(57)【要約】  発作関連障害、双極性障害、躁病、鬱病、偏頭痛、注意欠陥性多動性障害、潜在性HIV感染症、アルツハイマー病、舞踏病、統合失調症、虚血、がんおよび致命的出血の治療または予防に用いるための、式(I)で示される化合物。  R1-COOH     (I)  式中、R1は骨格上の任意のＣの位置にC1-6アルキル基分岐鎖として有していてもよいC7-11骨格を有するアルキルまたはアルケニル基であるか、またはそれらの薬学的に許容される塩、アミドもしくはエステルであり、前記アルキル又はアルケニル基、及び／又は前記分岐アルキル基の骨格内に、１以上のヘテロ原子が介在していてもよく、ただし、R1がC7骨格を有するアルキル基の場合、分岐はR1のα位炭素上のヘキシル基のみから成ることはなく、もしくはR1のγ位炭素上のメチル基のみから成ることはなく、もしくはR1のβ位およびω-1位の両方における炭素上の単一のメチル基のみから成ることはなく、R1がC8またはC11骨格を有するアルキル基の場合、分岐はR1のα位炭素上のプロピル基のみから成ることはない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発作関連障害、双極性障害、躁病、鬱病、偏頭痛、注意欠陥性多動性障害、潜在性HIV感染症、アルツハイマー病、舞踏病、統合失調症、虚血、がんおよび致命的出血の治療または予防に用いるための、式(I)で示される化合物。
R1-COOH 
(I)
式中、R1は骨格上の任意のＣの位置にC1-6アルキル基分岐鎖として有していてもよいC7-11骨格を有するアルキルまたはアルケニル基であるか、またはそれらの薬学的に許容される塩、アミドもしくはエステルであり、前記アルキル又はアルケニル基、及び／又は前記分岐アルキル基の骨格内に、１以上のヘテロ原子が介在していてもよく、
ただし、R1がC7骨格を有するアルキル基の場合、分岐はR1のα位炭素上のヘキシル基のみから成ることはなく、もしくはR1のγ位炭素上のメチル基のみから成ることはなく、もしくはR1のβ位およびω-1位の両方における炭素上の単一のメチル基のみから成ることはなく、
R1がC8またはC11骨格を有するアルキル基の場合、分岐はR1のα位炭素上のプロピル基のみから成ることはない。
【請求項２】
R1がアルキル基である、請求項１の治療用化合物。
【請求項３】
R1がC7-10骨格を有するアルキル基である、請求項１または２の治療用化合物。
【請求項４】
R1が少なくとも１つの分岐点をもつアルキル基である、請求項１〜３の何れか一項の治療用化合物。
【請求項５】
C1-4アルキル基から成る分岐鎖を有する、請求項１〜４の何れか一項の治療用化合物。
【請求項６】
R1が分岐しないアルキル基である、請求項１〜３の何れか一項の治療用化合物。
【請求項７】
発作関連障害の治療または予防のために用いる、請求項１〜６の何れか一項の化合物。
【請求項８】
発作関連障害がてんかんである、請求項１〜７の何れか一項の治療用化合物。
【請求項９】
ノナン酸、デカン酸、４−エチルオクタン酸、２−プロピルオクタン酸、２−ブチルオクタン酸、４−メチルオクタン酸、８−メチルオクタン酸、３−メチルノナン酸および３−メチルウンデカン酸から選ばれる、請求項１〜８の何れか一項の治療用化合物。
【請求項１０】
アルキル基またはアルケニル基中のヘテロ原子が、酸素、硫黄または窒素から成る群より選ばれる、請求項１〜８の何れか一項の治療用化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は化合物の使用方法に関する。特に、疾患及び生物医学的症状、例えば、発作関連障害、双極性障害、躁病、鬱病、偏頭痛、注意欠陥性多動性障害、潜在性HIV感染症、アルツハイマー病、舞踏病、統合失調症、虚血、がん及び致命的出血の治療又は予防への化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
てんかんは、蔓延性の深刻な神経症状であり、相当な個人的、社会的及び経済的な困難を呈している。全人口の0.5-1%が罹患し、うち30%は既存の抗てんかん薬では十分な治療がされていない（Bialer and White 2010）。これらの患者は高い死亡率及び罹患率を有する。てんかんを引き起こす発作の細胞及び分子的機構は不明であるが、現在の研究は発作の進行に必須の分子経路の解明、及び発作を制御するための新しい治療の開発を中心に、現在研究が進められている。
【０００３】
バルプロ酸（VPA, 2-プロピルペンタン酸；エピリム）は短鎖長の分岐脂肪酸であり、抗てんかん薬として世界中で最も広く用いられているが、その発作の制御の作用機序は40年以上経った今もあまり明らかになっていない(Lagace et al., 2005; Perucca, 2002)。発作の制御に効果的であることが偶然発見されたことから(Carraz G., 1967)、VPAは現在、双極性障害や偏頭痛、加えてがんやHIVの治療を含む種々の新たな治療方策にも用いられている。VPAは当初、イノシトールの枯渇を制御する長期的効果を持つことが示され(Williams et al., 2006; Williams, 2005)、この長期的効果は双極性障害における効果に関連している可能性が高い。
【０００４】
てんかんの治療に関しては、VPAは直接γ-アミノブタン酸（GABA）シグナル伝達を上昇させ(Lagace et al., 2005）、ナトリウムチャネル活性を阻害する（Costa et al., 2006）ことにより、その治療効果を発揮すると考えられている。てんかんの治療におけるVPAの作用機序として最も重要なのは、静脈投与後30分以内に脳内VPAが最高濃度に達し、発作の機序を迅速に阻害する点である。（Aly and bdel-Latif, 1980）。斯かる迅速な作用は、チャネル等のてんかんの（転写的標的よりもむしろ）生化学的標的に対して直接作用することを示すものではあるが、ＶＰＡの急性効果はほとんど明らかにされていない (Lagace et al., 2005)。よって、ＶＰＡが触媒する急性効果は、極めて有望な治療法の候補であるといえる。VPAの急性の効果は、最近、タマホコリカビ（Dictyostelium ）の単一のモデルを用いて解析された(Xu et al., 2007)。VPAはホスファチジルイノシトール-（3,4,5）-トリホスフェート（PIP3）の産生の阻害を誘導し、ホスファチジルイノシトールモノホスフェート（PIP）とジホスフェート（PIP2）のホスホリル化の減少を誘導することが実証された。
【０００５】
また、双極性障害の脳検体の検視結果は、脂肪酸の代謝回転に関する酵素の濃度変動(Kim et al., 2009)と、細胞膜内の脂肪酸の変動(Chiu et al., 2003)も示している。また、多数の研究によって、PLA2活性上昇の触媒作用による発作後アラキドン酸（AA）放出の増大も示されている(Siesjo et al., 1982, Rintala et al., 1999, Bazan et al., 2002, Basselin et al., 2003)）。従って、この過程を減衰させることにより、発作の制御とてんかん発生に何らか有益性を提供できる可能性がある(Rapoport and Bosetti, 2002)。
【０００６】
VPAは解明されていない作用機序により、AAの脳内代謝回転を減少させることが示されてきた(Chang et al., 2001)。AAは必須の脂肪酸であり、大部分のリン脂質膜の主要な多不飽和脂肪酸であり(Svennerholm, 1968)、炎症のシグナル伝達の中心的役割を担っている(Yedgar et al., 2006)。AAの代謝回転に対するVPAの作用と、VPAににより治療され得る個々の症状との関連の有無は依然として不明である。例えばこの効果は双極性障害の予防と関連している可能性がある(Rapoport, 2008b)。なぜなら、他の構造的に独立した双極性障害の治療、例えばリチウム(Basselin et al., 2005)や、カルバマゼピン(Bazinet et al., 2006a)、においても、同様にＡＡシグナル伝達の減少が観察されるためである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＶＰＡは、多数の広範な疾患に処方されているにもかかわらず、催奇形性や肝毒性を含む望まない副作用を多数有する。よって、副作用が低減された、より高い活性を有する抗てんかん薬が緊急に必要とされている。
【０００８】
国際特許出願WO99/02485には、VPAの誘導体がてんかん、躁病、双極性障害及び疼痛の治療に用いられることが開示されている。WO99/02485は化合物として特に２−プロピルヘプチル酢酸、２−プロピルデカン酢酸及び１-O−ステアロイル-２-プロピルヘプチルアセトイル-ｓｎ−グリセロ-３-ホスホチジルコリンを開示している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、生物医学的モデルとしてタマホコリカビ（Dictyostelium）を用い、VPAが急激なホスホイノシタイドの代謝回転の減衰の原因となっていることを見出し、この効果がホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ（PI3K）活性の直接の阻害に基づくものではなく、イノシトールの再利用の調節を通じて引き起こされるものでもないことを見出した。また、本発明者等は、VPAが、放射標識されたAA及びパルミチン酸（飽和の長鎖脂肪酸）の放出の減少及び再取り込みの増加の両方を引き起こすことを見出した。このＶＰＡに触媒される効果は脂肪酸活性化の減少によるものではない。
【００１０】
さらに、構造活性相関(SAR)研究は、これらの作用機序に対する高度の構造特異性を示した。これにより、VPAに類似の治療可能性を示す一方で、副作用低減及び/又は治療活性の増加の可能性を伴う化合物群を同定することが可能になった。
【００１１】
本発明の第１の観点に従って、下記式で示される化合物を提供する。
R1-COOH
(I)
式中、R1は、骨格上の任意のCの位置にC1-6アルキル基を分岐鎖として有していてもよいC7-11骨格を有するアルキル又はアルケニル基であるか、又はそれらの薬学的に許容される塩、アミド若しくはエステルであり、前記アルキル又はアルケニル基、及び/又は前記分岐アルキル基の骨格内に、１以上のヘテロ原子が介在していてもよく、
ただし、R1がC７骨格を有するアルキル基の場合、分岐はR1のα位炭素上のヘキシル基のみから成ることはなく、もしくはR1のγ位炭素上のメチル基のみから成ることはなく、もしくはR1のβ位およびω-1位の両方における炭素上の単一のメチル基のみから成ることはなく、
R1がC8またはC11骨格を有するアルキル基の場合、分岐はR1のα位炭素上のプロピル基のみから成ることはなく、
上記化合物は、発作関連障害、双極性障害、躁病、鬱病、偏頭痛、注意欠陥性多動性障害、潜在性HIV感染症、アルツハイマー病、舞踏病、統合失調症、虚血、がんおよび致命的出血の治療または予防に用いるためのものであり、
化合物が２−メチル-２−ペンタン酸である場合、疾患又は症状は双極性障害またはてんかんではない。
【００１２】
本明細書に記載の上記化合物は、ホスホイノシトールの代謝回転及び/又は脂肪酸の代謝回転を迅速に減衰させることが判明した。ホスホイノシトール及び脂肪酸代謝回転の減弱は、VPAの作用機序として特定されているから、これらの化合物はVPAで治療されうる症状、例えば、発作関連障害、双極性障害、躁病、鬱病、偏頭痛、注意欠陥性多動性障害、潜在性HIV感染症、アルツハイマー病、舞踏病、統合失調症、特に、てんかん、双極性障害及び偏頭痛の治療または予防に有用である可能性を有する。
