(57)【要約】  本発明は、ヒトＣＳＦ−１Ｒに高親和性で結合するヒト抗体を提供する。本発明の抗体は、多機能性：ＣＳＦ−１Ｒのシグナル伝達の阻害、内部移行およびＣＳＦ−１Ｒ分解の誘導、ならびに腫瘍、マクロファージおよび単球を含む細胞におけるＡＤＣＣの刺激であることによって当該技術分野における公知の抗体よりも有意な長所を有する。それらは、白血病、乳癌、子宮内膜癌および前立腺癌を、単独で、またはドセタキセル、パクリタキセル、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）もしくはドキソルビシンと組合わせて治療することにおいても効果的であることが示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＳＦ−１Ｒ変異体（配列番号１５）を特異的に結合し、配列ＳＹＧＭＨ（配列番号１）を含むＣＤＲＨ１、配列ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）を含むＣＤＲＨ２、配列ＧＤＹＥＶＤＹＧＭＤＶ（配列番号３）を含むＣＤＲＨ３、配列ＲＡＳＱＧＩＳＮＡＬＡ（配列番号４）を含むＣＤＲＬ１、配列ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）を含むＣＤＲＬ２、および配列ＱＱＦＮＳＹＰＷＴ（配列番号６）を含むＣＤＲＬ３を含む、抗体またはその断片。
【請求項２】
ヒトＣＳＦ−１Ｒ（配列番号１６）を特異的に結合し、配列ＳＹＧＭＨ（配列番号１）を含むＣＤＲＨ１、配列ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）を含むＣＤＲＨ２、配列ＧＤＹＥＶＤＹＧＭＤＶ（配列番号３）を含むＣＤＲＨ３、配列ＲＡＳＱＧＩＳＮＡＬＡ（配列番号４）を含むＣＤＲＬ１、配列ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）を含むＣＤＲＬ２、および配列ＱＱＦＮＳＹＰＷＴ（配列番号６）を含むＣＤＲＬ３を含む、抗体またはその断片。
【請求項３】
アミノ酸配列：
ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＮＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＮＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８）を含むＶＬ、
およびアミノ酸配列：
ＱＤＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＥＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＤＹＥＶＤＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＡＳ（配列番号７）を含むＶＨ
を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項４】
配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項５】
配列番号９のアミノ酸配列を各々含む２個の重鎖および配列番号１０のアミノ酸配列を各々含む２個の軽鎖を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項６】
薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体または断片を含む、医薬組成物。
【請求項７】
追加の医薬用薬剤をさらに含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
治療法における使用のための請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項９】
癌の治療における使用のための請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項１０】
前記癌が、白血病、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、腎臓癌、多発性骨髄腫またはホジキンリンパ腫である、請求項９に記載の使用のための抗体またはその断片。
【請求項１１】
前記癌が、白血病、乳癌、子宮内膜癌または前立腺癌である、請求項１０に記載の使用のための抗体またはその断片。
【請求項１２】
前記癌が、白血病、乳癌または前立腺癌である、請求項１１に記載の使用のための抗体またはその断片。
【請求項１３】
前記抗体またはその断片が、他の抗癌治療による治療法の開始の前、その間、実質的にそれと同時、またはその後に投与される、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。
【請求項１４】
前記抗癌治療が、抗血管新生剤、化学療法剤および抗新生物剤からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用のための抗体またはその断片。
【請求項１５】
前記抗新生物剤が、ドセタキセル、パクリタキセル、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびドキソルビシンからなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のための抗体またはその断片。
【請求項１６】
哺乳動物において癌を治療する方法であって、有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を、それを必要とする前記哺乳動物に対して投与することを含み、前記癌が、白血病、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、腎臓癌、多発性骨髄腫およびホジキンリンパ腫からなる群から選択される、方法。
【請求項１７】
前記癌が、白血病、乳癌、子宮内膜癌および前立腺癌からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌が、白血病、乳癌および前立腺癌からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物に他の抗癌治療を投与することをさらに含み、該抗癌治療が、抗血管新生剤、化学療法剤および抗新生物剤からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗新生物剤が、ドセタキセル、パクリタキセル、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびドキソルビシンからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（１）サンプルを血液、血清、血漿、腫瘍細胞および循環性腫瘍細胞からなる群から選択し、患者から採取した前記サンプルにおけるＣＳＦ−１のレベルを測定する工程、および（２）ＣＳＦ−１レベルが対照集団において見出されるＣＳＦ−１レベルよりも高いならば、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を前記患者に対して投与する工程を含む、患者における癌を治療する方法。
【請求項２２】
（１）サンプルを血液、血清、血漿、腫瘍細胞および循環性腫瘍細胞からなる群から選択し、患者から採取された前記サンプルにおけるＩＬ−３４のレベルを測定する工程、および（２）ＩＬ−３４レベルが対照集団において見出されるＩＬ−３４レベルよりも高いならば、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を前記患者に対して投与する工程を含む、患者における癌を治療する方法。
【請求項２３】
癌を有する被験体が抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ベースの癌治療レジメンのための候補かどうかを決定する方法であって、該抗体が請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体であり、該方法が、
サンプルを血液、血清、血漿、腫瘍細胞および循環性腫瘍細胞からなる群から選択し、前記被験体の前記サンプルにおけるＣＳＦ−１のレベルをエクスビボまたはインビトロで決定することを含み、
癌を患わない個体におけるＣＳＦ−１のレベルと比較して、ＣＳＦ−１のレベルの増加は前記被験体が抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ベースの癌治療レジメンのための候補であることを示す、方法。
【請求項２４】
癌を有する被験体が抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ベースの癌治療レジメンのための候補かどうか決定する方法であって、該抗体は請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体であり、該方法は、
サンプルを血液、血清、血漿、腫瘍細胞および循環性腫瘍細胞からなる群から選択し、前記被験体の前記サンプルにおけるＩＬ−３４のレベルをエクスビボまたはインビトロで決定することを含み、
癌を患わない個体におけるＩＬ−３４のレベルと比較して、ＩＬ−３４のレベルの増加は前記被験体が抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ベースの癌治療レジメンのための候補であることを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年４月１日に出願された米国仮出願第６１／３１９，８９６号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は免疫学および癌治療の分野に関する。より具体的には、本発明は、ヒトコロニー刺激因子−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）に結合するヒト抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｍ−ＣＳＦＲまたはＣＤ−１１５としても公知の、ｃ−ｆｍｓ遺伝子によってコードされるコロニー刺激因子−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）（ヒトＣＳＦ−１Ｒ変異体；配列番号１５）（ヒトＣＳＦ−１Ｒ；配列番号１６；Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０７３３３）は、正常な個体におけるマクロファージおよび顆粒球の細胞系譜上で、ならびに癌中の腫瘍細胞上で選択的に発現されるチロシンキナーゼ受容体である。２個の公知のリガンドがあり、それらはＭ−ＣＳＦとして公知のコロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）（ヒトＣＳＦ−１；配列番号１７）（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０９６０３）、およびＩＬ−３４（ヒトＩＬ−３４；配列番号１８）（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＺＭＪ４）であり、ＣＳＦ−１Ｒの細胞外ドメインに結合する。ＣＳＦ−１またはＩＬ−３４の結合に際して、ＣＳＦ−１Ｒは二量体化し、受容体のトランスリン酸化ならびにＭＡＰＫおよびＡｋｔ等の下流のシグナル分子のリン酸化および活性化をもたらす。ＣＳＦ−１Ｒのリン酸化は、（１）マクロファージの増殖および造血系祖先幹細胞からの分化、ならびに（２）マクロファージの生存および身体中の様々な臓器および組織、特に腫瘍間質への移動をもたらす。ＣＳＦ−１Ｒは、腫瘍細胞の表面上でも発現し得る。
【０００４】
マウスＣＳＦ−１Ｒに対する抗体はヒトにおいて交差反応せず、したがってヒトにおける癌の治療については効果がない治療法であるだろう。
【０００５】
ＣＳＦ−１Ｒに対するヒト抗体は特許文献１中で開示される。かかる抗体は、抗体によって結合された細胞に対して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を誘導しない。抗原を発現する細胞（標的細胞）に抗体が結合し、ナチュラルキラー細胞、単球、好中球および樹状細胞（エフェクター細胞）上でのＦｃ受容体への結合のために抗体のＦｃ領域が利用可能にされたときにＡＤＣＣが生じる。特許文献１中で開示された抗体は、標的細胞とエフェクター細胞が一緒に標的細胞の殺傷を開始するように導くことができない。
【０００６】
リガンドに対する抗体は交差反応性ではない。それゆえ、ＣＳＦ−１に対する抗体はＣＳＦ−１ＲへのＩＬ−３４結合を阻害せず、ＩＬ−３４に対する抗体はＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１結合を阻害しない。受容体へのリガンド結合は癌増殖に対する効果を有し得る。加えて、リガンドに対する抗体は内部移行せず、ＣＳＦ−１Ｒ分解を誘導せず、細胞に対するＡＤＣＣ活性を刺激しない。
【０００７】
ＣＳＦ−１Ｒへのリガンドの結合をブロックし、さらに抗体によって結合された細胞に対するＡＤＣＣ活性を誘導する多機能性抗体が必要である。
【０００８】
本発明の抗体は多くの機能を有するので、公知の抗体よりも有利である。本発明の抗体は、受容体へのＣＳＦ−１およびＩＬ−３４の結合をブロックし、それによって受容体の二量体化を防止し、細胞内チロシン残基のリン酸化をもたらし、マクロファージ誘導性腫瘍増殖の防止において重大な機能を果たす。本発明の抗体は内部移行し、ＣＳＦ−１Ｒ分解を誘導する。重要なことにはリガンド結合のブロックに加えて、本発明の抗体は、腫瘍細胞ならびに腫瘍関連マクロファージおよび単球の殺傷を刺激することによって、ＡＤＣＣ活性を促進する。本発明の抗体は、同時にマクロファージ活性（腫瘍進行において主要な役割を果たす活性）にも影響を与える。本発明の抗体は、それらが有する多くの治療上の機能のために、当該技術分野における公知の抗体よりも有意に優れている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、ヒトＣＳＦ−１Ｒ変異体（配列番号１５）を特異的に結合し、配列ＳＹＧＭＨ（配列番号１）を含むＣＤＲＨ１、配列ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）を含むＣＤＲＨ２、配列ＧＤＹＥＶＤＹＧＭＤＶ（配列番号３）を含むＣＤＲＨ３、配列ＲＡＳＱＧＩＳＮＡＬＡ（配列番号４）を含むＣＤＲＬ１、配列ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）を含むＣＤＲＬ２、および配列ＱＱＦＮＳＹＰＷＴ（配列番号６）を含むＣＤＲＬ３を含む、抗体またはその断片である。本発明の他の態様は、ヒトＣＳＦ−１Ｒ（配列番号１６）を特異的に結合し、配列ＳＹＧＭＨ（配列番号１）を含むＣＤＲＨ１、配列ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）を含むＣＤＲＨ２、配列ＧＤＹＥＶＤＹＧＭＤＶ（配列番号３）を含むＣＤＲＨ３、配列ＲＡＳＱＧＩＳＮＡＬＡ（配列番号４）を含むＣＤＲＬ１、配列ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）を含むＣＤＲＬ２、および配列ＱＱＦＮＳＹＰＷＴ（配列番号６）を含むＣＤＲＬ３を含む、抗体またはその断片である。本発明の一態様は、ヒトＣＳＦ−１Ｒ（配列番号１５）を特異的に結合し、配列ＳＹＧＭＨ（配列番号１）を含むＣＤＲＨ１、配列ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）を含むＣＤＲＨ２、配列ＧＤＹＥＶＤＹＧＭＤＶ（配列番号３）を含むＣＤＲＨ３、配列ＲＡＳＱＧＩＳＮＡＬＡ（配列番号４）を含むＣＤＲＬ１、配列ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）を含むＣＤＲＬ２、および配列ＱＱＦＮＳＹＰＷＴ（配列番号６）を含むＣＤＲＬ３を含む、抗体またはその断片である。本発明の抗体は、前記ＣＤＲ配列のうちの１つの内部のアミノ酸置換をさらに含むことができる。他の態様において、前記のＣＤＲはＣＤＲ配列のうちの１つの中にアミノ酸置換を有していない。
【００１０】
本発明の他の態様は、ＣＳＦ−１Ｒを結合し、アミノ酸配列ＱＤＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＥＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＤＹＥＶＤＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＡＳ（配列番号７）を含むＶＨ、またはアミノ酸配列ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＮＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＮＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８）を含むＶＬを含む、抗体またはその断片である。
【００１１】
本発明の他の態様は、ＣＳＦ−１Ｒを結合し、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗体またはその断片である。本発明のさらに他の態様において、抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を各々含む２個の軽鎖および配列番号９のアミノ酸配列を各々含む２個の重鎖を含む。かかる抗体のＣＳＦ−１Ｒ結合断片は本発明の一部である。
【００１２】
本発明は、上述された抗体またはその断片をコードする単離されたＤＮＡおよびポリヌクレオチド／ポリ核酸、このポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびにこのポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供する。本発明は抗体またはその断片を精製する方法をさらに提供する。本発明は、本発明の抗体もしくはその断片、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を単独で、または薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤と共に含む医薬組成物をさらに提供する。本発明は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に本発明の抗体またはその断片を含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
加えて、本発明は、有効量の抗体の投与により哺乳動物において癌細胞の増殖を阻害する方法、ならびに白血病および乳癌および前立腺癌を治療する方法に関する。本発明の他の態様は、有効量の抗体の投与により哺乳動物において癌細胞の増殖を阻害する方法、ならびに白血病、子宮内膜癌、乳癌および前立腺癌を治療する方法に関する。本発明のさらに他の態様は、癌細胞の増殖を阻害する方法、ならびに白血病、子宮内膜癌、乳癌および前立腺癌に加えて、卵巣癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、腎臓癌、多発性骨髄腫およびホジキンリンパ腫を治療する方法に関する。本発明の抗体は、固形腫瘍を含む新生物疾患の治療、ならびに乳癌および前立腺癌の治療のために使用することができる。他の態様において、本発明の抗体は、固形腫瘍を含む新生物疾患の治療、ならびに乳癌、子宮内膜癌および前立腺癌の治療のために使用することができる。他の態様において、本発明の抗体は、固形腫瘍を含む新生物疾患の治療、ならびに乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肝細胞癌および腎癌の治療のために使用することができる。
【００１４】
本発明の一態様は、治療法における使用のための、治療における使用のための、または医薬品としての使用のための抗体またはその断片である。さらに他の態様において、先に記述された抗体またはその断片は、癌の治療における使用のためのものである。本発明は、白血病、乳癌および前立腺癌を含むが、これらに限定されない癌の治療において使用することができる。一態様において、本発明は、白血病、乳癌、子宮内膜癌および前立腺癌を含むが、これらに限定されない癌の治療において使用することができる。他の態様において、本発明は、白血病、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、腎臓癌、多発性骨髄腫およびホジキンリンパ腫を含むが、これらに限定されない癌の治療において使用することができる。
【００１５】
本発明は、抗癌治療が、抗血管新生剤、化学療法剤または抗新生物剤を含むが、これらに限定されない他の抗癌治療の有効量を提供または投与することを含む癌の治療における使用のための、本発明の抗体またはその断片も含む。さらに、抗新生物剤は、ドセタキセル、パクリタキセル、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびドキソルビシンを含むが、これらに限定されない。抗癌治療は本明細書で開示された抗体または断片に加えて患者に投与される。抗体またはその断片は、他の抗癌治療または他の抗新生物剤による治療法の開始の前、その間、実質的にそれと同時、またはその後に投与される。
【００１６】
本発明は、癌の治療のための医薬品の製造のための本発明の抗体の使用も提供する。一態様において、癌は白血病、乳癌または前立腺癌である。一態様において、癌は白血病、乳癌、子宮内膜癌または前立腺癌である。本発明の他の態様において、癌は、白血病、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、腎臓癌、多発性骨髄腫またはホジキンリンパ腫である。抗体の使用は、抗癌治療が、抗血管新生剤、化学療法剤または抗新生物剤を含むが、これらに限定されない他の抗癌治療の有効量を提供または投与することを含む。さらに、抗新生物剤は、ドセタキセル、パクリタキセル、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびドキソルビシンを含むが、これらに限定されない。抗癌治療は本明細書で開示された抗体または断片に加えて患者に投与される。抗体またはその断片は、他の抗癌治療または他の抗新生物剤による治療法の開始の前、その間、実質的にそれと同時、またはその後に投与される。
【００１７】
本発明は、哺乳動物において癌を治療する方法であって、有効量の本発明の抗体またはその断片を、それを必要とする前記哺乳動物に対して投与することを含む、方法をさらに提供する。癌は、白血病、乳癌、子宮内膜癌および前立腺癌からなる群から選択される。他の態様において、癌は、白血病、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、腎臓癌、膵臓癌、多発性骨髄腫およびホジキンリンパ腫からなる群から選択される。加えて、方法は前記哺乳動物に他の抗癌治療を投与することをさらに含むことができる。抗癌治療は、抗血管新生剤、化学療法剤および抗新生物剤からなる群から選択される。抗新生物剤は、ドセタキセル、パクリタキセル、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびドキソルビシンからなる群から選択することができる。
【００１８】
本発明は、抗体または組成物を使用して、それを必要とする哺乳動物を治療、例えば、血管新生もしくは骨転移を阻害、または腫瘍もしくは過剰増殖を阻害、または炎症性疾患を治療する方法をさらに提供する。本発明は、抗体または組成物を、それを必要とする哺乳動物の治療において使用して、例えば、血管新生または骨転移を阻害、または腫瘍もしく過剰増殖もしくは炎症性疾患を阻害するための抗体または組成物をさらに提供する。
【００１９】
本発明は、本明細書で開示された抗体またはその断片を含む製品または医薬組成物にも関する。加えて、製品または医薬組成物は、治療法において同時、個別または連続で本明細書で開示された抗体と組合わせて与えられる、ドセタキセル、パクリタキセル、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）またはドキソルビシンを含むが、これらに限定されない追加の医薬用薬剤、抗新生物剤もしくは抗癌剤または治療も含むことができる。
【００２０】
本発明は、癌が腫瘍関連マクロファージの表面上でＣＳＦ−１Ｒを発現するならば、本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体またはその断片による患者における治療成功の指標としての、血液、血清、血漿、腫瘍細胞または循環性腫瘍細胞のサンプルにおけるＣＳＦ−１レベルの使用を提供する。本発明は、（１）サンプルを血液、血清、血漿、腫瘍細胞および循環性腫瘍細胞からなる群から選択し、患者から採取したサンプルにおけるＣＳＦ−１のレベルを測定する工程、および（２）ＣＳＦ−１レベルが対照集団において見出されるＣＳＦ−１レベルよりも高いならば、本発明の抗体またはその断片を患者に対して投与する工程を含む、患者における癌を治療する方法も提供する。
【００２１】
