(57)【要約】核酸免疫化は、リポソーム内に被包されたＲＮＡを送達することによって達成される。上記ＲＮＡは、目的の免疫原をコードし、上記リポソームは、６０〜１８０ｎｍの範囲、および理想的には、８０〜１６０ｎｍの範囲の直径を有する。従って、本発明は、水性コアを被包する脂質二重層を有するリポソームを提供し、ここで：（ｉ）上記脂質二重層は、６０〜１８０ｎｍの範囲の直径を有し；そして（ｉｉ）上記水性コアは、免疫原をコードするＲＮＡを含む。これらリポソームは、脊椎動物細胞への上記ＲＮＡのインビボ送達に適しているので、それらは、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物中の成分として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の免疫原をコードするＲＮＡを中に被包しているリポソームであって、６０ｎｍ〜１８０ｎｍの範囲の直径を有する、リポソーム。
【請求項２】
請求項１に記載のリポソームであって、８０ｎｍ〜１６０ｎｍの範囲の直径を有する、リポソーム。
【請求項３】
前述の請求項のいずれかに記載のリポソームであって、カチオン性頭部を有する脂質を含む、リポソーム。
【請求項４】
前述の請求項のいずれかに記載のリポソームであって、両性イオン性頭部を有する脂質を含む、リポソーム。
【請求項５】
前記ＲＮＡは、自己複製ＲＮＡである、前述の請求項のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項６】
前記自己複製ＲＮＡ分子は、
（ｉ）該自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および
（ｉｉ）免疫原
をコードする、請求項５に記載のリポソーム。
【請求項７】
前記ＲＮＡ分子は、２個のオープンリーディングフレームを有し、該２個のオープンリーディングフレームのうちの第１のものは、アルファウイルスレプリカーゼをコードし、該２個のオープンリーディングフレームのうちの第２のものは、前記免疫原をコードする、請求項６に記載のリポソーム。
【請求項８】
前記ＲＮＡ分子は、９０００〜１２０００ヌクレオチド長である、前述の請求項のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項９】
前記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対するインビボでの免疫応答を誘発し得る、前述の請求項のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項１０】
前述の請求項のいずれかに記載のリポソームを含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
リポソームの集団を含む薬学的組成物であって、ここで該集団中の該リポソームの平均直径は、６０ｎｍおよび１８０ｎｍも含めた６０ｎｍ〜１８０ｎｍである、薬学的組成物。
【請求項１２】
脊椎動物における防御免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、該脊椎動物に、請求項１〜９に記載のリポソームまたは請求項１０もしくは請求項１１に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年８月３１日に出願された米国仮出願番号第６１／３７８，８３１号の利益を主張し、上記米国仮出願の全容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、免疫化のためのＲＮＡの非ウイルス性送達の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
動物を免疫化するための核酸の送達は、数年間にわたり目標であった。種々のアプローチが、試験されてきており、それらとしては、ＤＮＡもしくはＲＮＡの使用、ウイルスもしくは非ウイルス性送達ビヒクルの使用（またはさらには「裸の」ワクチンにおいて、送達ビヒクルなし）、複製もしくは非複製ベクターの使用、またはウイルスもしくは非ウイルス性ベクターの使用が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
さらなる改善された核酸ワクチン、特に、核酸ワクチンの送達の改善された方法への必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の開示）
本発明によれば、核酸免疫化は、リポソーム内に被包されたＲＮＡを送達することによって達成される。上記ＲＮＡは、目的の免疫原をコードし、上記リポソームは、６０〜１８０ｎｍの範囲、および理想的には、８０〜１６０ｎｍの範囲の直径を有する。このサイズは、例えば、エンベロープで包まれていないアルファウイルスアイソメトリックタンパク質キャプシドの直径約４０ｎｍと匹敵する。小さなリポソームとＲＮＡ（特に、自己複製ＲＮＡ）の効率的な被包との組み合わせは、強力な免疫応答を誘発するための効率的送達を可能にする。
【０００６】
従って、本発明は、目的の免疫原をコードするＲＮＡを中に被包しているリポソームを提供し、ここで上記リポソームは、６０〜１８０ｎｍの範囲の直径を有する。これらリポソームは、脊椎動物細胞への上記ＲＮＡのインビボ送達に適しているので、それらは、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物中の成分として有用である。
【０００７】
本発明はまた、ＲＮＡ含有リポソームを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、ＲＮＡと、１種以上の脂質とを、上記脂質がリポソーム（６０〜１８０ｎｍの範囲の直径を有し、上記ＲＮＡが被包されている）を形成する条件下で混合する工程を包含する。
【０００８】
（リポソーム）
本発明は、免疫原コードＲＮＡを中に被包しているリポソームを利用する。従って、上記ＲＮＡは、いかなる外部媒体からも分離している（天然ウイルスにおけるように）。上記リポソーム内への被包は、ＲＮＡをＲＮａｓｅ消化から保護することが見いだされた。上記リポソームは、いくらかの外部ＲＮＡを（例えば、それらの表面に）含み得るが、上記ＲＮＡのうちの少なくとも半分（および理想的には、全て）は、上記リポソームのコア中に被包される。リポソーム内への被包は、例えば、参考文献１で開示される脂質／ＲＮＡ複合体とは異なる（ここでは、ＲＮＡは、予め形成されたリポソームと混合される）。
【０００９】
種々の両親媒性脂質は、水性環境中で二重層を形成して、ＲＮＡ含有水性コアをリポソームとして被包し得る。これら脂質は、アニオン性、カチオン性もしくは両性イオン性の親水性頭部（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）を有し得る。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、１９６０年代にさかのぼり、カチオン性リポソーム形成脂質は、１９９０年代以来研究されてきた。あるリン脂質はアニオン性であるのに対して、他のものは両性イオン性であり、そして他のものはカチオン性である。リン脂質の適切なクラスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロール。そしていくつかの有用なリン脂質は、表１に列挙される。有用なカチオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤｌｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。両性イオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質。有用な両性イオン性脂質の例は、以下である：ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、ドデシルホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１，２−ジフィタノイル（ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）。上記脂質は、飽和であってもよいし、不飽和であってもよい。リポソームを調製するための少なくとも１種の不飽和脂質の使用が好ましい。不飽和脂質が２つのテールを有する場合、両方のテールが不飽和であり得、またはそれは、１つの飽和テールおよび１つの不飽和テールを有し得る。脂質は、例えば、ＲＶ０５におけるように、１つのテールにステロイド基を含み得る（図１６ＡおよびＣ〜Ｋもまた参照のこと）。
【００１０】
従って、いくつかの実施形態において、本発明は、水性コアを被包する脂質二重層を有するリポソームを提供し、ここで：（ｉ）上記リポソームは、６０〜１８０ｎｍの範囲の直径を有し；そして（ｉｉ）上記水性コアは、免疫原をコードするＲＮＡを含む。
【００１１】
本発明のリポソームは、単一の脂質から、または脂質の混合物から形成され得る。混合物は、（ｉ）アニオン性脂質の混合物、（ｉｉ）カチオン性脂質の混合物、（ｉｉｉ）両性イオン性脂質の混合物、（ｉｖ）アニオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、（ｖ）アニオン性脂質と両性イオン性脂質との混合物、（ｉｖ）両性イオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、または（ｖｉｉ）アニオン性脂質と、カチオン性脂質と、両性イオン性脂質との混合物を含み得る。同様に、混合物は、飽和脂質および不飽和脂質の両方を含み得る。例えば、混合物は、ＤＳＰＣ（両性イオン性，飽和）、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性，不飽和）、および／もしくはＤＭＧ（アニオン性，飽和）を含み得る。脂質の混合物が使用される場合、上記混合物中の成分の脂質の全てが、両親媒性である必要はない（例えば、１種以上の両親媒性脂質が、コレステロールと混合され得る）。
【００１２】
本発明のリポソームが脂質の混合物から形成される場合、好ましくは、カチオン性である脂質の割合は、脂質の全量のうちの２０〜８０％（例えば、３０〜７０％、もしくは４０〜６０％）であるべきである。その残りは、例えば、コレステロール（例えば、３５〜５０％  コレステロール）および／もしくはＤＭＧ（必要に応じて、ＰＥＧ化される）および／もしくはＤＳＰＣから構成され得る。このような混合物は、以下で使用される。これらパーセンテージの値は、モルパーセンテージである。
【００１３】
リポソームは、親水性部分がＰＥＧ化されている（すなわち、ポリエチレングリコールの共有結合によって改変されている）両親媒性脂質を含み得る。この改変は、上記リポソームの安定性を増大させ得、かつ非特異的吸着を妨げ得る。例えば、脂質は、参考文献２および３に開示されるもののような技術を使用して、ＰＥＧに結合体化され得る。ＰＥＧは、上記リポソームに、都合の良い薬物動態特性を付与し得るコーティングを提供する。種々の長さのＰＥＧが使用され得る（例えば、０．５〜８ｋＤａ）。
【００１４】
従って、リポソームは、カチオン性脂質（例えば、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＲＶ０５）、両性イオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣ、ＤＰｙＰＥ）、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質から形成され得る。ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧおよびコレステロールの混合物は、実施例において使用され、いくつかのさらなる混合物もまた同様に使用される。
【００１５】
リポソームは、通常、３つの群に分けられる：多層小胞（ＭＬＶ）；小さな単層小胞（ＳＵＶ）；および大きな単層小胞（ＬＵＶ）。ＭＬＶは、各小胞において複数の二重層を有し、いくつかの別個の水性区画を形成する。ＳＵＶおよびＬＵＶは、水性コアを被包する単一の二重層を有する；ＳＵＶは、代表的には、直径≦５０ｎｍを有し、ＬＵＶは、直径＞５０ｎｍを有する。本発明のリポソームは、理想的には、６０〜１８０ｎｍの範囲、好ましくは、８０〜１６０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶである。上記リポソームは、好ましくは、実質的に球状である。それらが球状でない場合には、用語「直径」は、リポソームの最も大きな断面直径に言及する。
【００１６】
本発明のリポソームは、複数のリポソームを含む組成物の一部であり得、上記複数のリポソーム中のリポソームは、ある範囲の直径を有し得る。異なる直径を有するリポソームの集団を含む組成物に関して：（ｉ）上記リポソームの数で少なくとも８０％は、６０〜１８０ｎｍの範囲、および好ましくは、８０〜１６０ｎｍの範囲の直径を有するべきであり、そして／または（ｉｉ）上記集団の平均直径（強度で、例えば、Ｚ平均）は、理想的には、６０〜１８０ｎｍの範囲、および好ましくは、８０〜１６０ｎｍの範囲にある。
【００１７】
理想的には、リポソームサイズ（強度で）の分布は、唯一の最大を有する。すなわち、２つの最大を有するのではなく、平均あたりに分布したリポソームの単一の集団が存在する（モード）。リポソームの集団内の直径は、理想的には、多分散性指数＜０．２、およびときおり、＜０．１を有するはずである。参考文献１のリポソーム／ＲＮＡ複合体は、６００〜８００ｎｍの範囲の直径を有し、高い多分散性を有すると予測される。
【００１８】
リポソームの懸濁物における平均粒子直径およびサイズ分布を決定するための装置は、市販されている。これらは、代表的には、動的光散乱および／もしくは単一粒子光学感知の技術を使用する（例えば、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，  ＵＳＡ）から入手可能なＡｃｃｕｓｉｚｅｒＴＭおよびＮｉｃｏｍｐＴＭシリーズの機器、またはＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＫ）のＺｅｔａｓｉｚｅｒＴＭ機器、またはＨｏｒｉｂａ（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）のＰａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器）。動的光散乱は、リポソーム直径が決定される好ましい方法である。リポソームの集団に関して、本発明の組成物中の平均リポソーム直径を規定するための好ましい方法は、Ｚ平均（すなわち、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されるリポソームの全体の集合の強度重み付け平均流体力学的サイズ（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｍｅａｎ  ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｉｚｅ））である。上記Ｚ平均は、測定された相関曲線のキュムラント分析から導出され、ここで、単一粒子サイズ（リポソーム直径）が想定され、単一指数関数的あてはめが、自己相関関数に適用される。上記キュムラント分析アルゴリズムは、分布を生じるのではなく、強度重み付けＺ平均に加えて、多分散性指数を与える。
【００１９】
適切なリポソームを調製するための技術は、当該分野で周知である（例えば、参考文献４〜６を参照のこと）。１つの有用な方法は、参考文献７において記載され、（ｉ）脂質のエタノール性溶液、（ｉｉ）核酸の水性溶液、および（ｉｉｉ）緩衝液を混合する工程、続く、混合、平衡化、希釈および精製を包含する。好ましい本発明のリポソームは、この混合プロセスによって得られ得る。所望の直径を有するリポソームを得るために、混合は、水性ＲＮＡ溶液の２つの供給ストリームが、１つの混合ゾーンにおいて、脂質のエタノール性溶液の１つのストリームと、全て同じ流量において、例えば、以下に記載されるとおりのマイクロ流体チャネルにおいて、合わされるプロセスを使用して行われ得る。
【００２０】
（ＲＮＡ）
本発明のリポソームは、免疫原をコードするＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡとは異なる）を含む。上記粒子のインビボ投与後、ＲＮＡは、上記粒子から放出され、上記免疫原をインサイチュで提供するように、細胞の中で翻訳される。
【００２１】
上記ＲＮＡは、プラス鎖であるので、いかなる介在複製工程（例えば、逆転写）も必要とすることなく、細胞によって翻訳され得る。それはまた、免疫細胞によって発現されるＴＬＲ７レセプターに結合し得、それによって、アジュバント効果を開始する。
【００２２】
好ましいプラス鎖ＲＮＡは、自己複製性である。自己複製ＲＮＡ分子（レプリコン）は、あらゆるタンパク質なしで脊椎動物細胞に送達される場合でも、上記自己複製ＲＮＡ分子自体からの転写によって（上記自己複製ＲＮＡ分子自体から生成するアンチセンスコピーを介して）、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらし得る。自己複製ＲＮＡ分子は、従って、代表的には、細胞へ送達された後に直接翻訳され得るプラス鎖分子であり、この翻訳は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供し、次いで、これは、上記送達されたＲＮＡからアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方を生成する。従って、上記送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらす。これら娘ＲＮＡ、ならびに同一線上（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）のサブゲノム転写物は、それ自体が翻訳されて、コードされた免疫原のインサイチュ発現を提供し得るか、または転写されて、上記送達されたＲＮＡと同じセンスのさらなる転写物（上記免疫原のインサイチュ発現を提供するように翻訳される）を提供し得る。この一連の転写の全体的な結果は、上記導入されたレプリコンＲＮＡの数における非常に多くの増幅であり、よって、上記コードされた免疫原は、上記細胞の主なポリペプチド生成物になる。
【００２３】
自己複製を達成するための１つの適切なシステムは、アルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンを使用することである。これらのプラス鎖レプリコンは、細胞への送達後に翻訳され、レプリカーゼ（もしくはレプリカーゼ−転写酵素）をもたらす。上記レプリカーゼは、上記送達されたプラス鎖ＲＮＡのゲノムマイナス鎖コピーを作り出す複製複合体を提供するように自己切断するポリプロテインとして翻訳される。これらマイナス鎖転写物は、これ自体が、上記プラス鎖親ＲＮＡのさらなるコピーを与え、そしてまた、免疫原をコードするサブゲノム転写物を与えるように転写され得る。従って、上記サブゲノム転写物の翻訳は、感染した細胞による上記免疫原のインサイチュ発現をもたらす。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビス・ウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用し得る。変異型ウイルスもしくは野生型ウイルスの配列が使用され得る（例えば、ＶＥＥＶの弱毒化ＴＣ８３変異体は、レプリコンにおいて使用されてきた［８］）。
【００２４】
好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、従って、（ｉ）上記自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）免疫原をコードする。上記ポリメラーゼは、アルファウイルスレプリカーゼ（例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４のうちの１種以上を含む）であり得る。
【００２５】
