(57)【要約】【課題】単なる症状緩和ではなく、損傷を受けた皮膚障壁の再生及び強化を通じて皮膚疾患及び障害を根本的に予防、改善又は治療するための医薬または機能性化粧料としての組成物及びそれを利用した前記疾患及び障害の予防、改善又は治療方法を提供する。また、角質形成細胞の分化促進用組成物及び角質形成細胞の分化促進方法を提供する。【解決手段】本発明は、ニコチン酸アデニンディヌクレオチドリン酸又はその誘導体の角質形成細胞から繊維芽細胞への分化を促進する用途に関し、ＮＡＡＤＰまたはその誘導体を含む組成物の皮膚障壁再生及び改善、乾せん症やアトピー皮膚炎のような角質層異常疾患の予防、改善または治療のための薬学的または美容的用途、及び分離された角質形成細胞の分化促進用途を提供する。【選択図】図２
2013533308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式１に示す：
【化１】
2013533308.tif 000004
式中、
Ｒ１，Ｒ２は、各々と独立的にＨ，Ｃ１−４アルキル（非置換されるかまたはハロゲンに置換され得る）、又はＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ３であって；
Ｗは、ＮＨ２，ＯＨ及びＳＨからなる群から選択され；
Ｘは、Ｈ，ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２及びハロゲンからなる群から選択され；及び
Ｙは、ＯＨ，Ｈ，ＮＨ２及びハロゲンからなる群から選択される
ことである、ニコチン酸アデニンディヌクレオチドリン酸（ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ＮＡＡＤＰ）またはその誘導体、又はこれらの薬学的に許容可能な塩、薬学的に許容可能な溶媒化物または薬剤学的に許容可能な多形体を有効成分として含む、皮膚障壁の再生又は強化用の薬学組成物。
【請求項２】
乾癬、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、原発性接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、皮膚乾燥症、湿疹、ステロイド副作用による皮膚萎縮、皮膚の傷、傷跡、皺、皮膚老化、肝斑の発生、皮膚弾力弱化などの皮膚疾患及び障害の予防又は治療用の請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項３】
溶液、懸濁液、乳化剤、軟膏、ゲル、ペースト、クリーム、ローション、パウダー、噴霧剤、パック及び皮膚接着用のパッチ、ドレッシング、含水性添付剤又は含水性のない添付剤からなる群から選択される皮膚外用剤に剤形化されることである請求項１又は２に記載の薬学組成物。
【請求項４】
有効成分の投与量は、皮膚外溶剤の場合、１日皮膚表面的（ｃｍ２）当り１ｎＭ乃至１００μＭである請求項３に記載の薬学組成物。
【請求項５】
下記化学式１に示される：
【化１】
2013533308.tif 000005
式中、
Ｒ１，Ｒ２は、各々と独立的にＨ，Ｃ１−４アルキル（非置換されるかまたはハロゲンに置換され得る）、又はＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ３であって；
Ｗは、ＮＨ２，ＯＨ及びＳＨからなる群から選択され；
Ｘは、ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２及びハロゲンからなる群から選択され；及び
Ｙは、ＯＨ，Ｈ，ＮＨ２及びハロゲンからなる群から選択される
ことである、ニコチン酸アデニンディヌクレオチドリン酸（ＮＡＡＤＰ）またはその誘導体、又はこれらの塩、溶媒化物または多形体を有効成分として含む皮膚障壁の再生、強化用又は皮膚保湿用の機能性化粧料組成物。
【請求項６】
乾癬、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、原発性接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、皮膚乾燥症、湿疹、ステロイド副作用による皮膚萎縮、皮膚の傷、傷跡、皺、皮膚老化、肝斑の発生、皮膚弾力弱化、皮膚の引っ張り、肌荒いまたはつや不足、予防または改善用の請求項５に記載の機能性化粧料組成物。
【請求項７】
前記組成物は、スキン、ローション、ゲル、クリーム、エッセンス、水溶性パウダー、脂溶性パウダー、水溶性リキッド、ファンデーション、スプレー、パックを含む化粧品類、クレンジングフォーム、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクリーム、ボディオイル、ボディ洗浄剤、石けん、シャンプー、軟膏及びパッチからなる群から選択される形態で製造されることである請求項５または６に記載の機能性化粧料組成物。
【請求項８】
下記化学式１に示される：
【化１】
2013533308.tif 000006
式中、
Ｒ１，Ｒ２は、各々と独立的にＨ，Ｃ１−４アルキル（非置換されるかまたはハロゲンに置換され得る）、又はＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ３であって；
Ｗは、ＮＨ２，ＯＨ及びＳＨからなる群から選択され；
Ｘは、ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２及びハロゲンからなる群から選択され；及び
Ｙは、ＯＨ，Ｈ，ＮＨ２及びハロゲンからなる群から選択される
ことである、ニコチン酸アデニンディヌクレオチドリン酸（ＮＡＡＤＰ）またはその誘導体、又はこれらの塩、溶媒化物または多形体を有効成分として含む皮膚角質形成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）分化促進用の組成物。
【請求項９】
哺乳動物の皮膚から分離された角質形成細胞または皮膚から分離されて培養された角質形成細胞に請求項８に記載の組成物を接触させるステップを含む、哺乳動物の角質形成細胞の分化を促進する方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の組成物を含む角質形成細胞の分化促進用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニコチン酸アデニンディヌクレオチドリン酸（ＮＡＡＤＰ）又はその誘導体の角質形成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）分化促進用途に関する。より詳しくは、本発明はＮＡＡＤＰまたはその誘導体の皮膚障壁再生及び改善、乾せん症やアトピー性皮膚炎のような角質層異常疾患の予防、改善または治療のための薬学的または美容的用途、及び分離された角質形成細胞の分化促進用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚は、真皮（ｄｅｒｍｉｓ）と表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）から構成されている。真皮はコラーゲンとその他のタンパク質を主に合成し、少量の脂質を生産する繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）で主に構成されている。これに対して、表皮は脂質を主に生成してコラーゲンを実質的に合成しない角質形成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）で主に構成されている。特に、皮膚の最外角に位置している表皮は、外からの多様な刺激、例えば、化学物質、大気汚染物質、乾燥した環境、紫外線などの物理化学的刺激因子に対する防御と皮膚を通じた体内水分の過度な発散を防ぐ保護機能を行っている。これらの保護機能は角質形成細胞で構成された角質層が正常的に形成され維持されることによって可能になる。
