(57)【要約】複数のヌクレオチド種に関するアピラーゼ酵素のヌクレオチド種特異的分解速度を計算し；そのヌクレオチド種特異的分解速度を用いてそのヌクレオチド種のそれぞれに関する濃度を決定し；ポリメラーゼ酵素および鋳型核酸分子の種を含む反応環境においてそのヌクレオチド種のそれぞれの濃度を反復して提供し、ここで配列決定反応においてそのヌクレオチド種の１個以上の分子が新生分子中に組み込まれ、そしてアピラーゼ酵素をその反応環境に導入して組み込まれなかったヌクレオチド種分子を分解し；そしてそのヌクレオチド種の組み込みに応じたシグナルを検出する工程を含む、配列決定性能を最適化するための方法の態様を記述する。【選択図】なし
2013529901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
ａ）複数のヌクレオチド種に関するアピラーゼ酵素のヌクレオチド種特異的分解速度を計算し；
ｂ）そのヌクレオチド種特異的分解速度を用いてそれぞれのヌクレオチド種の濃度を決定し；
ｃ）ポリメラーゼ酵素および鋳型核酸分子の種を含む反応環境においてそれぞれのヌクレオチド種の濃度を反復して提供し、ここで配列決定反応において１以上のヌクレオチド種の分子を新生分子中に組み込み、そしてアピラーゼ酵素を反応環境に導入して組み込まれなかったヌクレオチド種分子を分解し；そして
ｄ）ヌクレオチド種の組み込みに応じたシグナルを検出する
工程を含む、配列決定性能を最適化するための方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで：
それぞれのヌクレオチド種の濃度がポリメラーゼ酵素の組み込み効率と比較したその種特異的分解効率の釣り合いを提供するように決定される、前記方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで：
ヌクレオチド種特異的分解速度がミカエリス・メンテンの式を用いて計算される、前記方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで：
それぞれのヌクレオチド種の濃度がそのヌクレオチド種の中で最も低い濃度および活性値を含むｄＣＴＰ種に対して正規化される、前記方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、ここで：
複数のヌクレオチド種の濃度が互いに異なる、前記方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、ここで：
それぞれのヌクレオチド種の濃度が互いに異なる、前記方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ここで：
アピラーゼ酵素による分解の前に組み込みが起こるのに十分な時間の間、反応環境中のそれぞれのヌクレオチド種の濃度を維持することによって、組み込み効率が最適化される、前記方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、ここで：
核酸鋳型種に対するヌクレオチド種の相補性に基づいて、ヌクレオチド種の分子が新生分子中に１以上（ａｔ  ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）組み込まれる、前記方法。
【請求項９】
さらに以下の：
ｅ）検出されたシグナルから配列の読みを生成し、ここでその配列の読みは鋳型核酸分子の種の配列組成を含む
ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
以下の：
ａ）複数の相対濃度のヌクレオチド種を、ポリメラーゼ酵素、アピラーゼ酵素、および鋳型核酸分子の種を含むあるタイプの反応環境中に導入して、鋳型核酸分子の種の修正されていない配列組成を生成し；
ｂ）その鋳型核酸分子の種の修正されていない配列組成および参照配列組成からヌクレオチド種のそれぞれに関して完成効率値および繰り越し値を決定し；そして
ｃ）そのヌクレオチド種特異的完成効率値およびそのヌクレオチド種特異的繰り越し値を用いて複数の核酸種のそれぞれに関して種特異的濃度を同定し、ここでその種特異的濃度はそのタイプの反応環境における配列決定反応により生成されるエラーを最小限にするように最適化されている
工程を含む、配列決定性能を最適化するための方法。
【請求項１１】
さらに以下の：
ｄ）そのタイプの反応環境を用いて配列決定反応を実行し、ここでその配列決定反応は以下の工程を含む：
ｉ．それぞれの核酸種をその種特異的濃度で第２の種の鋳型核酸分子およびポリメラーゼ酵素を含むそのタイプの反応環境に反復して送達し、ここで核酸種の送達の反復の間にアピラーゼ酵素をその反応環境に送達し；そして
ｉｉ．ポリメラーゼによるその核酸種の組み込みに応じて生じた複数のシグナルを検出する
ことを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、ここで：
アピラーゼが反応環境にヌクレオチド種特異的濃度で送達される、前記方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法であって、ここで：
相対濃度が、Ｇヌクレオチド種濃度およびＣヌクレオチド種濃度の第２の百分率と比較したＡヌクレオチド種濃度およびＴヌクレオチド種濃度の第１の百分率を含む、前記方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、ここで：
第１の百分率および第２の百分率が鋳型核酸分子の種の配列組成に従って定められ、ここでその配列組成がＡＴに富む、またはＧＣに富む、前記方法。
【請求項１５】
以下：
ａ）その上に記憶された実行可能なコードを含むコンピューター、ここでその実行可能なコードは以下の工程を含む方法を実施する：
ｉ．複数のヌクレオチド種に関するアピラーゼ酵素のヌクレオチド種特異的分解速度を計算し；
ｉｉ．そのヌクレオチド種特異的分解速度を用いてそれぞれのヌクレオチド種の濃度を決定し、ここでそれぞれのヌクレオチド種の濃度はポリメラーゼ酵素の組み込み効率と比較したその種特異的分解効率の釣り合いを提供するように決定される；および
ｂ）以下の工程を含む方法を実施する配列決定機器：
ｉ．ポリメラーゼ酵素および鋳型核酸分子の種を含む反応環境においてそれぞれのヌクレオチド種の濃度を反復して提供し、ここで配列決定反応においてヌクレオチド種の１以上の分子が新生分子の中に組み込まれ、そしてアピラーゼ酵素を反応環境に導入して組み込まれなかったヌクレオチド種分子を分解し；そして
ｉｉ．そのヌクレオチド種の組み込みに応じたシグナルを検出する
を含む、配列決定性能を最適化するための系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列決定技術において最も好都合なヌクレオチド濃度を決定する、および用いるための系および方法を提供する。より具体的には、本発明は、少なくとも部分的に酵素効率に基づいてそれぞれのヌクレオチド種の濃度を調節することにより実現される最適配列決定性能を獲得する手段としての、アピラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼの種特異的酵素効率の検出に基づく。
【背景技術】
【０００２】
合成による配列決定（ＳＢＳ）は一般に核酸試料中の１種類以上のヌクレオチドの同一性または配列組成を決定するための方法を指し、ここでその方法は、ヌクレオチド配列組成を決定する予定の鋳型核酸分子に相補的なポリヌクレオチド分子の一本鎖の段階的合成を含む。例えば、ＳＢＳ技法は典型的には、対応する配列の位置において鋳型分子の核酸種に相補的な新生（ｎａｓｃｅｎｔ）ポリヌクレオチド分子に単一の核酸（ヌクレオチドとも呼ばれる）種を付加することにより作動する。新生分子への核酸種の付加は一般には当技術で既知の様々な方法を用いて検出され、それにはピロホスフェート分子の放出に応じて放射される光を検出するｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法と呼ばれる方法、水素イオンの放出に応じたｐＨの変化を検出する方法、または蛍光検出法、例えば可逆的終結剤を用いる蛍光検出法が含まれるが、それらに限定されない。典型的には、ヌクレオチド種を付加するプロセスは、その鋳型に相補的な完全な（すなわち全ての配列の位置が表される）、または望まれる配列の長さが合成されるまで反復される。ＳＢＳ技法のいくつかの例が米国特許第６，２７４，３２０号、第７，２１１，３９０号；第７，２４４，５５９号；第７，２６４，９２９号；および第７，３３５，７６２号において記述されており、そのそれぞれをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。
【０００３】
ＳＢＳのいくつかの態様において、試料鋳型分子と結合した予め決められた相補的配列にアニールするようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。そのプライマー／鋳型複合体に、核酸ポリメラーゼ酵素の存在下でヌクレオチド種を与える。そのヌクレオチド種がそのオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に直接隣接する試料鋳型分子上の配列位置に相当する核酸種に相補的である場合、そのポリメラーゼはそのヌクレオチド種を用いてそのプライマーを伸長するであろう。あるいは、一部の態様において、そのプライマー／鋳型複合体に複数の目的のヌクレオチド種（典型的にはＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴ）を一度に与え、そのオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に直接隣接する試料鋳型分子上の対応する配列位置において相補的であるヌクレオチド種が組み込まれる。記述した態様のいずれにおいても、そのヌクレオチド種はさらなる伸長を妨げるように（例えば３’−Ｏの位置において）化学的にブロッキングされていてよく、合成の次のラウンドの前に脱ブロッキングされる必要がある。上記で記述したように、ヌクレオチド種の組み込みは当技術で既知の様々な方法により、例えばピロホスフェート（ＰＰｉ）の放出を検出することにより（米国特許第６，２１０，８９１号；第６，２５８，５６８号；および第６，８２８，１００号において記述されている例、そのそれぞれをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する）、水素の放出を検出することにより、またはそのヌクレオチドに結合させた検出可能な標識により検出することができる。検出可能な標識のいくつかの例には、質量タグ（ｍａｓｓ  ｔａｇｓ）および蛍光または化学発光標識が含まれるが、それらに限定されない。
【０００４】
典型的な態様において、組み込まれなかったヌクレオチドは例えば酵素的分解および洗浄により除去される。遊離のヌクレオチドの酵素的除去は、特に洗浄が非効率的である場合、アピラーゼの添加により成し遂げることができる。当業者は理解しているであろうように、アピラーゼは遊離のヌクレオチドに対して、ｄＮＴＰ分子の分子結合を壊してモノホスフェートヌクレオチドおよび無機ホスフェート（Ｐｉ）を生成することにより働く。従って、ｄＮＴＰ、例えばＡＴＰは分解されてｄＮＭＰ（またはＡＴＰの場合はＡＭＰ）および２Ｐｉ分子になる。検出可能な標識が用いられる態様において、それらは典型的には合成の次のサイクルの前に（例えば化学的開裂または光退色により）不活性化されなければならないであろう。次いでその鋳型／ポリメラーゼ複合体における次の配列の位置を、上記のように別のヌクレオチド種、または複数の目的のヌクレオチド種を用いて照会する（ｑｕｅｒｉｅｄ）ことができる。ヌクレオチド種の添加、プライマーの伸長、シグナルの獲得、過剰なヌクレオチド分子の分解および洗浄の反復は、結果として鋳型鎖のヌクレオチド配列の決定をもたらす。
【０００５】
ＳＢＳの典型的な態様において、信頼できる検出のために十分に強いシグナルを獲得するために、多数の実質的に同一の鋳型分子、または実質的に同一の鋳型分子の集団（例えば１０３、１０４、１０５、１０６または１０７個の分子）があらゆる１つの配列決定反応において同時に分析される。低いシグナル対ノイズ比のために、所与の反応の集団において実質的に全ての鋳型分子と結合した新生分子の“均一な伸長”と呼ばれるものが必要である。用語“均一な伸長”は、本明細書で用いられる際、一般に上記で記述した実質的に同一の鋳型分子のそれぞれがその反応において均一に同じ工程を行う伸長反応の関係または相を指す。例えば、鋳型分子の集団と関係するそれぞれの伸長反応は、それらが結合した鋳型分子のそれぞれに関して同じ配列の位置で同じ反応工程を行っている際に、互いと同調している（ｉｎ  ｐｈａｓｅ）、または互いと相が同調している（ｉｎ  ｐｈａｓｉｃ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｙ）と記述することができる。
