(57)【要約】  本発明は、酵母細胞、特に組換え酵母細胞であって、ＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に必要な酵素活性を欠損しているか、またはその対応する野生型酵母細胞と比較してＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に対する酵素活性が低下しており、かつＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１０）活性をコードする１つまたは複数の異種核酸配列を含む、酵母細胞に関する。本発明はさらに、エタノールの調製における本発明による細胞の使用に関する。
2013500006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え酵母細胞、特にトランスジェニック酵母細胞であって、ＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１０）活性をコードする１つまたは複数の組換え、特に異種の核酸配列を含み、ＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に必要な酵素活性を欠損しているか、あるいは、その対応する野生型酵母細胞と比較してＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に対する酵素活性が低下している、酵母細胞。
【請求項２】
前記細胞は、配列番号２もしくは配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ：）２９で表されるＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、または配列番号２もしくは配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）２９の機能的ホモログをコードする１つまたは複数の異種核酸配列を含み、前記ホモログは好ましくは配列番号２もしくは配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）２９との配列同一性が少なくとも６０％、詳細には少なくとも７０％、より詳細には少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記細胞は、前記デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列であって、配列番号１、配列番号２８もしくは配列番号３２に記載の配列または配列番号１、配列番号２８もしくは配列番号３２の機能的ホモログを含む、核酸配列を含み、前記ホモログは好ましくは配列番号１との配列同一性が少なくとも６０％、詳細には少なくとも７０％、より詳細には少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％である、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記細胞はＮＡＤ依存性グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を含まないか、もしくは、ＮＡＤ依存性グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性がその対応する野生型細胞と比較して低下しており、および／または、前記細胞はグリセロールリン酸ホスファターゼ活性を含まないか、もしくは、グリセロールリン酸ホスファターゼ活性がその対応する野生型細胞低下している、先行する請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
前記細胞のゲノムは、ＧＰＤ１、ＧＰＤ２、ＧＰＰ１およびＧＰＰ２の群から選択される少なくとも１つの遺伝子に突然変異を含み、前記突然変異はノックアウト突然変異でもよく、前記ノックアウト突然変異は前記細胞に対応する野生型酵母遺伝子に対する、前記遺伝子の少なくとも１つの完全な欠失でもよい、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞はＮＡＤ＋依存性グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．８）をコードする遺伝子を含まない、請求項４または５に記載の細胞。
【請求項７】
アセチルコエンザイムＡシンテターゼ活性（ＥＣ６．２．１．１）をコードする１つまたは複数の核酸配列、およびＮＡＤ＋依存性アルコールデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ１．１．１．１）をコードする１つまたは複数の核酸配列を含む、先行する請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項８】
前記細胞はサッカロミセス科から、特にサッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属；クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などのクリベロマイセス属；ピキア・スティピティスまたはピキア・アンガスタなどのピキア属；ザイゴサッカロミセス・バイリーなどのザイゴサッカロミセス属；およびブレタノマイセス・インターメディウスなどのブレタノマイセス属の群から選択される酵母細胞である、先行する請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞は２００９年７月１６日にセントラルビューロー・フォー・シュメルカルチャーズに寄託された寄託番号ＣＢＳ１２５０４９のＳ．セレビシエ株の細胞である、先行する請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項１０】
エタノールの調製のための、先行する請求項のいずれかに記載の細胞の使用。
【請求項１１】
酵母細胞内で異種ポリペプチドを機能的に発現するベクターであって、前記発現ベクターは前記酵母細胞内で機能的なプロモーターに作動可能に連結された異種核酸配列を含み、前記異種核酸配列は前記酵母細胞（のサイトゾル）内でアセチルコエンザイムＡをアセトアルデヒドに変換する酵素活性を持つポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは好ましくは、配列番号２、配列番号２９に記載の配列、または前記配列のいずれかの機能的ホモログを含む、ベクター。
【請求項１２】
アセテートと、発酵性糖質−特にグルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、キシロース、アラビノース、ガラクトースおよびマンノースの群から選択される糖質−とからエタノールを調製することを含み、前記調製は酵母細胞を用いて嫌気条件下で行われ、前記細胞はアセチルコエンザイムＡシンテターゼ活性、およびＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を含み、前記細胞は好ましくは、ＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に必要な酵素活性を欠損している細胞、およびその対応する野生型酵母細胞と比較してＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に対する酵素活性が低下している細胞の群から選択される細胞である、エタノールを調製する方法。
【請求項１３】
前記調製は発酵培地内で行われ、前記アセテートおよび前記糖質を０．７以下、詳細には少なくとも０．００４〜０．５、より詳細には０．０５〜０．３のモル比で含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記糖質の少なくとも一部および前記アセテートの少なくとも一部はリグノセルロース、セルロース、ヘミセルロースおよびペクチンの群から選択される多糖を加水分解することにより得られる、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１５】
リグノセルロース系バイオマスは加水分解され、それにより前記発酵性糖質およびアセテートを得る、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所望の発酵生成物を生成する能力を有する組換え酵母細胞と、遺伝子改変による前記酵母細胞の構築と、前記酵母細胞を使用する、発酵生成物を生成するプロセスとに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるエタノール生成は、量で見ると、産業バイオテクノロジーにおいて唯一最大の発酵プロセスである。リグノセルロース加水分解物、特に非食品の供給原料（たとえばエネルギー作物および農業廃棄物、林業廃棄物、またはセルロース、ヘミセルロースおよび／もしくはペクチンを豊富に含む産業／消費者廃棄物）由来の加水分解されたリグノセルロース系バイオマスを含むＳ．セレビシエの基質範囲を拡大し、生産性、頑健性、および生成物の収率を高めるべく、世界的な研究努力が進行中である。
【０００３】
リグノセルロースバイオマスは豊富である一方、一般にＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの野生型のエタノール生成微生物により、容易に発酵されない。バイオマスは、加水分解されなければならない。その結果生じる加水分解物は、多くの場合、様々な単糖類およびオリゴ糖の混合物であり、これらは、必ずしも野生型微生物の好適な基質であるとは限らない場合がある。加えて、この加水分解物は通常、特にペクチンまたはヘミセルロースを加水分解する際に副生成物として形成される酢酸、さらに加水分解の種類に応じて、発酵に好ましくない影響を与える１つまたは複数の他の複製生成物または残留試薬を含む。特に、酢酸は、野生型Ｓ．セレビシエ株および遺伝子改変Ｓ．セレビシエ株による糖発酵のカイネティクスおよび／または化学量論に好ましくない影響を与え、低ｐＨ培養ではその毒性が強く増大することが報告されている（ヘレ（Ｈｅｌｌｅ）ら「エンザイム・アンド・マイクロバイアル・テクノロジー（Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」第３３巻（２００３年）ｐ．７８６−７９２；ベリシミ（Ｂｅｌｌｉｓｓｉｍｉ）ら、ＦＥＭＳイーストリサーチ（ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第９巻（２００９年）ｐ．３５８−３６４）。
【０００４】
遺伝子改変によるエタノール生成生物の発酵特性を改善するため、およびバイオマスの加水分解プロセスを改善するため、様々なアプローチが提案されてきた。たとえば、バイオマス加水分解物からのエタノールの発酵生産における発展の概要は、Ａ．ファン・マリス（Ａ．ｖａｎ  Ｍａｒｉｓ）ら（アントニ・ファン・レーウェンフック（Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ）（２００６年）第９０巻：ｐ．３９１−４１８）による概説に記載されている。Ｓ．セレビシエを改変し得る様々な方法、およびリグノセルロース系バイオマスを加水分解する様々な方法について言及されている。
【０００５】
酵母を用いたエタノール生成の化学量論に関する主な課題は、相当量のグリセロールが常に副生成物として形成されることである。典型的なエタノールの産業処理では、糖供給原料の最大約４ｗｔ％がグリセロールに変換されると推定されている（ニッセン（Ｎｉｓｓｅｎ）ら、イースト（Ｙｅａｓｔ）第１６巻（２０００年）ｐ．４６３−４７４）。嫌気的増殖に理想的な条件下でのグリセロールへの変換率は、さらに高く、最大約１０％である場合がある。
【０００６】
嫌気条件下でのグリセロール生成は主に、レドックス代謝と関連している。Ｓ．セレビシエの嫌気的増殖における糖異化は、アルコール発酵により起こる。このプロセスでは、ピルベートの脱炭酸により形成されるアセトアルデヒドを、ＮＡＤ＋依存性アルコールデヒドロゲナーゼによりエタノールに変換することにより、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼによる解糖反応で形成されたＮＡＤＨが再酸化される。このレドックス−中性異化経路の安定な化学量論により、代謝の別の箇所で全体としてＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの還元が起こると問題が引き起こされる。嫌気条件下で、Ｓ．セレビシエにおけるＮＡＤＨの再酸化は、グリセロールへの糖の還元に厳密に依存している。グリセロールの形成は、ＮＡＤ＋依存性グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼにより触媒される反応である、解糖系中間体ジヒドロキシアセトンリン酸のグリセロール３−リン酸への還元により惹起される。その後、この反応により形成されたグリセロール３−リン酸は、グリセロール−３−ホスファターゼにより加水分解されてグリセロールおよび無機リン酸塩を与える。したがって、グリセロールは、Ｓ．セレビシエによるエタノールの嫌気性生成における主要な副生成物であり、これは、糖のエタノールへの全体的な変換を低下させるため、好ましくない。さらに、エタノール生産工場の廃液にグリセロールが存在すると、廃水処理に費用がかかる恐れもある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、新規な組換え細胞であって、糖質、特にリグノセルロース系バイオマスから得られる糖質からのエタノールの嫌気性発酵生産に好適であり、本細胞をエタノールの発酵調製に使用する場合、その対応する野生型生物と比較してグリセロール生成が減少するか、またはグリセロール生成が起こらない、組換え細胞を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明はさらに、嫌気性酵母培養物を用いてエタノールを発酵調製する新規な方法であって、グリセロールが形成されないか、あるいは、既存のＳ．セレビシエ株を利用する方法よりも形成されるグリセロールが少なくとも少ない、方法を提供することを目的とする。
【０００９】
達成できた１つまたは複数の別の目的については、本記載および／または特許請求の範囲から明らかになる。
【００１０】
本発明者らは、ＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に必要な酵素活性の非存在下でも糖質の発酵で形成されるＮＡＤＨの再酸化を可能にする他の特定の酵素活性が組み込まれている、特定の組換え細胞を提供することによりこれらの目的の１つまたは複数を達成できることを認識した。
【００１１】
したがって本発明は、組換え酵母細胞であって、１つまたは複数の組換え体、特に、ＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１０）活性をコードする１つまたは複数の異種核酸配列を含む、組換え酵母細胞に関する。
【００１２】
本発明者らは特に、ＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に必要な酵素活性を持たない細胞、またはＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に必要な酵素活性が低下した細胞を提供することが有利であることを認識した。
【００１３】
したがって、本発明は特に、ＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性をコードする１つまたは複数の異種核酸配列を含む組換え酵母細胞であって、ＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に必要な酵素活性を欠失している（すなわちこうした活性を含まない）か、あるいは、その対応する野生型酵母細胞と比較してＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に対する酵素活性が低下している、組換え酵母細胞に関する。
【００１４】
本発明はさらに、エタノールの調製のための、本発明による細胞の使用も対象とする。
【００１５】
特に、本発明はさらに、エタノールを調製する方法であって、発酵性糖質およびアセテートからエタノールを調製することを含み、その調製は酵母細胞を用いて嫌気性発酵条件下で行われ、前記細胞はアセチルコエンザイムＡシンテターゼ活性、およびＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を発現し、前記細胞は好ましくは糖質からのグリセロール合成の生化学的経路に必要な酵素活性を欠損しているか、または野生型Ｓ．セレビシエ細胞と比較して糖質からのグリセロール合成の生化学的経路に対する酵素活性が低下している、方法も対象とする。
【００１６】
本発明によれば、グリセロール：エタノールのモル比で０．０４：１未満、特に０．０２：１未満、好ましくは０．０１：１未満でエタノールを生成すると有利である。グリセロールは生成されない（検出不能である）場合があるけれども、少なくともいくつかの実施形態（ＮＡＤＨ依存性グリセロール合成は低下しているものの、まだ完全には防止されていない場合）では、たとえばグリセロールとエタノールとの比０．００１：１以上で副生物として若干のグリセロールが生成される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明による細胞作製の一部として行ってもよい遺伝子改変手順を模式的に示す。
【図２Ａ】グルコース（２０ｇ  ｌ−１）を用いた、Ｓ．セレビシエＩＭＥ０７６（ＧＰＤ１    ＧＰＤ２）の嫌気回分培養中のバイオマスおよび生成物の濃度を示す。酢酸（２．０ｇ  ｌ−１）については、発酵の開始から存在していた。増殖条件：Ｔ＝３０℃、ｐＨ５．０。符号：▲、６６０ｎｍの光学密度；●、グルコース；○、エタノール；■、アセテート；□、グリセロール。
【図２Ｂ】グルコース（２０ｇ  ｌ−１）を用いた、Ｓ．セレビシエＩＭＺ１３２（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｈｐＦ遺伝子を過剰発現するｇｐｄ１Δ  ｇｐｄ２Δ）の嫌気回分培養中のバイオマスおよび生成物の濃度を示す。酢酸（２．０ｇ  ｌ−１）については、発酵の開始から存在していた。増殖条件：Ｔ＝３０℃、ｐＨ５．０。符号：▲、６６０ｎｍの光学密度；●、グルコース；○、エタノール；■、アセテート；□、グリセロール。
