(57)【要約】【課題】アスパラギン酸由来アミノ酸及びその前駆体、特にＬ−リシンの生産に組み換え微生物を使用する方法を提供すること。【解決手段】本発明は、初期微生物と対比して改善されたアスパラギン酸由来アミノ酸合成活性を有する組み換え微生物、並びに前記アミノ酸、前駆体及び誘導体の生産、特にＬ−リシン合成における前記微生物の使用を提供する。【選択図】図３３
2013533740.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
初期微生物と対比して、（ａ）増加したグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、（ｂ）増加したフルクトース１，６−ビスホスファターゼ活性、（ｃ）減衰したイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性、（ｄ）増加したジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性、及び（ｅ）増加したアスパラギン酸キナーゼ活性の特性を少なくとも含む微生物を用いて、アスパラギン酸由来アミノ酸、好ましくはリシンを製造する方法。
【請求項２】
前記微生物が組み換え微生物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）増加したグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、（ｉ）ｚｗｆ遺伝子の
過発現、好ましくは異種プロモーターを介したｚｗｆ遺伝子の自然型プロモーターの置換に基づいたｚｗｆ遺伝子の過発現及び／又は（ii）アミノ残基交換Ａ２４３Ｔ、又は(iii）二種プロモーターを介したｔｋｔオペロンの自然型プロモーターの置換によるものであり、
（ｂ）増加したフルクトース１，６−ビスホスファターゼ活性は、ｆｂｐ遺伝子の過発現、好ましくは異種プロモーターを介した自然型プロモーターの置換に基づいたｆｂｐ遺伝子の過発現によるものであり、
（ｃ）減衰したイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性は、異なる開始コドンによるｉｃｄ遺伝子の自然型開始コドンの置換に基づき、
（ｄ）増加したジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性はｄｄｈ遺伝子の過発現、好ましくは遺伝子増殖によるｄｄｈ遺伝子の過発現に基づき、
（ｅ）増加したアスパラギン酸キナーゼ活性は、ｌｙｓＣ遺伝子の過発現、好ましくはアミノ酸交換Ｔ３１１Ｉを引き起こすｌｙｓＣ遺伝子の変異によるｌｙｓＣ遺伝子の過発現に基づくことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記特徴（ａ）及び／又は（ｂ）の異種プロモーターは、スーパーオキサイドディスムターゼ（ｓｏｄ）のプロモーター又は延長因子ｔｕ（ｅｆｔｕ）のプロモーターから選ばれることを特徴とする、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記組み換え微生物は、
（ｆ）ジヒドロジピコリン酸リダクターゼの過発現、
（ｇ）ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの過発現、
（ｈ）ピルビン酸カルボキシラーゼの過発現及び突然変異、
（ｉ）ＰＥＰカルボキシキナーゼの欠失、及び
（ｊ）ホモセリンデヒドロゲナーゼの突然変異のうち、少なくとも一つの変異をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物はＤＳＭ２３５８６でＤＳＭＺに寄託されたか、或いはその変異体であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記組み換え微生物は変異されたコリネバクテリウム、好ましくは変異されたＣ．グルタミカムであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
アスパラギン酸由来アミノ酸、好ましくはリシンを収集し精製する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）増加したグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、
（ｂ）増加したフルクトース１，６−ビスホスファターゼ活性、
（ｃ）減衰したイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性、
（ｄ）増加したジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性、及び
（ｅ）増加したアスパラギン酸キナーゼ活性の特徴を有する組み換え微生物。
【請求項１０】
（ａ）増加したグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、（ｉ）ｚｗｆ遺伝子の
過発現、好ましくは異種プロモーターを介したｚｗｆ遺伝子の自然型プロモーターの置換に基づいたｚｗｆ遺伝子の過発現及び／又は（ii）アミノ酸残基交換Ａ２４３Ｔ、又は（
iii）異種プロモーターを介したｔｋｔオペロンの自然型プロモーターの置換によるものであり、
（ｂ）増加したフルクトース１，６−ビスホスファターゼ活性は、ｆｂｐ遺伝子の過発現、好ましくは異種プロモーターを介した自然型プロモーターの置換に基づいたｆｂｐ遺伝子の過発現によるものであり、
（ｃ）減衰したイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性は、異なる開始コドンによるｉｃｄ遺伝子の自然開始コドンの置換に基づき、
（ｄ）増加したジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性は、ｄｄｈ遺伝子の過発現、好ましくは遺伝子増殖によるｄｄｈ遺伝子の過発現に基づき、
（ｅ）増加したアスパラギン酸キナーゼ活性はｌｙｓＣ遺伝子の過発現、好ましくはアミノ酸交換Ｔ３１１Ｉを引き起こすｌｙｓＣ遺伝子の変異によるｌｙｓＣ遺伝子の過発現に基づくことを特徴とする、請求項９に記載の組み換え微生物。
【請求項１１】
前記異種プロモーターは、スーパーオキサイドディスムターゼ（ｓｏｄ）又は延長因子ｔｕ（ｅｆｔｕ）のプロモーターから選ばれることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の微生物。
【請求項１２】
（ｆ）ジヒドロジピコリン酸リダクターゼの過発現、
（ｇ）ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの過発現、
（ｈ）ピルビン酸カルボキシラーゼの過発現及び突然変異、
（ｉ）ＰＥＰカルボキシキナーゼの欠失、及び
（ｊ）ホモセリンデヒドロゲナーゼの突然変異のうち、少なくとも一つの変異をさらに含むことを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１３】
前記組み換え微生物は、変異されたコリネバクテリウム、好ましくは変異されたＣ．グルタミカムであることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１４】
ＤＳＭ２３５８６でＤＳＭＺに寄託されたか、或いはその変異体であることを特徴とする、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１５】
請求項９〜１４のいずれか１項の微生物の、アスパラギン酸由来アミノ酸、好ましくはＬ−リシン生産への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換え微生物を用いたアスパラギン酸系アミノ酸、特にＬ−リシン及びその前駆体の生産方法に関する。また、本発明は、初期微生物と比較してアスパラギン酸系アミノ酸の合成に関与した変異経路を有する組み換え型微生物、及び前記微生物のアスパラギン酸系アミノ酸、特にＬ−リシン及び前駆体の生産における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸及びその誘導体は、薬学産業において重要な前駆体であり、様々な飲食及び飼料にサプリメントとして添加される。グルタミン酸(glutamate)、リシン及びトレオニンなどの幾つかのアミノ酸は、それらの自然生合成経路(natural biosynthetic pathways)を用いて生産される。自然アミノ酸生合成において、アミノ酸のアスパラギン酸(aspartate)は、例えばリシン、トレオニン、イソロイシン及びメチオニンなどの他のアミノ酸の生産において前駆体の役割を果たす。
【０００３】
９００，０００ｔ／ａの世界市場で、必須アミノ酸のＬ−リシンは最も重要な生命工学発酵産物の一つである(Kohl and Tauch, 2009)。これは主に動物飼料にサプリメントとして使われる(Anastassiadis, 2007)。このような飼料物質をリシンに富んだソースで補充することは、例えば豚又は鶏の最適化成長をもたらす。過去数十年で、白肉摂取の継続的な増加はリシンの要求を増加させた。
【０００４】
リシンは例えば発酵方法で生産できる。そこで、Ｃ．グルタミカム(C. glutamicum)などの特定の微生物が特に適するということが明らかになった。アミノ酸の産業的生産技術としての発酵は、グルタミン酸(glutamate)を分泌するコリネバクテリウムグルタミカム(corynerbacterium glutamicum)の発見によって知られた。前記発見の数年後に、リシンを分泌するＣ．グルタミカムの突然変異体が、リシンの大規模生産に最初に適用された(Kinoshita, et al., 1961)。菌株変異のみならず、発酵手順の最適化、ダウンストリーム工程を含む高効率発酵を確立するための新しい技術を見出す研究が続けられている。
【０００５】
従来では、紫外線又は化学的突然変異誘発源及び後の菌株選択を用いたランダムな突然変異生成の反復的アプローチによって、菌株を変異させた。この頃の成功の核心は、Ｓ−（２−アミノエチル）システインなどの毒性のリシン類似体を用いてフィードバック耐性菌株を選択することであった(Nakayama and Araki, 1973)。このような従来の菌株は、典型的に、リシン及びトレオニンによってフィードバック制御(feedback inhibition)から放出されたアスパルトキナーゼ遺伝子における点突然変異を共有した(Kalinowski, et al., 1991; Thierbach, et al., 1990)。このような従来の方法によって誘導された菌株を用いて、５０％までの転換率及び１００ｇ Ｌ-1のリシン・Ｃｌ力価などの驚くべき生産特性が達成された(Leuchtenberger, et al., 2005)。ところが、これは生産性を制限する、典型的に２〜３日かかる長い発酵時間と関連している。また、菌株発達の間に蓄積した非所望の突然変異による栄養要求性及び弱い耐ストレス性(Ohnishi, et al., 2002)は、従来の生産菌株の深刻な欠点をさらに示す。近年、組み換え型ＤＮＡ技術及び分子生物学が、代謝工学による菌株工学−合理的な最適化の新しい時代を開始した(Ikeda, et al., 2006)。これらの多くの研究は、リシン生合成経路の酵素を直接変異することによるリシン生合成フラックスの最適化に焦点を合わせている。アスパラギン酸キナーゼのフィードバック制御に対する放出は、今日、産業的生産菌株の最も重要な要素と見做される。経路調節に関連した変異以外に、生合成経路の速度を決定する酵素の細胞内活性が菌株変異のキーポイントである。細胞内の酵素活性を増加させる戦略は、さらに強いプロモーター(promoter)の使用による過発現、プロモーターシーケンス又は遺伝子の上流調節領域の突然変異化、又はコードする遺伝子の複製個数の増加を含む。これに関連して、プラスミド関連の発現は、より高い酵素活性及び優れたリシン収率の達成に適するが(Eggeling, et al., 1998)、産業的生産には殆ど適用できない。
【０００６】
生合成経路自体を除いた有益な標的の認知は、競争力のある生産菌株を生産するための補助因子の供給及び前駆体内のボトルネック現象を無くすために必要とされた。ところが、これはシステム水準の微生物に対する理解を要求するため一層困難である。この点に関連して、コリネバクテリウムグルタミカム(corynerbacterium glutamicum)のゲノムシーケンスの利用可能性が代謝工学の重要な段階となった(Haberhauer, et al., 2001; Kalinowski, et al., 2003; Ohnishi, et al., 2002; Pompejus, et al., 2002)。それはｉ）従来の方式で誘導された生産菌株と野生型(wild type)の比較シーケンス分析によるゲノム培養(Ohnishi, et al., 2002)、ii）関連した代謝経路(Kromer, et al., 2006; Wittmann and Becker, 2007)だけでなく、理論的生産容量を分析するための化学量論のモデリングアプローチを含むＣ．グルタミカムの代謝ネットワークのインシリコ（in silico)再構成(Kjeldsen and Nielsen, 2009)、及びiii）ゲノム内の特定のシーケンスモチーフを用いた転写調節ネットワークの発見(Kohl and Tauch, 2009)の基礎を提供した。ところが、前記モデルは、菌株変異を理解するシステムの主要特性としてインビボ(in vivo)代謝経路の活性、すなわちフラクソーム(fluxome)を予測するには適用できない。インビボ代謝フラックスを測定するための優れた発展によって言及されているように(Christensen and Nielsen, 2000; Christensen, et al., 2000; Frick and Wittmann, 2005; Van Dien, et al., 2006; Wittmann, 2007; Wittmann and Heinzle, 2002)、フラックス分析(flux analysis)は代謝工学の重要要素である(Stephanopoulos, 1999)。生物学的システムに対する理解を超えて、13Ｃ代謝のフラックス分析は、菌株特有化及びリシン生産の有益な標的の識別に有用であると明らかにされた(Kiefer, et al., 2004; Wittmann and Heinzle, 2002)。全体的水準の細胞生理学的洞察を得るために、活性遺伝子セット（転写体：transcriptome）(Hayashi, et al., 2005)及び活性タンパク質セット（プロテオーム：proteome）(Bendt, et al., 2003)の測定及び細胞内代謝産物レベルの数量化（メタボロム：metabolome）(Borner, et al., 2007)からの補完的な結果と共に、広範囲なデータセットが提供される。前記システム指向のアプローチ(systems-oriented approach)は代謝工学の立派なプラットフォームを示す(Lee, et al., 2005)。
【０００７】
主要リシン生産微生物であるコリネバクテリウムグルタミカムは、１９５０年代に日本の巨大なスクリーニングプログラムで発見された。菌株は、ランダム突然変異生成の反復工程及び改良された生産特性のスクリーニングプログラムを用いて、リシン生産に続いて最適化された。これは、効率的生産菌株を引き起こしたが、成長を損傷させ、弱い耐ストレス性又は増加した栄養要求性を引き起こす突然変異の副作用の蓄積をもたらした。したがって、現在取得された生産性は、Ｃ．グルタミカムに対して理論的に予測したことより一層低い。 分子生物学及びシステム指向性の代謝分析ツール及び細胞の制御状態分析ツールの発展は、菌株変異をより正確で標的化された最適化−システム代謝工学となるように移行する。これは増加した生産率、力価及び生産性を出す独占的かつ有益な変異セットを有する優れた高生産菌株を目的とする。
【０００８】
今まで微生物を用いてＬ−リシンの生産性を増加させるための様々な試みが行われてきた。たとえば、メチオニン又はリシンの生合成に関連した遺伝子発現を上方調節及び／又は下方調節してメチオニン又はリシンの生産を増加させる試みは、例えば国際公開第０２／１０２０９号、国際公開第２００６／００８０９７号及び国際公開第２００５／０５９０９３号に示されている。
【０００９】
Ｃ．グルタミカムで以前に発見された中央異化ネットワーク(central catabolic network)は、グリコリシス経路、ペントースリン酸経路（pentose phosphate pathway、ＰＰＰ）、トリカルボン酸(ＴＣＡ)経路(tricarboxylic acid cycle)及びグリオキシル酸シャント(glyoxylate shunt)を含む。
【００１０】
国際公開第０３／０４２３８９号は、Ｇ６ＰＤ遺伝子（ｚｗｆ）が導入された或いはＧ６ＰＤ遺伝子が変異された遺伝子変異微生物、及び前記微生物の関連化合物、例えばアミノ酸、特に好ましくはリシンの生産への使用に関するものである。
