(57)【要約】  ＯＲＦ７欠損水痘ウイルス、そのウイルスを含むワクチン、及びそれらの使用、並びにそのウイルスを製造する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのＯＲＦ７が完全に若しくは部分的に欠失している、又は１塩基若しくは２塩基が置換若しくは付加されていることを特徴とし、ヒトの皮膚及び感覚神経節に感染することができない水痘ウイルス。
【請求項２】
前記ＯＲＦ７が、抗生物質耐性遺伝子及び／又は非機能性核酸配列により完全に又は部分的に置換されている、請求項１に記載の水痘ウイルス。
【請求項３】
前記抗生物質耐性遺伝子が、ペニシリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、及びカナマイシン耐性遺伝子から選択される、請求項２に記載の水痘ウイルス。
【請求項４】
前記非機能性核酸配列が、反転逆フレームシフト突然変異を有するＯＲＦ７断片を指す、請求項２に記載の水痘ウイルス。
【請求項５】
前記反転逆フレームシフト突然変異を有するＯＲＦ７断片の配列が、配列番号１３に示されている、請求項４に記載の水痘ウイルス。
【請求項６】
２００９年７月２８日に、寄託番号ＣＧＭＣＣ第３２０７号で中国微生物株寄託管理委員会普通微生物センター（Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託されている水痘ウイルス。
【請求項７】
請求項１に記載の水痘ウイルスを調製する方法であって、
１）野生型水痘ウイルスのゲノムを、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター中にクローニングして、ＯＲＦ７の完全又は部分的な欠失、１塩基又は複数塩基の置換又は挿入を有する組換え水痘ウイルスＶＺＶ−ＢＡＣを作製するステップであって、前記組換え水痘ウイルスが、ヒトの皮膚及び感覚神経節に感染することができない上記ステップと、
２）１）で得られたＶＺＶからＤＮＡを単離し、単離されたＤＮＡ及び酵素Ｃｒｅを含有する組換えプラスミドにより、Ｍｅｗｏ細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＡＲＰＥ細胞又は２ＢＳ細胞又はＷＩ−３８細胞又はＫＭＢ１７細胞を共形質転換するステップと、
３）酵素Ｃｒｅにより、Ｍｅｗｏ細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＡＲＰＥ細胞又は２ＢＳ細胞又はＷＩ−３８細胞又はＫＭＢ１７細胞からＢＡＣを切り出すステップと
を含む、上記方法。
【請求項８】
前記野生型水痘ウイルスが、Ｐ−Ｏｋａ株であり、ステップ１）における前記ＯＲＦ７が、カナマイシン耐性遺伝子、又はその配列が配列番号１３に示されている反転逆フレームシフト突然変異を有するＯＲＦ７断片により置換されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の水痘ウイルスを含む組合せ。
【請求項１０】
水痘及び／又は帯状疱疹を予防するためのワクチンであって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の水痘ウイルス、ワクチンにおいて許容される賦形剤又は担体を含む、上記ワクチン。
【請求項１１】
水痘及び／又は帯状疱疹を予防するためのワクチンを調製するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の水痘ウイルスの使用。
【請求項１２】
発現ベクターを調製するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の水痘ウイルスの使用。
【請求項１３】
ＢＡＣと、前記ＢＡＣ中に挿入されている請求項１〜６のいずれか一項に記載の水痘ウイルスのＤＮＡとで構成される発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の水痘ウイルスＤＮＡのＤＮＡである発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の発現ベクターと、挿入外来遺伝子とを含む組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１３若しくは１４に記載の発現ベクター、又は請求項１５に記載の組換えベクターを含む組換え細胞。
【請求項１７】
前記宿主細胞が、以下の細胞：ＭＲＣ−５細胞、Ｍｅｗｏ細胞、ＡＲＰＥ細胞、２ＢＳ細胞、ＷＩ−３８細胞、及びＫＭＢ１７細胞から選択される、請求項１６に記載の組換え細胞。
【請求項１８】
水痘及び／又は帯状疱疹を予防する方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項１０に記載のワクチンを接種するステップを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス学及び生物医薬の分野に属する。とりわけ、本発明は、ＯＲＦ７欠損水痘ウイルス、このウイルスを含有するワクチン、及びその使用を提供する。本発明は、水痘帯状疱疹ウイルスを予防するための候補ワクチンを提供する。
【背景技術】
【０００２】
水痘帯状疱疹ウイルス（「水痘ウイルス」又は「ＶＺＶ」と称する）は、厳密に種特異的なウイルスであり、ヒトにおいて水痘又は帯状疱疹を引き起こす病原性因子である。水痘ウイルスのＰ−Ｏｋａ株は、典型的な水痘を有する、「岡（Ｏｋａ）」という姓の３歳の日本人男児の水疱液から、１９７１年に高橋（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）により初めて単離され、ヒト胎児肺細胞においてこのウイルスを継代培養することにより得られた。Ｐ−Ｏｋａは、水痘及び帯状疱疹を引き起こす能力を有すると考えられている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｍ、Ｏｔｓｕｋａ  Ｔ、Ｏｋｕｎｏ  Ｙら、「院内小児における水痘の拡大を防止するために用いられる生ワクチン（Ｌｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｔｈｅ  ｓｐｒｅａｄ  ｏｆ  ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｉｎ  ｈｏｓｐｉｔａｌ）」、Ｌａｎｃｅｔ  １９７４、２：１２８８〜９０）。
【０００３】