【図２Ｃ】グルコース（２０ｇ  ｌ−１）を用いた、Ｓ．セレビシエ（Ｅ．コリｍｈｐＦ遺伝子を過剰発現するｇｐｄ１Δ  ｇｐｄ２Δ）の嫌気回分培養中のバイオマスおよび生成物の濃度を示す。酢酸（２．０ｇ  ｌ−１）については、矢印で示す時点に加えた。増殖条件：Ｔ＝３０℃、ｐＨ５．０。符号：▲、６６０ｎｍの光学密度；●、グルコース；○、エタノール；■、アセテート；□、グリセロール。
【図２Ｄ】グルコース（２０ｇ  ｌ−１）を用いた、Ｓ．セレビシエＩＭＺ１２７（ｇｐｄ１Δ  ｇｐｄ２Δ）の嫌気回分培養中のバイオマスおよび生成物の濃度を示す。酢酸（２．０ｇ  ｌ−１）については、矢印で示す時点に加えた。増殖条件：Ｔ＝３０℃、ｐＨ５．０。符号：▲、６６０ｎｍの光学密度；●、グルコース；○、エタノール；■、アセテート；□、グリセロール。５％未満異なるデータを与える独立した２回の反復実験の１つの値を示す。グルコース（２０ｇ  ｌ−１）で増殖させた。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ＮＡＤＨ依存性反応による酢酸のエタノールへの還元によりＮＡＤＨを再酸化できるような組換え酵母細胞、特にＳ．セレビシエを提供することにより、グリセロール生成を完全に除去できるか、あるいは、グリセロール生成を少なくともかなり低下させることができる。
【００１９】
これは、グリセロール生成が回避されるか、または少なくとも低下するという点で有利であるばかりでなく、ＮＡＤＨの再酸化で形成される生成物も所望の生成物、すなわちエタノールであるため、本発明の方法は、生成物の収率（変換される供給原料、すなわちエタノールに変換される糖質プラス酢酸のｗｔ％として測定）を高めることもできる。
【００２０】
酢酸は一般にリグノセルロース加水分解物において相当量で利用可能であるため、これにより、本発明は、リグノセルロース系バイオマスを発酵性糖質の供給源として用いるエタノールの調製に特に有利である。さらに、かなりの量のアセテートを含んでもよい糖質供給源として、サトウダイコン糖蜜（の加水分解物）、およびデンプンを含むもの（たとえばトウモロコシのドライミリングプロセスの廃棄物、トウモロコシのウエットミリングプロセスの廃棄物；たとえば蒸留残液のリサイクルによるデンプン廃棄物プロセスの廃棄物）がある。本発明は、阻害性化合物である酢酸のレベルの低下に貢献し、加水分解物のより多くの部分が実際にエタノールの生成の基質になる。
【００２１】
実施例で説明するように、ＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に必要な顕著な酵素活性を持たない酵母細胞を用いて、良好な結果が得られている。しかしながら、本発明者らは、ＮＡＤＨ依存性グリセロール合成活性を持つ本発明による酵母細胞も、たとえば、エタノール生成に使用するのに有利であり得ると考える。こうした細胞は、アセテートを使用してＮＡＤＨの少なくとも一部再酸化することができると考えられる。それにより、アセテートは、ＮＡＤＨ依存性グリセロール合成経路と競合し得るため、グリセロール合成を抑制する可能性がある。さらに、リグノセルロース加水分解物などエタノールの生成に使用する供給原料に存在するアセテートは、エタノールに変換され得、したがって生成物の収率を上昇させる。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」という語は、他に記載がない限り、「少なくとも１つ」として定義する。
【００２３】
名詞（たとえば、化合物、添加剤等）について単数形で言及する場合、複数形を含むことを意図している。したがって、特定の部分、たとえば「化合物」について言及する場合、他に記載がない限り、その部分の「少なくとも１つ」、たとえば「少なくとも１つの化合物」を意味する。
【００２４】
「または（ｏｒ）」という用語は、本明細書で使用する場合、「および／または」として理解すべきである。
【００２５】
本明細書でカルボキシレート、たとえばアセテートについて言及する場合、それに対応するカルボン酸（その共役酸）だけでなく、その塩も含むことを意図しており、その逆も同様である。
【００２６】
いくつかの異性体（たとえば、ＤエナンチオマーおよびＬエナンチオマー）が存在する化合物について言及する場合、化合物は原則として、本発明の個々の方法に使用してもよい、その化合物の全エナンチオマー、ジアステレオマーおよびシス／トランス異性体を含む。特に化合物などに言及する場合、化合物は、天然異性体（単数または複数）を含む。
【００２７】
本明細書では、「発酵」、「発酵の」などの用語は、古典的な意味で使用する、すなわち嫌気条件下で行われる、あるいは、行われた過程を示す。本明細書では、酸素のまったくない状態、あるいは、酵母細胞により本質的に酸素が消費されない状態、特に酵母細胞の酸素消費量が通常５ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満、特に酸素消費量が２．５ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満、または１ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満に相当する場合を、嫌気条件と定義する。。これは通常、空気飽和に対して培養ブロス中の溶存酸素濃度５％未満、特に空気飽和に対して溶存酸素濃度１％未満、または空気飽和に対して０．２％未満に相当する。
【００２８】
「酵母」または「酵母細胞」という用語は、系統的に多様な単細胞真菌群をいい、その大部分は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）門および担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門である。出芽酵母（「真性酵母」）は、サッカロミセス目（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）に分類され、最もよく知られた種としてサッカロマイセス・セレビシエ種がある。
【００２９】
「組換え（細胞）」という用語は、本明細書で使用する場合、組換えＤＮＡ技術（単数または複数）および／または別の突然変異誘発技術（単数または複数）による１つまたは複数の遺伝子改変の結果としての核酸を含む菌株（細胞）をいう。特に組換え細胞は、対応する野生型細胞には存在せずに、組換えＤＮＡ技術を用いてその菌株（細胞）に導入した核酸を含んでもよいし（トランスジェニック細胞）、あるいは、たとえば、組換えＤＮＡ技術またはＵＶ照射などの別の変異誘発技術による、前記野生型に存在する核酸配列（野生型ポリペプチドをコードする遺伝子）に、１つまたは複数の突然変異の結果として、野生型細胞に存在しない核酸を含んでもよいし、あるいは、遺伝子の核酸配列を改変して、別の細胞コンパートメントに対して（ポリペプチドをコードする）ポリペプチド産物を標的とする、野生型細胞に存在しない核酸を含んでもよい。さらに、「組換え（細胞）」という用語は特に、組換えＤＮＡ技術によりそこからＤＮＡ配列を除去した菌株（細胞）を指す。
【００３０】
「トランスジェニック（酵母）細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、その菌株（細胞）に天然に存在せずに、組換えＤＮＡ技術によりその菌株（細胞）に導入された核酸を含む菌株（細胞）、すなわち、組換え細胞）をいう。
【００３１】
タンパク質またはポリペプチドに関する「変異した」という用語は、本明細書で使用する場合、野生型または天然のタンパク質またはポリペプチド配列の少なくとも１つのアミノ酸が、それらのアミノ酸をコードする核酸の変異誘発により、異なるアミノ酸で置換されているか、挿入されているか、または配列から欠失していることを意味する。変異誘発は、当該技術分野においてよく知られた方法であり、たとえば、ＰＣＲによる部位特異的変異誘発、またはサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラー・クローニング−ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、第１−３巻（１９８９年）に記載されているようなオリゴヌクレオチドを介した変異誘発によるものがある。遺伝子に関する「変異した」という用語は、本明細書で使用する場合、その遺伝子の核酸配列中またはその制御配列中の少なくとも１つのヌクレオチドが、変異誘発により、異なるヌクレオチドで置換されているか、または配列から欠失しており、その結果、定性的または定量的に異なる機能を持つタンパク質配列が転写されるか、あるいは、その遺伝子がノックアウトされることを意味する。
【００３２】
「遺伝子」という用語は、本明細書で使用する場合、真核生物の核酸ポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型を含む核酸配列をいう。遺伝子は、ｍＲＮＡに転写され、次いでタンパク質に翻訳される。
【００３３】
「核酸」という用語は、本明細書で使用する場合、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマー、すなわち、一本鎖形態あるいは二本鎖形態のポリヌクレオチドへの言及を含み、他の限定がない限り、天然のヌクレオチドと同様に一本鎖核酸にハイブリダイズするという点で天然ヌクレオチドの本質的性質を持つ公知のアナログ（たとえば、ペプチド核酸）を包含する。ポリヌクレオチドは、全長であっても、あるいは、ネイティブな遺伝子もしくは異種構造遺伝子もしくは調節遺伝子の部分配列であってもよい。他に記載がない限り、この用語は、明記した配列だけでなく、その相補配列への言及を含む。したがって、安定性のため、または他の理由で修飾された骨格を持つＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書で意図している「ポリヌクレオチド」である。さらに、２つだけ例を挙げると、イノシンなどの特殊な塩基、またはトリチル化塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡも、本明細書で使用するところのポリヌクレオチドである。当業者に公知の多くの有用な目的を満たす様々な修飾が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対してなされてきたことが理解されよう。本明細書で使用されるポリヌクレオチドという用語は、そうした化学的、酵素的にまたは代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチドだけでなく、ウイルス、ならびに特に単純型および複雑型細胞を含む特徴的な細胞ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態も包含する。
【００３４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において同義で使われ、アミノ酸残基のポリマーをいう。この用語は、天然のアミノ酸ポリマーのほか、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工化学アナログであるアミノ酸ポリマーにも使用する。天然のアミノ酸のこうしたアナログの本質的性質は、タンパク質に組み込むと、そのタンパク質が、同じタンパク質であるが、すべて天然のアミノ酸からなるタンパク質に対して誘導された抗体に特異的に反応することである。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、以下に限定されるものではないが、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化などの修飾も含む。
【００３５】
酵素クラス（ＥＣ：ｅｎｚｙｍｅ  ｃｌａｓｓ）に関連して酵素について言及する場合、酵素クラスは、国際生化学分子生物学連合の命名委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ：Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）により規定された酵素命名法に基づき、酵素を分類するか、または分類し得るクラスであり、その命名法は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／で確認することができる。特定のクラスに（まだ）分類されていないが、そのように分類し得る他の好適な酵素も含めることを意図している。
【００３６】
受託番号を参照してタンパク質、または遺伝子などの核酸配列について言及する場合、他に記載がない限り、その番号を用いて特に、タンパク質または核酸配列（遺伝子）が、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／（２００９年７月１３日現在利用可能）で確認できる配列を持つことを示す。
【００３７】
また、遺伝コードとしてポリペプチドをコードする本明細書の核酸配列はどれも、核酸の考えられるあらゆるサイレント変異を表現する。「保存的に改変された変異体」という用語は、アミノ酸配列および核酸配列のどちらにも使用する。特定の核酸配列に関し、保存的に改変された変異体とは、同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または遺伝コードの縮重に伴うアミノ酸配列の保存的に改変された変異体をコードする核酸をいう。「遺伝コードの縮重」という用語は、機能的に同一な多くの核酸が任意の特定のタンパク質をコードすることをいう。たとえば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはどれも、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンがアラニンを特定しているどの位置においても、コードされたポリペプチドを変更することなく、コドンを上記のそれぞれのコドンのいずれかに変化させることができる。こうした核酸の変化は、「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の１種である。
【００３８】
特定の配列（たとえば配列番号２）を持つポリペプチドの「機能的ホモログ」（または単に「ホモログ」）という用語は、本明細書で使用する場合、前記特定の配列を含み、ただし、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されており、かつポリペプチドが基質変換に対して（定性的に）同じ酵素機能性、たとえばＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１０）活性を有するポリペプチドをいい、ホモログは、アセトアルデヒドをエタノールに変換することができる。この機能性については、酵母中でホモログを発現する発現ベクターを含む組換え酵母細胞であって、前記発現ベクターは酵母内で機能的なプロモーターに作動可能に連結された異種核酸配列を含み、前記異種核酸配列は相同なポリペプチドをコードし、酵母細胞内でアセチルコエンザイムＡをアセトアルデヒドに変換するその酵素活性を検査して、前記変換が前記細胞内で起こるかどうかを評価する、組換え酵母細胞を含む、アッセイ系を使用して検査することができる。候補ホモログについては、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの類似性解析を用いて同定してもよい。こうした解析の詳細な例は、国際公開第２００９／０１３１５９号の実施例２に記載されている。当業者であれば、そこから好適な候補ホモログを発見する方法を得られるであろうし、任意にコドン（対）の最適化時に、上記のような好適なアッセイ系を用いてそうした候補ホモログに必要な機能性を検査することもできるであろう。好適なホモログは、特定のポリペプチドに対するアミノ酸配列の類似性が５０％を超える、好ましくは６０％以上、詳細には少なくとも７０％、より詳細には少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であり、たとえば配列番号２に対するアミノ酸配列の類似性がそうしたものであり、かつアセトアルデヒドへのアセチルコエンザイムＡの変換に必要な酵素の機能性を持つポリペプチドである。核酸配列に関し、機能的ホモログという用語は、遺伝コードの縮重による別の核酸配列と異なり、同じポリペプチド配列をコードする核酸配列を含むことを意図している。
【００３９】
本発明では、各配列を比較して判定した２つ以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列間、または２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係を配列同一性と定義する。通常、配列同一性または類似性については、比較対象の配列の全長にわたって比較を行う。当該技術分野において、「同一性」はまた、場合によっては、アミノ酸配列または核酸配列の配列関連性の程度を、一連のそうした配列間のマッチングにより判定したものも意味する。
【００４０】
同一性の判定に好ましい方法は、検査対象の配列間のマッチングが最大になるように設計される。同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手可能なコンピュータープログラムに組み込まれている。２つの配列間の同一性および類似性を判定するのに好ましいコンピュータープログラム法として、たとえば、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）第２１５巻：ｐ．４０３−４１０（１９９０年）があり、ＮＣＢＩおよび他の入手先から一般に入手可能である（ＢＬＡＳＴマニュアル（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ）、アルチュール，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、メリーランド州２０８９４）。ＢＬＡＳＴＰを用いたアミノ酸配列比較に好ましいパラメーターは、ギャップオープン＝１１．０、ギャップエクステンション＝１、マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２である。
【００４１】
「発現」とは、遺伝子が構造ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、その後タンパク質に翻訳されることをいう。
【００４２】
