(57)【要約】本発明は、線維芽細胞の細胞フィーダー層を含む細胞培養支持体を提供し、前記線維芽細胞が有毛皮膚組織から分離されていることを特徴とする。
2013500738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬として使用するために有毛皮膚組織から分離された線維芽細胞の細胞。
【請求項２】
皮膚創傷治癒で使用するために有毛皮膚組織から分離された線維芽細胞の細胞。
【請求項３】
前記線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である、請求項１または２に記載の線維芽細胞。
【請求項４】
前記線維芽細胞は１またはそれよりも多くの表皮細胞と共に投与するために調製される、請求項３に記載の線維芽細胞。
【請求項５】
前記１またはそれよりも多くの表皮細胞はケラチノサイトである、請求項４に記載の線維芽細胞。
【請求項６】
前記線維芽細胞の細胞はマトリックスと関係する、請求項２から５のいずれか一項に記載の線維芽細胞。
【請求項７】
前記マトリックスはコラーゲンマトリックスである、請求項６に記載の線維芽細胞。
【請求項８】
前記線維芽細胞は局所性投与のために調製される、請求項２から７のいずれか一項に記載の線維芽細胞。
【請求項９】
有毛皮膚組織から分離された１またはそれよりも多くの線維芽細胞の細胞を皮膚創傷に適用することを含む、皮膚創傷を治癒する方法。
【請求項１０】
前記線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１またはそれよりも多くの線維芽細胞の細胞を皮膚創傷の創傷床に適用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに１またはそれよりも多くの表皮細胞を皮膚創傷または皮膚創傷の創傷床に適用することを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
有毛皮膚組織から分離された１またはそれよりも多くの線維芽細胞の細胞および薬学的に許容可能なキャリアを含む、創傷治癒組成物。
【請求項１４】
同時の、別々のまたは連続した投与のため、さらに１またはそれよりも多くの上皮細胞を含む、請求項１３に記載の創傷治癒組成物。
【請求項１５】
有毛皮膚組織から分離された１またはそれよりも多くの線維芽細胞の細胞および薬学的に許容可能なキャリアからなる、創傷治癒組成物。
【請求項１６】
同時の、別々のまたは連続した投与のため、有毛皮膚組織から分離された１またはそれよりも多くの線維芽細胞の細胞、薬学的に許容可能なキャリアおよび、１またはそれよりも多くの上皮細胞からなる、創傷治癒組成物。
【請求項１７】
前記１またはそれよりも多くの表皮細胞はケラチノサイトである、請求項１４または１６に記載の創傷治癒組成物。
【請求項１８】
前記線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の創傷治癒組成物。
【請求項１９】
局所性投与のために調製された、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の創傷治癒組成物。
【請求項２０】
請求項２から８のいずれか一項に記載の線維芽細胞または請求項１３から１９のいずれか一項に記載の組成物を含む、創傷外傷用医薬材料材。
【請求項２１】
有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞の細胞は、無毛組織から分離された線維芽細胞の細胞と比較して、ZIC1、LNX1、EN1、MAFB、HMCN1、LGR4、AGTR1、ITGA11、POSTN、ISLR、DSP、ITGA8、MYO1D、KCNK2、CH25H、KCNJ15、CLIC2、DPT、TMEPAI、FOXD1、LGR5、SPON1、HAPLN1、THBS4、CYP26B1、WISP1およびIL7からなる群から選択される少なくとも１のマーカーの上昇した発現を有することを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の線維芽細胞、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の組成物または請求項２０に記載の創傷外傷用医薬材料材。
【請求項２２】
有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞の細胞は、無毛組織から分離された線維芽細胞の細胞と比較して、ZIC1、LNX1、EN1、MAFB、HMCN1、LGR4、AGTR1、ITGA11、POSTN、ISLR、DSP、ITGA8、MYO1D、KCNK2、CH25H、KCNJ15、CLIC2、DPT、TMEPAI、FOXD1、LGR5、SPON1、HAPLN1、THBS4、CYP26B1、WISP1およびIL7からなる群から選択される少なくとも５、１０、１５、２０または２５のマーカーの上昇した発現を有することを特徴とする、請求項２１に記載の線維芽細胞、方法、組成物または創傷外傷用医薬材料材。
【請求項２３】
有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞の細胞は、無毛組織から分離された線維芽細胞の細胞と比較して、ＳＰＡＲＣおよびペリオスチンからなる群から選択されるタンパク質マーカーの上昇したレベルを発現することを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の線維芽細胞、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の組成物または請求項２０に記載の創傷外傷用医薬材料材。
【請求項２４】
前記有毛皮膚は活発に成長する毛包を生じる、いずれか一項の先行する請求項に記載の線維芽細胞、方法、組成物または創傷外傷用医薬材料材。
【請求項２５】
前記有毛組織は、頭皮組織、顔組織、陰部組織からなる群から選択される、いずれか一項の先行する請求項に記載の線維芽細胞、方法、組成物または創傷外傷用医薬材料材。
【請求項２６】
前記線維芽細胞の細胞は有毛皮膚組織から分離されることを特徴とする、線維芽細胞の細胞フィーダー層を含む細胞支持体。
【請求項２７】
さらに表皮細胞培養物を含む、請求項２６に記載の支持体。
【請求項２８】
前記表皮細胞培養物はケラチノサイト細胞培養物である、請求項２７に記載の支持体。
【請求項２９】
前記表皮細胞培養物は表皮先駆体である、請求項２７に記載の支持体。
【請求項３０】
有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞の細胞は、無毛組織から分離された線維芽細胞の細胞と比較して、ZIC1、LNX1、EN1、MAFB、HMCN1、LGR4、AGTR1、ITGA11、POSTN、ISLR、DSP、ITGA8、MYO1D、KCNK2、CH25H、KCNJ15、CLIC2、DPT、TMEPAI、FOXD1、LGR5、SPON1、HAPLN1、THBS4、CYP26B1、WISP1およびIL7からなる群から選択される少なくとも１のマーカーの上昇した発現を有することを特徴とする、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の支持体。
