(57)【要約】  機械刺激活性化陽イオンチャネルの活性を調整する作用剤のスクリーニング方法を提供する。機械刺激活性化陽イオンチャネルを拮抗または阻害することによって疼痛を改善するための組成物および方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機械刺激活性化陽イオンチャネルの活性を調整する作用剤のスクリーニング方法であって、
配列番号2、4、18、または20の少なくとも一つに対して少なくとも70％のアミノ酸配列同一性を有する機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドを作用剤と接触させること；および
機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの活性を調整する作用剤を選択すること
を含む方法。
【請求項２】
ポリペプチドが細胞において発現し、接触が、細胞を作用剤と接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ポリペプチドが細胞にとって異種である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
細胞が、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現カセットを含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドが細胞にとって内在性である、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの活性が、ポリペプチドによって媒介される電気生理学的変化を測定することによって決定される、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
電気生理学的変化が、膜電位の変化、電流の変化、または陽イオンの内向き流束である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
膜電位色素アッセイで膜電位を測定することを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
パッチクランプアッセイで電気生理学的変化を測定することを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
測定が、機械刺激によって活性化される電気生理学的変化を測定することを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１１】
機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの活性を調整すると同定された作用剤を、機械刺激によって活性化される電気生理学的変化を調整する能力について試験することを、さらに含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１２】
選択された作用剤が、ポリペプチドによって媒介される電気生理学的変化を低減または阻害する、請求項6に記載の方法。
【請求項１３】
選択された作用剤が、ポリペプチドによって媒介される電気生理学的変化を増加させる、請求項6に記載の方法。
【請求項１４】
細胞が真核細胞である、請求項2に記載の方法。
【請求項１５】
細胞がニューロンである、請求項2に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が動物中にある、請求項2に記載の方法。
【請求項１７】
動物がマウスである、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
作用剤を動物に投与すること、および痛覚感受性に対する作用剤の効果を決定することを、さらに含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号18、または配列番号20を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
ポリヌクレオチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号17、または配列番号19を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項２１】
機械刺激活性化陽イオンチャネルの活性を拮抗する抗体。
【請求項２２】
配列番号2、配列番号4、配列番号18、または配列番号20に対して少なくとも70％のアミノ酸配列同一性を有する機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドに、選択的に結合する、請求項21に記載の抗体。
【請求項２３】
ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号18、または配列番号20を含む、請求項22に記載の抗体。
【請求項２４】
モノクローナル抗体である、請求項22に記載の抗体。
【請求項２５】
ヒト化抗体である、請求項22に記載の抗体。
【請求項２６】
キメラ抗体である、請求項22に記載の抗体。
【請求項２７】
対象における疼痛を改善する方法であって、請求項21〜26のいずれか一項に記載の抗体を対象に投与することを含む方法。
【請求項２８】
ポリペプチドが配列番号4または配列番号20を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
ポリペプチドが、膀胱、結腸、腎臓、肺、または皮膚において発現する、請求項27に記載の方法。
【請求項３０】
ポリペプチドが後根神経節ニューロンにおいて発現する、請求項27に記載の方法。
【請求項３１】
対象が哺乳動物である、請求項27に記載の方法。
【請求項３２】
対象がヒトである、請求項27に記載の方法。
【請求項３３】
疼痛が、急性の機械的疼痛、慢性の機械的疼痛、機械的痛覚過敏、機械的異痛、関節炎、炎症、歯痛、がん性痛、および陣痛からなる群より選択される、請求項27に記載の方法。
【請求項３４】
配列番号1、3、17、または19に対して少なくとも70％同一であり、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの少なくとも15連続ヌクレオチドに相補的であって、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの生産を阻害する、単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉RNA（siRNA）。
【請求項３５】
配列番号1、3、17、または19の少なくとも15連続ヌクレオチドに相補的である、請求項34に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNA。
【請求項３６】
配列番号5〜16のいずれか一つを含む、請求項34に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNA。
【請求項３７】
請求項34に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット。
【請求項３８】
請求項37に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項３９】
請求項38に記載の発現カセットまたは発現ベクターを含む細胞であって、発現カセットまたは発現ベクターが細胞にとって異種である細胞。
【請求項４０】
対象における疼痛を改善する方法であって、請求項34〜36のいずれか一項に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを対象に投与することを含む方法。
【請求項４１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAが、膀胱、結腸、腎臓、肺、または皮膚における機械刺激活性化陽イオンチャネルの生産を阻害する、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAが、後根神経節ニューロンにおける機械刺激活性化陽イオンチャネルの生産を阻害する、請求項40に記載の方法。
【請求項４３】
対象が哺乳動物である、請求項40に記載の方法。
【請求項４４】
対象がヒトである、請求項40に記載の方法。
【請求項４５】
疼痛が、急性の機械的疼痛、慢性の機械的疼痛、機械的痛覚過敏、機械的異痛、関節炎、炎症、歯痛、がん性痛、および陣痛からなる群より選択される、請求項40に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、2010年8月23日に出願された米国仮特許出願第61/376,182号の利益を主張する。この優先権基礎出願は引用によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［連邦政府の後援による研究および開発においてなされた発明に対する権利に関する陳述］
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号DE016927およびNS046303の下で、政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
［発明の背景］
メカノトランスダクション、機械力の生物学的シグナルへの変換は、生理機能において極めて重要な役割を担っている。哺乳動物では、胚発生、触覚、疼痛、固有受容、聴覚、血管緊張および血流の調節、腎臓における流れ感知、肺の成長および傷害、骨および筋ホメオスタシス、ならびに転移が、いずれもメカノトランスダクションによって調節されている（M. Chalfie, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 44 (Jan. 2009)；O. P. Hamill, B. Martinac, Physiol Rev 81, 685 (Apr. 2001)）。植物では、例えば側根形成における形態形成に、機械力が強く影響している（G. B. Monshausen, S. Gilroy, Trends Cell Biol. 19, 228 (May 2009)）。繊毛虫などの単細胞生物でさえ触覚を感知し、触覚刺激に応答して向きを変える（K. Iwatsuki, T. Hirano, Comp. Biochem. Physiol. A. Physiol. 110, 167 (Feb. 1995)）。
【０００４】
脊椎動物内耳有毛細胞からの電気生理学的記録は、メカノトランスダクションが極めて迅速であることを示しており、力によって直接活性化されるイオンチャネルの関与が示唆される（D. P. Corey, A. J. Hudspeth, Biophys. J. 26, 499 (June 1979)）。実際、カルシウム透過性機械刺激活性化（MA）陽イオン電流が、後根神経節（DRG）ニューロン（G. C. McCarter, D. B. Reichling, J. D. Levine, Neurosci. Lett. 273, 179）、腎臓の一次線毛（H. A. Praetorius, K. R. Spring, J Membr Biol 184, 71 (Nov. 1, 2001)）、および植物（G. B. Monshausen, S. Gilroy, Trends Cell Biol. 19, 228 (May 2009)）を含むさまざまな機械刺激感受性細胞において記述されている。しかし、今のところ、同定されたMAチャネルは数少ない。
【発明の概要】
【０００５】
［発明の概略］
本発明は、機械刺激活性化（mechanically-activated）陽イオンチャネルの活性を調整する作用剤のスクリーニング方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、配列番号2、4、18、または20の一つに対して少なくとも70％のアミノ酸配列同一性を有する機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドを作用剤と接触させること；および機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの活性を調整する作用剤を選択することを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドが細胞において発現し、接触が、その細胞を作用剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが前記細胞にとって異種である。いくつかの実施形態では、細胞が、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号17、または配列番号19を含む。別の実施形態では、ポリペプチドが前記細胞にとって内在性である。いくつかの実施形態では、細胞が真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞がニューロンである。
【０００７】
いくつかの実施形態では、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの活性が、そのポリペプチドによって媒介される電気生理学的変化を測定することによって決定される。一定の実施形態では、電気生理学的変化が、膜電位の変化、電流の変化、または陽イオンの内向き流束である。いくつかの実施形態では、膜電位が膜電位色素アッセイで測定される。いくつかの実施形態では、電気生理学的変化がパッチクランプアッセイで測定される。一定の実施形態では、測定が、機械刺激によって活性化される電気生理学的変化を測定することを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの活性を調整すると同定された作用剤を、機械刺激によって活性化される電気生理学的変化を調整する能力について試験することを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、選択された作用剤が、ポリペプチドによって媒介される電気生理学的変化を低減または阻害する。いくつかの実施形態では、選択された作用剤が、ポリペプチドによって媒介される電気生理学的変化を増加させる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、細胞が動物中にある。いくつかの実施形態では、動物がマウスである。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、作用剤を動物に投与すること、および痛覚感受性に対する作用剤の効果を決定することを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号18、または配列番号20を含む。
【００１２】
本発明は、機械刺激活性化陽イオンチャネルの活性を拮抗する抗体も提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号2、配列番号4、配列番号18、または配列番号20に対して少なくとも70％のアミノ酸配列同一性を有する機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドに、選択的に結合する。一定の実施形態では、ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号18、または配列番号20を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、抗体がモノクローナル抗体である。一定の実施形態では、抗体がキメラ抗体である。別の実施形態では、抗体がヒト化抗体である。
【００１５】
本発明は、対象における疼痛を改善する方法も提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、配列番号2、配列番号4、配列番号18、または配列番号20に対して少なくとも70％のアミノ酸配列同一性を有する機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドに選択的に結合する抗体を、対象に投与することを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本方法は、配列番号4または配列番号20を含む機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドに選択的に結合する抗体を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、膀胱、結腸、腎臓、肺、または皮膚において発現する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、後根神経節ニューロンにおいて発現する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、対象が哺乳動物である。一定の実施形態では、対象がヒトである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、疼痛が、急性の機械的疼痛、慢性の機械的疼痛、機械的痛覚過敏、機械的異痛、関節炎、炎症、歯痛、がん性痛、および陣痛からなる群より選択される。
【００１９】
本発明は、配列番号1、3、17、または19に対して少なくとも70％同一でありかつ機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの少なくとも15連続ヌクレオチドに相補的な、単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉RNA（siRNA）も提供し、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAは、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの生産を阻害する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉RNA（siRNA）が、配列番号1、3、17、または19の少なくとも15連続ヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAが配列番号5〜16のいずれかを含む。
【００２１】
本発明は、配列番号1、3、17、または19に対して少なくとも70％同一でありかつ機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの少なくとも15連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットも提供し、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAは、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの生産を阻害する。本発明は、該発現カセットを含むベクターならびに該発現カセットおよび/または該ベクターを含む細胞も提供する。
【００２２】
本発明は、対象における疼痛を改善する方法であって、配列番号1、3、17、または19に対して少なくとも70％同一でありかつ機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの少なくとも15連続ヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉RNA（siRNA）を、対象に投与することを含む方法も提供し、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAは、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの生産を阻害する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAが、膀胱、結腸、腎臓、肺、または皮膚における機械刺激活性化陽イオンチャネルの生産を阻害する。一定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAが、後根神経節ニューロンにおける機械刺激活性化陽イオンチャネルの生産を阻害する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、対象が哺乳動物である。一定の実施形態では、対象がヒトである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、疼痛が、急性の機械的疼痛、慢性の機械的疼痛、機械的痛覚過敏、機械的異痛、関節炎、炎症、歯痛、がん性痛、および陣痛からなる群より選択される。
【００２６】
［定義］
本明細書において使用する以下の用語は、別段の明示がある場合を除き、それらに割り当てられた意味を有する。
【００２７】
用語「機械刺激活性化陽イオンチャネル」は、機械力または圧力の、例えばそのチャネルを発現する細胞への印加に応答して開口することで、細胞内外への正に帯電したイオン（すなわち陽イオン）の通行を可能にするイオンチャネルを指す。本明細書において使用する場合、この用語は、機械刺激活性化陽イオンチャネルのポリペプチド構成要素、例えば陽イオンチャネルのサブユニットも包含する。いくつかの実施形態において、本発明の機械刺激活性化陽イオンチャネルは、配列番号2、配列番号4、配列番号18、または配列番号20と実質的に同一である。いくつかの実施形態において、本発明の機械刺激活性化陽イオンチャネルは、疼痛伝達などの感覚伝達、例えば限定するわけではないが、ニューロンなどの細胞に関与する。
【００２８】
機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチド活性の「インヒビター」、「アクチベーター」および「モジュレーター」は、本明細書では互換的に使用されて、感覚（例えば疼痛または体性感覚）伝達に関するインビトロおよよびインビボアッセイを使って同定される阻害分子、活性化分子、または調整分子、例えばリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、ならびにそれらのホモログおよびミメティックを指す。用語「モジュレーター」はインヒビターおよびアクチベーターを包含する。インヒビターは、例えば結合して、刺激を部分的または全面的にブロックし、活性化を減少させ、防止し、もしくは遅延させ、不活性化し、脱感作し、またはシグナル伝達をダウンレギュレートする化合物、例えばアンタゴニストである。アクチベーターは、例えば結合して、刺激し、増加させ、開口し、活性化し、活性化を促進もしくは強化し、感作し、もしくはシグナル伝達をアップレギュレートする化合物、例えばアゴニストである。モジュレーターには、天然および合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小さい化学分子などが包含される。インヒビターおよびアクチベーターに関する上述のアッセイは、例えば細胞または細胞膜において機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドを発現させること、推定モジュレーター化合物を適用すること、そして次に、イオン流束、膜電位、電気生理、または機械的活性化に対する機能的効果を決定することを含む。潜在的アクチベーター、インヒビター、またはモジュレーターで処理した機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドを含む試料またはアッセイを、インヒビター、アクチベーター、またはモジュレーターなしの対照試料と比較することで、調整の程度を調べる。対照試料（インヒビターで処理していないもの）に、100％の相対的機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチド活性値を割り当てる。機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの阻害は、対照と比較した機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチド活性値が約80％、場合によっては75％、50％、または25〜0％である場合に達成される。機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの活性化は、対照と比較した機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチド活性値が110％、場合によっては125％、場合によっては150％、場合によっては200〜500％、または1000〜3000％高い場合に達成される。