本明細書で使用する場合、核酸またはタンパク質に関し、「異種の」とは、核酸またはタンパク質が異なる種に由来するか、あるいは、同じ種に由来する場合、ヒトの人為的介入により組成および／またはゲノム遺伝子座のネイティブな形態から実質的に修飾されている。たとえば、異種の構造遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、構造遺伝子を得た元の種と異なる種に由来するか、あるいは、同じ種である場合、一方または両方が元の形態から実質的に修飾されている。異種のタンパク質は、異なる種に由来してもよいし、あるいは、同じ種である場合、ヒトの人為的介入によりその元の形態から実質的に修飾されている。
【００４３】
「異種発現」という用語は、宿主細胞内での異種核酸の発現をいう。酵母などの真核生物宿主細胞系における異種タンパク質の発現は、当業者によく知られている。ある比活性の酵素をコードする遺伝子の核酸配列を含むポリヌクレオチドを、こうした真核生物系に発現させてもよい。いくつかの実施形態では、酵素を発現させる発現系として、形質転換／トランスフェクトされた酵母細胞を利用してもよい。酵母内での異種タンパク質の発現は、よく知られている。シャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ），Ｆ．ら、メソッズ・イン・イースト・ジェネティックス（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２年）は、酵母内でのタンパク質の発現に利用可能な様々な方法について記載した著名な著作物である。広く利用されている２種の酵母として、サッカロマイセス・セレビシエおよびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）がある。サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）で発現させるためのベクター、菌株およびプロトコルについては、当該技術分野において公知であり、供給業者（たとえば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））から入手することができる。好適なベクターは通常、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはアルコールオキシダーゼなどのプロモーター等の発現制御配列、さらに望ましいように複製起点、終結配列および同種のものを有する。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「プロモーター」とは、（構造）遺伝子の転写を指令するＤＮＡ配列である。典型的には、プロモーターは、（構造）遺伝子の転写開始部位の近傍の遺伝子の５’領域に位置する。プロモーター配列は、構成的でも、誘導的でも、または抑制的でもよい。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、誘導剤に応答して転写速度が増加する。
【００４５】
「ベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、常染色体発現ベクター、および染色体への組み込みに使用するインテグレーションベクターへの言及を含む。
【００４６】
「発現ベクター」という用語は、直鎖状または環状のＤＮＡ分子であって、その転写を行う別の核酸セグメントの制御下で（すなわち作動可能に連結され）、目的のポリペプチドをコードするセグメントを含む、ＤＮＡ分子をいう。こうした別のセグメントは、プロモーター配列およびターミネーター配列を含んでもよく、任意に１つまたは複数の複製起点、１つまたは複数の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよび同種のものを含んでもよい。発現ベクターは一般に、プラスミドまたはウイルスＤＮＡ由来であり、あるいは、両方の要素を含んでもよい。特に発現ベクターは、５’から３’方向に作動可能に連結された、（ａ）酵母認識転写開始領域および翻訳開始領域、（ｂ）目的のポリペプチドのコード配列、ならびに（ｃ）酵母認識転写終結領域および翻訳終結領域を含む、核酸配列を含む。「プラスミド」とは、微生物のゲノムに組み込まれていない、自律複製する染色体外ＤＮＡをいい、元来、通常環状である。
【００４７】
「インテグレーションベクター」とは、微生物のゲノムに組み込み、目的のポリペプチドをコードする遺伝子を安定的に遺伝することができる、直鎖状または環状のＤＮＡ分子をいう。インテグレーションベクターは一般的に、その転写を行う別の核酸セグメントの制御下で（すなわち作動可能に連結され）、目的のポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数のセグメントを含む。こうした別のセグメントは、プロモーター配列およびターミネーター配列、ならびに通常相同組換えのプロセスにより、標的細胞のゲノムへの目的の遺伝子の組み込みを誘導する１つまたは複数のセグメントを含んでもよい。典型的には、インテグレーションベクターは、標的細胞に移行することができても、その生物内で機能しないレプリコンを持つベクターである。目的の遺伝子を含むセグメント内に適切なマーカーが組み込まれている場合、そのセグメントを組み込むことを選択してもよい。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」という用語は、そのように記載された各要素がそれぞれ意図したように機能し得る関係に並んでいることをいう。制御配列を別の制御配列および／またはコード配列に「作動可能に連結する」際は、制御配列との適合性がある条件下で、コード配列の転写および／または発現が達成されるようにライゲートする。一般に、作動可能に連結されたとは、連結されている核酸配列が近接しており、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、近接して同じリーディングフレーム内にあることを意味する。
【００４９】
「宿主細胞」とは、ベクターを含み、ベクターの複製および／または発現を促進する細胞を意味する。宿主細胞は、Ｅ．コリなどの原核細胞でも、または酵母、昆虫、両生類もしくは哺乳動物細胞などの真核細胞でもよい。好ましくは、宿主細胞は、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）の細胞であり、最も好ましくは酵母細胞であり、最も好ましくはサッカロマイセス・セレビシエの細胞である。
【００５０】
「形質転換」および「形質転換する」とは、本明細書で使用する場合、たとえば、直接取り込み、形質導入、ｆ−交配またはエレクトロポレーションなど、挿入に使用する方法に関係なく、外来ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することをいう。外来ポリヌクレオチドは、非組み込み型ベクター、たとえば、プラスミドとして維持しても、またはあるいは、宿主細胞ゲノムに組み込んでもよい。
【００５１】
本発明による細胞は、好ましくはサッカロミセス科、一層好ましくはサッカロマイセス属の細胞、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の細胞の群から選択される。特にサッカロマイセス・セレビシエ宿主細胞を用いて良好な結果が得られている。ザイゴサッカロミセス・バイリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｌｉｉ）は、もう１つの特に好ましい細胞であり、特にその高いアセテート耐性、およびその高いエタノール耐性のため好ましい。
【００５２】
さらに、本発明による細胞は、キシロース発酵酵母、一層好ましくはピキア種、たとえばピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）またはピキア・アンガスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）（ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）とも呼ばれる）の群から選択される酵母細胞であってもよい。
【００５３】
さらなる実施形態では、本発明による宿主細胞は、ＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に必要な酵素活性を自然に欠損している宿主細胞、たとえば、ブレタノマイセス・インターメディウス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）種に属する酵母細胞である。
【００５４】
本発明による好ましい細胞は、ＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に必要な酵素活性含まないか、あるいは、その対応する野生型酵母細胞と比較して、糖質からグリセロールを合成するＮＡＤＨ依存性の生化学的経路における酵素活性が低い。
【００５５】
酵素活性の低下は、ＮＡＤ依存性グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性（ＧＰＤ）をコードする１つまたは複数の遺伝子、またはグリセロールリン酸ホスファターゼ活性（ＧＰＰ）をコードする１つまたは複数の遺伝子について、こうした酵素が野生型よりかなり少なく発現するようにするか、または、遺伝子が活性の低いポリペプチドをコードするように改変することにより、達成することができる。こうした改変については、一般に知られた技術を用いて行うことができ、特に、ＧＰＤおよび／またはＧＰＰをコードする構造遺伝子のプロモーター領域またはコード領域の１つまたは複数のノックアウト突然変異、または部位特異的変異誘発を挙げることができる。あるいは、ランダム変異誘発を行ってから、ＧＰＤおよび／またはＧＰＰの活性が低いかまたは活性がない菌株を選択して、グリセロール産生に欠陥がある酵母菌株を得てもよい。Ｓ．セレビシエＧＤＰ１、ＧＤＰ２、ＧＰＰ１およびＧＰＰ２の各遺伝子を配列番号２４〜２７に示す。
【００５６】
好ましくは、ＧＰＤをコードする少なくとも１つの遺伝子、またはＧＰＰをコードする少なくとも１つの遺伝子を完全に欠失させるか、または酵素の一部をコードし、かつその活性に不可欠である遺伝子の少なくとも一部を欠失させる。特に、ＧＰＤ１遺伝子およびＧＰＤ２遺伝子のオープンリーディングフレームを不活性化してあるＳ．セレビシエ細胞を用いて、良好な結果が得られている。当業者は、欠失させる宿主細胞のゲノム領域を挟んでいる配列と同一のＤＮＡ配列に挟まれた選択可能なマーカー遺伝子からなるＤＮＡフラグメントを人工的に合成するか、または他の方法で構築することにより、構造遺伝子（標的遺伝子）の不活性化を達成してもよい。特に、マーカー遺伝子ｋａｎＭＸおよびｈｐｈＭＸ４を組み込んでサッカロマイセス・セレビシエのＧＰＤ１遺伝子およびＧＰＤ２遺伝子を不活性化すると、良好な結果が得られている。続いて、このＤＮＡフラグメントを宿主細胞に形質転換する。この優性マーカー遺伝子を発現する形質転換細胞について、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応診断またはサザンハイブリダイゼーションにより、欠失されるように設計した領域が適切に置換されたかを調べる。
【００５７】
前述のとおり、本発明による細胞は、ＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１０）をコードする異種核酸配列を含む。この酵素は、アセチルコエンザイムＡのアセトアルデヒドへの変換を触媒する。この変換は、下記平衡反応式で表すことができる：
アセチルコエンザイムＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＜−＞アセトアルデヒド＋ＮＡＤ＋＋コエンザイムＡ。
【００５８】
したがって、この酵素は、増殖培地中に存在するアセテートからアセチルコエンザイムＡが生成されるとＮＡＤＨの再酸化を可能にする。それによって、レドックス補酵素の平衡にグリセロール合成は必要でなくなる。
【００５９】
ＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列は、原則として前記デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を含む任意の生物に由来してもよい。
【００６０】
アセチルコエンザイムＡのアセトアルデヒドへのＮＡＤＨ依存性還元を触媒できる既知のＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは一般に、下記の３種類のＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ機能的ホモログに分類される。
【００６１】
１）アセチルコエンザイムＡのアセトアルデヒドへの可逆変換と、その後のアセトアルデヒドのエタノールへの可逆変換とを触媒する二機能タンパク質。この種のタンパク質の例として、Ｅ．コリのＡｄｈＥタンパク質（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ番号ＮＰ＿４１５７５７）がある。ＡｄｈＥは、遺伝子融合による進化の産物であると考えられる。ＡｄｈＥタンパク質のＮＨ２末端領域はアルデヒド：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼとの相同性が高いのに対し、ＣＯＯＨ−末端領域はＦｅ２＋依存性エタノール：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼファミリーと相同である（メンブリロ−ヘルナンデス（Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ）ら、（２０００年）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２７５巻：ｐ．３３８６９−３３８７５）。Ｅ．コリＡｄｈＥは、金属触媒酸化を受けるため、酸素感受性である（タマリット（Ｔａｍａｒｉｔ）ら（１９９８年）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第２７３巻：ｐ．３０２７−３２）。
【００６２】
２）絶対嫌気性または通性嫌気性微生物においてアセチルコエンザイムＡのアセトアルデヒドへの可逆変換を触媒するけれども、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有さないタンパク質。クロストリジウム・クライベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）でこの種類のタンパク質の例が報告されている（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（１９８０年）アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）第２０３巻：ｐ．６６３−６７５）。クロストリジウム・クライベリＤＳＭ  ５５５のゲノムのアセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼにアノテーションが付与されている（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＥＤＫ３３１１６）。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のゲノム中の相同タンパク質ＡｃｄＨが同定されている（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿７８４１４１）。この種のタンパク質の別の例には、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）ＮＲＲＬ  Ｂ５９３の前記遺伝子産物がある（トート（Ｔｏｔｈ）ら（１９９９年）アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第６５巻：ｐ．４９７３−４９８０、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＤ３１８４１）。
【００６３】
３）４−ヒドロキシ−２−ケトバレラート異化に関与している二機能アルドラーゼ−デヒドロゲナーゼ複合体の一部であるタンパク質。こうした二機能酵素は、フェノール、トルエート、ナフタレン、ビフェニルおよび他の芳香族化合物の分解において、多くの細菌種で中間体であるカテコールのメタ開裂経路の最終の２ステップを触媒する（ポウロウスキー（Ｐｏｗｌｏｗｓｋｉ）およびシングラー（Ｓｈｉｎｇｌｅｒ）（１９９４年）バイオデグラデーション（Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）第５巻、ｐ．２１９−２３６）。４−ヒドロキシ−２−ケトバレラートは最初に４−ヒドロキシ−２−ケトバレラートアルドラーゼによりピルベートおよびアセトアルデヒドに変換され、その後アセトアルデヒドは、アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼによりアセチルＣｏＡに変換される。この種のアセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの例には、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ）ＣＦ６００のＤｍｐＦタンパク質がある（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＣＡＡ４３２２６）（シングラーら（１９９２年）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１７４巻：ｐ．７１１−２４）。Ｅ．コリのＭｐｈＦタンパク質（フェルランデス（Ｆｅｒｒａｎｄｅｚ）ら（１９９７年）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７９巻：ｐ．２５７３−２５８１、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿４１４８８５）は、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＣＦ６００のＤｍｐＦタンパク質と相同である。
【００６４】