【０００６】
関連技術における当業者は、ポリメラーゼ伸長反応が結果としてそれぞれの集団中の鋳型分子の小さな画分がその集団中の残りの鋳型分子との相の同調を失う、または相の同調から脱け出ることをもたらす可能性があることを理解しているであろう（すなわち、鋳型分子のその画分と関係する反応は、その集団に対して行われる配列決定反応において他の鋳型分子を追い越すか、または他の鋳型分子より遅れるかのどちらかである（いくつかの例がRonaghi, M. ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇがＤＮＡの配列決定に光明を投じる. Genome Res. 11, 3-11 (2001)において記述されており、それをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する）。例えば、ポリメラーゼがその配列の伸長に関して１つの位置により１個以上のヌクレオチド種を１個以上の新生分子中に正しく組み込むことを失敗することは、結果としてそれに続くそれぞれの反応が、その集団の残りの部分の配列の位置より後ろで、同調しない配列の位置で生じることをもたらす。この作用を本明細書において“不完全伸長”（ＩＥ）と呼ぶ。あるいは、その集団の残りの部分の配列の位置より前にあり、同調しない配列の位置における１個以上のヌクレオチド種の組み込みによる新生分子の不正確な伸長を、本明細書において“繰り越し（ｃａｒｒｙ  ｆｏｒｗａｒｄ）（ＣＦ）”と呼ぶ。ＣＦおよびＩＥの組み合わせた作用を本明細書においてＣＡＦＩＥと呼ぶ。ＣＡＦＩＥエラーの修正のための系および方法が、２００７年２月１５日に出願された“核酸配列データ中のプライマー伸長エラーを修正するための系および方法”と題された米国特許出願一連番号１２／２２４，０６５；および２００１年３月８日に出願された“再帰的アルゴリズムの使用によりＤＮＡ配列決定データ中の位相外れエラーを修正するための系および方法”と題された米国特許出願一連番号１３／０４３，０６３において記述されており、そのそれぞれをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。
【０００７】
不完全伸長の問題に関して、単独で、またはいくつかの組み合わせで起こりえるものであり、ＩＥに寄与するいくつかの可能性のある機構が存在しうる。ＩＥに寄与する可能性のある機構の１つの例には、鋳型／ポリメラーゼ複合体の亜集団に与えられるヌクレオチド種の欠如が含まれうる。ＩＥに寄与する可能性のある機構の別の例には、ポリメラーゼ分子の亜集団の、組み込みのために適切に与えられたヌクレオチド種の新生分子中への組み込みの失敗が含まれうる。ＩＥに寄与する可能性のある機構のさらなる例には、鋳型／ポリメラーゼ複合体におけるポリメラーゼ活性の不在が含まれうる。
【０００８】
ＣＦの問題に関して、単独で、またはいくつかの組み合わせで起こる可能性のある、ＣＦに寄与するいくつかの可能性のある機構が存在しうる。例えば、１つの可能性のある機構には、前のサイクルから残っている過剰なヌクレオチド種が含まれうる。この例では、結果には、“Ｇ”ヌクレオチド種サイクル中に小さな割合の“Ａ”ヌクレオチド種が存在し、それがその鋳型分子中の対応する配列の位置において相補的な“Ｔ”ヌクレオチド種が存在する場合にその新生分子の小さな画分の伸長をもたらすことが含まれ得る。繰り越し作用を引き起こす可能性のある機構の別の例には、ポリメラーゼのエラー、例えばその鋳型分子上のヌクレオチド種に相補的でないヌクレオチド種の新生分子中への不正確な組み込みが含まれる可能性がある。
【０００９】
従って、ＣＡＦＩＥ位相同調エラーの導入の可能性を最小限にするために、短い期間の間にそのポリメラーゼが効率的にそのヌクレオチド種を鋳型分子の集団の全てのメンバーに組み込むことができるように十分に高く最適化され、一方で同時にその組み込み期間の後にポリメラーゼにより組み込まれることができなかった過剰なヌクレオチドとアピラーゼのような分解酵素とが反応して与えることができるように十分に低く最適化されたフロー中のヌクレオチド種の濃度を与えることが非常に望ましいことは理解されるであろう。酵素の効率はそれぞれのヌクレオチド種に特異的である可能性があり、ある種に関してより効率的であり、別の種に関してより非効率的である可能性があることも理解されるであろう。
【００１０】
従って、ポリメラーゼおよびアピラーゼ酵素の両方に関して種特異的酵素効率を決定し、その種に関するその酵素の組み込みおよび分解効率の間で最適化された釣り合いである合成反応による配列決定におけるそれぞれのヌクレオチド種の濃度を用いる能力には、重要な利点が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６，２７４，３２０号
【特許文献２】米国特許第７，２１１，３９０号
【特許文献３】米国特許第７，２４４，５５９号
【特許文献４】米国特許第７，２６４，９２９号
【特許文献５】米国特許第７，３３５，７６２号
【特許文献６】米国特許第６，２１０，８９１号
【特許文献７】米国特許第６，２５８，５６８号
【特許文献８】米国特許第６，８２８，１００号
【特許文献９】米国特許出願一連番号１２／２２４，０６５
【特許文献１０】米国特許出願一連番号１３／０４３，０６３
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ronaghi, M. ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇがＤＮＡの配列決定に光明を投じる. enome Res. 11, 3-11 (2001)
【発明の概要】
【００１３】
本発明の態様は分子生物学に関する。より詳細には、本発明の態様は、配列決定法において用いられるそれぞれのヌクレオチド種の濃度を、種特異的酵素効率、特にアピラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼの効率に基づいて、あらゆる所与のＳＢＳランの最適な配列決定性能に達するように合わせるための方法および系に関する。
【００１４】
複数のヌクレオチド種に関するアピラーゼ酵素のヌクレオチド種特異的分解速度を計算し；そのヌクレオチド種特異的分解速度を用いてそのヌクレオチド種のそれぞれに関する濃度を決定し；ポリメラーゼ酵素および鋳型核酸分子の種を含む反応環境においてそのヌクレオチド種のそれぞれの濃度を反復して提供し、ここで配列決定反応においてそのヌクレオチド種の１個以上の分子が新生分子中に組み込まれ、そしてアピラーゼ酵素をその反応環境に導入して組み込まれなかったヌクレオチド種分子を分解し；そしてそのヌクレオチド種の組み込みに応じたシグナルを検出する工程を含む、配列決定性能を最適化するための方法の態様を記述する。
【００１５】
加えて、複数の相対濃度のヌクレオチド種を、ポリメラーゼ酵素、アピラーゼ酵素、および鋳型核酸分子の種を含むあるタイプの反応環境中に導入して、その鋳型核酸分子の種の修正されていない配列組成を生成し；その鋳型核酸分子の種の修正されていない配列組成および参照配列組成からそのヌクレオチド種のそれぞれに関して完成効率値および繰り越し値を決定し；そしてそのヌクレオチド種特異的完成効率値およびそのヌクレオチド種特異的繰り越し値を用いて複数の核酸種のそれぞれに関して種特異的濃度を同定する工程を含む、配列決定性能を最適化するための方法の態様を記述し、ここでその種特異的濃度はそのタイプの反応環境における配列決定反応により生成されるエラーを最小限にするように最適化されている。
【００１６】
一部の実施において、その方法はさらに以下の工程を含む：そのタイプの反応環境を用いて配列決定反応を実行し、ここでその配列決定反応は以下の工程を含む：その核酸種のそれぞれをその種特異的濃度で第２の種の鋳型核酸分子およびそのポリメラーゼ酵素を含むそのタイプの反応環境に反復して送達し、ここでその核酸種の送達の反復の間にアピラーゼ酵素をその反応環境に送達し；そしてそのポリメラーゼによるその核酸種の組み込みに応じて生じた複数のシグナルを検出する。
【００１７】
さらに、以下のものを含む配列決定性能を最適化するための系の態様を記述する：その上に記憶された実行可能なコードを含むコンピューター、ここでその実行可能なコードは以下の工程を含む方法を実施する：複数のヌクレオチド種に関するアピラーゼ酵素のヌクレオチド種特異的分解速度を計算し；そしてそのヌクレオチド種特異的分解速度を用いてそのヌクレオチド種のそれぞれに関する濃度を決定し、ここでそのヌクレオチド種のそれぞれに関する濃度はポリメラーゼ酵素の組み込み効率と比較したその種特異的分解効率の釣り合いを提供するように決定される；および以下の工程を含む方法を実施する配列決定機器：ポリメラーゼ酵素および鋳型核酸分子の種を含む反応環境においてそのヌクレオチド種のそれぞれの濃度を反復して提供し、ここで配列決定反応においてそのヌクレオチド種の１個以上の分子が新生分子の中に組み込まれ、そしてアピラーゼ酵素をその反応環境に導入して組み込まれなかったヌクレオチド種分子を分解し；そしてそのヌクレオチド種の組み込みに応じたシグナルを検出する。
【００１８】
上記の態様および実施は、それらが同じ態様もしくは実施と関連して提供されようと、または異なる態様もしくは実施と関連して提供されようと、必ずしも互いを含む、または含まないわけではなく、矛盾しない、およびそうでなければ可能であるあらゆる方法で組み合わせられてよい。１つの態様または実施の記述は、他の態様および／または実施に関して制限することを意図していない。また、この明細書の他の箇所で記述されるあらゆる１個以上の機能、工程、操作、または技法は、代わりの実施において、要約において記述されたあらゆる１個以上の機能、工程、操作、または技法と組み合わせられてよい。従って、上記の態様および実施は限定的ではなく説明的なものである。
【００１９】
従って、本発明の第１観点は、以下の工程を含む配列決定性能を最適化するための方法として定義される：
ａ）複数のヌクレオチド種に関するアピラーゼ酵素のヌクレオチド種特異的分解速度を計算し；
ｂ）そのヌクレオチド種特異的分解速度を用いてそのヌクレオチド種のそれぞれに関する濃度を決定し；
ｃ）ポリメラーゼ酵素および鋳型核酸分子の種を含む反応環境においてそのヌクレオチド種のそれぞれの濃度を反復して提供し、ここで配列決定反応においてそのヌクレオチド種の１個以上の分子が新生分子の中に組み込まれ、そしてアピラーゼ酵素をその反応環境に導入して組み込まれなかったヌクレオチド種分子を分解し；そして
ｄ）そのヌクレオチド種の組み込みに応じたシグナルを検出する。
【００２０】
そのヌクレオチド種のそれぞれに関する濃度はポリメラーゼ酵素の組み込み効率と比較したその種特異的分解効率の釣り合いを提供するように決定される。そのヌクレオチド種特異的分解速度はミカエリス・メンテンの式を用いて計算することができる。
【００２１】
その複数のヌクレオチド種は、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよび／またはα−チオ−ｄＡＴＰを含んでいてよい。そのヌクレオチド種のそれぞれに関する濃度は、そのヌクレオチド種の中で最も低い濃度および活性値を含むｄＣＴＰ種に対して正規化することができる。
【００２２】
複数のそのヌクレオチド種、またはさらにはそのヌクレオチド種のそれぞれに関する濃度は互いに異なっていてよい。
その組み込み効率は、反応環境中のそのヌクレオチド種のそれぞれの濃度をアピラーゼ酵素による分解の前に組み込みが起こるのに十分な時間の間維持することにより最適化することができる。
【００２３】
そのヌクレオチド種の分子は、そのヌクレオチド種のその核酸鋳型種に対する相補性に基づいて、その新生分子中に１個以上（ａｔ  ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）組み込まれてよい。
【００２４】
上記で開示した方法はさらにその検出されたシグナルから配列の読みを生成する工程を含んでいてよく、ここでその配列の読みはその鋳型核酸分子の種の配列組成を含む。
本発明の第２観点は、以下の工程を含む配列決定性能を最適化するための方法として定義される：
ａ）複数の相対濃度のヌクレオチド種を、ポリメラーゼ酵素、アピラーゼ酵素、および鋳型核酸分子の種を含むあるタイプの反応環境中に導入して、その鋳型核酸分子の種の修正されていない配列組成を生成し；