【００１３】
一実施態様において、R1はC7骨格を有するアルキル基である場合、分岐はR1のω-1炭素におけるメチル基のみから成ることはなく、好ましくはR1のω-1炭素におけるメチル基を含むことはない。
【００１４】
本発明の目的のために使用される化合物は、それだけに限られるものではないが、ノナン酸、デカン酸、4-エチルオクタン酸、２-プロピルオクタン酸、２-ブチルオクタン酸、４−メチルノナン酸、８−メチルノナン酸、３-メチルノナン酸、及び３-メチルウンデカン酸が挙げられる。
【００１５】
本明細書において、用語「CX-Y骨格を有するアルキル基」は、xからy個の炭素原子を含む直鎖の飽和炭化水素をいう。例えば、C1-4骨格を有するアルキル基は、分岐しない１から４の炭素原子を含む飽和炭化水素基をいう。C1-4骨格を有するアルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル及びブチルなどが含まれる。
【００１６】
本明細書において、用語「CX-Y骨格を有するアルケニル基」は、xからy個の炭素原子と、少なくとも１（例えば、１，２，３又は４）の二重結合をを含む直鎖の不飽和炭化水素をいう。例えば、C3-5骨格を有するアルケニル基は、分岐しない3から5の炭素原子を含む不飽和炭化水素基をいう。C3-5骨格を有するアルキル基の例には、プロピレン、ブチレン及びペンチレンが含まれる。
【００１７】
用語「R1のα炭素」、「R1のβ炭素」、「R1のγ炭素」とは、R1を形成する炭素鎖において、式(I)のCOOH基自体は含めずCOOH基から数えて、それぞれ１番目、２番目及び３番目の炭素原子をいう。用語「R1のω-1炭素」とは、R1を形成する炭素鎖において、再び式（I）のCOOHから数えて末端から２番目の炭素原子をいう。言い換えれば、用語「R1のω-1炭素」とは、R1中の末端のメチル基又はメチレン基の隣の炭素をいう。
【００１８】
本明細書において、用語「CX-Yアルキル」は、xからy個の炭素原子を含む、分岐又は非分岐の飽和炭化水素基をいう。例えば、C1-4アルキルは、分岐する又は非分岐の、炭素数１-4の飽和の炭化水素基をいう。C1-4骨格を有するアルキルの例には、メチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル及びt-ブチル等が含まれる。
【００１９】
本発明化合物の「医薬的に許容される塩」には、無機塩基の塩、有機塩基の塩、無機酸の塩、有機酸の塩、塩基性又は酸性のアミノ酸の塩などが含まれる。ある場合には、特に塩基の塩が採用される。本発明の化合物は水和物であっても無水物であってもよい。
【００２０】
本発明化合物の「医薬的に許容されるアミド」とは、上記化合物のカルボキシル（すなわち、-C(O)OH）基がアミン-NHR1’R2’と反応して-C(O)NR1’R2’基を生成するような反応によって修飾されるものであり、
ここで、R1’とR2’は場合により、独立してH, C1-8アルキル（例えばC1-6アルキル）、アリール、ヘテロアリール及びC3-8シクロアルキル基である。
【００２１】
本発明化合物の「医薬的に許容されるエステル」は、上記化合物のカルボキシル（すなわち、-C(O)OH）基がアルコール部分W-OHと反応して-C（O）OW基を生成するような反応によって修飾されるものであり、
ここで、WはC1-18アルキル（例えば、C1-6アルキル）、アリール、ヘテロアリール又はC3-8シクロアルキルである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
塩、アミド及びエステルを調整するための一般的な方法は、当業者に周知である。塩、アミド及びエステルが医薬的に許容されるか否かは、製剤加工特性や生体内での挙動を含む種々の要因に依存する。当業者であれば、本開示に関するそれらの要因を容易に評価することができる。
【００２３】
本発明のある実施形態では、R1はアルキル基である。
本発明のある実施形態では、R1はC7-10骨格を有するアルキル基である。
本発明のある実施形態では、R1はアルキル基であり、少なくとも１点で分岐を有し、例えば、１、２又は３点で分岐を有する。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態において、R1はC7-10骨格アルキレン基は骨格上の任意の位置で分岐し、好ましくは、R1のα、β、γ又はω-1炭素において分岐する。
【００２５】
本発明のある実施形態において、分岐はC1-4アルキル基、メチル、エチル、プロピル又はブチル基、好ましくはメチル、エチル又はプロピル基から成る。
【００２６】
特定の実施形態において、R1は分岐したエチル、プロピル又はブチル基を有する、C7骨格のアルキル基である。
【００２７】
特定の実施形態において、R1は分岐したメチル基を有する、C８骨格のアルキル基である。
特定の実施形態において、R1は分岐しないアルキル基である。
特定の実施形態において、R1はC８-９の分岐しないアルキル基である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、アルキル又はアルケニル基中の１又はそれ以上のヘテロ原子が酸素、硫黄及び窒素から成る群より選ばれる。好ましくは、１又はそれ以上のヘテロ原子は酸素である。
【００２９】
特定の実施形態において、本発明の化合物は、発作関連障害、双極性障害、躁病、鬱病、偏頭痛、注意欠陥性多動性障害、潜在性HIV感染症、アルツハイマー病、舞踏病、統合失調症、虚血、がんおよび致命的出血、特にてんかん、双極性障害及び偏頭痛から選ばれる疾患又は生物医学的症状の治療又は予防に用いられる他の薬理活性物質と組み合わせて独立に、同時に、又は連続して投与される。
【００３０】
特定の実施形態によれば、本発明の第１の観点に従う化合物を２種以上用い、これらを独立に、同時に、又は連続して投与してもよい。
【００３１】
２番目の観点として、本発明はまた、発作関連障害、発作関連障害、双極性障害、躁病、鬱病、偏頭痛、注意欠陥性多動性障害、潜在性HIV感染症、アルツハイマー病、舞踏病、統合失調症、虚血、がんおよび致命的出血、特にてんかん、双極性障害及び偏頭痛から選ばれる疾患又は生物医学的症状の予防又は治療の方法を提供し、その方法は、治療又は予防を必要とする被験体に対して、本発明の第１の観点により用いられる治療有効量の化合物を投与することを含む。
【００３２】
上記化合物は、１又はそれ以上の、無毒の医薬的に許容される担体、アジュバント又は賦形剤とともに投与してもよい。本発明の最初の見地に従って使用される無毒の医薬的に許容される担体、アジュバント又は賦形剤は、製剤設計の分野で慣用的に採用されるものであり、限定されるものではないが、例えば、糖、糖アルコール、デンプン、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク、例えば、ヒト血清アルブミン、リン酸塩などの緩衝剤、グリセリン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、部分的にグリセリド混合した飽和植物性脂肪酸、水、塩又は電解質、例えばプロタミン硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース物質、ポリエチレングリコール、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロック重合体、ポリエチレングリコール及びラノリンが挙げられる。化合物は経口又は非経口で、例えば吸入スプレー、直腸、経鼻、舌下、経膣又は埋め込み容器により投与される。ここで「非経口」の用語は皮下、皮内、静脈内、筋肉内、間接内、滑液内、胸骨内、莢膜内、病変部内、頭蓋内の注射又は点滴の投与技術をいう。
【００３３】
本発明において使用される化合物は無菌注射用調製物、例えば、無菌水性又は油性懸濁液等の形態で投与される。この懸濁液は分散剤、湿潤剤（例えば、Tween 80等）及び懸濁剤を用い、公知の技術により形成される。また、無菌注射用調製物は、無毒性の非経口投与可能な希釈剤又は溶液中の無菌注射用溶液又は懸濁液、例えば、1, 3-ブタンジオール溶液等であってもよい。許容される賦形剤及び溶媒のうち、マンニトール、水、リンゲル液（Ringer’s  solution）及び生理食塩水が用いられ得る。加えて、殺菌された固定油脂が溶媒又は懸濁化剤として用いられる。この目的のために、合成されたモノ-又はジグリセリドを含む無刺激の固定油脂が用いられ得る。脂肪酸、例えばオレイン酸及びそのグリセリド誘導体は注射物質の調製に有用であり、同様に天然の医薬的に許容される油脂、例えばオリーブ油、ヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチレン化された型のものなどが挙げられる。これらの油脂の溶液又は懸濁液はまた、Ph.Helvに掲載されているような長鎖アルコールの希釈剤又は分散剤、又は類似のアルコールが用いられ得る。
【００３４】
本発明の化合物は、任意の経口的投与可能な投薬形態で経口投与することができる。例としては、これらに限定されるものではないが、カプセル、錠剤、粉末剤、顆粒剤、水性の懸濁液又は溶液が含まれる。これらの投薬形態は製剤処方における周知の方法により調製される。経口投与のための錠剤の場合、一般的に用いられる担体としてラクトース及びコーンスターチを含む。潤滑剤として、通常、例えばステアリン酸マグネシウムも加えられる。経口投与のためのカプセル剤のために、有用な希釈剤としてラクトース及び乾燥コーンスターチを含む。水性懸濁液が経口投与される場合、活性成分は乳化剤及び懸濁剤と組み合わせられる。必要であれば、甘味料、及び/又は香料、及び/又は色素が添加され得る。
【００３５】
また、本発明のための化合物は、直腸投与剤型として直腸投与してもよい。この目的においては、当該化合物を、室温では固体であるが直腸の温度では液体であり、直腸内で溶融して活性薬物を放出し得る、適切な無刺激性の賦形剤と混合すればよい。これらの物質には、限定されるものではないが、カカオ油脂、ミツロウ及びポリエチレングリコールが含まれる。
【００３６】
本発明に用いられる化合物は、鼻エアロゾル又は吸入によって投与してもよい。この目的においては、当該化合物は、製剤処方における周知の方法により調製される。生理食塩水溶液としては、ベンジルアルコール又は他の適した保存料、バイオアベイラビリティを増強させるための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び/又は技術的に知られた他の溶解又は分散補助剤を用いて調製され得る。
【００３７】
本発明のために用いられる化合物は、治療又は予防される症状に応じて、及び化合物とともに投与される物質の性質に応じて、１回投与につき約１から約20,000μｇ/kgの投与量で投与される。多くの例において、投与量は１回投与につき約１から約1500μｇ/kgである。特定の化合物の用法は当業者がこの開示を利用することにより、容易に決定される
【００３８】
第３番目の観点において、本発明は、発作関連疾患、双極性障害、躁病、鬱病、偏頭痛、注意欠陥性多動性障害、潜在性HIV感染症、アルツハイマー病、舞踏病、統合失調症、虚血、がんおよび致命的出血から選ばれる疾患又は生医学的症状の治療または予防のための治療薬の調製における、本発明の第１の観点によって定義される化合物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
