(57)【要約】  燃料組成物の成分としての生物学的に製造されるイソブタノールは、再生可能な成分を燃料組成物に含めるための価値ある手段となり、それと同時に、燃料組成物が所与の環境域を汚染する場合に燃料組成物による環境影響が低減されるようにする。
2013529242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭化水素燃料組成物の再生可能性を増大させるための、また該炭化水素燃料組成物によって汚染されるときの環境領域への影響を制限するための方法であって、該炭化水素燃料組成物の生分解性を増大させるために該炭化水素燃料組成物に適した量のイソブタノールを添加する工程を含む、上記方法。
【請求項２】
炭化水素燃料組成物がエタノールをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エタノールが、イソブタノールの添加前に燃料組成物の最高で約１０％までを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
イソブタノールが、炭化水素燃料組成物のＢＴＥＸ成分の少なくとも１つの改善された生分解を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
イソブタノールが、ベンゼンの改善された生分解を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
環境領域が土壌マトリックスを含み、ここでイソブタノールの添加が土壌マトリックス中のエタノールの輸送を低減する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
イソブタノールの添加が、前記組成物からのＢＴＥＸプルームの拡大を妨げる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
イソブタノールの添加が、炭化水素燃料組成物の様々な成分の生分解性を増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
改善された生分解が好気性条件下で生じる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１０】
改善された生分解が硝酸還元条件または硫酸還元条件下で生じる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１１】
嫌気性条件下の環境領域にあるイソブタノール含有炭化水素燃料組成物の環境運命を改善する方法であって、１つまたはそれより多いＢＴＥＸ成分の生分解速度を増大させるのに十分な量で電子受容体を該領域に加えることを含む、上記方法。
【請求項１２】
電子受容体が、鉄、硫酸塩、もしくは硝酸塩、またはそれらの組合せである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
電子受容体がＦｅ（ＯＨ）３である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
電子受容体がＮａＮＯ３である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
電子受容体がＭｇＳＯ４である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
１つまたはそれより多いＢＴＥＸ成分がトルエンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
１つまたはそれより多いＢＴＥＸ成分がキシレンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
１つまたはそれより多いＢＴＥＸ成分がベンゼンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
電子受容体が硝酸塩であり、それを硝酸還元条件を作り出すのに十分な量で加える、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
電子受容体が硫酸塩であり、それが硫酸還元条件を作り出すのに十分な量で存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
電子受容体が硝酸塩であり、それが硝酸還元条件を作り出すのに十分な量で存在し、ここでトルエンがイソブタノールとほぼ同じ日数で生分解する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
電子受容体が硫酸塩であり、それが硫酸還元条件を作り出すのに十分な量だけ存在し、ここでトルエンがイソブタノールとほぼ同じ日数で生分解する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
電子受容体が硝酸塩であり、それが硝酸還元条件を作り出すのに十分な量だけ存在し、ここでベンゼンがイソブタノールとほぼ同じ日数で生分解する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
電子受容体が硫酸塩であり、それが硫酸還元条件を作り出すのに十分な量だけ存在し、ここでベンゼンの生分解が、硫酸還元条件なしのその生分解と比べて改善される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
電子受容体が硫酸塩であり、それが硫酸還元条件を作り出すのに十分な量だけ存在し、ここでベンゼンの生分解がイソブタノールの非存在下でのその生分解と比べて改善される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
電子受容体が硫酸塩であり、それが硫酸還元条件を作り出すのに十分な量だけ存在し、ここでベンゼンの生分解がエタノールの存在下でのその生分解と比べて改善される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２７】
ガソリンとイソブタノールと、Ｆｅ（ＯＨ）３、ＮａＮＯ３、またはＭｇＳＯ４の少なくとも１種とを含む組成物。
【請求項２８】
ガソリンとイソブタノールと、Ｆｅ（ＯＨ）３、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、ＮＨＮＯ３、Ｎａ２ＳＯ４、ＣａＳＯ４、ＭｇＳＯ４、キレート化鉄、ゼロ価の鉄、およびゼロ価のナノ鉄の少なくとも１種とを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年５月２１日出願の米国仮出願第６１／３４７，１２７号明細書に関連し、その優先権を主張するものであり、その全体を本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、再生可能な燃料組成物の分野および環境における前記組成物の運命に関する。
【背景技術】
【０００３】
イソブタノールは、ガソリンに用いるのに適した生物燃料分子として魅力的なものである。なぜなら、再生可能な供給原料から製造でき、その多くの特性により、潜在的にエタノールよりも魅力的な燃料添加物となるからであり、さらに、エネルギー密度が高く、吸水率が低く、混合をうまく行うことができ、改質しなくても従来の燃焼機関に使用できるからである（非特許文献１）。ガソリン成分の環境運命に対するエタノールの効果の評価により、好気系では、ガソリンの成分であるベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、およびキシレン（ＢＴＥＸ）よりも前に、燃料エタノールが優先的に生分解されること、さらに帯水層中のエタノール分解によって溶存酸素および他の栄養素が急速に消費されることが実証された（非特許文献２；３；４）。そのせいで、ガソリン中にエタノールが存在すると、ＢＴＥＸの分解が遅れ、最終的に、ＢＴＥＸプルームの拡大が起こりうる（非特許文献５）。Ｄｅｅｂらによるモデルシミュレーション（非特許文献６）では、エタノールの存在下においてベンゼンのプルーム長が１６〜３４％増大することが予測されたが、他の人々は、エタノールでの増殖によって多くの微生物菌が生み出される場合、ガソリン中のエタノール濃度が高くなるにつれてベンゼンのプルームの寿命が減少しうることを示唆した（非特許文献７）。
【０００４】
Ｍａｒｉａｎｏとその同僚らによる研究（非特許文献８）では、間接測定（ＣＯ２放出および染料の還元）を使用して、汚染されていない土壌、河川水、または汚染されていない土壌と河川水の組合せを含んでいる好気性ミクロコスムにおけるガソリンの生分解に対するｎ−ブタノールの影響が評価された。その研究の結果は、ｎ−ブタノールにより土壌中のガソリンの分解が促進されうること、またその促進係数はエタノールで得られるものよりも大きいものでありうることを示唆した。Ｇａｒｃｉａ−Ｒｉｖｅｒｏら（非特許文献９）によって得られた結果も、ｎ−ブタノールを炭化水素混合物に添加すると、炭化水素の好気性生分解の速度が向上しうることを示唆している。１９７０年代に行われた研究では、生物学的酸素要求量（ＢＯＤ）に基づく測定値を使用してイソブタノールの生分解が評価された（非特許文献１０；１１）。また幾つかの研究（以下と比較：非特許文献１２；１３；１４；１５）では、ガソリン燃焼促進物質のメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）の１次生分解生成物であるｔｅｒｔ−ブチルアルコール（ＴＢＡ）の生分解が評価された（非特許文献１６；１７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｕｒｒｅ，２００７，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．２：１５２５−１５７８
【非特許文献２】Ｃｏｒｓｅｕｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｗａｔ．Ｒｅｓ．３２：２０６５−２０７２
【非特許文献３】Ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ａｎｄ  Ａｌｖａｒｅｚ，２００２，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：４７２０−４７２６
【非特許文献４】Ｃａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｗａｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４１：６５６−６６４
【非特許文献５】Ｐｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３５：２４Ａ−３０Ａ．
【非特許文献６】２００２，Ｊ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｅｎｇｉｎ．１２８：８６８−８７５
