(57)【要約】  主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、Ｉ型糖尿病関連ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとを含む、単離された複合体であって、前記ＭＨＣクラスＩＩと、前記Ｉ型糖尿病関連ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体の天然型立体配座に特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む、高親和性実体の単離を可能にする構造的立体配座を有する、単離された複合体が提供される。また、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、Ｉ型糖尿病関連ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体と特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む、単離された高親和性実体であって、前記糖尿病関連ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの非存在下での前記ＭＨＣクラスＩＩには結合せず、かつ、前記ＭＨＣクラスＩＩの非存在下での前記糖尿病関連ＧＡＤ自己抗原性ペプチドには結合しない、単離された高親和性実体、並びにこれらを診断および治療目的のために使用する方法およびキットが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）自己抗原性ペプチドとを含む、単離された複合体であって、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドが、配列番号１４によって示されるコアアミノ酸配列（ＧＡＤ５５６〜５６５、ＦＦＲＭＶＩＳＮＰＡ）を含み、かつ、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドが前記ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖に共有結合により結合させられる、単離された複合体。
【請求項２】
前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドはそのＣ末端において前記ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖の細胞外ドメインのＮ末端に共有結合により結合される、請求項１に記載の単離された複合体。
【請求項３】
前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドは前記ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖の細胞外ドメインのアミノ酸１〜６の間に共有結合により埋め込まれる、請求項１に記載の単離された複合体。
【請求項４】
前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドは前記ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖の成熟型ポリペプチドの３番目のアミノ酸と４番目のアミノ酸との間において前記ベータ鎖に共有結合により結合される、請求項１に記載の単離された複合体。
【請求項５】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）自己抗原性ペプチドとから構成される複合体と特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む、単離された抗体であって、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの非存在下での前記ＭＨＣクラスＩＩには結合せず、かつ、前記ＭＨＣクラスＩＩの非存在下での前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドには結合しない、単離された抗体。
【請求項６】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）自己抗原性ペプチドとから構成される複合体と特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む、単離された高親和性実体であって、単離された抗体は前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの非存在下での前記ＭＨＣクラスＩＩには結合せず、かつ、単離された高親和性実体は前記ＭＨＣクラスＩＩの非存在下での前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドには結合しない、単離された高親和性実体。
【請求項７】
前記抗原結合ドメインは、前記ＭＨＣクラスＩＩと、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体の天然型立体配座に特異的に結合することができる、請求項５に記載の単離された抗体又は請求項６に記載の高親和性実体。
【請求項８】
請求項１，２，３又は４に記載の複合体によって単離可能である、抗原結合ドメインを含む単離された高親和性実体。
【請求項９】
請求項１，２，３又は４に記載の単離された複合体に特異的に結合することができる、抗原結合ドメインを含む単離された高親和性実体。
【請求項１０】
前記抗原結合ドメインは、前記ＭＨＣクラスＩＩと、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体の天然型立体配座に特異的に結合することができる、請求項５に記載の単離された抗体又は請求項６，８もしくは９に記載の単離された高親和性実体。
【請求項１１】
前記抗原結合ドメインはさらに、請求項１，２，３又は４に記載の単離された複合体に特異的に結合することができる、請求項１０に記載の単離された抗体又は高親和性実体。
【請求項１２】
配列番号４３〜配列番号４８および配列番号３７〜配列番号４２によって示される相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｇ３Ｈ８の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）、または、配列番号５５〜配列番号６０および配列番号４９〜配列番号５４によって示される相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｇ１Ｈ１２の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、単離された抗体。
【請求項１３】
配列番号４３〜配列番号４８および配列番号３７〜配列番号４２によって示される相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｇ３Ｈ８の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）、または、配列番号５５〜配列番号６０および配列番号４９〜配列番号５４によって示される相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｇ１Ｈ１２の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、単離された高親和性実体。
【請求項１４】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）自己抗原性ペプチドとから構成される複合体に特異的に結合する高親和性実体を単離する方法であって、
（ａ）複数の高親和性実体を含むライブラリーを、請求項１，２，３又は４に記載の単離された複合体によりスクリーニングすること、および
（ｂ）請求項１，２，３又は４に記載の単離された複合体に特異的に結合し、かつ、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの非存在下での前記ＭＨＣクラスＩＩ、または、前記ＭＨＣクラスＩＩの非存在下での前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドには結合しない少なくとも１つの高親和性実体を単離し、
それにより、前記ＭＨＣクラスＩＩと前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとの前記複合体に特異的に結合する前記高親和性実体を単離すること
を含む方法。
【請求項１５】
抗体はさらに、ＭＨＣクラスＩＩとＧＡＤ自己抗原性ペプチドとの複合体の天然型立体配座に特異的に結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドはそのＣ末端にリンカーペプチドが配置される、請求項１，２，３又は４に記載の単離された複合体。
【請求項１７】
ＧＡＤ自己抗原性ペプチドは前記ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖の細胞外ドメインに翻訳融合される、請求項１，２，３又は４に記載の単離された複合体。
【請求項１８】
前記ＭＨＣクラスＩＩの前記ベータ鎖は、真核生物細胞における発現のとき、前記ＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖に含まれる結合対の第２のメンバーに結合する前記結合対の第１のメンバーを含み、ただし、前記ベータ鎖および前記アルファ鎖により、前記ＭＨＣクラスＩＩが形成される、請求項２，３，４，１６又は１７に記載の単離された複合体。
【請求項１９】
前記ＭＨＣクラスＩＩと、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体の天然型立体配座に特異的に結合することができる、抗原結合ドメインを含む抗体の単離を可能にする構造的立体配座を有する、請求項１，２，３，４，１６又は１７に記載の単離された複合体。
【請求項２０】
前記天然型立体配座は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示されるときの、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドと前記ＭＨＣクラスＩＩとの前記複合体の構造的立体配座を含む、請求項１９に記載の単離された複合体、請求項７もしくは１０に記載の単離された抗体もしくは高親和性実体、又は請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＧＡＤ自己抗原は最大でも３０個のアミノ酸を含む、請求項１，２，３，４，１６，１７又は１８に記載の単離された複合体。
【請求項２２】
前記ＧＡＤ自己抗原は配列番号２２によって示される（ＮＦＦＲＭＶＩＳＮＰＡＡＴ、ＧＡＤ５５５〜５６７）、請求項１，２，３，４，１６，１７又は１８に記載の単離された複合体。
【請求項２３】
前記ＭＨＣクラスＩＩの前記ベータ鎖は、真核生物細胞における発現のとき、前記ＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖に含まれる結合対の第２のメンバーに結合する前記結合対の第１のメンバーを含み、ただし、前記ベータ鎖および前記アルファ鎖により、前記ＭＨＣクラスＩＩが形成される、請求項１，２，３，４及び１８のいずれかに記載の単離された複合体。
【請求項２４】
前記ＭＨＣクラスＩＩは、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される、請求項１〜４及び１６〜２３のいずれかに記載の単離された複合体。
【請求項２５】
前記ＭＨＣクラスＩＩの前記ベータ鎖はＤＲ−Ｂ１＊０４０１である、請求項１〜４及び１６〜２３のいずれかに記載の単離された複合体。
【請求項２６】
前記ＭＨＣクラスＩＩの前記アルファ鎖はＤＲ−Ａ１＊０１０１である、請求項１〜４及び１６〜２３のいずれかに記載の単離された複合体。
【請求項２７】
前記抗原結合ドメインは、配列番号４３〜配列番号４８および配列番号３７〜配列番号４２によって示される相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｇ３Ｈ８の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）、または、配列番号５５〜配列番号６０および配列番号４９〜配列番号５４によって示される相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｇ１Ｈ１２の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、請求項５〜７及び１０〜１１のいずれかに記載の単離された抗体又は請求項７〜９及び１１のいずれかに記載の高親和性実体。
【請求項２８】
請求項５〜７及び１０〜１２のいずれかに記載の単離された抗体、又は請求項７，９，１１及び１３のいずれかに記載の高親和性実体を含む分子であって、治療成分にコンジュゲートされる分子。
【請求項２９】
請求項５〜７及び１０〜１２のいずれかに記載の単離された抗体、又は請求項７〜９，１１及び１３のいずれかに記載の高親和性実体を含む分子であって、検出可能成分にコンジュゲートされる分子。
【請求項３０】
請求項５〜７及び１０〜１２のいずれかに記載の抗体の多価形態または抗体フラグメントの多価形態を含む、単離された抗体。
【請求項３１】
前記多価形態はＩｇＧ抗体である、請求項３０に記載の単離された抗体。
【請求項３２】
有効成分として、請求項５〜７及び１０〜１２のいずれかに記載の単離された抗体、請求項７，９，１１及び１３のいずれかに記載の高親和性実体、又は請求項２８もしくは２９に記載の分子を含み、かつ、医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項３３】
グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）自己抗原性ペプチドの細胞における提示を検出する方法であって、前記細胞を、免疫複合体の形成を許す条件のもと、請求項５〜７及び１０〜１２のいずれかに記載の抗体、請求項７〜９，１１及び１３のいずれかに記載の高親和性実体、又は請求項２８もしくは２９に記載の分子と接触させることを含み、ただし、前記免疫複合体の所定の閾値を超える存在またはレベルが前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの前記細胞における提示を示している方法。
【請求項３４】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を対象において診断する方法であって、前記対象の細胞を、免疫複合体の形成を許す条件のもと、請求項５〜７及び１０〜１２のいずれかに記載の抗体、請求項７〜９，１１及び１３のいずれかに記載の高親和性実体、又は請求項２８もしくは２９に記載の分子と接触させることを含み、ただし、前記免疫複合体の所定の閾値を超える前記細胞の内部または表面での存在またはレベルが前記対象における前記１型糖尿病を示している方法。
【請求項３５】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を処置する方法であって、その必要性のある対象に、治療効果的な量の請求項５〜７及び１０〜１２のいずれかに記載の抗体、請求項７〜９，１１及び１３のいずれかに記載の高親和性実体、又は請求項２８もしくは２９に記載の分子、又は請求項３２に記載の医薬組成物を投与し、それにより、前記１型糖尿病を処置する方法。
【請求項３６】
前記抗体は、前記ＭＨＣクラスＩＩと、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとを含む複合体の抗原提示細胞における提示を阻止することができる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体は、前記ＭＨＣクラスＩＩと、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとを含む複合体を呈示する抗原提示細胞を殺傷することができる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとを含む複合体の存在および／またはレベルを検出するためのキットであって、請求項５〜７及び１０〜１２のいずれかに記載の抗体、請求項７〜９，１１及び１３のいずれかに記載の高親和性実体、又は請求項２８もしくは２９に記載の分子を含むキット。
【請求項３９】
１型糖尿病を診断する際に使用される説明書をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記抗体は前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの非存在下での前記ＭＨＣクラスＩＩには結合せず、かつ、前記抗体は前記ＭＨＣクラスＩＩの非存在下での前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドには結合しない、請求項１９に記載の単離された複合体。
【請求項４１】
単離された複合体は、複合体に結合した異種の免疫グロブリンを含まない、請求項１〜４，１６〜２３及び４０のいずれかに記載の単離された複合体。
【請求項４２】
ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖の細胞外ドメインをコードする第１の核酸配列と、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）自己抗原性ペプチドをコードする第２の核酸配列とを含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記第２の核酸配列が前記第１の核酸配列の上流に翻訳融合されるか、または、前記細胞外ドメインのアミノ酸１〜６をコードする核酸配列の間に翻訳融合される、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４３】
前記第２の核酸配列の下流に翻訳融合される、リンカーペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項４２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４４】
単離されたポリヌクレオチドはさらに、真核生物細胞における発現のとき、結合対の第２のメンバーに結合する前記結合対の第１のメンバーをコードする第３の核酸配列を含む、請求項４２又は４３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４５】
（ｉ）請求項４４に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む第１のポリヌクレオチド；および
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖をコードする第４の核酸配列を含む第２のポリヌクレオチド
を含む核酸システム。
【請求項４６】
前記第２のポリヌクレオチドはさらに、前記結合対の前記第２のメンバーをコードする第５の核酸構築物を含む、請求項４５に記載の核酸システム。
【請求項４７】
高親和性実体は、抗体、抗体フラグメント、抗体を呈示するファージ、ペプチド体、抗体を呈示する細菌、抗体を呈示する酵母、および、抗体を呈示するリボソームからなる群から選択される、請求項６〜１１，１３，２０及び２７のいずれかに記載の高親和性実体、請求項１４及び３３〜３５のいずれかに記載の方法、請求項３２に記載の医薬組成物、請求項２８もしくは２９に記載の分子、又は請求項３８に記載のキット。
【請求項４８】
高親和性実体は抗体または抗体フラグメントである、請求項６〜１１，１３，２０及び２７のいずれかに記載の高親和性実体、請求項１４及び３３〜３５のいずれかに記載の方法、請求項３２に記載の医薬組成物、請求項２８もしくは２９に記載の分子、又は請求項３８に記載のキット。
【請求項４９】
請求項１〜４及び１６〜２３のいずれかに記載の単離された複合体と、前記複合体にコンジュゲートされる機能的成分とを含む組成物。
【請求項５０】
請求項４９に記載の組成物と、治療的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項５１】
前記機能的成分が細胞表面マーカに特異的な抗体またはフラグメントを含む、請求項４９又は５０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩとグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）自己抗原性ペプチドとの単離された複合体、この複合体に特異的に結合する単離された高親和性実体（例えば、抗体など）、ならびに、限定ではないが、より具体的には、Ｉ型糖尿病を診断および処置するためのそれらの使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
様々な主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子が専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞など）において発現される。それぞれのＭＨＣクラスＩＩ分子が、２つの相同的サブユニットから、すなわち、アルファ鎖（α１ドメインおよびα２ドメインを有する）およびベータ鎖（β１ドメインおよびβ２ドメインを有する）から構成されるヘテロダイマーである。ペプチドが細胞外タンパク質に由来する場合、様々なペプチドがエンドサイトーシスを介して細胞内に入り、リソソームにおいて消化され、さらに、膜上での提示のためにＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。
【０００３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原特異的な活性化または調節は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）がＡＰＣの表面においてＭＨＣ  ＩＩ／ペプチドの複合体とともに共結合することが重要な役割を果たす多段階プロセスである。
【０００４】
専門のＡＰＣによって提示される結合した自己のペプチドを有するＭＨＣクラスＩＩ分子が、自己免疫疾患（例えば、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）など）に関与する特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化することにおいて重要な役割を果たしている。
【０００５】
Ｔ１Ｄ（これは若年性糖尿病としてもまた知られている）が、膵臓のベータ膵島細胞の自己免疫性破壊により、インスリンホルモンの産生が妨げられるときに生じる。このことは、グルコース代謝を調節することができないことを引き起こし、その結果、危険なほどに上昇した血中グルコース濃度が生じる。胸腺由来リンパ球（Ｔ細胞）が１型糖尿病の発症および進行に非常に大きく関与することが一般に受け入れられており、しかし、この破壊的プロセスを開始させ、また、促進させる抗原は依然として、特徴づけが不十分なままである。だが、いくつかの候補が検討されている（例えば、インスリン、インスリン誘導体、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連ペプチド（ＩＧＲＰ）、カルボキシペプチダーゼＨ、インスリノーマ関連抗原（ＩＡ−２）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、カルボキシペプチダーゼＥおよび熱ショックタンパク質６０など）。
【０００６】
Ｔ１Ｄに対する感受性に影響する遺伝的要因には、染色体６ｐ２１上のＭＨＣクラスＩＩ領域に位置し、かつ、膵臓のベータ細胞が不適切な抗原をＴ細胞に呈示する１型糖尿病に特徴的な組織適合性障害に関わっていることが考えられるインスリン依存性糖尿病１（ＩＤＤＭ１）遺伝子（ＧｅｎｅＩＤ  ７９２４）が含まれる。連鎖分析により、９６％の糖尿病患者が、非糖尿病コントロールと比較した場合、糖尿病患者におけるＨＬＡ−ＤＲ３／ＤＲ４ヘテロ接合性の過剰提示を含めて、ＨＬＡ−ＤＲ３および／またはＨＬＡ−ＤＲ４を発現することが示される。これらの対立因子は、ＩＤＤＭに対する感受性を与えるＨＬＡ−ＤＱ対立因子に強く連鎖している。１型糖尿病に対する感受性に影響するかもしれない他の非遺伝的な要因には、食事が含まれる。これは、食事が、腸内細菌叢、腸管の透過性および腸における免疫機能に影響を与えるからである。
【０００７】
哺乳動物におけるグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）酵素は、ＧＡＤ（６５ｋＤａ）（ＧＡＤ２；ＧｅｎｅＩＤ  ２５７２）およびＧＡＤ（６７ｋＤａ）（ＧＡＤ１；ＧｅｎｅＩＤ  ２５７１）の２つのイソ型で存在する。両方のイソ型が脳において発現するが、ＧＡＤ（６５ｋＤａ）はまた、膵臓において発現する。膵島自己抗原としてのＧＡＤの重要性が、この分子に対する患者血清中の自己抗体の頻度が高いために、最初に強調された。その後の研究により、データの大きな蓄積がもたらされた。これらのデータは、ＧＡＤ（６５ｋＤａ）に対する優勢なＣＤ４＋Ｔ細胞応答が、Ｔ１Ｄにおける細胞の自己免疫についての関連マーカーであるという考えを裏付けている（Ｎｅｐｏｍ  ＧＴ、２００３、ＧＡＤとの会話、Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ、２０：１９５〜８）。
【０００８】
ＨＬＡ−ＤＲ４遺伝子のＴ１Ｄに対する大きい関係に基づいて、多くのエピトープ特定研究が行われ、ＤＲ４分子によって提示される限られた数のＧＡＤペプチドが明らかにされた（Ｎｅｐｏｍ  Ｇ．Ｔ．他、２００１）。ＤＲ４／ＧＡＤペプチドに対するヒトのＣＤ４＋Ｔ細胞応答がＴ１Ｄ患者の間およびコントロールの間での両方で得られた（Ｍａｓｅｗｉｃｚ，Ｓ．Ａ．他、２００２；Ｂａｃｈ，Ｊ．Ｍ．他、１９９７；Ｏｕ，Ｄ．他、１９９９；Ｒｏｅｐ，Ｂ．Ｏ．他、１９９９；Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｔ．他、１９９６；Ｒｈａｒｂａｏｕｉ他、１９９９）。このことは、自己反応性の潜在的可能性が多くの個体において存在することを示唆する。
【０００９】
ＨＬＡ−ＤＲ４の状況におけるＧＡＤ５５５〜５６７ペプチドは、１型糖尿病患者およびＤＲ４０１遺伝子組換えマウスにおいて、効率的にプロセシングされた免疫優性エピトープであることが示されている（Ｒｅｉｊｏｎｅｎ，Ｈ．他、２００２；Ｐａｔｅｌ，Ｓ．Ｄ．他、１９９７）。自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞のＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７四量体検出がＴ１Ｄ被験者および危険性のある被験者の末梢血において認められたが、健康なコントロールにおいては認められなかった（Ｏｌｉｎｇ，Ｖ．他、２００５）。
【００１０】
追加の背景技術は、米国特許出願第２００２０１１４８１６号（ＥＮＤＬ，ＪＯＳＥＦ他）；米国特許出願第２００９０１５５２９２号；米国特許出願第２００３０１６６２７７号；およびＫｒｏｇｓｇａａｒｄ  Ｍ．他，２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐａｇｅｓ  １３９５−１４１２を含む。
【発明の概要】
