(57)【要約】 【課題】ＦａｃVIIａ、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域が相互共有結合によって連結されており、生体内持続性及び安定性が向上した血液凝固結合体、及びその利用を提供すること。【解決手段】本発明の血液凝固結合体は、ＦａｃVIIａの生体内活性が比較的高く維持され、血中半減期が顕著に増加して血液凝固治療の際に服薬順応度を著しく改善することができる。【選択図】図１
2013533875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦａｃVIIａ及び免疫グロブリンＦｃ領域が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、及びこれらの組み合わせよりなる群から選ばれる非ペプチド性重合体を介して連結された、ＦａｃVIIａ結合体。
【請求項２】
非ペプチド性重合体の各末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域とＦａｃVIIａのＮ末端に結合した、請求項１に記載のＦａｃVIIａ結合体。
【請求項３】
前記非ペプチド性重合体の各末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域とＦａｃVIIａの軽鎖のＮ末端に結合した、請求項１に記載のＦａｃVIIａ結合体。
【請求項４】
免疫グロブリンＦｃ領域が非グリコシル化されることを特徴とする、請求項１に記載のＦａｃVIIａ結合体。
【請求項５】
免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４よりなる群から選ばれた１つ〜４つのドメインからなる、請求項１に記載のＦａｃVIIａ結合体。
【請求項６】
免疫グロブリンＦｃ領域がヒンジ領域をさらに含む、  請求項５に記載のＦａｃVIIａ結合体。
【請求項７】
免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ領域である、請求項１に記載のＦａｃVIIａ結合体。
【請求項８】
免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭよりなる群から選ばれる免疫グロブリンに由来する相異なる起源を有するドメインのハイブリッドである、請求項７に記載のＦａｃVIIａ結合体。
【請求項９】
免疫グロブリンＦｃ領域が、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体または多量体である、請求項７に記載のＦａｃVIIａ結合体。
【請求項１０】
免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４  Ｆｃ領域である、請求項７に記載のＦａｃVIIａ結合体。
【請求項１１】
免疫グロブリンＦｃ領域がヒト非グリコシル化ＩｇＧ４  Ｆｃ領域である、請求項１０に記載のＦａｃVIIａ結合体。
【請求項１２】
非ペプチド性重合体の反応基が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基及びスクシニミド誘導体よりなる群から選ばれる、請求項１に記載のＦａｃVIIａ結合体。
【請求項１３】
スクシニミド誘導体がスクシニミジルプロピオネート、スクシニミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシニミジル又はスクシニミジルカルボネートである、  請求項１２に記載のＦａｃVIIａ結合体。
【請求項１４】
非ペプチド性重合体が両末端又は３末端に反応アルデヒド基の反応基を有する、  請求項１２に記載のＦａｃVIIａ結合体。
【請求項１５】
非ペプチド性重合体が各末端に反応アルデヒド基の反応基を有する、請求項１２に記載のＦａｃVIIａ結合体。
【請求項１６】
非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールである、請求項１５に記載のＦａｃVIIａ結合体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項のＦａｃVIIａ結合体を含む、血液凝固用薬学的組成物。
【請求項１８】
（１）各末端にアルデヒド、マレイミド、又はスクシニミド誘導体反応基を有する非ペプチド性重合体を用いて免疫グロブリンＦｃ領域のアミン基又はチオール基に共有結合によって連結する段階と、
（２）前記（１）の反応混合物から、非ペプチド性重合体が共有結合した免疫グロブリンＦｃ領域を含む連結体を分離する段階と、
（３）分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端にＦａｃVIIを共有結合によって連結し、非ペプチド性重合体の末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びＦａｃVIIに結合したＦａｃVII結合体を生成する段階と、
（４）前記（３）で生成されたＦａｃVII結合体を活性化させ、ＦａｃVIIａ及び免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体を介して連結されるＦａｃVIIａ結合体を生成する段階とを含む、ＦａｃVIIａ結合体の製造方法。
【請求項１９】
（１）各末端にアルデヒド反応基を有する非ペプチド性重合体を用いて免疫グロブリンＦｃのＮ末端にｐＨ５．０〜ｐＨ７．０で共有結合によって連結する段階と、
（２）前記（１）の反応混合物から、Ｎ末端に非ペプチド性重合体が共有結合した免疫グロブリンＦｃ領域を含む連結体を分離する段階と、
（３）分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端にＦａｃVIIを共有結合によって連結し、非ペプチド性重合体の末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びＦａｃVIIに結合したＦａｃVII結合体を生成する段階と、
（４）前記（３）で生成されたＦａｃVII結合体を活性化させ、ＦａｃVIIａ及び免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体を介して連結されるＦａｃVIIａ結合体を生成する段階とを含む、ＦａｃVIIａ結合体の製造方法。
【請求項２０】
前記（１）段階が、各末端にアルデヒド反応基を有する非ペプチド性重合体を用いてＦａｃVIIの軽鎖のＮ末端に共有結合によって連結する段階である、請求項１８に記載のＦａｃVIIａ結合体の製造方法。
【請求項２１】
前記ＦａｃVIIはＦａｃVIIのＮ末端が非ペプチド性重合体と結合する、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のＦａｃVIIａ結合体の製造方法。
【請求項２２】
前記活性化がオンカラム（Ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ）活性化又はインソリューション（Ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）活性化によって行われる、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のＦａｃVIIａ結合体の製造方法。
【請求項２３】
前記ＦａｃVII及びＦａｃVIIａが天然型ＦａｃVII及び天然型ＦａｃVIIａである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のＦａｃVIIａ結合体の製造方法。
【請求項２４】
前記非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールである、  請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のＦａｃVIIａ結合体の製造方法。
【請求項２５】
請求項１のＦａｃVIIａ結合体を、血液凝固が必要である或いは血液凝固の必要可能性がある個体に投与する段階を含む、血液凝固関連疾病の治療方法。
【請求項２６】
請求項１７の組成物を血液凝固が必要であるとか、或いは血液凝固の必要可能性がある個体に投与する段階を含む、血液凝固関連疾病の治療方法。