好適な核酸配列は特に、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、特にＥ．コリ；マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特にマイコバクテリウム・マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；カルボキシドサーマス属（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、特にカルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）；エントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、特にＥｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ；シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、特にシゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）；バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、特にバークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、特にクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、特にアゾトバクター・ビネランジー（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）；アゾアルカス・エスピー（Ａｚｏａｒｃｕｓ  ｓｐ）；カプリアビダス属（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、特にカプリアビダス・タイワネンシス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、特にシュードモナス・エスピーＣＦ６００；ペロマキュラム属（Ｐｅｌｏｍａｃｕｌｕｍ）、特にペロトマキュラム・サーモプロピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）の群から選択される生物で発見することができる。好ましくは、ＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列は、エシェリキア属、一層好ましくはＥ．コリ由来である。
【００６５】
特に好適なのは、Ｅ．コリ由来のｍｈｐＦ遺伝子、またはその機能的ホモログである。この遺伝子については、フェルランデスら（１９９７年）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７９巻：ｐ．２５７３−２５８１に記載されている。Ｅ．コリ由来のｍｈｐＦ遺伝子を組み込んであるＳ．セレビシエを用いて、良好な結果が得られている。
【００６６】
さらに有利な実施形態では、（アセチル化）アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列は、特にシュードモナス属。シュードモナス・エスピーＣＦ６００由来のｄｍｐＦである。
【００６７】
原則として、ＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列は、野生型核酸配列であってもよい。
【００６８】
好ましい核酸配列は、配列番号２、配列番号２９で表されるＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、または配列番号２もしくは配列番号２９の機能的ホモログをコードする。特に、核酸配列は、配列番号１。配列番号２８に記載の配列、または配列番号１もしくは配列番号２８の機能的ホモログを含む。
【００６９】
さらに、アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（またはそうした活性をコードする核酸配列）は、たとえば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ａｄｈＥ、エントアメーバ・ヒストリティカａｄｈ２、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ａｄｈＥ、ピロミセス・エスピー（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｅ２  ａｄｈＥ、クロストリジウム・クライベリＥＤＫ３３１１６、ラクトバチルス・プランタルムａｃｄＨ、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＹＰ  ００１２６８１８９の群から選択してもよい。これらの酵素の配列の場合、これらの酵素をコードする核酸配列、および核酸配列を宿主細胞に組み込む方法については、国際公開第２００９／０１３１５９号、特に実施例３、表１（ページ２６）、およびそこに記載された配列番号を参照されたい。この公報の表１、および前記表に記載された配列番号で表される配列については、参照によって本明細書に援用する。
【００７０】
通常、本発明による細胞は、アセテートからアセチルコエンザイムＡを形成するのを触媒するアセチルコエンザイムＡシンテターゼをさらに含む。この酵素は、たとえば、ＡＣＳ１［配列番号１７］遺伝子およびＡＣＳ２［配列番号１８］遺伝子がコードする２つのアセチルコエンザイムＡシンテターゼのアイソザイムを含むＳ．セレビシエと同様に、野生型細胞に存在する場合もあるし（ファン・デン・ベルク（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ）ｅｔ  ａｌ（１９９６年）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第２７１巻：ｐ．２８９５３−２８９５９）、あるいは、この活性、たとえばＳ．セレビシエのＡＣＳ１遺伝子および／またはＡＣＳ２遺伝子をコードする１つもしくは複数の異種遺伝子（単数または複数）を宿主細胞に導入してもよいし、あるいは、その機能的ホモログを、アセチルコエンザイムＡシンテターゼのアイソザイム活性を欠損している細胞に組み込んでもよい。
【００７１】
さらに、特に効率的なエタノール生成のみならず、効率的なＮＡＤＨ酸化の観点から、細胞は、ＮＡＤ＋依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）を含むことが好ましい。この酵素は、アセトアルデヒドのエタノールへの変換を触媒する。細胞は、Ｓ．セレビシエ（ＡＤＨ１〜５）［配列番号１９〜２３］と同様に、こうしたデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を自然に含むことがある。「ルトストルフ（Ｌｕｔｓｔｏｒｆ）およびメグネット（Ｍｅｇｎｅｔ）．１９６８年、アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス、第１２６巻：ｐ．９３３−９４４」、または「シリアシー（Ｃｉｒｉａｃｙ）、１９７５年、ミューテーション・リサーチ（Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第２９巻：ｐ．３１５−３２６」）を参照されたい。あるいは、この活性、たとえばＳ．セレビシエのＡＤＨ１−５の遺伝子のいずれかもしくはそれぞれをコードする１つもしくは複数の異種遺伝子（単数または複数）を宿主細胞に導入してもよいし、あるいは、その機能的ホモログを、ＮＡＤ＋依存性アルコールデヒドロゲナーゼ活性を欠損している細胞に組み込んでもよい。
【００７２】
具体的には、本発明による好ましい細胞は、２００９年７月１６日にセントラルビューロー・フォー・シュメルカルチャーズ（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ユトレヒト、オランダ）に寄託された寄託番号ＣＢＳ１２５０４９のＳ．セレビシエ菌株の細胞である。
【００７３】
特定の態様では、本発明は、本発明による組換え酵母細胞を調製する方法を対象とする。
【００７４】
１つまたは複数の異種核酸配列を宿主細胞を組み込むことを含み、通常、ＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に必要な酵素活性をコードする遺伝子の突然変異（完全な欠失を含む）を含む、細胞の遺伝子改変は、たとえば、一般に当該技術分野において公知の標準的な遺伝子および分子生物学技術により共通一般知識に基づいて行うことができ、以前に記載されている（たとえば、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら１９８２年、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）１９７２年、「エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー；サムブルックおよびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）２００１年、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル」（第３版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス；Ｆ．アスベル（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、「カレント・プロトコル・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ）」、グリーン・パブリッシング・アンド・ワイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク、１９８７年）。
【００７５】
本発明による組換え酵母細胞を調製する本発明の方法は、下記を含む。
【００７６】
（ａ）酵母細胞、好ましくはＮＡＤＨ依存性グリセロール合成に必要な酵素活性を欠損した酵母細胞、およびその対応する野生型酵母細胞と比較してグリセロール合成における酵素活性が低い酵母細胞の群から選択される酵母細胞を用意すること；
【００７７】
（ｂ）前記酵母細胞と異種であり、かつＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を持つ酵素をコードする遺伝子を含み、前記遺伝子は、前記酵母細胞内で機能的なプロモーターに作動可能に連結されている、核酸セグメントを得ること；
【００７８】
（ｃ）必要に応じて（たとえば、酵母細胞が、アセチルコエンザイムＡシンテターゼ活性を欠損している、またはアセチルコエンザイムＡシンテターゼ（単数または複数）の活性がアセテートをエタノールに変換する経路全体のインビボ活性を低下させている場合、あるいは、本発明におけるその使用と両立しない細胞コンパートメントでアセチルコエンザイムＡシンテターゼを発現する場合）、前記酵母細胞と異種であり、かつアセチルコエンザイムＡシンテターゼ活性を持つ酵素をコードする遺伝子を含み、前記遺伝子は、前記酵母細胞内で機能的なプロモーターに作動可能に連結されている、核酸セグメントを得ること；
【００７９】
（ｄ）必要に応じて（たとえば、酵母細胞が、ＮＡＤ＋依存性アルコールデヒドロゲナーゼ活性を欠損している、またはＮＡＤ＋依存性アルコールデヒドロゲナーゼ活性がアセテートをエタノールに変換する経路のインビボ活性を低下させている場合、あるいは、本発明におけるその使用と両立しない細胞コンパートメントでＮＡＤ＋依存性アルコールデヒドロゲナーゼを発現する場合）、前記酵母細胞と異種であり、かつＮＡＤ＋依存性アルコールデヒドロゲナーゼ活性を持つ酵素をコードする遺伝子を含み、前記遺伝子は、前記酵母細胞内で機能的なプロモーターに作動可能に連結されている、核酸セグメントを得ること；ならびに
【００８０】
（ｅ）前記核酸セグメント（単数または複数）で酵母細胞を形質転換し、それにより前記異種遺伝子を発現させ、前記組換え酵母細胞は、発酵条件下、対応する非組換え酵母細胞と比較してＮＡＤＨ依存性グリセロール合成の低下を示すか、あるいは、発酵条件下、ＮＡＤＨ依存性グリセロール合成が前記酵母細胞内に存在しない、組換え酵母細胞を用意すること。
【００８１】
酵母細胞のプロモーターは、当該技術分野において公知であり、たとえば、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼＴＰＩ１プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＴＤＨ３プロモーター、翻訳伸長因子ＥＦ−１αのＴＥＦ１プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ１プロモーター、グルコース−６−ホスファートデヒドロゲナーゼｇｐｄＡおよびＺＷＦｌプロモーター、プロテアーゼプロモーター、たとえばｐｅｐＡ、ｐｅｐＢ、ｐｅｐＣ、グルコアミラーゼｇｌａＡプロモーター、アミラーゼａｍｙＡ、ａｍｙＢプロモーター、カタラーゼｃａｔＲまたはｃａｔＡプロモーター、グルコースオキシダーゼｇｏｘＣプロモーター、β−ガラクトシダーゼｌａｃＡプロモーター、α−グルコシダーゼａｇｌＡプロモーター、翻訳伸長因子ｔｅｆＡプロモーター、キシラナーゼプロモーター、たとえばｘｌｎＡ、ｘｌｎＢ、ｘｌｎＣ、ｘｌｎＤ、セルラーゼプロモーター、たとえばｅｇｌＡ、ｅｇｌＢ、ｃｂｈＡ、転写制御因子のプロモーター、たとえばａｒｅＡ、ｃｒｅＡ、ｘｌｎＲ、ｐａｃＣ、ｐｒｔＴ等、または他の任意のプロモーターであってもよく、特にＮＣＢＩのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／）で見つけることができる。
【００８２】
好ましい実施形態では、本発明の組換え酵母細胞を調製する際、酵母細胞に導入する異種核酸配列をベクターに組み込み、ベクターで細胞の形質転換を行う。複数の異種核酸配列（様々な酵素活性、またはまとめて単一の酵素活性をコードする）を組み込む場合、これらの核酸配列は、単一のベクター内に存在してもよいし、あるいは、これらの核酸配列を別々のベクターの一部として組み込んでもよい。
【００８３】
したがって、本発明はさらに、酵母細胞、特に酵母細胞内に異種ポリペプチドを発現させるためのベクターであって、酵母細胞内で機能的なプロモーターに作動可能に連結された１つまたは複数の異種核酸配列を含み、前記異種核酸配列（単数または複数）は、前記酵母細胞（のサイトゾル）内でアセチルコエンザイムＡをアセトアルデヒドに変換する酵素活性を持つポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは好ましくは、配列番号２に記載の配列、またはその機能的ホモログを含む、ベクターを対象とする。
【００８４】
本発明（の方法に使用される）ベクターは、ファージベクターでも、細菌ベクターでも、セントロメアプラスミドベクター、エピソーマルプラスミドベクターもしくは組み込みプラスミドベクターでも、またはウイルスベクターでもよい。
【００８５】
好ましい実施形態では、本ベクターは、サッカロマイセス属、特にＳ．セレビシエ内で発現するベクターである。こうした実施形態では、野生型をコードする核酸配列を用いて良好な結果が得られているけれども、ＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性をコードする異種核酸配列は、サッカロマイセス属、特にＳ．セレビシエ内での発現に最適化されたコドン（対）であってもよい。
【００８６】
特定の細胞（Ｓ．セレビシエなど）内で最適な発現を達成するには、様々な合成遺伝子の設計ソフトウェアパッケージのいずれか１つ、たとえば国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５５９４号に記載されているようにコドン使用頻度の最適化、またはコドン対使用頻度の最適化用のジーンアート（Ｇｅｎｅａｒｔ）ＡＧ（レーゲンスブルク（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）、ドイツ）製のＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）を用いて、異種遺伝子のコドン（対）使用頻度を最適化すればよい。こうしてコドン使用頻度を適合させると、たとえば細菌由来の異種遺伝子が、酵母の転写および翻訳機構により効率的に処理されることになる。コドン対使用頻度を最適化すると、酵母細胞内のタンパク質の発現が高まる。最適化された配列は、たとえば、真菌（酵母）内で機能的な（好ましくは構成的）プロモーターに作動可能に連結された高コピーの酵母発現プラスミドにクローニングしてもよい。
【００８７】
前述のとおり、本発明はさらに、エタノールの調製を対象とする。
【００８８】
エタノールの調製方法では、嫌気条件下で糖を発酵させ、それによりエタノールを形成する、本発明による細胞を使用する  糖の発酵に好適な酵母細胞は一般に知られており、特にＳ．セレビシエが挙げられる。本発明の方法では、さらにＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１０）を生成する酵母細胞を使用する。この細胞は、上記に記載し、下記の本明細書の例に説明するように得ることができる。本細胞をエタノールの調製に使用する場合、細胞は、好ましくはアセチルコエンザイムＡシンテターゼ活性をさらに含む。本細胞をエタノールの調製に使用する場合、細胞は、好ましくはＮＡＤ＋依存性アルコールデヒドロゲナーゼ活性をさらに含む。これらの活性は、Ｓ．セレビシエと同様に天然に存在しているものでもよいし、あるいは、遺伝子改変により得てもよい（本明細書の上記も参照されたい）。
【００８９】
発酵条件は、原則として、たとえば、上掲のファン・マリスによる概説、またはそこに引用された参考文献に記載されているような一般に知られた条件に基づくものであってもよい。ただし、典型的には、発酵を行う培地は、発酵性糖質（単数または複数）に加えてアセテートを含む。
【００９０】
本発明により改変された酵母細胞の嫌気培養により消費される糖質に対するアセテートのモル比は通常、少なくとも０．００４、詳細には少なくとも０．０１、少なくとも０．０３、少なくとも０．１、または少なくとも０．２である。リグノセルロース系バイオマスの加水分解物中に存在する糖質に対するアセテートのモル比は通常、０．７０以下、詳細には０．５以下、より詳細には０．３以下、または０．２以下である。本明細書の糖質のモル数は、単糖単位に基づくものであり、すなわち１モルのオリゴ／多糖がｎ単糖単位を有する場合、ｎｍｏｌと見なす。
【００９１】
絶対数では、発酵性糖質の濃度は通常、６５〜４００ｇ／Ｌの範囲、詳細には１００〜２５０ｇ／Ｌの範囲である。
【００９２】
絶対数では、アセテート濃度は通常、０．５〜２０ｇ／Ｌの範囲、詳細には１〜１５ｇ／Ｌの範囲、より詳細には２〜１２ｇ／Ｌの範囲である。
【００９３】
