(57)【要約】  処置を必要する対象に苦味物質を投与することにより、例えばぜん息及びＣＯＰＤのような閉塞性肺疾患を処置するために、気道拡張を増強し、かつ／又は気道収縮を軽減するための方法が本明細書に記載される。また、苦味物質受容体の機能を調節する化合物を同定する方法も本明細書に記載される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与し、それにより対象における閉塞性肺疾患を処置することを含む、対象における閉塞性肺疾患又は状態を処置する方法。
【請求項２】
閉塞性肺疾患又は状態が、ぜん息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫又は気管支炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
苦味物質が、アリストコール酸、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンからなる群より選択される化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
医薬組成物が吸入剤の形態にある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与し、それにより対象におけるぜん息を処置することを含む、対象におけるぜん息を処置する方法。
【請求項７】
苦味物質が、アリストコール酸、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンからなる群より選択される化合物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
医薬組成物が吸入剤の形態にある、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
対象がヒトである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与し、それにより対象におけるＣＯＰＤを処置することを含む、対象におけるＣＯＰＤを処置する方法。
【請求項１１】
苦味物質が、アリストコール酸、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンからなる群より選択される化合物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
医薬組成物が吸入剤の形態にある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
対象がヒトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与し、それにより対象における気管支炎を処置することを含む、対象における気管支炎を処置する方法。
【請求項１５】
苦味物質が、アリストコール酸、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンからなる群より選択される化合物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
医薬組成物が吸入剤の形態にある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
対象がヒトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気管支拡張を必要とする対象に投与し、それにより対象における気管支拡張を誘発することを含む、対象における気管支拡張を誘導する方法。
【請求項１９】
苦味物質が、アリストコール酸、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンからなる群より選択される化合物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
医薬組成物が吸入剤の形態にある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
対象がヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気道平滑筋（ＡＳＭ）弛緩を必要とする対象に投与し、それにより対象における気道平滑筋を弛緩させることを含む、対象における気道平滑筋を弛緩させる方法。
【請求項２３】
苦味物質が、アリストコール酸、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンからなる群より選択される化合物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
医薬組成物が吸入剤の形態にある、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
対象がヒトである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
対象における気管支収縮又は気管支痙攣を処置又は予防する方法であって、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、該処置又は予防を必要とする対象に投与し、それにより気管支収縮又は気管支痙攣を処置又は予防することを含む、上記方法。
【請求項２７】
苦味物質が、アリストコール酸、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンからなる群より選択される化合物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
医薬組成物が吸入剤の形態にある、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
対象がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
気道平滑筋細胞を、苦味物質受容体に結合する試験化合物と接触させる工程、及び試験化合物が気道平滑筋細胞を弛緩させるか否かを決定する工程を含み、ここで平滑筋細胞を弛緩させる化合物は気道平滑筋を弛緩させるための化合物として同定される、気道平滑筋を弛緩させるための化合物を同定する方法。
【請求項３１】
気道平滑筋細胞の弛緩が、気道平滑筋細胞における苦味物質受容体仲介シグナル伝達の増加を検出することにより検出される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
苦味物質受容体仲介シグナル伝達の増加が、気道平滑筋細胞における細胞内カルシウム放出の増加又は細胞内ＩＰ３の増加を検出することにより検出される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
苦味受容体の調節剤を同定するための方法であって：
（ａ）苦味受容体を天然で発現する気道細胞を試験化合物と接触させる工程、及び
（ｂ）苦味受容体の活性を測定する工程
を含み、
ここで苦味受容体の活性を増加させる化合物は苦味受容体のアゴニストであり、そして苦味受容体の活性を減少させる化合物は苦味受容体のアンタゴニストである、上記方法。
【請求項３４】
苦味物質受容体の活性の変化が、試験化合物と接触していない気道平滑筋細胞と比較した、気道平滑筋細胞における細胞内カルシウム放出の変化又は細胞内ＩＰ３の変化により検出される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
苦味受容体のアンタゴニストである化合物を同定する方法であって：
（ａ）苦味受容体を天然で発現する気道細胞を、試験化合物と、そして苦味物質と接触させる工程、及び
（ｂ）苦味受容体の活性を測定する工程
を含み、
ここで苦味物質と接触したが試験化合物とは接触していない細胞における苦味受容体の活性と比較して、苦味受容体の活性を阻害する試験化合物を苦味受容体のアンタゴニストと同定する、上記方法。
【請求項３６】
苦味受容体の活性が、細胞内カルシウム放出の変化又は細胞内ＩＰ３の変化を測定することにより測定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
試験化合物が、苦味物質の前に、後に、又は苦味物質と同時に加えられる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
気道細胞が気道平滑筋細胞又は非線毛気道上皮細胞である、請求項３３又は３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究の陳述
本発明は、国立衛生研究所に認められた助成番号ＨＬ０４５９６７及びＨＬ０７１６０９で政府支援を受けて行われた。政府は本発明に所定の権利を有する。
【０００２】
分野
気道平滑筋細胞の表面上に発現された苦味物質受容体に結合する化合物を投与することにより、例えば閉塞性肺疾患を処置するために、気道拡張を増加させ、かつ／又は気道収縮を減少させるための方法が本明細書において提供される。また、苦味物質受容体の機能を調節する化合物を同定する方法も本明細書において提供される。
【背景技術】
【０００３】
背景
世界中で３億人の個体がぜん息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に同時に罹患している。両方の疾患に由来する罹患率及び死亡率の主な原因は気道閉塞であり、これはしばしば、気管支／気管支樹の活発に収縮した平滑筋に起因する（非特許文献１）。ＣＯＰＤにおける気道抵抗は喫煙に由来する構造的変化に起因して変動する程度の可逆性を有するが、ＣＯＰＤ及びぜん息の治療は両方とも気管支収縮性受容体に特異的なアンタゴニスト及び気道平滑筋（ＡＳＭ）を弛緩させる受容体に特異的なアゴニストを含む（非特許文献２、３）。
【０００４】
収縮及び弛緩を調節するＡＳＭの主要な受容体シグナル伝達ファミリーはＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である（非特許文献３）。気道緊張の調節をもたらすＧＰＣＲ経路を同定し、それによりぜん息及びＣＯＰＤについての新しい処置方策を提供するための努力が続けられている。両方の疾患の発生数が増えつつあり、そして少なくとも全ての患者の二分の一は現在利用可能な薬剤では十分に制御されていないので、このような努力が必要とされている（非特許文献４、５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Vignola, A.M., Bonsignore, G., Chanez, P. & Bousquet, J. Fatal Asthma 139-155 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1998)
【非特許文献２】Billington, C.K. & Penn, R.B. Signaling and regulation of G protein-coupled receptors in airway smooth muscle. Respir. Res. 4, 2-24 (2003).
【非特許文献３】Green, S.A. & Liggett, S.B. The Genetics of Asthma 67-90 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1996)
【非特許文献４】Drazen, J.M., Silverman, E.K. & Lee, T.H. Heterogeneity of therapeutic responses in asthma. Br. Med. Bull. 56, 1054-1070 (2000).
【非特許文献５】Malmstrom, K. et al. Oral montelukast, inhaled beclomethasone, and placebo for chronic asthma. A randomized, controlled trial. Montelukast/Beclomethasone Study Group. Ann. Intern. Med. 130, 487-495 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ぜん息及びＣＯＰＤのような閉塞性気道疾患の処置におけるさらなる治療選択肢に対する満たされていない必要性が存在する。特定のＧq−共役経路を拮抗し、それにより気管支痙攣を減少させる可能性のある薬物の改善においていくらかの進展があったが、β−アゴニストが依然として唯一の実用的な直接的気管支拡張薬である。ぜん息及びＣＯＰＤのような閉塞性肺疾患を処置するための新しい手段の発見及び開発が緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
第一の局面において、対象（subject）における閉塞性肺疾患又は状態を処置する方法が本明細書において提供され、この方法は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む。特定の局面において、閉塞性肺疾患又は状態は、例えばぜん息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫又は気管支炎であり得る。
【０００８】
第二の局面において、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気管支拡張を必要とする対象に投与することを含む、対象における気管支拡張を誘発する方法が本発明において提供される。
【０００９】
第三の局面において、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気道平滑筋（ＡＳＭ）弛緩を必要とする対象に投与することを含む、対象における気道平滑筋を弛緩させる方法が本明細書において提供される。
【００１０】