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）自己抗原性ペプチドとを含む、単離された複合体であって、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドが、配列番号１４によって示されるコアアミノ酸配列（ＧＡＤ５５６〜５６５、ＦＦＲＭＶＩＳＮＰＡ）を含み、かつ、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドが前記ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖に共有結合により結合させられる、単離された複合体が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）自己抗原性ペプチドとから構成される複合体と特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む、単離された抗体であって、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの非存在下での前記ＭＨＣクラスＩＩには結合せず、かつ、前記ＭＨＣクラスＩＩの非存在下での前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドには結合しない、単離された抗体が提供される。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、配列番号３７〜配列番号３９および配列番号４３〜配列番号４５によって示される相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｇ３Ｈ８の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）、または、配列番号４９〜配列番号５１および配列番号５５〜配列番号５７によって示される相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｇ１Ｈ１２の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、単離された抗体が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）自己抗原性ペプチドとから構成される複合体と特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む、単離された高親和性実体が提供され、ただし、この場合、単離された高親和性実体は前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの非存在下での前記ＭＨＣクラスＩＩには結合せず、かつ、単離された高親和性実体は前記ＭＨＣクラスＩＩの非存在下での前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドには結合しない。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、本発明のいくつかの実施形態の複合体によって単離可能である、抗原結合ドメインを含む単離された高親和性実体が提供される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、本発明のいくつかの実施形態の複合体によって単離可能である、抗原結合ドメインを含む単離された高親和性実体が提供される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、本発明のいくつかの実施形態の単離された複合体に特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む、単離された高親和性実体が提供される。配列番号３７〜配列番号３９および配列番号４３〜配列番号４５によって示される相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｇ３Ｈ８の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）、または、配列番号４９〜配列番号５１および配列番号５５〜配列番号５７によって示される相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｇ１Ｈ１２の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、単離された高親和性実体が提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）自己抗原性ペプチドとから構成される複合体に特異的に結合する高親和性実体を単離する方法であって、
（ａ）複数の高親和性実体を含むライブラリーを単離された複合体によりスクリーニングすること、および
（ｂ）本発明のいくつかの実施形態の単離された複合体に特異的に結合し、かつ、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの非存在下での前記ＭＨＣクラスＩＩ、または、前記ＭＨＣクラスＩＩの非存在下での前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドには結合しない少なくとも１つの高親和性実体を単離し、
それにより、前記ＭＨＣクラスＩＩと前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとの前記複合体に特異的に結合する前記高親和性実体を単離すること
を含む方法が提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、本発明のいくつかの実施形態のいずれかの単離された抗体、または、本発明のいくつかの実施形態のいずれかの高親和性実体を含む分子であって、検出可能成分にコンジュゲートされる分子が提供される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の抗体の多価形態または抗体フラグメントの多価形態を含む、単離された抗体が提供される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、本発明のいくつかの実施形態のいずれかの単離された抗体、または、本発明のいくつかの実施形態のいずれかの高親和性実体を含む分子であって、治療成分にコンジュゲートされる分子が提供される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、有効成分として、本発明のいくつかの実施形態の単離された抗体、本発明のいくつかの実施形態の高親和性実体、または、本発明のいくつかの実施形態の分子を含み、かつ、医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物が提供される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）自己抗原性ペプチドの細胞における提示を検出する方法であって、前記細胞を、免疫複合体の形成を許す条件のもと、本発明のいくつかの実施形態のいずれかの抗体、本発明のいくつかの実施形態の高親和性実体、または、本発明のいくつかの実施形態の分子と接触させることを含み、ただし、前記免疫複合体の所定の閾値を超える存在またはレベルが前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの前記細胞における提示を示している方法が提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を対象において診断する方法であって、前記対象の細胞を、免疫複合体の形成を許す条件のもと、本発明のいくつかの実施形態の抗体、本発明のいくつかの実施形態の高親和性実体、または、本発明のいくつかの実施形態の分子と接触させることを含み、ただし、前記免疫複合体の所定の閾値を超える前記細胞の内部または表面での存在またはレベルが前記対象における前記１型糖尿病を示している方法が提供される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を処置する方法であって、その必要性のある対象に、治療効果的な量の本発明のいくつかの実施形態の抗体、本発明のいくつかの実施形態の高親和性実体、または、本発明のいくつかの実施形態の分子、あるいは、本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物を投与し、それにより、前記１型糖尿病を処置する方法が提供される。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとを含む複合体の存在および／またはレベルを検出するためのキットであって、本発明のいくつかの実施形態の抗体、本発明のいくつかの実施形態の高親和性実体、または、本発明のいくつかの実施形態の分子を含むキットが提供される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖の細胞外ドメインをコードする第１の核酸配列と、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）自己抗原性ペプチドをコードする第２の核酸配列とを含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記第２の核酸配列が前記第１の核酸配列の上流に翻訳融合されるか、または、前記細胞外ドメインのアミノ酸１〜６をコードする核酸配列の間に翻訳融合される、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、
（ｉ）本発明のいくつかの実施形態の単離されたポリヌクレオチドを含む第１のポリヌクレオチド；および
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖をコードする第４の核酸配列を含む第２のポリヌクレオチド
を含む核酸システムが提供される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、本発明のいくつかの実施形態の単離された複合体と、前記複合体にコンジュゲートされる機能的成分とを含む組成物が提供される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、本発明のいくつかの実施形態の組成物と、治療的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物が提供される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドはそのＣ末端においてＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖の細胞外ドメインのＮ末端に共有結合により結合する。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドはＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖の細胞外ドメインのアミノ酸１〜６の間に共有結合により埋め込まれる。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドはＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖の成熟型ポリペプチドの３番目のアミノ酸と４番目のアミノ酸との間においてベータ鎖に共有結合により結合させられる。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原結合ドメインは、ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体の天然型立体配座に特異的に結合することができる。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原結合ドメインは、ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体の天然型立体配座に特異的に結合することができる。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原結合ドメインはさらに、本発明のいくつかの実施形態の単離された複合体に特異的に結合することができる。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体はさらに、ＭＨＣクラスＩＩとＧＡＤ自己抗原性ペプチドとの複合体の天然型立体配座に特異的に結合する。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドはそのＣ末端にリンカーペプチドが配置される。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドは細胞外ドメインに翻訳融合される。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖は、真核生物細胞における発現のとき、ＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖に含まれる結合対の第２のメンバーに結合する結合対の第１のメンバーを含み、ただし、ベータ鎖およびアルファ鎖により、ＭＨＣクラスＩＩが形成される。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離された複合体は、ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体の天然型立体配座に特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む抗体の単離を可能にする構造的立体配座を有する。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、天然型立体配座は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示されるときの、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとＭＨＣクラスＩＩとの複合体の構造的立体配座を含む。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原は最大でも３０個のアミノ酸を含む。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原は配列番号２２によって示される（ＮＦＦＲＭＶＩＳＮＰＡＡＴ、ＧＡＤ５５５〜５６７）。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖は、真核生物細胞における発現のとき、ＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖に含まれる結合対の第２のメンバーに結合する結合対の第１のメンバーを含み、ただし、ベータ鎖およびアルファ鎖により、ＭＨＣクラスＩＩが形成される。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＨＣクラスＩＩは、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖はＤＲ−Ｂ１＊０４０１である。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖はＤＲ−Ａ１＊０１０１である。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原結合ドメインは、配列番号３７〜配列番号３９および配列番号４３〜配列番号４５によって示される相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｇ３Ｈ８の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）、または、配列番号４９〜配列番号５１および配列番号５５〜配列番号５７によって示される相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｇ１Ｈ１２の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、多価形態はＩｇＧ抗体である。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体は、ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとを含む複合体の抗原提示細胞における提示を阻止することができる。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体は、ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとを含む複合体を呈示する抗原提示細胞を殺傷することができる。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、キットはさらに、１型糖尿病を診断する際に使用される説明書を含む。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体はＧＡＤ自己抗原性ペプチドの非存在下でのＭＨＣクラスＩＩには結合せず、かつ、抗体はＭＨＣクラスＩＩの非存在下でのＧＡＤ自己抗原性ペプチドには結合しない。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離された複合体は、複合体に結合した異種の免疫グロブリンを含まない。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドはさらに、第２の核酸配列の下流に翻訳融合される、リンカーペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドはさらに、真核生物細胞における発現のとき、結合対の第２のメンバーに結合する結合対の第１のメンバーをコードする第３の核酸配列を含む。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第２のポリヌクレオチドはさらに、結合対の第２のメンバーをコードする第５の核酸構築物を含む。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、高親和性実体は、抗体、抗体フラグメント、抗体を呈示するファージ、ペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、抗体を呈示する細菌、抗体を呈示する酵母、および、抗体を呈示するリボソームからなる群から選択される。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、高親和性実体は抗体または抗体フラグメントである。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、機能的成分は、細胞表面マーカーに特異的な抗体またはフラグメントを含む。
【００６２】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００６３】
本発明の実施形態の方法および／またはシステムを実行することは、選択されたタスクを、手動操作で、自動的にまたはそれらを組み合わせて実行または完了することを含んでいる。さらに、本発明の装置、方法および／またはシステムの実施形態の実際の機器や装置によって、いくつもの選択されたステップを、ハードウェア、ソフトウェア、またはファームウェア、あるいはオペレーティングシステムを用いるそれらの組合せによって実行できる。
【００６４】
例えば、本発明の実施形態による選択されたタスクを実行するためのハードウェアは、チップまたは回路として実施されることができる。ソフトウェアとして、本発明の実施形態により選択されたタスクは、コンピュータが適切なオペレーティングシステムを使って実行する複数のソフトウェアの命令のようなソフトウェアとして実施されることができる。本発明の例示的な実施形態において、本明細書に記載される方法および／またはシステムの例示的な実施形態による１つ以上のタスクは、データプロセッサ、例えば複数の命令を実行する計算プラットフォームで実行される。任意選択的に、データプロセッサは、命令および／またはデータを格納するための揮発性メモリ、および／または、命令および／またはデータを格納するための不揮発性記憶装置（例えば、磁気ハードディスク、および／または取り外し可能な記録媒体）を含む。任意選択的に、ネットワーク接続もさらに提供される。ディスプレイおよび／またはユーザ入力装置（例えば、キーボードまたはマウス）も、任意選択的にさらに提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００６６】
【図１Ａ−１Ｄ】図１Ａ−１Ｄは、組換えＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７複合体の産生を示す。図１Ａ−Ｓ２細胞における産生のためのＤＲ−Ａ構築物およびＤＲ−Ｂ構築物の概略図。図１Ｂ〜図１Ｃ−精製されたＤＲ４／ＧＡＤ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＤＲ４複合体が高度に精製され、ＳＤＳに安定なヘテロダイマーを形成する。サンプルの煮沸により、ＤＲ−Ａ鎖およびＤＲ−Ｂ鎖が解離する（図１Ｂ；「Ｂ」−煮沸、「ＮＢ」−非煮沸）。高いビオチン化レベルが、精製されたＤＲ４−ＧＡＤ複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の前に、増大する濃度のストレプトアビジンとインキュベーションすることによって確認された（図１Ｃ）。すべての検出可能なＤＲ−Ａ鎖がビオチン化され、したがって、ストレプトアビジンに結合した。図１Ｄ−ＤＲ４／ＧＡＤ複合体が、正しい天然型立体配座で折り畳まれる。希釈濃度の抗ＤＲ立体配座感受性ｍＡｂ（Ｌ２４３）および抗ＤＲ  ｍＡｂのＴＵ３９を用いる固定化ＤＲ４／ＧＡＤ−５５５〜５６７複合体のＥＬＩＳＡ結合アッセイ。
【００６７】
【図２Ａ−２Ｃ】図２Ａ−２Ｃは、ＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７に向けられるＧ３Ｈ８およびＧ１Ｈ１２のＴＣＲＬ  Ｆａｂの特徴づけを示す。図２Ａ−固定化されたＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７、コントロールの複合体ＤＲ４／ＨＡ３０７〜３１９、ＧＡＤ５５５〜５６７ペプチドおよびＨＡ３０７〜３１９ペプチドを用いる精製されたＴＣＲＬ  ＦａｂのＥＬＩＳＡ。抗ＤＲ  ｍＡｂのＬ２４３を使用して、結合アッセイ時における結合した複合体の正しい立体配座および安定性を求めた。Ｆａｂ抗体のＧ１Ａ１、Ｇ１Ａ２およびＧ３Ｈ８（クローンＧ３Ｈ８）ならびにＧ１Ｈ１２（クローンＧ１Ｈ１２）がＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７複合体に特異的に結合することには、それ以外のコントロールペプチド複合体への結合がないことと比較した場合には留意すること。図２Ｂ−ＧＡＤ５５５〜５６７ペプチドまたはコントロールペプチド（ＩｎｓＡ１〜１５、ＣＩＩ２６１〜２７３、Ｈａ３０７〜３１９）によりパルス処理されたＰｒｅｉｓｓ  ＡＰＣに対するＦａｂ  Ｇ３Ｈ８結合のフローサイトメトリー分析。図２Ｃ−天然においてプロセシングされたペプチドＧＡＤ５５２〜５７２に対するＦａｂ  Ｇ３Ｈ８のフローサイトメトリー分析。
【図２Ｄ−２Ｅ】図２Ｄ−２Ｅは、ＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７に向けられるＧ３Ｈ８およびＧ１Ｈ１２のＴＣＲＬ  Ｆａｂの特徴づけを示す。図２Ｄ−様々な抗体濃度（２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）におけるＦａｂ  Ｇ３Ｈ８抗体の結合強さ。図２Ｅ−様々な負荷されたＧＡＤ５５５〜５６７ペプチド濃度（０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌおよび４００μｇ／ｍｌ）におけるＦａｂ  Ｇ３Ｈ８の結合強さ。結合強さが抗体濃度（図２Ｄ）およびペプチド濃度（図２Ｅ）に対して用量依存的であることに留意すること。
【００６８】
【図３Ａ−３Ｆ】図３Ａ−３Ｆは、ＤＲ４／ＧＡＤ  ＴＣＲＬの認識エピトープのマッピングを示すフローサイトメトリー分析である。下記によりパルス処理されたＰｒｅｉｓｓ  ＡＰＣに対するＦａｂ  Ｇ３Ｈ８結合のフローサイトメトリー分析：野生型（ＷＴ）ＧＡＤ５５５〜５６７ペプチド（図３Ａ）、ＧＡＤを変化させたペプチドリガンド（ＡＰＬ）のＭ５５９Ｚ（図３Ｂ）、Ｉ５６１Ｍ（図３Ｃ）、Ｎ５６３Ｑ（図３Ｄ）、Ｉ５６１Ｍ＋Ｎ５６３Ｑ（図３Ｅ）、および、コントロールのＨＡ３０７〜３１９ペプチド（図３Ｆ）。
【００６９】
【図４Ａ】図４Ａは、Ｇ３Ｈ８  ＦａｂがＧＡＤ５５５〜５６７ペプチドに対するＤＲ４拘束のＧＡＤ特異的Ｔ細胞応答を阻害し得ることを示すグラフである。Ｔ細胞ハイブリドーマを、増大するＦａｂ濃度の存在下、ペプチドによりパルス処理されたＤＲ０４０１−Ｔｇ脾細胞によってＡｇ特異的に活性化した。図４Ａ−ＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７エピトープに対して特異的なＧ２．１．３８．１ハイブリドーマが、Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂによって用量依存的様式で阻害され、コントロールの１Ｆ１１  ＴＣＲＬ  Ｆａｂによって阻害されなかった。これらの結果から、Ｇ３Ｈ８はＧＡＤ５５５〜５６７特異的なＤＲ０４０１拘束のＴ細胞ハイブリドーマ応答を阻害し得ることが明らかにされる。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｇ３Ｈ８  ＦａｂがＧＡＤ５５５〜５６７ペプチドに対するＤＲ４拘束のＧＡＤ特異的Ｔ細胞応答を阻害し得ることを示すグラフである。Ｔ細胞ハイブリドーマを、増大するＦａｂ濃度の存在下、ペプチドによりパルス処理されたＤＲ０４０１−Ｔｇ脾細胞によってＡｇ特異的に活性化した。図４Ｂ−ＤＲ４／Ｈａ３０７〜３１９エピトープに対して特異的なＨ１．１３．２ハイブリドーマは、Ｇ３Ｈ８  ＴＣＲＬ  Ｆａｂによって阻害されなかった。これらの結果から、Ｇ３Ｈ８はＧＡＤ５５５〜５６７特異的なＤＲ０４０１拘束のＴ細胞ハイブリドーマ応答を阻害し得ることが明らかにされる。
【００７０】
【図５Ａ−５Ｅ】図５Ａ−５Ｅは、糖尿病マウスのランゲルハンス島におけるＤＲ４によるＧＡＤ５５５〜５６７提示を明らかにする、Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂ抗体を使用する免疫蛍光分析を示す写真である。糖尿病マウスＢ７／０４０１から得られる凍結切片（図５Ａ〜図５Ｃ）およびＣ５７ＢＬ／６マウスから得られる凍結切片（図５Ｄ〜図５Ｅ）を、Ｇ３Ｈ８抗体を使用する免疫染色分析に供し、その後、抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ−４８８による染色（緑色）および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）による染色（青色）を行った。切片を、Ｃｅｌｌ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ−Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡によって可視化した。Ｂ７／０４０１糖尿病マウスではランゲルハンス島において緑色に標識化されること（図５Ａ〜図５Ｃ）、および、コントロールのＣ５７ＢＬ／６マウスでは標識化されないこと（図５Ｄ〜図５Ｅ）に留意すること。