【請求項３１】
有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞の細胞は、無毛組織から分離された線維芽細胞の細胞と比較して、ZIC1、LNX1、EN1、MAFB、HMCN1、LGR4、AGTR1、ITGA11、POSTN、ISLR、DSP、ITGA8、MYO1D、KCNK2、CH25H、KCNJ15、CLIC2、DPT、TMEPAI、FOXD1、LGR5、SPON1、HAPLN1、THBS4、CYP26B1、WISP1およびIL7からなる群から選択される少なくとも５、１０、１５、２０または２５のマーカーの上昇した発現を有することを特徴とする、請求項３０に記載の支持体。
【請求項３２】
有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞の細胞は、無毛組織から分離された線維芽細胞の細胞と比較して、ＳＰＡＲＣおよびペリオスチンからなる群から選択されるタンパク質マーカーの上昇したレベルを発現することを特徴とする、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の支持体。
【請求項３３】
前記有毛皮膚は活発に成長する毛包を生じる、請求項２６から３２のいずれか一項に記載の支持体。
【請求項３４】
前記有毛組織は、頭皮組織、顔組織、陰部組織からなる群から選択される、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の支持体。
【請求項３５】
前記培養支持体はさらにフィーダー層の支持体を含む、請求項２６から３４のいずれか一項に記載の支持体。
【請求項３６】
前記フィーダー層の支持体は、マトリックス、ディッシュ、ウェル、フラスコまたはプレートである、請求項３５に記載の支持体。
【請求項３７】
前記マトリックスはコラーゲンマトリックスである、請求項３６に記載の支持体。
【請求項３８】
１またはそれよりも多くの線維芽細胞の細胞を有毛皮膚組織から分離することを特徴とする、少なくとも１の表皮細胞種を前記１またはそれよりも多くの線維芽細胞の細胞と一緒に共培養することを含む、表皮細胞培養方法。
【請求項３９】
前記１またはそれよりも多くの線維芽細胞の細胞を線維芽細胞フィーダー層として提供する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
有毛皮膚組織から分離される前記線維芽細胞の細胞は、無毛組織から分離される線維芽細胞の細胞と比較して、ZIC1、LNX1、EN1、MAFB、HMCN1、LGR4、AGTR1、ITGA11、POSTN、ISLR、DSP、ITGA8、MYO1D、KCNK2、CH25H、KCNJ15、CLIC2、DPT、TMEPAI、FOXD1、LGR5、SPON1、HAPLN1、THBS4、CYP26B1、WISP1およびIL7からなる群から選択される少なくとも１のマーカーの上昇した発現を有することを特徴とする、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
有毛皮膚組織から分離される前記線維芽細胞の細胞は、無毛組織から分離される線維芽細胞の細胞と比較して、ZIC1、LNX1、EN1、MAFB、HMCN1、LGR4、AGTR1、ITGA11、POSTN、ISLR、DSP、ITGA8、MYO1D、KCNK2、CH25H、KCNJ15、CLIC2、DPT、TMEPAI、FOXD1、LGR5、SPON1、HAPLN1、THBS4、CYP26B1、WISP1およびIL7からなる群から選択される少なくとも５、１０、１５、２０または２５のマーカーの上昇した発現を有することを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞の細胞は、無毛組織から分離された線維芽細胞の細胞と比較して、ＳＰＡＲＣおよびペリオスチンからなる群から選択されるタンパク質マーカーの上昇したレベルを発現することを特徴とする、請求項３８から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記共培養は無血清培地中である、請求項３８から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記表皮細胞はケラチノサイトである、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記表皮細胞は表皮前駆細胞である、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記表皮前駆体はケラチノサイト先駆体である、請求項４５に記載の表皮培養支持体。
【請求項４７】
前記表皮細胞はヒト表皮細胞である、請求項３８から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記線維芽細胞の細胞はヒト線維芽細胞である、請求項３８から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
請求項２６から３７のいずれか一項に記載の細胞支持体および１またはそれよりも多くの表皮細胞を含む、共培養容器。
【請求項５０】
前記１またはそれよりも多くの表皮細胞はケラチノサイトである、請求項４９に記載の共培養容器。
【請求項５１】
前記１またはそれよりも多くの表皮細胞は表皮前駆細胞である、請求項４９に記載の共培養容器。
【請求項５２】
前記１またはそれよりも多くの表皮前駆細胞はケラチノサイト前駆細胞である、請求項５１に記載の共培養容器。
【請求項５３】
前記容器はさらに無血清培地を含む、請求項４９から５２のいずれか一項に記載の共培養容器。
【請求項５４】
皮膚由来前駆体（ＳＫＰ）を得るために、線維芽細胞の培養物が少なくとも１の継代の対象とされた、有毛皮膚から分離された線維芽細胞の前記培養物の使用。
【請求項５５】
添付図を参照とする本明細書に実質的に記載した培養支持体。
【請求項５６】
添付図を参照とする本明細書に記載した表皮細胞培養方法。
【請求項５７】
添付図を参照とする本明細書に記載した共培養容器。
【請求項５８】
添付図を参照とする本明細書に記載した皮膚創傷の治癒方法。
【請求項５９】
添付図を参照とする本明細書に記載した創傷治癒組成物。
【請求項６０】
添付図を参照とする本明細書に記載した創傷外傷用医薬材料材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良した細胞支持体に関する。より詳細には、本発明は、有毛皮膚組織から分離された線維芽細胞の細胞を含む細胞支持体に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療は、臨床外科および美容整形の数々の分野と密接な係わり合いがあり、損傷若しくは罹患組織の置換、回復または治療に関する。再生医療は、皮膚創傷治療のための皮膚移植対策における創傷治癒に特別な用途がある。
