(57)【要約】  本発明は、遺伝子発現レベルが、ＩＬ−６受容体アンタゴニスト、例えばＩＬ６−Ｒ抗体を用いた治療に対する関節リウマチ患者の治療応答と相関する、遺伝子産物バイオマーカーに関連する方法、組成物及びキットを提供する。本発明の方法、組成物及びキットは、ＩＬ−６受容体アンタゴニスト治療に対して応答性の可能性がある、又は非応答性の可能性がある関節リウマチ患者を同定するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインターロイキン−６受容体抗体を用いた治療に対する候補者である関節リウマチ患者を同定するか、又は前記治療から除外されるべきである関節リウマチ患者を同定する方法であって、以下のステップ：
患者由来の末梢血リンパ球から得られるＲＮＡ核酸試料を提供し；
ＩＬ−６受容体抗体を用いた治療に対する治療応答と関係する、表１、表２又は表３に記載された遺伝子によってコードされた少なくとも１つの遺伝子産物の発現レベルを決定すること；
を含み、ここで、前記発現レベルが閾値を越えるとき、バイオマーカーの発現レベルはヒトインターロイキン−６受容体抗体を用いた治療に対する候補者である患者の指標となるか、又は前記治療から除外されるべきである患者の指標となる、前記方法。
【請求項２】
表１、表２又は表３に記載された、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個若しくは４０個又はそれ以上の遺伝子によってコードされた遺伝子産物の発現レベルを検出するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発現レベルを決定する前記ステップが増幅反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅反応が定量ＲＴ−ＰＣＲである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＳＮＰの存在と、ＩＬ−６受容体抗体を用いた治療に対する陽性応答との相関を記録することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
患者へＩＬ−６受容体抗体を投与することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ヒトインターロイキン−６受容体抗体を用いた治療に対する候補者である関節リウマチ患者を同定するか、又は前記治療から除外されるべきである関節リウマチ患者を同定する方法であって、以下のステップ：
患者由来の血清試料、又は末梢血リンパ球由来のタンパク質を含む試料を提供し；
ＩＬ−６受容体抗体を用いた治療に対する治療応答と関係する、表１、表２又は表３に記載された遺伝子によってコードされた少なくとも１つの遺伝子産物の発現レベルを決定すること；
を含む、前記方法。
【請求項８】
表１、表２又は表３に記載された、２個又は３個以上のバイオマーカーのＲＮＡ発現レベルを検出するための、固体表面に取り付けられた２個又は３個以上の核酸プローブを含む、診断装置。
【請求項９】
表１、表２又は表３に記載された、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個若しくは４０個又はそれ以上のバイオマーカーのＲＮＡ発現レベルを検出するためのプローブを含む、請求項８に記載の診断装置。
【請求項１０】
ヒトインターロイキン−６受容体抗体を用いた治療に対する候補者である関節リウマチ患者を同定するか、又は前記治療から除外されるべきである関節リウマチ患者を同定する方法であって、以下のステップ：
患者由来の末梢血リンパ球から得られるＲＮＡ核酸試料を提供し；
表５の列Ｃにおける値が０超である、少なくとも２つの遺伝子産物の発現レベルを決定するか、又は、表５の列Ｄにおける値が０超である、少なくとも２つの遺伝子産物の発現レベルを決定するか、又は、表５の列Ｅにおける値が０超である、少なくとも２つの遺伝子産物の発現レベルを決定するか、又は、表５の列Ｆにおける値が０超である、少なくとも２つの遺伝子産物の発現レベルを決定するか、又は、表５の列Ｇにおける値が０超である、少なくとも２つの遺伝子産物の発現レベルを決定するか、又は、表５の列Ｈにおける値が０超である、少なくとも２つの遺伝子産物の発現レベルを決定するか、又は、表５の列Ｉにおける値が０超である、少なくとも２つの遺伝子産物の発現レベルを決定するか、又は、表５の列Ｊにおける値が０超である、少なくとも２つの遺伝子産物の発現レベルを決定すること；
を含み、ここで、閾値を超える前記少なくとも２つの遺伝子産物の発現レベルの線形結合が、ヒトインターロイキン−６受容体抗体を用いた治療に対する候補者である患者の指標となるか、又は前記治療から除外されるべきである患者の指標となる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）は、関節リウマチを治療するために開発された、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）を阻害する最初のヒト化モノクローナル抗体である。他の治療と同様に、抗体は、患者において様々な範囲の治療効果を示す。したがって、トシリズマブを用いた治療に対して、陽性に応答する（respond positively）可能性がより高い患者、及び／又は、当該治療に応答しない可能性が高い患者を決定する必要性がある。本発明をこの必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００２】
発明の概要
本発明は、一部分において、ＩＬ−６調節性シグナルの変換を調節する薬剤を用いた治療に対する陽性治療応答に関係している、遺伝子発現の変化の発見に基づく。当該薬剤は、例えば、当該変換を阻害する抗ＩＬ−６抗体、又はトシリズマブのようなＩＬ−６Ｒ阻害性モノクローナル抗体である。
【０００３】
したがって、１つの態様において、本発明は、トシリズマブを用いた治療に対して応答する可能性がある関節リウマチ患者を同定するか、又はトシリズマブを用いた治療に対して応答する可能性がない患者を同定する方法であって、表１、表２又は表３に記載された遺伝子の発現レベルを同定するステップを含む前記方法を提供する。かかる遺伝子は、アレイプローブセット及び増幅技術を含む、種々の技術を使用して同定され得る。マーカー遺伝子の発現レベルはその後、相関関係を証明するために使用されるデータセット中に示された発現レベルと比較される。
【０００４】
さらなる態様において、本発明は、ＩＬ−６Ｒ抗体、例えばトシリズマブの投与を含む治療計画に対してリウマチ患者の治療応答を予測するためのキットを提供する。幾つかの実施形態において、当該キットはまた、表１、表２又は表３に記載されたバイオマーカー遺伝子の、患者におけるマーカー遺伝子発現レベルを、データセットと比較するための、電子デバイス又はコンピュータソフトウェアを含む。治療応答を評価するためのエンドポイントは、関節リウマチの任意の症状であり得る。例えば、実施例１において評価されたエンドポイントであり得る。
【０００５】
幾つかの実施形態において、マーカー遺伝子は、表１に記載された遺伝子のいずれか１つである。幾つかの実施形態において、マーカー遺伝子は、表１に記載された少なくとも２つの遺伝子である。したがって幾つかの実施形態において、マーカー遺伝子は、表１に記載された２〜２０個、２〜３０個、２〜４０個、２〜５０個、２〜６０個、２〜７０個、２〜８０個又は２〜全てのいずれか１つである。
【０００６】
幾つかの実施形態において、マーカー遺伝子は、表２に記載された遺伝子のいずれか１つである。幾つかの実施形態において、マーカー遺伝子は、表２に記載された少なくとも２つの遺伝子である。したがって幾つかの実施形態において、マーカー遺伝子は、表２に記載された２〜２０個、２〜３０個、２〜４０個、２〜５０個、２〜６０個、２〜７０個、２〜８０個又は２〜全てのいずれか１つである。
【０００７】
幾つかの実施形態において、マーカー遺伝子は、表３に記載された遺伝子のいずれか１つである。幾つかの実施形態において、マーカー遺伝子は、表３に記載された少なくとも２つの遺伝子である。したがって幾つかの実施形態において、マーカー遺伝子は、表３に記載された２〜２０個、２〜３０個、２〜４０個、２〜５０個、２〜６０個、２〜７０個、２〜８０個又は２〜全てのいずれか１つである。
【０００８】
幾つかの実施形態において、バイオマーカー遺伝子の発現レベルを決定するステップは、マーカー遺伝子によって発現されたＲＮＡのレベルを測定することを含む。発現されたＲＮＡの量は、例えば、増幅領域反応（amplification area reaction）、例えばｑＰＣＲを使用することによって、又はプローブアレイを使用することによって決定され得る。例えば、プローブセットを形成する核酸アレイが、バイオマーカー遺伝子から発現されたＲＮＡを検出するために使用されてもよい。ＲＮＡ発現レベルは通常、患者から単離されたＲＮＡから転写されたｃＤＮＡレベルを測定することによって決定される。ＲＮＡ発現レベルは、発現レベルを定量するための既知のプローブセットを使用して決定され得る。当技術分野において周知である通り、かかるプローブは、対象の標的配列とハイブリダイズするマルチプルプローブを含んでもよい。或いは、マーカー遺伝子の発現は、当該遺伝子によってコードされたタンパク質の発現レベルを測定することによって決定され得る。
【０００９】
