【事件の表示】
　特許第２５７３４６７号「第ＩＸ因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物」の特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結論】
　訂正を認める。
　特許第２５７３４６７号の特許を維持する。
【理由】
１．経緯
　本件特許２５７３４６７号は、昭和５９年３月２日に出願された特願昭５９−３８８８６号（優先権主張、１９８３年３月４日、米国）の一部を新たに分割した出願に係り、平成８年１０月２４日の設定登録後、特許異議申立がなされ、取消理由通知に対して、平成１０年６月９日に訂正請求がなされたものである。
２．訂正請求について、
　本件上記訂正請求に係る訂正事項は、以下のとおりである。
ａ．特許明細書の請求項１中の「カオトロピック試薬」を「リチウム塩」に訂正する。
ｂ．請求項４及び７を削除し、請求項５及び６の項番をそれぞれ４及び５に、また、請求項８の項番を６に繰り上げる。
　そして、ａ．の訂正は、「カオトロピック試薬」を特定の「リチウム塩」に限定するものであり、特許請求の範囲の減縮を目的とするものであるし、「カオトロピック試薬」として「リチウム塩」を使用することは、特許明細書の請求項４および７に記載されていたものであり、願書に添付された明細書に記載された事項の範囲内の訂正であることは明らかである。また、ｂ．の訂正は、特許請求の範囲の請求項を削除するものであり、この訂正も特許請求の範囲の減縮を目的とし、願書に添付された明細書に記載された事項の範囲内の訂正である。
　しかも、これらの訂正は、特許請求の範囲を実質的に、拡張、変更するものでもない。
　さらに、後記することから明らかなように、本件訂正後の特許請求の範囲に記載された事項により特定される発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
　したがって、本件訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項で準用する同法第１２６条第２−４項の規定に適合するので、該訂正を認める。
３．異議申立てについて、
　本件訂正後の発明の要旨は、訂正明細書の記載からみて、それぞれ訂正明細書の請求項１に記載されたとおりの以下のものである。
「［請求項１］（ａ）．第ＩＸ因子タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を結合した粒子上に、前記第ＩＸ因子タンパク質と１種またはそれ以上の他のタンパク質との混合物からなる源物質から前記第ＩＸ因子タンパク質を吸着し、
（ｂ）リチウム塩を含む緩衝水溶液を用いて、前記粒子から第ＩＸ因子タンパク質を欠いた現物質を除去し、さらに
（ｃ）溶離液を用いて前記粒子から吸着した第ＩＸ因子タンパク質を溶離することにより、変性されておらず高い純度で濃縮されたかたちの活性な第ＩＸ因子タンパク質の組成物を回収する、各ステップを具備し、プロテアーゼインヒビターを添加することなく実行される方法により得ることができる、活性で高い純度で生成され濃縮されたかたちの第ＩＸ因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物。」
　一方、本件異議申立人の主張の概要は、本件請求項１及び２の発明は甲第２号証に記載された発明であり、また、本件請求項３〜８に係る発明は甲第１号証および甲第４〜７号証に記載された発明から当業者が容易に発明できたものであるから、本件特許は、特許法第２９条第１項または同条第２項の規定に違反してなされたものであるというものである。
　証拠方法
甲第１号証：「生化学実験講座１タンパク質の化学Ｉ−分離精製」第５刷、株式会社東京化学同人、１９８１年３月３１日、第３１３〜３３３頁
甲第２号証：「ＰＲＯＴＩＤＥＳ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＦＬＵＩＤＳ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｔｈｉｒｔｉｅｔｈ　Ｃｏｌｌｏｑｕｉｎｍ」（１９８２）第４０３〜４０７頁
甲第３号証：大英図書館の蔵する第２号証の表紙
甲第４号証：「蛋白質・酵素の基礎実験法」株式会社南江堂、１９８１年９月１日、第１８〜２４頁
甲第５号証：「凝固・腺溶・キニン」株式会社中外医学社、１９７９年８月１０日、第８４〜１０６頁
甲第６号証：特公昭４８−３３６１号公報
　そこで、本件異議申立人の主張について以下検討する。
　甲第２号証においては、第ＩＸ因子に対するモノクローナル抗体を臭化シアン活性化シアン活性化セファロース２Ｂに固定化すること、該モノクローナル抗体固定カラムに第ＩＸ因子濃縮物を流すことにより第ＩＸ因子がモノクローナル抗体と結合したこと、この第ＩＸ因子が結合したモノクローナル抗体を緩衝化された生理食塩水および１Ｍの塩化ナトリウム水溶液で洗浄すること、さらに沃化力リ溶液で第ＩＸ因子を固定化モノクローナル抗体から溶離したことが記載されている。また、このように溶離された第ＩＸ因子は活性を保持しているとともに高度に精製されていること、及びクリスマス病患者の治療用途のために高純度第ＩＸ因子を大量に調製することを可能にする旨の記載があり、さらに、得られた第ＩＸ因子の分子量は５９，０００であることが記載されている。
