(57)【要約】  本発明は、維持、細胞仕様、細胞決定、幹細胞運命の誘導、細胞分化、細胞脱分化、および細胞分化転換などの細胞運命の修飾因子を同定および立証する組成および方法を提供する。本発明は、レポ-タ-核酸コンストラクト、そのようなコンストラクトを含む宿主細胞、およびそのような細胞およびコンストラクトを使用した方法に関連する。本発明は、蛍光発生オリゴヌクレオチドを使用する１個または複数のレポ-タ-核酸コンストラクトを含む細胞を産生する方法に関連する。これらの方法は高処理量のスクリ-ンに関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸コンストラクトであって、
（ａ）ＯＲＦが細胞型関連（ＣＴＲ）プロモータと機能的に連結するレポ-タ-をコ-ド化する前記翻訳領域（ＯＲＦ）、および
（ｂ）標的配列ＲＮＡ１（「ＴＳＲ１」）をコ-ド化する塩基配列、を含むコンストラクト。
【請求項２】
標的配列ＲＮＡ２（「ＴＳＲ２」）をコ-ド化する塩基配列さらに含む請求項１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項３】
標的配列ＲＮＡ３（「ＴＳＲ３」）をコ-ド化する塩基配列をさらに含む請求項２に記載の核酸コンストラクトであって、前記ＴＳＲ３が前記レポ-タ-と同時転写される核酸コンストラクト。
【請求項４】
前記ＣＴＲプロモータが幹細胞プロモータである請求項１、２、または３に記載の核酸コンストラクト。
【請求項５】
前記ＣＴＲプロモータが細胞内で背景レベルより上に活性化する請求項３に記載の核酸コンストラクトを有する宿主細胞。
【請求項６】
前記ＣＴＲプロモータが細胞内で背景レベルより上に活性化しない請求項３に記載の核酸コンストラクトを有する宿主細胞。
【請求項７】
前記ＣＴＲプロモータが細胞内で背景レベルより上に活性化する請求項４に記載の核酸コンストラクトを有する宿主細胞。
【請求項８】
前記ＣＴＲプロモータが細胞内で活性化しない請求項４に記載の核酸コンストラクトを有する宿主細胞。
【請求項９】
ＣＴＲ因子をコ-ド化する組換え型核酸さらに含む請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
ＣＴＲ因子をコ-ド化する組換え型核酸さらに含む請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
ＣＴＲ因子をコ-ド化する組換え型核酸さらに含む請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
ＣＴＲ因子をコ-ド化する組換え型核酸さらに含む請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
組換え型細胞を産生する方法であって、
（ａ）請求項３に記載の核酸コンストラクトを細胞に導入するステップ、
（ｂ）ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、およびＴＳＲ３に相補的な蛍光発生オリゴヌクレオチドを前記細胞に導入するステップ、および
（ｃ）背景レベルより上で、ＴＳＲ１およびＴＳＲ２を転写しかつＴＳＲ３を転写しない細胞を選択するステップ、
を含む方法。
【請求項１４】
組換え型細胞を産生する方法であって、
（ａ）請求項３に記載の核酸コンストラクトを細胞に導入するステップ、
（ｂ）ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、およびＴＳＲ３に相補的な蛍光発生オリゴヌクレオチドを前記細胞に導入するステップ、および
（ｃ）背景レベルより上で、ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、およびＴＳＲ３を転写する細胞を選択するステップ、
を含む方法。
【請求項１５】
前記ＣＴＲプロモータが幹細胞プロモータである請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
細胞型の修飾因子を同定する方法であって、
（ａ）請求項６に記載の細胞を化合物に接触させるステップ、および
（ｅ）前記レポ-タ-の活性または発現レベルを測定するステップ
を含む方法であって、；
前記化合物の非存在下で前記レポ-タ-の活性または発現レベルのそれぞれと比較して、前記化合物の存在下で前記レポ-タ-の活性または発現レベルが増加または減少するならば前記化合物が細胞型の修飾因子である方法。
【請求項１７】
細胞型の陽性修飾因子を同定する方法であって、
（ａ）請求項７に記載の細胞を化合物に接触させるステップ、および
（ｅ）前記レポ-タ-の活性または発現レベルを測定するステップ
を含む方法であって、
前記化合物の非存在下で前記レポ-タ-の活性または発現レベルのそれぞれと比較して、前記化合物の存在下で前記レポ-タ-の活性または発現レベルが増加するならば前記化合物が細胞型の陽性修飾因子である方法。
【請求項１８】
前記ＣＴＲプロモータが幹細胞プロモータである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＴＲ因子をコ-ド化するＣＴＲ因子または組換え型核酸を前記細胞に導入するステップをさらに含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＴＲ因子をコ-ド化するＣＴＲ因子または組換え型核酸を前記細胞に導入するステップをさらに含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＴＲ因子をコ-ド化するＣＴＲ因子または組換え型核酸を前記細胞に導入するステップをさらに含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＴＲプロモータが筋細胞特異的プロモータである請求項１、２、または３のいずれかに記載の核酸コンストラクト。
【請求項２３】
前記筋細胞特異的プロモータが活性化する請求項２２に記載の核酸コンストラクトを含む宿主細胞。
【請求項２４】
前記筋細胞特異的プロモータが、背景レベルより上に活性化しない請求項２２に記載の核酸コンストラクトを含む宿主細胞。
【請求項２５】
ＣＴＲ因子をコ-ド化する組換え型核酸をさらに含む請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
ＣＴＲ因子をコ-ド化する組換え型核酸をさらに含む請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
筋細胞分化の修飾因子を同定する方法であって、：
（ａ）請求項２３に記載の宿主細胞を化合物に接触させるステップ、および
（ｅ）前記レポ-タ-の活性または発現レベルを測定するステップ
を含む方法であって、
前記化合物の非存在下で前記レポ-タ-の活性または発現レベルのそれぞれと比較して、前記化合物の存在下で前記レポ-タ-の活性または発現レベルが増加または減少するならば前記化合物が筋細胞分化の修飾因子である方法。
【請求項２８】
筋細胞分化の陽性修飾因子を同定する方法であって、
（ａ）請求項２４に記載の宿主細胞を化合物に接触させるステップ、および
（ｅ）前記レポ-タ-の活性または発現レベルを測定するステップ
を含む方法であって、
前記化合物の非存在下で前記レポ-タ-の活性または発現レベルのそれぞれと比較して、前記化合物の存在下で前記レポ-タ-の活性または発現レベルが増加するならば前記化合物が筋細胞分化の陽性修飾因子である方法。
【請求項２９】
ＴＳＲ１をコ-ド化する前記塩基配列が恒常的活性型プロモータと機能的に連結する請求項１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項３０】
ＴＳＲ１およびＴＳＲ２をコ-ド化する前記塩基配列が恒常的活性型プロモ-タと機能的に連結する請求項２または請求項３に記載の核酸コンストラクト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／２３０，５８１号の優先権を主張し、この開示は、参照により本明細書に完全に組みこまれる。
【０００２】
本発明は、維持、細胞特異化、細胞運命決定、幹細胞運命の誘導、細胞分化、細胞脱分化、および細胞分化転換などの細胞運命の修飾因子を同定および検証するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
動物の発育期に発生する、および成人期にある程度発生する細胞型の特異化は、遺伝子発現における量的および質的な差の両方に応じて決まる（例えば、Ｌｏｄｉｓｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２０００を参照されたい）。ある種の遺伝子は、ある特定の細胞型または細胞系統のみに発現し、細胞型の特異化において重要である。ハウスキーピングタスク、または全ての細胞型の基礎となるプロセスに関与する遺伝子は、一般的に、より普遍的に発現する。転写の調節は、転写因子および補因子と遺伝子プロモータとの相互作用、並びに基本的な転写機構を含む、遺伝子発現調節の広汎な形態である。ゲノムまたは染色体のリモデリングも転写調節に寄与する可能性がある。
【０００４】
転写調節は、幹細胞での遺伝子発現の調節において重要なプロセスで-あり、細胞運命、すなわち、細胞の特異化、細胞の運命決定、および細胞分化において決定的な役割を果たす。転写制御は、胚性幹細胞（「ＥＳＣ」）において、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇを含めたいくつかの「主要調節因子」−特異的にＥＳＣで発現するが、分化した組織では発現しない転写因子−によって維持される（例えば、ＣｏｌｅおよびＹｏｕｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、２００８、７３：１８３〜１９３を参照されたい）。Ｏｃｔ４−Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇは互いに協力して働き、同じ遺伝子セットの上流のプロモータ領域に共に結合することも多い（例えば、Ｌｏｈ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００６、３８：４１３〜４４０を参照されたい）。
【０００５】
Ｏｃｔ４−Ｓｏｘ２は、未分化のＥＳＣに特異的に発現し、安定なヘテロ二量体を形成する。Ｏｃｔ４の発現は、幹細胞の多能性の維持に必須であり、幹細胞マーカーとしての機能を果たし得る。Ｏｃｔ４がない場合、多能性幹細胞は栄養芽層系統に逆戻りする。
【０００６】
プロモータ上のＯｃｔ４−Ｓｏｘ２結合部位は、典型的には互いに隣接している。Ｓｏｘ２は、典型的には、コンセンサス配列ＣＡＴＴＧＴＡを有する「Ｓｏｘエレメント」に結合し、Ｏｃｔ４は、コンセンサス配列ＡＴＧＣＡＡＡＡを有する「Ｏｃｔエレメント」に結合する。これら２つのモチーフはＤＮＡ配列中で近接している可能性があり、順方向または逆方向に存在している可能性がある。
【０００７】
Ｏｃｔ４のプロモータ領域は、よく特徴付けられている（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＰ０００５０９）。この領域は、転写開始部位を基準として−３９１７から＋５５塩基対（ｂｐ）までを包含する（例えば、Ｎｏｒｄｈｏｆｆら、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ、２００１、１２：３０９〜３１７を参照されたい）。最小プロモータ領域は、転写開始部位の最初の２５０ｂｐ以内にあり、エンハンサー、および、リプレッサーエレメントなどの他の調節エレメントはさらに上流にある。プロモータ領域全体は、問題とする遺伝子を含有するレポーター構築物の、組織特異的および細胞特異的な発現を駆動することができる（例えば、Ｇｅｒｒａｒｄら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００５；２３：１２４〜１３３を参照されたい）。
【０００８】
Ｎａｎｏｇ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＴ＿００９７１４、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣ００６５１７）の発現は、Ｎａｎｏｇプロモータによって駆動される。このＮａｎｏｇプロモータ領域は、およそ４００ｂｐ（転写開始部位を基準として−２８９から＋１１７ｂｐ）を包含する（例えば、Ｒｏｄｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５、２８０（２６）：２４７３１〜２４７３７を参照されたい）。Ｎａｎｏｇプロモータ内のおよそ２００ｂｐの領域は、高度に保存されている。この保存された領域は、互いに隣接し、いずれも逆方向である、「Ｓｏｘエレメント」（ＣＡＴＴＧＴＡ）および「Ｏｃｔエレメント」（ＡＴＧＣＡＡＡＡ）を含有する。こうしたエレメントは、Ｓｏｘ２−Ｏｃｔ４ヘテロ二量体の結合部位である。
【０００９】
このプロモータ領域は、問題とする遺伝子のＥＳＣ特異的な発現を駆動するために使用することができる。例えば、このプロモータ領域をｅＧＦＰレポーターの上流に付加すると、内在性Ｎａｎｏｇと同一な発現パターンをＥＳＣで駆動する（例えば、Ｒｏｄｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５、２８０（２６）：２４７３１〜２４７３７を参照されたい）。
【００１０】
幹細胞は、分割して、同一の発生能を有することができる娘細胞、および／または、より制限された（例えば分化した）発生能を有する娘細胞を生じさせる、自己複製細胞である（例えば、Ｌｏｄｉｓｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２０００を参照されたい）。幹細胞は、胎児および成人の体の様々な組織にも少数を見出すことができる。幹細胞は、他の供給源から得ることができる。例えば、新生児の臍帯は血液幹細胞の供給源である。幹細胞は、その能力−すなわち、産生可能な細胞型の数や範囲−に関して記載されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００８、４３８：３〜８を参照されたい）。組織幹細胞は定義された組織を再配置させる能力があるのに対して、多能性幹細胞は３種全ての胚葉−内胚葉、中胚葉、および外胚葉−を生じさせる能力がある（例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００９、２２０（１）：２１〜９を参照されたい）。ＥＳＣなどの多能性幹細胞も、自己複製する能力を有する。ＥＳＣは胚盤胞の内部細胞塊に由来する。
【００１１】
最近では、ＥＳＣにおける幹細胞状態の維持に重要であることが知られている遺伝子の混合物（すなわち、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４、およびＳｏｘ２）を発現させると、成熟細胞または体細胞を、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞と呼ばれる、ＥＳＣと区別がつかない細胞に再プログラミングできることが示されている（例えば、Ｗｏｌｔｊｅｎら、（２００９）Ｎａｔｕｒｅ、４５８：７６６〜７７０を参照されたい）。ＥＳＣとｉＰＳ細胞は、いずれもｉｎ  ｖｉｔｒｏで幹細胞の状態に長期間維持することができる。いずれの細胞型も、マウスに注入したときに、３種全ての胚葉に由来する細胞を含有する奇形腫、腫瘍を生じさせる。
【００１２】
成人では、維持および修復の過程で定義された組織を再配置させる能力がある幹細胞が、各組織に存在すると考えられている（例えば、Ｐｅｋｏｖｉｃら、Ｊ．Ａｎａｔ．、２００８、２１３（１）：５〜２５を参照されたい）。造血幹細胞（ＨＳＣ）は骨髄内に存在し、赤血球、マクロファージおよび他の免疫細胞を含めた、血中および骨髄中の全ての細胞を生じさせる能力がある（例えば、Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＩＬ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２００１、１７：３８７〜４０３を参照されたい）。「サイドポピュレーション」または「ＳＰ」と呼ばれる、血液または骨髄からのＨＳＣの特殊な型は、ＣＤ３４−／ｌｏｗ、ｃ−Ｋｉｔ＋、およびＳｃａ−１＋として記載されている（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら、（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０７（１１）：１３９５〜１４０２を参照されたい）。
【００１３】
他の明確に定義された成人幹細胞集団には、神経幹細胞、腸幹細胞、間葉系幹細胞、内皮幹細胞、脂肪幹細胞、嗅覚幹細胞、および皮膚幹細胞が含まれる。こうした細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、幹細胞状態を維持する上での重要な役割を果たす、明確に定義された「ニッチ」環境に存在する。成人幹細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで培養すると、通常はこれらの細胞が分化する。これらの細胞をドナーから収集してレシピエントに与えると、ある種の条件下でレシピエントに生着し、成熟組織をもたらすことができる（例えば、Ｓｅｎｓｅｂeら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００９、８７（９  付録）：Ｓ４９〜Ｓ５３を参照されたい）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
現在、ハイスループットスクリーニングに適した、細胞運命の修飾因子のスクリーニング系への需要がある。本発明はかかる系を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
３．概要
本発明は、細胞運命の修飾因子を同定および検証するための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、本明細書に記述する方法に使用するための核酸構築物および組換え宿主細胞、並びに、かかる組換え宿主細胞を作製するための方法を提供する。本明細書に記述する方法によって、化合物ライブラリのスクリーニングを可能とする細胞状況を実現するのに必要な同義遺伝子を導入して、細胞運命をモジュレートするのに必要な１つまたは複数の遺伝子の活性を補う化合物の同定が可能となる。これにより、新規または別個の経路または機構を通して作用することができる化合物を同定することができる。
【００１６】
本明細書に記述する核酸構築物は、（ａ）細胞型に関係する（「ＣＴＲ」）プロモータに作動可能に連結される、レポーターをコード化するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；および（ｂ）１つまたは複数の標的配列ＲＮＡ（「ＴＳＲ」）をコード化する、１つまたは複数の核酸配列を含む。ＴＳＲは、蛍光性オリゴヌクレオチドまたは分子ビーコンプローブによって検出可能であり、これらは、１つまたは複数の核酸構築物を含有する、個々の組換え宿主細胞を同定するために、フルオロフォアおよびＴＳＲに相補的な核酸配列（例えば、ＴＳＲとハイブリッド形成可能な核酸配列）を含有することができる。１つまたは複数の所望の核酸構築物および所望の表現型を含有する、かかる組換え宿主細胞を単離することで、細胞運命／細胞型特異化の修飾因子の同定および検証に使用するための、確固とした信頼できる細胞ベースの系が得られる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本明細書で記述する本発明は、複数のレポーター核酸構築物であって、該複数のレポーター核酸構築物のうちのそれぞれが独立に、異なるＣＴＲプロモータに作動可能に連結される、レポーターをコード化するＯＲＦと、プロモータ（例えば普遍的プロモータ）に作動可能に連結される、１つまたは複数のＴＳＲをコード化する核酸配列とを含む、複数のレポーター核酸構築物に関する。同じレポーターを、複数の異なるＣＴＲプロモータと共に使用することができる。
【００１８】
本明細書で記述する本発明は、いくつかの利点を提供する。一態様では、蛍光性オリゴヌクレオチドを使用することにより、レポーター核酸構築物を含有する組換え宿主細胞の厳しい選択プロセスを緩和することができる（例えば、薬物を使用しない選択）。理論に拘束されるものではないが、これにより、単離されたレポーター核酸構築物含有組換え宿主細胞が、（ｉ）長期間にわたって培養および維持される、ならびに／または（ｉｉ）生理学的により適切なスクリーニングに利用されることが可能となる。
【００１９】
宿主細胞を、単一の細胞レベルで分析することもできる。２つ以上の標的配列を使用することで、偽陽性を最小限にすることができる。本明細書で記述する細胞ベースの系の別の利点は、組換え宿主細胞を単離するプロセスだけでなく、かかる細胞を使用して細胞運命／細胞型特異化の修飾因子を同定および検証するプロセスを合理化できることである。プロセスを合理化するとハイスループットな応用も可能となり、それにより効率および量が増加する。例えば、ある種の態様では、複数の異なるＣＴＲプロモータを試験するために、ハイスループットスクリーニング用の宿主細胞を、複数の核酸構築物を含むように設計することができ、ここでは、核酸構築物のそれぞれが、問題とする異なるＣＴＲプロモータに作動可能に連結される、同じレポーターをコード化するＯＲＦを含む。問題とする異なるＣＴＲプロモータは、１つの特定の細胞型に関連している可能性がある。これらの構築物を含むように設計された宿主細胞をハイスループットスクリーニングに使用すると、レポーターを活性化させる化合物を同定することができる。異なるＣＴＲプロモータのうち、どれが活性化して、検出されたレポーター活性が生じたのかを知る必要が最初はないかもしれないが、それでも、これによって異なるＣＴＲプロモータのうち少なくとも１つを活性化させることができた化合物を同定することになるであろう。必要であれば、さらなる試験を実施して探求し、異なるＣＴＲプロモータのうちどれが活性化したのかを決定することができる。異なる細胞型に関連する複数のＣＴＲプロモータ群を試験することができ、ここでは、特定の細胞型に関連する各ＣＴＲプロモータ群が特定のレポーターの転写を駆動する。
【００２０】
特別な態様では、レポーター核酸構築物を含有する組換え宿主細胞であって、該宿主細胞内でＣＴＲプロモータの活性がないまたは活性が低い、組換え宿主細胞を単離および使用することが望ましい。特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータの活性が基礎転写活性以下である。基礎転写活性は、基礎転写機構および最小プロモータ領域（一般的には転写開始部位の上流にあるＴＡＴＡボックスまたはイニシエーターおよび隣接する核酸配列（例えば約１０〜１００ｂｐ）を含み、エンハンサーまたはリプレッサーを伴わない）を本質的に含む転写に関係している。特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータの活性はバックグラウンド活性以下である。かかる宿主細胞は、ＣＴＲプロモータの活性を誘導または増大させる修飾因子を同定および／または検証するのに有用であり得る。しかし、レポーター核酸構築物を有するが、（ＣＴＲプロモータに作動可能に連結されている）レポーターをまだ発現していないまたはバックグラウンドレベルと比べると低いレベルでレポーターが発現しているこうした宿主細胞および細胞系を、当業者に既知である従来の方法を使用して単離および樹立することは、時間がかかり、労力を要し、困難である。例えば、想定される各細胞を活性化させ、レポーターの活性を評価して選択し、選択後に活性化シグナルを除去しなければならないであろう。本明細書に記述する方法および組成物は、一つには蛍光性オリゴヌクレオチドを使用することによって、レポーター核酸構築物を含む宿主細胞および細胞系を単離または樹立するための、より良い解決方法を提供する。一態様では、ＣＴＲプロモータは、２つのＴＳＲの発現を駆動する２つの構成的に活性なプロモータ配列に隣接している。該ＴＳＲは、ＣＴＲプロモータおよびレポーターの方向に対して同じであっても逆方向であってもよい。これらのＴＳＲヌクレオチドの発現は、蛍光性オリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳＲと相補的な、またはＴＳＲとハイブリッド形成するヌクレオチド）を使用して検出することができる。このように、ＣＴＲプロモータの活性とは独立に、レポーター核酸構築物を（好ましくは安定に）発現する宿主細胞および細胞系を速やかに選択することができる。ある種の態様では、本発明は、細胞選択用マーカーとしてのレポーターと同時転写（ｃｏｔｒａｎｓｃｒｉｂｅ）されるＴＳＲをコード化する、非翻訳標的配列を含むレポーター核酸構築物を提供し、ここでは、ＣＴＲプロモータは、バックグラウンド活性を上回る活性がないまたはバックグラウンド活性を上回る低レベルの活性がある。特別な実施形態では、非翻訳標的配列は、ＣＴＲに作動可能に連結される、レポーターをコード化するＯＲＦの３’側にある。例えば、レポーターと同時転写される非翻訳ＴＳＲに相補的な蛍光性オリゴヌクレオチドを細胞内に導入し、このＴＳＲを転写しないまたはこのＴＳＲを少量転写する細胞を選択する。例えば、蛍光性オリゴヌクレオチドは、細胞内のＴＳＲ転写産物の存在を検出できない、または少量のＴＳＲ転写物しか検出できない。
【００２１】
他の実施形態では、ＣＴＲプロモータは宿主細胞で活性がある。具体的には、レポーターと同時転写された非翻訳ＴＳＲを検出するための蛍光性オリゴヌクレオチドを使用して、強いシグナルを有する細胞を選択する。選択されたかかる宿主細胞は、ＣＴＲプロモータの活性を阻害するまたは低減させる化合物を同定するのに有用であり得る。
【００２２】
ある特定の態様では、本発明は、（ａ）ＣＴＲプロモータに作動可能に連結される、レポーターをコード化するＯＲＦ；および（ｂ）標的配列ＲＮＡ１（「ＴＳＲ１」）をコード化する核酸配列を含む、核酸構築物を提供する。該核酸構築物は、標的配列ＲＮＡ２（「ＴＳＲ２」）をコード化する核酸配列をさらに含むことができる。かかる核酸構築物は、レポーターと同時転写される標的配列ＲＮＡ３（「ＴＳＲ３」）をコード化する核酸配列を、さらに含むことができる。特定の実施形態では、レポーターはホタルルシフェラーゼである。他の実施形態では、レポーターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。他の実施形態では、レポーターは、プロテアーゼ、または、アルカリホスファターゼなどの酵素である。
【００２３】
本明細書に記述するレポーター核酸構築物により、細胞型に関係する遺伝子の発現を調節する役割を果たすことができる、ＣＴＲプロモータの活性を監視することができる。本明細書に記述するレポーター核酸構築物により、細胞型に関係する遺伝子の発現調節に関連する、一群のＣＴＲプロモータの活性のプロファイルも監視することができる。幹細胞運命の修飾因子の同定および／または検証に関係する特別な態様では、レポーター核酸構築物のＣＴＲプロモータは幹細胞プロモータである。かかる幹細胞プロモータとして、それだけには限らないが、Ｏｃｔ４プロモータ、Ｓｏｘ２プロモータ、Ｋｌｆ４プロモータ、ｃ−ｍｙｃプロモータ、ＬＩＮ２８プロモータ、Ｎａｎｏｇプロモータ、ＳＳＥＡ−３プロモータ、およびＳＳＥＡ−４プロモータを挙げることができる。例えば、幹細胞プロモータに（バックグラウンドを超える）活性がない、分化した宿主細胞内に、幹細胞プロモータを含むレポーター核酸構築物を導入することができ、宿主細胞の細胞運命における変化または移行（例えば、宿主細胞の脱分化）がもたらした幹細胞プロモータ活性の誘導および増強に関して、様々な刺激、薬剤および／または培養条件を試験することができる。これにより、脱分化を誘導または増強できる修飾因子、および／または条件を同定できる可能性がある。同様の態様では、活性がある幹細胞プロモータを含むレポーター核酸構築物を幹細胞内に導入することができ、分化を防ぐために幹細胞プロモータの活性を維持することに関して、様々な刺激および／または培養条件を試験することができる。
【００２４】
いくつかの態様では、活性がない細胞型特異的なプロモータを含むレポーター核酸構築物を異なる細胞型に導入することができ、分化転換の指標である細胞型特異的なプロモータの活性の誘導に関して、様々な刺激および／または培養条件を試験することができる。特別な実施形態では、レポーター核酸構築物のＣＴＲプロモータは筋細胞特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、レポーター核酸構築物のＣＴＲプロモータは、網膜細胞特異的プロモータ、皮膚細胞特異的プロモータ、または心筋細胞特異的プロモータである。
【００２５】
本発明はまた、本明細書に記述する１つまたは複数のレポーター核酸構築物を含む宿主細胞を提供する。ある種の実施形態では、レポーター核酸構築物のＣＴＲプロモータは、宿主細胞におけるバックグラウンドレベルを上回る活性がある。他の実施形態では、レポーター核酸構築物のＣＴＲプロモータは、細胞におけるバックグラウンドレベルを上回る活性がない。一実施形態では、ＣＴＲプロモータは、宿主細胞内で活性がある幹細胞プロモータである。別の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、宿主細胞におけるバックグラウンドレベルを上回る活性がない幹細胞プロモータである。一実施形態では、ＣＴＲプロモータは、宿主細胞内で活性がある筋細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、皮膚細胞特異的プロモータ、または心筋細胞特異的プロモータである。別の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、宿主細胞におけるバックグラウンドレベルを上回る活性がない筋細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、皮膚細胞特異的プロモータ、または心筋細胞特異的プロモータである。特定の実施形態では、宿主細胞は安定な細胞系である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、それぞれ異なるレポーターを含む、１つもしくは複数のまたは２つ以上の異なるレポーター核酸構築物を含有する。ある種の実施形態では、宿主細胞は２つ以上の異なるレポーター核酸構築物を含有し、異なるレポーター核酸構築物それぞれが独立に、異なるＣＴＲプロモータに作動可能に連結される、レポーターをコード化するＯＲＦを含む。特別な実施形態では、細胞は、複数の異なるレポーター核酸構築物を含有することができ、異なるレポーター核酸構築物それぞれが同じレポーターをコードし、かつレポーターの転写を調節するためにレポーターに作動可能に連結される異なるＣＴＲプロモータを含む。特別な実施形態では、細胞は、複数の異なるレポーター核酸構築物群を含有することができ、異なるレポーター核酸構築物群それぞれが異なるレポーターをコードし、異なるレポーターそれぞれが、問題とする細胞型のＣＴＲプロモータに作動可能に連結される。例えば、ある宿主細胞は４つの異なるレポーター核酸構築物を含むことができ、第１のレポーター核酸構築物が、第１のＣＴＲプロモータに作動可能に連結される第１のレポーターを含み、第２のレポーター核酸構築物が、第２のＣＴＲプロモータに作動可能に連結される第１のレポーターを含み、第３のレポーター核酸構築物が、第３のＣＴＲプロモータに作動可能に連結される第２のレポーターを含み、第４のレポーター核酸構築物が、第４のＣＴＲプロモータに作動可能に連結される第２のレポーターを含み、第１および第２のＣＴＲプロモータが第１の細胞型に関連し、第３および第４のＣＴＲプロモータが第２の細胞型に関連する。
【００２６】
特定の態様では、宿主細胞は、１つまたは複数のＣＴＲ因子をコード化する、１つまたは複数の組換え核酸をさらに含む。ＣＴＲ因子は、他の因子または修飾因子と連携して、ＣＴＲプロモータの活性を誘導または増強するＣＴＲ因子であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＴＲ因子は、他の因子または修飾因子と連携して、ＣＴＲプロモータの活性を阻害するまたは低減させるＣＴＲ因子であり得る。ある種の実施形態では、ＣＴＲ因子は転写調節に関与する。いくつかの実施形態では、ＣＴＲ因子は、幹細胞の維持もしくは増殖、細胞分化、細胞脱分化、または細胞分化転換に関与する。ある種の実施形態では、ＣＴＲ因子は、例えばヒストンのアセチル化または脱アセチル化といった、メチル化、アセチル化、または脱アセチル化に関与し得る。特別な実施形態では、ＣＴＲ因子として、それだけには限らないが、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＬＩＮ２８、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を挙げることができる。いくつかの実施形態では、ＣＴＲ因子はＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡ）である。宿主細胞は、かかるＣＴＲ因子のうちの１つまたは複数をコード化する組換え核酸構築物（複数）を含むことができる。特別な実施形態では、宿主細胞は単離される。特定の実施形態では、宿主細胞は、それぞれ異なるＣＴＲ因子をコード化する２つ以上の異なる組換え核酸構築物を含む。ある種の態様では、ＣＴＲ因子は、宿主細胞内に導入されたレポーター核酸構築物によってコードされる。
【００２７】
特定の態様では、本発明は、組換え宿主細胞を作製するための方法であって、（ａ）本明細書に記述する、１つまたは複数のＴＳＲを含む１つまたは複数のレポーター核酸構築物を、宿主細胞内に導入するステップ；（ｂ）該ＴＳＲに相補的な（またはハイブリッド形成する）蛍光性オリゴヌクレオチドを該宿主細胞内に導入するステップ；および（ｃ）１つまたは複数のＴＳＲを転写し、かつバックグラウンドレベルを上回る他のＴＳＲを転写しない細胞を選択するステップを含む方法に関する。特別な態様では、本発明は、組換え宿主細胞を作製するための方法であって、（ａ）本明細書に記述するレポーター核酸構築物を宿主細胞内に導入するステップ；（ｂ）ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、およびＴＳＲ３に相補的な（またはハイブリッド形成する）蛍光性オリゴヌクレオチドを該宿主細胞内に導入するステップ；および（ｃ）ＴＳＲ１およびＴＳＲ２を転写し、かつバックグラウンドレベルを上回るＴＳＲ３を転写しない細胞を選択するステップを含む方法に関する。特定の実施形態では、蛍光性オリゴヌクレオチドは、蛍光分子に結合したポリヌクレオチドを含む。ある種の実施形態では、標的配列とハイブリッド形成していないとき、蛍光性オリゴヌクレオチドはステムループ構造を形成する。特定の実施形態では、レポーター核酸構築物のＣＴＲプロモータは、Ｏｃｔ４プロモータ、Ｓｏｘ２プロモータ、Ｋｌｆ４プロモータ、ｃ−ｍｙｃプロモータ、ＬＩＮ２８プロモータ、Ｎａｎｏｇプロモータ、ＳＳＥＡ−３プロモータ、およびＳＳＥＡ−４プロモータなどの、幹細胞プロモータである。いくつかの実施形態では、レポーター核酸構築物のＣＴＲプロモータは、筋細胞プロモータ、眼細胞もしくは網膜細胞プロモータ、皮膚細胞プロモータ、造血細胞プロモータ、または心筋細胞プロモータである。ある種の実施形態では、ＣＴＲプロモータには、１つまたは複数の特定の細胞型に優先的に発現する遺伝子またはＲＮＡの、プロモータまたはその断片が含まれる。ある種の実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、ＧＦＰもしくはＹＦＰなどの自己蛍光タンパク質、プロテアーゼ、またはアルカリホスファターゼなどの酵素である。特定の実施形態では、本明細書に記述する方法は、１つまたは複数のＣＴＲ因子をコード化する１つまたは複数の組換え核酸を細胞内に導入するステップをさらに含む。
【００２８】
