(57)【要約】  本願発明は、非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦを安定して長期貯蔵する方法であって、非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦおよびソルビトールを含有する酢酸またはグルタミン酸塩緩衝化Ｇ−ＣＳＦ水性組成物を−１５℃またはそれ以下の温度に冷却し、凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物を得、ついでその凍結された組成物を凍結状態にて貯蔵し、次に温度を該組成物を解凍させるのに調節された時間にわたって２℃ないし８℃の範囲内にある温度にまで上げ、最初の組成物のＧ−ＣＳＦ含量の少なくとも９５％のＧ−ＣＳＦ含量を有する液体組成物を得る、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦを安定して長期貯蔵する方法であって：
（ａ）非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦおよびソルビトールを含有する酢酸またはグルタミン酸塩緩衝化Ｇ−ＣＳＦ水性組成物を提供し；
（ｂ）工程（ａ）にて提供されたＧ−ＣＳＦ組成物を−１５℃またはそれ以下の温度に冷却し、凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物を得；
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＧ−ＣＳＦ組成物を凍結状態にて貯蔵し；および
（ｄ）工程（ｃ）の凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物の温度を、該組成物を解凍させるのに調節された期間にわたって２℃ないし８℃の範囲内にある温度にまで上げ、工程（ａ）にて提供された組成物のＧ−ＣＳＦ含量の少なくとも９５％のＧ−ＣＳＦ含量を有する液体組成物を得る、工程を含む、方法。
【請求項２】
工程（ａ）の緩衝化Ｇ−ＣＳＦ組成物中のＧ−ＣＳＦの量が、０．１ｍｇ／ｍｌ〜８．０ｍｇ／ｍｌの、好ましくは０．２５ｍｇ／ｍｌ〜６．５ｍｇ／ｍｌの範囲にある、請求項１記載の方法。
【請求項３】
緩衝化Ｇ−ＣＳＦ組成物が３．５〜５の、好ましくは３．７〜４．８のｐＨを有する、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項４】
緩衝化Ｇ−ＣＳＦ組成物中の酢酸またはグルタミン酸塩の濃度が、０．５ｍＭ〜１００ｍＭの、好ましくは２ｍＭ〜８０ｍＭの範囲にある、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｇ−ＣＳＦ組成物中のソルビトールの量が、１０〜１００ｍｇ／ｍｌの、好ましくは２５〜７５ｍｇ／ｍｌの範囲にある、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）にて提供される酢酸またはグルタミン酸塩緩衝化Ｇ−ＣＳＦ水性組成物が、０．１ｍｌ〜８Ｌ、好ましくは５ｍｌ〜４Ｌ、より好ましくは１００ｍｌ〜１．５Ｌの容量を有する、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）におけるＧ−ＣＳＦ組成物を、−１５℃と−２５℃の間の温度に、または−６０℃と−８０℃の間の温度に冷却する、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）における凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物が、少なくとも２日間、好ましくは少なくとも１ヶ月、より好ましくは少なくとも３ヶ月の期間にわたって貯蔵される、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｄ）における凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物の、２℃〜８℃の範囲内にある温度までの昇温が、少なくとも６時間にわたって、徐々にまたは直線的に、温度を上昇させることによりなされる、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物の、工程（ｄ）における温度までの昇温が、該凍結された組成物を２℃〜８℃の範囲内にある温度に移し、該組成物を該温度で少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも３６時間維持することによりなされる、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｇ−ＣＳＦ組成物が界面活性剤を含まない、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｇ−ＣＳＦ組成物が界面活性剤を含む、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦの医薬組成物を提供する方法であって、
（ａ）非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦを酢酸またはグルタミン酸塩緩衝剤およびソルビトールと共に処方し、緩衝化Ｇ−ＣＳＦ水性組成物を得；
（ｂ）工程（ａ）のＧ−ＣＳＦ組成物を−１５℃またはそれ以下の温度に冷却し、凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物を得；
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＧ−ＣＳＦ組成物を凍結状態にて貯蔵し；
（ｄ）工程（ｃ）の凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物の温度を、該組成物を解凍させるのに調節された期間にわたって２℃ないし８℃の範囲内にある温度にまで上げ、工程（ａ）にて提供された組成物のＧ−ＣＳＦ含量の少なくとも９５％のＧ−ＣＳＦ含量を有する液体組成物を得；および
