【事件の表示】
　特許第２６８４２０８号「水不溶性バイオ適合性ゲルの製造方法」の請求項１ないし１２に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結論】
　　訂正を認める。
　　特許第２６８４２０８号の請求項１ないし１２に係る特許を維持する。
【理由】
［Ｉ］手続の経緯
　特許第２６８４２０８号の発明についての出願は、昭和６３年８月２６日（優先権主張　１９８７年９月１８日、米国）に特許出願され、平成９年８月１５日にその発明について特許の設定登録がなされ、その後、その特許について、生化学工業株式会社より特許異議の申立てがなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１１年４月１６日に訂正請求がなされたものである。
［ＩＩ］訂正の適否についての判断
ア．訂正の内容
　特許権者は、以下のａ−ｂの訂正を請求する。
訂正ａ
　特許請求の範囲の請求項１中の「水不溶性のバイオ適合性ゲルを生成する条件下で反応させる」を、「水溶液中で、実質的に架橋を含まない水不溶性のバイオ適合性ゲルを生成する条件下で反応させる」と訂正する。
訂正ｂ
　特許請求の範囲の請求項１中の「水不溶性のバイオ適合性ゲルの製造方法」を、「実質的に架橋を含まない水不溶性のバイオ適合性ゲルの製造方法であって、ここに、「水不溶性」は、このゲルから形成された３ｃｍ×３ｃｍ×０．３ｍｍフィルムが、５０ｍｌの２０℃の蒸留水を含むビーカー中に置いた場合に２０分後に構造が完全であり、フィルムは膨潤されるがフィルムの境界及びエッジが２４時間の後に依然存在することを意味する当該製造方法。」と訂正する。
イ．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　訂正ａは、請求項１において、「水不溶性のバイオ適合性ゲル」を、明細書に記載された、実質的に架橋を含まないものに限定し、「反応させる」を、明細書に記載された、水溶液中で反応させることに限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当するものであり、新規事項の追加に該当しない。
　訂正ｂは、請求項１において、「水不溶性のバイオ適合性ゲル」を、明細書に記載された、実質的に架橋を含まないものに限定し、「水不溶性」を明細書に記載された具体的な条件に特定するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当するものであり、新規事項の追加に該当しない。
　そして、上記いずれの訂正も、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
ウ．独立特許要件
　上記訂正ａ．ｂにより訂正された特許請求の範囲の請求項１〜２に係る発明は、後記［ＩＩＩ］で示した内容から明らかなように、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
エ．むすび
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する第１２６条第２〜４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
［ＩＩＩ］特許異議の申立てについて
ア．本件発明
　本件発明は、訂正した明細書の特許請求の範囲の請求項１〜１２に記載された、以下のとおりのものである。
　【請求項１】ＨＡを濃度０．４〜２．６％Ｗ／Ｗの範囲で含む水性混合物を供し、
　該ＨＡを活性化剤で活性にして活性化されたＨＡを形成し、
　該活性化されたＨＡを求核性試薬と、水溶液中で、実質的に架橋を含まない水不溶性のバイオ適合性ゲルを生成する条件下で反応させる
ことを含む実質的に架橋を含まない水不溶性のバイオ適合性ゲルの製造方法であって、
ここに、「水不溶性」は、このゲルから形成された３ｃｍ×３ｃｍ×０．３ｍｍのフィルムが、５０ｍｌの２０℃の蒸留水を含むビーカー中に置いた場合に２０分後に構造が完全であり、フィルムは膨潤されるがフィルムの境界及びエッジが２４時間の後に依然存在することを意味する当該製造方法。
　【請求項２】前記活性化が
　前記ＨＡを含む水性混合物を供し、
　該水性混合物のｐＨを、酸を添加して４．０〜５．０に下げ、次いで、
　該水性混合物に前記活性化剤を接触させる
ことを含む請求項１に記載の方法。
　【請求項３】前記ＨＡ及び前記活性化剤が活性化する間、活性化剤少なくとも０．２モル当量対ＨＡのグルクロン酸残基１モル当量のモル比で存在する請求項１に記載の方法。
　【請求項４】前記活性化されたＨＡ及び前記求核性試薬が前記反応工程において、前記求核性試薬少なくとも０．２モル当量対活性化されたＨＡのグルクロン酸残基１モル当量のモル比で存在する請求項１に記載の方法。　　　　　　　　　　　
　【請求項５】前記活性化剤がカルボジイミドを含む請求項１に記載の方法。
　【請求項６】前記求核性試薬がアミノ酸を含む請求項１に記載の方法。
　【請求項７】前記求核性試薬がアミノ酸塩を含む請求項１に記載の方法。
　【請求項８】前記求核性試薬がアミノ酸エステルを含む請求項１に記載の方法。
　【請求項９】前記求核性試薬がアミノ酸アミドを含む請求項１に記載の方法。
　【請求項１０】前記求核性試薬が一官能価アミンを含む請求項１に記載の方法。
　【請求項１１】前記活性化及び前記反応が同時に行なわれる請求項１に記載の方法。
　【請求項１２】更に、検出可能なマーカを混和することを含む請求項１に記載の方法。
イ．申立ての理由の概要
　これに対し、特許異議申立人生化学工業株式会社は、証拠として
甲第１号証：　Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，１６（１９７１）１９９−２０５
甲第２号証：Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，５７８（１９７９）２８１−２８９
