(57)【要約】間葉系幹細胞などの細胞を培養するための、任意の血清を含まず、栄養分および増殖因子を含有する、化学的に定められている細胞培養培地の実施形態、ならびに間葉系幹細胞などの細胞集団を多能性表現型を維持しながら増大させるために、細胞培養培地の実施形態を使用する方法、ならびに分化因子を細胞培養培地の実施形態に混合することによって間葉系幹細胞の軟骨形成および骨形成を誘導する方法。本発明の別の広範な目的は、ＭＳＣなどの細胞を、負に荷電したポリスチレンプラスチックの表面などの負に荷電したプラスチック表面上で培養し、表面をフィブロネクチンなどでコーティングするステップを回避する方法であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学的に定められている無血清細胞培養培地であって、
ａ）無血清の基礎培地と、
ｂ）基礎培地補充物質であって、
ｉ）インスリン；
ｉｉ）１つまたは複数のリン脂質増殖因子；および
ｉｉｉ）１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子；
を含む、基礎培地補充物質と
を含む、化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項２】
前記基礎培地が、ある量のＤＭＥＭとある量のＭＣＤＢとを、約０．７５：１．２５ｖ／ｖ〜約１．２５：０．７５ｖ／ｖの範囲内のＤＭＥＭ対ＭＣＤＢ比で含む、請求項１に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項３】
前記ＤＭＥＭ対ＭＣＤＢ比が、約０．７５：１．２５から約０．８５：１．１５、約０．８０：１．２０から約０．９０：１．１０、約０．８５：１．１５から約０．９５：１．０５、約９０：１１０から約１．０５：０．９５、約１．００：１．００から約１．１０：０．９０、約１．０５：０．９５から約１．１５：０．８５、約１．１０：０．９０から約１．２０：０．８０、および約１．１５：０．８５から約１２５：０．７５からなる群より選択される、請求項２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項４】
ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータ１およびＩＧＦ−１からなる群より選択される１つまたは複数の細胞増殖因子をさらに含む、請求項１に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項５】
請求項１に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地であって、前記インスリンが、該化学的に定められている無血清細胞培養培地において、約４ｍｇ／Ｌから約６ｍｇ／Ｌの範囲内の濃度を有する、化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項６】
請求項４に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地であって、前記ｂＦＧＦ、前記ＰＤＧＦ−ｂｂ、前記ＥＧＦ、前記ＴＧＦ−ベータ１および前記ＩＧＦ−１のそれぞれが、該化学的に定められている無血清細胞培養培地において、約１ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有する、化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項７】
請求項６に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地であって、前記ｂＦＧＦ、前記ＰＤＧＦ−ｂｂ、前記ＥＧＦ、前記ＴＧＦ−ベータ１および前記ＩＧＦ−１のそれぞれが、該化学的に定められている無血清細胞培養培地において、約１ｎｇ／ｍＬ〜約４ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ〜約５ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ〜約６ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ〜約７ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ〜約８ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ〜約９ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ〜約１１ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１２ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ〜約１３ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ〜約１４ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ〜約１５ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ〜約１６ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ〜約１７ｎｇ／ｍＬ、約１６ｎｇ／ｍＬ〜約１８ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬ、および約１９ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬからなる群より選択される範囲内の濃度を有する、化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項８】
前記１つまたは複数の脂質増殖因子が、ＬＰＡおよびＳ１Ｐからなる群より選択される、請求項２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項９】
前記１つまたは複数の脂質増殖因子が、前記基礎培地において、約１００ｎＭから約２００ｎＭの範囲内の濃度を有する、請求項８に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項１０】
前記１つまたは複数の脂質増殖因子が、前記基礎培地において、約１００ｎＭから約１２０ｎＭ、約１１０ｎＭから約１３０ｎＭ、約１２０ｎＭから約１４０ｎＭ、約１３０ｎＭから約１５０ｎＭ、約１４０ｎＭから約１６０ｎＭ、約１５０ｎＭから約１７０ｎＭ、約１６０ｎＭから約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭから約２００ｎＭからなる群より選択される濃度を有する、請求項９に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項１１】
前記１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子が、ヒトＷＮＴ３ＡおよびＲＳＰＯ１からなる群より選択される、請求項２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項１２】
前記１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子が、前記基礎培地において、約２０ｎｇ／ｍＬから約２００ｎｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有する、請求項１１に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項１３】
前記１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子が、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度を有するヒトＷＮＴ３Ａと、約４０ｎｇ／ｍＬの濃度を有するＲＳＰＯ１との組み合わせを含む、請求項１２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項１４】
１つまたは複数のステロイドをさらに含む、請求項２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項１５】
前記１つまたは複数のステロイドが、デキサメタゾンおよびヒドロコルチゾンからなる群より選択される、請求項１４に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項１６】
前記１つまたは複数のステロイドが、約２．０μｇ／ｍＬから約５．０μｇ／ｍＬの濃度を有するデキサメタゾンと、約０．５ｍｇ／ｍＬから約１．５ｍｇ／ｍＬの濃度を有するヒドロコルチゾンとの組み合わせを含む、請求項１４に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項１７】
調節性鉄供給源をさらに含む、請求項２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項１８】
前記調節性鉄供給源が、ある量のトランスフェリンを含み、該ある量のトランスフェリンが、前記基礎培地において、約２ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの範囲内の濃度を有する、請求項１７に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項１９】
トランスフェリンの濃度が、約２ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌから約６ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌから約７ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌから約８ｍｇ／Ｌ、約７ｍｇ／Ｌから約９ｍｇ／Ｌ、約８ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌからなる群より選択される、請求項１８に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項２０】
電子伝達活性化因子をさらに含む、請求項２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項２１】
前記電子伝達活性化因子が、ある量のセレン、およびある量の亜セレン酸からなる群より選択される、請求項２０に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項２２】
ある量のＨＳＡをさらに含む、請求項２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項２３】
前記ある量のＨＳＡが、前記基礎培地において、約１００μｇ／ｍＬから約３５０μｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有する、請求項２２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項２４】
前記ある量のＨＳＡが、ある量の組換えＨＳＡを含む、請求項２３に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項２５】
１つまたは複数の抗酸化剤をさらに含む、請求項２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項２６】
前記抗酸化剤が、酢酸α−トコフェロールおよびアスコルビン酸−２−リン酸からなる群より選択される、請求項２５に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項２７】
約０．００１ｇ／Ｌから約０．００３ｇ／Ｌの範囲内の量の５−ヒドロキシトリプタミンをさらに含む、請求項２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項２８】
バッファーをさらに含む、請求項２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項２９】
前記バッファーが、約３．２ｇ／Ｌから約４．２ｇ／Ｌの範囲内の量の炭酸水素ナトリウムを含む、請求項２５に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項３０】
請求項２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地であって、該化学的に定められている無血清細胞培養培地において培養された間葉系幹細胞から軟骨細胞を誘導するために十分な量のＴＧＦＢ１をさらに含む、化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項３１】
請求項２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地であって、該化学的に定められている無血清細胞培養培地において培養された間葉系幹細胞から軟骨細胞を誘導するために十分な量のＢＭＰ２をさらに含む、化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項３２】
前記基礎培地が、
ａ）約０．５Ｌ／Ｌの量のＭＣＤＢ２０１、
ｂ）約０．５Ｌ／Ｌの量のＤＭＥＭ、
ｃ）約３．７ｇ／Ｌの量の炭酸水素ナトリウム、
ｄ）約０．２５ｇ／Ｌの量の組換えヒト血清アルブミン、
ｅ）約０．００５ｇ／Ｌの量のトランスフェリン、
ｆ）約０．００５ｇ／Ｌの量のインスリン、
ｇ）約０．０００００３７ｇ／Ｌの量の亜セレン酸、
ｈ）約０．０３２２０５ｇ／Ｌの量のアスコルビン酸−２−リン酸、
ｉ）約０．００２１２７ｇ／Ｌの量の５−ヒドロキシトリプタミン、
