(57)【要約】      （修正有）【課題】各種光学フィルターの組合わせと調整交換を容易にでき、色の再現性と解析性を高める。【解決手段】試料３に含まれる蛍光色素や蛍光物を光らせる励起光源１、３５と、光学鏡筒レンズ９を通り励起光を照射して試料３に向かわせかつ試料からの蛍光を透過するダイクロックミラー６を介した励起光量を測定モニター出来る光量検出器１３等を備える蛍光観察用の顕微鏡光学系と、顕微鏡光学系を通過した蛍光のみを透過するエミションフィルター８や色温度補正フィルター等の光学素子調整機構７を備えた蛍光の撮像記録用のデジタル記録系からなる。【選択図】図１
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【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
試料近傍へ蛍光標識体を光らせる様に導光用光ファイバーを用いて出射できる励起光源。
【請求項２】
請求項１の光ファイバー方式の励起光源に、先端部に穿孔構造を有するピペットを用いてこの中に封入された光ファイバー方式を用いて試料内部へ穿孔照射できる励起光源と対になった構造。
【請求項３】
請求項１又は２のピペット内部に励起光源導光用ファイバーの他に照射先端画像を取得するイメージガイドなる光ファイバーとその先端にレンズを取付けた構造からなる励起光源。
【請求項４】
請求項３に吸引導出孔を設けて新たに抗体反応用に蛍光粒子試薬をピペット先端部より導出したり、蛍光発現している部位を吸引排出する構造も可能とした励起光源。
【請求項５】
励起光源ユニットに使用する発光ダイオードや半導体レーザーの各種波長毎の配置印加方法と、上記請求項１を可能ならしめるファイバー分岐を可能とし、印加電源部に冷却機構からなる構造。
【請求項６】
励起光源から出射される励起光量を測定モニター出来る光量検出器を内蔵した蛍光観察装置。
【請求項７】
撮像素子の前面に、デジタル画像記録を容易ならしめる様に、紫外線域から可視光、赤外線域迄の励起波長に対応し、且つ色温度補正フィルター等を設けた光学素子調整機構を有する蛍光観察記録装置。
【考案の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、発光ダイオードや半導体レーザー等の小型発光素子を用いて、光ファイバーを駆使し且つ光量検出器を設置して定量化を促進し、生体内の現象が″何時″、″何処で″、″何れ位の時間スケール″で起こるかを観察記録出来る様にした蛍光顕微鏡画像を観察取得する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】今日バイオ分野では蛍光観察を基にした研究が多くなり、それに伴い蛍光画像取得装置並びに蛍光色素も種々開発される様になっている。しかし、従来の蛍光画像取得装置、蛍光顕微鏡は相変わらず重厚長大のものが多いのが実情です。これらの蛍光励起光源には、水銀ランプや大型レーザー等を用いた高輝度照明源が使用されている。これらの光源はランプ寿命が短かったり、発熱を伴ったり、匡体が大きい等の課題が有った。
【考案の開示】
【考案が解決しようとする課題】
【０００３】細胞１個１個において実時間で事象を観察する技術や、一分子レベルで直接観察する為に簡便に試料の特定部位への励起する手法も無かった。【０００４】従来の蛍光顕微鏡の励起光源としては、水銀ランプやクセノンセンプを用いるのが主流でしたが、これらの励起光源と比較して発光ダイオードや半導体レーザ等の小型発光素子を用いる励起方法では、連続出力に加えてパルス励起法を加える事により、蛍光強度を増す事が可能となったり、他の蛍光現象測定ができる様になり応用が広がる。【０００５】従来の蛍光顕微鏡の光量を可変するには光量フィルター等でアナログ的に操作をしていたが、これらの方法では、励起に対する蛍光発現現象の再現性を求める時の正確なデータが不足する事になり、則ちその光量フィルターの調整範囲に依存するので光量再現性の明確さを欠く事にもなっていた。これは励起光源の光量をデジタル値としてモニターする事で解決が出来る。【０００６】従来人の目は、被写体の対象に照射される光源が変わっても白は白と認識できていましたが、人工の眼であるデジタル式の撮像素子ではその様な順応応答性は無かった。さらに、デジタル記録が一般化するにつれて、色調整は大きなテーマとなっている。エバンスは、「この世界の被写体を全て加算すると無彩色になる」という仮説をたてました。この仮説に基づいて画像の平均が灰色になる様な色バランス調整をしようという事で、オートホワイトバランスという考えが生まれた。ここで、色調整の基本として、色温度という考え方に基づき調整する事になる。しかし、色再現性の設定には、デジタルカメラに依る初期設定だけではなかなか満足する事ができない。ホワイトバランスというアルゴリズムをもっともっと進化させないと難しいといったのが現状でした。さらに顕微鏡画像としては一般写真撮影と異なり、単なる光学顕微鏡として観察記録する以外に本案の様に蛍光観察という場面が多くなり、則ち人間の可視光以外の領域の観察記録する事がデジタルカメラを用いて記録する事が多くなっている。各種の光学フィルターの組合せの上での利用となるが、これらの用途に対応し簡便化される顕微鏡用デジタルカメラは無かった。デジタル記録の不満を解消する為に各種光学フィルターの組合せと調整交換を容易にできる機構にして、色の再現性と解析性を高めた光学素子調整機構を設置をする事で解決が出来る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】本発明の請求項１に係る光量検出器を内蔵した蛍光観察装置は、上記目的を達成するために、光ファイバーを斜入射もしくは水平入射させて照射し、光学鏡筒に光ファイバーを固定可動させる機構を設け、出射させる光ファイバーは、設置角度が可変となり、角度は水平角度から斜入できる角度迄対応する機構とする。