(57)【要約】  本発明は、特に神経学的疾患に対する治療および診断を目的とする、可溶性ニューレグリン−１アイソフォームおよびポリペプチドの新しい使用法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４０〜１４６からなる群から選択されるＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦＬＤ１）を包含するかこれからなるポリペプチドであって、前記ＥＧＦ様ドメインが５個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができ、かつＥＧＦ様ドメインが場合によりそのＣおよび／またはＮ末端に３０個以下のさらなるアミノ酸を包含するポリペプチド。
【請求項２】
ＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦＬＤ１）が配列番号１４７〜１５３からなる群から選択され、かつＥＧＦ様ドメインが１３個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも１個のさらなるＥＧＦ様ドメインをさらに包含し、それぞれが独立して配列番号１４０〜１５３からなる群から選択され、各さらなるＥＧＦ様ドメインが１３個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができる、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１４０〜１５３からなる群から選択される第２のＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦＬＤ２）を少なくとも包含し、第２のＥＧＦ様ドメインが１３個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができる、請求項１から３までのいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
さらにヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を包含する、請求項１から４までのいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ヘパリン結合ドメインが配列番号１５４〜１５７のいずれかに基づくアミノ酸配列を有し、かつヘパリン結合ドメインが１２個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができる、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ヘパリン結合ドメインがＥＧＦ様ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置する、請求項５または６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ＥＧＦ様ドメインＥＧＦＬＤ１と第２のＥＧＦ様ドメインＥＧＦＬＤ２との間、任意の２個以上の隣接するＥＧＦ様ドメイン間、前記ヘパリン結合ドメインと前記ＥＧＦ様ドメインＥＧＦＬＤ１との間および／または前記ヘパリン結合ドメインと前記第２のＥＧＦ様ドメインＥＧＦＬＤ２との間にリンカーをさらに包含する、請求項４から７までのいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ＥＧＦＬＤ１−リンカー−ＥＧＦＬＤ２、
ＨＢＤ−リンカー−ＥＧＦＬＤ１−リンカー−ＥＧＦＬＤ２、
ＥＧＦＬＤ１−リンカー−ＨＢＤ−リンカー−ＥＧＦＬＤ２、または
ＥＧＦＬＤ１−リンカー−ＥＧＦＬＤ２−リンカー−ＨＢＤ
の構造を有する、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
各リンカーが、共有結合、化学的リンカーおよび好ましくは４５個以下のアミノ酸の長さを有するポリペプチドから個々に選択される、請求項８または９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
リンカーが配列番号１５８に基づくアミノ酸配列を有し、リンカーが１５個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができる、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ｅｒｂＢ３受容体（配列番号１５９）および／またはｅｒｂＢ４受容体（配列番号１６０）に特異的に結合する、請求項１から１０までのいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１から１２までのいずれかのポリペプチドを包含する医薬組成物。
【請求項１４】
さらに神経学的疾患の治療薬、好ましくはカテコラミン代謝に影響を及ぼす化合物、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、ＭＡＯ−ＢまたはＣＯＭＴ阻害薬、メマンチン型チャネル遮断薬、ドパミンまたはセロトニン受容体作用薬、ドパミンまたはセロトニン受容体拮抗薬、カテコラミンまたはセロトニン再取り込み阻害薬、抗精神病薬、アルツハイマー病またはパーキンソン病の治療薬および統合失調症、双極性障害またはうつ病の治療薬からなる群から選択される薬物を包含する、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
神経学的疾患の予防または治療に使用される、請求項１から１２までのいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
神経学的疾患が統合失調症、特に統合失調症の認知関連の側面、双極性障害およびうつ病；パーキンソン病；アルツハイマー病；てんかん；ＭＳ；ＡＬＳ；卒中；外傷性脳損傷および脊髄損傷からなる群から選択される、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１から１２までのいずれか１項に記載のポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの、細胞分化を誘導するための使用。
【請求項１８】
診断薬として使用するための、１４−３−３ゼータ（配列番号５８、１３３）、１４−３−３エプシロン（配列番号５９、１３４）、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（配列番号５０、１２４）、アルドラーゼＡ、フルクトースビスホスフェート（配列番号２、６８）；アルドラーゼＣ、フルクトースビスホスフェート（配列番号３、６９）；トリオースリン酸イソメラーゼ１（配列番号４、６５、７０）；グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素アイソフォーム１に準ずるもの（配列番号５、７１、７２）；エノラーゼ１、α非ニューロン（配列番号６、７３）；エノラーゼ２、γニューロン（配列番号７、７４）、乳酸脱水素酵素Ｂ（配列番号８、７５）；グリセロールリン酸脱水素酵素２、ミトコンドリア（配列番号９、７６、７７）；グルタミン酸アンモニアリガーゼ（グルタミン合成酵素）（配列番号１０、７８、７９）；ジヒドロリポアミドＳ−アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ２成分）（配列番号１１、８０、６６）；イソクエン酸脱水素酵素３（ＮＡＤ＋）α、アイソフォームＣＲＡ＿ｅ（配列番号１２、８１）；リンゴ酸脱水素酵素、細胞質（配列番号１３、８２）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）１αサブ複合体、８（配列番号１４、８３）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質１（配列番号１５、８４、６７）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質８（配列番号１６、８５）；ユビキノール−チトクロム−ｃ還元酵素複合体コアタンパク質１（配列番号１７、８６）；ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送性、ミトコンドリアＦ０複合体、サブユニットｄ（配列番号１８、８７、８８）；クレアチンキナーゼ、脳（配列番号１９、８９）；熱ショックタンパク質８（配列番号２０、９０、９１）；熱ショックタンパク質９（配列番号２１、９２）；Ｈｓｐ７０ホモログ、核周囲型（モルタリンｍｏｔ−２）（配列番号２２）；タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ関連３（配列番号２３、９３）；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送性、ライソゾームＶ１サブユニットＡ（配列番号２４、９４）；プロテアソーム２６Ｓサブユニット、ＡＴＰａｓｅ、４（配列番号２５、９５、９６）；プロテアソームサブユニットαタイプ２（配列番号２６、９７）；ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２７、９８）；バロシン含有タンパク質、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２８、９９）；３−ヒドロキシイソブチレート脱水素酵素（配列番号２９、１００）；ビフェニルヒドロラーゼ様（配列番号３０、１０１）；ハロ酸デハロゲナーゼ様ヒドロラーゼドメイン含有２（配列番号３１、１０２）；βアクチン（ａａ２７−３７５）（配列番号３２、１０３）；γアクチン（配列番号３３、１０４）；プロフィリン２、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３４、１０５、１０６）；トランスゲリン３（配列番号３５、１０７）；アネキシンＡ６、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３６、１０８、１０９）；インターネキシン神経細胞性中間径フィラメントタンパク質、α（配列番号３７、１１０）；神経フィラメント、軽ポリペプチド（配列番号３８、１１１）；グリア原線維酸性タンパク質（配列番��３９、１１２、１１３）；チューブリン、α１Ｂ（配列番号４０、１１４）；チューブリン、β（配列番号４１、１１５）；チューブリン、β３（配列番号４２、１１６）；ジヒドロピリミジナーゼ様２（配列番号４３、１１７）；ジヒドロピリミジナーゼ様４、アイソフォームＣＲＡ＿ｃ（配列番号４４、１１８）；脳に豊富に存在する膜結合性シグナルタンパク質１（配列番号４５、１１９）；ＲＡＢ１Ｂ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー；アイソフォームＣＲＡ＿ａ（配列番号４６、１２０）；ＲＡＢ３Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４７、１２１）；ＲＡＢ６Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４８、１２２）；グアノシンジホスフェート解離抑制因子１（配列番号４９、１２３）；ホスホリパーゼＣ−α（配列番号５１、１２５）；カルシニューリンＢ、タイプＩ（配列番号５２、１２６、１２７）；カルビンジン−２８Ｋ（配列番号５３、１２８）；カルレチニン（配列番号５４、１２９）；ビジニン様１（配列番号５５、１３０）；細胞内塩化物チャネル４（ミトコンドリア）（配列番号５６、１３１）；ｍＣＧ７１９１（Ｒａｆキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ））（配列番号５７、１３２）；ペルオキシレドキシン１（配列番号６０、１３５）；ペルオキシレドキシン３（配列番号６１、１３６）；ピリドキサール（ピリドキシン、ビタミンＢ６）キナーゼ（配列番号６２、１３７）；およびグアニンヌクレオチド結合タンパク質、αｏアイソフォームＢ（配列番号６３、１３８、１３９）からなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合することのできる抗体。
【請求項１９】
（ｉ）１４−３−３ゼータ（配列番号５８、１３３）、１４−３−３エプシロン（配列番号５９、１３４）、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（配列番号５０、１２４）、アルドラーゼＡ、フルクトースビスホスフェート（配列番号２、６８）；アルドラーゼＣ、フルクトースビスホスフェート（配列番号３、６９）；トリオースリン酸イソメラーゼ１（配列番号４、６５、７０）；グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素アイソフォーム１に準ずるもの（配列番号５、７１、７２）；エノラーゼ１、α非ニューロン（配列番号６、７３）；エノラーゼ２、γニューロン（配列番号７、７４）、乳酸脱水素酵素Ｂ（配列番号８、７５）；グリセロールリン酸脱水素酵素２、ミトコンドリア（配列番号９、７６、７７）；グルタミン酸アンモニアリガーゼ（グルタミン合成酵素）（配列番号１０、７８、７９）；ジヒドロリポアミドＳ−アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ２成分）（配列番号１１、８０、６６）；イソクエン酸脱水素酵素３（ＮＡＤ＋）α、アイソフォームＣＲＡ＿ｅ（配列番号１２、８１）；リンゴ酸脱水素酵素、細胞質（配列番号１３、８２）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）１αサブ複合体、８（配列番号１４、８３）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質１（配列番号１５、８４、６７）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質８（配列番号１６、８５）；ユビキノール−チトクロム−ｃ還元酵素複合体コアタンパク質１（配列番号１７、８６）；ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送性、ミトコンドリアＦ０複合体、サブユニットｄ（配列番号１８、８７、８８）；クレアチンキナーゼ、脳（配列番号１９、８９）；熱ショックタンパク質８（配列番号２０、９０、９１）；熱ショックタンパク質９（配列番号２１、９２）；Ｈｓｐ７０ホモログ、核周囲型（モルタリンｍｏｔ−２）（配列番号２２）；タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ関連３（配列番号２３、９３）；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送性、ライソゾームＶ１サブユニットＡ（配列番号２４、９４）；プロテアソーム２６Ｓサブユニット、ＡＴＰａｓｅ、４（配列番号２５、９５、９６）；プロテアソームサブユニットαタイプ２（配列番号２６、９７）；ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２７、９８）；バロシン含有タンパク質、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２８、９９）；３−ヒドロキシイソブチレート脱水素酵素（配列番号２９、１００）；ビフェニルヒドロラーゼ様（配列番号３０、１０１）；ハロ酸デハロゲナーゼ様ヒドロラーゼドメイン含有２（配列番号３１、１０２）；βアクチン（ａａ２７−３７５）（配列番号３２、１０３）；γアクチン（配列番号３３、１０４）；プロフィリン２、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３４、１０５、１０６）；トランスゲリン３（配列番号３５、１０７）；アネキシンＡ６、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３６、１０８、１０９）；インターネキシン神経細胞性中間径フィラメントタンパク質、α（配列番号３７、１１０）；神経フィラメント、軽ポリペプチド（配列番号３８、１１１）；グリア原線維酸性タンパク質（配列番号３９、１１２、１１３��；チューブリン、α１Ｂ（配列番号４０、１１４）；チューブリン、β（配列番号４１、１１５）；チューブリン、β３（配列番号４２、１１６）；ジヒドロピリミジナーゼ様２（配列番号４３、１１７）；ジヒドロピリミジナーゼ様４、アイソフォームＣＲＡ＿ｃ（配列番号４４、１１８）；脳に豊富に存在する膜結合性シグナルタンパク質１（配列番号４５、１１９）；ＲＡＢ１Ｂ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー；アイソフォームＣＲＡ＿ａ（配列番号４６、１２０）；ＲＡＢ３Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４７、１２１）；ＲＡＢ６Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４８、１２２）；グアノシンジホスフェート解離抑制因子１（配列番号４９、１２３）；ホスホリパーゼＣ−α（配列番号５１、１２５）；カルシニューリンＢ、タイプＩ（配列番号５２、１２６、１２７）；カルビンジン−２８Ｋ（配列番号５３、１２８）；カルレチニン（配列番号５４、１２９）；ビジニン様１（配列番号５５、１３０）；細胞内塩化物チャネル４（ミトコンドリア）（配列番号５６、１３１）；ｍＣＧ７１９１（Ｒａｆキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ））（配列番号５７、１３２）；ペルオキシレドキシン１（配列番号６０、１３５）；ペルオキシレドキシン３（配列番号６１、１３６）；ピリドキサール（ピリドキシン、ビタミンＢ６）キナーゼ（配列番号６２、１３７）；およびグアニンヌクレオチド結合タンパク質、αｏアイソフォームＢ（配列番号６３、１３８、１３９）からなる群から選択されるタンパク質と少なくとも９０％のアミノ酸の同一性を有するタンパク質または前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの量を、被験者の単離組織または単離体液においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定すること；
（ｉｉ）場合により、そのタンパク質量が、健常被験者で定量される対応するタンパク質の量と異なるかどうかを判定すること；および
（ｉｉｉ）場合により、健常被験者における前記タンパク質の発現と比較した前記タンパク質の発現の変化を、好ましくはアルツハイマー病、多発性硬化症または脳損傷およびパーキンソン病からなる群から選択される神経学的疾患と相関させること
を含む疾患の診断方法。
【請求項２０】
請求項１から１２までのいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に神経学的疾患に対する治療および診断を目的とする、可溶性ニューレグリン−１アイソフォームおよびポリペプチドの新しい使用法に関する。
【０００２】
成長および分化因子のニューレグリン（Ｎｒｇ）ファミリーは、神経系の発達および可塑性に決定的な役割を果たす。４つの遺伝子（ＮＲＧ−１〜ＮＲＧ−４）がさまざまな膜貫通および可溶性アイソフォームに翻訳される。ＮＲＧ−１は、異なる時間および組織特異的発現パターンを有する１５の既知のＮｒｇ１アイソフォームをコードする。Ｎｒｇ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）はβ−アミロイド変換酵素−１によって分割され、細胞間隙へと放出され、パラクリン栄養因子として働く。ＥＣＤには表皮成長因子（ＥＧＦ）様モチーフが含まれ、二量体化およびチロシンのリン酸化によってＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４受容体を活性化する。ＥｒｂＢ４は機能性の受容体型チロシンキナーゼであるのに対し、ＥｒｂＢ３はシグナルを変換するのにヘテロ二量体化の影響を受ける。
【０００３】
Ｎｒｇ１は遺伝学的に、ドパミン作動性神経伝達の異常を伴う神経発達性精神疾患である統合失調症と関連づけられてきた。いくつかのエビデンスは、Ｎｒｇ１がドパミンシグナル伝達に影響を及ぼすことを示唆している。事実、ヒトおよびげっ歯類の中脳のドパミン作働性ニューロンは、発達期から成体期にかけてＥｒｂＢ４を多く発現する。ヒトＮｒｇ１β1のＮ末端切断ＥＣＤ（ヌクレオチド４６〜６３４、２５．４ｋＤａ）は、新生仔マウスの未成熟な血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、中脳のＥｒｂＢ４受容体を活性化し、チロシンヒドロキシラーゼ（ドパミン生合成の律速酵素であるＴＨ）の酵素活性を亢進させ、持続的な高ドパミン作動状態を誘導する。この研究では、Ｎｒｇ１β1の投与と同時に生後の個体発生的細胞死および中脳ドパミン作動系の軸索分化が起こり、Ｎｒｇ１β1が発達中に神経栄養因子として働くことが示唆された。
【０００４】
成体げっ歯類でも、ヒトＮｒｇ１β1の全ＥＣＤ（Ｓｅｒ２−Ｌｙｓ２４６、２６．９ｋＤａ）を海馬に注入するか、ＥＧＦ様ドメインのみ（Ｔｈｒ１７６−Ｌｙｓ２４６、８ｋＤａ）を線状体に注入することにより、局所ドパミン放出量は一時的に増加し、成体期でもドパミン作動系のＮｒｇ１β1への反応性が若干持続していることが示された。
【０００５】
成体のドパミン作動系は、身体障害をもたらすｈｙｐｏｋｉｎｅｔｉｃ−ｒｉｇｉｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ15へといたるパーキンソン病（ＰＤ）などのさまざまな神経学的疾患における段階的な変性の対象となるため、当該技術分野では神経保護を促進し、ニューロンの減少をもたらす神経変性を予防するための新しい治療戦略が必要とされている。
【０００６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｓｉｌｉｃｏデータに基づき、発明者らは、本明細書に記載するＮｒｇ１β1のニューレグリン−１アイソフォームおよびニューレグリンポリペプチドなどが、（ｉ）ドパミン作働性ニューロンなどの神経を保護することができる、（ｉｉ）受容体への結合親和性を向上させる、および／または（ｉｉｉ）神経メラニンおよびチロシンヒドロキシラーゼを発現しないｅｒｂＢ４および／またはｅｒｂＢ３発現細胞の細胞分化を誘導することができることを見出している。これらの細胞は、本発明のポリペプチドと接触するとドパミン作働性ニューロンに変換されることが明らかになった。
【０００７】
このように、本発明は第一の態様においてポリペプチドとして提供され、このポリペプチドは配列番号１４０−１４６（すなわち配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５および１４６）からなる群から選択されるＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦＬＤ１）を包含するかこれにより構成され、前記ＥＧＦ様ドメインは５個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができ、前記ＥＧＦ様ドメインは場合によりそのＣおよび／またはＮ末端に３０個以下の追加のアミノ酸を包含する。
【０００８】
第二の態様として提供されるのは、本発明のポリペプチドを包含する医薬組成物である。
【０００９】
本発明のさらなる態様は、神経学的疾患の予防または治療において使用される本発明のポリペプチドに関する。
【００１０】
また、細胞分化を誘導する本発明に基づくポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの、本明細書に記載の可溶性ニューレグリンアイソフォームの使用法が提供される。
【００１１】
下記の実施例に記載する実験的エビデンスに基づき、
ａ）非神経細胞を本発明のニューレグリンアイソフォームおよび／または本発明のポリペプチドと接触させる
段階を包含するドパミン作働性ニューロンを生成する方法を提供することが、本発明のさらなる態様である。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、１４−３−３ゼータ（配列番号５８、１３３）、１４−３−３エプシロン（配列番号５９、１３４）、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（配列番号５０、１２４）、アルドラーゼＡ、フルクトースビスホスフェート（配列番号２、６８）；アルドラーゼＣ、フルクトースビスホスフェート（配列番号３、６９）；トリオースリン酸イソメラーゼ１（配列番号４、６５、７０）；グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素アイソフォーム１に準ずるもの（配列番号５、７１、７２）；エノラーゼ１、α非ニューロン（配列番号６、７３）；エノラーゼ２、γニューロン（配列番号７、７４）、乳酸脱水素酵素Ｂ（配列番号８、７５）；グリセロールリン酸脱水素酵素２、ミトコンドリア（配列番号９、７６、７７）；グルタミン酸アンモニアリガーゼ（グルタミン合成酵素）（配列番号１０、７８、７９）；ジヒドロリポアミドＳ−アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ２成分）（配列番号１１、８０、６６）；イソクエン酸脱水素酵素３（ＮＡＤ＋）α、アイソフォームＣＲＡ＿ｅ（配列番号１２、８１）；リンゴ酸脱水素酵素、細胞質（配列番号１３、８２）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）１αサブ複合体、８（配列番号１４、８３）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質１（配列番号１５、８４、６７）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質８（配列番号１６、８５）；ユビキノール−チトクロム−ｃ還元酵素複合体コアタンパク質１（配列番号１７、８６）；ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送性、ミトコンドリアＦ０複合体、サブユニットｄ（配列番号１８、８７、８８）；クレアチンキナーゼ、脳（配列番号１９、８９）；熱ショックタンパク質８（配列番号２０、９０、９１）；熱ショックタンパク質９（配列番号２１、９２）；Ｈｓｐ７０ホモログ、核周囲型（モルタリンｍｏｔ−２）（配列番号２２）；タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ関連３（配列番号２３、９３）；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送性、ライソゾームＶ１サブユニットＡ（配列番号２４、９４）；プロテアソーム２６Ｓサブユニット、ＡＴＰａｓｅ、４（配列番号２５、９５、９６）；プロテアソームサブユニットαタイプ２（配列番号２６、９７）；ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２７、９８）；バロシン含有タンパク質、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２８、９９）；３−ヒドロキシイソブチレート脱水素酵素（配列番号２９、１００）；ビフェニルヒドロラーゼ様（配列番号３０、１０１）；ハロ酸デハロゲナーゼ様ヒドロラーゼドメイン含有２（配列番号３１、１０２）；βアクチン（ａａ２７−３７５）（配列番号３２、１０３）；γアクチン（配列番号３３、１０４）；プロフィリン２、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３４、１０５、１０６）；トランスゲリン３（配列番号３５、１０７）；アネキシンＡ６、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３６、１０８、１０９）；インターネキシン神経細胞性中間径フィラメントタンパク質、α（配列番号３７、１１０）；神経フィラメント、軽ポリペプチド（配列番号３８、１１１）；グリア原線維酸性タンパク質（配列番号３��、１１２、１１３）；チューブリン、α１Ｂ（配列番号４０、１１４）；チューブリン、β（配列番号４１、１１５）；チューブリン、β３（配列番号４２、１１６）；ジヒドロピリミジナーゼ様２（配列番号４３、１１７）；ジヒドロピリミジナーゼ様４、アイソフォームＣＲＡ＿ｃ（配列番号４４、１１８）；脳に豊富に存在する膜結合性シグナルタンパク質１（配列番号４５、１１９）；ＲＡＢ１Ｂ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー；アイソフォームＣＲＡ＿ａ（配列番号４６、１２０）；ＲＡＢ３Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４７、１２１）；ＲＡＢ６Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４８、１２２）；グアノシンジホスフェート解離抑制因子１（配列番号４９、１２３）；ホスホリパーゼＣ−α（配列番号５１、１２５）；カルシニューリンＢ、タイプＩ（配列番号５２、１２６、１２７）；カルビンジン−２８Ｋ（配列番号５３、１２８）；カルレチニン（配列番号５４、１２９）；ビジニン様１（配列番号５５、１３０）；細胞内塩化物チャネル４（ミトコンドリア）（配列番号５６、１３１）；ｍＣＧ７１９１（Ｒａｆキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ））（配列番号５７、１３２）；ペルオキシレドキシン１（配列番号６０、１３５）；ペルオキシレドキシン３（配列番号６１、１３６）；ピリドキサール（ピリドキシン、ビタミンＢ６）キナーゼ（配列番号６２、１３７）；およびグアニンヌクレオチド結合タンパク質、αｏアイソフォームＢ（配列番号６３、１３８、１３９）からなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合することのできる抗体であって、疾患の診断に使用する。
