(57)【要約】本発明は概して以下の工程：（ｉ）少なくとも１個以上の生細胞を含む第１の量を有する液体を容器の中に移し、（ｉｉ）前記の容器に第２の量を有するＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液を添加し、一方で前記の第２の量は前記の第１の量の少なくとも２倍の大きさであり、（ｉｉｉ）前記の少なくとも１個以上の生細胞を前記の容器内で、少なくとも９０℃で少なくとも２０秒間の保温により溶解させ、そして（ｉｖ）前記の標的を、中間の精製工程を実施せずに１ステップＲＴ−ＰＣＲにより増幅する；を含む、標的ＲＮＡの増幅のための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ標的核酸の増幅のための方法であって、以下の工程：
ａ）１個以上の生細胞を含む第１の量を有する液体試料を容器の中に移し、
ｂ）前記の容器に第２の量を有する１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液を添加し、一方で前記の第２の量は前記の第１の量の少なくとも２倍の大きさであり、
ｃ）前記の容器を少なくとも９０℃で少なくとも２０秒間加熱し、
ｄ）前記の容器中の前記の標的を、中間の精製工程を実施せずに１ステップＲＴ−ＰＣＲを実施することが可能な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅する；
を含み、前記の工程ｂ）の間に添加される１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液が１ステップＲＴ−ＰＣＲを実施することが可能な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを含む、前記方法。
【請求項２】
前記の工程ｂ）のＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液が追加で少なくとも一対の増幅プライマーおよび場合により少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物のどちらかを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の容器が少なくとも一対のＰＣＲ増幅プライマーおよび場合により少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物のどちらかの乾燥組成物を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性が工程ｃ）の間に熱的に活性化されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記のポリメラーゼがＴｔｈポリメラーゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）の前に前記の少なくとも１個以上の生細胞を含む液体が細胞選別法により得られていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記の工程ａ）の生細胞の数のその中で工程ｄ）のポリメラーゼ連鎖反応が実施される液体の量に対する比率が２細胞／μｌより大きくない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記の比率が少なくとも１細胞／２５μｌである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記の試料が２μｌ未満の量を有し、工程ｂ）およびｃ）の間に前記の試料が３７℃〜６５℃の温度で３０秒間〜５分間保温される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
以下：
−サーマルサイクラー機器の中に取りつけられるように設計された複数の反応容器
−１ステップＲＴ−ＰＣＲを実施することが可能な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを含むＰＣＲ反応緩衝液
を含むキット。
【請求項１１】
さらに少なくとも一対の増幅プライマーおよび場合により少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物のどちらかを含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記の反応容器が少なくとも一対のＰＣＲ増幅プライマーおよび場合により少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物のどちらかの乾燥組成物を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
前記の複数の反応容器がマイクロタイタープレートまたは反応容器の線状細片の形態で互いに物理的に連結されている、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
前記の熱安定性ポリメラーゼが９０℃で少なくとも１分間の保温により熱的に活性化される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲによるＲＮＡ発現分析の分野に関する。より具体的には、本発明は、リアルタイムＰＣＲによる、少数の細胞のみの材料から出発する発現分析、およびそれに続く前記の試料ＤＮＡの直接分析を実施するための新規の方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
過去数十年で、ＰＣＲは、それが核酸の指数関数的増幅を可能にするため、ＤＮＡの分析のための“馬車馬”になってきた。特に、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲとも呼ばれる）は、それが増幅された核酸をその増幅の間に、または途中で開けずに、その増幅反応の直後に融解曲線分析により同時分析することを可能にするため、強力な道具になってきた。
【０００３】
さらに、ＰＣＲならびにＲＴ−ＰＣＲの自動化は、今では９６、３８４または１５３６個の反応をマイクロタイタープレート形式で並行して実施することを可能にするｑＰＣＲシステムが利用可能であるため、著しく進歩してきた。システムはより使いやすくもなってきた。例えば、それぞれの反応容器が既にＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲの増幅または増幅および検出を実施するために必要な化合物を冷凍乾燥された形態で含むマイクロタイタープレートが商業的に入手可能であり、客は分析する予定の核酸を含む試料を実際の反応自体の前に添加しさえすればよい。ガラススライド上でのＰＣＲ増幅および検出を可能にする代わりの系がＡｄｖａｌｙｔｉｃｓ（ＡＧ  ４８０Ｆ）により提供されている。
【０００４】
それでもなお、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ分析に関する作業の流れをさらに向上させることは、特に少数の細胞のみに由来するＲＮＡに対してしか分析を行うことができない場合、依然として課題である。伝統的なリアルタイムＰＣＲでは、ＤＮＡまたはＲＮＡをまず細胞から時間のかかる手順で単離し、それは材料の喪失につながる可能性がある。回収した後、その細胞を溶解し、そうしないとＰＣＲ増幅が少なくとも定量的に阻害される可能性があるため、そのＤＮＡをその溶解物から少なくとも部分的に精製する。
【０００５】
この状況において、本発明の基礎をなす技術的な問題は、さらに単純化された核酸分析プロトコルを可能にする、向上された、自動化可能な高スループットな方法を提供することであった。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、以下の工程を含む、ＲＮＡ標的核酸の増幅のための方法を提供する：
ａ）１個以上の生細胞を含む第１の量を有する液体試料を容器の中に移し、
ｂ）前記の容器に第２の量を有する１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液を添加し、一方で前記の第２の量は前記の第１の量の少なくとも２倍の大きさであり、
ｃ）前記の１個以上の生細胞を前記の容器内で、少なくとも９０℃で少なくとも２０秒間の保温により溶解させ、
ｄ）前記の標的核酸を、中間の精製工程を実施せずに１ステップＲＴ−ＰＣＲを実施することが可能な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅する。
【０００７】
ここで、工程ｂ）の間に添加される１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液は、さらに熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを含む。