米国特許第３，９８５，６１５号では、モルモット胎仔組織（ＧＰＥＣ）及びヒト胎児肺細胞においてこのウイルスを連続的に継代培養することにより、弱毒化Ｐ−Ｏｋａ株が得られること、水痘を予防するためにＶ−Ｏｋａ生ワクチンを調製することが開示された。米国特許第４，０００，２５６号では、ヒト胎児線維芽細胞ＷＩ−３８株においてＶＺＶを１０〜８０回にわたり継代培養して、弱毒化ＶＺＶ生ワクチンを製造することが記載された。これまでのところ、細胞内でＰ−Ｏｋａ株を継代培養することにより得られる「弱毒化生水痘ウイルスＯｋａ株」（臨時速報、５３号−４１２０２Ｋｉｍｉａｋｉ、Ｌａｎｃｅｔ２：１２８８〜１２９０、１９７４）だけが、水痘又は帯状疱疹を予防するためのワクチンの調製についてＷＨＯにより承認されており、この株から調製されたワクチンは、世界中で広く用いられている［水痘ワクチン（生）採用の要件（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｖａｒｉｃｅｌｌａ  Ｖａｃｃｉｎｅ（Ｌｉｖｅ）Ａｄｏｐｔｅｄ）、１９８４：ＷＨＯ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、７２５号、１０２〜１０４ページ、１９８５］。水痘ワクチンを接種された集団は、自然感染した集団より帯状疱疹の発生率が低く、大部分の小児は免疫不全であることが報告されているが、実際のところ、ワクチン接種を受けた集団においてもなお、帯状疱疹は出現し、また、ワクチン接種を受けた集団における帯状疱疹の水疱液からもＶ−Ｏｋａ株が単離された（Ｓｃｈｍｉｄ  Ｄ．Ｓら、「水痘帯状疱疹ウイルスの動態に対する水痘ワクチンの影響（Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｏｎ  ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ  ｄｙｎａｍｉｃｓ）」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１０年１月、２０２〜２１７ページ）。
【０００４】
中国特許第ＣＮ１１６３６０４Ｃ号は、Ｏｋａ株による弱毒化水痘ワクチンの同定に関するが、これにより、Ｖ−Ｏｋａ株が混合株であることが分子レベルで明らかにされ、これは多数の異なる配列で構成されていた。Ｖ−Ｏｋａワクチンを接種された患者が、Ｖ−Ｏｋａ株を含有する帯状疱疹を発症したと報告されているので、弱毒化水痘ウイルス株には、野生型の株も存在しうる。これは、弱毒化ウイルス株にもなお、何らかの潜在的有害性が存在することを意味する。しかし、これまでのところ、ＶＺＶに対する他のワクチンは市場に出ていない。このウイルスは、種特異性が厳密であり、天然の宿主はヒトに限られる。また、ＶＺＶの遺伝子機能を研究するのに用いるために利用可能な動物モデルは存在しない。さらに、このウイルスは、宿主細胞に対する結合親和性が強い。遊離ウイルスは、容易に不活化される。したがって、形質転換に用いることができるＶＺＶウイルスのＤＮＡを得ることは極めて困難である。結果として、このウイルスの遺伝子機能についての研究過程の進展は、長期にわたって非常に遅々としたものである。
【０００５】
研究に細菌人工染色体（ＢＡＣ）技術が適用され、組織培養法が進歩し、異種生物間における臓器移植の障壁が突破された（複合型免疫不全マウスモデルの開発）ことにより、種特異的ＶＺＶの遺伝子機能についての研究領域が拡大されている。ＶＺＶの遺伝子機能についての研究は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて実施することもでき、動物への移植後に行うこともできる。２００４年に、Ｋａｚｕｈｉｒｏ  Ｎ．らは、「大腸菌における感染性ＢＡＣとしての水痘帯状疱疹ウイルスゲノムのクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）」において、ＢＡＣベクター中にクローニングされたＶＺＶ  Ｏｋａ株の全ゲノムが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及びヒト胎児肺細胞において増殖しうることを明らかにした。このＢＡＣは、ヒト胎児肺細胞へと共形質転換される酵素であるＣｒｅにより、正確に切り出すことができる。結果として得られる組換えＶＺＶウイルスは、親ウイルスであるＰ−Ｏｋａ株と同じ構造及び特徴を有する。ＢＡＣを適用することにより、ＶＺＶの遺伝子機能についての研究が大幅に促進されている。各機能性遺伝子について研究し、これにより、ＶＺＶの遺伝子機能についての研究過程を加速化させることが可能である。
【０００６】
ウイルスゲノムの８６０７〜９３６８位に位置するＶＺＶのＯＲＦ７は、２９ｋＤａのタンパク質をコードし、テグメント内に位置すると考えられている。しかし、その機能は、依然として不明である。
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことであるが、広範な研究の後に、ＶＺＶに感染した患者における皮膚及び感覚神経節の機能をＯＲＦ７が決定することを見出した。ＯＲＦ７は、ＯＲＦ７において以下のうちのいずれかが生じる場合、機能を喪失する：完全又は部分的な欠失、停止コドンの挿入、１塩基又は２塩基の置換、とりわけＯＲＦ７の欠失又は反転逆フレームシフト突然変異。すなわち、ＶＺＶはもはや、ヒトの皮膚及び感覚神経節に感染しなくなる。このため、水痘を発生させる潜在的な危険性、又は帯状疱疹を引き起こす再活性化の危険性は生じない（本明細書において、本発明者らは、これを、ＯＲＦ７が欠損することにより引き起こされるＯＲＦ７の機能喪失と規定するが、この機能とは、ヒトの皮膚及び感覚神経節に接触することを意味する）。単一クローン株を得るために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で、抗生物質又はガラクトースにより、ＯＲＦ７欠失ＶＺＶ株（ＶＺＶ−７Ｄ  ＢＡＣ又はＶＺＶ−７ＤＲＭ  ＢＡＣ）をさらにスクリーニングすることができる。このため、混合型Ｖ−Ｏｋａ株の潜在的な危険性は存在しない。ＯＲＦ７欠失ＶＺＶ株は、ＯＲＦ７が欠失したウイルス又はＯＲＦ７の突然変異体ウイルスによる、より安全でより有効なワクチンを開発するための扉を開く。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様では、本発明は、ＯＲＦ７が完全に若しくは部分的に欠失している、停止コドンが挿入されている、又は１塩基若しくは２塩基が置換若しくは付加されている水痘ウイルス（例えば、Ｐ−Ｏｋａ株）に関し、記載されているＶＺＶは、ヒトの皮膚及び感覚神経節に感染することができない。
【０００９】
ＯＲＦ７の配列（８６０７〜９３８６ｂｐ）を、以下に示す。
【化１】
2013500024.tif 000002
【００１０】
本発明の一実施形態では、ＯＲＦ７の全体又は部分が、抗生物質耐性遺伝子及び／又は非機能性核酸配列により置換されている。前記非機能性核酸配列とは、それがＯＲＦ７の機能を回復しないことを意味する。すなわち、上記のＶＺＶウイルスはやはり、ヒトの皮膚及び感覚神経節に感染することが不可能である。該非機能性核酸配列は、融合タンパク質をコードしていなくてもよく、コードされるタンパク質がＯＲＦ７機能を回復することができない条件で融合タンパク質をコードしていてもよい。本発明の一実施形態では、上記の非機能性核酸配列が、反転逆フレームシフト突然変異を有するＯＲＦ７である。