【００１３】
本発明のさらなる態様として、以下を包含する疾患の診断方法が提供される：
（ｉ）１４−３−３ゼータ（配列番号５８、１３３）、１４−３−３エプシロン（配列番号５９、１３４）、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（配列番号５０、１２４）、アルドラーゼＡ、フルクトースビスホスフェート（配列番号２、６８）；アルドラーゼＣ、フルクトースビスホスフェート（配列番号３、６９）；トリオースリン酸イソメラーゼ１（配列番号４、６５、７０）；グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素アイソフォーム１に準ずるもの（配列番号５、７１、７２）；エノラーゼ１、α非ニューロン（配列番号６、７３）；エノラーゼ２、γニューロン（配列番号７、７４）、乳酸脱水素酵素Ｂ（配列番号８、７５）；グリセロールリン酸脱水素酵素２、ミトコンドリア（配列番号９、７６、７７）；グルタミン酸アンモニアリガーゼ（グルタミン合成酵素）（配列番号１０、７８、７９）；ジヒドロリポアミドＳ−アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ２成分）（配列番号１１、８０、６６）；イソクエン酸脱水素酵素３（ＮＡＤ＋）α、アイソフォームＣＲＡ＿ｅ（配列番号１２、８１）；リンゴ酸脱水素酵素、細胞質（配列番号１３、８２）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）１αサブ複合体、８（配列番号１４、８３）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質１（配列番号１５、８４、６７）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質８（配列番号１６、８５）；ユビキノール−チトクロム−ｃ還元酵素複合体コアタンパク質１（配列番号１７、８６）；ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送性、ミトコンドリアＦ０複合体、サブユニットｄ（配列番号１８、８７、８８）；クレアチンキナーゼ、脳（配列番号１９、８９）；熱ショックタンパク質８（配列番号２０、９０、９１）；熱ショックタンパク質９（配列番号２１、９２）；Ｈｓｐ７０ホモログ、核周囲型（モルタリンｍｏｔ−２）（配列番号２２）；タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ関連３（配列番号２３、９３）；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送性、ライソゾームＶ１サブユニットＡ（配列番号２４、９４）；プロテアソーム２６Ｓサブユニット、ＡＴＰａｓｅ、４（配列番号２５、９５、９６）；プロテアソームサブユニットαタイプ２（配列番号２６、９７）；ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２７、９８）；バロシン含有タンパク質、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２８、９９）；３−ヒドロキシイソブチレート脱水素酵素（配列番号２９、１００）；ビフェニルヒドロラーゼ様（配列番号３０、１０１）；ハロ酸デハロゲナーゼ様ヒドロラーゼドメイン含有２（配列番号３１、１０２）；βアクチン（ａａ２７−３７５）（配列番号３２、１０３）；γアクチン（配列番号３３、１０４）；プロフィリン２、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３４、１０５、１０６）；トランスゲリン３（配列番号３５、１０７）；アネキシンＡ６、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３６、１０８、１０９）；インターネキシン神経細胞性中間径フィラメントタンパク質、α（配列番号３７、１１０）；神経フィラメント、軽ポリペプチド（配列番号３８、１１１）；グリア原線維酸性タンパク質（配列番号３９、１１２、１１３��；チューブリン、α１Ｂ（配列番号４０、１１４）；チューブリン、β（配列番号４１、１１５）；チューブリン、β３（配列番号４２、１１６）；ジヒドロピリミジナーゼ様２（配列番号４３、１１７）；ジヒドロピリミジナーゼ様４、アイソフォームＣＲＡ＿ｃ（配列番号４４、１１８）；脳に豊富に存在する膜結合性シグナルタンパク質１（配列番号４５、１１９）；ＲＡＢ１Ｂ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー；アイソフォームＣＲＡ＿ａ（配列番号４６、１２０）；ＲＡＢ３Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４７、１２１）；ＲＡＢ６Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４８、１２２）；グアノシンジホスフェート解離抑制因子１（配列番号４９、１２３）；ホスホリパーゼＣ−α（配列番号５１、１２５）；カルシニューリンＢ、タイプＩ（配列番号５２、１２６、１２７）；カルビンジン−２８Ｋ（配列番号５３、１２８）；カルレチニン（配列番号５４、１２９）；ビジニン様１（配列番号５５、１３０）；細胞内塩化物チャネル４（ミトコンドリア）（配列番号５６、１３１）；ｍＣＧ７１９１（Ｒａｆキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ））（配列番号５７、１３２）；ペルオキシレドキシン１（配列番号６０、１３５）；ペルオキシレドキシン３（配列番号６１、１３６）；ピリドキサール（ピリドキシン、ビタミンＢ６）キナーゼ（配列番号６２、１３７）；およびグアニンヌクレオチド結合タンパク質、αｏアイソフォームＢ（配列番号６３、１３８、１３９）からなる群から選択されるタンパク質と、少なくとも９０％のアミノ酸の同一性を有するタンパク質または前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの量を、被験者の単離組織または単離体液においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定すること；および
（ｉｉ）場合により、そのタンパク質量が、健常被験者で定量される対応タンパク質量と異なるかどうかを判定すること；および
（ｉｉｉ）場合により、前記タンパク質の発現量の変化と神経学的疾患とを相関させること。
【００１４】
本発明のさらなる態様では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。
【００１５】
本発明を詳述する前に、本発明は本明細書に記載する特殊な方法、プロトコールおよび試薬に限定されるわけではなく、これらは変更できることを理解しておく必要がある。また、本明細書で使用する用語は、特殊な実施態様の説明のみを目的とするものであって、添付の請求項以外で制限されることのない本発明の適用範囲を制限することを意図するものではないことも理解しておく必要がある。他に記載のない限り、本明細書で使用する技術的および科学的用語はすべて、当業者に広く理解されるものと同じ意味を有する。
【００１６】
好ましくは、本明細書で使用する用語は、「Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」、Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｈ．Ｇ．Ｗ，  Ｎａｇｅｌ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｋｌｂｌ，  Ｈ．  ｅｄｓ（１９９５），  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，  ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，  Ｐａｔｅｎｔｓ，  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｘｅｌ  ＫｌｅｅｍａｎｎおよびＪｕｒｇｅｎ  Ｅｎｇｅｌ著、Ｔｈｉｅｍｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  １９９９；「Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ：  Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ」、Ｓｕｓａｎ  Ｂｕｄａｖａｒｉら編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６および米国薬局方−２５／国民医薬品集−２０、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，  Ｉｎｃ．，販売、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｍｄ．  ２００１に記載の通り定義される。
【００１７】
本明細書および添付の請求項では、特に要求されない場合、「包含する」という言葉は記載された特性、整数または段階あるいは一群の特性、整数および段階が含まれることを意味するのであって、その他の特性、整数または段階あるいは一群の特性、整数および段階を除外するものではない。以下の節では、本発明のさまざまな態様を詳細に規定する。規定される各態様は、明確に反対の旨が示されない限りは、他の態様または複数の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示されたあらゆる特性は、好ましいまたは有利であると示された他の特性または複数の特性と組み合わせることができる。
【００１８】
本明細書の文章中ではいくつかの文書が引用される。本明細書で引用する文書はすべて（すべての特許、特許申請書、科学的文献、製造者の仕様書、説明書など）、上述または下述に関係なく、その全文が参照として本明細書に組み込まれる。本発明が過去の発明に対してかかる開示内容を先行させる資格がないことを承認するという趣旨で解釈されてはならない。
【００１９】
本発明は、部分的に、本明細書に記載の可溶性ニューレグリン−１アイソフォーム（Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤなど）が、ドパミン作働性ニューロンなどの神経を保護する、および／または神経メラニンおよびチロシンヒドロキシラーゼを発現しないｅｒｂＢ４および／またはｅｒｂＢ３発現細胞、および／またはドパミン作働性ニューロン中のグリア細胞、特に星細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、放射状グリア細胞、シュワン細胞、サテライト細胞および／または腸グリア細胞といった非神経細胞の分化を誘導することができるという驚くべき所見に基づく。ドパミン作働性ニューロン中のこうした細胞が分化する場合、こうしたニューロンが増加することで内因性ドパミンの生成量が増加する。このような内在性ドパミンの増加および／またはニューレグリン−１の神経保護作用は、パーキンソン病患者の症状緩和に特に有用である。特定の理論に束縛されるものではないが、本発明の発明者らは、この新しいニューレグリン−１の治癒効果、すなわち神経保護および／または神経分化作用は、非神経細胞、好ましくはｅｒｂＢ４またはｅｒｂＢ３発現細胞におけるチロシンヒドロキシラーゼの誘導によって達成されると考える。また、神経保護の期間および神経分化の誘導期間が、パーキンソン病の新しい治療法、例えば治癒の鍵を握ると考えられる。
【００２０】
さらに、本発明は、（ｉ）ｅｒｂＢ４またはｅｒｂＢ３受容体に結合させるには、ニューレグリンの細胞外ドメインの小断片で十分であり、（ｉｉ）本明細書に記載するニューレグリンタンパク質、例えばニューレグリン−１タンパク質の選択されたドメインの複数のコピーを包含するポリペプチドが、ｅｒｂＢ４またはｅｒｂＢ３受容体に対する結合親和性を高めるだけでなく、ｅｒｂＢ４またはｅｒｂＢ３受容体を天然に発現する近傍細胞を濃縮するという、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ実験から導き出された予期しない所見に基づく。これらの本発明の改良ポリペプチドは、少量で患者などの被験者に投与することができ、それでいて依然として薬学的に有効である、すなわち、大量に投与される従来技術のポリペプチドと同じ治療効果を有する。低用量の剤型は製造にかかるコストが低いだけでなく、治療用ポリペプチドが標的細胞に特異的に蓄積され、そこで前述の受容体に対して高い親和性で結合するため、副作用の可能性が最低限に抑えられるという利点がある。
【００２１】
また、本発明は、神経分化の誘導および／または神経保護によって神経学的疾患を予防、改善および／または治療するための、本明細書にすべて記載された可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは可溶性ニューレグリン−１アイソフォームをコードする核酸分子を提供する。好ましい実施態様において、神経学的疾患は、統合失調症、特に統合失調症の認知関連の側面；パーキンソン病；アルツハイマー病；多発性硬化症（ＭＳ）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；てんかん；卒中；外傷性脳損傷；脊髄損傷；双極性障害；うつ病；前頭側頭型認知症；発作；虚血；ニューロパチー、特に糖尿病性ニューロパチー；神経痛；神経因性疼痛；および封入体ミオパチーからなる群から選択される。特に好ましい実施態様において、神経学的疾患はパーキンソン病または双極性障害である。
【００２２】
さらに、本発明は、神経学的疾患、例えば統合失調症、特に統合失調症の認知関連の側面；パーキンソン病；アルツハイマー病；多発性硬化症（ＭＳ）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；てんかん；卒中；外傷性脳損傷；脊髄損傷；双極性障害；うつ病；前頭側頭型認知症；発作；虚血；ニューロパチー、特に糖尿病性ニューロパチー；神経痛；神経因性疼痛；および封入体ミオパチーからなる群から選択される神経学的疾患などのニューロンの減少に起因する疾患を予防、改善および／または治療するための、本明細書にすべて記載された可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは可溶性ニューレグリン−１アイソフォームをコードする核酸分子を提供する。特に好ましい実施態様において、ニューロンの減少は神経学的疾患であるパーキンソン病に伴う。さらに好ましい実施態様において、ニューロンの減少は、本明細書に記載の神経分化の誘導および／または神経保護によって予防される。本発明の好ましい実施態様において、ニューロンの減少は興奮毒性、好ましくはＳｃｈｒａｔｔｅｎｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６，  ６６３−５８６に記載のグルタミン酸誘導興奮毒性によってもたらされる。
【００２３】
本発明のさらに好ましい実施態様において、本明細書に記載の神経分化は、神経メラニンおよびチロシンヒドロキシラーゼを発現しないｅｒｂＢ４および／またはｅｒｂＢ３発現細胞、および／またはグリア細胞、特に星細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、放射状グリア細胞、シュワン細胞、サテライト細胞および／または腸グリア細胞といった非神経細胞で誘導される。
【００２４】
本発明のさらなる実施態様において、本明細書に記載の第２表の１つ以上のタンパク質、例えばアルドラーゼＡ、フルクトースビスホスフェート（配列番号２、６８）；アルドラーゼＣ、フルクトースビスホスフェート（配列番号３、６９）；トリオースリン酸イソメラーゼ１（配列番号４、６５、７０）；グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素アイソフォーム１に準ずるもの（配列番号５、７１、７２）；エノラーゼ１、α非ニューロン（配列番号６、７３）；エノラーゼ２、γニューロン（配列番号７、７４）、乳酸脱水素酵素Ｂ（配列番号８、７５）；グリセロールリン酸脱水素酵素２、ミトコンドリア（配列番号９、７６、７７）；グルタミン酸アンモニアリガーゼ（グルタミン合成酵素）（配列番号１０、７８、７９）；ジヒドロリポアミドＳ−アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ２成分）（配列番号１１、８０、６６）；イソクエン酸脱水素酵素３（ＮＡＤ＋）α、アイソフォームＣＲＡ＿ｅ（配列番号１２、８１）；リンゴ酸脱水素酵素、細胞質（配列番号１３、８２）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）１αサブ複合体、８（配列番号１４、８３）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質１（配列番号１５、８４、６７）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質８（配列番号１６、８５）；ユビキノール−チトクロム−ｃ還元酵素複合体コアタンパク質１（配列番号１７、８６）；ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送性、ミトコンドリアＦ０複合体、サブユニットｄ（配列番号１８、８７、８８）；クレアチンキナーゼ、脳（配列番号１９、８９）；熱ショックタンパク質８（配列番号２０、９０、９１）；熱ショックタンパク質９（配列番号２１、９２）；Ｈｓｐ７０ホモログ、核周囲型（モルタリンｍｏｔ−２）（配列番号２２）；タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ関連３（配列番号２３、９３）；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送性、ライソゾームＶ１サブユニットＡ（配列番号２４、９４）；プロテアソーム２６Ｓサブユニット、ＡＴＰａｓｅ、４（配列番号２５、９５、９６）；プロテアソームサブユニットαタイプ２（配列番号２６、９７）；ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２７、９８）；バロシン含有タンパク質、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２８、９９）；３−ヒドロキシイソブチレート脱水素酵素（配列番号２９、１００）；ビフェニルヒドロラーゼ様（配列番号３０、１０１）；ハロ酸デハロゲナーゼ様ヒドロラーゼドメイン含有２（配列番号３１、１０２）；βアクチン（ａａ２７−３７５）（配列番号３２、１０３）；γアクチン（配列番号３３、１０４）；プロフィリン２、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３４、１０５、１０６）；トランスゲリン３（配列番号３５、１０７）；アネキシンＡ６、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３６、１０８、１０９）；インターネキシン神経細胞性中間径フィラメントタンパク質、α（配列番号３７、１１０）；神経フィラメント、軽ポリペプチド（配列番号３８、１１１）；グリア原線維酸性タンパク質（配列番号３９、１１２、１１３）；チューブリン、α１Ｂ（配列番号４０、１１４）；チューブリン、β（配���番号４１、１１５）；チューブリン、β３（配列番号４２、１１６）；ジヒドロピリミジナーゼ様２（配列番号４３、１１７）；ジヒドロピリミジナーゼ様４、アイソフォームＣＲＡ＿ｃ（配列番号４４、１１８）；脳に豊富に存在する膜結合性シグナルタンパク質１（配列番号４５、１１９）；ＲＡＢ１Ｂ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー；アイソフォームＣＲＡ＿ａ（配列番号４６、１２０）；ＲＡＢ３Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４７、１２１）；ＲＡＢ６Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４８、１２２）；グアノシンジホスフェート解離抑制因子１（配列番号４９、１２３）；ホスホリパーゼＣ−α（配列番号５１、１２５）；カルシニューリンＢ、タイプＩ（配列番号５２、１２６、１２７）；カルビンジン−２８Ｋ（配列番号５３、１２８）；カルレチニン（配列番号５４、１２９）；ビジニン様１（配列番号５５、１３０）；細胞内塩化物チャネル４（ミトコンドリア）（配列番号５６、１３１）；ｍＣＧ７１９１（Ｒａｆキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ））（配列番号５７、１３２）；ペルオキシレドキシン１（配列番号６０、１３５）；ペルオキシレドキシン３（配列番号６１、１３６）；ピリドキサール（ピリドキシン、ビタミンＢ６）キナーゼ（配列番号６２、１３７）；およびグアニンヌクレオチド結合タンパク質、αｏアイソフォームＢ（配列番号６３、１３８、１３９）；１４−３−３ゼータ（配列番号５８、１３３）、１４−３−３エプシロン（配列番号５９、１３４）、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（配列番号５０、１２４）の発現レベルを変化させることによって、神経分化を誘導する。
【００２５】
ある実施態様における発現レベルの変化とは、本明細書に記載され、１４−３−３ゼータ（配列番号５８、１３３）、１４−３−３エプシロン（配列番号５９、１３４）、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（配列番号５０、１２４）からなる群から選択される、第２表のタンパク質の発現量の減少である。
【００２６】
また別の実施態様において、発現レベルの変化とは、本明細書に記載され、アルドラーゼＡ、フルクトースビスホスフェート（配列番号２、６８）；アルドラーゼＣ、フルクトースビスホスフェート（配列番号３、６９）；トリオースリン酸イソメラーゼ１（配列番号４、６５、７０）；グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素アイソフォーム１に準ずるもの（配列番号５、７１、７２）；エノラーゼ１、α非ニューロン（配列番号６、７３）；エノラーゼ２、γニューロン（配列番号７、７４）、乳酸脱水素酵素Ｂ（配列番号８、７５）；グリセロールリン酸脱水素酵素２、ミトコンドリア（配列番号９、７６、７７）；グルタミン酸アンモニアリガーゼ（グルタミン合成酵素）（配列番号１０、７８、７９）；ジヒドロリポアミドＳ−アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ２成分）（配列番号１１、８０、６６）；イソクエン酸脱水素酵素３（ＮＡＤ＋）α、アイソフォームＣＲＡ＿ｅ（配列番号１２、８１）；リンゴ酸脱水素酵素、細胞質（配列番号１３、８２）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）１αサブ複合体、８（配列番号１４、８３）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質１（配列番号１５、８４、６７）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質８（配列番号１６、８５）；ユビキノール−チトクロム−ｃ還元酵素複合体コアタンパク質１（配列番号１７、８６）；ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送性、ミトコンドリアＦ０複合体、サブユニットｄ（配列番号１８、８７、８８）；クレアチンキナーゼ、脳（配列番号１９、８９）；熱ショックタンパク質８（配列番号２０、９０、９１）；熱ショックタンパク質９（配列番号２１、９２）；Ｈｓｐ７０ホモログ、核周囲型（モルタリンｍｏｔ−２）（配列番号２２）；タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ関連３（配列番号２３、９３）；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送性、ライソゾームＶ１サブユニットＡ（配列番号２４、９４）；プロテアソーム２６Ｓサブユニット、ＡＴＰａｓｅ、４（配列番号２５、９５、９６）；プロテアソームサブユニットαタイプ２（配列番号２６、９７）；ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２７、９８）；バロシン含有タンパク質、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２８、９９）；３−ヒドロキシイソブチレート脱水素酵素（配列番号２９、１００）；ビフェニルヒドロラーゼ様（配列番号３０、１０１）；ハロ酸デハロゲナーゼ様ヒドロラーゼドメイン含有２（配列番号３１、１０２）；βアクチン（ａａ２７−３７５）（配列番号３２、１０３）；γアクチン（配列番号３３、１０４）；プロフィリン２、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３４、１０５、１０６）；トランスゲリン３（配列番号３５、１０７）；アネキシンＡ６、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３６、１０８、１０９）；インターネキシン神経細胞性中間径フィラメントタンパク質、α（配列番号３７、１１０）；神経フィラメント、軽ポリペプチド（配列番号３８、１１１）；グリア原線維酸性タンパク質（配列番号３９、１１２、１１３）；チューブリン、α１Ｂ（配列番号４０、１１４）；チューブリン、β（配列番号４１、１１５���；チューブリン、β３（配列番号４２、１１６）；ジヒドロピリミジナーゼ様２（配列番号４３、１１７）；ジヒドロピリミジナーゼ様４、アイソフォームＣＲＡ＿ｃ（配列番号４４、１１８）；脳に豊富に存在する膜結合性シグナルタンパク質１（配列番号４５、１１９）；ＲＡＢ１Ｂ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー；アイソフォームＣＲＡ＿ａ（配列番号４６、１２０）；ＲＡＢ３Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４７、１２１）；ＲＡＢ６Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４８、１２２）；グアノシンジホスフェート解離抑制因子１（配列番号４９、１２３）；ホスホリパーゼＣ−α（配列番号５１、１２５）；カルシニューリンＢ、タイプＩ（配列番号５２、１２６、１２７）；カルビンジン−２８Ｋ（配列番号５３、１２８）；カルレチニン（配列番号５４、１２９）；ビジニン様１（配列番号５５、１３０）；細胞内塩化物チャネル４（ミトコンドリア）（配列番号５６、１３１）；ｍＣＧ７１９１（Ｒａｆキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ））（配列番号５７、１３２）；ペルオキシレドキシン１（配列番号６０、１３５）；ペルオキシレドキシン３（配列番号６１、１３６）；ピリドキサール（ピリドキシン、ビタミンＢ６）キナーゼ（配列番号６２、１３７）；およびグアニンヌクレオチド結合タンパク質、αｏアイソフォームＢ（配列番号６３、１３８、１３９）からなる群から選択される、第２表のタンパク質の発現量の増加である。特に好ましい発現レベルの変化は、ジヒドロピリミジナーゼ様２タンパク質（配列番号４３、１１７）の増加である。特に好ましい発現レベルの変化は、バロシン含有タンパク質、アイソフォーム＿ｂ（配列番号２８、９９）の増加である。
【００２７】