ｊ）約０．０００００３９２５ｇ／Ｌの量のデキサメタゾン、
ｋ）約０．００１ｇ／Ｌの量のヒドロコルチゾン、および
ｌ）約０．０００２ｇ／Ｌの量の酢酸α−トコフェロール
からなる、請求項１に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項３３】
前記基礎培地補充物質が、
ａ）約１０ｎｇ／ｍＬの量のＰＤＧＦ−ｂｂ、
ｂ）約１０ｎｇ／ｍＬの量のｂＦＧＦ（１５５ａａ）、
ｃ）約２０ｎｇ／ｍＬの量のＥＧＦ、
ｄ）約５ｎｇ／ｍＬの量のＩＧＦ１、
ｅ）約１００ｎＭの量のＬＰＡ、
ｆ）約１５０ｎＭの量のＳ１Ｐ、
ｇ）約２０ｎｇ／ｍＬの量のＷＮＴ３Ａ、および
ｈ）約４０ｎｇ／ｍＬの量のＲＳＰＯ１
からなる、請求項３２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項３４】
前記基礎培地補充物質が、さらに、ある量のＴＧＦＢ１からなる、請求項３３に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項３５】
前記基礎培地補充物質が、さらに、ある量のＢＭＰ２からなる、請求項３３に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項３６】
化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法であって、
ａ）無血清の基礎培地を準備するステップと；
ｂ）該基礎培地が、さらに、
ｉ）インスリン；
ｉｉ）１つまたは複数のリン脂質増殖因子；および
ｉｉｉ）１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子
を含むように、該基礎培地に補充するステップと
を含む、方法。
【請求項３７】
基礎培地を準備する前記ステップが、ある量のＤＭＥＭとある量のＭＣＤＢとを、約０．７５：１．２５ｖ／ｖ〜約１．２５：０．７５ｖ／ｖの範囲内のＤＭＥＭ対ＭＣＤＢ比で組み合わせるステップを含む、請求項３６に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項３８】
前記基礎培地に補充する前記ステップが、該基礎培地に、
ａ）インスリンに加えて、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータ１およびＩＧＦ−１からなる群より選択される１つまたは複数の増殖因子；
ｂ）ＬＰＡおよびＳ１Ｐからなる群より選択される１つまたは複数の脂質増殖因子；および
ｃ）ヒトＷＮＴ３Ａタンパク質、およびＲＳＰＯ１からなる群より選択される１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子
を混合するステップを含む、請求項３７に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項３９】
前記基礎培地に、デキサメタゾンおよびヒドロコルチゾンからなる群より選択される１つまたは複数のステロイドを混合するステップをさらに含む、請求項３６に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項４０】
前記基礎培地に、ある量のトランスフェリンを混合するステップをさらに含む、請求項３９に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項４１】
前記基礎培地に、ある量の亜セレン酸を混合するステップをさらに含む、請求項４０に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項４２】
前記基礎培地に、ある量の５−ヒドロキシトリプタミンを混合するステップをさらに含む、請求項４１に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項４３】
前記基礎培地に、ある量のｒＨＳＡを混合するステップをさらに含む、請求項４２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項４４】
前記基礎培地に、酢酸α−トコフェロールおよびアスコルビン酸−２−リン酸からなる群より選択されるある量の抗酸化剤を混合するステップをさらに含む、請求項４３に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項４５】
ある量の炭酸水素ナトリウムを混合するステップをさらに含む、請求項４４に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項４６】
前記基礎培地にある量のＴＧＦＢ１を補充するステップをさらに含む、請求項３６に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項４７】
前記基礎培地にある量のＢＭＰ２を補充するステップをさらに含む、請求項３６に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項４８】
前記基礎培地が、
ａ）約０．５Ｌ／Ｌの量のＭＣＤＢ２０１、
ｂ）約０．５Ｌ／Ｌの量のＤＭＥＭ、
ｃ）約３．７ｇ／Ｌの量の炭酸水素ナトリウム、
ｄ）約０．２５ｇ／Ｌの量の組換えヒト血清アルブミン、
ｅ）約０．００５ｇ／Ｌの量のトランスフェリン、
ｆ）約０．００５ｇ／Ｌの量のインスリン、
ｇ）約０．０００００３７ｇ／Ｌの量の亜セレン酸、
ｈ）約０．０３２２０５ｇ／Ｌの量のアスコルビン酸−２−リン酸、
ｉ）約０．００２１２７ｇ／Ｌの量の５−ヒドロキシトリプタミン、
ｊ）約０．０００００３９２５ｇ／Ｌの量のデキサメタゾン、
ｋ）約０．００１ｇ／Ｌの量のヒドロコルチゾン、および
ｌ）約０．０００２ｇ／Ｌの量の酢酸α−トコフェロール
からなる、請求項３６に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項４９】
前記基礎培地補充物質が、
ａ）約１０ｎｇ／ｍＬの量のＰＤＧＦ−ｂｂ、
ｂ）約１０ｎｇ／ｍＬの量のＢＦＧＦ１５５ａａ、
ｃ）約２０ｎｇ／ｍＬの量のＥＧＦ、
ｄ）約５ｎｇ／ｍＬの量のＩＧＦ１、
ｅ）約１００ｎＭの量のリゾホスファチジン酸、
ｆ）約１５０ｎＭの量のスフィンゴシン１−リン酸、
ｇ）約２０ｎｇ／ｍＬの量のＷＮＴ−３ａ、および
ｈ）約４０ｎｇ／ｍＬの量のＲスポンジン−１
からなる、請求項４８に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項５０】
前記基礎培地補充物質が、さらに、ある量のＴＧＦＢ１からなる、請求項４４に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項５１】
前記基礎培地補充物質が、さらに、ある量のＢＭＰからなる、請求項４４に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項５２】
細胞培養の方法であって、該方法は、細胞培養培地を使用して、間葉系幹細胞集団をｅｘ−ｖｉｖｏで増大させるステップを含み、該細胞培養培地は、
ａ）無血清の基礎培地と、
ｂ）基礎培地補充物質であって、
ｉ）１つまたは複数の細胞増殖因子；
ｉｉ）１つまたは複数のリン脂質増殖因子；および
ｉｉｉ）１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子；
を含む、基礎培地補充物質と
を含む、方法。
【請求項５３】
臍帯血、骨髄、臍帯マトリックス、および脂肪組織からなる群より選択される供給源から前記間葉系幹細胞集団を得るステップをさらに含む、請求項５２に記載の細胞培養の方法。
【請求項５４】
ｅｘ−ｖｉｖｏで増大させるために、血清に事前に曝露されていない間葉系幹細胞集団を得るステップをさらに含む、請求項５２に記載の細胞培養の方法。
【請求項５５】
ｅｘ−ｖｉｖｏで増大させることにより、血清に事前に曝露されていない間葉系幹細胞集団を生成するステップをさらに含む、請求項５２に記載の細胞培養の方法。
【請求項５６】
前記間葉系幹細胞集団から軟骨細胞集団を誘導するステップをさらに含む、請求項５２または５５のいずれか一項に記載の細胞培養の方法。
【請求項５７】
前記細胞培養培地にある量のＴＧＦＢ１を補充するステップをさらに含み、前記１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子がヒトＷＮＴ３Ａからなる、請求項５６に記載の細胞培養の方法。
【請求項５８】
前記間葉系幹細胞集団から骨細胞集団を誘導するステップをさらに含む、請求項５２または５５のいずれか一項に記載の細胞培養の方法。
【請求項５９】
前記細胞培養培地にある量のＢＭＰ２を補充するステップをさらに含み、前記１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子がヒトＷＮＴ−３ａタンパク質からなる、請求項５８に記載の細胞培養の方法。
【請求項６０】
コーティングしていない培養フラスコ内で前記間葉系幹細胞集団を増大させるステップをさらに含む、請求項５２または５５のいずれか一項に記載の細胞培養の方法。
【請求項６１】
ａ）細胞培養培地を使用して、ｅｘ−ｖｉｖｏで増大させた間葉系幹細胞集団を得るステップであって、該細胞培養培地は、
ｉ）無血清の基礎培地と、
ｉｉ）基礎培地補充物質であって、
−１つまたは複数の細胞増殖因子；
−１つまたは複数のリン脂質増殖因子；および
−１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子；
を含む、基礎培地補充物質と
を含む、ステップと、
ｂ）個体に治療有効量の該間葉系幹細胞集団を投与するステップと
を含む、処置の方法。
【請求項６２】
間葉系幹細胞集団を得る前記ステップが、請求項１に記載の細胞培養培地を使用して、ｅｘ−ｖｉｖｏで増大させた間葉系幹細胞集団から誘導された軟骨細胞集団を得るステップを含み、個体に治療有効量の該間葉系幹細胞集団を投与する前記ステップが、個体に治療有効量の該軟骨細胞集団の集団を投与するステップを含む、請求項６１に記載の処置の方法。
【請求項６３】
前記治療有効量の前記軟骨細胞集団が、骨を再構成するために十分な量の該軟骨細胞集団の集団を含む、請求項６２に記載の処置の方法。
【請求項６４】
間葉系幹細胞集団を得る前記ステップが、請求項１に記載の細胞培養培地を使用して、ｅｘ−ｖｉｖｏで増大させた間葉系幹細胞集団から誘導された骨細胞集団を得るステップを含み、個体に治療有効量の該間葉系幹細胞集団を投与する前記ステップが、個体に治療有効量の該骨細胞集団の集団を投与するステップを含む、請求項６１に記載の処置の方法。
【請求項６５】
前記治療有効量の前記骨細胞集団が、軟骨組織を再構成するために十分な量の該骨細胞集団の集団を含む、請求項６４に記載の処置の方法。
【請求項６６】
請求項１、３２、３３、３４、または３５のいずれか一項に記載の無血清細胞培養培地を含む細胞培養のためのキット。
【請求項６７】
ヒト間葉系幹細胞の無血清細胞培養の方法において使用するための、請求項１、３２、３３、３４、または３５のいずれか一項に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項６８】
実質的に本明細書において開示されている任意の実施形態を参照して記載されている、請求項１に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項６９】
添付図に示されている任意の実施形態を参照して本明細書において記載されている、化学的に定められている無血清細胞培養培地。
【請求項７０】
実質的に本明細書において開示されている任意の実施形態を参照して記載されている、化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項７１】
添付図に示されている任意の実施形態を参照して本明細書において記載されている、化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
【請求項７２】
実質的に本明細書において開示されている任意の実施形態を参照して記載されている、請求項６１に記載の処置の方法。
【請求項７３】
本明細書において記載または特許請求されている任意の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
国際特許協力条約に基づく本特許出願は、米国仮特許出願第６１／３９７，８４７号（２０１０年６月１７日）の利益を主張し、上記米国仮特許出願は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
概して、細胞を培養するための化学的に定められている無血清細胞培養培地である。詳細には、間葉系幹細胞を、軟骨細胞および骨細胞が誘導され得る多能性表現型を維持しながら増大させること（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を可能にする、間葉系幹細胞を培養するための化学的に定められている無血清細胞培養培地、およびそのような増大し、分化した間葉系幹細胞集団を治療量で投与することが有益である障害を処置するために、増大した間葉系幹細胞集団のそのような集団を使用する方法である。
【背景技術】
【０００３】
骨および軟骨の移植は、形成手術、外傷性外科手術における、または腫瘍性病変除去後における、骨および軟骨のセグメントの再構築において実施される。現在、この目的のために、自己の供給源由来、または生きているドナーもしくは死去したドナー由来のヒト組織が使用されている。幹細胞の研究が進むにつれて、間葉系幹細胞から誘導される骨細胞および軟骨細胞が、骨格修復のための細胞の供給源になりつつある。