【００７１】
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ−６Ｂは、Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂ抗体（抗ＨＬＡ−ＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７  Ｆａｂ）の軽鎖（図６Ａ〜図６Ｂ）のアミノ酸配列［図６Ａ（配列番号１）］および核酸配列［図６Ｂ（配列番号２）］を示す。ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義による）には下線が付される（配列番号３７〜配列番号３９、軽鎖についてのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３；配列番号４３〜配列番号４５、重鎖についてのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３；配列番号４０〜配列番号４２、軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３をコードする核酸配列；配列番号４６〜配列番号４８、重鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３をコードする核酸配列）。重鎖について：黒色文字−ＶＨ（可変ドメイン）、青色文字−定常ドメイン１（ＣＨ１）、赤色文字−コネクター、紫色文字−Ｈｉｓタグ、緑色文字−Ｍｙｃタグ。
【図６Ｃ−６Ｄ】図６Ｃ−６Ｄは、Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂ抗体（抗ＨＬＡ−ＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７  Ｆａｂ）の重鎖（図６Ｃ〜図６Ｄ）のアミノ酸配列［図６Ｃ（配列番号３）］および核酸配列［図６Ｄ（配列番号４）］を示す。ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義による）には下線が付される（配列番号３７〜配列番号３９、軽鎖についてのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３；配列番号４３〜配列番号４５、重鎖についてのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３；配列番号４０〜配列番号４２、軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３をコードする核酸配列；配列番号４６〜配列番号４８、重鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３をコードする核酸配列）。重鎖について：黒色文字−ＶＨ（可変ドメイン）、青色文字−定常ドメイン１（ＣＨ１）、赤色文字−コネクター、紫色文字−Ｈｉｓタグ、緑色文字−Ｍｙｃタグ。
【００７２】
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ−７Ｂは、Ｇ１Ｈ１２（抗ＨＬＡ−ＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７  Ｆａｂ）抗体の軽鎖（図７Ａ〜図７Ｂ）のアミノ酸配列［図７Ａ（配列番号５）］および核酸配列［図７Ｂ（配列番号６）］を示す。ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義による）には下線が付される（配列番号４９〜配列番号５１、軽鎖についてのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３；配列番号５５〜配列番号５７、重鎖についてのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３；配列番号５２〜配列番号５４、軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３をコードする核酸配列；配列番号５８〜配列番号６０、重鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３をコードする核酸配列）。重鎖について：黒色文字−ＶＨ（可変ドメイン）、青色文字−定常ドメイン１（ＣＨ１）、赤色文字−コネクター、紫色文字−Ｈｉｓタグ、緑色文字−Ｍｙｃタグ。
【図７Ｃ−７Ｄ】図７Ｃ−７Ｄは、Ｇ１Ｈ１２（抗ＨＬＡ−ＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７  Ｆａｂ）抗体の重鎖（図７Ｃ〜図７Ｄ）のアミノ酸配列［図７Ｃ（配列番号７）］および核酸配列［図７Ｄ（配列番号８）］を示す。ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義による）には下線が付される（配列番号４９〜配列番号５１、軽鎖についてのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３；配列番号５５〜配列番号５７、重鎖についてのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３；配列番号５２〜配列番号５４、軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３をコードする核酸配列；配列番号５８〜配列番号６０、重鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３をコードする核酸配列）。重鎖について：黒色文字−ＶＨ（可変ドメイン）、青色文字−定常ドメイン１（ＣＨ１）、赤色文字−コネクター、紫色文字−Ｈｉｓタグ、緑色文字−Ｍｙｃタグ。
【００７３】
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａ−８Ｂは、本発明のいくつかの実施形態による組換えベータ鎖（ＤＲＢ１＊０４０１；配列番号９；図８Ａ）および組換えアルファ鎖（ＤＲＡ＊０１０１；配列番号１０；図８Ｂ）のアミノ酸配列を示す。図８Ａ−リーダーペプチド（黄色で強調される）、ベータ鎖（赤色）、ＧＡＤ５５５〜５６７ペプチド（青色）、リンカー（黒色、下線部）、Ｊｕｎ二量体化ドメイン（緑色）；図８Ｂ−リーダーペプチド（黄色で強調される）、アルファ鎖（赤色）、ＧＡＤ５５５〜５６７ペプチド（青色）、リンカー（黒色、下線部）、Ｊｕｎ二量体化ドメイン（緑色）、ＢｉｒＡタグ（紫色）。
【００７４】
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ−９Ｂは、本発明のいくつかの実施形態による組換えベータ鎖（ＤＲＢ１＊０４０１；配列番号１１；図９Ａ）および組換えアルファ鎖（ＤＲＡ１＊０１０１；配列番号１２；図９Ｂ）の核酸配列を示す。図９Ａ−リーダーペプチド（黄色で強調される）、ベータ鎖（赤色）、ＧＡＤ５５５〜５６７ペプチド（青色）、リンカー（黒色、下線部）、Ｊｕｎ二量体化ドメイン（緑色）；図９Ｂ−リーダーペプチド（黄色で強調される）、アルファ鎖（赤色）、ＧＡＤ５５５〜５６７ペプチド（青色）、リンカー（黒色、下線部）、Ｊｕｎ二量体化ドメイン（緑色）、ＢｉｒＡタグ（紫色）。
【００７５】
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ−１０Ｂは、マウスのリンパ節細胞へのＧ３Ｈ８の結合を示すフローサイトメトリー分析を示すヒストグラムである。ＧＡＤ−５５５〜５６７（図１０Ａ）またはＨＡ−３０６〜３１８（図１０Ｂ）により免疫化されたＨＬＡ−ＤＲ４遺伝子組換え（Ｔｇ）マウスの鼠蹊部（流入領域）リンパ節（ＬＮ）に由来する細胞懸濁物に対するＧ３Ｈ８結合のフローサイトメトリー分析。Ｙ軸は陽性細胞の平均蛍光強度を示す。Ｘ軸は前方散乱（ＦＣＳ）カウント数を示す。Ｇ３Ｈ８抗体は、ＧＡＤ−５５５５６７により免疫化されたＨＬＡ−ＤＲ４遺伝子組換えマウスに由来するＨＬＡ−ＤＲ４−ＧＡＤ−５５５〜５６７複合体を提示するＡＰＣを検出する（６．５％の陽性細胞）（図１０Ａ）が、この抗体は、ＨＡ−３０６〜３１８により免疫化されたＨＬＡ−ＤＲ４遺伝子組換えマウスに由来するＨＬＡ−ＤＲ４−ＨＡ−３０６〜３１８を発現する細胞を検出しない（０．９％のバックグラウンドレベル）（図１０Ｂ）ことに留意すること。ＧＡＤ免疫化マウスに由来する非流入領域傍大動脈ＬＮおよび脾臓の細胞懸濁物は、ＨＡ免疫化マウスから得られるバックグラウンドレベルを超える染色を示さなかった（データは示されず）。これらの結果から、ＧＡＤにより免疫化されたＤＲ４マウスの鼠蹊部リンパ節に由来する、ＧＡＤ−５５５〜５６７を提示するＡＰＣの特異的な検出が明らかにされる。
【００７６】
【図１１Ａ−１１Ｃ】図１１Ａ−１１Ｃは、Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂの結合能およびＴ細胞阻止能と比較して、Ｇ３Ｈ８  ＩｇＧ１抗体の増大した結合能およびＴ細胞阻止能を示すヒストグラムである。図１１Ａ−ＧＡＤ５５５〜５６７ペプチドが負荷されたＤＲ４＋  Ｐｒｉｅｓｓ細胞に対するＦａｂ抗体またはＩｇＧ型Ｇ３Ｈ８抗体の結合を示すヒストグラム。完全ヒト型のＧ３Ｈ８  ＩｇＧ１  Ａｂは、ＤＲ４／ＧＡＤに対する特異性を維持し、Ｆａｂと比較して、１／１０の濃度により、はるかにより大きい強さで細胞に結合することに留意すること。図１１Ｂ−ＧＡＤ５５５〜５６７特異的な、ＤＲ４拘束されたＴ細胞応答が阻止されることを示すヒストグラム。Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂと、ＩｇＧとが、ＧＡＤ５５５〜５６７ハイブリドーマにおいて自己反応性ＴＣＲと競合し、ＧＡＤ特異的な応答を用量依存的様式で阻害する。ＩｇＧ阻害は、Ｆａｂ阻害と比較して、１０倍を超えてより効率的である。図１１Ｃ−ＨＡ−３０６〜３１８特異的な、ＤＲ４拘束されたＴ細胞応答が、Ｇ３Ｈ８ではなく、ＨＢ２９８によって阻止されることを示すヒストグラム。Ｇ３Ｈ８  ＩｇＧ  Ａｂは、インフルエンザペプチド（ＨＡ−３０６〜３１８）に対抗する他のＴ細胞特異性を阻害しなかった。これは、コントロールの抗ＤＲ  ｍＡｂ（ＨＢ２９８）によって得られる阻害と比較される。これらの結果から、無関連な複合体（例えば、インフルエンザの複合体）に対してではなく、ＤＲ４／ＧＡＤ−５５５〜５６７に対するＧ３Ｈ８抗体の特異性が明らかにされる。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩとＧＡＤ自己抗原性ペプチドとの単離された複合体、この複合体に特異的に結合する単離された高親和性実体（例えば、抗体など）、ならびに、限定ではないが、より具体的には、Ｉ型糖尿病を診断および処置するためのそれらの使用に関連する。
【００７８】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるか、または実施例において例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行されることが可能である。
【００７９】
本発明者らは、Ｉ型糖尿病の進行時における抗原提示を研究するために有用であり、同様にまた、Ｉ型糖尿病の診断および処置を行うために有用であるＴ細胞受容体様抗体を単離するために使用されたＭＨＣクラスＩＩ−ＧＡＤ自己抗原性ペプチド複合体を作製している。
【００８０】
下記の実施例の節において記載されるように、本発明者らは、抗原性ペプチドがＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖のＮ末端に共有結合により連結される、ＭＨＣクラスＩＩとＧＡＤ５５５〜５６７抗原性ペプチドとの単離された複合体を作製した（図１Ａ、実施例１）。このＭＨＣクラスＩＩ／ＧＡＤペプチド複合体は、ＧＡＤ５５５〜５６７抗原性ペプチドにインビトロで結合したとき、および、天然型立体配座で結合したとき（例えば、細胞表面に提示されるとき）の両方でＭＨＣクラスＩＩ（例えば、ＤＲ４）に特異的に結合し、しかし、この特異的な抗原性ペプチドの非存在下でのＭＨＣクラスＩＩには結合しない特異的な可溶性抗体（例えば、Ｆａｂ）を単離するために使用された（図２Ａ〜図２Ｂ）。加えて、これらの抗体は、天然においてＴ１Ｄと会合するエピトープＧＡＤ５５２〜５７２（配列番号１３）が負荷された細胞に結合することができること（図２Ｃ、実施例１、データは示されず）、また、Ｔ細胞受容体様の特異性を様々な抗体濃度（図２Ｄ、実施例１）および様々な抗原性ペプチド濃度（図２Ｅ、実施例１）において示すことが、増大する抗体染色が細胞表面での総ＭＨＣクラスＩＩ／抗原性ペプチド複合体における増大と相関していることとともに見出された。これらの結果は、単離された抗体が、目的とする抗原提示細胞の抗原提示を定量することにおいて使用され得ることを示す。加えて、実施例２に記載されるように、本発明の単離された抗体はそれらの標的化された複合体に対する細かい特異性を示し、かつ、野生型ペプチドを含めて、様々な複合体に示差的に結合し、しかし、ＭＨＣクラスＩＩ−ＧＡＤ拘束を受ける抗原性ペプチドのＰ５位に変異アミノ酸を有する複合体には結合しない（図３Ａ〜図３Ｅ）。さらには、実施例３において示されるように、Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂは、ＨＬＡ−ＤＲ＊０４０１によって拘束されるＧＡＤ−５５５〜５６７に対して特異的なＧ２．１．３６．１  Ｔ細胞ハイブリドーマの応答を約８０％阻害し（図４Ａ）、ＨＬＡ−ＤＲ＊０４０１によって拘束されるＨＡ３０７〜３１９ペプチドに対するＨ１．１３．２ハイブリドーマ応答を阻害しないこと（図４Ｂ）が見出された。したがって、これらから、自己反応性ＧＡＤ−エピトープに対する自己反応性Ｔ細胞応答が、Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂによって抗原特異的に阻止されることが明らかにされる。加えて、実施例４に記載されるように、Ｇ３Ｈ８  ＦａｂはＭＨＣクラスＩＩ−ＧＡＤ５５５〜５６７複合体にＢ７／ＤＲ４糖尿病マウスの膵島において特異的に結合し（図５Ａ〜図５Ｃ）、また、糖尿病発症前のＢ７／ＤＲ４マウスの浸潤された膵島において特異的に結合し（データは示されず）、しかし、Ｃ５７Ｂ６コントロールマウスの膵島には結合しなかった（図５Ｄ〜図５Ｅ）。そのうえ、実施例６に記載されるように、完全なＩｇＧ型のＧ３Ｈ８抗体が作製され、これは、エクスビボにおいてＨＬＡ−ＤＲ４−ＧＡＤ５５５〜５６７複合体を提示する細胞に対して特異的であること（図１０Ａ〜図１０Ｂ）、そして、Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂと比較した場合には高まった結合（図１１Ａ）を有し、また、より大きい効力（図１１Ｂ）を有し、一方で、独特のＴＣＲ様特異性を維持すること（図１１Ｃ）を示した��まとめると、これらの結果は、本発明の抗体の特異性、糖尿病を早期段階で診断することにおけるそれらの使用、および、治療目的のために、すなわち、この疾患の進行に伴う特異的なＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド事象を阻止するために不可欠である、膵島浸潤性ＡＰＣに対する抗体が入手できることを明らかにする。
【００８１】
したがって、本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）自己抗原性ペプチドとを含む、単離された複合体であって、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドが、配列番号１４によって示されるコアアミノ酸配列（ＧＡＤ５５６〜５６５、ＦＦＲＭＶＩＳＮＰＡ）を含み、かつ、前記ＧＡＤ自己抗原性ペプチドが前記ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖に共有結合により結合させられる、単離された複合体が提供される。本明細書中で使用される場合、用語「単離された」は、自然の環境（例えば、ヒトの身体）から少なくとも部分的に分離されたことを示す。
【００８２】
いくつかの実施形態によれば、単離された複合体は可溶性である。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、表現「主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）」は、一群の連鎖した遺伝子座によってコードされる各種抗原（これらはマウスではＨ−２と総称され、ヒトではヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と総称される）の複合体を示す。ＭＨＣ抗原の２つの主要なクラス（クラスＩおよびクラスＩＩ）はそれぞれが、組織タイプおよび移植片適合性を決定することにおいて役割を果たす一組の細胞表面糖タンパク質を含む。移植反応において、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が異物由来のクラスＩ糖タンパク質に対して主に応答し、一方で、ヘルパーＴ細胞が異物由来のクラスＩＩ糖タンパク質に対して主に応答する。
【００８４】
様々なＭＨＣクラスＩＩ分子が専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞など）において発現される。それぞれのＭＨＣクラスＩＩ分子が、２つの相同的サブユニットから、すなわち、アルファ鎖（α１およびα２の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインならびに短い細胞質テールを有する）およびベータ鎖（β１およびβ２の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインならびに短い細胞質テールを有する）から構成されるヘテロダイマーである。ペプチドが細胞外タンパク質に由来する場合、様々なペプチドがエンドサイトーシスを介して細胞内に入り、リソソームにおいて消化され、さらに、膜上での提示のためにＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。
【００８５】
様々なＭＨＣクラスＩＩ分子がヒトにおいて見出されている。その例は、以下のものを含むが、これらに限定されない：ＨＬＡ−ＤＭ，ＨＬＡ−ＤＯ，ＨＬＡ−ＤＰ，ＨＬＡ−ＤＱ（例えばＤＱ２，ＤＱ４，ＤＱ５，ＤＱ６，ＤＱ７，ＤＱ８，ＤＱ９），ＨＬＡ−ＤＲ（例えばＤＲ１，ＤＲ２，ＤＲ３，ＤＲ４，ＤＲ５，ＤＲ７，ＤＲ８，ＤＲ９，ＤＲ１０，ＤＲ１１，ＤＲ１２，ＤＲ１３，ＤＲ１４，ＤＲ１５およびＤＲ１６）。
【００８６】
ＤＱ  Ａ１対立因子の非限定的な例は、以下のものを含む：０５０１，０２０１，０３０２，０３０１，０４０１，０１０１，０１０２，０１０４，０１０２，０１０３，０１０４，０１０３，０１０２，０３０３，０５０５および０６０１。
【００８７】
ＤＱ  Ｂ１対立因子の非限定的な例は、以下のものを含む：０２０１，０２０２，０４０２，０５０１，０５０２，０５０３，０５０４，０６０１，０６０２，０６０３，０６０４，０６０９，０３０１，０３０４，０３０２および０３０３。
【００８８】
ＤＰＡ１対立因子の非限定的な例は、以下のものを含む：０１，例えば０１０３，０１０４，０１０５，０１０６，０１０７，０１０８，０１０９；０２，例えば０２０１，０２０２，０２０３；０３，例えば０３０１，０３０２，０３０３，０４０１。
【００８９】
ＤＰＢ１対立因子の非限定的な例は、以下のものを含む：０１，例えば０１０１，０１０２；０２，例えば０２０１，０２０２，０２０３；０３；０４，例えば０４０１，０４０２，０４０３；０５，例えば０５０１，０５０２；０６；０８，例えば０８０１，０８０２；０９，例えば０９０１，０９０２；１０，例えば１００１，１００２；１１，例えば１１０１，１１０２；１３，例えば１３０１，１３０２；１４，例えば１４０１，１４０２；１５，例えば１５０１，１５０２；１６，例えば１６０１，１６０２；１７，例えば１７０１，１７０２；１８，例えば１８０１，１８０２；１９，例えば１９０１，１９０２；２０，例えば２００１，２００２；２１；２２；２３；２４；２５；２６，例えば２６０１，２６０２；および２７。
【００９０】
ＤＰハロタイプの非限定的な例は、以下のものを含む：ＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０１０３／ＤＰＢ１＊０４０１（ＤＰ４０１）；およびＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０１０３／ＤＰＢ１＊０４０２（ＤＰ４０２）。
【００９１】
ＤＲ  Ｂ１対立因子の非限定的な例は、以下のものを含む：０１０１，０１０２，０１０３，０３０１，０４０１，０４０７，０４０２，０４０３，０４０４，０４０５，０７０１，０７０１，０８０１，０８０３，０９０１，１００１，１１０１，１１０３，１１０４，１２０１，１３０１，１３０２，１３０２１３０３，１４０１，１５０１，１５０２，１６０１対立因子。
【００９２】
ＤＲ−ＤＱハロタイプの非限定的な例は、以下のものを含む：ＤＲ１−ＤＱ５，ＤＲ３−ＤＱ２，ＤＲ４−ＤＱ７，ＤＲ４−ＤＱ８，ＤＲ７−ＤＱ２，ＤＲ７−ＤＱ９，ＤＲ８−ＤＱ４，ＤＲ８−ＤＱ７，ＤＲ９−ＤＱ９，ＤＲ１０−ＤＱ５，ＤＲ１１−ＤＱ７，ＤＲ１２−ＤＱ７，ＤＲ１３−ＤＱ６，ＤＲ１３−ＤＱ７，ＤＲ１４−ＤＱ５，ＤＲ１５−ＤＱ６およびＤＲ１６−ＤＱ５。
【００９３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＨＣクラスＩＩ複合体のベータ鎖はＤＲ−Ｂ１＊０４０１（配列番号１５；天然型ＤＲ−Ｂ１＊０４０１分子）である。
【００９４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖はＤＲ−Ａ１＊０１０１（配列番号１６；天然型ＤＲ−Ａ１＊０１０１分子）である。
【００９５】
本明細書中で使用される場合、表現「グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）」は、Ｌ−グルタミン酸からのガンマ−アミノ酪酸の生成を触媒することに関わるタンパク質の一群を示す。２つの主要なＧＡＤ酵素がヒトには存在する：脳および膵臓の両方において発現するＧＡＤ（６５ｋＤａ）［ＧｅｎｅＩＤ  ２５７２；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００８１８．２（配列番号１７）、同ＮＭ＿００１１３４３６６．１（配列番号１８）、同ＮＰ＿０００８０９．１（配列番号１９）によってコードされる］、および、脳において発現するＧＡＤ（６７ｋＤａ）［ＧｅｎｅＩＤ  ２５７１；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００８１７．２（配列番号２０）、同ＮＰ＿０００８０８．２（配列番号２１）によってコードされる］。ＧＡＤ（６５ｋＤａ）が、インスリン依存性糖尿病における自己抗体および自己反応性Ｔ細胞標的として特定されている。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、表現「ＧＡＤ自己抗原性ペプチド」は、膵臓の細胞（例えば、膵臓のベータ細胞など）において発現され、かつ、それに対する炎症応答が自己免疫性炎症応答の一部として誘発される自己のＧＡＤタンパク質（すなわち、内因性タンパク質）に由来する抗原を示す。
【００９７】
ＧＡＤ自己抗原性ペプチドは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）において提示されるとき、特異的なＴ細胞によって認識されるＭＨＣクラスＩＩ拘束のペプチドであることに留意しなければならない。ＡＰＣによるそのような提示は、ベータ細胞を殺傷および破壊し、したがって、低下したインスリン産生を引き起こす細胞傷害性Ｔ細胞および抗体の生成を含めて、ベータ細胞に対するＴ細胞応答およびＢ細胞応答の活性化および動員をもたらし得る炎症応答を生じさせる。
【００９８】
本発明のいくつかの実施形態によるＧＡＤ自己抗原性ペプチドは、配列番号１４によって示されるコアアミノ酸配列（ＧＡＤ５５６〜５６５、ＦＦＲＭＶＩＳＮＰＡ）を含む。
【００９９】
自己抗原のアミノ酸配列は、長さにおいて、同じＭＨＣクラスＩＩ対立因子の間で、または、異なるＭＨＣクラスＩＩ対立因子の間で変化し得るので、本発明のいくつかの実施形態による自己抗原性ペプチドの長さは、少なくとも１０個のアミノ酸から、少なくとも１０個、２５個、または、最大でも３０個のアミノ酸を有する自己抗原性ペプチドにまで変化し得る。
【０１００】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドは、１０個のコアアミノ酸を含む。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの長さは約１００個のアミノ酸を超えず、例えば、約５０個のアミノ酸を超えず、例えば、約３０個のアミノ酸を超えない。
【０１０２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドは、配列番号６１、配列番号６２および配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、長さにおいて最大でも３０個のアミノ酸を含む。
【０１０３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドは、配列番号６１、配列番号６２および配列番号２２からなる群から選択される。
【０１０４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドはＧＡＤ５５５〜５６７（ＮＦＦＲＭＶＩＳＮＰＡＡＴ；配列番号２２）である。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの長さは少なくとも１０個のアミノ酸を含み、かつ、最大でも３０個のアミノ酸を含む。
【０１０６】
加えて、それぞれの自己抗原性ペプチドにおけるいくつかのアミノ酸はＭＨＣクラスＩＩの様々な対立因子の間で保存されており、置換され得ないが、他のアミノ酸は、ＭＨＣ分子に対する結合の本質的に同等な特異性および／または親和性を有し、かつ、上記および表３（実施例の節の実施例５）に記載される例示的な自己抗原において示されるアミノ酸配列と同等なＴ細胞エピトープをもたらすアミノ酸により置換され得ることに留意しなければならない。したがって、コアアミノ酸は、それぞれのＭＨＣクラスＩＩ分子との認識のために要求される。それぞれの自己抗原性ペプチドについてのコアアミノ酸の特定を実験により行うことができ、例えば、自己抗原性ペプチドを構成するアミノ酸の変異誘発、および、（ｉ）拘束されたＭＨＣクラスＩＩ分子への結合、（ｉｉ）拘束されたＴ細胞応答を刺激することの検出によって行うことができる。例えば、ＧＡＤ５５５〜５６７については、コアアミノ酸は５５６位〜５６５位におけるアミノ酸である。コアアミノ酸配列は、アンカー残基と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）接触残基とからなる。配列ＮＦＦＲＭＶＩＳＮＰＡＡＴ（配列番号２２）におけるアンカー残基が、Ｐ１（Ｆ５５７）、Ｐ４（Ｖ５６０）、Ｐ６（Ｓ５６２）およびＰ９（Ａ５６５）のＭＨＣポケット結合残基である。配列ＮＦＦＲＭＶＩＳＮＰＡＡＴ（配列番号２２）におけるＴＣＲ接触残基が、Ｆ５５６、Ｒ５５８、Ｍ５５９、Ｉ５６１、Ｎ５６３の位置である。したがって、ＧＡＤ５５５〜５６７自己抗原性ペプチドのコアアミノ酸はＧＡＤ５５６〜５６５（ＦＦＲＭＶＩＳＮＰＡ、配列番号１４）である。