以下、図を参照しながら本発明を詳細に説明するが、あくまでも例示にすぎない。
【００４０】
【図１】図１は、タマホコリカビにおけるホスホイノシタイドのシグナル伝達の減衰におけるVPAの時間依存及び用量依存的効果を示す。放射標識リン酸を新規合成脂質へ取込ませてホスホイノシタイド標識を測定した後、抽出、TLC分離、Typhoon phosphorimagerを用いた定量化を行った (Pawolleck & Williams 2009)。 (a) VPA（0.5ｍＭ）で指定時間処理された細胞内の、PIP及びPIP2の代謝回転の解析。(b)様々な濃度のVPAで9分間処理された細胞内の、PIP及びPIP2の代謝回転の解析。結果は、二重の検体を用いた３回の実験について算出した。ＰＩＰ濃度±SDの形で示す。 *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 。
【００４１】
【図２】図２は、野生株型（ｗｔ）、並びにリン脂質キナーゼ及びイノシトール再利用酵素が欠如したノックアウト変異における、９分間ＶＰＡ（0.5mM）処理又は未処理の場合の、ホスホイノシタイドのシグナル伝達及びＶＰＡ感受性を示す。（a）下記所定の脂質キナーゼ活性を欠損する未処理の同質変異株間のホスホノイノシタイド濃度の比較：５つの型の1-ホスファチジルイノシトール ３−キナ−ゼ (5xPI3K; DBS0252654)遺伝子；ホスファチジルイノシトール-4-ホスフェート 5-キナーゼ(rPKA; DDB0191443)遺伝子;  ホスファチジルイノシトール-４−ホスフェート 5-キナーゼ遺伝子(PIPKinA; DDB0185056)遺伝子。 (b) 5xPI3K 変異株; (c) rPKA 変異株、及び(d) the PIPKinA 変異株のＶＰＡ及びＰＩ３Ｋ阻害剤感受性は、それぞれ0.5ｍＭのＶＰＡ又は50μＭのLY2946004を用いて測定した。(e)ホスホイノシタイドのシグナル伝達の図解。ホスホリパーゼＣ(PLC), プロピルオリゴペプチダーゼ(PO), イノシトールモノホスファターゼ(IMPase)及びmyo-イノシトールシンターゼ(INO1)の、ホスホイノシタイドの生成及び再利用における役割を示す。(f)PLC及びPO遺伝子の除去は、VPAにより減衰されたPIP及びPIP2のシグナル伝達に影響を及ぼさなかった。(g)ＶＰＡ処理の延長(60 min, 0.5 mM)はさらにホスホイノシタイドシグナル伝達を減少させた。この効果はＩＭＰaseの過剰発現により覆されることはない。二重の検体を用いた３回の実験について、ＰＩＰ濃度±SD の形で示す。*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 。
【００４２】
【図３】図３は、インビトロ急性発作型ペンチルテトラゾール(PZT)モデル及び低濃度マグネシウムモデルを用いた、ＶＰＡ及びホスホイノシタイド減衰化合物群による発作の制御を示す。 (a)内嗅皮質-海馬切片結合標本を、浸潤させた記録用容器内に設置し、予め高濃度のカリウムイオン[K+] 及び PTZを含む人工脳脊髄液を潅流させてんかん様の活性を誘導し、その後にＶＰＡ又は新規化合物群1ｍＭを加えた。(b) VPA, 4-メチルオクタン酸 (4-MO), 2-プロピルオクタン酸 (2-PO)、及び 2-ブチルオクタン酸(2-BO)を投与した後の、突発的活性増加の波形記録の例。(c)突発的活性増加の回数を、薬物投与後の時間に対してプロットした結果。当該薬物は0分から40分まで投与した。(d)より長い直鎖であるノナン酸 (NA) 及びデカン酸(DA) の波形の例、及び(e) 突発的活性増加の回数の記録。(f) VPA (1 mM)、及び 4-メチルオクタン酸 (4-MO, 1mM)を投与した場合の、低濃度マグネシウム誘発性の突発的活性増加の波形の例。(g) 薬物投与後（VPA 1 mM, n=5; 4-MO 1 mM, n=5）の、低濃度マグネシウム誘発の突発的活性増加の回数の記録。低濃度マグネシウム誘発性のてんかん様発作の頻度を、時間に対してプロットした。当該薬物は 0分から40分まで投与した。VPAの投与は突発的活性増加の著しい減少をもたらした (基準値の72.7±3.6%、n=5、 投与後30-40 分。当該抑制効果は洗浄により可逆的に回復される)。一方、本発明では、 4-MOの投与によりてんかん様活性化の消失 (基準値の1.6± 3.1 %, n=5, 対照群に対しp<0.01 、ＶＰＡに対し P<0.01)が確認された。薬物を洗浄(各薬物につき5回)すると、両者ともてんかん様活性は回復した。(h) 低濃度マグネシウム誘発の、最後１０分間の突発的活性増加の平均回数を、異なる処置による薬剤投与の比較。すべての化合物の発作活性の減衰において顕著な効果を示す。 * P < 0.05, ** P < 0.01 ；対照群と比較、 +P<0.05， ++P<0.01；ＶＰＡ処置群と比較。データは平均±ＳＥＭの形で示す。
【００４３】
【図４】図４は発作のインビボモデルにおいてホスホイノシチジドを減衰させる化合物を用いた場合の発作の制御を示す。(a)実験操作のまとめ。持続性てんかん重積状態(SSSE)の電気的誘導。電極移植から７日後のラットに対し、有孔質路を通じて、4-5 mA, 50 μs 、20 Hz の単極のパルスにより2 時間に亘って電気刺激を加え、ＳＳＳＥを誘発させた。ＳＳＳＥの誘発から３時間後、ラットにジアゼパムを腹腔内投与(i.p.)し、発作を停止させた。(b)てんかん重積状態の動物の脳波記録の実例。ＶＰＡ(400 mg/kg) 又は4-メチルオクタン酸  (400 mg/kg)を投与した結果、発作が減衰したのに対し、ＤＭＳＯは効果を示さなかった。(c) DMSO (n=5), VPA (n=7) 及び4-MO (n=7)投与後の、スパイク振幅の効果の経時変化。 (d) DMSO (n=5), VPA (n=7) 又は 4-MO (n=7)投与後の、不随意的なスパイク頻度の効果の経時変化。
【００４４】
【図５】図５は脂肪酸の取込み及び放出に対し、ＶＰＡにより時間及び濃度依存的な変化が誘導されることを示す。タマホコリカビ（Dictyostelium）野生型(Ax2)細胞を3H アラキドン酸 (A) 又は パルミチン酸 (C)とともにプレインキュベートした後の、ＶＰＡの存在下/又は非存在下における 3H の緩衝液への放出を示す。脂肪酸の再取込みは、ＶＰＡの存在下/又は非存在下で、3H アラキドン酸(B) 又はパルミチン酸 (D)と同時に、細胞をインキュベートすることにより測定した。タマホコリカビ（Dictyostelium）細胞ペレットへの3Hの取込みを示す。すべての結果は60分の時点での対照の値を基準として示す。挿入図は用量反応曲線を示す。統計解析と用量反応曲線はGraphpad PrizmTM （登録商標）ソフトウェアにより計算された。すべてのデータは少なくとも３回の独立した反復実験の結果であり、平均値± SEMの形で示す。
【００４５】
【図６】図6は、ＶＰＡによりタマホコリカビ（Dictyostelium）内で、エンドサイトーシス非依存性のボディパイ（bodipy）蛍光脂質滴の蓄積が誘導されることを示す。(a) 0.5ｍＭＶＰＡの不在下(i)及び存在下(ii)における、タマホコリカビ（Dictyostelium）内の、ボディパイ（bodipy）蛍光脂肪酸の蓄積を示す画像。ＶＰＡの作用により、脂質滴の蛍光強度及び平均径 が対照(b)と比べて有意に増加した(t テスト, *** p<0.001, * p<0.05)。アクチン重合化阻害剤であるラツルンクリン(10μM) は、VPAによる3H アラキドン酸再取込みの増加を完全には阻害しなかった。 データは何れも、少なくとも３回の独立した反復実験の結果であり、平均値SEMの形で示す。
【００４６】
【図７】図７は、PlaAノックアウト細胞が、ＶＰＡにより誘導される成長阻害作用から保護されることを示す。(A)タマホコリカビ（ Dictyostelium discoideum） (XP_642421.1) 由来の PlaAタンパクの配列とヒト（Homo sapiens ）(AAD08847)由来のiPLA2 タンパク質の配列とのアラインメント。これらの配列は、ＡＴＰ結合及びリパーゼ部位において相同性（ホモロジー）が保存されることを示す。アラインメントはBLAST により行った。(B) 野生株及びPlaA細胞の放射標識体の放出は、ＶＰＡ存在下においても同様の放射標識体の放出減少を示す。 (C) 1 mM VPA の存在下又は不存在下における30時間後のタマホコリカビ（Dictyostelium ）野生型 (Ax2) 細胞又はPlaA−ve細胞の、成長状態を示す画像(表示のとおり)。縮尺バーは 500 μmを示す。
【００４７】
【図８】図８は、脂肪酸標識化細胞からのＶＰＡ誘導性 3H 放出が、ＬＡ２阻害剤により表現型コピーされることを示す。(A) 凝集可能タマホコリカビ（Dictyostelium） 野生型(Ax2)細胞を 3H AA とプレインキュベートした。ＰＬＡ２阻害剤の存在下又は非存在下における、外部の緩衝液への3H放出を示す。 阻害剤x = 80μM BEL、Ca2+ PLA2 阻害剤、 y = 20 μM BPB、 一般的なPLA2 阻害剤、及び z = 50 μM MAFP、Ca2+ 依存性及び Ca2+ 非依存性の細胞質性PLA2阻害剤、Mix = 全ての阻害剤の混合。 (B) PLA2 阻害はVPA依存の脂肪酸取込を再現しない。VPA 及び PLA2 阻害剤混合物の存在下で、細胞をインキュベートした（実験方法を参照）。タマホコリカビ（Dictyostelium ）細胞ペレットへの3H の取込みを示す。(C) VPA が誘導する 3H アラキドン酸の取込 はCoA 活性に依存しない。野生型、野生型+ 0.5 mM VPA 又は fcsA -/- タマホコリカビ（Dictyostelium ）における、ＣｏＡ活性化パルミチン酸の定量(一元配置 ANOVA、ダネット事後分析、*** p< 0.001)。  (D) 0.5 mM VPA の存在又は非存在下における、野生株 fcsA -/- 又は fcsB -/- 細胞への3H アラキドン酸の取込  (一元配置 ANOVA、ボンフェローニ事後分析、*** p< 0.001)。
【００４８】
【図９】図9は、ＶＰＡ誘導体が3H アラキドン酸の取込み及び放出に対して及ぼす影響。ＶＰＡは放射標識体の取込み増加及び放出減少を平行して誘引し、この作用は2-イソプロピルペンタン酸(PIA) により増強され、4-メチルオクタン酸により低減された。 PLA2 阻害剤混合物は放射標識体の取込と放出の両方を阻害した(一元配置 ANOVA、ボンフェローニ事後分析、*** p< 0.001)。
【実施例】
【００４９】
１．材料と方法
1.1  化学物質と遺伝子
全ての化学物質はシグマ社（Sigma UK Ltd）より提供された。バルプロ酸誘導体はアルドリッチ社（Aldrich UK）, アルファエイサー/アボカド（Alfa Aesar/Avocado）, ケムサンプコ（ChemSampCo）, ケムコ（ChemCo）, The NCI/DTP Open Chemical Repository (http://dtp.cancer.gov) 又はTCI europeより提供された。放射標識されたＡＴＰはパーキンエルマー社(Perkin Elmer Ltd.)より提供された。タマホコリカビ（Dictyostelium）変異株はディクティベース（Dictybase.org）より提供された。ただし、5xPI3K (及びPTEN)ノックアウト及びrPKAノックアウト型の菌株についてはR.Kay (Cambridge, UK) 及びA.Noegel (Koeln, Germany)より寄贈された。タマホコリカビ（Dictyostelium ）培地 (純培養) はフォメディウム（Formedium 、Norfolk, UK)より供給された。 3H標識アラキドン酸は Hartmann analytic (Germany) より、 3H 標識パルミチン酸は  パーキンエルマー社(Cambridge, UK)より購入した。