本発明は、本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体またはその断片による患者における治療成功の指標としての、血液、血清、血漿、腫瘍細胞または循環性腫瘍細胞のサンプルにおけるＩＬ−３４レベルの使用を提供する。本発明は、（１）サンプルを血液、血清、血漿、腫瘍細胞および循環性腫瘍細胞からなる群から選択し、患者から採取されたサンプルにおけるＩＬ−３４のレベルを測定する工程、および（２）ＩＬ−３４レベルが対照集団において見出されるＩＬ−３４レベルよりも高いならば、本発明の抗体またはその断片を患者に対して投与する工程を含む、患者における癌を治療する方法も提供する。
【００２２】
本発明の一態様は、癌を有する被験体が抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ベースの癌治療レジメンのための候補かどうかを決定する方法であって、該抗体が本発明の抗体であり、（１）サンプルを血液、血清、血漿、腫瘍細胞および循環性腫瘍細胞からなる群から選択し、被験体のサンプルにおけるＣＳＦ−１のレベルをエクスビボまたはインビトロで決定すること；および（２）癌を患わない個体におけるＣＳＦ−１のレベルと比較して、ＣＳＦ−１のレベルの増加は被験体が抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ベースの癌治療レジメンのための候補であることを示すことを含む方法である。
【００２３】
本発明の他の態様は、癌を有する被験体が抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ベースの癌治療レジメンのための候補かどうかを決定する方法であって、該抗体は本発明の抗体であり、（１）サンプルを血液、血清、血漿、腫瘍細胞および循環性腫瘍細胞からなる群から選択し、被験体のサンプルにおけるＩＬ−３４のレベルをエクスビボまたはインビトロで決定すること；および（２）癌を患わない個体におけるＩＬ−３４のレベルと比較して、ＩＬ−３４のレベルの増加は被験体が抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ベースの癌治療レジメンのための候補であることを示すことを含む方法である。
【００２４】
本発明は特異的にＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体も提供する。抗体は、（ａ）ＣＳＦ−１またはＩＬ−３４のＣＳＦ−１Ｒへの結合を阻害する；（ｂ）ＣＳＦ−１Ｒの活性化を阻害する；（ｃ）ＣＳＦ−１Ｒのリン酸化を減少させる；（ｄ）ＭＡＰＫの活性化を減少させる；（ｅ）Ａｋｔの活性化を減少させる；（ｆ）ＣＳＦ−１Ｒ量を減少させる；および（ｇ）ＡＤＣＣを誘導する、から選択される少なくとも１つの特性を有する。本発明の好ましい実施形態は特性（ａ）〜（ｇ）を保持する。
【００２５】
本発明の一態様は、ヒトＣＳＦ−１Ｒ変異体（配列番号１５）またはヒトＣＳＦ−１Ｒ（配列番号１６）を特異的に結合し、ＣＳＦ−１Ｒのシグナル伝達を阻害し、内部移行してＣＳＦ−１Ｒ分解を誘導し、腫瘍、マクロファージおよび単球を含む様々な細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を刺激する、抗体またはその断片である。配列番号１５および配列番号１６は結合領域の外部に分類される位置５４で１個のアミノ酸で異なる。
【００２６】
本明細書において使用される時、「抗体」という用語は、４個のポリペプチド鎖（２個の重（Ｈ）鎖および２個の軽（Ｌ）鎖がジスルフィド結合によって相互結合される）を含む免疫グロブリン分子を含む。個々の鎖は、類似したサイズ（１１０〜１２５アミノ酸）および構造であるが異なる機能を有するドメインへと折り畳むことができる。
【００２７】
軽鎖は、１個の可変ドメイン（ＶＬとして本明細書において省略される）および／または１個の定常ドメイン（ＣＬとして本明細書において省略される）を含むことができる。ヒト抗体（免疫グロブリン）の軽鎖はカッパ（κ）軽鎖またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかである。ＶＬという表現は、本明細書において使用される時、カッパタイプ軽鎖（Ｖκ）およびラムダタイプ軽鎖（Ｖλ）からの両方の可変領域を含むことが意図される。重鎖は、１個の可変ドメイン（ＶＨとして本明細書において省略される）、および／または、抗体のクラスまたはアイソタイプに依存して、３または４個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）（本明細書においてＣＨとしてまとめて省略される）も含むことができる。ヒトにおいて、アイソタイプはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭであり、ＩｇＡおよびＩｇＧはサブクラスまたはサブタイプ（ＩｇＡ１〜２、ＩｇＧ１〜４）へとさらに細分される。本発明は前記のクラスまたはサブクラスのいずれかの抗体を含む。ヒトＩｇＧ１は本発明の抗体のために好ましいアイソタイプである。
【００２８】
超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される３個の領域が各々のＶＬ、ＶＨ中に見出され、それはフレームワーク（ＦＲとして本明細書において省略される）と称される可変性の少ない領域によってサポートされる。アミノ酸はＫａｂａｔの慣例に従って特定のＣＤＲ領域またはドメインに割り当てられる（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）；Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））。各々のＶＨ、ＶＬは３個のＣＤＲ、４個のＦＲからなり、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ構成される。ＶＬおよびＶＨのドメインからなる抗体の部分は、Ｆｖ（可変断片）と指定され、抗原結合部位を構成する。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、１個のポリペプチド鎖上にＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む抗体断片であり、１つのドメインのＮ末端および他のドメインのＣ末端は柔軟なリンカーによって連結される。
【００２９】
「単離された抗体」とは、（１）成分の混合物から部分的に、実質的に、または完全に精製されている抗体であるか；（２）同定されており、天然環境の成分から分離および／または回収されている抗体であるか；（３）モノクローナル抗体であるか；（４）同じ種からの他のタンパク質が無い抗体であるか；（５）異なる種からの細胞によって発現される抗体であるか；または（６）天然に生じない抗体である。成分は、本明細書において使用される時、本発明の抗体を除外する。天然環境の混入成分は、抗体の診断使用または治療法使用を妨げ、酵素、ホルモンおよび他のタンパク性溶質または非タンパク性溶質を含み得る物質である。単離された抗体の例は、親和性精製した抗体、ハイブリドーマまたは他の細胞株によってインビトロで作製された抗体、およびトランスジェニックマウスに由来するヒト抗体を含む。
【００３０】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において使用される時、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体、例えば存在し得る可能性のある天然に存在する変異またはマイナーな翻訳後のバリエーション以外は実質的に同一な集団を含む個々の抗体を指す。単一の抗原部位（決定基またはエピトープとしても公知である）に対する指向性を持つモノクローナル抗体は非常に特異的である。さらに、典型的には異なる決定基に対する指向性を持つ異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は抗原上に単一の決定基に対する指向性を持つ。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすることとして解釈されるべきではない。
【００３１】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される時、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域および定常領域を有する抗体を含む（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、前出中で記載されるように）。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲ中にヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えばインビトロのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボの体細胞変異によって導入された変異）を含むことができる。ヒト抗体は、少なくとも１つの位置を、アミノ酸残基（例えばヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされない、活性を促進するアミノ酸残基）で置換することができる。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される時、他の哺乳動物種（マウス等）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされた抗体を含むことは意図しない。「ヒト抗体」を産生する方法は、本明細書において使用される時、ヒトにおいて産生された抗体を含むことは意図しない。
【００３２】
「組換えヒト抗体」という語句は、組換え手段によって調製、発現、生成または単離されるヒト抗体（宿主細胞の中へトランスフェクションされた組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック動物から単離された抗体、または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、生成または単離された抗体等）を含む。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。
【００３３】
Ｆｃ（断片、結晶化可能な領域）は、ペアになった重鎖定常ドメインからなる抗体の部分または断片の名称である。ＩｇＧ抗体において、例えば、Ｆｃは重鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなる。ＩｇＡ抗体またはＩｇＭ抗体のＦｃはさらにＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃは、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または細胞媒介性細胞傷害（ＣＭＣ）の活性化に関連する。ＩｇＡおよびＩｇＭ等の抗体（それは複数のＩｇＧ様タンパク質の複合体である）については、複合体形成はＦｃ定常ドメインを必要とする。
【００３４】
したがって、本発明の抗体は、単離された抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、組換えヒト抗体、モノクローナル抗体、消化断片、規定の部分およびその変異体を含み、それらは抗体模倣物を含むか、または抗体または規定の断片もしくはその部分の構造および／または機能を模倣する抗体の部分を含むが、これらに限定されず；その各々は少なくとも１つのＣＤＲを含む。機能的断片は、ＣＳＦ−１Ｒ抗原に結合する抗原結合断片を含む。例えば、ＣＳＦ−１Ｒまたはその部分に結合可能な本発明によって包含される抗体断片は、完全な形の鎖間ジスルフィド結合を備えた（Ｆａｂ’）２等の二価断片、ＶＬ−ＣＬおよびＶＨ−ＣＨ１ドメインからなる抗体の断片に当てはまり、重鎖ヒンジ領域を保持しない（例えばパパイン消化による）Ｆａｂ（断片、抗原結合）等の一価断片、重鎖ヒンジ領域を保持するＦａｂ、Ｆａｃｂ（例えばプラスミン消化による）、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド結合を欠損するＦａｂ’、ｐＦｃ’（例えばペプシンまたはプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えばペプシン消化、部分還元および再凝集による）およびＦｖまたはｓｃＦｖ（例えば分子生物学技法による）を含む。抗体断片は、例えばドメインを欠失する抗体、直鎖状抗体、一本鎖抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、多価一本鎖抗体、抗体断片から形成された多重特異性抗体（ダイアボディ、トリアボディ、および特異的に抗原と結合する同種のものを含む）も含むように意図される。
【００３５】
ヒンジ領域は抗体のＦａｂ部分およびＦｃ部分を分離し、Ｆａｂの互いに関する可動性およびＦｃに関する可動性を提供し、それに加えて２個の重鎖の共有結合のための複数のジスルフィド結合を含む。
【００３６】
結合特異性を保持するが、例えば二重特異性、多価性（２を超える結合部位）およびコンパクトなサイズ（例えば結合ドメインのみ）を含む、所望される他の特性を有する抗体形式が開発されている。本発明の抗体はＣＳＦ−１Ｒについて特異的である。抗体特異性は、抗原の特定のエピトープについての抗体の選択的認識を指す。本発明の抗体は、例えば単一特異性または二重特異性であり得る。二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は２個の異なる抗原結合特異性または部位を有する抗体である。抗体が１を超える特異性有する場合、認識されるエピトープは単一抗原または１を超える抗原と関連し得る。したがって、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒについて少なくとも１つの特異性を備えた、２個の異なる抗原に結合する二重特異性抗体を提供する。上述されるように、かかる抗体はその任意の断片も含む。
【００３７】
本抗体またはその断片のＣＳＦ−１Ｒについての特異性は、親和性および／または結合力に基づいて決定することができる。親和性（抗体と抗原の解離についての平衡定数（ＫＤ）によって表わされる）は、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合の強度を測定する。
【００３８】
本発明の抗体またはその断片は、細胞外ドメインセグメント（以下、「ドメイン」または「ＥＣＤ」と単純に呼ぶ）上に位置するＣＳＦ−１Ｒのエピトープに結合する。本明細書において使用される時「エピトープ」という用語は、本発明の抗体によって認識される抗原上の不連続な３次元部位を指す。エピトープは複合抗原上の免疫学的活性領域であり、Ｂ細胞受容体に実際に結合する領域であり、それは実際にＢ細胞によって産生される生じた抗体分子によって結合される。抗原は概して少なくとも１個のエピトープおよび通常は１個を超えるエピトープを含む。タンパク質抗原上のエピトープは直線状または非直線状であり得る。直線状エピトープは、タンパク質のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸残基からなるものである。直線状エピトープは、本来の三次元構造を形成し、抗原への結合特異性を備えた抗体を産生する免疫応答を誘発するために、立体配座的折り畳みを必要としても必要としなくてもよい。非直線状エピトープは連続していないアミノ酸残基からなる。したがって、非線形エピトープは、本来の三次元構造を形成するのに必要なアミノ酸残基を互いに接近させ、抗原への結合特異性を備えた抗体を産生する免疫応答を誘発するために、ある程度のタンパク質の折り畳みを常に必要とする。
【００３９】
本発明の抗体は、直接的変異、親和性成熟法、ファージディスプレイ、または鎖シャッフリングによって結合特性が改善されたものも含む。親和性および特異性は、ＣＤＲおよび／またはＦＷ残基の変異ならびに所望の特性を有する抗原結合部位についてのスクリーニングにより修飾または改善することができる（例えばＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：３９２−４０３（１９９５）を参照されたい）。ＣＤＲは様々な方法で変異させられる。１つの手段は、ランダム化させなければ同一の抗原結合部位の集団中で、２〜２０のアミノ酸のサブセットが特定の位置で見出されるように、個々の残基または残基の組合わせをランダム化することである。あるいは、変異はエラープローンＰＣＲ法によって広範囲にわたる残基で誘導することができる（例えばＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−９６（１９９２）を参照されたい）。他の例において、重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子を含むファージディスプレイベクターは、大腸菌の変異誘発株中で増殖させることができる（例えばＬｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０：３５９−６８（１９９６）を参照されたい）。変異誘発のこれらの方法は当業者に公知の多くの方法の例示である。
【００４０】
置換変異体の生成のための便利な方法はファージディスプレイを使用する親和性成熟である。簡潔には、複数のＣＤＲ領域部位を変異させて各々の部位ですべてのアミノ酸置換を生成する。このように生成された抗体変異体は、各々の粒子内でパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として、線状ファージ粒子から一価様式で提示される。次いで、ファージディスプレイされた変異体は、本明細書において開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば結合親和性（ＫＤ）、特異性、ＥＣ５０）についてスクリーニングされる。修飾についての候補ＣＤＲ領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を実行して抗原結合を有意に寄与するＣＤＲ領域残基を同定するすることができる。あるいは、または加えて、ランダム変異誘発は１つまたは複数の残基位置で１つまたは複数のＣＤＲ配列上で実行することができ、これはＣＤＲが可変領域に作動可能に連結された状態で実行されるか、またはＣＤＲが他の可変領域配列に依存しない状態で実行され、次いで改変されたＣＤＲは組換えＤＮＡ技術を使用して可変領域に戻されるかのいずれかである。いったんかかる変異体抗体は生成および発現されれば、変異体のパネルは本明細書において記述されるようにスクリーニングされ、１つまたは複数の関連するアッセイにおいて優れた特性を持つ抗体はさらなる開発のために選択することができる。
【００４１】
本明細書において具体的に記述された抗体に加えて、他の「実質的に相同な」修飾された抗体は、当業者に周知の様々な組換えＤＮＡ技法を利用して、容易にデザインおよび製造することができる。例えば、フレームワーク領域は、複数のアミノ酸置換、端末および中間での追加および削除、ならびに同種のものによって一次構造レベルで本来の配列から変動させることができる。さらに、様々な異なるヒトフレームワーク領域は、本発明のヒト化免疫グロブリンのためのベースとして単独でまたは組合わせで使用することができる。一般に、遺伝子の修飾は、部位特異的変異誘発等の様々な周知の技法によって容易に達成することができる。
【００４２】
本発明は、本明細書において開示されるように、ＶＨ領域もしくはその部分の任意の１つ、またはＶＨ  ＣＤＲの任意の１つ（その任意の変異体を含む）を含む、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体重鎖をコードする核酸配列を含む。本発明は、本明細書において開示されるように、ＶＬ領域もしくはその部分の任意の１つ、またはＶＬ  ＣＤＲの任意の１つ（その任意の変異体を含む）を含む、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体軽鎖をコードする核酸分子も含む。本発明は、さらに抗体１の核酸配列、重鎖および軽鎖についてそれぞれ配列番号１３および配列番号１４を含む。本発明の抗体は、抗体１と同一のＣＤＲ領域、ならびに／または抗体１と同一の軽鎖可変領域および／もしくは重鎖可変領域を含む抗体を含む。
【００４３】
本発明の抗体は当該技術分野において公知の方法によって産生することができる。これらの方法は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｏｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ編、１９８４）中のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３巻（Ｂｕｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）によって記述された免疫学的方法に加えて；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）によって記述された組換えＤＮＡ法を含む。抗体は、ｓｃＦｖまたはＦａｂの形態でＶＨおよびＶＬのドメインの組合わせを有するライブラリーからも得ることができる。ＶＨおよびＶＬのドメインは、合成、部分的に合成、または天然に由来するヌクレオチドによってコードすることができる。本発明はヒト抗体断片を有するファージディスプレイライブラリーによって製造することができる。ヒト抗体の他のソースは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するように操作されたトランスジェニックマウスである。
【００４４】
抗体の調製のための一実施形態は、挿入されたヒト抗体を産生するゲノムの実質的な部分を有しており、内因性の抗体の産生を欠損させたトランスジェニック動物における、本発明に記載の抗体をコードする核酸の発現である。トランスジェニック動物はマウス、ヤギおよびウサギを含むが、これらに限定されない。本発明の抗体はトランスジェニックマウスにより製造された。さらなる本発明の一実施形態は、例えば乳汁分泌の間のポリペプチドの分泌のために動物の乳腺中での抗体をコードする遺伝子の発現を含む。
【００４５】
「ヒト化」抗体を産生する一般的な方法は、モノクローナル抗体（げっ歯類宿主の免疫により産生された）からのＣＤＲ配列をヒトＩｇ骨格上にグラフトし、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の中へキメラ遺伝子をトランスフェクションし、そしてＣＨＯ細胞によって分泌される機能的抗体を産生することである。
【００４６】
単一ドメイン抗体の結合の主要決定基であるアミノ酸残基はＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａに定義されたＣＤＲ内に存在することができるが、例えば他の場合にはＶＨ−ＶＬヘテロ二量体のＶＨ−ＶＬ境界面中に埋まる残基等の他の残基も同様に含み得ることが理解される。
【００４７】
本発明のＣＳＦ−１Ｒ結合抗体の同定に使用されるタンパク質は、好ましくはＣＳＦ−１Ｒおよびより好ましくはＣＳＦ−１Ｒの細胞外ドメインである。ＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメインは独立しているかまたは他の分子にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は追加のアミノ酸残基に融合することができる。かかるアミノ酸残基は、恐らく単離を促進するペプチドタグまたは二量体化を最適化するＩｇＧ  ＦＣ部分であり得る。特異的臓器または組織に対する抗体のホーミングのための他のアミノ酸残基も検討される。
【００４８】
抗体断片は、抗体全体の切断によって、または断片をコードするＤＮＡの発現によって産生することができる。抗体の断片は、Ｌａｍｏｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５６：２３５−２４３（１９８３）およびＰａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２８９５−２９０２（１９８３）によって記述された方法によって調製することができる。かかる断片は１つもしくは両方のＦａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片を含むことができる。かかる断片は、一本鎖断片可変領域抗体（すなわちｓｃＦｖ、ダイアボディ、または他の抗体断片）も含むことができる。かかる機能的同等物を産生する方法は、欧州特許出願公開第２３９，４００号（Ｗｉｎｔｅｒ）；国際出願ＰＣＴ公開第８９／０９６２２号（Ｈａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．）；欧州特許出願公開第３３８，７４５号（Ｏｗｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．）；および欧州特許出願公開第３３２，４２４号（Ｂｅｌｄｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．）中で開示される。本明細書の全体にわたって、具体的な明示有無に関わらず、本発明の「抗体」という用語はいかなるその断片も含む。
