(57)【要約】  本発明は、アンカー部と、架橋部と、シグナル発生部とを備えるナノ検出デバイスであって、アンカー部が分子モーターであり、シグナル発生部がナノロッドであり、架橋部が対象の代謝産物に特異的に結合するタンパク質である、ナノ検出デバイスの使用を含む、対象の代謝産物の極めて高感度の検出のための方法及び組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの標的小分子代謝産物を検出する方法であって、アンカー部と、架橋部と、シグナル発生部とを含み、
（ａ）前記アンカー部が分子モーターを含み、該分子モーターが、検出することが可能な並進運動又は回転運動を誘導することが可能な生体分子又は合成分子であり、
（ｂ）前記架橋部が、検出対象の小代謝産物に結合するか、又は別の形で検出対象の小代謝産物の存在に応答する少なくとも１つの生体成分又は合成成分を含み、前記架橋部が、共有結合相互作用又は高親和性結合相互作用によって前記アンカー部に連結し、
（ｃ）前記シグナル発生部が、前記検出対象の代謝産物の存在下で前記架橋成分に特異的に結合するか、又は前記架橋成分から解離する部分で官能基化された少なくとも１つの電磁検出プローブを含む、
少なくとも１つの標的小分子代謝産物を検出する方法。
【請求項２】
サンプル中の標的分子のナノ検出の方法であって、
（ａ）複数の分子モーターの各々と、選択された架橋部とを結合することであって、該分子モーターが、検出可能な並進運動又は回転運動を誘導することが可能な生体分子又は合成分子であり、前記架橋部が、検出対象の小代謝産物に結合するか、又は別の形で検出対象の小代謝産物の存在に応答する少なくとも１つの生体成分又は合成成分である、複数の分子モーターの各々と、選択された架橋部とを結合することと、
（ｂ）前記分子モーターと前記架橋部との集合の後に、前記複数の分子モーターを固体支持体に付着させることと、
（ｃ）前記架橋部に特異的な電磁検出プローブを、固定化した架橋デバイスに結合することであって、前記架橋部が、標的代謝産物の非存在下で前記プローブに対して高い親和性を有し、標的代謝産物と前記架橋部との結合が、前記架橋部に対する前記プローブの親和性の減少を誘導する、前記架橋部に特異的な電磁検出プローブを、固定化した架橋デバイスに結合することと、
（ｄ）前記架橋部に特異的な前記標的代謝産物を含有する疑いがあるサンプルを適用することと、
（ｅ）前記固体支持体と共役した少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を誘導することと、
（ｆ）前記固体支持体と共役した前記少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を顕微鏡で検出することであって、前記プローブの電磁特性の変化によって示される前記サンプルの存在下での並進運動又は回転運動の存在が、前記サンプルにおける標的代謝産物の欠如の指標となり、前記サンプルの存在下での前記プローブの電磁特性の変化の欠如によって示される並進運動又は回転運動の非存在が、前記サンプルにおける前記標的代謝産物の存在の指標となる、前記固体支持体と共役した前記少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を顕微鏡で検出することと、
を含む、サンプル中の標的分子のナノ検出の方法。
【請求項３】
サンプル中の標的分子のナノ検出の方法であって、
（ａ）複数の分子モーターの各々と、選択された架橋部とを結合することであって、該分子モーターが、検出可能な並進運動又は回転運動を誘導することが可能な生体分子又は合成分子であり、前記架橋部が、検出対象の小代謝産物に結合するか、又は別の形で検出対象の小代謝産物の存在に応答する少なくとも１つの生体成分又は合成成分である、複数の分子モーターの各々と、選択された架橋部とを結合することと、
（ｂ）前記分子モーターと前記架橋部との集合の後に、前記複数の分子モーターを固体支持体に付着させることと、
（ｃ）前記電磁プローブの非存在下で、前記架橋成分に特異的な前記標的代謝産物を含有する疑いがあるサンプルを適用することと、
（ｄ）前記架橋部に特異的な電磁プローブを結合することであって、該架橋部に特異的な標的代謝産物が該架橋部に結合している場合に、該架橋部が前記プローブに対して高い親和性を有する、前記架橋部に特異的な電磁プローブを結合することと、
（ｅ）前記固体支持体と共役した少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を誘導することと、
（ｆ）前記プローブの電磁特性の変化をモニタリングすることによって、前記固体支持体と共役した前記少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を顕微鏡で検出することと、
を含み、前記サンプルの存在下での並進運動又は回転運動の増大によって示される前記架橋部に対する前記プローブの親和性の増大が、前記サンプルにおける前記架橋部に特異的な標的代謝産物の存在を示し、前記サンプルの存在下での並進運動又は回転運動の減少によって示される前記架橋部に対する前記プローブの親和性の減少が、前記サンプルにおける前記架橋部に特異的な標的代謝産物の非存在を示す、サンプル中の標的分子のナノ検出の方法。
【請求項４】
サンプル中の標的分子のナノ検出の方法であって、
（ａ）複数の分子モーターの各々と固体支持体とを結合することであって、該分子モーターが、検出可能な並進運動又は回転運動を誘導することが可能な生体分子又は合成分子である、複数の分子モーターの各々と固体支持体とを結合することと、
（ｂ）前記複数の分子モーターの各々に、検出対象の小代謝産物に結合するか、又は別の形で検出対象の小代謝産物の存在に応答する少なくとも１つの生体成分又は合成成分を含む架橋部を連結することと、
（ｃ）前記架橋部に特異的な電磁検出プローブを、固定化した架橋デバイスに結合することであって、前記架橋部が、標的代謝産物の非存在下で前記プローブに対して高い親和性を有し、標的代謝産物と前記架橋部との結合が、前記架橋部に対する前記プローブの結合親和性の減少を誘導する、前記架橋部に特異的な電磁検出プローブを、固定化した架橋デバイスに結合することと、
（ｄ）前記架橋部に特異的な前記標的分子又は代謝産物を含有する疑いがあるサンプルを適用することと、
（ｅ）前記固体支持体と共役した少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を誘導することと、
（ｆ）前記固体支持体と共役した前記少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を顕微鏡で検出することであって、前記プローブの電磁特性の変化によって示される前記サンプルの存在下での並進運動又は回転運動の存在が、前記サンプルにおける標的代謝産物の欠如の指標となり、前記プローブの電磁特性の変化の欠如によって示される並進運動又は回転運動の非存在が、前記サンプルにおける代謝産物の存在の指標となる、前記固体支持体と共役した前記少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を顕微鏡で検出することと、
を含む、サンプル中の標的分子のナノ検出の方法。
【請求項５】
サンプル中の標的分子のナノ検出の方法であって、
（ａ）複数の分子モーターの各々と固体支持体とを結合することであって、該分子モーターが、検出可能な並進運動又は回転運動を誘導することが可能な生体分子又は合成分子である、複数の分子モーターの各々と固体支持体とを結合することと、
（ｂ）前記複数の分子モーターの各々に、検出対象の小代謝産物に結合するか、又は別の形で検出対象の小代謝産物の存在に応答する少なくとも１つの生体成分又は合成成分を含む架橋部を連結することと、
（ｃ）前記電磁プローブの非存在下で、前記架橋成分に特異的な前記標的代謝産物を含有する疑いがあるサンプルを適用することと、
（ｄ）前記架橋部に特異的な電磁プローブを結合することであって、該架橋部に特異的な標的分子が該架橋部に結合する場合に、該架橋部が前記プローブに対して高い親和性を有する、前記架橋部に特異的な電磁プローブを結合することと、
（ｅ）前記固体支持体と共役した少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を誘導することと、
（ｆ）前記プローブの電磁特性の変化をモニタリングすることによって、前記固体支持体と共役した前記少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を顕微鏡で検出することと、
を含み、前記サンプルの存在下での並進運動又は回転運動の増大によって示される前記架橋部に対する前記プローブの親和性の増大が、前記サンプルにおける前記架橋部に特異的な標的代謝産物の存在を示し、前記サンプルの存在下での並進運動又は回転運動の減少によって示される前記架橋部に対する前記プローブの親和性の減少が、前記サンプルにおける前記架橋部に特異的な標的代謝産物の非存在を示す、サンプル中の標的分子のナノ検出の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）を工程（ｄ）の前、工程（ｄ）の後、又は工程（ｄ）と同時に行う、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記架橋部が、特異的ＤＮＡ配列に対する結合部位と、前記小分子代謝産物に対する結合部位とを含む転写調節タンパク質であり、前記シグナル発生部が、該転写調節タンパク質と結合することが知られる特異的ＤＮＡ配列を含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記転写調節タンパク質が転写活性化タンパク質であり、前記小分子代謝産物と該転写調節タンパク質との結合の存在下でのみ、前記特異的ＤＮＡ配列と該転写活性化タンパク質との結合による前記デバイスの集合が起こる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記転写調節タンパク質が転写抑制タンパク質であり、前記小分子代謝産物の存在下で、前記特異的ＤＮＡ配列と前記転写抑制タンパク質との結合による前記デバイスの集合が起こり、前記電磁検出プローブが前記タンパク質から解離する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記架橋部が、前記小分子代謝産物に対する結合部位を含むシグナル伝達タンパク質であり、該シグナル伝達タンパク質が前記小分子代謝産物に結合すると、立体配座が変化し、前記シグナル発生部が、前記シグナル伝達タンパク質の活性型立体配座を検出する抗体を含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記架橋部が、ＤＮＡ配列中の修飾塩基を認識するＤＮＡ校正タンパク質であり、前記シグナル発生部が検出対象のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を含み、前記検出対象のＤＮＡと、前記電磁検出プローブに固定された前記ＤＮＡ配列とのＤＮＡ塩基対合により前記デバイスの集合が起こる、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記電磁レポーターが光学粒子、磁性粒子及び熱粒子の少なくとも１つを含む、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記電磁レポーターが、蛍光ビーズ及び光散乱粒子の少なくとも１つを含む光学レポーターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記電磁レポーターが金属元素群に由来するコロイド粒子である、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
アンカー部と、架橋部と、シグナル発生部とを備えるナノ検出デバイスであって、
ａ）前記アンカー部が、Ｆ１−αサブユニット又はＦ１−βサブユニットのＮ末端上にｈｉｓタグ、及びＦ１−γサブユニット上にシステインを含むように部位特異的突然変異誘発によって修飾されたＦ１−ＡＴＰアーゼ分子を含み、複数の前記Ｆ１−ＡＴＰアーゼ分子が、前記Ｆ１−γサブユニットが顕微鏡スライドの表面から離れた状態で各々のＦ１−ＡＴＰアーゼ分子が配向するように前記顕微鏡スライドの表面に固定され、前記Ｆ１−γサブユニット上の前記システインがビオチン化され、
ｂ）前記架橋部が、検出対象の小分子代謝産物に結合するか、又は別の形で検出対象の小分子代謝産物の存在に応答するタンパク質を含み、前記架橋部中の該タンパク質が、ビオチン化されるとともに、前記アンカー部の前記ビオチン化Ｆ１−γサブユニットとのビオチン−アビジン−ビオチン連結を介して前記アンカー部に連結し、
ｃ）前記シグナル発生部が、前記検出対象の代謝産物の存在下で前記架橋部の前記タンパク質に特異的に結合する部分で官能基化された電磁検出プローブを含む、アンカー部と、架橋部と、シグナル発生部とを備えるナノ検出デバイス。
【請求項１６】
前記架橋部中の前記タンパク質が、特異的ＤＮＡ配列に対する結合部位と、前記小分子代謝産物に対する結合部位とを含む転写調節タンパク質であり、前記シグナル発生部が、該転写調節タンパク質と結合することが知られる特異的ＤＮＡ配列を含む、請求項１５に記載のナノ検出デバイス。
【請求項１７】
前記転写調節タンパク質が転写活性化タンパク質であり、前記小分子代謝産物と該転写調節タンパク質との結合の存在下でのみ、前記特異的ＤＮＡ配列と該転写活性化タンパク質との結合による前記デバイスの集合が起こる、請求項１６に記載のナノ検出デバイス。
【請求項１８】
前記転写調節タンパク質が転写抑制タンパク質であり、前記小分子代謝産物の存在下で、前記特異的ＤＮＡ配列と前記転写抑制タンパク質との結合による前記デバイスの集合が起こり、前記電磁検出プローブが前記タンパク質から解離する、請求項１６に記載のナノ検出デバイス。
【請求項１９】
前記架橋部中の前記タンパク質が、前記小分子代謝産物に対する結合部位を含むシグナル伝達タンパク質であり、該シグナル伝達タンパク質が前記小分子代謝産物に結合すると、立体配座が変化し、前記シグナル発生部が、前記シグナル伝達タンパク質の活性型立体配座を検出する抗体を含む、請求項１５に記載のナノ検出デバイス。
【請求項２０】
前記架橋部中の前記タンパク質が、ＤＮＡ配列中の修飾塩基を認識するＤＮＡ校正タンパク質であり、前記シグナル発生部が検出対象のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を含み、前記検出対象のＤＮＡと、前記電磁検出プローブに固定された前記ＤＮＡ配列とのＤＮＡ塩基対合により前記デバイスの集合が起こる、請求項１５に記載のナノ検出デバイス。
【請求項２１】
前記電磁レポーターが光学粒子、磁性粒子及び熱粒子の少なくとも１つを含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のナノ検出デバイス。
【請求項２２】
前記電磁レポーターが、蛍光ビーズ及び光散乱粒子の少なくとも１つを含む光学レポーターを含む、請求項２１に記載のナノ検出デバイス。
【請求項２３】
前記電磁レポーターが金属元素群に由来するコロイド粒子である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のナノ検出デバイス。
【請求項２４】
分子が転写調節タンパク質の活性化因子に結合するか否かを検出する方法であって、
ａ）請求項１５に記載のナノ検出デバイスを作製することと、
ｂ）前記デバイスと標的小分子代謝産物とを接触させることと、
ｃ）前記デバイスに、Ｆ１−ＡＴＰアーゼの活性により前記Ｆ１−γサブユニットが回転する条件下でＡＴＰを添加することと、
