(57)【要約】  グルコースナノセンサーを用いて、高い空間時間分解能でもって細胞または組織の代謝速度またはグルコース消費の速度を測定する方法が開示される。該方法は概して、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片、またはインビボの動物組織における、単細胞または細胞集団、懸濁または接着した状態の細胞を、グルコース代謝速度の測定のために用意すること；個々の細胞においてグルコースセンサーを発現させること；制御条件において上記センサーを較正すること；上記細胞に入るグルコースの定常状態を阻害すること；上記センサーからの出力を記録することおよび異なる時間における対応するグルコース濃度を計算すること；およびグルコース代謝速度を決定すること、を含んでいる。この方法は、薬理学的な潜在性を有する分子のスクリーニング、癌細胞のグルコース速度の決定、組織生理学的および生化学的な研究のために利用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高い時間分解能でもってグルコース代謝速度を測定する方法であって、以下の工程を含んでいる方法：
ａ．細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片、またはインビボの動物組織における、単細胞または細胞集団、懸濁または接着した状態の細胞を、グルコース代謝速度の測定のために用意すること；
ｂ．個々の細胞においてグルコースセンサーを発現させること；
ｃ．制御条件において上記センサーを較正すること；
ｄ．上記細胞に入るグルコースの定常状態を阻害すること；
ｅ．上記センサーからの出力を記録することおよび異なる時間における対応するグルコース濃度を計算すること；および
ｆ．グルコース代謝速度を決定すること。
【請求項２】
工程（ｂ）の上記グルコースセンサーは蛍光性センサーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記グルコースセンサーはFLIPglu600μΔ11である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）の較正は、糖分解を妨げるために、上記細胞を０．５ｍＭのヨード酢酸で３０分間前処理することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
次第に増加する濃度のグルコースに上記細胞を曝すことおよび上記センサーによって与えられるシグナルをモニターすること：ならびに
異なる細胞型のそれぞれについての飽和パラメーターを見積もるために、上記センサーのシグナル対グルコース濃度をプロットすること：
をさらに含んでいる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ゼロリーディングを作るためにグルコース非存在下で細胞におけるシグナルを一過的に測定すること；および
上記センサーのシグナルを、上記ゼロリーディングおよび飽和パラメーターを用いて、グルコース濃度に変換すること：
をさらに含んでいる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記グルコースの定常状態の阻害は、初期の定常状態の間に、細胞外のグルコースを細胞内の濃度より低い濃度まで減少させることによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記グルコースの定常状態の阻害は、グルコーストランスポーター阻害剤を細胞外空間に添加することによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記グルコーストランスポーター阻害剤は、サイトカラシンＢ、フロレチン、ゲニステイン、パラクロロ水銀ベンゾエート、または抗ＧＬＵＴ抗血清を含んでいる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記グルコーストランスポーター阻害剤はサイトカラシンＢであり、かつ５μＭ〜２０μＭの最終濃度において上記細胞外空間に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
上記グルコースセンサーの出力は、１００ミリ秒〜１分の時間の間隔において記録される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記グルコース代謝速度の決定は、減少の経時変化に単一指数関数を当てはめることおよび瞬間の傾きを算出することを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法に従って、癌組織のサンプルのグルコース代謝速度を決定することを含んでいる、癌のステージを決定する方法。
【請求項１４】
上記癌組織は、乳癌、膀胱癌、大腸癌、グリア芽腫、肺癌、肝細胞癌、胃癌、黒色腫、甲状腺癌、子宮体癌、腎臓癌、子宮頸癌、膵癌、食道癌、前立腺癌、脳癌、卵巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、中皮腫、肉腫、小児悪性腫瘍、胆管癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法に従って、潜在的薬物に曝されたモデル細胞培養物のグルコース代謝速度を決定することを含んでいる、潜在的薬物をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
上記モデル細胞培養物は、３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞および脂肪細胞、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞およびミオサイトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記モデル細胞培養物は、ＨｅＬａ細胞、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ、Ｃａｃｏ２、Ｃ６、Ａ５４９、ＭＣＦ７、ＰＣ−３、およびＡＧＳである、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の技術分野〕
本発明は、グルコースナノセンサーを用いて、高い空間時間分解能でもって細胞または組織の代謝速度またはグルコース消費速度を測定する新規な方法である。この方法は、薬理学的な潜在性を有する分子のスクリーニング、癌細胞のグルコース速度の決定、組織生理学的および生化学的な研究のために利用され得る。
【０００２】
〔発明の背景〕
代謝速度は、身体が食糧を燃焼する速さであり、生理学的活性、ホルモン、ストレス、老化および癌化に対して感受性がある。組織の内部ではあらゆる細胞が特異的な代謝速度によって特徴づけられ、遅い皮膚の繊維芽細胞のような静止状態の細胞から、非常に速い上皮および筋肉におけるいくつかの細胞まで多岐にわたる。また、個々の細胞の代謝速度は、経時的に変化し得る：例えば、脂肪細胞はインスリンに対する応答においてグルコース吸収の速度を１０倍に至るまで増加させ、一方、ニューロンは電気刺激に対する応答においてより大きなファクターよってエネルギー要求を増加させ得る。また、代謝速度は老化および疾病に影響される。例えば、癌細胞は、それらの周囲にある組織よりも速い代謝速度を示し、腫瘍進行に関係する現象を示し、この疾病の診断、段階付けおよび予後の目的に役立つ１、２。
【０００３】
単細胞における代謝速度を測定するために利用可能な方法は存在しない。もっと具体的にいえば、放射性同位体を用いて代謝速度を測定する現在一般的な技術は、単細胞を区別することができず、時間分解能が不十分であり、それは複合組織または素早い現象の研究を妨げる。
