(57)【要約】  本発明は、被験体の大腸癌を診断または検出する方法において、ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＥｐＣａｍ、ＭＩＰ１β、ＴＧＦβ１およびＴＩＭＰ−１から選択されるバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含む方法を提供する。本発明はまた、バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定する試薬を含む診断キット、ならびに大腸癌を検出または診断する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の大腸癌を診断または検出する方法において、
ｉ）前記被験体の試料中に、ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＥｐＣａｍ、ＭＩＰ１β、ＴＧＦβ１およびＴＩＭＰ−１から選択される少なくとも２種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含み、
前記２種のバイオマーカーの存在および／またはレベルが、大腸癌の指標であることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、Ｍ２ＰＫ、ＥｐＣａｍ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＩＬ−８およびＩＧＦＢＰ２から選択される２種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、少なくとも３種の前記バイオマーカーの存在および／または発現レベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記３種のバイオマーカーは、Ｍ２ＰＫ、ＥｐＣａｍ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＩＰ１β、ＴＧＦβ１およびＭＡＣ２ＢＰから選択されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、３種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含み、前記３種のバイオマーカーは、
ｉ）ＤＫＫ−３、Ｍ２ＰＫおよびＩＧＦＢＰ２；
ｉｉ）Ｍ２ＰＫ、ＩＧＦＢＰ２およびＥｐＣＡＭ；
ｉｉｉ）Ｍ２ＰＫ、ＭＩＰ１βおよびＴＧＦβ１；または
ｉｖ）ＩＬ−８、ＩＬ−１３およびＭＡＣ２ＢＰ
であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法において、少なくとも４種の前記バイオマーカーの存在および／または発現レベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、４種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含み、前記４種のバイオマーカーは、
ｉ）ＤＫＫ−３、Ｍ２ＰＫ、ＭＡＣ２ＢＰおよびＩＧＦＢＰ２；
ｉｉ）ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＭＡＣ２ＢＰおよびＥｐＣａｍ；
ｉｉｉ）ＤＫＫ３、Ｍ２ＰＫ、ＴＧＦβ１およびＴＩＭＰ−１；
ｉｖ）Ｍ２ＰＫ、ＭＩＰ１β、ＩＬ−１３およびＴＩＭＰ−１；または
ｖ）ＩＬ−８、ＭＡＣ２ＢＰ、ＩＧＦＢＰ２およびＥｐＣａｍ
であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１乃至７の何れか１項に記載の方法において、少なくとも５種の前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載の方法において、少なくとも６種の前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項に記載の方法において、少なくとも７種の前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法において、少なくとも８種の前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１１の何れか１項に記載の方法において、少なくとも９種の前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１２の何れか１項に記載の方法において、少なくとも１０種の前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３の何れか１項に記載の方法において、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−ＢＰ２、アンフィレグリン、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＤ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＭＡＣ２ＢＰ、腫瘍Ｍ２ピルビン酸キナーゼ、Ｍ６５、ＯＰＮ、ＤＫＫ−３、ＥｐＣａｍ、ＴＧＦβ−１およびＶＥＧＦｐａｎから選択される少なくとも１種の追加のバイオマーカーの存在および／またはレベルを検出するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１乃至１４の何れか１項に記載の方法において、少なくとも５０％の感度で大腸癌を診断または検出することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、少なくとも６６％の感度で大腸癌を診断または検出することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、少なくとも７７％の感度で大腸癌を診断または検出することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１乃至１７の何れか１項に記載の方法において、少なくとも５０％の感度および少なくとも９５％の特異度でデュークスＡ大腸癌を診断または検出することを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１乃至１８の何れか１項に記載の方法において、少なくとも６０％の感度および少なくとも８０％の特異度でデュークスＡ大腸癌を診断または検出することを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１乃至１９の何れか１項に記載の方法において、少なくとも５０％の感度および少なくとも９０％の特異度でデュークスＡ大腸癌を診断または検出することを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１乃至２０の何れか１項に記載の方法において、バイオマーカーポリペプチドと結合する少なくとも１種の化合物に前記試料を接触させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法において、前記化合物は検出可能に標識されていることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の方法において、前記化合物は抗体であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２１乃至２３の何れか１項に記載の方法において、前記化合物は固体担体に結合していることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１乃至２０の何れか１項に記載の方法において、前記バイオマーカーはポリヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１乃至２５の何れか１項に記載の方法において、
ｉ）前記被験体の前記試料中の前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップと、
ｉｉ）前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを対照と比較するステップと、
を含み、前記試料における存在および／またはレベルが前記対照と異なることが、大腸癌の指標であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１乃至２６の何れか１項に記載の方法において、前記試料は、血液、血漿、血清、尿、血小板、巨核細胞または糞便を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
（ｉ）本発明の方法にしたがって大腸癌を診断または検出するステップと、
（ｉｉ）大腸癌を治療するための療法を施行、または勧奨するステップと、
を含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２９】
被験体の大腸癌に対する治療効果を観察する方法において、前記被験体の大腸癌を治療するステップと、その後、ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＥｐＣａｍ、ＭＩＰ１β、ＴＧＦβ１およびＴＩＭＰ−１から選択される少なくとも２種のバイオマーカーの前記被験体の試料中における存在および／またはレベルを検出するステップとを含み、治療前と比較して治療後の前記ポリペプチドの発現がない、および／または発現のレベルが低下していることが、治療の有効性の指標であることを特徴とする方法。
【請求項３０】
大腸癌を診断または検出するための少なくとも２種の化合物のアレイにおいて、前記各化合物が、ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＥｐＣａｍ、ＭＩＰ１β、ＴＧＦβ１およびＴＩＭＰ−１から選択される、異なるバイオマーカーポリペプチドに結合することを特徴とするアレイ。
【請求項３１】