ｄ）前記標的代謝産物の存在下で前記顕微鏡スライドに結合した回転する前記電磁検出プローブから発生したシグナルと、前記標的代謝産物の非存在下でプローブによって発生したシグナルとを比較することであって、前記代謝産物の存在下での前記シグナルの増大が、前記代謝産物が前記転写調節タンパク質に結合していることを示す、比較することと、
を含む、分子が転写調節タンパク質の活性化因子に結合するか否かを検出する方法。
【請求項２５】
抑制タンパク質に結合する分子を検出する方法であって、
ａ）請求項１８に記載のナノ検出デバイスを作製することと、
ｂ）前記デバイスと標的小分子代謝産物とを接触させることと、
ｃ）前記デバイスに、Ｆ１−ＡＴＰアーゼの活性により前記Ｆ１−γサブユニットが回転する条件下でＡＴＰを添加することと、
ｄ）前記標的代謝産物の存在下で前記顕微鏡スライドに結合した回転する前記電磁検出プローブから発生したシグナルと、前記標的代謝産物の非存在下でプローブによって発生したシグナルとを比較することであって、前記代謝産物の存在下での前記シグナルの減少が、前記代謝産物が前記抑制タンパク質に結合していることを示す、比較することと、
を含む、抑制タンパク質に結合する分子を検出する方法。
【請求項２６】
分子とシグナル伝達タンパク質との結合を検出する方法であって、
ａ）請求項１９に記載のナノ検出デバイスを作製することと、
ｂ）前記デバイスと標的小分子代謝産物とを接触させることと、
ｃ）前記デバイスに、Ｆ１−ＡＴＰアーゼの活性により前記Ｆ１−γサブユニットが回転する条件下でＡＴＰを添加することと、
ｄ）前記標的代謝産物の存在下で前記顕微鏡スライドに結合した回転する前記電磁検出プローブから発生したシグナルと、前記標的代謝産物の非存在下でプローブによって発生したシグナルとを比較することであって、前記代謝産物の存在下での前記シグナルの増大が、前記代謝産物が前記シグナル伝達タンパク質に結合していることを示す、比較することと、
を含む、分子とシグナル伝達タンパク質との結合を検出する方法。
【請求項２７】
ＤＮＡを校正する方法であって、
ａ）請求項２０に記載のナノ検出デバイスを作製することと、
ｂ）前記デバイスと校正対象のＤＮＡ配列とを接触させることと、
ｃ）前記デバイスに、Ｆ１−ＡＴＰアーゼの活性により前記Ｆ１−γサブユニットが回転する条件下でＡＴＰを添加することと、
ｄ）前記校正対象のＤＮＡの存在下で前記顕微鏡スライドに結合した回転する前記電磁検出プローブから発生したシグナルを決定することによって、該校正対象のＤＮＡ配列における修飾ＤＮＡの存在を決定することであって、前記電磁検出プローブに固定されたＤＮＡ配列とのＤＮＡ塩基対合が存在する場合にシグナルが発生する、決定することと、
を含む、ＤＮＡを校正する方法。
【請求項２８】
工程（ｄ）が、暗視野顕微鏡検査による視覚的検出を用いて前記シグナルを検出することを含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｄ）が、前記検出プローブからの１つ又は複数の波長での光の強度の振動を決定することを含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
キットであって、
（ａ）対象の小分子代謝産物に特異的に結合するタンパク質であって、前記対象の小分子代謝産物の結合を妨げないようにビオチン化される、タンパク質と、
（ｂ）Ｆ１−ＡＴＰアーゼ分子であって、該Ｆ１−ＡＴＰアーゼと固体支持体との付着を容易にするｈｉｓタグを有し、更にはビオチン化される、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ分子と、
（ｃ）前記（ａ）のタンパク質を、該タンパク質が対象の小分子代謝産物に結合している場合に認識する分子に結合した金ナノロッドと、
を含む、キット。
【請求項３１】
固体支持体を更に含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
アビジンを更に含む、請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本願は、２０１０年７月７日付で出願された米国仮出願第６１／３６２，１９３号に対する優先権を主張する国際ＰＣＴ出願である。上述の出願の全文が全体として、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００２】
核酸及びタンパク質の迅速かつ高感度なバイオセンシングは、法医学的証拠をもたらす生物医学的に及び生物テロに重要な病原因子の同定、並びに生体／無機ハイブリッドデバイスを用いた既知の遺伝子型の同定に極めて重要である。
【０００３】
Ｆ１−ＡＴＰアーゼは近年、単一分子検出（特許文献１）に使用することができる、ナノスケールの回転デバイス（特許文献２）の構築に使用されている。これらの文献から、顕微鏡検査によって見ることが可能な検出シグナルを用いて、ＤＮＡの単一分子検出をもたらすために生体分子を使用することの可能性が実証される。本発明は、対象の特異的タンパク質に対する標的の検出に使用することができる検出方法に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第６，９８９，２３５号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／０１１０７３８号
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、アンカー部と、架橋部と、シグナル発生部とを備えるナノ検出デバイスであって、アンカー部が分子モーターであり、シグナル発生部がナノロッドであり、架橋部が対象の代謝産物に特異的に結合するタンパク質である、ナノ検出デバイスの使用を含む、対象の代謝産物の極めて高感度の検出のための方法及び組成物を提供する。
【０００６】
第１の実施の形態では、本発明は、アンカー部と、架橋部と、シグナル発生部とを備えるナノ検出デバイスであって、
ａ）前記アンカー部が、Ｆ１−αサブユニット又はＦ１−βサブユニットのＮ末端上にｈｉｓタグ、及びＦ１−γサブユニット上にシステインを含むように部位特異的突然変異誘発によって修飾されたＦ１−ＡＴＰアーゼ分子を含み、複数の前記Ｆ１−ＡＴＰアーゼ分子が、前記Ｆ１−γサブユニットが顕微鏡スライドの表面から離れた状態で各々のＦ１−ＡＴＰアーゼ分子が配向するように前記顕微鏡スライドの表面に固定され、前記Ｆ１−γサブユニット上の前記システインがビオチン化され、
ｂ）前記架橋部が、検出対象の小分子代謝産物に結合するか、又は別の形で（otherwise）検出対象の小分子代謝産物の存在に応答するタンパク質を含み、前記架橋部中の該タンパク質が、ビオチン化されるとともに、前記アンカー部の前記ビオチン化Ｆ１−γサブユニットとのビオチン−アビジン−ビオチン連結を介して前記アンカー部に連結し、
ｃ）前記シグナル発生部が、前記検出対象の代謝産物の存在下で前記架橋部の前記タンパク質に特異的に結合する部分で官能基化された電磁検出プローブを含む、アンカー部と、架橋部と、シグナル発生部とを備えるナノ検出デバイスに関する。
【０００７】
より具体的には、前記架橋部中の前記タンパク質は、特異的ＤＮＡ配列に対する結合部位と、前記小分子代謝産物に対する結合部位とを含む転写調節タンパク質であり、前記シグナル発生部は、該転写調節因子と結合することが知られる特異的ＤＮＡ配列を含む。
【０００８】
例えば、前記転写調節タンパク質は転写活性化タンパク質であり、前記小分子代謝産物と該転写調節タンパク質との結合の存在下でのみ、前記特異的ＤＮＡ配列と該転写活性化タンパク質との結合による前記デバイスの集合が起こる。
【０００９】
代替的には、前記転写調節タンパク質は転写抑制タンパク質であり、前記小分子代謝産物の存在下で、前記特異的ＤＮＡ配列と前記転写抑制タンパク質との結合による前記デバイスの集合が起こり、前記電磁検出プローブが前記タンパク質から解離する。
【００１０】
別の代替形態では、前記架橋部中の前記タンパク質は、前記小分子代謝産物に対する結合部位を含むシグナル伝達タンパク質であり、該シグナル伝達タンパク質が前記小分子代謝産物に結合すると、立体配座が変化し、前記シグナル発生部が、前記シグナル伝達タンパク質の活性型立体配座を検出する抗体を含む。
【００１１】
また更なる代替形態では、前記架橋部中の前記タンパク質は、ＤＮＡ配列中の修飾塩基を認識するＤＮＡ校正タンパク質であり、前記シグナル発生部が検出対象のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を含み、前記検出対象のＤＮＡと、前記電磁検出プローブに固定された前記ＤＮＡ配列とのＤＮＡ塩基対合により前記デバイスの集合が起こる。
【００１２】
本明細書に記載されるナノ検出デバイスのいずれかにおいて、前記電磁レポーターは光学粒子、磁性粒子及び熱粒子の少なくとも１つを含む。特に好ましい実施の形態では、電磁レポーターは金属ナノロッド、好ましくは金ナノロッドである。
【００１３】
或る特定の実施の形態では、前記電磁レポーターは、蛍光ビーズ及び光散乱粒子の少なくとも１つを含む光学レポーターを含む。
【００１４】
好ましいナノ検出デバイスでは、前記電磁レポーターは金属元素群に由来するコロイド粒子である。
【００１５】
使用方法も企図される。例えば、本発明は、分子が転写調節タンパク質の活性化因子に結合するか否かを検出する方法であって、
（ａ）アンカー部と、架橋部と、シグナル発生部とを備えるナノ検出デバイスを作製することであって、
ｉ）アンカー部が、Ｆ１−αサブユニット又はＦ１−βサブユニットのＮ末端上にｈｉｓタグ、及びＦ１−γサブユニット上にシステインを含むように部位特異的突然変異誘発によって修飾されたＦ１−ＡＴＰアーゼ分子を含み、複数のＦ１−ＡＴＰアーゼ分子が、Ｆ１−γサブユニットが顕微鏡スライドの表面から離れた状態で各々のＦ１−ＡＴＰアーゼ分子が配向するように顕微鏡スライドの表面に固定され、Ｆ１−γサブユニット上のシステインがビオチン化され、
ｉｉ）架橋部が、検出対象の小分子代謝産物に結合するか、又は別の形で検出対象の小分子代謝産物の存在に応答するタンパク質を含み、架橋部中のタンパク質が、ビオチン化されるとともに、アンカー部のビオチン化Ｆ１−γサブユニットとのビオチン−アビジン−ビオチン連結を介してアンカー部に連結し、
ｉｉｉ）シグナル発生部が、検出対象の代謝産物の存在下で架橋部のタンパク質に特異的に結合する部分で官能基化された電磁検出プローブを含む、
作製することと、
（ｂ）デバイスと標的小分子代謝産物とを接触させることと、
（ｃ）デバイスに、Ｆ１−ＡＴＰアーゼの活性によりＦ１−γサブユニットが回転する条件下でＡＴＰを添加することと、
（ｄ）標的代謝産物の存在下で顕微鏡スライドに結合した回転する電磁検出プローブから発生したシグナルと、標的代謝産物の非存在下でプローブによって発生したシグナルとを比較することであって、代謝産物の存在下でのシグナルの増大が、代謝産物が転写調節タンパク質に結合していることを示す、比較することと、
を含む、分子が転写調節タンパク質の活性化因子に結合するか否かを検出する方法を記載する。
【００１６】
抑制タンパク質に結合する分子を検出する方法であって、
（ａ）アンカー部と、架橋部と、シグナル発生部とを備えるナノ検出デバイスを作製することであって、架橋部中のタンパク質が、特異的ＤＮＡ配列に対する結合部位と、上記小分子代謝産物に対する結合部位とを含む転写調節タンパク質であり、上記シグナル発生部が、上記転写調節因子と結合することが知られる特異的ＤＮＡ配列を含む、作製することと、
（ｂ）デバイスと標的小分子代謝産物とを接触させることと、
（ｃ）デバイスに、Ｆ１−ＡＴＰアーゼの活性によりＦ１−γサブユニットが回転する条件下でＡＴＰを添加することと、
（ｄ）標的代謝産物の存在下で顕微鏡スライドに結合した回転する電磁検出プローブから発生したシグナルと、標的代謝産物の非存在下でプローブによって発生したシグナルとを比較することであって、代謝産物の存在下でのシグナルの減少が、代謝産物が抑制タンパク質に結合していることを示す、比較することと、
を含む、抑制タンパク質に結合する分子を検出する方法も企図される。
【００１７】
別の実施の形態では、本発明は、分子とシグナル伝達タンパク質との結合を検出する方法であって、
（ａ）本発明のナノ検出デバイスを作製することであって、架橋部中のタンパク質が、上記小分子代謝産物に対する結合部位を含むシグナル伝達タンパク質であり、該シグナル伝達タンパク質が上記小分子代謝産物に結合すると、立体配座が変化し、上記シグナル発生部が、上記シグナル伝達タンパク質の活性型立体配座を検出する抗体を含む、作製することと、
（ｂ）デバイスと標的小分子代謝産物とを接触させることと、
（ｃ）デバイスに、Ｆ１−ＡＴＰアーゼの活性によりＦ１−γサブユニットが回転する条件下でＡＴＰを添加することと、
（ｄ）標的代謝産物の存在下で顕微鏡スライドに結合した回転する電磁検出プローブから発生したシグナルと、標的代謝産物の非存在下でプローブによって発生したシグナルとを比較することであって、代謝産物の存在下でのシグナルの増大が、代謝産物がシグナル伝達タンパク質に結合していることを示す、比較することと、
を含む、分子とシグナル伝達タンパク質との結合を検出する方法を提供する。
【００１８】
別の実施の形態では、本発明は、ＤＮＡを校正する方法であって、
（ａ）本発明のナノ検出デバイスを作製することであって、架橋部中のタンパク質が、ＤＮＡ配列中の修飾塩基を認識するＤＮＡ校正タンパク質であり、上記シグナル発生部が、検出対象のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を含み、上記検出対象のＤＮＡと、上記電磁検出プローブに固定されたＤＮＡ配列とのＤＮＡ塩基対合により上記デバイスの集合が起こる、作製することと、
（ｂ）デバイスと校正対象のＤＮＡ配列とを接触させることと、
（ｃ）デバイスに、Ｆ１−ＡＴＰアーゼの活性によりＦ１−γサブユニットが回転する条件下でＡＴＰを添加することと、
（ｄ）校正対象のＤＮＡの存在下で顕微鏡スライドに結合した回転する電磁検出プローブから発生したシグナルを決定することによって、校正対象のＤＮＡ配列における修飾ＤＮＡの存在を決定することであって、電磁検出プローブに固定されたＤＮＡ配列とのＤＮＡ塩基対合が存在する場合にシグナルが発生する、決定することと、
を含む、ＤＮＡを校正する方法を提供する。
【００１９】
本明細書に記載の使用方法のいずれにおいても、決定／検出する工程は好ましくは、シグナル発生部によって発生したシグナルを、暗視野顕微鏡検査による視覚的検出を用いて検出することを含む。より詳細には、本方法は、前記検出プローブからの１つ又は複数の波長での光の強度の振動を決定することを含む。
【００２０】
本明細書において、標的代謝産物の存在を特定するのに使用されるキットであって、
（ａ）対象の小分子代謝産物に特異的に結合するタンパク質であって、前記対象の小分子代謝産物の結合を妨げないようにビオチン化される、タンパク質と、
（ｂ）Ｆ１−ＡＴＰアーゼ分子であって、該Ｆ１−ＡＴＰアーゼと固体支持体との付着を容易にするｈｉｓタグを有し、更にはビオチン化される、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ分子と、
（ｃ）前記（ａ）のタンパク質を、該タンパク質が対象の小分子代謝産物に結合している場合に認識する分子に結合した金ナノロッドと、
を含む、標的代謝産物の存在を特定するのに使用されるキットも教示される。
【００２１】
特定の実施の形態では、キットは固体支持体を更に含むことができる。更に他の実施の形態では、キットはアビジンを更に含むことができる。
【００２２】
本発明はまた、少なくとも１つの標的小分子代謝産物を検出する方法であって、アンカー部と、架橋部と、シグナル発生部とを含み、
（ａ）前記アンカー部が分子モーターを含み、該分子モーターが、検出することが可能な並進運動又は回転運動を誘導することが可能な生体分子又は合成分子であり、