甲第３号証：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ　Ｄｅ１ｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９８３）Ｃｈａｐｔｅｒ　６（１０７−１１９），　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　ｌｎｃ．
甲第４号証：特開昭６１−１３８６０１号公報
を提示し、以下の２点を主張している。
１）本件特許の請求項１、２，３，４，５，８に係る発明は、甲第１〜３号証に記載された発明であり、本件特許の請求項１１に係る発明は、甲第２号証に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号に該当し、本件特許の請求項１、６，７，９，１０に係る発明は、甲第１〜３号証に記載された発明から当業者が容易になし得た発明であり、本件特許の請求項１２に係る発明は、甲第１〜４号証に記載された発明から当業者が容易になし得た発明であるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものである。
２）請求項１の記載は不明瞭であり、また、明細書には本発明の効果が記載されていないので、本件出願は特許法第３６条に規定する要件を満たしていない。
ウ．判断
　そこで、上記特許異議申立人の主張について、以下検討する。
１）の主張について
　甲第１号証は、ムコ多糖のカルボキシル基のアミノ酸エステルとのアミドへの転換に関する文献であって、ムコ多糖としてヒアルロン酸を用い、ＥＤＣの存在下、グリシンメチルエステルと反応させたことが記載されている。
　甲第２号証は、ヒアルロン酸が固定されたアフィニティークロマトグラフィーに関する文献であって、水中でヒアルロン酸と置換アガロースゲルとを混合し、ＥＤＣの存在下、反応させたことが記載されている。
　甲第３号証には、ＤＭＦ／水（２：１）中でヒアルロン酸とアラニルクロラムフェニコールを、ＥＤＣの存在下、反応させたことが記載されている。
　甲第４号証は、架橋ヒアルロン酸ゲルに関するものであり、架橋反応の際、不溶性染料を添加することが記載されている。
　ここで、本件請求項１に係る発明と甲第１号証に記載された方法とを対比すると、本件請求項１に係る発明は、「実質的に架橋を含まない水不溶性のバイオ適合性ゲル」を製造する方法であるところ、甲第１号証には、ゲルを製造する旨の記載はなく、製造された反応生成物がゲルであることを窺わせる記載もない。即ち、甲第１号証には、ヒアルロン酸とグリシンメチルエステルの反応生成物の状態については何らの記載もなく、その状態に関して記載のあるヘパリンＮａ塩とグリシンメチルエステルとの反応生成物は、５％セチルトリメチルアンモニウム塩として沈澱されたことが記載されていることからみて、沈澱される前は水に溶けていたものと解される。
　してみれば、本件請求項１に係る発明と甲第１号証記載のものは、製造しようとする目的物の点で異なるものであり、また本件請求項１に係る発明の製造方法で得られるようなゲルを製造することが甲第１号証の記載から予測し得たものでもない。
　したがって、本件請求項１に係る発明は、甲第１号証に記載された発明でないばかりか、甲第１号証に記載された発明から当業者が容易に発明をすることができたものでもない。
　次に、本件請求項１に係る発明と甲第２号証に記載された方法とを対比すると、本件請求項１に係る発明は、「実質的に架橋を含まない水不溶性のバイオ適合性ゲル」を製造する方法であるところ、甲第２号証記載の方法は、アフィニティークロマトグラフィーに用いる置換アガロースゲルにヒアルロン酸を固定したものを製造する方法であって、このものは、生体に適合させるためのものではない点で相違する。
　してみれば、本件請求項１に係る発明と甲第２号証記載のものは、製造しようとする目的物の点で異なるものであり、また本件請求項１に係る発明の製造方法で得られるような生体適合性のものを製造することが甲第２号証の記載から予測し得たものでもない。
　したがって、本件請求項１に係る発明は、甲第２号証に記載された発明でないばかりか、甲第２号証に記載された発明から当業者が容易に発明をすることができたものでもない。
　さらに、本件請求項１に係る発明と甲第３号証に記載された方法とを対比すると、本件請求項１に係る発明は、「実質的に架橋を含まない水不溶性のバイオ適合性ゲル」を製造する方法であるところ、甲第３号証には、ゲルを製造する旨の記載はなく、製造された反応性成物がゲルであることを窺わせる記載もない。即ち、甲第３号証には、ヒアルロン酸とアラニルクロラムフェニコールの反応生成物が生理的溶液に溶解されることが記載されていることからみて、このものは水溶性のものと解される。
　してみれば、本件請求項１に係る発明と甲第３号証記載のものは、製造しようとする目的物の点で異なるものであり、また本件請求項１に係る発明の製造方法で得られるようなゲルを製造することが甲第３号証の記載から予測し得たものでもない。
　したがって、本件請求項１に係る発明は、甲第３号証に記載された発明でないばかりか、甲第３号証に記載された発明に基いて当業者が容易に発明をすることができたものでもない。
　また、本件請求項２〜１１に係る発明は、本件請求項１に係る発明の反応条件や試薬を限定したものであるから、本件請求項１に係る発明についての理由と同様の理由により、甲第１〜３号証に記載された発明でないばかりか、甲第１〜３号証に記載された発明に基いて当業者が容易に発明をすることができたものでもない。
　また、本件請求項１２に係る発明は、本件請求項１に係る発明の方法において、更に検出可能なマーカを混和することを含むものであるところ、甲第４号証に記載の不溶性染料は、架橋ヒアルロン酸ゲルを製造する架橋反応の際使用するものであって、「実質的に架橋を含まない」ゲルを製造することについては甲第４号証には何らの記載もないから、かかる甲第４号証と上記甲第１〜３号証を組み合わせても、本件請求項１２に係る発明を当業者が容易に発明することができたものとはいえない