前記の工程ｂ）の１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液は、追加で少なくとも一対の増幅プライマーおよび場合により少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を含んでいてよい。
【０００８】
あるいは、前記の容器は少なくとも一対のＰＣＲ増幅プライマーおよび場合により少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物のどちらかの乾燥組成物を含む。
【０００９】
１態様において、前記の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性は、工程ｃ）の間に熱的に活性化される。
また、上記で開示した態様と相互排他的ではない１態様において、前記のポリメラーゼはＴｔｈポリメラーゼである。
【００１０】
本発明の方法の１態様において、前記の少なくとも１個以上の生細胞を含む液体は工程ａ）の前に細胞選別法により得られている。
好ましくは、前記の工程ａ）の生細胞の数の、その中で工程ｄ）のポリメラーゼ連鎖反応が実施される液体の量に対する比率は、２細胞／μＬより大きくない。
【００１１】
好ましくは、増幅されることになる核酸はＲＮＡである。その標的ＲＮＡが非常に低い量でしか発現されていない、および／または単一コピーのＤＮＡからしか転写されていない場合も、本発明の範囲内である。
【００１２】
特定の態様において、前記の試料は２μｌ未満の量を有し、工程ｂ）およびｃ）の間に前記の試料は３７℃〜６５℃の温度で３０秒間〜５分間保温される。
別の観点において、本発明は、サーマルサイクラー機器の中に取りつけられるように設計された複数の反応容器、ならびに１ステップＲＴ−ＰＣＲを実施することが可能な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを含むＰＣＲ反応緩衝液を含むキットを提供する。
【００１３】
１態様において、前記のキットはさらに、少なくとも一対の増幅プライマーおよび場合により少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物のどちらかを含む。
【００１４】
代わりの態様において、前記のキット内の前記の反応容器は、少なくとも一対のＰＣＲ増幅プライマーおよび場合により少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物のどちらかの乾燥組成物を含む。
【００１５】
前記の複数の反応容器は、マイクロタイタープレートまたは反応容器の線状細片（ｓｔｒｉｐ）の形態で互いに物理的に連結されていてよい。
加えて、そのようなキット内の前記の熱安定性ポリメラーゼは、好ましくは９０℃で少なくとも１分間の保温により熱的に活性化されてよい。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一般的に言って、本発明は、細胞試料を液体環境中で溶解させ、それを後で一切の中間の精製工程または複雑な液体取り扱い手順なしで１ステップＲＴ−ＰＣＲを適用することによるＲＮＡ発現分析のために直接用いることを可能にする方法を提供する。より正確には、本発明は、以下の工程を含む、ＲＮＡ標的核酸の増幅のための方法を提供する：
ａ）１個以上の生細胞を含む第１の量を有する液体試料を容器の中に移し、
ｂ）前記の容器に第２の量を有する１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液を添加し、一方で前記の第２の量は前記の第１の量の少なくとも２倍の大きさであり、
ｃ）前記の容器を少なくとも９０℃で少なくとも２０秒間保温し、それにより前記の１個以上の生細胞を前記の容器内で溶解させ、
ｄ）前記の標的核酸を、中間の精製工程を実施せずに、逆転写酵素活性ならびにＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を含む熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅する。
【００１７】
本発明の１観点によれば、工程ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の全てを同じ反応容器内で実施することが可能である。
実施例により実証されると考えられるように、本発明は、驚くべきことに最初の試料物質として単一の生細胞のみから出発する１ステップＲＴ−ＰＣＲ分析を実施するために適用可能である方法を提供する。さらに、少数の細胞のみ、またはさらには単一の細胞のみから単一コピー遺伝子からの標的ＤＮＡを再現性よく増幅および分析することが可能である。
【００１８】
その標的核酸は、それぞれのＲＮＡの発現レベルを監視する目的でのｍＲＮＡが含まれるがそれに限定されないあらゆるＲＮＡであってよい。従って、ＲＮＡ標的核酸を、ＲＮＡ鋳型依存性ポリメラーゼ活性（逆転写酵素活性）およびＤＮＡ鋳型依存性活性の両方を含む熱安定性ポリメラーゼで増幅することが必要である。そのような酵素の卓越した例は、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：１１  ４８０  ０２２  ００１）である。あるいは、逆転写酵素活性ならびにＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を含む熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素活性を有する酵素およびＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性の混合物であってよい。例えば、Ｃ．ｔｈｅｒｍポリメラーゼシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：１２  ０１６  ３４６  ００１）は、Ｃ．ｔｈｅｒｍポリメラーゼおよびＴａｑポリメラーゼの混合物からなる。
【００１９】
Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ活性の高い温度（＋５５℃〜＋７０℃が最適、最大で＋９５℃）は、ＲＮＡ二次構造により引き起こされる問題を克服する。結果として得られるｃＤＮＡは、Ｍｇ２＋イオンの存在下での同じ酵素を用いるＰＣＲにより増幅され得る。高い温度で逆転写およびＤＮＡ増幅の両方を行うＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼの能力は、この酵素を定量的ＲＴ−ＰＣＲ、クローニング、および遺伝子発現分析のために用いることを可能にする。Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼは、１ｋｂまでのＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅のために用いられる。
【００２０】
Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ活性は高温（＋９５℃）での延長された保温に耐性であり、従ってＰＣＲ増幅のために用いることができる。マンガンイオン（Ｍｎ２＋）の存在下では、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼは非常に効率的な逆転写酵素（ＲＴ）活性を有し、それは大腸菌のＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに関して報告されている活性よりもはるかに高い(Saiki, R.K., et al., Science 239 (1988) 487-491)。
【００２１】
工程ａ）
工程ａ）に従う１個以上の生細胞は、好ましくはヒト、動物または植物由来の真核細胞である。その細胞は、細胞株、血液または生検由来のものであってよい。
【００２２】
その細胞を含有する液体試料は、その中で前記の細胞が少なくとも一定の期間の間生存するあらゆる液体、緩衝液または培地であってよく、それは好ましくは３０分間より長い。そのような液体は、例えばその中で細胞の懸濁状態での生存および増殖がうまく培養されてきた（ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ）培地であってよい。接着細胞の場合、その液体は、その中でその細胞が固体支持体から脱離されてきた緩衝液であってよい。しかし、好ましくは、そのような緩衝液は、その後のポリメラーゼに仲介されるＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ増幅反応への阻害作用を有する可能性のあるあらゆるプロテアーゼを含まない。そのような作用は、観察された場合、その細胞にその容器中への沈着（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）の前に追加の洗浄工程を施すことにより回避することができる。