（ｂ）前記架橋部が、検出対象の小代謝産物に結合するか、又は別の形で検出対象の小代謝産物の存在に応答する少なくとも１つの生体成分又は合成成分を含み、前記架橋部が、共有結合相互作用又は高親和性結合相互作用によって前記アンカー部に連結し、
（ｃ）前記シグナル発生部が、前記検出対象の代謝産物の存在下で前記架橋成分に特異的に結合するか、又は前記架橋成分から解離する部分で官能基化された少なくとも１つの電磁検出プローブを含む、
少なくとも１つの標的小分子代謝産物を検出する方法も企図する。
【００２３】
別の実施の形態では、本発明は、サンプル中の標的分子のナノ検出の方法であって、
（ａ）複数の分子モーターの各々と、選択された架橋部とを結合することであって、該分子モーターが、検出可能な並進運動又は回転運動を誘導することが可能な生体分子又は合成分子であり、前記架橋部が、検出対象の小代謝産物に結合するか、又は別の形で検出対象の小代謝産物の存在に応答する少なくとも１つの生体成分又は合成成分である、複数の分子モーターの各々と、選択された架橋部とを結合することと、
（ｂ）前記分子モーターと前記架橋部との集合の後に、前記複数の分子モーターを固体支持体に付着させることと、
（ｃ）前記架橋部に特異的な電磁検出プローブを、固定化した架橋デバイスに結合することであって、前記架橋部が、標的代謝産物の非存在下で前記プローブに対して高い親和性を有し、標的代謝産物と前記架橋部との結合が、前記架橋部に対する前記プローブの親和性の減少を誘導する、前記架橋部に特異的な電磁検出プローブを、固定化した架橋デバイスに結合することと、
（ｄ）前記架橋部に特異的な前記標的代謝産物を含有する疑いがあるサンプルを適用することと、
（ｅ）前記固体支持体と共役した少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を誘導することと、
（ｆ）前記固体支持体と共役した前記少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を顕微鏡で検出することであって、前記プローブの電磁特性の変化によって示される前記サンプルの存在下での並進運動又は回転運動の存在が、前記サンプルにおける標的代謝産物の欠如の指標となり、前記サンプルの存在下での前記プローブの電磁特性の変化の欠如によって示される並進運動又は回転運動の非存在が、前記サンプルにおける前記標的代謝産物の存在の指標となる、前記固体支持体と共役した前記少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を顕微鏡で検出することと、
を含む、サンプル中の標的分子のナノ検出の方法に関する。
【００２４】
本発明の別の実施の形態は、サンプル中の標的分子の存在を決定する方法であって、
（ａ）複数の分子モーターの各々と、選択された架橋部とを結合することであって、該分子モーターが、検出可能な並進運動又は回転運動を誘導することが可能な生体分子又は合成分子であり、前記架橋部が、検出対象の小代謝産物に結合するか、又は別の形で検出対象の小代謝産物の存在に応答する少なくとも１つの生体成分又は合成成分である、複数の分子モーターの各々と、選択された架橋部とを結合することと、
（ｂ）前記分子モーターと前記架橋部との集合の後に、前記複数の分子モーターを固体支持体に付着させることと、
（ｃ）前記電磁プローブの非存在下で、前記架橋成分に特異的な前記標的代謝産物を含有する疑いがあるサンプルを適用することと、
（ｄ）前記架橋部に特異的な電磁プローブを結合することであって、該架橋部に特異的な標的代謝産物が該架橋部に結合している場合に、該架橋部が前記プローブに対して高い親和性を有する、前記架橋部に特異的な電磁プローブを結合することと、
（ｅ）前記固体支持体と共役した少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を誘導することと、
（ｆ）前記プローブの電磁特性の変化をモニタリングすることによって、前記固体支持体と共役した前記少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を顕微鏡で検出することと、
を含む、サンプル中の標的分子の存在を決定する方法に関する。
【００２５】
ここで、前記サンプルの存在下での並進運動又は回転運動の増大によって示される前記架橋部に対する前記プローブの親和性の増大が、前記サンプルにおける前記架橋部に特異的な標的代謝産物の存在を示し、前記サンプルの存在下での並進運動又は回転運動の減少によって示される前記架橋部に対する前記プローブの親和性の減少が、前記サンプルにおける前記架橋部に特異的な標的代謝産物の非存在を示す。
【００２６】
更に別の実施の形態では、サンプル中の標的分子のナノ検出の方法であって、
（ａ）複数の分子モーターの各々と固体支持体とを結合することであって、該分子モーターが、検出可能な並進運動又は回転運動を誘導することが可能な生体分子又は合成分子である、複数の分子モーターの各々と固体支持体とを結合することと、
（ｂ）前記複数の分子モーターの各々に、検出対象の小代謝産物に結合するか、又は別の形で検出対象の小代謝産物の存在に応答する少なくとも１つの生体成分又は合成成分を含む架橋部を連結することと、
（ｃ）前記架橋部に特異的な電磁検出プローブを、固定化した架橋デバイスに結合することであって、前記架橋部が、標的代謝産物の非存在下で前記プローブに対して高い親和性を有し、標的代謝産物と前記架橋部との結合が、前記架橋部に対する前記プローブの結合親和性の減少を誘導する、前記架橋部に特異的な電磁検出プローブを、固定化した架橋デバイスに結合することと、
（ｄ）前記架橋部に特異的な前記標的分子又は代謝産物を含有する疑いがあるサンプルを適用することと、
（ｅ）前記固体支持体と共役した少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を誘導することと、
（ｆ）前記固体支持体と共役した前記少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を顕微鏡で検出することであって、前記プローブの電磁特性の変化によって示される前記サンプルの存在下での並進運動又は回転運動の存在が、前記サンプルにおける標的代謝産物の欠如の指標となり、前記プローブの電磁特性の変化の欠如によって示される並進運動又は回転運動の非存在が、前記サンプルにおける代謝産物の存在の指標となる、前記固体支持体と共役した前記少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を顕微鏡で検出することと、
を含む、サンプル中の標的分子のナノ検出の方法が存在する。
【００２７】
本発明のまた更なる実施の形態では、サンプル中の標的分子の存在を決定する方法であって、
（ａ）複数の分子モーターの各々と固体支持体とを結合することであって、該分子モーターが、検出可能な並進運動又は回転運動を誘導することが可能な生体分子又は合成分子である、複数の分子モーターの各々と固体支持体とを結合することと、
（ｂ）前記複数の分子モーターの各々に、検出対象の小代謝産物に結合するか、又は別の形で検出対象の小代謝産物の存在に応答する少なくとも１つの生体成分又は合成成分を含む架橋部を連結することと、
（ｃ）前記電磁プローブの非存在下で、前記架橋成分に特異的な前記標的代謝産物を含有する疑いがあるサンプルを適用することと、
（ｄ）前記架橋部に特異的な電磁プローブを結合することであって、該架橋部に特異的な標的分子が該架橋部に結合する場合に、該架橋部が前記プローブに対して高い親和性を有する、前記架橋部に特異的な電磁プローブを結合することと、
（ｅ）前記固体支持体と共役した少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を誘導することと、
（ｆ）前記プローブの電磁特性の変化をモニタリングすることによって、前記固体支持体と共役した前記少なくとも１つの分子モーターの並進運動又は回転運動を顕微鏡で検出することと、
を含む、サンプル中の標的分子の存在を決定する方法。
【００２８】
ここで、前記サンプルの存在下での並進運動又は回転運動の増大によって示される前記架橋部に対する前記プローブの親和性の増大が、前記サンプルにおける前記架橋部に特異的な標的代謝産物の存在を示し、前記サンプルの存在下での並進運動又は回転運動の減少によって示される前記架橋部に対する前記プローブの親和性の減少が、前記サンプルにおける前記架橋部に特異的な標的代謝産物の非存在を示す。
【００２９】
上述の方法では、工程（ｃ）を工程（ｄ）の前、工程（ｄ）の後、又は工程（ｄ）と同時に行うことができることが理解されるものとする。
【００３０】
本発明の方法のいずかにおいて、前記架橋部は、特異的ＤＮＡ配列に対する結合部位と、前記小分子代謝産物に対する結合部位とを含む転写調節タンパク質であり、前記シグナル発生部は、該転写調節タンパク質と結合することが知られる特異的ＤＮＡ配列を含む。好ましくは、前記転写調節タンパク質は転写活性化タンパク質であり、前記小分子代謝産物と該転写調節タンパク質との結合の存在下でのみ、前記特異的ＤＮＡ配列と該転写活性化タンパク質との結合による前記デバイスの集合が起こる。代替的には、前記転写調節タンパク質は転写抑制タンパク質であり、前記小分子代謝産物の存在下で、前記特異的ＤＮＡ配列と前記転写抑制タンパク質との結合による前記デバイスの集合が起こり、前記電磁検出プローブが前記タンパク質から解離する。
【００３１】
幾つかの実施の形態では、前記架橋部は、前記小分子代謝産物に対する結合部位を含むシグナル伝達タンパク質であり、該シグナル伝達タンパク質が前記小分子代謝産物に結合すると、立体配座が変化し、前記シグナル発生部が、前記シグナル伝達タンパク質の活性型立体配座を検出する抗体を含む。
【００３２】
前記架橋部は、ＤＮＡ配列中の修飾塩基を認識するＤＮＡ校正タンパク質とすることができ、前記シグナル発生部は検出対象のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を含み、前記検出対象のＤＮＡと、前記電磁検出プローブに固定された前記ＤＮＡ配列とのＤＮＡ塩基対合により前記デバイスの集合が起こる。
【００３３】
本発明では、前記電磁レポーター又はプローブは光学粒子、磁性粒子及び熱粒子の少なくとも１つを含む。例えば、前記電磁レポーター又はプローブは、蛍光ビーズ及び光散乱粒子の少なくとも１つを含む光学レポーターを含む。例示的な実施の形態では、前記電磁レポーター又はプローブは金属元素群に由来するコロイド粒子である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】代謝産物のナノ検出のための暗視野顕微鏡検査のセットアップを示す図である。
【図２】ナノロッドを偏光フィルターに対して０度（図２Ａ）、４５度（図２Ｂ）及び９０度（図２Ｃ）に配置した場合の、偏光フィルターを通して見られる単一の金ナノロッドからの散乱光の顕微鏡写真を示す図である。この図は、Ｆ１−ＡＴＰアーゼの回転アーム（γサブユニット）に対する金ナノロッドの付着を示す。位置Ａ（０度）では色は緑色であり、位置Ｃでは色は赤色である。位置Ｂでは、色は橙色ではなく、ナノロッドからの緑色及び赤色の散乱光の強度の混合である。
【図３】大腸菌ＥＤＬ９３３  Ｓｔｘ２産生株（図３Ａ、図３Ｃ）、又は大腸菌ＭＧ１６５５非毒素産生株（図３Ｂ、図３Ｄ）を含有する細胞上清を用いた、３０個の連続視野において観察されたナノロッドの数に基づく細胞上清中のＳｔｘ２毒素タンパク質の検出を示す棒グラフである。図３Ｃ及び図３Ｄのナノデバイスは、捕捉（抗Ｓｔｘ２Ｂ）抗体を有しない対照であった。
【図４】精製毒素を含有するサンプル中の、又はＥＤＬ９３３（毒素産生株）若しくはＭＧ１６５５（非毒素産生株）のいずれかを含有する唾液サンプルからのＳｔｘ２毒素タンパク質の検出を示す棒グラフである。
【図５】１０個の連続視野における回転するナノロッドの数（赤色のバー）又は３０個の連続視野における回転するナノロッドの数（緑色のバー）に対する、ナノデバイス集合によって１０個の連続視野（青色）において測定した細胞上清中のＳｔｘ２毒素タンパク質の検出限界を示す棒グラフである。
【図６】１０個の連続視野において決定した精製Ｓｔｘ２毒素タンパク質の回転に基づく検出限界を示す棒グラフである。データは、サンプルにおける標的分子数（図６Ａ）又は標的濃度（図６Ｂ）の関数として表す。
【図７】視野のデジタル写真において赤色、緑色、青色及び黄色のナノロッドを同定し、その数を定量するために利用されるアルゴリズムに用いられる基準の概要を示す図である。
【図８】同じサンプルウェルにおけるＳｔｘ２毒素タンパク質（左；赤色のナノロッド）及びｓｔｘ１遺伝子ＤＮＡ配列（右；緑色のナノロッド）の多重化検出のための自己集合ナノデバイスを示す図である。
【図９】大腸菌株ＥＤＬ９３３（＋毒素）又はＭｇ１６５５（−毒素）からの上清を含有するウェルにおける、赤色及び緑色のナノロッドそれぞれを用いた、同じサンプル中のＳｔｘ２タンパク質及びｓｔｘ１遺伝子ＤＮＡ配列の同時検出を示す棒グラフである。
【図１０】転写活性化タンパク質を用いた代謝産物の検出を示す図である。図１０Ａでは、標的代謝産物（ｃＡＭＰ）が、Ｆ１分子モーターの回転アーム上に固定化したカタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）に結合する。図１０Ｂには、ｃＡＭＰとＣＡＰとの結合が、ＤＮＡ受容体配列に対する高親和性結合部位を生じる立体配座変化を誘導することが示される。図１０Ｃには、特異的ＤＮＡ受容体配列でコーティングした金ナノロッドが、ＣＡＰ−ｃＡＭＰ複合体に結合してナノデバイス集合体を複合させ（complex）、顕微鏡検査による代謝産物の検出を可能にすることが示される。
【図１１】集合した成分の結晶構造（左；Ｆ１、アビジン、ＣＡＰ及びＤＮＡを含む）、及び代謝産物検出のアクチュエータとして転写調節タンパク質を用いたナノデバイス成分を示す図である。
【図１２】転写抑制タンパク質を用いた代謝産物の検出を示す図である。図１２Ａには、標的代謝産物（ＮＡＤＨ）が、Ｆ１分子モーターの回転アーム上に固定化したＮＡＤＨ抑制タンパク質（ＮＲＰ）に結合することが示される。図１２Ｂには、ＮＡＤＨとＮＲＰとの結合がＮＡＤ＋を置換し、ＤＮＡ受容体配列に対する結合部位が取り除かれる立体配座変化を誘導することが示される。図１２Ｃには、特異的ＤＮＡ受容体配列でコーティングした金ナノロッドが、洗浄によって除去され、代謝産物が、顕微鏡スライド上に結合したナノロッドの数の減少によって検出されることが示される。
【図１３】ＮＡＤＨを用いた代謝産物の検出のための規則的なナノデバイスアレイを示す図である。
【図１４】寸法を制御した或るパターンで顕微鏡スライド上にナノスケールのニッケル島を構築するためのＥビームリソグラフィーの使用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明では、固定化したＦ１−ＡＴＰアーゼを利用するナノ検出法を用いて標的代謝産物を検出する方法を提供する。多様な転写調節タンパク質が存在し、その各々が高い親和性及び特異性をもって小分子と結合する。かかる転写調節タンパク質は、特異的ＤＮＡ配列との結合の結果として、ＤＮＡ転写の活性化又は抑制に関与する。これらの調節タンパク質のほとんどは、シグナル分子による占有の結果として生じる二量体形態のＤＮＡのみに結合する。転写活性化タンパク質については、代謝産物の結合は二量化、及びＤＮＡに結合する高親和性結合部位の形成を誘導する。抑制タンパク質においては、代謝産物の結合は逆の影響を有する。調節タンパク質の例としては、環状ＡＭＰに結合するカタボライト活性化タンパク質、アラビノースに結合するアラビノース転写活性化因子、ウラシル依存性転写調節因子、ＧＴＰ及びイソロイシン応答性調節因子、トリプトファン抑制タンパク質、並びにマルトース転写活性化因子、グルコース耐性アミラーゼ調節因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