【非特許文献７】Ｇｏｍｅｚ  ａｎｄ  Ａｌｖａｒｅｚ，２００９，Ｗａｔｅｒ  Ｒｅｓｏｕｒ．Ｒｅｓ．４５
【非特許文献８】２００９，Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ，３３：１１７５−１１８１
【非特許文献９】２００７，Ｊ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．６：３８９−３９５
【非特許文献１０】Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ  １９７４，Ｊ．Ｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｌｕｔ．Ｃｏｎｔｒ．Ｆｅｄ．４６，６３−７７
【非特許文献１１】Ｄｉａｓ  ａｎｄ  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，１９７１，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２：１１１４−１１１８
【非特許文献１２】Ｄｅｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，１１；１７１−１８５
【非特許文献１３】Ｐｒｕｄｅｎ  ａｎｄ  Ｓｕｉｄａｎ，２００４，Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，１５：２１３−２２７
【非特許文献１４】Ｓｏｍｓａｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３９：１０３−１０９
【非特許文献１５】Ｖａｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｅｎｇ．１２８：８４２−８５１
【非特許文献１６】Ｈａｔｚｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５６０１−５６０７
【非特許文献１７】Ｓｔｅｆｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４２１６−４２２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ガソリンの再生可能成分を増やすこと、及び／または環境が汚染される状況において燃料組成物の環境運命に関連して環境に悪影響が生じないように前記組成物を輸送することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、炭化水素燃料組成物の再生可能性（ｒｅｎｅｗａｂｉｌｉｔｙ）を向上させると共に環境放出の状況下における前記燃料組成物の環境運命を改善するための方法および組成物を提供する。
【０００８】
本発明の一態様は、イソブタノールを炭化水素燃料組成物に含有させて、ガソリンの１種または複数種のＢＴＥＸ化合物の生分解性を改善することによって、前記組成物の環境運命を改善する方法である。１つの態様では、こうした方法および組成物により、嫌気条件下で改善された生分解がもたらされる。１つの態様では、こうした方法および組成物により、好気条件下で改善された生分解がもたらされる。１つの態様では、こうした方法および組成物により、硝酸塩還元条件下で改善された生分解がもたらされる。１つの態様では、炭化水素燃料組成物中にイソブタノールを含有させると、ベンゼンの生分解が改善される。
【０００９】
本発明の別の態様は、エタノールを含む液体燃料組成物にイソブタノールを添加して、ガソリンの１種または複数種のＢＴＥＸ化合物の生分解を改善することによって、前記組成物の環境運命を改善する方法である。
【００１０】
本発明の別の態様は、土壌マトリックスにおけるエタノールが環境領域（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）（例えば、土壌、堆積物、地下水）に放出される炭化水素燃料組成物の成分である場合に前記エタノールの移動を低減する方法であって、イソブタノールと燃料組成物とを混ぜ合わせることを含む、土壌マトリックスにおけるエタノールの移動を低減する方法である。
【００１１】
本発明の別の態様は、任意選択的にエタノールを含む炭化水素組成物から環境領域への放出によって生じるＢＴＥＸプルームを低減する方法であって、好適な量のイソブタノールを添加することを含み、前記イソブタノールが炭化水素組成物の炭化水素成分およびエタノール成分の補助溶剤として働き、それによってＢＴＥＸプルームを抑制しかつ／または一部分含んで、地下水面に漏れる可能性を減少させる、ＢＴＥＸプルームを低減する方法である。
【００１２】
本発明の別の態様は、炭化水素組成物の再生可能性を改善するのに十分な量だけ、炭化水素、エタノールおよびイソブタノールを含む液体燃料組成物であって、（それが環境領域を汚染する場合）前記組成物の潜在的環境影響を増大させることのない、液体燃料組成物に関する。別の態様では、イソブタノールを含有させることにより、燃料組成物の再生可能性は増大し、潜在的環境影響は減少する。例えば、ＢＴＥＸプルームの拡大は、イソブタノールが存在しない同じ組成物のＢＴＥＸプルームの拡大と比べて（特に、好気環境条件において）小さくなりうる。
【００１３】
本明細書ではまた、嫌気条件下の環境領域においてイソブタノールを含む炭化水素燃料組成物の環境運命を改善する方法であって、１種または複数種のＢＴＥＸ成分の生分解速度を増大させるのに十分な量だけ電子受容体を前記領域に加えることを含む方法も提供される。
【００１４】
本明細書においては、炭化水素燃料組成物の再生可能性を増大させ、かつ前記炭化水素燃料組成物によって汚染されるときの環境領域への影響を抑制するための方法であって、前記炭化水素燃料組成物を好適な量のイソブタノールと混ぜ合わせることを含む、方法が提供される。複数の実施形態において、炭化水素燃料組成物はエタノールをさらに含む。複数の実施形態において、イソブタノールを添加する前の時点で、エタノールは燃料組成物の約１０％までを構成する。複数の実施形態において、イソブタノールは、炭化水素燃料組成物のＢＴＥＸ成分の少なくとも１種で改善された生分解が行われるようにする。複数の実施形態において、イソブタノールは、ベンゼンの改善された生分解が行われようにする。複数の実施形態において、環境領域は土壌マトリックスを含み、イソブタノールにより、土壌マトリックスにおけるエタノールの移動が低減される。複数の実施形態において、イソブタノールにより、前記組成物からのＢＴＥＸプルームの拡大が抑えられる。複数の実施形態において、イソブタノールは、炭化水素燃料組成物の生分解性を増大させるのに適した量量だけ存在する。複数の実施形態において、好気条件下で改善された生分解が行われる。複数の実施形態において、硝酸塩還元または硫酸塩還元条件下で、改善された生分解が行われる。
【００１５】
また、嫌気条件下の環境領域におけるイソブタノール含有炭化水素燃料組成物の環境運命を改善する方法であって、１種または複数種のＢＴＥＸ成分の生分解速度を増大させるのに十分な量だけ電子受容体を前記領域に加えることを含む、イソブタノール含有炭化水素燃料組成物の環境運命を改善する方法も提供される。複数の実施形態において、電子受容体は、鉄、硫酸塩、または硝酸塩、またはこれらの組合せである。複数の実施形態において、電子受容体はＦｅ（ＯＨ）３である。複数の実施形態において、電子受容体はＮａＮＯ３である。複数の実施形態において、電子受容体はＭｇＳＯ４である。複数の実施形態において、１種または複数種のＢＴＥＸ成分は、トルエン、キシレン、またはベンゼンを含む。複数の実施形態において、電子受容体は硝酸塩であり、硝酸塩還元条件を作り出すのに十分な量だけ加えられる。複数の実施形態において、電子受容体は硫酸塩であり、硫酸塩還元条件を作り出すのに十分な量だけ存在する。複数の実施形態において、電子受容体は硝酸塩であり、硝酸塩還元条件を作り出すのに十分な量だけ存在し、このときトルエンはイソブタノールとほぼ同じ日数の間に生分解する。複数の実施形態において、電子受容体は硫酸塩であり、硫酸塩還元条件を作り出すのに十分な量だけ存在し、このときトルエンはイソブタノールとほぼ同じ日数の間に生分解する。複数の実施形態において、電子受容体は硝酸塩であり、硝酸塩還元条件を作り出すのに十分な量だけ存在し、このときベンゼンはイソブタノールとほぼ同じ日数の間に生分解する。複数の実施形態において、電子受容体は硫酸塩であり、硫酸塩還元条件を作り出すのに十分な量だけ存在し、このときベンゼンの生分解は、硫酸塩還元条件がない状態のその生分解と比べて改善される。複数の実施形態において、電子受容体は硫酸塩であり、硫酸塩還元条件を作り出すのに十分な量だけ存在し、このときベンゼンの生分解は、イソブタノールの非存在下でのその生分解と比べて改善される。複数の実施形態において、電子受容体は硫酸塩であり、硫酸塩還元条件を作り出すのに十分な量だけ存在し、このときベンゼンの生分解は、エタノールの存在下でのその生分解と比べて改善される。
【００１６】
本明細書ではまた、ガソリンとイソブタノールと、Ｆｅ（ＯＨ）３、ＮａＮＯ３、またはＭｇＳＯ４の少なくとも１種とを含む組成物も提供される。また、ガソリンとイソブタノールと、Ｆｅ（ＯＨ）３、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、ＮＨＮＯ３、Ｎａ２ＳＯ４、ＣａＳＯ４、ＭｇＳＯ４、キレート化鉄、ゼロ価の鉄、およびゼロ価のナノ鉄（ｎａｎｏ  ｚｅｒｏ−ｖａｌｅｎｔ  ｉｒｏｎ）の少なくとも１種とを含む組成物も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】最高１０日間までのイソブタノールの分解を示す。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図１Ｂ】最高５０日間までのイソブタノールの分解を示す。
【図１Ｃ】最高５０日間までのエタノールの分解を示す。
