(57)【要約】  本発明は、対象における低酸素症に関連する状態を検出する方法、低酸素症に関連する状態の重症度を決定する方法、低酸素症に関連する状態の治療的処置の効果を決定する方法、および、低酸素症に関連する状態に罹患しており治療的処置を受けるべき対象を選択する方法を提供し、本発明のこれらの方法は、対象におけるｐ５３誘導性遺伝子の無細胞リボ核酸（ＲＮＡ）のレベルを測定することに基づく。本発明は、本発明の上記方法を実施するためのキットも対象とする。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における低酸素症に関連する状態を検出する方法であって、前記方法は、前記対象から取得した生体サンプル中の少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞リボ核酸（ＲＮＡ）のレベルを決定することを含み、前記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子に関連付けられた所定範囲より無細胞ＲＮＡのレベルが上か下である場合、前記対象は低酸素症に関連する状態を有することを示す、方法。
【請求項２】
対象における低酸素症に関連する状態の重症度を決定する方法であって、前記対象から取得した生体サンプル中の少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡのレベルを決定することと、前記ｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルを、前記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子のレベルと低酸素症に関連する状態の重症度とを相関させる所定範囲と比較することと、を含み、前記比較により、前記対象における低酸素症に関連する状態の重症度の決定を可能にする、方法。
【請求項３】
対象における低酸素症に関連する状態の治療的処置の効果を決定する方法であって、少なくとも１つの時点は前記処置の間または後である、２つ以上の時点に前記対象から取得した２つ以上の生体サンプルから、少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルを決定することを含み、
（ｉ）低酸素症に関連する状態において過剰発現するｐ５３誘導性遺伝子の場合、前記２つ以上のサンプル間での前記ｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルの減少は、前記治療的処置の効果を示し；
（ｉｉ）低酸素症に関連する状態において抑制されるｐ５３誘導性遺伝子の場合、前記２つ以上のサンプル間での前記ｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルの増加は、前記治療的処置の効果を示す、
方法。
【請求項４】
前記処置の開始前の時点に１つ以上の第１サンプルを採取し、前記処置中または処置後の時点に１つ以上の第２サンプルを採取する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記処置中の時点に１つ以上の第１サンプルを採取し、前記１つ以上の第１サンプルの時点に続く処置中の時点に１つ以上の第２サンプルを採取する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記処置中の時点に１つ以上の第１サンプルを採取し、前記処置が停止された後の時点に１つ以上の第２サンプルを採取する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
低酸素症に関連する状態に罹患しており、治療的処置を受けて前記状態を治療すべき対象を選択する方法であって、前記対象から取得した生体サンプル中の少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡのレベルを決定することと、前記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルが、前記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子と関連付けられている所定範囲より上または下である場合、前記治療的処置を受けるべき対象を選択することと、を含む方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、生体サンプルからの少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡを増幅するための少なくとも１つの試薬と、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を実施するための指示と、を含むキット。
【請求項９】
前記少なくとも１つの試薬は、前記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子と特異的にハイブリダイズするためのプライマーまたはプローブを含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
生体サンプルから無細胞ＲＮＡを抽出するための少なくとも１つの試薬をさらに含む、請求項８または９に記載のキット。
【請求項１１】
前記サンプルは体液サンプルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法または請求項８〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２】
前記体液サンプルは血液サンプルである、請求項１１に記載の方法またはキット。
【請求項１３】
前記サンプルは血清サンプルである、請求項１１に記載の方法またはキット。
【請求項１４】
前記サンプルは血漿サンプルである、請求項１１に記載の方法またはキット。
【請求項１５】
少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡのレベルはＲＴ−ＰＣＲで決定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法または請求項８〜１０のいずか一項に記載のキット。
【請求項１６】
少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡのレベルはリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲで決定される、請求項１５に記載の方法またはキット。
【請求項１７】
前記低酸素症に関連する状態は循環器疾患、癌、脳血管障害（ＣＶＡ）、および胎児ストレスから選ばれる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法または請求項８〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１８】
前記低酸素症に関連する状態は胎児ストレスである、請求項１７に記載の方法またはキット。
【請求項１９】
前記循環器疾患は心筋梗塞である、請求項１７に記載の方法またはキット。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子は、ＴＰ５３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００５４６）、ｐ２１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００３８９）、ＥＲＣＣ５（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００１２３）、ＭＤＭ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００６８７８）、ＴＰ５３Ｉ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００４８８１）、ＮＯＴＣＨ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０１７６１７）、ＰＩＧＦ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００２６４３）、ＢＴＧ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００６７６３）、ＺＭＡＴ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００２２４７０）、ＡＰＡＦ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０１３２２９）、ＦＡＳ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿１５２８７３）、ＡＮＧＰＴＬ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０１２０９８）、ＰＵＭＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０１４４１７）、ＩＧＦＢＰ６（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００２１７８）、ＧＤＦ１５（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００４８６４）、ＢＮＩＰ３Ｌ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００４３３１．２）、ＴＧＦβ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００３２３９）、ＶＥＧＦ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００１０２５３６６）、およびＨＩＦ−１αから選ばれる、請求項１８または１９に記載の方法またはキット。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子は、ｐ２１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００３８９）、ＢＴＧ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００６７６３）、ＨＩＦ−ｌα（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００１５３０）、ＮＯＴＣＨ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０１７６１７）、ＴＧＦβ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００３２３９）、およびＺＭＡＴ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００２２４７０）から選ばれる、請求項２０に記載の方法またはキット。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子はｐ２１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００３８９）である、請求項２０に記載の方法またはキット。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子はＢＴＧ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００６７６３）である、請求項２０に記載の方法またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低酸素症に関連する状態、特に脳血管障害、胎児ストレス、および循環器疾患を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織低酸素は、組織細胞から適切な酸素供給が奪われる病態である。これが発生すると、代謝的に酸素欠乏に適応することから、正常な生物学的プロセスが損なわれる。酸素が欠乏する結果、血管新生、解糖といった多数のプロセスに関連する遺伝子（エリスロポイエチン、血管内皮増殖因子を含む）のアップレギュレーションが生じる。
【０００３】
虚血とは、局所領域に通じる血管の閉塞に起因する、不十分な血液供給（循環）と定義される。その結果、組織低酸素または組織無酸素（酸素の欠如）が生じる。虚血は必ず低酸素症をもたらすが、虚血が存在しなくても低酸素症は発生し得る。例えば、貧血時のように、動脈血の酸素含有量が減少した場合も低酸素症が発生する。虚血性心疾患（ＩＨＤ）あるいは心筋虚血とは、心筋の虚血を特徴とする疾患であり、一般に冠動脈疾患（冠動脈のアテローム硬化症）が原因で発生する。米国では、推定で約１，４００万人が虚血性心疾患を有している。このうち、症状がほとんどないか無症状であり、アンギナ（狭心症）や心臓発作（心筋梗塞）の恐れがあることに気づかない人は４００万人にも上る。
【０００４】
ｐ５３（タンパク質５３、腫瘍タンパク質５３とも呼ばれる）は、ヒトにおいてＴＰ５３遺伝子にコードされる腫瘍抑制タンパク質である（Ｍａｔｌａｓｈｅｗｓｋｉ  Ｇ，ＥＴ  ＡＬ．Ｅｍｂｏ  Ｊ．（１９８４），３（１３）：３２５７−６２）。ｐ５３は多細胞生物において重要であり、細胞周期を調節し、よって癌予防に関与する腫瘍抑制物質として機能する。ｐ５３遺伝子が活性化する結果、Ａｐａｆ−１、ｐ２１を含む多くの標的遺伝子が転写上昇し、そのうちの一部は３０〜５０倍転写上昇する（Ｋａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００１）２０（２６）：３４４９−５５；Ｋａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１；２０（１８）：２２２５−３４）。
【０００５】
野生型ｐ５３は、細胞の状態を監視し、ストレスに対して細胞周期停止またはアポトーシスの誘発により応答する働きを担うことから、守護神のような役割を持つと称される。最近のデータでは、低酸素症誘発性のｐ５３は、Ａｐａｆ−１やＰｅｒｐなどの既知の標的遺伝子を転写活性化しないが、これらの遺伝子のプロモーターに結合することが示されている（Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００６；１２：５１１２−７）。他の研究では、低酸素時、ｐ５３の細胞レベルは安定していることが明らかにされている（Ｈａｍｍｏｎｄ  ＥＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００６）１２（１７）：５００７−５００９）。
【０００６】
以前の研究により、胎児発育遅延を併発した妊娠状態（子癇前症など）の胎盤は、正常の妊娠状態と比べて、アポトーシスの亢進とｐ５３のアップレギュレーションを示すことが明らかにされた（Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ（２００２）１８６（５）：１０５６−６１）。
【０００７】
Ｆｅｒｇｕｓｏｎ−Ｓｍｉｔｈは、少数の有核胎児細胞（胎児栄養芽細胞など）および無細胞胎児ＤＮＡが母体循環系に入ることを文書に記録した。子癇前症では、有核胎児細胞および無細胞胎児ＤＮＡが増加する。特に後者は、臨床徴候が現れる前でも増加する。胎児ＤＮＡレベルは妊娠中に上昇し、出産後数時間のうちになくなる（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ−Ｓｍｉｔｈ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００３；１００（８）：４３６０−２）。同様に、母胎循環系において少量の胎児ＤＮＡを検出することができる（Ｌｏ  ＹＭ，Ｃｏｒｂｅｔｔａ  Ｎ，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ＰＦ，Ｒａｉ  Ｖ，Ｓａｒｇｅｎｔ  ＩＬ，Ｒｅｄｍａｎ  ＣＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ，１９９７；３５０：４８５−７）。
【０００８】
したがって、血漿および血清中に循環核酸（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を発見できる。この核酸はＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡであり得る。健常人の血漿および血清にＤＮＡ（１．８〜３５ｎｇ  ｍＬ−１）とＲＮＡ（２．５ｎｇ  ｍＬ−１）の両方の存在が確認されており、種々の癌、外傷（ｔｒａｕｍａ）、心筋梗塞、脳卒中を有する患者では、これらのレベルが上昇する。
【０００９】
Ｐｏｏｌらは、男の胎児を妊娠している女性の血漿に胎児由来の男性特異的なｍＲＮＡが存在することを、ツーステップの逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲアッセイを用いて初めて実証し、非侵襲的な出生前診断方法を提供した（Ｐｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，２０００；４６（１１）：１８３２−４）。
【００１０】
また、循環核酸は、固形の新生組織形成を有する患者の予後マーカーおよび予測マーカーとしても有用であることが明らかにされている（Ｇｏｅｂｅｌ  Ｇ，Ｄｉｓ  Ｍａｒｋｅｒｓ，２００５；２１（３）：１０５−２０）。Ｃｈｅｎｇ  Ｔらは、循環するｃ−Ｍｅｔが、非小細胞肺癌における独立した陰性予後指標であることを報告した（Ｃｈｅｓｔ，２００５；１２８：１４５３−６０）。
【００１１】
血漿の分泌型（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）ｍＲＮＡを測定することにより、肝傷害の早期検出が可能になることが報告されている（Ｋｕｄｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ，２００８；７０：９９３−５）。
【００１２】
血漿および血清中の循環核酸の存在に関する初期の研究は、主に胎児医療および腫瘍学の分野を指向していた。
【００１３】
これまでに行われた循環核酸関連の研究は、外傷、敗血症、心筋梗塞、脳卒中、移植、真性糖尿病、血液病を含む他の病態が関係している（Ｂｕｔｔ  ａｎｄ  Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．２００８；１１３７：２３６−４２）。循環する遊離ＲＮＡは、血漿および血清中に低濃度でしか存在しないことが多いが、ワンステップでリアルタイムの高感度定量逆転写（ＲＴ）−ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を導入することにより、容易に検出し定量化することができる（Ｎａｎｃｙ  Ｂ．Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６  Ｖｏｌｕｍｅ  ３３６；ｐｐ：１２３−１３４）。
【００１４】
Ｃｏｒｒｉａｓ  ＭＶらは、神経芽細胞腫（ＮＢ）を有する小児の無細胞ＲＮＡの検出および、全血液細胞ＲＮＡの検出との比較について報告し、病態のモニタリング目的では、ＮＢ患者の無細胞の腫瘍特異的ＲＮＡを検出することは、全細胞ＲＮＡに代わる信頼性のある方法ではないことを示唆した（Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１０；５４：８９７−９０３）。
【００１５】
本明細書において、添付の図面を参照しながら、あくまで例として本発明を説明する。以下、特に図面を詳細に参照するが、下記詳細事項は、例として、本発明の好適な実施形態を例示的に検討する目的でのみ示すものであり、かつ本発明の原理および概念的側面が最も有益かつ容易に理解されると考えられる記述を提供するために提示することが強調される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】正常妊娠と低酸素性妊娠のｐ２１遺伝子レベルを比較表示するグラフである。各サンプルについて、三重に作成しβアクチンレベルに対して正規化した結果を示す。
【図２】正常妊娠（Ｎ）と低酸素性妊娠（Ｈ）のｐ２１レベルを比較表示するグラフである。各サンプルについて、三重に作成しβアクチンレベルに対して正規化した結果を示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の一態様において、本発明は、対象における低酸素症に関連する状態を検出する方法を提供する。この方法は、当該対象から取得した生体サンプル中の少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞リボ核酸（ＲＮＡ）のレベルを決定することを含み、当該少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子に関連付けられている所定範囲より無細胞ＲＮＡレベルが上か下である場合、当該対象は低酸素症に関連する状態を有していることを示す。
【００１８】
本発明の別の一態様において、本発明は、対象における低酸素症に関連する状態の重症度を決定する方法を提供する。この方法は、当該対象から取得した生体サンプル中の少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡのレベルを決定することと、当該ｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルを、当該少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子のレベルと低酸素症に関連する状態の重症度とを相関させる所定範囲と比較することを含み、この比較により、当該対象における低酸素症に関連する状態の重症度の決定を可能にする。
【００１９】
本発明のさらに別の一態様において、本発明は、対象における低酸素症に関連する状態の治療的処置の効果を決定する方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの時点は当該処置の間または後である、２つ以上の時点に当該対象から取得した２つ以上の生体サンプル中の、少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルを決定することを含む。ここで、
（ｉ）低酸素症に関連する状態において過剰発現するｐ５３誘導性遺伝子の場合、当該２つ以上のサンプル間でのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルの減少は、治療的処置の効果を示し；
（ｉｉ）低酸素症に関連する状態において抑制されるｐ５３誘導性遺伝子の場合、当該２つ以上のサンプル間でのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルの増加は、治療的処置の効果を示す。
【００２０】
本発明のさらに別の一態様において、本発明は、低酸素症に関連する状態に罹患しており、治療的処置を受けて当該状態を治療すべき対象を選択する方法を提供する。この方法は、当該対象から取得した生体サンプル中の少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡのレベルを決定することと、当該少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルが、当該少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子に関連付けられている所定範囲より上または下である場合、当該治療的処置を受けるべき対象を選択することを含む。
【００２１】
実施形態のリスト
本発明のいくつかの非限定的な実施形態を、番号付けした段落の形態で以下に開示する。対象における低酸素症に関連する状態を検出する方法であって、当該対象から取得した生体サンプル中の少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞リボ核酸（ＲＮＡ）のレベルを決定することを含み、少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子に関連付けられた所定範囲より無細胞ＲＮＡのレベルが上か下である場合、当該対象は低酸素症に関連する状態を有することを示す、方法。
【００２２】
１．対象における低酸素症と関連する状態を検出する方法であって、当該対象から取得した生体サンプル中の少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞リボ核酸（ＲＮＡ）のレベルを決定することを含み、少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子に関連付けられた所定範囲より無細胞ＲＮＡレベルが上か下である場合、当該対象は低酸素症に関連する状態を有することを表す、方法。
【００２３】
２．対象における低酸素症と関連する状態の重症度を決定する方法であって、当該対象から取得した生体サンプル中の少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡのレベルを決定することと、当該ｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルを、当該少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子のレベルと低酸素症に関連する状態の重症度とを相関させる所定範囲と比較することと、を含み、この比較により、当該対象における低酸素症に関連する状態の重症度の決定を可能にする、方法。
【００２４】
３．対象における低酸素症と関連する状態の治療的処置の効果を決定する方法であって、少なくとも１つの時点は当該処置の間または後である、２つ以上の時点に当該対象から取得した２つ以上の生体サンプルから、少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルを決定することを含む、方法。ここで、
（ｉ）低酸素症に関連する状態において過剰発現するｐ５３誘導性遺伝子の場合、当該２つ以上のサンプル間でのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルの減少は、治療的処置の効果を示し；
（ｉｉ）低酸素症に関連する状態において抑制されるｐ５３誘導性遺伝子の場合、２つ以上のサンプル間でのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルの増加は、治療的処置の効果を示す。
【００２５】
４．処置の開始前の時点に１つ以上の第１サンプルを採取し、処置中または処置後の時点に１つ以上の第２サンプルを採取する、実施形態３に記載の方法。
【００２６】
５．処置中の時点に１つ以上の第１サンプルを採取し、当該１つ以上の第１サンプルの時点に続く処置中の時点に１つ以上の第２サンプルを採取する、実施形態３に記載の方法。
【００２７】
６．処置中の時点に１つ以上の第１サンプルを採取し、処置が停止された後の時点に１つ以上の第２サンプルを採取する、実施形態３に記載の方法。
【００２８】
７．低酸素症に関連する状態に罹患しており、治療的処置を受けて当該状態を治療すべき対象を選択する方法であって、当該対象から取得した生体サンプル中の少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡのレベルを決定することと、当該少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルが、当該少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子と関連付けられている所定範囲より上または下である場合、当該治療的処置を受けるべき対象を選択することと、を含む方法。
【００２９】
８．実施形態１〜７のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、生体サンプルからの少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡを増幅するための少なくとも１つの試薬と、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を実施するための指示と、を含むキット。
【００３０】
９．上記少なくとも１つの試薬は、上記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子と特異的にハイブリダイズするためのプライマーまたはプローブを含む、実施形態８に記載のキット。
【００３１】
１０．生体サンプルから無細胞ＲＮＡを抽出するための少なくとも１つの試薬をさらに含む、実施形態８または９に記載のキット。
【００３２】
１１．上記サンプルは体液サンプルである、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の方法または実施形態８〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【００３３】