標的代謝産物としては、アミノ酸、炭水化物、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ホルモン、有機酸、及び転写調節タンパク質に特異的に結合する任意の小分子が挙げられるが、これらに限定されない。調節タンパク質を遺伝子操作して、代謝産物の特異性を変化させることができる。１つの実施形態では、アラビノース転写活性化因子を、アラビノースの代わりにグルコースの結合に特異的となるように突然変異させることができる。
【００３７】
本発明では、特定の代謝産物の検出に使用することができるナノ検出デバイスを提供する。かかるデバイスの例は、Ｆ１−ＡＴＰアーゼの分子を顕微鏡スライドの表面上に、回転γ−サブユニット軸が表面から離れるように配向させて取り付けることによって構築される。これは、未修飾であるか、又はニッケル−ＮＴＡを含有するように官能基化された顕微鏡スライドの表面に対して高親和性結合を有する、Ｆ１のαサブユニット及び／又はβサブユニットのＣ末端上のｈｉｓタグの存在によって達成される。Ｆ１−ＡＴＰアーゼのγサブユニットを遺伝子操作して、例えばビオチン−マレイミドを介してビオチン部分を含有するように共有結合的に修飾されたシステインを含有させる。
【００３８】
標的分子（代謝産物）の検出に対する特異性をもたらす転写調節タンパク質を遺伝子操作して、二量化又はＤＮＡ結合部位を妨げないように位置するビオチン化のためのシステインを含有させる。次いで、ビオチン化された調節タンパク質及びビオチン化されたＦ１−ＡＴＰアーゼをアビジンを用いて集合させる。
【００３９】
顕微鏡下で見ることが可能な検出プローブ（金ナノロッドを含むが、これに限定されない）の表面を、調節タンパク質に特異的な配列を有する二本鎖ＤＮＡを含有するように官能基化する。標的分子（代謝産物）が調節タンパク質に結合し、二量化及び高親和性ＤＮＡ結合部位の形成が誘導される場合に、検出が行われる。続く官能基化されたナノロッドの添加は、代謝産物と結合した調節タンパク質のみについて、ナノスケールの検出デバイスの複合体の集合を可能にする。標的代謝産物の存在下と非存在下とで顕微鏡スライド上に結合したナノロッドの数を比較することによって検出を行うことができる。ナノデバイスの集合を用いた検出限界は、ナノデバイスの標的特異的な集合の数が、顕微鏡スライドの表面に非特異的に結合した金ナノロッドの数を超えて顕著に増大しない点である。これらの限定条件下では、ＡＴＰの添加は、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ分子モーターによる回転の誘導を更に強める。回転するナノロッドは、標的代謝産物を含有する正確に集合したナノデバイスに特異的に結合したナノロッドのみである。
【００４０】
ＡＴＰの存在が回転を誘導するため、金ナノロッドをＦ１−ＡＴＰアーゼのγサブユニットに直接付着させることによってＡＴＰの検出を行うことができる。同様にして、高濃度のピルビン酸キナーゼ及びホスホエノールピルビン酸を用いた共役酵素アッセイを用いて、ＡＤＰの存在の検出を行うことができる。同様に、Ｆ１−ＡＴＰアーゼと集合したグルコース耐性アミラーゼ調節因子を使用して、グルコースをグルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）に変換するためにヘキソキナーゼ及びＡＴＰを用いた酵素共役アッセイによって、グルコースを検出することができる。次いで、Ｇ−６−Ｐが調節タンパク質に結合して、検出のためのＤＮＡで官能基化された金ナノロッドとの集合を容易にする。
【００４１】
抑制タンパク質を用いた検出は、抑制タンパク質二量体と、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ及びＤＮＡで官能基化されたナノロッドとの集合によって達成される。この場合、抑制タンパク質二量体は、標的代謝産物の非存在下でＤＮＡに対して高親和性を有する。標的代謝産物と抑制タンパク質との結合は複合体の解離を引き起こし、これは観察される顕微鏡スライドの表面に結合したナノロッドの数の減少として検出される。結合した標的代謝産物の数の定量を容易にするために、ナノデバイスを、顕微鏡スライド表面上に特定の間隔を置いてナノアレイパターンで集合させることができる。これは、標的代謝産物の結合によって破壊されるナノロッドの格子パターンをもたらす。標的代謝産物の添加前及び添加後に観察されるナノロッドの数によって定量が決定される。
【００４２】
別の実施形態では、標的代謝産物を検出するためにシグナル伝達タンパク質キナーゼを用いてデバイスを構築する。幾つかのタンパク質キナーゼは、特異的な代謝産物の結合によって活性化される。特定の実施形態は、環状ＡＭＰの結合の結果としてキナーゼ触媒活性が活性化されるタンパク質キナーゼＡである。このタンパク質は、２つの触媒サブユニットと、ｃＡＭＰと結合する２つの調節サブユニットとを含有する。ｃＡＭＰと調節サブユニットとの結合は、触媒サブユニットの解離及び活性化を引き起こす立体配座変化を誘導する。これらのキナーゼの１つを用いて標的代謝産物を検出するために、このキナーゼの調節サブユニットを、ビオチン−アビジン連結を用いてビオチン化した、遺伝子操作したシステインを介してビオチン化Ｆ１−ＡＴＰアーゼに付着させる。この集合体は、触媒サブユニットがＦ１−ＡＴＰアーゼから遠位となるように設計される。標的代謝産物と結合すると、触媒サブユニットが解離し、それにより調節サブユニットのそれまで隠れていた領域が露出する。活性化の際に露出する調節サブユニットのその部分に対する、モノクローナル抗体で官能基化された金ナノロッドの付加は、ナノデバイスの集合を可能にし、それにより検出が可能となる。
【００４３】
別の実施形態では、デバイスは、ナノロッド／ナノ粒子とＦ１−ＡＴＰアーゼとの間に架橋を形成するタンパク質成分が、修飾ＤＮＡの検出に使用されるＤＮＡプルーフリーディングタンパク質となるように構築される。ＤＮＡのシトシンメチル化は、細胞分裂時のクロマチン状態の伝播において中心的役割を果たす重要なエピジェネティックシグナルである。プルーフリーディングタンパク質は、５−メチルシトシンのような修飾塩基を含有するＤＮＡの配列に特異的に結合する。例えば、ＰＨＤ及びＲＩＮＧフィンガードメインを含有するユビキチン様物質（ＵＨＲＦ１）のＳＲＡドメインは、ＤＮＡ複製フォークでのＣｐＧ維持メチル化に必要とされる。このタンパク質はＤＮＡ配列中の５−メチルシトシンに特異的に結合し、ＤＮＡヘリックスからその塩基をフリップアウトする。
【００４４】
ＤＮＡの特異的修飾に対する結合に関与するプルーフリーディングタンパク質を、アビジン−ビオチン連結を介してＦ１−ＡＴＰアーゼに付着させる。修飾塩基を含有する一本鎖標的ＤＮＡの鎖が、この検出複合体に導入されるか、又は検出プローブ鎖として知られる相補ＤＮＡ鎖とハイブリダイズする。この相補鎖は、検出を可能にするナノデバイスの集合のためのアビジンでコーティングした金ナノロッドへの付着のために、いずれかの末端にビオチンを共有結合的に含有するように修飾される。
【００４５】
このため、本発明は、所与のサンプルにおける標的代謝産物の非常に高感度の検出のための新規のデバイス、及びかかるデバイスを使用する方法を提供する。本明細書中で開示される方法では、検出対象の小分子代謝産物と、その小分子代謝産物に特異的に結合し、検出対象の特異的な小分子代謝産物の存在下でのみデバイス内にシグナルを発生する結合タンパク質との相互作用の結果として、その標的小分子代謝産物が検出される。対象の小分子代謝産物に結合する特異的タンパク質が、固体表面に固着する分子モーターと検出プローブとを架橋するために使用される。しかしながら、架橋は、そのタンパク質が検出対象の小分子代謝産物に結合する場合にのみ形成される。この結合が生じる場合、これは、検出対象の小分子代謝産物と架橋部中のタンパク質との結合の指標となる、分子モーターによって架橋部に与えられる運動を明らかにする検出プローブによって明らかとなる。プローブに与えられる運動は、検出プローブからのシグナルを検出する適切に選ばれた手段によって観察される。本発明の方法は、検出対象の小分子代謝産物の単一分子を検出することが可能であり、これにより臨床診断、法医学的分析、遺伝子発現分析、ＤＮＡシークエンシング及びＤＮＡ校正、並びにＤＮＡ計算を含むが、これらに限定されない幅広い用途を有する非常に高感度の標的検出技法がもたらされる。
【００４６】
本発明に使用されるデバイスは、３つの別個の部分（アンカー部、架橋部及びシグナル発生部）からなると説明することができる。アンカー部は、集合全体を顕微鏡スライドに固着させ、発生したシグナルの顕微鏡による検出を可能にする部分である。アンカー部は、Ｆ１−αサブユニット又はＦ１−βサブユニットのＮ末端上にｈｉｓタグ、及びＦ１−γサブユニット上にシステインを含むように、部位特異的突然変異誘発によって修飾されたＦ１−ＡＴＰアーゼ分子を含み、ここで、複数の上記Ｆ１−ＡＴＰアーゼ分子は、Ｆ１−γサブユニットが顕微鏡スライドの表面から離れた状態で各々のＦ１−ＡＴＰアーゼ分子が配向するように上記顕微鏡スライドの表面に固定され、Ｆ１−γサブユニット上の上記システインがビオチン化される。架橋部は、検出対象の代謝産物に結合するか、又は別の形で検出対象の代謝産物の存在に応答するタンパク質を含み、ここで、上記架橋部中の上記タンパク質は、ビオチン化されるとともに、上記アンカー部の上記ビオチン化Ｆ１−γサブユニットとのビオチン−アビジン−ビオチン連結を介して上記アンカー部に連結する。シグナル発生部は、上記検出対象の代謝産物の存在下で上記架橋部の上記タンパク質に特異的に結合する部分で官能基化された電磁検出プローブを含む。
【００４７】
検出対象の小分子代謝産物は、対象のタンパク質が分子モーターとモーターによって誘導される運動を検出する検出プローブとの間の架橋内のタンパク質として使用される場合に、そのタンパク質に結合することができ、その架橋を形成する手段が検出対象の小分子代謝産物に特異的である任意の分子であり得る。（訳注：原文の繰り返しは削除）
【００４８】
検出対象の小分子代謝産物の検出が行われるサンプルは、合成核酸、ゲノムＤＮＡ、細胞溶解物、組織ホモジネート、法医学サンプル、環境サンプル、及び細胞、組織又は完全な生物に由来する単離核酸サンプルを含むが、これらに限定されない任意の対象のサンプルであり得る。加えて、サンプルは、架橋部分の一部であるタンパク質に結合する作用因子を同定するために使用することができる小分子のライブラリーに由来するものであってもよい。このように、デバイスの架橋部分を形成する新たなタンパク質のモジュレーターを同定することができる。
【００４９】
検出対象の小分子代謝産物を含有するか、又は含有する疑いがあるサンプルと、ナノ検出デバイスとを、検出対象の小分子代謝産物がデバイスの架橋部分のタンパク質に結合する条件下で接触させるための条件の最適化は、当業者によって容易に達成され得る。
【００５０】
Ａ．アンカー部
ナノ検出デバイスのアンカー部は、検出することが可能な並進運動又は回転運動を誘導することが可能な任意の生体分子又は合成分子である分子モーターからなる。好ましい実施形態では、分子モーターは生体分子モーターを含む。かかる生体分子モーターの非限定的な例としては、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ、アクトミオシン、絨毛軸糸、細菌絨毛モーター、キネシン／微小管、並びに核酸ヘリカーゼ及びポリメラーゼが挙げられる。
【００５１】
好ましい実施形態では、分子モーターはＦ１−ＡＴＰアーゼを含む。Ｆ１−ＡＴＰアーゼ酵素は、その基礎構造においてα−サブユニット及びβ−サブユニットを含む。基礎構造は回転せず、表面に選択的に固着又は付着する。表面はＤＮＡマイクロアレイ、スライドガラス、又は他の誘電体基板の一部であり得る。
【００５２】
例として、Ｆ１  ＡＴＰアーゼ上で回転するサブユニットにはγサブユニット及びεサブユニットが含まれるが、αサブユニット、βサブユニット、及びδサブユニットは回転しない。このため、Ｆ１  ＡＴＰアーゼを分子モーターとして使用する場合、第１の親和性タグが、ｙサブユニット及び及び／又はｓサブユニットに（直接的に又は間接的に）結合し、分子モーターが機能的部分、例えばｈｉｓタグを介してαサブユニット、βサブユニット、又はδサブユニットを通して基板に付着するのが好ましい。好ましい実施形態では、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ回転生体分子モーターはα３β３γサブユニットの複合体である。この複合体によって、Ｆ１  ＡＴＰアーゼと固体支持体との最適結合、及びγサブユニットとＤＮＡとの最適結合が与えられる。Ｆ１−ＡＴＰアーゼ集合、サブユニット組成、及びＦ１−ＡＴＰアーゼ回転の誘導の詳細は当業者にとって既知である。例えば、米国特許出願公開第２００３０２１５８４４号、Yoshida et al., Journal of Biological Chemistry, 252: 3480-3485 (1977)、Du et al., Journal of Biological Chemistry, 276: 11517-11523 (2001)、Bald et al., Journal of Biological Chemistry, 275: 12757-12762 (2000)、Kato-Yamada et al., Journal of Biological Chemistry, 273: 19375-19377 (1998)、Kato et al., Journal of Biological Chemistry, 272: 24906-24912 (1997)、Tucker et al., Journal of Biological Chemistry, 279: 47415-8 (2004)、Tucker et al., Eur. J. Biochem. 268: 2179-86 (2001)、及びDu et al., Journal of Biological Chemistry, 276: 11517-23 (2001)を参照されたい。
【００５３】