【００４９】
ベクターの形質転換および本発明の抗体の発現のための好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばＮＳ０細胞（分泌しない（０）マウスミエローマ細胞）、２９３、ＳＰ２０およびＣＨＯ細胞ならびにリンパ腫、骨髄腫またはハイブリドーマ細胞等のリンパ系起源の他の細胞株である。酵母等の他の真核生物宿主を代わりに使用することができる。
【００５０】
本発明の抗体は、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムによる沈殿後の生理食塩水に対する透析、親和性クロマトグラフィーまたは免疫親和性クロマトグラフィーに加えて、ゲル濾過またはゾーン電気泳動法を含む、当該技術分野において公知の任意の方法によって単離または精製することができる。本発明の抗体のための精製の好ましい方法は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーである。
【００５１】
ヒト抗体をコードするＤＮＡは、対応するヒト抗体領域に実質的にまたは独占的に由来するヒト定常領域およびＣＤＲ以外の可変領域をコードするＤＮＡならびにヒトに由来するＣＤＲをコードするＤＮＡを組換えることによって調製することができる。
【００５２】
抗体の断片をコードするＤＮＡの好適なソースは、全長抗体を発現するハイブリドーマおよび脾臓細胞等の任意の細胞を含む。上記のように、断片は抗体同等物として単独で使用されてもよいか、または同等物へと組換えられてもよい。本明細書において記述されたＤＮＡ組換えおよび他の技法は、公知の方法によって行うことができる。ＤＮＡの他のソースは、当該技術分野において公知の抗体のファージディスプレイライブラリーである。
【００５３】
加えて、本発明は、発現配列、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列等の制御配列に作動可能に連結された、前述したポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。原核細胞系（細菌等）、および酵母細胞培養系および哺乳動物細胞培養系を含むが、これらに限定されない真核細胞系における抗体ポリペプチドの効果的な合成のために様々な発現ベクターが開発されている。本発明のベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含むことができる。
【００５４】
任意の好適な発現ベクターを使用することができる。例えば、原核生物のクローニングベクターは、ｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＵＣ、ｐＫＳＭおよびＲＰ４等の大腸菌からのプラスミドを含む。原核生物のベクターは、Ｍ１３および他の線状一本鎖ＤＮＡファージ等のファージＤＮＡの派生物も含む。酵母において有用なベクターの一例は２μプラスミドである。哺乳動物細胞における発現のための好適なベクターは、ＳＶ−４０、ＣＭＶ、アデノウイルス、レトロウイルスに由来するＤＮＡ配列、および上述のもの等の機能的哺乳動物ベクターの組合わせに由来するシャトルベクターの周知の誘導体、ならびに機能的プラスミドおよびファージＤＮＡを含む。追加の真核細胞発現ベクターは当該技術分野において公知である（例えばＰ．Ｊ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−４１（１９８２）；Ｓｕｂｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−６４（１９８１）；Ｋａｕｆｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−２１（１９８２）；Ｓｃａｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４６５４−５９（１９８３）；Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−２０（１９８０））。
【００５５】
本発明において有用な発現ベクターは、発現されるＤＮＡ配列または断片に作動可能に連結される少なくとも１つの発現制御配列を含む。制御配列は制御するためおよびクローン化ＤＮＡ配列の発現を調節するためにベクター中に挿入される。有用な発現制御配列の例は、ｌａｃシステム、ｔｒｐ系、ｔａｃシステム、ｔｒｃシステム、ファージラムダの主要なオペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、酵母の解糖作用のプロモーター（例えば３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター）、酵母酸ホスファターゼのプロモーター（例えばＰｈｏ５、酵母α接合因子のプロモーター）、およびポリオーマウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスおよびシミアンウィルスに由来するプロモーター（例えばＳＶ４０の初期プロモーターおよび後期プロモーター）、ならびに原核細胞または真核細胞およびそれらのウイルスの遺伝子またはその組合わせの発現を制御することが公知である他の配列である。
【００５６】
酵母において遺伝子コンストラクトを発現することが所望される場合、酵母における使用のために好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンに関する増殖能力を欠く酵母の変異株（例えばＡＴＣＣ番号４４０７６）のために選択マーカーを提供する。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１障害の存在は、トリプトファンの非存在下における増殖による形質転換の検出のために効果的な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２または３８，６２６）はＬｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドによって相補される。
【００５７】
本発明は、前述した組換えベクターを含む組換え宿主細胞も提供する。本発明の抗体は、ハイブリドーマ以外の細胞株中で発現させることができる。本発明に記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸は、好適な哺乳動物宿主細胞の形質転換に使用することができる。
【００５８】
特定の優先性の細胞株は、高レベル発現、対象となるタンパク質の構成的発現および宿主タンパク質からの最小混入に基づいて選択される。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該技術分野において周知であり、ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、およびリンパ腫、骨髄腫またはハイブリドーマ細胞等のリンパ系起源の細胞株を含む他の多くのもの等であるが、これらに限定されない多くの不死化細胞株を含む。好適な追加の真核細胞は酵母および他の真菌を含む。有用な原核生物の宿主は、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（大腸菌ＳＧ−９３６、大腸菌ＨＢ  １０１、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌Ｘ１７７６、大腸菌Ｘ２２８２、大腸菌ＤＨＩおよび大腸菌ＭＲＣｌ等）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等）、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含む。
【００５９】
これらの組換え宿主細胞は、抗体またはその断片の発現を可能にする条件下の細胞の培養および宿主細胞または宿主細胞の周囲の培地からの抗体またはその断片の精製によって、抗体またはその断片の産生に使用することができる。組換え宿主細胞中の分泌のために発現される抗体または断片の標的化は、対象となる抗体をコードする遺伝子の５’末端にシグナルペプチドまたは分泌リーダーペプチドをコードする配列を挿入することによって促進することができる。分泌リーダーペプチドエレメントは原核生物配列または真核生物配列のいずれかに由来し得る。したがって、好適な分泌リーダーペプチドが使用され、それはポリペプチドのN末端端部に連結されて、宿主細胞サイトゾルから外へのポリペプチドの移動および培地の中への分泌を指令するアミノ酸である。
【００６０】
形質転換した宿主細胞は、同化可能な炭素源（グルコースまたはラクトース等の炭水化物）、窒素源（アミノ酸、ペプチド、タンパク質、またはペプトン、アンモニウム塩もしくは同種のもの等のそれらの分解産物）、および無機塩源（ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、リン酸塩および／または炭酸塩）を含む液体培地中で当該技術分野において公知の方法によって培養される。培地はさらに例えば微量元素（例えば鉄、亜鉛、マンガンおよび同種のもの）等の増殖促進物質を含む。
【００６１】
哺乳動物に対して抗体の有効量を投与することによって哺乳動物中で腫瘍増殖を治療する方法も、本発明によって提供される。本発明に従って治療される好適な症状は、好ましくはＣＳＦ−１Ｒを発現する細胞に関与する。特定の機序により束縛されるものではないが、本方法は例えば、腫瘍性成長、骨転移、移植臓器拒絶またはＣＳＦ−１Ｒによって刺激される自己免疫性疾患等の免疫障害を含む癌細胞の増殖の治療を提供する。
【００６２】
「治療」または「治療する」は、本発明の文脈中で、疾患または障害に関連する基礎症状または所望されない生理学的変化の進行を阻害、減速、減少、もしくは好転すること、症状の臨床的病徴を改良することまたは症状の臨床的病徴の出現を防止することを含む療法的治療を指す。有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能であるか検出不可能であるかに関わらず、病徴の軽減、疾患または障害の程度の減少、疾患または障害の安定化（すなわち疾患または障害が悪化しない場合）、疾患または障害の進行の遅延または減速、疾患または障害の改良または緩和、および疾患または障害の寛解（部分的であるか全面的であるかに関わらず）を含むが、これらに限定されない。治療は、治療を受けずに予想される生存と比較して、生存を延長することも意味することができる。治療を必要とするものは既に疾患に罹患したものを含む。一実施形態において、本発明は医薬品として使用することができる。
【００６３】
本発明の方法において、本発明の抗体の治療上有効量がそれを必要とする哺乳動物または患者に対して投与される。加えて、本発明の医薬組成物は本発明の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の治療上有効量を含むことができる。「治療上有効量」または「効果的な用量」は、必要な投薬量でおよび期間で、所望の治療結果の達成に有効な量を指す。抗体の治療上有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重等の因子、ならびに抗体または抗体部分が個体における所望の応答を誘発する能力に従って変動し得る。他の因子は、投与、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトまたは動物であるかどうか、投与された他の薬物、および治療は予防的または治療法的かどうか、を含む。本発明のヒト抗体はヒトに対する投与のために特に有用であるが、他の哺乳動物に対して同様に投与することができる。哺乳動物という用語は、本明細書において使用される時、ヒト、実験用動物、家庭用ペットおよび家畜を含むが、これらに限定されないことが意図される。さらに、治療上有効量は、治療上有益な効果が抗体または抗体部分の任意の毒性効果（または損傷効果）を上回るものである。
【００６４】
投薬量レジメンは、最適の所望の応答（例えば治療上の応答または予防的な応答）を提供するように調整することができる。治療投薬量は、当業者に公知のルーチンの方法を使用して滴定して、安全性および有効性を最適化できる。投薬スケジュールは、典型的には単一ボーラス投薬量もしくは継続的な点滴から１日あたり複数の投与（例えば４〜６時間ごと）の範囲であるか、または治療する医師および患者の症状によって示される。本発明の抗体の治療上有効量についての例示的な非限定的範囲は、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは３〜３５ｍｇ／ｋｇ、およびより好ましくは５〜２０ｍｇ／ｋｇである。投薬量および頻度は、患者を治療する医師によって決定され、毎日１回、１週間あたり３回、週１回、２週間ごとに１回、またはそれ未満の頻度で、１ｍｇ／ｋｇ未満から１００ｍｇ／ｋｇを超える用量を含むことができる。しかしながら、本発明は任意の特定の用量に限定されていないことに注目すべきである。
【００６５】
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体は、抗血管新生剤、化学療法剤および抗新生物剤を含むが、これらに限定されない１つまたは複数の他の抗癌治療と組合わせて投与することができる。化学療法剤、放射線、抗体またはその組合わせ等の任意の好適な抗癌剤を使用することができる。
【００６６】
抗癌剤は抗新生物剤、抗体、アジュバントおよびプロドラッグを含むが、これらに限定されない。当該技術分野において現時点で公知であるかまたは評価されている抗新生物剤は、例えば、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、抗代謝物質、インターカレーション性抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存因子、生物応答修飾因子、抗ホルモンおよび抗血管新生剤を含む様々なクラスへと分類することができる。アルキル化剤の例は、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファランおよびダカルバジンを含むが、これらに限定されない。抗代謝物質の例は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）およびトポイソメラーゼ阻害剤イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、アミノカンプトテシン、カンプトテシン、ＤＸ−８９５１ｆ、トポテカン（トポイソメラーゼＩ）、エトポシド（ＶＰ−１６）ならびにテニポシド（ＶＭ−２６）（トポイソメラーゼＩＩ）を含むが、これらに限定されない。抗新生物剤が放射線である場合、放射線のソースは治療されている患者に対して外部（外照射療法−ＥＢＲＴ）または内部（近接照射療法−ＢＴ）であり得る。投与される抗新生物剤の用量は、例えば、薬剤のタイプ、治療されている腫瘍のタイプおよび重症度、ならびに薬剤の投与経路を含む多数の因子に依存する。しかしながら、本発明が任意の特定の用量に限定されていないことは強調されるべきである。一態様において、ドセタキセルは本発明の好ましい抗新生物剤である。本発明の他の態様において、パクリタキセル、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびドキソルビシンは好ましい抗新生物剤である。
【００６７】
本発明の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体は、腫瘍増殖または血管新生に関与する他の受容体を中和する抗体と共に投与することができる。本発明の一実施形態において、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体は、Ｈｅｒ２に特異的に結合する受容体アンタゴニストと組合わせて使用される。かかる受容体の他の例はＶＥＧＦＲである。抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体はＶＥＧＦＲアンタゴニストと組合わせて使用することができる。ＣＳＦ−１Ｒ抗体は、例えばサイトカイン（例えばＩＬ−１０、ＩＬ−４およびＩＬ−１３）、またはケモカイン、腫瘍関連抗原およびペプチド等であるが、これらに限定されない他の免疫促進剤等の１つまたは複数の好適なアジュバントとも組合わせて投与することができる。
【００６８】
本発明において、本発明の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の投与、ならびに任意で他の受容体の抗新生物剤および／またはアンタゴニストの共投与に、任意の好適な方法または経路を使用することができる。本発明の組合せ療法において、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体は、ドセタキセル、パクリタキセル、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）またはドキソルビシンに加えてその任意の組合わせを含むが、これらに限定されない他の薬剤による治療法の開始の前、その間、実質的にそれと同時、またはその後に投与することができる。本発明に従って利用される抗新生物剤レジメンは、患者の新生物症状の治療のために最適に好適であると考えられる任意のレジメンを含む。異なる悪性腫瘍は、特異的抗腫瘍抗体および特異的抗新生物剤の使用を必要とすることができ、それは患者間の違いに基づいて決定されるだろう。投与経路は、例えば経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与を含む。投与されるアンタゴニストの用量は、例えば、アンタゴニストのタイプ、治療されている腫瘍のタイプおよび重症度、ならびにアンタゴニストの投与経路を含む多数の因子に依存する。しかしながら、本発明が任意の特定の方法または投与経路に限定されていないことは強調されるべきである。
【００６９】
本発明の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体は、予防または治療の目的のために哺乳動物において使用する場合、好ましくは医薬組成物として製剤化される。かかる医薬組成物およびそれらを調製するプロセスは当該技術分野において周知である。例えば、Ｒｅｍｅｎｉｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．編、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、１９９５）を参照されたい。
【００７０】
本発明の他の態様において、本発明の抗体は、抗癌剤、抗新生物もしくは抗血管新生剤または検出可能なシグナルを産生する薬剤と併用して、または化学的もしくは生合成的にこれらに連結して、投与することができる。抗体に連結した抗腫瘍剤は、抗体が結合した新生血管もしくは腫瘍またはマクロファージを、または抗体が結合した細胞の環境において新生血管もしくは腫瘍またはマクロファージを、破壊または損傷する任意の薬剤を含む。本発明は、特異的に受容体に結合し、リガンド毒素の内部移行に続いて毒素を送達する免疫コンジュゲートを含むが、これらに限定されないコンジュゲートとして投与される抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体であり得る。抗体薬剤コンジュゲートは、直接互いを、またはリンカー、ペプチドもしくは非ペプチドを介して連結することができる。例えば、抗腫瘍剤または抗マクロファージ剤は、抗新生物剤または放射性同位体等の毒性薬剤である。化学療法剤を含む好適な抗新生物剤は、当業者に公知であり、以下で検討される。本発明は、単なる例としてであるが、抗新生物剤、他の抗体または放射性同位元素で標識された同位体等のレポーターを含む標的部分またはレポーター部分に連結した抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を、検出可能なシグナルを産生する薬剤が抗体にコンジュゲートされる診断システムにおいて、さらに検討する。
【００７１】
本発明によれば、血管新生を阻害する方法は、血管新生を阻害するのに効果的な時間および量で、本発明の抗体または抗体断片を含む組成物を哺乳動物に対して投与することを含む。同様に、抗体および抗体断片は、腫瘍の転移を阻害するのに効果的な時間および量で、本発明の抗体を含む組成物を哺乳動物に対して投与することにより哺乳動物における腫瘍転移を阻害する方法において使用することができる。
【００７２】
本発明に従って、腫瘍間質の中へのマクロファージインフィルトレーションおよび腫瘍増殖の刺激を阻害する方法は、腫瘍増殖に対するマクロファージの効果を阻害するのに効果的な時間および量で、本発明の抗体または抗体断片を含む組成物を哺乳動物に対して投与することを含む。同様に、抗体および抗体断片は、骨侵食を阻害するのに効果的な時間および量で、本発明の抗体を含む組成物を哺乳動物に対して投与することにより哺乳動物における腫瘍転移の周囲で骨侵食を軽減する方法において使用することができる。
【００７３】
本発明は癌が腫瘍関連マクロファージの表面上でＣＳＦ−１Ｒを発現する場合に、治療に対して応答する癌患者の血液、血清、血漿、腫瘍細胞または循環性腫瘍細胞におけるバイオマーカーとしてＣＳＦ−１Ｒリガンド（ＣＳＦ−１またはＩＬ−３４）を使用することを検討する。本発明は、サンプルが血清、血漿または腫瘍細胞または循環性腫瘍細胞からなる群から選択される場合の、サンプル中の血液におけるＣＳＦ−１レベルを測定することによって、本発明の抗体または断片により患者の治療成功を予測する方法をさらに検討する。本発明の他の態様は、（１）サンプルを血液、血清、血漿、腫瘍細胞および循環性腫瘍細胞からなる群から選択し、患者から採取されたサンプルにおけるＣＳＦ−１のレベルを測定する工程、および（２）ＣＳＦ−１レベルが対照集団において見出されるＣＳＦ−１レベルよりも高いならば、本発明の抗体またはその断片を患者に対して投与する工程を含む、患者における癌を治療する方法である。本発明は、サンプルを血清、血漿、腫瘍細胞または循環性腫瘍細胞からなる群から選択し、サンプル中の血液におけるＩＬ−３４レベルを測定することによって、本発明の抗体または断片により患者の治療成功を予測する方法をさらに検討する。本発明の他の態様は、（１）サンプルを血液、血清、血漿、腫瘍細胞および循環性腫瘍細胞からなる群から選択し、患者から採取されたサンプルにおけるＩＬ−３４のレベルを測定する工程、および（２）ＩＬ−３４レベルが対照集団において見出されるＩＬ−３４レベルよりも高いならば、本発明の抗体またはその断片を患者に対して投与する工程を含む、患者における癌を治療する方法である。
【００７４】
本発明は、癌を有する被験体が抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ベースの癌治療レジメンのための候補かどうかを決定する方法であって、該抗体が本発明の抗体であり、（１）サンプルを血液、血清、血漿、腫瘍細胞および循環性腫瘍細胞からなる群から選択し、被験体のサンプルにおけるＣＳＦ−１のレベルをエクスビボまたはインビトロで決定すること；および（２）癌を患わない個体におけるＣＳＦ−１のレベルと比較して、ＣＳＦ−１のレベルの増加は被験体が抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ベースの癌治療レジメンのための候補であることを示すことを含む方法も検討する。
【００７５】
本発明は、癌を有する被験体が抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ベースの癌治療レジメンのための候補かどうかを決定する方法であって、該抗体は本発明の抗体であり、（１）サンプルを血液、血清、血漿、腫瘍細胞および循環性腫瘍細胞からなる群から選択し、被験体のサンプルにおけるＩＬ−３４のレベルをエクスビボまたはインビトロで決定すること；および（２）癌を患わない個体におけるＩＬ−３４のレベルと比較して、ＩＬ−３４のレベルにおける増加は被験体が抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ベースの癌治療レジメンのための候補であることを示すことを含む方法をさらに検討する。
【００７６】
本発明は、癌を有する被験体が抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ベースの癌治療レジメンのための候補かどうかを決定する方法であって、該抗体が本発明の抗体であり、（１）サンプルを血液、血清、血漿、腫瘍細胞および循環性腫瘍細胞からなる群から選択し、被験体のサンプルにおけるＣＳＦ−１もしくはＩＬ−３４または両者のレベルをエクスビボまたはインビトロで決定すること；および（２）癌を患わない個体におけるＣＳＦ−１もしくはＩＬ−３４または両者のレベルと比較して、ＣＳＦ−１もしくはＩＬ−３４または両者のレベルの増加は被験体が抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体ベースの癌治療レジメンのための候補であることを示すことを含む方法も検討する。
【００７７】