被験体の大腸癌を診断または検出するキットにおいて、それぞれがＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＥｐＣａｍ、ＭＩＰ１β、ＴＧＦβ１およびＴＩＭＰ−１から選択される、異なるバイオマーカーポリペプチドに結合する２種の化合物を含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌を検出または診断するバイオマーカーの存在および／またはレベルの測定に関する。本発明はまた、バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するための試薬を含む診断キット、ならびに大腸癌を検出または診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸癌または腸癌とも呼ばれる大腸癌は、世界的に見て最も一般的な癌の第２の原因となっている。大腸癌の年間発生率はほぼ百万例であり、年間死亡率は５００，０００件前後である（Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，２００８）。残念なことに、患者の３０〜５０％は、受診時に潜在性または顕性の転移が生じており、腫瘍が一度転移すると、５年生存率は１０％未満となり、予後は非常に厳しいものとなる（Ｅｔｚｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。これとは逆に、腫瘍が未だ局所的な間に受診した患者の９０％超は、５年後もなお生存している可能性があり、治癒したと見做し得る。大腸の病変の早期発見は、したがって、大腸癌の影響を著しく減少させるであろう（Ｅｔｚｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０００３】
現在、大腸癌の診断法として広く使用されているスクリーニング検査は、便潜血検査（ＦＯＢＴ）、軟性Ｓ状結腸鏡検査および大腸内視鏡検査である（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，２０１０）。ＦＯＢＴの特異度は比較的低く、高い割合で偽陽性の結果を与える。したがって、陽性のＦＯＢＴはすべて、その後に大腸内視鏡検査が行われなければならない。試料採取は個人が自宅で行うが、最適感度を得るには、少なくとも２つの連続した検便試料が必要である。ＦＯＢＴの中には、試料採取の前に食事制限を要求する方法もある。ＦＯＢＴはまた、腸内への出血がない早期の癌性病変に対する感度がないが、これらは治療すればほぼ確実に成功が見込める病変である。
【０００４】
ＦＯＢＴスクリーニングは大腸癌による死亡率の減少をもたらすものの、概ねこの検査の好ましくない性質のために遵守率が低く（３０〜４０％）、スクリーニングツールとしての有用性を低下させるという問題がある。大腸内視鏡検査は目下究極の判断基準であり、９０％超の特異度を有するが、煩わしく、かつ費用がかかり、僅かではあるが限られた合併症のリスクを伴う（１０００件の検査につき２．１件）（Ｌｅｖｉｎ，２００４）。迅速で特異度が高く安価な血液ベースの検査法が開発されれば、他のスクリーニング検査で一般的に見られる遵守の問題を克服することができるであろうし（Ｔｏｎｕｓ、２００６；Ｈｕｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、また大規模なスクリーニング検査の一部としてより受け入れられ易いであろう。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、大腸癌に関係する６０を超えるバイオマーカーを調査したが、どのバイオマーカーも単独では診断検査用として適していないようであることがわかった。驚くべきことに、被験体の試料中の大腸癌に関係する少なくとも２つのバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定すれば、いかなる病期の大腸癌であっても検出または診断できることがわかった。有利なことに、少なくとも２つのバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定することによって、感度および特異度において少なくともＦＯＢＴと同等の診断検査が提供される。
【０００６】
したがって、一態様において、本発明は被験体の大腸癌を診断または検出する方法において、
ｉ）被験体の試料中に、ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＥｐＣａｍ、ＭＩＰ１β、ＴＧＦβ１およびＴＩＭＰ−１から選択される少なくとも２種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含み、
２種のバイオマーカーの存在および／またはレベルが、大腸癌の指標である方法を提供する。
【０００７】
一実施形態では、方法は、Ｍ２ＰＫ、ＥｐＣａｍ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＩＬ−８およびＩＧＦＢＰ２から選択される２種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含む。
【０００８】
他の実施形態では、方法は、少なくとも３種のバイオマーカーの存在および／または発現レベルを測定するステップを含む。
【０００９】
一実施形態では、３種のバイオマーカーは、Ｍ２ＰＫ、ＥｐＣａｍ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＩＰ１β、ＴＧＦβ１およびＭＡＣ２ＢＰから選択される。
【００１０】
特定の一実施形態では、方法は、３種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含み、３種のバイオマーカーは、
ｉ）ＤＫＫ−３、Ｍ２ＰＫおよびＩＧＦＢＰ２；
ｉｉ）Ｍ２ＰＫ、ＩＧＦＢＰ２およびＥｐＣＡＭ；
ｉｉｉ）Ｍ２ＰＫ、ＭＩＰ１βおよびＴＧＦβ１；または
ｉｖ）ＩＬ−８、ＩＬ−１３およびＭＡＣ２ＢＰ
である。
【００１１】
他の実施形態では、方法は、少なくとも４種のバイオマーカーの存在および／または発現レベルを測定するステップを含む。
【００１２】
特定の一実施形態では、方法は、４種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含み、４種のバイオマーカーは、
ｉ）ＤＫＫ−３、Ｍ２ＰＫ、ＭＡＣ２ＢＰおよびＩＧＦＢＰ２；
ｉｉ）ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＭＡＣ２ＢＰおよびＥｐＣａｍ；
ｉｉｉ）ＤＫＫ３、Ｍ２ＰＫ、ＴＧＦβ１およびＴＩＭＰ−１；
ｉｖ）Ｍ２ＰＫ、ＭＩＰ１β、ＩＬ−１３およびＴＩＭＰ−１；または
ｖ）ＩＬ−８、ＭＡＣ２ＢＰ、ＩＧＦＢＰ２およびＥｐＣａｍ
である。
【００１３】
さらに他の実施形態では、方法は、少なくとも５種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含む。
【００１４】
特定の一実施形態では、５種のバイオマーカーはＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫおよびＩＬ−１３である。
【００１５】
他の実施形態では、方法は、少なくとも６種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含む。
【００１６】
他の実施形態では、方法は、少なくとも７種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含む。
【００１７】
特定の一実施形態では、７種のバイオマーカーは、
ｉ）ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３およびＴＧＦβ１；または
ｉｉ）ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＩＬ−１３、ＥｐＣａｍおよびＭＩＰ１β
である。
【００１８】
さらに他の実施形態では、方法は、少なくとも８種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含む。
【００１９】
一実施形態では、方法は、少なくとも９種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含む。
【００２０】
さらに他の実施形態では、方法は、少なくとも１０種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含む。
【００２１】
他の実施形態では、方法は、表７〜１８のいずれかに示されているバイオマーカーの組み合わせの存在および／またはレベルを測定するステップを含む。
【００２２】
他の実施形態では、方法は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−ＢＰ２、アンフィレグリン、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＤ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＭＡＣ２ＢＰ、腫瘍Ｍ２ピルビン酸キナーゼ、Ｍ６５、ＯＰＮ、ＤＫＫ−３、ＥｐＣａｍ、ＴＧＦβ−１およびＶＥＧＦｐａｎから選択される少なくとも１種の追加のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含む。
【００２３】
一実施形態では、方法は、少なくとも５０％の感度で大腸癌を診断または検出する。
【００２４】
他の実施形態では、方法は、少なくとも６６％の感度で大腸癌を診断または検出する。
【００２５】
さらに他の実施形態では、方法は、少なくとも７７％の感度で大腸癌を診断または検出する。
【００２６】
一実施形態では、方法は、少なくとも７５％の特異度で大腸癌を診断または検出する。
【００２７】
一実施形態では、方法は、少なくとも８０％の特異度で大腸癌を診断または検出する。
【００２８】
他の実施形態では、方法は、少なくとも９０％の特異度で大腸癌を診断または検出する。
【００２９】
さらに他の実施形態では、方法は、少なくとも９５％の特異度で大腸癌を診断または検出する。
【００３０】
他の実施形態では、方法は、少なくとも５０％の感度および少なくとも９５％の特異度でデュークスＡ大腸癌を診断または検出する。
【００３１】
さらに他の実施形態では、方法は、少なくとも６０％の感度および少なくとも８０％の特異度でデュークスＡ大腸癌を診断または検出する。
【００３２】
他の実施形態では、方法は、少なくとも５０％の感度および少なくとも９０％の特異度でデュークスＡ大腸癌を診断または検出する。
【００３３】
当業者であれば、デュークスＡがＴＮＭ分類のＴ１、Ｎ０、Ｍ０およびＴ２、Ｎ０、Ｍ０に対応していることを理解しているであろう。
【００３４】
したがって、一実施形態では、方法は、少なくとも５０％の感度および少なくとも９５％の特異度で、ＴＮＭ分類でＴ１、Ｎ０、Ｍ０またはＴ２、Ｎ０、Ｍ０の大腸癌を診断または検出する。
【００３５】
さらに他の実施形態では、方法は、少なくとも６０％の感度および少なくとも８０％の特異度で、ＴＮＭ分類でＴ１、Ｎ０、Ｍ０またはＴ２、Ｎ０、Ｍ０の大腸癌を診断または検出する。
【００３６】
他の実施形態では、方法は、少なくとも５０％の感度および少なくとも９０％の特異度で、ＴＮＭ分類でＴ１、Ｎ０、Ｍ０またはＴ２、Ｎ０、Ｍ０の大腸癌を診断または検出する。
【００３７】
本発明の方法では、ポリペプチドの検出に適した任意の手法を使用し得る。一実施形態では、方法は、バイオマーカーポリペプチドと結合する少なくとも１種の化合物に試料を接触させるステップを含む。あるいは、方法は、質量分析法によりポリペプチドを検出するステップを含む。