（図２参照）。【０００８】同請求項２に係るものは、上記目的を達成するために、光ファイバーをガラスピペット内に封入された構造とし、試料に鋭利に穿孔できる様にしたもの。光ファイバーは概ね３０〜１００ミクロンのものを用いて、ガラスピベット内に封入するが、ピベット形状は、使用目的に応じてストレート（直管）又は図３の様に一定の角度を有した機構からなる。【０００９】同請求項３に係るものは、上記目的を達成するために、光ファイバーを２種類を用いて、励起照明用と画像伝送用の組み合わせからなり、画像伝送用イメージガイドにはその先端にレンズを取付けた構造とする。【００１０】同請求項４に係るものは、上記目的を達成するために、請求項３に吸引導出孔を設け、新たに抗体反応用に蛍光粒子試薬をピペット先端部より導出したり、蛍光発現している部位を吸引排出する構造からなる。更に励起光源８に半導体レーザーを配置しレーザートラップ法を応用して先端で浮遊した試料を吸引捕捉するもの。【００１１】同請求項５に係るものは、上記目的を達成するために、発光ダイオード又はそのチップを環状又は馬蹄形の形で配置し、励起する各波長毎に交互に設置し、スイッチで切替えを行い、所定波長又は同時出射する機構とし、例えばＵＶ、Ｂｌｕｅ、Ｇｒｅｅｎ、ＩＲの各発光ダイオード又はそのチップを複数個、交互に配置しておき、その印加方法としては、連続出力に加えてパルス励起法もできる様にパルス駆動回路を設け、又紫外線等の励起には、印加電源部に冷却機構を設置し、更にはファイバー出射を可能とする様に分岐機構を設けた励起光源ユニットとからなる構造とする。【００１２】同請求項６に係るものは、上記目的を達成するために、光量を定量化する目的で、励起光源の光路上にダイクロックミラーから導かれた励起光量を測定できるセンサーを配置し、尚、センサーには希土類元素等を添加し、紫外線を可視光に変換できる波長変換特殊ガラス製のものを用いて励起光量をモニター表示が出来る構造としたものを用いるか、又はフォトダイオード等のセンサーからなるもの。【００１３】同請求項７に係るものは、上記目的を達成するために、撮像素子の受光面に近い位置に、光学素子調整機構部を設け、スライド式又はターレット回転板式機構とし、各種フィルターの組合せ配置して画像の取得生成を容易にするもの。
【発明を実施するためのの最良の形態】
【００１４】以下本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。
【実施例１】図１は本発明に係る光量検出器を内蔵した蛍光観察装置の一実施形態の構成を示す概要図である。【００１５】顕微鏡光学系は、一個または複数個のレンズ（図では２個のレンズ、すなわち対物レンズ９、接眼レンズ２２）及びその他の光学素子２７、さらに幾枚かのミラー２７、２８を備え、試料３から発する蛍光を一部は接眼レンズ２２を介し、他方は撮像素子２３からモニター２４で観察できるように構成してある。又、試料３を下方から照明する透過照明系２６と、試料３に予め染色してある蛍光色素を光らせるための励起光を試料３に対して出射する励起照明系として、試料３の上方から照明する落射照明光源１と、図１に示すように、光源３５を含むを光ファイバ１０とピペット２を試料３の側面から、斜めに又は水平から入射させて励起するようにしてもよい。使用する光ファイバー１０は、紫外域波長に対応するものを使用する。光ファイバー１０の固定は、ＸＹＺ軸で可動とし、芯出し機構を合わせ持つ固定ガイド機構５を用い、微小スポット光を照射できるようにしたものが好ましい。
さらに図２に示すように、光ファイバー１０を斜めにまたは水平に入射させて照射する構成とすることもできる。更に試料に穿孔して内部を照射する事もできる。この場合、顕微鏡光学系の光学鏡筒４に光ファイバー１０を固定しかつ可動させる固定ホルダ５を設け、光ファイバ１０の設置角度を可変できるようにする。光ファイバー１０の設置角度は水平から斜めまで対応できるようにすることが好ましい。図中２９は集光レンズ、３０はスリットである。また落射照明励起光源１は、発光ダイオード（以下ＬＥＤと省略することもある。）や半導体レーザー等の小型発光素子を励起光源２として備えている。透過照明系２６は、各種顕微鏡観察法との併用を可能とするもので、通常の明視野観察、位相差観察等と併用するために設けてある。【００１６】なおこれら照明系１、２６、３５は、透過照明系２６が対物レンズ９の直下から照明し、落射励起照明系１が対物レンズ９の直上から照明するが、さらに光ファイバーによる斜光入射法からなる。【００１７】デジタル記録系は、上述した顕微鏡光学系により得た画像をデジタル的に記憶するとともに、画像表示できるようにするもので、エミッションフィルターを含む光学素子調整機構７、撮像手段２３及びモニター２４からなる。撮像手段２３は、詳細な図示は省略するが、ＣＣＤカメラ等と記録メディア（ハードディスク、スマートメディア等）から構成し、ＣＣＤ等の構成要素には公知の手段を適宜採用すればよい。なお公知のように、ＣＣＤカメラ等とＣＲＴ等のモニタ２４の組み合わせにより観察倍率を上げることも可能である。【００１８】この光量検出器を内蔵した蛍光観察装置は、落射照明励起光源１から発した光を通ってエキサイターフィルター３１により波長選択して励起光として試料３に照射する。励起光はダイクロックミラー６、対物レンズ９を通り試料３を励起照明する。必要であれば、透過照明系２６で試料３を下方から照明することもできる。尚、発信波長が明確な発光ダイオードや半導体レーザ等の発光素子を用いるので、エキサイターフィルター３１は省略することもできる。【００１９】試料３はあらかじめ蛍光色素にて染色しておき、励起光が照射されると蛍光を発するようにしておく。