ＣＳＦ−１またはＩＬ−３４のレベルは、商業的に入手可能なキット（ＣＳＦ−１についてはＲ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓおよびＩＬ−３４についてはＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を含む様々な方法で測定することができる。１つのかかる技法において、ＣＳＦ−１またはＩＬ−３４のスタンダードまたはサンプルのいずれかを、ヒトＣＳＦ−１またはＩＬ−３４に対する抗体によりプレコートしたプレートに添加して、ＣＳＦ−１またはＩＬ−３４を抗体に結合させる。未結合のＣＳＦ−１またはＩＬ−３４および他のタンパク質の洗浄後に、抗ＣＳＦ−１抗体または抗ＩＬ−３４抗体をそれぞれ認識する二次抗体を添加する。二次抗体は、基質をウェルに添加した場合、青みを帯びた色を発するホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされている。色の強度はプレート中で見出されるＣＳＦ−１またはＩＬ−３４の量に相関する。
【００７８】
ＣＳＦ−１およびＩＬ−３４は健康なヒト身体中に天然に存在するので、ＣＳＦ−１およびＩＬ−３４のベースラインは対照集団において決定される必要がある。対照集団は、癌性症状または感染兆候を有すると診断されていない個体群を含み得る。したがって、対照集団は正常なＣＳＦ−１およびＩＬ−３４レベルの範囲または健康な個人についてのベースラインを確立する。例えば、ＣＳＦ−１レベルは、乳癌または結腸直腸癌の患者血清において対照群の血清においてよりもそれぞれ６８％または７７％高い（Ｌａｗｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ３１７：１１２−１１６（２００６）；Ｍｒｏｃｚｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ３８０：２０８−２１２（２００７））。本発明の一態様において、ＣＳＦ−１Ｒリガンドレベルは、対照集団からのサンプルよりも癌患者サンプルにおいて少なくとも５０％高い。対照集団におけるＣＳＦ−１および／またはＩＬ−３４のレベルの範囲を、患者のサンプルまたはサンプルから同定されたＣＳＦ−１および／またはＩＬ−３４のレベルと比較して、患者のＣＳＦ−１および／またはＩＬ−３４のレベルが対照集団のベースライン範囲よりも高いかどうかが決定される。
【００７９】
一態様において、本発明の抗体は、癌細胞がリガンドを分泌する癌の治療における使用のためのものである。他の態様において、本発明の抗体は、癌細胞がＣＳＦ−１を分泌する癌の治療における使用のためのものである。さらに他の態様において、本発明の抗体は、癌細胞がＩＬ−３４を分泌する癌の治療における使用のためのものである。
【００８０】
本発明は、ヒト抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の治療上有効量を含む、腫瘍増殖および／または血管新生の阻害のためのキットも含む。キットは、抗体またはその断片、およびドセタキセル、パクリタキセル、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）またはドキソルビシンを含むが、これらに限定されない追加の抗癌剤、抗新生物剤または治療を含む、追加の薬剤をさらに含むことができる。代わりにまたは加えて、キットは、例えば以下に検討される腫瘍形成または血管新生に関与する他の増殖因子受容体の任意の好適なアンタゴニストを含むことができる。本発明のキットはさらにアジュバントを含むことができる。
【００８１】
したがって、本レセプター抗体は、このように当該技術分野において周知の調査法、診断法、予防法または治療法のためにインビボおよびインビトロで使用することができる。本明細書において開示された発明の原理における変形は当業者によって行うことができ、かかる修飾が本発明の範囲内に含まれるべきであることが意図される。
【００８２】
本明細書において開示された発明の原理における変形は当業者によって行うことができることが理解および予想され、かかる修飾が本発明の範囲内に含まれるべきであることが意図される。
【実施例】
【００８３】
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、いかなる手段においても本発明の範囲を限定するように解釈されるべきでなく；それらは本発明の広範囲の限定として全く解釈されるべきではない。従来の方法（ベクターおよびプラスミドの構築、かかるベクターおよびプラスミドの中へのポリペプチドをコードする遺伝子の挿入、宿主細胞の中へのプラスミドの導入、ならびに遺伝子および遺伝子産物のその発現および決定において用いられるもの等）の詳細な説明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、およびＣｏｌｉｇａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（２００７）を含む多数の出版物から得ることができる。
【００８４】
ヒト抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の発現および精製
各々の抗体については、ＰＣＲクローニング等の好適な方法によって、好適な発現プラスミド（例えばｐＧＳＨＣ）の中へ好適な重鎖ヌクレオチド配列（例えば抗体１については配列番号１３）を操作し、好適な発現プラスミド（ｐＧＳＬＣ等）の中へ好適な軽鎖ヌクレオチド配列（例えば抗体１については配列番号１４）を操作する。安定した細胞株を樹立するために、直線化した重鎖プラスミドおよび軽鎖プラスミドを好適な宿主細胞線（ＮＳＯまたはＣＨＯの細胞等）中にエレクトロポレーションによってコトランスフェクションし、透析したウシ胎仔血清およびグルタミン合成酵素を補充した好適な培地（グルタミン不含有ダルベッコ変法イーグル培地等）中で培養する。酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって抗体発現についてクローンをスクリーニングし、スピナーフラスコ中での培養が最高の産生株を選択する。プロテインＡ親和性クロマトグラフィー等の好適な方法によって抗体を精製する。
【００８５】
表１は、本発明の抗体１の様々なＣＤＲのアミノ酸配列および配列番号を提供する。ＣＤＲ配列はすべてＫａｂａｔの慣例を使用して決定される。表２は、本発明に関連する様々な配列の配列番号を提供する。以下に開示されたアミノ酸配列をコードするポリ核酸配列も本発明の範囲内に含まれる。
【００８６】
【表１】
2013529183.tif 000002
【００８７】
【表２】
2013529183.tif 000003
【００８８】
酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）結合アッセイ
ＣＳＦ−１Ｒ結合アッセイについては、可溶性組換えヒトＣＳＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１μｇ／ｍＬ×１００μＬ）により９６ウェルプレートをコートし、プレートを密封し、４℃で一晩インキュベーションする。０．２％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）（ＰＢＳ／Ｔ）によりウェルを３回洗浄し、次いで３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで室温（２０〜２５℃）（ＲＴ）で１時間ブロッキングする。ＢＳＡ−ＰＢＳ混合物を吸引し、ＰＢＳ／Ｔでプレートを３回洗浄する。抗体１または対照ＩｇＧの連続的な希釈を行い（３μｇ／ｍＬで開始し３倍希釈をする）、１００μＬをＲＴで１時間ウェルに添加する。ＰＢＳ／Ｔでウェルを３回洗浄する。洗浄後に、１００μＬのＰＢＳ中の抗ヒトＦ（ａｂ’）２断片特異的ＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）（１：５０００希釈）によりプレートをＲＴで１時間インキュベーションする。ＰＢＳ／Ｔでプレートを５回洗浄し、次いで１００μＬのＴＭＢペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ溶液Ｂ（ＫＰＬ）の１：１調製物によりＲＴで１５分間インキュベーションする。１００μＬの０．１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して比色反応を停止する。４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを使用して、データを採取する。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで吸光度データを分析してＥＤ５０を計算する。ＥＤ５０（すなわち２分の１最大有効用量）は最大結合の５０％を達成するのに必要な用量である。
【００８９】
ヒトＣＳＦ−１Ｒに対する抗体１のＥＤ５０は８．７×１０−１１Ｍであり、０．０９ｎＭとして報告される。抗体１はＣＳＦ−１Ｒに対して強い結合を示す。
【００９０】
酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）ブロッキングアッセイ
抗体がＣＳＦ−１／ＣＳＦ−１Ｒ相互作用をブロックすることを示すＥＬＩＳＡ
ＣＳＦ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（０．５μｇ／ｍＬ×１００μＬ）により９６ウェルマイクロタイタープレートを４℃で一晩コートする。ＰＢＳ／Ｔでウェルを３回洗浄し、次いで１００μＬの３％ＢＳＡ／ＰＢＳでＲＴで１時間ブロッキングする。ＰＢＳ／Ｔで再び３回洗浄する。０．２５０μｇ／ｍＬの最終的な濃度までＰＢＳ中で可溶性ヒトｒｈ−ＣＳＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を希釈する。同時に、２００ｎＭの最終的な濃度までＰＢＳ中で抗体１を希釈する。最初は２００ｎＭから３×１０−１２Ｍまで１：３で増加させて抗体１を連続的に希釈する。１００μＬの各希釈の抗体１と１００μＬのｒｈ−ＣＳＦ−１Ｒ−ＦｃをＲＴで３０分間合わせる。ＣＳＦ−１をコートしたウェル中で１００μＬの抗体１：ＣＳＦ−１Ｒ−Ｆｃ混合物をＲＴで１時間インキュベーションする。ＲＴで１時間のインキュベーション後に、ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄し、抗ヒトＩｇＧ−ＦｃＨＲＰコンジュゲート抗体の１：５０００希釈をＲＴで１時間プレートに添加する。ＰＢＳ／Ｔでプレートを５回洗浄し、次いで１００μＬのＴＭＢペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ溶液Ｂ（ＫＰＬ）の１：１調製物によりＲＴで１５分間インキュベーションする。１００μＬの０．１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して比色反応を停止する。４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを使用して、データを採取する。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで吸光度データを分析してＩＣ５０を計算する。ＩＣ５０（すなわち２分の１最大阻害濃度）は受容体に対するリガンド結合の５０％阻害を引き起こす抗体の濃度である。
【００９１】
ヒトＣＳＦ−１Ｒに対する抗体１の結合のＩＣ５０は８．１×１０−１０Ｍであり、０．８１ｎＭとして報告される。抗体１はＣＳＦ−１Ｒに対するＣＳＦ−１結合を阻害し、それによってＣＳＦ−１リガンドによるＣＳＦ−１Ｒ活性化を防止する。
【００９２】
抗体がＩＬ−３４／ＣＳＦ−１Ｒ相互作用をブロックすることを示すＥＬＩＳＡ
ＩＬ−３４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（０．５μｇ／ｍＬ×１００μＬ）により９６ウェルマイクロタイタープレートを４℃で一晩コートする。ＰＢＳ／Ｔでウェルを３回洗浄し、次いで１００μＬの３％ＢＳＡ／ＰＢＳでＲＴで１時間ブロッキングする。ＰＢＳ／Ｔで再び３回洗浄する。０．２５０μｇ／ｍＬの最終的な濃度までＰＢＳ中で可溶性ヒトｒｈ−ＣＳＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を希釈する。同時に、２００ｎＭの最終的な濃度までＰＢＳ中で抗体１を希釈する。最初は２００ｎＭから３×１０−１２Ｍまで１：３で増加させて抗体１を連続的に希釈する。１００μＬの各希釈の抗体１と１００μＬのｒｈ−ＣＳＦ−１Ｒ−ＦｃをＲＴで３０分間合わせる。ＩＬ−３４をコートしたウェル中で１００μＬの抗体１とＣＳＦ−１Ｒ−Ｆｃ混合物をＲＴで１時間インキュベーションする。ＲＴで１時間のインキュベーション後に、ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄し、抗ヒトＩｇＧ−ＦｃＨＲＰコンジュゲート抗体の１：５０００希釈をＲＴで１時間プレートに添加する。ＰＢＳ／Ｔでプレートを５回洗浄し、次いで１００μＬのＴＭＢペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ溶液Ｂ（ＫＰＬ）の１：１調製物によりＲＴで１５分間インキュベーションする。１００μＬの０．１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して比色反応を停止する。４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを使用して、データを採取する。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで吸光度データを分析してＩＣ５０を計算する。ＩＣ５０（すなわち２分の１最大阻害濃度）は受容体に対するリガンド結合の５０％阻害を引き起こす抗体の濃度である。
【００９３】
ヒトＣＳＦ−１Ｒに対する抗体１の結合のＩＣ５０は７．０×１０−１０Ｍであり、０．７１ｎＭとして報告される。抗体１はＣＳＦ−１Ｒに対するＩＬ−３４結合を阻害し、それによってＩＬ−３４リガンドによるＣＳＦ−１Ｒ活性化を防止する。
【００９４】
表面プラズモン共鳴／Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析による結合反応速度分析
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００  ＳＰＲ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で２５℃でＣＳＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する抗体１の結合反応速度を測定する。標準的なアミンカップリングプロトコルを使用して、ＣＭ５チップ上で３９５〜１２００の応答単位で、可溶性ＣＳＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質（１０μｇ／ｍＬの濃度でｐＨ５）を固定化した。結合親和性測定の間のランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍヘペス（ｐＨ７．４）、０．１５ｍＭ  ＮａＣｌおよび３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０）を使用する。溶液中の抗体がＣＭ５センサーチップの準備された表面の上に１．５〜１００ｎＭの範囲の濃度で注入されるようにして相互作用分析を実行する。結合のために３分間にわたり抗体を注入し、１５分間解離させる。１０μＬ／分の２０ｍＭ  ＨＣＬの注入によって固定化タンパク質の再生を実行する。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン４．１ソフトウェアを使用して、１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルに対してデータを同時に全体的にフィッティングさせることによって複合体形成のＫａ（ｋｏｎ）およびＫｄ（ｋｏｆｆ）を決定する。モーラー（１／Ｍ）における測定した１／ＫＤの比から平衡会合定数（ｋＡ）を計算する。モーラー（Ｍ）における測定した速度定数Ｋｄ／Ｋａの比から平衡解離定数（ＫＤ）を計算する。
【００９５】
ヒトＣＳＦ−１Ｒによる抗体１の多重Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析についての平均のＫａ、ＫｄおよびＫＤの値は表３に要約される。
【００９６】
【表３】
2013529183.tif 000004
【００９７】
抗体１はＣＳＦ−１Ｒに対する高い結合親和性を実証する。
【００９８】
ウエスタンブロットによって検出されるＣＳＦ−１Ｒのリン酸化
ＣＳＦ−１Ｒを安定的にトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞を播種し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１ｍｇ／ｍＬのジェネティシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の１ｍＬのウェル中で５×１０５細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレート中に細胞を５時間置く。ＰＢＳ中で単層を２回洗浄し、０．９ｍＬ／ウェルの１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で一晩培養する。ＤＭＥＭ中で抗体１の連続的な希釈を行い（１μｇ／ｍＬで開始し３倍希釈をする）、１００μＬを３７℃で２時間ウェルに添加する。１００ｎｇ／ｍＬのＣＳＦ−１またはＩＬ−３４リガンドにより細胞を１０分間刺激し、次いで氷上に置き、氷冷ＰＢＳで洗浄する。細胞を、１００μＬの５０ｍＭヘペス（ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ  ＮａＰＰｉ、５０ｍＭ  ＮａＦ）およびプロテアーゼ阻害剤の錠剤（Ｒｏｃｈｅ）中で１０分間氷上で溶解する。溶解した細胞を４℃で遠心分離によって清澄化する。２０μＬのライセートを変性電気泳動ゲルにロードし、ニトロセルロース膜上にブロッティングする。１μｇ／ｍＬで抗リン酸化ＣＳＦ−１Ｒ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用することによって、ブロット上のチロシンがリン酸化されたＣＳＦ−１Ｒを検出する。抗リン酸化−ＭＡＰＫ（１：５００希釈）または抗リン酸化−Ａｋｔ（１：１０００）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）のいずれかによるブロットのプロービングによって、ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達を決定する。レーンの等しいローディングを保証するために、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体（１μｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）または抗アクチン抗体（１：２０００；Ｓｉｇｍａ）によりブロットをプロービングする。すべての一次抗体をＲＴで１時間振動しながら、続いてＨＲＰをコンジュゲートした対応する二次抗体もＲＴで１時間振動しながらインキュベーションした。化学発光試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりバンドを可視化する。
【００９９】
ＣＳＦ−１またはＩＬ−３４のいずれかで刺激された場合、ＣＳＦ−１Ｒを安定的にトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞はＣＳＦ−１Ｒの迅速なリン酸化を示す。抗体のレベルが１ｎＭである場合でさえ、抗体１の存在はＣＳＦ−１Ｒリン酸化を阻害し、ＣＳＦ−１Ｒに対する抗体１の結合がＣＳＦ−１またはＩＬ−３４のいずれかによる受容体の活性化を防止することを示す。ＣＳＦ−１Ｒリン酸化の阻害は、ＣＳＦ−１またはＩＬ−３４経路のどちらかによって使用されるシグナル分子のリン酸化の減退ももたらす。細胞を１００ｎＭ〜１ｎＭの抗体１によりインキュベーションする場合、ＡｋｔおよびＭＡＰＫ（ＣＳＦ１−Ｒの下流である）の両方のリン酸化レベルは減少した。それゆえ、抗体１は、ＣＳＦ−１Ｒ活性化およびＣＳＦ−１Ｒ刺激に続くキナーゼカスケードの活性化を防止する。ブロットをアクチンおよびＣＳＦ−１Ｒ分子に対する抗体でプロービングした場合に観察される各レーン中の等しい化学発光シグナルによって証明されるように、レーンの間のアクチンおよびＣＳＦ−１Ｒのタンパク質レベルに差はなかった。したがって、ＣＳＦ−１Ｒリン酸化の阻害はタンパク質サンプルの不均等なローディングによる技術的問題点のためではなく、シグナル伝達が低下したことが真に示されている。
【０１００】
内部移行および分解のアッセイ
抗体１はＣＳＦ−１Ｒ受容体の内部移行を誘導する
８ウェルチャンバー付スライド（Ｎｕｎｃ）上にＮＩＨ−３Ｔ３−ＣＳＦ−１Ｒ細胞をプレーティングし、細胞がウェルの表面積の５０％を覆うまで３７℃でインキュベーションする。実験の開始前に水：氷スラリー混合物中で４℃までスライドを冷却する。５μｇ／ｍＬの抗体１により細胞をインキュベーションし、直ちに３７℃に１５分間〜４時間移して内部移行を生じさせる。スライドの別のセットを、対照として、５μｇ／ｍＬ抗体１により１５分間〜４時間、水：氷スラリー混合物中でインキュベーションし続ける。４℃インキュベーションはＣＳＦ−１受容体の内部移行を防止し、それゆえこの細胞内で観察されるいかなるシグナルもアーティファクトである。インキュベーション後に、冷ＰＢＳで２回細胞を洗浄してから、氷冷１％パラホルムアルデヒドで細胞を１５分間固定する。冷ＰＢＳで３回洗浄した後に、０．５％サポニンおよび１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で細胞を５分間透過性にし、次いで１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で再び洗浄する。ヤギＣｙ３抗ヒトＩｇＧ（１：５０００希釈）により１時間標識して抗体１を蛍光標識する。ＰＢＳで最終的な洗浄を３回実行してから、ＧｅｌＭｏｕｎｔ（Ｂｉｏｍｅｄａ）中でマウントし、カバーグラスでスライドを覆う。蛍光標識した抗体１を顕微鏡で観察して、上述された様々な条件下の細胞内局在を決定できる。
【０１０１】
顕微鏡検査で、抗体１は実験の開始前の４℃では細胞の周囲で観察される。３７℃への細胞のスイッチは、通常１５分間以内に観察される抗体１／ＣＳＦ−１Ｒ複合体の迅速な内部移行を可能にする。抗体１による１または２時間のインキュベーション後に、抗体／ＣＳＦ−１Ｒ複合体はすべて核周囲に存在し、原形質膜上でほとんど観察されず、ＣＳＦ−１Ｒに対する抗体１結合が、受容体の迅速な内部移行および細胞の内側での残存を誘導することを示す。最大２時間４℃で維持した細胞は、抗体１の内部移行なしで細胞周囲のみの染色を示す。したがって、抗体／ＣＳＦ−１Ｒの内部移行は、細胞への抗体添加の１５分以内に生じるＡＴＰ依存性のプロセスである。
【０１０２】
抗体１はＣＳＦ−１Ｒ受容体の分解を誘導する
１２ウェルプレート中の１０％ＦＢＳおよび１ｍｇ／ｍＬのジェニティシン（ｇｅｎｉｔｉｃｉｎ）を含む１ｍＬのＤＭＥＭ培地中に、５×１０５細胞／ウェルでＮＩＨ−３Ｔ３−ＣＳＦ−１Ｒ細胞を播種する。細胞を３７℃で５時間インキュベーションした後に、１００ｎｇ／ｍＬのＣＳＦ−１または１５μｇ／ｍＬの抗体１のいずれかをプレートへ添加する。ＣＳＦ−１はＣＳＦ−１Ｒの内部移行および分解を誘導し、そのために実験の陽性対照として働くことが公知である。細胞の回収前の１および５時間、ＣＳＦ−１を細胞上に残存するようにする。他のウェルにおいて、細胞の回収前に抗体１により２４および４８時間インキュベーションする。培地を吸引し、細胞を溶解し、清澄化した溶解物をゲル上で泳動する（上記のように）。転写したタンパク質を抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体によりプロービングして、各条件についての受容体の量を決定する。抗アクチン抗体により同じブロットをプロービングして、タンパク質レベルを正規化する。ウエスタンブロット上のバンド密度を測定するＭｕｌｔｉ−Ｇａｕｇｅプログラムを使用して、ＣＳＦ−１Ｒおよびアクチンレベルを定量する。相対的全ＣＳＦ−１Ｒタンパク質レベルは、対応するアクチンバンド密度で割った全ＣＳＦ−１Ｒバンド密度によって表わされる。
【０１０３】
ＮＩＨ−３Ｔ３−ＣＳＦ−１Ｒ細胞のＣＳＦ−１インキュベーションは処理の１時間以内にＣＳＦ−１Ｒの分解をもたらし、ＣＳＦ−１Ｒレベルは５時間までに半分になる。抗体１によりインキュベーションした場合ＣＳＦ−１Ｒの分解は前述のようではなく；抗体１は４分の１までＣＳＦ−１Ｒレベルを減少させる。４８時間後に分解レベルは同じままであり、分解速度が一定のままであることを示す。それゆえ、ＣＳＦ−１Ｒへ結合する抗体１は細胞中で受容体の分解をもたらす。
【０１０４】
抗体１による抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１結合の阻害ならびにＣＳＦ−１Ｒの内部移行および分解の誘導に加えて、抗体１は、ＡＤＣＣ応答の誘導によってもＣＳＦ−１Ｒを阻害する。
【０１０５】