　しかしながら、この甲第２号証においては、第ＩＸ因子が結合したモノクローナル抗体を緩衝化された生理食塩水および１Ｍの塩化ナトリウム水溶液を用いて洗浄しているのに対して、本件訂正後の発明（以下、本件発明という。）においては、対応する工程において、リチウム塩を使用しているのであるから、両者における精製工程は異なる。
　そして、精製方法が異なれば、得られる第ＩＸ因子も純度、活性等において同一であるとは直ちにはいえない。しかも、甲第２号証においては、上記甲第２号証の精製法により得られた第ＩＸ因子の分子量は５９，０００であることが示されている。一方、平成１１年６月３日付上申書においては、本件特許出願に対応する米国特許５，６１４５００号明細書の精製法（発明の詳細な説明中の精製法に関する記載は、本件訂正明細書と米国特許明細書とで異ならない。）を追試したルイス　サマリア作成の宣誓書が添付されており、該宣誓書の試験によれば、リチウム塩の使用を含む上記米国特許明細書記載の精製法によって得られる第ＩＸ因子の分子量は、甲第２号証に示される分子量とは異なり、７１，０００であることが示されており、これらの点からみて、本件発明において薬剤成分として使用する第ＩＸ因子タンパク質と甲第２号証における第ＩＸ因子は同一のものとすることはできない。
　してみれば、本件発明は甲第２号証に記載された発明とはいえない。
　さらに、付言するに、特許異議申立人は、特許明細書の請求項４及び７におけるリチウム塩の使用について、さらに甲第４号証を提示し、リチウム塩の使用は甲第２号証および甲第４号証の記載から当業者において容易にできる旨主張している。
　しかし、甲第４号証においては、カオトロピックイオンが、蛋白質の水に対する溶解度を高める旨記載され、カオトロピックイオンの性質の強さの順序は、陽イオンの場合、「Ｂａ２＋＞・・・Ｌｉ＋＞Ｃｓ＋＞Ｎａ＋・・・（ＣＨ３）４Ｎ＋」であると記載されており、リチウム塩もナトリウム塩もともにカオトロピック塩であることは伺われるが、甲第４号証においては、カオトロピックイオンを用いて第ＩＸ因子蛋白質吸着体から他のタンパクを除去することは記載されてはいないのであり、また、甲第２号証においては、第ＩＸ因子が結合したモノクローナル抗体を緩衝化された生理食塩水および１Ｍの塩化ナトリウム水溶液で洗浄することが記載されてはいるが、ここには、この洗浄液が甲第４号証に示されたカオトロピック性を利用するものであることも示されてはいないのである。してみれば、甲第４号証の記載を甲第２号証の記載と関連づけ、第ＩＸ因子の精製工程において甲第２号証の上記生理的食塩水等に代え、リチウム塩を使用することが当業者において容易にできるとすることは妥当ではない。しかも、このリチウム塩の使用を含む精製法によって得られる本件発明の薬剤成分である第ＩＸ因子は上記したように甲第２号証の第ＩＸ因子とは同じものとはいえず、さらに、甲第２号証及び甲第４号証においては、本件発明の第ＩＸ因子が得られることを予想し得る記載もないものであるから、これらの点からみれば、本件発明は、甲第２号証に加え甲第４号証の記載をみても、これらから当業者が容易に発明できたものではない。
　そして、甲第１、５、６及び７号証は、リチウム塩の使用について記載のない請求項に対していわゆる進歩性を否定するために提示されたものであり、また、甲第３号証は、甲第２号証に係る刊行物が本件出願前に頒布されたものであることを立証するために提示されたものであって、これら甲各号証は、リチウム塩の使用を何等示唆するものでもなく、本件発明の薬剤成分を示唆するものではないから、甲第２および４号証に加えさらにこれら甲各号証の記載を検討しても、本件発明はこれら甲１〜７号証から当業者が容易に発明できたものとすることはできない。なお、訂正後の請求項２〜６はいずれも本件発明をさらに技術的に限定したものであるから、これら請求項の事項も当業者が容易に想到できたものとはいえない。
４．結び、
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は認めることができ、本件異議申立の理由及び証拠によっては本件特許を取り消すことができない。
　また、他に本件特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１１年８月３日（１９９９．８．３）
【訂正の要旨】
　訂正事項ａ
　　特許請求の範囲の請求項１中の「カオトロピック試薬」を特許請求の範囲の減縮を目的として「リチウム塩」と訂正する。
　訂正事項ｂ
　　特許請求の範囲の請求項４を特許請求の範囲の減縮を目的として削除する。この請求項４の削除に伴い、これに続く「請求項５」、「請求項６」をそれぞれ「請求項４」、「請求項５」と訂正する。
