(57)【要約】  開示された発明は滅菌プロセスをモニターするための方法に関する。上記方法は、（Ａ）滅菌プロセスの間、滅菌される物品および生物学的インジケータを滅菌培地に曝露する工程であって、該生物学的インジケータが、形質膜を有する細胞を含む、工程；および（Ｂ）該細胞の膜電位を測定して、該細胞のバイアビリティを検出する工程を含む。
2013530723.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
滅菌プロセスをモニターするための方法であって；
（Ａ）滅菌プロセスの間、滅菌される物品および生物学的インジケータを滅菌培地に曝露する工程であって、該生物学的インジケータが、形質膜を有する細胞を含む、工程；および
（Ｂ）該細胞の膜電位を測定して、該細胞のバイアビリティを検出する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記生物学的インジケータが、工程（Ａ）の後であるが工程（Ｂ）より先に、培養培地中で培養される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記滅菌培地が、少なくとも１つの液体滅菌剤を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記液体滅菌剤が、少なくとも１つの過酢酸、少なくとも１つの過酸化物、またはそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記滅菌培地が、少なくとも１つのガス状滅菌剤を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記ガス状滅菌剤が、過酸化水素を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ガス状滅菌剤が、アンモニアをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記滅菌培地が、蒸気を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的インジケータが、芽胞を含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的インジケータが、バチルス、ゲオバチルスまたはクロストリジウム属の細菌を含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的インジケータが、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アトロファエウス、バチルス・サブチリス、バチルス・スファエリクス、バチルス・アントラシス、バチルス・プミルス、バチルス・コアグランス、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・ボツリヌム、バチルス・サブチリス・グロビジ、バチルス・セレウス、バチルス・サーキュランス、大腸菌、またはそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的インジケータが、真菌、マイコバクテリア、原生生物、栄養細菌、またはそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的インジケータが、アスペルギルス・ニガー、カンジダ・アルビカンス、トリコフィトン・メンタグロフィテス、ワンギエラ・デルマティティス、マイコバクテリウム・ケローネ、マイコバクテリウム・ゴルドネ、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・テラエ、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ジアルジア・ランブリア、クロストリジウム・パルバム、アエロモナス・ヒドロフィラ、エンテロコッカス・ファカーリス、ストレプトコッカス・ファカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、ストレプトコッカス・パイロジェンス、大腸菌、クレブシエラ（ニューモニエ）、レジオネラ・ニューモフィラ、メチロバクテリウム、シュードモナス・エルギノーサ、サルモネラ・コレラエスイス、ヘリコバクター・ピロリ、ミクロコッカス・ラディオデュランス、デイノコッカス・ラジオデュランス、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、またはそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的インジケータが、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスを含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的インジケータが遺伝子組換え生物学的インジケータを含み、該遺伝子組換え生物学的インジケータが：
酵素を生産するために好適な少なくとも１つの試験生物および少なくとも１つのレポーター遺伝子を含み、該レポーター遺伝子が該試験生物によって取り込まれている、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記レポーター遺伝子が、少なくとも１つのプラスミドおよび／または少なくとも１つのウイルスを使用して前記試験生物によって取り込まれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子組換え生物学的インジケータが、前記レポーター遺伝子が少なくとも１つのインデューサーに曝露されるまで該レポーター遺伝子の発現を阻害する少なくとも１つのリプレッサー遺伝子をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記レポーター遺伝子および前記リプレッサー遺伝子が、少なくとも１つのプラスミドおよび／または少なくとも１つのウイルスを使用して前記試験生物によって取り込まれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試験生物が、１つ以上の細菌、病原体、グラム陰性生物、グラム陽性生物、栄養生物、ウイルス、非自己複製因子、亜細胞構成部または細胞生産物を含む、請求項１５から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記試験生物が、細菌芽胞を含む、請求項１５から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記試験生物が、バチルス、ゲオバチルスまたはクロストリジウム属の細菌を含む、請求項１５から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記試験生物が、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アトロファエウス、バチルス・サブチリス、バチルス・スファエリクス、バチルス・アントラシス、バチルス・プミルス、バチルス・コアグランス、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・ボツリヌム、バチルス・サブチリス・グロビジ、バチルス・セレウス、バチルス・サーキュランス、大腸菌、またはそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項１５から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記試験生物が、真菌、マイコバクテリア、原生生物、栄養細菌、またはそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項１５から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記試験生物が、アスペルギルス・ニガー、カンジダ・アルビカンス、トリコフィトン・メンタグロフィテス、ワンギエラ・デルマティティス、マイコバクテリウム・ケローネ、マイコバクテリウム・ゴルドネ、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・テラエ、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ジアルジア・ランブリア、クロストリジウム・パルバム、アエロモナス・ヒドロフィラ、エンテロコッカス・ファカーリス、ストレプトコッカス・ファカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、ストレプトコッカス・パイロジェンス、大腸菌、クレブシエラ（ニューモニエ）、レジオネラ・ニューモフィラ、メチロバクテリウム、シュードモナス・エルギノーサ、サルモネラ・コレラエスイス、ヘリコバクター・ピロリ、ミクロコッカス・ラディオデュランス、デイノコッカス・ラジオデュランス、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、またはそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項１５から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記試験生物が、栄養細菌、栄養細胞および／またはそれらの構成部を含む、請求項１５から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記試験生物が、バンコマイシン耐性腸球菌、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス、マイコバクテリウム・ケローニ、またはそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項１５から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記培養培地が、１つ以上の栄養源および１つ以上の微生物の回復、誘導または成長インジケータを含む、請求項１５から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記培養培地が、１つ以上のｐＨ緩衝液、１つ以上の浸透圧平衡維持剤、１つ以上の中和剤、またはそれらの２つ以上の混合物をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記生物学的インジケータが、培養培地にて培養され、該生物学的インジケータが膜電位蛍光色素の存在下にて培養されている、請求項１から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記色素が、カルボシアニンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記色素が、オキソノールである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記色素が、３，３’−ジヘキシルオキシカルボシアニンヨージドまたはビス−（１，３−ジブチルバルビツル酸）トリメチンオキソノールである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記膜電位が、蛍光偏光法を使用して測定される、請求項１から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記膜電位が、蛍光共鳴エネルギー転移を使用して測定される、請求項１から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記生物学的インジケータが、電圧感知色素の存在下にて培養される、請求項１から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記電圧感知色素が、スチリル色素である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記電圧感知色素が、ジ−８−ブチル−アミノナフチル−エチレン−ピリジニウム−プロピルスルホネートまたはジ−４−ブチル−アミノナフチル−エチレン−ピリジニウム−プロピルスルホネートである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記膜電位が、蛍光共鳴エネルギー転移を使用して測定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記生物学的インジケータが、導電性材料上に配置される、請求項１から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