【０００３】
皮膚は、体の外面を覆う非常に複雑な器官である。皮膚は、真皮(dermis)および表皮(epidermis)の２層から構成される。真皮は、コラーゲンマトリックスに埋め込まれた線維芽細胞を含む結合組織から主に構成される。表皮は、数細胞の厚さの外層である。表皮は、９５％を超える細胞集団を構成するケラチノサイトから主に構成される。細胞集団の残りは、樹枝細胞、例えばランゲルハンス細胞およびメラノサイトとして称される色素性細胞からなる。表皮は、実質的に細胞性であって、血管がなく、ケラチノサイトの基底層の下にコラーゲンおよび他のタンパク質の層を除いては、比較的わずかに余分な細胞マトリックスが存在する。ケラチノサイトは、表皮バリアの提供を伴い、回復および再生特性を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
皮膚は、とりわけ、体からの水分損失を防ぎ、物理的、化学的または病原菌に対する保護バリアとして働くように機能する。皮膚欠損は、死または病的状態を結果として生じ、火傷等の広範囲な傷の治療の際、皮膚のバリア機能を回復する、例えば自己の皮膚移植を表面再建することが勧められる。再生医療、特に皮膚移植における１つの障害は、ケラチノサイト培養物の形成に必要とされる時間である。従って、ケラチノサイト培養物の形成を確立する改良した方法の必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書の明細書および請求項を通して、「含む(comprise)」および「含む（contain)」の語句およびその語句の活用、例えば「含む（comprising）」および「含む（comprises）」は、「を含むが、制限しない」ことを意味するものであり、他の部分、添加物、成分、完全体またはステップを排除する（また、そうしない）ことを意図するものでない。
【０００６】
本明細書の詳細な説明および請求項を通して、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、単数形は複数形も包含する。特に、不定冠詞を用いる場合、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、明細書は、複数形並びに単数形を考慮すると解釈される。
【０００７】
本発明の特定の態様、実施形態および例と共に記載された特徴、完全体、特質、化合物、化学部位または群は、それに不適合でない限り、ここに記載の他のどの態様、実施形態または例にも適用することができると解釈される。
【０００８】
＜本開示の概要＞
第１の態様において、本発明は、線維芽細胞の細胞のフィーダー層を含む細胞支持体であって、前記線維芽細胞は、有毛皮膚組織から分離されていることを特徴とするものを提供する。
【０００９】
好ましくは、前記支持体は、さらに表皮細胞（epidermal cell）の培養物、例えばケラチノサイト細胞の培養物または表皮先駆体を含む。
【００１０】
好ましくは、有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞は、皮膚線維芽細胞である。
【００１１】
１実施形態において、有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞は、無毛組織から分離された線維芽細胞と比較して、ZIC1、LNX1、EN1、MAFB、HMCN1、LGR4、AGTR1、ITGA11、POSTN、ISLR、DSP、ITGA8、MY01D、KCNK2、CH25H、KCNJ15、CLIC2、DPT、TMEPAI、FOXD1、LGR5、SPON1、HAPLN1、THBS4、CYP26B1、WISP1およびIL7からなる群から選択される少なくとも１のマーカーの上昇した発現を有することを特徴とする。
【００１２】
好ましくは、有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞の細胞は、無毛組織から分離された線維芽細胞の細胞と比較して、ZIC1、LNX1、EN1、MAFB、HMCN1、LGR4、AGTR1、ITGA11、POSTN、ISLR、DSP、ITGA8、MY01D、KCNK2、CH25H、KCNJ15、CLIC2、DPT、TMEPAI、FOXD1、LGR5、SPON1、HAPLN1、THBS4、CYP26B1、WISP1およびIL7からなる群から選択される少なくとも５、１０、１５、２０または２５のマーカーの上昇した発現を有することを特徴とする。
【００１３】
１実施形態において、有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞の細胞は、無毛組織から分離された前記線維芽細胞の細胞と比較した場合、ＳＰＡＲＣおよびペリオスチンからなる群から選択されるタンパク質マーカーの上昇した発現を有することを特徴とする。
【００１４】
好ましくは、前記有毛皮膚は、活発に成長する毛包を生じる。より好ましくは、前記有毛組織は、頭皮組織、顔組織、陰部組織からなる群から選択される。１実施形態において、前記培養物の支持体は、さらにフィーダー層の支持体、例えばマトリックス、ディッシュ、フラスコまたはプレートを含む。好ましくは、前記マトリックスは、コラーゲンマトリックスである。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、１またはそれよりも多くの線維芽細胞の細胞であって、前記１またはそれよりも多くの線維芽細胞の細胞が、有毛皮膚組織から分離されたものと、少なくとも１の表皮細胞種を、一緒に共培養する表皮細胞培養方法を提供する。好ましくは、前記１またはそれよりも多くの線維芽細胞の細胞を、線維芽細胞のフィーダー層として提供する。
【００１６】
好ましくは、有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞の細胞は、皮膚線維芽細胞である。
【００１７】
１実施形態において、有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞の細胞は、無毛組織から分離された前記線維芽細胞の細胞と比較して、ZIC1、LNX1、EN1、MAFB、HMCN1、LGR4、AGTR1、ITGA11、POSTN、ISLR、DSP、ITGA8、MY01D、KCNK2、CH25H、KCNJ15、CLIC2、DPT、TMEPAI、FOXD1、LGR5、SPON1、HAPLN1、THBS4、CYP26B1、WISP1およびIL7からなる群から選択される少なくとも１のマーカーの上昇した発現を有することを特徴とする。
【００１８】