【００２３】
その液体のその容器中への移動は、まず細胞試料の適切な希釈系列を調製し、次いで１個のみまたは数個の細胞に相当するものをピペットで前記の容器中に入れることにより、手作業で達成することができる。好ましくは、その移動は、適切な自動化されたピペット操作ステーション、または大抵は好ましくは細胞選別機を用いて達成される。そのような細胞選別機械は当技術で周知であり、いくつかの異なる製造業者から商業的に入手可能である。細胞選別機の基礎をなす技術のため、細胞破壊片の大きな粒子が細胞選別機により細胞と誤認されることが時々起こるであろう。この作用により、単一細胞分析の場合、それに続くＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ反応の間に一部の試料が結果を与えない可能性がある。
【００２４】
好ましくは、一切の精製工程なしではより高い濃度の細胞破砕片の存在がそれに続く増幅反応を阻害する可能性があるため、その反応容器に移される細胞の数は制限されるべきである。好都合には、その反応容器に移される細胞の数は、下記で開示する工程ｄ）がその試料が２細胞相当数（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）／μｌの比率を超えないような方式で実施されるように調節される。
【００２５】
やはり好ましくは、その反応容器に移される細胞の数は低いべきではなく、これはそうでなければ低い存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｙ）でのみ発現しているＲＮＡの増幅のためのＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ反応を実施するのが難しくなる可能性があるためである。従って、その反応容器に移される細胞の数は、下記で開示する工程ｄ）がその試料が少なくとも１細胞相当数／２５μｌの比率を含むような方式で実施されるように調節される。
【００２６】
その液体の量は、工程ｂ）における１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液の添加および−必要であれば−それに続く増幅反応に必要なさらなる化合物の添加が最終的に結果として前記のＲＴ−ＰＣＲの実施に関してなお合理的に小さい最終的な量をもたらすように、十分に小さい。前記の量は絶対に１００μｌを超えるべきではなく、決して２００μｌを超えるべきではない。好都合には、前記の量は５０μｌより大きくない。２０μｌ未満、さらには１０μｌの量が非常に好ましい。１個以上の細胞を含有する液体の自動化された沈着の場合、μｌより下の範囲で非常に少ないことが可能である。特に、細胞選別機を用いる場合、１細胞相当数のみを含有する量は約１００ｎｌ未満である。たとえ後者の場合においてその試料が乾燥しても、その新規の方法はなお有効であることが本発明者により証明されている。単一細胞分析の特定の態様において、その最終的な量は好ましくは２５μｌを超えない。
【００２７】
その反応容器は、その中で増幅反応を実施することができるあらゆるタイプの反応容器であってよい。従って、唯一の本質的な制限はその容器が十分な熱耐性を有することであり、これはその熱サイクルプロトコルの間にそれが９０℃以上の高温に繰り返しさらされることになると考えられるためである。
【００２８】
１態様において、その反応容器は、サーマルサイクラー機器中に入れられるように適合された、または設計されたマイクロタイタープレートのウェルである。これは本発明の方法を高度に並行した様式で多くの試料に対して実行することを可能にする。９６、３８４、および１５３６ウェルを含むマイクロタイタープレートが当技術において既知であり、多数の異なる供給業者から商業的に入手可能である。当技術で入手可能なマイクロタイタープレートは、少なくとも２μｌの反応量を可能にする。そのようなマイクロタイタープレートは、それらを適切な加熱ブロック上に置く、あるいはマイクロタイタープレートを組み込むように設計されたＰＣＲサーマルサイクラー機器中に直接入れることにより、少なくとも９０℃の高温にさらされ得る。
【００２９】
第２態様において、その反応容器は単独の反応チューブまたはそれらをサーマルサイクラー機器の加熱ブロックの中に一緒に入れることができるように互いに連結されている反応チューブの細片の一部である反応チューブであってよい。さらなる態様において、その反応容器は毛細管ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ機器（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号０２３  ５３１  ４１４  ００１）の中に入れることができる特別な毛細管である。
【００３０】
工程ｂ）
本発明の文脈において、本発明の工程ｂ）において添加される“１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液”という用語は、その中でその試料に対して後で一切の中間の精製工程なしでＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことができるあらゆる液体として理解される。前記の添加される反応緩衝液の第２の量は、その第１の量の少なくとも２倍（２×）の大きさ、好ましくは５倍（５×）の大きさであるべきである。これは、それに続く１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応の間のその標的核酸の効率的な増幅を可能にするであろう。
【００３１】
その“１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液”は、少なくとも逆転写酵素活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を含む熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物（ｄＮＴＰ）を含む。１態様において、その“１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液”は、ＰＣＲ反応の実施にさらに必要である化合物を既に含有している。従って、前記の“１ステップＲＴ−反応緩衝液”は、さらに少なくとも１種類の適切な増幅プライマーの対を含んでいてよい。その“１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液は、適切なｐＨ緩衝化合物（例えばトリス）、Ｍｇ２＋塩、Ｍｎ２＋塩、ホットスタート構成要素等も含んでいてよい。
【００３２】
特定の態様において、その“１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液”は、その標的ＤＮＡの増幅をリアルタイムで監視するのに必要な化合物を既に含んでいてよい。特に、これらの化合物は蛍光ハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖ＤＮＡ結合色素のどちらかである。様々な可能な検出形式の詳細は下記で論じられるであろう。
【００３３】
あるいは、前記の構成要素の一部、いずれかもしくは全て、またはあらゆる他の追加の化合物が、溶解工程ｃ）の後に、しかし工程ｄ）に従う実際の増幅反応の実施の前に添加される場合も、本発明の範囲内である。
【００３４】
工程ｃ）
本発明によれば、その細胞の溶解は、当技術において従来法で用いられる特定の溶解工程試薬を一切事前添加せずに、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液内で起こる。むしろ、その１個以上の生細胞の溶解は、その試料を少なくとも９０℃において少なくとも２０秒の期間の間保温することにより起こる。通常、１分未満の期間の高温での保温は中程度の数の細胞（６４個より多くない細胞）の完全な溶解に十分であり、それはそれに続く低い存在量で発現された転写産物の増幅および検出を可能にする。しかし、前記の期間が３０分の期間まで、しかし好ましくは１５分より長くない期間まで延長される場合も、本発明の範囲内である。
【００３５】
細胞の溶解のために用いられる温度は１００℃を超えるべきではなく、好ましくは９５℃未満であり、これはより高い温度ではそれに続くＰＣＲ反応に必要であるその反応緩衝液に含有される構成要素が破壊される危険性が増大するためである。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼでさえも、１００℃より上の温度では実質的に変性または分解した状態になる。
【００３６】
工程ｄ）