この蛍光は対物レンズ９を通りダイクロックミラー６とエミッションフィルターを含む光学素子調整機構７を透過し、接眼レンズ２２による観察や、デジタル記録系による撮像、記録に供される。試料３の蛍光色素による染色は公知の手法を用いればよいが、近年開発された微粒状の蛍光物を試料３に含ませるようにしてもよい。この場合、試料３が動物や植物等から採取するものであれば、微粒状の蛍光物を摂取させた後に試料とすることができる。【００２０】この光量検出器を内蔵した蛍光観察装置は、光源として発光ダイオードや半導体レーザー等の小型発光素子を用いていることで光源部の小型化、顕微鏡部分の小型化、低消費電力化、低発熱量化を実現している。【００２１】次に、励起光源の選択について説明する。既述の各種蛍光観察に対して本発明では以下のように発光ダイオードを組み合せて構成する。半導体レーザー等の他の小型発光素子を用いる場合についてもほぼ同様に検討すればよい。
【実施例２】
【００２２】図２は、ファイバー励起光源を用いた概要図である。光ファイバー１０は、光学鏡筒４に固定しかつ可動させる固定ホルダ５を設け、ＸＹＺ軸で可動とし、芯出し機構を合わせ持つ固定ガイド機構５を用い、微小スポット光を照射できる様に設計され、発光ダイオード又は半導体レーザー３５から出射された励起光は光ファイバー１０を通じて試料３の側面近傍に入射され、光ファイバー１０の設置角度は水平から斜めまで対応できるように設置角度が可変できる機構になっている。３３はインジェクターである。
【実施例３】
【００２３】図３は、光ファイバー１０をガラスピペット１２内に封入された構造とし、試料に鋭利に穿孔ささる様にしたものであり、使用する光ファイバー１０は概ね３０〜１００ミクロンのものを用いて、ガラスピペット１２内に封入するが、ピペット形状は、使用目的に応じてストレート（直管）と図示の様に一定の角度を有した機構からなる説明図である。ガラスビペットは、外径１〜２ｍｍ、厚み０．５〜１．２ｍｍの細いガラス管をヒーターで加熱し融点近くに成った時に引き延ばすと先端部が細くなり、これを切断加工して作成し、更に使用目的に応じた針状に加工し、この中に光ファイバーを封入する。
【実施例４】
【００２４】図４−１は、ピペット内部に励起光源導光用ファイバー１０の他にファイバー照射先端画像を取得するイメージガイドなる光ファイバー１１とその先端にレンズを取付け、更に照射用ファイバーとイメージガイドを同軸光軸ならしめる同軸調整スリット３４構造からなる説明図である。イメージガイドは得られる画像解像度を考慮して３０００画素以上有るものが望ましい。図４−２の様にイメージガイド１１を中心に配置し周囲に励起照射用ファイバー１０で包み込む構造としても良い。
【実施例５】
【００２５】図５は、上記の励起光源構造部に吸引導出孔チューブ３２を設け、新たに抗体反応を生じさせる為の蛍光粒子試薬等をピペット先端部より導出したり、蛍光発現している部位を吸引する構造からなる説明図である。吸引導出孔は新たなチューブ３２を配置せずにガラスピペット１２内の隙間の細孔路を利用する事ができる。又、励起光源３５に半導体レーザーを配置してレーザートラップ法により先端で浮遊した試料を吸引捕捉するものである。
【実施例６】
【００２６】図６は、発光ダイオード又はそのチップを環状又は馬蹄形の形で配置し、励起する各波長毎に交互に設置し、例えばＵＶ、Ｂｌｕｅ、Ｇｒｅｅｎ、ＩＲの各発光ダイオード又はそのチップを複数個、交互に配置した模式図である。図示せぬスイッチで切替えを行い、所定波長又は同時出射する機構としたものとする。機能は、波長切替え、同時励起出来る様に事と励起コントロール表示が明示されたものである。本案の想定する基本的励起波長光源の組合せは次ぎの通りである。この他の波長の組合わせでも構わない。
ＵＶ      ：３６５ｎｍ又は３８０ｎｍ（これ以下の波長でも良い）。
Ｂｌｕｅ  ：４６５ｎｍ
Ｇｒｅｅｎ：５３０ｎｍ
ＩＲ      ：８００ｎｍ
【実施例７】
【００２７】図７は、発光ダイオードを用いた励起光源ユニット概要図である。右端発光ダイオードから照射された光束は集光レンズ系を通じて、例えば個別コンデンサレンズで対応させるか、フライアイレンズ又は円筒形レンズ（球面レンズ）を用いて、平行光束系光路設計とし、左端から出射できる設計となるもの。印加電源装置１７は、定常光とパルス光の二つの励起法ができる様にパルス駆動回路を設けた励起光源ユニットとからなる構造とする。
【実施例８】
【００２８】図８は、更にはファイバー出射を可能とする様に分岐機構１９を設けた励起光源ユニットとからなる概要図である。光ファイバーへ導光された励起光は、ファイバーライトガイドを通じて照射される。光ファイバーと発光ダイオードへの接合は平行光束を重要視する。発光ダイオードの光源系に対応するケーラーレンズ若しくはファイバーロッドを通じて集光させる。発光ダイオードとファイバーの接合には、１対１で対応し、できればチップタイプの発光ダイオードを用いる、この時のチップＬＥＤのサイズを一つの面光源とし、その複数個に束ねた場合はその束ねたサイズが面光源である。光ファイバーをバンドル化して対応としても良い。
【実施例９】
【００２９】図９は、励起光源から出射される励起光量を測定モニター出来る光量検出器の模式図である。センサーには希土類元素等を添加し、紫外線を可視光に変換できる波長変換特殊ガラス製のものを用いて励起光量をモニター表示が出来る構造とする。又はホトダイオード等でも良い。従来、蛍光反応材としては、希土類錯体や有機蛍光色素が有ったが、希土類イオンをガラス結晶化した蛍光ガラスが製造される様になった。しかし蛍光センサーとして紫外線を検知出来るものは耐久性の観点からは見当たらなかったが、これらの蛍光ガラスはその耐久性、変換効率からセンサーとして利用できる様になった。ただ残念な事に波長域を制限された蛍光ガラスしか無いので、本案の様な広域の波長感度に対応工夫するにはセンサー１３を考案して用いる。基板は光が透過できる材料を選定し、厚みが約１ｍｍのガラス基板１５を用いる。この基板１５上に上記の各波長毎に対応した蛍光ガラス膜１４を蒸着等で積層する。厚みは凡そ５０〜１００ｎｍの膜厚としたものを検知部とし、ここへ照射された光量がこの膜で波長変換されて可視化された光量を基板の反対側に整列させた光ファイバー１６で受光して光電変換して測定をする。