【００３８】
特定の一実施形態では、化合物は検出可能に標識されている。
【００３９】
他の実施形態では、化合物は抗体である。
【００４０】
一実施形態では、化合物は固体担体に結合している。
【００４１】
本発明の方法において、バイオマーカーの存在および／またはレベルの測定は、バイオマーカー遺伝子転写産物などの、バイオマーカーをコードするポリヌクレオチドの存在および／またはレベルの測定を含み得る。したがって、一実施形態では、バイオマーカーはポリヌクレオチドである。
【００４２】
本発明の方法のさらに他の実施形態では、方法は、
ｉ）被験体の試料中のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップ；および
ｉｉ）バイオマーカーの存在および／またはレベルを対照と比較するステップを含み、試料における存在および／またはレベルが対照と異なる場合、大腸癌の指標である。
【００４３】
一実施形態では、試料は、血液、血漿、血清、尿、血小板、巨核細胞または糞便を含む。
【００４４】
他の態様では、本発明は、
（ｉ）本発明の方法にしたがって大腸癌を診断または検出するステップ；および
（ｉｉ）大腸癌を治療するための療法を施行、または勧奨するステップ
を含む治療方法を提供する。
【００４５】
さらに他の態様では、本発明は、被験体の大腸癌に対する治療効果を観察する方法であって、被験体の大腸癌を治療し、その後、ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＥｐＣａｍ、ＭＩＰ１β、ＴＧＦβ１およびＴＩＭＰ−１から選択される少なくとも２種のバイオマーカーの被験体の試料中における存在および／またはレベルを検出するステップを含み、治療前と比較して治療後のポリペプチドの発現がない、および／または発現のレベルが低下していることが、治療の有効性の指標である方法を提供する。
【００４６】
他の態様では、本発明は、大腸癌を診断または検出するための少なくとも２種の化合物のアレイにおいて、各化合物が、ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＥｐＣａｍ、ＭＩＰ１β、ＴＧＦβ１およびＴＩＭＰ−１から選択される、異なるバイオマーカーポリペプチドに結合するアレイを提供する。
【００４７】
さらに他の態様では、本発明は、被験体の大腸癌を診断または検出するキットにおいて、それぞれがＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＥｐＣａｍ、ＭＩＰ１β、ＴＧＦβ１およびＴＩＭＰ−１から選択される、異なるバイオマーカーポリペプチドに結合する２種の化合物を含むキットを提供する。
【００４８】
本明細書を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの活用形が、言及された要素、整数もしくはステップ、または要素群、整数群もしくは工程群を包含するが、他の任意の要素、整数もしくは工程、または要素群、整数群もしくは工程群も排除しないことを意味することは理解されるであろう。
【００４９】
以下で明らかになるように、本発明の一態様の好ましい特徴と特性は、本発明の多くの他の態様に適用可能である。
【００５０】
以下、添付の図面を参照しながら、下記の実施例により本発明を説明するが、本発明はそれらの実施例に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】調査３において、ロジスティック回帰モデル化法を使用して、可能性がある４６のタンパク質バイオマーカーの最適組み合わせを見出し、７種のバイオマーカーのパネルを得た。これをＲＯＣ曲線として示す（黒色の曲線）。「リーブワンアウト（ｌｅａｖｅ  ｏｎｅ  ｏｕｔ）」交差確認法（灰色の曲線）を使用して、独立したデータに対するこの「パネル」のパフォーマンスを推定した。特異度が８０％および９０％の点―スクリーニング検査で目的とする操作点―に垂直線が引かれている。パフォーマンス統計を表５に示す。
【図２】デュークスの各病期で正常な被験体から大腸癌患者を同定する７種のバイオマーカーモデルのパフォーマンスを、各病期に対するＲＯＣ曲線で示す。調査３ａからのＡ（赤）−病期Ａ、Ｂ（緑）−病期Ｂ、Ｃ（青）−病期Ｃ、およびＤ（黒）−病期Ｄ。パフォーマンス特性を表６に示す。
【図３】調査４（調査３の再測定とも称する）のバイオマーカーの結果をペアでモデル化したところ、全部で５組のペア（上記１０種のバイオマーカーのリストから選択された可能な４５の組み合わせから）が、特異度９５で感度５２％超を与えることが示されたといい得た。これらペア方式のバイオマーカー組み合わせのパフォーマンスをＲＯＣ曲線（ｎ＝５曲線）として示す。パフォーマンス特性を表７に示す。
【図４】特異度９５％で感度が少なくとも５０％である調査４のデータから得られた３種のバイオマーカーモデルの例。３〜１０種のバイオマーカーの組み合わせは９６８組あり、これらの組み合わせの約半分が、特異度９５％で感度が少なくとも５０％のパフォーマンスを示した。
【図５】特異度９５％で少なくとも５０％の感度を有する調査４のデータから得られた３〜１０種のバイオマーカーの全ての組み合わせに対するＲＯＣ曲線を示す（可能な９６８モデルからのｎ＝４８５の交差確認曲線）。
【図６】最良の４８５モデル中の各バイオマーカーの頻度。これらのＢＭは、９５％で少なくとも５０％の感度を与える全ての血清モデルを表す。有用なモデル中の１０種全てのバイオマーカーの頻度の高さは、これら１０種のバイオマーカーに対する我々の選択の統一性を示すものである。
【図７】調査４のデータから得られた５種のバイオマーカーモデルを、ＲＯＣ曲線（黒色）および交差確認ＲＯＣ曲線（灰色）として示す。このモデルは、病期の全てが含まれ、かつ交差確認が６４％の感度を与えるとき、特異度９５％で感度６８％を示す。含まれるバイオマーカーは、［ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、Ｍａｃ２ＢＰ、ＤＫＫ−３およびＭ２ＰＫ］である。
【図８】調査４のデータから得られた６種のバイオマーカーモデルを、ＲＯＣ曲線（黒色）および交差確認ＲＯＣ曲線（灰色）として示す。このモデルは、全ての病期が含まれ、かつ交差確認が６７％の感度を与えるとき、特異度９５％で感度７７％を示す。含まれるバイオマーカーは、［ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、Ｍａｃ２ＢＰ、ＤＫＫ−３、ＴＧＦｂｅｔａ１およびＭ２ＰＫ］である。
【図９】調査３ａのデータから得られた、二者択一的な２つの７種のバイオマーカーモデルを示す。一方は高特異度に対して最適化したものであり（黒色／新）、そして他方、すなわち曲線下の面積に対して最適化されたモデルを示す（灰色／旧）。特異度９０％で、新モデルでは感度は７２％であり、旧モデルでは７７％であった。含まれるバイオマーカーは、次の通りであった。      新：ＩＬ８、ＩＧＦＢＰ２、ｓ９０ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＤＫＫ−３、ＩＬ−１３およびＴＧＦベータ、      旧：ＩＬ８、ＩＧＦＢＰ２、ｓ９０ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＥｐＣＡＭ、ＩＬ１３およびＭＩＰ−１ｂ
【図１０】調査４のデータから得られた７種のバイオマーカーモデルを、ＲＯＣ曲線（黒色）および交差確認ＲＯＣ曲線（灰色）として示す。このモデルは、特異度９５％で感度８４％を示す。含まれるバイオマーカーは、［Ｍ２ＰＫ血清、ＩＬ−８．血漿、ＴＧＦベータ１．血清、ＩＧＦＢＰ２．血漿、Ｍａｃ２ＢＰ．血清、ＴＩＭＰ１．血清およびＤｋｋ３血漿］である。
【図１１】各デュークス病期に対する３つのバイオマーカーモデルのパフォーマンスを示す交差確認ＲＯＣ曲線を示す。このデータは、病気進行の異なるステージで癌を検出するために３種のバイオマーカー（ＤＫＫ−３、Ｍ２ＰＫおよびＩＧＦＢＰ２）を選択したことの有効性を示すものである。このデータは、病期Ａで３種のマーカーを使用すれば、検査が、特異度９５％でなお、病気の後期で達成される感度（７９％）に匹敵する高い感度（６４％）を達成するであろうことを示している。すなわち、３種のバイオマーカーパネルは病気の初期の状態を見つけ出し、早期検出を可能にするであろう。含まれるバイオマーカーは、Ｄｋｋ３、Ｍ２ＰＫおよびＩＧＦＢＰ２である。
【００５２】
配列リストのキー
配列番号１―ＩＬ−８のアミノ酸配列
配列番号２―ＩＧＦＢＰ２のアミノ酸配列
配列番号３―ＭＡＣ２ＢＰのアミノ酸配列
配列番号４―Ｍ２ＰＫ変異体１のアミノ酸配列
配列番号５―Ｍ２ＰＫ変異体２のアミノ酸配列
配列番号６―Ｍ２ＰＫ変異体３のアミノ酸配列
配列番号７―ＩＬ−１３のアミノ酸配列
配列番号８―ＤＫＫ−３変異体１のアミノ酸配列
配列番号９―ＤＫＫ−３変異体２のアミノ酸配列
配列番号１０―ＤＫＫ−３変異体３のアミノ酸配列
配列番号１１―ＥｐＣａｍのアミノ酸配列
配列番号１２―ＭＩＰ１βのアミノ酸配列
配列番号１３―ＴＧＦβ１のアミノ酸配列
配列番号１４―ＴＩＭＰ−１のアミノ酸配列
【発明を実施するための形態】
【００５３】
一般的手法および定義
特に他に定義されていなければ、本明細書中に使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、生化学の分野における）が一般に理解するのと同じ意味を有するものと解釈されるべきである。
【００５４】
他に示されていなければ、本発明で使用する組換えタンパク質、細胞培養および免疫学的手法は、当業者によく知られた標準的な方法である。そのような手法は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄｅｄｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄｅｄｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９４）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５  および  １９９６）、およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、今日までの全ての改訂版を含む）、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、およびＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（今日までの全ての改訂版を含む）などの文献に記載され、説明されている。
【００５５】
本明細書では、「結腸癌」、「腸癌」または「直腸癌」としても知られている用語「大腸癌」は、大腸および／または直腸を覆っている上皮細胞から生ずる全ての形態の癌をいう。
【００５６】
