(57)【要約】  本発明は、インビボでのアポトーシスの放射性医薬品イメージングに関する。本発明は、アポトーシス細胞の表面に露出しているアミノリン脂質のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）への選択的結合によってアポトーシス細胞を標的化するイメージング剤を提供する。放射性医薬品は、ＰＥ結合ペプチドのキレーターコンジュゲートの放射性金属錯体を含んでいる。また、放射性医薬組成物、キット及びインビボイメージング方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式Ｉの化合物を含んでなるイメージング剤。
Ｚ1−（Ｌ）n−[ＬＢＰ]−Ｚ2
（Ｉ）
（式中、
ＬＢＰは次の式ＩＩのランチビオチックペプチドであり、
Ｃｙｓa−Ｘａａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒb−Ｃｙｓc−Ｓｅｒd−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒc−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃｙｓb−（ＨＯ−Ａｓｐ）−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒa−Ｌｙｓd
（ＩＩ）
（式中、
ＸａａはＡｒｇ又はＬｙｓであり、
Ｃｙｓa−Ｔｈｒa、Ｓｅｒb−Ｃｙｓb及びＣｙｓc−Ｔｈｒcはチオエーテル結合を介して共有結合しており、
Ｓｅｒd−Ｌｙｓdはリシノアラニン結合を介して共有結合しており、
ＨＯ−Ａｓｐはβ−ヒドロキシアスパラギン酸である。）
Ｚ1−（Ｌ）n−はＬＢＰのＣｙｓa及び任意にはＸａａにも結合しており、ここでＺ1は４以上の金属ドナー原子を有するイメージング剤の放射性金属錯体を含み、
Ｚ2はＬＢＰのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢc（式中、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）又はＭIGであり、ＭIGはＬＢＰペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基である代謝阻害基であり、
Ｌは式−（Ａ）m−（式中、各Ａは独立に−ＣＲ2−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ2−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ2ＮＲ−、−ＮＲＳＯ2−、−ＣＲ2ＯＣＲ2−、−ＣＲ2ＳＣＲ2−、−ＣＲ2ＮＲＣＲ2−、Ｃ4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基又はＣ3-12ヘテロアリーレン基、アミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4アルケニル、Ｃ2-4アルキニル、Ｃ1-4アルコキシアルキル及びＣ1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。）の合成リンカー基であり、
ｎは０又は１の値を有する整数である。）
【請求項２】
キレート化剤が、６以上のドナー原子を有するアミノカルボキシレートリガンド又はＮ４ドナーセットを有する四座キレーターである、請求項１記載のイメージング剤。
【請求項３】
Ｎ４ドナーセットがジアミンジオキシムキレーター又はテトラアミンキレーターである、請求項２記載のイメージング剤。
【請求項４】
Ｚ１がＬＢＰのＣｙｓaのみに結合している、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項５】
ＸａａがＡｒｇである、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項６】
Ｚ2がＯＨ又はＯＢcである、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項７】
ｎが１であり、Ｌが式−（ＯＣＨ2ＣＨ2）x−（式中、ｘは６〜１８の値を有する整数である。）のＰＥＧ基を含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項８】
放射性金属が99mＴｃである、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載のイメージング剤。
【請求項９】
次の式ＩＩＩのキレーターコンジュゲート。
Ｚ3−（Ｌ）n−[ＬＢＰ]−Ｚ2
（ＩＩＩ）
（式中、
Ｚ3は４以上の金属ドナー原子を有するキレート化剤であり、
Ｌ、ｎ、ＬＢＰ及びＺ2は請求項１乃至請求項７のいずれか１項で定義した通りである。）
【請求項１０】
請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のイメージング剤の製造方法であって、請求項９記載のキレーターコンジュゲートを適当な溶媒中で所望の放射性金属の供給物と反応させることを含んでなる方法。
【請求項１１】
請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のイメージング剤を、哺乳動物への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含んでなる放射性医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１記載の放射性医薬組成物を製造するためのキットであって、請求項９記載のキレーターコンジュゲートを無菌固体形態で含んでいる結果、生体適合性キャリヤー中の放射性金属の無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の放射性医薬組成物を与える、キット。
【請求項１３】
無菌固体形態が凍結乾燥固体である、請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
ヒト又は動物の身体をイメージングする方法であって、当該方法はＰＥＴ又はＳＰＥＣＴを用いて請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のイメージング剤又は請求項１１記載の組成物が分布した前記身体の少なくとも一部の画像を生成する段階を含み、前記イメージング剤又は前記組成物は前記身体に予め投与されている、方法。
【請求項１５】
前記身体の一部が、異常なアポトーシスが関与している疾患状態である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
薬物によるヒト又は動物の身体の治療効果をモニターするために繰り返して実施される、請求項１４又は請求項１５記載の方法であって、前記イメージングは前記薬物による治療前及び治療後に実施され、任意には前記薬物による治療中にも実施される、方法。
【請求項１７】
ヒト又は動物の身体の診断方法における、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のイメージング剤、請求項１１記載の組成物又は請求項１２記載のキットの使用。
【請求項１８】
請求項１４又は請求項１５記載のイメージング方法を含んでなる、ヒト又は動物の身体の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボでのアポトーシス及び他の形態の細胞死の放射性医薬品イメージングに関する。本発明は、アポトーシス細胞の表面に露出しているアミノリン脂質のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）への選択的結合によってアポトーシス細胞を標的化するイメージング剤を提供する。また、放射性医薬組成物、キット及びインビボイメージング方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシス又はプログラム細胞死（ＰＣＤ）は最も普遍的な細胞死経路であり、高度に調節されたエネルギー保存機構によって進行する。健常状態では、アポトーシスは細胞増殖の制御において中心的な役割を果たし、細胞数の調節、形態形成の促進及び有害な異常細胞の除去を行う。ＰＣＤ過程のディスレギュレーション（ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は、癌及び自己免疫障害のようなアポトーシスの阻害に関連するもの、並びに神経変性疾患、血液学的疾患、ＡＩＤＳ、虚血症及び同種移植片拒絶のような過活性アポトーシスに関連するものを含む、多数の疾患状態に関係づけられている。したがって、アポトーシスの可視化及び定量化は、かかるアポトーシス関連病態生理学の診断において有用である。
【０００３】
これらの疾患に関する治療学的処置は、場合に応じてＰＣＤ過程を促進又は抑制することにより、バランスの取れたアポトーシスを回復することを目指している。したがって、細胞及び組織におけるアポトーシスをインビボで非侵襲的にイメージングすることは、治療学的介入に対する応答の早期評価のために非常に大きな価値を有し、破壊的な病理学的過程に対する新しい洞察を与えることができる。特に興味深いのは、癌療法の効力の早期モニタリングにより、状態が末期になる前に悪性増殖を確実に制御することである。
【０００４】
その結果、アポトーシスに関するイメージング剤の開発に大きな関心が寄せられてきた［例えば、Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，９（９），９８６−９９５（２００９）、Ｚｈａｏ，ｉｂｉｄ，９（９），１０１８−１０２３（２００９）及びＭ．Ｄｅ  Ｓａｉｎｔ−Ｈｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，４８，１７８−１８７（２００９）を参照されたい］。細胞死をイメージングするために利用できるプローブのうち、放射性標識アネキシンＶは最も多くの注目を集めた。アネキシンＶは負に帯電したリン脂質のみに結合し、そのためにアポトーシスと壊死とを識別することができない。
【０００５】
ランチオニン含有抗生物質ペプチド（「ランチビオチック」）であるジュラマイシン及びシンナマイシンは、コンパクトな四環式構造を有する２種の密接に関係した１９量体ペプチドである［Ｚｈａｏ，ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ，ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ００７２６−００９−０３８６−９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（２００９）及びそこに引用された参考文献］。これらは４つの共有結合した分子内橋によって架橋されており、２位のただ１つのアミノ酸残基のみによって異なっている。ジュラマイシン及びシンナマイシンの構造を下記に模式的に示すが、式中の番号は１９量体配列中における連結アミノ酸の位置を表している。
【０００６】
【化１】
2013538819.tif 000002
プログラム細胞死又はアポトーシスは、細胞の細胞内におけるエネルギー依存性自己破壊である。細胞原形質膜の二重層を横切るリン脂質の再分布は、アポトーシスに関する重要なマーカーである。即ち、生細胞では、アミノリン脂質であるホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ又はＰｔｄＥ）及びホスファチジルセリン（ＰＳ）は主に細胞原形質膜の内側リーフレットの成分である。アポトーシス細胞では、ＰＥ及びＰＳの同時外在化が存在している。
【０００７】
ジュラマイシン及びシンナマイシンは共に、ＰＥ頭部基の回りに嵌合する疎水性ポケットを形成することにより、同様な特異性及び高い親和性をもって中性のアミノリン脂質ＰＥと結合する。かかる結合は、β−ヒドロキシアスパラギン酸残基（ＨＯ−Ａｓｐ15）とエタノールアミン基とのイオン性相互作用によって安定化される。この残基に対する修飾はジュラマイシンを不活性化することが知られている［Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ，４９，１３４５−１３５２（２００８）］。Ｚｈａｏ［Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ００７２６−００９−０３８６−９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（２００９）］は、Ｗａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９，１１３−１８８（１９９０）］による初期の研究を引用している。そこでは、ＮＭＲ試験によれば、シンナマイシンの５つの末端アミノ酸の1Ｈ  ＮＭＲ共鳴はいずれもＰＥとの結合後にシフトしないことが示され、これらはＰＥとの相互作用に関与しないことが示唆されている。
【０００８】
米国特許出願公開第２００４／０１４７４４０号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）は、前アポトーシス又はアポトーシス細胞の検出或いは癌のイメージングにおいて使用できる標識抗アミノリン脂質抗体を記載している。また、癌療法用のジュラマイシンとビオチン、タンパク質又は抗ウイルス薬物とのコンジュゲーションも提供されている。
【０００９】
国際公開第２００６／０５５８５５号は、タンパク質のホスファチジルセリン結合Ｃ２ドメインを含む放射性標識化合物を用いたアポトーシスのイメージング方法を開示している。
【００１０】
国際公開第２００９／１１４５４９号は、下記の方法によって製造される放射性医薬品を開示している。かかる方法は、
（ｉ）ＣＫＱＳＣＳＦＧＰＦＴＦＶＣＤＧＮＴＫと７０％以上の配列類似性を有するポリペプチドを用意する段階であって、ポリペプチドはアミノ酸残基１−１８、４−１４及び５−１１の間にチオエーテル結合を含むと共に、アミノ酸残基６−１９の間にアミド結合を含み、かつ次の構造を有する１以上の末端部分がポリペプチドの１位、２位又は１位及び２位のアミノ酸に共有結合している段階、並びに
【００１１】
【化２】
2013538819.tif 000003
（式中、Ｒ1及びＲ2は各々独立に直鎖又は枝分れの飽和又は不飽和Ｃ1-4アルキルである。）
（ｉｉ）99mＴｃx、（99mＴｃ＝Ｏ）3+、（99mＴｃ≡Ｎ）2+、（Ｏ＝99mＴｃ＝Ｏ）+又は[99mＴｃ（ＣＯ）3]+（式中、ｘは＋７、＋６、＋５、＋４、＋３、＋２、＋１、０及び−１からなる群から選択されるレドックス又は酸化状態である。）或いはその塩、溶媒和物又は水和物で１以上の末端部分をキレート化する段階
を含んでいる。
【００１２】