　結局、本件請求項１〜１２に係る発明は、特許法第２９条第１項第３号及び同第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものとはいえない。
　よって、特許異議申立人の１）の主張は、採用できない。
２）の主張について
　特許異議申立人は、本件明細書の記載不備の理由として、以下の３点を挙げている。
（ｉ）請求項１の記載は、「水不溶性のバイオ適合性ゲルを生成する条件下で反応させる」との要件及びＨＡ濃度の要件が、実施例の記載と整合していない点において不明確である。
（ｉｉ）請求項１に記載の「水不溶性」の定義が不明瞭である。
（ｉｉｉ）明細書に発明の効果、特に、本発明によって水不溶性とされたＨＡ誘導体の、従来のＨＡに対しての優れた点、についての記載がない。
　しかしながら、上記訂正により、請求項１において、「水不溶性」の内容が明確に定義された。そして、この「水不溶性」の定義、及び、請求項１記載のＨＡ濃度に合致する実施例として、例５〜６，８〜１０，１２及び１５が記載されている。
　してみれば、請求項１の記載は、実施例との関係において、特許異議申立人が（ｉ）で主張するような不明確な点はない。
　また、上記訂正により、請求項１において、「水不溶性」の内容が明確に定義されたのであるから、
上記（ｉｉ）の点の不備も解消された。
　さらに、本件明細書には、本件発明の製造方法によって得られるゲルやフィルムが、外科用エイドや徐放薬物送達用に好適に使用できることが記載されていることから、本件発明の効果が記載されていないという、上記（ｉｉｉ）の点の不備もない。
　したがって、訂正した明細書には、特許異議申立人が主張するような記載上の不備はないから、本件特許が特許法第３６条に規定する要件を満たしていないとはいえない。
　よって、特許異議申立人の２）の主張も採用できない。
［ＩＶ］むすび
　以上のとおり、特許異議申立ての理由及び証拠によっては、本件請求項１〜１２に係る特許を取り消すことができない。
　また、請求項１〜１２に係る特許について、他に取消理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１１年５月１９日（１９９９．５．１９）
【訂正の要旨】
訂正ａ
　特許請求の範囲の請求項１中の「水不溶性のバイオ適合性ゲルを生成する条件下で反応させる」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「水溶液中で、実質的に架橋を含まない水不溶性のバイオ適合性ゲルを生成する条件下で反応させる」と訂正する。
訂正ｂ
　特許請求の範囲の請求項１中の「水不溶性のバイオ適合性ゲルの製造方法」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「実質的に架橋を含まない水不溶性のバイオ適合性ゲルの製造方法であって、ここに、「水不溶性」は、このゲルから形成された３ｃｍ×３ｃｍ×０．３ｍｍフィルムが、５０ｍｌの２０℃の蒸留水を含むビーカー中に置いた場合に２０分後に構造が完全であり、フィルムは膨潤されるがフィルムの境界及びエッジが２４時間の後に依然存在することを意味する当該製造方法。」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
ヒアルロン酸の水不溶性誘導体
【発明の詳細な説明】
　
発明の背景
　本発明は化学的に改質したヒアルロン酸から生成するバイオ適合性フィルム及びゲルに関する。
　ヒアルロン酸（「ＨＡ」）は天然産のムコ多糖で、例えば滑液、硝子体液、血管壁及びへそ帯及びその他の連結組織中に見られる。多糖は交互Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びＤ−グルクロン酸残基が交互β１−３グルクロンジック及びβ１−４グルコサミニジック結合によって結合されてなり、それで反復単位は−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→３）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−である。ヒアルロン酸は水に溶解して高粘性流体を形成する。天然源から単離したヒアルロン酸の分子量は５×１０４〜１×１０７ダルトンまでの範囲内に入るのが普通である。
　本明細書中で用いる通りの「ＨＡ」なる用語はヒアルロン酸及びそのヒアルロネート塩、例えばヒアルロン酸ナトリウム（ナトリウム塩）、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム及びヒアルロン酸カルシウムを含む任意のものを意味する。
　ＨＡは化学的に改質した（「誘導化した」）形で外科用エイド（補助剤）として有用であり、手術後の期間中に体組織が癒着或は付着するのを防ぐ。誘導化したＨＡゲル或はフィルムを、分離したままにして相互に癒着しないようにする組織の間の場所に注入或は挿入する。ゲルは、有効であるには、決まった場所に留まり、ゲルが終局的に分散しかつ組織が接触するようになって、組織がもはや癒着する傾向をもたなくなるように十分長い時間、組織を接触させないようにしなければならない。