【０００４】
細胞集団および組織は、通常、放射性の代謝産物の吸収を測定することによって研究される。典型的なインビトロ実験では、培養ディッシュ中の１００万個の細胞が放射標識されたデオキシグルコースに２０分間曝される。放射標識されたデオキシグルコースはヘキソキナーゼによってリン酸化されるため、細胞内に取り込まれた放射能が代謝速度に比例するであろうと推定される。インビボ実験については、トレーサーが静脈内に投与され、２０分またはそれより長い時間の経過後、組織中に蓄積した放射能がオートラジオグラフィーによって検出されるか、あるいはフッ化デオキシグルコース（ＦＤＧ）−ＰＥＴスキャン（脳の機能マッピングにおける幅広い応用および腫瘍の検出のための幅広い応用が見出されている技術）によって非観血的に検出される。デオキシグルコースの吸収、デオキシグルコースのオートラジオグラフィーおよびＦＤＧ−ＰＥＴスキャンは、便利であるが、制約を有している。第一に、それらはグルコースではなく類似体を用いており、細胞は類似体を同様には扱わない。第二に、グルコース類似体の吸収は、代謝速度によって直ちには決定されないだけでなく、細胞内への進入を仲介するグルコーストランスポーターの通常知られていない特性に依存する。第三に、それらは低い空間時間分解能を示し、個々の細胞の寄与を区別することまたは素早い現象を検出することを妨げる。最後に、それらは感受性が比較的なく、かつアイソトープの操作を必要とし、ハイスループット分析に不適当である。
【０００５】
さらに、現在知られているように、代謝速度の決定に関する全ての特許出願は、グルコースの測定に関するものであるが、代謝速度の決定の問題点に取り組んだ特許出願はない。特に、細胞内グルコースを測定するための組成物および方法が記載されている米国特許出願第２００５０１９７３１１号。この出願は、グルコース調節ｍＲＮＡの不安定な成分を含む核酸構成物を用いている。この不安定な成分は、高いグルコース濃度の存在下で下方制御され得るレポーターベクターに結合する。この方法における制約はタンパク質の発現における遅れであり、それゆえこの方法は、単細胞または組織の代謝速度を決定する場合のような、良好な時間分解能が要求される用途には不適当である。米国特許出願第２００５０１９７３１１号に見られる記載によって達成される時間（hours）の時間分解能と比較して、本願発明は分さらには秒の時間分解能を可能にする。
【０００６】
米国特許出願第２００５０１１８７２６号には、蛍光性の領域を含んでいる融合タンパク質を基本とした異なるタンパク質領域を含むセンサーが記載されている。また、グルコース濃度の検出のための潜在的な装置も記載されている。それでもやはり、センサーの時間分解能に言及していないし、代謝速度の決定の問題点に取り組んでいない。
【０００７】
蛍光は、高い感受性および空間時間分解能でもって、代謝産物の濃度を評価することを可能にする。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ自己蛍光３に加えて、ＤＮＡコード化プローブの有用性の向上は、蛍光を用いて種々の代謝産物の濃度を測定することを可能にしてきた４、５。代謝産物の濃度はそれ自体が興味深いが、生細胞における恒常性機構の存在は、流動予測にとって少し価値のある定常状態の濃度を作り出す。
【０００８】
現在、ＦＲＥＴナノセンサーを用いて単細胞におけるグルコースの濃度を測定することが可能である４、６、７。
【０００９】
国際特許出願第ＷＯ２００６００６１６６号には、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）およびシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）に基づくグルコースセンサーが記載されている。米国特許第７，４３２，３５３号には、強化された黄色、シアン、青色および緑色蛍光タンパク質ならびに赤色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質を基本とした異なる部分を含むマルトースセンサーが記載されている。国際特許出願第ＷＯ２００７０４６７８６号には、グルコース蛍光センサーが記載されている。これらの特許出願は全て、蛍光のグルコースまたはマルトースセンサーに言及しているが、これらのうちの何れもが単細胞または組織における代謝速度の決定の問題点に取り組んでいない。
【００１０】
しかしながら、他の代謝産物と同様に、定常状態におけるグルコースの濃度は代謝経路を通した流れについて情報を与えるものではない。本願発明は、グルコースの流れにアプローチする方法を提供する。
【００１１】
本願発明においては、ＤＮＡコード化ナノセンサーを用いてグルコースの濃度を測定しつつ定常状態を阻害することによって、定常状態におけるグルコース濃度の測定の不自由さが回避されている。特に、ニューロンのシグナルによって数秒以内にアストロサイトの糖分解が活性化され得ることを、本願発明の方法によって初めて観察することができ、脳における神経代謝および神経血管の共役におけるアストロサイトについての中心的な役割を支持した。また、至近距離にあるニューロンおよびアストロサイトにおける代謝の直接比較を行うことを可能にし、脳のエネルギー代謝を高分解能でもって特徴付ける道を開いた。また、繊維芽細胞、脂肪細胞、筋芽細胞および腫瘍細胞において単細胞の代謝速度が測定され、細胞株に関してさえも代謝の不均一性を明らかにした。本願発明の方法は、単細胞レベルにおける組織の代謝の調査を可能にし、マイクロタイタープレートを用いたハイスループット分析に直ちに適用できる。
【００１２】
〔発明の簡単な説明〕
本願発明は、代謝速度を決定するためのグルコースの測定に関する、定常状態によって強いられる制約から生じる問題点に、定常状態を阻害することによって取り組んでいる。分析物の測定を行うための定常状態の阻害は、先行技術を考慮しても明白ではない。なぜなら、現在通常の方法は全て、定常状態の前提に頼っており、それゆえ定常状態を阻害する代わりに、定常状態を維持するような条件が与えられるからである。方法、分析物、センサー、およびデータの適当な解釈が達成されれば、定常状態の阻害は有用な結果および情報のみを提供し得る。
【００１３】
本発明はグルコース代謝速度を測定するための方法を含んでいる。該方法は、単細胞または細胞集団、懸濁または接着した状態の細胞に適用し得、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片に適用し得、あるいはインビボの動物組織にも適用し得る。該方法は、個々の細胞における、適当なグルコースセンサーの発現を含んでいる。グルコースセンサーはリアルタイムでグルコース濃度をモニターすることができることが望ましい。適当なグルコースセンサーは、グルコース濃度に依存する方法において読み取り易いシグナルを与えることが望ましく、細胞内に通常存在する他の分子に対して感受性がないことが望ましい。センサーの発現、存在または分解は、細胞の代謝を著しくは阻害しないことが望ましい。そのようなセンサーの非限定的な例は、特許出願第ＷＯ２００７０４６７８６号に記載されているものであり得る。
【００１４】
グルコースセンサーは、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片、またはインビボの動物組織における、単細胞または細胞集団、懸濁または接着した状態の細胞において発現することが望ましい。遺伝子的にコード化されたグルコースセンサーを用いる場合、宿主細胞にセンサーの遺伝子情報を導入するための任意の適当な方法によって遺伝子発現が達成され得る。遺伝子導入の方法論の例は、プラスミドの導入（例えば、リポソーム伝達を用いる）、ウイルス導入および遺伝子転換である。
【００１５】