【０００３】
表皮の中、最も外に存在する角質層（Ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ、ｈｏｒｎｅｙ  ｌａｙｅｒ）は角質形成細胞から形成され、分化済の角質細胞とそれを囲む脂質層で構成されている（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９８３；８０；４４−４９）。角質細胞は表皮最下層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｂａｓａｌｅ）で持続的に増殖する基底細胞（ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ）が角質層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ）に移動しつつ段階的に形態及び機能上の変化を経て形成された細胞である。一定期間が経過すると古い角質細胞は皮膚から脱落し、表皮最下層から上がった新しい角質形成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）がその機能を代わりにするが、この反復的な一連の変化過程を表皮分化（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｆｉｏｎ）又は角化（ｋｅｒａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ）という。この角化過程において、角質形成細胞は天然保湿因子（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ；ＮＭＦ）と細胞間脂質（セラミド、コレステロール及び脂肪酸）を生成しつつ角質層を形成して、角質層が堅固さと柔軟性を持つようにして外部との遮断層の役割を果たす皮膚障壁（Ｓｋｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）としての機能を有することになる。
【０００４】
このような角質層は、過度な洗顔や、お風呂に入るなどの生活の習慣的な要素や、乾燥した大気汚染物質などの環境的要因、及びアトピー性皮膚や老人性皮膚のような内因性疾患などによってその機能が損失しやすいことになる可能性がある。実際に、現代には皮膚に対する危害要因がますます増加しており、食生活様子の変化による角質層の形成及び脱落速度が遅くなり、角質形成細胞の機能低下によって角質層の保湿因子と脂質の量が減少されることによって、角質層が正常的な皮膚障壁機能を発揮できない皮膚を持つ人々が増加している趨勢である。
【０００５】
現代社会の主要疾患の一つとされる皮膚乾燥症は、皮膚障壁機能異常が最も主たる原因であると明らかになっている。乾癬（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）は皮膚の炎症性疾患であって、表皮増殖と皮膚炎症を特徴として炎症により皮膚が厚くて赤くなり鱗屑（角質）が起きてしまう。伝染性はないが見た目が悪いのでこれによる患者はストレス及び生活の質低下に苦労している。乾癬を起こす原因としては皮膚角質形成細胞の過度な増殖及び分化の阻害（Ｒｏｅｎｉｇｋ  ＨＨ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ，ｐｐ．２３３−２４７，１９８５）、Ｔ細胞又は樹脂上細胞などの白血球が係る免疫システムの異常（Ｊ．Ｃ．Ｐｒｉｎｚ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２４，２９１−２９５，１９９９）などが提議されている。近頃、小児の１０％で発病するアトピー性皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）は、慢性再発生湿疹性疾患であってその発病機制は明らかではないが、慢性的皮膚乾燥症及びこれによる皮膚障壁の損傷が主な症状であって適切な管理を行っていないと苔癬化、色素変化、紅皮症などの病変に進む。また、ステロイド製剤を長期間又は過多使用した場合に現す皮膚萎縮（ｓｋｉｎ  ａｔｒｏｐｈｙ）現象は皮膚が薄くなりその機能が弱くなる副作用であって、主な原因はステロイドによる繊維芽細胞の活性抑制及びコラーゲン生成低下にあることが報告されている（Ｓ．Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，９１，８４０−８５１，２００４）。
【０００６】
従来には、そのために水分を吸収する性質があるヒューメクタント（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）や水分蒸発を防止する閉鎖保湿剤（ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ  ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｅｒ）を使用して角質層における水分保有を増加させる方式が行ってきた。ヒューメクタントはグリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、２−ピロリドン−５−カルボン酸ナトリウムなどの物質があるが、皮膚に塗布する際に粘りがひどい感じがする短所がある。閉鎖保湿剤としては、セラミドなどの脂質成分や必須脂肪酸及び脂質複合体などが使用されたが（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．（５），７３１−７４０，１９９４）乳化剤型の安定度を維持するのに困難であり透明なゼル状の製品を製造することには不適合した短所がある。また、上記の通常的な水分保有機能を有する保湿剤を使用する場合、一時的な症状緩和は期待できるが根本的な治癒は難しい実情である。従って、角質形成細胞の分化を促進し、繊維芽細胞の成長を促進して損傷を受けた障壁を根本的に再生させる物質の開発が急である。
【０００７】