【００５０】
1.2  細胞及び培養
タマホコリカビ（Dictyostelium ）細胞はアキセニック（Axenic）培地中又はサスマンス（Sussmans）培地プレート上で、ラオウルテア・プランティコラ（Raoultella planticola）とともに培養した(Drancourt et al., 2001)。全標識細胞の人工培養は、22℃の細胞振盪器(120 rpm)を用い、cAMP(最終濃度25 nM)による刺激を６分毎に４時間に亘って印加しながら、リン酸緩衝液(16.5 mM KH2PO4, 3.8 mM K2HPO4 pH 6.2)1ｍｌ中2.5 ×106 細胞に達するまで、前述のように実施した(Boeckeler et al., 2006)。
【００５１】
1.3  タマホコリカビ（Dictyostelium ）リン脂質標識化及びイノシトール解析
タマホコリカビ（Dictyostelium ）用のサポニンによる細胞透過化処理のプロトコルを本発明の実験に適用した (Pawolleck & Williams, 2009)。Dictyostelium AX2 細胞は前述のように５時間培養し(Boeckeler et al., 2006) (cAMPによる刺激を最終濃度25nMに達するまで行った)、静置培養皿 (2.5 cm) に移送し、KK2 (20 mMリン酸カリウム緩衝液, pH 6.1)中で静置してコンフルエントな単層を生じさせ、これを化合物 (0.5 mM VPA 、 50 μM LY294002) により３分間に亘って予処理した。所定の間隔を措いて、緩衝液を標識溶液(139 mM グルタミン酸ナトリウム, 5 mM グルコース, 5 mM EDTA, 20 mM PIPES pH 6.6, 1 mM MgSO4.2H2O, 0.25% (w/v) サポニン, 1x ホスファターゼ阻害剤混合物 1 及び 2 (ロシュ社), 及び1 μCi/ml γ[32P]ATP)で置換し、化合物を規定の濃度となるように補充した。
【００５２】
６分間のインキュベーションに続き、標識された溶液を除去し、細胞を酸性化メタノールで溶解させ、リン脂質を分離した（先に詳述した手順 (Williams et al., 1999)のとおり）。リン脂質標識体はTyphoon リン酸撮像装置（Typhoon phosphor-imager）を用いて定量した。硫酸銅による総脂質染色を用いて均一なロード量を決定した。イノシトール濃度は、細胞を５時間培養した後、凍結乾燥してから測定した（前述(Maslanski & Busa, 1990)のとおり）。
【００５３】
1.4  インビトロてんかんモデル
ラット(p21)を過剰のペントバルビトン（pentobarbitone ）(500 mg/kg)の腹腔内投与により屠殺した後、断頭した。大脳を除去し、氷冷したスクロース溶液（単位：ｍＭ、：NaCl 87, KCl 2.5, MgCl2 7, CaCl2 0.5, NaH2PO4 1.25, スクロース 75, グルコース 25）を充填し、 95% O2 / 5% CO2 (pH 7.4)の平衡状態とした。Leica vibratome (Leica VT1200S)により内嗅皮質-海馬結合水平切片（350μｍ）を調製した後、この切片を人工脳脊髄液(aCSF)（含有量：mM、: NaCl 119, KCl 2.5, MgSO4 4, CaCl2 4, NaHCO3 26.2, NaH2PO4 1, グルコース 11）を含み、 95% O2 / 5% CO2のガスを充填したインターフェイスチャンバー内で保存した。１時間以上の保存後、当該切片を予め浸潤させた記録チャンバーに移送した。記録チャンバーには記録のためカルボゲン化（carbogenated-）された aCSF連続的に還流させた。磁場電位の記録は、aCSF 溶液で満たされたCA1ガラス微小電極 (~1-2 MΩ)、ＣＡ１の放線状層（stratum radiatum）に留置することにより行った。切片の生死を判別するために、双極性の刺激電極をシャファー側枝/交連神経線維経路の放線状層（stratum radiatum）に留置した。ＰＴＺ急性発作モデルでは、ＰＴＺ(2 mM)を還流液に加え、カリウムイオン濃度[K+]を6ｍＭまで増加させ、目的となるてんかん様の活動を誘導した(Armand et al., 1998)。低濃度マグネシウムイオン（Mg2+）急性発作モデルでは、Mg2+を含まないaCSFを適用して、律動性の短期反復性の放出を発生させた。てんかん様の放出の頻度及び強度が10分間に亘って安定したところで、新規な抗痙攣剤を投与した。抗痙攣剤の評価は、放出頻度の変動を毎分ごとに測定することにより行った。新規な抗痙攣剤の投与後30分から40分の間に得られたデータをＡＮＯＶＡにより比較した後、Tukey検定及び SPSS 統計解析を用いて事後試験を行った。
【００５４】
1.5  インビボのてんかんの症状
この方法はすでに詳細に述べたとおりである(Walker et al., 1999)。端的には、雄のSprague Dawley ラット(300〜400 mg)を1-2％イソフラン/Ｏ２で麻酔した。接地電極を
皮下に装着し、単極の記録用電極を右海馬内へ定位的に留置した（座標、ブレグマから側方 2.5 mm 、尾方4ｍｍ）。有孔質路を刺激するために、双極記録用電極を右脳半球内の角神経束（angular bundle）内に挿入した（座標、ブレグマから側方 4.4 mm 、尾方8.1 ｍｍ）。電極の深さは、歯状回顆粒細胞の電場電位の傾斜が最大になるように調節した(Guo et al., 1999)。デンタルアクリル及び頭蓋骨用ねじを用いて電極を設置した。動物を放置して麻酔から覚醒させた。7日後、有孔質路に対して4〜5 mA の50 μsec の単極パルスで、20 Hz で2 hrに亘って電気刺激を与えることにより、自律的なてんかん様症状の状態を誘導した。自律的なてんかん様症状を10分間継続した後、化合物またはビヒクルを投与し、発作による行動及びＥＥＧを３時間にわたって測定した。この時点でてんかん様症状を止めるため、全ての動物に対してジアゼパム (10 mg/kg)を投与した。各群をＡＮＯＶＡにより比較された後、テューキー検定及びＳＰＳＳを用いた事後試験を行った。
【００５５】
1.6  脂肪酸の取込み及び放出
タマホコリカビ（Dictyostelium ）細胞を以下の手順でトリチウム化脂肪酸により標識した。即ち、1.5×106 細胞/ml の培養液を、0.5μCi の 3H 標識脂肪酸を加えた0.5% BSA (脂肪酸不含有 BSA)とともに、２回ごとにインキュベートした。4.5 ×106の細胞を除去し、リン酸緩衝液で１回洗浄し、リン酸緩衝液に再懸濁することにより一定時間で検体を調製し、シンチレーションカウンターによる計測に供した。脂肪酸放出実験のために、細胞を（上記のように）4時間電気刺激し、脂肪酸不含有BSA (0.5 %)を添加したリン酸緩衝液に1.5×106 細胞/mlの濃度で再懸濁され、更に1時間に亘ってサンプリングを行った。
取込まれない放射活性物を除去するため、細胞(各時点あたり4.5×106)を洗浄し、規定時間ごとに上清をシンチレーションカウンターで測定した。結果のモデル化にはGraphpad Prism ソフトウェアを用いた。ボディパイ（Bodipy）標識化は4時間刺激後の細胞を用い、蛍光化脂肪酸(インビトロジェン(Invitrogen))とともに、VPA (0.5 mM)の存在又は非存在下、30分間インキュベートすることにより行った。Olympus IX 71倒立蛍光顕微鏡 及びRetiga FastA 1394 カメラによって画像を記録し、ImageProTM（登録商標） ソフトウェアによって解析した。
【００５６】
1.7  変異体の単離、反復発生、及び成長
REMI ライブラリのスクリーニングは 、前述(Kuspa & Loomis, 2006)のように、Ax2 バックグラウンドを用い、1mM VPAの存在下でのＲ．プランチコラ（R. planticola. ）の成長能力に基づいて選択された、VPA 抵抗性変異体を用いて行った。除去された遺伝子を同定することにより、ノックアウトカセットの相同組み換えを用いて、同定されたPLAa (DDB_G0278525)を反復させることが可能となった。遺伝子のオープンリーディングフレーム領域の増幅は、プライマーとして pCR2.1 TOPO (Invitrogen Ltd))によりクローン化された(5’ ATGGGAGATAATAAAAAAGAAAATATCAG 及び 3’ TAAGAATTCATGGGAGATAA TAAAAAAGAAAATATCAGを用い、これをEcoR1消化によりpUC19にクローン化し、BLPblp 由来のSmal 消化フラグメント(Faix et al, 2004)を挿入物のEcoRV 挿入部位へ挿入した。遺伝子破壊はＰＣＲ解析によって確認された。ＶＰＡに対する成長抵抗性は、1ｍＭＶＰＡ又は対照の何れかを含むリン酸緩衝液に浸漬した47ｍｍニトロセルロースフィルター(Millipore)上に被覆した細胞(1x106)をプレーティングし、特に指定のない限り３０時間後の成長状態を記録することにより評価した。が、1 mM VPA又は対照のいずれかを含むリン酸緩衝液中に浸潤されることによって評価され、特に指定のない限り30時間後の成長状態を記録した。成長の画像はLeica CLS 150X 顕微鏡を用いて観察し、QICAM FAST 1394 カメラを用いて記録した。脂肪酸の活性化は、Wilson らの方法(Wilson et al, 1982) に若干の改良を加え確立された方法により決定した。簡潔には、無菌培養された1 ×107細胞を沈殿させ、10 ml の予冷1 M Tris-HCl (pH 7.5)で１回洗浄し、それらを4°Cで30分間、1 % Triton 及びプロテアーゼ阻害剤混合物 (P8340, Sigma-Aldrich, Germany) を含む100 μl の1 M Tris-HCl (pH 7.5) で溶解させることにより、抽出物を調製した。20 μg のタンパク質 を含む体積140 μlの抽出物を、250 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM MgCl2、3 mM ATP、 0.6 mM EDTA、0.25 % Triton及び 2.5 mM DTTを含む緩衝液400 μlで希釈された。100 μM のメタノールストック由来の放射標識されていないパルミチン酸40 μl (P9767, Sigma-Aldrich, Germany)、及び5 μl の3H-パルミチン酸 (20 μM, 1 mCi/ml) を基質として用いた。反応は、20 μl の10 mM コエンザイムA-溶液を加えて35 °Cでインキュベートした。10分後、500 μlの ドール培地 (0.4 ml イソプロパノール, 0.1 ml n-ヘプタン, 10 μl H2SO4) を反応停止のためにが加た。卓上遠心分離機を用いて14,000 rpm、30秒の遠心分離を行うことにより層分離を行った。有機層は廃棄し、水層を300 μlのｎ-ヘプタンで6回洗浄し、活性化されない脂肪酸を除去し、水層に残るアシルＣｏＡチオエステルの放射活性を、 2 ml のLumasafeTM（登録商標） 、Plus fluid (Lumac LSC, Groningen, The Netherlands)を用いて、シンチレーションカウンターで測定し決定した。