【００１１】
国際公開第０２２０５４２号は、特に所望のＬ−アミノ酸の形成を減少させる代謝経路が少なくとも部分的に除去された代謝経路が使用された、例えば強化「ｇａｐ２」遺伝子を用いた、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシンの発酵生産工程に関するものである。変異可能な追加の遺伝子の長いリストも開示している。
【００１２】
欧州特許第０４３５１２２号明細書は、組み換え型ＤＮＡを含有し、アミノ酸、特にＬ−リシンの取得に適したコリネバクテリウム又はブレビバクテリウム(Brevibacterium)属の微生物を開示している。ＤＮＡシーケンスは、特にＬ−リシン生産コリネバクテリウム又はブレビバクテリウム属菌株から、好ましくは減少したアスパラギン酸キナーゼのフィードバック阻害を有するコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の突然変異の生成により取得された突然変異体から誘導される。
【００１３】
欧州特許第１０６７１９３号明細書は、追加遺伝子ｄａｐＡ（dihydropicolinate synthase、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ｌｙｓＣ（アスパラギン酸キナーゼ）、ｌｙｓＥ（lysine exporter-carrier、リシンエクスポーターキャリア）及び／又はｄａｐＢ（dihydropicolinate reductase：ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ）の少なくとも一つが増幅された、好ましくは過発現された増幅ｐｙｃ（pyruvate carboxylase：ピルビン酸カルボキシラーゼ）遺伝子を有するＬ−リシン生産コリネ型バクテリウム（Ａ）を開示している。
【００１４】
欧州特許第０８５４１８９号明細書は、Ｌ−リシン及びＬ−トレオニンによるフィードバック阻害が実質的に感受性を減じたアスパラギン酸キナーゼを含み、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼをコードする強化ＤＮＡシーケンス、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼをコードする強化ＤＮＡシーケンス、ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする強化ＤＮＡシーケンス、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする強化ＤＮＡシーケンス、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする強化ＤＮＡシーケンスを含むコリネ型バクテリウムを開示している。
【００１５】
欧州特許第０８５７７８４号明細書は、Ｌ−リシンなどによるフィードバック阻害がなく、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含有し、コリネ型バクテリウムのＬ−リシン生産能力が改善されたＤＮＡに関するものである。
【００１６】
国際公開第２００７／０１７５２６号は、強化されたイソクエン酸リアーゼ及び／又はリンゴ酸シンターゼの発現を有する微生物を用いたリシン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、又はホモセリンなどのアスパラギン酸塩及び誘導されたアミノ酸の生産方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第０２／１０２０９号
【特許文献２】国際公開第２００６／００８０９７号
【特許文献３】国際公開第２００５／０５９０９３号
【特許文献４】国際公開第０３／０４２３８９号
【特許文献５】国際公開第０２２０５４２号
【特許文献６】欧州特許第０４３５１２２号明細書
【特許文献７】欧州特許第１０６７１９３号明細書
【特許文献８】欧州特許第０８５４１８９号明細書
【特許文献９】欧州特許第０８５７７８４号明細書
【特許文献１０】国際公開第２００７／０１７５２６号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Kohl and Tauch, 2009
【非特許文献２】Anastassiadis, 2007
【非特許文献３】Kinoshita, et al., 1961
【非特許文献４】Nakayama and Araki, 1973
【非特許文献５】Kalinowski, et al., 1991; Thierbach, et al., 1990
【非特許文献６】Leuchtenberger, et al., 2005
【非特許文献７】Ohnishi, et al., 2002
【非特許文献８】Ikeda, et al., 2006
【非特許文献９】Eggeling, et al., 1998
【非特許文献１０】Haberhauer, et al., 2001; Kalinowski, et al., 2003; Ohnishi, et al., 2002; Pompejus, et al., 2002
【非特許文献１１】Kromer, et al., 2006; Wittmann and Becker, 2007
【非特許文献１２】Kjeldsen and Nielsen, 2009
【非特許文献１３】Christensen and Nielsen, 2000; Christensen, et al., 2000; Frick and Wittmann, 2005; Van Dien, et al., 2006; Wittmann, 2007; Wittmann and Heinzle, 2002
【非特許文献１４】Stephanopoulos, 1999
【非特許文献１５】Kiefer, et al., 2004; Wittmann and Heinzle, 2002
【非特許文献１６】Hayashi, et al., 2005
【非特許文献１７】Bendt, et al., 2003
【非特許文献１８】Borner, et al., 2007
【非特許文献１９】Lee, et al., 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の主な目的は、合理的な菌株変異によるリシン生産の最適化にある。鋳型微生物としてコリネバクテリウムグルタミカムをシステム指向アプローチに利用した。原料費用が、産業的リシン生産費用の主費用であるから、菌株最適化はリシン収率、力価及び生産性の増加を目的とする。主な戦略は、Ｃ．グルタミカムの代謝及び調節状態を解除するシステム指向段階の最先端技術を目的とするもので、最適の生産成果のための遺伝子標的を探索するために、得られた知識を使用する。Ｃ．グルタミカムにおいて、リシン生合成は炭素前駆体及び還元力ＮＡＤＰＨの要求による中枢代謝(central metabolism)と密接な関連がある。このため、本研究は、菌株最適化の有望な標的として中枢代謝経路の反応を含む。戦略は、主にＮＡＤＰＨ代謝、ＴＣＡ回路、リシン生合成のみならず、オキサロ酢酸の供給のエンジニアリングに焦点を合わせた。先ず、向上したリシン生産のための幾つかのエンジニアリング戦略の価値をリシン生産菌株における目的解明によって調査した。（ｉ）細胞生理学に対する高い識見を得るために、（ii）産業的適用に対して適用された戦略の利得を測定するために、及び（iii）生産菌株の合理的なデザインの価値のある情報を提供するために、転写体、代謝体及びフロクソーム（fluxome）の段階のみならず、比較培養実験によって独創的な菌株を詳しく調査した。
【００２０】
また、本発明に係る生合成経路、特にＮＡＤＰＨ代謝の変異、ＴＣＡ回路、微生物へのオキサロ酢酸の供給の変異は、Ｌ−リシンの生産のために重要であるうえ、アスパラギン酸系の他のアミノ酸及びその前駆体の生産にも関連がある。したがって、メチオニン、トレオニン又はイソロイシンなどのアスパラギン酸誘導アミノ酸系の追加メンバーも本明細書に提供された情報を考慮して生産できる。
【００２１】
下記の発明に関する説明でさらに詳しく述べる前記及び他の目的は、本発明の独立項で説明されるように、本発明によって達成されるであろう。従属項は好適な実施態様に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、特に、アミノ酸誘導アスパラギン酸を高生産する微生物、好ましくは野生型のＣ．グルタミカムをベースとするリシン高生産微生物菌株、及びこれを用いた方法に関するものである。このような菌株は、本明細書に明示された有益な変異によって取得された。テーラーメイド型細胞工場(tailor-made cell factory)は、高い時空収率(space-time yield)、高い最終リシン力価、良い成長挙動及び高い炭素転換率を有し、好ましくは副産物の形成が減少する。このような生産特徴は、供給された基質の迅速かつ効率的な転換を確保し、これによりリシンの費用効率的な生産を確保する。
【００２３】
また、アスパラギン酸誘導アミノ酸、好ましくはＬ−リシンの生産は、遺伝子変異された微生物、好ましくはコリネバクテリウム、より好ましくはＣ．グルタミカムを用いて向上される。
【００２４】
アスパラギン酸誘導アミノ酸の好ましい生産方法、より好ましくはＬ−リシンの生産方法において、例えば、変異されたリシン生合成及び変異されたリシン前駆体の供給を有する微生物を使用した。好ましくは、前記微生物は組み換え型微生物である。特に好ましい実施態様において、前記微生物は変異されていることもある。たとえば、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及び酵素活性が増加していることもある。より好ましくは、変異されたグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）は、変異されたプロモーター、好ましくはｚｗｆ遺伝子の野生型プロモーターの異種への置換、すなわち非自然型プロモーター(non-natural promoter)、より好ましくはスーパーオキサイドディスムターゼ（ｓｏｄ）のプロモーターを含む。前記非自然型プロモーターは、同じ有機体から誘導できるが、他の遺伝子又は他の種からは誘導できない。さらに好ましくは、前記微生物はまたｚｗｆ遺伝子における点突然変異Ａ２４３Ｔを含む。追加の好適な実施態様において、前記微生物は、ｔｋｔオペロンの野生型プロモーターが異種プロモーターによって、好ましくはｓｏｄプロモーターによって置換され、それぞれグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及び酵素の活性増加を引き起こす、変異されたｔｋｔオペロンを含む。また、強いｓｏｄプロモーターを用いて、ｚｗｆ遺伝子はその中でもトランスケトラーゼ遺伝子（ｔｋｔ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌ）をコードする遺伝子、及びｚｗｆを含むｔｋｔオペロンの過発現によって過発現できる。
【００２５】
他の好適な実施態様において、前記微生物は、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ遺伝子及び酵素（ｆｂｐ）の増加した活性をさらに有する。前記目的は、前記変異だけでなく、強い異種プロモーター、例えばｓｏｄプロモーター又は、好ましくは元来のプロモーターを置換するｅｆｔｕプロモーターを含む微生物によって達成される。
【００２６】
また、前記微生物は、好ましくは元来のＡＴＧ開始コドンのＧＴＧ開始コドンへの置換による減衰したイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｉｃｄ）及びそれによる減少した酵素活性をさらに含むことが好ましい。
【００２７】
さらに好適な実施態様において、前記微生物は、増加したジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及び酵素活性をさらに有する。これは、たとえばジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）をコードする当該遺伝子の過発現によって達成できる。より好ましくは、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼは少なくとも一つのｄｄｈ遺伝子の追加コピーを含む微生物によって過発現される。
【００２８】
また、前記微生物が前記変異だけでなく、好ましくはアミノ酸交換Ｔ３１１Ｉによる増加した遺伝子及び酵素活性を有する変異アスパラギン酸キナーゼ（ｌｙｓＣ）を含むことが特に好ましい。
【００２９】
好適な実施態様は、上述した変異だけでなく、（ｉ）ジヒドロジピコリン酸リダクター
ゼ（ｄａｐＢ）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ｌｙｓＡ）の過発現、（ii）
アミノ酸交換Ｖ５９Ａを含む突然変異体の導入によるホモセリンデヒドロゲナーゼの変異、（iii）ピルビン酸カルボキシラーゼの過発現及び変異、並びに（iv）ＰＥＰカルボキシキナーゼの欠失のうち、少なくとも一つの変異を含む微生物に関するものである。
【００３０】
本発明に係る方法において好ましく使用される微生物は、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、好ましくはＣ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の誘導体、より好ましくは２０１０年５月１１日にドイツにおけるブダペスト条約（Budapest Treaty at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）)によって寄託された寄託番号ＤＳＭ２３５８６の微生物である。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、本発明の微生物はアスパラギン酸誘導アミノ酸、好ましくはＬ−リシンを生産する方法への使用に適する。本発明の他の好適な態様は下記の詳細な説明及び実施例から分かる。
【００３２】
生産方法に使用された細胞は、原核細胞、下等真核生物、孤立した植物細胞、酵母菌、孤立した昆虫細胞又は孤立した哺乳動物細胞、特に細胞培養システム内の細胞でありうる。本明細書において、用語「微生物」は前述した種類の細胞に使用される。本発明を行う上で好ましい種類の微生物は、コリネバクテリウム(Corynebacterium)であり、特に好ましくはＣ．グルタミカム(C. glutamicum)である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のシーケンスの部分的欠失による遺伝子欠失の例を示す挿入−構築用ＰＣＲ戦略。３つのＰＣＲ段階で部位特異性プライマー（例えば、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４と言われるもの）を用いて２つに分離されたＤＮＡ断片を融合した。
【図２】選択マーカーＫａｎR及びｓａｃＢ、大腸菌(E.coli)のためのＯＲＩ及び多重クローニングサイトを有する統合的形質転換ベクターｐＣｌｉｋ。
【図３】それぞれ３つの生物学的複製からのＣ．グルタミカムＢＳ１（閉鎖菱形）、Ｃ．グルタミカムＢＳ８７（閉鎖円）及びＣ．グルタミカムＢＳ２０５（開放円）の吸光度（ＯＤ660、Ｌｉｂｒａ Ｓ１１）と細胞乾量との相関関係。
【図４】単一炭素源としてグルコースを用いた標準最小培地におけるＣ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）の培養中の培養プロフィール（Ａ）、並びに培養及び生産特性（Ｂ）。バイオマス形成とグルコース消費との線形相関関係、並びにリシン形成とグルコース消費との線形相関関係はそれぞれ代謝定常状態を示す。
【図５】［１−13Ｃ］グルコースで成長したＣ．グルタミカムＢＳ１３の同位元素定常状態（Ａ）及び［Ｕ−13Ｃ］グルコースと自然的に標識されたグルコース（Ｂ）の同モル混合物で成長したＣ．グルタミカムＢＳ１３の同位元素定常状態の証明。アミノ酸のラベルパターンは培養中に異なる細胞乾量（ＣＤＭ）濃度で測定された。ここで、例示されるアミノ酸は代謝ネットワークの異なる部分に起因し、アラニン（閉鎖四角形）、フェニルアラニン（開放四角形）、バリン（閉鎖円）、グリシン（開放円）、グルタミン酸（閉鎖三角形）、トレオニン（開放三角形）及びセリン（閉鎖菱形）を含む。Ｍ０（ラベルされていない）、Ｍ１（単一ラベル）、Ｍ２（二重ラベル）は当該マスアイソトポマーの相対的比率を示す。
