(57)【要約】本発明は、組み換えウイルスベクター、および黄熱病ウイルスに対する免疫反応を惹起するためにこの組み換えウイルスベクターを使用する方法に関する。本発明は、非複製改質ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａに基づく、またはＤ４Ｒ−欠損ワクシニアウイルスに基づく組み換えウイルスベクターを提供する。本発明の方法に従って投与されると、組み換えウイルスベクターは、黄熱病ウイルスに対する広い免疫反応を惹起し、優れた安全性プロファイルを示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）ｐｒＭＥポリペプチドをコード化する遺伝子カセットを備える、組み換え改質ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）。
【請求項２】
前記遺伝子カセットは、配列番号：２に示されるＹＦＶ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する、請求項１に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項３】
前記遺伝子カセットは、配列番号：５に示されるＹＦＶ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する、請求項１に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項４】
前記遺伝子カセットは、配列番号：６に示されるＹＦＶ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する、請求項１に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項５】
前記遺伝子カセットは、配列番号：７に示されるＹＦＶ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する、請求項１に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項６】
前記遺伝子カセットは、配列番号：８に示されるＹＦＶ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する、請求項１に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項７】
前記遺伝子カセットは、配列番号：９に示されるＹＦＶ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する、請求項１に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項８】
前記遺伝子カセットは、配列番号：１０に示されるＹＦＶ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する、請求項１に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項９】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ５プロモーターの制御下である、請求項１に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項１０】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ５プロモーターの制御下である、請求項２に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項１１】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ５プロモーターの制御下である、請求項３に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項１２】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ５プロモーターの制御下である、請求項４に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項１３】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ５プロモーターの制御下である、請求項５に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項１４】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ６プロモーターの制御下である、請求項６に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項１５】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ７プロモーターの制御下である、請求項７に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項１６】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ８プロモーターの制御下である、請求項８に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項１７】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項１に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項１８】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項２に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項１９】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項３に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項２０】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項４に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項２１】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項５に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項２２】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項６に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項２３】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項７に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項２４】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項８に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項２５】
配列番号：１に示されるＹＦＶ−１７Ｄ  ｐｒＭＥ遺伝子カセットを備える組み換えＭＶＡ。
【請求項２６】
配列番号：３に示されるＹＦＶ−１７Ｄ  ｐｒＭＥ遺伝子カセットを備える組み換えＭＶＡ。
【請求項２７】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項１に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項２８】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項２に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項２９】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項３に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項３０】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項４に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項３１】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項５に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項３２】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項６に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項３３】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項７に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項３４】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項８に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項３５】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項９に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項３６】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項１０に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項３７】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項１１に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項３８】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項１２に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項３９】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項１３に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項４０】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項１４に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項４１】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項１５に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項４２】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項１６に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項４３】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項１７に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項４４】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項１８に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項４５】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項１９に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項４６】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項２０に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項４７】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項２１に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項４８】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項２２に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項４９】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項２３に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項５０】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項２４に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項５１】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項２５に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項５２】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．