第四の局面において、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気管支収縮又は気管支痙攣の処置又は予防を必要とする対象に投与することを含む、気管支収縮又は気管支痙攣を対象における処置又は予防する方法が本明細書において提供される。
【００１１】
上記の方法の特定の局面において、苦味物質は、アリストコール酸（ａｒｉｓｔｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビンのような化合物であり得る。上記の方法のさらに他の局面において、医薬組成物は吸入剤又は他の送達方法、例えば経口送達の形態であり得、そして対象はヒトでも他の動物でもよい。
【００１２】
第五の局面において、気道平滑筋細胞を、苦味物質受容体に結合する試験化合物と接触させること、及び試験化合物が気道平滑筋細胞を弛緩させるか否かを決定することを含み、ここで平滑筋細胞を弛緩させる化合物は気道平滑筋を弛緩させるための化合物として同定される、気道平滑筋を弛緩させるための化合物を同定する方法が本明細書において提供される。例えば、気道平滑筋細胞の弛緩は、気道平滑筋細胞における苦味物質受容体仲介シグナル伝達の増加を、例えば気道平滑筋細胞における細胞内カルシウム放出の増加又は細胞内ＩＰ３の増加を検出することにより検出され得る。
【００１３】
第六の局面において、苦味物質受容体の調節剤を同定するための方法が本明細書において提供され、この方法は、苦味受容体を天然で発現する気道細胞を試験化合物と接触させること、及び苦味受容体の活性を測定することを含み、ここで苦味受容体の活性を増加させる化合物は苦味受容体のアゴニストであり、そして苦味受容体の活性を減少させる化合物は苦味受容体のアンタゴニストである。例えば、苦味物質受容体の活性の変化は、試験化合物と接触していない気道平滑筋細胞と比較して、気道平滑筋細胞における細胞内カルシウム放出の変化又は細胞内ＩＰ３の変化により検出される。
【００１４】
第七の局面において、苦味受容体のアンタゴニストである化合物を同定する方法が本明細書において提供され、この方法は、苦味受容体を天然で発現する気道細胞を、試験化合物と、かつ苦味物質と接触させること、及び苦味受容体の活性を測定することを含み、ここで苦味物質と接触したが試験化合物とは接触していない細胞における苦味受容体の活性と比較して、苦味受容体の活性を阻害する試験化合物を苦味受容体のアンタゴニストと同定する。例えば、苦味受容体の活性は、細胞内カルシウム放出の変化又は細胞内ＩＰ３の変化を測定することにより測定される。試験化合物は、苦味物質の前に、後に、又は苦味物質と同時に加えられ得る。
【００１５】
本明細書において記載されるスクリーニング方法において、気道細胞は気道平滑筋細胞でも非線毛気道上皮細胞でもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】多様な構造の苦味物質がヒト気道平滑筋細胞において［Ｃａ2+］iの増加を惹起する。培養初代ＡＳＭ細胞にＦｌｕｏ−４  ＡＭをロードして研究を行った。（ａ，ｂ）５〜６回の実験からのサッカリン及びクロロキンに対する一過性［Ｃａ2+］i上昇及び用量応答曲線、（ｃ）１．０ｍＭの苦味物質（アリストコール酸、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビン）、気管支収縮性Ｇq−共役アゴニストヒスタミン（０．１ｍＭ）、及びブラジキニン（０．０１ｍＭ）、並びに１．０ｍＭの甘味物質スクラロース（ｓｕｃｒａｌｒｏｓｅ）及びＳＣ４５６４７に対する最大［Ｃａ2+］i応答。結果は４〜６回の実験からのものである。＊，基礎に対してＰ＜０．０１；＃，デナトニウムに対してＰ＜０．０５。（ｄ）［Ｃａ2+］i応答はＰＬＣ阻害剤Ｕ７３１２２及びβγアンタゴニスト  ガレインにより除去され、そしてＩＰ3受容体アンタゴニスト２ＡＰＢにより減衰する。これらの研究を細胞外カルシウムを存在させずに行った。示される結果は少なくとも３回行われたうちの１つの代表的な実験からのものである。
【図２】免疫細胞学によるヒト気道平滑筋細胞での苦味受容体及び他のタンパク質の発現。細胞切片を他所31に記載される標準的な方法により処理し、そして抗血清を、示されたタンパク質を同定するために利用した。抗血清はＴ２Ｒ１０、４４、及び７、ガストデューシン及びＢＫCaに対して特異的なものであった。そのｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲにより十分豊富に見出されたＴ２Ｒ１０及びＴ２Ｒ４４のタンパク質発現（表２を参照のこと）を、ヒトＡＳＭで赤いシグナルとして検出し、一方でそのｍＲＮＡが検出されなかったＴ２Ｒ７はシグナルを示さなかった。２行目のネガティブコントロールは、抗血清が存在しない場合のバックグラウンドシグナルを表す。核をＤＡＰＩ蛍光からの青色により同定した。ガストデューシン及びＢＫCaタンパク質も示されるように同定した。（結果は３回の実験の代表であり、実験あたり＞１００個の細胞を撮像した、倍率６０Ｘ。）
【図３】ＡＳＭ細胞のポリクローナルＴ２Ｒ１０抗血清とのインキュベーションによるＴ２Ｒ１０の遮断は、ストリキニーネ促進［Ｃａ2+］i増加を阻害する。細胞を２時間、示された力価（１：２００〜１：２５）のＴ２Ｒ１０及びＴ２Ｒ７抗血清、１：５０力価のアイソタイプ特異的ＩｇＧ、又は培地のみ（コントロール）とともにインキュベートした。［Ｃａ2+］iをＴ２Ｒ１０アゴニストストリキニーネ（１ｍＭ）により刺激した。Ｔ２Ｒ１０抗血清はストリキニーネ促進［Ｃａ2+］i増加を減少させた。ＩｇＧもＴ２Ｒ７に対する抗血清（ＡＳＭにおいて発現されない）も、［Ｃａ2+］i刺激に対して有意な効果を有していなかった。＊，コントロールに対してＰ＜０．０１。
【図４】苦味物質は非ｃＡＭＰ依存性様式で気管支拡張を惹起する。（ａ）β−アゴニストイソプロテレノール（ｉｓｏ）並びに苦味受容体アゴニストのクロロキン（ｃｈｌｏｒｏ）、デナトニウム（ｄｅｎａｔ）、及びキニーネについての弛緩の用量−応答曲線（１．０ｍＭアセチルコリンを用いて収縮したインタクトなマウス気管から誘導された）（ｎ＝７回の実験）。（ｂ）クロロキン及びキニーネは、１．０ｍＭのセロトニンにより収縮したインタクトなマウス気管を弛緩させる（ｎ＝４回の実験）。（ｃ）培養ヒトＡＳＭ細胞を１．０ｍＭクロロキンと共に示された時間、又は３０μＭイソプロテレノールと共に１５分間インキュベートし、そしてｃＡＭＰをラジオイムノアッセイにより測定した。クロロキンにより促進されたｃＡＭＰ蓄積の証拠はなかった（ｎ＝３回の実験）。挿入図：培養ヒトＡＳＭ細胞を１．０ｍＭのクロロキン若しくはサッカリン（ｓａｃｃ）、又は１０μＭのフォルスコリン（ｆｏｒｓｋ）に曝露し、そして細胞抽出物を免疫ブロットして、ｃＡＭＰ促進事象であるＰＫＡ媒介ＶＡＳＰリン酸化を確認した（上のバンド）。ｃＡＭＰ産生を刺激するフォルスコリンは、上のバンドにより示されるようにＶＡＳＰのリン酸化を生じた。クロロキンもサッカリンもＶＡＳＰリン酸化を促進せず、ｃＡＭＰ測定と一致していた。（ｄ）イソプロテレノール及びクロロキンに対する気道弛緩応答は相加的である。インタクトなマウス気管を１．０ｍＭ  アセチルコリン（ａｃｈ）を用いて収縮させ、これをクロロキン（２００μＭ）又はイソプロテレノール（３０μＭ）、又は両方の薬物を加えた場合に浴中で維持した。クロロキン曝露の後、軟骨輪（ｒｉｎｇｓ）を洗浄し、次いで同じ用量のアセチルコリンで再誘発した。＊，アセチルコリン単独に対してＰ＜０．０５；＃，アセチルコリン＋イソプロテレノール、又はクロロキン単独に対してＰ＜０．０１。結果は４回の実験からのものである。
【図５】苦味物質はベースライン気道張力を弛緩させる。マウス気管軟骨輪を約５ｍＮの静止張力（ｐａｓｓｉｖｅ  ｔｅｎｓｉｏｎ）に配置して１．０ｍＭのクロロキン、デナトニウム、又はキニーネに曝露した。結果は４回の実験からのものである。＊，ベースラインに対してＰ＜０．０５。
【図６】苦味物質はヒト気道平滑筋を弛緩させる。外科標本から得た肉眼で見て正常な肺組織に由来する第四世代気管支からの軟骨輪を実施例に記載されるように取り付けた。軟骨輪を５ｍＮの静止張力に設定し、１．０ｍＭアセチルコリンを用いて連続的に収縮させ、次いで１ｍＭのクロロキン若しくはサッカリン、又は１０μＭのイソプロテレノールに曝露した。３個体からの６つの軟骨輪を用いて行われた個々の実験からの結果を示す。
【図７】単離された気道平滑筋は、単細胞力学により評価して、苦味物質に応答する。（ａ）イソプロテレノール（Ｉｓｏ）、クロロキン（Ｃｈｌｏｒｏ）及びサッカリン（Ｓａｃｃ）は単離されたＡＳＭ細胞を弛緩させるがヒスタミン（Ｈｉｓｔ）は収縮させる。（ｂ）単離されたＡＳＭ細胞における１ｍＭサッカリンに対する弛緩応答は、ＰＬＣβ阻害剤Ｕ７３１２２（１μＭ）、１００ｎＭのＢＫCaアンタゴニスト  イベリオトキシン（ＩｂＴｘ）及びカリブドトキシン（ＣｈＴｘ）により阻害されるが、１００ｎＭのＰＫＡ阻害剤Ｈ８９により影響を受けない。（ｃ）単離されたマウス気道における１ｍＭ  Ｃｈｌｏｒｏに対する弛緩応答は１００ｎＭ  ＩｂＴｘにより阻害される。結果は行われた５〜８回の実験の代表である。
【図８】タプシガルジンによるＳＲカルシウムの枯渇は、ヒトＡＳＭ細胞における［Ｃａ2+］iの苦味物質刺激を除去する。細胞を担体（コントロール）又は１０μＭタプシガルジンで３０分間処理し、そして苦味物質媒介［Ｃａ2+］i放出を実施例に記載されるように測定した。ＳＲ貯蔵に由来する［Ｃａ2+］iの増加も刺激するＧq−共役受容体リガンド  ブラジキニン及びヒスタミンをコントロールとして使用した。全てのアゴニストに対する［Ｃａ2+］i応答はタプシガルジン処理により除去された。４回行われたものの代表の単一の実験からのトレースを示す。
【図９】タプシガルジンによるＳＲカルシウムの枯渇は、インタクトなマウス気管軟骨輪のクロロキン媒介弛緩を除去する。軟骨輪を約５ｍＮの静止張力に配置して、示されるように１０μＭタプシガルジンと共にプレインキュベートせずに、又はプレインキュベートして担体、クロロキン（３．０ｍＭ）、又はアセチルコリン（１．０ｍＭ）に曝露した。白いバーはそれぞれタプシガルジンが存在しない場合又は存在下での洗浄後のベースライン張力を示す。結果は４回の実験からのものである。＊，対を成すベースライン張力に対してＰ＜０．０１。
【図１０】苦味物質は、イベリオトキシンに対して感受性であるＡＳＭ細胞において膜過分極を惹起する。細胞に、記載されるような19蛍光ベースの膜電位感受性色素をロードし、そして実施例に記載されるように示された薬剤を加えた後にデータを取得した（一番上のトレース＝ＫＣｌ；上から二番目のトレース＝ｈｉｓｔ；一番下のトレース＝ｃｈｌｏｒｏ；下から二番目のトレース＝ｓａｃｃ）。蛍光の増加は脱分極を示し、減少は過分極を示す。ａ）６０ｍＭ  ＫＣｌ及び１．０μＭヒスタミンへの曝露は予期された脱分極を生じた。苦味物質サッカリン及びクロロキン（１ｍＭ）は過分極を惹起した。結果は４回行われたうちの単一の実験からのものである。ｂ）１００ｎＭの特異的ＢＫCaチャネルアンタゴニスト  イベリオトキシン（ＩｂＴＸ）とのプレインキュベーションは、両方の苦味物質からの膜過分極を阻害した。結果は４回の実験からのピーク応答を表す。＊，ビヒクルコントロールに対してＰ＜０．０１。
【図１１】サッカリンはＡＳＭ細胞において局所的［Ｃａ2+］i応答を優先的に引き起こす。（ａ，ｃ）Ｆｌｕｏ−３をロードした細胞の連続的共焦点像は、０．３ｍＭサッカリンへのＡＳＭ細胞の曝露の際の細胞周辺における局所的［Ｃａ2+］i増加の活性化を示し、そして１．０μＭヒスタミンへの曝露では［Ｃａ2+］iの全体的な増加を示す。画像はバックグラウンドを差し引いた後のＦｌｕｏ−３蛍光であり、そしてベースラインは疑似カラーにより符号化された強度で正規化されている（Ｆ／Ｆ0）。矢印は局所［Ｃａ2+］i「ホットスポット」を強調している。（ｂ，ｄ）局所的一過性［Ｃａ2+］i上昇を関心領域（ＲＯＩ）において測定した。サッカリンは末梢端（ＲＯＩ  １）において急速なＣａ2+上昇を活性化したが、細胞の中心部（ＲＯＩ  ２，３）ではより小さく穏やかな［Ｃａ2+］i増加であった。ヒスタミン応答（ＲＯＩ  ４−７）は非同期的であり、そして細胞全体を通して観察された。（ｅ）共焦点ラインスキャン画像化は、末梢部位においてサッカリンにより活性化された空間時間分解局所［Ｃａ2+］i事象を示す。走査線（白い破線）を、左のパネルに示されるように細長いＡＳＭ細胞の一端で細胞膜に対して平行に１μｍ以内に配置した。矢印は、分離した領域内のより明確な増加の前に生じるいくつかの局所的［Ｃａ2+］i事象を示す。一番下のパネルはラインスキャンから生じた空間的に平均した正規化蛍光シグナル（Ｆ／Ｆ0）である。結果は５回行われたうちの１つの代表的な実験である。画像を構築するために利用したデータ取得数については方法を参照のこと。
【図１２】苦味受容体アゴニストはぜん息のマウスモデルにおいて気管支収縮を軽減する。（ａ，ｂ）  コントロール及びオボアルブミン負荷マウス肺の切片からの顕微鏡写真は、オボアルブミン負荷気道における気道の好酸球性炎症、上皮肥厚及び及び基底膜肥厚を示す（ヘマトキシリン及びエオシン染色、倍率４０Ｘ）。Ｂｒ，気管支；Ｂｍ，基底膜；Ｅｏ，好酸球；Ｅｐ，上皮；Ｂｌ，血管。コントロール（ｃ）及びオボアルブミン負荷マウス（ｄ）における気道抵抗をベースラインで測定し、そして気管支収縮期の間に与えられたエアロゾル化メタコリン（ｍｃｈ）、キニーネ又はβ−アゴニスト  アルブテロールに応じて測定した（ｎ＝５回の実験）。＊，メタコリンに対してＰ＜０．０１；＃，メタコリンに対してＰ＜０．０５。
【図１３】ヒト気道平滑筋細胞を使用した、様々な用量の公知の苦味受容体アゴニストクロロキンに対するヒト気道平滑筋細胞における一過性［Ｃａ2+］i上昇。
【図１４】ヒト気道平滑筋細胞を使用した、クロロキン（公知の苦味受容体アゴニスト）についての用量−応答曲線。効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を７０マイクロモル濃度と算出した。有効性（ｅｆｆｉｃａｃｙ）を８４，３１７蛍光単位の純変化と算出した。