工程（Ｂ）の間、前記生物学的インジケータが、培地中に設置され、そして該培地中の電気リードが、前記膜電位を測定するために使用される、請求項１から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記膜電位が、前記生物学的インジケータを横切ってまたは中に設置された電気リードを使用して測定される、請求項１から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
滅菌インジケータであって：基板上に配置された導電性材料；および該導電性材料の一部または全部の上に配置された生物学的インジケータを含む、滅菌インジケータ。
【請求項４３】
方法であって：
インクジェットプリンターを使用して、基板上に導電性材料を堆積させる工程；および
該インクジェットプリンターを使用して、該導電性材料の一部または全部の上のアレイに生物学的インジケータを堆積させる工程；
該導電性材料の電気特性の変化を検出するように適合された電気回路を提供する工程；
該生物学的インジケータを滅菌培地に曝露する工程；および
該導電性材料の該電気特性にいかなる変化が生じるかを決定する工程
を含む、方法。
【請求項４４】
前記生物学的インジケータが、芽胞を含む、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その全体について参照により本明細書中に援用されている２０１０年７月２０日付で出願された米国仮特許出願第６１／３５５，３０７号に関連し、そして米国特許法第１１９条（ｅ）の利益を請求する。
【０００２】
本発明は、滅菌プロセスをモニターするための方法に関する。より詳細には、本発明は、形質膜を有する細胞を含む生物学的インジゲータが滅菌培地に曝露される、滅菌プロセスをモニターするための方法に関する。生物学的インジゲータの膜電位は、次いで、細胞のバイアビリティを検出するために測定される。
【背景技術】
【０００３】
滅菌プロセスにおいて、細菌のような生物学的インジゲータを用いて、滅菌される物品が殺菌剤の活性成分の有効な程度に曝露されたか否かを決定することは一般的である。生物学的インジゲータは、プロセッサーまたは処理物自体の中で滅菌条件が満たされるという保障を提供するために使用され得る。生物学的インジゲータは、インジケータ内または上に特定のプロセスに非常に耐性のある極度に大きい数の生物を提供することによって、そのプロセシングシステムに関する最悪の事態を表すために使用され得る。そのような滅菌プロセスをモニターするための選択生物として、芽胞がしばしば使用される。典型的には、生物学的インジゲータのユーザーは、生物学的インジゲータが用いられる滅菌プロセスの効果を決定するために、生き残っている生存可能な生物の増殖後に起こり得る可視的な効果に依存する。このプロセスは、このようなインジケータが使用されれば、培養培地の濁度またはｐＨインジケータの色の変化のような可視的変化を生じるために数時間から数日かかり得る。
【０００４】
芽胞殻内に存在する内因性（内部由来であり、既存の）熱安定酵素の活性と生物の実際のバイアビリティとを相関する生物学的インジゲータが提案されている。これは、蛍光計または比色計を用いて数分から数時間に及ぶ生物学的読み取り時間になる。これらの生物学的インジゲータは、酵素の活性と生物のバイアビリティとの間の相関を提供するけれども、得られた実際の結果は、完全に酵素の活性が原因であり、そして生物のバイアビリティへの直接的なつながりはない。
【０００５】
組換え遺伝子の化学誘導で生産された外因性（外部由来であり、既存の）酵素の活性と相関する生物学的インジゲータもまた、その遺伝子を有する生存可能な試験生物が、評価されている滅菌事象後に存在する場合に提案されている。これは、蛍光定量読み取りで数分から数時間に及ぶ生物学的読み取り時間を与え、そして生物のバイアビリティへの直接的なつながりを提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの以前の技術における課題は、先行技術が、バイアビリティを検出するために生物の成長および分裂または酵素活性の存在に主に依存しているという事実に関する。生物の成長および分裂は、検出するために数時間から数日かかり得る。酵素活性は、蛍光定量的または比色定量的のいずれかで検出するのに充分高いシグナルを発生するのに数分から数時間かかり得る。このため、成長および分裂技術を使用して得られるものと同様に決定的である、迅速な結果を達成するための方法の必要性がある。本発明は、この課題への解決を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、（Ａ）滅菌プロセスの間、滅菌される物品および生物学的インジケータの両方を滅菌培地に曝露する工程であって、生物学的インジケータが、形質膜を有する細胞を含む工程；および（Ｂ）プロセスに供した細胞の膜電位を測定して、滅菌プロセスの完了後の細胞群内の残存するバイアビリティを検出する工程を含む方法に関する。このバイアビリティは、イオンフラックス事象またはインジケータ芽胞の出芽に関連する膜電位変化によって例示されるが、これらに限定されない。
【０００８】
本発明は、基板上に配置された導電性材料を含む滅菌インジケータ、および導電性材料の一部または全部の上に配置された生物学的インジケータ（例えば、芽胞）に関する。
【０００９】
本発明は、滅菌インジケータを作製するための方法に関し、この方法は、基板上に導電性材料を堆積させる工程（例えば、インクジェット印刷が例示されるがこれに限定されない印刷法を使用する）および、例えば、インクジェットプリンターを使用して、導電性材料の一部または全部の上に生物学的インジケータ（例えば、芽胞）を堆積させる工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例１で試験された芽胞に関する膜電位の変化を示すプロットである。
【図２】図２は、蛍光偏光法の概略図である。
【図３】図３は、出芽の電子モニタリングと併せて使用される生物学的インジケータの概略図である。
【図４】図４および５は、電気シグナルを通じて膜電位の評価のための代替の生物学的インジケータの図である。
【図５】図４および５は、電気シグナルを通じて膜電位の評価のための代替の生物学的インジケータの図である。
【図６】図６は、本発明に従う滅菌インジケータの電気的実施形態の底部エレメントの概略図である。
【図７】図７は、図６のような、本発明に従う滅菌インジケータの電気的実施形態の上部エレメントの概略図である。
【図８】図８は、図４〜７のような、本発明の実施形態での使用のための上部シール層の概略平面図である。
【図９】図９は、本発明の別の実施形態の底部エレメント７００の概略平面図であり、滅菌インジケータの蛍光ベースの実施形態である。
【図１０】図１０は、例示的な電子滅菌インジケータカードの正面および背面図とともに、本発明の一実施形態に従う滅菌インジケータの電子ベースバージョンでの使用のためのリーダーの概略正面図である。
【図１１Ａ】図１１ＡおよびＢは、それぞれ閉鎖および開放位置にて、本発明の一実施形態に従う滅菌インジケータの蛍光ベースバージョンでの使用のためのリーダーの概略正面図である。
【図１１Ｂ】図１１ＡおよびＢは、それぞれ閉鎖および開放位置にて、本発明の一実施形態に従う滅菌インジケータの蛍光ベースバージョンでの使用のためのリーダーの概略正面図である。
【図１２】図１２は、例示的な蛍光滅菌インジケータカードの正面および背面図とともに、図１１のような蛍光リーダーの内部コンポーネントの概略透視図である。
【図１３】図１３は、ＦＡＢＩセルフコンテインド生物学的インジケータでの使用のためのリーダーの概略正面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
用語「滅菌」は、物質を繁殖、代謝および／または成長することができないようにすることをいう。これは、しばしば、生存する生物の完全な非存在を意味すると取られる一方で、当該用語は、許容可能であると予め同意または決定された程度にまで、物質が生存する生物を含まないことを指すために、本明細書において使用され得る。他に示されなければ、滅菌という用語は、滅菌よりも厳密ではない方法および手順、例えば、消毒、衛生化などをもいうために、本明細書において使用され得る。
【００１２】
本明細書に記載されるプロセスおよび装置は、保健医療分野、科学的分野などにおいて使用され得る。これらは、滅菌、消毒、衛生化、除染、洗浄などが所望され得る、商業および工業用途において用いられ得る。商業および工業用途は、例えば、食品加工、低温殺菌、土壌浄化、水浄化などのプロセスをも含み得る。
【００１３】
本発明の方法が使用され得る滅菌プロセスは、任意の滅菌プロセスを含み得る。滅菌プロセスは、滅菌培地または滅菌剤が、蒸気、乾熱、放射線、プラズマ、ならびに１つ以上のガス状滅菌剤、１つ以上の液体滅菌剤などを含み得る、滅菌プロセスを含み得る。使用される放射線ベースのプロセスは、イオン化照射、パルス状の白色光もしくは紫外光、マイクロ波などを含む、電子ビームまたは任意の電磁スペクトルを含み得る。放射線は、ガンマまたはベータ放射線を含み得る。ガス状滅菌剤は、エチレンオキシド、ガス状過酸化水素などを含み得る。液体滅菌剤は、ホルマリン（水に溶解され、かつ毒性物質の形成を阻害するために、必要に応じてメタノールを含むホルムアルデヒドガス）、グルタルアルデヒド、過酢酸、液体過酸化水素などを含み得る。生物学的インジケータは、生物学的インジケータが提供される試験生物よりも滅菌プロセスへの耐性が低い、任意の微生物に対する滅菌剤の致死率を調べるために使用され得る。これらの微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、レジオネラ種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、カンピロバクター種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、および他の腸内細菌、これら以外にもスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種および他のヒト病原性微生物、例えば、クリプトスポリディウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）を含み得る。生物学的インジケータは１つ以上の試験生物を含み得る。試験生物は、意図される滅菌プロセスへのその耐性が、滅菌プロセスが破壊するように設計される他の生物の耐性を越える、形質膜を有する任意の細胞を含み得る。生物学的インジケータとしてとして使用される試験生物のタイプは、これに限定されないが、使用される滅菌プロセスのタイプによって例示される種々の因子に依存し得る。試験生物は微生物であり得る。使用され得る株は、滅菌に使用されるプロセスへの最も耐性のある株であり得る。試験生物は細菌を含み得る。細菌微生物は、内生芽胞、すなわち、細菌芽胞を形成する微生物であり得る。試験生物は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはクロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）属の細菌を含み得る。試験生物は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、バチルス・サブチリス・グロビジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、およびバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはそれらの２つ以上の混合物などを含み得る。
【００１４】