細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片、またはインビボの動物組織における、単細胞または細胞集団、懸濁または接着した状態の細胞においてセンサーがいったん発現すれば、センサーは予め確立された条件に従って較正される。
【００１６】
較正工程において得られた情報を用いて、グルコースの流れ（一般的には定常状態が維持される）を阻害することによって代謝速度の決定が行われる。この阻害は任意の適当な方法によって達成され得る。一実施形態において、定常状態の阻害は、細胞外のグルコースの濃度を、細胞内のグルコースレベルより低いレベルに変えることによって得られる。別の実施形態において、定常状態の阻害は、グルコーストランスポーターＧＬＵＴの阻害剤（例えば、サイトカラシンＢ、フロレチン、ゲニステイン、パラクロロ水銀ベンゾエート、抗ＧＬＵＴ抗血清などが挙げられるが、これらに限定されない）を添加することによって達成される。細胞において、グルコース輸送はＮａ＋依存型トランスポーターによって仲介されるため、該方法はフロリジンを用いて適用され得る。
【００１７】
定常状態の阻害がいったん得られれば、センサーによって生み出されるデータの記録によって、代謝速度の決定をすることができる。
【００１８】
要約すると、本願発明の方法は、以下の工程を含んでいる：
−グルコース代謝速度の測定のためのシステムを用意すること。該システムは、単細胞または細胞集団、懸濁または接着した状態の細胞、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片、またはインビボの動物組織であり得る；
−個々の細胞において適当なグルコースセンサーを発現させること。遺伝子発現、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片、またはインビボの動物組織における、単細胞または細胞集団、懸濁または接着した状態の細胞；
−制御条件において上記センサーを較正すること；
−上記細胞に入るグルコースの定常状態を以下の方法によって阻害すること：
−グルコースの濃度における変化に細胞外空間を曝すこと（ＥＴＭ：平衡輸送法（Equilibrium Transport Method））または
−ＧＬＵＴ阻害剤を添加すること（ＩＴＭ；阻害剤輸送法（Inhibitor Transport Method））；
−上記センサーからの出力を記録することおよび異なる時間における対応するグルコース濃度を計算すること；
−グルコース代謝速度を決定すること。
【００１９】
細胞または組織の好ましい種類は、受動拡散型グルコーストランスポーターを発現し、かつＮａ＋依存型グルコーストランスポーターを発現しないものであり、ニューロン、アストロサイト、筋細胞、脂肪細胞、肝細胞、膵臓細胞、線維芽細胞、幹細胞、血液細胞、内皮細胞、およびほとんどの種類の哺乳類細胞が挙げられる。Ｎａ＋依存型グルコーストランスポーターを発現する細胞（腸細胞および腎細胞など）については、阻害剤フロリジンを用いてグルコースの流れを遮断することによって代謝速度が測定され得る。
【００２０】
〔図面の簡単な説明〕
本発明は添付の図面によって例証される。
【００２１】
図１の（ａ）〜（ｃ）は、ＥＴＭおよびＩＴＭと定義される本発明の方法の２つのタイプを図式的に説明している。
【００２２】
図２の（ａ）〜（ｃ）は、アストロサイトにおいて用いた該方法のＥＴＭタイプを実証している。
【００２３】
図３の（ａ）〜（ｆ）は、アストロサイトにおける方法の該ＩＴＭタイプを実証している。
【００２４】
図４の（ａ）および図４の（ｂ）は、ＩＴＭを用いたニューロンのシグナルによるアストロサイトの糖分解の活性化に関する時間分解能を説明している。
【００２５】
図５の（ａ）〜（ｄ）は、アストロサイトおよびニューロンにおける糖分解速度の同時測定に関する空間分解能を説明している。
【００２６】
図６の（ａ）〜（ｆ）は、ＩＴＭを用いることによって決定された種々の細胞における糖分解速度の不均一性を示すグラフを包含する。
【００２７】
図７の（ａ）〜（ｄ）FLII12Pglu600Δμ6ナノセンサーの較正。ナノセンサーは、アストロサイト（ａ）、３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞（ｂ）、Ｃ２Ｃ２１筋芽細胞（ｃ）およびＨｅＬａ細胞（ｄ）において、ヨード酢酸と共に３０分間プレインキュベートすることによって糖分解を完全に阻害した後、次第に増加するグルコース濃度（０〜２ｍＭ）に培養物を曝すことによって較正した。データは、各細胞種について、３回の実験からの少なくとも７個の細胞から得られたものである。飽和パラメーターは、非線形回帰を用いて該データに直角双曲線を当てはめることによって得られた。
【００２８】
図８の（ａ）〜（ｃ）アストロサイトの細胞体積に対するグルタミン酸塩／Ｋ＋の影響。ａ）カルセインがロードされた細胞は、まず５０μＭ グルタミン酸塩／１５ｍＭ Ｋ＋に曝され、次いで３０％低張溶液（hypo）になるようＮａＣｌが減らされた溶液に曝された。相対的カルセイン濃度は、較正因子として、低張性に対する応答を用いて、カルセインの蛍光から計算された。ｂ）Ａ（カルセイン）に示されているグルタミン酸塩／Ｋ＋に対する応答の初期の経時変化が、Ｋ＋によって誘発されたグルコース濃度における相対的減少の例示と共にプロットされている（グルコース、図４のａ）に示されているのと同様のデータ）。ｃ）グルコース（５回の実験においてｎ＝２５細胞）およびカルセイン（３回の実験においてｎ＝２０細胞）に関して、５０μＭ グルタミン酸塩／１５ｍＭ Ｋ＋を用いた一連の実験について、減少の初速度が与えられている。
【００２９】
〔発明の詳細な説明〕
前述のように、本願発明の方法は、種々のシステムにおける代謝速度の測定に関する。特には、本願発明の方法は、グルコースの定常状態の阻害に基づいている。
【００３０】
グルコースの定常状態の阻害は、種々の手段によって達成され得る。一実施形態において、グルコースの定常状態の阻害は、１つの工程における細胞外のグルコースを、細胞内のグルコースよりも低いがゼロではない濃度まで低下させることによって達成され得る。そのような乱れは新たな定常状態に向かう迅速な減少を引き起こす。決定的に、減少の過程において、内側と外側のグルコースが等しい瞬間が存在する。ほとんどの哺乳類細胞へのグルコース吸収を仲介するトランスポーターは受動拡散型である（すなわち原形質膜を挟んで濃度勾配がある場合にだけグルコースを移動させる）ため、グルコースが平衡となる時点において、トランスポーターを介した（さらに詳しく言えば、単純拡散または任意の他の受動経路を介した）正味の流れはなくなり得る。このように浸透性の寄与が排除され、グルコースの平衡時におけるグルコース濃度の低下の速度は、ヘキソキナーゼの速度（すなわちその入口点における糖分解の速度）と等しくなり得る。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、グルコースの定常状態の阻害は、グルコーストランスポーターの薬理学的遮断によって浸透性の寄与を排除することによって達成される。トランスポーターの阻害は、細胞内のグルコースにおける準線形の減少、グルコースに対するヘキソキナーゼの高い親和性（グルコースがミリモルの範囲から数百マイクロモルへ減少する際、ほぼ飽和したままである）から得られる線形性をもたらす。それゆえ、輸送を遮断した後のグルコースの減少速度も、糖分解の速度に対応し、ヘキソキナーゼのＶｍａｘの満足できる評価となる。
【００３２】
本願発明の方法は、６つの工程において好ましくは説明され得る。
【００３３】
第１の工程：グルコース代謝速度の測定のためのシステムを用意すること。