【請求項２７】
前記血液凝固関連疾病が血友病、出血、急性脳内出血、外傷又はＦａｃVII欠乏である、請求項２５又は２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第７因子（Ｆａｃｔｏｒ  VIIａ、ＦａｃVIIａ）の持続型剤形のための血液凝固結合体に関し、具体的には、ＦａｃVIIａ、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合によって相互連結して血中半減期を顕著に増加させ、血液凝固機能を維持しながら服薬順応度を著しく向上させた血液凝固結合体に関するものである。また、本発明は、血液凝固因子結合体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、世界の血友病患者数は１４万人に達するものと推定されており、その発病率は毎年２０％の増加趨勢を示している。遺伝的に１万人当たり１人の比率で血友病が発生しているが、患者全体の２５％内外のみが診断又は治療を受けている。血液凝固因子治療の最も大きい問題点は、既存の治療剤に対する抗体が生成される部分にある。血液凝固因子VIIが欠乏して発病する血友病をＡ型、血液凝固因子ＸＩが欠乏して発病する血友病をＢ型に分けて区分する。Ａ型血友病が全体血友病患者の８０％、Ｂ型血友病患者が全体血友病患者の２０％をそれぞれ占めるが、Ａ型血友病患者のうち１０〜１５％が血液凝固因子治療の際に抗体が生成され、Ｂ型血友病患者のうち１〜３％が血液凝固因子治療の際に抗体が生成される。
【０００３】
ＦａｃVIIａはＦａｃVIIの活性型である。肝臓で生成されるＦａｃVIIは、４０６個のアミノ酸からなる酵素であって、１０番のアミノ酸であるグルタミン酸がγ−カルボキシル化されており、１４５番及び３２２番のアミノ酸であるアスパラギンがＮ−グリコシル化されており、５２番及び６０番のアミノ酸であるセリンがＯ−グリコシル化されている。２つのＥＧＦ様ドメインと一つのセリンプロテアーゼドメインを有し、ＦａｃVIIの１５２番目のアルギニンと１５３番目のイソロイシンとの間が切断されながら重鎖の活性部位が露出して活性を有する。この過程で、軽鎖と重鎖がついている単鎖構造のＦａｃVIIが、軽鎖と重鎖が離れている２つの鎖構造のＦａｃVIIａに変形する。
【０００４】
ＦａｃVIIａは、既存の様々な血液凝固因子とは異なり、血液凝固過程で補助血液凝固経路として作用して抗体が生成されず、それによる高用量投与が可能な血液因子である。したがって、血友病治療方法において、Ａ型及びＢ型の血友病に全て適用可能であり、抗体生成及び高用量投与に高い安定性を有するＦａｃVIIａへの代替治療が行われている。また、血液因子の治療過程で生成された抗体によりそれ以上既存の血液因子への血友病治療は不可能であり、ＦａｃVIIａのみの治療が可能なのが現実である。
【０００５】
これに対し、ＦａｃVIIａは、抗体は生成されないが、様々な血液凝固因子の中では最も短い血中半減期を有する。よって、頻繁な薬物投与により患者に苦痛を引き起こし、過量の薬物投与により患者に経済的負担を倍加させた。このような欠点を補完するために、ＦａｃVIIａは必ず持続型製剤の開発が行われなければならず、それにより出血があるたびに血液因子を補充する補充療法だけでなく、予防目的の治療が可能になると期待している。
【０００６】
ＦａｃVIIａのＣ末端にアルブミンを融合させたｒVIIａ−ＦＰ（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）は、前臨床段階にあり、ラットにおいて血中半減期が天然型ＦａｃVIIａに比べて６．７倍増加したが、依然として４．３８ｈと非常に短くて効果的な血友病治療及び予防への使用には適さない。
【０００７】
ペグ化リポソーム剤形（Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を用いたＰＥＧＬｉｐ−ＦVIIａ（Ｏｍｒｉ）の場合、やはり前臨床段階であるが、血中半減期が天然型ＦａｃVIIａに比べて２倍増加して微々たる水準である。
【０００８】
ＦａｃVIIａのＧｌａドメイン変異（ｄｏｍａｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）及びハイパーグリコシル化（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を介して血中半減期を延長させたＭＡＸＹ−VII（Ｂａｙｅｒ／Ｍａｘｙｇｅｎ）、４０Ｋ  ＰＥＧグリコシル化を用いて血中半減期を延長させたＮＮ７１２８（Ｎｏｖｏ／Ｎｅｏｓｅ）の２つの製品がそれぞれ臨床１床及び臨床２床進行中であるが、天然型ＦａｃVIIａに比べて５倍の血中半減期の増加により依然として効果的な血友病治療及び予防に適さない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者は、ＦａｃVIIａの血中半減期の増加及び生体内活性の維持を同時に極大化することが可能な方法として、免疫グロブリンＦｃ領域、非ペプチド性重合体及びＦａｃVIIａを共有結合によって位置特異的に相互連結させる製造方法を使用した。その結果、血液凝固機能結合体の血中半減期を６０時間に画期的に増加させ、従来のペグ化方法又はインフレーム融合（ｉｎｆｒａｍｅ  ｆｕｓｉｏｎ）方法より著しく改善された血中半減期増加効果を確認することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、ＦａｃVIIａの生体内活性を相対的に高く維持しながら血中半減期を延長させて著しく優れた血液凝固機能を有するＦａｃVIIａ結合体、これを含む持続型製剤、及びその製造方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１１】
これまで述べたように、本発明のＦａｃVIIａ結合体は、ＦａｃVIIａの生体内活性が比較的高く維持され、血中半減期が顕著に増加して、血液凝固機能を必要とする患者の服薬順応度を高めることが可能なＦａｃVIIａ持続型剤形の開発に有用に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＳＤラットにおけるＦａｃVIIａと免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦａｃVIIａの時間別血中濃度変化を示すグラフである。
【図２】Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ、ＦａｃVIIａ、免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦａｃVIIａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を比較試験した結果である。
【図３】Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ、ＦａｃVIIａ、免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦａｃVIIａのｉｎ  ｖｉｖｏ効力を比較試験した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において使用される用語、「  ＦａｃVIIａ」は凝固因子VIIの活性型を意味する。
【００１４】
好ましくは、本発明のＦａｃVIIａ結合体は、ＦａｃVII結合体を活性化させて生成される。ＦａｃVII、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域から持続型結合体が生成され、その後、ＦａｃVIIａ、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域から構成されたＦａｃVIIａ結合体を形成する活性化過程を経るが、この際、結合体の体内活性は増加し、構造的に同質化（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）される。
【００１５】