　化学的に改質したＨＡは、また、徐放薬剤送達用に有用になることができる。Ｂａｌａｚｓ等の米国特許４，５８２，８６５号（１９８６年）は、「ＨＡ」の架橋ゲルはその中に分散され、ゲル高分子マトリックに共有結合されていない低分子量物質の放出の速度を落とすことができると記述している。Ｒ．Ｖ．Ｓｐａｒｅｒ等は、ニューヨーク在　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｔ．Ｊ．Ｒｏｓｅｍａｎ等のＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｂａｓｅ　Ｄｅ１ｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９８３年、６章、１０７〜１１９頁において、直接か或はアラニンブリッジを中間結合基として含むエステル錯体におけるかのいずれかでエステル結合を経てヒアルロン酸に共有結合させたクロラムフェニコールの開放が持続されることを記載している。
　Ｉ．Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ等、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ．，１９７１年、１６巻、１９９〜２０５頁は、ムコ多糖とアミノ酸エステルとを１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（「ＥＤＣ」）の存在において水溶液中で反応させてムコ多糖のカルボキシル基を置換されたアミドに転化することによってムコ多糖を改質することを記載している。彼等はグリシンメチルエステルとＨＡを含む種々の多糖とを反応させた。生成した生成物は水溶性である、すなわち、水或は体組織の間で遭遇するような水性環境に迅速に分散する。
　ＨＡ組成物の水溶性を減少させる提案はＨＡを架橋させることを含む。Ｒ．Ｖ．Ｓｐａｒｅｒ等は、ニューヨーク、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｒ．Ｊ．Ｒｏｓｅｍａｎ等、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｂａｓｅ　Ｄｅ１ｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９８３年、６章、１０７〜１１９頁において、システィン残基をＨＡにアミド結合を経て結合させ、次いで結合させたシスティン残基の間にジスルフィド結合を形成することによってシスティン改質したＨＡを架橋させることによってＨＡを改質することを記載している。システイン改質したＨＡはそれ自体水溶性であり、かつ酸化によってジスルフィド形に架橋させた場合にのみ不溶性になった。
　Ｄｅ　Ｂｅｌｄｅｒ等のＰＣＴ公表第ＷＯ　８６／００９１２号は、カルボキシル含有多糖に二或は多官能価エポキシドを架橋させて作る。手術後の組織癒着を防止する分解のおそいゲルを記載している。水溶性の減少したＨＡの架橋ゲルを作るのに提案された他の反応性の二或は多官能価試薬は下記を含む：５０℃のアルカリ性媒質中の１，２，３，４−ジエポキシブタン（Ｔ．Ｃ．Ｌａｕｒｅｎｔ等、１９６４年、Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ　Ｓｃａｎｄ．，１８巻、１７４頁）；アルカリ性媒質中のジビニルスルホン（Ｅ．Ａ．Ｂａｌａｓｚ等、米国特許４，５８２，８６５号（１９８６年）；ホルムアルデヒド、ジメチロールウレア、ジメチロールエチレンウレア、エチレンオキシド、ポリアジリジン及びポリイソシアネート（Ｅ．Ａ．Ｂａｌａｓｚ等、英国特許出願第８４２０５６０（１９８４年））を含む種々の他の試薬、Ｔ．Ｍａｌｓｏｎ等のＰＣＴ公表第ＷＯ　８６／０００７９号（１９８６年）は、ＨＡを二−或は多官能価エポキシドのような二−或は多官能価試薬と反応させて、代用硝子体液として用いるためのＨＡの架橋ゲルを作ることを記載している。Ｔ．Ｍａｌｓｏｎ等のＥＰＯ　０１９３５１０号（１９８６年）は、架橋ＨＡゲルを真空乾燥或は圧縮して造形品を作ることを記載している。
　
発明の要約
　総括的には、発明は、一態様において、水不溶性のバイオ適合性ゲルの製造方法、ＨＡを活性化剤で活性にして活性化ＨＡを生成し及び活性化ＨＡを求核性試薬と水不溶性のバイオ適合性ゲルを生成する条件下で反応させることを含む方法を特徴とする。
　好ましい実施態様では、活性化及び反応は同時に行われる。活性化はＨＡを含む水性混合物を準備し、酸を加えて水性混合物のｐＨを４．０〜５．０に下げ、次いで水性混合物に活性化剤を接触させることを含む。水性混合物はＨＡを濃度０．４〜２．６％Ｗ／Ｗの範囲で含む。酸は塩酸を含む。ＨＡ及び活性化剤は、活性化する間、活性化剤少なくとも０．２モル当量対ＨＡのグルクロン酸残基１モル当量のモル比で存在し、活性化ＨＡ及び求核性試薬は反応工程において、求核性試薬少なくとも０．２モル当量対活性化ＨＡのグルクロン酸残基１モル当量のモル比で存在する。活性化剤はカルボジイミド（好ましくは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド或は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドメチオジド）を含む。求核性試薬は下記を含む：アミノ酸アミド（好ましくはロイシンアミドヒドロクロリド）、一官能価アミン（好ましくはアニリン）、アミノ酸、アミノ酸の塩、或は下記を含む群から選ぶアミノ酸のエステル（好ましくはメチルエステル或はｔ−ブチルエステルを含むブチルエステル）：ロイシン、バリン、イソロイシン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン或はフェニルアラニン（好ましくはＬ−ロイシンメチルエステルヒドロクロリド、Ｌ−バリンメチルエステルヒドロクロリド、Ｌ−イソロイシンメチルエステルヒドロクロリド、Ｌ−アルギニンメチルエステルヒドロクロリド、Ｌ−プロリンメチルエステルヒドロクロリド、Ｌ−ヒスチジンメチルエステルヒドロクロリド、Ｌ−フェニルアラニンヒドロクロリド、或はＬ−ロイシンｔ−ブチルエステルヒドロクロリド）。方法は更に検出可能なマーカ（好ましくは、「Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒ」を含む。アミノ酸を染色する染料）を混和することを含む。