【０１０７】
本発明はまた、そのいくつかの実施形態によれば、配列が上述のアミノ酸配列と完全には対応しないが、同一の「アンカー位置」または密接に関連する「アンカー位置」を単に有するペプチド変化体に関する。用語「アンカー位置」はこの関連においては、ＭＨＣクラスＩＩ複合体（例えば、ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ３、ＤＲ４またはＤＱ）に結合するための不可欠なアミノ酸残基を意味する。ＤＲＢ１＊０４０１結合モチーフについてのアンカー位置が、例えば、Ｈａｍｍｅｒ他、Ｃｅｌｌ、７４（１９９３）、１９７〜２０３において述べられる。そのようなアンカー位置はＧＡＤ自己抗原性ペプチドにおいて保存されるか、または、場合により、化学的に非常に近い関係にある側鎖を有するアミノ酸残基によって置換される（例えば、バリンによるアラニンの置換、イソロシンによるロイシンの置換、および、逆に、アラニンによるバリンの置換、ロイシンによるイソロシンの置換）。本発明のいくつかの実施形態によるペプチドにおけるアンカー位置は、上述の具体的なペプチドの変化体をＭＨＣ分子に対するそれらの結合能について試験することによる簡便な様式で決定することができる。本発明のいくつかの実施形態によるペプチドが、上述のペプチドと本質的に同等な、ＭＨＣ分子に対する結合の特異性および／または親和性を有するという点で特徴づけられる。本明細書中に記載されるＧＡＤ自己抗原性ペプチドに対する少なくとも５０％の同一性（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の同一性）を有する相同的なペプチドもまた、本発明のいくつかの実施形態によって意図される。
【０１０８】
上記のＧＡＤ自己抗原性ペプチドのそれぞれがＭＨＣクラスＩＩ対立因子と複合体形成し得ることに留意しなければならない。そのようなＭＨＣクラスＩＩ特異的対立因子がこの技術分野では知られている。ＭＨＣクラスＩＩ対立因子およびそれらの拘束された自己抗原性ペプチドの限定されない例が下記の実施例の節の実施例５における表３に例示される。
【０１０９】
本明細書において使用される用語「ペプチド」には、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細が本明細書中下記に示される。
【０１１０】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、ｏ−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【０１１１】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。本発明のいくつかの実施形態によれば、これらの修飾は、アンカーアミノ酸を除外すべきであるが、これはすべての場合において必須ではない。
【０１１２】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、ＴＩＣ、ナフチルアラニン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【０１１３】
上述のことに加えて、本発明のペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【０１１４】
本明細書において使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、この用語が本明細書中で定義されるように少なくとも１つの付加アミノ酸にペプチド結合またはペプチド結合アナログを介して連結されるＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【０１１５】
本発明のペプチドは好ましくは、線状形態で利用される。だが、環化がペプチド特性をひどく妨害しない場合には、ペプチドの環状形態もまた利用され得ることが理解されるであろう。
【０１１６】
本発明のペプチドは、ペプチドの溶解性をそれらのヒドロキシル含有側鎖のために増大させることができる１つまたは複数の非天然型または天然型の極性アミノ酸（セリンおよびトレオニンが含まれるが、これらに限定されない）を含むことができる。
【０１１７】
本発明のペプチドは、ペプチド合成の分野における当業者に既知の任意の技術によって合成されることができる。固相ペプチド合成については、多くの技術の要約が、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），１９６３に、および、Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ「Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」第２巻、４６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９７３に見出されうる。古典的な溶液合成については、Ｇ．ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｐｋｅ「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」第１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９６５を参照のこと。大規模ペプチド合成は、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２０００；５５（３）：２２７−５０によって記載されている。
【０１１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとを含む単離された複合体は、ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体の天然型立体配座に特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む高親和性実体の単離を可能にする構造的立体配座を有する。
【０１１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、高親和性実体（例えば、抗体）はＧＡＤ自己抗原性ペプチドの非存在下でのＭＨＣクラスＩＩには結合せず、かつ、単離された高親和性実体はＭＨＣクラスＩＩの非存在下でのＧＡＤ自己抗原性ペプチドには結合しない。
【０１２０】
表現「ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの非存在下でのＭＨＣクラスＩＩ」は、本明細書中で使用される場合、空のＭＨＣクラスＩＩ複合体（すなわち、抗原性ペプチドを何ら有しないＭＨＣクラスＩＩ複合体）、同様にまた、本発明のいくつかの実施形態のＧＡＤ自己抗原性ペプチドでない別の抗原ペプチド（例えば、異なるＭＨＣクラスＩＩ拘束の抗原性ペプチド）に結合するＭＨＣクラスＩＩ複合体を包含する。
【０１２１】
表現「ＭＨＣクラスＩＩの非存在下でのＧＡＤ自己抗原性ペプチド」は、本明細書中で使用される場合、ＭＨＣクラスＩＩ複合体に結合していないときの本発明のいくつかの実施形態のＧＡＤ自己抗原性ペプチド、同様にまた、別のＭＨＣクラスＩＩ複合体（例えば、本発明のいくつかの実施形態の複合体を形成するために使用される鎖とは異なる、ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖またはアルファ鎖の対立因子）に結合したときの本発明のいくつかの実施形態のＧＡＤ自己抗原性ペプチドを包含する。
【０１２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとを含む単離された複合体は、（ＭＨＣクラスＩＩ分子への共有結合性または非共有結合性のどちらの結合であれ、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子のＣ’末端を介して）複合体に結合した異種の免疫グロブリン（例えば、Ｆｃ抗体、Ｆａｂ抗体および／または単鎖Ｆｖ抗体）を含まない。
【０１２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離された複合体は、ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体の天然型立体配座に特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む高親和性実体（例えば、抗体）の単離を可能にする構造的立体配座を有する。
【０１２４】
天然型の構造的立体配座を有するＭＨＣクラスＩＩ／ＧＡＤ自己抗原性ペプチドに特異的に結合することができる高親和性実体（例えば、抗体）を単離するためには、単離されたＭＨＣ／ペプチド複合体は、抗原性ペプチドを伴うＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖およびベータ鎖の正しい折り畳みが生じるように作製されなければならない。ＭＨＣクラスＩＩと、拘束された抗原ペプチドとの組換え複合体を調製するためには、アルファ鎖およびベータ鎖の細胞外ドメインが要求されることに留意しなければならない。
【０１２５】
真核生物細胞において発現されるとき、ＭＨＣクラスＩＩ分子のシグナルペプチドが翻訳後に切断され、したがって、これにより、成熟型タンパク質が得られる。ＭＨＣクラスＩＩ分子内における抗原性ペプチドの正しい折り畳みを可能にするために、抗原性ペプチドは成熟型ＭＨＣクラスＩＩベータ鎖の細胞外ドメインのＮ末端の近くに共有結合により結合されなければならない。
【０１２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、そのような構造的立体配座は、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドがＭＨＣクラスＩＩの成熟型ベータ鎖の細胞外ドメインに共有結合によりコンジュゲートまたは結合されるときに得ることができるか又は得られる。
【０１２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドはそのＣ末端においてＭＨＣクラスＩＩの細胞外ドメインのＮ末端に共有結合により結合する。
【０１２８】
本明細書中で使用される場合、表現「共有結合により結合される（する）」（またはコンジュゲートされる）は、成熟型ベータ鎖のポリペプチド鎖の一部であることを示す。そのような共有結合性コンジュゲート化は、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドのコード配列をＭＨＣクラスＩＩ分子のベータ鎖の細胞外ドメインのコード配列に翻訳融合することによって達成することができる。
【０１２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドはＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖の細胞外ドメインのアミノ酸１〜６の間に共有結合により埋め込まれる。
【０１３０】
本明細書中で使用される場合、表現「の間に共有結合により埋め込まれる」は、アミノ酸配列（ポリペプチド）内に共有結合により結合される（する）ことを示す。
【０１３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖の細胞外ドメインのアミノ酸１〜２の間、アミノ酸２〜３の間、アミノ酸３〜４の間、アミノ酸４〜５の間またはアミノ酸５〜６の間に共有結合により埋め込まれる。
【０１３２】
したがって、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドを、ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖の成熟型細胞外ドメインの１番目、２番目、３番目、４番目または５番目のアミノ酸位置の後に埋め込むことができる。
【０１３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドは、成熟型ＭＨＣクラスＩＩベータ鎖の３番目のアミノ酸の後（すなわち、成熟型ＭＨＣクラスＩＩベータ鎖の３番目のアミノ酸と４番目のアミノ酸との間）に共有結合により結合させられる。
【０１３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドはそのＣ末端にリンカーペプチドが配置される。
【０１３５】
リンカーペプチドは、組換えＭＨＣクラスＩＩ−抗原性ペプチドを調製するために使用される発現系に従って選択することができる。
【０１３６】
通常、リンカーペプチドは柔軟性を成熟型ベータ鎖に与え、また、コンジュゲートされた抗原性ペプチドのＭＨＣクラスＩＩ分子内でのペプチド結合溝の中における折り畳みを可能にする。
【０１３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、リンカーペプチドは組換えタンパク質の酵素的切断のための部位を含む。切断を、インビボ（すなわち、生体内）、エクスビボ（生物の細胞が培養されるとき）、または、インビトロで行うことができる。
【０１３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、リンカーペプチドはトロンビン切断部位を含むことができる。例えば、リンカーペプチドは、組換えタンパク質の柔軟性を増大させる２つの配列（例えば、ＧＧＧＧＳなど）が配置されるトロンビン切断部位（例えば、配列ＬＶＰＲＧＳ）を含むことができる。
【０１３９】
下記は、ＧＡＤ自己抗原性ペプチド複合体に共有結合によりコンジュゲートされ得るリンカーペプチドの限定されない例である：
（１）１回〜３０回の間で繰り返されるグリシン（Ｇ）−セリン（Ｓ）対のアミノ酸［ＧＳ］ｎ（ただし、ｎ＝１〜３０）（配列番号２３）を含むリンカーペプチド。
（２）１回〜６回の間で繰り返されるＧＧＧＧＳ配列［ＧＧＧＧＳ］ｎ（ただし、ｎ＝１〜６）（配列番号２４）を含むリンカーペプチド。
（３）リンカーペプチドＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２５）。
（４）リンカーペプチドＧＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２６）。
【０１４０】
リンカーペプチドは、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドに対して、また、ＭＨＣクラスＩＩの成熟型ベータ鎖の細胞外ドメインに対して翻訳融合することができる。例えば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドのＣ末端がリンカーペプチドのＮ末端に直接に融合される；また、リンカーペプチドのＣ末端が、成熟型ベータ鎖の細胞外ドメインのＮ末端に、または、成熟型ベータ鎖の細胞外ドメインのＮ末端端部の１〜６の間のアミノ酸位置に直接に融合される。
【０１４１】
加えて、非共有結合性の複合体をＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖とベータ鎖との間において形成するために、アルファ鎖およびベータ鎖の細胞外ドメインのそれぞれが結合対のメンバーを含み、ただし、この場合、そのようなメンバーは、他方のメンバーと相互作用したとき、結合対を形成する。
【０１４２】
そのような結合対の限定されない例には、Ｊｕｎ−Ｆｏｓ結合対のロイシンジッパー二量体化ドメイン、ならびに、安定なタンパク質複合体を形成する酸性（ＡＺ）ロイシンジッパーモチーフおよび塩基性（ＢＺ）ロイシンジッパーモチーフが含まれる。
【０１４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖は、真核生物細胞における発現のとき、ＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖に含まれる結合対の第２のメンバーに結合する結合対の第１のメンバーを含み、ただし、ベータ鎖およびアルファ鎖により、ＭＨＣクラスＩＩが形成される。
【０１４４】
例えば、下記の実施例の節において記載されるように、本発明のいくつかの実施形態のＭＨＣクラスＩＩ複合体が、ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖（例えば、ＤＲ−Ｂ１＊０４０１；配列番号１５）をコードする核酸配列に翻訳融合される、ＧＡＤ自己抗原性ペプチド（例えば、ＧＡＤペプチド）をコードする核酸配列を含み、その結果、コードされた抗原性ペプチドがベータ鎖（ベータ鎖の成熟型細胞外ドメイン）の３番目のアミノ酸位置と４番目のアミノ酸位置との間に融合されるようにされるポリヌクレオチドを宿主細胞（例えば、Ｓ２細胞）において発現させることによって作製された。図８Ａ〜図８Ｂにおいてさらに示されるように、抗原性ペプチドが、ベータ鎖の成熟型細胞外ドメインの４番目のアミノ酸配列（第４アミノ酸）に直接に結合されるリンカーペプチドに共有結合により融合される。
【０１４５】
表現「翻訳融合される」および表現「読み枠を合わせて」は、連結されたポリヌクレオチドのコード配列の長さに広がるただ１つの連続したオープンリーディングフレームを形成するように共有結合により連結されるポリヌクレオチドを示すために本明細書中では交換可能に使用される。そのようなポリヌクレオチドは直接に連結することができ、あるいは、好ましくはスペーサー領域またはリンカー領域を介して間接的に共有結合により連結することができる。
【０１４６】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖［例えば、ＤＲ−Ｂ１＊０４０１；（アミノ酸配列については配列番号２７）および（核酸配列については配列番号２８）］の細胞外ドメインをコードする第１の核酸配列と、ＧＡＤ自己抗原性ペプチド［例えば、ＧＡＤペプチドＮＦＦＲＭＶＩＳＮＰＡＡＴ（配列番号２２）、このＧＡＤペプチドをコードする核酸配列についてはＡＡＣＴＴＣＴＴＴＣＧＴＡＴＧＧＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＴ（配列番号２９）］をコードする第２の核酸構築物とを含む単離されたポリヌクレオチドが提供され、ただし、この場合、第２の核酸構築物は第１の核酸構築物の上流に翻訳融合されるか、または、細胞外ドメインのアミノ酸１〜６をコードする核酸配列の間に翻訳融合される。
【０１４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第２の核酸構築物は、細胞外ドメインのアミノ酸３および４をコードする核酸配列の間に翻訳融合される。
【０１４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドはさらに、第２の核酸配列の下流に翻訳融合される、リンカーペプチドをコードする核酸配列を含む。
【０１４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、リンカーペプチド（ＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号６３）をコードする核酸配列を介してつながれる。
【０１５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドはさらに、真核生物細胞における発現のとき、結合対の第２のメンバーに結合する結合対の第１のメンバー［例えば、Ｊｕｎ、配列番号６４で示されるアミノ酸配列（ＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＶＭＮＨ）］をコードする第３の核酸配列を含む。
【０１５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、結合対の第１のメンバーをコードする第３の核酸配列が、ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖をコードする第１の核酸配列の下流に翻訳融合される。
【０１５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、結合対の第１のメンバー（例えば、Ｊｕｎアミノ酸配列）が、短いペプチドリンカーを介して、ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖につながれる。そのようなリンカーの限定されない一例が配列番号６５（ＶＤＧＧＧＧＧ）で示される。
【０１５３】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、下記の（ｉ）および（ｉｉ）を含む核酸システムが提供される：
（ｉ）ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖をコードする第１の核酸配列と、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドをコードする第２の核酸構築物（ただし、第２の核酸構築物は第１の核酸構築物の上流に翻訳融合される）と、真核生物細胞における発現のとき、結合対の第２のメンバーに結合する結合対の第１のメンバーをコードする第３の核酸配列とを含む第１のポリヌクレオチド；および
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖［例えば、ＤＲ−Ａ１＊０１０１；（組換え分子の）配列番号１０のアミノ酸１〜２１７］をコードする第４の核酸配列［配列番号１２の核酸１〜６５１］を含む第２のポリヌクレオチド。
【０１５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第２のポリヌクレオチドはさらに、結合対の第２のメンバー［例えば、Ｆｏｓ、配列番号６６で示されるアミノ酸配列（ＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＬＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＦＩＬＡＡＨ）］をコードする第５の核酸配列を含む。
【０１５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、結合対の第２のメンバーをコードする第５の核酸配列が、ＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖をコードする第４の核酸配列の下流に翻訳融合される。
【０１５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｆｏｓアミノ酸配列が、短いペプチドリンカーを介して、ＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖につながれる。そのようなリンカーの限定されない一例が配列番号６５（ＶＤＧＧＧＧＧ）で示される。
【０１５７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、結合対の第２のメンバーをコードする第５の核酸配列と、ＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖をコードする第４の核酸配列とが、リンカーペプチド（例えば、ＶＤＧＧＧＧＧ；配列番号６５）をコードする核酸配列を介してつながれる。
【０１５８】
組換えベータ鎖分子および組換えアルファ鎖分子の限定されない例が図８Ａ〜図８Ｂおよび図９Ａ〜図９Ｂにそれぞれ例示され、また、それらの例示的な配列が配列番号９〜配列番号１０および配列番号１１〜配列番号１２においてそれぞれ提供される。
【０１５９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＨＣクラスＩＩ複合体の少なくとも一方の分子（すなわち、アルファ鎖またはベータ鎖）はさらに、読み枠を合わせたタグ、すなわち、結合性実体を含むために酵素改変され得るペプチドをコードする核酸配列を含む。例えば、そのようなペプチドは、例えば、ビオチンタンパク質リガーゼ（ＢｉｒＡ酵素（ＡＶＩＤＩＴＹ））を使用する部位特異的なビオチン化のために使用することができる。そのようなタグの限定されない例には、配列番号６７によって示されるＢｉｒＡ認識配列（Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｓｐ）が含まれる。
【０１６０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ビオチン化のためのＢｉｒＡ認識配列が組換えアルファ鎖のカルボキシ末端（Ｃｔ）に共有結合によりコンジュゲートされる。
【０１６１】
読み枠を合わせたタグは、例えば、ストレプトアビジンを使用するなどして、特異的なＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的に結合する抗体を単離するために使用され得ることに留意しなければならない。
【０１６２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＨＣクラスＩＩ−ペプチド複合体は、一般的な結合性実体によって結合させられる多量体を形成する。
【０１６３】
例えば、ＭＨＣクラスＩＩ−ペプチド複合体の多量体（例えば、四量体）を、ビオチン化された複合体に結合するストレプトアビジンを使用して形成することができる。
【０１６４】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体と特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む単離された抗体が提供され、ただし、この場合、単離された抗体はＧＡＤ自己抗原性ペプチドの非存在下でのＭＨＣクラスＩＩには結合せず、かつ、単離された抗体はＭＨＣクラスＩＩの非存在下でのＧＡＤ自己抗原性ペプチドには結合しない。
【０１６５】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体と特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む単離された高親和性実体が提供され、ただし、この場合、単離された高親和性実体はＧＡＤ自己抗原性ペプチドの非存在下でのＭＨＣクラスＩＩには結合せず、かつ、単離された高親和性実体はＭＨＣクラスＩＩの非存在下でのＧＡＤ自己抗原性ペプチドには結合しない。
【０１６６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原結合ドメインは、ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体の天然型立体配座に特異的に結合することができる。
【０１６７】
本明細書中で使用される場合、表現「天然型立体配座」は、細胞（例えば、哺乳動物の細胞、例えば、ヒト細胞）の表面に天然において提示されるときの複合体の立体配座を示す。
【０１６８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、天然型立体配座は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示されるときの、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとＭＨＣクラスＩＩとの複合体の構造的立体配座を含む。
【０１６９】
ＭＨＣクラスＩＩとＧＡＤ自己抗原性ペプチドとの複合体を呈示または提示する抗原提示細胞の限定されない例には、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）およびＢ細胞が含まれる。