好ましくは、有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞の細胞は、無毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞の細胞と比較して、ZIC1、LNX1、EN1、MAFB、HMCN1、LGR4、AGTR1、ITGA11、POSTN、ISLR、DSP、ITGA8、MY01D、KCNK2、CH25H、KCNJ15、CLIC2、DPT、TMEPAI、FOXD1、LGR5、SPON1、HAPLN1、THBS4、CYP26B1、WISP1およびIL7からなる群から選択される少なくとも５，１０，１５，２０または２５のマーカーの上昇した発現を有することを特徴とする。
【００１９】
さらなる実施形態において、有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞の細胞は、無毛組織から分離された前記線維芽細胞の細胞と比較して、ＳＰＡＲＣおよびペリオスチンからなる群から選択されるタンパク質マーカーの上昇した発現を有することを特徴とする。
【００２０】
１実施形態において、前記共培養は、無血清培地中である。
【００２１】
１実施形態において、前記表皮細胞は、ケラチノサイト、表皮先駆細胞またはケラチノサイト先駆体である。好ましくは、前記表皮細胞は、ヒト表皮細胞である。
【００２２】
好ましくは、前記線維芽細胞の細胞は、ヒト線維芽細胞である。
【００２３】
好ましくは、有毛皮膚組織から分離された前記線維芽細胞の細胞は、皮膚線維芽細胞である。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、本発明による線維芽細胞のフィーダー層および１またはそれよりも多くの表皮細胞を含む共培養容器を提供する。
【００２５】
好ましくは、前記１またはそれよりも多くの表皮細胞は、ケラチノサイト、表皮先駆細胞またはケラチノサイト先駆細胞である。
【００２６】
１実施形態において、前記容器は、さらに無血清培地を含む。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、薬として使用するために有毛皮膚組織から分離された線維芽細胞の細胞を提供する。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、皮膚創傷を治癒する薬の製造における有毛皮膚組織から分離された線維芽細胞の細胞の使用を提供する。
【００２９】
１実施形態において、前記薬を、１またはそれよりも多くの表皮細胞投与用として調製する。好ましくは、前記１またはそれよりも多くの表皮細胞は、ケラチノサイトである。
【００３０】
１実施形態において、前記線維芽細胞の細胞は、マトリックス、例えばコラーゲンマトリックスと関係している。
【００３１】
１実施形態において、前記薬を、局所性投与用のために調製する。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、有毛皮膚組織から分離された１またはそれよりも多くの前記線維芽細胞の細胞を皮膚創傷に適用することを備える皮膚創傷の治癒方法を提供する。
【００３３】
１実施形態において、前記１またはそれよりも多くの線維芽細胞の細胞を、皮膚創傷の創傷床に適用する。
【００３４】
１実施形態において、方法は、さらに１またはそれよりも多くの表皮細胞を皮膚創傷または皮膚創傷の創傷床に適用することを備える。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、有毛皮膚組織から分離された１またはそれよりも多くの線維芽細胞の細胞および薬学的に許容可能なキャリアを含有する創傷治癒組成物を提供する。
【００３６】
１実施形態において、組成物は、さらに同時、別々または連続した投与のための１またはそれよりも多くの表皮細胞を含む。好ましくは、前記１またはそれよりも多くの表皮細胞は、ケラチノサイトである。
【００３７】
好ましくは、前記組成物を、局所性投与用のために調製する。
【００３８】
さらなる態様において、本発明は、本発明による薬を含有する創傷外傷用医薬材料材または本発明による組成物を提供する。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は、皮膚由来前駆体（ＳＫＰ）を得るために、有毛皮膚から分離された線維芽細胞の培養物を使用して提供し、前記線維芽細胞の培養物は、少なくとも１の経路を有する。
【００４０】
本発明の実施形態を添付の図を参照として、以下に詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】マイクロアレイ分析のためのＲＮＡ抽出および処理方法を詳しく述べる図である。
【図２】異なるヒト皮膚線維芽細胞の培養物からのサンプルの免疫組織化学およびウェスタン分析の結果は、有毛皮膚（ＤＦ）からの線維芽細胞が、毛包真皮乳頭（ＤＰ）および真皮シース（ＤＳ）細胞より低いレベルのα平滑筋アクチンを発現するが、無毛包皮、胸部および顔の皮膚からの線維芽細胞より高いレベルを発現することを示す図である。
【図３】ヒト表皮細胞（ケラチノサイト）の成長を２次元の培養における異なる支持ヒト皮膚線維芽細胞と関連させて示す図である。表皮細胞の相対的成長は、表皮ケラチノサイトを染色する赤色ローダミン染色の強度によって測定される。より一層高い表皮細胞の成長が、２の無毛部位、包皮および胸部からの皮膚線維芽細胞並びにマウス３Ｔ３細胞と比較して、支持有毛皮膚線維芽細胞で見出された。
【図４】表皮細胞（ケラチノサイト）の成長を異なる支持皮膚線維芽細胞と関連させて示したグラフ表示の図である。表皮細胞の相対的な成長は、ケラチノサイトを染色する赤色ローダミミン染料（分光光度計）の吸光度によって測定される。有毛皮膚（陰部）領域からの皮膚細胞の３つの複製サンプルは、無毛皮膚の３領域である胸部、包皮および（頭髪のない個々の）頭皮からの皮膚細胞より、表皮細胞を著しく高く支持する。マウス３Ｔ３細胞は、有毛皮膚の皮膚線維芽細胞より、表皮成長の支持が著しく低い。
【図５】表皮細胞（ケラチノサイト）の成長を異なる支持皮膚細胞と関連させて示すグラフ表示の図である。表皮細胞の相対的な成長は、ケラチノサイトを染色する赤色ローダミン染料の吸光度（分光光度計）によって測定される。有毛皮膚領域（有毛頭皮）からの皮膚細胞の３つの複製サンプルは、無毛皮膚の３領域である胸部、包皮および（頭髪のない個々の）頭皮からの皮膚細胞より、著しく高く表皮細胞を支持する。マウス３Ｔ３細胞も、有毛皮膚の皮膚線維芽細胞より、支持表皮細胞成長が著しく低い。
【図６】表皮細胞（ケラチノサイト）の成長を異なる支持皮膚線維芽細胞と関連させて示すグラフ表示である。表皮細胞の相対的な成長は、ケラチノサイトを染色する赤色ローダミン染料の吸光度によって（分光光度計で）測定される。無毛皮膚の３領域である胸部、包皮および（頭髪のない個々の）頭皮からの皮膚細胞より、有毛皮膚領域（あごひげ）からの皮膚細胞の３つの複製サンプルは、著しく高く表皮細胞を支持する。有毛皮膚の皮膚線維芽細胞より、マウス３Ｔ３細胞も支持表皮細胞成長が著しく低い。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明者等は、驚くべきことに、皮膚線維芽細胞の部分母集団、特に有毛皮膚から分離したものが、無毛皮膚からの線維芽細胞の細胞支持体特性と比較した場合、改良された細胞支持特性、特に表皮支持特性を有することを認識した。