試験生物は、真菌、マイコバクテリア、原生生物、栄養細菌、栄養細胞および／またはそれらの構成部などを含み得る。使用され得る真菌の例としては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、およびワンギエラ・デルマティティス（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）などが挙げられ得る。使用され得るマイコバクテリアの例としては、マイコバクテリウム・ケローネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウム・ゴルドネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、およびマイコバクテリウム・テラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｅｒｒａｅ）などが挙げられ得る。使用され得る原虫の例としては、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、およびクロストリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などが挙げられ得る。使用され得る栄養細菌の例としては、アエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、エンテロコッカス・ファカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ファカーリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・パイロジェンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ（ニューモニエ）（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ・コレラエスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）などが挙げられ得る。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アトロファエウス、バチルス・サブチリス、バチルス・コアグランス、クロストリジウム・スポロゲネスなどの生物は、湿性の加熱滅菌（加圧滅菌）の有効性を決定するために使用され得、特にゲオバチルス・ステアロサーモフィルスが有用である。
【００１５】
試験生物は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、ワンギエラ・デルマティティス（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、マイコバクテリウム・ケローネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウム・ゴルドネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅ）、マイコバクテリウム・スメグマチスス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・テラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｅｒｒａｅ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、クロストリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、エンテロコッカス・ファカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ファカーリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・パイロジェンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ・コレラエスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ミクロコッカス・ラディオデュランス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、デイノコッカス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）またはそれらの２つ以上の混合物を含み得る。
【００１６】
最も耐性のある生物を表すそれらの承認に基づいて選択された試験生物（例えば、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスおよびバチルス・アトロファエウス）に加えて、生物学的インジケータは、例えば、バチルス・アントラシスなどのバイオテロリズムまたは細菌戦の作用物質をさらに含み得る。これらの耐性生物は、天然または人為的な改変により、抗生物質処理または化学消毒の以前に有効な手段に対して耐性となった株もまた含み得る。以前のタイプの例としては、ＶＲＥ（バンコマイシン耐性のエンテロコッカス）、ＭＳＲＡ（メチシリン耐性のスタフィロコッカス・アウレウス）、マイコバクテリウム・ケローネなどが挙げられ得る。ＶＲＥおよびＭＲＳＡが治療手段への耐性（例えば、抗生物質耐性）を近年発達させ、かつＭ．ケローニ（Ｍ  ｃｈｅｌｏｎｉ）がある様式の消毒への耐性（例えば、グルタルアルデヒド耐性）を発達させるため、そのような耐性生物が望ましいとされ得、そしてこのために、「最も悪い場合」のモデルとして適した試験生物を提供し得る。
【００１７】
細菌のような生存可能な生物において、細胞の形質膜を横切る電位が現れる。この膜電位は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の発生、走化性、グルコース輸送、および低ｐＨにおける生物の生存のような活動に必要な生物のプロトン駆動力において必須の役割を果たす。膜電位の確立は、生物が出芽し始めるか、そうでなければ環境の変化に反応するときに起こる最初の事象の１つである。膜電位の確立は、細胞が物質／情報をその環境と交換することを可能にする。このため、膜電位を測定することによって、本発明の方法は、細胞バイアビリティに対する即時のまたは迅速な読み取りを提供する。
【００１８】
生存可能な活発に代謝している生物における膜電位は高いものであり得、そして高い膜電位を有する細胞は、しばしばエネルギーを与えられた（ｅｎｅｒｇｉｚｅｄ）または過分極されたといわれる。生存不能な生物および休眠状態の生物は、低い〜ゼロの膜電位を示し得、そしてしばしばエネルギーを奪われた（ｄｅ−ｅｎｅｒｇｉｚｅｄ）または脱分極されたといわれる。
【００１９】
本発明の方法は、試験生物のバイアビリティを検出する手段として、試験生物の出芽および成長の際に生じる膜電位変化に依存し得る。生存可能な生物が出芽および成長に有利な条件におかれたとき、その生物の膜電位は変化し得る。もし、一方で、生物が生存不能であれば、出芽することができずそしてその膜電位の変化が生じ得ない。
【００２０】
生物学的インジケータは遺伝子組換えされた生物学的インジケータを含み得、これは、好適な媒体（例えば、プラスミドまたはウイルス）を使用して、試験生物（例えば、細菌微生物）によって取り込まれた膜電位の増強に適したレポーター遺伝子をさらに含み得る。レポーター遺伝子の発現は、リプレッサー遺伝子によって活発に遮断され得る。レポーター遺伝子の発現は、リプレッサー遺伝子が回復培地に存在し得るインデューサーに曝露されるまで遮断されたままであり得る。遺伝子組換えされた生物学的インジケータでの使用のための試験生物は、上記試験生物のいずれかを含み得る。ある実施形態では、試験生物は、滅菌プロセスが完了した後までインデューサーに曝露されず、そして結果として、インジケータ酵素は、滅菌の前または間に存在しない。滅菌プロセスに曝露され得るものは、試験生物が生き残りそして成長するために使用し、そしてインジケータ酵素の生産のためにもまた使用される様々かつ必須のメカニズムである。これらは、細胞の成長（およびプラスミドの複製）のために使用されるＤＮＡポリメラーゼ、試験生物（およびリポーター遺伝子を持つプラスミドまたはウイルス）の代謝必要物の転写のためのＲＮＡポリメラーゼおよび細胞内タンパク質の翻訳（ならびにインジケータ酵素の発現およびまたはイオン輸送メカニズム）のために必要なリボソームポリソームを含み得る。
【００２１】
膜電位蛍光色素の２つの主要なクラスがあり、各クラスは細胞へ結合する方法が異なる。膜電位蛍光色素の第１のクラスであるカルボシアニンは、過分極された膜上に蓄積し、そして脂質二重層内に輸送され得る。有用なカルボシアニンは、３，３’−ジヘキシルオキサカルボシアニンヨージド［ＤｉＯＣ６（３）］である。使用され得る膜電位色素の第２のクラスはオキソノールを含む。オキソノール色素は脱分極された細胞に入り、そして細胞内タンパク質または膜に結合し得る。有用なオキソノール色素は、ビス−（１，３−ジブチルバルビツル酸）トリメチンオキソノール［ＤｉＢＡＣ４（３）］である。カルボシアニン色素を用いた場合、時間および膜電位とともに蛍光は増加し得る。これに対して、オキソノールを用いた場合、時間および減少した膜電位とともに蛍光は減少し得る。膜電位の存在または不在は、次いで、経時的に蛍光と直接的に関連し得る。
【００２２】
培養培地は、成長培地または回復培地といわれ得る。培養培地は固体または液体の形態であり得る。培養培地は、生物学的インジケータがｐＨシフト、酸化還元電位、酵素活性などに対してより感受性であり得るように、特定の緩衝化水溶液を含み得る。
【００２３】
滅菌インジケータは、滅菌インジケータが滅菌プロセスの間滅菌培地に曝露され、そして次に回復および誘導に曝露される任意のプロセスにおいて使用され得る。培養培地は１つ以上の栄養源を含み得る。栄養源は、滅菌プロセスを生き残り得る試験生物のいずれかの成長のためのエネルギーを提供するために使用され得る。栄養源の例としては、カゼインの膵液消化物、大豆ミールの酵素消化物、スクロース、デキストロース、酵母抽出物、Ｌ−システイン、およびこれらの２つ以上の混合物が挙げられ得る。微生物成長インジケータは、色または本来の状態を変化させ、生存可能な試験生物の存在下にて培養培地と一緒に使用され得る。
【００２４】
培養（回復／誘導）培地は、例えば、膜電位色素または電圧感受性色素を含み得る。これらの微生物の成長インジケータの使用は、ｐＨの変化、酸化還元電位、酵素活性ならびに他の成長の指標のような、微生物成長の現象に応答した蛍光の変化という結果になり得る。
【００２５】
培養培地は、１つ以上のｐＨ緩衝液、１つ以上の中和剤、１つ以上の浸透圧平衡維持剤、またはそれらの２つ以上の混合物をさらに含み得る。ｐＨ緩衝液は、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２”−ニトリロトリエタノール（ビス  トリス）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］プロパン（ビス−トリス  プロパン）、４−（２−ヒドロキシメチル）ピペラジン−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｚｍａ、トリスベース）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン(Ｔｒｉｃｉｎｅ)）、ジグリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ））、Ｎ−（２−１５アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（アセス（ａｃｅｓ））、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、β−ヒドロキシ−４−モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸（ＭＯＢＳ）、２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸水和物（ＨＥＰＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）２水和物（ＰＯＰＳＯ）、４−（２−２５ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）、［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸（ＴＡＢＳ）、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシル−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸（ＣＡＢＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸水和物（ＭＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、およびそれらの２つ以上の混合物が挙げられ得る。