においてＭＶＡに挿入される、請求項２６に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項５３】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項１に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項５４】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項２に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項５５】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項３に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項５６】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項４に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項５７】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項５に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項５８】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項６に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項５９】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項７に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項６０】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項８に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項６１】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項９に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項６２】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項１０に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項６３】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項１１に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項６４】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項１２に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項６５】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項１３に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項６６】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項１４に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項６７】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項１５に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項６８】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項１６に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項６９】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項１７に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項７０】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項１８に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項７１】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項１９に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項７２】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項２０に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項７３】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項２１に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項７４】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項２２に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項７５】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項２３に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項７６】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項２４に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項７７】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項２５に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項７８】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、欠失ＩＩＩ領域においてＭＶＡに挿入される、請求項２６に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項７９】
請求項１〜７９のいずれか一項に記載の組み換えＭＶＡを含む薬学的組成物。
【請求項８０】
請求項７７または７８に記載の組み換えＭＶＡを含む薬学的組成物。
【請求項８１】
個人におけるＹＦＶに対する免疫反応を惹起する方法であって、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の組み換えＭＶＡを含む薬学的組成物を前記個人に投与することを含む、方法。
【請求項８２】
前記薬学的組成物が単回用量として投与される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
個人におけるＹＦＶに対する免疫反応の惹起における使用のための薬学的組成物であって、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の組み換えＭＶＡを含む薬学的組成物を前記個人に投与するステップを含む、方法。
【請求項８４】
前記薬学的組成物が単回用量として投与される、請求項８３に記載の薬学的組成物。
【請求項８５】
配列番号：１に示されるＹＦＶ−１７Ｄ  ｐｒＭＥ遺伝子カセットを発現する組み換えＭＶＡを生成する方法であって、
ａ）一次ニワトリ胚細胞または永久鳥類細胞株を、ＭＶＡに感染させるステップと、
ｂ）配列番号：１に示されるｐｒＭＥ遺伝子カセットを備え、またＭＶＡゲノムの非必須領域と相同性の遺伝子カセットの側面に位置するＤＮＡを備えるプラスミドを、感染した細胞に形質移入するステップと、
ｃ）前記感染した細胞における前記ＭＶＡの複製中に、前記プラスミドを前記ＭＶＡゲノムと再結合させるように細胞を成長させ、それにより、前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットを前記非必須領域における前記ＭＶＡゲノムに挿入するステップと、
ｄ）生成される前記組み換えＭＶＡを得るステップと、を含む方法。
【請求項８６】
配列番号：３に示されるＹＦＶ−１７Ｄ  ｐｒＭＥ遺伝子カセットを発現する組み換えＭＶＡを生成する方法であって、
ａ）一次ニワトリ胚細胞または永久鳥類細胞株を、ＭＶＡに感染させるステップと、
ｂ）配列番号：３に示されるｐｒＭＥ遺伝子カセットを備え、またＭＶＡゲノムの非必須領域と相同性の遺伝子カセットの側面に位置するＤＮＡを備えるプラスミドを、感染した細胞に形質移入するステップと、
ｃ）前記感染した細胞における前記ＭＶＡの複製中に、前記プラスミドを前記ＭＶＡゲノムと再結合させるように細胞を成長させ、それにより、前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットを前記非必須領域における前記ＭＶＡゲノムに挿入するステップと、
ｄ）生成される前記組み換えＭＶＡを得るステップと、を含む方法。
【請求項８７】
前記非必須ＭＶＡ領域は、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記非必須ＭＶＡ領域は、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記非必須ＭＶＡ領域は、欠失ＩＩＩ領域である、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
前記非必須ＭＶＡ領域は、欠失ＩＩＩ領域である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）ｐｒＭＥポリペプチドをコード化する遺伝子カセットを備える、組み換えＤ４Ｒ−欠損ワクシニアウイルス（ｄＶＶ）。
【請求項９２】
前記遺伝子カセットは、配列番号：２に示されるＹＦＶ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する、請求項９１に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項９３】
前記遺伝子カセットは、配列番号：５に示されるＹＦＶ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する、請求項９１に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項９４】
前記遺伝子カセットは、配列番号：６に示されるＹＦＶ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する、請求項９１に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項９５】
前記遺伝子カセットは、配列番号：７に示されるＹＦＶ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する、請求項９１に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項９６】
前記遺伝子カセットは、配列番号：８に示されるＹＦＶ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する、請求項９１に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項９７】
前記遺伝子カセットは、配列番号：９に示されるＹＦＶ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する、請求項９１に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項９８】
前記遺伝子カセットは、配列番号：１０に示されるＹＦＶ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する、請求項９１に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項９９】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ５プロモーターの制御下である、請求項９１に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１００】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ５プロモーターの制御下である、請求項９２に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１０１】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ５プロモーターの制御下である、請求項９３に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１０２】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ５プロモーターの制御下である、請求項９４に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１０３】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ５プロモーターの制御下である、請求項９５に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１０４】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ５プロモーターの制御下である、請求項９６に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１０５】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ５プロモーターの制御下である、請求項９７に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１０６】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｍＨ５プロモーターの制御下である、請求項９８に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１０７】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項９１に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１０８】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項９２に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１０９】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項９３に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１１０】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項９４に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１１１】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項９５に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１１２】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項９６に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１１３】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項９７に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１１４】