【００５７】
2.結果
2.1  ＶＰＡはホスホイノシタイドのシグナル伝達を減衰させる。
ＶＰＡのホスホイノシタイドのシグナル伝達における急性効果は明らかにされていないが、最初に、発明者等はタマホコリカビ（Dictyostelium）における時間-及び濃度-依存の薬物の挙動を検証した (図1)。0.5 mM VPA 処置に続いてホスホイノシタイドのリン酸化の急激な減少が観察され、６分間のVPA 処置において、放射標識されたPIP 及び PIP2両方 の代謝回転が49% 減少し、60分間 のVPA 処置において、各ホスホイノシタイド化合物の代謝回転が94％減少にまで進行した (図1a)。これらの値は、ホスホイノシタイドの合成及び分解の組合せが細胞内で起こっていることを示しており、実際ホスホイノシタイドの代謝回転に反映しているが、一方、ホスファターゼ活性は阻害剤の混合物の使用により阻害された。当該効果の急性の程度は、マウスの発作モデルにおける VPAの静脈内注射に続いて起こる、発作の制御と近似する速さで起こるものである(Honack & Loscher, 1992)。また、当該ホスホイノシタイドシグナル伝達の減衰は濃度にも依存し、9分間のＶＰＡ処置において、0.25ｍＭのＶＰＡ投与に対しPIP 及び PIP2 代謝回転はそれぞれ25% 及び 42%の阻害を示し、0.5ｍＭのＶＰＡ投与に対し68% 及び 79%の阻害にまで進行した(図1b)−当該濃度はＶＰＡの治療用途(血漿中0.4-0.7 mM)から導かれるものである(DSM IV, 2000)。これらの条件下、当該ＶＰＡ阻害活性はEC50 が154 μMを示し、取込みとは無関係である（ただし、細胞はサポニン透過性である）。この急性且つ強力なホスホイノシチドシグナル伝達はＶＰＡによって引き起こされ、当該効果は治療可能性への関心を高めるものである。
【００５８】
ホスホイノシタイドのリン酸化の急速な減衰は、当初は未知の脂質キナーゼ活性の阻害を通じて起こるものと考えられていた。脂質キナーゼの解析には従来、酵素の分類に特異的な化合物の薬理学的阻害が採用されるが、これらの研究は多数のホスファチジルイノシトールキナーゼ酵素の存在、及び阻害剤との間の重複した影響のため、複雑である。以前の研究は、ＶＰＡの、ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ(PI3K)シグナル伝達経路影響における減衰に対する役割を提示してきた(Xu et al., 2007)が、本発明者らは単一の細胞株由来の1 PI3K 遺伝子の5つの異なる型の混合物(Hoeller & Kay, 2007)の、ホスホイノシタイドシグナル伝達における効果について解析した(figure 2a)。これらの細胞は野生型細胞に対し28% a及び 44%のPIP 及び PIP2 の産生の形成をそれぞれ示し、ホスホイノシタイドシグナル伝達における当該酵素の主要な役割であることを示唆している。VPAが触媒するホスホイノシタイドの減少がPI3K 依存性であるか否かを確認するため、VPA (0.5 mM)をこれらの細胞に加えた。VPA はPIP 及び PIP2 の産生を、処置後９分間でそれぞれ未処置の細胞と比較して48% 及び 70%の減少が確認された (図2b)。当該５つの酵素の混合物はホスホイノシタイドの代謝回転の減衰におけるＶＰＡの標的となっていないことを示唆している。
【００５９】
ＶＰＡが触媒するホスホイノシタイド減衰作用における他の脂質キナーゼの役割を検討するために、発明者らは２つの独立したホスファチジルイノシトールキナーゼを解析した：ホスファチジルイノシトール5-キナーゼ (PIP5K) ドメインを含む、エンドソームの Ｇタンパク質共役受容体タンパク質が欠如したrPKA ノックアウト変異(Bakthavatsalam et al., 2006); 及び核内ホスファチジルイノシトール 4/5 キナーゼ活性が欠如したPIPKinA 変異(Guo et al., 2001)。rPKAの破壊(図2a)PIP 及び PIP2 産生において30%及び54%の減少を示し、それぞれ 野生株型と比較し、VPA 処置により、未処置のものと比較してさらに72%及び33%の減少 (図2c)となった。PIPKinA の破壊は PIP 及び PIP2 産生において顕著な変化を示さず (図2a)、VPA 処置により、未処置のものと比較して、PIP 及び PIP2 の合成においてそれぞれ54% 及び 68% の減少 (図2d)となった。３種の細胞株は全てPI3K 活性の薬理学的阻害に感受性であり(50μM LY294006-PI3K 活性阻害剤-を使用)、これらの多様性はホスホイノシタイド代謝活性の減衰と関係することが確認される(図2b-d)。３種の脂質キナーゼ変異全てについて感受性が減弱したことは、ＶＰＡ活性の通常の作用機序が、特異的なホスファチジルイノシトールキナーゼ活性とは無関係であることを示している。
【００６０】
ホスホイノシタイドシグナル伝達調節のもう1つの作用機序は、イノシトールリン酸経由のホスファチジルイノシトールの再利用であるが(図2e)、発明者等は同質遺伝子変異におけるホスホイノシチジド代謝回転について、当該再利用経路を遮断又は活性化させ解析した。単一のホスホリパーゼＣ遺伝子が欠如する細胞(Drayer et al., 1994)は、野生型細胞と比較して、PIP 及びPIP2 代謝回転において著しい減少を示さなかった(図2f)、また、ＶＰＡが触媒するPIP 及びPIP2代謝回転の減衰は野生型細胞に対する場合と近いことを示した(PIP 及び PIP2 につきそれぞれ73％ 及び 75%の減衰)。プロピルオリゴペプチダーゼ破壊(PO; Williams et al., 1999, Williams et al., 2002)により引き起こされる約３倍高いイノシトールトリホスフェート(InsP3)をともなう細胞は、未処置細胞においてPIP濃度の若干の減少を示し（また、PIP2 濃度は著しい変化はなく）そしてＶＰＡが触媒するPIP 及び PIP2 のシグナル伝達の減衰はそれぞれ66% 及び 68％であった。さらに、発明者らは、10 mMのリチウムによるイノシトールモノホスファターゼ(IMPase)活性の阻害は、急性の処置(9分)後のホスホイノシタイドシグナル伝達を減衰させないことを示した(King et al., 2009)が、長時間のリチウム処置(60分)によりPIP 及び PIP2 濃度が減少し、この効果はIMPaseの過剰発現により打ち消される (King et al., 2009)。対して、IMPaseの過剰発現は長時間のVPA 処置 (60分; 0.5 mM)を打ち消さなかった(figure 2g)。これらの結果は、イノシトールホスフェートシグナル伝達を通じたイノシトール再利用の上昇又は減少が、急性のホスホイノシタイド産生において主要な調節機能を担当せず、本モデルのＶＰＡが触媒する急性のホスホイノシタイドシグナル伝達を克服しないことを示唆している。これらの結果は事実、ＶＰＡの作用機序-イノシトールの枯渇とは無関係の-ホスホイノシタイドシグナル伝達に関する、最初の強力な証拠を示す。
【００６１】
2.2  ホスホイノシチド減衰作用の増強を示す新規化合物の同定
ＶＰＡの急性のホスホイノシチドシグナル伝達減衰作用を同定することにより、当該効果に必要な化学構造を検討した。本発明のホスホイノシチド減衰作用効果を確認した化合物群につき、試験結果のまとめを以下の表１に示す。
【表１】
2013543882.tif 000002
【００６２】
試験された化合物の大多数はホスホイノシタイド代謝回転作用をある程度阻害することが示された(表1)が、いくつかの化合物はＶＰＡよりも高いホスホイノシタイドシグナル伝達阻害作用を示した。当該高活性の化合物は構造的に２つの群に分類される;第１群はＶＰＡと構造が概ね類似する分岐脂肪酸から成り;第２群は骨格の様々な位置において短い側鎖を有するか又は有しない、新規の化合物群である。後者において、脂肪酸の示す活性は鎖長に強く依存し、Ｃ8-10骨格の酸が高活性を示し（例えば、4-メチルオクタン酸は、ＰＩＰ及びＰＩＰ２シグナル伝達を各々88％及び93％減衰させ、ノナン酸は各々92％又は93%減衰させる。表１参照）、骨格の鎖長がそれより増加しても減少しても活性は減弱する。当該群において高い活性を示す化合物は全て脂肪酸であり、催奇形性の予見はなく(Eickholt et al., 2005)、高い脂溶性との関連性が示されている。また、当該効果は酸性度と無関係であり、なぜならば同等の酸性度を有する直鎖カルボン酸であっても多様な活性を示すからである(pKa, 表２はＶＰＡ及び直鎖カルボン酸の、タマホコリカビ（Dictyostelium)におけるホスホイノシタイドの減衰作用と酸性度（ｐＫａ）とを比較したものである）。当該化学構造の違いは、ＶＰＡの誘導体の、ホスホイノシタイド減衰作用に対する第１の特徴を提供する。興味深いことに、脂肪酸の高い化学構造特異性は抗痙攣作用及び抗アロデニア（抗ニューロパシー痛）活性においても、以前より示されてきた(Kaufmann et al., 2009)。ある関連化合物についての、動物モデルにおける行動の予備的な観測では、強い鎮静作用は示されなかった。
【表２】
2013543882.tif 000003
【００６３】
ＶＰＡはイノシトールのデノボ生合成の阻害剤として同定され、間接的にグルコース-6-リン酸からのイノシトール-1-リン酸産生を阻害する(Shaltiel et al., 2004, Shaltiel et al., 2007a, Vaden et al., 2001)。イノシトールシグナル伝達のＶＰＡによる減衰作用の役割は広く示されており、その範囲は酵母(Vaden et al., 2001) 及びタマホコリカビ（ Dictyostelium ）(Williams et al., 1999, Williams 2002)から、シノラブディス・エレガンス（Caenorhabditis elegans） (Tokuoka et al., 2008), ラット及びヒト (Shaltiel et al., 2007a, Shaltiel et al., 2007b)に亘る。イノシトール及びイノシトール３リン酸(InsP3)濃度、並びにイノシトールに依存する哺乳類の成長円錐拡散性の測定は、すべてイノシトールの枯渇を示した。ＶＰＡが誘導するイノシトール濃度減少は、ここで示されるホスホイノシタイドシグナル伝達における急性の減少であるか否かは明確にされていないが、本発明者等はホスホイノシタイド代謝回転の解析を、イノシトール枯渇において活性を示す、ＶＰＡに関連する化合物を用いて行った。タマホコリカビ（Dictyostelium）において、哺乳類の成長円錐肥大に依存性のイノシトールの枯渇を伴いInsP3の強い枯渇作用を示す化合物として2-メチル−２−ペンテン酸があり(Eickholt et al., 2005)、当該化合物はＶＰＡと比べてより強力なホスホイノシチド減衰作用を示した。興味深いことに、化合物のカルボン酸部分をカルボキシアミド基へ置換する（対応するアミド(VPD)とする）と、ホスホイノシチド代謝回転の阻害作用は減弱し、また成長円錐の拡散作用も減弱した。また、ＶＰＤは、イノシトール枯渇におけるＶＰＡの標的となるヒト筋肉イノシトール合成酵素（myo-inositol synthase）について、弱い阻害活性を示した(MIP合成酵素 (Shaltiel et al., 2004, Shaltiel et al., 2007a))。当該イノシトール枯渇及びホスホイノシチド減衰作用を有する化合物は、前述の第１群の化学構造群に含まれ、また、最近の研究(Bialer & Yagen, 2007)によれば、これらの化合物は抗痙攣活性を有するいくつかの第２世代のＶＰＡが含まれる。本研究で同定された、より長鎖の骨格の化合物群は、イノシトール枯渇に関する研究では解析されていない。
