(57)【要約】  Ｈｓｐ９０阻害剤並びにその製造方法及び応用を提供する。当該Ｈｓｐ９０阻害剤は２−（４−（３−アセチルカルニチンアシルオキシ）シクロヘキシルアミノ）−４−（１−（３，６，６−トリメチル−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロインダゾール））ベンズアミドである。当該Ｈｓｐ９０阻害剤は水溶性がよく、生物学的利用能が高く、白血病、子宮頚癌、乳癌、ヒト喉頭上皮癌、又は悪性黒色腫のようながん細胞の増殖を効果的に抑制し得るとともに、単純ヘルペスウイルスの活性を効果的に抑制し得る。正常細胞に対する最大無毒濃度が大きく、がん細胞のみに対して特異性の抑制作用を有する。【選択図】図２
2013538861.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）に示される構造式を有する２−（４−（３−アセチルカルニチンアシルオキシ）シクロヘキシルアミノ）−４−（１−（３，６，６−トリメチル−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロインダゾール））ベンズアミドであることを特徴とするＨｓｐ９０阻害剤。
【化１】
2013538861.tif 000010
【請求項２】
請求項１に記載のＨｓｐ９０阻害剤の製造方法であって、
式（ＩＩＩ）に示される化合物と式（ＩＩ）に示される化合物とを２：１のモル比で混合し、２０〜３０℃において３〜５時間攪拌して反応させる；その後、クエンチング反応させ、生成物を抽出し、抽出後の有機層を乾燥させ、減圧して溶媒を除去し、式（Ｉ）に示されるＨｓｐ９０阻害剤を得るステップを含むことを特徴とする方法。
【化２】
2013538861.tif 000011
【請求項３】
抗腫瘍又は抗ウイルスの薬物の製造に用いられることを特徴とする請求項１に記載のＨｓｐ９０阻害剤の応用。
【請求項４】
前記腫瘍が、白血病、子宮頚癌、乳癌、ヒト喉頭上皮癌、又は悪性黒色腫であることを特徴とする請求項３に記載のＨｓｐ９０阻害剤の応用。
【請求項５】
前記ウイルスが単純ヘルペスウイルスであることを特徴とする請求項３に記載のＨｓｐ９０阻害剤の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬分野に属し、具体的には、新規のＨｓｐ９０阻害剤並びにその製造方法及び応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
熱ショックタンパク質（Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｈｓｐ）は、ストレス条件で、例えば、熱ショック、グルコース飢餓、又は病原性微生物感染時に、細胞で生産されるタンパク質であり、正常状態の細胞においても広範に存在している。Ｈｓｐは、生物の進化の過程において高度な保在性を示すタンパク質ファミリーであり、分子シャペロンとして、様々な刺激（冷、熱、低酸素、重金属イオン、及びウイルス感染などを含む）に対する細胞保護作用に関与している。Ｈｓｐは主に、細胞内の新生ペプチド鎖のフォールディング及び輸送、並びに変性タンパク質の識別に関与し、細胞の成長分化や生存を調節する機能を発揮する。Ｈｓｐは、ストレス保護、シグナル伝達、免疫応答、発生分化などの重要な生理的過程に関与するだけではなく、例えば、感染、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化及び腫瘍などの形成にも関連する。
【０００３】
分子量の大きさに基づき、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、及び低分子量ＨＳＰという五大ファミリーに分類することができる。Ｈｓｐ９０は、細胞内で最も活躍する分子シャペロンの一つであり、細胞のシグナル伝達、ホルモン応答、及び転写調節の過程に広範に関与し、その主な機能は、細胞タンパク質の安定を維持し、ストレスに対する細胞の耐性を向上させ、抗酸化作用を強め、細胞の正常な生理的機能を維持することである。Ｈｓｐ９０そのものは、標的蛋白質の組成に関与しない。