前記遺伝子カセットからの前記ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドの発現は、ｓｅｌＰプロモーターの制御下である、請求項９８に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１１５】
配列番号：１に示されるＹＦＶ−１７Ｄ  ｐｒＭＥ遺伝子カセットを備える組み換えｄＶＶ。
【請求項１１６】
配列番号：３に示されるＹＦＶ−１７Ｄ  ｐｒＭＥ遺伝子カセットを備える組み換えｄＶＶ。
【請求項１１７】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項９１に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１１８】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項９２に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１１９】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項９３に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１２０】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項９４に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１２１】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項９５に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１２２】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項９６に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１２３】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項９７に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１２４】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項９８に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１２５】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項９９に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１２６】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１００に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１２７】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１０１に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１２８】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１０２に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１２９】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１０３に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１３０】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１０４に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１３１】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１０５に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１３２】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１０６に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１３３】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１０７に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１３４】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１０８に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１３５】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１０９に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１３６】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１１０に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１３７】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１１１に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１３８】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１１２に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１３９】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１１３に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１４０】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１１４に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１４１】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１１５に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１４２】
前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、ｄＶＶにおけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換える、請求項１１６に記載の組み換えｄＶＶ。
【請求項１４３】
請求項９１〜１４２のいずれか一項に記載の組み換えｄＶＶを含む薬学的組成物。
【請求項１４４】
請求項１４１または１４２に記載の組み換えｄＶＶを含む薬学的組成物。
【請求項１４５】
個人におけるＹＦＶに対する免疫反応を惹起する方法であって、請求項９１〜１４２のいずれか一項に記載の組み換えｄＶＶを含む薬学的組成物を前記個人に投与することを含む、方法。
【請求項１４６】
前記薬学的組成物が単回用量として投与される、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
個人におけるＹＦＶに対する免疫反応の惹起における使用のための薬学的組成物であって、請求項９１〜１４２のいずれか一項に記載の組み換えｄＶＶを含む薬学的組成物を前記個人に投与するステップを含む、方法。
【請求項１４８】
前記薬学的組成物が単回用量として投与される、請求項１４７に記載の薬学的組成物。
【請求項１４９】
配列番号：１に示されるＹＦＶ−１７Ｄ  ｐｒＭＥ遺伝子カセットを発現する組み換えｄＶＶを生成する方法であって、
ａ）Ｄ４Ｒ−補完細胞株を、野生型ワクシニアウイルス（ＶＶ）に感染させるステップと、
ｂ）配列番号：１に示されるｐｒＭＥ遺伝子カセットを備え、また野生型ＶＶゲノムのＤ３ＲおよびＤ５Ｒ領域と相同性の遺伝子カセットの側面に位置するＤＮＡを備えるプラスミドを、感染した細胞に形質移入するステップと、
ｃ）前記Ｄ４Ｒ−補完細胞株におけるウイルスゲノムの複製中に、前記プラスミドをウイルスゲノムと再結合させるように前記感染した細胞を成長させ、それにより、前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットを前記Ｄ３Ｒ領域と前記Ｄ５Ｒ領域との間の前記ウイルスゲノムに挿入するステップと、
ｄ）生成される前記組み換えｄＶＶを得るステップと、を含む方法。
【請求項１５０】
配列番号：３に示されるＹＦＶ−１７Ｄ  ｐｒＭＥ遺伝子カセットを発現する組み換えｄＶＶを生成する方法であって、
ａ）Ｄ４Ｒ−補完細胞株を、野生型ＶＶに感染させるステップと、
ｂ）配列番号：３に示されるｐｒＭＥ遺伝子カセットを備え、ＶＶゲノムのＤ３ＲおよびＤ５Ｒ領域と相同性の遺伝子カセットの側面に位置するＤＮＡを備えるプラスミドを、感染した細胞に形質移入するステップと、
ｃ）前記Ｄ４Ｒ補完細胞株におけるウイルスゲノムの複製中に、前記プラスミドをウイルスゲノムと再結合させるように前記感染した細胞を成長させ、それにより、前記ｐｒＭＥ遺伝子カセットを前記Ｄ３Ｒ領域と前記Ｄ５Ｒ領域との間の前記ウイルスゲノムに挿入するステップと、
ｄ）生成される前記組み換えｄＶＶを得るステップと、を含む方法。
【請求項１５１】
前記Ｄ４Ｒ−補完細胞株は、ウサギＲＫ４４．２０細胞株またはアフリカミドリザルｃＶｅｒｏ−２２細胞株である、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５２】
前記Ｄ４Ｒ−補完細胞株は、ウサギＲＫ４４．２０細胞株またはアフリカミドリザルｃＶｅｒｏ−２２細胞株である、請求項１５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換えウイルスベクター、および黄熱病ウイルスに対する免疫反応を惹起するためにこの組み換えウイルスベクターを使用する方法に関する。本発明は、非複製改質ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａに基づく、またはＤ４Ｒ−欠損ワクシニアウイルスに基づく組み換えウイルスベクターを提供する。本発明の方法に従って投与されると、組み換えウイルスベクターは、黄熱病ウイルスに対する広い免疫反応を惹起し、優れた安全性プロファイルを示す。
【背景技術】
【０００２】
黄熱病（ＹＦ）は、熱帯アフリカおよび南アフリカの流行地域においては、未だに公衆衛生に対する絶え間ない脅威となっている。世界保健機構（ＷＨＯ）は、年間２００，０００件が発生し、死亡者数は３０，０００件であると予測した（ＷＨＯ２００９）。一本鎖ＲＮＡウイルスである黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）は、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科に属し、蚊によって伝染する（Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ  ＢＤ、Ｔｈｉｅｌ  ＨＪ、およびＲｉｃｅ  ＣＭ  ２００７）。黄熱病は、３つの段階に分けることができる。３〜６日の潜伏期間後、患者は、発熱、倦怠感、腰痛、頭痛、筋肉痛、吐き気、嘔吐、および疲労等の症状を伴う熱病を発症し、３〜４日持続する。症状が２〜４８時間消失した後、患者の１５〜２５パーセントが、発熱、嘔吐、上腹部痛、出血性素因、黄疸、ならびに肝不全および腎不全を特徴とする、第３段階である中毒期間に移行する。７日目から１０日目に、重度ＹＦ症例の２０〜５０パーセントが死亡する（Ｍｏｎａｔｈ  ２００１；Ｍｏｎａｔｈ  ２００４；Ｇｕｂｌｅｒ、Ｋｕｎｏ、およびＭａｒｋｏｆｆ  ２００７）。
【０００３】
早くも１９３７年には、生弱毒ワクチン株、黄熱病１７Ｄが、マウスおよびニワトリ組織培養物における継代によりＡｓｉｂｉ野生型株に基づき開発された（ＴｈｅｉｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ  １９３７；Ｓｔｏｋｅｓ、Ｂａｕｅｒ、およびＨｕｄｓｏｎ  ２００１）。１７Ｄワクチンは、何十年もの間使用されており、４億人を超える人々に投与されている（Ｍｏｎａｔｈ  ２００１）。
【０００４】