本発明の方法及び組成物に使用することができるＦ１−ＡＴＰアーゼサブユニットの例示的な非限定的な例は、当業者に既知であり、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１２８８６４；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ１２１３４８；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ１０４０４３；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ１４６９９；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ１４７００；ＡＢ０９５０２６；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＴ０００４０９；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ１３６２８９；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ１１４５４０；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＪ４８７４７１；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ２０９２９；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３４１１８；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ１０４９１；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０５３６６；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ０７２３０９；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ０６２６２７；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ６１３９２；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ６１３９１；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０５９７０；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４４９４２；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５２９５５；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ３７９４８；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０２２０１８；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ００７０３４；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ１５０６５；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ０００２２；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０５３９７；ＡＦ１３４８９２；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｚ０００１８；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ４６２１５；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ５３５３７；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０３５５９；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１０３２３；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ００３５４９；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ８８３７７；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ８８３７６；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ８８３７５；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ８８３７４；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ１０６６０；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ６８６９１；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ５６００８；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ５５３８９；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ５９０６６；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ１３３２０；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ５１４２２；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｚ０００２６；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０７７４５；Ｘ５５９６３；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ６８６９０；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ５６１３３；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｖ００３１２；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ３７７６４；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ６５１２９；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０３２１８；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１６２２２；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０２６０３；及びＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ０９３０５で寄託されているものを含む。
【００５４】
Ｆ１−ＡＴＰアーゼは、回転可視化技法のために、又はその検出が局所環境、例えばマイクロ電流又はインピーダンスの変動に左右される場合に固定化されているのが好ましい。同一の又は２つ以上の異なる分子モーターのいずれかである分子モーター群を表面上に固定化し、本発明のナノ検出デバイスのアレイを作製することができる。各々のＦ１−ＡＴＰアーゼがデバイスの架橋部で異なるタンパク質に付着し、異なるデバイスが異なるラベルで標識される場合、この分子モーターアレイを用いて、遺伝子チップを使用する場合と同様に複数の小分子代謝産物を検出することができる。本明細書で使用される場合、「アレイ」は分子モーターがその表面に付着する固体表面を含む。幾つかの実施形態では、アレイは固体表面に付着した複数のナノ検出デバイスのランダムアレイであり、そこでこのデバイスは同じ又は異なる小分子代謝産物を検出する（すなわち、ナノ検出デバイスの架橋部中のタンパク質が異なる小分子を検出する）。他の実施形態では、アレイは特定のタンパク質を含有する特定のナノ検出デバイスの配置がそのアレイ上に特定の位置に与えられ、その位置が色の違い又は他の選択マーカーにより示され、それによって特異的な分子モーターの配置を正確に示すことが可能になる「アドレス可能な」アレイである。
【００５５】
アイレは通常、異なる既知の配置で基板の表面と共役する異なる捕捉基に連結した複数の分子モーターを含む。例えば、様々な官能基がガラス表面に付着した幾つかのシラン誘導体が存在する。「固体表面」という用語は、本明細書で使用される場合、剛体表面又は半剛体表面を有する物質を表す。
【００５６】
かかる物質は、チップ、プレート、スライド、カバーガラス、小ビーズ、ペレット、ディスクの形態又は他の便利な形態をとるのが好ましいが、他の形態を使用してもよい。表面は一般的に親和性標的でコーティングされている。かかる固体表面を、その表面との所望の結合を改善し、及び／又はその表面との非特異的な結合を最小限に抑える任意の方法でコーティングすることができる。好ましい実施形態では、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）親和性樹脂（Sigma-Aldrichの製品番号Ｐ６６１１）が使用される。更なる実施形態では、アセチル化ＢＳＡを添加して、非特異的な結合を低減することができる。アレイを例えば電子ビームリソグラフィーを使用して作製することができる。
【００５７】
Ｆ１−ＡＴＰアーゼ酵素のγ−サブユニットは基礎構造と分子的に共役し、基板の表面に垂直に上方へと配向している。Ｆ１−ＡＴＰアーゼ酵素は、γ−サブユニットアームの回転を誘導するα−サブユニット及びβ−サブユニットを有する分子モーターとして作用する。このため、γ−サブユニットアームは、酵素が付着する表面に垂直に上方へと配向し、α−サブユニット及びβ−サブユニットの活性に応答して回転する駆動軸として働く。γ−サブユニットアームの回転は顕微鏡下で直接観察することが困難であり、そのためγサブユニットをシグナル発生部と共役させる。
【００５８】
Ｂ．シグナル発生部及びシグナルの検出
本発明のナノ検出デバイスのシグナル発生部には、検出プローブが存在する。検出プローブは、デバイスの架橋部に付着し、分子モーターによって生じる運動を検出する手段、例えば金属ナノ粒子（ロッド、球体（spheres）、量子ドット等）、蛍光色素、及び蛍光色素で標識したナノ粒子を与えることが可能ないずれのものであってもよい。好ましい実施形態では、金、銀、アルミニウム、白金、銅、亜鉛、及びニッケルを含むがそれらに限定されない元素金属ナノロッドを使用する。一例では、顕微鏡による目視観察が可能な金ロッド検出プローブを官能基化し、架橋部タンパク質が検出対象の小分子に結合する場合に、そのタンパク質に結合する部分をビオチン−アビジン結合を介してその上に付着させている。
【００５９】
金ナノロッドはタンパク質又は他の結合分子、例えばアビジンによってγ−サブユニットアームに付着する。γ−サブユニットアームを金ナノロッドの任意の部分に、例えばいずれかの末端に、その中央に、又はその間にある任意の点に付着させることができる。γ−サブユニットアームの回転運動が金ナノロッドに伝わるように、結合分子が金ナノロッドとγ−サブユニットとを連結させる。金ナノロッドは、γ−サブユニットアームの回転運動に合わせて回転する。更なる例では、金ナノロッドを、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）二次親和性タグと特異的に結合する抗ＤＩＧ抗体（親和性標的）でコーティングする。
【００６０】
金属ナノ粒子、例えば金ナノロッドは、表面プラズモンとして知られるその伝導電子の集団振動のために有効な光の吸収体及び散乱体である。表面プラズモンバンドの数、位置、及び形状は、金属の種類、粒子のサイズ及び形状、並びに周囲媒体の誘電率によって決定される。非球形ナノ粒子は複数の表面プラズモンモードを保有する。例えば、ロッド形状のナノ粒子はその長軸及び短軸にそれぞれ対応する２つの共振モードを示す。
【００６１】
金ナノロッドは先端が丸い又は平らな、ロッド、シャフト、又はシリンダーの形状である。金ナノロッドは直径が約１５ｎｍ〜４０ｎｍ及び対称軸に沿った長さが約６０ｎｍ〜８０ｎｍである。他の実施形態では、金ナノロッドの長さ−直径の縦横比は２．５：１〜２０：１である。ロッド形状のナノ粒子は通常、ベースウェハ又は球体から成長させる。金ナノロッドはシャフトの直径及び長さに対応する２つの表面プラズモン共鳴を有するという光学異方性を示す。短軸はロッドの横方向のプラズモン共鳴に対応する。長軸はロッドの縦方向のプラズモン共鳴に対応する。金ナノロッドの短軸及び長軸は、それぞれの寸法に応じて異なる波長で白色の入射光を散乱する。より長い軸はより短い軸よりも表面積が大きい。金ナノロッドの短軸又は端面は、表面積が小さくなるためにより短い波長の光を散乱し、金ナノロッドの長軸又は側面は、表面積が大きくなるためより長い波長の光を散乱する。１つの実施形態では、金ナノロッドの短軸は約５２０ｎｍ〜５７０ｎｍの波長の緑色光を散乱し、長軸は６８５ｎｍ〜７３０ｎｍの波長の赤色光を散乱する。他の相対寸法の金ナノロッドでも２つの異なる波長の白色の入射光を散乱すると考えられる。
【００６２】
金ナノロッドの光散乱特性をγ−サブユニットアームによって伝えられる回転運動と組み合わせることで、ナノスケールでの分子構造の物理的特性及び挙動現象の観察及び測定が可能になる。簡潔に考えると、フルスペクトル白色光源を一般的に基準方向へと向ける。白色光の光子が波動関数として金ナノロッドに衝突し、偏光フィルターの入射角に対する金ナノロッドの配向に応じて、光の波長の一部が散乱する。金ナノロッドの所与の寸法によって、短軸が偏光子と平行となるようにナノロッドが配向する場合（位置Ａ）、緑色光の散乱が最大となり、赤色光の散乱が最小となる。ナノロッドの長軸が偏光の方向で配向する場合（位置Ｂ）、赤色光の散乱が最大となり、緑色光の散乱が最小となる。これは図２に見ることができる。
【００６３】
金ナノロッドからの散乱光を偏光する。赤色及び緑色の共鳴の強度は、入射光の偏光面に対するナノロッドの相対配向に応じて変化する。回転するＦ１−ＡＴＰアーゼ分子モーターとの接続による金ナノロッドの回転性質により、緑色と赤色とが交互に閃光する（flashes）又は点滅する観察可能な光が生じる。赤色光及び緑色光の点滅の強度及び速度は、γ−サブユニットアームの回転の速度に応じたものである。金ナノロッドからの赤色と緑色との点滅光を観察することによって、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ酵素の回転運動を検出及び測定することができる。可視点滅光は物理的な回転構造自体よりも観察するのが非常に容易である。その上、散乱波長の偏光性質により、位置Ａと位置Ｄとの間で金ナノロッドが暗くなる。緑色光及び赤色光の閃光は、暗視野顕微鏡検査を用いて検出、観察、及び測定が可能である。
【００６４】
金ナノロッド３０からの散乱光を検出、観察、及び測定するための暗視野顕微鏡検査機器の構成を図１に示す。光源からのフルスペクトル白色光３８が、暗視野集光器及びレンズ４０に入射し、光の経路が変更され、金ナノロッド３０の長軸及び短軸の配向に対する斜角を生じる。金ナノロッド３０が付着したＦ１−ＡＴＰアーゼ酵素１０をスライド表面２０上に配置する。Ｆ１−ＡＴＰアーゼ酵素１０及び回転金ナノロッド３０を白色光に曝す。Ｆ１−ＡＴＰアーゼ酵素１０の回転運動、及び対応する金ナノロッド３０の回転により、入射光の赤色及び緑色の波長がナノロッドの配向に応じて散乱する。長軸が白色光に曝されると赤色光が散乱し、短軸が白色光に曝されると緑色光が散乱する。非散乱光は対物レンズ４２へと進み、そこでその光は絞り４４によって遮断される。金ナノロッド３０によって散乱された光の波長は絞り又はアパチャー４４を通過する。
【００６５】
偏光フィルター４６が対物レンズ４２の出光部（output）に配置され、偏光フィルターと配向する散乱光の波長を通過させ、さらに散乱していても又は散乱していなくても偏光フィルターと配向しないあらゆる光を遮断する。偏光フィルター４６と配向する赤色散乱光はフィルターを通過する。同様に、偏光フィルター４６と配向する緑色散乱光もフィルターを通過する。赤色及び緑色の散乱光の強度は、偏光の角度に応じて変化し、金ナノロッド３０の適当な軸が偏光面と平行となる場合に最大となる。金ナノロッド３０の長軸から散乱された光が偏光フィルター４６と配向する場合、赤色光が通過する。金ナノロッド３０の短軸から散乱された光が偏光フィルター４６と配向する場合、緑色光が通過する。偏光フィルター４６を通過する光が他になければ、偏光フィルター４６の出光部は暗くなる。
【００６６】