Ｈｓｐ９０はサイドゾルタンパク質であり、哺乳動物細胞では、Ｈｓｐ９０ファミリーは、サイドゾルシャペロンであるＨｓｐ９０−ａ（誘導型／主要型）及びＨｓｐ９０−ｂ（恒常型／副次型）、アナログ小胞体シャペロンであるＧＲＰ９４（グルコース関連タンパク質９４）、並びにミトコンドリアホモログであるＨｓｐ７５／ＴＲＡＰ１（腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質１）の３種のメンバーからなる。ストレス反応が起こったとき、Ｈｓｐ９０は、環境刺激によって自己立体配座が変わったタンパク質と相互作用しタンパク質の適度なフォールディングを保証してその非特異性凝集を防止することにより、細胞の正常活性を維持することができる。タンパク質は、膜運送の前にアンフォールディングし、膜を透過した後に改めてフォールディングして成熟型を形成しなければならない。Ｈｓｐ９０は、分子シャペロンとしてアンフォルダーゼ機能を有し、タンパク質のアンフォールディング後の局所的に露出した疎水面を識別してそれに結合し、膜を透過して輸送するまで相互作用による凝集を防止することができる。腫瘍細胞に存在する異常活性化及び突然変異増殖シグナル分子はＨｓｐ９０と結合してその構造を安定化する必要があり、これにより、腫瘍細胞の成長優位特性が維持される。Ｈｓｐ９０は、腫瘍細胞では主に活性化状態（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｔａｔｅ）にあり、正常細胞では主に潜伏状態（ｌａｔｅｎｔ  ｓｔａｔｅ）にある。活性化状態にある場合、Ｈｓｐ９０は、受容体タンパク質や、補助分子シャペロンであるＨｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、Ｈｏｐ（Ｈｓｐ７０  ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐ２３、ＣＤＣ３７等と複合体を形成し、受容体タンパク質を、成熟機能を有する立体配座に維持し、プロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）に分解されないように保護する。
【０００４】
正常状態ではＨｓｐ９０は発現量が低く、細胞周期によって調節され、主にサイドゾルに存在する。ストレス下では、Ｈｓｐ９０は細胞核に迅速に進入し、転写及び翻訳の両方において合成の向上を誘導し、細胞の抗ストレス能力を向上させることができる。しかしながら、腫瘍細胞では、熱刺激、突然変異、又は異常タンパク質がなくとも、Ｈｓｐ９０は持続的な高レベル誘導発現を呈し、合成を刺激することができる。これは、腫瘍細胞がＨｓｐ９０阻害剤に特に敏感である原因の一つでもある。
【０００５】
１９９９年、クラインは最初に腫瘍マルチ攻撃（Ｍｕｌｔｉ−ｅｎｚｙｍｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ）理論を提唱した。この理論は、あるターゲットを用いて腫瘍シグナル経路ネットワークに対するマルチブロックを実現することにより、腫瘍が頼るシグナル経路ネットワーク全体を徹底的に破壊することを中心としている。従って、有効なターゲット点を見つけることが腫瘍治療に応用するための鍵となる。分子シャペロンに基づく阻害剤は、キナーゼに直接に作用するものではなく、キナーゼ活性立体配座を維持する関連分子シャペロンを抑制し、ユビキチン／プロテアソームルートによって、大量のキナーゼをプロテアソームに分解させることにより、キナーゼを媒介とするシグナル伝達経路を失活させて上流からのシグナルに対して受信不能にするものである。従来のキナーゼ直接阻害剤に比べて、Ｈｓｐ９０の単一ターゲット点の抑制は、マルチルートにおける抗腫瘍効果を同時に生じさせる特徴を有し、単一薬剤使用が可能となるとともに、薬物耐性の発生を減少し得る。故に、Ｈｓｐ９０は、人心を奮い立たせる腫瘍治療分子ターゲットになっている。
【０００６】
また、Ｈｓｐ９０はウイルス感染にも密接な関係を有する。ウイルスの宿主への侵入後に誘導産生されたＨＳＰが、ウイルスタンパク質と結合して複合体を形成することは既に実証されているが、この過程はウイルス複製に関係する可能性がある。様々な種類のウイルス感染により誘導され宿主細胞で産生されたＨＳＰは、ウイルス複製の様々な段階でウイルスタンパク質と結合してＨＳＰ−ウイルスペプチド複合体を形成し、ウイルスタンパク質の正確なフォールディング、膜透過輸送、ウイルス構築、成熟などに協力するため、ウイルスの複製に有利である。