【００４３】
この皮膚線維芽細胞の部分母集団を用いて、本発明は、体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での表皮培養および増殖の改良した方法を提供する。本発明は、部分母集団の皮膚線維芽細胞を用いた創傷治癒および再上皮形成の方法も提供する。
【００４４】
線維芽細胞は、結合組織の構造的完全性の維持に関与する。それは、細胞外マトリックスおよびコラーゲンの前躯体を分泌する。本発明の線維芽細胞の部分母集団を、有毛皮膚組織から分離する。好ましくは、前記有毛皮膚は、毛包、好ましくは活性化された毛包、例えば毛周期で活性化された毛包を含む組織である。より好ましくは、前記組織は、頭皮、あごひげ部位、首、腕、陰部（脇の下）領域から分離される。
【００４５】
皮膚から線維芽細胞を分離する方法は、従来技術において周知であり、本発明に使用される皮膚線維芽細胞の部分母集団は、利用可能な一般的な方法を用いて分離することができる。
【００４６】
生物学的マーカーは、有毛皮膚組織から分離された線維芽細胞を認識し、特性解析することを可能とする。特に、これら生物学的マーカーは、有毛皮膚組織から分離された線維芽細胞を無毛皮膚組織、例えば包皮、手のひらの皮膚、足底の皮膚および胸部から分離された線維芽細胞と識別するために使用することができる。
【００４７】
有毛皮膚組織から分離された線維芽細胞は、無毛皮膚、例えば包皮、手のひらの皮膚、足底の皮膚から分離された線維芽細胞を比較した場合、ZIC1、LNX1、EN1、MAFB、HMCN1、LGR4、AGTR1、ITGA11、POSTN、ISLR、DSP、ITGA8、MYO1D、KCNK2、CH25H、KCNJ15、CLIC2、DPT、TMEPAI、FOXD1、LGR5、SPON1、HAPLN1、THBS4、CYP26B1、WISP1およびIL7からなる群から選択される少なくとも１のポリペプチドの発現レベルの上昇または核酸分子、例えばZIC1、LNX1、EN1、MAFB、HMCN1、LGR4、AGTR1、ITGA11、POSTN、ISLR、DSP、ITGA8、MYO1 D、KCNK2、CH25H、KCNJ15、CLIC2、DPT、TMEPAI、FOXD1、LGR5、SPON1、HAPLN1、THBS4、CYP26B1、WISP1およびIL7からなる群から選択される少なくとも１のポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの発現レベルの上昇を示す。
【００４８】
好ましくは、有毛皮膚から分離された線維芽細胞は、無毛皮膚から分離された線維芽細胞と比較した場合、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４または２５の前記ポリペプチドまたは核酸マーカーの上昇した発現を示す。
【００４９】
尚、有毛皮膚から分離された線維芽細胞は、無毛皮膚、例えば包皮、手のひらの皮膚、足底の皮膚から分離された線維芽細胞と比較した場合、ＳＰＡＲＣ（分泌型酸性高システインタンパク質）およびペリオスチンからなる群から選択される少なくとも１の分泌されたタンパク質マーカーまたは核酸分子、例えばＳＰＡＲＣ若しくはペリオスチンコード化するｍＲＮＡのレベルの上昇も示す。好ましくは、有毛皮膚から分離された線維芽細胞は、無毛皮膚から分離された線維芽細胞と比較した場合、上昇したレベルの細胞外ＳＰＡＲＣおよび／またはペリオスチンのタンパク質発現、分泌または活性を示す。
【００５０】
ＳＰＡＲＣ（別名オステオネクチンまたはＢＭ４０）は、最初に骨で発見されたが（Termine et al., 1981 Cell. 26, 99-105）、その発現が最も強い基底膜の直下並びに真皮乳頭層、血管および腺状構造付近の皮膚を含む他の組織でも発見された（Hunzelmann Invest dermatol (1998) 1 10:122-126）。組織治療およびリモデリングにおけるＳＰＡＲＣの役割は、ＳＰＡＲＣの主な活性が、細胞ＥＣＭ相互作用を調節し、細胞周期の進行を遅らせ、増殖および血管形成を阻害し、数々の成長因子およびＥＣＭタンパク質の発現を制御することを含むことを記載したPhan et al 2006によって専門的に概説された。
【００５１】
好ましくは、有毛皮膚から分離された線維芽細胞は、無毛皮膚から分離された線維芽細胞と比較した場合、ZIC1、LNX1、EN1、MAFB、HMCN1、LGR4、AGTR1、ITGA11、POSTN、ISLR、DSP、ITGA8、MYO1D、KCNK2、CH25H、KCNJ15、CLIC2、DPT、TMEPAI、FOXD1、LGR5、SPON1、HAPLN1、THBS4、CYP26B1、WISP1およびIL7からなる群から選択される少なくとも１のポリペプチドまたは核酸分子、例えば前記ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの上昇した発現並びにＳＰＡＲＣおよびペリオスチンからなる群から選択される少なくとも１のポリペプチドまたは核酸分子、例えば前記ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの上昇した発現を示す。
【００５２】
さらにより好ましくは、有毛皮膚から分離された線維芽細胞は、無毛皮膚から分離された線維芽細胞と比較した場合、ZIC1、LNX1、EN1、MAFB、HMCN1、LGR4、AGTR1、ITGA11、POSTN、ISLR、DSP、ITGA8、MYO1D、KCNK2、CH25H、KCNJ15、CLIC2、DPT、TMEPAI、FOXD1、LGR5、SPON1、HAPLN1、THBS4、CYP26B1、WISP1およびIL7からなる群から選択されるそれぞれのポリペプチドの上昇した発現または核酸分子、例えば前記ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの上昇した発現並びにＳＰＡＲＣおよびペリオスチンからなる群から選択されるそれぞれのポリペプチド、若しくは、核酸分子、例えば前記ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの上昇した発現を示す。
【００５３】
本発明者等は、驚くべきことに、有毛皮膚組織から分離された線維芽細胞の細胞が、それらの多能性皮膚由来前駆体（ＳＫＰｓ）の形成能力によって示されるように、培養物中での連続した細胞継代後、幹細胞の潜在能力がありうることを確認した。有毛皮膚組織から分離された線維芽細胞の細胞は、無毛組織から分離された線維芽細胞の細胞と比較して、培養物中での連続した継代後、上昇した幹細胞の潜在能力を有することをさらに特徴とし、好ましくは、前記幹細胞の潜在能力は、前記線維芽細胞の多能性皮膚由来前駆体（ＳＫＰｓ）の形成能力によって示される。
【００５４】
本明細書に使用するように、「継代」とは、サブカルチャーの一連を指す。従って、細胞をサブカルチャーする場合、それらは継代されたことを指す。