国際公開第２００９／１１４５４９号の「末端部分」は放射性同位体９９ｍＴｃに対する錯化剤であって、これはヒドラジノニコチンアミド（普通「ＨＹＮＩＣ」と略す）に基づいている。ＨＹＮＩＣは文献中で公知であり［Ｂａｎｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ，３２，１−２０（２００５）］、ペプチド及びタンパク質を99mＴｃで標識するための好ましい方法である［Ｒ．Ａｌｂｅｒｔｏ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，ｐａｇｅｓ  １９−４０  ｉｎ  ＩＡＥＡ  Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｓｅｒｉｅｓ  １：“Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ−９９ｍ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅｎｄｓ”（２００９）］。
【００１３】
国際公開第２００９／１１４５４９号は、具体的には99mＴｃ−ＨＹＮＩＣ−ジュラマイシンを開示し、そこに教示された放射性医薬品がアポトーシス及び／又は壊死、粥状斑或いは急性心筋梗塞をイメージングするために有用であることを示唆している。
【００１４】
Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ［Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ，４９，１３４５−１３５２（２００８）］は、99mＴｃ−ＨＹＮＩＣ−ジュラマイシンの製法を開示している。Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌは、ジュラマイシンがＨＹＮＩＣへのコンジュゲーションのために利用し得る２つのアミン基、即ちＮ末端（Ｃｙｓ1残基）のアミン基及びＬｙｓ2残基のε−アミン側鎖を有することに注目している。彼らは、99mＴｃでの放射性標識に先立ち、ＨＹＮＩＣ−ジュラマイシンコンジュゲートをＨＰＬＣで精製してビス−ＨＹＮＩＣ官能化ジュラマイシンを除去した。Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌは、試験した99mＴｃ標識モノ−ＨＹＮＩＣ−ジュラマイシンコンジュゲートが恐らくは異性体の混合物の形態であることを認めている。
【００１５】
ＨＹＮＩＣは安定な99mＴｃ錯体を形成するものの、テクネチウム金属錯体の配位球を完成するために追加の補助リガンドを必要とする。ＨＹＮＩＣは、近傍にあるアミノ酸側鎖官能基の性質に応じて単座リガンド又は仁座キレーターとして機能し得る［Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓ．，４９９８−５００７（２００７）、Ｍｅｓｚａｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ［Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，３６３，１０５９−１０６９（２０１０）］。即ち、環境に応じて、ＨＹＮＩＣは１つ又は２つの金属ドナー原子を有する金属錯体を形成する。Ｍｅｓｚａｒｏｓ  ｅｔ  ａｌは、ＨＹＮＩＣと共に使用する補助リガンドの性質が系の挙動に顕著な効果を及ぼし得ることに注目し、いずれの補助リガンドも理想的でないと述べている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
国際公開第２００９／１１４５４９号パンフレット
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、特に異常なアポトーシスが関与している哺乳動物体の疾患状態をイメージングするための放射性医薬品イメージング剤を提供する。かかるイメージング剤は、ランチビオチックペプチドの放射性金属キレーターコンジュゲートを含んでいる。本発明は、再現可能に、高い放射化学純度（ＲＣＰ）で、かつ補助リガンドの必要なしに生成する放射性金属錯体を提供する。本発明者らはまた、本明細書中の式ＩＩのランチビオチックペプチドのＮ末端（Ｃｙｓa残基）における放射性金属錯体の結合が著しく好ましいことも立証した。これは、Ｎ末端に隣接したアミノ酸（式ＩＩのＸａａ）においても、非錯体化キレーターの結合はホスファチジルエタノールアミンへの結合に対して有害な効果を有するからである。このような効果は、以前には先行技術において認識されておらず、したがって結合親和性に対する影響の程度は新規なものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、動物モデルにおける99mＴｃ−［コンジュゲート５］腫瘍取込みを示している。
【図２】図２は、99mＴｃ−［コンジュゲート５］と腫瘍アポトーシスとの相関を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
第１の態様では、本発明は、次の式Ｉの化合物を含んでなるイメージング剤を提供する。
Ｚ1−（Ｌ）n−[ＬＢＰ]−Ｚ2
（Ｉ）
式中、
ＬＢＰは次の式ＩＩのランチビオチックペプチドであり、
Ｃｙｓa−Ｘａａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒb−Ｃｙｓc−Ｓｅｒd−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒc−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃｙｓb−（ＨＯ−Ａｓｐ）−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒa−Ｌｙｓd
（ＩＩ）
（式中、
ＸａａはＡｒｇ又はＬｙｓであり、
Ｃｙｓa−Ｔｈｒa、Ｓｅｒb−Ｃｙｓb及びＣｙｓc−Ｔｈｒcはチオエーテル結合を介して共有結合しており、
Ｓｅｒd−Ｌｙｓdはリシノアラニン結合を介して共有結合しており、
ＨＯ−Ａｓｐはβ−ヒドロキシアスパラギン酸である。）
Ｚ1−（Ｌ）n−はＬＢＰのＣｙｓa及び任意にはＸａａにも結合しており、ここでＺ1は４以上の金属ドナー原子を有するイメージング剤の放射性金属錯体を含み、
Ｚ2はＬＢＰのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢc（式中、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）又はＭIGであり、ＭIGはＬＢＰペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基である代謝阻害基であり、
Ｌは式−（Ａ）m−（式中、各Ａは独立に−ＣＲ2−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ2−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ2ＮＲ−、−ＮＲＳＯ2−、−ＣＲ2ＯＣＲ2−、−ＣＲ2ＳＣＲ2−、−ＣＲ2ＮＲＣＲ2−、Ｃ4-8シクロヘテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基又はＣ3-12ヘテロアリーレン基、アミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4アルケニル、Ｃ2-4アルキニル、Ｃ1-4アルコキシアルキル及びＣ1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。）の合成リンカー基であり、
ｎは０又は１の値を有する整数である。
【００２０】
「イメージング剤」という用語は、哺乳動物体をイメージングするのに適した化合物を意味する。好ましくは、哺乳動物はインタクトな哺乳動物生体であり、さらに好ましくはヒト被験体である。好ましくは、イメージング剤は最小限に侵襲的なやり方（即ち、職業的な医学専門技術の下で実施した場合に哺乳動物被験体に対して実質的な健康リスクのないやり方）で哺乳動物体に投与できる。かかる最小限に侵襲的な投与は、好ましくは、局所又は全身麻酔の必要なしに行われる、前記被験体の末梢静脈への静脈内投与である。第１の態様のイメージング剤は、第６の態様（下記）に記載されるように、アポトーシス及び他の形態の細胞死をイメージングするため特に適している。
【００２１】
本明細書中で使用される「インビボイメージング」という用語は、哺乳動物被験体の内部構造の全部又は一部の画像を非侵襲的に生成する技法をいう。
【００２２】
「アミノ酸」という用語は、Ｌ−又はＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）或いはアミノ酸模倣体を意味し、これらは天然のもの又は純粋に合成由来のものであってよく、光学的に純粋なもの（即ち、単一の鏡像異性体）、したがってキラルなものであるか、或いは鏡像異性体の混合物であってよい。本明細書中では、アミノ酸に関する通常の三文字略語又は一文字略語が使用される。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋なものである。
【００２３】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合（即ち、１つのアミノ酸のアミンを別のアミノ酸のカルボキシルに連結するアミド結合）によって連結された（上記に定義したような）２以上のアミノ酸を含む化合物を意味する。
【００２４】
「ランチビオチックペプチド」という用語は、１以上のランチオニン結合を含むペプチドをいう。「ランチオニン」はその通常の意味を有し、下記に示す化学構造を有するシスチンのスルフィド類似体をいう。
【００２５】
【化３】
2013538819.tif 000004
「チオエーテル結合を介して共有結合している」という用語は、関連するＣｙｓ残基のチオール官能基がＳｅｒ又はＴｈｒのヒドロキシル官能基の脱水素によって示されたＳｅｒ又はＴｈｒ残基に対するチオエーテル結合として連結されてランチオニン又はメチルランチオニン結合を与えることを意味する。かかる結合は、Ｗｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ［Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１，４７７−５０１（２００７）］によって記載されている。
【００２６】
「リシノアラニン結合」という用語は、Ｌｙｓ残基のε−アミン基がＳｅｒのヒドロキシル官能基の脱水素によって示されたＳｅｒ残基に対するアミン結合として連結されて、アミノ酸残基の２つのα−炭素原子を連結する−（ＣＨ2）−ＮＨ−（ＣＨ2）4−結合を与えることを意味する。
【００２７】
「放射性金属錯体」という用語は、放射性金属とキレーターとの配位菌錯体であって、前記キレーターが式Ｉのリンカー基（Ｌ）を介してＬＢＰペプチドに共有結合しているものを意味する。かかる配位錯体は、放射性金属に結合したヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）リガンドを含まない。したがって、キレーターは放射性金属に結合する主な化学種であって、単にＨＹＮＩＣに対する補助リガンドというわけではない。
【００２８】
「キレート化剤」という用語はその通常の意味を有し、金属配位後にキレート環（好ましくは五員乃至七員のキレート環、さらに好ましくは五員又は六員のキレート環）を生じるように配列された２以上の金属ドナー原子をいう。金属ドナー原子は、炭素原子又は非配位ヘテロ原子の非配位主鎖によって共有結合されている。本発明のキレート化剤は４以上の金属ドナー原子（好適には４〜８の金属ドナー原子）を含んでいて、４以上のかかる金属ドナー原子が放射性金属錯体中で放射性金属に結合している。
【００２９】
本発明の好適な放射性金属には、99mＴｃ、94mＴｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、105Ｒｈ、101mＲｈ、111Ｉｎ、89Ｚｒ及び45Ｔｉがある。
【００３０】
Ｚ1がＣｙｓaに結合する場合、それはＬＢＰペプチドのＮ末端に結合している。Ｚ1がＸａａにも結合する場合、それはＸａａがＬｙｓであることを意味し、Ｚ1はＬｙｓ残基のε−アミノ基に結合している。
【００３１】
Ｚ2基は、ＬＢＰの最後のアミノ酸残基のカルボニル基（即ち、カルボキシ末端）を置換する。したがって、Ｚ2がＯＨである場合、ＬＢＰのカルボキシ末端は最後のアミノ酸残基の遊離ＣＯ2Ｈ基で終わり、Ｚ2がＯＢcである場合、その末端カルボキシ基はＣＯ2Ｂc基としてイオン化されている。
【００３２】
「生体適合性陽イオン」（Ｂc）という用語は、イオン化して負に帯電した基と共に塩を形成する正に帯電した対イオンを意味する。この場合、前記正に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳動物体（特に人体）への投与に適している。好適な生体適合性陽イオンの例には、アルカリ金属であるナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属であるカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンがある。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。
【００３３】
「代謝阻害基」（ＭIG）という用語は、カルボキシ末端（Ｚ2）におけるＬＢＰペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基を意味する。かかる基は当業者にとって公知であり、ペプチドのアミン末端については、好適にはカルボキサミド、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、アミノアルコール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位から選択される。本発明のＬＢＰペプチドは高いインビボ代謝安定性（６０分で９５％）を示すことが知られており、したがってＺ２は好ましくはＯＨ又はＯＢcである。
【００３４】
好ましい実施形態
キレート化剤は、好ましくは、放射性金属との錯体形成後に生じるキレート環が１以上の五員又は六員環、さらに好ましくは２〜４のかかる環、最も好ましくは３又は４のかかる環を含むように設計されている。
【００３５】
キレート化剤は、好ましくは、６以上のドナー原子を有するアミノカルボキシレートリガンド、及びＮ３Ｓ、Ｎ２Ｓ２又はＮ４ドナーセットを有する四座キレーターから選択される。キレート化剤は、さらに好ましくは６以上のドナー原子を有するアミノカルボキシレートリガンド又はＮ４ドナーセットを有する四座キレーターであり、最も好ましくはＮ４ドナーセットを有する四座キレーターである。
【００３６】
「アミノカルボキシレートリガンド」という用語はその通常の意味を有し、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ型のキレート化剤をいう。かかるキレーターのドナー原子は、アミン（Ｎ）ドナーとカルボン酸（Ｏ）ドナーとの混合物である。かかるキレーターは、開鎖のもの（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ又はＨＢＥＤ）或いは大環状のもの（例えば、ＤＯＴＡ又はＮＯＴＡ）であり得る。好適なかかるキレーターには、ＤＯＴＡ、ＨＢＥＤ及びＮＯＴＡがある。これらは当技術分野で公知であり、67Ｇａ又は68Ｇａ、111Ｉｎ、銅の放射性同位体、89Ｚｒ及び45Ｔｉのような放射性金属に対して好ましい。