実施例により明示されるように、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応はその溶解物を中間の精製工程なしで直接用いて実施することができる。しかし、態様次第で、前記の反応に必要な追加の化合物がその溶解の後にその試料に添加される場合は、本発明の範囲内である。
【００３７】
本発明は非常に少数の細胞のみ、またはさらには単一の細胞のみに由来する核酸の分析に適用可能であるため、分析される細胞の数およびその中で工程ｄ）に従う実際のＲＴ−ＰＣＲ反応が起こる量の間の比率を考慮すれば、本発明に従う実験の設計に好都合である。一方で、そのような少量の出発物質が分析されることになるのであれば、その反応は最適な程度の感度を達成するために最小限の量の中で実施されるべきである。従って、前記の工程ａ）の細胞の数の、その中で工程ｄ）のポリメラーゼ連鎖反応が実施される液体の量に対する比率が、少なくとも１細胞／２０μｌ反応量であれば好都合であることが証明されている。
【００３８】
中間の精製工程がないため、その溶解された試料はそのＰＣＲ反応の効率を損なう可能性のある細胞破砕片を含有しているであろう。この状況において、前記の工程ａ）の生細胞または細胞相当物の数の、その中で工程ｄ）のポリメラーゼ連鎖反応が実施される液体の量に対する比率が、２細胞／μｌより大きくなければ好都合であることが証明されている。１細胞／２５μｌ〜２細胞／μｌの比率がさらにもっと好都合である。実験により決定されているように、この範囲内の比率は、単一の細胞のみ、ならびにはるかに多い細胞数に由来するＤＮＡに対する単一コピー分析を可能にする。
【００３９】
１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応のために用いられる化合物は、当技術で用いられる従来の化合物であってよい：その反応の反応構成には、標的ＲＮＡ、ｄＮＴＰ、本発明の方法を遺伝子発現の監視のために用いるために１ステップＲＴ  ＰＣＲを実施することもできる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも一対の増幅プライマーが含まれる。
【００４０】
好都合には、そのプライマーは、その生成される増幅産物が比較的小さいような方式で設計される。１ｋｂまでの大きさを有する増幅産物が本発明に従う方法により定量的に生成されているが、３００ｂｐ未満またはさらには１２０ｂｐ未満のアンプリコンの大きさが非常に好ましい。
【００４１】
やはり好都合には、本発明に従うプライマーはそれらがイントロン配列にまたがるような方式で設計され、すなわち、それぞれのプライマーの一部は第１エキソンに対して向けられ、前記のプライマーのその他の部分は第２の連続したエキソンに対して向けられる。そのような設計はその試料中のＲＮＡに由来する増幅産物を特異的に作り出すことを可能にし、それぞれのゲノムＤＮＡ断片に由来する可能性のある増幅産物を生成する可能性を排除する。
【００４２】
その１ステップＲＴ−ＰＣＲの逆転写部分は、サーマルサイクラー機器内の別個のプログラム作成を必要としない。代わりに、その逆転写工程はその熱サイクルプロトコルの最初の温度変動（ｒａｍｐｉｎｇ）、アニーリングおよび伸長工程の間に起こる。これは、欧州特許第１  ９７８  １０９号において開示されている観察に従う。
【００４３】
しかし、２μｌ未満の少ない試料量に関して、本発明者らは、驚くべきことに、実際の熱溶解工程の前の前保温工程が逆転写酵素反応に最適な温度に近い温度である場合に、発現の検出がさらにもっと高感度であることを観察している。従って、特定の態様において、前記の試料は２μｌ未満の量を有し、工程ｂ）およびｃ）の間に前記の試料を３７℃〜６５℃の温度で３０秒間〜５分間保温する。おそらく、そのようなプラスの作用は２μｌ未満の少ない試料量によるものであり、それは結果としてその少数の選別された細胞の膜の即時の乾燥およびそれに続く破壊をもたらす。結果として、その細胞のＲＮＡは逆転写反応に利用可能になることができる。
【００４４】
続いて、増幅されたＤＮＡの分析を、通常はゲル電気泳動により達成することができる。しかし、より重要な態様において、そのＲＴ−ＰＣＲ反応はリアルタイムＰＣＲ反応であってよく、ここでその増幅の進行は、例えば以下の検出形式のいずれかを用いて連続的に監視される：
−ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ形式：
一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを２種類の構成要素で標識する。第１構成要素が適切な波長の光で励起された際に、吸収されたエネルギーが第２構成要素（いわゆるクエンチャー）に、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って移動する。そのＰＣＲ反応のアニーリング工程の間に、そのハイブリダイゼーションプローブが標的ＤＮＡに結合し、それに続く伸長段階の間にＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により分解される。結果として、その励起された蛍光構成要素およびクエンチャーが空間的に互いから分離され、そうして第１構成要素の蛍光放射を測定することができる。ＴａｑＭａｎプローブアッセイは、米国特許第５，２１０，０１５号、米国特許第５，５３８，８４８号、および米国特許第５，４８７，９７２号において詳細に開示されている。ＴａｑＭａｎハイブリダイゼーションプローブおよび化合物の混合物は、米国特許第５，８０４，３７５号において開示されている。
【００４５】
特定の態様において、そのＴａｑＭａｎハイブリダイゼーションプローブは、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能であるような（カタログ２０１０／２０１１，ｐ．５７７）ユニバーサルプローブライブラリーからのＵＰＬプローブである。
【００４６】
−分子ビーコン：
これらのハイブリダイゼーションプローブも第１構成要素およびクエンチャーで標識されており、その標識は好ましくはそのプローブの両端に位置している。そのプローブの二次構造の結果として、両方の構成要素は溶液中で空間的に近くにある。標的核酸へのハイブリダイゼーションの後、両方の構成要素は、適切な波長の光による励起後にその第１構成要素の蛍光放射を測定することができるように、互いから分離される（米国特許第５，１１８，８０１号）。
【００４７】
−ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ：
ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ試験形式は、全ての種類の相同ハイブリダイゼーションアッセイに特に有用である(Matthews, J.A., and Kricka, L.J., Analytical Biochemistry 169 (1988) 1-25)。それは、同時に用いられ、増幅された標的核酸の同じ鎖の隣接部位に相補的である２種類の一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを特徴とする。両方のプローブは異なる蛍光構成要素で標識されている。適切な波長の光で励起された際に、第１構成要素は、両方のハイブリダイゼーションプローブが検出する予定の標的分子の隣接する位置に結合した際に第２構成要素の蛍光放射を測定することができるように、吸収したエネルギーを蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って第２構成要素に移動させる。ＦＲＥＴアクセプター構成要素の蛍光の増大を監視する代わりに、ＦＲＥＴドナー構成要素の蛍光の減少をハイブリダイゼーション事象の定量的測定として監視することも可能である。
【００４８】
特に、そのＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ形式は、増幅された標的ＤＮＡを検出するためにリアルタイムＰＣＲにおいて用いることができる。リアルタイムＰＣＲの技術分野で既知の全ての検出形式の中で、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ形式は非常に高感度、正確かつ信頼できることが証明されている（ＷＯ９７／４６７０７；ＷＯ９７／４６７１２；ＷＯ９７／４６７１４）。２種類のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの使用に対する代替策として、蛍光標識されたプライマーおよび１種類のみの標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いることも可能である(Bernard, P.S., et al., Analytical Biochemistry 255 (1998) 101-107)。この点について、そのプライマーがＦＲＥＴドナー化合物で標識されるか、またはＦＲＥＴアクセプター化合物で標識されるかは任意に選択されてよい。