本明細書では、「バイオマーカー」は、大腸癌を有する被験体と正常ないし健康な被験体とを区別するのに有用な、被験体により生成された、遺伝子、遺伝子転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）、ペプチドもしくはタンパク質、またはそれらのフラグメントなどの分子をいう。
【００５７】
本明細書では、用語「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」，および「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｅ）」、「診断された（ｄｉａｇｎｏｓｅｄ）」または「診断すること（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」など（これらに限定されない）の変化形は、臨床状態の一次診断に限定されず、病気の再発の診断を含むと解釈されるべきである。
【００５８】
本明細書では、用語「被験体」は、大腸癌を発症し得る任意の動物をいい、哺乳動物、例えばヒト、またはネコおよびイヌ、マウス、ラット、ウサギまたはモルモットなどの実験動物、並びに家畜動物などのヒト以外の哺乳動物を含む。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【００５９】
「試料」は任意の適切なタイプのものであってもよく、例えば、バイオマーカーの存在またはレベルをその中で検出することができる物質といい得る。好ましくは、試料は、バイオマーカーの存在および／またはレベルをインビトロで検出することができるように、被験体から採取する。あるいは、バイオマーカーの存在および／またはレベルは、インビボで検出することもできる。試料は、採取源から直接得たままで、または少なくとも１段の（部分的）精製工程の後、使用することができる。試料は、本発明の方法を妨害しない、任意の好都合の媒体中で調製することができる。典型的には、試料は水溶液、体液、細胞または組織である。好ましくは、試料は、血液、血漿、血清、尿、血小板、巨核細胞または糞便である。前処理には、例えば、血液からの血漿の調製、粘稠な流体の希釈などが含まれ得る。処理法には、濾過、蒸留、分離、濃縮、妨害成分の不活性化および試薬の添加が含まれ得る。検査前の生物学的試料の選択および前処理については、この分野でよく知られており、さらに説明する必要はない。
【００６０】
本明細書では、用語「「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」には、大腸癌の発生もしくは進行を減じるかもしくは遅らせる、または大腸癌の少なくとも１つの症状を緩和するかもしくは除くことができる、治療上有効な量の化合物を投与することが含まれる。
【００６１】
バイオマーカー
本発明者らは、被験体の試料中の少なくとも２種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定すれば、ＦＯＢＴで達成されるのと同等もしくはそれより高い特異度および感度でデユークスＡでの早期発見、またはデユークスＢもしくはＣもしくはＤなどの後期での大腸癌の検出または診断が可能になることを示した。本発明の方法に有用な少なくとも２種のバイオマーカーは、ＩＬ−８（インターロイキン−８）、ＩＧＦＢＰ２（インスリン様成長因子結合タンパク質−２）、ＭＡＣ２ＢＰ（ＭＡＣ２結合タンパク質；血清蛋白質９０Ｋ）、Ｍ２ＰＫ（ピルビン酸キナーゼマッスル２、ピルビン酸キナーゼ３）、ＩＬ−１３（インターロイキン−１３）、ＤＫＫ−３（ディックコップ同族体、３）、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＭＩＰ１β（マクロファージ炎症性タンパク質１β、ＣＣＬ４、ＭＩＰ１ベータ）、ＴＧＦβ１（形質転換成長因子β１、ＴＧＦベータ１）およびＴＩＭＰ−１（組織メタロプロテアーゼ阻害物質１）から選択される。これらのバイオマーカーに対する言及には、当業者に知られているように、アイソフォーム、転写産物変異体など、全てのポリペプチドおよびポリヌクレオチドの変異体に対する言及を含むものとする。各バイオマーカーの代表的配列のＮＣＢＩアクセス番号を表１に示す。
2013533977.tif 000002
【００６２】
大腸癌の検出または診断
これまでの説明で、本発明の診断方法が、患者の試料中のバイオマーカーレベルを測定する一定の定量化を含み得ることは明らかであろう。そのような定量化は、適切な対照試料の使用により容易に提供される。
【００６３】
一実施形態では、本発明の方法に内部対照が含まれる。好ましい内部対照は１人以上の健康な個体から採取された１つ以上の試料である。
【００６４】
これに関連して、用語「健康な個体」は、大腸癌に罹っていないことが分かっている個体を意味すると解釈すべきであり、そのような知識は、その個体の臨床データから得られ、それには、限定はされないものの、本明細書に記載した診断法とは異なる方法の評価が含まれる。
【００６５】
当業者には知られているであろうが、実施される各検査で内部参照が含まれていない場合、対照は、確立されているデータセットから得ることができる。
【００６６】
対照被験体のデータは、
１．大腸癌に罹っていることが分かっている被験体の典型的母集団を対象としたバイオマーカーの存在または発現レベルの測定結果を含むデータセット；
２．検査される被験体を対象としたバイオマーカーの存在またはレベルの測定結果を含むデータセットであって、前記測定が、例えば、その被験体が健康であることが分かっていたとき、または、被験体が大腸癌に罹っている場合に、その被験体が診断を受けたとき、もしくは病気の進行の非常に早い段階のときなどの、以前に行われたものであるデータセット；
３．健康な個体または健康な個体群を対象としたバイオマーカーの存在またはレベルの測定結果を含むデータセット；および
４．正常な個体または正常な個体群を対象としたバイオマーカーの存在またはレベルの測定結果を含むデータセット；
からなる群から選択することが好ましい。
【００６７】
これに関連して、大腸癌であることが分かっている被験体に関する用語「典型的母集団」は、大腸癌と診断された被験体の、多様な大腸癌患者を代表する母集団または標本をいうと解釈されるべきである。これについては、こうした分布にはいくらかの変動が許容されるため、母集団中の形態学的または臨床病理学的パラメータに対して厳密な正規分布を要求するものと解釈されるべきではない。「典型的母集団」は、病気の進行が異なるステージにある多様な大腸癌を示すことが好ましい。「典型的母集団」は、本明細書に記載するように、被験体コホートの発現特性を示すことが特に好ましい。
【００６８】
用語「正常な個体」は、試料中にバイオマーカーを発現しないか、またはバイオマーカーの発現レベルが低い個体を意味するものと解釈されるべきである。当業者には知られているであろうように、十分に大きい母集団から得られたデータは、正規化され、特定のバイオマーカーの平均レベルを測定するためのデータセットを生成することが可能になる。
【００６９】
当業者であれば、本明細書に示された教示に基づき、必要以上の実験を行わずに、本発明の診断検査法における比較のためのベースラインを容易に決定することができる。
【００７０】
診断に使用されたときにバイオマーカーに結合する化合物を、検出可能な標識などの診断試薬と結合させて、その結合が起きたことをインビトロまたはインビボで容易に検出できるようにすることができる。適切な標識としては、標的分子の検出および／または位置特定用の放射性同位物質、染料マーカーまたは他のイメージング試薬が挙げられる。検出可能な標識と結合した化合物は、例えば、放射線医学、蛍光透視、核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、ＣＡＴスキャン、陽電子放出型コンピュータ断層撮影（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影などの適切なインビボイメージング技術とともに使用することができる。
【００７１】
本発明の診断法は、ＦＯＢＴと少なくとも同等かまたはそれより高い感度および特異度で大腸癌を診断または検出することができる。当業者は理解しているであろうが、感度は、診断検査で大腸癌であると正しく診断される、実際の陽性割合をいう。特異度は、大腸癌でないと正しく診断される、陰性の割合を測定する。一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも５０％、６０％もしくは６６％、または少なくとも７７％、８０％、８３％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、もしくは少なくとも９３％の感度で大腸癌を診断または検出することができる。他の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の感度で、大腸癌を診断または検出することができる。
【００７２】
一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％の特異度で、大腸癌を診断または検出することができる。
【００７３】
有利なことに、本発明の方法は、全てのデュークス病期で、ＦＯＢＴより高い感度で大腸癌を検出することができる。デュークスＡでは、腫瘍は腸壁に浸入しているが、貫通はしていない。デュークスＢでは、腫瘍は腸壁を貫通しているが、リンパ節に達するまでには至っていない。デュークスＣでは、局部的にリンパ節に達している。デュークスＤでは、離れた、例えば肝臓または肺にまで転移している。一実施形態では、本発明の方法は、任意のデュークス病期の大腸癌を少なくとも８０％の感度で診断または検出することができる。
【００７４】
当業者に知られているように、この分野で知られている癌の病期を分類する他の系がある。一例を挙げれば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ：Ｃｏｌｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｔｕｍ．  ｉｎ  Ｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ；ＡＪＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ，７ｔｈ  ｅｄ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１０，ｐｐ：１４３−１６４）により使用されているＴＭＮ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｔｕｍｏｒｓ（ＴＮＭ）がある。他の例としては、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｓｔｌｅｒ−Ｃｏｌｌｅｒ分類（ＭＡＣ）がある。
【００７５】