　発明は、別の態様では、上述した方法に従って作るゲルを特徴とする。
　発明は、別の態様では、バイオ適合性ゲルを準備し、ゲルを乾燥し或はゲルから水を逃散させる条件下でゲルを圧縮することを含む、水不溶性のバイオ適合性フィルムの製造方法を特徴とする。
　発明は、別の態様では、上述した方法に従って作るフィルムを特徴とする。
　発明は、別の態様では、ＨＡを含み、実質的に架橋が存在しない。実質的に二官能価或は多官能価求核性試薬が存在しない、実質的に二官能価或は多官能価の求電子性試薬が存在しない水不溶性組成物を特徴とする。
　好ましい実施態様では、組成物は、更に、一官能価アミンを含む一官能価求核性試薬、検出可能なマーカー、医薬上活性な物質（好ましくは、ＨＡに共有結合しているか或は組成物内に分散しているかのいずれか及び組成物に共有していない）を含む。
　発明は、別の実施態様では、ＨＡと、活性化剤と、求核性試薬との反応生成物を含む水不溶性組成物を特徴とする。
　本明細書中で使用する通りの「フィルム」なる用語はゲルを圧縮して或はゲルを脱水させて形成する物質を意味し、発明の全てのゲルはこのようなフィルムに成形することができる。
　「バイオ適合性」物質とは、その用語を本明細書中で用いる場合、医学上容認し得ない毒性或は有害な作用を生物学的機能に与えないものである。
　本発明者等は、ＨＡを適当な活性化剤及び求核性試薬で処理することによって、二−或は多官能価架橋試薬を何ら使用しないで、ＨＡのカルボキシル基を共有的に改質した水溶性の減少したゲル或はフィルムを作り得ることを見出した。「水溶性」ゲル或はフィルムとは、その用語を本明細書中で用いる場合、水中ヒアルロン酸ナトリウム１％重量／重量（「Ｗ／Ｗ」）の水溶液を乾燥し、３ｃｍ×３ｃｍ×０．３ｍｍの寸法を有するように作り、２０℃の蒸留水５０ｍｌのビーカーに入れて撹拌しないで静置させた際に、フィルムとしてのその構造上の結合性を３分後に失い、２０分以内に全体が分散されるようになるものである。発明の「水不溶性」フィルムとは、その語句及び同様の用語を本明細書中で用いる場合、ＨＡの１％水溶液を使用し、発明に従って改質し、同じ寸法を有するように形成し、同様にして２０℃の蒸留水５０ｍｌのビーカー中に撹拌しないで静置させて、２０分の後に構造が完全なものである。フィルムは膨潤されるが、フィルムの境界及びエッジは２４時間の後に依然存在する。
　ＨＡが「活性化される」とは、その用語を本明細書中で用いる場合、ＨＡを水性混合物中でＨＡに付いたカルボキシル基を求核作用に対して攻撃されやすくさせるように処理する場合に言う。「活性化剤」とは、ＨＡを含む水性混合物中で、ＨＡをそのように活性になるようにさせる物質である。
　種々の反応条件下で、種々の求核性試薬を用いて活性化ＨＡを改質することができる。本明細書中で用いる通りの「求核性試薬」とは、活性化ＨＡと反応することができる電子に富んだ官能基（好ましくは、第一アミン）を保持する任意の分子である。
　発明のゲル或はフィルムの製造或は使用において、架橋剤を使用しない。本明細書中で用いる通りの「架橋剤」とは、活性化ＨＡと反応することができる求核性部分（例えばアミノ基のような）を２つ或はそれ以上含有する分子であり、或はＨＡのヒドロキシル基と反応することができる求電子性部分を２つ或はそれ以上含有する分子である。好ましい求核性試薬はバイオ適合性のものであるが、活性化ＨＡと反応してバイオ適合性生成物となることができる任意の求核性試薬を用いてよい。その上、ゲル及びフィルムは水不溶性であるから、使用する前に水で十分に洗浄して未反応物質を除くことができる。
　また、発明のフィルム及びゲルは、染料或はステインを反応混合物に入れて、着色した形で作ることができる。このような着色フィルム及びゲルは、決まった場所にある際或は配置する間、見るのが一層容易であり、無着色のものに比べて外科手術中の取扱いを一層容易にさせることができる。
　発明のゲル及びフィルムは、バイオ適合性でありかつ水不溶性であるので、組織を、例えば創傷の治癒を可能にするのに十分な期間のような長い期間の間、のける或は分離するつもりの外科エイドとして特に有用になることができる。
　
好ましい実施態様の説明
　発明のゲル及びフィルムは一般的に下記の通りにして作る。ＨＡを水に溶解し、生成した水性混合物のｐＨを下方向に調整し、次いで適当な活性化剤を混和して溶解したＨＡを活性化し、適当な求核性試薬を活性化ＨＡに混和して、所望のゲルが生成するまで静置させる。活性化剤及び求核性試薬は任意の順序で混和することができる。
　発明のゲル及びフィルムの好ましい製造方法を今詳細に説明する。発明のゲル及びフィルムは、当業者ならばわかる通りに、発明の方法の範囲内であり、その上、本明細書中に記載するものと詳細な点で異なるプロトコルを使用して作ることができる。
　ヒアルロン酸或はヒアルロン酸ナトリウムのようなヒアルロン酸の塩を水に溶解して水性混合物を作る。種々の源の内の任意のものからのＨＡを使用することができる。ＨＡは、よく知られている通りに、動物組織から抽出し或はバクテリア発酵の生成物として収穫することができる。ヒアルロン酸は、例えばＰＣＴ公表第ＷＯ８６／０４３５５号に記載されている通りにしてバイオプロセス技術によって商業量で製造することができる。この第一水性混合物中のＨＡの濃度は０．４〜２．６％重量／重量（「Ｗ／Ｗ」）の範囲であるのが好ましい。濃度が著しく低いと、続く反応がのろくなりかつ有効性が低くなり、濃度が著しく高いと、粘度が高いことにより、取扱いが困難である。
　水性ＨＡ混合物は酸性にすべきであり、ｐＨ４．０〜５．０を有するのが好ましく、ｐＨ４．７５〜５．０を有するのが一層好ましく、ｐＨ４．７５を有するのが最も好ましい。ｐＨ値が低いと、好ましい活性化剤ＥＤＣは不安定であり、ｐＨ値が高いと、反応速度を減少させる。塩酸を加えてｐＨを調整するのが好ましいが、他の既知の酸を使用することができる。