【００２９】
「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびその一本鎖型もしくは二本鎖型のポリマーを指す。この用語は、参照核酸と類似する結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同じように代謝される、合成、天然、および非天然の、既知のヌクレオチド類似体または修飾バックボーン残基もしくは結合を含有する核酸を包含する。そのような類似体の例には、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）などがあるが、これらに限るわけではない。
【００３０】
別段の表示がある場合を除き、特定の核酸配列は、明示的に示された配列に加えて、保存的に修飾されたその変異体（例えば縮重コドン置換）および相補的配列も、暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つ以上の選ばれた（または全ての）コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成することができる（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。用語「核酸」は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドの各用語を包含する。
【００３１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに加えて、1つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学ミメティックであるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３２】
用語「アミノ酸」は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同じように機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティックを指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされているもの、ならびに後から修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたR基を有するか（例えばノルロイシン）、修飾されたペプチドバックボーンを有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸ミメティックとは、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然のアミノ酸と同じように機能する化学化合物を指す。
【００３３】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸配列にも核酸配列にも適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列を指す。遺伝暗号の縮重ゆえに、任意の所与のタンパク質を、多数の機能的に同一な核酸がコードする。例えばコドンGCA、GCC、GCG、およびGCUは全て、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンがアラニンを指定している位置はどこでも、そのコドンを、コードされているポリペプチドを改変することなく、上記の対応するコドンのどれにでも改変することができる。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、これは保存的に修飾された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書に記載の核酸配列はいずれも、その核酸の考えうるサイレント変異の全てを表している。核酸中の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるAUGと、通常はトリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く）を修飾して、機能的に同一な分子を得ることができることは、当業者にはわかるであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載する各配列に、暗に示されている。
【００３４】
アミノ酸配列に関して、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に加えられる個々の置換、欠失または付加であって、コードされている配列中の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を改変し、付加し、または欠失させるものは、その改変が化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす場合には、「保存的に修飾された変異体」であることは、当業者にはわかるであろう。機能的に類似するアミノ酸を記載した保存的置換表は当技術分野では周知である。そのような保存的に修飾された変異体は、本発明の多形変異体、種間ホモログ、およびアレルに加えて挙げられるものであり、これらも除外されるわけではない。
【００３５】
次に挙げる8つの群には、互いに保存的置換であるアミノ酸が含まれている：
1）アラニン（A）、グリシン（G）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リジン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
7）セリン（S）、スレオニン（T）；および 
8）システイン（C）、メチオニン（M)（例えばCreighton「Proteins」（1984）参照）。
【００３６】
「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」という用語は、その自然状態で見いだされるそれには通常付随している構成要素を実質的または本質的に含まない材料を指す。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を使って決定される。調製物中に存在する優勢種であるタンパク質は、実質的に純粋である。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1本のバンドを与えることを表す。特にこれは、核酸またはタンパク質が少なくとも85％純粋、場合によっては少なくとも95％純粋、場合によっては少なくとも99％純粋であることを意味する。
【００３７】
「組換え」という用語を、例えば細胞、または核酸、タンパク質もしくはベクターなどに関して使用する場合、これは、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されていること、あるいはその細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば組換え細胞は、天然（非組換え）型の細胞内には見いだされない遺伝子を発現するか、あるいは天然遺伝子を異常発現するか、過少発現するか、または全く発現しない。
【００３８】
「異種」という用語を、ある細胞に対するタンパク質または核酸の関係について使用する場合、これは、そのタンパク質または核酸が、自然界では、その細胞に対して同じ関係では見いだされないこと（例えばその細胞では発現しないこと）を示す。「異種」という用語を、核酸の一部に関して使用する場合、これは、その核酸が、自然界では互いに同じ関係では見いだされない2つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、典型的には、新しい機能的核酸をもたらすように配置された、無関係な遺伝子に由来する2つ以上の配列、例えばある供給源からのプロモーターと別の供給源からのコード配列とを有する核酸が、組換え生産される。同様に、異種タンパク質とは、そのタンパク質が、自然界では互いに同じ関係では見いだされない2つ以上の部分配列を含むこと（例えば融合タンパク質）を示す。
【００３９】
「プロモーター」は、核酸の転写を指示する一連の核酸制御配列と定義される。本明細書にいうプロモーターには、転写開始部位の近くにある必要な核酸配列、例えばポリメラーゼII型プロモーターの場合であれば、TATAエレメントなどが含まれる。プロモーターには、転写開始部位から数千塩基対も離れて位置する場合がある遠隔エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも、場合によっては含まれる。「構成的」プロモーターは、大半の環境条件下および発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境調節下または発生調節下で活性なプロモーターである。「作動可能に連結された」という用語は、核酸発現制御配列（例えばプロモーター、または一連の転写因子結合部位）と第2の核酸配列の間の機能的連結を指し、ここでは、発現制御配列が、第2の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【００４０】
「発現カセット」は、宿主細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の指定された核酸エレメントを使って組換え的または合成的に作製された核酸コンストラクトである。発現カセットは、プラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントの一部であることができる。典型的には、発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結された、転写されるべき核酸を含む。
【００４１】
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連において、「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、同じである2つ以上の配列または部分配列を指す。後述する配列比較アルゴリズムの一つを使った測定で、または手作業によるアラインメントおよび目視検査による測定で、比較ウインドウまたは指定した領域（指定した長さ、または指定されない場合は全長）にわたって比較し、最大の一致が得られるようにアラインメントした場合に、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドが指定したパーセンテージ（すなわち、指定した領域にわたって70％同一、場合によっては75％、80％、85％、90％、または95％同一）であるならば、それらの配列は「実質的に同一」である。本発明は、例えば配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号17、配列番号18、配列番号19、または配列番号20と実質的に同一な配列を提供する。場合によっては、同一性は、少なくとも約15アミノ酸またはヌクレオチドの長さである領域にわたって、または少なくとも約18アミノ酸またはヌクレオチドの長さ、約20アミノ酸またはヌクレオチドの長さ、約22アミノ酸またはヌクレオチドの長さ、約25〜50アミノ酸またはヌクレオチドの長さ、もしくは約75〜100アミノ酸またはヌクレオチドまたは以上の長さである領域にわたって、存在する。
【００４２】
配列比較のためには、通例、1つの配列を参照配列とし、試験配列をそれと比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合は、試験配列と参照配列とをコンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することもできるし、代替パラメータを指定することもできる。そうすれば、配列比較アルゴリズムが、そのプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【００４３】
本明細書にいう「比較ウインドウ」には、20〜600、通常は約50〜約200、より一般的には約100〜約150からなる群より選択される連続位置数の任意の一つのセグメントであって、その中の配列を、同じ連続位置数の参照配列と、それら2つの配列を最適にアラインメントした後に比較することができるセグメントへの言及が含まれる。比較のために配列をアラインメントする方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所ホモロジーアルゴリズムによって、またはNeedleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、またはPearson & Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Wisconsin Genetics Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Genetics Computer Group、ウィスコンシン州マディソン、サイエンスドライブ575）によって、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって、行うことができる（「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubel et al. eds. 1995 supplement）参照）。
【００４４】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの二つの例が、BLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムであり、これらは、Altschul et al.；Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に、それぞれ記述されている。BLSAT解析を実行するためのソフトウエアは国立バイオテクノロジー情報センターから公に入手することができる。このアルゴリズムでは、まず最初に、クエリ配列中の長さWの短いワードであって、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントした場合に、マッチするか、何らかの正の値を持つ閾スコアTを満たすものを同定することによって、高スコア配列ペア（high scoring sequence pair：HSP）を同定する。Tは隣接ワードスコア閾（neighborhood word score threshold）と呼ばれる（Altschulら、前掲）。これらの初期隣接ワードヒットを、それらを含有する、より長いHSPを見いだすための検索を開始するためのシード（seed）とする。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータM（マッチする残基対に対する報酬スコア（reward score）；常に＞0）およびN（ミスマッチする残基に対するペナルティスコア（penalty score）；常に＜0）を使って計算される。アミノ酸配列の場合は、スコア行列（scoring matrix）を使って累積スコアを計算する。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Xだけ低下するか；1つ以上の負スコア残基アラインメントの蓄積ゆえに、累積スコアが0以下になるか；またはどちらかの配列の末端に到達したら、停止させる。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXは、アラインメントの感度と速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（wordlength：W）11、期待値（expectation；E）10、M＝5、N＝−4および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合は、BLASTPプログラムが、デフォルトとして、ワード長3および期待値（E）10、ならびにBLOSUM62スコア行列（HenikoffおよびHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)参照）、アラインメント（alignments；B）50、期待値（E）10、M＝5、N＝−4、ならびに両鎖の比較を使用する。
【００４５】
BLASTアルゴリズムは2つの配列間の類似性の統計解析も実施する（例えばKarlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)参照）。BLASTアルゴリズムによって得られる類似性の尺度の一つは、最小和確率（smallest sum probability）（P(N)）であり、これは、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の合致が偶然に起こる確率の指標になる。例えば試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満であるなら、その核酸は参照配列に類似しているとみなされる。
【００４６】
「に選択的（または特異的）にハイブリダイズする」という語句は、ある特定ヌクレオチド配列が複雑な混合物（例えば全細胞またはライブラリーDNAまたはRNA）中に存在する場合に、ある分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、その配列にのみ結合し、二重鎖化し、またはハイブリダイズすることを指す。
【００４７】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という表現は、プローブがそのターゲット部分配列に（典型的には複雑な核酸混合物中で）ハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしないような条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況では異なるであろう。長い配列ほど高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する包括的な指針は、Tijssen「Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes」の「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」（1993）に見いだされる。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度、pHにおけるその具体的配列の熱融解点（Tm）よりも約5〜10℃低くなるように選択される。Tmは、平衡時に、ターゲットに相補的なプローブの50％が、ターゲット配列にハイブリダイズする（所定のイオン強度、pH、および核酸濃度における）温度である（ターゲット配列は過剰に存在するので、Tmでは、平衡時に、プローブの50％が占有される）。ストリンジェントな条件は、pH7.0〜8.3において、塩濃度が約1.0Mナトリウムイオン未満、典型的には約0.01〜1.0Mのナトリウムイオン濃度（または他の塩類）であり、温度が、短いプローブ（例えば10〜50ヌクレオチド）の場合は少なくとも約30℃、長いプローブ（例えば50ヌクレオチドを超えるもの）の場合は少なくとも60℃であるような条件になるであろう。ストリンジェントな条件は、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加によって達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも2倍、場合によってはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件として、次の例を挙げることができる：50％ホルムアミド、5×SSC、および1％SDS、42℃でインキュベート、または5×SSC、1％SDS、65℃でインキュベートすると共に、0.2×SSC、および0.1％SDS中、65℃で洗浄。
【００４８】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸であっても、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、実質的に同一である。これは、例えば、ある核酸のコピーを、遺伝暗号が許す最大限のコドン縮重を使って作製した場合に起こる。そのような場合、核酸は典型的には中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、40％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDSのバッファー中、37℃でのハイブリダイゼーション、および1×SSC中、45℃での洗浄が含まれる。陽性ハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも2倍である。代替的ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を利用しても、同様のストリンジェンシーを持つ条件が得られることは、当業者にはすぐに理解されるであろう。
【００４９】
「抗体」は、抗原を認識し特異的に結合する免疫グロブリン遺伝子由来のフレームワーク領域またはそのフラグメントを含むポリペプチドを指す。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子がある。軽鎖はカッパまたはラムダのどちらかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、そしてそれらが、免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEを、それぞれ規定している。
【００５０】
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位はテトラマーを含む。各テトラマーは、同一な2対のポリペプチド鎖から構成され、各対は、1つの「軽」鎖（約25kDa）と1つの「重」鎖（約50〜70kDa）とを有する。各鎖のN末端は、アミノ酸数が約100〜110またはそれ以上の可変領域を規定していて、主に抗原認識を担っている。可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００５１】
抗体は、例えばインタクトな免疫グロブリンとして存在するか、またはさまざまなペプチダーゼを使った消化によって生成する、明確に特徴づけられたいくつかのフラグメントとして存在する。例えばペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、FabのダイマーであるF(ab)'2を生じ、Fabそのものは、軽鎖がジスルフィド結合によってVH-CH1につながれたものである。F(ab)'2は、温和な条件下で還元して、ヒンジ領域中のジスルフィド結合を切断することができ、これにより、F(ab)'2ダイマーがFab'モノマーに転化される。Fab'モノマーは、本質的に、ヒンジ領域部分を伴うFabである（「Fundamental Immunology」（Paul編、第3版、1993）参照）。さまざまな抗体フラグメントがインタクトな抗体の消化という観点から定義されているが、そのようなフラグメントを化学的に、または組換えDNA法を使って、デノボ合成できることは、当業者には理解されるであろう。したがって、本明細書において使用する抗体という用語は、抗体全体の修飾によって生成する抗体フラグメントや、組換えDNA法を使ってデノボ合成されたもの（例えば単鎖Fv）、またはファージディスプレイライブラリーを使って同定されたもの（例えばMcCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)参照））も包含する。