赤色光及び緑色光の強度は光学処理装置４８で回収され、そこで赤色光及び緑色光が個々のチャネルに分離される。ＭｅｔａＶｕｅソフトウェアを用いて、赤色光及び緑色光の強度を単離、検出、観察、及び測定する。Ｆ１−ＡＴＰアーゼ酵素により誘導された回転は、金ナノロッド３０の表面プラズモン共鳴により、偏光フィルター４６を通る赤色と緑色とが点滅する光として観察される。赤色と緑色とが交互に点滅する光は、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ酵素１０の物理的特性及び挙動特性の観察可能かつ定量可能な表示を与えており、例えば赤色と緑色との点滅速度は、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ酵素１０の回転の速度に応じたものである。
【００６７】
ナノ粒子は楕円状、ロッド形状、又は他の異方性形状であってもよい。ナノ粒子は純金属又は合金で構成されていてもよく、異なる種類の金属又はガラスのような他の材料でコーティングされていてもよい。ナノ粒子は、例えばｅビームリソグラフィーによって金属化表面上にパターニングされた平板構造であってもよい。
【００６８】
分子モーターの運動の誘導は所与の分子モーターに対して当該技術分野において標準的な方法によって行われる。例えば、Ｆ１  ＡＴＰアーゼの運動は、標準技法（Noji, H., Yasuda, R., Yoshida, M. and Kinosita, K. (1997) Nature 386, 299-302）を用いてＡＴＰを添加することによって誘導される。本発明の方法に使用されるＡＴＰの好適な濃度は、１ｐＭ〜２ｍＭ、好ましくは２００μＭ〜１ｍＭの範囲である。Ｆ１−ＡＴＰアーゼの回転速度は、使用するＡＴＰ濃度によって制御することができる。例えば、検出方法によっては、他よりも大きい回転速度を検出することが可能な場合があり、このため使用するＡＴＰの特定の濃度は採用する検出技法に一部依拠すると考えられる。
【００６９】
当業者であれば、同じような公開されているプロトコルを用いて他の既知の分子モーターの運動を誘導する方法を決定することができる。検出される唯一の運動が検出プローブに接続する分子モーターに起因するものであり、この接続が、検出対象の小分子代謝産物が分子の架橋部でタンパク質に結合することに依拠し、またその場合にのみ起こることが、本発明の特定の態様である。この接続が検出対象の小分子代謝産物とタンパク質との特異的な結合に起因する架橋においてタンパク質に結合した検出対象の小分子代謝産物の存在に依拠するため、この運動の観察によって、検出対象の小分子代謝産物の存在が特定されると考えられる。
【００７０】
検出プローブによる分子モーターの運動の検出を任意の好適な手段により達成することができる。１つの実施形態では、その運動の直接的な可視化が用いられる。好ましい実施形態では、顕微鏡による目視観察が可能な元素金属ロッド検出プローブをデバイスの架橋部に付着させる。
【００７１】
他の観察手段としては、単一分子蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光寿命異方性、及び原子間力顕微鏡検査が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
顕微鏡検査の他にも、他の方法を使用して、検出プローブの回転を観察することができ、その方法には、（１）分子モーターをナノ電極上に付着させ、回転により生じたマイクロ電流の変化又はインピーダンスの変化を測定すること；（２）分子モーターの非回転部上にＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）（Molecular Probes）等の蛍光標識を付着させること；及び（３）単一分子異方性測定が含まれるが、それらに限定されない。別の代替形態では、回転は消光（quencher）検出プローブによる蛍光シグナルの周期的な消光によって観察することができる。更なる代替形態では、表面プラズモン共鳴バイオセンサを使用して、金属ナノロッドの回転中の表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。
【００７３】
最も好ましい実施形態では、金属（例えば金）ナノロッドを可視光（４００ｎｍ〜７００ｎｍの波長範囲）で使用して、回転を検出し、検出能の改善をもたらすことができる（例えば国際公開第２００４／０５３５０１号を参照されたい）。ナノロッドから散乱される光を、ロッドの長軸及び短軸それぞれから散乱されるより長い波長及びより短い波長で偏光させる。偏光フィルターを通して見た場合、散乱光の強度はフィルターの方向に対するロッドの角度に依拠する。ロッドの長軸及び短軸から散乱される光は、それらの軸がフィルターの方向と平行である場合に最大値をとり、フィルターに垂直である場合に最小値をとる。
【００７４】
例えば、散乱光の長波長及び短波長がそれぞれ、赤色及び緑色である場合、緑色の強度が最小である場合に赤色の強度が最大となる。このため、偏光フィルターを通して見た金属ナノロッドの回転は、赤色と緑色との点滅であると考えられる。この実施形態では、ナノロッドを回転させながら赤色光及び緑色光の両方の強度の振動をモニタリングすることで、ロッドを回転させる独立した立体配座が得られる。更なる好ましい実施形態では、一方のみの波長の光の強度の振動を測定し、それによりシグナル対ノイズ比を更に改善させる。これらの実施形態では、光の両方の波長を用いて（例えばビームスプリッタ又はカラーカメラを用いて）又は一方のみの波長を用いて（例えば緑色フィルター又は赤色フィルターを用いて）測定を行うことができる。
【００７５】
デジタルカメラによっては、フレームレート（データ収集の速度）に関して制限があるものがあるが、このカメラであっても回転ナノロッドからの強度の振動を測定するのには十分高感度である。単一光子カウンタを用いて、振動の測定を行うことができる。
【００７６】
ピンホールカメラはカメラオブスクラとして作用し、一度に１つのロッドのみの振動しか測定することができないが、シグナル対ノイズ比を大幅に高くすることでフレームレートを大幅に大きくすることが可能である。デジタルカメラは一度に多くのナノロッドの振動データを収集することができるが、カメラの速度及び感度はロッドの回転速度を捕捉するのに十分なものであればよい。
【００７７】
好ましい振動速度はその測定を行うのに使用される検出デバイスで容易に測定されるものである。元素金属ナノロッドを用いるこれらの実施形態では、暗視野顕微鏡検査が好ましい検出方法であるが、これはナノロッドから散乱される光のみが観察され、シグナル対ノイズ比が更に改善するためである。別の実施形態では、明視野顕微鏡検査を用いて検出を行う。
【００７８】
本発明の方法が検出対象の小分子代謝産物の単一分子を検出することが可能であるため、本発明の方法により、サンプルに存在する検出対象の小分子代謝産物の量を定量する正確な手段が与えられる。１つの実施形態では、回転分子の数を可視化により決定し、観察される総サンプルに対する割合に関して計算が行われる。これは、ＤＮＡマイクロアレイを用いる現在使用されている蛍光検出方法では不可能である。
【００７９】
特定の実施形態では、アンカー部はビオチン／アビジンを介して隣接架橋部に連結するが、他の結合対を用いてこの結合を達成してもよい。他のかかる結合対の非限定的な例としては、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）／抗ジゴキシゲニン抗体及び他の抗原／抗体対が挙げられる。エピトープタグ、例えばｈｉｓタグ、及びエピトープタグに指向性を有する抗体（又はその断片）は本発明の方法に使用される結合対の更なる例である。当業者であれば、親和性タグと、分子モーター又は検出プローブとの間接的な結合として本明細書で挙げられる或る特定の実施形態を、直接的に結合する実施形態にも使用することができることを理解するであろう。
【００８０】
Ｃ．架橋部
本発明では、ナノ粒子とγサブユニットとの間に、検出対象の代謝産物に結合する又は別の形でその存在に応答するタンパク質からなる連結部、架橋部又は共役部が存在する。本明細書の上記で述べられるように、そのタンパク質は、転写調節タンパク質、シグナル伝達タンパク質、ＤＮＡ校正タンパク質、又は実際に対象の代謝産物に対する結合タンパク質として作用する任意の他のタンパク質であり得る。
【００８１】
例示的な転写調節タンパク質としては、ＪＮＫ１（Ｃ−ｊｕｎキナーゼ１；マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ８；ＭＡＰＫ８）；Ｐ３８キナーゼ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１４；ＭＡＰＫ１４；ｐ３８  ＭＡＰ  ＫＩＮＡＳＥ；ｐ３８−ＡＬＰＨＡ）；ＡＴＦ２、ＭＥＦ２Ｃ、及びＭＡＸ、細胞周期調節因子ＣＤＣ２５Ｂ、腫瘍抑制因子ｐ５３；遺伝子コードｃｄｃ２、遺伝子コードサイクリン（サイクリンＡ、サイクリンＤ、サイクリンＥ）、ｃｄｃ２５Ｃ、ＷＡＦ１（野生型ｐ５３活性化断片１）、ＩＮＫ４、ＣＤＫ（ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６）、Ｒｂタンパク質、及びＥ２Ｆが挙げられる。例示的な転写抑制タンパク質としては、例えばテトラサイクリン（ｔｅｔ）抑制タンパク質が挙げられる。上記で述べられるように、使用することができる特異的なシグナル伝達タンパク質はタンパク質キナーゼＡである。使用することができる他のタンパク質キナーゼとしては、Ｒａｓ、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、及びＲａｆ−１等が挙げられる。
【００８２】
Ｄ．キット及び例示的な実施形態
別の態様では、本発明は、小分子代謝産物の検出のためのキットであって、（ａ）対象の小分子代謝産物に特異的に結合するタンパク質であって、対象の小分子代謝産物の結合を妨げないようにビオチン化される、タンパク質と、（ｂ）３サブユニット又は５サブユニットのＦ１−ＡＴＰアーゼ分子等の分子モーターであって、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ分子がＦ１−ＡＴＰアーゼと固体支持体との付着を容易にするｈｉｓタグを有し、更にはＦ１−ＡＴＰアーゼ分子がビオチン化される、分子モーターと、（ｃ）（ａ）のタンパク質を、タンパク質が対象の小分子代謝産物に結合している場合に認識する分子に結合した金ナノロッドと、を含む、小分子代謝産物の検出のためのキットを提供する。キットは固体支持体及びアビジンを更に含んでいてもよい。
【００８３】
好ましい実施形態では、キットは架橋部に結合する分子モーター及び／又は架橋部に結合する検出プローブを更に含有する。更なる実施形態では、分子モーターが固体支持体、例えばガラスカバースリップ又は他の好適な支持体に結合する。支持体を分子モーターとの結合に好適な任意の方法で誘導体化することができる。
【００８４】
本発明はまた、アンカー部と、架橋部と、シグナル発生部とを含む組成物であって、
ａ）前記アンカー部が、Ｆ１−αサブユニット又はＦ１−βサブユニットのＮ末端上にｈｉｓタグ、及びＦ１−γサブユニット上にシステインを含むように部位特異的突然変異誘発によって修飾されたＦ１−ＡＴＰアーゼ分子を含み、複数の前記Ｆ１−ＡＴＰアーゼ分子が、前記Ｆ１−γサブユニットが顕微鏡スライドの表面から離れた状態で各々のＦ１−ＡＴＰアーゼ分子が配向するように前記顕微鏡スライドの表面に固定され、前記Ｆ１−γサブユニット上の前記システインがビオチン化され、
ｂ）前記架橋部が、検出対象の小分子代謝産物に結合するか、又は別の形で検出対象の小分子代謝産物の存在に応答するタンパク質を含み、前記架橋部中の該タンパク質が、ビオチン化されるとともに、前記アンカー部の前記ビオチン化Ｆ１−γサブユニットとのビオチン−アビジン−ビオチン連結を介して前記アンカー部に連結し、
ｃ）前記シグナル発生部が、前記検出対象の代謝産物の存在下で前記架橋部の前記タンパク質に特異的に結合する部分で官能基化された電磁検出プローブを含む、アンカー部と、架橋部と、シグナル発生部とを含む組成物を提供する。
【００８５】
本発明は、アンカー部と、架橋部と、シグナル発生部とを含む組成物であって、
ａ）アンカー部が、Ｆ１−αサブユニット又はＦ１−βサブユニットのＮ末端上にｈｉｓタグ、及びＦ１−γサブユニット上にシステインを含むように部位特異的突然変異誘発によって修飾されたＦ１−ＡＴＰアーゼ分子を含み、複数の上記Ｆ１−ＡＴＰアーゼ分子が、Ｆ１−γサブユニットが顕微鏡スライドの表面から離れた状態で各々のＦ１−ＡＴＰアーゼ分子が配向するように上記顕微鏡スライドの表面に固定され、Ｆ１−γサブユニット上の上記システインがビオチン化され、
ｂ）転写調節タンパク質が検出対象の小分子代謝産物に結合するか、又は別の形で検出対象の小分子代謝産物の存在に応答する場合に、架橋部が特異的なＤＮＡ配列に対する結合部位を含む転写調節タンパク質を含み、上記架橋部中の該タンパク質がビオチン化されるとともに、上記アンカー部の上記ビオチン化Ｆ１−γサブユニットとのビオチン−アビジン−ビオチン連結を介して上記アンカー部に連結し、
ｃ）転写調節タンパク質が検出対象の小分子代謝産物に結合する場合に、シグナル発生部が、上記架橋部分の上記転写調節因子に結合することが知られている特異的なＤＮＡ配列で官能基化された電磁検出プローブを含む、
アンカー部と、架橋部と、シグナル発生部とを含む組成物も提供する。
【００８６】
本発明は、（ａ）固体支持体と、（ｂ）検出対象の小分子代謝産物に特異的なタンパク質を含む架橋部に付着する、固体支持体に付着した複数の分子モーターとを含む組成物を更に提供する。好ましい実施形態では、複数の分子モーターは２種類以上の分子モーターを含む。更に好ましい実施形態では、支持体上の異なる種類の分子モーターは検出対象の異なる小分子代謝産物に特異的な異なるタンパク質を架橋部に含む。更なる好ましい実施形態では、組成物は、ビオチン−アビジン−ビオチン連結を介して分子モーターに結合した検出対象の小分子代謝産物に特異的に結合する転写活性化タンパク質である第１のタンパク質を架橋部に更に含む。更に好ましい実施形態では、架橋部中のタンパク質は、ビオチン−アビジン連結等の親和性タグによる連結を介して金ナノロッドに結合するＤＮＡ分子に結合する転写抑制タンパク質である。
【００８７】
本明細書に記載されるようなかかる方法は、上述の理由から、金ナノロッドが検出アッセイにおける使用に好ましいため有用である。
【実施例】
【００８８】
Ｆ．実施例
実施例１：
本発明の１つの実施形態では、第１の親和性タグであるビオチンを本発明のデバイスの架橋部の一部をなすタンパク質上のシステイン残基に付着させる。このビオチン化タンパク質は、分子モーターと、親和性タグを介して分子モーターから生じる運動を検出するのに使用される検出プローブとの間の架橋として使用する。架橋部のビオチン化タンパク質を分子モーターの可動成分に付着させる。検出プローブに存在する検出部がナノ検出デバイスの架橋部に結合することができるように架橋部中のタンパク質の立体配座が変更されるために、検出対象の標的小分子代謝産物が存在する場合に架橋部が検出部と接続することになる。具体例では、検出プローブは、ビオチンアビジン結合によりナノロッドに結合する架橋部中のタンパク質に結合する又はそれを認識する部分に付着する、顕微鏡検査により可視化することができる金ナノロッドを含む。特定の金ロッドは特定のサイズを有し、赤色から緑色（又は赤色のみの場合は黒色）への及びその逆の（back）規則的な色の変化がロッドの回転を特徴的に示すように照射を受けた。
【００８９】
Ｆ１−ＡＴＰアーゼと架橋部との集合、及びナノロッドの調製後、Ｆ１−ＡＴＰアーゼを顕微鏡スライド等の固体基板上に固定化する。この固定化は非回転Ｆ１モーター構造とニッケル表面とのヒスチジン結合によって行われる。
【００９０】