【０００４】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄、血液、真皮および骨膜などの体の特定の組織において見いだすことができる。間葉系幹細胞は、他の細胞型に分化する能力を保有し、したがって、傷害を受けた後の組織の治癒に寄与し得る。ＭＳＣは、骨髄から単離し、精製し、ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおいて培養することにより増大させることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在、ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおけるＭＳＣの増大は、ウシ胎仔血清（以下「ＦＢＳ」）、またはヒト自己血清、もしくは実質的に類似した血清もしくは等しい血清（「血清」とも称される）を補充した培地中で起こる。しかし、ＭＳＣ培養物中に動物血清またはヒト血清が存在することには、これらの培養物を処置に応用する可能性を考慮すると特定の不都合および制限がある。第１に、ウシ血清、ヒト血清、または他の動物血清は、血液由来の病原体、例えばウイルスおよび狂牛病のプリオン、牛海綿状脳症（「ＢＳＥ」）などを含有し得る。第２に、ウシ血清は、レシピエント患者における免疫応答を引き起こし得る、生体異物タンパク質に対する抗体生成を引き起こす。第３に、ウシ血清はロット間の変動を示し、それにより性能が一貫しない可能性がある。
【０００６】
本発明の細胞培養培地および本発明の細胞培養培地を利用する方法により、ＭＳＣを含めた細胞の増大がもたらされ、さらに培養物中のＭＳＣの分化がもたらされると仮定すると、ＭＳＣ（および他の細胞）を培養するために、化学的に定められている物質のみを含有し、血清および生体異物を含まない細胞培養培地が非常に望ましい場合があることが明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明の広範な目的は、細胞培養のための本発明の化学的に定められている無血清培地（「無血清培地」とも称される）の１つまたは複数の実施形態、およびこれらに限定されないが、ヒトＭＳＣ（「ｈＭＳＣ」）を含めたＭＳＣの集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増大させるための本発明の無血清培地の特定の非限定的な実施形態を提供することであり得る。
【０００８】
本発明の別の広範な目的は、ｅｘ−ｖｉｖｏ、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ細胞培養物、および具体的には、ウシ胎仔血清、自己血清、または他の動物血清などの任意の血清を含有しないＭＳＣのｉｎ−ｖｉｔｒｏ培養物において、ＭＳＣの生存能力、増殖および分化を支持することができる化学成分の組み合わせを含有する無血清培地の実施形態を提供することであり得る。さらに、本発明の培地の実施形態を利用して、従来の血清を含有する細胞培養培地と比較して実質的に同様である、またはそれよりも大きい有効性または結果を伴って、ＭＳＣの生存能力、増殖および分化を支持することができる。
【０００９】
本発明の別の広範な目的は、ＭＳＣ、具体的にはヒトＭＳＣなどの細胞を本発明の培地中で培養し、ＭＳＣ集団を増大させ、ＭＳＣを分化させて軟骨細胞または骨細胞を生じさせる方法であり得る。
【００１０】
本発明の別の広範な目的は、ＭＳＣなどの細胞を、負に荷電したポリスチレンプラスチックの表面などの負に荷電したプラスチック表面上で培養し、表面をフィブロネクチンなどでコーティングするステップを回避する方法であり得る。
【００１１】
当然ながら、本明細書の他の箇所、図、写真、および特許請求の範囲全体を通して本発明の別の目的が開示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、１０％のＦＢＳを含有する従来の培地中で培養したｈＭＳＣと本発明の無血清培地の特定の実施形態において培養したｈＭＳＣの間で細胞培養物の形態を比較した画像を提供する。
【図２】図２は、１０％のＦＢＳを含有する従来の培地中で培養したｈＭＳＣの増殖速度と本発明の無血清培地の特定の実施形態において培養したｈＭＳＣの増殖速度を比較した、日数に対する細胞数のグラフである。
【図３】図３は、１０％のＦＢＳを含有する従来の培地から、本発明の無血清培地の特定の実施形態または１０％のＦＢＳを含有する従来の培地のいずれかへの出発時の継代数が４である場合の、各分割におけるｈＭＳＣの総数を比較した、継代数に対する細胞数のグラフである。
【図４】図４は、本発明の無血清培地の特定の実施形態において培養したｈＭＳＣと、１０％のＦＢＳを含有する従来の培地中で培養したｈＭＳＣとでコロニー形成能を比較した画像を提供する。
【図５】図５は、本発明の無血清培地の特定の実施形態において長期培養した後のｈＭＳＣと、１０％のＦＢＳを含有する従来の培地中で培養したｈＭＳＣとで多系列分化能を比較した画像を提供する。
【図６】図６は、本発明の無血清培地の特定の実施形態におけるｈＭＳＣの増殖速度が、培養容器にプレートコーティングを使用しても、使用しなくても同様であることを示す、継代数に対する細胞数のグラフである。
【図７】図７は、１０％のＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充した基礎培地のある実施形態において培養した臍帯血由来ＭＳＣと、本発明の無血清培地の特定の実施形態において培養した臍帯血由来ＭＳＣとで増殖速度を比較した、継代数に対する細胞数のグラフである。
【図８】図８は、１０％のＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充した基礎培地中で培養した脂肪組織由来ＭＳＣと、本発明の無血清培地の特定の実施形態において培養した脂肪組織由来ＭＳＣとで増殖速度を比較した、継代数に対する細胞数のグラフである。
【図９】図９は、本発明の無血清培地の特定の実施形態におけるｈＭＳＣの培養に利用した培養フラスコの種類に対する総細胞数の棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
細胞を培養するための化学的に定められている無血清細胞培養培地である。詳細には、間葉系幹細胞から軟骨細胞および骨細胞が誘導され得る多能性表現型を維持しながら、ｅｘ−ｖｉｖｏで単核細胞を増大させるために使用することができる、間葉系幹細胞を培養するための化学的に定められている無血清細胞培養培地である。ｉｎ−ｖｉｔｒｏで増大させた間葉系幹細胞集団から軟骨細胞および骨細胞を分化させるため、ならびに誘導された軟骨細胞または骨細胞集団が有益である、骨および軟骨の障害を処置するための、化学的に定められている無血清細胞培養培地の使用方法である。
【００１４】
本発明の目的に関して、「無血清（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ）」という用語は、これらに限定されないが、ウシ胎仔血清、仔ウシ血清、ヒト血清など、またはそれらの組み合わせが存在しないことを含めた、任意の種の任意の血清が存在しないことを意味する。
【００１５】
本発明の目的に関して、本明細書における数値は全て、明示されていようがいまいが、「約」という用語で修飾されているものとする。本発明の目的に関して、範囲は、「約」１つの特定の値から「約」別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲が表されている場合、別の実施形態は、１つの特定の値から他の特定の値までを包含する。終点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される数値の全てを包含する。１〜５の数値範囲は、例えば、数値１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む。さらに、範囲のそれぞれについての終点は、他の終点との関連においても、他の終点とは独立しても、有意であることも理解されよう。値が、先行詞「約」を用いることによって近似で表されている場合、特定の値は別の実施形態を形成することが理解されよう。
【００１６】
本発明の目的に関して、「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」または「組み合わせること（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）」という用語は、２種以上の材料を一緒にする任意の方法を指す。そのような方法としては、これらに限定されないが、混合すること（ｍｉｘｉｎｇ）、ブレンドすること、混合すること（ｃｏｍｍｉｎｇｌｉｎｇ）、調合すること（ｃｏｎｃｏｃｔｉｎｇ）、ホモジナイズすること、組み入れること、混ぜ合わせること（ｉｎｔｅｒｍｉｎｇｌｉｎｇ）、撹拌することなどが挙げられる。
【００１７】
本発明の目的に関して、「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」実体という用語は、１つまたは複数のその実体を指し、例えば、「ａ（１つの）タンパク質」または「ａ（１つの）ペプチド」とは、１つまたは複数のこれらの化合物、または少なくとも１つの化合物を指す。そのように、「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」、「１つまたは複数の」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。さらに、「〜からなる群より選択される」化合物とは、その後の一覧中の１つまたは複数の化合物を指し、該化合物の２つ以上の組み合わせを含む。本発明によると、単離された化合物とは、その天然の環境から取り出された化合物である。そのように、「単離された」とは、化合物が精製されている程度を必ずしも反映しない。本発明の単離された化合物は、その天然の供給源から得ることができ、分子生物学技法を用いて作製することができ、または、化学合成によって作製することができる。
【００１８】
さらに、本発明の実施形態の特定の構成成分または要素の特定の供給源および構成成分または要素の特定の製品番号が記載されているが、本発明はそのように限定されず、本発明の実施形態において使用するために適した同じ、等しいまたは実質的に類似した構成成分または要素を、多数の多種多様の供給源から得ることができる。
【００１９】
本発明の最良の形態を含めた本発明の培地の実施形態により、無血清基礎培地（「基礎培地」とも称される）を提供することができる。無血清基礎培地は、ダルベッコ改変イーグル培地、または組成が同じである、等しい、または実質的に類似した培地（以下「ＤＭＥＭ」と称される）（本発明の実施形態において使用するための適切なＤＭＥＭは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、５７９１  Ｖａｎ  Ａｌｌｅｎ  Ｗａｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから、液体の形態であるＰＮ１１９６５で、または粉末のＰＮ１２１００として入手し、製造者の説明書に従って調製することができる）と、ＭＣＤＢ２０１培地または組成が同じである、等しい、または実質的に類似した培地（以下「ＭＣＤＢ」と称される）（本発明の実施形態において使用するための適切なＭＣＤＢは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手することができる、ＰＮ  Ｍ６７７０）の混合物を含んでよい。これらの従来の培地のそれぞれは、特定の添加された構成成分、例えば、グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、フェノールレッド、グルコースなどと一緒に利用することもでき、また、特定の構成成分、例えば、メチオニン、シスチン、またはカルシウムなどを伴わずに利用することもでき、そのような培地のそれぞれを、適用に応じて、基礎培地の特定の実施形態において利用することができる。
【００２０】
基礎培地の特定の実施形態は、ＤＭＥＭとＭＣＤＢとを、約０．７５：１．２５〜約１．２５：０．７５の範囲のＤＭＥＭ：ＭＣＤＢ比（ｖ／ｖ）で組み合わせて含んでよいが、本発明はそのように限定されず、特定の適用において利点をもたらす実施形態は、約０．７５：１．２５から約０．８５：１．１５、約０．８０：１．２０から約０．９０：１．１０、約０．８５：１．１５から約０．９５：１．０５、約９０：１１０から約１．０５：０．９５、約１．００：１．００から約１．１０：０．９０、約１．０５：０．９５から約１．１５：０．８５、約１．１０：０．９０から約１．２０：０．８０、および約１．１５：０．８５から約１．２５：０．７５を含む群から選択される範囲のＤＭＥＭ：ＭＣＤＢ比を使用して調製することができる。間葉系幹細胞（「ＭＳＣ」）、具体的にはヒト間葉系幹細胞（「ｈＭＳＣ」）を培養するための本発明の特定の実施形態に関しては、ＤＭＥＭ：ＭＣＤＢを、約１：１ｖ／ｖのＤＭＥＭ：ＭＣＤＢ比で、適切な結果を伴って利用することができる。
【００２１】
基礎培地の実施形態は、さらに下記されている構成成分のうちの１つまたは複数をさらに含んでよく、その構成成分は、適用に応じて、ＤＭＥＭおよびＭＣＤＢとの組み合わせと、種々の順列、組み合わせ、濃度または量で組み合わせることができる。それぞれの場合において、記載されている範囲または量の中で１つまたは複数の構成成分を用いることができ、適用または構成成分との組み合わせに応じて、任意の特定の構成成分または要素について記載されている範囲の選択された部分を使用して特定の利点を実現することができる。
【００２２】
基礎培地の実施形態は、バッファー、例えば、基礎培地１Ｌ当たり約３．２ｇから約４．２ｇの範囲、また特定の実施形態に関しては、基礎培地１Ｌ当たり約３．７ｇの量の炭酸水素ナトリウムなどをさらに含んでよい。基礎培地のｐＨを、ある量の水酸化ナトリウムを用いて最終的なｐＨ約７．３〜約７．５の範囲、特定の実施形態ではｐＨ約７．４に調整することができる。
【００２３】