ｂ）その鋳型核酸分子の種の修正されていない配列組成および参照配列組成からそのヌクレオチド種のそれぞれに関して完成効率値および繰り越し値を決定し；そして
ｃ）そのヌクレオチド種特異的完成効率値およびそのヌクレオチド種特異的繰り越し値を用いて複数の核酸種のそれぞれに関して種特異的濃度を同定し、ここでその種特異的濃度はそのタイプの反応環境における配列決定反応により生成されるエラーを最小限にするように最適化されている。
【００２５】
１態様において、その方法はさらに以下の工程を含む：
ｄ）そのタイプの反応環境を用いて配列決定反応を実行し、ここでその配列決定反応は以下の工程を含む：
ｉ．その核酸種のそれぞれをその種特異的濃度で第２の種の鋳型核酸分子およびポリメラーゼ酵素を含むそのタイプの反応環境に反復して送達し、ここでその核酸種の送達の反復の間にアピラーゼ酵素をその反応環境に送達し；そして
ｉｉ．そのポリメラーゼによるその核酸種の組み込みに応じて生じた複数のシグナルを検出する。
【００２６】
工程ｄ）が含まれる場合、そのアピラーゼをその反応環境にヌクレオチド種特異的濃度で送達してよい。
その反応環境のタイプは平面の支持体上に配置されたウェルを含んでいてよく、ここでその平面の支持体は複数のウェルを含む。
【００２７】
その相対濃度は、Ｇヌクレオチド種濃度およびＣヌクレオチド種濃度の第２の百分率と比較したＡヌクレオチド種濃度およびＴヌクレオチド種濃度の第１の百分率を含む。この場合、その第１の百分率および第２の百分率はその鋳型核酸分子の種の配列組成に従って定められてよく、ここでその配列組成はＡＴに富む、またはＧＣに富む。
【００２８】
上記で（ａｂｏｖｅｒ）開示した本発明の第１観点（ａｓｐｅｃ）に類似して、その複数のヌクレオチド種はｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよび／またはα−チオ−ｄＡＴＰを含んでいてよい。そのヌクレオチド種のそれぞれに関する濃度は、そのヌクレオチド種の中で最も低い濃度および活性値を含むｄＣＴＰ種に対して正規化することができる。
【００２９】
第３観点において、本発明は上記で開示した新規の方法を実施するための系または機器に向けられている。より正確には、本発明は以下のものを含む配列決定性能を最適化するための系または機器を提供する：
ａ）その上に記憶された実行可能なコードを含むコンピューター、ここでその実行可能なコードは以下の工程を含む方法を実施する：
ｉ．複数のヌクレオチド種に関するアピラーゼ酵素のヌクレオチド種特異的分解速度を計算し；
ｉｉ．そのヌクレオチド種特異的分解速度を用いてそのヌクレオチド種のそれぞれに関する濃度を決定し、ここでそのヌクレオチド種のそれぞれに関する濃度はポリメラーゼ酵素の組み込み効率と比較したその種特異的分解効率の釣り合いを提供するように決定される；および
ｂ）以下の工程を含む方法を実施する配列決定機器：
ｉ．ポリメラーゼ酵素および鋳型核酸分子の種を含む反応環境においてそのヌクレオチド種のそれぞれの濃度を反復して提供し、ここで配列決定反応においてそのヌクレオチド種の１個以上の分子が新生分子の中に組み込まれ、そしてアピラーゼ酵素をその反応環境に導入して組み込まれなかったヌクレオチド種分子を分解し；そして
ｉｉ．そのヌクレオチド種の組み込みに応じたシグナルを検出する。
【００３０】
上記の、およびさらなる特徴は、添付の図面と合わせて受け取られた際に以下の詳細な記述からより明確に理解されるであろう。その図面において、同じ参照番号は同じ構造、要素、または方法の工程を示し、参照番号の最も左の数字はその参照要素が最初に載っている図の番号を示す（例えば、要素１６０は図１で最初に載っている）。しかし、これらの慣例の全ては、限定的ではなく典型的または説明的であることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１はコンピューター制御下の配列決定機器および反応支持体の１態様の機能ブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
下記でより詳細に記述されるように、ここで記述する発明の態様には、配列決定技術においてヌクレオチド種の濃度をその種特異的酵素効率に合わせる系および方法が含まれる。特に、本発明の態様は、ＳＢＳ系の酵素、すなわちアピラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼの反応速度に基づくヌクレオチド濃度の最適化に関する。
【００３３】
ａ．全般
用語“フロー図（ｆｌｏｗｇｒａｍ）”は一般にＳＢＳ法、特にピロホスフェートに基づく配列決定法（“ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法”とも呼ばれる）により生成された配列データの図表による表現を指し、より具体的に“ピログラム（ｐｙｒｏｇｒａｍ）”と呼ばれてもよい。
【００３４】
用語“読み”または“配列の読み”は、本明細書で用いられる際、一般に単一の核酸鋳型分子またはその鋳型核酸分子の複数の実質的に同一のコピーの集団から得られた配列データ全体を指す。
【００３５】
用語“ラン”または“配列決定ラン”は、本明細書で用いられる際、一般に１種類以上のの鋳型核酸分子の配列決定操作において実施される一連の配列決定反応を指す。
用語“フロー”は、本明細書で用いられる際、一般に典型的には鋳型核酸分子を含む反応環境への流体溶液の導入の反復プロセスの一部である単一のサイクルを指し、ここでその溶液には、新生分子への付加のためのヌクレオチド種または他の試薬、例えば緩衝液、洗浄溶液、または配列決定プロセスにおいて、もしくは前のフローのヌクレオチド種からの持ち越しもしくはノイズ作用を低減するために用いられてよい酵素が含まれていてよい。
【００３６】
用語“フローサイクル”は、本明細書で用いられる際、一般にヌクレオチド種を含む流体がそのサイクルの間に一度流される連続的な一連のフローを指す（すなわち、フローサイクルにはＴ、Ａ、Ｃ、Ｇヌクレオチド種の順での連続的な添加が含まれてよいが、他の順序の組み合わせもその定義の一部であると考えられる）。典型的には、そのフローサイクルはサイクルからサイクルへのフローの同じ順序を有する繰り返しサイクルである。
【００３７】
用語“読み取り長（ｒｅａｄ  ｌｅｎｇｔｈ）”は、本明細書で用いられる際、一般に信頼できる配列決定を行うことができる鋳型分子の長さの上限を指す。系および／またはプロセスの読み取り長に寄与する数多くの要因が存在し、それには鋳型核酸分子中のＧＣ含量の程度が含まれるが、それに限定されない。
【００３８】
用語“試験断片”または“ＴＦ”は、本明細書で用いられる際、一般に品質管理、較正、または他の関連する目的のために用いることができる既知の配列組成の核酸要素を指す。
【００３９】
用語“プライマー”は、本明細書で用いられる際、一般に核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が適切な緩衝液中で適切な温度において誘導される条件下でＤＮＡ合成の開始点の役目をするオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは好ましくは一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。
【００４０】
“新生分子”は一般に、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによりその鋳型分子中の対応するヌクレオチド種に相補的なヌクレオチド種の組み込みにより伸長されているＤＮＡ鎖を指す。
【００４１】
用語“鋳型核酸”、“鋳型分子”、“標的核酸”、または“標的分子”は一般に、それから配列データまたは情報が生成される配列決定反応の対象である核酸分子を指す。
用語“ヌクレオチド種”は、本明細書で用いられる際、一般に新生核酸分子中に典型的に組み込まれるプリン類（アデニン、グアニン）およびピリミジン類（シトシン、ウラシル、チミン）が含まれる核酸単量体の同一性を指す。
【００４２】
用語“単量体の繰り返し”または“ホモポリマー”は、本明細書で用いられる際、一般に同じヌクレオチド種（すなわち、繰り返されるヌクレオチド種）を含む２個以上の配列の位置を指す。
【００４３】
用語“均一な伸長”は、本明細書で用いられる際、一般に実質的に同一の鋳型分子の集団のそれぞれのメンバーがその反応において均一に同じ伸長工程を実施している伸長反応の関係または相を指す。
【００４４】
用語“完了効率”は、本明細書で用いられる際、一般に所与のフローの間に正しく伸長された新生分子の百分率を指す。
用語“不完全伸長率”は、本明細書で用いられる際、一般に全ての新生分子の数に対する正しく伸長し損ねた新生分子の数の比率を指す。
【００４５】
用語“ゲノムライブラリー”または“ショットガンライブラリー”は、本明細書で用いられる際、一般にある生物または個人のゲノム全体（すなわちゲノムの全領域）に由来する、および／またはそれを表す分子の集合を指す。
【００４６】
用語“アンプリコン”は、本明細書で用いられる際、一般に選択された増幅産物、例えばポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応技法から生成された増幅産物を指す。
用語“変種”または“対立遺伝子”は、本明細書で用いられる際、一般にそれぞれが類似の配列組成をコードするが互いにある程度の差異を有する複数の種の内の１つを指す。その差異には関連技術の当業者に既知のあらゆるタイプの変化が含まれてよく、それには多型、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入または欠失（挿入／欠失事象の組み合わせは“インデル（ｉｎｄｅｌｓ）”とも呼ばれる）、繰り返し配列（タンデム反復とも呼ばれる）の数における違い、および構造的変化が含まれるが、それらに限定されない。
【００４７】
用語“対立遺伝子頻度”または“対立遺伝子の頻度”は、本明細書で用いられる際、一般に特定の変種からなる集団中の全ての変種の比率を指す。
用語“キー配列”または“キー要素”は、本明細書で用いられる際、一般に、鋳型分子から生成された配列データに関する品質管理基準として用いられる、既知の配列組成を含む、既知の位置（すなわち、典型的にはライゲーションされたアダプター要素中に含まれる）において鋳型核酸分子と結合した（典型的には約４個の配列位置、すなわちＴＧＡＣまたはヌクレオチド種の他の組み合わせの）核酸配列要素を指す。その配列データは、それが正しい位置においてキー要素と結合した既知の配列組成を含む場合、品質管理を通過する。
【００４８】
用語“キーパス（ｋｅｙｐａｓｓ）”または“キーパスウェル（ｋｅｙｐａｓｓ  ｗｅｌｌ）”は、本明細書で用いられる際、一般に反応ウェル中の既知の配列組成の完全長核酸試験配列（すなわち、上記で言及したような“試験断片”または“ＴＦ”）の配列決定を指し、ここでＴＦ配列および／またはＴＦと結合した、または標的核酸と結合したアダプター中のキー配列に由来する配列の正確さをＴＦおよび／またはキーの既知の配列組成と比較し、その配列決定の正確さを判定するために、および品質管理のために用いる。典型的な態様において、配列決定ラン中のウェルの総数のある割合がキーパスウェルであると考えられ、それは一部の態様において局所的に（ｒｅｇｉｏｎａｌｌｙ）分布していてよい。
【００４９】
用語“平滑末端”は、本明細書で用いられる際、関連技術における当業者の理解と一致して解釈され、一般に相補的ヌクレオチド塩基種の対で終結している末端を有する線状二本鎖核酸分子を指し、ここで平滑末端の対は典型的には互いへのライゲーションに適合している。
【００５０】
用語“粘着末端”または“オーバーハング”は、本明細書で用いられる際、関連技術における当業者の理解と一致して解釈され、一般にその分子の１つの鎖の末端において１個以上の対合していないヌクレオチド種を有する線状二本鎖核酸分子を指し、ここでその対合していないヌクレオチド種はどちらの鎖に存在していてもよく、単一の塩基位置または複数の塩基位置を含んでいてよい（時々“相補末端”とも呼ばれる）。
【００５１】
用語“ＳＰＲＩ”は、本明細書で用いられる際、関連技術における当業者の理解と一致して解釈され、一般に“固相可逆固定法（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）”という特許取得された技術を指し、ここで標的核酸は特定の緩衝条件下でビーズの存在下で選択的に沈降し、ここで前記のビーズはしばしばカルボキシル化されており、常磁性である。その沈降した標的核酸は前記のビーズに固定され、操作者の必要に応じて溶離緩衝液により取り外されるまで結合したままである(DeAngelis, Margaret M. et al:ＰＣＲ産物の単離のための固相可逆固定法。 Nucleic Acids Res (1995), Vol. 23:22; 4742-4743, それをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する)。