（ｅ）工程（ｄ）にて得られた液体組成物を非経口的使用のためのプライマリーパッケージに充填する、工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦの長期貯蔵方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）は天然に存する成長因子であり、サイトカインのファミリーに属する。Ｇ−ＣＳＦは造血にて極めて重要な役割を果たし、好中球および好中球継承細胞の成熟、増殖、分化および生存を強化する。臨床的には、Ｇ−ＣＳＦは主として腫瘍の制御に使用され、特に化学療法後の好中球減少症の処置に使用され、また骨髄移植に、および感染疾患の処置にて適用される。
【０００３】
天然に存する形態のヒトＧ−ＣＳＦは、５個のシステイン残基を有する約２０ｋＤａの糖蛋白である。これらのうちの４個の残基が、蛋白の活性に不可欠な２つの分子内ジスルフィド結合を形成する。Ｇ−ＣＳＦは天然源からほんのわずかな量でしか得られないため、医薬では主に組換え形態のＧ−ＣＳＦ、特に原核生物宿主にて該蛋白を発現させることで産生される形態のＧ−ＣＳＦが使用される。イー・コリなどの原核生物宿主にて発現される蛋白は、それらがグリコシル化されていない点で、天然に存するＧ−ＣＳＦと区別される。イー・コリで発現される蛋白はこの宿主生物での発現に不可欠な付加的なＮ−末端メチオニン残基を有する。
【０００４】
蛋白の高い疎水性に起因して、非グリコシル化組換えＧ−ＣＳＦは相対的に不安定である。分子は貯蔵容器、バイアル、シリンジ等の内面に容易に吸着し、二量体およびより重合度の高い凝集体を形成する。従来の液体Ｇ−ＣＳＦ製剤はまた、例えば、輸送の間に振盪される結果としての機械的ストレスに対して、および偶発的な凍結および解凍に対して感受的であり、それはまたより高いレベルの凝集体および生物活性の喪失をもたらす可能性がある。その上また、Ｇ−ＣＳＦはアミド分解、酸化、ジスルフィド結合の切断または蛋白分解などの化学的修飾に供される。他の分解経路よりもより迅速に生じるアミド分解は、Ｇ−ＣＳＦにおけるグルタミン含量が高いため、特に問題となる。同時に、このことは、特に蛋白を長期にわたって貯蔵した後では、生物学的に利用可能かつ活性な単量体であるＧ−ＣＳＦ含量の減少をもたらすかもしれない。例えば、Ｇ−ＣＳＦが一定用量で長期にわたって投与される場合、このことは費用がかかるだけでなく、治療効能の理由からも望ましくない。さらには、多量体化またはアミド分解により形成される産物は望ましくない免疫反応をもたらすかもしれない。
【０００５】
Ｇ−ＣＳＦ製剤の安定化は種々の特許および非特許文献のテーマである。
【０００６】
ＤＥ−Ａ−３７２３７８１は、活性成分を安定化するためにヒト血清アルブミンおよびマンニトールと組み合わせて使用される、ポリオキシエチレンソルビタンエステルなどの医薬上許容される界面活性剤を含有するリン酸塩緩衝化Ｇ−ＣＳＦ水性製剤を記載する。これらの製剤は長期間にわたって４℃で安定している。しかしながら、その抗原性のため、ヒトおよび動物起源の蛋白およびペプチドは望ましくない免疫反応を惹起するかもしれない。
【０００７】
ＥＰ−Ａ−０３７３６７９は、ｐＨが２．７５〜４．０であって、導電性が低い、Ｇ−ＣＳＦ製剤を開示し、それは、凝集体を形成することなく、長期にわたって貯蔵される可能性がある。Ｇ−ＣＳＦの凝集を回避するために、あるとすれば、２ｍＭ未満の少量にて緩衝剤がこれらの製造に使用される。
【０００８】
ＥＰ−Ａ−１１９７２２１は、５ないし７のｐＨで長期安定性を有し、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニンおよびアスパラギンからなる群の一または複数のアミノ酸、ならびに一または複数の疎水性アミノ酸を含有する、Ｇ−ＣＳＦ製剤を開示する。Ｇ−ＣＳＦ分子のメチオニン残基の酸化を防止するためにメチオニンが添加される。
【０００９】
ＷＯ−Ａ−２００７／０３４５０９は、組換えヒトＧ−ＣＳＦおよび蛋白中のメチオニン残基の酸化抑制剤であるアミノ酸を含有する安定した水性製剤を開示する。
【００１０】
ＷＯ−Ａ−２００５／０４２０２４はＧ−ＣＳＦおよび酢酸またはグルタミン酸などの酸を含むが、界面活性剤を含まない、医薬組成物を開示する。
【００１１】
ＷＯ−Ａ−２００５／０３９６２０は、広範囲のｐＨで安定しているコハク酸および酒石酸塩緩衝化組成物を開示する。
【００１２】
Herman, A.C.らは、「Characterisation, Formulation, and Stability of Neupogen (Filgrastim), a Recombinant Human Granulocyte-Colony Stimulating Factor.」 In: Formulation Characterisation and Stability of Protein Drugs, p.303-328, R. Pearlman and Y.J.Wang編、Plenum Press, New York, 1996にて、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５％のマンニトールおよび０．００４％のポリソルベート８０を含有する、非グリコシル化組換えＧ−ＣＳＦの安定化されている組成物を記載する。かかる組成物は２−８℃で２４ヶ月以上の間安定している。フィルグラスチム（filgrastim）製剤にてマンニトールをソルビトールと置き換えることで、不慮の凍結および解凍の間の、該蛋白の凝集に対する感受性が排除されることが判明した。しかしながら、製造業者の使用説明書によれば、冷凍庫での貯蔵は避けなければならない。
【００１３】
ＷＯ−Ａ−２００７／０９９１４５はポリソルベート２０および／またはポリソルベート８０を界面活性剤として含み、４．１と４．４の間のｐＨを有する、酢酸塩緩衝化Ｇ−ＣＳＦ液体製剤を開示する。
【００１４】
ＷＯ−Ａ−２００８／１２２４１５は、３．５ないし４．８のｐＨを有し、例えば、凍結および解凍に供される機械的ストレスの条件下で安定している、グルタミン酸塩緩衝化Ｇ−ＣＳＦ液体製剤を開示する。
【００１５】