　訂正事項Ｃ
　　特許請求の範囲の請求項７を特許請求の範囲の減縮を目的として削除する。この請求項７の削除に伴い、これに続く「請求項８」を「請求項６」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
第ＩＸ因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物
（５７）【特許請求の範囲】
　　【請求項１】（ａ）．第ＩＸ因子タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を結合した粒子上に、前記第ＩＸ因子タンパク質と１種またはそれ以上の他のタンパク質との混合物からなる源物質から前記第ＩＸ因子タンパク質を吸着し、
（ｂ）．リチウム塩を含む緩衝水溶液を用いて、前記粒子から前記第ＩＸ因子タンパク質を欠いた源物質を除去し、さらに、
（ｃ）．溶離液を用いて前記粒子から吸着した第ＩＸ因子タンパク質を溶離することにより、変性されておらず高い純度で濃縮されたかたちの活性な第ＩＸ因子タンパク質の組成物を回収する、各ステップを具備し、プロテアーゼインヒビターを添加することなしに実行される方法により得ることができる、活性で高い純度で精製され濃縮されたかたちの第ＩＸ因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物。
　　【請求項２】　前記源物質が血漿、血漿分画または血漿濃縮物であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤的組成物。
　　【請求項３】　前記源物質が前記第ＩＸ因子タンパク質を生産するための遺伝子を含む細胞により発現されているものであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤的組成物。
　　【請求項４】　４℃の条件下で前記方法を実行することによって得ることができる請求項１に記載の薬剤的組成物。
　　【請求項５】　キレート化剤を存在させて前記方法を実行することによって得ることができる請求項１に記載の薬剤的組成物。
　　【請求項６】　ＥＤＴＡを存在させて前記方法を実行することによって得ることができる請求項１に記載の薬剤的組成物。
【発明の詳細な説明】
　　　【０００１】
　　【産業上の利用分野】
　本発明は、第ＩＸ因子および他のビタミンＫ依存性タンパク質である第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、プロトロンビン、プロテインＣ並びにプロテインＳの分離および精製により得られる治療用途に適した薬剤的組成物に関する。特には、高純度タンパク質を血漿または濃縮物からクロマトグラフ吸着および濃縮技術により分離して得られる治療用途に適した薬剤的組成物に関する。
　　　【０００２】
　　【従来の技術】
　血液凝固因子は正常な凝固機構において、生命の維持に必要な役割を果たしている。例えば、第ＩＸ因子欠乏症の患者は重大な出血問題を示している（血友病Ｂ）。従って、科学研究用だけでなく、治療に用いる量の第ＩＸ因子および他のビタミンＫ依存性タンパク質の単離を可能にすることが望まれていた。この目的に対して種々の方法が文献に記載されている。本発明に係る薬剤的組成物ないしタンパク質は、高純度でかつ高収率で得られ、特に他の血漿因子による汚染の比較的低い点において従来技術より優れているものである。さらに、多くの工程を必要とする従来技術では、時間がかかるのと全工程でのタンパク質の損失が避けられない。
　　　【０００３】
　従来方法の一つとして、Ｓ．Ｐ．Ｂａｊａｊ等による「人間のプロトロンビン、第ＩＸ因子および第Ｘ因子の精製のための簡単化した処理方法」、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，１１（４），３９７〜４１２（１９８１年）がある。この方法では、血漿をクエン酸バリウムへの吸着およびそれからの溶離、硫酸アンモニウム分画、ＤＥＡＥ−セフアデックスクロマトグラフィー、そして、ｐＨ７．５のクエン酸ナトリウム緩衝液の中でのヘパリンーアガロースクロマトグラフィ−によってプロトロンビン、第Ｘ因子および第ＩＸ因子を分離するものである。第ＩＸ因子の報告された収率は、８０〜２２０ユニット／ｍｇの比活性で約３５％であった。他の方法として、Ｊ．Ｐ．Ｍｉｌｅｔｉｃｈ等による「硫酸塩化したデキストラン球体を用いての人間の血液凝固因子の第ＩＩ．第ＩＸおよび第Ｘの精製」、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第８０巻、頁２２１〜２２８に記載のものがある。この方法では、新鮮な冷凍血漿を解凍し、クエン酸バリウムにより沈澱、ジイソプロピルフルオロリン酸とトリス−塩酸中での再懸濁、硫酸アンモニウムによる沈澱、ＤＥ−５２セルロースへのクロマトグラフィー、そして得られた分画の選択的な硫酸塩化したデキストラン球体への適用の手順で行うものである。