【００６４】
イノシトール濃度の減少は当該化合物のホスホイノシタイド減衰作用における作用機序を提示する可能性があるため、本発明者等はイノシトール濃度の解析を行うにあたり、ホスホイノシタイド減衰作用効果を示す化学構造の２群のうち両群から一定範囲の化合物を用いて処置を行った。当該実験結果において、ＶＰＡは、ホスホイノシタイド減衰作用の惹起を示すのに要する時間（9分間）ではイノシトール濃度の顕著な減少を与えず、また他の試験化合物についても同様であり、そしてホスホイノシタイド減衰作用とイノシトール枯渇作用との間には関連性は認められなかった。この結論はタマホコリカビ（Dictyostelium）における前出のデータ、すなわちイノシトールモノホスファターゼ（リチウムによる）の急性阻害作用はホスホイノシチド減衰作用を引き起こすものではないことと合致し、そしてこの実験モデルでのイノシトール３リン酸の枯渇にはＶＰＡの６時間の処置-ここで用いられる時間よりかなり長時間-を要する(Williams et al., 1999)。よって、当該実験は、ホスホイノシタイド減衰作用がタマホコリカビ（Dictyostelium）におけるＶＰＡの新規な作用を提供することを示し、当該効果において活性が増加することを示す化合物の範囲を特定するものである。発作動物モデルにおいてＰＩＰ及びＰＩＰ２の濃度増加が観察されたことから（Van Rooijen et al., 1986）、本発明者等は当該作用を引き起こす新規の化合物群を見出した。
【００６５】
2.3  新規化合物はインビトロてんかん様モデルにおいて薬効の増強を示す
本発明の放射標識化実験をインビボ動物モデルにおいて繰り返し、発明者らの作用機序に関連する知見をより高度なモデルにおいて再現することは不可能であるため、代わりに発明者等は新規化合物群の薬効について、発作制御において解析した。当該実験のため、それら/彼らはＶＰＡ感受性ペンテレンテトラゾール（ＰＴＺ）のインビトロてんかん様活性モデル(Armand et al., 1998)を採用し、様々な側鎖の置換位置や鎖長をもつＣ８骨格の、新規化合物群のうち３化合物を解析した(Fig 3a,b)。VPA はてんかん様放出作用を顕著に減少させた(Armand et al., 1998; figure 3b; VPA: 75.1±1.7％)。また等モル濃度のＣ８骨格の化合物を適用すると、ＶＰＡよりも顕著に強い薬効を示し、強力に放出作用を減少させた (figures 3b,c)。新規３化合物すべての適用において、それぞれ発作の放出回数が大幅に減少した (4-メチルオクタン酸49.1±4.4%, 2-プロピルオクタン酸 5.3±3.3、2-ブチルオクタン酸5.2 ±5.0% 、全て P=0.005 、対VPA比)。また、発明者等は化合物を直鎖がＣ９-及びＣ10-骨格のものにも拡張し、同様の結果を示した(ノナン酸, 20.9±7.5％, P = 2 x 10-6 対VPA比; デカン酸 0.23±0.23%, P = 2 x 10-6 対VPA比、 Fig 3d, e)。当該活性はより短鎖の骨格では見られなかった（例えば、炭素数5であるペンタン酸の場合−データ示さず）。これらの高活性を示す化合物は以前より発作の制御作用とは関連性はなく、また催奇形性作用の発現は予見されていなかった(Guo et al., 1999)。
【００６６】
これら化合物の当該効果が発作モデルに特異的なものではないことを示すために、発明者等はさらにこれらの化合物のうちの１つをインビトロ低濃度マグネシウム発作モデル（in vitro low Mg2+ seizure model）において検討した (図3f, g, h)。本発明者等は4-メチルオクタン酸(hircinoic acid)を、動物系統の内因性物質であるという理由から選択した。ＶＰＡ(1mM)の投与は、当該モデルにおける頻発性の短期放出の回数を僅かに減少させた。4-メチルオクタン酸を適用した場合は、投与後30-40分後の頻発性の短い放出の回数は殆ど消失した。よってこれらの結果は、4-メチルオクタン酸は複数のインビトロてんかん様活性モデルにおいてＶＰＡの活性以上の増強を示すことを示唆している。
【００６７】
2.4  新規化合物はてんかん重積症状（status epilepticus）制御の増強を示す
当該化合物について発作の動物モデルにおける薬理活性をさらに実証するため、発明者等はてんかん重積症状（status epilepticus）の動物モデルにおいて4-メチルオクタン酸を試験した(図4)。この試験のため、てんかん重積症状は、覚醒し自由に行動するラットにおいて、有孔質路を刺激することにより、既報告の通り誘発させた (Holtkamp et al., 2001, Walker et al., 1999; 図4a)。発明者等は以前、ＶＰＡは本モデルでは高用量(600mg/kg)において効果的であるが、低用量(400 mg/kg)においては部分的にのみ効果的であることを確認している。よって、発明者等は４-メチルオクタン酸(400 mg/kg)と、VPA (400 mg/kg)とを比較した。４-メチルオクタン酸の分子量(MW=158) は、VPA (MW=144)と比べて僅かに高いため、本試験の用量では4-メチルオクタン酸のモル濃度が僅かに低いのみである。ＶＰＡは本モデルの発作を投与後２時間で強力に減衰させ、投与後３時間で薬効が減少し(図 4b)、このとき４-メチルオクタン酸は実験時間を通して発作を抑制し続けた。両方の化合物はスパイク波の振幅及び頻度を減少させた(図4)：VPA はスパイク波の振幅を減少させた(75.2±9.2 %  １時間目; 6：1.1±8.3% ２時間目; 55.1±6.6% ３時間目) (図 4e,f)。これに対し、4-メチルオクタン酸はより優れた制御活性を顕著に示し、スパイク波の頻度を１時間目で39.3±11.3 %まで減少させ(p<0.05、VPAと比べ顕著に優れた効果である)、２時間目で18.1±10.3% (p<0.05 、対VPA比) 、３時間目で26.9±12.3% まで減少させた(図4e,f)。４-メチルオクタン酸はてんかん重積症状を、すべてのてんかん重積症状の動物において終了させた（ここではスパイク波の頻度が1Ｈｚ以下で終了と定義する）。さらに、 4-メチルオクタン酸は７匹の動物全ての発作を投与後２時間で停止させたが、一方、 VPA は発作のseizure 重症度を軽減させるものの発作は終了しなかった(P = 0.0003、フィッシャーの正確確率検定（Fisher’s exact test）)、 そしてこの効果は、メチルオクタン酸投与後３時間で7匹中５匹の動物で維持された(P = 0.01、フィッシャーの正確確率検定（Fisher’s exact test）)。
【００６８】
2.5  ＶＰＡは脂肪酸取込及び放出を調節する
タマホコリカビ（Dictyostelium）における、ＶＰＡに仲介されたアラキドン酸放出の調節機能の役割を解析するために、発明者等は経時的な3H標識化された脂肪酸を含む評価系を開発した。このアッセイ系（評価系）を用い、発明者等は、細胞の3H-AA標識後、放射標識体の媒体への放出は45分間以上に亘って線形であることを示した(図 5A)。ＡＡ標識された細胞からの標識体の放出における、当該ＶＰＡの効果は急性且つ用量依存的であり、一方、ＶＰＡは放出活性の減少を導き、その結果はIC50 が89μＭであった。当該効果はＡＡに対して特異的ではなく、何故ならばパルミチン酸3H標識体放出もまた、ＶＰＡの存在下IC50 of 163μMの阻害を受けるからである(図 5C)。当該効果が急性であるとの性質は、30分の曝露時間後の顕著な阻害活性にみられる(p<0.05)。
【００６９】
放射標識された脂肪酸の放出減少は脂質中への再取込みが原因となる可能性があることから、発明者等は脂肪酸の細胞内への取込みを放射測定することにより、脂肪酸の取込みも行った。脂肪酸の放出のように、滴定後のＡＡの取込みは30分間に亘り線形であった(図 5B)が、ＶＰＡは用量依存的なＡＡ取込みの増加を引き起こし、結果はEC50 が47μMであった。この効果はパルミチン酸を用いた場合にも見られ、結果はEC50 が160μM (図 5D)であり、薬物処置後30分後で顕著な薬効となった(p<0.05)。
【００７０】
上記の効果が脂肪酸の単なる膜挿入を通じて起こるか否かを試験することを目的として、発明者等は脂肪酸の取込みについて、脂肪酸の炭素数１２の炭素鎖を有し、該炭素鎖が蛍光の頭部基を結合させたもの(ボディピー（bodipy）; 図6A)である化合物を用いて可視化した(Worsfold et al., 2004)。細胞をボディピー（bodipy）で標識化された脂質と共にインキュベートしたところ、VPA  0.5ｍＭで処理することにより、未処置の細胞と比較して細胞内の蛍光化された脂質滴の蛍光強度及び直径の増加が引き起こされた(図 6B)。当該結果は、ＶＰＡはこの脂肪酸の取込みも増加させること、また薬物が脂質滴内の脂肪酸の貯留を増加させることを示している。
【００７１】
2.6  ＶＰＡにより誘導される脂質取込はアクチンの動的作用とは無関係である
タマホコリカビ（Dictyostelium）における化合物の取込（及び放出）は、マクロピノサイトーシス（macropinocytosis）を制御する細胞の作用機序より調節されていると考えられ、実際、脂肪酸取込は当該プロセスの単純な調節機能による可能性がある。このことについて試験（検討）することを目的として、またマクロピノサイトーシスはアクチン重合に依存することから、発明者等はアクチン重合阻害剤であるラツルンクリン（latrunculin ）(10 μM) (de Oliveira and Mantovani, 1988)を用い、脂肪酸取込の効果を観察した。アクチン重合阻害は、対照実験の細胞における再取込を減少させた。しかし、ラツルンクリンはＶＰＡが誘導するＡＡ取込みを減衰させることはなく、ＶＰＡが誘導する脂肪酸調節は小胞の動力作用とは無関係であることを示唆した(図 6C)。
【００７２】
2.7  ＰＬＡ２活性の遺伝子除去は脂肪酸の摂取活性を反転しない
当該動物モデルにおけるＶＰＡの効果を制御している特定の遺伝子を明らかにするため、発明者等はREMI 法（restriction enzyme mediated integration ）を用いた変異体スクリーニングにより、発生過程においてＶＰＡの効果を制御する遺伝子座の同定を試みた(Kuspa and Loomis, 2006)。ＶＰＡはタマホコリカビ（Dictyostelium）の成長を、ＶＰＡ処置を受けた患者の血漿中で確認される濃度において阻害する(0.28-0.7mM; (Silva et al., 2008)) (図 7B)。当該スクリーニングにより単離された変異体の１つが切断されたＰＬＡ２遺伝子を有し(van Haastert et al., 2007)、Ca2+-非依存性酵素との類似性を示すと共に、保存されたＡＴＰase及びリパーゼモチーフを含んでいた(図7A)。また、当該変異体は、発生時にＶＰＡに対する部分的な抵抗性を示した (図 7B)。しかし、ノックアウト細胞系統は放射標識化された細胞からの放出を減衰させなかった(図 7C)、ＰＬＡ２遺伝子の断絶が、ＶＰＡの保護を成長段階において部分的に呈しているが、ＶＰＡが誘導する脂肪酸放出の全てを阻害するには十分でないことを示唆している。
