(57)【要約】  式（Ｉ）の化合物：［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］。そのような化合物は、対象において、炎症、炎症性障害及びがんを検出するために有用であり、これらの状態の治療及び／又は予防を包含する治療的用途においても使用され得る。したがって、医薬組成物、組合せ及び補給剤、並びに記載した化合物を使用する治療方法についても記載されている。
2013500275.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2013500275.tif 000052
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］。
【請求項２】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
下記構造群：
【化２】
2013500275.tif 000053
から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
下記構造の化合物Ｄ０４６−１２４：
【化３】
2013500275.tif 000054
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
対象において、結腸直腸がん（ＣＲＣ）を治療又は予防するのに十分な量で、式（Ｉ）の化合物：
【化４】
2013500275.tif 000055
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
を投与するステップを含む、前記対象においてＣＲＣを治療又は予防する方法。
【請求項７】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
化合物が下記構造群：
【化５】
2013500275.tif 000056
から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
化合物が下記構造のＤ０４６−１２４：
【化６】
2013500275.tif 000057
である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
対象において、腫瘍の成長を阻害するのに十分な量で、式（Ｉ）の化合物：
【化７】
2013500275.tif 000058
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
を投与するステップを含む、前記対象において腫瘍成長を阻害する方法。
【請求項１２】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
化合物が下記構造群：
【化８】
2013500275.tif 000059
から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
化合物が下記構造のＤ０４６−１２４：
【化９】
2013500275.tif 000060
である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
対象において、前記対象において胃腸（ＧＩ）障害を治療、予防又は緩和するのに十分な量で、式（Ｉ）の化合物：
【化１０】
2013500275.tif 000061
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
を投与するステップを含む、前記対象において前記ＧＩ障害を治療又は予防する方法。
【請求項１７】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
化合物が下記構造群：
【化１１】
2013500275.tif 000062
から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
化合物が下記構造のＤ０４６−１２４：
【化１２】
2013500275.tif 000063
である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
それを必要とする対象において、炎症及び／又は炎症に関係する障害を予防するのに有効な量で、式（Ｉ）の化合物：
【化１３】
2013500275.tif 000064
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
を投与するステップを含む、前記対象において前記炎症及び／又は炎症に関係する障害を治療又は予防する方法。
【請求項２２】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
化合物が下記構造群：
【化１４】
2013500275.tif 000065
から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
化合物が下記構造のＤ０４６−１２４：
【化１５】
2013500275.tif 000066
である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
対象において水酸化多価不飽和超長鎖脂肪酸（ｈＰＵＬＣＦＡ）欠乏障害（ｈＰＤＤ）を治療又は予防するのに十分な量で、式（Ｉ）の化合物：
【化１６】
2013500275.tif 000067
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
を投与するステップを含む、前記対象においてｈＰＤＤを治療又は予防する方法。
【請求項２７】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
化合物が下記構造群：
【化１７】
2013500275.tif 000068
から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項３０】
化合物が下記構造のＤ０４６−１２４：
【化１８】
2013500275.tif 000069
である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
投与される化合物の量が、ｈＰＵＬＣＦＡレベルを上昇させ又は修復するのに有効なものである、請求項２６〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
ａ）対象由来の試料を分析して、前記試料中の式（Ｉ）の化合物：
【化１９】
2013500275.tif 000070
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
の量を定量するステップと、
ｂ）前記対象試料中の定量された前記化合物の量を、１又は２以上の標準試料中の対応する前記化合物の量と比較して、前記対象試料中の前記化合物の量における増加又は減少の有無を決定するステップと、
ｃ）前記増加又は減少を、前記対象のＣＲＣ健康状態若しくは健康状態における変化を診断するために、又は前記対象においてＣＲＣ若しくはＣＲＣのリスクを診断するために使用するステップと
を含む、前記対象のＣＲＣ健康状態若しくは健康状態における変化を診断するための、又は前記対象においてＣＲＣ若しくはＣＲＣのリスクを診断するための方法。
【請求項３３】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
化合物が下記構造群：
【化２０】
2013500275.tif 000071
から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップａ）において、化合物についての正確な質量強度データを得るために、質量分析によって分析され、前記正確な質量強度データが、ステップｂ）において正確な質量強度における増加又は減少を特定するために、１又は２以上の標準試料から得られた対応する正確な質量強度データと比較される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップａ）において、タンデム質量分析、ＮＭＲ又はＥＬＩＳＡによって分析される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
ａ）対象由来の試料を分析して、前記試料中の式（Ｉ）の化合物：
【化２１】
2013500275.tif 000072
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
の量を定量するステップと、
ｂ）前記対象試料中の定量された前記化合物の量を、１又は２以上の標準試料中の対応する前記化合物の量と比較して、前記対象試料中の前記化合物の量における増加又は減少の有無を決定するステップと、
ｃ）前記増加又は減少を、前記対象においてｈＰＤＤを診断するために使用するステップと
を含む、前記対象においてｈＰＵＬＣＦＡ欠乏障害（ｈＰＤＤ）を診断する方法。
【請求項３９】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
化合物が下記構造群：
【化２２】
2013500275.tif 000073
から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップａ）において、化合物についての正確な質量強度データを得るために、質量分析によって分析され、前記正確な質量強度データが、ステップｂ）において、正確な質量強度における増加又は減少を特定するために、１又は２以上の標準試料から得られた対応する正確な質量強度データと比較される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップａ）において、タンデム質量分析、ＮＭＲ又はＥＬＩＳＡによって分析される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
ａ）対象由来の試料を分析して、前記試料中の式（Ｉ）の化合物：
【化２３】
2013500275.tif 000074
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
の量を定量するステップと、
ｂ）前記対象試料中の定量された前記化合物の量を、１又は２以上の標準試料中の対応する前記化合物の量と比較して、前記対象試料中の前記化合物の量における増加又は減少の有無を決定するステップと、
ｃ）前記増加又は減少を、前記対象において炎症又は炎症性疾患を診断するために使用するステップと
を含む、炎症又は炎症性疾患を診断する方法。
【請求項４５】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
化合物が下記構造群：
【化２４】
2013500275.tif 000075
から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップａ）において、化合物についての正確な質量強度データを得るために、質量分析によって分析され、前記正確な質量強度データが、ステップｂ）において、正確な質量強度における増加又は減少を特定するために、１又は２以上の標準試料から得られた対応する正確な質量強度データと比較される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップａ）において、タンデム質量分析、ＮＭＲ又はＥＬＩＳＡによって分析される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
炎症が、ＩＢＤ、クローン病及び／若しくは結腸炎から選択されるＧＩ障害によって引き起こされる、又は炎症性疾患がそれらを包含する、請求項４４〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
ａ）抗炎症薬で治療される対象由来の試料を分析して、前記試料中の式（Ｉ）の化合物：
【化２５】
2013500275.tif 000076
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
の量を定量するステップと、
ｂ）前記対象試料中の定量された前記化合物の量を、１又は２以上の標準試料中の対応する前記化合物の量と比較して、前記対象試料中の前記化合物の量における増加又は減少の有無を決定するステップとを含み、
ここで、前記対象試料中の前記化合物の量における増加又は減少が、前記対象において前記抗炎症薬によって引き起こされる効果を示す、
前記抗炎症薬の効果をモニターする方法。
【請求項５２】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
化合物が下記構造群：
【化２６】
2013500275.tif 000077
から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップａ）において、化合物についての正確な質量強度データを得るために、質量分析によって分析され、前記正確な質量強度データが、ステップｂ）において、正確な質量強度における増加又は減少を特定するために、１又は２以上の標準試料から得られた対応する正確な質量強度データと比較される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
試料が、対象由来の血液試料であり、ステップａ）において、タンデム質量分析、ＮＭＲ又はＥＬＩＳＡによって分析される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
抗炎症薬で治療される対象が、炎症及び／又は炎症性状態若しくは疾患を有する、請求項５１〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
検出剤で標識された、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項５９】
検出剤で標識された、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物又はそのいずれか２以上の混合物を含む基準物質。
【請求項６０】
検出剤が、インビトロ又はインビボにおける検出を可能にする、安定同位体若しくは放射性同位体、酵素、又はタンパク質である、請求項５９に記載の基準物質。
【請求項６１】
請求項５９又は６０に記載の基準物質と、分析物を定量化するため、又は診断検査を実施するための取扱説明書とを含むキット。
【請求項６２】
薬学的に許容される担体又は賦形剤と、式（Ｉ）の化合物：
【化２７】
2013500275.tif 000078
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
とを含む医薬組成物。
【請求項６３】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
化合物が下記構造群：
【化２８】
2013500275.tif 000079
から選択される、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６６】
下記構造の化合物Ｄ０４６−１２４：
【化２９】
2013500275.tif 000080
である、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６７】
式（Ｉ）：
【化３０】
2013500275.tif 000081
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
によって定義されるとおりの２以上の化合物を含む組合せ。
【請求項６８】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項６７に記載の組合せ。
【請求項６９】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項６７に記載の組合せ。
【請求項７０】
２以上の化合物が下記構造群：
【化３１】
2013500275.tif 000082
から選択される、請求項６７に記載の組合せ。
【請求項７１】
医薬組合せ、栄養補給剤、栄養補助食品又は機能性食品として製剤化される、請求項６７に記載の組合せ。
【請求項７２】
対象において結腸直腸がん（ＣＲＣ）を治療又は予防するための、下記構造：
【化３２】
2013500275.tif 000083
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
を有する式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項７３】
対象において結腸直腸がん（ＣＲＣ）を治療又は予防するための薬剤の製造のための、以下の式（Ｉ）で示される下記構造：
【化３３】
2013500275.tif 000084
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
を有する式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項７４】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項７２又は７３に記載の使用。
【請求項７５】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項７４に記載の使用。
【請求項７６】
化合物が下記構造群：
【化３４】
2013500275.tif 000085
から選択される、請求項７２又は７３に記載の使用。
【請求項７７】
化合物が下記構造のＤ０４６−１２４：
【化３５】
2013500275.tif 000086
である、請求項７２又は７３に記載の使用。
【請求項７８】
対象において腫瘍の成長を阻害するための、下記構造：
【化３６】
2013500275.tif 000087
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
を有する式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項７９】
対象において腫瘍の成長を阻害するための薬剤の製造のための、下記構造：
【化３７】
2013500275.tif 000088
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
を有する式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項８０】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項７８又は７９に記載の使用。
【請求項８１】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項８０に記載の使用。
【請求項８２】
化合物が下記構造群：
【化３８】
2013500275.tif 000089
から選択される、請求項７８又は７９に記載の使用。
【請求項８３】
化合物が下記構造のＤ０４６−１２４：
【化３９】
2013500275.tif 000090
である、請求項７８又は７９に記載の使用。
【請求項８４】
対象において胃腸（ＧＩ）障害を治療又は予防するための、下記構造：
【化４０】
2013500275.tif 000091
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
を有する式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項８５】
対象において胃腸（ＧＩ）障害を治療又は予防するための薬剤の製造のための、下記構造：
【化４１】
2013500275.tif 000092
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
を有する式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項８６】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項８４又は８５に記載の使用。
【請求項８７】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項８６に記載の使用。
【請求項８８】
化合物が下記構造群：
【化４２】
2013500275.tif 000093
から選択される、請求項８４又は８５に記載の使用。
【請求項８９】
化合物が下記構造のＤ０４６−１２４：
【化４３】
2013500275.tif 000094
である、請求項８４又は８５に記載の使用。
【請求項９０】
それを必要とする対象において炎症及び／又は炎症に関係する障害を治療又は予防するための、下記構造：
【化４４】
2013500275.tif 000095
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
を有する式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項９１】
それを必要とする対象において炎症及び／又は炎症に関係する障害を治療又は予防するための薬剤の製造のための、下記構造：
【化４５】
2013500275.tif 000096
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
を有する式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項９２】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項９０又は９１に記載の使用。
【請求項９３】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項９２に記載の使用。
【請求項９４】
化合物が下記構造群：
【化４６】
2013500275.tif 000097
から選択される、請求項９０又は９１に記載の使用。
【請求項９５】
化合物が下記構造のＤ０４６−１２４：
【化４７】
2013500275.tif 000098
である、請求項９０又は９１に記載の使用。
【請求項９６】
対象において水酸化多価不飽和超長鎖脂肪酸（ｈＰＵＬＣＦＡ）欠乏障害（ｈＰＤＤ）を治療又は予防するための、下記構造：
【化４８】
2013500275.tif 000099
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
を有する式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項９７】
対象において水酸化多価不飽和超長鎖脂肪酸（ｈＰＵＬＣＦＡ）欠乏障害（ｈＰＤＤ）を治療又は予防するための薬剤の製造のための、下記構造：
【化４９】
2013500275.tif 000100
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
を有する式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項９８】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項９６又は９７に記載の使用。
【請求項９９】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項９８に記載の使用。
【請求項１００】
化合物が下記構造群：
【化５０】
2013500275.tif 000101
から選択される、請求項９６又は９７に記載の使用。
【請求項１０１】
化合物が下記構造のＤ０４６−１２４：
【化５１】
2013500275.tif 000102
である、請求項９６又は９７に記載の使用。
【請求項１０２】
化合物が、ｈＰＵＬＣＦＡレベルを上昇させ又は修復するのに有効な量で投与するためのものである、請求項９６〜１０１のいずれかに記載の使用。
【請求項１０３】
【化５２】
2013500275.tif 000103
からなる群から選択される化合物。
【請求項１０４】
化合物Ｄ０４６−１２４：
【化５３】
2013500275.tif 000104
(D046-124)
の合成における、
【化５４】
2013500275.tif 000105
からなる群から選択される中間体。
【請求項１０５】
化合物Ｄ０４６−１２４：
【化５５】
2013500275.tif 000106
(D046-124)
を調製するための方法であって、
（ｉ）式（II）の化合物：
【化５６】
2013500275.tif 000107
(II)
と式（III）の化合物：
【化５７】
2013500275.tif 000108
(III)
とを、式（IV）の化合物：
【化５８】
2013500275.tif 000109
(IV)
を生成するための条件下で反応させるステップと、
（ii）ＴＢＤＰＳ基を除去して式（Ｖ）の化合物：
【化５９】
2013500275.tif 000110
(V)
を生成するステップと、
（iii）前記式（Ｖ）の化合物と式（VI）の化合物：
【化６０】
2013500275.tif 000111
(VI)
とを、式（VII）の化合物：
【化６１】
2013500275.tif 000112
(VII)
を生成するための条件下で反応させるステップと、
（iv）前記式（VII）の化合物を触媒と、式（VIII）の化合物：
【化６２】
2013500275.tif 000113
(VIII)
を生成するための条件下で反応させるステップと、
（ｖ）前記式（VIII）の化合物の末端エステル官能基を加水分解してカルボン酸基とし、それによって表題化合物を生成するステップと
を含む方法。
【請求項１０６】
表題化合物を単離するための１又は２以上の精製ステップをさらに含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