【００１１】
「ＯＲＦ７」断片という用語は、ＯＲＦ７核酸配列の全体又は部分を指す。
【００１２】
本発明の一実施形態では、該記載されている反転逆フレームシフト突然変異を有するＯＲＦ７断片の配列が、配列番号１３に示されている。
【００１３】
本発明の一実施形態では、抗生物質耐性遺伝子が、ペニシリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、及びカナマイシン耐性遺伝子から選択される。
【００１４】
本発明の一実施形態では、本発明者らは、相同組換えの原理を適用することにより、スタンフォード大学医学部のＡｎｎ  Ａｒｖｉｎ博士の研究室により臨床で単離されたＰ−Ｏｋａ株に基づく組換えクローン、並びにＶＺＶ−ＢＡＣ（Ｐ−Ｏｋａ）のフレームワークを作製した。全長ＯＲＦ７を、カナマイシン耐性遺伝子により置換してＶＺＶ−７Ｄ  ＢＡＣを作製し、又は反転逆フレームシフト突然変異を有するＯＲＦ７断片により置換してＶＺＶ−７ＤＲＭ  ＢＡＣを作製した。前記Ｋａｎｒの配列は、以下に示される。
【化２】
2013500024.tif 000003
【００１５】
特に、本発明は、２００９年７月２８日に中国微生物株寄託管理委員会普通微生物センター（Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託されている水痘帯状疱疹ウイルス株を提供し、その寄託番号は、ＣＧＭＣＣ第３２０７号である。
【００１６】
このウイルス株が、ヒトの皮膚及び感覚神経節に感染しないことは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの研究により確認されている。そのため、水痘を引き起こす潜在的な危険性、又は帯状疱疹を引き起こす再活性化の危険性は見られない可能性が極めて高い。このウイルスは、ＭＲＣ−５細胞、ＭｅＷｏ細胞、及びＡＲＰＥ細胞において、Ｐ−Ｏｋａ株と同じ増殖特性で増殖する。その一方で、胸腺組織培養物における生育及び増殖特性も変化しない。このウイルス株は、Ｐ−Ｏｋａ株のすべての糖タンパク質を保持し、そのため、Ｐ−Ｏｋａ株と同じ免疫原性を示すはずである。このウイルス株は、カナマイシン又はガラクトースによりスクリーニングされる、該ウイルスの単一クローンである。したがって、Ｖ−Ｏｋａ株のクローンと混在する潜在的な危険性は存在しない。ＯＲＦ７全体の欠失（ＶＺＶ−７Ｄ  ＢＡＣ）、又はＯＲＦ７の反転逆フレームシフト突然変異（ＶＺＶ−７ＤＲＭ  ＢＡＣ）により、本発明のウイルス株に逆突然変異が導入される可能性はない。ＶＺＶ−７Ｄ  ＢＡＣ又はＶＺＶ−７ＤＲＭ  ＢＡＣから調製される弱毒性生ワクチン株は、より安全で、より有効である。
【００１７】
別の態様では、本発明は、上記の水痘ウイルスを調製する方法であって、
１）野生型ＶＺＶのゲノムを、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター中にクローニングして、ＯＲＦ７の完全又は部分的な欠失、１塩基又は複数塩基の置換又は挿入を有する組換え水痘ウイルスＶＺＶ−ＢＡＣを作製するステップであって、前記組換え水痘ウイルスが、ヒトの皮膚及び感覚神経節に感染することができないステップと、
２）１）で得られたＶＺＶからＤＮＡを単離し、単離されたＤＮＡ及び酵素Ｃｒｅを含有する組換えプラスミドにより、ＭＲＣ−５細胞、Ｍｅｗｏ細胞、又はＡＲＰＥ細胞を共形質転換するステップと、
３）酵素Ｃｒｅにより、ＭＲＣ−５細胞、Ｍｅｗｏ細胞、又はＡＲＰＥ細胞からＢＡＣを切り出すステップと
を含む方法に関する。
【００１８】
本発明の一実施形態では、野生型ＶＺＶが、Ｐ−Ｏｋａ株であり、ステップ１）におけるＯＲＦ７が、Ｋａｎｒ、又は反転逆フレームシフト突然変異を有するＯＲＦ７断片により置換されている。本発明の特定の一実施形態では、反転逆フレームシフト突然変異を有するＯＲＦ７断片が、配列番号１３として示される。
【００１９】
別の態様ではまた、本発明は、上記の任意の水痘ウイルスを含む組成物にも関する。
【００２０】
さらに別の態様ではまた、本発明は、水痘及び／又は帯状疱疹を予防するためのワクチンであって、上記の任意の水痘ウイルス、及びワクチンにおいて許容される賦形剤又は許容される担体を含有するワクチンにも関する。
【００２１】
本発明で用いられる「水痘又は帯状疱疹を予防するためのワクチン」という用語は、水痘ワクチン、帯状疱疹ワクチン、並びに水痘及び帯状疱疹を予防するためのワクチンを指す。
【００２２】
別の態様ではまた、本発明は、水痘ワクチン及び／又は帯状疱疹ワクチンの調製における、上記の水痘ウイルスのうちのいずれか１つの使用にも関する。
【００２３】
別の態様ではまた、本発明は、発現ベクターの調製における、上記の水痘ウイルスのうちのいずれか１つの使用にも関する。
【００２４】
本発明はまた、ＢＡＣと、前記ＢＡＣ中に挿入されている上記の水痘ウイルスのうちのいずれか１つのＤＮＡとで構成される発現ベクターにも関する。発現ベクターは、上記の水痘ウイルスのうちのいずれか１つのＤＮＡを含む。ベクターの機能に影響を及ぼすことなく、少なくとも１０ｋｂの外来遺伝子を上記の発現ベクターに挿入することができる。これはまた外来遺伝子も発現することができる。加えて、該発現ベクターは、ＯＲＦ７の欠失の結果として安全である。該発現ベクターはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＶＺＶ−７ＤＲＭ  ＢＡＣの機能をモニタリングする目的で、ルシフェラーゼ遺伝子による標識化（Ｚｈａｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００７年９月、９０２４〜９０３３ページ）にも用いることができる。
【００２５】
別の態様ではまた、本発明は、上記の発現ベクターと、挿入された外来遺伝子とを含む組換えベクターにも関する。
【００２６】
別の態様ではまた、本発明は、上記の発現ベクター又は組換えベクターを含有する組換え細胞にも関する。
【００２７】
本発明の一実施形態では、組換え細胞として用いられる宿主細胞は、ＭＲＣ−５細胞、Ｍｅｗｏ細胞、ＡＲＰＥ細胞、２ＢＳ細胞、ＷＩ−３８細胞、及びＫＭＢ１７細胞から選択される。
【００２８】
別の態様ではまた、本発明は、水痘及び／又は帯状疱疹を予防する方法であって、それを必要とする患者に有効量の上記のワクチンを接種するステップを含む方法にも関する。
【００２９】
本明細書では、「ＤＰＩ」という用語は、「感染後日数」を表し、感染後の日数を指す。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Ｐ−Ｏｋａ  ＢＡＣ（ＶＺＶ  ＢＡＣ）ベクターの構築を示す図である。