特定の実施形態では、本発明は、組換え宿主細胞を作製するための方法であって、（ａ）本明細書に記述するレポーター核酸構築物を細胞内に導入するステップ；（ｂ）ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、およびＴＳＲ３に相補的な（またはハイブリッド形成する）蛍光性オリゴヌクレオチドを該細胞内に導入するステップ；および（ｃ）ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、およびＴＳＲ３を転写する細胞を選択するステップを含む方法に関する。特定の実施形態では、レポーター構築物のＣＴＲプロモータは、Ｏｃｔ４プロモータ、Ｓｏｘ２プロモータ、Ｋｌｆ４プロモータ、ｃ−ｍｙｃプロモータ、ＬＩＮ２８プロモータ、Ｎａｎｏｇプロモータ、ＳＳＥＡ−３プロモータ、およびＳＳＥＡ−４プロモータなどの、幹細胞プロモータである。特定の実施形態では、本明細書に記述する方法は、１つまたは複数のＣＴＲ因子をコード化する１つまたは複数の組換え核酸を細胞内に導入するステップをさらに含む。特別な実施形態では、宿主細胞は安定な細胞系である。特定の実施形態では、宿主細胞は、例えばレポーターまたはＣＴＲ因子などの、問題とするＲＮＡまたはタンパク質を安定に発現する。ある種の実施形態では、本明細書に記述するレポーター核酸構築物は、宿主細胞のゲノム内に安定に組み込まれる。
【００２９】
他の態様では、本発明は、細胞型（または細胞運命）の修飾因子を同定するための方法であって、（ａ）本明細書に記述するレポーター核酸構築物を含有する宿主細胞を化合物に接触させるステップ；および（ｂ）該レポーターの活性または発現レベルを決定するステップを含む（ここでは、該化合物の非存在下におけるレポート（ｒｅｐｏｒｔ）の発現レベルに対して、該化合物の存在下における該レポーターの発現レベルの方が増加または減少していれば、該化合物が細胞型の修飾因子である）方法に関する。ある種の実施形態では、本発明は、細胞維持、細胞特異化，細胞運命決定，幹細胞運命の誘導，細胞分化，細胞脱分化，または細胞分化転換などの、細胞型または細胞運命の修飾因子を同定するための方法に関する。特定の実施形態では、レポーター構築物のＣＴＲプロモータは、Ｏｃｔ４プロモータ、Ｓｏｘ２プロモータ、Ｋｌｆ４プロモータ、ｃ−ｍｙｃプロモータ、ＬＩＮ２８プロモータ、Ｎａｎｏｇプロモータ、ＳＳＥＡ−３プロモータ、およびＳＳＥＡ−４プロモータなどの、幹細胞プロモータである。ある種の実施形態では、ＣＴＲプロモータには、１つまたは複数の特定の細胞型に優先的に発現する遺伝子またはＲＮＡの、プロモータまたはその断片が含まれる。特定の実施形態では、本明細書に記述する方法は、ＣＴＲ因子をコード化する組換え核酸を該細胞内に導入するステップをさらに含む。ある種の実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、ＧＦＰもしくはＹＦＰなどの自己蛍光タンパク質、プロテアーゼ、またはアルカリホスファターゼなどの酵素である。
【００３０】
ある種の態様では、本発明は、細胞型の正の修飾因子を同定するための方法であって、（ａ）本明細書に記述するレポーター核酸構築物を含有する宿主細胞を化合物に接触させるステップ；および（ｂ）該レポーターの発現レベルを決定するステップ；を含む（ここでは、該化合物の非存在下におけるレポート（ｒｅｐｏｒｔ）の活性または発現レベルに対して、該化合物の存在下における該レポーターの活性または発現レベルの方が増加していれば、該化合物が細胞型の正の修飾因子である）方法に関する。特定の実施形態では、レポーター構築物のＣＴＲプロモータは、Ｏｃｔ４プロモータ、Ｓｏｘ２プロモータ、Ｋｌｆ４プロモータ、ｃ−ｍｙｃプロモータ、ＬＩＮ２８プロモータ、Ｎａｎｏｇプロモータ、ＳＳＥＡ−３プロモータ、およびＳＳＥＡ−４プロモータなどの、幹細胞プロモータである。特定の実施形態では、本明細書に記述する方法は、ＣＴＲ因子（例えば、ＲＮＡまたはポリペプチド）をコード化する組換え核酸を細胞内に導入するステップをさらに含む。
【００３１】
いくつかの態様では、本発明は、筋細胞分化の修飾因子を同定するための方法であって、（ａ）本明細書に記述するレポーター核酸構築物を含む宿主細胞を化合物に接触させるステップ；および（ｂ）該レポーターの活性または発現レベルを決定するステップを含む（ここでは、該化合物の非存在下における該レポーターの発現レベルに対して、該化合物の存在下における該レポーターの活性または発現レベルの方が増加または減少していれば、該化合物が筋細胞分化の修飾因子である）方法に関する。
【００３２】
ある種の態様では、本発明は、筋細胞分化の正の修飾因子を同定するための方法であって、（ａ）本明細書に記述するレポーター核酸構築物を含有する宿主細胞を化合物に接触させるステップ；および（ｂ）該レポーターの活性または発現レベルを決定するステップを含む（ここでは、該化合物の非存在下における該レポーターの活性または発現レベルに対して、該化合物の存在下における該レポーターの活性または発現レベルの方が増加していれば、該化合物が筋細胞分化の正の修飾因子である）方法に関する。宿主細胞は、２つ以上の異なるレポーター核酸構築物を含むことができる。異なるレポーター核酸構築物のそれぞれは、同じレポーターをコード化するＯＲＦに作動可能に連結される、異なるＣＴＲプロモータを含むことができる。異なるレポーター核酸構築物のそれぞれは、異なるレポーターをコード化するＯＲＦに作動可能に連結される、異なるＣＴＲプロモータを含むことができる。特定の実施形態では、宿主細胞は、１つまたは複数のＣＴＲ因子（例えば、ＲＮＡまたはポリペプチド）を組換えにより発現する。
【００３３】
他の態様では、本発明は、ＣＴＲプロモータの修飾因子を同定するための方法であって、（ａ）本明細書に記述するレポーター核酸構築物（例えば、ＣＴＲプロモータに作動可能に連結される、レポーターをコード化するＯＲＦ、および１つまたは複数のＴＳＲをコード化する配列を含む構築物）を含む宿主細胞を化合物に接触させるステップ；および（ｂ）該レポーターの活性または発現レベルを決定するステップを含む（ここでは、該化合物の非存在下における該レポーターの発現レベルに対して、該化合物の存在下における該レポーターの発現レベルの方が増加または減少していれば、該化合物がＣＴＲプロモータの修飾因子である）方法に関する。特定の実施形態では、レポーター構築物のＣＴＲプロモータは、Ｏｃｔ４プロモータ、Ｓｏｘ２プロモータ、Ｋｌｆ４プロモータ、ｃ−ｍｙｃプロモータ、ＬＩＮ２８プロモータ、Ｎａｎｏｇプロモータ、ＳＳＥＡ−３プロモータ、およびＳＳＥＡ−４プロモータなどの幹細胞プロモータである。ある種の実施形態では、ＣＴＲプロモータには、１つまたは複数の特定の細胞型に優先的に発現する遺伝子またはＲＮＡの、プロモータまたはその断片が含まれる。特定の実施形態では、本明細書に記述する方法は、ＣＴＲ因子をコード化する組換え核酸を該細胞内に導入するステップをさらに含む。ある種の実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、ＧＦＰもしくはＹＦＰなどの自己蛍光タンパク質、プロテアーゼ、またはアルカリホスファターゼなどの酵素である。
【００３４】
本発明のさらなる態様では、本発明に記述する方法により産出した、分化、成人、または特殊化細胞を、幹細胞を産出するために使用することができる。本発明はまた、分化、成人、または特殊化細胞を再プログラムして幹細胞化させることができる化合物を同定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞型または細胞特性が、分化、成人、または特殊化細胞である記述の細胞は、それだけには限らないが、組織幹細胞、多能性幹細胞、全能性幹細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞、癌幹細胞、および臓器または組織特異的幹細胞を含めた幹細胞へと脱分化することができる。本明細書に記述する細胞から産出される幹細胞は、分化、成人、または特殊化した細胞型または細胞特性の、１つまたは複数の細胞へと分化することができる。本明細書で記述する細胞から産出される胚性幹細胞およびｉＰＳ細胞を、例えばマウスなどの非ヒト生物全体を産生するために使用することができる。マウス胚性幹細胞を使用してマウスを産生する方法は、当業者には既知である（例えば、Ｏｈｔａら、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ．、７９（３）：４８６〜９２（２００８）を参照されたい）。ｉＰＳ細胞を使用してマウスを産生する方法は、当業者には既知である（（例えば、Ｚｈａｏら、「ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｖｉａｂｌｅ  ｍｉｃｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ、ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ２００９年７月２３日を参照されたい）。
【００３５】
いくつかの実施形態では、細胞型または細胞特性が分化、成人、または特殊化細胞である本明細書に記述する細胞は、それだけには限らないが、組織幹細胞、多能性幹細胞、全能性幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、癌幹細胞、および臓器または組織特異的幹細胞を含めた幹細胞へと脱分化することができ、そのようにして産生された幹細胞は、分化、成人、または特殊化した細胞型もしくは細胞特性の、１つまたは複数の細胞へと分化することができる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、細胞型または細胞特性が分化、成人、または特殊化細胞である本明細書に記述する細胞は、胚性幹細胞またはｉＰＳ細胞へと脱分化することができ、そのようにして産生された幹細胞を、例えばマウスなどの非ヒト生物全体を産生するために使用することができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、細胞型または細胞特性が分化、成人、または特殊化細胞である本明細書に記述する細胞は、胚性幹細胞またはｉＰＳ細胞へと脱分化することができ、そのようにして産生された幹細胞を、例えばマウスなどの非ヒト生物全体を産生するために使用することができ、ここでは、非ヒト生物内の同じ細胞型または細胞特性の細胞が、本明細書に記述する細胞を選択した同じ特性（例えば、問題とするタンパク質またはＲＮＡの発現）を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡもしくはタンパク質、または、機能性もしくは生理学的形態のＲＮＡもしくはタンパク質を含む、特殊化した細胞または組織型の細胞を、胚性幹細胞またはｉＰＳ細胞を産生するために使用することができ、これらを例えばマウスなどの非ヒト生物を産生するために使用することができ、ここでは、非ヒト生物の同じ型の細胞または組織が、該ＲＮＡもしくはタンパク質、または、機能性もしくは生理学的形態の該ＲＮＡもしくはタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、こうして産生した非ヒト生物は、異なる種のＲＮＡまたはタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト生物はマウスであり、ＲＮＡまたはタンパク質はヒト起源である。いくつかの実施形態では、このように産生した非ヒト生物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ相関物（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ）を含む。いくつかの実施形態では、このように産生した非ヒト生物を、前臨床試験を含めた試験に使用することができる。いくつかの実施形態では、試験または前臨床試験は、ヒトにおける試験化合物の活性を予測するのに使用される。
【００３９】
特定の態様では、本発明は、本明細書に記述する方法から同定される修飾因子を提供する。かかる修飾因子は、例えば、脊髄損傷、パーキンソン病、黄斑変性症、および糖尿病などの、組織の若返りまたは再生が有益であり得るような病状を治療するための療法に、単独または併用で有用であり得る。本明細書に記述する方法で同定される修飾因子は、移植のために、または患者から単離した細胞（例えばＨＳＣ）をｅｘ  ｖｉｖｏで増やした後に該患者に移植し戻すまたは別の患者に移植するために、組織または臓器を産出する組織工学でも有用であり得る。ある種の態様では、癌幹細胞の修飾因子は、癌の治療または癌の再発の予防のための療法として、単独または併用で有用であり得る。
【００４０】
ある種の実施形態では、本明細書に記述する方法から同定される修飾因子は、特異的にＣＴＲプロモータまたはその領域、例えばエンハンサーまたはリプレッサー領域などに結合し、転写を増加もしくは増強させる、または低減させるもしくは阻害することができる。他の実施形態では、修飾因子は、タンパク質またはポリペプチドと特異的に相互作用し得る。かかるタンパク質またはポリペプチドは、転写因子、シグナル分子、酵素、またはプロテアーゼであり得る。特定の実施形態では、修飾因子は作用薬である。他の実施形態では、修飾因子は拮抗薬である。
【００４１】
本発明はまた、それぞれが本明細書に記述する１つまたは複数の組成物、例えば本明細書に記述する組換え宿主細胞を含む、１つまたは複数の容器を含むキットに関する。かかるキットは、本明細書に記述する１つまたは複数の核酸構築物；および１つまたは複数の蛍光性オリゴヌクレオチドを含む、１つまたは複数の容器も含むことができる。キットは、１つまたは複数の、ＣＴＲ因子またはＣＴＲ因子をコード化する核酸構築物も含むことができる。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
４．詳細な説明
本明細書において、維持、細胞特異化、細胞運命決定、幹細胞運命の誘導、細胞分化、細胞脱分化、および細胞分化転換などの、細胞運命の修飾因子を同定および検証するための組成物および方法を記述する。本発明は、レポーター核酸構築物、かかる構築物を含む組換え宿主細胞、および、本明細書に記述する方法によって同定される細胞運命の修飾因子を提供する。本明細書に記述する方法には、ハイスループットスクリーニングが含まれる。
【００４３】
いくつかの態様では、本明細書に記述する方法は、１つまたは複数のレポーター核酸構築物を含む宿主細胞を作製するための方法であって、該レポーター核酸構築物それぞれが、（ｉ）ＣＴＲプロモータに作動可能に連結される、レポーターをコード化するＯＲＦ、および（ｉｉ）１つまたは複数のＴＳＲをコード化する１つまたは複数の核酸配列を含む方法である。かかる方法は、（ａ）本明細書に記述する、１つまたは複数のＴＳＲを含む１つまたは複数のレポーター核酸構築物を、宿主細胞内に導入すること；（ｂ）ＴＳＲを検出できる蛍光性オリゴヌクレオチドを宿主細胞内に導入すること；および（ｃ）バックグラウンドレベルを上回る１つまたは複数のＴＳＲを転写する細胞を選択することを含む。ある種の実施形態では、ステップ（ｃ）は、バックグラウンドレベルを上回る１つまたは複数のＴＳＲを転写しない細胞を選択することを含む。特定の実施形態では、ステップ（ｃ）は、１つまたは複数のＴＳＲをＣＴＲプロモータとは独立に転写し（例えば、その転写がＣＴＲプロモータではない構成的プロモータによって調節される）、かつレポーターと同時転写される１つまたは複数のＴＳＲを転写しない（例えば、ＴＳＲの転写はＣＴＲプロモータによって調節される）細胞を選択することを含む。他の実施形態では、ステップ（ｃ）は、１つまたは複数のＴＳＲをＣＴＲプロモータとは独立に転写し、かつレポーターと同時転写される１つまたは複数のＴＳＲを転写する細胞を選択することを含む。ＴＳＲは、１つまたは複数のレポーター核酸構築物を含有する宿主細胞を同定するために使用される。特定の実施形態では、挿入部位がレポーターの転写に影響しない（例えば、挿入部位が原因でレポーターの転写が上方制御されることがない）ようにゲノム内に組み込まれている、１つまたは複数のレポーター核酸構築物を含有する宿主細胞を同定するために、ＴＳＲが使用される。
【００４４】
ある種の実施形態では、レポーター核酸構築物は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれる。安定な組み込みは、宿主細胞系において多数回の継代培養にわたって１つまたは複数のＴＳＲが存在することにより、試験することができる。他の実施形態では、レポーター核酸構築物は、宿主細胞内に一過性に導入される。そうした場合、宿主細胞は数回の継代の後にレポーター核酸構築物を失う。
【００４５】
ある種の実施形態では、レポーター核酸構築物は少なくとも２つのＴＳＲを有し、１つまたは複数のＴＳＲが、構成的に活性なプロモータなどの宿主細胞で活性があるまたは活性があり得るプロモータの制御下にあり、異なるＴＳＲが、レポーターと同時転写される、すなわち、該ＴＳＲもＣＴＲプロモータの転写制御下にある。
【００４６】
ある種の実施形態では、本明細書において、ＣＴＲプロモータの活性化因子のスクリーニング系が提供される。かかる系を確立するために、レポーター核酸構築物を例えば形質移入などで宿主細胞内に導入し、次に、構成的プロモータによって転写的に調節されるＴＳＲが陽性であるがレポーターと同時転写されるＴＳＲが陰性である（すなわちＣＴＲプロモータによって転写的に調節される）宿主細胞を選択する。選択されたかかる宿主細胞は、レポーター核酸構築物を含むが、バックグラウンド活性（例えば、陰性対照細胞におけるバックグラウンド活性）と比較して、ＣＴＲプロモータは不活性であるまたは低レベルもしくは基礎レベルの活性がある。選択されたかかる宿主細胞を次に化合物と接触させて、ＣＴＲプロモータの活性または発現レベルを上方制御する化合物を同定することができる。ＣＴＲプロモータを上方制御する化合物は、ＣＴＲプロモータが活性である細胞型の誘導因子であると予測される。
【００４７】
ある種の実施形態では、本明細書において、ＣＴＲプロモータの阻害因子のスクリーニング系が提供される。かかる系は、１つまたは複数のレポーター核酸構築物を宿主細胞内に導入すること、および、次に構成的プロモータまたはＣＴＲプロモータによって制御されるＴＳＲの転写が陽性である宿主細胞によって、確立することができる。選択されたかかる宿主細胞は、レポーター核酸構築物を含み、かつ宿主細胞でＣＴＲプロモータの活性がある。かかる宿主細胞を、次に化合物と接触させて、ＣＴＲプロモータの活性または発現レベルを下方制御する化合物を同定することができる。ＣＴＲプロモータを下方制御する化合物は、ＣＴＲプロモータが活性である細胞型の阻害因子であると予測される。
【００４８】
スクリーニング系を、同じレポーターの発現を転写的に調節する、１つまたは複数の異なるＣＴＲプロモータ群のために確立することもできる。この系では、レポーターの活性または発現は、一群の異なるＣＴＲプロモータの活性と相互に関連する。この異なるＣＴＲプロモータは、ある特定の細胞型に関連し得る。よって、問題とする異なるＣＴＲプロモータのうちのいずれか一つの修飾因子を同定するために、スクリーニングを実施することができる。異なるＣＴＲプロモータのうち、どれが活性化して検出されたレポーター活性が生じたのかを知る必要が最初はないかもしれないが、それでも、これによって、異なるＣＴＲプロモータのうち少なくとも１つを活性化させることができた化合物を同定することになるであろう。必要であれば、さらなる試験を実施して探求し、異なるＣＴＲプロモータのうちどれが活性化したのかを決定することができる。例えば、この系で使用される細胞が３つのレポーター核酸構築物を含み、各レポーター核酸構築物が、Ｎａｎｏｇプロモータ、Ｏｃｔ４プロモータ、およびｃ−ｍｙｃプロモータなどの異なる３つのＣＴＲプロモータのうちの１つに作動可能に連結される、同じレポーターのＯＲＦを含む。各群が異なるレポーターを含む、複数のＣＴＲプロモータ群も使用することができる。例えば、第１のＣＴＲプロモータ群が第１のレポーターを転写的に調節し、第２のＣＴＲプロモータ群が第２のレポーターを転写的に調節する。
【００４９】
特別な態様では、本発明は、維持、細胞特異化、細胞運命決定、幹細胞運命の誘導、細胞分化、細胞脱分化、および、細胞分化転換などの細胞運命の修飾因子である化合物を同定および／または検証するための、スクリーニング法およびスクリーニング系に関する。本明細書に記述する方法およびスクリーニング系は、レポーター核酸構築物を含む宿主細胞を利用し、それにより、スクリーニングされた化合物と細胞運命をモジュレートするために協働することができる複数のＣＴＲ因子（例えばＲＮＡおよびポリペプチド）の導入が可能となる。特定の実施形態では、本明細書で記述する方法は、分化、成人、または特殊化細胞を再プログラミングして幹細胞（例えば、組織幹細胞、多能性幹細胞、全能性幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、癌幹細胞、および臓器または組織特異的幹細胞）を産出する能力のある化合物を同定および検証することを提供する。他の態様では、本明細書に記述する方法は、本明細書に記述する方法から産出された幹細胞を再プログラミングして、分化、成人、または特殊化した細胞型または細胞特性の、１つまたは複数の細胞に分化させる能力のある化合物を同定および検証することを提供する。本明細書に記述する細胞および方法から産出された胚性幹細胞およびｉＰＳ細胞を、例えばマウスなどの非ヒト生物全体を産生するために使用することができる。
【００５０】
本発明は、本明細書に記述する方法および組成物の多くの変形を提供する。以下の節でさらに詳細に論じるのは本発明のさらなる非限定的な実施形態であり、例えば、レポーター核酸構築物は３つ以上のＴＳＲをコード化することができる、ＣＴＲプロモータの中程度の活性を有する細胞も本明細書に記述する方法で使用することができる、本明細書に開示するスクリーニング法で使用することができる細胞を、細胞運命の調節に重要であるさらなる因子を発現するように設計することもできる、といった実施形態である。
４．１レポーター核酸構築物
【００５１】
本明細書において、（ａ）ＣＴＲプロモータに作動可能に連結される、レポーターをコード化するＯＲＦ；および（ｂ）ＴＳＲ、例えばＴＳＲ１をコード化する核酸配列を含む、レポーター核酸構築物が提供される。該核酸構築物は、第２のＴＳＲ、すなわちＴＳＲ２をコード化する核酸配列をさらに含むことができる。ある種の実施形態では、ＴＳＲ２はレポーターと同時転写される。他の実施形態では、ＴＳＲ２はレポーターとは独立に転写される。特定の実施形態では、レポーター核酸構築物はＴＳＲ１およびＴＳＲ２を含み、ＴＳＲ１がレポーターとは独立に転写され、ＴＳＲ２がレポーターと同時転写される。ある種の実施形態では、該核酸構築物は、第３のＴＳＲ、すなわちＴＳＲ３をコード化する核酸配列をさらに含むことができ、ＴＳＲ３がレポーターと同時転写される。他の実施形態では、ＴＳＲ３がレポーターとは独立に転写される。ある種の実施形態では、レポーター核酸構築物は、４つ以上のＴＳＲ（例えば、ＴＳＲ４、ＴＳＲ５、ＴＳＲ６など）をコード化する核酸配列を含むことができる。ＴＳＲ（例えば、ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、ＴＳＲ３など）は、ＴＳＲと相補的な配列をそれぞれ有する蛍光性オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する能力があり、蛍光性オリゴヌクレオチドの蛍光特性がＴＳＲとのハイブリッド形成時に変化する。ハイブリッド形成は、ＴＳＲの核酸配列と蛍光性オリゴヌクレオチドが１００％相補的であっても、相補性が１００％未満であっても起こり得る。本明細書で使用される場合、「相補的な」は、塩基対（ｂａｓｅｄ−ｐａｉｒ）二重らせんを互いに形成することができる２つの核酸配列または核酸鎖を指す。特定の実施形態では、ＴＳＲと蛍光性ヌクレオチドの核酸配列が、少なくとも、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、もしくは６５％相補的であるまたは間にある任意の割合（％）で相補的であるときに、ハイブリッド形成が起こり得る。特定の実施形態では、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０個の、ＴＳＲの核酸（複数）が、蛍光性オリゴヌクレオチドの核酸（複数）と塩基対を形成しない。本明細書で使用する場合、「ハイブリッド形成する」または「ハイブリッド形成」は、ワトソン・クリック対（すなわち、Ａ−Ｔ／ＵおよびＧ−Ｃ対）に基づく二本鎖分子（２本のＤＮＡ鎖、２本のＲＮＡ鎖、１本のＲＮＡ鎖と１本のＤＮＡ鎖など）を形成するための、２本の核酸鎖の非共有結合的な対合を指す。特定の実施形態では、ＴＳＲは、ステムループの蛍光性オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することが可能である。
【００５２】
ある種の実施形態では、ＴＳＲは、最大で１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、または１００ヌクレオチドの長さである。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ＴＳＲは、転写終結シグナルまたは転写終結配列を含まない。他の実施形態では、ＴＳＲはＵＴＲ（例えば５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ）ではない。他の実施形態では、ＴＳＲは翻訳されない。いくつかの実施形態では、ＴＳＲは遺伝子のコード領域ではない。特別な実施形態では、ＴＳＲは、ゲノム（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、カエル、虫、昆虫（例えばハエ）、または雌ウシのゲノム）の天然配列ではない。
【００５４】
特定の実施形態では、レポーター核酸構築物は、それぞれが異なる２つのレポーター（例えば、レポーター１およびレポーター２）をコード化する２つのＯＲＦを含み、各ＯＲＦが異なるＣＴＲプロモータ（例えば、ＣＴＲプロモータ１およびＣＴＲプロモータ２）に作動可能に連結される。該レポーター核酸構築物は、それぞれ異なるレポーターと同時転写される２つのＴＳＲをさらに含む。ある種の実施形態では、レポーター核酸構築物は、同じレポーターをコード化する２つのＯＲＦを含み、各ＯＲＦが異なるＣＴＲプロモータ（例えば、ＣＴＲプロモータ１およびＣＴＲプロモータ２）に作動可能に連結される。特定の実施形態では、レポーター核酸構築物内のエレメント（例えば、ＯＲＦ、またはＴＳＲをコード化する核酸配列）間の距離は、約１〜１００ヌクレオチド、約１００〜３００ヌクレオチド、約１００〜５００ヌクレオチド、５００〜１，０００ヌクレオチド、１，０００〜２，０００ヌクレオチド、１，０００〜３，０００ヌクレオチド、１，０００〜５，０００ヌクレオチド、５，０００〜１０，０００ヌクレオチド、または５，０００〜１５，０００ヌクレオチドの間であり得る。
【００５５】
特別な実施形態では、レポーター核酸構築物は、ＣＴＲプロモータの活性をモジュレートする役割を果たすことができる、ＲＮＡまたはＣＴＲ因子をコード化する核酸配列も含むことができる。ＲＮＡまたはＣＴＲ因子をコード化する核酸配列は、誘導性プロモータまたは構成的もしくは普遍的プロモータに作動可能に連結され得る。
【００５６】
他の実施形態では、宿主細胞は、２つ以上のレポーター核酸構築物を含むことができ、第１のレポーター核酸構築物が、第１のＣＴＲプロモータに作動可能に連結される、第１のレポーターをコード化するＯＲＦと、１つまたは複数のＴＳＲをコード化する核酸配列とを含み、前記１つまたは複数のＴＳＲのうちの１つが第１のレポーターと同時転写され、第２のレポーター核酸構築物が、第２のＣＴＲプロモータに作動可能に連結される、第２のレポーター（第１のレポーターとは異なる）をコード化するＯＲＦと、１つまたは複数のＴＳＲをコード化する核酸配列とを含み、第２のレポーター核酸構築物の前記１つまたは複数のＴＳＲのうちの１つが第２のレポーターと同時転写される。
【００５７】
他の実施形態では、宿主細胞は、２つ以上の異なるレポーター核酸構築物を含むことができ、異なるレポーター核酸構築物それぞれが、異なるＣＴＲプロモータに作動可能に連結される、レポーターのＯＲＦと、１つまたは複数のＴＳＲをコード化する核酸配列とを含み、前記１つまたは複数のＴＳＲのうちの１つが、レポーターと同時転写される。これらの構築物を含むように設計された宿主細胞をハイスループットスクリーニングに使用すると、レポーターを活性化させる化合物を同定することができる。異なるＣＴＲプロモータのうち、どれが活性化して検出されたレポーター活性が生じたのかを知る必要が最初はないかもしれないが、それでも、これによって異なるＣＴＲプロモータのうち少なくとも１つを活性化させることができた化合物を同定することになるであろう。必要であれば、さらなる試験を実施して探求し、異なるＣＴＲプロモータのうちどれが活性化したのかを決定することができる。
【００５８】
本明細書に記述する核酸構築物は、当技術分野で知られたいかなる構築物であってもよい。核酸構築物は一般的に、宿主細胞内で特定のコード配列を発現させるエレメントを含有する、組換えまたは合成で産出したポリヌクレオチドを指す。核酸構築物としては、それだけには限らないが、コスミド、プラスミド、ベクター、およびウイルスベクターを挙げることができる。核酸構築物は、核酸を細胞内に一過性または安定に導入する（例えば、宿主細胞のゲノムへの安定な組込み）ために使用することができる。
４．１．１レポーター遺伝子
【００５９】
本明細書に記述するレポーター核酸構築物は、ＣＴＲプロモータに作動可能に連結される、任意のレポーターをコード化するＯＲＦを含むことができる。レポーターの活性、シグナル、または発現は、特定の細胞状況におけるＣＴＲプロモータの活性のマーカーとして機能し得る。レポーターの活性、シグナル、または発現は、特定の細胞型または細胞状況のマーカーとしても機能し得る。特定の実施形態では、化合物の存在下および非存在下または異なる培養条件での、レポーターの活性、シグナル、または発現レベルにおける変化が検出できる。
【００６０】
ある特定の実施形態では、レポーターはホタルルシフェラーゼまたはその変異体である。レポーターの他の非限定的例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの自己蛍光タンパク質が挙げられる。特定の実施形態では、レポーターは、野生型の自己蛍光タンパク質とは異なる励起／発光スペクトルを有する、ＧＦＰなどの自己蛍光タンパク質が変異した変異体である。レポーターの他の非限定的例としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）およびβ−ガラクトシダーゼを挙げることができる。
【００６１】
ある種の実施形態では、レポーターは、細胞表面に局在するタンパク質またはペプチドであってもよく、これらに結合する蛍光標識抗体試薬または他の標識試薬を使用して検出することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、レポーターは、基質を触媒するまたは変換して検出可能な生成物（例えば蛍光生成物）とする酵素（例えばアルカリホスファターゼ）であり得る。
【００６３】
いくつかの実施形態では、レポーターは、検出可能なシグナルまたは効果（ａｆｆｅｃｔ）をもたらす反応を触媒するプロテアーゼであり得る。例えば、細胞は、プロテアーゼによって切断することができるアミノ酸配列を含む細胞内可溶質のＧＦＰ融合タンパク質を含むことができ、切断時に蛍光標識を含む融合タンパク質部分が、例えば分泌される、分解される、または転位置（例えば核内へ）されるように設計することができる。したがってこのように、レポーターは、かかる基質に作用するプロテアーゼを含むことができる。
【００６４】
他の実施形態では、レポーターは、発現すると細胞に検出可能な変化をもたらすまたは検出可能な試薬を生成する酵素も含むことができる。細胞における検出可能な変化は、形態的変化、生物的変化、または化学的変化であり得る。
【００６５】
ある種の実施形態では、レポーター核酸構築物は、レポーターの変異体または断片をコード化するＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、レポーター核酸構築物は、発現、シグナル検出、または安定性が向上した、レポーターの修飾型をコード化するＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、レポート変異体（ｒｅｐｏｒｔ  ｖａｒｉａｎｔ）は、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、切断型、イソ型、キメラサブユニット、並びにアミノ酸置換（保存または非保存）、化学修飾アミノ酸および非天然アミノ酸を含めた修飾アミノ酸を含む変異型である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、レポーター核酸構築物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０，１５、２０、またはそれ以上の保存的変異を有するレポーターをコード化するＯＲＦを含む。ある種の実施形態では、レポーター核酸構築物は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、３０、４０、または５０未満の保存的変異を有するレポーターをコード化するＯＲＦを含む。
【００６７】
核酸配列の「保存的変異」は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチドを指し、または、ヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を指す。これは、遺伝コードが「縮重している」、すなわち、いくつもの異なる核酸が同じアミノ酸をコード化するという事実に基づいている。例えば、コドンＧＴＴ、ＧＴＡ、ＧＴＣ、およびＧＴＧは、すべてアミノ酸バリンをコード化する。したがって、コドンによってバリンが指定されるあらゆる位置で、そのコドンは、コード化されるポリペプチドを変えることなく、記述した相当するコドンのうちのいずれかに変更され得る。かかる核酸の変形は「サイレント変異」であり、「保存的変異の」の一種である。特に記述しない限り、アミノ酸をコード化する本明細書に記述するすべてのヌクレオチド配列には、あり得るすべてのサイレントな変形も含まれる。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＴＧは除く）を、標準的な技法によって、修飾して機能的に同一な分子を生成し得ることが認識されよう。したがって、突然変異誘発が使用される各例において、アミノ酸をコード化する核酸の各「サイレント変異」が暗黙的に含まれる。
【００６８】
さらに、「保存的変異」には、単一または少数のアミノ酸を変更、追加、または消去する、コード配列中の核酸の置換、消去、または付加も含まれ、この場合、核酸の変更が化学的に類似するアミノ酸の置換をもたらすことが、当業者には認識されよう。互いに保存的置換の役割を果たすことができるアミノ酸には、以下が含まれる：塩基性：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；親水性：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；疎水性：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；含硫：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）。
【００６９】
特別な実施形態では、レポーター核酸構築物は、コドン最適化がなされた、レポーターをコード化するＯＲＦを含む。コドン最適化により、翻訳されるアミノ酸残基を変えずに特定の種における安定性および／または発現レベルを増強することができる、遺伝コードの枠内でのヌクレオチドの置換が可能となる。特別な実施形態では、ヒトなどの特定の種における効率的および安定な発現のために、コンドン（ｃｏｎｄｏｎ）使用を最適化することができる。
【００７０】