【００５２】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の製造には、当技術分野において知られている任意の技法を使用することができる（例えばKohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)；Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983)；Cole et al.「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」（1985）のpp.77-96参照）。単鎖抗体を製造するための技法（米国特許第4,946,778号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体を製造するために適合させることができる。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物、例えば他の哺乳動物を使って、ヒト化抗体を発現させることもできる。あるいは、ファージディスプレイ技術を使って、選択した抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーFabフラグメントを同定することができる（例えばMcCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)；Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)参照）。
【００５３】
「キメラ抗体」は、（a）定常領域またはその一部が改変、置換、または交換されて、抗原結合部位（可変領域）が、異なるまたは改変されたクラス、エフェクター機能および/または種の定常領域に連結されているか、そのキメラ抗体に新しい性質を付与する全く異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などに連結されている抗体分子、あるいは（b）可変領域またはその一部が、異なる抗原特異性または改変された抗原特異性を有する可変領域で、改変、置換、または交換されている抗体分子である。
【００５４】
「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体の反応性を保持しており、しかもヒトにおける免疫原性が低い抗体である。これは、例えば、非ヒトCDR領域を保ちつつ、抗体の残りの部分をそのヒト対応物で置き換えることによって、達成することができる。例えばMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)；Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)；Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991)；Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)を参照されたい。
【００５５】
タンパク質またはペプチドに関して、抗体に「特異的（または選択的）に結合する」または「〜と特異的（または選択的）に免疫反応する」という語句は、タンパク質および他の生物製剤（biologics）の不均一な集団における、そのタンパク質の存在を決定づける結合反応を指す。したがって、明示されたその抗体は、指定されたイムノアッセイ条件下で、ある特定タンパク質にバックグラウンドの少なくとも2倍は結合するが、その試料中に存在する他のタンパク質には、有意な量では実質的に結合しない。そのような条件下での抗体への特異的結合は、特定タンパク質に対するその特異性によって選択された抗体を必要としうる。例えば、ラット、マウス、またはヒトなどといった特定の種からのPiezo1またはPiezo2に対して生じたポリクローナル抗体は、Piezo1またはPiezo2と特異的に免疫反応し、Piezo1またはPiezo2の多形変異体およびアレルを除く他のタンパク質とは免疫反応しないポリクローナル抗体だけが得られるように、選択することができる。この選択は、他の種からのPiezo1またはPiezo2分子と交差反応する抗体を差し引くことによって達成することができる。さまざまなイムノアッセイフォーマットを使って、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ELISAイムノアッセイは、あるタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用されている（例えば、特異的免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイフォーマットおよび条件の説明については、HarlowおよびLane「Using Antibodies, A Laboratory Manual」(1998)を参照されたい）。典型的には、特異的または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも2倍、より典型的には、バックグラウンドの10〜100倍以上であるだろう。
【００５６】
「対象」または「個体」は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または他の哺乳動物を含む動物を指す。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】Neuro2AおよびC2C12細胞は異なるタイプの機械刺激活性化電流を示す。（A，B）Neuro2A細胞（N2A，A）およびC2C12細胞（B）において発現する機械刺激活性化（MA）内向き電流の代表的トレース。ホールセルパッチ構成において、保持電位を-80mVとし、刺激ピペット（挿入図、矢印）を使って、1μm刻みで、細胞を一連の機械的ステップに付した。（C）-80mVの保持電位において誘発された電流に関する、N2A細胞およびC2C12細胞における、機械的ステップ（持続時間150ms）の最後において不活性化された電流の、ピーク電流に対する比（平均値±SEM、バーの上は細胞数）。***，P＜0.001。（D，E）N2A細胞（D，n＝11）およびC2C12細胞（E，n＝4）におけるMA電流の平均電流-電圧関係。挿入図、-80mVから+40mVまでの範囲にわたる保持電位（機械的ステップの0.7秒前に適用）において惹起された代表的なMA電流。（F）N2A細胞およびC2C12細胞中、-80mVの保持電位において誘発された、MA内向き電流の平均最大振幅（平均値±SEM、試験した細胞の数をバーの上に示す）。*，P＜0.05。（G）N2A細胞中、-80mVから+80mVまでの範囲にわたる保持電位において、負のピペット圧（挿入図、矢印）によって誘導された単一チャネル電流（セルアタッチトパッチ構成）。（H）N2A細胞における伸展活性化単一チャネルの平均電流-電圧関係（n＝4，平均値±SEM）。単一チャネルコンダクタンスは各細胞の線形回帰線の傾きから算出され、γ＝22.9±1.4pS（平均値±SEM）が得られる。単一チャネル振幅を、全トレースヒストグラムのガウスフィットにおける振幅差として決定した。（I）N2A細胞において負のピペット圧（0〜-60mmHg，Δ10mmHg）によって誘導された代表的電流（平均トレース）。（J）ボルツマン式とフィットさせた-80mVにおける伸展活性化電流の規格化された電流-圧力関係（n＝21）。P50は個々の細胞からのP50の平均値である。
【図２】Piezo1（Fam38A）siRNAによる機械刺激活性化電流の抑制。（A）スクランブルsiRNA（左端のドット、n＝56）、Piezo1（Fam38A）siRNA（右下のドット、n＝20）または試験した他の候補に対するsiRNA（黒いドット、候補の一覧は表S2として入手可能）をトランスフェクトしたN2A細胞中、-80mVの保持電位において誘発されたMA内向き電流の平均最大振幅。各候補について、黒い丸とエラーバーはそれぞれ平均値±SEM（n＝4〜27）を表す。黒い線は試験した全細胞の平均値を表し（n＝807）、2本の破線はこの値の4倍減または4倍増を表す。（B）スクランブルsiRNA（上側のトレース）またはPiezo1（Fam38A）siRNA（下側のトレース）をトランスフェクトしたN2A細胞中、-80mVの保持電位において発現した、MA内向き電流の代表的トレース。（C）スクランブルsiRNA（左側のバー）またはさまざまなPiezo1（Fam38A）siRNAのいずれかをトランスフェクトしたN2A細胞中、-80mVの保持電位において誘発された、MA内向き電流の平均最大振幅。siRNA1、2、および3は、個別に試験したsmart-pool IのsiRNAである。（D）スクランブルsiRNA（左側のパネル）またはPiezo1 siRNA（右側のパネル）をトランスフェクトしたN2A細胞において負のピペット圧（0〜-60mmHg，Δ10mmHg，セルアタッチト）によって誘導された代表的電流（平均トレース）。-60mmHgによって誘発された電流のトレースが強調されている。（E）スクランブルsiRNA（左側のバー）またはPiezo1 siRNA（右側のバー）をトランスフェクトしたN2A細胞中、-80mVの保持電位において誘発された、伸展活性化電流の平均最大振幅。バーは平均値±SEMを表し、試験した細胞の数がバーの上に示されている。**，P＜0.01、***，P＜0.001。
【図３】Piezo1 siRNA qPCRおよび細胞生存性対照、ならびにインテグリン機能を破壊した後のN2A MA電流。（A）N2A細胞におけるPiezo1 mRNAのsiRNA誘導性ダウンレギュレーション。トランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞が選別されていないので、これらの差は過小評価されている。（B）TRPV1およびGFPをスクランブルsiRNAまたはPiezo1 siRNAと共に同時トランスフェクトしたカプサイシン刺激N2A細胞の代表的レシオメトリックカルシウムイメージング実験（GFP陽性細胞トレースの平均値±SEM）。（C）カプサイシンに応答するGFP陽性細胞のパーセンテージおよびカプサイシン応答細胞のFura-2 340/380比倍率変化（平均値±SEM）。（D）対照条件下で、または5mM EGTAを含有する二価イオン非含有溶液（divalent free solution）による30〜60分間の灌流後に、N2A細胞中、-80mVの保持電位において誘発された、ホールセルMA電流の最大電流振幅。（E）対照条件下または5mM EGTAを含有する二価イオン非含有溶液による30〜60分間の灌流後のピークに対して規格化されたMA電流の代表的トレース（左側のパネル）。電流の不活性化を単一指数式（mono-exponential equation）とフィットさせる。二価陽イオンの非存在下では、不活性化の時定数が、対照溶液の場合よりも高い（右側のパネル）。***，P＜0.001，対応のないt検定。
【図４】Piezo1およびPiezo2の進化的保存、疎水性プロット、および発現プロファイル。（A）Piezoタンパク質ファミリーの異なるメンバーの配列関係を示す無根系統樹。MegalignおよびDrawTreeプログラムを使ってアラインメントを作成した。点線は、フィットを調整するために人為的に延長した線を表す。Hs，ヒト（Homo Sapiens）；Mm，マウス（Mouse musculus）；Gg，ニワトリ（Gallus gallus）、Dr，ゼブラフィッシュ（Danio Rerio）；Ci，カタユウレイボヤ（Ciona intestinalis）；Dm，キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）；Ce，カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）；Dd，キイロタマホコリカビ（Dictyostelium discoidem）；At，シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）；Os，イネ（Oryza sativa）；Tt，テトラヒメナ・サーモフィラ（Tetrahymena thermophila）（アクセッション番号は方法の項に記載する）。（B）マウスPiezo1の疎水性分析。Kyte-Doolittleパターン（19残基ウインドウ）が疎水性領域と親水性領域の連続を示している。TMHMM2により、30個の膜貫通ドメインが予想される。（C）さまざまな成体マウス組織からのqPCRによって決定されたPiezo1（左側のパネル）およびPiezo2（右側のパネル）のmRNA発現プロファイル。2-ΔΔCT法を使って、GAPDHを参照遺伝子として使用し、肺を組織キャリブレーターとして使用した。各バーは2回の別々の実験の平均の平均値＋SEMである。
【図５】Piezo1は大きな機械刺激活性化非選択性陽イオン電流誘を誘導する。（A〜F）ホールセル構成で記録した、Piezo1を発現するN2A（A〜C）およびHEK293T（D〜F）細胞のMA電流。（A，D）Piezo1をトランスフェクトした異なる細胞タイプにおいて発現したMA内向き電流の代表的トレース。ガラスプローブ刺激を使用し、-80mVの保持電位において、1μm（A）または0.5μm（D）刻みで、細胞を一連の機械的ステップに付した。（B，E）Piezo1をトランスフェクトした異なる細胞タイプにおいて発現したMA電流の代表的電流-電圧関係。挿入図，-80〜+40mVの範囲にわたる保持電位において惹起されたMA電流。（C，F）Piezo1トランスフェクト細胞（右側のバー）またはモックトランスフェクト細胞（左側のバー）中、-80mVの保持電位において誘発された、MA内向き電流の平均最大振幅。バーは平均値±SEMを表し、試験した細胞の数をバーの上に示す。***，P＜0.001。（G）Piezo1発現細胞におけるMA電流のPX/PCsイオン選択性比。（H）30μMガドリニウムまたはルテニウムレッドによるPiezo1発現細胞におけるMA電流のブロック率。（I〜N）セルアタッチト構成における、マウスPiezo1を発現するN2A細胞（I〜K）およびHEK293T細胞（L〜N）の伸展活性化電流。Piezo1をトランスフェクトしたN2A細胞（I）およびHEK293T細胞（L）において、負のピペット圧（0〜-60mmHg，Δ10mmHg）によって誘導された代表的平均電流。Piezo1をトランスフェクトしたN2A細胞（J，n＝12）およびHEK293T細胞（M，n＝11）中、-80mVにおいて誘発された伸展活性化電流の規格化された電流-圧力関係（ボルツマン式とフィットさせたもの）。P50は、個々の細胞について決定された全てのP50の平均値である。モックトランスフェクトするか（左側のバー）またはPiezo1をトランスフェクトした（右側のバー）N2A細胞（K）およびHEK293T細胞（N）中、-80mVの保持電位において誘発された、伸展活性化電流の平均最大振幅。バーは平均値±SEMを表し、試験した細胞の数をバーの上に示す。***，P＜0.001。**，P＜0.01。
【図６】Piezo1誘導MA電流はガドリニウムおよびルテニウムレッドによってブロックされる陽イオン非選択性電流である。（A〜C）ホールセル構成で記録したPiezo1発現C2C12細胞のMA電流。（A）Piezo1トランスフェクト細胞中で発現したMA内向き電流の代表的トレース。ガラスプローブ刺激を使用し、-80mVの保持電位において、1μm刻みで、細胞を一連の機械的ステップに付す。（B）Piezo1トランスフェクト細胞において発現したMA電流の代表的電流-電圧関係。挿入図，-80〜+40mVの範囲にわたる保持電位において惹起されたMA電流。（C）Piezo1トランスフェクト細胞（右側のバー）またはモックトランスフェクト細胞（左側のバー）中、-80mVの保持電位において誘発された、MA内向き電流の平均最大振幅。バーは平均値±SEMを表し、試験した細胞の数をバーの上に示す。***，P＜0.001，ウェルチの補正をした対応のないt検定。（D）対照溶液に浸した（左側のパネル）、または150mM NMDG-Cl溶液による灌流後の（中央のパネル）、Piezo1トランスフェクト細胞において誘発された、ホールセルMA電流トレース。-80mVから+80mVまで40mVステップで電流を誘発する。右側のパネルは同じ細胞からのMA電流-電圧関係を示している。対照条件（黒塗りの記号）において存在する内向き電流が、外部NMDG-Cl溶液（白抜きの記号）で抑制されることに注目されたい。（E〜F）Piezo1トランスフェクトHEK293T細胞において誘発されたMA電流の平均電流-電圧関係（CsClベースの内部溶液および150mM NaCl、150mM KCl、100mM CaCl2、もしくは100mM MgCl2ベースの細胞外溶液で記録したもの）。（E）個々の細胞からのI-V関係を、液間電位を補正する前の-40mVにおける値に対して規格化した。（F）各記録条件および個々の細胞について決定された逆転電位値の平均（平均値±SEM）。（G〜H）30μMガドリニウム（E）またはルテニウムレッド（F）の灌流前、灌流中および灌流後に、Piezo1トランスフェクト細胞において誘発されたMA電流の代表的電流トレース。
【図７】Piezo2はPiezo1誘導電流とは動態的に異なる大きな機械刺激活性化電流を誘導する。（A〜F）ホールセル構成における、Piezo2を発現するN2A細胞（A〜C）およびHEK293T細胞（D〜F）のMA電流。N2A細胞では、Piezo2またはベクターのみを、内在性Piezo1依存性MA電流を抑制するためのPiezo1 siRNAと同時トランスフェクトした。（A，D）Piezo2をトランスフェクトした異なる細胞タイプにおいて発現したMA内向き電流の代表的トレース。ガラスプローブ刺激を使用し、-80mVの保持電位において、1μm刻みで、細胞を一連の機械的ステップに付した。（B，E）Piezo2をトランスフェクトした異なる細胞タイプにおいて発現したMA電流の代表的電流-電圧関係。挿入図，-80〜+40mVの範囲にわたる保持電位において惹起されたMA電流。（C，F）Piezo1トランスフェクト細胞（右側のバー）またはモックトランスフェクト細胞（左側のバー）中、-80mVの保持電位において誘発された、MA内向き電流の平均最大振幅。（G〜H）Piezo1（右側のトレース）またはPiezo2（左側のトレース）をトランスフェクトした細胞中、明記した保持電位において発現した、機械刺激活性化内向き（G）または外向き（H）電流の代表的トレース。トレースはピークに対して規格化されており、破線は、不活性化の単一指数式とのフィットを表す。（I）負（-80および-40mV、上側のパネル）および正（40および80mV、下側のパネル）の保持電位における、Piezo1（左側のバー）およびPiezo2（右側のバー）の不活性化の時定数。バーは平均値±SEMを表し、バーの上の数字は細胞数である。**，P＜0.01。***，P＜0.001。
【図８】Piezo2誘導MA電流は陽イオン非選択性である。（A）対照溶液に浸した（左側のパネル）、およびNMDG-Cl溶液による灌流後の（右側のパネル）、Piezo2トランスフェクト細胞において誘発された、ホールセルMA電流トレース。-80、-40、0、+40および+80mVにおいて電流を誘発した。（B）同じ細胞からのMA電流-電圧関係。対照条件（黒塗りの記号）において存在する内向き電流が、NMDG-Cl溶液（白抜きの記号）で抑制されたことに注目されたい。（C）30μMガドリニウム（上側のパネル）またはルテニウムレッド（下側のパネル）の灌流前、灌流中および灌流後に、Piezo2トランスフェクト細胞において誘発されたMA電流の代表的電流トレース。（D）30μMガドリニウムおよびルテニウムレッドによるPiezo2発現細胞におけるMA電流のブロック率。バーは平均値±SEMを表し、試験した細胞の数をバーの上に示す。
【図９】Piezo1抗体はトランスフェクトHEK293T細胞中のPiezo1を検出する。（A）Piezo1-IRES-EGFPトランスフェクト細胞（緑色）中のPiezo1ラベリング（赤色）の代表的画像。GFP陰性（したがって非トランスフェクト）細胞がラベリングを欠くことに注目されたい。（B）Piezo1の一部は、TRPA1およびPiezo1同時トランスフェクトHEK293T細胞の形質膜またはその近傍に発現する。形質膜を明示するために細胞をTRPA1抗体で生細胞ラベリング（緑色）し、固定し、透過処理し、Piezo1（赤色）およびMYC（総TRPA1）について染色した。挿入図，オーバーレイ像において枠で囲んだ領域の拡大図である。スケールバー＝20μm。
【図１０】DRGニューロンにおけるPiezo2のsiRNAノックダウンは急速不活性化（fast-inactivating）MA電流を選択的に低減する。（A）アンチセンスプローブ（左側のパネル）およびセンスプローブ（右側のパネル）を使った後根神経節（DRG）ニューロン中のPiezo2に関する比色インサイチューハイブリダイゼーションの代表的画像。（B）DRGニューロンにおいて発現した3つの典型的MA内向き電流の代表的トレースは、異なる不活性化動態によって特徴づけられる。-80mVの保持電位において、1μm刻みで、ニューロンを一連の機械的ステップに付す。電流不活性化は、双指数式（bi-exponential equation）とフィットさせて7.3msの速い時定数（τ）と＞100msの遅い時定数（左側のパネル）を与えるか、単一指数式とフィットさせて27msの時定数（中央のパネル）を与える。150ms持続するステップ刺激中、τ＞30msの一部の電流は、遅すぎて効率よくフィットさせることができない（右側のパネル）。（C〜D）その不活性化動態によって特徴づけられるMA電流をもって機械的刺激に応答する、スクランブルsiRNA（Ctr）またはPiezo2 siRNA（siRNA）をトランスフェクトしたニューロンの比率を示す頻度ヒストグラム。バーは、7回の独立した実験からのニューロンの比率の平均値±SEM（B，1条件あたりおよび1実験あたりn＝12〜19ニューロン）または7回全ての実験からプールした全てのニューロンからの比率（C）；Cのバーの上の数字はニューロンの数を表す。**，P＜0.01。ns，有意差なし。
【図１１】Piezo2 mRNAはDRGニューロンのサブセットにおいて発現する。Piezo2蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（左側のパネル）と、マウスDRGにおけるペリフェリン（A，中央のパネル）およびニューロフィラメント200（NF200）（B，中央のパネル）免疫染色、ならびに（C）ラットDRGにおけるTRPV1（中央のパネル）免疫染色との組合せは、Piezo2陽性ニューロンのうち、60％はペリフェリンも発現し（合計1188のニューロンのうち、Piezo2はn＝204、ペリフェリンはn＝555で、そのうちの23％がPiezo2を発現する）；28％はNF200も発現し（合計1203のニューロンのうち、Piezo2はn＝277、NF200はn＝368で、そのうちの19％がPiezo2を発現する）、24％はTRPV1も発現した（合計975のニューロンのうち、Piezo2はn＝233、TRPV1はn＝394で、そのうちの15％がPiezo2を発現する）ことを示している。矢じりは、Piezo2および各マーカーを発現するニューロンの例を示す（A〜C、右側のパネル）。スケールバー＝50μm。
【図１２】DRGおよびPiezo2 siRNA対照実験ならびにDRGニューロンのMA電流不活性化の比較。（A〜B）培養DRGニューロンにおけるTRPA1のsiRNA媒介ノックダウン。（A）スクランブルsiRNA対照（n＝415ニューロン、左側パネル）およびTRPA1 siRNA（n＝467ニューロン、右側パネル）をトランスフェクトした培養DRGニューロンでのレシオメトリックカルシウムイメージングの代表的トレース。（B）2回の独立したトランスフェクションから、カラシ油（MO、TRPA1チャネルのアゴニスト）およびカプサイシン（CAPS、TRPV1チャネルのアゴニスト）に応答するニューロンの平均パーセンテージを、トランスフェクションの48〜72時間後にアッセイした。MO（100μM）に対するレスポンダーのパーセンテージはsiRNA処理すると有意に低減し（スクランブル：15.34±3.69％；siRNA：2.48±0.96％；P＝0.0286、マン-ホイットニー検定）、CAPS（0.5μM）に対する応答はTRPA1 siRNA処理による影響を受けない（スクランブル：27.43±5.81％；siRNA：32.28±3.84％；ns）。バーは平均値±SEMを表す。（C）Piezo2 siRNAの存在下または非存在下でのPiezo2誘導MA電流の平均最大振幅。内在性MA電流を抑制するためにPiezo1 siRNAをトランスフェクトしたN2A細胞に、Piezo2 cDNAまたはPiezo2 cDNA＋Piezo2 siRNAを同時トランスフェクトした。（D）スクランブルsiRNAトランスフェクトDRGニューロンにおいて記録されたMA電流の不活性化の時定数のヒストグラム。不活性化の時定数が≦30msであるMA電流を発現するニューロンの数を、2.5msのビンを使ってプロットした（＞30msの時定数を有する電流の不活性化動態は、遅すぎて、150msにわたって正確にフィットさせることができない）。二重ガウス式（double Gaussian equation）とのフィットは、それぞれ7.2±0.5msおよび16.0±2.1msに中心を有する2つのピークを示す。（E）機械的刺激の150ms後の不活性化された電流の量（I[不活性化]，右側の両頭矢印）とピーク時の電流の量（I[ピーク]，左側の両頭矢印）との比較を示すMA電流のトレース例（左側のパネル）。150ms時点における電流不活性化の度合が異なるDRGニューロンのパーセンテージ（100％を完全に不活性化された状態とする5％刻みのI[不活性化]/I[ピーク]）を、スクランブルsiRNAトランスフェクト条件またはPiezo2 siRNAトランスフェクト条件で比較している（右側のパネル，各ペアにおいてそれぞれ左側のバーおよび右側のバー）。