【図１５】固定濃度（１ｍＭ）の各化合物を使用したヒト気道平滑筋細胞における［Ｃａ2+］i刺激についての苦味受容体アゴニストのスクリーニング。
【図１６】様々な用量の公知の苦味受容体アゴニスト  キニーネに対するＨ２９２細胞における一過性［Ｃａ2+］i上昇。キニーネの用量を凡例と逆の順序で示す。すなわち、５０秒における最低のトレースが１００ｍＵであり、次の上のトレースが５００ｕＭであり、以後そのようにして５０秒における一番上のトレースは２．５ｍＭである。
【図１７】Ｈ２９２細胞を使用したキニーネ（公知の苦味受容体アゴニスト）についての［Ｃａ2+］i−刺激用量−応答曲線。効力を７０３マイクロモル濃度と算出し、そして、有効性を１３３，２０１蛍光単位と算出した。
【図１８】Ｈ２９２細胞を使用したクロロキン（公知の苦味受容体アゴニスト）についての［Ｃａ2+］i−刺激用量−応答曲線。効力を７４マイクロモル濃度と算出し、そして有効性を３７，１３６蛍光単位と算出した。
【図１９】様々な用量の公知の苦味受容体アゴニスト  クロロキンに対するＢＥＡＳ２Ｂ細胞における一過性［Ｃａ2+］i上昇。
【図２０】ＢＥＡＳ２Ｂ細胞を使用したクロロキン（公知の苦味受容体アゴニスト）に対する［Ｃａ2+］i−刺激用量−応答曲線。効力を９０マイクロモル濃度と算出し、そして有効性を１３，９９５蛍光単位と算出した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
例えばぜん息及びＣＯＰＤのような閉塞性肺疾患を処置するための、気道拡張を増加させる新規な方法が本明細書において提供される。本発明の処置方法は、苦味受容体が単離されたヒト気道平滑筋（ＡＳＭ）において発現されるという予期しない発見に基づく。舌上の苦味の受容体は植物ベースの毒素を回避するために発達したと考えられている9,10。これらの受容体はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であり、少なくとも２５の受容体サブタイプからなり、通常は他の苦味受容体と重複するアゴニストのレパートリーをそれぞれが認識して、重複した広く同調した回避及び拒絶のネットワークを作っている9,11,13。ＡＳＭ上の苦味受容体の発見により、本発明者らは、これらの気道受容体における環境性吸入抗原の作用が痙縮及び気管支収縮をもたらすことにより、特定の気管支痙攣性障害、例えば職業性ぜん息14が引き起こされるのかもしれないという仮説を最初に立てることとなった。この考えは、苦味受容体が舌の分化した味覚細胞における［Ｃａ2+］iの増加と対になっており、かつこのシグナルがＡＳＭ細胞におけるヒスタミン、アセチルコリン及びブラジキニンのような公知の気管支収縮性ＧＰＣＲでも見られる2という事実に基づくものであった。本明細書に開示される様々なアプローチを使用して、苦味物質がＡＳＭ細胞において［Ｃａ2+］iを増加させることも見出された。しかし逆説的に、本発明者らは、苦味受容体アゴニストが気管支拡張剤であり、いずれの公知の治療剤よりも有意に高い有効性を有するということを発見した。これらの受容体は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の受容体生成Ｇβγ活性化、及び細胞表面Ｋ＋チャネルを開いて膜過分極を生じる分割された一過性［Ｃａ2+］i上昇を含む新規な機構によりＡＳＭにおける弛緩応答を変換する。以下の実施例において詳細に考察されるこれらの知見は、本明細書において特許請求される本発明の基礎である。
【００１８】
本発明の様々な局面において、苦味物質が気道平滑筋の弛緩及び気管支拡張を誘発するということ、並びに苦味物質の対象への投与が気管支収縮に関連する状態及び疾患を処置するために使用され得るという新しい知見に基づく処置方法が提供される。従って、一局面において本発明は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む、対象における閉塞性肺疾患又は状態を処置する方法を提供する。第二の局面において、本発明は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気管支拡張を必要とする対象に投与することを含む、対象における気管支拡張を誘発する方法を提供する。第三の局面において、本発明は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気道平滑筋（ＡＳＭ）弛緩を必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＡＳＭを弛緩させる方法を提供する。第四の局面において、本発明は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、気管支収縮又は気管支痙攣の処置又は予防を必要とする対象に投与することを含む、対象における気管支収縮又は気管支痙攣を処置又は予防する方法を提供する。関連する局面において、本発明は、気道平滑筋を弛緩させるための化合物を同定する方法を提供し、この方法は、気道平滑筋細胞を、苦味物質受容体に結合する試験化合物と接触させること、及び試験化合物が気道平滑筋細胞を弛緩させるか否かを決定することを含み、ここで平滑筋細胞を弛緩させる化合物は気道平滑筋を弛緩させるための化合物として同定される。
【００１９】
上記の本発明の局面の各々において、苦味物質（ＢＴ）のアイデンティティは方法の成功に決定的ではないが、特定のＢＴが特定の方法において、かつ特定の状態及び疾患の処置において、他のＢＴよりも有効だろうということは想定される。非毒性であり、苦味受容体を活性化する多くの公知の合成薬剤がある10。そして好ましい治療プロフィールを有し得る多くの植物由来苦味物質及びそれらの代謝産物が存在する10。「苦味受容体」、「苦味物質受容体」及び同類のものは、当該分野で知られているように、かつ／又は例えばＣｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １００：７０３−７１１（２０００）；Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １００：６９３−７０２（２０００）；Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：２８８−２９４（２００６）；若しくはＣｏｎｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．９８：４５−５３（２００２）において記載されるように、Ｔ２Ｒ又はＴＡＳ２Ｒ受容体を意味する。「苦味物質」は、合成でも天然に存在するものでも、気道平滑筋細胞の表面上に存在する苦味物質受容体に結合し、そしてそのような結合を介して、気道平滑筋細胞を弛緩させる化合物を意味し；このような化合物はいずれも、本明細書に記載される方法における使用のための苦味物質として考慮される。本発明の医薬組成物及び方法において使用され得る苦味物質の例としては、限定されないが、以下の１つ又はそれ以上が挙げられる：アリストコール酸（ａｒｉｓｔｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、クロロキン、コルヒチン、デナトニウム、キニーネ、サッカリン、サリシン、ストリキニーネ及びヨヒンビン。
【００２０】
このような苦味物質は１つ又はそれ以上の苦味受容体の「アゴニスト」であり、そしてこのような上記（ｓｕｃｈ  ｓｕｃｈ）アゴニストのそれらの同族苦味受容体への結合は、本明細書に記載されるような周知の方法により検出され得る。苦味受容体「アンタゴニスト」は、アゴニストの苦味受容体への結合を阻害し、かつ／又はそうでなければ苦味受容体アゴニストのそれらの同族受容体への結合により開始される生化学的シグナル伝達カスケードを阻害する。結合の減少及び／又は苦味受容体シグナル伝達の阻害は部分的でも完全でもよい。従って苦味アンタゴニストは、食料品、医薬品、及び他の経口摂取製品における苦味を部分的に又は完全に減少させ得るか又はマスクし得る。
【００２１】
本発明により包含される閉塞性肺疾患及び状態は、急性でも慢性でも、対象の肺中へ、かつ／又は肺からの気流の欠陥を特徴とする呼吸器の状態又は疾患を含む。閉塞性肺疾患及び状態としては、例えばぜん息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫及び気管支炎に加えて、嚢胞性線維症、気管支拡張症、細気管支炎、及びアレルギー性気管支肺アスペルギルス症が挙げられる。本明細書に記載されるよに苦味物質を投与することにより処置又は予防され得る別のこのような閉塞性肺疾患又は状態としては、例えば喫煙又は腐食性化学物質のような有害化合物の吸入により；呼吸器感染症により；又は敗血症、若しくは食物（例えば落花生）、薬物（例えばペニシリン）、昆虫の刺創若しくは咬傷、花粉、カビ、イエダニ、ラテックス若しくは他の物質に対するアレルギー反応により引き起こされるようなアナフィラキシーにより；又は気管支収縮若しくは気管支痙攣の他の要因により引き起こされ得る気管支収縮又は気管支痙攣が挙げられる。例えば苦味物質は、運動又は大気汚染により誘発される気管支痙攣を予防（又は処置）するために投与され得る。別の例において、苦味物質は呼吸管の配置により誘発される気管支痙攣を予防（又は処置）するために管の配置前又は配置中に投与され得る。本発明の苦味物質は、例えば低酸素環境（例えば海抜数千フィート）における酸素摂取量を改善するため、又は運動能力を改善するために、気管支拡張を増加させることが望ましいかもしれない状況において、健常個体に投与され得る。
【００２２】
本発明の実施態様の各々において、処置を受ける対象はヒト又は非ヒト動物、例えば非ヒト霊長類、鳥類、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、コンパニオンアニマル、例えばイヌ、ネコ若しくは齧歯類、又は他の哺乳動物である。いくつかの実施態様において、対象はヒトである。
【００２３】
苦味物質を含む本発明の医薬組成物は、苦味物質のアイデンティティによって、１つ又はそれ以上の担体、希釈剤及び添加剤（例えば、薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は添加剤）を含んでいてもよい。「薬学的に許容しうる」は、生物学的にも他の点でも有害でない物質、すなわち、有害な生物学的影響を引き起こすことも、それが含まれる医薬組成物のいずれの構成要素とも有害な様式で相互作用することもなく、苦味物質とともに個体に投与され得る物質を意味する。このような組成物を対象に投与するための適切な製剤又は組成物を提供するために従来の薬務が使用され得る。これらの用語は、細胞培地を具体的に除外する。適切な希釈剤（乾燥及び液状の医薬製剤の両方について）は当業者に周知であり、そしてこれらとしては、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース（例えば水中５％デキストロース）、水、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ−８０TM）、ポリ（エチレン）グリコール３００及び４００（ＰＥＧ３００及び４００）、ＰＥＧ化ヒマシ油（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ）、ポロキサマー４０７及び１８８、シクロデキストリン又はシクロデキストリン誘導体（ＨＰＣＤ  （（２−ヒドロキシプロピル）−シクロデキストリン）及び（２−ヒドロキシエチル）−シクロデキストリンを含む；例えば米国特許出願公開２００６０１９４７１７号を参照のこと）が挙げられる。
【００２４】
担体は、医薬製剤の文脈において、活性成分の対象への送達を改善及び／又び延長する化合物及び物質である。担体は、制御放出技術を使用して、薬物のインビボでの活性を延長させるか又は対象における薬物の放出を遅らせるために役立ち得る。担体はまた、対象における薬物代謝を減少させ得、かつ／又は薬物の毒性を低減し得る。担体はまた、薬物の送達が対象における特定の細胞又は組織を対象にするために使用され得る。一般的な担体（親水性担体及び疎水性担体の両方）としては、脂肪エマルジョン、脂質、ＰＥＧ化リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｄｓ）、リポソーム及びリポスフェア（ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅｓ）、ミクロスフェア（生分解性ポリマー又はアルブミンで作られているものを含む）、ポリマーマトリックス、生体適合性ポリマー、タンパク質−ＤＮＡ複合体、タンパク質複合体、赤血球、小胞及び粒子が挙げられる。
【００２５】