１２．上記体液サンプルは血液サンプルである、実施形態１１に記載の方法またはキット。
【００３４】
１３．上記サンプルは血清サンプルである、実施形態１１に記載の方法またはキット。
【００３５】
１４．上記サンプルは血漿サンプルである、実施形態１１に記載の方法またはキット。
【００３６】
１５．少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡのレベルをＲＴ−ＰＣＲで決定する、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の方法または実施形態８〜１０のいずか一項に記載のキット。
【００３７】
１６．上記ＲＴ−ＰＣＲはリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲである、実施形態１５に記載の方法またはキット。
【００３８】
１７．低酸素症に関連する状態は循環器疾患、癌、脳血管障害（ＣＶＡ）、および胎児ストレスから選ばれる、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の方法または実施形態８〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【００３９】
１８．低酸素症に関連する状態は胎児ストレスである、実施形態１７に記載の方法またはキット。
【００４０】
１９．上記循環器疾患は心筋梗塞である、実施形態１７に記載の方法またはキット。
【００４１】
２０．上記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子は、ＴＰ５３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００５４６）、ｐ２１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００３８９）、ＥＲＣＣ５（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００１２３）、ＭＤＭ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００６８７８）、ＴＰ５３Ｉ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００４８８１）、ＮＯＴＣＨ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０１７６１７）、ＰＩＧＦ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００２６４３）、ＢＴＧ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００６７６３）、ＺＭＡＴ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００２２４７０）、ＡＰＡＦ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０１３２２９）、ＦＡＳ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿１５２８７３）、ＡＮＧＰＴＬ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０１２０９８）、ＰＵＭＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０１４４１７）、ＩＧＦＢＰ６（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００２１７８）、ＧＤＦ１５（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００４８６４）、ＢＮＩＰ３Ｌ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００４３３１．２）、ＴＧＦβ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００３２３９）、ＶＥＧＦ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００１０２５３６６）、およびＨＩＦ−１αから選ばれる、実施形態１８または１９に記載の方法またはキット。
【００４２】
２１．上記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子は、ｐ２１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００３８９）、ＢＴＧ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００６７６３）、ＨＩＦ−ｌα（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００１５３０）、ＮＯＴＣＨ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０１７６１７）、ＴＧＦβ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００３２３９）、およびＺＭＡＴ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００２２４７０）から選ばれる、実施形態２０に記載の方法またはキット。
【００４３】
２２．上記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子はｐ２１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００３８９）である、実施形態２０に記載の方法またはキット。
【００４４】
２３．上記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子はＢＴＧ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００６７６３）である、実施形態２０に記載の方法またはキット。
【００４５】
いくつかの非限定的実施形態の詳細説明
本発明は、種々のｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡ濃度の変化、特に血中での変化が、低酸素症に関連する種々の状態、例えば胎児ストレス（胎児に対して測定される低酸素濃度に現れる）、子癇前症、虚血性心疾患、脳卒中（脳血管障害（ＣＶＡ））、心筋梗塞等と相関しているという知見に基づいている。
【００４６】
したがって、理論に拘束されることは所望しないが、低酸素症は、ｐ５３およびｐ５３誘導性遺伝子発現レベルに影響を及ぼすことが知られている。
【００４７】
上記に基づき、本発明の発明者らは、低酸素症に関連する種々の疾患を予測するための有効な診断ツールとして、無細胞ＲＮＡが使用可能であると想定した。
【００４８】
また、本発明は、低酸素症に関連する状態の治療の前後における、種々のｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルの差に基づいて、低酸素症に関連する状態の治療の効果を評価するツールも企図している。
【００４９】
よって、本発明の第１の態様によれば、対象における低酸素症に関連する状態を検出する方法が提供される。この方法は、当該対象から取得した生体サンプル中の、少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞リボ核酸（ＲＮＡ）のレベルを決定することを含み、少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子に関連付けられた所定範囲より無細胞ＲＮＡレベルが上か下である場合、当該対象は低酸素症に関連する状態を有することを示す。
【００５０】
本明細書で使用する「検出」という語は、対象から取得した生体サンプル中の無細胞ＲＮＡの有無を、定量的および定性的に決定することをいう。したがって、検出により、対象から取得した生体サンプル中の無細胞ＲＮＡのレベルに基づき、低酸素症に関連する病態（例えば、心筋虚血；心筋梗塞の急性期（最初の数時間〜７日目）、治癒過程期（７〜２８日目）、および治癒完了期（２９日目以降））の存在（または不存在）を特定することが可能になる。
【００５１】
本明細書で使用する「低酸素症に関連する状態」という語は、ある器官または組織の酸素レベルが、一般に当該器官への血流量が減少する結果、所定の正常な生理的レベルまたは範囲より下に減少する状態をいう。この血流量の減少は、以下の非限定的な状況が原因であり得る：（ｉ）塞栓による血管遮断（血栓）；（ｉｉ）アテローム硬化症に起因する血管遮断；（ｉｉｉ）血管破損（出血性脳卒中）；（ｉｖ）例えば血管痙攣時や、場合によっては一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）時、およびくも膜下出血後に発生する血管収縮に起因する血管遮断。本教示による低酸素症は、慢性または一過性であり得る。
【００５２】
低酸素症に関連する状態の例として、脳血管障害（ＣＶＡ）、胎児ストレス（例えば、出産前期（分娩前）または分娩期（出生過程）中に胎児にさらされる危険）；胎児低酸素症（胎児の低酸素レベル）と同義）、虚血性心疾患、心筋虚血（虚血性心疾患とも呼ばれる）、心筋梗塞（ＭＩ）等の急性冠動脈症候群（本明細書に記載のように、これらの全病期を含む）、心臓手術、脳外科手術、脳低酸素症、脳梗塞、手術（例えば、術前低酸素症、術後低酸素症）、外傷、肺疾患、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、冠動脈疾患、末梢血管疾患［例えば、動脈硬化（アテローム硬化症、移植加速型動脈硬化）、深部静脈血栓症］、癌（例えば子宮頸部、結腸、腎臓、肺、子宮、乳線、膵臓の細胞癌、リンパ腫、白血病を含むがこれらに限定されない）、血管新生および血管新生関連の障害（例えば糖尿病網膜症、黄斑変性、乾癬、関節リウマチを含むが、これらに限定されない）、腎不全、骨格筋虚血、睡眠時無呼吸、睡眠時低酸素、ウイルス感染、細菌感染、喫煙、貧血、血液量減少、出血、高血圧、糖尿病、血管病変、レイノー病、内皮機能不全、局所灌流欠乏（例えば四肢、消化管、腎臓の虚血）、血栓症、凍傷、中毒症（例えば一酸化炭素、重金属）、高山病、乳児突然死症候群（ＳＩＤＳ）、喘息、先天性の循環器異常（例えばファロー四徴症）、および赤芽球症（ブルーベビー症候群）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
本明細書で使用する「生体サンプル」という語は、対象から取得される任意のサンプルをいう。こうしたサンプルは、好ましくは体液である。適切なサンプルの例として、血液、血漿、血清、羊水、喀痰、唾液、精液、尿、糞便、骨髄、および脳脊髄液（ＣＳＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。「血清」という語は、フィブリン塊および血球細胞を除去した後に得られ、循環血液中の血漿と区別される液体部分をいう。「血漿」という語は、血液のうち細胞を含まない液体部分であり、凝固の後に血清と区別される部分をいう。いくつかの実施形態では、生体サンプルは喀痰または唾液から選ばれる。生体サンプルは、通常、細胞画分を除去するように処理される（すなわち、後で詳述する無細胞ＲＮＡ細胞になる）。
【００５４】
対象から生体サンプルを取得する手順は、当技術分野でよく知られている。このような手順の例として、採血、羊水穿刺、絨毛採取、および採尿が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書で使用する「対象」という語は、特に哺乳類に属する任意の温血動物を指し、例として、ヒト、チンパンジー等の非ヒト霊長類、その他の類人猿およびサル種；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ等の家畜；イヌ、ネコ等の家畜化哺乳類；マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類動物を含む実験動物が挙げられるが、これらに限定されない。この語は特定の年齢・性別を意味しないため、成人と新生児を含み、男性か女性かを問わない。本発明の文脈における対象は、好ましくはヒトである。
【００５６】
本明細書で使用する「無細胞リボ核酸（ＲＮＡ）」（分泌型（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）ＲＮＡ、あるいはｃｉＲＮＡとも呼ばれる）という語句は、サンプルの無細胞画分内に存在するＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）をいう。本明細書に記載の無細胞ＲＮＡは、完全細胞（すなわち無傷の細胞膜を含む細胞）に含まれるのでなく、概して粒子（例えば、胎盤由来の合胞体栄養膜細胞微粒子、Ｒｕｓｔｅｒｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；ｏｒ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｓｓｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  （２００１）４７：１４８８−１４８９を参照）に関連している。いくつかの実施形態では、無細胞ＲＮＡは無傷である（すなわち断片化されない）。
【００５７】
無細胞ＲＮＡサンプルは、当技術分野で知られている任意の方法に従って生体サンプルから抽出してよい（実施例の「一般的な材料および方法」のセクションを参照）。例えば、生体サンプル（すなわち血液）を取得した後、以前に説明されているようにサンプルを調製する（例えば、上記Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．を参照）。手短に述べると、２サイクルの遠心分離（例えば４℃、１，６００×ｇで１０分間）により、サンプルから有核細胞を完全に除去する。得られた無細胞サンプル（例えば血漿または血清）を清潔なチューブ（例えばエッペンドルフチューブ）に移し、ＴＲＩｚｏｌ  ＬＳ試薬（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）およびクロロホルムと混合し、遠心分離する（例えば４℃、１１，９００×ｇで１５分間）。水層を新しいチューブに移し、（１：１の比率で）７０％エタノールと混合する。次に、製造者の推奨事項に従って、混合物をＲＮｅａｓｙミニカラム（ＲＮｅａｓｙミニキット、キアゲン、カリフォルニア州バレンシア）に移し、ＲＮａｓｅのない水中でトータルＲＮＡを溶出する。