該システムは、単離状態、細胞培養、組織培養、混合細胞培養における細胞、組織外植片、または生きている動物の組織における細胞であり得る。非限定的で例証的な例において、該システムはアストロサイト、ニューロン、線維芽細胞、脂肪細胞または筋細胞の細胞培養であり得る。
【００３４】
第２の工程：個々の細胞において適当なグルコースセンサーを発現させること。
グルコースセンサーはリアルタイムでグルコース濃度をモニターすることが可能であることが望ましい。適当なグルコースセンサーは、グルコース濃度に依存する方法において読み取り易いシグナルを与えることが望ましく、細胞内に通常存在する他の分子に対して感受性がないことが望ましい。センサーの発現、存在または分解は、細胞の代謝を著しくは阻害しないことが望ましい。非限定的で例証的な例において、グルコースセンサーはFLIPglu600μΔ11（特許出願第ＷＯ２００７０４６７８６号に記載されている）であり得る。
【００３５】
センサーが遺伝子的にコード化されている場合、遺伝子発現は任意の遺伝子工学的な方法（例えば、プラスミド導入、ウイルス導入または遺伝子転換）によって達成され得る。
【００３６】
第３の工程：制御条件においてセンサーを較正すること。
まず、細胞を０．５ｍＭのヨード酢酸で３０分間前処理して糖分解を遮断することによってセンサーを較正する。糖分解の流れがない状態において、受動拡散型ＧＬＵＴトランスポーターの存在によって、細胞の内側および外側におけるグルコース濃度が等しくなる。次いで、次第に増加する濃度のグルコースに細胞を曝し、センサーによって与えられるシグナルをモニターする。センサーのシグナルを濃度に対してプロットし、飽和パラメーターを見積もる。この手順は、異なる種類の細胞のそれぞれについて一回行われる。続く測定に関しては、グルコースの非存在下で細胞において瞬間的にシグナルを測定する。この「ゼロ」リーディングは、センサーのシグナルをグルコース濃度に変換するために、前述の飽和パラメーターと共に用いられる。
【００３７】
第４の工程：細胞に入るグルコースの定常状態を阻害すること。
グルコースの定常状態の阻害は、細胞外空間をグルコースの濃度における変化に曝すことによって得られうる（ＥＴＭ）。非限定的で例証的な例において、細胞外のグルコース濃度は、２ｍＭから０．３ｍＭに下げられる。この細胞外のグルコースにおける変化は、細胞内のグルコース濃度を１ｍＭから０．１ｍＭへ漸進的に減少させる（図２のｂ）。アッセイを複数回繰り返したところ、図２のｃに示されるように、速度は前の測定に影響されず、アッセイ自体は糖分解を乱さないことが示唆された。この細胞内のグルコースにおける穏やかな減少に対する代謝の非感受性は、ヘキソキナーゼが飽和したままでいる間の代謝の流れの定常性と一致する。
【００３８】
別の実施形態において、グルコースの定常状態の阻害は、適当な阻害剤を用いてグルコーストランスポーターＧＬＵＴを遮断することによって達成され得る（ＩＴＭ）。そのような阻害剤の非限定的で例証的な例は、サイトカラシンＢ、フロレチン、ゲニステイン、パラクロロ水銀ベンゾエートおよび抗ＧＬＵＴ抗血清である。阻害剤は、少なくとも９０％のトランスポーターを遮断する濃度（サイトカラシンＢでは、範囲は５μＭ〜２０μＭである）で培養培地に添加される。
【００３９】
第５の工程：センサーからの出力を記録することおよび異なる時間における対応するグルコース濃度を計算すること。
定常状態を阻害するために用いた方法の実施形態に関係なく、センサーからの読み取りは、１００ミリ秒〜１分の範囲の適当な時間の間隔（例えば、１００ミリ秒毎、１秒毎、１０秒毎、１分毎）を考慮した適切な時間で記録される。センサーの読み取りからの出力および較正曲線によって、各時点におけるグルコース濃度の計算が可能となる。
【００４０】
第６の工程：グルコース代謝速度を決定すること。
定常状態を阻害するために用いた方法の実施形態に関係なく、糖分解の速度は、減少の経時変化に単一指数関数を当てはめることによって見積もられる。一実施形態において、代謝速度は、細胞内の濃度が細胞外の濃度（例えば、０．３ｍＭ）と等しくなる時点におけるグルコース濃度の減少の速度から計算される（図２のｂにおける破線）。第２の実施形態において、ＧＬＵＴ遮断剤の存在下、代謝速度は、任意のグルコース濃度におけるグルコース濃度の速度から計算される。
【００４１】
さらなる実施形態において、該方法は、ヒトまたは動物の組織サンプルにおける代謝速度の測定のための診断キットに組み入れられ得る。
【００４２】
本発明の方法は、必要とされる任意の状態における代謝速度を決定するために適用され得る。
【００４３】
癌細胞は、それらの糖分解の速度における大幅な増加によって特徴付けられる。いわゆる糖分解表現型であり、それは癌の転移を作り出す能力に重要である。
【００４４】
糖分解表現型の薬理学的転換（pharmacological reversion）は、癌表現型の部分的な反転（reversal）を引き起こすことが示されている。一実施形態において、該方法は、癌の生検における代謝速度の決定に適用され得、それゆえ、細胞における糖分解の速度を評価する助けとなり、さらに、癌がどのぐらい活動的であるか、ならびに最も適切な方針および投与すべき薬物を評価する助けとなる。本願発明の方法に従って分析される対象となり得る癌の種類は、乳癌、膀胱癌、大腸癌、グリア芽腫、肺癌、肝細胞癌、胃癌、黒色腫、甲状腺癌、子宮体癌、腎臓癌、子宮頸癌、膵癌、食道癌、前立腺癌、脳癌、卵巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、中皮腫、肉腫、小児悪性腫瘍、胆管癌から選択されるが、これらに限定されない。
【００４５】
他の実施形態において、該方法は、潜在的な抗癌剤の候補の効果を試験するために、癌細胞株を用いて、ハイスループットで用いられ得る。好適な候補は、癌細胞株の糖分解速度を減少させ得る。特に、抗癌剤の候補のスクリーニングは、異なる条件の組み合わせにおいて、本発明の方法を用い得る。潜在的な抗癌剤の候補のスクリーニングに適した癌細胞株は、ＨｅＬａ細胞、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ、Ｃａｃｏ２、Ｃ６、Ａ５４９、ＭＣＦ７、ＰＣ−３、ＡＧＳから選択されるが、これらに限定されない。
【００４６】
真正糖尿病は、筋細胞および脂肪細胞の、グルコースを代謝する能力における低下によって引き起こされる。血糖低下薬は、筋細胞および脂肪細胞の、グルコースを代謝する能力を向上させることによって、糖尿病を改善し得る。さらなる実施形態において、本発明は、３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞および脂肪細胞、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞およびミオサイトなどに、ハイスループットで用いられ得、一連の潜在的な薬物の候補は、代謝速度の変化における効果について試験され得る。
【００４７】
潜在的な薬物の候補のスクリーニングにハイスループットで該方法が用いられ得る特定の場合において、潜在的な薬物の特定の候補は培養培地に添加される。
【００４８】
〔実施例〕
標準的な化学物質および組織培養の試薬は、Sigma（ミズーリ州セントルイス）から入手した。センサーであるFLIPglu170n、FLIPglu600μΔ11、FLII12Pglu600μΔ6をコードする構造物は、以前に記載されている４、６、７。プラスミドはwww.addgene.orgを介して利用可能である。アデノウイルスベクターであるAd FLIPglu600μΔ11およびAd FLII12Pglu600μΔ6は、Vector Biolabsによって特注で作製された。
【００４９】
（動物、細胞培養および組織スライス）