医薬組成物に含められる添加剤は、例えば薬物の性質、及び投与様式によって異なる目的を有する。一般的に使用される添加剤の例としては、限定することなく、以下が挙げられる：安定化剤、可溶化剤、及び界面活性剤、緩衝剤及び保存料、等張化剤、増量剤、滑沢剤（例えばタルク又はシリカ、及び脂肪、例えば植物ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、又はステアリン酸）、乳化剤、懸濁化剤又は粘性剤、不活性希釈剤、フィラー（例えばセルロース、第二リン酸カルシウム、植物脂肪及び油脂、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、及びステアリン酸マグネシウム）、崩壊剤（例えば架橋ポリビニルピロリドン、グリコール酸ナトリウムデンプン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース又は変性セルロース、例えば微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、糖類、例えばスクロース及びラクトース、又は糖アルコール、例えばキシリトール、ソルビトール若しくはマルチトール、ポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコール）、湿潤剤、抗菌剤、キレート剤、コーティング（例えばセルロースフィルムコーティング、合成ポリマー、シェラック、トウモロコシタンパク質ゼイン又は他の多糖類、及びゼラチン）、保存料（ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、レチニルパルミテート、及びセレン、システイン、メチオニン、クエン酸及びクエン酸ナトリウム、並びにメチルパラベン及びプロピルパラベンを含む合成保存料）、甘味料、芳香剤、矯味矯臭剤、着色剤、投与補助剤、並びにそれらの組み合わせ。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、鼻腔吸入でも頬側吸入でも、肺投与のために製剤化され得る。医薬組成物の単位投薬量は、加圧パック若しくはネブライザからのエアロゾルスプレーの形態で、又は気化器を介して都合よく送達され得る。医薬組成物は製剤化散剤として送達されてもよく、そして散剤組成物はガス注入粉末吸入器デバイスを用いて吸入され得る。吸入のための送達システムの一例は  定量吸入（ＭＤＩ）エアロゾルであり、これは本発明の医薬組成物の、適切な噴霧剤（例えばＨＦＡ−１３４ａ  （１，１，１，２−テトラフルオロエタン）を含むフルオロカーボン又は炭化水素中の乾燥懸濁剤又は湿性液剤として製剤化され得る。噴霧剤は、１つ又はそれ以上の安定化添加剤、例えばエタノール及びオレイン酸も含み得る。さらに、いずれの他の適切な投与経路も使用され得、例えば、限定されないが、静脈内、非経口、口腔粘膜経由（ｔｒａｎｓｂｕｃｃａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下、鼻腔内、エアロゾル、又は経口投与である。治療用製剤はは液状の液剤形態でも懸濁剤形態でもよく；例えば、経口投与については、製剤は錠剤又はカプセル剤の形態であり得；鼻腔内製剤については、散剤、点鼻薬、又はエアロゾルの形態；経皮製剤については、クリーム剤、又は皮膚に適用するためのパッチ上に広げられた形態でであり得る。
【００２７】
医薬製剤中の苦味物質の有効量は、使用される苦味物質及び並びに処置される状態又は疾患、さらには対象の年齢及び他に摂取される薬剤のような因子によって変わる。有効投薬量は、典型的には当該分野で周知であるように担当医によって設定されるだろう。しかし単位用量で対象に送達される苦味物質の濃度は、一般的には約０．０５ｍｇから約１００ｍｇの範囲に及び、又はこの範囲内の値である。苦味物質は組み合わせて（例えば２つ又はそれ以上の苦味物質）、かつ／又は１つ若しくはそれ以上の苦味物質でない化合物（例えば、限定されないがアルブテロールのようなベータ−アゴニスト）と組み合わせて投与され得る。本明細書において提供される１つの非限定的な例において、イソプロテレノール及びクロロキンに対する気道弛緩応答は相加的であり；したがって、いくつかの状況下では、この組み合わせをそれを必要とする対象に投与することが適切であり得る。
【００２８】
本明細書で使用される用語「用量」、「投薬量」、「単位用量」、「単位投薬量」、「有効用量」及び関連する用語は、所望の治療効果（例えば、気管支拡張又は気道の弛緩）を生じるように計算された活性成分（苦味物質）の所定の量を含有する物理的に別個の単位を指す。これらの用語は治療有効量及び本明細書において開示される方法の示された目的を達成するために十分な量と同義である。
【００２９】
本明細書で使用される用語「処置する」、「処置すること」、及び「処置」はそれらの通常及び慣例の意味を有し、そして対象における閉塞性肺疾患又は状態の症状を寛解させること、対象における閉塞性肺疾患又は状態の症状の再発を遮断すること又は寛解させること、対象における閉塞性肺疾患又は状態の症状の重症度及び／又は頻度を減少させることの１つ又はそれ以上を含む。本明細書において使用される「処置」は、患者又は対象がより容易に呼吸できるように、少なくとも部分的に、かつ少なくとも一時的に、気管支収縮（又は気管支痙攣）を軽減すること又は気管支拡張を増加させることを含む。処置は、医薬組成物が投与されていない対象に対して、約１％〜約１００％だけ寛解させること、遮断すること、低減すること、減少させること又は阻害することを意味する。好ましくは、寛解させること、遮断すること、低減すること、減少させること又は阻害することは、医薬組成物が投与されていない対象に対して約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、又は１％である。
【００３０】
本明細書で使用される用語「予防する」、「予防すること」、及び「予防」はそれらの通常及び慣例の意味を有し、そして対象における閉塞性肺疾患又は状態の症状を予防すること、対象における閉塞性肺疾患又は状態の症状の再発を阻止すること、及び対象における閉塞性肺疾患又は状態の症状の頻度を減少させることの１つ又は以上を含む。本明細書で使用される「予防」は、患者又は対象における呼吸が阻害されないように、少なくとも部分的に、かつ少なくとも一時的に、気管支収縮（又は気管支痙攣）を阻止することを含む。予防は、医薬組成物が投与されていない対象に対して、対象における約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又は１％の保護であり得る。予防は、医薬組成物の投与の後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又はそれ以上持続する。
【００３１】
平滑筋細胞の表面上の苦味物質受容体を活性化し、それにより気道平滑筋を弛緩させることにより気道平滑筋を弛緩させる方法が本明細書において提供される。苦味物質受容体は、受容体を苦味物質と接触させることにより活性化され得る。活性化され得る苦味物質受容体としては、例えば、Ｔ２Ｒ１０；Ｔ２Ｒ１４；Ｔ２Ｒ４４；Ｔ２Ｒ５；Ｔ２Ｒ４；Ｔ２Ｒ４８；Ｔ２Ｒ３；Ｔ２Ｒ４９；Ｔ２Ｒ４５；Ｔ２Ｒ５０；Ｔ２Ｒ４７；Ｔ２Ｒ９；Ｔ２Ｒ１３；ＴＡＳ２Ｒ５５；ＴＡＳ２Ｒ４６；ＴＡＳ２Ｒ１；ＴＡＳ２Ｒ８が挙げられる。本明細書において提供される方法のいずれかにおいて、上述の苦味物質受容体の１つ又はそれ以上が活性化され得る。苦味物質は、様々な刺激により引き起こされるか若しくは疾患若しくは状態の原因となっている気管支痙攣若しくは気管支収縮を予防若しくは処置するため；気管支拡張を増加させるため；かつ／又は気道平滑筋を弛緩させることが望ましいであろう様々な疾患及び状態を処置するために使用され得る。
【００３２】
例えば、本発明は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む、対象におけるぜん息を処置する方法を提供する。
【００３３】
別の例において、本発明は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＣＯＰＤを処置する方法を提供する。
【００３４】
さらに別の例において、本発明は、苦味物質を含む治療有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む、対象における気管支炎を処置する方法を提供する。
【００３５】
これらの局面の各々において、医薬組成物は吸入剤の形態であり得、又はいずれかの周知の方法（例えば、限定されないが、経口、静脈内、頬側、経皮など）により全身投与され得る。これらの局面の各々において、医薬組成物は好ましくは吸入剤の形態である。
【００３６】
気道平滑筋細胞を、苦味物質受容体に結合する試験化合物と接触させること、及び試験化合物が気道平滑筋細胞を弛緩させるか否かを決定することを含み、ここで平滑筋細胞を弛緩させる化合物は気道平滑筋を弛緩させるための化合物として同定される、気道平滑筋を弛緩させるための化合物を同定する方法もまた本明細書において提供される。試験化合物が結合し得る苦味物質受容体としては、例えば、Ｔ２Ｒ１０；Ｔ２Ｒ１４；Ｔ２Ｒ４４；Ｔ２Ｒ５；Ｔ２Ｒ４；Ｔ２Ｒ４８；Ｔ２Ｒ３；Ｔ２Ｒ４９；Ｔ２Ｒ４５；Ｔ２Ｒ５０；Ｔ２Ｒ４７；Ｔ２Ｒ９；Ｔ２Ｒ１３；ＴＡＳ２Ｒ５５；ＴＡＳ２Ｒ４６；ＴＡＳ２Ｒ１；ＴＡＳ２Ｒ８が挙げられ得る（表２のとおりの命名法；代替の命名については表３を参照のこと）。本明細書において提供される方法のいずれかにおいて、苦味物質は上述の苦味物質受容体の１つ又はそれ以上に結合し得る。
【００３７】
苦味受容体アゴニストである化合物を同定する方法も本明細書において提供される。
【００３８】
苦味受容体アンタゴニストである化合物を同定する方法も本明細書において提供される。
【００３９】
苦味受容体アゴニスト及びアンタゴニストの同定
苦味受容体が気道細胞（例えば、気道平滑筋細胞及び非線毛気道上皮細胞）の表面上で発現されるという本発明者らの発見は、苦味受容体アゴニスト及びアンタゴニストとして役立つ化合物を同定するための新しいスクリーニングアプローチを提供する。苦味受容体アゴニストは、本明細書に記載されるように、例えば気道平滑筋を弛緩させるため、及び苦味受容体を活性化させることが望ましいであろういずれかの他の用途のために使用され得る。苦味受容体アンタゴニストは多くの用途を見出し、例えば食物及び飲料；薬物、栄養補助食品、及び栄養補給剤；口腔ケア製品などにおける苦味を減少させるかマスクするための成分として含まれる。本明細書に記載される方法により同定された候補苦味受容体アンタゴニストを、周知の方法により、例えば候補苦味受容体アンタゴニストを消耗品又は他の経口摂取される製品と混合し、そしてそれらの製品を苦味の知覚に敏感な人々による味覚試験にかけることにより、さらに評価され得る。
【００４０】
試験化合物はいずれかの合成又は天然に存在する分子であり得る。化合物は、化合物のライブラリ、例えば、限定されないが、当該分野で周知であるような、コンビナトリアル化合物ライブラリ又は天然に存在する化合物（例えば、限定されないが、ペプチド、タンパク質、糖類、炭水化物、ヌクレオチド、核酸、脂質及び／又はそれらの誘導体若しくは混合物）のライブラリから同定され得る。試験化合物には、苦味受容体アゴニスト又はアンタゴニストとの構造類似性が既知である化合物が含まれ得る。当業者は、合成及び天然の化学化合物ライブラリーの多くの商業的供給源があることを理解するだろう（例えば、限定されないが：  ＴｉｍＴｅｃ  ＵＳＡ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｕｒｏｒａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓなど）。コンビナトリアルライブラリー及び他の化合物ライブラリーを製造及びスクリーニングするための多数の方法が当該分野で周知である。例えば、米国特許第７，３９３，６５号；米国特許公開第２０１０／０１２９８３３号；及び米国特許公開第２０１０／０１１３５４８号（これはそれぞれその全体が参照により本明細書に加入される）を参照のこと。
【００４１】
苦味受容体の試験化合物（すなわち可能性のあるアゴニスト又はアンタゴニスト）の結合はいずれかの適切なアプローチにより検出され得る。例えば、苦味物質の苦味受容体への結合は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）のホスホリパーゼＣ媒介加水分解を介するイノシトール酸リン酸（ＩＰ３）の増加のような細胞内事象を開始する。次いでＩＰ３は細胞内カルシウム貯蔵の放出を刺激する。従って、このような変化を検出するための周知の方法を使用して、細胞質カルシウム濃度の変化又は第二メッセンジャーレベルの変化が、苦味受容体アゴニスト又はアンタゴニストを同定するために使用され得る。本明細書において記載される方法に加えて、このような有用な方法の例については例えば米国特許第７，３９３，６５４号；米国特許公開第２０１０／０１２９８３３号；及び米国特許公開第２０１０／０１１３５４８号（これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に加入される）を参照のこと。「苦味受容体の活性を測定すること」は、苦味受容体により達成される生化学的シグナル伝達の変化（例えば、細胞内カルシウム放出、ＩＰ３レベル、又は他のシグナル伝達分子レベルの変化）を測定すること、又は苦味物質受容体への苦味物質の結合の量を測定することを意味する。例えば、苦味受容体に対するアンタゴニストは、既知の苦味物質のその同族受容体への結合を阻害する能力、又は例えば細胞内カルシウム放出、ＩＰ３生成などにより証明されるような生化学的シグナル伝達における苦味物質が媒介する増加を阻害する能力により同定され得る。反対に、苦味物質受容体アゴニストは、苦味物質受容体に結合するその能力、及び／又は本明細書に記載され、そして当該分野で周知であるような苦味物質が媒介する生化学的シグナル伝達を刺激するその能力により同定される。苦味物質アゴニスト及びアンタゴニストを検出するためのこのような周知のアッセイの例については、例えば、米国特許第７，３９３，６５号；米国特許公開第２０１０／０１２９８３３号；及び米国特許公開第２０１０／０１１３５４８号を参照のこと。
【００４２】
さらに、本明細書に記載されるように、苦味受容体アゴニスト及びアンタゴニストは、気道平滑筋細胞を弛緩させるそれらの能力（苦味受容体アゴニストの場合）、又はこのような弛緩を阻害するそれらの能力（苦味受容体アンタゴニストの場合）により同定され得る。苦味受容体媒介活性の少なくとも１０％の増加は  苦味受容体アゴニストを同定する。アゴニスト媒介苦味受容体活性の少なくとも１０％の減少は苦味受容体アンタゴニストを同定する。このような変化は、例えば少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１０％などの変化であり得る。
【００４３】
一例において、細胞をマルチウェルディッシュで増殖させ、蛍光ベースのカルシウム指示薬色素をロードし、そして試験化合物を添加し、続いて細胞内カルシウム［Ｃａ2+］i放出の変化を示す蛍光の変化をモニタリングする。試験化合物には、既知の苦味受容体アゴニスト又はアンタゴニストに対して構造的類似性を有するものが含まれ得る。