【００５８】
本発明による無細胞ＲＮＡの定量化は、当技術分野で知られている任意の方法および当該方法を用いた任意のキットで実施できる。こうした方法の非限定的な例をいくつか挙げると、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）およびＡｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）（アプライドバイオシステムズ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（登録商標）、およびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（モレキュラープローブス））、血漿／血清分泌型ＲＮＡ精製キット（ノルジェン製：ｗｗｗ．ｎｏｒｇｅｎｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ等）、およびＲＮＡマイクロアレイなどがある。いくつかの実施形態では、生体サンプル中の無細胞ＲＮＡのより正確な測定値を提供する目的で、さらに、無細胞ＲＮＡをいくつかのハウスキーピング遺伝子（例えば、βアクチン、ＧＡＰＤＨ、ＣｙｐＡ、ＨＰＲＴ、Ｋｉ−６７、ＳＤＨＡ、ＨＰＲＴ１、ＨＢＳ１Ｌ、ＡＨＳＰ、β２−ミクログロブリン）に対して正規化する。ＲＮＡ定量化を実施するための試薬は、一般に、少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子と特異的にハイブリダイズするための、少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブを含む。本明細書で使用する「特異的にハイブリダイズする」という語は、例えばＲＮＡ：ＲＮＡ分子、ＲＮＡ：ＤＮＡ分子、および／またはＤＮＡ：ＤＮＡ分子のような二本鎖分子を形成することをいう。
【００５９】
特定遺伝子の無細胞ＲＮＡの増幅および／または検出は、一般に、少なくとも１つの配列特異的オリゴヌクレオチドの使用を伴う（後述する実施例の「一般的な材料および方法」のセクションを参照）。このオリゴヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズ可能な、少なくとも１０塩基、少なくとも１５塩基、少なくとも２０塩基、少なくとも２５塩基、または少なくとも３０塩基の長さであり得る。
【００６０】
ハイブリッド二本鎖の検出は、配列特異的なプローブ（例えばＭＧＢプローブ）の使用を含む、いくつかの方法で実施できる。通常、プローブに標識またはタグを付ける（コンジュゲートする）。このような標識またはタグは、当技術分野において標準的に使用されており、放射性、蛍光、生体、酵素などのタグまたは標識がある。
【００６１】
従来から使われているハイブリダイゼーションアッセイの例として、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクション、ｉｎ−ｓｉｔｅハイブリダイゼーション、プライマー伸長法、ノーザンブロット、およびドットブロット解析が挙げられる（下記実施例のセクションを参照）。
【００６２】
ある特定のｐ５３誘導性遺伝子の検出に適した特定のプライマーおよびプローブの例を、下記実施例のセクションに示す。当業者であれば、本明細書に示される使用可能な遺伝子配列または当技術分野において使用可能な遺伝子配列に基づき、当技術分野で周知の方法を用いて、適切なプライマーおよびプローブを生成できると考えられる。
【００６３】
本明細書で使用する「ｐ５３誘導性遺伝子」という語は、タンパク質５３（ｐ５３）により直接的または間接的に発現が制御される遺伝子をいう。いくつかの実施形態では、ｐ５３による遺伝子制御は、遺伝子の転写速度に応じて（例えば転写開始に影響を及ぼすことにより）遺伝子の発現レベルが変わる転写制御により発生する。遺伝子が転写レベルで制御される場合、ｐ５３タンパク質は、ＤＮＡ結合部位（この部位はときおり遺伝子のプロモーター近くに位置する）に結合するか調節結合部位を結合することにより、遺伝子の発現を制御して、遺伝子をオンにする（すなわち遺伝子を活性化する）か遺伝子を遮断する（すなわち遺伝子を抑制する）ことができる。いくつかの実施形態では、転写後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、脂肪酸アシル化、ジスルフィド結合形成等）、ＲＮＡ輸送、ＲＮＡ翻訳（例えば、翻訳開始）、タンパク質輸送、タンパク質安定、ｍＲＮＡ分解（すなわち転写安定）の１つ以上のレベルで遺伝子の制御が発生して、遺伝子のクロマチン成分に影響を及ぼす（例えば、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子に対するクロマチンの到達性に影響する）。
【００６４】
本明細書で使用する「少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子に関連付けられている所定範囲」という語は、概して、ｐ５３誘導性遺伝子の濃度範囲であって、低酸素症に関連するどの状態にも罹患していない健常対象から取得したサンプル（すなわち、低酸素症の影響を受けていない正常な対照サンプル）において測定される無細胞ＲＮＡのレベルを定義した範囲をいう。このような対照サンプルは、通常、年齢範囲、生理学的状態（妊娠等）、および性別が同一の対象から取得する。状況によっては、対照サンプルは、低酸素状態となる前の同一対象に由来する場合もある。例えば、低酸素症に関連する状態を発症しやすい対象から対照サンプルを取得する（例えば妊娠前）。いくつかの実施形態では、所定範囲とは、低酸素症に関連する状態の種々の病期（例えばＭＩの場合、本明細書に記載するように、心筋梗塞の急性期、治癒過程期、治癒完了期）の対象から取得したサンプルから測定される無細胞ＲＮＡのレベルを定義した、ｐ５３誘導性遺伝子の濃度範囲である。この所定範囲は、実験的に（例えば、ＭＩ患者から取得した血液から無細胞ＲＮＡをサンプル採取することにより）決定してよく、文献があれば文献から所定範囲を導いてもよい。
【００６５】
したがって、本発明によれば、少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の所定の濃度範囲（上記に定義の通り）に対して、測定した無細胞ＲＮＡのレベルが統計的に異なる（すなわち所定範囲より上または下である）場合、当該対象は低酸素症に関連する状態を有していることを示す。
【００６６】
いくつかの実施形態では、低酸素症に関連する状態は、それぞれのあらゆる発生期における胎児ストレス、動脈硬化性血管疾患、心筋虚血、心筋梗塞、不安定狭心症、心臓突然死、冠動脈プラーク破裂、血栓症から選ばれる。
【００６７】
本明細書で使用する「虚血」という語は、一般に動脈の遮断が原因で、器官への不十分な血液供給を伴う状態をいう。本明細書で使用する「心筋虚血」という語は、心臓の筋組織への血流量が不十分であるために生じる心機能障害をいう。虚血は、無症状または症候性であり得る。血流量が減少する原因は、例えば、冠動脈の狭窄（冠動脈硬化症）、血栓による閉塞（冠動脈血栓症）、あるいは、比較的頻度は低いが、心臓内の細動脈その他の小血管のびまん性狭窄などである。本明細書で使用する「心筋梗塞（ＭＩ）」という語（急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、あるいは心臓発作とも呼ばれる）は、長時間の虚血に続く心筋の不可逆的壊死をいう。心筋梗塞は、一般に、心筋に供給する動脈が閉塞または遮断することにより発生し、その結果、心筋が損傷または壊死する（すなわち心臓発作）。本発明の文脈では、心筋梗塞は、あらゆる病期（例えば、本明細書に記載するような心筋梗塞の急性期、治癒過程期、治癒完了期）を指す。本明細書で使用する「胎児ストレス」という語は、胎児が、妊娠に関連する合併症を発症する恐れのある任意の状態をいう。胎児ストレスには、栄養供給不足、および胎児発育停止が含まれるが、これらに限定されない。胎児ストレスは胎児の発達と脳機能に影響することがあり、早産児および緊急分娩（例えば帝王切開）に関連する妊娠結果において重要な役割を果たす。胎児ストレスに関連する状態の例として、異常妊娠、胎児低酸素症、胎児のストレス、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、胎児発育不全（ＦＧＲ）、胎児性アルコール症候群（ＦＡＳ）、ニコチン摂取、アルコール摂取、栄養不良、母体糖尿病、高年齢出産、母体の過度な運動が挙げられるが、これらに限定されない。胎児ストレスに関連する妊娠関連の低酸素状態のさらなる例については、上記で詳しく例示している。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に定義される胎児ストレスは、妊娠関連の低酸素状態、例えば、子癇前症、子癇、軽度の子癇前症、慢性高血圧、ＥＰＨ（浮腫・タンパク尿・高血圧）を伴う妊娠中毒症、妊娠性高血圧、混合型子癇前症（慢性高血圧、慢性腎症、または狼瘡と混合した子癇前症を含む）、ＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝酵素上昇、血小板減少）、腎症、妊娠糖尿病、胎盤低酸素症、胎児低酸素症、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、胎児発育不全（ＦＧＲ）、胎児性アルコール症候群（ＦＡＳ）と関係する低酸素症に関連する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子は、以下の遺伝子から選ばれる：ｐ２１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ０９５７９）、ＶＥＧＦ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０２５３６６）、ＨＩＦ１α（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１５３０．２）、ＭＤＭ２（ＥＳＴ＝ＭＤＭ２、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ９２４２４）およびＴＰ５３Ｉ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１４７１８４．１）、Ｆａｓ抗原／ＴＮＦＲ６（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｘ８９１０１）、ＴＮＦＲ１８（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＩ９２３７１２）、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｘ０４４１２）、ｂｔｇ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｘ６１１２３）、ＥＳＴ＝ＰＩＧ８（エトポシド誘導性、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｒ１１７３２）、Ｔ１０  ｍＲＮＡ／ヒトセントリン／ＳＵＭＯ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ８３１１７）、Ａｐａｆ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＬ１３５２２０）、ＡＮＧＬ２、ＥＳＴ＝アンジオポエチン様（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＦ１２５１７５）、および細胞質アデニル酸キナーゼ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｊ０４８０９）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ４（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ８０５６３）、ｃｙｃｌｉｎ  Ｇ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ４７４１４）、ＥＳＴ＝ＲａｓインヒビターＲｉｎ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｌ３６４６３）、Ｂ細胞転座遺伝子２、抗増殖性（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ７２６４９）、ＥＲＣＣ５（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＷ５０２００４）、Ｈ２ＢおよびＨ２Ａヒストン遺伝子（２９１Ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｚ８３３３６）、Ｎｏｔｃｈ遺伝子相同体１、（ショウジョウバエＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＩ５６６２７１）、Ｅｐｈ受容体Ａ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ５９３７１）、肝細胞増殖因子様タンパク質遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ３７０５５）およびＥＳＴ＝α−Ｌフコシダーゼ前駆体（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ２９８７７）、マンノシダーゼ２、αＢ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ３７２４８）、ホスホマンノムターゼＳｅｃ５３ｐ相同体（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ８６０７０）、スペルミジン（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ４０３６９）、ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＩ８７１４２９）、機能未知タンパク質／ヒトキユビリン（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＦ０３４６１１）、アルギニノコハク酸合成酵素１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＡ０６９２８９）、リポコルチン１／ヒトアネキシンＡ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＳＷ３７９７０２）、ＥＳＴ＝キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ３９４８７）およびＥＳＴ＝プロスタグランジンシンターゼ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ９８５３９）、ビオチンカルボキシラーゼ／ヒト神経酸性タンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＩ４２２５８０）、Ｌｙ−６アロ抗原／ヒトジヒドロピリミジナーゼ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｄ７８０１４）、ニューラルビジニン様タンパク質３（ＮＶＰ−３、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＩ３９１９２４）、ＥＳＴ＝アリール−炭化水素受容体相互作用タンパク質（Ｇ��ｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ７８５２１）、ＰＩＧＦ、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ  ３Ａ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｗ０１５２７９）、ＥＳＴ＝ＵＮＣ−５１様キナーゼ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＬ０４６２５６）、Ｔｏｂファミリー用ＤＮＡ／ＥＲＢＢ２のトランスデューサー（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｄ３８３０５）、ＴＹＲＯプロテインチロシンキナーゼ結合タンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＩ２９９３４６）、ｐ５３−誘導型ジンクフィンガータンパク質（Ｗｉｇ−１／ＺＭＡＴ３）ｍＲＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＩ４５７３４４）およびフレンドオブＧＡＴＡ−１（ｆｒｉｅｎｄ  ｏｆ  ＧＡＴＡ−１）（ＦＯＧ）１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＦ４８８６９１）、Ｔ−複合体関連精巣発現３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＡ７８１４３６）、セレン結合タンパク質１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ２９０９１）、ＥＳＴ＝ＢＰＭ１／ヒトプレクチン１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｚ５４３６７）、ＥＳＴ＝Ｖａｍｐ２／ヒトシナプトブレビン２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ３６２０５）、Ｆａｓ／ＡＰＯ−１細胞表面抗原（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｘ６３７１７）、Ｂｃｌ−２結合成分３（ｂｂｃ３／ＰＵＭＡ、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ８２９８７）、Ｂｃｌ−６（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ００１１５）、Ｂａｋ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ１６８１１）、ＡＴＬ由来ＰＭＡ応答性ペプチド（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｄ９００７０）およびＧＡＤＤ４５（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ６０９７４）、ＢＴＧ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ７２６４９）、損傷特異的ＤＮＡ結合タンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ１８３００）、ヒストン２Ａ様タンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ９０５５１）、ＰＣＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ１５７９６）、エンドグリン（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｘ７２０１２）、バーシカン（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ１６３０６）、重鎖４Ｆ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ２１９０４）、ＳＭＡＤ７（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１０１９３）、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＢ０００５８４）およびＩＧＦＢＰ６（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ６２４０２）、Ｑｕｉｅｓｃｉｎ／ＱＳＣＮ６（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｌ４２３７９）、アディポフィリン（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｘ９７３２４）、多発性外骨腫症ＩＩ型タンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ７２２６３）、血管平滑筋αアクチン（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｘ１３８３９）、スムーテリン（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｚ４９９８９）、神経フィラメントサブユニットＮＦ−Ｌ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｘ０５６０８）、ＮＢサイモシンβ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｄ８２３４５）、ＬＩＭドメインタンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｘ９３５１０）、リジルオキシダーゼ様タンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ２４３８９）およびＵＤＰ−ガラクトース４エピメラーゼ（ＧＡＬＥ、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｌ３８６６８）、ｃＡＭＰ活性化プロテインキナーゼＢ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｙ１２５５６）、リソソームマンノシダーゼＢ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号��０５５７２）、カルボキシエステラーゼ（ｌｉｖｅｒ、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｙ０９６１６）、ＡＢＣ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ７８７３５）、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ−Ｉ（ＶＬＤＬ、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ２０９０２）、ＣＡＲＴ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ２０３２５）、レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ１２６２５）、ロダネーゼ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｄ８７２９２）、ＮＥＣＤＩＮ関連タンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ３５１３９）およびＮＳＣＬ−２遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ９６７４０）、ＦＥＺＩ−Ｔ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ６００６２）、ニンジュリン１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ７２６６１）、アミロイド前駆体様タンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ４８４３７）、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｊ００２７７）、腸管ＶＩＰＲ関連タンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｘ７７７７７）、ジアシルグリセロールキナーゼ（ａｌｐｈａ、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｘ６２５３５）、仮想ｓｅｒ／ｔｈｒプロテインキナーゼ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ５６９９８）、ＤＭキナーゼ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｌ０８８３５）、ＤＲＡＬ−ＦＨＬ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｌ４２１７６）および活性化転写因子３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｌ１９８７１）、ＺＮＦ１２７−Ｘｐ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ３８３１５）、ＬＩＳＣＨ７（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＤ０００６８４）、ジンクフィンガータンパク質７（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ２９５８０）、Ｔｉｐ−１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ９０９１３）、核因子ＮＦ−１１６（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＨＧ３４９４）、ＰＯＭ−ＺＰ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ１００９９）、ＫＩＡＡＡ０２４７（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｄ８７４３４）、マンマグロビン１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ３３１４７）、ジスルフィド異性化酵素関連タンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｊ０５０１６）およびＯＳ４（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ８１５５６）、不妊関連精子タンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｓ５８５４４）、ＫＩＡＡ０１４７（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｄ６３４８１）、ＳＵＲＦ−１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｚ３５０９３）、ＷＤ反復タンパク質ＨＡＮ１１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ９４７４７）、ｐ５３誘導性遺伝子３（ＰＩＧ３、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１０３０９）、ＭＩＣ−１／ＧＤＦ１５、ＴＧＦ−Ｌファミリーのメンバー（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１９７７０）、ＤＤＢ２、ヌクレオチド除去修復に関与（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ１８３００ａ）、ＭＹＤ８８、ミエロイド分化（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ７０４５１ａ）、レチノイン酸受容体Ｌ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｘ０７２８２）およびＦａｓ／ＡＰＯ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｚ７０５１９）、ＭＡＰＫ１４（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｌ３５２５３）、Ｂｃｌ２関連Ｘタンパク質（Ｂａｘ、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｌ２２４７４）、ＦＫＢＰ４（ペプチジル−プロリル−シス−トランス異性化酵素であり得る、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ８８２７９）、ミトコンドリアストレス７０前駆体（Ｍｏｒｔａｌｉｎ２、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｌ１５１８９ａ）、ｐ５７ＫＩＰ２（ＣＤＫインヒビター１Ｃ、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ２２３９８）、ＤＮＡリガーゼ１（ＬＩＧ１、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ３６０６７）、ＤＮＡ除去修復関連１（ＥＲＣＣ５、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｌ２００４６ａ）、Ｇ／ＴミスマッチチミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ５１１６６）、ホメオボックスタンパク質１（ＨＯＸＤ３、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｄ１１１１１７ａ）およびＭＡＰ４Ｋ５（Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼの活性化因子、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ７７１２９、タンパク質１の複製因子Ａ（ＲＰＡ１、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ６３４８８）、Ｂｃｌ２アンタゴニスト／キラー１（ＢＡＫ１、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ２３７６５）、ＴＧＦ−Ｌ誘導性初期増殖応答遺伝子（ＴＩＥＧ、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｓ８１４３９ａ）、ＭＡＰ２Ｋ１（ＭＥＫ１  １．