天然のアルファウイルスゲノムが、上記非構造レプリカーゼポリプロテインに加えて、構造的ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。従って、好ましい自己複製ＲＮＡは、細胞においてそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの生成をもたらし得るが、ＲＮＡ含有ビリオンの生成はもたらさない。これらのビリオンを生成できないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、上記自己複製ＲＮＡ分子が、感染性形態においてそれ自体を永続させられないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続に必要な上記アルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡには存在せず、それらの位置は、上記目的の免疫原をコードする遺伝子によってしめられている。その結果、上記サブゲノム転写物は、上記構造的アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく、上記免疫原をコードする。
【００２６】
従って、本発明で有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２個のオープンリーディングフレームを有し得る。第１の（５’側）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし；第２の（３’側）オープンリーディングフレームは、免疫原をコードする。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、例えば、さらなる免疫原（以下を参照のこと）をコードするために、もしくは補助ポリペプチドをコードするために、さらなる（例えば、下流の）オープンリーディングフレームを有し得る。
【００２７】
自己複製ＲＮＡ分子は、コードされたレプリカーゼとの適合性の５’配列を有し得る。
【００２８】
自己複製ＲＮＡ分子は、種々の長さを有し得るが、それらは、代表的には、５０００〜２５０００ヌクレオチド長（例えば、８０００〜１５０００ヌクレオチド、もしくは９０００〜１２０００ヌクレオチド）である。従って、上記ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ送達において認められるものより長い。
【００２９】
本発明で有用なＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば、７−メチルグアノシン）を有し得る。このキャップは、上記ＲＮＡのインビボ翻訳を増強し得る。
【００３０】
本発明で有用なＲＮＡ分子の上記５’ヌクレオチドは、５’トリホスフェート基を有し得る。キャップされたＲＮＡにおいて、これは、５’から５’への架橋を介して、７−メチルグアノシンに連結され得る。５’トリホスフェートは、ＲＩＧ−Ｉ結合を増強し得るので、アジュバント効果を促進し得る。
【００３１】
ＲＮＡ分子は、３’ポリ−Ａテールを有し得る。それはまた、その３’末端付近にポリ−Ａポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含み得る。
【００３２】
本発明で有用なＲＮＡ分子は、代表的には、一本鎖である。一本鎖ＲＮＡは、一般に、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＲＮＡヘリカーゼおよび／もしくはＰＫＲへの結合によって、アジュバント効果を開始し得る。二本鎖形態において送達されるＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＴＬＲ３に結合し得、このレセプターはまた、一本鎖ＲＮＡの複製の間もしくは一本鎖ＲＮＡの二次構造内のいずれかで形成されるｄｓＲＮＡによって駆動（ｔｒｉｇｇｅｒ）され得る。
【００３３】
本発明で有用なＲＮＡ分子は、便宜上、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって調製され得る。ＩＶＴは、細菌においてプラスミド形態において作られ、増やされたか、または合成で作製された（例えば、遺伝子合成および／もしくはポリメラーゼ連鎖反応操作法によって）（ｃＤＮＡ）テンプレートを使用し得る。例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）は、ＤＮＡテンプレートからＲＮＡを転写するために使用され得る。適切なキャッピングおよびポリＡ付加反応は、必要時に使用され得る（しかし、上記レプリコンのポリＡは、通常、上記ＤＮＡテンプレート内にコードされる）。これらＲＮＡポリメラーゼは、転写される５’ヌクレオチドについてストリンジェントな要件を有し得、いくつかの実施形態において、これらの要件は、上記ＩＶＴ転写ＲＮＡが、自己がコードするレプリカーゼの基質として効率的に機能し得ることを確実にするために、上記コードされたレプリカーゼの要件とマッチしなければならない。
【００３４】
参考文献９において考察されるように、上記自己複製ＲＮＡは、（任意の５’キャップ構造に加えて）改変された核酸塩基を有する１個以上のヌクレオチドを含み得る。従って、上記ＲＮＡは、以下を含み得る：ｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）、Ｕｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍ１Ａ（ｌ−メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２−メチルアデノシン）；Ａｍ（２’−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６．−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート））；Ｉ（イノシン）；ｍ１１（１−メチルイノシン）；ｍ’Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２Ｔ−Ｏ−メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５−ホルミル（ｆｏｎｎｙｌ）シチジン）；ｍ５Ｃｍ（５，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リシジン）；ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（改変未満（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）；Ｑ（キューオシン）；ｏＱ（エポキシキューオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシル（ｇａｌｔａｃｔｏｓｙｌ）−キューオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−キューオシン）；ｐｒｅＱｏ（７−シアノ−７−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱｉ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ＊（アルカエオシン（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ））；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ−メトキシカルボニルメチル−２−Ｏ−メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−Ｌ−Ｏメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）；Ｔｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ−Ｏ−ジメチルアデノシン）；ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２−トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（（１，２−Ｏ−ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）；ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ−タウリノメチル−２−チオウリジン）；ｉｍＧ−１４（４−デメチルグアノシン）；ｉｍＧ２（イソグアノシン）；もしくはａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８−オキソ−アデニン、７−置換されたその誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルウラシル、５−メチルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルシトシン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、８−オキソグアニン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換された７−デアザプリン、７−デアザ−７−置換プリン、７−デアザ−８−置換プリン、または無塩基ヌクレオチド。例えば、自己複製ＲＮＡは、１つ以上の改変されたピリミジン核酸塩基（例えば、シュードウリジンおよび／もしくは５−メチルシトシン残基）を含み得る。しかし、いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、改変された核酸塩基を含まず、改変されたヌクレオチドを含まなくてもよい（すなわち、上記ＲＮＡ中のヌクレオチドのすべては、標準的なＡ、Ｃ、ＧおよびＵというリボヌクレオチドである（任意の５’キャップ構造を除く。これは、７’−メチルグアノシンを含み得る））。他の実施形態において、上記ＲＮＡは、７’−メチルグアノシンを含む５’キャップを含み得、最初の１個、２個もしくは３個の５’リボヌクレオチドは、リボースの２’位においてメチル化され得る。
【００３５】
本発明で使用されるＲＮＡは、理想的には、ヌクレオチド間にホスホジエステル結合のみを含むが、いくつかの実施形態において、それは、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、および／もしくはメチルホスホネート結合を含み得る。
【００３６】
理想的には、リポソームは、１０より少ない種の異なるＲＮＡ（例えば、５種、４種、３種、もしくは２種の異なる種）を含み；最も好ましくは、リポソームは、単一のＲＮＡ種を含み、すなわち、上記リポソーム中の全てのＲＮＡ分子は、同じ配列および同じ長さを有する。
【００３７】
リポソーム１つあたりのＲＮＡの量は、変動し得る。リポソーム１つあたりの個々の自己複製ＲＮＡ分子の数は、代表的には、リポソーム１つあたり≦５０（例えば、＜２０、＜１０、＜５、もしくは１〜４）である。
【００３８】
（免疫原）
本発明で使用されるＲＮＡ分子は、ポリペプチド免疫原をコードする。上記リポソームの投与後に、上記ＲＮＡは、インビボで翻訳され、上記免疫原はレシピエントにおける免疫応答を誘発し得る。上記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対して（あるいは、いくつかの実施形態において、アレルゲンに対して；および他の実施形態において、腫瘍抗原に対して）免疫応答を誘発し得る。上記免疫応答は、抗体応答（通常は、ＩｇＧを含む）および／もしくは細胞媒介性免疫応答を含み得る。上記ポリペプチド免疫原は、代表的には、対応する細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物（またはアレルゲンもしくは腫瘍）ポリペプチドを認識する免疫応答を誘発するが、いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物のサッカリドを認識する免疫応答を誘発するように、ミモトープとして作用し得る。上記免疫原は、代表的には、表面ポリペプチド（例えば、アドヘシン、ヘマグルチニン、エンベロープ糖タンパク質、スパイク糖タンパク質など）である。
【００３９】
上記ＲＮＡ分子は、単一のポリペプチド免疫原もしくは複数のポリペプチドをコードし得る。複数の免疫原は、単一のポリペプチド免疫原（融合ポリペプチド）として、または別個のポリペプチドとして提示され得る。免疫原が、レプリコンから別個のポリペプチドとして発現される場合、これらのうちの１種以上は、上流のＩＲＥＳもしくはさらなるウイルスプロモーターエレメントと共に提供され得る。あるいは、複数の免疫原は、短い自己触媒性プロテアーゼ（例えば、口蹄疫ウイルス２Ａタンパク質）に融合された個々の免疫原をコードするポリプロテインから、またはインテインとして発現され得る。
【００４０】
参考文献１および１０とは異なり、上記ＲＮＡは、免疫原をコードする。不確かさを避けるために、本発明は、ホタルルシフェラーゼをコードするＲＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼの融合タンパク質をコードするＲＮＡ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＲＮＡを含まない。このようなポリペプチドは、マーカーとして、またはさらに遺伝子治療の状況においても有用であり得るが、本発明は、免疫学的応答系を誘発するためのＲＮＡの送達に関する。遺伝子治療のためのリポソームの最適な直径は、免疫化目的のためのリポソームとは異なり得る。なぜなら標的細胞および組織が、これら２つのアプローチに関して異なるからである。従って、上記免疫原はまた、防御的宿主タンパク質を補充するかもしくはその代わりになる（遺伝子治療におけるように）ように送達される自己タンパク質ではない。また、上記ＲＮＡは、全マウス胸腺ＲＮＡではない。
【００４１】
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これら細菌のうちの１種に対して免疫応答を誘発する：
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ：有用な免疫原としては、膜タンパク質、例えば、アドヘシン、オートトランスポーター、毒素、鉄獲得タンパク質、およびＨ因子結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。３種の有用なポリペプチドの組み合わせが、参考文献１１に開示される。
【００４２】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用なポリペプチド免疫原は、参考文献１２に開示される。これらとしては、ＲｒｇＢ線毛サブユニット、β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ前駆体（ｓｐｒ００５７）、ｓｐｒ００９６、一般的なストレスタンパク質（ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｔｒｅｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ＧＳＰ−７８１（ｓｐｒ２０２１、ＳＰ２２１６）、セリン／スレオニンキナーゼＳｔｋＰ（ＳＰ１７３２）、および肺炎球菌表面アドヘシンＰｓａＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ：有用な免疫原としては、参考文献１３および１４に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ：有用な百日咳免疫原としては、百日咳毒素もしくはトキソイド（ＰＴ）、線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、ペルタクチン、ならびに凝集原２および３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：有用な免疫原としては、参考文献１５に開示されるポリペプチド（例えば、溶血素、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＢ、フェリクロム結合タンパク質（ｓｔａ００６）および／もしくはｓｔａ０１１リポプロテイン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ：代表的な免疫原は、破傷風トキソイドである。
【００４７】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ：代表的な免疫原は、ジフテリアトキソイドである。
【００４８】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ：有用な免疫原としては、参考文献１６および１７に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ：有用な免疫原としては、参考文献１３に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：有用な免疫原としては、ＰｅｐＡ、ＬｃｒＥ、ＡｒｔＪ、ＤｎａＫ、ＣＴ３９８、ＯｍｐＨ様、Ｌ７／Ｌ１２、ＯｍｃＡ、ＡｔｏＳ、ＣＴ５４７、Ｅｎｏ、ＨｔｒＡおよびＭｕｒＧ（例えば、参考文献１８に開示されるとおり）が挙げられるが、これらに限定されない。ＬｃｒＥ［１９］およびＨｔｒＡ［２０］は、２つの好ましい免疫原である。
【００５１】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用な免疫原としては、参考文献２１に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ：有用な免疫原としては、ＣａｇＡ、ＶａｃＡ、ＮＡＰ、および／もしくはウレアーゼ［２２］が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：有用な免疫原としては、腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡｇｇＥＣ）、分散接着性（ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ  ａｄｈｅｒｉｎｇ）Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ）および／もしくは腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）に由来する免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。ＥｘＰＥＣ株としては、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）および髄膜炎／敗血症関連Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＮＥＣ）が挙げられる。有用なＵＰＥＣポリペプチド免疫原は、参考文献２３および２４に開示される。有用なＭＮＥＣ免疫原は、参考文献２５に開示される。いくつかのＥ．ｃｏｌｉタイプに有用な免疫原は、ＡｃｆＤである［２６］。
【００５４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ
Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ：有用な免疫原としては、参考文献２７および２８に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
【化１】
2013538569.tif 000002
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これらウイルスのうちの１種に対して免疫応答を誘発する：
オルソミクソウイルス：有用な免疫原は、インフルエンザＡ、ＢもしくはＣウイルスに由来し得る（例えば、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼもしくはマトリクスＭ２タンパク質）。上記免疫原がインフルエンザＡウイルスヘマグルチニンである場合、それは、任意のサブタイプ（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６）に由来し得る。
【００５６】
パラミクソウイルス科のウイルス：ウイルス免疫原としては、肺炎ウイルス（例えば、ＲＳウイルス、ＲＳＶ）、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザ・ウイルス）、メタニューモウイルスおよびモルビリウイルス（例えば、麻疹ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