【００５２】
用語“カルボキシル化された”は、本明細書で用いられる際、関連技術における当業者の理解と一致して解釈され、一般に物質、例えば微粒子の少なくとも１個のカルボキシル（ｃａｒｂｏｘｌ）基の付加による修飾を指す。カルボキシル基はＣＯＯＨまたはＣＯＯ−のどちらかである。
【００５３】
用語“常磁性”は、本明細書で用いられる際、関連技術における当業者の理解と一致して解釈され、一般に物質の特徴を指し、ここで前記の物質の磁性は外部の適用された磁場の存在下でのみ生じ、一度その外部の適用された磁場が取り外されたらその磁化を一切保持しない。
【００５４】
用語“ビーズ”または“ビーズ支持体”は、本明細書で用いられる際、一般にあらゆるタイプのあらゆる都合のよい大きさの、不規則または規則的な形状の固相粒子を指し、それはあらゆる数の既知の物質、例えばセルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル類、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドのコポリマー類、ジビニルベンゼンまたは同様のもので架橋されたポリスチレン（例えばMerrifield, Biochemistry 1964, 3, 1385-1390において記述されているようなもの）、ポリアクリルアミド類、ラテックスゲル類、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック類、ニトロセルロース、天然の海綿、シリカゲル類、制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、金属、架橋されたデキストラン類（例えばＳｅｐｈａｄｅｘ（商標））、アガロースゲル（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））、ならびに当業者に既知の他の固相ビーズ担体から製作される。
【００５５】
用語“反応環境”は、本明細書で用いられる際、一般にそこで反応が起こることができ、典型的にはそこに反応物が少なくとも一時的に含有され、または閉じ込められて少なくとも１種類の反応産物の検出を可能にする、ある体積の空間を指す。反応環境の例には、キュベット、チューブ、ボトル、および平面の、または非平面の支持体上の１個以上のくぼみ、ウェル、または室が含まれるが、それらに限定されない。
【００５６】
試料の調製および処理、配列データの生成、ならびに配列データの分析と関係する系および方法のいくつかの典型的な態様を下記で一般的に記述し、その一部または全部は本明細書で記述する発明の態様による使用に適用できる。特に、鋳型核酸分子の調製、鋳型分子の増幅、標的特異的アンプリコンおよび／またはゲノムライブラリーの生成のための系および方法、配列決定法および機器、ならびにコンピューターシステムの典型的な態様を記述する。
【００５７】
典型的な態様において、実験または診断試料に由来する核酸分子をその未処理の形から調製および処理して高スループット配列決定を適用できる鋳型分子にするべきである。その処理方法は適用ごとに異なっていてよく、結果として様々な特徴を含む鋳型分子をもたらす。例えば、高スループット配列決定の一部の態様において、少なくとも特定の配列決定法が正確に配列データを生成することができる長さと比較可能な配列または読み取り長を有する鋳型分子を生成するのが好ましい。この例において、その長さには約２５〜３０塩基対、約５０〜１００塩基対、約２００〜３００塩基対、約３５０〜５００塩基対、約５００〜１０００塩基対の範囲、１０００塩基対より大きい長さ、または特定の配列決定の適用を適用できる他の長さが含まれてよい。一部の態様において、試料、例えばゲノム試料からの核酸は、当業者に既知のいくつかの方法を用いて断片化される。好ましい態様において、核酸をランダムに断片化する（すなわち特定の配列または領域に関して選択しない）方法には、噴霧または超音波処理法と呼ばれる方法が含まれ得る。しかし、他の断片化の方法、例えば制限エンドヌクレアーゼを用いる消化を断片化の目的のために用いることができることは理解されるであろう。やはりこの例において、いくつかの処理方法は、望まれる長さの核酸断片を選択的に分離するために当技術で既知のサイズ選択法を用いることができる。
【００５８】
また、一部の態様において、それぞれの鋳型核酸分子に追加の機能要素を結合させることが好ましい。その要素は様々な機能のために用いることができ、それには増幅および／または配列決定法のためのプライマー配列、品質管理要素（すなわちキー要素または他のタイプの品質管理要素）、例えば由来の試料または患者との様々な関連付けをコードする独特の識別子（多重識別子または“ＭＩＤ”とも呼ばれる）、または他の機能要素が含まれるが、それらに限定されない。
【００５９】
例えば、記述される発明の一部の態様は、既知の、および同定可能な配列組成を有するＭＩＤ要素の１個以上の態様を試料と結合させ、そのＭＩＤ要素の態様をその結合した試料からの鋳型核酸分子と連結することを含む。いくつかの異なる試料からのそのＭＩＤを連結された鋳型核酸分子を単一の“多重化された”試料または組成物中にプールし、次いでそれを、それぞれのＭＩＤを連結された鋳型核酸分子に関して配列データを生成するために効率的に処理することができる。そのそれぞれの鋳型核酸に関する配列データをデコンボリューションして（ｄｅ−ｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）連結されたＭＩＤ要素の配列組成を同定し、由来の試料との関連を同定する。この例において、多重化された組成には約３８４個の試料、約９６個の試料、約５０個の試料、約２０個の試料、約１６個の試料、約１２個の試料、約１０個の試料、または他の数の試料からの代表が含まれていてよい。それぞれの試料は研究の状況において異なる実験条件、処理、種、または個人と関係している可能性がある。同様に、それぞれの試料は診断の状況において異なる組織、細胞、個人、条件、薬物または他の処置と関係している可能性がある。当業者は、上記で列挙した試料の数は例の目的のためであり、従って限定するものと考えられるべきでないことを理解しているであろう。
【００６０】
好ましい態様において、それぞれのＭＩＤ要素の配列組成は容易に同定可能であり、配列決定プロセスから導入されるエラーに耐性がある。ＭＩＤ要素の一部の態様は、天然起源配列に対する最小限の配列の類似性を有する核酸種の独特の配列組成を含む。あるいは、ＭＩＤ要素の態様には天然起源配列に対するある程度の配列の類似性が含まれていてよい。
【００６１】
また、好ましい態様において、それぞれのＭＩＤ要素の位置は、鋳型核酸分子および／またはその鋳型分子に連結されたアダプター要素のいくつかの特徴と比較して既知である。それぞれのＭＩＤの既知の位置を有することは、配列データ中のそのＭＩＤ要素の発見ならびに可能性のあるエラーに関するそのＭＩＤ配列組成およびその後のその由来の試料との関連の解釈のために有用である。
【００６２】
例えば、ＭＩＤ要素への位置的な関係のためのアンカーとして有用ないくつかの特徴には、鋳型分子の長さ（すなわち、そのＭＩＤ要素はその５’または３’末端からこれだけの数の配列の位置にあると知られている）、ＭＩＤ要素に隣接して位置する識別可能な配列マーカー、例えばキー要素および／または１個以上のプライマー要素が含まれてよいが、それらに限定されない。この例において、そのキーおよびプライマー要素は一般に、典型的にはその多重組成中で試料ごとに異ならず、そのＭＩＤ要素を探すための位置の基準として用いることができる、既知の配列組成を含む。適用１３５により実施される分析アルゴリズムは、コンピューター１３０上で実行されて、それぞれのＭＩＤを連結された鋳型に関して生成された配列データを分析して、より容易に識別可能なキーおよび／またはプライマー要素を同定し、それらの位置から外挿してそのＭＩＤ要素の配列が含まれると推定される配列領域を同定することができる。次いで適用１３５はその推定された領域（およびおそらくその両側の領域においていくらかの距離離れた所まで）の配列組成を処理し、そのＭＩＤ要素およびそれの配列組成を明確に同定することができる。
【００６３】
記述された機能要素の一部または全部を、特定の処理工程においてヌクレオチド配列に連結されるアダプター要素中に組み合わせることができる。例えば、一部の態様は、増幅および／または配列決定のために用いられるプライマー配列に相補的な配列組成を含むプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）配列要素または領域を結合させることができる。さらに、その同じ要素を、“鎖選択”と呼ぶことができる方法および核酸分子の固相支持体への固定のために用いることができる。一部の態様において、２セットのプライミング配列領域（以下プライミング配列Ａおよびプライミング配列Ｂと呼ぶ）を鎖選択のために用いることができ、ここで１コピーのプライミング配列Ａおよび１コピーのプライミング配列Ｂを有する単一の鎖のみが選択されて調製された試料として含まれる。代わりの態様において、そのアダプター要素の設計特徴は鎖選択の必要性を排除する。その同じプライミング配列領域を増幅および固定のための方法において用いることができ、ここで例えば、プライミング配列Ｂを固体支持体上に固定することができ、増幅産物をそれから伸長させる。
【００６４】
断片化、鎖選択、ならびに機能要素およびアダプターの付加のための試料処理の追加の例が、２００４年１月２８日に出願された“一本鎖ＤＮＡライブラリーを調製するための方法”と題された米国特許出願一連番号１０／７６７，８９４；２００８年５月２９日に出願された“多重混合物からの個々の試料の同定のための系および方法”と題された米国特許出願一連番号１２／１５６，２４２；および２００９年２月２３日に出願された“配列決定可能なライブラリーの生成のための核酸の向上した処理のための系および方法”と題された米国特許出願一連番号１２／３８０，１３９において記述されており、そのそれぞれをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。
【００６５】
実質的に同一のコピーの集団を生成するための鋳型核酸分子の増幅を実施するための系および方法の様々な例を記述する。ＳＢＳの一部の態様において、１種類以上のヌクレオチド種が１コピーの鋳型分子と結合したそれぞれの新生分子の中に組み込まれる際、より強いシグナルを生成するために、それぞれの核酸要素の多くのコピーを生成することが望ましいことは、当業者には明らかであろう。例えば細菌ベクターの“ローリングサークル”増幅と呼ばれる方法（上記で援用した米国特許第６，２７４，３２０号および第７，２１１，３９０号において記述されている）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いる増幅のような、核酸分子のコピーを生成するための当技術で既知の多くの技法が存在し、その技法のそれぞれが本明細書で記述する発明による使用に適用可能である。高スループット適用に特に適用できるあるＰＣＲ技法には、エマルジョンＰＣＲ法と呼ばれる方法（ｅｍＰＣＲ（商標）法とも呼ばれる）が含まれる。
【００６６】
エマルジョンＰＣＲ法の典型的な態様には、その内部で反応が起こることができる水性の液滴を作り出す２種類の不混和性物質の安定なエマルジョンを作り出すことが含まれる。特に、ＰＣＲ法における使用に適用できるエマルジョンの水性の液滴には、別の流体、例えば典型的にはあるタイプの油が含まれる疎水性の流体（連続相とも呼ばれる）内で液滴（不連続相とも呼ばれる）として懸濁または分散されている第１の流体、例えば水に基づく流体が含まれてよい。用いることができる油の例には、鉱油、シリコンに基づく油、またはフッ素化油が含まれるが、それらに限定されない。
【００６７】