５キナーゼ、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｌ０５６２４）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン２（ＣＳＰＧ２、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ１６３０６ａ）およびジンクフィンガータンパク質１９７（ｐ１８タンパク質、ＺＮＦ１９７、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｚ２１７０７ａ）、アデニル酸キナーゼ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｊ０４８０９）、アルドラーゼＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００３４）、アルドラーゼＣ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５１６５４）、エノラーゼ１（ＥＮＯ１、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１４２８）、グルコース輸送体１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１５３３６９）、グルコース輸送体３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１００９７７０）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０４６）、ヘキソキナーゼ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００１８８Ｘ）およびヘキソキナーゼ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００１８９Ｘ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６１２）、ＩＧＦ結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ｕｃ００１ｇｋｚ．１）、ＩＧＦＢＰ−３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ｕｃ００３ｔｎｒ．１）、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿
００５５６６）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００２９１）、ピルビン酸キナーゼＭ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ２３７２５）、トランスフォーミング増殖因子β３（ＴＧＦβ３、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ｕｃ００１ｄｏｈ．１）、セルロプラスミン（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００９６）、エリスロポエチン（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００７９９）、トランスフェリン（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０６３）およびトランスフェリン受容体（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３２３４）、α１Ｂ−アドレナリン受容体（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６７９）、アドレノメデュリン（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１２４）、エンドセリン−１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１０１６９６）、ヘムオキシゲナーゼ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２１３３）、一酸化窒素シンターゼ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ｕｃ００２ｇｚｕ．１）およびＶＥＧＦ受容体ＦＬＴ−１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０２５３６６）およびＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９  ｋｄ−相互作用タンパク質３様（ＢＮＩＰ３Ｌ、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４３３１．２。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ｐ５３誘導性遺伝子は、表１に示すＴＰ５３、Ｐ２１、ＥＲＣＣ５、ＭＤＭ２、ＴＰ５３Ｉ３（ＰＩＧ３）、ＮＯＴＣＨ、ＰＩＧＦ、ＢＴＧ２、ＺＭＡＴ３（ＷＩＧ１）、ＡＰＡＦ１、ＦＡＳ、ＡＮＧＰＴＬ２、ＰＵＭＡ（ＢＢＣ３）、ＩＧＦＢＰ６、ＧＤＦ１５、ＢＮＩＰ３Ｌ、ＴＧＦ−β３、ＶＥＧＦ、ＨＩＦ１αから選ばれ、同じ表１に表示されているＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（アプライドバイオシステムズ）を使用するか、または当業者に認められている同等の市販または設計されたプライマー／プローブを使用して定量化される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ｐ５３誘導性遺伝子は、表３に示すＴＰ５３、Ｐ２１、ＥＲＣＣ５、ＭＤＭ２、ＴＰ５３Ｉ３（ＰＩＧ３）、ＮＯＴＣＨ、ＰＩＧＦ、ＢＴＧ２、ＺＭＡＴ３（ＷＩＧ１）、ＡＰＡＦ１、ＦＡＳ、ＡＮＧＰＴＬ２、ＰＵＭＡ（ＢＢＣ３）、ＩＧＦＢＰ６、ＧＤＦ１５、ＢＮＩＰ３Ｌ、ＴＧＦ−β３、ＶＥＧＦ、ＨＩＦ１αから選ばれ、同じ表３に表示されているＡｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）（アプライドバイオシステムズ）を使用するか、または当業者に認められている同等の市販または設計されたプライマー／プローブを使用して定量化される。
【表１】
2013529092.tif 000002
【表２】
2013529092.tif 000003
【表３】
2013529092.tif 000004
【００７２】
さらなる態様によれば、本発明は、対象における低酸素症と関連する状態の重症度を決定する方法を提供する。この方法は、当該対象から取得した生体サンプル中の少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡのレベルを決定することと、当該ｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルを、当該少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子のレベルと低酸素症に関連する状態の重症度とを相関させる所定の値（ある範囲の個別的な数でもよい）と比較することを含み、この比較により、当該対象における低酸素症と関連する状態の重症度の決定を可能にする。
【００７３】
さらなる態様によれば、対象における低酸素症と関連する状態の治療的処置の効果を決定する方法が提供される。この方法は、少なくとも１つの時点は当該処置の間または後である、２つ以上の連続した時点に当該対象から取得した２つ以上の生体サンプルから、少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルを決定することを含む。ここで、
（ｉ）低酸素症に関連する状態において過剰発現するｐ５３誘導性遺伝子の場合、当該２つ以上のサンプル間でのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルの減少は、治療的処置の効果を示し；
（ｉｉ）低酸素症に関連する状態において抑制されるｐ５３誘導性遺伝子の場合、当該２つ以上のサンプル間でのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡレベルの増加は、治療的処置の効果を示す。
【００７４】
本明細書で使用する「治療的処置の効果」という語は、低酸素症に関連する状態（例えば、心筋梗塞）を有している対象に対する、当該状態の治療を受けている当該対象の健康状態の改善を測定することによる、治療の成功の評価をいう。本発明によれば、当技術分野で知られている容認可能な任意の医療検査／手順を使用して、対象の医学的健康の評価を実施できる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の発現レベルから、正常な遺伝子発現レベル、すなわち対照（例えば、測定を受けている健常な被験者、または健常な被験者から前に取得した測定値）において測定される当該少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の発現レベルへの復帰をもって、治療的処置の効果を明示する。
【００７６】
本明細書で使用する、ｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡのレベルの「減少」または「増加」とは、本発明に従って測定した場合の統計的に有意な減少または増加をいう。統計的に有意な減少または増加の特定は、一般に使われている任意の統計的検定を用いて行ってよい。当業者であれば、ｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡのレベルの有意な減少または増加を特定するための、最適な統計的検定の選択方法を理解していると考えられる。ある実施形態では、この検定はカイ二乗検定である。別の実施形態では、この検定はｔ検定である。さらに別の実施形態では、この検定はマンホイットニー検定である。
【００７７】
したがって、例えば、急性胸痛を起こしている対象から、入院時（例えば、病院到着時からカテーテル留置または心筋梗塞の治療に使われる他の手技もしくは処置（例えば抗血小板薬、ニトログリセリン、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、β遮断薬等）までの間）に最初の血漿サンプルまたは血清サンプルを取得し、数時間または数日ごとに追加のサンプルを逐次的に採取して、入院した対象に対する治療（例えば、カテーテル留置手技、または本明細書に記載する心筋梗塞の治癒に使われる他の処置）の効果をモニターする。
【００７８】
いくつかの実施形態では、処置（例えばカテーテル留置手技）の開始後１〜３０日の期間、１日ごと（および／または１時間ごと）の頻度で追加のサンプルを採取する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、処置（例えばカテーテル留置手技）の開始から３〜６時間後に追加のサンプルを採取する。
【００８０】
ある実施形態では、処置（例えばカテーテル留置手技）の開始から約４時間後に追加のサンプルを採取する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のように対象から取得した、２つ以上の生体サンプルからの少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡのレベルを、対照（例えば健常な対象）から取得した少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子のＲＮＡレベルと比較することにより、治療の効果をさらに特定する。こうした実施形態によれば、治療中または治療が完了した対象（例えば、カテーテル留置手技から３〜６時間経過したＭＩ患者）における少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の遺伝子発現値を、対照サンプル（例えば健常な対象）における少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の遺伝子発現値と比較することにより、治療的処置の効果を評価する。
【００８２】
これらのサンプルの無細胞ＲＮＡを測定し、少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子のレベルをサンプル間で比較することにより、対象の治療の効果を特定する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡの濃度を、性別・体重・年齢が類似した健常者から採取した基準の対照サンプルとも比較する。本発明によれば、細胞株（例えばＡ２７８０ヒト卵巣癌細胞株）から基準の対照を取得してもよい。
【００８３】