【図２Ａ】ＢＴＥＸの生分解に対する高濃度のイソブタノールの影響を示す。（図２Ａはベンゼンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図２Ｂ】ＢＴＥＸの生分解に対する高濃度のイソブタノールの影響を示す。（図２Ｂはトルエンを示示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図２Ｃ】ＢＴＥＸの生分解に対する高濃度のイソブタノールの影響を示す。（図２Ｃはエチルベンゼンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図２Ｄ】ＢＴＥＸの生分解に対する高濃度のイソブタノールの影響を示す。（図２Ｄは総キシレンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図３Ａ】様々な処理レベルでのＢＴＥＸ生分解に対するイソブタノールとエタノールの濃度の影響を比較している。（図３Ａはベンゼンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図３Ｂ】様々な処理レベルでのＢＴＥＸ生分解に対するイソブタノールとエタノールの濃度の影響を比較している。（図３Ｂはトルエンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図３Ｃ】様々な処理レベルでのＢＴＥＸ生分解に対するイソブタノールとエタノールの濃度の影響を比較している。（図３Ｃはエチルベンゼンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図３Ｄ】様々な処理レベルでのＢＴＥＸ生分解に対するイソブタノールとエタノールの濃度の影響を比較している。（図３Ｄは総キシレンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図４Ａ】ＢＴＥＸの生分解に対する低濃度のイソブタノールの影響を示す。（図４Ａはベンゼンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図４Ｂ】ＢＴＥＸの生分解に対する低濃度のイソブタノールの影響を示す。（図４Ｂはトルエンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図４Ｃ】ＢＴＥＸの生分解に対する低濃度のイソブタノールの影響を示す。（図４Ｃはエチルベンゼンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図４Ｄ】ＢＴＥＸの生分解に対する低濃度のイソブタノールの影響を示す。（図４Ｄは総キシレンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図５Ａ】様々な嫌気的還元条件下でのイソブタノールの生分解（高濃度）を示す。（図５Ａは処理２（非改質）を示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。処理２の破線は、ミクロコスムをイソブタノールで再改質した時を示す。
【図５Ｂ】様々な嫌気的還元条件下でのイソブタノールの生分解（高濃度）を示す。（図５Ｂは処理６（硝酸塩還元）を示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。処理２の破線は、ミクロコスムをイソブタノールで再改質した時を示す。
【図５Ｃ】様々な嫌気的還元条件下でのイソブタノールの生分解（高濃度）を示す。（図５Ｃは処理９（鉄還元）を示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。処理２の破線は、ミクロコスムをイソブタノールで再改質した時を示す。
【図５Ｄ】様々な嫌気的還元条件下でのイソブタノールの生分解（高濃度）を示す。（図５Ｄは処理１２（硫酸塩還元）を示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。処理２の破線は、ミクロコスムをイソブタノールで再改質した時を示す。
【図６Ａ】処理４（非改質）のエタノールの生分解を示す。エラーバーは９５％信頼区間を表す。処理４の破線は、地下水中の残留硫酸塩が還元された後にミクロコスムをエタノールで再改質した時を示す。
【図６Ｂ】処理１４（硫酸塩還元）のエタノールの生分解を示す。エラーバーは９５％信頼区間を表す。処理４の破線は、地下水中の残留硫酸塩が還元された後にミクロコスムをエタノールで再改質した時を示す。
【図７Ａ】様々な嫌気的還元条件下での、およびイソブタノール（ＩＢＡ）の存在下または不存在下での、ベンゼンの生分解（高濃度）を示す。（処理１、２、５、および６でのベンゼンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図７Ｂ】様々な嫌気的還元条件下での、およびイソブタノール（ＩＢＡ）の存在下または不存在下での、トルエンの生分解（高濃度）を示す。（処理１、２、５、および６でのトルエンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図７Ｃ】様々な嫌気的還元条件下での、およびイソブタノール（ＩＢＡ）の存在下または不存在下での、ベンゼンの生分解（高濃度）を示す。（処理８、９、１１、および１２でのベンゼンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図７Ｄ】様々な嫌気的還元条件下での、およびイソブタノール（ＩＢＡ）の存在下または不存在下での、トルエンの生分解（高濃度）を示す。（処理８、９、１１、および１２でのトルエンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図８Ａ】様々な嫌気的還元条件下での、およびイソブタノール（ＩＢＡ）またはエタノールの存在下または不存在下での、ＢＴＥＸの生分解（低濃度）を示す。（図８Ａはベンゼンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図８Ｂ】様々な嫌気的還元条件下での、およびイソブタノール（ＩＢＡ）またはエタノールの存在下または不存在下での、ＢＴＥＸの生分解（低濃度）を示す。（図８Ｂはトルエンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図８Ｃ】様々な嫌気的還元条件下での、およびイソブタノール（ＩＢＡ）またはエタノールの存在下または不存在下での、ＢＴＥＸの生分解（低濃度）を示す。（図８Ｃはエチルベンゼンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図８Ｄ】様々な嫌気的還元条件下での、およびイソブタノール（ＩＢＡ）またはエタノールの存在下または不存在下での、ＢＴＥＸの生分解（低濃度）を示す。（図８Ｄは総キシレンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図９Ａ】イソブタノールの生分解（低濃度）を示す。（Ａは処理３（非改質）を示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。補助的な監視によると、イソ酪酸濃度が、処理３では第１６０日までに、処理１３では第４８日までに、分析検出限界未満に減少した（データは示していない）。
【図９Ｂ】イソブタノールの生分解（低濃度）を示す。（Ｂは処理７（硝酸塩還元）を示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。補助的な監視によると、イソ酪酸濃度が、処理３では第１６０日までに、処理１３では第４８日までに、分析検出限界未満に減少した（データは示していない）。
【図９Ｃ】イソブタノールの生分解（低濃度）を示す。（Ｃは処理１０（鉄還元）を示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。補助的な監視によると、イソ酪酸濃度が、処理３では第１６０日までに、処理１３では第４８日までに、分析検出限界未満に減少した（データは示していない）。
【図９Ｄ】イソブタノールの生分解（低濃度）を示す。（Ｄは処理１３（硫酸塩還元）を示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。補助的な監視によると、イソ酪酸濃度が、処理３では第１６０日までに、処理１３では第４８日までに、分析検出限界未満に減少した（データは示していない）。
【図１０Ａ】様々な嫌気的還元条件下での、およびイソブタノール（ＩＢＡ）の存在下または不存在下での、高濃度のエチルベンゼンの生分解を示す。（処理１、２、５、および６でのエチルベンゼンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図１０Ｂ】様々な嫌気的還元条件下での、およびイソブタノール（ＩＢＡ）の存在下または不存在下での、総キシレンの生分解を示す。（処理１、２、５、および６での総キシレンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図１０Ｃ】様々な嫌気的還元条件下での、およびイソブタノール（ＩＢＡ）の存在下または不存在下での、高濃度のエチルベンの生分解を示す。（処理８、９、１１、および１２でのエチルベンゼンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図１０Ｄ】様々な嫌気的還元条件下での、およびイソブタノール（ＩＢＡ）の存在下または不存在下での、総キシレンの生分解を示す。（処理８、９、１１、および１２での総キシレンを示す）。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図１１】１．３％および２．６％の水が最初にＥ１０ガソリンに加えられた時のイソブタノールの挙動を示す。イソブタノールのレベルが増大すると、相分離時に水相の量が減少している。
【図１２】１．３％および２．６％の水が最初にＥ１０ガソリンに加えられた時のイソブタノールの挙動を示す。分離が起きたときに水性部分のエタノールが少なくなっていることを示す。
【図１３】微生物分析の結果を示す。エラーバーは９５％信頼区間を表す。ＩＢＡ＝イソブタノール。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
特に定義されていない限り、本明細書に用いられている技術用語および科学用語はすべて、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。矛盾がある場合には、定義を含んでいる本出願が優先されることになる。また、文脈で特に求められているのでない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書で挙げる刊行物、特許、および他の文献はすべて、あらゆる目的のためにその全体を援用する。
【００１９】
本発明をさらに明確にするために、以下の用語および定義を本明細書に示す。
【００２０】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語あるいはそれらの他の任意の変形は、示されている整数または整数群を含むことを意味するが、他の整数または整数群を除外することを意味しないと理解されるであろう。例えば、列挙された要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそうした要素に限定されるわけではなく、明確に列挙されていない他の要素あるいはそうした組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素も含みうる。さらに、逆のことを特に述べていない限り、「または」は、包含的な「または」であり、排他的な「または」ではない。例えば、ＡまたはＢという条件は、以下のいずれによっても満たされる：Ａが正しく（または存在し）かつＢが誤りである（または存在しない）、Ａが誤りであり（または存在せず）かつＢが正しい（または存在する）、さらにＡおよびＢの両方が正しい（または存在する）。