したがって、当業者であれば、デュークス病期が、あるＴＮＭ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎと対応していることを認識するであろう。例えば、デュークスＡはＴ１、Ｔ２、Ｎ０およびＭ０に対応し；デュークスＢはＴ３、Ｔ４ａ、Ｔ４ｂ、Ｎ０およびＭ０に対応し；デュークスＣはｉ）Ｔ１〜Ｔ２、Ｎ１／Ｎ１ｃ、Ｍ０；ｉｉ）Ｔ１、Ｎ２ａおよびＭ０；ｉｉｉ）Ｔ３〜Ｔ４ａ、Ｎ１／Ｎ１ｃおよびＭ０；ｉｖ）Ｔ２〜Ｔ３、Ｎ２ａおよびＭ０；ｖ）Ｔ１〜Ｔ２、Ｎ２ｂおよびＭ０；ｖｉ）Ｔ４ａ、Ｎ２ａおよびＭ０；ｖｉｉ）Ｔ３〜Ｔ４ａ、Ｎ２ｂおよびＭ０；ならびにｖｉｉｉ）Ｔ４ｂ、Ｎ１〜Ｎ２およびＭ０に対応する。このように、当業者であれば、本明細書で使用されているようなデュークス病期への言及が、この分野で知られているような、対応するＴＭＮ分類への言及を含んでいることを理解するであろう。
【００７６】
タンパク質検出手法
一実施形態では、バイオマーカーポリペプチドが患者の試料中に検出され、試料中のそのポリペプチドの存在および／またはレベルが大腸癌の指標になる。例えば、その方法は、被験体から得た生物学的試料をバイオマーカーポリペプチドと結合し得る化合物と接触させるステップと、その化合物とバイオマーカーポリペプチドとの複合体の生成を検出するステップとを含むことができる。用語「バイオマーカーポリペプチド」は、本明細書では、例えばバイオマーカーポリペプチドの免疫原性フラグメントやエピトープなどの、バイオマーカーポリペプチドのフラグメントを含む。
【００７７】
一実施形態では、バイオマーカーに結合する化合物は抗体である。
【００７８】
用語「抗体」は、本明細書では、完全な分子、およびそのフラグメントを含むか、またはそのフラグメントからなる分子、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖ、ならびに、エピトープ決定基と結合することができる二重特異性抗体、三重特異性抗体、ミニ抗体、単一ドメイン抗体などの遺伝子工学によって作られた変異体などを含む。したがって、抗体は、完全な免疫グロブリンとして存在してもよく、または各種形態の改変体として存在してもよい。
【００７９】
他の実施形態では、バイオマーカーポリペプチドに対する抗体が、患者の試料中に検出され、試料中のその抗体の存在および／またはレベルが大腸癌の指標になる。
【００８０】
本明細書で考えられている好ましい検出システムには、ヒト被験体から分離された生物学的試料中のタンパク質または抗体を検出する任意の公知の分析法、例えば、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、分画電気泳動、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび分画電気泳動を含む２次元ゲル電気泳動、免疫測定法、例えば蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー、例えば小分子などの抗体または非抗体化合物（例えば、化学化合物、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック調節剤、タンパク質の競合的阻害剤または非競合的阻害剤など）を使用する検出ベースのシステムなどの、公知の分析法が含まれる。これらの実施形態によれば、抗体または小分子は、タンパク質の検出に適した標準的な固相または液相分析フォーマットで使用することができる。例えば、質量分析計、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、バイオセンサー技術、エバネッセントファイバー光学または蛍光共鳴エネルギー転移などを使用する光または蛍光検出は、明らかに本発明に包含される。大量の試料の高速スクリーニングで使用するのに適した分析システム、例えば、高速分光共鳴法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、エレクトロスプレーＭＳ、またはナノ−エレクトロスプレーＭＳ）もまた考えられる。他の適切なタンパク質検出手法としては、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）内蔵ＬＣ−ＭＳ（ＬＣ／ＭＲＭ−ＭＳ）の使用がある（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ，２００６）。
【００８１】
例えば、免疫ブロット、ウェスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法からなる群から選択される免疫測定法フォーマットは特に適している。蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）、同位体コードアフィニティタグ法（ＩＣＡＴ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間法（ＭＡＬＤ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、バイオセンサー技術、エバネッセントファイバー光学技術またはタンパク質チップ技術を用いた修正された免疫測定法もまた有用である。
【００８２】
核酸検出手法
試料中のバイオマーカーポリヌクレオチドのレベルの定性的および／または定量的評価ができる任意の適切な手法を使用することができる。用語「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書では、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはこれらのフラグメントをいう。
【００８３】
健康な組織に見出される標準対照物質または対照物質レベルを参照することにより、比較を行うことができる。例えば、転写遺伝子レベルは、ノーザンブロット法および／またはＲＴ−ＰＣＲ法により測定することができる。定量（実時間）ＰＣＲの出現によって、目的の遺伝子に対して適切なプライマーを使用すれば、遺伝子発現の定量的分析を行うことが可能である。核酸に標識を付け、遺伝子配列上でハイブリダイズすることができるが、この場合、遺伝子の濃度は配列中で発生する放射性または蛍光信号の強度に正比例するであろう。
【００８４】
ヌクレオチド配列の直接配列決定法は、当業者にはよく知られており、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ，（１９９５）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２００１）に見出すことができる。配列の決定は、任意の適切な方法、例えば、ジデオキシ配列決定法、化学的配列決定法またはこれらの変形法により行うことができる。直接配列決定法は、特定の配列の任意の塩基対における変化を決定できるという利点を有する。
【００８５】
本発明を実施する際に使用することができる他のＰＣＲ法としては、ハイブリダイゼーションベースのＰＣＲ検出システム、ＴａｑＭａｎ分析法（米国特許第５，９６２，２３３号明細書）および分子標識分析法（米国特許第５，９２５，５１７号明細書）が挙げられる。
【００８６】
核酸を、検査のために試料から分離することができる。当業者であれば、適切な方法を知っていよう。例えば、ＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮの技術により提供されているものなど、従来の方法を使用して、分析のために試料から分離することができる。その後、このＲＮＡを、逆転写酵素を使用してＤＮＡに逆転写し、その後、当該ＤＮＡ分子を特定のプライマーを使用してＰＣＲ手法により増幅させることができる。
【００８７】
診断もまた、患者の試料に対して直接行うことができる。例えば、サザンブロットまたはノーザンブロット分析などのハイブリダイゼーションまたは増幅分析法、免疫組織化学法、一本鎖立体配座多形分析法（ＳＳＣＰ）およびＰＣＲ分析法は、この点において有用な手法に含まれる。必要ならば、標的またはプローブ核酸は、マイクロタイタープレート、膜、ポリスチレンビーズ、ガラススライドまたは他の固相などの固体担体に固定することができる。
【００８８】
キット
本発明は、大腸癌の診断または検出用のキットを提供する。そのようなキットは、上述したように、核酸種、あるいはポリペプチド遺伝子生成物の検出に適したものとなり得る。
【００８９】
ポリペプチドの検出では、キット構成物として抗体が最も典型的に使用されるであろう。しかしながら、バイオマーカー遺伝子生成物に特異的に結合することができる任意の薬剤を、本発明のこの態様においては有用であろう。キットの他の構成物としては、発現レベルの定量化および／または診断実験が正しく行われた否かの評価をユーザーが行うことができるようにするために、標識、二次抗体、基質（遺伝子が酵素ならば）、阻害剤、補助因子および対照用遺伝子生成物調製物が、一般に含まれるであろう。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）に基づく検査、および競合ＥＬＩＳＡ法検査が、キット構成物を使用して当業者が容易に実施することができる、特に適した検査法である。
【００９０】
任意選択により、キットは、バイオマーカーポリペプチドへの抗体の結合を検出する手段をさらに含んでもよい。そのような手段には、例えば、酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、またはアルカリホスファターゼなど）、染料、放射化ヌクレオチド、発光基、蛍光基、ビオチンまたはコロイド状の金もしくはセレンなどのコロイド粒子などのレポーター分子が含まれる。そのようなレポーター分子は抗体に直接結合することが好ましい。
【００９１】
さらに他の実施形態では、キットは対照試料をさらに含んでもよい。一実施形態では、対照試料は、抗体により検出されるポリペプチドを含む。ポリペプチドは、濃度が知られたものであることが好ましい。そのようなポリペプチドは、標準物質として特に有用である。したがって、本明細書中に記載した診断分析法を使用して、そのようなポリペプチドの各種既知濃度を検出することができる。
【００９２】
核酸の検出では、そのようなキットは、オリゴヌクレオチドプローブを含有するバイアルもしくはプラスチックチューブ、またはマイクロタイタープレートなどの第１の容器を含むことができる。キットは、任意選択により、プライマーを保持する第２の容器を含むことができる。プローブは、変化した発現が大腸癌と関係するＤＮＡにハイブリダイズすることができ、プライマーはこのＤＮＡを増幅するのに有用である。固体担体に固定されたオリゴヌクレオチドプローブを含むキットはまた、例えば、配列を使用して開発することができよう（２１（１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９９の補遺を参照）。
【００９３】