【実施例１０】
【００３０】図１０は、撮像素子の前面に紫外線域から可視光、赤外線域迄の励起波長に対応し、且つ色温度補正フィルター等を設けた光学素子調整機構の模式図である。機構としては、スライド式図１０−１又は、ターレット回転板式図１０−２となる機構で有る。顕微鏡撮影にあたり、先ず基本的な事は、照明を前提にした撮影記録故に通常、上部からの落射（反射）式照明と、下部からの透過照明方式の二通りが有る。さらには光源の種類、照射の仕方が異なる方式の中で、一律の最適化したホワイトバランス調整は難しいこととなり、各々の設定条件を考慮し複雑な調整作業を必要としていた。ここで、色温度の概要を把握できれば、光学フィルターによる変換を行う事で解決できる。フィルターとしては、２種類以上を組み合わせて、より色温度補正を行える機構にしたもの。則ち蛍光フィルターだけでは解決しえない色温度フィルターを組合わせて使用するもの。
色温度校正用には、色温度変換フィルターには、色温度を上げるブルーフィルター（波長の大きい赤色光を抑制し波長の短かい青色光の透過率を向上）と、色温度を下げるアンバーフィルター（波長の短い青色光を抑制し、波長の長い赤色光の透過光を向上）するフィルターを配置する。即ち、光学フィルター無しか、又はホワイトバランス調整をしたデジタルカメラで、撮影記録されたもので赤みが強すぎる時には、色温度が低い為に色温度を上げる光学フィルターを使用する。撮影記録されたものが青味が強い時は、色温度を下げる光学フィルターを使用する。但し、配置する光学フィルターは簡単に取り外しと交換が容易にできる機構となっているもの。この様にフィルターを試しながら観察撮影記録する事によって、失敗が防げたり、各種色彩の異なった画像、蛍光画像等に対応する。
【発明の効果】
【００３１】本発明に係る光量検出器を内蔵した蛍光観察装置は  以上説明してきたように、顕微鏡蛍光観察を容易に行えるシステムである。各種励起照明法のうち、導光用光ファイバーを用いた励起照明法は、試料近傍又は試料内部へ穿孔照射できる励起光源となり、細胞内のダイナミックな生命現象解析の為の細胞１個１個への局在観察に有効な一分子蛍光イメージングの有効な観察道具となる。又、小型省電力の発光ダイオードを用いる事により、複数の印加励起法、定常光とバルス光励起が行え、更に励起光量検出器を付加する事で、複雑な蛍光発現事象をトレース出来たり、再現性実験が容易となる効果が出る。一方、蛍光反応は従来の紫外線領域から可視域、赤外線領域にも範囲が広がっており、これらの広範な波長対応を考慮した顕微鏡画像を撮影記録する上で光学素子調整機構を設ける事で、デジタル記録方式の一律機会的な画像撮影記録を補完しうるもので有る。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明に係る光量検出器を内蔵した蛍光観察装置の概要図である。
【図２】ガラスピペット内封入光ファイバー励起法による部分蛍光観察法の概要図である。
【図３】光ファイバーをガラスピペット内に封入された構造図である。
【図４】ピペット内部に励起光源導光用ファイバーとイメージガイドなる光ファイバーとその先端にレンズを取付けた構造図である。
【図５】図３の励起光源導光用ファイバーとイメージガイドなる光ファイバーの他に更に吸引導出孔を設けた構造図である。
【図６】発光ダイオード又はそのチップを複数個、交互に配置した模式図である。
【図７】発光ダイオードを用いた励起光源ユニット概要図である。
【図８】ファイバー出射を可能とする様に分岐機構を設けた励起光源ユニット概要図である。
【図９】励起光源から出射される励起光量を測定モニター出来る光量検出器の模式図である。
【図１０】光学素子調整機構の模式図である。
【符号の説明】
【００３３】  １・・・励起光源
２・・・発光ダイオード
３・・・試料
４・・・光学鏡筒
５・・・固定ガイドフォルダ
６・・・ダイクロックミラー
７・・・光学素子調整機構
８・・・フィルター（ＥＭ）
９・・・対物レンズ
１０・・・光ファイバー
１１・・・イメージガイド
１２・・・ガラスビペット
１３・・・励起光量センサー
１４・・・波長対応蛍光膜
１５・・・基板
１６・・・受光ファイバー
１７・・・印加電源装置
１８・・・冷却機構
１９・・・ファイバー分岐
２０・・・光学調整機構スライド式
２１・・・光学調整機構ターレット式
２２・・・接眼レンズ
２３・・・撮像素子
２４・・・モニター
２５・・・ＸＹＺ駆動ステージ
２６・・・透過照明
２７、２８・・・ミラー
２９・・・集光レンズ
３０・・・スリット
３１・・・フィルター（ＥＸ）
３２・・・吸引導出孔チューブ
３３・・・インジェクター
３４・・・同軸調整スリット
３５・・・励起光源
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
0003102954.tif 000013
【図１０−２】
0003102954.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月19日(2004.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】実用新案登録請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