一方、最近には角質層の分化が皮膚水分の乾燥を防ぐのに重要であるとの主張が提議されて、基底層の角質形成細胞から最外角の角質層の角質細胞に発達される分化過程が正常的に行ってからこそ皮膚水分保有障壁としての役割を果たすことができるという事実が明らかになった。すなわち、角化の過程の中、細胞は自然保湿因子（ｎａｔｕｒａｌ  ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，ＮＭＦ）と細胞間脂質を生成して、その結果、角質層は堅固で柔軟になり防御壁としての機能をすることができるということである。ヒトの年齢が増加されつつ皮膚の乾燥していく傾向を生理的から見ると、角質層の脱落時間が長くなるか表皮細胞の脂質合成能力が低下され、皮膚角質層の保湿因子と脂質の量が減少されることと解析し得る。それで、角質形成細胞の分化を促進させることによって、皮膚障壁の強化を誘導して皮膚水分維持機能と外部環境からの保護機能を増進させ得る新たな接近方法が可能になっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２００９−０１２０３５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、単なる症状緩和ではなく、損傷を受けた皮膚障壁の再生及び強化を通じて皮膚疾患及び障害を根本的に予防、改善又は治療するための医薬または機能性化粧料としての組成物及びそれを利用した前記疾患及び障害の予防、改善又は治療方法を提供することである。また、本発明は角質形成細胞の分化促進用組成物及び角質形成細胞の分化促進方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述の目的を達成するために、本発明は化学式１に示されるニコチン酸アデニンディヌクレオチドリン酸（ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＮＡＡＤＰ）またはその誘導体を有効成分として含む組成物及びこれを使用する方法を提供する。
【化１】
2013533308.tif 000003
式中、
Ｒ１，Ｒ２は、各々と独立的にＨ，Ｃ１−４アルキル（非置換されるかまたはハロゲンに置換され得る。）、又はＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ３であって；
Ｗは、ＮＨ２，ＯＨ及びＳＨからなる群から選択され；
Ｘは、ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２及びハロゲンからなる群から選択され；及び
Ｙは、ＯＨ，Ｈ，ＮＨ２及びハロゲンからなる群から選択される。
【００１１】
本発明において使用されるＮＡＡＤＰは細胞内でＣＤ３８を含むＡＤＰ−リボシルシクラーゼ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ）により合成され（Ｃｈｉｎｉ  ＥＮ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３６２：１２５−１３０，２００２；ＢＥＲＲＩＤＧＥ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，３６５：２９５−３０１，２００２；Ａａｒｈｕｓ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７０（５１）：３０３２７−３０３３３，１９９５）、全ての生命体の細胞内におけるカルシウム濃度を調節することに利用されている物質として細胞の生命現象の維持のために重要である。
【００１２】
本発明者らは、前記ＮＡＡＤＰを角質形成細胞（ｈｕｍａｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）に処理して分化と係る研究を行う過程のうちＮＡＡＤＰが角質形成細胞の分化能を向上させる機能があることを世界初に発見した。具体的に、本発明者らはＮＡＡＤＰが角質形成細胞でカルシウム信号調節分子として細胞中のカルシウム遊離を促進させ（図１）、角質形成細胞の分化表示子のインボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）、ケラチン１、ケラチン１０の発現を増加させる効果を有する（図２）ということを明らかにした。さらに、本発明者らはＮＡＡＤＰを含有する外用剤の剤形を製造して動物及びヒトの皮膚に適用して皮膚障壁を強化するという結果を得ることによって（図３）本発明を完成させた。
【００１３】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は化学式１に示すＮＡＡＤＰ又はその誘導体を有効成分として含む角質形成細胞の分化を促進する組成物を提供する。
また、本発明は化学式１に示すＮＡＡＤＰ又はその誘導体を有効成分として含む皮膚障壁の再生及び強化用の組成物を提供する。
【００１４】
本発明の化学式１に示すＮＡＡＤＰ又はその誘導体を有効成分として含む組成物は、角質形成細胞の分化を促進させることで皮膚障壁を再生及び強化し、乾癬、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬などの慢性皮膚障壁損傷疾患、原発性接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎のような接触性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎のような急性皮膚障壁損傷疾患、皮膚乾燥症、湿疹、ステロイド副作用による皮膚萎縮、皮膚の傷、傷跡、皺、皮膚老化、肝斑の発生、皮膚弾力弱化などの皮膚疾患及び障害の予防又は治療に効果的に使用され得るし、これに限ることではない。上述で、皮膚乾燥症は皮膚の老化、環境的原因によることに限ることなく、糖尿病、粘液水腫、リンパ腫、腫瘍、後天性免疫不全症候群、ダウン症候群のような遺伝性疾患など他の原因疾患に起因する場合及び亜鉛欠乏、利尿剤又は抗ヒスタミン剤の服用による乾燥症などを含む。損傷された皮膚にできる傷跡は年をとるほどさらにひどく残り、これは皮膚再生能力が減退するせいである。皮膚再生能力が減退すると傷などの回復が遅延されて皮膚弾力の減少が深化され得るので、本発明の組成物は皮膚再生力を増加させてこれらの問題を改善することができる。また、角質層中には皮膚の保湿に重要な役割を果たす天然保湿因子（ｎａｔｕｒａｌ  ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，ＮＭＦ）が含まれており、この天然保湿因子は角質形成細胞の最終分化過程において生成されることと知られている。よって、本発明の化学式１に示すＮＡＡＤＰ又はその誘導体を有効成分として含む組成物は角質形成細胞の分化を促進する成分は、皮膚障壁を再生させる機制のほかにもＮＭＦの生成を促進することで保湿剤としてもその機能することができる。
【００１５】