　一担、水性ＨＡ混合物のｐＨを調整したら、活性化剤を混和する。好ましい活性化剤はカルボジイミド、最も好ましくはＥＤＣ（いくつかの参考文献では、この物質は１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルー力ルボジイミド或は「ＤＥＣ」と呼ばれている）或はＥＴＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドメチオジン）を含む。
　次いで、求核性試薬を水性ＨＡ活性化剤混合物に混和する。好ましい求核性試薬は所定のアミノ酸エステル、一層好ましくはロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、ヒスチジン或はプロリンのメチルエステル、最も好ましくはＬ−ロイシンメチルエステルヒドロクロリドを含む。例えばエチル及びｔ−ブチルエステルを含むアミノ酸の他の置換エステルを使用することができ、例えばアニリンのような他の一官能価アミンを使用することができる。
　求核性試薬及び活性化剤をｐＨ調整したＨＡ混合物に、任意の順序で、一度に全てを或は徐々に混和することができる。
　着色生成物を望むならば、染料或はステイン、例えばＳｅｒｖａが「Ｓｅｒｖａ　Ｂｌｕｅ」として配布している青色染料「Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒ」（また、「Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）　Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒ−２５０」としても知られている）をこの点で反応混合物に混和することができる。生成した生成物は青色を有し、体組織の色と良好な対比をなし、フィルム或はゲルを手術中取扱う間及び一担決まった場所において、見るのを容易にする。
　一担、試薬（有るとすれば、ステイン或は染料）を混和したら、反応混合物を単に当分静置させることができ、或は連続して或は時々撹拌する或はかきまぜることができる。
　試薬を混和すると、ｐＨが上がり、反応が進むにつれて酸を添加してｐＨ４．７５に保つことができる。しかしながら、本発明者等は、種々の所望の物理的性質を有するフィルム及びゲルを、反応が進むにつれて単にｐＨを上昇させて得ることができることを見出した。試薬、特にＥＤＣ及び求核性試薬を添加する様式は臨界的なものでなく、これらの試薬対ＨＡの比が重要である。本発明者等は、グルクロン酸残基１モル当量対ＥＤＣ１．６モル当量の比が強いゲルを生じ、１：０．２の比が数日の期間にわたってつぶれて流動溶液になる弱いゲルを生じる。すなわち、ＥＤＣ及び求核性試薬対ＨＡの比は広い範囲にわたって変わることができるが、ＥＤＣ対ＨＡ或は求核性試薬対ＨＡの比は０．２：１より大きくするのが好ましい。一層好ましい比は使用する特定の求核性試薬及び最終生成物の所望の物理的性質に依存する。典型的には、値が小さい程、生成物は弱く、溶性になり、値が大きい程、生成物は強く、不溶性になるのが典型的である。
　上記に従って改質したＨＡは簡単な方法でフィルムとしてキャストすることができる。反応混合物を所望の寸法及び形状を有する容器に注いで風乾させるのが代表的である。フィルムは厚く注いだ混合物を乾燥して作るのが普通であり、それで薄く、表面積／容積の大きい混合物を乾燥して形成するフィルムに比べて表面積／容積が小さく、強度が大きくなる。
　別法として、水を逃散させる条件下でゲルを圧縮することにより、例えばゲルを、例えばＥＰＯ　０１９３５１０号に記載されている通りにして、２つの表面であって、それらの内の少なくとも１つは多孔質であるものの間で圧縮することによる等でフィルムを形成することができる。
　所望の場合、ゲル或はフィルムを使用する前に、例えば水或は１Ｍの塩化ナトリウム水溶液を灌流させることによって洗浄することができる。別法として、反応混合物を透析して残留試薬を除いた後にフィルムとしてキャストすることができる。フィルム或はゲルを治療用途用に用いるつもりならば、洗浄して残留試薬或は試薬誘導化物質、例えば置換尿素を除くことが望ましい。上述した通りにしてＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒで青色に着色したゲル或はフィルムは、このように洗浄する間に着色を失わない。試薬或は反応生成物の除去は高圧液体クロマトグラフィーでモニターすることができる。
　
発明の詳細な説明
　発明を下記の例で一層詳細に説明する。これらの例は例示として挙げるものであり、請求の範囲に記載する通りの他は、発明を制限するつもりのものではない。
　例１：本例では、ＥＤＣを活性化剤として及びロイシンメチルエステルヒドロクロリドを求核性試薬として用いて、ヒドロゲルを作製した。
　分子量１×１０６〜２×１０６を有するヒアルロン酸ナトリウム（４００ｍｇ；カルボキシル基１．０ｍモル）を蒸留水１０ｍｌに溶解した。水溶液のｐＨを、０．１Ｎ　ＨＣｌを添加してｐＨ４．７５に調整した。次いで、ＥＤＣ３１４ｍｇ（１．６４ｍモル）を一度に全部加えた後に、Ｌ−ロイシンメチルエステルヒドロクロリド１９０ｍｇ（１．０５ｍモル）を加えた。次いで、反応混合物のｐＨは２時間にわたって６．２に上昇した。反応混合物を室温に５時間保った後に、粘稠な不溶性ヒドロゲルを形成していた。このヒドロゲルを０．１Ｍ　ＮａＣｌ溶液で洗浄して残留試薬を除いて、その物理的性質を失わなかった。
　例２：本例では、種々のＥＤＣ／ロイシン：ＨＡ比を用いて、ゲルの形成及び性質を比較した。