本明細書で使用する用語「第２表のタンパク質」とは、哺乳類タンパク質、最も好ましくはマウス、ラットまたはヒトタンパク質を指す。また、本明細書で使用する用語「第２表のタンパク質」には、これらのタンパク質の対立遺伝子変異型、スプライス変異型といった変異型、特に本明細書に記載のマウスタンパク質、例えば第２表に示すマウスタンパク質と相同率が９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９３％、９０％、８５％または８０％であるヒト変異型ならびにこれらのタンパク質の機能的に活性な誘導体または断片が含まれる。上の文脈で使用し、本明細書全体でも一般に使用する用語「相同率」は、ＲｅｆＳｅｑタンパク質データベースを使用してＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．，  Ｇｉｓｈ，  Ｗ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｗ．，  Ｍｙｅｒｓ，  Ｅ．  Ｗ．  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．  （１９９０）  "Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．"  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０；  Ｇｉｓｈ，  Ｗ．  ＆  Ｓｔａｔｅｓ，  Ｄ．Ｊ．  （１９９３）  "Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｂｙ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｅａｒｃｈ．"  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ３：２６６−２７２；  Ｍａｄｄｅｎ，  Ｔ．Ｌ．，  Ｔａｔｕｓｏｖ，  Ｒ．Ｌ．  ＆  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．  （１９９６）  "Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ＢＬＡＳＴ  ｓｅｒｖｅｒ"  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６６：１３１−１４１；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．，  Ｍａｄｄｅｎ  Ｔ．Ｌ．，  Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，  Ａ．  Ａ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｗ．  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．  （１９９７）  "Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．"  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２）に基づいて特定された相同率を指す。ある好ましい実施態様において、相同率はより長い配列に対して決定される。すなわち、互いに比較される２配列のうち長い配列を参照配列とするのが好ましい。第２表のタンパク質は、神経学的疾患の予防、改善および／または治療に使用することができる。本発明に基づいて使用することのできる第２表のタンパク質は、アルドラーゼＡ、フルクトースビスホスフェート（配列番号２、６８）；アルドラーゼＣ、フルクトースビスホスフェート（配列番号３、６９）；トリオースリン酸イソメラーゼ１（配列番号４、６５、７０）；グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素アイソフォーム１に準ずるもの（配列番号５、７１、７２）；エノラーゼ１、α非ニューロン（配列番号６、７３）；エノラーゼ２、γニューロン（配列番号７、７４）、乳酸脱水素酵素Ｂ（配列番号８、７５）；グリセロールリン酸脱水素酵素２、ミトコンドリア（配列番号９、７６、７７）；グルタミン酸アンモニアリガーゼ（グルタミン合成酵素）（配列番号１０、７８、７９）；ジヒドロリポアミドＳ−アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸脱水素酵���複合体のＥ２成分）（配列番号１１、８０、６６）；イソクエン酸脱水素酵素３（ＮＡＤ＋）α、アイソフォームＣＲＡ＿ｅ（配列番号１２、８１）；リンゴ酸脱水素酵素、細胞質（配列番号１３、８２）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）１αサブ複合体、８（配列番号１４、８３）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質１（配列番号１５、８４、６７）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質８（配列番号１６、８５）；ユビキノール−チトクロム−ｃ還元酵素複合体コアタンパク質１（配列番号１７、８６）；ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送性、ミトコンドリアＦ０複合体、サブユニットｄ（配列番号１８、８７、８８）；クレアチンキナーゼ、脳（配列番号１９、８９）；熱ショックタンパク質８（配列番号２０、９０、９１）；熱ショックタンパク質９（配列番号２１、９２）；Ｈｓｐ７０ホモログ、核周囲型（モルタリンｍｏｔ−２）（配列番号２２）；タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ関連３（配列番号２３、９３）；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送性、ライソゾームＶ１サブユニットＡ（配列番号２４、９４）；プロテアソーム２６Ｓサブユニット、ＡＴＰａｓｅ、４（配列番号２５、９５、９６）；プロテアソームサブユニットαタイプ２（配列番号２６、９７）；ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２７、９８）；バロシン含有タンパク質、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２８、９９）；３−ヒドロキシイソブチレート脱水素酵素（配列番号２９、１００）；ビフェニルヒドロラーゼ様（配列番号３０、１０１）；ハロ酸デハロゲナーゼ様ヒドロラーゼドメイン含有２（配列番号３１、１０２）；βアクチン（ａａ２７−３７５）（配列番号３２、１０３）；γアクチン（配列番号３３、１０４）；プロフィリン２、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３４、１０５、１０６）；トランスゲリン３（配列番号３５、１０７）；アネキシンＡ６、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３６、１０８、１０９）；インターネキシン神経細胞性中間径フィラメントタンパク質、α（配列番号３７、１１０）；神経フィラメント、軽ポリペプチド（配列番号３８、１１１）；グリア原線維酸性タンパク質（配列番号３９、１１２、１１３）；チューブリン、α１Ｂ（配列番号４０、１１４）；チューブリン、β（配列番号４１、１１５）；チューブリン、β３（配列番号４２、１１６）；ジヒドロピリミジナーゼ様２（配列番号４３、１１７）；ジヒドロピリミジナーゼ様４、アイソフォームＣＲＡ＿ｃ（配列番号４４、１１８）；脳に豊富に存在する膜結合性シグナルタンパク質１（配列番号４５、１１９）；ＲＡＢ１Ｂ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー；アイソフォームＣＲＡ＿ａ（配列番号４６、１２０）；ＲＡＢ３Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４７、１２１）；ＲＡＢ６Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４８、１２２）；グアノシンジホスフェート解離抑制因子１（配列番号４９、１２３）；ホスホリパーゼＣ−α（配列番号５１、１２５）；カルシニューリンＢ、タイプＩ（配列番号５２、１２６、１２７）；カルビンジン−２８Ｋ（配列番号５３、１２８）；カルレチニン（配��番号５４、１２９）；ビジニン様１（配列番号５５、１３０）；細胞内塩化物チャネル４（ミトコンドリア）（配列番号５６、１３１）；ｍＣＧ７１９１（Ｒａｆキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ））（配列番号５７、１３２）；ペルオキシレドキシン１（配列番号６０、１３５）；ペルオキシレドキシン３（配列番号６１、１３６）；ピリドキサール（ピリドキシン、ビタミンＢ６）キナーゼ（配列番号６２、１３７）；およびグアニンヌクレオチド結合タンパク質、αｏアイソフォームＢ（配列番号６３、１３８、１３９）；１４−３−３ゼータ（配列番号５８、１３３）、１４−３−３エプシロン（配列番号５９、１３４）、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（配列番号５０、１２４）からなる群から選択される。
【００２８】
さらに、本発明は、好ましくはヒトニューレグリン−１アイソフォームである、例えば天然のヒトニューレグリン−１アイソフォームの一次アミノ酸配列を包含する遺伝子組換えアイソフォームまたはこの遺伝子組換えアイソフォームの全長に対して９０％以上、好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上相同である配列を包含するアイソフォームである、可溶性ニューレグリン−１アイソフォームに関する。
【００２９】
また本発明には、対立遺伝子変異型、スプライス変異型といった可溶性ニューレグリン−１アイソフォームの変異型ならびにこれらのタンパク質の誘導体または断片が含まれる。好ましくは、前記誘導体はこのタンパク質のグリコシル化体であるのがよい。
【００３０】
可溶性ニューレグリン−１アイソフォームは、ニューレグリン−１タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶまたはタイプＶＩアイソフォームであることができ、好ましくはニューレグリン−１β1アイソフォーム、ニューレグリン−１αアイソフォームまたは感覚および運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）アイソフォーム、特にニューレグリン−１β1アイソフォームおよび特にヒトニューレグリン−１β1アイソフォームであるのがよい。
【００３１】
好ましい実施態様において、可溶性ニューレグリン−１アイソフォームは、血液脳関門を通過することを特徴とする（例：ニューレグリン−１β1アイソフォーム）。
【００３２】
可溶性ニューレグリン−１アイソフォームは、少なくともニューレグリン−１の細胞外ドメインの一部またはその断片、特にＥＧＦ様ドメインまたはＥＧＦ様ドメイン、ＩｇＧ様ドメインおよびヘパラン硫酸結合モチーフを包含し、特に配列番号１を包含するか、配列番号１であるアイソフォームを包含する。好ましい実施態様において、可溶性ニューレグリン−１アイソフォームは、
（ａ）配列番号６４のヌクレオチド４６−６３４、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１７６−２４６および／または
（ｃ）配列番号１のアミノ酸２−２４６（本明細書でＮＲＧ−β1−ＥＣＤとして記載）
を包含する。
【００３３】
本明細書で下述する本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、ポリペプチドは、
（ａ）配列番号６４のヌクレオチド４６−６３４によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１７６−２４６から構成されるポリペプチドおよび／または
（ｃ）配列番号１のアミノ酸２−２４６から構成されるポリペプチド
を包含し、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のポリペプチドは１３個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができる。
【００３４】
特に好ましい実施態様において、可溶性ニューレグリン−１アイソフォームは、配列番号１のアミノ酸２−２４６を包含する。
【００３５】
また本発明は、本明細書に記載の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームをコードする核酸分子、好ましくは配列番号６４を包含するか、本明細書に記載の第２表のタンパク質をコードする核酸分子ならびにかかる核酸分子を包含するベクター、例えば発現ベクターを提供する。本明細書にすべて記載される核酸分子またはベクターは細胞にトランスフェクトすることができ、この細胞は原核細胞、例えば大腸菌細胞または真核細胞であることができる。
【００３６】
本発明のある実施態様において、可溶性ニューレグリン−１アイソフォームをコードする核酸分子または本明細書にすべて記載される第２表のタンパク質をコードする核酸分子は、本明細書に記載の通り、神経分化の誘導および／または神経保護によって、例えば神経学的疾患の予防、改善および／または治療または本明細書に記載の通り、ニューロンの減少に起因する疾患の予防、改善および／または治療、好ましくはパーキンソン病の予防、改善および／または治療などの医薬目的で使用される。
【００３７】
さらに、本発明は、さらなる活性物質、例えば神経学的病態および／またはパーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷といった神経学的疾患、統合失調症、双極性障害およびうつ病といった精神疾患の治療のための薬剤（オランザピンまたはクロザピンなど）と組み合わせる、本明細書にすべて記載された可溶性ニューレグリン−１アイソフォーム、可溶性ニューレグリン−１アイソフォームをコードする核酸分子、第２表のタンパク質または第２表のタンパク質をコードする核酸分子に関する。
【００３８】
さらに、本発明は、本明細書にすべて記載された可溶性ニューレグリン−１アイソフォーム、可溶性ニューレグリン−１アイソフォームをコードする核酸分子、第２表のタンパク質または第２表のタンパク質をコードする核酸分子を活性物質として包含し、場合により薬学的に活性な担体を包含する医薬組成物に関する。
【００３９】
さらに、本発明は、神経学的疾患、ニューロンの減少の分子学的機序、それに伴う生理学的過程またはニューロンの減少に起因する疾患を研究するための以下を包含する方法を提供する：
（ａ）好ましくは本明細書に記載のニューレグリン−１アイソフォームを、細胞または非ヒト脊椎動物に投与する；
（ｂ）前記細胞または前記動物の臓器または組織試料を対象にプロテオーム解析または遺伝子発現解析を実施する；および
（ｃ）プロテオーム解析または遺伝子発現解析の結果を、対照細胞または対照非ヒト動物の解析結果と比較する。
【００４０】
上述の方法において神経学的疾患は、統合失調症、特に統合失調症の認知関連の側面；パーキンソン病；アルツハイマー病；多発性硬化症（ＭＳ）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；てんかん；卒中；外傷性脳損傷；脊髄損傷；双極性障害；うつ病；前頭側頭型認知症；発作；虚血；ニューロパチー、特に糖尿病性ニューロパチー；神経痛；神経因性疼痛；および封入体ミオパチーからなる群から選択することができる。好ましい実施態様において、神経学的疾患はパーキンソン病である。
【００４１】
本明細書に記載の方法において、非ヒト脊椎動物は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、鳥、ネコ、ヒツジ、ウシおよびウマからなる群から選択することができ、好ましくはマウス、最も好ましくは野生型マウスに対して６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨＤＨ）を用いて神経死を誘導したパーキンソン病などの神経学的疾患のマウスモデルまたはトランスジェニックマウスモデルＡ５３Ｔαシヌクレイン（Ｈａｒｖｅｙ  ＢＫ，  Ｗａｎｇ  Ｙ，  Ｈｏｆｆｅｒ  ＢＪ．  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ′ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ  Ｓｕｐｐｌ．  ２００８；１０１：８９−９２；  Ｃｈｅｓｓｅｌｅｔ  ＭＦ．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ；  ａ  ｕｓｅｆｕｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ′ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ？  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２００８  Ｊａｎ；２０９（１）：２２−７）またはアルツハイマー病では好ましくはＡＰＰ／ＰＳマウスモデル（Ｍｅｙｅｒ−Ｌｕｅｈｍａｎｎ，  Ｍ．；  Ｃｏｏｍａｒａｓｗａｍｙ，  Ｊ．；  Ｂｏｌｍｏｎｔ，  Ｔ．；  Ｋａｅｓｅｒ，  Ｓ．；  Ｓｃｈａｅｆｅｒ，  Ｃ．；  Ｋｉｌｇｅｒ，  Ｅ．；  Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒ，  Ａ．；  Ａｂｒａｍｏｗｓｋｉ，  Ｄ．；  Ｆｒｅｙ，  Ｐ．；  Ｊａｔｏｎ，  Ａ．Ｌ．；  Ｖｉｇｏｕｒｅｔ，  Ｊ．Ｍ．；  Ｐａｇａｎｅｔｔｉ，  Ｐ．；  Ｗａｌｓｈ，  Ｄ．Ｍ．；  Ｍａｔｈｅｗｓ，  Ｐ．Ｍ．；  Ｇｈｉｓｏ，  Ｊ．；  Ｓｔａｕｆｅｎｂｉｅｌ，  Ｍ．；  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｌ．Ｃ．；  Ｊｕｃｋｅｒ，  Ｍ．  （２００６）  Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｓ  ｇｏｖｅｒｎｅｄ  ｂｙ  ａｇｅｎｔ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３，  １７８１−１７８４；  Ｒａｄｄｅ  Ｒ．；  Ｂｏｌｍｏｎｔ，  Ｔ．；  Ｋａｅｓｅｒ，  Ｓ．Ａ．；  Ｃｏｏｍａｒａｓｗａｍｙ，  Ｊ．；  Ｌｉｎｄａｕ，  Ｄ．；  Ｓｔｏｌｔｚｅ，  Ｌ．；  Ｃａｌｈｏｕｎ，  Ｍ．Ｅ．；  Ｊａｇｇｉ，  Ｆ．；  Ｗｏｌｂｕｒｇ，  ＩＩ．；  Ｇｅｎｇｌｅｒ，  Ｓ．；  ＩＩａａｓｓ，  Ｃ．；  Ｇｈｅｔｔｉ，  Ｂ．；  Ｃｚｅｃｈ，  Ｃ．；  ＩＩｏｌｓｃｈｅｒ，  Ｃ．；  Ｍａｔｈｅｗｓ，  Ｐ．Ｍ．；  Ｊｕｃｋｅｒ，  Ｍ．  Ａ  ｂｅｔａ４２−ｄｒｉｖｅｎ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  ｒｏｂｕｓｔ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  （２００６）  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔ  ７，  ９４０−９４６）である。あるいは、非ヒト動物モデルは野生型動物とすることができる。
【００４２】
さらに、本発明は、第２表のタンパク質または第２表のタンパク質をコードする核酸のいずれかの発現量および／または機能を変化させる物質の、以下を包含する特定方法および／または試験方法を提供する：
（ａ）前記物質を細胞または非ヒト脊椎動物に投与する；
（ｂ）前記タンパク質または前記タンパク質をコードする核酸分子の発現量および／または機能を測定またはモニターする；および
（ｃ）前記タンパク質または核酸分子の発現量および／または機能を、対照細胞または対照非ヒト脊椎動物の前記タンパク質または核酸分子の発現量および／または機能と比較する。
【００４３】
上述の方法における特に好ましい第２表のタンパク質は、ジヒドロピリミジナーゼ様２（配列番号４３、１１７）および／またはバロシン含有タンパク質、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２８、９９）である。上述の方法における別の好ましい第２表のタンパク質は、１４−３−３ゼータ（配列番号５８、１３３）、１４−３−３エプシロン（配列番号５９、１３４）および／またはＮ−エチルマレイミド感受性因子（配列番号５０、１２４）である。
【００４４】
前記タンパク質の発現量は、例えば放射活性を有するか安定な同位体などの差分識別が可能な同位体マーカーを用いて、発現解析によって測定する。あるいは、前記タンパク質の発現量は、２Ｄゲル電気泳動または質量分析法を用いて測定する。
【００４５】
前記核酸分子の発現量は、アフィメトリクスなどのＤＮＡ／ＲＮＡアレイで測定することができる。
【００４６】
本明細書に記載の方法に基づいて使用することのできる細胞は、ＬＵＨＭＥＳ細胞（Ｓｃｈｉｌｄｋｎｅｃｈｔ，  Ｓ．；  Ｐｏｌｔｌ，  Ｄ．；  Ｎａｇｅｌ，  Ｄ．Ｍ．；  Ｍａｔｔ，  Ｆ．；  Ｓｃｈｏｌｚ，  Ｄ．；  Ｌｏｔｈａｒｉｕｓ，  Ｊ．；  Ｓｃｈｍｉｅｇ，  Ｎ．；  Ｓａｌｖｏ−Ｖａｒｇａｓ，  Ａ．；  Ｌｅｉｓｔ，  Ｍ．，  ２００９，  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｆｏｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  １−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ，  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２４１，  ２３−３５）または、神経芽細胞、神経細胞の一次培養物などのその他のあらゆる神経細胞であり、特にＳＨＳＹ５Ｙ細胞が含まれる（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２６６）。
【００４７】
上述の方法において、用語「対照細胞」および「対照非ヒト動物」は、前記ニューレグリン−１アイソフォームまたは前記物質の投与以外は同一の条件下で並行して実施した実験で使用した細胞または動物を指す。
【００４８】
また、以下の項目は本発明の適用範囲に含まれる：
項目１は、神経分化の誘導および／または神経保護による神経学的疾患の予防、改善および／または治療のための、本明細書に記載の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームに関する。
【００４９】
本発明は、項目２として、ニューロンの減少に起因する疾患の予防、改善および／または治療のための、本明細書に記載の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームを提供する。
【００５０】
項目３は、ニューロンの減少が興奮毒性、好ましくはグルタミン酸誘導興奮毒性によってもたらされる、項目２の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームを提供する。
【００５１】
ある実施態様において、本発明は項目４として、ニューロンの減少が神経分化の誘導および／または神経保護によって予防される、項目２または３の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームを提供する。
【００５２】
さらなる実施態様において、本発明は項目５として、神経分化がグリア細胞、特に星細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、放射状グリア細胞、シュワン細胞、サテライト細胞および／または腸グリア細胞といった非神経細胞で誘導される、項目１または項目４の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームを提供する。
【００５３】
さらなる実施態様において、本発明は項目６として、神経分化が神経メラニンおよびチロシンヒドロキシラーゼを発現しないｅｒｂＢ４および／またはｅｒｂＢ３発現細胞において誘導される、項目１、４または５のいずれかの可溶性ニューレグリン−１アイソフォームを提供する。
【００５４】
さらなる実施態様において、本発明は項目７として、第２表で開示される１つ以上のタンパク質の発現レベルを変化させることによって神経分化が誘導される、項目１および４〜６のいずれかの可溶性ニューレグリン−１アイソフォームを提供する。
【００５５】
さらなる実施態様において、本発明は項目８として、発現レベルの変化が１４−３−３ゼータ（配列番号５８、１３３）、１４−３−３エプシロン（配列番号５９、１３４）、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（配列番号５０、１２４）からなる群から選択されるタンパク質の発現量の減少である、項目７の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームを提供する。
【００５６】
さらなる実施態様において、本発明は項目９として、発現レベルの変化がアルドラーゼＡ、フルクトースビスホスフェート（配列番号２、６８）；アルドラーゼＣ、フルクトースビスホスフェート（配列番号３、６９）；トリオースリン酸イソメラーゼ１（配列番号４、６５、７０）；グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素アイソフォーム１に準ずるもの（配列番号５、７１、７２）；エノラーゼ１、α非ニューロン（配列番号６、７３）；エノラーゼ２、γニューロン（配列番号７、７４）、乳酸脱水素酵素Ｂ（配列番号８、７５）；グリセロールリン酸脱水素酵素２、ミトコンドリア（配列番号９、７６、７７）；グルタミン酸アンモニアリガーゼ（グルタミン合成酵素）（配列番号１０、７８、７９）；ジヒドロリポアミドＳ−アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ２成分）（配列番号１１、８０、６６）；イソクエン酸脱水素酵素３（ＮＡＤ＋）α、アイソフォームＣＲＡ＿ｅ（配列番号１２、８１）；リンゴ酸脱水素酵素、細胞質（配列番号１３、８２）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）１αサブ複合体、８（配列番号１４、８３）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質１（配列番号１５、８４、６７）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質８（配列番号１６、８５）；ユビキノール−チトクロム−ｃ還元酵素複合体コアタンパク質１（配列番号１７、８６）；ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送性、ミトコンドリアＦ０複合体、サブユニットｄ（配列番号１８、８７、８８）；クレアチンキナーゼ、脳（配列番号１９、８９）；熱ショックタンパク質８（配列番号２０、９０、９１）；熱ショックタンパク質９（配列番号２１、９２）；Ｈｓｐ７０ホモログ、核周囲型（モルタリンｍｏｔ−２）（配列番号２２）；タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ関連３（配列番号２３、９３）；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送性、ライソゾームＶ１サブユニットＡ（配列番号２４、９４）；プロテアソーム２６Ｓサブユニット、ＡＴＰａｓｅ、４（配列番号２５、９５、９６）；プロテアソームサブユニットαタイプ２（配列番号２６、９７）；ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２７、９８）；バロシン含有タンパク質、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２８、９９）；３−ヒドロキシイソブチレート脱水素酵素（配列番号２９、１００）；ビフェニルヒドロラーゼ様（配列番号３０、１０１）；ハロ酸デハロゲナーゼ様ヒドロラーゼドメイン含有２（配列番号３１、１０２）；βアクチン（ａａ２７−３７５）（配列番号３２、１０３）；γアクチン（配列番号３３、１０４）；プロフィリン２、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３４、１０５、１０６）；トランスゲリン３（配列番号３５、１０７）；アネキシンＡ６、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３６、１０８、１０９）；インターネキシン神経細胞性中間径フィラメントタンパク質、α（配列番号３７、１１０）；神経フィラメント、軽ポリペプチド（配列番号３８、１１１）；グリア原線維酸性タンパク質（配列番号３９、１１２、１１３）；チューブリン、α１Ｂ（配列番号４０、１１４）；チューブリン、β（配列番号４１、１１５）���チューブリン、β３（配列番号４２、１１６）；ジヒドロピリミジナーゼ様２（配列番号４３、１１７）；ジヒドロピリミジナーゼ様４、アイソフォームＣＲＡ＿ｃ（配列番号４４、１１８）；脳に豊富に存在する膜結合性シグナルタンパク質１（配列番号４５、１１９）；ＲＡＢ１Ｂ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー；アイソフォームＣＲＡ＿ａ（配列番号４６、１２０）；ＲＡＢ３Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４７、１２１）；ＲＡＢ６Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４８、１２２）；グアノシンジホスフェート解離抑制因子１（配列番号４９、１２３）；ホスホリパーゼＣ−α（配列番号５１、１２５）；カルシニューリンＢ、タイプＩ（配列番号５２、１２６、１２７）；カルビンジン−２８Ｋ（配列番号５３、１２８）；カルレチニン（配列番号５４、１２９）；ビジニン様１（配列番号５５、１３０）；細胞内塩化物チャネル４（ミトコンドリア）（配列番号５６、１３１）；ｍＣＧ７１９１（Ｒａｆキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ））（配列番号５７、１３２）；ペルオキシレドキシン１（配列番号６０、１３５）；ペルオキシレドキシン３（配列番号６１、１３６）；ピリドキサール（ピリドキシン、ビタミンＢ６）キナーゼ（配列番号６２、１３７）；およびグアニンヌクレオチド結合タンパク質、αｏアイソフォームＢ（配列番号６３、１３８、１３９）からなる群から選択されるタンパク質の発現量の増加である、項目７の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームを提供する。
【００５７】
さらなる実施態様において、本発明は項目１０として、前記タンパク質がジヒドロピリミジナーゼ様２タンパク質（配列番号４３、１１７）および／またはバロシン含有タンパク質、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２８、９９）である、項目９の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームを提供する。
【００５８】
本発明のさらなる態様は、神経学的疾患の予防、改善および／または治療のための第２表のタンパク質である項目１１である。
【００５９】
また提供される項目１２は、神経学的疾患にニューロンの減少が伴う項目２〜１０のいずれかの可溶性ニューレグリン−１アイソフォームに関する。
【００６０】