第ＩＸ因子を含む分画の濃度は第Ｖ因子１ｗｔ％と同じ程度に不純物が混じっているとされている。Ｂ．Ｏｓｔｅｒｕｄ等による「人間の血液凝固因子ＩＸ」、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５３巻、Ｎｏ．１７、頁５９４６〜５９５１（１９７８年）、では、第ＩＸ因子の精製を以下の手順、硫酸バリウムへの吸着およびそれからの溶離、ＤＥＡＥ−セルロースバツチクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、そしてヘパリンーアガロースのアフイニテイークロマトグラフで行っている。第ＩＸ因子活性は、２０７ユニット／ｍｇであり、収率は記載されていない。
　　　【０００４】
　　【発明が解決しようとする課題】
　以上のことから、改良された方法で得られる活性で高い純度で精製され濃縮されたかたちのタンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物を提供することを目的としている。
　　　【０００５】
　　【課題を解決するための手段】
　上記目的を達成するために本発明に係る活性で高い純度で精製され濃縮されたかたちのビタミンＫ依存性タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物は、（ａ）．ビタミンＫ依存性タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を結合した粒子上に、前記ビタミンＫ依存性タンパク質と１種またはそれ以上の他のタンパク質との混合物からなる源物質から前記ビタミンＫ依存性タンパク質を吸着し、（ｂ）．カオトロピック試薬を含む緩衝水溶液を用いて、前記粒子から前記ビタミンＫ依存性タンパク質を欠いた源物質を除去し、さらに、（ｃ）．溶離液を用いて前記粒子から吸着したビタミンＫ依存性タンパク質を溶離することにより、変性されておらず高い純度で濃縮されたかたちの活性なビタミンＫ依存性タンパク質の組成物を回収する、各ステップを具備し、プロテアーゼインヒビターを添加することなしに実行される方法により得ることができるものであることを特徴とする。
　　　【０００６】
　ここで、前記源物質が血漿、血漿分画または血漿濃縮であること、あるいは、前記ビタミンＫ依存性タンパク質を生産するための遺伝子を含む細胞により発現されたものであること、を特徴とすることができる。
　　　【０００７】
　また、別の本発明に係る活性で高い純度で精製され濃縮されたかたちの第ＩＸ因子を含有する治療用途に適した薬剤的組成物は、（ａ）．第ＩＸ因子に特異的なモノクローナル抗体に結合した吸着体粒子上に、前記第ＩＸ因子と１種またはそれ以上の他のタンパク質との混合物からなる源物質から前記第ＩＸ因子を吸着し、（ｂ）．カオトロピック試薬を含有する緩衝水溶液を用いて、前記吸着体粒子から前記第ＩＸ因子を欠いた源物質を除去し、さらに、（ｃ）．溶離液を用いて前記吸着体粒子から吸着した第ＩＸ因子を溶離することにより、変性されておらず高い純度で濃縮されたかたちの活性な第ＩＸ因子を回収する、各ステップを具備し、プロテアーゼインヒビターを添加することなしに実行される方法により得ることができるものであることを特徴としている。
　　　【０００８】
　また、別の本発明に係る活性で高い純度で精製され濃縮されたかたちで得られるビタミンＫ依存性タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物は、（ａ）．ビタミンＫ依存性タンパク質からなる群から選ばれるビタミンＫ依存性タンパク質に特異的なモノクローナル抗体に結合した吸着体粒子上に、前記ビタミンＫ依存性タンパク質と１種またはそれ以上の他のタンパク質との混合物である血漿、血漿分画または血漿濃縮の源物質から前記ビタミンＫ依存性タンパク質を吸着し、（ｂ）．塩化リチウムを含有する緩衝水溶液を用いて、前記吸着体粒子から前記ビタミンＫ依存性タンパク質を欠いた源物質を除去し、さらに、（ｃ）．溶離液を用いて前記吸着体粒子から吸着したビタミンＫ依存性タンパク質を溶離することにより、変性されておらず高い純度で濃縮されたかたちの活性なビタミンＫ依存性タンパク質の組成物を回収する、各ステップを具備し、４℃で、キレート化合物の存在下で、プロデアーゼインヒビターを添加することなしに実行される方法により得ることができるものであることを特徴とする。
　　　【０００９】
　本発明によれば、タンパク質に特異的な抗体を用いての吸着操作でタンパク質を高度に精製されたかたちで得られる。
　　　【００１０】
　上記構成において、ステップ（ａ）の段階は、血漿または濃縮物のような源物質からのタンパク質の免疫吸着を含む。ここで用いられる吸着体はタンパク質に特異的なモノクローナル抗体であり、そのモノクローナル抗体は適当な基質、例えばアガロース球体に結合されている。タンパク質を吸着した後、基質粒子を非吸着タンパク質を除去するために大量の緩衝溶液で洗浄する。吸着したタンパク質を溶液で処理し溶離させる。回収されたタンパク質は高純度、即ち不純物はほとんどなく、治療に用いることも更に精製することもできる。