【００４４】
苦味受容体アゴニストとして役立つ化合物で細胞を処理した場合、［Ｃａ2+］iの用量依存性上昇が観察される。用量−応答曲線から、効力（最大応答の５０％が生じる場合の有効濃度；ＥＣ５０としても知られる）及び有効性（最大［Ｃａ2+］i応答）がその化合物について確認され得る。
【００４５】
苦味受容体のアンタゴニストは、これらの細胞における［Ｃａ2+］iのアゴニスト活性化を遮断するそれらの能力によりそれ自体特異的に同定される。従って、苦味受容体へのアンタゴニストの結合は単独で調べた場合は［Ｃａ2+］iの変化を生じないか、又は減少をもたらすだろう。苦味受容体アンタゴニストを同定するための実験は、提案されているアンタゴニスト及び苦味受容体の既知のアゴニストで細胞を処理することにより行われる。既知のアゴニストからの［Ｃａ2+］iシグナルと提案されているアンタゴニスト化合物の存在下でのそのアゴニストからのシグナルとを比較することにより、アゴニストの受容体へのアクセスを遮断するように作用しているという証拠が得られ、これはアンタゴニストであることを示す。様々な用量の提案されているアンタゴニストを使用することにより、効力（上で定義される）及び有効性（ここではアゴニストシグナルの最大阻害と定義される）が明らかにされる。
【００４６】
具体例は、苦味受容体アゴニスト  アセスルファームＫを８００マイクロモル濃度の固定濃度で、多様な濃度の味覚受容体アンタゴニストＧＩＶ３７２７（ＴＡＳ２Ｒ３１でアンタゴニストであることが知られている）と共に使用し、そしてＧＩＶ３７２７の濃度を増加させながら［Ｃａ2+］iシグナルの大きさの減少を観察することである。この具体例において、アッセイは例えば、初代ヒト気道平滑筋細胞又はＨ２９２細胞（両方ともＴＡＳ２Ｒ３１を発現するので）を用いて行われ得る。
【００４７】
一般に、苦味受容体のアゴニスト及びアンタゴニストについてのアッセイは、１つ又はそれ以上の苦味受容体を発現する気道細胞（例えば、気道平滑筋細胞又は非線毛気道上皮細胞）のいずれかの供給源を用いて行われ得る。例えば、初代ヒト気道平滑筋細胞は、ＳＡ  Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｂｅｔａ２−  ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｉｒｗａｙ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２５−３３，１９９５）（その全体が参照により本明細書に加入される）において記載されるようにヒト組織から得られ得る。
【００４８】
本明細書において記載されるスクリーニング方法において使用され得る初代平滑筋細胞の別の供給源は、Ｌｏｎｚａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓからのカタログ番号ＣＣ−２５７６（及び他のもの）である。さらに、当業者には当然のことながら、Ｌｏｎｚａは正常及び疾患の気道上皮細胞並びに気道平滑筋細胞の供給元である。Ｌｏｎｚａはまた正常及び疾患の気道線維芽細胞を提供し、これもまた、選択された細胞型が１つ又はそれ以上の興味のある苦味受容体を発現する限り、本発明のスクリーニング方法において使用され得る。
【００４９】
本明細書に記載される方法において有用である別の細胞株は、不死化ヒト気管支上皮細胞株ＢＥＡＳ−２Ｂ（アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）カタログ番号ＣＲＬ−９６０９）である。Ｈ２９２（ＮＣＩ−Ｈ２９２としても知られる；アメリカ培養細胞系統保存機関カタログ番号ＣＲＬ−１８４８）は、多数の型の苦味受容体を発現するヒト肺粘液性類表皮癌由来の誘導された細胞である（例えば表１を参照のこと）。適切な場合、気道細胞はまた、本明細書に記載され、かつ当該分野で周知であるように、気管軟骨内でそれらを使用して試験され得る。
【００５０】
【表１】
2013533310.tif 000003
【００５１】
さらに、必要に応じて、いずれかの非ヒト細胞、例えばマウス又はラット初代気道細胞が使用され得、初代細胞分離株、樹立細胞株、又は気管軟骨として使用され得る。いずれかの他の動物種も必要に応じて使用され得る（限定されないが、イヌ、ウシ、ブタ、霊長類などが挙げられる）。当業者は、本明細書に記載される方法における使用のために適切な細胞供給源を同定する方法を理解するだろう。
【実施例】
【００５２】
方法
［Ｃａ2+］i、ｃＡＭＰ及び膜電位の測定。初代ヒトＡＳＭ細胞を商業的供給源（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）から入手し、そして３〜８継代で細胞を使用して実験しながら記載されるように維持した31。これらの細胞は以前に確認されたように31、＞９５％の気道平滑筋からなるものであった。［Ｃａ2+］iの変化を検出するために、９６ウェルプレートに付着した細胞（８０，０００細胞／ウェル）に、プロベネシドと共にＦｌｕｏ−４  ＡＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１時間３７℃でロードした。受容体アゴニストを示された濃度で３７℃にて自動化ピペット操作システムにより三連で加え、そしてＦｌｅｘ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４８５ｎｍでの励起により５２５ｎｍのシグナルが生じた。データを１．５秒ごとに６０秒間取得した。別の記載がなければ、研究は１．５ｍＭカルシウムを含有する培地で行った。いくつかの研究において、ＡＳＭを、４ｘ１０6細胞及びｓｉＲＮＡ  ４μｇを使用してエレクトロポレーション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ，Ｌｏｎｚａ）により、Ｔ２Ｒ１０  ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はスクランブル配列ｓｉＲＮＡコントロールでトランスフェクトした。２４に時間後に細胞を［Ｃａ2+］iアッセイのために９６ウェルプレートに移した。ｃＡＭＰ測定のために、ヒトＡＳＭ細胞を２４ウェルディッシュにプレーティングし、アゴニストを示された時間、３７℃で三連で加え、そして溶解緩衝液を加えて急速凍結させることにより反応を停止させた。サンプルをアセチル化し、そしてｃＡＭＰを、以前に記載されたように32、高感度125Ｉ−ｃＡＭＰベースのラジオイムノアッセイにより測定した。ＶＡＳＰリン酸化状態を、非リン酸化形態及びリン酸化形態に特異的な抗体（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して全細胞溶解物のウェスタンブロットにより確認した。ＡＳＭ細胞全体の膜電位に対する苦味物質の効果を、膜電位感受性蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、記載されるように19９６ウェルプレート形式で５０，０００細胞／ウェルを用いて測定した。励起は５３０ｎｍであり、そして発光は５６５ｎｍで得られた。データをリアルタイムで３００秒間集め、相対的蛍光単位として示す。
【００５３】
エクスビボでのインタクトな気道の生理学。全てのマウス研究は動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により認可されており、そしてヒト組織研究は、メリーランド大学（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）の治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）により認可された。約６０日齢のＦＶＢ／Ｎマウスから、気管の５ｍｍ切片を切除し、そして以前に記載されたように33、等長性（ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ）ミオグラフシステム（Ｒａｄｎｏｔｉ）において調べた。手短には、固定ワイヤと変換器連結ワイヤとの間に取り付けた気管軟骨を、Ｋｒｅｂｓ緩衝液中に３７℃で９５％Ｏ2、５％ＣＯ2から通気して維持した。５ｍＮの静止張力を各軟骨輪について確立し、これはＧＰＣＲアゴニストからの収縮及び弛緩を調べるための長さ−張力の最適な関係をもたらすということを本発明者らは示した34。示された範囲の用量又は単一濃度を使用して実験を行った。適切な場合は、Ｋｒｅｂｓ緩衝液を用いて３回２５ｍｌ交換することにより薬物の洗い流しを達成した。弛緩研究のために、軟骨輪を、固定濃度を使用してアセチルコリンのような薬剤を用いて収縮させ、これを複数の用量のイソプロテレノール又は苦味物質を加える間維持した。外科標本から新たに得られたヒト組織からの第四次気管支を、肉眼で病理のない領域から切開し、軟骨輪を上記の方法と類似した方法で調製し試験した。
【００５４】
磁気ツイスティングサイトメトリー（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｔｗｉｓｔｉｎｇ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）。ベースライン細胞剛性の動的変化を、以前に詳細に記載されるように15、磁気ツイスティングサイトメトリーを使用して単離されたヒトＡＳＭ細胞の収縮及び弛緩の指標として測定した。手短には、接着性ヒトＡＳＭ細胞に結合されたＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ被覆強磁性マイクロビーズを水平方向に磁化し、次いで時間内に正弦波的に変動している垂直方向に整列された均一な磁場で回転させる。正弦波的に回転する（ｔｗｉｓｔｉｎｇ）磁場は、ビーズの回転（ｒｏｔａｔｉｏｎ）及び旋回変位の両方を引き起こし：次いでこのような強制的なビーズの運動は、細胞により生じる内部応力により妨げられる。生じた振動トルクに対応したビーズの側方変位を、約５ｎｍの空間分解能で検出し、そしてビーズ変位に対する固有トルクの比を計算し、そして細胞剛性としてパスカル／ｎｍ（Ｐａ／ｎｍ）の単位で表した。それぞれ個々のＡＳＭ細胞について、ベースライン剛性を最初の６０秒間測定し、そして薬物添加後に、次の５４０秒間連続的に剛性を測定した。いくつかの実験において、ＧＰＣＲアゴニストを加える前に、細胞をビヒクル又は阻害剤に１０分間予め曝露した（イベリオトキシン  １０ｎＭ、カリブドトキシン１０ｎＭ、Ｈ８９  １００ｎＭ、又はＵ７３１２２  １μＭ）。各細胞について、アゴニスト刺激の前に剛性をそのベースライン剛性に対して正規化した。
【００５５】
領域的かつ局所的［Ｃａ2+］iシグナルの共焦点像。領域的かつ局所的［Ｃａ2+］iシグナルを、膜透過性［Ｃａ2+］i感受性蛍光色素Ｆｌｕｏ−３アセトキシメチルエステル（Ｆｌｕｏ−３  ＡＭ）を使用して以前に記載されたように35,36可視化した。培養ヒトＡＳＭに５μＭ  Ｆｌｕｏ−３  ＡＭ（２０％プルロニック酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を含むＤＭＳＯに溶解した）を３０〜４５分間、室温で（約２２℃）ロードした。細胞を（ｍＭで）１３７  ＮａＣｌ、５．４  ＫＣｌ、２  ＣａＣｌ2、１  ＭｇＣｌ2、１０  ＨＥＰＥＳ、及び１０グルコースを含有するＴｙｒｏｄｅ液（ｐＨ７．４（ＮａＯＨで調整）で洗浄して細胞外Ｆｌｕｏ−３  ＡＭを除去し、そして１５〜３０分間細胞チャンバーに置いて細胞質の色素の脱エステル化を完了させた。Ｆｌｕｏ−３  ＡＭを４８８ｎｍで励起し、そして蛍光を＞５０５ｎｍで測定した。２次元画像を０．２２μｍ／ピクセル、５１２ピクセル／ライン、２５６ライン／画像で０．５秒ごとに１回スキャンした。ラインスキャン画像を０．０７５μｍ／ピクセル、５１２ピクセル／ラインで２ｍｓ間隔で１０，０００ライン／画像を収集した。画像をＩＤＬソフトウェアパッケージを使用したアルゴリズムで処理した。各共焦点像の蛍光シグナル（Ｆ）から最初にバックグラウンドを差し引いて、Ｆ／Ｆ0に関して正規化した（ここでＦ0は薬物適用前のベースライン蛍光である）。［Ｃａ2+］iシグナルの大きさを、擬比率（ｐｓｅｕｄｏ−ｒａｔｉｏ）法37により絶対［Ｃａ2+］iに対してさらに較正した。典型的な画像フィールドは２〜４個の細胞を含み、そして各実験について１０フィールドを調べた。
【００５６】
Ｔ２Ｒ発現。全ＲＮＡをヒトＡＳＭ細胞から抽出し、そして２μｇ  ＲＮＡ、オリゴｄＴプライマー、及びモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素を使用して逆転写を行った。リアルタイムＰＣＲを、以前に詳細に記載された方法38を使用して、２５のＴ２Ｒに特異的なプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、示された他のＧＰＣＲ、及びＧＡＰＤＨを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行った。データをΔΔＣT法を使用してＡＤＲＢ２を参照として使用して解析した39。Ｔ２Ｒ１０、１４、４４、５、４及び４８に対するプライマーから誘導されたＰＣＲ産物を配列解析して、示されたヒトＴ２Ｒであることを確認した。免疫細胞学を、記載されるように31固定化細胞を使用して行った。抗血清力価は：Ｔ２Ｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１：３００、ガストデューシン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）１：５００及びＢＫCa（Ｓｉｇｍａ）１：１００であった。
【００５７】