核酸のＰＣＲ増幅では、本明細書で説明したように、バイオマーカー遺伝子の少なくとも一部に相補的な核酸プライマーを、キットに含んでもよい。このプライマーのセットには、通常、ＤＮＡを特異的に増幅することができる少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、好ましくは４つのオリゴヌクレオチドが含まれる。定量的なＰＣＲ測定を可能にするであろう蛍光標識オリゴヌクレオチドが含まれていてもよい（例えば、ＴａｑＭａｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）。ＤＮＡの増幅に適した酵素もまた、含まれるであろう。
【００９４】
比較または検証の目的で、対照用核酸を含まれていてもよい。そのような対照物質は、健康な組織、もしくは健康な個体から採取したＲＮＡ／ＤＮＡか、または大腸癌によってｍＲＮＡレベルが影響を受けないβアクチンもしくはＧＡＰＤＨなどのハウスキーピング遺伝子であろう。
【００９５】
回帰アルゴリズムと統計
大腸癌の診断または検出に適したバイオマーカーのパネルを作成するために、本発明者らは多数のバイオマーカーを統計モデルで解析した。そのような検査パフォーマンスの向上は、しばしば「インサンプル」パフォーマンスと呼ばれる。検査の公正な評価には、アウトオブサンプル被験体、すなわち、最初の予測モデル構築の際には含まれていない被験体を使用した評価が求められる。これは、交差確認により検査パフォーマンスを評価することにより行われる。
【００９６】
統計的有意性の検査としては、ＡＮＯＶＡ法、クラスカル・ウォリス検定、ウィルコクソン検定、マン・ホイットニー検定およびオッズ比検定、ベイズ確率アルゴリズムなどの線形および非線形回帰が挙げられる。しかしながら、測定するバイオマーカーの数が増加するにつれて、２、３例を挙げれば、ランダムフォレスト法、単純ロジスティック、ベイズネットなどの、より高機能の手法を使用することが一般に好都合であると言える。
【００９７】
例えば、ベイズ確率を採用することができる。この場合、対象モデルの「アウトオブサンプル」パフォーマンスを推定するのに１０分割交差確認を使用することができる。考慮下のバイオマーカーの各組み合わせについて、データを１０個のサブ標本にランダムに分割することができ、それぞれが健康な被験体と各病期の被験体とで類似の割合を有する。各サブ標本を順に排除することができ、残りの９０％の被験体を使用してロジスティックモデルを構築する。その後、このモデルを使用して、排除したサブ標本に対する癌の確率を推定することができ、「アウトオブサンプル」のパフォーマンスを推定することができる。残りの９個のサブ標本に対して、これを繰り返すことにより、調査データそれ自身から「アウトオブサンプル」のパフォーマンスを推定することができる。これらのアウトオブサンプルで予測された確率を、その後、被験体の実際の病状と比較して、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成することができ、この曲線から、９５％特異度における交差確認した感度を推定し得る。
【００９８】
交差確認（または、他の方法）による「アウトオブサンプル」パフォーマンスの各推定は、不偏性を有するとしても、それに対する変異性の要素を有している。したがって、モデルのランキング（バイオマーカーの組み合わせに基づく）は、そのようなモデルの相対的パフォーマンスについてのみ指標となるものである。しかしながら、「アウトオブサンプル」のパフォーマンス評価を通して示したように、診断検査を行うために多数の組み合わせの中で使用することができるバイオマーカーのセットは、繰り返しの評価に耐えられるであろうバイオマーカーの組み合わせを、それ自身の中にほぼ確実に含んでいる。
【００９９】
多くの異なる組み合わせが、有用で、対費用効果が高く、所与の特異度に対して許容される感度を有する診断検査として適格であり得る。一例として、ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫおよびＤＫＫ−３の５種のバイオマーカーを考えよう。癌を有する被験体と健康な対照とを区別するモデルは、次のようであり得る。
2013533977.tif 000003
【０１００】
ここで、ｐは個人が癌に罹っている確率を表す。各Ｃｉは個人の血漿（または血清）中のバイオマーカーｉの濃度の対数である。各ベータ（β）は、バイオマーカーが測定された濃度単位で、そのバイオマーカーに適用される係数であり、β０は「オフセット」または「切片」である。この線形ロジスティックモデルは本明細書で提示した全ての結果に共通であるが、癌の確率を予測するためにバイオマーカー濃度の組み合わせをモデル化し得る唯一の方法からは隔たりがある。
【０１０１】
同等に適用できるであろう他の非線形または線形ロジスティックアルゴリズムとしては、ランダムフォレスト法、ＡＮＯＶＡ法、ｔ検定、フィッシャー解析、サポートベクターマシーン法、マイクロアレイデータのための線形モデル（ＬＩＭＭＡ）および／またはマイクロアレイデータの有意性解析（ＳＡＭ）、ベストファースト法、グリーディ・ステップワイズ法、ナイーブベイズ法、リニアフォワードセレクション法、散乱探索法、線形判別分析（ＬＤＡ）、ステップワイズロジスティック回帰法、受信者動作特性法および分類木法（ＣＴ）が挙げられる。
【０１０２】
このように、本明細書における教示を踏まえれば、本明細書で説明したようにバイオマーカーの異なる組み合わせを選択することにより、大腸癌診断検査の感度および特異度を調節できることを、当業者であれば認識するであろう。
【０１０３】
知識ベースシステム
本明細書中の考察から、アルゴリズムを実行する知識ベースのコンピュータソフトウェアおよびハードウェアもまた、本発明の一部を構成することは明らかであろう。そのようなコンピュータソフトウェアおよび／またはハードウェアは、本発明の大腸癌の診断または検出方法にとって有用である。したがって、本発明はまた、疾患スコアを提供し、かつ大腸癌の診断または検出を提供または可能とし、かつ／または大腸癌の進行または病状を決定し、または大腸癌が既に進行しているか否かを決定し、または疾患スコアの結果を所定の値と比較して施される大腸癌の治療に被験体が応答しているか否かを決定するために、多変量解析により本発明の方法を実施することによって得られたデータを処理するアルゴリズムを実行するようプログラムされたソフトウェアまたはハードウェアを提供する。
【０１０４】
一例を挙げれば、本発明の方法は、病理学的サービスに関係した、既存の知識ベースアーキテクチャーまたはプラットフォームで使用することができる。例えば、本明細書に記載した方法で得られた結果は、通信ネットワーク（例えば、インターネット）経由で、アルゴリズムが格納されている処理システムへ伝達され、予測事後確率値を計算するために使用される。この確率値は、病気の可能性、または再発もしくは転移のリスク、または処置への応答性のスコアに変換された後、診断または予測報告書の形式でエンドユーザーに送付される。
【０１０５】
したがって、本発明の方法は、バイオマーカーの濃度の検出に必要な試薬、ならびに、測定および臨床医への報告書の送付を容易にするコンピュータハードウェアおよび／またはソフトウェアを含む、キットまたはコンピュータベースのシステムの形態を採り得る。
【０１０６】
本発明の分析法は、既存の、または新規に開発された病理学的アーキテクチャーまたはプラットフォームシステムへの統合化が可能である。例えば、本発明は、ユーザーに被験体の大腸癌の状態を測定させる方法であって、
（ａ）容易に得られた試料中の、ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＥｐＣａｍ、ＭＩＰ１β、ＴＧＦβ１およびＴＩＭＰ−１から選択される少なくとも２種のバイオマーカーのレベル形態のデータを、任意選択により大腸癌の他のマーカーのものと組み合わせて受け取るステップ；
（ｂ）多変量解析（例えば、回帰分析）により被験体のデータを処理して、疾患スコアを提供するステップ；
（ｃ）疾患スコアの結果を所定の値と比較して、被験体の状態を決定するステップ；および
（ｄ）被験体の状態に関する表示を通信ネットワークを通じてユーザーに送付するステップ
を含む方法を考慮している。多変量解析への言及には、多変量解析機能を実行するアルゴリズムが含まれる。
【０１０７】
一実施形態では、本発明の大腸癌を診断または検出する方法は、本明細書に記載したように、患者から血液試料を採取し、１種以上のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定することにより実施することができる。測定は、必要に応じて、複数のバイオマーカーの存在および／またはレベルの測定を一回の分析で行うことができるように、例えばバイオチップで行うことができる。この分析結果は、その後、それらを線形回帰分析するコンピュータプログラムに入力することができる。コンピュータがまた、対照の値または予想される範囲に関する情報を含むか、あるいは臨床医、看護師、医療管理職員または一般開業医がそのようなデータを入力できよう。その結果、この分析により大腸癌のスコアまたは可能性が提供される。患者に対する２回目の検査が行われれば、回帰分析はスコアの変化を示し、それにより、患者の病気の進行または悪化を知ることができる。
【実施例】
【０１０８】
材料と方法
患者の試料
複数の病院で治療中の大腸癌患者（デュークスＡ〜Ｄ）のコホートから、血漿および血清を採取し、処理した。
【０１０９】
また、６５歳超の約５０人の健康なボランティア群および５０歳超の１５人の群からも血液を採取し、処理した。
【０１１０】
僅かに異なるバイオマーカーを用いて、４つの個別の調査を行った。調査１では５２個の癌試料および５０個の対照試料を扱い、調査２では５５個の癌試料および５３個の対照試料を扱い、調査３および４では９６個の癌試料および５０個の対照試料を扱った。調査２、３および４では、デュークス分類の全病期にわたって患者の年齢と性を一致させた。統計を要約した表２を参照されたい。
2013533977.tif 000004
【０１１１】
バイオマーカーの分析
市販のキットとソース付き抗体（ＤＳＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｄｕｏｓｅｔ、Ｃａｌｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ａｂｎｏｖａ、Ｇｅｎｗａｙ、Ｐｅｖｉｖａ、Ｓｃｈｅｂｏ、Ｂｅｎｄｅｒ）を用い、ＥＬＩＳＡまたはＬｕｍｉｎｅｘ分析法により、バイオマーカーの分析を行った。
【０１１２】
統計的評価およびパネルバイオマーカーのモデル化
それぞれの分析法の結果を、統計ソフトウェアパッケージのＰｒｉｓｍおよび「Ｒ」を使用して解析した。ノンパラメトリック・マン−ホイットニーｔ検定を使用してマーカーの個々のパフォーマンスを評価し、個々の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した。