【００２１】
本明細書で使用される「から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」という用語、または本明細書全体および請求項を通じて使用されている「から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」または「から構成されている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」などの変形は、挙げられている任意の整数または整数群を含むことを示すが、さらなる整数または整数群を、明記されている方法、構造、または組成物に加えることができないことを示す。
【００２２】
本明細書で使用される「から基本的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語、または本明細書全体および請求項を通じて使用される「から基本的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「から基本的に構成されている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの変形は、挙げられている任意の整数または整数群を含むこと、ならびに明記されている方法、構造、または組成物の基本的特性または新規の特性を実質的に変えることのない、挙げられている任意の整数または整数群を任意選択的に含むことを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい。
【００２３】
また、本発明の要素または成分の前に付いている不定冠詞の「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」は、例の数、すなわち要素または成分の出現に関して非制限的であることを意図している。したがって「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」は、１つまたは少なくとも１つを含むと理解すべきであり、さらに要素または成分の語の単数形も、数が明らかに単数を意味するのでない限り、複数を含む。
【００２４】
本明細書で使用される「発明」または「本発明」という用語は、非制限的用語であり、特定の発明のいずれか１つの実施形態を指すことを意図するものではなく、本出願に記載された可能な実施形態すべてを包含する。
【００２５】
使用される本発明の成分または反応物の量を修飾する、本明細書で使用される「約」という用語は、起こりうる数値的量の変動を指し、そうした変動は、例えば、現実の世界で濃縮物または溶液を作るために使用する普通の測定手順および液体処理手順によって；そうした手順における不注意による間違いによって；組成物を作るかまたは方法を実施するために用いる成分の製造、供給源、または純度の違いなどによって起こりうる。「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物の種々の平衡状態のせいで違ってくる量も包含する。「約」という用語で修飾されているかどうかにかかわりなく、請求項は量に相当するものを含む。１つの実施形態では、「約」という用語は、報告されている数値の１０％以内、好ましくは報告されている数値の５％以内を意味する。
【００２６】
本明細書に記載したように、イソブタノールを含む炭化水素燃料組成物により、再生可能成分（これも、環境内で生分解性である）によって再生可能性の増大した燃料組成物が提供される。イソブタノールは、本明細書に示したように、帯水層ミクロコスムに加えられた場合に急速に分解する再生可能成分である。さらに、ここで示した結果は、イソブタノール自体が生分解するだけでなく、イソブタノールにより、様々な環境条件下でガソリンに対して更なる生分解の利点がもたらされることを実証している。当技術分野において語られているように、イソブタノールは、再生可能な供給原料（バイオマスなど）由来の炭素物質をイソブタノールに変換する微生物によって生物学的に製造できる。したがって、生物学的に製造されたイソブタノールは、燃料組成物に添加される場合、再生可能な成分を燃料に含めるための価値ある手段となり、それと同時に、燃料組成物の環境影響を減らすものとなる（それが所与の環境域を汚染する場合）。
【００２７】
ガソリンの成分であるベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、および総キシレン（ＢＴＥＸ）が、望ましくない環境汚染物であることはよく知られている。エタノールをガソリンに添加すると、ガソリンの再生可能性を高めることができるが、エタノールによりＢＴＥＸプルームの拡大が生じうるので、この添加により、ＢＴＥＸによってもたらされる害も大きくなりうる。それに対して、ガソリンへのイソブタノールの添加は、添加剤としてのエタノールの添加と比べてＢＴＥＸプルームの増大なしに、燃料の再生可能成分を増大させる手段となる。これは、燃料ブレンドが環境域または環境領域（例えば、土壌、堆積物、地下水）に放出される場合である。さらに、本明細書に示されているように、イソブタノールが添加されても、ある条件下でエタノールの場合に観察されるほどＢＴＥＸの生分解は妨げられない。
【００２８】
本明細書で使用される「生分解」または「分解」は、注目している化合物から副生成物への１次変化を指す。
【００２９】
本明細書で使用される「環境運命の改善」とは、環境領域内の炭化水素燃料ブレンドの１種または複数種の成分の量を減少させること、環境領域内の炭化水素燃料ブレンドの１種または複数種の成分の分解速度を増大させること、炭化水素燃料ブレンドの１種または複数種の成分が接触する環境領域の大きさを減少させること、またはそれらの組合せを意味する。
【００３０】
本明細書で使用される「環境領域」は、燃料組成物が接触する領域を指し、それには、例えば、土壌、堆積物、地下水、またはそれらの組合せを挙げることができる。
【００３１】
本明細書で使用される「ＢＴＥＸプルーム」は、溶解相プルームを指す。
【００３２】
燃料組成物に関連して用いられる場合、「再生可能性の増大」とは、組成物のより多くの部分が、再生不能な資源（化石燃料および石油など）とは違い、再生可能と見なされる資源（バイオマスなど）から作られることを意味する。
【００３３】
本明細書では、イソブタノールを燃料組成物に含有させることにより、燃料組成物の環境影響を減少させると共に、燃料組成物中の再生可能成分の量を増やすための方法が提供される。本明細書に開示されている方法に適した燃料組成物の炭化水素部分は、内燃機関（火花点火エンジンを含むが、これに限定されない）で消費するためのガソリンを作るのに使用できるガソリンブレンドストック（ｇａｓｏｌｉｎｅ  ｂｌｅｎｄ  ｓｔｏｃｋｓ）を含む。ガソリンブレンドストックとしては、ＡＳＴＭ  ４８１４、ＥＵ規格のＥＮ２２８に準拠したガソリン用のブレンドストック、および組成変更ガソリン用のブレンドストックがあるが、これらに限定されない。本明細書に開示されている方法の炭化水素燃料組成物中のイソブタノールの量（容量に基づく）には、少なくとも約２％の量、少なくとも約５％の量、少なくとも少なくとも約７％の量、少なくとも約１０％の量、または少なくとも約１５％の量が含まれる。態様によっては、イソブタノールの量（容量に基づく）には、約２％〜約２０％の量、および約１０％〜約１６％の量が含まれる。イソブタノールの量は、乗り物の技術に依存しうることが理解されるであろう。したがって、複数の実施形態において、イソブタノールの量は最高約８５容量％にすることができる。イソブタノールは、当該技術分野において知られている任意の方法を用いて、燃料組成物の炭化水素部分と混ぜ合わせることができる。
【００３４】
実施形態によっては、炭化水素燃料組成物はエタノールをさらに含み、また実施形態によっては、エタノールは、イソブタノールを添加する前の時点で、炭化水素組成物の最高約１０％、最高約１５％、最高約２０％、または最高約５０％を構成する。実施形態によっては、燃料組成物中のエタノールの代わりにイソブタノールを使用する。他の実施形態では、エタノールを含んでいる燃料組成物にイソブタノールを加える。
【００３５】
本明細書で提供する方法には、炭化水素燃料組成物中にイソブタノールを含めることによって、前記組成物からのＢＴＥＸプルームの拡大を抑制する方法が含まれる。炭化水素燃料組成物の潜在的環境影響は、放出が起こる場合、影響を受ける領域のＢＴＥＸプルームの大きさ、及び／または拡大速度、及び／またはＢＴＥＸプルームの濃度を測定することにより、評価できる。ＢＴＥＸプルームの拡大の大きさおよび速度は、地下水の直接採取などの当該技術分野において知られている方法および米国環境保護局（ＥＰＡ）の方法ＳＷ８４６などの方法によって評価できる。
【００３６】
実施形態によっては、イソブタノールを含んでいる燃料組成物の分解は、エタノールを含むがイソブタノールは含んでいない燃料組成物よりも速く起こる。燃料成分の分解は、当該技術分野において知られている方法（例えば、米国ＥＰＡ法８０１５によるガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、または、例えば、米国ＥＰＡ法８２６０によるＧＣ−質量分析法など）を用いて環境試料で測定できる。本明細書に示すように、イソブタノールは、少なくともエタノールと同じくらい速く分解し、１種または複数種のＢＴＥＸ成分は、エタノールの存在下よりもイソブタノールの存在下で速く分解する。実施形態によっては、イソブタノールは、少なくとも約０．０８１ｄ−１の一次速度定数で分解する。実施形態によっては、イソブタノールは、少なくとも約０．２８ｄ−１の一次速度定数で分解する。実施形態によっては、イソブタノールは、約０．０７４ｄ−１より大きい一次速度定数で分解する。場合によっては、イソブタノールを含む燃料組成物は、再生可能成分を含まない燃料組成物と比べてＢＴＥＸの生分解速度が速い。場合によっては、イソブタノールを含む燃料組成物は、エタノールは含むがイソブタノールは含まない燃料組成物と比べて、ＢＴＥＸの生分解速度が速い。
【００３７】
さらに、本明細書に示されているように（図１１および１２を参照）、エタノール含有ガソリンにブタノールを含有させると、相分離が起きたときの水相の量が減少し、水相に含まれるエタノールの重量パーセントが制限される。理論に縛られることは望まないが、ブタノールにより、エタノールが水に溶けにくい炭化水素部分内に保持されて、地下水に漏れるエタノールの量が制限されうると考えられる。土壌マトリックス中のエタノールの移動が低減すると、それにより、地下水面へのＢＴＥＸの拡大が抑制されうる。
【００３８】