【００５８】
［発明の詳細な説明］
I．序論
本発明は、細胞でのメカノトランスダクションにおける「Piezo」タンパク質と呼ばれる複数回膜貫通型タンパク質の役割を同定するものである。1つ以上のPiezoタンパク質が、動物、植物、および他の真核生物種、例えば、限定するわけではないが、脊椎動物（例えばヒトおよびマウスなどの哺乳動物、ニワトリなどの鳥、およびゼブラフィッシュなどの魚）、無脊椎動物（例えばユウレイボヤ（Ciona）、ショウジョウバエ（Drosophila）、ハマダラカ（Annopheles）、およびシー・エレガンス（C. elegans））、アラビドプシス（Arabidopsis）、イネ、および繊毛虫などにおいて同定されているが、これらのPiezoタンパク質の機能的特徴づけは今までに報告されていない。Piezoタンパク質は中等度に保存された二次構造と、一般に約2100アミノ酸から約4700アミノ酸までの全長とを有し、約24〜36個の膜貫通ドメインが推定タンパク質の全体にわたって配置されている。Piezoの過剰発現はロバストな機械刺激活性化電流を誘導し、一方、Piezo発現の阻害は機械刺激活性化電流を低減することを、ここに初めて実証する。本発明の範囲を限定するつもりはないが、Piezoは、細胞におけるメカノトランスダクションに、機械刺激活性化陽イオンチャネルの構成要素として参加すると考えられる。
【００５９】
したがって本発明は、作用剤を、Piezoタンパク質と実質的に同一なポリペプチドと接触させることにより、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの活性を調整する作用剤のスクリーニング方法を提供する。本発明は、機械刺激活性化陽イオンチャネルの活性を拮抗するPiezoタンパク質に対する抗体と、該抗体を投与することによって対象における疼痛を改善する方法も提供する。本発明はさらに、Piezoタンパク質の生産を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAと、該アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを投与することによって対象における疼痛を改善する方法とを提供する。本発明はさらに、該方法を実施するためのキットを提供する。
【００６０】
II．機械刺激活性化陽イオンチャネル活性のモジュレーターに関するアッセイ
一態様において、本発明は、機械刺激活性化陽イオンチャネルの活性を調整する作用剤のスクリーニング方法であって、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドを作用剤と接触させること；および機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの活性を調整する作用剤を選択することを含む方法を提供する。
【００６１】
A．機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの発現
機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチド、および該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Piezo膜貫通タンパク質ファミリーのメンバーと実質的に同一である。いくつかの実施形態では、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドが、配列番号2、4、18、または20のいずれか一つと実質的に同一（例えば少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一）である。いくつかの実施形態では、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドが、配列番号2、4、18、または20のいずれかを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、機械刺激活性化陽イオンチャネルの活性を調整する作用剤のスクリーニング方法が、配列番号2、4、18、または20のいずれか一つと実質的に同一（例えば少なくとも70％の同一性を有する）機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドを含む細胞を、作用剤と接触させること、および機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの活性を調整する作用剤を選択することを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドを内在性に発現する。いくつかの実施形態では、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドが細胞にとって異種である。
【００６３】
配列番号2、4、18、または20のいずれかに対して少なくとも70％の同一性を有する機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドを検出可能なレベルで内在性に発現する細胞はどれでも、本発明のスクリーニング方法において使用することができる。ある細胞が機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドを検出可能なレベルで内在性に発現するかどうかは、当技術分野において知られている任意の核酸またはタンパク質発現方法によって決定することができる。核酸は、ノーザン分析、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、マイクロアレイ、配列解析、またはマーカーコード配列の一部に相補的な核酸配列へのハイブリダイゼーションに基づく他の任意の方法（例えばスロットブロットハイブリダイゼーション）などの日常的技法を使って検出することができる。タンパク質は、日常的な抗体ベースの技法、例えばELISA、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光、および免疫組織化学などのイムノアッセイを使って検出することができる。配列番号2、4、18、または20のいずれか一つに対して少なくとも70％の同一性を有する機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドを検出可能なレベルで内在性に発現する細胞の例として、Neuro2Aが挙げられるが、これに限るわけではない。
【００６４】
あるいは、発現カセットを使って、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドを、目的の細胞中で異種性に発現させることもできる。本明細書において述べる機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットは、当技術分野において既知の技法を使って作製される。
【００６５】
いくつかの実施形態では、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号1、3、17、または19のいずれか一つと実質的に同一（例えば少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一）である。いくつかの実施形態では、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号1、3、17、または19のいずれか一つを含む。本開示のポリヌクレオチドは、化学的方法によって合成するか、当技術分野において周知の技法によって調製することができる。例えばCreighton「Proteins: Structures and Molecular Principles」W.H.Freeman & Co.，ニューヨーク州ニューヨーク（1983）を参照されたい。本開示の機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、当業者に周知の技法に従って、合成しかつ/またはクローニングし、発現させることができる。例えばSambrook, et al.「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」Vol.1〜3，Cold Spring Harbor Press，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1989）を参照されたい。
【００６６】
機械刺激活性化陽イオンチャネルをコードするポリヌクレオチド配列は、cDNAライブラリーおよびゲノムDNAライブラリーから、プローブとのハイブリダイゼーションによってクローニングするか、またはオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅技法を使って単離することができる。例えば、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリヌクレオチド配列は、配列番号1、3、17、または19に由来しうる配列を有する核酸プローブとハイブリダイズさせることによって、哺乳動物核酸（ゲノムまたはcDNA）ライブラリーから単離することができる。cDNAライブラリーを作成しスクリーニングするための方法はよく知られている（例えばGubler & Hoffman, Gene 25:263-269 (1983)；Sambrook et al., 前掲書；Ausubel et al., 前掲書を参照されたい）。機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドRNAおよびcDNAを単離することができる適切な組織には、後根神経節、神経、ニューロン、膀胱、結腸、腎臓、肺、および皮膚などがあるが、これらに限るわけではない。
【００６７】
これに代わる機械刺激活性化陽イオンチャネルポリヌクレオチドの単離方法では、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用と、RNAまたはDNAテンプレートの増幅とを組み合わせる（米国特許米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号参照；「PCR Protocols: A Guide to Methods and Application」（Innis et al.編, 1990）参照）。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびリガーゼ連鎖反応（LCR）などの方法を使って、機械刺激活性化陽イオンチャネルの核酸配列を、mRNA、cDNA、ゲノムライブラリー、またはcDNAライブラリーから、直接的に増幅することができる。増幅技法は当技術分野では知られており、例えばSambrook, et al., 1989「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」Vol.1〜3, Cold Spring Harbor Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい。プライマーは、公的に利用可能なデータベースに見いだされるポリヌクレオチド配列を使って調製することができる。PCR反応によって増幅された遺伝子をアガロースゲルから精製し、宿主における増殖のための選択可能マーカーを含有する適当なベクター中にクローニングすることができる。そのようなマーカーには、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、ならびに大腸菌（E. coli）および他の細菌での培養のためのテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシン耐性遺伝子などがあるが、これらに限るわけではない。
【００６８】
機械刺激活性化陽イオンチャネルをコードするcDNAなどといった、クローン化された遺伝子または核酸の高レベル発現を得るために、典型的には、転写を指示するための強力なプロモーター、転写/翻訳ターミネーター、そしてタンパク質をコードする核酸の場合には、翻訳開始用のリボソーム結合部位を含有する発現ベクターに、機械刺激活性化陽イオンチャネルをサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは、当技術分野ではよく知られており、例えばSambrook et al.およびAusubel et al.に記載されている。機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドを発現させるための細菌発現系は、例えば大腸菌、バチルス（Bacillus）属、およびサルモネラ（Salmonella）で利用することができる（Palva et al., Gene 22:229-235 (1983)；Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983)）。そのような発現系のためのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞用の真核発現系は当技術分野ではよく知られており、同様に市販されている。
【００６９】
異種核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、具体的応用に依存する。プロモーターは、場合によっては、その自然環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ異種転写開始部位からの距離に位置する。ただし、当技術分野において知られているとおり、この距離の多少の変動は、プロモーター機能の喪失を伴わずに許容されうる。
【００７０】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、宿主細胞における機械刺激活性化陽イオンチャネルコード核酸の発現に必要な追加エレメントを全て含有する転写単位または発現カセットを含有する。したがって、典型的な発現カセットは、機械刺激活性化陽イオンチャネルをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、ならびに転写産物の効率のよいポリアデニル化、リボソーム結合部位、および翻訳ターミネーションに必要なシグナルを含有する。コードされているタンパク質の形質転換細胞による分泌を促進するために、機械刺激活性化陽イオンチャネルをコードする核酸配列は、典型的には、切断可能なシグナルペプチド配列に連結することができる。そのようなシグナルペプチドとしては、なかんずく、組織プラスミノゲン活性化因子、インスリン、およびニューロン成長因子、ならびにニセアメリカタバコガ（Heliothis virescens）の幼若ホルモンエステラーゼに由来するシグナルペプチドが挙げられるだろう。カセットの追加エレメントとしては、エンハンサー、そしてゲノムDNAを構造遺伝子として使用する場合には、機能的スプライスドナー部位およびアクセプター部位を伴うイントロンを挙げることができる。
【００７１】
プロモーター配列に加えて、発現カセットは、効率のよいターミネーションに備えて、構造遺伝子の下流に転写ターミネーション領域も含有することができる。ターミネーション領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ることもできるし、異なる遺伝子から得ることもできる。
【００７２】
細胞中に遺伝情報を輸送するために使用される発現ベクターの詳細は、とりわけ決定的な問題ではない。真核細胞または原核細胞における発現に使用される従来のベクターはどれでも使用することができる。標準的な細菌発現ベクターとして、pBR322系プラスミド、pSKF、pET23Dなどのプラスミド、ならびにGSTおよびLacZなどの融合発現系が挙げられる。便利な単離方法を提供するために、例えばc-mycなどのエピトープタグを組換えタンパク質に付加することもできる。
【００７３】
真核生物発現ベクターには、通例、真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクター、例えばSV40ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バーウイルス由来のベクターなどが使用される。他の例示的真核生物ベクターとして、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、バキュロウイルスpDSVE、およびSV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効であることが示されている他のプロモーターの指揮下でのタンパク質の発現を可能にする他の任意のベクターが挙げられる。
【００７４】
いくつかの発現系は、遺伝子増幅をもたらすマーカー、例えばチミジンキナーゼ、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼなどを有する。あるいは、遺伝子増幅を伴わない高収量発現系、例えば昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターをポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指揮下にある機械刺激活性化陽イオンチャネルコード配列と共に使用するものも、好適である。
【００７５】
発現ベクターに通例含まれているエレメントとして、大腸菌中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にするための、抗生物質耐性をコードする遺伝子、プラスミドの非必須領域にある、真核生物配列の挿入を可能にするためのユニーク制限部位も挙げられる。選択した抗生物質耐性遺伝子の詳細は決定的な問題ではなく、当技術分野において知られている数多くの耐性遺伝子はどれでも好適である。必要であれば、真核細胞におけるDNAの複製を妨害しないように、場合によっては、原核生物配列が選択される。
【００７６】
異種プロモーターによって駆動される機械刺激活性化陽イオンチャネルコード配列を含む組換え発現ベクターは、さまざまな周知の手法のいずれかを使って、所望の宿主細胞のゲノム中に導入することができる。これらの手法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマ（plasma）ベクター、ウイルスベクター、およびクローン化されたゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞中に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用などがある（例えばSambrook et al., 前掲書参照）。必要なのは、使用するその遺伝子工学手法が、機械刺激活性化陽イオンチャネルを発現する能力を有する宿主細胞中に、少なくとも1つの遺伝子をうまく導入することができるという点だけである。
【００７７】
B．陽イオンチャネル活性の調整に関するスクリーニング
1．陽イオンチャネル活性アッセイ
Piezoは、機械刺激活性化陽イオンチャネルの構成要素である。Piezoと実質的に同一なポリペプチドを含む機械刺激活性化陽イオンチャネルの活性は、さまざまなインビトロおよびインビボアッセイを使って、例えば（機械刺激感受性アッセイと機械的刺激には依存しないアッセイの両方で）電流の変化などの電気生理学的変化を測定するアッセイ、二次メッセンジャーおよび転写レベルを測定するアッセイ、リガンド結合を測定するアッセイ、陽イオン内向き流束を測定するアッセイ、および電圧感受性色素、イオン感受性色素（例えばCa2+）を使用するアッセイなどを使って、評価することができる。さらにまた、そのようなアッセイは、機械刺激活性化陽イオンチャネルのインヒビターおよびアクチベーターに関する試験にも使用することができる。そのようなモジュレーターは、機械刺激活性化陽イオンチャネルが関与するさまざまな生涯を処置するのに有用である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、機械刺激活性化陽イオンチャネルの活性を調整（活性化または阻害）する作用剤が、機械的刺激に依存しない側面を測定するアッセイ、例えば電圧固定アッセイまたはパッチクランプアッセイ、電圧感受性色素、イオン感受性色素、陽イオン内向き流束アッセイなどを使った初期スクリーニングにおいて同定される。そのようなアッセイを使って機械刺激活性化陽イオンチャネルの活性をアゴナイズまたは阻害すると同定された作用剤を、次に、機械刺激活性化陽イオンチャネルの活性を機械刺激依存的に調整する能力について、例えば圧電駆動の圧力アッセイまたは膜伸展アッセイを使って機械刺激感受性アッセイにおけるその作用剤のアゴニスト効果またはアンタゴニスト効果を試験することにより、スクリーニングすることができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、機械刺激活性化陽イオンチャネルの活性を調整する作用剤が、本明細書において述べるように機械刺激感受性アッセイを使って、初期スクリーンにおいて同定される。
【００８０】
モジュレーターは、Piezoと実質的に同一な、組換え体または天然物である、生物学的に活性な機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドを使って試験される。機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドは、単離するか、細胞中で同時発現もしくは発現させるか、または細胞に由来する膜中で発現させることができる。調整は上述のインビトロまたはインビボアッセイの一つを使って試験される。潜在的機械刺激活性化陽イオンチャネルインヒビターまたはアクチベーターで処理された試料またはアッセイを、試験化合物を含まない対照試料と比較することで、調整の程度を調べる。対照試料（アクチベーターまたはインヒビターで処理されていないもの）に、100の相対的機械刺激活性化陽イオンチャネル活性値を割り当てる。機械刺激活性化陽イオンチャネルの阻害は、対照と比較した機械刺激活性化陽イオンチャネル活性値が、約90％未満、例えば75％未満、50％未満、または25％未満である場合に達成される。機械刺激活性化陽イオンチャネルの活性化は、対照と比較した機械刺激活性化陽イオンチャネル活性値が、110％以上、125％以上、150％以上、または200％以上高い場合に達成される。イオンの流束を増加させる化合物は、機械刺激活性化陽イオンチャネルが開いている確率を増加させること、それが閉じている確率を減少させること、チャネルのコンダクタンスを増加させること、および/またはイオンの通行を可能にすることによって、イオン電流密度の検出可能な増加を引き起こすであろう。
【００８１】
イオン流束の変化は、機械刺激活性化陽イオンチャネルを発現する細胞または膜の分極（すなわち電位）の変化を決定することによって評価することができる。細胞分極の変化を決定するための方法は、電圧固定およびパッチクランプ技法、例えば「セルアタッチト」モード、「インサイド-アウト」モード、「ホールセル」モードで、電流の変化を測定すること（それによって分極の変化を測定すること）による（例えばAckerman et al., New Engl. J. Med. 336:1575-1595 (1997)を参照されたい）。ホールセル電流は標準的な方法を使って便利に決定される（例えばHamill et al., Pflugers. Archiv. 391:85-100 (1981)を参照されたい）。他の既知アッセイには放射標識イオン流束アッセイおよび電圧感受性またはイオン感受性色素を用いる蛍光アッセイなどがある（例えばVestergarrd-Bogind et al., J. Membrane Biol. 88:67-75 (1988)；Daniel et al., J. Pharmacol. Meth. 25:185-193 (1991)；Holevinsky et al., J. Membrane Biology 137:59-70 (1994)を参照されたい）。機械刺激活性化陽イオンチャネルを通る陽イオン流束を阻害または増加させる能力を有する化合物に関するアッセイは、本発明のチャネルを有する細胞と接触しそれを含むバス溶液への化合物の適用によって行うことができる（例えばBlatz et al., Nature 323:718-720 (1986)；Park, J. Physiol. 481:555-570 (1994)参照）。一般に、試験されるべき化合物は、1pMから100mMまでの範囲で存在する。