レポーターは、レポーターと共に翻訳される、Ｈｉｓ−ｔａｇまたはＦＬＡＧ−ｔａｇなどのタグを任意選択で含むことができる。タグの他の非限定的な例としては、ｍｙｃタグ、血球凝集素（ＨＡ）タグ、プロテインＣ、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）−Ｇ、ＦＬＵ、ＢＣＣＰ、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓ−ｔａｇ、Ｓｏｆｔａｇ−１、Ｓｏｆｔａｇ−２、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ、Ｓ−ｔａｇ、チオレドキシン、ＧＳＴ、Ｖ５、ＴＡＰ、またはＣＢＰが挙げられる。タグは、タンパク質発現レベル、細胞内局在、タンパク質間相互作用、問題とするタンパク質の調節、またはタンパク質の機能を決定するためのマーカーとして使用することができる。タグは、タンパク質を精製または分画するためにも使用することができる。タグは、プロテアーゼ切断に感受性がある、１つまたは複数のプロテアーゼ配列を含むことができる。特定の実施形態では、レポーターはタグを含まない。
【００７１】
レポーターの活性、シグナル、および発現レベルを検出する方法は、当業者に既知である。かかる方法の非限定的な例は、以降の節でさらに詳細に論じる。例えば、ルシフェラーゼ活性は生物発光分析法によって検出することができ、自己蛍光タンパク質は顕微鏡またはフローサイトメトリーによって検出することができ、酵素およびプロテアーゼは妥当な基質と共に適切なアッセイで検出することができる。レポーターのタンパク質は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または免疫ブロットを使用して検出することができる。レポーターの転写産物は、例えば、ノーザンブロット、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ、またはマイクロアレイ解析によって検出することができる。バックグラウンドまたはノイズを上回るレポーターの活性、シグナルまたは発現レベルを決定するのに適正な対照は、当業者であれば容易に入手できる。ある種の実施形態では、レポーターの活性が対照試料におけるバックグラウンド活性より高ければレポーターは活性があり、レポーターの活性が対照試料におけるバックグラウンド活性以下であればレポーターは活性がないと考えられる。
４．１．２レポーターの転写を駆動するＣＴＲプロモータ
【００７２】
一般に、プロモータには、転写の開始および転写を調節を行うために、ＲＮＡポリメラーゼまたは他のタンパク質を動員して結合することに関与する、転写開始部位から上流にあるＤＮＡ領域への言及が含まれる。本明細書に記述するレポーター核酸構築物は、いかなるＣＴＲプロモータを含んでもよい。ＣＴＲプロモータはＣＴＲ遺伝子の転写を調節する。本明細書で使用する場合、ＣＴＲ遺伝子は、維持、細胞特異化、細胞運命決定、幹細胞運命の誘導、細胞分化、細胞脱分化、および／または細胞分化転換などの細胞運命に機能する、タンパク質またはポリペプチドをコード化する。本明細書で使用する場合、ＣＴＲ遺伝子は、細胞型特異的遺伝子であっても、細胞型関連遺伝子であってもよい。細胞型特異的遺伝子は、１つの特定の細胞型または少数の特定の細胞型に主に発現し、他の細胞型には発現しない遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、細胞型特異的遺伝子は、ある特定の細胞型だけに発現する遺伝子を指す。本明細書で使用する場合、細胞型関連遺伝子は、１つの特定の細胞型またはいくつかの特定の細胞型に、他の細胞型よりも高いレベルで発現する遺伝子を指す。ある種の実施形態では、細胞型関連遺伝子はいくつかの類似した細胞型（例えば、ある組織、臓器、または系統の細胞）に発現し、他の細胞型（例えば、他の組織、臓器、または系統の細胞）には発現しないまたは低レベルで発現する。細胞型特異的および細胞型関連遺伝子は、単独または併用で特定の細胞型のマーカーとして機能し得る。併用の場合、細胞型特異的および細胞型関連遺伝子の、速度を含めた発現プロファイルは、特定の細胞型と相関する可能性があり、こうした特定の細胞型のマーカーとして機能し得る。特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、細胞型特異的遺伝子の転写を調節する。ある種の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、細胞型関連遺伝子の転写を調節する。特記しない限り、ＣＴＲプロモータは、細胞型特異的遺伝子または細胞型関連遺伝子のいずれかであり得るＣＴＲ遺伝子の転写を調節するプロモータを指す。例えば、幹細胞プロモータは、幹細胞特異的遺伝子または幹細胞関連遺伝子の転写を調節するプロモータを指す。ある種の実施形態では、ＣＴＲプロモータには、１つまたは複数の特定の細胞型で優先的に発現する遺伝子またはＲＮＡ（マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介するＲＮＡを含めて）のプロモータまたはその断片が含まれる。
【００７３】
複数のレポーター核酸構築物が使用されるある種の態様では、互いに関係する異なるＣＴＲプロモータの活性レベルのパターン／プロファイルは、特定の細胞型を表すＣＴＲ遺伝子発現のプロファイルと相関する。かかる場合は、あるＣＴＲプロモータが活性であるか不活性であるかは、互いに関係する異なるＣＴＲプロモータの活性レベルの集合的なパターン／プロファイルほど、特定の細胞型を表してはいない。例えば、幹細胞のＣＴＲ遺伝子発現のパターン／プロファイルは、筋細胞のそれとは異なる。ある種の実施形態では、特定の細胞型を表すＣＴＲ遺伝子発現のパターンまたはプロファイルをマイクロアレイ解析で決定し、それにより、妥当なパターン／プロファイルを、本明細書で記述する方法のための問題とするベースラインパターン／プロファイルとして選択することができる。他の実施形態では、本明細書に記述する方法の後でマイクロアレイ解析を行って、特定の細胞型を表すＣＴＲ遺伝子発現のパターンまたはプロファイルを確認することができる。
【００７４】
ＣＴＲプロモータは、問題とする細胞型の転写に必要なプロモータのエレメントまたは領域を含み、こうしたエレメントまたは領域は、当技術分野で当業者に既知である任意の技法によって決定することができる。特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、維持、細胞特異化、細胞運命決定、幹細胞運命の誘導、細胞分化、細胞脱分化、または細胞分化転換などの、細胞運命に関与するプロモータである。
【００７５】
特定の実施形態では、レポーター核酸構築物のＣＴＲプロモータは、ＣＴＲ遺伝子の最小プロモータエレメント、または、ＣＴＲ遺伝子の１つまたは複数のプロモータエレメントを含み、こうしたエレメントがＣＴＲ遺伝子の転写調節に寄与して細胞型特異性を与える。プロモータエレメントは、エンハンサーまたはリプレッサーであり得る。ＣＴＲプロモータは、細胞型特異性を与える転写調節に寄与する、転写開始部位上流のエンハンサーおよびリプレッサーエレメントも含むことができる。一般に、最小プロモータとは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（「Ｐｏｌ  ＩＩ」）および基本転写因子を含めた転写開始複合体を伴う基礎転写に必要とされる、プロモータ配列の転写開始部位および近傍のヌクレオチドを含むヌクレオチドを指す。基本転写因子は、Ｐｏｌ  ＩＩを転写開始部位に配置する開始因子であり、Ｐｏｌ  ＩＩによって転写されるほとんどの遺伝子の転写に必要とされると考えられている。転写開始複合体は、プロモータに結合して転写を開始する。
【００７６】
多くの最小プロモータは、「ＴＡＴＡボックス」配列（例えば、真核生物ではＴＡＴＡＡＡ、またはこの配列のいくつかの変形）、および転写に必要とされる他の配列を含有する可能性がある。一般に、ＴＡＴＡボックスは、転写開始部位の約２５〜３５ｂｐ上流に見出すことができる。プロモータにはＴＡＴＡボックスを含有しないものもあり、ＴＡＴＡのない転写は、ＴＢＰおよびＴＢＰ関連因子（ＴＡＦ）を含むマルチサブユニット複合体を含む。ＴＡＴＡボックスの代わりにイニシエーターを含むプロモータもある。一般に、多くのイニシエーターエレメントは、シトシンを−１の位置に、アデニン残基を転写開始部位（＋１）に有し、５’から３’へのコンセンサス配列ＹＹＡＮ（Ｔ／Ａ）ＹＹＹを有する（ここでは、Ａは＋１の位置にあり、ＹはＣまたはＴであり、（Ｔ／Ａ）はＴまたはＡで＋３の位置にあり、Ｎは４種の塩基のうちのいずれかである）（Ｌｏｄｉｓｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２０００、３６５〜２６６ページを参照）。いくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、ＴＡＴＡボックスを含むプロモータを含む。他の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、ＴＡＴＡボックスを含まないプロモータを含む。ある種の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、イニシエーターエレメントを含む。ある種の実施形態では、ＣＴＲプロモータはイニシエーターエレメントを含まない。特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、ＣＴＲ遺伝子プロモータからの１つまたは複数のエンハンサー領域を含む。特別な実施形態では、ＣＴＲプロモータは、１つまたは複数の（コンセンサス）転写因子結合部位を含む。ある種の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、プロモータ活性を阻害するまたは低減させるリプレッサーを動員する、いかなるリプレッサー領域も含まない。特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、１つまたは複数のリプレッサー領域を含む。特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、ＣＴＲ遺伝子の１つまたは複数のリプレッサー領域が欠如している。いくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータのある領域は、特定の細胞型ではエンハンサー領域として機能し、異なる細胞型ではリプレッサー領域として機能する。ある種の実施形態では、ＣＴＲプロモータは雑種または異種プロモータである（例えば、こうしたプロモータは異種配列を含有するまたは異なる供給源からの配列を含有する）。例えば、ＣＴＲプロモータは、第１の供給源からの最小プロモータ、および第２の供給源からのエンハンサーエレメントを含む。
【００７７】
ＣＴＲプロモータ内の、最小プロモータ領域である領域、または調節機能（例えば、活性化因子またはリプレッサー機能）を有する領域を決定する技法は、当技術分野で記載されている。例えば、Ｌｏｄｉｓｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２０００、３６６ページを参照されたい。簡単に述べると、遺伝子の開始部位上流のゲノムＤＮＡ断片を、レポーターをコード化するＯＲＦに作動可能に連結されるように、レポーター構築物中にクローン化する。この構築物を細胞内に導入して、レポーターの活性または発現レベルを決定する。様々な断片、例えば１０ｂｐから１０，０００ｂｐの間の断片を、転写調節機能について試験することができる。加えて、重なりリンカースキャニング変異（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｌｉｎｋｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を、分析する領域の一端から他端まで導入し、変異レポーター構築物を細胞内でレポーターの活性について分析試験することができる。野生型の対照（プロモータ領域に変異がない）と比較してレポーターの活性に影響を与える変異が、転写調節に関与するプロモータエレメントである可能性がある。この方法を使用して、最小プロモータ領域、エンハンサープロモータ領域、およびリプレッサープロモータ領域を同定し、検証することができる。
【００７８】
当技術分野で既知である他の方法としては、それだけには限らないが、電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）、ＤＮａｓｅフットプリント法、およびクロマチン免疫沈降（Ｃｈｉｐ）法が挙げられる。かかるアッセイを、ある転写因子に特異的な親和性を有するプロモータ領域を同定および／または検証するのに使用することができる。Ｈｅｌａ細胞抽出物を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写アッセイも、プロモータエレメントを分析するために使用することができる。
【００７９】
多くの転写因子およびこれらに対応するコンセンサスＤＮＡ結合エレメントは、当分野で記載され、容易に決定し得る（例えば、Ｇｈｏｓｈ，Ｄ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１：３１１７〜３１１８、１９９３を参照されたい）。特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、１つまたは複数の転写因子コンセンサスＤＮＡ結合エレメントを含むことができる。転写因子とこれらのコンセンサスＤＮＡ結合エレメントの非限定的な例としては、以下が挙げられる（「｛｝」内の数は、存在し得る塩基対の数の範囲を示す；「Ｐｕ」はプリン（アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））を表す）；「Ｐｙ」はピリミジン（チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ））を表す；「．．．」は配列を隔てる１つまたは複数の塩基対を示す；「［］」内の核酸は、その場所にあり得る核酸の選択肢を示す）：
【表１】
2013500722.tif 000002
2013500722.tif 000003
2013500722.tif 000004
2013500722.tif 000005
【００８０】
ＫＬＦファミリーメンバー（ＫＬＦ４）結合部位の突然変異分析に基づいた、Ｓｐ１／ＫＬＦファミリーに対するコンセンサス結合配列の非限定的な例は、（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ａ）ＧＧ（Ｃ／Ｔ）Ｇ（Ｃ／Ｔ）である（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１９９８、２６：７９６〜８０２を参照されたい）。ｃ−Ｍｙｃに対するコンセンサス結合配列の非限定的な例は、ＰｕＡＣＣＡＣＧＴＧＣＴＣであり、ここでは「Ｐｕ」はプリンヌクレオチドを表す（例えば、Ｐａｐｏｕｌａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９２、２６７（１５）：１０４７０〜１０４８０を参照されたい）。
【００８１】
ある種の態様では、ＣＴＲプロモータは、リボザイムおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの、翻訳されないＲＮＡ分子であるＣＴＲ遺伝子の転写を調節するプロモータである。ｍｉＲＮＡは、２１〜２３ヌクレオチド長に処理された一本鎖のＲＮＡ分子であり、標的遺伝子のｍＲＮＡに結合して標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって、主に他の遺伝子の遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡの前駆体は、短いステムループ構造を形成する一本鎖ＲＮＡであり、さらに処理されて機能性ｍｉＲＮＡとなる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１つまたは複数のｍＲＮＡ分子に部分的に相補的である。リボザイムは、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。
【００８２】
ＣＴＲプロモータの選択は、問題とする特定の細胞プロセス、および本明細書に記述する方法に応じて決まる。例えば、幹細胞の維持／自己複製および／または増殖の修飾因子を同定するために、ＣＴＲプロモータは幹細胞プロモータ（例えば、幹細胞特異的遺伝子または幹細胞関連遺伝子の発現を調節するプロモータ）であり得る。幹細胞プロモータは、それだけには限らないが、ＥＳＣプロモータ、神経幹細胞プロモータ、毛包（バルジ）幹細胞プロモータ、上皮幹細胞プロモータ、筋幹細胞プロモータ、間葉系幹細胞プロモータ、皮膚幹細胞プロモータ、またはＨＳＣプロモータであり得る。
【００８３】
限定しないがＣＴＲプロモータの他の例は、体細胞プロモータ、ＥＳＣプロモータ、前駆細胞プロモータ、ミオサイトプロモータ（例えば、ミオサイト特異的またはミオサイト関連プロモータ）、ケラチノサイトプロモータ、線維芽細胞プロモータ、表皮基底細胞プロモータ、β細胞（膵臓）プロモータ、肝細胞プロモータ、骨格筋プロモータ、肝星細胞プロモータ、心筋細胞プロモータ、単球プロモータ、網膜色素上皮細胞プロモータ、およびドーパミン神経プロモータを含む。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、そのようなプロモータの断片を含む。   
【００８４】
いくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、以下の細胞型の一つと特異的または関連する遺伝子の遺伝子発現を調節するプロモータである：表皮角化細胞（分化表皮細胞）、表皮基底細胞（幹細胞）、爪および足指爪のケラチノサイト、爪床基底細胞（幹細胞）、髄質性毛幹細胞、皮質性毛幹細胞、角質性毛幹細胞、角質性毛根鞘細胞、ハックスレー層の角質性毛根鞘細胞、ヘンレー層の角質性毛根鞘細胞、外毛根鞘細胞、毛母細胞（幹細胞）、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道および膣の重層扁平上皮の表面上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道および膣の上皮の基底細胞（幹細胞）、尿上皮細胞（膀胱および尿管の内膜）、唾液腺粘膜細胞（多糖リッチ分泌物）、唾液腺漿液細胞（糖タンパク酵素リッチ分泌物）、舌にあるフォン・エブネル腺細胞（味蕾を洗浄）、乳腺細胞（乳汁分泌物）、涙腺細胞（涙液分泌物）、耳にある耳道腺細胞（耳垢分泌物）、エクリン汗腺暗細胞（糖タンパク分泌物）、エクリン汗腺明細胞（小分子分泌物）、アポクリン汗腺細胞（芳香性分泌物、性ホルモン感応性）、眼瞼のモル腺細胞（特殊な汗腺）、皮脂腺細胞（脂質リッチ皮脂分泌物）、鼻のボウマン腺細胞（嗅上皮を洗浄）、十二指腸のブルンネル腺（酵素およびアルカリ性粘膜）、精嚢細胞（精子が泳ぐためのフルクトースを含む分泌精液成分）、前立腺細胞（分泌精液成分）、尿道球腺細胞（粘液分泌物）、バルトリン腺細胞（膣潤滑性分泌物）、小細胞の腺（粘液分泌物）、子宮内膜細胞（糖質分泌物）、呼吸器および消化管の単離杯細胞（粘液分泌）、胃の内膜の粘膜細胞（粘液分泌）、胃腺発酵性細胞（ペプシノゲン分泌物）、胃腺酸分泌（塩酸分泌物）、膵腺房細胞（炭酸水素および消化酵素分泌物）、小腸のパネート細胞（リゾチーム分泌物）、肺のＩＩ型肺胞細胞（界面活性剤分泌物）、肺のクララ細胞、下垂体前葉細胞、成長ホルモン産生細胞、乳腺刺激ホルモン分泌細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激因子、メラニン細胞刺激ホルモン分泌する中間下垂体細胞、巨大細胞の神経分泌細胞（オキシトシンの分泌および／またはバソプレシンの分泌）、腸および気道細胞（セロトニンの分泌、エンドルフィンの分泌、ソマトスタチンの分泌、ガストリンの分泌、セクレチンの分泌、コレシストキニンの分泌、インスリンの分泌、グルカゴンの分泌、および／またはボンベシンの分泌）、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞、副腎細胞、クロマフィン細胞、副腎分泌ステロイドホルモン（ミネラルコルチコイドおよびグルココルチコイド）、テストステロンを分泌する精巣のライディッヒ細胞、エストロゲンを分泌する卵胞の内卵胞膜、プロゲステロンを分泌する破裂卵胞の黄体細胞（顆粒膜ルテイン細胞および卵胞膜ルテイン細胞）、傍糸球体細胞（レニン分泌物）、腎臓の密集斑、腎臓の周極細胞、腎臓のメサンギウム細胞、肝細胞（肝臓細胞）、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、肝臓脂質細胞、腎糸球体壁細胞、腎糸球体有足細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄薄層部分細胞、腎臓遠位尿細管刷子縁細胞、集合管細胞型Ｉ型肺細胞（肺の気腔の内膜）、膵管細胞（腺房中心細胞）、主細胞および間在細胞などの非線状部導管細胞（汗腺、唾液腺、乳腺など）、導管細胞（精嚢、前立腺など）、腸刷子縁細胞（微絨毛に存在）、外分泌腺の線条体導管細胞、胆汁膀胱上皮細胞、精巣輸出管非繊毛細胞、精巣上体主細胞、精巣上体基底細胞、血管およびリンパ管内皮有窓細胞、血管およびリンパ管内皮連続細胞、血管およびリンパ管内皮脾細胞、滑膜細胞（関節腔の内膜、ヒアルロン酸分泌物）、漿膜細胞（腹膜、胸膜、および囲心腔の内膜）、扁平細胞（耳の外リンパ腔の内膜）、扁平細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、微絨毛を有する内リンパ嚢の円柱状細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、微絨毛を有さない内リンパ嚢の円柱状細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、暗細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、血管性膜細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、血管条基底細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、血管条周辺細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、クラウディウス細胞（耳の内リンパ腔の内膜）、血管条（耳の内リンパ腔の内膜）、脈絡叢細胞（脳脊髄液分泌物）、軟柔膜扁平細胞、目の色素性絨毛上皮細胞、目の非着色性絨毛上皮細胞、角膜内皮細胞、呼吸器繊毛細胞、卵管繊毛細胞（雌）、子宮内膜繊毛細胞（雌）、精巣網繊毛細胞（雄）、精巣輸出管繊毛細胞（雄）、中枢神経系の繊毛性上衣細胞（脳腔の内膜）、エナメル芽細胞上皮細胞（歯のエナメル分泌物）、耳の前庭器の半月面上皮細胞（プロテオグリカン分泌物）コルチ器官の歯間上皮細胞（髪細胞を被覆する蓋膜を分泌）、疎性結合組織線維芽細胞、角膜線維芽細胞（角膜の角膜実質細胞）、腱の線維芽細胞、骨髄網状組織の線維芽細胞、他の非上皮線維芽細胞、周皮細胞、椎間板の髄核細胞、セメント芽細胞／セメント細胞（歯根骨状セメント質の分泌物）、骨芽細胞／骨細胞（骨象牙質分泌物）、硝子質軟骨の軟骨細胞、繊維軟骨の軟骨細胞、弾性軟骨
軟骨細胞、骨細胞／骨細胞、骨の前駆細胞（骨芽細胞の幹細胞）、目の硝子体細胞、耳の外リンパ空間の星状細胞、肝星細胞（伊東細胞）、膵星細胞、骨格筋細胞（赤色骨格筋細胞（遅筋）、白色骨格筋細胞（速筋）、中間体骨格筋細胞、筋紡錘の核袋細胞および筋紡錘の核鎖細胞など）、付随体細胞（幹細胞）、心筋細胞（通常の心筋細胞、結節性の心筋細胞、およびプルキンエ線維細胞など）、平滑筋細胞（各種）、虹彩の筋上皮細胞、外分泌腺の筋上皮細胞、赤血球（赤血球）、巨核球（血小板前駆体）、単球、結合組織マクロファージ（各種）、上皮性ランゲルハンス細胞、破骨細胞（骨内）、樹状細胞（リンパ組織内）、ミクログリア細胞（中枢神経系内）、好中球の顆粒球、好酸球の顆粒球、好塩基球の顆粒球、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、網状赤血球、血液系および免疫系の幹細胞および委任前駆体（各種）、コルチ器官の聴覚性外有毛細胞、嗅上皮の基底細胞（嗅覚ニューロンの幹細胞）、冷−感受性一次感覚ニューロン、熱−感受性一次感覚ニューロン、表皮のメルケル細胞（触感）、嗅覚受容体神経、痛−感受性一次感覚ニューロン（各種）、目の網膜の光受容体細胞（視細胞、桿体細胞、目の視細胞の青色−感受性錐状体細胞、目の視細胞の緑色−感受性錐状体細胞、目の視細胞の赤色−感受性錐状体細胞など）、固有受容性一次感覚ニューロン（各種）、触覚―感受性一次感覚ニューロン（各種）、Ｉ型頸動脈小体（血液ｐＨセンサ）、ＩＩ型頸動脈小体細胞（血液ｐＨの感知）、耳の前庭器のＩ型有毛細胞（加速および重力）、耳の前庭器のＩＩ型有毛細胞（加速および重力）、Ｉ型味蕾細胞、コリン作動性神経細胞（各種）、アドレナリン作動性神経細胞（各種）、ペプチド作動性神経細胞（各種）、コルチ器官の内柱細胞、コルチ器官の外柱細胞、コルチ器官の内指骨細胞、コルチ器官の外指骨細胞、コルチ器官の境界細胞、コルチ器官のヘンゼン細胞、前庭器の支持剤某、Ｉ型味蕾支持細胞、嗅上皮支持細胞、シュワン細胞、サテライト細胞（末梢神経細胞体を被包）、腸内グリア細胞、星状細胞（各種）、神経細胞（多種であり、未だ十分に分類されていない）、オリゴデンドロサイト、紡錘形神経、前水晶の上皮細胞、クリスタリン含有水晶体線維細胞、メラニン形成細胞、網膜色素上皮細胞、卵原細胞／卵母細胞、精細胞、精母細胞、精原細胞（精母細胞の幹細胞）、精子、卵胞細胞、セルトリ細胞（精巣内）胸腺上皮細胞、並びに間質性腎臓細胞。いくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、上述した細胞型の１つに特異的または関連する遺伝子の発現を調節するプロモータの断片を含む。
【００８５】
幹細胞またはｉＰＳ細胞の修飾因子に関する特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、限定されないが、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ｍｙｃ、ＬＩＮ２８、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−３、若しくはＳＳＥＡ−４のプロモータまたはプロモータ要素を含んでよい。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、以下の遺伝子のうちの１つのプロモータまたはプロモータ要素である：Ｎｏｔｃｈ、ＷＮＴ、Ｄａｘ１、Ｅｒａｓ、Ｆｂｏｘ、Ｆｏｘｄ３、Ｒｅｘ１、およびＺｆｐ２９６を含む。特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、転写開始点について−３９１７ｂｐ〜＋５５ｂｐまたはその一部を含むＯｃｔ４プロモータ領域などＯｃｔ４プロモータ領域を含み、最小限のプロモータ領域を含み得る。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、Ｏｃｔ４プロモータの転写開始点から最初の２５０ｂｐｓを含む。特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、転写開始点について−２８９ｂｐ〜＋１１７ｂｐまたはその一部を含むＮａｎｏｇプロモータ領域などＮａｎｏｇプロモータ領域を含み、最小限のプロモータ領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、約２００ｂｐｓのＮａｎｏｇプロモータを含む。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、ＳＯＸ転写因子結合要素（ＣＡＴＴＧＴＡ）を含有するＮａｎｏｇプロモータ領域を含む。特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、Ｏｃｔ転写因子結合要素（ＡＴＧＣＡＡＡＡ）を含有するＮａｎｏｇプロモータ領域を含む。  
【００８６】
毛包（膨隆）幹細胞の修飾因子に関するいくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、限定されないがＮＦＡＴｃ１、Ｓｏｘ９、ＴＣＦ３、若しくはＬｈｘ２のプロモータまたはプロモータ断片を含み得る。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、Ｋ１５、ＣＤ２００、ＣＤ３４、ＣＤ２７１、ネスチン、若しくはＬｇｒ５など毛包（膨隆）幹細胞マーカーのプロモータまたはプロモータ断片であり得る。
【００８７】
表皮基底細胞の修飾因子に関するいくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、限定されないがｃ−ｒｅｌ、ＲｅｌＡ、Ｄｅｌｔａ１、若しくはＦｒｉｎｇｅのプロモータまたはプロモータ断片であり得る。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、β１−インテグリン、α６−インテグリン、ケラチン１５、ｐ６３、若しくはＣＤ３など表皮基底細胞のプロモータまたはプロモータ断片であり得る。
【００８８】
上皮幹細胞の修飾因子に関するいくつかの実施形態ではＣＴＲプロモータは、限定されないがＢｍｉ−１、Ｔｃｆ−４、β−、若しくはカテニンのプロモータまたはプロモータ断片を含み得る。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、ＡＢＣＧ２、Ｂｍｉ−１、ＤｅｌｔａＮｐ６３、ｐ７５、ＨＥＡ、ＣＤ４４、α２β１インテグリン、アミンＡ、ＣＤ４９ｆ、Ｌｇｒ５、若しくはＣＤ１３３など上皮幹細胞マーカーのプロモータまたはプロモータ断片であり得る。
【００８９】
皮膚組織細胞の修飾因子に関する他の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、限定されないがＮＦＡＴｃ１、ＳＯＸ９、ＴＣＦ３、ＬＨＸ２、ＣＤ２００、Ｋ１５、ＩＤ２、ＤＫＫ３、ＷＩＦ１、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＰＨＬＤＡ１、ＦＯＬＬＩＳＴＡＴＩＮ、ＤＩＯ２、ＬＣＥ２Ｂ、ＡＳＰＲＶ１、ＤＥＦＢ４、ＰＩ３、ＲＮＡＳＥ７、Ｋ１９、ＩＴＧＢ１、ＲＥＬ、ＲＥＬＡ、ＤＬＬ１、ＢＭＩ１、ＴＣＦ４、ＣＴＮＮＢ１、ＭＣ１Ｒ、ＳＬＣ４５Ａ２、およびＳＬＣ２４Ａ５から成る群から選択される遺伝子のプロモータまたはプロモータ断片を含み得る。
【００９０】
β細胞（膵臓）修飾因子に関するいくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、限定されないがＭｎｘ１、Ｐｄｘ１、Ｎｋｘ６−１、Ｎｋｘ２−２、Ｍａｆｂ、Ｍａｆａ、Ｉｎｓ１、若しくはＳｌｃ２ａ２のプロモータまたはプロモータ断片を含み得る。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、Ｉｎｓ１など膵臓β細胞マーカーのプロモータまたはプロモータ断片であり得る。
【００９１】
肝細胞の修飾因子に関するいくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、限定されないがＰｒｏｘ１、Ｒｅｘ３、ＷＮＦ−４、アルブミン、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アンチトリプシン、アネキシンＩ、若しくはアネキシンＩＩのプロモータまたはプロモータ断片を含み得る。ある実施形態では、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アンチトリプシン、アネキシンＩ、若しくはアネキシンＩＩなど幹細胞のプロモータまたはプロモータ断片で有り得る。
【００９２】
骨格筋細胞の修飾因子に関するいくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、ミオゲニン、Ｍｒｆ４、Ｍｅｆ２、ＭＵＲＣ、ミオシン重鎖、トロポニン、若しくはトロポミオシンのプロモータまたはプロモータ断片を含み得る。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、ミオシン重鎖、トロポニン、若しくはトロポミオシンなど骨格筋細胞のプロモータまたはプロモータ断片で有り得る。
【００９３】
肝星細胞の修飾因子に関するいくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、Ｆｏｘｌ１、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ、Ｅｇｒ−１、α−平滑筋細胞アクチン、リーリン、若しくはｐ７５ＮＴＲのプロモータまたはプロモータ断片を含み得る。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、α−平滑筋細胞アクチン、リーリン、若しくはｐ７５ＮＴＲなど肝星細胞マーカーのプロモータまたはプロモータ断片で有り得る。
【００９４】
筋幹細胞の修飾因子に関するいくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、限定されないがＭｙｏＤ、Ｐａｘ７、Ｒｕｎｘ２、Ｍｙｆ５、Ｍ−カドヘリン、神経接着分子−１、ＣＤ５６、ＣＤ３４、若しくはＣＤ１４４のプロモータまたはプロモータ断片を含み得る。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、Ｍ−カドヘリン、神経接着分子−１ＣＤ５６、ＣＤ３４、若しくはＣＤ１４４など筋幹細胞マーカーのプロモータまたはプロモータ断片であり得る。
【００９５】
心筋細胞の修飾因子に関するいくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータ は、限定されないがＮｋｘ２．５、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、ミオシン重鎖、α−アクチニン、デスミン、ナトリウム利尿ペプチド、若しくは心筋トロポニンのプロモータまたはプロモータ断片を含み得る。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、ミオシン重鎖、α−アクチニン、デスミン、ナトリウム利尿ペプチド、若しくは心筋トロポニンなどの心筋細胞マーカーのプロモータまたはプロモータ断片であり得る。
【００９６】
単球の修飾因子に関するいくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、限定されないがＰＵ．１、Ｃ／ＥＢＰα、ＡＭＬ１、ＲＡＲα、ＭＺＦ−１、Ｈｏｘ、ＳＴＡＴ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３６、ＣＤ６４、ＣＤ１６３、Ｍ−ＣＳＦ受容体、若しくはＧＭ−ＣＳＦ受容体のプロモータまたはプロモータ断片を含み得る。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３６、ＣＤ６４、ＣＤ１６３、Ｍ−ＣＳＦ受容体、およびＧＭ−ＣＳＦ
受容体など単球マーカーのプロモータまたはプロモータ断片であり得る。
【００９７】
網膜色素上皮細胞の修飾因子に関するいくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、限定されないが小眼球症、ＥＬＦ３、ベストロフィン、サイトケラチン８および１８、ＺＯ−１、ＴＩＭＰ３、若しくはＲＰＥ６５のプロモータまたはプロモータ断片を含み得る。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、ベストロフィン、サイトケラチン８および１８、ＺＯ−１、ＴＩＭＰ３、若しくはＲＰＥ６５など網膜色素上皮細胞マーカーのプロモータまたはプロモータ断片であり得る。
【００９８】