【００４９】
−二本鎖ＤＮＡ結合色素形式：
増幅産物が二本鎖核酸結合部分を用いて検出される場合に、リアルタイムＰＣＲが本発明に従う添加物の存在下で実施される場合も、本発明の範囲内である。例えば、それぞれの増幅産物を本発明に従って蛍光ＤＮＡ結合色素により検出することもでき、それは二本鎖核酸との相互作用の際に、適切な波長の光による励起後に、対応する蛍光シグナルを放射する。色素ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩおよびＳｙｂｒＧｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が当技術において頻繁に用いられる。別の特に有用な色素は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｒｅｓｏｌｉｇｈｔ色素（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：０４  ９０９  ６４０  ００１）である。
【００５０】
ホットスタートＰＣＲ
そのＰＣＲ反応構成は、ホットスタート効果、すなわち、時々結果としてプライマーダイマーのような非特異的増幅産物の形成をもたらす周囲温度での非特異的なプライマーのアニーリングおよびそれに続く伸長の阻害を提供するいくつかの化合物を含有することができる。温度が上昇した際、そのホットスタート化合物があらゆる結合パートナーから遊離するため、この阻害が除去された状態になり、その結果その熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが熱的に活性化された状態になり、特異的なポリメラーゼに触媒されるプライマー伸長が起こることができる。そのような化合物に関する多くの例が当技術において既知である。具体的な例が米国特許第５，３３８，６７１号において与えられており、それはホットスタート化合物としてのポリメラーゼ抗体を開示している。そのようなホットスタート化合物に関するより最近の例が欧州特許第１  ９８９  ３２４  Ａ号および欧州特許第２  １６３  ５５６号において開示されている。
【００５１】
前記のホットスタート化合物は、溶解の後に、工程ｄ）の前にポリメラーゼおよびあらゆる他のＲＴ−ＰＣＲ化合物と一緒にその試料に添加されてよい。しかし、好ましくは、前記のホットスタート化合物は工程ｂ）の間に添加されている“１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液”内に既に含まれている。結果として、その熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの熱的活性化は、工程ｃ）の間の少なくとも９０℃での保温により既に達成されていることができる。
【００５２】
特定の態様において、そのＤＮＡポリメラーゼは化学修飾の結果として可逆的に不活性化される。より正確には、熱不安定性ブロック基をそのポリメラーゼ中に導入し、それはその酵素を室温で不活性にする（米国特許第５，７７３，２５８号）。これらのブロック基は前ＰＣＲ工程の間に、その酵素が活性化された状態になるように高温で除去される。そのような熱不安定性修飾は、例えばシトラコン酸無水物またはアコニチン酸無水物をその酵素のリシン残基に結合させることにより得ることができる（米国特許第５，６７７，１５２号）。
【００５３】
好ましい態様において、そのホットスタートの特徴は、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼをアプタマーとの組み合わせで用いることにより達成される。Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼはＲＮＡ依存性逆転写酵素活性およびＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する熱安定性酵素であり、単一チューブでの反応における逆転写（ＲＴ）およびＰＣＲの組み合わせを可能にする。
【００５４】
アプタマーは、Ｔｔｈ酵素の最適反応温度より下の温度でそのポリメラーゼの活性中心に結合して核酸標的への付着を妨げる専用のオリゴヌクレオチドである。従って、反応の準備およびそれに続くＲＴ工程の前の加熱段階の間にはプライマーの伸長は起こらない。より高い温度において、そのアプタマーはその酵素から遊離し、ＲＴまたはＤＮＡの重合が開始され得る。Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼによるＲＴに関する推奨される保温温度（＋６１℃）は、ＲＮＡの二次構造を克服することができる。これは結果として高度に特異的かつ効率的なｃＤＮＡ合成をもたらし、それは高度に特異的かつ高感度なＰＣＲをもたらす。
【００５５】
アプタマーを用いるホットスタートは、それが追加の保温工程、ピペット操作工程、または反応時間の延長を必要としないため、高度に効果的かつ非常に便利である。アプタマーを用いるホットスタートプロトコルは他の酵素的プロセス、増幅産物のオンライン検出、またはそれに続く取り扱い工程を妨げない。
【００５６】
ＰＣＲ試薬の乾燥組成物を含むマイクロタイタープレート
上記で開示したように、本発明に従う方法を実施するためにマイクロタイタープレートを用いることができる。この場合、そのマイクロタイタープレートのそれぞれの容器または反応ウェルは、既にその表面上に、その後でＰＣＲに必要である試薬の乾燥組成物を含んでいてよい。そのマスター混合物の乾燥組成物は、工程ｂ）における“１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液”の添加により溶解される。本発明の文脈において、句“乾燥組成物”は、溶媒の、好ましくは水性溶媒の量が５重量％未満に低減されていることを強調するために用いられる。
【００５７】
例えば、そのような乾燥組成物は、少なくとも一対の増幅プライマーを含んでいてよく、またはそれのみで構成されていてよい。この場合、その“１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液”は増幅プライマーを一切含まない。マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルは同じ増幅プライマーの対を含んでいてよく、それにより多数の試料の並行分析が可能になり、または実質的にそれぞれのウェルは異なる増幅プライマーの対を含んでいてよく、それにより１種類もしくはごく少数の異なる試料の多パラメーター分析が可能になる。当然、そのプレートのレイアウトはその２つの概念を混合したものに従って、ならびに二重、三重または四重の分析のために設計することもできる。ＰＣＲ増幅プライマーのような核酸の乾燥組成物を生成するための方法は当技術で周知であり、それには冷凍乾燥（ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｉｎｇ）、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｙｌｌｉｚａｔｉｏｎ）または真空乾燥の方法が含まれるが、それらに限定されない。ＷＯ２００８／３６５４４は乾燥組成物を提供するためのいわゆる充填物質の使用を記述しており、前記の充填物質は例えば炭水化物、例えばＦＩＣＯＬＬ（商標）、スクロース、グルコース、トレハロース、メレチトース、ＤＥＸＴＲＡＮ（商標）またはマンニトール、タンパク質、例えばＢＳＡ、ゼラチンまたはコラーゲン、およびポリマー、例えばＰＥＧまたはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。その生物学的物質を炭水化物ポリマー母材中で乾燥させるために、冷凍乾燥（米国特許第５，５９３，８２４号）または真空乾燥（米国特許第５，５６５，３１８号）が開示されている。
【００５８】
加えて、そのような乾燥組成物は場合により、リアルタイムＰＣＲでの監視を可能にするために、少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物のどちらかを含んでいてよい。さらに、前記の乾燥した組成物は追加で熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはｄＮＴＰを含んでいてよい。この場合、その“１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液”にはその乾燥組成物の一部である試薬は一切含まれない。
【００５９】