【００８２】
チャネルの機能に対する試験化合物の効果は、電流もしくはイオン流束の変化によってまたは電流および流束の変化の帰結によって測定することができる。電流またはイオン流束の変化は、陽イオン（例えばカルシウム、ナトリウム、カリウム、またはマグネシウムイオン）などのイオンの流束の増加または減少によって測定される。イオンはさまざまな標準的方法で測定することができる。これらは、イオンの濃度変化、例えば細胞内濃度の変化によって直接的に測定するか、膜電位によってまたはイオンの放射標識によって間接的に測定することができる。イオン流束に対する試験化合物の帰結は極めてさまざまでありうる。したがって、任意の適切な生理学的変化を使って、本発明のチャネルに対する試験化合物の影響を評価することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、アッセイにおいて使用される機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドが、次に挙げるGenBankアクセッション番号に表示される配列を有するであろう：ヒトPiezo1−NP_001136336.2；マウスPiezo1−NP_001032375.1；ニワトリPiezo1−XP_414209.2またはXP_423106.2；ゼブラフィッシュPiezo1−XP_696355.4；ヒトPiezo2−NP_071351.2；マウスPiezo2−NP_001034574.3；ニワトリPiezo2−XP_419138.2；ゼブラフィッシュPiezo2−XP_00266625.1；またはそれらの保存的に修飾された変異体、オルソログ、および/もしくは実質的に同一な変異体。一般に、アミノ酸配列同一性は、少なくとも65％、例えば少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも99％であるだろう。
【００８４】
Piezoオルソログ、アレル、多形変異体、および保存的に修飾された変異体は、一般に、上述のような機械刺激活性化陽イオンチャネルに、実質的に類似する性質を付与するであろう。いくつかの実施形態では、Piezoホモログであると疑われる化合物と接触させた細胞を、真核細胞、例えばゼノパス（Xenopus）（例えばアフリカツメガエル（Xenopus laevis））の卵母細胞、またはCHOもしくはHeLa細胞などの哺乳動物細胞におけるイオン流束の増加もしくは減少について、または類似する細胞タイプを使った結合試験でアッセイされるように、アッセイする。Piezoと同様の影響を化合物によって受けるチャネルは、Piezoのホモログまたはオルソログとみなされる。
【００８５】
2．機械刺激感受性陽イオンチャネル活性アッセイ
いくつかの実施形態では、Piezoと実質的に同一であるポリペプチドを含むチャネルにおいて、機械刺激によって活性化される電気生理学的変化を調整する能力について、作用剤がスクリーニングされる。機械刺激感受性アッセイは当技術分野において知られており、例えばピエゾ駆動の圧力、パッチ膜伸展、ずれ応力、浸透圧刺激、および両親媒性化合物などがある。
【００８６】
限定でない一例として、細胞における機械刺激によって活性化される電気生理学的変化を調整する作用剤の能力は、圧電駆動のメカニカルプローブによる刺激を測定するホールセル記録を使ってアッセイすることができる。ピエゾ駆動の圧力をアッセイする方法は記述されており、例えばHu and Lewin, J. Physiol. 577:815-828 (2006)を参照されたい。簡単に述べると、典型的には、ファイアポリッシュ（fire-polish）したガラスプローブが細胞表面近くに≧45°の角度で配置される。Clampex（Molecular Devices, カリフォルニア州サニーベール）で制御された圧電結晶マイクロステージを使って、プローブを、制御された速度で、かつ制御された長さの時間、細胞に向かって駆動し、機械刺激活性化内向き電流を記録する。機械的刺激の強さ、速度、および持続時間などといったパラメータを変更することが有用でありうることは、当業者にはわかるであろう。
【００８７】
もう一つの限定でない例として、細胞において機械刺激によって活性化される電気生理学的変化を調整する作用剤の能力は、セルアタッチトモードにおいて、パッチピペットによる形質膜の伸展によって、アッセイすることができる。パッチ膜伸展をアッセイする方法は記述されており、例えばGil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:14594-14599 (1999)を参照されたい。簡単に述べると、ヒートポリッシュ（heat-polish）したパッチピペットの先端を細胞の膜に押しつけた後、Clampexで制御された圧力クランプ（例えばHSPC-1圧力クランプ、ALA Scientific Instruments、ニューヨーク州ウェストベリー）を使って、そのパッチピペットにわずかな陰圧を適用することにより、オンセル（on-cell）パッチまたはセルアタッチトパッチを形成させ、機械刺激活性化内向き電流を記録する。当業者には、電圧ならびに適用される圧力の量および持続時間などといったパラメータを変更することが有用でありうることは、当業者にはわかるであろう。
【００８８】
3．ソリッドステート（solid state）および高スループットアッセイ
本発明の高スループットアッセイでは、最大で数千、1万、10万またはそれ以上の異なるモジュレータまたはリガンドを、1日でスクリーニングすることができる。具体的には、マイクロタイタープレートの各ウェルを使って、選ばれた潜在的モジュレーターに対する別々のアッセイを行うか、濃度効果またはインキュベーション時間効果を観察したい場合には、5〜10個ごとのウェルで、1つのモジュレーターを試験することができる。したがって、1枚の標準的マイクロタイタープレートで約100（例えば96）個のモジュレーターをアッセイすることができる。1536ウェルプレートを使用すれば、1枚のプレートで約100〜約1500個の異なる化合物を容易にアッセイすることができる。1日あたり数枚の異なるプレートをアッセイすることも可能であり、本発明の統合システムを使うことで、最大で約6,000〜20,000またはそれ以上の異なる化合物について、アッセイスクリーンを行うことが可能である。最近、マイクロ流体工学的な試薬操作の手法が、例えばCaliper Technologies（カリフォルニア州パロアルト）などによって開発されており、それらを使用することができる。
【００８９】
限定でない一例として、IonWorks（商標）HT（Molecular Devices，カリフォルニア州サニーベール）などの高スループット電気生理学的スクリーニングシステムを使って、潜在的モジュレーターを、機械刺激活性化陽イオンチャネルに対する効果についてスクリーニングすることができる。簡単に述べると、IonWorks（商標）HTシステムは、384ウェルプレートを使って、複数の細胞から同時にホールセル電流を測定する。目的の電位作動性イオンチャネルを発現する細胞を、オンボード流体工学システムを使って、個々のウェルに、並列に分注した後、単一の細胞が各ウェル内の単一の小さな開口部に配置される。この開口部は、流体で満たされた2つの孤立した上部および下部チャンバーを隔てており、それら上部および下部チャンバーはそれぞれ緩衝溶液と別々の電極を含有している。配置された細胞は開口部の上に安定なシールを形成し、2つのチャンバー間の電気の流れを妨害する。細胞膜ポア形成剤（例えばアンホテリシンB）を下部チャンバーに導入することで、細胞膜のうち、各ウェルの小さい開口部を通して露出している部分に電気経路を生成させる。48個の電極を持つ電子工学ヘッドを上部チャンバーに配置して、細胞膜電位を固定し、次に48個の細胞からのイオン電流を並列に記録する。12チャンネル流体工学ヘッドピペッターを使って、96ウェルまたは384ウェルマイクロプレートから化合物を吸引し、並列に分注する。
【００９０】
目的の分子は、ソリッドステート構成要素に、共有結合または非共有結合を介して、例えばタグを介して、直接的または間接的に結合することができる。タグは、さまざまな構成要素のいずれであることもできる。一般的には、タグに結合する分子（タグ結合剤）を固形支持体に固定し、タグとタグ結合剤の相互作用によって、目的のタグ付き分子（例えば機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチド）を固形支持体にとりつける。
【００９１】
文献に詳しく記述されている既知の分子相互作用に基づいて、いくつかのタグとタグ結合剤を使用することができる。例えば、ビオチン、プロテインA、またはプロテインGなど、タグに天然の結合剤がある場合は、それを適当なタグ結合剤（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、免疫グロブリンのFc領域など）と一緒に使用することができる。ビオチンなどの天然結合剤を有する分子に対する抗体も広く入手することができ、適当なタグ結合剤である；SIGMA Immunochemicals 1998カタログ（SIGMA、ミズーリ州セントルイス）参照。
【００９２】
同様に、タグ/タグ結合剤ペアを形成させるために、任意のハプテン化合物または抗原化合物を適当な抗体と組み合わせて使用することができる。何千もの特異的抗体が市販されており、他にも数多くの抗体が文献に記載されている。例えば、よくある構成の一つでは、タグが第1の抗体であり、タグ結合剤が第1の抗体を認識する第2の抗体である。抗体-抗原相互作用に加えて、受容体-リガンド相互作用もタグおよびタグ結合剤ペアとして適当である。例えば、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト（例えばトランスフェリン、c-kit、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体および抗体、カドヘレイン（cadherein）ファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなどの細胞受容体-リガンド相互作用）；例えばPigott & Power「The Adhesion Moleculae Facts Book I」(1993)を参照されたい。同様に、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えばオピエート、ステロイドなど）、細胞内受容体（例えばステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンDを含むさまざまな小リガンド、ペプチドの効果を媒介するもの）、薬物、レクチン、糖類、核酸（線状ポリマー構成と環状ポリマー構成の両方）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質および抗体は、いずれも、さまざまな細胞受容体と相互作用することができる。
【００９３】
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテートなどの合成ポリマーも、適当なタグまたはタグ結合剤を形成することができる。この開示を検討した当業者には明白であるだろうとおり、他の多くのタグ/タグ結合剤ペアも、本明細書に記載するアッセイ系では有用である。
【００９４】
ペプチド、ポリエーテルなどの一般的リンカーは、タグとしても役立つことができ、これには、約5〜200アミノ酸のポリGly配列などのポリペプチド配列が含まれる。そのようなフレキシブルなリンカーは、当業者には知られている。例えばポリ(エチレングリコール)リンカーは、Shearwater Polymers, Inc.（アラバマ州ハンツビル）から入手することができる。これらのリンカーは、場合により、アミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能性（heterofunctional）結合を有する。
【００９５】
タグ結合剤は、現在利用できるさまざまな方法のいずれかを使って、固形基体に固定される。固形基体は、一般に、基体の全部または一部を、タグ結合剤の一部と反応する化学基を表面に固定する化学試薬に曝露することによって、誘導体化または官能化される。例えば、より長い鎖部分への取り付けに適した基としては、アミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基が挙げられるだろう。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランは、ガラス表面などのさまざまな表面を官能化するために使用することができる。そのような固相生体高分子アレイの構築は文献に詳しく記述されている。例えばMerrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)（ペプチドなどの固相合成が記述されている）；Geysen et al., J. Immun. Meth. 102:259-274 (1987)（ピン上での固相構成要素の合成が記述されている）；Frank & Doring, Tetrahedron 44:60316040 (1988)（セルロースディスク上でのさまざまなペプチド配列の合成が記述されている）；Fodor et al., Science, 251:767-777 (1991)；Sheldon et al., Clinical Chemistry 39(4):718-719 (1993)；およびKozal et al., Nature Medicine 2(7):753759 (1996)（固形基体に固定された生体高分子のアレイが記述されている）を参照されたい。基体にタグ結合剤を固定するための非化学的アプローチには、他の一般的方法、例えば熱、UV照射による架橋などがある。
【００９６】
4．検証
上記のスクリーニング方法のいずれかによって最初に同定された作用剤をさらに試験して、見掛けの活性を検証し、かつ/またはその作用剤の他の生物学的効果を決定することができる。いくつかの例では、同定された作用剤を動物（例えばマウスなどの非ヒト哺乳動物）に投与して、痛覚感受性に対する作用剤の効果を決定する。
【００９７】
C．陽イオンチャネル活性を調整する作用剤
機械刺激活性化陽イオンチャネルのモジュレーターとして試験される化合物は、任意の小さい化学化合物または生物学的実体、例えばタンパク質、糖、核酸もしくは脂質であることができる。典型的には、試験化合物は小さい化学分子およびペプチドであるだろう。本質的に、本発明のアッセイでは、任意の化学化合物を潜在的モジュレーターまたはリガンドとして使用できるが、ほとんどの場合、化合物は水溶液または有機（とりわけDMSOベースの）溶液に溶解することができる化合物が使用される。アッセイは、アッセイステップを自動化すること、および通例（例えばロボットアッセイにおいてマイクロタイタープレート上でのマイクロタイターフォーマットで）並列に処理される化合物を任意の好都合な供給源からアッセイに供給することにより、大きな化合物ライブラリーがスクリーニングされるように設計される。化学化合物の供給者は、Sigma（ミズーリ州セントルイス）、Aldrich（ミズーリ州セントルイス）、Sigma-Aldrich（ミズーリ州セントルイス）、Fluka Chemika-Biochemica Analytika（スイス・ブーフス）など、数多く存在することは理解されるであろう。
【００９８】
ある実施形態では、高スループットスクリーニング法が、多数の潜在的治療化合物（潜在的モジュレーターまたはリガンド化合物）を含有するコンビナトリアル化合物またはペプチドライブラリーを用意することを伴う。次に、そのような「コンビナトリアル化合物ライブラリー」または「リガンドライブラリー」を、本明細書に記述するような1つ以上のアッセイでスクリーニングすることにより、所望の特徴的活性を示すライブラリーメンバー（特に化学種または化学サブクラス）を同定する。こうして同定された化合物は従来の「リード化合物」とするか、それら自身を潜在的治療薬または実際の治療薬として使用することができる。
【００９９】
コンビナトリアル化合物ライブラリーは、化学的合成または生物学的合成により、試薬などの化学的「ビルディングブロック」をいくつか組み合わせることによって作製される、多様な化学化合物の収集物である。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの線状（linear）コンビナトリアル化合物ライブラリーは、一組の化学的ビルディングブロック（アミノ酸）を所与の化合物長（すなわちポリペプチド化合物中のアミノ酸数）に関して考えうる全ての方法で組み合わせることによって形成される。化学的ビルディングブロックのそのようなコンビナトリアル混合により、何百万もの化学化合物を合成することができる。
【０１００】
コンビナトリアル化合物ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者にはよく知られている。そのようなコンビナトリアル化合物ライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば米国特許第5,010,175号、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991)およびHoughton et al., Nature 354:84-88 (1991)参照）があるが、これに限るわけではない。化学的多様性ライブラリーを作製するために他の化学を使用することもできる。そのような化学には、次に挙げるものがあるが、これらに限るわけではない：ペプトイド（例えばPCT公開番号WO 91/19735）、コードされたペプチド（例えばPCT公開WO 93/20242）、ランダムバイオオリゴマー（例えばPCT公開番号WO 92/00091）、ベンゾジアゼピン類（例えば米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン類、ベンゾジアゼピン類およびジペプチド類などのダイバーソマー（diversomer）（Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)）、ビニロガス（vinylogous）ポリペプチド（Hagiharaら, J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)）、グルコーススキャフォールドを有する非ペプチドペプチドミメティック（Hirschrnann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)）、低分子化合物ライブラリーの類似有機合成（analogous organic syntheses of small compound libraries）（Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)）、オリゴカルバメート（Cho et al., Science 261:1303 (1993)）、および/またはペプチジルホスホネート（Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)）、核酸ライブラリー（Ausubel、BergerおよびSambrook、いずれも前掲書参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば米国特許第5,539,083号参照）、抗体ライブラリー（例えばVaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996)およびPCT/US96/10287参照）、糖質ライブラリー（例えばLiang et al., Science, 274:1520-1522 (1996)および米国特許第5,593,853号参照）、低分子量有機分子ライブラリー（例えばベンゾジアゼピン類、Baum C&EN, 1月18日号, 33ページ(1993)；イソプレノイド類、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノン類およびメタチアザノン類、米国特許第5,549,974号；ピロリジン類、米国特許第5,525,735号および同第5,519,134号；モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン類、米国特許第5,288,514号など）。
【０１０１】
コンビナトリアルライブラリーを調製するためのデバイスは市販されている（例えば357MPS、390MPS［Advanced Chem Tech，ケンタッキー州ルイビル］；Symphony［Rainin，マサチューセッツ州ウォーバーン］；433A［Applied Biosystems，カリフォルニア州フォスターシティ］；9050 Plus［Millipore，マサチューセッツ州ベッドフォード］）。また、数多くのコンビナトリアルライブラリーそのものが市販されている（例えばComGenex（ニュージャージー州プリンストン）、Tripos, Inc.（ミズーリ州セントルイス）、3D Pharmaceuticals（ペンシルベニア州エクストン）、Martek Biosciences（メリーランド州コロンビア）など）。
【０１０２】
III．機械刺激活性化陽イオンチャネルの発現を阻害する
A．抗体
もう一つの態様において、本発明は、機械刺激活性化陽イオンチャネルに特異的に結合する抗体を提供する。そのような抗体は、例えば対象における疼痛または痒みを改善または処置するのに有用である。適切な抗体には、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメント（すなわちFv、Fab、(Fab')2、またはscFv）などがあるが、これらに限るわけではない。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号2、配列番号4、配列番号18、または配列番号20に対して少なくとも70％のアミノ酸配列同一性を有する機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体が、配列番号2、配列番号4、配列番号18、または配列番号20を含むポリペプチドに選択的に結合する。
【０１０４】
モノクローナル抗体は当業者によく知られているさまざまな技法によって得られる。簡単に述べると、所望の抗原で免疫した動物の脾細胞を、一般的には骨髄腫細胞との融合によって、不死化する（例えばKohler & Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519 (1976)）。代替的な不死化方法には、エプスタイン・バーウイルス、がん遺伝子、もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当技術分野において周知の他の方法がある。単一の不死化細胞から生じたコロニーを、抗原に対して所望の特異性およびアフィニティーを有する抗体の生産についてスクリーニングする。そのような細胞によって生産されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹膜腔への注入など、さまざまな技法によって高めることができる。あるいは、Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)に概説されている一般プロトコールに従ってヒトB細胞からのDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体またはその結合性フラグメントをコードするDNA配列を単離してもよい。
【０１０５】
モノクローナル抗体を集め、イムノアッセイで、例えば免疫原が固形支持体上に固定化されている固相イムノアッセイで、免疫原に対する力価を測定する。モノクローナル抗体は通常は少なくとも約0.1mM、より一般的には少なくとも約1μMのKdで結合するであろうし、多くの場合、1nM未満のKdで結合するように設計することができる。
【０１０６】
例示的一実施形態では、ウサギまたはマウスなどの動物を、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードする核酸コンストラクトで免疫する。免疫化の結果として生産される抗体は標準的方法を使って単離することができる。
【０１０７】