本発明において、ＦａｃVII結合体をＦａｃVIIａ結合体に活性化させる方法は、オンカラム（Ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ）活性化方法及びインソリューション（Ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）活性化方法を含むが、これに限定されるものではない。好ましくは、本発明のＦａｃVII結合体はオンカラム活性化方法を用いて活性化される。
【００１６】
固相（Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ）活性化方法とも呼ばれるオンカラム活性化過程において、ＦａｃVII結合体は、陰イオン交換カラムに固定され、以後、別途の添加物なしでも「自己活性化（ａｕｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」される。
【００１７】
インソリューション活性化方法は、オンカラム活性化方法とは異なり、ＦａｃVIIの活性化に必要ないろいろの要素、例えばカルシウムイオンの濃度、ｐＨ、温度及びＦａｃVIIの濃度などを全て考慮してＦａｃVIIの活性化を誘導する方法である。
【００１８】
本発明のＦａｃVIIａは、補助血液凝固経路を介して血液凝固過程に作用するＦａｃVIIの活性型ペプチドである。このようなペプチドは、天然型ＦａｃVIIの活性型、ＦａｃVIIａアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）、前駆物質（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）、誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）、変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）などを含む。
【００１９】
本発明において使用される用語「ＦａｃVIIａアゴニスト」は、ＦａｃVIIａの構造を問わず、ＦａｃVIIａと同一の生物学的活性を示す物質を意味する。
【００２０】
本発明において使用される用語、「ＦａｃVIIａ誘導体」は、体内で血液凝固を調節する機能を保有したペプチドを意味するもので、天然型ＦａｃVIIａと比較するときに少なくとも８０％のアミノ酸配列で相同性を示し、アミノ酸残基の一部グループが化学的に置換（例えば、アルファ−メチル化（ａｌｐｈａ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、アルファ−ヒドロキシル化（ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ））、除去（例えば、脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ））又は修飾（例えば、Ｎ−メチル化（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ））された形態であってもよい。
【００２１】
本発明において使用される用語、「ＦａｃVIIａ誘導体」は、ＦａｃVIIａ配列に対して一つ又はそれ以上のアミノ酸が追加又は削除された形態を意味し、体内で血液凝固を調節する機能を保有する。追加されたアミノ酸は天然には存在しないアミノ酸（例えば、Ｄ型アミノ酸）であってもよい。
【００２２】
本発明において使用される用語、「ＦａｃVIIａ変異体」は、ＦａｃVIIａとアミノ酸配列が一つ以上異なるペプチドであって、体内で血液凝固を調節する機能を保有したペプチドを意味する。
【００２３】
それぞれのＦａｃVIIａアゴニスト、誘導体、断片及び変異体においてそれぞれ使用された製造方法は、独立して或いは組み合わせて適用できる。例えば、アミノ酸配列が一つ以上異なり、Ｎ末端のアミノ酸残基に脱アミノ化された、体内での血液凝固調節機能を保有したペプチドも含まれる。
【００２４】
好ましくは、本発明のＦａｃVIIａ結合体は、非ペプチド性重合体、免疫グロブリンＦｃ領域及びＦａｃVIIａから構成されているが、非ペプチド性重合体の一方の末端と免疫グロブリンＦｃ領域間、及び非ペプチド性重合体の他方の末端とＦａｃVIIａのＮ末端部位間が結合している。
【００２５】
さらに好ましくは、本発明のＦａｃVIIａ結合体において、非ペプチド性重合体の一方の末端は免疫グロブリンＦｃ領域に連結され、非ペプチド性重合体の他方の末端はＦａｃVIIａの軽鎖のＮ末端に連結されている。
【００２６】
ＦａｃVIIａに関連して使用される用語、「Ｎ末端」とは、ＦａｃVIIａのＮ末端を含む領域を含む意味である。よって、ＦａｃVIIａ結合体において、非ペプチド性重合体は、ＦａｃVIIａのＮ末端アミノ酸残基に結合するか、或いはＦａｃVIIａ結合体の機能が維持される限り、多少遠くにあるアミノ酸残基とも結合できる。
【００２７】
活性化前のＦａｃVIIは、軽鎖と重鎖とが連結された単鎖構造であるから、軽鎖のＮ末端のみが露出している。ＦａｃVIIがＦａｃVIIａの形態になると、ＦａｃVIIの１５２番目のアルギニンと１５３番目のイソロイシンとの間が切断されながら重鎖の活性部位が露出する。この際、露出する１５３番目のイソロイシンが重鎖のＮ末端になる。重鎖のＮ末端はＦａｃVIIａの活性に重要な役割を果たす部分であるから、重合体は重鎖ではなく軽鎖のＮ末端に結合する場合に力価が高くなる。
【００２８】
具体的な一実施例として、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端にＰＥＧに結合させ、ここにＦａｃVIIの軽鎖のＮ末端に選択的に結合してＦａｃVII−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を製造した。その後、別途の活性化過程を経てＦａｃVIIａ−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を完成した。本発明で製造したＦａｃVIIａ−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、従来の治療物質に比べて一層増加した約６０時間の血中半減期を有するとともに、モデル動物で卓越した血液凝固効果を示して生体内活性を維持した。よって、新規な持続型ＦａｃVIIａ剤形を製造することができた。
【００２９】
免疫グロブリンＦｃ領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるため、薬物のキャリアとして使用するには安全である。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンの全体分子に比べて相対的に分子のサイズが小さいため、結合体の製造、精製及び収率の面で有利である。それだけでなく、アミノ酸配列が抗体ごとに異なるため、高い不均質性を示すＦａｂ部分を除去することにより、物質の同質性が大きく増加し、血中抗原性の誘発可能性も低くなる効果も期待することができる。
【００３０】
本発明において使用される用語、「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）と軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び重鎖不変領域３（ＣＨ３）部分を意味する。任意に重鎖不変領域にヒンジ部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の可変領域のみを除いた典型的なＦｃ領域に比べて実質的に同等又はより向上した効果を有する限り、重鎖の不変領域２と３（ＣＨ２とＣＨ３）だけでなく、重鎖の不変領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖不変領域１（ＣＬ１）の一部又は全部を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に該当する相当長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４メイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）１つ又は２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。