ポックスウイルス科：ウイルス免疫原としては、オルトポックスウイルス（例えば、真正痘瘡（大痘瘡および小痘瘡が挙げられるが、これらに限定されない））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
ピコルナウイルス：ウイルス免疫原としては、ピコルナウイルス（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルスおよびアフトウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、上記エンテロウイルスは、ポリオウイルス（例えば、１型、２型、および／もしくは３型のポリオウイルス）である。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、ＥＶ７１エンテロウイルスである。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、コクサッキーＡもしくはＢウイルスである。
【００５９】
ブンヤウイルス：ウイルス免疫原としては、オルソブンヤウイルス（例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス）、フレボウイルス（例えば、リフトバレー熱ウイルス）、もしくはナイロウイルス（例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
ヘパルナウイルス：ウイルス免疫原としては、ヘパルナウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
フィロウイルス：ウイルス免疫原としては、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス（ザイールエボラウイルス、アイボリーコーストエボラウイルス、レストンエボラウイルスもしくはスーダンエボラウイルスを含む））またはマールブルグウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
トガウイルス：ウイルス免疫原としては、トガウイルス（例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、もしくはアルテリウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。これは、風疹ウイルスを含む。
【００６３】
フラビウイルス：ウイルス免疫原としては、フラビウイルス（例えば、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング（１、２、３もしくは４型）ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ウエストナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
ペスチウイルス：ウイルス免疫原としては、ペスチウイルス（例えば、牛ウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、豚コレラ（ＣＳＦＶ）もしくはボーダー病（ＢＤＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
ヘパドナウイルス：ウイルス免疫原としては、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含み得る。
【００６６】
他の肝炎ウイルス：組成物は、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、もしくはＧ型肝炎ウイルスに由来する免疫原を含み得る。
【００６７】
ラブドウイルス：ウイルス免疫原としては、ラブドウイルス（例えば、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
カリシウイルス科：ウイルス免疫原としては、カリシウイルス科（例えば、ノーウォークウイルス（ノロウイルス）、およびノーウォーク様ウイルス（例えば、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルス））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
コロナウイルス：ウイルス免疫原は、ＳＡＲＳコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記コロナウイルス免疫原は、スパイクポリペプチドであり得る。
【００７０】
レトロウイルス：ウイルス免疫原としては、オンコウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２）またはスプマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
レオウイルス：ウイルス免疫原としては、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、もしくはコルチウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
パルボウイルス：ウイルス免疫原としては、パルボウイルスＢ１９に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
ヘルペスウイルス：ウイルス免疫原としては、ヒトヘルペスウイルス（例えば、例示に過ぎないが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、ＨＳＶ１型および２型）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
パポバウイルス：ウイルス免疫原としては、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記（ヒト）パピローマウイルスは、血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３もしくは６５のもの（例えば、血清型６、１１、１６および／もしくは１８のうちの１種以上に由来する）であり得る。
【００７５】
アデノウイルス：ウイルス免疫原としては、アデノウイルス血清型３６（Ａｄ−３６）に由来するものが挙げられる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、魚類に感染するウイルス（例えば：伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、アメリカナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚類リンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（大西洋サケピコルナ様ウイルスとしても公知）、ヤマメウイルス（ＬＳＶ）、大西洋サケロタウイルス（ＡＳＲ）、マスイチゴ病ウイルス（ＴＳＤ）、銀ザケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、もしくはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ））に対する免疫応答を誘発する。
【００７７】
真菌免疫原は、皮膚糸状菌類（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）（以下が挙げられる：
【００７８】
【化２】
2013538569.tif 000003
【００７９】
【化３】
2013538569.tif 000004
に由来し得る。
【００８０】
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅもしくはＰ．ｏｖａｌｅ）に由来する寄生生物に対する免疫応答を誘発する。従って、本発明は、マラリアに対して免疫化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科に由来する寄生生物、特に、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ属およびＣａｌｉｇｕｓ属に由来する寄生生物（例えば、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓもしくはＣａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉのようなフナムシ）に対する免疫応答を誘発する。
【００８１】
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下に対する免疫応答を誘発する：花粉アレルゲン（樹木花粉、草本花粉、雑草の花粉、および草の花粉のアレルゲン）；昆虫もしくは蛛形類のアレルゲン（吸入、唾液および毒液のアレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリアレルゲンおよび小虫アレルゲン、膜翅類毒液アレルゲン（ｈｙｍｅｎｏｐｔｈｅｒａ  ｖｅｎｏｍ  ａｌｌｅｒｇｅｎ））；動物の毛およびふけのアレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどに由来する）；ならびに食物アレルゲン（例えば、グリアジン）。樹木、草および草本に由来する重要な花粉アレルゲンは、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｏｌｅａｌｅｓ、Ｐｉｎａｌｅｓの分類学上の目およびスズカケノキ科（ｐｌａｔａｎａｃｅａｅ）（カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）およびオリーブ（Ｏｌｅａ）、シーダー（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、プラタナス（Ｐｌａｔａｎｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない）、Ｐｏａｌｅｓの目（属Ｌｏｌｉｕｍ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｈｏｌｃｕｓ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｓｅｃａｌｅ、およびＳｏｒｇｈｕｍの草が挙げられる）、ＡｓｔｅｒａｌｅｓおよびＵｒｔｉｃａｌｅｓの目（属Ａｍｂｒｏｓｉａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ、およびＰａｒｉｅｔａｒｉａの草本が挙げられる）から由来するそのようなものである。他の重要な吸入アレルゲンは、属ＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓおよびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓのチリダニ類、コナダニ類（ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｉｔｅ）（例えば、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ、ＧｌｙｃｙｐｈａｇｕｓおよびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓ）、ゴキブリ、小虫およびノミに由来するもの（例えば、Ｂｌａｔｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ、ＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓおよびＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ）、ならびに哺乳動物（例えば、ネコ、イヌおよびウマ）に由来するもの、毒液のアレルゲン（刺咬昆虫（ｓｔｉｎｇｉｎｇ  ｏｒ  ｂｉｔｉｎｇ  ｉｎｓｅｃｔ）に由来するようなもの、例えば、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａの分類学上の目（蜂（Ａｐｉｄａｅ）、スズメバチ（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）、およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）が挙げられる）が挙げられる）に由来するものである。
【００８２】
いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下から選択される腫瘍抗原である：（ａ）がん−精巣（ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ）抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＭＡＧＥファミリーのポリペプチド（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＭＡＧＥ−１２）、これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用され得る；（ｂ）変異した抗原、例えば、ｐ５３（種々の固形腫瘍（例えば、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん）と関連）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓がんおよび結腸直腸がんと関連）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫と関連）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫と関連）、カスパーゼ−８（例えば、頭頸部がんと関連）、ＣＩＡ  ０２０５（例えば、膀胱がんと関連）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、β−カテニン（例えば、黒色腫と関連）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫と関連）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＫＩＡ  ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ；（ｃ）過剰発現された抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病と関連）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、ＷＴ  １（例えば、種々の白血病と関連）、炭酸脱水酵素（例えば、腎がんと関連）、アルドラーゼＡ（例えば、肺がんと関連）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫と関連）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳がん、結腸がん、肺がんおよび卵巣がんと関連）、マンマグロビン、α−フェトプロテイン（例えば、肝がんと関連）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガストリン（例えば、膵臓がんおよび胃がんと関連）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳がんおよび卵巣がんと関連）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞がんと関連）、ｐ５３（例えば、乳がん、結腸がんと関連）、ならびにがん胎児性抗原（例えば、乳がん、肺がん、および胃腸管のがん（例えば、結腸直腸がん）と関連）；（ｄ）共通抗原（ｓｈａｒｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）、例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラノサイト刺激ホルモンレセプター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２（例えば、黒色腫と関連）；（ｅ）前立腺関連抗原（例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２（例えば、前立腺がんと関連））；（ｆ）イムノグロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫と関連）。特定の実施形態において、腫瘍免疫原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バー・ウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原（Ｅ６およびＥ７を含む）、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ���肝炎ウイルスの抗原、ヒトＴリンパ球向性ウイルス抗原、
【００８３】
【化４】
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（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなど。
【００８４】
（薬学的組成物）
本発明のリポソームは、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物中の成分として有用である。これらの組成物は、代表的には、上記リポソームに加えて、薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアの詳細な考察は、参考文献２９において入手可能である。
【００８５】
本発明の薬学的組成物は、１種以上の低分子免疫強化因子を含み得る。例えば、上記組成物は、ＴＬＲ２アゴニスト（例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４）、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（例えば、Ｅ６０２０））、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、イミキモド）、ＴＬＲ８アゴニスト（例えば、レシキモド）および／もしくはＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＩＣ３１）を含み得る。任意のこのようなアゴニストは、理想的には、分子量＜２０００Ｄａを有する。いくつかの実施形態において、このようなアゴニストもまた、上記ＲＮＡと共リポソーム内に被包されるが、他の実施形態において、それらは、被包されない。
【００８６】
本発明の薬学的組成物は、上記リポソームを、ただの水（ｐｌａｉｎ  ｗａｔｅｒ）（例えば、ｗ．ｆ．ｉ．）もしくは緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、もしくはクエン酸緩衝液）中に含み得る。緩衝塩は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲において含まれる。
【００８７】
本発明の薬学的組成物は、５．０〜９．５（例えば、６．０〜８．０）のｐＨを有し得る。
【００８８】
本発明の組成物は、張度を与えるために、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌの濃度が代表的である（例えば、約９ｍｇ／ｍｌ）。
【００８９】
本発明の組成物は、金属イオンキレート化剤を含み得る。これらは、ホスホジエステル加水分解を加速し得るイオンを除去することによって、ＲＮＡ安定性を延長し得る。従って、組成物は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ペンテト酸などのうちの１種以上を含み得る。このようなキレート化剤は、代表的には、１０〜５００μＭ（例えば、０．１ｍＭ）で存在する。クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）はまた、キレート化剤として作用し得るのと同時に、有利なことには、緩衝化活性も提供し得る。
【００９０】