本発明において使用されるＮＡＡＤＰ又はその誘導体は遊離物質のみならず、その薬学的に許容可能な塩、薬学的に許容可能な溶媒化物、薬剤学的に許容可能な多形体、又は薬剤学的に許容可能な前駆薬剤として提供できるものとして理解され得る。また、前記有効成分は単独に又は他の薬学的活性化合物との結合体や集合体の形でも使用され得る。
【００１６】
本発明による化合物の塩においては、医薬又は化粧料のうち配合できる形であれば、特に制限されることはない。無機塩又は有機塩を含み、酸性塩又はアルカリ性塩であってもよい。特に、陽イオンによる塩の場合、ナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩及びバリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルギニンやリジンなどの塩基性アミノ酸塩；アンモニウム塩やトリシクロヘキシルアンモニウム塩などのアンモニウム塩；モノエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、モノイソプロパノールアミン塩、ジイソプロパノールアミン塩及びトリイソプロパノールアミンなど各種アルカノールアミン塩であってもよい。好ましくは、前記塩はアルカリ金属塩であり、よく好ましくはテトラソジウム塩である。
【００１７】
本発明は化学式１に示されるＮＡＡＤＰ又はその誘導体を有効成分として含む角質形成細胞の分化を促進する薬学組成物を提供する。または、本発明は化学式１に示されるＮＡＡＤＰ又はその誘導体を有効成分として含む皮膚障壁再生及び強化用の医薬組成物を提供する。なお、本発明は前記組成物の有効量を含む、皮膚障害及び疾患治療用の医薬製剤、特に皮膚外用剤を提供する。
【００１８】
また、本発明は、哺乳動物に前記組成物又は製剤を投与して前記の皮膚障害及び疾患を予防、治療又は改善する方法を提供する。
【００１９】
本発明のＮＡＡＤＰ又はその誘導体を含有する薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常的に使用される適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含めてもよい。
【００２０】
製剤化するときには、通常的に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの賦形剤又は希釈剤を使用して製造される。抗凝集剤、潤滑剤、香料、硫化剤、防腐剤などをさらに含めてもよく、哺乳動物に投与した後、活性成分の迅速、持続、又は遅延された放出を提供するために当業界に周知の方法を使用して剤形化してもよい。
【００２１】
本発明によるＮＡＡＤＰまたはその誘導体を含む薬学組成物は、本発明が属する技術分野に公知されている通常的薬剤学的剤形に製剤化されてもよい。前記剤形は局所適用製剤（局所塗布、貼布及びイオントホレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ））、経口投与製剤、注射剤、座剤、経皮投与製剤、経皮投与製剤及び吸入投与製剤を含めてこれに限定されない何れの剤形に製剤化されて投与されてもよいが、好ましくは経皮投与製剤及び局所適用のための皮膚外用製剤に製剤化されてもよい。
【００２２】
一具体例において、本発明の組成物は皮膚外用製剤であって、溶液、懸濁液、乳化剤、軟膏、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、スプレー、パック、皮膚接着用のパッチ、ドレッシング、含水性添付剤または含水性のない添付剤など皮膚に適用可能な全剤形に製剤化され得る。
【００２３】
本発明の剤形がペースト、クリーム又はゲル状の場合には、担体成分として動物油、植物油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク又は酸化亜鉛などが利用されてもよい。
【００２４】
本発明の剤形がパウダー又はスプレーの場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーが利用されてもよく、特にスプレーの場合にはさらにクロロフルオロヒドロカボン、プロパン／ブタン又はジメチルエテールのような推進剤を含めてもよい。
【００２５】
＊本発明の剤形が溶液又は乳濁液の場合には、担体成分として溶媒、溶解化剤又は乳濁化剤が利用され、例えば水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００２６】
本発明の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁液、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラガカントなどが利用されてもよい。
【００２７】
また、本発明の皮膚外用製剤には皮膚や粘膜に適用される化粧料や外用の医薬品・医薬部外品に配合される公知の各種成分を適用量配合することができる。
【００２８】
このような成分は、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、クエン酸のようなカルボン酸類；トコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエンのようなフェノール類）、防腐剤（例えば、デヒドロ酢酸、サリチル酸、エデト酸二ナトリウムのようなカルボン酸類；パラオキシベンゾ酸エチル、パラオキシベンゾ酸メチル、パラオキシベンゾ酸イソプロピル、チモールのようなフェノール類）、湿潤剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールのようなグリコール類；ヒアルロン酸のような有機塩類；ヨウ素のようなアミド類）、粘稠剤（例えば、ポリエチレングリコールのような高分子化合物；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシプロピルセルロースのようなセルロース類）、緩衝剤（例えば、クエン酸、乳酸、酒石酸のような有機酸類；塩酸、ホウ酸のような無機酸類；リン酸二水素ナトリウム、クエン酸ナトリウムのような塩類；トリエタノールアミンのような有機塩類；水産化ナトリウム、水産化カリウムのような無機塩基）、吸着剤（例えば、カオリン、ベントナイトのような含水ケイ酸アルミニウム類；水産化アルミナマグネシウム、水産化アルミニウムのような無機塩類）、基剤（例えば、白色ワセリン、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、流動パラフィン、蜜蝋、ワセリン、ひまし油、シリコーン油、硬化ひまし油、天然ゴム、やし油脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、天然ゴムラテックス、１，３−ペンタジエン共重合樹脂のような有機物；ポリブテン、合成ゴムＳＢＲ、モノステアル酸ポリエチレングリコール、モノステアル酸ポリオキシグリコール、ポリオキシエチレンセトステアリルエテール、ポリオキシエチレンオレイルセチルエテール、シリコーン、アクリル酸澱粉３００、ポリアクリル酸ナトリウム、メタアクリル酸・アクリル酸ｎ−ブチルコポリマ、カルボキシビニルポリマのような高分子化合物；ステアル酸のような脂肪酸類；セタノール、ミリスチルアルコールのようなアルコール類；ミリスチン酸オクタドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、オクタン酸セチルのような脂肪酸エステル類）、溶剤（例えば、エタノール、イソプロパノール、１，３−ブチレングリコール、ｎ−オクタデシルアルコール、クロタミトン、トリ（カプリル酸・カプロン）グリセリンのような炭水化物）、安定化剤（例えば、メタリン酸ナトリウム、酸化亜鉛、酸化チタンのような無機塩類；ポリオキシエチレンラウリル硫酸エーテル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムのような有機塩類）、粘着剤（例えば、ポリアクリル酸ナトリウム、ジプロピレングリコールのような高分子化合物）、乳化剤（例えば、モノオレフィン酸ソルビタン、モノオレフィン酸ポリオキシエチルソルビタン、Ｄ−ソルビトール、モノラウリン酸ポリグリセリン、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウムのような炭水化物）、界面活性剤（例えば、モノラウリン酸ポリグリセリン、ポリオキシエチレンオレイルアルコールエテールのような高分子化合物）のほかに、香料、色素（染料、顔料）、金属封鎖剤、防臭剤、皮膜形成剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、ビタミン類などを含む。
【００２９】
また、前記皮膚外用製剤として使用される組成物は、皮膚障壁機能強化の効果、皮膚角質形成細胞分化誘導の効果及び皮膚保湿の効果を増大させるために皮膚吸収促進の物質を追加的に含有してもよい。
【００３０】
また、本発明の皮膚外溶剤を製造することにおいて、その薬理的効果を低害しない限り、他の薬効成分を含めることもある。この薬効成分は例えば、公知の清涼成分、皮質抑制剤、抗菌剤、殺菌剤、抗炎症剤、皮膚収斂剤、細胞復活剤、血管拡張剤、決行促進剤、皮膚機能抗促進剤及び生薬などである。具体的に、メントール、サリチル酸、エストラジオール、グリチルリチン酸、塩化ベンザアルコニウム、フェノール、カンファなど；麻薬及び覚醒剤類例えば、塩酸エチルモルフィン、塩酸オキシコドン、塩酸コカイン、塩酸ペチジン、塩酸メタンフェタミン、ｄｌ−塩酸メチルエフェドリン、塩酸モルフィン、クエン酸フェンタニル、酒石酸レバロールパンなど；局所殺菌剤、例えば、フォビドォンヨウ素、ヨードフルムなど；酵素製剤、例えば、塩化リゾチーム、ストレプトキナーゼ、ストレプトドルナーゼトリプシン、デオキシリボヌクレアーゼなど；生薬類、例えば、シコンエクス、ロットエクスなどが挙げられる。
【００３１】
水性懸濁液は一般的に一つ異常の懸濁化剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、ガムトラガガント及びガムアカシア；分散剤又は湿潤剤、例えばレシチン又は酸化アルキレンと脂肪酸の縮合生成物（例えば、ポリオキセチレンステアレート）、又は酸化エチレンとヘプタデカエチレンオキシセタノールのような長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物、又は脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルと酸化エチレンの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、又は酸化エチレンとヘプタデカエチレンオキセタノールのような長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物、又は脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルと酸化エチレンの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、又は脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導された部分エステルと酸化エチレンの縮合生成物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレアートと共に微粉形態の活性成分を含有する。水性懸濁液はもう一つ以上の保存剤（例えば、エチル又はプロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、着色剤、芳香剤及び／又は甘味剤（例えば、スクロース、サカリン又はサッカリン又はアスパルテーム）を含有してもよい。
【００３２】
油性懸濁液は活性成分を植物油（例えば、落花生油、オリーブ油、ごま油又はココナッツ油）又は鉱油（例えば、液状パラフィン）に懸濁させて剤形にされえる。油性懸濁液は又は蜜蝋、硬質パラフィン又はセチルアルコールのような憎粘剤を含有してもよい。上述されたような甘味剤、及び芳香剤を添加して味のいい経口製剤を提供することができる。これら組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加によって保存されえる。
【００３３】
水を添加して水性懸濁液を製造することに適当な分散性粉末及び顆粒剤は一般的に分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤及び一つ以上の保存剤と共に活性成分を含有する。適当な分散剤又は湿潤剤と懸濁化剤は先に上述されたことに例示される。付加的賦形剤、例えば甘味剤、芳香剤及び着色剤もまた存在してもよい。
【００３４】
本発明の薬学的組成物は、また水中油型乳化液の形態に存在することもある。油状は植物油、例えば、オリーブ油又は落花生油、又は鉱油、例えば、液状パラフィン又はこのうち何れの油らの混合物であってもよい。適当な乳化剤は、例えば、天然−発生ガム、例えばガムアカシア又はガムトラガカント、天然−発生ホスファチド、例えば、大豆、レシチン、脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導されたエステルまたは部分エステル（例えば、ソルビタンモノオレアート）、及び前記部分エステルと酸化エチレンの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであってもよい。乳化液は甘味剤、芳香剤及び保存剤もまた含有してもよい。
【００３５】
シロップ及びエリキシルは甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、アスパルテームまたはスクロースを使用して剤形されえるし、粘活剤（ｄｅｍｕｌｃｅｎｔ）、保存剤、芳香剤及び／または着色剤をまた含有してもよい。