したがって、本明細書で提供する方法は、有利なことに、汚染サイトを修復するのに必要な時間を少なくすることができるか、ＢＴＥＸプルームの大きさを制限できるか、またはその両方の利点を提供でき、それゆえに炭化水素燃料組成物の環境運命を改善できることが理解されるであろう。
【００３９】
本明細書で提供する方法は、嫌気条件下の環境領域におけるイソブタノール含有炭化水素燃料組成物の環境運命を改善できる。複数の実施形態において、この方法は、１種または複数種のＢＴＥＸ成分の生分解速度を増大させるのに十分な量だけ前記領域に電子受容体を加えることを含む。好適な電子受容体としては、硝酸塩（これには、ＮａＮＯ３、ＮＨ４ＮＯ３、ＫＮＯ３があるが、これらに限定されない）、および硫酸塩（これには、ＭｇＳＯ４およびＣａＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４があるが、これらに限定されない）、および鉄
化合物（これには、Ｆｅ（ＯＨ）３、キレート化鉄、ゼロ価の鉄、およびゼロ価のナノ鉄があるが、これらに限定されない）がある。電子受容体は、スラリーとしての注入、貫入（ｅｍｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、監視井戸からの注入、重力注入（ｇｒａｖｉｔｙ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、及び／または加圧注入、またはそれらの組合せを含む（ただし、これらに限定されない）方法を用いて、硝酸塩還元、鉄還元、及び／または硫酸塩還元の条件を実現するのに十分な量だけ、環境領域に加えることができる。硫酸塩及び／または硝酸塩及び／または鉄化合物を注入して、硫酸塩還元細菌及び／または硝酸塩還元細菌（存在する場合）を生物刺激して、地下へのイソブタノール含有ガソリンの放出によるＢＴＥＸ汚染物質を生分解することができる。そのような生体刺激により、細菌の生物活性、個体群、およびまたは代謝の増大がもたらされうる。
【００４０】
好気条件
一次近似を用いてイソブタノールとエタノールの生分解速度を比較すると、幾つかのイソブタノール処理では、一次速度定数が０．０８１±０．００４４ｄ−１であることが観察されたが（Ｒ２＝０．８０、処理４および処理５の両方のデータを使用、実施例１）、エタノール処理では、一次速度定数が０．０７４±０．００２３ｄ−１（Ｒ２＝０．９０）であることが観察された。したがって、イソブタノールは、高濃度処理において、エタノールの速度よりも速い速度で生分解した。低濃度処理（処理３）では、イソブタノールの速度定数は０．２８±０．０５４ｄ−１（Ｒ２＝０．６９）であった。これは、高濃度処理におけるイソブタノールまたはエタノールの生分解速度定数よりもおよそ３．５倍大きい。この相違は、細菌増殖の相違のみに起因するものではなかった。理論に縛られることは望まないが、イソブタノールの生分解（およびイソブタノール分解細菌の増殖）は、イソブタノール生分解のほとんどが行われた研究の最初の２週間の間ずっと、栄養制限されていたことが、この食い違いの１つの説明として考えられる。栄養制限は、低濃度イソブタノール処理の場合、同じくらい厳しいものではなかったかもしれず、その結果、低イソブタノール処理では、速度定数が増大した。あるいは、イソブタノールの速度定数の食い違いは高濃度でのイソブタノール基質阻害が原因であろう。基質阻害は、およそ３，０００μＭという低い濃度でのｎ−ブタノール生分解の研究の際に観察された（Ａｌａｇａｐｐａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｗａｎ，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ａｎｄ  Ｂｏｅｎｇｉｎ．７５：３９３−４０５）。
【００４１】
エタノールでは、望ましくないことに、イソブタノールよりもＢＴＥＸの生分解速度が減少するという結果が本明細書に示されている。興味深いことに、ＢＴＥＸの生分解に対するイソブタノールおよびエタノールの影響を比較した場合、ベンゼンが最も顕著な相違を示した。というのは、ベンゼンの好気性生分解は、エタノールの存在下では、イソブタノールの存在下よりもおよそ１２倍ゆっくりであったからである。ベンゼンは、多くの場合、ガソリンで汚染されたサイトにおける地下水汚染の規制対象物質（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｄｒｉｖｅｒ）である。
【００４２】
嫌気条件
本明細書で示された結果は、イソブタノールが、硝酸塩還元、鉄還元、硫酸塩還元、およびメタン生成の条件下で容易に生分解することを実証している。この研究の条件では、イソブタノールがＢＴＥＸの生分解を遅くしないか、またはイソブタノールがＢＴＥＸの生分解速度を遅くする度合いが、エタノールがＢＴＥＸの生分解を遅くする度合いよりも小さかった。場合によっては、イソブタノールを添加すると、観察されたＢＴＥＸの生分解速度が増大した。したがって、イソブタノールの持続性および帯水層嫌気条件下でのＢＴＥＸの生分解へのその影響は、エタノールのそれよりも好ましいと考えられる。
【実施例】
【００４３】
実施例１  好気性試験
材料および方法
土壌および地下水の試料
実験室でのミクロコスム試験用の土壌および地下水は、Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇ  Ａｉｒ  Ｆｏｒｃｅ  Ｂａｓｅ，ＣＡのサイト６０内から集めた。このサイトにはガソリン汚染歴があるが、大規模な浄化計画が実施された。集めた地下水は、上部空間が窒素の状態である殺菌したステンレス鋼のソーダ樽（ｓｏｄａ  ｋｅｇｓ）（１８．５Ｌ）に詰めた。アセテートコアスリーブ（ａｃｅｔａｔｅ  ｃｏｒｅ  ｓｌｅｅｖｅｓ）を備えたＧｅｏｐｒｏｂｅ（登録商標）６６２０ＤＴを用いて、地面下（ｂｇｓ）のおよそ８〜１２フィートにある土壌を集めた。現場でアセテートスリーブ内のコア試料に蓋をし密封して空気への暴露を最小限に抑え、氷上に置いて一晩の間に実験室へ運び、４℃で保管した。
【００４４】
嫌気性チャンバー（Ｃｏｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｓｓ  Ｌａｋｅ，ＭＩ）内でアセテートスリーブから土壌を取り出し、酸素にさらされたと思われるコアの先端の最初の１０ｃｍを廃棄した。集めた土壌は、いくらかの砂利を含んだ沈泥質砂ともっと大きな石とからなっていた。土壌は、０．９５ｃｍの篩いにかけ、均質化してから、ミクロコスムの準備が完了するまで、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）のライニングが施された蓋を有するこはく色ガラスジャー内に４℃で保管した。土壌および地下水の基本データを表１に示す。（ＮＡ＝分析せず；＊ＳＶＯＣ（半揮発性有機化合物）検出は、０．００８ｍｇＬ−１のフェノールおよび０．００３ｍｇＬ−１のフタル酸ビス（２−エチルヘキシル）を含む；＊＊標準単位）。
【００４５】
【表１】
2013529242.tif 000003
【００４６】
ミクロコスムの実験
ミクロコスムの実験に関する全体的な扱い方は、土壌−地下水スラリー中の、「高」濃度および「低」濃度の両方におけるＢＴＥＸ（ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、および総キシレン）およびイソブタノールの生分解を評価するというものであった。最終的な転換生成物は同定しなかった。比較のため、イソブタノールの代わりにエタノールを使用して１つの処理試料を調製した。それぞれのＢＴＥＸ化合物の目標ＢＴＥＸ濃度を、実験処理マトリックスを示す表２のＢＴＥＸ欄に列挙してある。対照は、塩化第二水銀およびホルムアルデヒドによって改質した。ＢＴＥＸおよびアルコールの濃度は、供給源地内および近くの下降勾配（ｄｏｗｎｇｒａｄｉｅｎｔ）プルームで観察されるであろう（おおよその）潜在的地下水濃度を表すように選択した。この研究では、イソブタノール濃度に対してエタノール濃度が高いが、これは、地下水中のイソブタノールおよびエタノールの実際の溶解度を反映するよう意図したものである。エタノールの水溶解度は、イソブタノールの水溶解度のおよそ１０倍であり、イソブタノールのオクタノール−水の分配係数は、エタノールの分配係数のおよそ１０倍である（Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｃｏ−ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００４．  ＳＩＤＳ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ＳＩＡＭ  １９−Ｅｔｈａｎｏｌ（ＣＡＳ番号６４−１７−５）．Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｃｏ−ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００４．  ＳＩＤＳ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ＳＩＡＭ  １９−Ｉｓｏｂｕｔａｎｏｌ（ＣＡＳ番号７８−８３−１），Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。したがって、イソブタノールのおよそ３倍高いエタノールのモル濃度は、この研究での試験のために控えめに選択された。セット１の処理試料は、試料を集めてから４日以内に調製したが、セット２の処理試料は、土壌および地下水をおよそ２ヶ月間保管した後に調製した。実験処理試料のマトリックスを表２Ａおよび２Ｂに示す。
【００４７】
【表２】
2013529242.tif 000004
【００４８】
【表３】
2013529242.tif 000005
【００４９】
ミクロコスムは、４０ｇのサイトの土壌を５４のガラス血清瓶（それぞれ容量が１６０ｍＬ）のそれぞれに入れて調製した。表２ＡおよびＢに示す目標濃度になるように、ＢＴＥＸおよびアルコール（イソブタノールまたはエタノール）を処理瓶に加えた。１０ｍＬの上部空間が残るように、瓶に地下水を満たした。微生物活動を抑制するために、対照は塩化第二水銀で改質した（瓶中に７００ｍｇ／Ｌ）。続いて４日後に対照をホルムアルデヒドで改質して（瓶中に１％（ｖ／ｖ））、微生物活動を制限した。処理試料の調製では、それぞれ最低３個から最高８個の複製試料があるようにした。
【００５０】
調製したミクロコスムを、１００ｒｐｍで作動するローターリーシェーカーにおいて１５℃でインキュベートした。ＢＴＥＸおよび酸素に関して瓶のそれぞれの上部空間を監視した。水中ＢＴＥＸ濃度は、ヘンリーの法則を使用して計算した。イソブタノールおよびエタノールならびに潜在的イソブタノール分解生成物（イソブチルアルデヒドおよびイソ酪酸）に関して、水相の試料を分析した。それぞれの瓶の上部空間は、周期的に酸素ガスでフラッシュして、瓶の好気条件を維持した。それぞれの対照瓶の上部空間も酸素でフラッシュして、フラッシングの処置に起因するＢＴＥＸの起こりうる消失を評価した。