発現レベルは、標準対照データ（standard control data）、例えば実施例１及び２において得られた発現データセットと比較される。バイオマーカー遺伝子の発現が、トシリズマブのようなＩＬ−６Ｒ抗体を用いた治療に対する患者の治療応答の指標となるか否かを決定するための統計モデルを使用することによって、マーカー遺伝子の発現レベルの増大、又はバイオマーカー遺伝子の発現レベルの低下が決定されてもよい。幾つかの場合において、本発明は、治療応答の見込み（likelihood）を決定するための統計モデルの使用を行う、電子デバイス又はコンピュータソフトウェアを提供する。
【００１０】
幾つかの実施形態において、トシリズマブのようなＩＬ−６Ｒアンタゴニストを用いた治療に対して、応答性の可能性がある、又は非応答性の可能性がある関節リウマチ患者を同定するために、表５に記載された遺伝子の発現レベルが評価される。典型的な実施形態において、列（column）Ｃ、列Ｄ、列Ｅ、列Ｆ、列Ｇ、列Ｈ、列Ｉ又は列Ｊにおいて、２〜１０、２〜２０、２〜３０、２〜４０、２〜５０、２〜６０、２〜７０、２〜８０、若しくは２〜９０、又は２〜全てである遺伝子は、分析されて治療応答の見込みが決定される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本明細書中に使用される場合、「陽性の治療応答」又は「治療上の利点（therapeutic benefit）」は、関節リウマチのいずれかの症状の改善及び／又はその発症の遅れを指す。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、「陰性の治療応答」は、関節リウマチの１若しくは２以上の症状の改善の不足を指す。
【００１３】
「インターロイキン‐６受容体（ＩＬ‐６Ｒ）阻害抗体」は、その抗体がＩＬ‐６受容体に結合し、そしてＩＬ‐６受容体活性に拮抗する（すなわち、阻害する）ところのＩＬ‐６受容体に対する抗体を指す。かかる抗体の例は、関節リウマチの治療に使用されるトシリズマブ、つまり、ヒト化ＩＬ‐６Ｒモノクローナル抗体（例えば、Sato et al., Cancer Res 1993; 53: 851-6；及び米国特許第７４７９５４３号を参照）である。
【００１４】
当該発明において、「表１に記載された遺伝子」は、表１に注釈したプローブセットに相当する遺伝子を指す。同様に、表２、３、又は５「に記載の遺伝子セット」は、それぞれの表に注釈されたプローブセットに相当する遺伝子を指す。表１〜３に関しては、「代表的な公的ＩＤ」は、表１に受入番号として記載されている。「代表的な公的ＩＤ」は代表的な配列の受入番号である。コンセンサスに基づくプローブセットに関して、代表的な配列は、実施例において使用されるプローブセットの中でコンセンサス配列を構築するのに使用されるいくつかの配列（配列サブクラスター）のうちの一つにすぎないので、それがプローブ配列を導き出すのに直接使用されるわけではない。代表的な配列は、プローブセットによって照合される（interrogated）転写領域に最も関連する配列としてアレイ設計中に選ばれる。当該技術分野で理解されている通り、多くの遺伝子配列に関して天然に存在する多型（polymorphism）が存在する。本願発明の目的のための天然に存在する対立遺伝子変異である遺伝子は、同じ遺伝子座によってコードされたそれらの遺伝子である。表１、表２、又は表３に記載された遺伝子の対立遺伝子変異によってコードされたタンパク質は通常、互いに少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有している、すなわち、表１、表２、又は表３で示した遺伝子の対立遺伝子変異体は通常、その遺伝子についての表に示した受入番号によって規定されたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性、多くの場合、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、又はそれを上回る同一性を有するタンパク質産物をコードしている。例えば、Ｅｐｈ受容体Ｂ２（遺伝子：ＥＰＨＢ２、代表的な受入番号ＡＦ０２５３０４）をコードする遺伝子の対立遺伝子変異体は通常、受入番号ＡＦ０２５３０４により入手可能な配列によってコードされたＥｐｈ受容体ｂ２タンパク質に対して少なくとも９５％の同一性、多くの場合、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、又はそれを上回る同一性を有する。
【００１５】
用語「同一」又は「１００％の同一性」は、２以上の核酸又はタンパク質との関連において、同じ配列である２以上の配列又は部分配列を指す。比較し、そして規定値のパラメーターを使用した公知の配列比較アルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴを使用して計測した場合に、又は手動の整列（alignment）と目視検査によって、比較ウィンドウ又は指定された領域を通じた最大の一致のために整列させたとき、２個の配列が指定されたパーセンテージの同じアミノ酸残基又はヌクレオチドを有するのであれば、２個の配列は「実質的に同一」であるか、又は特定のパーセントの同一性（すなわち、指定された領域にわたる、若しくは指定されていないときには配列全体にわたる７０％の同一性、任意で、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の同一性）がある。
【００１６】
「遺伝子産物」又は「遺伝子発現産物」は、本願発明との関連において、遺伝子によってコードされたＲＮＡ又はタンパク質を指す。
【００１７】
関節リウマチの患者における「バイオマーカーの評価」という用語は、表１、表２、表３、又は表５で列挙した遺伝子又はその遺伝子の対立遺伝子変異体（allelic variant）によってコードされた遺伝子産物の発現レベルを決定することを指す。通常、ＲＮＡ発現レベルは確定されている。
【００１８】
序論
本発明は、一部分において、薬剤投与前又は投薬の８週間後、その遺伝子発現レベルがトシリズマブへの応答と関連する特定の遺伝子／転写産物の同定に基づいている。
【００１９】
そのため、本発明は、患者に薬物を与える前のバイオマーカーの発現レベルの計測に関する。いくつかの実施形態において、かかる転写産物を検出するプローブを、どの関節リウマチ患者がＩＬ‐６受容体アンタゴニスト、例えばＩＬ‐６受容体拮抗抗体、例えば、トシリズマブに応答するのか又は応答しないのかを予測するための診断装置の形で適用し得る。転写産物もまた、どのＲＡ患者がもっと遅い時点でトシリズマブに応答性であるかを予測するために計測され得る。さらに、実施例の項の中で、本明細書中で同定された転写産物に対して経路、細胞型又は組織発現によって関係づけられるタンパク質／代謝産物、及び／又はつながりのある転写産物及び関連産物の同定が、トシリズマブへの応答の測定のための代替バイオマーカーとして使用され得る。
【００２０】
表１、表２、又は表３に記載の遺伝子のうちの一種類の任意の遺伝子発現産物の発現レベルを計測してもよいが、しかしながら、通常、複数の遺伝子の発現が評価される。遺伝子発現レベルは、当該技術分野で知られている様々な方法を使用することで計測することができる。典型的な実施形態において、その方法はＲＮＡのレベルを計測することを伴う。ＲＮＡ発現は、例えば、ｑＰＣＲなどの定量的な増幅方法を用いた、任意の方法を使用することで定量化できる。他の実施形態において、その方法はアレイベースのアッセイを用いる。さらに他の実施形態において、タンパク質産物を検出してもよい。遺伝子発現パターンは、患者からの全血又は末梢血リンパ球試料を使用して測定される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、表１、表２、又は表３に示したバイオマーカーと同じ経路にある遺伝子によってコードされる遺伝子産物、通常ＲＮＡが定量化され得る。いくつかの実施形態において、トシリズマブによる治療の候補である関節リウマチ患者を同定するために評価される少なくとも一種類のバイオマーカーは、ＪＡＭ３、ＣＤ４１、ＣＤ６１、エフリン受容体Ｂ２から成る群から選択される。いくつかの実施形態において、評価のために選択されるバイオマーカーのうちの少なくとも１個は、ＪＡＭ３、ＣＤ４１、又はＣＤ６１であり、そして評価される第２のバイオマーカーがエフリン受容体Ｂ２である。いくつかの実施形態において、患者で評価されるバイオマーカーは、インフラマソーム、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ‐１受容体、又はＣＡＲＤ１６の構成要素（component）である。いくつかの実施形態において、評価される少なくとも１種類のバイオマーカーは、セリン・パルミトイルトランスフェラーゼ長鎖塩基サブユニット２又はスフィンゴシン‐１‐ホスフェート（Ｓ１Ｐ）、セラミド又は関連スフィンゴ脂質である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法には、列Ｃ〜Ｊのうちの１つに示された「０」超の値を有する表５の２個以上のバイオマーカーの遺伝子発現産物を解析するステップが含まれる。かかるバイオマーカーは、トシリズマブなどのＩＬ‐６Ｒアンタゴニストにおける治療に対する関節リウマチ患者の応答の可能性を予測するのに組み合せて使用できる。したがって、例えば、列Ｃに「０」超の値を有する少なくとも２個のバイオマーカー、好ましくは３個、４個、５個、又は最大１００個までの任意の数のバイオマーカーの遺伝子発現レベルの解析は、トシリズマブによる治療に対する応答を予測するのに組み合せて使用できる。同様に、「０」超の値を有する列Ｄからの少なくとも２個のバイオマーカー、好ましくは３個、４個、５個、若しくはそれ以上、又はすべてのバイオマーカーを、トシリズマブなどのＩＬ‐６Ｒアンタゴニストを用いた治療に応答する又は応答しない可能性がある関節リウマチ患者を同定するために発現レベルについて解析できる。典型的な実施形態において、より少ない数のそれらの遺伝子のそれらの発現レベルが評価される。したがって、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の値を有する列Ｃの遺伝子が、例えば、遺伝子発現解析に通常含まれる。いくつかの態様において、本発明の方法には、列Ｃの２個以上の遺伝子の発現レベルを解析し；そして列Ｄの２個以上の遺伝子又は列Ｅなどの２個以上の遺伝子について発現レベルを解析するステップが含まれる。