ＮＫＭ−１ヒト白血病細胞を、９６ウェルプレート中の１０％  Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳおよび３ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２を含む２５μＬ  ＲＰＭＩ培地中に、２×１０５細胞／ｍＬで播種する。ＩｇＧ１またはＩｇＧ２いずれかの骨格中の抗体１の１μｇ／ｍＬを１：３で連続的に希釈し、２５μＬ／ウェルで添加する。１５分間のインキュベーション後に、２５μＬの３×１０６細胞／ｍＬのヒトＮＫ細胞（Ｌｏｎｚａ）を播種し、３７℃で追加の４時間インキュベーションする。ａＣｅｌｌａ−ＴＯＸキット（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）からのＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを１０μＬ添加し、１５分間ＲＴにする。１２５μＬの低ＩｇＧ  ＦＢＳを添加し、７５０×ｇで１分間プレートを遠心分離する。Ｏｐｔｉｐｌａｔｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において、ａＣｅｌｌａ−ＴＯＸキットからの５０μＬのＥｎｚｙｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔを添加し、５０μＬの細胞上清をＯｐｔｉｐｌａｔｅｓへ慎重に移す。キット説明書に従って酵素アッセイ試薬および検出試薬を調製し、１００μＬの酵素アッセイ試薬を、直ちに続いて５０μＬの検出試薬をＯｐｔｉｐｌａｔｅｓへ添加する。試薬の添加２０分間後にルミノメーター中のプレートを読み取る。
【０１０６】
ＡＤＣＣ活性は抗体１用量依存的様式で増加し、抗体１濃度が１μｇ／ｍＬに到達する場合ＮＫＭ−１細胞の９％が死滅した。これとは対照的に、抗体１がＩｇＧ２骨格の中へクローン化された場合、抗体１の量を増加させてもＡＤＣＣ活性の変化はない。それゆえ、抗体１（ＩｇＧ１分子）は結合する細胞のＡＤＣＣを誘導する。
【０１０７】
エピトープマッピング
先の出版物は、ＣＳＦ−１Ｒの最初の３個のＩｇドメインへＣＳＦ−１が結合することを決定した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：５３４８（１９９３））。抗体１はＣＳＦ−１Ｒを結合し、ヒトＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１結合を阻害し、したがってそれはＣＳＦ−１Ｒの最初の３個のＩｇドメインまたはそのドメインの近くに結合するに違いない。ＣＳＦ−１Ｒ分子上のどのエピトープに抗体１が結合するかを決定するために、マウスおよびヒトの最初の３個のＩｇドメインを取り替える（表４を参照されたい）。マウスＩｇドメインがヒトＣＳＦ−１Ｒの重要な結合領域中に挿入されるならば、それゆえ抗体１はマウスＣＳＦ−１Ｒを認識せず、抗体の結合は生じないだろう。
【０１０８】
最初の３個のＩｇドメインの修飾物を、細胞外ドメインの最もＣ末端の残りの２個のＩｇドメインを含むヒトＣＳＦ−１Ｒ骨格の中へ挿入する。タンパク質産生および分子の安定性の容易性のためにこれらのコンストラクトをＩｇＧ分子のＦｃ部分へ融合させる。
【０１０９】
【表４】
2013529183.tif 000005
【０１１０】
したがってキメラ１は、マウスＩｇドメイン１、ヒトＩｇドメイン２およびヒトＩｇドメイン３（ｍ、ｈ、ｈ）、ヒトＩｇドメイン４および５を含み、Ｆｃタグへ融合される。キメラ２〜キメラ７は以下の通りである。ｍ、ｍ、ｈ（キメラ２）、ｍ、ｍ、ｍ（キメラ３）、ｈ、ｍ、ｈ（キメラ４）、ｈ、ｍ、ｍ（キメラ５）、ｈ、ｈ、ｍ（キメラ６）およびｍ、ｈ、ｍ（キメラ７）を、ヒトＣＳＦ−１Ｒの最後の２個のＩｇドメインおよび次いでＦｃタグへ融合する。
【０１１１】
キメラＣＳＦ−１Ｒタンパク質への抗体１結合は、結合ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）によって上記のように決定する。簡潔には、２００ｎｇ／ｍＬのヒト、マウスまたはキメラ１〜７のタンパク質を１００μＬ用いてプレートを一晩コートする。プレートの洗浄およびブロッキングの後に、抗体１を１００ｎＭ濃度で重複して添加する。ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＦａｂ二次抗体を１：１０，０００の濃度で添加して、ＣＳＦ−１Ｒ分子と結合する抗体１を検出する。
【０１１２】
予想されるように、抗体１は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいてヒトＣＳＦ−１Ｒへ結合するが、マウスＣＳＦ−１Ｒには結合しない。抗体１は、第１または第２のヒトＩｇドメインを含むキメラへ弱く結合するが、第１または第２のマウスＩｇドメインを含むキメラには結合しない。抗体１は、ヒトＣＳＦ−１Ｒの第１および第２のＩｇドメインを含むキメラへ強く結合する。他のすべてのコンストラクトは抗体１を結合しない。したがって、結合アッセイにおいて評価した場合、抗体１はＩｇドメイン１および２へ結合するが、ヒトＣＳＦ−１Ｒへの強い抗体結合のためには両方のドメインを必要とする。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）データはＥＬＩＳＡデータを再現する。抗体レベルが１μＭの場合でさえ、ヒト第２のＩｇドメインを含まないキメラコンストラクトはどれも抗体１を結合せず、第２のＩｇドメインが抗体１結合に必要なことが示された。第１のＩｇドメインもヒト起源の場合、抗体１の結合はさらに促進された。それゆえ、抗体１は主としてＣＳＦ−１Ｒの第２のＩｇドメインへ結合するが、第１のＩｇドメインとある程度の有用な接触を有する。
【０１１３】
分化および増殖のアッセイ
ＣＳＦ−１によるマクロファージ分化
８チャンバースライドの各チャンバー中の１０％ＦＢＳおよび１００ｎｇ／ｍＬのｈＣＳＦ−１を含む９００μＬ  Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地中に４×１０５細胞／ｍＬの密度で単球（Ｌｏｎｚａ）を播種する。ＲＰＭＩ中で抗体１の連続的な希釈を行い（１μｇ／ｍＬで開始し３倍希釈をする）、１００μＬをウェルに添加する。単球のプレートへの接着および伸長（マクロファージ分化の特性である）が明らかに観察されるまで、３日ごとに培地を交換して３７℃でインキュベーションする。
【０１１４】
ＣＳＦ−１の存在下において２ｎＭ以上の濃度の抗体１で処理した単球はマクロファージへと分化することができず、単球の丸い形態特性を保持する。単球のマクロファージ分化へのＣＳＦ−１による誘導は、０．２５ｎＭのＩＣ５０で抗体１により阻害することができる。加えて、多くのものが処理の間に死滅し、ＣＳＦ−１による連続的な刺激なしには生き残ることができない。
【０１１５】
ＩＬ−３４によるマクロファージ分化
８チャンバースライドの各チャンバー中の１０％ＦＢＳおよび１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−３４を含む９００μＬ  Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地中に、４×１０５細胞／ｍＬの密度で単球（Ｌｏｎｚａ）を播種する。ＲＰＭＩ中で抗体１の連続的な希釈を行い（１μｇ／ｍＬで開始し３倍希釈をする）、１００μＬをウェルに添加する。単球のプレートへの接着および伸長（マクロファージ分化の特性である）が明らかに観察されるまで、３日ごとに培地を交換して３７℃でインキュベーションする。
【０１１６】
ＩＬ−３４の存在下において２ｎＭ以上の濃度の抗体１により処理した単球はマクロファージへと分化することができず、単球の丸い形態特性を保持する。単球のマクロファージ分化へのＩＬ−３４による誘導は、０．３ｎＭのＩＣ５０で抗体１により阻害することができる。加えて、多くのものが処理の間に死滅し、ＣＳＦ−１による連続的な刺激なしには生き残ることができない。
【０１１７】
ＣＳＦ−１による単球の増殖
１０％ＦＢＳおよび１００ｎｇ／ｍＬのＣＳＦ−１を含むＲＰＭＩ  １６４０培地の存在下において９６ウェルプレート中に３０００細胞／ウェルの密度で単球（Ｌｏｎｚａ）を播種する。翌日、培地を交換し、２０ｎＭ〜０．０１ｎＭに連続的に希釈した抗体１（１：３倍希釈）を添加する。３日後に、１０％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのＣＳＦ−１、および抗体を含む新鮮培地と培地を交換し、細胞を追加の５日間増殖させる。１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｃｅｎｔ緩衝液および基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加と同時に、細胞を１０分間振盪し、発光を生存率の指標として読み取る。
【０１１８】
単球増殖の５０％を阻害する抗体１のＩＣ５０は１．４×１０−１０Ｍであり、０．１ｎＭとして報告される。抗体１の存在下における単球増殖のＣＳＦ−１による誘導についてのＩＣ５０は、抗体１が培養中の単球の増殖を阻害することを示す。
【０１１９】
ＩＬ−３４による単球の増殖
１０％ＦＢＳおよび１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３４を含むＲＰＭＩ  １６４０培地の存在下において９６ウェルプレート中に３０００細胞／ウェルの密度で単球（Ｌｏｎｚａ）を播種する。翌日、培地を交換し、２０ｎＭ〜０．０１ｎＭに連続的に希釈した抗体１（１：３倍希釈）を添加する。３日後に、１０％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３４、および抗体を含む新鮮培地と培地を交換し、細胞を追加の５日を増殖させる。１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｃｅｎｔ緩衝液および基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加と同時に、細胞を１０分間振盪し、発光を生存率の指標として読み取る。
【０１２０】
単球増殖の５０％を阻害する抗体１のＩＣ５０は、０．５ｎＭである。抗体１の存在下における単球増殖のＩＬ−３４による誘導についてのＩＣ５０は、抗体１が培養中の単球の増殖を阻害することを示す。
【０１２１】
ＣＳＦ−１による腫瘍細胞株の増殖アッセイ
９６ウェルプレート中の１％ＦＢＳを含む１００μＬのＲＰＭＩ  １６４０培地中に、１×１０４細胞／ｍＬでＮＫＭ−１白血病細胞を一晩播種する。１％ＦＢＳおよび２０ｎＭ〜０．０１ｎＭに連続的に希釈した抗体１（１：３倍希釈）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地中の細胞に２０ｎｇ／ｍＬのＣＳＦ−１を添加する。追加の３日間３７℃でインキュベーションする。１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｃｅｎｔ緩衝液および基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加と同時に、細胞を１０分間振盪してから、発光（生存率の指標として）を読み取る。
【０１２２】
抗体１の存在下におけるＮＫＭ−１増殖についてのＩＣ５０は７．６×１０−１１Ｍであり、０．０７ｎＭとして報告される。これは抗体１が培養においてＮＫＭ−１細胞の増殖を阻害することを示す。
【０１２３】
ＣＳＦ−１Ｒが腫瘍の表面上で発現される、インビボの腫瘍モデル
抗体１により処理したＮＫＭ−１ヒト白血病を有するマウスの生存延長
Ｎｕ／ｎｕマウスを致死量以下の２００ｒａｄ／マウスで２４時間照射してから、２．５×１０６のＮＫＭ−１白血病細胞を静脈注射する。さらに２４時間後、６０ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ、６０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇの抗体１のいずれかを毎週２回投与される４群へと、マウスをランダムに分ける。マウスを生存について毎日モニターする。ログランクＭａｎｔｅｌ  Ｃｏｘ検定によって確率を決定する。
【０１２４】
【表５】
2013529183.tif 000006
【０１２５】
腫瘍体積は、式、体積＝［（π／６）ｌ×ｗ２］によって計算され、式中、πは３．１４と等しく、ｗは幅を表わし、ｌは長さを表わす。対照のパーセントまたは％Ｔ／Ｃ＝１００＊（処理体積）／（対照体積）。ｐ値が０．０５以下だったならば、統計的有意性があるとみなされた。
【０１２６】
表５中で見られるように、抗体１はＮＫＭ−１白血病細胞を有するマウスの生存を増加させる。
【０１２７】
ＣＳＦ−１Ｒが腫瘍関連マクロファージの表面上で発現されるインビボの腫瘍モデル
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体１は、ＣＳＦ−１Ｒのヒト型を認識するが、この受容体のマウス型を認識しない完全ヒト抗体である。それゆえ、ＣＳＦ−１Ｒがマクロファージ上で発現される場合のインビボの研究の概念実証を行うために、抗マウス抗体が必要とされる。これらの研究は、マウス異種移植モデルにおけるヒト腫瘍の増殖に対するマウスマクロファージの役割を検討する。抗マウス抗体は腫瘍ではなくマウスマクロファージに影響を与え、この能力は腫瘍増殖に対する間質マクロファージの効果を測定することを可能にする。以下の実験は、抗体２（ラット抗マウスＣＳＦ−１Ｒ抗体）で行なわれる。
【０１２８】
ヒト子宮内膜癌のＡＮ３ＣＡ異種移植モデルにおける抗マウスＣＳＦ−１ＲｍＡｂの有効性
Ｎｕ／ｎｕマウス（メス、７〜８週齢）に５×１０６のＡＮ３ＣＡ細胞／マウスを左脇腹へ皮下注射する。腫瘍が約２００ｍｍ３に到達した時に、マウスを１２マウス／処理の群へとランダム化する。
【０１２９】
抗体２およびラットＩｇＧを６ｍｇ／ｍＬの濃度で生理食塩水中で調製し、４０ｍｇ／ｋｇで１週間に３回皮下投与する。１５日目に、腫瘍体積を記録し、％Ｔ／Ｃを計算する。反復測定分散分析を使用して腫瘍体積を分析する。ラットＩｇＧ対照群に対する、抗体２による処理群についての６６％のＴ／Ｃ％を計算する。これらの結果は抗体２により処理した動物における有意な腫瘍阻止（ｐ＝０．０４５）を示す。
【０１３０】
ヒト乳癌のＨＣＣ１９５４異種移植モデルにおける抗マウスＣＳＦ−１ＲｍＡｂの有効性
Ｎｕ／ｎｕ（メス、７〜８週；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）マウスに、１×１０７のＨＣＣ１９５４細胞／マウスで皮下注射する。腫瘍が３００ｍｍ３のサイズに到達した時に、腫瘍サイズによりマウスをランダム化し、各処理群に１２動物を割り付ける。ラットＩｇＧおよび抗体２を６ｍｇ／ｍＬの濃度で生理食塩水中で調製し、１週間に３回皮下投与する。４０ｍｇ／ｋｇでラットＩｇＧを動物に与え、各注入を４０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのいずれかで抗体２を動物に与える。毎週２回の腫瘍測定を記録し；第１の注入の３７日後にＴ／Ｃ％を計算する。反復測定分散分析を使用して、腫瘍体積を分析する。
【０１３１】
表６中で示されるように、３７日目に７７％のＴ／Ｃ％は１０ｍｇ／ｋｇを投与した処理群について、および５６％のＴ／Ｃ％は４０ｍｇ／ｋｇを投与した処理群について、生理食塩水対照群に対する相対的腫瘍体積の比としてて計算した。結果は４０ｍｇ／ｋｇの抗体２により処理した動物における有意な腫瘍阻止（ｐ＝０．００１４）を示す。
【０１３２】
ＤＵ１４５ヒト前立腺異種移植モデルにおける抗マウスＣＳＦ−１ＲｍＡｂの抗腫瘍効果
Ｎｕ／ｎｕマウス（オス、７〜８週齢）に１５×１０６のＤＵ１４５細胞／マウスを左脇腹へ皮下注射する。腫瘍が約２５０ｍｍ３に到達した時に、マウスを１２マウス／処理の群へランダム化する。
【０１３３】
抗体２およびラットＩｇＧを６ｍｇ／ｍＬの濃度で生理食塩水中で調製し、４０および１０ｍｇ／ｋｇで１週間に３回皮下投与する。２１日目に、腫瘍体積を記録し、１０ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇについての％Ｔ／Ｃを計算する。反復測定分散分析を使用して腫瘍体積を分析する。
【０１３４】
表６中で示されるように、ラットＩｇＧ対照群に対する、処理群（１０ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇ）それぞれについての５０のＴ／Ｃ％および４３のＴ／Ｃ％を計算する。これらの結果は抗体２により処理した動物における有意な腫瘍阻止（両方の濃度についてｐ＝＜０．０００１）を示す。
【０１３５】
【表６】
2013529183.tif 000007
【０１３６】
抗マウスＣＳＦ−１ＲｍＡｂにより処理されたＨＣＣ１９５４乳房腫瘍およびＤＵ１４５前立腺腫瘍におけるマクロファージインフィルトレーションの低下
上述されたＨＣＣ１９５４（乳房）およびＤＵ１４５（前立腺）の動物試験中の動物から腫瘍を取り出す。最長の軸に沿って腫瘍を切断し、振動させながら４℃で一晩１０％ホルマリン中に置く。２４時間後に、ＰＢＳ中で２０分間にわたって２回洗い、次いで腫瘍が１００％エタノール中に存在するまで、エタノール溶液の濃度を漸増させて添加する。１００％のキシレン中の複数回のインキュベーションによりエタノールをキシレンと交換し、パラフィン中に腫瘍を包埋する。パラフィンブロックを４μｍで切片にし、スライドグラス上に置く。キシレン、続いて水濃度を増加させたエタノール中の漸進的なインキュベーションによって組織を脱パラフィンおよび再水和する。ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄａｋｏ）中で腫瘍スライドをマイクロ波で３分間加熱してから、３％Ｈ２Ｏ２により内因性のペルオキシダーゼをＲＴで１０分間ブロッキングする。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ（Ｄａｋｏ）で非特異的タンパク質結合を１０分間ブロッキングしてから、ビオチンにコンジュゲートしたラット抗マウスマクロファージ特異的抗体（Ｆ４／８０（２μｇ／ｍＬ；Ｓｅｒｏｔｅｃ））を添加し、４℃で一晩インキュベーションする。ＨＲＰストレプトアビジン（１：１０００希釈；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）中でＲＴで４５分間インキュベーションし、３回洗浄する。キットの説明書通りにＤＡＢ（Ｄａｋｏ）中で顕色させ、水中で２回洗浄することにより反応を停止する。マイヤーのヘマトキシリン（１０分間；Ｄａｋｏ）で短時間対比染色し、続いて水洗浄、酸アルコール浸漬、第２の水洗浄およびアンモニア水を使用する青味付を行う。脱水し、透明化し、および永久封入剤を使用してカバーグラスをかける。各処理群につき３匹の動物からの５画像を分析する。ＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェアを使用して、各処理群についてのマクロファージ数／領域を決定する。
【０１３７】
【表７】
2013529183.tif 000008
【０１３８】
表７中で見られるように、マクロファージ数は特に周囲に沿って両方の腫瘍モデルにおいて低下している。したがって抗体２による処理は腫瘍のマクロファージインフィルトレーションの減少をもたらし、抗マウスＣＳＦ−１Ｒ抗体がこれらの腫瘍中のマクロファージ集団を枯渇させる原因であることを示す。
【０１３９】
腫瘍進行に対するマクロファージおよびＣＳＦ−１レベルの重要性
乳房腫瘍および前立腺腫瘍の他の腫瘍の増殖の阻害と同様に、多くの癌の治療は、抗体１の投与によって有益に達成することができる。腎臓癌等いくつかの腫瘍タイプは細胞表面上でＣＳＦ−１Ｒを発現し、抗体１処理により増殖することを直接阻害することができた（Ｓｏａｒｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌ．２２：７４４−７５２（２００９））。腫瘍増殖を誘導するマクロファージを抗体１が除去することができる場合には、ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫（多くの腫瘍関連マクロファージ集団を有する）等の他の腫瘍タイプは、抗体１処理から利益を得ることができる（Ｓｔｅｉｄｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６２：８７５−８８５（２０１０）；Ｚｈｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１４：３６２５−３６２８（２００９））。加えて、結腸直腸癌等のＣＳＦ−１を分泌する腫瘍は、抗ＣＳＦ−１処理または抗ＣＳＦ−１Ｒ処理に対して感受性が高く（Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：５３１７−５３２４（２００２））、抗体１処理に適切だろう。さらに、ＣＳＦ−１の高発現が予後不良と相関する卵巣癌、肝細胞癌および腎細胞癌はすべて抗体１処理のための候補になるだろう（Ｔｏｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｙｎ．Ｏｎｃｏｌ．８０：１９４−２００（２００１）；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｙｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０７：５２６−５３１（２００７）；Ｚｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：２７０７−２７１６（２００８）；Ｇｅｒｈａｒｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｏｌ．５８：８２１−８２７（２００１））。
【０１４０】
腫瘍関連マクロファージを保持する非ＣＳＦ−１Ｒ発現腫瘍は、ＣＳＦ−１を分泌する場合のみ、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体によって増殖阻害される
５×１０５細胞／ｍＬで、腫瘍細胞株ＨＣＣ１９５４（乳房）、ＤＵ１４５（前立腺）およびＰｃ３（前立腺）を１％ＦＢＳを含む増殖培地中で４８時間播種する。培地を回収し、清澄化し、Ｒ＆Ｄ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍ−ＣＳＦ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析する。時刻０時間および４８時間でｐｇ／ｍＬとしてＣＳＦ−１レベルを決定する。
【０１４１】
０時間では、予想されるように培地中に認識できるＣＳＦ−１は存在しなかった。しかしながら、４８時間以内に、ＨＣＣ１９５４細胞は３６１３ｐｇ／ｍＬのＣＳＦ−１を分泌し、一方ＤＵ１４５細胞は４０１９ｐｇ／ｍＬのＣＳＦ−１を産生した。これとは対照的に、Ｐｃ３細胞培地はわずか３９ｐｇ／ｍＬのＣＳＦ−１を含んでいた。
【０１４２】
ＣＳＦ−１発現の欠如が抗ＣＳＦ−１Ｒ処理への抵抗性と相関しているのかを検証するために、前立腺細胞株Ｐｃ３をマウスにおいて増殖させる
ヌードマウス（オス、７〜８週齢）に５×１０６のＰｃ３前立腺細胞を皮下注射し、腫瘍を３００ｍｍ３に到達させてから１２匹の各マウスを処理群へと細分する。対照腫瘍が２０００ｍｍ３に到達するまで、４０ｍｇ／ｋｇのラットＩｇＧ、４０ｍｇ／ｋｇの抗体２、または１０ｍｇ／ｋｇの抗体２のいずれかを動物に１週間に３回与える。腫瘍体積を測定し、１８日目にラットＩｇＧ対照群に対する相対的腫瘍体積の比として処理群についてのＴ／Ｃ％を計算する。反復測定分散分析を使用して腫瘍体積を分析する。
【０１４３】
【表８】
2013529183.tif 000009
【０１４４】
ラットのＩｇＧ処理対照群と抗体２処理群との間に増殖の差はなく、ＣＳＦ−１レベルの上昇は抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体による処理のためのバイオマーカーであり得ることを示す。
【０１４５】
ＣＳＦ−１Ｒが腫瘍関連マクロファージの表面上で発現される場合、ＣＳＦ−１分泌は抗ＣＳＦ−１Ｒ処理の感受性に相関する
表９および１０中で以下で詳述されるように、ヌードマウスへ細胞を皮下注射し、腫瘍が３００ｍｍ３を到達させてから１２匹の各マウスを処理群へと細分する。対照腫瘍が２０００ｍｍ３に到達するまで、表９および１０中で以下に詳述される処理レジメントに従って、動物に１週間に３回投薬する。腫瘍体積を測定し、ラットＩｇＧ対照群に対する相対的腫瘍体積の比として各処理群についてのＴ／Ｃ％を計算する。反復測定分散分析を使用して腫瘍体積を分析する。
【０１４６】
【表９】
2013529183.tif 000010
【０１４７】
【表１０】
2013529183.tif 000011
【０１４８】
ＣＳＦ−１分泌腫瘍（表９）はすべて、抗体２による抗ＣＳＦ−１Ｒ処理に応答するが、ＣＳＦ−１を分泌しない腫瘍（表１０）は抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体２に応答しないかまたは弱く応答する。ＣＳＦ−１分泌は、ＣＳＦ−１Ｒが腫瘍関連マクロファージの表面上で発現される腫瘍モデルにおける抗ＣＳＦ−１Ｒ処理の感受性に相関する。したがって、ＣＳＦ−１Ｒが腫瘍関連マクロファージの表面上で発現する場合、ＣＳＦ−１レベルの上昇は感受性指標またはバイオマーカーとして機能する可能性がある。
【０１４９】
ＣＳＦ−１Ｒは腫瘍細胞の表面上でも発現し得る。ＣＳＦ−１分泌は、ＣＳＦ−１Ｒ腫瘍細胞表面発現のための抗ＣＳＦ−１Ｒ処理の感受性に相関しない。