ｐＨについては、共通一般知識に基づき、使用する生物に許容可能なｐＨに応じて選択してもよいし、あるいは、定法で決定してもよい。発酵は通常、中性または酸性ｐＨ、詳細にはｐＨ２〜７の範囲、より詳細にはｐＨ３〜６、さらにより詳細には３．５〜５．５で行う（発酵が起こる温度の発酵培地で測定した見かけのｐＨ）。
【００９４】
温度については、使用する生物に許容可能な温度に応じて選択すればよい。温度は通常、１５〜５０℃の範囲、詳細には２５〜４５℃の範囲である。
【００９５】
発酵性糖質としては、原則として、特定の組換え細胞により代謝され、エタノールが代謝産物である任意の糖質を使用してもよい。細胞は、必要とされる代謝酵素系を天然に含んでいてもよいし、あるいは、たとえば、ファン・マリスによる概説、そこに引用された参考文献に記載されているように、または本開示に記載されているように、その目的に合わせて細胞を遺伝子改変してもよい。好ましくは、加水分解物中の発酵性糖質は、ヘキソース、ペントース、ならびに１つまたは複数のヘキソース単位および／またはペントース単位を含むオリゴ糖の群から選択される少なくとも１つの糖質を含む。特に組換え細胞がサッカロマイセス属由来である場合、好ましくは、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、ガラクトース、キシロース、アラビノースおよびマンノースから選択される少なくとも１つの糖質を含むＳ．セレビシエを使用する。グルコースを用いて良好な結果が得られている。
【００９６】
本発明による方法は、セルロース、ヘミセルロースおよびペクチンから選択される少なくとも１つのポリマーの加水分解物、好ましくはヘミセルロースおよびペクチンから選択される少なくとも１つのポリマーの加水分解物を用いたエタノールの調製に特に好適である。これらのポリマーの加水分解時にアセテートは典型的には、加水分解により遊離するか、または分解産物として形成されるためである。特に、加水分解物は、リグノセルロース系バイオマスなどの加水分解されたリグノセルロース材料であってもよい。たとえば、リグノセルロース材料は、農産物リグノセルロース材料、たとえば綿、麦わら、（エレファント）グラス、バガス、トウモロコシ茎葉、リグノセルロース水生植物材料、シュガービートパルプ、柑橘類の果皮、森林由来のリグノセルロース材料、たとえば樹木もしくは低木由来のリグノセルロース廃材（切り取られた／刈り取られた／剪定された植物材料、おがくず等）、または特にリグノセルロース材料の原料として栽培された樹木もしくは低木、たとえばポプラ並木、工業由来の（リグノ）セルロース廃棄物、たとえば木材パルプ、紙屑から選択してもよい。
【００９７】
好ましくは、リグノセルロース加水分解物は、１つまたは複数の発酵性糖（特にグルコース、キシロースおよびアラビノース）、および加水分解中に形成されるアセテートを含む。このため、本発明の好ましい実施形態では、エタノールの調製は、リグノセルロース材料を加水分解し、それにより１つまたは複数の発酵性糖質、特にグルコースと、任意に１つまたは複数の他のヘキソースおよびペントースと、アセテートとを含む加水分解物を形成し、その後加水分解物を本発明の組換え細胞と接触させるステップを含む。本発明の組換え細胞と接触させる基質中のアセテートおよび発酵性糖質の相対濃度は、様々な加水分解物をブレンドすることにより、および／または、糖質および／または酢酸の（部分的に）精製された原料とブレンドすることにより、加水分解の条件を最適化することにより変更してもよい。
【００９８】
好適な加水分解の方法は、上掲のファン・マリスの概説、またはそこに引用された参考文献に基づいて行うことができ、酵素加水分解、熱加水分解、化学的加水分解、およびこれらの組み合わせがある。ポリマーは通常、鎖の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％が単糖単位、または単糖単位および二糖単位に分解される程度まで加水分解する。
【００９９】
次に、本発明を以下の例により説明する。
【実施例１】
【０１００】
材料および方法
菌株の構築および維持
使用したサッカロマイセス・セレビシエ株（表１）は、ＣＥＮ．ＰＫファミリー由来であり、遺伝学および生理学を組み合わせた研究に好適なバックグランドとして以前確認された（ファン・ダイケン（ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ）ら（２０００年）エンザイム・アンド・マイクロバイアル・テクノロジー第２６巻：ｐ．７０６−７１４）。
【０１０１】
【表１】
2013500006.tif 000003
【０１０２】
ＧＰＤ１遺伝子（ＹＤＬ０２２Ｗ）を破壊するため、ＧＰＤ１遺伝子内の配列と相同な４５ヌクレオチドのフランキング領域、およびｐＵＧ６の破壊モジュールの配列と相同な約２０ヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、グルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら（１９９６年、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第２４巻：ｐ．２５１９−２５２４）に従い、ＰＣＲによりｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰ破壊カセットを増幅してもよい（グルデナーら（１９９６年）ヌクレイック・アシッズ・リサーチ２４：２５１９−２５２４）（図２、表２）。同様に、ｈｐｈＭＸ４破壊モジュールのＰＣＲ増幅の鋳型としてプラスミドｐＡＧ３２（（ゴールドステイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）およびマッカスカー（ＭｃＣｕｓｋｅｒ）（１９９９年）イースト第１５巻：ｐ．１５４１−１５５３）を使用してもよい。ＧＰＤ２（ＹＯＬ０５９Ｗ）破壊カセットの構築には、ＧＰＤ２遺伝子内の配列と相同な４５ヌクレオチドのフランキング領域、およびｐＡＧ３２の破壊モジュールの配列と相同な２０核酸配列を含む、プライマーセットを使用してもよい（表２）。
【０１０３】
表２．ＧＰＤ１遺伝子およびＧＰＤ２遺伝子の不活性化、およびＰＣＲ診断による破壊の適切さの確認のためのオリゴヌクレオチド。遺伝子破壊オリゴヌクレオチド；欠失される遺伝子の左（５’側）または右（３’側）のどちらかの配列と相同なヌクレオチドを大文字で示し；小文字は、破壊カセットの配列と相同なヌクレオチドを示す。
【０１０４】
【表２】
2013500006.tif 000004
【０１０５】
サッカロマイセス・セレビシエ株ＣＥＮ．ＰＫ１０２−３Ａ（表１）への、ＰＣＲ増幅したＧＰＤ１破壊カセットおよびＧＰＤ２破壊カセットの形質転換については、グルデナーら（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（１９９６年）第２４巻：ｐ．２５１９−２５２４）により記載されたプロトコルに従い行い、その後ＫａｎＭＸ破壊カセットで形質転換された菌株用の２００ｍｇ／ＬのＧ−４１８、およびｈｐｈＭＸ４破壊カセットで形質転換された菌株用の３００ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢを用いて、ＹＰＤ複合培地で形質転換体を選択してもよい（バーク（Ｂｕｒｋｅ）ら（２０００年）メソッズ・イン・イースト・ジェネティックス、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、プレーンビュー（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ）、ニューヨーク）。ＧＰＤ１遺伝子破壊カセットが適切に組み込まれたかの確認は、プライマーセット５’ＧＰＤ１＼ＫＡＮＡおよび３’ＧＰＤ１＼ＫＡＮＢ（表２）の組み合わせを用いてコロニーＰＣＲにより調べることができる。ＧＰＤ２の不活性化の適切さは同様に、プライマーセット５’ＧＰＤ２＼ＫＡＮＡおよび３’ＧＰＤ２＼ＫＡＮＢ（表２）を用いて確認することができる。それぞれｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットおよびｈｐｈＭＸ４カセットで置換され、菌株ＣＥＮ．ＰＫ１０２−３Ａ（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｌｅｕ２）のＧＰＤ１遺伝子およびＧＰＤ２遺伝子のオープンリーディングフレームが欠失している菌株ＲＷＢ００９４を、ＢＩＲＤエンジニアリング、ロッテルダム、オランダから取得した。菌株ＲＷＢ００９４のＫａｎＭＸマーカーを、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現により除去し（グルデナーら（１９９６年）ヌクレイック・アシッズ・リサーチ第２４巻：ｐ．２５１９−２５２４）、そのロイシン要求性を、ＬＥＵ２を含むプラスミドＹＥＰｌａｃ１８１での形質転換により相補し（ギーツ（Ｇｉｅｔｚ），Ｒ．Ｄ．およびＳ．アキコ（Ａｋｉｏ）、（１９８８年）ジーン（Ｇｅｎｅ）第７４巻：ｐ．５２７−５３４．）、菌株ＩＭＺ００８を得た。図１２は、遺伝子破壊手順、ＧＰＤ１のＯＲＦのＫａｎＭＸとの置換、およびＧＰＤ２のＯＲＦのｈｐｈＭＸ４との置換を模式的に示す。矢印は、遺伝子不活性化が適切かをＰＣＲ診断により確認するためのオリゴヌクレオチドプライマーを示す。
【０１０６】
菌株ＩＭＺ００８を、ＵＲＡ３を含むｍｈｐＦ発現プラスミドｐＵＤＥ４３（以下を参照）で形質転換して、原栄養性のｍｈｐＦ発現菌株ＩＭＺ１３２を得、ＵＲＡ３を含む「空」ベクターｐ４２６＿ＧＰＤで形質転換して、菌株ＩＭＺ１２７を得た。最後に、菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄ（ｕｒａ３）をｐ４２６＿ＧＰＤで形質転換して、原栄養性のＧＰＤ１ＧＰＤ２基準菌株ＩＭＥ０７６を得た。欠失カセットで形質転換した培養細胞を、Ｇ４１８（２００ｍｇ  ｌ−１）またはハイグロマイシン（２００ｍｇ  ｌ−１）を含むＹＰＤ複合培地に蒔いた。欠失カセットの組み込みに成功したかをＰＣＲ診断により確認した。
【０１０７】
２０ｇ  ｌ−１のグルコースを炭素源とした１００ｍｌの合成培地（以下を参照）を含む振盪フラスコで全菌株の保存培養物を増殖させた。３０％（ｖ／ｖ）グリセロールの添加後、定常期培養物のアリコート１ｍｌを−８０℃で保存した。
【０１０８】
プラスミドの構築
ａｔｔＢｌ配列およびａｔｔＢ２配列をそれぞれ含むプライマー対ｍｈｐＦ−ＦＷ（５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＴＧＡＧＴＡＡＧＣＧＴＡＡＡＧＴＣＧＣＣＡＴＴＡＴＣＧＧ−３’［配列番号３］）およびｍｈｐＦ−ＲＶ（５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣ−３’、［配列番号４］）を用いて、Ｅ．コリｍｈｐＦ遺伝子（ＥＭＢＬ受託番号Ｙ０９５５５．７）を、Ｅ．コリＫ１２菌株ＪＭ１０９ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。製造者の仕様に従いＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ホット・スタート・ハイフィデリティーＤＮＡポリメラーゼ（Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（フィンザイム・オイ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｏｙ）、エスポー（Ｅｓｐｏｏ）、フィンランド）を用いて、以下の条件のＢｉｏｍｅｔｒａ  ＴＧｒａｄｉｅｎｔサーモサイクラー（バイオメトラ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）、ゲッティンゲン（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）、ドイツ）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った：変性９８℃で１０秒、アニーリング３０秒、伸長７２℃で２５サイクル。１０１１ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングテクノロジー（ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア、米国）を用いてクローニングした。ＢＰ反応によりプラスミドｐＤＯＮＲ２２１を用いてエントリークローンを作製し、プラスミドｐＵＤ６４と命名した。このエントリークローン、および多コピープラスミドｐＡＧ４２６ＧＰＤ−ｃｃｄＢ（アドジーン（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）から、ＬＲ反応を利用して酵母発現プラスミドｐＵＤＥ４３を構築した。Ｚ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ（商標）Ｅ．トランスフォーメーションキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ザイモリサーチ・コーポレーション（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、オレンジ、米国）に従い、コンピテントなＥ．コリＫ１２菌株ＪＭ１０９への組換え反応産物の形質転換を行い、アンピシリン（１００ｍｇ  ｌ−１）あるいはカナマイシン（５０ｍｇ．ｌ−１）のどちらかを含むＬＢ培地に蒔いた。酵母形質転換は、バークら（メソッズ・イン・イースト・ジェネティックス（２０００年）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、プレーンビュー、ニューヨーク）に従い実施した。酵母発現プラスミドによる形質転換後、細胞を合成培地に蒔いた。多コピープラスミドｐＵＤＥ４３の挿入が成功したかを、クローニング用のプライマー対を用いてＰＣＲ診断により確認した。
【０１０９】
培養および培地
合成培地（４６）を用いて３０℃で振盪フラスコ培養を行った。培地のｐＨは、滅菌の前に２ＭのＫＯＨで６．０に調整した。５００ｍＬ振盪フラスコ中に２０ｇ  ｌ−１のグルコースを含む１００ｍｌの培地に、（１ｍｌの）凍結した保存培養物を接種して、前培養液を調製した。Ｉｎｎｏｖａ（登録商標）インキュベーターシェーカー（２００ｒｐｍ、ニューブランズウィックサイエンティフィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ニュージャージー州、米国）を用いた３０℃で２４時間のインキュベーション後、培養物をバイオリアクターに移した。
【０１１０】
有効容積１リットルの２リットル実験室用バイオリアクター（アプリコン（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）、スヒーダム（Ｓｃｈｉｅｄａｍ）、オランダ）を用いて３０℃で嫌気性回分発酵を行った。すべての発酵について、２０ｇ  ｌ−１のグルコース（４６）を含む合成培地を使用し、１００μｌ  ｌ−１のシリコーン消泡剤（Ｓｉｌｃｏｌａｐｓｅ５０２０、カルディックベルギー（Ｃａｌｄｉｃ  Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ブルースターシリコーン（Ｂｌｅｕｓｔａｒ  Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ））のほか、エタノールに溶解させた嫌気性増殖因子、エルゴステロール（０．０１ｇ  ｌ−１）およびＴｗｅｅｎ８０（０．４２ｇ  ｌ−１）を補充した。その結果、培地中に１１〜１３ｍＭのエタノールが得られた。必要な場合、２ｇ  ｌ−１の濃度で酢酸を加え、接種の前にｐＨを５．０に再調整した。培養物のｐＨを２Ｍ  ＫＯＨの自動添加により５．０に維持した。培養物を８００ｒｐｍで撹拌し、０．５Ｌ  ｍｉｎ−１の窒素（＜１０ｐｐｍ酸素）でパージした。オートクレーブ可能な酸素電極（アプリセンス（Ａｐｐｌｉｓｅｎｓ）、スヒーダム、オランダ）で、溶存酸素をモニターした。酸素の拡散を最小限に抑えるため、バイオレアクターにノルプレンチューブ（コール・パルマー・インストゥルメント・カンパニー（Ｃｏｌｅ  Ｐａｌｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ヴァーノンヒルズ（Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ）、米国）を装着した。発酵はすべて少なくとも２回ずつ行った。
【０１１１】
培養物の乾燥重量および光学密度の判定
予め秤量したニトロセルロースフィルター（細孔サイズ０．４５μｍ；ゲルマンラボラトリー（Ｇｅｌｍａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、アナーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ）、米国）により所定の時間間隔で培養サンプル（１０ｍｌ）を濾過した。培地の除去後、フィルターを脱イオン水で洗浄し、電子レンジ（ボッシュ（Ｂｏｓｃｈ）、シュトゥットガルト（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）、ドイツ）で３５０Ｗ、２０ｍｉｎ乾燥させ、秤量した。２反復測定のばらつきは１％未満であった。さらに、Ｎｏｖａｓｐｅｃ（登録商標）ＩＩ分光光度計を用いて波長６６０ｎｍの光学密度の測定値により培養増殖もモニターした。
【０１１２】
ガス分析
排気ガスを冷却器（ｃｏｎｄｅｎｓｏｒ）（２℃）で冷却し、パーマピュアドライヤー（Ｐｅｒｍａｐｕｒｅ  ｄｒｙｅｒ）タイプＭＤ−１１０−４８Ｐ−４（パーマピュア、トムズリバー（Ｔｏｍｓ  Ｒｉｖｅｒ）、米国）で乾燥させた。酸素および二酸化炭素の濃度をＮＧＡ  ２０００アナライザー（ローズマウント・アナリティカル（Ｒｏｓｅｍｏｕｎｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）、オービル（Ｏｒｒｖｉｌｌｅ）、米国）で判定した。排気ガス流速および二酸化炭素生成速度を、以前記載されたように判定した（３）。これらのバイオマス特有の速度を算出する際、培養サンプルの除去により起こる体積変化の補正を行った。
【０１１３】
代謝産物の解析
バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）ＨＰＸ  ８７Ｈカラム（バイオラッド、ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、米国）を含むウォーターズアライアンス（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ）２６９０ＨＰＬＣ（ウォーターズ、ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ）、米国）を用いたＨＰＬＣ解析で、培養サンプルの遠心分離により得られた上清を、グルコース、酢酸、コハク酸、乳酸、グリセロールおよびエタノールについて解析した。カラムは、０．５ｇ  ｌ−１のＨ２ＳＯ４を用いて６０℃、０．６ｍｌ  ｍｉｎ−１の流速で溶出した。検出は、ウォーターズ２４１０屈折率検出器、およびウォーターズ２４８７  ＵＶ検出器により行った。さらに、酵素的測定キット（アールバイオファーム（Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ）ＡＧ、ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、ドイツ）を用いて最初と最後のグリセロール濃度を判定した。窒素ガスをスパージするバイオレアクターでの培養の過程で、オフガスによりエタノールのかなりの部分が失われる。これを補正するため、無菌合成培地を用いて同一条件下、異なる有効容積で運転したバイオレアクターでエタノール蒸発のカイネティクスを解析した。得られた容積依存性のエタノール蒸発定数（この構成の場合、リットル単位の容積で割った商０．００８０に相当し、ｈ−１で表す）を用いて、培養上清におけるエタノール濃度のＨＰＬＣ測定値を補正し、サンプリングにより起こる容積の変化を考慮した。
【０１１４】
酵素活性アッセイ
以前記載されたように指数関数的に増殖する嫌気回分培養から、ＮＡＤ＋依存性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）活性アッセイのための細胞抽出物を調製した（アボット（Ａｂｂｏｔｔ）ら、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー、第７５巻：ｐ．２３２０−２３２５）。３４０ｎｍでＮＡＤＨの酸化をモニタリングすることにより、ＮＡＤ＋依存性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）活性を３０℃で測定した。反応混合物（全容積１ｍｌ）は、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１５ｍＭのＮＡＤＨおよび細胞抽出物を含んでいた。０．５ｍＭのアセチルコエンザイムＡを添加して反応を開始した。グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．８）活性の判定では、リン酸塩緩衝液をトリエタノールアミン緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５）（５、１９）と交換したこと以外は上記のように細胞抽出物を調製した。グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、以前記載されたように細胞抽出物を用いて３０℃でアッセイした（ブロムバーグ（Ｂｌｏｍｂｅｒｇ）およびアドラー（Ａｄｌｅｒ）（１９８９年）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７１巻：ｐ．１０８７−１０９２。反応速度は、添加した細胞抽出物の量に比例した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準物質としてローリー（Ｌｏｗｒｙ）法により判定した（ローリーｅｔ  ａｌ（１９５１年）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第１９３巻：ｐ．２６５−２７５）。
【０１１５】
結果
嫌気回分培養における増殖および産物形成
原栄養性の基準菌株Ｓ．セレビシエＩＭＥ０７６（ＧＰＤ１    ＧＰＤ２）の培養物に２．０ｇ  ｌ−１の酢酸を補充した場合、比増殖速度（０．３２ｈ−１）は、酢酸の非存在下で増殖させた培養物で報告された比増殖速度（０．３４ｈ−１）、カイパー（Ｋｕｙｐｅｒ）ら（２００５年）ＦＥＭＳイーストリサーチ第５巻：ｐ．３９９−４０９と同一であった。酢酸の添加によりバイオマスの収率は若干低下し、その結果、酢酸の非存在下で増殖した培養物と比較してグルコースのグリセロールの収率も低下した（図２、表３）。
【０１１６】
この作用は、酢酸の細胞への拡散による細胞内ｐＨホメオスタシスのためのグルコース異化作用の速度が高まり、それに伴いグルコースのバイオマスの収率が低下することに起因している。同じ条件下で、細胞抽出物中にＮＡＤ＋依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性が存在しないことが確認された同質遺伝子のｇｐｄ１Δ  ｇｐｄ２Δ菌株（表２）は、嫌気的にまったく増殖することができず（図２）、これはＳ．セレビシエの嫌気培養におけるＮＡＤＨ再酸化に、Ｇｐｄ１およびＧｐｄ２によるグリセロール生成が必須であるという考えと整合している。
【０１１７】
【表３】
2013500006.tif 000005
【０１１８】
ｇｐｄ１Δ  ｇｐｄ２Δ菌株を用いてＥ．コリｍｈｐＦ遺伝子を発現させると、細胞抽出物中のアセチルＣｏＡ依存性のＮＡＤＨの還元速度は０．０２０μｍｏｌ  ｍｉｎ−１（ｍｇタンパク質）−１（表３）となり、グルコースが唯一の炭素源である場合、嫌気的増殖はできなかった。しかしながら、培地に２．０ｇ  ｌ−１の酢酸を補充すると、０．１４ｈ−１の比増殖速度で指数増殖が観察された。培養中にグリセロールの形成は起こらなかった。（図２、表３）。ｇｐｄ１Δ  ｇｐｄ２Δ菌株の培養物中に存在する微量（＜１ｍＭ）のグリセロールは、凍結したグリセロールストックから生じた接種培養物に由来する。エタノールが、主要な有機生成物であり、生成された少量のスクシネートおよびラクテートは、同じ条件下で増殖させた基準菌株の培養物中に観察されたものと類似していた（データ示さず）。
【０１１９】
ＩＭＺ１３２の発酵（４０ｈ）は、野生株（１５ｈ）より長く持続したことが観察され、嫌気回分培養に窒素ガスをスパージした。したがって、菌株ＩＭＺ１３２の蒸発により失われたエタノールの割合は、より大きかった。無菌の対照実験におけるエタノール蒸発のカイネティクスの測定およびエタノール収率の補正後、エタノールへの酢酸のＮＡＤＨ依存性還元の線形経路を用いて、本発明による操作された菌株の場合、グルコースの見かけのエタノール収率が１３％高いことが示された（表３）。
【０１２０】
考察
本研究は、化学量論的には、Ｓ．セレビシエの嫌気的増殖のレドックスシンクとしてのグリセロールの役割を、アセテートのエタノールへのＮＡＤＨ依存性還元における線形経路で十分に置き換えられるという原理の証拠となる。これは、リグノセルロース加水分解物など酢酸を含む供給原料からの大規模エタノール生成の興味深い視点を与える。
【０１２１】
酢酸のエタノールへの還元により、消費された培地の有機炭素含量が減少し、エタノール収率が増加するだけでなく、低ｐＨと、操作した酵母菌株によるペントース糖の消費の過程とで特に問題となる、酵母の増殖および代謝に対するアセテートの阻害作用を少なくともある程度緩和し得る
【実施例２】
【０１２２】
本例は、シュードモナス・エスピーＣＦ６００（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＣＡＡ４３２２６）由来の野生型ｄｍｐＦ遺伝子のコドン最適化型（配列番号２８）を発現するｇｐｄ１Δ  ｇｐｄ２Δサッカロマイセス・セレビシエ株による、グリセロールを含まない発酵によるエタノール生成に関する（シングラーら（１９９２年）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７４巻：ｐ．７１１−２４）。。
【０１２３】
この目的のため、菌株ＩＭＺ１３２（ｇｐｄ１Δ  ｇｐｄ２ΔｍｈｐＦ）の構築および性能評価に使用したのと同じ手順および技術を用いた。これらの手順および技術は、実施例１の材料および方法のセクションに記載されている。この研究では、ＵＲＡ３を含むｄｍｐＦ発現プラスミドｐＵＤＥ４７で菌株ＩＭＺ００８（ｇｐｄ１Δ  ｇｐｄ２Δｕｒａ３Δ）を形質転換して、原栄養性のｄｍｐＦを発現する菌株ＩＭＺ１３０を得た。プラスミドｐＵＤＥ４７の構築では、シュードモナス・エスピーＣＦ６００由来のｄｍｐＦ遺伝子のコドン最適化コピー（ＥＭＢＬ受託番号Ｘ６０８３５．１）を、ｐ４２６＿ＧＰＤプラスミドにライゲートした。Ｓ．セレビシエにおける発現のためのコドン最適化、およびプラスミドｐ４２６＿ＧＰＤへのライゲーションは、ＢａｓｅＣｌｅａｒ  ＢＶ（ライデン（Ｌｅｉｄｅｎ）、オランダ）により行った。プライマー対ｄｍｐＦ−ＦＷ（ＣＡＴＴＧＡＴＴＧＣＧＣＣＡＴＡＣＧ）およびｄｍｐＦ−ＲＶ（ＣＣＧＧＴＡＡＴＡＴＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣ）を用いたコロニーＰＣＲ診断により、多コピープラスミドｐＵＤＥ４７の挿入に成功したかを確認した。
【０１２４】
結果
嫌気回分培養における増殖および生成物の形成
ｇｐｄ１Δ  ｇｐｄ２ΔＳ．セレビシエ株におけるシュードモナス・エスピーＣＦ６００ｄｍｐＦ遺伝子の発現の結果は、同じ菌株におけるＥ．コリｍｈｐＦ遺伝子の発現で得られた結果と類似していた。嫌気性回分発酵では、菌株ＩＭＺ１３２（ｇｐｄ１Δ  ｇｐｄ２ΔｍｈｐＦ）と類似して、２．０ｇ  ｌ−１の酢酸を含む培地の補充に伴いｄｍｐＦ遺伝子の機能発現は指数増殖し、比増殖速度は０．１１ｈ−１であった（図１）。菌株ＩＭＺ１３０（ｇｐｄ１Δ  ｇｐｄ２ΔｄｍｐＦ）の回分時間（５５ｈ）は、菌株ＩＭＺ１３２（４０ｈ）よりやや長かった。培養中、グルコースの初濃度２０ｇ  ｌ−１は完全に消化される一方、グリセロールの形成が観察された。同時に、アセテートは初濃度２．１ｇ  ｌ−１から最終濃度１．６ｇ  ｌ−１に消化された。エタノールが主な有機生成物であり、グルコースのエタノール収率は０．４８ｇ  ｇ−１（エタノール蒸発で補正した収率）を示した。同じ条件下で増殖させた基準菌株の培養で観察されたのと同様に、少量のスクシネートおよびラクテートが生成された。
【０１２５】
図３は、菌株ＩＭＺ１３０（ｇｐｄ１Δ  ｇｐｄ２ΔｄｍｐＦ）を接種した回分発酵の流出物におけるＣＯ２の容積百分率を示す。グラフは、指数増殖を明示し、最大比増殖速度を算出するため、ｙ軸を対数スケールで示す。
【０１２６】
シュードモナス・エスピーＣＦ６００由来の遺伝子ｄｍｐＦの合成コドン最適化コピーの挿入は、化学量論的には、Ｓ．セレビシエの嫌気的増殖のレドックスシンクとしてのグリセロール形成を、エタノールへのアセテートのＮＡＤＨ依存性還元における線形代謝経路で置き換えられる、もう１つの例を示す。さらに、この例は、ｇｐｄ１Δ  ｇｐｄ２ΔＳ．セレビシエ株に（アセチル化（ａｃｅｔａｌｙｔｉｎｇ））アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを挿入すると、グルコースのエタノール収率が上昇し、副生成物グリセロールが生成されず、発酵阻害剤化合物のアセテートが消費されたことを示す。
配列表
SEQ ID NO: 1
E. coli mhpF gene Acetaldehyde dehydrogenase, acylating
ATGAGTAAGCGTAAAGTCGCCATTATCGGTTCTGGCAACATTGGTACCGATCTGATGATTAAAATTTTGCGTCACGGTCAGCATCTGGAGATGGCGGTGATGGTTGGCATTGATCCTCAGTCCGACGGTCTGGCGCGCGCCAGACGTATGGGCGTCGCCACCACCCATGAAGGGGTGATCGGACTGATGAACATGCCTGAATTTGCTGATATCGACATTGTATTTGATGCGACCAGCGCCGGTGCTCATGTGAAAAACGATGCCGCTTTACGCGAAGCGAAACCGGATATTCGCTTAATTGACCTGACGCCTGCTGCCATCGGCCCTTACTGCGTGCCGGTGGTTAACCTCGAGGCGAACGTCGATCAACTGAACGTCAACATGGTCACCTGCGGCGGCCAGGCCACCATTCCAATGGTGGCGGCAGTTTCACGCGTGGCGCGTGTTCATTACGCCGAAATTATCGCTTCTATCGCCAGTAAATCTGCCGGACCTGGCACGCGTGCCAATATCGATGAATTTACGGAAACCACTTCCCGAGCCATTGAAGTGGTGGGCGGCGCGGCAAAAGGGAAGGCGATTATTGTGCTTAACCCAGCA
GAGCCACCGTTGATGATGCGTGACACGGTGTATGTATTGAGCGACGAAGCTTCACAAGATGATATCGAAGCCTCAATCAATGAAATGGCTGAGGCGGTGCAGGCTTACGTACCGGGTTATCGCCTGAAACAGCGCGTGCAGTTTGAAGTTATCCCGCAGGATAAACCGGTCAATTTACCGGGCGTGGGGCAATTCTCCGGACTGAAAACAGCGGTCTGGCTGGAAGTCGAAGGCGCAGCGCATTATCTGCCTGCCTATGCGGGCAACCTCGACATTATGACTTCCAGTGCGCTGGCGACAGCGGAAAAAATGGCCCAGTCACTGGCGCGCAAGGCAGGAGAAGCGGCATGA
SEQ ID NO: 2
E. coli  Acetaldehyde dehydrogenase OS=Escherichia coli (strain K12) GN=mhpF PE=1 SV=1
MSKRKVAIIGSGNIGTDLMIKILRHGQHLEMAVMVGIDPQSDGLARARRMGVATTHEGVIGLMNMPEFADIDIVFDATSAGAHVKNDAALREAKPDIRLIDLTPAAIGPYCVPVVNLEANVDQLNVNMVTCGGQATIPMVAAVSRVARVHYAEIIASIASKSAGPGTRANIDEFTETTSRAIEVVGGAAKGKAIIVLNPAEPPLMMRDTVYVLSDEASQDDIEASINEMAEAVQAYVPGYRLKQRVQFEVIPQDKPVNLPGVGQFSGLKTAVWLEVEGAAHYLPAYAGNLDIMTSSALATAEKMAQSLARKAGEAA
SEQ ID NO: 3
primer mhpF-FW
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGAGTAAGCGTAAAGTCGCCATTATCGG
SEQ ID NO: 4
primer mhpF-RV GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTCATGCCGCTTCTCCTGCCTTGC
SEQ ID NO: 5 GPD1/YDL022W fw gene disruption primer
TTGTACACCCCCCCCCTCCACAAACACAAATATTGATAATATAAAcagctgaagcttcgtacgc
SEQ ID NO: 6 GPD1/YDL022W rv gene disruption primer
AATCTAATCTTCATGTAGATCTAATTCTTCAATCATGTCCGGCGgcataggccactagtggatctg
SEQ ID NO: 7 GPD2/YOL059W fw gene disruption primer
TCAATTCTCTTTCCCTTTCCTTTTCCTTCGCTCCCCTTCCTTATC ccaggctgaagcttcgtacg
SEQ ID NO: 8 GPD2/YOL059W rv gene disruption primer
GTGTCTATTCGTCATCGATGTCTAGCTCTTCAATCATCTCCGGTAGgcataggccactagtggatc
SEQ ID NO: 9 GPD1/YDL022W fw verification primer
CCCACCCACACCACCAATAC
SEQ ID NO: 10 GPD1/YDL022Wrv verification primer
CGGACGCCAGATGCTAGAAG
SEQ ID NO: 11 GPD2/YOL059W fw verification primer
GTTCAGCAGCTCTTCTCTAC
SEQ ID NO: 12 GPD2/YOL059W rv verification primer
CCAAATGCGACATGAGTCAC
SEQ ID NO: 13 GPD1/YDL022W fw disruption cassette specific verification primer
CGCACGTCAAGACTGTCAAG
SEQ ID NO: 14 GPD1/YDL022W rv disruption cassette specific verification primer
TCGTATGTGAATGCTGGTCG
SEQ ID NO: 15 GPD2/YOL059W fw disruption cassette specific verification primer
CGCACGTCAAGACTGTCAAG
SEQ ID NO: 16 GPD2/YOL059W rv disruption cassette specific verification primer
TCGTATGTGAATGCTGGTCG
SEQ ID NO: 17 S. cerevisiae ACS 1 gene
ATGTCGCCCTCTGCCGTACAATCATCAAAACTAGAAGAACAGTCAAGTGAAATTGACAAG
TTGAAAGCAAAAATGTCCCAGTCTGCCGCCACTGCGCAGCAGAAGAAGGAACATGAGTAT
GAACATTTGACTTCGGTCAAGATCGTGCCACAACGGCCCATCTCAGATAGACTGCAGCCC
GCAATTGCTACCCACTATTCTCCACACTTGGACGGGTTGCAGGACTATCAGCGCTTGCAC
AAGGAGTCTATTGAAGACCCTGCTAAGTTCTTCGGTTCTAAAGCTACCCAATTTTTAAAC
TGGTCTAAGCCATTCGATAAGGTGTTCATCCCAGACCCTAAAACGGGCAGGCCCTCCTTC
CAGAACAATGCATGGTTCCTCAACGGCCAATTAAACGCCTGTTACAACTGTGTTGACAGA
CATGCCTTGAAGACTCCTAACAAGAAAGCCATTATTTTCGAAGGTGACGAGCCTGGCCAA