基礎培地の実施形態は、培養されている細胞の受容体と結合すると、ある量の鉄を放出する、調節性鉄供給源（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｒｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ）をさらに含んでよい。調節性鉄供給源の非限定的な例は、前記基礎培地中の濃度が約２ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの範囲の量のトランスフェリンであってよい。基礎培地の特定の実施形態に関しては、トランスフェリンの量は、約２ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌから約６ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌから約７ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌから約８ｍｇ／Ｌ、約７ｍｇ／Ｌから約９ｍｇ／Ｌ、および約８ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌを含む群から選択することができる。基礎培地の特定の実施形態は、約５ｍｇ／Ｌの量のトランスフェリンを含んでよい。
【００２４】
基礎培地の実施形態は、電子伝達活性化因子をさらに含んでよい。電子伝達活性化因子は、ある量のセレンまたはある量の亜セレン酸を含んでよいが、本発明は、そのように限定されず、電子伝達を支持するために、他の微量元素、金属酵素またはタンパク質を利用することができる。基礎培地中にある量の亜セレン酸を含む実施形態に関しては、量は、約０．０００００２５ｇ／Ｌから約０．０００００５０ｇ／Ｌの範囲内であり得、特定の実施形態では約０．０００００３７ｇ／Ｌを含む。
【００２５】
基礎培地の実施形態は、１つまたは複数の抗酸化剤をさらに含んでよい。抗酸化剤としては、非限定的な例として、ある量の酢酸α−トコフェロールまたはある量のアスコルビン酸−２−リン酸、またはある量の酢酸α−トコフェロールとアスコルビン酸−２−リン酸の両方を挙げることができる。特定の実施形態は、約０．０００１ｇ／Ｌから約０．０００３ｇ／Ｌの範囲の量の酢酸α−トコフェロール、および約０．０２ｇ／Ｌから約０．０４ｇ／Ｌの範囲の量のアスコルビン酸−２−リン酸を含んでよい。１つの非限定的な例は、約０．０００２ｇ／Ｌの量の酢酸α−トコフェロールおよび約０．０３２２ｇ／Ｌの量のアスコルビン酸−２−リン酸を含む。
【００２６】
基礎培地の実施形態は、１つまたは複数のステロイドをさらに含んでよい。ステロイドとしては、非限定的な例として、ある量のデキサメタゾンまたはある量のヒドロコルチゾン、またはある量のデキサメタゾンとヒドロコルチゾンの両方を挙げることができる。特定の実施形態は、約２．０μｇ／Ｌから約５．０μｇ／Ｌの範囲の量のデキサメタゾンと、約０．５ｍｇ／ｍＬから約１．５ｍｇ／ｍＬの量のヒドロコルチゾンを組み合わせて含み得る。基礎培地の１つの非限定的な例は、約０．０００００４ｇ／Ｌの量のデキサメタゾンと約０．００１ｇ／Ｌの量のヒドロコルチゾンとの組み合わせを含む。
【００２７】
基礎培地の実施形態は、約０．００１ｇ／Ｌから約０．００３ｇ／Ｌの範囲の量の５−ヒドロキシトリプタミンをさらに含んでよい。基礎培地の１つの非限定的な例は、約０．００２ｇ／Ｌの量の５−ヒドロキシトリプタミンを含む。
【００２８】
基礎培地の実施形態は、ある量のヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）（組換えヒト血清アルブミン（「ｒＨＳＡ」）であってよい）をさらに含んでよい。特定の実施形態は、約０．１ｇ／Ｌから約０．３ｇ／Ｌの範囲の量のＨＳＡを含んでよい。基礎培地の１つの非限定的な例は、約０．２５ｇ／Ｌの量のＨＳＡを含む。
【００２９】
ＭＳＣまたはｈＭＳＣを培養するための基礎培地の特定の非限定的な実施形態は、そのそれぞれの最終濃度が表１において詳述されている成分との組み合わせを含んでよい、それから本質的になってよい、または、それからなってよい。
【００３０】
【表１】
2013529917.tif 000002
【００３１】
当然のことながら、基礎培地のこの特定の実施形態は、限定的なものではなく、むしろ、等しいまたは実質的に類似した構成成分を、培養されている特定の細胞、細胞株、ＭＳＣ、またはｈＭＳＣに基づいて濃度を調整して使用して調製することができる多数の多様な実施形態を例示するものである。表１の実施形態ついて列挙されている最終濃度は、ＭＳＣまたはｈＭＳＣの培養において有用な特定の適用に応じて、作製における通常の変動に関連する範囲で絶対値から変動し得る。さらに、本発明の特定の実施形態は、表１に列挙されているよりも少ない構成成分を含んでよく、これらの実施形態は、本発明の外延により包含されるものとする。
【００３２】
本発明の実施形態は、基礎培地と組み合わせることができる基礎培地補充物質をさらに含んでよい（この組み合わせは、「補充された培地」とも称される）。基礎培地補充物質は、１つまたは複数の細胞増殖因子、１つまたは複数のリン脂質増殖因子、および１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子を、種々の順列および組み合わせで含んでよい。当然のことながら、本発明の無血清培地の実施形態は、適用に応じて、１つまたは複数の細胞増殖因子、１つまたは複数のリン脂質増殖因子、または１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子を、種々の組み合わせおよび順列で含んでよいが、含まなければならないわけではない。
【００３３】
したがって、基礎培地補充物質の実施形態は、１つまたは複数の細胞増殖因子、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手することができるインスリン、ＰＮ  Ｉ６６３４（ＣＡＳ番号：１１０７０−７３−８）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手することができる塩基性線維芽細胞増殖因子ヒト（ｂＦＧＦ）、ＰＮ  Ｆ０２９１−２５ＵＧ（ＣＡＳ番号：１０６０９６−９３−９）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手することができる血小板由来の増殖因子ｂｂ（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、ＰＮ  Ｐ３２０１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手することができる上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＰＮ  Ｅ９６４４（ＣＡＳ番号：６２２５３−６３−８）、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手することができるインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）（ＣＡＳ番号：７７３３−２９−１）、ＰＮ  Ｉ８７７９またはＰＮ  Ｉ３７６９などを含んでよい。
【００３４】
基礎培地補充物質の実施形態は、ある量のインスリンを含んでよい。特定の実施形態の濃度は、無血清培地中約０．００４ｇ／Ｌから約０．００６ｇ／Ｌの範囲であってよい。１つの非限定的な例は、約０．００５ｇ／Ｌの量のインスリンを含む。
【００３５】
基礎培地補充物質の実施形態は、ある量のｂＦＧＦを含んでよい。特定の実施形態のｂＦＧＦの濃度は、無血清培地中約５ｎｇ／ｍＬから約２０ｎｇ／ｍＬの範囲であってよい。１つの非限定的な例は、約１０ｎｇ／ｍＬ量のｂＦＧＦを含む。
【００３６】
基礎培地補充物質の実施形態は、ある量のＰＤＧＦ−ｂｂを含んでよい。特定の実施形態のＰＤＧＦ−ｂｂの濃度は、無血清培地中約５ｎｇ／ｍＬから約２０ｎｇ／ｍＬの範囲であってよい。１つの非限定的な例は、無血清培地中約１０ｎｇ／ｍＬの量のＰＤＧＦ−ｂｂを含む。
【００３７】
基礎培地補充物質の実施形態は、ある量のＥＧＦを含んでよい。特定の実施形態のＥＧＦの濃度は、無血清培地中約１５ｎｇ／ｍＬから約２５ｎｇ／ｍＬの範囲であってよい。１つの非限定的な例は、無血清培地中約２０ｎｇ／ｍＬの量のＥＧＦを含む。
【００３８】
基礎培地補充物質の実施形態は、ある量のＩＧＦ−１を含んでよい。特定の実施形態のＩＧＦ−１の濃度は、無血清培地中約２ｎｇ／ｍＬから約１０ｎｇ／ｍＬの範囲であってよい。１つの非限定的な例は、無血清培地中約５ｎｇ／ｍＬの量のＩＧＦ−１を含む。
【００３９】
上記の細胞増殖因子：ＰＤＧＦ−ｂｂ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、およびＩＧＦ−１のそれぞれに関して、無血清培地中、約２ｎｇ／ｍＬ〜約４ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ〜約５ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ〜約６ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ〜約７ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ〜約８ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ〜約９ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ〜約１１ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１２ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ〜約１３ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ〜約１４ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ〜約１５ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ〜約１６ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ〜約１７ｎｇ／ｍＬ、約１６ｎｇ／ｍＬ〜約１８ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬ、および約１９ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬを含む群から選択される濃度が有利であり得る。
【００４０】
基礎培地補充物質の実施形態は、１つまたは複数のリン脂質増殖因子、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手することができるリゾホスファチジン酸（「ＬＰＡ」）（ＣＡＳ番号：２２０２２−８７−５）、ＰＮ  Ｌ７２６０、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手することができるスフィンゴシン１−リン酸（「Ｓ１Ｐ」）（ＣＡＳ番号：２６９９３−３０−６）、ＰＮ  Ｓ９６６６などを含んでよい。特定の実施形態のＬＰＡもしくはＳ１Ｐのそれぞれ、またはＬＰＡとＳ１Ｐの両方の濃度は、無血清培地中約８０ｎＭから約２００ｎＭの範囲であってよい。１つの非限定的な例は、無血清培地中約１００ｎＭの量のＬＰＡと無血清培地中約１５０ｎＭの量のＳ１Ｐとの組み合わせを含む。
【００４１】
上記のリン脂質増殖因子のそれぞれに関して、無血清培地中、約８０ｎＭから約１００ｎＭ、約９０ｎＭから約１１０ｎＭ、約１００ｎＭから約１２０ｎＭ、約１１０ｎＭから約１３０ｎＭ、約１２０ｎＭから約１４０ｎＭ、約１３０ｎＭから約１５０ｎＭ、約１４０ｎＭから約１６０ｎＭ、約１５０ｎＭから約１７０ｎＭ、約１６０ｎＭから約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭから約２００ｎＭを含む群から選択される濃度が有利であり得る。
【００４２】
基礎培地補充物質の実施形態は、１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子を含んでよい。ＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子は、ＳｔｅｍＲＤ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡから入手することができるヒトＷＮＴ−３ａタンパク質（「ＷＮＴ３Ａ」）、ＰＮ  Ｗ３Ａ−Ｈ００５およびＳｔｅｍＲＤ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡから入手することができるＲ−スポンジン−１（「ＲＳＰＯ１」）、ＰＮ  ＲＳＰＯ−００５を含む非限定的な群から選択することができる。特定の実施形態は、無血清培地中約１０ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度の、１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子のそれぞれを含んでよい。１つの非限定的な例は、無血清培地中約２０ｎｇ／ｍＬの量のＷＮＴ３Ａと無血清培地中約４０ｎｇ／ｍＬの量のＲＳＰＯ１との組み合わせを含む。
【００４３】
ＭＳＣまたはｈＭＳＣを培養するための基礎培地補充物質の特定の非限定的な実施形態は、そのそれぞれの無血清培地における最終濃度が表２において詳述されている成分との組み合わせを含んでよい、それから本質的になってよい、または、それからなってよい。
【００４４】
【表２】
2013529917.tif 000003
【００４５】
さらに、表２には本発明の無血清培地の特定の実施形態において利用する、培養物中でＭＳＣを増大させるための種々の細胞増殖因子、脂質増殖因子、およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子の最終濃度が列挙されているが、本発明は、そのように限定されず、本発明のさらなる実施形態は、これらに限定されないが、適用に応じて、表に列挙されている増殖因子のうちの１つ以上またはその全てを、上記の通り変動する濃度の各構成成分または要素と一緒に、種々の組み合わせおよび順列で用いて、ＭＳＣまたはｈＭＳＣから軟骨細胞および骨細胞を誘導することを含め、細胞培養を実現することができる。