【０１５０】
腫瘍および患者血清サンプルにおけるＩＬ−３４レベル
ＣＳＦ−１に加えて、ＩＬ−３４もＣＳＦ−１Ｒに結合することができ、受容体のリン酸化を誘導し、下流のシグナル分子を活性化し、これらはマクロファージ分化および生存をもたらす。ＣＳＦ−１およびＩＬ−３４の両方はＣＳＦ−１Ｒの細胞外領域中のＩｇＧドメインに結合し（Ｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０：８０７−１１（２００８））、両方のリガンドのＣＳＦ−１Ｒへの結合は抗体１によって阻害することができる（抗体１によるＣＳＦ−１およびＩＬ−３４の結合の阻害については、それぞれ上で論じられたようにＩＣ５０＝０．８１ｎＭおよびＩＣ５０＝０．７１ｎＭ）。ＣＳＦ−１Ｒにより安定的にトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞の抗体１による処理は、ＩＬ−３４によるＣＳＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する（上で論じられたように）。さらに、単球からマクロファージへの分化およびマクロファージ増殖のＩＬ−３４誘導は、それぞれ０．３ｎＭおよび０．５ｎＭのＩＣ５０で抗体１により阻害することができ（上で論じられたように）、それはＣＳＦ−１で観察された結果と同等である。それゆえ、ＩＬ−３４活性および抗体１によるその阻害はＣＳＦ−１により観察されたものに類似する。
【０１５１】
ＩＬ−３４レベルは、乳房腫瘍株、前立腺腫瘍株および子宮内膜腫瘍細胞株を含む多くの腫瘍細胞において上昇する。加えて、前立腺および乳房の患者の亜集団は血清中で高ＩＬ−３４タンパク質レベルを有する。したがって、ＩＬ−３４はＣＳＦ−１とほぼ同一に機能し、ＣＳＦ−１分泌は抗ＣＳＦ−１Ｒ処理の感受性に相関するので、ＩＬ−３４レベルの上昇も感受性指標またはバイオマーカーとして機能する。
【０１５２】
乳房腫瘍組合わせ研究
Ｎｕ／ｎｕマウス（メス、７〜８週齢）に１×１０７のＨＣＣ−１９５４乳腺細胞／マウスを皮下注射し、腫瘍を処理の前に３００ｍｍ３に到達させる。マウスを１２群へとランダム化して、以下のように処理する。
【０１５３】
【表１１】
2013529183.tif 000012
【０１５４】
腫瘍体積を測定し、対照群に対する相対的腫瘍体積の比として各処理群についてＴ／Ｃ％を計算する。反復測定分散分析を使用して腫瘍体積を分析する。
【０１５５】
表１１中に示されるすべての研究において、抗体２、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ドキソルビシンおよびパクリタキセルは単一薬剤として腫瘍増殖を阻害する。しかしながら、腫瘍標的剤と抗体２の組合わせは相加効果を有し、化学療法剤または腫瘍に影響を与える他の薬剤と抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の組合わせは、単独のこれらの薬剤よりも効果的であることを示す。
【０１５６】
前立腺組合せ研究
Ｎｕ／ｎｕマウス（オス、７〜８週齢）に１．５×１０７のＤＵ１４５前立腺細胞／マウスを皮下注射し、腫瘍を処理の前に３００ｍｍ３に到達させる。マウスを１０群へとランダム化して、以下のように処理する。
【０１５７】
【表１２】
2013529183.tif 000013
【０１５８】
腫瘍体積を測定し、対照群に対する相対的腫瘍体積の比として各処理についてＴ／Ｃ％を計算する。反復測定分散分析を使用して腫瘍体積を分析する。
【０１５９】
ドセタキセルと抗体２の組合わせは相加効果を有し、前立腺癌の化学療法薬との組合わせは単独の化学療法薬よりも効果的であることを示す。
追加配列
配列番号９
Gln Asp Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
1               5                   10                  15      
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
20                  25                  30          
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val 
35                  40                  45              
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
50                  55                  60                  
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
65                  70                  75                  80  
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
85                  90                  95      
Ala Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 
100                 105                 110         
Gly Thr Thr Val Thr Val Ala Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
115                 120                 125             
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
130                 135                 140                 
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
145                 150                 155                 160 
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
165                 170                 175     
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
180                 185                 190         
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
195                 200                 205             
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
210                 215                 220                 
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 
225                 230                 235                 240 
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
245                 250                 255     
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
260                 265                 270         
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
275                 280                 285             
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
290                 295                 300                 
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
305                 310                 315                 320 
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 
325                 330                 335     
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
340                 345                 350         
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
355                 360                 365             
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
370                 375                 380                 
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
385                 390                 395                 400 
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
405                 410                 415     
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
420                 425                 430         
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
435                 440                 445             
Gly Lys 
450 
配列番号１０
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
1               5                   10                  15      
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Ala 
20                  25                  30          
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
35                  40                  45              
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
50                  55                  60                  
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
65                  70                  75                  80  
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Trp 
85                  90                  95      
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
100                 105                 110         
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
115                 120                 125             
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
130                 135                 140                 
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
145                 150                 155                 160 
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
165                 170                 175     
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
180                 185                 190         
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
195                 200                 205             
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
210                 
配列番号１１
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 
1               5                   10                  15      
Val His Ser Gln Asp Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 
20                  25                  30          
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 
35                  40                  45              
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu 
50                  55                  60                  
Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 
65                  70                  75                  80  
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 
85                  90                  95      
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 
100                 105                 110         
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asp Tyr Gly Met Asp Val 
115                 120                 125             
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ala Ser Ala Ser Thr Lys Gly 
130                 135                 140                 
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 
145                 150                 155                 160 
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 
165                 170                 175     
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 
180                 185                 190         
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 
195                 200                 205             
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 
210                 215                 220                 
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 
225                 230                 235                 240 
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 
245                 250                 255     
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
260                 265                 270         
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
275                 280                 285             
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
290                 295                 300                 
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 
305                 310                 315                 320 
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
325                 330                 335     
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 
340                 345                 350         
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
355                 360                 365             
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 
370                 375                 380                 
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
385                 390                 395                 400 
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
405                 410                 415     
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 
420                 425                 430         
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
435                 440                 445             
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
450                 455                 460                 
Leu Ser Pro Gly Lys 
465                 
配列番号１２
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 
1               5                   10                  15      
Val His Ser Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 
20                  25                  30          
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile 
35                  40                  45              
Ser Asn Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 
50                  55                  60                  
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg 
65                  70                  75                  80  
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 
85                  90                  95      
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser 
100                 105                 110         
Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 
115                 120                 125             
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 
130                 135                 140                 
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 
145                 150                 155                 160 
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 
165                 170                 175     
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 
180                 185                 190         
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 
195                 200                 205             
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 
210                 215                 220                 
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