【０００７】
ある報告では、単純ヘルペスウイルスが７０Ｋｄａの熱ショックタンパク質Ｈｓｐ７０を誘導することができ、この誘導が、早期ウイルスタンパク質の合成を必要としたものの、ウイルスＤＮＡの複製を必要としなかったことが示されている。この報告では、Ｈｓｐ７０はノンストレスのげっ歯類の細胞では発現量が少ないはずだが、ＨＳＶの感染はその発現を誘導できたこと、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の感染から４時間内に感染細胞内でＨｓｐ７０が一定程度に増加し、その合成及び蓄積の増加が見られたこと、ＵＶ輻射後のＨＳＶ−１がＨｓｐ７０を誘導する活性を喪失したこと、ウイルスＤＮＡの抑制がＨｓｐ７０の誘導に影響しなかった一方、感染後２時間以内のタンパク質合成がＨｓｐ７０を誘導するのに必須であったことが示されている。
【０００８】
単純ヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルス科アルファヘルペスウイルス亜科に属し、最も早く発見されたヒトヘルペスウイルスであり、Ｉ型（ＨＳＶ−１）とＩＩ型（ＨＳＶ−２）との２つの血清型を有する。その感染は非常に普遍的であり、主に皮膚、粘膜、及び神経組織を侵し、人間や多くの動物で感染を引き起こす。口、唇、目の皮膚及び粘膜、並びに中枢神経システム、偶には生殖器がＨＳＶ−１に感染する。ＨＳＶ−２は生殖器感染及び新生児感染に多く関連する。
【０００９】
現在、有効なウイルスワクチンがないため、薬物治療がＨＳＶ感染を治療する主なルートになっている。臨床上で常用される治療薬物は主にアシクロビルなどのヌクレオチド類であり、その作用ターゲット点がウイルスＤＮＡポリメラーゼであり、ウイルスの複製に影響を与える。現在、アシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビル、ファムシクロビル、及びガンシクロビルのような、アシクロビル（Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ，ＡＣＶ）を代表とするアシクロビル類似物が広範に使用されている。また、ピロリン酸ナトリウムを代表とする非ヌクレオチド類似物もある。しかしながら、ヨードデオキシウリジン、トリフルオロチミジン、ビダラビン、及びガンシクロビルなどのような一部のヌクレオチド類似物は変異原性を有し、安全性が低い。また、２０世紀８０年代にはＡＣＶ耐薬株が出現し、骨髄移植患者及びエイズ患者には耐薬がより見られやすい。従って、新たな作用メカニズムを有する抗ウイルス薬物は期待されている。Ｈｓｐ９０はウイルス感染において重要な役割を果たすため、潜在の抗ウイルスターゲットにもなっている。
【００１０】
最初のＨｓｐ９０阻害剤薬物であるゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ，ＧＡ）は、抗真菌薬として選別して発見されたベンゾキノン系薬物である。ＧＡは特異的なＨｓｐ９０阻害剤であり、１つのベンゾキノン部分と１つの平面性大環状アンサ橋とが接続する主な構造を有する。研究によると、その抗腫瘍能力はプロテアソームによる発腫瘍性プロテインキナーゼの分解に依存するが、そのオフターゲット効果のせいか、ＧＡの腎臓や肝臓への毒性は大きい。アメリカ国立がん研究所（ＮＣＩ）は毒性の低い誘導体を選別したところ、ＧＡの１側鎖が置換された１７−アリルアミノゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）が発見された。１７−ＡＡＧはＧＡのすべての特徴を有しながら、毒性がより低く、Ｈｓｐ９０阻害作用及び抗腫瘍活性を保持した。しかしながら、１７−ＡＡＧは水溶性が悪く、経口使用することができない。その後、引き続いて、ＧＡの新たな誘導体である１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−ジメトキシゲルダナマイシン（１７−ＤＭＡＧ）が開発された。この化合物は良好な水溶性及び経口生物学的利用能を示し、固形癌及び悪性血液疾患に対してすでにＩＩ期／ＩＩＩ期臨床試験の段階に入っている。