また提供される項目１３は、神経学的疾患が統合失調症、特に統合失調症の認知関連の側面；パーキンソン病；アルツハイマー病；多発性硬化症（ＭＳ）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；てんかん；卒中；外傷性脳損傷；脊髄損傷；双極性障害；うつ病；前頭側頭型認知症；発作；虚血；ニューロパチー、特に糖尿病性ニューロパチー；神経痛；神経因性疼痛；および封入体ミオパチーからなる群から選択される、項目１〜１０または１２のいずれかの可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは項目１１のタンパク質である。
【００６１】
項目１４は、神経学的疾患がパーキンソン病である、項目１３の好ましい実施態様に対するものである。
【００６２】
また、項目１５として提供されるのは、血液脳関門を通過することを特徴とする項目１〜１０または１２〜１４のいずれかの可溶性ニューレグリン−１アイソフォームである。
【００６３】
項目１〜１０または１２〜１５のいずれかの可溶性ニューレグリン−１アイソフォームのある実施形態において、ニューレグリン−１アイソフォームはニューレグリン−１β1アイソフォームである。この実施態様は項目１６とも呼ばれる。
【００６４】
さらなる実施態様において、項目１７は、ニューレグリン−１の細胞外ドメインまたはその断片、特にＥＧＦ様ドメインまたはＥＧＦ様ドメイン、ＩｇＧ様ドメインおよびヘパラン硫酸結合モチーフを包含することを特徴とする、項目１〜１０または１２〜１６のいずれかの可溶性ニューレグリン−１アイソフォームに関する。
【００６５】
さらなる実施態様において、項目１８は、アイソフォームが配列番号１を包含する、項目１〜１０または１２〜１７のいずれかの可溶性ニューレグリン−１アイソフォームを提供する。
【００６６】
さらなる実施態様において、項目１９は、アイソフォームが
（ａ）配列番号６４のヌクレオチド４６−６３４、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１７６−２４６および／または
（ｃ）配列番号１のアミノ酸２−２４６
を包含する、項目１５〜１７のいずれかの可溶性ニューレグリン−１アイソフォームを提供する。
【００６７】
さらなる実施態様において、本発明は項目２０として、配列番号１のアミノ酸２−２４６を包含する、項目１９の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームを提供する。
【００６８】
さらなる実施態様において、本発明は項目２１として、さらなる活性物質と組み合わされる項目１〜１０または１２〜２０のいずれかの可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは項目１１のタンパク質を提供する。
【００６９】
さらなる実施態様において、本発明は項目２２として、さらなる活性物質が神経学的病態および／または神経学的疾患の治療のための物質である、項目２１の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは項目２１のタンパク質を提供する。
【００７０】
さらなる実施態様において、項目２３は、さらなる物質がカテコラミン代謝に影響を及ぼす化合物、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、ＭＡＯ−ＢまたはＣＯＭＴ阻害薬、メマンチン型チャネル遮断薬、ドパミンまたはセロトニン受容体作用薬または拮抗薬、カテコラミンまたはセロトニン再取り込み阻害薬またはアルツハイマー病およびパーキンソン病、統合失調症、双極性障害、うつ病またはその他の神経学的病態の治療におけるあらゆる種類の抗精神病薬様のクロザピンまたはオランザピンまたはガバペンチン様薬物から選択される、項目２２の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは項目２２のタンパク質を提供する。
【００７１】
さらなる実施態様において、本発明は項目２４として、さらなる物質がオランザピンまたはクロザピンといった統合失調症、双極性障害およびうつ病などの精神疾患の治療薬である、項目２１または２２の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは項目２１または２２のタンパク質を提供する。
【００７２】
さらなる実施態様において、本発明は項目２５として、さらなる物質がパーキンソン病の治療薬である、項目２１または２２の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは項目２１または２２のタンパク質を提供する。
【００７３】
さらなる実施態様において、本発明は項目２６として、さらなる物質がアルツハイマー病の治療薬である、項目２１または２２の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは項目２１または２２のタンパク質を提供する。
【００７４】
さらなる実施態様において、本発明は項目２７として、さらなる物質が多発性硬化症（ＭＳ）の治療薬である、項目２１または２２の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは項目２１または２２のタンパク質を提供する。
【００７５】
さらなる実施態様において、本発明は項目２８として、さらなる物質が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療薬である、項目２１または２２の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは項目２１または２２のタンパク質を提供する。
【００７６】
さらなる実施態様において、本発明は項目２９として、さらなる物質がてんかんの治療薬である、項目２１または２２の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは項目２１または２２のタンパク質を提供する。
【００７７】
さらなる実施態様において、本発明は項目３０として、さらなる物質が卒中の治療薬である、項目２１または２２の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは項目２１または２２のタンパク質を提供する。
【００７８】
さらなる実施態様において、本発明は項目３１として、さらなる物質が外傷性脳損傷の治療薬である、項目２１または２２の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは項目２１または２２のタンパク質を提供する。
【００７９】
さらなる実施態様において、項目３２は、さらなる物質が脊髄損傷の治療薬である、項目２１または２２の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは項目２１または２２のタンパク質を提供する。
【００８０】
さらなる態様において、項目３３は、項目１５〜２０のいずれかの可溶性ニューレグリン−１アイソフォームをコードする核酸分子、好ましくは配列番号６４を包含する核酸分子に関する。
【００８１】
また別の態様において、項目３４は、項目１〜１０、１２〜１４または２２〜３２のいずれかを使用するための項目３３の核酸分子を提供する。
【００８２】
また、項目１１、１３、１４または２２〜３２のいずれかを使用するための第２表のタンパク質をコードする核酸分子である項目３５も提供される。
【００８３】
さらなる態様において、項目３６は、活性物質として項目１５〜２０のいずれかの可溶性ニューレグリン−１アイソフォームおよび／または項目３３の可溶性ニューレグリン−１アイソフォームをコードする核酸分子および場合により薬学的に活性な担体を包含する医薬組成物に関する。
【００８４】
また別の態様において、本発明は神経学的疾患、ニューロンの減少の分子学的機序、それに伴う生理学的過程またはニューロンの減少に起因する疾患を研究するための以下を包含する方法である項目３７を提供する：
（ａ）ニューレグリン−１アイソフォームを、細胞または非ヒト脊椎動物に投与する；
（ｂ）前記細胞または前記動物の臓器または組織試料を対象にプロテオーム解析または遺伝子発現解析を実施する；および
（ｃ）プロテオーム解析または遺伝子発現解析の結果を、対照細胞または対照非ヒト動物の解析結果と比較する。
【００８５】
ある実施態様において、本発明は項目３８として、神経学的疾患が統合失調症、特に統合失調症の認知関連の側面；パーキンソン病；アルツハイマー病；多発性硬化症（ＭＳ）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；てんかん；卒中；外傷性脳損傷；脊髄損傷；双極性障害；うつ病；前頭側頭型認知症；発作；虚血；ニューロパチー、特に糖尿病性ニューロパチー；神経痛；神経因性疼痛；および封入体ミオパチーからなる群から選択される、項目３７の方法を提供する。
【００８６】
項目３９は、神経学的疾患がパーキンソン病である、項目３７または３８の方法に関する。
【００８７】
好ましい実施態様である項目４０は、非ヒト脊椎動物がマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、鳥、ネコ、ヒツジ、ウシおよびウマからなる群から選択される、項目３７〜３９のいずれかの方法である。
【００８８】
さらなる実施態様において、本発明は項目４１として、非ヒト脊椎動物がマウス、好ましくは神経学的疾患のマウスモデルである、項目４０の方法を提供する。
【００８９】
さらなる実施態様において、項目４２は、前記マウスモデルが、好ましくは６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨＤＨ）で神経死を誘導したパーキンソン病マウスモデルまたはＡ５３Ｔαシヌクレイントランスジェニックマウスまたはアルツハイマー病では好ましくはＡＰＰ／ＰＳマウスモデルである、項目４１の方法を提供する。
【００９０】
また、本発明の適用範囲内にある項目４３は、本明細書でも上述した第２表のタンパク質または第２表のタンパク質をコードする核酸のいずれかの発現量および／または機能を変化させる物質を特定および／または試験するための以下を包含する方法である：
（ａ）前記物質を細胞または非ヒト脊椎動物に投与する；
（ｂ）前記タンパク質または前記タンパク質をコードする核酸分子の発現量および／または機能を測定またはモニターする；および
（ｃ）前記タンパク質または核酸分子の発現量および／または機能を、対照細胞または対照非ヒト脊椎動物の前記タンパク質または核酸分子の発現量および／または機能と比較する。
【００９１】
また、下記の態様および好ましい実施態様も、本発明の適用範囲内である。
【００９２】
これらのさらなる態様および実施態様の概略を説明する前に、本明細書で頻繁に使用するいくつかの追加的な用語の定義を記載する。これらの用語は、使用されるたびに、それぞれ規定された意味および好ましい意味を有する。
【００９３】
本明細書で使用する用語「単離」は、それに天然に随伴する他の分子を実質的に有さない分子を指す。したがって単離分子は、自然界、すなわち実験環境外で生きている動物内では遭遇または接触するであろう他の分子を有さない。好ましくは、本発明の抗体またはその断片は、単離抗体またはその断片であるのがよい。
【００９４】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は、天然のポリペプチドおよび合成ポリペプチドの両方を指し、天然または非天然のアミノ酸を含むことができる。また、ポリペプチドは修飾することができ、例えば側鎖の化学的修飾または遊離アミノ酸または天然または非天然のアミノ酸のカルボキシ末端を包含することができる。この化学的修飾には、蛍光体などの検出可能な標識が含まれる。また、ポリペプチドは側鎖または遊離アミノ酸などの修飾部位を包含することができるか、ポリペプチドのアミノ酸のカルボキシ末端を例えばグリコシル化、アミド化、リン酸化、ユビキチン化などによって修飾することができる。タンパク質科学の当該技術分野で既知の通り、かかる修飾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは宿主細胞内、すなわちｉｎ  ｖｉｖｏで達成することができる。例えば、好適な化学的修飾モチーフ、例えばグリコシル化配列モチーフが当該ポリペプチドのアミノ酸配列内に存在すれば、これはｉｎ  ｖｉｖｏでグリコシル化される。好ましい実施態様において、本発明に基づくポリペプチドは、３００個以下のアミノ酸、好ましくは２４４個以下のアミノ酸、最も好ましくは２００個以下のアミノ酸を有する。
【００９５】
本明細書全体を通じて使用されるフレーズ、ポリペプチドの「単一アミノ酸の置換、欠失および／または挿入」は、一般に修飾されたポリペプチドを指す。例えば当該ポリペプチドの１個のアミノ酸は欠失、挿入および／または置換されてよい。当該ポリペプチドに、いくつかの単一アミノ酸の置換、欠失および／または挿入が包含される場合、その都度かかる置換、欠失および／または挿入の合計数を示す。前記挿入とは、もともとのポリペプチドまたはタンパク質に対する示された数の単一アミノ酸の挿入である。当該ポリペプチドが１個以上の単一アミノ酸の置換を包含する場合、前記置換はその都度独立して保存的置換または非保存的置換であってよく、好ましくは保存的置換であるのがよい。いくつかの実施態様において、置換には、天然のアミノ酸と非天然のアミノ酸との交換も含まれる。最も好ましい実施態様において、下にさらに規定する通り、すべての置換は保存的置換である。保存的置換は、１個のアミノ酸と、置換対象のアミノ酸と類似の化学的特性を有する別のアミノ酸との置換を包含する。好ましくは保存的置換は、以下からなる群から選択される置換である：
（ｉ）塩基性アミノ酸と別の異なる塩基性アミノ酸の置換；
（ｉｉ）酸性アミノ酸と別の異なる酸性アミノ酸の置換；
（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸と別の異なる芳香族アミノ酸の置換；
（ｉｖ）非極性脂肪族アミノ酸と別の異なる非極性脂肪族アミノ酸の置換；
（ｖ）極性の電荷をもたないアミノ酸と別の異なる極性の電荷をもたないアミノ酸の置換。
【００９６】
塩基性アミノ酸は、好ましくはアルギニン、ヒスチジンおよびリジンからなる群から選択される。酸性アミノ酸は、好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸である。芳香族アミノ酸は、好ましくはフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択される。非極性脂肪族アミノ酸は、好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択される。極性の電荷をもたないアミノ酸は、好ましくはセリン、スレオニン、システイン、プロリン、アスパラギンおよびグルタミンからなる群から選択される。アミノ酸の保存的置換とは異なり、アミノ酸の非保存的置換とは、１個のアミノ酸が上述の保存的置換の定義（ｉ）〜（ｖ）に該当しない何らかのアミノ酸と交換されることである。
【００９７】
ポリペプチドが１個または示された数の単一アミノ酸の欠失を包含する場合、この参照ポリペプチドからは前記の数のアミノ酸が除去されている。
【００９８】
下表に概略を示した好ましいアミノ酸配列を参照する：
【表１】
2013529911.tif 000002
【００９９】
【表２】
2013529911.tif 000003
【０１００】
本発明の発明者らは、ニューレグリンの全細胞外ドメイン（ＥＣＤ）が血液脳関門を通過できることを見出した（下記の実施例参照）。ＥＧＦ様ドメイン（配列番号１のＴｈｒ１７６−Ｌｙｓ２４６、８ｋＤａ）のみを含有するニューレグリンＮｒｇ１β1の小断片も、無傷の成人の血液脳関門を通過することができたが、ＥｒｂＢ受容体とのむしろ非選択的な相互作用を示した。
【０１０１】
血液脳関門を効果的に通過する、および／または望ましくない細胞分裂促進作用を示すことなくｅｒｂＢ３受容体および／またはｅｒｂＢ４受容体などの標的受容体と選択的に相互作用する遺伝子組換えニューレグリンポリペプチドを提供することは、本発明の一つの目的であった。
【０１０２】
Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリングに基づき、発明者らは、短いニューレグリン断片を選択し、またニューレグリンのＥＧＦ様ドメインまたはその断片を、至適化したヘパリン結合ドメインおよび／またはヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸と相互作用することができる多塩基性ポリペプチドに融合させて遺伝子組み換えポリペプチドを生成することによって、標的受容体との相互作用が改善されると評価した。特定の理論に束縛されるものではないが、ニューレグリンは細胞外基質のヘパリン様グリコサミノグリカンに結合することによって、シナプスで特異的に濃縮されるというのは魅力的な仮説である。これにより、ＥＧＦ様ドメインの標的外の作用、例えば発がんリスクにより望まれない細胞分裂を誘導することのあるｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４以外の受容体の活性化を抑制することができる。
【０１０３】
このように、概略を下述する通り、本発明の融合ポリペプチドは、個々の標的受容体に結合し、これを活性化するための最小限の必須システムのみを包含する医薬化合物を提供する。同時に、例えばドメイン間に短いリンカー分子を使用するか、ドメイン同士を直接結合させることにより、このポリペプチドのサイズを減少させることができる。ヘパリン結合ドメインを至適化して、ヘパリン結合機能を保持させつつ可能な限りこれを短くすることに注意を払った（例えば下記の図５および６を参照）。
【０１０４】
したがって、さらなる態様において本発明はポリペプチドに関し、このポリペプチドは配列番号１４０−１４６（すなわち配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５および１４６）からなる群から選択されるＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦＬＤ１）を包含するかこれにより構成され、前記ＥＧＦ様ドメインは１個、２個、３個、４個または５個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができ、前記ＥＧＦ様ドメインは場合によりそのＣおよび／またはＮ末端に５個以下、１０個以下、１５個以下、２０個以下、２５個以下、３０個以下、３５個以下または４０個以下および最も好ましくは３０個以下の追加のアミノ酸を包含する。
【０１０５】
ある実施態様において、本発明はポリペプチドに関し、このポリペプチドは配列番号１４７に基づくＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦＬＤ１）を包含するかこれにより構成され、前記ＥＧＦ様ドメインは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１３個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができ、前記ＥＧＦ様ドメインは場合によりそのＣおよび／またはＮ末端に５個以下、１０個以下、１５個以下、２０個以下、２５個以下、３０個以下、３５個以下または４０個以下および最も好ましくは３０個以下の追加のアミノ酸を包含する。
【０１０６】
本発明のポリペプチドに包含されるＥＧＦ様ドメインに基づけば、前記の単一アミノ酸の欠失および／または変異は、前記の第一のＥＧＦ様ドメインおよび存在する場合は追加のＥＧＦ様ドメインにおける以下のいずれかの位置で起こらないことが好ましい。すなわち、配列番号１４０−１４６（すなわち配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５および１４６）では第１位（システイン）、第５位（フェニルアラニン）、第６位（スレオニン）、第７位（グリシン）、第９位（アルギニン）、第１０位（システイン）および／または第１４位（バリン）。換言すれば、第１、５、６、７、９、１０および／または１４位のアミノ酸は、配列番号１４０−１４６（すなわち配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５および１４６）で特定される通りであって、変異、欠失または挿入による移動がないことが好ましい。当該技術分野における有用な慣例であることから、各位置は配列番号１４０−１４６（すなわち配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５および１４６）のいずれかに基づき、配列のＮ末端からカウントする。例えば第１位は、配列番号１４０−１４６（すなわち配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５および１４６）の１番目のアミノ酸、すなわちシステインを指す。
【０１０７】
好ましくは、ＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦＬＤ１）は、配列番号１４７−１５３（すなわち配列番号１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２および１５３）からなる群から選択され、前記ＥＧＦ様ドメインは合計１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１３個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができる。前記の態様および好ましい実施態様のさらに好ましい実施態様において、ＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦＬＤ１）は、配列番号１４０−１４３（すなわち配列番号１４０、１４１、１４２または１４３）または配列番号１４７−１５０（すなわち配列番号１４７、１４８、１４９または１５０）からなる群から選択される、すなわちニューレグリン１−βＥＧＦ様ドメインを包含する。
【０１０８】
発明者らは、ポリペプチドが２個以上のＥＧＦ様ドメインを包含する場合、本発明のポリペプチドの受容体結合能が改善されると予測した。
【０１０９】
このように、さらに好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは１個以上の追加のＥＧＦ様ドメインを包含し、追加の各ＥＧＦ様ドメインは独立して配列番号１４０−１５３（すなわち配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２および１５３）からなる群から選択され、追加の各ＥＧＦ様ドメインは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１３個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができる。より好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドに包含されるすべてのＥＧＦ様ドメインは、合計５個、４個、３個、２個または１個を超える単一アミノ酸の欠失、挿入または変異を包含しない。
【０１１０】
このように、本発明のポリペプチドはある実施態様において、配列番号１４０−１５３（すなわち配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２および１５３）からなる群から（存在する場合は他のＥＧＦ様ドメインからは独立して）選択される少なくとも第２のＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦＬＤ２）を包含し、この第２のＥＧＦ様ドメインは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１３個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができる。
【０１１１】
より好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号１４７に基づく第１のＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦＬＤ１）および配列番号１４７に基づく第２のＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦＬＤ２）を包含し、この第１および第２のＥＧＦ様ドメインはともに１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１３個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができる。
【０１１２】
また、好ましい本発明のポリペプチドでは、ポリペプチドがさらにヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を包含する。Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏコンピュータ解析により、最小限かつ必須のヘパリン結合ドメインがその電荷プロファイルおよび好ましくはＩｇ様ドメインの存在に基づいて特定されており、本発明のポリペプチドの結合特異性を高め、それによってポリペプチドが有する可能性のある細胞分裂促進作用を抑制することが期待される。このため、好ましい実施態様において、本発明に基づくポリペプチドのヘパリン結合ドメインは、配列番号１５４、１５５、１５６または１５７（最も好ましくは１５７）のいずれかに基づくアミノ酸配列を有し、ヘパリン結合ドメインは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個以下（最も好ましくは５個以下）の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができる。ヘパリン結合ドメインが１個以上の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を有する場合、ヘパリン結合ドメインのすべてのアミノ酸の５〜４０％、より好ましくは１５〜３５％、最も好ましくは２０〜３０％が、１個以上の以下のアミノ酸であるのが好ましい：ヒスチジン、アルギニンおよびリジン。
【０１１３】
本明細書で使用する「ヘパリン結合ドメイン」は、ヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸に結合することができる。ヘパリンは、ある実施態様において分子量１０6ダルトン以上のプロテオグリカン（ＰＧ）として細胞内で合成される。ヘパリンは、１→４位で結合したウロン酸およびグルコサミン残基の反復直線状コポリマーである。ヘパラン硫酸は、炭水化物のグリコサミノグリカンファミリーに属し、ヘパリンの構造にきわめて密接に関係する。ヘパラン硫酸内で最もよくみられる二糖ユニットは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に結合したグルクロン酸（ＧｌｃＡ）から構成され、通常は全二糖ユニットの約５０％を占める。
【０１１４】
さまざまなヘパリンおよびヘパラン硫酸結合タンパク質が平均的な当業者に既知であり、その結合ドメインの特徴は明確にされている（例えば、Ｈｉｌｅｍａｎ，  "Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ"，  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ２０：１５６−１６７，  １９９８  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．を参照）。ある実施態様において、本発明の好ましいポリペプチドに包含されるヘパリン結合ドメインは、ヘパリンなどの細胞外基質の構成要素に結合するＩｇ様（Ｉｇ−Ｌ）ドメインである（例えば、Ｌｏｅｂ，  Ｊ．Ａ．  ＆  Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ，  Ｇ．Ｄ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３０，  １２７−１３５を参照）。本発明の好ましいヘパリン結合ドメインのひとつは、免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインであり、最も好ましくはＣ２型免疫グロブリン様ドメインである。
【０１１５】
本発明のポリペプチドのより好ましい実施態様において、ポリペプチドは、配列番号１４０−１４６（すなわち配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５および１４６）からなる群から選択されるＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦＬＤ１）にリンカーを介して結合した配列番号１５４、１５５、１５６または１５７（最も好ましくは１５７）のいずれかに基づくアミノ酸配列を有するヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を包含し、前記ＥＧＦ様ドメインおよび前記ヘパリン結合ドメインはともに合計１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１３個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができる。リンカーは好ましくは、共有結合、本明細書に記載の化学的リンカーおよび１〜４５個、より好ましくは１〜２５個、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸からなるポリペプチドから選択される。
【０１１６】