【００４６】
無血清培地の実施形態は、ＳｔｅｍＲＤ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡから入手することができる、ある量の形質転換増殖因子ベータ１（「ＴＧＦＢ１」）、ＰＮ  ＴＧＦ−ｂ−００５をさらに含んでよい。ＴＧＦＢ１の量は、上記の化学的に定められている無血清細胞培養培地中で培養された間葉系幹細胞から軟骨細胞を誘導するために十分な量であってよい。無血清培地の特定の実施形態は、無血清培地中約０．５ｎｇ／ｍＬから約５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度のＴＧＦＢ１を含んでよい。１つの非限定的な例は、無血清培地中約１ｎｇ／ｍＬの濃度の量のＴＧＦＢ１を含む。
【００４７】
無血清培地の実施形態は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手することができる、ある量の骨形態形成タンパク質２（「ＢＭＰ２」）、ＰＮ  Ｂ３５５５をさらに含んでよい。ＢＭＰ２の量は、上記の化学的に定められている無血清細胞培養培地中で培養された間葉系幹細胞から骨細胞を誘導するために十分な量であってよい。無血清培地の特定の実施形態は、無血清培地中約０．５ｎｇ／ｍＬから約５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度のＢＭＰ２を含んでよい。１つの非限定的な例は、無血清培地中約１ｎｇ／ｍＬの濃度の量のＴＧＦＢ１を含む。
【００４８】
当然のことながら、実施形態は、ＭＳＣまたはｈＭＳＣから、軟骨細胞集団または骨細胞集団または軟骨細胞集団と骨細胞集団の両方を含む集団を誘導するために十分な、ＴＧＦＢ１またはＢＭＰ２の一方または両方を含んでよい。ｈＭＳＣから軟骨細胞または骨細胞を誘導するために適した無血清培地の特定の実施形態は、表１および表２において列挙されている成分の組み合わせを含んでよい、それから本質的になってよい、または、それからなってよく、それから、ある量の、ＴＧＦＢ１およびＢＭＰ２のいずれかまたはその両方と混合して組み合わせることができる。
【００４９】
以下の実施例は、当業者が本発明に包含される広範囲の実施形態を作出し、使用するために十分な、本発明の化学的に定められている無血清細胞培養培地（本発明の基礎培地および本発明の補充培地の特定の実施形態を含む）を作出し、使用する方法を例示するものとする。
【実施例】
【００５０】
（実施例１）
凍結保存された細胞の回収
これらに限定されないが、ＭＳＣ、具体的にはｈＭＳＣを含めた凍結細胞を、細胞を増殖または凍結させるために以前使用していた培地にかかわらず、上記の本発明の無血清培地に適合させることができる。段階的な手順は、ｈＭＳＣなどの凍結細胞を、約３７℃のウォーターバス中で解凍することを含む。ｈＭＳＣを５０ｍＬの円錐管または他の適切な容器に移すことができる。各１ｍＬのｈＭＳＣ懸濁液に、約３７℃に予め温めた本発明の無血清培地約１０ｍＬを、穏やかに旋回させながら滴下して加える。円錐管の内容物を組織培養フラスコに移す、または組織培養プレートの多数のウェルに播く。あるいは、ｈＭＳＣを約２５０×ｇ（約１２００ｒｐｍ）で約１０分間遠心分離し、本発明の無血清培地（適用に応じて、基礎培地または補充された培地）に再懸濁させた後に移すまたは播くこともできる。ｈＭＳＣを、約４％〜約６％の二酸化炭素を含有する加湿雰囲気中、約３６℃〜約３８℃でインキュベートすることができる。約２４時間後、ｈＭＳＣを移すか播いたかした本発明の無血清培地を、新鮮な本発明の無血清培地と交換する。継代または分割が必要な細胞が増大するまで、本発明の無血清培地を２日ごとに取り換えることによりｈＭＳＣ細胞培養物を維持する。
【００５１】
（実施例２）
細胞の継代
本発明の無血清培地（例えば、「基礎培地」または「補充された培地」など）の実施形態では、これらに限定されないが、ＭＳＣ、具体的にはヒトＭＳＣを含めた細胞を培養する際に細胞培養容器の表面へのコーティングまたは他の処理は必要ない場合がある。ＭＳＣおよびｈＭＳＣを含めた細胞の十分かつ一般的な最適な細胞付着および増殖は、従来の組織培養容器をコーティングせずに利用して実現することができる。非限定的な例として、細胞継代用の負に荷電したポリスチレン容器、例えば、ＢＤ  Ｐｒｉｍａｒｉａ、１  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙから入手可能な２５ｃｍ２の組織培養フラスコ（ＢＤ  Ｃａｔ番号３５３８０８）およびＢＤ  Ｐｒｉｍａｒｉａ、Ｆａｌｃｏｎ６ウェルプレート（ＢＤ  Ｃａｔ番号３５３０４６）などを、プレートコーティングせずに本発明の培地の実施形態と一緒に利用することができるが、本発明は、そのように限定されず、所望であれば、容器の表面を、約０．５〜１．０マイクログラム／ｃｍ２の表面領域にフィブロネクチンを用いて、約３７℃約１時間コーティングし、その後本発明の無血清培地に細胞を播くことができる。血清を含有する培地中または無血清培地中で培養したＭＳＣおよびｈＭＳＣを含めた細胞は、本発明の無血清培地の実施形態に、すぐにかつ容易に適合させることができる。ほとんどの場合、血清を含有する培地から本発明の無血清培地の実施形態への一段階の移行で十分であり得る。所望であれば、以下の通り、本発明の無血清培地の量を段階的に増加させる（例えば２５％、５０％など）段階的な適応も実施することができる。
【００５２】
細胞のストック培養物（本発明の無血清培地中で増殖させたものであろうと他の培地中で増殖させたものであろうと）を、顕微鏡の下で目視検査し、細胞がさらなる継代（ｓｕｂ−ｐａｓｓａｇｅ）をすることができる状態であることを確認する。ＭＳＣの増殖能を維持するために、細胞が約７０％の集密度に到達したら、細胞を継代することができる。ＭＳＣまたはｈＭＳＣの培養物が約８０％以上の集密度に到達すると、継代後に細胞の増殖が停止し得る。したがって、この結果を回避するために、ＭＳＣおよびｈＭＳＣは、８０％の集密度に到達する前に継代することができる。室温で容器に約０．０５％のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液またはＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓを加え、容器を傾けて全ての細胞を覆うようにする。
【００５３】
ＭＳＣまたはｈＭＳＣまたは細胞を顕微鏡の下で観察する。細胞が解離し始めたら、容器の側面を穏やかに軽くたたいて、残りの細胞がばらばらになるのを支持する。ＭＳＣまたはｈＭＳＣを本発明の無血清培地の実施形態において培養した場合、細胞が解離するために必要な時間は、約１分〜約３分のはずである。興味深いことに、血清を含有する従来の培地中で増殖させた細胞は、解離までにより長いインキュベート時間を必要とする場合がある。
【００５４】
細胞が解離したら、以下のステップを行う。ＭＳＣの増殖に悪影響を及ぼすので、細胞が解離した後にＭＳＣをトリプシンまたはＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓなどの細胞解離酵素中に長時間放置しない。
【００５５】
細胞が解離したら、十分なダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（「ＤＰＢＳ」）を加えて表面領域を覆う（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉから製品番号Ｄ４０３１として入手可能な、本発明の方法において使用するために適したＤＰＢＳ）。細胞懸濁液を滅菌した１５ｍＬの円錐管内に収集する。必要であれば、フラスコをしっかりと軽くたたくことまたは懸濁液をピペッティングすることによって細胞凝集塊を破壊する。
【００５６】
細胞を１２００ｒｐｍ（２５０×ｇ）で１０分間遠心分離する。上清を実質的に全て吸引し、廃棄する。細胞をＤＰＢＳまたは本発明の無血清培地に再懸濁させ、再度遠心分離する。上清を吸引し、細胞を、予め温めた本発明の培地に再懸濁させる。細胞を計数するために、細胞懸濁液から一定分量を取る。
【００５７】
細胞を組織培養容器内に、１ｃｍ２当たり細胞約３．６×１０３個の密度で移す。容器を数回傾けて、細胞懸濁液の均一な分布を確実にする。４〜６％のＣＯ２の加湿雰囲気中、３６〜３８℃でインキュベートする。２日ごとに培養培地を新鮮な予め温めた本発明の培地と交換する。細胞の集密度が約７０％に到達したら細胞を継代する（一般には、３日間隔）。
【００５８】
（実施例３）
細胞の凍結保存
基礎培地と約１０％の補充された培地および１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を混合することによって凍結保存溶液を調製する。ＭＳＣなどの細胞を遠心分離によってペレット化し、細胞を凍結保存溶液に穏やかに再懸濁させて１ｍＬ当たり細胞約１．０×１０６個にし、クライオバイアルに移す。クライオバイアルを凍結容器（例えば、Ｎａｌｇｅｎｅ、５１００  Ｃｒｙｏ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ  ５１００−０００１）の中に置き、−７０℃の冷凍装置内に一晩置く。長期間保管するためにクライオバイアルを液体窒素中に移す。
【００５９】
（実施例４）
細胞の軟骨形成
本発明の無血清培地中で増大させたＭＳＣまたはｈＭＳＣなどの細胞の分化能をｉｎ−ｖｉｔｒｏで試験することができる。記載されている実験条件下で、増大した細胞を、軟骨細胞を形成するように誘導することができる。
【００６０】
本発明の無血清中で増大させたＭＳＣの軟骨形成を誘導するために、増大したＭＳＣを固定法に依存しない条件に移し、本発明の血清を含まない基礎培地中でペレット培養物として約１〜約４週間維持すること、そうでなければ以前Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら、Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２３８巻、２６５〜２７２頁（１９９８年）に記載されている方法を用いることができる。
【００６１】
結果は、本発明の無血清基礎培地の実施形態において増大させたＭＳＣが、アルシアンブルーおよびＩＩ型コラーゲンに対して染色陽性であり得、Ｉ型コラーゲンに対してほとんど染色陰性であり得る軟骨構造を形成したことを示す。軟骨形成の程度は、上記の通り、本発明の基礎培地中にＴＧＦＢ１およびＷＮＴ経路阻害剤を添加することによって、または補充培地を使用することによって増強することができる。
【００６２】
結果は、本発明の基礎培地、ＴＧＦＢ１およびＷＮＴ経路阻害剤をさらに含む本発明の基礎培地、または補充された培地の特定の実施形態により、ＦＢＳを含有する従来の培地と同じまたはそれよりも大きな程度、速度、または効率で軟骨形成を誘導できることを証明している。
【００６３】
（実施例５）
間葉系幹細胞の骨形成
本発明の培地中で増大させたＭＳＣまたはｈＭＳＣなどの細胞の分化能をｉｎ−ｖｉｔｒｏで試験することができる。増大した細胞を、記載されている実験条件下で、骨細胞を形成するように誘導することができる。
【００６４】
結果は、本発明の基礎培地中で増大させたＭＳＣなどの細胞が、アリザリンレッドＳに対して染色陽性であり得る骨構造を形成したことを証明している。骨形成の程度は、上記の通り、本発明の基礎培地の実施形態にＢＭＰ２およびＷＮＴ経路活性化因子を添加することによって、または補充培地を使用することによって増強することができる。
【００６５】
結果は、本発明の基礎培地、基礎培地、または補充培地を利用する方法により、ＦＢＳを含有する従来の培地と同じまたはそれよりも大きな程度、速度、または効率で骨形成を誘導できることを証明し得る。
【００６６】
（実施例６）
結果
ここで、１０％のＦＢＳを含有する従来の培地中で増殖させたｈＭＳＣの細胞培養物と本発明の無血清培地（図では「ＭｅｓｅｎＧｒｏ」とも称される）中で増殖させたｈＭＳＣの細胞培養物を４０％集密および８０％集密のそれぞれにおいて比較した画像を提供する図１を主に参照する。画像を比較することにより、本発明の無血清培地におけるｈＭＳＣ培養物は、１０％のＦＢＳを含有する従来の培地におけるｈＭＳＣ培養物と実質的に異なるようには見えないことが証明される。本発明の無血清培地は、組成が大きく変動し得、ドナー動物まで遡ることができず、またＭＳＣまたはｈＭＳＣの分化を阻害または防止し得るＦＢＳを利用しなくてよいという利点を提供する。本発明の無血清培地により、下にさらに記載されている通り他の利点がもたらされ得る。
【００６７】
ここで、１０％のＦＢＳを含有する従来の培地におけるｈＭＳＣの細胞増殖と本発明の無血清培地（「ＭｅｓｅｎＧｒｏ」）における細胞増殖を比較した、日数単位の時間に対する細胞数のグラフである図２を主に参照する。２日ごとに培地を取り換えながら、各時点におけるウェル当たり（２４ウェルプレート）の細胞数を計数した。驚いたことに、このグラフは、本発明の無血清培地におけるｈＭＳＣの細胞増殖の速度が、１０％のＦＢＳを含有する従来の培地におけるｈＭＳＣの細胞増殖の速度を超え得ることを証明している。特定の適用では、これにより、より早い時点で継代することが可能になるという利点がもたらされる、またはより短い時間で所望の数の細胞が得られるという利点がもたらされる。
【００６８】
ここで、１０％のＦＢＳを含有する従来の培地におけるｈＭＳＣの細胞増殖と本発明の無血清培地（「ＭｅｓｅｎＧｒｏ」と称される）における細胞増殖を比較した、継代数に対する総ｈＭＳＣ数のグラフである図３を主に参照する。各分割（３日ごと）時にウェル当たり（６ウェルプレート）の総細胞数を計数した。出発時の継代数は４であり（１０％のＦＢＳを含有する従来の培地から、本発明の無血清培地または１０％のＦＢＳを含有する従来の培地のいずれかへ）、最初の細胞密度はウェル当たり約２０，０００個であった。このグラフは、本発明の無血清培地におけるｈＭＳＣが、従来の培地におけるものと同様に指数関数的に増大することを証明している。