【図２】ＯＲＦ７欠失ＶＺＶ  ＢＡＣ株（ＶＺＶ−７Ｄ  ＢＡＣ）の調製を示す図である。
【図３】ＯＲＦ７欠失ＶＺＶの電気泳動を示す図である。
【図４Ａ】後根神経節におけるＶＺＶ−７Ｄの培養を示す図である。ＭｅＷｏ細胞において培養した、野生型ウイルス（ＷＴ）、逆突然変異体ウイルス（７Ｒ）、欠損ウイルス（７Ｄ）についての増殖曲線を示す図である。
【図４Ｂ】後根神経節におけるＶＺＶ−７Ｄの培養を示す図である。後根神経節（ＤＲＧ）において培養した、野生型ウイルス（ＷＴ）、逆突然変異体ウイルス（７Ｒ）、欠損ウイルス（７Ｄ）についての増殖曲線を示す図である。
【図５】ＯＲＦ−７逆突然変異体ＶＺＶ（ＶＺＶ−７Ｒ）の調製について示す図である。
【図６】ヒトＭｅＷｏ細胞において培養した、蛍光タグ（ｌｕｃ）を有するＶＺＶ−７ＤＲＭについての増殖曲線を示す図である。
【図７】ヒト胸腺組織培養物（ＴＯＣ）において培養した、蛍光タグ（ｌｕｃ）を有するＶＺＶ−７ＤＲＭについての増殖曲線を示す図である。
【図８】ヒト皮膚組織培養物（ＳＯＣ）中の、蛍光タグ（ｌｕｃ）を有するＶＺＶ−７ＤＲＭについての増殖曲線を示す図である。
【図９Ａ】ＷＴ、ＶＺＶ−７ＤＲＭ、及びＶＺＶ−７Ｒに由来するＤＮＡをトランスフェクトしたＭｅＷｏ細胞及び神経芽腫（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）細胞を示す図である。神経芽腫細胞において、ＶＺＶ−７ＤＲＭは増殖できない。
【図９Ｂ】ヒト胚の脊髄から摘出した後根神経節（ＤＲＧ）を示す図である。
【図９Ｃ】ＤＲＧを、重症複合型免疫欠損マウスモデル（ＳＣＩＤ−ｈｕ）の腎被膜へと移植し、次いで、ＷＴ又はＶＺＶ−７ＤＲＭを感染させた。ＩＶＩＳ計測器によりウイルスの増殖を測定する。ヒト組織を移植した重症複合型免疫欠損マウス（ＳＣＩＤ−ｈｕ）において、ＶＺＶ−７ＤＲＭは増殖できない。
【図９Ｄ】感染後、ＧＦＰ強度の増大により、ＤＲＧ培養物において、ＷＴ  ＶＺＶが増殖できることが示された。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下の実施例に言及することにより、本発明の実施形態を詳細に説明する。これらの実施例が、本発明の実施を例示することを意図するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを、当業者は理解するであろう。具体的に例示されない技法又は条件については、当技術分野において説明されている（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｅｉｔａｎｇ  Ｈｕａｎｇ訳）技法及び条件に従って、又は製造元の指示書に従って、該手順を実施する。別段に指定しない限り、試薬及び装置は市販されている。
【実施例】
【００３２】
（例１）
ｐ−Ｏｋａ  ＢＡＣ（ＶＺＶ  ＢＡＣ）の構築
（１）ＢＡＣベクター：ＢＡＣベクターであるｐＵＳＦ−６は、原核細胞の複製起点（ｏｒｉ）、該複製遺伝子及び分配遺伝子（ｒｅｐＥ、ｐａｒＡ、及びｐａｒＢ）、Ｃａｍｒ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）遺伝子、２つの５００ｂｐのＶＺＶ断片ａ及びｂ（グレー）、並びに２つのｌｏｘＰ部位（白）を含有する。ＢａｍＨＩによるｐＵＳＦ−６の消化の結果として直鎖断片を得、これを、相同組換えにより、ＶＺＶを含有するコスミドであるｐｖＳｐｅ２３に挿入した。
【００３３】
（２）ｐＯｋａゲノムについての概略図は、ＶＺＶが、固有の長いセグメント（ＵＬ）と、固有の短いセグメント（ＵＳ）とを伴う、１２５ｋｂのヌクレオチド配列を含有することを示す。全ゲノムを、重複領域を含む４つのＶＺＶセグメントへと消化し、コスミド中にクローニングし、その結果として、４つの組換えクローン、すなわち、ｐｖＦｓｐ７３、ｐｖＳｐｅ１４、ｐｖＰｍｅ１９、及びｐｖＳｐｅ２３を得た。相同組換えにより、ｐＵＳＦ−６を、ＶＺＶコスミドであるｐｖＳｐｅ２３のＯＲＦ６０とＯＲＦ６１との間に挿入した。
【００３４】
（３）ＢＡＣベクター（ｐＵＳＦ−６）を含有するｐｖＳｐｅ２３を、他の３つのＶＺＶコスミドと共にＭｅＷｏ細胞へと共トランスフェクトしたところ、その結果として得られる組換えウイルス（ＶＺＶ  ＢＡＣ）は、ＭｅＷｏ細胞内で複製されることが可能であり、緑色蛍光プラークを生成した。
【００３５】
図１にもまた、該手順を示す。
【００３６】
ＶＺＶ  ＢＡＣの増殖曲線を、野生型ｐＯｋａの増殖曲線と比較した。各ｄｐｉにおけるプラーク形成単位（ＰＦＵ）を記録した。結果は、ＶＺＶ  ＢＡＣ（緑）が、検出可能な増殖の欠陥を示さず、これが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける親ウイルスの増殖と符合することを示唆する。
【００３７】
（例２）
ＯＲＦ７欠損ＶＺＶ  ＢＡＣ（ＶＺＶ−７Ｄ  ＢＡＣ）の作製及び検証
既に説明されているｌｕｃ  ＶＺＶ  ＢＡＣ（Ｚｈａｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００７年９月、９０２４〜９０３３ページ）を参照することにより、ＯＲＦ７欠失突然変異体を構築した。手順を図２及び下記で説明した。
【００３８】
（１）カナマイシン耐性遺伝子に相同な２０ｂｐのヌクレオチドと、欠失の標的とされるＯＲＦ７の開始コドン又は停止コドンに近接する隣接配列に相同な４０ｂｐのヌクレオチドとを含有するように２つのプライマーをデザインした。プライマーＦ１及びＲ１の配列を以下に示す。
【化３】
2013500024.tif 000004
【００３９】
プラスミドｐＧＥＭ−ｏｒｉＶ／ｋａｎ１（Ｎｅｔｔｅｒｗａｌｄ、Ｙａｎｇら、２００５）により、ＫａｎＲ遺伝子を増幅した。そのＰＣＲ産物をＤｐｎＩで消化し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）により回収した。
【００４０】
（２）ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ装置を用いて、１．６ｋＶ及び２５０ｕＦでエレクトロポレーションにより、約２００ｎｇずつの各ＰＣＲ産物を、ＶＺＶ  Ｌｕｃ  ＢＡＣを保有するＤＹ３８０株へと形質転換した。
【００４１】
（３）高効率の相同組換え系として機能するＤＹ３８０株により、４０ｂｐという短い相同配列の組換えが可能となる。４２℃で活性化され、３２℃で抑制される組換え酵素により、カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎｒ）とＯＲＦ７との相同組換えを実現する。結果として、ＯＲＦ７が、Ｋａｎｒにより置換される。３２℃で３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する寒天プレート上で、単一組換え体を選択した。ＶＺＶ突然変異体（ＯＲＦ７欠失による）のＤＮＡを、大腸菌から単離した。