225                 230             
配列番号１３
atgggatggt catgtatcat cctttttctg gtagcaactg caactggagt acattcacag       60
gaccagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc      120
tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca      180
ggcgaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca      240
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac actgtatctg      300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggtgactac      360
gaggtcgact acggaatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt cgcctcagct      420
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc      480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg      540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga      600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac      660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa      720
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg      780
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag      840
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtat      900
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc      960
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccaag actggctgaa tggcaaggag     1020
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa     1080
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg     1140
accaagaacc aagtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc     1200
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg     1260
gactccgacg gctccttctt cctctattcc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag     1320
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag     1380
aagagcctct ccctgtctcc gggcaaa                                         1407
配列番号１４
atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caactggagt acattcagcc       60
atccagttga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc      120
acttgccggg caagtcaggg cattagcaat gctttagcct ggtatcagca gaaaccaggg      180
aaagctccta agctcctgat ctatgatgcc tccagtttgg aaagtggggt cccatcaagg      240
ttcagcggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagcct gcagcctgaa      300
gattttgcaa cttattactg tcaacagttt aatagttacc cgtggacgtt cggccaaggg      360
accaaggtgg aaatcaaacg tgagttctag aggatccatc tgggataagc atgctgtttt      420
ctgtctgtcc ctaacatgcc ctgtgattat ccgcaaacaa cacacccaag ggcagaactt      480
tgttacttaa acaccatcct gtttgcttct ttcctcagga actgtggctg caccatctgt      540
cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct      600
gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca      660
atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct      720
cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga      780
agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt        838
配列番号１５
Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His 
1               5                   10                  15      
Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val 
20                  25                  30          
Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val 
35                  40                  45              
Glu Trp Asp Gly Pro Ala Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly 
50                  55                  60                  
Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly 
65                  70                  75                  80  
Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala 
85                  90                  95      
Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala 
100                 105                 110         
Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu 
115                 120                 125             
Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg 
130                 135                 140                 
Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His 
145                 150                 155                 160 
Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln 
165                 170                 175     
Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg 
180                 185                 190         
Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val 
195                 200                 205             
Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys 
210                 215                 220                 
Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn 
225                 230                 235                 240 
Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg 
245                 250                 255     
Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His 
260                 265                 270         
Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser 
275                 280                 285             
Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser 
290                 295                 300                 
Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn 
305                 310                 315                 320 
Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp 
325                 330                 335     
Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala 
340                 345                 350         
Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu 
355                 360                 365             
Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg 
370                 375                 380                 
Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr 
385                 390                 395                 400 
Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr 
405                 410                 415     
Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu 
420                 425                 430         
Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln 
435                 440                 445             
Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His 
450                 455                 460                 
Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn 
465                 470                 475                 480 
Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp 
485                 490                 495     
Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu 
500                 505                 510         
Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu 
515                 520                 525             
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro 
530                 535                 540                 
Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser 
545                 550                 555                 560 
Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu 
565                 570                 575     
Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala 
580                 585                 590         
Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp 
595                 600                 605             
Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala 
610                 615                 620                 
Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu 
625                 630                 635                 640 
Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly 
645                 650                 655     
Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu 
660                 665                 670         
Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser 
675                 680                 685             
Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu 
690                 695                 700                 
Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val 
705                 710                 715                 720 
Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser 
725                 730                 735     
Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu 
740                 745                 750         
Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe 
755                 760                 765             
Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val 
770                 775                 780                 
Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala 
785                 790                 795                 800 
Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg 
805                 810                 815     
Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr 
820                 825                 830         
Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile 
835                 840                 845             
Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys 
850                 855                 860                 
Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe 
865                 870                 875                 880 
Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu 
885                 890                 895     
Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu 
900                 905                 910         
Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser 
915                 920                 925             
Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu 
930                 935                 940                 
Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala 
945                 950                 955                 960 
Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys 
965                 970         
配列番号１６
Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His 
1               5                   10                  15      
Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val 
20                  25                  30          
Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val 
35                  40                  45              
Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly 
50                  55                  60                  
Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly 
65                  70                  75                  80  
Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala 
85                  90                  95      
Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala 
100                 105                 110         
Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu 
115                 120                 125             
Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg 
130                 135                 140                 
Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His 
145                 150                 155                 160 
Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln 
165                 170                 175     
Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg 
180                 185                 190         
Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val 
195                 200                 205             
Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys 
210                 215                 220                 
Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn 