式（VII）の化合物を、ステップ（iv）において、Ｐｄ触媒の存在下、炭酸カルシウムと１気圧の水素下で反応させて、三重結合を二重結合へ選択的に変換し、それによって式（VIII）の化合物を生成する、請求項１０４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患及び生理学的状態の検出及び治療において有用な化合物に関する。より具体的には、本発明は、ヒドロキシ脂肪酸化合物、それを含む組成物、並びに、結腸直腸がん、炎症及び炎症性疾患を治療及び検出するためにこれらの化合物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸がん（ＣＲＣ，colorectal cancer）の死亡率は、すべてのがんの中で、依然として肺がんに次いで２番目に高い（Canadian Cancer Statistics, 2008）。早期検出という公知の利益にもかかわらず、結腸鏡検査法及び糞便潜血検査に基づくスクリーニングプログラムは、パブリックアクセプタンス、コスト、限りある資源、正確さ及び標準化等の課題に悩まされてきた。当分野においては、ＣＲＣスクリーニングのための結腸鏡検査法単独での使用は実際的ではなく（Roy HK, Backman V, Goldberg MJ. Colon cancer screening: the good, the bad, and the ugly. Arch Intern Med 2006; 166:2177-9）、ＣＲＣ発症のリスクが高い対象を正確に特定することができる低侵襲性の血清ベース試験は、現在のアプローチよりも高いスクリーニングコンプライアンス及び既存の内視鏡検査手段のより良好な利用をもたらし得る（Roy HK, Backman V, Goldberg MJ. Colon cancer screening: the good, the bad, and the ugly. Arch Intern Med 2006; 166:2177-9、Ouyang DL, Chen JJ, Getzenberg RH, Schoen RE. Noninvasive testing for colorectal cancer: a review. Am J Gastroenterol 2005; 100:1393-403、Davies RJ, Miller R, Coleman N. Colorectal cancer screening: prospects for molecular stool analysis. Nat Rev Cancer 2005; 5:199-209）という合意がある。ＣＲＣ患者由来の生物試料に関連して、転写レベルの改変（Kleivi K, Lind GE, Diep CB, Meling GI, Brandal LT, Nesland JM, Myklebost O, Rognum TO, Giercksky KE, Skotheim RI, Lothe RA. Gene expression profiles of primary colorectal carcinomas, liver metastases, and carcinomatoses. Mol Cancer 2007; 6:2、Solmi R, Ugolini G, Rosati G, Zanotti S, Lauriola M, Montroni I, del Governatore M, Caira A, Taffurelli M, Santini D, Coppola D, Guidotti L, Carinci P, Strippoli P. Microarray-based identification and RT-PCR test screening for epithelial specific mRNAs in peripheral blood of patients with colon cancer. BMC Cancer 2006; 6:250、Komori T, Takemasa I, Higuchi H, Yamasaki M, Ikeda M, Yamamoto H, Ohue M, Nakamori S, Sekimoto M, Matsubara K, Monden M. Identification of differentially expressed genes involved in colorectal carcinogenesis using a cDNA microarray. J Exp Clin Cancer Res 2004; 23:521-7、Hegde P, Qi R, Gaspard R, Abernathy K, Dharap S, Earle-Hughes J, Gay C, Nwokekeh NU, Chen T, Saeed AI, Sharov V, Lee NH, Yeatman TJ, Quackenbush J. Identification of tumor markers in models of human colorectal cancer using a 19,200-element complementary DNA microarray. Cancer Res 2001; 61:7792-7、Kitahara O, Furukawa Y, Tanaka T, Kihara C, Ono K, Yanagawa R, Nita ME, Takagi T, Nakamura Y, Tsunoda T. Alterations of gene expression during colorectal carcinogenesis revealed by cDNA microarrays after laser-capture microdissection of tumor tissues and normal epithelia. Cancer Res 2001; 61:3544-9、Notterman DA, Alon U, Sierk AJ, Levine AJ. Transcriptional gene expression profiles of colorectal adenoma, adenocarcinoma, and normal tissue examined by oligonucleotide arrays. Cancer Res 2001; 61:3124-30、Takemasa I, Higuchi H, Yamamoto H, Sekimoto M, Tomita N, Nakamori S, Matoba R, Monden M, Matsubara K. Construction of preferential cDNA microarray specialized for human colorectal carcinoma: molecular sketch of colorectal cancer. Biochem Biophys Res Commun 2001; 285:1244-9、Backert S, Gelos M, Kobalz U, Hanski ML, Bohm C, Mann B, Lovin N, Gratchev A, Mansmann U, Moyer MP, Riecken EO, Hanski C. Differential gene expression in colon carcinoma cells and tissues detected with a cDNA array. Int J Cancer 1999; 82:868-74）、異常にメチル化された遺伝子産物（Mori Y, Cai K, Cheng Y, Wang S, Paun B, Hamilton JP, Jin Z, Sato F, Berki AT, Kan T, Ito T, Mantzur C, Abraham JM, Meltzer SJ. A genome-wide search identifies epigenetic silencing of somatostatin, tachykinin-1, and 5 other genes in colon cancer. Gastroenterology 2006; 131:797-808、Chen WD, Han ZJ, Skoletsky J, Olson J, Sah J, Myeroff L, Platzer P, Lu S, Dawson D, Willis J, Pretlow TP, Lutterbaugh J, Kasturi L, Willson JK, Rao JS, Shuber A, Markowitz SD.Detection in fecal DNA of colon cancer-specific methylation of the nonexpressed vimentin gene. J Natl Cancer Inst 2005; 97:1124-32、Leung WK, To KF, Man EP, Chan MW, Bai AH, Hui AJ, Chan FK, Sung JJ. Quantitativedetection of promoter hypermethylation in multiple genes in the serum of patients with colorectal cancer. Am J Gastroenterol 2005; 100:2274-9）及びプロテオームパターン（Ward DG, Suggett N, Cheng Y, Wei W, Johnson H, Billingham LJ, Ismail T, Wakelam MJ, Johnson PJ, Martin A. Identification of serum biomarkers for colon cancer by proteomic analysis. Br J Cancer 2006; 94:1898-905、Lou J, Fatima N, Xiao Z, Stauffer S, Smythers G, Greenwald P, Ali IU. Proteomic profiling identifies cyclooxygenase-2-independent global proteomic changes by celecoxib in colorectal cancer cells. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006; 15:1598-606、Mazzanti R, Solazzo M, Fantappie O, Elfering S, Pantaleo P, Bechi P, Cianchi F, Ettl A, Giulivi C. Differential expression proteomics of human colon cancer. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006; 290:G1329-38、Roblick UJ, Hirschberg D, Habermann JK, Palmberg C, Becker S, Kruger S, Gustafsson M, Bruch HP, Franzen B, Ried T, Bergmann T, Auer G, Jornvall H. Sequential proteome alterations during genesis and progression of colon cancer. Cell Mol Life Sci 2004; 61:1246-55）がいくつも報告されているが、臨床的に有用な試験まで進んだのは、あるとしてもごくわずかである。これは、アッセイ設計における技術的な困難、再現性のある結果を得る課題、コスト及び長時間の調節過程を包含する複数の理由に起因し得る。さらに、現在使用されている又は開発中の試験のほとんどは、腫瘍特異的マーカーの検出に基づいており、極めて初期段階である又はリスクが高まりやすいが疾患の臨床提示を示していない対象を特定するための感度に乏しい。
【０００３】
ＣＲＣの原因となる遺伝子変化はよく特徴付けられているが、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ，adenomatous polyposis coli）及び遺伝性の非ポリポーシス結腸直腸がん（ＨＮＰＣＣ，hereditary nonpolyposis colorectal cancer）に起因する症例数は全体の５％未満であり、およそ１５％が、未だ解明されていない浸透度の低い突然変異の複合パターンに起因すると思われる遺伝性家族性リスクを原因とするものであると言われている（de la Chapelle A. Genetic predisposition to colorectal cancer. Nat Rev Cancer 2004; 4:769-80）。ＣＲＣ症例のおよそ８０％が、食習慣及び生活様式を主なリスク要因として散発的に生じると考えられていることもまた事実である（Marshall JR. Prevention of colorectal cancer: diet, chemoprevention, and lifestyle. Gastroenterol Clin North Am 2008; 37:73-82, vi、Fearnhead NS, Wilding JL, Bodmer WF. Genetics of colorectal cancer: hereditary aspects and overview of colorectal tumorigenesis. Br Med Bull 2002; 64:27-43）。加えて、個体のミクロビオームはその胃腸の生理学的状況と複雑に関係しており、それ自体がリスク要因として関与し得る（McGarr SE, Ridlon JM, Hylemon PB. Diet, anaerobic bacterial metabolism, and colon cancer: a review of the literature. J Clin Gastroenterol 2005;39:98-109）。代謝が食習慣及び生活様式の両方によって大きく影響されること、並びにミクロビオームが自らの代謝過程に寄与することを考慮すれば、ＣＲＣのリスク指標としての代謝マーカーを同定することを目標とした努力がほとんど為されてこなかったことは驚くべきことである。これは、部分的に、ＤＮＡマイクロアレイ又は表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ，surface-enhanced laser desorption/ionization）が転写物又はタンパク質をそれぞれ特徴付けることができるのと同様の手法で、代謝産物を包括的に特徴付けることができるプラットフォーム技術及び情報学的アプローチの欠如に起因していたかもしれない。
【０００４】
したがって、ＣＲＣを検出するための正確な方法、特に、該疾患の初期段階を検出するための方法が依然として必要である。
【０００５】
代謝産物分析のための質量分析ベースのシステム
近年、試料内の多数の代謝成分を並列方式で同定することができる質量分析ベースのシステムが進歩してきている（Aharoni A, Ric de Vos CH, Verhoeven HA, Maliepaard CA, Kruppa G, Bino R, Goodenowe DB. Nontargeted metabolome analysis by use of Fourier Transform Ion Cyclotron Mass Spectrometry. Omics 2002;6:217-34、Dettmer K, Aronov PA, Hammock BD. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrom Rev 2007;26:51-78、Want EJ, Nordstrom A, Morita H, Siuzdak G. From exogenous to endogenous: the inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. J Proteome Res 2007;6:459-68）。
【０００６】
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴＩＣＲ−ＭＳ，Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry）は、荷電粒子が磁場においてサイクロトロン運動を呈するという原理に基づいており、ここで、スピン周波数は質量に比例する（Pinto DM, Boyd RK, Volmer DA. Ultra-high resolution for mass spectrometric analysis of complex and low-abundance mixtures - the emergence of FTICR-MS as an essential analytical tool. Anal Bioanal Chem 2002; 373:378-89）。ＦＴＩＣＲ−ＭＳは、その高分解能及び１パート・パー・ミリオン（ｐｐｍ，part per million）未満の質量精度でイオンを検出する性能で知られている。液体試料抽出物は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ，electrospray ionization）及び大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ，atmospheric pressure chemical ionization）を使用してクロマトグラフ分離なしで直接注入することができ（Aharoni A, Ric de Vos CH, Verhoeven HA, Maliepaard CA, Kruppa G, Bino R, Goodenowe DB. Nontargeted metabolome analysis by use of Fourier Transform Ion Cyclotron Mass Spectrometry. Omics 2002;6:217-34）、ここで、フーリエ変換を使用して、質量対電荷（Ｍ／Ｚ，mass to charge）比が異なるイオンを同時に分解することができる。情報学的アプローチを使用して、いくつもの試料からのスペクトルファイルを正確に整列化し、試料全体にわたってピーク強度を比較することができる（Aharoni A, Ric de Vos CH, Verhoeven HA, Maliepaard CA, Kruppa G, Bino R, Goodenowe DB. Nontargeted metabolome analysis by use of Fourier Transform Ion Cyclotron Mass Spectrometry. Omics 2002;6:217-34）。高分解能は、試料において検出されたすべてのイオンの元素組成予測も可能にし、代謝産物の分類及び同定のための確固たる基盤、並びにデノボ代謝ネットワークを構成する能力を提供する（Aharoni A, Ric de Vos CH, Verhoeven HA, Maliepaard CA, Kruppa G, Bino R, Goodenowe DB. Nontargeted metabolome analysis by use of Fourier Transform Ion Cyclotron Mass Spectrometry. Omics 2002;6:217-34、Breitling R, Ritchie S, Goodenowe D, Stewart ML, Barrett MP. Ab initio prediction of metabolic networks using Fourier transform mass spectrometry data. Metabolomics 2006; 2:155-164）。
【０００７】
それでも、ＣＲＣの初期段階において該疾患を検出するために利用可能である正確な血清マーカーなしでは、質量分析ベースの診断システムは臨床試験において広く使用されてこなかった。
【０００８】
炎症及び疾患における生物活性脂質の役割
炎症は、がんを包含する多くのヒト疾患の根底にある重大な構成要素である。炎症がどのように生じ、体によって制御されるか、並びに食事及び環境要因が炎症にどのように影響を与えるかを理解することは、疾患の予防及び治療のために重要である。
【０００９】
炎症における生物活性脂質の役割は、アラキドン酸が、シクロオキシゲナーゼ及びリポキシゲナーゼの活性を介して、種々の炎症促進性メディエーター、プロスタグランジン及びロイコトリエンを生じさせることを示したBorgeat及びSamuelssonにより、１９７９年に報告された（Borgeat P, Samuelsson B. Metabolism of arachidonic acid in polymorphonuclear leukocytes.  Structural analysis of novel hydroxylated compounds. J. Biol. Chem., 1979, 254:7865-9）。それ以来、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ，polyunsaturated fatty acid）が有益な健康効果も有し得、がんを包含する複数の炎症関連障害から保護し得ることを示唆する優位なデータが報告されてきた（Chapkin RS, Davidson LA, Ly L, et al. Immunomodulatory effects of (n-3) fatty acids: putative link to inflammation and colon cancer. J. Nutr. 2007, 137:200S-204S、Chapkin RS, McMurray DN, Lupton JR. Colon cancer, fatty acids and anti-inflammatory compounds. Curr. Opin. Gastroenterol. 2007, 23:48-54、Chapkin RS, Seo J, McMurray DN, et al. Mechanisms by which docosahexaenoic acid and related fatty acids reduce colon cancer risk and inflammatory disorders of the intestine. Chem. Phys. Lipids 2008, 153:14-23）。特に興味深いのは、炎症の消散におけるｎ−３及びｎ−６脂肪酸の役割である。
【００１０】
ＰＵＦＡのｎ−３クラスは、魚油に多く、アシル鎖のメチル位から１番目の二重結合の位置によって定義される。超長鎖ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ，docosahexaenoic acid；２２：６ｎ−３）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，eicosapentaenoic acid；２０：５ｎ−３）は、魚油において高度に豊富なｎ−３ＰＵＦＡであり、一方、短鎖リノレン酸（ＬＮＡ，linolenic acid；１８：３ｎ−３）は、アマ及びアブラナ等の種子油において豊富である。ｎ−３脂肪酸の内因性レベルは、食習慣によって大きく影響されるが、インビボにおけるそれらの合成が可能である。ｎ−３抗炎症活性の厳密な機序は、ほとんど理解されておらず、事実上多様である。しかしながら、多面発現効果の多くは、細胞膜構築及び流動性の変調、プロスタグランジン合成の阻害、ＰＰＡＲ及びトール様受容体を介するＮＦ−κＢの調節、タンパク質標的における変化、並びに種々の炎症消散生成物への変換に帰する場合がある（Chapkin RS, Davidson LA, Ly L, et al. Immunomodulatory effects of (n-3) fatty acids: putative link to inflammation and colon cancer. J. Nutr. 2007, 137:200S-204S、Chapkin RS, McMurray DN, Lupton JR. Coloncancer, fatty acids and anti-inflammatory compounds. Curr. Opin. Gastroenterol. 2007, 23:48-54、Chapkin RS, Seo J, McMurray DN, et al. Mechanisms by which docosahexaenoic acid and related fatty acids reduce colon cancer risk and inflammatory disorders of the intestine. Chem. Phys. Lipids 2008, 153:14-23）。
【００１１】
急性炎症は、感染、負傷又は外傷に対する短期的応答であり、ｎ−６アラキドン酸に由来するロイコトリエン及びプロスタグランジン等の炎症促進性メディエーターの放出によって特徴付けられ、他の化学誘引剤と組み合わせて、感染又は負傷部位への白血球の動員をもたらす。炎症のこの初期波には、その後まもなく消散の波が付随して起こり、ここで、アラキドン酸からもリポキシゲナーゼ由来のエイコサノイドを産生する血小板−白血球相互作用を介するさらなるＰＭＮ動員が確認される。生じたリポキシンは非常に強力であり、ピクトグラム数で作用する。リポキシンはアスピリン誘発性であってもよく、炎症の消散を促進するための非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ，non-steroidal anti-inflammatory drug）に固有の能力をアスピリンに与える。
【００１２】
リポキシンに加えて、ｎ−３超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ，very-long-chain fatty acid）メディエーターの並列する役割が同定された。これらは、２つの別個のクラス：レソルビン（消散相相互作用生成物）及びプロテクチン（ニューロプロテクチンとも称される神経組織の初期保護から発生する）に分けられる。ＥＰＡを発生源とするレソルビンはＥシリーズ、レソルビンＥ１（ＲｖＥ１，resolvin E1）は原型的メンバーと称され、一方、ＤＨＡを発生源とするレソルビンは、レソルビンＤ１（ＲｖＤ１，resolvin D1）に代表されるＤシリーズを表す。しかしながら、ＤＨＡは、ニューロプロテクチンＤ１等のプロテクチンも生じさせ得る（Serhan CN. Novel chemical mediators in the resolution of inflammation: resolvins and protectins. Anesthesiol Clin 2006; 24:341-64、Serhan CN. Novel eicosanoid and docosanoid mediators: resolvins, docosatrienes, and neuroprotectins. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 2005, 8:115-21、Serhan CN, Gotlinger K, Hong S, Lu Y, Siegelman J, Baer T, Yang R, Colgan SP, Petasis NA. Anti-inflammatory actions of neuroprotectin D1/protectin D1 and its natural stereoisomers: assignments of dihydroxy-containing docosatrienes. J Immunol 2006; 176:1848-59）。リポキシンのように、Ｅ及びＤシリーズ両方のレソルビンは、アスピリンによっても誘発され得る（Serhan CN, Hong S, Gronert K, Colgan SP, Devchand PR, Mirick G, Moussignac RL. Resolvins: a family of bioactive products of omega-3 fatty acid transformation circuits initiated by aspirin treatment that counter proinflammation signals. J Exp Med 2002; 196:1025-37）。
【００１３】
多くの疾患における炎症の中心的役割を考慮すれば、炎症制御に関与する内因性代謝系の同定は最高に興味深い。急性炎症を十分に「消散」できないことが、がん及びアルツハイマー病等の状態の根底をなす慢性炎症状態の背景にある有力な説である。特に関連性があるのは、炎症性腸疾患（ＩＤＢ，inflammatory bowel disease）、クローン病、結腸炎及び結腸がん等の腸管の炎症性状態に対する消散促進性メディエーターの効果である。
【００１４】
ＲｖＥ１及びＬＸＡ４はいずれも、結腸炎症に対する保護効果に関わっているとされてきた。ＲｖＥ１は、白血球浸潤のブロック、炎症促進性遺伝子発現の減少、一酸化窒素シンターゼの誘導が生存率及び体重の維持における改善に付随して起こる、マウスにおける２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸誘導性結腸炎の発症から保護することが示された（Arita M, Yoshida M, Hong S, Tjonahen E, Glickman JN, Petasis NA, Blumberg RS, Serhan CN. Resolvin E1, an endogenous lipid mediator derived from omega-3 eicosapentaenoic acid, protects against 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102:7671-6）。同様に、ＬＸＡ４アナログは、ヒト結腸におけるケモカイン分泌をエクスビボで減衰させることが示されており（Goh J, Baird AW, O'Keane C, Watson RW, Cottell D, Bernasconi G, Petasis NA, Godson C, Brady HR, MacMathuna P. Lipoxin A(4) and aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A(4) antagonize TNF-alpha-stimulated neutrophil-enterocyte interactions in vitro and attenuate TNF-alpha-induced chemokine release and colonocyte apoptosis in human intestinal mucosa ex vivo. J Immunol 2001; 167:2772-80）、病原誘導性胃腸炎に応答して誘導された遺伝子、特にＮＦκＢによって調節される遺伝子の５０％を減衰させた（Gewirtz AT, Collier-Hyams LS, Young AN, Kucharzik T, Guilford WJ, Parkinson JF, Williams IR, Neish AS, Madara JL. Lipoxin a4 analogs attenuate induction of intestinal epithelial proinflammatory gene expression and reduce the severity of dextran sodium sulfate-induced colitis. J Immunol 2002; 168:5260-7）。インビボでは、ＬＸＡ４アナログはＤＳＳ誘導性炎症性結腸炎において腸管の炎症を低減させ、体重損失、血便及び死亡率の有意な低減をもたらした（Gewirtz AT, Collier-Hyams LS, Young AN, Kucharzik T, Guilford WJ, Parkinson JF, Williams IR, Neish AS, Madara JL. Lipoxin a4 analogs attenuate induction of intestinal epithelial proinflammatory gene expression and reduce the severity of dextran sodium sulfate-induced colitis. J Immunol 2002; 168:5260-7）。
【００１５】
構造的に、リポキシン、レソルビン及びプロテクチンは、種々のリポキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ及びｐ４５０酵素によって触媒される親ＶＬＣＦＡの一、二及び三水酸化生成物である。これらの分子のある特定の生理学的効果を上記で論じた通り立証してきたが、これらの消散「停止シグナル」がどのように発揮されるかを記述する機序は、依然として謎のままである。
【００１６】
本発明者らは、本明細書において、炎症及びアポトーシス促進性抗がん活性の促進を低減させる上で役割を果たす新規クラスの水酸化脂肪酸について記述する。これらの水酸化脂肪酸は、疾患及び生理学的状態を診断するための有用なバイオマーカーでもある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Canadian Cancer Statistics, 2008