ＹＦＶエンベロープ（Ｅ）タンパク質は、防御免疫反応の惹起において主要な役割を果たす。動物実験において、精製Ｅタンパク質または膜およびエンベロープタンパク質の前駆体（ｐｒＭＥ）を発現する組み換えワクシニアウイルスは、高レベルの中和抗体を誘導し、致死的ＹＦＶ感染に対する免疫を与える（Ｂｒａｎｄｒｉｓｓ、Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、およびＷａｌｓｈ  １９９０；Ｐｉｎｃｕｓら  １９９２）。さらに、モノクローナル抗Ｅ抗体の受動伝達は、抗体媒介免疫がマウスを防御するのに十分であることを示した（Ｂｒａｎｄｒｉｓｓら  １９８６）。大部分が液性免疫反応を標的とするＹＦＶワクチンの手法として、不活化全ウイルス候補ワクチンが、最近説明されている（Ｍｏｎａｔｈら  ２０１０）。しかしながら、最近のデータは、細胞性免疫反応の重要な役割についても示唆している。抗体と組み合わされたＴｈ１表現型を有するＣＤ４リンパ球は、ウイルス除去における重大な役割を担う（Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ２００１）。ＹＦＶ−１７Ｄにより誘導されたＣＤ８  Ｔ細胞は、広い特異性、安定した増殖、規模の大きさ、および長期持続性等の、防御細胞性免疫に必要な全ての特性を示した（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８；Ａｋｏｎｄｙら  ２００９）。多数のＣＤ８−およびＣＤ４−特異的Ｔ細胞エピトープが、エンベロープタンパク質においてマッピングされた（Ｃｏら  ２００２；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｏｓｔら  ２００２；Ｍａｃｉｅｌ，Ｊｒ．ら  ２００８）。
【０００５】
改質ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）に基づく組み換えワクチンが、多くの非臨床および臨床研究において使用されている（Ｃｅｂｅｒｅら  ２００６；Ｂｅｊｏｎら  ２００７；Ｂｒｏｏｋｅｓら  ２００８；Ｋａｕｆｍａｎら  ２００９）。ＭＶＡは、極めて安全であることが証明されている（Ｄｒｅｘｌｅｒ、Ｓｔａｉｂ、およびＳｕｔｔｅｒ  ２００４）。天然痘根絶に関して１２０，０００人を超える人間患者にＭＶＡが投与されても、有意な副作用は生じなかった（Ｓｔｉｃｋｌら  １９７４；Ｍａｙｒら  １９７８）。ビリオン形態形成における阻止に起因して、極めて弱毒化されたワクシニアウイルス株は、ヒトおよびほとんどの他の哺乳動物細胞において生産的に複製できない（ＣａｒｒｏｌｌおよびＭｏｓｓ  １９９７；Ｄｒｅｘｌｅｒら  １９９８；Ｗｙａｔｔら  １９９８）。それにもかかわらず、早期および後期におけるウイルスおよび外来遺伝子を発現する能力は、維持される。これらの特性により、ＭＶＡは、液性および細胞性免疫反応を誘導し、高い安全性プロファイルを示す有望な生ワクチンベクターとなる。別の非複製ワクシニアウイルス、Ｄ４Ｒ欠損ワクシニアウイルス（ｄＶＶ）は、ウイルスＤＮＡ合成に関与する必須ＶＶウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子（Ｄ４Ｒ）の標的化された欠失により生成された。したがって、任意の野生型細胞において、複製周期は、後期遺伝子発現の前のウイルスゲノム複製の段階で阻止される。ｄＶＶの伝播には、欠失したウイルスＤ４Ｒ機能を補完する操作された細胞株が使用される（ＨｏｌｚｅｒおよびＦａｌｋｎｅｒ  １９９７；Ｍａｙｒｈｏｆｅｒら  ２００９）。この明確な欠失のために、非複製ウイルスｄＶＶは、安全なワクチンベクターとなる（Ｏｂｅｒら  ２００２）。
【０００６】
特許文献１；特許文献２；特許文献３および特許文献４は、ワクシニア等の組み換えポックスウイルスに関する。
【０００７】
ＭＶＡ系ワクチンは、例えば、ＨＩＶ（Ｃｅｂｅｒｅら  ２００６）、結核（Ｂｒｏｏｋｅｓら  ２００８）、マラリア（Ｂｅｊｏｎら  ２００７）および癌（Ｋａｕｆｍａｎら  ２００９）に対する臨床研究において使用されている。これらの研究の全てにおいて、少なくとも２つの用量が使用された。ＭＶＡ系ワクチンの人間に対する用量は、臨床試験において適用されるように、５×１０７〜５×１０８ＰＦＵであった（Ｃｅｂｅｒｅら  ２００６；ＴｙｋｏｄｉおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ  ２００８；Ｂｒｏｏｋｅｓら  ２００８）。
【０００８】
特許文献５および特許文献６は、ＹＦＶ等のフラビウイルスからの外来ＤＮＡを含むワクシニアウイルスの宿主域突然変異株等の、組み換えポックスウイルスに関する。特許文献７は、非必須領域に挿入された日本脳炎ウイルスＥタンパク質ｃＤＮＡを有する弱毒天然痘ウイルス等の、組み換えワクシニアウイルスに関する。特許文献８は、外来ＤＮＡを含有する必須機能を有さない欠損組み換えポックスウイルスに関する。Ｈｏｌｚｅｒら  １９９９（Ｈｏｌｚｅｒら  １９９９）は、ダニ媒介脳炎ウイルスｐｒＭ／Ｅ遺伝子を有するウラシルＤＮＡグリコシラーゼ欠損ワクシニアウイルスベクターを説明している。
【０００９】
以前の研究（Ｐｉｎｃｕｓら  １９９２）において、ＹＦＶ−１７Ｄ  ｐｒＭＥを発現する複製可能ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株の１×１０７ＰＦＵの単回用量は、フランス向神経性ＹＦＶ株での１００倍ＬＤ５０負荷に対し、マウスをある程度しか防御することができなかった。２回の接種後であっても、動物の９４％のみが生存した。日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）ｐｒＭＥ遺伝子を発現する組み換えＭＶＡに関する研究において、１０５  ＬＤ５０でのＪＥＶ負荷に対してマウスを防御するのに、２×１０６感染単位の３回用量が必要であった（Ｎａｍら  １９９９）。
【００１０】
かつては利用可能な最も効果的で最も安全なものとして分類されていた１７Ｄワクチン（Ｂａｒｒｅｔｔ  １９９７）は、現在では安全性が低いと考えられている（Ｍｏｎａｔｈ  ２００７）。最近の研究では、複数のワクチンが深刻な有害事象に関連することが明らかとなった。１００，０００件のワクチン接種当たり０．８人の患者がワクチン関連向神経性疾患を発症し（Ｌｉｎｄｓｅｙら  ２００８）、被ワクチン接種者２００，０００〜４００，０００人に１人が内臓向性疾患を発症した（Ｍｏｎａｔｈ  ２００７）。主要な旅行者層、すなわち６０歳を超える年齢の人々においては、罹患率は、５０，０００件のワクチン接種につき１人に上昇する。さらに、死亡を含む深刻な有害転帰が、スペイン、ブラジル、アメリカ合衆国、オーストラリア、およびタイにおいて、全ての年齢層にわたって報告されている（Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｏｓら  ２００１；Ｍａｒｔｉｎら  ２００１；Ｃｈａｎら  ２００１；Ｋｅｎｇｓａｋｕｌ、Ｓａｔｈｉｒａｐｏｎｇｓａｓｕｔｉ、およびＰｕｎｙａｇｕｐｔａ  ２００２；ＧｅｒａｓｉｍｏｎおよびＬｏｗｒｙ  ２００５；Ｄｏｂｌａｓら  ２００６；Ｂｅｌｓｈｅｒら  ２００７）。したがって、当技術分野において、改善された安全性プロファイルを有するワクチンが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６，９９８，２５２号明細書
【特許文献２】米国特許第７，０１５，０２４号明細書
【特許文献３】米国特許第７，０４５，１３６号明細書
【特許文献４】米国特許第７，０４５，３１３号明細書
【特許文献５】米国特許第５，５１４，３７５号明細書
【特許文献６】米国特許第５，７４４，１４０号明細書
【特許文献７】米国特許第５，０２１，３４７号明細書
【特許文献８】米国特許第５，７６６，８８２号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
詳細な説明
本発明は、ＹＦＶに対する免疫反応を生成するのに有用な組み換えウイルス（本明細書において組み換えウイルスベクターとも呼ばれる）を提供する。組み換えウイルスは、非複製ワクシニアウイルス、ＭＶＡおよびｄＶＶに基づき、ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドをコード化する。投与されると、組み換えウイルスは、１７Ｄワクチンに類似したレベルでＹＦＶ特異的液性および細胞性免疫反応（ＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞反応）を惹起し、野生型ワクシニアウイルスでの事前免疫化の後であっても致死的ＹＦＶ負荷に対しマウスを防御する。さらに、組み換えウイルスは、１７Ｄワクチンと比較して、マウスにおける改善された安全性プロファイルを示す。したがって、組み換えウイルスは、人間におけるワクチンとして有用であることが企図される。
【００１３】
本発明の組み換えウイルスにおけるオープンリーディングフレームによりコード化されたｐｒＭＥアミノ酸配列は、例えば、配列番号：２に示されるＹＦＶ−１７Ｄ  ｐｒＭＥアミノ酸配列；配列番号：５に示されるＰａｓｔｅｕｒ  １７Ｄ−２０４  ＹＦＶワクチンｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＣＡＢ３７４１９．１から）；配列番号：６に示されるＹＦＶ  ＹＦＶ１７Ｄ−２１３  ｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＣ５４２６８．１から）、配列番号：７に示される南アフリカ１７Ｄ−２０４  ＹＦＶワクチンｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＣ３５９０７．１から）、配列番号：８に示されるＹＦＶワクチン株１７ＤＤ  ｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＣ５４２６７．１から）、配列番号：９に示されるＹＦＶ株Ａｓｉｂｉ  ｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＴ５８０５０）または配列番号：１０に示されるフランス内臓向性ＹＦＶ株ｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＡ９９７１３．１から）であってもよい。いくつかの実施形態において、本発明の組み換えウイルスにおけるオープンリーディングフレームによりコード化されたｐｒＭＥポリペプチドの配列は、配列番号：２、５、６、７、８、９または１０と異なってもよいが、ｐｒＭＥポリペプチドは、組み換えウイルスが個人に投与されると防御免疫反応を惹起する能力を維持する。これらの実施形態において、ｐｒＭＥポリペプチドは、配列番号：２、５、６、７、８、９または１０と、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９５％、約９７％、約９８％または約９９％同一であってもよい。
【００１４】
本発明の組み換えウイルスにおいて、ＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレームは、ヒト細胞のためにコドン最適化されてもよい。これらの実施形態において、自然発生ＹＦＶ  ｐｒＭＥオープンリーディングフレームにおけるコドンの１つ以上（または全て）は、コドン最適化ＹＦＶ  ｐｒＭＥオープンリーディングフレームにおいて、ヒト細胞内の遺伝子において頻繁に使用されるコドン（好ましいコドンと呼ばれることがあると置き換えられている。コドン最適化は、一般に、細胞内のポリペプチドの発現を高めるために、組み換え遺伝子発現の領域に使用されている。
【００１５】
本発明の組み換えウイルスにおけるＹＦＶ  ｐｒＭＥポリペプチドをコード化する遺伝子カセットは、組み換えワクシニアウイルスにおいて機能する（すなわち、オープンリーディングフレームの転写を方向付ける）プロモーターの制御下の（すなわち、動作可能に結合した）ＹＦＶ  ｐｒＭＥオープンリーディングフレームを含む。例示的実施形態において、遺伝子カセットからのｐｒＭＥポリペプチドの発現は、強固な早期／後期ワクシニアウイルスｍＨ５プロモーターまたは合成早期／後期ｌＰプロモーターの制御下である（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ、Ｓｉｓｌｅｒ、およびＭｏｓｓ  １９９７）。
【００１６】
一態様において、本発明は、ＹＦＶ  ｐｒＭＥ遺伝子カセットを備える組み換え改質ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を提供する。例示された一実施形態において、遺伝子カセットは、配列番号：１に示されるように、ヒトコドン最適化ＹＦＶ−１７Ｄ  ｐｒＭＥオープンリーディングフレームに動作可能に結合した強固な早期／後期ワクシニアウイルスプロモーターｍＨ５、およびワクシニアウイルス早期転写停止シグナルを備える。オープンリーディングフレームによりコード化されたｐｒＭＥアミノ酸配列は、配列番号：２（および配列番号：４）に示されている。ｐｒＭＥオープンリーディングフレームのコドン最適化配列は、ＹＦＶ−１７Ｄワクチン株ゲノム（受託番号  ＮＣ＿００２０３１）のヌクレオチド４１９〜２４５２に対応する。例示された別の実施形態において、配列番号：３に示されるような遺伝子カセットは、同じヒトコドン最適化ｐｒＭＥオープンリーディングフレームに動作可能に結合した合成早期／後期プロモーター（ｓｅｌＰ）（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ、Ｓｉｓｌｅｒ、およびＭｏｓｓ  １９９７）を含む。他の実施形態において、ｐｒＭＥポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレームは、配列番号：２に示されるＹＦＶ−１７Ｄ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する任意のヒトコドン最適化オープンリーディングフレームであってもよい。
【００１７】