【００７３】
2.8  ＶＰＡの脂肪酸シグナル伝達調節はＰＬＡ２阻害作用による遺伝表現型模写ではない
ＶＰＡはホスホリパーゼＡ２(PLA2)に関連するシグナル伝達の調節を示したこと (Rao et al., 2008)から、また単一のＰＬＡ２遺伝子断片が、ＶＰＡに対する抵抗性を成長段階において一部のみ示し、脂肪酸の放射標識放出の総計には影響を示さないことにより、発明者等はＡＡ調節におけるＰＬＡ２の薬理学的阻害作用の役割を評価した。異なるＰＬＡ２クラスに対し特異的な化学的阻害剤(BEL [80 μM], Ca2+非依存性 PLA2 阻害剤 (Ackermann et al., 1995); MAFP [50 μM], Ca2+-依存性 及び Ca2+-非依存性の 細胞質性の PLA2 阻害剤 (Balsinde and Dennis, 1996, Lio et al., 1996); 及び BPB [20 μM], ホスホリパーゼA2 阻害剤(Mitchell et al., 1976)）は、全てＶＰＡ処置の場合と同様に3H-AA細胞からの放射標識体の放出を減少させた(図 8)。これらの阻害剤に対する特異性の違いは、３つの阻害剤の全てを混合した場合、放出が累積的に阻害されたことにより、示された。一方、ＶＰＡの放出における効果（経時的な脂肪酸の増加によるもの）に対しては、ＰＬＡ２の化学的阻害剤の活性は脂肪酸の取込みを減少を引き起こしている(図 8)。当該データはＰＬＡ２阻害活性は、ＡＡのシグナル伝達を修飾するうえでのＶＰＡの効果を部分的に遺伝表現型模写するが、ＶＰＡは脂肪酸代謝のシグナル伝達におけるより一般化された効果を有することが示された。
【００７４】
2.9  ＶＰＡが誘導する脂肪酸取込は脂肪酸の活性化に依存しない
脂肪酸の取込は活性化に依存するか否かを試験するために、最初に発明者等は細胞抽出物の、パルミチン酸を活性化させPaA-CoAを形成する能力について試験した。当該実験結果において、細胞抽出物を3H-PaA 及び coenzyme Aとともにインキュベートされることにより脂肪酸の活性化を可能とし、続いて脂肪酸は溶媒の溶解度の違いによって分離され、定量された(von Lohneysen et al., 2003)。ＶＰＡ（1.0ｍＭ）で処理する場合、活性化アッセイの間、細胞抽出物と共存させる場合、又は抽出物の調製の前に細胞を予め処理(10 分, 1 mM)する場合のいずれにおいても、脂肪酸の活性化には影響しなかった。一方で、ペルオキシゾームの脂肪酸のＣｏＡ合成Ａ酵素（peroxisomal fatty acid CoA synthase A enzyme (FcsA)）-エンドソームにおける脂肪酸ＣｏＡ活性化に貢献する酵素-
が除去されていても、野生型細胞と比べて顕著なＰａＡ-ＣｏＡ合成の減少を示した(図 8)。さらに、fcsA欠如の細胞系統 (DDB_G0269242; (von Lohneysen et al., 2003))は、VPＡが誘導する脂肪酸取込の増加を、野生型細胞と同様に示した(図8).  
当該結果は、VPAの脂肪酸シグナル伝達の調節における効果は脂肪酸ＣｏＡの活性化とは無関係であることを示しており、以前に示唆された結果と同じであった(Bazinet et al., 2006b).
【００７５】
2.10  脂肪酸の放出誘導に関する構造特異性
ＳＡＲ研究は効果を及ぼすために必須の物理学的性質を同定し、当該研究は各化合物間での効果を識別することの一助となり得る。ＶＰＡの、3H-AAの取込みに続く放射標識体の放出の構造依存性を検証することを目的として、本発明者等はＶＰＡ関連化合物として様々な炭素骨格と側鎖長、先頭の置換基、立体的特異性及び飽和を有する範囲の化合物を採用し、0.5ｍＭ、処置後30分での放出を測定した。この結果は以下の表３に示す。
【表３】
2013543882.tif 000004
【００７６】
当該化合物群の試験結果は幅のある阻害活性を高い構造特異性を示すとともに、活性の強さは酸性度や脂溶性(pKA a及び logP values のそれぞれについて)に依存しないことを示した。
【００７７】
ＶＰＡは対照と比べて（ＡＡの放出）活性について50％の減少活性を示すことから、 発明者等は例えば２-プロピルオクタン酸のような、45%又はそれ以下の減少活性を示す化合物を高活性化合物と定義した。当該高活性化合物はカルボン酸であり（バルプロアミドは実質的に阻害活性を示さなかった。データは示していない）、２番目の炭素において分岐し、最高活性を有する化合物はイソプロピル基を有した。催奇形性の場合(Eickholt et al 2006)とは異なり、３級で置換されＣ２も活性を示し、長い又は中程度の直鎖脂肪酸も活性を保持した。分岐鎖の化合物は対応する直鎖のものよりも強い活性を示し、より長い側鎖有するももが好ましい（プロピル基側鎖はメチル基側鎖と比べて強い活性を示す。最後に、不飽和化合物は阻害活性の減少を示した。当該ＳＡＲ研究はVPA触媒効果についての新規な説を提示するものである。
【００７８】
脂肪酸の放出の減少及び取込みの増加の重畳的効果が単一の部位で起こるということを確認するため、発明者等は、標識体の放出における3H-AA取込みについて、強弱の阻害活性を示す2化合物（それぞれイソプロピルペンタン酸及び4-メチルオクタン酸)を解析した（図9）。当該実験結果から、ＶＰＡの場合と比較して、放射標識体の放出阻害の増強は細胞内への脂肪酸取込みの上昇と合致し、放出作用の減弱は、再取込みの減少と合致していた。当該データは、ＶＰＡへ作用する単独の高い構造特異的な部位が脂肪酸シグナル伝達調節と関連していることを示す。
【００７９】
3.  考察
VPA は、現在多く見られる症状であるてんかん、双極性障害、及び偏頭痛の治療に用いられ、またその役割はがん (Blaheta et al., 2006)、HIV 及び アルツハイマー病(Qing et al. 2008)の治療 (reviewed in Lagace et al., 2005, Terbach & Williams, 2009, Bialer & Yagen, 2007), 虚血(Costa et al. 2006), 及び致命的出血 (Alam et al. 2009)を含む広範囲に拡張し得る。未知の1次標的とともに細胞が多様に変化することを引き起こし、当該変化は特定の臨床症状に無関係であるため、これらの症状をＶＰＡによって制御する方法は高度に複雑であることがわかっており、そして構造活性研究は殆どなされていない (総説は Lagace et al., 2005, Terbach & Williams, 2009, Bialer & Yagen, 2007, Nalivaeva et al., 2009)。
【００８０】
3.1 ホスホイノシトールシグナル伝達の効果
発明者等は、タマホコリカビ（Dictyostelium）生物医学的モデルにおいて、ＶＰＡがPIP 及びPIP2 (図 1a及びb)の用量依存的減少を引き起こすことを示し、更にはこの作用こそが、急性期に生じ、誘導性の発作に対する保護を提供する、ＶＰＡの数少ない効果の１つであることを示した (図1b; Honack & Loscher, 1992)。VPAの作用機序に関する研究の大半は、長期投与が引き起こす遺伝子発現の変化(催奇形性による媒介の可能性が高い (Gurvich et al., 2004, Phiel et al., 2001)) 、又は多重の間接的標的の調節を可能とする時間の変化により、惑わされてきた。そのため、ホスホイノシタイドシグナル伝達の急激な減衰は、ＶＰＡの急性作用に対する意義深い洞察をもたらす。発作中のホスホイノシタイド濃度の増加を考慮すると(Van Rooijen et al., 1986)、当該結果は我々の発作制御の理解においてブレイクスルーを示す。
【００８１】
哺乳類のインビボにおけるホスホイノシタイド代謝を調節する薬物標的の同定は困難であり、その原因は多数のキナーゼ及びホスファターゼ、及びリン脂質キナーゼ基質への雑多な選択性のためである。タマホコリカビ (Dictyostelium)において進められる有利な実験アプローチは、破壊されたキナーゼ遺伝子を含む同質遺伝子系統を用いることである。ＶＰＡがＰＩＰ３産生を減衰させることが以前より示されていたため (Xu et al., 2007)、発明者らは、全ての1型ＰＩ３Ｋ活性の活性を欠く細胞株におけるホスホイノシタイドにおける代謝回転 (Hoeller & Kay, 2007)、及び、無関係な脂質キナーゼを欠く２つのヌル変異体、即ち受容体結合性ホスファチジルイノシトール５キナーゼ (rPKA) (Bakthavatsalam et al., 2006)及び核ホスファチジルイノシトール4/5キナーゼ活性 (PIPKinA)) (Guo et al., 2001)における代謝回転を解析した （図 2)。３種類の変異細胞株は全て、野生株と比較した減少レベルであるものの、ＶＰＡ処置後のＰＩＰ代謝回転を大きく且つ著しい減少させることを示し、当該酵素はＶＰＡの直接の標的となり得ないこと、さらなるキナーゼ試験は利益をほとんどもたらさないであろうことを示唆した。
【００８２】
イノシトール枯渇に関する理論 (Berridge et al., 1989) は、イノシトールのデノボ生合成の原因となる酵素であるmyo-イノシトール-1-リン酸合成酵素（myo-inositol-1-phosphate synthase (MIP)）の間接的阻害を潜在的に通じて、双極性障害予防におけるＶＰＡ活性に関する十分支持された理論を示した(Williams et al., 2002, Williams, 2005)。強いＭＩＰ阻害活性は限られた数のＶＰＡ誘導体で見られ(Shaltiel et al., 2004; Shaltiel et al., 2007)、イノシトールの調節と発作の制御との関連性を示唆する。しかし、強力な発作制御を示すものとして新規に見出された化合物(例えば、4-MO及びノナン酸)−は、発作制御の時間内でイノシトールの急激な枯渇をもたらすことはなく、イノシトールシグナル伝達が当該臨床の治療において担う役割に対し、逆の議論を提示する。また、Einat ら（ 2008）は、ＭＩＰの薬理的阻害活性（ＶＰＡと化学構造的に無関係の化合物による）はイノシトール感受性ピロカルピン誘導発作モデルに対して制御作用を示さない。代わりに、ここに示されるデータは、ホスホイノシタイドシグナル伝達は発作発生の鍵となる役割を果たすものであることを特定するのに重要性を増し(Backman et al., 2001)、そして、ホスホイノシタイド代謝回転及び発作制御におけるＶＰＡの効果は、イノシトール枯渇の効果とは無関係であることを示唆するものである。
【００８３】
ＶＰＡの作用標的及び臨床効果に関する大多数の研究は、炭素数５の骨格（２番目の炭素上で分岐を有する）又は環化誘導体のいずれかの化合物周辺に集中していた(Bialer & Yagen, 2007)。実際、さらに長鎖の炭素骨格を有する新規化合物群がホスホイノシタイド代謝回転活性阻害及び発作の制御を示すことが発見され、新規治療の発展に主要な進歩をもたらした。当該新規化合物群は２番目又は４番目の炭素における分岐を含み、化合物中の分岐の変化による薬効を示し、そして、実際に臨床的に興味深い大規模な新規化合物群を提供する。
【００８４】