　　　【００１１】
　本発明に係るプロセスでは第ＩＸ因子の精製が１５００倍の程度で得られ、これは従来技術を通じて大きな改良である。比活性は約３４．８ユニット／ｍｇであり、さらに第ＩＸ因子の収率はこの新規な方法において平均約５０％、高くて約７０％である。
　　　【００１２】
　本発明は、ビタミンＫ依存性タンパク質として知られている第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｖ因子、プロトロンロビン、プロテインＣおよびプロテインＳのあらゆるタンパク質精製フォームにおける回収に容易に適用できる。血漿、血漿分画、血漿濃縮物が典型的な源物質として含まれる。タンパク質はまた、ＤＮＡ組み換え技術、即ち、バクテリア、酵母または他の細胞の中へタンパク質を生産するための遺伝子を組み入れたタンパク質の混合物からも精製することができる。このような遺伝子組み込み技術は当該技術分野に通常の技術を有するものであれば公知のことであり、また、示されたタンパク質が１種またはそれ以上のタンパク質、細胞の残骸等の混合状態であることは理解される。
　　　【００１３】
　　【実施例】
　以下の説明は、従来一つの操作で達成されるとは知られていなかった純度と濃度にまで第ＩＸ因子の分離と精製を達成するためになされ、用いられる本発明の具体例の詳細を提供するものである。この説明は、第ＩＸ因子の精製に適用される本発明の好適例であり、本発明を限定するものでなく、当該技術分野の領域内にある変化応用は本発明の範囲に属すると考えるべきである。その他のビタミンＫ依存性タンパク質は同様の操作により精製されるが、その操作は用いられる抗体を生じさせる第ＩＸ因子に代わる他のタンパク質を用いる範囲で改変される。
　　　　【００１４】
　Ａ．第ＩＸ因子に対するモノクローナル抗体の調製
　第ＩＸ因子に吸着するモノクローナル抗体は、続いて分離基質に結合されるが、そのモノクローナル抗体は種々の公開されている方法により高度に精製される第ＩＸ因子の調製することに始まる段階的手順により調製される。第ＩＸ因子の精製は血漿源から得られる物質を用いて達成されるが、純度が充分に高くないものは高濃度で用いられる。
　　　　【００１５】
　抗凝血性の正常な血漿の精製はＯｓｔｅｒｕｄ等により示された方法、硫酸バリウムへの吸着および溶離、ＤＥＡＥ−セルロースバツチクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、そしてヘパリンーアガロースカラムによるアフイニテイークロマトグラフイーの順序で行なわれた。この方法による順序は、高度に精製された第ＩＸ因子を提供する。
　　　　【００１６】
　以下の手順に従って、血漿から得られた高度に精製された第ＩＸ因子をマウスに注射した。他の手順でも同様の効果を期待できる。第０日目、前記タンパク質１００μｇを０．０５Ｍトリス、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．３の緩衝液０．１ｍｌに溶解（または懸濁）させ、同容量のフロインドの完全アジュバントで振とうして調製した組成物をマウスの腹膜を通して注射した。第１５日目、フロインドの完全アジュバントをフロインドの不完全アジュバントに代えた以外は同様のタンパク質５６μｇを再び注射した。第２２、３０、３８および１２４日目、第１５日目の注射を繰り返した。第２３９日目、マウスに精製した第ＩＸ因子のみを注射した。第２４３日目、マウスの牌臓を取り出し、定法に従って融合した。この方法はＪ．Ｐ．Ｂｒｏｗｎ等による「モノクローナル抗体との免疫沈降反応により同定される正常および悪性の人細胞のタンパク質抗原」、ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，２２５巻、頁４９８０〜４９８３（１９８０年）に記載されている。この標準的手法は３５％ポリエチレングリコール１０００を５０％ポリエチレングリコールに代える程度おいて変化させられる。
　　　【００１７】
　陽性クローンは、正常人血漿の等量と各クロークからの上清液をインキュベートし、第ＩＸ因子活性を分析することにより同定される。クローンは、上清液が実質的に第ＩＸ因子凝血活性を中和したならば陽性と見なされる。クローンが陽性であると決定した後、それらは少なくとも２度サブクローン化し、第ＩＸ因子に対する抗体を生産する安定なクローンを得、少なくとも細胞の注入４日目に０．５ｍｌのプリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）で腹膜を通じて前もって処理したＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔中に注射した。ハイブリドーマ細胞を牛の胎児の血清を含まないＤｅｌｂｅｃｃｏで修飾されたＥａｇｌｅ媒質０．５ｍｌにおいて、マウス１匹当り約５×１０６細胞の濃度になるように注射した。マウスの腹が膨れるのを確認して、腹水液をヘパリン中に約１０ユニット／ｍｌで集めた。多数のマウスからの腹水液は次のモノクローナル免疫グロブリン（ＩｇＧ）の単離のために適当な容量に分けて貯蔵した。ヘパリン処理腹水液をすぐに使用しない場合には、−７０℃で貯蔵し、使用直前に解凍するのがよい。腹水液からのＩｇＧの最終収率は、腹水液１００ｍｌ当たり約１ｇのＩｇＧである。