試料近傍へ蛍光標識体を光らせる様に導光用光ファイバーピペットを用いて出射できる励起光源に於いて、前記光ファイバーピペットが先端部に穿孔構造を有するピペットの中に封入された光ファイバーを用いて試料内部へ穿孔照射できる構造である励起光源。
【請求項２】
請求項１のピペット内部に励起光源導光用ファイバーの他に照射先端画像を取得するイメージガイドなる光ファイバーとその先端にレンズを取付けた構造からなる励起光源。
【請求項３】
請求項２に吸引導出孔を設けて新たに抗体反応用に蛍光粒子試薬をピペット先端部より導出したり、蛍光発現している部位を吸引排出する構造も可能とした励起光源。
【請求項４】
励起光源ユニットを構成する発光ダイオードあるいは半導体レーザーの励起波長に対応した発光素子を環状又は馬蹄形の形で配置し、励起させる各波長の素子を交互に並べスイッチ等で切替えを行い、所定同一波長又は同時に各波長の励起光を光ファイバーピペットへ導く光路として光源ユニットに分岐光路を設ける構造、もしくは光ファイバーピペットの導入先端部に発光素子を設ける構造を備える請求項１記載の励起光源。
【請求項５】
請求項１記載に記載する励起光源を介して励起する時の励起光源から出射される励起光量を測定モニター出来る光量検出器を内蔵した蛍光観察装置。
【請求項６】
請求項１記載に記載する励起光源を介して励起する時の微弱光反応による観察記録の最適化とデジタル画像記録を容易ならしめる為に、撮像素子の前面に紫外線域から可視光、赤外線域迄の励起波長に対応し、且つ色温度補正フィルター等を設けた光学素子調整機構を有する蛍光観察記録装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
0003102954.tif 000016
【図３】
0003102954.tif 000017
【図４】
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【図５】
0003102954.tif 000019
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【考案の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】本発明は、発光ダイオードや半導体レーザー等の小型発光素子を用いて、光ファイバーを駆使し且つ光量検出器を設置して定量化を促進し、生体内の現象が“何時”、“何処で”、“何れ位の時間スケール”で起こるかを観察記録出来る様にした蛍光顕微鏡画像を観察取得する装置に関する。【０００２】
【背景技術】今日バイオ分野では蛍光観察を基にした研究が多くなり、それに伴い蛍光画像取得装置並びに蛍光色素も種々開発される様になっている。しかし、従来の蛍光画像取得装置、蛍光顕微鏡は相変わらず重厚長大のものが多いのが実情です。これらの蛍光励起光源には、水銀ランプや大型レーザー等を用いた高輝度照明源が使用されている。これらの光源はランプ寿命が短かったり、発熱を伴ったり、匡体が大きい等の課題が有った。
【考案の開示】
【考案が解決しようとする課題】
【０００３】細胞１個１個において実時間で事象を観察する技術や、一分子レベルで直接観察する為に簡便に試料の特定部位への励起する手法も無かった。【０００４】従来の蛍光顕微鏡の励起光源としては、水銀ランプやクセノンセンプを用いるのが主流でしたが、これらの励起光源と比較して発光ダイオードや半導体レーザ等の小型発光素子を用いる励起方法では、連続出力に加えてパルス励起法を加える事により、蛍光強度を増す事が可能となったり、他の蛍光現象測定ができる様になり応用が広がる。【０００５】従来の蛍光顕微鏡の光量を可変するには光量フィルター等でアナログ的に操作をしていたが、これらの方法では、励起に対する蛍光発現現象の再現性を求める時の正確なデータが不足する事になり、則ちその光量フィルターの調整範囲に依存するので光量再現性の明確さを欠く事にもなっていた。これは励起光源の光量をデジタル値としてモニターする事で解決が出来る。【０００６】従来人の目は、被写体の対象に照射される光源が変わっても白は白と認識できていましたが、人工の眼であるデジタル式の撮像素子ではその様な順応応答性は無かった。さらに、デジタル記録が一般化するにつれて、色調整は大きなテーマとなっている。エバンスは、「この世界の被写体を全て加算すると無彩色になる」という仮説をたてました。この仮説に基づいて画像の平均が灰色になる様な色バランス調整をしようという事で、オートホワイトバランスという考えが生まれた。ここで、色調整の基本として、色温度という考え方に基づき調整する事になる。しかし、色再現性の設定には、デジタルカメラに依る初期設定だけではなかなか満足する事ができない。ホワイトバランスというアルゴリズムをもっともっと進化させないと難しいといったのが現状でした。さらに顕微鏡画像としては一般写真撮影と異なり、単なる光学顕微鏡として観察記録する以外に本案の様に蛍光観察という場面が多くなり、則ち人間の可視光以外の領域の観察記録する事がデジタルカメラを用いて記録する事が多くなっている。各種の光学フィルターの組合せの上での利用となるが、これらの用途に対応し簡便化される顕微鏡用デジタルカメラは無かった。デジタル記録の不満を解消する為に各種光学フィルターの組合せと調整交換を容易にできる機構にして、色の再現性と解析性を高めた光学素子調整機構を設置をする事で解決が出来る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】本発明の請求項１に係る光量検出器を内蔵した蛍光観察装置は、上記目的を達成するために、光ファイバーを斜入射もしくは水平入射させて照射し、光学鏡筒に光ファイバーを固定可動させる機構を設け、出射させる光ファイバーは、設置角度が可変となり、角度は水平角度から斜入できる角度迄対応する機構とする。