本発明の免疫グロブリンは、その結合性フラグメントおよび他の誘導体を含めて、さまざまな組換えDNA技法によって、例えばトランスフェクト細胞（骨髄腫またはハイブリドーマ細胞などの不死化真核細胞）における発現、またはマウス、ラット、ウサギ、もしくは抗体を生産する能力を有する他の脊椎動物における発現などにより、周知の方法で容易に製造することができる。DNA配列の適切な供給細胞ならびに免疫グロブリンの発現および分泌のための宿主細胞は、American Type Culture Collection（Catalogue of Cell Lines and Hydridomas, Fifth edition (1985)、メリーランド州ロックビル）など、数多くの供給源から入手することができる。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、抗体が、ヒト化抗体、すなわち非ヒト抗体の反応性を保持していて、しかもヒトにおける免疫原性が低い抗体である。これは、例えば、機械刺激活性化陽イオンチャネルに特異的な非ヒトCDR領域を保持し、抗体の残りの部分をそのヒト対応部分で置き換えることによって、達成することができる。例えばMorrison et al., PNAS USA, 81:6851-6855 (1984)；Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)；Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991)；Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)を参照されたい。抗体をヒト化するための技法は当技術分野ではよく知られており、例えば米国特許第4,816,567号；同第5,530,101号；同第5,859,205号；同第5,585,089号；同第5,693,761号；同第5,693,762号；同第5,777,085号；同第6,180,370号；同第6,210,671号；および同第6,329,511号；WO 87/02671；EP特許出願第0173494号；Jonesら (1986) Nature 321:522；ならびにVerhoyenら (1988) Science 239:1534に記述されている。ヒト化抗体はさらに、例えばWinter and Milstein (1991) Nature 349:293に記述されている。例えば、ヒト化された免疫グロブリンフレームワーク領域をコードする第1配列と、所望の免疫グロブリン相補性決定領域をコードする第2配列セットとを含むポリヌクレオチドを、合成的に、または適当なcDNAセグメントとゲノムDNAセグメントとを組み合わせることによって、作製することができる。ヒト定常領域DNA配列は、さまざまなヒト細胞から、周知の手法で単離することができる。本発明の免疫グロブリンを作製するためのCDRは、機械刺激活性化陽イオンチャネルに特異的に結合する能力を有するモノクローナル抗体から同様に得られるであろう。
【０１０９】
いくつかの例では、ヒトフレームワークへのCDRの移植が、ヒト化抗体に、特異性の喪失をもたらす。これらの場合、抗体のヒト部分のフレームワーク領域に、復帰変異を導入することができる。復帰変異を作る方法は、当技術分野ではよく知られており、例えばCo et al., PNAS USA 88;2269-2273 (1991)およびWO 90/07861に記述されている。
【０１１０】
機械刺激活性化陽イオンチャネル特異的抗体はキメラであることもでき、この場合は、可変領域の全部または大部分が保持されているが、定常領域は置き換えられている。例えば、機械刺激活性化陽イオンチャネル結合活性を有するマウス可変領域を、ヒト定常領域または獣医学的処置に使用される他の哺乳動物由来の定常領域と組み合わせることができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、抗体が、Fab、F(ab')2、FvまたはscFvなどの抗体フラグメントである。抗体フラグメントは、例えば化学的消化（例えばパパインまたはペプシン）や組換え法など、当技術分野において知られている任意の手段を使って生成させることができる。組換え核酸を単離し調製するための方法は当業者に知られている（Sambrook et al.「Molecular Cloning. A Laboratory Manual」（第2版1989）；Ausubel et al.「Current Protocols in Molecular Biology」（1995）参照）。抗体は、大腸菌、他の細菌宿主、酵母、ならびに他の高等真核細胞、例えばCOS、CHO、およびHeLa細胞株、ならびに骨髄腫細胞株を含むさまざまな宿主細胞において発現させることができる。
【０１１２】
B．siRNAおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド
もう一つの態様において、本発明は、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの生産を阻害するオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列を提供する。そのような阻害核酸配列は、例えば対象における疼痛または痒みを改善しまたは処置するのに有用である。適切なオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドとして、siRNAおよびアンチセンスヌクレオチドが挙げられるが、これらに限るわけではない。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、配列番号1、3、17、または19に対して少なくとも70％同一なポリヌクレオチドの少なくとも15連続ヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、配列番号1、3、17、または19に対して少なくとも70％同一なポリヌクレオチドの少なくとも18、少なくとも20、少なくとも22、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、または少なくとも50個の連続ヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、または配列番号16のいずれかを含む。
【０１１４】
1．siRNA
機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドをコードする遺伝子に対応する二本鎖siRNAは、mRNA転写産物の分解を誘導することによって機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの転写および/または翻訳をサイレンシングするために、したがって機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの発現を防止することによって疼痛または痒みを改善または処置するために、使用することができる。siRNAは、典型的には約5〜約100ヌクレオチド長、より典型的には約10〜約50ヌクレオチド長、最も典型的には約15〜約30ヌクレオチド長である。siRNA分子とそれらの生成方法は、例えばBass, 2001, Nature, 411, 428-429；Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498；WO 00/44895；WO 01/36646；WO 99/32619；WO 00/01846；WO 01/29058；WO 99/07409；およびWO 00/44914に記載されている。dsRNAまたはsiRNA（例えばヘアピン二重鎖として）を転写するDNA分子もRNAiをもたらす。dsRNAを転写するためのDNA分子は、米国特許第6,573,099号、ならびに米国特許出願公開第2002/0160393号および同第2003/0027783号、ならびにTuschl and Borkhardt, Molecular Interventions, 2:158 (2002)に開示されている。例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号17、または配列番号19に示す核酸配列と特異的にハイブリダイズするdsRNAオリゴヌクレオチドは、本発明の方法において使用することができる。干渉性RNAの非存在下で検出される症状と比較した疼痛症状の重症度の減少を使って、siRNAの効力をモニターすることができる。
【０１１５】
siRNAは、siRNAの注射、吸入、または経口摂取など、当技術分野において知られる任意の手段を使って、対象に送達することができる。もう一つの適切なsiRNA用送達システムは、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系（水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む）などである。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボでの送達媒体として有用な人工膜小胞である。リポソーム内の核酸（RNAおよびDNAを含む）は、生物学的活性な形で細胞に送達される（Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 6:77，1981）。リポソームは、当技術分野において知られている任意の手段を使って、特定の細胞タイプまたは組織にターゲティングすることができる。
【０１１６】
2．アンチセンスオリゴヌクレオチド
機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドをコードする核酸配列に特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドも、機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの転写および/または翻訳をサイレンシングするために、したがって疼痛または痒みを改善または処置するために、使用することができる。例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号17、または配列番号19に示す核酸配列に特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、本発明の方法において使用することができる。アンチセンス核酸の非存在下で検出される症状と比較した疼痛症状の重症度の減少を使って、アンチセンス核酸の効力をモニターすることができる。
【０１１７】
アンチセンス核酸は、特異的mRNA分子の少なくとも一部分に相補的なDNA分子またはRNA分子である（例えばWeintraub, Scientific American, 262:40 (1990)参照）。通例、合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般には、15〜25塩基長である。アンチセンス核酸は、天然ヌクレオチド、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、-アノマー糖ホスフェート、バックボーン修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを含みうる。
【０１１８】
細胞では、アンチセンス核酸が対応するmRNAにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。細胞は二本鎖であるmRNAを翻訳しないので、アンチセンス核酸はmRNAの翻訳を妨害する。約15ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。というのも、それらは合成が容易であるし、ターゲットヌクレオチド変異体生産細胞中に導入した場合に、より大きな分子と比べて問題を引き起こす可能性が低いからである。遺伝子のインビトロ翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用は、当技術分野では周知である（Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, (1988)）。それほど一般的ではないが、DNAに直接結合するアンチセンス分子も使用することができる。
【０１１９】
機械刺激活性化陽イオンチャネルをコードする遺伝子に特異的なアンチセンスポリヌクレオチドの送達は、例えばポリヌクレオチドの直接的注射、吸入、または接種など、当技術分野において知られている任意の手段を使って達成することができる。加えて、組換え発現ベクター（例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、またはレトロウイルスに基づくウイルスベクター）または本明細書に記載するコロイド分散系（例えばリポソーム）を使って、アンチセンスポリヌクレオチドを送達することもできる。
【０１２０】
IV．機械刺激活性化陽イオンチャネル媒介疾患を処置する方法
さらにもう一つの態様において、本発明は、機械刺激活性化陽イオンチャネルのアンタゴニストを含む組成物を提供する。本発明の組成物は、機械刺激活性化陽イオンチャネルを介して伝達される疼痛が関与する疾患または状態を改善または処置するために提供することができる。
【０１２１】
機械刺激活性化陽イオンチャネルは、触覚、圧迫、振動、固有受容、および疼痛など、さまざまな感覚の伝達に関係するとされている。したがって、機械刺激活性化陽イオンチャネルのアンタゴニストは、これらの感覚の伝達の改変、例えば急性痛もしくは慢性痛、疼痛もしくは触覚に対する感受性の亢進、または疼痛もしくは触覚の強度の亢進をもたらす触覚経路または疼痛経路の改変を特徴とする疾患または状態を有する対象に投与することができる。
【０１２２】
ある実施形態では、本発明の組成物（例えば機械刺激活性化陽イオンチャネルに選択的に結合する抗体または機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチドの生産を阻害するオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド）を、急性の機械的疼痛、慢性の機械的疼痛、機械的痛覚過敏、機械的異痛、関節炎、炎症、歯痛、がん性痛、および陣痛からなる群より選択される疼痛を有する対象に提供することができる。
【０１２３】
本発明の組成物は、単回投与するか、複数回投与するか、またはある期間（例えば2、3、4、5、6日もしくは1〜3週間またはそれ以上）にわたって定期的に（例えば毎日）投与することができる。
【０１２４】
本発明の組成物は、機械刺激活性化陽イオンチャネル活性をブロックするために、当技術分野における任意の経路を使って、例えば注射（例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、または皮内）、吸入、経皮適用、直腸投与、または経口投与などによって、哺乳動物対象に直接投与することができる。
【０１２５】
本発明の医薬組成物は、医薬上許容される担体を含みうる。医薬上許容される担体は、一つには、投与されるその組成物によって決まり、またその組成物を投与するために使用されるその方法によっても決まる。したがって、本発明の医薬組成物の適切な製剤は、広範囲にわたってさまざまである（例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」第17版、1989）。
【０１２６】
本発明の組成物は、単独で、または他の適切な構成要素と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる（すなわちそれらは「噴霧」することができる）。エアロゾル製剤は加圧された許容される噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などに入れることができる。
【０１２７】
投与に適した製剤としては、水性および非水性溶液、酸化防止剤、緩衝剤、静細菌剤、およびその製剤を等張性にする溶質を含有することができる等張性滅菌溶液、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および保存剤を含むことができる水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。本発明の実施においては、組成物を、例えば経口投与、鼻腔投与、局所外用、静脈内投与、腹腔内投与、または髄腔内投与することができる。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアルなどの1回量または複数回量密封容器に入れて提示することができる。溶液および懸濁液は、今までに記述された種類の滅菌された粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。モジュレーターは、加工調理済み食品または薬物の一部として投与することもできる。
【０１２８】
経口投与に適した製剤は、次に挙げるものを含むことができる：（a）液状溶液剤、例えば有効量のパッケージングされた核酸が、水、食塩水、またはPEG400などの希釈剤に懸濁されているもの；（b）それぞれが、前もって決定された量の活性成分を、液状物、固形物、顆粒またはゼラチン質として含有する、カプセル剤、分包、または錠剤；（c）適当な液体中の懸濁液；および（d）適切なエマルション。錠剤形は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、矯味矯臭剤、色素、崩壊剤、および医薬上適合する担体の1つ以上を含むことができる。トローチ剤（lozenge）形は、矯味矯臭薬（flavor）、例えばスクロース中に、活性成分を含むことができ、例えばゼラチンとグリセリンまたはスクロースとアラビアゴムのエマルション、ゲルなどといった不活性基剤（活性成分の他に当技術分野において知られている担体を含有するもの）中に活性成分を含む口中剤（pastille）も同様である。
【０１２９】
患者に投与される用量は、本発明との関連においては、時間の経過と共に、対象において有益な応答、例えば、肺毛細管静水圧の低減、肺における液量の低減、肺における体液蓄積の速度の低減、またはそれらの組合せを達成するのに十分な用量であるべきである。どの患者についても、至適用量レベルは、使用する具体的モジュレーターの効力、患者の年齢、体重、身体活動度、および食餌などといったさまざまな因子、考えうる他の薬物との併用、ならびに疼痛の重症度に依存するであろう。用量のサイズは、特定の対象における特定の化合物またはベクターの投与に付随する何らかの有害副作用の存在、性質、および程度によっても決まるであろう。
【０１３０】
投与すべき機械刺激活性化陽イオンチャネルのアンタゴニストの有効量を決定するにあたって、医師は、アンタゴニストの循環血漿中レベルおよびアンタゴニスト毒性を評価することができる。一般に、アンタゴニストの用量当量（dose equivalent）は、典型的な対象の場合、約1ng/kg〜10mg/kgである。
【０１３１】
V．キット
本発明は、機械刺激活性化陽イオンチャネルのモジュレーターのスクリーニングのためのキットおよび対象における疼痛を処置するためのキットも提供する。そのようなキットは、容易に入手できる材料および試薬から調製することができる。例えば、機械刺激活性化陽イオンチャネルのモジュレーターのスクリーニングのためのキットは、次に挙げる材料の任意の1つ以上を含むことができる：機械刺激活性化陽イオンチャネルポリペプチド、反応チューブ、および機械刺激活性化陽イオンチャネル活性の試験に関する指示。対象における疼痛を処置するためのキットは、次に挙げる材料の任意の1つ以上を含むことができる：本明細書に記載する抗体または阻害性オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド組成物、およびその組成物を対象に投与するための指示。キットの想定ユーザーおよびユーザーの具体的必要に応じて、広範囲にわたる多様なキットおよび構成要素を本発明に従って調製することができる。
【実施例】
【０１３２】
以下の実施例は、本願に係る発明を例示するために記載するのであって、本願に係る発明を限定しようとするものではない。
【０１３３】
［実施例1］
材料と方法
この実施例では、以下の実施例で使用した材料と方法の詳細を説明する。記載する方法においてさまざまな変更または置き換えを使用できることは、当業者には、すぐに理解されるであろう。
【０１３４】
細胞培養および一過性トランスフェクション．Neuro2A細胞は、4.5mg.ml-1グルコース、10％ウシ胎児血清、50単位.ml-1ペニシリンおよび50μg.ml-1ストレプトマイシンを含有するイーグル最小必須培地中で成長させた。C2C12またはヒト胎児腎臓293T（HEK293T）細胞は、4.5mg.ml-1グルコース、10％ウシ胎児血清、50単位.ml-1ペニシリンおよび50μg.ml-1ストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地中で成長させた。細胞を、35mmディッシュ上、または24ウェルプレートに入れた12mm円形カバーガラス上にプレーティングし、リポフェクトアミン2000（Invitrogen）を製造者の指示に従って使用することにより、トランスフェクトした。Piezo1過剰発現実験の場合は、500〜1000ng.ml-1のPiezo1-IRES-GFPまたはベクターのみをトランスフェクトし、細胞を12〜48時間後に記録した。Piezo2過剰発現実験の場合は、600〜1000ng.ml-1のmPiezo2またはベクターを、トランスフェクト細胞を同定するための300ng.ml-1GFPと同時トランスフェクトし、細胞を12〜48時間後に記録した。
【０１３５】
siRNA実験の場合は、20nM全siRNAと、トランスフェクト細胞を同定するための300または500ng.ml-1GFPとを同時トランスフェクトし、トランスフェクションの3日後に細胞を使用した。mPiezo1に対するSmartpool IのsiRNAをQiagenから購入し（ターゲット配列：CACCGGCATCTACGTCAAATA（siRNA1）（配列番号5）、ACCAAGAAATACAACCATCTA（siRNA2）（配列番号6）、TCGGCGCTTGCTAGAACTTCA（siRNA3）（配列番号7）、およびCGGAATCCTGCTGCTGCTATA（siRNA4）（配列番号8））、Smartpool I中で一つにして各5nMで使用するか、個別に20nMで使用した。siRNA4は20nMでは、細胞剥離を引き起こし、続いて、トランスフェクションの3日後には細胞死を引き起こしたので、毒性だった。Smartpool II siRNAは、Dharmaconから購入した4つの異なるsiRNA（ターゲット配列：GAAAGAGATGTCACCGCTA（配列番号9）、GCATCAACTTCCATCGCCA（配列番号10）、AAAGACAGATGAAGCGCAT（配列番号11）、GGCAGGATGCAGTGAGCGA（配列番号12））のプールであった。N2A細胞におけるPiezo2 siRNA実験の場合、600ng.ml-1のmPiezo2と300ng.ml-1GFPとを、20nM Piezo1 siRNA1のみと、または20nM Piezo2 siRNAも一緒に、同時トランスフェクトした。トランスフェクションの3日後に細胞を記録した。mPiezo2に対するsiRNAは、Dharmaconから購入した4つの異なるsiRNA（ターゲット配列：GAATGTAATTGGACAGCGA（配列番号13）、TCATGAAGGTGCTGGGTAA（配列番号14）、GATTATCCATGGAGATTTA（配列番号15）、GAAGAAAGGCATGAGGTAA（配列番号16））のプールであった。
【０１３６】
DRG培養およびsiRNA．マウス後根神経節ニューロン（雄C57Bl6マウス由来）の調製および培養は、以前記述されたように（M. Chalfie, Nat Rev Mol Cell Biol 10, 44 (Jan, 2009)）、ただし次に挙げる変更を加えて行った：成長培地に、100ng/ml神経成長因子（NGF）、50ng/ml GDNF、50ng/ml BDNF、50ng/ml NT-3、50ng/ml NT-4を補足した。低分子干渉RNA（siRNA）によるノックダウンは、SCNヌクレオフェクターキットをヌクレオフェクターデバイスと共に製造者の指示（SCN Basic Neuro program 6；Lonza AG）に従って使用して、新鮮単離DRGニューロンへのsiRNAのヌクレオフェクションによって達成した。被験siRNAごとに1匹のマウスから単離されたDRGニューロンを使用した。siRNAは、TRPA1の場合は150nM〜250nM（smartpool、Qiagen）で、またPiezo2の場合は250nM（smartpool、Qiagen）で使用し、スクランブル対照（Qiagen）の濃度を相応に調節した。ヌクレオフェクション後に、ニューロンをRPMI培地中、37℃で10分間回復させ、成長培地（抗生物質を含まず、AraCを含まないもの）を加え、前もってラミニン（2μg.ml-1）をコートしておいたポリ-D-リジンコートカバーガラス上に、ニューロンをプレーティングした。トランスフェクションの2〜4時間後に、成長培地の半分を新鮮培地と交換し、ニューロンを48〜72時間成長させた。