この実施態様においては、ヘパリン結合ドメインおよび／またはリンカーの全アミノ酸の２０〜５０％、より好ましくは２０〜３５％、最も好ましくは２３〜３５％が、１個以上の以下のアミノ酸であるのが好ましい：ヒスチジン、アルギニンおよびリジン。
【０１１７】
別の実施態様においては、ヘパリン結合ドメインおよび／またはリンカーの全アミノ酸の２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％または２９％以上が、ヒスチジン、アルギニンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸であるのが好ましい。
【０１１８】
さらに好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは、リンカー、ＨＢＤおよびＥＧＦＬＤ１を包含するかこれらから構成され、前記リンカーは本明細書に記載のＨＢＤを本明細書に記載のＥＧＦＬＤ１に結合させるペプチドであって、ポリペプチドはさらに下表に列記する特性を有する：
【表３】
2013529911.tif 000004
【０１１９】
さらに好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは、リンカー、ＨＢＤおよびＥＧＦＬＤ１を包含するかこれらから構成され、前記リンカーは、示されるＨＢＤを本明細書に記載のＥＧＦＬＤ１に結合させる化学的リンカーまたは０〜２５個のアミノ酸からなるポリペプチドであって、ポリペプチドはさらに下表に列記する特性を有する：
【表４】
2013529911.tif 000005
【０１２０】
さらに好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは、リンカー、ＨＢＤおよびＥＧＦＬＤ１を包含するかこれらから構成され、前記リンカーは、示されるＨＢＤを配列番号１４７に基づくＥＧＦＬＤ１に結合させる化学的リンカーまたは０〜２５個のアミノ酸からなるポリペプチドであって、ポリペプチドはさらに下表に列記する特性を有する：
【表５】
2013529911.tif 000006
【０１２１】
さらに好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは、リンカー、ＨＢＤおよびＥＧＦＬＤ１を包含するかこれらから構成され、前記リンカーは、示されるＨＢＤを配列番号１４７に基づくＥＧＦＬＤ１に結合させる化学的リンカーまたは０〜５個のアミノ酸からなるポリペプチドであって、ポリペプチドはさらに下表に列記する特性を有する：
【表６】
2013529911.tif 000007
【０１２２】
さらに好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは、リンカー、ＨＢＤおよびＥＧＦＬＤ１を包含するかこれらから構成され、前記リンカーは、示されるＨＢＤを配列番号１４０に基づくＥＧＦＬＤ１に結合させる化学的リンカーまたは０〜５個のアミノ酸からなるポリペプチドであって、ポリペプチドはさらに下表に列記する特性を有する：
【表７】
2013529911.tif 000008
【０１２３】
また、本発明の好ましいポリペプチドは、２個以上のＥＧＦ様ドメインおよびヘパリン結合ドメイン、好ましくは上の表に概略を示したヘパリンドメインを有する。この実施態様に基づくポリペプチドは、場合により前記ドメインを互いにあらゆる順序で結合させる１個または２個のリンカーを包含することができる。最も好ましくは、上述の実施態様は下記の特性を有し、各リンカーは下表に記載の範囲から独立して選択される長さを有する：
【表８】
2013529911.tif 000009
【０１２４】
本発明のポリペプチドのさらに好ましい実施態様において、ポリペプチドは配列番号１４７に基づくＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦＬＤ１）にリンカーを介して結合した配列番号１５４、１５５、１５６または１５７（最も好ましくは１５７）のいずれかに基づくアミノ酸配列を有するヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を包含し、前記ＥＧＦ様ドメインおよび前記ヘパリン結合ドメインはともに合計１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１３個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができる。リンカーは好ましくは、共有結合、本明細書に記載の化学的リンカーおよび１〜４５個、より好ましくは１〜２５個、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸からなるポリペプチドから選択する。
【０１２５】
この実施態様において、ヘパリン結合ドメインおよび／またはリンカーの全アミノ酸の２０％、２２％、２４％、２６％、２８％または２９％以上が、ヒスチジン、アルギニンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸であるのが好ましい。
【０１２６】
本発明のポリペプチドのさらに好ましい実施態様において、前記ヘパリン結合ドメインはＥＧＦ様ドメインのＮ末端またはＣ末端、最も好ましくはＮ末端に位置する。
【０１２７】
さらに好ましい実施態様における本発明に基づくポリペプチドは、ＥＧＦ様ドメインＥＧＦＬＤ１と第２のＥＧＦ様ドメインＥＧＦＬＤ２との間、２個以上の隣接するＥＧＦ様ドメイン間、前記ヘパリン結合ドメインと前記ＥＧＦ様ドメインＥＧＦＬＤ１との間および／または前記ヘパリン結合ドメインと前記第２のＥＧＦ様ドメインＥＧＦＬＤ２との間に存在するリンカーをさらに包含する。
【０１２８】
好ましくは、本発明に基づくポリペプチドは以下から選択される構造を有する：
ＥＧＦＬＤ１−リンカー−ＥＧＦＬＤ２、
ＨＢＤ−リンカー−ＥＧＦＬＤ１−リンカー−ＥＧＦＬＤ２、
ＥＧＦＬＤ１−リンカー−ＨＢＤ−リンカー−ＥＧＦＬＤ２、または
ＥＧＦＬＤ１−リンカー−ＥＧＦＬＤ２−リンカー−ＨＢＤ。
【０１２９】
本明細書で使用する用語「リンカー」は、共有結合、化学的リンカーおよびポリペプチドから選択されるリンカーを指し、前記ポリペプチドは好ましくは１〜６３個または１〜４５個のアミノ酸、より好ましくは１〜２５個のアミノ酸、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸の長さを有するのがよい。本発明のポリペプチドが２個以上のリンカーを包含する場合、各リンカーは独立して共有結合、化学的リンカーおよび、好ましくは１〜４５個のアミノ酸、より好ましくは１〜２５個のアミノ酸、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸のポリペプチドからなる群から選択される。本発明のポリペプチドが、ポリペプチドであるリンカーを２個以上包含する場合、各リンカーを構成するポリペプチドは異なることができると理解される、すなわち本発明のポリペプチド中に存在する他のリンカーから独立して選択される。前記リンカーが１〜１０個のアミノ酸である場合、このリンカーは１個以上のグリシン残基を包含する、例えばアミノ酸配列ＧＧＧＳを有するのが特に好ましい。前記リンカーが化学的リンカーである場合、それはリンカーを介して結合する二体間に空間的距離を提供するあらゆる化学基である。この距離は、好ましくは結合する二体が自由に回転できる距離であるのがよい。本発明の２個のポリペプチドは、例えば二価アルデヒドを使用するか、ジスクシンイミドエステル（例えばスベリン酸ジスクシニミジル）などの活性エステルを使用することによって互いに結合させることができる。
【０１３０】
好ましい実施態様において、リンカーは配列番号１５８に基づくアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、リンカーは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができる。
【０１３１】
本発明のポリペプチドが、配列番号１４０−１５３（すなわち配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２および１５３）（および好ましくは配列番号１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２および１５３）（および最も好ましくは配列番号１４７）からなる群から選択される第１のＥＧＦ様ドメイン、配列番号１５８に基づくリンカーおよび配列番号１４０−１５３（すなわち配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２および１５３）（および好ましくは配列番号１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２および１５３）（および最も好ましくは配列番号１４７）から独立して選択される第２のＥＧＦ様ドメインを包含するあらゆる実施態様において、前記第１のＥＧＦ様ドメイン、前記リンカーおよび前記第２のＥＧＦ様ドメインは合計１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができる。
【０１３２】
本発明のポリペプチドが、配列番号１４０−１５３（すなわち配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２および１５３）（および好ましくは配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５および１４６）からなる群から選択されるＥＧＦ様ドメイン、配列番号１５８に基づくリンカーおよび配列番号１５４、１５５、１５６または１５７のいずれか（最も好ましくは１５７）に基づくアミノ酸配列を有するヘパリン結合ドメインを包含するあらゆる実施態様において、前記ＥＧＦ様ドメイン、前記リンカーおよび前記ヘパリン結合ドメインは合計１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入および／または変異を包含することができ、より好ましくは合計１個、２個、３個、４個または５個以下の単一アミノ酸の欠失を包含することができる。
【０１３３】
本発明に基づくポリペプチドは、ｅｒｂＢ３受容体（配列番号１５９）および／またはｅｒｂＢ４受容体（配列番号１６０）と特異的に結合するのが好ましい。本明細書で使用する場合、第１の化合物（例えば本発明のポリペプチドまたは抗体など）は第２の化合物（例えば受容体または抗原など）と、前記第２の化合物に対する解離定数ＫDが１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、好ましくは３０μＭ以下、好ましくは２０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、好ましくは５μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下、より好ましくは９００ｎＭ以下、より好ましくは８００ｎＭ以下、より好ましくは７００ｎＭ以下、より好ましくは６００ｎＭ以下、より好ましくは５００ｎＭ以下、より好ましくは４００ｎＭ以下、より好ましくは３００ｎＭ以下、より好ましくは２００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下、さらにより好ましくは９０ｎＭ以下、さらにより好ましくは８０ｎＭ以下、さらにより好ましくは７０ｎＭ以下、さらにより好ましくは６０ｎＭ以下、さらにより好ましくは５０ｎＭ以下、さらにより好ましくは４０ｎＭ以下、さらにより好ましくは３０ｎＭ以下、さらにより好ましくは２０ｎＭ以下、さらにより好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは１ｎＭ以下のＫDである場合に「特異的に結合する」と考えられる。プラズモン共鳴法、ＥＬＩＳＡアッセイ法など、解離定数を測定する方法は平均的な当業者には既知である。
【０１３４】
本発明のある好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは可溶性である。好ましいポリペプチドは、約１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約１０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬで精製水に溶ければ可溶性である。
【０１３５】
さらに好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは単離ポリペプチドであり、さらに好ましい実施態様においては上述の通り可溶性も有する。
【０１３６】
本発明のあらゆるポリペプチドは血液脳関門を通過することができ、例えば静脈内投与または腹腔内注入された場合に治療効果を発揮できるのも好ましい。
【０１３７】
血液脳関門の透過性の試験方法については、下記の実施例に概略を記載した。
【０１３８】
下記の実施例で示した通り、ニューレグリンポリペプチドは治療薬であり、例えばパーキンソン病の治療に有用である。本発明のポリペプチドは受容体への結合特異性および結合親和性を高めると考えられるため、少量で投与することができ、治療有効剤型の製造コストを抑え、さらに患者の副作用も最小限に抑えることができる。
【０１３９】
このように、本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチドを包含する医薬組成物に関する。
【０１４０】
好ましくは、この医薬組成物はさらに神経学的疾患の治療薬、好ましくはカテコラミン代謝に影響を及ぼす化合物、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、ＭＡＯ−ＢまたはＣＯＭＴ阻害薬、メマンチン型チャネル遮断薬、ドパミンまたはセロトニン受容体作用薬、ドパミンまたはセロトニン受容体拮抗薬、カテコラミンまたはセロトニン再取り込み阻害薬、抗精神病薬、アルツハイマー病またはパーキンソン病の治療薬および統合失調症、双極性障害またはうつ病の治療薬からなる群から選択される薬物を包含する。これに基づき使用される好ましい薬物はすでに上述した。
【０１４１】
本発明のまた別の態様は、神経学的疾患の予防または治療に使用する本発明のポリペプチドに関する。好ましくは、前記神経学的疾患は、統合失調症、特に統合失調症の認知関連の側面、双極性障害およびうつ病；パーキンソン病；アルツハイマー病；てんかん；ＭＳ；ＡＬＳ；卒中；外傷性脳損傷および脊髄損傷からなる群から選択される。特に好ましい使用法のひとつは、双極性障害の治療である。
【０１４２】
双極性障害（ＢＰ）は、世界人口の約１％が罹患する、日常生活に支障をもたらし、生命を脅かすことの多い障害である。双極性障害（ＢＰ）は、急激な気分の変化を特徴とし、患者は正常な機能の期間を挟んでうつ病と躁病のエピソードを繰り返す。ＢＰは慢性で、日常生活に重度の支障をもたらし生命を脅かすもので、自殺リスクが高まり、生涯における推定罹患率はほぼ１％である。
【０１４３】
ＢＰは実質的に遺伝的要素を有する。一卵性双生児の推定一致率は４５〜７０％であり、同胞再発危険率の推定値は５〜１０％である。
【０１４４】
双極性障害または躁うつ病は、双極性感情障害または躁うつ病とも呼ばれ、異常に上昇したエネルギーレベル、認知力および気分を示す１つ以上のエピソードに、１つ以上の抑うつエピソードが伴うか伴わない状態と定義される気分障害のカテゴリーを示す精神医学的診断名である。この文脈において、気分の上昇は臨床的に躁病とみなされる。この場合は、単極性障害（大うつ病）および双極性障害の鑑別が行われる。
【０１４５】
また実施例でも示す通り、ニューレグリンのＥＣＤを包含する本発明のポリペプチドを末梢投与することにより、ドパミン作働性チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＩＩ）＋ニューロンの合計数が増加した。特に、使用したＮｒｇ１β1ポリペプチドは細胞分裂促進作用を示さなかったことから、このニューロンの増加は細胞分化に起因するものではなかった。Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤは成人ＳＮｃで神経発生を誘導しなかったため、この新たに発現したドパミン作働性ニューロンは、おそらく既存の細胞中でドパミン作働性の表現型が誘導された結果であると考えられる。このように、本発明のポリペプチドは細胞分化を誘導する機能を有することが示された。
【０１４６】
したがって、本発明はさらなる態様において、本発明に基づくポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して細胞分化を誘導する方法も提供する。
【０１４７】
本明細書で使用する用語「細胞分化」または「細胞の分化」は、本発明のポリペプチドなどの分化因子を細胞に投与することで前記細胞内で起こる遺伝子発現の変化を指す。この遺伝子発現の変化によって、好ましくは細胞の表現型が変化する、例えば前記細胞のサイズ（容量など）、形状、膜電位、代謝活性および／またはシグナルへの反応性が変化するのがよい。好ましい実施態様において、細胞分化とは、細胞のドパミン産生能の調節、好ましくは誘導を指す。このように、本発明の使用法の特に好ましい実施態様において、前記細胞は細胞分化を経た後に、より多くのドパミンを産生する。最も好ましくは分化細胞は、好ましくはチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現するドパミン作働性ニューロンであり、例えばこのタンパク質に対して免疫染色されるのがよい。
【０１４８】
ある実施態様において、分化する前記細胞は神経細胞または非神経細胞、好ましくはグリア細胞である。これに基づき、前記神経細胞または非神経細胞は、好ましくはｅｒｂＢ４および／またはｅｒｂＢ３発現細胞である。最も好ましくは、前記神経細胞または非神経細胞は、神経メラニンおよび／またはチロシンヒドロキシラーゼを発現しないｅｒｂＢ４および／またはｅｒｂＢ３発現細胞である。
【０１４９】
平均的な当業者は必要以上の負担なく、細胞が神経メラニンまたはチロシンヒドロキシラーゼを発現しているかどうかを、例えば神経メラニンおよびチロシンヒドロキシラーゼにそれぞれ特異的に結合する検出可能に標識した抗体を使用することによって決定することができる。かかる抗体は、例えばＥＬＩＳＡアッセイで使用して、当該技術分野で既知の通り、上述のタンパク質を定量することができる。ウェスタンブロット法またはＥＬＩＳＡアッセイ法のいずれかで評価した場合に、神経メラニンまたはチロシンヒドロキシラーゼに特異的に結合することのできる抗体が検出可能な量でこれらのタンパク質に結合していない場合、その細胞は神経メラニンまたはチロシンヒドロキシラーゼを発現していないと考えられる。
【０１５０】
ある実施態様において、前記分化細胞は以下を特徴とする：
（ｉ）１４−３−３ゼータ（配列番号５８、１３３）、１４−３−３エプシロン（配列番号５９、１３４）、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（配列番号５０、１２４）からなる群から選択されるタンパク質の発現量が減少する、および／または
（ｉｉ）アルドラーゼＡ、フルクトースビスホスフェート（配列番号２、６８）；アルドラーゼＣ、フルクトースビスホスフェート（配列番号３、６９）；トリオースリン酸イソメラーゼ１（配列番号４、６５、７０）；グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素アイソフォーム１に準ずるもの（配列番号５、７１、７２）；エノラーゼ１、α非ニューロン（配列番号６、７３）；エノラーゼ２、γニューロン（配列番号７、７４）、乳酸脱水素酵素Ｂ（配列番号８、７５）；グリセロールリン酸脱水素酵素２、ミトコンドリア（配列番号９、７６、７７）；グルタミン酸アンモニアリガーゼ（グルタミン合成酵素）（配列番号１０、７８、７９）；ジヒドロリポアミドＳ−アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ２成分）（配列番号１１、８０、６６）；イソクエン酸脱水素酵素３（ＮＡＤ＋）α、アイソフォームＣＲＡ＿ｅ（配列番号１２、８１）；リンゴ酸脱水素酵素、細胞質（配列番号１３、８２）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）１αサブ複合体、８（配列番号１４、８３）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質１（配列番号１５、８４、６７）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質８（配列番号１６、８５）；ユビキノール−チトクロム−ｃ還元酵素複合体コアタンパク質１（配列番号１７、８６）；ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送性、ミトコンドリアＦ０複合体、サブユニットｄ（配列番号１８、８７、８８）；クレアチンキナーゼ、脳（配列番号１９、８９）；熱ショックタンパク質８（配列番号２０、９０、９１）；熱ショックタンパク質９（配列番号２１、９２）；Ｈｓｐ７０ホモログ、核周囲型（モルタリンｍｏｔ−２）（配列番号２２）；タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ関連３（配列番号２３、９３）；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送性、ライソゾームＶ１サブユニットＡ（配列番号２４、９４）；プロテアソーム２６Ｓサブユニット、ＡＴＰａｓｅ、４（配列番号２５、９５、９６）；プロテアソームサブユニットαタイプ２（配列番号２６、９７）；ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２７、９８）；バロシン含有タンパク質、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２８、９９）；３−ヒドロキシイソブチレート脱水素酵素（配列番号２９、１００）；ビフェニルヒドロラーゼ様（配列番号３０、１０１）；ハロ酸デハロゲナーゼ様ヒドロラーゼドメイン含有２（配列番号３１、１０２）；βアクチン（ａａ２７−３７５）（配列番号３２、１０３）；γアクチン（配列番号３３、１０４）；プロフィリン２、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３４、１０５、１０６）；トランスゲリン３（配列番号３５、１０７）；アネキシンＡ６、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３６、１０８、１０９）；インターネキシン神経細胞性中間径フィラメントタンパク質、α（配列番号３７、１１０）；神経フィラメント、軽ポリペプチド（配列番号３８、１１１）；グリア原線維酸性タンパク質（配列番号３９、１１２、１１３）；チューブリン、α１Ｂ（配列番号４０、１１４）；チューブリン、β（配列番号４１、１１５）；チューブリン、β３（配列番号４２、１１６）；ジヒドロピリ��ジナーゼ様２（配列番号４３、１１７）；ジヒドロピリミジナーゼ様４、アイソフォームＣＲＡ＿ｃ（配列番号４４、１１８）；脳に豊富に存在する膜結合性シグナルタンパク質１（配列番号４５、１１９）；ＲＡＢ１Ｂ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー；アイソフォームＣＲＡ＿ａ（配列番号４６、１２０）；ＲＡＢ３Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４７、１２１）；ＲＡＢ６Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４８、１２２）；グアノシンジホスフェート解離抑制因子１（配列番号４９、１２３）；ホスホリパーゼＣ−α（配列番号５１、１２５）；カルシニューリンＢ、タイプＩ（配列番号５２、１２６、１２７）；カルビンジン−２８Ｋ（配列番号５３、１２８）；カルレチニン（配列番号５４、１２９）；ビジニン様１（配列番号５５、１３０）；細胞内塩化物チャネル４（ミトコンドリア）（配列番号５６、１３１）；ｍＣＧ７１９１（Ｒａｆキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ））（配列番号５７、１３２）；ペルオキシレドキシン１（配列番号６０、１３５）；ペルオキシレドキシン３（配列番号６１、１３６）；ピリドキサール（ピリドキシン、ビタミンＢ６）キナーゼ（配列番号６２、１３７）；およびグアニンヌクレオチド結合タンパク質、αｏアイソフォームＢ（配列番号６３、１３８、１３９）からなる群から選択されるタンパク質の発現量が増加する。
【０１５１】
上に概略を示した発現量の変化は、前記細胞と本発明のポリペプチドが接触した後に起こるものと理解される。
【０１５２】
本明細書の実施例において、ニューレグリン１−β1の細胞外ドメインは細胞分化をもたらし、このドメインは細胞分裂促進作用を有さないことが明らかになった。このため、本発明に基づくポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して、本発明に基づき細胞分化を誘導する場合、前記ポリペプチドは細胞分裂を誘導せず、細胞分化のみを誘導するのが好ましい。ＥＧＦ様ドメインならびにヘパリン結合ドメインを包含するニューレグリンの細胞外ドメインはこの特性を有することを実施例は明らかにしたため、本発明のポリペプチドは少なくとも１個以上、好ましくは２個以上のＥＧＦ様ドメインおよび／またはヘパリン結合ドメインを包含するものを使用するのが好ましい。
【０１５３】
下記の実施例で提供された実験的エビデンスに基づけば、段階ａ）非神経細胞と本発明のニューレグリンアイソフォームおよび／または本発明のポリペプチドを接触させる、を包含するドパミン作働性ニューロンの生成方法を提供することが、本発明のさらなる態様である。
【０１５４】
好ましくは、この方法で使用する前記非神経細胞は、グリア細胞、特に星細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、放射状グリア細胞、シュワン細胞、サテライト細胞および／または腸グリア細胞からなる群から選択される細胞などの神経メラニンまたはチロシンヒドロキシラーゼを発現しない非神経細胞であるのがよい。
【０１５５】
ＮＲＧの発現量は、アルツハイマー病、多発性硬化症または脳損傷といった神経変性疾患または障害を来した患者で増加することが見出されている（Ｃａｎｎｅｌｌａ  Ｂ，  Ｐｉｔｔ  Ｄ，  Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｒａｉｎｅ  ＣＳ．  Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｒｂＢ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｗｈｉｔｅ  ｍａｔｔｅｒ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  １００：  ２３３−２４２，  １９９９；  Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ  ＡＲ，  Ｇｅｒｅｃｋｅ  ＫＭ，  Ｗｙｓｓ  ＪＭ，  Ｍｏｒｇａｎ  ＤＧ，  Ｇｏｒｄｏｎ  ＭＮ，  ａｎｄ  Ｃａｒｒｏｌｌ  ＳＬ．  Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ−１  ａｎｄ  ｅｒｂＢ４  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｉｔｉｃ  ｐｌａｑｕｅｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６２：  ４２−５４，  ２００３；  ａｎｄ  Ｔｏｋｉｔａ  Ｙ，  Ｋｅｉｎｏ  Ｈ，  Ｍａｔｓｕｉ  Ｆ，  Ａｏｎｏ  Ｓ，  Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｈ，  Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｏｏｈｉｒａ  Ａ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｊｕｒｅｄ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１：  １２５７−１２６４，  ２００１）。これと合致して、本発明の実施例はパーキンソン病を来した患者でＥｒｂＢ４の発現量が増加することを示している。
【０１５６】
特定の理論に束縛されるものではないが、ニューレグリンの発現量の増加は、上述の疾患に対抗するための生体の自然な反応を示す可能性がある。このため、この自然な反応を促すため、本発明のニューレグリンアイソフォームまたは本発明のポリペプチドを投与して、上に概略を示した個々の疾患に対する生体の防御機序を助けることができる。
【０１５７】
さらに、ニューレグリンおよびその受容体ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４の発現量の増加は、内因性ニューレグリン（例えばニューレグリン−１および／またはニューレグリン−２）の濃度をタンパク質またはｍＲＮＡとして測定し、その後健常被験者の濃度と比較する診断方法の根拠を提供することができる。ニューレグリンタンパク質またはニューレグリンをコードするポリヌクレオチドの濃度の増加が明らかになった場合、これはパーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症または脳損傷といった疾患を示すものである。
【０１５８】
実施例では、ニューレグリンの投与により中脳の一連のタンパク質（特に第２表を参照）の発現量が変化することが明らかになった。このため、ニューレグリンがもたらすこの発現量の調節も、ニューレグリン量の上昇を示す上述の疾患および障害を診断する根拠となる。
【０１５９】