本発明の薬学的組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、もしくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の重量オスモル濃度を有し得る。
【００９１】
本発明の薬学的組成物は、１種以上の保存剤（例えば、チオメルサールもしくは２−フェノキシエタノール）を含み得る。水銀非含有組成物が好ましく、保存剤非含有ワクチンが調製され得る。
【００９２】
本発明の薬学的組成物は、好ましくは、無菌である。
【００９３】
本発明の薬学的組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１  ＥＵ（エンドトキシンユニット、標準尺度）、および好ましくは、１用量あたり＜０．１  ＥＵを含む）。
【００９４】
本発明の薬学的組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【００９５】
本発明の薬学的組成物は、単位用量形態において調製され得る。いくつかの実施形態において、単位用量は、０．１〜１．０ｍｌ（例えば、約０．５ｍｌ）の容積を有し得る。
【００９６】
上記組成物は、注射物として調製され得る（溶液もしくは懸濁物のいずれかとして）。上記組成物は、微細スプレーを使用する、肺投与（例えば、吸入器による）のために調製され得る。上記組成物は、鼻、耳もしくは眼への投与（例えば、スプレーもしくは滴剤として）のために調製され得る。筋肉内投与のための注射物が、代表的である。
【００９７】
組成物は、免疫学的に有効量のリポソーム、ならびに任意の他の成分（必要であれば）を含む。「免疫学的に有効な量」とは、個体への投与量が、単一用量においてもしくはシリーズのうちの一部としてのいずれかで、処置もしくは予防に有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の健康状態および身体的状態、処置されるべき個体の年齢、分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、上記個体が抗体を合成する免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、その処置している医師の医学的状況の評価、および他の関連因子に依存して変動する。上記量は、慣用的な治験を通じて決定され得る比較的広い範囲に入ると予測される。本発明の組成物のリポソームおよびＲＮＡ含有量は、一般に、１用量あたりのＲＮＡの量に関して表される。好ましい用量は、≦１００μｇ  ＲＮＡ（例えば、１０〜１００μｇ（例えば、約１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇもしくは１００μｇ））を有するが、発現は、遙かに低いレベル、例えば、≦１μｇ／用量、≦１００ｎｇ／用量、≦１０ｎｇ／用量、≦１ｎｇ／用量などにおいてみられ得る。
【００９８】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物を含む送達デバイス（例えば、シリンジ、ネブライザ、噴霧器、吸入器、皮膚パッチなど）を提供する。このデバイスは、上記組成物を脊椎動物被験体に投与するために使用され得る。
【００９９】
本発明のリポソームは、リボソームを含まない。
【０１００】
（処置方法および医学的使用）
参考文献１０で開示される粒子とは対照的に、本発明のリポソームおよび薬学的組成物は、目的の免疫原に対する免疫応答を誘発するためのインビボでの使用のためのものである。
【０１０１】
本発明は、本発明のリポソームもしくは薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、脊椎動物において免疫応答を惹起するための方法を提供する。上記免疫応答は、好ましくは、防御的であり、好ましくは、抗体および／もしくは細胞媒介性免疫を含む。上記方法は、ブースター応答を惹起し得る。
【０１０２】
本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための方法において使用するための本発明のリポソームもしくは薬学的組成物を提供する。
【０１０３】
本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための医薬の製造における本発明のリポソームの使用を提供する。
【０１０４】
これら使用および方法により上記脊椎動物における免疫応答を惹起することによって、上記脊椎動物は、上記で考察されるように、種々の疾患および／もしくは感染から（例えば、細菌疾患および／もしくはウイルス疾患から）防御され得る。上記リポソームおよび組成物は、免疫原性であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。本発明に従うワクチンは、予防的である（すなわち、感染を妨ぐ）か、もしくは治療的である（すなわち、感染を処置する）のいずれかであり得るが、代表的には、予防的である。
【０１０５】
上記脊椎動物は、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒトもしくは大型の獣医学的哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタ）である。上記ワクチンが予防的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、小児（例えば、幼児もしくは乳児）またはティーンエイジャーである；上記ワクチンが治療的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、ティーンエイジャーもしくは成人である。小児用に意図されたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与され得る。
【０１０６】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。従って、ヒト患者は、１歳未満、５歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、もしくは少なくとも５５歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい患者は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年者（例えば、≦５歳）、入院患者、ヘルスケアワーカー、軍従事者、および軍職員、妊婦、慢性疾患患者、もしくは免疫不全患者である。しかし、上記ワクチンは、これらの群にのみ適切であるわけではなく、より一般に、集団において使用され得る。
【０１０７】
本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射によって達成され得る（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、もしくは組織の間隙空間に；参考文献１とは異なり、舌内（ｉｎｔｒａｇｌｏｓｓａｌ）注射は、代表的には、本発明で使用されない）。代替の送達経路としては、直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、口内、舌下、膣、局所、経真皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）もしくは経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻内、眼、耳、肺もしくは他の粘膜投与が挙げられる。皮内および筋肉内投与は、２つの好ましい経路である。注射は、針を介してであってもよい（例えば、皮下針）が、針なしの注射が、代わりに使用され得る。代表的な筋肉内用量は、０．５ｍｌである。
【０１０８】
本発明は、全身免疫および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、好ましくは、増強された全身免疫および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、使用され得る。
【０１０９】
投与量は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、一次免疫スケジュールにおいて、および／もしくはブースター免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて、種々の用量が、同じ経路もしくは異なる経路（例えば、非経口の一次と粘膜のブースト、粘膜の一次と非経口のブーストなど）によって与えられ得る。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間間隔を空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。一実施形態において、複数用量は、生後約６週間、１０週間、および１４週間で（例えば、世界保健機関のＥｘｐａｎｄｅｄ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｎ  Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ（「ＥＰＩ」）においてしばしば使用されるように、６週齢、１０週齢および１４週齢において）投与され得る。代替の実施形態において、２回の一次用量が、約２ヶ月間間隔を空けて（例えば、約７週間、８週間もしくは９週間間隔を空けて）投与され、続いて、１回以上のブースター用量が、２回目の一次用量の約６ヶ月から１年後に（例えば、２回目の一次用量の約６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後もしくは１２ヶ月後）投与される。さらなる実施形態において、３回の一次用量が、約２ヶ月間間隔を空けて（例えば、約７週間、８週間もしくは９週間間隔を空けて）投与され、続いて、１回以上のブースター用量が、３回目の一次用量の約６ヶ月後から１年後に（例えば、３回目の一次用量の約６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後もしくは１２ヶ月後）投与される。
【０１１０】
（一般）
本発明の粒子は、別段示されなければ、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の、当該分野の技術内の従来の方法を使用する。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、参考文献３０〜３６などを参照のこと。
【０１１１】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから専らなってもよいし、何かさらなるものを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１１２】
数値ｘに関して用語「約」とは、選択的であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１１３】
語句「実質的に」とは、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もある。必要な場合、語句「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１１４】
電荷、カチオン、アニオン、両性性イオンなどへの言及は、ｐＨ７において取り扱われる。
【０１１５】
ＴＬＲ３は、Ｔｏｌｌ様レセプター３である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ３アゴニストは、ポリ（Ｉ：Ｃ）を含む。「ＴＬＲ３」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ  ＩＤは、ＨＧＮＣ：１１８４９である。ヒトＴＬＲ３遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２４５９６２５である。
【０１１６】
ＴＬＲ７は、Ｔｏｌｌ様レセプター７である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ７アゴニストは、例えば、イミキモドを含む。「ＴＬＲ７」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ  ＩＤは、ＨＧＮＣ：１５６３１である。ヒトＴＬＲ７遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：６７９４４６３８である。
【０１１７】
ＴＬＲ８は、Ｔｏｌｌ様レセプター８である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ８アゴニストは、例えば、レシキモドを含む。「ＴＬＲ８」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ  ＩＤは、ＨＧＮＣ：１５６３２である。ヒトＴＬＲ８遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２０３０２１６５である。
【０１１８】
ＲＩＧ−Ｉ様レセプター（「ＲＬＲ」）ファミリーは、先天的免疫系において重要な役割を果たす種々のＲＮＡヘリカーゼを含む［３７］。ＲＬＲ−１（ＲＩＧ−Ｉもしくはレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉとしても公知）は、そのＮ末端付近にある２つのカスパーゼリクルートドメインを有する。上記ＲＬＲ−１ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、「ＤＤＸ５８」（ＤＥＡＤ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）ボックスポリペプチド５８（ＤＥＡＤ  （Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）  ｂｏｘ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ５８）について）であり、その特有のＨＧＮＣ  ＩＤは、ＨＧＮＣ：１９１０２である。ヒトＲＬＲ−１遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：７７７３２５１４である。ＲＬＲ−２（ＭＤＡ５もしくは黒色腫分化関連遺伝子５（ｍｅｌａｎｏｍａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ５）としても公知）はまた、そのＮ末端付近にある２つのカスパーゼリクルートドメインを有する。ＲＬＲ−２ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、「ＩＦＩＨ１」（ヘリカーゼＣドメイン１で誘導されるインターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  Ｃ  ｄｏｍａｉｎ  １）について）であり、特有のＨＧＮＣ  ＩＤは、ＨＧＮＣ：１８８７３である。ヒトＲＬＲ−２遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：  ２７８８６５６７である。ＲＬＲ−３（ＬＧＰ２もしくは遺伝学および生理学研究室２（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２）としても公知）は、カスパーゼリクルートドメインを有さない。ＲＬＲ−３ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、  「ＤＨＸ５８」（ＤＥＸＨ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｈｉｓ）ボックスポリペプチド５８について）であり、特有のＨＧＮＣ  ＩＤは、ＨＧＮＣ：２９５１７である。ヒトＲＬＲ−３遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：１４９４０８１２１である。
【０１１９】
ＰＫＲは、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼである。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす。「ＥＩＦ２ＡＫ２」（真核生物翻訳開始因子２−αキナーゼ２（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２−ａｌｐｈａ  ｋｉｎａｓｅ  ２）について）は、この酵素をコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ  ＩＤは、ＨＧＮＣ：９４３７である。ヒトＰＫＲ遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２０８４３１８２５である。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、染色されたＲＮＡを有するゲルを示す。レーンは、（１）マーカー、（２）裸のレプリコン、（３）ＲＮａｓｅ処理後のレプリコン、（４）リポソームに被包されたレプリコン、（５）ＲＮａｓｅ処理後のリポソーム、（６）ＲＮａｓｅで処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出に供したリポソーム、を示す。
【図２】図２は、リポソームの電子顕微鏡写真である。
【図３】図３は、大きな（下の線）、もしくは小さな（上の線）リポソームにおいてＲＮＡを送達した後、１日目、３日目および６日目でのタンパク質発現（相対光単位、ＲＬＵとして）を示す。
【図４】図４は、染色されたＲＮＡを有するゲルを示す。レーンは、（１）マーカー、（２）裸のレプリコン、（３）リポソームに被包されたレプリコン、（４）ＲＮａｓｅで処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出に供したリポソームを示す。
【図５】図５は、ビリオンパッケージングされたレプリコン（四角）として、裸のＲＮＡ（菱形）として、もしくはリポソーム中（＋＝０．１μｇ、×＝１μｇ）においてＲＮＡを送達した後、１日目、３日目および６日目でのタンパク質発現を示す。
【図６】図６は、リポソーム被包ＲＮＡの４種の異なる用量を送達した後、１日目、３日目および６日目でのタンパク質発現を示す。
【図７】図７は、ビリオンパッケージングされたレプリコン（ＶＲＰもしくはＶＳＲＰ）、１μｇ  裸のＲＮＡ、および１μｇ  リポソーム被包ＲＮＡを与えられた動物における抗Ｆ  ＩｇＧ力価を示す。
【図８】図８は、ＶＲＰ、１μｇ  裸のＲＮＡ、および０．１ｇもしくは１μｇのリポソーム被包ＲＮＡを与えられた動物における抗Ｆ  ＩｇＧ力価を示す。
【図９】図９は、ＶＲＰ、または０．１ｇもしくは１μｇのリポソーム被包ＲＮＡのいずれかを与えられた動物における中和抗体力価を示す。
【図１０】図１０は、裸のＲＮＡ（丸）、リポソーム被包ＲＮＡ（三角および四角）、またはリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）（逆三角）としてレプリコンを送達した後の発現レベルを示す。
【図１１】図１１は、レプリコンを裸のＲＮＡとして（０．０１〜１μｇ）、リポソーム被包ＲＮＡとして（０．０１〜１０μｇ）、またはビリオンとしてパッケージングされたものとして（ＶＲＰ、１０６  感染単位もしくはＩＵ）、送達した後のＦ特異的ＩｇＧ力価（２回目の用量後２週間）を示す。
【図１２】図１２は、レプリコンを裸のＲＮＡとして（１μｇ）、リポソーム被包ＲＮＡとして（０．１もしくは１μｇ）、またはビリオンとしてパッケージングされたものとして（ＶＲＰ、１０６  ＩＵ）、送達した後のＦ特異的ＩｇＧ力価（丸）およびＰＲＮＴ力価（四角）を示す。ナイーブマウスの力価もまた、示す。実線は、幾何平均を示す。
【図１３】図１３は、２回目の用量の４週間後、Ｆタンパク質中の主要なエピトープを表す合成ペプチドで再刺激した後の細胞内サイトカイン生成を示す。ｙ軸は、ＣＤ８＋ＣＤ４−の％サイトカイン＋を示す。
【図１４】図１４は、仔ウシの免疫化後２１０日間にわたるＦ特異的ＩｇＧ力価（平均ｌｏｇ１０力価±標準偏差）を示す。その３つの線は、６３日目において容易に区別され、下から上へ：ＰＢＳ陰性コントロール；リポソーム送達ＲＮＡ；および「Ｔｒｉａｎｇｌｅ  ４」製品である。