目に由来する細胞の修飾因子に関するいくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、限定されないがＳｉｘ６（ＮＰ＿０３１４００）のプロモータまたはその断片であり得る。目に由来する細胞の修飾因子に関する他の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、限定されないがＲＰＥ６５、ＡＢＣＡ４、ＣＯＬ１１Ａ１、ＧＮＡＴ２、ＲＨＯ、ＧＮＢ３、ＧＮＡＴ１、ＧＮＧＴ１、ＰＤＥ６Ａ、ＰＤＥ６Ｂ、ＰＤＥ６Ｇ、ＣＮＧＡ１、ＣＮＧＢ１、ＲＣＶＮ、ＳＡＧ、ＧＵＣＡ１Ａ、ＳＬＣ２４Ａ１、ＮＲＧ４、ＡＢＣＡ４、ＰＲＰＨ２、ＲＯＭ１、ＲＤＨ５、ＴＴＲ、ＢＥＳＴ１、ＣＴＳＤ、ＣＳＴ３、ＨＭＣＮ１、ＲＤ３、ＥＦＥＭＰ１、ＡＬＭＳ１、ＣＮＧＡ３、ＣＮＮＭ４、ＭＥＲＴＫ、ＡＲＲ３、ＰＤＥ６Ｈ、ＣＰＬＸ４、ＯＰＡ１、ＭＰＰ４、ＮＲＬ、ＣＬＵＬ１、ＲＤＨ１２、ＲＢＰ３、ＰＤＣ、ＣＲＸ、ＩＭＰＧ１、ＲＡＸ、ＲＴＢＤＮ、ＲＰ１、ＣＲＡＢＰ１、ＲＬＢＰ１、ＲＳ１、ＳＴＲＡ１３、ＰＲＯＭ１、ＬＲＡＴ、ＴＵＬＰ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＶＳＸ１、ＲＧＳ１６、ＮＲ２Ｅ３、ＧＵＣＹ２Ｆ、ＡＯＣ２、ＲＧＲ、ＲＤＨ１１、ＦＳＣＮ２、ＰＯＵ６Ｆ２、ＳＬＣ１Ａ７、ＳＬＣ２４Ａ１、ＺＮＦ３８５Ａ、ＳＤＲ１６Ｃ５、ＨＳＤ１７Ｂ１４、ＤＨＲＳ７、ＳＬＣ２４Ａ２、ＰＩＴＰＮＣ１、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ２、およびＡＬＤＨ１Ａ３から成る群から選択される遺伝子のプロモータまたはプロモータ断片を含み得る。
【００９９】
間葉系幹細胞の修飾因子に関するいくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、限定されないがＥＴＶ１、ＥＴＶ５、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ６、ＨＭＧＡ２、ＳＩＭ２、ＳＯＸ１１、ＳＴＲＯ−１、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、若しくはｐ７５ＮＴＲのプロモータまたはプロモータ断片を含み得る。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、ＳＴＲＯ−１、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、若しくはｐ７５ＮＴＲなど間葉系幹細胞マーカーのプロモータまたはプロモータ断片であり得る。
【０１００】
神経幹細胞の修飾因子に関するいくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、限定されないがＰＬＺＦ、ＰＬＡＧＬ１、Ｄａｃｈ１、Ｆｏｘｇ１、ＮＲ２Ｆ１、ネスチン、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ｐ７５ニューロトロフィンＲ、若しくはビメンチンのプロモータまたはプロモータ断片を含み得る。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、ネスチン、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ｐ７５ニューロトロフィンＲ、若しくはビメンチンなどの神経幹細胞マーカーのプロモータまたはプロモータ断片であり得る。
【０１０１】
ドーパミン神経の修飾因子に関するいくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータは、限定されないがＯｔｘ２、Ｌｍｘ１ａ、Ｎｇｎ２、Ｆｏｘ２ａ、Ｐｉｔｘ３、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ、Ｎｕｒｒ１、Ｗｎｔ１、Ｆｇｆ８、Ｓｈｈ、若しくはＲａｌｄｈ１（Ａｈｄ２）のプロモータまたはプロモータ断片を含み得る。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、Ｗｎｔ１、Ｆｇｆ８、Ｓｈｈ、若しくはＲａｌｄｈ１（Ａｈｄ２）などのドーパミン神経マーカーのプロモータまたはプロモータ断片であり得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、造血幹細胞の修飾因子に関し、ＣＴＲプロモータは、限定されないがＥｖｉ１、ＧＡＴＡ−２、ＥＧＲ１、Ｇｆｉ−１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ５９、ＣＤ１３３、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、若しくはＡＢＣＧ２のプロモータまたはプロモータ断片を含んでよい。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、ＣＤ３４、ＣＤ５９、ＣＤ１３３、若しくはＡＢＣＧ２のような造血幹細胞マーカーのプロモータまたはプロモータ断片でよい。
【０１０３】
心筋細胞の修飾因子に関する他の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、限定されないがＡＣＴＮ２、ＡＤＢＲ１、ＡＦＰ、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６、ＡＮＫＲＤ１、ＡＴＦ２、ＢＭＰＲ２、ＣＫＭ、ＣＭＹＡ、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＳＲＰ３、ＣＶＤ１、ＣＸＣＬ１４、ＤＣＮ、ＤＥＳ、ＤＮＭ３、ＦＧＢ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ４、ＨＳＢＰ７、ＩＳＬ１、ＫＣＮＧ２、ＫＣＮＩＰ２、ＫＣＮＪ２、ＫＣＮＪ５、ＬＤＢ３、ＬＵＭ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＧＰ、ＭＬＣ２ｖ、ＭＹＢＰＣ３、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、ＭＹＬ３、ＭＹＬ７、ＭＹＬＫ３、ＭＹＯＣＤ、ＭＹＯＭ１、ＭＹＯＺ２、ＮＫＸ２．５、ＮＰＰＡ、ＮＰＰＢ、ＰＬＮ、ＲＹＲ２、ＳＬＣ４Ａ３、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ８、ＳＭＰＸ、ＳＹＮＰＯ２Ｌ、ＴＡＫ１、ＴＢＸ５、ＴＢＸ５、ＴＮＮＩ１、ＴＮＮＩ３Ｋ、およびＴＮＮＴ２から成る群から選択される遺伝子のプロモータまたはプロモータ断片を含んでよい。
【０１０４】
表１は、限定されない特定の細胞型のマーカー例のリストを提供する。理論に限定されることなく、マーカー遺伝子は、特定の細胞型に特異的または関連しているか、あるいはマーカー遺伝子は、優性または優先的に特定の細胞型で発現する。特定の実施形態では、本明細書に記載したＣＴＲプロモータは、表１に提示した遺伝子群から選択されたマーカー遺伝子などのプロモータであるか、またはマーカー遺伝子のプロモータ領域を含む。 
【表２】
2013500722.tif 000006
2013500722.tif 000007
2013500722.tif 000008
2013500722.tif 000009
【０１０５】
特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、第４．２．１節で記載したようなＣＴＲ因子遺伝子のプロモータである。
【０１０６】
特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータはヒトプロモータである。特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、トリ、カエル、寄生虫、昆虫、またはウシのプロモータである。いくつかの実施形態では、ＣＴＲプロモータはヒトプロモータに相同性を有する。ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは哺乳類プロモータである。  
【０１０７】
特定の実施形態では、ＣＴＲプロモータは、約１０ｂｐｓ〜１０，０００ｂｐｓ、１ｂｐ〜５０ｂｐｓ、１０ｂｐｓ〜１００ｂｐｓ、２０ｂｐｓ〜２００ｂｐｓ、５０ｂｐｓ〜２００ｂｐｓ、５０ｂｐｓ〜３００  ｂｐｓ、５０ｂｐｓ〜４００ｂｐｓ、５０ｂｐｓ〜５００ｂｐｓ、１００ｂｐｓ〜６００ｂｐｓ、１００ｂｐｓ〜７００ｂｐｓ、１００ｂｐｓ〜８００ｂｐｓ、１００ｂｐｓ〜９００ｂｐｓ、１００ｂｐｓ〜１，０００ｂｐｓ、５００ｂｐｓ〜１，５００ｂｐｓ、５００ｂｐｓ〜２，０００ｂｐｓ、５００ｂｐｓ〜５，０００ｂｐｓ、若しくは１，０００ｂｐｓ〜１０，０００ｂｐｓ、または任意の範囲間隔を含む。
【０１０８】
ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、最大で約１０，０００ｂｐｓ、最大で約９，０００ｂｐｓ、最大で約８，０００ｂｐｓ、最大で約７，０００ｂｐｓ、最大で約６，０００ｂｐｓ、最大で約５，０００ｂｐｓ、最大で約４，０００ｂｐｓ、最大で約３，０００ｂｐｓ、最大で約２，０００ｂｐｓ、最大で約１，５００ｂｐｓ、最大で約１，０００ｂｐｓ、最大で約９００ｂｐｓ、最大で約８００ｂｐｓ、最大で約７００ｂｐｓ、最大で約６００ｂｐｓ、最大で約５００ｂｐｓ、最大で約４００ｂｐｓ、最大で約３００ｂｐｓ、最大で約２００ｂｐｓ、最大で約１５０ｂｐｓ、最大で約１００ｂｐｓ、最大で約７５ｂｐｓ、最大で約５０ｂｐｓ、最大で約４０ｂｐｓ、最大で約３０ｂｐｓ、最大で約２５ｂｐｓ、最大で約２０ｂｐｓ、最大で約１５ｂｐｓ、または最大で約１０ｂｐｓを含む。
【０１０９】
ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、転写開始点の上流から最大で約１０，０００ｂｐｓ、最大で約９，０００ｂｐｓ、最大で約８，０００ｂｐｓ、最大で約７，０００ｂｐｓ、最大で約６，０００ｂｐｓ、最大で約５，０００ｂｐｓ、最大で約４，０００ｂｐｓ、最大で約３，０００ｂｐｓ、最大で約２，０００ｂｐｓ、最大で約１，５００ｂｐｓ、最大で約１，０００ｂｐｓ、最大で約９００ｂｐｓ、最大で約８００ｂｐｓ、最大で約７００ｂｐｓ、最大で約６００ｂｐｓ、最大で約５００ｂｐｓ、最大で約４００ｂｐｓ、最大で約３００ｂｐｓ、最大で約２００ｂｐｓ、最大で約１５０ｂｐｓ、最大で約１００ｂｐｓ、最大で約７５ｂｐｓ、最大で約５０ｂｐｓ、最大で約４０ｂｐｓ、最大で約  ３０ｂｐｓ、最大で約２５ｂｐｓ、最大で約２０ｂｐｓ、最大で約１５ｂｐｓ、または最大で約１０ｂｐｓを含む。
【０１１０】
ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、転写開始点の下流から最大で約２００ｂｐｓ、最大で約１５０ｂｐｓ、最大で約１００ｂｐｓ、最大で約９０ｂｐｓ、最大で約８０ｂｐｓ、最大で約７０ｂｐｓ、最大で約６０ｂｐｓ、最大で約５０ｂｐｓ、最大で約４０ｂｐｓ、最大で約３０ｂｐｓ、最大で約２０ｂｐｓ、最大で約１５ｂｐｓ、最大で約１０ｂｐｓ、最大で約８ｂｐｓ、最大で約９ｂｐｓ、最大で約７ｂｐｓ、最大で約６ｂｐｓ、最大で約５ｂｐｓ、最大で約４ｂｐｓ、最大で約３ｂｐｓ、または最大で約２ｂｐｓを含む。
【０１１１】
ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、最大で約１０，０００ｂｐｓ、最大で約９，０００ｂｐｓ、最大で約８，０００ｂｐｓ、最大で約７，０００ｂｐｓ、最大で約６，０００ｂｐｓ、最大で約５，０００ｂｐｓ、最大で約４，０００ｂｐｓ、最大で約３，０００ｂｐｓ、最大で約２，０００ｂｐｓ、最大で約１，５００ｂｐｓ、最大で約１，０００ｂｐｓ、最大で約９００ｂｐｓ、最大で約８００ｂｐｓ、最大で約７００ｂｐｓ、最大で約６００ｂｐｓ、最大で約５００ｂｐｓ、最大で約４００ｂｐｓ、最大で約３００ｂｐｓ、最大で約２００ｂｐｓ、最大で約１５０ｂｐｓ、最大で約１００ｂｐｓ、最大で約７５ｂｐｓ、最大で約５０ｂｐｓ、最大で約４０ｂｐｓ、最大で約３０ｂｐｓ、最大で約２５ｂｐｓ、最大で約２０ｂｐｓ、最大で約１５ｂｐｓ、または最大で約１０ｂｐｓを含む。
【０１１２】
ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、転写開始点の上流から少なくとも約１０，０００ｂｐｓ、少なくとも約９，０００ｂｐｓ、少なくとも約８，０００ｂｐｓ、少なくとも約７，０００ｂｐｓ、少なくとも約６，０００ｂｐｓ、少なくとも約５，０００ｂｐｓ、少なくとも約４，０００ｂｐｓ、少なくとも約３，０００ｂｐｓ、少なくとも約２，０００ｂｐｓ、少なくとも約１，５００ｂｐｓ、少なくとも約１，０００ｂｐｓ、少なくとも約９００ｂｐｓ、少なくとも約８００ｂｐｓ、少なくとも約７００ｂｐｓ、少なくとも約６００ｂｐｓ、少なくとも約５００ｂｐｓ、少なくとも約４００ｂｐｓ、少なくとも約３００ｂｐｓ、少なくとも約２００ｂｐｓ、少なくとも約１５０ｂｐｓ、少なくとも約１００ｂｐｓ、少なくとも約７５ｂｐｓ、少なくとも約５０ｂｐｓ、少なくとも約４０ｂｐｓ、少なくとも約３０ｂｐｓ、少なくとも約２５ｂｐｓ、少なくとも約２０ｂｐｓ、少なくとも約１５ｂｐｓ、または少なくとも約１０ｂｐｓを含む。
【０１１３】
ある実施形態では、ＣＴＲプロモータは、転写開始点の下流から少なくとも約１００ｂｐｓ、少なくとも約９０ｂｐｓ、少なくとも約８０ｂｐｓ、少なくとも約７０ｂｐｓ、少なくとも約６０ｂｐｓ、少なくとも約５０ｂｐｓ、少なくとも約４０ｂｐｓ、少なくとも約３０ｂｐｓ、少なくとも約２０ｂｐｓ、少なくとも約１５ｂｐｓ、少なくとも約１０ｂｐｓ、少なくとも約８ｂｐｓ、少なくとも約９ｂｐｓ、少なくとも約７ｂｐｓ、少なくとも約６ｂｐｓ、少なくとも約５ｂｐｓ、少なくとも約４ｂｐｓ、少なくとも約３ｂｐｓ、または少なくとも約２ｂｐｓを含む。
【０１１４】
プロモータを単離およびクローニングする方法は、当業者に公知されている。例えば、遺伝子の惹起開始点の上流にあるゲノムＤＮＡ断片をレポーター構築物にクローニングすることができ、これによりゲノムＤＮＡ断片がレポーターをコード化するＯＲＦに動作可能に連結する。このレポーター構築物は、プロモータの活性またはプロモータの種々の断片の分析に使用することができる。特定の遺伝子については、プロモータ領域が既に同定されている。
【０１１５】
当業者に公知されている任意の技術を使用し、目的のＣＴＲ遺伝子のプロモータ分析を行って、細胞型の特異性をもたらすことができる転写制御機能を有するＣＴＲ遺伝子のプロモータを同定することができる。（例えば、Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，  Ｓｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＬＬＣ，  ２００７を参照されたい）。ある実施形態では、ＣＴＲ遺伝子の転写開始点を囲むゲノムＤＮＡの断片をレポーター構築物にクローニングし、レポーター遺伝子と動作可能に連結させることができる。特定の実施形態では、ゲノムＤＮＡ断片は、異種性のミニマルプロモータのようなミニマルプロモータにも動作可能に連結される。ある実施形態では、ゲノムＤＮＡ断片は、既にミニマルプロモータを包含している。結果生じた調節ＤＮＡ構築物を、次に目的のＣＴＲ遺伝子を発現する細胞型に導入する。レポーター遺伝子が、結果として生じた細胞で発現する場合、ゲノム断片はその細胞型に特異的な細胞型をもたらすプロモータ要素を含む。その細胞型において発現させるために必要な最小の配列を同定するために、次にゲノム断片をさらに精査することができる。他の実施形態では、転写制御因子（単数または複数）が、目的のＣＴＲ遺伝子の発現を活性化させることが知られている場合、目的のＣＴＲ遺伝子の転写開始を包囲するゲノムＤＮＡを用いてＥＭＳＡまたはＤＮＡフットプリント実験を行うことができる。
【０１１６】
４．１．３  標的配列
本明細書に記載したこのレポーター核酸コンストラクトは、例えば、ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、ＴＳＲ３、などの本明細書では標的配列ＲＮＡ（「ＴＳＲ」）として参照されるＲＮＡ転写物をコード化する１つまたはそれ以上の標的配列核酸を含む。レポーター核酸によってコードされた標的配列がＲＮＡ（即ち、ＴＳＲ）に転写される時、転写されたＴＳＲが蛍光発生オリゴヌクレオチドによって検出される。この蛍光発生オリゴヌクレオチドは、標的配列と部分的または完全に相補的であり、転写されたＴＳＲとハイブリッド形成することができる塩基配列を含む。
【０１１７】
当該分野で知られた任意の技術を使って細胞内のＴＳＲを検出することができる。いくつかの実施形態において、蛍光発生オリゴヌクレオチドを使うことができる。いくつかの実施形態において、分子標識を使うことができる。例えば、米国特許第６．６９２．９６５号およびＰＣＴ国際出願ＷＯ２００５／０７９４６２２Ａ２号を参照されたい。いくつかの実施形態において、蛍光発生オリゴヌクレオチドは、フルオロフォアおよび失活剤と接合する。蛍光発生オリゴヌクレオチドは、標的配列と結合またはハイブリッド形成しない時は、１つの構造または高次構造の形を取るが、標的配列と結合またはハイブリッド形成する時は、異なる構造または高次構造の形を取る。
【０１１８】
即ち、蛍光発生オリゴヌクレオチドの立体構造変化が標的配列の存在下で起こることがあるが、この変化は、フルオロフォア興奮すると放射されるシグナルの消光効率を減少させる結果を生み出す。いくつかの特定の実施形態において、標的配列の存在下で蛍光発生オリゴヌクレオチドから放射した蛍光性シグナルは、標的配列の非存在下で蛍光発生オリゴヌクレオチドから放射した蛍光性シグナルより高いいくつかの特定の実施形態において、蛍光発生オリゴヌクレオチドが標的配列とハイブリッド形成しない時、蛍光性シグナルが消光する。非ハイブリッドの蛍光発生オリゴヌクレオチドがステムループ構造を形成することがある。いくつかの態様において、消光検出シグナルは、ステムループ構造の結果であることがある。
【０１１９】
いくつかの特定の実施形態において、標的配列の存在下で蛍光発生オリゴヌクレオチドから放射した蛍光性シグナルは、標的配列の非存在下で蛍光発生オリゴヌクレオチドから放射した蛍光性シグナルより少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％より高い。いくつかの特定の実施形態において、標的配列の存在下で蛍光発生オリゴヌクレオチドから放射した蛍光性シグナルは、標的配列の非存在下で蛍光発生オリゴヌクレオチドから放射した蛍光性シグナルより少なくとも約１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１．０００倍高い。
【０１２０】
種々のＲＮＡ配列のどれも標的配列（例えば、ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、ＴＳＲ３、など）として使って良く、上記したレポーターをコード化する配列、またはレポーターの非翻訳領域（「ＵＴＲ」）を含む。標的配列は、異種性配列（例えば、転写されるレポーター塩基配列と無関係な配列）であっても良い。蛍光発生オリゴヌクレオチドと結合またはハイブリッド形成する標的配列は、レポーター転写物と同時転写されるレポーター核酸コンストラクトの３’ＵＴＲなど３’ＵＴＲの部分であって良い。いくつかの特定の実施形態において、蛍光発生オリゴヌクレオチドと結合またはハイブリッド形成する標的配列は、レポーター転写物と同時転写されるレポーター核酸コンストラクトの５’ＵＴＲなど５’ＵＴＲの部分であって良い。
【０１２１】
いくつかの特定の実施形態において、ＴＳＲはレポーター遺伝子と同時に転写される。いくつかの特定の実施形態において、レポーター遺伝子と同時に転写されるＴＳＲは、アミノ酸配列をコード化することがあったりなかったりする。いくつかの実施形態において、標的配列は、レポーター遺伝子のメッセージタンパク質翻訳領域の部分のフレーム内であっても、またはフレーム外でも良い。従って、標的配列を、蛍光発生オリゴヌクレオチドによって、検出ために翻訳する必要はない。標的配列は、同一または異なる複数の標的配列を含み、ここで蛍光発生オリゴヌクレオチドは、各標的配列とハイブリッド形成する。標的配列は、レポーターなどの対象とする遺伝子をコードＲＮＡ内に位置するか、または標的配列は、５’あるいは３’ＵＴＲ内、または５’あるいは３’ＵＴＲの直前または直後に位置する。その他の実施形態において、標的配列は、レポーター、５’ＵＴＲ、または３’ＵＴＲ内のＯＲＦのどの配列とも相同でない異種性配列である。
【０１２２】
いくつかの特定の実施形態において、レポーター核酸コンストラクトはレポーターと同時転写される標的配列（例えば、ＴＳＲ３）を含む。いくつかの特定の実施形態において、レポーターと同時転写される標的配列はレポーター転写物の３’ＵＴＲに位置する。いくつかの特定の実施形態において、レポーターと同時転写される標的配列はレポーター転写物の５’ＵＴＲに位置する。いくつかの特定の実施形態において、レポーターと同時転写される標的配列はレポーター転写物内に位置する。いくつかの特定の実施形態において、レポーターと同時転写される標的配列はレポーターレポーター転写物の任意の近接する断片と相同でない。いくつかの態様において、レポーターと同時転写される標的配列が、標的配列に相補的な蛍光発生オリゴヌクレオチドを使用するレポーターの低基底転写を持つ細胞を選択させる。いくつかの実施形態において、標的配列を含むレポーター転写物の３’ＵＴＲは異種性配列である。
【０１２３】
ＴＳＲは二次構造を持つＲＮＡであって良い。その構造は、３つのアーム接合構造であって良い。いくつかの実施形態において、蛍光発生オリゴヌクレオチドは、レポーターなどの対象とするタンパク質コード配列内に配列を検出することがある。この場合、レポーターのｍＲＮＡはＴＳＲとしての役目を果たす。
【０１２４】
いくつかの特定の実施形態において、レポーター核酸コンストラクトは１つまたはそれ以上のレポーターと同時転写されないＴＳＲを含む、しかし、その転写は別のプロモータの支配下にある。いくつかの特定の実施形態において、第１の標的配列はレポーターをコード化する５’からＯＲＦまでである。いくつかの特定の実施形態において、第１の標的配列はレポーターをコード化する３’からＯＲＦまでである。レポーター核酸コンストラクトは１つまたは複数の標的配列を含み、第１と第２の標的配列は、レポーターをコード化するＯＲＦに隣接する（例えば、第１の標的配列は、５’からレポーターをコード化するＯＲＦまでで、第２の標的配列は３’からレポーターをコード化するＯＲＦまである）。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、恒常的なプロモータに機能的に連結する標的配列は、レポーターの配列とは逆の配向である。例えば、レポーターＯＲＦのプロモータコンストラクト上流は、そこからレポーターの転写が起こるＤＮＡの逆鎖からの転写物を結果として生じることがある。いくつかの実施形態において、レポーターＯＲＦから下流にある恒常的なプロモータに機能的に連結する標的配列は、レポーターＯＲＦと同じ配向であって良く、そこからレポーターの転写が始まるＤＮＡの同鎖からの転写物を結果として生じることがある。いくつかの実施形態において、恒常的なプロモータに機能的に連結する標的配列は、レポーター核酸コンストラクト内のレポーターＯＲＦの配向と同じ配向である。
【０１２６】
いくつかの特定の実施形態において、恒常的なプロモータに機能的に連結する標的配列は、交差転写の調節または活性化を最小化するためにその他の標的配列またはレポーターＯＲＦからある一定の距離に置かれる。いくつかの特定の実施形態において、恒常的なプロモータに機能的に連結する標的配列は、その他の標的配列またはレポーターＯＲＦから少なくとも１００塩基対、２００塩基対、３００塩基対、４００塩基対、５００塩基対、６００塩基対、７００塩基対、８００塩基対、９００塩基対、１．０００塩基対、１．５００塩基対、２．０００塩基対、２．５００塩基対、３．０００塩基対、３．５００塩基対、４．０００塩基対、４．５００塩基対、５．０００塩基対、６．０００塩基対、７．０００塩基対、８．０００塩基対、９．０００塩基対、または１０．０００塩基対の距離に位置する。いくつかの特定の実施形態において、恒常的なプロモータに機能的に連結する標的配列は、その他の標的配列またはレポーターＯＲＦから最大で１００塩基対、２００塩基対、３００塩基対、４００塩基対、５００塩基対、６００塩基対、７００塩基対、８００塩基対、９００塩基対、１．０００塩基対、１．５００塩基対、２．０００塩基対、２．５００塩基対、３．０００塩基対、３．５００塩基対、４．０００塩基対、４．５００塩基対、５．０００塩基対、６．０００塩基対、７．０００塩基対、８．０００塩基対、９．０００塩基対、または１０．０００塩基対の距離に位置する。
【０１２７】
ＴＳＲは二次構造を持つＲＮＡであって良い。この構造３アーム接合構造である。いくつかの特定の実施形態において、標的配列は約３０％〜７０％のＧＣ含量を持つ。いくつかの特定の実施形態において、標的配列は少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％のＧＣリッチである。いくつかの特定の実施形態において、標的配列は最大限で３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％のＧＣである。
【０１２８】
いくつかの特定の実施形態において、標的配列またはＴＳＲは、約５から１．０００のヌクレオチド、約５から７５０のヌクレオチド、約５から５００のヌクレオチド、約５から２５０のヌクレオチド、約５から２００のヌクレオチド、約５から１５０のヌクレオチド、約５から１００のヌクレオチド、約５から１００のヌクレオチド、約５から７５のヌクレオチド、約５から５００のヌクレオチド、約１０から１００のヌクレオチド、約１０から７５のヌクレオチド、約１０から５０のヌクレオチド、約１０から３０のヌクレオチド、約５から２０のヌクレオチド、約２０から１００のヌクレオチド、約２０から７５のヌクレオチド、または約３０から１００のヌクレオチドの長さ、または各２数値間の任意の値の長さである。いくつかの特定の実施形態において、標的配列またはＴＳＲは、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のヌクレオチドの長さである。
【０１２９】
いくつかの特定の実施形態において、標的配列またはＴＳＲは、最大限で１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９５
ヌクレオチドまたは１００ヌクレオチドの長さである。いくつかの特定の実施形態において、標的配列またはＴＳＲは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、
３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０未満のヌクレオチドの長さである。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、ＴＳＲは転写終結配列を含む。真核細胞内において、精製されたＲＮＡポリメラーゼＩＩＩが、一連のＵ残基を重合した後転写を終結する。転写終結配列は、ＵＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵＵ、またはＵＵＵＵＵＵＵＵＵなどの一連のＵ残基を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写終結配列は、連続または連続しない１０またはそれ以上のＵ残基を含むＲＮＡ配列を含む。いくつかの特定の実施形態において、転写終結配列は、少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のＵ残基を含む。細菌内では、転写終結は、Ｒｈｏ依存または非依存終結を含む。Ｒｈｏ非依存終結は、ＧＣリッチな自己相補的領域が先行した一連のＵ残基と転写されたＲＮＡ内のいくつかの介在性ヌクレオチドを含む。ＧＣリッチな自己相補的領域はステムループ構造を形成することがある。
【０１３１】
いくつかの特定の実施形態において、ＴＳＲはポリアデニル化配列、ＵＡを含まない。いくつかの実施形態において、ＴＳＲはｐｏｌｙ（Ａ）テールを含まないか、またはｐｏｌｙ（Ａ）テールではない。いくつかの実施形態において、ＴＳＲは一貫した３’末端を作ることがある転写物の３’末端を切断するリボザイムである。いくつかの特定の実施形態において、ＴＳＲは転写物の３’末端を切断するリボザイムではない。
【０１３２】
いくつかのその他の実施形態において、ＴＳＲはＵＴＲ（例えば、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ）、またはその断片ではない。いくつかのその他の実施形態において、ＴＳＲは翻訳されない。いくつかの実施形態において、ＴＳＲは遺伝子の翻訳領域、ｎｍＲＮＡ、またはそれらの断片ではない。いくつかの特定の実施形態において、ＴＳＲはゲノムの自然配列（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、カエル、寄生虫、昆虫（例えば、ハエ）、または雌ウシのゲノム）ではない。いくつかの特定の実施形態において、ＴＳＲはｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ、またはそれらの前駆物質ではない。
【０１３３】
４．４．１  標的配列の転写を駆動するプロモータ
いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトの標的配列を転写することは、プロモータによって駆動する、すなわち、標的配列ＲＮＡをコード化する塩基配列は、機能的にプロモータに連結する。当業者は、標的配列を転写するのに適したプロモータを選択することができるだろう。
【０１３４】
いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトの標的配列を転写することは、恒常的なプロモータによって駆動する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトの標的配列を転写は、誘導性のプロモータ（例えば、Ｔｅｔオンオフシステム）によって駆動する。いくつかの実施形態において、標的配列の転写を駆動するプロモータはＣＴＲプロモータではない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトの標的配列を転写は、ＣＴＲプロモータによって駆動するいくつかの実施形態において、本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトの標的配列を転写は、レポーターのＯＲＦと機能的に連結したＣＴＲプロモータと異なるＣＴＲプロモータによって駆動する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の標的配列の各々の転写を駆動するプロモータは、それぞれ異なる。例えば、第１のプロモータはＴＳＲ１の転写を駆動し、第２のプロモータ（第１のプロモータとは異なる）はＴＳＲ２の転写を駆動するなど。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、レポーターと同時転写しないＴＳＲ１の転写を駆動するプロモータは宿主細胞内で初期には活性化しているはずであるが、宿主細胞が細胞運命の変遷を経過するにしたがって（例えば、分化、脱分化、または分化転換）宿主細胞内の新しい細胞運命での細胞環境でプロモータは不活性化する。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、標的配列の転写がＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータで駆動されることがある。いくつかの実施形態において、標的配列の転写がＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータで駆動されることがある。いくつかの特定の実施形態において、標的配列の転写を駆動するプロモータは異種性プロモータである。いくつかの特定の実施形態において、標的配列の転写を駆動するプロモータは最小プロモータ領域を含むか、または実質的に含む。いくつかの実施形態において、標的配列の転写を駆動するプロモータは１つまたは複数のエンハンサーエレメントを含む。
【０１３７】
［００１３５］操縦する本明細書に記載した１つまたは複数の標的配列の転写駆動するために使うことのできるプロモータの非限定の例として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、核Ｔ７プロモータおよびＳＶ４０初期プロモータ領域、ラウス肉腫ウイルスの３’長い終端反復に含まれるプロモータ、疱疹チミジンキナーゼプロモータ、およびメタロチオネイン遺伝子の制御配列を含む。
【０１３８】
４．１．５．  核酸コンストラクトのクローニング
当業者に理解されているように、任意の適切な方法を使って本明細書に記載した核酸コンストラクトをクローン化することができる（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２）。コンストラクトおよびプラスミドの調製ならびに宿主細胞の形質転換の際に採用されている様々な方法が当業者に知られている。両宿主細胞ならびに一般的な組換え型手順に対する適切な発現系の非限的の例ついては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕｌ、３ｒｄＥｄ．ｅｄ．，ｂｙＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌｂｏｒｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１）を参照されたい。
【０１３９】
核酸を細胞に導入する技術は、当業者に知られており、容易に理解できる。この方法は以下に制限される訳ではないが、形質移入、ウイルス性送達、タンパク質、またはペプチド媒介挿入、共沈方法、脂質ベース送達試薬
（リポフェクション）、サイトフェクション、リポポリアミン送達、デンドリマー送達試薬、電気穿孔法、または機械的送達を含む。
【０１４０】