　ヒアルロン酸ナトリウム（４００ｍｇ；カルボキシル基１．０ｍモル）を水１５ｍｌに溶解して用いて、手順を例１の通りにした。次いで、下記の量のＥＤＣ及びロイシンメチルエステルヒドロクロリドを別々の実験で加えた：ＥＤＣ１５３ｍｇ（０．８ｍモル）／ロイシンメチルエステルヒドロクロリド１８２ｍｇ（１．０ｍモル）；ＥＤＣ７６ｍｇ（０．４ｍモル）／ロイシンメチルエステルヒドロクロリド９０ｍｇ（０．５ｍモル）；ＥＤＣ３８ｍｇ（０．２ｍモル）／ロイシンメチルエステルヒドロクロリド４５ｍｇ（０．２５ｍモル）。例１の通りにＥＤＣ及びロイシンメチルエステルヒドロクロリドの比が最も高い場合に、強いヒドロゲルが得られた。反応体の比が最も低い場合（０．２ｍモル／ＨＡカルボキシル基０．２５〜１．０ｍモル）、弱いゲルが得られ、これは２週間後につぶれて流体になった。
　例３：本例では、ＨＡ濃度を半分減らして生成するゲルの性質を比較した。
　手順は例１の通りにしたが、ＨＡ（４００ｍｇ；カルボキシル基１．０ｍモル）を水１５ｍｌよりもむしろ３０ｍｌに溶解した（１−１／３％Ｗ／Ｗ　ＨＡ）。ヒドロゲルが形成されたが、例１で得られたものよりも弱かった。
　例４：本例では、ＥＤＣを活性化剤として及びロイシンメチルエステルヒドロクロリドを求核性試薬として用いて、フィルムを作製した。
　ヒアルロン酸ナトリウム（４００ｍｇ；カルボキシル基１．０ｍモル）を蒸留水１０ｍｌに溶解した。溶液のｐＨを、０．１Ｎ　ＨＣｌを添加してｐＨ４．７５に調整した。次いで、ＥＤＣ（３１４ｍｇ；１．６４ｍモル）を単一部分で加えた後に、Ｌ−ロイシンメチルエステルヒドロクロリド１９０ｍｇ（１．０５ｍモル）を加えた。反応混合物のｐＨは２時間の間に６．２に上昇し、その時間の後に溶液を面積６３６０ｍｍ２のペトリ皿に注ぎ、２日の期間にわたって乾燥させてフィルムにした。このようにして作ったフィルムは強く、水及び１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液に不溶性であった。フィルムを例１０通りにして水成はＮａＣｌ水溶液で洗浄して残留試薬を除いて、それらの物理的性質を失わなかった。かかるフィルムの赤外分光分析は約２１３０ｃｍ−１におけるカルボジイミド吸収を示さず、約１７４０ｃｍ−１、１７００ｃｍ−１、１６５０ｃｍ−１及び１５５０ｃｍ−１における吸収を示した。
　例５：本例では、フィルムを作るのに種々のＨＡ濃度を用いて生成するフィルムの性質を比較した。
　ＨＡ（４００ｍｇ；カルボキシル基１．０ｍモル）を蒸留水３０ｍｌ、４０ｍｌ或は１００ｍｌに溶解して作った３つの異なる初期ＨＡ濃度を用いて、例４に記載する手順を繰り返した。これらの初期濃度のＨＡの各々を用いて作ったフィルムは強くかつ水及び１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液に不溶性であった、このことはＨＡを濃度範囲で用い得ることを示す。これらのフィルムの各々を、その物理的性質を失わないで、水或はＮａＣｌ水溶液で洗うことができた。
　例６：本例は、反応混合物を透析した後にキャストしてフィルムを形成する効果を、フィルムを形成した後に洗浄するのと比較して示す。
　ヒアルロン酸ナトリウム（４０ｍｌの水中４００ｍｇ）と、ＥＤＣ（３１４ｍｇ；１．６４ｍモル）と、Ｌ−ロイシンメチルエステルヒドロクロリド（１９０ｍｇ；１．０５ｍモル）とを例４の通りにして反応させた。反応が完了した（２時間）際に、残留試薬を除くために、反応混合物を１２．０００ＮＭＷカットオフ透析チュービングに通して、水に対して透析した。透析した混合物を、次いで、例４の通りにしてフィルムとしてキャストした。そのようにして得たフィルムは強くかつ水或は１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液に不溶性であった。
　例７：本例では、フィルムを一層厚く注いだ反応混合物を乾燥して形成して、混合物を異なる表面積／容積で乾燥させて作るフィルムの性質を比較した。
　例４の通りにして得た反応混合物（反応容積４００ｍｌ）を小さいペトリ皿（面積３３３０ｍｍ２）にキャストした。そのようにして得たフィルムは１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液及び水に不溶性であった（１００℃；１時間）。
　例８：本例では、他のアミノ酸エステル及びＨＡをＥＤＣで活性にして用いて、フィルムを作製した。
　ＨＡの溶液（Ｈ２Ｏ　４０ｍｌ中４００ｍｇ）を、０．１ＮＨＣｌを用いてｐＨ４．７にもたらした。次いで、ＥＤＣ（３１４ｍｇ；１．６ｍモル）を一度に全部加えた後に、アミノ酸誘導体１ｍモルを加えた。反応混合物をペトリ皿に注いで乾燥させた。Ｌ−バリンメチルエステルヒドロクロリド、Ｌ−イソロイシンメチルエステルヒドロクロリド、Ｌ−プロリンメチルエステルヒドロクロリド及びＬ−フェニルアラニンメチルエステルヒドロクロリドから不溶性フィルムが得られた。
　例９：本例では、単純な第一アミン（アニリン）を求核性試薬として用いてフィルムを作製した。
　ＨＡの溶液（Ｈ２Ｏ　４０ｍｌ中４００ｍｇ）を、０．１ＮＨＣｌを用いてｐＨ４．７にもたらした。次いで、ＥＤＣ（３１４ｍｇ；１．６ｍモル）を一度に全部加えた後に、アニリン１ｍモルを加えた。反応混合物をペトリ皿に注いで乾燥させて不溶性フィルムが得られた。
　例１０：本例では、他のロイシンのエステルを用いてフィルムを作製した。
　ＨＡの溶液（Ｈ２Ｏ　４０ｍｌ中４００ｍｇ）を、０．１ＮＨＣｌを用いてｐＨ４．７にもたらした。次いで、ＥＤＣ（３１４ｍｇ；１．６ｍモル）を一度に全部加えた後に、ロイシンエステル１ｍモルを加えた。反応混合物をペトリ皿に注いで乾燥させた。Ｌ−ロイシンエチルエステルヒドロクロリド及びＬ−ロイシンｔ−ブチルエステルヒドロクロリドの両方から不溶性フィルムが得られた。
　例１１：本例では、他のアミノ酸メチルエステルを用いてゲルを作製した。