【００３７】
「四座キレーター」という用語はその通常の意味を有し、放射性金属が四座キレート化剤の４つの金属ドナー原子によって配位されているキレート化剤をいう。
【００３８】
「Ｎ３Ｓドナーセット」という用語は、四座キレーターの４つの金属ドナー原子が３つの窒素ドナー原子及び１つの硫黄ドナー原子から構成されることを意味する。好適なかかるＮドナー原子タイプの例は、アミン（特に第一又は第二アミン）、アミド又はオキシム、或いはこれらの組合せてある。好適なかかるＳドナー原子タイプの例は、チオール及びチオエーテルである。好ましいかかるＮ３Ｓキレーターはチオールトリアミドドナーセットを有し、好ましくはＭＡＧ３（メルカプトアセチルトリグリシン）のような開鎖キレーターである。
【００３９】
「Ｎ２Ｓ２ドナーセット」という用語は、四座キレーターの４つの金属ドナー原子が２つの窒素ドナー原子及び２つの硫黄ドナー原子から構成されることを意味する。好適なかかるＮ及びＳドナー原子は、Ｎ３Ｓ（上記）に関して記載した通りである。好ましいかかるＮ２Ｓ２キレーターはジアミンジチオール又はアミドアミンジチオールドナーセットを有し、好ましくはＢＡＴ又はＮ，Ｎ’−エチレンジ−Ｌ−システイン［Ｉｎｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．，３５（２）：４０４−４１４（１９９６）］のような開鎖キレーターである。
【００４０】
「Ｎ４ドナーセット」という用語は、四座キレーターの４つの金属ドナー原子がすべて窒素に基づいていることを意味する。好適なかかるＮドナー原子タイプの例は、アミン（特に第一又は第二アミン）、アミド又はオキシム、或いはこれらの組合せてある。
【００４１】
Ｎ４ドナーセットは、好ましくはジアミンジオキシム、テトラアミン、アミドトリアミン及びジアミドジアミンから選択される。Ｎ４キレーターは、開鎖のもの又は大環状のもの（例えば、シクラム、モノオキソシクラム又はジオキソシクラム）であり得る。本発明の好ましいＮ４四鎖キレート化剤はジアミンジオキシム又はテトラアミンドナーセットを有し、さらに好ましくは開鎖ジアミンジオキシム又は開鎖テトラアミンである。
【００４２】
好ましいジアミンジオキシムキレーターは次の式を有する。
【００４３】
【化４】
2013538819.tif 000005
式中、Ｅ1〜Ｅ6は各々独立にＲ'基であり、
各Ｒ'は独立にＨ或いはＣ1-10アルキル、Ｃ3-10アルキルアリール、Ｃ2-10アルコキシアルキル、Ｃ1-10ヒドロキシアルキル、Ｃ1-10フルオロアルキル、Ｃ2-10カルボキシアルキル又はＣ1-10アミノアルキルであるか、或いは２以上のＲ'基がそれに結合した原子と共に炭素環式又は複素環式の飽和又は不飽和環を形成し、
Ｑは式−（Ｊ）f−（式中、ｆは３、４又は５であり、各Ｊは−（Ｊ）f−が−Ｏ−又は−ＮＲ'−である最大１つのＪ基を含み得ることを条件にして独立に−Ｏ−、−ＮＲ'−又は−Ｃ（Ｒ'）2−である。）の橋かけ基である。
【００４４】
好ましいＱ基は下記の通りである。
Ｑ＝−（ＣＨ2）（ＣＨＲ'）（ＣＨ2）−（即ち、プロピレンアミンオキシム又はＰｎＡＯ誘導体）、
Ｑ＝−（ＣＨ2）2（ＣＨＲ'）（ＣＨ2）2−（即ち、ペンチレンアミンオキシム又はＰｅｎｔＡＯ誘導体）、及び
Ｑ＝−（ＣＨ2）2ＮＲ'（ＣＨ2）2−。
【００４５】
Ｅ1〜Ｅ6は、好ましくはＣ1-3アルキル、Ｃ2-4アルコキシアルキル、Ｃ1-3ヒドロキシアルキル、Ｃ1-3フルオロアルキル、Ｃ2-6カルボキシアルキル及びＣ1-3アミノアルキルから選択される。最も好ましくは、各Ｅ1〜Ｅ6基はＣＨ3である。
【００４６】
Ｑは、好ましくは−（ＣＨ2）（ＣＨＲ'）（ＣＨ2）−、−（ＣＨ2）2（ＣＨＲ'）（ＣＨ2）2−又は−（ＣＨ2）2ＮＲ'（ＣＨ2）2−であり、最も好ましくは−（ＣＨ2）（ＣＨＲ'）（ＣＨ2）2−である。特に好ましいジアミンジオキシムキレーターは次の式を有する。
【００４７】
【化５】
2013538819.tif 000006
式中、橋頭の第一アミン基は（Ｌ）n（即ち、リンカー基）及び／又はＬＢＰペプチドにコンジュゲートされる。
【００４８】
好ましいテトラアミンキレーターは次の式を有する。
【００４９】
【化６】
2013538819.tif 000007
式中、橋頭のカルボキシル基はリンカー基及び／又はＬＢＰペプチドにコンジュゲートされる。
【００５０】
キレーター２中、［リンカー］は好ましくは式（Ａ'）m1（式中、ｍ１は０〜６の値を有する整数であり、各Ａ'は独立にＣＨ2又はｐ−フェニレンであり、１以下のＡ'基がｐ−フェニレンである。）の基である。好ましくは、Ａ'基の各々はＣＨ2であり、ｍ１は１〜６である。好ましいかかるキレーターは、［リンカー］が−（ＣＨ2）−であるキレーター２Ａである。
【００５１】
イメージング剤の放射性金属は、好ましくは94mＴｃ又は99mＴｃであり、さらに好ましくは99mＴｃである。これらのテクネチウム放射性同位体に関しては、キレーターは好ましくは上記に定義したようなＮ４ドナーセットを有する四座キレーターである。
【００５２】
Ｚ2は、好ましくはＯＨ又はＯＢｃである。
【００５３】
第１の態様のイメージング剤では、Ｚ1は好ましくはＬＢＰのＣｙｓaのみに結合している。ＸａａがＡｒｇである場合、それはＺ1がＣｙｓa残基の遊離アミン基の位置でＬＢＰのＮ末端に結合されることを意味する。ＸａａがＬｙｓである場合、それは
（ｉ）Ｘａａ残基のε−アミン基に優先して、Ｃｙｓa残基の位置でＬＢＰペプチドを選択的に官能化する段階、又は
（ｉｉ）Ｃｙｓa及びＸａａの両方の位置においてＺ1で官能化されたＬＢＰを含む組成物を調製し、次いでＸａａ官能化化学種を除去する段階
が採用されることを意味する。
【００５４】
第１の態様のイメージング剤では、Ｘａａは好ましくはＡｒｇである。
【００５５】
第１の態様のイメージング剤は、好ましくはリンカー基（Ｌ）を含んでいる。即ち、式（Ｉ）中のｎは好ましくは１である。Ｌは、好ましくは式−（ＯＣＨ2ＣＨ2）x−（式中、ｘは６〜１８、好ましくは８〜１４、さらに好ましくは１０〜１２の値を有する整数である。）のＰＥＧ基を含んでいる。かかるリンカー基は、インビボでイメージング剤の肝臓バックグラウンド保持を低減させかつ尿中排泄を増加させる点で有利である。好ましくは、Ｌは次の式ＩＡ又はＩＢのバイオモディファイアー基を含んでいる。
【００５６】
【化７】
2013538819.tif 000008
式ＩＡは１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸であり、ここでｐは１〜１０の整数である。式ＩＡ中では、ｐは好ましくは１、２又は３である。別法として、式ＩＢのプロピオン酸誘導体に基づくＰＥＧ様構造を使用することもできる。
【００５７】
【化８】
2013538819.tif 000009
式中、ｐは式ＩＡに関して定義した通りであり、ｑは１〜１５の整数である。式ＩＢ中では、ｐは好ましくは１又は２、さらに好ましくは１であり、ｑは好ましくは５〜１２、さらに好ましくは１２である。
【００５８】
「バイオモディファイアー」という用語は、インビボで薬剤の体内分布に対して効果を及ぼす基を意味する。
【００５９】
第１の態様のイメージング剤は、第３の態様に記載するようにして得ることができる。
【００６０】
第２の態様では、本発明は次の式ＩＩＩのキレーターコンジュゲートを提供する。
Ｚ3−（Ｌ）n−[ＬＢＰ]−Ｚ2
（ＩＩＩ）
式中、
Ｚ3は４以上の金属ドナー原子を有するキレート化剤であり、
Ｌ、ｎ、ＬＢＰ及びＺ2は第１の態様で定義した通りである。
Ｌ、ｎ、ＬＢＰ及びＺ2並びに第２の態様におけるキレート化剤（Ｚ3）の好ましい態様は、第１の態様（上記）に記載した通りである。
【００６１】
若干のＬＢＰペプチドは商業的に入手できる。即ち、シンナマイシン及びジュラマイシンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手できる。ジュラマイシンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ由来の菌株Ｄ３１６８ Ｄｕｒａｍｙｃｉｎによって産生される。シンナマイシンは、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ又はＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｒｉｓｅｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｍ由来の複数の菌株によって生化学的に産生することができる。Ｃ．Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ［Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１０５，６３３−６８３（２００５）］による総説を参照されたい。他のペプチドは、Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ  ａｎｄ  Ｅ．Ｇｉｒａｌｄ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されているような固相ペプチド合成によって得ることができる。
【００６２】
第２の態様のキレーターコンジュゲートは、以下のようにして得ることができる。キレーターがジアミノジオキシムである場合には、適切なジアミンを
（ｉ）適切なクロロニトロソ誘導体Ｃｌ−Ｃ（Ｒ1）2−ＣＨ（ＮＯ）Ｒ1と反応させるか、
（ｉｉ）式Ｃｌ−Ｃ（Ｒ1）2−Ｃ（＝ＮＯＨ）Ｒ1のα−クロロオキシムと反応させるか、或いは
（ｉｉｉ）式Ｂｒ−Ｃ（Ｒ1）2−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ1のα−ブロモケトンと反応させ、続いてヒドロキシルアミンを用いてジアミンジケトン生成物をジアミンジオキシムに転化させる。
【００６３】
経路（ｉ）は、Ｓ．Ｊｕｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ［Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２６，３５７６−８２（１９８７）］によって記載されている。クロロニトロソ化合物は、当技術分野で公知の通り、適切なアルケンを塩化ニトロシル（ＮＯＣｌ）で処理することで得ることができる。クロロニトロソ化合物の合成に関するさらなる詳細は、Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ［Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２５（５），７４３−７５２（１９９５）］、Ｇｌａｓｅｒ［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６１（３），１０４７−４８（１９９６）］、Ｃｌａｐｐ［Ｊ．ＯｒｇＣｈｅｍ．，３６（８）１１６９−７０（１９７１）］、Ｓａｉｔｏ［Ｓｈｉｚｅｎ  Ｋａｇａｋｕ，４７，４１−４９（１９９５）］及びＳｃｈｕｌｚ［Ｚ．Ｃｈｅｍ．，２１（１１），４０４−４０５（１９８１）］によって示されている。経路（ｉｉｉ）は、Ｎｏｗｏｔｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５０（２９），ｐ．８６１７−８６３２（１９９４）］によって一般的な表現で記載されている。α−クロロオキシムは、対応するα−クロロ−ケトン又はアルデヒド（これらは商業的に入手できる。）をオキシム化することで得ることができる。α−ブロモケトンは商業的に入手できる。
【００６４】
さらに好ましいテトラアミンキレーターは次の式を有する。
【００６５】
【化９】
2013538819.tif 000010
式中、
Ｌ、ＬＢＰ、ｎ及びＺ2は第１の態様で定義した通りであり、
Ｑ1〜Ｑ6は独立にＱ基であり、ここでＱはＨ又はアミン保護基である。
【００６６】
「保護基」という用語は、望ましくない化学反応を阻止又は抑制するが、分子の残部を変質させない程度に温和な条件下で問題の官能基から脱離させ得るのに十分な反応性を有するように設計された基を意味する。脱保護後には所望の生成物が得られる。アミン保護基は当業者にとって公知であり、好適にはＢｏｃ（ここでＢｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである。）、Ｆｍｏｃ（ここでＦｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニルである。）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［即ち、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］及びＮｐｙｓ（即ち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）から選択される。場合によっては、保護基の性質は、Ｑ1／Ｑ2基及びＱ5／Ｑ6基が共に保護基である（即ち、関連するアミン窒素原子上にＮＨ結合が存在しない）ようなものであり得る。さらに他の保護基の使用は、‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，４th  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ［Ｗｉｌｅｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，（２００６）］に記載されている。好ましいアミン保護基はＢｏｃ及びＦｍｏｃであり、最も好ましくはＢｏｃである。Ｂｏｃを使用する場合、Ｑ1及びＱ6は共にＨであり、Ｑ2、Ｑ3、Ｑ4及びＱ6はそれぞれｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである。
【００６７】
キレーター３中におけるＬ、ＬＢＰ、ｎ及びＺ2の好ましい態様は、第１の態様（上記）に記載した通りである。好ましいキレーター３は（Ｌ）n＝（Ａ'）m1を有しており、ここでＡ'及びｍ１並びにこれらの好ましい態様はキレーター２（上記）に関して記載した通りである。
【００６８】
テトラアミンキレーターは、スキーム１（下記）に記載したようにして製造できる。アミノ官能化及びカルボキシ官能化テトラアミンキレーターの合成に関するさらなる情報は、Ａｂｉｒａｊ  ｅｔ  ａｌ［Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，１６，２１１５−２１２４（２０１０）］によって記載されている。−（ＣＨ2）5ＯＨ橋頭置換基を有するＢｏｃ保護テトラアミン類似体の合成は、Ｔｕｒｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ［Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，４５，３７９−３９３（２００２）］によって記載されている。テトラアミンキレーターと生物学的標的化ペプチドとのコンジュゲーションは、Ｎｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３０（２），２４７−２５８（２００３）］及びＭａｉｎａ  ｅｔ  ａｌ［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３０（９），１２１１−１２１９（２００３）］によって記載されている。ペンダント活性エステル基を有する二官能性ＨＢＥＤ誘導体は、Ｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，３５，１８７８−１８８６（２００８）］によって教示されている。