【００３１】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、野生型Ｆｃだけでなく、そのアミノ酸配列変異体（ｍｕｔａｎｔ）を含む。アミノ酸配列変異体とは、一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的又は保全的置換、又はこれらの組み合わせによって野生型とは異なる配列を有するものを意味する。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２、又は３２７〜３３１番のアミノ酸残基が変形のために適当な部位として利用できる。また、二硫化結合を形成することが可能な部位が除去されるか、或いは天然型Ｆｃから幾つかのＮ末端のアミノ酸が除去されるか、或いは天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されるなど、多様な種類の誘導体が可能である。また、天然型Ｆｃ領域からエフェクター機能を無くすために補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されることも、ＡＤＣＣ部位が除去されることも可能である。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列変異体を製造する技術は、国際公開第９７／３４６３１号、国際公開第９６／３２４７８号などに開示されている。
【００３２】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質又はペプチドにおけるアミノ酸置換は、当該分野における公知となっている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７９）。最も一般に起こる置換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の置換である。
【００３３】
場合に応じては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、アミル化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）などで修飾されることも可能である。
【００３４】
前述したＦｃ誘導体は、野生型のＦｃ領域と同一の生物学的活性を示すが、熱やｐＨなどに対する構造的安定性を増大させた誘導体である。
【００３５】
また、このようなＦｃ領域は、ヒトや牛、ヤギ、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離した天然型から得られてもよく、形質転換された動物細胞又は微生物から得られた組み換え型又はその誘導体であってもよい。天然型Ｆｃ領域は、ヒト又は動物の生体から分離された免疫グロブリン全体のプロテアーゼ分解によって得ることができる。免疫グロブリンは、パパインを処理する場合にはＦａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンを処理する場合にはｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ’）２に切断された後、サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。
【００３６】
好ましくは、微生物から収得した組み換えヒトのＦｃ領域である。
【００３７】
また、本発明で有用な免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法、及び微生物を用いた遺伝工学的方法などの通常の方法が利用できる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）の結合力が顕著に低下し、抗体依存性細胞毒性又は補体依存性細胞毒性が減少又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことからみて、薬物のキャリアとしての本来の目的により良く符合する形態は脱グリコシル化或いは非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域であるといえる。
【００３８】
本発明において、「脱グリコシル化（Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」はＦｃ領域からの酵素による糖の除去を意味する。「非グリコシル化（Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」は原核動物、好ましくは大腸菌からの糖がないＦｃ領域を意味する。
【００３９】
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトや牛、ヤギ、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であり、好ましくはヒト起源である。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来又はこれらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、又はこれらの混成（ｈｙｂｒｉｄ）によるＦｃ領域でありうる。好ましくはヒトの血液中に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来であり、最も好ましくはリガンド結合タンパク質の血中半減期を向上させるものと知られたＩｇＧ由来である。
【００４０】
一方、本発明において、「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、二量体又は多量体を形成するとき、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが、異なる起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。すなわち、ＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ３  Ｆｃ及びＩｇＧ４  Ｆｃ断片よりなる群から選ばれた２つ以上の断片から二量体又は多量体の製造が可能である。
【００４１】
本発明において、「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」とは、単鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に２つ以上の異なる起源の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ  Ｆｃ、ＩｇＭ  Ｆｃ、ＩｇＡ  Ｆｃ、ＩｇＥ  Ｆｃ及びＩｇＤ  ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４よりなる群から選ばれた１つ〜４つのドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含むことができる。
【００４２】
一方、ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明ではこれらの組み合わせ又はこれらの混成化も可能である。好ましくはＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであり、最も好ましくは補体依存的細胞毒性（ＣＤＣ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）などのエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）が殆どないＩｇＧ４のＦｃ領域である。
【００４３】
すなわち、最も好ましい本発明の薬物のキャリア用免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化Ｆｃ領域である。ヒト由来のＦｃ領域は、ヒト生体において抗原として作用し、これに対する新しい抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を引き起こすことが可能な非ヒト由来のＦｃ領域に比べてさらに好ましい。
【００４４】