さらに他の実施形態において、組み換えＭＶＡ  ＹＦＶ  ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、配列番号：５に示されるＰａｓｔｅｕｒ  １７Ｄ−２０４  ＹＦＶワクチンｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＣＡＢ３７４１９．１から）；配列番号：６に示されるＹＦＶ  ＹＦＶ１７Ｄ−２１３  ｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＣ５４２６８．１から）、配列番号：７に示される南アフリカ１７Ｄ−２０４  ＹＦＶワクチンｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＣ３５９０７．１から）、配列番号：８に示されるＹＦＶワクチン株１７ＤＤ  ｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＣ５４２６７．１から）、または配列番号：９に示されるＹＦＶ株Ａｓｉｂｉ  ｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＴ５８０５０から）、配列番号：１０に示されるフランス内臓向性ＹＦＶ株ｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＡ９９７１３．１から）をコード化してもよい。ポリペプチド配列は、上記段落［００１２］において議論したように変動し得る。ｐｒＭＥポリペプチド配列をコード化するオープンリーディングフレームはまた、ヒトコドン最適化配列であってもよい。遺伝子カセットの発現は、例えば、強固な早期／後期ワクシニアウイルスｍＨ５プロモーターまたは合成早期／後期ｓｅｌＰプロモーターの制御下であってもよい。
【００１８】
ｐｒＭＥ  遺伝子カセットは、ゲノムの非必須領域、例えば欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域、欠失ＩＩＩ領域、欠失ＩＶ領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、Ｄ４／５遺伝子間領域、またはＨＡ遺伝子座．におけるＭＶＡに挿入されてもよい。例示された実施形態において、挿入は、欠失ＩＩＩ領域内である。組み換えＭＶＡは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈから得られるＭＶＡ７４  ＬＶＤ６等の牛海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まないＭＶＡから得られる。
【００１９】
ＹＦＶ  ｐｒＭＥ  遺伝子カセットを発現する組み換えＭＶＡは、当技術分野における標準的方法に従って薬学的組成物として製剤化され得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含む。「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、緩衝剤、ならびに賦形剤、例えばリン酸緩衝生理食塩水、デキストロースまたはマンニトールの５％水溶液、およびエマルジョン、例えば油／水または水／油エマルジョン、ならびに様々な種類の湿潤剤および／またはアジュバントを含む。好適な薬学的担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，１９９５）に記載されている。組成物に有用な薬学的担体は、活性薬剤の意図される投与形態に依存する。
【００２０】
本発明は、個人におけるＹＦＶに対する免疫反応を惹起する方法であって、薬学的組成物を前記個人に投与することを含む方法を提供する。この方法において、薬学的組成物は、単回用量、２回用量または複数回用量として投与されてもよい。本明細書において例示されるように、組み換えＭＶＡの１０５ＴＣＩＤ５０の単発投与は、マウスにおいて、ＹＦＶ−１７Ｄの単回用量（１０４ＴＣＩＤ５０）に匹敵する防御を惹起した。人間における免疫化ルートは、筋肉内（ｉ．ｍ．）または皮下（ｓ．ｃ．）であってもよい。人間の免疫化用量の範囲は、約１０６〜約１０９ＰＦＵであってもよい。本発明の方法は、個人における液性および細胞性免疫反応を惹起する。さらに、本発明の実施形態において、方法は、個人における防御免疫反応を惹起する。防御免疫反応は、個人のＹＦＶへの後の暴露が熱病をもたらさないようであってもよい。熱病は、発熱、倦怠感、腰痛、頭痛、筋肉痛、吐き気、嘔吐、および疲労等の症状を含む。防御免疫反応は、個人のＹＦＶへの後の暴露が、例えば、発熱、嘔吐、上腹部痛、出血性素因、黄疸、ならびに肝不全および腎不全を特徴とする、感染症の第３段階をもたらさないようであってもよい。防御免疫反応は、個人のＹＦＶへの後の暴露が致死的な感染症をもたらさないようであってもよい。
【００２１】
また、ＹＦＶ  ｐｒＭＥ遺伝子カセットを発現する組み換えＭＶＡを生成する方法であって、ａ）一次ニワトリ胚細胞または永久鳥類細胞株を、ＭＶＡに感染させるステップと、ｂ）ｐｒＭＥ遺伝子カセットを備え、またＭＶＡゲノムの非必須領域と相同性の遺伝子カセットに隣接するＤＮＡを備えるプラスミドを、感染した細胞に形質移入するステップと、ｃ）ニワトリ細胞におけるＭＶＡの複製中に、プラスミドをＭＶＡゲノムと再結合させるように細胞を成長させ、それにより、ｐｒＭＥ遺伝子カセットを非必須領域におけるＭＶＡゲノムに挿入するステップと、ｄ）生成される組み換えＭＶＡを得るステップと、を含む方法が提供される。例示的なニワトリ胚細胞は、米国特許第５，３９１，４９１号に記載されている。（Ｓｌａｖｉｋ、Ｃｉａｍｐｏｒ、およびＭａｙｅｒ  １９８３。）他の鳥類細胞（例えば、ＤＦ−１）もまた企図される。この方法において、非必須ＭＶＡ領域は、欠失Ｉ領域、欠失ＩＩ領域（Ｍｅｙｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒ、およびＭａｙｒ  １９９１）、欠失ＩＩＩ領域（Ａｎｔｏｉｎｅら  １９９６）、欠失ＩＶ領域（Ｍｅｙｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒ、およびＭａｙｒ  １９９１）（Ａｎｔｏｉｎｅら  １９９８）、チミジンキナーゼ遺伝子座（Ｍａｃｋｅｔｔ、Ｓｍｉｔｈ、およびＭｏｓｓ  １９８２）、Ｄ４／５遺伝子間領域（Ｈｏｌｚｅｒら  １９９８）、またはＨＡ遺伝子座（Ａｎｔｏｉｎｅら  １９９６）である。例示された一実施形態において、挿入は、欠失ＩＩＩ領域内である。遺伝子は、任意の他の好適なゲノム領域またはゲノム間領域に追加的に挿入されてもよい。
【００２２】
別の態様において、ＹＦＶ  ｐｒＭＥ遺伝子カセットを発現する組み換えＤ４Ｒ−欠損ワクシニアウイルス（ｄＶＶ）が提供される。例示された一実施形態において、遺伝子カセットは、配列番号：１に示されるように、ヒトコドン最適化ＹＦＶ−１７Ｄ  ｐｒＭＥオープンリーディングフレームに動作可能に結合した強固な早期／後期ワクシニアウイルスプロモーターｍＨ５、およびワクシニアウイルス早期転写停止シグナルを備える。オープンリーディングフレームによりコード化されたｐｒＭＥアミノ酸配列は、配列番号：２（および配列番号：４）に示されている。ｐｒＭＥオープンリーディングフレームの配列は、ＹＦＶ−１７Ｄワクチン株ゲノム（受託番号  ＮＣ＿００２０３１）のヌクレオチド４１９〜２４５２に対応する。別の実施形態において、配列番号：３に示されるような遺伝子カセットは、同じヒトコドン最適化ｐｒＭＥオープンリーディングフレームに動作可能に結合した合成早期／後期プロモーター（ｓｅｌＰ）（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ、Ｓｉｓｌｅｒ、およびＭｏｓｓ  １９９７）を含む。ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、複製ワクシニアウイルス（ＶＶ）におけるＤ４Ｒ遺伝子を置き換えてもよく、または、ｄＶＶの非必須領域に挿入されてもよい。他の実施形態において、組み換えｄＶＶにおけるｐｒＭＥポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレームは、配列番号：２に示されるＹＦＶ−１７Ｄ  ｐｒＭＥアミノ酸配列をコード化する任意のヒトコドン最適化オープンリーディングフレームであってもよい。
【００２３】
さらに他の実施形態において、組み換えｄＶＶ  ＹＦＶ  ｐｒＭＥ遺伝子カセットは、配列番号：５に示されるＰａｓｔｅｕｒ  １７Ｄ−２０４  ＹＦＶワクチンｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＣＡＢ３７４１９．１から）；配列番号：６に示されるＹＦＶ  ＹＦＶ１７Ｄ−２１３  ｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＣ５４２６８．１から）、配列番号：７に示される南アフリカ１７Ｄ−２０４  ＹＦＶワクチンｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＣ３５９０７．１から）、配列番号：８に示されるＹＦＶワクチン株１７ＤＤ  ｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＣ５４２６７．１から）、配列番号：９に示されるＹＦＶ株Ａｓｉｂｉ  ｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＴ５８０５０から）、または配列番号：１０に示されるフランス内臓向性ＹＦＶ株ｐｒＭＥポリペプチド配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＡ９９７１３．１から）をコード化してもよい。ポリペプチド配列は、上記段落［００１２］において議論したように変動し得る。ｐｒＭＥポリペプチド配列をコード化するオープンリーディングフレームはまた、ヒトコドン最適化配列であってもよい。遺伝子カセットの発現は、例えば、強固な早期／後期ワクシニアウイルスｍＨ５プロモーターまたは合成早期／後期ｓｅｌＰプロモーターの制御下であってもよい。
【００２４】
ＹＦＶ  ｐｒＭＥ遺伝子カセットを発現する組み換えｄＶＶは、薬学的組成物として製剤化されてもよい。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含む。「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、緩衝剤、ならびに賦形剤、例えばリン酸緩衝生理食塩水、デキストロースまたはマンニトールの５％水溶液、およびエマルジョン、例えば油／水または水／油エマルジョン、ならびに様々な種類の湿潤剤および／またはアジュバントを含む。好適な薬学的担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，１９９５）に記載されている。組成物に有用な薬学的担体は、意図される投与形態に依存する。
【００２５】
本発明は、個人におけるＹＦＶに対する免疫反応を惹起する方法であって、薬学的組成物を前記個人に投与することを含む方法を提供する。この方法において、薬学的組成物は、単回用量、２回用量または複数回用量として投与されてもよい。人間における免疫化ルートは、ｉ．ｍ．またはｓ．ｃ．であってもよい。免疫化用量の範囲は、約１０６〜約１０９ＰＦＵであってもよい。本発明の方法は、個人における液性および細胞性免疫反応を惹起する。さらに、本発明の実施形態において、方法は、個人における防御免疫反応を惹起する。防御免疫反応は、個人のＹＦＶへの後の暴露が熱病をもたらさないようであってもよい。熱病は、発熱、倦怠感、腰痛、頭痛、筋肉痛、吐き気、嘔吐、および疲労等の症状を含む。防御免疫反応は、個人のＹＦＶへの後の暴露が、例えば、発熱、嘔吐、上腹部痛、出血性素因、黄疸、ならびに肝不全および腎不全を特徴とする、感染症の第３段階をもたらさないようであってもよい。防御免疫反応は、個人のＹＦＶへの後の暴露が致死的な感染症をもたらさないようであってもよい。
【００２６】
また、ＹＦＶ  ｐｒＭＥを発現する組み換えｄＶＶを生成する方法であって、ａ）Ｄ４Ｒ補完細胞株を、野生型ＶＶ（例えばＬｉｓｔｅｒ／Ｅｌｓｔｒｅｅ株）に感染させるステップと、ｂ）遺伝子カセットを備え、野生型ＶＶゲノムのＤ３ＲおよびＤ５Ｒ領域と相同性の遺伝子カセットに隣接するＤＮＡを備えるプラスミドを、感染した細胞に形質移入するステップと、ｃ）Ｄ４Ｒ補完細胞株におけるウイルスゲノムの複製中に、プラスミドをウイルスゲノムと再結合させるように細胞を成長させ、それにより、ｐｒＭＥ遺伝子カセットをＤ３Ｒ領域とＤ５Ｒ領域との間のウイルスゲノムに挿入するステップと、ｄ）生成される組み換えｄＶＶを得るステップと、を含む方法が提供される。Ｄ４Ｒ補完細胞株は、ウサギＲＫ４４．２０細胞株（ＨｏｌｚｅｒおよびＦａｌｋｎｅｒ  １９９７）、アフリカミドリザルｃＶｅｒｏ−２２細胞株（Ｍａｙｒｈｏｆｅｒら  ２００９）、またはトランスのＶＶ  Ｄ４Ｒ遺伝子産物を提供するＶＶに許容される任意の他の細胞株であってもよい。
【００２７】
１７Ｄワクチンと比較して、本発明の組み換えワクシニアウイルスは、免疫力のない個人における禁忌を回避し、また、人間において複製可能でないため、向神経性および内臓向性ワクチン関連有害事象を惹起し得ない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＭＶＡ−ＹＦ（Ａｉｉ）およびｄＶＶ−ＹＦ（Ｂｉｉ）のプラスミド伝達ベクター（ｉ）およびゲノム構造（ｉｉ）を示す図である。プラスミドベクターｐｄ３−ｌａｃＺ−ｍＨ５−ＹＦｐｒＭＥｃｏ（Ａｉ）は、ＭＶＡゲノムにおける欠失ＩＩＩ挿入を標的化する。いかなる補助配列も有さない組み換えウイルス（Ａｉｉ）を得るために、一時的なｌａｃＺ／ｇｐｔスクリーニングマーカーには、自己組み換えによるマーカーカセットの除去を媒介するＭＶＡ隣接部の１つの２２０ｂｐ自己反復（Ｒ）が隣接する。プラスミドベクターｐＤＷ−ｍＨ５−ＹＦｐｒＭＥｃｏ（Ｂｉ）の挿入部位は、野生型Ｌｉｓｔｅｒ／Ｅｌｓｔｒｅｅ  ウイルスのＯＲＦｓ  Ｄ３ＲとＤ５Ｒとの間の領域である。ｌａｃＺ／ｇｐｔマーカーカセットは、タンデムＤＮＡ反復（Ｒ）の間に位置し、マーカーカセットの最終的な除去を達成する。得られる組み換え欠損ウイルス（Ｂｉｉ）は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子（Ｄ４Ｒ）を有さないが、まだ１つのタンデム反復を含有する。両方のプラスミド（ＡｉおよびＢｉ）は、早期／後期ワクシニアウイルスｍＨ５プロモーターの制御下で、ヒトコドン最適化ＹＦＶ  ｐｒＭおよびＥコード化領域を含有する。
【図２】感染したニワトリ細胞（ＤＦ−１）の二重免疫染色を示す図である。（Ａ）ＭＶＡ−ＹＦ、（Ｂ）野生型ＭＶＡおよび（Ｃ）ＭＶＡ−ＹＦ／ＭＶＡスパイク対照である。４日後、感染した細胞を固定し、モルモット抗ＹＦＶ−１７Ｄ抗血清およびペルオキシダーゼに共役した抗モルモットＩｇＧでインキュベートした。ｐｒＭＥの発現物質を、ニッケルを含むＤＡＢ溶液により染色する黒色プラークとして可視化した。ｐｒＭＥ発現のないＭＶＡを検出するために、細胞をウサギ抗ワクシニアウイルス血清および抗−ウサギペルオキシダーゼ共役ＩｇＧ抗体でインキュベートし、続いて、ニッケルを含まないＤＡＢ溶液で染色し、褐色プラーク（ｐｒＭＥ非発現物質）を得た。