【００１１】
ラディシコール（Ｒａｄｉｃｉｃｏｌ）はモノスポリウム・ボノルデン（Ｂｏｎｏｒｄｅｎ）から分離されたマクロライド抗生物質であり、ＧＡに類似した悪性表現型を逆転する潜在力を有し、Ｈｓｐ９０受容体タンパク質分解において役割を果たす。ラディシコールは、ｖ−ｓｒｃ及びｖ−Ｈａ−Ｒａｓをトランスフェクションした繊維細胞の悪化程度を逆転し得る。ラディシコールはＨｓｐ９０の末端領域に結合し、生体外では良好な抗腫瘍活性を有するが、生体内では抗腫瘍能力を有しない。これは主に、その化学的構造が不安定であり、体内に入ると分解されやすいからである。近年の研究によると、ノボビオシン（Ｎｏｖｏｂｉｏｃｉｎ）は細胞内のｐ１８５ｅｒｂ２、ｐ６０ｖ−ｓｒｃ、Ｒａｆ−１、及び突然変異型ｐ５３のレベルを顕著に減少することができる。また、ノボビオシンがＨｓｐ９０のＣ端阻害剤であることが点突然変異実験によって証明されている。ネッカーズ等の研究によると、クーママイシン類の３種の化合物（ノボビオシン、クロロノボビオシン、クーママイシンＡ１）は、いずれも細胞内のＰ１８５ｅｒｂ２、ｐ６０ｖ−ｓｒｃ、低酸素誘導因子１、及び突然変異型Ｐ５３のレベルを顕著に減少する。ノボビオシンは、すでに臨床使用されているが、毒性の小さいクマリン類抗生物質であり、良好な薬物動態学特徴を有する。ノボビオシンは、Ｈｓｐ９０のＣ端阻害剤であり、多くのがん細胞に対する抑制作用を有するとともに、抗がん剤とともに使用されて抗がん剤の薬物耐性を逆転させることができる。しかしながら、ノボビオシンは、Ｈｓｐ９０の阻害剤としての濃度が７００μＭと高い。これは、その体内抗腫瘍薬物としての更なる開発を制限するものであった。
【００１２】
上記Ｈｓｐ９０阻害剤のほか、近年、いくつかのＨｓｐ９０阻害剤が引き続き合成され選別された。プリン骨格を有するＨｓｐ９０阻害剤（ｐｕｒｉｎｅ−ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）であるＰＵ３は、Ｘ線結晶回折の結果に基づいて設計された小分子化合物である。ＰＵ３は、作用サイトがＧＡに一致してＨｓｐ９０のＮ端ＡＴＰ／ＡＤＰ結合サイトに作用し、Ｈｓｐ９０受容体タンパク質分解抑制及び抗腫瘍能力もＧＡに類似する。ＰＵ３を修飾し改善して形成した誘導体は、Ｈｓｐ９０Ｎ末端に結合し、ＰＵ３の３０倍の親和力を有するが、ｌ７−ＡＡＧほどの強い活性を有しない。しかしながら、この誘導体は特異的な細胞間累積を示さない。このような特性は、より疎水的なＧＡ誘導体ではより典型的である。ＩＰＩ−５０４（１７−ＡＡＧヒドロキノン）は主に多発性骨髄腫の治療に向けるものであり、現在すでにＩ期臨床試験に入っている。この化合物は高度の水溶性を有し、体内において１７−ＡＡＧの活性形式に変わることができ、その抗がんメカニズムはいまだに研究中である。ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２は、イソオキサゾール誘導体であり、小分子Ｈｓｐ９０阻害剤に属し、ＥＲ及びＥＲＢＢ２陽性の乳がん患者に潜在的な治療作用を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従来技術の欠点及び不足を克服するために、本発明の第一の目的は新規のＨｓｐ９０阻害剤を提供することにある。
【００１４】
本発明の更なる目的は、上記Ｈｓｐ９０阻害剤の製造方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の更なる目的は、上記Ｈｓｐ９０阻害剤の応用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の目的は、下記技術案により実現されている。
【００１７】