Piedmonteら（Pharmaceutical Research, Vol.24, No.1, January 2007, p.136-146）は凍結蛋白製剤中の蛋白凝集に対するソルビトールの効果を記載する。
【発明の概要】
【００１６】
本願発明の目的は、生物学的に活性な非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦを安定して長期貯蔵する方法であって、分解、特にアミド分解、および容器壁への吸着現象による貯蔵の間のＧ−ＣＳＦの喪失が減少する方法を提供することである。
【００１７】
この目的は、非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦを安定して長期貯蔵するための本願発明の方法であって：
（ａ）非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦおよびソルビトールを含有する酢酸またはグルタミン酸塩緩衝化Ｇ−ＣＳＦ水性組成物を提供し；
（ｂ）工程（ａ）にて提供されたＧ−ＣＳＦ組成物を−１５℃またはそれ以下の温度に冷却し、凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物を得；
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＧ−ＣＳＦ組成物を凍結状態にて貯蔵し；および
（ｄ）工程（ｃ）の凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物の温度を、該組成物を解凍させるのに調節された時間にわたって２℃ないし８℃の範囲内にある温度にまで上げ、工程（ａ）にて提供された組成物のＧ−ＣＳＦの含量の少なくとも９５％のＧ−ＣＳＦ含量を有する液体組成物を得る、工程を含む、方法により達成される。
【００１８】
本願発明は、さらには、非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦの医薬組成物を提供する方法であって、
（ａ）非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦを酢酸塩またはグルタミン酸塩緩衝剤およびソルビトールと共に処方し、緩衝化Ｇ−ＣＳＦ水性組成物を得；
（ｂ）工程（ａ）のＧ−ＣＳＦ組成物を−１５℃またはそれ以下の温度に冷却し、凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物を得；
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＧ−ＣＳＦ組成物を凍結状態にて貯蔵し；
（ｄ）工程（ｃ）の凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物の温度を、該組成物を解凍させるのに調節された時間にわたって２℃ないし８℃の範囲内にある温度にまで上げ、工程（ａ）にて提供された組成物のＧ−ＣＳＦ含量の少なくとも９５％のＧ−ＣＳＦ含量を有する液体組成物を得；および
（ｅ）工程（ｄ）にて得られた液体組成物を非経口的使用のためのプライマリーパッケージに充填する、工程を含む方法に関する。
【００１９】
発明の過程で、Ｇ−ＣＳＦが、たとえ、高濃度および高容量で、界面活性剤を用いることなく提供されたとしても、本願発明の方法によって、非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦのアミド分解および喪失がかなり減少し、あるいは回避さえされ得ることが見いだされた。この方法にて、長期貯蔵であっても活性は維持される。その上、Ｇ−ＣＳＦ組成物は凍結状態にて貯蔵され得るため、該組成物は例えば移送の間に受けるような機械的ストレスに対して感受的ではない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本願発明の方法に供されたフィルグラスチム試料（レーン１および２）と、２５℃の温度で貯蔵されたフィルグラスチム試料（レーン３および４）とで観察された、分画電気泳動（ＩＥＦ）で測定された場合のアミド分解産物の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本願発明の組成物にて使用される非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦ蛋白（以下、Ｇ−ＣＳＦとも称される）は、ヒトＧ−ＣＳＦの非グリコシル化アミノ酸配列を含み、その生物学的活性を有するいずれの蛋白であってもよい。非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦは、典型的には、ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子をイー・コリなどの原核生物宿主にて発現させることで得られる。イー・コリにて発現された非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦは、典型的には、Ｎ−末端Ｍｅｔ残基を有する。本願発明の好ましい実施態様にて、ヒトＧ−ＣＳＦは、欧州薬局方６．３モノグラフ（０１／２００９：２２０６；「Filgrastim Concentrated Solution」４１４２頁）またはHerman, A.C.ら（前掲）に示されるように、ヒトＧ−ＣＳＦ＋Ｎ−末端メチオニン（ｒ−ｍｅｔＨＵ  Ｇ−ＣＳＦ）の主構造、すなわち、フィルグラスチムのアミノ酸配列、またはフィルグラスチムの生物学的活性を本質的に有するその変種、例えば融合蛋白などのＮ−末端またはＣ−末端拡張を有する変種、Ｎ−末端のメチオニン残基がグリシンなどの他のアミノ酸で置換されている変種、またはアミノ酸配列にて中立変異を有する変種を含むか、または有する。本願発明の製剤にて有用なＧ−ＣＳＦ変種は、例えばＥＰ−Ａ−０４５６２００に開示されている。
【００２２】