【００５１】
分析方法
ＦＩＤおよびＲｅｓｔｅｋ  ＱＳＰＬＯＴカラム（長さ３０ｍ、直径０．３２ｍｍ）を備えたＶａｒｉａｎ  ＣＰ−３９００ガスクロマトグラフ（試料導入管の温度は２６０℃、検出器の温度は２９０℃）を使用して、上部空間のガスのＢＴＥＸを分析した。パルス放電ヘリウムイオン化検出器（Ｐｕｌｓｅｄ  Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ  Ｈｅｌｉｕｍ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（ＰＤＨＩＤ）およびＣＰ−Ｍｏｌｓｉｅｎｅ  ５ＡカラムとＣＰ−ＰａｒａＢｏｎｄ  Ｑカラムの両方（どちらも長さが１０ｍ、直径が０．３２ｍｍ）を備えたＶａｒｉａｎ  ＣＰ−３８００ガスクロマトグラフ（試料導入管の温度は２１０℃、検出器の温度は２４０℃）を使用して、上部空間の酸素を分析した。酸素は、１．２０分で溶出した。塩化第二水銀で保持された１３０μＬの副試料を最初に集めて、水中アルコール濃度（ならびにイソブチルアルデヒドおよびイソ酪酸）を測定した。水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）およびＳｔａｂｉｌｗａｘ  ＤＡカラム（長さ３０ｍ、直径３２０μｍ）を備えたＶａｒｉａｎ  ＣＰ−３８００ガスクロマトグラフ（試料導入管の温度が２８０℃、検出器の温度が２８０℃）を使用して、これらの試料を分析した。
【００５２】
微生物分析
実験の最初、（およそ）中頃、および最後に、ＢＴＥＸおよびイソブタノールで改質されたミクロコスムから試料（２ｍＬ）を集めて、研究の過程全体にわたって微生物群の変化を評価した。回収したらすぐに、ＳＭ９２１５Ｃ法に従って、試料を連続的に希釈して、Ｒ２Ａ寒天（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）および基礎塩培地（Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＢＳＭ；Ｈａｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２１：２７２−２８５）寒天にまいた。こうした基質で増殖できる細菌を選択するために、ＢＳＭプレートを、ＢＴＥＸまたはイソブタノールのどちらかを含んだ密封容器でインキュベートした。Ｒ２Ａ寒天の場合は３日後、選択培地の場合は１０日後に、手作業でコロニー数を数えた。試料（約８ｍＬ）はまた、−７０℃で即座に凍結させ、研究の終わりに、ＣＥＮＳＵＳ分析のためにドライアイスに入れて、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＴＮに輸送した。ＣＥＮＳＵＳでは、真正細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子コピーの計数に基づいた真正細菌の合計を定量するため、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）試験法を使用した（ＣＥＮＳＵＳの方法の詳細については、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，２００９のｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｂｅ．ｃｏｍ／ｈｏｗ−ｃｅｎｓｕｓ−ｗｏｒｋｓ．ｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｂｅ．ｃｏｍ／ｃｅｎｓｕｓ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ａｎａｅｒｏｂｉｃ−ｂｔｅｘ．ｈｔｍｌ（それぞれ０７．０７．２００９および０５．０８．０９でアクセスする）を参照されたい）。
【００５３】
イソブタノールおよびエタノールの分解
いずれの対照でも、イソブタノールやエタノールの測定可能な減少（＞１０％）も、イソブチルアルデヒドの蓄積もイソ酪酸の蓄積も、観察されなかった。処理３および４におけるイソブタノールの生分解を図１に示す。低濃度処理（処理３）では、イソブタノールは分解して、７日以内に分析検出限界（３μＭ）未満になる。イソブタノールの分解生成物であるイソブチルアルデヒドおよびイソ酪酸が、４日間のインキューベーションで最初に検出され、その後、イソブチルアルデヒドは減少して５日間以内に検出されなくなった。イソ酪酸の濃度は最初に増大したが、８２日後に取られた試料は、イソ酪酸もミクロコスム中でさらに分解したことを確証している（データは示されていない）。イソ酪酸の生分解生成物は、同定しなかったが、以前の研究では、イソ酪酸は好気条件下で容易に生分解すること、またブチレートは好気条件下で容易にＣＯ２に変化することが示されている（Ｍｉｌｌｅｒ，２００１，Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．７９：２５０３−２５１２；Ｂｏｎａｒｔｓｅｖａ，２００３，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１０９：２８５−３０１）。
【００５４】
高濃度処理（処理４、図１ｂ．）では、イソブタノールは分解して、２３日以内に、初期濃度である３，４００μＭから分析検出限界未満になった。イソブタノールが分解するにつれ、イソブタノールの２種類の分解生成物（イソブチルアルデヒドとイソ酪酸）の形成およびその後の分解が観察された。イソブチルアルデヒドは、第９日にピーク濃度である９００μＭに達し、その後減少して１９日後に分析検出限界である１１μＭ未満になった。イソ酪酸は増加して、第２５日にピーク濃度である１，７５０μＭになり、その後減少して第４８日までに１００μＭになった。イソブタノールとエタノールの比較に使用されたミクロコスムの第２セットでは（処理５）、イソブタノールは似たような時間枠内に分解し、似たような量のイソ酪酸が観察された。しかし、微量レベルのイソブチルアルデヒド（７８μＭ）しか観察されなかった。
【００５５】
エタノールで改質されたミクロコスムでは、エタノール濃度は、およそ４０〜４５日のうちに１１，０００μＭから分析検出限界である２２μＭ未満にまで減少した（図１ｃ）。対照では、エタノールの減少は観察されなかった。観察されたエタノール分解が利用可能な栄養素によって制限されなかったことを確かめるため、改変基本塩培地の形の栄養素（Ｈａｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５）を、第２２日にすべての処理試料に加えた。エタノール（または他の任意の化合物）の分解速度の測定可能な増加は観測されなかった。このことは、汚染物質の生分解は、この実験系において第２２日付近で、利用可能な栄養素によって制限されなかったことを示唆している。
【００５６】
ＢＴＥＸの分解
高濃度のＢＴＥＸで改質されたミクロコスム（イソブタノールを含むものと含まないもの）を図２に示す。低濃度のＢＴＥＸの場合の結果は図４に示す。観察された遅延時間および後退した１次有効半減期（ｆｉｒｓｔ−ｏｒｄｅｒ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｈａｌｆ  ｌｉｖｅｓ）は日数で表され、表３に示されている。有効半減期は、後退半減期（ｒｅｇｒｅｓｓｅｄ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）と遅延時間とを加えたものである。（ＩＢＡ＝イソブタノール；±値は９５％信頼区間を示す。）
【００５７】
【表４】
2013529242.tif 000006
【００５８】
高濃度対照でのＢＴＥＸ濃度では、およそ２５日間を通じて観察可能な低下傾向はないことが示されたが、その間に、一部の化合物では対照濃度において低下が観察された（最高でおよそ２０％）。その後、対照は、微生物活動を抑制するためにホルムアルデヒドで再び改質した。更なるホルムアルデヒドは、対照での更なる低下を防ぐためである。２５日間までに、ＢＴＥＸ化合物のほとんどは分解し、そのためそのような消失はデータの評価に影響を与えなかった。総キシレンについては、この実験の１０日間で総キシレン濃度のおよそ２５％の減少が観察されたが、それ以外は、低濃度ＢＴＥＸの対照においては著しい（＞１０％）減少は観察されなかった。
【００５９】
好気条件下で得られたＢＴＥＸ化合物の半減期（表３）は、概して、他の人たちによって観察された範囲内にあった（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｇｅｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｒｖｅｙ，２００６にある総説である“Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｖｏｌａｔｉｌｅ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｇｒｏｕｎｄｗａｔｅｒ−ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．Ｏｐｅｎ  Ｆｉｌｅ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２００６−１３３８を参照）。比較ミクロコスム（処理４、５および６）の結果によると、一般にエタノールは、イソブタノールよりもＢＴＥＸの生分解に対する悪影響が大きかった（図３および表３）。唯一の例外はエチルベンゼンであり、その場合、イソブタノールおよびエタノールはエチルベンゼンの生分解に対して似たような影響を与えた。さらに、イソブタノールの添加により、低濃度処理でのエチルベンゼンおよび総キシレンの生分解において少しではあるが測定できるほどの増加があった（処理１および３）。これは、イソブタノールの場合に、エチルベンゼンおよび総キシレンの分解促進菌（ｄｅｇｒａｄｅｒｓ）が偶然に成長したせいであると思われる。
【００６０】
処理５におけるＢＴＥＸの有効半減期は、処理４の場合より少なく（表３）、およそ２分の１から５分の１であった。しかし、これら２つの処理におけるイソブタノールの生分解速度は、ほぼ同じであった。
【００６１】
微生物的特徴づけ
微生物のコロニー数およびｑＰＣＲ分析の結果を図１３に示す。これらのデータは、ミクロコスム中の微生物濃度が、研究の間中ずっと増大したことを示している。微生物コロニー数および総真正細菌のデータは両方とも似たような傾向を示しているが、分子分析で求められた真正細菌の濃度は、微生物コロニー数より大きかった。好気性平板菌数と分子分析による総細菌との間の食い違いは、珍しいことではない。なぜなら、細菌によってはすべての寒天平板で十分に増殖するわけではなく、後者の方法は、培養できる細菌、培養できない細菌、嫌気性細菌、および好気性細菌を測定するからである。平板菌数データにより、イソブタノールおよびＢＴＥＸの両方を分解できる天然細菌がサイトの物質中に存在することが確認された。低濃度処理で示されているように、微生物増殖は、基質（ＢＴＥＸまたはイソブタノールのいずれか）がなくなってくると、限られてきた。