【図６】［Ｕ−13Ｃ］グルコースと自然的に標識されたグルコースの同モル混合物を用いたコリネバクテリウムグルタミカムのピルビン酸ノードにおけるフラックス媒介変数の数量化のための実験計画。多様なΦＰＥＰＣによるアスパラギン酸塩(aspartate)（ｍ／ｚ ４１８）のマスアイソトポマー分布(mass isotopomer distribution)の相対的変化、多様なζＰＥＰＣ／ＰＥＰＣＫによるバリン（ｍ／ｚ ２８８）のマスアイソトポマー分布の相対的変化、多様なζＰＣ／ＭａｌＥによるアラニン（ｍ／ｚ ２６０）のマスアイソトポマー分布の相対的変化。
【図７】Ｃ．グルタミカムＢＳ１の９９％［１−13Ｃ］グルコース及び５０％［Ｕ−13Ｃ］グルコース上の培養中の細胞タンパク質のアミノ酸及び分泌されたトレハロースの実験的に測定されたマスアイソトポマー分率(mass isotopomer fractions)と模擬のマスアイソトポマー分率との相関関係。前記データは実験したＧＣ−ＭＳデータ及び最適化されたフラックスセットに該当する数学モデルの解法によって予測された数値を含む。
【図８】グルコースで培養される間にリシン−生産Ｃ．グルタミカムＢＳ１のピルビン酸ノードにおける炭素フラックス分布。全てのフラックスは１００％に設定された比グルコース消費速度ｑＧｌｃ＝４．６ｍｍｏｌｇ-1ｈ-1のモルパーセントとして与えられる。誤差はＭｏｎｔｅ−Ｃａｒｌｏ分析で取得された異なるフラックスの該当９０％信頼区間を示す。
【図９】ヌクレオチド交換の候補としての第２組み換えイベントからの６つの突然変異体、及びＣ．グルタミカムＢＳ８７の粗細胞抽出物状態のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤ）、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）及びグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）の比活性。データは複合培地で培養された細胞の単一測定を示す。
【図１０】菌株Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、ＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）、ＢＳ５（Ｐsodｚｗｆ）及びＢＳ６（ＰsodｚｗｆA243T）におけるＧ６Ｐデヒドロゲナーゼのインビトロ比活性（Ａ）；抑制剤としてのＮＡＤＰＨの添加による野生型及びＡ２４３Ｔ変種のインビトロ比活性［％］（Ｂ）。データは炭素源としてグルコースを有する最小培地で培養された細胞からの３つの異なる細胞抽出物の測定値の平均値及び当該偏差を示す。
【図１１】［１−13Ｃ］グルコースで培養されたＣ．グルタミカムＢＳ１、Ｃ．グルタミカムＢＳ５、Ｃ．グルタミカムＢＳ６及びＣ．グルタミカムＢＳ７（上方から下方）の細胞内フラックス及び当該９０％信頼区間。データはグルコース吸収率に正常化された相対値（％）として与えられた（表１５）。参考菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ１の前記フラックスデータは文献(Becker, et al., 2005)から抜粋した。
【図１２】スーパーオキサイドディスムターゼ（ｓｏｄ）のプロモーターを介したｔｋｔオペロンの過発現によるグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ａ）、トランスアルドラーゼ（Ｂ）及びトランスケノラーゼ（Ｃ）の比活性。
【図１３】それぞれグルコース又はフルクトースで培養されたＣ．グルタミカムＷＴ、Ｃ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）及びＣ．グルタミカムＢＳ６（ＰsodｚｗｆA243T）の粗細胞抽出物におけるリンゴ酸酵素の比活性。三回測定されたとともに、当該偏差が与えられた。
【図１４】グルコースにおけるバッチ培養中のＣ．グルタミカムの異なるリシン生産菌株の生産特性。収率はそれぞれ全体培養時間のバイオマス又はリシン形成と基質消費との線形最適合の勾配として測定された。収率は３つの生物学的複製から測定された。
【図１５】ＰＰＰ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸酵素をＮＡＤＰＨ提供反応と見做し、バイオマス形成及びリシン分泌をＮＡＤＰＨ消費反応と見做したインビボフラックスから計算されたＣ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）のＮＡＤＰＨバランス。
【図１６】Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（三角形）、Ｃ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）（四角形）、及びＣ．グルタミカムＢＳ６（ＰsodｚｗｆA243T）（円形）におけるＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ比とリンゴ酸酵素比活性との相関関係。
【図１７】単一炭素源としてグルコースを用いて標準最小培地で培養されたＣ．グルタミカムＢＳ１（縞柄カラム）、及びＣ．グルタミカムＢＳ２２２（灰色カラム）の粗細胞抽出物における、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの比活性。
【図１８】多様な硫酸アンモニウム濃度におけるＣ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）の比成長率。
【図１９】最小培地で多様な硫酸アンモニウム濃度で培養されたＣ．タミクムＢＳ２２２のリシン収率。
【図２０】Ｃ．グルタミカムＢＳ１及びＣ．グルタミカムＢＳ２２２のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの硫酸アンモニウム濃度、それぞれ２ｇＬ-1及び１５ｇＬ-1での比活性。
【図２１】グルコースにおけるバッチ培養のリシン−生産Ｃ．グルタミカムＢＳ１の定量的生理学的特性（Ａ、Ｂ）、及びそのｐｙｋ欠失誘導体ＢＳ１３（Ｃ、Ｄ）の定量的生理学的特性。リシン及びジヒロドキシアセトン（ＤＨＡ）の成長、生産量とグルコース消費との線形相関関係は培養中の代謝定常状態を示す。
【図２２】グルコースにおける成長中のリシン−生産Ｃ．グルタミカムＢＳ１の中枢代謝におけるインビボ炭素フラックス分布（上）、及びそのピルビン酸キナーゼ欠乏誘導体Ｃ．グルタミカムＢＳ１３の中枢代謝におけるインビボ炭素フラックス分布（下）。全てのフラックスは１００％に設定された平均比グルコース消費速度のモルパーセントｑＧｌｃ＝４．６ｍｍｏｌｇ-1ｈ-1（ＢＳ１）及び４．５ｍｍｏｌｇ-1ｈ-1（ＢＳ１３）として与えられた。代謝可逆反応についてはフラックス可逆性が括弧内にさらに与えられ、正味フラックスの方向が矢印で表される。
【図２３】グルコースで培養されたリシン−生産Ｃ．グルタミカムＢＳ１のピルビン酸ノードにおける炭素正味フラックス(net flux)分配（Ａ）、及びそのピルビン酸キナーゼ欠乏誘導体Ｃ．グルタミカムＢＳ１３のピルビン酸ノードにおける炭素正味フラックス分配（Ｂ）。実際フラックス値は当該矢印の厚さで表される。
【図２４】Ｃ．グルタミカムＢＳ１のＮＡＤＰＨバランス（左）、及びそのピルビン酸キナーゼ欠乏誘導体Ｃ．グルタミカム（ＢＳ１３）のＮＡＤＰＨバランス（右）。
【図２５】親菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ８７、減少したＰＤＨ比活性を有する第２組み換えイベントの２つの突然変異体、及び菌株の構築に使用された形質転換ベクターのシーケンス配列からの開始コドン部位の抜粋。
【図２６】グルコース培養Ｃ．グルタミカムＢＳ８７におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼの比酵素活性（縞柄カラム）、及びそのａｃｅＥatt誘導体Ｃ．グルタミカムＢＳ２３８におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼの比酵素活性（白色カラム）。灰色カラムは一連の回分における永久成長の５０世代後の開始コドン突然変異体の比酵素活性を示す。値は３回測定されたとともに、当該偏差はエラーバーによって示される。
【図２７】３つの生物学的複製からの最小培地で測定されたＣ．グルタミカムＢＳ８７のリシン及びバイオマス収率（縞柄カラム）、及びＣ．グルタミカムＢＳ２３８のリシン及びバイオマス収率（灰色カラム）。当該偏差が与えられた。収率は生産物形成と基質消費との線形最適合の勾配として測定された。
【図２８】Ｃ．グルタミカムＢＳ８７のｉｃｄ遺伝子、ｉｃｄ遺伝子の開始コドン交換のための形質転換ベクター、及び第２組み換えイベントからの４つのクローンの開始コドン部位の配列。
【図２９】単一炭素源としてグルコースを用いて最小培地で培養したＣ．グルタミカムＢＳ８７の粗細胞抽出物における、イソクエン酸デヒドロゲナーゼの比活性（縞柄カラム）、及びＣ．グルタミカムＢＳ２０５（ｉｃｄatt）の粗細胞抽出物におけるイソクエン酸デヒドロゲナーゼの比活性（白色カラム）。灰色カラムは一連のバッチにおける５０世代の成長後の開始コドン突然変異体（ｉｃｄatt）のＩＣＤ比活性を示す。データは３つの類似の平均値及び当該偏差を示す。
【図３０】グルコースにおけるバッチ培養中のリシン−生産Ｃ．グルタミカムＢＳ８７の成長及び生産特性（Ａ、Ｂ）、及びＣ．グルタミカムＢＳ２０５（ｉｃｄatt）の成長及び生産特性（Ｃ、Ｄ）。バイオマスとグルコース消費との線形相関関係及びリシン生産とグルコース消費との線形相関関係はそれぞれ培養中の代謝定常状態を示す。与えられたデータは３つの生物学的複製からの値を示す。
【図３１】グルコース−培養Ｃ．グルタミカムＢＳ８７及びＣ．グルタミカムＢＳ２０５（ｉｃｄatt）のＴＣＡ回路a及びピルビン酸カルボキシラーゼbによるインビボフラックス。誤差はＭｏｎｔｅ−Ｃａｒｌｏ分析で取得された９０％信頼区間を示す。  aクエン酸シンターゼによる導入フラックスとして与えられる。  b同化作用のカルボキシル化によるランプ正味フラックス(lumped net flux)として与えられる。
【図３２】経路エンジニアリングによるテーラーメイド型リシン高生産菌株の構築及び設計。変異は菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ１（開放菱形）、Ｃ．グルタミカムＢＳ２２２（閉鎖菱形）、Ｃ．グルタミカムＢＳ８７（閉鎖四角形）、Ｃ．グルタミカム２０５（開放四角形）、Ｃ．グルタミカムＢＳ２４２（閉鎖円）及びＣ．グルタミカム２４４（開放円）を生産するように連続的に実現されたｌｙｓＣT311I（１）、２×ｄｄｈ（２）、Δｐｃｋ（３）、ＰsodｄａｐＢ（４）、２×ｌｙｓＡ（５）、ＰsodｌｙｓＣT311I（６）、ｈｏｍV59A（７）、ｐｙｃP458S（８）、ＰsodｐｙｃP458S（９）、ｉｃｄatt（１０）、Ｐeftuｆｂｐ（１１）及びＰsodｔｋｔ（１２）を含む。
【図３３】単一炭素源としてグルコースを用いて１５ｇＬ-1の硫酸アンモニウムの最小培地のシェークフラスコで実験された野生型ベースリシン生産源の系譜のリシン収率。データは３つの生物学的複製の平均値及び当該偏差を示す。図示された菌株はＣ．グルタミカムＷＴ（ＡＴＣＣ１３０３２）、Ｃ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）（１）、Ｃ．グルタミカムＢＳ２２２（ｄｄｈ）（２）、Ｃ．グルタミカムＢＳ８７（９）、Ｃ．グルタミカムＢＳ２０５（ｉｃｄatt）（１０）、Ｃ．グルタミカムＢＳ２４２（Ｐeftuｆｂｐ）（１１）及びＣ．グルタミカムＢＳ２４４（Ｐsodｔｋｔ）（１２）である。
【図３４】糖蜜ベース複合培地における流加(fed-batch)発酵中のリシン生産Ｃ．グルタミカムＢＳ２４４の培養プロフィール。糖類の濃度はそれぞれグルコース、フラクトース及びスクロースの集中濃度として与えられる。
【図３５】流加発酵中のＣ．グルタミカムＢＳ２４４の二相(two-phase)リシン生産特性。総リシン生産量は総糖消費についてグラフで示した。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
Ｃ．グルタミカムの酵素及び遺伝子
表１は、本発明に関連したＣ．グルタミカムの酵素及び遺伝子をＫＥＧＧデータベースによる当該ＥＣ番号及び体系的な遺伝子名と共に示す。
【００３５】
【表１】
2013533740.tif 000003
【００３６】
表１： ＫＥＧＧデータベースの酵素コード及び遺伝子命名法によるＣ．グルタミカムの酵素及び遺伝子の体系的特性
【００３７】
本明細書において、単数型の「ａ」及び「ａｎ」の使用は、特に言及がない限り、各複数型も含む。よって、用語「微生物(a microorganism)」は、同じ種類の微生物を１つ以上、すなわち２つ、３つ、４つ、５つなど含むことができる。
【００３８】
本明細書における数値及びパラメータの範囲と共に使われる「約」という表現は、当業者がある特徴の技術的効果を確保すると理解すべき正確度の区間を示す。前記表現は典型的に提示された数値から＋／−１０％、好ましくは＋／−５％の偏差を意味する。
【００３９】
本発明の目的において、用語「宿主細胞」は、例えばポリペプチド又は精製化学製品の生産のためのヌクレオチド配列の発現によく使われる分離細胞をいう。特に、「宿主細胞」は原核生物、下等真核生物、植物細胞、酵母菌、昆虫細胞又は哺乳動物細胞培養システムに関するものである。
【００４０】
用語「微生物」は、原核生物、下等真核生物、単離された植物細胞、酵母菌、単離された昆虫細胞又は単離された哺乳動物細胞、特に細胞培養システム内の細胞に関するものである。本発明を行う上で適した微生物は、Ｓ．ポンベ(S. pombe)又はＳ．セレビシエ(S. cerevisiae)及びピチア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母を含む。哺乳動物細胞培養システムは、例えばＮＩＨ Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＨｅＬａ細胞を含む群から選択できる。本明細書において、微生物は、好ましくは原核生物又は酵母菌である。本明細書における好ましい微生物は、下記の発明に対する詳細な説明で明示されるであろう。特に好ましい微生物は、Ｃ．グルタミカム及びその誘導体などのコリネバクテリウムである。
【００４１】
用語「自然型(native)」は、「野生型」及び「自然的に発生する」と同様の意味である。「野生型」の微生物は、特に言及がない限り、言及された微生物の通常の自然的に発生する態様である。一般に、野生型微生物は組み換え型微生物ではない。
【００４２】
「初期(initial)」は、「開始する(starting)」と同じ意味である。「初期の」ヌクレオチド配列又は酵素活性は、その変異、例えば突然変異又は抑制剤の添加による変異の開始点である。「初期の」シーケンス、酵素又は微生物は、その「最終の」又は「変異された」相手が持っている、特定の文脈に言及されている弁別的特徴が足りない。本明細書において、「初期」という表現は「自然」という表現を含み、好ましくは「自然」と同義語である。
【００４３】
野生型又は突然変異（組み換えではなく、突然変異体又は組み換え突然変異体）微生物は、組み換えではない方法（例えば、特定の酵素抑制剤の添加）又は組み換えの方法によってさらに変異され、少なくとも一つの物理的又は化学的特性において初期の微生物とは異なるようにすることができる。
【００４４】
本明細書において初期の、変異されていない微生物を「初期微生物」又は「初期（微生物）菌株」と示す。
【００４５】
与えられた活性レベルの初期菌株と比較して微生物の選択された遺伝子又は酵素の活性の変異（例えば、変異された細胞内の核酸又はタンパク質の量、又は生産された生産物の量、例えばＬ−リシンの量）は、標準の教科書に出てくる分子生物学の標準方法、又は実施例で特別に説明された方法を用いて、同様の条件下で２つの微生物の活性を比較して測定される。
【００４６】
典型的に、本発明に係る微生物は、遺伝的変異を伴わない初期微生物に遺伝的変異を導入することにより得られる。
【００４７】
微生物菌株の「誘導体」は、その親菌株から、たとえば典型的な突然変異生成及び選択、又は指定突然変異の生成によって誘導される菌株である。
【００４８】
本発明の目的において、「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」という用語は、ペプチドやタンパク質などのポリペプチドをコードする核酸分子に関するものである。前記核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその類似体で形成できる。ところが、ＤＮＡで形成された核酸分子が好ましい。
【００４９】
本明細書において、「組み換え型」は、「遺伝子変異によって生成された又は遺伝子変異の結果である」ことを意味する。よって、「組み換え型微生物」は少なくとも一つの「組み換え型核酸」又は「組み換え型タンパク質」を含む。組み換え型微生物は、好ましくは発現ベクター又はクローニングベクターを含むか、或いは複製された核酸シーケンスを宿主細胞の内生ゲノムに含むように遺伝子変異された。