タンパク質または酵素を含む乾燥組成物を製造するいくつかの方法も当技術において開示されている。凍結乾燥または冷凍乾燥はタンパク質の貯蔵のための十分に確立された技法であり、それは多くの現状技術の文書において開示されている（例えば、Passot, S., et al., Pharmaceutical Development and Technology 12 (2007) 543-553; Carpenter, J.F., et al., Pharmaceutical Research 14 (1997) 969-975; Schwegman, J.J., et al., Pharmaceutical Development and Technology 10 (2005) 151-173）。特に、米国特許第７，４０７，７４７号は、Ｔａｑポリメラーゼを緩衝溶液、ヌクレオチド、ＢＳＡおよびトレハロースからなる混合物中で乾燥させることができることを開示している。また、ＵＳ２０１０／０１５９５２９は、アプタマーのその液体溶液への添加がＴａｑポリメラーゼの安定性を高め、ここで前記の安定化は乾燥させるだけでなくその乾燥混合物を保存するのにも十分に優れていたことを開示している。
【００６０】
当業者には理解されるであろうが、開示された方法は多くの変形を含む。例えば、その乾燥組成物が増幅プライマーのみを含む場合、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび増幅に必要な全ての他のＰＣＲ化合物を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲマスター混合物は“１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液”として工程ｂの間に添加されてよい。場合により、その“１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液”または１ステップＲＴ−ＰＣＲマスター混合物のどちらかが、リアルタイムで増幅を監視するための手段、例えば蛍光標識されたハイブリダイゼーションプローブ、あるいは蛍光二本鎖ＤＮＡ結合色素を追加で含んでいてよい。
【００６１】
別の例では、その乾燥組成物は増幅に必要な全ての化合物、すなわち、少なくとも一対の増幅プライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび場合により少なくとも１種類の蛍光標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは蛍光二本鎖ＤＮＡ結合色素を含んでいてよい。その場合、工程ｂ）の“１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液”は単に水であってよく、または必要な場合には追加の補助的化合物、例えばｐＨ緩衝系（例えばトリス塩）、Ｍｇ２＋塩等を含んでいてよい。
【００６２】
本発明に従うキット
本発明は、リアルタイムＰＣＲ分析を実施するための新規のタイプのキットも提供する。そのキットは試薬構成要素および使い捨ての構成要素を含み、それは一緒に上記で開示した方法のいずれかのために用いることができ、特にそれに適合している。
【００６３】
従って、そのようなキットは、サーマルサイクラー機器の中に取りつけられるように設計された複数の反応容器、ならびに逆転写酵素およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む熱安定性ＤＮＡポリメラーゼまたは一緒にそのような活性の両方を提供するポリメラーゼの混合物ならびにｄＮＴＰを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液を含む。従って、そのようなキットは、遺伝子発現分析に必要な全ての試薬および使い捨て用品の完全なセットを含有する有用な道具を初めて科学者に提供する。
【００６４】
適切な酵素の卓越した例は、Ｔｔｈポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：１１  ４８０  ０２２  ００１）またはＣ．ｔｈｅｒｍポリメラーゼシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：１２  ０１６  ３４６  ００１）である。非常に好ましい態様において、ホットスタートの特徴は、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼをアプタマーと組み合わせて用いることにより実施される。Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼはＲＮＡ依存性逆転写酵素活性およびＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する熱安定性酵素であり、単一チューブでの反応における逆転写（ＲＴ）およびＰＣＲの組み合わせを可能にする。好ましくは、そのようなキット内の前記の熱安定性ポリメラーゼは、９０℃で少なくとも１分間の保温により熱的に活性化されることができる。
【００６５】
好ましくは、その反応容器はマイクロタイタープレートの形態で物理的に互いに連結されている。そのマイクロタイタープレートは好ましくは９６、３８４または１５３６ウェルマイクロタイタープレートであってよい。あるいは、前記の反応容器は反応容器の線状細片の形態で互いに物理的に連結されている。
【００６６】
１態様において、前記のキットはさらに、少なくとも一対の増幅プライマー、および場合により少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物のどちらかを含む。これらの試薬は別々の容器内で保管され、その実験の開始前にＰＣＲ反応緩衝液に添加されてよい。
【００６７】
代わりの態様において、前記のキット内の前記の反応容器は少なくとも一対のＰＣＲ増幅プライマーおよび場合により少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物のどちらかを含む。
【実施例】
【００６８】
実施例１
選別されたマウスハイブリドーマ細胞からのＧＡＰＤＨ遺伝子およびＲＰＬＩ１３Ａ遺伝子の増幅のためのｑＰＣＲ
定められた数のマウスハイブリドーマ細胞を、細胞選別機（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  Ｉ）を用いて９６ウェルマイクロタイタープレートの別々のウェルの中に、その液体ビームが常にそのウェルの中心に向けられるような方式で沈着させた。しかし、細胞選別機の基礎をなす技術のため、その選別された粒子の小さい割合が無傷の細胞全体ではなく細胞破砕片であることを排除できなかった。従って、以下において、選別された物質の数を細胞相当数と呼ぶことにする。
【００６９】
開示したように選別された細胞を、ＬＣ４８０リアルタイムＰＣＲ機器（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：０５  ０１５  ２７８  ００１）のために設計された９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：０４  ７２９  ６９２  ００１）の中に、以下のピペット操作スキームに従って分配した：
１細胞相当数／縦列１〜４のウェル
２細胞相当数／縦列５〜６中のウェル
４細胞相当数／縦列７〜８中のウェル
８細胞相当数／縦列９中のウェル
１６細胞相当数／縦列１０中のウェル
３２細胞相当数／縦列１１中のウェル
６４細胞相当数／縦列１２中のウェル
それぞれのウェルに、以下：
０．４μＭ  順方向プライマー  ａｇｃｔｔｇｔｃａｔｃａａｃｇｇｇａａｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
０．４μＭ  逆方向プライマー  ｔｔｔｇａｔｇｔｔａｇｔｇｇｇｇｔｃｔｃｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
０．２μＭ  ＵＰＬプローブ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：０４  ６８５  ０７５  ００１，Ｎｏ．９）
１×ＬＣ４８０  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：０４  ９０２  ３４３  ００１）
を含有するマスター混合物を添加した。
【００７０】
その順方向および逆方向プライマーは、マウスゲノム中に高いコピー数で存在することが既知であるマウスＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅するように設計された。
別々のプレート上で、その同じマスター混合物を添加したが、プライマーおよびプローブはマウスゲノムの１２コピーのみ存在する遺伝子ＲＰＬＩ１３Ａを増幅するように設計された。プライマーおよびプローブは以下の通りであった：
０．４μＭ  順方向プライマー  ｃａｔｇａｇｇｔｃｇｇｇｔｇｇａａｇｔａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
