおよびＧＳＴ−Ｈｉｓ６の希釈系列と、陽性対照としてのヒストン、ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ、ならびにＥＢＮＡ１の希釈系列とを包含する対照タンパク質とを、ＦｕｌｌＭｏｏｎスライド（ＦｕｌｌＭｏｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）上に２連でスポットする。各バッチのチップの品質、および表面上に固定化されるタンパク質の量は、チップを、抗ＧＳＴ抗体の後、Ｃｙ３で標識した二次抗体でプロービングすることにより、モニタリングする。プリンティングの成功率は、＞９０％に到達すると予測される。
ヒト抗原マイクロアレイを用いる、染色体タンパク質に対する抗体の検証
ｍＡｂの特異性の決定：ヒト染色体タンパク質に対して生成させたｍＡｂの特異性を評価するため、腹水から精製したｍＡｂを、作業用原液として、ＰＢＳ中で１０００倍に希釈する。自家製の加湿チャンバー内で静かに振とうしながら、室温（ＲＴ）で最低１時間にわたり、ＰＢＳ緩衝液中に１％のＢＳＡで、チップ（マイクロアレイ）をブロッキングする。ＰＢＳ緩衝液中で適正に希釈されたｍＡｂを、静かに振とうしながら、３０分間にわたりＲＴのチップ上でインキュベートする。次いで、チップを、振とうしながら、ＰＢＳＴ（１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）緩衝液中４２℃で３〜１０分間にわたる洗浄にかける。Ｃｙ−５（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ、ＰＢＳ中１：１，０００の希釈率）で標識化した抗マウスＩｇＧ抗体をチップに添加し、暗所内ＲＴで１時間にわたりインキュベートする。同じ洗浄ステップの後、チップを、フィルターで滅菌した二段脱イオン水中で短時間にわたりすすぎ、スピンして乾燥させる。結合プロファイルを可視化するため、チップを、マイクロアレイスキャナーで走査し、ＧｅｎｅＰｉｘソフトウェアにより結合シグナルを解析する。陰性対照実験として、Ｃｙ５で標識化した二次抗体をプロービングし、非特異的結合活性を同定する。１７，０００のタンパク質によるマイクロアレイに対して試験したところ、約１５０のタンパク質（例えば、ＭＧＭＴおよびＰＣＢＰ１）が、Ｃｙ５で標識化したマウスＩｇＧに対する二次抗体に対する結合活性を示した。非特異的相互作用性タンパク質は、さらなる解析から除外する。
【０１８０】
プーリング解析：予備的データに基づき、プーリング法を用いて、単一特異性を示すｍＡｂを迅速に同定する。「水平方向」のプールおよび「垂直方向」のプールにおいて高レベルのＩｇＧ陽性ｍＡｂを分泌するハイブリドーマの上清を、図６に概略的に示す。マイクロアレイ上のタンパク質が、問題のハイブリドーマに由来する上清をそれらのいずれもが含有する、単一の水平方向および垂直方向のプールにより認識される場合に、抗体を単一特異性と分類する。スクリーニングされた全てのハイブリドーマのうちのおおよそ１０％が単一特異性を示し、このようなｍＡｂのうちの大多数を単離しうることが予測される。合計１４のマイクロアレイを用いて、４９の異なるハイブリドーマの特異性を解析することができることから、解析のスループットが実質的に増大する。
【０１８１】
二次スクリーニング：次いで、プーリングされた上清を解析することにより単一特異性であることが決定された抗体を、タンパク質マイクロアレイを用いる二次スクリーニングのラウンドにかけて、それらのアフィニティーおよび特異性の両方をさらに特徴付ける。単一特異性のｍＡｂよりは与えられる優先度が低いが、高度に選択的な（必ずしも単一特異性ではないにせよ）タンパク質の認識特性を伴うｍＡｂもまた、ある範囲の適用では有用でありうるので、アレイ上で認識する異なるタンパク質が３つ以下である抗体もまた、このようにしてさらなる解析のために取り置く。これらの実験では、二次スクリーニングの過程において、希釈率を１０，０００倍とする各ｍＡｂで１つのヒトプロテオームチップをプロービングする。ｍＡｂがその対応する標的タンパク質を特異的に認識しうることが、チップ上の他の任意のタンパク質に対して明らかな結合シグナルが観察されないことを意味する（上記で記載された通り、非特異性タンパク質を除外する）場合は、希釈率を５０，０００倍とするｍＡｂでチップを再度プロービングし、最適の希釈率を規定する一助とする。結合シグナルが観察されない場合は、力価を１００倍まで増大させ、チップを再度プロービングする。結合シグナルが発生する場合は、希釈率を１０００倍増大させる。１００倍の希釈率で結合シグナルを示さないものは、失敗と考えられる。したがって、典型的な抗原の場合、マイクロアレイベースのスクリーニングのこの第２ラウンドでは、抗原１つ当たり６つずつのチップ（１つの抗原当たり３つずつのｍＡｂを試験し、それぞれにつき２つずつのチップを用いる）を用いる。
【０１８２】
上記で概括した通り、特異性を評価するための主要なツールは、１７，０００の抗原によるマイクロアレイにおける、単一のタンパク質との反応である。抗原マイクロアレイベースのスクリーンにおいて高度な特異性を示す抗体は、適用試験パイプラインと称する試験ワークフローへと統合される試験バッテリーを介してさらに試験される。免疫ブロッティング試験では、同種抗原に対する各抗体の特異性、および多様な組織培養物の細胞型からの少なくとも３つのヒト細胞抽出物に対する各抗体の特異性を点検する。これらは、混合された同種抗原（抗原はＧＳＴタグ付けされているので、天然抗原とは識別される）を伴って試験するが、これらを伴わずにも試験する。
【０１８３】