【００２６】
中和剤としては、これらに限定されないが、チオグリコール酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、カタラーゼ、重硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、レシチン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、重炭酸カルシウム、およびそれらの２つ以上の混合物が挙げられ得る。
【００２７】
浸透圧平衡維持剤としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、カルシウム塩、その他、例えば、遷移金属塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化鉄、およびそれらの２つ以上の混合物が挙げられ得る。
【００２８】
１つの実施形態では、培養培地は、水；水１リットル当たり約０．０１〜約１００グラム（ｇ／ｌ）、および１つの実施形態において約０．１〜約５０ｇ／ｌの、１つ以上の栄養源；約１．０×１０−５〜約１０ｇ／ｌ、および１つの実施形態において約１．０×１０−４〜約１．０ｇ／ｌの、１つ以上の微生物成長インジケータ；約５０００ｇ／ｌまでの、および１つの実施形態において約０．００１〜約５０００ｇ／ｌの、および１つの実施形態において約０．１〜約１０００ｇ／ｌの、１つ以上のｐＨ緩衝液；約１００ｇ／ｌまでの、および１つの実施形態において約０．０１〜約１００ｇ／ｌのおよび１つの実施形態において約０．１〜約５０ｇ／ｌの、１つ以上の中和剤；約５０ｇ／ｌまでの、および１つの実施形態において約０．１〜約５０ｇ／ｌの、および１つの実施形態において約０．１〜約２５ｇ／ｌの、１つ以上の浸透圧平衡維持剤を含む、水性組成物を含む。
【００２９】
培養培地は、栄養ブロス、Ｄ／Ｅ中和ブロス、デイビス最小培地、滅菌性試験ブロス、および大豆−カゼイン消化物または牛肉エキスベースの培地を含み得る。これらは大豆−カゼイン消化物ブロス、液体チオグリコレートおよびデキストローストリプトン（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）の水溶液を含み得る。改変トリプシン大豆ブロスベース（グルコースなし）が、使用され得る。膜電位色素または電圧感受性色素もまた添加され得る。
【００３０】
使用され得る培養培地の一例は、ＢａｃｔｏＴＭ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈであり、これは、カゼインの膵液消化物（１７．０ｇ／ｌ）、大豆ミールの酵素消化物（３．０ｇ／ｌ）、塩化ナトリウム（５．０ｇ／ｌ）、リン酸二カリウム（２．５ｇ／ｌ）、およびデキストロース（２．５ｇ／ｌ）を含む。これらの成分は、水に分散または溶解され得る。ｇ／ｌの用語にて表現される濃度は、１リットルの水当たりの成分のグラムをいう。カゼインの膵液消化物、大豆ミールの酵素消化物、およびデキストロースは、微生物の成長のためのエネルギー源を供給する。これらは、栄養源といわれ得る。塩化ナトリウムは、液体培地における浸透圧平衡を維持するために使用され得る。リン酸二カリウムは、ｐＨ緩衝液として作用し得る。例えば、膜電位色素であるＤｉＯＣ６（３）は、ＢａｃｔｏＴＭ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ処方に添加され得る（３μｇ／ｌ）。
【００３１】
培養培地は、イオンフラックス事象を高めるかつ／または芽胞の出芽を開始するためにのみ供し得る非常に基本的な処方を含み得る。この培地はアミノ酸、塩、および／または糖を含み得る。アミノ酸の例としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−乳酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−酒石酸、葉酸、Ｌ−チロシン、Ｌ−プロリン、およびアスパラギンが挙げられる。塩の例は、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムである。糖の例としては、グルコース、スクロース、フルクトース、およびキシロースが挙げられる。さらなるイオンフラックス事象または出芽事象は、ペプチドグリカンおよびムロペプチドのような成長中の生物の上清にみられる成分によって引き起こされ得る。
【００３２】
膜電位色素は蛍光であり、それゆえ選択の検出方法は、遊離色素分子からの蛍光と膜内に結合された色素分子からの蛍光との間を区別する能力を有さなければならない。これら２つの供給源からの蛍光放出間を区別するのに特に適した２つの方法は、蛍光偏光法（蛍光異方性としても知られる）および蛍光共鳴エネルギー転移ベースの（ＦＲＥＴベースの）技術（時間分解ＦＲＥＴを含む）である。
【００３３】
蛍光偏光法は、検出用蛍光分子の見かけのサイズの変化に依存する検出方法である。偏光測定は、偏光による蛍光体の選択励起の原理に基づき得る。蛍光体は、蛍光体の分子軸に関して特定方向に沿って位置する吸収および放出のための遷移モーメントを有し、その電気ベクトルがこれらの遷移モーメントに平行に整列される光子を優先的に吸収する。アイソトロピック溶液中にて、蛍光体は、ランダムに配向され得る。偏光での励起により、その吸収遷移双極子が励起の電気ベクトルに平行である蛍光体分子が、優先的に励起され得る。この選択励起は、蛍光体の部分的に配向された集団を生じ、さらに部分的に偏光された蛍光放出を生じる。放出は、蛍光体内の固定軸に沿って偏光された光でまた生じる。蛍光偏光法は平面偏光で分子を励起し得る。放出光は、次いで最初の平面偏光位置および平面偏光からの位置オフセット（通常９０°オフセットである）の両方で測定され得る。例えば、励起光の電気ベクトルが垂直に平面偏光化される場合、放出光は、垂直または水平位置の両方で測定され得る。励起光の電気ベクトルと「整列」されている蛍光体が、光を優先的に吸収する。放出光は、次いで水平の偏光位置内および垂直の偏光位置の両方にて測定され得る。偏光は、光強度の比率として表現され得、そして、励起および放出の間の期間内の分子回転の程度の測定値である。小さい分子は、より大きい分子よりも、より速く回転し得、そしてより低い固有偏光値（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）を有し得る。一方、より大きい分子は、回転が少なく、それゆえより高い固有偏光値を有する。蛍光偏光法を使用することによって、結合された膜電位色素と結合されていない膜電位色素との間を区別することが可能であり得る。
【００３４】
蛍光偏光法に基づくインキュベーター／リーダーは、図２にて示されるように設計され得る。図２は蛍光偏光法の概略図である。図２について、インキュベーター／リーダー１００は、サンプル１１０の試験を提供し、単色光源１２０、ビームスプリッター１３０、ならびに偏光器１４０、１５０および１６０を備える。単色光源１２０からの単色光は偏光器１４０を通過し、全ての励起光が偏光化される。この偏光は次いで、フィルターと同じ偏光状態にあるサンプル１１０内の分子のみを励起する。これらの分子が回転するにつれて、それらは、平面偏光位置外へ移動する。放出光はビームスプリッター１３０によって分割される。ビームスプリッターは光を分割し、そしておよそ半分の光を、励起光と同じ平面に配向された偏光器１５０に通過させ、そして他の半分を、最初の励起光に対してある角度にて配向された偏光器１６０に通過させる。各偏光器１５０および１６０を通過した光を測定および比較する。
【００３５】
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、最初に励起されたドナー蛍光体からアクセプター蛍光体へのエネルギーの転移である。ドナー蛍光体は、典型的に、アクセプターの吸収スペクトルと重複する、より短い波長にて放出する。共鳴エネルギー転移は、光子の出現なく生じ、ドナー蛍光体とアクセプター蛍光体との間の長距離二極間相互作用の結果である。
【００３６】
ＦＲＥＴで膜電位変化をモニターするために、２つの蛍光体が要求される。ＦＲＥＴドナーは、アクセプターに充分な吸収スペクトルを提供し得る任意の蛍光体であり得る。アクセプター蛍光体は膜電位色素であり得る。好ましくは、ドナー蛍光体は芽胞壁に付着または接着し得、膜電位色素と極めて近接させることを可能にする。そうでなければ、蛍光検出（ＦＲＥＴ）の選択は、本明細書中の他の箇所または提供された実施例に記載された同じタイプの蛍光メーターによってモニターされ得る。
【００３７】
膜電位色素に加えて、電圧感知または電圧感受性色素は、なお別の原理のセットを使用して生物の膜電位の同じ変化を検出し得る。膜電位の検出のための電圧感受性色素の使用は、エレクトロクロミズムとして知られた物理的メカニズムに基づく。これらの色素の励起および放出スペクトルの両方が、電圧変化による重大なシフトを示す。スペクトルにおけるこれらのシフトは、膜電位変化を反映する電荷再配置から生じる。最も一般的に使用されるクラスの電圧感受性色素は、スチリル色素であり、具体例としては、ジ−８−ブチル−アミノ−ナフチル−エチレン−ピリジニウム−プロピル−スルホネート（ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ）およびジ−４−ブチル−アミノ−ナフチル−エチレン−ピリジニウム−プロピル−スルホネート（ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ）が挙げられる。
【００３８】
ＦＲＥＴ型技術と組み合わせた電圧感受性色素の使用は、膜電位変化の容易な検出を可能にする。例えば、電荷再配置が、芽胞のような出芽生物の膜に生じるとき、電圧感受性色素の放出波長がシフトし始める。放出波長におけるこのシフトは、次いで培養培地内に位置する第２の蛍光体によって検出され得る。この第２の波長からの放出は検出器によって検出され得る。例えば、ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳの励起スペクトルのピークは、電圧／電荷特性に依存して４５０ｎｍと５２０ｎｍとの間をシフトする。これは、５３０ｎｍから６４０ｎｍまでの放出スペクトルにおいて相当するピークシフトを生じる。蛍光メーター／インキュベーターは、ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳを４５０ｎｍまたは５２０ｎｍのいずれかで励起し、次いでｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳの相当する放出ピークにて励起ピークを有する第２の蛍光体を検出するように設計され得る。
【００３９】
膜電位変化の検出のための代替の検出方法は、電子シグナルの使用である。芽胞などの生物が出芽し始めるとき、膜電位が増加し、より多くの電流およびより大きな電圧の下降を可能にし、増加された膜電位からのイオン輸送の増加（それは、電流の増加として観察される）を生じる。電子リードは、培地中に、または生物学的インジケータ基板を横切って／内に設置され得、膜電位を電気的に測定する。電気シグナルを測定する生物学的インジケータの３つの可能な設計が、以下の図３〜５に示される。図３について、生物学的インジケータ２００が、ベッセル２０４内に含まれる培地２０２内に設置される。電子リード２０６および２０８が培地２０２内に設置され、そして膜電位を測定するために使用される。図４について、電子リード２１０および２１２が、生物学的インジケータ２１４を横切って膜電位を測定するために使用される。図５について、電子リード２２０および２２２が、生物学的インジケータ２２４内で膜電位を測定するために使用される。