オボアルブミン感作及び肺機能試験。６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの感作を、２００μｌミョウバン中１００μｇオボアルブミン、又はミョウバンのみ（コントロール）の腹腔内注射により０日目及び１４日目に行った。次いで１９、２１及び２４日目に、マウスを１．０％エアロゾル化オボアルブミンに曝露した。最後の曝露の２４時間後にマウスを鎮静させ、挿管し、そして以前に記載されるように40ｆｌｅｘｉＶｅｎｔシステム（ＳＣＩＲＥＱ）を換気及び気道抵抗の測定のために利用した。換気は、一回換気量２４０μｌ及び呼気終末陽圧２．５ｃｍ  Ｈ2Ｏで１５０呼吸／分であった。安定化した後、持続気道抵抗がベースラインより約５倍高くなるまでマウスをエアロゾル化メタコリンの用量（ネブライザで２．０、４．０、８．０及び１６ｍｇ／ｍｌ）に曝露した。最後のアセチルコリン吸入の３分後に、苦味物質キニーネ（１５０μｇ）若しくはデナトニウム（２００μｇ）、又はβ−アゴニストアルブテロール（３．０μｇ）をエアロゾルにより１０秒間かけて投与した。抵抗測定（Ｒａｗ、ｃｍ  Ｈ2Ｏ／ｍｌ／秒）を実験の間中、３０秒ごとに行った。
【００５８】
統計分析。［Ｃａ2+］i及びエクスビボ気管軟骨研究についての用量応答曲線を、反復非線形（シグモイド）最小二乗フィッティングにより解析した。全ての研究からの結果を、対応のある又は非対応の二元配置ｔ検定（ｐａｉｒｅｄ  ｏｒ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔｗｏ−ｗａｙ  ｔ−ｔｅｓｔｓ）（試験設計に依存する）を使用して、Ｐ＜０．０５を有意とみなして比較した。多重比較が求められる場合、事後（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）ｔ検定を用いるＡＮＯＶＡを、多重比較についての補正と共に利用した。データを平均値±標準誤差として示す。
【００５９】
結果
ヒトＡＳＭは［Ｃａ2+］iと共役した苦味受容体を発現する。初期の研究は、いくつかの公知の苦味受容体アゴニスト（例えばクロロキン、サッカリン、及びデナトニウム）が培養ヒトＡＳＭ細胞において増加した［Ｃａ2+］iを惹起することを見出した（図１ａ、ｂ、ｃ）。これらの苦味物質に対するＡＳＭ細胞における［Ｃａ2+］i応答は、ヒスタミン及びブラジキニンのような公知の気管支収縮性ＧＰＣＲアゴニストと大きさが類似していることが見出された（図１ｃ）。これらの結果は、全ての２５の公知のＴ２Ｒ遺伝子に対するプライマーを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ研究を促し、ここで本発明者らは、多数の苦味受容体転写物がヒトＡＳＭにおいて発現したことを確認した。発現を、β2−アドレナリン作用性受容体（β2ＡＲ）（ＡＳＭ緊張の調節との認識された生理学的及び薬理学的関連性を有する受容体）についての遺伝子レベルと比較した（表２−Ｗ．Ｍｅｙｅｒｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｓｅｎｓｅｓ  ３５：  １５７−１７０（２０１０）に記載される命名法）。ヒト気道平滑筋細胞（ＡＳＭ）上でそれぞれ高レベル及び低レベルで発現されることが公知の２つの他のＧＰＣＲ（ＡＤＯＲＡ１及びＬＴＢ４Ｒ）の発現も示す。表３は表２に示されるｍＲＮＡ発現レベルを示すが、当該分野で周知である苦味受容体についての代替の命名法を代わりに使用する。２つの命名法の差異は表２と３とを比較することにより理解され得る。
【００６０】
【表２】
2013533310.tif 000004
【００６１】
【表３】
2013533310.tif 000005
【００６２】
多数のＴＡＳ２Ｒ転写物がヒトＡＳＭにおいて発現されることが見出され、Ｔ２Ｒ１０，Ｔ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ４４サブタイプは最も高度に発現された。２つの甘味受容体についての転写物は、最初にアレイにより確認され6（Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ２）、ＲＴ−ＰＣＲにより確認されなかった（表２）。さらなる苦味物質のさらなる選別により、［Ｃａ2+］iがアリストコール酸、ストリキニーネ、キニーネ、コルヒチン及びヨヒンビンに応答することが明らかになった（図１ｃ）。重大なことには、２つの甘味受容体アゴニストのスクラロース及びＳＣ４５６４７に対する応答は見られなかった（図１ｃ）。そして、本発明者らは、Ｔ２Ｒ４を活性化するコルヒチンに対するＡＳＭにおける比較的低い応答（ＲＴ−ＰＣＲにより中間レベルのＡＳＭ発現剤（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ））及び排他的にＴ２Ｒ１６を発現する10サリシンに対して応答しないこと（これはＲＴ−ＰＣＲによりＡＳＭにおいて検出されない）に気付いた。ストリキニーネ（Ｔ２Ｒ１０及び−４６を活性化する）に対する強い応答はまた、ＡＳＭにおける高い発現を有するＴ２Ｒ１０と一致していた。従って、ＡＳＭにおいて、苦味物質に対する［Ｃａ2+］i応答は、アゴニスト特異性及びこれらの細胞におけるＴ２Ｒサブタイプ発現に基づく順位と一致しており、甘味受容体アゴニストに対する［Ｃａ2+］i応答はない。２つの高度に発現する受容体（Ｔ２Ｒ１０及びＴ２Ｒ４４）及びＲＴ−ＰＣＲにより検出されなかった受容体（Ｔ２Ｒ７）に対して特異的なポリクローナル抗血清を使用したヒトＡＳＭ細胞の免疫細胞学は、前者の２つの受容体の細胞表面発現を明らかにしたが、後者については明らかにならなかった（図２）。これらの研究はまた、これらの細胞におけるガストデューシンのαサブユニットの発現を明らかにした（図２）。
【００６３】
Ｔ２Ｒ１０特異的ｓｉＲＮＡを用いたＡＳＭ細胞のトランスフェクションは、Ｔ２Ｒ１０  ｍＲＮＡをスクランブルｓｉＲＮＡコントロールと比較して３６±１．８％減少させ、これはストリキニーネ促進［Ｃａ2+］iの２６＋２．０％の減少を伴っていた（コントロールに対してＰ＜０．０５）。さらなる研究において、ＡＳＭ細胞を培地のみで、又はＴ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ７に特異的なポリクローナル抗血清、若しくはアイソタイプ特異的ＩｇＧと共にインキュベートし、次いでストリキニーネ促進［Ｃａ2+］iを決定した。Ｔ２Ｒ１０抗血清はストリキニーネ促進［Ｃａ2+］i応答を用量依存性の様式で減少させ（約７７％の最大阻害、図３）、このＴ２Ｒの発現を示すＲＴ−ＰＣＲ及び免疫細胞学の結果と一致していた。非特異的効果についてのコントロールとして、Ｔ２Ｒ７（これはＡＳＭにおいて発現されない）に対する抗血清は、同じ力価で［Ｃａ2+］i刺激に対して有意な効果を有しておらず、ＩｇＧも有意な効果を有していなかった。総合すれば、上記の研究は、ＡＳＭ細胞でのＴ２Ｒの発現を裏付け、そして発現を苦味物質媒介［Ｃａ2+］iシグナル伝達と関連付ける。サッカリンにより誘発されるヒトＡＳＭ細胞における［Ｃａ2+］iの増加は、細胞外Ｃａ2+の存在に依存せず、そして応答はＧβγ阻害剤ガレイン、ＰＬＣβ阻害剤Ｕ７３１２２により除去され、そしてイノシトール−３−リン酸（ＩＰ3）受容体アンタゴニスト２ＡＰＢにより部分的に阻害された（図１ｄ）。ＡＳＭ細胞におけるこれらの結果は舌の特殊化味覚細胞における苦味受容体についてのシグナル伝達と一致し、ここでＧgust−関連βγはＰＬＣβを活性化してＩＰ3生成を生じ、これが筋小胞体（ｓａｒｃｏ（ｅｎｄｏ）ｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）上のＩＰ3受容体を活性化し、この細胞内貯蔵からＣａ2+が放出される9。
【００６４】
苦味受容体は気道弛緩を惹起する。ヒトＡＳＭにおいて苦味物質のいくつかにより促進される［Ｃａ2+］iの増加が、気管支収縮性ＧＰＣＲに対して作用するリガンドの大きさと類似した大きさであったことを考えると、本発明者らは、苦味受容体がＡＳＭ収縮を惹起すると最初に仮定した。しかし、単離されたインタクトなマウス気道において、クロロキン、デナトニウム及びキニーネは用量依存性弛緩を生じ、最大応答はアセチルコリンにより惹起された活性収縮を＞９０％減少させた（図４ａ）。これらの同じ実験条件下での完全β2ＡＲアゴニスト  イソプロテレノールに対する最大弛緩応答は、活動張力の３０±９．２％の減少であった（図４ａ）。クロロキン及びキニーネもまた、異なるＧq−受容体アゴニスト（セロトニン、図４ｂ）により収縮された気道を用いて調べ、そして顕著な弛緩も観察された。クロロキン弛緩についてのＥＣ50（９３±４．３μＭ及び１１０±３２μＭ）は、収縮がそれぞれアセチルコリンによって刺激されたかセロトニンによって刺激されたかに関わらずほとんど同じであった。さらに、本発明者らは、苦味物質がベースライン気管軟骨張力を約３０％弛緩させることを見出した（図５）。ヒト肺組織の非疾患部分から得られた第四次気管支における限られた数の研究において、本発明者らはまた、アセチルコリン収縮軟骨輪でのクロロキン又はサッカリンからの５０〜８０％の弛緩を観察した（図６）。苦味物質媒介気道弛緩は、シクロオキシゲナーゼ阻害剤インドメタシンによっても一酸化窒素シンターゼ阻害剤Ｌ−ＮＡＭＥによっても変更されず、このことは、気道上皮細胞から生じる気管支活性（ｂｒｏｎｃｈｏａｃｔｉｖｅ）リガンドから生じる二次的応答よりもむしろＡＳＭ受容体の直接活性化を示唆した。β−アゴニストを用いて観察される気道弛緩は、その後のＰＫＡ活性化を伴うｃＡＭＰの増加と共役するβ2ＡＲに起因する2。しかし、それぞれ高感度ラジオイムノアッセイにより又は血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質（ＶＡＳＰ）のＰＫＡ媒介リン酸化により評価して、ｃＡＭＰにおけるクロロキン促進増加についてもインタクトな培養ＡＳＭ細胞におけるＰＫＡ活性化についても証拠は見出されなかった（図４ｃ）。インタクトな気道を用いた一連の連続した投薬及び休薬の実験において、準最大用量のクロロキンはアセチルコリン媒介収縮の約６７％弛緩を生じ、これは、休薬及びアセチルコリンへの再曝露により完全に逆戻りした（図４ｄ）。次いでこれらの気道を最大濃度のイソプロテレノールに曝露して、クロロキンへの前曝露なしに得られた値と同様の値である２９±４．３％弛緩を達成した（図４ａ）。さらに、クロロキン及びイソプロテレノールの両方への曝露は、いずれかの化合物単独を用いて見られた弛緩よりも高い弛緩を生じた（図４ｄ）。これらのデータは、ＡＳＭ機能的収縮及び弛緩がクロロキンへの前曝露により損なわれないのでクロロキン促進は細胞傷害に起因しないということ、並びに弛緩はβ−アゴニストの弛緩に対して相加的であり、弛緩の異なる機構を示唆しているということを示す。
【００６５】
苦味受容体は、局在的Ｃａ2+放出からＢＫCaチャネルを開くことによりＡＳＭを弛緩する。総合すれば、これらの逆説的な結果は、苦味受容体アゴニストがＡＳＭにおける［Ｃａ2+］iの増加を惹起するにもかかわらず、それらが気管支拡張剤として作用することを示し、実際に、本発明者らがこれまでに発見した最も有効な気管支拡張剤である。本発明者らは、この細胞型におけるこれらの受容体の［Ｃａ2+］iに対するシグナル伝達の機構を特徴付けしたが、インタクトな気道における協調した気道応答は予期された気管支収縮と一致しなかった。苦味受容体がＡＳＭ弛緩を惹起する機構をさらに解明するために、本発明者らは、単離されたヒトＡＳＭ細胞の剛性の動的変化を測定するために磁気ツイスティングサイトメトリー15を使用し（図７）、従ってインタクトな組織に存在する未確認の機構からの潜在的な交絡因子を除去した。これらの実験において、ペプチドリンカーにより細胞に結合された磁気粒子は、それぞれベースラインからの予期される弛緩及び収縮を生じるイソプロテレノール曝露及びヒスタミン曝露を用いて、単細胞剛性の高度に定量的な測定をもたらす（図７ａ）。
【００６６】
クロロキン及びサッカリン曝露（図７ａ）は、この単細胞レベルでＡＳＭ弛緩を生じ、これらの苦味物質が平滑筋細胞に対して直接作用することを裏付け、そしてこのことはインタクトな気道の協調した弛緩応答における我々の知見と一致する（図４ａ及び図５）。サッカリンに対する弛緩応答はＰＫＡ阻害剤Ｈ８９により遮断されず（図７ｂ）、ｃＡＭＰ及びＶＡＳＰリン酸化測定からの結果を裏付けた（図４ｃ）。Ｕ７３１２２によるＰＬＣの阻害は、単離されたＡＳＭのサッカリン促進弛緩を除去した（図７ｂ）。［Ｃａ2+］iの苦味物質促進増加に対するＰＬＣ阻害（βγ阻害剤及びＩＰ3受容体アンタゴニストと同様）（図１ｄ）に伴う本発明者らの知見を考慮すると、これらの結果は、ＡＳＭにおけるこれらの受容体の弛緩応答が細胞内Ｃａ2+放出により引き起こされるか又は細胞内Ｃａ2+放出を必要とするということを示した。この考えと一致して、培養ＡＳＭ細胞における［Ｃａ2+］i放出についてのクロロキンのＥＣ50値（７０±１０μＭ、図１ａ）、及びインタクトな気道の弛緩におけるクロロキンのＥＣ50値（９３±４．３μＭ、図４ａ）は事実上同じである。
【００６７】
弛緩がＳＲ  Ｃａ2+放出に依存することは、ＳＲ  Ｃａ2+再取り込み阻害剤タプシガルジン（ＳＲ［Ｃａ2+］iを枯渇させる）を用いた研究の結果によりさらに支持された。タプシガルジンプレインキュベーションはＡＳＭ細胞におけるクロロキン及び他の苦味物質が媒介する［Ｃａ2+］i刺激を遮断し（図８）、そしてまたインタクトな気道軟骨のクロロキン媒介弛緩も遮断した（図９）。ＡＳＭにおけるＣａ2+媒介弛緩についての可能性のある機構は、大コンダクタンスＣａ2+活性化Ｋ+チャネル（ＢＫCa）の刺激に起因する過分極を介するものである。これらのチャネルはヒトＡＳＭで発現されることが知られてお
り16（本発明者らが確認した；図２）、そして気道緊張を調節すると報告されている17。観察された弛緩が、苦味物質の引き起こしたＢＫCaのＣａ2+活性化に起因するか否かを調べるために、ヒトＡＳＭ細胞を担体、Ｃａ2+依存性Ｋ+チャネルアンタゴニスト  カリブドトキシン、又は特異的ＢＫCaチャネルアンタゴニスト  イベリオトキシンで前処理した。図７ｂに示されるように、単離された細胞で評価して、両方の前処理がサッカリン媒介ＡＳＭ弛緩を除去した。同様の結果がクロロキンで見られた。そして最後に、イベリオトキシンでの前処理もまた単離されたマウス気道におけるクロロキン促進弛緩を減衰させた（図７ｃ）。