【００５０】
「異種(heterologous)」は、有機体の起源を問わず、細胞又は有機体において遺伝子変異によって前記細胞又は有機体に導入された核酸又はポリペプチド／タンパク質である。よって、「相同(homologous)」という用語が、場合によっては遺伝子変異分野で使用されるが、微生物から分離されて同種の他の微生物に導入されたＤＮＡは後者に対して異種のＤＮＡであり、本発明の文脈においては遺伝子変異された微生物である。ところが、「異種」という用語は、好ましくは本発明において相同ではなく、核酸又はポリペプチド／タンパク質をいう。「異種タンパク質／核酸」は「組み換え型タンパク質／核酸」と同義語である。
【００５１】
用語「発現した」、「発現する」、「発現された」及び「発現」は、宿主生物における遺伝子産物（例えば：経路の遺伝子の生合成酵素）の発現を意味する。発現は、開始有機体として使用される微生物の遺伝子変異によって実現できる。幾つかの実施態様では、微生物が遺伝子変異され（例えば、遺伝子操作され）、変異されていない同様の微生物又は開始微生物によって生産された遺伝子産物に比べて増加したレベルの遺伝子産物を発現することができる。遺伝子変異は、特定の遺伝子発現に関連した調節シーケンス又は部位の変更又は変異（例えば、強いプロモーター、誘導性プロモーター又は多重プロモーターを添加すること、或いは発現が構成的発現となるように調節シーケンスを除去することにより）、特定の遺伝子の遺伝子座の変異、リボソーム結合部位又は転写ターミネーターなどの特定の遺伝子に隣接した核酸配列の変異、特定遺伝子のコピー数の増加、特定遺伝子の転写及び又は特定遺伝子産物の翻訳に関連したタンパク質（例えば、調節タンパク質、抑制因子、増進因子、転写活性剤など）の変異、又は技術分野のルーチンを用いた特定遺伝子発現の脱調節(deregulating)の他の全ての従来の方法（アンチセンス核酸分子を用いて、例えば、抑制因子タンパク質の発現を防ぐことを含むが、これに制限されない）を含むが、これに限定されない。
【００５２】
「保存アミノ酸置換(conservative amino acid exchange)」は、初期アミノ酸シーケンスにおける一つ以上のアミノ酸が、同様の化学的特性を有するアミノ酸で置換されること、例えば、バリンがアラニンで置換されることを意味する。初期のポリペプチドシーケンスと比較したとき、置換されたアミノ酸の比率は、好ましくは初期アミノ酸シーケンスの総アミノ酸の０〜３０％、より好ましくは０〜１５％、最も好ましくは０〜５％である。
【００５３】
保存アミノ酸置換は、好ましくは下記アミノ酸基のいずれか一つである：
−酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）；
−塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）；
−疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アラニン）；
−親水性アミノ酸（セリン、グリシン、アラニン、トレオニン）；
−脂肪族側鎖を有するアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）；
−脂肪族−水酸基側鎖を有するアミノ酸（セリン、トレオニン）；
−アミノ含有側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン、グルタミン）；
−芳香族側鎖を有するアミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；
−硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（システイン、メチオニン）。
【００５４】
特に好ましい保存アミノ酸置換は、次のとおりである：
天然残基                         置換残基
Ala                              Ser
Arg                              Lys
Asn                              Gln; His
Asp                              Glu
Cys                              Ser
Gln                              Asn
Glu                              Asp
Gly                              Pro
His                              Asn; Gln
Ile                              Leu; Val
Leu                              Ile; Val
Lys                              Arg; Gln; Glu
Met                              Leu; Ile
Phe                              Met; Leu; Tyr
Ser                              Thr
Thr                              Ser
Trp                              Tyr
Tyr                              Trp; Phe
Val                              Ile; Leu
【００５５】
用語「単離された(isolated)」は、「原有機体から分離又は精製された」ことを意味する。より詳しくは、多細胞有機体の分離された細胞は原有機体から分離又は精製されたものである。これは生化学的に精製され、組み換え技術によって生産された細胞を含む。
【００５６】
本明細書において、「アスパラギン酸由来アミノ酸」は、アミノ酸のリシン、メチオニン、イソロイシン及びトレオニンを指し、好ましくは、前記アミノ酸はＬ型アミノ酸である。
【００５７】
本明細書において、アミノ酸の「前駆体」又は「生化学的前駆体」は、本発明の微生物の前記アミノ酸の形成を引き起こす生化学経路のアミノ酸に先行する（「アップストリーム」）化合物、特に前記生化学経路の幾つかの段階の前に形成された化合物である。本明細書において、アミノ酸リシンの「前駆体」は、野生型有機体におけるアスパラギン酸(aspartate)のリシンへのインビボ生化学的転換中に形成される全ての中間体である。
【００５８】
「中間体(intermediate)」又は「中間産物(intermediate product)」は、必ずしも分析的かつ直接的に探知可能な必要はない濃度における化学的又は生化学的工程中に一時的又は連続的に形成された化合物として理解する。前記中間体は、二次の化学的又は生化学的反応によって、特に下記の詳細な説明に規定されるように後続の酵素転換によって前記生化学工程から除去できる。前記後続の酵素転換は、好ましくは本発明に係る微生物で発生する。この好適な態様に係る方法において、前記微生物は、内生の中間体の前記方法の最終生産物への後続的な転換における少なくとも一つの異種酵素触媒反応段階を含む。
【００５９】
「炭素収率(carbon yield)」は、（発酵に使用された炭素源、通常糖の）消費された炭素の量当たり（産物の）発見された炭素の量、すなわち炭素源に対する産物の炭素比率である。
【００６０】
本明細書において、「変異(modification)」又は「変異された(modified)」は、本発明の微生物のゲノムが突然変異、欠失、挿入、置換、同種組み換えによる核酸残基の添加、プロモーターシーケンスの置換、遺伝子の複製など（各手本の文献が後で言及される）の方法を用いて変異されたことを意味する。前記変異の結果として、本発明の微生物の核酸情報は、例えば野生型微生物又は追加の変異に使用される、既に変異された微生物のそれとは異なる。変異技術としては、従来の公知の技術、例えばＰＣＲに基づく方法、サザンブロット(southern blot)、ノーザンブロット(Northern blot)、ウェスタンブロット(Western blot)、制限酵素消化及び増幅された及び／又は消化された核酸断片の可視化、追加の変異に使用された初期の微生物と比較した酵素活性の測定などを用いて立証できる。
【００６１】
本明細書内において、変異の例として、「変異されたグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ」は、前記遺伝子(ｚｗｆ）又は前記遺伝子を含むオペロンをコードする核酸が変異されたもの、すなわち、前記核酸シーケンスが、前記酵素をコードする野生型、又は初期に発見された核酸シーケンスとは異なるものを意味する。また、前記変異の結果として、酵素活性は、一般に同様の条件下で比較したときに初期の酵素とは異なり、酵素のミリグラム当たりのユニット（比活性）として表現されるか、或いは酵素の分子当たり分当たり変異された基質の分子量として表現される。好ましくは、前記酵素をコードする核酸は、変異されて初期プロモーターがスーパーオキサイドディスムターゼ（ｓｏｄ）のプロモーターなどの強い異種プロモーターで置換される。代案的に、又は強いプロモーターの使用に加えて、前記酵素をコードする核酸シーケンスは突然変異されてもよい。好ましい変異は２４３位のアラニン残基（Ａ）がトレオニン残基（Ｔ）で置換されるアミノ酸シーケンスを引き起こす突然変異である。追加の好適な実施態様において、ｔｋｔオペロンのプロモーターは上述したｓｏｄプロモーターなどの異種プロモーターによって置換される。
【００６２】
本明細書において、「Ｇ６ＰＤＨ活性」は、ＩＣＤの酵素活性、特にＧ６ＰＤＨによって与えられた触媒効果を意味する。特に、イソクエン酸のα−ケトグルタル酸への転換が「Ｇ６ＰＤＨ活性」である。Ｇ６ＰＤＨ活性は、酵素のミリグラム当たりのユニット（比活性）、或いは酵素の分子量当たり分当たり変異された基質の分子量として表現できる。
【００６３】
本明細書において、変異された遺伝子又は酵素の活性が「改善された」、「増加した」、「減衰した(attenuated)」、「減少した」、「低下した」、「減った」又は「阻害された」などで表現されると、これは前記遺伝子が元来の変異されていない遺伝子と比較して高い或いは低い程度で（すなわち、単位時間当たり、すなわち１日当たり、時間当たり、分当たり等の高い又は低い量で）転写又は翻訳されることを意味する。よって、前記変異された遺伝子産物の酵素活性もそれぞれ高い又は低いのである。
【００６４】
本発明に係る微生物において変異できる遺伝子又は酵素の活性は、ｚｗｆ遺伝子及び前記コードされた酵素に対して上述したことと一般に類似の方法で測定できる。各活性の測定の特定方法は実施例で説明する。
【００６５】
本発明は、変異された微生物の生産、及びＬ−リシン生産における変異された微生物の使用に関するものである。以下、本発明の微生物の核酸の好ましい変異について詳細に説明する。
【００６６】
本発明の微生物菌株は、Ｃ．グルタミカム(C. glutamicum)の代謝の詳細な知識に基づいて生産されてきた。この点に関連して、13Ｃ代謝フラックス分析は、経路のインビボ活性についての重要な情報を提供し、（ｉ）ボトルネック現象、すなわちリシン生合成だけ
でなく、主要ＮＡＤＰＨソースとしてペントースリン酸経路におけるボトルネック現象を克服するための標的を予測し、（ii）直接リシン生合成と競争するＴＣＡ回路などの反応
を発見した。Ｃ．グルタミカムにおける測定可能なフックスの数を増やすために、存在するフラックス測定モデルを本発明で相当拡張した。これはグリコリシスのＣ3代謝産物とＴＣＡ回路のＣ4代謝産物とを連結する反応ネットワークに焦点を合わせた。モデリングにおいて、これはピルビン酸塩及びホスホエノールピルビン酸の代謝プールの分離、及びフラックス評価のための追加のマスアイソトポマーの部分の実現を含む。実験準備において、［１−13Ｃ］グルコース、及び自然的に標識されたグルコースと［Ｕ−13Ｃ］グルコースとの同モル混合物を用いたトレーサー実験の結合的アプローチを適用した。前記アプローチを用いて、補充カルボキシル化又は脱カルボキシル化に含まれた各反応は正確に解明できた。前記拡張モデルは、後続的にリシン生産Ｃ．グルタミカムにピルビン酸キナーゼ欠失の代謝結果を解明するために適用された。ピルビン酸キナーゼから補充カルボキシル化へのフラックス移動によってリシン生産量を増加させ、これによりリシン前駆体オキサロ酢酸の供給増加を引き起こすものと仮定された前記変異は、遺伝的障害に対するＣ．グルタミカムの高い柔軟性を示すリンゴ酸酵素及びＰＥＰカルボキシラーゼによって生産された代謝迂回路により、インビボ(in vivo)で補償された。
【００６７】
本発明に係る菌株最適化のための遺伝子変異は、例えば、遺伝子欠失、プロモーター交換又はコドン適応による過発現を含む多様な方法によるリシン関連重要経路の変異を含む。行われた変化の利点は、代謝体及びフラクソーム(fluxome)の分析だけでなく、培養実験、酵素検査によって立証できる。
【００６８】
開始コドンの置換において、レア(rare)開始コドンＧＴＧの使用が、 頻出するＡＴＧ開始コドンの制御下の遺伝子発現と比較したとき、細胞で常に低くなった比酵素活性を引き起こすということが観察された。したがって、前記方法は比酵素活性の変異に適用でき、今日の遺伝子変異に適用される実験ツールを補完する。代案的に、前記レア開始コドンＴＴＧは、より頻出する開始コドンを置換するために使用できる。
【００６９】
本発明の一の実施態様において、前駆体供給の改善は、リシン前駆体オキサロ酢酸を供給する主要酵素であるピルビン酸カルボキシラーゼと直接競争するピルビン酸デヒドロゲナゼ（ＰＤＨ）の脱調節によって達成された。野生型に基づくリシン生産源Ｃ．グルタミカムＢＳ８７におけるＰＤＨの減衰はＡＴＧ開始コドンのＧＴＧ開始コドンへの置換によって達成された。これはＰＤＨの比活性を６０％減少させ、リシン収率を１７％増加させた。代謝フラックスの測定は、前記改善がピルビン酸デヒドロゲナーゼからピルビン酸カルボキシラーゼへの効果的なフラックス転換によって、さらに効果的なオキサロ酢酸の供給を引き起こしたためであることを示した。
【００７０】
ＴＣＡ回路の変異は、Ｃ．グルタミカムにおける前駆体の供給を改善する効果的な代案であることが明らかになった。イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤ）をコードするｉｃｄ遺伝子における開始コドンの置換（ＡＴＧ→ＧＴＧ）が、ＩＣＤ比活性の７０％減少によりリシン生産量を４０％以上増加させた。本発明において、Ｃ．グルタミカムは補充カルボキシル化へのフラックス経路変更によって、前記意図的に誘導されたボトルネック現象に対応した。
【００７１】
ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするｄｄｈ遺伝子の過発現によるリシン生合成経路の直接的な変異は、実現された変異の利点が適切な培養条件によって一層さらに増進できることを確実に示した。この場合、前記増進は約２ｇＬ-1〜１０ｇＬ-1の硫酸アンモニウムの培養培地のアンモニウム濃度が、それぞれリシン収率を約１０％〜５０％増進させるときに特に確然である。したがって、本発明の好適な実施態様において、培養条件はこのように選択される。すなわち、培養培地のアンモニウム濃度は、好ましくは約１０〜１００ｇＬ-1、より好ましくは約２０〜１００ｇＬ-1、３０〜１００ｇＬ-1、４０〜１００ｇＬ-1、５０〜１００ｇＬ-1、３０〜９０ｇＬ-1、３０〜８０ｇＬ-1、３０〜７０ｇＬ-1、３０〜６０ｇＬ-1、３０〜５０ｇＬ-1、よりさらに好ましくは４０〜９０ｇＬ-1、４０〜８０ｇＬ-1、４０〜７０ｇＬ-1、４０〜６０ｇＬ-1、又は４０〜５０ｇＬ-1などで選択される。
【００７２】
リシン生合成経路自体の代謝工学及び中心前駆体オキサロ酢酸の供給に対する成功的な研究は、リシン生合成に補助因子として多量要求されるＮＡＤＨＰＨの細胞内供給の標的化された最適化によって補完された。
【００７３】
Ｃ．グルタミカムにおけるリシン生産を裏付けるための増加したＮＡＤＰＨ供給は、ｚｗｆ遺伝子によってコードされる速度調節酵素であるグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）の過発現を用いたＰＰＰを介してのフラックス増加によって達成できる。また、前記酵素は中間代謝に起因する代謝産物によって陰性的調節に対して感度性を減らしたアミノ酸交換Ａ２４３Ｔの実現によって改善できる。代案的に、本発明の好ましい方法において、トランスケトラーゼ−オペロン（ｔｋｔ）が、例えばｚｗｆ遺伝子の発現を増加させるために過発現できる。
【００７４】
それ以上フィードバック阻害されていない、変異及び改善されたアスパラギン酸キナーゼを有するＣ．グルタミカムｌｙｓＣＴ３１１Ｉのバックグラウンドにおいて、前記変異はＰＰＰフラックスを１５％増加させた。これはリシン生産量を４０％まで増加させた。