０．４μＭ  逆方向プライマー  ｇｃｃｔｇｔｔｔｃｃｇｔａａｃｃｔｃａａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
０．２μＭ  ＵＰＬプローブ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：０４  ６８６  ９９３  ００１，Ｎｏ．２５）
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒは熱安定性ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼを含み、それは化学修飾されたホットスタート酵素である。前記の修飾を高温での保温により除去することにより、活性化が誘導される。
【００７１】
以下の熱サイクルプロトコルに従って、ＬＣ４８０リアルタイムＰＣＲ機器においてｑＰＣＲを実施した：
前保温：          １×    ９５℃  １０’
変性              ４５×  ９５℃  １０’’
アニーリング      ４５×  ６０℃  ３０’’
伸長              ４５×  ７２℃  １’’
冷却温度変動速度  ２．２℃／ｓ
加熱温度変動速度  ４．４℃／ｓ
増幅シグナルの検出およびｃｐ値の計算（低いｃｐ値は高レベルの増幅を示す）を、製造業者の説明書の指示に従って実施した。
【００７２】
以下の表は、分析した異なる細胞数に関して得られた平均ｃｐ値を開示する：
【００７３】
【表１】
2013538585.tif 000002
【００７４】
その表から理解できるように、高コピー数のマウスＧＡＰＤＨ遺伝子ならびにマウスゲノム中に１２コピー存在するＲＰＬＩ１３Ａ遺伝子に由来するシグナルは、たとえ出発物質として１個の細胞しか用いなくても検出することができる。
【００７５】
さらに、ｃｐ値はウェルあたりの細胞の数と逆相関することを観察することができる。従って、ＰＣＲ反応緩衝液の添加およびそれに続く９５℃で１０’の保温は明らかに細胞を定量的様式で溶解させるのに十分であったと明らかに結論付けることができる。
【００７６】
実施例２
選別されたマウスハイブリドーマ細胞からのＫｃｎｊ２遺伝子の増幅のためのｑＰＣＲ
その実験は本質的に実施例１に関して開示したように実施され、プライマーおよびプローブが単一コピーのマウス遺伝子Ｋｃｎｊ２を増幅するように設計されたという変更があった。プライマーおよびプローブは以下の通りであった：
順方向プライマー  ｃｔｇｔｃｔｔｇｃｃｔｔｃｇｔｇｃｔｃｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
逆方向プライマー  ａｇｃａｇｇｇｃｔａｔｃａａｃｃａａａａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
ＵＰＬプローブ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：０４  ６８８  ９９６  ００１，Ｎｏ．７６）
以下の表は、分析した異なる細胞数に関して得られた平均ｃｐ値を開示する：
【００７７】
【表２】
2013538585.tif 000003
【００７８】
その表から理解できるように、単一コピー数のマウス遺伝子Ｋｃｎｊ２に由来する増幅シグナルは、たとえ出発物質として１個の細胞しか用いなくても得ることができる。言い換えれば、本発明は単一細胞試料からの単一コピー遺伝子の増幅のための溶液を提供する。
【００７９】
さらに、その試料がより高い細胞数、例えば６４細胞に由来する場合、ｃｐ値が増大することを観察することができる。これは、９５℃におけるそのＰＣＲ反応緩衝液内での溶解のため、所与の反応体積内の細胞破砕片の濃度が増大し、従ってそれがそのＰＣＲ反応の増幅効率を抑制し得るという事実により説明することができる。本発明は、より低い細胞数に由来する試料に対するＰＣＲに特に適用可能であると結論付けることができる。
【００８０】
さらに、以下の表は、個々の単一細胞試料から得られたｃｐ値を開示する：
【００８１】
【表３】
2013538585.tif 000004
【００８２】
その表から推測できるように、１６の並行した反応からの約４において増幅シグナルが得られなかった。全ての単一選別事象が結果として実際の単一細胞の反応容器中への分離および送達をもたらすわけではないことを証明する実施例２の結果を考慮すると、この結果を説明することができる。言い換えれば、一部の場合において増幅シグナルが観察されない事実はその個々のウェルが細胞を含有していなかったという事実によるものであるが、それはその溶解および増幅手順自体が一定の失敗率を有するという事実によるものではない。
【００８３】
実施例３
乾燥試薬を含有するマイクロタイタープレートを用いる選別されたマウスハイブリドーマ細胞からのＫｃｎｊ２遺伝子の増幅のためのｑＰＣＲ
その実験は本質的に実施例２に関して開示したように実施され、以下の変更があった：
必要なプライマーおよびプローブを含有する１０μｌの溶液を、マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルの中に入れた。そのマイクロタイタープレートを、そのプライマーおよびプローブがそのマイクロタイタープレートのそれぞれの反応ウェルの表面上に乾燥するように、２５℃および２００ｍＢａｒで１２時間、続いて２５℃および５０ｍＢａｒで４時間保温した。
【００８４】
続いて、細胞の沈着を以下のように実施した：
１細胞相当数／縦列１〜６のウェル
２細胞相当数／縦列７中のウェル
４細胞相当数／縦列８中のウェル
８細胞相当数／縦列９中のウェル
１６細胞相当数／縦列１０中のウェル
３２細胞相当数／縦列１１中のウェル
６４細胞相当数／縦列１２中のウェル
２０μｌのマスター混合物を添加した後、リアルタイムＰＣＲ分析を実施した。以下の表は、分析された異なる細胞数に関して得られた平均ｃｐ値を開示する：
【００８５】
【表４】
2013538585.tif 000005
【００８６】
単一細胞分析のために用いられた４８のウェルから１０の増幅反応のみが陰性であったことを特筆するのも重要である。これらの反応は平均ｃｐ値の計算には含まれなかった。
実施例４
乾燥試薬を含有するマイクロタイタープレートを用いる単一のマウスハイブリドーマ細胞からのＫｃｎｊ２遺伝子の増幅のためのｑＰＣＲ
細胞相当物のどれだけ多くの割合が細胞破砕片ではなく実際に生細胞に対応するのかを分析するため、３×３０の選別された相当物をそれぞれ顕微鏡スライド上に沈着させ、計数した。顕微鏡による目視検査により、それぞれ２８、２８および２９個の細胞を確認することができた。これは、細胞相当物（選別事象）あたり９４％の生細胞対６％の細胞破砕片に対応する。
【００８７】
以下において、実験は本質的に２個の実施例３に関して開示したようなマイクロタイタープレートにおいて実施され、両方のマイクロタイタープレートにおいてそれぞれの反応ウェルは単一細胞相当物のみを含有していたという変更があった。結果は以下の通りであった：
【００８８】
【表５】
2013538585.tif 000006
【００８９】
その結果は、本発明により提供されるようなＰＣＲ法に従って単一細胞分析を実施することが可能であることを示している。さらに、単一細胞分析が意図される場合も、そのプライマーおよびプローブはそのマイクロタイタープレートの表面上に乾燥させられる。
【００９０】
実施例５
ＡｃｔＢ、およびＢ２Ｍおよび１の発現の検出のための１ステップＲＴ−ＰＣＲ
細胞を選別し、実施例１で開示したようにマイクロタイタープレート上に配置し、結果として２μｌ未満の試料量をもたらした。
【００９１】
それぞれのウェルに、１×ＬＣ４８０  ＲＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ加水分解プローブ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号０４  ９９１  ８８５  ００１、Ｔ．ｔｈポリメラーゼおよびホットスタートアプタマーを含有）を添加した。
【００９２】
そのマスター混合物は、追加で以下のプライマーおよびプローブを含有していた：
横列１〜２：ＡｃｔＢの１ステップＲＴ−ＰＣＲ
０．４μＭ  順方向プライマー  ＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
０．４μＭ  逆方向プライマー  ＧＴＧＧＴＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
０．２μＭ  ＵＰＬプローブ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：５６）
横列３〜４：Ｂ２Ｍの１ステップＲＴ−ＰＣＲ