核酸を宿主細胞に導入するために使うことのできる技術の例は、以下に制限されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、コスミド、および人工染色体を含むプラスミド、ウイルスを含む。プラスミドの非限定例として、例えば、ｐＣＭＶＳｃｒｉｐｔ、ｐｃＤＮ３．１Ｈｙｇｒｏ、ｐｃＤＮ３．１ｎｅｏ、ｐｃＤＮ３．１ｐｕｒｏ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｉＲＥＳｐｕｒｏ、ｐＳＶ２ｎｅｏを含めて良い。本明細書に記載された細胞または株化細胞を作るのに有用な模範的な哺乳類の発現ベクターは、ｐＦＮ１１（ＢＩＮＤ）Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＧＬ４．３１、ｐＦＣ１４Ａ（ＨｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶＦｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＣ１４Ｋ（ＨｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶＦｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＮ２４Ａ（ＨｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶｄ３Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＮ２４Ｋ（ＨｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶｄ３Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ＨａｌｏＴａｇ（トレードマーク）ｐＨＴ２、ｐＡＣＴ、ｐＡｄＶｎｔｇｅ（トレードマーク）、ｐＡＬＴＥＲ（登録商標）−ＭＡＸ、ｐＢＩＮＤ、ｐＣＴ（登録商標）３−Ｂａｓｉｃ、ｐＣＴ（登録商標）３Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＣＴ（登録商標）３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＣＴ（登録商標）３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶＴＮＴＴＭ、ｐＧ５ｌｕｃ、ｐＳＩ、ｐＴＲＧＥＴＴＭ、ｐＴＮＴＴＭ、ｐＦ１２ＲＭＦｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦ１２ＫＲＭＦｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＲｅｇｎｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＡｃＹＣＭＶＮ５−ＤＥＳＴＧａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｖｅｃｔ、またはｐＡ＆ＰＬ−ＤＥＳＴＴＭＧａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｖｅｃｔ、またはＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（トレードマーク）２７Ｖｅｃｔ、またはＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１ＶｅｃまたはＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐｃＤＮＴＭ−ＤＥＳＴ４７ｖｅｃｔ、またはｐＣＭＶ／ＢｓｄＶｅｃｔ、またはｐＥＦ６／ＨｉｓＡ、Ｂ、＆Ｃ、ｐｃＤＮ（トレードマーク）６．２ＤＥＳＴ、ｐＬｅｎｔｉ６／ＴＲ、ｐＬＰ−ｃＧＦＰ１−Ｃ、ｐＬＰＳ−ｃＧＦＰ１−Ｎ、ｐＬＰ−ＩＲＥＳｎｅｏ、ｐＬＰ−ＴＲＥ２、ｐＬＰ−ＲｅｖＴＲＥ、ｐＬＰ−ＬＮＣＸ、ｐＬＰ−ＣＭＶ−ＨＡ、ｐＬＰ−ＣＭＶ−Ｍｙｃ、ｐＬＰ−ＲｅｔｒｏＱおよびｐＬＰＣＭＶｎｅｏ、を含む。本明細書に記載された方法に使用できる別のプラスミドの非限定例は、ＰＢ−ＴＥＴトランスポゾンプラスミドである。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、ベクターは恒常的または条件的プロモータなどの発現制御配列を含む。当業者はそのような配列を選択できるだろう。例えば、適したプロモータは、以下に制限されないが、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）ＴＫ（チミジンキナーゼ）ＳＶ４０およびＥＦ１０を含む。例えば、プロモータは、誘導性の、温度制御の、組織特異的な、抑制可能な、熱ショックの、発生上の、細胞系特異的な、真核生物の、原核生物の、あるいは時間的なプロモータであるか、または上記のいずれかあるいはいくつかの未変性あるいは突然変異性の組み合わせあるいは組換えの、またはランダム化した、混合した配列である。別の実施形態において、ＣＴＲ因子などの対象とするタンパク質は、遺伝子活性化またはエピソーム化により発現する。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、ベクター（例えば、レポーター核酸コンストラクト）は選択可能なマーカーまたは薬剤抵抗性遺伝子を欠く。他の実施形態において、ベクター（例えば、レポーター核酸コンストラクト）は任意選択で薬剤または抗生物質耐性またはより一般的に細胞に選択圧を及ぼす任意の産物などを与えるタンパク質などの選択可能なマーカーをコード化する核酸を任意選択で含む。１種以上のベクターが使われる場合、各ベクターは、同種あるいは異なる薬剤耐性またはその他の選択圧マーカーを持つことがある。薬剤耐性またはその他の選択圧マーカーの１つ以上が同じであれば、同時選択が薬剤のレベルを増加することによって達成できる。
【０１４３】
適正なマーカーが当業者に知られていて、以下に限定されないが、ネオマイシン／Ｇ４１８、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、メトトレキサートおよびブラストサイジンの内いずれかに抵抗性を与えるポリペプチド産物を含む。薬剤選択（または、その他の適切な選択マーカーを使用した選択）は本明細書に記載された細胞および株化細胞を産生する段階において必要とされないが、形質移入されたコンストラクトが薬剤耐性を与えるようにデザインされているという条件の下に、安定に形質移入された細胞のために形質移入された細胞集団を強化するのに使うことができる。対象とするタンパク質を発現する細胞を引き続き選択することが蛍光発生オリゴヌクレオチドを使用して達成される場合、形質移入に引き続いて選択を早過ぎると、一過性で不安定に形質移入されただけのいくつかの陽性細胞結果として生み出すことがある。しかしながら、この効果は、形質移入された細胞内で一過性発現を希釈させるために十分な細胞継代をさせることによって最小化することができる。
【０１４４】
４．２  宿主細胞
本明細書に記載された方法に適した任意の宿主細胞を使って良い。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞はヒト細胞ではない。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、カエル、寄生虫、昆虫（例えば、ハエ）または、雌ウシ由来の細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳類細胞、または真核細胞である。
【０１４５】
特定の宿主細胞／ＣＴＲ組み合わせの選択は、同定される細胞運命修飾因子に依存する。例えば、線維芽細胞由来の多能性幹細胞を誘発することができる修飾因子を同定したいのであれば、多能性幹細胞ＣＴＲプロモータに機能的に連結するレポーターのＯＲＦを含むレポーター核酸コンストラクトを含む線維芽細胞宿主細胞を、本明細書に記載された方法のために選択できる。
【０１４６】
本発明は、細胞運命の修飾因子を同定およびまたは立証する方法（例えば、幹細胞維持、細胞特定、細胞決定、幹細胞運命の誘導、細胞分化、細胞脱分化および細胞分化転換）などの本明細書に記載された方法に使用する宿主細胞提供する。本発明はまたそのような宿主細胞を調製し単離する方法を提供する。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載する宿主細胞は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、カエル、サルなどの哺乳類に移植できる。細胞を、細胞運命／細胞型特定において本明細書に記載する修飾因子の生物活性を評価する生体内アッセイために使用することができる。レポーターの活性を生体内で検出することができる。
【０１４８】
いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載する新しい組織、器官、または動物もしくは生物体の全体を産生することに有用である。例えば、線維芽細胞の宿主細胞は、幹細胞を有するプロモータレポーター核酸コンストラクトを含むように設計され、線維芽細の胞宿主細胞は、線維芽細胞の宿主細胞由来のｉＰＳ細胞を産生する条件にさらす。引き続いて、ｉＰＳ細胞を新しい分化細胞、新しい組織、新しい器官、または非ヒト生物体全体を産生する条件にさらす。宿主細胞は、体細胞からｉＰＳ細胞および異なる細胞型への宿主細胞の進行をモニタリングまたは検出するレポーター核酸コンストラクトの組み合わせを含んで良い。本発明はまた、ｉＰＳ細胞に誘導される体細胞性宿主細胞などの宿主細胞から新しい組織、新しい器官、または非ヒト生物体全体を産生する方法に関する。任意の設計された細胞は、本明細書に記載するｉＰＳ細胞を産生する方法に使用して良い。
【０１４９】
いくつかの特定の実施形態において、本発明はまたは本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクト（例えば、ＣＴＲプロモータと機能的に連結するレポーターをコード化するＯＲＦを含む核酸コンストラクト、および標的配列をコード化する核酸配列）を含む宿主細胞を提供する。いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載した宿主細胞は、それぞれが異なるレポーター遺伝子をコード化するＯＲＦを含む２個以上のレポーター核酸コンストラクトを含む。例えば、第１のレポーター核酸コンストラクトは、第１のＣＴＲプロモータに機能的に連結する第１のレポーターをコード化する第１のＯＲＦ、および第１のレポーターと同時転写される第１のＴＳＲをコード化する核酸配列を含み、第２のレポーター核酸コンストラクトは、第２のＣＴＲプロモータに機能的に連結する第２のレポーターをコード化する第２のＯＲＦ、および第２のレポーターと同時転写される第２のＴＳＲをコード化する核酸配列を含む。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載した３以上のレポーター核酸コンストラクトを含んで良い。
【０１５０】
いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は２個以上の異なるレポーター核酸コンストラクトを含む。異なるレポーター核酸コンストラクトの各々は、同じレポーターをコード化するＯＲＦに機能的に連結する異なるＣＴＲプロモータを含むことがある。いくつかの実施形態において、レポーター核酸コンストラクトの各々は、異なるレポーターをコード化するＯＲＦに機能的に連結する異なるＣＴＲプロモータを含むことがある。例えば、宿主細胞は３個以上の異なるレポーター核酸コンストラクトを含み、ここで異なるレポーター核酸コンストラクトの各々は、Ｎａｎｏｇプロモータ、Ｏｃｔ４プロモータ、およびｃ−ｍｙｃプロモータなどの３個の異なるＣＴＲプロモータの内の１個に機能的に連結する同レポーターのＯＲＦを含むことがある。ＣＴＲプロモータの複数グループも使って良く、ここで各グループは異なるレポーターを含む。例えば、宿主細胞は、転写的に第１のレポーターを制御するＣＴＲプロモータの第１のグループ、および転写的に第２のレポーターを制御するＣＴＲプロモータの第２のグループを含んで良い。宿主細胞は、第３または第４のレポーターそれぞれを発現する第３または第４のＣＴＲプロモータのグループをそれぞれさらに含む。例えば、いくつかの特定の実施形態において、第１のグループのＣＴＲプロモータは第１の細胞型に付随し、第２のグループのＣＴＲプロモータは第２の細胞型に付随する。そのような系において、同じ細胞を、第１の細胞型（例えば、幹細胞）に達成するのに関わる化合物を同定するために、同様に第２の細胞型（例えば、筋細胞）に達成するのに関わる化合物を同定するために使って良い。
【０１５１】
［００１４８］いくつかの特定の態様において、本発明は発現ライブラリを提供し、ここで異なる細胞のパネルが本明細書に記載された１個または複数のレポーター核酸コンストラクトを含むように設計される。そのような発現ライブラリ、宿主細胞を同定または選択するために有用であり、ここでＣＴＲプロモータは活性化しているかまたは不活性である。いくつかの特定の実施形態において、発現ライブラリは、本明細書に記載された１個または複数のレポーター核酸コンストラクトを含む１００を超す異なる細胞型を含む。いくつかの特定の実施形態において、発現ライブラリは、本明細書に記載された１個または複数のレポーター核酸コンストラクトを含む、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１．０００の異なる細胞型を含む。いくつかの実施形態において、発現ライブラリは、本明細書に記載された１個または複数のレポーター核酸コンストラクトを含む少なくとも５−１０、５−１５、１０−２０、１０−４０、２０−４０、２０−５０、３０−６０、４０−１００、１００−１５０、１００−２００、１００−３００、１００−４００、１００−５００、２００−６００、または５００−１．０００異なる細胞型を含む。
【０１５２】
いくつかの特定の実施形態において、発現ライブラリの宿主細胞は、１個または複数のＣＴＲ因子を組換えで発現するように設計することができる。いくつかの特定の実施形態において、発現ライブラリの宿主細胞は、ＲＮＡである１個または複数のＣＴＲ因子を組換えで発現するように設計することができる。これらのＲＮＡは宿主細胞に導入されるレポーター核酸コンストラクトによってコードできる。例えば、レポーター核酸コンストラクトのライブラリは、レポーター核酸コンストラクトが、（ｉ）ＣＴＲプロモータに機能的に連結するレポーターＯＲＦ、（ｉｉ）１個または複数のＴＳＲをコード化する配列、および（ｉｉｉ）テストＲＮＡをコード化するＯＲＦが含まれるように産生される。ライブラリの各レポーター核酸コンストラクトは、異なるテストＲＮＡをコード化する。宿主細胞内のレポーターの活性が決定され、目的とするレポーター活性を有する宿主細胞に含まれるレポーター核酸コンストラクトによってコードされたテストＲＮＡが同定される。いくつかの特定の実施形態において、テストＲＮＡ（単数または複数）が異なる核酸発現コンストラクトによってコード化される。
【０１５３】
本明細書に記載された方法と共に使用可能な細胞は、真核細胞および株化細胞などの任意の適切な宿主細胞または株化細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳類の細胞または株化細胞である。適した宿主細胞を選択することは多様な因子に依存する。いくつかの特定の実施形態において、レポーター核酸コンストラクトのＣＴＲプロモータは宿主細胞内で活性化していないことが望ましい。別の実施形態において、レポーター核酸コンストラクトのＣＴＲプロモータは宿主細胞内で活性化していることが望ましい。
【０１５４】
本明細書に記載された方法と共に使用可能な宿主細胞の非限定例として、ヒト胚性腎臓−２９３Ｔ細胞、ニューロン、確立されたニューロン系統、褐色細胞腫、神経芽細胞腫線維芽細胞、横紋筋肉腫、後根神経節細胞、ＮＳ０細胞、変動係数−１（アメリカ培養細胞系統保存機関（ＣＣ）ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（（ＣＣ）ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（（ＡＣＣ）ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（（ＣＣ）ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（（ＡＣＣ）ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（（ＡＣＣ）ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（（ＣＣ）ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（（ＡＣＣ）ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（（ＡＣＣ）ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（（ＡＣＣ）ＣＣＬ１７１）、Ｌ細胞、ＨＥＫ−２９３（（ＡＣＣ）ＣＲＬ１５７３）およびＰＣ１２（（ＣＣ）ＣＲＬ−１７２１）、ＨＥＫ２９３Ｔ（（ＡＣＣ）ＣＲＬ−１１２６８）、ＲＢＬ（（ＡＣＣ）ＣＲＬ−１３７８）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（（ＣＣ）ＣＲＬ−２２６６）、ＭＤＣＫ（（ＣＣ）ＣＣＬ−３４）、ＳＪ−ＲＨ３０（（ＣＣ）ＣＲＬ−２０６１）、ＨｅｐＧ２（（ＡＣＣ）ＨＢ−８０６５）、ＮＤ７／２３（ＥＣＡＣＣ９２０９０９０３）、ＣＨＯ（ＥＣＣＣ８５０５０３０２）、ベロ（（ＣＣ）ＣＣＬ８１）、Ｃａｃｏ−２（（ＡＣＣ）ＨＴＢ３７）、Ｋ５６２（（ＣＣ）ＣＣＬ２４３）、Ｊｕｒｋｔ（（ＡＣＣ）ＴＩＢ−１５２）、Ｐｅｒ。Ｃ６（Ｃｒｕｃｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）、Ｈｕｖｅｃ（（ＡＣＣ）ヒト一ＰＣＳ１００−０１０、マウスＣＲＬ２５１４、ＣＲＬ２５１５、ＣＲＬ２５１６）、ＨｕＨ−７Ｄ１２（ＥＣＡＣＣ０１０４２７１２）、２９３（（ＡＣＣ）ＣＲＬ１０８５２）、５４９（（ＡＣＣ）ＣＣＬ１８５）、ＩＭＲ−９０（（ＣＣ）ＣＣＬ１８６）、ＭＣＦ−７（ＴＣＨＴＢ−２２）、Ｕ−２ＯＳ（（ＡＣＣ）ＨＴＢ−９６）、Ｔ８４（（ＡＣＣ）ＣＣＬ２４８）、または任意の確立された株化細胞（極性化したまたは非極性の）、または（ＡＣＣ）（ＴＣＣ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．Ｍｎａｓｓｓ．Ｖａ．２０１１０−２２０９アメリカ合衆国）あるいは細胞培養のヨーロッパ・コレクションの（ＥＣＣＣ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ０ＪＧ  Ｅｎｇｌａｎｄ）などの貯蔵所から入手可能な任意の株化細胞、を含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法に使用できる宿主細胞は、胚性幹細胞、癌幹細胞、前駆細胞、体細胞、筋細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、上皮性基底細胞、β細胞（膵臓）、肝細胞、骨格筋細胞、肝星細胞、心筋細胞、単球、網膜色素上皮細胞、またはドーパミン作動性ニューロンなどの幹細胞である。本明細書に使用されているように、幹細胞とは、分裂して同一の発生上の潜在力を有する細胞を生みだすかおよびまたはより制限された発生上の潜在力を持つ細胞を生じる任意の自己再生する細胞のことを呼ぶ。幹細胞は、以下に制限される訳ではないが、全能性、多能性、および多分化能の細胞を含む。幹細胞の非限定的な例として、ＥＳＣｓ、ｉＰＳ細胞、癌幹細胞、および器官または組織特異的幹細胞（ＨＳＣｓ、神経細胞の幹細胞、眼幹細胞、および皮膚幹細胞など）を含む。
【０１５６】
いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は、体細胞核の移植（ＳＣＮＴ）（精子および卵を除く任意の体細胞の核を、本来の核を除去した卵に移植する技術である）によって設計された細胞である。卵は、現在ドナー体細胞と同一のＤＮＡまたは遺伝子物質である。正確なシグナルの下、卵受精したかのように発生に誘導できるはずである。卵は、胚盤胞が形成されるまで分裂して２個の細胞に、次に４個の細胞、さらに８細胞などになる。胚性幹細胞が、胚盤胞から誘導できてドナー体細胞と遺伝的に同一の株化細胞を生成する。
【０１５７】
本明細書に記載された方法に使うことにできる宿主細胞のその他の非限定の例は、以下を含む：表皮角化細胞（分化する表皮細胞）、上皮性基底細胞（幹細胞）、爪および足指爪のケラチノサイト、爪床基底細胞（幹細胞）、延髄の毛シャフト細胞、皮質性毛シャフト細胞、角質の毛シャフト細胞、角質の毛根外筒細胞、ハクスレー層の毛根外筒細胞、ヘンレ層毛根外筒細胞、外部毛根外筒細胞、毛マトリックス細胞（幹細胞）、表面上皮細胞の重層化する扁平上皮の角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道および腟、基底細胞（幹細胞）の上皮の角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道および腟、泌尿器の上皮細胞（内張り膀胱および尿管）、唾液腺粘膜の細胞（多糖類リッチ分泌）、唾液腺漿液の細胞（糖タンパク質酵素リッチ分泌）、舌内ｖｏｎＥｂｎｅｒ腺細胞（味蕾を洗浄）、乳腺細胞（ミルク分泌）、涙腺細胞（涙分泌）、耳内耳道腺細胞（ワックス分泌）、エクリン汗腺暗細胞（糖タンパク質分泌）、エクリン汗腺明細胞（小分子分泌）、アポクリン汗腺細胞（芳香性分泌、性ホルモン感受性）、眼瞼内モール細胞腺（特定化汗腺）、皮脂腺細胞（脂質リッチ皮脂分泌）、鼻内ボウマン腺細胞  （嗅上皮を洗浄）、十二指腸内ブルンネル腺細胞  （酵素およびアルカリ性粘液）、精嚢細胞（水泳精子のための果糖含む精液成分を分泌、）、前立腺細胞（精液成分分泌）、尿道球腺細胞（粘液分泌）、バルトリン腺細胞（腟の潤滑剤分泌）、腺のリトレ細胞（粘液分泌）、子宮子宮内膜細胞（炭水化物分泌）、呼吸性および消化管の単離された杯状細胞（粘液分泌）、胃内張り粘膜の細胞（粘液分泌）、胃腺発酵性細胞（ペプシノーゲン分泌）、胃腺酸分泌の細胞（塩酸分泌）、膵腺房細胞（炭酸水素塩および消化酵素分泌）、パネート細胞の小腸（リゾチーム分泌）、肺のＩＩ型肺細胞（界面活性物質分泌）、肺のｃｌｒａ細胞、脳下垂体前葉細胞、成長ホルモン産生細胞、乳腺刺激ホルモン分泌細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激因子、中間下垂体細胞、分泌するメラニン細胞刺激ホルモン、巨大細胞の神経分泌の細胞（オキシトシン分泌および／またはバソプレッシン分泌）、腸および気道細胞（セロトニン分泌、エンドルフィン分泌、ソマトスタチン分泌、ガストリン分泌、セクレチン分泌、コレシストキニン分泌、インスリン分泌、グルカゴン分泌、および／またはボンベシン分泌）、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、濾胞周縁細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞、副腎細胞、クロム親和性細胞、副腎分泌するステロイドホルモン（ミネラルコルチコイドおよびグルココルチコイド）、テストステロンを分泌するライディッヒ細胞の精巣、エストロゲン分泌卵胞膜内細胞、黄体細胞のプロゲステロン分泌破裂卵胞（顆粒膜黄体細胞、および卵胞膜黄体細胞）、傍糸球体細胞（レニン分泌）、密集斑細胞の腎臓、腎臓極周囲細胞、腎臓メサンギウム細胞、肝細胞（肝細胞）、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、肝臓脂質細胞、腎糸球体壁細胞、腎糸球体有足細胞、腎臓腎近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄薄セグメント細胞のループ、腎臓遠位尿細管細胞、集合管細胞、Ｉ型肺細胞（肺内張空気スペース）、膵管細胞（腺房中心細胞）、平滑筋管細胞（汗��、唾液腺、乳腺、などの）など主細胞および間在細胞、管細胞（精嚢、前立腺、などの）、腸の刷子縁細胞（微絨毛を有する）、外分泌腺線条体管細胞、胆汁膀胱上皮細胞、非線毛性細胞輸出管、精巣上体の主細胞、精巣上体の基底細胞、血管およびリンパ性血管内皮の有窓細胞、血管およびリンパ性血管内皮の連続的細胞、血管およびリンパ性血管内皮の脾細胞、滑膜の細胞（関節腔内張り、ヒアルロン酸分泌）、漿膜の細胞（腹膜の、胸膜の、および囲心腔の内張り）、扁平細胞（耳の外リンパ腔内張り）、扁平細胞（耳腔リンパ管内張り）、リンパ嚢内の微絨毛付き円柱状細胞  （耳腔リンパ管内張り）、リンパ嚢内の微絨毛無し円柱状細胞（耳腔内リンパ管内張り）、暗細胞（耳腔内リンパ管内張り）、前庭階壁細胞（耳腔内リンパ管内張り）、血管条基底細胞（耳腔内リンパ管内張り）、血管条辺縁性細胞（耳腔内リンパ管内張り）、クラウディウス細胞  （耳腔内リンパ管内張り）、細胞Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ細胞（耳腔内リンパ管内張り）、脈絡叢細胞（脳脊髄液分泌）、軟くも膜扁平細胞、眼の色素性毛様体の上皮細胞、眼の非着色毛様体の上皮細胞、角膜の血管内皮細胞、気道繊毛細胞、卵管繊毛細胞（雌性）、子宮の子宮内膜の繊毛細胞（雌性）、精巣網繊毛細胞（雄性）、精巣輸出管繊毛細胞（雄性）、中枢神経系の繊毛性上衣細胞（脳腔内張り）、エナメル芽細胞上皮細胞（歯エナメル分泌）、耳前庭器半月面上皮細胞（プロテオグリカン分泌）、コルチ器官歯間上皮細胞（有毛細胞カバー蓋膜分泌）、疎性結合組織線維芽細胞、角膜線維芽細胞（角膜の角膜実質細胞）、腱線維芽細胞、骨髄網状組織線維芽細胞、その他の非上皮性線維芽細胞、周皮細胞、核随性細胞の椎間板、セメント芽細胞／セメント細胞（歯根骨類似セメント質分泌）、象牙芽細胞／象牙細胞（歯象牙質分泌）、硝子軟骨軟骨細胞、線維軟骨軟骨細胞、弾性軟骨軟骨細胞、骨芽細胞／骨細胞、骨細胞前駆細胞（骨芽細胞の幹細胞）、眼の硝子体の硝子体細胞、耳外部外リンパ星状細胞、肝星細胞（Ｉｔｏ細胞）、膵臓の星状細胞、骨格筋細胞（赤色骨格筋細胞（緩徐）、白色骨格筋細胞（急速）、中間骨格筋細胞、筋紡錘の核バッグ細胞、および筋紡錘の核鎖細胞など）、衛星細胞（幹細胞）、心筋細胞（通常の心筋細胞、結節性心筋細胞、およびプルキンエ線維細胞など）、平滑筋細胞（多様な型）、虹彩の筋上皮細胞、外分泌腺の筋上皮細胞、赤血球（赤血球）、巨核球（血小板前駆物質）、単球、結合組織マクロファージ（多様な型）、上皮性ランゲルハンス細胞、破骨細胞（骨内）、樹状細胞（リンパ組織内）、ミクログリアの細胞（中枢神経系内）、好中球顆粒球、好酸球顆粒球、好塩基球顆粒球、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、抑制因子Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、網状赤血球、幹細胞および血液および免疫系の関連前駆体（多様な型）、聴覚性外有毛細胞のコルチ器官、嗅上皮の基底細胞（臭覚細胞の幹細胞）、冷感受性一次感覚神経、感熱性一次感覚神経、メルケル細胞の表皮（タッチセンサー）、嗅覚受容神経、疼痛−感受性一次感覚神経（多様な型）、眼内網膜光受容器細胞（光受容器桿体細胞、眼の光受容器青色感受性錐体細胞、眼の光受容器緑色感受���錐体細胞、光受容器赤色−感受性錐体細胞など）、固有受容性一次感覚神経（多様な型）、タッチ−感受性一次感覚神経（多様な型）、Ｉ型頚動脈小体細胞（血液ｐＨセンサー）、ＩＩ型頚動脈小体細胞（血液ｐＨセンサー）、耳前庭器のＩ型有毛細胞  （加速および重力）、耳前庭器のＩＩ型有毛細胞（加速および重力）、Ｉ型味蕾細胞、コリン作動性神経系細胞（多様な型）、アドレナリン作動性神経系細胞（多様な型）、ペプチド作動性神経系細胞（多様な型）、コルチ器官の内側中心存在細胞、コルチ器官の外側中心存在細胞、コルチ器官の内側指骨の細胞、コルチ器官の外側指骨の細胞、コルチ器官の境界細胞、Ｃｏｒｔｉｍ前庭器支持細胞器官のヘンゼン細胞、Ｉ型味蕾支持細胞、嗅上皮支持細胞、シュワン細胞、衛星細胞（末梢神経細胞体封入）、腸内グリア細胞、アストロサイト（多様な型）、ニューロン細胞（大多様性の型、未だ不十分に分類されている）、オリゴデンドロサイト、紡錘ニューロン、前側レンズ上皮細胞、クリスタリン含有レンズ線維細胞、メラニン形成細胞、網膜色素上皮細胞、卵原細胞／卵母細胞、精細胞、精母細胞、精原細胞細胞（精母細胞のための幹細胞）、精子、卵胞細胞、セルトリ細胞（精巣内）、胸腺上皮細胞、および間質性腎細胞。
【０１５８】
いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は本明細書に記載のレポーター核酸コンストラクト（例えば、レポーターをコード化するＯＲＦレポーター核酸コンストラクト）を含む線維芽細胞であり、ＯＲＦは、ＣＴＲプロモータおよび１つまたは複数の標的配列をコード化する塩基配列に機能的に連結し、ＣＴＲプロモータはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ｍｙｃ、ＬＩＮ２８、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−３、またはＳＳＥ−４のプロモータ領域を含む。そのような宿主細胞は、誘発した多能性幹細胞の修飾因子を同定およびまたは立証する方法に有用である。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載のレポーター核酸コンストラクトを含む幹細胞（例えば、ＥＳＣｓ）であり、核酸コンストラクトのＣＴＲプロモータはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ｍｙｃ、ＬＩＮ２８、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥ−３、またはＳＳＥ−４のプロモータ領域を含む。そのような宿主細胞は、自己再生、成長、およびまたは増殖などの幹細胞維持ための修飾因子を同定およびまたは立証する方法に有用である。
【０１６０】
いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載のレポーター核酸コンストラクトを含む幹細胞であり、核酸コンストラクトのＣＴＲプロモータは分化マーカープロモータ（例えば、細胞型特異的プロモータまたは細胞型付随遺伝子）領域を含む。そのような宿主細胞は、細胞分化の修飾因子を同定およびまたは立証する方法に有用である。例えば、宿主細胞が幹細胞であり、ＣＴＲプロモータが分化マーカーのプロモータである場合、レポーターの基礎の発現レベルは、低いかまたは検出不可能であり、分化の陽性修飾因子は、陽性修飾因子の非存在下での宿主細胞内の発現に関してレポーターの発現を増加または誘発することができる。
【０１６１】
いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含む分化した細胞であり、核酸コンストラクトのＣＴＲプロモータは、分化マーカーのプロモータ領域を含む。他の実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含む分化した細胞であり、ＣＴＲプロモータは幹細胞マーカーのプロモータである。そのような宿主細胞は脱分化に関する方法において有用である。
【０１６２】
第１の細胞型から第２の細胞型への細胞分化転換に関連する特定の態様において、宿主細胞は本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含む第１の細胞型の分化細胞であり、レポーター核酸コンストラクトのＣＴＲプロモータは特定の第２の細胞型（例えば、皮膚細胞、筋細胞、線維芽細胞、または膵臓のβ細胞）の分化マーカーである遺伝子のプロモータ領域を含む。例えば、宿主細胞が分化した皮膚細胞でありＣＴＲプロモータがニューロンの分化マーカーのプロモータである場合、レポーターの基礎の発現レベルは、宿主分化皮膚細胞内で低い、また分化転換の陽性修飾因子は、分化転換陽性修飾因子の非存在下での宿主細胞内の発現と比較してレポーターの発現を増加または誘発させる。
【０１６３】
いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は、１個または複数のＣＴＲ因子を発現するように設計され、このＣＴＲ因子は、幹細胞維持（例えば、自己再生、増殖および／または増殖）、細胞分化、細胞脱分化、または細胞分化転換のための宿主細胞内の細胞状況を提供する。宿主細胞はｔｏ１個または複数のＣＴＲ因子を発現するように設計される、このＣＴＲ因子は、多能性幹細胞を誘発するための宿主細胞内の細胞状況を提供する。
【０１６４】
いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は一次細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は株化細胞である。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は一過性にレポーター核酸コンストラクトを形質移入される。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞はレポーター核酸コンストラクトを含む安定な細胞である。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含み、ここでこのレポーター核酸コンストラクトは宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれている。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は対象とするＲＮＡまたはタンパク質（例えば、レポーターまたはＣＴＲ因子）を安定に発現する。いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載した宿主細胞または株化細胞、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質などのレポーター核酸コンストラクトおよび任意選択で１個または複数のＣＴＲ因子を含む宿主細胞は、淘汰圧の有る無しに関わらず３ヶ月またはそれ以上の月の間３０％未満の変動という安定さである。
【０１６５】
当業者で認識されているように、選択された宿主細胞と共に使用するのに適した任意のベクターおよび方法を対象とする核酸コンストラクトを細胞に導入するために使用して良い。いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載した核酸コンストラクトリポソームの方法（Ｏｌｉｇのｅｃｔａｍｉｎｅ（トレードマーク）、Ｔｆｘ（トレードマーク）ｒｅｇｅｎｔｓ、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（登録商標）、Ｆｅｃｔｕｒｉ、Ｌｉｐｏｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ（トレードマーク）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（トレードマーク）２０００およびＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６など）によって細胞に導入して良い。
【０１６６】
本明細書に記載した望ましい性質を持つ宿主細胞を、選択することができる。検出可能な望ましい性質を選択して良い。当業者はそのような特徴に気がついている。非限定の例によると、そのような性質は以下を含む：脆弱性、固形表面への形態および粘着性、トリプシンまたは細胞解離試薬による単一の分散、自動化した培養条件への適応性、血清添加条件での性能、無血清条件での性能、無血清懸濁液条件への転換性、凝集塊、継代に続く単分散の細胞層形成性向、弾性、異なる力の液体添加の下でのグロースチャンバ表面への付着性性向、非断片核、細胞内無空胞、微生物の非コンタミネーション、無マイコプラズマ、ウイルス性の非コンタミネーション、クローン性、ウエル内の細胞の目視による物理的特質の一貫性、室温以下、以上での増殖性、様々な時間での様々な温度の許容性、プラスミド／オリゴヌクレオチド／蛍光発生オリゴヌクレオチド／ペプチド類／タンパク質／化合物の均等取り込みの細胞性向、ＯＭＳＯ／エタノール／メタノール有機溶剤／洗剤を使用したインキュベーションへの細胞許容性、継続したＵＰＲ誘導に対する細胞抵抗性、ＯＴＴへの曝露に対する細胞抵抗性、ウイルス性／レンチウイルスの／コスミドベクターへの細胞の感染度、望ましいＲＮＡ（ｓ）／タンパク質（ｓ）の内在性発現性と非発現性、染色体数、染色体異常、ｐｈ５／６／７／８／９での増殖許容度、紫外／突然変異原／照射に対する耐性、改変した／マニュアル／スケールアップ増殖条件（即ち、反応器を含む）下での特徴保持能力。
【０１６７】
４．２．１．  ＣＴＲ因子
【０１６８】
本発明は、細胞運命／細胞型特定の修飾因子を同定および／または立証する方法に使用する本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含む宿主細胞を提供する。特定の態様において、付加的なＣＴＲ因子が、細胞運命／細胞型仕様（例えば、幹細胞維持および増殖、細胞分化、分化転換、または脱分化）を調節するその他の因子または薬剤と協調することがある。いくつかの特定の実施形態において、ＣＴＲ因子が欠乏した細胞（例えば、内因的に発現しない細胞）は、特定の条件または化合物に応じて細胞型を維持または変化させることができない。ＣＴＲ因子の特定の組み合わせが、細胞運命／細胞型の仕様を化合物によって調節できる細胞状況を提供することがある。例えば、特定の宿主細胞は、その宿主細胞を化合物と接触させても効果がないような１個または複数のＣＴＲ因子を内因的に発現することがない、および宿主細胞を化合物と接触させると、ＣＴＲプロモータ活性増進またはレポーター発現の誘導、幹細胞維持の促進、または細胞分化の促進、脱分化または分化転換などの効果があるような細胞状況を提供する１個または複数のＣＴＲ因子を組換えで発現する宿主細胞の設計。いくつかの特定の実施形態、宿主細胞は、内因的にいくつかのＣＴＲ因子を発現するが、化合物と望ましい効果ための十分な量または組み合わせのＣＴＲ因子を達成することはない。
【０１６９】