【０１７０】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、抗原結合ドメインを含む単離された高親和性実体が提供され、ただし、高親和性実体は本発明のいくつかの実施形態の単離された複合体によって単離可能である。
【０１７１】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、本発明のいくつかの実施形態の単離された複合体に特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む単離された高親和性実体が提供される。
【０１７２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離された高親和性実体の抗原結合ドメインは、ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体の天然型立体配座に特異的に結合することができる。
【０１７３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離された高親和性実体の抗原結合ドメインはさらに、本発明のいくつかの実施形態の単離された複合体に特異的に結合することができる。
【０１７４】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、下記の（ｉ）および（ｉｉ）と特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む単離された高親和性実体が提供される：
（ｉ）主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体（ただし、単離された高親和性実体はＧＡＤ自己抗原性ペプチドの非存在下でのＭＨＣクラスＩＩには結合せず、かつ、単離された高親和性実体はＭＨＣクラスＩＩの非存在下でのＧＡＤ自己抗原性ペプチドには結合しない）；および
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体の天然型立体配座。
【０１７５】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとを含む単離された複合体に特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む単離された高親和性実体が提供され、ただし、この場合、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドはＭＨＣクラスＩＩの組換えベータ鎖のアミノ末端（Ｎｔ）に共有結合によりコンジュゲートされる。
【０１７６】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとを含む単離された複合体（ただし、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドはＭＨＣクラスＩＩの組換えベータ鎖のアミノ末端（Ｎｔ）に共有結合によりコンジュゲートされる）によって単離可能である単離された高親和性実体が提供され、ただし、この場合、単離された高親和性実体の抗原結合ドメインは、ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体の天然型立体配座に特異的に結合することができる。
【０１７７】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとを含む単離された複合体（ただし、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドはＭＨＣクラスＩＩの組換えベータ鎖のアミノ末端（Ｎｔ）に共有結合によりコンジュゲートされる）によって単離可能である単離された高親和性実体が提供され、ただし、この場合、単離された高親和性実体の抗原結合ドメインは下記の（ｉ）および（ｉｉ）に特異的に結合することができる：
（ｉ）ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとを含む単離された複合体（ただし、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドはＭＨＣクラスＩＩの組換えベータ鎖のアミノ末端（Ｎｔ）に共有結合によりコンジュゲートされる）；および
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体の天然型立体配座。
【０１７８】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、配列番号４３〜配列番号４５および配列番号３７〜配列番号３９によって示される相補性決定領域（ＣＤＲ）（これらはそれぞれ、Ｇ３Ｈ８の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３である）を含む単離された高親和性実体が提供される。
【０１７９】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、配列番号５５〜配列番号５７および配列番号４９〜配列番号５１によって示される相補性決定領域（ＣＤＲ）（これらはＧ１Ｈ１２の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３である）を含む単離された高親和性実体が提供される。
【０１８０】
表現「高親和性実体」は、どのような分子、組成物または生物であれ、特異的な抗原には、非特異的な抗原よりも大きい親和性により結合する、天然に存在する分子、組成物または生物、あるいは、人工的に作製された分子、組成物または生物を示す。
【０１８１】
親和性は、知られている方法を使用して、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（これは、Ｓｃａｒａｎｏ  Ｓ、Ｍａｓｃｉｎｉ  Ｍ、Ｔｕｒｎｅｒ  ＡＰ、Ｍｉｎｕｎｎｉ  Ｍ、親和性に基づくバイオセンサーのための表面プラズモン共鳴画像化、Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ、２０１０、２５：９５７〜６６に記載される）などを使用して定量化することができ、また、例えば、より低いＫｄがより大きい親和性を反映するような解離定数（Ｋｄ）を使用して計算することができる。
【０１８２】
記載されるように、高親和性実体は、ＭＨＣクラスＩＩと、ＭＨＣクラスＩＩ拘束の自己抗原（ＧＡＤ自己抗原性ペプチド）とを含む複合体に結合する。
【０１８３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、高親和性実体は、ある種の特異的な複合体には、類似する複合体に対する同じ実体の親和性と比較して、より大きい親和性により結合する。ただし、この場合、類似する複合体は、複合体成分の少なくとも１つが、すなわち、ＭＨＣクラスＩＩのアルファ鎖、ＭＨＣクラスＩＩのベータ鎖および／またはＭＨＣクラスＩＩ拘束の自己抗原が、特異的複合体の成分に関して少なくとも１つの変異（置換、欠失または挿入）を有する成分により置換される。
【０１８４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、そのような変異は、様々なＭＨＣクラスＩＩ対立因子の拘束された抗原の間で保存されるアミノ酸位置においてである。
【０１８５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、高親和性実体は、非特異的な抗原に対する同じ実体の親和性と比較して、少なくとも約１桁ほど大きい、例えば、少なくとも約２桁大きい、少なくとも約３桁大きい、少なくとも約４桁大きい、少なくとも約５桁大きい、少なくとも約６桁大きい、少なくとも約７桁大きい、少なくとも約８桁大きい、少なくとも約９桁大きい、少なくとも約１０桁大きい、特異的な抗原に対する親和性を示す。
【０１８６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、特異的な抗原に対する高親和性実体の解離定数は約１０−４Ｍ以下であり、例えば、約１０−５Ｍ以下であり、例えば、約１０−６Ｍ以下であり、例えば、約１０−７Ｍ以下であり、例えば、約１０−８Ｍ以下であり、例えば、約１０−９Ｍ以下であり、例えば、約１０−１０Ｍ以下である。
【０１８７】
高親和性実体の限定されない例には、抗体、抗体フラグメント、抗体を呈示するファージ、ペプチボディー、細胞に基づくディスプレー実体（例えば、抗体を呈示する細菌または酵母）、および、細胞を含まない呈示実体（例えば、ペプチドまたは抗体を呈示するリボソーム）が含まれる。
【０１８８】
抗体を呈示するバクテリオファージで、本発明のいくつかの実施形態に従って使用することができるバクテリオファージには、Ｍ１３およびｆｄの繊維状ファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ、ならびに、λファージが含まれる。
【０１８９】
抗体を呈示させるために細菌（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ）および酵母を使用する技術は周知である（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ＰＳ．他、１９９８、細菌表面ディスプレーを使用する抗体親和性成熟化、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１１：８２５〜８３２；Ｊｏｈａｎ  Ｒｏｃｋｂｅｒｇ他、細菌表面ディスプレーを使用する抗体のエピトープマッピング、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、５、１０３９〜１０４５（２００８）；Ｓａｃｈｄｅｖ  Ｓ  Ｓｉｄｈｕ、ディスプレーでの全長型抗体、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５、５３７〜５３８（２００７）を参照のこと。これらのそれぞれが全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１９０】
細胞を含まない呈示実体には、タンパク質を呈示するリボソームが含まれる（これは、Ｍｉｎｇｙｕｅ  ＨｅおよびＭｉｃｈａｅｌ  Ｊ．Ｔａｕｓｓｉｇ、２００２、リボソームディスプレー：無細胞タンパク質ディスプレー技術、Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、第１巻：２０４〜２１２；Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｄｕｆｎｅｒ他、２００６、ファージディスプレーおよびリボソームディスプレーを抗体最適化のために利用する、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２４巻：５２３〜５２９に記載される。これらのそれぞれが全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１９１】
ペプチボディーは、抗体（例えば、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体）のＦｃドメインまたはＦｃドメインのフラグメントに結合させられる抗原（例えば、ＣＤＲ）に結合することができる少なくとも１つのペプチドを含む単離されたポリペプチドである。ペプチボディーは、互いに同じであり得るか、または、互いに異なり得る、抗原に結合することができる２つ以上のペプチド（例えば、２つのペプチド、３つのペプチド、４つのペプチドまたは５つのペプチド）を含むことができる。
【０１９２】
本明細書で使用される用語「抗体」は、完全な抗体分子、並びにその機能的なフラグメント、例えば、マクロファージに結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどを含む。これらの機能的な抗体フラグメントは次のように定義される：（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含有するフラグメントであり、完全な抗体を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖と、一方の重鎖の一部とを生じさせることによって作製することができる；（２）Ｆａｂ’は、完全な抗体をペプシンで処理し、その後、還元して、無傷の軽鎖と、重鎖の一部とを生じさせることによって得ることができる抗体分子のフラグメントである；２つのＦａｂ’フラグメントが１つの抗体分子あたり得られる；（３）（Ｆａｂ’）２は、その後の還元を行うことなく、完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体のフラグメントである；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒にされた２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである；（４）Ｆｖは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝子的に融合された単一鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結されて、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子である；（６）ＣＤＲペプチドは単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである；そして（７）単一ドメイン抗体（ナノボディとも称される）は、特定の抗原に選択的に結合する、遺伝子操作された単一モノマー可変抗体ドメインである。ナノボディは、１２〜１５ｋＤａの分子量しか有さず、普通の抗体（１５０〜１６０ｋＤａ）よりずっと小さい。
【０１９３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原結合ドメインは、配列番号４３〜配列番号４５および配列番号３７〜配列番号３９によって示されるＣＤＲ（それぞれ、Ｇ３Ｈ８の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）、ならびに、配列番号５５〜配列番号５７および配列番号４９〜配列番号５１によって示されるＣＤＲ（それぞれ、Ｇ１Ｈ１２の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）の群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１９４】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体並びにそれらのフラグメントの産生方法は、当業者には周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８を参照されたい。この文献は、参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１９５】
本発明による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解的加水分解によって、またはフラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現系）中での発現によって調製されることができる。抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントを、抗体をペプシンで酵素切断して、Ｆ（ａｂ’）２として示される５Ｓフラグメントを得ることによって製造することができる。このフラグメントは、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを製造するために、チオール還元剤、および場合により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基に対する保護基を使用してさらに切断することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素切断により、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントが直接的に得られる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号、ならびにそれらに含まれる参考文献に記載されている（それらの特許は本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）。また、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、７３：１１９〜１２６、１９５６も参照のこと。抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成させるための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的な技術などもまた、フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用することができる。
【０１９６】
ＦｖフラグメントはＶＨ鎖およびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２６５９〜６２、１９７２に記載されているように非共有結合性であり得る。あるいは、可変鎖を、分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、または、グルタルアルデヒドなどの化学剤によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによりつながれたＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。この構造遺伝子は発現ベクターに導入され、続いて、発現ベクターは大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞により、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖が合成される。ｓＦｖを製造するための様々な方法が、例えば、ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：９７〜１０５、１９９１；Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、１９８８；Ｐａｃｋ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１２７１〜７７、１９９３；米国特許第４９４６７７８号（これは本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）によって記載されている。
【０１９７】
ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製される。例えば、ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１０６〜１０、１９９１を参照のこと。
【０１９８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体は、多価形態、例えば、四量体Ｆａｂ、ＩｇＭ抗体またはＩｇＧ１抗体などであり、したがって、標的に対するより大きいアビディティーを有する多価組成物を形成する。
【０１９９】
ヒトの治療または診断のためにはヒト化された抗体を用いることが好ましいことは理解されるであろう。非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、または抗体の他の抗原結合性の部分配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望する特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置換されているヒト免疫グロブリンレシピエント抗体が含まれる。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、あるいは取り込まれたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列においても、そのいずれにも見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、実質的にはすべての可変ドメインまたは１つ以上の（典型的には２つ）可変ドメインを含み、この場合、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部を、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の一部を少なくとも含む［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２）］。
【０２００】
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法がこの技術においては広く知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、輸入残基と呼ばれており、この輸入残基は、典型的には、輸入可変ドメインに由来する。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って本質的には行うことができる［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）］。従って、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全でないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり、この場合、一部のＣＤＲ残基およびおそらくは一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換される。
【０２０１】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリー［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］を含む、この分野で知られている様々な技術を使用して製造することができる。Ｃｏｌｅ他およびＢｏｅｒｎｅｒ他の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用することができる［Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１）］。同様に、ヒト抗体を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されている遺伝子組換え動物（例えば、マウス）に導入することによって作製することができる。抗原投与したとき、ヒト抗体の産生が認められ、この場合、その産生は、遺伝子再配置、組み立ておよび抗体レパートリーを含むすべての点に関してヒトにおいて見られる産生と非常に似ている。この方法は、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号、および下記の科学的刊行物：Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３（１９９５）に記載されている。
【０２０２】
（対象において、例えば、ヒトにおいて投与するための）インビボ使用のために、ヒト抗体またはヒト化抗体は一般に、非ヒト起源の抗体よりも良好に免疫学的に許容される傾向を有するであろう。これは、非ヒト抗体の非可変部分により、典型的には個体と同種であろうヒト抗体によって誘発される同種免疫応答よりも強力な異種免疫応答が誘発されやすいであろうからである。そのような免疫応答を最小限にすることが好ましいであろう。これは、このような免疫応答は、個体における抗体の半減期を短くし、したがって、その有効性を縮める傾向を有するであろうからである。さらには、そのような免疫応答は、例えば、有害な炎症反応を誘発することによって、個体にとって病原性であるかもしれない。
【０２０３】
代替において、ヒト起源の抗体またはヒト化抗体はまた、個体において抗体の定常領域によって活性化される機能的な生理学的機能（例えば、標的細胞に対する免疫応答）が所望される様々な適用（例えば、標的化された細胞殺傷など）のために好都合であろう。これらの場合において、抗体の機能的部分（例えば、Ｆｃ領域など）と、それと相互作用する分子（例えば、Ｆｃ受容体またはＦｃ結合性の補体成分など）とが、類似する起源（例えば、ヒト起源）であるとき、最適な機能的相互作用が生じる。
【０２０４】
適用および目的に依存して、本発明の抗体を用いることができる。これは、本発明の抗体が様々なイソ型のいずれかの定常領域またはその一部分を含むからである。本発明のいくつかの実施形態によれば、イソ型は、所望される生理学的影響を可能にするように、または阻害するように、あるいは、定常領域またはその一部分を介した抗体の望まれない特異的結合を阻害するように選択される。例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）を誘導するためには、イソ型はＩｇＧが可能である；マスト細胞／好塩基球によるＡＤＣＣを誘導するためには、イソ型はＩｇＥが可能である；また、好酸球によるＡＤＣＣを誘導するためには、イソ型はＩｇＥまたはＩｇＡが可能である。補体カスケードを誘導するために、抗体は、そのカスケードを開始させることができる定常領域またはその一部分を含むことができる。例えば、抗体は、Ｃ１ｑ媒介による補体カスケードを誘発するためにＩｇＧのＣｇａｍｍａ２ドメインまたはＩｇＭのＣｍｕ３ドメインを含むことが好都合であるかもしれない。
【０２０５】
逆に、免疫応答（例えば、上述の免疫応答など）を回避するために、あるいは、定常領域またはその一部分を介した特異的結合を回避するために、本発明の抗体は、関連のあるイソ型の（補体活性化のために要求される）定常領域、その一部分または特定のグリコシル化部位を含んでいなくもよい（そのような定常領域を欠いていてもよい）。
【０２０６】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、本発明のいくつかの実施形態のＭＨＣクラスＩＩ−ＧＡＤ抗原性ペプチドの単離された複合体と特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む単離された抗体が提供される。単離された抗体は抗原性ペプチドの非存在下でのＭＨＣクラスＩＩには結合せず、かつ、単離された抗体はＭＨＣクラスＩＩの非存在下での抗原性ペプチドには結合しない。
【０２０７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の抗体は、約１００ナノモル濃度以下である解離定数、例えば、約５０ナノモル濃度以下である解離定数、例えば、約２０ナノモル濃度以下である解離定数、例えば、約１０ナノモル濃度以下である解離定数によって特徴づけられる親和性により標的複合体（ＭＨＣクラスＩＩ−ＧＡＤ自己抗原）に結合する。
【０２０８】
抗体のＣＤＲが特定されると、従来の遺伝子操作技術を使用して、本明細書中に記載される抗体の各種形態または各種フラグメントのいずれかをコードする発現可能なポリヌクレオチドを、様々な関連した製造物を製造するために多くの方法のいずれかで合成し、改変することができる。
【０２０９】