GGCTATTCCATTACCTACAAGGAACTACTTGAAGAAGTTTGTCAAGTGGCACAAGTGCTG
ACTTACTCTATGGGCGTTCGCAAGGGCGATACTGTTGCCGTGTACATGCCTATGGTCCCA
GAAGCAATCATAACCTTGTTGGCCATTTCCCGTATCGGTGCCATTCACTCCGTAGTCTTT
GCCGGGTTTTCTTCCAACTCCTTGAGAGATCGTATCAACGATGGGGACTCTAAAGTTGTC
ATCACTACAGATGAATCCAACAGAGGTGGTAAAGTCATTGAGACTAAAAGAATTGTTGAT
GACGCGCTAAGAGAGACCCCAGGCGTGAGACACGTCTTGGTTTATAGAAAGACCAACAAT
CCATCTGTTGCTTTCCATGCCCCCAGAGATTTGGATTGGGCAACAGAAAAGAAGAAATAC
AAGACCTACTATCCATGCACACCCGTTGATTCTGAGGATCCATTATTCTTGTTGTATACG
TCTGGTTCTACTGGTGCCCCCAAGGGTGTTCAACATTCTACCGCAGGTTACTTGCTGGGA
GCTTTGTTGACCATGCGCTACACTTTTGACACTCACCAAGAAGACGTTTTCTTCACAGCT
GGAGACATTGGCTGGATTACAGGCCACACTTATGTGGTTTATGGTCCCTTACTATATGGT
TGTGCCACTTTGGTCTTTGAAGGGACTCCTGCGTACCCAAATTACTCCCGTTATTGGGAT
ATTATTGATGAACACAAAGTCACCCAATTTTATGTTGCGCCAACTGCTTTGCGTTTGTTG
AAAAGAGCTGGTGATTCCTACATCGAAAATCATTCCTTAAAATCTTTGCGTTGCTTGGGT
TCGGTCGGTGAGCCAATTGCTGCTGAAGTTTGGGAGTGGTACTCTGAAAAAATAGGTAAA
AATGAAATCCCCATTGTAGACACCTACTGGCAAACAGAATCTGGTTCGCATCTGGTCACC
CCGCTGGCTGGTGGTGTTACACCAATGAAACCGGGTTCTGCCTCATTCCCCTTCTTCGGT
ATTGATGCAGTTGTTCTTGACCCTAACACTGGTGAAGAACTTAACACCAGCCACGCAGAG
GGTGTCCTTGCCGTCAAAGCTGCATGGCCATCATTTGCAAGAACTATTTGGAAAAATCAT
GATAGGTATCTAGACACTTATTTGAACCCTTACCCTGGCTACTATTTCACTGGTGATGGT
GCTGCAAAGGATAAGGATGGTTATATCTGGATTTTGGGTCGTGTAGACGATGTGGTGAAC
GTCTCTGGTCACCGTCTGTCTACCGCTGAAATTGAGGCTGCTATTATCGAAGATCCAATT
GTGGCCGAGTGTGCTGTTGTCGGATTCAACGATGACTTGACTGGTCAAGCAGTTGCTGCA
TTTGTGGTGTTGAAAAACAAATCTAGTTGGTCCACCGCAACAGATGATGAATTACAAGAT
ATCAAGAAGCATTTGGTCTTTACTGTTAGAAAAGACATCGGGCCATTTGCCGCACCAAAA
TTGATCATTTTAGTGGATGACTTGCCCAAGACAAGATCCGGCAAAATTATGAGACGTATT
TTAAGAAAAATCCTAGCAGGAGAAAGTGACCAACTAGGCGACGTTTCTACATTGTCAAAC
CCTGGCATTGTTAGACATCTAATTGATTCGGTCAAGTTGTAA
SEQ ID NO: 18 S. cerevisiae ACS 2 gene
ATGACAATCAAGGAACATAAAGTAGTTTATGAAGCTCACAACGTAAAGGCTCTTAAGGCT
CCTCAACATTTTTACAACAGCCAACCCGGCAAGGGTTACGTTACTGATATGCAACATTAT
CAAGAAATGTATCAACAATCTATCAATGAGCCAGAAAAATTCTTTGATAAGATGGCTAAG
GAATACTTGCATTGGGATGCTCCATACACCAAAGTTCAATCTGGTTCATTGAACAATGGT
GATGTTGCATGGTTTTTGAACGGTAAATTGAATGCATCATACAATTGTGTTGACAGACAT
GCCTTTGCTAATCCCGACAAGCCAGCTTTGATCTATGAAGCTGATGACGAATCCGACAAC
AAAATCATCACATTTGGTGAATTACTCAGAAAAGTTTCCCAAATCGCTGGTGTCTTAAAA
AGCTGGGGCGTTAAGAAAGGTGACACAGTGGCTATCTATTTGCCAATGATTCCAGAAGCG
GTCATTGCTATGTTGGCTGTGGCTCGTATTGGTGCTATTCACTCTGTTGTCTTTGCTGGG
TTCTCCGCTGGTTCGTTGAAAGATCGTGTCGTTGACGCTAATTCTAAAGTGGTCATCACT
TGTGATGAAGGTAAAAGAGGTGGTAAGACCATCAACACTAAAAAAATTGTTGACGAAGGT
TTGAACGGAGTCGATTTGGTTTCCCGTATCTTGGTTTTCCAAAGAACTGGTACTGAAGGT
ATTCCAATGAAGGCCGGTAGAGATTACTGGTGGCATGAGGAGGCCGCTAAGCAGAGAACT
TACCTACCTCCTGTTTCATGTGACGCTGAAGATCCTCTATTTTTATTATACACTTCCGGT
TCCACTGGTTCTCCAAAGGGTGTCGTTCACACTACAGGTGGTTATTTATTAGGTGCCGCT
TTAACAACTAGATACGTTTTTGATATTCACCCAGAAGATGTTCTCTTCACTGCCGGTGAC
GTCGGCTGGATCACGGGTCACACCTATGCTCTATATGGTCCATTAACCTTGGGTACCGCC
TCAATAATTTTCGAATCCACTCCTGCCTACCCAGATTATGGTAGATATTGGAGAATTATC
CAACGTCACAAGGCTACCCATTTCTATGTGGCTCCAACTGCTTTAAGATTAATCAAACGT
GTAGGTGAAGCCGAAATTGCCAAATATGACACTTCCTCATTACGTGTCTTGGGTTCCGTC
GGTGAACCAATCTCTCCAGACTTATGGGAATGGTATCATGAAAAAGTGGGTAACAAAAAC
TGTGTCATTTGTGACACTATGTGGCAAACAGAGTCTGGTTCTCATTTAATTGCTCCTTTG
GCAGGTGCTGTCCCAACAAAACCTGGTTCTGCTACCGTGCCATTCTTTGGTATTAACGCT
TGTATCATTGACCCTGTTACAGGTGTGGAATTAGAAGGTAATGATGTCGAAGGTGTCCTT
GCCGTTAAATCACCATGGCCATCAATGGCTAGATCTGTTTGGAACCACCACGACCGTTAC
ATGGATACTTACTTGAAACCTTATCCTGGTCACTATTTCACAGGTGATGGTGCTGGTAGA
GATCATGATGGTTACTACTGGATCAGGGGTAGAGTTGACGACGTTGTAAATGTTTCCGGT
CATAGATTATCCACATCAGAAATTGAAGCATCTATCTCAAATCACGAAAACGTCTCGGAA
GCTGCTGTTGTCGGTATTCCAGATGAATTGACCGGTCAAACCGTCGTTGCATATGTTTCC
CTAAAAGATGGTTATCTACAAAACAACGCTACTGAAGGTGATGCAGAACACATCACACCA
GATAATTTACGTAGAGAATTGATCTTACAAGTTAGGGGTGAGATTGGTCCTTTCGCCTCA
CCAAAAACCATTATTCTAGTTAGAGATCTACCAAGAACAAGGTCAGGAAAGATTATGAGA
AGAGTTCTAAGAAAGGTTGCTTCTAACGAAGCCGAACAGCTAGGTGACCTAACTACTTTG
GCCAACCCAGAAGTTGTACCTGCCATCATTTCTGCTGTAGAGAACCAATTTTTCTCTCAA
AAAAAGAAATAA
SEQ ID NO: 19 S. cerevisiae ADH1
ATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCACGGTAAGTTGGAA
TACAAAGATATTCCAGTTCCAAAGCCAAAGGCCAACGAATTGTTGATCAACGTTAAATAC
TCTGGTGTCTGTCACACTGACTTGCACGCTTGGCACGGTGACTGGCCATTGCCAGTTAAG
CTACCATTAGTCGGTGGTCACGAAGGTGCCGGTGTCGTTGTCGGCATGGGTGAAAACGTT
AAGGGCTGGAAGATCGGTGACTACGCCGGTATCAAATGGTTGAACGGTTCTTGTATGGCC
TGTGAATACTGTGAATTGGGTAACGAATCCAACTGTCCTCACGCTGACTTGTCTGGTTAC
ACCCACGACGGTTCTTTCCAACAATACGCTACCGCTGACGCTGTTCAAGCCGCTCACATT
CCTCAAGGTACCGACTTGGCCCAAGTCGCCCCCATCTTGTGTGCTGGTATCACCGTCTAC
AAGGCTTTGAAGTCTGCTAACTTGATGGCCGGTCACTGGGTTGCTATCTCCGGTGCTGCT
GGTGGTCTAGGTTCTTTGGCTGTTCAATACGCCAAGGCTATGGGTTACAGAGTCTTGGGT
ATTGACGGTGGTGAAGGTAAGGAAGAATTATTCAGATCCATCGGTGGTGAAGTCTTCATT
GACTTCACTAAGGAAAAGGACATTGTCGGTGCTGTTCTAAAGGCCACTGACGGTGGTGCT
CACGGTGTCATCAACGTTTCCGTTTCCGAAGCCGCTATTGAAGCTTCTACCAGATACGTT
AGAGCTAACGGTACCACCGTTTTGGTCGGTATGCCAGCTGGTGCCAAGTGTTGTTCTGAT
GTCTTCAACCAAGTCGTCAAGTCCATCTCTATTGTTGGTTCTTACGTCGGTAACAGAGCT
GACACCAGAGAAGCTTTGGACTTCTTCGCCAGAGGTTTGGTCAAGTCTCCAATCAAGGTT
GTCGGCTTGTCTACCTTGCCAGAAATTTACGAAAAGATGGAAAAGGGTCAAATCGTTGGT
AGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAA
SEQ ID NO: 20 S. cerevisiae ADH2
ATGTCTATTCCAGAAACTCAAAAAGCCATTATCTTCTACGAATCCAACGGCAAGTTGGAG
CATAAGGATATCCCAGTTCCAAAGCCAAAGCCCAACGAATTGTTAATCAACGTCAAGTAC
TCTGGTGTCTGCCACACCGATTTGCACGCTTGGCATGGTGACTGGCCATTGCCAACTAAG
TTACCATTAGTTGGTGGTCACGAAGGTGCCGGTGTCGTTGTCGGCATGGGTGAAAACGTT
AAGGGCTGGAAGATCGGTGACTACGCCGGTATCAAATGGTTGAACGGTTCTTGTATGGCC
TGTGAATACTGTGAATTGGGTAACGAATCCAACTGTCCTCACGCTGACTTGTCTGGTTAC
ACCCACGACGGTTCTTTCCAAGAATACGCTACCGCTGACGCTGTTCAAGCCGCTCACATT
CCTCAAGGTACTGACTTGGCTGAAGTCGCGCCAATCTTGTGTGCTGGTATCACCGTATAC
AAGGCTTTGAAGTCTGCCAACTTGAGAGCAGGCCACTGGGCGGCCATTTCTGGTGCTGCT
GGTGGTCTAGGTTCTTTGGCTGTTCAATATGCTAAGGCGATGGGTTACAGAGTCTTAGGT
ATTGATGGTGGTCCAGGAAAGGAAGAATTGTTTACCTCGCTCGGTGGTGAAGTATTCATC
GACTTCACCAAAGAGAAGGACATTGTTAGCGCAGTCGTTAAGGCTACCAACGGCGGTGCC
CACGGTATCATCAATGTTTCCGTTTCCGAAGCCGCTATCGAAGCTTCTACCAGATACTGT
AGGGCGAACGGTACTGTTGTCTTGGTTGGTTTGCCAGCCGGTGCAAAGTGCTCCTCTGAT
GTCTTCAACCACGTTGTCAAGTCTATCTCCATTGTCGGCTCTTACGTGGGGAACAGAGCT
GATACCAGAGAAGCCTTAGATTTCTTTGCCAGAGGTCTAGTCAAGTCTCCAATAAAGGTA
GTTGGCTTATCCAGTTTACCAGAAATTTACGAAAAGATGGAGAAGGGCCAAATTGCTGGT
AGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAA
SEQ ID NO: 21 S. cerevisiae ADH3
ATGTTGAGAACGTCAACATTGTTCACCAGGCGTGTCCAACCAAGCCTATTTTCTAGAAAC
ATTCTTAGATTGCAATCCACAGCTGCAATCCCTAAGACTCAAAAAGGTGTCATCTTTTAT
GAGAATAAGGGGAAGCTGCATTACAAAGATATCCCTGTCCCCGAGCCTAAGCCAAATGAA
ATTTTAATCAACGTTAAATATTCTGGTGTATGTCACACCGATTTACATGCTTGGCACGGC
GATTGGCCATTACCTGTTAAACTACCATTAGTAGGTGGTCATGAAGGTGCTGGTGTAGTT
GTCAAACTAGGTTCCAATGTCAAGGGCTGGAAAGTCGGTGATTTAGCAGGTATCAAATGG
CTGAACGGTTCTTGTATGACATGCGAATTCTGTGAATCAGGTCATGAATCAAATTGTCCA
GATGCTGATTTATCTGGTTACACTCATGATGGTTCTTTCCAACAATTTGCGACCGCTGAT
GCTATTCAAGCCGCCAAAATTCAACAGGGTACCGACTTGGCCGAAGTAGCCCCAATATTA
TGTGCTGGTGTTACTGTATATAAAGCACTAAAAGAGGCAGACTTGAAAGCTGGTGACTGG
GTTGCCATCTCTGGTGCTGCAGGTGGCTTGGGTTCCTTGGCCGTTCAATATGCAACTGCG
ATGGGTTACAGAGTTCTAGGTATTGATGCAGGTGAGGAAAAGGAAAAACTTTTCAAGAAA
TTGGGGGGTGAAGTATTCATCGACTTTACTAAAACAAAGAATATGGTTTCTGACATTCAA
GAAGCTACCAAAGGTGGCCCTCATGGTGTCATTAACGTTTCCGTTTCTGAAGCCGCTATT
TCTCTATCTACGGAATATGTTAGACCATGTGGTACCGTCGTTTTGGTTGGTTTGCCCGCT
AACGCCTACGTTAAATCAGAGGTATTCTCTCATGTGGTGAAGTCCATCAATATCAAGGGT
TCTTATGTTGGTAACAGAGCTGATACGAGAGAAGCCTTAGACTTCTTTAGCAGAGGTTTG
ATCAAATCACCAATCAAAATTGTTGGATTATCTGAATTACCAAAGGTTTATGACTTGATG
GAAAAGGGCAAGATTTTGGGTAGATACGTCGTCGATACTAGTAAATAA
SEQ ID NO: 22 S. cerevisiae ADH4
ATGTCTTCCGTTACTGGGTTTTACATTCCACCAATCTCTTTCTTTGGTGAAGGTGCTTTA
GAAGAAACCGCTGATTACATCAAAAACAAGGATTACAAAAAGGCTTTGATCGTTACTGAT
CCTGGTATTGCAGCTATTGGTCTCTCCGGTAGAGTCCAAAAGATGTTGGAAGAACGTGAC
TTAAACGTTGCTATCTATGACAAAACTCAACCAAACCCAAATATTGCCAATGTCACAGCT
GGTTTGAAGGTTTTGAAGGAACAAAACTCTGAAATTGTTGTTTCCATTGGTGGTGGTTCT
GCTCACGACAATGCTAAGGCCATTGCTTTATTGGCTACTAACGGTGGGGAAATCGGAGAC
TATGAAGGTGTCAATCAATCTAAGAAGGCTGCTTTACCACTATTTGCCATCAACACTACT
GCTGGTACTGCTTCCGAAATGACCAGATTCACTATTATCTCTAATGAAGAAAAGAAAATC
AAGATGGCTATCATTGACAACAACGTCACTCCAGCTGTTGCTGTCAACGATCCATCTACC
ATGTTTGGTTTGCCACCTGCTTTGACTGCTGCTACTGGTCTAGATGCTTTGACTCACTGT
ATCGAAGCTTATGTTTCCACCGCCTCTAACCCAATCACCGATGCCTGTGCTTTGAAGGGT
ATTGATTTGATCAATGAAAGCTTAGTCGCTGCATACAAAGACGGTAAAGACAAGAAGGCC
AGAACTGACATGTGTTACGCTGAATACTTGGCAGGTATGGCTTTCAACAATGCTTCTCTA
GGTTATGTTCATGCCCTTGCTCATCAACTTGGTGGTTTCTACCACTTGCCTCATGGTGTT
TGTAACGCTGTCTTGTTGCCTCATGTTCAAGAGGCCAACATGCAATGTCCAAAGGCCAAG
AAGAGATTAGGTGAAATTGCTTTGCATTTCGGTGCTTCTCAAGAAGATCCAGAAGAAACC
ATCAAGGCTTTGCACGTTTTAAACAGAACCATGAACATTCCAAGAAACTTGAAAGAATTA