【０１３７】
電気生理学．パッチクランプ実験は、Axopatch 200B増幅器（Axon Instruments）を使って、標準的なホールセル記録またはセルアタッチト記録で行った。パッチピペットは、133 CsCl、10 HEPES、5 EGTA、1 CaCl2、1 MgCl2、4 MgATP、および0.4 Na2GTP（単位mM）からなる内部溶液（CsOHでpHを7.3に調節）で満たした場合に、2〜3MΩの抵抗を持っていた。細胞外溶液は、127〜130 NaCl、3 KCl、1 MgCl2、10 HEPES、2.5 CaCl2、10 グルコース（単位mM）からなった（NaOHでpHを7.3に調節）。NMDG溶液は、150 NMDG、10 HEPES（単位mM）からなった（pH7.5）。イオン選択性実験の場合、内部溶液は150 CsCl、10 Hepesからなり（CsOHでpH7.3）、一価外部溶液は150 NaClまたはKCl、10 HEPES（単位mM）からなり（NaOHまたはKOHでpH7.3）、二価外部溶液は、100 CaCl2またはMgCl2、10 HEPES（単位mM）からなった（CsOHでpH7.3）。セルアタッチト記録の場合、130 NaCl、5 KCl、10 HEPES、1 CaCl2、1 MgCl2、10 TEA-Cl（単位mM）からなる溶液（NaOHでpH7.3）でピペットを満たし、膜電位をゼロにするために使用した外部溶液は、140 KCl、10 HEPES、1 MgCl2、10 グルコース（単位mM）からなった（KOHでpH7.3）。全ての実験は室温で行った。電流は20kHzでサンプリングし、2kHzでフィルタリングした。電圧は、Clampex 10.1ソフトウェア（Axon Instruments）を使ってLJPを計算したイオン選択性実験を除いて、液間電位について補正しなかった。機械的刺激前のリーク電流は、オフラインで電流トレースから差し引いた。10mMルテニウムレッド保存溶液はDMSO中に、また100mMガドリニウム保存溶液は水中に、調製した。
【０１３８】
機械的刺激．ホールセル記録の場合、機械的刺激は、記録される細胞に対して80°の角度で配置したファイアポリッシュガラスピペット（先端径3〜4μm）を使って達成した。細胞に向かうプローブの下向きの動きは、Clampexで制御された圧電結晶マイクロステージ（E625 LVPZTコントローラー/アンプリファイア；Physik Instrumente）によって駆動された。プローブは、典型的には、細胞体から約2μmに配置した。MA電流活性化の閾を測定するために使用した圧電駆動刺激の強度は、細胞に触れる距離を超えて移動した距離と定義した。プローブは、前進運動のためのコマンドのランプセグメント中は、1μm/msの速度を有し、刺激は150msにわたって適用された。細胞の機械刺激感受性を評価するために、一連の機械的ステップを、1μm刻みで、機械刺激感受性電流の完全な回復を可能にする10秒ごとに適用した。内向きMA電流を-80mVの保持電位で記録した。I-V関係の記録には、電圧ステップを、-60mVの保持電位から、機械的刺激の0.7秒前に適用した。DRGニューロンにおけるMA電流の記録のために、1細胞ごとに誘発された電流の最大振幅の少なくとも75％に達する、電流のトレースの、-80mVの保持電位における不活性化動態を、単一指数式とフィットさせ（いくつかの例では、先の報告（O. P. Hamill, B. Martinac, Physiol Rev 81, 685 (Apr, 2001)）に従って、速順応性電流に関して双指数式とフィットさせ、解析には速い時定数を使用；図5A左パネル参照）、解析に使用した各ニューロンごとにτinac値を得た。
【０１３９】
セルアタッチト記録の場合は、Clampexで制御された圧力クランプHSPC-1デバイス（ALA-scientific）を使って、記録電極を介して、膜パッチを短い陰圧パルスで刺激した。別段の明記がある場合は、0から-60mmHgまで（-10mmHg刻み）の圧力ステップで、伸展活性化チャネルを-80mVの保持電位で記録し、解析のために1細胞につき3〜10の記録トレースを平均した。電流-圧力関係は、I(P)＝[1＋exp（-(P-P50)/s)]-1の形のボルツマン式とフィットさせた（式中、Iは所与の圧力における伸展活性化電流のピークであり、Pは適用されたパッチ圧（単位mmHg）であり、P50は、Imaxの50％である電流値を惹起した圧力値であり、sは圧力に対する電流感受性を反映する）。
【０１４０】
透過性比の決定．各溶液中の各細胞について逆転電位を、それぞれの電流-電圧データの内挿によって決定した。これらの実験では、I-V関係を、-60mVの保持電位から、20mV刻みで-60mVから+60mVまで（液間電位補正前）の範囲にわたる電圧ステップで行った。
【０１４１】
透過性の比PX/PCsを、各細胞ごとに各試験陽イオンXについて、その陽イオンが主要外部陽イオンである場合のMA活性化ホールセル電流の逆転電位から決定した。膜のそれぞれの側の透過陽イオンが単一であるとして簡略化されたGoldman-Hodgkin-Katz（GHK）式（G. B. Monshausen, S. Gilroy, Trends Cell Biol 19, 228 (May, 2009)）を使用した：
【数１】
2013538058.tif 000002
（式中、RT/zFは23℃において25.5の値を有する）。二価陽イオンの場合は、適当に改変された式を使用した：
【数２】
2013538058.tif 000003
比PX/PCsは、各陽イオンについて、平均値±SEMとして表された。
【０１４２】
レシオメトリックカルシウムイメージング．細胞内Ca2+イメージング実験は、細胞をCa2+イメージングバッファー［10mM HEPESを補足した1×ハンクス平衡塩類溶液（HBSS，1.3mM Ca2+）］で3回洗浄することによって行い、次に、レシオメトリックCa2+指示薬色素Fura-2/AM（Molecular Probes）を、製造者の推奨に従って、室温で30分間ローディングした。倒立顕微鏡でのイメージングに先だって細胞を3回洗浄した。交互する340/380nmの光で細胞を照明することによって、Fura-2蛍光を測定した。蛍光強度は510nmで測定した。細胞内Ca2+濃度は340/380比として表される。
【０１４３】
培養DRGニューロンのレシオメトリックカルシウムイメージングは、本質的に、文献記載のとおりに行った［1］。実験は、プレーティングの47〜72時間後に、37℃で行った。活性化に関する閾は、MO（100μM）を添加する直前の5時点からの平均ベースラインより40％上に設定した。siRNA特異性、ニューロンの健康状態および応答性を確認（control）するために、各実験の最後にカプサイシン（CAPS，0.5μM）を加えた。比較すべき全ての実験群を、同じDRG培養調製物を使って並列に処理した（2つの独立した調製物を使用した）。
【０１４４】
Piezo1抗血清の生成．合成ポリペプチドRQRRERARQERAEQ（配列番号2のアミノ酸1454〜1467）に対するカスタムポリクローナル抗体は、標準的方法により、ウサギにおいて調製され、アフィニティ精製された（Thermo Fisher Scientific，Openbiosystems）。
【０１４５】
TRPA1生細胞ラベリング（live-labeling）および免疫細胞化学．HEK293T細胞でのTRPA1生細胞ラベリングおよび免疫細胞化学は、本質的に、文献記載のとおりに（Schmidt et al., 2009）、ただし次に挙げる変更を加えて行った：Piezo1抗血清の特異性を評価するために、細胞にPiezo1-IRES-EGFPコンストラクトをトランスフェクトし、36時間後に、以下に概説する免疫細胞化学に使用した。Piezo1抗血清は1：100で使用し、Alexa Fluor 546（Invitrogen）にコンジュゲートした二次抗体によって検出した。Piezo1の膜発現を評価するために、細胞に、マウスTrpa1-MYC/HisコンストラクトとPiezo1とを同時トランスフェクトし、トランスフェクションの36時間後に、生細胞ラベリングに使用した。生HEK293T細胞をTRPA1抗体（1：50）と共にインキュベートした後、ヤギ抗ウサギのAlexa Fluor 488 F(ab')2フラグメント（1：200，Invitrogen）と共にインキュベートすることによって、表面TRPA1を標識した。細胞を、PBS中の2％パラホルムアルデヒド（PFA）で20分間固定し、洗浄し、過剰の非標識ヤギ抗ウサギIgGと共に1時間インキュベートすることにより、残存する未結合TRPA1抗体結合部位を全てブロックした。次に、0.4％Triton X-100を含有するPBS中で細胞を透過処理し、正常ヤギ血清（PBS中の10％血清）でブロックし、Piezo1に対する一次抗体（1：100）およびc-MYC（1：100，9E11，マウス，Santa Cruz Biotechnology）と共にインキュベートした後、二次抗体（Alexa Fluor 568ヤギ抗ウサギIgGおよびAlexa Fluor 633ヤギ抗マウスIgG；1:200；Invitrogen）と共にインキュベートした。
【０１４６】
免疫細胞化学実験は、アルゴンレーザーの488nm線、HeNe緑色543nmレーザーおよびHeNe赤色633nmレーザーを使った逐次的照明により、オリンパス（日本国東京）Fluoview 500共焦点顕微鏡を使って撮像した。40×および60× PlanAPO油浸対物レンズ（後者は1.5のズーム）を使って、マージされた積層イメージを作成した。
【０１４７】
リアルタイムqPCR．後根神経節を、成体C57BL/6J野生型マウスから新たに単離し、ドライアイス上で瞬間凍結した。DRGまたはsiRNAトランスフェクトN2A細胞（GFP同時トランスフェクションの3日後、記録に使用したものと同じ条件）から、Trizol処理を使って、全RNAを抽出した。他の組織に由来する全RNAは全て、Zyagen（サンディエゴ）から購入した。Quantitect逆転写キット（Qiagen）を使用して第1鎖cDNAを作製するために、500ngの全RNAを使用した。mPiezo1およびmPiezo2に関するリアルタイムTaqman PCRアッセイ（アッセイid：Mm01241570_g1およびMm01262433_m1）は、FAMリポーター色素および非蛍光クエンチャーと共にApplied Biosystemsから購入した。AmpErase UNGを含まないユニバーサルTaqMan PCRマスターミックス（20×）（Applied Biosystems）を使用した。反応は、ABI 7900HT fastリアルタイムシステムにおいて、製造者の指示に従い、20μlの反応液中に1μlのcDNAを使って、三つ一組にして行った。
【０１４８】
キャリブレーションと規格化は、2-ΔΔCT法［4］法を使って行った。ここで、ΔΔCT＝((CT(ターゲット遺伝子)-CT(参照遺伝子))-(CT(キャリブレーター）-CT(参照遺伝子))である。異なる組織におけるmRNA発現の解析（図4C）には、ターゲット遺伝子をmPiezo1またはmPiezo2とし、一方、参照遺伝子はGAPDHとし、キャリブレーターは肺組織とした。mRNA発現のsiRNA誘導性ダウンレギュレーションの解析（図3A）には、β-アクチンを参照遺伝子として使用し、スクランブルsiRNAトランスフェクトN2A細胞をキャリブレーターとした。
【０１４９】
インサイチューハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学．インサイチューハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学は、以前記述されたとおりに行った（M. Chalfie, Nat Rev Mol Cell Biol 10, 44 (Jan, 2009)）。簡単に述べると、成体雄C57BL/6Jマウス、6〜16週齢、または成体雄Sprague Dawleyラットに、4％PFAを灌流し、後根神経節を素速く切離した。後固定と30％スクロースにおける凍結保護の後、単一DRGをOCTに包埋し、クリオスタットで10μmの厚さに薄切した。塩基3822〜4886；4837〜5849；5922〜7019および7102〜8171に対応する4つの異なる1000bp cRNAセンスおよびアンチセンスプローブを作製した。全てのプローブをインビトロ転写し、ジゴキシゲニン（Roche Diagnostics）で標識した。蛍光インサイチューハイブリダイゼーションの場合は、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ジゴキシゲニン（digoxygenin）POD抗体（1：500）およびチラミドシグナル増幅（TSA；NEN）を使って、ハイブリダイズしたプローブを検出し、可視化した。インサイチューハイブリダイゼーションとTSA検出の後に免疫組織化学を行った。ニワトリ抗NF-200（1：1000；Abcam）およびニトワリ抗ペリフェリン（1：100；Abcam）をマウスDRGに使用し、一方、ラットDRGにはモルモット抗TRPV1（1：1000；Abcam）一次抗体を使用した（この抗体はマウスDRGでは機能しなかった）。Alexa Fluor 568にコンジュゲートされた二次抗体によって一次抗体を検出した。比色インサイチューハイブリダイゼーションの場合は、アルカリホスファターゼ抗DIG-AP抗体（Roche；1：500）を使用した後、NBT/BCIP液体基質システム（Sigma）と共にインキュベートすることで、暗紫色を発色させた。切片をSlow fade Gold試薬（Invitrogen）に封入し、AX70顕微鏡（オリンパス）を使って撮像した。
【０１５０】
定量には蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを使用し、アルゴンレーザーの488nm線とHeNe緑色543nmレーザーを使った逐次的照明により、オリンパス（日本国東京）Fluoview 500共焦点顕微鏡を使って撮像した。20×および40× PlanAPO油浸対物レンズを使って、マージされた積層イメージを作成した。どの実験群についてもイメージは同一の取得パラメータを使って撮影し、RAW画像をImage J（NIH）による解析に使用した。平均蛍光強度（任意単位で測定したもの）が、少なくとも10個のランダム未染色細胞から測定される平均バックグラウンド蛍光＋標準偏差の4倍よりも高ければ、そのニューロンはPiezo2陽性とみなした。二重カウントニューロンを避けるために、少なくとも50μm離れている切片だけを考慮した。平均蛍光強度（任意単位で測定したもの）が、少なくとも10個のランダム未染色細胞から測定される平均バックグラウンド蛍光＋標準偏差の3倍よりも高ければ、そのニューロンはNF200陽性またはペリフェリン陽性とみなした。Piezo2の比色インサイチューハイブリダイゼーションも類似する結果を与えたが（26.9％Piezo2陽性ニューロン、データ未掲載）、基質による発色の長さに依存する変動性ゆえに、定量には使わなかった。発表用にのみ、画像の明度、コントラストおよびレベルを調節した。
【０１５１】
Piezo1の分子クローニング．NCBIデータベースのmPiezo1のcDNA配列（NM_001037298）からプライマーを設計した。Neuro2A全RNAから作製されたcDNAライブラリーから、プライマーmPiezo1 fwd（5'atggagccgcacgtgctg3'（配列番号21））およびmPiezo1 rev（5'ctactccctctcacgtgtcca3'（配列番号22））を使って、7.644kbフラグメントを増幅し、NotI制限部位およびHindIII制限部位でpcDNA3.1(-)（Invitrogen）にクローニングした。このコンストラクトを全配列決定したところ、NCBI配列と比較して、残基156におけるQの挿入、および3つのアミノ酸変化（R147G、V228IおよびM1571V）が明らかになった。
【０１５２】
このベクターをさらに修飾して、3'AscI制限部位およびFseI制限部位を含むようにしてから、これらの部位を使って、pIRES2-EGFP（Clontech）由来のIRES-GFP PCRフラグメントを挿入した。N2A細胞からクローニングされたPiezo1のタンパク質配列（配列番号2）は次のとおりである。
【化１】
2013538058.tif 000004
【０１５３】
Piezo2の分子クローニング．NCBIデータベースのPiezo2のcDNA配列（NM_001039485）からプライマーを設計した。成体C57BL/6J DRG全RNAから作製されたcDNAライブラリーから、プライマーmPiezo2 fwd（5'atggcttcggaagtggtgtgc3'（配列番号23））およびmPiezo2 rev（5'tcagtttgttttttctctagtccac3'（配列番号24））を使って、8.469kbフラグメントを増幅し、KpnI制限部位およびNotI制限部位でpCMV-Sport6（Invitrogen）にクローニングした。クローニングされたDRG由来のmPiezo2遺伝子を配列決定したところ、3つのアミノ酸挿入領域がエクソンとして正しくアサインされていないNCBIアノテーションとの相違が明らかになった（628E、833の14残基および1751の56残基）。本発明者らがマウスDRGからクローニングしたPiezo2のタンパク質配列（配列番号4）は次のとおりである。
【化２】
2013538058.tif 000005
【０１５４】
系統学的解析．系統学的解析を行うために使用したPiezo配列のアクセッション番号を、TMHMM2プログラムを使って予想されたTMドメインの数と共に記載する。いくつかの種については、複数の予想遺伝子配列を融合して完全な配列を得た。
Hs Piezo1（ヒト）：NP_001136336.2，2521aa（31TM）
Mm Piezo1（マウス（Mus musculus））：NP_001032375.1，2546aa（30TM）
Gg Piezo1（ニワトリ）：XP_414209.2，1718aa；XP_423106.2，217aa（25TM）
Dr Piezo1（ゼブラフィッシュ）：XP_696355.4，2538aa（29TM）
Hs Piezo2（ヒト）：NP_071351.2，2752aa（35TM）
Mm Piezo2（マウス）：NP_001034574.3，2753aa（34TM）
Gg Piezo2（ニワトリ）：XP_419138.2，3080aa（33TM）
Dr Piezo2（ゼブラフィッシュ）： XP_002666625.，2102aa（24TM）
Ci Piezo（カタユウレイボヤ）：XP_002122901.1，1669aa；XP_002128850.1，591aa（33TM）
Dm Piezo（キイロショウジョウバエ）：NP_001036346.3，2671aa（36TM）
Ce Piezo（カエノラブディティス・エレガンス）：NP_501648.2，800a；NP_501647.2，1843（33TM）
Dd Piezo（キイロタマホコリカビ）：XP_640187，3080 aa（35TM）     
At Piezo（シロイヌナズナ）：NP_182327.5，2440 aa（28TM）
Os Piezo（ジャポニカイネ（Oryza sativa−japonica group））：NP_001043105.1，2196aa（24TM）
Tt Piezo i（テトラヒメナ・サーモフィラ）：XP_976967.1，4690aa（30TM）
Tt Piezo ii（テトラヒメナ・サーモフィラ）：XP_001021704.1，4136aa（29TM）
Tt Piezo iii（テトラヒメナ・サーモフィラ）：XP_001017682.1，2636aa（26TM）
【０１５５】
データ解析．全ての図において、データは平均値±SEMとして示されている。別段の明記がない限り、統計的有意性は、2つの試料間の相違を比較するために、対応のない両側スチューデントt検定を使って評価した。分散が有意に異なる場合は、ウェルチの補正をした対応のない両側スチューデントt検定を使用した。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
【０１５６】
［実施例2］
Neuro2A細胞はMA電流を発現する
メカノトランスダクションに関与するタンパク質を同定するために、初代細胞から記録されるものに類似するロバストなMA電流を発現する細胞株を探した（B. Coste, M. Crest, P. Delmas, J Gen Physiol 129, 57 (Jan, 2007)）。数種類のマウス細胞株およびラット細胞株（Neuro2A、C2C12、NIH/3T3、Min-6、50B11、F11、PC12）を、圧電駆動のガラスプローブからなる機械的刺激を使ったホールセル構成のパッチクランプによってスクリーニングした（G. C. McCarter, D. B. Reichling, J. D. Levine, Neurosci Lett 273, 179 (Oct 8, 1999)；B. Coste, M. Crest, P. Delmas, J Gen Physiol 129, 57 (Jan, 2007)；L. J. Drew, J. N. Wood, P. Cesare, J Neurosci 22, RC228 (Jun 15, 2002)）。Neuro2A（N2A）マウス神経芽細胞腫細胞株が、かなり迅速な順応動態を有する最も一貫したMA電流を発現した（図1A）。これに比して、他の細胞株において記録されたMA電流の代表例として、C2C12マウス筋芽細胞細胞株は、不活性化の動態が遅いMA電流を発現した（図1B）。-80mVの保持電位において記録されたN2A MA電流はすべて、150msの機械的刺激パルスの最後には不活性化されているのに対し、C2C12 MA電流は、部分的にしか不活性化されていない（図1C）。これらの電流は、速順応性MA電流と遅順応性MA電流とが記述されているDRGニューロンにおいて発現する一部の電流と共通する動態特性を有している（B. Coste et al., J Gen Physiol 129, 57 (Jan, 2007)；L. J. Drew et al., J Physiol 556, 691 (May 1, 2004)；L. J. Drew et al., PLoS ONE 2, e515 (2007)；J. Hu, G. R. Lewin, J Physiol 577, 815 (Dec 15, 2006)；C. Wetzel et al., Nature 445, 206 (Jan 11, 2007)）（表1および下参照）。不活性化動態の相違は、これらの細胞株において発現するメカノトランスダクション装置の構成要素が異なることを示唆するが、不活性化動態のこの相違は、細胞株の膜伸展性などといった間接的因子によるものである可能性もある。N2A MA電流とC2C12 MA電流の電流-電圧関係は-80mVと+80mVの間は直線的であり、逆転電位（Erev）はそれぞれ+6.6および+6.7mVであって、内向き電流がNMDGクロライド外部溶液で抑制されたことから（データ未掲載）、陽イオン非選択的透過性（図1D〜E）が示唆される。最後に、N2A細胞において発現したMA電流の振幅は、C2C12 MA電流よりおよそ2倍大きい（図1F）。
［表1］無処理細胞株およびPiezo1処理細胞株における不活性化の動態
【表１】
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【０１５７】
パッチ膜伸展刺激をセルアタッチトモードで使用することにより、N2A MA電流をさらに特徴づけた（Besch et al., Pflugers Arch 445, 161 (Oct, 2002)）。短い陰圧パルスは、内在性チャネルの開口を惹起し（図1G）、単一チャネルコンダクタンスは22.9±1.4pS、Erevは+6.2mVだった（図1H）。圧力パルスの強さを増加させると、これらのMAチャネルの漸進的かつ可逆的な開口が誘導された（図1I）。電流-圧力関係は、-60mmHgでの最大開口を特徴とし、半値活性化（P50）は-28.0±1.8mmHgだった（図1J）。これらのコンダクタンスおよびP50値は、報告されている伸展活性化チャネルの性質に似ている（Cho et al., Eur J Neurosci 23, 2543 (May, 2006)；Earley et al., Circ Res 95, 922 (Oct 29, 2004)；Sharif-Naeini et al., J Mol Cell Cardiol 48, 83 (Jan, 2010)）。