【００６９】
【化１０】
2013538819.tif 000011
Ｎ3Ｓ二官能性キレーターは、Ｓｕｄｈａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．９，１０８−１１７（１９９８）］の方法によって製造できる。Ｎ2Ｓ2二官能性化合物は、Ｋｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ［Ｔｅｔｒ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ３０，４０６９−４０７２（１９８９］の方法によって製造できる。
【００７０】
モノアミドモノアミンビスチオール化合物は、Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ［Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ３８，５３５１−５３５８（１９９９）］の方法によって製造できる。
【００７１】
第３の態様では、本発明は、第１の態様のイメージング剤の製造方法であって、第２の態様のキレーターコンジュゲートを適当な溶媒中で所望の放射性金属の供給物と反応させることを含んでなる方法を提供する。
【００７２】
第３の態様におけるキレーターコンジュゲート及び放射性金属の好ましい態様は、本発明の第１及び第２の態様（上記）に記載した通りである。
【００７３】
適当な溶媒は通例水性のものであり、好ましくは第４の態様（下記）で定義されるような生体適合性キャリヤー溶媒である。
【００７４】
第４の態様では、本発明は、第１の態様のイメージング剤を、哺乳動物への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含んでなる放射性医薬組成物を提供する。
【００７５】
第４の態様におけるイメージング剤の好ましい態様は、本発明の第１の態様（上記）に記載した通りである。
【００７６】
「生体適合性キャリヤー」とは、組成物が生理学的に認容され得るようにして（即ち、毒性又は過度の不快感なしに哺乳動物体に投与できるようにして）イメージング剤を懸濁又は好ましくは溶解するための流体（特に液体）である。生体適合性キャリヤーは、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、（有利には注射用の最終生成物が等張性になるように平衡させ得る）食塩水のような水溶液、生体適合性緩衝剤を含む水性緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）、或いは１種以上の張度調整物質（例えば、血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。好ましくは、生体適合性キャリヤーはパイロジェンフリー注射用水、等張食塩水又はリン酸緩衝液である。
【００７７】
「哺乳動物への投与に適した形態で」という語句は、無菌でパイロジェンフリーであり、毒性又は有害効果を生じる化合物を含まず、生体適合性ｐＨ（およそｐＨ４．０〜１０．５）で製剤化される組成物を意味する。かかる組成物は、インビボで塞栓を生じる危険性を有し得る粒状物質を含まないと共に、生物学的流体（例えば、血液）と接触した際に沈殿が起こらないように製剤化される。かかる組成物はまた、生物学的に適合性の賦形剤のみを含み、好ましくは等張性である。
【００７８】
イメージング剤及び生体適合性キャリヤーはそれぞれ、注射器又はカニューレによる溶液の追加及び抜取りを許しながら、無菌保全性及び／又は放射能安全性の維持、さらに任意には不活性ヘッドスペースガス（例えば、窒素又はアルゴン）の維持を可能にする密封容器からなる適当なバイアル又は容器に入れた状態で供給される。好ましいかかる容器は、気密クロージャーを（通例はアルミニウムからなる）オーバーシールと共にクリンプ加工した隔壁密封バイアルである。クロージャーは、無菌保全性を維持しながら皮下注射針による１回又は数回の穿刺に適したもの（例えば、クリンプ加工した隔壁シールクロージャー）である。かかる容器は、（例えば、ヘッドスペースガスの交換又は溶液のガス抜きのために）所望される場合にはクロージャーが真空に耐え得ると共に、酸素又は水蒸気のような外部大気ガスの侵入を許すことなしに減圧のような圧力変化にも耐え得るという追加の利点を有している。
【００７９】
好ましい複数用量容器は、複数の患者用量を含む（例えば、容積１０〜３０ｃｍ3の）単一のバルクバイアルからなり、したがって臨床的状況に合わせて製剤の実用寿命中に様々な時間間隔で１回分の患者用量を臨床グレードの注射器中に抜き取ることができる。予備充填注射器は１回分のヒト用量又は「単位用量」を含むように設計され、したがって好ましくは臨床用に適した使い捨て注射器又は他の注射器である。本発明の医薬組成物は、好ましくは１人の患者用に適した用量を有し、上述したような適当な注射器又は容器に入れて供給される。
【００８０】
かかる医薬組成物は、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤、フィラー、放射線防護剤、可溶化剤又は重量オスモル濃度調整剤のような追加の任意賦形剤を含むことができる。「放射線防護剤」という用語は、水の放射線分解から生じる含酸素フリーラジカルのような高反応性フリーラジカルを捕捉することにより、レドックス過程のような分解反応を阻止する化合物を意味する。本発明の放射線防護剤は、好適には、アスコルビン酸、ｐ−アミノ安息香酸（即ち、４−アミノ安息香酸）、ゲンチシン酸（即ち、２，５−ジヒドロキシ安息香酸）及びかかる酸と上記に記載した生体適合性陽イオンとの塩から選択される。「可溶化剤」という用語は、溶媒に対するイメージング剤の溶解性を高める、組成物中に存在する添加剤を意味する。好ましいかかる溶媒は水性媒質であり、したがって可溶化剤は好ましくは水に対する溶解性を高める。好適なかかる可溶化剤には、Ｃ1-4アルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート、ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）ポリ（オキシエチレン）ブロック共重合体（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標））、シクロデキストリン（例えば、α−、β−又はγ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン或いはヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン）及びレシチンがある。
【００８１】
「抗菌防腐剤」という用語は、潜在的に有害な微生物（例えば、細菌、酵母又はかび）の増殖を阻止する薬剤を意味する。抗菌防腐剤はまた、使用する用量に応じて多少の殺菌性を示すこともある。本発明の抗菌防腐剤の主な役割は、医薬組成物中におけるこのような微生物の増殖を阻止することである。しかし、抗菌防腐剤は、任意には投与に先立って前記組成物を製造するために使用されるキットの１種以上の成分中における潜在的に有害な微生物の増殖を阻止するためにも使用できる。好適な抗菌防腐剤には、パラベン類（即ち、メチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン或いはこれらの混合物）、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。好ましい抗菌防腐剤はパラベン類である。
【００８２】
「ｐＨ調整剤」という用語は、組成物のｐＨがヒト又は哺乳動物への投与のために許容される範囲（およそｐＨ４．０〜１０．５）内にあることを保証するために有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。好適なかかるｐＨ調整剤には、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ［即ち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］のような薬学的に許容される緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような薬学的に許容される塩基がある。組成物をキットの形態で使用する場合には、ｐＨ調整剤を任意には独立のバイアル又は容器に入れて供給することができ、その結果としてキットのユーザーは多段操作の一部としてｐＨを調整することができる。
【００８３】
「フィラー」という用語は、製造及び凍結乾燥中における材料の取扱いを容易にすることができる薬学的に許容される増量剤を意味する。好適なフィラーには、塩化ナトリウムのような無機塩、及びスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性糖又は糖アルコールがある。
【００８４】
第２の態様の医薬組成物は、無菌製造条件下で（即ち、クリーンルーム内で）製造して所望の無菌で非発熱性の生成物を得ることができる。基本構成部分、特に関連する試薬並びにイメージング剤に接触する装置部品（例えば、バイアル）は無菌であることが好ましい。かかる構成部分及び試薬は、無菌濾過或いは（例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は（例えば、エチレンオキシドによる）化学処理を用いる）終末滅菌をはじめとする、当技術分野で公知の方法によって滅菌できる。一部の構成部分を予め滅菌しておけば、最小数の操作を実施すれば済むので好ましい。しかし、予防策として、医薬組成物の製造における最終段階として少なくとも無菌濾過段階を含めることが好ましい。
【００８５】
上述の通り、本発明の医薬組成物は好ましくは可溶化剤を含んでいる。その結果、濾材に吸着される放射能の過度の損失なしに無菌濾過段階を使用できる。同様な考察は、可溶化剤を使用しないと吸着によって放射能の損失が引き起こされることのある、臨床グレード注射器中又はプラスチックチューブ使用時における医薬組成物の操作に対しても適用される。
【００８６】
本発明の放射性医薬組成物は、以下のような様々な方法によって製造できる。即ち、
（ｉ）放射性金属錯体形成をクリーンルーム環境中で実施する無菌製造技法、
（ｉｉ）無菌製造を用いずに放射性金属錯体形成を実施した後、最終段階で滅菌［例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は（例えば、エチレンオキシドによる）化学処理］を行う終末滅菌方法、並びに
（ｉｉｉ）式ＩＩＩのキレーターコンジュゲート及び任意の賦形剤を含む無菌の非放射性キット製剤を所望の放射性金属の供給物と反応させるキット方法。
方法（ｉｉｉ）が好ましく、この方法で使用するためのキットは第５の実施形態（下記）に記載される。
【００８７】
第５の態様では、本発明は、第４の態様の放射性医薬組成物を製造するためのキットであって、第２の態様のキレーターコンジュゲートを無菌固体形態で含んでいる結果、生体適合性キャリヤー中の放射性金属の無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の放射性医薬組成物を与えるキットを提供する。
【００８８】
第５の態様におけるキレーターコンジュゲートの好ましい態様は、本発明の第２の態様（上記）に記載した通りである。
【００８９】
「キット」という用語は、所望の放射性医薬組成物を製造するために必要な化学薬品を使用説明書と共に含んでなる１以上の非放射性医薬品グレード容器を意味する。キットは、所望の放射性金属で再構成することで、最小限の操作でヒトへの投与に適した溶液を与えるように設計されている。
【００９０】
無菌固体形態は、好ましくは凍結乾燥固体である。
【００９１】
99mＴｃに関しては、キットは好ましくは凍結乾燥され、99mＴｃ放射性同位体ジェネレーターからの無菌の99mＴｃ−過テクネチウム酸イオン（ＴｃＯ4-）で再構成することで、それ以上の操作なしにヒトへの投与に適した溶液を与えるように設計されている。好適なキットは、遊離塩基又は酸性塩形態のキレーターコンジュゲートを、亜ジチオン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ホルムアミジンスルフィン酸、第一スズイオン、Ｆｅ（ＩＩ）又はＣｕ（Ｉ）のような生体適合性還元剤と共に収容した容器（例えば、隔壁密封バイアル）を含んでいる。生体適合性還元剤は、好ましくは塩化第一スズ又は酒石酸第一スズのような第一スズ塩である。別法として、キットは非放射性金属錯体を任意に含むことができる。これは、テクネチウムの添加時にトランスメタレーション（即ち、金属交換）を受けて所望の生成物を与える。非放射性キットはさらに、上記に記載したようなトランスキレーター、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤又はフィラーのような追加成分を任意に含むことができる。
【００９２】
第６の態様では、本発明は、ヒト又は動物の身体をイメージングする方法であって、当該方法はＰＥＴ又はＳＰＥＣＴを用いて第１の態様のイメージング剤又は第４の態様の組成物が分布した前記身体の少なくとも一部の画像を生成する段階を含み、前記イメージング剤又は前記組成物は前記身体に予め投与されている方法を提供する。
【００９３】
第６の態様におけるイメージング剤又は組成物の好ましい態様は、本発明のそれぞれ第１及び第４の態様（上記）に記載した通りである。第６の態様の方法は、好ましくは、身体の一部が異常なアポトーシスが関与している疾患状態である場合に実施される。「異常なアポトーシス」という用語は、プログラム細胞死（ＰＣＤ）のディスレギュレーションを意味する。かかるディスレギュレーションは、癌及び自己免疫障害のようなアポトーシスの阻害に関連するもの、並びに神経変性疾患、血液学的疾患、ＡＩＤＳ、虚血症、同種移植片拒絶及び心臓病（心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症及び／又は薬物療法後の心臓毒性）のような過活性アポトーシスに関連するものを含む、多数の疾患状態に関係づけられている。したがって、アポトーシスの可視化及び定量化は、かかるアポトーシス関連病態生理学の診断において有用である。
【００９４】
第６の態様のイメージング方法は、任意には、薬物によるヒト又は動物の身体の治療効果をモニターするために繰り返して実施できる。この場合、前記イメージングは前記薬物による治療前及び治療後に実施され、任意には前記薬物による治療中にも実施される。これらの疾患に関する治療学的処置は、場合に応じてＰＣＤ過程を促進又は抑制することにより、バランスの取れたアポトーシスを回復することを目指している。特に興味深いのは、癌療法の効力の早期モニタリングにより、状態が末期になる前に悪性増殖を確実に制御することである。
【００９５】