さらに、一部のエマルジョンの態様はそのエマルジョンを安定化するように作用する界面活性剤を用いることができ、それは特定の処理方法、例えばＰＣＲに特に有用である可能性がある。界面活性剤の一部の態様には、シリコンまたはフッ素化界面活性剤の１種類以上が含まれてよい。例えば、１種類以上の非イオン性界面活性剤を用いることができ、それにはソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ（商標）８０とも呼ばれる）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（商標）８０とも呼ばれる）、または一部の好ましい態様において、ジメチコンコポリオール（Ａｂｉｌ（登録商標）ＥＭ９０とも呼ばれる）、ポリシロキサン、ポリアルキルポリエーテルコポリマー、ポリグリセロールエステル類、ポロキサマー類、およびＰＶＰ／ヘキサデカンコポリマー類（Ｕｎｉｍｅｒ  Ｕ−１５１とも呼ばれる）、またはより好ましい態様において、シクロペンタシロキサン中の高分子量シリコンポリエーテル（ＤＣ  ５２２５Ｃとも呼ばれ、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇから入手可能）が含まれるが、それらに限定されない。
【００６８】
そのエマルジョンの液滴は、区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ）、マイクロカプセル、マイクロ反応器、微小環境とも呼ばれてよく、または関連技術で一般的に用いられる他の名前で呼ばれてよい。その水性の液滴は、そのエマルジョン構成要素または組成物の組成、その中に含有される内容物、および用いられる形成技法に応じて大きさに幅があってよい。記述されたエマルジョンは、その中で化学反応、例えばＰＣＲを実施することができる微小環境を作り出す。例えば、鋳型核酸および望ましいＰＣＲ反応を実施するために必要な全ての試薬をそのエマルジョンの液滴中に封入し（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）、化学的に分離することができる。上記で記述したような液滴の追加の安定性を促進するために、一部の態様において追加の界面活性剤または他の安定化剤を用いることができる。ＰＣＲ法に典型的な熱サイクル操作をその液滴を用いて実行して封入された核酸鋳型を増幅することができ、それは結果としてその鋳型核酸の多くの実質的に同一のコピーを含む集団の生成をもたらす。一部の態様において、その液滴内の集団は“クローン的に分離された”、“区画化された”、“隔離された”、“封入された”、または“局在化された”集団と呼ぶことができる。やはりこの例において、その記述された液滴の一部または全部はさらに、鋳型およびその鋳型の増幅されたコピー、その鋳型に相補的な増幅されたコピー、またはそれらの組み合わせの付着のためのビーズのような固体支持体を封入することができる。さらに、その固体支持体は他のタイプの核酸、試薬、標識、または他の目的の分子の付着を可能にすることができる。
【００６９】
エマルジョンの破壊およびビーズの回収の後、典型的な態様において、その上に固定された鋳型核酸分子の実質的に同一のコピーのうまく増幅された集団を有するビーズに関して“濃縮する”ことも望ましい可能性がある。例えば、“ＤＮＡ陽性”ビーズに関して濃縮するためのプロセスには、プライマー種をその固定された増幅されたコピーの遊離末端上の領域（典型的にはアダプター配列中に見出される）にハイブリダイズさせ、そのプライマーをポリメラーゼに仲介される伸長反応を用いて伸長し、濃縮支持体、例えば磁気またはセファロースビーズにそのプライマーを結合させることが含まれてよい。そのビーズを含む溶液に選択条件、例えば磁場または遠心分離を適用することができ、ここでその濃縮ビーズはその選択条件に応答し、“ＤＮＡ陰性”（すなわち固定されたコピーが無い、またはほとんど無い）ビーズから分離される。
【００７０】
本明細書で記述する発明に有用なエマルジョンの態様には、記述した化学反応を大量に並行した方式で行うことを可能にする非常に高密度の液滴またはマイクロカプセルが含まれ得る。増幅のために用いられるエマルジョンおよび配列決定適用のためのそれらの使用の追加の例が米国特許第７，６３８，２７６号；第７，６２２，２８０号；第７，８４２，４５７号；および第７，９２７，７９７号；ならびに米国特許出願一連番号１１／９８２，０９５において記述されており、そのそれぞれをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。
【００７１】
時々ウルトラディープ配列決定（Ｕｌｔｒａ−Ｄｅｅｐ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）と呼ばれる態様も配列決定のための標的特異的アンプリコンを生成し、それを本明細書で記述する発明と共に用いることができ、それには特異的核酸プライマーのセットを用いて標的核酸を含む試料から選択された標的領域（単数または複数）を増幅することが含まれる。さらに、その試料には、研究または診断の有用性と関係する配列組成を含む配列変種を含有することが既知である、または疑われる核酸分子の集団が含まれてよく、ここでそのプライマーを用いてその試料中の配列変種を増幅してその試料中の配列変種の分布を見抜くことができる。例えば、核酸試料中の複対立遺伝子の特異的な増幅および配列決定により配列変種を同定するための方法を実施することができる。まずその核酸に対して、目的の領域またはその核酸集団に一般的な区域（ｓｅｇｍｅｎｔ）の周囲の領域を増幅するように設計されたＰＣＲプライマーの対による増幅を施す。そのＰＣＲ反応の産物のそれぞれ（第１アンプリコン）を続いてさらに別々の反応容器、例えば上記で記述したエマルジョンに基づく容器中で個々に増幅する。その結果として得られたアンプリコン（本明細書において第２アンプリコンと呼ぶ）はそれぞれが第１のアンプリコンの集団の１つのメンバーに由来し、それを配列決定して、その配列の集合を用いて存在する１種類以上の変種の対立遺伝子頻度を決定する。重要なことだが、その方法は存在する変種を前もって知っていることを必要とせず、典型的には核酸分子の集団中に１％未満の頻度で存在する変種を同定することができる。
【００７２】
記述した標的特異的増幅および配列決定法のいくつかの利点には、以前に達成されていたよりも高いレベルの感度が含まれる。さらに、高スループット配列決定機器を用いる態様、例えば４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより提供されるウェルのＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ（登録商標）アレイと呼ばれるもの（時々ＰＴＰ（商標）プレートまたはアレイとも呼ばれる）を用いる態様において、記述された方法を用いてランまたは実験あたり１００，０００を超える、３００，０００を超える、５００，０００を超える、または１，０００，０００を超える核酸領域に関する配列組成を生成することができ、それは少なくとも部分的に使用者の好み、例えばガスケット等の使用により可能になるレーン構成に依存する可能性がある。また、記述した方法は、その対立遺伝子変種の１％未満に相当する可能性のある存在比の低い対立遺伝子の検出の感度を提供する。その方法の別の利点には、その分析されている領域の配列を含むデータを生成することが含まれる。重要なことだが、分析されている部位の配列の事前知識を有する必要はない。
【００７３】
配列決定のための標的特異的アンプリコンの追加の例が、２００５年４月１２日に出願された“ウルトラディープ配列決定を用いて配列変種を決定するための方法”と題された米国特許出願一連番号１１／１０４，７８１；２００８年３月１４日に出願された“ＨＩＶ薬物耐性変種の検出のための系および方法”と題されたＰＣＴ特許出願一連番号ＵＳ  ２００８／００３４２４；および２００９年６月１７日に出願された“ＨＩＶ向性変種の検出のための系および方法”と題された米国特許第７，８８８，０３４号において記述されており、そのそれぞれをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。
【００７４】
さらに、配列決定の態様には、サンガー型の技法、一般にハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）、ライゲーションによる配列決定（ＬＢＨ）、または組み込みによる配列決定（ＳＢＩ）技法と呼ばれる技法が含まれてよい。さらに、その配列決定技法には、ポロニー（ｐｏｌｏｎｙ）配列決定技法と呼ばれる方法；ナノポア、導波（ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）および他の単一分子検出技法；または可逆的終結剤技法が含まれてよい。上記で記述したように、好ましい技法には合成による配列決定の方法が含まれてよい。例えば、一部のＳＢＳの態様は核酸鋳型の実質的に同一のコピーの集団を配列決定し、典型的には試料鋳型分子の予め決められた相補的位置またはその鋳型分子に結合した１個以上のアダプターにアニールするように設計された１種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。そのプライマー／鋳型複合体に、核酸ポリメラーゼ酵素の存在下でヌクレオチド種を与える。そのヌクレオチド種がそのオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に直接隣接する試料鋳型分子上の配列位置に相当する核酸種に相補的である場合、そのポリメラーゼはそのヌクレオチド種を用いてそのプライマーを伸長するであろう。あるいは、一部の態様において、そのプライマー／鋳型複合体に複数の目的のヌクレオチド種（典型的にはＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴ）を一度に与え、そのオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に直接隣接する試料鋳型分子上の対応する配列位置において相補的であるヌクレオチド種が組み込まれる。記述した態様のいずれにおいても、そのヌクレオチド種はさらなる伸長を妨げるように（例えば３’−Ｏの位置において）化学的にブロッキングされていてよく、合成の次のラウンドの前に脱ブロッキングされる必要がある。ヌクレオチド種を新生分子の末端に付加するプロセスはプライマーの末端への付加に関して上記で記述した方法と実質的に同じであることも理解されるであろう。
【００７５】
上記で記述したように、ヌクレオチド種の組み込みは当技術で既知の様々な方法により、例えば光を生成する酵素反応プロセスを用いてピロホスフェート（ＰＰｉ）の放出を検出することにより、またはｐＨの変化の検出により（米国特許第６，２１０，８９１号；第６，２５８，５６８号；および第６，８２８，１００号において記述されている例、そのそれぞれをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する）、またはそのヌクレオチドに結合させた検出可能な標識により検出することができる。検出可能な標識のいくつかの例には、質量タグおよび蛍光または化学発光標識が含まれるが、それらに限定されない。典型的な態様において、組み込まれなかったヌクレオチドは例えば洗浄により除去される。さらに、一部の態様において、その組み込まれなかったヌクレオチドに、例えば２００８年６月２７日に出願された“核酸配列決定における適応性（Ａｄａｐｔｉｖｅ）試薬制御のための系および方法”と題された米国特許出願一連番号１２／２１５，４５５；および２００９年１月２９日に出願された“核酸配列決定における向上したシグナル検出のための系および方法”と題された米国特許出願一連番号１２／３２２，２８４（そのそれぞれをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する）において記述されているようなアピラーゼまたはピロホスファターゼ酵素を用いる分解のような酵素的分解を施すことができる。
【００７６】
検出可能な標識が用いられる態様において、それらは典型的には次の合成のサイクルの前に（例えば化学的開裂または光退色により）不活性化されなければならないであろう。次いでその鋳型／ポリメラーゼ複合体における次の配列の位置を、上記で記述したように別のヌクレオチド種、または複数の目的のヌクレオチド種を用いて照会することができる。ヌクレオチドの添加、伸長、シグナルの獲得、および洗浄の繰り返されるサイクルは、結果として鋳型鎖のヌクレオチド配列の決定をもたらす。この例を続けることにより、信頼できる検出のために十分に強いシグナルを獲得するために、多数の実質的に同一の鋳型分子、または実質的に同一の鋳型分子の集団（例えば１０３、１０４、１０５、１０６または１０７個の分子）が典型的にはあらゆる１つの配列決定反応において同時に分析される。
【００７７】