本願発明のＧ−ＣＳＦ組成物にて使用される緩衝系は酢酸／酢酸塩緩衝剤またはグルタミン酸／グルタミン酸塩緩衝剤である。本願発明にて使用される組成物は他の緩衝剤を含まないことが好ましい。本願発明にて使用される緩衝剤は、例えば酢酸またはグルタミン酸および／またはその塩で出発し、対応する酸または塩基あるいは塩酸またはアルカリ水酸化物またはアルカリ土類水酸化物などの他の適当な無機または有機酸または無機塩基を用いて所望の値にｐＨを調節して調製され得る。生理学的に許容される酢酸塩またはグルタミン酸塩は、例えばアルカリ、アルカリ土類またはアンモニウム塩であることが好ましい。アルカリまたはアンモニウム塩、特にモノナトリウム塩が好ましい。好ましくは、該緩衝剤は、酢酸またはグルタミン酸より出発し、そのｐＨ値を適当な無機塩基、例えば水酸化ナトリウムを用いて調節することで調製される。
【００２３】
本願発明の方法の工程（ａ）にて提供される組成物のｐＨ値は、典型的には、３．５〜５．０の範囲に、好ましくは、３．７〜４．８の範囲にある。より好ましくは、該ｐＨは３．７〜４．６の、例えば４．０〜４．６の範囲にある。
【００２４】
酢酸またはグルタミン酸塩緩衝剤の濃度は、有利には、所望のｐＨ値でｐＨ安定化作用および十分な緩衝能を達成するように調整されている。通常、酢酸またはグルタミン酸塩緩衝剤は少なくとも０．５ｍＭ、好ましくは１〜１００ｍＭ、より好ましくは２〜８０ｍＭの濃度を有する。２〜４０ｍＭの、特に２〜２５ｍＭ、例えば５〜１５ｍＭの範囲の、好ましくは約１０ｍＭの緩衝剤濃度は、十分な安定性を提供するであろうし、組成物を注射した際の望ましくない組織反応を回避するのにも十分に低いであろう。
【００２５】
本願発明の方法の工程（ａ）にて提供される組成物のＧ−ＣＳＦ濃度は意図する使用に依存するであろう。その濃度の上限は、Ｇ−ＣＳＦの緩衝剤中の溶解度に由来する。典型的には、Ｇ−ＣＳＦ濃度は０．１〜８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２５〜６．５ｍｇ／ｍｌの範囲にある。分析試料またはさらに希釈されることなく投与される医薬組成物にて、Ｇ−ＣＳＦは、典型的には、０．１〜２．０ｍｇ／ｍｌの範囲の、好ましくは２．５ｍｇ／ｍｌまでの量にて配合される。さらに濃縮される組成物、例えば、加工処理の中間体として、患者に投与するのに適する薬物を得るのにさらに処理されてもよい、Ｇ−ＣＳＦ含有の組成物にて、Ｇ−ＣＳＦ濃度は、典型的には、２．５ｍｇ／ｍｌ〜８．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２．５ｍｇ／ｍｌ〜６．５ｍｇ／ｍｌの範囲、より好ましくは５．５ｍｇ／ｍｌまでの範囲である。
【００２６】
本願発明の方法の工程（ａ）にて提供される組成物は、等張化修飾剤としてソルビトールを含む。好ましくは、ソルビトールは、緩衝系を除き、組成物にて使用される等張化修飾剤に過ぎない。ソルビトールは、典型的には、２００ｍｇ／ｍｌまでの、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍｌの、より好ましくは２５〜７５ｍｇ／ｍｌの、例えば約５０ｍｇ／ｍｌの量にて配合される。
【００２７】
本願発明の方法にて使用される組成物は界面活性剤を含んでいても、いなくてもよい。界面活性剤が配合されている場合、該界面活性剤は、典型的には、非イオン性界面活性剤である。好ましくは、該非イオン性界面活性剤は、脂肪族アルコール、エトキシレート、アルキル多糖類、ポリオキシアルキレン、ポリソルベートあるいはそれらの２種またはそれ以上の混合物からなる群より選択される。ポリオキシアルキレンブロックコポリマー、例えばポロキサマー１８８（Pluronic F68の商品名で入手可能）などのポリオキシアルキレン、およびポリソルベート、すなわち脂肪族の脂肪酸のポリオキシエチレンソルビタンエステルが好ましい。最も好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Tween 20の商品名で入手可能）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Tween 40）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Tween 60）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート（Tween 65）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Tween 80）、およびポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（Tween 85）などのポリソルベートである。ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが最も好ましい。
【００２８】
界面活性剤が用いられる場合、該界面活性剤は、５ｍｇ／ｍｌ以下の、好ましくは１ｍｇ／ｍｌ以下の量で配合されるのが好ましい。好ましくは、界面活性剤、特にポリソルベートは、０．００１〜１．０ｍｇ／ｍｌの、より好ましくは０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌの量で使用される。
【００２９】
本願発明の方法の工程（ａ）にて提供される組成物は、アミノ酸、還元剤、酸化防止剤および血清蛋白などのさらなる薬剤を含んでもよいが、該組成物は、典型的には、Ｇ−ＣＳＦ、酢酸またはグルタミン酸水性緩衝剤、ソルビトール、および所望により界面活性剤からなり、かくして他の薬剤は不含である。
【００３０】
本願発明の方法の工程（ａ）にて提供される組成物は、自体公知の方法にて調製されてもよい。例えば、緩衝物質、すなわち酢酸またはグルタミン酸あるいはその塩、ソルビトール、および任意の、界面活性剤などの他の添加剤が、適量の水性媒体、通常、水中に溶解される。必要ならば、上記した適当な酸または塩基を用いてｐＨ値を調整する。例えば、滅菌フィルターを介して濾過することで滅菌処理を行った後、Ｇ−ＣＳＦを所望の濃度で添加する。あるいはまた好ましくは、工程（ａ）にて使用されるＧ−ＣＳＦは、再度緩衝処理を行って、または行うことなく、生成工程よりバッチとして得られる。