本発明において使用される用語、「非ペプチド性重合体」は、繰り返し単位が２つ以上結合した生体適合性重合体を意味し、前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく、任意の共有結合によって互いに連結される。このような非ペプチド性重合体は２つ又は３つの末端反応基を有する。
【００４５】
本発明に使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸グリコール酸）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、及びこれらの組み合わせよりなる群から選択でき、最も好ましくはポリエチレングリコールである。当該分野における公知のこれらの誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造することが可能な誘導体も、本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
既存のインフレーム融合（ｉｎｆｒａｍｅ  ｆｕｓｉｏｎ）方法によって製造された融合タンパク質で使用されたペプチド性重合体の欠点は、生体内でタンパク質分解酵素によって容易に切断され、キャリアによる活性薬物の血中半減期増加効果を期待するほど得ることができない。ところが、本発明では、タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体を用いてキャリアと同様にペプチドの血中半減期を維持することができる。よって、生体内でタンパク質分解酵素に対する抵抗性を有する限り、本発明ではいずれの非ペプチド重合体でも制限なく使用できる。非ペプチド性重合体は、分子量１〜１００ｋＤａの範囲、好ましくは１〜２０ｋＤａの範囲である。また、前記免疫グロブリンＦｃ領域と結合する非ペプチド性重合体は、１種類の重合体でなく、異なる種類の重合体の組み合わせも使用できる。
【００４７】
本発明に有用に使用される非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンＦｃ領域とタンパク質薬物が結合できる反応基を有する。
【００４８】
前記非ペプチド性重合体の両末端又は３末端を有する。そして、反応基は、反応アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、及びスクシニミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）誘導体よりなる群から選ばれることが好ましい。ここで、前記スクシニミド誘導体としては、スクシニミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシニミジル、スクシニミジルカルボキシメチル又はスクシニミジルカルボネートが利用できる。特に、前記非ペプチド性重合体が両末端に反応アルデヒド基の反応基を有する場合、非特異的反応を最小化し、非ペプチド性重合体の両末端で生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンとそれぞれ結合するのに効果的である。アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものより一層安定的である。アルデヒド反応基は低いｐＨでアミノ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０条件ではリシン残基と共有結合を形成することができる。
【００４９】
前記非ペプチド性重合体の両末端又は３末端の反応基は互いに同じでも異なってもよい。例えば、一方の末端にはマレイミド基、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、又はブチルアルデヒド基を有してもよい。両方の末端にヒドロキシ反応基を有するポリ（エチレングリコール）を非ペプチド性重合体として用いる場合には、ヒドロキシ基を本発明で使用される前に前記反応基として活性化させることができる。そうでない場合には、変形した反応基を有する商業的に入手可能なポリ（エチレングリコール）を用いて本発明のタンパク質結合体を製造することができる。
【００５０】
また、本発明の他の様態として、本発明は、ＦａｃVIIａ結合体を含む血液凝固用薬学的組成物を提供する。
【００５１】
好ましくは、本発明は、血友病、出血、急性脳内出血、外傷及びＦａｃVII欠乏を含む血液凝固関連疾病の治療用薬学的組成物を提供する。
【００５２】
本発明において使用される用語、「投与」は、ある適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味する。前記結合体の投与経路は、薬物が目的組織に到達することができる限り、ある一般な経路を介して投与できる。多様な方法の投与、例えば腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などが使用できるが、本発明はこれに制限されない。ところが、経口投与の際に、ペプチドは消化がなされるため、経口用組成物は活性薬剤をコートし、或いは胃における分解から保護されるように剤形化することが好ましい。好ましくは、注射剤として投与できる。また、本発明の薬学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動することが可能な任意の装置によって投与できる。
【００５３】
本発明の結合体を含む薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。薬学的に許容される担体は、経口投与の場合には結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができる。注射剤の場合には緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して使用することができる。局所投与用の場合には基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬学的組成物の剤形は、上述したような薬学的に許容される担体と混合して様々に製造できる。例えば、経口投与の場合には錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、サスペンション、シロップ、ウエハーなどの形で製造することができる。注射剤の場合には単位投薬アンプル又は多数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。
【００５４】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム又は鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含むことができる。
【００５５】
本発明の薬学的組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類によって決定される。本発明の薬学的組成物は、生体内持続性及び力価に優れるので、本発明の薬学的製剤の投与回数及び頻度を著しく減少させることができる。
【００５６】
また、本発明の他の様態として、本発明は、前記ＦａｃVIIａ結合体又は本発明の薬学的組成物を血液凝固が必要である或いは血液凝固の必要可能性がある個体に投与する段階を含む、血液凝固関連疾病の治療方法を提供する。
【００５７】
好ましくは、前記疾病は、血液凝固が不十分であって発生したものであって、その例として血友病、出血、急性脳内出血、外傷又はＦａｃVII欠乏を含み、これに限定されない。
【００５８】
本発明において、個体はヒトを含むマウス、豚、牛、イヌ、羊などの哺乳動物を制限なく含むことができるが、好ましくはヒトである。
【００５９】
ＦａｃVIIａ結合体、組成物、投与などは前述したとおりである。
【００６０】
本発明の他の様態として、本発明は、
【００６１】
（１）末端にアルデヒド、マレイミド、又はスクシニミド誘導体反応基を有する非ペプチド性重合体を用いて免疫グロブリンＦｃ領域のアミン基に共有結合によって連結する段階と、
【００６２】
（２）前記（１）の反応混合物から、非ペプチド性重合体が共有結合した免疫グロブリンＦｃ領域を含む連結体を分離する段階と、
【００６３】