　　　【００１８】
　第ＩＸ囚子を精製する目的のためのモノクローナルＩｇＧの特異性は、後述するようにモノクローナルＩｇＧが分離基質体にカップリングすることにより、そして、分離基質に結合したＩｇＧが血漿から第ＩＸ因子を除きその第ＩＸ因子が続くチオシアン酸ナトリウムを含む溶液で溶離されることを示すことにより評価される。
　　　【００１９】
　モノクローナルＩｇＧは、続く免疫吸着体を調整するのに用いられ、採取後すぐまたは貯蔵溶液の冷凍部分を解凍したヘパリン処理した腹水液から単離される。新鮮または凍結物に関わりなく使用され、溶液を４℃とし、等容量のリン酸緩衝液の塩溶液（ＰＢＳ）で処理し、以下に示す組成物とする。希釈腹水を４℃で撹拌しながら等容量の飽和硫酸アンモニウム（ＳＡＳ）（水中に過剰の硫酸アンモニウムを入れ沸とうさせ、４℃に冷却し、不溶の結晶をろ過し水酸化アンモニウムでｐＨ７．０に調整して得る）を滴下しながら加え沈澱させた。沈澱物と上清液を２時間以上撹拌し、４℃にて遠心分離した。遠心分離は好ましくは、６０分間、１４，０００ｒｐｍ（３０，０００×ｇ）で行なう。腹水の上清液はＳＡＳでさらに２回沈澱させ、その沈澱物と上清液を第１回目と同様に撹拌し、遠心分離した。３回の沈澱から得られたペレットを希釈した腹水液と等量のＰＢＳで再懸濁した後、ＰＢＳに対し充分に透析した。透析袋に凝固物が現われた時、２０℃で遠心分離により除いた。透析されたＩｇＧを室温で５％の水酸化アルミニウム水溶液と共に撹拌して吸着させ、吸着後２０℃で遠心分離した。吸着処理は第１回目の後少なくとも３回以上、それぞれ２．５％水酸化アルミニウム溶液を用いて繰り返される。吸着されたＩｇＧは４℃にして、上記の如くＳＡＳで再沈澱させた。沈澱させたペレットは使用するまで−２０℃で貯蔵される。モノクローナルＩｇＧ精製の他の方法は、ここで用いた方法と同様にもしくはよりよいものであり、例えば、Ｂｒｕｃｋ，Ｃ．，Ｐｏｒｔｅｔｅｌｌｅ，Ｄ．，Ｇｌｉｍｅｕｒ，Ｃ．，Ｂｏｌｌｅｎ，Ａ．の記述による「ＤＥＡＥアフイニテイ−ゲルブル−クロマトグラフイ−による腹水液からのマウスモノクローナル抗体の一段階精製」がＪｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｃｔｈｏｄｓ，５３巻、頁３１３〜３１９（１９８２年）に記載されている。
　　　【００２０】
Ｂ．免疫吸着体の調製
　免疫吸着体は、フカップリングのためのモノクローナルＩｇＧを調製し、カップリングのための固体基質を調製し、モノクローナルＩｇＧを固体基質に結合させるため２つの成分を反応させることにより好適に調製される。
　　　【００２１】
（ｉ）カップリングのためのＩｇＧの調製
　新しく沈澱させたＩｇＧまたは以前に冷凍した沈澱を解凍したものを用いることができる。その物質をＰＢＳに対して透析し、ＰＢＳ中にある間に、ＩｇＧの容量と濃度（Ａ２８０／１．４＝ｍｇ／ｍｌ　ＩｇＧ）を決定する。次いで、ＩｇＧ溶液５０ｍｌ当たり、ジイソプロピルフルオロリン酸の１０〜３０μｌ、好ましくは２０μｌで処理した。得られた溶液を３０分間、ドラフト中室温で撹拌し、その処理したＩｇＧを使用直前にカップリング緩衝液に対し一晩透析した。見い出されている最も好適なカップリング用緩衝液は、好ましくは水酸化ナトリウムでｐＨ９に調整された０．２５Ｍ重炭酸ナトリウム溶液である。
　　　【００２２】
（ｉｉ）カップリングのための固体基質の調製
　モノクローナル抗体はタンパク質、特には第ＩＸ因子自体に高い親和性を有するものでなければあらゆる物質に結合されるが、そのような物質として、ガラズビーズ、アガロースおよびそれらの誘導体が好ましい。最も好ましくは、架橋結合されたアガロースで、セフアロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．の登録商標）として知られたゲル市で市販されている。
　　　【００２３】