【００６２】
実施例２−嫌気性試験
材料および方法
土壌および地下水
土壌および地下水および試料の収集と取り扱いの手順は、上述したとおりである。土壌および地下水の基本データを表４に示す。（ＮＡ＝分析せず；＊ＳＶＯＣ検出は、０．００８ｍｇＬ−１のフェノールおよび０．００３ｍｇＬ−１のフタル酸ビス（２−エチルヘキシル）を含む；＊＊標準単位）
【００６３】
【表５】
2013529242.tif 000007
【００６４】
ミクロコスムの調製
ミクロコスムの実験では、硝酸塩還元からメタン生成までの範囲の条件下における土壌−地下水のスラリー中のＢＴＥＸおよびイソブタノールの生分解を評価した。ＢＴＥＸおよびイソブタノールは、「高」濃度および「低」濃度で評価した（表５）。２つの処理試料は、イソブタノールの代わりにエタノールを用いて調製した。電子受容体の濃度は、試料に添加された量を反映し、（表５）はサイトの地下水のバックグラウンド電子受容体濃度を含んでいない。ＢＴＥＸおよびアルコールの濃度は、供給源地内および近くの下降勾配プルームで観察されるであろう潜在的地下水濃度を表す。この研究では、イソブタノール濃度に対してエタノール濃度が高いが、これは、地下水中のイソブタノールおよびエタノールの実際の溶解度を反映するよう意図したものである。エタノールの水溶解度は、イソブタノールの水溶解度のおよそ１０倍であり、イソブタノールのオクタノール−水の分配係数は、エタノールの分配係数のおよそ１０倍である（Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｃｏ−ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００４．ＳＩＤＳ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ＳＩＡＭ  １９−Ｅｔｈａｎｏｌ（ＣＡＳ番号６４−１７−５）．Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｃｏ−ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００４．ＳＩＤＳ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ＳＩＡＭ  １９−Ｉｓｏｂｕｔａｎｏｌ（ＣＡＳ番号７８−８３−１），Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。エタノールの生分解速度は、イソブタノールの生分解速度よりも大きいと予想さたため、イソブタノールよりもおよそ３倍高いエタノールのモル濃度は、試験のために控えめに選択された。
【００６５】
すべてのミクロコスム調製は、嫌気性チャンバー内で行った。ミクロコスムは、４０ｇのサイトの土壌を１６０ｍＬのガラス血清瓶に入れて調製した。ＢＴＥＸおよびアルコールを処理瓶に加えて、表５に示した目標濃度にした。（それぞれのＢＴＥＸ化合物の目標ＢＴＥＸ濃度を、ＢＴＥＸの欄に挙げてある）。瓶に地下水を満たし、およそ２ｍＬの上部空間を残した。対照ミクロコスムを、塩化第二水銀（瓶中に７００ｍｇＬ−１）およびホルムアルデヒド（瓶中に１容量％）で改質して、微生物活動を制限した。アルコールおよびＢＴＥＸの分析用として、処理試料を調製し、最低でも３つの複製試料があるようにした；電子受容体およびメタンの監視用として、１つの処理当たり１つの追加の複製試料を使用した。
【００６６】
瓶は、テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）の施されたブチルストッパーでクリンプシールし（ｃｒｉｍｐ  ｓｅａｌｅｄ）、１００ｒｐｍで作動するロータリーシェーカーによって１５℃でインキュベートした。必要に応じて、更なる電子受容体を加えて、所望の還元条件を維持した。対照を塩化第二水銀およびホルムアルデヒドで改質した。改質電子受容体の濃度を最後の欄に示してある。栄養素（改変基本塩培地の形態）（Ｈａｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５）を、第２２日にすべての処理試料に加えた。
【００６７】
【表６】
2013529242.tif 000008
【００６８】
分析方法
上部空間のガスを、ＢＴＥＸについては、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）およびＲｅｓｔｅｋ  ＱＳＰＬＯＴカラムを備えたＶａｒｉａｎ  ＣＰ−３９００ガスクロマトグラフ（ＧＣ）を用いて分析し、メタンについては、ＦＩＤおよびＲｅｓｔｅｋ  Ｒｔ−アルミナカラムを備えたＧＣを用いて分析した。水中濃度は、ヘンリーの法則を使用して計算した。
【００６９】
水中アルコール濃度（ならびに潜在的なイソブタノール分解生成物であるイソブチルアルデヒドおよびイソ酪酸）は、ＦＩＤおよびＳｔａｂｉｌｗａｘ  ＤＡカラムを備えたＶａｒｉａｎ  ＣＰ−３８００ガスクロマトグラフを用いて分析した。水性試料を、イオンクロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＸ−１２０，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で陰イオン分析するために集めた。硝酸塩も、Ｑｕａｎｔ  Ｎｉｔｒａｔｅ  Ｔｅｓｔ  ｓｔｒｉｐｓ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）を用いて周期的に測定した。鉄の合計および溶解した鉄は、Ｈａｃｈ  ｔｅｓｔ  Ｋｉｔｓ（Ｈａｃｈ，Ｌｏｖｅｌａｎｄ，ＣＯ）を用いて製造業者の使用説明書にしたがって測定した。
【００７０】
微生物分析
ミクロコスムスラリー副試料の試料（およそ８ｍＬ）を、実験の最初および最後に処理２、６、９、および１２から入手して、研究の過程全体にわたる微生物群の変化を確かめた。試料は、ただちに−７０℃で凍結させ、（研究の終わりに）ドライアイスに入れて、総真正細菌の定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）のために、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＴＮに運び、ＣＥＮＳＵＳ（商標）定量ＰＣＲ技法によって細菌、鉄および硫酸塩還元細菌、およびメタン生成細菌を同定した（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，２００９  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｂｅ．ｃｏｍ／ｈｏｗ−ｃｅｎｓｕｓ−ｗｏｒｋｓ．ｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｂｅ．ｃｏｍ／ｃｅｎｓｕｓ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ａｎａｅｒｏｂｉｃ−ｂｔｅｘ．ｈｔｍｌ；それぞれ０７．０７．２００９および０５．０８．０９でアクセスする）。
【００７１】
イソブタノールおよびエタノールの分解
イソブタノールは高濃度処理では完全に分解し、その分解速度は種々の嫌気条件下で変化した。図５は、高濃度処理におけるイソブタノールおよび電子受容体の濃度を示す（処理２、６、９、および１２）。非改質処理のバックグラウンド硫酸塩濃度を示してある。対照ミクロコスムでは、イソブタノールやエタノールの減少も、またイソブチルアルデヒドやイソ酪酸の蓄積も観察されなかった。最も速いイソブタノール生分解は、硝酸塩で改質されたミクロコスムで観察された。１６日以内に、イソブタノールは、硝酸塩還元条件において検出限界未満にまで分解した（処理６）。硝酸塩は、イソブタノールの分解と並行して利用され、減少して第１３日までには検出されなくなり、その後第１４日に再び改質された。バックグラウンド硫酸塩の測定できるほどの減少は、処理６では第１９日までずっと観察されなかった（データは示されていない）。
【００７２】
イソブタノールの生分解は、硫酸塩改質処理（処理１２）および非改質ミクロコスム（処理２）（この場合、限られたバックグラウンド硫酸塩が存在していた）の両方で観察された。硫酸塩が枯渇した後（すなわち、メタン生成条件）のイソブタノールの生分解を評価するため、第８８日に、イソブタノールを（最終濃度が３，４００μＭになるまで）処理２のミクロコスム瓶に再び加えた。追加のイソブタノールがおよそ３０日以内に分解した。ただし、ほんの微量レベル（＜２μＭ）のメタンが、硫酸塩の枯渇後に処理２で観察されたが、これは対照のメタンのレベルとほぼ同じである。
【００７３】
鉄改質処理におけるイソブタノールは、およそ８０日以内に分析検出限界未満にまで生分解した。４４日間ずっと監視された第二鉄は、およそ１８〜３６μＭの範囲の濃度であった。しかし、比較的低レベルの溶解した第一鉄（最高３６μＭまで）が観察された。はっきり認められるような第一鉄の蓄積がなかったのは、ミクロコスム瓶中で硫化鉄が形成した結果であると思われる（黒色沈殿が観察されたため）。さらに、硫化鉄の形成と調和して、バックグラウンド硫酸塩の濃度が鉄改質処理では減少した。イソブタノール濃度の減少は、硫酸塩の量の減少と相関関係があった。
【００７４】
イソブタノール濃度の低いミクロコスム（処理３、７、１０、および１３）の場合、イソブタノールは、鉄改質処理では、およそ２５日間以内に完全に生分解し、非改質処理、硝酸塩改質処理および硫酸塩改質処理では、およそ１５日間以内に完全に生分解した（図９）。改質電子受容体に加えて、それぞれのミクロコスムは、およそ１００μＭの量のバックグラウンド硝酸塩を地下水物質中に含んでいた。またイソブタノールの生分解に相関するバックグラウンド硝酸塩の減少が、インキュベーションの間に観察された。１モルのイソブタノールが分解するためには、理論的に、４モルの硝酸塩（完全に還元されて窒素になると仮定される）が必要とされる（ＭｃＣａｒｔｙ，“Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｓｓｕｅｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ  ｓｏｉｌｓ  ａｎｄ  ｇｒｏｕｎｄｗａｔｅｒ”Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｎ  ：Ｏｍｅｎｎ，Ｇ．Ｓ．，Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｒｉｓｋｓ  ｆｒｏｍ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｐｌｅｎｕｍ  ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１４３-１６２，１９８８）。集積培養実験では、消費された硝酸塩と分解されたベンゼンとのモル比が１０であり、理論数（Ｂｕｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｅｄｗａｒｄｓ，１９９９，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６５（２）：５２９−５３３）の２倍であることが示唆された。１００μＭのバックグラウンド硝酸塩が、およそ１３μＭのイソブタノール（低濃度処理の初期イソブタノールの１８％）の生分解を促進することができた。バックグラウンド硫酸塩の還元は、低濃度処理では観察されなかった。