【非特許文献２】Roy HK, Backman V, Goldberg MJ. Colon cancer screening: the good, the bad, and the ugly. Arch Intern Med 2006; 166:2177-9
【非特許文献３】Ouyang DL, Chen JJ, Getzenberg RH, Schoen RE. Noninvasive testing for colorectal cancer: a review. Am J Gastroenterol 2005; 100:1393-403
【非特許文献４】Davies RJ, Miller R, Coleman N. Colorectal cancer screening: prospects for molecular stool analysis. Nat Rev Cancer 2005; 5:199-209
【非特許文献５】Kleivi K, Lind GE, Diep CB, Meling GI, Brandal LT, Nesland JM, Myklebost O, Rognum TO, Giercksky KE, Skotheim RI, Lothe RA. Gene expression profiles of primary colorectal carcinomas, liver metastases, and carcinomatoses. Mol Cancer 2007; 6:2
【非特許文献６】Solmi R, Ugolini G, Rosati G, Zanotti S, Lauriola M, Montroni I, del Governatore M, Caira A, Taffurelli M, Santini D, Coppola D, Guidotti L, Carinci P, Strippoli P. Microarray-based identification and RT-PCR test screening for epithelial specific mRNAs in peripheral blood of patients with colon cancer. BMC Cancer 2006; 6:250
【非特許文献７】Komori T, Takemasa I, Higuchi H, Yamasaki M, Ikeda M, Yamamoto H, Ohue M, Nakamori S, Sekimoto M, Matsubara K, Monden M. Identification of differentially expressed genes involved in colorectal carcinogenesis using a cDNA microarray. J Exp Clin Cancer Res 2004; 23:521-7
【非特許文献８】Hegde P, Qi R, Gaspard R, Abernathy K, Dharap S, Earle-Hughes J, Gay C, Nwokekeh NU, Chen T, Saeed AI, Sharov V, Lee NH, Yeatman TJ, Quackenbush J. Identification of tumor markers in models of human colorectal cancer using a 19,200-element complementary DNA microarray. Cancer Res 2001; 61:7792-7
【非特許文献９】Kitahara O, Furukawa Y, Tanaka T, Kihara C, Ono K, Yanagawa R, Nita ME, Takagi T, Nakamura Y, Tsunoda T. Alterations of gene expression during colorectal carcinogenesis revealed by cDNA microarrays after laser-capture microdissection of tumor tissues and normal epithelia. Cancer Res 2001; 61:3544-9
【非特許文献１０】Notterman DA, Alon U, Sierk AJ, Levine AJ. Transcriptional gene expression profiles of colorectal adenoma, adenocarcinoma, and normal tissue examined by oligonucleotide arrays. Cancer Res 2001; 61:3124-30
【非特許文献１１】Takemasa I, Higuchi H, Yamamoto H, Sekimoto M, Tomita N, Nakamori S, Matoba R, Monden M, Matsubara K. Construction of preferential cDNA microarray specialized for human colorectal carcinoma: molecular sketch of colorectal cancer. Biochem Biophys Res Commun 2001; 285:1244-9
【非特許文献１２】Backert S, Gelos M, Kobalz U, Hanski ML, Bohm C, Mann B, Lovin N, Gratchev A, Mansmann U, Moyer MP, Riecken EO, Hanski C. Differential gene expression in colon carcinoma cells and tissues detected with a cDNA array. Int J Cancer 1999; 82:868-74
【非特許文献１３】Mori Y, Cai K, Cheng Y, Wang S, Paun B, Hamilton JP, Jin Z, Sato F, Berki AT, Kan T, Ito T, Mantzur C, Abraham JM, Meltzer SJ. A genome-wide search identifies epigenetic silencing of somatostatin, tachykinin-1, and 5 other genes in colon cancer. Gastroenterology 2006; 131:797-808
【非特許文献１４】Chen WD, Han ZJ, Skoletsky J, Olson J, Sah J, Myeroff L, Platzer P, Lu S, Dawson D, Willis J, Pretlow TP, Lutterbaugh J, Kasturi L, Willson JK, Rao JS, Shuber A, Markowitz SD.Detection in fecal DNA of colon cancer-specific methylation of the nonexpressed vimentin gene. J Natl Cancer Inst 2005; 97:1124-32
【非特許文献１５】Leung WK, To KF, Man EP, Chan MW, Bai AH, Hui AJ, Chan FK, Sung JJ. Quantitativedetection of promoter hypermethylation in multiple genes in the serum of patients with colorectal cancer. Am J Gastroenterol 2005; 100:2274-9
【非特許文献１６】Ward DG, Suggett N, Cheng Y, Wei W, Johnson H, Billingham LJ, Ismail T, Wakelam MJ, Johnson PJ, Martin A. Identification of serum biomarkers for colon cancer by proteomic analysis. Br J Cancer 2006; 94:1898-905
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、炎症、炎症性障害及びがんの治療及び緩和のための化合物、並びに関係する医薬組成物及び治療の方法を提供することを目的とする。
【００１９】
本発明は、対象において、炎症、炎症性障害及びがんを検出するために有用な化合物、並びに関係する検出又は診断の方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の態様によれば、式（Ｉ）の化合物：
【００２１】
【化１】
2013500275.tif 000003
(I)
【００２２】
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、該鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
が提供される。
【００２３】
上記の式（Ｉ）において、Ｒは、好ましくはＣ２８−Ｃ３６脂肪族基、より好ましくはＣ２８脂肪族基であってよい。直鎖脂肪族基が意味するのは、本明細書において使用される場合、例えばオレフィン基又はアルケニル基としての開鎖飽和炭化水素である。ヒドロキシ置換が意味するのは、本明細書において使用される場合、化合物が、炭化水素鎖中の１又は２以上の水素原子と置き換えて、１又は２以上のヒドロキシ置換基を有し得ることである。
【００２４】
何ら限定することを望まないが、上記の化合物は、ある特定の実施形態において、下記化合物の１つであってよい。
【００２５】
【化２】
2013500275.tif 000004
【００２６】
上記の化合物は天然源から単離してよく、又は化学的に合成してもよい。加えて、すべての化合物は、単一の立体異性体として若しくはその混合物として、及び／又は薬学的に許容されるその塩若しくはエステルとして提供され得る。
【００２７】
上記の化合物は、例えば、診断アッセイ、インビボでの分析物レベルの定量化等における基準物質としての使用を容易にするために、標識されていてもよい。非限定的な実施形態において、化合物は、１３Ｃ等の安定同位体、３２Ｐ若しくは３５Ｓ等の放射性同位体、フルオレセイン等の蛍光タグ、又は等価物で標識される。代替的非限定的な実施形態において、化合物は、インビトロ又はインビボにおける検出を容易にするように、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ，horse radish peroxidase）、アルカリ性ホスファターゼ、ビオチン等の酵素又はタンパク質で標識される、又はそれらと共役される。
【００２８】
故に、本発明は、検出剤で標識された式（Ｉ）の化合物を含む基準物質をさらに提供する。
【００２９】
上述した基準物質を含むキットも提供される。そのようなキットは、取扱説明書、及び分析物を定量化するため又は診断アッセイを本明細書において記載されている通りに実施するために有用な他の材料を含み得る。
【００３０】
本発明の別の態様として、式（Ｉ）の化合物を、ＣＲＣを治療、予防又は緩和するのに十分な量で投与するステップを含む、該癌疾患と診断された、又は該疾患を有する疑いがある対象を治療する方法が提供される。
【００３１】
式（Ｉ）の化合物を、腫瘍の成長を阻害するのに十分な量で投与するステップを含む、腫瘍成長を阻害する方法が追加で提供される。ある特定の実施形態において、腫瘍成長の阻害は、成長の完全阻害を包含する種々の程度の腫瘍成長遅延を包含し得る。そのような治療は、腫瘍サイズの低減も伴い得る。腫瘍は、腺癌等の大腸及び直腸のがん、胃がん（gastric and stomach cancers）、膵がん、卵巣がん、食道がん、並びに他の胃腸／腹部がんを包含し得るがこれらに限定されない。
【００３２】
本発明は、対象に、該対象において胃腸（ＧＩ，gastrointestinal）障害を治療、予防又は緩和するのに十分な量で、式（Ｉ）の化合物を投与するステップを含む、該対象において該疾患を治療又は予防する方法をさらに提供する。ＧＩ障害は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病及び／若しくは結腸炎等の非悪性障害、又はポリープ若しくは種々の異型度の異形成の存在であってよい。
【００３３】
それを必要とする対象に、炎症及び／又は炎症に関係する障害を予防するのに有効な量で、式（Ｉ）の化合物を投与するステップを含む、該対象において前記炎症及び／又は炎症に関係する障害を予防する方法も、本明細書において提供される。
【００３４】
上記で言及した通り、本発明は、疾患の初期兆候を包含する疾患の診断及び検出の方法にも関する。したがって、
ａ）対象由来の試料を分析して、前記試料中の式（Ｉ）の化合物の量を定量するステップと、
ｂ）対象試料中の定量された化合物の量を、１又は２以上の標準試料中の対応する化合物の量と比較して、対象試料中の化合物の量における増加又は減少の存在又は非存在を決定するステップと、
ｃ）前記増加又は減少を、対象のＣＲＣ健康状態若しくは健康状態における変化を診断するために、又は対象においてＣＲＣ若しくはＣＲＣのリスクを診断するために使用するステップと
を含む、対象のＣＲＣ健康状態若しくは健康状態における変化を診断するための、又は対象においてＣＲＣ若しくはＣＲＣのリスクを診断するための方法を本明細書においてさらに提供する。
【００３５】
本発明はさらに、対象における式（Ｉ）の化合物のレベルを計測するステップと、前記レベルを健常状態における水酸化多価不飽和超長鎖脂肪酸（ｈＰＵＬＣＦＡ，hydroxylated polyunsaturated ultra long-chain fatty acid）の対応する標準レベルと比較するステップとを含む、ｈＰＵＬＣＦＡ欠乏障害（ｈＰＤＤ，hPULCFA deficiency disorder）を有する対象の同定及び／又は診断の方法に関する。そのような方法は、
ａ）対象由来の試料を分析して、試料中の式（Ｉ）の化合物の量を定量するステップと、
ｂ）対象試料中の定量された化合物の量を、１又は２以上の標準試料中の対応する化合物の量と比較して、対象試料中の化合物の量における増加又は減少の存在又は非存在を決定するステップと、
ｃ）増加又は減少を、対象においてｈＰＤＤを診断するために使用するステップと
を含み得る。
【００３６】
本発明はさらに、対象においてｈＰＤＤを寛解させるのに十分な量で式（Ｉ）の化合物を投与することにより、対象においてｈＰＤＤを治療する方法に関する。好ましくは、投与される化合物の量は、ｈＰＵＬＣＦＡレベルを上昇させるのに、より好ましくは、ｈＰＵＬＣＦＡレベルを健常状態に修復するのに有効なものである。
【００３７】
「健常状態」が意味するのは、健康であるとみなされる又はｈＰＤＤを有さない対象におけるｈＰＵＬＣＦＡのレベルである。
【００３８】
本発明は、炎症のマーカーとしての、及び抗炎症薬の効果をモニターするための、１又は２以上の式（Ｉ）の化合物の使用にも関する。したがって、
ａ）対象由来の試料を分析して、試料中の式（Ｉ）の化合物の量を定量するステップと、
ｂ）対象試料中の定量された化合物の量を、１又は２以上の標準試料中の対応する化合物の量と比較して、対象試料中の化合物の量における増加又は減少の存在又は非存在を決定するステップと、
ｃ）増加又は減少を、対象において炎症又は炎症性疾患を診断するために使用するステップと
を含む方法が提供される。
【００３９】
炎症又は炎症性疾患を診断する上記の方法において、炎症は、ＩＢＤ、クローン病及び／若しくは結腸炎等のＧＩ障害によって引き起こされ得る、又は炎症性疾患はそれらを包含し得る。故に、そのような方法は、そのようなＧＩ障害を診断する方法を包括し得る。
【００４０】
抗炎症薬の効果をモニターする方法は、
ａ）前記抗炎症薬で治療される対象由来の試料を分析して、試料中の式（Ｉ）の化合物の量を定量するステップと、
ｂ）対象試料中の定量された化合物の量を、１又は２以上の標準試料中の対応する化合物の量と比較して、対象試料中の化合物の量における増加又は減少の存在又は非存在を決定するステップとを含み、
ここで、対象試料中の化合物の量における増加又は減少は、対象において抗炎症薬によって引き起こされる効果を指示する。
【００４１】
上記の方法において、前記抗炎症薬で治療される対象は、典型的には、炎症及び／若しくは炎症性状態若しくは疾患と診断される、又はそれらを有すると疑われることになる。代替として、方法は、炎症及び／若しくは炎症性状態若しくは疾患と診断される、又はそれらを有すると疑われる第一の亜群又は集団と、炎症及び／若しくは炎症性状態若しくは疾患を有さないと診断される、又はそれらの生理学的兆候を呈さない第二の亜群又は集団とを包含する、対象群を包含する比較分析に適用され得る。
【００４２】
上記診断法のある特定の実施形態において、対象由来の試料は、ステップａ）において、化合物についての正確な質量強度データを得るために、質量分析によって分析され、該正確な質量強度データが、ステップｂ）において、正確な質量強度における増加又は減少を特定するために、１又は２以上の標準試料から得られた対応する正確な質量強度データと比較される。加えて、対象由来の試料は、１又は２以上の内部対照代謝産物を定量するため、又は該代謝産物についての正確な質量強度データを得るためにさらに分析され得る。そのような実施形態において、定量された化合物の量又は得られる正確な質量強度と、１又は２以上の内部対照代謝産物について得られる定量された量又は正確な質量強度との比を決定することができる。比較するステップ（ｂ）は、次いで、各比を、１又は２以上の標準試料について得られる１又は２以上の対応する比と比較するステップを含む。
【００４３】
上述した診断法において、データを定量するステップは、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析、飛行時間、オービトラップ（Orbitrap）、四重極又は三連四重極質量分析計を使用して得ることができる。タンデム質量分析、ＮＭＲ又は酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ，enzyme-linked immunosorbent assay）法を包含するがこれらに限定されない、分析物を定量化する他の方法を使用してもよい。加えて、試料は、対象由来のいかなる生物試料であってもよく、好ましくは、血液試料、血清試料、脳脊髄液試料等である。さらに、正確な質量強度は、本明細書において記載されている通りの抽出法によって、例えば、非極性代謝産物を有機溶媒に溶解し、極性代謝産物を水性溶媒に溶解する液液抽出を試料に対して実施することによって得られた試料内のイオン化された代謝産物を表す。この手法で、ポジティブエレクトロスプレーイオン化、ネガティブエレクトロスプレーイオン化、ポジティブ大気圧化学イオン化、ネガティブ大気圧化学イオン化、又はこれらの方法の組合せ等のイオン化法を使用して、抽出された試料のイオン化から正確な質量強度を得ることができる。
【００４４】
本明細書において参照される通りの標準試料は、１又は２以上の標準試料を包含し得、試験される疾患又は状態に基づいて選択されることになる。例えば、対象のＣＲＣ健康状態若しくは健康状態における変化を試験する場合、又は患者におけるＣＲＣ若しくはＣＲＣのリスクを診断するためには、１又は２以上の標準試料は、ＣＲＣと診断されておらず、且つ／又はＣＲＣに関連する生理学的状態を呈さない１又は２以上の健常な個体由来のものとする。ｈＰＤＤについて対象を試験する場合、１又は２以上の標準試料は、ｈＰＤＤと診断されておらず、一般集団のレベルと一致するｈＰＵＬＣＦＡレベルを有し、且つ／又はｈＰＤＤに関連する生理学的状態を呈さない１又は２以上の健常な個体由来のものとする。炎症又は炎症性疾患を診断する方法のためには、１又は２以上の標準試料は、炎症とも炎症性疾患とも診断されておらず、且つ／又は炎症若しくは炎症性疾患に関連する生理学的状態を呈さない１又は２以上の健常な個体由来のものとする。他方で、抗炎症薬の効果をモニターする場合、１又は２以上の標準試料は、抗炎症薬の投与又はそれを用いる治療前に採取された同対象由来の試料であってよく、又は、代替として、炎症及び／若しくは炎症性状態若しくは疾患を有さないと診断される、又はそれらの生理学的兆候を呈さない１又は２以上の健常な個体由来の試料であってよい。
【００４５】
本明細書において、下記化合物も提供される。
【００４６】
【化３】
2013500275.tif 000005
【００４７】
そのような化合物は、化合物Ｄ０４６−１２４：
【００４８】
【化４】
2013500275.tif 000006
(D046-124)
【００４９】
の合成における中間体として特に有用である。
【００５０】
（ｉ）式（II）の化合物：
【化５】
2013500275.tif 000007
(II)
と式（III）の化合物：
【化６】
2013500275.tif 000008
(III)
とを、式（IV）の化合物：
【化７】
2013500275.tif 000009
(IV)
を生成するための条件下で反応させるステップと、
（ii）ＴＢＤＰＳ基を除去して式（Ｖ）の化合物：
【化８】
2013500275.tif 000010
(V)
を生成するステップと、
（iii）式（Ｖ）の化合物と式（VI）の化合物：
【化９】
2013500275.tif 000011
(VI)
とを、式（VII）の化合物：
【化１０】
2013500275.tif 000012
(VII)
を生成するための条件下で反応させるステップと、
（iv）式（VII）の化合物と触媒とを、式（VIII）の化合物：
【化１１】
2013500275.tif 000013
(VIII)
を生成するための条件下で反応させるステップと、
（ｖ）式（VIII）の化合物の末端エステル官能基を加水分解してカルボン酸基とし、それによって表題化合物を生成するステップと
を含む、化合物Ｄ０４６−１２４を調製するための方法も、本明細書において提供される。
【００５１】
上記の方法は、化合物Ｄ０４６−１２４を単離するための１又は２以上の精製ステップをさらに含み得る。加えて、式（VII）の化合物を、ある特定の非限定的な実施形態では、上記のステップ（iv）において、Ｐｄ触媒の存在下、炭酸カルシウムと１気圧の水素下で反応させて、三重結合を二重結合へ選択的に変換し、それによって式（VIII）の化合物を生成し得る。
【００５２】
当業者であれば、日常的実験を超えるものは使用せずに、本明細書において記載されている通りの具体的手順の数々の等価物を認識し又は見極めることができるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内であるとみなされ、下記請求項によって網羅される。
【００５３】
本発明のこれら及び他の特色は、下記の図を参照する下記の記述から、より明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】研究設計図である。研究は、３つの相：３つの独立な試料セットにおけるＦＴＩＣＲ−ＭＳメタボロミック発見、ｈＰＵＬＣＦＡとしての代謝バイオマーカーの構造研究及び決定、並びに三連四重極ＭＲＭ標的アッセイを使用するバリデーションを含むものであった。
【図２】３つの独立な研究における、ＣＲＣと健常な患者の血清との間の平均試料ピーク強度倍数変化の散布図である。すべての対象の試料特異的なピークを、ｌｏｇ２で正規化して対照集団の平均値とし、質量（Ｄａ）に従ってプロットした。対応のないStudentのｔ−検定に基づく有意性に従って点を着色する（説明文を参照）。（Ａ）ＧＣＩ社製発見集団、（Ｂ）Seracare社製１発見集団、（Ｃ）大阪発見集団。灰色の枠で囲まれた領域は、３つすべてのコホートにおける対照と比較した、ＣＲＣ患者において一貫して低減する４４０〜６００Ｄａの質量のクラスターを表す。
【図３】病期ごとの代謝産物４４６及び４４８の相対強度並びに各発見データセットについてのＡＵＣを示す図である。（Ａ）各試料セットにおける相対強度対病期の棒グラフ、（Ｂ）代謝産物４４６及び４４８についての病期と対照とのＰ値比較の概要、（Ｃ）マーカー４４６及び４４８、並びに各発見セットにおけるすべてのＣＲＣ対すべての対照に基づくＲＯＣ分析。
【図４】健常な対象及びＣＲＣ患者由来の血清の抽出質量スペクトルである。ＧＣＩ社製発見セットの５つの代表的なＣＲＣ及び５つの対照試料からの抽出物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，high performance liquid chromatography）、続いて、ＡＰＣＩネガティブモードのApplied Biosystems社製QSTAR XL（商標）質量分析計でのフルスキャン検出に供した。１６〜１８分で溶離する質量範囲１００〜７００Ｄａ内のすべてのイオンの平均強度を、各コホートについて示す。枠で囲まれた領域は、健常な患者には存在するがＣＲＣ陽性血清には存在しないスペクトルの特色を指示している。
【図５】Seracare社製２バリデーション試料セットの三連四重極ＭＲＭ分析の結果を示す図である。（Ａ）無症候性対照及び前治療ＣＲＣ患者において１３Ｃ−コール酸等価物として発現するｈＰＵＬＣＦＡ４４６、４４８及び４５０の濃度の散布図、（Ｂ）（Ａ）における対応する散布図に基づくＲＯＣ分析。灰色の点線は、９５％信頼区間を指示している。（Ｃ）病期ごとのｈＰＵＬＣＦＡの平均濃度当量の棒グラフ。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。（Ｄ）病期ごとのＲＯＣ分析。
【図６】Chiba検証試料セットの三連四重極ＭＲＭ分析の結果を示す図である。（Ａ）無症候性対照及び前治療ＣＲＣ患者において１３Ｃ−コール酸等価物として発現するｈＰＵＬＣＦＡ４４６、４４８及び４５０の濃度の散布図、（Ｂ）（Ａ）における対応する散布図に基づくＲＯＣ分析。灰色の点線は、９５％信頼区間を指示している。（Ｃ）病期ごとのｈＰＵＬＣＦＡの平均濃度当量の棒グラフ。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。（Ｄ）病期ごとのＲＯＣ分析。
【図７】バイオマーカーｍ／ｚ４４６のＭＳ／ＭＳスペクトル図である。
【図８】バイオマーカーｍ／ｚ４４８のＭＳ／ＭＳスペクトル図である。
【図９】バイオマーカーｍ／ｚ４５０のＭＳ／ＭＳスペクトル図である。
【図１０】バイオマーカーｍ／ｚ４６４のＭＳ／ＭＳスペクトル図である。
【図１１】バイオマーカーｍ／ｚ４６６のＭＳ／ＭＳスペクトル図である。
【図１２】バイオマーカーｍ／ｚ４６８のＭＳ／ＭＳスペクトル図である。
【図１３】ヒト血清からｈＰＵＬＣＦＡ富化画分を得るための精製過程を示す図である。血清の乾燥有機抽出物を、水／アセトニトリル溶媒ステップ勾配を使用する逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーによって初期精製して、半精製ｈＰＵＬＣＦＡ富化画分（Ｆ９）を得た。Ｆ９のいくつかを、ヘキサン／クロロホルム／メタノール溶媒ステップ勾配を使用する順相フラッシュカラムクロマトグラフィーによる二次精製ステップのために合わせて、高度ｈＰＵＬＣＦＡ富化画分７（Ｆ７＿２）を得た。
【図１４】逆相カラム上で血清抽出物を分画した後に得られる脂肪酸と結腸直腸がんバイオマーカーとの混合物を含有する第Ｉ期画分９（Ｆ９）のＬＣ／ＭＳスペクトル図である。
【図１５】ＣＲＣバイオマーカー中におよそ６５％の富化度を含有する第II期画分７（Ｆ７）のＬＣ／ＭＳスペクトル図である。
【図１６】未精製ヒト血清抽出物の全イオンクロマトグラム（Ａ）、すべてのイオンの抽出質量スペクトル（Ｂ）、及び４４０〜５２０Ｄａのイオンの抽出質量スペクトル（Ｃ）図である。
【図１７】本明細書において記載されている富化手順後のヒトｈＰＵＬＣＦＡ陰性血清抽出物の全イオンクロマトグラム（Ａ）、抽出質量スペクトル（Ｂ）図である。ｈＰＵＬＣＦＡは存在しない。
【図１８】本明細書において記載されている富化手順後のヒトｈＰＵＬＣＦＡ陽性血清抽出物の全イオンクロマトグラム（Ａ）、抽出質量スペクトル（Ｂ）図である。ｈＰＵＬＣＦＡは、４４０〜６００Ｄａで存在する。
【図１９】可変用量の全血清抽出物（図１６に示す通り）で４８時間処理したＳＷ６２０結腸がん細胞の細胞増殖アッセイを示す図である。
【図２０】ｈＰＵＣＬＦＡ富化抽出物で処理した細胞の明視野検査を示す図である。ｈＰＵＬＣＦＡを富化（ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ）又は枯渇（ｈＰＵＬＣＦＡ−ｖｅ）させた８０ｕｇ／ｍｌの半精製抽出物、ビヒクル又は１ｕＭのドキソルビシンでＭＣＦ−７細胞を２４時間処理し、倒立光学顕微鏡で撮像した。細胞の拡大を各パネルの左上に示す。細胞生存性及び形態学に対するｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ処理（左下）の有意な効果は、他の処理と比較して顕著である。
【図２１】ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ及び−ｖｅ抽出物（８０ｕｇ／ｍｌ）による処理後のカスパーゼ媒介性アポトーシス促進性ポリ−ＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ，Poly-ADP-Ribose Polymerase）開裂断片について、ＭＣＦ７細胞溶解物のウエスタン（免疫ブロット）を示す図である。
【図２２】８０ｕｇ／ｍｌのｈＰＵＣＬＦＡ陽性、ｈＰＵＬＣＦＡ陰性及びビヒクルによる、１２、２４及び４８時間の処理後のＳＷ６２０結腸がん細胞の細胞増殖率を示す図である。