　好ましい免疫吸着体樹脂を調製する方法は、一般に文献に記載の方法と同様であり、例えば、Ｊ．Ｐｏｒａｔｈ等による方法、Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、８６巻、頁５３〜５６（１９７３年）がある。見い出された最も好適な方法は、以下の如くである。即ち、容量約２リットルのセフアロース４Ｂを酸で洗浄した２リットル用の焼結グラスフィルターロートに入れた。樹脂を水洗し、ろ過して水気のある状態にした。水洗した樹脂を回転子を入れた大容量（約４リットル）のガラスビーカーに移した。次いで、５Ｍの２塩基性リン酸カリウム溶液の１部と５Ｍの３塩基性リン酸カリウム溶液の２部を混合して調製した７５０ｍｌの冷リン酸カリウム緩衝溶液を樹脂に加えた。充分に冷却した水を加えて最終容量を３リットルとした。次に、この混合物を４℃に冷却し、マグネチックスターラ上の氷−水浴中で４〜１０℃に保持した。ドラフト内で、臭化シアンを回転子を入れた栓付きガラスビンの３０ｍｌの水中に加えた。混合物を溶液になるまで迅速に撹拌した。この臭化シアン溶液を先の冷セファロース混合物に２分間以上撹拌しながら加えた。撹拌を続けて８分間行ない、その溶液を４リットルの耐圧ビンに固定した冷２リットル焼結ガラスフィルターロートに移した。次いで、臭化シアン処理した樹脂を約２０リットルの冷水で（ろ液のｐＨが中性になるまで）洗浄した。水洗した樹脂は冷却したカップリング用緩衝液と速やかに平衝状態とし、大きな回転子を入れた４リットルのプラスチックビーカーに移した。
　　　【００２４】
　（ｉｉｉ）モノクローナル抗体の固体基質へのカップリング
　上記の如く調製した固体基質樹脂は、ＰＢＳと平衝状態にある時は使用できる状態にあり、それ以後は貯蔵されるべきではない。従って、樹脂混合物は、カップリング反応用緩衝液に対して前もって１晩透析したＩｇＧと結合させた。この結合した樹脂／ＩｇＧ懸濁混合物を２４時間４℃で撹拌した。カップリング時の上清液の無希釈サンプルのＡ２８０は、標準試料として牛の血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてまたは標準試料としてＢＳＡと共にバイオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク質分析（ブラッドフオード試薬）により決定される。次に、カップリングしたリガンドのパーセンテージを計算する。上記した手順が行なわれる時、この値は通常約９５％である。抗体とカップリングしなかった樹脂上に残っている活性サイトは、０．１Ｍグリシンを含有する冷カップリング用緩衝液で焼結ガラスフイルターロート上の樹脂を洗浄することによりブロックされる。次いで、この樹脂を樹脂と抗体を結合させた時のそれぞれのカップリング用緩衝液と等容量になるように上記溶液で再懸濁した。懸濁液をゆっくり４℃で１晩撹拌した。次いで、この樹脂をＰＢＳで充分に洗浄した。その組成を以下に示す。カップリングし、ブロックされた上記樹脂は、付加的に０．５Ｍカルシウムイオン、好ましくは塩化カルシウムを含むＰＢＳで予備溶離される。樹脂を再びＰＢＳのみで洗浄し、４℃で貯蔵するかまたは使用できる用意ができるまで、室温で連続したポンプの働いているカラム内におかれる。セフアロースに対するＩｇＧのカップリング密度は、セフアロース球体１リットル当り２〜５ｇＩｇＧ、好ましくは、３〜４ｇＩｇＧであろう。
　　　【００２５】
Ｃ．第ＩＸ因子の分離と精製
　人や動物の血漿および市販の第ＩＸ因子の濃縮物のような第ＩＸ因子の試料調製は、本発明の方法を用いることができ、本方法は物質の特定のタイプに限定されない。好適な物質、成功した結果を与えたものとしては、それぞれ目的とするタンパク質を含む人の血漿、血漿分画および濃縮物、市販または一部実験室で精製されたものである。以下の記載では、正常な人の血漿を用いたもので詳細を説明する。新しく採取したものでない血漿は通常の手段でクエン酸塩化され冷凍保存される。使用基準ができた時、３５〜４０℃、好ましくは３７℃の温度で解凍し、カラムに直接入れる。
　　　【００２６】
　本発明の説明では最初に直接にクロマトグラフ用カラムに免疫吸着体がカップリングされた粒子を入れて使用したが、適当な容器の中へ抗体と結合する樹脂粒子を入れてバツチ法で分離し、その後再構成した濃縮物または血漿を加え、上記で概要を示したように目的とするタンパク質を回収する方法も本発明の範囲にあるものである。以下、さらに詳細に説明する。
　　　【００２７】
　クロマトグラフ工程を遂行するには、以下の具体例が好ましい。
　　　【００２８】
　樹脂をカラム、例えばＡｍｉｃｏｎ　８６００１（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐ．，Ｌｅｘｉｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．の登録商標）に充填し、ぜん動性ポンプで速やかに流れるようにする。人の血漿を第ＩＸ因子源として使用する時、抗体を保持する球体の各容量に対し約３〜７、好ましくは５部の血漿が処理される。血漿はゆっくりとカラムに注がれ、流速は免疫吸着体上に血漿からの第ＩＸ因子の望ましい量が吸着される接触時間を与えるものである。より長い接触時間がタンパク質の少なくとも約５０％、好ましくは７５％、より好ましくは、９５％以上を吸着させるのに必要であり、その時間は１〜６時間、好ましくは２〜４時間で一般的に満足される。
　　　【００２９】