【図１５】図１５は、Ｆタンパク質をコードするレプリコンの第１の用量の２週間後の抗Ｆ力価発現（相対的）を示す。上記力価は、リポソームＺ平均直径（ｎｍ）に対してプロットされている。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｍは、代替のカチオン性脂質の構造を示す：（Ａ）ＲＶ０５；（Ｂ）ＲＶ０２；（Ｃ）ＲＶ０４；（Ｄ）ＲＶ０７；（Ｅ）ＲＶ０３；（Ｆ）ＲＶ０８；（Ｇ）ＲＶ０９；（Ｈ）ＲＶ１４；（Ｉ）ＲＶ１０；（Ｊ）ＲＶ１１；（Ｋ）ＲＶ１５；（Ｌ）ＲＶ１６；（Ｍ）ＲＶ１７。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｍは、代替のカチオン性脂質の構造を示す：（Ａ）ＲＶ０５；（Ｂ）ＲＶ０２；（Ｃ）ＲＶ０４；（Ｄ）ＲＶ０７；（Ｅ）ＲＶ０３；（Ｆ）ＲＶ０８；（Ｇ）ＲＶ０９；（Ｈ）ＲＶ１４；（Ｉ）ＲＶ１０；（Ｊ）ＲＶ１１；（Ｋ）ＲＶ１５；（Ｌ）ＲＶ１６；（Ｍ）ＲＶ１７。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｍは、代替のカチオン性脂質の構造を示す：（Ａ）ＲＶ０５；（Ｂ）ＲＶ０２；（Ｃ）ＲＶ０４；（Ｄ）ＲＶ０７；（Ｅ）ＲＶ０３；（Ｆ）ＲＶ０８；（Ｇ）ＲＶ０９；（Ｈ）ＲＶ１４；（Ｉ）ＲＶ１０；（Ｊ）ＲＶ１１；（Ｋ）ＲＶ１５；（Ｌ）ＲＶ１６；（Ｍ）ＲＶ１７。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｍは、代替のカチオン性脂質の構造を示す：（Ａ）ＲＶ０５；（Ｂ）ＲＶ０２；（Ｃ）ＲＶ０４；（Ｄ）ＲＶ０７；（Ｅ）ＲＶ０３；（Ｆ）ＲＶ０８；（Ｇ）ＲＶ０９；（Ｈ）ＲＶ１４；（Ｉ）ＲＶ１０；（Ｊ）ＲＶ１１；（Ｋ）ＲＶ１５；（Ｌ）ＲＶ１６；（Ｍ）ＲＶ１７。
【図１６Ｅ】図１６Ａ〜１６Ｍは、代替のカチオン性脂質の構造を示す：（Ａ）ＲＶ０５；（Ｂ）ＲＶ０２；（Ｃ）ＲＶ０４；（Ｄ）ＲＶ０７；（Ｅ）ＲＶ０３；（Ｆ）ＲＶ０８；（Ｇ）ＲＶ０９；（Ｈ）ＲＶ１４；（Ｉ）ＲＶ１０；（Ｊ）ＲＶ１１；（Ｋ）ＲＶ１５；（Ｌ）ＲＶ１６；（Ｍ）ＲＶ１７。
【図１６Ｆ】図１６Ａ〜１６Ｍは、代替のカチオン性脂質の構造を示す：（Ａ）ＲＶ０５；（Ｂ）ＲＶ０２；（Ｃ）ＲＶ０４；（Ｄ）ＲＶ０７；（Ｅ）ＲＶ０３；（Ｆ）ＲＶ０８；（Ｇ）ＲＶ０９；（Ｈ）ＲＶ１４；（Ｉ）ＲＶ１０；（Ｊ）ＲＶ１１；（Ｋ）ＲＶ１５；（Ｌ）ＲＶ１６；（Ｍ）ＲＶ１７。
【図１６Ｇ】図１６Ａ〜１６Ｍは、代替のカチオン性脂質の構造を示す：（Ａ）ＲＶ０５；（Ｂ）ＲＶ０２；（Ｃ）ＲＶ０４；（Ｄ）ＲＶ０７；（Ｅ）ＲＶ０３；（Ｆ）ＲＶ０８；（Ｇ）ＲＶ０９；（Ｈ）ＲＶ１４；（Ｉ）ＲＶ１０；（Ｊ）ＲＶ１１；（Ｋ）ＲＶ１５；（Ｌ）ＲＶ１６；（Ｍ）ＲＶ１７。
【図１６Ｈ】図１６Ａ〜１６Ｍは、代替のカチオン性脂質の構造を示す：（Ａ）ＲＶ０５；（Ｂ）ＲＶ０２；（Ｃ）ＲＶ０４；（Ｄ）ＲＶ０７；（Ｅ）ＲＶ０３；（Ｆ）ＲＶ０８；（Ｇ）ＲＶ０９；（Ｈ）ＲＶ１４；（Ｉ）ＲＶ１０；（Ｊ）ＲＶ１１；（Ｋ）ＲＶ１５；（Ｌ）ＲＶ１６；（Ｍ）ＲＶ１７。
【図１６Ｉ】図１６Ａ〜１６Ｍは、代替のカチオン性脂質の構造を示す：（Ａ）ＲＶ０５；（Ｂ）ＲＶ０２；（Ｃ）ＲＶ０４；（Ｄ）ＲＶ０７；（Ｅ）ＲＶ０３；（Ｆ）ＲＶ０８；（Ｇ）ＲＶ０９；（Ｈ）ＲＶ１４；（Ｉ）ＲＶ１０；（Ｊ）ＲＶ１１；（Ｋ）ＲＶ１５；（Ｌ）ＲＶ１６；（Ｍ）ＲＶ１７。
【図１６Ｊ】図１６Ａ〜１６Ｍは、代替のカチオン性脂質の構造を示す：（Ａ）ＲＶ０５；（Ｂ）ＲＶ０２；（Ｃ）ＲＶ０４；（Ｄ）ＲＶ０７；（Ｅ）ＲＶ０３；（Ｆ）ＲＶ０８；（Ｇ）ＲＶ０９；（Ｈ）ＲＶ１４；（Ｉ）ＲＶ１０；（Ｊ）ＲＶ１１；（Ｋ）ＲＶ１５；（Ｌ）ＲＶ１６；（Ｍ）ＲＶ１７。
【図１６Ｋ】図１６Ａ〜１６Ｍは、代替のカチオン性脂質の構造を示す：（Ａ）ＲＶ０５；（Ｂ）ＲＶ０２；（Ｃ）ＲＶ０４；（Ｄ）ＲＶ０７；（Ｅ）ＲＶ０３；（Ｆ）ＲＶ０８；（Ｇ）ＲＶ０９；（Ｈ）ＲＶ１４；（Ｉ）ＲＶ１０；（Ｊ）ＲＶ１１；（Ｋ）ＲＶ１５；（Ｌ）ＲＶ１６；（Ｍ）ＲＶ１７。
【図１６Ｌ】図１６Ａ〜１６Ｍは、代替のカチオン性脂質の構造を示す：（Ａ）ＲＶ０５；（Ｂ）ＲＶ０２；（Ｃ）ＲＶ０４；（Ｄ）ＲＶ０７；（Ｅ）ＲＶ０３；（Ｆ）ＲＶ０８；（Ｇ）ＲＶ０９；（Ｈ）ＲＶ１４；（Ｉ）ＲＶ１０；（Ｊ）ＲＶ１１；（Ｋ）ＲＶ１５；（Ｌ）ＲＶ１６；（Ｍ）ＲＶ１７。
【図１６Ｍ】図１６Ａ〜１６Ｍは、代替のカチオン性脂質の構造を示す：（Ａ）ＲＶ０５；（Ｂ）ＲＶ０２；（Ｃ）ＲＶ０４；（Ｄ）ＲＶ０７；（Ｅ）ＲＶ０３；（Ｆ）ＲＶ０８；（Ｇ）ＲＶ０９；（Ｈ）ＲＶ１４；（Ｉ）ＲＶ１０；（Ｊ）ＲＶ１１；（Ｋ）ＲＶ１５；（Ｌ）ＲＶ１６；（Ｍ）ＲＶ１７。
【図１７】図１７は、有用な「スプリット」ＰＥＧ結合体化脂質の構造を示す。ボックスの中のＰＥＧの全分子量は、試験されたリポソームにおいて２０００である。
【図１８Ａ】図１８Ａ〜１８Ｅは、種々のＰＥＧ結合体化脂質（ここでＲは、所望の長さのＰＥＧである）の構造を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａ〜１８Ｅは、種々のＰＥＧ結合体化脂質（ここでＲは、所望の長さのＰＥＧである）の構造を示す。
【図１８Ｃ】図１８Ａ〜１８Ｅは、種々のＰＥＧ結合体化脂質（ここでＲは、所望の長さのＰＥＧである）の構造を示す。
【図１８Ｄ】図１８Ａ〜１８Ｅは、種々のＰＥＧ結合体化脂質（ここでＲは、所望の長さのＰＥＧである）の構造を示す。
【図１８Ｅ】図１８Ａ〜１８Ｅは、種々のＰＥＧ結合体化脂質（ここでＲは、所望の長さのＰＥＧである）の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２１】
（発明を実施するための態様）
（ＲＮＡレプリコン）
種々のレプリコンは、以下で使用される。一般に、これらは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に由来する非構造タンパク質、ＶＥＥＶ由来のパッケージングシグナル、およびシンドビス・ウイルスもしくはＶＥＥＶ変異体に由来する３’ＵＴＲを有するハイブリッドアルファウイルスゲノムに基づく。上記レプリコンは、約１０ｋｂ長であり、ポリＡテールを有する。
【０１２２】
アルファウイルスレプリコンをコードするプラスミドＤＮＡ（名称：ｐＴ７−ｍＶＥＥＶ−ＦＬ．ＲＳＶＦもしくはＡ３１７；ｐＴ７−ｍＶＥＥＶ−ＳＥＡＰもしくはＡ３０６；ｐＳＰ６−ＶＣＲ−ＧＦＰもしくはＡ５０）を、インビボでのＲＮＡ合成のテンプレートとして供した。上記レプリコンは、ＲＮＡ複製に必要とされるアルファウイルス遺伝的エレメントを含むが、粒子アセンブリに必要な遺伝子産物をコードするエレメントを欠いている；構造タンパク質は、代わりに、目的のタンパク質（レポーター（例えば、ＳＥＡＰもしくはＧＦＰ）または免疫原（例えば、全長ＲＳＶ  Ｆタンパク質）のいずれか）によって置き換えられるので、上記レプリコンは、感染性粒子の生成を誘導できない。上記アルファウイルスｃＤＮＡの上流にあるバクテリオファージ（Ｔ７もしくはＳＰ６）プロモーターは、インビトロで上記レプリコンＲＮＡの合成を促進し、上記ポリ（Ａ）テールの直ぐ下流にあるデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムは、その自己切断活性を介して正確な３’末端を生成する。
【０１２３】
適切な制限エンドヌクレアーゼで上記ＨＤＶリボザイムの下流で上記プラスミドＤＮＡを直線状にした後に、ランオフ転写物（ｒｕｎ−ｏｆｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を、Ｔ７もしくはＳＰ６バクテリオファージ由来ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロで合成した。転写を、製造業者（Ａｍｂｉｏｎ）によって提供される指示書に従って、ヌクレオシドトリホスフェート（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）の各々の７．５ｍＭ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）もしくは５ｍＭ（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）の存在下で、３７℃において２時間にわたって行った。転写の後、上記テンプレートＤＮＡを、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で消化した。上記レプリコンＲＮＡを、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。キャップのないＲＮＡを、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ｍ７Ｇキャッピングシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ユーザーマニュアルに概説されるとおり、ワクシニアキャッピング酵素（ＶＣＥ）で転写後にキャップした；このようにキャップしたレプリコンに、「ｖ」の接頭文字を付ける（例えば、ｖＡ３１７は、ＶＣＥによってキャップされたＡ３１７レプリコンである）。転写後キャップされたＲＮＡを、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。上記ＲＮＡサンプルの濃度を、ＯＤ２６０ｎｍを測定することによって決定した。上記インビトロ転写物の完全性を、変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０１２４】
（リポソーム被包）
ＲＮＡを、参考文献７および３８の方法によって作製したリポソーム中に被包した。上記リポソームを、１０％  ＤＳＰＣ（両性イオン性）、４０％  ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性）、４８％  コレステロールおよび２％  ＰＥＧ結合体化ＤＭＧ（２ｋＤａ  ＰＥＧ）から作製した。これら割合は、全リポソーム中の％モルに言及する。
【０１２５】
ＤｌｉｎＤＭＡ（１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン）を、参考文献２の手順を使用して合成した。ＤＳＰＣ（１，２−ジアステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）を、Ｇｅｎｚｙｍｅから購入した。コレステロールを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。ＰＥＧ結合体化ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール），アンモニウム塩）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン，塩化物塩）およびＤＣ−ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールヒドロクロリド）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓからであった。
【０１２６】
簡潔には、脂質をエタノール（２ｍｌ）中に溶解し、ＲＮＡレプリコンを、緩衝液（２ｍｌ，１００ｍＭ  クエン酸ナトリウム，ｐＨ６）中に溶解し、これらを２ｍｌの緩衝液と混合し、続いて、１時間平衡化させた。上記混合物を６ｍｌの緩衝液で希釈し、次いで、濾過した。得られた生成物は、リポソームを含み、約９５％の被包効率であった。
【０１２７】
例えば、１つの特定の方法において、新鮮な脂質ストック溶液を、エタノール中で調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロールおよび８．０７ｍｇのＰＥＧ−ＤＭＧを秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中に溶解した。新たに調製した脂質ストック溶液を、３７℃において約１５分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、７５５μＬの上記ストックを、１．２４５ｍＬ  エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製した。この脂質量を使用して、２５０μｇ  ＲＮＡを有するリポソームを形成した。ＲＮＡの２ｍＬ  作業溶液をまた、１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中の約１μｇ／μＬのストック溶液から調製した。３つの２０ｍＬ  ガラスバイアル（撹拌子有り）を、ＲＮａｓｅ  Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ですすぎ、使用前に多量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、上記バイアルのＲＮａｓｅの汚染を除去した。上記バイアルのうちの１つを、上記ＲＮＡ作業溶液に使用し、他のものを脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した（後に記載されるとおり）。作業脂質溶液およびＲＮＡ溶液を、３７℃において１０分間にわたって加熱し、その後、３ｃｃ  ルアーロックシリンジに入れた。２ｍＬ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃ  シリンジに入れた。ＲＮＡおよび脂質を含むシリンジを、ＦＥＰチューブ（フッ素化エチレン−プロピレン；使用したすべてのＦＥＰチューブは、２ｍｍ内径および３ｍｍ外径を有した；Ｉｄｅｘ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅから得た）を使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫＴＭ  ５００μｍ  ＩＤ接合部，Ｉｄｅｘ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に接続した。上記Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第３のシリンジを、別個の１つのチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量７ｍＬ／分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、２０ｍＬ  ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。上記混合物のうちの４ｍｌを、５ｃｃ  シリンジに入れ、これを、ＦＥＰチューブの１つに接続し、別の５ｃｃ  シリンジを、等しい長さのＦＥＰチューブに接続し、等量の１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、上記シリンジポンプを使用して７ｍＬ／分の流量において作動させ、最終の混合物を、２０ｍＬ  ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、第２の混合工程（リポソーム）から集めた上記混合物を、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得られる、結合してアニオン性分子を除去するアニオン交換支持体）を通過させた。上記リポソームに関してこの膜を使用する前に、４ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨ、４ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＬの１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）が、連続してこの膜を通過した。リポソームを、１０分間にわたって３７℃において加温し、その後、上記膜を通過させた。次に、接線流濾過を使用することによって、リポソームを２ｍＬに���縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記ＴＦＦシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ（Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ）から購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび８ｃｍ２  表面積を有するポリスルホン中空ファイバー濾過膜を使用した。インビトロおよびインビボ実験に関しては、処方物を、１×ＰＢＳで、必要とされるＲＮＡ濃度へと希釈した。
【０１２８】
図２は、これら方法によって調製されるリポソームの例示的な電子顕微鏡写真を示す。これらリポソームは、被包された、全長ＲＳＶ  Ｆ抗原をコードするＲＮＡを含む。１つのバッチの動的光散乱は、平均直径１４１ｎｍ（強度で）もしくは７８ｎｍ（数で）を示した。
【０１２９】
被包されたＲＮＡのパーセンテージおよびＲＮＡの濃度を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、製造業者の指示書に従って決定した。上記キット中に提供されたリボソームＲＮＡ標準を使用して、標準曲線を作成した。リポソームを、１×ＴＥ緩衝液（キットから）中で、１０×もしくは１００×に希釈し、その後、色素を添加した。別個に、リポソームを、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘを含む１×ＴＥ緩衝液中で１０×もしくは１００×に希釈し、その後、色素を添加した（上記リポソームを破壊するため。従って、全ＲＮＡをアッセイするため）。その後、等量の色素を各溶液に添加し、次いで、色素添加後の約１８０μＬの各溶液を、二連において、９６ウェル組織培養プレートに入れた。蛍光（励起４８５ｎｍ，発光５２８ｎｍ）を、マイクロプレートリーダーで読み取った。すべてのリポソーム処方物を、被包されたＲＮＡの量に基づいて、インビボで投与した。
【０１３０】
リポソームにおける被包は、ＲＮａｓｅ消化からＲＮＡを保護することを示した。実験では、３．８ｍＡＵのＲＮａｓｅ  Ａ／μｇ  ＲＮＡを使用し、３０分間にわたって室温においてインキュベートした。ＲＮａｓｅを、プロテイナーゼＫで、５５℃において１０分間にわたって不活性化した。次いで、サンプル  対  ２５：２４：１  ｖ／ｖ／ｖ，フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの１：１  ｖ／ｖ混合物を添加して、上記ＲＮＡを上記脂質から水相へと抽出した。サンプルを、数秒間にわたってボルテックスすることによって混合し、次いで、１２ｋ  ＲＰＭにおける１５分間にわたる遠心分離に置いた。上記水相（上記ＲＮＡを含む）を取り出し、上記ＲＮＡを分析するために使用した。ローディング前に（４００ｎｇ  ＲＮＡ／ウェル）、上記サンプルすべてを、ホルムアルデヒドローディング色素と共にインキュベートし、１０分間にわたって６５℃において変性させ、室温へと冷却した。Ａｍｂｉｏｎ  Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍマーカーを使用して、上記ＲＮＡ構築物の分子量を概算した。上記ゲルを、９０Ｖにおいて泳動した。上記ゲルを、室温において１時間にわたって振盪することによって、製造業者のガイドラインに従って、水中の０．１％  ＳＹＢＲゴールドを使用して染色した。図１は、被包の非存在下でＲＮａｓｅがＲＮＡを完全に消化することを示す（レーン３）。ＲＮＡは、被包後に検出不能であり（レーン４）、これらリポソームがＲＮａｓｅで処理されても全く変化が認められない（レーン４）。ＲＮａｓｅ処理リポソームをフェノール抽出に供した後、消化されていないＲＮＡが認められる（レーン６）。４℃において１週間後ですら、上記ＲＮＡを、いかなるフラグメント化もなしに認めることができた（図４，矢印）。インビボでのタンパク質発現は、４℃において６週間および１回の凍結融解サイクル後にも変化しなかった。従って、リポソーム被包ＲＮＡは安定である。
【０１３１】