複数の異なる神経芽腫細胞系を用いて、抗体特異性についてのこれらのさらなる研究を実施する。Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）ウェブサイトでは、大量の遺伝子発現データが公開されており、これにより、問題の転写因子およびその推定標的遺伝子の両方が、容易に培養および解析されうるヒト細胞系において発現するかどうかを、容易に決定することが可能となる。表２に示す通り、既に公表されているマイクロアレイデータを解析して、容易に入手可能などの細胞系が、モノクローナル抗体を生成させるのに用いられた各抗原について、頑健なレベルのｍＲＮＡ発現を示すかどうかを決定した。
【０１８４】
【表２−１】
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【０１８５】
【表２−２】
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【０１８６】
【表２−３】
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【０１８７】
【表２−４】
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略号：ＢＦＬＳ＝ベルエソン−フォルスマン−レーマン症候群、ＭＤ＝気分障害、ＮＩ＝同定なし、ＮＳＭＲ＝無症候性精神遅滞、ＰＷＳ／ＡＳ＝プラダー−ウィリー症候群／アンジェルマン症候群、ＲＳ＝レット症候群、ＳＺ＝統合失調症、ＷＢＳ＝ウィリアムズ−ボイレン症候群。
＊ＣｈＩＰグレードの抗体が市販されていないことを示す。
【０１８８】
対象の抗原の大半については、十分に特徴付けられたＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞系を用いる。しかし、他の場合には、対象の抗原に対応するｍＲＮＡが、例えば、容易に培養される異なる神経芽腫細胞系またはニューロン以外の細胞系において著明により高度に発現する。これらを表３に示す。
【０１８９】
【表３−１】
2013533865.tif 000007
【０１９０】
【表３−２】
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【０１９１】
【表３−３】
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【０１９２】
【表３−４】
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【０１９３】
【表３−５】
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【０１９４】
【表３−６】
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＊標的遺伝子が、ＣｈＩＰ、ルシフェラーゼ解析などにより直接検証されるのではなく、
機能喪失解析から推定されることを示す。
【０１９５】
この場合は、後出で記載される通り、これらの他の細胞系を、免疫細胞化学解析、およびクロマチン免疫沈降に用いる。スクリーンの過程において生成させるモノクローナルが、免疫ブロットを介して内因性タンパク質を検出しうるかどうかを決定するためには、以下の試験パネル：抗原単独、系列１〜３の抽出物、１μＧｍ／ｍＬで混合した系列１〜３の抽出物＋抗原を用いる。免疫沈降（ＩＰ）試験では、最終的なリードアウトが、抗原を検出するための、抗ＧＳＴを伴う免疫ブロット（ＩＢ）である点を除き、同じ出発材料を用いる。免疫組織化学（ＩＨＣ）を介して内因性タンパク質の発現を検討するには、間接的な免疫蛍光ベースの検出を実施して、ポリ−Ｄ−リシンでコーティングしたカバースリップ上で増殖させた神経芽腫細胞をスクリーニングする。陰性対照としては、マウス線維芽細胞系（３Ｔ３）をスクリーニングする。
【０１９６】
これらの試験の両方により特異的であると確認される限定数の抗体はまた、それらがクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を成功裏に媒介する能力についてもスクリーニングすることができる。この目的で、定量的ＣｈＩＰプロトコール（Ｏｎｉｓｈｉ，  Ａ．ら、「Ｐｉａｓ３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＳＵＭＯｙｌａｔｉｏｎ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｒｏｄ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｎｅｕｒｏｎ、２００９年、６１巻（２号）：２３４〜４６頁；  Ｐｅｎｇ，  Ｇ．Ｈ．およびＳ．  Ｃｈｅｎ、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，  ｎｅｗ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ」、Ｖｉｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００５年、２２巻（５号）：５７５〜８６頁）を用いる。略述すると、１マイクログラムの各抗体を用いて、ホルムアルデヒドで架橋され、超音波でせん断処理された同量のクロマチンを、培養細胞（５×１０６個の細胞）から免疫沈降させる。遺伝子特異的なプライマーを伴うリアルタイムｑＰＣＲを用いて、ＩＰ試料中で濃縮された特異的なゲノム領域を、投入された対照と対比して検出し定量化する。非特異的なマウスＩｇＧを、陰性対照として用いる。遺伝子の多様なゲノム領域におけるＩＰ／投入量比を用いて、同じタンパク質に対して作製された異なる抗体を、それらの特異性および有効性について比較する。表３に示される通り、標的抗原を高レベルで発現する細胞系をこの解析に用いる。