【００７５】
トランスケトラーゼオペロン内のグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）をコードするｚｗｆ遺伝子の遺伝的位置付けは、トランスアルドラーゼ及びトランスケトラーゼと結合してＧ６ＰＤＨの過発現を代案的に可能として、ＰＰＰの酸化力がない部分を形成する。発現制御のためのｓｏｄプロモーターの使用はＧ６ＰＤＨ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの活性増加を引き起こした。これにより、ＰＰＰ内の今後発生可能なボトルネック現象を除去した。
【００７６】
ＰＰＰ酵素の直接変異だけでなく、ＮＡＤＰＨ供給は、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ（ｆｂｐ）の過発現によってさらに増加した。Ｇ６ＰＤＨの過発現及び変異体と結合して、前記変化はグルコース上のリシン収率を７０％増加させた。他の産業的に関連がある糖、フルクトース及びスクロースにおいても大きい改善をもたらした。好ましくは、１種以上の前記関連糖に増加したＮＡＤＰＨ供給を有する菌株は変異されたｌｙｓＣ遺伝子、例えばｌｙｓＣT311Iを有する。
【００７７】
本発明に係るＰＰＰ変異の更なる利点は、細胞内Ｇ６Ｐのレベルが減少した結果として副産物トレハロースの形成が減少したことである。詳細な代謝の調査はＮＡＤＰＨ代謝への新たな知見をさらに提供することができた。今まで、主にＰＰＰ及びＩＣＤはリシン生産Ｃ．グルタミカムにおいてＮＡＤＰＨソースとして見做された。野生型と比較したとき、Ｃ．グルタミカムのリシン生産菌株はＮＡＤＰＨ依存リンゴ酸酵素（ＭａｌＥ）の増加した比活性を示した。親Ｃ．グルタミカムｌｙｓＣT311Iのバックグラウンドにおける、コードするリンゴ酸酵素遺伝子の欠失は、ＮＡＤＰＨ要求産物バイオマス及びリシンの形成を減少させた。減少した全体ＮＡＤＰＨ消費量は、リンゴ酸酵素を介しての１５％のインビボフラックスと完璧に一致し、13Ｃフラックス分析によって測定された。これは、Ｃ．グルタミカムが、変化した生理的要求に合わせるようにＮＡＤＰＨ限定条件下でのリンゴ酸酵素を活性化させるということを示唆する。
【００７８】
Ｃ．グルタミカムの代謝に対する膨大な知識、及び本発明の異なる主要標的に基づいて、優れたリシン生産源が本発明の好適な実施態様で創作された。前記目的のために、有益な変異のセットが、非生産野生型Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムに統合された。
【００７９】
創作された菌株系譜の生産性の比較は、本発明に係る只５つの変異の部分集合がアスパラギン酸誘導アミノ酸、特にリシンの生産を増加させる上で特に好ましいことを示した。前記変異はフィードバック阻害からのアスパラギン酸キナーゼ（ｌｙｓＣ）の脱調節、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの過発現、ｉｃｄの減衰、及びフルクトース１，６−ビスホスファターゼ及びトランスケトラーゼオペロンの過発現によるＮＡＤＰＨ代謝の変異を含む。合理的に設計された菌株は、顕著な生産特性、例えば３０時間内に達成された最終リシンＨＣｌ力価１２０ｇＬ-1及び５５％までの転換率などを示した。前記生産性と共に、本発明内で創作されたリシン高生産源は、われわれが知る限り、最も良い野性型ベースの生産菌株である。達成された最終リシン力価及び炭素転換率は、４０年以上最適化された、産業的に適用された生産菌株によって達成された最高限界にある。空間−時間収率において、野生型ベースの生産源は早い成長、及びそれによる発酵時間の減少により従来の菌株より一層優れる。前記生産特性のため、前記菌株は産業的生産に非常に適する。
【００８０】
特に好ましい菌株は１２個の遺伝子変異を含む。これによって、リシン生合成（アスパラギン酸キナーゼのフィードバック脱調節及び過発現、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ及びジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの過発現）及び前駆体の供給（ピルビン酸カルボキシラーゼの過発現及び突然変異化、ＰＥＰカルボキシキナーゼの欠失及びホモセリンデヒドロゲナーゼの突然変異化）の変異は、前駆体の供給（イソクエン酸デヒドロゲナーゼの減衰）及びＮＡＤＰＨ代謝（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ及びトランスケトラーゼオペロンの過発現）の追加的主要標的によって補完された。
【００８１】
本発明の好適な態様において、生産方法は発酵方法である。ところが、植物及び非ヒト動物のインビボ生産を含む化学的化合物の他の生命工学的生産方法も考慮された。
【００８２】
本発明に係る発酵生産方法は、上述した変異を含む少なくとも一つ−好ましくは組み換え型の微生物の培養を含むことができる。
【００８３】
本発明の他の好適な態様において、生産方法に使用された微生物は、組み換え型微生物である。植物及び非ヒト動物のインビボ生産を含む化学的化合物の他の生物工学的生産方法が考慮される限りは、微生物の選択は、好ましくは組み換え型微生物である。
【００８４】
本発明の好適な実施態様において、使用された微生物におけるグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）の活性が変異された。すなわち、遺伝子が過発現された。本明細書において、「過発現」又は「増加した活性」は、同種で同一の遺伝的バックグラウンドを有する、変異されていない微生物の初期活性が低いこと、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％低い或いはそれより一層さらに低いことを意味する。逆に、変異された微生物における遺伝子又は酵素の活性は、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれよりさらに増加した。グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼの活性において考慮されたことと同様の事項は、本明細書の過発現できる追加の遺伝子又は酵素、すなわちジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌ）、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ（ｆｂｐ）、アスパラギン酸キナーゼ（ｌｙｓＣ）、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ（ｄａｐＢ）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ｌｙｓＡ）、又はピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）にも適用される。
【００８５】
前記遺伝子又は酵素の活性をできる限り多く増加させることが、必ずしも好ましいのではない。ある場合は、上述したレベルの不完全な減少だけでなく、例えば２５％、４０％、５０％などの中間レベルも十分かつ好ましい。
【００８６】
また、減少した酵素活性を有する本発明に係る微生物、例えば同種で同一の遺伝子的バックグラウンドを持っている初期微生物と比較したとき、初期のＩＣＤ活性を部分的かつ完全に失った本発明に係る微生物が好ましい。ＩＣＤの初期活性の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも４％、少なくとも６％、少なくとも８％、少なくとも１０％を失ったものが好ましく、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は全てを失ったものは、より好ましい。活性の減少の程度は、同様の条件下の初期微生物における内生のＩＣＤ活性の活性レベルと比較して測定される。
【００８７】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼの減少した活性と同様に、本明細書においてさらに低いレベルで発現された他の遺伝子又は酵素は、例えばホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）であり、本発明の最も好適な実施態様ではなくとも、選択的に、ピルビン酸デヒドロゲナーゼも変異できる。前記遺伝子又は酵素の活性をできる限り多く減少させることが常に好ましいのではない。ある場合は、上述したようにレベルの不完全な減少だけでなく、２５％、４０％、５０％などの中間レベルの減少も十分かつ好ましい。
【００８８】
特定酵素活性の完全又はほぼ完全な（すなわち、９０％以上）損失が微生物の特徴となる実施態様において、前記微生物の培養培地、特に本発明に係る方法で使用された培地は、酵素活性の抑制によって前記微生物において欠乏した１種以上の必須化合物によって補充できる。例えば、ＩＣＤの活性が抑制されたとき、容易にアプローチ可能で安価な化合物であるグルタミン酸(glutamate)が培地に補充できる。
【００８９】
本明細書で使用された、減少した活性を有する酵素の追加の例は、ｈｏｍ遺伝子である。前記遺伝子の変異は下記にさらに詳しく説明する。例えば、Ｖ５９Ａの突然変異は、活性を減少させるとともに、トレオニン合成へのフローを減少させる。
【００９０】
本発明に必要な酵素活性の増加又は減少は、それぞれ本発明に係る方法で使用された微生物の内生の特性、例えば自発的突然変異による特性であり、或いは部分的に若しくは完全に酵素活性を、特にインビボ酵素活性を増進、抑圧又は抑制する従来の方法による特性である。酵素活性の増加又は減少は、それぞれ酵素合成及び酵素反応の全ての段階において、遺伝的、転写、翻訳又は反応レベルで発生しうる。
【００９１】
酵素活性の増加又は減少は、それぞれ好ましくは遺伝子変異の結果である。宿主細胞内の１種以上の内生遺伝子発現の量を増加又は減少させ、これにより標的遺伝子がそれぞれ増進又は抑制された宿主細胞の酵素の量及び／又は活性を減少させるために、従来の公知の全方法が適用できる。
【００９２】
大腸菌(E. coli)又はＣ．グルタミカム(C. glutamicum)などの微生物又はＰ．パストリス(P. pastoris)及びＡ．ニガー(A. niger)などの他の宿主細胞内の遺伝子発現を脱調節するために、遺伝子ノックアウト(gene-knockout)アプローチ、アンチセンス技術、ＲＮＡｉ技術などの多数の技術が使用可能である。各遺伝子の初期コピーを欠失させるか及び／又はこれを減少した活性、特に減少した比活性を有する突然変異体バージョンで置換し、或いは弱いプロモーターから発現させることができる。又は、遺伝子の開始コドン及び遺伝子のプロモーターを置換し、ランダム又は標的突然変異の生成による突然変異を導入し、遺伝子を妨害又はノックアウトすることができる。また、ｍＲＮＡに不安定要素を導入し、或いはＲＮＡのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の悪化を引き起こす遺伝子変異を導入することもできる。最後に、反応混合物に特定のＩＣＤ抑制遺伝子を添加することができる。
【００９３】
大腸菌(E. coli)又はＣ．グルタミカム(C. glutamicum)などの微生物内の遺伝子発現、又はＰ．パストリス(P. pastoris)及びＡ．ニガー(A. niger)などの他の宿主細胞内の遺伝子発現を上方調節（すなわち、過発現）又は強化するための多数の技術が存在するが、例えば、より強いプロモーターを使用し或いは遺伝子増幅などの技術を使用することができる。
【００９４】
一つの好適な態様において、「発現の減少」は、ポリペプチドをコードする内生のヌクレオチドシーケンスを、実質的に同じアミノ酸シーケンス及び／又は機能のポリペプチドをコードする変異ヌクレオチドシーケンスで置換すると、コードされたポリペプチドの減少した量が、変異された細胞内に発現される状況を意味する。
【００９５】
さらに好適な態様において、「発現の減少」は、遺伝子発現を干渉するためにアンチセンス技術又はＲＮＡ干渉（該当するならば、例えば真核細胞培養で）による発現の脱調節を意味する。前記技術はｍＲＮＡレベル及び／又は翻訳効率に影響を及ぼしうる。
【００９６】
さらに好適な態様において、「発現の減少」は、「弱い」遺伝子、すなわち酵素活性が初期活性より低い蛋白質をコードする遺伝子の導入に結合した遺伝子の欠失又は破壊、又は細胞内の酵素活性を減少させる結果を生む、弱く発現された部位における遺伝子の統合による遺伝子の欠失又は破壊を意味する。これは、あまり遺伝子の転写が良くない染色体位置における遺伝子を統合することにより、或いはより低い比活性を有する又はより非効率的に転写された、より非効率的に翻訳される又はあまり細胞で安定的ではない突然変異体又は異種遺伝子を導入することにより行われ得る。前記突然変異遺伝子の導入は複製プラスミドを用いて或いはゲノムへの統合によって行われ得る。
【００９７】
さらに好適な態様において、「発現の減少」は、染色体的にコードされた遺伝子からの転写を低めることにより、好ましくは初期プロモーターの突然変異化又は初期プロモーターの弱化したバージョンとの置換或いはより弱い異種プロモーターとの置換によってｍＲＮＡレベルを低めることにより、活性が減少するという意味である。
【００９８】
さらに好適な態様において、「発現の減少」は、減少した酵素活性がリボソームの翻訳開始部位への減少した結合を引き起こし、これによりｍＲＮＡの減少した翻訳を引き起こすＲＢＳ突然変異の結果であることを意味する。突然変異は単純なヌクレオチド変化であってもよく、及び／又は開始コドンと関連してＲＢＳの間隔に影響を及ぼしてもよい。前記突然変異を達成するために、突然変異された１セットのＲＢＳを含有する突然変異体ライブラリーが生成できる。例えば、より低い酵素活性を選択することにより、適宜のＲＢＳが選択できる。そして、初期ＲＢＳは前記選択されたＲＢＳで置換できる。
【００９９】
さらに好適な態様において、「発現の減少」は、ｍＲＮＡの安定性を低めることにより、例えば二次構造を変えてｍＲＮＡのレベルを低めることにより達成される。
【０１００】
さらに好適な態様において、「発現の減少」は、調節因子、例えば転写調節因子によって達成される。
【０１０１】
ヌクレオチドシーケンスによってコードされる遺伝子又は酵素の量を減少させるために、コリネバクテリウム及び特に好ましくはＣ．グルタミカムで発現される変異ヌクレオチドシーケンスの場合、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも４％、少なくとも６％、少なくとも８％、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％又は少なくとも９５％の変異されていないヌクレオチドシーケンスのコドンが、最も好ましくは全ての変異されていないヌクレオチドシーケンスのコドンが、変異ヌクレオチドシーケンスで各アミノ酸により少ない頻繁で使用されるコドンによって置換できる。さらに好適な実施態様において、上述した数の置換されるべきコドンは頻出、非常に頻出、及び極めて頻出或いは最も頻出するコドンをいう。他の特に好適な実施態様において、前記数のコドンは最も少ない頻度で使用されるコドンによって置換される。前述したいずれの場合にも、参考コドンの使用頻度はコリネバクテリウムのコドンの使用頻度、好ましくはＣ．グルタミカム及び好ましくはコリネバクテリウムの豊富なタンパク質のコドン使用頻度、そして好ましくはＣ．グルタミカムのコドン使用頻度に基づく。詳細な説明はＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６１１５１に開示されている。
【０１０２】
上述したように、本発明は、リシン生産方法だけでなく、微生物及びリシン生産における微生物の使用に関するものである。本発明において、用語「微生物」はＬ−リシン生産のためのヌクレオチドシーケンスの発現によく使用される非ヒト有機体、特に上述した微生物、藻類(algae)及び蘇類(mosses)を含む植物、酵母及び非ヒト動物をいう。Ｌ−リシンの生産に特に適した微生物以外の有機体は、植物及び植物の部分でありうる。前記植物は単子葉植物又は双子葉植物の作物植物、食用植物又は飼料植物などの単子葉植物綱又は双子葉植物綱でありうる。単子葉植物の作物植物は、その中でもカラスムギ属（オートムギ）、小麦（ウィート）、ライムギ(secale)、オオムギ(hordeum)、稲属（oryza：米）、キビ、チカラシバ、エノコログザ、モロコシ（キビ）、ゼア(zea：トウモロコシ）などに属する植物である。
【０１０３】