【０１１３】
対照と大腸癌患者を最もよく区別するバイオマーカーの組み合わせを見出すために、ロジスティック回帰および関連するモデル化ストラテジーを使用した。同じ試料／アリコットを用いて４つの個別の調査を行った。これらのそれぞれの結果を下に示す。
【０１１４】
調査１、２および３の結果
調査１、２および３で測定のために選んだバイオマーカーを表３に示す。太字で示したバイオマーカーは、それぞれの調査から期待できるものとして同定されたものである（すなわち、それらは大腸癌患者と対照とで試料に相当の違いがあり、かつ／または、対照と大腸癌とを区別するバイオマーカーの組み合わせパネルで同定されたものである）。
2013533977.tif 000005
【０１１５】
統計的評価およびパネルバイオマーカーのモデル化
対照と大腸癌患者とを最もよく分けるバイオマーカーの組み合わせを見出すために、オーバーフィッティングを避けるため対数尤度にペナルティを課したベイズ情報量基準を使用した前進変数選択法を適用した。独立したデータセットに対するバイオマーカーパネルのパフォーマンスの見込みを推定するために、「ｎ分割］または「リーブ−ワン−アウト（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ）」交差確認を行った。この手順では、全体のモデルフィッティングアルゴリズムを残りのオブザベーションに適用しながら、１度に１つのオブザベーションを排除した。
【０１１６】
得られたモデルを、その後、排除されたオブザベーションが一例となる確率を推定するために使用した。データセットの各オブザベーションについてこれを繰り返した。このように、各オブザベーションを、モデル構築アルゴリズムの独立した検査として順に行った。それぞれが「独立して予測された」症例確率を有する症例と対照からなる得られたデータセットは、その後、オリジナルのモデルと比較することができる。多数のバイオマーカーから選択し、それらに適切な重み付けをする能力によって、ＲＯＣ曲線上の目的の領域におけるパフォーマンスを最適化する探索ストラテジーが可能になる。特異度が低いことの代償は、多数の不必要な大腸内視鏡検査である。
【０１１７】
調査３では、バイアスを避けるために、プレート内でのブロックランダム化を行って、４８種の可能性のあるバイオマーカーを評価し、大腸癌バイオマーカーの候補パネルを選択した。この４８種のリストから、４２種のみが測定可能なレベルを示した。ｔ検定で評価すると、個々には、１４種のバイオマーカーが、対照とＣＲＣとで有意の差を示した（ＩＧＦＩＩ、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−７、ｓ９０／Ｍａｃ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＥｐＣａｍ、ＴＩＭＰ−１（血清および血漿）、Ｍ６５、ＯＰＮ、ＴＧＦβ１、ＶＥＧＦｐａｎ）。予想されたように、単独では、バイオマーカーとして有用とされる十分な感度または特異度を有するものはなかった（示さず）。しかしながら、対数値の使用など、多様なモデル化ストラテジーを使用すると、特に初期から後期の病気で、ＦＯＢＴのパフォーマンスを超える数種類の異なるバイオマーカーのパネルが見出された。
【０１１８】
図１に、ＩＬ８、（血清）、ＩＬ−１３（血清）、ＥｐＣＡＭ（血漿）、Ｍ２ＰＫ（血漿）、ＩＧＦＢＰ２（血清）およびＭａｃ２ＢＰ（血清）を含み、交差確認を行って独立した試料に対するパフォーマンスを予測した７種のバイオマーカーパネルの結果を示す。
【０１１９】
少なくとも概念的には、
2013533977.tif 000006
で表される、この７種のバイオマーカーモデルは、高特異度で良好なパフォーマンスを示し、交差確認において頑強である。血漿中のこのバイオマーカーの組み合わせに対して最良のモデルを与えると推定される係数を表４に示す。パフォーマンス統計を表５に示す。このパフォーマンスはＦＯＢＴに付された値（感度６５．８％、特異度９５％）を超えている（Ｍｏｒｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
2013533977.tif 000007
2013533977.tif 000008
【０１２０】
このモデルをまた、別に、大腸癌の各病期（デュークスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）の患者に適用したところ、各病期で同等の良好なパフォーマンスを示した（図２）。ＡＵＣは０．８８〜０．９３であり、大腸癌の全ての病期をほぼ等しく良好に区別できた。このモデルは、病期Ｃに対して特異度９０％で最も高い感度９０％を示し、病期Ｂに対して特異度９０％で最も低い感度７３％を示す（表６）。
2013533977.tif 000009
【０１２１】
調査４（「調査３の再測定」とも称する）
調査４では、調査３と同じコホートで１０種のバイオマーカーを再測定した。９６人の大腸癌患者および５０人の正常な被験体（対照群）から血液を採取した。この調査では、１０種のバイオマーカー、すなわち、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ８、ＩＬ１３、Ｍａｃ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、Ｄｋｋ３、ＥｐＣａｍ、ＴＧＦベータ１、ＴＩＭＰ−１、ＭＩＰ１ベータに焦点を当てた。前述したように分析を行った。各バイオマーカーの血清および血漿中のレベルを共に測定し、対照の値と比較した。
【０１２２】
ペア（２種のマーカー）でモデル化したとき、全部で５組のペア（上記１０種のバイオマーカーのリストから選択された、可能な４５組の組み合わせの中から）が９５％の特異度で５２％超の感度を有することが示された。表７および図３を参照されたい。
2013533977.tif 000010
【０１２３】
指定した３〜１０種のバイオマーカーの組み合わせを解析する場合、９６８の可能な組み合わせがある。３〜１０種のバイオマーカーの９６８の組み合わせは、３種のマーカーからなる１２０の組み合わせ；４種のマーカーからなる２１０の組み合わせ；５種のマーカーからなる２５２の組み合わせ；６種のマーカーからなる２１０の組み合わせ；７種のマーカーからなる１２０の組み合わせ；８種のマーカーからなる４５の組み合わせ；９種のマーカーの１０からなる組み合わせ；および１０種のバイオマーカー全てを含む１つの組み合わせからなる。線形ロジスティックモデルを使用してそれらをモデル化し、その後、１０分割交差確認により検査したところ、９６８の組み合わせの約半分が、９５％の特異度で５０％の感度を有していた。３種のバイオマーカーの組み合わせに対する結果である図４を参照されたい。これらの組み合わせの半分超は、９０％の特異度および５０％の感度を有するであろう。
【０１２４】
図５に、３〜１０種のバイオマーカーの可能な全ての組み合わせに基づく、可能な全９６８のモデルの検査について、４８５本全てのアウトオブサンプル（１０分割交差確認）の推定ＲＯＣ曲線を示す。各水平セグメントが１つの対照を、各垂直セグメントが１つの症例を表しているために、４８５本のＲＯＣ曲線の個々のセグメントの多くが一致していることに注意されたい。この場合、５０．１％の組み合わせで、感度５０％、特異度９５％を超えている。最良の推定「アウトオブサンプル」パフォーマンスは特異度９５％で感度７６％である。交差確認を繰り返すと、異なるセットのモデルを選択することになる―任意の１つの組み合わせの感度は、ランダムサンプリングのために、特異度９５％で１０％の変動があり得る−であろうが、しかし有用な「有用なスクリーニング検査」として類似の割合が得られるであろう。個々のモデルを厳密に検証するには、実験の繰り返しと大きなサイズの試料が必要である。
【０１２５】
図６に、感度５０％、特異度９５％を有する４８５の組み合わせ中、所与の任意のバイオマーカーを含むものの数を示す。最高値では、選択された４３２の「有用な」組み合わせが、Ｍ２ＰＫを含む。最低値では、選択された２２７の「有用な」組み合わせが、ＭＩＰ１ベータを含む。「有用な」モデルにおける１０種全てのマーカーのこの高い数値は、これら１０種のバイオマーカーの選択の統一性と自己相補性を示している。
【０１２６】
図７〜図１１は、試料が血漿または血清群のいずれかからのものであるモデルを含む、５種および７種のバイオマーカーの組み合わせに対する最後の調査（調査４）結果のいくつかを示す。図１１は、病気の進行の異なるステージで、３種のバイオマーカー（ＤＫＫ−３、Ｍ２ＰＫおよびＩＧＦＢＰ２）を選択することが有効であることを示している。データは、病期Ａで３種のマーカーを使用すれば、検査が、特異度９５％でなお、病気の後期で達成される感度（７９％）に匹敵する高い感度（６４％）を達成するであろうことを示している。すなわち、３種のバイオマーカーパネルは、病気の初期の状態を見つけ出し、早期検出を可能にするであろう。
【０１２７】
表８〜１６に、各種バイオマーカーパネルセットの各種組み合わせの結果を示す。使用した線形回帰や、コホート対照および試料起源、分析キット手法などの他の因子に応じて、実際の図またはマーカーの順序に変動があり得る。それにもかかわらず、これらの組み合わせの多くは、病気進行の任意のステージでの大腸癌の診断または検出に有用となるよう、高特異度で良好な感度を達成するであろう。
2013533977.tif 000011
2013533977.tif 000012
2013533977.tif 000013
2013533977.tif 000014
2013533977.tif 000015
2013533977.tif 000016
2013533977.tif 000017
2013533977.tif 000018
2013533977.tif 000019
【０１２８】
当業者であれば、広く記載された発明の範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示された発明に、多くの変更および／または修正を加え得ることは認識していよう。したがって、ここに示した実施形態は、あらゆる点において説明のためのものであって、限定するためのものではないと考えられるべきである。
【０１２９】
本明細書で説明および／または参照した全ての刊行物は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３０】
本出願は、オーストラリア特許出願第２０１０９０３１４０号明細書に基づく優先権を主張するものであって、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
本明細書に含まれている文献、法令、材料、デバイス、記事などについての説明は、単に本発明の背景を提供するためのものである。それが本願の各請求項の優先日の前に存在していたからといって、それらの事項の一部または全部が、先行技術の基礎の一部を形成するか、または本発明に関連する分野において共通の一般的知識であったということを認めたと受け取られるべきではない。