【０１５８】
［実施例3］
Piezo1（Fam38A）はN2A細胞のMA電流に必要である
N2Aにおける候補MAイオンチャネルのリストを作成するために、N2Aと、試験した他のマウス細胞株について、遺伝子発現プロファイリングを行い、基準の組合せを使って、N2A細胞中で豊富な転写産物に焦点を絞った。膜を少なくとも2回またぐ（全てのイオンチャネルに共通する特徴）と予想されるタンパク質を選択した。既知の陽イオンチャネル、または機能未知のタンパク質のいずれかを選ぶことによって、このリストに優先順位を付けた。N2A細胞中でsiRNAノックダウンを使用し、ホールセルモードでピエゾ駆動の圧力刺激によるMA電流を測定することによって、各候補を試験した。73番目の候補であるFam38A（Family with sequence similarity 38)のノックダウンが、MA電流の顕著な減少を引き起こした（図2A〜B、表2）。追跡実験では、この遺伝子に対する異なるsiRNAで、MA電流のロバストな減弱が観察された（図2C）。試験したsiRNAは全て、qPCRによってアッセイされるターゲット転写産物を有意に減少させた（図3A）。
［表2］siRNAノックダウンのための候補タンパク質
【表２】
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【０１５９】
Fam38Aが圧力によって活性化されるイオンチャネルの発現に必要なタンパク質をコードしていることから、この遺伝子を、圧力を意味するギリシャ語「πιεση」（ｐιｅｓｉ）から、Piezo1と名付けた。Piezo1のノックダウンが、一般的細胞シグナリングまたは細胞生存を損なうかどうかを調べるために、N2A細胞にTRPV1 cDNAとスクランブルsiRNAまたはPiezo1 siRNAのどちらか一方とをトランスフェクトした。カプサイシン応答に相違は観察されなかった（図3B〜C）。次に、Piezo1が、パッチ膜伸展によって誘発されるN2A MA電流にも必要であるかどうかを決定するための実験を行った（図2D〜E）。ここでも、Piezo1に対するsiRNAで、強力なノックダウンが観察された。このことは、上記2つの機械的刺激プロトコールのどちらかを使って記録されるMA電流の発現にPiezo1が必要であることを示唆している。
【０１６０】
哺乳動物Piezo1（KIAA0233，Fam38A，Mib）については、ほとんど何もわかっていない。その発現は、老人斑関連アストロサイトにおいて誘導され（K. Satoh et al., Brain Res 1108, 19 (Sep 7, 2006)）、このタンパク質はインテグリン活性化に関与することが示唆されている（B. J. McHugh et al., J Cell Sci 123, 51 (Jan 1, 2010)）。二価イオン非含有および5mM EGTA溶液の細胞外灌流を30〜60分行うとインテグリン機能が破壊されるが（R. O. Hynes, Cell 110, 673 (Sep 20, 2002)）、これは、MA電流を抑制しなかった（図3D〜E）。したがってPiezo1 siRNAがインテグリン調整によってMA電流をブロックするとは思われない。ただし、Piezo1の機械的活性化が、インテグリン活性化と、細胞の接着、分裂および移動を含むさまざまな下流帰結とにつながる可能性は考えられる。
【０１６１】
［実施例4］
Piezoはさまざまな種の間で保存されている大きな膜貫通タンパク質である
Piezoタンパク質は非哺乳動物種に存在するが、特徴づけたと報告されたものはない。多くの動物、植物および他の真核生物種は、単一のPiezoを含有する（図4A）。脊椎動物（哺乳動物、鳥、魚）は、2つのメンバー、Piezo1（Fam38A）およびPiezo2（Fam38B）を有する。ただし、初期の脊索動物であるユウレイボヤは単一のメンバーを有する。繊毛虫（Ciliophora）界でも複数のPiezoが存在する。すなわち、テトラヒメナ・サーモフィラは3つのメンバーを有し；ヨツヒメゾウリムシ（Paramecium tetraurelia）は6つのメンバーを有する（図示していない）。酵母または細菌には明確なホモログが同定されなかった。Piezoタンパク質の二次構造および全体の長さは中等度に保存されており、一方、他のタンパク質に対する相同性はごくわずかである。TMHMM2プログラムでアッセイしたところ、全てが24〜36個の予想膜貫通ドメインを有する（変動はおそらく不正確なcDNAまたは膜貫通予想に起因する）。予想タンパク質は2100〜4700アミノ酸であり、膜貫通ドメインは、マウスPiezo1の疎水性プロット（図4B）によって例証されるとおり、推定タンパク質の全体にわたって配置されている。
【０１６２】
qPCRによって決定されたPiezo1の発現プロファイル（図4C）には、膀胱、結腸、腎臓、肺および皮膚におけるロバストな発現と、試験した他の組織（DRG感覚ニューロンを含む）における低い発現とが含まれる。このパターンはラットにおけるノーザンブロット発現解析と合致する（K. Satoh et al., Brain Res 1108, 19 (Sep 7, 2006)）。膀胱、結腸、および肺は、内臓痛に関連するメカノトランスダクションを起こし（G. Burnstock, Mol Pain 5, 69 (2009)）、腎臓の一次線毛は尿の流れを感知する（L. Rodat-Despoix, P. Delmas, Pflugers Arch 458, 179 (May, 2009)）。DRGにおける低いmRNAレベルは、Piezo1が、そこで観察されるMA電流の説明にはならないだろうということを示唆しているが（B. Coste, M. Crest, P. Delmas, J Gen Physiol 129, 57 (Jan, 2007)；L. J. Drew, J. N. Wood, P. Cesare, J Neurosci 22, RC228 (Jun 15, 2002)；J. Hu, G. R. Lewin, J Physiol 577, 815 (Dec 15, 2006)）、Piezo1は体性感覚のもう一つの推定部位である皮膚において発現している。膀胱、結腸および肺ではPiezo2発現も観察されるが、腎臓または皮膚では少ない。興味深いことに、Piezo2の極めて強い発現がDRG感覚ニューロンに観察され、体性感覚メカノトランスダクションにおける潜在的役割が示唆される（下記参照）。
【０１６３】
［実施例5］
Piezo1はさまざまな細胞タイプにおいてMA電流を誘導する
N2A細胞から完全長Piezo1をpIRES2-EGFPベクター中にクローニングした。トランスフェクションの12〜48時間後に、ホールセルモードでMA電流の電気生理学的記録を行った。N2A、HEK293T（図5A〜F）およびC2C12細胞株（図6A〜C）において、Piezo1トランスフェクト細胞は大きなMA電流を示したが、モックトランスフェクト細胞はそうではなかった。Piezo1を過剰発現するどの細胞でも、MA電流-電圧関係は、内在性N2A MA電流に似ていて（図5B、5E、6B、および1D）、Erevは約+6mVだった。Piezo1過剰発現細胞において誘発されるMA電流の活性化の閾および不活性化の時定数は、試験した3つの細胞株全てにおいて類似している（表1参照）。次に、Piezo1誘導MA電流のイオン選択性を特徴づけた。細胞外バス溶液に非透過陽イオンNMDGを代用すると、内向きMA電流が抑制されたことから、このチャネル活性は陽イオン性であることが実証された（図6D）。CsClのみの内部溶液とバス中のさまざまな陽イオンとを使って記録することにより、イオン選択性をさらに調べた。Na+、K+、Ca2+およびMg2+イオンは全て透過することができ、Ca2+にわずかな選択性があった（図5Gおよび図6E〜F）。さらにまた、30μMのルテニウムレッドおよびガドリニウム（多くの陽イオン性MA電流のブロッカーであることが知られている）（L. J. Drew, J. N. Wood, P. Cesare, J Neurosci 22, RC228 (Jun 15, 2002)；J. Hao et al.「Mechanosensitivity of the Nerveous System」（I. K. e. A. Kamkin編，Springer，オランダ，2008）vol.2の51〜67ページ）は、Piezo1誘導性MA電流をそれぞれ74.6±2.5％（n＝6）および84.3±3.8％（n＝5）ブロックした（図5Hおよび6G〜H）。
【０１６４】
次に、パッチ膜伸展刺激をセルアタッチトモードで使用して、Piezo1トランスフェクト細胞をアッセイした（図5I〜N）。N2A細胞およびHEK293T細胞におけるPiezo1の過剰発現は、陰圧パルスによって誘発される大きな電流を生じさせた（図5I、5L）。Piezo1を過剰発現する細胞および内在性N2A細胞における電流-圧力関係は類似していて、N2AおよびHEK293T過剰発現細胞におけるP50はそれぞれ-28.1±2.8および-31.2±3.5mmHgだった（図5J、5M、および1J）。ベクターのみをトランスフェクトしたHEK293T細胞では、N2A内在性MAチャネルに類似するチャネル活性は検出されなかった（データ未掲載）。それゆえに、Piezo1過剰発現は、試験した細胞株の全てにおいて、圧電駆動のガラスプローブ刺激とパッチ膜伸展のどちらによっても誘発されるMA電流を誘導する。これは、これら2つの異なる機械刺激プロトコールが同じMAチャネルを活性化することの、初めての証明である。
【０１６５】
［実施例6］
Piezo2はPiezo1誘導電流とは異なるMA電流を誘導する
完全長Piezo2をDRGニューロンからクローニングし、異種発現時のその機械的感受性を調べた。Piezo2/GFP同時トランスフェクト細胞は、N2A細胞（内在性MA電流を抑制するためにPiezo1 siRNAと同時トランスフェクトしたもの）およびHEK293T細胞において、大きなMA電流を示したが、モックトランスフェクト細胞ではそうならなかった（図7A〜F）。Piezo2誘導MA電流-電圧関係は-80mVと+80mVの間は直線的で（図7B、7E）、N2A細胞およびHEK293T細胞における逆転電位（Erev）はそれぞれ+6.3±0.4mV（n＝3）および+8.7±1.5mV（n＝7）だったことから、比較的非選択的な陽イオンコンダクタンスが示唆される。Piezo1と同様に、Piezo2誘導電流は、非透過陽イオンNMDGによって抑制され、ガドリニウムおよびルテニウムレッドによって阻害された［それぞれ、85.0±3.7％（n＝5）および79.2±4.2％（n＝5）］（図8）。これらの特徴は、DRGニューロンから記録されたMA電流のプロファイルと合致する（G. C. McCarter et al., Neurosci Lett 273, 179 (Oct 8, 1999)；L. J. Drew et al., J Neurosci 22, RC228 (Jun 15, 2002)；また、J. Hu, G. R. Lewin, J Physiol 577, 815 (Dec 15, 2006)も参照されたい）。
【０１６６】
異種発現したPiezo2が誘導するMA電流の不活性化動態を単一指数式とベストフィットさせると、算出される不活性化の時定数（ιinac）は、-80mVで測定した場合、N2A細胞（6.8±0.7ms，n＝27）でもHEK293T細胞（7.3±0.7，n＝11）でも、比較的早い。さらにまた、Piezo2誘導MA電流の不活性化の動態は、内向き電流（図7G）でも外向き電流（図7H）でも、また試験した全ての保持電位で（図7I）、Piezo1誘導MA電流より速い。これらの相違は、Ca2+透過性が高いせいではない。というのも、Piezo1誘導MA電流とPiezo2誘導MA電流のCa2+選択性は類似しているからである（データ未掲載）。したがってPiezo1およびPiezo2はユニークなチャネル特性を付与する。セルアタッチトモードで膜パッチの陰圧刺激を使用することでPiezo2誘導MA電流の性質をさらに特徴づけようとする最初の試みでは、Piezo2依存的チャネル活性を検出することができなかった（図示していない，21パッチ）。
【０１６７】
［実施例7］
Piezo1は形質膜に検出される
上記の結果は、Piezo1および2がメカノトランスダクション複合体の構成要素であり、したがって形質膜に存在するはずであることを示唆している。以前の報告により、小胞体におけるFam38A（Piezo1）の発現が示されている（K. Satoh et al., Brain Res 1108, 19 (Sep 7, 2006)；B. J. McHugh et al., J Cell Sci 123, 51 (Jan 1, 2010)）。マウスPiezo1に対するペプチド抗体を作製した。この抗体は、Piezo1トランスフェクトHEK293T細胞を特異的に認識したが、ナイーブHEK293T細胞は認識しなかった（図9A）。Piezo1およびTRPA1（形質膜に発現する異が知られているイオンチャネル）をトランスフェクトした細胞では、Piezo1発現の大半が（TRPA1と同様）細胞内部に存在したものの、生細胞標識された表面TRPA1と共に、Piezo1の同時染色が観察された（M. Schmidt, A. E. Dubin, M. J. Petrus, T. J. Earley, A. Patapoutian, Neuron 64, 498 (Nov 25, 2009)）。これは、Piezo1タンパク質が形質膜またはその近傍に局在化しうることを実証している（図9B）。抗体には、Piezo1の内在性N2A発現を検出できるほど十分な感度がなかった（データ未掲載）。
【０１６８】
［実施例8］
Piezo2はDRG速順応性MA電流に必要である
qPCRで評価したところ、DRGでは、Piezo2が比較的高レベルに発現するが、Piezo1はそうではない（図4C）。DRGのニューロンおよび膠細胞の不均一集団内でのPiezo2発現を特徴づけるために、成体マウスDRG切片で、インサイチューハイブリダイゼーションを行った（図10A）。Piezo2 mRNA発現は、DRGニューロンの20％（合計2391個のニューロン中、下記方法の項参照）に観察された。Piezo2は、機械感覚ニューロン中に存在するマーカーであるペリフェリン（60％）およびニューロフィラメント200（28％）も発現するDRGニューロンのサブセットにおいて発現する（図11）（M. E. Goldstein et al., J Neurosci Res 30, 92 (Sep, 1991)；S. N. Lawson, Exp Physiol 87, 239 (Mar, 2002)；S. N. Lawson et al., J Comp Neurol 228, 263 (Sep 10, 1984)；H. Sann et al., Cell Tissue Res 282, 155 (Oct, 1995)）。侵害受容マーカーTRPV1との多少のオーバーラップ（24％）は、有害機械感覚におけるPiezo2の潜在的役割を、さらに示唆している。
【０１６９】
次に、siRNAトランスフェクションを使って、DRGニューロンのMA電流におけるPiezo2の役割を直接調べた。まず最初に、RNAiアプローチを、TRPA1（DRGニューロンにおいて発現し、カラシ油（MO）によって活性化されるイオンチャネル）で検証した（M. Bandell et al., Neuron 41, 849 (Mar 25, 2004)；S. E. Jordt et al., Nature 427, 260 (Jan 15, 2004)）（図12A〜B）。Piezo2の機能的発現をブロックするsiRNAの能力は、Piezo2 cDNAとPiezo2 siRNAの両方を同時トランスフェクトしたN2A細胞で実証された（図12C、15倍減少）。次に、ホールセルMA電流を、GFPとスクランブルsiRNAまたはPiezo2 siRNAのどちらか一方（スクランブルsiRNAについてはn＝101、Piezo2 siRNAについてはn＝109）とを同時トランスフェクトしたDRGニューロンから記録した。記録されたMA電流は、先に述べられているとおり、その不活性化動態に従ってグループ分けされた（図10B）（B. Coste et al., J Gen Physiol 129, 57 (Jan, 2007)；L. J. Drew et al., J Neurosci 22, RC228 (Jun 15, 2002)；L. J. Drew et al., J Physiol 556, 691 (May 1, 2004)；J. Hu, G. R. Lewin, J Physiol 577, 815 (Dec 15, 2006)；C. Wetzel et al., Nature 445, 206 (Jan 11, 2007)）。スクランブルsiRNAトランスフェクト細胞におけるτinac分布に基づいて、4種類のニューロンが同定された（図6D）：τinac＜10ms、10＜τinac＜30、τinac＞30、非応答性ニューロン。約7msのτinacを持つPiezo2発現ニューロンは、τinac＜10ms DRG集団の中にあると予想される。注目すべきことに、τinac＜10msのMA電流を発現するニューロンの比率は、スクランブルsiRNAトランスフェクトニューロンと比較して、Piezo2 siRNAでは、特異的かつ有意に低減した（図10C）。スクランブルsiRNAトランスフェクトニューロンの28.7％がτinac＜10msであるのに対し、Piezo2 siRNAトランスフェクトニューロンでは7.3％だった（図10D）。Piezo2 siRNA試料に存在するMA電流の動態が遅いニューロン（10msと30msの間のτinacおよびτinac＞30ms）は正常だった。Piezo2の喪失が速順応性ニューロンをノンレスポンダーへと添加するのだとすれば予想されるとおり、機械的に非感受性であるニューロンの数は増加する傾向が観察された。また、これらのRNAiデータを、150ms試験パルス中の電流不活性化の度合に従って解析したところ、同様の結論に達した（図12E）。τinac＜10msの残存MA電流が、不完全なPiezo2ノックダウンによるのか、別のチャネル複合体の存在によるのかはわかっていない。ともかく、培養DRGにおける速順応性MAイオンチャネル活性の大半にとって、Piezo2は特異的に必要である。
【０１７０】
［実施例9］
Piezo1およびPiezo2のターゲティングの治療的利益
多くの研究により、脊椎動物メカノトランスダクションには、カルシウム透過性機械刺激活性化(MA）陽イオン電流が関連付けられている（O. P. Hamill, B. Martinac, Physiol Rev 81, 685 (Apr, 2001)）。ここでは、2つの異なる確立された方法、すなわちホールセル構成においてガラスプローブから適用される圧電駆動の圧力、およびセルアタッチトモードにおけるパッチピペットによる形質膜の伸展を使って、細胞ベースの機械刺激感受性をアッセイした（J. Hao et al.「Mechanosensitivity of the Nervous System」I.K.e.A. Kamkin編（Springer オランダ，2008），vol.2, pp.51-67）。これらのアッセイを使って、Piezo1は、Neuro2A細胞におけるMA電流にとって必要であり、Piezo2は、DRGニューロンにおけるMA電流のサブセットにとって必要であることがわかった。さらにまた、3つの異なる細胞タイプにおいてPiezo1またはPiezo2を過剰発現させることにより、MA電流の顕著な17〜300倍の増加が起こる。それゆえに、Piezoは、さまざまな細胞タイプにおけるMA電流の発現にとって、必要かつ十分である。注目すべきことに、Piezo1またはPiezo2の過剰発現は、ユニークなMA電流順応特性を付与し、これは、それらが異なるMAイオンチャネルの構成要素であることを示している。
【０１７１】
Piezo1配列とPiezo2配列はユニークであると思われ、既知のイオンチャネルまたは他のタンパク質クラスには類似していない。予想膜貫通ドメインが非常に多いこと（マウスPiezo1およびPiezo2の場合、それぞれ30個および34個の膜貫通ドメイン）は、6つの膜貫通単位の4回の繰り返しから構成される24個の膜貫通ドメインを有する電圧活性化ナトリウムチャネルを連想させる（M. R. Hanlon, B. A. Wallace, Biochemistry 41, 2886 (Mar 5, 2002)）。しかしPiezoタンパク質に当初からポア含有ドメインまたは反復ドメインが認められているわけではない。もしかすると、電位作動性チャネルのベータサブユニット（M. R. Hanlon, B. A. Wallace, Biochemistry 41, 2886 (Mar 5, 2002)）またはATP感受性K+チャネルのSURサブユニット（S. J. Tucker, F. M. Ashcroft, Curr Opin Neurobiol 8, 316 (Jun, 1998)）と同様に、Piezoタンパク質は、チャネルの適正な発現またはチャネルの性質を調整するのに必要なイオンチャネルの非導電性サブユニットであるのかもしれない。しかし、おそらくそうではないだろう。というのも、それは、Piezoが機能するのに必要な、MAチャネルのサイレントな導電性サブユニットを、ここで使用した全ての細胞タイプが発現することを含意することになるからである。あるいは、Piezoタンパク質は、既知のチャネルに対して有意な相同性を有さない最近同定されたイオン導電性チャネルであるOrai1と同様の、新しい種類のイオンチャネルを規定するのかもしれない（M. Prakriya et al., Nature 443, 230 (Sep 14, 2006)）。Piezo1/Fam38Aは、小胞体にも見いだされているので（K. Satoh et al., Brain Res 1108, 19 (Sep 7, 2006)；B. J. McHugh et al., J Cell Sci 123, 51 (Jan 1, 2010)）、Piezoは、形質膜でも細胞内コンパートメントでも作用する可能性がある。実際、ここに示すデータは、過剰発現したPiezo1を形質膜またはその近傍に見いだしうることを示している。
【０１７２】
Piezo1は、腎臓を含めて、メカノトランスダクションに関与するさまざまな組織において発現する。興味深いことに、類似する性質を有する伸展活性化チャネルが腎臓由来細胞で記述されている（R. Sharif-Naeini et al., J Mol Cell Cardiol 48, 83 (Jan, 2010)；P. Gottlieb et al., Pflugers Arch,  (Oct 23, 2007)）。Piezo1発現配列タグ（EST）は内耳にも見いだされる。有毛細胞のMAチャネルのコンダクタンスは、蝸牛における場所に依存して変動し、80〜163pSの範囲にわたる（A. J. Ricci et al., Neuron 40, 983 (Dec 4, 2003)）。この範囲はPiezo1によって伝導されるものとは類似していないが、コンダクタンスの変動は、それが未知の因子によって調整されうること、そしてそれゆえに、これを根拠に候補を除外してはならないことを示唆している。
【０１７３】
Piezo2は感覚ニューロンにおいて発現し、機械刺激活性化電流にとって必要である。機械的痛覚過敏は、炎症痛および神経障害性痛を含む多くの疼痛状態において優勢な状態である。したがってPiezo2は、さまざまな疼痛、痒み、および炎症適応症のターゲットになりうる。Piezo1およびPiezo2のターゲティングは、聴覚、血管緊張および血流の調節、腎臓における尿流量感知、肺の成長および傷害を含むさまざまな適応症、ならびに骨および筋ホメオスタシス（これらはいずれもメカノトランスダクションによって調節される）においても、治療的利益を有しうる。
【０１７４】
配列表は、87396-817888_ST25.txtというタイトルのASCIIテキストファイルとして、本願と一緒に提出される。このファイルは2011年8月23日に作成されたもので、139キロバイトである。
【０１７５】
本明細書に記載する実施例および実施形態は例示を目的とするにすぎないこと、および当業者にはこれらを踏まえたさまざまな変更および改変が示唆され、それらが本願請求項の要旨および範囲に包含されることは、言うまでもない。本明細書において言及する刊行物、特許、および特許出願は、全て、参照により、あらゆる目的で、そのまま本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図４】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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