【００２３】
表５において、列の「ＩＤ」は、対応遺伝子のためにプローブセットを指す（表５Ｂ）。当業者は、表５Ｂ及び表５Ａの列Ｌのプローブセットの注釈がこの解析に使用されるチップのメーカー（Affymetrix）のデータベースを通して得られることを理解している。
【００２４】
ＲＮＡの定量方法
表１に記載された遺伝子によってコードされたＲＮＡの量は、ＲＮＡの定量の分野で知られている任意の方法に従って容易に測定できる。増幅反応、及び／又はプローブが固体支持体（solid support）に連結され、そしてＲＮＡを定量化するのに使用される反応を伴う様々な方法が使用できる。あるいは、ＲＮＡを固体支持体に連結し、そして着目の配列に対するプローブを使用することで定量化することもできる。
【００２５】
本発明で分析される「ＲＮＡ核酸試料」は、末梢血リンパ球から得られる。「ＲＮＡ核酸試料」にはＲＮＡが含まれているが、純粋なＲＮＡである必要はなく、例えば、ＤＮＡもまたその試料中に存在していてもよい。末梢血リンパ球からＲＮＡ試料を得る技術は、当該技術分野で周知である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡはまず逆転写され、そして得られたｃＤＮＡが定量化される。いくつかの態様において、ＲＴ‐ＰＣＲ又は他の定量的な増幅法が、標的ＲＮＡを定量化するのに使用される。ＰＣＲを使用したｃＤＮＡの増幅は周知である（米国特許第４６８３１９５号及び同第４６３８２０２号；並びにPCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS（Innis et al., eds, 1990）を参照）。定量的な増幅の方法は、例えば、米国特許第６１８３４９号；同第６０３３８５４号；及び同第５９７２６０２号、並びに、例えば、Gibson et al., Genome Research 6:995-1001 (1996)；DeGraves, et al., Biotechniques 34(1):106-10, 112-5 (2003)；Deiman B, et al., Mol Biotechnol. 20(2):163-79 (2002)に開示される。あるいは、試料中の着目のｍＲＮＡのレベルを決定するための方法は、例えば、リガーゼ連鎖反応（Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193）、自律型配列複製（Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878）、転写増幅系（Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）、Ｑβレプリカーゼ（Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197）、ローリング・サークル・レプリケーション（米国特許第５８５４０３３号）又はその他の核酸増幅法などの他の核酸増幅法と、それに続く当業者に周知の技術を使用した増幅分子の検出を伴ってもよい。
【００２７】
一般に、定量的な増幅は、増幅（例えば、ＰＣＲ）反応のサイクル中に鋳型のコピー数に相当するシグナル（例えば、プローブの蛍光）を観察することに基づいている。増幅産物の検出方法の１つは、５’‐３’エキソヌクレアーゼ「加水分解」ＰＣＲアッセイ（ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイとも呼ばれる）（米国特許第５２１００１５号及び同第５４８７９７２号；Holland et al., PNAS USA 88: 7276-7280 (1991)；Lee et al., Nucleic Acids Res. 21: 3761-3766 (1993)）。このアッセイは、増幅反応中に、二重に標識した蛍光プローブ（「ＴａｑＭａｎ（商標）」プローブ）のハイブリダイゼーションと切断（cleavage）により特異的ＰＣＲ産物の蓄積を検出する。蛍光プローブは、蛍光レポーター色素とクエンチャー色素の両方で標識されたオリゴヌクレオチドから成る。ＰＣＲの間、このプローブは、それが増幅されたセグメントにハイブリダイズした場合かつその場合に限り、ＤＮＡポリメラーゼの５’‐エキソヌクレアーゼ活性によって切断される。プローブの切断はレポーター色素の蛍光強度の増大を引き起こす。
【００２８】
エネルギー移動の使用に依存する別の増幅産物の検出方法は、Tyagi and Kramer, Nature Biotech, 14:303-309 (1996)によって記載された「ビーコンプローブ」法であり、そしてそれは、米国特許第５１１９８０１号及び同第５３１２７２８号の主題でもある。この方法は、ヘアピン構造を形成することができるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを用いる。ハイブリダイゼーションプローブの片端（５’又は３’末端のいずれか）に、ドナーフルオロフォアがあり、そしてもう一方の末端に、アクセプター部分がある。Tyagi and Kramer法の場合では、このアクセプター部分はクエンチャーである、すなわち、アクセプターはドナーによって放出されたエネルギーを吸収するが、そのとき自身は蛍光を発しない。したがって、ビーコンが開環型立体構造にあるとき、ドナーフルオロフォアの蛍光は検出可能である一方、ビーコンがヘアピン（閉鎖型）立体構造にあるとき、ドナーフルオロフォアの蛍光はクエンチされる。ＰＣＲで用いられると、（ＰＣＲ産物の鎖の一方にハイブリダイズしている）分子ビーコンプローブは「開環型立体構造」にあるので、蛍光が検出されるが、ハイブリダイズしないままで残っているものは蛍光を発しない（Tyagi and Kramer, Nature Biotechnol. 14: 303-306 (1996)）。その結果、蛍光の量は、ＰＣＲ産物の量の増加に従って増強するので、したがって、それをＰＣＲの進み具合の指標として使用できる。当業者は、他の定量的な増幅方法もまた利用可能であることを認識している。
【００２９】
核酸の定量的な増幅を実施するためのその他の様々な技術もまた知られている。例えば、いくつかの方法論では、１又は２以上のオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズしたとき、蛍光の変化が生じるように構築された１若しくは２以上のプローブオリゴヌクレオチドを用いる。例えば、かかる方法の一つは、２個のオリゴ・プローブが増幅産物にアニールする、例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）ハイブリダイゼーションプローブの蛍光共鳴エネルギー移動を利用する二重フルオロフォア・アプローチ（ＦＲＥＴ）である。前記オリゴヌクレオチドは、有効エネルギー移動に適合した距離だけ離れたフルオロフォアに頭尾（head-to-tail）方向でハイブリダイズするように設計されている。核酸に結合したか又は伸長産物内に取り込まれた際にシグナルを放つように構築された標識オリゴヌクレオチドのその他の例には：Scorpions（商標）プローブ（例えば、Whitcombe et al., Nature Biotechnology 17:804-807, 1999, and U.S. Pat. No. 6,326,145）、Sunrise（又はAmplifluor）プローブ（例えば、Nazarenko et al., Nuc. Acids Res. 25:2516-2521, 1997及び米国特許第６１１７６３５号）、並びにクエンチャーなしにシグナルを低減をもたらし、そして標的にハイブリダイズすると増大したシグナルを放つ二次構造を形成するプローブ（例えば、Ｌｕｘ ｐｒｏｂｅｓ（商標））が含まれる。
【００３０】
他の実施形態において、二本鎖ＤＮＡ内にインターカレートしたときにシグナルを生じるインターカレート剤を使用することもできる。代表的な作用物質には、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ（商標）やＳＹＢＲ ＧＯＬＤ（商標）が含まれる。これらの作用物質は鋳型特異的でないので、シグナルが鋳型特異的増幅に基づいて産生されていると仮定する。このことは、鋳型配列の融解温度が一般に、例えば、プライマー二量体などよりはるかに高くなるので、温度の関数としてシグナルを観察することによって確認できる。
【００３１】