【図３】許容条件下でのＹＦＶ  ｐｒＭＥタンパク質発現を示す図である。（Ａ）ＭＶＡ−ＹＦに感染したニワトリ細胞（ＤＦ−１）からの溶解物または対応する対照のウエスタンブロットである。ＭＶＡ−ＹＦ（レーン１）、陰性対象、野生型ＭＶＡ（レーン２）、非感染ＤＦ−１細胞（レーン３）、陽性対照ＹＦＶ−１７Ｄ感染ＤＦ−１細胞（１７Ｄ、レーン４）、感染ＨｅＬａ細胞から調製されたＹＦＶ−１７Ｄ（１７Ｄ対照、レーン５）である。（Ｂ）ｄＶＶ−ＹＦに感染したｃＶｅｒｏ２２細胞からの溶解物または対応する対照のウェスタンブロットである。ｄＶＶ−ＹＦ（レーン１）、陰性対象、野生型ｄＶＶ（レーン２）、非感染ｃＶｅｒｏ２２細胞（レーン３）、陽性対照ＹＦＶ−１７Ｄ感染ｃＶｅｒｏ２２（１７Ｄ、レーン４）、１７Ｄ対照（レーン５）である。５０ｋＤａ周囲のバンドは、ＹＦＶエンベロープタンパク質を表す。
【図４】非許容条件下でのＹＦＶ  ｐｒＭＥタンパク質発現レベルの比較を示す図である。（Ａ）（Ａ）マウス筋肉細胞（Ｓｏｌ８）または（Ｂ）組み換え型に感染したヒト細胞（ＨｅＬａ）または対応する対照のウエスタンブロットである。ＭＶＡ−ＹＦ（レーン１）、ｄＶＶ−ＹＦ（レーン２）、陰性対照野生型ＭＶＡ（レーン３）、陰性対照野生型ｄＶＶ（レーン４）、非感染（Ａ）Ｓｏｌ８（Ｂ）ＨｅＬａ細胞（レーン５）、ＹＦＶ−１７Ｄに感染した陽性対照の各細胞（１７Ｄ、レーン６）、１７Ｄ対照（レーン７）である。５０ｋＤａ周囲のバンドは、ＹＦＶエンベロープタンパク質を表す。
【図５】Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける防御試験を示す図である。（Ａ）ＭＶＡ−ＹＦ、（Ｂ）ｄＶＶ−ＹＦの示された用量を用いて、または（Ｃ）陽性対照ＹＦＶ−１７Ｄ（１７Ｄ）および陰性対照野生型ＭＶＡ、欠損ワクシニアウイルス（ｄＶＶ）もしくは緩衝剤（ＰＢＳ）を用いて、動物に単回用量方式でｉ．ｍ．で予防接種した。負荷は、ｉ．ｃ．で、２１日後、１×１０５ＴＣＩＤ５０のＹＦＶ−１７Ｄワクチン株で行い、１４日間監視した。結果は、３回の個々の実験の平均値である。
【図６】ＹＦＶ  Ｅ抗原に対し誘発された細胞性免疫反応を示す図である。（Ａ）ＭＶＡ−ＹＦ、ｄＶＶ−ＹＦまたは対応するＹＦＶ−１７Ｄ（１７Ｄ）陽性または野生型ＭＶＡおよびｄＶＶ陰性対照を用いた２回の免疫化後の、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４＋Ｔ−細胞の数のＦＡＣＳ分析である。マウスからの脾細胞を、ＹＦＶ  Ｅタンパク質の１５ｍｅｒペプチド、Ｅ５７〜７１（Ｅ４；黒いバー）、Ｅ１２９〜１４３（Ｅ５；グレーのバー）およびＥ１３３〜１４７（Ｅ６；白いバー）で刺激した。（Ｂ）上に示したような２回の免疫化後のＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の数のＦＡＣＳ分析である。マウスからの脾細胞を、ＹＦＶ  Ｅタンパク質の９ｍｅｒペプチド、Ｅ６０〜６８（Ｅ１、黒いバー）、Ｅ３３０〜３３８（Ｅ２、グレーのバー）およびＥ３３２〜３４０（Ｅ３、白いバー）で刺激した。（Ｃ）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるペプチドパルス標的細胞の細胞傷害性死滅のＦＡＣＳ分析である。標的細胞に、ＹＦＶ  Ｅタンパク質の９ｍｅｒペプチド、Ｅ６０〜６８（Ｅ１；黒いバー）、Ｅ３３０〜３３８（Ｅ２；グレーのバー）およびＥ３３２〜３４０（Ｅ３、白いバー）を投入した。データは、２つの独立した実験の平均値（＋／−ＳＤ）である。
【図７】防御に対する既存の抗ワクシニア免疫の影響を調査した実験の結果を示す図である。野生型ワクシニアウイルスを用いてＢａｌｂ／ｃマウスにｉ．ｍ．で予防接種し、３ヵ月後に、プライムまたはプライム／ブースト方式で、最適以下（１×１０３ＴＣＩＤ５０）もしくは最適（１×１０５ＴＣＩＤ５０）ｉ．ｍ．用量のＭＶＡ−ＹＦまたは１×１０４ＴＣＩＤ５０のＹＦＶ−１７Ｄウイルスまたは対照として緩衝剤を用いて免疫化した。全ての動物に、１×１０５ＴＣＩＤ５０のＹＦＶ−１７Ｄをｉ．ｃ．で負荷し、生存率について１４日間監視した。免疫化方式および結果を、表２に示す。
【図８】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける組み換え候補ワクチンの安全性を示す図である。（Ａ）動物に、１×１０５〜１×１０７ＴＣＩＤ５０（１×１０７ＴＣＩＤ５０用量のみが示されている）のＭＶＡ−ＹＦ（明るいグレーの線）、ｄＶＶ−ＹＦ（グレーの線）ならびに対応する対照野生型ＭＶＡ（点線）およびｄＶＶ（黒い線）をｉ．ｃ．で注射し、２１日間監視した。（Ｂ）マウスに、１×１０１（明るいグレーの線）、１×１０２（グレーの線）または１×１０３（点線）の用量のＹＦＶ−１７Ｄワクチンをｉ．ｃ．で注射し、２１日間監視した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（実施例）
本発明は、以下の実施例により例示されるが、実施例１および２は、それぞれ、ＹＦＶ株の膜およびエンベロープ（ｐｒＭＥ）タンパク質の前駆体をコード化するコドン最適化遺伝子の、非複製改質ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａへの、およびＤ４Ｒ−欠損ワクシニアウイルスへの挿入の様々な実施形態を説明する。実施例３および４は、様々な細胞における組み換えウイルスからの遺伝子カセットの発現を示す。実施例５および６に記載の実験においては、マウスモデルにおける免疫原性および防御について組み換えウイルスを評価し、市販のＹＦＶ−１７Ｄワクチンと比較した。組み換え生ウイルスは、１０５ＴＣＩＤ５０の単回低免疫化用量後で既に致死的負荷に対する完全防御をもたらし、実質的な量のガンマインターフェロン分泌ＣＤ４−および機能的に活性なＣＤ８  Ｔ細胞を誘導した。実施例７は、野生型ワクシニアウイルスに対する既存の免疫が、防御に悪影響を及ぼさなかったことを示している。実施例８は、従来の１７Ｄワクチンとは異なり、組み換えウイルスのいずれも、マウスへの脳内投与後の病的状態または死亡を引き起こさず、高い安全性プロファイルを示すことを示している。
実施例１
組み換えウイルスＭＶＡ−ＹＦの構築および特性決定
【００３０】
黄熱病株１７ＤのｐｒＭＥコード化配列（ＣＤＳ）を発現する組み換えＭＶＡを構築し、ＭＶＡ−ＹＦと命名した。ワクシニアウイルス早期／後期ｍＨ５プロモーター（Ｗｙａｔｔら  １９９６）の制御下のｐｒＭＥ  ＣＤＳを、化学的に合成した。これにより、元の配列に存在するポックスウイルス早期転写停止シグナル（５ＴＮＴ）の除去、およびアミノ酸配列の改質なしに人間における高い発現レベルを達成するためのヒトコドンの使用のためのオープンリーディングフレームの最適化が可能になった。ｍＨ５プロモーターを含む遺伝子カセットの配列は、配列番号：１に示される。
【００３１】
ＭＶＡ−ＹＦを生成するために、コドン最適化（共）発現カセットを、新たに構築した伝達プラスミドｐｄ３−ｌａｃＺ−ｇｐｔに挿入し、プラスミドｐｄ３−ｌａｃＺ−ｍＨ５−ＹＦｐｒＭＥｃｏ（図１  Ａｉ）を得た。このプラスミドは、相同的組み換えにより、外来遺伝子をＭＶＡの欠失ＩＩＩ（ｄｅｌＩＩＩ）領域に誘導する。ＭＶＡゲノムのｄｅｌ  ＩＩＩ領域への組み換えのための伝達プラスミド（図１  Ａｉｉ）は、以下のステップ（ｉ）〜（ｖ）において構築した。
【００３２】
（ｉ）  ｐｄ３−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅ１。ｄｅｌ  ＩＩＩ領域の左および右隣接部は、右隣接部にはオリゴヌクレオチドｏＹＦ−８（５’−ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＡＧＴ  ＴＴＣ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＡＴＧ  ＴＧＴ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  Ｔ−３’）（配列番号：１１）およびｏＹＦ−９（５’−ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＧＡＡ  ＡＧＴ  ＴＴＴ  ＡＴＡ  ＧＧ−３’）（配列番号：１２）を、また左隣接部にはｏＹＦ−１０（５’−ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＣＴＡ  ＧＣＧ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＡＣＣ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＣＧＡ  ＡＡＧ  ＡＧ−３’）（配列番号：１３）およびｏＹＦ−１１（５’−ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＣＣＡ  ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＡＧＧ−３’）（配列番号：１４）を使用して、野生型ＭＶＡのゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。鋳型としてこれらの２つの断片を、またプライマーｏＹＦ−１１およびｏＹＦ−８を用いて、重複ＰＣＲを行った。断片をベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローン化し、プラスミドｐｄ３−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅ１を得た。
【００３３】
（ｉｉ）  ｐｄ３−ｄｌａｃＺ／Ｎｏｔｒ−ＭＣＳ。残りのｌａｃＺ配列およびｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ−Ａｍｐ  ＳＫ（＋）プラスミドのＰｏｓ．１６１７におけるＮｏｔＩ制限酵素認識部位を、ＢａｍＨＩ、ＢｓｍＦＩまたはＢｓｉＷＩにより除去し、Ｅｅｌ１３６ＩＩ、マングビーン消化に続く平滑末端再連結により、プラスミドｐｄ３−ｄｌａｃＺ／Ｎｏｔｒを得た。ワクシニアＤＮＡ断片間に複数のクローニング部位（ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｌｕＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｔｕＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ）を導入するために、プラスミドをＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで切断し、アニールされたオリゴヌクレオチドｏＹＦ−５０（５’−ＣＴＡ  ＧＣＧ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＣＴＡ  ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＴＡＡ  ＣＴＡ  ＧＴＣ  ＣＧＣ  ＴＣＧ  ＡＧＡ  ＴＴＧ  Ｃ−３’）（配列番号：１５）およびｏＹＦ−５１（５’  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＡＧＧ  ＣＣＴ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  Ｇ−３’）（配列番号：１６）からなるリンカーを導入し、ｐｄ３−ｄｌａｃＺ／Ｎｏｔｒ−ＭＣＳを得た。
【００３４】
（ｉｉｉ）  ｐＤＷ２−ｒｅｐｅａｔ−ｄｅｌＩＩＩ。プラーク精製中の内部相同的組み換えにより、ｌａｃＺ／ｇｐｔ遺伝子カセットの除去を促進するために、左ＭＶＡ隣接部のｄｅｌＩＩＩ自己反復（Ｒ）（Ｓｔａｉｂら  ２０００）を生成した。オリゴヌクレオチドｏＹＦ−４８（５’−ＣＧＣ  ＣＧＴ  ＣＧＡ  ＣＴＡ  ＴＡＴ  ＴＡＧ  ＡＣＡ  ＡＴＡ  ＣＴＡ  ＣＡＡ  ＴＴＡ  ＡＣ−３’）（配列番号：１７）およびｏＹＦ−４９（５’−ＡＴＡ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＡＡＡ  Ｇ−３’）（配列番号：１８）を使用して、ｄｅｌＩＩＩ自己反復（２２０ｂｐ）をｐｄ３−ＳｃｒｉｐｔからのＰＣＲにより増幅し、ｇｐｔ／ｌａｃＺ遺伝子カセットの下流側のｐＤＷ２のＳａｌＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間でクローン化した（Ｈｏｌｚｅｒら  １９９８）。
【００３５】
（ｉｖ）  ｐｄ３−ｌａｃＺ−ｇｐｔ。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を使用して、ｐＤＷ２−ｒｅｐｅａｔ−ｄｅｌＩＩＩのｌａｃＺ／ｇｐｔ  ｄｅｌＩＩＩ自己反復断片をｐｄ３−ｌａｃＺ／Ｎｏｔｒ−ＭＣＳにクローン化し、ｐｄ３−ｌａｃＺ−ｇｐｔを得た。
【００３６】
（ｖ）  ｐｄ３−ｌａｃＺ−ｍＨ５−ＹＦｐｒＭＥｃｏ。強固な早期／後期ワクシニアウイルスプロモーターｍＨ５の制御下のＹＦＶ  ｐｒＭＥ  （ＹＦｐｒＭＥｃｏ）遺伝子（受託番号  ＮＣ＿００２０３１をコード化するオープンリーディングフレーム（Ｒｉｃｅら  １９８５）を、ヒトコドンの使用（ｃｏ）のために最適化し、合成した（Ｇｅｎｅａｒｔ、レーゲンスブルグ、ドイツ）。合成配列は、ワクシニアウイルス早期転写停止シグナルを含まず、そのようなシグナルは、コード化領域のすぐ下流側に導入された。発現カセットを、ｐｄ３−ｌａｃＺ−ｇｐｔのＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入し、ｐｄ３−ｌａｃＺ−ｍＨ５−ＹＦｐｒＭＥｃｏ（図１  Ａｉ）を得た。
【００３７】
組み換えＭＶＡ−ＹＦの構築および精製は、以下のように行った（図１Ａ（ＩＩ））。２０マイクログラムのｐｄ３−ｌａｃＺ−ｍＨ５−ＹＦｐｒＭＥｃｏプラスミドを、リン酸カルシウム沈澱によりＭＶＡ感染一次ニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）に形質移入した。ＣＥＣは、１２日齢ニワトリ胚から生成され、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００ＵＩ／ｍｌ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｌｏｎｚａ）および１００ＵＩ／ｍｌ  ＮＥＡＡ（Ｌｏｎｚａ）を含有するＭｅｄｉｕｍ  １９９（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させたものである。組み換えウイルスは、以前に説明されたように（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ、Ｄｏｒｎｅｒ、およびＦａｌｋｎｅｒ  １９９８）一時的マーカー安定化法を使用して選択された。精製ＭＶＡ−ＹＦクローンを、ＣＥＣ中で大規模伝播用に展開した。数ラウンドのプラーク精製後、最初は選択的圧力を用いて、次いで用いずに（Ｗｙａｔｔら  １９９６）、ＭＶＡ−ＹＦウイルスと指定される最終的組み換えウイルスを得た（図１  Ａｉｉ）。このウイルスは、ＭＶＡ  ｄｅｌ  ＩＩＩ挿入部位においてワクシニアウイルスｍＨ５プロモーターにより制御されたｐｒＭＥを含有し、追加的な外来配列を含まない。