【００３１】
本願発明の方法の工程（ａ）にて提供されるＧ−ＣＳＦ水性組成物は、望ましい容量にて提供されうるが、好ましくは０．１ｍｌ〜８Ｌの、好ましくは５ｍｌ〜４Ｌの、より好ましくは１０ｍｌ〜２．０Ｌの、最も好ましくは１００ｍｌ〜１．５Ｌの範囲の容量を有する。該組成物はポリエチレン（ＰＥ）容器、ガラス瓶、あるいはグリコールを含まないポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）またはグリコールとのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＧ）でできたボトルなどの適当な容器にて提供される。
【００３２】
該組成物の容器への充填は、典型的には、滅菌条件下、好ましくは窒素などの不活性気体を用いて実施される。典型的には、部分的に該組成物だけで、好ましくは多くて９０％の容量まで該容器を充填し、該容器の上部空間は、不活性気体で満たされていることが好ましい。
【００３３】
所望の容量にて提供される本願発明のＧ−ＣＳＦの水性液体組成物は、−１５℃以下の温度に凍結するまで冷却される。典型的には、該組成物を−１５℃と−２５℃の間の温度、例えば約−２０℃に冷却するか、または−６０℃と−８０℃の間の温度に冷却する。冷却は、例えば冷凍庫または冷却室で、あるいはＧ−ＣＳＦ組成物含有の容器を液体窒素に沈めることによりなされうる。
【００３４】
工程（ｂ）にて得られる凍結したＧ−ＣＳＦを、−１５℃以下の所望の温度で凍結状態にて貯蔵する。典型的には、該組成物が冷却されている、すなわち、上記の温度で、好ましくは、標準的な冷却室またはディープフリーザーが規定する温度である、−１５と−２５℃の間の、または−６０と−８０℃の間の温度で該組成物を貯蔵する。典型的には、凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物を少なくとも２日間、好ましくは少なくとも１ヶ月、例えば少なくとも３ヶ月または少なくとも６ヶ月にわたって貯蔵する。Ｇ−ＣＳＦ組成物が凍結状態で貯蔵されている期間の間にアミド分解がかなり減少することが判明した（実施例４および図１を参照のこと）。
【００３５】
工程（ｃ）にて凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物を貯蔵した後、凍結された組成物の温度を、該組成物が解凍し、工程（ａ）にて提供される組成物のＧ−ＣＳＦ含量の少なくとも９５％のＧ−ＣＳＦの含量を有する液体組成物を得ることを可能とするように調整されている期間にわたって２℃〜８℃の範囲内にある温度にまで上げる。
【００３６】
「温度を２℃〜８℃の範囲内にある温度にまで上げる」なる語は、組成物が８℃よりも高い温度に暴露されないことを意味する。具体的には、本願発明の一の実施態様によれば、凍結された組成物は、徐々にまたは直線的に長時間にわたって昇温させることにより、２℃と８℃の間の温度に加温され得る。凍結組成物を解凍し、最初に提供される組成物のＧ−ＣＳＦ含量の少なくとも９５％であるＧ−ＣＳＦの含量を有する液体組成物を得るのに必要な長い時間は、典型的には、少なくとも６時間である。例えば、組成物が−２０℃の温度で凍結状態に維持される場合には、該組成物は６時間にわたって徐々にまたは直線的に１時間に４℃昇温させることで−２０℃から＋４℃にまで加温され得る。直線的な温度勾配は、例えば、Integrated Biosystems CryoPilot（登録商標）Systemを用いて行われうる。
【００３７】
本願発明の好ましい実施態様によれば、凍結された組成物は直ちに２℃と８℃の所望の温度に移され、ついでその温度で長時間にわたって維持され、凍結された組成物を解凍させ、必要とされるＧ−ＣＳＦ含量を有する液体組成物を得るであろう。典型的には、凍結された組成物は冷却室またはこの温度範囲に調節されている水浴に移される。この場合、組成物がこの温度で維持される時間は、例えば凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物の容量および組成物中のＧ−ＣＳＦの濃度に依存する。概して、大容量、例えば、１００ｍｌ以上で、高濃度のＧ−ＣＳＦの組成物で必要とされる時間は、小容量、例えば１００ｍｌ以下で、低濃度のＧ−ＣＳＦの組成物に対する時間よりも長い。同様に、冷却室にて必要とされる時間は水浴での時間よりも長い。一般に、所望の高含量のＧ−ＣＳＦを得るのに必要とされる時間は少なくとも１２時間であり、典型的には、該時間は１２時間ないし７２時間の範囲内にある。例えば、１００ｍｌよりも小容量の組成物について必要とされる時間は、一般に、１２ないし２４時間の範囲内にある一方で、１００ｍｌ以上、例えば０．８Ｌなどの１００ｍｌないし８Ｌの大容量、および／またはＧ−ＣＳＦの、例えば２．５ないし８ｍｇ／ｍｌの高濃度の組成物で必要とされる時間は、典型的には水浴にて１８時間以上、例えば２４ないし４８時間、および冷却室にて３６時間以上、例えば３６ないし７２時間である。さらに大容量では直線的に多くの時間を必要とするかもしれない。
【００３８】
得られる液体組成物中のＧ−ＣＳＦ含量は、工程（ａ）にて提供される組成物のＧ−ＣＳＦの含量の少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９９％である。「Ｇ−ＣＳＦ含量」なる語は、Ｇ−ＣＳＦの単量体およびその多量体ならびにアミド分解および酸化された変種などのそれより誘導される関連蛋白を包含することを意味する。Ｇ−ＣＳＦ含量は、例えば、欧州薬局方６．３モノグラフ（０１／２００９：２２０６；「Filgrastim Concentrated Solution」、4143-4144頁、特に4143頁：「Impurities with molecular masses higher than that of filgrastim. Size-exclusion chromatography (2.2.30)」および「Related proteins. Liquid chromatography (2.2.29)」）に記載されるように、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）または逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって測定され得る。両方の方法ともに同じ結果をもたらすが、典型的にはＲＰ−ＨＰＬＣが使用される。