（図２参照）。【０００８】同請求項１に係るものは、上記目的を達成するために、光ファイバーをガラスピペット内に封入された構造とし、試料に鋭利に穿孔できる様にしたもの。光ファイバーは概ね５〜３００ミクロンのものを用いて、ガラスピベット内に封入するが、ピベット形状は、使用目的に応じてストレート（直管）又は図３の様に一定の角度を有した機構からなる。【０００９】同請求項２に係るものは、上記目的を達成するために、光ファイバーを２種類を用いて、励起照明用と画像伝送用の組み合わせからなり、画像伝送用イメージガイドにはその先端にレンズを取付けた構造とする。（図４、ａ参照）。【００１０】同請求項３に係るものは、上記目的を達成するために、請求項２に吸引導出孔を設け、新たに抗体反応用に蛍光粒子試薬をピペット先端部より導出したり、蛍光発現している部位を吸引排出する構造からなる。更に励起光源８に半導体レーザーを配置しレーザートラップ法を応用して先端で浮遊した試料を吸引捕捉するもの。【００１１】同請求項４に係るものは、上記目的を達成するために、励起光源として発光ダイオード又はそのチップを環状又は馬蹄形の形で配置し、励起させる各波長毎の素子を交互に設置し、スイッチで切替えを行い、所定同一波長又は同時に各波長を出射する機構とし、例えばＵＶ、Ｂｌｕｅ、Ｇｒｅｅｎ、ＩＲの各発光ダイオード又はそのチップを複数個、交互に設置しておき、その印加方法としては、連続出力に加えてパルス励起法もできる様にパルス駆動回路を設け、また紫外線素子を使用する時は、印加電源部に冷却機構を設置することも有る。更に落射照明光源による光路にファイバーピペットからの照明励起を可能ならしめる為に励起光源ユニットにダイクロックミラー等を介して光路を分岐できる構造とするか、またはファイバーピペット導光先端部に発光素子を設けた構造とする。【００１２】同請求項５に係るものは、上記目的を達成するために、光量を定量化する目的で、励起光源の光路上にダイクロックミラーから導かれた励起光量を測定できるセンサーを配置し、尚、センサーには希土類元素等を添加し、紫外線を可視光に変換できる波長変換特殊ガラス製のものを用いて励起光量をモニター表示が出来る構造としたものを用いるか、又はフォトダイオード等のセンサーからなるもの。【００１３】同請求項６に係るものは、上記目的を達成するために、撮像素子の受光面に近い位置に、光学素子調整機構部を設け、スライド式又はターレット回転板式機構とし、各種フィルターの組合せ配置して画像の取得生成を容易にするもの。【００１４】
【発明を実施するためのの最良の形態】
以下本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。
【実施例１】図１は本発明に係る光量検出器を内蔵した蛍光観察装置の一実施形態の構成を示す概要図である。【００１５】顕微鏡光学系は、一個または複数個のレンズ（図では２個のレンズ、すなわち対物レンズ９、接眼レンズ２２）及びその他の光学素子２７、さらに幾枚かのミラー２７、２８を備え、試料３から発する蛍光を一部は接眼レンズ２２を介し、他方は撮像素子２３からモニター２４で観察できるように構成してある。又、試料３を下方から照明する透過照明系２６と、試料３に予め染色してある蛍光色素を光らせるための励起光を試料３に対して出射する励起照明系として、試料３の上方から照明する落射照明光源１と、図１に示すように、光源３５を含むを光ファイバ１０とピペット１２を試料３の側面から、斜めに又は水平から入射させて励起するようにしてもよい。使用する光ファイバー１０は、紫外域波長に対応するものを使用する。光ファイバー１０の固定は、ＸＹＺ軸で可動とし、芯出し機構を合わせ持つ固定ガイド機構５を用い、微小スポット光を照射できるようにしたものが好ましい。
さらに図２に示すように、光ファイバー１０を斜めにまたは水平に入射させて照射する構成とすることもできる。更に試料に穿孔して内部を照射する事もできる。この場合、顕微鏡光学系の光学鏡筒４に光ファイバー１０を固定しかつ可動させる固定ホルダ５を設け、光ファイバ１０の設置角度を可変できるようにする。光ファイバー１０の設置角度は水平から斜めまで対応できるようにすることが好ましい。図中２９は集光レンズ、３０はスリットである。また落射照明励起光源１は、発光ダイオード（以下ＬＥＤと省略することもある。）や半導体レーザー等の小型発光素子を励起光源２として備えている。透過照明系２６は、各種顕微鏡観察法との併用を可能とするもので、通常の明視野観察、位相差観察等と併用するために設けてある。【００１６】なおこれら照明系１、２６、３５は、透過照明系２６が対物レンズ９の直下から照明し、落射励起照明系１が対物レンズ９の直上から照明するが、さらに光ファイバーによる斜光入射法からなる。【００１７】デジタル記録系は、上述した顕微鏡光学系により得た画像をデジタル的に記憶するとともに、画像表示できるようにするもので、エミッションフィルターを含む光学素子調整機構７、撮像手段２３及びモニター２４からなる。撮像手段２３は、詳細な図示は省略するが、ＣＣＤカメラ等と記録メディア（ハードディスク、スマートメディア等）から構成し、ＣＣＤ等の構成要素には公知の手段を適宜採用すればよい。なお公知のように、ＣＣＤカメラ等とＣＲＴ等のモニタ２４の組み合わせにより観察倍率を上げることも可能である。【００１８】この光量検出器を内蔵した蛍光観察装置は、落射照明励起光源１から発した光を通ってエキサイターフィルター３１により波長選択して励起光として試料３に照射する。励起光はダイクロックミラー６、対物レンズ９を通り試料３を励起照明する。