【図２３】ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ及び−ｖｅ抽出物（８０ｕｇ／ｍｌ）による処理後のカスパーゼ媒介性アポトーシス促進性ポリ−ＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）開裂断片について、ＳＷ６２０細胞溶解物のウエスタン（免疫ブロット）を示す図である。
【図２４】ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ及び−ｖｅ抽出物（８０ｕｇ／ｍｌ）による処理後の炎症促進性転写因子ＮＦκＢについて、ＳＷ６２０細胞溶解物のウエスタン（免疫ブロット）を示す図である。
【図２５】ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ及び−ｖｅ抽出物（８０ｕｇ／ｍｌ）による処理後のＮＦκＢ陰性調節タンパク質ＩκＢαについて、ＳＷ６２０細胞溶解物のウエスタン（免疫ブロット）を示す図である。
【図２６】ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ及び−ｖｅ抽出物（８０ｕｇ／ｍｌ）による処理後の誘導型一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ又はＮＯＳ２）について、ＳＷ６２０細胞溶解物のウエスタン（免疫ブロット）を示す図である。
【図２７】Griess試薬系を使用する、ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ及び−ｖｅ抽出物（８０ｕｇ／ｍｌ）によるＳＷ６２０細胞の処理後の、馴化培地中における一酸化窒素生成の指標としての亜硝酸塩のレベルを示す図である。
【図２８】ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ及び−ｖｅ抽出物による１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激ＲＡＷ２９３マクロファージ細胞の前処理後の、定量的リアルタイムｒｔＰＣＲに基づく相対的なＴＮＦα  ｍＲＮＡ転写レベルを示す図である。三角形は、２０、４０及び８０ｕｇ／ｍｌの漸増用量を表す。＊ｐ＜０．０５対＋ＬＰＳ処理単独。
【図２９】ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ及び−ｖｅ抽出物（８０ｕｇ／ｍｌ）による１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激ＲＡＷ２９３マクロファージ細胞の前処理後の、ＥＬＩＳＡによって決定した際の相対的なＴＮＦα細胞溶解物タンパク質レベルを示す図である。＊ｐ＜０．０５対＋ＬＰＳ処理単独。
【図３０】ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ及び−ｖｅ抽出物（８０ｕｇ／ｍｌ）による１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激ＲＡＷ２９３マクロファージ細胞の前処理後の、ＥＬＩＳＡによって決定した際の馴化培地中における相対的なＴＮＦαタンパク質レベルを示す図である。＊ｐ＜０．０５対＋ＬＰＳ処理単独。
【図３１】ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ及び−ｖｅ抽出物による１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激ＲＡＷ２９３マクロファージ細胞の前処理後の、定量的リアルタイムｒｔＰＣＲに基づく相対的なｉＮＯＳ  ｍＲＮＡ転写レベルを示す図である。三角形は、２０、４０及び８０ｕｇ／ｍｌの漸増用量を表す。＊ｐ＜０．０５対＋ＬＰＳ処理単独。
【図３２】ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ及び−ｖｅ抽出物（８０ｕｇ／ｍｌ）による１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激ＲＡＷ２９３マクロファージ細胞の前処理後の、ウエスタンブロット法によって決定した際の細胞溶解物中における相対的なｉＮＯＳタンパク質レベルを示す図である。ｎｓ、非特異的。
【図３３】Griess試薬系を使用する、ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ及び−ｖｅ抽出物（８０ｕｇ／ｍｌ）による１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激ＲＡＷ２９３マクロファージ細胞の処理後の、馴化培地中における一酸化窒素生成の指標としての亜硝酸塩の相対的レベルを示す図である。＊ｐ＜０．０５対＋ＬＰＳ処理単独。
【図３４】ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ及び−ｖｅ抽出物による１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激ＲＡＷ２９３マクロファージ細胞の前処理後の、定量的リアルタイムｒｔＰＣＲに基づく相対的なＣＯＸ２  ｍＲＮＡ転写レベルを示す図である。三角形は、２０、４０及び８０ｕｇ／ｍｌの漸増用量を表す。＊ｐ＜０．０５対＋ＬＰＳ処理単独。
【図３５】ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ及び−ｖｅ抽出物による１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激ＲＡＷ２９３マクロファージ細胞の前処理後の、定量的リアルタイムｒｔＰＣＲに基づく相対的なＩＬ−１β  ｍＲＮＡ転写レベルを示す図である。三角形は、２０、４０及び８０ｕｇ／ｍｌの漸増用量を表す。＊ｐ＜０．０５対＋ＬＰＳ処理単独。
【図３６】ｈＰＵＬＣＦＡ＋ｖｅ及び−ｖｅ抽出物（８０ｕｇ／ｍｌ）による１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激ＲＡＷ２９３マクロファージ細胞の前処理後の、ＥＬＩＳＡによって決定した際の細胞溶解物中における相対的なＩＬ−１βタンパク質レベルを示す図である。＊ｐ＜０．０５対＋ＬＰＳ処理単独。
【図３７】種々の濃度の純粋な合成ｈＰＵＬＣＦＡ  Ｄ０４６−１２４による１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激ＲＡＷ２９３マクロファージ細胞の前処理後の、定量的リアルタイムｒｔＰＣＲによって決定した際の相対的なＴＮＦα転写レベルを示す図である。＊ｐ＜０．０５対＋ＬＰＳ処理単独。
【図３８】０．５及び１ｍＭの純粋合成ｈＰＵＬＣＦＡ  Ｄ０４６−１２４による１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激ＲＡＷ２９３マクロファージ細胞の前処理後の、ＥＬＩＳＡによって決定した際の馴化培地中における相対的なＴＮＦαタンパク質レベルを示す図である。
【図３９】種々の濃度の純粋な合成ｈＰＵＬＣＦＡ  Ｄ０４６−１２４による１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激ＲＡＷ２９３マクロファージ細胞の前処理後の、定量的リアルタイムｒｔＰＣＲによって決定した際の相対的なｉＮＯＳ転写レベルを示す図である。＊ｐ＜０．０５対＋ＬＰＳ処理単独。
【図４０】種々の濃度の純粋な合成ｈＰＵＬＣＦＡ  Ｄ０４６−１２４による１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激ＲＡＷ２９３マクロファージ細胞の処理後の、馴化培地中における一酸化窒素生成の指標としての亜硝酸塩の相対的レベルを示す図である。＊ｐ＜０．０５対＋ＬＰＳ処理単独。
【図４１】種々の濃度の純粋な合成ｈＰＵＬＣＦＡ  Ｄ０４６−１２４による１ｕｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激ＲＡＷ２９３マクロファージ細胞の前処理後の、ＥＬＩＳＡによって決定した際の馴化培地中における相対的なＩＬ−１βタンパク質レベルを示す図である。＊ｐ＜０．０５対＋ＬＰＳ処理単独。
【図４２】６つのｈＰＵＬＣＦＡに対するSeracare社製前治療ＮＳＡＩＤ効果を示す図である。
【図４３】６つのｈＰＵＬＣＦＡに対するBioserve社製前治療ＮＳＡＩＤ効果を示す図である。
【図４４】ＬＰＳ誘導後のｈＰＵＬＣＦＡ陽性抽出物におけるＴＮＦ−アルファレベルの低減を示す図である。
【図４５】ｈＰＵＬＣＦＡ陽性抽出物におけるＬＰＳ誘導性一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ２，LPS-induced nitric oxide synthase）の低減を示す図である。トップペイン；ウエスタンブロッティング分析、ボトムペイン：Ponceau S染色ゲル。
【図４６】ｈＰＵＬＣＦＡ陽性抽出物で処理した細胞の馴化培地中における亜硝酸塩レベルの用量依存的低減を示す図である。
【図４７】化合物２のＮＭＲスペクトル図である。
【図４８】化合物２のＮＭＲスペクトル図である。
【図４９】化合物３のＮＭＲスペクトル図である。
【図５０】化合物４のＮＭＲスペクトル図である。
【図５１】化合物５のＮＭＲスペクトル図である。
【図５２】化合物６のＮＭＲスペクトル図である。
【図５３】化合物７のＮＭＲスペクトル図である。
【図５４】化合物７のＬＣクロマトグラフ図である。
【図５５】化合物７のＭＳスペクトル図である。
【図５６】断片ＡのＮＭＲスペクトル図である。
【図５７】断片ＡのＬＣクロマトグラフ図である。
【図５８】断片ＡのＭＳスペクトル図である。
【図５９】化合物９のＮＭＲスペクトル図である。
【図６０】化合物９のＮＭＲスペクトル図である。
【図６１】化合物９のＭＳスペクトル図である。
【図６２】断片ＢのＩＲ吸収スペクトル図である。
【図６３】断片ＢのＮＭＲスペクトル図である。
【図６４】断片ＢのＭＳスペクトル図である。
【図６５】化合物１１のＮＭＲスペクトル図である。
【図６６】化合物１１のＮＭＲスペクトル図である。
【図６７】化合物１２のＮＭＲスペクトル図である。
【図６８】化合物１２のＬＣクロマトグラフ図である。
【図６９】化合物１２のＭＳスペクトル図である。
【図７０】化合物１３のＮＭＲスペクトル図である。
【図７１】化合物１３のＬＣクロマトグラフ図である。
【図７２】化合物１３のＭＳスペクトル図である。
【図７３】断片ＣのＮＭＲスペクトル図である。
【図７４】断片ＣのＮＭＲスペクトル図である。
【図７５】断片ＣのＬＣクロマトグラフ図である。
【図７６】断片ＣのＭＳスペクトル図である。
【図７７】化合物１５のＮＭＲスペクトル図である。
【図７８】化合物１５のＬＣクロマトグラフ図である。
【図７９】化合物１５のＭＳスペクトル図である。
【図８０】化合物１６のＮＭＲスペクトル図である。
【図８１】化合物１６のＮＭＲスペクトル図である。
【図８２】化合物１６のＭＳスペクトル図である。
【図８３】化合物１７のＮＭＲスペクトル図である。
【図８４】化合物１７のＬＣクロマトグラフ図である。
【図８５】化合物１７のＭＳスペクトル図である。
【図８６】化合物１８のＮＭＲスペクトル図である。
【図８７】化合物１８のＬＣクロマトグラフ図である。
【図８８】化合物１８のＭＳスペクトル図である。
【図８９】化合物Ｄ０４６−１２４（本明細書においては、ＧＶＫ−ＦＦＳ−０９−０６−ＰＨＭとも称する）のＬＣクロマトグラフ図である。
【図９０】化合物Ｄ０４６−１２４のＭＳスペクトル図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
これまで、結腸直腸がん（ＣＲＣ）の初期リスクを検出するための正確な血清マーカーはなかった。この必要性に対処するために、質量分析ベースの発見プラットフォームを使用して、治療未経験のＣＲＣ患者の血清メタボローム内の代謝バイオマーカーを同定した。「非標的」アプローチは、新規化合物を検出するという利点を有し、したがって、バイオマーカー駆動型アプローチに理想的に適していた。質量分析ベースの発見プラットフォームの使用は、三連四重多重反応モニタリング（ＴＱ−ＭＲＭ，triple-quadruple multiple-reaction-monitoring）に基づく定量的診断法に容易に移行されるという追加の利点も有する。
【００５６】
バイオマーカー発見は、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）を使用して実施した。異なる大陸からの３つの独立な集団由来のＣＲＣ患者及び対照（米国及び日本；総ｎ=２２２）の包括的な代謝プロファイルを得、研究間の最良バイオマーカーを決定した。これら及び関係するマーカーの構造的特徴付けは、ＭＳ／ＭＳ及びＮＭＲ技術を使用して実施した。商業的な臨床的有用性評価は、米国及び日本（総ｎ＝２２０）からの２つのさらなる独立な集団由来の３つのバイオマーカーについて、標的化ハイスループット三連四重極ＭＲＭ（ＴＱ−ＭＲＭ，triple-quadrupoleＭＲＭ）法を使用して実施した。
【００５７】
これらの包括的なメタボロミクス分析は、対照と比べて、ＣＲＣ患者試料の３つの独立なコホートすべてにおけるＣ２８−Ｃ３６水酸化多価不飽和超長鎖脂肪酸（ｈＰＵＬＣＦＡ）のレベルの有意な低減を明らかにした。Ｃ２８分子についての構造解明研究は、２つのヒドロキシル置換（４４６、４４８及び４５０）又は３つのヒドロキシル置換（４６４、４６６及び４６８）のいずれかを持つ２つのファミリー、並びに可変不飽和度を明らかにした。ＴＱ−ＭＲＭ法は、２つのさらなる独立な研究において、ＦＴＭＳ結果を首尾よく再現した。合計で、２つの大陸域にわたって５つの独立な集団（ＦＴＩＣＲ−ＭＳによって３つ、及びＴＱ−ＭＲＭによって２つ）のうちの２つのバイオマーカーを評価した。生じた１０の受信者動作特性曲線ＡＵＣは、０．８５〜０．９８の範囲であった（平均＝０．９１±０．０４）。
【００５８】
今まで未知であったこれらの代謝産物の全身性代謝調節異常は、ＣＲＣの存在に高度に関連していることが分かった。代謝産物は血清等の生物試料中で計測可能であり、それらの濃度の減少は、人種的又は地理的バックグラウンドにかかわらず、ＣＲＣの存在に感受性が高く且つ特異的である。したがって、これらの代謝産物の計測は、ＣＲＣの早期検出及びスクリーニングのための有用なツールを提供する。
【００５９】
有用なＣＲＣバイオマーカーであることに加えて、本明細書において記載されているｈＰＵＬＣＦＡは細胞増殖を低減させ、アポトーシス促進において役割を果たすことが示されている。ｈＰＵＬＣＦＡは、ＮＦκＢ、ＩκＢα、ＮＯＳ２、ＣＯＸ２、ＴＮＦ−アルファ及びＳＯＤを包含する一連の炎症性タンパク質を使用する調査を介して、並びに馴化細胞の培地中における亜硝酸塩レベルを計測することによって実証される通り、抗炎症活性も有する。抗炎症活性は、ＣＲＣ及びＮＳＡＩＤを摂取している健常な対象の臨床試験を介しても実証され、これにより、ＮＳＡＩＤの使用は、欠損対象におけるｈＰＵＬＣＦＡレベルの増加をもたらした。
【００６０】
全体からみると、本発明者らは、以下でさらに詳細に論じる治療的及び診断的用途における、記載したｈＰＵＬＣＦＡの使用に幅広い裏付けを提供した。
【００６１】
したがって、本明細書において、式（Ｉ）による化合物：
【００６２】
【化１２】
2013500275.tif 000014
(I)
【００６３】
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、該鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］
が提供される。
【００６４】
上記の式（Ｉ）において、Ｒは、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９及び４０を包含する、２４〜４０の任意の数のＣ原子を含有するＣ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を包含し得る。好ましくは、炭化水素鎖は、Ｃ２８−Ｃ３６脂肪族基、とりわけＣ２８脂肪族基である。直鎖脂肪族基が意味するのは、本明細書において使用される場合、例えばオレフィン基又はアルケニル基としての開鎖飽和炭化水素である。ヒドロキシ置換が意味するのは、本明細書において使用される場合、化合物が、炭化水素鎖中の１又は２以上の水素原子と置き換えて、１又は２以上のヒドロキシ置換基を有し得ることである。
【００６５】
上記で述べた通り、Ｒの炭化水素鎖中の少なくとも１個の炭素はヒドロキシ（ＯＨ）基で置換されている。鎖中のＯＨ置換の数は、脂肪アシル鎖の長さに沿って、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０を包含する１〜１０個の任意の数のＯＨ置換基であってよい。しかしながら、いくつかの実施形態においては、より少ないＯＨ置換基、例えば１〜４、とりわけ２又は３個のＯＨ置換基があるのが好ましい場合がある。アシル鎖の長さに沿ったこれらのＯＨ置換基の位置付けは、炭素Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、又はより長い鎖ではＣ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ３１、Ｃ３２、Ｃ３３、Ｃ３４、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ３７、Ｃ３８、Ｃ３９、Ｃ３０及びそれらの組合せを包含する等、変動し得る。
【００６６】
上記の化合物中の二重結合の数は、概して、脂肪アシル鎖の長さによって決まることになり、したがって、Ｃ原子の数によって限定される。故に、二重結合の数は、アシル鎖の長さに沿って可変的に位置付けられた、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０、より好ましくは３〜６個の二重結合となり得る。
【００６７】
上記の化合物は天然源から単離してよく、又は化学的に合成してもよい。化合物は、生体工学アプローチを介して、例えば、化合物を合成するために必要とされる代謝酵素を含有する遺伝子組み換え細菌又は哺乳類細胞培養物（又はバイオリアクター）の使用によって生成されてもよい。
【００６８】
記載した化合物は、許容される担体若しくは賦形剤と一緒に、又は医薬組合せの一部として１若しくは２以上の別々の活性剤若しくは薬物と一緒に、医薬組成物において提供されてもよい。加えて、医薬組成物は、他の薬物又は医薬組成物を用いる治療計画において、別々に、又は合わせた製剤若しくは組合せでのいずれかで投与され得る。
【００６９】
本明細書において、式（Ｉ）の化合物の組合せも提供される。そのような組合せは、組合せ又は混合物中の種々の化合物の相乗効果又は相加効果によりとりわけ有用となり得る。
【００７０】
加えて、式（Ｉ）の化合物又はそれを含む組合せは、補給剤、栄養補助食品として調製され得るか、又は健康上の利益のある機能性食品に調製され得る。
【００７１】
本発明の組成物は、好ましくは、それを必要とする対象、好ましくはヒトへの投与のために薬学的に許容されるビヒクルとともに製剤化される。そのような組成物の製剤化の方法は当技術分野において周知であり、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985等の標準的な参考テキストにおいて教示されている。本発明の組成物は、単一の化合物又はその組合せを含み得る。
【００７２】
本発明の組成物は、単独で、又は第二の薬物若しくは作用物質と組み合わせて投与され得る。
【００７３】
本発明において有用であると予想される製剤、例えば静脈内製剤を包含する注射製剤は、滅菌水溶液（水溶性である場合）又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を包含し得るがこれらに限定されない。すべての事例において、組成物は滅菌でなくてはならず、平易なシリンジ注入性（syringability）がある程度に流体でなくてはならない。該組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなくてはならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から守られなくてはならない。ビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、及び油（例えば植物油）を含有する溶媒又は分散媒体であってよい。適正な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の事例においては必要とされる粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。
【００７４】
微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成できる。いくつかの事例においては、等張剤、例えば、砂糖、塩化ナトリウム、又はマンニトール及びソルビトール等の多価アルコールを組成物中に包含することが好ましいであろう。注射組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを組成物中に包含することによって実現され得る。
【００７５】
滅菌注射溶液は、上記で列挙した成分の１つ又はその組合せを必要に応じて加えた適切な溶媒に、本発明の組成物を必要とされる量で組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製できる。概して、分散液は、塩基性分散媒体及び上記で列挙したものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、本発明の組成物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、本発明の化合物の粉末、及び場合により予め滅菌濾過したその溶液から任意の追加の望ましい成分を生み出す真空乾燥及び凍結乾燥である。
【００７６】
本発明の化合物の経口投与のための固体剤形は、摂取可能なカプセル剤、錠剤、丸剤、ロリポップ剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤、舌下又は口腔錠、トローチ剤等を包含するがこれらに限定されない。そのような固体剤形において、化合物は、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容される賦形剤若しくは希釈剤又はクエン酸ナトリウム若しくは第二リン酸カルシウム等の同化可能な食用担体、及び／又はａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及びケイ酸等の充填剤若しくは増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及びアカシア等の結合剤、ｃ）グリセロール等の保湿剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、バレイショ若しくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケート、及び炭酸ナトリウム等の崩壊剤、ｅ）パラフィン等の溶液遅延剤、ｆ）第四級アンモニウム化合物等の吸収促進剤、ｇ）例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレート等の湿潤剤、ｈ）カオリン及びベントナイト粘土等の吸収剤、並びにｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物等の滑沢剤と混合されるか、或いは対象の食事に直接組み込まれる。カプセル剤、錠剤及び丸剤の事例において、剤形は、緩衝剤も含み得る。ラクトース又は乳糖及び高分子量ポリエチレングリコール等の賦形剤を使用する軟及び硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として、同様の種類の固体組成物を用いてもよい。組成物及び調製物中における本発明の化合物のパーセンテージは、当然ながら変動し得る。そのような治療上有用な組成物中における化合物の量は、適切な投薬量が得られるようなものである。
【００７７】
錠剤、糖衣丸、カプセル剤、丸剤及び顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング及び医薬製剤化分野において周知である他のコーティング等、コーティング及び外皮を用いて調製され得る。該剤形は、乳白剤を含有していてもよく、本発明の化合物（複数可）のみを、又は優先的に、腸管のある特定の部分において、場合により遅延方式で放出する組成物のものであってもよい。使用され得る包埋組成物の例は、ポリマー性物質及びワックスを包含する。組成物は、適切ならば、上記で言及した賦形剤の１又は２以上を加えた、マイクロカプセル化形態のものであってもよい。
【００７８】
経口投与用の液体剤形は、薬学的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤及びエリキシル剤を包含する。本発明の化合物に加えて、液体剤形は、例えば、水、又は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実、ラッカセイ、コーン、胚芽、オリーブ、ヒマシ及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物等の他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤等、当技術分野において一般に使用される不活性希釈剤を含有し得る。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化及び懸濁化剤、甘味、香味及び着香剤等のアジュバントも包含し得る。
【００７９】
懸濁剤は、本発明の化合物に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカント、並びにそれらの混合物等の懸濁化剤を含有し得る。
【００８０】
したがって、本発明の組成物は、疾患を治療及び／又は予防するために、対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与され得る。組成物は、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、局所、皮下、直腸内、経皮、舌下、口腔内、鼻腔内又は吸入を介してを包含するがこれらに限定されない種々の経路によって投与され得る。投与の製剤及び経路並びに投与の用量及び頻度は、治療されている状態の重症度、並びに年齢、体重等の患者特異的要因に基づいて、当業者により日常的に選択され得る。
【００８１】
当業者であれば、Mordenti, Man versus Beast: Pharmacokinetic Scaling in Mammals, 1028, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 75, No. 11, November 1986において論じられている通り、種間薬物動力学的スケーリングを使用して、種の間の薬物の体内動態における根底にある（underlining）類似性（及び差異）を研究すること、未試験の種における薬物の体内動態を予測すること、種々の種における薬物動力学的等価物を定義すること、並びに実験的動物モデルのための投薬レジメンを設計することができると認識する。
【００８２】
上記の化合物及び組成物は、炎症及びがん等の炎症に関係する障害の治療に使用され得る。例えば、式（Ｉ）の化合物又はそのような化合物を含む組成物は、ＣＲＣと診断される、又はＣＲＣを有すると疑われる対象に、該疾患を治療、予防又は緩和するのに十分な量で投与され得る。式（Ｉ）の化合物を使用して、ＩＢＤ、クローン病及び結腸炎等の他の非悪性ＧＩ障害を治療又は予防することもできる。
【００８３】
化合物及び組成物は、例えば、炎症及びがん等の炎症に関係する障害を予防するためのレジメンにおいて、対象に式（Ｉ）の化合物を投与することによる、予防法においても有用となり得る。
【００８４】
化合物及び組成物は、ｈＰＵＬＣＦＡ欠乏障害（ｈＰＤＤ）とも称される、ｈＰＵＬＣＦＡが欠乏している対象の同定及び診断方法においても使用され得る。そのような対象は、炎症のリスクの上昇、急性炎症を十分に消散できないというリスク、及び／又は炎症に関連する病状を有し得る。同様に、化合物及び組成物を使用して、対象においてｈＰＤＤを治療することもでき、ここで、式（Ｉ）の化合物又は該化合物を含む組成物は、対象においてｈＰＤＤを寛解させるのに十分な量で投与される。
【００８５】
１又は２以上の式（Ｉ）の化合物は、炎症のマーカーとして、及び抗炎症薬の効果をモニターするためにも使用され得る。
【００８６】
上記の方法において使用される生物試料は、例えば、血液（血清／血漿）、脳脊髄液（ＣＳＦ，cerebral spinal fluid）、尿、便、呼吸、唾液、又は、腫瘍、隣接正常、平滑及び骨格筋、脂肪組織、肝臓、皮膚、毛髪、脳、腎臓、膵臓、肺、結腸、胃等を包含する任意の固形組織の生検であるがこれらに限定されない体内のいかなる場所を発生源とするものであってもよい。特に興味深いのは、血清又はＣＳＦである試料である。本明細書においては用語「血清」が使用されるが、当業者であれば、血漿又は全血若しくは全血の副画分を使用してよいことを認識するであろう。
【００８７】
血液試料を患者から抜き取る場合、試料を処理することができる若干の手法がある。処置の範囲は、ほとんどないに等しい（すなわち、凍結全血）か、又は特定の細胞型の単離と同じくらい複雑であってよい。最も一般的且つ日常的な手順は、全血由来の血清又は血漿いずれかの調製を伴う。濾紙又は他の固定材料（immobile materials）等、固相支持体への血液試料のスポッティングを包含するすべての血液試料処理法も、本発明によって企図されている。