Ｈｓｐ９０阻害剤は、２−（４−（３−アセチルカルニチンアシルオキシ）シクロヘキシルアミノ）−４−（１−（３，６，６−トリメチル−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロインダゾール））ベンズアミド（２−ａｃｅｔｏｘｙ−４−（４−（２−ｃａｒｂａｍｏｙｌ−５−（３，６，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−４−ｏｘｏ−４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−１Ｈ−ｉｎｄａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−４−ｏｘｏｂｕｔａｎ−１−ａｍｉｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）であり、コードはＸｂｊ−Ｂ１６−１であり、その構造式は下記式（Ｉ）に示されるとおりである。
【００１８】
【化１】
2013538861.tif 000003
【００１９】
上記Ｈｓｐ９０阻害剤の製造方法は以下のステップを含む：
式（ＩＩＩ）に示される化合物と式（ＩＩ）に示される化合物とを２：１のモル比で混合し、２０〜３０℃において３〜５時間攪拌して反応させる；その後、クエンチング反応させ、生成物を抽出し、抽出後の有機層を乾燥させ、減圧して溶媒を除去し、式（Ｉ）に示されるＨｓｐ９０阻害剤を得る。
【００２０】
【化２】
2013538861.tif 000004
【００２１】
上記Ｈｓｐ９０阻害剤は、抗腫瘍又は抗ウイルスの薬物の製造に用いることができる。
【００２２】
前記腫瘍は、白血病、子宮頚癌、乳癌、ヒト喉頭上皮癌、又は悪性黒色腫である。
【００２３】
前記ウイルスは単純ヘルペスウイルスである。
【００２４】
Ｘｂｊ−Ｂ１６−１はベンズアミドを基本骨格とし、側鎖に異なる置換基が配されている。このような新規構造は、これまで開示されきたいずれのＨｓｐ９０阻害剤とも異なる。Ｘｂｊ−Ｂ１６−１がＨｓｐ９０上のＡＴＰサイトに競争的に結合することができ、タンパク質とプリンとの結合を効果的に抑制することができることは、Ｘ回折によって実証されている。実験によると、Ｘｂｊ−Ｂ１６−１は体外において、多くの実体腫瘍及び白血病細胞の増殖を抑制してそのアポトーシスを誘導することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は従来技術に対して下記の利点及び有益な効果を有する：
（１）Ｘｂｊ−Ｂ１６−１は白血病、子宮頚癌、乳癌、ヒト喉頭上皮癌、及び悪性黒色腫などのがん細胞の増殖を効果的に抑制し得るとともに、単純ヘルペスウイルスの活性を効果的に抑制し得る。
（２）Ｘｂｊ−Ｂ１６−１は正常細胞に対する最大無毒濃度が大きく、癌細胞のみに対して特異的な抑制作用を有する。
（３）Ｘｂｊ−Ｂ１６−１は水溶性がよく、生物学的利用能が高い。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】正常細胞（Ｖｅｒｏ）に対する薬物の毒性の測定結果図である。左図はＸｂｊ−Ｂ１６−１であり、右図は抗腫瘍陽性薬物１７−ＡＡＧである。
【図２】ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２による細胞病変図（１００×）である。Ａは正常細胞であり、ＢはＨＳＶ−１による細胞病変であり、ＣはＨＳＶ−２による細胞病変である。
【図３】Ｖｅｒｏ細胞に対する薬物の毒性及び抗ＨＳＶ活性の測定結果図である。Ａ図は細胞に対する薬物の毒性測定結果であり、ａ図は薬物抗ウイルスのプラーク統計結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、実施例及び図面を合わせて本発明をさらに詳しく説明する。但し、本発明の実施形態はこれに限られるものではない。
【００２８】
実施例１  Ｈｓｐ９０阻害剤Ｘｂｊ−Ｂ１６−１の製造
【００２９】
【化３】
2013538861.tif 000005
【００３０】
（１）式ＩＩの化合物の合成：式ＩＩに示される化合物の合成については、中国特許第２００６１００８７４９５．１号明細書を参照のこと；
（２）式ＩＩＩの化合物の合成：式ＩＩＩに示される化合物の合成については、文献の《有機化学》，２００６年，２６号，９４６−９４９頁及び中国特許出願第２００８１００１４２１２．Ｘ号明細書を参照のこと；