加えて、一部の態様において、“ペアエンド（ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ）”配列決定戦略と呼ばれ得る方法を用いることにより配列決定プロセスの読み取り長能力および質を向上することが好都合である可能性がある。例えば、配列決定法の一部の態様は、それから高品質で信頼できる読みを生成することができる分子の全長において制限を有する。言い換えると、信頼できる読み取り長のための配列位置の総数は、用いられる配列決定の態様に依存して、２５、５０、１００、または５００塩基を超えることができない。ペアエンド配列決定戦略は、それぞれの末端に中央でリンカー配列により連結された本来の鋳型核酸分子の断片を含む分子のそれぞれの末端（時々“タグ”末端と呼ばれる）を別々に配列決定することにより、信頼できる読み取り長を拡張する。その鋳型断片の本来の位置的関係は既知であり、従ってその配列の読みからのデータを再度組み合わせてより長い高品質読み取り長を有する単一の読みにすることができる。ペアエンド配列決定の態様のさらなる例が、“ペアエンド配列決定”と題された米国特許第７，６０１，４９９号において；および２００９年１月２８日に出願された“ペアエンド配列決定”と題された米国特許出願一連番号１２／３２２，１１９において記述されており、そのそれぞれをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。
【００７８】
ＳＢＳ装置のいくつかの例は上記で記述した方法の一部または全部を実施することができ、それには検出装置、例えば光学的検出のための電荷結合素子（すなわちＣＣＤカメラ）または共焦点型構造、イオンまたは化学的検出のための構造のためのイオン感応性電界効果トランジスタ（“ＩＳＦＥＴ”とも呼ばれる）または化学感応性電界効果トランジスタ（“ＣｈｅｍＦＥＴ”とも呼ばれる）、微少流体チャンバーまたはフローセル、反応支持体、および／またはポンプおよびフローバルブの内の１種類以上が含まれてよい。ピロホスフェートに基づく配列決定の例では、装置の態様は本質的に低いレベルのバックグラウンドノイズをもたらす化学発光検出戦略を用いることができる。
【００７９】
一部の態様において、配列決定のための反応支持体には平面の支持体、例えばスライド型の支持体、ＩＳＦＥＴ、または導波型の反応支持体が含まれてよく、それは一部の態様においてウェル型の構造を含んでいてよい。さらに、その反応支持体には上記で記述したような４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＰＴＰ（商標）アレイと呼ばれるものが含まれてよく、それは光ファィバーフェースプレートから形成され、数十万またはより多くの非常に小さいウェルを生じるように酸でエッチングされており、それぞれが実質的に同一の鋳型分子の集団を保持することが可能である（すなわち、一部の好ましい態様は、７０×７５ｍｍ  ＰＴＰ（商標）アレイ上に３５μｍのウェル間ピッチで約３３０万個のウェルを含む）。一部の態様において、それぞれの実質的に同一の鋳型分子の集団を固体支持体、例えばビーズの上に配置することができ、そのそれぞれを前記のウェルの１個の中に配置することができる。例えば、装置にはそのＰＴＰプレートホルダーに流体試薬を提供するための試薬送達要素およびそのＰＴＰプレート上のそれぞれのウェルから放射された光の光子を集めることが可能なＣＣＤ型検出装置が含まれていてよい。向上したシグナル認識のための特徴を含む反応支持体の例が、２００５年８月３０日に出願された“薄膜でコートされたマイクロウェルアレイおよび同じものを作る方法”と題された米国特許第７，６８２，８１６号において記述されており、それをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。ＳＢＳ型配列決定およびピロホスフェート配列決定を実施するための装置および方法のさらなる例が米国特許第７，３２３，３０５号および第７，５７５，８６５号において記述されており、その両方が上記で援用されている。
【００８０】
加えて、１つ以上の試料調製プロセスを自動化する系および方法、例えば上記で記述したｅｍＰＣＲ（商標）プロセスを用いることができる。例えば、自動化された系を用いて、ｅｍＰＣＲ処理のためのエマルジョンを生成するための効率的な溶液を提供する、ＰＣＲ熱サイクル操作を実施する、および配列決定のための核酸分子のうまく調製された集団に関して濃縮することができる。自動化された試料調製系の例が、２００５年１月２８日に出願された“連続的フローエマルジョンを用いた核酸増幅”と題された米国特許第７，９２７，７９７号において記述されており、それをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。
【００８１】
また、本明細書で記述する本発明の態様の系および方法には、コンピューターシステム上での実行のために記憶されているコンピューターで読み取り可能な媒体を用いるいくつかの設計、分析、または他の操作の実施が含まれてよい。例えば、検出されたシグナルを処理する、および／またはＳＢＳ系および方法を用いて生成されたデータを分析するためのいくつかの態様が下記で詳細に記述されており、ここでその処理および分析の態様はコンピューターシステム上で実施可能である。
【００８２】
本明細書で記述する発明と共に使用するためのコンピューターシステムの典型的な態様には、あらゆるタイプのコンピュータープラットフォーム、例えばワークステーション、パーソナルコンピューター、サーバー、またはあらゆる他の現在または未来のコンピューターが含まれてよい。しかし、本明細書で記述するような前記のコンピュータープラットフォームは記述される発明の特殊化された操作を実施するように特別に設計されており、汎用コンピューターとは考えられないことは当業者には理解されるであろう。コンピューターには典型的には既知の構成要素、例えば処理装置、オペレーティングシステム、システムメモリー、メモリー記憶装置、入出力制御装置、入出力デバイス、および表示装置が含まれる。関連分野の当業者には、コンピューターの多くの可能性のある構成および構成要素が存在し、それにはキャッシュメモリー、データバックアップユニット、および多くの他の装置も含まれてよいことも理解されるであろう。
【００８３】
表示装置には視覚情報を提供する表示装置が含まれてよく、この情報は典型的にはピクセルのアレイとして論理的におよび／または物理的に組織化されていてよい。インターフェイス制御装置も含まれていてよく、それは入出力インターフェイスを提供するための様々な既知の、または未来のソフトウェアプログラムのいずれかを含んでいてよい。例えば、インターフェイスには一般に“グラフィカルユーザーインターフェイス”（しばしばＧＵＩと呼ばれる）と呼ばれるものが含まれてよく、それは使用者に１種類以上のグラフ表現を提供する。インターフェイスは典型的には、関連技術における当業者に既知の選択または入力の手段を用いて使用者の入力を受け入れることが可能になっている。
【００８４】
同じまたは代わりの態様において、コンピューター上でのアプリケーションには“コマンドラインインターフェイス”（しばしばＣＬＩと呼ばれる）と呼ばれるものが含まれてよい。ＣＬＩは典型的にはアプリケーションと使用者の間のテキストに基づく相互作用を提供する。典型的には、コマンドラインインターフェイスは表示装置を通して出力を与え、テキストの列として入力を受ける。例えば、一部の実施には関連技術における当業者に既知のＵｎｉｘシェル、またはオブジェクト指向型プログラミングアーキテクチャ、例えばＭｉｃｒｏｓｏｆｔ．ＮＥＴフレームワークを用いるＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｐｏｗｅｒｓｈｅｌｌのような“シェル”と呼ばれるものが含まれてよい。
【００８５】
関連技術における当業者は、インターフェイスには１個以上のＧＵＩ、ＣＬＩまたはそれらの組み合わせが含まれてよいことを理解しているであろう。
処理装置には、商業的に入手可能な処理装置、例えばＩｎｔｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより作られたＣｅｌｅｒｏｎ（登録商標）、Ｃｏｒｅ（商標）、またはＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）処理装置、Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓにより作られたＳＰＡＲＣ（登録商標）処理装置、ＡＭＤ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより作られたＡｔｈｌｏｎ（商標）、Ｓｅｍｐｒｏｎ（商標）、Ｐｈｅｎｏｍ（商標）、またはＯｐｔｅｒｏｎ（商標）処理装置が含まれてよく、またはそれは入手可能な、または入手可能になるであろう他の処理装置の１つであってよい。処理装置の一部の態様には、マルチコア処理装置と呼ばれるものが含まれてよく、および／または単独またはマルチコア設計において並列処理技術を用いることが可能にされていてよい。例えば、マルチコアアーキテクチャは典型的には２個以上の処理装置の“実行コア”を含む。この例では、それぞれの実行コアは多数のスレッドの並列実行を可能にする独立した処理装置として機能することができる。加えて、当業者は、処理装置は一般に３２もしくは６４ビットアーキテクチャと呼ばれるもの、または現在知られている、もしくは将来開発される可能性のある他のアーキテクチャ構成で構成されていてよいことを理解しているであろう。
【００８６】
処理装置は典型的にはオペレーティングシステムを実行し、それは例えばＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）型オペレーティングシステム（例えばＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＸＰ、Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｖｉｓｔａ（登録商標）、またはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）＿７）；Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．からのＭａｃ  ＯＳ  Ｘオペレーティングシステム（例えばＭａｃ  ＯＳ  Ｘ  ｖ１０．６“Ｓｎｏｗ  Ｌｅｏｐａｒｄ”オペレーティングシステム）；多くのベンダーもしくはオープンソースと呼ばれるものから入手可能なＵｎｉｘ（登録商標）もしくはＬｉｎｕｘ型オペレーティングシステム；別の、もしくは未来のオペレーティングシステム；またはその何らかの組み合わせであってよい。オペレーティングシステムは周知の方式でファームウェアおよびハードウェアとインターフェイスされており、様々なプログラミング言語で書かれていてよい様々なコンピュータープログラムの機能の調和および実行においてその処理装置を手助けする。オペレーティングシステムは、典型的には処理装置と共同して、コンピューターの他の構成要素の機能を調和させ、実行する。オペレーティングシステムはスケジューリング、入出力制御、ファイルおよびデータの管理、メモリー管理、ならびに通信制御および関連するサービスも提供し、それらは全て既知の技法に従う。
【００８７】
システムメモリーには、様々な既知の、または未来のメモリー記憶装置のいずれかが含まれてよい。例には、あらゆる一般的に入手可能なランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、磁気媒体、例えば常在性（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）ハードディスクもしくはテープ、光学媒体、例えば読み取りおよび書き込み用コンパクトディスク、または他のメモリー記憶装置が含まれる。メモリー記憶装置には、コンパクトディスクドライブ、テープドライブ、取り外し可能なハードディスクドライブ、ＵＳＢもしくはフラッシュドライブ、またはディスケットドライブが含まれる様々な既知の、または未来の装置のいずれかが含まれてよい。そのようなタイプのメモリー記憶装置は典型的にはプログラム記憶媒体（示していない）、例えばそれぞれコンパクトディスク、磁気テープ、取り外し可能なハードディスク、ＵＳＢもしくはフラッシュドライブ、またはフロッピーディスクから読み取り、および／またはそれに書き込む。これらのプログラム記憶媒体、または現在用いられている、または後に開発される可能性のある他のもののいずれも、コンピュータープログラム製品と考えることができる。理解されているであろうように、これらのプログラム記憶媒体は典型的にはコンピューターソフトウェアプログラムおよび／またはデータを記憶する。コンピューター制御論理とも呼ばれるコンピューターソフトウェアプログラムは、典型的にはメモリー記憶装置と合わせて用いられるシステムメモリーおよび／またはプログラム記憶装置中に記憶されている。
【００８８】