したがって、本発明のまた別の態様は、診断、好ましくはアルツハイマー病、多発性硬化症または脳損傷およびパーキンソン病からなる群から選択される疾患の診断に使用する、１４−３−３ゼータ（配列番号５８、１３３）、１４−３−３エプシロン（配列番号５９、１３４）、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（配列番号５０、１２４）、アルドラーゼＡ、フルクトースビスホスフェート（配列番号２、６８）；アルドラーゼＣ、フルクトースビスホスフェート（配列番号３、６９）；トリオースリン酸イソメラーゼ１（配列番号４、６５、７０）；グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素アイソフォーム１に準ずるもの（配列番号５、７１、７２）；エノラーゼ１、α非ニューロン（配列番号６、７３）；エノラーゼ２、γニューロン（配列番号７、７４）、乳酸脱水素酵素Ｂ（配列番号８、７５）；グリセロールリン酸脱水素酵素２、ミトコンドリア（配列番号９、７６、７７）；グルタミン酸アンモニアリガーゼ（グルタミン合成酵素）（配列番号１０、７８、７９）；ジヒドロリポアミドＳ−アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ２成分）（配列番号１１、８０、６６）；イソクエン酸脱水素酵素３（ＮＡＤ＋）α、アイソフォームＣＲＡ＿ｅ（配列番号１２、８１）；リンゴ酸脱水素酵素、細胞質（配列番号１３、８２）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）１αサブ複合体、８（配列番号１４、８３）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質１（配列番号１５、８４、６７）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質８（配列番号１６、８５）；ユビキノール−チトクロム−ｃ還元酵素複合体コアタンパク質１（配列番号１７、８６）；ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送性、ミトコンドリアＦ０複合体、サブユニットｄ（配列番号１８、８７、８８）；クレアチンキナーゼ、脳（配列番号１９、８９）；熱ショックタンパク質８（配列番号２０、９０、９１）；熱ショックタンパク質９（配列番号２１、９２）；Ｈｓｐ７０ホモログ、核周囲型（モルタリンｍｏｔ−２）（配列番号２２）；タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ関連３（配列番号２３、９３）；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送性、ライソゾームＶ１サブユニットＡ（配列番号２４、９４）；プロテアソーム２６Ｓサブユニット、ＡＴＰａｓｅ、４（配列番号２５、９５、９６）；プロテアソームサブユニットαタイプ２（配列番号２６、９７）；ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２７、９８）；バロシン含有タンパク質、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２８、９９）；３−ヒドロキシイソブチレート脱水素酵素（配列番号２９、１００）；ビフェニルヒドロラーゼ様（配列番号３０、１０１）；ハロ酸デハロゲナーゼ様ヒドロラーゼドメイン含有２（配列番号３１、１０２）；βアクチン（ａａ２７−３７５）（配列番号３２、１０３）；γアクチン（配列番号３３、１０４）；プロフィリン２、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３４、１０５、１０６）；トランスゲリン３（配列番号３５、１０７）；アネキシンＡ６、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３６、１０８、１０９）；インターネキシン神経細胞性中間径フィラメント���ンパク質、α（配列番号３７、１１０）；神経フィラメント、軽ポリペプチド（配列番号３８、１１１）；グリア原線維酸性タンパク質（配列番号３９、１１２、１１３）；チューブリン、α１Ｂ（配列番号４０、１１４）；チューブリン、β（配列番号４１、１１５）；チューブリン、β３（配列番号４２、１１６）；ジヒドロピリミジナーゼ様２（配列番号４３、１１７）；ジヒドロピリミジナーゼ様４、アイソフォームＣＲＡ＿ｃ（配列番号４４、１１８）；脳に豊富に存在する膜結合性シグナルタンパク質１（配列番号４５、１１９）；ＲＡＢ１Ｂ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー；アイソフォームＣＲＡ＿ａ（配列番号４６、１２０）；ＲＡＢ３Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４７、１２１）；ＲＡＢ６Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４８、１２２）；グアノシンジホスフェート解離抑制因子１（配列番号４９、１２３）；ホスホリパーゼＣ−α（配列番号５１、１２５）；カルシニューリンＢ、タイプＩ（配列番号５２、１２６、１２７）；カルビンジン−２８Ｋ（配列番号５３、１２８）；カルレチニン（配列番号５４、１２９）；ビジニン様１（配列番号５５、１３０）；細胞内塩化物チャネル４（ミトコンドリア）（配列番号５６、１３１）；ｍＣＧ７１９１（Ｒａｆキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ））（配列番号５７、１３２）；ペルオキシレドキシン１（配列番号６０、１３５）；ペルオキシレドキシン３（配列番号６１、１３６）；ピリドキサール（ピリドキシン、ビタミンＢ６）キナーゼ（配列番号６２、１３７）；およびグアニンヌクレオチド結合タンパク質、αｏアイソフォームＢ（配列番号６３、１３８、１３９）からなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合することができる抗体である。
【０１６０】
用語「抗体」は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方、すなわち、抗原またはハプテン、すなわちＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ドメインまたはそのペプチドを認識することのできるあらゆる免疫グロブリンタンパク質またはその一部を指す。抗原結合部位は遺伝子組換えＤＮＡ技術または無傷抗体の酵素または化学的分解によって生成することができる。いくつかの実施態様において、抗原結合部位にはＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体などのキメラ抗体、二特異性抗体およびポリペプチドに特異的抗原結合能を付与するのに十分な抗体の一部を少なくとも含有するポリペプチドが含まれる。
【０１６１】
標的タンパク質の配列が特定された後の、その特異的な標的タンパク質に対する抗体の作製方法は、平均的な当業者には既知である。
【０１６２】
本発明のさらなる態様は、疾患を診断するための以下を包含する方法である：
（ｉ）被験者の単離組織または単離体液において、１４−３−３ゼータ（配列番号５８、１３３）、１４−３−３エプシロン（配列番号５９、１３４）、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（配列番号５０、１２４）、アルドラーゼＡ、フルクトースビスホスフェート（配列番号２、６８）；アルドラーゼＣ、フルクトースビスホスフェート（配列番号３、６９）；トリオースリン酸イソメラーゼ１（配列番号４、６５、７０）；グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素アイソフォーム１に準ずるもの（配列番号５、７１、７２）；エノラーゼ１、α非ニューロン（配列番号６、７３）；エノラーゼ２、γニューロン（配列番号７、７４）、乳酸脱水素酵素Ｂ（配列番号８、７５）；グリセロールリン酸脱水素酵素２、ミトコンドリア（配列番号９、７６、７７）；グルタミン酸アンモニアリガーゼ（グルタミン合成酵素）（配列番号１０、７８、７９）；ジヒドロリポアミドＳ−アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ２成分）（配列番号１１、８０、６６）；イソクエン酸脱水素酵素３（ＮＡＤ＋）α、アイソフォームＣＲＡ＿ｅ（配列番号１２、８１）；リンゴ酸脱水素酵素、細胞質（配列番号１３、８２）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）１αサブ複合体、８（配列番号１４、８３）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質１（配列番号１５、８４、６７）；ＮＡＤＨ脱水素酵素（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓタンパク質８（配列番号１６、８５）；ユビキノール−チトクロム−ｃ還元酵素複合体コアタンパク質１（配列番号１７、８６）；ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送性、ミトコンドリアＦ０複合体、サブユニットｄ（配列番号１８、８７、８８）；クレアチンキナーゼ、脳（配列番号１９、８９）；熱ショックタンパク質８（配列番号２０、９０、９１）；熱ショックタンパク質９（配列番号２１、９２）；Ｈｓｐ７０ホモログ、核周囲型（モルタリンｍｏｔ−２）（配列番号２２）；タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ関連３（配列番号２３、９３）；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送性、ライソゾームＶ１サブユニットＡ（配列番号２４、９４）；プロテアソーム２６Ｓサブユニット、ＡＴＰａｓｅ、４（配列番号２５、９５、９６）；プロテアソームサブユニットαタイプ２（配列番号２６、９７）；ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２７、９８）；バロシン含有タンパク質、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号２８、９９）；３−ヒドロキシイソブチレート脱水素酵素（配列番号２９、１００）；ビフェニルヒドロラーゼ様（配列番号３０、１０１）；ハロ酸デハロゲナーゼ様ヒドロラーゼドメイン含有２（配列番号３１、１０２）；βアクチン（ａａ２７−３７５）（配列番号３２、１０３）；γアクチン（配列番号３３、１０４）；プロフィリン２、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３４、１０５、１０６）；トランスゲリン３（配列番号３５、１０７）；アネキシンＡ６、アイソフォームＣＲＡ＿ｂ（配列番号３６、１０８、１０９）；インターネキシン神経細胞性中間径フィラメントタンパク質、α（配列番号３７、１１０）；神経フィラメント、軽ポリペプチド（配列番号３８、１１１）；グリア原線維酸性��ンパク質（配列番号３９、１１２、１１３）；チューブリン、α１Ｂ（配列番号４０、１１４）；チューブリン、β（配列番号４１、１１５）；チューブリン、β３（配列番号４２、１１６）；ジヒドロピリミジナーゼ様２（配列番号４３、１１７）；ジヒドロピリミジナーゼ様４、アイソフォームＣＲＡ＿ｃ（配列番号４４、１１８）；脳に豊富に存在する膜結合性シグナルタンパク質１（配列番号４５、１１９）；ＲＡＢ１Ｂ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー；アイソフォームＣＲＡ＿ａ（配列番号４６、１２０）；ＲＡＢ３Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４７、１２１）；ＲＡＢ６Ａ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（配列番号４８、１２２）；グアノシンジホスフェート解離抑制因子１（配列番号４９、１２３）；ホスホリパーゼＣ−α（配列番号５１、１２５）；カルシニューリンＢ、タイプＩ（配列番号５２、１２６、１２７）；カルビンジン−２８Ｋ（配列番号５３、１２８）；カルレチニン（配列番号５４、１２９）；ビジニン様１（配列番号５５、１３０）；細胞内塩化物チャネル４（ミトコンドリア）（配列番号５６、１３１）；ｍＣＧ７１９１（Ｒａｆキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ））（配列番号５７、１３２）；ペルオキシレドキシン１（配列番号６０、１３５）；ペルオキシレドキシン３（配列番号６１、１３６）；ピリドキサール（ピリドキシン、ビタミンＢ６）キナーゼ（配列番号６２、１３７）；およびグアニンヌクレオチド結合タンパク質、αｏアイソフォームＢ（配列番号６３、１３８、１３９）からなる群から選択されるタンパク質と、（好ましくはこの群から選択されるタンパク質の全長に対して）少なくとも９０％のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質または前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定すること；
（ｉｉ）場合により、そのタンパク質量が、健常被験者で定量される同タンパク質の量と異なるかどうかを判定すること；および
（ｉｉｉ）場合により、健常被験者における前記タンパク質の発現量と比較した前記タンパク質の発現量の変化を、好ましくはアルツハイマー病、多発性硬化症または脳損傷およびパーキンソン病からなる群から選択される神経学的疾患と相関させること。
【０１６３】
摘出組織片はあらゆる組織であってよく、好ましくは摘出脳試料であるのがよい。本明細書で使用する用語「体液」は、好ましくは脳脊髄液、血液、リンパ液、唾液および尿からなる群から選択される体液であるのがよい。
【０１６４】
基本的な教科書から、複数のタンパク質の定量法が平均的な当業者には既知である。これらの方法はいずれも本発明の方法で使用することができる。被験者は、前記タンパク質または好ましくは上記のタンパク質のうち３つ以上の発現量が、健常被験者、すなわち対照被験者の摘出組織片または単離体液中のこれらのタンパク質の個々の発現量から１０％以上逸脱する、アルツハイマー病、多発性硬化症、脳損傷またはパーキンソン病からなる群から選択される神経学的疾患を来したヒトまたは非ヒトでありえる。
【０１６５】
また、本発明のさらなる態様において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。
【０１６６】
本発明の遺伝子組換え可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは本明細書に記載する第２表のタンパク質は、神経系などの標的組織、特に脳および／または脊髄などの中枢神経系への有効な送達が達成されるあらゆる経路で投与することができる。ニューレグリンアイソフォームおよびその断片の薬学的に有効な濃度は、全身投与で達成できることが見出された。例えば、本発明のアイソフォームおよびポリペプチドは、静脈内注射などの注射または注入で投与することができる。本発明に基づき特に好ましいのは、腹腔内投与、例えば腹腔内注射である。また、本発明に基づき特に好ましいのは、脳内投与、例えば脳内注入である。本発明のアイソフォームおよびポリペプチドは、治療対象疾患の種類および重症度に応じ、投与対象被験者の体重に対して、好ましくは０．１〜５０００ｎｇ／ｋｇ、特に２〜１０００ｎｇ／ｋｇ、より具体的には３〜６００ｎｇ／ｋｇの量で投与する。本発明の他の実施態様において、可溶性アイソフォームは、例えば脊髄および／または脳などの中枢神経系への直接投与といった局所投与を行うこともできる。また、５００μｇ／ｋｇ以下の高用量を腹腔内または皮下注射または注入するか、吸入デバイスを用いて投与することも検討してよい。好ましくは治療対象は、哺乳動物、より好ましくはヒト患者であるのがよい。
【０１６７】
ただし、疾患の重症度、疾患の種類ならびに治療対象の個々の患者、例えば患者の一般状態などに応じ、治療効果を得るためには本発明の医薬組成物の異なる用量が必要であることが理解される。適切な用量の決定は、担当医の判断に委ねられる。
【０１６８】
可溶性遺伝子組換えニューレグリン−１アイソフォーム、本明細書に記載の第２表のタンパク質および本発明のポリペプチドは、単独の投薬、すなわち単剤療法として、または併用療法、すなわち別の薬剤、特に神経学的病態および／または神経学的疾患、好ましくはパーキンソン病および双極性障害の治療に好適な別の薬剤との組み合わせで投与することができる。別の薬剤の例としては、特にアルツハイマー病またはパーキンソン病、統合失調症、双極性障害、うつ病または他の神経学的病態の治療に使用されるカテコラミン代謝に影響を及ぼす化合物、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、ＭＡＯ−ＢまたはＣＯＭＴ阻害薬、メマンチン型チャネル遮断薬、ドパミンまたはセロトニン受容体作用薬、ドパミンまたはセロトニン受容体拮抗薬、カテコラミンまたはセロトニン再取り込み阻害薬、クロザピンまたはオランザピンまたはガバペンチン様薬物などのあらゆる種類の抗精神病薬が挙げられる。別の薬剤のさらなる例としては、本明細書に参照として組み込まれているＷＯ  ２００６／００８１１８およびＷＯ２００６／００８１１９に開示されたＰＡＲＰ−１阻害薬といった神経保護剤が挙げられる。
【０１６９】
このように本発明のある実施態様は、本明細書に記載の遺伝子組換え可溶性ニューレグリン−１アイソフォーム、本明細書に記載の第２表のタンパク質または本発明のポリペプチドと、統合失調症、双極性障害およびうつ病などの精神疾患の治療に使用される薬剤、例えばオランザピンまたはクロザピンとの組み合わせを指す。さらなる実施態様は、本明細書に記載の遺伝子組換え可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは本発明のポリペプチドと、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＭＳまたはＡＬＳといった神経変性疾患の治療に使用される薬剤との組み合わせを指す。さらなる実施態様は、本明細書に記載の遺伝子組換え可溶性ニューレグリン−１アイソフォームまたは本発明のポリペプチドと、てんかん、卒中、外傷性脳損傷または脊髄損傷といった神経学的損傷の治療に使用される薬剤との組み合わせを指す。
【０１７０】
併用療法は、医薬組成物またはキットの形態をとる遺伝子組換え可溶性ニューレグリン−１アイソフォーム、本明細書に記載の第２表のタンパク質または本発明のポリペプチドおよび前記の別の薬剤を同時に投与することによって達成され、個々の薬物は別々にまたは同じ投与経路で投与される。
【０１７１】
本発明の適用範囲を逸脱することのない本発明のさまざまな修正および改変は、当業者には明らかである。本発明を特に好ましい実施態様に関連して記載したが、請求項に基づく本発明はかかる特定の実施態様によって不当に制限されるべきものでないことを理解する必要がある。事実、本発明の実施を目的とした記載の方法のさまざまな修正は、当業者には明らかであって、本発明に含まれることを意図するものである。
【０１７２】
以下の図面および実施例は本発明の説明のみを目的としたものであって、添付の請求項によって示された本発明の適用範囲を何らかの方法で制限するものと解釈されてはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】図１は、黒質緻密部（ＳＮｃ）中のドパミン作働性ニューロンにおけるＥｒｂＢ４の発現量を示す。  （ａ，ｂ）神経学的疾患を有さない対照被験者（ａ）およびパーキンソン病（ＰＤ）患者（ｂ）のヒトＳＮｃ中のドパミン作働性ニューロンを、細胞質中の神経メラニン（ＮＭ、褐色）の存在によって特定した。Ｎｒｇ１β1受容体であるＥｒｂＢ４は黒で免疫染色される。  （ｃ−ｊ）（ａ）および（ｂ）の逐次拡大図；ＮＭを最も含有するニューロン（褐色の矢印）はＥｒｂＢ４免疫反応性（黒い矢印）を示し（ｇ−ｊ）、ＮＭを若干含有するニューロンはＥｒｂＢ４免疫反応性を示さない（ｇ，ｈ）。  （ｋ）対照のヒトで示された通り、ＳＮｃ中のいくつかのニューロンはＮＭを含有せず、細胞体（黒い矢印）および細胞突起（黒い矢印頭部）で強度のＥｒｂＢ４免疫反応性を示す。  （ｌ）マウスＳＮｃ中のドパミン作働性ニューロンを、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、赤）に対する免疫反応性によって特定した。ＥｒｂＢ４は緑色で免疫染色される。図の合併は、事実上すべてのＴＨ+ニューロンがＥｒｂＢ４を発現し（黄色）、ＳＮｃ中のいくつかのＥｒｂＢ４はＴＨを発現しない（白の矢印頭部）ことを示す。    バースケール（ａ，ｂ）２５０μｍ；（ｃ−ｆ）１００μｍ；（ｇ−ｌ）５０μｍ
【図２】図２は、健常な成体マウスにおいてＮｒｇ１β1−ＥＣＤは血液脳関門を通過しＥｒｂＢ４をリン酸化することを示している。  （ａ）全血中の［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤ値は単回ｉ．ｐ．注射から１時間後にピークに達し、１２時間以上にわたって明確に検出可能であった（ｋＣＰＭ＝１０００カウント／分）。  （ｂ）単回ｉ．ｐ．注射から１５分後に測定したところ、［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤは、［131Ｉ］−ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に比して２６６．８％、脳実質に侵入を果たした。データは血液に対する脳中のカウント数／分である。ＢＳＡの取り込み量を１００％とする。＊Ｐ＜０．０５、両側ｔ検定。  （ｃ−ｃ′′）単回ｉ．ｐ．注射から１時間後に［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤの脳実質内での分布状況を確認した。（ｃ）はクレシルバイオレット（ＣＶ、青）で染色した脳の矢状断面（ｒ＝吻側部、ｃ＝尾部、ｄ＝背側部、ｖ＝腹側部）の解剖学的マップである；（ｃ′）は同部位の［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤオートラジオグラフィーである（黒）；（ｃ′′）はＣＶ（青）と［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤ（赤）画像を重ね合わせたものである；最も強度な［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤシグナルは、第４脳室の脈絡叢（白い矢印頭部）、側脳室（グレーの矢印頭部）および小脳テント（黒い矢印頭部）に、特に強い［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤシグナルが梨状皮質（水色の矢印頭部）、前頭皮質（濃い青の矢印頭部）および黒質を含む腹側中脳（赤い丸）に認められた。  （ｄ）マウス１匹につきＮｒｇ１β1−ＥＣＤ  １０μｇまたは担体（ＮａＣｌ）のみを単回ｉ．ｐ．注射してから１時間後に、マウスの前頭皮質（ｆＣｘ）および線状体（Ｓｔｒ）を対象にＥｒｂＢ４受容体を免疫沈降した。リン酸化したチロシン残基（ｐ−Ｔｙｒ）に対して生じた抗体を用いて、溶出物をプローブしたところ、ＮａＣｌ投与マウスに比してＮｒｇ１β1−ＥＣＤ投与マウスでは高度のリン酸化状態が認められた。  （ｅ）また、低用量のＮｒｇ１β1−ＥＣＤ（５０ｎｇ／ｋｇ）を１日１回５連続日で腹腔内投与したところ、リン酸化ＥｒｂＢ４（ｐ−ＥｒｂＢ４）に対する抗体を用いた免疫組織化学的所見で示されたのと同じく、最終注射から１時間後には、担体（ＮａＣｌ）注射マウスに比して、前頭皮質（ｆＣＸ）、線状体（Ｓｔｒ）およびＳＮｃではＥｒｂＢ４のリン酸化の亢進が認められた。発現量の定量は、光学密度（ＯＤ）測定法によって行った；ＮａＣｌのＯＤを１００％とする。＊Ｐ＜０．０５、両側ｔ検定。    バースケール（ｃ−ｃ′′）１ｍｍ；（ｅ）１００μｍ
【図３】図３は、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤの末梢投与は、健常な成体マウスの黒質線条体ドパミン作動系を刺激することを示している。  （ａ）Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤを毎日５連続日で腹腔内投与したところ、直後（０日）ではないが７日後に、腹側中脳（ｖＭｅｓ）、腹側線条体（ｖＳｔｒ）および背側線状体（ｄＳｔｒ）中のドパミン濃度が有意に上昇した。ＮａＣｌ投与の対照マウスの値を１００％とし、対照絶対値は湿潤組織重量１ｍｇにつきドパミン０．８±０．１ｎｇ（ｖＭｅｓ）、１２．５±２．０ｎｇ（ｖＳｔｒ）および１５．６±３．０ｎｇ（ｄＳｔｒ）であった。ＮａＣｌ投与の対照マウスに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＡＮＯＶＡ、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＬＳＤ検定。  （ｂ，ｃ）Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤを毎日５連続日で腹腔内投与したところ、黒質緻密部（ＳＮｃ）に片側性に存在するドパミン作働性チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＩＩ）+ニューロン（ｂ）および大きな多角形のクレシルバイオレット（ＣＶ）+ニューロン（ｃ）の絶対数は２１日後に有意に増加した。＊＊＊ＮａＣｌ投与の対照マウスに対してＰ＜０．００１；両側ｔ検定。  （ｄ）ＮａＣｌ（対照）を毎日腹腔内投与してから７日後またはＮｒｇ１β1−ＥＣＤを毎日５連続日で腹腔内投与してから２１日後の、マウスのＳＮｃにおける５−ブロモ−２′−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）+新生細胞（赤）およびドパミン作働性ＴＩＩ+ニューロン（緑）の共焦点顕微鏡画像。挿入図は、個々の細胞におけるＢｒｄＵおよびＴＨの局所分布を拡大したものである。  （ｅ）ＮａＣｌ投与の対照マウスに比して、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤを毎日５連続日で腹腔内投与してから７日または２１日後の片側ＳＮｃ中のＢｒｄＵ+の絶対数は、有意に変化しなかった。  （ｆ，ｇ）Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤを毎日５連続日で腹腔内投与してから７日後のマウスの腹側中脳を対象にプロテオーム差分解析を実施したところ、ＮａＣｌ投与の対照マウスに比して、Ｎ＝６２のタンパク質のレベルが有意に変化した（Ｎ＝５９；アップレギュレート、Ｎ＝３；ダウンレギュレート）。（ｆ）はこれらのタンパク質の主要な機能カテゴリーを示す；％値は各群のタンパク質の相対数を示す。  （ｇ，ｈ，ｉ）細胞骨格（ｇ）、エネルギー代謝（ｈ）およびタンパク質の品質管理（ｉ）といった３つの主要な機能グループに属するタンパク質の数を示す。略号：ＤＡ＝ドパミン、ＩＦ＝中間フィラメント、ＯｘＰｈｏｓ＝酸化的リン酸化、ＲＯＳ＝活性酸素、ＵＰＳ＝ユビキチン−プロテアソーム系。    バースケール（ｄ）１００μｍ；（ｄ、挿入図）１０μｍ
【図４】図４は、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤの末梢投与は、６−ＯＨＤＡ誘発毒性から黒質線条体ドパミン作動系を保護することを示している。    マウスの片側線状体に６−ＯＨＤＡを注射するかシャム手術を行い、その直後（６−ＯＨＤＡの投与から６時間後）または時間をおいて（６−ＯＨＤＡの投与から４８時間後）、ＮａＣｌ（対照）またはＮｒｇ１β1−ＥＣＤを腹腔内投与した。  （ａ）６−ＯＨＤＡで病変を生じさせたマウスでは、アンフェタミン誘発性の病変側への体の回転が認められた。この病的な非対称性は、直後からＮｒｇ１β1−ＥＣＤの投与を開始した場合には予防されたが、時間をおいて開始した場合には予防されなかった。シャム−ＮａＣｌ投与マウスに対してｎ．ｓ．＝非有意、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；ＡＮＯＶＡ、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＬＳＤ検定。  （ｂ）ＮａＣｌ投与マウスまたは直後にＮｒｇ１β1−ＥＣＤを投与したマウスの前脳前部の冠状断面を、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）で免疫染色し、線状体中のドパミン作動性線維を描出した（左線状体：病変を生じさせなかった対照側；右線状体：シャム手術／６−ＯＨＤＡ注射側）。ＮａＣｌ投与マウスに比して、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤ投与マウスの６−ＯＨＤＡ誘発病変の範囲は小さいことに注目されたい。  （ｃ）６−ＯＨＤＡで病変を生じさせたマウスの線状体中のＴＨ+ドパミン作働性線維の光学密度は、病変を生じさせなかった対照側に比して、病変を生じさせた側で有意に低下した；この病的な非対称性は、直後からＮｒｇ１β1−ＥＣＤの投与を開始した場合には緩和されたが、時間をおいて開始した場合には緩和されなかった。＊＊＊シャム−ＮａＣｌ投与マウスに対してＰ＜０．００１、＃＃＃６−ＯＨＤＡ−ＮａＣｌ投与マウスに対してＰ＜０．００１；ＡＮＯＶＡ、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＬＳＤ検定。  （ｄ）ＮａＣｌ投与マウスまたは直後にＮｒｇ１β1−ＥＣＤを投与したマウスの黒質緻密部の冠状断面をＴＨで免疫染色し、シャム手術側／６−ＯＨＤＡ注射側のＳＮｃ中のドパミン作動性ニューロンを描出した。ＮａＣｌ投与マウスに比して、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤ投与マウスの６−ＯＨＤＡ誘発病変の範囲は小さいことに注目されたい。  （ｅ，ｆ）６−ＯＨＤＡで病変を生じさせたマウスのＳＮｃ中のＴＨ+ドパミン作働性ニューロン（ｅ）およびクレシルバイオレット＋（ＣＶ＋）大ニューロン（ｆ）の数は、病変を生じさせなかった対照側に比して、病変を生じさせた側で有意に減少した。この病的な非対称性は、直後からＮｒｇ１β1−ＥＣＤの投与を開始した場合または時間をおいて開始した場合のいずれでも緩和された。＊＊＊シャム−ＮａＣｌ投与マウスに対してＰ＜０．００１、＃＃＃６−ＯＨＤＡ−ＮａＣｌ投与マウスに対してＰ＜０．００１；ＡＮＯＶＡ、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＬＳＤ検定。  （ｇ）ＤＡＰＩ+核（青）を取り囲むドパミントランスポーター（ＤＡＴ、赤）の免疫染色を行うことによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定した有糸分裂後のヒトＬＵＨＭＥＳニューロンはすべて、細胞質中にＥｒｂＢ４受容体（緑）を発現した。すべての色は最終プレートで融合する。  （ｈ，ｉ）培養液へのＬＤＨ放出量（ｈ）および毎視野の濃縮核の数（ｉ）の有意な増加によって確認したＬＵＨＭＥＳ細胞の���−ＯＨＤＡ誘発性変性。ＤＡＰＩ＋の濃縮核は、不整なサイズの丸いクロマチン塊として特定した（ｉ、挿入図、矢印頭部）。いずれの現象もＮｒｇ１β1−ＥＣＤの投与によって有意に緩和した。＊＊＊対照マウスに対してＰ＜０．００１、＃＃６−ＯＨＤＡ投与マウスに対してＰ＜０．０１；ＡＮＯＶＡ、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＬＳＤ検定。    バースケール（ｂ）２ｍｍ；（ｄ）２００μｍ；（ｇ，ｉ）１０μｍ