必要であれば、透過照明系２６で試料３を下方から照明することもできる。尚、発振波長が明確な発光ダイオードや半導体レーザ等の発光素子を用いるので、エキサイターフィルター３１は省略することもできる。【００１９】試料３はあらかじめ蛍光色素にて染色しておき、励起光が照射されると蛍光を発するようにしておく。この蛍光は対物レンズ９を通りダイクロックミラー６とエミッションフィルターを含む光学素子調整機構７を透過し、接眼レンズ２２による観察や、デジタル記録系による撮像、記録に供される。試料３の蛍光色素による染色は公知の手法を用いればよいが、近年開発された微粒状の蛍光物を試料３に含ませるようにしてもよい。この場合、試料３が動物や植物等から採取するものであれば、微粒状の蛍光物を摂取させた後に試料とすることができる。【００２０】この光量検出器を内蔵した蛍光観察装置は、光源として発光ダイオードや半導体レーザー等の小型発光素子を用いていることで光源部の小型化、顕微鏡部分の小型化、低消費電力化、低発熱量化を実現している。【００２１】次に、励起光源の選択について説明する。既述の各種蛍光観察に対して本発明では以下のように発光ダイオードを組み合せて構成する。半導体レーザー等の他の小型発光素子を用いる場合についてもほぼ同様に検討すればよい。
【実施例２】
【００２２】図２は、ファイバー励起光源を用いた概要図である。光ファイバー１０は、光学鏡筒４に固定しかつ可動させる固定ホルダ５を設け、ＸＹＺ軸で可動とし、芯出し機構を合わせ持つ固定ガイド機構５を用い、微小スポット光を照射できる様に設計され、発光ダイオード又は半導体レーザー３５から出射された励起光は光ファイバー１０を通じて試料３の側面近傍に入射され、光ファイバー１０の設置角度は水平から斜めまで対応できるように設置角度が可変できる機構になっている。３３はインジェクターである。
【実施例３】
【００２３】図３は、光ファイバー１０をガラスピペット１２内に封入された構造とし、試料に鋭利に穿孔ささる様にしたものであり、使用する光ファイバー１０は概ね５〜３００ミクロンのものを用いて、ガラスピペット１２内に封入するが、ピペット形状は、使用目的に応じてストレート（直管）と図示の様に一定の角度を有した機構からなる説明図である。ガラスビペットは、外径１〜２ｍｍ、厚み０．５〜１．２ｍｍの細いガラス管をヒーターで加熱し融点近くに成った時に引き延ばすと先端部が細くなり、これを切断加工して作成し、更に使用目的に応じた針状に加工し、この中に光ファイバーを封入するか、予めファイバーをガラス管に挿入しておいてから成形加工しても良い。
【実施例４】
【００２４】図４、ａは、ピペット内部に励起光源導光用ファイバー１０の他にファイバー照射先端画像を取得するイメージガイドなる光ファイバー１１とその先端にレンズを取付け、更に照射用ファイバーとイメージガイドを同軸光軸ならしめる同軸調整スリット３４構造からなる説明図である。イメージガイドは得られる画像解像度を考慮して３０００画素以上有るものが望ましい。図４、ｂの様にイメージガイド１１を中心に配置し周囲に励起照射用ファイバー１０で包み込む構造としても良い。
【実施例５】
【００２５】図５は、上記の励起光源構造部に吸引導出孔チューブ３２を設け、新たに抗体反応を生じさせる為の蛍光粒子試薬等をピペット先端部より導出したり、蛍光発現している部位を吸引する構造からなる説明図である。吸引導出孔は新たなチューブ３２を配置せずにガラスピペット１２内の隙間の細孔路を利用する事ができる。又、励起光源３５に半導体レーザーを配置してレーザートラップ法により先端で浮遊した試料を吸引捕捉するものである。
【実施例６】
【００２６】図６は、発光ダイオード又はそのチップを環状又は馬蹄形の形で配置し、励起させる各波長毎に交互に設置し、例えばＵＶ、Ｂｌｕｅ、Ｇｒｅｅｎ、ＩＲの各発光ダイオード又はそのチップを複数個、交互に配置した模式図である。図示せぬスイッチで切替えを行い、所定波長又は同時出射する機構としたものとする。機能は、波長切替え、同時励起出来る様に事と励起コントロール表示が明示されたものである。本案の想定する基本的励起波長光源の組合せは次の通りである。この他の波長の組合わせでも構わない。
ＵＶ      ：３６５ｎｍ又は３８０ｎｍ（これ以下の波長でも良い）。
Ｂｌｕｅ  ：４６５ｎｍ
Ｇｒｅｅｎ：５３０ｎｍ
ＩＲ      ：８００ｎｍ
【実施例７】
【００２７】図７は、発光ダイオードを用いた励起光源ユニット概要図である。右端発光ダイオードから照射された光束は集光レンズ系を通じて、例えば個別コンデンサレンズで対応させるか、フライアイレンズ又は円筒形レンズ（球面レンズ）を用いて、平行光束系光路設計とし、左端から出射できる設計となるもの。印加電源装置１７は、定常光とパルス光の二つの励起法ができる様にパルス駆動回路を設けた励起光源ユニットとからなる構造とする。
【実施例８】
【００２８】図８は、更にはファイバー出射を可能とする様に分岐機構１９を設けた励起光源ユニットとからなる概要図である。光ファイバーへ導光された励起光は、ファイバーライトガイドを通じて照射される。光ファイバーと発光ダイオードへの接合は平行光束を重要視する。発光ダイオードの光源系に対応するケーラーレンズ若しくはファイバーロッドを通じて集光させる。発光ダイオードとファイバーの接合には、１対１で対応し、できればチップタイプの発光ダイオードを用いる、この時のチップＬＥＤのサイズを一つの面光源とし、その複数個に束ねた場合はその束ねたサイズが面光源である。光ファイバーをバンドル化して対応としても良い。
【実施例９】