【０１９７】
ゲノム領域を増幅および解析について選択する場合は、複数の基準を考慮する。ＣｈＩＰ能を確認されたポリクローナル抗体が既に入手可能である抗原に対するモノクローナル（表２に示される）の場合、新規の試薬の有効性を評価しうるように、問題のタンパク質を発現し、その転写因子の標的遺伝子が既に公知であるゲノム領域および細胞型を選択する。これらの抗原のうちの多くの場合は、ポリクローナル抗体を用いて、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するＣｈＩＰ解析が既に実施されており、これらの場合は、この細胞型においてこれらの因子が結合することが既に示されているゲノム領域を解析する。他のタンパク質の場合は、通常、市販されていない抗体によるが、他の細胞型または組織型においてＣｈＩＰ解析を実施する。表３は、生成させる抗体について公知であり、かつ、提起されてもいる、直接的な標的遺伝子を列挙する。これらの因子の標的遺伝子についてＣｈＩＰが既に実施されている場合は、既に試験されたプライマーセットを用いる。他の場合には、ＴＲＡＮＳＦＡＣｄｂなどのバイオインフォーマティックスのツールを用いて、これらの因子に共通の結合部位を同定し、次いで、これらの転写物についての推定制御領域内で見出されるか、またはハイスループットのタンパク質マイクロアレイベースのタンパク質−ＤＮＡ間相互作用についての解析を用いて特徴付けられている部位に対応する、進化において保存的な配列を挟むプライマー対をデザインする。このバイオインフォーマティックスのデータを、既に公表されている遺伝子発現データと組み合わせることにより、探索下にある転写因子に対する、高い確率の直接的標的のリストを作成し、プライマーセットを、抗体についてのＣｈＩＰ解析に用いる。
【０１９８】
（実施例７）
単一特異性モノクローナル抗体（ｍＭＡｂ）の特徴付け
単一特異性ＭＡｂのＩＣＣによる検証：ショットガン法を用いて生成させたｍＭＡｂをさらに特徴付けるために、高解像度の免疫細胞化学（ＩＣＣ）を実施して、ｍＭＡｂが固定された細胞内のタンパク質に結合する能力を評価した。透過処理したＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、またはＨＣＴ−１１６細胞を、パラホルムアルデヒド中で固定し、３％ＢＳＡ＋３％ＦＢＳ中でブロッキングした。各ｍＭＡｂを１０μｇ／ｍＬまで希釈し、４１／４Ｃで一晩にわたりインキュベートした。ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒｏｃｈｌａｎｄ）を、二次抗体として用いた。染色した細胞を観察し、蛍光顕微鏡を用いて画像を収集した。核、ミトコンドリア、小胞体／ゴルジ装置、細胞質ゾル、および細胞膜を包含する５つの単純な範疇を用いて、ｍＭＡｂにより検出される所与の抗原の細胞内局在化を分類した。
【０１９９】
予測される通り、ＨｅＬａ細胞を抗原供給源とした場合、５９の被験ｍＭＡｂのうち、５２がＨｅＬａ細胞内で識別可能なパターンをもたらしたのに対し、６つのｍＭＡｂおよび１つのｍＭＡｂは、それぞれ、ＨＣＴ−１１６細胞およびＨｅｐＧ２細胞において、それらの対応する抗原を適正に認識した。これらの５９のヒトタンパク質の細胞内局在化の分布を、表４にまとめる。
【０２００】
【表４】
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ＩＣＣの結果を、文献およびデータベース（例えば、ＮＣＢＩ）と比較することにより、これらのうちの３９が公知のパターンにマッチする一方で、１６はマッチしなかった。この懸隔は、被験細胞系／組織内の差違、および／または基底にある生物学的特徴の差違を反映する可能性が高い。加えて、それらの細胞内の位置が知られていない４つの抗原、すなわち、Ｃ１１ｏｒｆ６８、ＣＮＴＤ１、ＤＹＤＣ２、およびＴＸＮＤＣ９は、今やそれぞれ、ミトコンドリア、細胞質ゾル、細胞膜、および小胞体／ゴルジ装置に局在化されている（図８）。したがって、生成させたｍＭＡｂは、１００％のＩＣＣ成功率を示すだけでなく、この情報が以前は知られていなかったタンパク質の局在化を決定する一助にもなった。
免疫ブロットおよびｓｈＲＮＡベースの遺伝子ノックダウンを用いるｍＭＡｂの検証／特徴付け
本発明者らは、ｔｅｔ制御型のヒトプラスミド発現ベクターを構築しつつある。４２のヒトＯＲＦを、ＨｅＬａにおいて、Ｖ５タグ付けした融合タンパク質として過剰発現させるために、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ組換えを介して、市販の哺乳動物発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１−ｖ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとサブクローニングした。略述すると、全てのプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＨ５αにより増幅し、アルカリ性溶解により単離した。精製後、全てのクローンを、制限消化により検証した。ヒト細胞を一過性でトランスフェクトするため、６ウェルの組織培養プレート内のウェル１つ当たりの細胞約０．６×１０４個で播種したＨｅＬａ細胞を、対応するＯＲＦ発現構築物でトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を溶解させ、次いで、各溶解物の一部を、ｍＭＡｂ（希釈率を１：１０００とする）を用いる免疫ブロット解析にかけた。