双子葉植物の作物植物の例は、綿花、豆類(pulse)などの豆科(leguminoses)、及び特にムラサキウマゴヤシ(alfalfa)、大豆、菜種、トマト、サトウダイコン、ジャガイモ、木だけでなく観賞植物を含む。他の作物植物は、ジャボク、ジギタリスなどの薬用植物だけでなく、果物（特に、リンゴ、ナシ、チェリー、ブドウ、柑橘類、パイナップル及びバナナ）、油やし、茶の木、カカオ及びコーヒーの木、タバコ、サイザル麻を含むことができる。特に好ましくは小麦、オオムギ、ライムギ、オートムギ、米、トウモロコシ及びキビ、サトウダイコン、菜種、大豆、トマト、ジャガイモ及びタバコなどの穀物である。他の作物植物は米国特許ＵＳ６，１３７，０３０から参考することができる。
【０１０４】
当業者は、微生物、植物及び植物細胞、動物及び動物細胞などの異なる有機体及び細胞が本明細書で使用された細胞の遺伝子及びタンパク質の数及び種類において互いに異なることをよく知っている。同じ有機体内においても、異なる菌株はタンパク質のレベルにおけるやや異質的な発現プロフィールを示すことがある。
【０１０５】
微生物とは異なる有機体が、本発明の遂行の際に使用された場合、非発酵生産方法が適用できる。
【０１０６】
本発明において、上記の定義された全ての微生物が使用できる。好ましくは、前記微生物は原核生物である。本発明を行う上で特に好ましい微生物は、コリネバクテリウム及びブレビバクテリウム属、好ましくは特にコリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に焦点を合わせたコリネバクテリウム、特にエシェリキアコリ(Escherichia coli)に焦点を合わせたエシェリキア属、バシラス属、特にバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)、ストレプトミセス(Streptomyces)属及びアスパルギルス(Aspergillus)属から選ばれる。
【０１０７】
本発明の好適な実施態様は、コリネバクテリウム属のバクテリアなどのコリネ型バクテリアから選ばれる微生物の使用に関するものである。特に好ましい種は、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium acetoglutamicumｍ、Corynebacterium acetoacidophilum、Corynebacterium callunae、Corynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium thermoaminogenes、Corynebacterium melassecola及びCorynebacterium effiziensである。本発明の他の好適な実施態様は、ブレビバクテリウム、及び特にBrevibacterium flavum、Brevibacterium lactofermentum及びBrevibacterium divarecatum種の使用に関するものである。
【０１０８】
本発明の好適な実施態様において、微生物は、Corynebacterium glutamicum ＡＴＣＣ１３０３２、C. acetoglutamicum ＡＴＣＣ１５８０６、C. acetoacidophilum ＡＴＣＣ１３８７０、Corynebacterium thermoaminogenes ＦＥＲＭＢＰ−１５３９、Corynebacterium melassecola ＡＴＣＣ１７９６５、Corynebacterium effiziens ＤＳＭ４４５４７、Corynebacterium effiziens ＤＳＭ４４５４９、Brevibacterium flavum ＡＴＣＣ１４０６７、Brevibacterium lactoformentum ＡＴＣＣ１３８６９、Brevibacterium divarecatum ＡＴＣＣ１４０２０、 Corynebacterium glutamicum ＫＦＣＣ１００６５及び Corynebacterium glutamicum ＡＴＣＣ２１６０８だけでなく、それから誘導された菌株、例えば従来の突然変異生成及び選択又は指定突然変異によって誘導された菌株よりなる群から選択できる。
【０１０９】
Ｃ．グルタミカム(C. glutamicum)の他の好適な菌株は、ＡＴＣＣ１３０５８、ＡＴＣＣ１３０５９、ＡＴＣＣ１３０６０、ＡＴＣＣ２１４９２、ＡＴＣＣ２１５１３、ＡＴＣＣ２１５２６、ＡＴＣＣ２１５４３、ＡＴＣＣ１３２８７、ＡＴＣＣ２１８５１、ＡＴＣＣ２１２５３、ＡＴＣＣ２１５１４、ＡＴＣＣ２１５１６、ＡＴＣＣ２１２９９、ＡＴＣＣ２１３００、ＡＴＣＣ３９６８４、ＡＴＣＣ２１４８８、ＡＴＣＣ２１６４９、ＡＴＣＣ２１６５０、ＡＴＣＣ１９２２３、ＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ２１１５７、ＡＴＣＣ２１１５８、ＡＴＣＣ２１１５９、ＡＴＣＣ２１３５５、ＡＴＣＣ３１８０８、ＡＴＣＣ２１６７４、ＡＴＣＣ２１５６２、ＡＴＣＣ２１５６３、ＡＴＣＣ２１５６４、ＡＴＣＣ２１５６５、ＡＴＣＣ２１５６６、ＡＴＣＣ２１５６７、ＡＴＣＣ２１５６８、ＡＴＣＣ２１５６９、ＡＴＣＣ２１５７０、ＡＴＣＣ２１５７１、ＡＴＣＣ２１５７２、ＡＴＣＣ２１５７３、ＡＴＣＣ２１５７９、ＡＴＣＣ１９０４９、ＡＴＣＣ１９０５０、ＡＴＣＣ１９０５１、ＡＴＣＣ１９０５２、ＡＴＣＣ１９０５３、ＡＴＣＣ１９０５４、ＡＴＣＣ１９０５５、ＡＴＣＣ１９０５６、ＡＴＣＣ１９０５７、ＡＴＣｃ１９０５８、ＡＴＣＣ１９０５９、ＡＴＣＣ１９０６０、ＡＴＣＣ１９１８５、ＡＴＣＣ１３２８６、ＡＴＣＣ２１５１５、ＡＴＣＣ２１５２７、ＡＴＣＣ２１５４４、ＡＴＣＣ２１４９２、ＮＲＲＬ Ｂ８１８３、ＮＲＲＬ Ｗ８１８２、Ｂ１２ＮＲＲＬＢ１２４１６、ＮＲＲＬＢ１２４１７、ＮＲＲＬＢ１２４１８、及びＮＲＲＬＢ１１４７６よりなる群から選択できる。
【０１１０】
略語ＫＦＣＣは韓国種菌協会(Korean Federation of Culture Collection)を示し、ＡＴＣＣは米国菌株保存機関(American-Type Strain Culture Collection)を示し、略語ＤＳＭはドイツ微生物菌株保管機関(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)を示す。略語ＮＲＲＬは米国イリノイ州のピオリアのＡＲＳ菌株保存北部地域実験研究所(ARS cultures collection Northern Regional Research Laboratory)を示す。
【０１１１】
このような菌株は、例えばコリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ１３０３２、及び特にその誘導体である。好ましくは、リシンを生産すると知られている菌株ＡＴＣＣ１３２８６、ＡＴＣＣ１３２８７、ＡＴＣＣ２１０８６、ＡＴＣＣ２１１２７、ＡＴＣＣ２１１２８、ＡＴＣＣ２１１２９、ＡＴＣＣ２１２５３、ＡＴＣＣ２１２９９、ＡＴＣＣ２１３００、ＡＴＣＣ２１４７４、ＡＴＣＣ２１４７５、ＡＴＣＣ２１４８８、ＡＴＣＣ２１４９２、ＡＴＣＣ２１５１３、ＡＴＣＣ２１５１４、ＡＴＣＣ２１５１５、ＡＴＣＣ２１５１６、ＡＴＣＣ２１５１７、ＡＴＣＣ２１５１８、ＡＴＣＣ２１５２８、ＡＴＣＣ２１５４３、ＡＴＣＣ２１５４４、ＡＴＣＣ２１６４９、ＡＴＣＣ２１６５０、ＡＴＣＣ２１７９２、ＡＴＣＣ２１７９３、ＡＴＣＣ２１７９８、ＡＴＣＣ２１７９９、ＡＴＣＣ２１８００、ＡＴＣＣ２１８０１、ＡＴＣＣ７００２３９、ＡＴＣＣ２１５２９、ＡＴＣＣ２１５２７、ＡＴＣＣ３１２６９及びＡＴＣＣ２１５２６も使用できる。特に好ましくは、既にＬ−リシンを生産することが可能なコリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)菌株である。よって、フィードバック耐性アスパルトキナーゼを有するコリネバクテリウムグルタミカムから誘導された菌株、及びその変異体が特に好ましい。前記選好は、フィードバック耐性アスパルトキナーゼを有するコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から変異された菌株を含み、特に菌株ＡＴＣＣ１３０３２ｌｙｓＣfbr及びＡＴＣＣ１３２８６に関するものである。
【０１１２】
本明細書において、フィードバック耐性アスパルトキナーゼを有するＣ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ｌｙｓＣfbr、ＡＴＣＣ１３０３２又はＡＴＣＣ１３２８６及びその変異体が特に好ましい微生物である。また、ＡＴＣＣ１３０３２ｌｙｓＣfbr又はＡＴＣＣ１３２８６が好ましい。
【０１１３】
ＡＴＣＣ１３０３２ｌｙｓＣfbrは、ＡＴＣＣ１３０３２から開始して生産できる。このようなリシン生産菌株を生産するために、ｌｙｓＣ野生型遺伝子の対立形質交換がＣ．グルタミカム(C. glutamicum)ＡＴＣＣ１３０３２で行われる。このために、ヌクレオチド交換はｌｙｓＣ遺伝子に導入され、その結果として生成されるタンパク質はトレオニンの代わりに３１１位のイソロイシンを保有する。前記菌株の詳細な構築方法が国際公開２００５／０５９０９３号に開示されている。前記ｌｙｓＣ菌株の登録番号はＰ２６５１２である。
【０１１４】
ヌクレオチドシーケンスをコードするイソクエン酸デヒドロゲナーゼの開始コドンとしてＡＴＧを代替、好ましくはＡＴＧをＧＴＧで代替することによりＩＣＤ活性が減少するＡＴＣＣ１３０３２ ｌｙｓＣfbrの誘導体が使用できる。ｉｃｄ開始コドンが変わった（菌株ＩＣＤ ＡＴＧ→ＧＴＧ）実施態様で説明される菌株が、本発明の文脈において特に好ましい。
【０１１５】
ここで説明された微生物の変異に使用できる技術は、例えば文献［Ausubel et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, pages 8.2.8 to 8.2.13 (1990), Wosnick et al., Gene 60:115 (1987); Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-8 to 8-9, John Wiley & Sons, Inc. (1995)］を参考することができる。
【０１１６】
前述した、ここで使用されたクロストリジウム酵素(clostridial enzyme)をコードする遺伝子のＤＮＡ分子は、各アミノ酸シーケンスから逆翻訳されたヌクレオチドシーケンスを有するポリヌクレオチドプローブ、又は各ヌクレオチドシーケンスを有するポリヌクレオチドプローブでｃＤＮＡ又は遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることにより取得できる。例えば、適切なライブラリーはクロストリジウム・サブターミナレ(Clostridium subterminale)菌株ＳＢ４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２９７４８）からゲノムＤＮＡを取得し、標準方法によるライブラリーを構築することにより準備できる。例えば、文献[Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 2-1 to 2-13 and 5-1 to 5-6 (John Wiley & Sons, Inc. 1995)］を参考することができる。
【０１１７】
代案的に、前記遺伝子は、互いにプライミングする長いオリゴヌクレオチド又はＰＣＲを用いたＤＮＡ分子合成によって取得できる。ＤＮＡ合成に関連して、例えば、文献［Ausubel et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, pages 8.2.8 to 8.2.13 (1990), Wosnick et al., Gene 60:115 (1987); Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-8 to 8-9, John Wiley & Sons, Inc. (1995)］を参考にすることができる。
【０１１８】
本明細書で言及された酵素は核酸シーケンスによってコードでき、核酸シーケンスはリシン生産が可能な前記親(parent)微生物のコドンの使用頻度に合わせられる。
【０１１９】
本発明に係る方法は、標的化合物（Ｌ−リシン）又はその前駆体を回収する段階をさらに含むことができる。用語「回収」は、培養培地から化合物を抽出、収集、分離又は精製することを含む。化合物の回収は、従来の樹脂（例えば、陰イオン又は陽イオン交換樹脂、非イオン吸収樹脂など）による処理、従来の吸着剤（例えば、活性化された炭、珪酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど）による処理、ｐＨ変更、溶媒抽出（例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサンなどの従来の溶媒で抽出）、蒸留、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶化、ｐＨ調節、凍結乾燥などを含むが、これに限定されない従来の分離又は精製方法によって行われ得る。例えば、標的化合物は、微生物を先ず除去することにより培養培地から回収できる。次いで、残余培地は、陽イオン交換樹脂を通過させて、所望しない陽イオンを除去し、陰イオン交換樹脂を通過させて、所望しない無機陰イオン及び有機酸を除去する。
【０１２０】
当業者は、例えば、特定のポリペプチドをコードする遺伝子又は内生のヌクレオチドシーケンスを、変異されたヌクレオチドシーケンスで置換する方法を熟知している。これは例えばエレクトロポレーション、化学的形質変換、コンジュゲーション、又は他の適切な形質変換方法による適切な構築物（複製起点のないプラスミド、複製起点のない線形ＤＮＡ断片）の導入によって達成できる。これに続いて、例えばこのような細胞のみが内生の自然発生シーケンスの代わりに変異されたヌクレオチドシーケンスを保有すると同定されたことを確認する選択マーカーを用いた相同組み換えが続く。他の方法は、内生の染色体位置の遺伝子破壊及び例えばプラスミドからの変異されたシーケンスの発現を含む。他の方法は、例えば転位(transposition)を含む。使用できるベクター及び宿主細胞に対する追加の情報が下記に与えられるであろう。
【０１２１】
一般に、当業者は、大腸菌(E. coli)及びＣ．グルタミカム(C. glutamicum)などの微生物におけるポリペプチドの発現を駆動するためのベクターなどの構築物の設計を熟知している。また、当業者は、Ｃ．グルタミカム(C. glutamicum)及び大腸菌(E. coli)などの微生物からのアミノ酸及び特にリシンの上述した微生物からの収集及び精製だけでなく、上述した微生物などの微生物の培養条件を熟知している。次に、上記の態様について詳しく説明する。
【０１２２】
また、当業者は、元来の変異されていないヌクレオチドシーケンスを、同じアミノ酸の、異なる核酸シーケンスを有するポリペプチドをコードする変異ヌクレオチドシーケンスに変える技術を熟知している。これは重合酵素連鎖反応に基づく突然変異生成技術、公知の複製手順、化学的合成などによって達成できる。組み換えＤＮＡ技術及び分子生物学の標準技術は、例えば、文献［Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, or Ausubel et al. (Eds.) Current protocols in molecular biology (John Wiley & Sons, Inc. 2007). Ausubel et al., Current Protocols in Protein Science, (John Wiley & Sons, Inc. 2002). Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition (John Wiley & Sons, Inc. 1995)］などの多様な刊行物に説明されている。特に、Ｃ．グルタミカムに対する方法は、文献［Eggeling and Bott (eds.) Handbook of Corynebacterium (Taylor and Francis Group, 2005)］に開示されている。前記手順中の幾つかは下記の「実施例」で取り扱う。
【０１２３】
以下、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)などの微生物の遺伝子変異がどのように行われ得るかについて詳細に説明する。
【０１２４】
ベクター及び宿主細胞
用語「ベクター」は、連結された他の核酸を移送することが可能な核酸分子をいう。
【０１２５】
ベクターの１種類は「プラスミド」であるが、これは追加のＤＮＡ断片が結合できる循環二重螺旋ＤＮＡ環である。他の種類のベクターは、追加のＤＮＡ断片がウイルス性ゲノムに結合できるウイルス性ベクターである。
【０１２６】