【００４０】
滅菌インジケータは、基板上に配置された導電性材料（例えば、シリコンのような非導電基板上に形成された銅回路のような導電性材料）および導電性材料の一部または全部の上に配置された生物学的インジケータ（例えば、芽胞）を含み得る。例えば、生物学的インジケータ（例えば、芽胞）および導電性材料（例えば、銅）を含む電子回路または導電性デジタルパターンは、Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍから入手可能なＤｉｍａｔｉｘ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｐｒｉｎｔｅｒ  ＤＭＰ−２８００のようなインクジェットプリンターを使用して、非導電性基板（例えば、シリコン基板）上に堆積され得る。電子回路または導電性デジタルパターンは任意の所望のパターンを使用する基板上に堆積され得る。生物学的インジケータは、次いでインクジェットプリンターを使用して電子回路または導電性デジタルパターンの一部または全部の上に堆積され得る。生物学的インジケータは、液状媒体または培地（例えば、水）内に分散され得、次いで約５ピコリットル、または約１０ピコリットル程度の小さな液滴で、電子回路またはデジタルパターンの一部または全部の上に堆積され得る。典型的な芽胞体積は、芽胞あたり約３ピコリットルであり得る。
【００４１】
生物学的インジケータは、生存生物（例えば、芽胞）が出芽し始めるとき、電圧（電位）、電流、抵抗性および／またはインピーダンスをモニターすることによって電気的に評価され得る。測定方法の選択は、電子設計を決定する。利点としては、生物学的インジケータを読み取るために必要な時間の減少が挙げられる。検出方法は、出芽後成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）または特定のレポーター酵素よりむしろ生物の出芽事象のカスケードにおける最も早い段階の１つに依存するため、検出時間は非常に減少し得る。
【００４２】
図６は、図４および５に示されるような、本発明の実施形態に従う滅菌インジケータの電子バージョンの底部エレメント６００の概略図である。図６は、滅菌インジケータの底部エレメント６００のエレメントを、より詳細に示す。底部エレメント６００は、導電性材料６０２（例えば、ポリアクリルアミド／ポリアニリンの単分子層）を含み、非導電性基板６０４上に配置される。導電性材料６０２は、その材料が、滅菌インジケータが使用される滅菌条件での使用に適する限り、任意の好適な材料を含み得る。非導電性基板６０４は、ＰＥＴまたは滅菌インジケータが使用され得る滅菌条件での使用に好適な他の好適な材料のような、任意の好適な気体／液体不透過性基板材料であり得る。図６に示すように、導電する下層６０６は、導電性材料６０２と層６０４との間に配置され、導電性材料６０２および検出回路と電気的に連通している。検出回路は、一連のシリアルトランジスタプリアンプ６０８を含み、電気コネクター６１０およびアースコネクター６１１に電気的に接続される。電気コネクター６１０は、以下に記載されるように、底部エレメント６００からリーダーデバイスまで電気的相互作用を提供する。プリアンプ６０８は、以下により詳細に記載されるように、滅菌インジケータを通過する電流の変化の段階的増幅を提供する。一連のアンプを有することによって、生物学的インジケータカードからのシグナルは、過剰ノイズの導入なしに好適に増幅され得る。回路はアースコネクター６１１によって完了される。
【００４３】
図６に示すように、好適な試験生物の芽胞６１２は、導電単分子層６０２上に堆積されまたは内に埋め込まれ得る。芽胞６１２は、個別の芽胞としてまたは複合の芽胞として堆積され得る。芽胞６１２は、例えば、ポリアクリルアミド／バッファー混合物内に堆積され得、その場合、芽胞がバッファー材料の「泡」の中にあると考えられ、その「泡」はポリアクリルアミドのようなマトリックス内に埋め込まれる。あるいは、芽胞６１２は、例えばポリアニリンの層内に直接埋め込まれ得る。
【００４４】
図７（滅菌インジケータに関する上部エレメント６１４の上部平面図である）について、本発明のこの実施形態のさらなる詳細が示される。図７に示す上部エレメント６１４の側は、図６に示す構造の上部層に直面し、かつ接触する側である。上部エレメント６１４は、取り外し可能な気体／液体不透過性保護膜６１６を含み、その上に気体／蒸気透過性層６１８が形成される。導電性層６２０は、透過性層６１８の上層にある。滅菌インジケータが組み立てられたとき、導電性層６２０は、芽胞６１２および任意の周囲の導電性材料（例えば、導電性単分子層６０２）と電気的に連通し、リード６２６を介してコネクター６２２とも電気的に連通する。図７に示すように、コネクター６２２は、絶縁パッド６２４の下に配置される。コネクター６２２は、ワイヤー６２６を経由し、導電性層６２０、芽胞６１２、導電性下層６０６、プリアンプ６０８およびコネクター６１０によって形成された電気回路を完了する。この電気回路を通じた電流の変化は、任意の試験生物が、滅菌インジケータ６００が使用される滅菌プロセスを生き残ったかを検出するために使用される。図７に示すように、上部エレメント６１４は接着ライン６２８を含み、それによって上部エレメント６１４は底部エレメント６００に密着され、こうしてこの実施形態の滅菌インジケータを形成する。
【００４５】
滅菌インジケータの使用前、気体／液体不透過性保護膜６１６は原位置に残とどまり、滅菌インジケータ６００を環境への曝露から保護する。滅菌インジケータを滅菌プロセスに使用する直前に、膜６１６は取り外され、滅菌培地が滅菌インジケータ内の芽胞６１２に到達することを可能にする。
【００４６】
図８は、図４〜７のような、本発明の実施形態にて使用の上部シール層６３０の概略上部平面図である。図８に示す実施形態では、上部シール６３０は、下層の芽胞６１２を活性化しそして支持する熱安定性インデューサーおよび培地を含む液体充填チャンバ６３２を含む。液体充填チャンバ６３２は、破壊容易な剥離ゾーン(ｆｒａｎｇｉｂｌｅ  ｂｒｅａｋ−ａｗａｙ  ｚｏｎｅ）６３４によって、上部シール層６３０の残りに接続され、それにより、チャンバは上部シール６３０の残りから取り外され得る。上部シール６３０は、上部エレメント６１４の気体／液体透過性層６１８と連通するウィンドウ６３６をさらに含む。上部シール６３０は、上部シール６３０を上部エレメント６１４に付着させるために、熱溶接点６３８および剥離容易な接着ゾーン（ｐｅｅｌａｂｌｅ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｚｏｎｅ）６４０をさらに含む。熱溶接点６３８によりチャンバ６３２が上部エレメント６３０に付着している。
【００４７】
図９は、本発明の別の実施形態の底部エレメント７００の概略上部平面図であり、滅菌インジケータの蛍光ベースの実施形態である。図９に示す滅菌インジケータは、滅菌プロセスの成功または失敗の指標として、成長中の芽胞によって発生される蛍光に依存する。
【００４８】
図９に示す実施形態では、底部エレメント７００は、上層の材料またはエレメントが堆積される裏打ち基板７０２を含む。裏打ち基板７０２は、任意の好適な気体／液体不透過性材料(例えば、ＰＥＴ（例えば、Ｍｙｌａｒ（登録商標））、ポリプロピレン、金属もしくはラッカー塗装箔、または滅菌インジケータに役に立つものとして当業者に公知の任意の好適なポリオレフィン）であり得る。水和している単分子層７０４が、裏打ち基板７０２上に堆積される。水和している単分子層７０４は、例えば、ポリアクリルアミドであり得、そして、芽胞のための付着を加えるものであってもよく、または芽胞が、水和している単分子層７０４内に埋め込まれてもよい。底部エレメント７０２は、気体／蒸気透過性の蛍光波長透過シール（図示せず）によって覆われ、底部エレメント７０２に接着または密着される。透過シールは、滅菌培地の試験生物の芽胞への進入を可能にし、そして滅菌インジケータを読み取るために使用された励起および蛍光波長の通過を可能とする。
【００４９】
図９にて説明された実施形態では、芽胞は、芽胞の「スポット」の１０×１０グリッド７０６内に塗布される。各スポットは、例えば、約１５０から約３００の芽胞を含み得る。図９の実施形態では、１０×１０グリッドの８×１２アレイがある。各スポットは、約１５０から約３００の芽胞を含むため、アレイの９６エレメントのそれぞれに１００スポットがあり、図９に示す滅菌インジケータ上に約１．４４×１０６から約２．８８×１０６の芽胞が存在する。
【００５０】
図９にて説明された実施形態は、液体充填チャンバ７０８をさらに含み、このチャンバは、例えば、検出される蛍光事象を発生する芽胞を活性化しそして支持するのに必要な熱安定性インデューサーおよび培地を含む。液体充填コンテナ７０８は、破壊容易な剥離ゾーン７１０によって底部エレメント７００の残りに付着される。破壊容易な剥離ゾーン７１０を破ったとき、コンテナ７０８の中身はグリッド７０６内の芽胞に提供される。
【００５１】
底部エレメント７００は、気体／蒸気透過性カバー（図示せず）が底部エレメントに密着されている周囲接着ライン７１２をさらに含む。
【００５２】
図１０は、図６のような、例示的な電子滅菌インジケータカードの正面および背面図とともに、本発明の実施形態に従う滅菌インジケータの電子ベースバージョンでの使用のための電子リーダー１０００の概略正面図である。電子リーダー１０００は、生物学的インジケータカードのその読み取りから得られた関連情報を表示するための前部表示パネル１００２を含む。電子リーダー１０００は、生物学的インジケータカードを挿入するための前部アクセスパネル１００４およびスロット１００６をさらに含む。図１０は、生物学的インジケータカード１００８の例示的な電子バージョンの図示もまた含み、図６に関して上述したような生物学的および電子コンポーネント（電気コネクター１０１０を含む）を含む。
【００５３】
電子リーダー１０００は好適な電子コンポーネントを含み、生物学的インジケータカード１００８の電気的コネクター１０１０と接触する。前部アクセスパネル１００４は、統合ローラーなどを含み得、培養のための液体リザーバーおよびヒーターを活性化させる。
【００５４】
図１０は、例示的な電子滅菌インジケータカード１００８の正面図および背面図の両方を示す。正面図のコンポーネントは、図６の実施形態に関して一般に記載されている。インジケータカード１００８の背面は、例えば、生物学的インジケータの特定のタイプ、滅菌培地、滅菌プロセスパラメーター、ロット番号、生物学的インジケータ試験の日付および結果に関連した情報を含み得る。インジケータカード１００８上に示された情報はこれらの具体例に限定されず；理解されるように、重要であるとみなされ得る他の情報も含まれ得る。インジケータカード１００８は、磁気ストリップ１０１２を含み得、理解されるように、滅菌プロセス、試験結果などに関連する情報の自動化読み取りおよび保存を促進する。
【００５５】
図１１Ａおよび図１１Ｂは、それぞれ閉鎖および開放位置にて、本発明の実施形態と一致して、滅菌インジケータの蛍光ベースバージョンでの使用のための蛍光リーダー１１００の概略正面図である。図１１Ａは、蛍光リーダー１１００が閉鎖位置であることを示す。蛍光リーダー１１００は、生物学的インジケータカードのその読み取りから得られた関連情報を表示するための前部表示パネル１１０２を含む。蛍光リーダー１１００は、図１１Ｂに示すように、前部アクセスパネル１１０４（それは開放し得る）をさらに含む。
【００５６】
図１１Ｂに示すように、前部アクセスパネル１１０４は外側に開き、そしてスロット１１０６を含み、その中に、図９に関して上記したように、蛍光ベース生物学的インジケータカードが挿入され得る。インジケータカードがスロット１１０６内に挿入されたとき、前部アクセスパネル１１０４は閉じられ、インジケータカードをリーダーチャンバ１１０８（スロット内でインジケータカードから情報を得るためのコンポーネントを含む）内に設置する。リーダーチャンバ１１０８の例示的な好適なコンポーネントは図１２に関して記載される。前部アクセスパネル１１０４は、統合ローラーなどを含み得、培養のために液体リザーバーおよびヒーターを活性化する。