第７の態様では、本発明は、ヒト又は動物の身体の診断方法における、第１の態様のイメージング剤、第４の態様の組成物又は第５の態様のキットの使用を提供する。
【００９６】
第８の態様では、本発明は、第６の態様のイメージング方法を含んでなる、ヒト又は動物の身体の診断方法を提供する。
【００９７】
第７及び第８の態様におけるイメージング剤又は組成物の好ましい態様は、本発明のそれぞれ第１及び第４の態様（上記）に記載した通りである。両態様のヒト又は動物の身体の診断方法は、好ましくは異常なアポトーシスが関与している疾患状態の診断方法である。かかる「異常なアポトーシス」は、第６の態様（上記）に記載した通りである。
【実施例】
【００９８】
下記に詳述する非限定的な実施例によって本発明を例示する。例１〜３は本発明のキレーター１（ジアミンジオキシム）の合成を示し、例４はキレーター１Ａ（グルタル酸で官能化されたジアミンジオキシム）の合成及び対応する活性エステルであるキレーター１Ａ−ＴＦＴＰエステルの合成を示している。例５はキレーター１Ｂ（グルタリル−アミノ−ＰＥＧ１２プロピオン酸で官能化されたジアミンジオキシム）の合成を示している。例６はＢｏｃ保護テトラアミンキレーター（キレーター２Ａ）の合成を示している。例７は比較目的のためのＨＹＮＩＣ−ジュラマイシンコンジュゲート（先行技術）の合成を示しており、例８はキレーター１Ａで官能化されたジュラマイシン（コンジュゲート３Ａ及びコンジュゲート３Ｂ）の合成を示している。例９はキレーター１Ａで官能化されたシンナマイシン（コンジュゲート５）の合成を示している。例１０はキレーター１Ｂで官能化されたジュラマイシン（コンジュゲート６）の合成を示している。例１１はキレーター１Ｂで官能化されたシンナマイシン（コンジュゲート６）の合成を示している。例１２はキレーター２Ａで官能化されたジュラマイシン（コンジュゲート２Ａ及びコンジュゲート２Ｂ）の合成を示し、例１３はキレーター２Ａで官能化されたシンナマイシン（コンジュゲート４）の合成を示している。例１４は放射性金属99mＴｃによる本発明のキレーターコンジュゲートの放射性標識を示している。99mＴｃ錯体は高いＲＣＰを有する単一の化学種として生成する。これは、ＨＹＮＩＣ／ホスフィン／トリシン標識を使用した場合に複数の化学種が生成するＨＹＮＩＣに比べて有利な点である。操作は簡単であって、室温で効率的な標識が行える。ＲＣＰは高い放射能濃度でも非常に良好である（＞５００ＭＢｑ／ｍＬでＲＣＰ＞９０％）。
【００９９】
例１５はキレーターのコンジュゲーション部位の決定を示し、例１６は、キレーターのコンジュゲーション部位がホスファチジルエタノールアミンに対する結合親和性に顕著な効果を有し、その差は１８倍である（Ｋdとして５ｎＭ対９０ｎＭ）であることを証明している。これは、Ｎ末端（式ＩＩのＣｙｓa）への放射性金属錯体の結合が式ＩＩのＸａａへの結合より好ましいという証拠を提供する。例１７のＥＬ４リンパ腫マウス異種移植腫瘍モデルは、化学療法後のアポトーシス応答を模倣するためのモデルとして使用されてきた。療法剤（エトポシド／シクロホスファミド）で処置したマウスは、ビヒクル対照で処置した動物に比べて４倍の腫瘍アポトーシス増加を示した。例１７の体内分布結果は化学療法処置腫瘍における各薬剤の高い取込みを示している一方、相関分析は高レベルのアポトーシスを有する腫瘍ほど結合剤取込みが高い傾向を示唆している。99mＴｃ−［コンジュゲート５］は、99mＴｃ−［コンジュゲート３Ａ］に比べて、同様な腫瘍性能及び改善された肝臓性能を有していた。99mＴｃ−［コンジュゲート２Ａ］は、99mＴｃ−［コンジュゲート５］に比べて、同様な腫瘍性能を示すが、肺性能は劣っている。99mＴｃ−［コンジュゲート５］を用いた反復イメージング試験は、療法後における一貫した腫瘍：筋肉比の増加を示した。例１８は、インビボで肝臓バックグラウンドを低減させかつ尿中排泄を増加させる点でＰＥＧリンカー基が有利であることを示している。
【０１００】
略語
通常の一文字又は三文字アミノ酸略語が使用される。
％ｉｄ：        パーセント注射量
Ａｃ：          アセチル
Ａｃｍ：        アセトアミドメチル
ＡＣＮ：        アセトニトリル
Ｂｏｃ：        ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｂｚ：          ベンジル
ＤＣＭ：        ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ：    Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：        Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：      ジメチルスルホキシド
Ｆｍｏｃ：      ９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｇｌｕｔ：      グルタル酸
ＨＡＴＵ：      Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＡｔ：      ７−アザ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ：      高速液体クロマトグラフィー
ＩＢＸ：        １−ヒドロキシ−１，２−ベンズヨードキソール−３（１Ｈ）−オン−
１−オキシド
ＭＤＰ：        メチレンジホスホン酸
ＮａＰＡＢＡ：  ｐ−アミノ安息香酸ナトリウム
ＮＨＳ：        Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド
ＮＭＭ：        Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＰ：        １−メチル−２−ピロリジノン
ＰＢＳ：        リン酸緩衝食塩水
ＰＥＧ１２：    −（ＯＣＨ2ＣＨ2）12−
ＰｙＡＯＰ：    （７−アザベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジ
ノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＰｙＢＯＰ：    ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘ
キサフルオロホスフェート
ＲＡＣ：        放射能濃度
ＲＣＰ：        放射化学純度
ｔＢｕ：        ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＦＡ          トリフルオロ酢酸
ＴＦＴＰ：      テトラフルオロチオフェノール
ＴＨＦ：        テトラヒドロフラン
ＴＩＳ：        トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ：        トリチル
【０１０１】
【表１】
2013538819.tif 000012
例１：１，１，１−トリス（２−アミノエチル）メタンの合成
段階１（ａ）：３−（メトキシカルボニルメチレン）グルタル酸ジメチルエステル
トルエン（６００ｍｌ）中のカルボメトキシメチレントリフェニルホスホラン（１６７ｇ、０．５ｍｏｌ）を３−オキソグルタル酸ジメチル（８７ｇ、０．５ｍｏｌ）で処理し、反応物を窒素雰囲気下において１２０℃の油浴上で１００℃に３６時間加熱した。次いで、反応物を真空中で濃縮し、油状残留物を４０／６０石油エーテル／ジエチルエーテル（１：１、６００ｍｌ）でトリチュレートした。トリフェニルホスフィンオキシドを沈殿させ、上澄み液をデカント／濾過して除去した。真空中で蒸発させた後の残留物を高真空Ｂｐｔ（０．２トルでオーブン温度１８０〜２００℃）下でクーゲルロール蒸留することで、３−（メトキシカルボニルメチレン）グルタル酸ジメチルエステル（８９．０８ｇ、５３％）を得た。
【０１０２】
ＮＭＲ  1Ｈ（ＣＤＣｌ3）：δ  ３．３１（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2），３．７（９Ｈ，ｓ，３ｘＯＣＨ3），３．８７（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2），５．７９（１Ｈ，ｓ，＝ＣＨ，）ｐｐｍ。
【０１０３】
ＮＭＲ  13Ｃ（ＣＤＣｌ3），δ  ３６．５６，ＣＨ3，４８．７，２ｘＣＨ3，５２．０９及び５２．５（２ｘＣＨ2）；１２２．３及び１４６．１６Ｃ＝ＣＨ；１６５．９，１７０．０及び１７０．５３ｘＣＯＯｐｐｍ。
【０１０４】
段階１（ｂ）：３−（メトキシカルボニルメチレン）グルタル酸ジメチルエステルの水素化
メタノール（２００ｍｌ）中の３−（メトキシカルボニルメチレン）グルタル酸ジメチルエステル（８９ｇ、２６７ｍｍｏｌ）を、水素ガス雰囲気（３．５バール）下で（木炭上１０％パラジウム：５０％水）（９ｇ）と共に３０時間振盪した。溶液をケイソウ土で濾過し、真空中で濃縮することで、３−（メトキシカルボニルメチル）グルタル酸ジメチルエステルを油状物として得た。収量（８４．９ｇ、９４％）。
【０１０５】
ＮＭＲ  1Ｈ（ＣＤＣｌ3），δ  ２．４８（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，３ｘＣＨ2），２．７８（１Ｈ，ｈｅｘｔｅｔ，Ｊ＝８ＨｚＣＨ，）３．７（９Ｈ，ｓ，３ｘＣＨ3）。
【０１０６】
ＮＭＲ  13Ｃ（ＣＤＣｌ3），δ  ２８．６，ＣＨ；３７．５０，３ｘＣＨ3；５１．６，３ｘＣＨ2；１７２．２８，３ｘＣＯＯ。
【０１０７】
段階１（ｃ）：トリメチルエステルからトリアセテートへの還元及びエステル化
窒素雰囲気下で三ツ口の２Ｌ丸底フラスコ内において、ＴＨＦ（４００ｍｌ）中の水素化リチウムアルミニウム（２０ｇ、５８８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２００ｍｌ）中のトリス（メチルオキシカルボニルメチル）メタン（４０ｇ、２１２ｍｍｏｌ）で１時間かけて注意深く処理した。激しい発熱反応が起こり、溶媒を激しく還流させた。反応物を９０℃の油浴上で３日間加熱還流した。水素の発生が止まるまで酢酸（１００ｍｌ）を注意深く滴下することで反応物を脱活した。撹拌した反応混合物を、穏やかな還流が生じる程度の速度で無水酢酸溶液（５００ｍｌ）で注意深く処理した。フラスコに蒸留装置を取り付け、撹拌し、次いで９０℃（油浴温度）で加熱してＴＨＦを留去した。追加の無水酢酸（３００ｍｌ）を添加し、反応物を還流配置に戻し、１４０℃の油浴中で５時間撹拌加熱した。反応物を放冷し、濾過した。酸化アルミニウムの沈殿物を酢酸エチルで洗浄し、合わせた濾液を真空（５ｍｍＨｇ）中５０℃の水浴温度でロータリーエバポレーター上で濃縮して油状物を得た。油状物を酢酸エチル（５００ｍｌ）に溶解し、飽和炭酸カリウム水溶液で洗浄した。酢酸エチル溶液を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空中で濃縮して油状物を得た。油状物を高真空下でクーゲルロール蒸留することで、トリス（２−アセトキシエチル）メタン（４５．３ｇ、９５．９％）を油状物として得た。０．１ｍｍＨｇで沸点２２０℃。
【０１０８】
ＮＭＲ  1Ｈ（ＣＤＣｌ3），δ  １．６６（７Ｈ，ｍ，３ｘＣＨ2,ＣＨ），２．０８（１Ｈ，ｓ，３ｘＣＨ3）；４．１（６Ｈ，ｔ，３ｘＣＨ2Ｏ）。
【０１０９】
ＮＭＲ  13Ｃ（ＣＤＣｌ3），δ  ２０．９，ＣＨ3；２９．３４，ＣＨ；３２．１７，ＣＨ2；６２．１５，ＣＨ2Ｏ；１７１，ＣＯ。
【０１１０】
段階１（ｄ）：トリアセテートからのアセテート基の除去
メタノール（２００ｍｌ）中のトリス（２−アセトキシエチル）メタン（４５．３ｇ、１６５ｍＭ）及び８８０アンモニア（１００ｍｌ）を８０℃の油浴上２日間で加熱した。反応物を追加の８８０アンモニア（５０ｍｌ）で処理し、油浴中８０℃で２４時間加熱した。追加の８８０アンモニア（５０ｍｌ）を添加し、反応物を８０℃で２４時間加熱した。次いで、反応物を真空中で濃縮し、すべての溶媒を除去して油状物を得た。これを８８０アンモニア（１５０ｍｌ）に溶解し、８０℃で２４時間加熱した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、すべての溶媒を除去して油状物を得た。クーゲルロール蒸留によってアセトアミド（沸点１７０〜１８０  ０．２ｍｍ）を得た。アセトアミドを含むバルブをきれいに洗浄し、蒸留を続行した。トリス（２−ヒドロキシエチル）メタン（２２．５３ｇ、９２％）が沸点２２０℃  ０．２ｍｍで留出した。
【０１１１】
ＮＭＲ  1Ｈ（ＣＤＣｌ3），δ  １．４５（６Ｈ，ｑ，３ｘＣＨ2），２．２（１Ｈ，五重線，ＣＨ）；３．７（６Ｈ，ｔ，３ｘＣＨ2ＯＨ）；５．５（３Ｈ，ｂｒｓ，３ｘＯＨ）。
【０１１２】
ＮＭＲ  13Ｃ（ＣＤＣｌ3），δ  ２２．１３，ＣＨ；３３．９５，３ｘＣＨ2；５７．８，３ｘＣＨ2ＯＨ。
【０１１３】
段階１（ｅ）：トリオールからトリス（メタンスルホネート）への転化
ジクロロメタン（５０ｍｌ）中のトリス（２−ヒドロキシエチル）メタン（１０ｇ、０．０６７６ｍｏｌ）の撹拌氷冷溶液に、ジクロロメタン（５０ｍｌ）中の塩化メタンスルホニル（４０ｇ、０．３４９ｍｏｌ）の溶液を温度が１５℃を超えないような速度で窒素下でゆっくり滴下した。次いで、ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解したピリジン（２１．４ｇ、０．２７ｍｏｌ、４当量）を発熱反応で温度が１５℃を超えないような速度で滴下した。反応物を室温で２４時間撹拌し続け、次いで５Ｎ塩酸溶液（８０ｍｌ）で処理し、層を分離した。水性層を追加のジクロロメタン（５０ｍｌ）で抽出し、有機抽出液を合わせ、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮することで、過剰の塩化メタンスルホニルで汚染されたトリス［２−（メチルスルホニルオキシ）エチル］メタンを得た。理論収量は２５．８ｇであった。
【０１１４】
ＮＭＲ  1Ｈ（ＣＤＣｌ3），δ  ４．３（６Ｈ，ｔ，２ｘＣＨ2），３．０（９Ｈ，ｓ，３ｘＣＨ3），２（１Ｈ，ｈｅｘｔｅｔ，ＣＨ），１．８５（６Ｈ，ｑ，３ｘＣＨ2）。
【０１１５】
段階１（ｆ）：１，１，１−トリス（２−アジドエチル）メタンの製造
窒素下にある乾燥ＤＭＦ（２５０ｍｌ）中の［段階１（ｅ）からの、過剰の塩化メチルスルホニルで汚染された］トリス［２−（メチルスルホニルオキシ）エチル］メタン（２５．８ｇ、６７ｍｍｏｌ、理論量）の撹拌溶液を、アジ化ナトリウム（３０．７ｇ、０．４７モル）で少量ずつ１５分かけて処理した。発熱が観察され、反応物を氷浴上で冷却した。３０分後、反応混合物を５０℃の油浴上で２４時間加熱した。反応物は褐色になった。反応物を放冷し、希炭酸カリウム溶液（２００ｍｌ）で処理し、４０／６０石油エーテル／ジエチルエーテル１０：１（３×１５０ｍｌ）で３回抽出した。有機抽出液を水（２×１５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した。石油／エーテル溶液にエタノール（２００ｍｌ）を添加してトリアジドを溶液状態に保ち、真空中で２００ｍｌを下回らないように体積を減少させた。エタノール（２００ｍｌ）を添加し、真空中で再濃縮して痕跡量の石油を除去することで、２００ｍｌを下回らない量のエタノール溶液を得た。トリアジドのエタノール溶液を段階１（ｇ）で直接使用した。