【００４２】
（４）ＨｉｎｄＩＩＩ消化によりウイルスゲノムの完全性を検証し、ＰＣＲ解析により組換えＤＮＡを確認した。ＫａｎｒによりＯＲＦ７が置換された、ＯＲＦ７欠損ＢＡＣ（ＶＺＶ−７Ｄ  ＢＡＣ）が得られたことが確認される。
【００４３】
（例３）
反転逆フレームシフト突然変異を有するＶＺＶ  ＢＡＣ（ＶＺＶ−７ＤＲＭ  ＢＡＣ）の作製及び検証
戦略：野生型ウイルスのＯＲＦ７を、ｇａｌｋ遺伝子で置換した。ｇａｌｋ遺伝子を有する組換えＶＺＶは、ガラクトースを唯一の炭素供給源とするマッコンキー寒天培地上において、明赤色のプラークを生成させるはずである。この方法によるならば、単一クローンが選択されるであろう。次いで、ｇａｌｋ遺伝子を、反転逆フレームシフト突然変異配列で置換し、完全最小培地プレート上において単一クローンを選択して、ＶＺＶ−７ＤＲＭ  ＢＡＣを得る。
【００４４】
詳細なプロトコールを以下に示す。
【００４５】
（１）ｐＧａｌＫ（１〜８２ｂｐ：プロモーター；８３〜１２３１ｂｐ：ＧａｌＫのオープンリーディングフレーム）により、ｇａｌｋ遺伝子を増幅するための増幅プライマーＦ２及びＲ２をデザインする。これらのフォワードプライマー及びリバースプライマーは各々が、５'側に６０ｂｐの、ＯＲＦ７に隣接する相同配列を有する。ＧａｌＫ配列を以下（配列番号５）に示す。
【化４】
2013500024.tif 000005
【００４６】
プライマーＦ２及びＲ２の配列を以下に示す。
【化５】
2013500024.tif 000006
【００４７】
（２）これらのプライマーを用いて、ＧａｌＫカセットを増幅する。この産物を、ＤｐｎＩにより終夜にわたり消化し、精製する。
【００４８】
（３）ＶＺＶ  ＢＡＣを、大腸菌のＳＷ１０２株へと形質転換する。
【００４９】
（４）単一コロニーを５ｍｌのＬＢ−ＣＭ培地（クロラムフェニコールを含むＬＢ培地）へと接種し、３２℃で終夜にわたり増殖させる。
【００５０】
（５）終夜にわたる培養物を、２５０ｍｌのＬＢ−ＣＭｏｌ培地へと接種し、ＯＤが０．４〜０．６となるまで、振とうしながら３２℃で増殖させる。
【００５１】
（６）エレクトロコンピテント細胞（ＶＺＶ  ＢＡＣで形質転換したＳＷ１０２細胞）を調製する。
【００５２】
（７）ステップ（６）で調製されたエレクトロコンピテント細胞（ＶＺＶ  ＢＡＣで形質転換したＳＷ１０２細胞）を、ステップ（２）による１〜２μｌ（約２００ｎｇ）の精製されたＰＣＲ産物により、例２において説明したエレクトロポレーションパラメータで形質転換する。
【００５３】
（８）３２℃で１ｍｌのＬＢ培地中で、１時間にわたり、形質転換体を回収する。
【００５４】
（９）回収時間の後、１×Ｍ９塩中で、以下の通り、３回にわたり細菌を洗浄する。培養物を１３，２００ＲＰＭで１５秒間にわたり遠心分離にかけ、ピペットで上清を除去する。ペレットを１×Ｍ９塩中に再懸濁させ、上記の通り、再度遠心分離にかける。洗浄ステップを再度繰り返す。３回にわたり洗浄した後、上清を除去し、ペレットを１ｍｌの１倍濃度Ｍ９塩中に再懸濁させる。次いで、ペレットの懸濁液、１０倍の希釈系列、及び１００倍の希釈系列を、ガラクトース、ロイシン、ビオチン、及びクロラムフェニコールを含むＭ６３最小培地プレートへと播種する。
【００５５】
（１０）３２℃で３日間にわたりプレートをインキュベートする。
【００５６】
（１１）数個のコロニーを、ガラクトース＋クロラムフェニコールを含むマッコンキー寒天培地プレート上へと画線培養して、単一コロニーを得る。３日間にわたるインキュベーション後に出現するコロニーはＧａｌ＋コロニーのはずであるが、Ｇａｌ−混入を除去するためには、明赤色の単一コロニーを得てから、次のステップへと進むことが重要である。
【００５７】
（１２）単一の明赤色の（Ｇａｌ＋）コロニーを採取して、５ｍｌのＬＢ−ＣＭ培地へと接種し、３２℃で終夜にわたり培養する。該終夜にわたる培養物からＢＡＣ  ＤＮＡを調製し、ＰＣＲによりｇａｌｋ遺伝子を検証する。用いられるプライマーは、
【化６】
2013500024.tif 000007
である。
【００５８】
（１３）プライマーＦ４（配列番号１０）及びＲ４（配列番号１１）を用いて、ＯＲＦ７停止コドンの３'側に近接する４５７ｂｐの配列（４５７ｂｐのＯＲＦ配列を、配列番号１２に示す）を増幅する。プライマーＦ４及びＲ４は、１塩基のフレームシフトを導入するようにデザインされているので、フレーシフト突然変異を有するＰＣＲ産物が生成される。
【００５９】
Ｆ４及びＲ４の配列を、以下に示す。
【化７】
2013500024.tif 000008
【００６０】
４５７ｂｐのオープンリーディングフレームは、
【化８】
2013500024.tif 000009
である。
【００６１】
上記のステップ４〜１０を繰り返して、エレクトロコンピテントＳＷ１０２細胞を得る。
【００６２】
（１４）ステップ（１３）の熱ショック処理した細菌５０μｌを、ステップ（２）のｇａｌｋ遺伝子に隣接する領域と相同的なＰＣＲ産物２００ｎｇにより形質転換する。振とうしながら、３２℃の水浴中で４．５時間にわたりインキュベートすることにより、５０ｍｌのバッフル付き三角フラスコ内のＬＢ培地１０ｍｌ中に回収する。この長い回収時間は、対象の配列だけを含有する組換えＶＺＶ  ＢＡＣを得る（したがって、ＧａｌＫカセットを含有するＶＺＶ  ＢＡＣを除去する）のに役立つ。プライマーＦ４は、ＯＲＦ７の５'側に隣接する６０ｂｐの相同配列と、ＯＲＦ７の３'側に近接する４５７ｂｐの逆配列とで構成され、プライマーＲ４は、ＯＲＦ７の３’側に隣接する６０ｂｐの相同配列と、ＯＲＦ７の３’側に近接する４５７ｂｐのフォワード配列とで構成されるので、増幅されたＰＣＲ産物と、ＯＲＦ７遺伝子座内のｇａｌｋ遺伝子との相同組換えにより、３'側４５７ｂｐの反転逆リンクがもたらされ、その結果として、機能を発現しない反転逆フレームシフト突然変異（配列番号１３）が得られる。反転逆フレームシフト突然変異配列を、以下に示す。
【化９】
2013500024.tif 000010
【００６３】
（１５）ステップ９の通り、１ｍｌの培養物をスピニングし、１×Ｍ９塩中で３回にわたり洗浄し、１ｍｌの１倍濃度Ｍ９塩中に再懸濁させる。ペレットの懸濁液及び１０倍の希釈系列（各々１００μｌずつ）を、グリセロール、ロイシン、ビオチン、２−デオキシ−ガラクトース、及びクロラムフェニコールを含むＭ６３最小培地プレートへと播種する。
【００６４】
（１６）３２℃で３〜４日間にわたりインキュベートする。
【００６５】
（１７）コロニーを採取し、それらをＬＢ−ＣＭプレート及びＧａｌＫ−Ｍ６３  ＣＭ最小培地プレート上に画線培養する。ＬＢ−ＣＭプレート上では増殖するが、最小培地プレート上では増殖しない単一コロニーを選択する。ウイルスＤＮＡを抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化により完全性を検証し、ＰＣＲにより組換えＤＮＡを確認する。ＯＲＦ７を含むＶＺＶ  ＢＡＣが逆フレームシフト型突然変異（ＶＺＶ−７ＤＲＭ  ＢＡＣ）を反転させることを確認する。