本明細書に記載したＣＴＲ因子は、細胞運命／細胞型仕様を調節できるポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば、ＤＮまたはＲＮＡ）であって良い。いくつかの特定の実施形態において、ＣＴＲ因子は、細胞型を維持または変化させるために重要なＲＮＡである。そのようなＲＮＡ非限定の例は、タンパク質をコード化するメッセンジャーＲＮＡ；アンチセンスＲＮＡ；低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；ｍｉＲＮＡ；構造ＲＮＡ；細胞のＲＮＡ（例えば、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、およびｓｎＲＮＡ）；ランダムＲＮＡ；ｃＤＮＡまたはＥＳＴに対応するＲＮＡ；または多様な巨大分子の複合体に取り込まれるＲＮＡ；リボザイムであるＲＮＡ；ウイルス性または外来性ＲＮＡに対応するＲＮＡ、リンカーＲＮＡ、１個または複数のＲＮＡをリンクする配列；または上述の機能または活性を持ち合わせていないが、にも関わらず細胞によって発現することがあるＲＮＡを含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は小分子である。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞内でＣＴＲ因子は内因的に発現しない。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞内でＣＴＲ因子は外因的にまたは組換えで発現する。いくつかの特定の実施形態において、ポリペプチドであるＣＴＲ因子は可溶性（例えば、分泌されたもの）であり、細胞膜結合、または細胞内ポリペプチドである。いくつかの特定の実施形態において、ポリペプチドであるＣＴＲ因子はヒトＣＴＲ因子またはマウスのＣＴＲ因子である。例えば、宿主細胞から分泌したＣＴＲ因子は同じ培養内の細胞上で活性を有することがある
【０１７１】
従って、本発明は、本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクト、および１個または複数のＣＴＲ因子をコード化する組換え型核酸コンストラクトを含む宿主細胞を提供する。いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクト含む宿主細胞が、それぞれが異なるＣＴＲ因子コード化する２個以上の核酸コンストラクトをさらに含む。いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクト含む宿主細胞が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれより大きいＣＴＲ因子をコード化する組換え型核酸コンストラクトをさらに含む。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は、１個または複数のこれらのＣＴＲ因子発現をするように選択される。いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクを含む宿主細胞が、１個または複数のＣＴＲ因子を組換えで発現する。いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクを含む宿主細胞が、１個または複数のＣＴＲ因子を内因的に発現する。いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクを含む宿主細胞が、１個または複数のＣＴＲ因子を内因的に発現しない。
【０１７２】
いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞が１個または複数のＣＴＲ因子を発現するように設計されているレポーター核酸コンストラクトを含む宿主細胞を本明細書に提供する。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は、宿主細胞から対象とする特定の細胞型への仕様、決定、分化にための１個または複数のＣＴＲ因子約１０％、２０％、２５％、３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、６６％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％を組換えで発現するように設計されている。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は、宿主細胞から対象とする特定の細胞型への仕様、決定、分化のために約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれより大の数の個数のＣＴＲ因子を組換えで発現するように設計されている。特に、宿主細胞は、レポーター核酸コンストラクトに含まれている１個または複数の宿主細胞を活性化するのに十分なＣＴＲ因子約１０％、２０％、２５％、３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、６６％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％を発現するように設計されている。特に、宿主細胞は、レポーター核酸コンストラクトに含まれている１個または複数のＣＴＲプロモータを活性化するのに十分な約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれより大きい数の個数のＣＴＲ因子を発現するように設計されている。細胞を、遺伝子活性化（例えば、国際出願ＷＯ９４／０１２６５０号を参照されたい）または遺伝子導入技術などの当業者に知られた任意の技術によってＣＴＲ因子を発現するように設計することができる。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は幹細胞維持または増殖、細胞分化、細胞脱分化、または細胞分化転換に関わっている。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞によって組換えで発現したＣＴＲ因子の組み合わせは、幹細胞維持または増殖、細胞分化、細胞脱分化、または細胞分化転換に関わる。
【０１７４】
いくつかの特定の実施形態において、ＣＴＲ因子が他の因子または修飾因子と協調してＣＴＲプロモータの活性を誘発または増強する。いくつかの特定の実施形態において、ＣＴＲ因子は転写制御に関わる。１つの実施形態において、ＣＴＲ因子は遺伝子の転写を誘発または増加させることに関わる。別の実施形態において、ＣＴＲ因子は遺伝子の転写を抑制または減少させることに関わる。
【０１７５】
いくつかの特定の実施形態において、ＣＴＲ因子はメチル化、アセチル化または脱アセチル（例えば、ヒストンアセチル化または脱アセチル。）に関わる。いくつかの特定の実施形態において、ＣＴＲ因子はＲＮＡ安定性に関わる。
【０１７６】
誘発された多能性幹細胞の修飾因子関連するいくつかの特定の実施形態において、ＣＴＲ因子は、限定される訳ではないが、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ｍｙｃ、ＬＩＮ２８、およびＮｎｏｇを含む。
【０１７７】
毛包（隆起）幹細胞の修飾因子に関連するいくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は限定される訳ではないが、ＮＦＴｃ１、Ｓｏｘ９、ＴＣＦ３、およびＬｈｘ２を含む。
【０１７８】
上皮性基底細胞の修飾因子に関連するいくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は限定される訳ではないが、ｃ−ｒｅｌ、ＲｅｌＡ、Ｄｅｌｔ１、および縞を含む。
【０１７９】
上皮性基底細胞の修飾因子に関連するいくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は限定される訳ではないが、Ｂｍｉ−１、Ｔｃｆ−４、およびβ―カテニンを含む。
【０１８０】
皮膚組織細胞の修飾因子に関連するいくつかの特定の実施形態において、ＣＴＲ因子は、下記に限定される訳ではないが、ＮＦＴｃ１、ＳＯＸ９、ＴＣＦ３、ＬＨＸ２、ＣＤ２００、Ｋ１５、ＩＤ２、ＤＫＫ３、ＷＩＦ１、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＰＨＬＤ１、ＦＯＬＬＩＳＴＡＴＩＮ、ＤＩＯ２、ＬＣＥ２Ｂ、ＳＰＲＶ１、ＤＥＦＢ４、ＰＩ３、ＲＮＳＥ７、Ｋ１９、ＩＴＧＢ１、ＲＥＬ、ＲＥＬＡ、ＤＬＬ１、ＢＭＩ１、ＴＣＦ４、ＣＴＮＮＢ１、ＭＣ１Ｒ、ＳＬＣ４５Ａ２、およびＳＬＣ２４５を含む。
【０１８１】
β細胞（膵臓）修飾因子に関連するいくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は下記に限定される訳ではないが、Ｍｎｘ１、Ｐｄｘ１、Ｎｋｘ６−１、Ｎｋｘ２−２、Ｍａｆｂ、Ｍａｆａ、およびＳｌｃ２ａ２を含む。
【０１８２】
肝細胞の修飾因子に関連するいくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は下記に限定される訳ではないが、Ｐｒｏｘ１、Ｒｅｘ３、ＷＴ１、Ｃ／ＥＢＰαあるいはβ、ＨＮＦ−１、およびＨＮＦ−４を含む。
【０１８３】
骨格筋細胞の修飾因子に関連するいくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は下記に限定される訳ではないが、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、ミオゲニン、Ｍｒｆ４、Ｍｅｆ２、およびＭＵＲＣを含む。
【０１８４】
肝星細胞の修飾因子に関連するいくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は下記に限定される訳ではないが、Ｆｏｘｌ１、ＰＰＲｇｍｍ、およびＥｇｒ−１を含む。
【０１８５】
筋幹細胞の修飾因子に関連するいくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は下記に限定される訳ではないが、ＭｙｏＤ、Ｐａｘ７、Ｒｕｎｘ２、およびＭｙｆ５を含む。
【０１８６】
心筋細胞の修飾因子に関連するいくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は下記に限定される訳ではないが、Ｎｋｘ２。５、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、ＣＴＮ２、ＤＢＲ１、ＦＰ、ＬＫ３、ＡＬＫ６、ＮＫＲＤ１、ＴＦ２、ＢＭＰＲ２、ＣＫＭ、ＣＭＹＡ、ＣＯＬ３１、ＣＳＲＰ３、ＣＶＤ１、ＣＸＣＬ１４、ＤＣＮ、ジエチルスチルベストロール、ＤＮＭ３、ＦＧＢ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ４、ＨＳＢＰ７、ＩＳＬ１、ＫＣＮＧ２、ＫＣＮＩＰ２、ＫＣＮＪ２、ＫＣＮＪ５、ＬＤＢ３、ＬＵＭ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＧＰ、ＭＬＣ２ｖ、ＭＹＢＰＣ３、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、ＭＹＬ３、ＭＹＬ７、ＭＹＬＫ３、ＭＹＯＣＤ、ＭＹＯＭ１、ＭＹＯＺ２、ＮＰＰＡ、ＮＰＰＢ、ＰＬＮ、ＲＹＲ２、ＳＬＣ４３、ＳＭＤ１、ＳＭＤ５、ＳＭＤ８、ＳＭＰＸ、ＳＹＮＰＯ２Ｌ、ＴＡＫ１、ＴＢＸ５、ＴＢＸ５、ＴＮＮＩ１、ＴＮＮＩ３Ｋ、およびＴＮＮＴ２を含む。
【０１８７】
単球の修飾因子に関連するいくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は下記に限定される訳ではないが、ＰＵ。１、Ｃ／ＥＢＰａｌｐｈａ、ＭＬ１、ＲＡＲａｌｐｈａ、ＭＺＦ−１、Ｈｏｘ、およびＳＴＡＴを含む。
【０１８８】
網膜色素上皮細胞の修飾因子に関連するいくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は下記に限定される訳ではないが、小眼球症およびＥＬＦ３を含む。
【０１８９】
眼由来の細胞の修飾因子に関連するいくつかの特定の実施形態において、ＣＴＲ因子は下記に限定される訳ではないが、ＲＰＥ６５、ＢＣ４、ＣＯＬ１１Ａ１、ＧＮＴ２、ＲＨＯ、ＧＮＢ３、ＧＮＡＴ１、ＧＮＧＴ１、ＰＤＥ６、ＰＤＥ６Ｂ、ＰＤＥ６Ｇ、ＣＮＧＡ１、ＣＮＧＢ１、ＲＣＶＮ、選択的増幅遺伝子、ＧＵＣＡ１Ａ、ＳＬＣ２４１、ＮＲＧ４、ＢＣ４、ＰＲＰＨ２、ＲＯＭ１、ＲＤＨ５、トランスサイレチン、ＢＥＳＴ１、ＣＴＳＤ、ＣＳＴ３、ＨＭＣＮ１、ＲＤ３、ＥＦＥＭＰ１、ＬＭＳ１、ＣＮＧＡ３、ＣＮＮＭ４、ＭＥＲＴＫ、ＲＲ３、ＰＤＥ６Ｈ、ＣＰＬＸ４、ＯＰ１、ＭＰＰ４、ＮＲＬ、ＣＬＵＬ１、ＲＤＨ１２、ＲＢＰ３、ＰＤＣ、ＣＲＸ、ＩＭＰＧ１、ＲＡＸ、ＲＴＢＤＮ、ＲＰ１、ＣＲＢＰ１、ＲＬＢＰ１、ＲＳ１、ＳＴＲＡ１３、ＰＲＯＭ１、ＬＲＴ、ＴＵＬＰ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＶＳＸ１、ＲＧＳ１６、ＮＲ２Ｅ３、ＧＵＣＹ２Ｆ、ＯＣ２、ＲＧＲ、ＲＤＨ１１、ＦＳＣＮ２、ＰＯＵ６Ｆ２、ＳＬＣ１７、ＳＬＣ２４Ａ１、ＺＮＦ３８５、ＳＤＲ１６Ｃ５、ＨＳＤ１７Ｂ１４、ＤＨＲＳ７、ＳＬＣ２４Ａ２、ＰＩＴＰＮＣ１、ＡＬＤＨ１１、ＬＤＨ１２、およびＡＬＤＨ１３を含む。
【０１９０】
間葉幹細胞の修飾因子に関連するいくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は下記に限定される訳ではないが、ＥＴＶ１、ＥＴＶ５、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ６、ＨＭＧＡ２、ＳＩＭ２、およびＳＯＸ１１を含む。
【０１９１】
神経幹細胞の修飾因子に関連するいくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は下記に限定される訳ではないが、ＰＬＺＦ、ＰＬＧＬ１、Ｄａｃｈ１、Ｆｏｘｇ１、およびＮＲ２Ｆ１を含む。
【０１９２】
ドパミン作動性ニューロンの修飾因子に関連するいくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は下記に限定される訳ではないが、Ｏｔｘ２、Ｌｍｘ１ａ、Ｎｇｎ２、Ｆｏｘ２、Ｐｉｔｘ３、エングレイルド、およびＮｕｒｒ１を含む。
【０１９３】
造血幹細胞の修飾因子に関連するいくつかの実施形態において、ＣＴＲ因子は下記に限定される訳ではないが、Ｅｖｉ１、ＧＡＴＡ−２、ＥＧＲ１、およびＧｆｉ−１を含む。
【０１９４】
眼特異的プロモータの調節に関連するいくつかの実施形態において、Ｌｈｘ２およびＰｘ６は、Ｓｉｘ６のプロモータ（ＮＰ＿０３１４００）と結合するＣＴＲ因子である（例えば、Ｔeｔｒｅａｕｌｔｅｔａｌ．、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００９，３２７（２）：５４１−５０を参照されたい）。
【０１９５】
皮膚幹細胞（隆起細胞）の調節に関連するいくつかの実施形態において、ＮＦＡＴｃ１は、ＣＤＫ４プロモータ（ＮＭ＿００００７５）を抑制するＣＴＲ因子である。
【０１９６】
皮膚幹細胞（隆起細胞）の調節に関連するいくつかの特定の実施形態において、Ｓｏｘ９はＭＩＴＦプロモータ（小眼球症付随転写制御因子アイソフォー２ＮＰ＿９３７８２０）を活性化するＣＴＲ因子である。皮膚幹細胞（隆起細胞）の調節に関連するいくつかの特定の実施形態において、ＴＣＦ３は、ＣＤＫＮ１Ａプロモータ（ＮＰ＿０００３８０）を活性化するＣＴＲ因子である。
【０１９７】
いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載した方法に望ましい細胞状況を提供する。ＣＴＲ因子、またはその断片あるいは誘導体などの任意の組み合わせを組換えで発現するように設計されている。
【０１９８】
当業者は、本明細書に記載した方法に使用するのに適切なＣＴＲ因子の組み合わせを決定することができるだろう。例えば、宿主細胞には１個のＣＴＲ因子またはＣＴＲ因子の異なる組み合わせが導入され、また望ましい性質または細胞状況（例えば、細胞型特異的マーカーの発現、ＣＴＲプロモータの活性、および／または形態。）のためにアッセイされる。いくつかの特定の実施形態において、１個のＣＴＲ因子、またはＣＴＲ因子の２、３、４個の組み合わせを宿主細胞に導入によって、望ましい性質または細胞状況が達成する。いくつかの特定の実施形態において、ＣＴＲ因子をスクリーニングする方法は、（ｉ）宿主細胞に、２個または３個の異なる組み合わせのＣＴＲ因子を導入するステップと、および（ｉｉ）１個または複数の望ましい性質または細胞状況決定するステップとを含む。
【０１９９】
核酸を細胞に導入する技術は、良く知られており、当業者によって容易に理解される。この方法は、以下に限定される訳ではないが形質移入、ウイルス性送達、タンパク質またはペプチド介在挿入、共沈方法、脂質ベース送達試薬（リポフェクション）、サイトフェクション、リポポリアミン送達、デンドリマー送達試薬、電気穿孔法または機械的送達）を含む。
【０２００】
１個または複数のＣＴＲ因子をコード化する核酸を宿主細胞に導入するために使うことの出来るベクターの例として、以下に限定される訳ではないがプラスミド、およびレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、コスミド、および人工染色体を含むウイルスが含まれる。プラスミドの非限定的例は、上記されている。１個または複数のＣＴＲ因子をコード化する単離された核酸コンストラクトは、蛍光発生オリゴヌクレオチドと相補的な標的配列ＲＮＡをコード化する核酸配列を含む。そのような標的配列は、組換えでＣＴＲ因子を発現する宿主細胞の選択するために使用することができる。
【０２０１】
本明細書に記載した１個または複数のＣＴＲ因子を組換えで発現する宿主細胞および株化細胞は、従来の方法で作成した細胞および株化細胞と比較すると強化された性質を持つことがある。例えば、本明細書に記載した細胞および株化細胞は、１個または複数のＣＴＲ因子の発現の強化された安定度および／またはレベルを持つ（選択圧が存在しない培養で維持された場合でも、例えば、抗生物質およびその他の薬剤を含む）。さらにその他の実施形態において、本明細書に記載した１個または複数のＣＴＲ因子を組換えで発現する宿主細胞および株化細胞は、より従来の方法で設計された細胞と比較すると生理的に関連があるタンパク質活性が発現する条件で増進する。これらの性質が、本明細書に記載した１個または複数のＣＴＲ因子を組換えで発現する宿主細胞および株化細胞の能力を増強および改善して、アッセイにおいて、細胞治療、タンパク質産生、またはその他の用途ために修飾因子を同定し、および同定した修飾因子の機能的特質を増進させるかどうかなど、どのような使用にも利用できる。
【０２０２】
［００１９８］さまざまな実施形態において、記載した宿主細胞または株化細胞は対象とする核酸コンストラクトを含むか、または対象とする機能的ＣＴＲ因子ＲＮＡあるいはタンパク質を発現する。すなわち、細胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００日間または２００日間より以上の増殖日数後安定して機能的である、ここで安定した発現または安定した機能的とは以下の発現量を超す変化がないことを指す：２日から４日間の連続的細胞培養ついて、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％；５日から１５日間の連続的細胞培養について、１％、２％、４％、６％、８％、１０％または１２％；１６日から２０日間の連続的細胞培養について、１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％または２０％；２１日から３０日間の連続的細胞培養について、１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％；３０日から４０日間の連続的細胞培養について、１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％または３０％；４１日から４５日間の連続的細胞培養について、１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％または３０％；４５日から５０日間の連続的細胞培養について、１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％または３０％；４５日から５０日間の連続的細胞培養について、１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％または３５％；５０日から５５日間の連続的細胞培養について、１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％または３０％または３５％；５０日から５５日間の連続的細胞培養について、１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％または３５％；５５日から７５日間の連続的細胞培養について、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％；７５日から１００日間の連続的細胞培養について、１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または４５％；１０１日から１２５日間の連続的細胞培養について、１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または４５％；１２６日から１５０日間の連続的細胞培養について、１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または４５％；１５１日から１７５日間の連続的細胞培養について、１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または４５％；１７６日から２００日間の連続的細胞培養について、１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または４５％；２００日を超す連続的細胞培養について、１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または４５％。
【０２０３】
４．２．２．  細胞を産生する方法
特定の態様において、本発明は、１個または複数のレポーター核酸コンストラクトを含む本明細書に記載した細胞を産生する方法に関する。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞を産生する方法は，：（ａ）細胞に、（ｉ）ＯＲＦが機能的にＣＴＲプロモータ連結するレポーターをコード化するＯＲＦ、および（ｉｉ）１個または複数のＴＳＲをコード化する塩基配列、を含むレポーター核酸コンストラクトを導入するステップと；（ｂ）細胞に、ＴＳＲに相補的な蛍光発生オリゴヌクレオチド導入するステップと；および（ｃ）ＴＳＲを転写する細胞を選択するステップとを含む。特定の態様において、そのような方法は、細胞に２個または複数のレポーター核酸コンストラクトを導入することを含む、ここで各レポーター核酸コンストラクトは異なるレポーターをコード化する異なるＯＲＦを含み、各ＯＲＦは機能的に異なるＣＴＲプロモータと連結する。
【０２０４】
いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞を産生する方法は、：（ａ）細胞に、（ｉ）ＯＲＦが機能的にＣＴＲプロモータ連結するレポーターをコード化するＯＲＦ、および（ｉｉ）ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、およびＴＳＲ３（ここで、ＴＳＲ３はレポーターと同時転写される）をコード化する塩基配列、を含むレポーター核酸コンストラクトを導入するステップと、；（ｂ）細胞に、ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、およびＴＳＲ３に相補的な蛍光発生オリゴヌクレオチド導入するステップと、；および（ｃ）ＴＳＲ１およびＴＳＲ２を転写し、かつ上記の背景レベル以上にＴＳＲ３を転写しない細胞を選択するステップと、を含む。特定の態様において、ＴＳＲ１およびＴＳＲ２の転写が、ＣＴＲプロモータとは異なる恒常的なプロモータによって駆動しかつレポーターＯＲＦおよびＣＴＲプロモータに隣接する。
【０２０５】
ＴＳＲ１およびＴＳＲ２を転写し、かつ上記の背景レベルより上にＴＳＲ３を転写しない細胞は、レポーター核酸コンストラクトを含むべきであり、ＣＴＲプロモータは背景レベルより上に活性化しない、なぜならＴＳＲ３は、ＣＴＲプロモータの制御の下でレポーターと同時転写され、またＴＳＲ１およびＴＳＲ２は異なるプロモータによって転写されるからである。任意の特定の理論に縛られることなしに、そのような特徴をもった宿主細胞は、ＣＴＲプロモータを活性化でき、かつＣＴＲプロモータの活性を誘発しまたは増加させるように宿主細胞の細胞状況を調節できる修飾因子を同定および／または立証する方法に有用である。従来の方法による細胞よりも低基礎のＣＴＲプロモータ活性を持つ細胞を使用すると、陽性修飾因子を同定および／または立証するための高感度アッセイを可能にし、ならびに維持、細胞仕様、細胞決定、幹細胞運命誘導、細胞分化、細胞脱分化、および細胞分化転換などの細胞運命の修飾因子を同定および／または立証するための望ましい細胞状況／条件の選択を可能にする。
【０２０６】
特定の態様において、レポーター核酸コンストラクトは、のＣＴＲプロモータは、Ｏｃｔ４プロモータ、Ｓｏｘ２プロモータ、Ｋｌｆ４プロモータ、ｃ−ｍｙｃプロモータ、ＬＩＮ２８プロモータ、Ｎａｎｏｇプロモータ、ＳＳＥＡ−３プロモータ、ＳＳＥＡ−４プロモータ、または当業者に知られた任意の幹細胞プロモータなどの幹細胞プロモータである。幹細胞プロモータなどのＣＴＲプロモータの非限定の例は、セクション４．１．２．に記載されている。いくつかの特定の実施形態において、レポーター核酸コンストラクトのＣＴＲプロモータは分化マーカープロモータである。例えば、宿主細胞は、幹細胞または癌幹細胞であって良く、その分化マーカープロモータは背景レベルより上に活性化しない、また宿主細胞内で分化マーカープロモータの活性を誘発しまたは増加させることのできる宿主細胞は条件および／または化合物に曝露される。そのような条件および／または化合物は、幹細胞または癌幹細胞の分化の修飾因子であるはずである。
【０２０７】
いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞を産生する方法は、：（ａ）細胞に、（ｉ）、ＯＲＦが機能的にＣＴＲプロモータ連結するレポーターをコード化するＯＲＦ、および（ｉｉ）ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、およびＴＳＲ３（ここで、ＴＳＲ３はレポーターと同時転写される）をコード化する塩基配列、を含むレポーター核酸コンストラクトを導入するステップと、；（ｂ）細胞に、ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、およびＴＳＲ３に相補的な蛍光発生オリゴヌクレオチド導入するステップと、；および（ｃ）ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、およびＴＳＲ３を転写しない細胞を選択ステップと、を含む。特定の態様において、ＴＳＲ１およびＴＳＲ２の転写が、レポートおよびＴＳＲ３の転写を駆動するＣＴＲプロモータとは異なる恒常的なプロモータによって駆動される。ＴＳＲ３を転写する宿主細胞は、そのような細胞状況の下で活性化しているＣＴＲプロモータを持ち、宿主細胞は、ＣＴＲプロモータ活性または細胞運命の修飾因子を抑制または減少させる修飾因子を同定および／または立証するに有用であることがある。
【０２０８】
さらなる実施形態において、本明細書に記載した宿主細胞を産生する方法は、セクション４．２．１．に記載したものなどのＣＴＲ因子をコード化する１個または複数の宿主細胞組換え型核酸に導入するステップをさらに含む。特定の理論に縛られることなく、宿主細胞による１個または複数のＣＴＲ因子の組換え型発現は、化合物がＣＴＲプロモータの活性を調節、または細胞運命／細胞型仕様を調節するために必要なことがある。例えば、宿主細胞は、化合物がＣＴＲプロモータの活性を調節、または細胞運命／細胞型仕様を調節するために必要なＣＴＲ因子の発現を欠いても良く、従って、そのようなＣＴＲ因子またはそのようなＣＴＲ因子をコード化する核酸コンストラクトを宿主細胞に導入することにより化合物の効果を検出できる。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞内の１個または複数のＣＴＲ因子の発現は遺伝子活性化によって達成することができる。
【０２０９】
いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載した宿主細胞を産生する方法は、宿主細胞を、維持、細胞特定、細胞決定、誘導の幹細胞運命、細胞分化、細胞脱分化、および細胞分化転換などのＣＴＲプロモータ活性または細胞運命などを調節ための適切な条件を提供する１個または複数のＣＴＲ因子に曝露させるステップを更に含む。。
【０２１０】
核酸（例えば、ＣＴＲ因子をコード化するレポーター核酸コンストラクトおよび組換え型核酸コンストラクト）を細胞に導入する技術は当業者に知られていて容易に理解される。この方法は、以下に限定される訳ではないが、形質移入、ウイルス性送達、タンパク質またはペプチド介在挿入、共沈方法、脂質ベース送達試薬（リポフェクション）、サイトフェクション、リポポリアミン送達、デンドリマー送達分娩試薬、電気穿孔法または機械的送達分娩を含む。ウイルス性送達系の例として、限定される訳ではないが、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノウイルスがある。いくつかの特定の実施形態において、遺伝子活性化を宿主細胞内の１個または複数のＣＴＲ因子の発現のために使うことができる。
【０２１１】
本明細書に記載した宿主細胞および株化細胞を産生するために、
例えば、米国特許６．６９２．９６５号および国際出願Ｗ０／２００５／０７９４６２号に記載された技術を使うことができる。これら両方の文書を参照によりその全体を本明細書に組み入れる。この技術は、百万の細胞（即ち、任意の望まれるクローン（数百から数千のクローン））の実時間試験を提供する。フロー細胞数測定の細胞ソーティング（例えば、ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）を使用）、または磁気細胞分離（例えば、ＭＡＣＳ（磁気細胞分離装置）を使用）  などの細胞ソーティング技術を使って、１ウエルに付き１個の細胞を、高い統計的信頼性を持って自動的に培養血管（ウエル培養プレートなど）に沈着物させる。技術の速度と自動化によって多重遺伝子組換え型株化細胞が容易に単離できる。
【０２１２】
４．２．３  細胞培養条件
【０２１３】
本明細書に記載した方法によると、宿主細胞が望ましい培養条件のセットの下で培養される。いくつかの特定の実施形態において、細胞培養条件は、宿主細胞内でＣＴＲプロモータが活性化するのに適している。その他の実施形態において、細胞培養条件は、宿主細胞内でＣＴＲプロモータが不活性化するのに適している。いくつかの実施形態において、細胞培養条件は、宿主細胞内のＣＴＲプロモータの活性化を調節（例えば、誘発／増加または抑制／減少）するのに適している。
【０２１４】
いくつかの特定の実施形態において、幹細胞などの宿主細胞は、幹細胞維持細胞培養条件にさらされる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、筋細胞分化細胞培養条件などの細胞分化細胞培養条件にさらされる。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は細胞脱分化培養条件にさらされる。いくつかの実施形態において、線維芽細胞などの宿主細胞は多能性幹細胞を誘発するのに適した細胞培養にさらされる。他の実施形態において、宿主細胞は細胞分化転換培養条件にさらされる。
【０２１５】
条件は任意の望ましい条件で良い。当業者は、どのようなパラメータが培養条件のセット内に含まれるか理解しているだろう。例えば、培養条件は、以下に限定される訳ではないが、：培地（基礎培地（ダルベッコ変法イーグル培地、基礎培地、ＲＰＭＩ、無血清、血清付き、十分に化学的に定義されたもの、無動物由来成分）、モノおよび二価イオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム）濃度、付加的成分を付加されたもの（アミノ酸、抗生物質、グルタミン、グルコースまたは他の炭素源、ＨＥＰＥＳ、チャネル遮断薬、その他の標的の修飾因子、ビタミン、微量元素、重金属、補助因子、増殖因子、抗アポトーシス試薬）、条件無しまたは条件培地、ＨＥＰＥＳ有り、ｐＨ、特定栄養の欠乏または制限（アミノ酸、炭素源））、細胞が分割／継代前に達成させられる培養密度のレベル、細胞の支持細胞層、またはγ−照射細胞、ＣＯ２、３ガスシステム（酸素、窒素、二酸化炭素）、湿度、温度、静止または振盪機上、およびその他の当業者に良くしたれたもの。を含む。
【０２１６】
細胞培養条件は、便宜上または細胞の特定の望ましい用途のために選ぶことができる。好都合に、本発明は特定の望ましい用途に至適な宿主細胞および株化細胞を提供する。即ち、宿主細胞が特定の望ましい用途の条件の下培養される本発明の実施形態において、宿主細胞は、望ましい用途のための条件の下で望ましい特性を有するように選択される。
【０２１７】
本明細書に記載した宿主細胞および株化細胞の更に好都合な特性は、レポーター核酸コンストラクトを含む細胞または株化細胞が、薬または他の選択圧の非存在下で選択および／または達成できることである。従って、好ましい実施形態において、本明細書に記載した宿主細胞および株化細胞が無選択圧の培養下で維持される。さらなる実施形態において、本明細書に記載した宿主細胞および株化細胞は薬剤または抗生物質なしに維持される。
【０２１８】
本明細書に記載した宿主細胞および株化細胞の無薬剤／無選択圧の細胞維持によって多くの有利点を提供される。例えば、選択薬および他の選択圧因子は変異原性であるか、またはさもなければ細胞の生理機能に干渉でき、セルベースのアッセイに歪んだ結果を導く。例えば、選択薬は、アポトーシスに対する感受性を減少させ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６（３７）：１１１６９−１１１７８（１９９７））、ＤＮ修復およびを薬物代謝増加させ（Ｄｅｆｆｉｅｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ４８（１３）：３５９５−３６０２（１９８８））、細胞のｐＨを増加させる（Ｔｈｉｅｂａｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＨｉｓｔｏｃｈｅｍＣｙｔｏｃｈｅｍ．３８（５）：６８５−６９０（１９９０）；Ｒｏｅｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２（４１）：１１０４２−１１０５６（１９９３）；Ｓｉｍｏｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ．９１（３）：１１２８−１１３２（１９９４））、リソソームおよびエンドソームのｐＨを減少させる（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５（９）：２８１１−２８１７（１９９６）；Ａｌｔｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（１０）：１５８３−１５９８（１９９８））、原形質膜の潜在力を減少させ（Ｒｏｅｐｅｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２（４１）：１１０４２−１１０５６（１９９３））、塩素イオンへの原形質膜のコンダクタンスを増加させ（Ｇｉｌｌｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ７１（１）：２３−３２（１９９２））またＡＴＰへの原形質膜のコンダクタンスを増加させ（ｂｒｈａｍｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ，９０（１）：３１２−３１６（１９９３））、および小胞輸送率を増加させる（Ａｌｔｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６（８）：４４３２−４４３７（１９９９））。従って、いくつかの実施形態において、本明細書に記載した宿主細胞および株化細胞によって、選択圧によって引き起こされた人為的影響がないスクリーニングアッセイが可能となる。いくつかの実施形態において、細胞本明細書に記載した宿主細胞および株化は、細胞ソーティングの前または後に、抗生物質などの選択圧因子の下で培養されない、そのため濃縮された細胞集団から始めない場合にでさえ、望ましい特質を持つ宿主細胞および株化細胞がソーティングによって単離される。特定の実施例において、宿主細胞または株化細胞が精製または単離される。