【０２０１】
免疫ブロット解析にはまた、陰性対照としての空ベクターのＤＮＡでトランスフェクトした細胞も包含した。場合によっては、所与のｍＭＡｂにより、トランスフェクトされた細胞において２つのバンドが検出された。例えば、α−ＥＦＨＤ２により、Ｖ５でタグ付けしたＥＦＨＤ２でトランスフェクトした細胞において２つのバンドが認識されたが、ベクターをトランスフェクトされた細胞では１つのバンドだけが認識された（図９、左上パネルのレーン１、２）。同じブロットをストリッピングし、抗Ｖ５抗体でプロービングしたところ、いずれの細胞でも遊走の速いバンドが消滅したことから、α−ＥＦＨＤ２が、細胞における、Ｖ５でタグ付けしたＥＦＨＤ２および天然ＥＦＨＤ２の両方を忠実に検出したことが示される。４２の被験ｍＭＡｂのうち、３０（７１％）は、ｍＭＡｂを、Ｖ５ブロットと比較することにより、対応するタンパク質を正確に検出すると確認された（図９、上パネルおよび下パネルのレーン１、２）。
【０２０２】
これらのｍＭＡｂが高度に特異性であることをさらに確認するため、ｓｈＲＮＡを用いる遺伝子ノックダウン解析を実施した。１マイクログラムの発現構築物を、３μｇのｓｈＲＮＡ発現構築物と共に、ＨｅＬａ細胞に共トランスフェクトした。トランスフェクションの２４〜３６時間後に細胞を採取し、溶解させ、対応するｍＭＡｂおよび抗Ｖ５抗体を用いて免疫ブロット解析にかけた（図９、上パネルおよび下パネルのレーン３）。被験６例の全て（これらのうちの４例を、図９に示す）において、対応するｓｈＲＮＡは、ｍＭＡｂおよび抗Ｖ５の両方の免疫ブロッティングにより決定される通り、抗原の発現を有効にノックダウンした。これらの結果は、パイプラインにおいて作製されるｍＭＡｂが、高度に特異的であり、したがって、免疫ブロット解析に極めて有用である可能性が極めて高いことについての極めて厳密な確証を直接的に確認した。さらに、ｓｈＲＮＡノックダウン試薬が、アレイに配置されるタンパク質を発現させるのに用いられるＯＲＦコレクション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とは全く異なるコレクション（Ｓｉｇｍａ）に由来するので、これらの結果は、アレイの作製からアレイ画像の解釈までのパイプラインの全体において、タンパク質の適正な識別が維持されることの究極的な検証をもたらす。
免疫沈降を用いるｍＭＡｂの特徴付け
ヒト細胞のための免疫沈降（ＩＰ）検証プロトコールを実施した。ＨｅＬａ細胞を、Ｎ末端をＶ５でタグ付けしたタンパク質の形態で対象の抗原を発現するプラスミドによりトランスフェクトし、溶解させた。対応するｍＭＡＡｂを用いて抗原を免疫沈降させ、抗Ｖ５抗体による免疫ブロッティングを用いて解析した。抗マウスＩｇＧ抗体および抗Ｖ５抗体を、ＩＰにおいて、それぞれ、陰性対照および陽性対照として用いた。２７の被験ｍＭＡｂのうちの１６が、ＨｅＬａ細胞において、それらの対応する抗原を有効にＩＰさせることが示され、全体の成功率は５９％であった（図１０に例を示す）。したがって、ｍＭＡｂのうちの大部分はＩＰグレードである。
クロマチン免疫沈降を用いるｍＭＡｂの特徴付け
ｈｎＲＮＰ（異種核リボヌクレオタンパク質）の１つである、ＲＮＡ結合タンパク質のＨＮＲＰＣを包含する、多くの異例のＤＮＡ結合タンパク質（ｕＤＢＰ）が、配列特異的な結合特性を示す（Ｈｕら、Ｃｅｌｌ、２００９年）。ｈｎＲＮＰは、異種核内ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）と複合体を形成することが公知である。ｈｎＲＮＰはまた、核内におけるプレｍＲＮＡとも会合し、プレｍＲＮＡのプロセシングならびにｍＲＮＡの代謝および輸送の他の側面にも影響を及ぼすと考えられている。ｈｎＲＮＰタンパク質は、４０ＳのｈｎＲＮＰ粒子の形成など、異なる核酸結合特性を有するが、タンパク質結合マイクロアレイ（ＰＢＭ）を用いる近年の研究は、ｈｎＲＮＰタンパク質が、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡのいずれにも、配列依存的な形で結合することを示した。ＣＤＩパイプラインでは、ＨＮＲＰＣに対する高度に特異的なｍＭＡｂ（アイソタイプのＩｇＧ２ｂ）を生成させたので、本発明者らは、多様な標準的アッセイを用いて、この抗体を完全に特徴付けることに決定した。
【０２０３】
図１１Ａに示す通り、ＨｅＬａ細胞におけるこの抗体によるＩＣＣ染色は、ＨＮＲＰＣの明確な核内局在化を示し、細胞内におけるその公知の局在化（すなわち、核質および前核）と符合する。このｍＭＡｂは、ＨｅＬａ細胞における天然のＨＮＲＰＣを検出しうるので、このｍＭＡｂが、ＤＮＡに対する架橋後にＨＮＲＰＣを特異的に免疫沈降させうるかどうかを試験する前に、このｍＭＡｂが、ＩＰ解析に有用であるかどうかを決定するための試験を実施した。
【０２０４】
Ｖ５でタグ付けしたＨＮＲＰＣを過剰発現する２００万個のＨｅＬａ細胞を溶解させ、２０μｇの抗ＨＮＲＰＣ  ｍＭＡｂを溶解物に添加し、一晩にわたりインキュベートした。プロテインＧをコンジュゲートしたビーズを添加して抗体を捕捉した後で、十分に洗浄した。抗マウスＩｇＧ抗体および抗Ｖ５抗体はまた、それぞれ、陰性対照および陽性対照として、並行的なＩＰ実験でも用いた。次いで、煮沸したビーズの上清を、抗Ｖ５抗体で免疫ブロットした。図１１Ｂに示す通り、Ｖ５でタグ付けしたＨＮＲＰＣの単一のバンドが、投入されたレーンおよびＶ５のレーンの両方において観察される分子量と同じ分子量で検出されることから、このｍＭＡｂを用いるＨＮＲＰＣ  ＩＰの成功が示される。予測される通り、ＩｇＧ陰性対照は、いかなるシグナルも示さなかった。