【００３９】
本願発明の方法を用いた場合、工程（ｄ）にて得られる組換えＧ−ＣＳＦの生物学的効果は本質的に維持される。具体的には、生物学的効果は、工程（ａ）にて提供されるＧ−ＣＳＦの生物学的効果に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％である。生物学的活性は、欧州薬局方６．３モノグラフ（０１／２００９：２２０６；「Filgrastim Concentrated Solution」、4142-4144頁、特に4143頁：ASSAY−「Potency」）にてフィルグラスチムについて記載されるように測定される。簡単には、工程（ｄ）にて得られる組成物の生物学的効果は、工程（ａ）にて提供される組成物と比較した、基準としての国際単位にて修正される、ＮＦＳ−３６０細胞の増殖の刺激能を測定することにより決定される。生存細胞の数を決定するのに、ルシフェラーゼ化学発光システムを用いて細胞内ＡＴＰが定量されてもよい。測定される発光シグナルはＡＴＰの量に比例し、その量は存在する細胞数に正比例する。相対効果は、適当な統計方法、例えば、欧州薬局方５．３モノグラフによるパラレルラインアッセイを用いて計算され、工程（ｄ）にて得られた組成物の、工程（ａ）の組成物と比べた割合にて表される。
【００４０】
工程（ｄ）に続いて、特に非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦの医薬組成物を提供する方法にて、得られた液体組成物はバイアルまたはシリンジなどの非経口的使用のためのプライマリーパッケージに充填されてもよい。有利には、液体組成物は、充填の前に、注射または注入で患者への投与に適するアリコートに分割されてもよい。Ｇ−ＣＳＦの濃縮溶液は、充填前に希釈されてもよく、所望により、希釈緩衝剤は界面活性剤および添加剤を含有してもよい。
【００４１】
本願発明の方法の工程（ｃ）および（ｄ）における貯蔵および解凍の後に得られるＧ−ＣＳＦ製剤は、蛋白の吸着、アミド分解または凝集による、Ｇ−ＣＳＦ蛋白の喪失がないか、またはほんの少量の喪失を示すに過ぎなかった。上記したように、本願発明の方法によって最終的に得られるＧ−ＣＳＦ組成物は、Ｇ−ＣＳＦの最初の含量の、全体として少なくとも９５％のＧ−ＣＳＦ含量を有する。所望により希釈された後のこれらの組成物は種々の適用形態の治療薬として、例えば注射または注入用製剤、特に静脈内、筋肉内または皮下投与用製剤として、使用されてもよい。得られた治療薬は、好中球減少症の処置、骨髄移植、ならびに炎症疾患および腫瘍疾患の処置などの、Ｇ−ＣＳＦが利用され得る適応症にて使用されてもよい。
【００４２】
本願発明を何ら限定することを意図としない、以下の実施例および図１に言及して、該発明をさらに詳細に説明する。
【００４３】
実施例
方法
【００４４】
１．サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣによる凝集分析を、蛍光検出が使用されることを除いて、欧州薬局方６．３モノグラフ（０１／２００９：２２０６；「Filgrastim Concentrated Solution」、4143頁：「Impurities with molecular masses higher than that of filgrastim. Size-exclusion chromatography (2.2.30)」に記載の方法に従って実施した。簡単には、親水性シリカゲルを固定相として３０℃の温度で用いた。リン酸塩緩衝化の炭酸水素アンモニウム溶液を０．５ｍｌ／分の流速で移動相として用いて溶出を行った。蛍光検出を３４５ｎｍで行い、励起を２８０ｎｍで行った。クロマトグラムを定量し、Ｇ−ＣＳＦの単量体と、不純物としてのより高分子の凝集体とを区別した。実験結果をピーク面積割合（％）として表す。
【００４５】
２．逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ
長期貯蔵後の試料中のＧ−ＣＳＦ含量および不純物（アミド分解および酸化変種）が、ＲＰ−ＨＰＬＣを用い、蛍光検出が上記したように純度の測定のために使用されることを除いて、欧州薬局方６．３モノグラフ（０１／２００９：２２０６；「Filgrastim Concentrated Solution」、4143頁：「Related proteins. Liquid chromatography (2.2.29)」に記載の方法に従って決定された。蛋白含量が２１５ｎｍでのＵＶ検出によりＧ−ＣＳＦ対照基準に対して決定された。試験結果をピーク面積割合（％）として表す。
【００４６】
３．分画電気泳動（ＩＥＦ）
凍結および解凍後の試料の、フィルグラスチムの特性と異なる変化を有する不純物についての分析が、低濃度の基準溶液および銀染色法を用いてより高感度を達成することを除き、欧州薬局方６．３モノグラフ（０１／２００９：２２０６；「Filgrastim Concentrated Solution」、4143頁：「Impurities with changes differing from that of filgrastim.  Isielectric focusing (2.2.54)」に記載される方法に従って、ＩＥＦにより実施された。
【００４７】
実施例１
非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦとしてのフィルグラスチムの以下に示される酢酸またはグルタミン酸塩緩衝化の水性組成物を、表１に示されるように調製し、次の実験に使用した：
表１
【表１】
2013529618.tif 000002
【００４８】
各組成物のＧ−ＣＳＦ含量（ｍｇ／ｍｌ）は、以下のすべての実験にて１００％値であると規定された。
【００４９】
実施例２