【００３６】
本発明の組成物の適合した投与量及び投与時期は製剤化方法、投与対象の年齢、性別、体重、疾病症状の程度、排泄速度及び反応感応性、投与経路及び期間に従って異なるが、当業者が目的とする治療に効果的な投与量を適切に選択することができる。例えば、経口投与製剤において、大人を基準にして１日０．０１乃至１０．０ｇ／ｋｇ、好ましくは０．１乃至１．０ｇ／ｋｇになるように所定数回に分けて投与することができる。また、皮膚外用製剤において、前記有効量は１日皮膚表面積（ｃｍ２）当り１ｎＭ乃至１０ｍＭ、好ましくは１ｎＭ乃至１００μＭ範囲内であって、これを１日１回乃至５回塗布することができる。前記組成物の投与剤形は単一投与または反復投与剤形であってもよく、前記１日有効量を所定の数回に分けて投与してもよい。
【００３７】
本発明の薬学組成物は、単独の療法として利用され得るが、手術、ホルモン治療、放射線治療、薬物治療、生物学的反応調節剤を使用する方法、食餌療法などと併行して使用してもよい。
【００３８】
本発明の組成物は、化学式１のＮＡＡＤＰまたはその誘導体の他に追加的に角質形成細胞などの皮膚を構成する細胞をさらに含めてもよい。
【００３９】
本発明のさらなる態様において、本発明は化学式１のＮＡＡＤＰまたはその誘導体を含む、皮膚障壁機能改善用及び皮膚保湿用の機能性化粧料組成物を提供する。本発明の組成物は、角質形成細胞の分化を促進して皮膚障壁機能を回復させることによって、外部環境からの保護機能を増進させ、皮膚の傷、傷跡、皺、弾力低下またはアトピー性皮膚炎、湿疹、または乾癬のような皮膚障害または疾患を予防または改善するためのことである。また、皮膚水分維持機能を向上させ、皮膚の引っ張り、荒れを解除しつやを増加させる効果がある。
【００４０】
本発明のＮＡＡＤＰまたはその誘導体を有効成分として含有する機能性化粧料は皮膚に適用される全剤形において適用され得る。より具体的に、スキン、ローション、ゲル、クリーム、エッセンス、水溶性パウダー、脂溶性パウダー、水溶性リキッド、ファンデーション、スプレー、パックなどのような化粧品のみならず、クレンジングフォーム、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクリーム、ボディオイル、ボディ洗浄剤、石けん、シャンプー、軟膏及びパッチなどに製造され得る。その他にも、化粧、洗剤、及び繊維など皮膚に接触する皮膚接触物質としても製造され得る。
【００４１】
各剤形の化粧料の組成物において、前記ＮＡＡＤＰまたはその誘導体の以外に他の成分らは、本発明の目的及び効果を損傷させない範囲内で当業者が適切に選定して配合することができる。添加可能な配合成分としては油脂成分、保湿剤、エモリアント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ組成剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。
【００４２】
また、本発明の化粧料はＮＡＡＤＰまたはその誘導体のほかに、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質及び海草エキスからなる群から洗濯される成分をさらに含めてもよい。
【００４３】
本発明の化粧料の組成物は、適用しようとする皮膚面積に応じて適切な量を皮膚に塗布することで適用されることができ、必要に応じて一日一回乃至数回使用することができる。適用する量及び回数は個人の皮膚状態、年齢などに従って必要に応じて増減できる。
【００４４】
本発明の他の態様において、本発明はインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）またはインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において皮膚の角質層または角質形成細胞の培養物に前記組成物を接触させるステップを含む、角質形成細胞の分化を促進する方法を提供する。
【００４５】
角質形成細胞の培養は、火傷、慢性疾患、白斑症のような皮膚損傷の治療に幅広く使用されるのみならず、細胞の分化ステップを研究することにも使用される。角質形成細胞が医学的に適用されるためには、人体から得た少量の細胞から培養容器で大量に増殖する必要がある。
【００４６】
一具体例において、前記方法は、哺乳動物から分離された角質形成細胞または分離して培養した角質形成細胞に、化学式１のＮＡＡＤＰまたはその誘導体を含む組成物を接触させるステップを含む。前記方法によって得る分化された細胞はインビボまたはインビトロ実験で利用されてもよく、組織復旧／再生のための移植用注射剤及び移植物、人工皮膚などに使用されえるが、上述の用途に限定されることではない。前記方法は、表皮の再生及び分化を必要とする哺乳動物個体の皮膚に本発明による組成物の有効量を適用するステップをさらに含めてもよい。組成物の有効量、適用回数、間隔及び期間などはその目的に応じて当業者が適切に選択することができる。
【００４７】
また、本発明は角質形成細胞の分化を促進するための目的として使用される、化学式１のＮＡＡＤＰまたはその誘導体を含むキットを提供する。
【００４８】
また他の態様において、本発明は前記皮膚疾患及び障害の治療用の医薬を製造するための、前記組成物の使用方法を提供する。
【００４９】
本発明は、他の態様において、本発明の組成物を使用した被験物質の角質形成細胞分化能を調節できる物質のスクリーニング法を提供する。前記方法は、
分離されたヒト角質形成細胞を用意するステップと、
分離されたヒト角質形成細胞をＮＡＡＤＰまたはその誘導体を含有する組成物、及び被験物質各々と接触させるステップと、
前記角質形成細胞内のカルシウム増加量または分化表示子発現量を検出するステップと、
前記組成物及び被験物質に接触させた角質形成細胞から検出されたカルシウム増加量または分化表示子発現量を比較して前記被験物質の角質形成細胞分化誘導能を決定するステップと、を含む。
【００５０】
このようなスクリーニング法で使用されるヒト角質形成細胞は、本発明の組成物及び被験物質の存在下で各々培養することによってカルシウム及び分化表示子発現量の変動を留意に識別できるなら如何なる細胞であっても可能である。好ましくは、ヒト包皮由来の正常細胞と指示支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ  ｌａｙｅｒ）としてヒト角質形成細胞（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｎｅｏｎａｔａｌ，ＮＨＥＫ−Ｎｐ、ＣＣ−２５０７，Ｌｏｎｚａ  Ｃｏ．ＬＴｄ．）からなる培養細胞系を適切に使用することができる。
【００５１】
角質形成細胞の分化表示子はインボルクリン、ロリクリン、ケラチン１またはケラチン１０のような特異タンパク質が利用されてもよいが、これに限定されることではなく、その発現有無及び量はウェスタンブロックのような通常的なタンパク質の検出方法を使用して測定することができる。
【００５２】