【０２０５】
次に、本発明者らは、内因的に発現させたＨＮＲＰＣに対するクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施して、このｍＭＡｂが、ＨＮＲＰＣをＣｈＩＰさせることが可能であるかどうか、および、成功する場合、ＨＮＲＰＣタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてどのような特異的ＤＮＡ配列と関連するのかを決定した。略述すると、５×１０７個のＨｅＬａ細胞を架橋、抑制、採取、および洗浄した。穏和な条件下における細胞の溶解後、核ペレットを回収し、洗浄し、超音波でせん断処理した。ＨＮＲＰＣをＣｈＩＰさせるには、１０μｇの抗ＨＮＲＰＣ抗体（または陰性対照としての１０μｇのマウスＩｇＧ）を添加し、４℃で一晩にわたりインキュベートした。プロテインＧを結合させたＤｙｎａｂｅａｄを添加して、ＤＮＡ−ＨＮＲＰＣ複合体を捕捉した後、溶出させた。溶出物のうちの約１０％を、免疫ブロッティングに用いた。図１１Ｃに示す通り、内因的に発現させたＨＮＲＰＣは、１回目および２回目のいずれの溶出でも観察される通り、ＣｈＩＰしうるが、ＩｇＧ対照は、検出可能なシグナルを示さなかった。どのＤＮＡ断片が抗体によりＣｈＩＰしたかどうかを決定するため、ＣｈＩＰした複合体を、６５℃で一晩にわたり逆架橋処理した。ＨＮＲＰＣは、公知のＲＮＡ結合タンパク質であるため、溶出物をＲＮアーゼで処理した後で、除タンパク質処理した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて、濃縮されたＤＮＡ試料の品質および濃度を決定した。図１１Ｄにおいて示される通り、高収量の高品質ＤＮＡが得られた。
ＭＡｂアフィニティーの逐次測定
図１２に示される通り、標識化されない抗体を用いて、３つの抗原−抗体間相互作用の動態を、リアルタイムで同時にモニタリングする。３つの抗体を、ＩｇＧマイクロアレイを覆うフローチャンバーに逐次的に注入したところ、図１２の赤色の直線により示される通り、結合シグナルは、約２０分間で飽和に到達すると考えられた。このデータは、ハイスループットシステムにおけるＭＡｂのアビディティーを逐次的に測定するこの方法の実現可能性を実証する。
【０２０６】
（実施例８）
単一特異性モノクローナル抗体（ｍＭＡｂ）を作製および特徴付けするためのプラットフォーム
注記されたヒトプロテオームのうちの７０％超を含む、１７，２６３の固有の全長ヒトタンパク質を含むタンパク質マイクロアレイを構築した。これらのタンパク質を発現させ精製するために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ＯＲＦコレクションを、４００のさらなるＯＲＦと共に、Ｎ末端をＧＳＴおよび６×Ｈｉｓでタグ付けした組換えタンパク質のガラクトース依存性過剰発現を可能とする酵母発現ベクターへとサブクローニングした。精製されたタンパク質の品質は、組換えタンパク質のランダムサブセットに対するＧＳＴ免疫ブロッティングおよび銀染色の両方により決定した。これらの結果に基づくと、全てのタンパク質のうちの約８５％を、高収量で、少なくとも８０％の純度まで精製することができるであろう。これらの組換えタンパク質を含むマイクロアレイを作製し、抗ＧＳＴ抗体でプロービングすることにより、その品質を試験した。スポットされたタンパク質のうちの８５％超が、バックグラウンドを上回る著明なシグナルをもたらした。
【０２０７】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成させるための、全細胞または組織など、抗原の高度に複合的な混合物は、免疫細胞化学（ＩＣＣ）にも良好に作用した。この「ショットガン」的方法でｍＡｂを生成させることにより、ｍＡｂが、天然のタンパク質エピトープを認識する可能性が増大し、このため、潜在的な適用の範囲が増大する。しかし、この手法の主要な限界は、所与のｍＡｂにより優先的に認識される抗原を同定するときの困難であり、これは、典型的には、質量分析と組み合わせたアフィニティー精製を介して可能であるに過ぎなかった。ヒトプロテオームマイクロアレイに対してｍＡｂを直接スクリーニングすることにより、複合的な生物学的試料で免疫化することにより生成させた所与のｍＡｂにより認識される対応する抗原を直接同定することが可能となる。
【０２０８】
このショットガン法を用いて、マウスを、異なる多様ながん細胞系で免疫化した。ヒト生細胞を足蹠に直接注射し、３週間後、膝窩リンパ節を回収し、ハイブリドーマを生成させた。有用なｍＡｂを濃縮するため、！２２００のハイブリドーマに由来する上清を用いて、１または複数の細胞系に対してハイスループットのＩＣＣプレスクリーニングステップを実施した。次いで、ＩＣＣ陽性のハイブリドーマをさらに増殖させ、アイソタイプ生成させ、ＩｇＧアイソタイプ陽性の上清を、マイクロアレイ解析のために選択した。
【０２０９】