【０１３２】
参考文献
Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ  （２００６）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  ５：５７３−５８８．
Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ，  ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  （２００８）  ＡＩＨＷ  （Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ
Ｗｅｌｆａｒｅ）  ＆  ＡＡＣＲ  （Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｉｅｓ），  Ｃａｎｃｅｒ  ｓｅｒｉｅｓ  ｎｏ．  ４６，  Ｃａｔ．  Ｎｏ：  ＣＡＮ  ４２，  Ｃａｎｂｅｒｒａ：  ＡＩＨＷ．  
Ｅｔｚｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，  ３：２４３−２５２．
Ｈｕｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ，  １６：  １９３５−１９５３．  
Ｋｉｍｍｅｌ  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  １５２：５０７−５１１．
Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ８６：  １１７３−１１７７．  
Ｌｅｖｉｎ  （２００４）  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  １２７：  １８４１−１８４４．
Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  （２０１０）  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  １３８：２１１５−２１２６．
Ｍｏｒｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  １２９：４２２−４２８．
Ｎｏｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８：Ｅ６３．
Ｔｏｎｕｓ  （２００６）  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，  １２：７００７−７０１１．
Ｗａｈｌ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  １５２：３９９−４０７．
Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２ａ）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ８９：３９２−３９６．
Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２ｂ）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：  １６９１−１６９６．
【図１】
2013533977.tif 000020
【図２】
2013533977.tif 000021
【図３】
2013533977.tif 000022
【図４】
2013533977.tif 000023
【図５】
2013533977.tif 000024
【図６】
2013533977.tif 000025
【図７】
2013533977.tif 000026
【図８】
2013533977.tif 000027
【図９】
2013533977.tif 000028
【図１０】
2013533977.tif 000029
【図１１】
2013533977.tif 000030
【配列表】
2013533977000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年3月26日(2013.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の大腸癌を診断または検出する方法において、
ｉ）前記被験体の試料中に、ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＥｐＣａｍ、ＭＩＰ１β、ＴＧＦβ１およびＴＩＭＰ−１から選択される少なくとも３種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含み、
前記３種のバイオマーカーの存在および／またはレベルが、大腸癌の指標であることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、３種のバイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含み、前記３種のバイオマーカーは、
ｉ）ＤＫＫ−３、Ｍ２ＰＫおよびＩＧＦＢＰ２；
ｉｉ）Ｍ２ＰＫ、ＩＧＦＢＰ２およびＥｐＣＡＭ；
ｉｉｉ）Ｍ２ＰＫ、ＭＩＰ１βおよびＴＧＦβ１；または
ｉｖ）ＩＬ−８、ＩＬ−１３およびＭＡＣ２ＢＰ
であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、少なくとも４種の前記バイオマーカーの存在および／または発現レベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、少なくとも５種の前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、少なくとも６種の前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、少なくとも７種の前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、少なくとも８種の前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、少なくとも９種の前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、少なくとも１０種の前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１乃至１３の何れか１項に記載の方法において、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−ＢＰ２、アンフィレグリン、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＤ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、、ＴＩＭＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＭＡＣ２ＢＰ、腫瘍Ｍ２ピルビン酸キナーゼ、Ｍ６５、ＯＰＮ、ＤＫＫ−３、、ＴＧＦβ−１およびＶＥＧＦｐａｎから選択される少なくとも１種の追加のバイオマーカーの存在および／またはレベルを検出するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法において、少なくとも５０％の感度で大腸癌を診断または検出することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１５に記載の方法において、少なくとも６６％の感度で大腸癌を診断または検出することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１６に記載の方法において、少なくとも７７％の感度で大腸癌を診断または検出することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３の何れか１項に記載の方法において、少なくとも５０％の感度および少なくとも９５％の特異度でデュークスＡ大腸癌を診断または検出することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１乃至１４の何れか１項に記載の方法において、少なくとも６０％の感度および少なくとも８０％の特異度でデュークスＡ大腸癌を診断または検出することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１乃至１５の何れか１項に記載の方法において、少なくとも５０％の感度および少なくとも９０％の特異度でデュークスＡ大腸癌を診断または検出することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１乃至１６の何れか１項に記載の方法において、
ｉ）前記被験体の前記試料中の前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを測定するステップと、
ｉｉ）前記バイオマーカーの存在および／またはレベルを対照と比較するステップと、
を含み、前記試料における存在および／またはレベルが前記対照と異なることが、大腸癌の指標であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１乃至１７の何れか１項に記載の方法において、前記試料は、血液、血漿、血清、尿、血小板、巨核細胞または糞便を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
（ｉ）本発明の方法にしたがって大腸癌を診断または検出するステップと、
（ｉｉ）大腸癌を治療するための療法を施行、または勧奨するステップと、
を含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２０】
被験体の大腸癌に対する治療効果を観察する方法において、前記被験体の大腸癌を治療するステップと、その後、ＩＬ−８、ＩＧＦＢＰ２、ＭＡＣ２ＢＰ、Ｍ２ＰＫ、ＩＬ−１３、ＤＫＫ−３、ＥｐＣａｍ、ＭＩＰ１β、ＴＧＦβ１およびＴＩＭＰ−１から選択される少なくとも３種のバイオマーカーの前記被験体の試料中における存在および／またはレベルを検出するステップとを含み、治療前と比較して治療後の前記バイオマーカーの発現がない、および／または発現のレベルが低下していることが、治療の有効性の指標であることを特徴とする方法。
【国際調査報告】
2013533977.tif 000031
2013533977.tif 000032
2013533977.tif 000033
2013533977.tif 000034
2013533977.tif 000035