上記ＲＮＡのインビボ発現を評価するために、免疫原ではなく、レポーター酵素（ＳＥＡＰ；分泌型アルカリホスファターゼ）を、上記レプリコン中にコードさせた。発現レベルを、化学発光アルカリホスファターゼ基質を使用して、１×Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ希釈緩衝液中で１：４希釈した血清中で測定した。８〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／群）に、０日目に、０．１μｇもしくは１μｇ  ＲＮＡ用量で５０μｌ／脚を筋肉内に注射した。同じベクターを、１μｇにおいて上記リポソームなしで（ＲＮａｓｅ非含有１×ＰＢＳ中で）も投与した。ビリオンパッケージングされたレプリコンもまた、試験した。本明細書で使用したビリオンパッケージングされたレプリコン（「ＶＲＰ」と呼ぶ）を、参考文献３９の方法によって得た。ここでアルファウイルスレプリコンは、変異ＶＥＥＶに由来するか、またはシンドビスウイルスの３’ＵＴＲおよびシンドビスウイルスパッケージングシグナル（ＰＳ）を含むように操作されたＶＥＥＶのゲノムから得られるキメラであり、シンドビスウイルスキャプシドおよび糖タンパク質遺伝子をコードする欠損性ヘルパーＲＮＡと共にＢＨＫ細胞へと共エレクトロポレーション（ｃｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｎｇ）することによってパッケージングした。
【０１３２】
図５に示されるように、被包は、１μｇ用量においてＳＥＡＰレベルを約１／２対数増大させ、６日目において、０．１μｇ  被包用量からの発現は、１μｇ  非被包用量で認められたレベルに匹敵した。３日目までに、発現レベルは、ＶＲＰで達成されたものを超えた（四角）。従って、発現は、裸のＲＮＡコントロールと比較して、１０×低用量においてすら、上記ＲＮＡが上記リポソーム中に処方された場合に増大された。発現はまた、上記ＶＲＰコントロールと比較して高かったが、発現の動態は、非常に異なっていた（図５を参照のこと）。エレクトロポレーションを用いた上記ＲＮＡの送達は、上記裸のＲＮＡコントロールと比較して増大した発現を生じたが、これらレベルは、リポソームでのものより低かった。
【０１３３】
上記リポソーム群において認められる効果が、上記リポソーム成分にのみ起因するか、または上記被包に関連するのかを評価するために、上記レプリコンを、被包形態（２つの異なる精製プロトコルで、０．１μｇ  ＲＮＡ）において、または上記リポソーム形成後に混合して（非被包化「リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）」，０．１μｇ  ＲＮＡ）、または裸のＲＮＡ（１μｇ）として投与した。図１０は、上記リポプレックスが、最低レベルの発現を与えたことを示し、このことは、被包が、強力な発現に必須であることを示す。
【０１３４】
さらなるＳＥＡＰ実験から、インビボで明らかな用量応答が示された。発現は、１ｎｇほどのＲＮＡの送達後にも認められた（図６）。被包レプリコンからの発現と裸のレプリコンからの発現とを比較するさらなる実験から、０．０１μｇ  被包ＲＮＡは、１μｇの裸のＲＮＡに等しいことが示された。ＲＮＡの０．５μｇ用量において、上記被包物質は、６日目において１２倍高い発現を与えた；０．１μｇ用量レベルでは、６日目において２４倍高かった。
【０１３５】
上記群において平均レベルで調べるだけでなく、個々の動物もまた研究した。いくらかの動物は、裸のレプリコンに対して非応答者であったのに対して、被包は、非応答者を排除した。
【０１３６】
さらなる実験では、ＤｌｉｎＤＭＡをＤＯＴＡＰで置換した。ＤＯＴＡＰリポソームは、裸のレプリコンより良好な発現を与えたが、それらは、ＤｌｉｎＤＭＡリポソームより劣っていた（１日目において２〜３倍の差異）。
【０１３７】
インビボでの免疫原性を評価するために、レプリコンを構築して、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）に由来する全長Ｆタンパク質を発現させた。これを、裸（１μｇ）、リポソーム中に被包（０．１もしくは１μｇ）、またはビリオン中でパッケージング（１０６  ＩＵ；「ＶＲＰ」）で、０日目および２１日目に送達した。図７は、２回目の用量の２週間後の抗ＦのＩｇＧ力価を示す。上記リポソームは、明らかに免疫原性を増強する。図８は、２週間後の力価を示す。この時点までに、０．１μｇの上記被包ＲＮＡと、１μｇの上記被包ＲＮＡと、上記ＶＲＰ群との間に統計学的差異は何らなかった。中和力価（６０％のプラーク減少として測定，「ＰＲＮＴ６０」）は、２回目の用量の２週間後に、これら３群において有意差はなかった（図９）。図１２は、２回目の用量の４週間後のＩｇＧ力価およびＰＲＮＴ力価の両方を示す。
【０１３８】
図１３は、上記ＲＮＡが堅調なＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘発することを確認する。
【０１３９】
さらなる実験において、ＶＲＰ、０．１μｇ  リポソーム被包ＲＮＡ、もしくは１μｇ  リポソーム被包ＲＮＡを与えられたマウスにおけるＦ特異的ＩｇＧ力価を比較した。２回目の用量の後の種々の時点での力価比（ＶＲＰ：リポソーム）は、以下のとおりであった：
【０１４０】
【数１】
2013538569.tif 000006
従って、上記リポソーム被包ＲＮＡは、ビリオン送達で認められるのと本質的に同程度の免疫応答を誘導する。
【０１４１】
さらなる実験から、優れたＦ特異的ＩｇＧ応答が１０μｇ用量で示され、これは、１μｇおよび０．１μｇ用量についての応答と等しく、０．０１μｇ用量ではより低い応答が示された。図１１は、３種の異なる用量における裸の形態において、４種の異なる用量におけるリポソームにおいて、もしくはＶＲＰ（１０６  ＩＵ）として、上記レプリコンを与えられた動物におけるＩｇＧ力価を示す。１μｇ  リポソーム被包ＲＮＡで認められた応答は、ＶＲＰと比較した場合に統計的に有意ではなかった（ＡＮＯＶＡ）が、１０μｇ  リポソーム被包ＲＮＡで認められたより高い応答は、これらの群の両方と比較した場合、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０１４２】
さらなる研究から、上記０．１μｇのリポソーム被包ＲＮＡは、０．１μｇの送達されたＤＮＡより遙かに高い抗Ｆ  ＩｇＧ応答を与え（２回目の用量の１５日後）、さらに、エレクトロポレーション（ＥｌｇｅｎＴＭ  ＤＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｉｎｏｖｉｏ）によって送達された、上記Ｆ抗原をコードする２０μｇ  プラスミドＤＮＡより免疫原性であることが確認された。
【０１４３】
（コットンラット）
研究を、マウスの代わりにコットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｉｓ）において行った。１μｇ用量において、リポソーム被包は、裸のＲＮＡと比較してＦ特異的ＩｇＧ力価を８．３倍増大させ、ＰＲＮＴ力価を９．５倍増大させた。抗体応答の大きさは、５×１０６  ＩＵ  ＶＲＰによって誘導されたものに等しかった。裸のＲＮＡおよびリポソーム被包ＲＮＡはともに、上記コットンラットをＲＳＶチャレンジ（１×１０５  プラーク形成単位）から保護することができ、肺のウイルス負荷を少なくとも３．５対数低下させた。被包は、上記低下を約２倍増大させた。
【０１４４】
コットンラットにおけるさらなる研究は、４種の異なるレプリコンを使用した：ｖＡ３１７は、全長ＲＳＶ−Ｆを発現する；ｖＡ３１８は、短縮型（膜貫通および細胞質テールが除去されている）ＲＳＶ−Ｆを発現する；ｖＡ１４２は、ＲＳＶ−Ｆ（融合ペプチドが欠失されている）を発現する；ｖＡ１４０は、短縮型ＲＳＶ−Ｆ（同様にそのペプチドなし）を発現する。コットンラット（１群あたり４〜８匹の動物）に、以下を０日目および２１日目に筋肉内にワクチン接種した（一方の脚に１００μＬ）：方法（Ｄ）によって（ただし１５０μｇ  ＲＮＡバッチサイズで）、２ｋＤａ  ＰＥＧ結合体化ＤＭＧを使用して作製したリポソーム中に処方した、２種の用量（１．０μｇおよび０．１μｇ）での、４種の異なるレプリコン。コントロール群には、アラム（ａｌｕｍ）をアジュバント添加したＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（５μｇ）（８匹の動物／群）、全長ＲＳＶ−Ｆを発現するＶＲＰ（１×１０６  ＩＵ，８匹の動物／群）、もしくはナイーブコントロール（４匹の動物／群）を与えた。０日目、２１日目および３４日目に、抗体分析のために、血清を集めた。
【０１４５】
２１日目および３４日目のＦ特異的血清ＩｇＧ力価およびＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下であった：
【０１４６】
【数２】
2013538569.tif 000007
この研究において評価した４種全てのレプリコン（ｖＡ３１７、ｖＡ３１８、ｖＡ１４２、ｖＡ１４０）は、リポソームによって送達された場合にはコットンラットにおいて免疫原性であったが、血清中和力価は、アジュバント添加したタンパク質ワクチンもしくはＶＲＰによって誘導されるものの、多くとも１／１０であった。上記リポソーム／ＲＮＡワクチンは、第１のワクチン接種後に、血清Ｆ特異的ＩｇＧおよびＲＳＶ中和抗体を誘発し、第２のワクチン接種は、上記応答を効率的にブーストした。１μｇ  レプリコンでの上記第２のワクチン接種後のＦ特異的ＩｇＧ力価は、０．１μｇ  レプリコンでの上記第２のワクチン接種後より２〜３倍高かった。上記４種のレプリコンは、同等の抗体力価を誘発した。このことは、全長および短縮型ＲＳＶ−Ｆ（各々、上記融合ペプチドありもしくはなし）が、コットンラットにおいて同様に免疫原性であることを示唆する。
【０１４７】
コットンラットにおけるさらなる研究は、再び、上記ｖＡ３１７、ｖＡ３１８およびｖＡ１４２レプリコンを使用した。コットンラット（１群あたり２〜８匹の動物）に、０日目および２１日目に、以下を筋肉内にワクチン接種した（一方の脚に１００μＬ）：方法（Ｄ）によって（ただし１５０μｇ  ＲＮＡバッチサイズで）作製されたＲＶ０１リポソーム（ＰＥＧ−２０００を有する）中に被包されたレプリコン（０．１μｇもしくは１μｇ）。コントロール群に、アラムをアジュバント添加した上記ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（５μｇ）、もしくは全長ＲＳＶ−Ｆを発現するＶＲＰ（１×１０６  ＩＵ，８匹の動物／群）を与えた。これらの動物全てに、アラムをアジュバント添加したＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（５μｇ）で第３のワクチン接種を行った（５６日目）。さらに、ナイーブコントロールを加えた（４匹の動物／群）。さらに、追加の群に、０日目および５６日目に、リポソーム中の１μｇ  ｖＡ３１７  ＲＮＡを両側の筋肉内にワクチン接種（５０μＬ／脚）したが、上記サブユニットタンパク質ワクチンでの第３のワクチン接種は与えなかった。
【０１４８】
０日目、２１日目、３５日目、５６日目、７０日目に、上記追加の群については、加えて、１４日目、２８日目および４２日目に、抗体分析のために血清を集めた。Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：
【０１４９】
【数３】
2013538569.tif 000008
血清中和力価は、以下のとおりであった（３〜４匹の動物／群の２つのプールについての６０％  ＲＳＶ中和力価，１群あたりこれら２プールのＧＭＴ）：
【０１５０】
【数４】
2013538569.tif 000009
上記追加の群の血清力価および中和力価は、以下のとおりであった：
【０１５１】
【数５】
2013538569.tif 000010
従って、上記レプリコンは、コットンラットにおいて免疫原性であると確認され、上記第１のワクチン接種後に血清Ｆ特異的ＩｇＧおよびＲＳＶ中和抗体を誘発する。第２のワクチン接種は、上記応答を効率的にブーストした。１．０μｇ  レプリコンでの上記第２のワクチン接種後のＦ特異的ＩｇＧ力価は、０．１μｇ  レプリコンでの上記第２のワクチン接種後より１．５〜４倍高かった。
【０１５２】
上記第３のワクチン接種（５６日目でのタンパク質）は、Ｆトリマーサブユニット＋アラムを以前にワクチン接種したコットンラットにおいて力価をブーストしなかったが、レプリコンを以前にワクチン接種したコットンラットにおいて力価の大きなブーストを提供した。大部分の場合において、２回のレプリコンワクチン接種、続くタンパク質ブーストの後の上記ＲＳＶ血清中和力価は、２回もしくは３回の一連のタンパク質ワクチン接種によって誘導される力価に匹敵するかもしくはそれより大きかった。
【０１５３】
この研究はまた、１．０μｇ  ｖＡ３１７に対する抗体応答の動態を評価した。単一のワクチン接種によって誘導されたＦ特異的血清ＩｇＧおよびＲＳＶ中和力価は、２１日目あたりでピークに達し、少なくとも５６日目まで維持された（Ｆ特異的ＩｇＧ力価においては５０〜７０％低下，ＲＳＶ中和力価においてはごく僅かに変化）。同種の第２のワクチン接種を、５６日目にこれら動物に与えたところ、上記第２のワクチン接種を２１日目に施した場合に達成されたものに少なくとも等しいレベルへと抗体力価をブーストした。
【０１５４】
さらなる実験は、ウイルスチャレンジを包含した。上記ｖＡ３６８レプリコンは、ＥＶ７１  ＩＲＥＳによって発現が駆動される、上記融合ペプチドが欠失したＲＳＶの全長野生型表面融合糖タンパク質をコードする。コットンラット（７匹／群）に、０日目および２１日目に、以下を筋肉内にワクチン接種した（１００μＬ／脚）：方法（Ｈ）によって調製したリポソーム中のｖＡ３６８（１７５μｇ  ＲＮＡバッチサイズ）、または同じレプリコンを有するＶＲＰ。上記リポソームは、ＤＭＧに結合体化された２ｋＤａ  ＰＥＧを含む。コントロール群に、５μｇ  アラムアジュバント添加タンパク質を与え、ナイーブコントロール群もまた、含めた。
【０１５５】
全ての群に、最後の免疫化の４週間後に、１×１０６  ＰＦＵ  ＲＳＶでの鼻内チャレンジ（ｉ．ｎ．）を与えた。０日目、２１日目、３５日目に、抗体分析のために血清を集めた。ウイルス肺力価を、チャレンジの５日後に測定した。結果は、以下のとおりであった：
【０１５６】
【数６】
2013538569.tif 000011
従って、上記ＲＮＡワクチンは、非ワクチン接種コントロールコットンラットの約１０６  ＰＦＵ／ｇから、ワクチン接種コットンラットの１０３  ＰＦＵ／ｇ未満へと、上記肺ウイルス負荷を３対数超低下させた。
【０１５７】
（大型哺乳動物研究）
大型動物研究を、ウシにおいて行った。仔ウシ（４〜６週齢，約６０〜８０ｋｇ，５頭／群）を、全長ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードするレプリコンｖＡ３１７  ６６μｇで、０日目、２１日目、８６日目および１４６日目に免疫化した。上記レプリコンを、方法（Ｅ）によって（ただし１．５ｍｇ  ＲＮＡバッチサイズで）作製したリポソームの中に処方した；それらは、４０％  ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％  ＤＳＰＣ、４８％  コレステロール、および２％  ＰＥＧ−２０００（ＤＭＧに結合体化）を有した。ＰＢＳ単独を、陰性コントロールとして使用し、認可されたワクチンを、陽性コントロールとして使用した（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅの「Ｔｒｉａｎｇｌｅ  ４」，死滅ウイルスを含む）。全ての仔ウシに、１４６日目に、ＭＦ５９エマルジョンをアジュバント添加した１５μｇ  Ｆタンパク質を与えた。
【０１５８】
上記ＲＮＡワクチンは、ヒトＲＳＶ  Ｆをコードしたのに対して、上記「Ｔｒｉａｎｇｌｅ  ４」ワクチンは、ウシＲＳＶ  Ｆを含むが、上記ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＢＲＳＶとＨＲＳＶとの間で非常によく保存されている。
【０１５９】
仔ウシに、各実験ワクチン２ｍｌを与え、頸部の各側に２×１ｍｌとして筋肉内投与した。対照的に、上記「Ｔｒｉａｎｇｌｅ  ４」ワクチンは、頸部に単一の２ｍｌ用量として与えた。
【０１６０】
０日目、１４日目、２１日目、３５日目、４２日目、５６日目、６３日目、８６日目、１００日目、１０７日目、１１４日目、１２１日目、１２８日目、１３５日目、１４６日目、１６０日目、１６７日目、１７４日目、１８１日目、１８８日目、１９５日目、および２０２日目に、抗体分析のために血清を集めた。個々の動物が検出限界より低い力価を有した場合、それには、力価５を割り当てた。
【０１６１】
図１４は、２１０日間にわたるＦ特異的ＩｇＧ力価を示す。最初の６３日間にわたって、上記ＲＮＡレプリコンは、リポソームを介して雌ウシにおいて免疫原性であったが、上記認可されたワクチンより低い力価を与えた。全てのワクチン接種した雌ウシは、第２の用量の後にＦ特異的抗体を示し、力価は、上記第２の用量後の２〜６週の期間、非常に安定であった（そして上記ＲＮＡワクチンに関しては、特に安定であった）。２０２日目までの力価は、以下のとおりであった：
【０１６２】
【数７】
2013538569.tif 000012
ＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下のとおりであった：
【０１６３】
【数８】
2013538569.tif 000013
上記第２のリポソーム用量のために使用した物質は、新たに調製しなかったので、ＲＮＡのそのロットは、マウス免疫原性研究において効力の低下を示した。従って、新たな材料を全てのワクチン接種のために使用していれば、上記ワクチンはより免疫原性であったと考えられる。
【０１６４】
補体でアッセイされる場合、中和抗体を、全てのワクチン接種した雌ウシにおいて検出した。このアッセイにおいて、全てのワクチン接種した仔ウシは、第２のＲＮＡワクチン接種の後に、良好な中和抗体力価を有した。さらに、上記ＲＮＡワクチンは、Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価を誘発し、これは、上記第２のワクチン接種の後に数頭の仔ウシにおいて、および第３のワクチン接種の後に全ての仔ウシにおいて検出された。
【０１６５】
ＭＦ５９アジュバント添加したＲＳＶ−Ｆは、全ての以前にワクチン接種した仔ウシにおいてＩｇＧ応答をブーストでき、ＲＮＡを以前にワクチン接種した仔ウシの補体非依存性中和力価をブーストできた。
【０１６６】
大型動物におけるＲＮＡワクチンの概念の立証は、小動物モデルから大型動物およびヒトへと移行する場合に、ＤＮＡベースのワクチンで以前に観察された効力の喪失を踏まえると、特に重要である。雌ウシＤＮＡワクチンの代表的な用量は、０．５〜１ｍｇである［４０，４１］ので、免疫応答がわずか６６μｇのＲＮＡで誘導されたことは、非常に有望である。
【０１６７】
（リポソーム直径の効果）
より小さなリポソームを得るために、上記シリンジ／チューブ法を、上記脂質およびＲＮＡ溶液をマイクロ流体チップ上のチャネルにおいて混合する方法に交換した。
【０１６８】
エタノール中に新たな脂質ストック溶液を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロールおよび８．０７ｍｇのＰＥＧ−ＤＭＧを秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中に溶解した。上記新たに調製した脂質ストック溶液を、３７℃において約１５分間にわたって穏やかに振盪させて、均質な混合物を形成した。次いで、上記ストック  ２２６．７μＬを、１．７７３ｍＬ  エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製した。また、ＲＮＡの作業溶液４ｍＬを、１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）において、約１μｇ／μＬのストック溶液から調製した。４本の２０ｍＬ  ガラスバイアル（撹拌子あり）を、ＲＮａｓｅ  Ａｗａｙ溶液ですすぎ、使用前に多量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、上記バイアルのＲＮＡｓｅの汚染を除去した。上記バイアルのうちの２本を、上記ＲＮＡ作業溶液（各バイアル中に２ｍＬ）のために使用し、他のものを、上記脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した。上記作業脂質溶液および上記ＲＮＡ溶液を、３７℃において１０分間にわたって加熱し、その後、３ｃｃ  ルアーロックシリンジの中に入れた。ＲＮＡおよび脂質を含むシリンジを、４ウェイエッジコネクタを使用するＰＴＦＥチューブ（０．０３インチＩＤ×１／１６インチＯＤ，（Ｓｙｒｒｉｓ））を使用して、Ｍｉｔｏｓ  Ｄｒｏｐｌｅｔ接合チップ（Ｓｙｒｒｉｓから得たガラス製マイクロ流体デバイス，  部品番号３０００１５８）に接続した。２本のＲＮＡストリームおよび１本の脂質ストリームを、シリンジポンプによって作動させ、上記エタノール相および水相の混合を、上記チップのＸ接合部（１００μｍ×１０５μｍ）において行った。３本全てのストリームの流量を、１．５ｍＬ／分において維持し、従って、全水性の流量  対  エタノール性の流量の比は、２：１であった。チューブ出口を、２０ｍＬガラスバイアル中に上記混合物を集めるために配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。次いで、上記混合物を、５ｃｃ  シリンジに入れ、これを、１本のＰＴＦＥチューブ（０．０３インチＩＤ×１／１６インチＯＤ）にはめ、等しい長さのＰＴＦＥチューブ付きの別の５ｃｃシリンジに、等容積の１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、３ｍＬ／分の流量において、シリンジポンプを使用して作動させ、最終混合物を、２０ｍＬガラスバイアル中に集めた（撹拌しながら）。次に、ＴＦＦシステムを使用して、リポソームを２ｍＬに濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。１００ｋＤａ孔サイズカットオフおよび２０ｃｍ２表面積を有する中空ファイバー濾過膜を使用した。インビトロ実験およびインビボ実験のために、処方物を、１×ＰＢＳで、必要とされるＲＮＡ濃度へと希釈した。