225                 230                 235                 240 
Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg 
245                 250                 255     
Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His 
260                 265                 270         
Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser 
275                 280                 285             
Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser 
290                 295                 300                 
Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn 
305                 310                 315                 320 
Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp 
325                 330                 335     
Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala 
340                 345                 350         
Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu 
355                 360                 365             
Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg 
370                 375                 380                 
Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr 
385                 390                 395                 400 
Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr 
405                 410                 415     
Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu 
420                 425                 430         
Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln 
435                 440                 445             
Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His 
450                 455                 460                 
Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn 
465                 470                 475                 480 
Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp 
485                 490                 495     
Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu 
500                 505                 510         
Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu 
515                 520                 525             
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro 
530                 535                 540                 
Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser 
545                 550                 555                 560 
Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu 
565                 570                 575     
Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala 
580                 585                 590         
Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp 
595                 600                 605             
Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala 
610                 615                 620                 
Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu 
625                 630                 635                 640 
Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly 
645                 650                 655     
Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu 
660                 665                 670         
Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser 
675                 680                 685             
Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu 
690                 695                 700                 
Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val 
705                 710                 715                 720 
Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser 
725                 730                 735     
Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu 
740                 745                 750         
Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe 
755                 760                 765             
Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val 
770                 775                 780                 
Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala 
785                 790                 795                 800 
Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg 
805                 810                 815     
Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr 
820                 825                 830         
Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile 
835                 840                 845             
Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys 
850                 855                 860                 
Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe 
865                 870                 875                 880 
Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu 
885                 890                 895     
Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu 
900                 905                 910         
Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser 
915                 920                 925             
Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu 
930                 935                 940                 
Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala 
945                 950                 955                 960 
Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys 
965                 970         
配列番号１７
Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu 
1               5                   10                  15      
Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr 
20                  25                  30          
Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 
35                  40                  45              
Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 
50                  55                  60                  
Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 
65                  70                  75                  80  
Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr 
85                  90                  95      
Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 
100                 105                 110         
Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 
115                 120                 125             
Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 
130                 135                 140                 
Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 
145                 150                 155                 160 
Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 
165                 170                 175     
Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu 
180                 185                 190         
Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His 
195                 200                 205             
Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu 
210                 215                 220                 
Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro 
225                 230                 235                 240 
Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser 
245                 250                 255     
Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser 
260                 265                 270         
Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn 
275                 280                 285             
Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val 
290                 295                 300                 
Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly 
305                 310                 315                 320 
Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu 
325                 330                 335     
Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala 
340                 345                 350         
Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu Pro 
355                 360                 365             
Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gln Asp Trp Asn His Thr Pro 
370                 375                 380                 
Gln Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu Pro 
385                 390                 395                 400 
Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ser Asn Pro 
405                 410                 415     
Ser Thr Leu Ser Ala Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ser His Ser Ser Gly 
420                 425                 430         
Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg Asp 
435                 440                 445             
Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala 
450                 455                 460                 
Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr Gly 
465                 470                 475                 480 
His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Phe Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser 
485                 490                 495     
Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val 
500                 505                 510         
Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro 
515                 520                 525             
Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr 
530                 535                 540                 
Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 
545                 550                 
配列番号１８
Met Pro Arg Gly Phe Thr Trp Leu Arg Tyr Leu Gly Ile Phe Leu Gly 
1               5                   10                  15      
Val Ala Leu Gly Asn Glu Pro Leu Glu Met Trp Pro Leu Thr Gln Asn 
20                  25                  30          
Glu Glu Cys Thr Val Thr Gly Phe Leu Arg Asp Lys Leu Gln Tyr Arg 
35                  40                  45              
Ser Arg Leu Gln Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Lys Ile 
50                  55                  60                  
Ser Val Pro Tyr Glu Gly Val Phe Arg Ile Ala Asn Val Thr Arg Leu 
65                  70                  75                  80  
Gln Arg Ala Gln Val Ser Glu Arg Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Leu 
85                  90                  95      
Val Ser Leu Ser Ala Thr Glu Ser Val Gln Asp Val Leu Leu Glu Gly 
100                 105                 110         
His Pro Ser Trp Lys Tyr Leu Gln Glu Val Glu Thr Leu Leu Leu Asn 
115                 120                 125             
Val Gln Gln Gly Leu Thr Asp Val Glu Val Ser Pro Lys Val Glu Ser 
130                 135                 140                 
Val Leu Ser Leu Leu Asn Ala Pro Gly Pro Asn Leu Lys Leu Val Arg 
145                 150                 155                 160 
Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Glu Leu Leu Tyr 
165                 170                 175     
Cys Ser Cys Cys Lys Gln Ser Ser Val Leu Asn Trp Gln Asp Cys Glu 
180                 185                 190         
Val Pro Ser Pro Gln Ser Cys Ser Pro Glu Pro Ser Leu Gln Tyr Ala 
195                 200                 205             
Ala Thr Gln Leu Tyr Pro Pro Pro Pro Trp Ser Pro Ser Ser Pro Pro 
210                 215                 220                 
His Ser Thr Gly Ser Val Arg Pro Val Arg Ala Gln Gly Glu Gly Leu 
225                 230                 235                 240 
Leu Pro
【配列表】
2013529183000001.app
【国際調査報告】
2013529183.tif 000014
2013529183.tif 000015
2013529183.tif 000016