【００６６】
上記の手順で用いた試薬は、表１の通りに調製する。
【表１】
2013500024.tif 000011
【００６７】
（例４）
ＶＺＶ−７Ｄウイルス及びＶＺＶ−７ＤＲＭウイルスの作製
（１）例２で得たＶＺＶ−７Ｄ  ＢＡＣからＤＮＡを抽出する。
【００６８】
（２）精製されたＤＮＡを、エレクトロポレーションを介して、ＭＲＣ−５細胞（Ｍａｒｃｈｉｎｉ、Ｌｉｕら、２００１）へと個別にトランスフェクトする（ＢＡＣにおいて保有されるＧＦＰにより、ウイルスの増殖をモニタリングすることができる）か、又は精製されたＤＮＡを、Ｃｒｅ発現ベクターと共に、ＭＲＣ−５細胞へと共トランスフェクトした（Ｍａｒｃｈｉｎｉ、Ｌｉｕら、２００１）。Ｃｒｅにより、ＢＡＣに隣接するｌｏｘＰ部位で、ＢＡＣを正確に切り出し、ＶＺＶ  ７Ｄウイルスを得た。
【００６９】
同様にまた、ＯＲＦ７の反転逆フレームシフト突然変異を有するＶＺＶ−７ＤＲＭウイルスも得た。ＶＺＶ  ７ＤＲＭは、反転逆配列であるＯＲＦ７の一部だけを含有するので、発現することができず、ＯＲＦ７機能を示さない。ＶＺＶ−７ＤＲＭ及びＶＺＶ−７Ｄはいずれも、示す機能が同じである。
【００７０】
（例５）
ＶＺＶ−７Ｄの検証
単層ＭＲＣ−５細胞に、例４で調製され、２％ウシ血清を補充したＭＥＭ培地中で培養されたＶＺＶ−７Ｄを感染させた。細胞のほぼ８０％が細胞変性効果を呈示したところで、培地を廃棄し、細胞を採取し、ＤＮＡを抽出する。Ｐ−Ｏｋａは対照としての役割を果たす。ＰＣＲによりＯＲＦ−１０遺伝子及びＯＲＦ−７遺伝子を増幅した。ＶＺＶ−７Ｄ及びＰ−ＯｋａのＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩにより消化した。ＰＣＲ産物と、ＨｉｎｄＩＩＩ消化生成物とを、０．５％アガロースゲル中の電気泳動にかけた。結果を図３に示した。ＶＺＶ−７ＤにおけるＯＲＦ−１０のＰＣＲ産物はＰ−Ｏｋａと同じであるが、ＶＺＶ−７ＤにおけるＯＲＦ−７バンドは不在である。これにより、ＶＺＶ−７ＤにおけるＯＲＦ−７が欠失されていることが確認された。ＶＺＶ−７Ｄ及びＰ−Ｏｋａとで、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化されたウイルスＤＮＡのプロファイルの差違は見られなかった。
【００７１】
（例６）
ヒト後根神経節内におけるＶＺＶ−７Ｄの培養
ヒト胎児脊椎（妊娠２０週齢）から、頸椎及び胸椎の後根神経節（ＤＲＧ）を摘出した。１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含む１×氷冷ＰＢＳ中でこのＤＲＧを簡単に洗浄し、次いで、氷冷組織培養培地（１５％の熱不活化ウシ胎仔血清と、１％のペニシリン／ストレプトマイシンとを含むＤＥＭ）へと移した。０．５ｍｌの培地で覆われた６ウェルプレート内の、コラーゲンでコーティングされたカバースリップ上に各ＤＲＧを個別に入れ、培地を１回交換して、５日間にわたり培養した。６ウェルプレート内で５０％のＭｅＷｏ細胞を調製し、滴定及び増殖曲線（図４Ａ）の作成を行った。６日目に、Ｐ−Ｏｋａ、ＶＺＶ−７Ｄ、及びＶＺＶ−７Ｒを感染させたばかりのＭｅｗｏ細胞を採取し、培地中で１ｍｌの最終容量へと再懸濁させた。各ＤＲＧは、６ウェルプレート内のコラーゲンでコーティングされたカバースリップ上で個別に増殖させる。１０μｌの懸濁液を用いて、ウイルス力価を決定し、２μｌの懸濁液を用いて、感染ＭｅＷｏ細胞の増殖曲線を作成した。細胞懸濁液の残りを、２０回にわたり２７ゲージ針に通し、４０００ｒｐｍで１０分間にわたり遠心分離することにより、細胞破砕物をペレット化させた。上清を等量に分割し、これらを用いてＤＲＧに感染させ（約１２０μｌ／試料１例）、加えて、２滴（２０μｌ）の細胞懸濁液を用いて、別のＤＲＧセットに感染させた。３７℃／５％ＣＯ２中で３時間にわたるインキュベーション後、１×ＰＢＳでＤＲＧを洗浄し、新鮮な培地を添加した。２４時間間隔でルシフェラーゼ活性を測定した。試料を、１５０μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリンと共に、３７℃で１０分間にわたりインキュベートした。ＩＶＩＳ測定器により光子をカウントし、ソフトウェアにより解析した。結果は、図４Ｂに示した。
【００７２】
結果は、ＶＺＶ−７Ｄが、ＭｅＷｏ細胞内では良好に増殖するが、ＤＲＧ内ではほとんど増殖しないことを示す。ＶＺＶ−７ＤがＤＲＧに感染しないという事実は、安全な弱毒化生ワクチンを開発するための基盤をもたらす。
【００７３】
（例７）
ＶＺＶ−７Ｄに対する逆突然変異体（ＶＺＶ−７Ｒ）の構築及び検証
ＯＲＦ７欠失突然変異体は、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によるだけでなく、相同組換えにより得られる完全ＶＺＶウイルスによっても同定することができる。すなわち、完全ＶＺＶは、相同組換えの機構によりレスキューされる、図５を参照されたい）。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼキットを用いるＰＣＲにより、ＯＲＦ７断片を増幅し、プラスミドｐＧＥＭ−ｌｏｘ−ｚｅｏのＮｏｔＩ部位とＢｇｌＩＩ部位との間にクローニングして、ｐＧＥＭ−ｚｅｏ−ＯＲＦ７プラスミドを形成した。配列決定解析により、クローニングされた断片を検証したところ、ＰＣＲ増幅により、不適正なコドンがＯＲＦ７へと導入されることはなかったことが示される。次いで、２つのプライマーを用いて、ｐＧＥＭ−ｚｅｏ−ＯＲＦ７から、ＰＣＲによりｚｅｏＲ−ＯＲＦ７カセットを増幅した。
【化１０】
2013500024.tif 000012
【００７４】
結果として得られるＰＣＲ産物は、各末端に４０ｂｐの相同ＶＺＶセグメントを含有し、前記セグメントは、ｋａｎＲ遺伝子に近接し、欠失ＯＲＦ７遺伝子内に位置する。結果として得られるキメラＰＣＲ産物を、上記のエレクトロポレーションを介して、ＯＲＦ７Ｄ  ＢＡＣクローンを保有するＤＹ３８０株へと形質転換する。５０μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する寒天プレート上、３２℃で組換え体を選択した。それらの抗生物質感受性により、適正なＶＺＶクローンを確認した。適正なクローンは、クロラムフェニコール、ハイグロマイシン、Ｚｅｏｃｉｎに耐性であり、カナマイシン及びアンピシリンに感受性のはずである。制限酵素消化及びＰＣＲ解析により、これらのクローンをさらに検証した。
【００７５】