【０２１９】
単離された宿主細胞および株化細胞は、発現された（ＲＮＡ）絶対的量および相対的量（複数のＣＴＲ因子の場合）を測定するためのＰＣＲ法、逆転写ＰＣＲ、および単一終点ＲＴ−ＰＣＲ法などによってさらに特徴づけることができる。
【０２２０】
４．２．４．  蛍光発生オリゴヌクレオチド
本明細書に記載した方法に有用な任意の蛍光発生オリゴヌクレオチドを使用することができる。蛍光発生オリゴヌクレオチドは、望ましい特色（例えば、１個または複数のレポーター核酸コンストラクトを含む宿主細胞）を持つ宿主細胞を選択するために有用でありうる。蛍光発生オリゴヌクレオチドは、蛍光性シグナルが標的配列の非存在下で消光し、および蛍光性シグナルが標的配列の存在下でもはや消光しないかまたはより低いレベルで消光するように準備された標的配列（例えば、ＲＮＡ転写物の翻訳領域、ＲＮＡ転写物の５’または３’ＵＴＲ内の配列）と相補的な配列およびシグナル放出システムとを、含むオリゴヌクレオチドである。非限定の図解のために、蛍光発生オリゴヌクレオチドは、標的配列の非存在下で失活剤およびフルオロフォアが集まるように蛍光発生オリゴヌクレオチドに置かれたフルオロフォアおよび失活剤を含んで良い。
【０２２１】
例えば、フルオロフォアはオリゴヌクレオチドの終端に位置し、また失活剤はオリゴヌクレオチドの別の終端に位置する、ここでオリゴヌクレオチドは、ステムループまたはヘアピンループなどの１つの高次構造または二次構造の形をとり、また標的配列に結合またはハイブリッド形成する時、異なる高次構造または二次構造の形をとる。例えば、蛍光発生ヌクレオチドおよび標的配列が結合すると、失活剤およびフルオロフォアが分離し、結果として蛍光性シグナルが消光しない。例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ２００５／０７９４６２号は、細胞および株化細胞の産生におそらくまた好ましく使用される多くのシグナル伝達プローブを記述している。現在知られているフルオロフォアと失活剤が相互作用するのに必要な距離は、約２０〜１００Ａである。いくつかの特定の実施形態において、蛍光発生オリゴヌクレオチドのフルオロフォアと失活剤の間の距離は、約１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１０５、１１０、１１５、または１２０、またはその間の任意の値である。
【０２２２】
蛍光発生オリゴヌクレオチドは、フルオロフォアと失活剤からなる相互作用する対を１対以上含む。例えば、波長シフト蛍光発生オリゴヌクレオチドは、共に失活剤と相互作用する第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアを有し、また２個のフルオロフォアはＦＲＥＴドナーと受容体の対である。フルオロフォアと消光剤の相互作用する対の成分は、蛍光発生オリゴヌクレオチドの終端、または塩基配列内に付着することができる。蛍光発生オリゴヌクレオチドの配列の内部に取り込まれる成分の例として、消光剤：ｄａｂｃｙｌチミジン、ＢＨＱ２チミジン、あるいはＢＨＱ１チミジン、およびフルオロフォア：フルオレセンチミジン、ｌｅｘａチミジン、あるいはＴａｍｒチミジンがある。複数の消光剤は、標的配列の非存在下でシグナルを減少または除去させるために使用できる。消光剤の例として、以下に限定される訳ではないがｄｔｏＤＢＣＹＬ、ＥＤＣ、セシウム、ｐ−キシレン−ビス−ピリジニウム臭化物、タリウムおよび金ナノ粒子を含む。
【０２２３】
蛍光発生オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであって良い。蛍光発生オリゴヌクレオチドは、当業者に知られた技術で化学的に合成して良い。蛍光発生オリゴヌクレオチドの化学的修飾は、当該分野に記述されている、例えば、米国特許第６．６９２．９６５号および国際ＰＣＴ出願第ＷＯ２００５／０７９４６２号を参照されたい。これらの文書は参照によりその全体を本明細書に取り込む。
【０２２４】
標的配列および蛍光発生オリゴヌクレオチドは、十分に相補的または相補的領域と非相補的領域を含むように設計できる。１つの実施形態において、２個の別々の標的配列およびプローブが十分に互いに相補的であるように設計できる。１つの実施形態において、標的配列および蛍光発生オリゴヌクレオチドが末端に４から９個、５から６個、２から１０個、１０から４０個、または４０から４００個の連続的塩基対の相互に相補的領域を形成する。標的配列および蛍光発生オリゴヌクレオチドは、それぞれ５〜７個、８〜１０個、１１〜１５個、１６〜２２個、３０個より以上、３〜１０個、１１〜８０個、８１〜２００個、または２００より以上のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含む。標的配列および蛍光発生オリゴヌクレオチドは、同一または異なる数のヌクレオチドであって良い。１つの実施形態において、１本の鎖の５’末端（例えば、標的配列および蛍光発生オリゴヌクレオチド）はもう一方の鎖からオフセットされ、またはその鎖の３’末端はもう一方の鎖からオフセットされ、またはその両方であり、ここでオフセットは５個まで、１０個まで、２０個まで、または３０個までのヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドである。
【０２２５】
標的配列とハイブリッド形成する領域は、１本または両方の鎖またはそれらの組み合わせの相補的領域、非相補的領域内にある。２個以上の標的塩基配列を、同じ蛍光発生オリゴヌクレオチドによって標的にできる。１個または複数の標的配列が、同じまたは異なる配列上にあり、これらの標的配列は、標的に結合するように設計されたプローブの部分に正確に相補的であるか、少なくとも充分相補的である。１つの実施形態において、２本の鎖が各末端で相互に相補的領域を形成し、および標的補体配列は両末端での相互に相補的領域を除く領域に存在する。
【０２２６】
いくつかの特定の実施形態において、標的配列または蛍光発生オリゴヌクレオチドは、約５から１、０００のヌクレオチド、約５から７５０のヌクレオチド、約５から５００のヌクレオチド、約５から２５０のヌクレオチド、約５から２００のヌクレオチド、約５から１５０のヌクレオチド、約５から１００のヌクレオチド、約５から１００のヌクレオチド、約５から７５のヌクレオチド、約５から５００のヌクレオチド、約１０から１００のヌクレオチド、約１０から７５のヌクレオチド、約１０から５０のヌクレオチド、約２０から１００のヌクレオチド、約２０から７５のヌクレオチド、または約３０から１００のヌクレオチドの長さ、または両値の間の任意の長さである。いくつかの特定の実施形態において、標的配列または蛍光発生オリゴヌクレオチドは、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のヌクレオチドの長さである。
【０２２７】
いくつかの特定の実施形態において、蛍光発生オリゴヌクレオチドは、最大で１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、または１００ヌクレオチドの長さである。いくつかの特定の実施形態において、蛍光発生オリゴヌクレオチドは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０ヌクレオチド以下の長さである。
【０２２８】
１つの実施形態において、少なくとも２本の別々の鎖を持つ蛍光発生オリゴヌクレオチドは蛍光発生オリゴヌクレオチドである。１つの実施形態において、１本の鎖は１つの終端に少なくとも消光剤部分を持ち、また隣接する他方の終端上にフルオロフォアを持つ。１つの実施形態において、１本の鎖の５’および３’終端の各々は、同じまたは異なるフルオロフォアを持ち、他方の鎖の５’および３’終端の各々は、同じまたは異なる消光剤部分を持つ。１つの実施形態において、１本の鎖の５’終端はフルオロフォアを持ちかつ３’終端は消光剤部分持つ、他方の鎖の３’終端は同じまたは異なる消光剤部分を持ちかつ５’終端は同じまたは異なるフルオロフォアを持つ。
【０２２９】
標的配列が使われる場合、各ベクター（ここでは複数ベクターが使用される）は同じまたは異なる標的配列を含むことができる。標的配列が同じであろうと異なろうと、蛍光発生オリゴヌクレオチドは、異なる色のフルオロフォアなど各サブユニットの発現が別々に検出できるように異なるシグナルエミッタを含むことができる。図解のために、対象とする第１のｍＲＮＡを特異的に検出する蛍光発生ヌクレオチドが赤色フルオロフォアを含むことができ、対象とする第２のｍＲＮＡを検出するプローブが緑色フルオロフォアを含むことができ、対象とする第３のｍＲＮＡを検出するプローブが青色フルオロフォアを含むことができる。当業者は、３重に形質移入された細胞内の蛍光発生オリゴヌクレオチドでもって３個のサブユニットの発現を差動的に検出できるその他の手段を知っている。
【０２３０】
１つの実施形態において、蛍光発生オリゴヌクレオチドが、対象とするタンパク質をコード化するＲＮＡのいずれの部分（例えば、レポーター、または５’または３’ＵＴＲの部分）にも相補的であるように設計される。対象とするメッセンジャーＲＮＡを認識するように設計された蛍光発生オリゴヌクレオチドが内因的に発現した標的配列を偽って検出することが出来たとしても、形質移入された細胞によって産生された対象とする配列の比率と比較して、これらの比率は選別機が２個の細胞型を識別することができる比率である。
【０２３１】
対象とするタンパク質（例えば、レポーターまたはＣＴＲ因子）の活性または発現レベルは、細胞から細胞または株化細胞から株化細胞によって異なる。細胞または株化細胞の活性または発現レベルもまた、ＤＮＡメチル化および遺伝子サイレンシングおよび導入遺伝子コピーの損失などの後成的イベントなどにより徐々に増加または減少することがある。これらの変動は、例えば、様々な因子細胞によって取り込まれた導入遺伝子のコピー数、導入遺伝子のゲノム組込部位、およびゲノムの組込みに引き続く導入遺伝子の組込などに起因するはずである。発現レベルを評価するために、ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）または細胞ソーティング方法（すなわち、ＭＡＣＳ（磁気細胞分離装置））を使って良い。シグナル伝達プローブを導入する付加的ラウンドを使用して良く、例えば、それらが元々単離された対象の任意のまたは複数のＲＮＡに対してある期間にわたって細胞が陽性であるか、どの程度陽性であり続けるのかを測定する。
【０２３２】
当業者によって理解されているように、選択された宿主細胞と共に使用するのに適した任意の試薬は、例えば、プラスミド、オリゴヌクレオチド、標識オリゴヌクレオチドなどの核酸を適切に最適化して宿主細胞に導入するために使用することができる。蛍光発生オリゴヌクレオチドなどの核酸を宿主細胞に導入するために使用できる試薬の例は、限定される訳ではないが以下を含む：リポフェクタミン、リポフェクタミン２０００、オリゴフェクタミン、ＴＦＸ試薬、Ｆｕｇｅｎｅ６、ＤＯＴＰ／ＤＯＰＥ、メタフィクチン、またはフェクチュリ（Ｆｅｃｔｕｒｉ）。細胞を収集し、また蛍光発生オリゴヌクレオチドを形質移入させる。
【０２３３】
４．３  化合物
【０２３４】
本明細書に記載した方法によって、細胞運命／細胞型仕様の修飾因子としての化合物の同定および立証ができる。任意の化合物を本明細書に記載した方法使用することができる。特定の態様において、本明細書に記載した方法によって、高処理アッセイ内の化合物ライブラリをスクリーニングできる。
【０２３５】
本明細書に使われているように、化合物とは、その維持、細胞特定、細胞決定、の幹細胞運命の誘導、細胞分化、脱分化、および／または分化転換などの細胞運命を調節する能力がテストされる任意の薬剤を指す。他の態様において、化合物とは、その転写を調節する能力（例えば、ＣＴＲプロモータなどのプロモータの活性を調節する能力）がテストされる任意の薬剤を指す。化合物は、限定される訳ではないがタンパク質性の分子、限定される訳ではないが、ペプチド類（そのようなペプチド類の二量体および多量体を含む）、ポリペプチド、タンパク質、翻訳後修飾タンパク質、抱合体、抗体、抗体断片など；無機または有機化合物を含む小分子；核酸分子（例えば、ＤＮまたはＲＮＡ）、または、
限定される訳ではないが二重鎖のまたは一本鎖ＤＮＡを含むポリヌクレオチド、または二重鎖のまたは一本鎖ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）、など、）、イントロン配列、三重らせん体核酸分子およびアプタマー；炭水化物；および脂質を含む。いくつかの特定の実施形態において、化合物はハイブリッドまたは誘導体であって良い。１つの実施形態において、化合物は精製される。
【０２３６】
いくつかの特定の実施形態において、化合物は、天然抽出物などの自然なソースから得ることがまたは精製することができる。いくつかの実施形態において、化合物が合成される。いくつかの特定の実施形態において、精製された化合物は、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の他の異なる化合物または薬剤を含まない。
【０２３７】
化合物の任意の適したライブラリを、細胞運命／細胞型仕様の修飾因子をスクリーンするために本明細書に記載した方法に使用することができる。小分子ライブラリの非限定例は、ＬＯＰＡＣ、ＴｉｍＴｅｃ、ＣｈｅｍＤｉｖ、ｓｉｎｅｘおよＲｙａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃを含む。いくつかの化合物は市販のソース、例えばＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅ’ｓ  Ｈｉｔ２Ｌｅａｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｏｒｅ（Ｓａｎ  Ｄｅｉｇｏ、ＣＡ）を通して購入できる。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡライブラリなどのその他の化合物ライブラリもまた商業的に入手可能である。いくつかの実施形態において、小分子である化合物は、溶媒和化合物、水和物、プロドラッグ、立体異性体および／またはそれらの薬剤的に容認できる塩を含む
【０２３８】
いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載した化合物は、タンパク質（例えば、転写制御因子、サイトカイン、受容体、細胞内シグナル分子）をコード化するメッセンジャーＲＮＡ；アンチセンスＲＮＡ；低分子干ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；ｍｉＲＮＡ；構造上のＲＮＡ；細胞のＲＮＡ（例えば、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、およびｓｎＲＮＡ）；ランダムなＲＮＡ；ｃＤＮまたはＥＳＴに対応するＲＮＡ；多様な巨大分子の複合体に取り込めるＲＮＡ；リボザイムまたは触媒ＲＮＡであるＲＮＡ；ウイルス性または外来性ＲＮＡに対応するＲＮＡ、リンカーＲＮＡ、または１個または複数のＲＮＡを結合させる配列；または上述の機能または活性を有しないが、にもかかわらず細胞によって発現できるＲＮＡ、などのＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡである化合物のライブラリは、本明細書に記載した方法に使用することができる、いくつかの特定の実施形態において、化合物はそのような複数のＲＮＡをコード化するＤＮＡである。いくつかの実施形態において、化合物はＣＴＲ因子などのタンパク質の発現を抑制または減少させる複数のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む。
【０２３９】
いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載した方法に使用される化合物は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害薬）、レチノイド（例えば、全トランスレチノイド酸）、ホルモン、抗体、可溶性受容体、または受容体リガンドである。
【０２４０】
いくつかの特定の実施形態において、ポリペプチドである本明細書に記載した化合物は、可溶性（例えば、分泌されたもの）、細胞膜結合、または細胞内ポリペプチドである。いくつかの態様において、本明細書に記載した方法に使用される化合物は、転写制御因子またはＣＴＲ因子である。
【０２４１】
いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載した化合物は発現ライブラリをスクリーンするのに使用できる。例えば、本明細書に記載した１個または複数のレポーターコンストラクトを含むように設計された異なる細胞型の発現ライブラリは、１個または複数の化合物に接触、曝露、または導入させられ、およびレポーターの活性または発現のレベルが細胞内のＣＴＲプロモータ活性の指標として測定される、この指標は細胞運命のマーカーとしての役割をも果たす。いくつかの特定の実施形態において、背景に対してレポーターの発現または活性がある細胞が、発現ライブラリから選択される。他の実施形態において、背景に対してレポーターの低発現あるいは低活性の、または無発現あるいは無活性の細胞が、発現ライブラリから選択される。
【０２４２】
いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載した方法に使用される化合物は、本明細書に記載した（例えば、ｉｎセクション４。２。１）１個または複数の転写制御因子またはＣＴＲ因子をコード化する核酸コンストラクト（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。例えば、眼特異的プロモータの調節に関連するいくつかの実施形態において、Ｌｈｘ２およびＰｘ６、またはＬｈｘ２およびＰａｘ６をコード化するＤＮＡまたはＲＮＡは、Ｓｉｘ６（ＮＰ＿０３１４００）のプロモータの活性を調節できる化合物である。皮膚幹細胞（隆起細胞）の調節に関連するいくつかの実施形態において、ＮＦＡＴｃ１、またはそれをコード化するＤＮＡあるいはＲＮＡは、ＣＤＫ４プロモータ（ＮＭ＿００００７５）を抑制する化合物であり、およびＳｏｘ９、またはそれをコード化するＤＮＡあるいはＲＮＡコードは、ＭＩＴＦプロモータを活性化する化合物である。皮膚幹細胞（隆起細胞）の調節に関連するいくつかの特定の実施形態において、ＴＣＦ３、または同じものをコード化するＤＮＡあるいはＲＮＡは、ＣＤＫＮ１Ａプロモータ（ＮＰ＿０００３８０）を活性化する化合物である。他の実施形態において、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４、またはそれをコード化するＤＮＡまたはＲＮＡコードは、Ｎａｎｏｇプロモータを活性化する化合物である。いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載した方法に使用される化合物は、そのような転写制御因子をコード化する核酸コンストラクト（例えば、ＤＮまたはＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載した方法に使用される化合物は、そのような転写制御因子またはそれらのポリペプチド断片のポリペプチドである。
【０２４３】
いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載した方法に使用される化合物は、サイトカインあるいは増殖因子、またはそれをコード化するＤＮＡまたはＲＮＡである。様々な実施形態において、サイトカインは、以下からなるグループ選択される：白血病抑制因子（白血病抑制因子）、幹細胞因子（幹細胞因子）、ｃ−キット、ｆｌｔ−３／ｆｌｋ−２リガンド、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ―β、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦ−γ、ＩＮＦ−α、ＳＬＣ、内皮単球活性化するタンパク質−２（ＥＭＰ２）、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、または、ヒト白血球抗原−Ｂ７（ＨＬＡ−Ｂ７）などのＭＨＣ遺伝子。そのうえ、その他の模範的なサイトカインは、腫瘍壊死因子ファミリーのその他のメンバーを含み、このファミリーは、限定される訳ではないが腫瘍壊死因子関連アポトーシス−誘発リガンド（ＴＲＩＬ）、腫瘍壊死因子α関連活性化誘発サイトカイン（ＴＲＮＣＥ）、腫瘍壊死因子α関連アポトーシス弱誘導物質（ＴＷＥＡＫ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ロイコトリエンα（ＬＴ−α）、ロイコトリエンβ（ＬＴ−β）、ＯＸ４ＯＬ、ＣＤ４ＯＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＰＲＩＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１、ＴＮＦＳＦ１６、ＴＮＦＳＦ１７、およびＡＩＴＲ−Ｌ、またはこれらの機能的部分を含む。例えば、ＴＮＦファミリーの概説について、Ｋｗｏｎｅｔｌ．，１９９９，Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：３４０−３４５を参照されたい。
【０２４４】
いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載した方法に使用される化合物は、抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントである。本明細書に使われているように、用語「抗体」および「複数の抗体」（免疫グロブリン）は、単クローン抗体（全長単クローン抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２個のインタクトな抗体から形成された多選択性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ｃａｍｅｌｉｓｅｄ抗体、キメラの抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、単一領域抗体、領域抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２断片、望ましい生物活性を示す抗体断片、ジスルフィド−連結Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗−Ｉｄ抗体を含む）、細胞内抗体、および上記の内の任意のエピトープ結合断片、を指す。抗体は、以下のクラスの１つに属して良い：Ｉｇ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ。いくつかの特定の実施形態において、本明細書に使われている化合物は抗ノッチ抗体、またはそれらの断片である。
【０２４５】
本明細書に記載した方法に使用して同定および／または立証された化合物は、細胞運命／細胞型仕様の陽性修飾因子または陰性修飾因子である。修飾因子は転写制御に関わる。修飾因子は細胞型特異的遺伝子の転写を誘発または増強することができる。別の実施形態において、修飾因子は細胞型特異的遺伝子の転写を抑制または減少させることができる。いくつかの特定の実施形態において、修飾因子は、本明細書に記載した宿主細胞内のレポーター核酸コンストラクトのＣＴＲプロモータの活性を増加させる。
【０２４６】
いくつかの特定の態様において、修飾因子が分化細胞を誘発させて多能性幹細胞または組織幹細胞の特徴を獲得する。いくつかの実施形態において、修飾因子は幹細胞維持および／または増殖を調節する。いくつかの他の実施形態において、修飾因子が細胞分化を誘発させる。いくつかの実施形態において、修飾因子が細胞分化転換を誘発させる。いくつかの特定の実施形態において、修飾因子が細胞脱分化を誘発させる。
【０２４７】
当業者に細胞運命／細胞型仕様の修飾因子として知られている化合物を、本明細書に記載した方法に陽性および負の制御として使うことができる。例えば、レチノイン酸は、神経系列の細胞分化の誘導物質として使用することができる。
【０２４８】
４．４  修飾因子を同定方法
【０２４９】
本発明は、細胞運命の修飾因子を同定および立証する方法およびＣＴＲプロモータ活性の修飾因子を同定および立証をする方法を提供する。１つの態様において、本発明は、幹細胞維持（例えば、自己複製、増殖および／または増殖）、細胞仕様、細胞決定、幹細胞運命の誘導、または細胞分化、脱分化、または分化転換の修飾因子を同定および立証する方法に関連する。誘発された多能性幹細胞の修飾因子を同定および立証する方法、癌幹細胞の修飾因子を同定および立証する方法、および筋細胞分化の陽性修飾因子を同定する方法を提供する。いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載した方法は、高処理量プラットフォームで化合物のライブラリをスクリーニングするためである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載した方法は発現ライブラリをスクリーニングするためである。
【０２５０】
他の態様において、本発明は、ＣＴＲプロモータ活性の修飾因子を同定および／または立証する方法に関連し：（ａ）本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含む宿主細胞を化合物に接触、曝露、または導入するステップ；および（ｂ）レポーターの活性または発現レベルを測定するステップと、（ここで、化合物の非存在下でのレポートの活性または発現レベルと比較して化合物の存在下でレポーターの活性または発現レベルが増加または減少するならば、化合物はＣＴＲプロモータ活性の修飾因子である）を含む。そのような方法のいくつかの特定の実施形態において、レポーターの活性または発現レベルを測定する（すなわち、ステップ（ｂ））ステップを、ステップ（ａ）の後約１２時間から９６時間の間に、または１日から３５日の間に実行する。そのような方法のいくつかの特定の実施形態において、レポーターの活性または発現レベルを測定する（すなわち、ステップ（ｂ））ステップを、ステップ（ａ）の後、約１週間、２週間、３週間、４週間、または５週間で実行する。
【０２５１】
特定の態様において、本明細書に記載した方法は、幹細胞プロモータなどのＣＴＲプロモータの活性を誘発または増加させることのできる修飾因子を同定および立証するためである。他の態様において、本明細書に記載した方法は、プロモータの活性を抑制または減少させることのできる修飾因子を同定および立証するためである。そのような方法は、ＯＲＦが機能的にＣＴＲプロモータを化合物に連結しているレポーターをコード化するＯＲＦを含む１個または複数のレポーター核酸コンストラクト含む宿主細胞を接触、曝露、または導入させることと、並びに、化合物の存在下と非存在下で、ＣＴＲプロモータの活性の指標としてレポーターの活性または発現レベルを測定することに関わる。
【０２５２】
化合物は、レポーターの活性または発現レベルが、化合物の非存在下での宿主細胞内より化合物の存在下での宿主細胞内でより高い場合、陽性修飾因子である。化合物は、レポーターの活性または発現レベルが、化合物の非存在下での宿主細胞内より化合物の存在下での宿主細胞内でより低い場合、陰性修飾因子である。いくつかの実施形態において、ＣＴＲプロモータの陽性修飾因子は、ＣＴＲプロモータまたはＣＴＲ遺伝子が付随する細胞型の誘導物質であると予想されている。いくつかの実施形態において、ＣＴＲプロモータの陰性修飾因子は、そのようなＣＴＲプロモータまたはＣＴＲ遺伝子が付随する細胞型のリプレッサーまたは阻害剤であると予想されている。いくつかの特定の実施形態において、ＣＴＲプロモータの活性、またはレポーターの活性あるいは発現のレベルが細胞型マーカーとしての役目を果たす。
【０２５３】
いくつかの他の態様において、本発明は、細胞運命の修飾因子を同定および／または立証する方法に関連し、以下のステップを含む：（ａ）本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含む宿主細胞を化合物に接触、曝露、または導入するステップ；および（ｂ）レポーターの活性または発現レベルを測定するステップと、（ここで、化合物の非存在下でのレポートの活性または発現レベルと比較して化合物の存在下でレポーターの活性または発現レベルが増加または減少するならば、化合物は細胞運命の修飾因子である）を含む。
【０２５４】
いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は幹細胞であり、およびＣＴＲプロモータは幹細胞プロモータまたは分化マーカープロモータである。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は分化された細胞であり、およびＣＴＲプロモータは幹細胞プロモータまたは分化マーカープロモータである。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は第１の細胞型の細胞であり、およびＣＴＲプロモータは第１の細胞型の細胞型マーカープロモータまたは第２の細胞型の細胞型マーカープロモータである。そのような方法のいくつかの特定の実施形態において、レポーターの活性または発現レベルを測定する（すなわち、ステップ（ｂ））ステップが、ステップ（ａ）の後約１２時間から７２時間の間に、または１日から３５日の間に実行される。そのような方法のいくつかの特定の実施形態において、レポーターの活性または発現レベルを測定する（すなわち、ステップ（ｂ））ステップが、ステップ（ａ）の後約１週間、２週間、３週間、４週間、または５週間で実行される。
【０２５５】
特定の態様において、本発明は細胞運命の陽性修飾因子を同定方法に関連し：（ａ）本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含む宿主細胞を化合物に接触、曝露、または導入するステップ；および（ｂ）レポーターの活性または発現レベルを測定するステップと、（ここで、化合物の非存在下でのレポートの活性または発現レベルと比較して化合物の存在下でレポーターの活性または発現レベルが増加するならば、化合物は細胞運命の陽性修飾因子である）を含む。
【０２５６】
他の態様において、本発明は、幹細胞維持、または細胞分化、脱分化または分化転換の修飾因子を同定および／または立証する方法に関連：（ａ）本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含む宿主細胞を化合物に接触（曝露、または導入）するステップ；および（ｂ）レポーターの活性または発現レベルを測定するステップと、（化合物の非存在下でのレポートの活性または発現レベルと比較して化合物の存在下でレポーターの活性または発現レベルが増加または減少するならば、化合物は、それぞれ幹細胞維持、または細胞分化、脱分化または分化転換の修飾因子である）を含む。
【０２５７】
特定の態様において、本発明はｉＰＳ細胞の修飾因子を同定方法に関連し、以下のステップを含む：（ａ）本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含む宿主細胞を化合物に接触、曝露、または導入するステップ；および（ｂ）レポーターの活性または発現レベルを測定するステップと、（化合物の非存在下でのレポートの活性または発現レベルと比較して化合物の存在下でレポーターの活性または発現レベルが増加するならば、化合物はｉＰＳ細胞の修飾因子である）を含む。
【０２５８】
いくつかの特定の実施形態において、ｉＰＳ細胞の修飾因子である化合物は、線維芽細胞などのｉＰＳ細胞を誘発または再プログラムさせてｉＰＳ細胞にすることができる。いくつかの実施形態において、複数の化合物の組み合わせは、ｉＰＳ細胞の複数の修飾因子であり、線維芽細胞などの体細胞を誘発または再プログラムさせてｉＰＳ細胞にすることができる。いくつかの特定の実施形態において、ｉＰＳ細胞の修飾因子である化合物は、ｉＰＳ細胞を誘発または再プログラムさせてより分化した細胞または細胞型にすることができる。いくつかの実施形態において、複数の化合物の組み合わせは、ｉＰＳ細胞の複数の修飾因子であり、ｉＰＳ細胞を誘発または再プログラムさせてより分化した細胞または細胞型にすることができる。いくつかの特定の実施形態において、ｉＰＳ細胞の修飾因子である化合物は、ｉＰＳ細胞を誘発または再プログラムさせて前駆細胞または分化細胞または細胞型にすることができる。いくつかの実施形態において、複数の化合物の組み合わせは、ｉＰＳ細胞の複数の修飾因子であり、ｉＰＳ細胞を誘発または再プログラムさせてより分化した細胞（例えば、前駆細胞または分化／特定化した細胞）または細胞型にすることができる。いくつかの特定の実施形態において、ｉＰＳ細胞の修飾因子である化合物は、ｉＰＳ細胞を誘発または再プログラムさせて非ヒトの生物体全体を産生することに関わる。任意の設計された細胞を使ってｉＰＳ細胞を産生できる。いくつかの実施形態において、複数の化合物の組み合わせは、ｉＰＳ細胞の複数の修飾因子であり、ｉＰＳ細胞を誘発または再プログラムさせて非ヒトの生物体全体を産生することに関わる。任意の設計された細胞を使ってｉＰＳ細胞を産生できる。
【０２５９】
そのような方法のいくつかの特定の実施形態において、レポーターの活性または発現レベルを測定する（すなわち、ステップ（ｂ））ステップが、ステップ（ａ）の後約１２時間から７２時間の間に、または１日から３５日の間に実行される。そのような方法のいくつかの特定の実施形態において、レポーターの活性または発現レベルを測定する（すなわち、ステップ（ｂ））ステップが、ステップ（ａ）の後約１週間、２週間、３週間、４週間、または５週間で実行される。
【０２６０】
いくつかの特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載したｉＰＳ細胞から新しい組織、新しい器官、または非ヒトの生物体全体を産生する方法に関連する。本発明はまた、本明細書に記載したｉＰＳ細胞から新しい組織、新しい器官、または非ヒトの生物体全体を産生することを調節することができるか、それに関わる化合物を同定方法に関連する。本明細書に記載したｉＰＳ細胞から新しい組織、新しい器官、または非ヒトの生物体全体を産生する方法は、（ｉ）ｉＰＳ細胞を入手すること；（ｉｉ）ｉＰＳ細胞を新しい組織、新しい器官、または非ヒトの生物体全体を産生するために適した条件に曝露すること、を含んで良い。本明細書に記載したｉＰＳ細胞から新しい組織、新しい器官、または非ヒトの生物体全体を産生することを調節するか、それに関わる化合物を同定方法は、（ｉ）化合物の存在下または非存在下で、ｉＰＳ細胞を新しい組織、新しい器官、または非ヒトの生物体あるいは非ヒト動物の全体を産生するために適した条件に曝露すること；および（ｉｉ）ｉＰＳ細胞が新しい組織、新しい器官、または非ヒトの生物体全体を産生できるかを測定することを含んで良い。
【０２６１】