【００５７】
図１２は、例示的な蛍光ベースの滅菌インジケータカードの正面および背面図とともに、図１１のような蛍光リーダー１２００の内部コンポーネントの概略透視図である。
【００５８】
蛍光リーダー１２００は、蛍光ベースの滅菌インジケータを読み取るための好適なコンポーネントを含む。いくつかの例示的なコンポーネントは、図１２に図示される。リーダー１２００は、冷却ＣＣＤ（電荷結合素子）カメラおよびイメージプロセッサー１２０２（ＣＣＤカメラから得られたデータ処理のための好適なハードウェアおよびソフトウェアを含む）のような好適な読み取りデバイスを含み得る。リーダー１２００は、ＬＥＤエキサイターおよび蛍光検出器のような好適なオプティクス１２０４を含み得る。リーダー１２００は、カメラボード、ＬＥＤコントロールおよびＵＳＢインターフェースのような好適な機械的コンポーネント１２０６を含み得る。リーダー１２００は、生物学的インジケータカードを保持し、上記カードを整列させ、そして励起および読み取りのためにそれを登録された位置に保持するための好適な装置１２１０をさらに含み得る。リーダー１２００は、好適なイメージスキャンポート１２１４をさらに含み得る。
【００５９】
図１２は、例示的な電子生物学的インジケータカード１２０８の正面図および背面図の両方を示す。正面図のコンポーネントは、図９の実施形態に関連して一般的に記載されている。インジケータカード１２０８の背面は、例えば、生物学的インジケータの特定のタイプ、滅菌剤、滅菌プロセス、ロット番号、生物学的インジケータ試験の日付、滅菌条件および結果に関連した様々な情報を含む。インジケータカード１２０８上に示された情報はこれらの具体例に限定されず；理解されるように、重要であるとみなされる他の情報も含まれ得る。インジケータカード１２０８は、磁気ストリップ１２１２を含み得、理解されるように、滅菌プロセス、試験結果などに関連する情報の自動化読み取りおよび保存を促進する。
【００６０】
図１３は、図３に関して記載されおよび示されるように、ＦＡＢＩセルフコンテインド生物学的インジケータ（ＳＣＢＩ）での使用のためのバイアルリーダー１３００の概略正面図である。バイアルリーダー１３００は、上記の電子ベースおよび蛍光ベースの実施形態と類似の前部表示パネル１３０２および前部アクセスパネル１３０４を含む。前部アクセスパネル１３０４は複数のウェル１３０６を含み、その中にＳＣＢＩが挿入され得る。前部アクセスパネル１３０４は外側に旋回し、ＳＣＢＩの挿入および取り外しを可能とし、そしてリーダーチャンバ１３０８内に閉鎖可能である。バイアルリーダー１３００は、蛍光ベースＳＣＢＩとともにまたは電子ベースのＳＣＢＩとともに使用され得、滅菌プロセスの結果の読み取りについて、本明細書に開示したのと同じような基本原理を用い、そして本発明の生物学的インジケータによって指示される。図１３は例示的なＦＡＢＩ  ＳＣＢＩ  １３１０を含む。
【００６１】
本発明の方法を用いて、生存可能な生物の膜電位変化が、滅菌プロセスの有効性を評価するために使用され得る。この技術は、当該技術分野で知られるような好適な滅菌インジケータまたはＳＣＢＩとともに使用され得る。それはまた、１アンプル内の生物（例えば、芽胞）懸濁液とともに使用され得る。それはまた、基板（例えば、シリコンのような非導電材料上に形成または堆積された銅回路）上に配置された導電性材料を含む滅菌インジケータとともに使用され得、導電性材料の一部または全部の上に生物学的インジケータ（例えば、細菌芽胞）が配置される。本発明の方法は、全ての滅菌技術をまたいで使用されるのに充分に適応性がある。本発明の方法は、即時読み取り（ｉｎｓｔａｎｔ−ｒｅａｄ）または近即時な読み取り（ｎｅａｒ−ｉｎｓｔａｎｔ  ｒｅａｄ）生物学的インジケータを提供するために使用され得る。上記生物学的インジケータは速効性生物学的インジケータといわれ得る。
【００６２】
全体にわたる構造の材料の例：支持、セパレーター、およびまたは絶縁体：ガラス、シリコン、金属箔、紙および他のセルロース形態、ポリプロピレン、ポリカーボネート、または混合物を含むポリオレフィン、セルロースアセテート、マイラー（Ｍｙｌａｒ）など。半透過性または透過性膜：グラシン、天然または人工起源の透析膜、多孔性ポリオレフィンおよび他のプラスチック材料。導体：金属、箔、導電性インク、ナノチューブ、フラーレンなど。スイッチ可能な導体／絶縁体またはポリアニリンなどのような他の半導性材料。付着化学物質（例えば、ＳＰＤＰなど）。生物：Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アトロファエウス（Ｂ．ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）など。蛍光体およびまたは蛍光源、例えば、光励起、化学誘導および電気物理活性化のような物理的励起に応答する全てを含むＭＵＧおよびヨウ化プロピジウム、フルオレセイン、ローダミンなど。
【００６３】
１つの実施形態では、形質膜電位が唯一の検出手段である。別の実施形態では、膜電位および導電性蛍光（例えば、ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳなど）の両方による。ＡＮＥＰ（アミノナフチルエテニルピリジニウム）色素、ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳは、サブミリ秒膜電位変化の検出のための感受性プローブである。この後者の場合において、リーダーは、図１０のような電子ベースリーダーと図１２のような蛍光ベースリーダーとのハイブリッドであり得る。１つの実施形態では、誘導および酵素活性化後の蛍光源化合物の蛍光発光が、唯一の検出手段であり得る。別の実施形態では、第２の表面結合蛍光体（例えば、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ  ＷＧＡ）もまた使用され得、参照コントロールとしておよび全ての芽胞が生物学的インジケータカードとなお関連することを確保する手段としての両方で、連続的な蛍光発光を提供し得る。各蛍光体は、別個の放出および励起波長を有し得る。
【実施例】
【００６４】
本明細書で提供された実施例は、単に説明目的のためのものである。それらは、充分に複合された詳細を提供し、当業者が本発明を生産しおよび使用することを可能にし、かつ好適なデバイスおよび方法の説明例を提供することが意図される。好ましい実施形態は、本明細書に記載された材料、成分、方法または適用の一部または全てを含み得るが単に示されたものに限定されない。成分リストまたは適用有用性を変更し得る簡単な代替が実行され得るがこれらもまた考慮され得る。最終生産デバイスは、記載された選択肢の１つ以上とともに、示した実施形態の１つまたは別の形態を取り得るが、例示された構成は、当業者が開示された発明に拡大し得る他のバリエーションまたは作用様式の放棄を構成しない。
【００６５】
（実施例１）
生／死のバチルス・アトロファエウス芽胞の膜電位の評価は、膜電位変化とバイアビリティとの間の相関を説明する。膜電位は、ＤｉＯＣ６（３）およびＰｉｃｏｆｌｕｏｒ蛍光メーターを使用して測定する。生存可能および（オートクレーブされた）生存不能な両芽胞を、３７℃にて代表的な時間、トリプシン性大豆培地およびＤｉＯＣ６（３）内で培養する。示した培養時間後、これらの生物を取り出し、そしてトリス／ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）にて洗浄する。次に蛍光測定を行う。この結果を図１に示す。
【００６６】
（実施例２）
平面上の生存可能なゲオバチルス・ステアロサーモフィルス芽胞の電気的検出
伝導性金属化材料を、およそクレジットカードのサイズの非伝導性マイラーシート上に均等に成型する。マイラーシートは気体および液体の両方に不透過性である。ポリアクリルアミド／ポリアニリン混合物を、金属化層の上に成型する。ポリアクリルアミド／ポリアニリン混合物は、気体および蒸気の両方に透過性である。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス芽胞を、１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度にてポリアクリルアミド／ポリアニリン混合物中に再懸濁する。この芽胞濃度は、インクジェットプリンターからそれぞれ１０ｐＬ（ピコリットル）の液滴に単一の芽胞を与える。芽胞ポリアクリルアミド／ポリアニリン混合物を、アレイフォーマットにて、成型したポリアクリルアミド／ポリアニリンフィルム上に堆積する。第２の伝導性金属化材料を芽胞のアレイの上方に成型する。これは生物学的インジケータ（ＢＩ）カードを形成する。芽胞が出芽するときに、材料の導電率が増加し始める。電流を、ダーリントンカップルのようなシリアルトランジスタプリアンプによって検出する。これらのダーリントントランジスタは対であるため、それらは電流の増幅を可能にする。ダーリントントランジスタを、システムの電流をモニターするリードに連結する。マイラーのような気体バリアを、使用直前まで、剥離性接着剤によってインジケータの上に付着する。使用時にこのバリアを取り外し、滅菌装置内に設置されたときに、蒸気または気体がシステムを透過し得る。インジケータの遠端に、生存可能な芽胞を出芽させることを可能にする培養培地を含む小さい破壊容易なチャンバをおく。蒸気または蒸発性過酸化水素を利用する滅菌プロセス後、生物学的インジケータを培養する。
【００６７】
ＢＩカードを、滅菌装置内に統合されているカードリーダー／インキュベータースロット内に挿入する。リーダー／インキュベーターは、培養温度を維持する加熱ブロック、ＢＩカードが接続する電気的接続、ユーザーが読むことができる形態にサイクルパラメーターおよびロードＩＤを示すプリントヘッド、ＢＩカードをスロット内に先導し、培養培地を含みかつ培地分散を助ける破壊可能なチャンバを壊すことによってＢＩを自動的に活性させるローラー、磁気ストリップスキャナー、ならびにデバイスロードおよび滅菌サイクルまでＢＩカードの結果をたどるバーコードリーダーからなる。
【００６８】
インジケータを、５５〜６０℃（ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスの最適温度）にて培養し、そしてインジケータの電気伝導度をモニターする。生存可能な芽胞の出芽から生じる電流の小さな変化は数分程度で検出され、それらの滅菌プロセスが成功していないことをユーザーに警告する。滅菌プロセスが成功した場合、培養時間とともに測定電流の増加はみられない。
【００６９】
（実施例３）
平面上の生存可能なゲオバチルス・ステアロサーモフィルス芽胞の蛍光検出
ポリアクリルアミド層を、およそクレジットカードのサイズのポリプロピレンバッキング上に成型する。ポリアクリルアミド層は、水和している単分子層として作用する。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス芽胞を、次いで生物のスポット内にプリントする。スポットを、アレイまたはグリッドフォーマットにてプリントし、各スポットは１５０〜３００芽胞を含む。一端に、必要な蛍光体を有する培養培地を含む破壊容易なチャンバをおく。滅菌プロセスの完了時に、ＢＩカードを、滅菌装置内に統合されているカードリーダー／インキュベータースロット内に挿入する。リーダー／インキュベーターは、培養温度を維持する加熱ブロック、ＬＥＤ励起源、蛍光検出のための発光ダイオード、ユーザーが読むことができる形態にサイクルパラメーターおよびロードＩＤを示すプリントヘッド、ＢＩカードをスロット内に先導し、培養培地を含みかつ培地分散を助ける破壊容易なチャンバを壊すことによってＢＩを自動的に活性させるローラー、磁気ストリップスキャナー、ならびにデバイスロードおよび滅菌サイクルまでＢＩカードの結果をたどるバーコードリーダーからなる。
【００７０】
インジケータを、５５〜６０℃（ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスの最適温度）にて培養する。ＬｕｍｉＳｅｎｓのような既成のイメージャを、このリーダーに採用し得る。これは、２つ以上の目的波長の検出を可能にする。１つめの波長は、染色された芽胞を測定し、全てのコントロールが適所にあることを確保し、そして２つめの波長は、生存可能な生物を検出するために使用される蛍光体を測定する。滅菌プロセスが成功した場合、全ての芽胞は生存不能となり、そして検出器は生物を染色するために使用された蛍光のみを検出する。滅菌プロセスが成功しなかった場合、２つの異なる蛍光シグナルによって、生存可能な芽胞が検出される。