【００８８】
次いで、上述した処理済みの血液試料をさらに処理して、処理済みの血清試料内に含有される生化学物質の検出及び計測において用いられる系統的分析技術と適合するようにした。処理の種類は、さらなる処理がほとんどないに等しいものから微分抽出及び化学誘導体化と同じくらい複雑なものまで多岐にわたり得る。抽出法は、メタノール、エタノール、アルコールと水との混合物、又は酢酸エチル若しくはヘキサン等の有機溶媒等、一般的な溶媒中での音波破砕、ソックスレー抽出、マイクロ波支援抽出（ＭＡＥ，microwave assisted extraction）、超臨界流体抽出（ＳＦＥ，supercritical fluid extraction）、加速溶媒抽出（ＡＳＥ，accelerated solvent extraction）、加圧液体抽出（ＰＬＥ，pressurized liquid extraction）、加圧温水抽出（ＰＨＷＥ，pressurized hot water extraction）及び／又は界面活性剤支援抽出（ＰＨＷＥ，surfactant assisted extraction）を包含し得る。ＨＴＳ分析のために代謝産物を抽出する好ましい方法は、非極性代謝産物を有機溶媒に溶解し、極性代謝産物を水性溶媒に溶解する液液抽出を実施することである。
【００８９】
試料を分析するステップは、質量分析計（ＭＳ，mass spectrometer）を使用して試料を分析することを含み得る。例えば、限定することを望まないが、そのような質量分析計は、ＦＴＭＳ、オービトラップ（Orbitrap）、飛行時間（ＴＯＦ，time of flight）又は四重極型のものであってよい。代替として、質量分析計には追加の前置検出器質量フィルターが装備されていてよい。例えば、限定することを望まないが、そのような機器は一般に、四重極ＦＴＭＳ（Ｑ−ＦＴＭＳ，quadrupole-FTMS）、四重極ＴＯＦ（Ｑ−ＴＯＦ，quadrupole-TOF）又は三連四重極（ＴＱ又はＱＱＱ，triple quadrupole）と称される。加えて、質量分析計は、親イオン検出モード（ＭＳ）又はＭＳｎモード（ここでｎは２以上である）のいずれかで操作され得る。ＭＳｎは、親イオンが衝突誘起解離（ＣＩＤ，collision induced dissociation）又は他の断片化手順によって断片化されて断片イオンを作成し、次いで前記断片の１又は２以上が質量分析計によって検出される状況を指す。次いで、そのような断片をさらに断片化して、さらなる断片を作成することができる。代替として、試料は、液体若しくはガスクロマトグラフシステムを使用して、又は直接注射によって質量分析計に導入されてもよい。
【００９０】
抽出された試料は、当技術分野において公知である任意の適切な方法を使用して分析され得る。例えば、何ら限定することを望まないが、生物試料の抽出物は、直接注射又はそれに続くクロマトグラフ分離のいずれかによって、本質的にいかなる質量分析プラットフォームでも分析を行いやすい。典型的な質量分析計は、試料内の分子をイオン化する源と、イオン化された分子又は分子の断片を検出するための検出器とから構成される。一般的な源の非限定的な例は、電子衝撃、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ，atmospheric pressure photo ionization）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ，matrix assisted laser desorption ionization）、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、及びそれらの派生物を包含する。一般的な質量分離及び検出システムは、四重極、四重極イオントラップ、線形イオントラップ、飛行時間（ＴＯＦ）、磁気セクター、イオンサイクロトロン（ＦＴＭＳ）、オービトラップ（Orbitrap）、並びにそれらの派生物及び組合せを包含し得る。他のＭＳベースのプラットフォームを上回るＦＴＭＳの利点は、１００分の１ダルトンだけ異なる代謝産物の分離を可能にするその高分解性能であり、これより低分解能の機器では多くが見逃されるであろう。
【００９１】
用語「代謝産物」が意味するのは、そのレベル又は強度が試料において計測され、病状を診断するためのマーカーとして使用され得る、特異的な小分子である。これらの小分子は、本明細書において、「代謝産物マーカー」、「代謝産物成分」、「バイオマーカー」又は「生化学マーカー」とも称され得る。
【００９２】
代謝産物は、概して、上記の方法において使用される質量分析技術によって計測した際の、それらの正確な質量によって特徴付けられる。正確な質量は、「正確な中性質量」又は「中性質量」とも称され得る。代謝産物の正確な質量は、本明細書においては、ダルトン（Ｄａ，Daltons）、又はそれと実質的に同等の質量で表示される。「それと実質的に同等の」が意味するのは、正確な質量における±５ｐｐｍの差異が、当業者によって認識されるであろうものと同じ代謝産物を指示することである。正確な質量は、中性代謝産物の質量として表示される。当業者によって認識されるであろう通り、試料の分析中に発生する代謝産物のイオン化、代謝産物は、１又は２以上の水素原子の損失又は獲得及び電子の損失又は獲得のいずれかを引き起こすことになる。これは、正確な質量を、イオン化中に損失若しくは獲得した水素（又は、ナトリウム、カリウム、アンモニア、及び当技術分野において公知の他のもの等の他の付加物）及び電子の質量分だけ正確な質量と異なる「イオン化された質量」に変化させる。別段の指定がない限り、本明細書においては正確な中性質量を参照する。
【００９３】
同様に、代謝産物をその分子式によって記述する場合、中性代謝産物の分子式を表示する。必然的に、イオン化された代謝産物の分子式は、イオン化中に損失又は獲得した水素（又は、ナトリウム、カリウム、アンモニア、及び当技術分野において公知の他のもの等の他の付加物）の数だけ中性分子式と異なることになる。
【００９４】
分析中にデータを収集し、１又は２以上の代謝産物について定量的データを得る。「定量的データ」は、試料中に存在する特異的な代謝産物のレベル又は強度を計測することによって得られる。
【００９５】
定量的データを、１又は２以上の標準試料由来の対応するデータと比較する。「標準試料」は、特定の病状又は状態に適切な任意の標準試料である。当業者によって理解されるであろう通り、定量的データとの比較に２以上の標準試料を使用してよい。
【００９６】
試料を分析するステップは、上述した通りであってよい。１又は２以上の標準試料は、対照個体から得られた第一の標準試料であってよい。「内部対照代謝産物」は、対象又は患者において自然に存在する内因性代謝産物を指す。病状又は状態によって変動しない任意の適切な内因性代謝産物は、内部対照代謝産物として使用され得る。
【００９７】
代謝産物マーカー対内部対照代謝産物の比の使用によって、本明細書において記載されている方法のある特定の実施形態において、代謝産物マーカーの絶対レベルの計測よりも安定且つ再現性のある計測を提供できる。内部対照代謝産物がすべての試料中に自然に存在し、且つ病状によって有意に変動しないように思われるため、試料間の可変性（取扱い、抽出等による）は最小化される。
【００９８】
定義
用語「有効量」は、例えば研究者又は臨床医が求めている組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を引き出す、化合物、薬物又は医薬品の量を意味する。さらに、用語「治療有効量」は、そのような量を受けていない対応する対象と比較した際に、疾患、障害若しくは副作用の治療、治癒、予防若しくは寛解の改善、又は疾患若しくは障害の進行速度の減少をもたらす任意の量を意味する。該用語は、その範囲内に、正常な生理学的機能を増強するために有効な量も包含する。
【００９９】
「ヒドロキシル」及び「ヒドロキシ」は、−ＯＨを指す。
【０１００】
「医薬品」又は「薬物」は、対象に適正に投与される場合、望ましい治療効果又は予防効果を誘導することができる化学化合物又は組成物を指す。
【０１０１】
すべての化学化合物は、（＋）及び（−）立体異性体の両方、並びに（＋）又は（−）立体異性体のいずれかを包含する。
【０１０２】
本明細書における他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1985)及びThe Condensed Chemical Dictionary (1981)によって例示される通り、当技術分野における従来の用法に従って使用される。
【０１０３】
下記の実施例において、本発明をさらに例証する。
［実施例］
【０１０４】
１．ＣＲＣ患者におけるｈＰＵＬＣＦＡの血清中レベルの低減
材料及び方法
患者試料選択
第一の発見プロジェクトに使用される臨床試料は、Genomics Collaborative, Inc.（ＧＣＩ）社から入手し、一方、第二の発見プロジェクト及び１つのバリデーションプロジェクトのための試料はSeracare Lifesciences社から入手した。これらの会社は、特に研究を目的とした血清及び組織試料の収集及び貯蔵を専門としている。標準化されたプロトコール及び操作手順を使用して、グローバルイニシアチブの一部としての医師団により、一貫した方式で試料を収集し、処理し、貯蔵した。すべての試料は適正に承認され、臨床プロトコールは倫理審査委員会によって認可された。発見及びバリデーションコホートの両方について、ＧＣＩ社及びSeracare社のバイオバンクからの患者試料選択のための試験対象患者基準は、外科手術、化学又は放射線療法を包含するあらゆる形態の治療の前に血清を採取することであった。すべての試料に、ＧＣＩ社及びSeracare社において認定された病理学者によって独立に検証された詳細な病理報告書が添付されていた。ＧＣＩ社製発見試料セットは、４０の前治療ＣＲＣ患者及び５０の対照由来の血清試料を包含し、Seracare社製発見セットは、２６の前治療ＣＲＣ及び２５の対照由来の試料を包含し、バリデーションSeracare社製セットは、７０の前治療ＣＲＣ及び７０の対照を包含していた。大阪医科大学によって提供された発見試料は、同学の標準的な収集プロトコールに従って事前に収集され、適正に承認された、４６の手術前ＣＲＣ患者及び３５の対照を包含していた。Chiba Japanバリデーション集団の試料は、４０の手術前ＣＲＣ患者及び４０の対照を包含しており、同じく倫理審査プロトコール及び適正な承認下で事前に収集された。病期分類を包含する集団の概要を表１に示す。すべての試料を無作為方式で処理及び分析し、分析後に結果を非盲検化した。
【０１０５】
【表１】
2013500275.tif 000015
【０１０６】
試料抽出
血清試料を分析のために解凍するまで−８０℃で貯蔵し、１度だけ解凍した。すべての抽出を氷上で実施した。ＦＴＩＣＲ−ＭＳ分析のために、最初に等体積の血清を１％アンモニア水溶液及び酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ，ethyl acetate）で順次に３回抽出することによって、血清試料を調製した。抽出の合間に、試料を４℃、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、有機層を除去し、新たなチューブに移した（抽出物Ａ）。第三のＥｔＯＡｃ抽出後、０．３３％ギ酸を添加し、続いてもう２回ＥｔＯＡｃ抽出を行った。最後の有機抽出の後、残った水性成分を水で２回さらに抽出し、３：１アセトニトリルでの沈殿によってタンパク質を除去した（抽出物Ｂ）。次いで、１：５比のＥｔＯＡｃ対ブタノール（ＢｕＯＨ）を窒素下で元のＢｕＯＨ出発体積に濃縮した（抽出物Ｃ）。すべての抽出物を、ＦＴＩＣＲ−ＭＳ分析まで−８０℃で貯蔵した。
【０１０７】
ＦＴＩＣＲ−ＭＳ分析
試料抽出物（画分Ｃ）を、ネガティブＥＳＩのためにメタノール：０．１％（ｖ／ｖ）アンモニア水溶液（５０：５０、ｖ／ｖ）中で１０倍希釈した。ＡＰＣＩのために、画分Ａ試料抽出物を希釈することなく直接注射した。分析はすべて、7.0Ｔ能動的遮蔽超電導磁石が装備されているBruker Daltonics APEX III FTICR-MS（Bruker Daltonics社製、Billerica、MA）で実施した。試料は、ＥＳＩ及びＡＰＣＩを使用して１時間当たり６００μＬの流速で直接注入した。セリン、テトラ−アラニン、レセルピン、Hewlett-Packard社製チューニングミックス及び副腎皮質刺激ホルモン断片４〜１０の標準ミックスを使用して、イオン移動／検出パラメーターを最適化した。加えて、機器製造業者の推奨に従って、イオン強度及び１００〜１０００ａｍｕの質量範囲にわたる広帯域蓄積を最適化するように機器条件を合わせた。上記で言及した基準物質の混合物を使用して、１００〜１０００ａｍｕの取得範囲にわたる質量精度の各試料スペクトルを内部較正した。線形最小二乗回帰線を使用してＦＴＩＣＲデータを分析し、各内部標準の質量ピークがその理論的質量と比較して１ＰＰＭ未満の質量誤差を有するように質量軸値を較正した。Bruker Daltonics Inc.社製XMASS（商標）ソフトウェアを使用して、１メガワードのデータファイルサイズを取得し、２メガワードにゼロ埋めした。SINmデータ変換は、フーリエ変換及び振幅算出の前に実施した。各分析からの質量スペクトルを統合し、各ピークの正確な質量及び絶対強度を含有するピークリストを作成した。１００〜１０００ｍ／ｚの範囲内の化合物を分析した。異なるイオン化モード及び極性にわたってデータを比較しまとめるために、水素付加物形成を想定して、検出されたすべての質量ピークをそれらの対応する中性質量に変換した。次いで、DISCOVAmetrics（商標）ソフトウェア（Phenomenome Discoveries Inc.社製、Saskatoon、SK、Canada）を使用して、自己生成した二次元（質量対試料強度）アレイを作成した。複数ファイルからのデータを統合し、次いで、この合わせたファイルを処理して、固有の質量をすべて決定した。各固有の質量の平均を決定し、ｙ軸に表した。各ファイルについて、分析するために初めに選択した各ファイルにカラムを作製し、ｘ軸に表した。次いで、選択されたファイルのそれぞれにおいて見られる各質量の強度を、その代表的なｘ，ｙ座標に入れた。強度値を含有しない座標は、ブランクのままとした。次いで、スペクトルのそれぞれをピーク選別して、検出されたすべての代謝産物の質量及び強度を得た。次いで、すべてのモード由来のデータを併合して、１試料当たり１つのデータファイルを作成した。９０すべての発見血清試料由来のデータを併合し、整列化して、各試料がカラムによって表され、各固有の代謝産物が単一の行によって表され、アレイ中の各セルが所与の試料の代謝産物強度に対応する、二次元代謝産物アレイを作成した。次いで、アレイ表を、「統計分析」において記載されている統計分析に使用した。
【０１０８】
フルスキャンＱ−ＴＯＦ及びＨＰＬＣ接続タンデム質量分析
５つのＣＲＣ及び５つの健常者試料由来の酢酸エチル抽出物を窒素ガス下で濃縮し、７０μＬのイソプロパノール：メタノール：ギ酸（１０：９０：０．１）中で再構成した。フルスキャン用には１０μＬ、ＭＳ／ＭＳ用には３０μＬの再構成した試料を、１ｍｌ／分の流速でＨＰＬＣ（HP 1100、Agilent Technologies社製  Hypersil（商標）  ＯＤＳ  ５μｍ、１２５×４ｍｍカラム）に供した。ＨＰＬＣからの溶離液を、ＡＰＣＩ源が装着されたABI社製QSTAR（登録商標）XL質量分析計を使用してネガティブモードで分析した。フルスキャンモードにおけるスキャン型は、蓄積時間１．００００秒、質量範囲５０〜１５００Ｄａ、及び継続時間５５分の飛行時間（ＴＯＦ）であった。ソースパラメーターは次の通りであった：イオン源ガス１（ＧＳ１，Ion source gas １）８０；イオン源ガス２（ＧＳ２，Ion source gas ２）１０；カーテンガス（ＣＵＲ，Curtain gas）３０；ネブライザー電流（ＮＣ，Nebulizer Current）−３．０；温度４００℃；クラスタ分離電位（ＤＰ，Declustering Potential）−６０；集束電圧（ＦＰ，Focusing Potential）−２６５；クラスタ分離電位２（ＤＰ２，Declustering Potential 2）−１５。ＭＳ／ＭＳモードにおいて、スキャン型は生成物イオンであり、蓄積時間は１．００００秒であり、スキャン範囲は５０〜６５０Ｄａであり、継続時間は５５分であった。ソースパラメーターはすべて上記と同じであり、−３５Ｖの衝突エネルギー（ＣＥ，collision energy）及び５ｐｓｉの衝突ガス（ＣＩＤ，collision gas、窒素）を用いた。ＭＳ３作業では、励起エネルギーを１８０Ｖに設定した。
【０１０９】
ＣＲＣバイオマーカーの予備単離及びＮＭＲ分析
薄層クロマトグラフィー法では、すべての化学物質及び培地をSigma-Aldrich Canada Ltd.社、Oakville、ONから購入した。溶媒はすべてＨＰＬＣ等級であった。分析用ＴＬＣは、プレコートシリカゲルＴＬＣアルミニウム板（EM science社製、Kieselgel 60 F254、５×２ｃｍ×０．２ｍｍ）上で行った。化合物を、ＵＶ光（２５４／３６６ｎｍ）下で、又はヨウ素蒸気槽に入れて、１％（ｗ／ｖ）硫酸セリウム及び４％（ｖ／ｖ）Ｈ２ＳＯ４を含有する５％（ｗ／ｖ）リンモリブデン酸水溶液中にプレートを浸漬することによって可視化し、続いて加熱した。ＮＭＲスペクトルをBruker社製Avance質量分析計で記録し、δ値は、１Ｈ（５００ＭＨｚ）についてはＣＤＣｌ３（７．２４ｐｐｍにおけるＣＨＣｌ３）を基準とし、１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５．８ＭＨｚ）についてはＣＤＣｌ３（７７．２３ｐｐｍ）を基準とした。
【０１１０】
市販の血清の酢酸エチル抽出物（１８０ｍＬの血清、５００ｍｇの抽出物）を、ステップ勾配溶離；アセトニトリル−水  ２５：７５〜１００％アセトニトリルを用いる逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーに供した。収集した画分を、ＬＣ／ＭＳ及びＭＳ／ＭＳによって分析した。ＣＲＣバイオマーカーを含有する画分をプールした（１２．５ｍｇ）。この手順を数回繰り返して、約６０ｍｇのＣＲＣバイオマーカーに富む画分を得た。次いで、この合わせた試料を、ステップ勾配溶離；ヘキサン−クロロホルム−メタノールを用いるＦＣＣに供し、収集した画分をＬＣ／ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ分析に供した。バイオマーカーに富む画分で標識した試料Ａ（５．４ｍｇ、約６５％）を、ＮＭＲによって分析した。次いで、試料Ａ（３ｍｇ）を過剰なエーテルジアゾメタンで処理し、終夜室温に保った。溶媒の除去後、試料をＮＭＲによって分析した。
【０１１１】
三連四重極多重反応モニタリング（ＴＱ−ＭＲＭ）方法論
抽出前に１０ｕｇ／ｍｌの［１３Ｃ１］コール酸を血清に添加しておき、非標的ＦＴＩＣＲ−ＭＳ分析について記載されている通りに血清試料を抽出した（３６ｎＭの［１３Ｃ１］コール酸の最終酢酸エチル濃度をもたらした。各試料の分析には、酢酸エチル有機画分を使用した。Randox社製血清抽出物由来の酢酸エチル中の一連の［１３Ｃ１］コール酸希釈物を使用して、０．０００２２ｕｇ／ｍｌ〜０．２２２ｕｇ／ｍｌの範囲の標準曲線を生成した。１００ｕＬの試料を、ＡＰＣＩプローブ付きのTurboV（商標）源が装備されている4000QTRAP（商標）に、フローインジェクション分析によって注射した。担体溶媒は９０％メタノール：１０％酢酸エチルであり、ＡＰＣＩ源への流速は３６０ｕＬ／分であった。ソースガスパラメーターは次の通りであった：ＣＵＲ：１０．０、ＣＡＤ：６、ＮＣ：−３．０、ＴＥＭ：４００、ＧＳ１：１５、インターフェイスヒーターオン。「化合物」設定は次の通りであった：入口電位（ＥＰ，entrance potential）：−１０、及び衝突セル出口電位（ＣＸＰ，collision cell exit potential）：−２０．０。方法は、Ｃ２８分子のそれぞれについての１つの親イオン遷移（４４５．３〜３８３．４Ｄａ、４４７．４〜３８５．４Ｄａ及び４４９．４〜４０５．４Ｄａ）、及び内部標準についての単一遷移（４０８．３〜３４３．４Ｄａ）の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）に基づく。遷移のそれぞれを、２５０ｍｓについて総サイクル時間２．３秒間モニターした。１試料当たりの総取得時間は、およそ１分であった。許容されるすべての分析により、０．９８を超える線形回帰方程式についてＲ２相関係数を示した。３つのＣ２８分子のそれぞれの［１３Ｃ１］コール酸等価物は、外挿濃度を０．０１４８ｕｇ／ｍｌ（３６ｎＭ、各試料の酢酸エチル抽出物中に存在する理論量）で割って各試料中の［１３Ｃ１］コール酸の回収率を決定することによって算出した。次いで、［１３Ｃ１］コール酸等価物として表される代謝産物濃度を外挿し、回収率で割って正規化し、適切な抽出希釈因子を乗じて最終血清濃度を生み出した。
【０１１２】
統計分析
ＦＴＩＣＲ−ＭＳ正確な質量のアレイアライメントは、DISCOVAmetrics（商標）バージョン3.0（Phenomenome Discoveries Inc.社製、Saskatoon）を使用して実施した。Microsoft（商標）社製Office Excel（商標）2007及び三連四重極ＭＲＭデータの分布分析を使用して、ＦＴＩＣＲ−ＭＳデータの統計分析及びグラフ化を行い、JMPバージョン8.0.1を使用して分析した。メタ分析（Fisherの逆カイ二乗法）は、SAS 9.2及びR 2.9.0を使用して行った。ＣＲＣと対照との間の有意性の決定に、対応のないStudentの両側ｔ−検定（Two-tailed unpair Student’s t-Test）を使用した。ｐ＜０．０５値は有意とみなした。JROCFIT（www.jrocfit.org）の連続データモードを使用して、ＲＯＣ曲線を生成した。
【０１１３】
結果
ＦＴＩＣＲメタボロミクスプロファイリング
記載した研究の実験ワークフローを図１にまとめる。治療未経験のＣＲＣ患者及び健常な対照の３つの独立な集団由来の血清の非標的メタボロミクスプロファイル（表１にまとめる）を２４か月間にわたって生成した（すなわち、各研究をおよそ１２か月ずつ分離した）。第一の研究は、Genomics Collaborative, Inc（ＧＣＩ）社から取得された４０のＣＲＣ患者及び５０の対照対象を含み、第二の研究は、Seracare Lifesciences Inc社から取得された２６のＣＲＣ対象及び２５の対照を含み、第三の研究は、大阪（Monden et al）において事前に収集された４６のＣＲＣ及び３５の対照を包含するものであった。すべての事例において、液体抽出過程を介して血清代謝産物を捕捉し（上記の方法を参照）、続いて、ＦＴＩＣＲ質量分析計においてネガティブエレクトロスプレーイオン化（ｎＥＳＩ，negative electrospray ionization）及びネガティブ大気圧化学イオン化（ｎＡＰＣＩ，negative atmospheric pressure chemical ionization）を使用して、抽出物の直接注入を行った。各研究についてすべての対象の生じたスペクトルデータを１ＰＰＭの質量精度内で整列化し、バックグラウンドピークを減じ、カスタムインフォーマティクスソフトウェア（custom informatics software）を使用して試料特異的なスペクトルピークそれぞれの強度を含む二次元アレイ表を作成した（上記の方法を参照）。３つの独立な研究についてＣＲＣ患者と対照プロファイルとの間の代謝の差異を、図２Ａ〜２Ｃに示す通りの検出された質量範囲にわたって対照平均値の正規化した対数比ピーク強度をプロットすることによって可視化した。各独立な研究において、およそ４４０〜６００Ｄａのスペクトル領域は、ＣＲＣ患者における強度が対照と比べて一貫して低減するピークを示した（図２における緑色、黄色、橙色及び赤色の点）。平均して、この質量のクラスターは、対照と比較してＣＲＣ患者の血清における５０％〜７５％の低減を示し、各研究においてｐ値は１×１０−５以下であった。
【０１１４】
各研究からのｐ値に基づいて上位５０の質量をランク付けし、それらを、表２に示す通りの他の研究において有意な差異（ＣＲＣと対照との間のｐが０．０５未満）を示す質量と比較することによって、発見研究それぞれの間の重複をさらに調査した。例えば、ＧＣＩ社製発見セットにおいて最も低いｐ値を有する上位５０の代謝産物のうち４６（９２％）は、Seracare社製１データセットにおいて有意に異なることも分かり、一方、大阪データセットにおいてｐ＜０．０５を有する５０のＧＣＩ社製質量のうちの３１も検出された。同じように、大阪の研究における上位５０の代謝産物は、８８％及び９４％の冗長性を示し、ＧＣＩ社及びSeracare社１の研究においては代謝産物はそれぞれｐ＜０．０５を示した。これらの結果は、３つの研究全体にわたって有意に識別される質量の間における極めて高度の共通性を指示しており、実際に、他２つの研究の少なくとも１つの上位５０以内に、各研究における上位５０の質量の６３％も存在していた（表２．１を参照）。上位５０にランク付けされた質量のうち、２以上の研究において同定されたもののみが、上記で強調表示されている４４０〜６００Ｄａの質量範囲内に存在することが分かり、この領域外において、研究の任意の２つにおけるＣＲＣと対照との間で有意に異なる単一ピークは検出されなかった。３つすべての研究において排他的に検出された代謝の差異のフィルタリング（並びにＥＳＩ及びＡＰＣＩの両方において検出されたＣ１３同位体ピーク及び冗長な質量の除去）により、表３に示す通りの個々の１２Ｃ代謝産物を表す１３の質量をもたらした。質量は、各研究内の患者試料全体にわたって同様の発現プロファイルを呈し、それらが関係し得ることを示唆した（Pearsonの相関係数によって評価した際；図示せず）。４４６及び４４８の公称質量を有する２つの最小分子量の分子の棒グラフを図３に示す。代謝産物の低減と病期との間の相関は、ほとんど又は全く観察されず（図３Ａ及び３Ｂ）、受信者動作特性曲線分析は、合わせた全期について３つすべての研究にわたって０．９１±０．０３の平均化曲線下面積（ＡＵＣ，area under-the-curve）をもたらした（図３Ｃ；個々のＡＵＣを示す）。
【０１１５】
次いで、妥当な分子式の計算的帰属を、上記で同定された１３の質量について行った。帰属は、精密な予測を高い質量精度に依存する、前述した通りの一連の数学的及び計量化学的規則（Aharoni A, Ric de Vos CH, Verhoeven HA, Maliepaard CA, Kruppa G, Bino R, Goodenowe DB. Nontargeted metabolome analysis by use of Fourier Transform Ion Cyclotron Mass Spectrometry. Omics 2002;6:217-34）に基づく。アルゴリズムは、炭素、水素、酸素及び他の元素の数をそれらの厳密な質量に基づいて計算し、それを定義された制約内の検出された正確な質量に帰属することができる。表３中の質量について論理上推定分子式を計算し、２８、３０、３２又は３６個の炭素及び４〜６個の酸素のいずれかを含有する元素組成をもたらした。種々の形態の脂溶性ビタミン、ステロイド及び脂肪酸を包含する若干のクラスの代謝産物は、理論的にはこれらの元素組成に当てはまる。本発明者らは、後続の項においてこの情報を使用して、構造比較研究のために適切な分子を選択した。集合的に、結果は、ＣＲＣ患者の血清における、長さ２８〜３６炭素の範囲をとる有機的に可溶性の酸素化代謝産物の、対照と比較して一貫した５０％〜７５％の低減を指示した。
【０１１６】
【表２】
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【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
【表４】
2013500275.tif 000018
【０１１９】
ＨＰＬＣ接続タンデム質量分析
上述したＦＴＩＣＲ−ＭＳ作業において使用したＧＣＩ社製コホート由来の血清の選択される酢酸エチル抽出物を、四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析計と接続されたＨＰＬＣを使用して、フルスキャンＡＰＣＩネガティブイオンモードで再分析した。ＦＴＩＣＲ−ＭＳ結果と一致して、逆相ＨＰＬＣ後、１６〜１８分の保持時間で、およそ４４０〜６００Ｄａのピークのクラスターが無症候性対照の血清において検出されたが、ＣＲＣ患者の血清には存在しなかった（図４）。６つすべてのＣ２８バイオマーカー（ｍ／ｚ４４６、ｍ／ｚ４４８、ｍ／ｚ４５０、ｍ／ｚ４６４、ｍ／ｚ４６６及びｍ／ｚ４６８）由来の分子イオン、並びに残ったＣ３２及びＣ３６マーカーの多くは、正常血清クラスター内で検出可能であった。１６〜１８分の保持時間内で最大４００Ｄａの抽出された質量は、両方の集団において、他の保持時間における抽出質量スペクトル（図示せず）と同様のピーク強度を示し（図４、枠の右側の領域）、ＣＲＣ患者の血清に対するこの枯渇した代謝領域の特異性を強化した。
【０１２０】