【０１１６】
注意：アジドは潜在的に爆発性であるので、すべての溶媒を除去してはならず、常に希薄溶液状態に保つべきである。
【０１１７】
０．２ｍｌ未満の溶液を真空中で蒸発させてエタノールを除去し、この少量の試料に関してＮＭＲを実施した。
【０１１８】
ＮＭＲ  1Ｈ（ＣＤＣｌ3），δ  ３．３５（６Ｈ，ｔ，３ｘＣＨ2），１．８（１Ｈ，七重線，ＣＨ，），１．６（６Ｈ，ｑ，３ｘＣＨ2）。
【０１１９】
段階１（ｇ）：１，１，１−トリス（２−アミノエチル）メタンの製造
エタノール（２００ｍｌ）中のトリス（２−アジドエチル）メタン（１５．０６ｇ、０．０６７６ｍｏｌ）（前反応からの１００％収率を仮定）を木炭上１０％パラジウム（２ｇ、５０％水）で処理し、１２時間水素化した。反応器を２時間ごとに排気して反応から生じる窒素を除去し、水素を再充填した。ＮＭＲ分析のために試料を採取し、トリアジドからトリアミンへの完全な転化を確認した。
【０１２０】
警告：還元しないアジドは蒸留で爆発することがある。反応物をセライトパッドで濾過して触媒を除去し、真空中で濃縮することで。トリス（２−アミノエチル）メタンを油状物として得た。これをクーゲルロール蒸留（０．４ｍｍ／Ｈｇで沸点１８０〜２００℃）によってさらに精製して無色の油状物（８．１ｇ、トリオールからの総合収率８２．７％）を得た。
【０１２１】
ＮＭＲ  1Ｈ（ＣＤＣｌ3），δ  ２．７２（６Ｈ，ｔ，３ｘＣＨ2Ｎ），１．４１（Ｈ，七重線，ＣＨ），１．３９（６Ｈ，ｑ，３ｘＣＨ2）。
【０１２２】
ＮＭＲ  13Ｃ（ＣＤＣｌ3），δ  ３９．８（ＣＨ2ＮＨ2），３８．２（ＣＨ2．），３１．０（ＣＨ）。
【０１２３】
例２：３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタンの製造
２−メチルブト−２−エン（１４７ｍｌ、１．４ｍｏｌ）と亜硝酸イソアミル（１５６ｍｌ、１．１６ｍｏｌ）との混合物を、ドライアイス及びメタノールの浴中で−３０℃に冷却し、オーバヘッドエア撹拌機で激しく撹拌し、温度を−２０℃未満に維持するような速度で濃塩酸（１４０ｍｌ、１．６８ｍｏｌ）を滴下して処理した。かなりの発熱があり、過熱を防ぐために注意を払う必要があるので、これには約１時間を要する。エタノール（１００ｍｌ）を添加して、添加終了時に形成されるスラリーの粘度を低下させ、反応物を−２０〜−１０℃でさらに２時間撹拌して反応を完了させた。沈殿物を真空下での濾過によって回収し、４×３０ｍｌの冷（−２０℃）エタノール及び１００ｍｌの氷冷水で洗浄し、真空中で乾燥することで、３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタンを白色の固体として得た。エタノール濾液及び洗液を合わせ、水（２００ｍｌ）で希釈し、冷却し、−１０℃で１時間放置したところ、３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタンの追加クロップが晶出した。沈殿物を濾過によって回収し、最小量の水で洗浄し、真空中で乾燥することで、総収量（１１５ｇ  ０．８５ｍｏｌ、７３％）の３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタン（ＮＭＲによる純度＞９８％）を得た。
【０１２４】
ＮＭＲ  1Ｈ（ＣＤＣｌ3），異性体の混合物として（異性体１，９０％）１．５ｄ，（２Ｈ，ＣＨ3），１．６５ｄ，（４Ｈ，２ｘＣＨ3），５．８５，ｑ，及び５．９５，ｑ，共に１Ｈ。（異性体２，１０％），１．７６ｓ，（６Ｈ，２ｘＣＨ3），２．０７（３Ｈ，ＣＨ3）。
【０１２５】
例３：ビス［Ｎ−（１，１−ジメチル−２−Ｎ−ヒドロキシイミンプロピル）２−アミノエチル］−（２−アミノエチル）メタン（キレーター１）の合成
乾燥エタノール（３０ｍｌ）中のトリス（２−アミノエチル）メタン（４．０４７ｇ、２７．９ｍｍｏｌ）の溶液に、無水炭酸カリウム（７．７ｇ、５５．８ｍｍｏｌ、２当量）を窒素雰囲気下で激しく撹拌しながら室温で添加した。３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタン（７．５６ｇ、５５．８ｍｏｌ、２当量）の溶液を乾燥エタノール（１００ｍｌ）に溶解し、この溶液７５ｍｌを反応混合物にゆっくり滴下した。シリカ上でのＴＬＣ［プレートをジクロロメタン、メタノール、濃（０．８８ｓｇ）アンモニア（１００／３０／５）で展開し、ニンヒドリンを噴霧して加熱することでＴＬＣプレートを発色させた］によって反応を追跡した。モノ−、ジ−及びトリ−アルキル化生成物がその順序で増加するＲＦで認められた。３％アンモニア水中の７．５〜７５％アセトニトリル勾配でＲＰＲ逆相カラムを使用して分析ＨＰＬＣを実施した。反応物を真空中で濃縮してエタノールを除去し、水（１１０ｍｌ）中に再懸濁した。水性スラリーをエーテル（１００ｍｌ）で抽出して一部のトリアルキル化化合物及び親油性不純物を除去し、水層中にモノ及び所望のジアルキル化生成物を残存させた。良好なクロマトグラフィーを保証するため、水溶液を酢酸アンモニウム（２当量、４．３ｇ、５５．８ｍｍｏｌ）で緩衝した。水溶液を４℃で一晩貯蔵した後、自動化分取ＨＰＬＣによって精製した。
収量（２．２ｇ、６．４ｍｍｏｌ、２３％）。
質量スペクトル；正イオン１０Ｖコーン電圧。実測値：３４４；計算値Ｍ＋Ｈ＝３４４。
【０１２６】
ＮＭＲ  1Ｈ（ＣＤＣｌ3），δ  １．２４（６Ｈ，ｓ，２ｘＣＨ3），１．３（６Ｈ，ｓ，２ｘＣＨ3），１．２５−１．７５（７Ｈ，ｍ，３ｘＣＨ2,ＣＨ），（３Ｈ，ｓ，２ｘＣＨ2），２．５８（４Ｈ，ｍ，ＣＨ2Ｎ），２．８８（２Ｈ，ｔＣＨ2Ｎ2），５．０（６Ｈ，ｓ，ＮＨ2，２ｘＮＨ，２ｘＯＨ）。
【０１２７】
ＮＭＲ  1Ｈ（（ＣＤ3）2ＳＯ）δ  １．１４ｘＣＨ；１．２９，３ｘＣＨ2；２．１（４Ｈ，ｔ，２ｘＣＨ2）；
ＮＭＲ  13Ｃ（（ＣＤ3）2ＳＯ），δ  ９．０（４ｘＣＨ3），２５．８（２ｘＣＨ3），３１．０２ｘＣＨ2，３４．６ＣＨ2，５６．８２ｘＣＨ2Ｎ；１６０．３，Ｃ＝Ｎ。
【０１２８】
ＨＰＬＣ条件：２５ｍｍ  ＰＲＰカラム［Ａ＝３％アンモニア溶液（比重＝０．８８）／水；Ｂ＝アセトニトリル］を用いて流量８ｍｌ／分。
時間        ％Ｂ
０          ７．５
１５        ７５．０
２０        ７５．０
２２        ７．５
３０        ７．５
各ランについて３ｍｌの水溶液を装填し、１２．５〜１３．５分の時間窓内で収集する。
【０１２９】
例４：キレーター１−グルタル酸のテトラフルオロチオフェニルエステル（キレーター１Ａ−ＴＦＴＰエステル）の合成
ａ）［キレーター１］−グルタル酸（キレーター１Ａ）の合成
【０１３０】
【化１１】
2013538819.tif 000013
キレーター１（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解し、無水グルタル酸（３３ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を撹拌しながら少量ずつ添加した。反応物を２３時間撹拌することで、所望生成物への完全な添加を達成した。ＲＰ−ＨＰＬＣの後、純粋な酸が良好な収率で得られた。
【０１３１】
ｂ）キレーター１Ａ−ＴＦＴＰエステルの合成
【０１３２】
【化１２】
2013538819.tif 000014
ＤＭＦ（２ｍｌ）中のキレーター１Ａ（段階ａから、３００ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）に、ＨＡＴＵ（２４９ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）及びＮＭＭ（１３２μＬ、１．３２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を５分間撹拌し、次いでテトラフルオロチオフェノール（０．６６ｍｍｏｌ、１１９ｍｇ）を添加した。溶液を１０分間撹拌し、次いで反応混合物を２０％アセトニトリル／水（８ｍｌ）で希釈し、生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製することで、凍結乾燥後に１１０ｍｇの所望生成物を得た。
【０１３３】
例５：キレーター１−グルタリル−アミノ−ＰＥＧ１２プロピオン酸（キレーター１Ｂ）の合成
【０１３４】
【化１３】
2013538819.tif 000015
Ｂｏｃ−アミノ−ＰＥＧ１２プロピオン酸（Ｐｏｌｙｐｕｒｅ、４５ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）をＴＦＡ／水（１９：１）（１ｍＬ）で３０分間処理した。次いで、ＴＦＡを真空中で蒸発させ、残留物を真空中で一晩乾燥して５２ｍｇの粗アミノ−ＰＥＧ１２プロピオン酸を得た。キレーター１Ａ（４６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＰｙＡＯＰ（３１ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（１ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（４２μＬ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を５分間振盪し、アミノ−ＰＥＧ１２プロピオン酸（０．０６ｍｍｏｌ）に添加した。反応混合物を一晩振盪した。追加のキレーター１Ａ（０．０３ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、１時間後に混合物を水／０．１％ＴＦＡ（７ｍＬ）で希釈し、生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０１３５】
精製及び特性決定
ＲＰ−ＨＰＬＣ（勾配：４０分で１０〜３０％Ｂ、ｔR：３４．５分）によって精製することで、凍結乾燥後に４４ｍｇ（収率６７％）のキレーター１Ｂを得た。キレーター１ＢをＬＣ−ＭＳによって特性決定した（勾配：５分で１０〜４０％Ｂ、ｔR：２．２分、計算ｍ／ｚ  １０５７．７[ＭＨ]+、実測ｍ／ｚ  １０５８．０）。
【０１３６】
例６：キレーター２Ａの合成
段階（ａ）：ジエチル［２−（ベンジルオキシ）エチル］マロネート
この化合物をＲａｍａｌｉｎｇａｍ  ｅｔ  ａｌ［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，２８７５−２８９４（１９９５）］の方法の変法によって製造した。即ち、ナトリウム（１．２０ｇ）をアルゴン下で無水エタノール（２５ｍｌ）に溶解した。マロン酸ジエチル（１４．００ｇ）を添加し、混合物を３０分間還流した。ベンジルブロモエチルエーテル（１０ｇ）を添加し、混合物を１６時間撹拌還流した。エタノールを回転蒸発で除去し、残留物をエーテル（１００ｍｌ）と水（５０ｍｌ）との間に分配した。エーテル層を水（３×５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。エーテルを回転蒸発で除去し、残留物を真空中で蒸留した。４０〜５５℃で留出する画分は廃棄した（未反応のマロン酸ジエチル）。生成物は１４０〜１５０℃（１ｍｍ）で留出した［文献沸点１３８〜１４０℃（１ｍｍ）］。収量は１２．６０ｇの無色油状物であった。
【０１３７】
1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，２５oＣ，ＴＭＳ）δ＝７．２８（ｍ，５ＨＣ6Ｈ5），４．４７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），４．１６（ｍ，４Ｈ，ＣＯＯＣＨ2），３．５８（ｔ，１Ｈ，ＣＨ），３．５０（ｔ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2），２．２１（ｔ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2），１．２０（ｔ，６Ｈ，ＣＯＯＣＨ2−ＣＨ3）。13Ｃ  ＮＭＲ（６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，２５oＣ，ＴＭＳ）δ＝１６９．２０（ＣＯ），１３８．１０，１２８．６０，１２７．８０（芳香族），７３．００（ＣＨ2Ｐｈ），６７．３０（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2），６１．７０（ＣＯＯＣＨ2），４９．１０（ＣＨ），２８．９０（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2），１４．１０（ＣＯＯＣＨ2ＣＨ3）。
【０１３８】
段階（ｂ）：Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−２−（２−ベンジルオキシ−エチル）マロンアミド
ジエチル［２−（ベンジルオキシ）エチル］マロネート（４．００ｇ）をエチレンジアミン（３０ｍｌ）に添加し、溶液を室温で２日間撹拌した。過剰のエチレンジアミンを回転蒸発で除去し、残留物を高真空下で２日間乾燥することで、静置後に結晶化する黄色の油状物（４．２８ｇ）を得た。生成物は、ＮＭＲスペクトル中に検出される痕跡量のエチレンジアミンを含んでいた。
【０１３９】
1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，２５oＣ，ＴＭＳ）δ＝７．７４（ｂｒ  ｔ，２Ｈ，ＣＯ−ＮＨ），７．３２（ｍ，５Ｈ，Ｃ6Ｈ5），４．４６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），３．５０（ｔ，２Ｈ，ＯＣＨ2−ＣＨ2−），３．３３（ｔ１Ｈ，ＣＨ），３．２３（ｍ，４Ｈ，ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ2），２．７４（ｔ，４Ｈ，ＣＨ2−ＮＨ2），２．１８（ｑ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−），１．５５（ｂｒ  ｓ，４Ｈ，ＮＨ2）。13Ｃ  ＮＭＲ（６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，２５oＣ，ＴＭＳ）δ＝１７１．１０（ＣＯ），１３８．２０，１２８．３０，１２７．７０（芳香族），７３．００（ＣＨ2−Ｐｈ），６７．８０（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2），５１．４０（ＣＨ），４２．４０（ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ2），４１．２０（ＣＨ2−ＮＨ2），３１．９０（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−）。
【０１４０】
段階（ｃ）：Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノ−エチル）−２−（２−ベンジルオキシ−エチル）−１，３−ジアミノプロパン