検証されたクローン（ＯＲＦ７が欠失している、又はレスキューｌｕｃ  ＶＺＶ  ＢＡＣを有する、大腸菌ＤＹ３８０株によるクローン）を、１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む５００ｍｌのＬＢ培地中、３２℃で２０時間にわたりインキュベートした。Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ＢＡＣ  ＤＮＡ単離キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて、ＶＺＶ  ＢＡＣ  ＤＮＡを単離し、これらを、製造元の指示書に従い、ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてＭＲＣ−５細胞にトランスフェクトするのに用いた。６ウェルプレートの各ウェル（３５ｍｍ）について、ＤＮＡ対トランスフェクション試薬の比は、１．５μｇ：６μｌであった。トランスフェクションの３日後には、ＶＺＶプラークが正常に見て取れた。ＶＺＶゲノムから、ＢＡＣベクター（２つのｌｏｘＰ部位により挟まれる）を除去するために、Ｃｒｅ発現ベクターを、ＶＺＶ  ＢＡＣ  ＤＮＡと共に、ＭＲＣ−５細胞へと共トランスフェクトした（Ｍａｒｃｈｉｎｉ、Ｌｉｕら、２００１）。Ｃｒｅ酵素により、ＢＡＣは正確に欠失され、完全ＶＺＶを生成させた。
【００７６】
ＯＲＦ−７レスキューウイルスは、Ｐ−Ｏｋａ株と同じ生育及び増殖特性を示す。これらの結果は、逆突然変異により、ＯＲＦ−７の機能を回復させうることを示した。
【００７７】
（例８）
Ｍｅｗｏ細胞におけるＶＺＶ−７ＤＲＭの培養
６ウェルプレート内の単層ＭｅＷｏ細胞にモック感染させ、又はｌｕｃＶＺＶ−７ＤＲＭ（Ｌｕｃを有するＶＺＶ−７ＤＲＭ）、ｌｕｃ７ＶＺＶ−７Ｒ（Ｌｕｃを有するＶＺ−７Ｒ）、及びｌｕｃＶＺＶ（Ｌｕｃを有するＰ−Ｏｋａ株）を感染させた。２％ウシ血清を含むＭＥＭ培地中、３７℃でＭｅｗｏ細胞を培養した。感染の２４時間後に、Ｄ−ルシフェリンを１５０μｇ／ｍｌの最終濃度まで、培養ウェルに添加した。３７℃で１０分間にわたるインキュベーション後、ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（５０  Ｓｅｒｉｅｓ；Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて、異なるウェル内の発光を同時に３連で記録した。測定後、ルシフェリン含有培地を、通常の細胞培地で置換した。２４時間ごとに７日間にわたり、この測定を繰り返した。平均データ対時間をプロットすること（図６）により、増殖曲線を作成した。
【００７８】
ヒトＭｅＷｏ細胞にモック感染させ、又は野生型ＶＺＶ（ｌｕｃＶＺＶ）、又はＶＺＶ−７ＤＲＭ、又はＶＺＶ−７Ｄレスキュー株（ｌｕｃ７Ｒ）を感染させ、７日間にわたり培養した。感染後毎日、ＩＶＩＳシステムにより３連で光子カウントを記録した。平均光子カウント対時間をプロットすることにより、増殖曲線を作成した。図中に誤差バーを表示した。この実験の結果は、ＶＺＶ−７ＤＲＭ及びＶＺＶ−７Ｒが、野生型ウイルスと同様に十分にＭｅＷｏ細胞内で増殖することを示した。一方、ＢＡＣを挿入した後、ＶＺＶ−７ＤＲＭが正常に増殖しうることが示された。ＢＡＣにより保有される遺伝子もまた、発現することが可能である。すなわち、ＶＺＶ−７ＤＲＭは、異種遺伝子の発現ベクターとして用いることができる。
【００７９】
（例９）
ヒト胸腺組織におけるＶＺＶ−７ＤＲＭの培養
ヒト胸腺−肝臓組織を、ＣＢ−１７ＳＣＩＤ／ベージュマウスへの異種移植片として同時移植した。ヒト胸腺−肝臓組織の組合せ移植片は、文献（Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｆ．Ｍ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９５年９月、５２３６〜５２４２ページ）で説明されている方法に従い構築する。移植の３カ月後、手術によりヒト胸腺−肝臓異種移植片を露出させ、これらに３連で、モック感染させ、又は１０〜２０μｌのＭｅＷｏ細胞により培養した、２×１０３〜４×１０３ＰＦＵのｌｕｃＶＺＶ−７ＤＲＭ（ルシフェラーゼを有するＶＺＶ−７ＤＲＭ）及びｌｕｃＶＺＶ（ルシフェラーゼを有するＰ−Ｏｋａ）を感染させた。感染後、毎日蛍光強度を測定した。腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により、ルシフェラーゼ基質であるＤ−ルシフェリン２５０μｌを添加した。１０分後、例８で説明した方法に従い、ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、３連で、異種移植片中の蛍光を記録した。結果を図７に示した。
【００８０】
７日間にわたり、培養されたヒト胸腺組織に、モック感染させ、又は野生型ＶＺＶ、若しくはＶＺＶ−７ＤＲＭを感染させた。感染後毎日（ＤＰＩ）、ＩＶＩＳシステムを用いて光子カウントを測定し、平均光子カウント対時間をプロットすることにより、増殖曲線を作成した。図中に、３回にわたるデータ測定による誤差バーを表示する。この実験により、ＶＺＶ−７ＤＲＭ突然変異体が、胸腺組織（Ｔ細胞）内で、野生型ＶＺＶと同様に増殖しうることが示された。
【００８１】
同様の実験によりまた、ＶＺＶ−７Ｄも、胸腺組織（Ｔ細胞）内で、野生型ＶＺＶと同様に増殖しうることが裏付けられた。
【００８２】
（例１０）
皮膚におけるＶＺＶ−７ＤＲＭの培養
文献（Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｆ．Ｍ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９５年９月、５２３６〜５２４２ページ）で説明されている方法に従い、ヒト胎児皮膚を、完全移植片としてＳＣＩＤマウスへと皮下移植した。移植の４週間後、マウスの皮膚に３連で、モック感染させ、又はｌｕｃＶＺＶ−７ＤＲＭ（Ｌｕｃを有するＶＺＶ−７ＤＲＭ）、ｌｕｃＶＺＶ−７Ｒ（Ｌｕｃを有するＶＺ−７Ｒ）及びｌｕｃＶＺＶ（Ｌｕｃを有するＰ−Ｏｋａ株）を感染させた。感染後、毎日蛍光強度を測定した。ｉ．ｐ．注射により、ルシフェラーゼ基質であるＤ−ルシフェリン２５０μｌを添加した。１０分後、例８で説明した方法に従い、ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、３連で、異種移植片中の蛍光を記録した。結果を図８に示した。
【００８３】
７日間にわたり、培養されたヒト皮膚組織に、モック感染させるか、野生型ＶＺＶ（Ｐ−Ｏｋａ株）、若しくはＯＲＦ７欠損突然変異体（ＶＺＶ−７ＤＲＭ）、又はＯＲＦ７逆突然変異体（ＶＺＶ−７Ｒ）を感染させた。感染後毎日（ＤＰＩ）、ＩＶＩＳシステムを用いて光子カウントを測定し、平均光子カウント対時間をプロットすることにより、増殖曲線を作成した。図中に、３回にわたるデータ測定による誤差バーを表示する。この実験により、ＶＺＶ−７ＤＲＭ突然変異体が、皮膚における増殖で大きな欠陥を示し、この機能の欠陥が、ＶＺＶ−７ＤＲＭにおける逆突然変異により回復されうることが示された。