GGTGTTAAAACCGAAGATTTTGAAATTTTGGCTGAACACGCCATGCATGATGCCTGCCAT
TTGACTAACCCAGTTCAATTCACCAAAGAACAAGTGGTTGCCATTATCAAGAAAGCCTAT
GAATATTAA
SEQ ID NO: 23 S. cerevisiae ADH5
ATGCCTTCGCAAGTCATTCCTGAAAAACAAAAGGCTATTGTCTTTTATGAGACAGATGGA
AAATTGGAATATAAAGACGTCACAGTTCCGGAACCTAAGCCTAACGAAATTTTAGTCCAC
GTTAAATATTCTGGTGTTTGTCATAGTGACTTGCACGCGTGGCACGGTGATTGGCCATTT
CAATTGAAATTTCCATTAATCGGTGGTCACGAAGGTGCTGGTGTTGTTGTTAAGTTGGGA
TCTAACGTTAAGGGCTGGAAAGTCGGTGATTTTGCAGGTATAAAATGGTTGAATGGGACT
TGCATGTCCTGTGAATATTGTGAAGTAGGTAATGAATCTCAATGTCCTTATTTGGATGGT
ACTGGCTTCACACATGATGGTACTTTTCAAGAATACGCAACTGCCGATGCCGTTCAAGCT
GCCCATATTCCACCAAACGTCAATCTTGCTGAAGTTGCCCCAATCTTGTGTGCAGGTATC
ACTGTTTATAAGGCGTTGAAAAGAGCCAATGTGATACCAGGCCAATGGGTCACTATATCC
GGTGCATGCGGTGGCTTGGGTTCTCTGGCAATCCAATACGCCCTTGCTATGGGTTACAGG
GTCATTGGTATCGATGGTGGTAATGCCAAGCGAAAGTTATTTGAACAATTAGGCGGAGAA
ATATTCATCGATTTCACGGAAGAAAAAGACATTGTTGGTGCTATAATAAAGGCCACTAAT
GGCGGTTCTCATGGAGTTATTAATGTGTCTGTTTCTGAAGCAGCTATCGAGGCTTCTACG
AGGTATTGTAGGCCCAATGGTACTGTCGTCCTGGTTGGTATGCCAGCTCATGCTTACTGC
AATTCCGATGTTTTCAATCAAGTTGTAAAATCAATCTCCATCGTTGGATCTTGTGTTGGA
AATAGAGCTGATACAAGGGAGGCTTTAGATTTCTTCGCCAGAGGTTTGATCAAATCTCCG
ATCCACTTAGCTGGCCTATCGGATGTTCCTGAAATTTTTGCAAAGATGGAGAAGGGTGAA
ATTGTTGGTAGATATGTTGTTGAGACTTCTAAATGA
SEQ ID NO 24: S. cerevisiae GPD1
ATGTCTGCTGCTGCTGATAGATTAAACTTAACTTCCGGCCACTTGAATGCTGGTAGAAAG
AGAAGTTCCTCTTCTGTTTCTTTGAAGGCTGCCGAAAAGCCTTTCAAGGTTACTGTGATT
GGATCTGGTAACTGGGGTACTACTATTGCCAAGGTGGTTGCCGAAAATTGTAAGGGATAC
CCAGAAGTTTTCGCTCCAATAGTACAAATGTGGGTGTTCGAAGAAGAGATCAATGGTGAA
AAATTGACTGAAATCATAAATACTAGACATCAAAACGTGAAATACTTGCCTGGCATCACT
CTACCCGACAATTTGGTTGCTAATCCAGACTTGATTGATTCAGTCAAGGATGTCGACATC
ATCGTTTTCAACATTCCACATCAATTTTTGCCCCGTATCTGTAGCCAATTGAAAGGTCAT
GTTGATTCACACGTCAGAGCTATCTCCTGTCTAAAGGGTTTTGAAGTTGGTGCTAAAGGT
GTCCAATTGCTATCCTCTTACATCACTGAGGAACTAGGTATTCAATGTGGTGCTCTATCT
GGTGCTAACATTGCCACCGAAGTCGCTCAAGAACACTGGTCTGAAACAACAGTTGCTTAC
CACATTCCAAAGGATTTCAGAGGCGAGGGCAAGGACGTCGACCATAAGGTTCTAAAGGCC
TTGTTCCACAGACCTTACTTCCACGTTAGTGTCATCGAAGATGTTGCTGGTATCTCCATC
TGTGGTGCTTTGAAGAACGTTGTTGCCTTAGGTTGTGGTTTCGTCGAAGGTCTAGGCTGG
GGTAACAACGCTTCTGCTGCCATCCAAAGAGTCGGTTTGGGTGAGATCATCAGATTCGGT
CAAATGTTTTTCCCAGAATCTAGAGAAGAAACATACTACCAAGAGTCTGCTGGTGTTGCT
GATTTGATCACCACCTGCGCTGGTGGTAGAAACGTCAAGGTTGCTAGGCTAATGGCTACT
TCTGGTAAGGACGCCTGGGAATGTGAAAAGGAGTTGTTGAATGGCCAATCCGCTCAAGGT
TTAATTACCTGCAAAGAAGTTCACGAATGGTTGGAAACATGTGGCTCTGTCGAAGACTTC
CCATTATTTGAAGCCGTATACCAAATCGTTTACAACAACTACCCAATGAAGAACCTGCCG
GACATGATTGAAGAATTAGATCTACATGAAGATTAG
SEQ ID NO: 25: S. cerevisiae GPD2
ATGCTTGCTGTCAGAAGATTAACAAGATACACATTCCTTAAGCGAACGCATCCGGTGTTA
TATACTCGTCGTGCATATAAAATTTTGCCTTCAAGATCTACTTTCCTAAGAAGATCATTA
TTACAAACACAACTGCACTCAAAGATGACTGCTCATACTAATATCAAACAGCACAAACAC
TGTCATGAGGACCATCCTATCAGAAGATCGGACTCTGCCGTGTCAATTGTACATTTGAAA
CGTGCGCCCTTCAAGGTTACAGTGATTGGTTCTGGTAACTGGGGGACCACCATCGCCAAA
GTCATTGCGGAAAACACAGAATTGCATTCCCATATCTTCGAGCCAGAGGTGAGAATGTGG
GTTTTTGATGAAAAGATCGGCGACGAAAATCTGACGGATATCATAAATACAAGACACCAG
AACGTTAAATATCTACCCAATATTGACCTGCCCCATAATCTAGTGGCCGATCCTGATCTT
TTACACTCCATCAAGGGTGCTGACATCCTTGTTTTCAACATCCCTCATCAATTTTTACCA
AACATAGTCAAACAATTGCAAGGCCACGTGGCCCCTCATGTAAGGGCCATCTCGTGTCTA
AAAGGGTTCGAGTTGGGCTCCAAGGGTGTGCAATTGCTATCCTCCTATGTTACTGATGAG
TTAGGAATCCAATGTGGCGCACTATCTGGTGCAAACTTGGCACCGGAAGTGGCCAAGGAG
CATTGGTCCGAAACCACCGTGGCTTACCAACTACCAAAGGATTATCAAGGTGATGGCAAG
GATGTAGATCATAAGATTTTGAAATTGCTGTTCCACAGACCTTACTTCCACGTCAATGTC
ATCGATGATGTTGCTGGTATATCCATTGCCGGTGCCTTGAAGAACGTCGTGGCACTTGCA
TGTGGTTTCGTAGAAGGTATGGGATGGGGTAACAATGCCTCCGCAGCCATTCAAAGGCTG
GGTTTAGGTGAAATTATCAAGTTCGGTAGAATGTTTTTCCCAGAATCCAAAGTCGAGACC
TACTATCAAGAATCCGCTGGTGTTGCAGATCTGATCACCACCTGCTCAGGCGGTAGAAAC
GTCAAGGTTGCCACATACATGGCCAAGACCGGTAAGTCAGCCTTGGAAGCAGAAAAGGAA
TTGCTTAACGGTCAATCCGCCCAAGGGATAATCACATGCAGAGAAGTTCACGAGTGGCTA
CAAACATGTGAGTTGACCCAAGAATTCCCATTATTCGAGGCAGTCTACCAGATAGTCTAC
AACAACGTCCGCATGGAAGACCTACCGGAGATGATTGAAGAGCTAGACATCGATGACGAA
TAG
SEQ ID NO 26: S. cerevisiae GPP1
ATGCCTTTGACCACAAAACCTTTATCTTTGAAAATCAACGCCGCTCTATTCGATGTTGAC
GGTACCATCATCATCTCTCAACCAGCCATTGCTGCTTTCTGGAGAGATTTCGGTAAAGAC
AAGCCTTACTTCGATGCCGAACACGTTATTCACATCTCTCACGGTTGGAGAACTTACGAT
GCCATTGCCAAGTTCGCTCCAGACTTTGCTGATGAAGAATACGTTAACAAGCTAGAAGGT
GAAATCCCAGAAAAGTACGGTGAACACTCCATCGAAGTTCCAGGTGCTGTCAAGTTGTGT
AATGCTTTGAACGCCTTGCCAAAGGAAAAATGGGCTGTCGCCACCTCTGGTACCCGTGAC
ATGGCCAAGAAATGGTTCGACATTTTGAAGATCAAGAGACCAGAATACTTCATCACCGCC
AATGATGTCAAGCAAGGTAAGCCTCACCCAGAACCATACTTAAAGGGTAGAAACGGTTTG
GGTTTCCCAATTAATGAACAAGACCCATCCAAATCTAAGGTTGTTGTCTTTGAAGACGCA
CCAGCTGGTATTGCTGCTGGTAAGGCTGCTGGCTGTAAAATCGTTGGTATTGCTACCACT
TTCGATTTGGACTTCTTGAAGGAAAAGGGTTGTGACATCATTGTCAAGAACCACGAATCT
ATCAGAGTCGGTGAATACAACGCTGAAACCGATGAAGTCGAATTGATCTTTGATGACTAC
TTATACGCTAAGGATGACTTGTTGAAATGGTAA
SEQ ID NO: 27 S. cerevisiae GPP2
ATGGGATTGACTACTAAACCTCTATCTTTGAAAGTTAACGCCGCTTTGTTCGACGTCGAC
GGTACCATTATCATCTCTCAACCAGCCATTGCTGCATTCTGGAGGGATTTCGGTAAGGAC
AAACCTTATTTCGATGCTGAACACGTTATCCAAGTCTCGCATGGTTGGAGAACGTTTGAT
GCCATTGCTAAGTTCGCTCCAGACTTTGCCAATGAAGAGTATGTTAACAAATTAGAAGCT
GAAATTCCGGTCAAGTACGGTGAAAAATCCATTGAAGTCCCAGGTGCAGTTAAGCTGTGC
AACGCTTTGAACGCTCTACCAAAAGAGAAATGGGCTGTGGCAACTTCCGGTACCCGTGAT
ATGGCACAAAAATGGTTCGAGCATCTGGGAATCAGGAGACCAAAGTACTTCATTACCGCT
AATGATGTCAAACAGGGTAAGCCTCATCCAGAACCATATCTGAAGGGCAGGAATGGCTTA
GGATATCCGATCAATGAGCAAGACCCTTCCAAATCTAAGGTAGTAGTATTTGAAGACGCT
CCAGCAGGTATTGCCGCCGGAAAAGCCGCCGGTTGTAAGATCATTGGTATTGCCACTACT
TTCGACTTGGACTTCCTAAAGGAAAAAGGCTGTGACATCATTGTCAAAAACCACGAATCC
ATCAGAGTTGGCGGCTACAATGCCGAAACAGACGAAGTTGAATTCATTTTTGACGACTAC
TTATATGCTAAGGACGATCTGTTGAAATGGTAA
SEQ ID NO: 28 dmpF ORF synthetic codon optimized for Saccharomyces cerevisiae. Reference sequence: Pseudomonas sp. CF600
EMBL Accession number: X60835.1
ATGAATCAGAAACTGAAAGTAGCTATCATAGGTTCCGGTAATATCGGAAC
AGACCTGATGATTAAGGTACTGCGTAATGCAAAGTACTTAGAAATGGGCG
CGATGGTCGGTATCGATGCAGCCTCTGATGGACTGGCCAGAGCTCAAAGA
ATGGGCGTTACGACTACTTATGCAGGTGTAGAAGGGCTAATCAAGCTTCC
TGAATTTGCAGACATAGATTTCGTCTTCGATGCTACATCTGCATCAGCCC
ACGTTCAGAACGAGGCTTTATTAAGACAAGCTAAACCTGGTATTAGATTG
ATCGACCTTACCCCGGCGGCAATCGGTCCTTACTGTGTCCCCGTAGTTAA
TCTCGAGGAACATTTGGGCAAGTTGAACGTTAACATGGTTACTTGCGGTG
GCCAAGCTACTATTCCGATGGTCGCAGCTGTCTCACGTGTAGCCAAAGTC
CATTATGCTGAGATTGTTGCTTCTATTTCAAGCAAGAGTGCCGGACCTGG
AACCAGAGCCAATATAGATGAATTCACTGAGACAACCAGTAAAGCCATAG
AAGTTATTGGTGGTGCTGCAAAGGGTAAAGCTATAATTATTATGAACCCA
GCTGAACCACCATTGATTATGAGGGATACGGTGTATGTGCTTTCCGCCGC
CGCTGATCAAGCCGCTGTCGCAGCTTCTGTGGCTGAAATGGTTCAAGCGG
TTCAAGCATACGTGCCAGGCTATAGGTTAAAACAACAGGTTCAGTTTGAC
GTGATTCCCGAGTCCGCGCCACTAAACATCCCCGGTTTGGGGAGATTCAG
CGGGTTGAAAACAAGTGTGTTCCTAGAAGTAGAAGGTGCTGCTCATTATT
TGCCAGCATACGCAGGAAACTTAGATATTATGACTTCCGCAGCGTTAGCT
ACAGCCGAACGTATGGCGCAATCAATGTTGAATGCATAG
SEQ ID NO: 29 dmpF ORF
MNQKLKVAIIGSGNIGTDLMIKVLRNAKYLEMGAMVGIDAASDGLARAQR
MGVTTTYAGVEGLIKLPEFADIDFVFDATSASAHVQNEALLRQAKPGIRL
IDLTPAAIGPYCVPVVNLEEHLGKLNVNMVTCGGQATIPMVAAVSRVAKV
HYAEIVASISSKSAGPGTRANIDEFTETTSKAIEVIGGAAKGKAIIIMNP
AEPPLIMRDTVYVLSAAADQAAVAASVAEMVQAVQAYVPGYRLKQQVQFD
VIPESAPLNIPGLGRFSGLKTSVFLEVEGAAHYLPAYAGNLDIMTSAALA
TAERMAQSMLNA
SEQ ID NO: 30 primer dmpF-FW
CATTGATTGCGCCATACG
SEQ ID NO: 31 primer  dmpF-RV
CCGGTAATATCGGAACAGAC
SEQ ID NO: 32 Wild type sequence of dmpF gene from Pseudomonas sp. CF600. EMBL Accession number: X60835.1
ATGAACCAGAAACTCAAAGTCGCGATCATCGGTTCGGGCAATATCGGCACCGACCTGATGATCAAGGTGCTGCGCAACGCCAAGTACCTGGAAATGGGCGCCATGGTCGGCATCGACGCCGCCTCCGACGGCCTGGCCCGCGCCCAGCGCATGGGCGTGACGACCACCTATGCCGGCGTCGAAGGGCTGATCAAGCTGCCCGAATTCGCCGACATCGATTTCGTCTTCGACGCCACCTCGGCCAGTGCCCACGTGCAGAACGAGGCGCTGCTGCGCCAGGCCAAACCTGGCATCCGCCTGATCGACCTGACCCCGGCGGCCATCGGCCCGTACTGCGTGCCGGTGGTCAATCTGGAGGAGCACCTCGGCAAGCTCAACGTCAACATGGTTACCTGCGGCGGCCAGGCGACCATCCCGATGGTCGCCGCGGTCTCCCGTGTGGCCAAGGTCCATTACGCCGAGATCGTCGCCTCGATCAGCAGCAAGTCGGCCGGACCCGGCACCCGCGCCAACATCGACGAGTTCACCGAGACCACCAGCAAAGCCATCGAAGTGATCGGTGGTGCGGCCAAGGGCAAGGCGATCATCATCATGAACCCGGCTGAGCCGCCGCTGATCATGCGCGACACCGTGTATGTGCTGTCCGCCGCCGCCGATCAGGCCGCCGTCGCGGCCTCGGTGGCGGAAATGGTTCAGGCGGTGCAGGCCTACGTGCCCGGCTATCGCCTGAAGCAGCAGGTGCAGTTCGACGTGATCCCCGAGTCCGCGCCGCTGAACATCCCCGGTCTCGGCCGGTTCAGCGGGTTGAAGACCTCGGTGTTCCTCGAAGTCGAAGGCGCCGCCCATTACCTGCCGGCCTACGCCGGCAACCTCGACATCATGACCTCCGCCGCGCTGGCTACCGCCGAGCGTATGGCGCAGTCGATGTTGAACGCCTGA
【図１】
2013500006.tif 000006
【図２Ａ】
2013500006.tif 000007
【図２Ｂ】
2013500006.tif 000008
【図２Ｃ】
2013500006.tif 000009
【図２Ｄ】
2013500006.tif 000010
【図３】
2013500006.tif 000011
【配列表】
2013500006000001.xml
【国際調査報告】
2013500006.tif 000025
2013500006.tif 000026
2013500006.tif 000027
2013500006.tif 000028
2013500006.tif 000029