　源物質をカラムに入れた後、５０部のトリス−塩化リチウム緩衝液（０．１Ｍリジン塩基と０．５Ｍ塩化リチウム、ｐＨ８）で洗浄し、溶離タンパク質を有効に除去する。除去率は好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは最大の除去である。次いで、第２の洗浄をトリスー塩酸緩衝液（０．０５Ｍトリス−塩酸、ｐＨ８）でカラムからリチウムイオンを最大限に除去する条件で行なう。約２〜４時間の接触時間で満足される。
　　　【００３０】
　精製第ＩＸ因子の溶離は、ジエチルアミン、塩化カルシウム、チオシアン酸ナトリウム塩、臭化カリウム、酢酸（好ましくは濃度約０．１〜１．０Ｍ）またはｐＨ２〜３、好ましくは約２．２の塩酸一グリシン混合物の如き溶離液を含む緩衝液で行なわれる。他の適当な溶離剤は、当該技術分野の通常の技術で簡単に同定することができる。直線的な濃度勾配の溶離液が良い結果を与えるが、本発明の目的を達成するためには必要はなく、一定のイオン濃度を有する溶液がさらに適当である。流出速度はセフアロースの充填によりカラム内の圧力を上げないでタンパク質の溶離を効果的に行うべきである。このように、第ＩＸ因子をチオシアン酸ナトリウムで溶離する時、チオシアン酸ナトリウムの溶離液を２Ｍ〜４Ｍ、好ましくは３Ｍを流し、その流速は３リットルカラムにおいて平方インチ当たり９ポンド以上の導入部の圧力を与え、圧力の上昇をしないように行なう。ジエチルアミンの溶離では、０．３〜０．７Ｍ、好ましくは０．５Ｍの濃度で行なわれる。ジエチルアミンを溶離液として用いた場合、分画はジエチルアミンを中和するために１Ｍグリシン中に集められるべきである。続いて、そのカラムはＰＢＳまたは中性緩衝液で洗浄される。
　　　【００３１】
　第ＩＸ因子活性を含む分画を貯蔵し、その全容量および活性を決定する。溶離された第ＩＸ因子を溶液のイオンを除くためにＰＢＳに対して透析し、次いで分析する。溶離された第ＩＸ因子は濃度約１０〜３０ユニット／ｍｌであり、治療または分析に用いることができる。
　　　【００３２】
　第ＩＸ因子を集めた液は限外ろ過のような通常の方法により１０〜２０ｍｌに濃縮することができる。この目的のためには、窒素圧５０ｐｓｉ下でＹＭ−１０メンブランとアミコン撹拌セル（Ａｍｉｃｏｎ　ｓｔｉｒｒｅｄ　ｃｅｌｌ）がよいことがわかった。ゆっくりとした撹拌を窒素圧を低下した後３０分間続け、濃縮液の容量と活性を決定した。ためた液は温度を４℃に保つならば短期間、例えば１晩貯蔵してもよい。
　　　【００３３】
　上記した免疫吸着体力ラムはカラムから精製しタンパク質を除く溶離により再生される。カラムはこのように何回でも繰り返し使用できる。
　　　【００３４】
　分析は通常の部分トロンボプラスチン時間分析（Ｐａｒｔｉａｌ　ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ　ｔｉｍｅ　ａｓｓａｙ）で行なわれる。
　　　【００３５】
　すべての緩衝液において、ＥＤＴＡ　４ナトリウム塩の１０ｍＭを含んだもの、および／またはすべての処理行程を４℃で行なうことは、第ＩＸ因子の活性およびタンパク質分解を最小にする。
　　　【００３６】
　緩衝液の組成を以下に示す。
　　　【００３７】
　リン酸緩衝塩溶液
　１．６ｇのリン酸ナトリウム１塩基性１水和物
　８．４ｇのリン酸ナトリウム２塩基性無水物
　６１．４ｇの塩化ナトリウム
　水を加えて７リットルとする。ｐＨを７．２に調整。
　　　【００３８】
　上記で説明した手順で７回の実験を行ない、平均回収率５２％、その範囲３２％〜７１％であった。精製度は平均２４００倍、比活性は３４．８ユニット／ｍｇであった。以下の実施例１で示すデータは、上で述べた本発明で得られたものの代表である。冷凍された正常人の血漿を３７℃で解凍し、次いで４℃で処理したものである。
　　　【００３９】
　実施例１
　実験Ａ：　第ＩＸ因子活性の１．５ユニット／ｍｌ、０．０２１ユニット／ｍｇを含む人の血漿１００ｍｌを免疫吸着体カラムに入れ、最初に血漿を次いで第ＩＸ因子を上述した方法に従って溶離した。溶離された第ＩＸ因子は３１ユニット／ｍｇの比活性を有しており、約１５００倍の精製度を示した。第ＩＸ因子の回収率６３．３％。溶離分画のピークにおいては、第ＩＸ因子の濃度の１２倍であった。
　　　【００４０】
　実験Ｂ：　第ＩＸ因子活性の０．９４ユニット／ｍｌ、０．０１３ユニット／ｍｇを含む人の血漿１００ｍｌを、すべての緩衝液にＥＤＴＡ　４ナトリウム塩の１０ｍＭを含ませた以外は上記手順と同様にして回収した。溶離した第ＩＸ因子は１７ユニット／ｍｇの比活性を有し、約１３００倍の精製度を示した。回収率は６１％、溶離分画のピークにおいては、第ＩＸ因子の濃度の８倍であった。
　　　【００４１】
　　【発明の効果】
　以上説明したように、本発明によれば、血漿または濃縮物から、平均回収率５２％、その範囲３２％〜７１％、精製度平均２４００倍、比活性３４．８ユニット／ｍｇの、すなわち、活性で高い純度で精製され濃縮されたかたちの、ビタミンＫ依存性タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物を得ることができた。