【００５５】
線維芽細胞は、ヒト線維芽細胞であることが好ましい。
【００５６】
線維芽細胞は、従来技術に既知の方法を用いて有毛皮膚から分離してもよい。例えば、線維芽細胞は、外植培養、酵素分離、細胞ソーティングまたはそれらの組み合わせで、有毛皮膚から分離してもよい。
【００５７】
本発明による有毛皮膚から分離された線維芽細胞は、細胞成長、好ましくは表皮細胞の体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、例えば再生医療および細胞培養並びに生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、表皮創傷治療および皮膚再生の双方を有利に促進するために使用することができる。
【００５８】
本発明による線維芽細胞の部分母集団によって支持される細胞は、好ましくは表皮先駆細胞である。前記表皮先駆細胞は、分化した表皮細胞または表皮前駆細胞でもよい。表皮前駆細胞は、表皮潜在能力を有する多能性細胞、例えば表皮細胞に分化できる細胞を意味する。
【００５９】
好ましくは、本発明による表皮細胞は、ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞またはメルケル細胞から選択される。或いは、前記表皮細胞は、表皮先駆体、より好ましくはケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞またはメルケル細胞の潜在能力を有する細胞である。好ましくは、表皮細胞は、ケラチノサイト、より好ましくは表皮ケラチノサイトまたは角膜ケラチノサイトである。
【００６０】
好ましくは、表皮細胞は、哺乳類細胞であり、より好ましくはヒト表皮細胞である。
【００６１】
或いは、線維芽細胞の部分母集団によって支持される細胞は、胚性幹細胞、神経先駆細胞または血液前駆細胞である。
【００６２】
本明細書に使用するように、用語「培養物」および「細胞培養物」は、交互に用いられ、生物から採取された細胞が、制御された条件、好ましくは生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で成長された工程を指す。
【００６３】
１態様において、本発明による有毛皮膚から分離された線維芽細胞は、前記のように細胞または細胞培養を支持するフィーダー層として、好ましくは表皮細胞培養として使用される。線維芽細胞のフィーダー層は、培養支持体、例えばマトリックス、ディッシュ、ウェル、フラスコまたはプレートに提供することが好ましい。
【００６４】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも１の表皮細胞種と有毛皮膚組織から分離された１またはそれよりも多くの線維芽細胞の細胞と一緒に共培養することを備える表皮細胞培養の改良した手段を提供する。本発明者等は、有毛皮膚から分離した線維芽細胞が、無毛皮膚からの線維芽細胞に提供される因子であって、改良したケラチノサイト培養を有利に促進する因子とは異なった、成長性および分化用の因子を有するケラチノサイトを提供すること証明した。
【００６５】
本発明の細胞培養は、適切な細胞培養培地の存在下、実施することができる。適切な表皮およびケラチノサイト培養培地が従来技術において既知であり、線維芽細胞に関してはMinimal Essential Medium (Eagles or Dulbecco's)；ケラチノサイトに関してはPromo Cell’s Cryo-SFMからのDulbecco's MEM, Keratinocyte Basal Medium 2、Invitrogenからのserum-free cryo-medium, Keratinocyte-SFM, Keratinocyte nutrient MCDB 153 mediumまたはEpiLife（登録商標）Mediumを含む。１実施形態において、培養培地は、無血清培養培地が好ましい。
【００６６】
培養支持体および方法は、組織再生、例えば皮膚移植の調製に使用することができる。本明細書に記載の方法および製品による組織培養は、患者に移植することができ、創傷治癒および治療を開始する。
【００６７】
さらなる態様において、本発明は、有毛皮膚組織からの線維芽細胞の薬としての使用を提供する。尚、さらなる態様において、本発明は、皮膚創傷治癒用薬の製造における有毛皮膚組織から分離された線維芽細胞の細胞の使用を提供する。
【００６８】
好ましくは、線維芽細胞の細胞は、マトリックスと関係している。好ましくは、マトリックスは、生物学的適合性マトリックスである。より好ましくは、マトリックスは、ポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリアンハイドライド、タンパク質、多糖類、ポリホスファゼンまたはそれらの組み合わせから形成される。尚、より好ましくは、支持体は、コラーゲン、例えばコラーゲン−グルコサミノグリカン支持体から形成されるか、または、それらを含む。
【００６９】
さらなる態様において、本発明は、有毛皮膚組織から分離された１またはそれよりも多くの線維芽細胞の細胞を含有する創傷治癒組成物を提供する。好ましくは、線維芽細胞の細胞を、通常の生理的および薬学的に許容可能なキャリアと提供する。組成物は、無菌であり、線維芽細胞の治療効果のある量を、患者への投与に適切な量として含む。線維芽細胞は、前記のようにマトリックスと関係し得る。１実施形態において、組成物は、同時、別々または連続した投与のため、さらに１またはそれよりも多くの内皮細胞を含有する。好ましくは、前記１またはそれよりも多くの表皮細胞は、ケラチノサイトである。好ましくは、前記表皮細胞を、前記マトリックスに提供する。
【００７０】
本明細書に使用する「薬学的に許容可能なキャリア」の用語は、ヒトに投与するのに適した１またはそれよりも多くの互換性のある固体または液状の充てん剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。投与する場合、本発明の薬学的に許容可能な組成物は、薬学的に許容可能なように調製され、投与される。前記調製は、通常、薬学的に許容可能な濃度の塩、バッファー剤、防腐剤、互換性のあるキャリア、サイトカインおよび任意に他の治療薬、好ましくは創傷治癒、例えば成長因子、ペプチド、タンパク質分解阻害剤、細胞外気質成分、ステロイドおよびサイトカインを含む。
【００７１】
「キャリア」の用語は、活性成分が化合することによって、使用を容易にする有機または無機成分、天然または合成を意味する。「薬学的に許容可能な」の用語は、活性成分の生物活性の効果を妨げない毒性のない物質を意味する。「生理的に許容可能な」の用語は、生体系、例えば細胞、細胞培養物、組織または生物と互換性のある毒性のない物質を指す。本明細書に使用するように、薬学的に許容可能なキャリアは、従来のキャリア、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co, Easton, PA, 15th Edition (1975)に記載するものを含む。