【０１６９】
上記シリンジ／チューブ法を使用して、７５μｇ  ＲＮＡで調製したリポソームは、Ｚ平均直径  １４８ｎｍおよび多分散性指数  ０．１２２を有したのに対して、上記チップ混合は、Ｚ平均直径  ９７ｎｍおよび多分散性指数  ０．０８６を有するリポソームを与えた。被包ＲＮＡの割合は、９０％から８７％へと僅かに低下した。これら直径および多分散性指数は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，  ＵＫ）を使用して、製造業者の説明書に従って測定した。リポソームを、１×ＰＢＳで希釈し、その後、測定した。
【０１７０】
上記リポソームを、０日目に、８〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内注射によって投与した（５０μＬ／脚）。１日目および３日目に眼窩静脈洞採血を行い、６日目に最後の採血を行った。血清ＳＥＡＰレベルを、化学発光アッセイによって測定した。図３に示されるように、小さなリポソームによって、ＳＥＡＰレベルは、１日目に約２倍、および６日目に約５倍、増大した。
【０１７１】
また、２種の異なる方法によって調製したリポソームを、全長ＲＳＶ−Ｆタンパク質をコードするレプリコンの送達について評価した。マウスのＦ特異的血清ＩｇＧ力価（８匹の動物／群）を、０日目および２１日目に筋肉内にワクチン接種した後に測定した。１４日目（２ｗｐ１）および３５日目（２ｗｐ２）に、抗体分析のために血清を集めた。個々の動物が、力価＜２５（検出限界）を有した場合、それには力価５に割り当てた。データを、各群の幾何平均力価として以下に示す：
【０１７２】
【数９】
2013538569.tif 000014
従って、上記のより小さなチップ混合リポソームは、２ｗｐ１および２ｗｐ２において、約２倍高いＧＭＴであった。
【０１７３】
また、異なる直径を有する種々の異なるリポソームを使用して、全長ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードするレプリコンを送達した。第１の用量の２週間後のＦタンパク質に対する全ＩｇＧ力価を、図１５においてリポソーム直径に対してプロットする。
【０１７４】
（リポソーム製造法）
一般に、８つの異なる方法を、本発明に従うリポソームを調製するために使用した。これらは、方法（Ａ）〜（Ｈ）として本文中で言及され、主に濾過およびＴＦＦ工程に関連して異なっている。詳細は、以下のとおりである。
【０１７５】
（Ａ）エタノール中の新鮮な脂質ストック溶液を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロールおよび８．０７ｍｇのＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００を秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中に溶解した。上記新たに調製した脂質ストック溶液を、３７℃において約１５分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、上記ストックのうちの７５５μＬを、１．２４５ｍＬ  エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製した。この量の脂質を使用して、２５０μｇ  ＲＮＡと共にリポソームを形成した。ＲＮＡの２ｍＬ  作業溶液をまた、１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中のストック溶液約１μｇ／μＬから調製した。３つの２０ｍＬ  ガラスバイアル（撹拌子有り）を、ＲＮａｓｅ  Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）ですすぎ、使用前に多量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、上記バイアルのＲＮａｓｅの汚染を除去した。上記バイアルのうちの１つを、上記ＲＮＡ作業溶液に使用し、他のものを脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した（後に記載されるとおり）。作業脂質溶液およびＲＮＡ溶液を、３７℃において１０分間にわたって加熱し、その後、３ｃｃ  ルアーロックシリンジに入れた。２ｍＬ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃ  シリンジに入れた。ＲＮＡおよび脂質を含むシリンジを、ＦＥＰチューブ（フッ素化エチレン−プロピレン；すべてのＦＥＰチューブは、２ｍｍ内径×３ｍｍ外径を有した；Ｉｄｅｘ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅによって供給）を使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫＴＭ  ５００μｍ  ＩＤ接合部，Ｉｄｅｘ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｏａｋ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＷＡ）に接続した。上記Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第３のシリンジを、別個の１つのＦＥＰチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量７ｍＬ／分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、２０ｍＬ  ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。上記混合物のうちの４ｍｌを、５ｃｃ  シリンジに入れ、これを、ＦＥＰチューブの１つに接続し、別の５ｃｃ  シリンジを、等しい長さのＦＥＰチューブに接続し、等量の１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、上記シリンジポンプを使用して７ｍＬ／分の流量において作動させ、最終の混合物を、２０ｍＬ  ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、第２の混合工程（リポソーム）から集めた上記混合物を、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  ＡｎｎＡｒｂｏｒ，  ＭＩ，  ＵＳＡから得られる、結合してアニオン性分子を除去するアニオン交換支持体）を通過させた。上記リポソームを通過させる前に、４ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨ、４ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＬの１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）が、上記Ｍｕｓｔａｎｇ膜を連続して通過した。リポソームを、１０分間にわたって３７℃において加温し、その後、���記膜を通過させた。次に、ＴＦＦを使用して、リポソームを２ｍＬに濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記ＴＦＦシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓから購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび８ｃｍ２  表面積を有するポリスルホン中空ファイバー濾過膜（部品番号Ｐ／Ｎ：  Ｘ１ＡＢ−１００−２０Ｐ）を使用した。インビトロおよびインビボ実験に関しては、処方物を、１×ＰＢＳで、必要とされるＲＮＡ濃度へと希釈した。
【０１７６】
（Ｂ）振盪後、上記ストックのうちの２２６．７μＬを、１．７７３ｍＬ  エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製したこと（従って、上記脂質：ＲＮＡ比を改変）を除いて、方法（Ａ）のとおり。
【０１７７】
（Ｃ）上記Ｍｕｓｔａｎｇ濾過を省略したので、リポソームが、上記２０ｍＬ  ガラスバイアルから上記ＴＦＦ透析へと向かったことを除いて、方法（Ｂ）のとおり。
【０１７８】
（Ｄ）上記ＴＦＦが、１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび２０ｃｍ２  表面積を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空ファイバー膜（部品番号  Ｐ−Ｃ１−１００Ｅ−１００−０１Ｎ）を使用したことを除いて、方法（Ｃ）のとおり。
【０１７９】
（Ｅ）方法（Ａ）のようにＭｕｓｔａｎｇ膜を使用したことを除いて、方法（Ｄ）のとおり。
【０１８０】
（Ｆ）上記Ｍｕｓｔａｎｇ濾過を省略したので、リポソームが、上記２０ｍＬ  ガラスバイアルから上記ＴＦＦ透析へと向かったことを除いて、方法（Ａ）のとおり。
【０１８１】
（Ｇ）ＲＮＡの４ｍＬ  作業溶液を、１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中の約１μｇ／μＬのストック溶液から調製したことを除いて、方法（Ｄ）のとおり。次いで、４つの２０ｍＬ  ガラスバイアルを、同じ方法で調製した。それらのうちの２本を、上記ＲＮＡ作業溶液（各バイアル中２ｍＬ）に使用し、他のものを、（Ｃ）のように、上記脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した。Ｔミキサーを使用するのではなく、ＲＮＡおよび脂質を含むシリンジを、Ｍｉｔｏｓ  Ｄｒｏｐｌｅｔ接合チップ（Ｓｙｒｒｉｓから得られるガラス製マイクロ流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）デバイス（部品番号  ３０００１５８））に、ＰＴＦＥチューブ（０．０３インチ内径×１／１６インチ外径）を使用して、４ウェイエッジコネクタ（Ｓｙｒｒｉｓ）を使用して接続した。２つのＲＮＡストリームおよび１つの脂質ストリームを、シリンジポンプによって作動させ、上記エタノールおよび水相の混合を、上記チップのＸ接合部（１００μｍ×１０５μｍ）において行った。３つすべてのストリームの流量を、１．５ｍＬ／分において維持し、従って、全水性の流量  対  エタノールの流量の比は、２：１であった。上記チューブ出口を、２０ｍＬ  ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。次いで、上記混合物を５ｃｃ  シリンジに入れ、これを、上記ＰＴＦＥチューブの別の１つにはめた；等しい長さのＰＴＦＥチューブ付きの別の５ｃｃ  シリンジに、等容積の１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、３ｍＬ／分の流量において、シリンジポンプを使用して作動させ、最終混合物を、２０ｍＬ  ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、（Ｄ）におけるように、ＴＦＦを使用して、リポソームを２ｍＬに濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析した。
【０１８２】
（Ｈ）上記２ｍＬ作業脂質ストック溶液を、１２０．９μＬの上記脂質ストックと１．８７９ｍＬ  エタノールとを混合することによって作製したことを除いて、方法（Ａ）のとおり。また、上記Ｔミキサーにおいて混合した後に、上記２０ｍＬ  バイアルからの上記リポソームを、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，特に強力，０．５〜３ｍＬ  容量）に入れ、オートクレーブしたプラスチック容器中、４００〜５００ｍＬの１×ＰＢＳに対して一晩４℃において透析し、その後、最終生成物を収集した。
【０１８３】
（ＲＳＶ免疫原性）
ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする上記ｖＡ３１７自己複製レプリコンを、以下のように、０日目および２１日目にＢＡＬＢ／ｃマウス（４匹もしくは８匹の動物／群）に、両側の筋肉内注射（５０μＬ／脚）によって投与した：上記レプリコン（１μｇ）単独、またはＤｌｉｎＤＭＡ（「ＲＶ０１」）もしくはＤＯＴＡＰ（「ＲＶ１３」）もしくは図１６Ａ〜１６Ｍに示される脂質（「ＲＶ０５」）でリポソームとして処方した上記レプリコン。上記ＲＶ０１リポソームは、４０％  ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％  ＤＳＰＣ、４８％  コレステロールおよび２％  ＰＥＧ−ＤＭＧを有したが、ＲＮＡの量は異なった。上記ＲＶ０５リポソームは、４０％  ＲＶ０５、１０％  ＤＳＰＣ、４８％  コレステロールおよび２％  ＰＥＧ−ＤＭＧ、または６０％  ＲＶ０５、３８％  コレステロールおよび２％  ＰＥＧ−ＤＭＧのいずれかを有した。上記ＲＶ１３リポソームは、４０％  ＤＯＴＡＰ、１０％  ＤＯＰＥ、４８％  コレステロールおよび２％  ＰＥＧ−ＤＭＧを有した。比較のために、同じＲＳＶ−Ｆ抗原を発現する裸のプラスミドＤＮＡ（２０μｇ）を、エレクトロポレーションを使用して、またはＲＶ０１（１０）リポソームと共に（０．１μｇ  ＤＮＡ）のいずれかで送達した。４匹のマウスを、ナイーブコントロール群として使用した。
【０１８４】
リポソームを、方法（Ａ）もしくは方法（Ｂ）によって調製した。方法（Ａ）によって作製したいくらかのリポソームに関しては、ＲＮＡの倍量もしくは半量を使用した。Ｚ平均粒子直径および多分散性指数は、以下であった。
【０１８５】
【数１０】
2013538569.tif 000015
血清を、１４日目、３６日目および４９日目に抗体分析のために集めた。脾臓を、４９日目に、Ｔ細胞分析のためにマウスから採取した。
【０１８６】
Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：
【０１８７】
【数１１】
2013538569.tif 000016
サイトカイン陽性であり、かつＲＳＶ  Ｆ５１−６６ペプチドに対して特異的なＴ細胞の割合は、以下のとおりであり、統計的に有意にゼロを上回る数字のみを示す：
【０１８８】
【数１２】
2013538569.tif 000017
従って、上記リポソーム処方物は、増大したＦ特異的ＩｇＧ力価およびＴ細胞頻度によって決定される場合、上記裸のＲＮＡコントロールと比較して免疫原性を顕著に増大した。リポソームと共に処方したか、またはエレクトロポレーションを使用して裸で送達されたプラスミドＤＮＡは、リポソーム処方された自己複製ＲＮＡより顕著に免疫原性が低かった。
【０１８９】
さらなるＲＶ０１リポソームを、上記ＤＭＧに結合体化した短いＰＥＧ（２ｋＤａ）もしくは長い（５ｋＤａ）ＰＥＧのいずれかを使用して、１５０μｇ  ＲＮＡ（ＲＳＶの表面融合糖タンパク質をコードするｖＡ３７５レプリコン）を被包するかもしくは緩衝液のみを被包して、方法（Ｈ）によって調製した。従って、これらリポソームは、４０％  ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％  ＤＳＰＣ、４８％  Ｃｈｏｌ、および２％  ＰＥＧ−ＤＭＧを有した。サイズおよび被包は、以下のとおりであった：
【０１９０】
【数１３】
2013538569.tif 000018
上記リポソームを、０日目および２１日目に、両側の筋肉内注射（５０μｌ／脚）によってＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹／群）に投与した。用量は、０．０１μｇ、０．０３μｇ、０．１μｇ、０．３μｇもしくは１μｇであった。Ｆ特異的血清ＩｇＧおよびＰＲＮＴ６０力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった（第１もしくは第２の注射の２週間後）：
【０１９１】
【数１４】
2013538569.tif 000019
（リポソーム−被包の必要性）
図１０を参照して上記で言及されるように、被包は、強力な発現に必須である。さらなる実験は、３種の異なるＲＮＡを使用した：（ｉ）ＲＳＶ−Ｆ（すなわち、ＲＳＶの表面融合糖タンパク質）を発現する「ｖＡ３１７」レプリコン；（ｉｉ）ＧＦＰを発現する「ｖＡ１７」レプリコン；および（ｉｉｉ）複製欠損性でありかつＧＦＰをコードする「ｖＡ３３６」。ＲＮＡを、裸でもしくは方法（Ｄ）によって作製したリポソームと共に、のいずれかで送達した。空のリポソームを、方法（Ｄ）によって、ただし、いかなるＲＮＡもなしで作製した。リポソーム処方物は、これらの特徴を有した：
【０１９２】
【数１５】
2013538569.tif 000020
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり５匹の動物）に、０日目および２１日目に、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を与えた：
群１  裸の自己複製性ＲＳＶ−Ｆ  ＲＮＡ（ｖＡ３１７，０．１μｇ）
群２  リポソーム中に被包された自己複製性ＲＳＶ−Ｆ  ＲＮＡ（ｖＡ３１７，０．１μｇ）
群３  空のリポソームに添加された自己複製性ＲＳＶ−Ｆ  ＲＮＡ（ｖＡ３１７，０．１μｇ）
群４  Ｆサブユニットタンパク質（５μｇ）。
【０１９３】
血清を、１４日目、３５日目および５１日目に、抗体分析のために集めた。Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）を測定した；個々の動物が力価＜２５（検出限界）を有した場合、それには力価５を割り当てた。さらに、５１日目にＴ細胞分析のために脾臓をマウスから採取して、サイトカイン陽性かつＲＳＶ  Ｆ５１−６６ペプチド（ＣＤ４＋）もしくはＲＳＶ  ＦペプチドＦ８５−９３およびＦ２４９−２５８（ＣＤ８＋）に対して特異的である細胞を決定した。
【０１９４】
ＩｇＧ力価は、１０群においておよび非免疫化コントロールマウスにおいて以下のとおりであった：
【０１９５】
【数１６】
2013538569.tif 000021
５１日目でのＲＳＶ血清中和力価は、以下のとおりであった：
【０１９６】
【数１７】
2013538569.tif 000022
５１日目にＲＳＶ  Ｆ特異的ＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞を示す動物は、以下のとおりであった。ここで数字（％陽性細胞）は、上記刺激された応答が統計的に有意にゼロを上回った場合にのみ与える：
【０１９７】
【数１８】
2013538569.tif 000023
５１日目にＲＳＶ  Ｆ特異的ＣＤ８＋脾臓Ｔ細胞を示す動物は、以下のとおりであった。ここで数字は、上記刺激された応答が統計的に有意にゼロを上回った場合にのみ与える：
【０１９８】
【数１９】
2013538569.tif 000024
従って、上記リポソーム内のＲＮＡの被包は、高い免疫原性に必要である。なぜなら、ＲＮＡおよび上記リポソームの単純な混合（群３）は、免疫原性ではなかったからである（実際に、裸のＲＮＡより免疫原性が低かった）。
【０１９９】
（ｖＡ３１７  ＲＳＶレプリコンを伴った様々なカチオン性脂質）