【００３８】
代替として、ｐｄ３−ｌａｃＺ−ｍＨ５−ＹＦｐｒＭＥｃｏと等価であるが、ｍＨ５プロモーターの代わりにＳａｃＩ／ＳｐｅＩ制限酵素認識部位間に合成Ｅ／Ｌプロモーター（ｓｅｌＰ）を含有するプラスミド（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら  １９９７）を構築した。ｓｅｌＰプロモーターは、オリゴヌクレオチドｏＹＦ−３９（５’−ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  ＡＡＡ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡＡ  ＡＴＡ  ＧＡＧ  ＣＴ−３’）（配列番号：１９）およびｏＹＦ−４０（５’−ＣＴＡ  ＴＴＴ  ＡＴＡ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＡＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＧＡＴ  ＣＣＡ−３’）（配列番号：２０）をアニールすることにより生成した。遺伝子カセットの配列は、配列番号：３に示される。ｓｅｌＰプロモーターの制御下のＹＦＶ  ｐｒＭＥ遺伝子カセットを有する組み換えＭＶＡ−ＹＦの構築および精製は、段落［００３６］において説明したように行った。ｐｄ３−ｌａｃＺ−ｍＨ５−ＹＦｐｒＭＥｃｏプラスミドの代わりに、ｐｄ３−ｌａｃＺ−ｓｅｌＰ−ＹＦｐｒＭＥｃｏプラスミドを導入に使用した。
【００３９】
別の代替として、外来遺伝子をＭＶＡのＨＡ遺伝子座に方向付けるために、ｍＨ５またはｓｅｌＰプロモーターの制御下のＹＦｐｒＭＥｃｏカセットを、それぞれ伝達プラスミドｐＨＡ−ｖＡ（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら  １９９８）のＸｈｏＩ／ＳｎａＢＩ制限酵素認識部位間に挿入し、それぞれプラスミドｐＨＡ−ｍＨ５−ＹＦｐｒＭＥｃｏまたはｐＨＡ−ｓｅｌＰ−ＹＦｐｒＭＥｃｏを得た。同様に相同的組み換えを行い、ＭＶＡ−ｍＨ５ＹＦまたはＭＶＡ−ｓｅｌＰＹＦと命名される、代替の挿入部位を有する組み換えＭＶＡ−ＹＦを生成した。
【００４０】
組み換えウイルスからの野生型ＭＶＡの不在は、ＰＣＲ分析および二重免疫染色アッセイにより確認した。ＰＣＲ分析では、隣接領域において欠失ＩＩＩ統合部位に結合し、ＭＶＡ−ＹＦを有する３４９０ｂｐのフラグメント、および野生型ＭＶＡを有する１２９８ｂｐの断片をもたらすプライマー対を選択した。このアッセイは、組み換えＭＶＡ−ＹＦ株が、１０００ＰＦＵの組み換えウイルス中約１ＰＦＵの汚染物質の検出限界において、親野生型ウイルスを含まないことを裏付けた（データは示さず）。
【００４１】
ＹＦ抗原を発現する能力を失った潜在的な汚染野生型ウイルスまたは組み換え型を検出するために、ＤＦ−１細胞またはｃＶｅｒｏ２２細胞（Ｍａｙｒｈｏｆｅｒら  ２００９）を６ウェルプレート内で培養し、１０、１００または１０００ＰＦＵの組み替え型に感染させた。野生型ウイルスならびに野生型ウイルスおよびそれぞれの組み換え型の混合物を、対照として使用した。５％ＣＯ２中での３７℃で１時間のインキュベーション後、ウイルス接種材料を吸引し、５％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭを含む３ｍｌの０．５％カルボキシメチルセルロース重層培地を、各ウェルに添加した。４日間のインキュベーション後、重層培地を除去し、メタノール／アセトン（１：１）で細胞を固定した。ＹＦＶ  Ｅタンパク質発現物質のプラークを検出するために、ＹＦＶ−１７Ｄに対するｇｐ抗血清を使用した。ヤギ抗モルモットホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、二次抗体として使用した。ニッケルを含むジアミノベンジジン（ＤＡＢ）溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でプラークを可視化し、黒色プラークを得た。ＭＥ発現のないＭＶＡプラークを検出するために、ポリクローナルウサギ抗ワクシニアウイルス血清を使用した（ロット番号ＡＶＶＳＫＰ２６０１２００６）。二次抗体は、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ共役ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｎｃ）であった。ニッケルを含まないＤＡＢ溶液でプラークを可視化し、褐色プラークを得た。黒色および褐色プラークを、視覚的に計数した。
【００４２】
ＭＶＡ−ＹＦ感染細胞は、ｐｒＭＥタンパク質を発現する組み換え型を表す一様に黒色の巣を示したが（図２Ａ）、これは、株が野生型ＭＶＡまたはｐｒＭＥ発現を有さない任意の異常な組み換え型（非発現物質）を含まないことを示唆している。野生型ＭＶＡ対照においては、褐色の巣のみが見られ（図２Ｂ）、一方ＭＶＡ−ＹＦ／ＭＶＡスパイク対照は、明確に区別可能な褐色および黒色の巣を、予測される割合で含有した（図２Ｃ）。
実施例２
組み換えウイルスｄＶＶ−ＹＦの構築および特性決定
【００４３】
並行して、コドン最適化ｐｒＭＥ  ＣＤＳを発現するＤ４Ｒ−欠損ワクシニアウイルス（ｄＶＶ）を生成し、ｄＶＶ−ＹＦと命名した。この目的のために、ｍＨ５−ｐｒＭＥカセットをプラスミドｐＤＷ２に挿入し、ｐＤＷ−ｍＨ５−ＹＦｐｒＭＥｃｏ（図１Ｂｉ）を得た。
【００４４】
Ｄ４Ｒ−欠損ワクシニアウイルスの生成のために、プラスミドｐＤＷ−２（Ｈｏｌｚｅｒら１９９８）の誘導体を構築した。ｐＤＷ−２は、相同的組み換えのためのＤ３ＲおよびＤ５Ｒ遺伝子のワクシニアウイルスゲノム配列、ならびに一時的選択および青色プラークスクリーニングを可能とするタンデムＤＮＡ反復間に位置するｌａｃＺ／ｇｐｔマーカーカセットを含有する。合成ｍＨ５−ＹＦｐｒＭＥｃｏ遺伝子カセットを、プラスミドｐＤＷ−２のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入し、ｐＤＷ−ｍＨ５−ＹＦｐｒＭＥｃｏ（図１Ｂｉ）を得た。プロモーターおよびｐｒＭＥ遺伝子カセットの配列を、配列分析により検証した。
【００４５】
このプラスミドを使用して非複製ウイルスｄＶＶ−ＹＦを構築したが、ＹＦＶ  ｐｒＭＥ発現カセットは、ワクシニアＤ３Ｒ遺伝子とＤ５Ｒ遺伝子との間に挿入され、必須Ｄ４Ｒ遺伝子を置き換える。Ｄ４Ｒ補完ｃＶｅｒｏ２２細胞を野生型ＶＶ（株Ｌｉｓｔｅｒ／Ｅｌｓｔｒｅｅ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎからのＶＲ−８６２）に感染させること、組み換えプラスミドの形質移入、および数ラウンドのプラーク精製により、組み換えウイルスを生成した。ｄＶＶ−ＹＦ（図１Ｂｉｉ）。組み換え複製欠損ワクシニアウイルス（ｄＶＶ−ＹＦ）を生成するために、２０マイクログラムのｐＤＷ２−ｍＨ５−ＹＦｐｒＭＥｃｏを、ワクシニアウイルスＬｉｓｔｅｒ／Ｅｌｓｔｒｅｅ感染ｃＶｅｒｏ２２細胞に導入した（Ｍａｙｒｈｏｆｅｒら  ２００９）。以前に説明されているようにプラーク精製を行った（ＨｏｌｚｅｒおよびＦａｌｋｎｅｒ  １９９７）。この手順により得られた欠損ｄＶＶ−ＹＦの精製された分離株を、ｃＶｅｒｏ細胞において大規模に増幅し、さらなる特性決定に供した。
【００４６】
これらのステップにより、ｄＶＶ−ＹＦと命名される複製欠損組み換えウイルスが得られた（図１Ｂｉｉ）。組み換え型は、ＰＣＲにより特性決定されるように、いかなるマーカー遺伝子も有さない意図される遺伝子構造を有した。これは、野生型細胞においては成長不能であり、二重免疫染色により分析された全てのプラークは、ｐｒＭＥタンパク質を発現した（データは示さず）。
実施例３
許容細胞における抗原発現
【００４７】
ＭＶＡ−ＹＦによるｐｒＭＥ発現パターンを、まずＭＶＡ複製に許容される条件下で試験した。この目的のために、鳥類ＤＦ−１細胞を、ＭＶＡ−ＹＦ、または対照としての野生型ＭＶＡもしくはＹＦＶ−１７Ｄ（１７Ｄ）（市販のワクチンＳｔａｍａｒｉｌ、Ｓａｎｏｆｉ／Ｐａｓｔｅｕｒ）に、０．０１ＭＯＩで感染させた。感染細胞を４日間インキュベートし、ポリクローナル抗ＹＦＶ−１７Ｄ抗血清を使用して、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により調査した。
【００４８】
ＭＶＡ−ＹＦおよびｄＶＶ−ＹＦ組み換え型によるｐｒＭＥタンパク質の発現を、ウェスタンブロッティングにより評価した。許容条件下での発現を分析するために、ＤＦ−１細胞、または、欠損組み換え型の場合、ｃＶｅｒｏ細胞を、０．０１のＭＯＩに４日間感染させた。非許容条件下での分析のために、ＨｅＬａまたはＳｏｌ８細胞を、１０のＭＯＩに７２時間感染させた。並行して、細胞を対照としての対応する野生型ワクシニアウイルスまたはＹＦＶ−１７Ｄに感染させた。超音波処理および熱処理された細胞溶解物を、１２％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｉｎｃ）上に投入し、ニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ）上にブロットした。ｐｒＭＥタンパク質を検出するために、ＹＦＶ−１７Ｄに対するポリクローナルモルモット（ｇｐ）抗血清を使用した。ヤギ抗モルモットホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、二次抗体として使用した。ＹＦＶ−１７Ｄ感染ＨｅＬａ細胞（ＭＯＩ０．０１で３日間）は、陽性対照として機能した。
【００４９】
図３Ａに示されるように、組み換えＭＶＡ−ＹＦにより発現されたＹＦエンベロープ（Ｅ）タンパク質（レーン１）は、フラビウイルスＥタンパク質の予測されるサイズ（Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ  ＢＤ、Ｔｈｉｅｌ  ＨＪ、およびＲｉｃｅ  ＣＭ  ２００７）である５０ｋＤａサイズ範囲において、単一バンドとして表れた。同一のバンドは、１７Ｄ対照（レーン５）においても検出可能であった。組み換えＭＶＡのＥタンパク質発現レベルは、ＹＦＶ−１７Ｄ感染（レーン４）の場合よりも高かった。鳥類ＤＦ−１細胞におけるＹＦＶ−１７Ｄの低い発現レベルは、繰り返し見られた。
【００５０】
また、ＨＡ遺伝子座におけるＹＦｐｒＭＥｃｏカセットを有する組み換えＭＶＡ−ＹＦの発現パターンを、ヒト細胞株において研究した。ｍＨ５またはｓｅｌＰプロモーターの制御下のｐｒＭＥｃｏ発現を分析するために、それぞれ、ヒト（ＨｅＬａ）細胞を１０のＭＯＩのＭＶＡ−ｓｅｌＰＹＦに２度感染させた。感染細胞を１日間インキュベートし、抗ＹＦＶ抗血清を使用して、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により調査した。ＨｅＬａ細胞において、同程度の量のＥタンパク質が、ＭＶＡ−ｍＨ５ＹＦおよびＭＶＡ−ｓｅｌＰＹＦ感染において見られた（データは示さず）。
【００５１】
Ｄ４Ｒ−欠損ワクシニアの複製を支持するｄＶＶ−ＹＦによるｐｒＭＥ発現を調査するために、補完Ｖｅｒｏ細胞株ｃＶｅｒｏ２２を、０．０１のＭＯＩでｄＶＶ−ＹＦまたは対照としてのｄＶＶ野生型ウイルスもしくはＹＦＶ−１７Ｄに感染させた。さらなるステップは、上述のように行った。
【００５２】
図３Ｂに示されるように、組み換えｄＶＶ−ＹＦ（レーン１）は、ＹＦＶ−１７Ｄウイルス（レーン４）と同様に、感染ｃＶｅｒｏ２２細胞においてＥタンパク質を発現した。
実施例４
非許容細胞における抗原発現
【００５３】
組み換えＭＶＡ−ＹＦおよびｄＶＶ−ＹＦを、免疫反応を惹起するための人間における使用のために設計し、マウス防御モデルにおいて有効性を評価した。マウスおよび人間の生体において、これらのウイルスは複製しない。ウイルス複製が存在しないにもかかわらず、ＹＦＶタンパク質発現は、効率的な免疫反応の惹起のために妥当なレベルで生じるべきである。この理由のために、組み換えＭＶＡ−ＹＦおよびｄＶＶ−ＹＦの両方に非許容性の人間およびマウス細胞株における発現パターンもまた研究した。マウス筋肉（Ｓｏｌ８）または人間（ＨｅＬａ）の細胞を、１０のＭＯＩのＭＶＡ−ＹＦまたはｄＶＶ−ＹＦ、および対応する対照に感染させた。感染細胞を２日間インキュベートし、抗ＹＦＶ抗血清を使用して、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により調査した。
【００５４】
Ｓｏｌ８筋肉細胞における発現は、マウスが筋肉内注射（ｉ．ｍ．）で免疫化される選択されたマウス負荷モデルにおいて、標的細胞型を反映すべきである。図４Ａに示されるように、組み換えＭＶＡ−ＹＦ（レーン１）およびｄＶＶ−ＹＦ（レーン２）は、同程度の量でＥタンパク質を発現した。陰性対照（レーン３〜５）において予測されるように、ＹＦＶタンパク質は検出不可能であった。この設定において、ＹＦＶ−１７Ｄ陽性対照（レーン６）によるＥタンパク質発現は、検出限界を下回っていた。
【００５５】
ＨｅＬａ細胞（図４Ｂ）においても、ＭＶＡ−ＹＦ（レーン１）およびｄＶＶ−ＹＦ（レーン２）感染において同程度の量のＥタンパク質が見られた。ＹＦＶ−１７Ｄ感染細胞（レーン６）は、同程度の量のＥタンパク質を示した。したがって、非複製ＭＶＡ−ＹＦまたはｄＶＶ−ＹＦで予防接種した人間において、有意なレベルでのＹＦＶ抗原の正しい発現が予測され得る。
実施例５
マウスにおける防御研究
【００５６】
次に、ＹＦＶ−１７Ｄウイルスでの致死的ｉ．ｃ．負荷に対しマウスを防御する組み換えＭＶＡ−ＹＦおよびｄＶＶ−ＹＦの能力を分析した。全ての動物実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により見直され、オーストリア規制当局により承認された。全ての動物実験は、動物実験に関するオーストリア法およびＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）により規定された指針に従って行われた。動物は、ＡＡＡＬＡＣ公認の施設において飼育された。