他の実施形態において、例えば、ドットブロット又はノーザンの形式では、ｍＲＮＡを固体表面上に固定し、そしてプローブと接触させる。代替の実施形態において、例えば、ＤＮＡチップアレイでは、プローブを固体表面上に固定し、そしてｍＲＮＡを１若しくは２以上のプローブと接触させる。当業者は、着目のバイオマーカー又は他のタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出する際に使用するための既知のｍＲＮＡ検出法を容易に適合させることができる。
【００３２】
いくつかの態様において、例えば、マイクロアレイが用いられる。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時測定するための一つの方法を提供する。各アレイは、固体支持体に取り付けられた再生可能なパターンの捕獲プローブから成る。標識ＲＮＡ又はＤＮＡをアレイ上で相補的なプローブにハイブリダイズさせ、次に、レーザー走査によって検出する。アレイ上の各プローブのハイブリダイゼーション強度が測定され、そして相対遺伝子発現レベルを表す定量値に変換される。米国特許第６０４０１３８号、同第５８００９９２号、及び同第６０２１３５号、同第６０３３８６０号、並びに同第６３４４３１６号を参照。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、試料中の多くのＲＮＡの遺伝子発現様式を測定するのに特に有用である。
【００３３】
機械的な合成法を使用したこれらのアレイの合成のための技術は、例えば、米国特許第５３８４２６１号に記載されている。平面アレイ表面が使用されることが多いが、実質的にどんな形状の表面上にも又は表面が多様であってもアレイを調製できる。アレイは、ビーズ、ゲル、高分子表面、光学繊維などの繊維、ガラス又はその他の適当な基質上のペプチド又は核酸であり得る。米国特許第５７７３５８号、同第５７８９１６２号、同第５７０８１５３号、同第６０４０１９３号及び同第５８００９９２号を参照。アレイは、診断上又は包括的なデバイスの他の操作を可能にするような様式でパッケージ化され得る。
【００３４】
着目の標的配列を増幅及び検出するのに使用するためのプライマーやプローブは、周知の技術を使用して選択できる。
【００３５】
本願発明との関連において、着目のＲＮＡの「発現レベルを決定すること」は、当該技術分野で知られている、着目のＲＮＡを定量化するあらゆる方法を包含する。
【００３６】
タンパク質レベルの確認
いくつかの実施形態において、例えば、表１に記載されたバイオマーカーの遺伝子によってコードされたタンパク質の発現レベルを計測する。多くの場合、免疫学的アッセイを使用することでかかる測定を実施できる。あるいは、タンパク質発現レベルは、例えば末梢血リンパ球試料などの細胞試料を使用して測定することができるが、タンパク質の発現は血清試料を使用して通常測定される。
【００３７】
適切な技術の概要は、Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)及びHarlow & Lane, Using Antibodies (1999)に見ることができる。特異的な対立遺伝子変異体と反応するポリクロナール抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当業者に知られている（例えば、Coligan, Current Protocols in Immunology (1991)；Harlow & Lane、前掲；Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986)；及びKohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)を参照）。かかる技術には、ファージ又は同様のベクターによる組換え抗体に関するライブラリーからの抗体の選択による抗体調製、並びにウサギ又はマウスを免疫化することによるポリクロナール抗体やモノクローナル抗体の調製が含まれる（例えば、Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)；Ward et al, Nature 341:544-546 (1989)を参照）。
【００３８】
多型対立遺伝子（polymorphic allele）は様々な免疫アッセイ法で検出できる。免疫学的及び免疫学的試験手順の総説に関して、Basic and Clinical Immunology（Stites & Terr eds., 7th ed. 1991）を参照のこと。そのうえ、免疫学的アッセイは、いくつかの構成のいずれかで実施でき、そしてそれは、Enzyme Immunoassay (Maggio, ed., 1980)；及びHarlow & Lane、前掲に幅広く概説されている。一般的な免疫学的アッセイの総説に関して、Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37 (Asai, ed. 1993)；Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, eds., 7th ed. 1991)を参照のこと。
【００３９】
一般的に使用されるアッセイには、非競合アッセイ、例えば、サンドイッチアッセイ、及び競合アッセイが含まれる。通常、ＥＬＩＳＡアッセイなどのアッセイが使用できる。ポリペプチド変異体の量は、定量分析法を実施することによって測定できる。
【００４０】
他の検出方法、例えば、ＭＡＬＤＩを、直接的治療結果に関連するタンパク質の存在を検出するのに使用できる。
【００４１】
デバイスとキット
更なる態様において、本発明は、ＩＬ‐６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブなどのＩＬ‐６受容体のシグナル伝達を中和する治療薬に対する関節リウマチ患者の改善された応答性に関連している遺伝子発現産物を同定するための診断装置及びキットを提供する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、診断装置には、表１に記載されている遺伝子発現産物のうちの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、５０個、６０個、７０個、若しくは８０個、又はそのすべてを検出するためのプローブが含まれている。いくつかの態様において、本発明は、例えば、DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual, 2003, Eds. Bowtell and Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の通り、アレイスライド又はチップなどの固体支持体に取り付けられたオリゴヌクレオチドプローブを提供する。かかるデバイスの構造は、例えば、米国特許及び米国特許公開第５８３７８３２号；ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１１９９５；米国特許第５８０７５２２号；米国特許第７１５７２２９号、同第７０８３９７５号、同第６４４４１７５号、同第６３７５９０３号、同第６３１５９５８号、同第６２９５１５３号、及び同第５１４３８５４号、同第２００７／００３７２７４号、同第２００７／０１４０９０６号、同第２００４／０１２６７５７号、同第２００４／０１１０２１２号、同第２００４／０１１０２１１号、同第２００３／０１４３５５０号、同第２００３／０００３０３２号、及び同第２００２／００４１４２０号に記載の通り、当該技術分野で周知である。核酸アレイもまた、以下の参考文献の中で概説されている：Biotechnol Annu Rev 8:85-101 (2002)；Sosnowski et al, Psychiatr Genet 12(4): 181-92 (Dec. 2002)；Heller, Annu Rev BiomedEng 4: 129-53 (2002)；Kolchinsky et al, Hum. Mutat 19(4):343-60 (Apr. 2002)；及びMcGail et al, Adv Biochem Eng Biotechnol 77:21-42(2002)。
【００４３】
アレイには、固体支持体に固定された、通常合成のアンチセンス・ポリヌクレオチド又はｃＤＮＡの断片のいずれかである、多数の独特な１本鎖ポリヌクレオチドから成る。典型的なポリヌクレオチドは、好ましくは長さが約６〜６０ヌクレオチド、より好ましくは長さが約１５〜３０ヌクレオチド、そして最も好ましくは長さが約１８〜２５ヌクレオチドである。特定のタイプのアレイ又は他の検出キット／システムに関して、長さが約７〜２０ヌクレオチドしかないオリゴヌクレオチドを使用することが望ましいこともある。他のタイプのアレイ、例えば、化学発光検出技術に関連して使用されるアレイなどでは、好ましいプローブの長さは、例えば、長さが約１５〜８０ヌクレオチド、好ましくは長さが約５０〜７０ヌクレオチド、より好ましくは長さが約５５〜６５ヌクレオチド、そして最も好ましくは長さが約６０ヌクレオチドである。
【００４４】