例えば、本発明の高親和性実体（例えば、本発明の抗体）を作製するために、本発明の抗体のアミノ酸配列［例えば、配列番号３７（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの軽鎖のＣＤＲ１）、配列番号３８（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの軽鎖のＣＤＲ２）、配列番号３９（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの軽鎖のＣＤＲ３）、配列番号４３（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの重鎖のＣＤＲ１）、配列番号４４（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの重鎖のＣＤＲ２）、配列番号４５（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの重鎖のＣＤＲ３）、配列番号１（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの軽鎖のアミノ酸配列、図６Ａ）または配列番号３（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの重鎖のアミノ酸配列、図６Ｃ）］をコードする単離されたポリヌクレオチド配列［例えば、配列番号４０（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの軽鎖のＣＤＲ１）、配列番号４１（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの軽鎖のＣＤＲ２）、配列番号４２（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの軽鎖のＣＤＲ３）、配列番号４６（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの重鎖のＣＤＲ１）、配列番号４７（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの重鎖のＣＤＲ２）、配列番号４８（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの重鎖のＣＤＲ３）、配列番号２（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの軽鎖をコードする核酸配列、図６Ｂ）または配列番号４（Ｇ３Ｈ８  Ａｂの重鎖をコードする核酸配列、図６Ｄ）］が好ましくは、宿主細胞における発現のために好適な核酸構築物（発現ベクター）に連結される。そのような核酸構築物は、細胞におけるポリヌクレオチド配列の転写を構成的または誘導可能な様式で行わせるためのプロモーター配列を含む。
【０２１０】
本発明の核酸構築物はまた、エンハンサー、転写開始配列および翻訳開始配列、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、ならびに、ポリアデニル化シグナル、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、ならびに、３’ＬＴＲ、または、それらの一部；抗体ポリペプチドを宿主細胞から分泌させるためのシグナル配列；さらなるポリヌクレオチド配列、例えば、数個のタンパク質をただ１つのｍＲＮＡから翻訳することを可能にする配列（例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ））、および、プロモーターキメラなポリペプチドのゲノム組み込みのための配列；発現ペプチドの安定性、産生、精製、収率または毒性を高めるために操作される配列を含むことができる。
【０２１１】
哺乳動物発現ベクターの例には、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１，ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）、ならびに、それらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１２】
真核生物ウイルス（例えば、レトロウイルスなど）に由来する調節エレメントを含有する発現ベクターもまた使用することができる。ＳＶ４０ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシ乳頭腫ウイルスに由来するベクターには、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタイン・バールウイルスに由来するベクターには、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または、真核生物細胞における発現のために効果的であることが示されている他のプロモーターの命令のもとでのタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
【０２１３】
様々な方法を、本発明の核酸構築物を細胞に導入するために使用することができる。そのような方法が、一般には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９８９）；Ｃｈａｎｇ他、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｇａ他、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）；および、Ｇｉｌｂｏａ他［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４〜５１２、１９８６］に記載され、そのような方法には、例えば、組換えウイルスベクターを用いた安定的トランスフェクション、一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が含まれる。加えて、陽性−陰性の選択法については米国特許第５４６４７６４号および同第５４８７９９２号を参照のこと。
【０２１４】
組換えウイルスベクターは、様々な利点（例えば、潜伏感染および標的化特異性など）を提供するため、インビボ発現のために有用である。ウイルス感染による核酸の導入は、リポフェクションやエレクトロポレーションなどの他の方法と比べていくつかの利点を提供する。なぜなら、ウイルスの感染性の性質のため、高いトランスフェクション効率が得られるからである。
【０２１５】
現在好ましいインビボ核酸移入技術では、ウイルス構築物または非ウイルス構築物（例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、および、脂質に基づく系など）によるトランスフェクションが含まれる。遺伝子の脂質媒介による移入のための有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１４（１）：５４〜６５（１９９６）］。遺伝子治療において使用される最も好ましい構築物はウイルスであり、最も好ましくは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。
【０２１６】
上述のように、様々な原核生物細胞または真核生物細胞が、本発明の抗体を発現させるための宿主発現システムとして使用され得ることが理解される。これらには、微生物（例えば、コード配列を含有する組換えられたバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌など）；コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母；コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた植物細胞システム、または、コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミドなど）により形質転換された植物細胞システムが含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現システムもまた、本発明のポリペプチドを発現させるために使用することができる。
【０２１７】
組換え抗体ポリペプチドの回収が培養での適切な時間の後で行われる。表現「組換えポリペプチドを回収する」は、ポリペプチドを含有する発酵培地全体を集めることを示し、分離または精製のさらなる工程を意味する必要はない。上記にかかわらず、本発明の抗体ポリペプチドは、様々な標準的なタンパク質精製技術を使用して、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび示差的可溶化などを使用して精製することができる。
【０２１８】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、機能的成分（例えば、検出可能成分または治療成分など）にコンジュゲートされる本発明の高親和性実体（例えば、抗体）を含む分子（これはまた、「免疫コンジュゲート」として示される）が提供される。免疫コンジュゲート分子は、単離された分子が可能であり、例えば、可溶性分子または合成分子などが可能である。
【０２１９】
様々なタイプの検出可能成分またはレポーター成分を本発明の高親和性実体（例えば、本発明の抗体）にコンジュゲートすることができる。これらには、放射性同位体（例えば、［１２５］ヨウ素など）、リン光性化学物質、化学発光性化学物質、蛍光性化学物質（蛍光団）、酵素、蛍光性ポリペプチド、親和性タグ、および、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）または磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）によって検出可能な分子（造影剤）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２０】
好適な蛍光団の例には、フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ−クロム、ローダミン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、テキサスレッドおよびＰＥ−Ｃｙ５などが含まれるが、これらに限定されない。蛍光団選択、蛍光団を様々なタイプの分子に連結する方法に関するさらなる指針については、下記を参照のこと：Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １９９２−１９９４”、第５版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）；米国特許第６０３７１３７号（Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｉｎ  Ｉｎｃ．）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９５）；Ｋａｙ  Ｍ．他、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４：２９３；Ｓｔｕｂｂｓ他、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：９３７；Ｇａｋａｍｓｋｙ  Ｄ．他、「受容体の化学量論を蛍光共鳴エネルギー転移によって評価する」、“Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｒｃｈ”、第２版、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｃ．およびＨｏｒｔｏｎ  Ｒ．（編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＵＫ（２００１）；米国特許第６３５０４６６号（Ｔａｒｇｅｓｏｍｅ，Ｉｎｃ．）。蛍光性の検出可能成分にコンジュゲートされたときの高親和性実体（例えば、抗体）を検出するために使用することができる蛍光検出方法には、例えば、蛍光活性化フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、免疫蛍光共焦点顕微鏡法、蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が含まれる。
【０２２１】
数多くのタイプの酵素を本発明のいくつかの実施形態の高親和性実体（例えば、抗体）に結合させてもよく［例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）］、酵素コンジュゲート化抗体の検出を、この技術分野で知られているＥＬＩＳＡ（例えば、溶液中）、酵素結合免疫組織化学アッセイ（例えば、固定処理された組織において）、酵素結合化学発光アッセイ（例えば、電気泳動で分離されたタンパク質混合物において）または他の方法を使用して行うことができる［例えば、Ｋｈａｔｋｈａｔａｙ  ＭＩ．およびＤｅｓａｉ  Ｍ．、１９９９、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、２０：１５１〜８３；Ｗｉｓｄｏｍ  ＧＢ．、１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３２：４３３〜４０；Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｅ．他、１９８３、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、４：２０９〜３２７；Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ  Ｍ．、１９８０、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８：１９７〜２０８；Ｓｃｈｕｕｒｓ  ＡＨ．およびｖａｎ  Ｗｅｅｍｅｎ  ＢＫ．、１９８０、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、１：２２９〜４９を参照のこと］。
【０２２２】
親和性タグ（または結合対のメンバー）は、対応する抗体によって特定可能な抗原［例えば、抗ＤＩＧ抗体によって特定されるジゴキシゲニン（ＤＩＧ）］、または、タグに対する大きい親和性を有する分子［例えば、ストレプトアビジンおよびビオチン］が可能である。親和性タグと結合する抗体または分子は上記のように蛍光標識することができ、または、上記のような酵素にコンジュゲートすることができる。
【０２２３】
様々な方法がこの技術分野では広く実施されるが、これらを、ストレプトアビジン分子またはビオチン分子を本発明の抗体に結合させるために用いることができる。例えば、ビオチン分子を、下記の実施例の節で記載されるように、また、Ｄｅｎｋｂｅｒｇ  Ｇ．他、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０：３５２２〜３５３２に記載されるように、ビオチンタンパク質リガーゼ（例えば、ＢｉｒＡ）の認識配列を介して本発明の抗体に結合させることができる。代替において、ストレプトアビジン分子を、本質的には下記に記載されるように、抗体フラグメント（例えば、単鎖Ｆｖなど）に結合させることができる：Ｃｌｏｕｔｉｅｒ  ＳＭ．他、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３７：１０６７〜１０７７；Ｄｕｂｅｌ  Ｓ．他、１９９５、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１７８：２０１；Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳ．他、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０３：４６；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ．他、１９９５、Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、６：９３；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ．他、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９：２０３；Ｐｅａｒｃｅ  ＬＡ．他、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｌ、４２：１１７９〜１１８８。
【０２２４】
ストレプトアビジンにコンジュゲートされる様々な機能的成分（例えば、蛍光団など）が免疫蛍光フローサイトメトリー試薬の本質的にすべての主要な供給者から市販されている（例えば、ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎまたはＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。
【０２２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ビオチンコンジュゲート化抗体が、多価組成物（例えば、抗体の二量体形態または四量体形態）を形成するためにストレプトアビジン分子に結合させられる。
【０２２６】
表１には、本発明の抗体にコンジュゲートすることができる特定可能な成分の限定されない例が提供される。
2013538555.tif 000002
【０２２７】
述べられたように、高親和性実体（例えば、抗体）は治療成分にコンジュゲートすることができる。治療成分は、例えば、細胞毒性成分、毒性成分、サイトカイン成分、および、本発明の抗体に対する異なる特異性を含む第２の抗体成分が可能である。
【０２２８】
本発明の高親和性実体（例えば、抗体）にコンジュゲートすることができる治療成分の限定されない例が本明細書中下記の表２に提供される。
2013538555.tif 000003
【０２２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、毒性成分はＰＥ３８ＫＤＥＬである（タンパク質については配列番号７６、核酸については配列番号７７）。
【０２３０】
機能的成分（本発明の検出可能成分または治療成分）は、状況、適用および目的に依存して、様々な方法で本発明の高親和性実体（例えば、抗体）に結合させることができ、またはコンジュゲートすることができる。
【０２３１】
機能的成分がポリペプチドであるとき、免疫コンジュゲートは組換え手段によって製造することができる。例えば、毒素（例えば、ＰＥ３８ＫＤＥＬ）または蛍光タンパク質［例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）］をコードする核酸配列を、本発明の高親和性実体（例えば、抗体）をコードする核酸配列と読み枠を合わせて連結し、組換えコンジュゲート化抗体を産生させるために宿主細胞において発現させることができる。代替において、機能的成分は、例えば、定義された順序での１つまたは複数のアミノ酸残基の段階的付加によって、例えば、固相ペプチド合成技術などによって化学合成することができる。
【０２３２】
機能的成分はまた、この技術分野で広く実施される標準的な化学合成技術［例えば、ｈｙｐｅｒｔｅｘｔｔｒａｎｓｆｅｒｐｒｏｔｏｃｏｌ：／／ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ（ｄｏｔ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ｄｏｔ）ｏｒｇ／ｐｏｒｔａｌ／Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照のこと］を使用して、例えば、（機能的成分がポリペプチドであるときには）ペプチド結合を介するように、あるいは、介在するリンカー要素、例えば、リンカーペプチドまたは他の化学的成分（例えば、有機ポリマーなど）などへの共有結合による結合を介するように、直接的または間接的であれ、何らかの好適な化学的連結を使用するなどして本発明の高親和性実体（例えば、抗体）に結合させることができる。キメラなペプチドを、ペプチドのカルボキシ（Ｃ）末端またはアミノ（Ｎ）末端での結合を介して、あるいは、内部の化学基（例えば、直鎖状の側鎖、分岐した側鎖または環状の側鎖、ならびに、内部の炭素原子または窒素原子など）への結合を介して連結することができる。抗体の蛍光標識化の記載が、米国特許第３９４０４７５号、同第４２８９７４７号および同第４３７６１１０号に詳しく提供される。
【０２３３】
ペプチド成分（治療成分または検出可能成分）を本発明の高親和性実体（例えば、抗体）にコンジュゲートするための例示的な方法が本明細書中下記に記載される。
【０２３４】
ＳＰＤＰによるコンジュゲート化−ＳＰＤＰによるコンジュゲート化方法の限定されない一例が、Ｃｕｍｂｅｒ他（１９８５、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１１２：２０７〜２２４）に記載される。簡単に記載すると、ペプチド（例えば、検出可能成分または治療成分など）（例えば、１．７ｍｇ／ｍｌ）を１０倍過剰のＳＰＤＰ（エタノールにおける５０ｍＭ）と混合し、抗体を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１０Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）における２５倍過剰のＳＰＤＰと混合し、反応液のそれぞれを室温で約３時間インキュベーションする。その後、反応液をＰＢＳに対して透析する。ペプチドを、例えば、室温で１時間、５０ｍＭのＤＴＴにより還元する。還元されたペプチドを、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）とのＧ−２５カラムでの平衡化によって脱塩する（カラム体積あたり５％までのサンプル）。還元されたペプチドを１：１０の抗体：ペプチドのモル比でＳＰＤＰ−抗体と一緒にし、４℃で一晩インキュベーションして、ペプチド−抗体コンジュゲートを形成させる。
【０２３５】
グルタルアルデヒドによるコンジュゲート化−グルタルアルデヒドによるコンジュゲート化方法の限定されない一例が、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に記載される。簡単に記載すると、抗体およびペプチド（１．１ｍｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍリン酸塩、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．８）における０．０５％グルタルアルデヒドと１０倍過剰で混合し、室温で２時間反応させる。０．０１Ｍのリシンを、過剰な部位をふさぐために加えることができる。反応後、過剰なグルタルアルデヒドを、ＰＢＳにより平衡化されるＧ−２５カラムを使用して除く（カラム体積あたり１０％（ｖ／ｖ）のサンプル）。
【０２３６】
カルボジイミドによるコンジュゲート化−抗体とのペプチドのコンジュゲート化を、例えば、４−ジメチルアミノピリジンの存在下、脱水剤（例えば、カルボジイミドなど）を使用して達成することができる。カルボジイミドによるコンジュゲート化を、ペプチドのカルボキシル基と、（エステル結合の形成をもたらす）抗体のヒドロキシル基との間における共有結合、または、（アミド結合の形成をもたらす）抗体のアミノ基との間における共有結合、または、（チオエステル結合の形成をもたらす）抗体のスルフヒドリル基との間における共有結合を形成させるために使用することができる。同様に、カルボジイミドによるカップリングを、抗体の炭素基と、ペプチドのヒドロキシル基、アミノ基またはスルフヒドリル基との間における類似した共有結合を形成させるために使用することができる［Ｊ．Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎ’ｓ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（３４９頁〜５０頁＆３７２頁〜７４頁（第３版）、１９８５）を参照のこと］。例えば、ペプチドを、カルボジイミドを使用して、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどを使用して共有結合により抗体にコンジュゲートすることができる［Ｂ．Ｎｅｉｓｅｓ他（１９７８）、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、１７：５２２；Ａ．Ｈａｓｓｎｅｒ他（１９７８）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、４４７５；Ｅ．Ｐ．Ｂｏｄｅｎ他（１９８６）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５０：２３９４；およびＬ．Ｊ．Ｍａｔｈｉａｓ（１９７９）、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、５６１］。
【０２３７】
上述のように、また、下記の実施例の節においてさらに例示されるように、本発明のいくつかの実施形態による単離された高親和性実体（例えば、抗体）は、ＭＨＣクラスＩＩと糖尿病関連自己抗原（例えば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチド）との複合体を抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞など）の表面において検出するために使用することができる。
【０２３８】
したがって、本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの細胞における提示を検出する方法が提供される。この方法は、細胞を、免疫複合体の形成を許す条件のもと、本発明のいくつかの実施形態の高親和性実体、本発明のいくつかの実施形態の分子、または、本発明のいくつかの実施形態の抗体と接触させることによって行われ、ただし、免疫複合体の所定の閾値を超える存在またはレベルが糖尿病関連自己抗原性ペプチドの細胞における提示を示している。
【０２３９】
ＧＡＤ自己抗原性ペプチド（例えば、ＧＡＤ抗原）を提示する細胞は、任意の有核細胞（例えば、血液、膵臓およびリンパ系器官（例えば、胸腺、骨髄、リンパ節およびリンパ濾胞など）における抗原提示細胞（ＡＰＣ）など）であり得る。
【０２４０】
細胞を本発明の高親和性実体（例えば、抗体）／分子または多価組成物と接触させることを、インビトロ（例えば、細胞株において）、エクスビボまたはインビボで行うことができる。
【０２４１】
述べられたように、本発明の方法は、免疫複合体を形成させるために十分な条件のもとで行われる；そのような条件（例えば、適切な濃度、緩衝液、温度、反応時間）、同様にまた、そのような条件を最適化するための方法が当業者には知られており、また、様々な例が本明細書中に開示される。
【０２４２】
本明細書中で使用される場合、表現「免疫複合体」は、本発明のいくつかの実施形態の高親和性実体（例えば、抗体）と、ＭＨＣクラスＩＩ−ＧＡＤ自己抗原性ペプチド（例えば、ＧＡＤペプチド）とを含む複合体を示す。本発明の免疫複合体の存在またはレベルを明らかにすることが、高親和性実体（例えば、抗体）が結合させられる検出可能成分を使用して行われ、また、本発明の免疫複合体の存在またはレベルを明らかにすることを、この技術分野で知られている様々な方法および本明細書中に記載される様々な方法を使用して行うことができる。
【０２４３】
本発明の免疫複合体の存在またはレベルを明らかにすることが、高親和性実体（例えば、抗体）が結合させられる検出可能成分を使用して行われ、また、本発明の免疫複合体の存在またはレベルを明らかにすることを、この技術分野で知られている様々な方法および本明細書中に記載される様々な方法を使用して行うことができる。
【０２４４】