【００７５】
イソ酪酸および微量レベルのイソブチルアルデヒドは、一時的生分解中間体として見分けられた。これらの化合物の両方に関してその後の生分解が、すべての処理で観察された。イソ酪酸は、理論量近く（およそ２分の一）まで蓄積したが、ただし、高濃度の硝酸塩改質処理は例外であり、ほんの５％の蓄積しか観察されなかった。高濃度の硝酸塩処理においてイソ酪酸の生成が限られていることは、簡単には説明されない。
【００７６】
エタノールで改質されたミクロコスム（処理４および１４）では、エタノールは、硫酸塩還元条件下においておよそ６０日間以内に分析検出限界未満にまで分解した（図６）。メタンは、処理４および１４の両方で第４４日に検出されたが（それぞれ４および２５μＭ）、第７８日までには非検出レベルにまで減少した。
【００７７】
硫酸塩が枯渇した後のエタノールの生分解を評価するために、第８８日にエタノールを処理４の瓶に再び加えた。９０日以内に、その後のエタノールの生分解は分析検出限界未満になった。この結果は、硫酸塩の非存在下での発酵によるエタノール生分解について記録している以前の嫌気性エタノール研究（Ｌａａｎｂｒｏｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３３：１７８−１８４）と一致する。
【００７８】
ＢＴＥＸの分解
対照におけるＢＴＥＸ濃度の減少は、実験過程の間、無視できるものであった（＜１５％）。高濃度処理におけるＢＴＥＸの生分解を図５および７に示し、低濃度でのＢＴＥＸの結果を（比較エタノール処理と一緒に）図８を示す。処理４の最後の２つの時点については、ＢＴＥＸを間違ってこの処理に再び加えてしまったので、データが得られていない。
【００７９】
電子受容体で改質されたすべての高濃度ミクロコスムで、トルエンの生分解が観察された（図７）。アルコールなしでインキュベートした場合、およそ３８μＭのトルエンがそれぞれ硝酸塩還元条件、鉄還元条件および硫酸塩還元条件で分解して、８０日以内に検出限界未満になった。イソブタノールが存在した場合、硝酸塩還元条件および硫酸塩還元条件のもとでのトルエン分解に対する影響はわずかであったが、鉄で改質されたミクロコスム中でトルエンの分解が遅くなった。しかし、非改質の高濃度ミクロコスムでは（処理２）、対照と比べて測定可能なトルエン濃度低下の傾向は観察されなかった。処理２のバックグラウンド硫酸塩は、最初の３０日間で枯渇したが、これはおそらくイソブタノールの生分解のせいであり、電子受容体の不足が、非改質処理においてトルエンが残存する理由であると考えられる。十分な電子受容体が存在する低濃度ミクロコスムスでは、非改質（硫酸塩が限定されている）ミクロコスムおよび電子受容体で改質された任意のミクロコスムの両方において、イソブタノールはトルエンの生分解にほとんど影響を及ぼさなかった（図８）。エチルベンゼンおよび総キシレンの結果（図１０）は、トルエンの結果と似ていたが、エチルベンゼンおよび総キシレンの生分解はトルエンと比べて少し遅かった。
【００８０】
イソブタノールが加えられていないＢＴＥＸ高濃度処理では、どの嫌気性条件下でも１６２日間のインキュベーションの間ずっと、ベンゼンの実質的な生分解は観察されなかった（図７）。しかし、イソブタノールが存在すると、鉄還元条件および硫酸塩還元条件の下ではベンゼンの生分解が刺激されるように見えた。それは、処理９および１２におけるベンゼン濃度が実験の終わりまでに減少し始めたためである。硫酸塩還元条件下での低濃度処理では、およそ３００日間インキュベートした後、イソブタノールを含んだミクロコスム中でベンゼン濃度が減少して分析検出限界（０．５０μＭ）未満になり（処理１３）、エタノールを含んだミクロコスムではおよそ０．８５μＭになった（処理１４）。ベンゼンの生分解は、処理１４では第１２０日の前に始まり、処理１３では１６０から３００日の間に起きた。
【００８１】
微生物分析
表６に示されている微生物分析の結果は、概して、インキュベーションの間に微生物濃度が増大していることを示した。（値は細胞数／ｍＬであり、±の値は９５％信頼区間を示す。）
【００８２】
【表７】
2013529242.tif 000009
【００８３】
第二鉄を含むミクロコスム（処理９）または硫酸塩を含むミクロコスム（処理２、および１２）では、対応する鉄還元細菌および硫酸塩還元細菌の個体数はそれぞれ１０００倍に増えた。処理６において硝酸塩が枯渇して、嫌気性インキュベーションの終わりに近づくにつれ、メタン生成菌の個体数は１００倍に増加した。他の処理では、やや少ないレベルのメタン生成菌バイオマスの増加が観察された。
【００８４】
硝酸塩によって改質された処理では、脱窒素細菌の増殖の増加は観察されなかった。この観察に対する１つの説明としては、２種類の異なる硝酸塩還元酵素遺伝子を監視したが、我々の系では脱窒素細菌の機能遺伝子を数量化しなかったというものがある。あるいは、脱窒素細菌の活動はかなりのものだったかもしれないが、脱窒素条件下におけるｎ−ブタノールの研究でＤｕｂｂｅｌｓらによって観察されたように脱窒素細菌の増殖が少なかったと思われる（２００９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１５７６−１５７８）。同様に、増殖において硝酸塩還元に依存しない発酵菌も、脱窒素条件下でのイソブタノール分解に関係している可能性がある（Ｌａａｎｂｒｏｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３３：１７８−１８４）。
【００８５】
実施例３−エタノールの補助溶剤としてのイソブタノール
スコーピング（ｓｃｏｐｉｎｇ）水分許容性および相分離の試験を、６５°Ｆでイソブタノール−エタノール−ガソリンブレンドに対して実施した。イソブタノールの量を増やしながらＥ１０ガソリンと混ぜ、その後、１．３％または２．６％のいずれかの水をすべてのブレンドに加えた。ブレンドによっては水を２．６容量％まで増やす必要があった。なぜならエタノールを含んでいるガソリンブレンドは、多量の水を吸収し、１．３％の水では分析のための分離した水相および炭化水素相を引き起こすのに必ずしも十分ではなかった（すなわち、１．３容量％の水は高濃度のイソブタノールブレンドによって完全に吸収されてしまった）からである。このことは、図１１から知ることができる。その図においては、Ｅ１０中のイソブタノールの量が５容量％に達するまでは、２つの相を生じさせるのに１．３容量％で十分であったが、Ｅ１０中に１０容量％のイソブタノールが含まれる場合、相分離を引き起こすために、そのレベルを２．６容量％の水にまで増やす必要があった。
【００８６】
図１２のデータは、水相に抽出されるエタノールの量がイソブタノール濃度の増大とともに減少したことを示しているが、そのことはイソブタノールがエタノールの補助溶剤として作用することを示す。炭化水素相および水相のどちらの濃度もＧＣで求めた。
【００８７】
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の全般的性質を十分に明らかにするであろう。それゆえに、他の人々は、当該技術分野の知識を当てはめることによって、過度の実験を行わずに、また本発明の一般概念から逸脱することなく、容易に様々な用途に合わせてそのような特定形態を変更し、かつ／または適合させることができる。それゆえに、そのような適合形態および変形形態は、本明細書に示されている教示および指針に基づいて、開示されている実施形態の同等物の意味および範囲に含まれることを意図している。本明細書の専門語または用語は、説明のためのものであり、限定するものではなく、本明細書の用語または専門語はその教示および指針に照らして当業者によって解釈されるものであることを理解すべきである。
【図１Ａ】
2013529242.tif 000010
【図１Ｂ】
2013529242.tif 000011
【図１Ｃ】
2013529242.tif 000012
【図２Ａ】
2013529242.tif 000013
【図２Ｂ】
2013529242.tif 000014
【図２Ｃ】
2013529242.tif 000015
【図２Ｄ】
2013529242.tif 000016
【図３Ａ】
2013529242.tif 000017
【図３Ｂ】
2013529242.tif 000018
【図３Ｃ】
2013529242.tif 000019
【図３Ｄ】
2013529242.tif 000020
【図４Ａ】
2013529242.tif 000021
【図４Ｂ】
2013529242.tif 000022
【図４Ｃ】
2013529242.tif 000023
【図４Ｄ】
2013529242.tif 000024
【図５Ａ】
2013529242.tif 000025
【図５Ｂ】
2013529242.tif 000026
【図５Ｃ】
2013529242.tif 000027
【図５Ｄ】
2013529242.tif 000028
【図６Ａ】
2013529242.tif 000029
【図６Ｂ】
2013529242.tif 000030
【図７Ａ】
2013529242.tif 000031
【図７Ｂ】
2013529242.tif 000032
【図７Ｃ】
2013529242.tif 000033
【図７Ｄ】
2013529242.tif 000034
【図８Ａ】
2013529242.tif 000035
【図８Ｂ】
2013529242.tif 000036
【図８Ｃ】
2013529242.tif 000037
【図８Ｄ】
2013529242.tif 000038
【図９Ａ】
2013529242.tif 000039
【図９Ｂ】
2013529242.tif 000040
【図９Ｃ】
2013529242.tif 000041
【図９Ｄ】
2013529242.tif 000042
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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