（３）Ｈｓｐ９０阻害剤の合成：式ＩＩＩに示される化合物（０．１３ｇ，０．５ｍｍｏｌ）を２５ｍＬナスフラスコに置き、式ＩＩに示される化合物（０．１０ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン５ｍＬを加え、２５℃で４時間攪拌して反応させた。飽和炭酸水素ナトリウムと食塩水との混合溶液１０ｍＬを加えてクエンチング反応させ、生成物をジクロロメタン２００ｍＬで抽出し、有機層を無水ＭｇＳＯ４によって乾燥させた。減圧して溶媒を除去し、固体生成物１（５０ｍｇ，２５％）を得た。
【００３１】
生成物の構造特定データを以下に示す。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：１．１１（ｓ，６Ｈ），１．３２（ｍ，２Ｈ），１．４６（ｍ，２Ｈ），２．０９（ｍ，４Ｈ），２．４１（ｓ，２Ｈ），２．５５（ｓ，３Ｈ），２．８２（ｓ，２Ｈ），３．４８（ｓ，９Ｈ），４．０７（ｍ，１Ｈ），４．３９（ｍ，１Ｈ），４．７９（ｍ，１Ｈ），５．６７（ｍ，１Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｓ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５９６．２（Ｍ）＋．
従って、得られた生成物は式Ｉに示される通りである。
【００３２】
実施例２  ５種の腫瘍細胞株に対するＸｂｊ−Ｂ１６−１の半数致死量（ＬＤ５０）
実施例において、陽性対照は１７−ＡＡＧ（アメリカＡｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入可能）であり、用いられる細胞系Ｋ５６２、Ｈｅｌａ、Ａ３７５、Ｍｃｆ−７等はいずれもアメリカＡＴＣＣ社から購入可能である。
（１）Ｘｂｊ−Ｂ１６−１をＨ２Ｏに溶解して２ｍＭの母液を調合し、４℃で貯蔵した。
（２）対数増殖期のヒト子宮頚癌細胞（Ｈｅｌａ）、ヒト悪性黒色腫細胞（Ａ３７５）、ヒト喉頭上皮癌細胞（Ｈｅｐ−２）、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（アメリカＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社から購入可能）にて、細胞濃度が２×１０５個／ｍＬである単細胞浮遊液に調整し、それを９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで接種した。細胞を壁に付くように一晩中培養した後、培養液を除去して、各ウェルには、異なるＸｂｊ−Ｂ１６−１サンプル濃度（それぞれ２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、１μＭ、０．１μＭ、０．０５μＭ）を含む培養基を１００μＬ加えた。それぞれの濃度で４つのサブウェルを設けた。実験には、実験グループ、溶媒対照グループ、及び空白グループを設けた。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２培養箱にて４８時間培養した。対数増殖期のヒト慢性骨髄性細胞白血病細胞（Ｋ５６２）を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（アメリカＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社から購入される）にて、細胞濃度が４×１０５個／ｍＬである単細胞浮遊液に調整した。単細胞浮遊液５０μＬと、異なるＸｂｊ−Ｂ１６−１サンプル濃度（それぞれ４０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、２μＭ、０．２μＭ、０．１μＭ）を有する培養基５０μＬとを各ウェルに加えた。それぞれの濃度で４つのサブウェルを設けた。実験には、実験グループ、溶媒対照グループ、及び空白グループを設けた。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２培養箱にて４８時間培養した。