【００６９】
ここで、１０％のＦＢＳを含有する従来の培地中で増殖させたｈＭＳＣのコロニー形成能と、本発明の無血清培地（「ＭｅｓｅｎＧｒｏ」と称される）中で増殖させたｈＭＳＣのコロニー形成能を比較した画像を提供する図４を主に参照する。この画像は、本発明の無血清培地中で増殖させたｈＭＳＣのコロニー形成能が、１０％のＦＢＳを含有する従来の培地中で増殖させたｈＭＳＣのコロニー形成能と比較して実質的な差異がないことを証明している。
【００７０】
ここで、本発明の無血清培地（「ＭｅｓｅｎＧｒｏ」と称される）中で長期培養した後のｈＭＳＣと、１０％のＦＢＳを含有する従来の培地中で長期培養した後のｈＭＳＣとで多系列分化能を比較した画像を提供する図５を主に参照する。９回目の継代時に、細胞を、６ウェルプレートに播き、１８〜２４日後に、本発明の無血清培地中で実現された分化と、１０％のＦＢＳを含有する従来の培地中で実現された分化を比較した。結果は、本発明の無血清培地中で培養したｈＭＳＣが、１０％のＦＢＳを含有する従来の培地中で培養したｈＭＳＣに匹敵し、それを超え得る多系列分化能を保持することを証明している。
【００７１】
ここで、継代数に対する細胞数のグラフである図６を主に参照する。ＢＤ  Ｐｒｉｍａｒｉａ  Ｆａｌｃｏｎ６ウェルプレート（ＢＤ  Ｃａｔ番号３５３０４６）における本発明の無血清培地における骨髄由来ｈＭＳＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の増殖速度は、上記の通りフィブロネクチンコーティングを使用してもしなくても同様である。これにより、同様の継代数に対する細胞数の結果を実現するためにプレートコーティングのステップを必要とするいくつかの他の市販の無血清培地、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳｔｅｍＰｒｏ  ＭＳＣ  ＳＦＭ（ＰＮ  Ａ１０３３２−０１）およびＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＭｅｓｅｎＣｕｌｔ−ＸＦ（ＰＮ  ０５４２０）などに対する利点がもたらされる。
【００７２】
ここで、１０％のＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充した基礎培地のある実施形態において培養した臍帯血由来ＭＳＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、本発明の無血清培地（「ＭｅｓｅｎＧｒｏ」と称される）のある実施形態において培養した臍帯血由来ＭＳＣとで増殖速度を比較した、継代数に対する細胞数のグラフである図７を主に参照する。
【００７３】
臍帯血由来ＭＳＣを、１０％のＦＢＳを含有する培地中で２〜６継代にわたって培養した。次いで、培養したＭＳＣを２つの群に分割し、２つの群のそれぞれを、１０％のＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充した基礎培地、または本発明の無血清培地（「ＭｅｓｅｎＧｒｏ」と称される）のいずれかにおいて培養した。
【００７４】
どちらの群もＢＤ  Ｐｒｉｍａｒｉａ  Ｔ２５フラスコにおいて培養し、３〜４日ごとに継代した。播種密度は、各継代時にフラスコ当たり細胞１．２５×１０５個であった。本発明の無血清培地（「ＭｅｓｅｎＧｒｏ」と称される）における臍帯血由来ＭＳＣの総細胞数単位での増殖速度は、１０％のＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充した基礎培地における臍帯血由来ＭＳＣの総細胞数単位での増殖速度を実質的に超えた。
【００７５】
ここで、１０％のＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充した基礎培地のある実施形態において培養した脂肪組織由来ＭＳＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、本発明の無血清培地（「ＭｅｓｅｎＧｒｏ」と称される）のある実施形態において培養した脂肪組織由来ＭＳＣとで増殖速度を比較した、継代数に対する細胞数のグラフである図８を主に参照する。
【００７６】
脂肪組織由来ＭＳＣを、１０％のＦＢＳを含有する培地において２〜６継代にわたって培養した。次いで、培養したＭＳＣを２つの群に分割し、２つの群のそれぞれを、１０％のＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充した基礎培地、または本発明の無血清培地（「ＭｅｓｅｎＧｒｏ」と称される）のいずれかにおいて培養した。
【００７７】
どちらの群もＢＤ  Ｐｒｉｍａｒｉａ  Ｔ２５フラスコにおいて培養し、３〜４日ごとに継代した。播種密度は、各継代時にフラスコ当たり細胞１．２５×１０５個であった。本発明の無血清培地（「ＭｅｓｅｎＧｒｏ」と称される）における脂肪組織由来ＭＳＣの総細胞数単位での増殖速度は、１０％のＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充した基礎培地における脂肪組織由来ＭＳＣの総細胞数単位での増殖速度を実質的に超えた。
【００７８】
ここで、ｈＭＳＣの培養に利用した培養フラスコの種類に対する総細胞数の棒グラフを提供する図９を主に参照する。凍結骨髄由来ＭＳＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を実施例１の手順に従って解凍した。次いで、コーティングしていないＰｒｉｍａｒｉａ  Ｔ２５フラスコにおける本発明の無血清培地（「ＭｅｓｅｎＧｒｏ」）において６継代にわたって継代された骨髄由来ＭＳＣを、２つの異なる種類のフラスコ：ＢＤ  Ｐｒｉｍａｒｉａ  Ｔ２５およびＣｏｒｎｉｎｇ  ＣｅｌｌＢＩＮＤ  Ｔ２５に、フラスコ当たり０．０９×１０６個で播種した。異なる種類のフラスコのそれぞれはコーティングせず、細胞は全て本発明の無血清培地（「ＭｅｓｅｎＧｒｏ」）中で培養した。４日後に、各フラスコから細胞数を計数した。異なる種類のコーティングしていない培養フラスコ間で、ＭＳＣの総数に実質的な差異はなかった。これは、本発明の無血清培地を、対応する異なる製造者の規格に従って製造された種々の異なるコーティングしていない培養フラスコにおいてＭＳＣを培養するために使用することができることを証明している。
【００７９】
ＭＳＣを無血清培地で培養することの利点
本発明の無血清培地により、ＭＳＣまたはｈＭＳＣを、ウシ胎仔血清またはヒト自己血清、または他の血清含有培地を補充した培地で培養することに対して種々の利点がもたらされる。
【００８０】
第１に、本発明の無血清培地の実施形態は、ウシ血清、ヒト血清、または他の動物血清を含有しない。したがって、本発明の無血清培地の実施形態は、対応する血液由来の病原体、例えばウイルスおよび狂牛病のプリオン、牛海綿状脳症（「ＢＳＥ」）などのいかなるものも含有し得ない。
【００８１】
第２に、本発明の無血清培地の実施形態は、軟骨および骨の障害を処置するためにｅｘ−ｖｉｖｏで増大させたＭＳＣの集団の集団を移入し得る患者における免疫応答を引き起こし得る生体異物タンパク質に対する抗体生成を引き起こすことがない。
【００８２】
第３に、本発明の無血清培地の実施形態は、組成のロット間変動が実質的に少なく、それにより、本発明の無血清培地は、ロット間でより一貫した性能で利用することができる。
【００８３】
第４に、本発明の無血清培地の実施形態は、種々の異なる製造者によって製造されたコーティングしていない培養フラスコと一緒に利用することができる。比較すると、他の市販の無血清培地、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｔｅｍＰｒｏ  ＭＳＣ  ＳＦＭ、またはＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｅｓｅｎＣｕｌｔ−ＸＦなどは、培養フラスコを付着材料で予めコーティングすることが必要である。
【００８４】
第５に、本発明の無血清培地の実施形態は、図７および図８および上記の説明によって証明されるように、臍帯マトリックス由来、臍帯血由来、骨髄由来および脂肪組織由来のＭＳＣなどの種々のＭＳＣ供給源に由来するＭＳＣの増大を支持することにおいて、ウシ胎仔血清を補充した従来の培地と比較して予想外に優良な結果を示す。
【００８５】
無血清培地の実施形態において培養したＭＳＣの使用
本発明の無血清培地の実施形態の第１の非限定的な使用は、細胞、ＭＳＣ、またはｈＭＳＣの集団をｅｘ−ｖｉｖｏで増大させるための無血清培地の種々の実施形態を調製するために、種々の順列および組み合わせで組み合わせた状態であろうと組み合わせることができる状態であろうと、本発明の無血清培地の構成成分の一部または全部を含む細胞培養キットを提供することであり得る。
【００８６】
さらに、上記の通り、予想外に優良な結果を伴う本発明の無血清培地の実施形態において、さらに分化して軟骨細胞または骨細胞を生じ得るＭＳＣの集団、一般的かつ具体的にはｈＭＳＣ集団のｅｘ−ｖｉｖｏにおける増大を実現することを考慮すると、分化していようがいまいが、そのような増大したＭＳＣの集団のうちの１つまたは複数を移入することが有益であり得る障害を処置するためにそのような増大または分化したＭＳＣの集団を使用することについては明白である。非限定的な例として、本発明の無血清培地を用いてｅｘ−ｖｉｖｏで増大させた間葉系幹細胞集団は上記の通り得ることができる。個体に、上記の通り増大させた間葉系幹細胞集団を治療有効量で投与することができる。
【００８７】
特定の例では、個体は、軟骨組織の障害に罹患していてよく、本発明の無血清培地を用いてｅｘ−ｖｉｖｏで増大させた間葉系幹細胞集団から誘導された骨細胞集団を得ることができ、治療的に有効または十分な量のそのような骨細胞集団を、再構成または再構成中の軟骨組織の支持に役立つように個体に投与することができる。
【００８８】
特定の例では、個体は、骨の障害に罹患していてよく、本発明の無血清培地を用いてｅｘ−ｖｉｖｏで増大させた間葉系幹細胞集団から誘導された軟骨細胞集団を得ることができ、治療的に有効または十分な量のそのような軟骨細胞集団を、再構成または再構成中の骨の支持に役立つように個体に投与することができる。
【００８９】
前述のことから容易に理解することができる通り、本発明の基本的な概念は、さまざまなやり方で具体化することができる。本発明は、細胞、ＭＳＣおよびｈＭＳＣのｅｘ−ｖｉｖｏにおける増大および分化、ならびにＭＳＣの集団またはそのようなＭＳＣから誘導される分化した集団を投与することが有益である障害の処置において有用な最良の形態を含めた無血清培地の多数の多様な実施形態を伴う。
【００９０】
そのように、本明細書に開示されているまたは本出願に付随する図面または表に示されている本発明の特定の実施形態または要素は、限定されるものではなく、むしろ、一般的に本発明に包含されるまたはその任意の特定の要素に関して包含される等価物の多数の多様な実施形態を例示するものである。さらに、本発明の単一の実施形態または要素の特定の説明は、可能性のある実施形態または要素の全てを明確に説明していない場合があり、多くの代替物が、説明および図面により暗示的に開示される。
【００９１】
装置の各要素または方法の各ステップは、装置用語または方法用語で記載することができることが理解されるべきである。そのような用語は、本発明が権利を有する暗示的に広範な適用範囲を明確にすることが望ましい場合、置き換えることができる。一例として、方法の全てのステップは、作用、その作用を起こすための手段として、またはその作用を引き起こす要素として開示することができることが理解されるべきである。同様に、装置の各要素は、物理的要素またはその物理的要素を容易にする作用として開示することができる。一例として、「細胞培養」の開示は、明確に考察されていようがいまいが、「細胞を培養すること」の作用の開示を包含するものと理解されるべきであり、逆に、「細胞を培養すること」の作用が有効に開示されていれば、そのような開示は、「細胞培養物」および「細胞を培養するための手段」までもの開示を包含するものと理解されるべきである。要素またはステップのそれぞれに対するそのような代替用語は、本明細書に明確に包含されるものと理解されるべきである。
【００９２】
さらに、使用される各用語に関して、本出願におけるその利用が、そのような解釈と相反しない限り、共通の辞書による定義は、定義のそれぞれが参照により本明細書に組み込まれるＲａｎｄｏｍ  Ｈｏｕｓｅ  Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ  Ｕｎａｂｒｉｄｇｅｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第２版に含有される各用語について、本明細書に包含されると理解されるべきであることが理解されるべきである。
【００９３】
本明細書における数値は全て、明示されていようがいまいが、「約」という用語で修飾されているものとする。本発明の目的に関して、範囲は、「約」１つの特定の値から「約」別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲が表されている場合、別の実施形態は、１つの特定の値から他の特定の値までを包含する。終点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される数値の全てを包含する。１〜５の数値範囲は、例えば、数値１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む。さらに、範囲のそれぞれについての終点は、他の終点との関連においても、他の終点とは独立しても、有意であることも理解されよう。値が、先行詞「約」を用いることによって近似で表されている場合、特定の値は別の実施形態を形成することが理解されよう。
【００９４】