組成物１および２（ポリエチレン（ＰＥ）バッグ中３０ｍｌ）をIntegrated Biosystems CryoPilot（登録商標）Systemを用いて種々の条件下で凍結および解凍に供した。Ｇ−ＣＳＦの凝集体、オリゴマー、二量体および単量体の割合、ならびにＧ−ＣＳＦの全含量を、欧州薬局方６．３モノグラフ（０１／２００９：２２０６；「Filgrastim Concentrated Solution」、4143頁：「Impurities with molecular masses higher than that of filgrastim. Size-exclusion chromatography (2.2.30)」に記載されるように、ＳＥＣを用いて決定した。すべての値を、以下の条件Ａ、ＢおよびＣに従って、凍結前（Ｔ０）および凍結および解凍後に測定した。結果および凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）条件を以下の表２に示す。
【００５０】
【表２】
2013529618.tif 000003
【００５１】
Ｆ／Ｔ条件：
Ｔ０：凍結前の組成物
Ａ：組成物を−２０℃に急冷した。該組成物をこの温度で４時間貯蔵した後、凍結された組成物を＋２０℃の温度に直ちに移した。組成物を該温度で２時間保持し、ついで＋４℃の温度に移し、そこでさらに１２時間保持した。＋２０℃で２時間および４℃で１時間経過した後には、組成物は完全に解凍した。
Ｂ：組成物を＋４℃から−２０℃に急冷した。この温度で４時間貯蔵した後、CryoPilot（登録商標）のプログラムされた温度直線勾配を用いて、温度を７時間にわたって＋４℃の温度までゆっくりと上昇させた。
Ｃ： CryoPilot（登録商標）のプログラムされた温度直線勾配を用い、組成物を１７時間にわたって＋４℃から−２０℃の温度まで冷却した。その後で、CryoPilot（登録商標）システムのプログラムされた温度勾配を用いて、温度を７時間にわたって＋４℃の温度までゆっくりと上昇させた。
【００５２】
結果は、条件Ａの下での迅速な解凍がＧ−ＣＳＦ含量の有意な喪失をもたらす一方で、条件ＢおよびＣの下での−２０℃から＋４℃への凍結された組成物の温度のゆっくりとした上昇は、最初に提供されたＧ−ＣＳＦ組成物のＧ−ＣＳＦ含量に匹敵するＧ−ＣＳＦ含量を有する液体組成物をもたらしうることを示す。
【００５３】
実施例３
組成物３および４（５ｍｌのＰＥＴＧボトル中にて３．５ｍｌ）を５回連続したＦ／Ｔサイクルに供した。各サイクルにて、試料を＋４℃から−２０℃に冷凍庫にて冷却し、−２０℃で２０時間貯蔵した後、それを＋４℃の温度に調節した冷却室に直ちに移した。試料を該温度で１６時間放置して解凍させ、該組成物にてＧ−ＣＳＦの最初の含量を再び得た。Ｇ−ＣＳＦ含量および不純物を、実験の開始の際に、サイクル１、３および５の後で、上記したように、ＳＥＣ（フィルグラスチムの多量体）およびＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｇ−ＣＳＦ含量およびアミド分解および酸化Ｇ−ＣＳＦ変種）を用いて測定した。結果を以下の表３に示す。
【００５４】
表３
【表３】
2013529618.tif 000004
【００５５】
上記した結果から分かるように、Ｇ−ＣＳＦ含量ならびに不純物の合計は、各サイクルの後で本質的に同じままであり、あらゆる値は実験誤差の範囲内にある。
【００５６】
実施例４
組成物５および６（１０ｍｌのＰＥＴＧボトル中にて７ｍｌ）を冷凍庫にて＋４℃から−２０℃に冷却した。凍結された試料を−２０℃で２ヶ月間貯蔵し、ついで＋４℃の温度に調節した冷却室に移した。試料を該温度で２４時間放置して解凍させ、該組成物にてＧ−ＣＳＦの最初の含量を再び得た。実験の間、組成物５および６の試料を対照として２５℃に保持した。
【００５７】
すべての試料を上記したように分画電気泳動（ＩＥＦ）を用い、フィルグラスチムの特性と異なる変化を有する不純物について分析した。結果を図１に示し、そこで主たるバンド、すなわち最大強度のバンドはフィルグラスチムを表し、主要バンドより下方に移動する強度の低いバンドは主にそのアミド分解変種を表す。図１から分かるように、−２０で貯蔵された試料（レーン１および２）は、２５℃で貯蔵された試料（レーン３および４）よりもフィルグラスチムのアミド分解変種がかなり少ないことを示す。
【００５８】
さらには、−２０℃で貯蔵した試料のＧ−ＣＳＦの全含量および不純物を、凍結の前に（Ｔ０）および２ヶ月間貯蔵し、解凍した後に（Ｔ１／−２０℃）、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｇ−ＣＳＦ含量およびアミド分解および酸化Ｇ−ＣＳＦ変種）およびＳＥＣ（Ｇ−ＣＳＦの多量体）を用いて測定した。結果を２５℃で貯蔵した対照となる試料（Ｔ１／＋２５℃）についての結果と一緒に以下の表４に示す。
【００５９】
表４
【表４】
2013529618.tif 000005
【００６０】
上記した結果から分かるように、Ｇ−ＣＳＦ含量は、凍結の前後で本質的に同じままであり、あらゆる値は実験誤差の範囲内にある。ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定されるようなアミド分解および酸化の変種の増加は、図１に示されるＩＥＦを用いて得られる結果に適合している。
【００６１】
実施例５
組成物５、７および８（１０００ｍｌのＰＥＴＧボトル中にて８００ｍｌ）を−２０℃で３６ヶ月間貯蔵した。貯蔵の後で、該組成物を＋４℃の温度に調節した冷却室に移し、該温度で解凍のために４８時間放置した。こうして得られた液体組成物を５回連続したＦ／Ｔサイクルに供した。各サイクルにて、試料を＋４℃から−２０℃に冷凍庫にて冷却し、−２０℃で少なくとも２４時間貯蔵した後、それを＋４℃の温度に調節した冷却室に直ちに移した。試料を該温度で少なくとも４８時間放置して解凍させ、該組成物にてＧ−ＣＳＦの最初の含量を再び得た。Ｇ−ＣＳＦ含量および不純物を、実験の開始の際に（Ｆ／Ｔ０）、サイクル５の完了後（Ｆ／Ｔ５）で、上記したように、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｇ−ＣＳＦ含量およびアミド分解および酸化Ｇ−ＣＳＦ変種）およびＳＥＣ（Ｇ−ＣＳＦの多量体）を用いて測定した。結果を以下の表５に示す。