一部の態様において、その中に記憶された制御論理（プログラムコードが含まれるコンピューターソフトウェアプログラム）を有する、コンピューター使用可能な媒体を含むコンピュータープログラム製品を記述する。その制御論理は、処理装置により実行される際、処理装置に本明細書で記述した機能を実行させる。他の態様において、一部の機能は主に例えばハードウェア状態の機械（ｈａｒｄｗａｒｅ  ｓｔａｔｅ  ｍａｃｈｉｎｅ）を用いてハードウェアにおいて実施される。本明細書で記述した機能を実施するためのそのハードウェア状態の機械の実施は、関連技術における当業者には明らかであろう。
【００８９】
入出力制御装置には、ヒトであろうと機械であろうと、手元であろうと遠隔であろうと、使用者からの情報を受け取る、および処理するための様々な既知の装置のいずれかが含まれ得る。そのような装置には、例えば、モデムカード、ワイヤレスカード、ネットワークインターフェイスカード、サウンドカード、または様々な既知の入力装置のいずれかのための他のタイプの制御装置が含まれる。出力制御装置には、ヒトであろうと機械であろうと、手元であろうと遠隔であろうと、使用者に情報を与えるための様々な既知の表示装置のいずれかのための制御装置が含まれ得る。本明細書で記述した態様において、そのコンピューターの機能要素はシステムバスを介して互いと通信する。コンピューターの一部の態様は、ネットワークまたは他のタイプの遠隔通信を用いていくつかの機能要素と通信することができる。
【００９０】
関連技術における当業者には明らかであるように、機器制御および／またはデータ処理アプリケーションは、ソフトウェアにおいて実施される場合、システムメモリーおよび／またはメモリー記憶装置中にロードされ、それから実行されてよい。その機器制御および／またはデータ処理アプリケーションの一部または全部がそのメモリー記憶装置の読み取り専用メモリーまたは類似の装置中に存在していてもよく、そのような装置はその機器制御および／またはデータ処理アプリケーションがまず入出力制御装置を通してロードされることを要求しない。関連技術における当業者には、その機器制御および／またはデータ処理アプリケーション、またはその一部が、実行のために好都合である際に、処理装置により既知の方式でシステムメモリーまたはキャッシュメモリーまたは両方の中にロードされてよいことは理解されるであろう。
【００９１】
また、コンピューターにはシステムメモリー中に記憶された１個以上のライブラリーファイル、実験データファイル、およびインターネットクライアントが含まれてよい。例えば、実験データには１個以上の実験もしくはアッセイに関連するデータ、例えば検出されたシグナル値、または１個以上のＳＢＳ実験またはプロセスと関係する他の値が含まれることができるであろう。加えて、インターネットクライアントにはネットワークを用いて別のコンピューター上の遠隔サービスにアクセスすることが可能になっているアプリケーションが含まれてよく、例えば一般に“ウェブブラウザー”と呼ばれるものを含んでいてよい。この例において、いくつかの一般的に用いられるウェブブラウザーには、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ８、Ｍｏｚｉｌｌａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＭｏｚｉｌｌａ  Ｆｉｒｅｆｏｘ（登録商標）３．６、Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．からのＳａｆａｒｉ  ４、Ｇｏｏｇｌｅ（商標）ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＧｏｏｇｌｅ  Ｃｈｒｏｍｅ、または当技術で現在知られている、もしくは将来開発される予定の他のタイプのウェブブラウザーが含まれる。また、その同じまたは他の態様において、インターネットクライアントにはネットワークを介して遠隔情報にアクセスすることが可能にされている特殊化されたソフトウェアアプリケーション、例えば生物学的アプリケーションのためのデータ処理アプリケーションが含まれていてよく、またはインターネットクライアントはそれらの要素であることができるであろう。
【００９２】
ネットワークには、当業者に周知の多くの様々なタイプのネットワークの１種類以上が含まれてよい。例えば、ネットワークには、通信のために一般にＴＣＰ／ＩＰプロトコルスイートと呼ばれるものを用いるローカルまたはワイドエリアネットワークが含まれてよい。ネットワークには相互接続されたコンピューターネットワークの世界的なシステムを含むネットワークが含まれてよく、それは一般にインターネットと呼ばれ、または様々なイントラネットアーキテクチャも含まれることができるであろう。関連技術における当業者は、ネットワーク化された環境における一部の使用者は、ハードウェアおよび／またはソフトウェアシステムへの、またはそれらからの情報のトラフィックを制御するために一般に“ファイアーウォール”と呼ばれるもの（時々パケットフィルターまたは境界保護装置とも呼ばれる）を用いることを好む可能性があることも理解しているであろう。例えば、ファイアーウォールはハードウェアもしくはソフトウェア要素またはそれらの何らかの組み合わせを含んでいてよく、それは典型的には例えばネットワーク管理者のような使用者により導入されたセキュリティポリシーを実施するように設計されている。
【００９３】
ｂ．本明細書で記述する発明の態様
上記で記述したように、記述される発明の態様は、反応環境中に導入されるヌクレオチド種の濃度をＤＮＡ配列決定技術において用いられる１種類以上の酵素の種特異的効率に基づいて最適化するための向上した系および方法に向けられている。
【００９４】
典型的な配列決定の態様において、１個以上のプロセス工程を自動化する１種類以上の機器要素が用いられてよい。例えば、配列決定法の態様は、一部または全部のプロセス工程を自動化する、および実行するための機器を用いて実行することができる。図１は配列決定機器１００の説明的な例を提供し、それは光学的シグナルの捕捉を必要とする配列決定プロセスのために典型的には反応支持体１０５上で行われる配列決定反応およびデータの捕捉の実行のための光学サブシステムおよび流体サブシステムを含む。しかし、他のデータの捕捉の方式（すなわちｐＨ、温度、電気化学的、等）を必要とする配列決定プロセスに関して、関連技術における当業者に既知であるそのデータの捕捉の方式のためのサブシステムを用いてよいことは理解されるであろう。例えば、使用者１０１または何らかの自動化された態様は鋳型分子の試料を反応支持体１０５の上に装填し、次いで配列決定機器１００を用いて大量に並行した方式で配列決定して、それぞれの鋳型分子の配列組成を表す配列データを生成することができる。重要なことだが、使用者１０１にはあらゆるそのような使用者が含まれてよく、それには独立した研究者、技術者、臨床家、大学、または企業体が含まれるがそれらに限定されない。
【００９５】
配列決定プロセスを実行するために用いられる配列決定機器１００の態様には、その流体サブシステム中の様々な流体構成要素、光学サブシステム中の様々な光学的構成要素またはｐＨ検出の場合では電界効果トランジスタ型検出構成要素（例えばＩＳＦＥＴまたはＣｈｅｍＦＥＴ）および関係するサブシステム、ならびに図１において図説されていないが一般的に用いられ、当業者に既知の追加の構成要素（いくつかの機能の現場制御のためのマイクロ処理装置および／またはマイクロ制御装置構成要素が含まれ得る）が含まれてよい。一部の態様において、試料は場合により機器１００を用いる配列決定のための必要な調製の一部または全部を実施するように設計された試料調製機器１８０を用いる自動化された、または部分的に自動化された様式での配列決定のために調製されてよい。さらに、図１で図説されているように、配列決定機器１００は１個以上の外部のコンピューター構成要素、例えばコンピューター１３０に有効に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結されていてよく、それは例えばシステムソフトウェアまたはファームウェア、例えばアプリケーション１３５を実行することができ、それは配列決定機器１００または試料調製機器１８０のような機器の１個以上の指示的制御、および／またはデータ分析機能を提供することができる。コンピューター１３０は加えてネットワーク１５０を介して他のコンピューターまたはサーバーに有効に接続されていてよく、それは機器システムの遠隔操作ならびに記憶および処理が可能なシステムへの大量のデータのエクスポートを可能にすることができる。この例において、配列決定機器１００および／またはコンピューター１３０には上記で一般的に記述した態様の構成要素および特徴の一部または全部が含まれてよい。
【００９６】
関連技術における当業者は、１種類以上の酵素を用いる典型的な配列決定系の性能はその関係する方法において用いられる様々な酵素の効率、例えばいくつかの合成による配列決定の方法論において用いられるポリメラーゼおよび／またはアピラーゼ酵素の効率に影響されやすいことを理解しているであろう。例えば、一般的なアピラーゼ活性の望ましいレベルを達成するために反応環境中のアピラーゼの濃度を最適に調節することの態様が、２００８年６月２７日に出願された“核酸配列決定における適応性試薬制御のための系および方法”と題された米国特許出願一連番号１２／２１５，４５５において記述されており、それをそのまま、全ての目的に関して本明細書に援用する。
【００９７】
あらゆる特定の酵素の効率は、酵素、特に酵素活性の特性を与える領域のアミノ酸配列組成、および反応環境における周囲の条件が含まれるがそれらに限定されないいくつかの要因に依存する可能性があることも理解されるであろう。例えば、ポリメラーゼは一般に約１２０，０００単位／ｍｇの特異的活性を含む可能性があり、ここで“１単位”は一般に６５℃において３０分間で１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを酸不溶性物質中に組み込むであろうポリメラーゼ酵素の量を指す。さらに、ヌクレオチドの組み込みに関する様々なポリメラーゼ種の効率、およびヌクレオチドの消化に関するアピラーゼ種の効率は、その反応環境中に存在するヌクレオチドの種に依存して異なり得る。
【００９８】
一部の配列決定系の態様において、ヌクレオチド種溶液（ｄＴＴＰ、α−チオ−ｄＡＴＰまたは一部の態様においてｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）は典型的には、間でアピラーゼ溶液のフローを用いるサイクル方式で反応環境中に導入される（すなわち、上記で記述したような“フロー”による導入）。一部の態様において、それぞれのヌクレオチド種に特異的なアピラーゼの定常状態濃度は、その配列決定プロセスの間の反応支持体（すなわち、例えば上記で記述したＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ型支持体のウェル）上の個々の反応環境中へのヌクレオチド種のフローにより確立される。
【実施例】
【００９９】
そのヌクレオチド種特異的な定常状態アピラーゼ濃度は、単純な速度論的条件が存在するという仮定に基づいて酵素の速度論的特徴を数学的に概算するためのミカエリスメンテン速度式と呼ばれるものを用いて算出することができる。そのミカエリスメンテン式はヌクレオチド種により異なる定数値を用い、それには反応環境中の酵素活性のミカエリス定数ＫＭおよび最大速度Ｖｍａｘが含まれる。例えば、配列決定系の実施において用いられるアピラーゼに関するその定数値を下記の表１において列挙する。
【０１００】
【表１】
2013529901.tif 000003
【０１０１】
この実施例において、配列決定試薬のフローの反復的な性質のため、アピラーゼは所与の時間で１つのタイプのヌクレオチド種のみに効果的に曝露される。アピラーゼおよびそれぞれのヌクレオチド種の間の反応速度は、以下の式を用いて概算することができる：
【０１０２】
【化１】
2013529901.tif 000004
【０１０３】
ここで、［ｄＮＴＰ］はｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰまたはｄＧＴＰの濃度である。
この実施例を続けて、ｄＴＴＰ、α−チオ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰに関する算出のために用いられたヌクレオチド種濃度は、その反応環境においてそれぞれ４０．３、１６６．１、１６．３および１９．７μＭである。α−チオ−ｄＡＴＰに関する濃度の値は実質的に他のヌクレオチド種の濃度よりも高く、それはポリメラーゼ酵素の組み込み効率に対して阻害作用を有する修飾（すなわち、従ってより高い濃度はポリメラーゼの組み込みの可能性を向上する）および下記でより詳細に説明するようなアピラーゼの増大した処理効率によるものであることは理解されるであろう。一部の態様において、より“自然な”ｄＡＴＰ種をα−チオ−ｄＡＴＰの代わりに用いることができ、それはその種に関するより高い酵素処理の効率を反映してヌクレオチド種濃度に関する異なる値を有していてよい。異なるヌクレオチド種に対するミカエリスメンテンの計算からの概算されたアピラーゼの活性を、下記の表２において示す。表２において説明されているアピラーゼのα−チオ−ｄＡＴＰに対する計算された効率は他の種に関してよりも実質的に高く、従ってアピラーゼはより高い濃度のα−チオ−ｄＡＴＰを効率的な方式で処理することが予想されるであろうことも特筆すべきである。
【０１０４】
【表２】
2013529901.tif 000005
【０１０５】
表３は、そのヌクレオチド種のそれぞれに関する濃度およびアピラーゼ活性の値をｄＣＴＰの値に基づいて（それはそのヌクレオチド種の中で最も低い濃度および活性の値を有するため）正規化することによる、表２からのデータの異なる方法での表現を提供する（表３中のヌクレオチド種Ａはα−チオ−ｄＡＴＰを指す）。
【０１０６】
【表３】
2013529901.tif 000006
【０１０７】
記述した態様において、その配列決定プロセスにおいて用いられるそれぞれのヌクレオチド種の濃度は、そのヌクレオチド種に関するアピラーゼ活性の相対的レベルに基づいて調節される。当業者は、アピラーゼはヌクレオチド分子を種特異的速度で消化するため、ヌクレオチド種に関する高いアピラーゼの活性は、組み込みに利用可能なヌクレオチド分子の濃度が組み込みが起こり得る前にそのアピラーゼにより実質的に低減される場合、その種に関するポリメラーゼ酵素の組み込み効率を低減させる可能性があることを理解しているであろう。従って、その種に関するヌクレオチド濃度は、高い種特異的アピラーゼ活性の作用に対抗するためにより高くなければならない。
【０１０８】
ポリメラーゼおよびアピラーゼ活性の、配列決定反応環境の外で測定されたそれらのそれぞれの速度定数を用いた概算は、反応環境、例えば記述した反応支持体の反応ウェル内で実際に生じる活性のレベルとは異なる可能性があることも理解されるであろう。しかし、それぞれのヌクレオチド種に対するアピラーゼの分解およびポリメラーゼの組み込みの組み合わせに関する全体的な酵素効率は、未処理の（すなわちデータ補正計算を適用していない）配列決定データから推測することができる。
【０１０９】
例えば、表４は、最高の配列決定性能を達成するために、個々のヌクレオチド種の完了効率および繰り越し値を用いてそれぞれのヌクレオチド種の濃度を最適化することができることを示している。この例において、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のゲノムのＤＮＡショットガンライブラリーを配列決定して、ポリメラーゼおよびアピラーゼ効率に関して最適化されたヌクレオチド種濃度を計算した。表４の２番目（ＴＡ）および３番目（ＣＧ）の縦列は、配列決定ランにおいて用いられるＴおよびＡのＣおよびＧヌクレオチド種濃度に対する相対的百分率を示し、ここで１００％濃度に関する値は表３からの計算され正規化された種相対的比率の値に基づいていてよい。例えば、表３からの数字を用いて、Ｇヌクレオチド種の１００％はその濃度比を考慮すればＣヌクレオチド種の１００％よりも１．２倍大きい。当業者は、Ｃ．ジェジュニはＡＴに富むゲノムであり、それは一般にそのゲノム組成においてＡおよびＴヌクレオチド種のＣおよびＧヌクレオチド種よりも高い出現率が存在することを意味することを理解しているであろう。従って、図４で図説するＴＡおよびＧＣ濃度に関する相対的百分率はその事実を反映しており、典型的にはＧＣに富むゲノム（すなわち、Ｔ．サーモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のゲノム）に関しては異なるであろう。
【０１１０】
それぞれの個々のヌクレオチド種の平均完了効率（すなわち不完全伸長を概算するため）および繰り越し値を、下記で詳細に記述する方法を用いて推測した。最後の縦列は得られた高品質読み取りの平均読み取り長（ＲＬ）を示し、ここで読み取り長の増大は、アピラーゼの種特異的分解効率に対するポリメラーゼの種特異的組み込み効率に関して釣り合いを取ったそれぞれのヌクレオチド種濃度の組み合わせの最適化のレベルの増大に相関している。
【０１１１】
【表４】
2013529901.tif 000007
【０１１２】
当業者には明らかであろうように、表４は、ヌクレオチド種の特定の対の濃度を増大させることはそれぞれの種に関する対応する完了効率を増大させるが、ほとんどの場合、その種に関する対応する繰り越し値も増大させることを説明している（Ｇヌクレオチド種に関する繰り越し値はこの傾向に従わなかった）。完了効率および繰り越し値の推測される値は組み合わせた酵素活性を表しており、それはポリメラーゼおよびアピラーゼそれぞれのそれぞれのヌクレオチド種に対する効率に直接関係している。ヌクレオチド種濃度の最適なセットはそれぞれのヌクレオチド種の完了効率を最大化し、繰り越し値を最小化し、それは結果として配列決定性能の尺度である最も長い平均読み取り長をもたらす。フローサイクルの数が増大するにつれて、全てのフローサイクルが一部のタイプのＣＡＦＩＥエラーが起こる可能性を増大させ、その種特異的な違いがより重要になることも理解されるであろう。
【０１１３】
個々のヌクレオチド種の平均完了効率および繰り越し値を、ヌクレオチド特異的ＣＡＦＩＥ（繰り越しおよび不完全伸長）当てはめを用いて推測した。例えば、その配列決定プロセスは、典型的には画像およびシグナル処理ソフトウェアの態様、例えばアプリケーション１３５により処理される未処理の配列の読みを生成する。この例において、アプリケーション１３５は生成された未処理の配列の読みをその配列決定された試料と関係する参照ゲノム配列、例えばＣ．ジェジュニのコンセンサス参照配列にマッピングする（ｍａｐｓ）（当業者にはアラインメントとも呼ばれる）。当業者には明らかであろうように、その未処理の修正されていない配列の読みの参照配列へのマッピング／アラインメントを用いて、どこでＣＡＦＩＥエラーが起こっているかおよびヌクレオチド種特異的ＣＡＦＩＥエラーの発生率の決定を決定することができる。
【０１１４】
本明細書で記述する実施例において、アプリケーション１３５はフローグラム（ｆｌｏｗｇｒａｍｓ）として表される２００個の修正されていない配列の読みを参照ゲノム配列にマッピングし、そのヌクレオチドフローの最初の１００回の反復はその完了効率および繰り越し値を推測することによるそのヌクレオチド種のそれぞれの最適濃度の決定に関して考慮される。その４種類のヌクレオチド種のそれぞれの検出されたシグナル強度を、まず全てのヌクレオチド種に関する１マー値（１−ｍｅｒ  ｖａｌｕｅ）の中央値を用いて正規化した。その用語“１マー中央値”は、本明細書で用いられる際、一般に単一の配列位置におけるヌクレオチド種の組み込みに応じた検出されたシグナルの程度を反映する値を指し、それはそのヌクレオチド種のそれぞれに関して実質的に同じであるべきである。典型的には、この１マー値は、鋳型核酸分子の配列決定ランの開始時に得られた検出されたシグナルから計算するのが最も容易であり、これはアダプター中のキー要素は既知の位置（すなわちＴＣＡＧキー要素）においてキー要素中にそれぞれのヌクレオチド種の１つの代表を含んでおり、従ってそれぞれの種の１個のヌクレオチドのみがその４個の配列位置のそれぞれにおいて組み込まれることが予想されるためである。
【０１１５】
表４において説明した完了効率および繰り越し値は、それぞれの個々の配列の読みに関する３段階の最小化プロセスを用いて推測することができる。第１段階において、以下の式を最小化してヌクレオチド種に依存しない完了効率および繰り越し値を得ることができる：
【０１１６】
【化２】
2013529901.tif 000008
【０１１７】
ここでｑは修正されていないフローグラム、ｖは参照フローグラム（その読みの参照配列に由来する）に由来する組み込みリスト、λはヌクレオチド種に依存しない完了効率のパラメーター、εはヌクレオチド種に依存しない繰り越し値、ＭはＣＡＦＩＥ行列、そしてｎは平均ノイズである。その組み込みリストｖはそのフローグラムの長さのベクトルであり、それはこの例では４００フローである。ｖ（ｉ）は、その参照フローグラムがフローｉにおいて１個以上の組み込みを示す場合は１であり、その参照フローグラムが組み込みを示さない場合は０である。この工程は、その平均ノイズからの陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）フロー（すなわちここでヌクレオチド種の組み込みは起こらない）の二乗偏差を最小化するパラメーター（λ，ε，ｎ）のセットを求める。その最小化は（λ，ε）＝（０．９９８，０．００５）の初期推測値を用いて行われ、ｎの初期推測値は最初の５回の陰性フロー（すなわちｖ（ｉ）＝０であるフロー）の平均正規化強度に設定される。検索は下限（λ，ε，ｎ）＝（０．９９，０，０）および上限（１，０．０５，ｍａｘ（ｑ（ｉ））  ここでｖ（ｉ）＝０である）で行われる。
【０１１８】
第２段階は、ヌクレオチド特異的完了効率および繰り越し値ならびに平均ノイズを推測することである。以下の式を最小化する：
【０１１９】
【化３】
2013529901.tif 000009
【０１２０】
その検索は初期推測値（λＴ，λＡ，λＣ，λＧ，εＴ，εＡ，εＣ，εＧ，ｎ）＝（λ１，λ１，λ１，λ１，ε１，ε１，ε１，ε１，ｎ１）を用いて開始され、ここでλ１、ε１およびｎ１は第１段階から得られた完了効率、繰り越し、および平均ノイズの値である。その検索の下限および上限は（０．９９，０．９９，０．９９，０．９９，０，０，０，０，０）および（１，１，１，１，０．０５，０．０５，０．０５，０．０５，ｍａｘ（ｑ（ｉ））  ここでｖ（ｉ）＝０である）である。
【０１２１】
第３および最終段階はそのヌクレオチド特異的完了効率および繰り越し値、平均ノイズならびに位相のずれ（すなわち、位相の同調における繰り越し変化の不完全伸長）を推測することである。以下の式を最小化する：
【０１２２】
【化４】
2013529901.tif 000010
【０１２３】
ここでφは位相のずれ（すなわちＣＡＦＩＥ作用からの位相同調エラー）である。その検索は第１段階からの初期推測値（λＴ，λＡ，λＣ，λＧ，εＴ，εＡ，εＣ，εＧ，ｎ，φ）＝（λＴ２，λＡ２，λＣ２，λＧ２，εＴ２，εＡ２，εＣ２，εＧ２，ｎ２，０）を用いて開始され、ここでλＴ２，λＡ２，λＣ２，λＧ２は第２段階で得られたヌクレオチド特異的完了効率の値であり、εＴ２，εＡ２，εＣ２，εＧ２は第２段階で得られたヌクレオチド特異的繰り越し値であり、ｎ２は第２段階で得られたノイズ値である。その検索の下限および上限はそれぞれ（０．９９，０．９９，０．９９，０．９９，０，０，０，０，０，０）および（１，１，１，１，０．０５，０．０５，０．０５，０．０５，ｍａｘ（ｑ（ｉ））  ここでｖ（ｉ）＝０，１である）である。
【０１２４】
上記の表４で列挙したヌクレオチド特異的完了効率および繰り越し値は、第３段階の計算から得られた値のセットであり、２００を超える試料を平均したものである。その完了効率および繰り越し値の変化の傾向に従ってヌクレオチド種濃度を調節することにより、ポリメラーゼおよびアピラーゼ酵素の両方ならびに配列決定条件により許容される最適なレベルまで完了効率を最大化し、繰り越し値を最小化するヌクレオチド種濃度の最適なセットを得ることができる。例えば、ヌクレオチド種濃度対ＣＡＦＩＥ作用に関して滴定曲線をプロットすることができ、それはその種特異的酵素活性レベルが含まれるその反応環境のパラメーターに関する最適なヌクレオチド種濃度を図式的に説明する。
【０１２５】
様々な態様および実施を記述したが、前記のものは単に説明的なものであり、限定するものではなく、例としてのみ示されていることは、関連技術における当業者には明らかであるはずである。説明した態様の様々な機能性要素の中の分布している機能に関して多くの他のスキームが可能である。あらゆる要素の機能は、代わりの態様において様々な方法で実施されてよい。
【符号の説明】
【０１２６】
１００  配列決定機器
１０１  使用者
１０５  反応支持体
１３０  コンピューター
１３５  アプリケーション
１５０  ネットワーク
１８０  試料調製機器
【図１】
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【国際調査報告】
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