当業者は、既知の配列情報に基づいて、検出試薬を開発し、そして表１、表２、又は表３に記載されるあらゆる遺伝子発現産物のアッセイに使用でき、しかも、かかる検出試薬をキットに組み込むことができることを認識している。「キット」という用語は、本明細書中で使用される場合、バイオマーカー検出試薬との関連において、複数のバイオマーカー検出試薬の組合せ、又は他の１若しくは２以上のタイプの部材又は部品（例えば、他のタイプの生化学的試薬、コンテナ、パッケージ、例えば商業販売のためのパッケージなど、バイオマーカー検出試薬が取り付けられた基質、電子部品など）と組合せた１若しくは２以上のバイオマーカー検出試薬といったものを指す。したがって、本発明は、これだけに限定されるものではないが、パッケージ化プローブとプライマーセット（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ／プライマーセット）、核酸分子のアレイ／マイクロアレイ（ここで、アレイ／マイクロアレイはバイオマーカー転写産物のレベルを検出するためのプローブを含んでなる）、並びに本発明の１若しくは２以上のバイオマーカーを検出するための１若しくは２以上のプローブ、プライマー、又は他の検出試薬を含むビーズを含めた、バイオマーカー検出キットとシステムを提供する。前記キットは、任意に、様々な電子機器部品を含んでいる；例えば、様々な製造業者によって提供されたアレイ（「ＤＮＡチップ」）やマイクロ流体システム（「ｌａｂ‐ｏｎ‐ａ‐ｃｈｉｐ」システム）は通常、機器部品を含んでなる。他のキット（例えば、プローブ／プライマーセット）は電子機器部品を含むことができないが、例えば、１若しくは２以上のコンテナ内にパック化された（任意に他の生化学的試薬を伴った）１若しくは２以上のバイオマーカー検出試薬を含んでなることもある。
【００４５】
いくつかの実施形態において、バイオマーカー検出キットは通常、１若しくは２以上の検出試薬、並びにアッセイ又は反応、例えば、バイオマーカー転写産物のレベルを検出するための増幅などをおこなうのに必要な他の構成要素（例えば、バッファー、酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼなど）を含んでいる。キットはさらに、標的核酸の量を測定するために手段、及びその量を標準と比べるための手段を含んでいて、そしてキットを使用して着目のバイオマーカー核酸分子を検出するための取扱説明書を含むことができる。本発明の一実施形態において、本明細書中に開示された１若しくは２以上のバイオマーカーを検出するための１若しくは２以上のアッセイをおこなうのに必要な試薬を含むキットが提供される。本発明の一実施形態において、バイオマーカー検出キット／システムは、核酸アレイ、又はマイクロ流体／ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐシステムを含めた区画化キットの形態をとる。
【００４６】
バイオマーカー検出キット／システムは、例えば、表１、表２、又は表３に記載された遺伝子でコードされた核酸分子にハイブリダイズする１若しくは２以上のプローブ、又はプローブの対若しくはセットを含むことができる。いくつかの実施形態において、２個以上のバイオマーカーの存在は、アッセイで同時に評価できる。例えば、いくつかの実施形態において、異なったバイオマーカーに対するプローブ又はプローブセットがアレイとして又はビーズ上に固定される。例えば、同じ基質に、表１、表２、又は表３に記載されるバイオマーカーのうちの少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、若しくは２０個、又はより多くを検出するためのバイオマーカープローブを含むことができる。
【００４７】
かかるアレイ又は他のキット／システムを使用して、本発明は、試験試料中の、本明細書中に記載されたバイオマーカーを同定する方法を提供する。かかる方法は通常、患者からの末梢血リンパ球から得られた核酸の試験試料を、表１、表２、又は表３に記載された遺伝子によってコードされた核酸に選択的にハイブリダイズする１若しくは２以上のプローブを含んでなるアレイとインキュベートするステップを伴う。バイオマーカー検出試薬（又は１若しくは２以上のかかるバイオマーカー検出試薬を用いるキット／システム）をインキュベートする条件は試験試料により異なる。インキュベーション条件は、アッセイで使用される形式、用いられた検出法、アッセイで用いられた検出試薬のタイプと性質に依存する。当業者は、一般的に利用可能なハイブリダイゼーション、増幅、及びアレイアッセイ形式のいずれか一つを、表１、表２、又は３に記載されたバイオマーカーを検出するために容易に適合させることができることを認識している。
【００４８】
本発明のバイオマーカー検出キットは、バイオマーカー核酸分子のその後の増幅及び／又は検出のために試験試料から核酸を調製するのに使用される構成要素を含むこともできる。
【００４９】
治療応答と相関する遺伝子発現レベル
本発明は、関節リウマチ患者がトシリズマブなどのＩＬ‐６Ｒ抗体を用いた治療に応答する可能性を評価するために遺伝子発現産物のレベルを決定する方法を提供する。男性の関節リウマチ患者でも女性の関節リウマチ患者でも遺伝子発現レベルについて解析できる。
【００５０】
特定のマーカー（例えば、治療結果における改善に関連する表１のベースライン発現マーカー）の存在は、トシリズマブなどのＩＬ‐６Ｒ抗体を用いた治療に対して陽性の治療応答を示すと予想される患者の指標となる。したがって、陽性の治療応答の可能性は、通常、遺伝子発現マーカーの量の増大と共に高まる。
【００５１】
同様に、患者は、陰性の治療結果に関連する遺伝子発現マーカー、例えば、表１に記載されたバイオマーカーのベースライン発現を有することもある。したがって、かかる患者は、ＩＬ‐６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブに対して応答しない可能性がある。通常、陰性の治療応答の可能性はバイオマーカーの量の増加と共に高まる。
【００５２】
表１、２、及び３では、「係数（co-efficient）」の列は、ベースラインＤＡＳについて調整されたＤＡＳ２８スコアの変化によって計測された応答に対する遺伝子発現値の効果を表す（表３のデータはまたベースライン血小板数についても調整されている）。係数の符号は効果の方向を表す。例えば、‐１．６という係数は、より高い発現がより良い応答に関連することを意味する。遺伝子発現値の２倍ごとの増大が、１．６単位でのＤＡＳスコアの更なる低減に相当している。同様に、正の係数は、より高い発現値がより乏しい応答（より高いＤＡＳ２８スコア）に関連することを示している。表１は、バイオマーカーのベースライン発現（すなわち、トシリズマブなどのＩＬ‐６Ｒ抗体で治療を受ける前のレベル）が治療応答の予測となるバイオマーカーを示す。したがって、例えば、表１に記載された遺伝子によってコードされた遺伝子発現産物のレベルは、関節リウマチ患者から入手された末梢血試料で決定できる。バイオマーカーの陽性／陰性群は、遺伝子発現レベルに閾値を使用することで規定される。各マーカーに関する適確な閾値は、当該技術分野で周知のアルゴリズムを使用することで決定でき、特定のプラットフォームや使用されるアッセイ、及び所望の性能パラメーター、例えば、アッセイの感度、特異性に依存する。
【００５３】
例えば、患者は、表１のバイオマーカーの発現レベルが閾値を上回れば（陽性の治療応答を示すと予測される）又は下回れば（陽性の治療応答を示さないと予測される）、ＩＬ‐６アンタゴニスト、例えば、トシリズマブに対する治療応答を示すか又は治療応答を示さない可能性が判定される。
【００５４】
表２に記載された遺伝子発現レベルの計測はまた、後の時点で、ＩＬ‐６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブなどのＩＬ‐６‐Ｒアンタゴニストでの治療に応答する患者の可能性を計測する能力を提供する。例えば、表２に記載された遺伝子セットの発現の計測はベースラインと、例えば、治療の８週間後に行われる。２つの測定値の間の遺伝子発現の変化が、例えば１６週間又は２４週間などの後の時点での応答の可能性を計算するのに使用される。ここで再び、応答における変化の閾値を適用できる。
【００５５】
あるいは、治療開始後、例えば、８週目に計測をおこなうことができ、そして所定の値に対する、観察された遺伝子発現レベルの「正規化（normalization）」を応答の予測に使用できる。
【００５６】
遺伝子発現はまた、表５で列挙された遺伝子に関しても評価できる。表５の列Ａ〜Ｊのそれぞれは、列の先頭に記した臨床応答について解析した遺伝子を表す。ＡＣＲに関して上位１００個の遺伝子を、＞０のランクで表中に列挙する。値が０であれば、遺伝子はＡＣＲには選択されない。＞０の値を示した遺伝子のうちの少なくとも２個、通常大部分、又はすべてのそれぞれの列に関して解析できる。遺伝子発現値は、表５に関連する説明の中の実施例の項の「クラス指数（class index）」に概説されているように、臨床応答の分類を予測するための同義遺伝子からの発現シグナルの線形結合（linear combination）として使用される。遺伝子発現レベルのこれらの線形結合に関する切り捨ては、当該技術分野で既知の分類アルゴリズム、例えば、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）などによって判定される（例えば、Vapnik, The Nature of Statistical Learning, Springer, NY, 1995；Cristianini & Shawe-Taylor, An Introduction to Support Vector Machines, Cambridge University Press, Cambridge, UK, 2000を参照）。