【００８４】
同様の実験によりまた、ＶＺＶ−７Ｄ突然変異体も、皮膚における増殖で大きな欠陥を示し、この機能の欠陥が、ＶＺＶ−７Ｄにおける逆突然変異により回復されうることが見出される。
【００８５】
（例１１）
神経細胞にＶＺＶが感染するのにＯＲＦ７が必須であることが実験により確認された
１．神経細胞腫細胞への感染
ＭｅＷｏ細胞並びに神経細胞腫細胞系であるＳＨ−ＳＹ５Ｙに、野生型（ＷＴ）、ＯＲＦ７欠失突然変異体（ＶＺＶ−７ＤＲＭ）ＢＡＣ、及びＯＲＦ７逆突然変異体（ＶＺＶ−７Ｒ）ＢＡＣに由来するＤＮＡをトランスフェクトした。結果は、ＷＴ、ＶＺＶ−７Ｒが、ＭｅＷｏ細胞及び神経細胞腫細胞において良好に増殖しうるが、ＶＺＶ−７ＤＲＭが、神経細胞腫細胞においては増殖しえないことを示した（図９Ａ）。これにより、神経細胞にＶＺＶが感染するのに、ＯＲＦ７が本質的である可能性が極めて高いことが示唆される。
【００８６】
２．ＤＲＧ移植片への感染
この例における試験１の結果をさらに検証するため、ヒト胎児ＤＲＧをＳＣＩＤマウスへと移植し、ウイルス感染の動物モデルとして用いた。結果は、野生型ウイルスが、短い複製周期の後に潜在化することを示す（蛍光現象による）一方、ＶＺＶ−７ＤがＤＲＧ移植片中では複製されえないことを示した。これらの結果は、ＯＲＦ７が、ＶＺＶの向神経性因子である可能性が極めて高いことを示した（図９Ｂ〜Ｄ）。
【００８７】
上記の２つの試験により、ニューロンにＶＺＶが感染するのに、ＯＲＦ７が本質的であることが裏付けられた。
【００８８】
（例１２）
ＶＺＶ−７ＤＲＭによるワクチンの調製並びにＶＺＶ−７ＤＲＭについての免疫原性アッセイ
単層ＡＲＰＥ細胞又はＭＲＣ−５細胞に、０．１の感染多重度（ＭＯＩ）でＶＺＶ−７ＤＲＭを感染させた。４０分間にわたりウイルスを細胞に付着させた後、フラスコに培地を添加し、これを３５℃でインキュベートした。細胞のうちの約８０％が細胞症を提示したら（一般に、３日後）、０．１％ＥＤＴＡで消化することにより、細胞を採取した。採取された細胞を遠心分離し、保護剤を添加し、破砕及び清明化の後にワクチンを得た。
【００８９】
１回のワクチン接種当たり５匹ずつのモルモット（体重約２５０ｇ）に、投与１回当たり５０００ｐｆｕ／０．５ｍｌで、復元されたワクチンを接種した。初回免疫化の４週間後に、追加免疫化を施した。Ｐ−Ｏｋａ及びＶ−Ｏｋａを対照として用いる。
【００９０】
追加免疫化の２週間後、心臓穿刺により血液を回収した。ｇｐ−ＥＬＩＳＡにより、血清抗体力価を検出した。免疫阻害アッセイにより、ウイルスに対する抗体の中和能を決定した。ワクチン接種の前後に、１０倍の血清希釈液を、１：１の比でウイルスと混合した。３７℃で６０分間にわたるインキュベーションの後、混合物を用いて、ＭＲＣ−５細胞に感染させた。５％ＣＯ２中３７℃における７日間のインキュベーション後、培地を除去し、クーマシーブルーで細胞を染色した。プラーク形成単位をカウントすることにより、ウイルス力価を計算した。１００×（［ワクチン接種前に血清により中和されるウイルス力価］−［ワクチン接種後に血清により中和されるウイルス力価］）／［ワクチン接種前に血清により中和されるウイルス力価］として、抗体によるウイルス中和度を計算する。結果を表２に示す。
【表２】
2013500024.tif 000013
【００９１】
結果により、ＶＺＶ−７ＤＲＭが、良好な免疫原性を保有し、それに対する抗体による中和度は、Ｖ−Ｏｋａの場合と同等であることが示された。ＶＺＶ−７ＤＲＭによるワクチン接種後の血清は、３種のウイルスすべてに対して良好な中和効果を有し、ワクチンとして開発される可能性を示す。
【００９２】
同様の実験によりまた、ＶＺＶ−７Ｄも良好な中和効果を有し、ワクチンとして開発される可能性を有することが示された。
【００９３】
（例１３）
ＶＺＶ−７ＤＲＭをベクターとして用いる生物学的活性物質の調製
ＯＲＦ７に対する隣接相同性を含有するＥＶ７１−ＶＰ１プライマーによるＰＣＲを介して、ｐＴ−ＶＰ１プラスミドから、ＥＶ７１−ＶＰ１カセットを増幅した。
【００９４】
ＥＶ７１−ＶＰ１カセットは、以下に示される。
【化１１】
2013500024.tif 000014
【００９５】
ＰＣＲプライマー配列：
Ｆ６（ＯＲＦ７の５'側隣接領域に対して相同な配列；開始コドン；ＥＶ７１−ＶＰ１に相同な配列）：
【化１２】
2013500024.tif 000015
【００９６】
Ｒ６（ＯＲＦ７の３’側隣接領域に対して相同な配列；ＥＶ７１−ＶＰ１に相同な配列）：
【化１３】
2013500024.tif 000016
【００９７】
ＶＺＶ−７ＤＲＭ  ＢＡＣを含有する大腸菌のエレクトロコンピテントＳＷ１０２株を、精製されたＰＣＲ産物により形質転換する。例２に従い、組換えＳＷ１０２株をスクリーニング及び同定した。適切な培養の後、ＶＺＶ−７ＤＲＭ−ＶＰ１  ＢＡＣを単離し、次いで、エレクトロポレーションを介して、Ｃｒｅ発現ベクターと共に、ＡＲＰＥ細胞へと共トランスフェクトした。ＢＡＣの両端におけるｌｏｘＰ部位から、ＢＡＣの全体を切り出し、その後、組換えＶＺＶ−７ＤＲＭ−ＶＰ１ウイルスを得た。単層ＡＲＰＥ細胞に組換えウイルスを感染させ、３５℃で３〜４日間にわたり培養した。そこで、細胞は細胞症を提示した。組換えウイルスの培養物上清、並びに細胞溶解（凍結融解又は超音波処理を繰り返した後の）に由来する遠心分離上清におけるＥＶ７１特異的サンドイッチＥＬＩＳＡにより、ＶＰ１の活性を検出した。ＥＶ７１及びＶＺＶ−７ＤＲＭを、対照として用いる。結果（表３）は、ＶＺＶ−７ＤＲＭ−ＶＰ１ウイルスを感染させたＡＲＰＥ細胞においてＶＰ１活性が検出されたことを示す。これは、ＶＰ１が、ＶＺＶ−７ＤＲＭウイルス内に組み換えられていることを示唆する。この例により、外来遺伝子を発現させるベクターとして、ＶＺＶ−７ＤＲＭを用いうることが示された。
【表３】
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【００９８】
同様の実験により、ＶＺＶ−７Ｄは外来遺伝子を発現させる発現ベクターとしても用いることができることが裏付けられた。
【００９９】
本発明の実施形態を詳細に説明してきたが、本発明の範囲を逸脱しない限りにおいて、本開示の教示に従い、これらの詳細に対して各種の改変及び置換を行いうることを、当業者は理解するであろう。付属の特許請求の範囲、及びそれらの同等物により、本発明の全範囲が規定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図５】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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