【００６２】
表５
【表５】
2013529618.tif 000006
【００６３】
上記した結果から分かるように、Ｇ−ＣＳＦ含量ならびに不純物の合計は、凍結の前およびサイクル５の完了後で本質的に同じままであり、あらゆる値は実験誤差の範囲内にある。
【図１】
2013529618.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成25年2月22日(2013.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦを安定して長期貯蔵する方法であって：
（ａ）非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦおよびソルビトールを含有する酢酸またはグルタミン酸塩緩衝化Ｇ−ＣＳＦ水性組成物を提供し、ここでＧ−ＣＳＦの量が０．１ｍｇ／ｍｌ〜８．０ｍｇ／ｍｌの範囲にあり、該組成物が１００ｍｌ〜８Ｌの容量を有し；
（ｂ）工程（ａ）にて提供されたＧ−ＣＳＦ組成物を−１５℃またはそれ以下の温度に冷却し、凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物を得；
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＧ−ＣＳＦ組成物を少なくとも１ヶ月の期間にわたって凍結状態にて貯蔵し；および
（ｄ）工程（ｃ）の凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物の温度を、該組成物を解凍させるのに調節された期間にわたって２℃ないし８℃の範囲内にある温度にまで上げ、工程（ａ）にて提供された組成物のＧ−ＣＳＦ含量の少なくとも９５％のＧ−ＣＳＦ含量を有する液体組成物を得る、工程を含む、方法。
【請求項２】
工程（ａ）の緩衝化Ｇ−ＣＳＦ組成物中のＧ−ＣＳＦの量が０．２５ｍｇ／ｍｌ〜６．５ｍｇ／ｍｌの範囲にある、請求項１記載の方法。
【請求項３】
緩衝化Ｇ−ＣＳＦ組成物が３．５〜５の、好ましくは３．７〜４．８のｐＨを有する、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項４】
緩衝化Ｇ−ＣＳＦ組成物中の酢酸またはグルタミン酸塩の濃度が、０．５ｍＭ〜１００ｍＭの、好ましくは２ｍＭ〜８０ｍＭの範囲にある、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｇ−ＣＳＦ組成物中のソルビトールの量が、１０〜１００ｍｇ／ｍｌの、好ましくは２５〜７５ｍｇ／ｍｌの範囲にある、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）にて提供される酢酸またはグルタミン酸塩緩衝化Ｇ−ＣＳＦ水性組成物が１００ｍｌ〜４Ｌ、好ましくは１００ｍｌ〜１．５Ｌの容量を有する、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）におけるＧ−ＣＳＦ組成物を、−１５℃と−２５℃の間の温度に、または−６０℃と−８０℃の間の温度に冷却する、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）における凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物が、少なくとも３ヶ月の期間にわたって貯蔵される、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｄ）における凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物の、２℃〜８℃の範囲内にある温度までの昇温が、少なくとも６時間にわたって、徐々にまたは直線的に、温度を上昇させることによりなされる、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物の、工程（ｄ）における温度までの昇温が、該凍結された組成物を２℃〜８℃の範囲内にある温度に移し、該組成物を該温度で少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも３６時間維持することによりなされる、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｇ−ＣＳＦ組成物が界面活性剤を含まない、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｇ−ＣＳＦ組成物が界面活性剤を含む、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦの医薬組成物を提供する方法であって、
（ａ）非グリコシル化組換えヒトＧ−ＣＳＦを酢酸またはグルタミン酸塩緩衝剤およびソルビトールと共に処方し、緩衝化Ｇ−ＣＳＦ水性組成物を得、ここでＧ−ＣＳＦの量が０．１ｍｇ／ｍｌ〜８．０ｍｇ／ｍｌの範囲にあり、該組成物が１００ｍｌ〜８Ｌの容量を有し；
（ｂ）工程（ａ）のＧ−ＣＳＦ組成物を−１５℃またはそれ以下の温度に冷却し、凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物を得；
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＧ−ＣＳＦ組成物を凍結状態にて少なくとも１ヶ月の期間にわたって貯蔵し；
（ｄ）工程（ｃ）の凍結されたＧ−ＣＳＦ組成物の温度を、該組成物を解凍させるのに調節された期間にわたって２℃ないし８℃の範囲内にある温度にまで上げ、工程（ａ）にて提供された組成物のＧ−ＣＳＦ含量の少なくとも９５％のＧ−ＣＳＦ含量を有する液体組成物を得；および
（ｅ）工程（ｄ）にて得られた液体組成物を非経口的使用のためのプライマリーパッケージに充填する、工程を含む方法。
【国際調査報告】
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