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−２−（２−ベンジルオキシ−エチル）マロンアミド（３．８０ｇ）をＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解し、フラスコを氷浴中に浸漬した。フラスコをアルゴンでフラッシュし、ＴＨＦボラン錯体（８０ｍｌ、ＴＨＦ中１Ｍ）を注射器で添加した。反応混合物を室温まで放温し、次いで４０℃で２日間撹拌し、１時間還流した。メタノール（５０ｍｌ）を滴下し、溶液を４０℃で一晩撹拌した。溶媒を回転蒸発で除去し、残留物をメタノール（２０ｍｌ）に溶解した。水酸化ナトリウム（１５ｍｌの水中に１０ｇ）を添加し、メタノールを沸騰させて除去した。無色の油状物を分離し、ＣＨ2Ｃｌ2（３×５０ｍｌ）中に抽出した。溶液をＮａ2ＳＯ4上で乾燥した。溶媒の除去によって３．４０ｇの無色油状物を得た。
【０１４１】
1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，２５oＣ，ＴＭＳ）δ＝７．３４（ｍ，５Ｈ，Ｃ6Ｈ5），４．４９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），３．５５（ｔ，２Ｈ，ＯＣＨ2−ＣＨ2−），２．７６（ｔ，４Ｈ，Ｎ−ＣＨ2），２．６３（ｍ，８Ｈ，Ｎ−ＣＨ2），１．８４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），１．５８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ），１．４１（ｂｒ  ｓ，６Ｈ，ＮＨ）。13Ｃ  ＮＭＲ（６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，２５oＣ，ＴＭＳ）δ＝１３８．６０，１２８．３０，１２７．６０（ａｒｏｍａｔｉｃ），７２．８０（ＣＨ2−Ｐｈ），６８．７０（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2），５３．５０（Ｎ−ＣＨ2），５２．８０（Ｎ−ＣＨ2），４１．６０（Ｎ−ＣＨ2）３６．４０（ＣＨ），３１．３０（ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）。ＭＳ−ＥＩ：２９５[Ｍ＋Ｈ]+，（計算値：２９５．２）。
【０１４２】
段階（ｄ）：Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−エチル）−２−（２−ベンジルオキシ−エチル）−１，３−ジ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパン
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノ−エチル）−２−（２−ベンジルオキシ−エチル）−１，３−ジアミノプロパン（３．３０ｇ）をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（５．４０ｇ）及びｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（１０．３０ｇ）を添加した。反応混合物を室温で２日間撹拌した。混合物を水（１００ｍｌ）、クエン酸溶液（１００ｍｌ、水中１０％）及び水（２×１００ｍｌ）で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、溶媒を回転蒸発で除去して黄色の油状物を得、これを高真空下で一定の質量になるまで乾燥した。粗生成物（７．７０ｇ）をシリカゲルカラム（２５０ｇ、２３０〜４００メッシュ、ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨ2Ｃｌ2−Ｅｔ2Ｏ  １：１）上で精製することで、６．１０ｇ（７８．３％）の透明な油状物を得た。
【０１４３】
1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，２５oＣ，ＴＭＳ）δ＝７．３２（ｍ，５Ｈ，Ｃ6Ｈ5），５．１２（ｂｒｄ，２Ｈ，ＮＨ），４．４７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2−Ｐｈ），３．４９（ｔ，２Ｈ，ＯＣＨ2−ＣＨ2−），３．２４（ｂｒ，１２Ｈ，Ｎ−ＣＨ2），２．１４（ｂｒ，１Ｈ，ＣＨ），１．５９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）１．４５（ｓ，１８Ｈ，ｔ−Ｂｕ），１．４２（ｓ，１８Ｈ，ｔ−Ｂｕ）。13Ｃ  ＮＭＲ（６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，２５oＣ，ＴＭＳ）δ＝１５５．９０（ＮＨ−ＣＯ），１３８．２０，１２８．３０１２７．６０，１２７．５０（ａｒｏｍａｔｉｃ），７９．９０，７８．９０（ＣＭｅ3），７２．８０（ＣＨ2−Ｐｈ），６８．００（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2），５０．００（ｂｒ，Ｎ−ＣＨ2），４６．９０（ｂｒ，Ｎ−ＣＨ2），３９．２０（Ｎ−ＣＨ2），３４．４０（ｂｒ，ＣＨ），２９．８０（ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ），２８．３０（ｔ−Ｂｕ）。ＭＳ−ＥＩ：６９５[Ｍ＋Ｈ]+，（計算値：６９５．５）。
【０１４４】
段階（ｅ）：Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−エチル）−２−（２−ヒドロキシエチル）−１，３−ジ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパン
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−エチル）−２−（２−ベンジルオキシ−エチル）−１，３−ジ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパン（３．１６ｇ）を無水エタノール（１００ｍｌ）に溶解し、活性化炭素上のＰｄ（１．００ｇ、乾燥、１０％）を添加した。混合物をＰａｒｒ水素化装置において３５ｐｓｉで２日間水素化した。触媒を濾去し、エタノール（３×２０ｍｌ）で洗浄した。エタノールを回転蒸発で除去して無色の油状物を得、これを高真空下で一定の質量（２．６７ｇ、９７．１％）になるまで乾燥した。
【０１４５】
1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，２５oＣ，ＴＭＳ）δ＝５．２５（ｂｒ  ｄ，２Ｈ，ＮＨ），３．６９（ｔ，２Ｈ，ＯＣＨ2−ＣＨ2−），３．２８（ｂｒ，１２Ｈ，Ｎ−ＣＨ2），２．７１（ｂｒ，ＯＨ），２．２３（ｂｒ，１Ｈ，ＣＨ），１．５６（ｓｈｏｕｌｄｅｒ，ｍ，２Ｈ，ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）１．４８（ｓ，１８Ｈ，ｔ−Ｂｕ），１．４４（ｓ，１８Ｈ，ｔ−Ｂｕ）。13Ｃ  ＮＭＲ（６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，２５oＣ，ＴＭＳ）δ＝１５６．１０（ＮＨＣＯ），８０．００，７９．２０（ＣＭｅ3），５９．６０（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2），４９．９０（ｂｒ，Ｎ−ＣＨ2），４７．００（ｂｒ，Ｎ−ＣＨ2），３９．３４（Ｎ−ＣＨ2），３３．８０（ＣＨ），３２．３０（ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ），２８．３０（ｔ−Ｂｕ）。ＭＳ−ＥＩ：６０５[Ｍ＋Ｈ]+，（計算値：６０５．４）。
【０１４６】
段階（ｆ）：Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−エチル）−２−（２−カルボキシメチル）−１，３−ジ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパン（Ｂｏｃ保護キレーター２Ａ）
Ｍａｚｉｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ［Ａｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４１，４０５９−４０６１（２００２）］の方法を使用した。即ち、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−エチル）−２−（２−ヒドロキシエチル）−１，３−ジ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロパン（２．６０ｇ）をＤＭＳＯ（１５ｍｌ）に溶解し、１−ヒドロキシ−１，２−ベンズヨードオキソール−３（１Ｈ）−オン−１−オキシド（ＩＢＸ、３．５０ｇ）を添加した。混合物を室温で１時間撹拌し、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２．５０ｇ）を添加した。反応混合物を室温で２日間撹拌した。水酸化ナトリウム溶液（２Ｍ、４０ｍｌ）を添加し、混合物を室温で４時間撹拌した。溶液を氷浴中に浸漬し、２Ｍ塩酸でｐＨ２に酸性化した。水性層をエーテル（４×１００ｍｌ）で抽出し、合わせたエーテル抽出液を水（３×５０ｍｌ）で洗浄した。エーテル層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、溶媒を回転蒸発で除去することで、生成物及び２−ヨードソ安息香酸を含む黄色の固体残渣を得た。クロロホルム−ヘキサン（１：３）（８０ｍｌ）からの結晶化によってヨードソ安息香酸の大部分（２．１ｇ）を除去した。クロロホルム−ヘキサン母液を蒸発させて黄色の油状物（３ｇ）を得、これをシリカカラム（３００ｇ、ＣＨ2Ｃｌ2−Ｅｔ2Ｏ、１：１）上に装填した。残留ヨードソ安息香酸はエーテルで溶出した。生成物はエーテル−メタノール（９：１）で溶出した。生成物を含む画分を合わせ、溶媒を除去して１．５ｇの淡黄色油状物を得た。これを再びシリカカラム上でクロマトグラフィー処理した（５０ｇ、Ｅｔ2Ｏ）。生成物をエーテル−酢酸（９５：５）で溶出した。生成物を含む画分を合わせ、溶媒を回転蒸発で除去して油状物を得、これを高真空下で乾燥した。収量は１．１０ｇ（４１．３％）であった。
【０１４７】
1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，２５oＣ，ＴＭＳ）δ＝７．６１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），５．１９（ｂｒ  ｄ，２Ｈ，ＮＨ），３．２２（ｂｒ，１２Ｈ，Ｎ−ＣＨ2），２．４７（ｂｒ  ｍ，１Ｈ，ＣＨ），２．２６（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ），１．４１（ｓ，１８Ｈ，ｔ−Ｂｕ），１．３７（ｓ，１８Ｈ，ｔ−Ｂｕ）。13Ｃ  ＮＭＲ（６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，２５oＣ，ＴＭＳ）δ＝１７５．９０（ＣＯＯＨ），１５６．１０（ＮＨＣＯ），８０．４０，７９．１０（ＣＭｅ3），４９．５０（Ｎ−ＣＨ2），４６．８０（Ｎ−ＣＨ2），３９．００（Ｎ−ＣＨ2），３４．７０（ＣＨ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ），３４．２０（ＣＨ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ），２８．３０，２８．２０（ｔ−Ｂｕ）。ＭＳ−ＥＩ：６１９[Ｍ＋Ｈ]+，（計算値：６１９．４）。
【０１４８】
例７：ＨＹＮＩＣ−ジュラマイシン（コンジュゲート１Ａ及びコンジュゲート１Ｂ）の合成
ジュラマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、５．０ｍｇ、２．５μｍｏｌ）及びＮ−Ｂｏｃ−ＨＹＮＩＣスクシンイミジルエステル（ＡＢＸ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ社、１．０ｍｇ、２．８μｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（２．０μＬ、１３μｍｏｌ）を混合物に添加した。反応の進行をＬＣ−ＭＳ分析によってモニターした。緩慢な反応を促進するため、３時間後にＨＯＡｔ（１．１当量）を添加したところ、一晩で約６０％の生成物が生じた。室温でさらに１日後及び４℃で３日後に約８０％のＨＹＮＩＣ−コンジュゲート生成を得るためには、追加のＮ−Ｂｏｃ−ＨＹＮＩＣスクシンイミジルエステル（１当量）及びＨＯＡｔ（２当量）が必要であった。ＬＣ−ＭＳ分析によれば、ビス−コンジュゲート（約３５％）に加えて、モノ−コンジュゲートに対応する２つの基線分離ピークが認められた。
【０１４９】
精製及び特性決定
水／０．１％ＴＦＡ（４ｍｌ）を反応混合物に添加し、２種のモノ−コンジュゲート化生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（勾配：１５分の０％Ｂ、１０分で０〜４５％Ｂ、４０分で４５〜６０％Ｂ、ｔR：４７．９分及び４９．３分）によって精製し、次いでＴＦＡ中でＢｏｃ脱保護することで、２種のモノ−コンジュゲート化ジュラマイシン異性体をそれぞれ１．７ｍｇ及び１．１ｍｇの収量で得た。
【０１５０】
２種の異性体をＬＣ−ＭＳによって特性決定した（勾配：５分で２０〜４０％Ｂ、ｔR：２．８分（コンジュゲート１Ａ）、実測ｍ／ｚ：１０７４．８、予測ＭＨ22+：１０７４．４、ｔR：２．９分（コンジュゲート１Ｂ）、実測ｍ／ｚ：１０７４．８、予測ＭＨ22+：１０７４．４）。
【０１５１】
例８：［キレーター１Ａ］−ジュラマイシンモノ−コンジュゲート（コンジュゲート３Ａ）及び［キレーター１Ａ］−ジュラマイシンビス−コンジュゲート（コンジュゲート３Ｂ）の合成
キレーター１Ａ（例４、３．０ｍｇ、６．６μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（２．６ｍｇ、５．０μｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１．７μＬ、９．７μｍｏｌ）をＮＭＰ（０．７ｍｌ）に溶解した。混合物を５分間振盪し、ＮＭＰ（０．５ｍｌ）中のジュラマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、５．０ｍｇ、２．５μｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を４０分間振盪し、次いで水／０．１％ＴＦＡ（６ｍｌ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１５２】
分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で５〜３５％Ｂ（ただし、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＨＣＯＯＨ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＨＣＯＯＨ））によって精製することで、２．５ｍｇの純粋なコンジュゲート３Ａ（収率４１％）及び１．７ｍｇの純粋なコンジュゲート３Ｂ（収率２８％）を得た。