いくつかの実施形態では、処置の開始前の時点に１つ以上の第１サンプルを採取し、処置中または処置後の時点に１つ以上の第２サンプルを採取する。ある実施形態では、第２サンプルは処置の３〜６時間後に採取する。ある実施形態では、この治療はカテーテル留置である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の第１サンプルは処置中の時点に採取し、当該１つ以上の第１サンプルの時点に続く処置中の時点に１つ以上の第２サンプルを採取する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、１つ以上の第１のサンプルは処置中の時点に採取し、１つ以上の第２のサンプルは処置が停止された後の時点に採取する。
【００８６】
次に、上記１つ以上の第１のサンプルを上記１つ以上の第２のサンプルと比較して、ｐ５３誘導性遺伝子の発現の違いを特定する。この比較により、本明細書に記載のように治療効果を特定することができる。
【００８７】
本発明の第３の態様によれば、低酸素症に関連する特定の状態に罹患しており、治療的処置を受けて当該状態を治療すべき対象を選択する方法が提供される。この方法は、当該対象から取得した生体サンプル中の少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡのレベルを決定することと、当該レベルが当該少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子に関連付けられている所定範囲より上または下である場合、上記治療的処置を受けるべき対象を選択することを含む。
【００８８】
本発明の第４の態様によれば、本明細書に定義される方法のいずれかを実施するためのキットが提供される。このキットは、生体サンプルからの少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡを増幅するための少なくとも１つの試薬と、本発明の方法を実施するための指示を含む。ある実施形態では、このキットは、生体サンプルから無細胞ＲＮＡを抽出するための少なくとも１つの試薬をさらに含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、無細胞ＲＮＡを増幅するための少なくとも１つの試薬は、上記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子と特異的にハイブリダイズするためのプライマーまたはプローブを含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は以下のステップを含む：
ａ）対象から取得した生体サンプルから無細胞ＲＮＡを抽出することと、
ｂ）少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡのレベルを定量化することと、
ｃ）ステップｂで取得した無細胞ＲＮＡのレベルを、上記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子の所定の濃度範囲および／または基準対照と比較すること。
【００９１】
いくつかの実施形態では、低酸素症に関連する状態とは、胎児ストレスである。
【００９２】
いくつかの実施形態では、低酸素症に関連する状態とは、心筋梗塞である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子は以下から選ばれる：ＴＰ５３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００５４６）、ｐ２１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００３８９）、ＥＲＣＣ５（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００１２３）、ＭＤＭ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００６８７８）、ＴＰ５３Ｉ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００４８８１）、ＮＯＴＣＨ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０１７６１７）、ＰＩＧＦ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００２６４３）、ＢＴＧ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００６７６３）、ＺＭＡＴ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００２２４７０）、ＡＰＡＦ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０１３２２９）、ＦＡＳ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿１５２８７３）、ＡＮＧＰＴＬ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０１２０９８）、ＰＵＭＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０１４４１７）、ＩＧＦＢＰ６（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００２１７８）、ＧＤＦ１５（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００４８６４）、ＢＮＩＰ３Ｌ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００４３３１．２）、ＴＧＦβ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００３２３９）、ＶＥＧＦ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００１０２５３６６）、およびＨＩＦ−１α。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子は以下から選ばれる：ｐ２１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０００３８９）、ＢＴＧ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００６７６３）、ＨＩＦ−１α（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００１５３０）、ＮＯＴＣＨ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿０１７６１７）、ＴＧＦβ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００３２３９）、およびＺＭＡＴ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｎｍ＿００２２４７０）。
【００９４】
ある実施形態では、上記ｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡを検出するために使用するプライマーもしくはプローブは、表２に示すプライマーもしくはプローブであるか、または、当技術分野から周知されている上記遺伝子用のプライマーおよびプローブから当業者が選択するプライマーおよびプローブである。
【００９５】
いくつかの実施形態では、上記ｐ５３誘導性遺伝子の無細胞ＲＮＡを検出するために使用するプライマーもしくはプローブは、表３に示すプライマーもしくはプローブであるか、または、当技術分野から周知されている上記遺伝子用のプライマーおよびプローブから当業者が選択するプライマーおよびプローブである。
【００９６】
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子は、ｐ２１、ＢＴＧ２、ＴＧＦβ３、ＮＯＴＣＨ１、ＨＩＦ１α、ＭＤＭ２、およびＺＭＡＴ３から選ばれる。
【００９７】
ある実施形態では、上記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子はｐ２１である。
【００９８】
別の実施形態では、上記少なくとも１つのｐ５３誘導性遺伝子はＢＴＧ２である。
【００９９】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される専門用語および／または科学用語はすべて、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施形態の実施または試験において、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を使用できるが、代表的な方法および／または材料を以下に記述する。矛盾がある場合は、本特許明細書（定義を含む）が優先する。加えて、材料、方法、および例はあくまで例示的なものであり、必ず限定するものとは意図されていない。
【０１００】
下記の実施例において、以上に詳述し下記請求項でクレームしている本発明の種々の実施形態および態様の実験的裏付けが確認される。
【０１０１】
いくつかの非限定的実施例の説明
上記説明とともに下記実施例を参照して、本発明を非限定的に例示する。
【０１０２】
概して、本明細書で使用する命名法および本発明で利用する実験手順は、分子、生化学、微生物学、および組み換えＤＮＡに関する手法を含む。このような手法は文献で十分に説明されている。例えば、以下の文献を参照のこと：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号；第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９号；第５，２７２，０５７号に記載されている各種方法論；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）。利用可能な免疫測定法については、特許および科学文献で広範に説明されている。例えば、以下の文献を参照のこと：米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号；第５，２８１，５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅ��ｓ．（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，Ｅｄｓ．（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）  ａｎｄ“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）。これらの文献はすべて、本明細書に完全に明記されているかの如く参照により組み入れられる。その他の一般的参考文献は、本明細書の各所に示す。これらの文献に記載の手順は、当技術分野において周知であると考えられ、読者の便宜のため本明細書に示す。これらの文献に記載されているすべての情報は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０３】
一般的な材料および方法
妊婦からの血液採取：合併症がなく単生児を有している（すなわち単一の胎児を妊娠している）健常な妊婦、および合併症を有する妊婦から、１５ｍｌの血液を採取した。本実験は、シバ医療センター（Ｓｈｅｂａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）の研究倫理委員会から承認を受けた。被験者へのインフォームドコンセントの後、産婦人科においてすべての血液サンプルを取得した。
【０１０４】
血液の調製：以前にＮｇが説明した通りに血液を調製した［Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（２００３）１００（８）：４３６０−２］。詳細に述べると、ＥＤＴＡの入ったチューブに血液サンプルを採取し、４℃、１，６００×ｇで１０分間、遠心分離した（これにより血液サンプルから有核細胞を除去する）。次に、血漿と血清を慎重に１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。血漿サンプルを４℃、１６，０００×ｇで１０分間、再度遠心分離し、上清を新しいポリプロピレンチューブに回収した。血清サンプルは、その後の参考のために−２０℃で保管した。
【０１０５】
ＲＮＡの抽出：（遠心分離の後）１．６ｍｌの血漿を、以前にＮｇが説明した通りに、２ｍｌのＴＲＩｚｏｌ  ＬＳ試薬（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）および０．４ｍｌのクロロホルムと混合した［Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ（２００２）４８（８）：１２１２−７］。混合物を４℃、１１，９００×ｇで１５分間、遠心分離し、水層を新しいチューブに移した。１容量の７０％エタノールを、１容量の水層に加えた。次に、製造者の推奨事項に従って、混合物をＲＮｅａｓｙミニカラム（ＲＮｅａｓｙミニキット、キアゲン、カリフォルニア州バレンシア）に移した。混入したＤＮＡを完全に除去するため、オンカラムＤＮａｓｅ処理を行った（ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ、キアゲン、カリフォルニア州バレンシア）。トータルＲＮＡを３０μｌのＲＮａｓｅフリー水で溶出し、−８０℃で保管した。
【０１０６】
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ：ワンステップのリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ、および各関心遺伝子を対象とする特定のプライマーを使用して、特定の無細胞ｍＲＮＡの増幅を行った。ＤＮＡの混入を低減するため、ＲＴ−ＰＣＲプライマーはイントロンを挟む設計であった。また、ＮＣＢＩ−Ｂｌａｓｔチェックを行って、非特異的増幅を排除した。
【０１０７】
製造者の指示に従って、２０μｌの反応容量でＲＴ−ＰＣＲを準備した（ＥＺ  ｒＴｔｈ  ＲＮＡ  ＰＣＲ試薬セット、アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティー）。詳細に述べると、抽出した５μｌの血漿ＲＮＡを、１００〜５００ｎＭのＰＣＲプライマーを用いて増幅した。各サンプルを２回分析し、分析ごとに、対応する検量線を同時に三重に処理した。テンプレートを含まない対照（ＮＴＣ：ｎｏ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）も各分析に含めた。