カルシウム増加量または分化表示子の発現量は、公知の測定法により検出されることによって、被験物質による角質形成細胞の分化誘導能、さらに皮膚障壁を再生及び強化させる効能程度を評価することができる。
【発明の効果】
【００５３】
本発明のＮＡＡＤＰ又はその誘導体を含む組成物は角質形成細胞の分化促進を通じて損傷を受けた皮膚障壁機能を回復させて皮膚保湿力を増加させる効果を示す。よって、前記ＮＡＡＤＰ又はその誘導体を含有する組成物は皮膚障壁再生及び強化用並びに皮膚保湿用の薬学組成物又は機能性化粧料の組成物として使用されてもよく、インビトロにおいて角質形成細胞の分化誘導物質として利用されてもよい。また、前記組成物を含む医薬又は化粧料は乾癬、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬などの慢性皮膚障壁の損傷疾患、原発性接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎のような接触性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎のような急性皮膚障壁損傷疾患、皮膚乾燥症、湿疹、ステロイド副作用による皮膚萎縮、皮膚の傷、傷跡、皺、皮膚老化、肝斑の発生、皮膚弾力弱化などの皮膚疾患及び障害の予防又は治療に効果的に使用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＮＡＡＤＰを含有する組成物が一次培養した角質形成細胞内のカルシウム濃度変化に及ぼす影響を濃度別に示したグラフである。
【図２】ＮＡＡＤＰを含有する組成物が一次培養した格式形成細胞の分化に及ぼす影響を分化表示子のインボルクリン、ケラチン１、ケラチン１０の発現程度を利用して評価したウェスタンブロック写真である。
【図３】ＮＡＡＤＰを含有する組成物を無毛マウスに塗布した場合、濃度による皮膚角質層の分化誘導程度を示すマウスの皮膚組織写真である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
以下、本発明を実施例によってより具体的に説明する。しかし、これらの実施例は本発明に対する理解を助けるための例に過ぎなく、如何なる意味であっても本発明の範囲がこれによって制限されることではない。
【００５６】
実施例１：ＮＡＡＤＰの角質形成細胞内のカルシウム上昇に対する効果検証
正常的に表皮にはカルシウム勾配（ｃａｌｃｉｕｍ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）があって、カルシウムイオンの濃度は基底層と有棘層において低くて上層へ行くほど増加されて外部果粒層で最も高い。皮膚障壁の損傷は皮膚の上部から水分損失を誘導してこれによる水分損失は表皮内のカルシウム勾配の変化をもたらす。このようなカルシウム勾配の変化は、皮膚において恒常性回復反応を誘発し、それによって皮膚障壁の機能は素早く回復されて引き続き正常的な形態のカルシウム勾配を形成する。すなわち、皮膚障壁の損傷の後に、回復の過程を始めるようにする信号としてカルシウムイオンの変化が重要な役割を果たすことと明らかになった。
本実施例においては、本発明の組成物において皮膚障壁の回復効果を確認するために、培養された角質形成細胞にＮＡＡＤＰを処理したとき、細胞内のカルシウム増加を誘導する効能を評価した。
【００５７】
方法
角質形成細胞（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｎｅｏｎａｔａｌ，  ＮＨＥＫ−Ｎｐ、ＣＣ−２５０７，Ｌｏｎｚａ  Ｃｏ．ＬＴｄ．）に細胞中のカルシウム表示子のｆｌｕｏ−３  ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社、アメリカ）を３０分間ＣＯ２培養器で処理した上、ＫＢＭ媒質（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉａ，ＫＢＭ−２，Ｌｏｎｚａ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）で３回洗浄した。細胞中カルシウムの測定は、ＫＢＭ媒質中から行われており、ＮＡＡＤＰによる細胞中カルシウム増加を観察した。細胞中カルシウムの測定は４８８ｎｍの励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）波長と５３０ｎｍの放出波長を有するレーザ光源が装着された共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｎｉｋｏｎ、Ｊａｐａｎ）を利用して５３０ｎｍにおける画像を収集してカルシウムの濃度を算出する。角質形成細胞（５Ｘ１０５ｃｅｌｌｓ）を、ＮＡＡＤＰを０．１，１，１０，１００，１０００ｎＭで処理した際に測定されたカルシウム変化量を図１に各々図示した。
【００５８】
結果
角質形成細胞を１ｎＭ乃至１００ｎＭのＮＡＡＤＰ処理時、細胞中のカルシウムの移動が誘導されることを確認した。損傷を受けた皮膚障壁においてカルシウムが重要な信号伝達物質として作用するということから、本発明によけるＮＡＡＤＰを含有する組成物は皮膚障壁機能の素早い回復効果を表すということを確認した。この結果は、下記の実施された角質形成細胞の分化誘導結果と共に傷の治療、アトピー性皮膚炎及び乾癬、湿疹、皮膚老化防止などに効果があることを示唆することである。
【００５９】
実施例２：ＮＡＡＤＰの角質形成細胞の分化促進効能の検証
角質形成細胞は、皮膚の最外角層を形成して皮膚の保湿及び保護機能に非常に重要な役割をする細胞であって過度な増殖は抑制され、細胞死が抑制され、分化を促進することが好ましい。過度な増殖は皮膚角質層を異常的に肥大にして皮膚が荒くて厚くなる原因になり、異常的な分化により正常的な皮膚障壁機能を行うことができなくなるので皮膚乾燥症、アトピー性皮膚炎、乾癬などのようないくつの問題をもたらす可能性を高くする。
角質形成細胞の分化の際、再生される分化表示子（インボルクリン、ケラチン１及びケラチン１０）の発現を、ウェスタンブロック法を利用して測定してＮＡＡＤＰの細胞分化の促進効果を試した。
【００６０】
方法
一次培養したヒトの角質形成細胞を培養用フラスクに入れて底に付着させた上、濃度別に希釈したＮＡＡＤＰと対照群としてレチノール酸を培養液に添加して、細胞が底面積の７０乃至８０％程度に伸びるまで５日間培養した。この細胞を収穫（ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔ）してホスペート緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）で洗滌した。続いて、２％ソジウムドデシルスルファート（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ，ＳＤＳ）と２０ｍＭ濃度のジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，ＤＴＴ）を含有した１０ｎＭ濃度のトリス−塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）１ｍｌを加えて超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、沸騰（ｂｏｉｌｉｎｇ）、遠心分離した沈殿物をさらにＰＤＳ  １ｍｌに懸濁させる。懸濁液中のタンパク質顔料を測定し、細胞分化程度の評価時の基準とした。角質形成細胞（５Ｘ１０５ｃｅｌｌｓ）にレチノール酸（１μＭ）処理群を陽性対照群とし、低カルシウム濃度にそれぞれ異なる濃度のＮＡＡＤＰ（１０ｐＭ乃至１０μＭ）を添加して実施した試験結果を下記図２に示した。