したがって、出願人（複数可）は、少なくとも、ｉ）本明細書において開示され、説明されている無血清細胞培養培地、ｉｉ）開示され、説明されている関連する方法、ｉｉｉ）これらのデバイスおよび方法のそれぞれの類似物、等価物、およびさらには暗黙の変形、ｉｖ）示されている、開示されている、または説明されている機能のそれぞれを実現する代替的な実施形態、ｖ）開示され、説明されていることが暗黙のうちに実現されるように示されている機能のそれぞれを実現する代替の設計および方法、ｖｉ）別々の独立した発明として示されているそれぞれの特徴、構成成分、およびステップ、ｖｉｉ）開示されている種々のシステムまたは構成成分によって増強される適用、ｖｉｉｉ）そのようなシステムまたは構成成分によって生成された生成物、ｉｘ）実質的に上文において、また付随的な例のいずれかを参照して記載されている方法および装置、ｘ）以前開示された各要素の種々の組み合わせおよび順列について特許請求していると理解されるべきである。
【００９５】
この特許出願の背景技術の節は、本発明が関係する努力傾注分野に関する記載を提供する。この節は、本発明が関する技術の現状に関する関連情報、問題、または関心において有用な特定の米国特許、特許出願、刊行物、または特許請求された発明の主題の言い換えも組み入れ得る、または含有し得る。本明細書において引用されているまたは本明細書に組み込まれる米国特許、特許出願、刊行物、陳述書または他の情報はいずれも、本発明に対する先行技術として認められると判定される、解釈される、またはみなされるものではない。
【００９６】
この国際ＰＣＴ特許明細書に記載の請求項は、これによって参照により本発明の本明細書の一部として組み込まれ、出願人は、そのような請求項のそのような組み込まれた内容の全部または一部を、請求項のいずれかまたは全て、または任意のその要素または構成成分を支持する追加的な説明として使用する権利を明白に留保し、また、出願人はさらに、本出願、あるいはその後の出願、またはその継続出願、分割出願もしくは一部継続出願により保護が求められる事柄を定義するため、またはあらゆる利益および手数料の削減を取得するため、または任意の国または条約の特許法、規則（ｒｕｌｅ）または規制（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に準ずる、またはそれに従うために、必要に応じて、そのような請求項またはその任意の要素または構成成分の組み込まれた内容の任意の一部または全部を、明細書から特許請求の範囲に、またはその逆に移動する権利を明白に留保し、参照により組み込まれるそのような内容は、任意のその後のその継続出願、分割出願もしくは一部継続出願またはそれに対する再発行もしくは延長を含めた本出願の全係属中に残存するべきである。
【００９７】
この国際ＰＣＴ特許明細書に記載の請求項は、さらに、限られた数の本発明の好ましい実施形態の境界を説明するものであり、本発明の最も広範な実施形態または特許請求され得る本発明の実施形態の完全な一覧であるとは解釈されないものとする。出願人は、任意の継続出願、分割出願もしくは一部継続出願、または同様の出願の一部として上記の説明に基づいてさらなる請求項を展開するいかなる権利も放棄しない。
（項目１）
化学的に定められている無血清細胞培養培地であって、
ａ）無血清の基礎培地と、
ｂ）基礎培地補充物質であって、
ｉ）１つまたは複数の細胞増殖因子；
ｉｉ）１つまたは複数のリン脂質増殖因子；および
ｉｉｉ）１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子；
を含む、基礎培地補充物質と
を含む、化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目２）
上記基礎培地が、ある量のＤＭＥＭとある量のＭＣＤＢとを、約０．７５：１．２５ｖ／ｖ〜約１．２５：０．７５ｖ／ｖの範囲内のＤＭＥＭ対ＭＣＤＢ比で含む、項目１に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目３）
上記ＤＭＥＭ対ＭＣＤＢ比が、約０．７５：１．２５から約０．８５：１．１５、約０．８０：１．２０から約０．９０：１．１０、約０．８５：１．１５から約０．９５：１．０５、約９０：１１０から約１．０５：０．９５、約１．００：１．００から約１．１０：０．９０、約１．０５：０．９５から約１．１５：０．８５、約１．１０：０．９０から約１．２０：０．８０、および約１．１５：０．８５から約１２５：０．７５からなる群より選択される、項目２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目４）
上記１つまたは複数の細胞増殖因子が、インスリン、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータ１およびＩＧＦ−１からなる群より選択される、項目２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目５）
項目４に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地であって、上記インスリンが、該化学的に定められている無血清細胞培養培地において、約４ｍｇ／Ｌから約６ｍｇ／Ｌの範囲内の濃度を有する、化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目６）
項目５に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地であって、上記ｂＦＧＦ、上記ＰＤＧＦ−ｂｂ、上記ＥＧＦ、上記ＴＧＦ−ベータ１および上記ＩＧＦ−１のそれぞれが、該化学的に定められている無血清細胞培養培地において、約１ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有する、化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目７）
項目６に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地であって、上記ｂＦＧＦ、上記ＰＤＧＦ−ｂｂ、上記ＥＧＦ、上記ＴＧＦ−ベータ１および上記ＩＧＦ−１のそれぞれが、該化学的に定められている無血清細胞培養培地において、約１ｎｇ／ｍＬ〜約４ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ〜約５ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ〜約６ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ〜約７ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ〜約８ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ〜約９ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ〜約１１ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１２ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ〜約１３ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ〜約１４ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ〜約１５ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ〜約１６ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ〜約１７ｎｇ／ｍＬ、約１６ｎｇ／ｍＬ〜約１８ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬ、および約１９ｎｇ／ｍＬ〜約２０ｎｇ／ｍＬからなる群より選択される範囲内の濃度を有する、化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目８）
上記１つまたは複数の脂質増殖因子が、ＬＰＡおよびＳ１Ｐからなる群より選択される、項目２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目９）
上記１つまたは複数の脂質増殖因子が、上記基礎培地において、約１００ｎＭから約２００ｎＭの範囲内の濃度を有する、項目８に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目１０）
上記１つまたは複数の脂質増殖因子が、上記基礎培地において、約１００ｎＭから約１２０ｎＭ、約１１０ｎＭから約１３０ｎＭ、約１２０ｎＭから約１４０ｎＭ、約１３０ｎＭから約１５０ｎＭ、約１４０ｎＭから約１６０ｎＭ、約１５０ｎＭから約１７０ｎＭ、約１６０ｎＭから約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭから約２００ｎＭからなる群より選択される濃度を有する、項目９に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目１１）
上記１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子が、ヒトＷＮＴ３ＡおよびＲＳＰＯ１からなる群より選択される、項目２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目１２）
上記１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子が、上記基礎培地において、約２０ｎｇ／ｍＬから約２００ｎｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有する、項目１１に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目１３）
上記１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子が、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度を有するヒトＷＮＴ３Ａと、約４０ｎｇ／ｍＬの濃度を有するＲＳＰＯ１との組み合わせを含む、項目１２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目１４）
１つまたは複数のステロイドをさらに含む、項目２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目１５）
上記１つまたは複数のステロイドが、デキサメタゾンおよびヒドロコルチゾンからなる群より選択される、項目１４に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目１６）
上記１つまたは複数のステロイドが、約２．０μｇ／ｍＬから約５．０μｇ／ｍＬの濃度を有するデキサメタゾンと、約０．５ｍｇ／ｍＬから約１．５ｍｇ／ｍＬの濃度を有するヒドロコルチゾンとの組み合わせを含む、項目１４に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目１７）
調節性鉄供給源をさらに含む、項目２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目１８）
上記調節性鉄供給源が、ある量のトランスフェリンを含み、該ある量のトランスフェリンが、上記基礎培地において、約２ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの範囲内の濃度を有する、項目１７に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目１９）
トランスフェリンの濃度が、約２ｍｇ／Ｌから約４ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌから約５ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌから約６ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌから約７ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌから約８ｍｇ／Ｌ、約７ｍｇ／Ｌから約９ｍｇ／Ｌ、約８ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌからなる群より選択される、項目１８に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目２０）
電子伝達活性化因子をさらに含む、項目２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目２１）
上記電子伝達活性化因子が、ある量のセレン、およびある量の亜セレン酸からなる群より選択される、項目２０に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目２２）
ある量のＨＳＡをさらに含む、項目２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目２３）
上記ある量のＨＳＡが、上記基礎培地において、約１００μｇ／ｍＬから約３５０μｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有する、項目２２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目２４）
上記ある量のＨＳＡが、ある量の組換えＨＳＡを含む、項目２３に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目２５）