【００７１】
（実施例４）
独立型リーダー／インキュベーター
リーダー／インキュベーターは、実施例２および実施例３に記載のいずれかのリーダー／インキュベーターについて独立型ユニットであり得る。独立型ユニットにおいて、全ての電子装置は、滅菌装置自体の中に統合されたリーダー／インキュベーターと同じである。
【００７２】
本発明を具体的な実施形態に関連して説明したが、その様々な変形が本明細書を読む際に当業者にとって明らかとなることが理解されるべきである。それゆえ、本明細書中に開示された発明は、添付の請求の範囲内に含まれ得る限り、そのような変形も包含することが意図されることが理解されるべきである。
【図１】
2013530723.tif 000003
【図２】
2013530723.tif 000004
【図３】
2013530723.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2013530723.tif 000009
【図８】
2013530723.tif 000010
【図９】
2013530723.tif 000011
【図１０】
2013530723.tif 000012
【図１１Ａ】
2013530723.tif 000013
【図１１Ｂ】
2013530723.tif 000014
【図１２】
2013530723.tif 000015
【図１３】
2013530723.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月13日(2012.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
滅菌プロセスをモニターするための方法であって；
（Ａ）滅菌プロセスの間、滅菌される物品および生物学的インジケータを滅菌培地に曝露する工程であって、該生物学的インジケータが、形質膜を有する芽胞を含む、工程；および
（Ｂ）出芽芽胞の膜電位における変化を測定して、該芽胞のバイアビリティを検出する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記生物学的インジケータが、工程（Ａ）の後であるが工程（Ｂ）より先に、培養培地中で培養される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記滅菌培地が、少なくとも１つの液体滅菌剤を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記液体滅菌剤が、少なくとも１つの過酢酸、少なくとも１つの過酸化物、またはそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記滅菌培地が、少なくとも１つのガス状滅菌剤を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記ガス状滅菌剤が、過酸化水素を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ガス状滅菌剤が、アンモニアをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記滅菌培地が、蒸気を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的インジケータが、バチルス、ゲオバチルスまたはクロストリジウム属の細菌を含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的インジケータが、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アトロファエウス、バチルス・サブチリス、バチルス・スファエリクス、バチルス・アントラシス、バチルス・プミルス、バチルス・コアグランス、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・ボツリヌム、バチルス・サブチリス・グロビジ、バチルス・セレウス、バチルス・サーキュランス、大腸菌、またはそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的インジケータが、真菌、マイコバクテリア、原生生物、栄養細菌、またはそれらの２つ以上の混合物をさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的インジケータが、アスペルギルス・ニガー、カンジダ・アルビカンス、トリコフィトン・メンタグロフィテス、ワンギエラ・デルマティティス、マイコバクテリウム・ケローネ、マイコバクテリウム・ゴルドネ、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・テラエ、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ジアルジア・ランブリア、クロストリジウム・パルバム、アエロモナス・ヒドロフィラ、エンテロコッカス・ファカーリス、ストレプトコッカス・ファカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、ストレプトコッカス・パイロジェンス、大腸菌、クレブシエラ（ニューモニエ）、レジオネラ・ニューモフィラ、メチロバクテリウム、シュードモナス・エルギノーサ、サルモネラ・コレラエスイス、ヘリコバクター・ピロリ、ミクロコッカス・ラディオデュランス、デイノコッカス・ラジオデュランス、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、またはそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的インジケータが、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスを含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的インジケータが遺伝子組換え生物学的インジケータを含み、該遺伝子組換え生物学的インジケータが：
酵素を生産するために好適な少なくとも１つの試験生物および少なくとも１つのレポーター遺伝子を含み、該レポーター遺伝子が該試験生物によって取り込まれている、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記レポーター遺伝子が、少なくとも１つのプラスミドおよび／または少なくとも１つのウイルスを使用して前記試験生物によって取り込まれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子組換え生物学的インジケータが、前記レポーター遺伝子が少なくとも１つのインデューサーに曝露されるまで該レポーター遺伝子の発現を阻害する少なくとも１つのリプレッサー遺伝子をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記レポーター遺伝子および前記リプレッサー遺伝子が、少なくとも１つのプラスミドおよび／または少なくとも１つのウイルスを使用して前記試験生物によって取り込まれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記試験生物が、１つ以上の細菌、病原体、グラム陰性生物、グラム陽性生物、栄養生物、ウイルス、非自己複製因子、亜細胞構成部または細胞生産物をさらに含む、請求項１４から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記試験生物が、バチルス、ゲオバチルスまたはクロストリジウム属の細菌を含む、請求項１４から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記試験生物が、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アトロファエウス、バチルス・サブチリス、バチルス・スファエリクス、バチルス・アントラシス、バチルス・プミルス、バチルス・コアグランス、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・ボツリヌム、バチルス・サブチリス・グロビジ、バチルス・セレウス、バチルス・サーキュランス、大腸菌、またはそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項１４から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記試験生物が、真菌、マイコバクテリア、原生生物、栄養細菌、またはそれらの２つ以上の混合物をさらに含む、請求項１４から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記試験生物が、アスペルギルス・ニガー、カンジダ・アルビカンス、トリコフィトン・メンタグロフィテス、ワンギエラ・デルマティティス、マイコバクテリウム・ケローネ、マイコバクテリウム・ゴルドネ、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・テラエ、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ジアルジア・ランブリア、クロストリジウム・パルバム、アエロモナス・ヒドロフィラ、エンテロコッカス・ファカーリス、ストレプトコッカス・ファカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、ストレプトコッカス・パイロジェンス、大腸菌、クレブシエラ（ニューモニエ）、レジオネラ・ニューモフィラ、メチロバクテリウム、シュードモナス・エルギノーサ、サルモネラ・コレラエスイス、ヘリコバクター・ピロリ、ミクロコッカス・ラディオデュランス、デイノコッカス・ラジオデュランス、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、またはそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項１４から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記試験生物が、栄養細菌、栄養細胞および／またはそれらの構成部を含む、請求項１４から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記試験生物が、バンコマイシン耐性腸球菌、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス、マイコバクテリウム・ケローニ、またはそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項１４から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記培養培地が、１つ以上の栄養源および１つ以上の微生物の回復、誘導または成長インジケータを含む、請求項１４から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記培養培地が、１つ以上のｐＨ緩衝液、１つ以上の浸透圧平衡維持剤、１つ以上の中和剤、またはそれらの２つ以上の混合物をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学的インジケータが、培養培地にて培養され、該生物学的インジケータが膜電位蛍光色素の存在下にて培養されている、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記色素が、カルボシアニンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記色素が、オキソノールである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記色素が、３，３’−ジヘキシルオキシカルボシアニンヨージドまたはビス−（１，３−ジブチルバルビツル酸）トリメチンオキソノールである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記膜電位が、蛍光偏光法を使用して測定される、請求項１から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記膜電位が、蛍光共鳴エネルギー転移を使用して測定される、請求項１から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記生物学的インジケータが、電圧感知色素の存在下にて培養される、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記電圧感知色素が、スチリル色素である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記電圧感知色素が、ジ−８−ブチル−アミノナフチル−エチレン−ピリジニウム−プロピルスルホネートまたはジ−４−ブチル−アミノナフチル−エチレン−ピリジニウム−プロピルスルホネートである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記膜電位が、蛍光共鳴エネルギー転移を使用して測定される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記生物学的インジケータが、導電性材料上に配置される、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