次に、６つのＣ２８バイオマーカー（表４、図７〜１２も参照）並びにより高度なＣ３２及びＣ３６バイオマーカー（表４．１を参照）について、タンデム質量分光断片化フィンガープリントを生成した。６つのＣ２８バイオマーカーのＭＳ／ＭＳ及びＭＳ３断片化データは、Ｈ２Ｏの損失（ｍ／ｚ４２７、４２９、４３１、４４５、４４７及び４４９）、Ｈ２Ｏの２分子の損失（ｍ／ｚ４０９、４１１、４１３、４２７、４２９、４３１）、ＣＯ２の損失（ｍ／ｚ４０１、４０３、４０５、４１９、４２１、４２３）、並びにＣＯ２及びＨ２Ｏの損失（ｍ／ｚ３８３、３８５、３８７、４０１、４０３、４０５）により生じたピークによって支配されており、カルボン酸官能基及び２個以上のヒドロキシル基の存在を指示するものであった。分子式、分子の有機特性及びタンデムＭＳデータに基づいて、本発明者らは、代謝産物が、レチノール及びレチノイン酸（ビタミンＡ）、カルシフェロール（ビタミンＤ）、トコフェロール（ビタミンＥ）、フィロキノン（ビタミンＫ）等の脂溶性ビタミン、ステロイド若しくは胆汁酸、又は長鎖多価不飽和ヒドロキシ脂肪酸を包含する１又は２以上の可能なクラスの分子の誘導体又はアナログであり得ると仮定した。したがって、タンデム質量分光断片化フィンガープリントを、基準物質５Ｓ，６Ｓ−（７Ｅ，９Ｅ，１１Ｚ，１４Ｚ）−ジヒドロキシエイコサテトラエン酸（１）、１５Ｓ−ヒドロキシ−（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１３Ｅ）−エイコサテトラエン酸（２）及び８Ｒ−ヒドロキシ−（５Ｚ，９Ｅ，１１Ｚ，１４Ｚ）−エイコサテトラエン酸（３）、α−トコフェロール（４）γ−トコフェロール（５）、１３−（６−ヒドロキシ−２，７，８−トリメチルクロマン−２−イル）−２，６，１０−トリメチルトリデカン酸（６）、１６−（４，５−ジメチル−３，６−ジオキソシクロヘキサ−１，４−ジエニル）−２，６，１０，１４−テトラメチルヘキサデカン酸（７）、６−ヒドロキシ−２，７−ジメチル−２−（４，８，１２−トリメチルトリデシル）クロマン−８−カルバルデヒド（８）、６−ヒドロキシ−２，７−ジメチル−２−（４，８，１２−トリメチルトリデシル）クロマン−８−カルボン酸（９）、カルシフェロール（１０）、コレカルシフェロール（１１）、エルゴステロール（１２）、フィロキノン（１３）、レチノール（１４）及び３β，７α−ジヒドロキシ−５−コレスタン酸（１５）について生成した（表５）。生じたＭＳ／ＭＳデータは、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、及びステロイド性分子（４〜１５）について、メタボロミクスバイオマーカーのいずれとも類似性を示さず；ビタミンＥ型分子について、いずれもそれらのクロマン環の診断用断片の特徴（４、５、６、７、８及び９についてそれぞれｍ／ｚ１６３、１４９、１４９、１４９、１６３及び１７９）を有しており、ビタミンＤ及びアナログについて、診断用断片が側鎖の損失の結果として形成され（１０、１１及び１３についてそれぞれｍ／ｚ２７１、２７３及び２５３）、フィロキノン（１３）について、診断用断片ｍ／ｚ１８７は、キノン環系について顕著であり、ビタミンＡ（１４）について、断片ｍ／ｚ２６９（Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ）は、シクロヘキシル環部分を損失してレチノール���診断用ｍ／ｚ１４５を形成し、３β，７α−ジヒドロキシ−５−コレスタン酸（１５）について、ｍ／ｚ２７７の診断用レトロディールス・アルダー断片が観察された。これに加えて、１５のようにプレグナン環系を有する他のカルボン酸基準物質（例えば、ケノデオキシコール酸及びコール酸）は、ＭＳ／ＭＳ断片化時にＣＯ２の損失を示さない（図示せず）。しかしながら、ヒドロキシ脂肪酸基準物質１、２及び３のＭＳ／ＭＳ断片化データ（表５）は、ＣＲＣバイオマーカーのＭＳ／ＭＳによって生成されるものと同様の、且つ種々の水酸化長鎖脂肪酸について他によって記載されたもの（Hong S, Gronert K, Devchand PR, Moussignac RL, Serhan CN. Novel docosatrienes and 17S-resolvins generated from docosahexaenoic acid in murine brain, human blood, and glial cells. Autacoids in anti-inflammation. J Biol Chem 2003; 278:14677-87、Hong S, Lu Y, Yang R, Gotlinger KH, Petasis NA, Serhan CN. Resolvin D1, protectin D1, and related docosahexaenoic acid-derived products: Analysis via electrospray/low energy tandem mass spectrometry based on spectra and fragmentation mechanisms. J Am Soc Mass Spectrom 2007; 18:128-44、Serhan CN, Hong S, Gronert K, Colgan SP, Devchand PR, Mirick G, Moussignac RL. Resolvins: a family of bioactive products of omega-3 fatty acid transformation circuits initiated by aspirin treatment that counter proinflammation signals. J Exp Med 2002; 196:1025-37、Lu Y, Hong S, Yang R, Uddin J, Gotlinger KH, Petasis NA, Serhan CN. Identification of endogenous resolvin E1 and other lipid mediators derived from eicosapentaenoic acid via electrospray low-energy tandem mass spectrometry: spectra and fragmentation mechanisms. Rapid Commun Mass Spectrom 2007; 21:7-22、Murphy RC, Fiedler J, Hevko J. Analysis of nonvolatile lipids by mass spectrometry. Chem Rev 2001;101:479-526）と一致する周辺切断イオン（peripheral cut ions）を示した。例えば、マーカーｍ／ｚ４４６は、周辺切断イオン４２７［Ｍ−Ｈ−Ｈ２Ｏ］−、４０１［Ｍ−Ｈ−ＣＯ２］−、４０９［Ｍ−Ｈ−２Ｈ２Ｏ］−、３８３［Ｍ−Ｈ−ＣＯ２−Ｈ２Ｏ］−及び３６５［Ｍ−Ｈ−ＣＯ２−２Ｈ２Ｏ］−並びに鎖切断イオン、２２３、２０５、２７７等を示した（図５及び図７を参照）。他のＣ２８、Ｃ３２及びＣ３６代謝産物について同様のイオンが得られた（表４、表４．１を参照）。集合的に、これらの演繹は、メタボロミクスマーカーがビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ及びステロイドのアナログである可能性は低く、むしろ数個の不飽和とヒドロキシ基とを含有する長鎖脂肪酸型分子であることを示唆していた。本発明者らは、これらの代謝産物を、ヒドロキシ多価不飽和超長鎖脂肪酸（ｈＰＵＬＣＦＡ；ここで、用語「超」は、Ｃ３０以上の長さの鎖脂肪酸を指すために使用されている（Poulos A, Beckman K, Johnson DW, Paton BC, Robinson BS, Sharp P, Usher S, Singh H.Very long-chain fatty acids in peroxisomal disease. Adv Exp Med Biol 1992; 318:331-40）と総称する。
【０１２１】
【表５】
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【０１２２】
【表６】
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【０１２３】
【表７】
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【０１２４】
次に、バルク血清抽出物を使用する富化戦略及び２段階フラッシュカラムクロマトグラフィーアプローチ、続いてＮＭＲ分析を行って、ｈＰＵＬＣＦＡのさらなる構造的特徴付けを提供した。最初に、水−アセトニトリル溶媒勾配を使用する逆相フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＦＣＣ，reverse phase flash column chromatography）を実施し、生じた画分をＬＣ／ＭＳによって分析した。ｈＰＵＬＣＦＡを含有する画分（画分９、図１４）をプールし、クロロホルム−メタノール混合物を使用する順相ＦＣＣに供して、およそ６５％の豊かな半精製画分で標識された試料Ａを得た（図１５参照）。試料ＡについてのＬＣ及びタンデム質量分光分析（ＭＳ２及びＭＳ３）データを使用して、マーカーの富化度を追跡及び確認した。試料Ａ及びそのメチルエステルについての核磁気共鳴（ＮＭＲ，Nuclear magnetic resonance、１Ｈ、１３Ｃ及び２Ｄ）分析は、ｓｐ２炭素に付着している水素原子に対する共鳴のいくらかの抑制の観察により、超長鎖多価不飽和ヒドロキシ脂肪酸と一致する共鳴及び相関（表６）を明らかにした。
【０１２５】
【表８】
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【０１２６】
多重反応モニタリング（ＭＲＭ）方法論を使用する独立なバリデーション
もう２つの独立な集団におけるタンデム質量分析アプローチ（方法を参照）を使用して、ＣＲＣ患者の血液中におけるｈＰＵＬＣＦＡのレベルの低減をさらに確認した。該アプローチは、分析物を定量するための親−娘断片イオン組合せの計測（多重反応モニタリング；ＭＲＭと称される）に基づくものである（Zytkovicz TH, Fitzgerald EF, Marsden D, Larson CA, Shih VE, Johnson DM, Strauss AW, Comeau AM, Eaton RB, Grady GF. Tandem mass spectrometric analysis for amino, organic, and fatty acid disorders in newborn dried blood spots: a two-year summary from the New England Newborn Screening Program. Clin Chem 2001; 47:1945-55、Johnson DW, Trinh MU. Analysis of isomeric long-chain hydroxy fatty acids by tandem mass spectrometry: application to the diagnosis of long-chain 3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase deficiency. Rapid Commun Mass Spectrom 2003; 17:171-5）。本発明者らは、方法において記載されている通り、４個の酸素を有する２８の炭素ｈＰＵＬＣＦＡ（親質量４４６、４４８及び４５０；それぞれ、Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４、Ｃ２８Ｈ４８Ｏ４及びＣ２８Ｈ５０Ｏ４）のうち３つを計測するためのアッセイを開発した。ｈＰＵＬＦＡの標識した基準物質の合成は分析時において依然進行中であったため、結果は、内部標準として各試料にスパイクされた［１３Ｃ１］コール酸の等価物（ＣＡＥｓ，equivalents to [13C1]cholic acid）として報告する。第一の研究は、７０の治療未経験のＣＲＣ対象及び７０のマッチング対照を含み、その全員が米国出身の白色人種であった。各対象について３つの２８炭素ｈＰＵＬＣＦＡのＣＡＥｓ（公称質量４４６、４４８及び４５０に従って命名される）を図５Ａに示す。代謝産物のそれぞれの、対照と比較して有意に低いレベル（ｐ＜０．００１、図５Ａに示される実際の値）が、治療未経験のＣＲＣ陽性対照において観察された。ＲＯＣ分析は、２８炭素含有ｈＰＵＬＣＦＡのそれぞれについて、０．８７±０．００５のＡＵＣをもたらした（図５Ｂ）。病期ごとに患者をプロットすることにより、第Ｉ〜III期にわずかなさらなる低減を示し、７人の対象のみであるが、第IV期の対象が最小の低減を示した（図５Ｃ及び５Ｄ）。期ごとの２８炭素プールの対応する平均ＡＵＣは、第Ｉ期について０．８７、第II期について０．８８、第III期について０．９４、及び第IV期について０．６６であった。
【０１２７】
本発明者らは次に、Chiba, JapanのＣＲＣ及び対照対象の別の独立な集団（Nomura et al）を特徴付けるためにＭＲＭ法を使用した。４０の前治療ＣＲＣ対象及び４０の対照由来の血清を分析し、ＣＲＣ陽性群において有意な低減が再度観察された（図６Ａ）。３つの代謝産物について対応する平均ＡＵＣは、０．９７±０．０１４であった（図６Ｂ）。この研究において、第Ｉ、II及びIII／IV期の間のすべての比較について、該期との有意な相関（ｐ＜０．０５）が観察された（図６Ｃ及び６Ｄ）。期ごとのＡＵＣは、第Ｉ期について０．９３、第II期について０．９７、及び第III／IV期について１．０であった（２つの第IV期は第III期と同グループにした；図６Ｄ）。
【０１２８】
考察
本明細書において記載されているのは、ヒドロキシル及びカルボキシル官能部分を持ち、且つ、健常な無症候性対照と比較して治療未経験のＣＲＣ患者の血清における２８〜３６炭素の低減を含有する、長鎖炭化水素ベースの代謝産物の発見及び予備構造的特徴付けである。高分解能ＦＴＩＣＲ−ＭＳをバイオマーカー発見のためのフローインジェクション技術と併せて使用し、該技術を３つの独立な被験集団に適用することによって、非標的メタボロミクスの有用性を試験した。多くの場合、バイオマーカーの性能をバリデートするために単一の試料セットを半分に分割することによって使用され（Lim JY, Cho JY, Paik YH, Chang YS, Kim HG. Diagnostic application of serum proteomic patterns in gastric cancer patients by ProteinChip surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Int J Biol Markers 2007; 22:281-6、Su Y, Shen J, Qian H, Ma H, Ji J, Ma L, Zhang W, Meng L, Li Z, Wu J, Jin G, Zhang J, Shou C. Diagnosis of gastric cancer using decision tree classification of mass spectral data. Cancer Sci 2007; 98:37-43、Chen YD, Zheng S, Yu JK, Hu X. Artificial neural networks analysis of surface-enhanced laser desorption/ionization mass spectra of serum protein pattern distinguishes colorectal cancer from healthy population. Clin Cancer Res 2004; 10:8380-5）、多くの場合、複合アルゴリズムに依存し（総説Ringner M, Peterson C, Khan J. Analyzing array data using supervised methods. Pharmacogenomics 2002; 3:403-15を参照）且つバイアスをもたらし得る（Baggerly KA, Morris JS, Coombes KR. Reproducibility of SELDI-TOF protein patterns in serum: comparing datasets from different experiments. Bioinformatics 2004; 20:777-85）「訓練／試験セット」アプローチとは対照的に、本発明者らは、世界中のいくつもの場所から収集された異なる人種的バックグラウンドの、症例にマッチングさせた３つの別々の試料セット及び対照について完全に独立な発見分析を行って、高度のロバスト性及びサンプリングバイアスの最小限の可能性を確実にした。大阪セットにおいて発見された上位５０の代謝識別子（metabolic discriminators）のうちの４４及び４７も、それぞれＧＣＩ社製及びSeracare社製セットにおいて有意に変化した。この異例の研究協定は、非標的ＦＴＩＣＲ−ＭＳ技術が再現性のあるバイオマーカー発見原動力であることだけでなく、その疾患に関係するメタボロミクス変化が、地理的な位置及び民族全体にわたって高度に保存され得ることを示している。この簡易化法を２つのさらなる独立な被験集団に対して使用して、２つのバイオマーカー候補のための標的ＴＱ−ＭＲＭ法を開発し、次いで３つのＦＴＩＣＲ−ＭＳ研究から生成されたＲＯＣ  ＡＵＣを、ＴＱ−ＭＲＭ法から生成されたＲＯＣ  ＡＵＣと比較することによっても、非標的ＦＴＩＣＲ−ＭＳ発見の簡易アッセイへの移行を試験した。簡易化法を使用して、同様の結果が得られた。２２２の治療未経験のＣＲＣ患者試料及び２２０の疾患のない無症候性対照を集合的に含む、合計で５つの独立な研究集団を、２つの異なる分析法を使用して評価した。実際のところ、ｈＰＵＬＣＦＡの低減と、ＣＲＣが試料の５つの独立なセット全体にわたって偽陽性結果であることとの間の報告されている関連の可能性は、天文学的に低い。偽陽性率について、Fisherの逆カイ二乗法（Ｐ＝−２Σｋｉ＝１ｌｏｇ  ｐｉ＞ＣであればＨ０を棄却；ｐ＝５つの独立な試料のＰ値、ｋ＝５つの異なる試料、Ｃ＝２ｋ自由度を有するカイ二乗分布の上側（Ｘ２０．０５，１０＝１８．３１））を使用してメタ分析を実施した（L.V. H. Meta-Analysis. Journal of Educational Statistics 1992; 17:279-296、Fisher RA. Statistical methods for research workers Oliver & Boyd, 193）。メタ分析に基づいて、マーカー４４６及び４４８について生じたｐ値は、それぞれ２．９６×１０−４７及び８．１１×１０−４９で、個々のｐ値よりも有意であった。したがって、本発明者らは、これらの代謝産物の低減がＣＲＣの存在と相関していると強く確信して言うことができる。
【０１２９】
ＦＴＩＣＲ−ＭＳは、抽出、イオン化、及び統計的相関情報と連動する正確な質量に基づいて、確信できる分子式予測に十分な分解能を提供した。多元素組成物は、理論的には所与のバイオマーカー質量に帰属可能であるが、２８〜３２個の炭素及び４〜６個の酸素を有する式だけが、発見セットの２又は３つにおいて検出される一般的な質量に一貫して帰属可能であった。ｈＰＵＬＣＦＡの試料間の発現プロファイルの間の高度の統計的相互作用（すなわち、対象全体にわたるマーカーの相対強度間における高度の相関）を考慮して、本発明者らは、それらがすべて同じ代謝系の一部であり、しがって関係する組成物を示すはずとの疑いを抱いた。ネガティブイオン化モードにおける検出は、窒素が組成物のいずれかにおいて存在する可能性も低減させた。水及び二酸化炭素の顕著な損失を示すタンデム質量分析と連動するこの情報は、表３及び表２．１に示す分子式を本発明者らが確信を持って提案することにつながった。理論的には該分子式のクラスに当てはまる複数の候補クラスの分子も、タンデムＭＳを使用して除外した。例えば、本発明者らは、ステロイド又はビタミンＤ中のもの等の縮合環系を指示する断片も、ビタミンＥトコフェロールにおいて観察されるもの等のクロマン環系を指示する断片も観察しなかった。ビタミンＫ及びレチノール、並びにコール酸及び３β，７α−ジヒドロキシ−５−コレスタン酸等の胆汁酸を包含する若干の他のクラスの分子も、類似の断片化パターンを示さなかった。しかしながら、断片化パターンにおける、特に、ＣＯ２及びＨ２Ｏの損失により生じた娘イオンの相対存在量と、ｈＰＵＬＣＦＡから公知のヒドロキシ脂肪酸基準物質並びにレソルビン及びプロテクチン等の文献において報告されている他の脂肪酸までの鎖切断イオン（以下で論じる）とにおける類似性は、水酸化直鎖脂肪酸型種を示唆していた。Ｃ２８シリーズ（質量４４６、４４８、４５０、４６４、４６６及び４４８）についてのタンデムＭＳデータの検査により、本発明者らがカルボキシ末端鎖断片−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨを表していると合理的に予測する一貫した１１３Ｄａの娘イオンが明らかになった。加えて、［Ｍ−（ＣＯ２＋Ｈ２Ｏ）］娘イオンからの５４の（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）の一貫した損失が４４６、４４８、４６４及び４６６分子について観察されたが４５０及び４６８分子については観察されず、１）４５０及び４６８が飽和カルボキシ末端領域を有し得ること、並びに２）分子のこの領域内にヒドロキシル部分がないであろうことを示唆していた。すべてのＣ２８及び他のマーカーのＭＳ／ＭＳデータも、１について観察された通りの１，２−ジオールモチーフを用いて得られる診断用断片を示さず（基準ピークはｍ／ｚ１１５における鎖切断イオンである）、フラッシュカラムクロマトグラフィーを介して富化された画分に対するＮＭＲは、δ２．７８（二重結合炭素間のメチレン中断）及びδ５．１２〜５．９０（二重結合炭素上の水素原子）における１Ｈ  ＮＭＲシグナルについて得られる、期待される積分値よりも低い値を示した。累積的に、これらの結果は、分子中のヒドロキシ基が、ｓｐ２炭素とカルボキシ末端から少なくとも７番��の炭素との間の炭素原子と結合していると思われることを示唆するものであった。
【０１３０】
構造分析に基づいて、６つのＣ２８バイオマーカーの構造は表６．１において以下に示す通りに提案された。
【０１３１】
【表９】
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【０１３２】
興味深いことに、本明細書において報告される代謝産物マーカーは、ヒト特異的代謝系を表す。本発明者らは、ラット、マウス及びウシを包含するいくつもの種、並びに、ＧＣＩ社製発見セットにおける患者からの数々の細胞株、馴化培地、腫瘍及び正常な結腸組織を包含するいくつもの異なる試料源、並びに、種々の種からの脳、肝臓、脂肪及び他の組織由来の血清試料を分析し、そのいずれも、これらのｈＰＵＬＣＦＡのいかなる検出可能なレベルも示すことがなかった（結果は図示せず）。本発明者らは、飽和Ｃ２８以上の長さの鎖脂肪酸に富むポリコサノール抽出物を包含する種々の植物組織又は穀類においてこれらの分子を検出することもできなかった（Marinangeli CP, Kassis AN, Jain D, Ebine N, Cunnane SC, Jones PJ. Comparison of composition and absorption of sugarcane policosanols. Br J Nutr 2007; 97:381-8、Wang MF, Lian HZ, Mao L, Zhou JP, Gong HJ, Qian BY, Fang Y, Li J. Comparison of various extraction methods for policosanol from rice bran wax and establishment of chromatographic fingerprint of policosanol. J Agric Food Chem 2007; 55:5552-8）。これは、分子が、特異的ｐ４５０媒介性及び／又は短命過程（microbiotic processes）等のヒト特異的代謝過程を発生源とすることを示唆している。腫瘍又は正常な結腸組織における検出の欠如は、代謝産物が「腫瘍マーカー」ではなく、第Ｉ期がんにおいて高い関連率で組み合わされており、低減が腫瘍量の結果ではないようだということを示唆している。しかしながら、いくつかの後期日本人症例において観察されるレベルのさらなる低減（図６）は、より低レベルのｈＰＵＬＣＦＡが実際にこの群における進行速度を指示するとすれば説明できる。本明細書において報告されるすべての対照群において、対象に腫瘍も進行性新生物もないと結腸鏡検査で確認されなかったことに留意することも重要である。Collins et alによる平均リスク対象における結腸鏡検査結果に基づいて、無症候性集団の最大１０％が進行性新生物陽性である（Collins JF, Lieberman DA, Durbin TE, Weiss DG. Accuracy of screening for fecal occult blood on a single stool sample obtained by digital rectal examination: a comparison with recommended sampling practice. Ann Intern Med 2005; 142:81-5）。したがって、ＣＲＣのリスクがある対象とリスクがない対象とを識別するこれらの代謝産物の能力は、本発明者らの結果において過小評価されていると思われる。
【０１３３】
ヒドロキシル基を含有するこの長さの脂肪酸分子については今まで報告されていないが、該分子は、急性炎症の消散を促進するのに重大な、ｎ３必須脂肪酸ＥＰＡ及びＤＨＡをそれぞれ発生源とするレソルビン及びプロテクチンとして公知である水酸化超長鎖脂肪酸のクラスに似ているように思われる。急性炎症を十分に「消散」できないことが、がん（Das UN. Essential fatty acids: biochemistry, physiology and pathology. Biotechnol J, 2006; 1:420-39）及びアルツハイマー病（Das UN. Folic acid and polyunsaturated fatty acids improve cognitive function and prevent depression, dementia, and Alzheimer's disease--but how and why? Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2008; 78:11-9）を包含するいくつもの状態の根底をなす慢性炎症状態の背景にある有力な説である。特に関連性があるのは、ＩＤＢ、クローン病、結腸炎及び結腸がん等の腸管の炎症性状態に対する消散促進性長鎖ヒドロキシル脂肪酸メディエーターの効果である。レソルビンＥ１（ＲｖＥ１）及びリポキシンＡ４（ＬＸＡ４，Lipoxin A4）はいずれも、結腸炎症に対する保護効果に関わっているとされてきた。ＲｖＥ１は、白血球浸潤のブロック、炎症促進性遺伝子発現の減少、一酸化窒素シンターゼの誘導が生存率及び体重の持続における改善に付随して起こる、マウスにおける２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸誘導性結腸炎の発症から保護することが示された（Arita M, Yoshida M, Hong S, Tjonahen E, Glickman JN, Petasis NA, Blumberg RS, Serhan CN. Resolvin E1, an endogenous lipid mediator derived from omega-3 eicosapentaenoic acid, protects against 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102:7671-6）。同様に、ＬＸＡ４アナログは、ヒト結腸におけるケモカイン分泌をエクスビボで減衰させることが示されており（Goh J, Baird AW, O'Keane C, Watson RW, Cottell D, Bernasconi G, Petasis NA, Godson C, Brady HR, MacMathuna P. Lipoxin A(4) and aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A(4) antagonize TNF-alpha-stimulated neutrophil-enterocyte interactions in vitro and attenuate TNF-alpha-induced chemokine release and colonocyte apoptosis in human intestinal mucosa ex vivo. J Immunol 2001; 167:2772-80（、病原誘導性胃腸炎に応答して誘導された遺伝子、特にＮＦκＢによって調節される遺伝子の５０％を減衰させた（Gewirtz AT, Collier-Hyams LS, Young AN, Kucharzik T, Guilford WJ, Parkinson JF, Williams IR, Neish AS, Madara JL. Lipoxin a4 analogs attenuate induction of intestinal epithelial proinflammatory gene expression and reduce the severity of dextran sodium sulfate-induced colitis. J Immunol 2002; 168:5260-7）。インビボでは、ＬＸＡ４アナログはＤＳＳ誘導性炎症性結腸炎において腸管の炎症を低減させ、体重損失、血便及び死亡率の有意な低減をもたらした（Gewirtz AT, Collier-Hyams LS, Young AN, Kucharzik T, Guilford WJ, Parkinson JF, Williams IR, Neish AS, Madara JL. Lipoxin a4 analogs attenuate induction of intestinal epithelial proinflammatory gene expression and reduce the severity of dextran sodium sulfate-induced colitis. J Immunol 2002; 168:5260-7）。構造的に、レソルビン及びプロテクチン（ｎ６リポキシンも）は、種々のリポキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ及びｐ４５０酵素によって触媒される親ＶＬＣＦＡの一、二及び三水酸化生成物を含む（Serhan CN. Controlling the resolution of acute inflammation: a new genus of dual anti-inflammatory and proresolving mediators. J Periodontol 2008;79:1520-6、Schwab JM, Chiang N, Arita M, Serhan CN. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature 2007; 447:869-74、Serhan CN, Gotlinger K, Hong S, Lu Y, Siegelman J, Baer T, Yang R, Colgan SP, Petasis NA. Anti-inflammatory actions of neuroprotectin D1/protectin D1 and its natural stereoisomers: assignments of dihydroxy-containing docosatrienes. J Immunol 2006; 176:1848-59、Serhan CN. Novel chemical mediators in the resolution of inflammation: resolvins and protectins. Anesthesiol Clin 2006; 24:341-64、Schwab JM, Serhan CN. Lipoxins and new lipid mediators in the resolution of inflammation. Curr Opin Pharmacol 2006; 6:414-20）。