　ＨＡの溶液（Ｈ２Ｏ　１５ｍｌ中４００ｍｇ）を、ｐＨ４．７にもたらし、ＥＤＣ（３１４ｍｇ；１．６ｍモル）を加えた後に、アミノ酸誘導体（１ｍモル）を加えた。反応混合物は５〜２４時間以内に濃厚ゲルを形成した。Ｌ−バリンメチルエステルヒドロクロリド、Ｌ−イソロイシンメチルエステルヒドロクロリド、Ｌ−アルギニンメチルエステルヒドロクロリド、Ｌ−プロリンメチルエステルヒドロクロリド及びＬ−ヒスチジニンメチルエステルヒドロクロリドを用いて、水不溶性ゲルが得られた。
　例１２：本例では、アミノ酸アミド（ロイシンアミド）を求核性試薬として用いてフィルムを作製した。
　ＨＡの溶液（Ｈ２Ｏ　４０ｍｌ中４００ｍｇ）を、０．１ＮＨＣｌを用いてｐＨ４．７にもたらした。次いで、ＥＤＣ（３１４ｍｇ；１．６ｍモル）を一度に全部加えた後に、Ｌ−ロイシンアミドヒドロクロリド１ｍモルを加えた。反応混合物をペトリ皿に注いで乾燥させて、不溶性フィルムが得られた。
　例１３：本例では、ロイシンエチルエステルヒドロクロリドを使用してゲルを作製した。
　ＨＡの溶液（Ｈ２Ｏ　１５ｍｌ中４００ｍｇ）を、ｐＨ４．７にもたらし、ＥＤＣ（３１４ｍｇ；１．６ｍモル）を加えた後に、ロイシンエチルエステルヒドロクロリド（１．０ｍモル）を加えた。混合物は、５〜２４時間以内で濃い水不溶性ゲルを形成した。
　例１４：本例では、ＥＴＣをＨＡ活性化剤として用いて、フィルム及びゲルを作製した。
　分子量１×１０６〜２×１０６ダルトンの範囲を有するヒアルロン酸ナトリウム（４００ｍｇ；カルボキシル基１．０ｍモル）を水（１０ｍｌ及び３０ｍｌ）に溶解した。各々の水溶液のｐＨを、０．１Ｎ　ＨＣｌを添加してｐＨ４．７５に調整した。次いで、ＥＴＣ４７５ｍｇ（１．６ｍモル）を一度に全部加えた後に、Ｌ−ロイシンメチルエステルヒドロクロリド１９０ｍｇ（１．０５ｍモル）を加えた。この反応混合物のｐＨは次の２時間にわたってｐＨ６．２に上昇した。水１０ｍｌを含有する反応混合物は不溶性ゲルを形成した。水３０ｍｌを含有する反応混合物は、乾燥した後に不溶性フィルムとなった。
　例１５：本例は着色フィルムの製造を例示する。
　ＨＡの溶液（Ｈ２Ｏ　３０ｍｌ中４００ｍｇ）を例１３の通りにしてｐＨ４．７５にもたらし、次いで、ＥＴＣ（４７５ｍｇ；１．６ｍモル）及びロイシンメチルエステルヒドロクロリド（１９０ｍｇ；１．０５ｍモル）を加えた。次いで、Ｈ２Ｏ（０．５ｍｌ）に溶解した「Ｓｅｒｖａ　Ｂｌｕｅ」（５ｍｇ／ｍｌ）染料の希薄溶液を反応混合物に加えた。生成した混合物をペトリ皿に注いで、１６時間後に、水不溶性青色フィルムが得られた。フィルムを１Ｍ　ＮａＣｌ、次いでＨ２Ｏで洗浄した際に、フィルムは青色を保持した。
　例１６：本例は化学的に改質したＨＡのフィルムの組織バイオ適合性を例示する。
　例４に記載する手順に従って作製したフィルムの４つのストリップ及び２つのＵＳＰネガチブ対照ストリップをホワイトニュージランドウサギ（試験当り２匹）の脊椎傍筋肉に外科手術により移植した。試験部位を７２時間後に肉眼により或は７日後に完全な組織病理学によるかのいずれかで評価した。ＵＳＰ　ＸＸＩ．１２３７頁に従って、試験物質はＵＳＰインプランテーションテストフォージイバルエーション　オブ　プラスチック　マテリアルズの要件を満足した。
　
用　途
　発明のフィルム或はゲルは、例えばＤｅ　Ｂｅｌｄｅｒ等のＰＣＴ公表第ＷＯ　８６／００９１２号に記載されている通りにして、外科分野において知られている手順に従って、手術後或は治癒する期間の間、体組織が癒着或は付着しないようにさせる外科用エイドとして使用することができる。外科手術の間離したままにするつもりの組織の間或は中に、ゲル或はフィルムを適した通りに１片或はそれ以上挿入或は注入する。
　発明のフィルム或はゲルは、また、持放薬剤送達用にも用いることができる。送達させる薬剤を、例えば、ニューヨーク、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　Ｉｎｃ．，Ｔ．Ｊ．Ｒｏｓｅｍａｎ等、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９８３年、６章、１０７〜１０９頁にＲ．Ｖ．Ｓｐａｒｅｒ等が記載する通りに、ゲル或はフィルムに共有結合させることができる。次いで、ゲル或はフィルムを、送達を望む場所に移植或は注入することができる。
（５７）【特許請求の範囲】
１．ＨＡを濃度０．４〜２．６％Ｗ／Ｗの範囲で含む水性混合物を供し、
　該ＨＡを活性化剤で活性にして活性化されたＨＡを形成し、
　該活性化されたＨＡを求核性試薬と、
水溶液中で、実質的に架橋を含まない
ことを含む
実質的に架橋を含まない
であって、
ここに、「水不溶性」は、このゲルから形成された３ｃｍ×３ｃｍ×０．３ｍｍのフィルムが、５０ｍｌの２０℃の蒸留水を含むビーカー中に置いた場合に２０分後に構造が完全であり、フィルムは膨潤されるがフィルムの境界及びエッジが２４時間の後に依然存在することを意味する当該製造方法
２．前記活性化が
　前記ＨＡを含む水性混合物を供し、
　該水性混合物のｐＨを、酸を添加して４．０〜５．０に下げ、次いで、
　該水性混合物に前記活性化剤を接触させる
ことを含む請求項１に記載の方法。
３．前記ＨＡ及び前記活性化剤が活性化する間、活性化剤少なくとも０．２モル当量対ＨＡのグルクロン酸残基１モル当量のモル比で存在する請求項１に記載の方法。
４．前記活性化されたＨＡ及び前記求核性試薬が前記反応工程において、前記求核性試薬少なくとも０．２モル当量対活性化されたＨＡのグルクロン酸残基１モル当量のモル比で存在する請求項１に記載の方法。
５．前記活性化剤がカルボジイミドを含む請求項１に記載の方法。
６．前記求核性試薬がアミノ酸を含む請求項１に記載の方法。
７．前記求核性試薬がアミノ酸塩を含む請求項１に記載の方法。
８．前記求核性試薬がアミノ酸エステルを含む請求項１に記載の方法。
９．前記求核性試薬がアミノ酸アミドを含む請求項１に記載の方法。
１０．前記求核性試薬が一官能価アミンを含む請求項１に記載の方法。
１１．前記活性化及び前記反応が同時に行なわれる請求項１に記載の方法。
１２．更に、検出可能なマーカを混和することを含む請求項１に記載の方法。