【００２９】図９は、励起光源から出射される励起光量を測定モニター出来る光量検出器の模式図である。センサーには希土類元素等を添加し、紫外線を可視光に変換できる波長変換特殊ガラス製のものを用いて励起光量をモニター表示が出来る構造とする。又はホトダイオード等でも良い。従来、蛍光反応材としては、希土類錯体や有機蛍光色素が有ったが、希土類イオンをガラス結晶化した蛍光ガラスが製造される様になった。しかし蛍光センサーとして紫外線を検知出来るものは耐久性の観点からは見当たらなかったが、これらの蛍光ガラスはその耐久性、変換効率からセンサーとして利用できる様になった。ただ残念な事に波長域を制限された蛍光ガラスしか無いので、本案の様な広域の波長感度に対応工夫するにはセンサー１３を考案して用いる。基板は光が透過できる材料を選定し、厚みが約１ｍｍのガラス基板１５を用いる。この基板１５上に上記の各波長毎に対応した蛍光ガラス膜１４を蒸着等で積層する。厚みは凡そ５０〜１０００ｎｍの膜厚としたものを検知部とし、ここへ照射された光量がこの膜で波長変換されて可視化された光量を基板の反対側に整列させた光ファイバー１６で受光して光電変換して測定をする。
【実施例１０】
【００３０】図１０は、撮像素子の前面に紫外線域から可視光、赤外線域迄の励起波長に対応し、且つ色温度補正フィルター等を設けた光学素子調整機構の模式図である。機構としては、スライド式図１０、ａ又は、ターレット回転板式図１０、ｂとなる機構で有る。顕微鏡撮影にあたり、先ず基本的な事は、照明を前提にした撮影記録故に通常、上部からの落射（反射）式照明と、下部からの透過照明方式の二通りが有る。さらには光源の種類、照射の仕方が異なる方式の中で、一律の最適化したホワイトバランス調整は難しいこととなり、各々の設定条件を考慮し複雑な調整作業を必要としていた。ここで、色温度の概要を把握できれば、光学フィルターによる変換を行う事で解決できる。フィルターとしては、２種類以上を組み合わせて、より色温度補正を行える機構にしたもの。則ち蛍光フィルターだけでは解決しえない色温度フィルターを組合わせて使用するもの。色温度校正用には、色温度変換フィルターには、色温度を上げるブルーフィルター（波長の大きい赤色光を抑制し波長の短かい青色光の透過率を向上）と、色温度を下げるアンバーフィルター（波長の短い青色光を抑制し、波長の長い赤色光の透過光を向上）するフィルターを配置する。即ち、光学フィルター無しか、又はホワイトバランス調整をしたデジタルカメラで、撮影記録されたもので赤みが強すぎる時には、色温度が低い為に色温度を上げる光学フィルターを使用する。撮影記録されたものが青味が強い時は、色温度を下げる光学フィルターを使用する。但し、配置する光学フィルターは簡単に取り外しと交換が容易にできる機構となっているもの。この様にフィルターを試しながら観察撮影記録する事によって、失敗が防げたり、各種色彩の異なった画像、蛍光画像等に対応する。【００３１】
【発明の効果】
本発明に係る光量検出器を内蔵した蛍光観察装置は  以上説明してきたように、顕微鏡蛍光観察を容易に行えるシステムである。各種励起照明法のうち、導光用光ファイバーを用いた励起照明法は、試料近傍又は試料内部へ穿孔照射できる励起光源となり、細胞内のダイナミックな生命現象解析の為の細胞１個１個への局在観察に有効な一分子蛍光イメージングの有効な観察道具となる。又、小型省電力の発光ダイオードを用いる事により、複数の印加励起法、定常光とバルス光励起が行え、更に励起光量検出器を付加する事で、複雑な蛍光発現事象をトレース出来たり、再現性実験が容易となる効果が出る。一方、蛍光反応は従来の紫外線領域から可視域、赤外線領域にも範囲が広がっており、これらの広範な波長対応を考慮した顕微鏡画像を撮影記録する上で光学素子調整機構を設ける事で、デジタル記録方式の一律機会的な画像撮影記録を補完しうるもので有る。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明に係る光量検出器を内蔵した蛍光観察装置の概要図である。
【図２】ガラスピペット内封入光ファイバー励起法による部分蛍光観察法の概要図である。
【図３】光ファイバーをガラスピペット内に封入された構造図である。
【図４】（ａ）ピペット内部に励起光源導光用ファイバーとイメージガイドなる光ファイバーとその先端にレンズを取付けた構造図である。（ｂ）イメージガイドを中心にその周囲に導光ファイバーからなる構造図である。
【図５】図３の励起光源導光用ファイバーとイメージガイドなる光ファイバーの他に更に吸引導出孔を設けた構造図である。
【図６】発光ダイオード又はそのチップを複数個、交互に配置した模式図である。
【図７】発光ダイオードを用いた励起光源ユニット概要図である。
【図８】ファイバー出射を可能とする様に分岐機構を設けた励起光源ユニット概要図である。
【図９】励起光源から出射される励起光量を測定モニター出来る光量検出器の模式図である。
【図１０】（ａ）スライド形式の光学素子調整機構の模式図である。（ｂ）回転形式の光学素子調整機構の模式図である。
【符号の説明】
【００３３】  １・・・励起光源
２・・・発光ダイオード
３・・・試料
４・・・光学鏡筒
５・・・固定ガイドフォルダ
６・・・ダイクロックミラー
７・・・光学素子調整機構
８・・・フィルター（ＥＭ）
９・・・対物レンズ
１０・・・光ファイバー
１１・・・イメージガイド
１２・・・ガラスビペット
１３・・・励起光量センサー
１４・・・波長対応蛍光膜
１５・・・基板
１６・・・受光ファイバー
１７・・・印加電源装置
１８・・・冷却機構
１９・・・ファイバー分岐
２０・・・光学調整機構スライド式
２１・・・光学調整機構ターレット式
２２・・・接眼レンズ
２３・・・撮像素子
２４・・・モニター
２５・・・ＸＹＺ駆動ステージ
２６・・・透過照明
２７、２８・・・ミラー
２９・・・集光レンズ
３０・・・スリット
３１・・・フィルター（ＥＸ）
３２・・・吸引導出孔チューブ
３３・・・インジェクター
３４・・・同軸調整スリット
３５・・・励起光源