工程（Ｂ）の間、前記生物学的インジケータが、培地中に設置され、そして該培地中の電気リードが、前記膜電位を測定するために使用される、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記膜電位が、前記生物学的インジケータを横切ってまたは中に設置された電気リードを使用して測定される、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
滅菌インジケータであって：基板上に配置された導電性材料；および該導電性材料の一部または全部の上に配置された生物学的インジケータを含み；
該生物学的インジケータが、芽胞を含む、滅菌インジケータ。
【請求項４１】
方法であって：
インクジェットプリンターを使用して、基板上に導電性材料を堆積させる工程；および
該インクジェットプリンターを使用して、該導電性材料の一部または全部の上のアレイに生物学的インジケータを堆積させる工程；
該導電性材料の電気特性の変化を検出するように適合された電気回路を提供する工程；
該生物学的インジケータを滅菌培地に曝露する工程；および
該導電性材料の該電気特性にいかなる変化が生じるかを決定する工程
を含む、方法。
【請求項４２】
前記生物学的インジケータが、芽胞を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
膜電位の変化が測定されなければ、前記滅菌プロセスが成功したと判断される、請求項１から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
膜電位の変化が測定されれば、前記滅菌プロセスが成功しなかったと判断される、請求項１から３８のいずれかに記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成25年3月15日(2013.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
滅菌プロセスをモニターするための方法であって；
（Ａ）滅菌プロセスの間、滅菌される物品および生物学的インジケータを滅菌培地に曝露する工程であって、該生物学的インジケータが、形質膜を有する芽胞を含む、工程；および
（Ｂ）出芽芽胞の膜電位における変化を測定して、該芽胞のバイアビリティを検出する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記生物学的インジケータが、工程（Ａ）の後であるが工程（Ｂ）より先に、培養培地中で培養される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記滅菌培地が、
少なくとも１つの液体滅菌剤、好ましくは少なくとも１つの過酢酸、少なくとも１つの過酸化物、またはそれらの２つ以上の混合物、あるいは
少なくとも１つのガス状滅菌剤、好ましくは過酸化水素または過酸化水素およびアンモニア；あるいは
蒸気
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的インジケータが、
ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アトロファエウス、バチルス・サブチリス、バチルス・スファエリクス、バチルス・アントラシス、バチルス・プミルス、バチルス・コアグランス、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・ボツリヌム、バチルス・サブチリス・グロビジ、バチルス・セレウス、バチルス・サーキュランス、大腸菌、またはそれらの２つ以上の混合物；あるいは
アスペルギルス・ニガー、カンジダ・アルビカンス、トリコフィトン・メンタグロフィテス、ワンギエラ・デルマティティス、マイコバクテリウム・ケローネ、マイコバクテリウム・ゴルドネ、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・テラエ、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ジアルジア・ランブリア、クロストリジウム・パルバム、アエロモナス・ヒドロフィラ、エンテロコッカス・ファカーリス、ストレプトコッカス・ファカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、ストレプトコッカス・パイロジェンス、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、メチロバクテリウム、シュードモナス・エルギノーサ、サルモネラ・コレラエスイス、ヘリコバクター・ピロリ、ミクロコッカス・ラディオデュランス、デイノコッカス・ラジオデュランス、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、またはそれらの２つ以上の混合物
を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的インジケータが遺伝子組換え生物学的インジケータを含み、該遺伝子組換え生物学的インジケータが：
酵素を生産するために好適な少なくとも１つの試験生物および少なくとも１つのレポーター遺伝子を含み、該レポーター遺伝子が該試験生物によって取り込まれており、
好ましくは、該レポーター遺伝子が、少なくとも１つのプラスミドおよび／または少なくとも１つのウイルスを使用して該試験生物によって取り込まれ；そして
必要に応じて、該遺伝子組換え生物学的インジケータが、該レポーター遺伝子が少なくとも１つのインデューサーに曝露されるまで該レポーター遺伝子の発現を阻害する少なくとも１つのリプレッサー遺伝子をさらに含み、好ましくは該レポーター遺伝子および該リプレッサー遺伝子が、少なくとも１つのプラスミドおよび／または少なくとも１つのウイルスを使用して該試験生物によって取り込まれる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記試験生物が、
ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アトロファエウス、バチルス・サブチリス、バチルス・スファエリクス、バチルス・アントラシス、バチルス・プミルス、バチルス・コアグランス、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・ボツリヌム、バチルス・サブチリス・グロビジ、バチルス・セレウス、バチルス・サーキュランス、大腸菌、またはそれらの２以上の混合物；あるいは
アスペルギルス・ニガー、カンジダ・アルビカンス、トリコフィトン・メンタグロフィテス、ワンギエラ・デルマティティス、マイコバクテリウム・ケローネ、マイコバクテリウム・ゴルドネ、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・テラエ、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ジアルジア・ランブリア、クロストリジウム・パルバム、アエロモナス・ヒドロフィラ、エンテロコッカス・ファカーリス、ストレプトコッカス・ファカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、ストレプトコッカス・パイロジェンス、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、メチロバクテリウム、シュードモナス・エルギノーサ、サルモネラ・コレレスイス、ヘリコバクター・ピロリ、ミクロコッカス・ラディオデュランス、デイノコッカス・ラジオデュランス、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、またはそれらの２以上の混合物；あるいは
バンコマイシン耐性腸球菌、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス、マイコバクテリウム・チェロニ、またはそれらの２つ以上の混合物
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的インジケータが、膜電位蛍光色素、好ましくはカルボシアニン色素またはオキソノール色素を含む培養培地にて培養され；あるいは
該生物学的インジケータが、電圧感知色素、好ましくはスチリル色素の存在下にて培養される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記膜電位が、蛍光偏光法を使用してまたは蛍光共鳴エネルギー転移を使用して測定される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的インジケータが、導電性材料上に配置される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
工程（Ｂ）の間、前記生物学的インジケータが、培地中に設置され、そして該培地中の電気リードが、前記膜電位を測定するために使用される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記膜電位が、前記生物学的インジケータを横切ってまたは中に設置された電気リードを使用して測定される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
滅菌インジケータであって：基板上に配置された導電性材料；および該導電性材料の一部または全部の上に配置された生物学的インジケータを含み；
該生物学的インジケータが、芽胞を含む、滅菌インジケータ。
【請求項１３】
方法であって：
インクジェットプリンターを使用して、基板上に導電性材料を堆積させる工程；および
該インクジェットプリンターを使用して、該導電性材料の一部または全部の上のアレイに生物学的インジケータを堆積させる工程；
該導電性材料の電気特性の変化を検出するように適合された電気回路を提供する工程；
該生物学的インジケータを滅菌培地に曝露する工程；および
該導電性材料の該電気特性にいかなる変化が生じるかを決定する工程
を含む、方法。
【請求項１４】
前記生物学的インジケータが、芽胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
膜電位の変化が測定されなければ、前記滅菌プロセスが成功したと判断されそして膜電位の変化が測定されれば、前記滅菌プロセスが成功しなかったと判断される、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
2013530723.tif 000017
2013530723.tif 000018
2013530723.tif 000019
2013530723.tif 000020
2013530723.tif 000021