【００７２】
本発明の組成物は、注射を含むあらゆる従来の経路によって投与することができる。投与は、例えば、局所的、腔内、皮下的または経皮的でもよい。組成物は、局所投与用に調製されることが好ましい。
【００７３】
本発明の組成物を有効量で投与する。「有効量」は、単独またはさらなる服用を伴う組成物量であって、望ましい反応を生じる。前記方法に使用した組成物は、好ましくは、無菌であり、患者への投与に適切な体重または容量単位あたりで、望ましい反応を生じる活性分の有効量を含む。反応は、例えば創傷治癒の速度または範囲に応じた組成物の生理的効果を測定することによって測定することができる。
【００７４】
さらなる態様において、本発明は、皮膚、皮膚創傷または皮膚創傷床に有毛から分離した線維芽細胞またはここに記載の組成物を適用することを備える皮膚または皮膚創傷の治療方法を提供する。方法は、皮膚再上皮形成に役立つ。「再上皮形成」の用語は、体内（皮膚を含む）または体外の創傷表皮の治療、置換、機能回復および最終的には再生に関する。
【００７５】
本発明による有毛皮膚から分離された線維芽細胞は、従って、生体、好ましくはヒトに適用するための薬の製造に使用することができる。好ましくは、本発明による有毛皮膚から分離された線維芽細胞を、創傷治療、創傷治癒または再上皮形成用の薬の製造に使用する。
【００７６】
本明細書に使用するように、創傷の用語は、創傷組織、好ましくは創傷皮膚に関してであって、皮膚または組織の機能を、例えば外力、ひどい健康状態、老化、日光の照射、熱若しくは化学反応の結果または内部生理学的工程による創傷の結果として妨害される。表皮が創傷した部位における創傷は、開放創として考えられる。創傷治癒は、組織の細胞層を、好ましくは再上皮形成または再構成することによって覆う、再生工程である。
【００７７】
１実施形態において、有毛皮膚から分離された線維芽細胞は、本明細書に記載された１またはそれよりも多くの表皮細胞と創傷に投与される。線維芽細胞および任意に１またはそれよりも多くの表皮細胞は、１またはそれよりも多くの他の創傷治癒剤、例えば成長因子、ペプチド、タンパク質分解阻害剤、細胞外マトリックス成分、ステロイド若しくはサイトカイン、酸素ドナーまたはビタミンと投与される。このような付加的創傷治癒剤は、別々、同時または連続して投与することができる。このような組み合わせを、薬製造にも使用できる。
【００７８】
１実施形態において、患者は有毛皮膚から分離された線維芽細胞および前記１またはそれよりも多くの表皮細胞を単一の薬として投与してもよい。或いは、有毛皮膚から分離された線維芽細胞および前記１またはそれよりも多くの表皮細胞を、別途投与してよい。
【００７９】
好ましくは、前記有毛皮膚から分離された線維芽細胞およびまたは前記１またはそれよりも多くの表皮細胞は、自己移植のものであり、即ち、前記細胞は、治療される個々に由来するか、または、組織培養物に添加される生物学的物質は、組織培養からの細胞のドナー由来である。或いは、細胞は、自己移植でなくてもよい。
【００８０】
さらなる態様において、本発明は、ここに記載の有毛組織から分離された線維芽細胞、組成物または薬を含有する創傷外傷用医薬材料材を提供する。ここに記載するように、創傷外傷用医薬材料材は、局所的に創傷に適用するための被覆材を指す。例えば、有毛組織から分離された少なくとも線維芽細胞、組成物または薬は、創傷に接触する物質、例えば織布または不織布地の固体シート中またはその上に分散することができるか、または、発泡体の層、例えばポリウレタン中に分散することができる。
【実施例】
【００８１】
＜生物学的マーカー＞
有毛皮膚から分離された皮膚線維芽細胞の「独特の」マーカーを見出すため、比較を真皮シースｖ「有毛」皮膚線維芽細胞ｖ新生の皮膚線維芽細胞で実施した。比較を３次元培養物中の「インテグラ（ｉｎｔｅｇｒａ）」で実施した。
【００８２】
以下の細胞種を比較した：真皮シース−雄−３株、有毛皮膚からの皮膚線維芽細胞−雄−３株、新生の皮膚線維芽細胞：−雄−３株。
【００８３】
個々の細胞種に関して約３００，０００細胞を、ＭＥＭおよび１０％ＦＢＳ中のインテグラパッチ上に播種した。３パッチを、それぞれの細胞種として播種した。細胞を３日間付着させ、成長させた。
【００８４】
３日後、細胞からのＲＮＡを従来の技術によって採取し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの完全なヒトゲノムアレイでハイブリッド形成した。全ＲＮＡは、最初に液体窒素を用いてサンプルを変性し、インテグラ中の細胞から分離された。ＲＮＡは、(RNeasy mini kit, Qiagen)を用いて分離された。ＲＮＡサンプルは、ハイブリッド形成のため、１サイクルのｃＤＮＡ合成キットを用いて調製され、製造業者の使用説明書に従ってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒト発現アレイに適用された。データは、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（登録商標）＊（Silicon Genetics、米国）を用いて分析された。
【００８５】
４４３遺伝子は、有毛皮膚線維芽細胞ｖ真皮シースで、＞２倍の差異（上昇または減少）を示す。１１３０遺伝子は、有毛皮膚線維芽細胞ｖ新生線維芽細胞で、＞２倍の差異を示す。
【００８６】
有毛皮膚から分離された線維芽細胞（「有毛線維芽細胞」）の特定の関心のある生物学的マーカーとして認識されるそれらの遺伝子を、以下の表１に列挙する。
【００８７】
【表１】
2013500738.tif 000003
2013500738.tif 000004
2013500738.tif 000005
2013500738.tif 000006
【００８８】
尚、皮膚細胞培養マイクロアレイにおけるペリオスチンの発現は、有毛線維芽細胞ｖｓ新生線維芽細胞で、６．４倍の上昇として示した。
【００８９】
さらに、生物学的マーカーを免疫標識によって認識した。細胞をカバースリップガラス上で４日間培養し、９５％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ：５％（ｖ／ｖ）酢酸を用いて、１５分間、−２０℃で固定した。その後、スライドをＰＢＳ（３×５分間）で洗浄し、３％（ｗｔ／ｖ）ＢＳＡでブロックし、それから１次抗体、例えばマウスモノクローナル抗αＳＭＡ１：２００（ｖ／ｖ）で１時間、室温でインキュベートした。その後、スライドをＰＢＳ（３×５分間）で洗浄し、２次抗体およびＤＡＰＩ、例えばアレクサフルオル  ヤギ抗マウス１：５００（ｖ／ｖ）で１時間、室温でインキュベートした。抗原結合（αＳＭＡ）を、ＦＩＴＣ入射青色光（図２に示すλｅｘ＝４９０ｎｍおよびλｅｍ＝５２３ｎｍ）の下、照射した。結果は、無毛部位からの皮膚線維芽細胞と比較して有毛皮膚から分離された皮膚線維芽細胞（ＤＦ有毛）が、より高いＡＳＭＡを示す。
【００９０】
＜ケラチノサイト支持体＞