（３）分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端にＦａｃVIIを共有結合によって連結し、非ペプチド性重合体の末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びＦａｃVIIに結合したＦａｃVII結合体を生成する段階と、
【００６４】
（４）前記（３）で生成されたＦａｃVII結合体を活性化させ、ＦａｃVIIａ及び免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体を介して連結されるＦａｃVIIａ結合体を生成する段階とを含む、ＦａｃVIIａ結合体の製造方法を提供する。
【００６５】
本発明の別の様態として、本発明は、
【００６６】
（１）各末端にアルデヒド反応基を有する非ペプチド性重合体を用いて免疫グロブリンＦｃのＮ末端にｐＨ５．０〜ｐＨ７．０で共有結合によって連結する段階と、
【００６７】
（２）前記（１）の反応混合物から、Ｎ末端に非ペプチド性重合体が共有結合した免疫グロブリンＦｃ領域を含む連結体を分離する段階と、
【００６８】
（３）分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端にＦａｃVIIを共有結合によって連結し、非ペプチド性重合体の末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びＦａｃVIIに結合したＦａｃVII結合体を生成する段階と、
【００６９】
（４）前記（３）で生成されたＦａｃVII結合体を活性化させ、ＦａｃVIIａ及び免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体を介して連結されるＦａｃVIIａ結合体を生成する段階とを含む、ＦａｃVIIａ結合体の製造方法を提供する。
【００７０】
本発明の別の様態として、本発明は、
【００７１】
（１）各末端にアルデヒド反応基を有する非ペプチド性重合体を用いてＦａｃVIIに共有結合によって連結する段階と、
【００７２】
（２）前記（１）の反応混合物から、非ペプチド性重合体が共有結合したＦａｃVIIを含む連結体を分離する段階と、
【００７３】
（３）分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合によって連結し、非ペプチド性重合体の両方の末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びＦａｃVIIに結合したＦａｃVII結合体を製造する段階と、
【００７４】
（４）前記（３）で製造されたＦａｃVII結合体を活性化させ、ＦａｃVIIａ及び免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体を介して連結されるＦａｃVIIａ結合体を生成する段階とを含む、ＦａｃVIIａ結合体の製造方法を提供する。
【００７５】
好ましくは、本発明のＦａｃVIIａ結合体の製造方法において、ＦａｃVII結合体は、陰イオン交換カラムに付着し、オンカラム活性化方法（ａｕｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）によってＦａｃVIIａ結合体に活性化される。
【００７６】
好ましくは、本発明のＦａｃVIIａ結合体の製造方法のＦａｃVIIは、ＦａｃVIIのＮ末端が非ペプチド性重合体と結合する。
【００７７】
さらに好ましくは、本発明のＦａｃVII結合体の製造方法のＦａｃVIIは、ＦａｃVIIの軽鎖のＮ末端が非ペプチド性重合体と結合する。
【００７８】
好ましくは、本発明のＦａｃVIIａ結合体の製造方法のＦａｃVIIは、天然型ＦａｃVII、ＦａｃVIIアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）、前駆物質（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）、誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）、又は変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）であり、最も好ましくは天然型ＦａｃVIIである。
【００７９】
好ましくは、本発明のＦａｃVIIａ結合体の製造方法のＦａｃVIIａは、天然型ＦａｃVIIａ、ＦａｃVIIａアゴニスト（Ａｇｏｎｉｓｔ）、前駆物質（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）、誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）、又は変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）であり、最も好ましくは天然型ＦａｃVIIａである。
【００８０】
好ましくは、本発明のＦａｃVIIａ結合体の製造方法の非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせよりなる群から選択でき、最も好ましくはポリエチレングリコールである。
【００８１】
好ましくは、本発明のＦａｃVIIａ結合体の製造方法の非ペプチド性重合体は、末端にアルデヒド誘導体反応基を持っており、さらに好ましくは３末端のアルデヒド反応基を有する非ペプチド性重合体である。
【実施例１】
【００８２】
以下、下記実施例によって本発明をより詳細に説明する。但し、これらの実施例は、本発明を例示するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８３】
実施例１：免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦａｃVIIａ結合体の製造
免疫グロブリンＦｃは、５Ｋ  ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（３）ＰＥＧ（末端プロピオンアルデヒド基を３つ持っているＰＥＧ、ＮＯＦ、日本）によってＮ末端でペグ化された。このために、免疫グロブリンＦｃとＰＥＧのモル比を１：２、免疫グロブリンＦｃ濃度を６ｍｇ／ｍＬにして４℃で４．５時間反応した。この際、反応はｐＨ６．０の１００ｍＭ濃度のリン酸カリウム緩衝液内で行われた。還元剤として２０ｍＭ  ＳＣＢ（ＮａＣＮＢＨ３）を添加して反応させた。反応液はＳＯＵＲＣＥ  Ｑ（ＬＲＣ２５  ８５ｍＬ、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてモノペグ化免疫グロブリンＦｃを精製した。その後、ＦVIIと免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧのモル比を１：１０（ＦVII：免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧ）、全体タンパク質濃度２０ｍｇ／ｍＬにして４℃で１８時間反応した。カップリング反応は１００ｍＭリン酸カリウムの下で行なわれ、ｐＨ６．０を有し、還元剤として２０ｍＭ  ＳＣＢを添加した。カップリング反応液は２つの精製カラムを経て精製される。まず、カップリング反応に参加していない免疫グロブリンＦｃ−５Ｋ  ＰＥＧを除去するために、ＳＯＵＲＣＥ  Ｑ（ＬＲＣ２５  ８５ｍＬ、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で１Ｍ  ＮａＣｌを用いて塩勾配を与えると、相対的に結合力が弱い免疫グロブリンＦｃ−５Ｋが先に溶出し、その後で免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦVIIが溶出する。その後、ＦVII及びＦVII多量体不純物から免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦVIIを分離するために、ＳＯＵＲＣＥ  ＩＳＯ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムで二次精製を行った。ＦVII、免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦVII、ＦVII多量体の不純物が順次溶出した。
【００８４】