【００６８】
ＢＫCa活性化からのＡＳＭの弛緩は、膜過分極に由来すると期待されるだろう18。ＡＳＭ細胞に膜電位感受性蛍光色素19をロードし、そして図１０ａに示されるように、ＫＣｌ及びヒスタミンへの曝露は、期待された膜脱分極を生じた。苦味物質のクロロキン及びサッカリンへの曝露で膜過分極が容易に観察された。さらに、苦味物質促進膜過分極はイベリオトキシンにより完全に阻害された（図１０ｂ）。従って、ＡＳＭ苦味受容体からの高度に効果的な気管支拡張応答は、ＢＫCaの［Ｃａ2+］i依存性活性化に起因すると思われ、これは収縮を引き起こす［Ｃａ2+］iのヒスタミン促進増加とは異なる。このことは、ヒスタミン及び苦味物質に対する  Ｃａ2+応答の細胞内分布が異なることを示唆し、そして実際に、高濃度の局在化［Ｃａ2+］iがＢＫCa活性化と関連するということが証明されている20。
【００６９】
ＡＳＭ細胞におけるサッカリン促進［Ｃａ2+］i増加の特徴を明確にするために、リアルタイム共焦点画像化をＦｌｕｏ−３をロードした細胞で行った（図１１）。示されるように、局在化した［Ｃａ2+］iシグナルがＡＳＭの細長い端部及び筋細胞膜領域において検出された。この応答は急速であり（例えば、断面の調査では２．５秒以内に観察される、図１１ａ）、そして強度は筋細胞の中心領域よりも高かった（図１１ｂ）。ＡＳＭ細胞の細胞膜に対して１μｍ以内の平行な領域においてラインスキャンモードを使用した場合、空間的かつ時間的に識別できる［Ｃａ2+］i事象が、その後の［Ｃａ2+］iの持続的な局在化した上昇の前に、サッカリンの適用後のごく初期に検出された（図１１ｅ）。これらの結果は、サッカリンがＡＳＭ細胞における局在化［Ｃａ2+］iシグナルを促進するとい考えを裏付けた。対照的に、ＡＳＭ細胞におけるヒスタミンに対する応答は、サッカリンで観察された局在化した特徴を伴わず、細胞全体にわたる［Ｃａ2+］iの急速な上昇を生じた（図１１ｃ）。
【００７０】
苦味物質はぜん息のマウスモデルにおいて気管支収縮に対抗する。集合的に、上記の結果は全て、ぜん息のような可逆性の閉塞性肺疾患を処置するために利用されるかもしれない新規なＡＳＭ弛緩経路を指し示す。この可能性を評価するために、苦味物質をアレルギー性気道炎症及び気管支過敏症のマウスモデルの状況において吸入により投与した。マウスをオボアルブミンに対して感作させ、次いで吸入オボアルブミンに繰り返し曝露し、これは急性気道炎症を生じた（図１２ａ、ｂ）。気道抵抗を、これらのインタクトな鎮静して挿管したマウスにおいて、気管支収縮剤メタコリンの吸入への応答後にベースラインで測定し、次いで気管支収縮期中の苦味物質の吸入後に測定した。これらの研究のためのポジティブコントロールには、アルブテロール（ぜん息治療において最も一般的に利用される気管支拡張剤であるβ−アゴニスト）を吸入させた。オボアルブミン感作マウスにおいて、ベースライン気道抵抗を５倍増加させるために必要な吸入メタコリンの濃度は８ｍｇ／ｍｌであり、非感作マウスについての≧１６ｍｇ／ｍｌと比較すると、気道過敏表現型を裏付けた。吸入されたエアロゾル化キニーネは、正常マウス及び感作マウスにおいて気道抵抗をそれぞれ５３±２．９６％及び５０±８％だけ減少させ、閉塞性気道疾患の病態生理学的に関連するモデルにおける有効性を示した（図１２ｃ、ｄ）。気管支拡張性効果はデナトニウムでも見られ、正常マウスにおいて４４±６％、そして感作マウスにおいて５７±４％に達した。
【００７１】
ＡＳＭ上で発現されるＧＰＣＲは、気道の緊張及び口径を調節するシグナル伝達受容体の主要なファミリーを代表するものである。ぜん息における気道環境内では、多数の局所的に生成されたリガンドが最終的にこれらの受容体に作用して気管支収縮をもたらす。気管支収縮促進性（ｐｒｏ−ｂｒｏｎｃｈｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｖｅ）ＧＰＣＲはＧ(qと共役し、［Ｃａ2+］iを増加させ、そしてＡＳＭ収縮を引き起こす。対照的に、Ｇ(sと共役したＧＰＣＲはｃＡＭＰを増加させ、ＡＳＭを弛緩させ、そして気管支を拡張し（ｂｒｏｎｃｈｏｄｉｌａｔｅ）、β−アゴニストの標的であるβ2ＡＲは気管支痙攣に対して最も一般的に利用される治療である。気管支収縮及び拡張をもたらす新規なＡＳＭ受容体の同定は、ぜん息において効果を現す（ａｔ  ｐｌａｙ）シグナル伝達ネットワークの我々の理解をさらに向上させ、そして新しい治療アプローチを可能にする。本明細書において、本発明者らはＴ２Ｒ苦味受容体ファミリーに属するいくつかのＧＰＣＲのヒトＡＳＭでの発現を予期せず見出した。苦味シグナル伝達が嫌悪応答の役目を果たすと考えられてきたことを考えると、本発明者らは、ＡＳＭの苦味受容体が、筋肉を収縮させ、有害な環境から逃避するきっかけとしての息切れを伴なって気管支収縮に至ると仮定した。これらの受容体は潜在的に数百の苦味リガンドに応答するので、このシナリオは、特異的リガンドの識別は必須ではなく、むしろ吸入抗原が有害である可能性があるというシグナルの生成のみが必須であるという点において妥当と思われる。これらの考察は、舌の苦味受容体が毒性の植物毒素に起因してどのように発展したかということと一致する9,13。最近の報告21はまた、脈拍頻度（ｂｅａｔ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を増加させる気道上皮細胞の運動毛上の苦味受容体を同定し、これは有害吸入剤に対する機械的防御と考えられる。これらの受容体はまた前鼻腔（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｎａｓａｌ  ｃａｖｉｔｙ）において見出され、ここでそれらはくしゃみを促進し、そして呼吸数を調節し22、この場合もやはり有害刺激に対する嫌悪様応答である。他方では、胃腸管の腸内分泌細胞で発現される苦味受容体は、グルコースレベルの恒常性制御を促進するように思われる23。気管支拡張により、ＡＳＭ上の苦味受容体は、これらの受容体においてアゴニストであり得24かつ気管支炎又は肺炎の間にグラム陰性菌により分泌される25アシル−ホモセリンラクトンに対して代償的様式で作用し得、それにより気管支痙攣からの保護をもたらす。しかし、本発明者らは、それらのアゴニストの多様な性質、及び［Ｃａ2+］i刺激とのそれらの共役に基づいて、ＡＳＭ上の苦味受容体が職業上のぜん息で見られるような未解明の気管支痙攣の基礎であるかもしれないと最初に考えた。
【００７２】
培養ＡＳＭ細胞の研究において、［Ｃａ2+］iの増加は例えばヒスタミンのような古典的な気管支収縮性ＧＰＣＲ活性化からの増加と類似しているので、苦味受容体リガンドに対する収縮性応答のこの予測は当然と思われた。しかし、インタクトな気道において、これらの薬剤は実質的な弛緩を誘発し、それはこれまで臨床上利用されてきた最も有効な気管支拡張剤（β−アゴニスト  イソプロテレノール）よりも高いものであった。弛緩は洗い流しにより容易に可逆性であり、そして気道はメタコリン及びイソプロテレノールへの曝露後にそれぞれ正常に収縮及び拡張されるので、この効果は能動的収縮の喪失をもたらす細胞傷害に起因するものではなかった。苦味物質は、増加した［Ｃａ2+］iに対してＰＬＣβ及びＩＰ3受容体依存性の様式を介してシグナル伝達した。さらに、［Ｃａ2+］iの苦味物質活性化はＧβγ阻害剤により遮断され、これはガストデューシン関連βγサブユニットを介する典型的な苦味受容体のシグナル伝達と一致した。この経路の活性化からの増加した［Ｃａ2+］iは、ＰＬＣβのＧ(q−共役受容体刺激で観察されたように、ＡＳＭ収縮を引き起こすと期待されるだろう。
【００７３】
本発明者らは、ＡＳＭ苦味受容体のＣａ2+及びｃＡＭＰに対する二重共役についての可能性を探索し、これは増加した［Ｃａ2+］iに直面した際の正味の弛緩を説明するかもしれない。このような二重共役は、膵臓β細胞における甘味受容体について記載されており26、そしてβ2ＡＲは平滑筋において［Ｃａ2+］iの増加及び減少を引き起こすることが報
告されている27,28。しかし、ＡＳＭ細胞において、本発明者らは苦味物質曝露からｃＡＭＰ増加もＰＫＡ活性化も検出することができず、そしてこれらの味覚物質からのＡＳＭ弛緩はＰＫＡ阻害剤Ｈ８９により影響を受けなかった。さらに、何かがｃＡＭＰレベルを減少させたかもしれない場合にガストデューシンαサブユニットはホスホジエステラーゼ活性を増強すると考えられている29。インタクトな気道におけるさらなる研究は、気道上皮細胞から惹起される２つの周知の気管支拡張剤経路（ＰＧＥ2のようなシクロオキシゲナーゼ産物及び一酸化窒素）を排除し、そして単離されたＡＳＭの単細胞力学は、苦味物質の効果がＡＳＭに対する直接的な作用によるものであることを示した。興味深いことに、［Ｃａ2+］i刺激及びＡＳＭ弛緩についての用量−応答曲線は同等のＥＣ50値を示し、この細胞内応答と生理応答との間の関連性を示唆した。そして実際に、ＳＲ  Ｃａ2+の枯渇は、ＡＳＭ細胞［Ｃａ2+］iにおける苦味物質媒介増加の喪失、さらにはインタクトな気道軟骨において観察される弛緩効果を生じた。［Ｃａ2+］iの共焦点蛍光画像化は、苦味物質に起因する局在化した増加を示し、これは細胞表面に対して１μｍ以内の距離で起こる初期カルシウム事象を含んでいた。本発明者らは、［Ｃａ2+］iと弛緩との間の密接な関係、ＡＳＭ上でのＢＫCaの公知の発現、及び活性のための膜結合［Ｃａ2+］iの必要性により、苦味受容体媒介性で［Ｃａ2+］i依存性のＢＫCaの開口を考えた。そして実際に、ＢＫCaの遮断は、単細胞弛緩、インタクトな気道の弛緩、及び苦味物質に由来する膜過分極を除去した。苦味物質からの制限的な［Ｃａ2+］i応答の理由は明確にされないままである。興味深いことに、わずかな脱分極がＢＫCa遮断の状況において苦味物質から観察され、２つのカルシムプール（ヒスタミン受容体促進対Ｔ２Ｒ促進）がいくらかの重複を有するかもしれないということを示唆した。それにもかかわらず、ヒスタミン媒介［Ｃａ2+］i増加の正味の効果は脱分極及び収縮であるが、苦味物質については、過分極及び弛緩である。最終的に、いくつかの苦味物質のエアロゾル化投与はアレルギー性炎症のマウスモデルにおいて気道を弛緩させ、この経路が疾患状態において治療的関連性を有することを示した。
【００７４】
ぜん息のような閉塞性気道疾患の処置において、さらなる治療選択肢の満たされていない必要性がある。特定のＧq共役経路を拮抗し、それにより気管支痙攣を減少させる可能性のある薬物の改良においていくらかの進展があったが、β−アゴニストが依然として唯一の実用的な直接気管支拡張剤である。本明細書において、本発明者らは、苦味受容体に結合する薬剤がインタクトな気道において顕著な気管支拡張を引き起こすことを示し、これはインビトロでβ−アゴニストにより促進されるものより約３倍高かった。さらに、苦味受容体の効果はβ−アゴニストの効果に対して相加的であると思われ、異なる作用機構と一致し、従って組み合わせ治療が使用され得る。苦味受容体は、ＰＫＡ媒介受容体脱感作のための部位を欠いており、かつＧ−タンパク質共役受容体キナーゼ媒介脱感作の可能性のある少数の部位を有するので、この新しいクラスの気管支拡張剤は、β−アゴニストを超えるさらなる利益を有し得る。従って、β−アゴニストで観察された30ものと比較して、苦味受容体アゴニストではタキフィラキシーがより少なく、又は気管支保護が無いかもしれない。
【００７５】
本明細書において引用される全ての書類、書籍、取り扱い説明書、論文、特許、公開された特許出願、案内書、要約及び他の参考資料は、それぞれの独立した刊行物又は特許出願が参照により加入されると具体的かつ個々に示されている場合と同じ程度まで、それら全体が参照により加入される。
【００７６】
本発明はその具体的な実施例及び実施態様に関連して記載されてきたが、当然のことながら、さらなる改変が可能であり、そして本出願は、概して本発明の原理に従い、かつ本発明が関連する分野内の公知又は慣例の実施内にあり、そして本明細書において上で記述された本質的な特徴に適用され得、かつ添付の特許請求の範囲に従う、本発明からの逸脱を含む、本発明のいずれの変形、使用又は改変も包含することを意図される。
【００７７】
引用文献
1.  Vignola, A.M., Bonsignore, G., Chanez, P. & Bousquet, J. Fatal Asthma 139-155 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1998).
2.  Billington, C.K. & Penn, R.B. Signaling and regulation of G protein-coupled receptors in airway smooth muscle. Respir. Res. 4, 2-24 (2003).
3.  Green, S.A. & Liggett, S.B. The Genetics of Asthma 67-90 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1996).
4.  Drazen, J.M., Silverman, E.K. & Lee, T.H. Heterogeneity of therapeutic responses in asthma. Br. Med. Bull. 56, 1054-1070 (2000).
5.  Malmstrom, K. et al. Oral montelukast, inhaled beclomethasone, and placebo
for chronic asthma. A randomized, controlled trial. Montelukast/Beclomethasone Study Group. Ann. Intern. Med. 130, 487-495 (1999).
6.  Einstein, R. et al. Alternative splicing of the G protein-coupled receptor