０．４μＭ  順方向プライマー  ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＴＡＡＧＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
０．４μＭ  逆方向プライマー  ＧＧＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＡＧＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
０．２μＭ  ＵＰＬプローブ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：１１７）
横列５〜６：１８ｓ  ＲＮＡの１ステップＲＴ−ＰＣＲ
０．４μＭ  順方向プライマー  ＧＣＣＧＣＴＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
０．４μＭ  逆方向プライマー  ＣＧＴＣＴＴＣＧＡＡＣＣＴＣＣＧＡＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
０．２μＭ  ＵＰＬプローブ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：９３）
第１プレートにおいて、ＬＣ４８０リアルタイムＰＣＲ機器中で、以下の熱サイクルプロトコルに従って１ステップＲＴ−ＰＣＲを実施した：
前保温：          １×    ９５℃  ３０’’
変性              ４５×  ９５℃  １０’’
アニーリング      ４５×  ６０℃  ３０’’
伸長              ４５×  ７２℃  １’’
冷却温度変動速度  ２．２℃／ｓ
加熱温度変動速度  ４．４℃／ｓ
第２プレートにおいて、ＬＣ４８０リアルタイムＰＣＲ機器中で、６１℃でのさらなる前保温工程を含む熱サイクルプロトコルに従って１ステップＲＴ−ＰＣＲを実施した：
前保温：          １×    ６１℃  ３’
前保温：          １×    ９５℃  ３０’’
変性              ４５×  ９５℃  １０’’
アニーリング      ４５×  ６０℃  ３０’’
伸長              ４５×  ７２℃  １’’
冷却温度変動速度  ２．２℃／ｓ
加熱温度変動速度  ４．４℃／ｓ
増幅シグナルの検出およびｃｐ値の計算（低いｃｐ値は高レベルの増幅を示す）を、製造業者の説明書の指示に従って実施した。
【００９３】
測定されたｃｐ値がＤＮＡではなく実際にｍＲＮＡの発現の検出を反映していることを証明するため、続いてアンプリコンの正確な大きさをゲル電気泳動により確認した（ｃｏｎｆｉｍｒｅｄ）。以下の表は、分析された異なる細胞数に関して得られた平均ｃｐ値を開示する。
【００９４】
【表６】
2013538585.tif 000007
【００９５】
その表から理解できるように、出発物質として用いられた１個の細胞のみに由来する物質において、試験した遺伝子の発現を検出することができる。そのｃｐ値はウェルのあたりの細胞の数と逆相関することを観察することができる。逆転写工程は、その熱サイクルプロトコルの最初の温度変動、アニーリングおよび伸長工程の間に起こる。
【００９６】
その表からさらに推測できるように、驚くべきことに発現の検出は９５℃における実際の溶解の前の６１℃で３分間の前保温工程の場合にさらにもっと高感度である。おそらく、そのようなプラスの作用は、結果としてその少数の選別された細胞の、その細胞のＲＮＡが逆転写反応に利用可能になるような即時の乾燥および破壊をもたらす、２μｌ未満の少ない試料量によるものである。
【００９７】
実施例６
１８ｓ標的に対するＤＮＡ  ＰＣＲおよび１ステップＲＴ−ＰＣＲの間の比較
以下のピペット操作スキームに従って、細胞を実施例１で開示したように選別し、マイクロタイタープレート上に配置した：
番号１〜３の３個の同一のプレートに関して、ＲＮＡを１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応で増幅するために、１×ＬＣ４８０  ＲＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ加水分解プローブ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号０４  ９９１  ８８５  ００１、Ｔ．ｔｈポリメラーゼおよびホットスタートアプタマーを含有）を添加した。プライマーは、この反応の間にＲＮＡおよびその対応するゲノムＤＮＡ断片の両方が増幅できるような方式で設計された。４番目のプレート（番号４）に関して、逆転写酵素活性を一切有しない熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含むＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ｒｅａｄｙ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ  ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：０５  ５０２  ３８１  ００１）を用いた。
【００９８】
加えて、その４種類の構成は１８ｓ  ＲＮＡおよびＤＮＡの増幅に適した以下のプライマーおよびプローブを含有していた：
０．４μＭ  順方向プライマー  ＧＣＣＧＣＴＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
０．４μＭ  逆方向プライマー  ＣＧＴＣＴＴＣＧＡＡＣＣＴＣＣＧＡＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
０．２μＭ  ＵＰＬプローブ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号：９３）
プレート１に関して、ＬＣ４８０リアルタイムＰＣＲ機器中で、以下の熱サイクルプロトコルに従って、６１℃での前保温工程を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲを実施した：
前変性：          １×    ９５℃  １’
前保温：          １×    ６１℃  ３’
前保温：          １×    ９５℃  ３０’’
変性              ４５×  ９５℃  １０’’
アニーリング      ４５×  ６０℃  ３０’’
伸長              ４５×  ７２℃  １’’
冷却温度変動速度  ２．２℃／ｓ
加熱温度変動速度  ４．４℃／ｓ
プレート２および３に関して、６１℃での前保温一切なしでＲＴ−ＰＣＲを実施した：
前保温：          １×    ９５℃  ３０’’（プレート２）または２’（プレート３）
変性              ４５×  ９５℃  １０’’
アニーリング      ４５×  ６０℃  ３０’’
伸長              ４５×  ７２℃  １’’
冷却温度変動速度  ２．２℃／ｓ
加熱温度変動速度  ４．４℃／ｓ
逆転写活性一切なしでＰＣＲを実施するために、プレート３に関するプロトコルと同じプロトコルをプレート４に関して用いた。
【００９９】
増幅シグナルの検出およびｃｐ値の計算（低いｃｐ値は高レベルの増幅を示す）を、製造業者の説明書の指示に従って実施した。
測定されたｃｐ値がＤＮＡではなく実際にｍＲＮＡの発現の検出を反映していることを証明するため、続いてアンプリコンの正確な大きさをゲル電気泳動により確認した。以下の表は、分析された異なる細胞数に関して得られた平均ｃｐ値を開示する。
【０１００】
【表７】
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【０１０１】
その表から理解できるように、ＲＴ−ＰＣＲからの結果は対応するＰＣＲ反応からの結果と比較してより低いｃｐ値を提供する。これは標的核酸のより高い出発濃度を示しており、選択されたような条件に従うそれは、そのＲＴ−ＰＣＲ構成内のそれぞれのＲＮＡおよびその対応する遺伝子配列の両方の増幅に起因する。
【０１０２】
６１℃で３分間の前保温を含む、および６１℃での前保温なしのＲＴ−ＰＣＲの結果を比較すると、前保温は必須ではないが結果として増大したＲＮＡ検出の感度をもたらすことは明らかである。実施例５で開示したように、後者の観察された作用は、結果としてその少数の選別された細胞の、その細胞のＲＮＡが逆転写反応に利用可能になるような即時の乾燥および破壊をもたらす、２μｌ未満の少ない試料量によるものである可能性がある。
【配列表】
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【国際調査報告】
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