【００５７】
本発明の方法は通常、トシリズマブなどのＩＬ‐６Ｒ抗体で治療された関節リウマチ患者における有益な治療結果又は陰性の治療結果に関連している遺伝子発現産物レベルを記録することを伴う。この情報を、コンピューターが読み取り可能な形式で保存することもできる。かかるコンピュータシステムには通常、主要なサブシステム、例えば、中央処理機構、システムメモリ（通常ＲＡＭ）、入出力（Ｉ／Ｏ）コントローラ、外部デバイス、例えば、ディスプレーアダプターを介してディスプレイ画面、シリアルポート、キーボード、記憶装置インタフェイスを介して固定ディスクデバイスやフロッピー（登録商標）ディスクを受け入れるよう作動するフロッピー（登録商標）ディスクドライブなど、及びＣＤ‐ＲＯＭを受け入れるように作動するＣＤ‐ＲＯＭ（又は、ＤＶＤ‐ＲＯＭ）デバイスを通常含んでなる。多くの他のデバイスが、シリアルポートを介して接続されたネットワークインタフェースなどに接続され得る。
【００５８】
コンピュータシステムはまた、データリンク、例えば、イーサネット（登録商標）ケーブル（ｃｏａｘ又は１０ＢａｓｅＴ）、電話回線、ＩＳＤＮライン、ワイヤレスネットワーク、光ファイバー、又は他の好適な信号伝達媒体、を介して、多くの演算デバイスを含んでなるネットワークに連結されてもおり、それにより、少なくとも１つのネットワークデバイス（例えば、コンピューター、ディスクアレイなど）が、本発明のアッセイから取得したデータをコードするビットパターンを含む磁区（例えば、磁気ディスク）及び／又は荷電ドメイン（例えば、ＤＲＡＭセルのアレイ）のパターンを含んでなる。
【００５９】
コンピュータシステムは、表１に記載の遺伝子によってコードされた１若しくは２以上の遺伝子発現産物のベースラインレベルを評価する発現解析の結果を読み取るためのコードを含んでなることができる。したがって、代表的な実施形態において、中央処理機構がＩＬ‐６受容体抗体での治療に対する治療応答の傾向を測定するためのコンピュータプログラムを実行するコンピューターに、発現解析の結果を提供する。
【００６０】
本発明はまた、次の：（１）コンピューター；（２）本発明の方法で得られた発現結果をコードする保存ビットパターン、そしてそれはコンピューターに保存され得る；（３）そして任意に；（４）陽性の治療応答の可能性を判定するためのプログラム、を含んでなるコンピュータシステム、例えば、先に記載したものなどの使用を提供する。
【００６１】
本発明はさらに、関節リウマチを患っている患者の遺伝子発現産物の検出に基づき報告を作成する方法を提供する。かかる報告は、陽性又は陰性の治療結果に関連する表１に記載された遺伝子によってコードされた遺伝子発現産物の検出に基づいている。
【００６２】
ＩＬ‐６Ｒ抗体での治療に対して陽性の治療応答を有する可能性が高い患者は、陽性の治療応答に関連する表１の遺伝子発現産物の少なくとも１個を持っている。通常、そういった患者は、表１に記載された遺伝子によってコードされた産物の少なくとも２個が測定される発現様式を有している。いくつかの実施形態において、患者は、表１に記載される遺伝子のうちの３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、若しくは１０個、又はそれ以上によってコードされた産物の発現レベルについて評価され得る。
【実施例】
【００６３】
実施例１．トシリズマブで治療した関節リウマチ患者の遺伝子発現プロフィールの解析
ＤＡＳ２８スコアの変化に対する応答との関連についての遺伝子発現データの解析
【００６４】
ＡＭＢＩＴＩＯＮ研究（Jones, et al., Ann Rheum Dis 2 69:88-96, 2010）において単剤療法として８ｍｇ／ｋｇのトシリズマブを投薬する進行中のＲＡを患っている患者から採取するＲＮＡ試料を、ベースラインと投薬後８週目に採取した。２０９個の試料（１１３個のベースライン試料と９６個の「８週目」試料）を、Affymetrix GeneChip（登録商標）Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayの使用により遺伝子発現プロファイリングにかけた。
【００６５】
遺伝子発現データに対する多くの品質管理ステップの後に、２個の試料が、品質が低くいために目を引き、そして２０７個の試料を更なる解析にかけた。
【００６６】
Affymetrix ＲＭＡアルゴリズムを、更なる解析のための正規化遺伝子発現データを作成する際に使用した。高い発現レベル（最大値＞４）を有するプローブセット、かつ、より広いダイナミックレンジ（最大値−最小値＞２）を有するものだけを含んだ。最大値と最小値をすべての試料に関して求めた。線形回帰法を次の解析のために実施した。すべての解析において、１６週目における疾患活動性スコア２８（ＤＡＳ２８）の変化（ｃＤＡＳ２８）を応答エンドポイントとして使用した。最も多くのトシリズマブ臨床試験においてそこがエスケープ療法（escape therapy）のための最も早い時点であったので、１６週目を選んだ。それがｃＤＡＳに対して有意な効果を有しているので、ベースラインＤＡＳをすべての解析における共変量として使用した。
【００６７】
１．ベースライン遺伝子発現、対ｃＤＡＳ２８。１１１個の被験体を解析に組み入れた。
【００６８】
２．ベースライン発現データを使用したＬＡＳＳＯ変数選択による線形回帰法。これは、目的関数に追加されたプローブセットの係数に対してＬ１ペナルティーを加えるモデルにすべてのプローブセットを含める多変量解析法である（Tibshirani, R. (1996). J. Royal Statist. Soc B., Vol. 58(1): 267-288）。プローブセットのサブセットをモデルによって選択した。モデルによって選択されるプローブセットの数はペナルティーのレベルに依存する。最適予測を達成するために選択されるプローブセットの最適数が続いて決定される、ペナルティーの最適レベルを１０分割交差検定を使用して決定した。
【００６９】
３．８週目の遺伝子発現変化、対ｃＤＡＳ２８。９４個の被験体が解析に組み入れた。
【００７０】
４．遺伝子発現の変化を使用したＬＡＳＳＯ変数選択を用いた線形回帰法。
【００７１】
５．ベースライン血小板に関して調整したベースライン遺伝子発現、対ｃＤＡＳ２８。
【００７２】
活性化された血小板発現遺伝子、例えば、ＩＴＧＡ２Ｂ（ＣＤ４１）、ＩＴＧＢ３（ＣＤ６１）、ＪＡＭ３、を示す多くのプローブセットを同定した解析（１）は、ｐ値によって順序付けられたデータリストの冒頭に存在している（表１を参照）。これらの遺伝子の発現はＣＤＡＳ２８と相関関係がある。
【００７３】
この観察は、ＤＡＳ２８の変化に対するベースライン血小板数の回帰解析をうながした。解析は、それほど大きくなかったが、ベースライン血小板数との統計的に有意なつながりを実証した。はるかに強い効果サイズは、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＢ３、ＪＡＭ３ＢのｃＤＡＳ２８に対する相関関係を通して注目され、そして血小板活性化のマーカーが血小板数よりも優れた応答の予測因子であることを示唆した。
【００７４】
解析（１）によって、ＥＰＨＢ２（エフリン受容体Ｂ２）のベースライン発現レベルがｃＤＡＳ２８に相関関係を有することが見つけ出された。ＥＰＨＢ２は、細胞の付着と遊走を調整するシグナルを変換し、そしてＲＡにおいて滑液線維芽細胞と滲出液リンパ球において、ＯＡからのそれらに比べてより高いレベルで発現される。そのリガンドであるＥｐｈｒｉｎＢ１は、健康対照者に比べてＲＡ末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中により高いレベルで発現される。
【００７５】
組換えＥｐｈｒｉｎＢ１は、正常なＰＢＬに高い遊走とＴＮＦ産生を示すように刺激し、そしてＲＡ滑液細胞にはＩＬ‐６を産生するように刺激する。これらの結果は、それもまたトシリズマブに対する応答を予測するための有用なバイオマーカーであることを示唆している。
【００７６】
我々は、解析（１）で観察された血小板発現遺伝子のｃＤＡＳとの高い相関関係が他の重要な応答シグナルの同定を「マスキング」している可能性があると推論した。そのため、回帰モデルにおける血小板数のベースライン補正を実施した。この解析から、ＮＡＬＰ１インフラマソームの４個の構成要素のうちのｐ値によって順序付けした３個を同定した。インフラマソームは、炎症誘発性カスパーゼの活性化を媒介する多タンパク質細胞質複合体である。ＮＡＬＰ１インフラマソームは、カスパーゼ１とカスパーゼ５を活性化する。カスパーゼ１は、プロＩＬ‐１βを切断してＩＬ‐１βとし、また、ＩＬ‐１８と潜在的ＩＬ‐３３を活性化する。我々はさらに、ＣＡＲＤ１６のベースライン発現の会合、カスパーゼ１の負の調節因子、及びＩＬ‐１受容体のベースライン発現のｃＤＡＳとの関連を同定した。ＩＬ‐１β／ＩＬ‐１８／ＩＬ‐３３の血清レベルと先に同定した転写産物の遺伝子発現特性もまた、トシリズマブに対する応答を予測するバイオマーカーとして使用できる。
【００７７】
解析（３）から、トシリズマブ投与から８週間後の遺伝子発現の変化によって応答を予測するのに使用できる多くの転写産物を同定した（表２）。これらには、カスパーゼ１、ＩＬ‐１β／ＩＬ‐１８／ＩＬ‐３３経路との関連性（及び前記（４）を参照）、セリン・パルミトイルトランスフェラーゼ、長鎖塩基サブユニット２、セラミドやスフィンゴシン‐１‐ホスフェート（Ｓ１Ｐ）などの分子のデノボ・スフィンゴ脂質生合成との関連性、並びに血小板発現遺伝子、例えば、ＣＤ４１、ＣＤ６１、及びＪＡＭ３などが含まれる。