試験された細胞（例えば、その必要性のある対象の細胞）における免疫複合体のレベルが所定の閾値に対して比較される。閾値は、知られている参照レベルおよび／またはコントロール細胞におけるレベルに基づいて決定することができる。コントロール細胞は、コントロールの健康な対象（例えば、糖尿病と診断されない対象、または、糖尿病についての危険性がない対象）から得ることができ、あるいは、ＭＨＣ−ペプチド複合体を形成する特異的なＭＨＣ分子（例えば、ＤＲ４）を有しない対象から得ることができる。本発明のいくつかの実施形態によれば、コントロールの対象は、その必要性のある対象と同じ年齢、体重、性別などにより好ましくは一致する、その必要性のある対象と同じ生物種（例えば、ヒト）である。
【０２４５】
したがって、本発明の教示は、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドを提示する細胞（例えば、ＧＡＤ提示細胞）を対象の生物学的サンプルにおいて検出するために使用することができる。
【０２４６】
本明細書中で使用される場合、表現「ＧＡＤ自己抗原性ペプチドを提示する細胞」は、どのような細胞またはその一部分であれ、ＭＨＣクラスＩＩと、ＭＨＣ拘束のＧＡＤ自己抗原性ペプチドとの複合体を呈示する対象の細胞またはその一部分を示す。
【０２４７】
生物学的サンプルは、どのようなサンプルであれ、ＭＨＣクラスＩＩ−ＧＡＤ自己抗原性ペプチド複合体を提示すると推定される細胞またはその一部分（例えば、細胞破片、膜、小胞）を含有するサンプルが可能である。
【０２４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は、１型糖尿病を発症する危険性がある。１型糖尿病を発症する危険性がある対象の限定されない例には、ＨＬＡ  ＤＲＢ１＊０３、ＤＲＢ１＊０４；ＤＱＢ１＊０３０２遺伝子型、ならびに、ＤＲ３−ＤＱ２ハプロタイプおよびＤＲ４−ＤＱ８ハプロタイプを有する対象が含まれる。
【０２４９】
１型糖尿病は膵臓のインスリン産生ベータ細胞の自己免疫性破壊から生じ、これにより、インスリンの不足が引き起こされ、その後、増大した血中グルコースおよび尿中グルコースが引き起こされる。古典的症状には、多尿（頻繁な排尿）、多飲（増大した渇き）、多食（増大した空腹）および体重減少が含まれる。
【０２５０】
今日まで、１型糖尿病の診断は、下記のうちのいずれか１つを明らかにすることによって行われている：７．０ｍｍｏｌ／Ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）以上の空腹時血漿グルコースレベル；ブドウ糖負荷試験でのような７５ｇ経口グルコース負荷後２時間における１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ（２００ｍｇ／ｄＬ）以上の血漿グルコース；１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ（２００ｍｇ／ｄＬ）以上の高血糖症および日常的血漿グルコースの症状；６．５以上の糖化ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ１Ｃ）。したがって、ほとんどの場合において、１型糖尿病が診断されるときには、膵臓におけるベータ細胞のほとんどが破壊されている。
【０２５１】
１型糖尿病の早期徴候には、膵島自己抗体の発達が含まれる。４つの膵島抗原群に対する自己抗体が今のところ特定されている：インスリンまたはプロインスリン、ＧＡＤ６５またはＧＡＤ６７、ＩＡ−２（ホグリン）およびＺｎＴ８。膵島自己抗体の数、より大きい力価、親和性、および、エピトープ反応性の広さが、Ｔ１Ｄの危険性に影響を及ぼす自己抗体の特徴である。家族歴情報、遺伝的要因、自己抗体、年齢およびベータ細胞機能マーカーの組合せは、経験的に計算することができる疾患リスク決定をもたらす。
【０２５２】
実施例の節の実施例４において示されるように、本発明のいくつかの実施形態の単離された抗体は、（ＭＨＣクラスＩＩ−ＧＡＤ抗原性ペプチドを提示する）ＡＰＣを糖尿病Ｂ７／ＤＲ４マウスの浸潤された膵島において検出することができることが示された。そのうえ、本発明のいくつかの実施形態の単離された抗体は、ＡＰＣを糖尿病発症前の若いＢ７／ＤＲ４マウスの浸潤された膵島において検出することができること、したがって、１型糖尿病を引き起こすベータ細胞破壊の早期徴候を診断することができることが示された。
【０２５３】
現在利用可能な診断ツールを使用した場合、Ｉ型糖尿病の診断が対象において行われるとき、インスリン産生細胞の約９０％が破壊されている（Ｇｅｐｔｓ  Ｗ．、若年性糖尿病における膵臓の病理解剖学、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９６５、１４：６１９〜６３３）。
【０２５４】
１型糖尿病を疾患の早期段階で診断することは、膵臓におけるベータ細胞のすべてが破壊されているとは限らないので、非常に重要であることに留意しなければならない。したがって、１型糖尿病の早期検出は、完全な診断が行われる前においては、ベータ細胞の完全な破壊を防止することになる臨床的な介入および処置を可能にするので、非常に重要である。
【０２５５】
抗原特異的な寛容取り組みはＴ１Ｄの望ましい処置である。これらの開発中の処置戦略の中心は、病原的な自己反応性Ｔ細胞を自己抗原特異的な様式で安全に不活性化し、一方で、免疫系の残りは乱されないままにしておくことである。免疫応答の抗原特異的性質を抗原特異的介入の前に特定することは、対象の目下の自己免疫応答のための好適な処置の調節を可能にするであろう。本発明のいくつかの実施形態の単離された抗体は、特異的な自己抗原の提示を検出することができること、したがって、自己免疫プロセスの特異的抗原性性質を特定することができることが示された。したがって、本発明の教示は、正確かつ最も好適な抗原特異的介入戦略を選択するために使用することができる。
【０２５６】
したがって、本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を対象において診断する方法が提供される。この方法は、対象の細胞を、免疫複合体の形成を許す条件のもと、本発明のいくつかの実施形態の高親和性実体（例えば、抗体）、本発明のいくつかの実施形態の分子、または、本発明のいくつかの実施形態の多価抗体と接触させることによって行われ、ただし、細胞における免疫複合体の所定の閾値を超える存在またはレベルが対象における１型糖尿病を示している。
【０２５７】
本明細書中で使用される場合、用語「診断する」は、病状の有無を明らかにすること、病状または症状を分類すること、病状の重篤度を明らかにすること、病状の進行をモニターすること、病状の結果および／または回復の見込みを予測することを示す。
【０２５８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、１型糖尿病の診断は、ベータ細胞の破壊が始まらないうちに、ベータ細胞が依然として機能的である（すなわち、インスリンをグルコースレベルにおける上昇に応答して産生する）ときにおいてさえ、疾患の早期徴候を検出することに関連する。
【０２５９】
診断を容易にするために、上記の教示は、この技術分野で広く知られている、１型糖尿病を診断する他の方法と組み合わせることができる。
【０２６０】
本発明者らによって示されるように、浸潤された膵島におけるＡＰＣ（樹状細胞、マクロファージなど）によるＭＨＣクラスＩＩ−ＧＡＤ抗原性ペプチド複合体の提示が疾患の早期段階で始まるので、ＭＨＣクラスＩＩとＧＡＤ自己抗原性ペプチドとの複合体を提示する細胞に特異的に結合する抗体は、１型糖尿病を処置するために使用することができる。
【０２６１】
したがって、本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を処置する方法であって、その必要性のある対象に、治療効果的な量の本発明のいくつかの実施形態の単離された高親和性実体（例えば、抗体）、本発明のいくつかの実施形態の分子（例えば、治療成分（例えば、毒素など）にコンジュゲートされる高親和性実体を含む分子）、本発明のいくつかの実施形態のそれらを含む多価組成物、それらをコードする単離されたポリヌクレオチドまたは核酸構築物を投与し、それにより、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を処置する方法が提供される。
【０２６２】
用語「処置する」は、疾患、障害または状態の発症を阻害または停止すること、および／あるいは、疾患、障害または状態の軽減、寛解または退行を引き起こすことを示す。当業者は、様々な方法論およびアッセイを、疾患、障害または状態の発症を評価するために使用することができ、また、同様に、様々な方法論およびアッセイを、疾患、障害または状態の軽減、寛解または退行を評価するために使用することができることを理解する。
【０２６３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、１型糖尿病の処置が、ＡＰＣにおけるＭＨＣクラスＩＩ／ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの提示を阻止すること、したがって、特異的なＴ細胞による抗原提示細胞の認識を防止または回避することによって達成される。
【０２６４】
ＡＰＣによるＭＨＣクラスＩＩ−抗原性ペプチド複合体の提示を阻止することによって、これらのＡＰＣによって誘導される炎症プロセスおよび炎症反応もまた阻止され、したがって、このことは、インスリンを産生する膵島におけるベータ細胞の破壊を軽減または解消することに留意しなければならない。
【０２６５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の単離された抗体による処置が、疾患の早期段階において、すなわち、糖尿病症状の発症の前に行われる。
【０２６６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の単離された高親和性実体（例えば、抗体）による処置では、ベータ細胞自身のインスリン産生が温存されるので、グルコース血中レベル増大の症状、および、インスリン投与（例えば、注射による投与）のその後の必要性が防止される。
【０２６７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、阻害取り組みのために、すなわち、ＡＰＣにおけるＭＨＣクラスＩＩ−Ｉ型糖尿病関連自己抗原提示（例えば、ＡＰＣにおけるＭＨＣクラスＩＩ−ＧＡＤ抗原提示）を阻害するために、高親和性実体（例えば、抗体）のエフェクター機能が、高親和性実体（例えば、抗体）が抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性を欠くように、または、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）活性を欠くように操作される。例えば、本発明のいくつかの実施形態の抗体は、関連のあるイソ型の（補体活性化のために要求される）定常領域、その一部分または特定のグリコシル化成分を欠いている。
【０２６８】
加えて、または、代替において、本発明の高親和性実体（例えば、抗体）は、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドをＭＨＣクラスＩＩとの複合体で呈示するＡＰＣを直接的に殺傷するために使用することができる。
【０２６９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、殺傷取り組み（すなわち、ＭＨＣクラスＩＩとＧＡＤ自己抗原性ペプチドとの複合体を提示するＡＰＣを殺傷すること）のために、単離された高親和性実体（例えば、抗体）は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介することができる裸の高親和性実体である。
【０２７０】
本明細書中で使用される場合、用語「裸の」は、コンジュゲートされた成分（例えば、検出可能成分または治療成分など）を欠いていることを示す。
【０２７１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、裸の抗体は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する定常領域、その一部分または特定のグリコシル化成分を含む。
【０２７２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、殺傷取り組み（すなわち、ＭＨＣクラスＩＩ−ＧＡＤ自己抗原性ペプチドを提示するＡＰＣを殺傷すること）のために、単離された高親和性実体（例えば、抗体）は、ＭＨＣクラスＩＩ−ＧＡＤ抗原性複合体を提示するＡＰＣを殺傷するであろう治療成分（例えば、薬物、毒性成分）にコンジュゲートされる。
【０２７３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬物は、膵島における局所的炎症の軽減または阻害を生じさせるであろう抗炎症性薬物またはサイトカインであり、したがって、インスリン産生ベータ細胞に対する損傷の解放および阻害を生じさせるであろう。
【０２７４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の単離された高親和性実体（例えば、抗体）、これを含む分子、多価抗体組成物、ポリヌクレオチドおよび／または核酸構築物は、ＭＨＣクラスＩＩ−ＧＡＤ自己抗原性ペプチド（例えば、ＧＡＤ）を提示する細胞をその必要性のある対象において殺傷することができる。
【０２７５】
本発明の高親和性実体（例えば、抗体）、本発明の分子（これは、治療成分または検出可能成分にコンジュゲートされる高親和性実体（例えば、抗体）を含む）、本発明の多価組成物、本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸構築物はそれ自体で与えることができ、または、医薬組成物として投与することができる。
【０２７６】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０２７７】
本明細書中において、用語「有効成分」は、生物学的影響の根拠になり得る本発明の高親和性実体（例えば、抗体）、本発明の分子（これは、治療成分または検出可能成分にコンジュゲートされる高親和性実体（例えば、抗体）、あるいは、それをコードするポリヌクレオチドを含む）、本発明の多価組成物、本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸構築物を示す。
【０２７８】
本明細書中以降、表現「生理学的に許容され得るキャリア」および表現「医薬的に許容され得るキャリア」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。
【０２７９】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２８０】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０２８１】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれることができる。
【０２８２】
あるいは、例えば、患者の組織領域に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に医薬組成物を投与することができる。
【０２８３】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
【０２８４】
従って、本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容され得るキャリアを使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０２８５】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０２８６】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのようなキャリアは、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
【０２８７】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
【０２８８】
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０２８９】
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０２９０】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
【０２９１】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０２９２】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０２９３】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
【０２９４】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
【０２９５】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、処置されている対象の障害（１型糖尿病）の症状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分［例えば、本発明の高親和性実体、例えば、本発明の抗体、本発明の分子（例えば、治療的または検出可能成分にコンジュゲートされた抗体を含む分子）、本発明の多価組成物、本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸構築物］の量を意味する。
【０２９６】
治療有効量の決定は、特に、本明細書に与えられる詳細な開示に鑑みれば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２９７】
例えば、有効成分（例えば、高親和性実体、例えば、本発明の抗体、または、それをコードするポリヌクレオチド）の１型糖尿病処置に対する影響は、広く知られている方法を使用して、グルコースのレベルを処置された対象の血液においてモニターすること、および／または、ヘモグロビンＡ１ｃのレベルを測定することによって評価することができる。
【０２９８】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外アッセイおよび細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて決定されることができ、そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０２９９】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。
【０３００】
投与量および投与間隔を、生物学的影響を誘導または抑制するために十分である有効成分の血漿中レベルまたは脳内レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するであろうが、インビトロでのデータから推測することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は個々の特性および投与経路に依存するであろう。様々な検出アッセイを、血漿中濃度を求めるために使用することができる。
【０３０１】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０３０２】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０３０３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の治療剤（例えば、本発明の高親和性実体、例えば、本発明の抗体、分子および／または多価組成物）は、１型糖尿病を処置するために設計される他の薬物（１つまたは複数）との併用で対象に与えることができる（併用治療）。そのような薬物の限定されない例には、インスリン（例えば、組換えヒトインスリン、ブタ由来インスリン）および抗ＣＤ３  ｍＡｂが含まれる。インスリンを投与する方法には、注射、インスリンポンプおよび吸入インスリンが含まれ、これらの方法は様々な回数で利用可能となっている。膵臓移植もまた、１型糖尿病を処置するために使用されている。併用治療は、処置された対象における本発明の薬剤の治療効果を増大させることができる。
【０３０４】
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ（米国食品医薬品局）承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパック）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上でさらに詳述されたように、示された状態を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０３０５】
ＭＨＣクラスＩＩ／ＧＡＤ自己抗原性ペプチド（例えば、ＧＡＤ抗原性ペプチド）の複合体を（単離された形態で、または、細胞の表面に呈示される場合のどちらでも）検出するために本明細書中上記で記載される本発明のいくつかの実施形態の薬剤は、１型糖尿病を診断すること、１型糖尿病に対する素因を明らかにすること、および／または、１型糖尿病を評価することにおける使用のための適切な説明書、ならびに、それらにおける使用のためのＦＤＡ承認を示す標識と一緒であることが好ましいが、診断キット／製造物に含めることができる。
【０３０６】
そのようなキットは、例えば、上記診断剤のうちの少なくとも１つ（例えば、高親和性実体、例えば、抗体）を含む少なくとも１つの容器と、別の容器に包装される画像化剤（例えば、酵素、二次抗体、緩衝液、発色基質、蛍光発生物質）とを含むことができる。キットはまた、キットの貯蔵寿命を改善するための適切な緩衝液および保存剤を含んでいてもよい。
【０３０７】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドとから構成される複合体に特異的に結合する高親和性実体を単離する方法であって、
（ａ）複数の高親和性実体を含むライブラリーを本発明のいくつかの実施形態の単離された複合体によりスクリーニングすること；および
（ｂ）本発明のいくつかの実施形態の単離された複合体に特異的に結合し、かつ、ＧＡＤ自己抗原性ペプチドの非存在下でのＭＨＣクラスＩＩ、または、ＭＨＣクラスＩＩの非存在下でのＧＡＤ自己抗原性ペプチドには結合しない少なくとも１つの高親和性実体を単離し、
それにより、ＭＨＣクラスＩＩとＧＡＤ自己抗原性ペプチドとの複合体に特異的に結合する高親和性実体を単離すること
を含む方法が提供される。
【０３０８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、高親和性実体はさらに、ＭＨＣクラスＩＩとＧＡＤ自己抗原性ペプチドとの複合体の天然型立体配座に特異的に結合する。
【０３０９】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、本発明のいくつかの実施形態の単離された、ＭＨＣクラスＩＩとＧＡＤ自己抗原性ペプチドとの複合体と、コンジュゲートされた機能的成分とを含む組成物が提供される。
【０３１０】
コンジュゲートされた機能的成分は、上記で記載されるような治療成分または検出可能成分が可能である。機能的成分のコンジュゲート化を、上記および／または米国特許出願公開第２００３０１６６２７７号（これは全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるように行うことができる。
【０３１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、機能的成分は、細胞表面マーカーに特異的な抗体またはフラグメントを含む。細胞表面マーカーが抗原提示細胞において発現され得る。
【０３１２】
細胞表面マーカーの例には、腫瘍細胞、上皮細胞、線維芽細胞およびＴ細胞の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２５）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、機能的成分は治療成分を含み、例えば、サイトカインまたはリンホカインなどを含む。サイトカインまたはリンホカインは、直接的に、あるいは、例えば、多価化合物の形成（例えば、ストレプトアビジンまたはアビジンを使用する多価化合物の形成）およびビオチン化されたサイトカインまたはリンホカインを介してのどちらであっても、ＭＨＣクラスＩＩとＧＡＤ自己抗原性ペプチドとの複合体に連結することができる。
【０３１４】
サイトカインまたはリンホカインの限定されない例には、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８）、アルファ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−アルファ）、ベータ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−ベータ）、ガンマ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−ガンマ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ、例えば、ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ）が含まれる。
【０３１５】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、上記で記載されるように、本発明のいくつかの実施形態の組成物と、治療的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物が提供される。
【０３１６】
本発明のいくつかの実施形態の組成物（例えば、機能的成分にコンジュゲートされるＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体を含む組成物）は、ＭＨＣクラスＩＩ／ＧＡＤ自己抗原性ペプチド複合体を専門の抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞またはマクロファージなど）、腫瘍細胞、上皮細胞、線維芽細胞、Ｔ細胞または他の細胞に導くことによって、免疫応答を調節すること（すなわち、免疫応答を阻害すること、または刺激することのどちらでも）、望ましい免疫応答（例えば、感染性作用因子またはガンに対する免疫応答）を刺激すること、望ましくない免疫応答（例えば、アレルギー応答、同種移植片拒絶反応および自己免疫疾患など）を阻害することのために有用である。標的化された細胞タイプに依存して、このことは、抗原特異的なＴ細胞活性の非常に効率的な刺激または阻害のどちらでも引き起こすであろう。