さらなる実験では、４種の異なるカチオン性脂質（ＤｌｉｎＤＭＡ、ＲＶ０２、ＲＶ０４およびＲＶ０７）を比較した。全てのリポソームは、２％  ＰＥＧ−ＤＭＧ  ２０００を含んだが、残りの脂質組成は異なった。上記組成および物理的特徴は、以下のとおりであった：
【０２００】
【数２０】
2013538569.tif 000025
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８匹／群）に、０日目および２１日目に、以下を両側の筋肉内ワクチン接種によって与えた（５０μＬ／脚）：裸のレプリコン（１μｇ）もしくは０．１μｇ  被包ＲＮＡ。これらの２回の注射の２週間後のＦ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：
【０２０１】
【数２１】
2013538569.tif 000026
ＲＶ０７に関しては、ＤＳＰＣがないことから、免疫原性の大きな低下が引き起こされた。
【０２０２】
さらなる脂質（ＲＶ０３、ＲＶ０８、ＲＶ０９、ＲＶ１４［４２］）を、同じように試験した：
【０２０３】
【数２２】
2013538569.tif 000027
【０２０４】
【数２３】
2013538569.tif 000028
リポソームＭ（ＤＣ−コレステロールあり）は、裸のＲＮＡコントロールをさらに下回って、不十分にしか機能しなかった。対照的に、残りのカチオン性脂質は、有用な結果を与えた。リポソームＮは、リポソームＧ（方法（Ｄ））とは異なる混合法（マイクロ流体チップを用いた方法（Ｇ））によって調製した。そしてこのより小さなリポソームは、ほぼ同じ被包でよりよい結果を与えた。
【０２０５】
さらなる脂質（ＲＶ０１、ＲＶ１０、ＲＶ１１、ＲＶ１５）を、同じように試験した：
【０２０６】
【数２４】
2013538569.tif 000029
【０２０７】
【数２５】
2013538569.tif 000030
リポソームＱを除いて、これらリポソームの各々は、上記コントロールより良好に機能した。リポソームＱにおける上記ＲＶ１０脂質は、ｐＫａ  ７．８６を有し、これは、高すぎてインビボで有用ではないようであった。しかし、有用なｐＫａ範囲  ５．０〜７．６の中であっても、結果は良好であったが、一方にアルキルテールおよび一方にステロイド含有テールを有する上記脂質はいずれも、ＲＶ０１ほど良好な結果を与えなかった。
【０２０８】
さらなるリポソームを、ＲＶ０５で作製した。上記リポソームは全て、４０％  ＲＶ０５および２％  ＰＥＧ化脂質を有したが、残りの成分は異なった（しかし、コレステロールは常に含まれた）。物理的特徴は、以下であった：
【０２０９】
【数２６】
2013538569.tif 000031
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、前のように試験した：
【０２１０】
【数２７】
2013538569.tif 000032
非対称脂質テール（アルキル＋コレステロール）を有するカチオン性脂質に関しては、中性脂質を、ＤＳＰＣ（飽和Ｃ１８脂質テール）から１８：２もしくは１８：３  ＰＣ（テール１つあたり２個および３個の不飽和二重結合を有する）へと変更したところ、全ＩｇＧ力価が増大した。同等の結果が、ＤＳＰＣをＤＰｙＰＥと交換することによって認められた。
【０２１１】
（ｖＡ３１７  ＲＳＶレプリコンを有する、さらなる異なるカチオン性脂質）
参考文献４３において開示されるカチオン性脂質をまた、上記ｖＡ３１７レプリコンのためのリポソームを調製するために使用した。これらカチオン性脂質は、５．８〜６．１のｐＫａを有する。比較のために、ＤＯＤＭＡ、ＤｌｉｎＤＭＡおよびＤＯＴＭＡもまた、試験した。カチオン性脂質は、４０％において常に存在させた。全てのリポソームは、コレステロールおよび２％  ＰＥＧ化ＤＭＧ（ＰＥＧ２０００，ＰＥＧ５０００を有するリポソームＥを除いて）を含み、方法（Ｈ）によって作製した。物理的特徴は、以下のとおりであった：
【０２１２】
【数２８】
2013538569.tif 000033
これらリポソームを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを前のようにワクチン接種した。Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：
【０２１３】
【数２９】
2013538569.tif 000034
従って、上記ＲＶ０５リポソームは、裸のＲＮＡよりも免疫原性であったが、ＲＶ０１リポソームよりは免疫原性が低かった。
【０２１４】
Ｔ細胞分析のために、４９日目に脾臓を採取した。全てのリポソームは、Ｆ特異的サイトカイン陽性Ｔ細胞頻度（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）を与えた（これは、統計的に有意にゼロを上回った）。
【０２１５】
（種々の脂質およびＰＥＧ長）
上記ｖＡ３１７レプリコンを、種々の異なる脂質と異なるＰＥＧ長を有するリポソーム中で投与した。上記リポソームは全て、４０％  ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％  ＤＳＰＣおよび４８％  コレステロールを有したが、残りの２％は異なり、異なるＰＥＧ化脂質（例えば、図１８Ａ〜１８Ｅ）および異なるＰＥＧ長を有した。
【０２１６】
上記リポソーム（方法（Ｈ）によって作製した）の物理的特徴は、以下であった：
【０２１７】
【数３０】
2013538569.tif 000035
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８匹／群）に、０日目および２１日目に、裸で（１μｇ）もしくは被包して（０．１μｇ）のいずれかで、上記レプリコンを両側の筋肉内にワクチン接種した（５０μＬ／脚）。１４日目および３５日目に、抗体分析のために血清を集めた。
【０２１８】
Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった（２回の注射の２週間後（２ｗｐ１））：
【０２１９】
【数３１】
2013538569.tif 000036
結果は、より高分子量のＰＥＧ頭部がより免疫原性である傾向を示す。ＤＭＧ結合体化ＰＥＧの長さが、１０００Ｄａから３０００Ｄａへと増大するにつれて、２ｗｐ２  Ｆ特異的ＩｇＧ力価は、７４１２から１５６５９〜２２３７８まで増大する。
【０２２０】
リンカー領域を、エステルからエーテルへと変更したところ、上記力価には実質的に影響しなかった。また、同じ分子量の頭部（２０００）において、脂質テールの長さを増大させたところ、力価は低下するという傾向があった（Ｃ１４ジアルキルを有するＨ  対  Ｃ１８ジアルキルを有するＩ）。ＰＥＧ  ジアルキル脂質テールをコレステロールで置換しても、免疫原性にはほとんど影響がなかった（ＤＭＧを有するＡ  対  コレステロールを有するＧ）。
【０２２１】
類似の実験を、２ｋＤａのＰＥＧを、２×１ｋＤａ基に分割した異なる脂質で行った（図１７）。上記ｖＡ３１７レプリコンを再び使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウス（８匹／群）に、０日目および２１日目に、１μｇ  裸のＲＮＡもしくは０．１μｇ  リポソーム被包ＲＮＡを、両側の筋肉内にワクチン接種した（５０μＬ／脚）。上記リポソームは全て、４０％  カチオン性脂質（ＤｌｉｎＤＭＡ）、１０％  ＤＳＰＣおよび４８％  コレステロールを有したが、残り２％は異なり、様々なＰＥＧ化脂質を有した（ただし、全て２ｋＤａ  ＰＥＧを有する）。それらを、方法（Ｈ）によって作製した。
【０２２２】
上記リポソームの物理的特徴は、以下であった：
【０２２３】
【数３２】
2013538569.tif 000037
さらなるリポソームを、ＲＶ０５で作製した。上記リポソームは全て、４０％  カチオン性脂質（ＲＶ０５）および２％  ＰＥＧ化脂質（２ｋＤａ  ＰＥＧ）を有したが、残りの成分は異なった（しかし、コレステロールは常に含めた）。上記リポソームを、ｐＨ５を有することを除いて、方法（Ｈ）によって作製した。物理的特徴は、以下であった：
【０２２４】
【数３３】
2013538569.tif 000038
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８匹／群）に、０日目および２１日目に、裸で（１μｇ）もしくは被包して（０．１μｇ）のいずれかで、上記レプリコンを両側の筋肉内ワクチン接種で与えた（５０μＬ／脚）。１４日目および３５日目に、抗体分析のために血清を集めた。Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった（２回の注射の２週間後（２ｗｐ１））：
【０２２５】
【数３４】
2013538569.tif 000039
このように上記ＰＥＧ頭部を分割すると、インビボでの力価が低下した。ＰＥＧ脂質テールに二重結合を含めたところ（アルキルテール１つあたり１不飽和度（ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｉｎｓｔａｕｒａｔｉｏｎ））、１４日目に６倍、および３５日目に７倍にＩｇＧ力価が増大した。非対称脂質テール（アルキル＋コレステロール）を有するカチオン性脂質に関しては、中性脂質を、ＤＳＰＣ（飽和Ｃ１８脂質テール）から１８：２もしくは１８：３  ＰＣ（テール１つあたり２個もしくは３個の不飽和二重結合を有する）に変更したところ、全ＩｇＧ力価が増大した。ＤＳＰＣをＤＰｙＰＥで置換して、同等の結果が認められた。
【０２２６】
（ＣＭＶ免疫原性）
ＤＬｉｎＤＭＡをカチオン性脂質として有するＲＶ０１リポソームを使用して、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）糖タンパク質をコードするＲＮＡレプリコンを送達した。「ｖＡ１６０」レプリコンは、全長糖タンパク質ＨおよびＬ（ｇＨ／ｇＬ）をコードするのに対して、「ｖＡ３２２」レプリコンは、可溶性形態（ｇＨｓｏｌ／ｇＬ）をコードする。上記２種のタンパク質は、単一のレプリコンにおいて別個のサブゲノムプロモーターの制御下にある；２つの別個のベクター（一方は、ｇＨをコードし、一方はｇＬをコードする）の共投与は、良好な結果を与えなかった。
【０２２７】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹／群）に、０日目、２１日目および４２日目に、ｇＨ／ｇＬを発現するＶＲＰ（１×１０６  ＩＵ）、ｇＨｓｏｌ／ｇＬを発現するＶＲＰ（１×１０６  ＩＵ）およびコントロールとしてＰＢＳを、両側の筋肉内ワクチン接種で与えた（５０μＬ／脚）。２つの試験群に、リポソーム（４０％  ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％  ＤＳＰＣ、４８％  Ｃｈｏｌ、２％  ＰＥＧ−ＤＭＧ；方法（Ｄ）を使用して作製（ただし１５０μｇ  ＲＮＡバッチサイズで））中に処方した１μｇの上記ｖＡ１６０レプリコンもしくはｖＡ３２２レプリコンを与えた。
【０２２８】
上記ｖＡ１６０リポソームは、Ｚａｖ直径  １６８．８ｎｍ、ｐｄＩ  ０．１４４、および８７．４％  被包を有した。上記ｖＡ３２２リポソームは、Ｚａｖ直径  １６２ｎｍ、ｐｄＩ  ０．１３１、および９０％  被包を有した。
【０２２９】
上記レプリコンは、単一ベクターから２種のタンパク質を発現できた。
【０２３０】
血清を、６３日目（３ｗｐ３）に免疫学的分析のために集めた。ＣＭＶ中和力価（コントロールと比較して、陽性ウイルスフォーカス／ウェルの数において５０％低下を生じる血清希釈の逆数）は、以下のとおりであった：
【０２３１】
【数３５】
2013538569.tif 000040
全長もしくは可溶性形態のＣＭＶ  ｇＨ／ｇＬ複合体のいずれかを発現するＲＮＡは、従って、上皮細胞でアッセイされる場合、高い力価の中和抗体を誘発した。上記リポソーム被包ＲＮＡによって誘発された平均力価は、その対応するＶＲＰについてのものと少なくとも同程度に高かった。
【０２３２】
反復実験から、上記レプリコンが、単一のベクターから２種のタンパク質を発現できることが確認された。上記ＲＮＡレプリコンは、ＶＲＰでの３ｗｐ３力価  ５５１６と比較して、３ｗｐ３力価  １１４５７を与えた。
【０２３３】
本発明は、例示によって記載されてきたに過ぎず、本発明の範囲および趣旨内に留まりながら、改変が行われ得ることは、理解される。
【０２３４】
表１：有用なリン脂質
ＤＤＰＣ        １，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＥＰＡ        １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＥＰＣ        １，２−エルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＥＰＥ        １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＥＰＧ        １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＬＯＰＣ      １，２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＬＰＡ        １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＬＰＣ        １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＬＰＥ        １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＬＰＧ        １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＬＰＳ        １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＭＧ          １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＭＰＡ        １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＭＰＣ        １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＭＰＥ        １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＭＰＧ        １，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＭＰＳ        １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＯＰＡ        １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＯＰＣ        １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＯＰＥ        １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＰＧ        １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＯＰＳ        １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＰＰＡ        １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＰＰＣ        １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＰＰＥ        １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＰＰＧ        １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＰＰＳ        １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＰｙＰＥ      １，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＳＰＡ        １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＳＰＣ        １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＳＰＥ        １，２−ジステアロイル（Ｄｉｏｓｔｅａｒｐｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＳＰＧ        １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＳＰＳ        １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＥＰＣ          卵−ＰＣ
ＨＥＰＣ        水素化卵ＰＣ
ＨＳＰＣ        高純度水素化ダイズＰＣ
ＨＳＰＣ        水素化ダイズＰＣ
ＬＹＳＯＰＣ  ＭＹＲＩＳＴＩＣ    １−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＬＹＳＯＰＣ  ＰＡＬＭＩＴＩＣ    １−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＬＹＳＯＰＣ  ＳＴＥＡＲＩＣ      １−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ミルクスフィンゴミエリンＭＰＰＣ  １−ミリストイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ  ３−ホスファチジルコリン
ＭＳＰＣ        １−ミリストイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＭＰＣ        １−パルミトイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＯＰＣ        １−パルミトイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＯＰＥ        １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＰＯＰＧ        １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール）．．．］
ＰＳＰＣ        １−パルミトイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＭＰＣ        １−ステアロイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＯＰＣ        １−ステアロイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＰＰＣ        １−ステアロイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
【０２３５】
【数３６】
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【０２３６】
【数３７】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１６Ｉ】
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【図１６Ｊ】
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【図１６Ｋ】
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【図１６Ｌ】
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【図１６Ｍ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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