【００６１】
結果
角質形成細胞の分化に及ぼす効果を評価した結果、図２に示したように１０ｐＭ乃至１０μＭの濃度のＮＡＡＤＰ処理群から分化表示子が発現されることを確認することができ、ケラチン１及びケラチン１０でよりよい効果が発現された。よって、上記の物質が角質形成細胞の分化能を向上させる効果があることを確認した。これによって、本発明による化合物が角質形成細胞の分化を促進して結果的に皮膚障壁機能を迅速に回復させえるということを究明した。
【００６２】
実施例３：無毛マウスにおいてＮＡＡＤＰの皮膚角質層の分化誘導効能の検証
本試験において使用した無毛マウス（ＳＰＦ／ＶＡＦ  Ｃｒｌ：ＳＫＨ１−ｈｒ）は、オリエントバイオ（ソンナン、韓国）で購入した。本発明実験材料のＮＡＡＤＰはシグマ社の製品を使用した。
【００６３】
方法
リン酸塩緩衝溶液に１％ＤＭＳＯを添加した溶液に濃度別にＮＡＡＤＰを溶解させて試験物質を製造し、これを６週頃の無毛マウス（Ｈａｉｒｌｅｓｓ  ｍｏｕｓｅ）の左右背部に綿棒で塗布する方法で試験を実施した。濃度別に各５回ずつ塗布しており、１日２回朝９時と夜７時に実施した。１週間薬物を塗布した動物を頸椎脱骨して犠牲させ、皮膚を１Ｘ１ｃｍに切開して１０％フォルマリン溶液で一晩固定した。固定組織は、パラフィンブロックを製作して５μｍ切片を製作してケラチン１と１０を同時に認識する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ＃ＳＣ５３２５１）を１：１００希釈倍率に染色を実施した。二次抗体としてはＡｌｅｘａ４８８が結合されたａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
対照群はリン酸塩緩衝溶液に１％ＤＭＳＯが添加された溶液を使用しており、試験群は対照群に使用した溶液にＮＡＡＤＰを多様な濃度に希釈して製造した溶液を使用した。
【００６４】
結果
ＮＡＡＤＰ処理群は対照群に対して皮膚の外皮部分にケラチン１及びケラチン１０の発現量が増加することを確認することができるし、該当分化表示子の発現量の増加が示す濃度は１００ｎＭ以上であることもわかる。
インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）試験において、高濃度ＮＡＡＤＰ処理はカルシウム増加と分化表示子の発現が減少されることと示されたが（実施例１及び２参照）、本実験ではＮＡＡＤＰ濃度に依存的にケラチン１及びケラチン１０が増加することを確認した。これは動物細胞のみを利用する条件とインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）における皮膚障壁を通じて吸収される過程においてその差があるせいであると判断される。
【００６５】
製剤例
製剤例１．外用クリーム剤（１００ｇ）
精製水に保湿剤とＮＡＡＤＰを加えて７０℃に加熱、調整した。乳成分らを加熱溶解した上、乳化剤、防腐剤などを加えて７０℃に調整した。これを先の水状に加えてホモミキサーで乳化粒子を均一化した後、脱気泡、ろ過、冷却させた。
主成分  ＮＡＡＤＰ  １．０ｍｇ
乳成分  セトステアリルアルコール  ６．０ｇ
ステアリン酸  ２．０ｇ
ラノリン  ４．０ｇ
スクアラン  ９．０ｇ
オクチルドデカノール  １０．０ｇ
保湿剤  １，３−ブチレングリコール  ３．０ｇ
グリセリン  ２．０ｇ
乳化剤  ＰＯＥ（２５）セチルアルコールエテール  ３．０ｇ
モノステアリン酸グリセリン  ２．０ｇ
＊防腐剤  プロピルパラベン  適当量
メチルパラベン  適当量
精製水  残量
【００６６】
製剤例２．外用ローション剤（１００ｇ）
精製水にＮＡＡＤＰと保湿剤を加えて７０℃に加熱、調整した。乳成分を加熱溶解した上、乳化剤、防腐剤などを加えて７０℃に調整した。これを先の水状に加えてホモミキサーで乳化させた後、ヒアルロン酸１水溶液を添加してホモミキサーで均質に混合した後、脱気泡、ろ過、冷却させた。
主成分  ＮＡＡＤＰ  １．０ｍｇ
乳成分  セトステアリルアルコール  １．０ｇ
蜜蝋  ０．５ｇ
ワセリン  ２．０ｇ
スクアラン  ６．０ｇ
ジメチルロリシロキ酸  ２．０ｇ
乳化剤  ＰＯＥ（１０）オレイン酸エステル  １．０ｇ
グリセロルモノステアリン酸エステル  １．０ｇ
保湿剤  グリセリン  ４．０ｇ
１，３−ブチレングリコール  ４．０ｇ
防腐剤  プロピルパラベン  適当量
メチルパラベン  適当量
精製水  残量
【００６７】
製剤例３．ゲル剤（１００ｇ）
精製水にポリエチレングリコールを添加して溶解し、ＮＡＡＤＰを添加して加温溶解させる。これを約５０℃に冷却して、攪拌しつつプロピレングリコール及びグリセリンにポリオキシエチレンセチルエテールを添加して約５０℃に加温したことを添加する。また連続的に攪拌しつつ水産化ナトリウムを添加し、ｐＨを約６．８になるように調剤する。約４０℃に冷却した後、イソプロパノールを添加して約２５℃に冷却した後適当な容器に採取する。
ＮＡＡＤＰ  １ｍｇ
ポリエチレングリコール  ８ｇ
カルボキシビニルポリマ  ０．５ｇ
メチルセルロース  ０．２ｇ
プロピレングリコール  ５ｇ
グリセリン  ２ｇ
ポリオキシエチレンオレイルセチルエテール  １ｇ
イソプロパノール  ５ｇ
水産化ナトリウム  適当量
精製水  残量
【００６８】
製剤例４．栄養クリーム（１００ｇ）
下記の成分を使用して製剤例１の方法に従って製造した。
ＮＡＡＤＰ  ０．５ｍｇ
ステアリルアルコール  ６．０ｇ
ステアリン酸  ２．０ｇ
濃グリセリン  １．０ｇ
スクアラン  ９．０ｇ
１，３−ブチレングリコール  ６．０ｇ
ポリソルベート６０  １．５ｇ
ポリエチレングリコール１０００  ４．０ｇ
硬化ラノリン  ４．０ｇ
オクチルドデカノール  １０．０ｇ
ソルビタンステアレート  ０．８ｇ
トリエタノールアミン  ０．５ｇ
防腐剤  適当量
色素  適当量
精製水  残量
【図１】
2013533308.tif 000007
【図２】
2013533308.tif 000008
【図３】
2013533308.tif 000009
【国際調査報告】
2013533308.tif 000010
2013533308.tif 000011
2013533308.tif 000012
2013533308.tif 000013