１つまたは複数の抗酸化剤をさらに含む、項目２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目２６）
上記抗酸化剤が、酢酸α−トコフェロールおよびアスコルビン酸−２−リン酸からなる群より選択される、項目２５に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目２７）
約０．００１ｇ／Ｌから約０．００３ｇ／Ｌの範囲内の量の５−ヒドロキシトリプタミンをさらに含む、項目２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目２８）
バッファーをさらに含む、項目２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目２９）
上記バッファーが、約３．２ｇ／Ｌから約４．２ｇ／Ｌの範囲内の量の炭酸水素ナトリウムを含む、項目２５に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目３０）
項目２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地であって、該化学的に定められている無血清細胞培養培地において培養された間葉系幹細胞から軟骨細胞を誘導するために十分な量のＴＧＦＢ１をさらに含む、化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目３１）
項目２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地であって、該化学的に定められている無血清細胞培養培地において培養された間葉系幹細胞から軟骨細胞を誘導するために十分な量のＢＭＰ２をさらに含む、化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目３２）
上記基礎培地が、
ａ）約０．５Ｌ／Ｌの量のＭＣＤＢ２０１、
ｂ）約０．５Ｌ／Ｌの量のＤＭＥＭ、
ｃ）約３．７ｇ／Ｌの量の炭酸水素ナトリウム、
ｄ）約０．２５ｇ／Ｌの量の組換えヒト血清アルブミン、
ｅ）約０．００５ｇ／Ｌの量のトランスフェリン、
ｆ）約０．００５ｇ／Ｌの量のインスリン、
ｇ）約０．０００００３７ｇ／Ｌの量の亜セレン酸、
ｈ）約０．０３２２０５ｇ／Ｌの量のアスコルビン酸−２−リン酸、
ｉ）約０．００２１２７ｇ／Ｌの量の５−ヒドロキシトリプタミン、
ｊ）約０．０００００３９２５ｇ／Ｌの量のデキサメタゾン、
ｋ）約０．００１ｇ／Ｌの量のヒドロコルチゾン、および
ｌ）約０．０００２ｇ／Ｌの量の酢酸α−トコフェロール
からなる、項目１に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目３３）
上記基礎培地補充物質が、
ａ）約１０ｎｇ／ｍＬの量のＰＤＧＦ−ｂｂ、
ｂ）約１０ｎｇ／ｍＬの量のｂＦＧＦ（１５５ａａ）、
ｃ）約２０ｎｇ／ｍＬの量のＥＧＦ、
ｄ）約５ｎｇ／ｍＬの量のＩＧＦ１、
ｅ）約１００ｎＭの量のＬＰＡ、
ｆ）約１５０ｎＭの量のＳ１Ｐ、
ｇ）約２０ｎｇ／ｍＬの量のＷＮＴ３Ａ、および
ｈ）約４０ｎｇ／ｍＬの量のＲＳＰＯ１
からなる、項目３２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目３４）
上記基礎培地補充物質が、さらに、ある量のＴＧＦＢ１からなる、項目３３に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目３５）
上記基礎培地補充物質が、さらに、ある量のＢＭＰ２からなる、項目３３に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目３６）
化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法であって、
ａ）無血清の基礎培地を準備するステップと；
ｂ）該基礎培地が、さらに、
ｉ）１つまたは複数の細胞増殖因子；
ｉｉ）１つまたは複数のリン脂質増殖因子；および
ｉｉｉ）１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子
を含むように、該基礎培地に補充するステップと
を含む、方法。
（項目３７）
基礎培地を準備する上記ステップが、ある量のＤＭＥＭとある量のＭＣＤＢとを、約０．７５：１．２５ｖ／ｖ〜約１．２５：０．７５ｖ／ｖの範囲内のＤＭＥＭ対ＭＣＤＢ比で組み合わせるステップを含む、項目３６に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目３８）
上記基礎培地に補充する上記ステップが、該基礎培地に、
ａ）インスリン、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータ１およびＩＧＦ−１からなる群より選択される１つまたは複数の増殖因子；
ｂ）ＬＰＡおよびＳ１Ｐからなる群より選択される１つまたは複数の脂質増殖因子；および
ｃ）ヒトＷＮＴ３Ａタンパク質、およびＲＳＰＯ１からなる群より選択される１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子
を混合するステップを含む、項目３７に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目３９）
上記基礎培地に、デキサメタゾンおよびヒドロコルチゾンからなる群より選択される１つまたは複数のステロイドを混合するステップをさらに含む、項目３６に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目４０）
上記基礎培地に、ある量のトランスフェリンを混合するステップをさらに含む、項目３９に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目４１）
上記基礎培地に、ある量の亜セレン酸を混合するステップをさらに含む、項目４０に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目４２）
上記基礎培地に、ある量の５−ヒドロキシトリプタミンを混合するステップをさらに含む、項目４１に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目４３）
上記基礎培地に、ある量のｒＨＳＡを混合するステップをさらに含む、項目４２に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目４４）
上記基礎培地に、酢酸α−トコフェロールおよびアスコルビン酸−２−リン酸からなる群より選択されるある量の抗酸化剤を混合するステップをさらに含む、項目４３に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目４５）
ある量の炭酸水素ナトリウムを混合するステップをさらに含む、項目４４に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目４６）
上記基礎培地にある量のＴＧＦＢ１を補充するステップをさらに含む、項目３６に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目４７）
上記基礎培地にある量のＢＭＰ２を補充するステップをさらに含む、項目３６に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目４８）
上記基礎培地が、
ａ）約０．５Ｌ／Ｌの量のＭＣＤＢ２０１、
ｂ）約０．５Ｌ／Ｌの量のＤＭＥＭ、
ｃ）約３．７ｇ／Ｌの量の炭酸水素ナトリウム、
ｄ）約０．２５ｇ／Ｌの量の組換えヒト血清アルブミン、
ｅ）約０．００５ｇ／Ｌの量のトランスフェリン、
ｆ）約０．００５ｇ／Ｌの量のインスリン、
ｇ）約０．０００００３７ｇ／Ｌの量の亜セレン酸、
ｈ）約０．０３２２０５ｇ／Ｌの量のアスコルビン酸−２−リン酸、
ｉ）約０．００２１２７ｇ／Ｌの量の５−ヒドロキシトリプタミン、
ｊ）約０．０００００３９２５ｇ／Ｌの量のデキサメタゾン、
ｋ）約０．００１ｇ／Ｌの量のヒドロコルチゾン、および
ｌ）約０．０００２ｇ／Ｌの量の酢酸α−トコフェロール
からなる、項目３６に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目４９）
上記基礎培地補充物質が、
ａ）約１０ｎｇ／ｍＬの量のＰＤＧＦ−ｂｂ、
ｂ）約１０ｎｇ／ｍＬの量のＢＦＧＦ１５５ａａ、
ｃ）約２０ｎｇ／ｍＬの量のＥＧＦ、
ｄ）約５ｎｇ／ｍＬの量のＩＧＦ１、
ｅ）約１００ｎＭの量のリゾホスファチジン酸、
ｆ）約１５０ｎＭの量のスフィンゴシン１−リン酸、
ｇ）約２０ｎｇ／ｍＬの量のＷＮＴ−３ａ、および
ｈ）約４０ｎｇ／ｍＬの量のＲスポンジン−１
からなる、項目４８に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目５０）
上記基礎培地補充物質が、さらに、ある量のＴＧＦＢ１からなる、項目４４に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目５１）
上記基礎培地補充物質が、さらに、ある量のＢＭＰからなる、項目４４に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目５２）
項目１に記載の細胞培養培地を使用して、間葉系幹細胞集団をｅｘ−ｖｉｖｏで増大させるステップを含む、細胞培養の方法。
（項目５３）
臍帯血、骨髄、臍帯マトリックス、および脂肪組織からなる群より選択される供給源から上記間葉系幹細胞集団を得るステップをさらに含む、項目５２に記載の細胞培養の方法。
（項目５４）
ｅｘ−ｖｉｖｏで増大させるために、血清に事前に曝露されていない間葉系幹細胞集団を得るステップをさらに含む、項目５２に記載の細胞培養の方法。
（項目５５）
ｅｘ−ｖｉｖｏで増大させることにより、血清に事前に曝露されていない間葉系幹細胞集団を生成するステップをさらに含む、項目５２に記載の細胞培養の方法。
（項目５６）
上記間葉系幹細胞集団から軟骨細胞集団を誘導するステップをさらに含む、項目５２または５５のいずれか一項に記載の細胞培養の方法。
（項目５７）
上記細胞培養培地にある量のＴＧＦＢ１を補充するステップをさらに含み、上記１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子がヒトＷＮＴ３Ａからなる、項目５６に記載の細胞培養の方法。
（項目５８）
上記間葉系幹細胞集団から骨細胞集団を誘導するステップをさらに含む、項目５２または５５のいずれか一項に記載の細胞培養の方法。
（項目５９）
上記細胞培養培地にある量のＢＭＰ２を補充するステップをさらに含み、上記１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子がヒトＷＮＴ−３ａタンパク質からなる、項目５８に記載の細胞培養の方法。
（項目６０）
コーティングしていない培養フラスコ内で上記間葉系幹細胞集団を増大させるステップをさらに含む、項目５２または５５のいずれか一項に記載の細胞培養の方法。
（項目６１）
ａ）項目１に記載の細胞培養培地を使用して、ｅｘ−ｖｉｖｏで増大させた間葉系幹細胞集団を得るステップと、
ｂ）個体に治療有効量の該間葉系幹細胞集団を投与するステップと
を含む、処置の方法。
（項目６２）
間葉系幹細胞集団を得る上記ステップが、項目１に記載の細胞培養培地を使用して、ｅｘ−ｖｉｖｏで増大させた間葉系幹細胞集団から誘導された軟骨細胞集団を得るステップを含み、個体に治療有効量の該間葉系幹細胞集団を投与する上記ステップが、個体に治療有効量の該軟骨細胞集団の集団を投与するステップを含む、項目６１に記載の処置の方法。
（項目６３）
上記治療有効量の上記軟骨細胞集団が、骨を再構成するために十分な量の該軟骨細胞集団の集団を含む、項目６２に記載の処置の方法。
（項目６４）
間葉系幹細胞集団を得る上記ステップが、項目１に記載の細胞培養培地を使用して、ｅｘ−ｖｉｖｏで増大させた間葉系幹細胞集団から誘導された骨細胞集団を得るステップを含み、個体に治療有効量の該間葉系幹細胞集団を投与する上記ステップが、個体に治療有効量の該骨細胞集団の集団を投与するステップを含む、項目６１に記載の処置の方法。
（項目６５）
上記治療有効量の上記骨細胞集団が、軟骨組織を再構成するために十分な量の該骨細胞集団の集団を含む、項目６４に記載の処置の方法。
（項目６６）
項目１、３２、３３、３４、または３５のいずれか一項に記載の無血清細胞培養培地を含む細胞培養のためのキット。
（項目６７）
ヒト間葉系幹細胞の無血清細胞培養の方法において使用するための、項目１、３２、３３、３４、または３５のいずれか一項に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目６８）
実質的に本明細書において開示されている任意の実施形態を参照して記載されている、項目１に記載の化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目６９）
添付図に示されている任意の実施形態を参照して本明細書において記載されている、化学的に定められている無血清細胞培養培地。
（項目７０）
実質的に本明細書において開示されている任意の実施形態を参照して記載されている、化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目７１）
添付図に示されている任意の実施形態を参照して本明細書において記載されている、化学的に定められている無血清細胞培養培地を作製する方法。
（項目７２）
実質的に本明細書において開示されている任意の実施形態を参照して記載されている、項目６１に記載の処置の方法。
（項目７３）
本明細書において記載または特許請求されている任意の発明。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2013529917.tif 000014
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