分子モーターの運動はＡＴＰの添加によって誘導される。検出される唯一の運動は付着した検出プローブと接続するモーターに起因するものである。この接続が架橋中のタンパク質に結合した検出対象の標的小分子代謝産物の存在に依拠し、また検出対象の標的小分子代謝産物が架橋部中のタンパク質に結合する場合にしか、ナノロッドビーズ上の部分と架橋部中のタンパク質との結合をもたらすことができないため、この運動の観察によって、サンプルにおける検出対象の標的小分子代謝産物の存在が特定されると考えられる。
【００９１】
実施例２：
ナノ検出デバイスの４つの成分を別々に調製した：（１）検出対象の標的小分子代謝産物に特異的なタンパク質で構成されたタンパク質架橋；（２）修飾されたＦ１−ＡＴＰアーゼ；（３）ニッケルでコーティングされたカバースリップ；及び（４）コーティングされたナノロッド。これらの成分を調製した後、それらを検出対象の標的小分子代謝産物を添加することでデバイスへと集合させた。デバイスに付着したナノロッドの回転は、検出対象の標的小分子代謝産物が存在し、デバイスの集合が可能であった場合にのみ観察された。
【００９２】
架橋タンパク質として働くタンパク質は概して、ビオチン−アビジン−ビオチン連結を介した分子モーターへの付着に最適な位置にある場所にシステインを組み込むように修飾される。架橋タンパク質の機能的特性が変わらないように、またシステインが可視プローブを付着させるのに用いられるＤＮＡ認識／結合部位の形成を妨げないように、架橋タンパク質に特異的なシステインの場所が選ばれる。架橋タンパク質を遺伝子操作し、標的分子に対するその特異性を変化させることもできる。一例として、アラビノース活性化タンパク質に対して突然変異を行い、アラビノースの代わりにグルコースに対するその親和性を増大させることができる。別の実施形態では、架橋成分が異なるＤＮＡ配列を認識し、ナノデバイスの集合が達成されるように、ＤＮＡ認識／結合部位をタンパク質の遺伝的修飾によって変化させることができる。
【００９３】
修飾Ｆ１−ＡＴＰアーゼ
大腸菌ＡＢ００４株から単離されたＦ１−ＡＴＰアーゼは、５つのサブユニットを全て含有し、その化学量論組成はα３β３γδεである。これらのタンパク質の配列は、以下の変更を加えた、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：α、ＡＡＡ２４７３５；β、ＡＡＡ２４７３７；γ、ＡＡＡ２４７３６；δ、ＡＡＡ２４７３４；及びε、ＡＡＡ２４７３８に対応する。突然変異を行い、αサブユニット、βサブユニット、γサブユニット、δサブユニット及びεサブユニットに存在する全てのシステインをアラニンに置き換えた。αサブユニットを突然変異させ、６個のヒスチジンでＮ末端を伸長した。γサブユニットを突然変異させ、リシン−１０９をシステインに置き換え、これをビオチンマレイミドを用いるビオチン化の部位とした。ビオチン化は、室温で１時間穏やかに振盪しながらインキュベーションすることにより、３倍モル過剰のＥＺ  ＬＩＮＫ（商標）  ＰＥＯマレイミド活性化ビオチン（Pierce Endogenの製品番号２１９０１）を用いて行った。結合しなかったビオチンをサイズ排除ゲル濾過により除去した。この部位で共有結合したビオチンはアビジンに対する効果的な結合部位として働き、その部位には代謝産物活性化タンパク質のような架橋成分を含む他のビオチン化部分を付着させることができる。
【００９４】
このシステインの配置を、γサブユニットのαβドメイン上の又はεサブユニット上のＡＴＰアーゼ活性及び／又は回転を妨げない任意の露出場所へと変更することができる。この酵素の３サブユニットα３β３γのサブ複合体も、突然変異誘発により６個のサブユニットシステインをアラニンに置き換えた５サブユニットのＦ１−ＡＴＰアーゼと同じように、Ｆ１−ＡＴＰアーゼとして働くことができる。ｈｉｓタグがあり、システイン修飾が行われていれば、いずれの生物学的供給源から精製された３サブユニット又は５サブユニットＦ１−ＡＴＰアーゼであってもその目的には十分であると考えられる。Ｆ１をカバースリップに付着させるのに用いられるｈｉｓタグがＡＴＰアーゼ活性を妨げなければ、そのｈｉｓタグは、代替的に（又は付加的に）αサブユニット及び／又はβサブユニット上に存在していてもよい。βサブユニット上に１０×ｈｉｓタグ、並びにビオチン化及びＤＮＡ付着を促進する場所にシステインを含有する、好熱性細菌ＰＳ３由来のＦ１  ＡＴＰアーゼのα３β３γサブ複合体も同様の実験において首尾よく使用された。Ｆ１、例えばクラミドモナス又はホウレンソウ葉緑体由来のＦ１を用いても同様に作用する構築物を作製することができる。
【００９５】
ビオチン化Ｆ１を５００μｌの洗浄済みのニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）親和性樹脂（Sigma-Aldrichの製品番号Ｐ６６１１）に添加し、室温で３０分間穏やかに撹拌し、６×Ｈｉｓでタグ付けされたＦ１とＮｉ−ＮＴＡ樹脂とを結合させた。Ｆ１が結合したＮｉ−ＮＴＡ樹脂をシリンジカラムに充填し、カラムを１ｍｌの洗浄バッファーでフラッシングした。ニュートラアビジン（Molecular Probesの製品番号Ａ２６６６）を、１ｍｇ／ｍｌの濃度及び初期Ｆ１濃度に対しておよそ８倍〜１０倍のモル比で洗浄バッファーに溶解し、これをＮｉ−ＮＴＡ樹脂に通して、ニュートラアビジンとビオチン部分とを結合させた。ニュートラアビジン処理の後、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を５ｍｌの洗浄バッファーでフラッシングし、結合していないニュートラアビジンを除去した後、ビオチン化及びアビジン化したＦ１を、１ｍｌの溶出バッファーを用いてカラムから放出させるとともに回収した。
【００９６】
この方法でのアビジンとＦ１との結合によって、大過剰のアビジンを使用することが可能となり、全てのＦ１にアビジンを結合させることができるようになる。アビジンを有しない状態のＦ１は検出の感度を低減させる。Ｆ１をカバースリップに結合させた後に、アビジンをＦ１に付加させる場合、Ｆ１の非存在下において架橋部のビオチン化タンパク質がカバースリップに直接結合する可能性がある。かかる結合タンパク質はナノロッドと結合するが、回転させることはできないため、感度を低減させ、バックグラウンドの増大とみなされると考えられる。
【００９７】
Ｆ１のビオチン化及びゲル濾過工程の後のＦ１の回収は典型的には、出発量の５％である。ビオチン化Ｆ１とＮｉ−ＮＴＡ樹脂との結合、アビジン化、及びＮｉ−ＮＴＡ樹脂からの溶出の後では、出発Ｆ１のおよそ７５％が回収された。ビオチン化及びアビジン化したＦ１のＡＴＰアーゼ活性は、初期活性のおよそ９０％であった。
【００９８】
Ｎｉ−ＮＴＡカバースリップを調製するための手順
Ｎｉ−ＮＴＡカバースリップをKastner et al. (2003, Biophysical Journal 84: 1651-1659)による手順に従って作製した。カバーガラス（２２×２２ｍｍ、VWR）を５００℃で２時間熱することで前処理した（precleaned）。続いて、ガラスをシール溶液（２％（ｖ／ｖ）の３−グリシジルオキシプロピル−トリメトキシシラン（Fluka, Buchs, Switzerland）、０．０１％（ｖ／ｖ）の酢酸）中で９０℃で３時間；コーティング溶液（２％（ｗ／ｖ）のＮ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リシン（Fluka, Buchs, Switzerland）、２ｍＭ  ＫＨＣＯ３（ｐＨ１０．０））中で６０℃で１６時間；及びＮｉ２＋溶液（１０ｍＭ  ＮｉＳＯ４、５ｍＭ  グリシン（ｐＨ８．０））中で室温で少なくとも２時間インキュベートした。各々のコーティング工程後、ガラスを超純水で洗浄した。
【００９９】
金ナノロッドを合成し、その金ナノロッドをアビジンでコーティングするプロトコル
金ナノ粒子の形状及びサイズに影響を与える因子には、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）の濃度、Ａｕ種濃度、銀（ＡｇＮＯ３）の存在、ＮａＯＨ、アスコルビン酸濃度、及びこれら全ての因子の適当な組合せが含まれる。他の形状に対する金ナノロッドの割合を増大させる技法が有用であるが、これは金ナノロッドが検出アッセイ、例えば本明細書に記載されるような検出アッセイでの使用において好まれるためである。金ナノロッドを合成する典型的な実験では、ＣＴＡＢでコーティングされた種の溶液を、２５μｌのＡｕ溶液（５０ｍＭ）を１０ｍｌ体積のＣＴＡＢ（１００ｍＭ）に添加した後、５５μｌのＮａＢＨ４（３０ｍＭ、氷冷）を約２分間強くかき混ぜながら添加することにより調製した。この種溶液はすぐに使用することができるが、少なくとも１日は活性状態を保っている。
【０１００】
金ナノロッドを成長させるために、１００μｌのＡｕ溶液（５０ｍＭ）を１０ｍｌのＣＴＡＢ（１００ｍＭ）に添加し、その後穏やかに振盪しながらＡｇＮＯ３（１０ｍＭ、５０μｌ〜１２５μｌ）を添加した。それから、８５μｌのアスコルビン酸（１００ｍＭ）を添加した後すぐに振盪すると、溶液は無色となった。最後に、２４μｌの調製した種溶液を穏やかに振盪しながら添加した。紫色と青色との混色が１０分〜２０分以内に見られる。高温（５５℃〜１００℃）での金ナノロッドの成長によって、より深い青色の溶液が得られた。この方法では、種濃度はナノロッドの割合を増大させるのに最も重要なパラメータである。
【０１０１】
金のアビジン化手順
１．５ｍｌの金ロッド調製物を用い、これを４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを１ｍｌの１ｍＭ  ＣＴＡＢ中で再懸濁させる。この混合物を６０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、再びペレットを０．５ｍｌの１ｍＭ  ＣＴＡＢ中で再懸濁させる。吸光度スペクトルを計測し、ロッドの吸光度ピーク（Ａ６５０）がおよそ２．０となるように、サンプルを１ｍＭ  ＣＴＡＢで希釈する。ニュートラアビジンを最終濃度が４０ｕｇ／ｍｌとなるように添加し、混合物を軽く撹拌しながら室温で１時間インキュベートする。この手順でアビジン化したロッドは室温で又は４℃で保存することができる。
【０１０２】
機能デバイスへの成分の集合
Ｔｒｉｓバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＫＣｌ（ｐＨ８．０））中のアビジン化Ｆ１（８０ｇ／ｍｌ）５μｌをＮｉ−ＮＴＡカバースリップ上にスポッティングし、５分間インキュベートする。それから、カバースリップをＴｒｉｓバッファーで３０秒間洗浄する。次の工程は、４μｌのビオチン化タンパク質架橋溶液をカバースリップに添加すること、及び５分間インキュベートすることを包含する。その後、この集合体をＴｒｉｓバッファーで３０秒間洗浄する。次いでこの集合体の架橋部のタンパク質に結合する小分子の存在下で、この集合体をアビジンでコーティングした金ロッド４μｌとインキュベートする。その混合物を５分間インキュベートし、Ｔｒｉｓバッファーで３０秒間洗浄する。顕微鏡下で回転を観察するために、４μｌのＴｒｉｓバッファーを添加する。このバッファーは回転を誘導するするために１ｍＭ  Ｍｇ２＋−ＡＴＰも含有している。
【０１０３】
カバースリップに添加する成分の各々の体積はアッセイフォーマットに基づき所望に応じて変更することができる。この実施例には回転を誘導するために１ｍＭ  Ｍｇ２＋−ＡＴＰの添加を示しているが、僅か０．４ｍＭのＭｇ２＋−ＡＴＰを添加しても、回転を示していた。これらのより低いＡＴＰ濃度では、回転速度が遅くなり、このため回転を記録するのに必要なフレームレートはそれほど速くなくてもよくなる。好熱性細菌ＰＳ３由来のＦ１の３サブユニットのサブ複合体を用ると、２ｐＭと低いＡＴＰ濃度でも回転を観察することができる。ＤＩＧが抗ＤＩＧでコーティングされたナノロッドに結合するように、ビオチン及びＤＩＧを有するタンパク質架橋を用いてデバイスを集合させる代替的なプロトコルを以下に示す。この実験では、アビジンがＦ１と２点で付着することができるようにビオチン化についてγＹ２１５Ｃの更なる突然変異を含有していたという点で、上記のものとは異なるＦ１も使用する。この実験はフローセルを採用しているという点で上記のものとは異なる。結果として、ＡＴＰを添加する前、また回転を誘導するためにＡＴＰを添加した後の集合デバイスの動画を作製することができる。
【０１０４】
サブユニット組成がα３β３γδεであり、突然変異（γＫ１０９Ｃ、γＬ２１５Ｃ）を含む４５μｌの０．５ｎＭ  Ｆ１を、架橋を形成するためのタンパク質８μｌと混合した。この混合物を室温で３０分間インキュベートする。それから、同量のＢＳＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）をサンプルに添加した。顕微鏡フローセルを、両面セロハンテープを用いてＮｉ−ＮＴＡカバースリップをスライドガラスに貼り付けることで準備する。それぞれのフローセルを２５μｌのサンプルで充填し、室温で５分間インキュベートする。フローセルを、１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する３００μｌの洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＫＣｌ（ｐＨ８））で洗浄する。抗ＤＩＧでコーティングされた金ナノロッド２５μｌを添加し、室温で５分間インキュベートして、その後２００μｌの洗浄バッファーで５回洗浄を行う。１００μｌの回転バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＫＣｌ（ｐＨ８）、０．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２９．１ｍｇ／ｍｌ  ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、１．２５ｍｇ／ｍｌ  ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、１．２５ｍｇ／ｍｌ  酪酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、４ｍｇ／ｍｌ  還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ））をフローセルに添加した後、フローセルを顕微鏡下に置いた。ＰＥＰ、ＰＫ、ＬＤＨ及びＮＡＤＨを用いて、ＡＤＰ及びホスフェートからＡＴＰを再生し、それにより測定を通してＡＴＰ濃度を一定に保った。動画は、ビームスプリッタを用いて又は用いずに１秒に５００フレームで撮影することができる。ビームスプリッタによって、動画の各々のフレームにおけるナノロッドからの赤色及び緑色の両方の散乱光の強度の振動の測定が可能になる。ビームスプリッタの非存在下では、赤色フィルタを用いて、赤色のみの振動を測定する。振動の分析を以下に示す。
【０１０５】
ナノロッドが回転しているかどうかを決定するためのナノロッドから散乱した光の強度の振動の分析
一工程検出手順
スライドを完全に集合させたナノ検出デバイス及び溶液中に存在するＡＴＰを用いて準備する。ブラウン運動と実際の回転とを区別することができるように、変動の２つの原因（source）を分離することができるほど速い速度でデータを収集するのが好ましい。好ましい実施形態では、これはこの変動を測定するために単一光子カウンタを用いることで達成され、それによりリアルタイムでの回転の可視化が可能になる。
【０１０６】
多重工程手順
回転を検出することができる別の方法はフローセル及びハイスピードビデオカメラを使用するものである。これには、少なくとも２つの動画を撮影することが必要であるが、３つの動画を撮影することが好ましい。最低でも、ＡＴＰの存在下及び非存在下の両方でロッドの動画を作製する。偏光レンズを回転させながらロッドの動画を撮ることが有用である。これによって、強度の振動の深度を決定し、そのロッドが回転しているかどうかを予測する。この制御はＦ１依存性の回転を検出する際の信頼度を増大させ、追加の測定を行わずにこの回転を確認することができる。