一定のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自発複製が可能である（例えば、複製のバクテリアの根源を有するバクテリアベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム(non-episomal)哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入後、宿主細胞のゲノムに統合され、これにより宿主ゲノムと共に複製される。また、一定のベクターは作動的に連結された遺伝子の発現を検出することができる。このようなベクターはここで「発現ベクター」という。
【０１２７】
一般に、組み換えＤＮＡ技術に使用される発現ベクターは一般にプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も頻繁に使用される形態であるため、相互交換的に使用できる。ところが、本発明はウイルスベクター（例えば、複製欠乏レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）などの、同じ機能を有する他の形態の発現ベクターも含む。
【０１２８】
本発明の組み換え型微生物の生産に適した組み換え型発現ベクターは、上述したように宿主細胞内の各核酸の発現に適した形態の異種核酸を含むことができる。これは、前記組み換え型発現ベクターは発現される核酸シーケンスに作動的に連結された発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節シーケンスを含むという意味である。
【０１２９】
組み換え型発現ベクター内で、「作動可能に連結」は、対象のヌクレオチドシーケンスがヌクレオチドシーケンスの発現を可能とするように（例えば、ベクターが宿主細胞に導入されるとき、インビトロで転写／翻訳システム又は宿主細胞の）調節配列に連結されていることを意味する。用語「調節配列」は、プロモーター、抑制物質結合部位、活性物質結合部位、エンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、終結部位、ポリアデニル化信号、又はｍＲＮＡ二次構造の他の要素）を含む。このような調節配列は、例えば文献［Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)］に説明されている。調節シーケンスは、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチドシーケンスの本質的発現を指定する調節シーケンス、及び特定の宿主細胞内のみにおけるヌクレオチドシーケンスの発現を指定する調節シーケンスを含む。好ましい調節配列は、例えば、ｃｏｓ−、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、ｌａｃ−、ｌｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃＩｑ−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ−、ｔｒｃ−、ａｒａ−、ＳＰ６−、ａｒｎｙ、ＳＰ０２、ｅ−Ｐｐ−ｏｒｅ ＰＬ、ＳＯＤ、ＥＦＴｕ、ＥＦＴｓ、ＧｒｏＥＬ、ＭｅｔＺ（最後の５つはＣ．グルタミカムから）などの好ましくはバクテリアで使用されるプロモーターである。追加の調節シーケンスは、例えばＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨなどの酵母及び菌類からのプロモーター、ＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３などの植物からのプロモーター、ｎｏｓ又はユビキチン−又はパセオリン−プロモーターである。人工プロモーターを使用することも可能である。発現ベクターの設計は転換されるべき宿主細胞の選択、所定のタンパク質発現レベルなどの因子に依存することができることを当業者が認識するであろう。発現ベクターは宿主細胞に導入でき、これにより融合タンパク質又はペプチドを含むタンパク質又はペプチドを生産することができる。
【０１３０】
宿主細胞内、好ましくはコリネバクテリウム、特に好ましくはＣ．グルタミカム内の変異されたヌクレオチドシーケンスの発現を駆動させる上で適した全てのベクターが使用できる。このようなベクターは、例えばコリネ型バクテリアで自己複製が可能なプラスミドベクターでありうる。例はｐＺ１(Menkel et al. (1989), Applied and Environmental Microbiology 64:549-554)、ｐＥＫＥｘ１(Eikmanns et al. (1991), Gene 102:93-98)、ｐＨＳ２−１(Sonnen et al. (1991), Gene 107:69-74)である。前記ベクターは、潜在プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１ ｏｄｅｒ ｐＧＡ１に基づく。他の適切なベクターはｐＣｌｉｋ５ＭＣＳ（国際公開第２００５／０５９０９３号）に基づく、或いはｐＣＧ４（ＵＳ−Ａ ４，４８９，１６０）又はｐＮＧ２(Serwold-Davis et al. (1990), FEMS Microbiology Letters 66:119-124)又はｐＡＧＡ（ＵＳ−Ａ ５，１５８，８９１）に基づく。他の適切なベクターの例は、文献［Handbook of Corynebacterium, Chapter 23 (edited by Eggeling and Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005)］から探すことができる。
【０１３１】
組み換え型発現ベクターは、原核生物又は真核生物細胞内の特定のヌクレオチドシーケンスの発現のために設計できる。例えば、前記ヌクレオチドシーケンスは、Ｃ．グルタミカム及び大腸菌(E. coli)、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いた）、酵母及び他の菌類細胞などの細菌細胞(Romanos, M. A. et al. (1992), Yeast 8:423-488; van den Hondel, C. A. M.J. J. et al. (1991) in: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure, eds., p. 396-428, Academic Press: San Diego; and van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge参照)、藻類及び多細胞植物細胞（Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) Plant Cell Rep.:583-586 参照）で発現できる。適切な宿主細胞が文献［Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)］にさらに開示されている。代案的に、組み換え型発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節シーケンス及びＴ７重合酵素を用いてインビトロ(in vitro)で転写又は翻訳できる。
【０１３２】
原核生物におけるタンパク質の発現は、殆どの場合、融合又は非融合タンパク質の発現を指定する構成要素的又は誘導性のプロモーターを含有するベクターと共に行われる。
【０１３３】
融合ベクターは、その中にコードされたタンパク質に、通常組み換え型タンパク質のアミノ末端だけでなく、Ｃ末端又はタンパク質に適切な部位内の融合タンパク質に多数のアミノ酸を添加する。前記融合ベクターは、典型的に、１）組み換え型タンパク質の発現を増加させること、２）組み換え型タンパク質の溶解度を増加させること、３）親和性精製におけるリガンドの役割を果たすことにより組み換えタンパク質の精製を助けること、及び、４）後のタンパク質の探索のための「タグ(tag)」を提供することなど、４つの目的を行う。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、タンパク質加水分解の切断位置が融合残基と組み換え型タンパク質との連結地点で導入され、融合タンパク質の精製後に融合残基から組み換え型タンパク質の分離を可能にする。前記酵素、及びその同族認識シーケンスは因子Ｘａ、トロムビン及びエンテロキナーゼを含む。
【０１３４】
典型的な融合発現ベクターは、それぞれグルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はタンパク質Ａを融合するｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988) Gene 67:31-40)、ｐＭＡＬ(New England Biolabs, Beverly, MA)、及びｐＲＩＴ５(Pharmacia, Piscataway, NJ)を含む。
【０１３５】
適切な誘導性非融合大腸菌(E. coli)発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ(Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315)、ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂｌ、ｅｇｔｌｌ、ｐＢｄＣｌ、及びｐＥＴ ｌｌｄ(Studier et al., Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; and Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York, ISBN 0 444 904018)を含む。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子の発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡ重合酵素転写に依存する。ｐＥＴ ｌｌｄベクターからの標的遺伝子発現は、共同発現されたウイルスＲＮＡ重合酵素（Ｔ７ｇｎｌ）によって媒介されたＴ７ ｇｎｌ０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。前記ウイルス重合酵素は、ｌａｃＵＶ ５プロモーターの転写制御下でＴ７ｇｎｌ遺伝子を含むレジダントＸプロファージからの宿主菌株ＢＬ２１（ＥＤ３）又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。他の多様なバクテリアの形質転換に、適切なベクターが選択できる。例えば、プラスミドｐＩＪ１０１、ＰＩＪ３６４、ＰＩＪ７０２及びＰＩＪ３６１はストレプトミセスの形質転換に有用であり、プラスミドｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４はウイルス種の形質転換に適する。遺伝子情報のコリネバクテリウムへの転送に使用する幾つかのプラスミドはｐＨＭ１５１９、ｐＢＬｌ、ｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７(Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York ISBN 0 444 904018)を含む。
【０１３６】
適切なＣ．グルタミカム(C. glutamicum)及び大腸菌(E. coli)シャトルベクターの例は、例えばｐＣｌｉｋ５ａＭＣＳ（国際公開２００５／０５９０９３号）であり、又は文献［Eikmanns et al. ((1991) Gene 102:93-8)］から探すことができる。
【０１３７】
コリネバクテリウムの変異に適したベクターの例は、文献［Handbook of Corynebacterium (edited by Eggeling and Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005)］から探すことができる。大腸菌(E. coli)−Ｃ．グルタミカムシャトルベクターのリスト（表２３．１）、大腸菌(E. coli)−Ｃ．グルタミカム(C. glutamicum)シャトル発現ベクターのリスト（表２３．２）、ＤＮＡのＣ．グルタミカム染色体への統合に使用できるベクターのリスト（表２３．３）、Ｃ．グルタミカム染色体への統合に使用できる発現ベクターのリスト（表２３．４）だけでなく、Ｃ．グルタミカム染色体への部位特異的統合に使用できるベクターのリスト（表２３．６）を探すことができる。
【０１３８】
他の実施態様において、発現ベクターは酵母発現ベクターである。イーストＳ．セレビシエ(S. cerevisiae)における発現ベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃｌ(Baldari, et al., (1987) Embo  J. 6:229-234)、２ｉ、ｐＡＧ−１、Ｙｅｐ６、Ｙｅｐｌ３、ｐＥＭＢＬＹｅ２３、ｐＭＦａ(Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943)、ｐＪＲＹ８８(Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123)、及びｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, CA)を含む。糸状菌類などの他の菌類への使用に適したベクター及びその構築方法は、文献［van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, and Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York (ISBN 0 444 904018)］に明示されたものを含む。
【０１３９】
本発明の目的のために、作動的リンクは、プロモーター（リボソーム結合部位（ＲＳＳ）を含む）、コーディングシーケンス、終結部位、及び選択的に追加調節要素の順次配列として理解するが、コーディングシーケンスを発現するときに各調節要素がその決定(determination)に基づいてその機能を行うことを可能とする方式である。
【０１４０】
他の実施態様において、異種ヌクレオチドシーケンスは、単細胞植物細胞（例：藻類）又は高等植物（例：作物植物などの種子植物）の植物細胞で発現できる。植物発現ベクターの例は、文献［Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; and Bevan, M. W. (1984) Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721］に開示されたものを含み、ｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮｌ９、ｐＡＫ２００４、及びｐＤＨ５１(Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York ISBN 0 444 904018)を含む。
【０１４１】
真核生物及び原核細胞の細胞に適した他の発現システムは、文献［Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003］のチャプター１６及び１７に開示されている。
【０１４２】
他の実施態様において、組み換え型発現ベクターは優先的に特定細胞タイプ、例えば植物細胞（例：組織特異的調節要素が核酸発現に使用される）における核酸発現を指定することができる。組織特異的調節要素は本技術分野に知られている。
【０１４３】
本発明の他の態様は、組み換え型発現ベクター又は核酸が導入された有機体又は宿主細胞に関するものである。その結果、生成された細胞又は有機体はそれぞれ組み換え型細胞又は有機体である。前記用語は、特定の対象細胞だけでなく、子孫(progeny)が組み換え型核酸を含むときの前記細胞の子孫(progeny)又は潜在的な子孫を指すものと理解される。一定の変異は突然変異又は環境的影響によって次の世代にも発生しうるため、実際、前記子孫は、親細胞と同一でない可能性もあるが、前記子孫が発現し或いは組み換え型タンパク質を発現することができる限り、ここに使用された用語の範囲内に含まれる。
【０１４４】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術によって真核生物又は原核生物の細胞に導入できる。ここで使用される「形質転換(transformation)」及び「トランスフェクション(transfection)」、「コンジュゲーション(conjugation)」及び「形質導入(transduction)」は、外来核酸（例：線形ＤＮＡ又はＲＮＡ（例：線形化されたベクター又はベクターのない遺伝子構築物）又はベクター形態の核酸（例：プラスミド、ファージ、ファスミド、ファジミド、トランスポゾン又は他のＤＮＡ））を宿主細胞に導入する、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共同沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、自然反応能、コンジュゲーション化学媒介トランスファー、又はエレクトロポレーションを含む多様な本技術分野で知られている技術をいう。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする適切な方法は、文献［Sambrook, et al. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003)、及び他の実験指針書から探すことができる。