【０１３４】
本明細書において記載されている診断法の有用性は、ＣＲＣ患者において一貫して観察されるｈＰＵＬＣＦＡの低減によって裏付けられる。加えて、ここで報告される症例対照データすべてにわたる平均ＡＵＣは０．９１±０．０４であったが、これは病期のバイアスがほとんど又は全くなく９０％の特異性でおよそ７５％の感受性に移行するものである。代謝産物が血清において計測されるため、コンプライアンスは高くあるべきであり、試験は、代謝試験の先天異常と同様の方式で標準的な三連四重極質量分析計等によりコスト効率よく実行され得る（Zytkovicz TH, Fitzgerald EF, Marsden D, Larson CA, Shih VE, Johnson DM, Strauss AW, Comeau AM, Eaton RB, Grady GF. Tandem mass spectrometric analysis for amino, organic, and fatty acid disorders in newborn dried blood spots: a two-year summary from the New England Newborn Screening Program. Clin Chem 2001; 47:1945-55）。
【０１３５】
２．ｈＰＵＬＣＦＡの生物学的役割の分析
材料及び方法
細胞株：ＳＷ６２０、ＭＣＦ−７及びＲＡＷ２６４．７をＡＴＣＣ社から購入し、高グルコースＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【０１３６】
定量的リアルタイムＰＣＲ：処理前日に、ＲＡＷ２６４．７細胞を６ウェルプレート中に１×１０６／ウェルで播種した。翌日、細胞を、異なる濃度のｈＰＵＣＬＦＡ（Ｄ０４６）又はビヒクル対照として１％ＦＡ／ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ）で４時間処理し、各処理は二通りとし、次いで、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（カタログ番号Ｌ４３９１、Sigma社製）で２０時間刺激した。Trizol（カタログ番号１５５９６−０１８、Invitrogen社製）を製造業者の取扱説明書通りに使用して、全ＲＮＡを細胞ペレットから単離した。ＲＮＡペレットを５０μＬのＤＥＰＣ処理水に再懸濁させ、−８０℃で貯蔵した。ＲＮＡの濃度及び純度を、２６０及び２８０ｎｍにおける分光光度法によって決定した。逆転写はqScript cDNA super mix（カタログ番号９５０４８−１００、Quanta Biosciences社製）を使用して実施し、ＰＣＲはApplied Biosystems社製Step one PlusリアルタイムＰＣＲシステムでFast SYBR Green Master Mix（カタログ番号４３８５６１２、AB Applied Biosystems社製）を使用して行った。リアルタイムＰＣＲで使用したプライマーを以下に収載する。各転写物コピーの相対数を、ハウスキーピング遺伝子ベータアクチンによって正規化した。
【０１３７】
【表１０】
2013500275.tif 000025
【０１３８】
亜硝酸塩：亜硝酸塩濃度は、Griess試薬（カタログ番号Ｇ２９３０、Promega社製）によって計測した。ＲＡＷ細胞又はＳＷ６２０細胞を、リアルタイムＰＣＲにおいて記載されている通りに処理した。馴化培地を亜硝酸塩計測のために収集した。計測は、９６ウェルプレート中で製造業者の取扱説明書通りに行った。
【０１３９】
マウスＴＮＦアルファのＥＬＩＳＡ：Ｒａｗ細胞を、リアルタイムＰＣＲにおいて記載されている通りに処理した。馴化培地を収集した。細胞を氷冷ＰＢＳで手早く洗浄し、細胞溶解緩衝液（Jerryの処方）で溶解し；Bio-Radタンパク質アッセイ（Bio-Rad社製、Hercules、CA）を使用して、細胞溶解物中のタンパク質を定量した。１ウェル当たり５０ｕｌの馴化培地又は１００ｕｇの細胞溶解物を使用して、ＴＮＦアルファの量を工場の取扱説明書通りに決定した（カタログ番号ＫＭＣ３０１１、Invitrogen社製）。
【０１４０】
マウスＩＬ−１ベータのＥＬＩＳＡ：Ｒａｗ細胞を、リアルタイムＰＣＲにおいて記載されている通りに処理した。５０ｕｌの馴化培地又は１００ｕｇの細胞溶解物を使用して、ＩＬ−１ベータの量を工場の取扱説明書通りに決定した（カタログ番号ＭＬＢ００Ｂ、Quantikine社製）。
【０１４１】
ウエスタン分析：冷蔵ＰＢＳ中にてラバーポリスマンを用いて１００ｍｍの組織培養プレートから細胞を除去し、４℃における遠心分離によって収集し、氷冷細胞溶解緩衝液（５０ｍＭのトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＮＰ−４０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＥＧＴＡプラス1X-Sigma哺乳類細胞抗プロテアーゼカクテル）中に１００ｕｌで再懸濁させた。いくつもの凍結融解サイクルを使用して細胞を溶解し、続いて、パルス音波破砕及び４℃における高速遠心分離をして、細胞残屑を除去した。ウエスタン分析では、当量のタンパク質（Biorad社製タンパク質試薬を使用するBradford社製タンパク質アッセイによって評価される）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶解した。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜（Pall-VWR社製）上にトランスブロットした。０．１％のTween-20を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，phosphate-buffered saline）中の５％の分子等級の無脂肪の脱脂粉乳（Biorad Laboratories社製、Mississauga ON Canada）を用いて、旋回プレート上４℃で膜を終夜ブロックした。Santa Cruz Biotechnology社製の一次抗体を、１：１０００希釈、４℃で終夜インキュベートし、二次ＨＲＰ抗体を１：１００００希釈に室温で３０分間適用した。後続の洗浄を同じ緩衝液中で行った。増強化学発光（ＥＣＬ，enhanced chemiluminescence）検出システム（Dupont-NEN社製）を使用して、抗原／抗体複合物を検出した。ブロットをBioMax化学発光Ｘ線フィルム（Kodak社製）に暴露し、ImageJ濃度測定ソフトウェアを用いるＨＰスキャナー（Scanjet G4010）を使用して、標的シグナルをスキャンし定量した。
【０１４２】
ｈＰＵＬＣＦＡ富化抽出物の産生
ｈＰＵＬＣＦＡを含有する健常ヒト血清の酢酸エチル抽出物（１８０ｍＬの血清、５００ｍｇの抽出物）を、ステップ勾配溶離；アセトニトリル−水  ２５：７５〜１００％アセトニトリルを用いる逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーに供した。ここでは、他の同様の抽出法を使用してもよく、精製及び／又は富化を、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に限定されないが、他のクロマトグラフィーアプローチを使用して実施してもよいことに留意されたい。フラッシュカラム画分を収集し、ＬＣ／ＭＳ及びＭＳ／ＭＳによって分析した。ＣＲＣバイオマーカーを含有する画分をプールした（１２．５ｍｇ）。ＡＰＣＩ源が装着されたABI社製QSTAR（登録商標）XL質量分析計を負ネガティブモードで使用するＨＰＬＣ（HP 1100、Agilent Technologies社製  Hypersil（商標）  ＯＤＳ  ５μｍ、１２５×４ｍｍカラム）接続飛行時間型質量分析に試料を供することによって、画分をｈＰＵＬＣＦＡについてモニターした。いかなる同等の質量分析計を使用してもよい。フルスキャンモードにおけるスキャン型は、蓄積時間１．００００秒、質量範囲５０〜１５００Ｄａ、及び継続時間５５分の飛行時間（ＴＯＦ）であった。ソースパラメーターは次の通りであった：イオン源ガス１（ＧＳ１）８０；イオン源ガス２（ＧＳ２）１０；カーテンガス（ＣＵＲ）３０；ネブライザー電流（ＮＣ）−３．０；温度４００℃；クラスタ分離電位（ＤＰ）−６０；集束電圧（ＦＰ）−２６５；クラスタ分離電位２（ＤＰ２）−１５。ＭＳ／ＭＳモードにおいて、スキャン型は生成物イオンであり、蓄積時間は１．００００秒であり、スキャン範囲は５０〜６５０Ｄａであり、継続時間は５５分であった。ソースパラメーターはすべて上記と同じであり、−３５Ｖの衝突エネルギー（ＣＥ）及び５ｐｓｉの衝突ガス（ＣＩＤ、窒素）を用いた。
【０１４３】
ｈＰＵＬＣＦＡのフラッシュカラム富化の結果は、図１６、１７及び１８において見られる。食事性及び短鎖脂肪酸等の血清成分を除去し、濃縮されたレベルのｈＰＵＬＣＦＡを含有する半精製抽出物をもたらすことができる。
【０１４４】
ｈＰＵＬＣＦＡの生物学的活性
ｈＰＵＬＣＦＡの生物学的活性は、Ａ）．種々の細胞ベースシステムを使用し、ｈＰＵＬＣＦＡ富化抽出物の活性をｈＰＵＬＣＦＡが枯渇した抽出物と比べて評価すること、並びにＢ）．特異的なｈＰＵＬＣＦＡを合成し、その活性を決定することによって決定した。
【０１４５】
８０ｕｇ／ｍｌのｈＰＵＬＣＦＡ陽性抽出物で処理したＭＦＣヒト乳癌細胞は、粒度、アポトソーム及び不規則な核の増加を包含するアポトーシス細胞に特有の形態学的転換をもたらし（図２０）、これは、ｈＰＵＬＣＦＡ陰性抽出物又はビヒクルで処理した細胞（対照）においては観察されなかった。生存細胞の数も、ｈＰＵＬＣＦＡ処理細胞においては視覚的に低かった（図２０）。ウエスタンブロット分析は、２９ｋＤａのポリ−ＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ，poly-ADP ribose polymerase）開裂生成物の出現を介して評価した際、ｈＰＵＬＣＦＡ処理ＭＣＦ細胞中におけるカスパーゼ活性の存在を確認した（図２１）。
【０１４６】
同様の様式で、ｈＰＵＬＣＦＡが富化された８０ｕｇ／ｍｌ血清抽出物で処理したＳＷ６２０結腸がん細胞は、１２時間で細胞増殖における４０％の低減、４８時間までに７０％の低減を示し、これは対照にもビヒクル抽出物にも観察されなかった（図２２）。ＭＣＦ７細胞と同様に、細胞の光学顕微鏡検査は、可能なアポトーシス促進効果が増殖の低減に関連していることを示唆していた（図示せず）。図２３に示す通り、ＰＡＲＰ活性は、ｈＰＵＬＣＦＡ富化抽出物を用いて検出可能であるが、対照抽出物でもビヒクルでも不可能である。集合的に、結果は、アポトーシスを誘導する上でのｈＰＵＬＣＦＡの機能的役割を示唆している。
【０１４７】
次に、一連の炎症性タンパク質に対するｈＰＵＬＣＦＡ抽出物の効果を免疫ブロットによって調査した。ｈＰＵＬＣＦＡ富化抽出物によるＳＷ６２０細胞の処理は、炎症促進性転写因子ＮＦκＢの低減（図２４）をＮＦκＢの陰性調節因子であるＩκＢαの同時誘導（図２５）とともにもたらした。加えて、ｈＰＵＬＣＦＡ富化抽出物は、誘導型一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ又はＮＯＳ２、図２６）に対する阻害効果を示したが、これは通常、炎症組織において誘導され、ＤＮＡ酸化及びタンパク質ニトロシル化を介して変異原性変化を促進し得る多量の一酸化窒素を産生する。その後、馴化培地中における亜硝酸塩レベル低減の計測を介して、ｈＰＵＬＣＦＡ処理細胞における一酸化窒素の産生を決定した（図２７）。亜硝酸塩は、種々の有機化合物と反応して、ニトロソアミン及び変異原性であってよい他の硝酸塩ラジカルを形成し得る、一酸化窒素の安定代謝産物である。留意すべきことに、ＮＯは細菌感染等の種々の炎症性応答中に誘導されるものであり、結腸がんの原因として直接的に関わっているとされてきた（Erdman et al, PNAS, Jan 27, 2009, vol 106 No.4）。ｉＮＯＳ（ＮＯＳ２）及びｈＰＵＬＣＦＡ処理細胞中の亜硝酸塩の低減は、ｈＰＵＬＣＦＡがこの炎症促進性過程を阻害し得ることを示唆している。
【０１４８】
化合物の抗炎症活性を評価するために、ＲＡＷ２９３マウスマクロファージ細胞モデル系が一般的に使用される。細胞を、大規模な炎症性応答を誘導するリポ多糖体で処理し、該応答から保護する能力について化合物を試験することができる。ＲＡＷ２９３細胞をｈＰＵＬＣＦＡ富化抽出物で前処理し、続いてＬＰＳで２４時間処理し、その後、サイトカインである腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα，tumor necrosis factor alpha）及びインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β，interleukin-1 beta）、上述した通りのｉＮＯＳ、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２，cyclooxygenase 2、アラキドン酸からの炎症促進性エイコサノイドの生成を司る酵素）を包含する炎症促進性マーカーのｍＲＮＡ転写物及びタンパク質レベルを評価した。ＬＰＳによる処理後、ＴＮＦα  ｍＲＮＡ転写レベルのレベルは、ｈＰＵＬＣＦＡ富化抽出物に暴露された細胞における、対照抽出物と比較して統計的に有意な低減（０．０５を超えるｐ）を示した（図２８）。細胞溶解物（図２９）及び馴化培地（図３０）中において酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価した際のＴＮＦαタンパク質のレベルは、ｈＰＵＬＣＦＡ処理細胞においても、対照と比較して有意に低減されていた（ｐ＜０．０５）。ｈＰＵＬＣＦＡ処理は、ｉＮＯＳ  ｍＲＮＡのＬＰＳ−媒介性誘導も対照処理と比較してブロックし（ｐ＜０．０５；図３１）、これは、免疫ブロットによって評価した際のｉＮＯＳタンパク質における有意な低減（図３２）及び亜硝酸塩レベルによって決定される通りの一酸化窒素生成の用量依存的阻害（図３３）に対応するものであった。ＣＯＸ２のｍＲＮＡ転写レベルは、図３４に示す通り、ＩＬ−１βのｍＲＮＡ転写レベル（図３５；ｐ＜０．０５）及び細胞溶解物タンパク質レベル（図３６；ｐ＜０．０５）のように、ｈＰＵＬＣＦＡ処理細胞対対照においても有意に低減されていた（ｐ＜０．０５）。集合的に、これらの結果は、炎症促進性状態から保護する上でのｈＰＵＬＣＦＡの有用性を例証している。
【０１４９】
下記の構造の分子式Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４：
【０１５０】
【化１３】
2013500275.tif 000026
【０１５１】
を有するｈＰＵＬＣＦＡ（Ｄ０４６−１２４と命名）を、実施例３（以下）において記載される合成スキームに従って９８．７％純度（ＬＣＭＳによって評価した際）に合成した。ＬＰＳ刺激前に純粋なｈＰＵＬＣＦＡでＲＡＷ２９３細胞を処理することにより、図３７に示す通りの５００ｕＭ（０．５ｍＭ）におけるＴＮＦα転写物の誘導（ｐ＜０．０５）及び図３８に示す通りの０．５ｍＭの馴化培地におけるタンパク質レベルの誘導を防止した。０．５及び０．１ｍＭの用量におけるｉＮＯＳ（ｐ＜０．０５）のｍＲＮＡ転写レベル（図３９）並びに同じ濃度の亜硝酸塩レベルを介して決定される通りの一酸化窒素（ｐ＜０．０５、図４０）について、同様の阻害効果が観察された。０．５ｍＭの純粋なｈＰＵＬＣＦＡによってＬＰＳ媒介性刺激が完全にブロックされた馴化培地中におけるＩＬ−１βのレベル（図４１、ｐ＜０．０５）についても、同様の効果が観察された。
【０１５２】
ｈＰＵＬＣＦＡの抗炎症性役割をさらに探究するために、６つのｈＰＵＬＣＦＡ（４５０Ｄａ、４４６Ｄａ、４６８Ｄａ、４６６Ｄａ、４４８Ｄａ及び４６４Ｄａ）のレベルを、ＮＳＡＩＤを服用しているＣＲＣ及び健常な対象の２つの大きな集団において計測した。図４２及び４３において見られるように（これについてそれぞれの集団の詳細は表７及び８において見ることができる）、非ステロイド性抗炎症薬を服用しているＣＲＣ対象において、ｈＰＵＬＣＦＡレベルの統計的に有意且つ再現性のある増加が生じる。この効果は、治療未経験のＣＲＣ患者（表７、図４２）及び治療後のＣＲＣ患者（表８、図４３）の両方において観察され、ＮＳＡＩＤの使用が欠損対象におけるｈＰＵＬＣＦＡレベルの増加をもたらすことを示している。しかしながら、この効果は、正常なｈＰＵＬＣＦＡレベルを既に有する対象においては観察されない。したがって、ｈＰＵＬＣＦＡレベルの計測を使用して、治療計画におけるＮＳＡＩＤの効果をモニターすることができる。
【０１５３】
表7. 6つのhPULCFAに対するNSAID効果を試験される治療未経験の集団中の対象の人口分布
【表１１】
2013500275.tif 000027
【０１５４】
表8. 治療後の、且つ6つのhPULCFAに対するNSAID効果について試験されるCRC患者における対象の人口分布
【表１２】
2013500275.tif 000028
【０１５５】
２つの誘導型炎症促進性マーカーも試験して、ｈＰＵＬＣＦＡ効果を見極めた。最初に、ＲＡＷ細胞中のＬＰＳによる誘導後にＴＮＦアルファレベルを計測し、図４４の棒グラフに見られるように、ｈＰＵＬＣＦＡ陽性抽出物で処理した試料中では低減されているが、ｈＰＵＬＣＦＡ陰性抽出物で処理した試料中では低減されていないことが分かった。この結果は、ＴＮＦアルファを介して評価した際、ｈＰＵＬＣＦＡ含有抽出物が炎症から保護する能力を有することを示唆している。第二の炎症促進性マーカーである誘導性一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ２）のレベルを、ＬＰＳ並びにｈＰＵＬＣＦＡ陽性及び陰性画分を用いる併用治療後にウエスタンブロット分析によって計測した。図４５のトップペインにおいて見られるように、ｈＰＵＬＣＦＡ富化抽出物は、ＲＡＷ細胞中のＬＰＳ誘導性ＮＯＳ２を低減させる。該図のボトムペインは、対応するPonceau S染色ゲルを示す。この結果も、ｈＰＵＬＣＦＡについての抗炎症性役割と一致する。
【０１５６】
図４６は、ｈＰＵＬＣＦＡ陽性抽出物が、細胞の馴化培地中における亜硝酸塩レベルを用量依存的方式で低減させることを示す。亜硝酸塩は、種々の有機化合物と反応して、ニトロソアミン及び変異原性であってよい他の硝酸塩ラジカルを形成し得る、一酸化窒素の安定代謝産物である。一酸化窒素（ＮＯ，Nitric oxide）は、上記で述べた通り、ｈＰＵＬＣＦＡ陽性抽出物によってタンパク質レベルで阻害される（図４５）一酸化窒素シンターゼによっても生成される。留意すべきことに、ＮＯは細菌感染等の種々の炎症性応答中に誘導されるものであり、結腸がんの原因として直接的に関わっているとされてきた（Erdman et al, PNAS, Jan 27, 2009, vol 106 No.4）。
【０１５７】
３．ｈＰＵＬＣＦＡ  Ｄ０４６−１２４の合成
構造：
【０１５８】
【化１４】
2013500275.tif 000029
【０１５９】
分子式  Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４
ＬＣＭＳ純度  ９８．７％
【０１６０】
断片Ａの合成スキーム：
【０１６１】
【化１５】
2013500275.tif 000030
【０１６２】
断片Ｂの合成スキーム：
【０１６３】
【化１６】
2013500275.tif 000031
【０１６４】
断片Ｃの合成スキーム：
【０１６５】
【化１７】
2013500275.tif 000032
【０１６６】
Ｄ０４６−１２４（本明細書においてはＧＶＫ−ＦＦＳ−０９−０６−ＰＨＭとも称される）の合成スキーム：
【０１６７】
【化１８】
2013500275.tif 000033
【０１６８】
ステップ１：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−０１５Ａ２
【０１６９】
【化１９】
2013500275.tif 000034
【０１７０】
手順：ベンゼン（４００ｍｌ）中の化合物１（２５０ｇ、２．９０６ｍｏｌ）の溶液に、ピリジン（２６２ｍｌ、３．１９６ｍｏｌ）、続いてＳＯＣｌ２（２２５ｍｌ、３．１９６ｍｏｌ）を０℃で添加し、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで室温で終夜撹拌した（溶媒系  石油エーテル中２０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．５）。
【０１７１】
ワークアップ：反応が完了したら、反応混合物を氷冷水でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ×３）で抽出し、合わせた有機層を、ＮａＨＣＯ３溶液、水（３００ｍｌ×２）及びブライン（２００ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物２（１００ｇ）を３０％収率で淡褐色油（Ｂ０６４−０１５Ａ２）として産生した。
【０１７２】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．１８（ｓ，２Ｈ）、４．３４（ｓ，２Ｈ）（図４７及び４８）。
【０１７３】
ステップ２：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−０１７Ａ２
【０１７４】
【化２０】
2013500275.tif 000035
【０１７５】
手順：アセトン（５０ｍｌ）中の化合物２（５ｇ、４８．０７ｍｍｏｌ）にＮａＢｒ（７．３ｇ、７２．１１ｍｍｏｌ）を添加し、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで終夜還流させた（溶媒系  石油エーテル中２０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．３）。
【０１７６】
ワークアップ：反応が完了したら、溶媒を減圧下で濃縮し、ＤＣＭ（５０ｍｌ）で希釈し、水（５０ｍｌ×２）及びブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物３（４ｇ）を７０％収率で無色油（Ｂ０６４−０１７Ａ２）として得た。
【０１７７】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ：４．３（ｓ，２Ｈ）、４．４５（ｓ，２Ｈ）（図４９）。
【０１７８】
ステップ３：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−０２５Ａ１
【０１７９】
【化２１】
2013500275.tif 000036
【０１８０】
手順：ＤＣＭ（１．５リットル）中の化合物３（１５０ｇ、１．００ｍｏｌ）に、ｐＴＳＡ（１．９ｇ、１０．０６ｍｍｏｌ）を０℃で、続いてＤＨＰ（９１ｍｌ、１．００６ｍｏｌ）を滴下添加し、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで室温で終夜撹拌した（溶媒系  石油エーテル中２０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．８）。
【０１８１】
ワークアップ：反応が完了したら、反応混合物をＤＣＭ（５００ｍｌ）で希釈し、水（５００ｍｌ×２）及びブライン（５００ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して粗化合物を得、これをシリカゲル（１００〜２００メッシュ）カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、化合物４（２３４．５ｇ）を８５％収率で無色油（Ｂ０６４−０２５Ａ１）として産生した。
【０１８２】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．５〜１．７９（ｍ，４Ｈ）、１．８〜１．９（ｍ．４Ｈ）、４．０（ｍ，２Ｈ）、４．２（ｍ，２Ｈ）、４．８（ｍ，１Ｈ）（図５０）。
【０１８３】
ステップ４：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−０３４Ａ２
【０１８４】
【化２２】
2013500275.tif 000037
【０１８５】
手順：ＴＨＦ（５００ｍｌ）中の亜鉛（１３９ｇ、２．１４５ｍｏｌ）の懸濁液に、ＨｇＣｌ２（３０ｍｇ）を添加し、１０分間撹拌し、次いで化合物４（２００ｇ、０．８５８ｍｏｌ）、続いてＴＨＦ（１リットル）中のブチルアルデヒド（９２ｍｌ、１．０３０ｍｏｌ）を還流条件下で添加し、次いで、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで室温で終夜撹拌を続けた（溶媒系  石油エーテル中２０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．８）。
【０１８６】
ワークアップ：反応が完了したら、反応混合物をＡｃＯＨでクエンチし、化合物をＥｔＯＡｃ（５００ｍｌ×２）で抽出し、水（５００ｍｌ×２）及びブライン（５００ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して粗化合物を得、これをシリカゲル（１００〜２００サイズ）カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、化合物５（３５ｇ）を２５％収率で淡黄色油（Ｂ０６４−０３４Ａ２）として産生した。
【０１８７】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．９（ｓ，３Ｈ）、１．２〜１．８（ｍ，１１Ｈ）、３．５（ｍ，１Ｈ）、３．７〜３．９（ｍ，２Ｈ）、４．０〜４．３（ｍ，４Ｈ）（図５１）。
【０１８８】
ステップ５：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−０４２Ａ１
【０１８９】
【化２３】
2013500275.tif 000038
【０１９０】
手順：ＤＣＭ（３５０ｍｌ）中の化合物５（３５ｇ、１５．４８６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、イミダゾール（２６ｇ、３８．７１ｍｍｏｌ）、続いてｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（ＴＢＤＰＳＣｌ）（４３ｍｌ、１７．０３５ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで室温で終夜撹拌した（溶媒系  石油エーテル中２０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．８）。
【０１９１】
ワークアップ：反応が完了したら、反応混合物をＤＣＭ（１００ｍｌ×２）で希釈し、水（２００ｍｌ×２）及びブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物６（７５ｇ、８５％）を淡黄色液体（Ｂ０６４−０４２Ａ１）として産生した。
【０１９２】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．９（ｔ，３Ｈ）、１．１（ｍ，１７Ｈ）、１．３（ｍ，１Ｈ）、１．５（ｍ，２Ｈ）、１．８（ｍ，１Ｈ）、２．３（ｍ，１Ｈ）、３．８（ｍ，２Ｈ）、４．２（ｍ，２Ｈ）、４．４（ｓ，１Ｈ）、７．４（ｍ，６Ｈ）、７．７（ｍ，４Ｈ）（図５２）。