個別の上清を、１２×１２の二次元プールのセットへと組み合わせ、次いで、これらのプールを、ヒトプロテオームマイクロアレイ上でインキュベートし、Ｃｙ５を結合させた抗ＩｇＧ二次抗体と共にインキュベートした。洗浄および走査の後、各スポットのシグナル強度を、フォアグラウンドシグナルのバックグラウンドシグナルに対する比として表した。次いで、本発明者らがＡ値と称した値である、タンパク質の各２連対について、アレイ全体にわたる平均シグナル強度を上回る標準偏差の数を測定した。Ａ＞３である二連スポットを標識付けし、結果をデコンボリュートして、単一の水平方向プールと単一の垂直方向プールとの交点に存在し、したがって、個別のｍＡｂにより認識されるタンパク質を同定する。これらのｍＡｂの特異性を確認するため、高度に特異的な各候補ｍＡｂを、アレイ全体に対して個別に試験し、スポットされた各タンパク質についてＡを測定する。次いで、シグナル強度をランク付けし、アレイ上の最大のシグナルと、２番目に大きなシグナルとの差を計算し、本発明者らはこれをＳ値と表した。Ａ＞６かつＳ＞３が同定される多くのｍＡｂが得られたが、本発明者らは、これらを単一特異性ｍＡｂ（ｍＭＡｂ）と称した。多くの場合、ｍＭＡｂは、極めて高度な選択性（すなわち、Ｓ＞１００）を示した。多くのｍＡｂが、アレイ上の２つの異なるタンパク質に強く結合した（Ａ＞６、Ｓ＜３）が、これらを、二重特異性ｍＡｂ（ｄＭＡｂ）と称した。
【０２１０】
ｍＭＡｂおよびｄＭＡｂの有用性および特異性をさらに特徴付けるため、異なる多様なアッセイを実施した。まず、ヒトがん細胞系についてのＩＣＣ解析を繰り返し、画像を収集して、標的抗原の細胞内発現パターンを評価した。個別のｍＡｂについて観察された特異性の確認は、この研究において得られる全てのＩＣＣパターンのうちの８５％が、このデータが入手可能な場合のそれらの標的タンパク質について既に報告されているＩＣＣパターンにマッチしたことに由来する。高品質のｍＡｂが得られたタンパク質の細胞内分布が、任意の特定の細胞内区画についてそれほどの優先性を示さなかったことから、ショットガン式免疫化は、広範にわたる細胞内タンパク質に対するｍＡｂを生成させうることが確認される。
【０２１１】
次に、免疫ブロット解析を用いて、それらの最重要の標的タンパク質を検出する能力について解析した。ＨｅＬａ細胞において、個別の標的タンパク質は、Ｎ末端をＶ５でタグ付けした融合タンパク質として過剰発現させ、発現は、Ｖ５に対する免疫ブロッティングを介して確認した。５６の被験ｍＡｂのうち、３１（５５％）がそれらの標的タンパク質を認識する一方で、１８（３３％）は、これらの細胞における内因性のタグ付けされていないタンパク質を認識した。これらの結果の精度をさらに裏付けるため、Ｖ５でタグ付けしたＯＲＦを、この遺伝子を標的とする個別のｓｈＲＮＡと共に共トランスフェクトした。被験９例の全てにおいて、免疫ブロットシグナルの実質的な低減が観察されたが、対照ｓｈＲＮＡは、対応するシグナルの低減をもたらさなかった。
【０２１２】
次に、これらのｍＡｂを試験し、これらが、免疫沈降に有効に作用するかどうかを決定し、これにより、細胞ホモジネート中の天然タンパク質を認識した。５１の被験ｍＡｂのうち、２８（５５％）は、トランスフェクトされたタンパク質を効率的に沈降させることができたが、次いで、これを、Ｖ５に対する免疫ブロッティングを介して検出した。免疫ブロッティング適用および免疫沈降適用のいずれにおいても、ｍＡｂのうちのかなりの画分が有効に作用する。まとめると、タンパク質マイクロアレイベースのショットガン法は、広範な適用に有用な高度に特異的なｍＡｂを生成させるための迅速で有効な方法である。
【０２１３】
【数１】
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【０２１４】
【数２】
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【０２１５】
【数３】
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【０２１６】
【数４】
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【０２１７】
【数５】
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【０２１８】
【数６】
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【０２１９】
【数７】
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【０２２０】
【数８】
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【０２２１】
【数９】
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【０２２２】
【数１０】
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【０２２３】
【数１１】
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【０２２４】
【数１２】
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【０２２５】
【数１３】
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【０２２６】
【数１４】
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【０２２７】
【数１５】
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【０２２８】
【数１６】
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【０２２９】