【図５】図５は、ニューレグリンＥＣＤの電荷プロット。Ｎ末端から数えた個々のアミノ酸の電荷およびニューレグリンＥＣＤの全領域に対する電荷の多項式外挿の結果を示す。Ｎ末端には正電荷の領域が存在し、これはヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）の局在を至適化する土台と考えられた。配列番号１５４−１５７も参照されたい。
【図６】図６は、短いリンカー（ＧＧＧＳ−本明細書に記載の本発明のポリペプチドのいずれかとともに使用できる好ましいリンカー）を介してニューレグリンのＥＧＦ様ドメインに結合した至適化ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を包含する融合タンパク質である、本発明の好ましい遺伝子組換えポリペプチドを示す。この融合タンパク質は、電荷を至適化したＨＢＤを包含し、非修飾ニューレグリンＥＣＤよりも短く、標的特異性が向上し、細胞分裂促進作用が低下した治療用ポリペプチドである。
【０１７４】
実施例
ヒトドパミン作働性ニューロン中のＥｒｂＢ４の発現量はＰＤで増加する。
【０１７５】
神経学的疾患を有さない対照被験者およびＰＤ患者の黒質緻密部（ＳＮｃ）中の神経メラニン含量を特定することによって、ドパミン作働性ニューロンにおけるＥｒｂＢ４の発現量を試験した（図１  ａ−ｋ）。
【０１７６】
対照被験者のＳＮｃ中の神経メラニン+ニューロンの大半はＥｒｂＢ４を発現していた。ＥｒｂＢ４を発現した神経メラニン+ニューロンの割合は、ＰＤ患者でさらに高かった（第１表）。
【０１７７】
興味深いことに、対照被験者のＳＮｃ中には、神経メラニンが不足したＥｒｂＢ４+細胞もいくつか存在した。これらの割合も、対照被験者に比してＰＤ患者で増加した（第１表）。
【０１７８】
ドパミン作働性ニューロンにおけるＥｒｂＢ４発現細胞の優位性およびＳＮｃにおけるドパミン作動性表現型を有さないいくつかのＥｒｂＢ４+細胞の存在は、成体マウスで確認された（図１１）。
【０１７９】
これらの所見は、黒質線条体ドパミン作働系に対するＮｒｇ１β1の機能的作用を分子学的に裏付けるものである。
【０１８０】
Ｎｒｇ１β1の全ＥＣＤは成体マウスのＢＢＢを通過する。
【０１８１】
ＥＧＦ様ドメイン（配列番号１のＴｈｒ１７６−Ｌｙｓ２４６、８ｋＤａ）のみを含有するＮｒｇ１β1の小断片は、無傷の成体ＢＢＢを通過するが、ＥｒｂＢ受容体とむしろ非選択的に相互作用する。これに対し、Ｎｒｇ１β1の全ＥＣＤは免疫グロブリン様およびヘパラン硫酸結合モチーフを含有するため、特定の神経部位を標的とし、特定の受容体との相互作用を強化し、それによって生物学的活性を高めることができる。したがって、発明者らはＮｒｇ１β1の全ＥＣＤを含有する可溶性断片を用いて研究を行った（Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤ；配列番号１のＳｅｒ２−Ｌｙｓ２４６；２６．９ｋＤａ；登録番号ＡＡＡ５８６３９）。発明者らは、動物種間でのＥｒｂＢ４のアミノ酸配列が９７％相同であることから、マウスおよびヒト実験系に対してヒトＮｒｇ１β1−ＥＣＤを使用した。
【０１８２】
［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤは、単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射から１時間以内に血中ピーク濃度に達し、１２時間以上にわたって明確に検出可能であった（図２ａ）。［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤは血漿中に主として見出され（８２．４±６．５％）、血液細胞に結合したのはわずかに１７．６±１．４％であった。
【０１８３】
［131Ｉ］−ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）は、無傷ＢＢＢに容易に侵入してはならない対照タンパク質として使用した。両タンパク質の単回ｉ．ｐ．注射から１５分後には、脳実質中に［131Ｉ］−ＢＳＡよりも有意に多い［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤが検出され（＋２６６．８％、Ｐ＜０．０５）（図２ｂ）、以前にはＥＧＦ様断片の８ｋＤでのみ示されていた通り、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤの全２６．９ｋＤが無傷の成体ＢＢＢに侵入したことが示唆された。
【０１８４】
成体マウスの脳実質に末梢注入された［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤの分布を、単回ｉ．ｐ．注射から１時間後のオートラジオグラフィーで確認したところ、これよりも小さなＮｒｇ１β1断片を用いた新生仔マウスでのみ示されていた通り、［125Ｉ］−ＢＳＡ注射マウスに比して梨状皮質および前頭皮質、特にＳＮｃを含む腹側中脳で明確なシグナルが認められた（図２ｃ）。
【０１８５】
Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤは成体マウスの脳においてＥｒｂＢ４のリン酸化をもたらす。
【０１８６】
Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤ  １０μｇを単回ｉ．ｐ．注射すると、前頭皮質および線状体からのＥｒｂＢ４の免疫沈降およびＥｒｂＢ４およびリン酸化したチロシン残基に対して生じた抗体を用いた溶出物のプローブ結果が示す通り、１時間以内に成体マウスの脳内でＥｒｂＢ４がリン酸化した（図２ｄ）。
【０１８７】
５０ｎｇ／ｋｇと低用量のＮｒｇ１β1−ＥＣＤを１日１回５連続日で腹腔内投与したところ、リン酸化ＥｒｂＢ４に対する抗体を用いた免疫組織化学的所見で示された通り、ＳＮｃでＥｒｂＢ４のリン酸化の亢進が認められた（図２ｅ）。したがって、その後の実験ではこの投与法を使用した。
【０１８８】
Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤはマウスの腹側中脳および線状体でドパミン濃度を上昇させる。
【０１８９】
腹側中脳および背側線状体（尾状核−被殻；Ｖｏｏｒｎ，  Ｐ．，  Ｖａｎｄｅｒｓｃｈｕｒｅｎ，  Ｌ．Ｊ．，  Ｇｒｏｅｎｅｗｅｇｅｎ，  Ｈ．Ｊ．，  Ｒｏｂｂｉｎｓ，  Ｔ．Ｗ．，  ＆  Ｐｅｎｎａｒｔｚ，  Ｃ．Ｍ．  Ｐｕｔｔｉｎｇ  ａ  ｓｐｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｏｒｓａｌ−ｖｅｎｔｒａｌ  ｄｉｖｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｉａｔｕｍ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２７，  ４６８−４７４  （２００４）を参照）のドパミン濃度は、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤを１日１回５連続日で腹腔内投与してから７日目に有意に上昇したが、直後（０日目）には上昇しなかった（それぞれ＋１９４．７％および＋１３６．１％；Ｐ＜０．００１）。腹側線状体（側坐核および嗅結節；上記のＶｏｏｒｎ，  Ｐ．を参照）に対する作用はこれほど著明でなかった（＋６３．８％；Ｐ＜０．０５；図３ａ）。
【０１９０】
Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤは正常なマウスのＳＮｃでドパミン作働性細胞の数を増加させる。
【０１９１】
ＴＨ免疫染色で特定したＳＮｃ中のドパミン作働性ニューロンの数は、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤを１日１回５連続日で腹腔内投与してから２１日後に有意に増加した（＋１６．７％；Ｐ＜０．００１；図３ｂ）。
【０１９２】
ＳＮｃ中の典型的なドパミン作働性ニューロンの形態を有する大きな多角形のクレシルバイオレット染色ニューロンの数も、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤの投与後に増加した（＋２１．５％；Ｐ＜０．００１；図３ｃ）。
【０１９３】
Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤは正常な成体マウスのＳＮｃにおいて細胞分裂促進作用を有さない。
【０１９４】
黒質ドパミン作働性ニューロンの増加が成体の神経新生の結果であるかどうかを判断するため、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤの５日間投与と同時に、チミジン類似体である５−ブロモ−２′−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を１日１回注射して、有糸分裂細胞を標識した。
【０１９５】
ＢｒｄＵの注射から７日後または２１日後には、単一ニューロン中にＢｒｄＵおよびＴＨの同時局在は認められず（図３ｄ）、Ｎｒｇ１β1による神経新生の誘発に反する根拠が示された。
【０１９６】
さらに、Ｎｒｇ１β1投与後のＳＮｃ中のＢｒｄＵ+細胞の絶対数は、ＮａＣｌ投与対照マウスに比して増加せず（図３ｅ）、Ｎｒｇ１β1は正常な成体マウスのＳＮｃにおいて細胞分裂促進作用を有さないことを示した。
【０１９７】
Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤは、ＳＮｃ中での神経分化を示すプロテオームの変化を誘導する。
【０１９８】
黒質で神経新生が起こらないまま（図３ｄ，ｅ）、黒質線条体ドパミンが遅発性に増加し（図３ａ）、黒質ドパミン作働性ニューロンが増加する（図３ｃ，ｄ）ことは、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤがＳＮｃ中で神経分化を誘導することを示唆する。この過程の性質を知るため、発明者らはマウスにＮｒｇ１β1−ＥＣＤを５連続日で注射してから７日後に、ＳＮｃを含有する腹側中脳に対して仮説を用いないプロテオーム差分解析を実施し、ＮａＣｌ注射マウスと比較した。
【０１９９】
Ｎ＝６２のタンパク質が有意な変化を示した（Ｎ＝３は減少［１４−３−３−ゼータ、１４−３−３−エプシロンおよびＮ−エチルマレイミド感受性因子］；Ｎ＝５９は増加；補遺第２表オンライン）。これらのタンパク質は機能別に６つに分類される（図３ｆ）：
１）細胞内シグナル伝達タンパク質。ＥｒｂＢ活性化Ｒａｆ−１経路の調節因子（２個の１４−３−３アイソフォーム；ｍＣＧ７１９１）；これもＥｒｂＢの下流で活性化され、サイトゾルのＣａ２+を増加させるホスホリパーゼＣ；およびいくつかのＣａ２+結合およびシグナル伝達タンパク質を含む。
【０２００】
２）細胞骨格タンパク質。アクチン、中間フィラメントおよび微小管ネットワーク、小胞輸送および軸索伸長に関与する（図３ｇ）。全体で最も増加したタンパク質（ＮａＣｌ投与マウスに対し＋２５００％）はジヒドロピリミジナーゼ様２であり、これは軸索伸長およびシナプス可塑性のＣａ２+依存性レギュレーターであるコラプシン反応媒介タンパク質２とも呼ばれる。また、ＰＤの神経モデルにおいて毒性を抑制することが知られているＲＡＢ３Ａの１００％の増加も認められた（Ｇｉｔｌｅｒ，  Ａ．Ｄ．；  Ｂｅｖｉｓ，  Ｂ．Ｊ．；  Ｓｈｏｒｔｅｒ，  Ｊ．；  Ｓｔｒａｔｈｅａｒｎ，  Ｋ．Ｅ．；  Ｈａｍａｍｉｃｈｉ，  Ｓ；  Ｓｕ，  Ｌ．Ｊ．；  Ｃａｌｄｗｅｌｌ，  Ｋ．Ａ．；  Ｃａｌｄｗｅｌｌ，  Ｇ．Ａ．；  Ｒｏｃｈｅｔ，  Ｊ．Ｃ．；  ＭｃＣａｆｆｅｒｙ，  Ｊ．Ｍ．；  Ｂａｒｌｏｗｅ，  Ｃ．；  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，  Ｓ．  （２００８）  Ｔｈｅ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ′ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒａｂ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ＰＮＡＳ  １０５，  １４５−１５０）。
【０２０１】
３）ドパミン代謝タンパク質。すなわち、Ｌドパをドパミンに変換する芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）の必須の補因子であるピリドキサールキナーゼ；およびドパミンの小胞への貯蔵を至適化するＧｏ１αおよびＧｏ２α  ＧＴＰａｓｅのαサブユニット。
【０２０２】
４）エネルギー代謝タンパク質。グルタミン合成酵素、クレアチンキナーゼおよび解糖、クエン酸回路および酸化的リン酸化のいくつかの構成要素（複合体Ｉ［ＮＡＤＨ−脱水素酵素］、ＩＩＩ［ユビキノール−還元酵素］およびＶ［ＡＴＰ合成酵素］）を含む（図３ｈ）。
【０２０３】
５）タンパク質の品質管理要素。ライソゾームのＨ+輸送ＡＴＰａｓｅであるシャペロン、プロテアーゼおよびユビキチン−プロテアソーム系の成員、特にプロテアソームサブユニットおよびその変異が家族性ＰＤにつながるユビキチン−カルボキシ−末端−ヒドロラーゼ−Ｌ１（図３ｉ）を含む。全体で２番目に最も増加したタンパク質（ＮａＣｌ投与マウスに対して＋２４００％）は、ユビキチン依存性タンパク質分解に関与する多機能タンパク質であり、その変異が封入体ミオパチーおよび前頭側頭型認知症を引き起こすバロシン含有タンパク質であった。
【０２０４】
６）抗酸化タンパク質。すなわち、ペルオキシレドキシン１および３。
【０２０５】
これらのデータはともに、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤがＥｒｂＢ下流およびＣａ２+依存性のシグナル伝達カスケードを調節し、神経分化を誘導し（軸索発芽、小胞輸送、ドパミン産生および貯蔵）、１）細胞エネルギー産生、２）酸化ストレスに対する防御および３）ミスフォールディングしたタンパク質に対する防御を促進することを示唆している。
【０２０６】
Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤはｉｎ  ｖｉｖｏで６−ヒドロキシドパミンからドパミン作働性マウスニューロンを保護する。
【０２０７】
Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤが誘導するプロテオームの変化は、ＰＤの病理生理学に関連する細胞の防御システムの刺激を示しているため、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤがＰＤ実験モデルにおいてドパミン作働性ニューロンを保護できるかどうかを試験した。６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨＤＡ）で神経死を誘導したのは、この神経毒が１）ＡＴＰ濃度を低下させ、２）酸化ストレスを誘発し、３）タンパク質を損傷することによって、ドパミン作働性ニューロンを強力かつ不可逆性に破壊するためである。
【０２０８】
マウスの片側線状体に６−ＯＨＤＡを注射するかシャム手術を行い、ＮａＣｌ（対照）またはＮｒｇ１β1−ＥＣＤ（８×５０ｎｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、２４時間間隔）を腹腔内投与した。Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤの投与は、最初の酸化ストレスが引き起こされる６−ＯＨＤＡ投与の直後（６時間後）または、部分的にではあるが軸索およびニューロンの減少が最初に引き起こされる時点まで間隔をおいて（６−ＯＨＤＡの投与から４８時間後）から開始した。
【０２０９】
６−ＯＨＤＡの注射から２４日後に、アンフェタミン誘発性の体の回転が行動学的な関連要因として認められ、６−ＯＨＤＡによる病変側で、片側性の線状体ドパミン欠乏症が発現していることが示された。この病的な非対称性は、直後からＮｒｇ１β1−ＥＣＤの投与を開始した場合には予防されたが、時間をおいて開始した場合には予防されなかった（図４ａ）。
【０２１０】
６−ＯＨＤＡの注射から２８日後に実施した組織学的解析では、病変を生じさせなかった対照側に比して、６−ＯＨＤＡによる病変側ではＴＨ+ドパミン作働性線維の密度が一貫して低下した。この病的な非対称性は、直後からＮｒｇ１β1−ＥＣＤの投与を開始した場合には緩和されたが、時間をおいて開始した場合には緩和されなかった（図４ｂ，ｃ）。
【０２１１】
ＳＮｃ中のＴＨ+ドパミン作働性ニューロン（図４ｄ，ｅ）およびクレシルバイオレット+大ニューロン（図４ｆ）の数は、病変を生じさせなかった対照側に比して、６−ＯＨＤＡによる病変側で減少した。ただし、この病的な非対称性は、直後からＮｒｇ１β1−ＥＣＤの投与を開始した場合または時間をおいて開始した場合のいずれでも緩和された（図４ｅ，ｆ）。
【０２１２】
黒質ニューロンの保護は、対照の健常マウスで認められた細胞数の上方調節（図３ｂ，ｃ）のみによるものではないことに留意することが重要である。この細胞数は個々の動物における反対側の病変を生じさせなかったＳＮｃに対する％として算出されたためである。
【０２１３】
Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤはｉｎ  ｖｉｔｒｏで６−ＯＨＤＡからヒトドパミン作働性ニューロンを保護する。
【０２１４】
Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤがヒトドパミン作働性ニューロンも保護するかどうかを確認するため、テトラサイクリン制御性ｖ−ｍｙｃ過剰発現ヒト中脳ＬＵＨＭＥＳ細胞の培養液を使用した。
【０２１５】
分化したＬＵＨＭＥＳ細胞はＥｒｂＢ４受容体を発現し（図４ｇ）、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤの存在下で６−ＯＨＤＡが誘発する変性から有意に保護された。同様の結果は、ＬＤＨ放出量アッセイによって生化学的に（図４ｈ）および濃縮核の計数によって顕微鏡学的に（図４ｉ）も認められた。
【０２１６】
考察
発明者らは、ヒトＮｒｇ１β1−ＥＣＤが血清に可溶性であり、健常な成体マウスの脳に侵入し、ＳＮｃ中のＥｒｂＢ４受容体のリン酸化を誘導し、神経およびドパミン作働性分化を示唆する方法で腹側中脳のプロテオームを変化させ、黒質線条体中のドパミン濃度を上昇させ、ＰＤ関連の分子学的防御系を活性化させ、神経毒６−ＯＨＤＡから黒質線条体ニューロンを保護することを明らかにした。また、発明者らはＭＰＴＰモデルから一貫した結果を得た（示さず）。ＰＤにおいてドパミン作働性の変性ニューロンは強度にＥｒｂＢ４を発現することから、これらの所見は、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤがＰＤ患者の対症療法および神経保護療法において有望な候補であることを示している。
【０２１７】
現在のＰＤの治療は主としてドパミンの補充に基づき、運動症状の一時的な対症的改善をもたらすものである。残念ながら、患者は通常、薬物誘発性の運動合併症（ジスキネジア）を発現し、臨床的意義を有する方法で疾患の進行を抑える療法は現在のところ存在しない。
【０２１８】
ＰＤ患者のドパミン作働性ニューロンを生物学的神経栄養因子を用いて死滅から守る過去の取り組みは、そのタンパク質に基づく性質により支障を来した。例えば、この種の化合物で最も研究が進んでいるグリア細胞系由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は、さまざまな毒素による傷害から中脳のドパミン作働性ニューロンを強力に保護するが（Ｌｉｎ，  Ｌ．Ｆ．，  Ｄｏｈｅｒｔｙ，  Ｄ．Ｈ．，  Ｌｉｌｅ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｂｅｋｔｅｓｈ，  Ｓ．，  ＆  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｆ．  ＧＤＮＦ：  ａ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｍｉｄｂｒａｉｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０，  １１３０−１１３２  （１９９３））、ＢＢＢを通過しない。このため、ＢＢＢを回避するためのいくつかの方法が試験されたが（Ｇｉｌｌ，  Ｓ．Ｓ．  Ｐａｔｅｌ，  Ｎ．Ｋ．；  Ｈｏｔｔｏｎ，  Ｇ．Ｒ．；  Ｏ′Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  Ｋ．；  ＭｃＣａｒｔｅｒ，  Ｒ．；  Ｂｕｎｎａｇｅ，  Ｍ．；  Ｂｒｏｏｋｓ，  Ｄ．Ｊ．；  Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，  Ｃ．Ｎ．；  Ｈｅｙｗｏｏｄ，  Ｐ．  Ｄｉｒｅｃｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９，  ５８９−５９５  （２００３）．  Ｋｏｒｄｏｗｅｒ，  Ｊ．Ｈ．  Ｅｍｂｏｒｇ，  Ｍ．Ｅ．；  Ｂｌｏｃｈ，  Ｊ．；  Ｍａ，  Ｓ．Ｙ．；  Ｃｈｕ，  Ｙ．；  Ｌｅｖｅｎｔｈａｌ，  Ｌ．；  ＭｃＢｒｉｄｅ，  Ｊ．；  Ｃｈｅｎ，  Ｅ．Ｙ．；  Ｐａｌｆｉ，Ｓ．；  Ｒｏｉｔｂｅｒｇ，Ｂ．Ｚ．；  Ｂｒｏｗｎ，  Ｗ．Ｄ．；  Ｈｏｌｄｅｎ，  Ｊ．Ｅ．；  Ｐｙｚａｌｓｋｉ，  Ｒ．；  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｍ．Ｄ．；  Ｃａｒｖｅｙ，Ｐ．；  Ｌｉｎｇ，  Ｚ．；  Ｔｒｏｎｏ，  Ｄ．；  ＩＩａｎｔｒａｙｅ，  Ｐ．；  Ｄｅｇｌｏｎ，  Ｎ．；  Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ，  Ｐ．  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＧＤＮＦ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ′ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０，  ７６７−７７３  （２０００）．  Ｂｅｈｒｓｔｏｃｋ，  Ｓ．  Ｂｅｈｒｓｔｏｃｋ，  Ｓ．；  Ｅｂｅｒｔ，  Ａ．；  ＭｃＨｕｇｈ，  Ｊ．；  Ｖｏｓｂｅｒｇ，  Ｓ．；  Ｍｏｏｒｅ，  Ｊ．；  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｂ．；  Ｃａｐｏｗｓｋｉ，  Ｅ．；  Ｈｅｉ，  Ｄ．；  Ｋｏｒｄｏｗｅｒ，  Ｊ．；  Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ，  Ｐ．；  Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，  Ｃ．Ｎ．  Ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｄｅｌｉｖｅｒ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ  ａｎｄ  ａｇｅｄ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １３，  ３７９−３８８  （２００６））、臨床的有効性はまだ確立されていない（Ｌａｎｇ，  Ａ．Ｅ．  Ｇｉｌｌ，Ｓ．；  Ｐａｔｅｌ，  Ｎ．Ｋ．；  Ｌｏｚａｎｏ，  Ａ．；  Ｎｕｔｔ，  Ｊ．Ｇ．；  Ｐｅｎｎ，  Ｒ．；  Ｂｒｏｏｋｓ，  Ｄ．Ｊ．；  Ｈｏｔｔｏｎ，  Ｇ．；  Ｍｏｒｏ，  Ｅ．；  Ｈｅｙｗｏｏｄ，  Ｐ．；  Ｂｒｏｄｓｋｙ，Ｍ．Ａ．；  Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，  Ｋ．；  Ｋｅｌｌｙ，  Ｐ．；  Ｄａｌｖｉ，  Ａ．；  Ｓｃｏｔｔ，  Ｂ．；  Ｓｔａｃｙ，  Ｍ．；  Ｔｕｒｎｅｒ，  Ｄ．；  Ｗｏｏｔｅｎ，  Ｖ．Ｇ．；  Ｅｌｉａｓ，  Ｗ．Ｊ．；  Ｌａｗｓ，  Ｅ．Ｒ．；  Ｄｈａｗａｎ，  Ｖ．；  Ｓｔｏｅｓｓｌ，  Ａ．Ｊ．；  Ｍａｔｃｈａｍ，  Ｊ．；  Ｃｏｆｆｅｙ，  Ｒ．Ｊ．；  Ｔｒａｕｂ，  Ｍ．  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｐｕｔａｍｅｎａｌ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ５９，  ４５９−４６６  （２００６））。これらの制約は他の既知の神経栄養因子にも当てはまる（Ｔｈｏｅｎｅｎ，  ＩＩ．  ＆  Ｓｅｎｄｔｎｅｒ，  Ｍ．  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ：  ｆｒｏｍ  ｅｎｔｈｕｓｉａｓｔｉｃ  ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｏｂｅｒｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．  Ｎａｔ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ５  Ｓｕｐｐｌ，  １０４６−１０５０  （２００２））。
【０２１９】
これに対し、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤは可溶性の栄養因子として生理学的に働く。Ｎ末端切断Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤ断片は、すでに新生仔マウスにおいて未成熟なＢＢＢを通過し、ＥｒｂＢ４をリン酸化することが明らかにされていた。発明者らは、全長のＮｒｇ１β1−ＥＣＤも、重要なことには成体の動物のＢＢＢを通過することを示すことによって、これらの所見を拡大した。末梢投与後に、発明者らは放射性標識したＮｒｇ１β1−ＥＣＤを脳実質中で特定した。この分布状況は以前に報告されたＥｒｂＢ４およびＥｒｂＢ４受容体の発現パターンによく合致していた（主として脳皮質およびＳＮｃに発現；Ｓｔｅｉｎｅｒ，  Ｈ．，  Ｂｌｕｍ，  Ｍ．，  Ｋｉｔａｉ，  Ｓ．Ｔ．，  ＆  Ｆｅｄｉ，  Ｐ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＥｒｂＢ３  ａｎｄ  ＥｒｂＢ４  ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｏｒｅｂｒａｉｎ  ａｒｅａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １５９，  ４９４−５０３  （１９９９）を参照）。また、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤの末梢投与後に、ＥｒｂＢ４のリン酸化の生化学的および免疫組織化学的エビデンスも見出した。Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤまたはＮａＣｌ投与マウスの中脳を対象としたプロテオーム差分解析では、ホスホリパーゼＣおよびＲａｆ−１経路の調節因子の著明な変化が特定された。これらはいずれもＥｒｂＢ４受容体の下流におけるシグナル伝達要素として知られている。これらのデータはともに、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤの末梢投与が脳内でのＥｒｂＢ４のシグナル伝達を活性化させたという見方を裏付けるものである。
【０２２０】