用いた動物は、Ｆ１の雄のマウス（C57BL/6J x CBA/J）であり、２０±２℃の室温、１２／１２時間の明暗条件において、自由に餌および水を入手できるＳＰＦ条件下の動物飼育室中で飼育されたものである。全ての実験は、Centro de Estudios Cientificos Animal Care and Use Committeeによって承認されたものである。N1-N2/MEMの代わりにB27-supplemented Neurobasal 培地（Gibco）を用いたことを以外はLoaiza et al. １９に記載されているとおりに、神経細胞およびグリア細胞の混合皮質培養物を、１〜３日齢の新生児マウスから用意した。３７℃、５％ＣＯ２の加湿された雰囲気において培養物を維持した。５〜７日目において、３５ｍｍディッシュ中の培養物を、Lipofectamine 2000（Gibco）を用いて、５μｇ プラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。または、その代わりに、３５ｍｍディッシュ中の培養物を、５×１０６ＰＦＵのアデノウイルスベクターに曝露した。アデノウイルスベクターはニューロンよりもアストロサイトに対して非常に高い（＞１００の比率）選択性を示した。細胞株はATCCから入手した。３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞を、１０％ ウシ胎児血清、２．５μｇ／ｍｌ アンホテリシンＢおよび１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったDulbecco's Modified Eagle Medium（ＤＭＥＭ）中に維持し、５μｇ／ｍｌ インスリンを用いて記載された２５とおりに脂肪細胞に分化させた。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞およびＨｅＬａ細胞を、１０％ ウシ胎児血清、２．５μｇ／ｍｌ アンホテリシンＢおよび１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ中に維持した。１０ｃｍディッシュ中で生育している３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞および脂肪細胞に、BioRad Gene Pulser XCellを用いて、１５μｇ プラスミドＤＮＡをエレクトロポレートした。３５ｍｍディッシュ中のＨｅＬａ細胞を、Lipofectamine 2000を用いて、５μｇ プラスミドＤＮＡでトラスフェクトした。
【００５０】
以下の標準的な手順によって、Vibratome 1000 Plus（Warner Instruments）を用いて、１５日齢のマウスから海馬のスライス（２００μｍの厚さ）を用意した２６。手短にいうと、以下の組成（（ｍＭにおいて）１２５ ＮａＣｌ、２．５ ＫＣｌ、１．２５ ＮａＨ２ＰＯ４、２．５ ＭｇＣｌ２、０．５ ＣａＣｌ２、２５ グルコース、２６ ＮａＨＣＯ３）の氷冷したａＣＳＦ（予めｐＨ ７．４に達するまで５％ＣＯ２／９５％Ｏ２で１時間泡立たせた）に脳を浸した。冠状スライスから海馬を切り分け、冷却した解剖培地中で１〜２時間インキュベートした。次いで、スライスを３５ｍｍのペトリ皿に移し、５０％（６．５ｇ／Ｌ グルコース、２３ｍＭ HEPESおよび２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３を含んでいるＭＥＭ）、２５％ ウシ胎児血清、６．５ｇ／Ｌ グルコースを含んでいる２５％ Hank's solution、０．３％ グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、N2 supplement （Invitrogen）、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンにおいて、３７℃、５％ＣＯ２の加湿された雰囲気において５〜６日間培養した。培養の２日目に、スライスを５０×１０６ＰＦＵのアデノウイルスベクターに２４時間感染させた。免疫組織化学のために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した４％パラホルムアルデヒド中で、スライスを一晩固定した。ＰＢＳを用いて完璧に洗浄した後、ウサギ１：５００抗ウシＧＦＡＰ抗血清（Dako）と共に、スライスを４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳを用いてさらに洗浄した後、１：５００Alexa Fluor 568ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Molecular Probes）と共に、組織を４℃で一晩インキュベートした。スライスをDakoCytomation medium（Dako）に載せ、Pascal 5 Zeisss 共焦点顕微鏡を用いて、４８８ 励起／５０５〜５５０ 発光（ＹＦＰに関して）および５４３ 励起／＞５８０ｎｍ 発光（Alexa Fluor 568に関して）において画像化した。
【００５１】
（グルコースおよび体積の測定）
実験を室温（２２〜２５℃）において行った。ＨＥＰＥＳで緩衝された生理食塩水（（ｍＭにおいて）１３６ ＮａＣｌ、３ ＫＣｌ、１．２５ ＣａＣｌ２、１．２５ ＭｇＳＯ４、１−２ グルコース、２ 乳酸ナトリウム、１０ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４を含む）、または、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２ガスが供給された緩衝液（（ｍＭにおいて）１１２ ＮａＣｌ、３ ＫＣｌ、１．２５ ＣａＣｌ２、１．２５ ＭｇＣｌ２、１−２ グルコース、２ 乳酸ナトリウム、１０ ＨＥＰＥＳ、２４ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ ７．４の成分を有する）の中で、培養細胞を画像化した。９５％Ｏ２／５％ＣＯ２ガスが供給された緩衝液（（ｍＭにおいて）１２６ ＮａＣｌ、３ ＫＣｌ、１．２５ ＮａＨ２ＰＯ４、１．２５ ＣａＣｌ２、１．２５ ＭｇＣｌ２、２−３ グルコース、１ 乳酸ナトリウム、26 NaHCO3、pH 7.4を含む）を用いて、脳のスライスを潅流した。より高いＫ＋濃度を用いる場合、等浸透圧を保つようＮａＣｌを調整した。４０×油浸対物レンズ、Optosplitを有するCairnモノクロメーター（Faversham, イギリス）、およびHamamatsu Orcaカメラ（浜松市、日本）を装備した、Kineticsソフトウェアによって制御されたOlympus IX70倒立顕微鏡を用いて、培養物およびスライスを画像化した。ＦＲＥＴ測定に関しては、ＣＦＰを４３０ｎｍにおいて４００ミリ秒間励起させた。FLII12Pglu600μΔ6のＦＲＥＴ効率は非常に高く、低いＣＦＰシグナルを招く７ため、我々は、対照におけるＣＦＰシグナルを用いないことを選択した。その代わり、ＹＦＰ／淡黄色を５０ミリ秒間励起させて、ＦＲＥＴ比についての糖非感受性の分母を与えた。ＦＲＥＴによって励起した（４３０ｎｍにおける）ＹＦＰ／淡黄色と直接励起した（５１２ｎｍにおける）ＹＦＰ／淡黄色との比を、糖分解の遮断剤であるヨード酢酸の存在下で、次第に増加する濃度のグルコースに、ｐＨが固定された細胞を曝すことによって較正した。図８には、アストロサイト、線維芽細胞、筋芽細胞およびＨｅＬａ細胞についての較正曲線が記載されている。ニューロンおよび脂肪細胞（グルコース浸透性が低いため、較正が非常に困難である）については、我々は、それぞれ、アストロサイトおよび線維芽細胞において得られた較正曲線を用いた。０．５μＭのカルセインを用いて３０分間エステルがロードされた細胞において、Pascal 5 Zeisss共焦点顕微鏡（光学的な区画＜２μｍ；４８８ｎｍ励起／５０５〜５５０ｎｍ発光）を用いて、相対的な細胞体積を測定した２７。９０％より多いカルセインの蛍光が体積に従うことが、非等浸透性の溶液へ曝すことによって示された。