【数１７】
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【０２３０】
【数１８】
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【数１９】
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【０２３２】
【数２０】
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【０２３３】
【数２１】
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【０２３４】
【数２２】
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【０２３５】
【数２３】
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【０２３６】
【数２４】
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【０２３７】
【数２５】
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【０２３８】
【数２６】
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【０２３９】
【数２７】
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【０２４０】
【数２８】
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【０２４１】
【数２９】
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【０２４２】
【数３０】
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【０２４３】
【数３１】
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【０２４４】
【数３２】
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【０２４５】
【数３３】
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【０２４６】
【数３４】
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【０２４７】
【数３５】
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【０２４８】
【数３６】
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【０２４９】
【数３７】
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【０２５０】
【数３８】
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【０２５１】
【数３９】
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【０２５２】
【数４０】
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【０２５３】
【数４１】
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【０２５４】
【数４２】
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【０２５５】
【数４３】
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【０２５６】
【数４４】
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【０２５７】
【数４５】
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【０２５８】
【数４６】
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【０２５９】
【数４７】
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【０２６０】
【数４８】
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【０２６１】
【数４９】
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【０２６２】
【数５０】
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【０２６３】
【数５１】
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【０２６４】
【数５２】
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【０２６５】
【数５３】
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【０２６６】
【数５４】