健常な成体マウスにおいて、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤは脳内のドパミン濃度を上昇させた。この作用は、腹側被蓋野から求心性線維を伝わる刺激を受ける腹側（辺縁系）線状体よりも、ＳＮｃから求心性線維を伝わる刺激を受ける背側（運動）線状体において著明であった。この所見は、腹側被蓋野よりもＳＮｃのほうがＥｒｂＢ４の発現量が多いという過去の報告と合致する。ドパミン濃度の上昇は、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤの投与直後には認められず、７日後に初めて認められ、この現象には急性の制御ではなく構造的な変化が関与していることが示唆された。注目すべきは、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤがＳＮｃにおいて、表現型が同定されたドパミン作働性ニューロンの数も増加させたことである。Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤは成体ＳＮｃにおいて神経発生を誘導しなかったため、新たに発現したドパミン作働性ニューロンはおそらく既存の細胞、最もあり得るのはＴＨまたは神経メラニンを含有しないマウスおよびヒトＳＮｃ中のＥｒｂＢ４+細胞のサブ集団において、ドパミン作働性表現型が誘導された結果であると考えられる。また、プロテオーム解析では、いくつかの神経細胞骨格タンパク質、特に小胞輸送および軸索伸長に関与するタンパク質、最も驚くべきはコラプシン反応媒介タンパク質２の増加が特定された。また、ドパミン合成におけるＡＡＤＣの必須の補因子であるピリドキサールキナーゼの上方調節が認められた。ＴＨの必須の補因子であるテトラヒドロビオプテリンを再利用するための経路の一部であるジヒドロプテリジン還元酵素は、５０％増加した（Ｐ＝０．０９）。最後に、ドパミンの小胞への貯蔵を至適化するＧｏ−ＧＴＰａｓｅのαサブユニットが上方調節された。これらのデータは、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤが黒質ドパミン作動系を機能的に強化する機序を解明するためのヒントを提供するものである。
【０２２１】
また、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤはＰＤの病態生理学に関与する多数のタンパク質を増加させた。特に、散発性ＰＤで機能が低下すると考えられているミトコンドリア呼吸鎖の複合体Ｉの３つのタンパク質構成要素が著明に増加した（Ｍｉｚｏｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９；  Ｍｉｚｕｎｏ  Ｙ，  Ｏｈｔａ  Ｓ，  Ｔａｎａｋａ  Ｍ，  Ｔａｋａｍｉｙａ  Ｓ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ，  Ｓａｔｏ  Ｔ，  Ｏｙａ  Ｈ，  Ｏｚａｗａ  Ｔ，  Ｋａｇａｗａ  Ｙ．  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｈａｉｎ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ′ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９８９  Ｓｅｐ  ２９；  １６３（３）：１４５０−５）。Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤは、ユビキチンの再利用を担い、いくつかの家族性ＰＤの病型において機能が低下するユビキチン−カルボキシ−末端−ヒドロラーゼ−Ｌ１を上方調節した31。
【０２２２】
また、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤは、ＰＤにおいて神経細胞死を引き起こす主要な因子と考えられるミトコンドリアのエネルギー産生障害、タンパク質の処理異常、酸化ストレスおよび興奮毒性に対する防御において機能を果たすことが既知の、他の多くのタンパク質を増加させた（Ｄａｕｅｒ，  Ｗ．  ＆  Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ，  Ｓ．  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ′ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｅｌｓ．  Ｎｅｕｒｏｎ  ３９，  ８８９−９０９  （２００３）．  Ｗｏｏｄ−Ｋａｃｚｍａｒ，  Ａ．；  Ｇａｎｄｈｉ，  Ｓ．；  Ｗｏｏｄ，  Ｎ．Ｗ．  （２００６）  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ′ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ  １２，  ５２１−５２８）。このため、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤは中脳ニューロンを強化し、理想的にはＰＤ関連ストレスに対して自らを防御すると考えられる。
【０２２３】
したがって、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤが、これらの病的機序すべてを活性化させる神経毒である６−ＯＨＤＡからドパミン作働性ニューロンを保護できるかどうかを試験した（Ｂｌｕｍ，  Ｄ．  Ｔｏｒｃｈ，  Ｓ．；  Ｌａｍｂｅｎｇ，  Ｎ．；  Ｎｉｓｓｏｕ，  Ｍ．；  Ｂｅｎａｂｉｄ，  Ａ．Ｌ．；  Ｓａｄｏｕｌ，  Ｒ．；  Ｖｅｒｎａ，  Ｊ．Ｍ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ６−ＯＨＤＡ，  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ＭＰＴＰ：  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｔｈｅｏｒｙ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ′ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｐｒｏｇ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  ６５，  １３５−１７２  （２００１））。マウスの線状体中に６−ＯＨＤＡを注射する亜急性投与法を使用し、酸化ストレスおよび軸索および神経の減少の時系列を分離することに成功した（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｉａｔａｌ  ６−ＯＨＤＡ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ′ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ−ｄｅｌｅｔｅｄ  ｍｉｃｅ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２１０，  １８２−１９３  （２００８）も参照）。事実、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤは、毒性物質の投与直後から投与された場合（すなわち酸化ストレスは存在するが、構造的損傷はまだ存在しない時点−上記のＡｌｖａｒｅｚ−Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．も参照）には、この６−ＯＨＤＡが誘発する黒質細胞の減少、線状体の軸索の減少およびこれに関連する回転性の行動からの強力な防御を示した。Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤがその後に投与された場合（すなわち、部分的な構造的損傷がすでに存在する時点−上記のＡｌｖａｒｅｚ−Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．も参照）、この投与によって線状体の軸索変性および関連する回転の非対称性からの防御はできないが、黒質ニューロンを逆行性変性からは保護することができた。
【０２２４】
過去の研究ではすでに、ラット中脳の一次培養液を用いてドパミン作働性ニューロンにおけるグリア成長因子−２（ＩＩ型Ｎｒｇ１）１、２の６−ＯＨＤＡに対する神経保護作用が報告されている（Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ−Ｔｕｒｎｅｒ，  Ａ．；  Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉ，  Ｍ．Ａ．；  Ａｐｐａｒｓｕｎｄａｒａｍ，  Ｓ．；  Ｌｕｎｄｇｒｅｎ，  Ｋ．Ｈ．；  Ｙｕｒｅｋ，  Ｄ．Ｍ．；  Ｓｅｒｏｏｇｙ，  Ｋ．Ｂ．  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ  ｇｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２  ｏｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｉｄｂｒａｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ９１，  １３５８−１３６８  （２００４））。Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤ（Ｉ型Ｎｒｇ１）１、２がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの６−ＯＨＤＡが誘発する変性からヒトドパミン作働性ＬＵＨＭＥＳニューロンを保護したという発見者らの所見は、ヒト中脳のドパミン作働性ニューロンもＮｒｇ１β1−ＥＣＤに反応することを示唆するものである。ヒトＳＮｃの神経メラニン+のドパミン作働性ニューロンの大半がＥｒｂＢ４を発現しているという事実は、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤの投与が生存患者においても有効である可能性を示唆する。ＳＮｃ中の神経メラニン+ニューロンは、対象被験者よりもＰＤ患者でより高い割合でＥｒｂＢ４+であるという所見は、ＰＤで罹患したニューロンが支援を求めてＥｒｂＢ４の発現量を上方調節していることを示す可能性がある。また別の解釈として、ＥｒｂＢ４を発現したＳＮｃ中の神経メラニン+ニューロンのサブセットは、ＥｒｂＢ４を発現しない神経メラニン+ニューロンに比して、ＰＤにおける変性に対して感受性が低い可能性もある。ただし、いずれの解釈も、ＰＤに対してＮｒｇ１β1−ＥＣＤ投与がもたらす利益の可能性を示すものである。
【０２２５】
Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤの投与はＰＤにおいて二重の利益をもたらす可能性がある。第一に、内因性ドパミン産生量の増加により症状が緩和され、運動合併症を誘発するリスクを有する薬物（例えばＬドパまたはドパミン作用薬）の投与までの時間を延長することができる。第二に、内因性ドパミン作働性ニューロンを変性から保護することで、疾患の進行を遅延または場合によっては抑制することができる。
【０２２６】
第１表：ＰＤ患者および対照被験者のＳＮｃにおけるＥｒｂＢ４の発現量
【表９】
2013529911.tif 000010
略号：Ｎ＝数；ｎ．ｓ．＝非有意；ＰＤ＝パーキンソン病；ＰＭＤ＝死後経過時間（死亡から組織固定までの時間）；ＮＭ＝神経メラニン；％  ｄｉｆｆ．＝対照被験者に対するＰＤの差率
【０２２７】
【表１０】
2013529911.tif 000011
【０２２８】
【表１１】
2013529911.tif 000012
【０２２９】
【表１２】
2013529911.tif 000013
【０２３０】
【表１３】
2013529911.tif 000014
【０２３１】
【表１４】
2013529911.tif 000015
【０２３２】
方法
ヒト脳
病理学的に確定診断されたＰＤ患者および神経精神疾患を有さない個体の剖検試料をＧｅｒｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｎｅｔ（ｗｗｗ．ｂｒａｉｎ−ｎｅｔ．ｎｅｔ）から入手した。脳１点につき、ＳＮｃを含む厚さ７μｍのホルマリン固定パラフィン包埋冠状断面２片を解析した。
【０２３３】
動物
実験は承認された（Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｅｓｉｄｉｕｍ  Ｇｉｅｓｓｅｎ；  ＭＲ２０／１５−Ｎｒ．  ８４／２００７，  ２９／２００８，  ６８／２００９，  ７３／２００９）。９〜１１週齢の野生型のＣ５７Ｂ１６雄マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、ドイツ）を、ＥＵ評議会指令８６／６０９／ＥＥＣに従い、１２時間の明暗周期で食餌および水を自由摂取にして飼育した。マウスはペントバルビタール１００ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与によって屠殺し、氷冷した０．１Ｍリン酸緩衝生食水（ＰＢＳ）５０ｍＬを心臓潅流した。
【０２３４】
Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤ
Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤ（３７７−ＨＢ／ＣＦ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）を０．９％  ＮａＣｌに１０ｎｇ／ｍＬで溶解し、腹腔内注射した（特に記載がない限りは５０ｎｇ／ｋｇ）。対照には生食水を注射した。
【０２３５】
［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤ
Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤおよびＢＳＡ（Ｆｌｕｋａ、ドイツ）をヨウ素化した（例えばＫａｓｔｉｎ，  Ａ．Ｊ．，  Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ，  Ｖ．，  ＆  Ｐａｎ，  Ｗ．  Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ−１−ｂｅｔａ１  ｅｎｔｅｒｓ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ８８，  ９６５−９７０  （２００４）を参照）。Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤ（０．１９ｎＭ）またはＢＳＡ（７４．６３ｐＭ）５μｇを、ＰＢＳ  ５０μＬ（０．２Ｍ、ｐＨ＝７．５）および担体を含まないＮａ［125Ｉ］またはＮａ［131Ｉ］（５μＬ、０．２４μＣｉ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に溶解し、新たに準備したポリプロピレン製ヨウ素化バイアルで、ヨードゲン１０μｇ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）と反応させた（３時間、室温）。この産物を、０．１％トリフルオロ酢酸および濃度を徐々に上昇させた２０−６０％アセトニトリルを用いて、３０分かけてＨＰＬＣ（Ｃ８カラム、ＥＣ２５０／４Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  ３００−５、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）で精製した後、５分かけて均一濃度溶離を行い、さらに５分かけて流量０．５ｍＬ／分でアセトニトリル濃度を６０−１００％に直線的に上昇させた。
【０２３６】
［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤによる血中動態
マウス３匹に［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤ  １．６２μＣｉを注射した。血中の放射活性をガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ  ＩＩ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｐａｃｋａｒｄ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）を用いて測定した。
【０２３７】
［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤによる脳透過性
マウスに［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤおよび［131Ｉ］−ＢＳＡ  １．６２μＣｉを注射し（投与群毎にＮ＝５）、１時間後に屠殺した。血液および潅流脳の放射活性をガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ  ＩＩ）で測定した。
【０２３８】
［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤによるオートラジオグラフィー
マウスに［125Ｉ］−Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤまたは［131Ｉ］−ＢＳＡ  １３．５１μＣｉを注射し（投与群毎にＮ＝４）、１時間後に屠殺および潅流を行った。３０μｍのミクロトーム脳矢状切片を、ＢｉｏＭａｘ  ＭＳフィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、ドイツ）で３０日間覆った。
【０２３９】
ＥｒｂＢ４のリン酸化
マウスにＮｒｇ１β1−ＥＣＤまたは担体１０μｇを腹腔内注射し（投与群毎にＮ＝４）、１時間後に屠殺した。ウサギポリクローナル抗体（ｓｃ−２８３、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を用いて、線状体および前頭皮質からＥｒｂＢ４タンパク質を親和精製した。溶出物に対して１Ｄ−ＰＡＧＥを行い、マウスモノクローナル抗体で染色した［抗ＥｒｂＢ４（ｓｃ−８０５０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）；抗ホスホチロシン（４Ｇ１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ、ドイツ）］。
【０２４０】
ＨＰＬＣ
腹側中脳、腹側線条体および背側線状体を切除し、０．４Ｍ過塩素酸５００μＬでホモジナイズした。Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極を使用し、定組成溶離条件下で、電気化学検出器（電位７５０ｍＶ）を用いて逆相イオン対ＨＰＬＣによりドパミンを測定した。
【０２４１】
ＢｒｄＵ
マウスにＢｒｄＵ  ５０ｍｇ／ｋｇ（Ｓｉｇｍａ；０．９％ＮａＣｌで５ｍｇ／ｍＬに溶解）を腹腔内注射し、１時間後にＮｒｇ１β1  ５０ｎｇ／ｋｇを注射してから、７日後または２１日後に屠殺した（群毎にＮ＝５）。
【０２４２】
プロテオーム差分解析
マウスにＮｒｇ１β1−ＥＣＤ  ５０ｎｇ／ｋｇまたは０．９％ＮａＣｌを１日１回、５連続日腹腔内注射し、最終注射から７日後に屠殺した（投与群毎にＮ＝５）。腹側中脳を切除した。試料を２５℃で解凍し、８Ｍ尿素／４％ＣＨＡＰＳ／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）で溶解し、同一ヨウ素濃度で［125Ｉ］または［131Ｉ］でヨウ素化した。［125Ｉ］および［131Ｉ］で標識した試料から同量のタンパク質（＜５μｇ）を混合し、ｐＨ４〜９をカバーする高解像度２Ｄ−ＰＡＧＥ高解像度「デイジーチェーン」によって分離した（例えばＰｏｚｎａｎｏｖｉｃ，  Ｓ．，  Ｓｃｈｗａｌｌ，  Ｇ．，  Ｚｅｎｇｅｒｌｉｎｇ，  Ｈ．，  ＆  Ｃａｈｉｌｌ，  Ｍ．Ａ．  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｉｎ  ｓｅｒｉａｌ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐＨ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２６，  ３１８５−３１９０  （２００５）を参照）。Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤおよびＮａＣｌ投与マウスから単離したタンパク質の［125Ｉ］−および［131Ｉ］−シグナルの定量的示差表示を、高感受性の放射性物質を用いた造影法によって行った（例えばＧｒｏｅｂｅ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｃｒｉｎａ，  ｒａｔ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｃｈａｎｇｅｓ．  Ｅｘｐ．  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．  ４２，  ８８７−８９８  （２００７））。Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤ群およびＮａＣｌ群の間の著明に異なる濃度のタンパク質スポットを判定し（ＧＲＥＧソフトウェア、ｗｗｗ．ｆｉｔ．ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ．ｄｅ）、２Ｄ−ＰＡＧＥゲルで励起し（ＰｒｏＰｉｃｋ  ｒｏｂｏｔ、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．、Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ、英国）、トリプシンで分解し（ＰｒｏＧｅｓｔ  ｒｏｂｏｔ、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．）、アンカーターゲット上に塗布した（ＰｒｏＭＳ  ｒｏｂｏｔ、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．）。質量範囲ｍ／ｚ  ８００〜４０００で、リフレクターモードでＵｌｔｒａｆｌｅｘ  ＭＡＬＤＩ飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｂｒｅｍｅｎ、ドイツ）を使用することにより、ペプチドイオンの質量スペクトルを入手した（例えば上記のＧｒｏｅｂｅ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．を参照）。ペプチドマスフィンガープリントを非重複ＮＣＢＩタンパク質配列データベース（Ｍａｓｃｏｔ  ｓｅｒｖｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ロンドン、英国）で検索した。
【０２４３】
６−ＯＨＤＡのｉｎ  ｖｉｖｏ投与
麻酔マウス（１％ケタミン／０．２％キシラジン、１０ｍＬ／ｋｇ）の線状体（座標：前項および硬膜からＡＰ  ＋０．９ｍｍ、ＭＬ  −１．８ｍｍ、ＤＶ  −３．０ｍｍ）に、６−ＯＨＤＡ（Ｓｉｇｍａ；０．２μｇ／μＬアスコルビン酸入り０．９％ＮａＣｌ  ２μＬに溶解した５μｇ）を緩徐（０．５μＬ／分）に注射した；対照には担体を注射した（シャム手術）。６−ＯＨＤＡの注射の直後（６時間後）または時間をおいて（４８時間後）、Ｎｒｇ１β1−ＥＣＤ  ５０ｎｇ／ｋｇを１日１回、正午に８連続日投与した；対照には生食水を注射した。６−ＯＨＤＡの注射から２８日後にマウスを屠殺した（群毎にＮ＝１０−１２）。
【０２４４】
アンフェタミン誘発性回転
屠殺の４日前に、すべてのマウスにｄ−アンフェタミン（Ｓｉｇｍａ）５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。３０分間、回転行動をモニターした（Ｖｉｅｗｅｒ  ＩＩ、ｒｏｔａｔｉｏｎ  ｐｌｕｇ−ｉｎ、Ｂｉｏｂｓｅｒｖｅ、Ｂｏｎｎ、ドイツ）。１分毎の３６０℃の回転数を算出した；正の数値は病変を生じさせた側と同側の回転を示す。
【０２４５】
６−ＯＨＤＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ投与
文献に報告されている通り、ＬＵＨＭＥＳ細胞を増殖し分化させた（Ｌｏｔｈａｒｉｕｓ，  Ｊ．  Ｆａｌｓｉｇ，  Ｊ．；  ｖａｎ，  Ｂｅｅｋ  Ｊ．；  Ｐａｙｎｅ，  Ｓ．；  Ｄｒｉｎｇｅｎ，  Ｒ．；  Ｂｒｕｎｄｉｎ，  Ｐ．；  Ｌｅｉｓｔ，  Ｍ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ  ｎｅｕｒｏｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｄｏｐａｍｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｉｘｅｄ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２５，  ６３２９−６３４２  （２００５））。培養液１ｍＬにつきＮｒｇ１β1  １００ｎｇで分化細胞を処理しまたは処理せずに、１時間後に３２μＭ  ６−ＯＨＤＡで４８時間処理した。
【０２４６】
ＬＤＨ放出量
ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を用いて、３件の実験の条件毎に１２ウェル以上で、培養液中のＬＤＨ濃度を測定した。
【０２４７】
免疫組織化学
マウントしたヒト切片、浮遊マウス切片または培養液を、以下の抗体で染色した：ウサギポリクローナル抗ＴＨ抗体（Ｐ４０１０１−０、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｒｏｇｅｒｓ、ＡＲ；１／１０００）、ラットポリクローナル抗ＤＡＴ抗体（ＭＡＢ３６９、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ；１／１０００）、ラットポリクローナル抗ＢｒｄＵ抗体（ＯＢＴ００３０ＣＸ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ；１／５００）、ウサギポリクローナル抗ＥｒｂＢ４抗体（ｓｃ−２８３、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ；１／２００）、ウサギポリクローナル抗Ｙ１２８４−リン酸化−ＥｒｂＢ４抗体（ａｂ６１０５９、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ；１／２００）。
【０２４８】
画像解析
切片毎にヒトＳＮｃ中の神経メラニン含有ニューロンをすべて解析し、明視野顕微鏡（ＤＭ−ＲＢ、Ｌｅｉｃａ、Ｗｅｔｚｌａｒ、ドイツ；ＳｉｍｐｌｅＰＣＩ  ６．１  ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、Ｈｅｒｒｓｃｈｉｎｇ、ドイツ）によってＥｒｂＢ４発現数および比率を測定した。蛍光免疫二重染色法の結果を共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ  ＴＣＳ  ＳＰ５、Ｌｅｉｃａ；ＭｅｔａＭｏｒｐｈ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）で解析した。細胞合計数のバイアスのない立体解析学的推定値を、光学的細胞分画法（Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ  ＦＸ、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ；Ｓｔｅｒｅｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ、Ｍａｇｄｅｂｕｒｇ、ドイツ）を用いて、マウスＳＮｃの頭尾軸方向の全長（前項から−２．４〜−４．１ｍｍ）にわたる５番目の連続切片毎に決定した。ＴＨ+線維の光学密度を、明視野照明下（ｅＶｉｓｉｏｎ  Ｃｏｐｙｌｉｚｅｒ、Ｋａｙｓｅｒ  Ｆｏｔｏｔｅｃｈｎｉｋ、Ｂｕｃｈｅｎ、ドイツ；ＩｍａｇｅＪ  ｖ１．４２  ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）で線状体（前項から１．７〜−０．５ｍｍ）の８等間隔にて定量し、隣接する白質においてバックグラウンドを差し引いた。ｐ−ＥｒｂＢ４の光学密度−免疫反応性を、前頭皮質（前項から＋１．７ｍｍ）、線状体（＋１．０ｍｍ）およびＳＮｃ（−３．０ｍｍ）の解剖学的にマッチングさせた切片で同様に測定した。不整なサイズの丸いクロマチン塊として特定される培養液中のＤＡＰＩ+の濃縮核を、培養ウェル毎に無作為に並べた１０視野で集計した（ＤＭ−ＩＲＢ；Ｌｅｉｃａ；ＳｉｍｐｌｅＰＣＩ  ６．１、Ｈａｍａｍａｔｓｕ）。
【０２４９】
統計
データは平均値±ＳＥＭで示す。通常のパラメトリックデータは両側の対応のないｔ検定またはＡＮＯＶＡで比較した後、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｆｉｓｈｅｒ最小有意差（ＬＳＤ）検定を実施した。Ｐ＜０．０５を有意水準とみなした。
【図１】
2013529911.tif 000016
【図２】
2013529911.tif 000017
【図３】
2013529911.tif 000018
【図４】
2013529911.tif 000019
【図５】
2013529911.tif 000020
【図６】
2013529911.tif 000021
【配列表】
2013529911000001.app
【国際調査報告】
2013529911.tif 000022
2013529911.tif 000023
2013529911.tif 000024
2013529911.tif 000025
2013529911.tif 000026
2013529911.tif 000027