【００５７】
６匹のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の群を、ＰＢＳ−０．０１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）緩衝液中５０μｌの体積で、１×１０２〜１×１０５ＴＣＩＤ５０の用量範囲にわたるＭＶＡ−ＹＦまたはｄＶＶ−ＹＦの単回筋肉内注射で免疫化した。対照群を、ＰＢＳ−０．０１％ＨＳＡ中５０μｌの体積で、１×１０６ＴＣＩＤ５０の野生型ＭＶＡ、ｄＶＶもしくは陰性対照としてのＰＢＳ、および陽性対照としての１×１０４ＴＣＩＤ５０（人間に対する用量と同等）のＹＦＶ−１７Ｄで、またはＰＢＳ緩衝液で免疫化した。マウスを、予防接種後２１日目に、１×１０５ＴＣＩＤ５０（＞１０００マウス致死用量５０（ＬＤ５０））のＴＢＳ−０．０１％ＨＳＡ緩衝液中ＹＦＶ−１７Ｄで脳内（ｉ．ｃ．）負荷し、臨床症状および生存率について１４日または２１日間監視した。９週齢のマウスにおけるＬＤ５０を、約８３ＴＣＩＤ５０であると決定した（データは示さず）。
【００５８】
ＭＶＡ−ＹＦによる防御は、明らかに用量依存性であった（図５Ａ）。動物当たり１×１０５ＴＣＩＤ５０の最高用量は、完全な防御を与え、１×１０２の最低用量であっても、動物の５０％超を防御した。また、ｄＶＶ−ＹＦ群（図５Ｂ）において、防御は用量依存性であり、１×１０５ＴＣＩＤ５０の最高免疫化用量において１００％生存率であった。しかしながら、より低い用量は、組み換えＭＶＡ−ＹＦと同様に防御しなかった。１×１０２ＴＣＩＤ５０の用量は、３０％未満を防御した。野生型ワクシニアウイルスまたはＰＢＳを注射した全ての陰性対照群は、死亡したか、または最大２０％の低い生存率を示した。予測されたように、ＹＦＶ−１７Ｄで免疫化した群において、完全な防御が見られた（図５Ｃ）。
【００５９】
防御の相関を明確化するために、中和抗体力価を、負荷前血清において１９日目に分析した。単回用量での予防接種後、ＰＲＮＴ５０力価は低かった。これは、最高免疫用量までの組み換えウイルスによる予防接種だけでなく、ＹＦＶ−１７Ｄによる予防接種に対しても事実であった。したがって、マウスに対し、１０４、１０６、１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＹＦもしくはｄＶＶ−ＹＦまたは陽性対照としての１０４および１０６ＴＣＩＤ５０のＹＦＶ−１７Ｄウイルスの単回または２回用量の接種を施す第２の実験を行った。さらに、マウスを、陰性対照としての１×１０７ＴＣＩＤ５０の空ＭＶＡまたはｄＶＶベクターの２回用量で免疫化した。
【００６０】
血清を、一次免疫化後４２日目に採取し、ＰＲＮＴ５０アッセイにより、ＹＦＶ中和抗体について分析した。ウェル当たり約３×１０５個のＶｅｒｏ細胞を、６ウェルプレートに播種し、一晩培養してコンフルエントな単層を得た。血清を、５６℃で３０分間補体不活性化した。予防接種前の血清を、１：１０希釈で試験し、これに１００ＰＦＵのＹＦＶ−１７Ｄを添加した。予防接種後の血清の連続２倍希釈液を、１００ＰＦＵのＹＦＶ−１７Ｄ株と混合し、４℃で一晩インキュベートした。ウイルスおよび血清の混合物を、Ｖｅｒｏ細胞単層に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ウイルス／血清混合物を、０．７５％カルボキシメチルセルロース−ＤＭＥＭ溶液で置き換え、４日間インキュベートし、上述のように免疫染色により可視化した。中和抗体力価は、予防接種前の血清に比べて少なくとも５０％ウイルスプラークの数を低減した最大血清希釈の逆数である。
【００６１】
以下の表１に示されるように、両方の組み換えワクチンは、１０５ＴＣＩＤ５０の１回の適用後、１００％防御を誘導したが、ＰＲＮＴ５０力価は、１０７ＴＣＩＤ５０の最高用量後であっても測定不可能であるか、または僅かしか測定されなかった。ＹＦＶ−１７Ｄワクチンのみが、１０４および１０６ＴＣＩＤ５０の単回用量投与後に、測定可能な中和力価を誘導した。
【表１】
2013538577.tif 000002
【００６２】
ＭＶＡ  ＹＦおよびｄＶＶ  ＹＦでの第２の予防接種後、中和力価は、用量依存的に検出可能であった。ここで、ＭＶＡ系ワクチンは、平均して、ｄＶＶ−ＹＦワクチンよりも幾分高い力価を示した。ＹＦＶ−１７Ｄワクチンで最も高い中和力価が誘導され、野生型ＭＶＡおよびｄＶＶ免疫化マウスにおいてＰＲＮＴ５０は測定不可能であった。
実施例６
マウスにおけるエンベロープタンパク質特異的Ｔ細胞の誘導
【００６３】
液性免疫反応の惹起およびエンベロープタンパク質に対する中和抗体の生成は、生ＹＦＶ−１７Ｄワクチンでの予防接種後の大きな防御機序を示すが（Ｍｏｎａｔｈ  １９８６；ＭｏｎａｔｈおよびＢａｒｒｅｔｔ  ２００３）、細胞性免疫反応もまた、感染に対する防御において重要な役割を果たすと考えられる（ＬｉｕおよびＣｈａｍｂｅｒｓ  ２００１；Ｃｏら  ２００２；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｏｓｔら  ２００２；ＭｏｎａｔｈおよびＢａｒｒｅｔｔ  ２００３；Ｍａｃｉｅｌ，Ｊｒ．ら  ２００８）。最近、ＹＦＶ−１７Ｄワクチンにより惹起されるＴ細胞反応が特性決定された（Ｍａｃｉｅｌ，Ｊｒ．ら  ２００８）。この報告において、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）マウスが１７Ｄワクチン株を接種され、ＣＤ８−およびＣＤ４特異的エピトープが調査された（Ｍａｃｉｅｌ，Ｊｒ．ら  ２００８）。
【００６４】
ＭＶＡ−ＹＦまたはｄＶＶ−ＹＦ予防接種後のＴ細胞反応をＹＦＶ−１７Ｄワクチンと比較するために、ワクシニアウイルス組み換え型または対応する対照でマウスを２回免疫化した（０週目および３週目）。２８日目に脾細胞を調製し、ＹＦエンベロープから得られたＣＤ８−およびＣＤ４−特異的ペプチドでｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した（Ｍａｃｉｅｌ，Ｊｒ．ら  ２００８）。ＩＦＮ−γ生成Ｔ細胞のパーセンテージを、ＦＡＣＳに基づく細胞内サイトカインアッセイにより決定した。上述のようにマウスを免疫化し、免疫化後２８日目に脾臓を採取し、脾細胞懸濁液を調製した。以前に説明されたように（Ｍａｙｒｈｏｆｅｒら．２００９）、フローサイトメトリーによるＩＦＮ−γ反応アッセイおよび特異的ＣＤ８  Ｔ細胞によるペプチドパルス標的細胞の死滅の分析を使用して、ワクチン特異的細胞媒介免疫を評価した。以下の以前に説明された（Ｍａｃｉｅｌ，Ｊｒ．ら  ２００８）黄熱病エンベロープタンパク質からの合成ペプチドを使用して、脾細胞を刺激した：Ｅ５７〜７１、Ｅ１２９〜１４３、Ｅ１３３〜１４７（ＣＤ４  Ｔ細胞により認識される１５ｍｅｒペプチド）およびＥ６０〜６８、Ｅ３３０〜３３８、Ｅ３３２〜３４０（ＣＤ８  Ｔ細胞により認識される９ｍｅｒペプチド）。
【００６５】
ｐｒＭＥ発現組み換えＭＶＡ−ＹＦ、ｄＶＶ−ＹＦにより、および対応する対照により得られた２つの独立した実験のＣＤ４特異的反応（Ｔｈ１）の結果を、図６Ａに示す。ペプチドＥ４〜Ｅ６による刺激後、組み換えＭＶＡ−ＹＦは、ＣＤ４陽性ＩＦＮ−γ生成Ｔ細胞の最も高い頻度を誘導し、一方、ｄＶＶ−ＹＦおよびＹＦＶ−１７Ｄは、幾分低いが一般に同程度の量の特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を誘導する。予測されるように、野生型対照は、有意な反応を誘導しなかった。
【００６６】
Ｅペプチドによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後の組み換え型および対照により誘導されたワクチン特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を、図６Ｂに示す。最大５％のＣＤ８  Ｔ細胞が、免疫優性ペプチドＥ１に反応した。ワクチン特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の最高頻度は、ＭＶＡ組み換え型、続いてｄＶＶ−ＹＦにより免疫化されたマウスにおいて検出された。ＹＦＶ−１７ＤワクチンによるＣＤ８  Ｔ細胞活性化は、組み換え型によるものよりもはるかに低いレベルであった。
【００６７】
エンベロープ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞が機能的に活性であったこと、および特異的ＹＦＶエンベロープペプチドでパルスされた標的細胞を死滅させることを検証するために、蛍光技術に基づく細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）死滅アッセイを使用した（Ｈｅｒｍａｎｓら  ２００４）。この目的のために、脾細胞をペプチド提示および染料標識化標的および対照細胞でインキュベートした。脾細胞の接種後の対照細胞の低減に対するペプチドパルス標的細胞の低減は、機能性ＣＴＬの存在を示す。Ｅ１パルス標的細胞においてのみ、有意なＣＴＬ特異的死滅（図６Ｃ）が誘導された。ＭＶＡ−ＹＦ（３６％±０）、ｄＶＶ−ＹＦ（４８％±２３）およびＹＦＶ−１７Ｄ（３８．５％±１６．５）で免疫化された群においては、死滅は同程度であった。要約すると、ＭＶＡおよびｄＶＶ組み換え型、ならびにＹＦＶ−１７Ｄワクチンでの免疫化は、機能的に有効なＣＴＬを誘導した。
実施例７
防御に対する既存の免疫の影響
【００６８】
人間集団の一部が以前の予防接種に起因するワクシニアウイルスに対する免疫を有すると仮定すると、天然痘予防接種を受けているかまたはＭＶＡ組み換えワクチンで予防接種されているかに関わらず（Ｃｅｂｅｒｅ  ｅｔら  ２００６；Ｂｅｊｏｎ  ｅｔら  ２００７；Ｈａｒｒｏｐら  ２００８；Ｂｒｏｏｋｅｓら  ２００８）、ベクターに対する既存の免疫の、組み換えワクチンによる防御に対する影響を分析することが重要である。ワクシニアウイルスに対する以前の暴露が組み換え型の有効性に影響するか調査するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、まず２×１０６ＴＣＩＤ５０野生型ＭＶＡ（単回および２回用量）またはワクシニアウイルスＬｉｓｔｅｒ／Ｅｌｓｔｒｅｅのそれぞれで免疫化した。３ヵ月後、動物を、１×１０３ＴＣＩＤ５０の最適以下の単回または２回用量で、または１×１０５ＴＣＩＤ５０の通常防御用量のＭＶＡ−ＹＦ、ｄＶＶ−ＹＦ、および対応する対照で予防接種した。最後に、動物を１，０００倍を超えるＬＤ５０  ＹＦＶ−１７Ｄで負荷した。実験計画および結果は、以下の表２に概説される。ＭＶＡ−ＹＦでの免疫化前、血清を採取してワクシニアウイルス特異的中和抗体力価（ＰＲＮＴ５０）を決定した。ワクシニアウイルスに対する中和抗体の試験は、上述のように行ったが、ただし、ワクシニアウイルス株Ｌｉｓｔｅｒ  ／Ｅｌｓｔｒｅｅ（ＡＴＣＣ  ＶＲ  ８６２）を標的ウイルスとして使用し、中和は３７℃で１時間行った。ＶＶプラークを、クリスタルバイオレット溶液で染色した。
【表２】
2013538577.tif 000003
【００６９】
事前予防接種なし（図７Ａ）での単回最適以下用量のＭＶＡ−ＹＦを得た全ての動物は、負荷後に死亡した（表２、第４群）。興味深いことに、野生型ワクシニアウイルスで予防接種されたマウス（第１〜３群）は、事前予防接種なし（第４群）の動物と比較して、防御の増加を示した。最善の防御は、ワクシニアウイルスＬｉｓｔｅｒ／Ｅｌｓｔｒｅｅ株（８３％；第１群）で予防接種された動物、続いて単回（５０％；第２群）または２回（１７％；第３群）用量ＭＶＡ野生型を得た群において誘導された。しかしながら、ワクシニアウイルス特異的中和抗体力価（表２）と防御の程度との間に相関は観察されなかった。
【００７０】
２回用量のＭＶＡ−ＹＦで免疫化された群においては、野生型ウイルスによる異なる事前予防接種の効果は見られなかった（図７Ｂ、表２、第５〜８群）。既存の免疫なし（５８％生存率）またはあり（ＶＶ  ＰＲＮＴ５０１６０〜８００、５０〜６０％生存率）の群において、同程度の防御が達成された。さらに、最適用量の１×１０５ＴＣＩＤ５０  ＭＶＡ−ＹＦは、ＭＶＡに対する既存の免疫（ＶＶ  ＰＲＮＴ５０  ３２０）にも関わらず、まだ１００％防御を誘導することができることが確認された（第９、１０群）。したがって、既存の抗ワクシニアウイルス免疫は、致死的ＹＦＶ−１７Ｄ負荷に対するＭＶＡ−ＹＦの防御に対する悪影響を有さなかった。
実施例８
ＭＶＡ−ＹＦおよびｄＶＶ−ＹＦの安全性
【００７１】
ｐｒＭＥ遺伝子の導入がワクシニアウイルスベクターの伝染力を改変し得る可能性を考慮して、ワクチンの安全性プロファイルを試験した。この目的のために、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１×１０５〜１×１０７ＴＣＩＤ５０ＭＶＡ−ＹＦ、ｄＶＶ−ＹＦの高用量、および対応する野生型ウイルスでｉ．ｃ．で負荷した。ＹＦＶ−１７Ｄワクチンによる組み換え型の安全性プロファイルも比較するため、１×１０１〜１×１０３ＴＣＩＤ５０のＹＦＶ−１７Ｄを脳内投与した。
【００７２】
ワクシニアウイルス負荷群において、１×１０７ＴＣＩＤ５０（図８Ａ）の最高用量で完全な生存率が見られた。さらに、野生型ワクシニアベクターと組み換え型との間に差はなかった。ＹＦＶ−１７Ｄ負荷マウスとは対照的に、非常に低い用量の１×１０２ＴＣＩＤ５０ＹＦＶ−１７Ｄは、６５％死亡率を誘導し、１×１０３ＴＣＩＤ５０は、マウスの１００％を死亡させた（図８Ｂ）。結論として、非複製ワクシニア系ワクチンは安全であり、非常に高い用量でもマウスを死亡させない。さらに、ｐｒＭＥ遺伝子の導入は、ワクシニアベクターの安全性プロファイルを改変せず、一方低用量のＹＦＶ−１７Ｄワクチンは、ｉ．ｃ．投与後にマウスを死亡させた。
【００７３】
上述の実施例により本発明を例示したが、その変形例は当業者に明らかである。したがって、以下の特許請求の範囲に記載のもの以外の限定は、本発明に付与されるべきではない。
【化１】
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【化２】
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【化３】
2013538577.tif 000006
【化４】
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【化５】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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