【０１０７】
ソフトウェア：
同じ目的を達成するために開発された２つの異なるソフトウェアプラットフォームはＦ１の有無によるロッドの回転である。回収されたデータは常に、時間の関数としての強度である。
【０１０８】
第１の方法はハイスピードカメラによるデータの傾向を分析することを包含する。
【０１０９】
ソフトウェアによってデータ、好ましくは３つの実験によるデータを読み取る：ＡＴＰを用いない実験、偏光子を回転させ、ＡＴＰを用いない実験、及びＡＴＰを用いる実験。回転中に予測されるダイナミックレンジを偏光子対照から計算し、それを用いて、検査する分子が実際に金ロッドであることを確認することができる。それからダイナミックレンジを、ＡＴＰを用いた測定値及びＡＴＰを用いない測定値による標準偏差と比較する。ＡＴＰを用いた動画がＡＴＰを用いない動画と異なり、計算された全ダイナミックレンジにわたり変動する場合、その分子は回転している。このソフトウェアプログラムは、所与の視野における全てのロッドでこれを行うことができる。このソフトウェアは回転を決定する好ましい方法であるが、ソフトウェアを用いずに（by hand）情報を収集し、それを解釈して、最終的な決定を下すことが可能である。いずれの方法でも判断基準は同じである。このソフトウェアは当業者によって標準的な技法を用いて実施することができる。このソフトウェアは、その視野で見られる全てのロッドについて回転が起こっているか否かという疑問に答える特別なものである。
【０１１０】
光子計測システム用に開発されたこのソフトウェアによって、期間、頻度、遷移速度、デューティサイクル、オーバーシュート、アンダーシュート、滞留時間、フーリエ変換、及びパワースペクトルを含む、シグナル処理に共通する多くの統計的尺度が計算される。要求される統計値はパワースペクトルのみであるが、フーリエ変換を計算し、パワースペクトルを得るのが一般的である。パワースペクトルから、ブラウン運動とは異なる回転が発生するかどうかを決定することができる。運動の更なる分析から他の統計値を得ることが有用であるが、それらはＦ１依存性の回転が発生するかどうかを決定するのには必要ではない。このソフトウェアは当業者によって標準的な技法を用いて実施することができる。
【０１１１】
実施例３
本発明の幾つかの実施形態では、ナノ検出デバイスを用いて、タンパク質標的を検出する。一例では、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株から産生されたＳｔｘ２志賀毒素をタンパク質標的として使用する。志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）株は、Ａ，Ｂ５のサブユニット組成を有するＳｔｘ１志賀毒素及びＳｔｘ２志賀毒素として知られる細胞毒素を産生する。Ｓｔｘ２毒素を検出するために、抗Ｓｔｘ２Ａモノクローナル抗体及び抗Ｓｔｘ２Ｂモノクローナル抗体を、ナノデバイスにおいてそれぞれ検出抗体及び捕捉抗体として使用する。タンパク質の検出のために、ビオチン化プロテインＧを、スライド上のＦ１モーターに付着させたアビジンに結合させる。プロテインＧが抗Ｓｔｘ２Ｂ（「捕捉」）抗体に結合するとともに、その抗体をスライドの表面上に固定化する。金ナノロッドを「検出」抗体、すなわち抗Ｓｔｘ２Ａが結合する非ビオチン化プロテインＧでコーティングする。検出抗体及び捕捉抗体は標的タンパク質（Ｓｔｘ２毒素）の異なるドメインに特異的である。このナノデバイスは、３０個の連続視野で観察されるナノロッドの数を決定することで、大腸菌の非毒素産生株（ＭＧ１６５５）（図３Ｂ及び図３Ｄ）に対して（as compared to）、大腸菌のＳｔｘ２産生株（ＥＤＬ９３３）（図３Ａ及び図３Ｃ）を含有する細胞上清中でＳｔｘ２毒素を検出することができる。図３Ｃ及び図３Ｄは対照である。図３Ｃでは捕捉抗体が取り除かれており、図３ＤではＳｔｘ２毒素が取り除かれていた。
【０１１２】
このナノデバイスは、図４に示されるように３０個の連続視野で観察されたナノロッドの数によって測定される、毒素産生株（ＥＤＬ９３３）又は非毒素産生株（ＭＧ１６５５）を含有する唾液サンプル中のＳｔｘ２毒素タンパク質を精製毒素と比較して検出することができる。
【０１１３】
図５は、１ｍｌ当たりの毒素産生株の細胞形成単位（すなわち細菌細胞の数）として提示される、粗細胞上清中でのＳｔｘ２タンパク質毒素の検出に対する検出限界を示す。１０個の連続視野での回転するナノロッドの数（赤色のバー）又は３０個の連続視野での回転するナノロッドの数（緑色のバーに対して、１０個の連続視野でのナノデバイス集合（青色のバー）によって検出を測定した。１０８ｃｆｕ／ｍｌの検出限界が、１０個の連続視野で非特異的に結合したナノロッドに対する集合したナノデバイスの数を計測することにより得られた。この検出限界は、同数の視野で回転するナノロッドの数を計測することによって１０００倍に改善し、３０個の連続視野で回転を測定することによって１０３ｃｆｕ／ｍｌの限界まで１０００００倍に改善した。精製Ｓｔｘ２標的タンパク質を用いるシステムの回転に基づく検出限界を図６に示す。このデータはサンプル中に存在する標的分子数（図６Ａ）又はサンプル中の標的濃度（図６Ｂ）の関数として表される。２μｌのサンプル体積を用い、僅か１０個の視野を計測することで、１０００個と少ない標的分子を１０ｆｇ×ｍｌ−１溶液中で検出することができる。
【０１１４】
実施例４
本発明の幾つかの実施形態では、ナノ検出デバイスを用いて、サンプル中で２つ以上の標的を検出する。幾つかの実施形態では、複数の標的、例えばタンパク質標的及びＤＮＡ標的を単一サンプルで検出することができる。異なる標的分子に対応させるために、異なる色（例えば緑色、赤色又は黄色）のナノロッドを用いることによって、これを行うことができる。図７は視野のデジタル写真において赤色、緑色、青色及び黄色のナノロッドを同定し、その数を定量するために利用されるアルゴリズムに用いられる基準の概要を示す。これらは、所与の色のナノロッドで予測される値を用いて、所与の範囲にある共通の色範囲内で隣接ピクセルの真円度及び直径を定量するのに良好な指標として、赤色、緑色及び青色の値の所与の範囲内にある隣接ピクセルの数を含む。十分に円形であり、それらの直径に対応する共通の範囲の赤色、緑色、青色（ＲＧＢ）値を有する連続ピクセル群のみが特定の色のナノロッドであるとみなされ、このようにしてナノスケールの細粉からの光は除外される。図８は単一ウェルにおけるＳｔｘ２毒素タンパク質（赤色のナノロッド）及びｓｔｘ２遺伝子ＤＮＡ配列（緑色のナノロッド）の多重化検出のためのナノデバイスの構成要素を示す。各々のウェルでのスライド表面は２つの方法の内の１つで修飾されたＦ１を含有していた。Ｆ１分子の一方のフィールドはＤＮＡ検出のために露出したアビジンを含有しており、Ｆ１の第２の多層フィールドはＳｔｘ２タンパク質に対する露出した捕捉抗体（抗ｓｔｘ２Ｂ抗体）を含有していた。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７からの上清のサンプルをウェル内でインキュベートし、その後ナノロッドを含有する溶液を添加した。赤色のナノロッドをプロテインＧ及び抗ｓｔｘ２Ａ抗体で官能基化し、緑色のナノロッドをプロテインＧ及び抗ＦＩＴＣモノクローナル検出抗体で官能基化した。ｓｔｘ２遺伝子標的が存在していた場合、その標的をナノデバイス集合のために３’ビオチン化、５’ＦＩＴＣ標識ＤＮＡに変換した。図９は３回の反復試験（replications）の平均としてＳｔｘ２毒素及びｓｔｘ１遺伝子に対するタンパク質及びＤＮＡの同時多重検出の結果を示す。このデータは、特定のタンパク質標的及びＤＮＡ標的を検出することができ、同じウェルで同時にプローブした場合、互いに区別することができることを示している。
【０１１５】
実施例５
本発明の幾つかの実施形態では、ナノ検出デバイスを、アクチュエータとして転写活性化タンパク質を含む代謝産物の検出に使用する。一実施形態は、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の単一分子を検出することができるデバイスである。ｃＡＭＰは、その合成がアデニリルシクラーゼ刺激性Ｇタンパク質共役型受容体及びアデニリルシクラーゼ阻害性Ｇタンパク質共役型受容体の活性化及び阻害を介して広範なシグナル伝達分子によって調節されることから二次メッセンジャーとして知られている。ｃＡＭＰに結合し、活性型立体配座を形成する細菌タンパク質であるカタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）をナノデバイスに使用する。ｃＡＭＰに結合したＣＡＰは、ｌａｃオペロンの正の調節に関与するＤＮＡに結合する。
【０１１６】
この細菌性のカタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）、好ましくは大腸菌のＣＡＰは、アビジンの結合を介したＦ１−ＡＴＰアーゼモーターとの集合を可能にする場所に切断型ｈｉｓタグ（精製目的で）及びシステイン（ビオチンマレイミドによるビオチン化のために）を含有するように修飾される。システインを、例えばこれらに限定されないが、大腸菌ＣＡＰのＮ末端又は残基−１０９に付加させることができる。ＣＡＰの活性型立体配座との結合を可能にする配列を含有するＤＮＡ分子を、アビジンでコーティングした金ナノロッドとの付着のためにビオチン化する。
【０１１７】
ナノデバイスは、図１０に示されるようにＦ１分子モーターと、変異ＣＡＰと、ＤＮＡ受容体配列で官能基化された金ナノロッドとを含む。ナノデバイスの集合を活性化した標的ｃＡＭＰの検出は、ナノロッドから散乱した光の暗視野顕微鏡検査によって達成される。
【０１１８】
ｃＡＭＰとＣＡＰとの結合により、立体配座変化を誘導することができ、それによってＤＮＡ受容体配列に対して高親和性の結合部位が生じる。顕微鏡スライドは、ビオチン化ＣＡＰがビオチン−アビジン連結を介して固定化される結合型のビオチン化Ｆ１のアレイを含有するように調製する。標的ｃＡＭＰ分子と、スライド上のＦ１分子モーターの回転アーム上に固定化されたＣＡＰとの高親和性の結合（図１０Ａ）がタンパク質を活性化し、それによってその受容体ＤＮＡ配列に対して高親和性の結合部位が生じる（図１０Ｂ）。次いでナノデバイスの集合を、活性型のＣＡＰ−ｃＡＭＰ複合体に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ分子のコーティングで官能基化された金ナノロッドを添加することによって完了させる（図１０Ｃ）。ナノデバイスの集合を活性化した標的ｃＡＭＰの検出は、本明細書に記載のようなナノロッドから散乱した光の暗視野顕微鏡検査によって達成される。
【０１１９】
実施例６
本発明の幾つかの実施形態では、転写抑制タンパク質を用いて、代謝産物の検出が達成される。一実施形態では、ＮＡＤＨの単一分子を検出するナノスケール検出デバイスを、ＮＡＤＨ抑制タンパク質（ＮＲＰ）を用いて作製する。
【０１２０】
還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）は、細胞エネルギー通貨の主要な形態である。ミトコンドリアは酸化的リン酸化中にＮＡＤＨを酸化し、ＡＴＰを作り出す。細胞ＮＡＤＨのレベルは細胞のエネルギー貯蔵量についての見解を与えることができる。ＮＲＰは十分に特性化された転写抑制タンパク質である。
【０１２１】
ＮＲＰは、（ニッケルビーズを用いて精製することができる形態を提供するために）ＮＲＰを含有するプラスミドから切断型のｈｉｓタグを用いて発現される。ＮＲＰ配列は、ＮＲＰ機能を妨げないが、ビオチンマレイミドを介してビオチン化することができるシステインを含むように変異させてもよい。ＮＰＲはアビジンを介してＦ１分子モーターの回転アーム上に固定化される。アビジンで官能基化されたナノロッドをＮＲＰ結合部位に特異的なビオチン化ＤＮＡ配列でコーティングする。
【０１２２】
精製中に、ＮＡＤＨが結合したＮＲＰが精製されることから、このジヌクレオチドを酸性硫酸アンモニウム沈殿によって除去する。次いでＮＡＤ＋の存在下での硫酸アンモニウムの除去によって、ＮＲＰを結合型ＮＡＤ＋と二量化させる。ＮＡＤＨを検出するために、結合型ＮＡＤ＋を含有するビオチン化ＮＲＰを顕微鏡スライド上に固定化されているアビジン化Ｆ１−ＡＴＰアーゼに付加させ（図１２Ａ及び図１２Ｂ）、集合をＮＲＰに特異的なＤＮＡで官能基化された金ナノロッドを添加することで完了させる（図１２Ｃ）。標的の結合によってＤＮＡの解離を誘導する立体配座変化が引き起こされるため、ＮＡＤＨの検出は顕微鏡スライドに結合したナノロッドの数の減少によって行われる。ＮＡＤ＋又はＮＡＤＨのいずれかが常にＮＲＰに結合しているため、この検出システムでは、この２つの比率を決定することが可能である。
【０１２３】
ＮＲＰをＮＡＤ＋検出システムに使用することもできる。これらの条件下では、ＤＮＡで官能基化されたナノロッドが結合しないように、ＮＡＤＨを用いてスライドを予め準備しておく。いかなる理論にも束縛されるものではないが、ＮＲＰは転写活性化タンパク質の様に働き、ＮＡＤ＋を添加した際にＤＮＡでコーティングしたナノロッドとの集合を可能にすることが予測される。
【０１２４】
実施例７
本発明の幾つかの実施形態は、転写調節タンパク質を含有する代謝産物の検出のための規則的なナノデバイスアレイを提供する。抑制タンパク質依存性のナノデバイスの幾つかの実施形態では、ＮＡＤＨは図１３に示されるようにナノデバイスの脱集合によって検出される。そのため、放出されるナノロッドの数は、格子の連続性を絶つ光のスポットの消失としてより容易に特定される。他の実施形態では、規則的なアレイを、ｃＡＭＰ検出に活性化因子依存性のナノデバイスシステムを用いる検出に使用することができる。
【０１２５】
規則的なアレイは顕微鏡スライドの表面上に露出したＮｉ−ＮＴＡ島（それらは各々、単一のＦ１分子に結合することが可能である）のアレイによって作製される。作製プロセスは、例えば図１４に示される電子ビームリソグラフィーであり得る。初めに、Ｎｉ−ＮＴＡでコーティングした清浄な顕微鏡スライドを１００ｍＭ  ＥＤＴＡでフラッシングし、ニッケルを除去するとともに、十分に洗浄する。シアノ−ＮＴＡはガラス表面上に組み込まれたままである。次いで表面をポリ−（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）レジストの単層（約４０ｎｍ）でスピンコーティングする。その後、ＰＭＭＳレジスト層を予め設計したパターンを用いてＥビームに曝す。続くＯ２プラズマ処理の後、硫酸ニッケルを添加し、それをＥビームによって露出したＮＴＡ島に結合させる。Ｏ２プラズマ処理工程によって、表面を清浄にし、ニッケルの強い付着を促進させる。最後に、表面をアセトンで洗浄し、ＰＭＭＡを取り除く。このようにして、スライドの表面にｈｉｓでタグ付けされたＦ１が結合するニッケル島の規則的なアレイを含有させる。
【０１２６】
ニッケル島間の間隔は、１つの金ナノロッドが隣接した島上で２つのＦ１分子の間に架橋するのを防ぐのに十分に、例えば約３００ｎｍ離れている。またこの間隔は任意の１つのナノロッドの回転が隣接する島上でのナノロッドの回転に影響を受けないように十分な距離を与えるものとする。
【０１２７】
規則的なアレイは、好ましくはＮｉ−ＮＴＡの島ごとに１つのＦ１分子を有するのが好ましい。ニッケル島は少なくとも１つのＦ１分子が結合するベースを与えるのに十分な直径を有し得る。
【図１】
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【図６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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