superfamily in human airway smooth muscle diversifies the complement of receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 5230-5235 (2008).
7.  Misior, A.M. et al. Glucocorticoid- and protein kinase A-dependent transcriptome regulation in airway smooth muscle. Am. J Respir. Cell Mol. Biol. 41, 24-39 (2009).
8.  Bosse, Y., Maghni, K. & Hudson, T.J. 1alpha,25-dihydroxy-vitamin D3 stimulation of bronchial smooth muscle cells induces autocrine, contractility, and remodeling processes. Physiol. Genomics 29, 161-168 (2007).
9.  Meyerhof, W. Elucidation of mammalian bitter taste. Rev. Physiol. Biochem.
Pharmacol. 154, 37-72 (2005).
10.  Meyerhof, W. et al. The molecular receptive ranges of human TAS2R bitter taste receptors. Chem. Senses 35, 157-170 (2010).
11.  Chandrashekar, J. et al. T2Rs function as bitter taste receptors. Cell 100, 703-711 (2000).
12.  Adler, E. et al. A novel family of mammalian taste receptors. Cell 100, 693-702 (2000).
13.  Chandrashekar, J., Hoon, M.A., Ryba, N.J. & Zuker, C.S. The receptors and
cells for mammalian taste. Nature 444, 288-294 (2006).
14.  Lombardo, L.J. & Balmes, J.R. Occupational asthma: a review. Environ. Health Perspect. 108 Suppl 4, 697-704 (2000).
15.  An, S.S., Fabry, B., Trepat, X., Wang, N. & Fredberg, J.J. Do biophysical
properties of the airway smooth muscle in culture predict airway hyperresponsiveness? Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 55-64 (2006).
16.  Martin, G. et al. Interleukin-4 activates large-conductance, calcium-activated potassium (BKCa) channels in human airway smooth muscle cells. Exp. Physiol. 93, 908-918 (2008).
17.  Morin, C., Sirois, M., Echave, V., Gomes, M.M. & Rousseau, E. Functional effects of 20-HETE on human bronchi: hyperpolarization and relaxation due to BKCa channel activation. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 293, L1037-L1044 (2007).
18.  Kotlikoff, M.I. & Kamm, K.E. Molecular mechanisms of β-adrenergic relaxation of airway smooth muscle. Annu. Rev. Physiol. 58, 115-141 (1996).
19.  Baxter, D.F. et al. A novel membrane potential-sensitive fluorescent dye improves cell-based assays for ion channels. J. Biomol. Screen. 7, 79-85 (2002).
20.  Fakler, B. & Adelman, J.P. Control of K(Ca) channels by calcium nano/microdomains. Neuron 59, 873-881 (2008).
21.  Shah, A.S., Ben Shahar, Y., Moninger, T.O., Kline, J.N. & Welsh, M.J. Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory. Science 325, 1131-1134 (2009).
22.  Finger, T.E. et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 8981-8986 (2003).
23.  Wu, S.V. et al. Expression of bitter taste receptors of the T2R family in
the gastrointestinal tract and enteroendocrine STC-1 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 2392-2397 (2002).
24.  Brockhoff, A., Behrens, M., Massarotti, A., Appendino, G. & Meyerhof, W. Broad tuning of the human bitter taste receptor hTAS2R46 to various sesquiterpene lactones, clerodane and labdane diterpenoids, strychnine, and denatonium. J. Agric. Food Chem. 55, 6236-6243 (2007).
25.  Sbarbati, A. et al. Acyl homoserine lactones induce early response in the
airway. Anat. Rec. 292, 439-448 (2009).
26.  Nakagawa, Y. et al. Sweet taste receptor expressed in pancreatic beta-cells activates the calcium and cyclic AMP signaling systems and stimulates insulin secretion. PLoS ONE 4, e5106 (2009).
27.  Felbel, J., Trockur, B., Ecker, T., Landgraf, W. & Hofmann, F. Regulation
of cytosolic calcium by cAMP and cGMP in freshly isolated smooth muscle cells from bovine trachea. J. Biol. Chem. 263, 16764-16771 (1988).
28.  Yamaguchi, H., Kajita, J. & Madison, J.M. Isoproterenol increases peripheral [Ca2+]i and decreases inner [Ca2+]i in single airway smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 268, C771-C779 (1995).
29.  Yan, W. et al. Bitter taste transduced by PLC-beta(2)-dependent rise in IP(3) and alpha-gustducin-dependent fall in cyclic nucleotides. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 280, C742-C751 (2001).  30.  Liggett, S.B. & Green, S.A. Beta2-Agonists in Asthma Treatment 19-34 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1996).
31.  Panebra, A., Schwarb, M.R., Glinka, C.B. & Liggett, S.B. Heterogeneity of
transcription factor expression and regulation in human airway epithelial and smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Lung 293, L453-L462 (2007).
32.  Liggett, S.B. et al. Altered patterns of agonist-stimulated cAMP accumulation in cells expressing mutant β2-adrenergic receptors lacking phosphorylation sites. Mol. Pharmacol. 36, 641-646 (1989).
33.  McGraw, D.W. et al. airway smooth muscle prostaglandin-EP1 receptors directly modulate beta2-adrenergic receptors within a unique heterodimeric complex. J. Clin. Invest. 116, 1400-1409 (2006).
34.  McGraw, D.W., Almoosa, K.F., Paul, R.J., Kobilka, B.K. & Liggett, S.B. Antithetic regulation by β-adrenergic receptors of Gq-receptor signaling via phospholipase-C underlies the airway β-agonist paradox. J. Clin. Invest. 112, 619-626 (2003).
35.  Yang, X.R. et al. Multiple ryanodine receptor subtypes and heterogeneous ryanodine receptor-gated Ca2+ stores in pulmonary arterial smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 289, L338-L348 (2005).
36.  Zhang, W.M. et al. ET-1 activates Ca2+ sparks in PASMC: local Ca2+ signaling between inositol trisphosphate and ryanodine receptors. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, L680-L690 (2003).
37.  Cheng, H., Lederer, W.J. & Cannell, M.B. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science 262, 740-744 (1993).
38.  Small, K.M. et al. Polymorphisms of the cardiac presynaptic α2Cadrenergic receptors: diverse intragenic variability with haplotype-specific functional effects. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 13020-13025 (2004).
39.  Livak, K.J. & Schmittgen, T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25, 402-408 (2001).
40.  McGraw, D.W. et al. Crosstalk between Gi and Gq/Gs pathways in airway smooth muscle regulates bronchial contractility and relaxation. J. Clin. Invest. 117, 1391-1398 (2007).
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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