【００５２】
（異なるシステムにおける代謝速度の測定）
培養したアストロサイトにおける代謝速度の決定
ＤＮＡにコード化されたＦＲＥＴグルコースナノセンサー４、６、７（その場で較正した）を用いて、細胞内グルコースをリアルタイムで測定した（図７）。２ｍＭの細胞外グルコースの存在下、培養したアストロサイトは、平均して０．６３±０．３０ｍＭ（２２回の実験においてｎ＝１００細胞）の定常状態の細胞内グルコース濃度を維持した。細胞内グルコース濃度は細胞毎にかなり異なっており、０．２〜１．９ｍＭに分布していた。これは、グルコース浸透性と糖分解とのバランスが固定されていないことを示す。
【００５３】
定常状態の阻害は、細胞外グルコースを０．３ｍＭまで下げることよって得られた。細胞外グルコースを下げることによって、細胞内グルコース濃度における漸進的な減少が引き起こされた（図２のｂ）。糖分解の速度は、減少の経時変化に単一指数関数を当てはめることおよび０．３ｍＭにおける瞬間の傾き（図２のｂにおける破線）を算出することによって、１．２μＭ／ｓの代謝速度と見積もられた。次いで、アッセイを数回繰り返した。図２のｃに記載されているように、速度は前の測定に影響されず、アッセイ自体は糖分解を乱さないということが示唆された。細胞内グルコースにおける緩やかな減少に対する代謝の非感受性は、ヘキソキナーゼが飽和したままでいる間の代謝の流れの恒常性と一貫している。
【００５４】
上述の実施例に加えて、ＧＬＵＴ阻害剤を細胞外空間に添加することによって、該方法を試験した。
【００５５】
最も広く使用されるグルコーストランスポーターの阻害剤はサイトカラシンＢであり、１μＭまたはそれ未満のＫｉでもって、ほとんどの細胞型に存在するトランスポーターのアイソフォーム、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ３およびＧＬＵＴ４を遮断する。アストロサイトを阻害剤へ曝すことによって、グルコースの濃度における直線的な減少が引き起こされた（図３のａ）。サイトカラシンＢの継続的な存在下、グルコースの濃度はゼロと区別できないレベルに達し、高度な輸送の阻害を達成したことが示された。培養したアストロサイトにおける糖分解の平均速度は、２．０±０．３μＭ／ｓ（３０回の実験においてｎ＝１２０細胞）であり、顕微鏡視野の内側でさえ数倍の相違を有する高度な不均一性を示した（データは示さず）。ＧＬＵＴ阻害剤を添加することによる定常状態の阻害の妥当性を確認するために、いくつかの対照実験を計画した。サイトカラシンＢは、グルコーストランスポーターを阻害することに加え、サイトカラシンＤ（骨格を標的とするがグルコーストランスポーターを標的としない構造類似体）によって制御され得る阻害の潜在的な原因であるアクチン細胞骨格に影響を与える１０。図３のａ（差込み）に説明されている実験は、サイトカラシンＤがグルコースの濃度に影響を与えないことを示すことによって、サイトカラシンＢの特異性を支持している。センサーに対するサイトカラシンＢの直接的な効果について確認するために、ガラクトースが平衡化されている、FLIPglu170nを発現している細胞に、阻害剤を適用した。この親和性が非常に高いタイプのセンサーは、生理的なグルコース濃度の存在下で飽和される６。そのため、その挙動におけるあらゆる変化は疑う余地なく人為結果とみなせる。図３のｂに説明されているように、サイトカラシンＢはFLIPglu170nの発光強度の比を変化させず、センサーに対する阻害剤の直接的な影響がないことが示された。ＧＬＵＴ阻害剤の使用による定常状態の阻害は再現性が非常に高く、細胞内グルコースにおける漸進的な減少が代謝に影響を与えないということを裏付ける（図３のｃ）。フロレチン（構造的に関連性のないグルコーストランスポーターの阻害剤）は、１．７±０．３μＭ／ｓの糖分解速度を与えたが、これは、サイトカラシンＢによって得られる糖分解速度（１．８±０．３μＭ／ｓ；３対の実験においてｎ＝２０細胞）と顕著には違わなかった。
【００５６】
定常状態が阻害された該方法の正当性を立証するために、図３のｆに説明されているプロトコールを用いた比較を用いたところ、予想されたように、それらの出力は高度に相関していた。このことは、２，０μＭ／ｓのＧＬＵＴ阻害剤を添加することによって得られた代謝速度と、１，２μＭ／ｓの細胞外グルコース濃度を変えることによって得られた平均代謝速度との相違が、該方法の出力間における相違に起因せず、細胞群のバリエーションに起因するということを示している。
【００５７】
（時間分解能：ニューロンのシグナルによるアストロサイトの糖分解の急激な活性化）
デオキシグルコースの吸収における典型的な吸収時間、デオキシグルコースのオートラジオグラフィーおよびＦＤＧ−ＰＥＴスキャンは１０分もより長いが、脳組織を特徴付ける代謝の変化は、秒を超えて発現する。例えば、ニューロンの活性化は、ミトコンドリアの酸化還元電位における秒以下のシフトを伴い３、次いで数秒以内に組織間腔の乳酸塩が増加する１１が、それは神経血管および神経代謝の迅速な共役において重要な役割を果たすと考えられている１２−１４。乳酸糖の原因となる細胞の種類の同定（すなわち、ニューロン対アストロサイト）および電気的活性と代謝の活性化とを結び付ける局所的なシグナルの同定は何れも異論が多い１３、１５、１６、９が、それは、デオキシグルコースが秒の範囲における事象をモニターすることができないということによって部分的に説明される。糖分解の活性化をリアルタイムで追うことができる本願発明の能力の利点を利用して、培養したアストロサイトをグルタミン酸塩およびＫ＋（興奮性シナプスにおけるニューロンによって共に放出される伝達物質）に同時に曝した。図４に要約されているデータは、アストロサイトにおける糖分解の速度における強くて迅速な増加を、ニューロンのシグナルが引き起こすことを示す。注目すべきことに、活性化はミトコンドリアへの毒の投与によって達成される活性化よりもさらに強力である（図３のｅ）。グルタミン酸塩／Ｋ＋に対する反応において観察されるグルコース濃度における迅速な減少を、細胞の膨張の間の糖の希釈によって説明することはできないということが、対照実験によって示された（図８）。アストロサイトの糖分解が秒の範囲におけるニューロンのシグナルによって達成され得ることを初めて示すことによって、これらの結果は、アストロサイトがニューロンの活性化の間に観察される乳酸糖の原因となっていることを示唆し、神経代謝と神経血管との共役において提案された役割に新たな支持を与える。このレベルの時間分解能は、現在の利用可能な方法またはセンサーの何れによっても得られないため、本願発明はそれらに対する大きな利点が与えられている。
【００５８】
（空間分解能：ニューロン対アストロサイト）
脳組織は、解剖学的にも機能的にもかなり詳細に知られているが、そのエネルギー使用は高い空間分解能においてマッピングされたことはない。オートラジオグラフィーまたはＰＥＴスキャンのミリメートルサイズの各３Ｄ画素は、互いに異なるタイプであるニューロンおよびグリア（各細胞は、現時点では知見できない特定の速度で燃料を消費している）のスコアによって生成される。成功への道は、図５のａに説明されている２つの実験によって示唆される。図５のａはニューロンおよび近接するアストロサイトにおける糖分解速度の同時測定を示している。我々は、両細胞種における基礎代謝速度の大きな変動性を観察したが、平均においてより速い細胞はアストロサイトであった（図６も参照）。培養した細胞におけるこれらの結果は脳組織における状況を予測するものではないが、ＦＲＥＴナノセンサーがウイルスベクターまたは遺伝子転換の手段によって、インビボにおける特定の細胞種に対する標的とされ得ることを考慮すると、この種の測定はインビボの脳組織においてそのうち行われ得る。その方向における最初のステップとして、海馬スライスにおいて、アデノウイルスベクターを用いて、センサーを発現させた。図５のｂはセンサーとグリアのタンパク質ＧＦＡＰとの共局在化を示しており、これらのベクターによるグリア細胞の選択的なターゲティングと一致する。培養した細胞においてみられるのと同様に、図５のｃ〜ｄは、スライスにおける代謝速度が平均２．８±０．４μＭ／ｓ（２５スライスにおいてｎ＝６８細胞、０．０２〜１２μＭ／ｓに分布している）であり、高度に不均一であったことを示している。