（３）モスマンが確立したＭＴＴ法を参考に、それぞれのウェルにはＭＴＴ溶液を２０μＬ加え、引き続き４時間培養した後に各ウェルの溶液を軽く吸い取って除去し、さらにそれぞれのウェルにはＤＭＳＯを１００ｍＬ加え、光を避けて振盪器で１５分振盪した。酵素標識カウンターの吸光光度分析（波長５７０ｎｍ，参照波長６３０ｎｍ）によって、吸光度Ａを測定した。薬物の半数毒性濃度（ＩＣ５０）を計算した。成長阻害率は下記式によって計算した：成長阻害率（％）＝（１−実験グループＡ５７０／６３０÷溶媒対照グループＡ５７０／６３０）×１００。改良ケルバー法によって、薬物の細胞に対する半数阻害濃度ＩＣ５０を計算した。改良ケルバー法の計算式：ｌｇＩＣ５０＝Ｘｍ−Ｉ［Ｐ−（３−Ｐｍ−Ｐｎ）／４］。［ただし、Ｘｍ：ｌｇ最大薬量；Ｉ：ｌｇ（最大薬量／しきい薬量）；Ｐ：陽性反応率の合計；Ｐｍ：最大陽性反応率；Ｐｎ：最小陽性反応率］
【００３３】
細胞株に対する薬物の半数阻害濃度（ＩＣ５０）結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
2013538861.tif 000006
【００３５】
表１の結果から分かる通り、Ｘｂｊ−Ｂ１６−１はヒト子宮頚癌細胞（Ｈｅｌａ）、ヒト悪性黒色腫細胞（Ａ３７５）、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）、ヒト喉頭上皮癌細胞（Ｈｅｐ−２）、及びヒト慢性骨髄性細胞白血病細胞（Ｋ５６２）のいずれに対しても明らかな増殖抑制作用を有するが、増殖抑制効果は陽性薬物の１７−ＡＡＧほど強くない。
【００３６】
実施例３  正常細胞（ミドリザル腎臓細胞Ｖｅｒｏ）に対するＸｂｊ−Ｂ１６−１の体外毒性試験
対数増殖期のＶｅｒｏ細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（アメリカＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社から購入可能）にて、細胞濃度が２×１０５個／ｍＬである単細胞浮遊液に調整し、それを９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで接種した。細胞を一晩中培養した後、培養液を除去して、各ウェルには、それぞれ５０μΜ、２５μΜ、１２．５μΜ、６．２５μΜ、３．１３μΜ、１．５７μΜ、０．６３μΜのＸｂｊ−Ｂ１６−１を１００μＬ加え、引き続きＶｅｒｏ細胞を４８時間培養した後、アメリカＬｏｎｚａ社の試薬キット（Ｖｉａｌｉｇｈｔ  ＨＳ  ｋｉｔ  及び  Ｔｏｘｉｌｉｇｈｔ  ｂｉｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ）を用いてＶｅｒｏ細胞内のＡＴＰレベル、及び培養液の上澄み液中のＡＫ放出量を測定し、４８時間内の薬物のＶｅｒｏ細胞に対する最大無毒濃度を検出した。試験は、陽性薬物１７−ＡＡＧを対照とした（１０μＭから、６つの濃度に倍加希釈する）。結果を図１に示す。
【００３７】
図１の結果に示されるように、正常細胞（ミドリザル腎臓細胞Ｖｅｒｏ）に対するＸｂｊ−Ｂ１６−１の最大無毒濃度は１２．５μＭであり、正常細胞の感受性はがん細胞に比べてかなり低い。陽性薬物１７−ＡＡＧに比べて毒性が小さい（１７−ＡＡＧの無毒濃度は０．６３μＭである）ため、薬物体外毒性が非常に低いことを示している。これから分かる通り、Ｘｂｊ−Ｂ１６−１はがん細胞に対して特異的な抑制作用を有する。
【００３８】
実施例４  ＣＰＥ法によるＸｂｊ−Ｂ１６−１の抗単純ヘルペスウイルス活性の観察
本実施例の正常細胞はＶｅｒｏ細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８１，アメリカＡＴＣＣ社から購入可能）を採用した。単純ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスＩ型Ｆ株（ＨＳＶ−１  Ｆ，ＡＴＣＣ  ＶＲ−７３３）と単純ヘルペスウイルスＩＩ型３３３株（ＨＳＶ−２  ３３３）とを含む。異なる濃度を有するＸｂｊ−Ｂ１６−１（２５μＭから、６つの濃度に倍加希釈する）と陽性薬物ＡＣＶ（１０μＭから、６つの濃度に倍加希釈する）を、それぞれＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２ウイルス希釈液（１００ＴＣＩＤ５０）５０μＬと混合した後に、単層Ｖｅｒｏ細胞上に直接に加え、３７℃、５％ＣＯ２培養箱中において４８時間培養し、光学顕微鏡を用いて細胞病変効果（ＣＰＥ）を観察した。