【０１９３】
ステップ６：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−０４９Ａ２
【０１９４】
【化２４】
2013500275.tif 000039
【０１９５】
手順：２−プロパノール（２．５リットル）及びジエチルエーテル（１．２５リットル）中の化合物６（７５ｇ、１６１．６３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ｐＴＳＡ（３ｇ、１６．１６３ｍｍｏｌ）を添加し、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで室温で７２時間撹拌した（溶媒系  石油エーテル中１０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．４）。
【０１９６】
ワークアップ：反応が完了したら、反応混合物をＮａＨＣＯ３溶液でクエンチし、濃縮した。残留物をＤＣＭ（３００ｍｌ×２）で抽出し、水（２００ｍｌ×２）及びブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮し、シリカゲル（１００〜２００メッシュ）クロマトグラフィーで精製して、化合物７（２７ｇ、４３％）を淡黄色液体（Ｂ０６４−０４９Ａ２）として産生した。
【０１９７】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．８（ｔ，３Ｈ）、１．１（ｓ，９Ｈ）、１．３（ｍ，２Ｈ）、１．６（ｍ，２Ｈ）、２．３（ｍ，２Ｈ）、３．９（ｍ，１Ｈ）、４．２（ｍ，２Ｈ）、７．４（ｍ，６Ｈ）、７．７（ｍ，４Ｈ）。ＬＣＭＳ：７９％純度、ｍ／ｚ＝２５１（ｍ＋１）。（図５３〜５５）。
【０１９８】
ステップ７：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−０５１Ａ２
【０１９９】
【化２５】
2013500275.tif 000040
【０２００】
手順：ＤＣＭ（１００ｍｌ）中の化合物７（１２ｇ、３１．５７８ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＤＭＰ（１６ｇ、３４．７３６ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで室温で３０分間撹拌した（溶媒系  石油エーテル中１０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．５）。
【０２０１】
ワークアップ：反応が完了したら、反応混合物をＤＣＭ（１００ｍｌ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３溶液、水（２００ｍｌ×２）及びブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮し、次いでシリカゲル（１００〜２００メッシュ）クロマトグラフィーによって精製して、断片Ａ（８ｇ、７５％）を淡黄色液体（Ｂ０６４−０５１Ａ２）として産生した。
【０２０２】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．８（ｔ，３Ｈ）、１．１（ｓ，９Ｈ）、１．３（ｍ，２Ｈ）、１．６（ｍ，２Ｈ）、２．５（ｍ，２Ｈ）、３．９（ｍ，１Ｈ）、７．４（ｍ，６Ｈ）、７．７（ｍ，４Ｈ）、９．１（ｓ，１Ｈ）ＬＣＭＳ：７５％純度、ｍ／ｚ＝３７９（ｍ＋１）（図５６〜５８）。
【０２０３】
ステップ８：
ＬＮＢ参照番号：ＧＫ−ＰＨＭ−０３０Ａ１
【０２０４】
【化２６】
2013500275.tif 000041
【０２０５】
手順：クロロホルム（１００ｍｌ）中の化合物８（２５ｇ、１２６．２６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、臭素（３０ｍｌ、６３１ｍｍｏｌ）を滴下添加し、室温で２時間撹拌した。次いで、これを減圧下で濃縮して、残留物をエタノール（２００ｍｌ）に溶解し、ＫＯＨ（９０ｇ）を添加し、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで８０℃で３時間撹拌した（石油エーテル中２０％ＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．６）。
【０２０６】
ワークアップ：反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた粗製物を６Ｎ  ＨＣｌ（３０ｍｌ）で酸性化し、酢酸エチル（３５０ｍｌ）で抽出した。有機層を水（１００ｍｌ）及びブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物９（１８ｇ、７８％）を淡褐色油（ＧＫ−ＰＨＭ−０３０Ａ１）として産生した。これを、それ以上精製することなく次のステップにおいて直接使用した。
【０２０７】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．３（ｍ，９Ｈ）、１．５（ｍ，２Ｈ）、１．６〜１．７（ｍ，２Ｈ）、２．０（ｍ，１Ｈ）、２．２（ｍ，１Ｈ）、２．４（ｍ，２Ｈ）。質量：ｍ／ｚ＝１８３（ｍ＋１）（図５９〜６１）。
【０２０８】
ステップ９：
ＬＮＢ参照番号：ＧＫ−ＰＨＭ−０３２Ａ２
【０２０９】
【化２７】
2013500275.tif 000042
【０２１０】
手順：メタノール（２００ｍｌ）中の化合物９（１８ｇ、９８．９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＳＯＣｌ２（２３．５ｇ、１９７．８ｍｍｏｌ）を０℃で滴下添加し、次いで、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで終夜還流させた（石油エーテル中２０％ＥｔＯＡｃ、Ｒｆ：０．７）。
【０２１１】
ワークアップ：反応混合物を濃縮し、ＤＣＭ（２００ｍｌ）で抽出し、次いで、ＮａＨＣＯ３溶液、水（２００ｍｌ×２）及びブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して粗化合物を手に入れ、シリカゲル（１００〜２００メッシュ）を使用するカラムクロマトグラフィーによってこれをさらに精製して、断片Ｂ（１４ｇ、７２％）を淡黄色油（ＧＫ−ＰＨＭ−０３２Ａ２）として産生した。
【０２１２】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．３（ｍ，７Ｈ）、１．４（ｍ，２Ｈ）、１．５〜１．６（ｍ，２Ｈ）、１．７（ｍ，２Ｈ）、２．１（ｍ，１Ｈ）、２．２（ｍ，１Ｈ）、２．３（ｍ，２Ｈ）。ＩＲ（ｃｍ−１）：６３４，７０４，７４１，７２４，１０１６，１１７２，１１９６，１２４０，１３６２，１４３６，１６２１，１７３９，２１１７，２８５６，２９３０，３３０５，３４５７。質量：ｍ／ｚ＝１９７（ｍ＋１）（図６２〜６４）。
【０２１３】
ステップ１０：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−０１５Ａ２
【０２１４】
【化２８】
2013500275.tif 000043
【０２１５】
手順：ベンゼン（４００ｍｌ）中の化合物１０（２５０ｍｇ、２．９０６ｍｏｌ）の溶液に、ピリジン（２６２ｍｌ、３．１９６ｍｏｌ）、続いてＳＯＣｌ２（２２５ｍｌ、３．１９６ｍｏｌ）を０℃で添加し、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで室温で終夜撹拌した（溶媒系  石油エーテル中２０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．５）。
【０２１６】
ワークアップ：反応が完了したら、反応混合物を氷冷水でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ×３）で抽出し、合わせた有機層を、ＮａＨＣＯ３溶液、水（３００ｍｌ×２）、ブライン（２００ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物１１（１００ｇ）を３０％収率で産生した。
【０２１７】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．２（Ｓ，２Ｈ）、４．３（ｓ，２Ｈ）（図６５〜６６）。
【０２１８】
ステップ１１：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−０６４Ａ２
【０２１９】
【化２９】
2013500275.tif 000044
【０２２０】
手順：乾燥ＤＭＦ（７０ｍｌ）中の画分Ｂ（７．５４ｇ、３８．４６１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＩ（７．４９ｇ、４９．９９ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（１６．２８ｍｍｏｌ）及びＣｕＩ（９．５２ｇ、４９．９９ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、２０分間撹拌した。次いで、化合物１１（４ｇ、３８．４６１ｍｍｏｌ）を添加し、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで室温で終夜撹拌した（溶媒系  石油エーテル中３０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．３）。
【０２２１】
ワークアップ：反応が完了したら、反応混合物をＮＨ４Ｃｌ溶液（１００ｍｌ）でクエンチし、ジエチルエーテル（２００ｍｌ×３）で抽出し、合わせた有機層を水（１００ｍｌ×２）及びブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して粗化合物を産出し、これをシリカゲル（１００〜２００メッシュ）カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、化合物１２（４．５ｇ、４３％）を無色油（Ｂ０６４−０６４Ａ２）として産生した。
【０２２２】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ：１．２（ｍ，８Ｈ）、１．４（ｍ，２Ｈ）、１．５（ｍ，２Ｈ）、２．１（ｍ，２Ｈ）、２．３（ｍ，２Ｈ）、３．２（ｍ，２Ｈ）、３．６（ｓ，３Ｈ）、４．１（ｍ，２Ｈ）、５．１（ｂｓ，１Ｈ）。ＬＣＭＳ：４２％純度、ｍ／ｚ＝２６５（ｍ＋１）（図６７〜６９）。
【０２２３】
ステップ１２：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−１１４Ａ２
【０２２４】
【化３０】
2013500275.tif 000045
【０２２５】
手順：Ｐｄ／ＢａＳＯ４（２５０ｍｇ）を、乾燥メタノール（５０ｍｌ）中の化合物１２（５ｇ）の撹拌溶液に添加し、Ｈ２圧力下、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで室温で６時間撹拌した（溶媒系  石油エーテル中３０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．４）。
【０２２６】
ワークアップ：反応が完了したら、反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、メタノール（２０ｍｌ×３）で洗浄し、濾液を減圧下で濃縮して粗生成物を得、これをシリカゲル（１００〜２００メッシュ）カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、化合物１３（３．６ｇ）を６８％収率で無色油（Ｂ０６４−１１４Ａ２）として産生した。
【０２２７】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．３（ｍ，１０Ｈ）、１．６（ｍ，２Ｈ）、２．１（ｍ，２Ｈ）、２．３（ｍ，２Ｈ）、２．８（ｍ，２Ｈ）、３．７（ｓ，３Ｈ）、４．３（ｍ，２Ｈ）、５．３〜５．５，（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝７．１）、５．５〜５．７（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝６．４）、ＬＣＭＳ：９４．７５％純度、ｍ／ｚ＝２６８（ｍ＋１）（図７０〜７２）。
【０２２８】
ステップ１３：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−１２３Ａ２
【０２２９】
【化３１】
2013500275.tif 000046
【０２３０】
手順：ＤＣＭ（６０ｍｌ）中の化合物１３（４．１ｇ、１５．２９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＰＰｈ３（５．２１ｇ、１９．８７ｍｍｏｌ）、続いてトリクロロアセトニトリル（４．４ｇ、３０．５９ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで室温で６時間撹拌した（溶媒系  石油エーテル中３０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．８）。
【０２３１】
ワークアップ：反応が完了したら、反応混合物をＤＣＭ（５０ｍｌ）で希釈し、水（１００ｍｌ×２）及びブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、次いで減圧下で濃縮して粗化合物を得、これをシリカゲル（１００〜２００メッシュ）カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、断片Ｃ（３．１ｇ）を７０％収率で無色油（Ｂ０６４−１２３Ａ２）として産生した。
【０２３２】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．２（ｍ，１０Ｈ）、１．６（ｍ，２Ｈ）、２（ｍ，２Ｈ）、２．３（ｍ，２Ｈ）、２．９（ｍ，２Ｈ）、３．７（ｓ，３Ｈ）、４．１（ｍ，２Ｈ）、５．３〜５．５（ｍ，２Ｈ  Ｊ＝１０．６）、５．７（ｍ，２Ｈ  Ｊ＝１０．８）。ＬＣＭＳ：７８％純度、ｍ／ｚ＝２８６（ｍ＋１）（図７３〜７６）。
【０２３３】
ステップ１４：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−０５５Ａ１
【０２３４】
【化３２】
2013500275.tif 000047
【０２３５】
手順：乾燥ＴＨＦ（３５ｍｌ）中の化合物１４（２．５５ｇ、１８．３８２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＥｔＭｇＢｒ（６．８ｍｌ、２０．２２ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、２０分間撹拌し、次いで、乾燥ＴＨＦ（３５ｍｌ）中の断片Ａ（６．９ｇ、１８．３８２ｍｍｏｌ）を添加し、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで室温で終夜撹拌を続けた（溶媒系  石油エーテル中２０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．５）。
【０２３６】
ワークアップ：反応が完了したら、反応混合物をＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で抽出し、水（１００ｍｌ×２）及びブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、次いで、溶媒を減圧下で除去して、化合物１５（９．３ｇ、９８％）を褐色油（Ｂ０６４−０５５Ａ１）として産生した。
【０２３７】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．２（ｓ，９Ｈ）、０．８（ｔ，３Ｈ）、１．１（ｓ，９Ｈ）、１．３（ｍ，２Ｈ）、１．６（ｍ，３Ｈ）、１．９（ｍ，１Ｈ）、２．３（ｍ，２Ｈ）、３．３（ｍ，２Ｈ）、３．９（ｍ，１Ｈ）、５（ｂｓ，１Ｈ）、７．４（ｍ，６Ｈ）、７．７（ｍ，４Ｈ）。ＬＣＭＳ：５２．６％純度、ｍ／ｚ＝５３１（ｍ＋１）（図７７〜７９）。
【０２３８】
ステップ１５：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−０５７Ａ２
【０２３９】
【化３３】
2013500275.tif 000048
【０２４０】
手順：乾燥ＴＨＦ（５０ｍｌ）中の化合物１５（４．６ｇ、８．９４９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＴＢＡＦ（２２ｍｌ、２２．３７ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで室温で終夜撹拌した（溶媒系  石油エーテル中５０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．５）。
【０２４１】
ワークアップ：反応が完了したら、反応混合物を水でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で抽出し、有機層を水（１００ｍｌ×２）、ブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、次いで減圧下で濃縮して、化合物１６（２．４５ｇ、６４％）を褐色油（Ｂ０６４−０５７Ａ２）として産生した。
【０２４２】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ：０．９（ｔ，３Ｈ）、１．２〜１．６（ｍ，５Ｈ）、２．３（ｍ，２Ｈ）、２．６（ｍ，２Ｈ）、３．５（ｂｓ，１Ｈ）、４．４（ｍ，１Ｈ）、４．６（ｍ，１Ｈ）、５．６（ｍ，１Ｈ）（図８０〜８２）。
【０２４３】
ステップ１６：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−１２５Ａ２
【０２４４】
【化３４】
2013500275.tif 000049
【０２４５】
手順：乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の化合物１６（０．９１１ｇ、４．４６５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＮａＩ（０．８７ｇ、５．８０４ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（１．８５ｇ、５．８０４ｍｍｏｌ）及びＣｕＩ（１．１６ｇ、５．８０４ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、２０分間撹拌し、次いで、乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の断片Ｃ（１．２７ｇ、４．４６５ｍｍｏｌ）を添加し、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで室温で終夜撹拌し続けた（溶媒系  石油エーテル中５０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．５）。
【０２４６】
ワークアップ：反応が完了したら、反応混合物をＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチし、ジエチルエーテル（５０ｍｌ×２）で抽出し、水（１００ｍｌ×２）及びブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これをシリカゲル（１００〜２００メッシュ）カラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、化合物１７（１．２２ｇ、６０％）を淡褐色油（Ｂ０６４−１２５Ａ２）として産生した。
【０２４７】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．９（ｔ，３Ｈ）、１．３（ｍ，１０Ｈ）、１．６（ｍ，１０Ｈ）、２．１（ｍ，２Ｈ）、２．３〜２．４（ｍ，３Ｈ）、２．７〜２．８（ｍ，３Ｈ）、３．１（ｍ，２Ｈ）、３．７（ｓ，３Ｈ）、３．８（ｂｓ，１Ｈ）、４．５（ｂｓ，１Ｈ）、５．３〜５．６（ｍ，４Ｈ，Ｊ＝６．４）。ＬＣＭＳ：９０％純度、ｍ／ｚ＝４７３（ｍ＋１）（図８３〜８５）。
【０２４８】
ステップ１７：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−１３１Ａ２−Ｆｒ−２
【０２４９】
【化３５】
2013500275.tif 000050
【０２５０】
手順：乾燥メタノール（１８ｍｌ）中の化合物１７（７３０ｍｇ）の撹拌溶液に、Ｐｄ／ＣａＣＯ３（１４０ｍｇ）を添加し、Ｈ２圧力下、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで室温で１時間撹拌した（溶媒系  石油エーテル中３０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．５）。
【０２５１】
ワークアップ：反応が完了したら、反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、メタノール（２０ｍｌ×２）で洗浄し、減圧下３０℃で濃縮して粗化合物１８（１．２ｇ）を産生し、分取ＨＰＬＣによってさらに精製して、純粋な化合物１８（１２０ｍｇ）を１０％収率で無色油（Ｂ０６４−１３１Ａ２−Ｆｒ−２）として産生した。
【０２５２】
特徴付け：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．９（ｔ，３Ｈ）１．３（ｍ，８Ｈ）１．６（ｍ，９Ｈ）２．１（ｍ，５Ｈ）２．３（ｍ，４Ｈ）２．５（ｍ，３Ｈ）２．８〜３．０（ｍ，３Ｈ）３．６（ｓ，３Ｈ）４．５（ｍ，１Ｈ）５．４（ｍ，６Ｈ）５．７〜５．８（ｍ，２Ｈ）６．３〜６．５（ｍ，１Ｈ  Ｊ＝１１）。ＬＣＭＳ：９９％純度、ｍ／ｚ＝４６１（ｍ＋１）（図８６〜８８）。
【０２５３】
ステップ１８：
ＬＮＢ参照番号：Ｂ０６４−１３６Ａ２
【０２５４】
【化３６】
2013500275.tif 000051
【０２５５】
手順：ＬｉＯＨ．Ｈ２Ｏ（５５ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を、メタノール（１０ｍｌ）及び水（５ｍｌ））中の化合物１８（１２０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に０℃で添加し、出発材料がＴＬＣ上で消失するまで室温で終夜撹拌し続けた（溶媒系  石油エーテル中３０％ＥｔＯＡｃ、生成物Ｒｆ＝０．１）。
【０２５６】
ワークアップ：反応が完了したら、溶媒を減圧下３０℃で留去し、次いでＨＣｌのエーテル溶液で酸性化しそして濃縮して１６０ｍｇの粗生成物を産生し、これを分取ＨＰＬＣによってさらに精製して、Ｄ０４６−１２４（１１ｍｇ、９％）を無色油（Ｂ０６４−１３６Ａ２）として産生した。
【０２５７】
特徴付け：ＬＣＭＳ：９８．７％純度、ｍ／ｚ＝４４５（ｍ−１）（図８９〜９０）。
【０２５８】
１又は２以上の現在好ましい実施形態を例として記載してきた。請求項において定義されている通りの本発明の範囲から逸脱することなく、複数の変形及び修正が為され得ることが、当業者には明らかとなるであろう。
【０２５９】
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【図１】
2013500275.tif 000114
【図２】
2013500275.tif 000115
【図３】
2013500275.tif 000116
【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
2013500275.tif 000118
【図５Ｃ−Ｄ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ−Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
2013500275.tif 000200
【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【配列表】
2013500275000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月12日(2012.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2013500275.tif 000206
(I)
［式中、Ｒが、炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含有するヒドロキシ置換Ｃ２４−Ｃ４０直鎖脂肪族基を表し、前記鎖中の少なくとも１個の炭素が、ヒドロキシ基で置換されている］。
【請求項２】
ＲがＣ２８−Ｃ３６脂肪族基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
鎖中の２、３又は４個の炭素がヒドロキシ基で置換されている、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
下記構造群：
【化２】
2013500275.tif 000207
から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
検出剤で標識された、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
検出剤で標識された、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又はそのいずれか２以上の混合物を含む基準物質。
【請求項７】
検出剤が、インビトロ又はインビボにおける検出を可能にする、安定同位体若しくは放射性同位体、酵素、又はタンパク質である、請求項６に記載の基準物質。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の基準物質と、分析物を定量化するため、又は診断検査を実施するための取扱説明書とを含むキット。
【請求項９】
薬学的に許容される担体又は賦形剤と、請求項１〜４のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物とを含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物によって定義されるとおりの２以上の化合物を含む組合せ。
【請求項１１】
医薬組合せ、栄養補給剤、栄養補助食品又は機能性食品として製剤化される、請求項１０に記載の組合せ。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物を含む、結腸直腸がん（ＣＲＣ）の治療又は予防剤。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物を含む、腫瘍の成長阻害剤。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物を含む、胃腸（ＧＩ）障害の治療又は予防剤。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物を含む、炎症及び／又は炎症に関係する障害の治療又は予防剤。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物を含む、水酸化多価不飽和超長鎖脂肪酸（ｈＰＵＬＣＦＡ）欠乏障害（ｈＰＤＤ）の治療又は予防剤。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物を含む、ｈＰＵＬＣＦＡレベルの上昇又は修復剤。
【請求項１８】
【化３】
2013500275.tif 000208
からなる群から選択される化合物、又は化合物Ｄ０４６−１２４の合成における中間体。
【請求項１９】
化合物Ｄ０４６−１２４：
【化４】
2013500275.tif 000209
(D046-124)
を調製するための方法であって、
（ｉ）式（II）の化合物：
【化５】
2013500275.tif 000210
(II)
と式（III）の化合物：
【化６】
2013500275.tif 000211
(III)
とを、式（IV）の化合物：
【化７】
2013500275.tif 000212
(IV)
を生成するための条件下で反応させるステップと、
（ii）ＴＢＤＰＳ基を除去して式（Ｖ）の化合物：
【化８】
2013500275.tif 000213
(V)
を生成するステップと、
（iii）前記式（Ｖ）の化合物と式（VI）の化合物：
【化９】
2013500275.tif 000214
(VI)
とを、式（VII）の化合物：
【化１０】
2013500275.tif 000215
(VII)
を生成するための条件下で反応させるステップと、
（iv）前記式（VII）の化合物を触媒と、式（VIII）の化合物：
【化１１】
2013500275.tif 000216
(VIII)
を生成するための条件下で反応させ、任意選択で前記触媒がＰｄ触媒であり、さらに任意選択で、炭酸カルシウムの存在下、１気圧の水素下で反応させて、三重結合を二重結合へ選択的に変換し、それによって式（VIII）の化合物を生成するステップと、
（ｖ）前記式（VIII）の化合物の末端エステル官能基を加水分解してカルボン酸基とし、それによって表題化合物を生成するステップと、
（vi）任意選択で、表題化合物を単離するための１又は２以上の精製を行うステップと
を含む、前記方法。
【国際調査報告】
2013500275.tif 000217
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