【００７８】
Ｌａｓｓｏ変数選択多変量法（解析２及び４）は、様々な「構成要素」が応答の予測にそれぞれ寄与する転写産物の同定を可能にする。プローブセットの最適数（それぞれｎ＝１２とｎ＝１３）を１０分割交差検定によって決定した。この解析で、予測的バイオマーカーとして使用できる多くの遺伝子を同定した。
【００７９】
これらの解析によって同定したプローブセット／遺伝子の一覧を表１に示す。表１のｃＤＡＳ、対ｂＥｘｐは、そのベースライン発現がトシリズマブ治療応答の予測となるプローブセット／遺伝子を含んでいる。この一覧は、９５個のプローブセットから成り、そのうち１２個はマッピングされておらず、残りのプローブセットは７２個の独特な遺伝子記号にマッピングされた。プローブセットの中で、両解析によって同定された５つのプローブセットを含め、８８個を一変量線形回帰法（解析１）によって同定し、そして、１２個を、多変量ＬＡＳＳＯ解析（解析２）を使用することで同定した。
【００８０】
表２のｃＤＡＳ、対ｃＥＸＰは、トシリズマブ治療応答の予測となるベースラインから８週目までプローブセット／遺伝子発現の変化を含む。この一覧は、１０４個のプローブセットから成り、そのうちの６個はマッピングされておらず、残りのものは９２個の独特な遺伝子記号にマッピングされた。プローブセットの中で、両解析によって同定された６つのプローブセットを含めて、９７個は一変量線形回帰法（解析３）によって同定し、そして、１３個は多変量ＬＡＳＳＯ解析（解析４）を使用することで同定した。
【００８１】
表３（ｃＤＡＳ、対ｂＥＸＰ、血小板に関して補正）はベースライン血小板数と組み合わせたベースライン発現がトシリズマブ治療応答の予測となるプローブセット／遺伝子を含む。この一覧は、８１個のプローブセットから成り、そのうち１０個はマッピングされておらず、残りのものは６１個の独特な遺伝子記号にマッピングされた。プローブセットのすべてを一変量線形回帰解析（解析５）によって同定した。
【００８２】
バイオマーカーのすべてを、一変量的に使用しても、多変量モデル内に組み合せて使用してもよい。
【００８３】
実施例２．トシリズマブに対する強い応答の予測値を有するプローブセット群の同定
トシリズマブに対する強い応答（すなわち、ＡＣＲ応答やＥＵＬＡＲ応答）の予測値を有するプローブセット群を同定する解析もまたおこなう。
【００８４】
２０９個のＣＥＬファイル（Affymetrix発現データファイル）をトシリズマブによって治療した患者について作成した。２個のＣＥＬファイルを技術的な理由によりデータセットから除外した。残った２０７個のＣＥＬファイルのうち１１１個をベースラインの時点で試料用とした。この実施例は、データセットＮ１１１に注目する。
【００８５】
我々は、表４に示す米国リウマチ学会（ＡＣＲ）の４つのクラスの応答を検討した。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
我々はまた、１６週目の欧州リウマチ学会（ＥＵＬＡＲ）の３つのクラスの応答（１が応答なし、２が中程度、そして、３が良好な応答）も検討した。ＤＡＳ２８の開始時とＤＡＳ２８の１６週目との変化（「ｄＤＡＳ２８」又は「ｃＤＡＳ２８」）、並びに１６週目のＤＡＳ２８も評価した。ＤＡＳ２８で１つの欠測データ点があり、そのため、我々は１６週目のＤＡＳ２８とｃＤＡＳ２８についてデータセットＮ１１０を持っている。
【００８８】
１６週目のＤＡＳ２８に関しては、我々は、ＤＡＳ２８値ｘ＞＝４（応答なし）を有するクラスとしてＣ１を、２．６〜４の範囲のｘを有するクラスとしてＣ２を、そして２．６＜ｘ（良い応答）を有するクラスをＣ３と規定する。ΔＤＡＳ２８に関しては、我々は、ΔＤＡＳ２８値ｙ＜＝２．５（低い応答性）を有するクラスとしてＣ１を、２．５〜３．６の範囲内にあるｙを有するクラスとしてＣ２を、そしてｙ＞３．６（良い応答）を有するクラスとしてＣ３を規定する。
【００８９】
前記のクラス指定のすべてにおいて、Ｃ１は低い応答性を有する群を表し、そしてＣ４（ＡＣＲ）又はＣ３（他の指標）は優れた応答を示す群を表す。Ｃ２（又はＡＣＲのＣ２及びＣ３）は中程度の応答のクラスである。
【００９０】
プローブセット選択のためのアプローチ
各指標（ＡＣＲ、ＥＵＬＡＲ、ΔＤＡＳ２８、及び１６週目のＤＡＳ２８）について、我々はＤｎ３発現シグナル（Liu, et al., J. Theortical Biol 243:273-278, 2006；及び係属中の米国特許出願第１２／５７８４１７号を参照）と２つの異なった組み分け方法を使用した。一つの組み分けが、低い応答性クラス、対他のクラス（良好及び中程度の応答性クラス）である。もう片方の組み分けは、極端なクラス（低い応答性クラス、対良好な応答性クラス）だけを使用するためのものである。最初の組み分け方法のための試料サイズは、以前に定められたＮ１１１又はＮ１１０である。極端なクラスの組み分けのための試料サイズは、Ｎ６２（ＡＣＲ）、Ｎ４５（ＥＵＬＡＲ）、Ｎ７０（１６週目のＤＡＳ２８）及びＮ８０（ΔＤＡＳ２８）である。
【００９１】
（完全一致とミスマッチの強さの違いを使用してＭＡＳ５を改善した）Ｄｎ３シグナルは通常、分類法結果に関してロバスト（robust）である。完全性に関して、我々はまた、（ＲＭＡに対する完全一致強度と類似だけを使用した）Ｐｎ３シグナルを用いて選択したプローブセットも含む。
【００９２】
それぞれ方法を分類するために、我々は、ｔ統計量の絶対値を計算し、そしてｔ統計量の最も高い絶対値を有する上位１００個のプローブセットを選択した。４つの異なった指標、２個の異なったシグナル、及び２つの異なった組み分け法（合計８群）に関するそれらの合併は、６２８個のプローブセットを含み、そして表５に列挙されている。「４つの異なった指標の合併」に関して、その４つの異なった指標（又は４つの異なったタイプの応答）は、ＡＣＲ、ＥＵＬＡＲ、ＤＡＳ及びｃＤＡＳである。合併とは、反復したものをカウントすることのない、すべてのプローブセットの組み合せである。例えば、セット１が｛１、３、５、７、９｝であり、セット２が｛１、２、３、４｝であり、セット３が｛３、５｝であり、セット４が｛９、１０、１１｝であれば、そのとき、これらの４セットの合併は｛１、２、３、４、５、７、９、１０、１１｝である。
【００９３】
表５の説明
表５において、「Ｎ１：５４６３０」という最初の列は、ＨＧ Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０マイクロアレイ上でヒト遺伝子を標的とする５４６３０個のプローブセットの１塩基表記を列挙している。「ＩＤ」という第２列は、AffymetrixプローブセットのＩＤを列挙している。
【００９４】
隣の８つの列は、８群のプローブセットの順位、及びプローブセットが特定の群に選択されるという情報が提供される。列名は、指標名前（indicator name）、試料サイズ、及びシグナル（Ｄｎ３）である。値０は、プローブセットが特定の群で選択されていないことを意味する。値１〜１００は選択したプローブセットのランクを与え、ここでは、１が最高のもの（最も有効）である。
【００９５】
「平均スコア(average score)」という列は、前の８つの列の集計に関するスコアを提供する。値０は、スコアに全く貢献していない（すなわち、スコアは０である）。他のすべての値（１〜１００）について、（差は１〜１００の範囲内にあるが、逆順では、最大の差である１００が最も有意なランク１に相当するように）我々は計算した（１０１−値）。我々は、８つの列に関して平均スコアを計算し、そして列のすべての平均スコアを列挙した。通常、スコアが高ければ高いほど、すべての群に関してより重要なプローブセットである。
【００９６】
「遺伝子記号(gene symbol)」及び「遺伝子名(gene title)」という列は、選択したプローブセットに関する注釈をAffymetrixウェブサイトから提供する。
【００９７】
表５に関して、表５の列Ｃ〜Ｊで同定した遺伝子の各群を、行００８０〜００８４の「クラス指標」の説明に概説されている臨床応答を予測するために同義遺伝子からの発現シグナルの１若しくは２以上の線形結合を形成するのに使用できる。遺伝子発現レベルのこれらの線形結合のための切り捨ては、例えば、サポートベクターマシン（SVM, The Nature of Statistical Learning, Springer, NY, 1995；Cristianini and Shawe-Taylor, An Introduction to Support Vector Machines, Cambridge University Press, Cambridge, UK, 2000）などの分類アルゴリズムによって決定される。表５に関して、それぞれの表示は数を示し；（同じ列の中で）０より大きい数を有する少なくとも２個の遺伝子の発現を使用できる。
【００９８】
以下の実施例３及び４は、ＩＬ‐６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブなどのＩＬ‐６Ｒアンタゴニストを用いた治療に対する患者の応答を予測するのに、２個及び３個の遺伝子転写物がどのように使用されるかに関する例を提供する。当該技術分野で理解されている通り、本明細書中に同定した追加の遺伝子、例えば、表１、表２、又は表３に記載されるそれらに相当するプローブセットを伴った多変量モデルを利用できる。