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【０２６７】
【数５５】
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【０２６８】
【数５６】
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【０２６９】
【数５７】
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【０２７０】
【数５８】
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【０２７１】
【数５９】
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【０２７２】
【数６０】
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【０２７３】
【数６１】
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【０２７４】
【数６２】
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【０２７５】
【数６３】
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【０２７６】
【数６４】
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【０２７７】
【数６５】
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【０２７８】
【数６６】
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【０２７９】
【数６７】
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【０２８０】
【数６８】
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【０２８１】
【数６９】
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【０２８２】
【数７０】
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【０２８３】
【数７１】
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【０２８４】
【数７２】
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【０２８５】
【数７３】
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【０２８６】
【数７４】
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【０２８７】
【数７５】
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【０２８８】
【数７６】
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【０２８９】
【数７７】
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【０２９０】
【数７８】
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【０２９１】
【数７９】
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【０２９２】
【数８０】
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【０２９３】
【数８１】
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【０２９４】
【数８２】
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【０２９５】
【数８３】
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【０２９６】
【数８４】
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本明細書では、本発明の好ましい実施形態を示し、これらについて記載してきたが、当業者には、このような実施形態が、例を目的として提示されるに過ぎないことが明らかであろう。今や、当業者は、本発明から逸脱することなしに、多くの変化、改変、および代替を行うであろう。本発明を実施するときには、本明細書で記載される本発明の実施形態に対する多様な代替物を用いうることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定するものであり、これらの特許請求の範囲内にある方法および構造ならびにそれらの同等物もこれらにより対象とされることが意図される。
【図１Ａ】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１Ｂ】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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