免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦVIIの活性化のために、精製された免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦVIIをＳＯＵＲＣＥ  Ｑに再結合させた後、１．７５ｍＭのカルシウムイオンが含有された移動相を６時間流した。３５ｍＭのカルシウムイオンとして溶出させて免疫グロブリンＦｃ−３  ａｒｍ  ＰＥＧ−ＦVIIａを得た。
【００８５】
カラム：Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ（ＬＲＣ２５  ８５ｍＬ  、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
【００８６】
流速：４ｍＬ／分  
【００８７】
勾配：Ａ  ０→７％  １分  Ｂ、７％→４０％  ８０分  Ｂ（Ａ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、Ｂ：Ａ＋１Ｍ  ＮａＣｌ）
【００８８】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ  ＩＳＯ（２３ｍＬ、１６／１０  ＨＲカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【００８９】
流速：２ｍＬ／分
【００９０】
勾配：Ｂ  １００→４０％  ６０分  Ａ（Ａ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、Ｂ：Ａ＋１．６Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４）
【００９１】
カラム：Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ（１５ｍＬ、１６／１０  ＨＲカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【００９２】
流速：１ｍＬ／分
【００９３】
移動相：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５＋１．７５ｍＭ  ＣａＣｌ２＋１．２５ｍＭ  ＮａＣｌ
【００９４】
実施例２：２０ｋ  ＰＥＧ−ＦａｃVIIａ（Ｎ）結合体の製造
ＦVII（ＦａｃVII）は、２０ｋ  ｍＰＥＧブチルアルデヒド（Ｎｅｋｔａｒ、米国）によってＮ末端でペグ化された。このために、ＦVIIと２０ｋ  ＰＥＧのモル比を１：５、ＦVIIの濃度を５ｍｇ／ｍＬにして４℃で１０時間反応した。この際、反応はｐＨ５．０の１００ｍＭ濃度の酢酸ナトリウム緩衝液内で行われた。還元剤として２０ｍＭ  ＳＣＢ（ＮａＣＮＢＨ３）が添加された。モノペグ化ＦVIIは、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ（１ｍＬ、ｐｒｅｐａｃｋｅｄ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介して精製された。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で１Ｍ  ＮａＣｌを用いて塩勾配を与えると、マルチペグ化ＦVII、モノペグ化ＦVII、ＦVIIの順に溶出する。その後、ＦVII及びＦVII多量体不純物からモノペグ化ＦVIIを分離するために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ--＿２００（Ｈｉｒｏａｄ  １６／６０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムで二次精製を行った。精製されたモノペグ化ＦVIIの活性化のために、該当物質をＳＯＵＲＣＥ  Ｑに結合させた後、１．７５ｍＭ  カルシウムイオンが含有された移動相を１時間流した。３５ｍＭのカルシウムイオンとして溶出させてモノペグ化ＦVIIａを得た。
【００９５】
カラム：ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ（１ｍＬ、ｐｒｅｐａｃｋｅｄ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【００９６】
流速：０．５ｍＬ／分 
【００９７】
勾配：Ａ  ０→５０％  ５０分  Ｂ（Ａ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、Ｂ：Ａ＋１Ｍ  ＮａＣｌ）
【００９８】
カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ＿２００（Ｈｉｒｏａｄ  １６／６０  ＨＲカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【００９９】
流速：１ｍＬ／分
【０１００】
移動相：ＰＢＳ
【０１０１】
カラム：ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ（１ｍＬ、ｐｒｅｐａｃｋｅｄ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【０１０２】
流速：０．５ｍＬ／分 
【０１０３】
移動相：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５＋１．７５ｍＭ  ＣａＣｌ２＋１．２５ｍＭ  ＮａＣｌ
【０１０４】
実施例３：２０ｋ  ＰＥＧ−ＦａｃVIIａ（Ｌｙｓ）結合体の製造
ＦVIIは、２０ｋ  ｍＰＥＧ  ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、米国）によってリシン（ｌｙｓｉｎｅ）残基でペグ化された。このために、ＦVIIと２０ｋ  ＰＥＧのモル比を１：５、ＦVIIの濃度を３ｍｇ／ｍＬにして常温で３時間反応した。この際、反応はｐＨ８．０の１００ｍＭ濃度のリン酸ナトリウム緩衝液内で行われた。モノペグ化ＦVIIは、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ（１ｍＬ、ｐｒｅｐａｃｋｅｄ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介して精製された。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で１Ｍ  ＮａＣｌを用いて塩勾配を与えると、マルチペグ化ＦVII、モノペグ化ＦVII、ＦVIIの順に溶出する。その後、ＦVII及びＦVII多量体不純物からモノペグ化ＦVIIを分離するために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ--＿２００（Ｈｉｒｏａｄ  １６／６０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムで二次精製を行った。精製されたモノペグ化ＦVIIの活性化のために、該当物質をＳＯＵＲＣＥ  Ｑに結合させた後、１．７５ｍＭのカルシウムが含有された移動相を１時間流した。３５ｍＭのカルシウムイオンとして溶出させてモノペグ化ＦVIIａを得た。
【０１０５】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ  Ｑ（２３ｍＬ、ＨＲカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【０１０６】
流速：２ｍＬ／分     
【０１０７】
勾配：Ａ  ０→５０％  ５０分  Ｂ（Ａ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、Ｂ：Ａ＋１Ｍ  ＮａＣｌ）
【０１０８】
カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ＿２００（Ｈｉｒｏａｄ  １６／６０  ＨＲカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【０１０９】
流速：１ｍＬ／分
【０１１０】
移動相：ＰＢＳ
【０１１１】
カラム：ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ（１ｍＬ、ｐｒｅｐａｃｋｅｄ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【０１１２】