【００３９】
顕微鏡による観察では、正常細胞は、紡錘形を呈し、細胞膜の限界がはっきりしており、細胞液の透明度がよく、細胞形態が完全であった（図２Ａ参照）。一方、ＨＳＶ−１によるＣＰＥ特徴は、細胞腫れ、円縮、融合、脱落、及び割れであり（図２Ｂ参照）、ＨＳＶ−２により形成される多核巨細胞又は細胞融合はさらに顕著であった（図２Ｃ参照）。
【００４０】
ＣＰＥ統計結果を表２及び表３に示す。化合物Ｘｂｊ−Ｂ１６−１は、一定の抗単純ヘルペスウイルスＩ型及び抗単純ヘルペスウイルス型ＩＩの作用を有し、１２．５μＭの場合にＨＳＶ−１による細胞病変を抑制し得るとともに、ＨＳＶ−２による細胞病変に一定の抑制作用を有するが、抑制効果は陽性薬物ＡＣＶほど強くない。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
【表３】
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【００４３】
実施例５  プラーク減数による（ＰＲＡ）Ｘｂｊ−Ｂ１６−１抗単純ヘルペスウイルスの総合作用の測定
本実施例の正常細胞はＶｅｒｏ細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８１，アメリカＡＴＣＣ社から購入可能）を採用した。単純ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスＩ型Ｆ株（ＨＳＶ−１  Ｆ，ＡＴＣＣ  ＶＲ−７３３）と単純ヘルペスウイルスＩＩ型３３３株（ＨＳＶ−２  ３３３）とを含む。Ｖｅｒｏ細胞を２４ウェルプレート上において単層になるように培養し、培養液を除去し、ウイルス希釈液（ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２）（５０ＰＦＵ／ウェル）と１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６３μＭのＸｂｊ−Ｂ１６−１をそれぞれ１００μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２培養箱で２時間培養した。ウイルス液を吸い取って除去し、０．５％カルボキシメチルセルロース含有細胞維持液（カバー液）を１ｍＬ加えた。それぞれの濃度で３つのサブウェルを設けた。ウイルス対照グループと正常細胞グループを設けた。７２時間観察した後、１０％ホルムアルデヒドで３０分固定し、１％クリスタルバイオレットで３０分染色し、清水ですすぎ、乾燥させた後、ニッタ法を参照してプラークをカウントしてプラーク抑制率を計算した。薬物濃度の対数を横座標とし、プラーク抑制率を縦座標として図を作成した。プラーク抑制率結果に基づいて薬物に対するウイルスの感受性曲線を作成し、薬物の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。プラーク抑制率＝（ウイルス対照グループプラーク数−薬物処理グループプラーク数）／（ウイルス対照グループプラーク数）×１００％。
【００４４】
薬物の毒性及び抗ＨＳＶ活性測定結果を図３に示す。薬物の抗単純ヘルペスウイルス試験結果統計を表４に示す。結果から分かるように、薬物Ｘｂｊ−Ｂ１６−１は一定の抗ＨＳＶ効果を有するが、その効果は陽性薬物ＡＣＶほど強くない。
【００４５】
【表４】
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【００４６】
上記実施例は本発明の好ましい実施形態であるが、本発明の実施形態は上記実施例に制限されるものではない。本発明の趣旨及び原理と背離しない如何なる改変、修飾、代替、組合せ及び簡略化も、等価の置換えであり、本発明の保護範囲内に含まれるべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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