【００５９】
（他の細胞種）
他の細胞種においても代謝速度を測定することができ、該方法の普遍的な適用性を証明した（図６）。その結果は、高速について放射能による技術を用いた先行の測定と一致し、未分化細胞および腫瘍細胞（Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞およびＨｅＬａ細胞）においてみられた、３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞の脂肪細胞への分化が代謝における顕著な減少を導いた。放射能による技術および現在の方法は同様の結果を与えるが、後者は、蛍光への依存に対する信頼性があるため、ハイスループット分析を目的として適合可能なはずである。さらに、図６に説明されているように、培養した細胞株は高度の代謝不均一性（おそらく細胞周期または変化の他の原因に関係する）を示したが、それは取り組みやすいものと現時点では思われる。
【００６０】
本願明細書に記載されている実施例は、本願発明を説明することを意図して示されており、発明の範囲の限定として解釈されるものではない。
【００６１】
本発明は、代謝速度の測定に関する新規な戦略を導入する。その共通の原理は、グルコーストランスポーターの寄与を排除することによる、グルコースのリン酸化の分離である。本発明の方法は、好ましくは２−デオキシグルコースに基づく方法（分の時間分解能およびミリメートルの空間分解能を提供する）と比較して、秒の時間分解能およびマイクロメートルの空間分解能を提供する。本発明の別の重要な利点は、グルコース自体（ヘキソキナーゼによる処理およびその後の末路が通常知られていないグルコース類似体に対比されるもの）の使用である。これらの類似体の１つである２−ＮＢＤＧ（デオキシグルコースの蛍光型）は、細胞の区別を与え得るが、その吸収速度は、代謝速度について直接的に情報を与えるものではない。なぜなら、大きさのオーダーがグルコースのものより低く、グルコーストランスポーターの特性に対する感受性が非常に高いからである１８−２０。以前の出願において、ＦＲＥＴグルコースナノセンサーがグルコース濃度を測定するために用いられてきた４、６、７が、それは、グルコーストランスポーターの活性およびヘキソキナーゼの活性の両方に依存し、それゆえ代謝の流れについて情報を与えない。目下のアプローチは、輸送特性から干渉されることなく、代謝の流れの直接的な読み取りを提供することによって、グルコース濃度の測定の疑わしさを回避する。
【００６２】
本願発明は、ＦＲＥＴグルコースナノセンサーを用いるが、同様の目的のために、リアルタイムでの細胞内のグルコース濃度の測定が可能な他のあらゆる技術が用いられ得る。本発明の方法は、細胞分解能を提供し、可逆的であり、補足し合う異なる強さおよび弱さを示す。例えば、該方法は阻害剤を必要とせず、それゆえ、肝細胞および膵β細胞（ＧＬＵＴ２に富んでおり、それゆえサイトカラシンＢおよびフロレチンに比較的感受性がある）に適用され得る。本発明の方法の時間分解能はさらに良く、データ取得に要する時間によってのみ制限され（高性能な装置を用いて通常１秒より短い）、図５に示されるような種類の実験の前後にとって理想的な測定の長時間のウインドー（extended window）を提供する；しかしながら、この方法はＧＬＵＴ１の薬理学的阻害剤（原理的には代謝を妨害し得る）を必要とする。アストロサイトにおけるサイトカラシンＢの場合にそのようなことは観察されなかったが、新たな細胞種を調べる際には図３のような対照実験を勧める。この方法の改良版は、強力で、特別で、かつ理想的な、未開発の非浸透性のＧＬＵＴの阻害剤を含み得る。
【００６３】
本出願において特許請求の範囲に記載された発明の方法に加えて、２つの独自の観察がなされた。第一に、アストロサイトの糖分解がニューロンのシグナルによって数秒以内に活性化され得ることを初めて観察することができた。以前の２０分を超えるデオキシグルコース吸収の測定は、相反する結果を与えていた１３、１５が、本願方法は、秒の時間分解能によって、アストロサイトの糖分解が興奮性シナプスにおいて放出される伝達物質に対する感受性が非常に高いということを示すことができた。アストロサイトにおいて観察された糖分解の活性化の強度および速度は、グルコース濃度における低下およびニューロンの活性化の開始の５〜２０秒後に脳組織において検出され得る乳酸塩中の糖濃度における減少に関する機構の説明を提供し１１、２１−２４、脳における代謝の共役および血流の制御における、アストロサイトの役割を強調する１２、１４。該方法の向上した空間分解能によって、アストロサイト上にあるニューロンの糖分解速度をモニターすることが初めて可能となった。同位体による測定の本質的な限界を考慮すると、以前の実験は、単独で培養されたこれらの細胞を比較していたが、これは理想的ではない。なぜなら、両方の細胞種は適切な分化および機能のために互いを必要とするからである。共生培養における我々の結果は、細胞間の高度な変動性を示したが、平均するとアストロサイトはニューロンよりも速くグルコースを代謝することがわかった。また、脳スライスにおいてアストロサイトを研究することができたため、組織、スライスおよびインビボにおいて両細胞種の代謝速度を測定することが近い将来可能であろうことが示唆された。
【００６４】
他の細胞種におけるこれらの方法の使用を証明するために、我々は、研究および薬物スクリーニングのために広く使用される細胞である繊維芽細胞、脂肪細胞および筋芽細胞を選択した。インスリンの血圧降下作用は、脂肪細胞および筋細胞の代謝速度における増加（糖尿病になるプロセス）によって説明される；目下の方法が、この病気に関する基礎研究および応用研究に役立ち得ると我々は予想する。ＨｅＬａ（癌研究において広範に使用される上皮細胞株）において、非常に速い代謝速度が観察された。腫瘍細胞において観察される高まった糖分解速度（すなわち、ワールブルク効果）は、ＦＤＧ−ＰＥＴスキャンの手段によって、診断および段階付けのために広く利用され、近年、癌進行において病因となる役割を果たすと提唱されている１。このように、ハイスループットのスクリーニングのための目下の蛍光による技術の適合性、および単細胞レベルにおいて明らかにされている代謝の不均一性は、癌における基礎研究および応用研究の助けとなり得る。
【００６５】
〔参考文献〕
１．Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., & Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
２．Yeluri, S., Madhok, B., Prasad, K. R., Quirke, P., & Jayne, D. G. Cancer's craving for sugar: an opportunity for clinical exploitation. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135, 867-877 (2009).