【０３１７】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０３１８】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０３１９】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０３２０】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０３２１】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０３２２】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０３２３】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０３２４】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０３２５】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０３２６】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０３２７】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０３２８】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０３２９】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａ��ｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０３３０】
一般的な材料および実験方法
Ｓ２細胞におけるＤＲ４分子の産生−Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ２細胞における誘導性発現のためのＤＥＳ  ＴＯＰＯ  ＤＲ−Ａ１＊０１０１／ＤＲ−Ｂ１＊０４０１（ＨＡ−３０７−３１９）プラスミドは、以前に報告されたように（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，Ｐ．他、２００４）、ＤＲ−Ｂ１＊０４０１（ＧＡＤ５５５〜５６７）構築物のクローニング、トランスフェクション、および組換え４ドメインＭＨＣクラスＩＩの発現のために使用された。簡単に述べると、これらの構築物において、ＤＲ−４およびＤＲ−Ｂ鎖の細胞内ドメインがヘテロダイマー組立てのためにＦｏｓおよびＪｕｎ転写因子のロイシンジッパー二量体化ドメインによって置き換えられた。抗原性ペプチドを、柔軟なリンカーを介してＤＲ−Ｂ鎖のＮ末端に導入した。ビオチン化のためのＢｉｒＡ認識配列をＤＲ−Ａ鎖のＣ末端に導入した。ＤＲ−ＡおよびＤＲ−Ｂプラスミドは、セルフェクチン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＳ２細胞中へｐＣｏＢｌａｓｔ選択ベクターで共トランスフェクトされた。安定な単一細胞系譜クローンは、タンパク質発現のために確認された。ＣｕＳＯ４での誘導後、細胞上澄みは回収され、ＤＲ４複合体は、抗ＤＲ  ＬＢ３．１（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−２９８）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によってアフィニティ精製された。精製されたＤＲ４複合体は、Ｂｉｒ−Ａリガーゼ（Ａｖｉｄｉｔｙ）によってビオチン化され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴づけされた。複合体の正しい折り畳みは、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおける抗ＤＲ立体配座感受性ｍＡｂ（Ｌ２４３）の認識によって確認された。
【０３３１】
ビオチン化された複合体上でのファージＡｂの選択−ビオチン化された複合体上でのファージＡｂの選択は、記述されたようにして（Ｃｏｈｅｎ  ＣＪ他、２００３，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００３，１６：３２４−３２）行われた。簡単に述べると、３．７×１０１０個の異なるＦａｂクローンからなる大きいヒトＦａｂライブラリーが、選択のために使用された（ｄｅ  Ｈａａｒｄ  Ｈ．Ｊ．他、１９９９）。ファージは、ストレプトアビジンで被覆された常磁性体ビーズ（２００μｌ；Ｄｙｎａｌ）と共にまず予めインキュベートされて、ストレプトアビジン結合剤が涸渇された。残りのファージは、減少された量のビオチン化されたＭＨＣ−ペプチド複合体と共にパンニングのために続いて使用された。ストレプトアビジンを涸渇されたライブラリーは、可溶性ビオチン化ＤＲ４／ＧＡＤ（第１ラウンドについては５００ｎＭ、それ以降のラウンドについては１００ｎＭ）を有する溶液中で室温で３０分間、インキュベートされた。ストレプトアビジンで被覆された磁気ビーズ（選択の第１ラウンドについては２００μｌ、それ以降のラウンドについては１００μｌ）が、混合物に添加され、室温で１０〜１５分間インキュベートされた。ビーズは、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１２回徹底的に洗浄され、ＰＢＳでさらに２回洗浄された。結合されたファージは、トリエチルアミンで溶出され（１００ｍＭ、室温で５分間）、次に、ＴｒｉｓーＨＣｌ（１Ｍ，ｐＨ７．４）で中和され、３７℃で３０分間大腸菌ＴＧ１細胞（ＯＤ＝０．５）を感染させるために使用された。選択されたＡｂの多様性は、Ａｂ  Ｖ遺伝子配列の頻繁なカッターである制限エンドヌクレアーゼ（ＢｓｔＮＩ）を使用したＤＮＡフィンガープリンティングによって決定された。
【０３３２】
可溶性組換えＦａｂ  Ａｂの発現および精製−ＴＧ１またはＢＬ２１細胞は、ＯＤ６００＝０．８〜１．０になるまで増殖され、３０℃で３〜４時間ＩＰＴＧを添加することによって組換えＦａｂ  Ａｂを発現するように誘導された。ペリプラズム内容物は、予め洗浄されたＴＡＬＯＮカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上に付与されたＢ−ＰＥＲ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して放出された。結合されたＦａｂは、ＰＢＳ中の１００ｍＭの０．５ｍｌを使用して溶出された。溶出されたＦａｂは、ＰＢＳに対して２回透析され（一晩、４℃）、残存イミダゾールを除去された。
【０３３３】
精製されたＦａｂ抗体を使用したＥＬＩＳＡ−個々の可溶性Ｆａｂフラグメントの結合特異性は、ビオチン化されたＭＨＣ／ペプチド複合体を使用したＥＬＩＳＡによって決定された。ＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ）は、ＢＳＡ−ビオチン（１μｇ／ウェル）で一晩被覆された。洗浄後、プレートは、ストレプトアビジン（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートされ（室温で１時間）、徹底的に洗浄され、５μｇ／ｍｌのＭＨＣ／ペプチド複合体と共にさらにインキュベートされた（室温で１時間）。プレートは、ＰＢＳ／２％スキムミルクで室温で３０分間ブロッキングされ、次に、５μｇ／ｍｌの可溶性の精製されたＦａｂと共に室温で１時間インキュベートされた。洗浄後、プレートは、西洋ワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲート化／抗ヒトＦａｂ抗体と共にインキュベートされた。検出は、ＴＭＢ試薬（Ｓｉｇｍａ）を使用して行われた。
【０３３４】
フローサイトメトリー−ＤＲ４−ＥＢＶ−形質転換Ｂリンパ芽球Ｐｒｅｉｓｓ細胞は、７０μＭのＧＡＤ５５５〜５６７（ＮＦＦＲＭＶＩＳＮＰＡＡＴ；配列番号２２）またはコントロールペプチド：ＧＡＤ５５２〜５７２（配列番号１３）、ＨＡ３０７〜３１９（ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ；配列番号３０）、ＩｎｓＡ１〜１５（ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱ；配列番号３１）、およびＣＩＩ２６１〜２７３（ＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰ；配列番号：３２）を含む培地と共に一晩インキュベートされた。Ｐｒｅｉｓｓに添加されたＧＡＤ６５改変ペプチドリガンド（ＡＰＬ）は、Ｍ５５９Ｚ（ＮＦＦＲＺＶＩＳＮＰＡＡＴ；配列番号３３）、Ｉ５６１Ｍ（ＮＦＦＲＭＶＭＳＮＰＡＡＴ；配列番号３４）、Ｎ５６３Ｑ（ＮＦＦＲＭＶＩＳＱＰＡＡＴ；配列番号３５）、Ｉ５６１Ｍ−Ｎ５６３Ｑ（ＮＦＦＲＭＶＭＳＱＰＡＡＴ；配列番号３６）であった。細胞（１０６個）は、１〜５μｇの特異的Ｆａｂと共に４℃で１時間インキュベートされ、次にマウスの抗ｍｙｃ  ＡｂおよびＦＩＴＣでラベルされた抗マウスＡｂと共に４℃で４５分間インキュベートされた。細胞は、最終的に洗浄され、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  フローサイトメーター（ＢＤ）によって分析された。
【０３３５】
Ｔ細胞ハイブリドーマのためのＩＬ−２バイオアッセイ−５０μｌの１０％ＦＢＳ含有培地におけるハイブリドーマ細胞（９６ウエルプレートにおいて１０５個／ウエル）をＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１−Ｔｇマウスの１０５個の放射線照射（３０００ｒａｄ）された脾細胞の５０μｌと混合し、また、２５μｇ／ｍｌの個々のペプチドおよび様々なＦａｂ濃度の５０μｌと混合した。細胞を３７℃および７％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした。上清をＩＬ−２捕獲ＥＬＩＳＡのために培養物の上部から集めた。
【０３３６】
組織学−新鮮な組織を、凍結切片に対する免疫蛍光のために、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＴＣコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、９０５０）において凍結した。凍結切片（８μｍ）を乾燥し、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳにより３０分間ブロッキング処理した。Ｇ３Ｈ８を室温において５０μｇ／ｍｌで１時間加えた。Ａｌｅｘａ−４８８−抗ヒト（Ａ１１０１３、Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、米国）を１：２００の希釈で二次Ａｂとして使用した。蛍光像をＣｅｌｌ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ−Ｚｅｉｓｓ顕微鏡で撮影した。
【０３３７】
実施例１
ＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７複合体に対して特異的な抗体の単離
天然型ＭＨＣ／ペプチド複合体に向けられたＴＣＲＬの単離のために、本発明者らは、ファージディスプレー抗体ライブラリーのスクリーニングのために使用された組換えＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７複合体を作製した。
【０３３８】
組換えＤＲ４複合体−４ドメインのＤＲ４分子を昆虫細胞における発現（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，Ｐ．他、２００４）のために以前に報告されたＤＲ４構築物から作製した。この構築物では、ＤＲ−Ａ１＊０１０１鎖およびＤＲ−Ｂ１＊０４０１鎖の細胞内ドメインがヘテロダイマー組立てのためにロイシンジッパー二量体化ドメインによって置き換えられた（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，Ｐ．他、２００４）。抗原性ペプチドを、柔軟なリンカーを介してＤＲ−Ｂ鎖のＮ末端に導入した。ビオチン化のためのＢｉｒＡ認識配列をＤＲ−Ａ鎖のＣ末端に導入した（図１Ａ）。
【０３３９】
Ａｂファージディスプレーライブラリーのスクリーニング：ＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７複合体に向けられるＦａｂの選択のために、本発明者らは、３．７×１０１０個のヒト組換えＦａｂフラグメントのレパートリーからなる大きいＡｂファージライブラリーをスクリーニングした（ｄｅ  Ｈａａｒｄ  Ｈ．Ｊ．他、１９９９）。パンニングのために、ビオチン化された可溶性ＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７複合体を使用した。ペプチド依存的なＭＨＣクラスＩＩ拘束の特異性を有するＦａｂクローンが目的のものであり、これらをさらなる特徴づけのために選んだ。ＢｓｔＮＩ制限反応によるＤＮＡフィンガープリンティングにより、ＧＡＤペプチド依存的なＤＲ４特異的Ｆａｂの１３の異なる制限パターンが明らかにされた。このことは、そのような特有の特異性を有する数個の異なるＦａｂが選択されたことを示している。
【０３４０】
ＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７複合体に対するＴＣＲ様Ｆａｂの特異性：本発明者らはＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用して、それぞれのＤＮＡ制限パターンの代表的クローンの可溶性Ｆａｂ形態を産生させた。選択されたクローンの特異性をＥＬＩＳＡ結合アッセイで特徴づけた（図２Ａ）。４つの異なるＴＣＲＬ  Ｆａｂ  Ａｂ（Ｇ１Ａ１、Ｇ１Ｈ１２、Ｇ３Ｈ８、Ｇ１Ａ２）を単離し、これらは、組換えの全長型ＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７複合体にだけ結合し、コントロールペプチドを伴うＤＲ４複合体（すなわち、ＧＡＤ５５５〜５６７ペプチドを有しないＤＲ４分子）、または、ＧＡＤ５５５〜５６７ペプチド単独には結合しないことが見出された。加えて、これらのＴＣＲＬは、ＥＢＶで形質転換されたＤＲ４＋  Ｐｒｉｅｓｓ  Ｂ細胞によって提示される天然型ＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７複合体を首尾よく検出する（図２Ｂ、代表的なＧ３Ｈ８  Ｆａｂについて）。加えて、これらのＦａｂは、コントロールのＤＲ４会合ペプチド（例えば、ＨＡ３０７〜３１９、ＩｎｓＡ１〜１５、ＣＩＩ２６１〜２７３）が負荷されたＰｒｅｉｓｓ細胞には結合しない（図２Ｂ）。ＧＡＤ５５５〜５６７は、ＤＲ４の状況におけるｈＧＡＤ６５の、ＧＡＤ５５２〜５７２が天然においてプロセシングされたＴ細胞エピトープに含まれる最小刺激ペプチドである（Ｎｅｐｏｍ  ＧＴ他、２００１）。したがって、本発明者らは、単離されたＴＣＲＬにより、天然においてＴ１Ｄと会合するこのエピトープが認識され得るかを調べた。図２Ｃにおいて認められるように、Ｇ３Ｈ８は、等モル量のＧＡＤ５５５〜５６７ペプチドが負荷された細胞の場合と同じ強さにより、ＧＡＤ５５２〜５７２が負荷されたＰｒｅｉｓｓ細胞と結合する。同じ結合パターンが、選択されたＤＲ４／ＧＡＤ  ＴＣＲＬ  Ｆａｂのすべてについて得られた（データは示されず）。Ｇ３Ｈ８に特徴的なＴＣＲ様特異性についてのさらなる裏付けが、Ｆａｂ濃度の滴定（図２Ｄ）および負荷されたＧＡＤ５５５〜５６７ペプチドの濃度の滴定（図２Ｅ）から得られるように、ＡＰＣ上のＤＲ４／ＧＡＤ複合体に対する用量依存的結合からもたらされた。ＡＰＣ上の総ＤＲ４／ペプチド複合体におけるＤＲ４／ＧＡＤ複合体の百分率における増大は、増大したＧ３Ｈ８染色強度と相関することが見出された。加えて、Ｇ３Ｈ８および他のＴＣＲＬのこの特徴づけは、それらを、目的とするＡＰＣによって提示される特異的なＭＨＣ／ペプチド複合体の定量化研究のために好適にする。
【０３４１】
実施例２
Ｇ３Ｈ８抗体の細かい特異性
Ｇ３Ｈ８  ＴＣＲＬ  Ｆａｂの細かい特異性−単離されたＴＣＲＬのＧＡＤペプチド内の結合性残基を突き止めるために、本発明者らは、一組のｈＧＡＤ６５変化型ペプチドリガンド（ＡＰＬ）が負荷されたＰｒｅｉｓｓ細胞の認識を調べた。ＴＣＲ接触部位でのＧＡＤ６５５５５〜５６７配列における置換を含有する一連のペプチドを使用した。アミノ酸置換を伴うＧＡＤ５５５〜５６７ペプチド（Ｍ５５９Ｚ（Ｐ３）、Ｉ５６１Ｍ（Ｐ５）、Ｎ５６３Ｑ（Ｐ７）、または、Ｉ５６１Ｍ（Ｐ５）＋Ｎ５６３Ｑ（Ｐ７））を提示するＤＲ４複合体に対するＧ３Ｈ８の結合アッセイでは、Ｐ５が、Ｇ３Ｈ８−ＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７相互作用のための不可欠な接触残基として示された。ＴｃＲ接触のＰ５位置は、このｈＧＡＤ６５エピトープとのＴｃＲ相互作用のために重要であることが示されている（Ｊｏｈｎ  Ａ．他、２００４）。このことは、Ｇ３Ｈ８  ＦａｂのＴＣＲ様性質を強調する。図３Ａ〜図３Ｆに示されるように、一アミノ酸置換を含有するＧＡＤ５５５〜５６７が負荷されたＰｒｅｉｓｓ細胞（Ｍ５５９Ｚ（図３Ｂ）およびＮ５６３Ｑ（図３Ｄ））では、ＧＡＤ５５５〜５６７ペプチドの野生型配列が負荷されたＰｒｅｉｓｓ細胞の場合（図３Ａ）と類似する、Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂの結合強さが得られた。反対に、Ｉ５６１Ｍの一アミノ酸置換を含有するＧＡＤ５５５〜５６７が負荷されたＰｒｅｉｓｓ細胞（図３Ｃ）、および、Ｉ５６１Ｍ／Ｎ５６３Ｑの二重のアミノ酸置換を含有するＧＡＤ５５５〜５６７が負荷されたＰｒｅｉｓｓ細胞（図３Ｅ）では、野生型ペプチドと比較した場合、Ｆａｂ  Ｇ３Ｈ８の結合強さにおける著しい低下が得られた。したがって、Ｉ５６１Ｍ置換により、Ｆａｂ  Ｇ３Ｈ８によるＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７複合体の認識がなくなり、Ｐ５位がＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７複合体におけるＧ３Ｈ８の不可欠な接触残基として強調された。Ｐ５は、ＤＲ４／ＧＡＤエピトープに対して特異的である多くの知られているＴ細胞クローンの不可欠なＴ細胞受容体接触位置であるので、Ｇ３Ｈ８は、ポリクローナルなＧＡＤ特異的Ｔ細胞応答を阻害することが潜在的に可能であろう。
【０３４２】
実施例３
本発明のいくつかの実施形態の単離された抗体はＧＡＤ特異的なＭＨＣ拘束のＴ細胞応答を阻害することができる
ＧＡＤ特異的なＤＲ０４０１拘束のＴ細胞応答を阻止すること−本発明者らはさらに、ＡＰＣによって提示されるＤＲ４／ＧＡＤ複合体との同族ＴｃＲの相互作用と競合し、かつ、Ｔ細胞の自己反応性をもたらすこの活性化シグナルを阻止するＧ３Ｈ８  Ｆａｂの能力を調べた。本発明者らは、Ｇ３Ｈ８がペプチド特異的なＨＬＡ拘束された様式でＴ細胞ハイブリドーマのＡｇ特異的活性化を阻害し得るかを調べた。Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂは、ＨＬＡ−ＤＲ＊０４０１によって拘束されるＧＡＤ−５５５〜５６７に対して特異的なＧ２．１．３６．１  Ｔ細胞ハイブリドーマの応答を約８０％阻害することが見出された（図４Ａ）。重要なことに、Ｇ３Ｈ８は、ＨＬＡ−ＤＲ＊０４０１によって拘束されるＨＡ３０７〜３１９ペプチドに対するＨ１．１３．２ハイブリドーマ応答を阻害しない（図４Ｂ）。したがって、自己反応性ＧＡＤエピトープに対する抗原特異的な免疫学的寛容が、Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂによってインビトロで明らかにされた。
【０３４３】
実施例４
ＧＡＤ５５５〜５６７ペプチドを糖尿病の遺伝子組換えマウスの膵島において提示する抗原提示細胞の特定
糖尿病Ｂ７／０４０１Ｔｇマウスの膵臓におけるＤＲ４／ＧＡＤ５５５〜５６７複合体の検出−ＤＲ４サブタイプＤＲＡ１＊０１０１／Ｂ１＊０４０１について遺伝子組換えのＲＩＰ−Ｂ７マウスは、自然発症性糖尿病を発症させることが報告された（Ｇｅｂｅ  ＪＡ他、２００６）。ＧＡＤ５５５〜５６７エピトープ（これはすべてのマウスイソ型およびヒトイソ型において同一である）に対する細胞寛容の週齢依存的喪失がこれらのマウスにおいて確認された。このことは、このヒト疾患のＭＨＣ−抗原相互作用を模倣するヒト化マウスモデルとしてのそれらの有用性を強調する。本発明者らは、Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂを使用して、糖尿病Ｂ７／ＤＲ０４０１マウスの浸潤された膵島におけるＡＰＣがＧＡＤ５５５〜５６７ペプチドをそれらのＭＨＣ分子において提示するかどうかを調べた。Ｇ３Ｈ８の陽性染色により、そのような複合体が、Ｃ５７Ｂ６コントロールマウスから得られる膵島（図５Ｄ〜図５Ｅ）と比較した場合、Ｂ７／ＤＲ４糖尿病マウスの膵島において特定され（図５Ａ〜図５Ｃ）、また、糖尿病発症前のＢ７／ＤＲ４マウスの浸潤された膵島において特定された（データは示されず）。これらの結果は、Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂが、ベータ細胞由来のＧＡＤ５５５〜５６７自己抗原を提示する浸潤性ＡＰＣを検出し、これと結合し得ることを明らかにする。Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂは、膵臓のランゲルハンス島においてＧＡＤ自己抗原を提示するＡＰＣとペプチド特異的な様式で結合することが見出された。膵島浸潤性ＡＰＣに対するＧ３Ｈ８抗体の実証された入手性は、自己反応性Ｔ細胞の下流側の活性化をこれらのＡＰＣによって阻止することによるその治療目標のために不可欠である。
【０３４４】
実施例５
ＭＨＣクラスＩＩとＧＡＤ自己抗原性ペプチドとの特異的複合体の単離
本明細書中下記の表３は、ＭＨＣクラスＩＩとの複合体を形成することができるＭＨＣクラスＩＩ拘束のＧＡＤ自己抗原のリストを提供する。そのような複合体は、診断目的および治療目的のために有用である特異的な抗体の単離のために使用される。
2013538555.tif 000004
【０３４５】
実施例６
完全なＩｇＧ型Ｇ３Ｈ８抗体の結合および特異性
実験結果
Ｇ３Ｈ８  ＩｇＧ抗体の作製−Ｇ３Ｈ８  Ｆａｂを、全体がヒト型の完全なＩｇＧ分子の中にクローン化した。Ｈ鎖およびＬ鎖のＦａｂ遺伝子を真核生物発現ベクターｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ＥＲにヒトＩｇＧ１κＡｂとしての発現のためにクローン化した。Ｈ鎖については、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ＥＲの多重クローニング部位、ｍｙｃエピトープタグおよび小胞体（ＥＲ）保持シグナルを、ＢｓｓＨＩおよびＮｈｅＩのための認識部位を含有するクローニング部位、それに続く、ヒトリンパ球の総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離されるヒトＩｇＧ１の定常Ｈ鎖領域のｃＤＮＡによって置き換えた。類似する構築物をＬ鎖について作製した。それぞれのシャトル発現ベクターが、異なる抗生物質抵抗性遺伝子を有する。発現が、これら２つの構築物のヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３細胞への共トランスフェクションを、ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して行うことによって容易になった。共トランスフェクションの後、細胞を選択培地で成長させた。ＧＡＤ−５５５〜５６７ペプチドでパルス処理されたＰｒｅｉｓｓ細胞と特異的に反応したクローンを０．５％血清における成長に順応させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用してさらに精製した。精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、１５０ｋＤａの予想された分子量を有する均一かつ純粋なＩｇＧが明らかにされた。
【０３４６】
ＨＬＡ−ＤＲ４−ＧＡＤ−５５５〜５６７複合体を提示する細胞に対するＧ３Ｈ８抗体のエクスビボでの特異性−ＧＡＤ抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対するＧ３Ｈ８  ＴＣＲＬの特異性が、ＧＡＤ−５５５〜５６７で免疫化されたＨＬＡ−ＤＲ４遺伝子組換え（Ｔｇ）マウスに由来する鼠蹊部（流入領域）リンパ節（ＬＮ）に対するフローサイトメトリーによってエクスビボでもまた明らかにされた。簡単に記載すると、マウスを、５０％ＣＦＡ／ＰＢＳの１００μｌにおける１００μｇのペプチドにより尾の基部において皮下に免疫化した。組織を５日目に集め、単一細胞懸濁物をフローサイトメトリーによって分析した。ＬＮ細胞を洗浄し、０．１２５μｇ／ｍｌのＧ３Ｈ８  ＩｇＧと４℃で１時間インキュベーションし、その後、二次Ａｂとしての抗ヒトＰＥ（２．５μｇ／ｍｌ）とインキュベーションした。
【０３４７】
図１０Ａ〜図１０Ｂに示されるように（示される結果はＩｇＧ抗体により得られた。しかし、類似する結果がＦａｂ抗体により得られた（示されず））、Ｇ３Ｈ８  ＴＣＲＬ  Ａｂにより、ＧＡＤ免疫化マウスに由来するＬＮにおけるＡＰＣが特異的に染色され（これには、６．５％の陽性細胞（すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ４−ＧＡＤ−５５５〜５６７複合体を提示する細胞）が含まれた）、しかし、コントロールのＨＡ−３０７〜３１９ペプチドにより免疫化されたマウスに由来するＨＬＡ−ＤＲ４−ＨＡ−３０７〜３１９複合体を提示するＡＰＣは染色されなかった。
【０３４８】
Ｇ３Ｈ８  ＩｇＧは、Ｆａｂと比較した場合、高まった結合および効力を示す−Ｇ３Ｈ８のＩｇＧ形態は、Ｆａｂフラグメントと比較した場合、高まった結合を示すことが見出された（図１１Ａ）。そのうえ、この完全なＩｇＧ型ＴＣＲＬ分子は、増大したアビディティーを有するものであり、Ｆａｂと比較して、１０倍を超えるより大きい効力により、ＧＡＤ特異的なＴ細胞活性化／機能を阻害し（図１１Ｂ）、一方、その特有のＴＣＲ様特異性を維持した（図１１Ｃ）。
【０３４９】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０３５０】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【０３５１】
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2013538555.tif 000007
【図６Ａ−６Ｂ】
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【図６Ｃ−６Ｄ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図７Ｃ−７Ｄ】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図１Ａ−１Ｄ】
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【図２Ａ−２Ｃ】
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【図２Ｄ−２Ｅ】
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【図３Ａ−３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｅ】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１１Ａ−１１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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