有毛皮膚部から分離された皮膚線維芽細胞（有毛ＤＦ細胞）をケラチノサイト増殖の支持能力を詳細に調べるため、共培養アプローチを用いた。皮膚および表皮細胞の共培養をローダミンＢ（ケラチノサイトを特異的に染色するローダミンＢ）で染色し、溶出染色を５５０ｎｍで定量化した。
【００９１】
有毛皮膚から分離された皮膚線維芽細胞をフィーダー層としてヒトケラチノサイトに用いた場合、それらの性能は、従来のケラチノサイト培養「最高品質」方法（フィーダー層プラスＲ＆Ｇ培地としてネズミ３Ｔ３細胞を使用する）と同等であった。
【００９２】
＜有毛および無毛皮膚組織からの線維芽細胞の培養物の分離および確立＞
倫理的に承認されたガイドラインrom Durham University Hospital (Durham, UK), The Royal Victoria Infirmary (Newcastle upon Tyne, UK)およびThe James Cook Hospital (South Tees, UK)に従ってヒト皮膚組織を得た。皮膚線維芽培養物を、サイズ約３ｍｍ×３ｍｍの真皮乳頭層外植片から確立した。無毛（胸部、顔および腹部）および有毛（あごひげ、頭皮、腕および腹部）の皮膚組織からの外植片は、品質を落とす毛包皮膚細胞を確実に除くため立体切除顕微鏡の下、切除した。外植片を、１４日間、２０％ＦＢＳ（シグマ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（インビトロジェン）、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（シグマ）および２５０μｇ／ｍＬアンフォテリシンＢ（インビトロジェン）で補足したＭＥＭ中、培養した。確立された皮膚細胞培養物を前記同一であるが、ＦＢＳ含有量２０％から１０％（ｖ／ｖ）減少した培地中、培養した。
【００９３】
＜ヒトケラチノサイトの培養＞
ヒトケラチノサイトを、ヒトケラチノサイト成長サプルメント（ＨＫＧＳ）、１：１００ｖ／ｖ（インビトロジェン）で補足されたＥｐｉｌｉｆｅ（商標）（インビトロジェン）中培養し、実験の第３継代時に使用した。
【００９４】
＜ヒトケラチノサイトのローダミンＢ染色＞
表皮細胞成長を支持するＤＳ，ＤＰおよびＤＦの潜在能力を比較するため、個々の表皮細胞種をヒトケラチノサイトと共培養した（第３継代）。比較の目的のため、ＭＥＭまたはＧｒｅｅｎ’ｓ培地中（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬ表皮成長因子(EGF;R&D Systems,City,UK)、０．４μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（シグマ）、１０−１０ｍｏｌ／Ｌコレラ毒素(Source)、１．８×１０−４ｍｏｌ／Ｌアデニン(Source)、５μｇ／ｍＬインスリン（シグマ）、５μｇ／ｍＬトランスフェリン(Source)、２×１０−３ｍｏｌ／Ｌグルタミン（シグマ）、２×１  ０−７ｍｏｌ／Ｌトリヨードチロニン、０．６２５μｇ／ｍＬアンフォテリシンＢ（シグマ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（シグマ）で補足したＤＭＥＭおよびＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、比率３：１（ｖ／ｖ））、成長停止ネズミ３Ｔ３細胞（３Ｔ３細胞は寄贈された）を用いて、ケラチノサイトを培養した。
【００９５】
表皮ケラチノサイトは、ローダミンＢを特異的に染色し、染色範囲は、Castro-Munozledo(1997)に記載に従って定量化することができる。概して、皮膚細胞（３５ｍｍディッシュあたり２０，０００）を３．５時間、８μｇ／ｍＬマイトマイシンＣ（シグマ）とインキュベートし、ヒトケラチノサイト（３５ｍｍディッシュあたり１２０，０００）の添加前、ＰＢＳ（×３）で洗浄した。８日後、共培養物を２時間、３．７％（ｖ／ｖ）ホルマリン(BDH,city,UK)で固定し、蒸留水で洗い流し、１％（ｗ／ｖ）ローダミンＢ溶液（シグマ）で３０分間、室温でインキュベートした。染色したサンプルを０．２Ｎ  ＨＣｌで洗浄した後、３２℃で一晩、乾燥させた。ローダミンＢをケラチノサイトから０．２Ｎ  ＮａＯＨで３０分間、室温でインキュベートして溶出し、抽出された染料を５５０ｎｍでＳ２１００ダイオードアレイ分光光度計を用いて分析した（Scientific Laboratory Supplies, city, UK)）。
【００９６】
ケラチノサイトの付着および増殖をＤＦ、フィーダー細胞層を用いて観測し、ケラチノサイトのポジティブローダミンＢ染色によって示した（図３）。成長停止されたＤＳおよびＤＰ細胞の存在下培養されたケラチノサイトは、ＭＥＭ中、成長停止された線維芽細胞またはネズミ３Ｔ３細胞の存在下培養されたものより大きなコロニーを形成するまで８日間、観測された。
【００９７】
図４，５および６に示した結果は、有毛（ＤＦ、ＤＳ、ＤＰ）からの皮膚細胞が、無毛ＤＦおよび３Ｔ３細胞より優れた支持をケラチノサイトに提供することを示した。全体的に図４，５および６は、有毛および無毛部領域からのヒト皮膚線維芽細胞と、それらの表皮ケラチノサイトの成長の支持の一貫性のある差異を示す。
【００９８】
＜ＳＫＰ形成＞
ＤＦ細胞から初期継代数（２および３）および後期継代数（１１および１２）で、前記完全に新鮮な皮膚組織由来の細胞からＳＫＰを形成する方法を用いて、ヒトＤＦ  ＳＫＰＳを生じた（Biernaskie 2006）。概して、１ｍＬあたり２５，０００細胞を、ＳＫＰ増殖培地中（４０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２(R&D Systems)；２０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ（シグマ）；２％Ｂ２７（インビトロジェン）で補足した３：１の比率のＤＭＥＭ（シグマ）およびＦ１２ （インビトロジェン））、播種し、２１日間、Ｔ２５ベントフラスコで培養した（Nunc, Scientific Laboratory Supplies）。１．５メチセルロース（シグマ）のＳＫＰ増殖培地への添加は、ＳＫＰ形成性能に差異を示さなかった。
【００９９】
＜継代皮膚線維芽細胞の細胞からの一連のＳＫＰ形成＞
ＳＫＰｓ増殖培地中でインキュベートした低い継代数および高い継代数を有する培養ヒト皮膚線維芽細胞は、直径１２３．７μｍから１４７．６μｍの球を形成した。初期および後期継代の双方のＳＫＰｓに関して、本発明者等は、ＳＫＰｓ形成にかかる時間の差異を観察しなかった（第１線維芽細胞ＳＫＰｓを増殖培地中７から１１日目に確認できた）。変異体は、ラインの間に、明らかになるまで１８日間に亘る若干の線維芽細胞ＳＫＰｓのみで観察された。
【図１】
2013500738.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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