３．Brennan, A. M., Connor, J. A., & Shuttleworth, C. W. NAD(P)H fluorescence transients after synaptic activity in brain slices: predominant role of mitochondrial function. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 1389-1406 (2006).
４．Deuschle, K. et al. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14, 2304-2314 (2005).
５．Berg, J., Hung, Y. P., & Yellen, G. A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP ratio. Nat. Methods. 6, 161-166 (2009).
６．Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., & Frommer, W. B. In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. J. Biol. Chem. 278, 19127-19133 (2003).
７．Takanaga, H., Chaudhuri, B., & Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).
８．      Wilson, J. E. Isozymes of mammalian hexokinase: structure, subcellular localization and metabolic function. J. Exp. Biol. 206, 2049-2057 (2003).
９．Barros, L. F. & Deitmer, J. W. Glucose and lactate supply to the synapse. Brain Res. Rev.(2009).
１０．Carruthers, A. Facilitated diffusion of glucose. Physiol Rev. 70, 1135-1176 (1990).
１１．Hu, Y. & Wilson, G. S. A temporary local energy pool coupled to neuronal activity: fluctuations of extracellular lactate levels in rat brain monitored with rapid-response enzyme-based sensor. J. Neurochem. 69, 1484-1490 (1997).
１２．Magistretti, P. J. Role of glutamate in neuron-glia metabolic coupling. Am. J. Clin. Nutr. 90, 875S-880S (2009).
１３．Pellerin, L. et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55, 1251-1262 (2007).
１４．Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., & MacVicar, B. A. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles. Nature. 456, 745-749 (2008).
１５．Dienel, G. A. & Cruz, N. F. Nutrition during brain activation: does cell-to-cell lactate shuttling contribute significantly to sweet and sour food for thought? Neurochem. Int. 45, 321-351 (2004).
１６．Mangia, S., Simpson, I. A., Vannucci, S. J., & Carruthers, A. The in vivo neuron-to-astrocyte lactate shuttle in human brain: evidence from modeling of measured lactate levels during visual stimulation. J. Neurochem. 109 Suppl 1, 55-62 (2009).
１７．Hewett, J. A. Determinants of regional and local diversity within the astroglial lineage of the normal central nervous system. J. Neurochem. 110, 1717-1736 (2009).
１８．Yamada, K., Saito, M., Matsuoka, H., & Inagaki, N. A real-time method of imaging glucose uptake in single, living mammalian cells. Nat. Protoc. 2, 753-762 (2007).
１９．Loaiza, A., Porras, O. H., & Barros, L. F. Glutamate triggers rapid glucose transport stimulation in astrocytes as evidenced by real-time confocal microscopy. J. Neurosci. 23, 7337-7342 (2003).
２０．Barros, L. F. et al. Preferential transport and metabolism of glucose in Bergmann glia over Purkinje cells: a multiphoton study of cerebellar slices. Glia 57, 962-970 (2009).
２１．Silver, I. A. & Erecinska, M. Extracellular glucose concentration in mammalian brain: continuous monitoring of changes during increased neuronal activity and upon limitation in oxygen supply in normo-, hypo-, and hyperglycemic animals. J. Neurosci. 14, 5068-5076 (1994).
２２．Hu, Y. & Wilson, G. S. Rapid changes in local extracellular rat brain glucose observed with an in vivo glucose sensor. J. Neurochem. 68, 1745-1752 (1997).
２３．Mangia, S. et al. The aerobic brain: lactate decrease at the onset of neural activity. Neuroscience. 118, 7-10 (2003).
２４．Caesar, K. et al. Glutamate receptor-dependent increments in lactate, glucose and oxygen metabolism evoked in rat cerebellum in vivo. J. Physiol. 586, 1337-1349 (2008).
２５．Nie, Y. & Wong, C. Suppressing the activity of ERRalpha in 3T3-L1 adipocytes reduces mitochondrial biogenesis but enhances glycolysis and basal glucose uptake. J. Cell Mol. Med.(2008).
２６．Ridoux, V., Robert, J., Perricaudet, M., Mallet, J., & Le Gal La, S. G. Adenovirus mediated gene transfer in organotypic brain slices. Neurobiol. Dis. 2, 49-54 (1995).
２７．Barros, L. F. Measurement of sugar transport in single living cells. Pflugers Arch. 437, 763-770 (1999).
２８．Barros, L. F., Bittner, C. X., Loaiza, A., & Porras, O. H. A quantitative overview of glucose dynamics in the gliovascular unit. Glia. 55, 1222-1237 (2007).
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ＥＴＭおよびＩＴＭと定義される本発明の方法の２つのタイプを図式的に説明している図である。
【図２】アストロサイトにおいて用いた該方法のＥＴＭタイプを実証している図である。
【図３】アストロサイトにおける該方法のＩＴＭタイプを実証している図である。
【図４】ＩＴＭを用いたニューロンのシグナルによるアストロサイトの糖分解の活性化に関する時間分解能を説明している図である。
【図５】アストロサイトおよびニューロンにおける糖分解速度の同時測定に関する空間分解能を説明している図である。
【図６】ＩＴＭを用いることによって決定された種々の細胞における糖分解速度の不均一性を示すグラフを包含する図である。
【図７】FLII12Pglu600Δμ6ナノセンサーの較正を示す図である。
【図８】アストロサイトの細胞体積に対するグルタミン酸塩／Ｋ＋の影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
2013529926.tif 000003
【図３】
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【図４】
2013529926.tif 000005
【図５】
2013529926.tif 000006
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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