【０１５３】
精製コンジュゲート３Ａを分析ＬＣ−ＭＳによって分析した（勾配：５分で２５〜３５％Ｂ、ｔR：１．９３分、実測ｍ／ｚ：１２２７．０、予測ＭＨ22+：１２２６．６）。
【０１５４】
精製コンジュゲート３Ｂを分析ＬＣ−ＭＳによって分析した（勾配：５分で２５〜３５％Ｂ、ｔR：２．３５分、実測ｍ／ｚ：１４４６．７、予測ＭＨ22+：１４４６．３）。
【０１５５】
２種のモノ−コンジュゲート（コンジュゲート３Ａ）の分離は、分析ＨＰＬＣ又は分取ＨＰＬＣを用いて達成することができなかった。各々の場合において、２種の位置異性体は単一のピークとして溶出した。
【０１５６】
例９：［キレーター１Ａ］−シンナマイシンコンジュゲート（コンジュゲート５）の合成
シンナマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、２．０ｍｇ、１．０μｍｏｌ）、キレーター１Ａ（例４、０．９ｍｇ、１．５μｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．５μＬ、２．９μｍｏｌ）を、ＮＭＰ（０．２ｍｌ）、ＤＭＦ（０．２ｍｌ）及びＤＭＳＯ（０．６ｍｌ）の溶液に溶解した。反応混合物を一晩振盪した。次いで、混合物を１０％ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ（７ｍｌ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１５７】
精製及び特性決定
分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜４０％Ｂ）によって精製することで、１．９ｍｇの純粋なコンジュゲート５（収率７８％）を得た。精製材料
を分析ＬＣ−ＭＳによって分析した（勾配：５分で２０〜４０％Ｂ、ｔR：２．８６分、実測ｍ／ｚ：１２４１．０、予測ＭＨ22+：１２４０．６）。
【０１５８】
例１０：［キレーター１Ｂ］−ジュラマイシンコンジュゲート（コンジュゲート６）の合成
キレーター１Ｂ（例５、１．６ｍｇ、１．５μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（０．４ｍｇ、０．８μｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１μＬ、５μｍｏｌ）をＮＭＰ（０．５ｍＬ）に溶解した。混合物を５分間振盪し、ＮＭＰ（０．５ｍＬ）中のジュラマイシン（３．０ｍｇ、１．５μｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を３０分間振盪した。活性化キレーター１Ｂのさらに２つのアリコート（２×１．６ｍｇ）を３０分間隔で添加した。混合物を水／０．１％ＴＦＡ（６ｍＬ）で希釈し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１５９】
精製及び特性決定
分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２０〜５０％Ｂ（ただし、Ａ＝水／０．１％酢酸アンモニウム及びＢ＝ＡＣＮ））によって精製することで、３．９ｍｇの純粋なコンジュゲート６（収率８７％）を得た。精製材料をＬＣ−ＭＳによって分析した（勾配：５分で２０〜４０％Ｂ、ｔR：２．８９分、実測ｍ／ｚ：１５２６．５、予測ＭＨ22+：１５２６．２）。
【０１６０】
例１１：［キレーター１Ｂ］−シンナマイシンコンジュゲート（コンジュゲート７）の合成
キレーター１Ｂ（例５、４．８ｍｇ、４．４μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（２．１ｍｇ、４．０μｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２．３μＬ、１３．２μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解した。混合物を５分間振盪し、固形のシンナマイシン（４．５ｍｇ、２．２μｍｏｌ）に添加した。反応を促進して４時間以内にほぼ完了させるため、２時間後及び３．５時間後に追加の予備活性化キレーター１Ｂを添加した。混合物を２０％ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ（８ｍＬ）で希釈し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１６１】
精製及び特性決定
分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（勾配：４０分で２５〜３５％Ｂ、ｔR：３８．６分）によって精製することで、３．９ｍｇの精製コンジュゲート７（収率５８％）を得た。
【０１６２】
精製材料をＬＣ−ＭＳによって分析した（勾配：５分で２０〜４０％Ｂ、ｔR：２．９分、実測ｍ／ｚ：１０２８．０、予測ＭＨ22+：１０２７．５（純度約９３．５％、未反応出発原料約３％））。
【０１６３】
例１２：［キレーター２Ａ］−ジュラマイシンコンジュゲート（コンジュゲート２Ａ及びコンジュゲート２Ｂ）の合成
ジュラマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、７．５ｍｇ、３．８μｍｏｌ）、Ｂｏｃ保護キレーター２Ａ（例６、５．０ｍｇ、６．９μｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（１．９ｍｇ、８．８μｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（４．１μＬ、２０．０μｍｏｌ）をＮＭＰ（１．５ｍｌ）に溶解した。反応混合物を一晩振盪した。次いで、混合物を２０％ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ（６ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１６４】
精製及び特性決定
分取ＨＰＬＣ（勾配：１０分の０％Ｂ、５分で０〜３０％Ｂ、４０分で３０〜７０％Ｂ、ｔR：４２．４分及び４５．０分）によって精製し、次いでＴＦＡ中でＢｏｃ脱保護することで、２種のモノ−コンジュゲート化ジュラマイシン異性体をそれぞれ２．０ｍｇ及び０．４ｍｇの収量で得た。
【０１６５】
２種の異性体をＬＣ−ＭＳによって特性決定した（勾配：５分で２０〜６０％Ｂ、ｔR：１．７分（コンジュゲート２Ａ）、実測ｍ／ｚ：１１０７．５、予測ＭＨ22+：１１０７．０、ｔR：１．６分（コンジュゲート２Ｂ）、実測ｍ／ｚ：１１０７．５、予測ＭＨ22+：１１０７．０）。
【０１６６】
例１３：［キレーター２Ａ］−シンナマイシンコンジュゲート（コンジュゲート４）の合成
シンナマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、２．０ｍｇ、１．０μｍｏｌ）、Ｂｏｃ保護キレーター２Ａ（例６、１．１ｍｇ、１．５μｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．５μＬ、２．９μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．０ｍｌ）に溶解した。反応混合物を一晩振盪した。次いで、混合物を２０％ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ（６ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。
【０１６７】
精製及び特性決定
分取ＨＰＬＣ（勾配：４０分で３０〜７０％Ｂ）によって精製することで、１．８ｍｇの純粋なＢｏｃ保護コンジュゲート４を得た。精製材料をＴＦＡ／４％水（２ｍｌ）中で４５分間Ｂｏｃ脱保護し、５０％ＡＣＮ／水から凍結乾燥することで、１．６ｍｇのコンジュゲート４（収率７３％）を得た。材料を分析ＬＣ−ＭＳによって分析した（勾配：５分で１０〜４０％Ｂ、ｔR：３．７分、実測ｍ／ｚ：１１２０．９、予測ＭＨ22+：１１２１．０）。
【０１６８】
例１４：99mＴｃ標識キレーター−コンジュゲートの製造
放射性標識製剤は、（ｉ）精製せずに（高いＲＡＣで高いＲＣＰを得ながら）、或いは（ｉｉ）精製によって非標識ＬＢＰペプチドを除去しながら使用した。
【０１６９】
コンジュゲート３Ａ（０．１ｍｇ、４０ｎｍｏｌ）をエタノール（１００ｍＬ）及び水（１００ｍＬ）の混合物に溶解し、可溶化を助けるため超音波浴中に約２０分間配置した。溶液を凍結乾燥キットに添加した［処方：ＳｎＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（０．０１６ｍｇ、０．０７μｍｏｌ）、ＭＤＰ（Ｈ4）（０．０２５ｍｇ，０．１４μｍｏｌ）、ＮａＨＣＯ3（４．５ｍｇ、５３．６μｍｏｌ）、Ｎａ2ＣＯ3（０．６ｍｇ、５．６６μｍｏｌ）及びＮａＰＡＢＡ（０．２ｍｇ、１．２６μｍｏｌ）］。
【０１７０】
次いで、99Ｍｏ／99mＴｃジェネレーターからの[99mＴｃＯ4]-溶出液（約１ｍｌ）を添加し、混合物を室温で約１０分間放置した。粗生成物の一部（約４００μＬ）をＨＰＬＣカラム上に注入した（下記のＨＰＬＣ条件を参照されたい）。約１８分の保持時間を有する放射性ピークを、ＰＢＳ（所望のＲＡＣに応じた様々な容量）を含むバイアル中に「カット」し、次いで真空中で乾燥して過剰の移動相を除去した。
粗ＲＣＰ＝９３±６％（ｎ＝１３）。
製剤化ＲＣＰ（ｔ＝０）＝９９±１％（ｎ＝１３）。
製剤化ＲＣＰ（ｔ＝１２０分）＝９７±３％（ｎ＝１３）。
比放射能＝３．５±０．５ＧＢｑ／ｎｍｏｌ（ｎ＝１３）。
ＲT（99mＴｃ−コンジュゲート５）＝１８分。
ＨＰＬＣ条件
【０１７１】
【表２】
2013538819.tif 000016
【０１７２】
【表３】
2013538819.tif 000017
先行技術のＨＹＮＩＣ対応物である99mＴｃ−［コンジュゲート１］のＲＣＰは、７８〜８９％（粗）であった。
【０１７３】
テトラアミンキレーターのコンジュゲート（コンジュゲート１Ａ及び４）は、移動相Ａとして５０ｍＭ酢酸アンモニウムの代わりに０．１％ＴＦＡを使用した点を除き、同様にして製造した。99mＴｃ−［コンジュゲート２Ａ］の保持時間は１２．２分であり、99mＴｃ−［コンジュゲート４］の保持時間は１２．４分であった。
１．０）。
【０１７４】
例１５：コンジュゲート２Ａ及び２Ｂのエドマン分解
ＭＳ分析技法のみの使用はキレーターのコンジュゲーション部位の決定には適さないことが判明し、ＬＣ−ＭＳと組み合わせて手動エドマン分解化学を適用した。
【０１７５】
修正した文献方法を使用した［Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ；ＰＮＡＳ，１０６，ｐ．１９３１０−１９３１５（２００９）、Ｏｎｉｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１８，ｐ．１０７０−１０７９（２００７）及びＨａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４３，１４２１−１４３０（１９９０）］。
【０１７６】
得られたデータは、コンジュゲート２ＡがＮα−アミノコンジュゲート化異性体に相当する一方、コンジュゲート２ＢがＬｙｓ2  Ｎε−アミノコンジュゲートに相当することを示した。データは第二アミノコンジュゲート（式ＩＩのＬｙｓd）に関して予想される分解生成物に適合せず、この部位がキレートコンジュゲーションのために使用される条件下では反応性を有しないことを示している。しかし、第二アミノ基はエドマン分解サイクル中に使用されるより強力なカップリング条件下でフェニルイソチオシアネートと反応することが注目された。
【０１７７】
例１６：ホスファチジルエタノールアミンに対する親和性
Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（ウプサラ、スウェーデン））にＬ１チップを取り付けた。ＰＯＰＥ／ＰＯＰＣ（２０％ＰＥ）から作製したリポソームを、製造者によって推奨される捕獲技法を用いた親和性試験のために適用した。各ランは、チップ表面の活性化、リポソームの固定化、ペプチドの結合、並びにリポソーム及びペプチドの洗浄除去（再生）からなっていた。同様な適用例は、Ｆｒｏｓｔｅｌｌ−Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ［Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖ．９４（１），（２００５）］）に見出すことができる。各サイクル後には、流れる緩衝液による針、チューブ及び液体取扱いシステムの完全な洗浄を実施した。
【０１７８】
ＢＩＡＣＯＲＥソフトウェア：すべての方法インストラクションを含むＢＩＡＣＯＲＥ制御ソフトウェアを適用した。プレプログラムドインストラクションに対する完全な制御を得るため、コマンド付きの方法がＢＩＡＣＯＲＥ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  Ｌａｎｇｕａｇｅ（ＭＤＬ）でも書かれていた。センサーグラムを分析するためには、ＢＩＡＣＯＲＥ評価ソフトウェアを適用した。すべての物質は、ホスファチジルエタノールアミンに対する良好な結合剤であることがわかった。すべての物質に関するＫDは１００ｎＭ未満であった。結果を下記表２に示す。
【０１７９】
【表４】
2013538819.tif 000018
例１７：腫瘍取込み試験
99mＴｃ−［コンジュゲート２Ａ］、99mＴｃ−［コンジュゲート３Ａ］及び99mＴｃ−［コンジュゲート５］を、ＥＬ４マウスリンパ腫異種移植片モデルにおける体内分布によって評価した。簡単に述べれば、Ｃ５７／Ｂ１６マウスにおける腫瘍増殖の確立後、動物を
（ｉ）食塩水／ＤＭＳＯ溶液、又は
（ｉｉ）化学療法剤（５０％食塩水／５０％ＤＭＳＯ中の６７ｍｇ／ｋｇエトポシド及び１００ｍｇ／ｋｇシクロホスファミド）
で処置した。
【０１８０】
療法剤又はビヒクルでの処置から２４時間後、動物を該当する放射性標識化合物の体内分布に関して評価した。加えて、腫瘍を摘出し、カスパーゼ活性の測定（カスパーゼ−Ｇｌｏアッセイ）によってアポトーシスのレベルを評価した。次いで、結合剤取込みとカスパーゼ活性との相関関係を様々な時点に関してプロットした。注射から１２０分後の結果を表３（下記）に示し、99mＴｃ−［コンジュゲート５］に関する結果を図１及び図２に示す。
【０１８１】
【表５】
2013538819.tif 000019
例１８：99mＴｃ標識キレーター−コンジュゲートの体内分布
種々の化合物の薬物動態プロファイルを決定するため、ナイーブラットにおける体内分布によって99mＴｃ−コンジュゲートを評価した。次いで、種々の器官／組織における結合剤保持の相関関係を様々な時点に関してプロットした。生成されたデータは、ＬＢＰ１及びＬＢＰ２コンジュゲート中におけるＰＥＧの含有が肝臓保持を低減させることで薬物動態を改善することを示した（下記表４を参照されたい）。
【０１８２】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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