【００９９】
実施例３．応答レベルを予測するための３つのプローブセットの組合せ
患者のベースライン血液試料中の遺伝子転写物を、AffymetrixヒトゲノムＵ１３３プラスｖ２アレイを使用して計測する。未加工データファイルを、アルゴリズムが引き出した１セットの参照試料からのデータに対して正規化する。患者がメトトレキサート（ＭＴＸ）と併用して８ｍｇ／ｋｇにてトシリズマブ（ＴＣＺ）治療を受けるのであれば、この実施例では、３つのプローブセット１２３４５＿ａｔ、１２３４６＿ａｔ、及び１２３４７＿ａｔ（ｅ１、ｅ２、及びｅ３と示される）について、遺伝子転写レベル（ＲＭＡタイプのデータ）の発現が抽出され、そしてベースラインＤＡＳ２８スコア（ｃＤＡＳ）から２４週目の変化を予測するための線形モデルに使用される。
【０１００】
ＴＣＺ治療に関して：ｃＤＡＳ＝ａ０*ＤＡＳ＿ベースライン＋ａ１*ｅ１＋ａ２*ｅ２＋ａ３*ｅ３
【０１０１】
患者に関するＤＡＳの予測平均変化は１〜−７であり、ベースラインＤＡＳ並びにｅ１、ｅ２、及びｅ３の遺伝子発現値に依存する。患者がＭＴＸのみでの治療を受けたのであれば、ＤＡＳの予測平均変化は以下の通り与えられる：
【０１０２】
ＭＴＸ治療に関して：ｃＤＡＳ＝ｂ０*ＤＡＳ＿ベースライン
【０１０３】
ＤＡＳの予測平均変化は０〜−３であり、患者のベースラインＤＡＳだけに依存する。
【０１０４】
そして、各患者の治療選択を、これらの予測の差に基づいて行う。例えば、患者Ａがトシリズマブに対して−４．５、及びＭＴＸに対して−２のＤＡＳにおける予測変化がある場合には、医師はＴＣＺ治療を薦めることができる。患者Ｂが、ＴＣＺに対して−３、及びＭＴＸに対して−２．５のＤＡＳにおける予測変化がある場合には、わずかな追加的治療効果が別途費用とあらゆる潜在的リスクに値しない可能性があるので、医師はＭＴＸでの治療を薦めることができる。
【０１０５】
実施例４．治療に対する患者の応答を予測するための２つの転写産物の組み合せ
患者のベースライン血液試料中の２つの遺伝子の発現レベルを、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して計測する。相対発現レベルをΔＣＴによって表す。バイオマーカー群を以下の通り規定する：
【０１０６】
陽性：ａ１*ΔＣＴ１＋ａ２*ΔＣＴ２＞＝２．１
陰性：ａ１*ΔＣＴ１＋ａ２*ΔＣＴ２＜２．１
【０１０７】
バイオマーカー陽性の患者は、バイオマーカー陰性の患者と比較して、トシリズマブ治療でのより高い奏功率を有する可能性が高いが（５５％対３８％のＡＣＲ５０奏功率）、３５％のＡＣＲ５０奏功率を有するメトトレキサートで治療されるときには、両群は同じような奏功率を有する。
【０１０８】
本明細書中に記載した実施例及び実施形態は例示のためだけのものであること、並びにそれを考慮した様々な修飾形態又は変形形態が当業者に示唆され、そしてそれが本出願の要旨と権限、及び添付の請求項の範囲内に含まれることは理解されている。
【０１０９】
【表２】
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【０１１０】
【表３】
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【０１１１】
【表４】
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【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
【表６】
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【０１１４】
【表７】
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【０１１５】
【表８】
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【０１１６】
【表９】
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【０１１７】
【表１０】
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【０１１８】
【表１１】
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【０１１９】
【表１２】
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【０１２０】
【表１３】
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【０１２１】
【表１４】
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【０１２２】
【表１５】
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【０１２３】
【表１６】
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【０１２４】
【表１７】
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【０１２５】
【表１８】
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【０１２６】
【表１９】
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【０１２７】
【表２０】
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【０１２８】
【表２１】
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【０１２９】
【表２２】
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【０１３０】
【表２３】
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【０１３１】
【表２４】
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【０１３２】
【表２５】
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【０１３３】
【表２６】
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【０１３４】
【表２７】
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【０１３５】
【表２８】
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【０１３６】
【表２９】
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【０１３７】
【表３０】
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【０１３８】
【表３１】
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【０１３９】
【表３２】
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【０１４０】
【表３３】
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【０１４１】
【表３４】
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【０１４２】
【表３５】
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【０１４３】
【表３６】
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【０１４４】
【表３７】
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【０１４５】
【表３８】
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【０１４６】
【表３９】
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【０１４７】
【表４０】
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【０１４８】
【表４１】
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【０１４９】
【表４２】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年1月8日(2013.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2013529089.tif 000044
2013529089.tif 000045
2013529089.tif 000046
2013529089.tif 000047
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