流速：０．５ｍＬ／分 
【０１１３】
移動相：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５＋１．７５ｍＭ  ＣａＣｌ２＋１．２５ｍＭ  ＮａＣｌ
【０１１４】
実施例４：ＦVIIａと免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦVIIａの血中半減期の測定
正常ＳＤラットに１００μｇ／ｋｇのＦVIIａと免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦVIIａを静脈投与した後、ＥＬＩＳＡ法を用いて血中濃度を求め、２試験物質の薬物動力学係数を比較した。
【０１１５】
ＦVIIａを投与したラットは薬物投与０．２５、０．５、１、２、５、１０、２４、４８時間後、免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦVIIａを投与したラットは投与０．２５、０．５、１、２、５、１０、２４、４８、７２、９６、１２０時間後に頚静脈から０．５ｍＬの血液を採血した。クエン酸ナトリウムを含有するチューブに血液試料を集めて凝固を防止し、エッペンドルフ社の高速マイクロ遠心分離機で５分間遠心分離して血漿を分離した。血漿内タンパク質の量はＦVIIａに特異的な抗体を用いてＥＬＩＳＡ法（ＩＭＵＢＩＮＤ、Ｆａｃｔｏｒ  VIIａ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、ａｍｅｒｉｃａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  ｉｎｃ．）で測定した。
【０１１６】
ＦVIIａと免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦVIIａの血中濃度グラフ及び薬物動力学的分析結果をグラフ１と表１に示す。表において、Ｔｍａｘは最高薬物濃度に到達する時間、Ｔ１／２は薬物の血中半減期、ＭＲＴ（ｍｅａｎ  ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ  ｔｉｍｅ）は薬物分子の平均的な体内滞留時間をそれぞれ意味する。
【０１１７】
表１及び図１から分かるように、免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦVIIａの血中半減期は、約６０時間であって、優れた血中半減期を示すことを確認した。
【０１１８】
【表１】
2013533875.tif 000003
【０１１９】
実施例５：ＦVIIａと免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦVIIａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の測定
天然型ＦVIIａ、及び実施例１で製造した免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦVIIａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を測定するために、商用ｋｉｔ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、ＣＯＡＳＥＴ）を用いてｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓａｙを行った。商用対照品として使用されたＮｏｖｏｓｅｖｅｎは、Ｎｏｖｏ  ｎｏｒｄｉｓｋ社から販売されている遺伝子組み換えＦVIIａであって、血友病患者の出血と手術の際に止血作用を適応症としている医薬品である。
【０１２０】
活性測定試験は、ヨーロッパ薬局方「２．７．１０  ＡＳＳＡＹ  ＯＦ  ＨＵＭＡＮ  ＣＯＡＧＵＬＡＴＩＯＮ  ＦＡＣＴＯＲ  VII」に記述された内容に基づいて行った。濃度別に希釈されたＮｏｖｏｓｅｖｅｎ、ＦVIIａ及び免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦVIIａがＦＸをＦＸａに活性化させ、活性化されたＦＸａによって、基質として使用されたＳ−２７６５が加水分解されてペプチドと発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｉｃ  ｇｒｏｕｐ）としてのｐＮＡに分解される。分解されたｐＮＡは黄色を帯びるので、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。測定された吸光度値と処理された薬物の濃度値を用いて用量反応曲線（ｄｏｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｕｒｖｅ）とＥＣ５０値を確認した。試験結果、免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦａｃVIIａのＥＣ５０値は５０．７２ｎｇ／ｍＬであって、Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎに比べて２７倍高かった（図２）。
【０１２１】
【表２】
2013533875.tif 000004
【０１２２】
実施例６：ＦVIIａと免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦVIIａのｉｎ  ｖｉｖｏ効力の測定
ＦVIIａと免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦVIIａのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を測定するために、ワルファリン（ｗａｒｆａｒｉｎ）前に投与したＳＤラットから試験物質投与によるｉｎ  ｖｉｖｏＦVII（ａ）の活性を測定した。商用対照品として使用されたＮｏｖｏｓｅｖｅｎは、Ｎｏｖｏ  ｎｏｒｄｉｓｋ社から販売されている遺伝子組み換えＦVIIａであって、血友病患者の出血と手術の際に止血作用を適応症としている医薬品である。
【０１２３】
ＦａｃｔｏｒII、IX、X、VIIなどのビタミンＫ依存性凝固因子のγ−カルボキシル化を阻害する物質であるワルファリンを２４時間前に投与したＳＤラットにＮｏｖｏｓｅｖｅｎ、ＦVIIａ及び免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦVIIａ２５０μｇを静脈投与した。投与２５分、４、２４、４８時間後に頚静脈を流れる１ｍＬの血液をクエン酸ナトリウム含有チューブを用いて採血した。遠心分離によって血清を分離し、分離された血清からＦVII（％）の活性をＡＣＬ９０００（Ｗｅｒｆｅｎ  ｇｒｏｕｐ）を用いて測定した。
【０１２４】
試験結果、ＦVIIａのｉｎ  ｖｉｖｏ活性はＮｏｖｏｓｅｖｅｎと類似した活性を持った。免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ−ＦVIIａの活性は、投与２５分後と４時間後にＮｏｖｏｓｅｖｅｎに比べて低い活性を示したが、投与２４時間後にはＮｏｖｏｓｅｖｅｎに比べて６．５倍高い活性を維持した（表３、図３）。
【０１２５】
【表３】
2013533875.tif 000005
【０１２６】
前述したように、本発明のＦａｃVIIａ結合体は、ＦａｃVIIａの生体内活性を保障し、ＦａｃVIIａの血中半減期を相当増加させることにより、血液凝固が起こらない患者の行動に対するＦａｃVIIａの持続型剤形の開発に有用であった。
【０１２７】
たとえ本発明の実施例が例示するためのものであっても、当該分野における技術者であれば、添付した請求の範囲に開示された本発明の範囲及び意味の範疇内において、多様な変形、追加及び置換を加え得るであろう。
【図１】
2013533875.tif 000006
【図２】
2013533875.tif 000007
【図３】
2013533875.tif 000008
【国際調査報告】
2013533875.tif 000009
2013533875.tif 000010
2013533875.tif 000011
2013533875.tif 000012