いくつかの特定の実施形態において、ｉＰＳ細胞から産生する非ヒトの生物体または動物の全体は、以下に限定される訳ではないが、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ロバ、カエル、寄生虫、昆虫（例えば、ハエ）、または雌ウシを含む。他の実施形態において、ｉＰＳ細胞から産生する新しい組織または器官は、以下に限定される訳ではないが、ヒトマウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ロバ、カエル、寄生虫、昆虫（例えば、ハエ）、または雌ウシの新しい組織または器官である。いくつかの特定の実施形態において、この器官は、以下に限定される訳ではないが、乳房、結腸、胃、心臓、脳、脊髄、肺、肝臓、膵臓、腎臓、眼、膀胱、または皮膚である。いくつかの特定の実施形態において、この新しい組織は、以下に限定される訳ではないが、乳房、結腸、胃、心臓、脳、脊髄、肺、肝臓、膵臓、腎臓、眼、膀胱、または皮膚の組織である。
【０２６２】
いくつかの特定の実施の形態において、宿主細胞は１個または複数のＣＴＲ因子を発現するように設計され、幹細胞維持（例えば、自己複製、増殖および／または増殖）、細胞特定、細胞決定、幹細胞運命の誘導、細胞分化、細胞脱分化、または細胞分化転換のために宿主細胞内の細胞状況を提供する。いくつかの他の実施形態において、宿主細胞は１個または複数のＣＴＲ因子を発現するように設計され、この因子が多能性幹細胞を誘発するために宿主細胞内の細胞状況を提供する。
【０２６３】
本発明はまた、本明細書に記載された方法に使用される化合物およびＣＴＲ因子およびＣＴＲ因子の組み合わせのためのスクリーニングの方法を提供する。例えば、そのような方法は、宿主細胞に１個または複数の化合物またはＣＴＲ因子の複数の異なる組み合わせを導入するステップ、および１個または複数の望ましい性質または細胞状況（例えば、細胞型特異的マーカーの発現、ＣＴＲプロモータ活性、酵素活性、遺伝子発現プロファイル、および／または形態）の存在を測定するステップ、を含む。いくつかの特定の実施形態において、１個の化合物あるいはＣＴＲ因子、または２個、３個、あるいは４個の化合物の組み合わせ、またはＣＴＲ因子を宿主細胞に導入すると、望ましい性質または細胞状況を達成する。いくつかの特定の実施形態において、これらの方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）などのポリヌクレオチドである化合物またはＣＴＲ因子をスクリーニングすることを提供する。特定の実施の形態において、１個または複数のテストＲＮＡが宿主細胞に導入され、レポーター核酸コンストラクトのＣＴＲプロモータの活性へのＲＮＡの効果をテストするか、細胞運命／細胞型仕様へのＲＮＡの効果をテストする。いくつかの実施形態において、テストＲＮＡは、本明細書に記載されたレポーター核酸コンストラクトによってコードされる。いくつかの他の実施形態において、これらの方法は、因子ポリペプチド、小分子、または抗体である化合物またはＣＴＲをスクリーニングすることを提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法は、本明細書に記載された薬剤または化合物の任意の組み合わせで良い化合物またはＣＴＲ因子のライブラリをスクリーニングすることを提供する。特定の態様において、これらの方法は高処理スクリーニングを提供する。いくつかの特定の実施形態において、これらの方法はリアルタイムで生細胞をスクリーニングすることを提供する。
【０２６４】
いくつかの特定の態様において、本発明は、異なる細胞のパネルは、本明細書に記載された１個または複数のレポーター核酸コンストラクトを含むように設計される発現ライブラリを提供する。例えば、１個または複数の本明細書に記載されたレポーターコンストラクトを含むように設計された異なる細胞型の発現ライブラリは、１個または複数の化合物に接触させられ（または曝露またはそれらを導入される）、およびレポーターの活性または発現レベルが、細胞内のＣＴＲプロモータ活性または細胞内の細胞状況と相関として測定される。そのような発現ライブラリは、宿主細胞を同定または選択するのに有用であり、ここでＣＴＲプロモータは、背景レベルと比較して活動的または不活性である。特定の実施の形態において、発現ライブラリは、本明細書に記載された１個または複数のレポーター核酸コンストラクトを含む１００を超す異なる細胞型を含む。いくつかの特定の実施形態において、発現ライブラリは、本明細書に記載された１個または複数のレポーター核酸コンストラクトを含む少なくとも５、１０、１５、２０、５０、７５、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１．０００の異なる細胞型を含む。いくつかの特定の実施形態において、発現ライブラリ内の宿主細胞は１個または複数のＣＴＲ因子を含むか、組換えで発現する。
【０２６５】
多能性の維持
特定の態様において、本明細書に記載されたこれらの方法は、幹細胞の多能性を維持できる修飾因子を同定および立証することを目的とする。そのような方法において、レポーターをコード化するＯＲＦ（ＯＲＦは機能的にＣＴＲプロモータと連結する）を含むレポーター核酸コンストラクトを含む宿主細胞は、化合物に接触させられ（または曝露するまたはそれを導入させられ）、この化合物の存在下および非存在下でのレポーターの活性または発現レベルを測定する。ＣＴＲプロモータは、幹細胞マーカーである遺伝子のプロモータであって良い。（例えば、主にまたはいくつかのケースでは独占的に幹細胞内で発現しかつその他の細胞型では発現しない、またはその他の細胞よりも幹細胞においてより高いレベルで発現する遺伝子）。宿主細胞は幹細胞（例えば、ＥＳＣ、ＨＳＣ、神経幹細胞、筋幹細胞など）であって良い。レポーターのは発現レベルはＣＴＲプロモータの活性の指標であり、細胞状況の指標としての役目を果たす。例えば、ＣＴＲプロモータが幹細胞マーカー遺伝子のプロモータであれば、ＣＴＲプロモータは幹細胞内で（背景以上に）活性化するだろう、またＣＴＲプロモータの活性はそこで幹細胞表現型失っているかおよび／またはもっと分化している細胞内で、減少するか不活性になるだろう。ＥＳＣおよびｉＰＳ細胞は、明確な増殖因子の添加によっておよび／または照射された線維芽細胞（例えば、Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｍｅｄ．，２００６、２４（５）：２９８−３０３を参照されたい）を持つ共培養細胞によって多能性状態に維持することができる。成体幹細胞集団は、試験管内で維持するのがより困難である。例えば、試験管内で造血管細胞を増殖させることは困難である。神経幹細胞などのその他の成体幹細胞は、試験管内で維持できる。
【０２６６】
幹細胞維持に関連するいくつかの実施の形態において、宿主細胞は、本明細書に記載されたレポーター核酸コンストラクトを含む幹細胞（例えば、ＥＳＣｓ）であり、また核酸コンストラクトのＣＴＲプロモータは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ｍｙｃ、ＬＩＮ２８、Ｎｏｇ、ＳＳＥＡ−３、またはＳＳＥ−４のプロモータ領域を含み、ここで領域とは、転写の機能的調節領域である。
【０２６７】
分化
分化のプロセス、または幹細胞からの成熟子孫の産生は、通常明確な増殖因子の存在を必要とする。分化は、異なるステージに対して相異なる要求を通常持つ複数のステップを進む。プロセスは、細胞が成熟するに従って生体内で出くわす環境を模倣する。再生医学の分野での１つのチャレンジは、ＥＳＣまたはｉＰＳ細胞から明確な細胞型を産生することを支持できる条件を発見することである。別のチャレンジは、産生いくつかの態様において、ＥＳＣまたはｉＰＳ細胞から明確な細胞型を産生することを結果として生み出す遺伝子発現を制御できる条件を発見することである。
【０２６８】
いくつかの態様において、本明細書に記載されたこれらの方法は、細胞分化を誘発または抑制できる修飾因子を同定かつ立証することが目的である。そのような方法において、レポーターをコード化するＯＲＦ（ＯＲＦは機能的にＣＴＲプロモータと連結する）を含むレポーター核酸コンストラクトを含む宿主細胞は化合物に接触させられ（または曝露するまたはそれを導入させられ）、この化合物の存在下および非存在下でのレポーターの活性または発現レベル測定をする。ＣＴＲプロモータは、分化マーカーである遺伝子のプロモータであって良い。（例えば、主にまたはいくつかのケースでは独占的に特定の分化した細胞（皮膚細胞および筋細胞など）で発現しかつその他の細胞型では発現しない、またはその他の細胞よりも特定の分化した細胞においてより高いレベルで発現する遺伝子）。宿主細胞は幹細胞（例えば、ＥＳＣ、ＨＳＣ、神経幹細胞、筋幹細胞、ｉＰＳ細胞など）であって良い。レポーターの活性または発現レベルはＣＴＲプロモータの活性の指標であり、細胞状況の指標としての役目を果たす。例えば、ＣＴＲプロモータが分化マーカー遺伝子のプロモータであれば、ＣＴＲプロモータはより分化した細胞で（背景と比べて）活性化するだろう、またＣＴＲプロモータの活性はそこで分化した表現型を持たないか、および／または比較的分化していない細胞内で、減少するか不活性になるだろう。例えば、ここで宿主細胞は幹細胞であり、またＣＴＲプロモータは分化マーカーのプロモータである場合、レポーターの基礎発現レベルが低いかまたは検出不可能であり、また分化の陽性修飾因子は、陽性修飾因子の非存在下での宿主細胞内の活性または発現のそれぞれと比較してレポーターの活性または発現を増加または誘発させることができる。いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載された方法は幹細胞が分化して前駆細胞になることに関連する。いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載された方法は、幹細胞または前駆細胞が分化して、分化または特定化した細胞になることに関連する。
【０２６９】
いくつかの態様において、本発明は、筋細胞分化の修飾因子を同定ための方法に関連し、：（ａ）本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含む宿主細胞を（または「宿主細胞へ」））化合物と接触（または導入または曝露）させるステップと、；および（ｂ）レポーターの活性または発現レベルを測定するステップと、（ここでこの化合物は、化合物の非存在下でのレポーターの活性または発現レベルとそれぞれ比較して、化合物の存在下でのレポーターの活性または発現レベルが増減少するならば、筋細胞分化の修飾因子である）を含む。
【０２７０】
特定の態様において、本発明は、筋細胞分化の陽性修飾因子を同定ための方法に関連し、：（ａ）本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトをを含む宿主細胞を（または「宿主細胞へ」））化合物と接触（または導入または曝露）させるステップと、；および（ｂ）レポーターの活性または発現レベルを測定するステップと、（ここでこの化合物は、化合物の非存在下でのレポーターの活性または発現レベルにそれぞれ比較して、化合物の存在下でのレポーターの活性または発現レベルが増減少するならば、筋細胞分化の陽性修飾因子である）を含む。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は幹細胞であり、およびＣＴＲプロモータは、筋細胞プロモータである。
【０２７１】
いくつかの態様において、本発明は、網膜細胞、皮膚細胞、または心筋細胞の分化の修飾因子を同定ための方法に関連し、：（ａ）本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトをを含む宿主細胞を（または「宿主細胞へ」））化合物に接触（または導入または曝露）させるステップと、；および（ｂ）レポーターの活性または発現レベルを測定するステップと、（ここでこの化合物は、化合物の非存在下でのレポーターの活性または発現レベルにそれぞれ比較して、化合物の存在下でのレポーターの活性または発現レベルが増加するならば、網膜細胞、皮膚細胞、または心筋細胞分化の修飾因子である）を含む。
【０２７２】
いくつかの態様において、本発明は、ｉＰＳ細胞分化の修飾因子を同定ための方法に関連し、：（ａ）本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトをを含む宿主細胞を（または「へ」））化合物に接触（または導入または曝露）させるステップと、；および（ｂ）レポーターの活性または発現レベルを測定するステップ、（ここでこの化合物は、化合物の非存在下でのレポーターの活性または発現レベルにそれぞれ比較して、化合物の存在下でのレポーターの活性または発現レベルが増加するならば、ｉＰＳ細胞分化の修飾因子である）を含む。
【０２７３】
脱分化および分化転換
ある条件の下で、より成熟した細胞または分化した細胞を操作してより少なく分化した状態に復帰することができる；このプロセスを「脱分化」と呼ぶ。成熟線維芽細胞からのｉＰＳ細胞は、この現象の１つの例である。脱分化はまた、癌性細胞の特徴でもある。一方、分化転換は成熟細胞が異なる系列に関連付けられることによるプロセスである。例えば、線維芽細胞細胞はニューロン細胞へトランス分化することがある。レポートの骨髄幹細胞が、肝臓またはニューロンなどの成熟非血液由来細胞型へ分化した報告がある。（例えば、Ｋｕcｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．，  ２００９，４（２）：１０７−１７を参照されたい）。
【０２７４】
いくつかの態様において、本明細書に記載した方法は、細胞脱分化を誘発または抑制できるかまたはそれに関わる修飾因子を同定かつ立証することを目的としている。そのような方法において、レポーターをコード化するＯＲＦ（ＯＲＦは機能的にＣＴＲプロモータと連結する）を含むレポーター核酸コンストラクトを含む宿主細胞は化合物に接触させられ（または曝露させられまたはそれを導入させられ）、この化合物の存在下および非存在下でのレポーターの活性または発現レベル測定をする。ＣＴＲプロモータは、分化マーカー（例えば、主にまたはいくつかのケースでは独占的に特定の分化した細胞（皮膚細胞および筋細胞など）で発現しかつその他の細胞型では発現しない、またはその他の細胞よりも特定の分化した細胞においてより高いレベルで発現する遺伝子）、幹細胞、または前駆細胞マーカーである遺伝子のプロモータであって良い。レポーターの活性または発現レベルはＣＴＲプロモータの活性の指標であり、細胞状況の指標としての役目を果たす。
【０２７５】
例えば、ＣＴＲプロモータが分化マーカー遺伝子のプロモータであれば、ＣＴＲプロモータはより分化した細胞で（背景と比べて）活性化するだろう。またＣＴＲプロモータの活性は、幹細胞または前駆細胞内で、活性がより鈍化するか不活性になるだろう。例えば、宿主細胞は分化した細胞であり、またＣＴＲプロモータは分化マーカーのプロモータである場合、レポーターの基礎活性または発現レベルが高く、また分化の陽性修飾因子は、脱分化の陽性修飾因子の非存在下で宿主細胞内の活性または発現とそれぞれ比較して、レポーターの活性または発現を減少または抑制させることができる。宿主細胞が分化細胞であり、またＣＴＲプロモータが幹細胞マーカーのプロモータである場合、レポーターの基礎活性または発現レベルは、そのような分化された細胞内で低いかまたは検出不可能であり、また脱分化の陽性修飾因子は、脱分化の陽性修飾因子の非存在下での宿主細胞内の活性または発現と比較してレポーターの活性または発現を増加または増強することができる。
【０２７６】
細胞脱分化に関連するいくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含む分化した細胞である、またＣＴＲプロモータは幹細胞または幹細胞マーカーのプロモータである。いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載した方法は、前駆細胞を幹細胞に脱分化させることに関連する。いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載した方法は、分化したまたは特定化した細胞を前駆細胞または幹細胞に脱分化させることに関連する。
【０２７７】
いくつかの特定の態様において、本明細書に記載した方法は、細胞分化転換を誘発または抑制できるかまたはそれに関わる修飾因子を同定かつ立証することを目的としている。そのような方法において、レポーターをコード化するＯＲＦ（ＯＲＦは機能的にＣＴＲプロモータと連結する）を含むレポーター核酸コンストラクトを含む宿主細胞は、化合物に接触させられ（または曝露させられまたはそれを導入させられ）、この化合物の存在下および非存在下でのレポーターの活性または発現レベルを測定する。ＣＴＲプロモータは、特定の細胞（例えば、皮膚細胞、筋細胞、線維芽細胞、または膵臓のβ細胞）の分化マーカーある。レポーターの活性または発現レベルはＣＴＲプロモータの活性の指標であり、細胞状況または細胞型の指標としての役目を果たす。
【０２７８】
例えば、ＣＴＲプロモータが、皮膚細胞の分化マーカー遺伝子のプロモータであれば、ＣＴＲプロモータは分化した細胞で活性化するだろう、またＣＴＲプロモータの活性は、膵臓のβ細胞またはニューロンなどのその他の細胞型で、活性がより鈍化するか不活性になるだろう。この点において、宿主細胞は分化した細胞であり、またＣＴＲプロモータはニューロンの分化マーカーのプロモータである場合、レポーターの基礎活性または発現レベルは、宿主分化皮膚細胞内で低い、またニューロンへの分化転換の陽性修飾因子は、分化転換の陽性修飾因子の非存在下での宿主細胞内の発現と比較して、レポーターの活性または発現を増加または増強させることができる。また脱分化の陽性修飾因子は、脱分化の陽性修飾因子の非存在下での宿主細胞内の活性または発現と比較してレポーターの活性または発現をすることができる。
【０２７９】
第１の細胞型から第２の細胞型への細胞分化転換に関連する特定の態様において、宿主細胞は本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含む第１の細胞型の分化した細胞であり、およびレポーター核酸コンストラクトＣＴＲプロモータは、特定の第２の細胞型（例えば、皮膚細胞、筋細胞、線維芽細胞、または膵臓のβ細胞）の分化マーカーである遺伝子のプロモータ領域を含む。例えば、宿主細胞が分化した皮膚細胞およびＣＴＲプロモータがニューロンの分化マーカーのプロモータである場合、レポーターの基礎活性または発現レベルは、宿主分化皮膚細胞内で低く、またニューロンへの分化転換の陽性修飾因子は、分化転換の陽性修飾因子の非存在下での宿主細胞内の活性または発現と比較してレポーターの活性または発現を増加または誘発できる
【０２８０】
その他の態様において、本発明はｉＰＳ細胞の修飾因子を同定および／または立証する方法に関連し、：（ａ）本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含む宿主細胞を化合物に接触（曝露、または導入）させるステップと、；および（ｂ）レポーターの活性または発現レベルを測定するステップと、（ここで、化合物の非存在下でのレポートの活性または発現レベルと比較して化合物の存在下でレポーターの活性または発現レベルが増加または減少するならば、化合物はｉＰＳ細胞の修飾因子である）を含む。
いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含む線維芽細胞である（例えば、（ｉ）  ＯＲＦが機能的にＣＴＲプロモータに連結するレポーターをコード化するＯＲＦ、および（ｉｉ）１個または複数の標的配列をコード化する塩基配列）、また
ＣＴＲプロモータは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ｍｙｃ、ＬＩＮ２８、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−３、またはＳＳＥＡ−４のプロモータの領域を含む。そのような方法のいくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は分化細胞などの線維芽細胞であり、またＣＴＲプロモータは、Ｎａｎｏｇプロモータまたはその部分などの幹細胞プロモータである。
【０２８１】
その他の態様において、本発明は癌幹細胞の修飾因子を同定および／または立証する方法に関連し、：（ａ）本明細書に記載したレポーター核酸コンストラクトを含む宿主細胞を化合物に接触（曝露、または導入）させるステップと、；および（ｂ）レポーターの活性または発現レベルを測定するステップと、（ここで、化合物の非存在下でのレポートの活性または発現レベルと比較して化合物の存在下でレポーターの活性または発現レベルが増加または減少するならば、化合物は癌幹細胞の修飾因子である）を含む。いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は癌幹細胞であり、およびＣＴＲプロモータは癌幹細胞マーカープロモータまたはその部分である、例えば、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、またはＣＤ２９のプロモータ、またはその部分。
【０２８２】
本明細書に記載した方法に使用できる幹細胞プロモータなどのＣＴＲプロモータの非限定例は、セクション４．１．２．の中に記述する。当業者は、望ましい活性およびゴールのための適切なＣＴＲプロモータを選択できるだろう。
【０２８３】
いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載した方法に使用する宿主細胞は、さらに１個または複数のＣＴＲ因子を組換えで発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載した細胞型の修飾因子を同定および／または立証する方法は、宿主細胞を、ＣＴＲプロモータ活性または細胞運命を調節するために適した条件を提供する１個または複数のＣＴＲ因子に曝露またはそれを導入させることをさらに含む。
【０２８４】
ＣＴＲプロモータ活性または細胞運命の修飾因子ためのライブラリの化合物をスクリーニングための広範囲の技術が、当該分野で知られている。そのような技術は、高処理量プラットフォームを採用して化合物ライブラリを急速にスクリーニングするために一般に適応できる。大規模遺伝子ライブラリをスクリーニングするための最も広く使われている技術は、典型的に宿主細胞を多重ウエルプレート（例えば、９６ウエルのプレートまたは３８４ウエルのプレート）上にプレーティングすること、およびそれらを異なる培養条件に曝露するおよび／またはそれらをライブラリからのテスト化合物と接触させること、および、レポーターの活性または発現レベルまたはＣＴＲプロモータの活性などの特徴を検出すること、を含む。同様の高処理量スクリーニングアッセイを、本明細書に記載した方法ための望ましい細胞の性質または状況を提供するＣＴＲ因子またはテストＲＮＡの特定の組み合わせを同定するために遂行して良い。
【０２８５】
当業者は、使用するレポーターに従って適切なアッセイを採用することができるだろう。例えば、レポーターがルシフェラーゼの時、ルシフェラーゼの活性を検出するために生物発光アッセイを採用することができる。可溶化液を、ルシフェリンなどの生物発光の基質に曝露する、およびプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して発光を測定する。発光の反応において、光はルシフェリンの酸化によって産生される。そのようなアッセイは当該分野に記述されている。
【０２８６】
レポーターの発現レベルは、レポーターｍＲＮＡの転写物の検出および数量化の両方を可能にする逆転写ＰＣＲまたはリアルタイム逆転写によって測定できる。レポーターに特異的なプライマーを使うことができる。レポーターに対応するＲＮＡ配列は、それ自体が検出される（例えば、蛍光発生オリゴヌクレオチドの使用）。
【０２８７】
レポーターが、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、またはＲＦＰなどの蛍光タンパク質である場合の実施形態において、レポーターの活性または発現を検出は、顕微法を使用して遂行できる。さらに加えて、当業者に知られているまたは本明細書に記載したその他の試験管内およびセルベースのアッセイを、本明細書に記載した方法に使用して良い。
【０２８８】
４．１．１．  アッセイ
本明細書に記載した方法を使用して同定および／または立証した修飾因子を、当該分野で知られている機能的アッセイで更に立証できる。例えば、試験管内の転写アッセイ、セルベースアッセイ、同様に生体内の動物モデルは、本明細書に記載した修飾因子の生物活性を確認するために使用して良い。
【０２８９】
試験管内アッセイ
細胞の転写アッセイの非限定例は、ＨｅＬａ細胞核抽出物を使用することを含む。ＨｅＬａ核抽出液は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩよって正確に転写を開始することを補助でき、およびＲＮＡポリメラーゼ転写の基本のおよび制御されたパターンの両方を示す。核抽出液はまた、ＲＮＡプロセシングに関わる種々の、転写制御因子、ＤＮＡ結合タンパク質および酵素の機構のソースでもある。ＨｅＬａ細胞核抽出液転写アッセイのプロトコルは、当該分野に記述されている、例えば、Ｄｉｇｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １１，  １４７５−８９を参照されたい。これらのアッセイのキットはまた、商業的に入手可能である、例えば、ｔｈｅ  ＨｅＬａＳｃｒｉｂｅ（登録商標）  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）。正の制御鋳型（ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）速効性初期プロモ-タＤＮＡ）を使って良い。ＣＴＲプロモータと機能的に連結するレポーターのＯＲＦを含む核酸コンストラクトを、多様な修飾因子の存在下および非存在下でＨｅＬａ細胞核抽出液試験管内転写アッセイを使用してアッセイする。
【０２９０】
セルベ-スアッセイ
当業者に知られた任意のセルベ-スアッセイを本明細書に記載した方法を使用して同定した修飾因子の生物活性を確認するために採用して良い。このセルベ-スアッセイを、転写、幹細胞維持、幹細胞増殖、分化アッセイなどの生物学的機能について化合物の効果を確認するために使用して良い。
【０２９１】
転写に関する効果を確認するためのセルベ-スアッセイの非限定例は、細胞にＣＴＲプロモータに機能的に連結するルシフェラ-ゼのＯＲＦを含むレポ-タ-核酸コンストラクトを導入することに関わり、化合物の存在下および非存在下で細胞を培養し、および生物発光アッセイなどの当業者に良く知られている方法を使用してルシフェラ-ゼの発現量を測定する。
【０２９２】
幹細胞維持および／または増殖に関する効果を確認するためのセルベ-スアッセイの非限定例は、化合物の存在下あるいは非存在下で幹細胞を培養すること、および当業者に良く知られている方法（例えば、フロ-サイトメトリ）によって、幹細胞の増殖の割合と、同様にＳＳＥＡ-３およびＳＳＥＡ-４などの幹細胞マ-カ-とを維持した細胞の集団の割合を測定することに関わる。増殖アッセイの非限定例は、ＢｒｄＵ組み入れアッセイ、トリパンブル-排除アッセイ、およびカルボキシフルオレセンサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）アッセイを含む。
【０２９３】
幹細胞維持および／または増殖に関する効果を確認するためのセルベ-スアッセイの非限定例は、化合物の存在下あるいは非存在下で幹細胞を培養すること、およびＳＳＥＡ-３およびＳＳＥＡ-４などの幹細胞マ-カ-を維持した細胞の集団の割合と、より分化した細胞の細胞マ-カ-を獲得した細胞の割合とを測定することに関わる。幹細胞マ-カ-を損失した細胞の割合もまた測定する。例えば、幹細胞を、ある特定の期間レチノイン酸の存在下および非存在下で培養して良い、およびネスチンに陽性である細胞、分化したニュ-ロン細胞のマ-カ-は、分化した細胞を指し示している。
【０２９４】
細胞脱分化に関する効果を確認するためのセルベ-スアッセイの非限定例は、化合物の存在下あるいは非存在下で分化した細胞を培養すること、および分化した細胞に特異的なマ-カ-を維持した細胞の割合と、幹細胞の細胞マ-カ-を獲得した細胞の割合とを測定することに関わる。分化した細胞マ-カ-を損失した細胞の割合もまた測定する。
【０２９５】
細胞分化転換に関する効果を確認するためのセルベ-スアッセイの非限定例は、化合物の存在下あるいは非存在下である細胞型の細胞を培養すること、および第１の細胞型に特異的なマ-カ-の発現を損失し、かつ第２の細胞型に特異的な１個または複数のマ-カ-の発現を獲得した細胞の割合を測定する。
【０２９６】
さらに、細胞形態をも細胞型物理的特徴の徴候として測定する。望ましい細胞型の形、サイズ、または粒度を観察して良い。例えば、分化したニュ-ロンは、余り分化しなかったニュ-ロンよりより長くかつ多くの伸展を持つ。別の例として、心筋細胞は収縮またはパルスでき、この活動は観察できる。
【０２９７】
例えば、脂質、タンパク質（例えば免疫蛍光法）、ＲＮＡ（例えばＦＩＳＨ）、または特定のまたは望ましい細胞型のその他のマ-カ-を標識する染色を使って細胞を染色することが利用できるだろう。
幾つかの細胞型について、細胞の活性を測定できるであろう（例えば、抗体産生、その細胞型によって分泌された分かっているタンパク質の分泌物、または筋細胞型の拍動または収縮）。
【０２９８】
幹細胞の特定の特徴もまた、セルベ-スアッセイで測定できる。幹細胞アッセイの非限定例は、４細胞胚盤胞の創造に関わる４倍体相補性アッセイ含む。これらの４細胞胚盤胞は、胎盤などの胚外の組織に寄与できるのみであり、したがって発生することができず、しかし注入された幹細胞は、幹細胞が多能性であれば発生して生物体になることができる。例えば、本明細書に記載された１個または複数のレポ-タ-核酸コンストラクトを含む体細胞を使って、体細胞をｉＰＳ細胞にリプログラムできる化合物をスクリ-ンでき、およびそのようなｉＰＳ細胞を四倍体相補性アッセイに使ってリプログラムされた細胞の多能性を測定できる。
【０２９９】
動物モデル
異種移植動物モデルは、細胞運命／細胞型仕様の修飾因子として本明細書に記載した修飾因子／化合物の生物活性を確認するために有用である。ヒト細胞をマウスなどの動物モデルに移植することは、ヒト特異的マ-カ-の存在によってヒト移植片細胞が宿主細胞から区別できると言う優位性を持つ。
【０３００】
例えば、分化転換における修飾因子の活性を確認するために、線維芽細胞などの特異的系列のヒト細胞を、ＳＣＩＤマウスなどの動物に移植できる。ヒト細胞は移植前に本明細書に記載した化合物で前処理でき、マウスは、脊髄損傷または心筋ダメ-ジなどの苦痛疾病または状態を受けていた。代わりに、移植後マウスに本明細書に記載した化合物を投与することもできる。引き続いて、マウスを、疾病または状態に付随する１個または複数の症状の改善について観察する。その上、マウス由来の組織試料を、移植されたヒト細胞が一種の細胞型から分化転換されたかどうかを測定するヒト特異的および細胞型特異的マ-カ-のためにアッセイできる（例えば、免疫組織化学によって）。検出を容易にするために、移植されたヒト細胞はまた、細胞を生体内で検出できるように
検出可能なシグナル（例えば、ルシフェラ-ゼまたは緑色蛍光タンパク質ＧＦＰなどのレポ-タ-）を発現するように設計できる。
【０３０１】
さらなる態様において、細胞を、ＣＴＲプロモータに機能的に連結するルシフェラ-ゼまたはＧＦＰなどのレポ-タ-のＯＲＦを含む組換え型核酸コンストラクトを含むように設計でき、そして設計された細胞を動物に移植できる。動物に化合物を投与する。１つの態様において、レポ-タ-は、細胞の細胞型が変化した時（例えば、ＣＴＲプロモータは、レポ-タ-が発現しないように初期には不活性であり、さらに化合物を動物に投与後、ＣＴＲプロモータは活性化しレポ-タ-の発現を駆動する）に、生体内で発現する。
【０３０２】
動物モデルもまた、癌細胞の数を減少させる、腫瘍の大きさを減少させる、または癌の再発を防ぐなどの癌を処置する際の癌幹細胞の修飾因子の活性をテストするために使用できる。癌幹細胞の修飾因子は、癌幹細胞を分化させる上で効率的である。例えば、特定の癌が特定の薬物療法に対して抵抗性を示し、この抵抗性は処置に対する癌幹細胞の抵抗性によるものだろうと考えられる。これらの癌幹細胞は、新しい癌細胞の再興を結果として生み出すだろう。癌幹細胞を分化させることが分かった化合物は、そのような効果ついて、癌幹細胞を動物に注射すること、そして動物を、  （ｉ）動物由来の癌を根絶することを通常は生み出せない治療、（ｉｉ）化合物のみ、および／または（ｉｉｉ）の（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせ、で処置すること、によってテストするだろう。動物は次に、化合物が癌幹細胞を、例えば、それらを分化させることによって除去するかどうかを確認するために、本明細書に記載した方法によって同定された化合物で処置できる。
【０３０３】
本発明のこれらおよびその他の実施形態は、次の非限定例に更に説明されるだろう。
【０３０４】
５．実施例
【０３０５】
形質移入
【０３０６】
ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ-１１２６８）に、ルシフェラ-ゼの発現を駆動するＮＡＮＯＧ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣ００６５１７）  の５’ＵＴＲ由来のプロモータをコ-ド化するプラスミドを形質移入し、次に、プロ-ブ標的配列をシグナルする検出タグをコ-ド化する非翻訳配列を形質移入する。このカセットは、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）および伸長因子１-α（ＥＦ）プロモータのそれぞれに制御された２個の付加的非翻訳標的配列に隣接している。薬剤抵抗性マ-カ-をコ-ド化する配列もまた存在する。核酸を、リポフェクタミンを使用して宿主細胞に導入する。使用する核酸を宿主細胞に導入することができるその他の試薬の例は、限定される訳ではないが、リポフェクタミン、リポフェクタミン２０００、オリゴフェクタミン、ＴＦＸ試薬、Ｆｕｇｅｎｅ６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、メタフェクチン、またはフェクチュリンを含む。
【０３０７】
薬剤選択は本発明の方法において最適であるが、プラスミド１つに付き１個の薬剤抵抗性マ-カ-を含める。細胞は、１０〜１４日間薬剤を含む培地で選択される。
【０３０８】
細胞を蛍光発生オリゴヌクレオチドに曝露
蛍光発生オリゴヌクレオチドを、リポフェクタミンを使用して宿主細胞に導入する。核酸を宿主細胞に導入するのに使用できる試薬（蛍光発生オリゴヌクレオチドなど）の例は、限定される訳ではないが：リポフェクタミン、リポフェクタミン２０００、オリゴフェクタミン、ＴＦＸ試薬、Ｆｕｇｅｎｅ６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、メタフェクチン、またはフェクチュリン、を含む。細胞を収集し、および蛍光発生オリゴヌクレオチドを形質移入する。細胞を、解析のために解離しおよび収集する、および細胞数測定の細胞選別機を使用してソ-トする。
【０３０９】
陽性細胞の単離
標準分析用方法が、背景より上のまたは極低レベルでの蛍光を放つ細胞をゲ-ト（遮断）するために、および９６ウエルのプレ-トに直接これらの明確なゲ-トの範囲内で落ちる細胞を単離するために使われる。細胞ソ-ティングを、単細胞が物各ウエルに沈着するように駆動させる。選択後、細胞が薬剤を欠く培地内で拡張する。
【０３１０】
誘導性の確認            
結果として生じる細胞に、標準試薬使用してＯｃｔ４およびＳｏｘ２コ-ド化するプラスミドを形質移入する。４８、７２、または９６時間後、細胞を収集、溶解しかつ上清を収集する。可溶化液を生物発光の基質に曝露し、発光をプレ-トリ-ダ（Ｔｅｃａｎ）使用して測定する。
【０３１１】
本発明は、本明細書に記載された、いくつかの特定の実施形態に限定される訳ではない。実際、これらの記載されたものにさらに加えて本発明の様々な変更は、先の記述および付随する図から当業者に明らかになるであろう。そのような変更は、付加した請求項の範囲内に含まれることが意図されている。
【０３１２】
本明細書に引用された全ての参考文献は、個々の出版物または特許または特許出願が明確におよび個々に参照により全ての目的のためにその全体を取り込むと指示したのと同程度に、全ての目的のためにその全体を組み入れる。
【国際調査報告】
2013500722.tif 000010
2013500722.tif 000011
2013500722.tif 000012