ここで、発明者等は、当該新規脂肪酸化合物群のうち5化合物の薬効を、インビトロてんかん様活性モデルであって強力な抗てんかん薬のスクリーニング用の重要なモデルにおいて試験した。ＰＴＺてんかん様活性モデルにおいて、全ての化合物は大幅な増加を生じたが可逆的低減を示した。１化合物(4-メチルオクタン酸)は低濃度マグネシウムモデルで薬効を示したため、この効果はモデルに特異的ではない。しかし、インビトロモデルでの薬効が必ずしもインビボの薬効を示すとは限らない。なぜならば、薬物代謝、薬物標的に対する脳内透過性及び薬物標的への到達といった他の要因が重要な役割を果たしているからである。よって、発明者等は、4-メチルオクタン酸を用いさらにインビボてんかん重積症状モデルでも評価し、ＶＰＡよりも高活性であることを示した。以前より当該モデルはフェニトイン抵抗性を示し、また高容量の他の抗痙攣剤のみに応答することが示された(Chang et al., 2009)。よって当該結果は、当該化合物により、薬効が増強された新規発作制御薬が提供されること、また、催奇形性が予想されないことからＶＰＡによる治療と比較して副作用低減がもたらされることを示唆する。
【００８５】
これらの知見は、単純生物医学的モデルでのホスホイノシタイド代謝回転減衰におけるVPAの作用機序を同定し、当該効果は、ホスホイノシタイドキナーゼ酵素、イノシトールの再利用及び枯渇の範囲において独立して起こることを示した。本発明者等は当該試験系を用いて、ホスホイシタイド減衰増強を示す新規化合物群を同定した。そして、本発明者等は当該単純モデルに基づく研究を、多くの発作制御の臨床モデルへ置き換えて理解し、てんかん様活性海馬切片モデルにおいて当該化合物のうちの５化合物が、また、てんかん状態の全身動物モデルにおいて当該化合物のうちの１化合物が、VPAを超える大きな薬効の増加を示す。実際、当該研究は、発作制御の薬効を示す新規化合物が、VPAと比較して長い炭素骨格を有し、変化に富む側鎖長及び置換位置を有することを示唆する。ホスホイノシタイドシグナル伝達制御をつかさどる生合成経路の解析を継続することにより、てんかん、及び双極性障害や偏頭痛のようなVPAで治療可能な症状の理解が著しく進歩する可能性がある。
【００８６】
3.2  脂肪酸代謝回転における効果
従来の研究は、VPAの作用機序としてアラキドン酸代謝回転の減衰が考えられることを示した(Chang et al., 2001)。ここで発明者等は、タマホコリカビ（Dictyostelium discoideum ）モデルにおいて、VPAは、3H標識アラキドン酸の取込み後に標識体が放出されるのを顕著に減弱させることを示した。驚くべきことに、発明者等はVPAの存在下、3H-AAの取込みが増強されたことをも確認した。アラキドン酸はタマホコリカビ（Dictyostelium）内因性の脂肪酸ではないため、発明者等はまた、タマホコリカビ（Dictyostelium discoideum ）において発見された脂肪酸であるパルミチン酸(Weeks, 1976)についても当該検証を行った。多不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸の両方において観察された類似の結果から、通常のVPAによる脂肪酸代謝調節の作用機序が示される。また、当該結果の類似性は、ここに示され、また例えばAA代謝回転の減少(Chang et al., 2001)及び脂質蓄積の増加(Kesterson et al., 1984)のようなインビボ動物試験に見られ、タマホコリカビ（Dictyostelium）はVPAが誘導する脂肪酸の力学的作用に関する研究の有用なモデルとなる可能性があることを示す。
【００８７】
VPAの脂肪酸調節に関する研究について、単に濃度上昇した脂肪酸が細胞内へ輸送される場合のVPAの役割について、動物モデルにおける検討は殆どされていない。実際にこの検討を目的とし、発明者等は、タマホコリカビ（Dictyostelium）の細胞外栄養素の取込みは小胞の動的機能（マクロピノサイトーシス）によって調節されていることを利用して、重合化作用の阻害による小胞機能をブロックすることにより、VPAが触媒する脂肪酸取込み増加は阻害されないことを示した。当該結果は前述の結果に支持される。彼らは、VPA処置により小胞の動的機能もまたタマホコリカビ（Dictyostelium）において阻害されることを示したためである(Xu et al., 2007)。よって、当該結果は、VPAは取込みとは無関係の脂肪酸シグナル伝達の調節効果をを示している。
【００８８】
多不飽和脂肪酸の代謝回転は、主に脂質から遊離脂肪酸を放出させるためにPLA2-触媒開裂によって調節され、またVPAは以前より示唆されていたようにPLA2依存シグナル伝達を調節する (Rapoport and Bosetti, 2002)。我々のモデルにおいて、ＶＰＡ依存シグナル伝達にＰＬＡ２が関与していることが示唆された。これは、発生時のＶＰＡの作用に耐性を示す変異株のスクリーニングの結果、単一のＰＬＡ遺伝子の切断によりＶＩＰに対する部分的な耐性が生じたことが明らかになったためである。これはVPAの臨床効果の可能性と強く関連することを示し、なぜならば双極性障害の患者（Ross et al., 2006）及び発作中(Siesjo et al., 1982;Rintala et al., 1999a; Bazan et al., 2002; Basselin et al., 2003a)においてPLA2濃度上昇が確認されたからである。しかし、遺伝子スクリーニングで同定された単一のPLA２アイソフォームの破壊は、VPAが誘導する放射標識放出の正味変化量に影響しなかった(図8B)。このことは、ゲノムにおいて他に18のPLA2様遺伝子が存在するためと考えられ(Fey et al., 2009)、当該遺伝子産生物の活性が  全細胞アッセイでの単一の遺伝子破壊により引き起こされる僅かな変化を隠蔽する傾向のためである。しかし、同定された細胞は、タマホコリカビ（Dictyostelium）の走化性及び成長において確実に的を絞られた役割を担っており（(Chen et al., 2007, Kortholt and van Haastert, 2008)が示すとおり）、実際、VPA関連性の成長効果については部分的に克服されている。このVPA依存性の成長阻害はここで採用されたアッセイでは可視化されていないが、なぜならば当該アッセイ系は細胞型に特異的な活性を区別できず、また発生過程における複数の時点での調査も不可能だからである。
【００８９】
観察されたVPAの効果におけるPLA2シグナル伝達についてさらに検討するため、発明者等は薬理的PLA2活性阻害剤を用い、3H-AA標識細胞からの放射標識放出減少について示した−実際には、VLAが当該モデルにおいてPLA２活性を再現していることを確認した。しかし、当該VPAの効果はPLA2による直接的なものではない、なぜならばVPAが誘導する脂肪酸の取込増加は、ｐLA2阻害剤により再生されないからである（図９）。このデータはVPAのPLA2阻害剤様効果は脂肪酸代謝調節における薬効のある１つの観点についてであることのみを示し、また、PLA2は当該効果におけるVPAの第１の標的ではないことの根拠となる。
【００９０】
仮にPLA2がVPAの薬理活性標的ではないとすると、観察されたPLA2阻害剤の部分的遺伝子模写は脂質代謝において上流への分裂傾向を示す可能性がある。例えば、脂肪酸アシルCoA合成酵素の活性減少は、リン脂質への放射標識脂肪酸取込みの減少を引き起こし、結果として放射標識脂肪酸の放出の減少をもたらす（事実、PLA2阻害様活性に類似する）。
【００９１】
最後に、本発明者等は、VPAが誘導する脂肪酸調節について調査するため、SAR研究を行った。当該アプローチはVPA活性に対するきわめて重要な明察を示し、VPAは広範な症状の治療処置に用いられ、非常に多数の細胞の効果が各疾患の役割ごとに無関係なままであり、そして当該効果の殆どは１次標的の同定に至っていない(Lagace and Eisch, 2005, Terbach and Williams, 2009)ためである。SAR研究は当該治療処置、作用機序及び標的の識別の助けとなるよう用いられる。例えば、細胞機能のとしてヒストンジアセチラーゼ阻害を示すVPA関連化合物群は、生物医学的活性として催奇形性の誘導を示し、当該構造の特定により新規化合物における催奇形性が現在では予測可能である(Phiel et al., 2001)。脂肪酸代謝回転のSAR研究より、当該効果は催奇形性とは無関係であり、なぜならばいくつかの化合物が強い脂肪酸調節活性を示したものの催奇形性は予測されなかったためである(Radatz et al., 1998)。タマホコリカビ（Dictyostelium）及び哺乳類神経系における他のVPA細胞活性はイノシトールによるシグナル伝達を阻害する (Williams et al., 2002, Eickholt et al., 2005, Shimshoni et al., 2007)。いくつかの化合物（例えば、イソプロピル-ペンタン酸）は、イノシトールシグナル伝達減衰及び脂肪酸調節の両方において強い活性を有するものの、当該効果はすべての化合物について共有できるものではなく、事実、当該脂肪酸―及びイノシトールによるシグナル伝達活性は無関係である。実際、脂肪酸調節、即ちHDAC阻害活性、及びイノシトール枯渇は、VPAの３つの独立した作用機序を示す。よって、脂肪酸調節において活性の増加又は減少を示すVPAの化学構造を採用することは、VPAで治療可能な症状において、治療活性の増加又は望ましくない副作用の減少を引き起こす。
【００９２】
当該研究の臨床上の結果は、VPA依存型脂質滴の形成において示される。出芽酵母（S. cerevisiae） (Sun et al., 2007) から、ラット大脳海馬及び新皮質 (Sobaniec-Lotowska, 2005)までの実験系において当該効果が示され、ここで報告される観察結果はモデル特異的ではないであろうことを明示する。さらに、脂質滴形成は肝毒性とも関連するが、作用機序については未だ明らかされていない(Fujimura et al., 2009)。脂質調節における当該効果に対する構造特異性を同定することにより、当該副作用のない新規治療法を選択可能とする作用機序を提示する。また、VPA依存型の脂質蓄積増加をもたらす化学構造を識別し単離することは、VPA治療を継続中の患者の体重増加と関連していることを説明し得る。
【００９３】
結論として、ここに、本発明者等はVPAが誘導する脂肪酸調節の研究について述べた。
PLA2 阻害作用は、一部のVPA依存性の効果を表現型模写し、しかしPLA2はVPAの一次活性標的ではないと考えらえる。当該効果の役割は  双極性障害の治療及び発作制御の両者において作用する可能性があり、なぜならばPLA２活性が両者の症状と関連するためである(Yegin et al., 2002, Rao et al., 2007)。当該効果をもたらす新規化学構造は、短鎖（炭素数５）から中程度の鎖（炭素数９）である骨格及び側鎖（エチル又はプロピル基）により、C2位で分岐されたカルボン酸であると同定され、両症状の新しい治療の可能性を示す。当該効果の１次活性部位を解明することは、我々のVPAの解明及び関連治療の進歩に著しく貢献するであろう。
【００９４】
ここに引用する全ての文献は、その全体が、参照により本明細書に組込まれる。
【００９５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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