【０１０８】
本発明に従って使用したＲＴ−ＰＣＲ熱プロファイルは次の通りである：５０℃で反応を開始し逆転写を２０分、９５℃で変性を５分。次に、以下のようにＰＣＲを５０サイクル行った：９５℃、１５秒の変性の後、６０℃、３０秒のアニーリング／伸長。
【０１０９】
心筋梗塞に罹患している患者からの血液採取：心筋梗塞（ＭＩ）に罹患している患者の無細胞ＲＮＡレベルの分析には、アプライドバイオシステムのアッセイキットを使用した（Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）、表３）。本アッセイでは、定量リアルタイムＰＣＲ遺伝子発現用にあらかじめ設計されたプライマーおよびプローブのセット一式を使用する。
【０１１０】
磁気ビーズ（Ｍａｇｍａｘキット、アプライドバイオシステム；ＡＭ１８３６）でＲＮＡを抽出し、このＲＮＡをワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（キアゲンの提供するＱｕａｎｔｉＦａｓｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｐｌｕｓキット；２０４４８２）で使用した。以下に説明する相対定量法に従って、ＲＮＡの定量化を行った。
【０１１１】
実施例
実施例１
正常な妊娠状態と比べて、低酸素症を併発した妊娠状態は血清中のｐ２１のｍＲＮＡが上昇する
【０１１２】
結果
結果は、低酸素症を併発した妊娠状態において、ｐ２１遺伝子発現が大きく上昇していることを示した（図１）。低酸素症を併発した妊娠状態の対象から取得した５つのＲＮＡサンプルのうち、４サンプルに陽性のｐ２１遺伝子発現が観察された。これに対して、正常な妊娠状態の対象から取得した５つのサンプルでは、ｐ２１遺伝子発現は全く見られなかった。
【０１１３】
さらなる実験において、正常な妊娠状態の２０個のＲＮＡサンプルのｐ２１遺伝子発現を試験し、低酸素症を併発した妊娠状態に見られるｐ２１遺伝子発現の上昇（図１に示す）と比較した。図２に示す通り、試験した正常妊娠２０例中、ｐ２１遺伝子発現が大きく上昇したのは１例のみであり（ケース番号１９）、４例で微小な上昇が検出された（ケース番号１、７、１３、１７）。
【０１１４】
総括すると、本実験の結果は、胎児ストレスを予測するための非侵襲的マーカーとしての、分泌型ｐ２１ｍＲＮＡの利用を実証している。
【０１１５】
実施例２
広範な臨床試験により、低酸素症を併発した妊娠状態の女性から取得した血漿サンプルにおいてｐ２１、ＭＤＭ２、およびＨＩＦ１αのＲＮＡ発現のアップレギュレーションが特定された
【０１１６】
結果
最初の結果（実施例１に示す）を得た後、試験対象をより大型のグループ（計５４人）に拡大した。このうち３１人は正常な妊娠状態の対象であり、２３人は併発症を有する妊娠状態の対象である。母胎血漿ＲＮＡサンプルに対して、低酸素症およびストレスと関連する遺伝子、具体的にはｐ２１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ０９５７９）、ＶＥＧＦ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０２５３６６）、ＭＤＭ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ９２４２４）、ＨＩＦ１α（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１５３０．２）、およびＴＰ５３Ｉ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１４７１８４．１）の遺伝子発現を、表２に示すプライマーおよびプローブを用いて試験した。
【０１１７】
下の表４Ａに示す通り、低酸素症の妊娠状態の被験者２３人中、１３人がｐ２１遺伝子発現の試験で陽性であり、１０人がｐ２１遺伝子発現の陰性と記録された。さらに、正常な妊娠状態の被験者３１人中、ｐ２１遺伝子発現の試験で陽性となったのは２人だけであり、２９人はｐ２１遺伝子発現の陰性と記録された。低酸素症の妊娠状態と正常な妊娠状態のｐ２１遺伝子発現をカイ二乗検定で検定した結果、ｐは０．００１より小さいことが示された（表４Ｂ）。
【表４Ａ】
2013529092.tif 000005
【表４Ｂ】
2013529092.tif 000006
【０１１８】
下の表５Ａに示す通り、低酸素症の妊娠状態の被験者２３人中、１０人がＶＥＧＦ遺伝子発現の試験で陽性であり、１３人がＶＥＧＦ遺伝子発現の陰性と記録された。さらに、正常な妊娠状態の被験者３１人中、ＶＥＧＦ遺伝子発現の試験で陽性となったのは６人であり、２５人はＶＥＧＦ遺伝子発現の陰性と記録された。低酸素症の妊娠状態と正常な妊娠状態のＶＥＧＦの遺伝子発現をカイ二乗検定で検定した結果、ｐ＝０．０５３であることが示された（表５Ｂ）。
【表５Ａ】
2013529092.tif 000007
【表５Ｂ】
2013529092.tif 000008
【０１１９】
下の表６Ａに示す通り、低酸素症の妊娠状態の被験者２２人中、１２人がＭＤＭ２遺伝子発現の試験で陽性であり、１０人がＭＤＭ２遺伝子発現の陰性と記録された。さらに、正常な妊娠状態の被験者３１人中、ＭＤＭ２遺伝子発現の試験で陽性となったのは５人だけであり、２６人はＭＤＭ２遺伝子発現の陰性と記録された。低酸素症の妊娠状態と正常な妊娠状態のＭＤＭ２の遺伝子発現をカイ二乗検定で検定した結果、ｐ＝０．００４であることが示された（表６Ｂ）。
【表６Ａ】
2013529092.tif 000009
【表６Ｂ】
2013529092.tif 000010
【０１２０】
下の表７Ａに示す通り、低酸素症の妊娠状態の被験者２２人中、１０人がＨＩＦ１α遺伝子発現の試験で陽性であり、１２人がＨＩＦ１αに変更遺伝子発現の陰性と記録された。さらに、正常な妊娠状態の被験者３１人中、ＨＩＦ１α遺伝子発現の試験で陽性となったのは０人であり、３１人はＨＩＦ１α遺伝子発現の陰性と記録された。低酸素症の妊娠状態と正常な妊娠状態のＨＩＦ１αの遺伝子発現をカイ二乗検定で検定した結果、ｐは０．００１より小さいことが示された（表７Ｂ）。
【表７Ａ】
2013529092.tif 000011
【表７Ｂ】
2013529092.tif 000012
【０１２１】
下の表８Ａに示す通り、低酸素症の妊娠状態の被験者２２人中、６人がＴＰ５３Ｉ３遺伝子発現の試験で陽性であり、１６人がＴＰ５３Ｉ３遺伝子発現の陰性と記録された。さらに、正常な妊娠状態の被験者２３人中、ＴＰ５３Ｉ３遺伝子発現の試験で陽性となったのは５人であり、１８人はＴＰ５３Ｉ３遺伝子発現の陰性と記録された。低酸素症の妊娠状態と正常な妊娠状態のＴＰ５３Ｉ３の遺伝子発現をカイ二乗検定で検定した結果、ｐ＝０．４６６であることが示された（表８Ｂ）。
【表８Ａ】
2013529092.tif 000013
【表８Ｂ】
2013529092.tif 000014
【０１２２】
下の表９に示すように、低酸素症の妊娠状態と正常な妊娠状態でｐ２１、ＭＤＭ２、およびＨＩＦ１αの遺伝子発現を相関させ、比較した結果、これら３つの遺伝子の発現に対して陰性である被験者数が、低酸素症の妊娠状態でわずか４人であるのに対し、正常な妊娠状態では２４人であることが明らかになった。さらに、ｐ２１、ＭＤＭ２、およびＨＩＦ１αに対して陽性である被験者数が、低酸素症の妊娠状態で５人であるのに対し、正常な妊娠状態ではゼロであった。
【表９】
2013529092.tif 000015
【０１２３】
同様に、下の表１０に示すように、低酸素症の妊娠状態と正常な妊娠状態でｐ２１、ＶＥＧＦ、およびＨＩＦ１αの遺伝子発現を相関させ、比較した結果、これら３つの遺伝子の発現に対して陰性である被験者数が、低酸素症の妊娠状態でわずか５人であるのに対し、正常な妊娠状態では２３人であることが明らかになった。さらに、ｐ２１、ＶＥＧＦ、およびＨＩＦ１αに対して陽性である被験者数が、低酸素症の妊娠状態で３人であるのに対し、正常な妊娠状態ではゼロであった。
【表１０】
2013529092.tif 000016
【０１２４】
低酸素症の妊娠状態における低酸症関連の各種遺伝子の遺伝子発現をまとめた結果（下の表１１、表１２）、低酸素症の妊娠状態において、ｐ２１遺伝子発現および／またはＨＩＦ１α遺伝子発現が最も顕著にアップレギュレートされていることが明らかになった。したがって、低酸素症に関連する状態において過剰発現または抑制されるｐ５３誘導性遺伝子の中で、特にこの２つの遺伝子は、一緒または個別に、妊娠中の低酸素ストレスを標識する。
【表１１】
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【表１２】
2013529092.tif 000018
【０１２５】
実施例３
急性心筋梗塞に罹患している患者におけるｐ５３誘導性遺伝子の活性化
【０１２６】
被験者
１００人の被験者グループが本実験に参加した。５０人の被験者は、急性心筋梗塞（ＭＩ）でメイア病院（Ｍｅｉｒ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（クファールサバ）の心臓集中治療室に入院している患者であった。患者全員が３０歳超の男性であった。５０人の被験者は、非侵襲的な虚血診断を受け、急性虚血を示していない患者であった（対照群）。
【０１２７】
ＭＩ患者
ＭＩ患者は、ＳＴ部分上昇を伴う急性ＭＩに罹患していた。これらの患者は継続する胸痛が理由で入院し、その胸痛は、少なくとも１時間は発生するが６時間より長くは発生しないと報告された。すべてのＭＩ患者で緊急カテーテル留置が予定され、以下の少なくとも１つを示していた。
１．前壁のＳＴ上昇
２．新たな左脚ブロック（ＬＢＢＢ）
３．側壁または後壁の病変を示す心電図の証拠を伴う後壁のＳＴ上昇
【０１２８】
対照群
対照群は、心エコー検査または心エコー負荷試験を用いた非侵襲的な虚血診断を受け、急性虚血を示さない５０人の患者で構成された。
【０１２９】
血液サンプルを分析して、遺伝子ＢＮＩＰ３Ｌ、Ｐ２１、ＭＤＭ２、ＨＩＦ１α、ＮＯＴＣＨ１、ＢＴＧ２、ＴＧＦβ３、ＺＭＡＴ３、およびＥＲＣＣ５の発現を調べた。患者からＲＮＡを単離し、増幅した。複数のサンプルに渡って遺伝子の定常状態のｍＲＮＡレベルの変化を測定し、内部標準ＲＮＡのレベルに対して相対的に測定値を表す方法である、相対定量法（Ｌｉｖａｋ  ＫＪ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ  ＴＤ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１；２５（４）：４０２−８；Ｍａｒｉｓａ  ＬＷ  ａｎｄ  Ｊｕａｎ  ＦＭ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２００５；３９：７５−８５）に従って、患者の血液サンプル中の無細胞ＲＮＡを定量化した。相対定量のための外部標準（キャリブレーター）として、Ａ２７８０（ヒト卵巣癌細胞株）から抽出したトータルＲＮＡを使用した。キャリブレーター（すなわち細胞株Ａ２７８０から得たＲＮＡ）との比較における試験サンプルの増加倍率を定量化した。（内部標準であるＧＡＰＤＨに対して正規化した後の）患者全員のＲＮＡサンプルを、Ａ２７８０細胞株の発現レベルと比較した。
【０１３０】
ＭＩ群の場合：
−２つの血液サンプルを以下の時点に採取した。
１．病院到着時（病院到着から救命センターを経てカテーテル留置されるまでの間）、ｔ＝０；
２．カテーテル留置から４時間後、ｔ＝４。
【０１３１】
対照群の場合：
−アッセイ（心エコー検査または心エコー負荷試験）実施前に１つの血液サンプルを採取した。
【０１３２】
統計的分析：
１．対照に対するｔ＝０（ＭＩ患者）、対照に対するｔ＝４（ＭＩ患者）、およびｔ＝４に対するｔ＝０の無細胞ＲＮＡレベルについて、パラメトリックｔ−検定を実施した（表１３、検定結果はｐ値を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【表１３】
2013529092.tif 000019
【０１３３】
２．一部の血液サンプルでｔ＝０および／またはｔ＝４および／または対照中で無細胞ＲＮＡが検出されない場合については、非パラメトリックのマンホイットニー統計検定（ウィルコクソン順位和検定）を行った（表１４、検定結果はｐ値を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【表１４】
2013529092.tif 000020
【０１３４】
この結果から、遺伝子ｐ２１、ＭＤＭ２、ＨＩＦ−１α、ＮＯＴＣＨ１、ＢＴＧ２の発現が急性ＭＩを示すことが明らかになった（表１３、１４の左の列）。遺伝子ｐ２１、ＨＩＦ−１α、ＮＯＴＣＨ１、ＴＧＦ−β３、およびＢＴＧ２は、ＭＩの治療の成功を表す予測マーカーとなることが示された（表１３、１４の右の列）。
【０１３５】
遺伝子ｐ２１、ＭＤＭ２、ＨＩＦ−１α、ＮＯＴＣＨ１、およびＢＴＧ２は、対照に対するｔ＝４で表される通り、遺伝子発現から正常値への復帰を表す予測マーカーとなることが示された（表１３、１４の中央の列）。
【０１３６】
本発明のいくつかの特徴は、明確にするため個別の実施形態の文脈で記述されているが、これらを組み合わせて単一の実施形態として提供することもできることが理解される。逆に、本発明の種々の特徴は、簡潔にするため単一の実施形態の文脈で記述されているが、個別に提供することも、部分的に組み合わせた適切な小集合として提供することもできる。
【０１３７】
本発明は、その特定の実施形態と併せて記述されているが、当業者にとって多くの代替、修正、および変形が明白であることは明らかである。よって、添付の請求項の精神および広範な範囲に含まれるこうした代替、修正、および変形のすべてが包含されることが意図されている。本明細書で言及しているすべての出版物、特許および特許出願、ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、個々の出版物、特許もしくは特許出願、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号が参照により本明細書に組み入れられることを特定的かつ個別に表示されるのと同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。加えて、本願において何らかの参考文献を引用または特定していても、当該参考文献が本発明の先行技術として利用可能であると認めたものとは解釈されない。
【図１】
2013529092.tif 000021
【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013529092.tif 000024
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