【０１４５】
前記成分を識別及び選択するために、選択マーカー（例：耐抗生剤性）をコードする遺伝子を一般に関心遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択マーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン及びメトトレキサートなどの薬剤耐性を与えるものを含む。選択マーカーをコードする核酸は、前述した変異ヌクレオチドシーケンスをコードするベクターなどのベクター上の宿主細胞に導入されるか、或いは別個のベクターに導入され得る。導入された核酸を用いて安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬剤の選択によって識別できる（例えば、選択マーカー遺伝子を統合した細胞は生存し、他の細胞死するであろう）。
【０１４６】
複製起点(origin of replication)のないプラスミド及び２つの異なるマーカー遺伝子が使用されるとき（例：ｐＣｌｉｋ ｉｎｔ ｓａｃＢ）、ゲノムから挿入された挿入体の部分を有する、マーカーのない菌株を生産することができる。これは２つの続く相同的組み換え(homologous recombination)イベントによって達成できる(Becker et al., APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 71 (12), p. 8587-8596; Eggeling and Bott (eds) Handbook of Corynebacterium (Taylor and Francis Group, 2005)参照)。プラスミドｐＣｌｉｋ ｉｎｔ ｓａｃＢのシーケンスは国際公開２００５／０５９０９３号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で表示される）から見られる；そこで、前記プラスミドはｐＣＩＳと呼ばれる。
【０１４７】
他の実施態様において、導入された遺伝子の調節された発現を可能にする、選択されたシステムを含有する組み換え型微生物が生産できる。例えば、ヌクレオチドシーケンスをラックオペロン(lac operon)の制御下におくベクター上のヌクレオチドシーケンスの含有はＩＰＴＧ存在下でのみ遺伝子発現を許容する。このような調節システムは技術分野でよく知られている。
【０１４８】
大腸菌(Escherichia coli)及びコリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)培地の成長及び培養条件
一の実施態様において、前記方法はリシンの生産に適切な培地で微生物を培養することを含む。他の実施態様において、前記方法は培地又は宿主細胞からリシンを分離させることを含む。
【０１４９】
当業者はＣ．グルタミカム(C. glutamicum)及び大腸菌(E. coli)などの有り触れた微生物の培養を熟知している。よって、大腸菌(E. coli)及びＣ．グルタミカム(C. glutamicum)の培養について一般的な説明を行うであろう。追加情報は大腸菌(E. coli)及びＣ．グルタミカム(C. glutamicum)の培養に対する標準教科書から見られる。
【０１５０】
大腸菌(E. coli)菌株は、通常、それぞれＭＢ及びＬＢ培地で培養される(Follettie et al. (1993) J. Bacteriol. 175:4096-4103)。大腸菌(E. coli)用最小培地はそれぞれＭ９及び変異されたＭＣＧＣ(Yoshihama et al. (1985) J.Bacteriol. 162:591-597)である。グルコースは最終濃度１％で添加できる。抗生剤は次の量だけ（μｇ／ｍＬ）添加できる：アンピシリン５０；カナマイシン２５；ナリジクス酸２５。アミノ酸、ビタミン、及び他の補充剤は次の量だけ添加できる：メチオニン９．３ｍＭ；アルギニン９．３ｍＭ；ヒスチジン９．３ｍＭ；チタミン０．０５ｍＭ。大腸菌(E. coli)細胞は通常それぞれ３７℃で培養される。
【０１５１】
遺伝子変異されたコリネバクテリウムは典型的に合成又は自然培養培地で培養される。コリネバクテリウム用の多くの異なる培養培地はよく知られており、直ちに使用可能である(Liebl et al. (1989) Appl.Microbiol. Biotechnol., 32:205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11:11-16; Patent DE 4,120,867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Springer-Verlag)。説明は文献［Handbook of Corynebacterium (edited by Eggeling and Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005)］からも見られる。
【０１５２】
前記培地は、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン及び微量元素からなる。好ましい炭素源は、一糖類、二糖類などの糖(sugars)、又は多糖類である。例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、ラクトース、マルトース、スクロース、グリセロール、ラフィノース、澱粉又はセルロースが炭素源の役割を果たす。
【０１５３】
糖蜜又は他の糖精製物の副産物などの錯化合物を介して、培地に糖を供給することもできる。他の炭素源の混合物を供給することが有利でありうる。他の可能な炭素源はメタノール、エタノール、酢酸又は乳酸などのアルコール及び有機酸である。窒素源は通常有機又は無機窒素化合物、又は前記化合物を含有する物質である。窒素源の例は、ＮＨ4Ｃｌや（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＮＨ4ＯＨなどのアンモニアガス又はアンモニア塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸、又はコーンスティープリカー(corn steep liquor)、大豆粉、大豆タンパク質、酵母抽出物、肉汁などの複合窒素源を含む。
【０１５４】
培地に含まれ得る無機塩化合物は、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅、鉄、及びカルシウムの塩化塩、リン塩又は硫酸塩を含む。キレート化合物は、溶液に金属イオンを維持するために培地に添加できる。特に有用なキレート化合物は、カテコールやプロトカテク酸などのジヒドロキシフェノール、又はクエン酸などの有機酸を含む。前記培地は、ビタミンなどの他の成長要素、又はビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸及びピリドキシンなどの成長促進剤を含有することが一般的である。成長要素及び塩は、通常、酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合培地要素に由来する。培地化合物の正確な組成は直接的な実験によって異なり、各場合に応じて個別的に決定される。培地最適化に関する情報は文献［Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach"(Eds. P. M. Rhodes, P.F.Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)］から見られる。Ｓｔａｎｄａｒｄ１（Ｍｅｒｃｋ）又はＢＨＩ（フレインハートインフュージョン培地：brain heart infusion、ＤＩＦＣＯ）などのように、商業的供給者から培養培地を選択することもできる。
【０１５５】
本発明の好ましい培地の例を下記の実施例で説明する。
【０１５６】
全ての培地要素は、熱（１２１℃、１．５ｂａｒで２０分間）又は無菌濾過により滅菌化されるべきである。これらの要素は共に滅菌してもよく、必要に応じては別途滅菌してもよい。
【０１５７】
全ての培地要素は、培養の初期に存在し、或いは選択的に連続的又はバッチ式に追加できる。培養条件は各実験で別途説明する。
【０１５８】
温度は、使用された微生物によって異なり、通常１５℃〜４５℃でなければならない。前記温度は一定に維持されてもよく、実験中に変更されてもよい。培地のｐＨは５〜８．５でありうるが、好ましくは約７．０であり、培地に緩衝剤を添加することにより維持できる。緩衝剤の例はリン酸カリウム緩衝剤である。ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＡＣＥＳなどの合成緩衝剤は交互に或いは同時に使用できる。培養中にＮａＯＨ又はＮＨ4ＯＨの添加によって一定の培養ｐＨを維持することができる。酵母抽出物などの複合培地要素が使用されるならば、多くの錯化合物が高い緩衝力を持っているため、追加の緩衝剤の必要性が減少しうる。発酵器が微生物の培養に使用されるならば、ｐＨもアンモニアガスを使用することにより調節できる。
【０１５９】
培養時間は通常数時間〜数日である。前記時間は最大量の産物を培地に蓄積することを可能とするために選択される。開示された培養実験は異なるサイズのマイクロタイタープレート、ガラスチューブ、ガラスフラスコ、又はガラス又は金属発酵器などの多様な容器で行われ得る。多数のクローンをスクリーニングするために、前記微生物はバッフル(baffle)の在る或いは無いマイクロタイタープレート、ガラスチューブ又はシェークフラスコで培養されるべきである。好ましくは、必要な培養培地の体積の１０％が充填された１００ｍＬのシェークフラスコを使用する。前記フラスコは回転振盪機（振幅２５ｍｍ）で１００〜３００ｒｐｍの速度範囲で振動すべきである。蒸発量の損失は湿っぽい大気の維持によって減少できる；代案的に、蒸発量に対する数学的補正(mathematical correction)例で説明する。
【０１６０】
遺伝子変異されたクローンが実験されると、変異されていない対照クローン（例：親菌株）、又は挿入体なしで基本プラスミドを含有する対照クローンも実験されるべきである。培地は、３０℃で培養されたＣＭプレート（１０ｇ／Ｌのグルコース、２．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、２ｇ／Ｌの尿素、１０ｇ／Ｌのポリペプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌの肉汁、２２ｇ／Ｌの寒天、２ＭのＮａＯＨを添加してｐＨ６．８にする）のように平面寒天培地で培養された細胞を用いて、０．５〜１．５のＯＤ６００となるように接種する。前記培地の接種は、ＣＭプレートからのＣ．グルタミカム細胞の塩水懸濁液の導入又は前記バクテリアの液体前培養の添加によって達成される。
【０１６１】
アミノ酸及びその中間体の数量化
アミノ酸及びその中間体の数量化は、当業者に知られている文献によって行われ得る。前記数量化を下記のとおりメチオニンの例を挙げて説明する。追加的な数量化の例は実施例に示されている。本明細書の文脈では後者が好ましい。
【０１６２】
分析はガードカートリッジ及びシナジー４μｍカラム（ＭＡＸ−ＲＰ ８０Å、１５０＊４．６ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって行う。注入の前に、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）及びメルカプトエタノールを還元剤（２−ＭＣＥ）として用いて分析物を誘導体化する。さらにスルホヒドリル基をヨード酢酸でブロックする。分離は、極性相として４０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4（溶離液Ａ、ＮａＯＨでｐＨ＝７．８に合わせる）を用いて、非極性相（溶離液Ｂ）としてメタノール水混合物（１００／１）を用いて流速１ｍＬ／ｍｉｎで行う。勾配は、最初０％Ｂ；３９分３９％Ｂ；７０分６４％Ｂ；１００％Ｂ３．５分；均衡のために２分０％Ｂを適用する。常温における誘導体化は下記のとおり自動化する。初めに０．５μＬの０．５％２−ＭＣＥを入れたバイシン(bicine)（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）を０．５μＬの細胞抽出物と混合する。次いで、１．５μＬの５０ｍｇ／ｍＬのヨード酢酸を入れたバイシン（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）を添加し、２．５μＬのバイシン緩衝剤（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）を添加する。誘導体化は１／４５／５４ ｖ／ｖ／ｖの２−ＭＣＥ／ＭｅＯＨ／バイシン（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）に溶解された０．５μＬの１０ｍｇ／ｍＬ ＯＰＡ試薬を添加することにより行う。最後に、前記混合物を３２μＬのＨ2Ｏを希釈する。前記各ピペット操作(pipetting)段階同士の間に１分の待機時間がある。総量３７．５μＬをカラムに注入する。オートサンプラーニードル(auto sampler needle)がサンプル準備中（例：待機時間内に）及びその後に定期的に精製されるならば、前記分析結果が大きく改善できる。検出は蛍光検出器（３４０ｎｍ励起、 ４５０ｎｍ放出、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行う。数量化のために、内部標準としてα−アミノ酪酸（ＡＢＡ）を使用する。
【０１６３】
Ｃ．グルタミカム(C. glutamicum)の組み換えプロトコル
以下、特定の組み換えプロトコルを用いて精密化学生産の増加した効率を有する菌株Ｃ．グルタミカム菌株を生産する方法について説明する。
【０１６４】
ここで使用される「キャンベルイン(Campbell in)」は、全体循環二重螺旋型のＤＮＡ分子（例えば、ｐＣｌｉｋ ｉｎｔ ｓａｃＢに基づくプラスミド）が一つの相同性組み換えイベント(a cross-in event)によって染色体に統合され、前記循環ＤＮＡ分子の線形化されたバーションが前記循環ＤＮＡ分子の第１ＤＮＡシーケンスと相同の染色体の第１ＤＮＡシーケンスへ効果的に挿入されるようにする原宿主細胞の形質転換株を意味する。「キャンベルドイン(Campbelled in)」は、「キャンベルイン」形質転換株の染色体に統合された線形化ＤＮＡシーケンスをいう。「キャンベルイン」は、各コピーが相同性組み換え交差点のコピーを含み且つ取り囲む第１相同型ＤＮＡシーケンスの複製を含有する。その名前は前記組み換えを最初に提案したＡｌａｎ Ｃａｍｐｂｅｌｌ教授の名前を引用した。
【０１６５】
ここで使用される「キャンベルアウト(Campbell out)」は、「キャンベルイン」形質転換株に由来する細胞を指すが、前記細胞において、第２相同組み換えイベント(a cross out event)が、「キャンベルドイン」ＤＮＡの線形化された挿入ＤＮＡに含有された第２ＤＮＡシーケンスと、前記線形化された挿入体の第２ＤＮＡシーケンスと相同の染色体オリジンの第２ＤＮＡシーケンスとの間で発生して、前記統合されたＤＮＡシーケンスの部分の欠失（無駄なものは捨てる）を引き起こすうえ、重要なことには、統合されたキャベルドインであるＤＮＡの部分（単一塩基分だけ小さいこともある）が染色体に残っているようにして、原宿主細胞と比較して、「キャンベルアウト」細胞が染色体に一つ以上の意図的な変化を含有（例えば、単一塩基置換、多重塩基置換、異種遺伝子又はＤＮＡシーケンスの挿入、相同遺伝子又は変異された相同遺伝子の追加的コピーの挿入、又は上記に列挙した例の一つ以上を含むＤＮＡシーケンスの挿入）するようにする。
【０１６６】
「キャンベルアウト」細胞又は菌株は、通常、常時ではないが、「キャンベルドイン」ＤＮＡシーケンスの部分（欠失されることが好ましい部分）に含有された遺伝子、例えば約５％〜１０％のスクロースの存在下で培養される細胞で発現されると、致命的なバチルスサブチリスｓａｃＢ(Bacillus subtilis sacB)遺伝子に対する逆選択(counter-selection)によって取得される。逆選択の利用を問わず、所定の「キャンベルアウト」細胞は所定の細胞をコロニー形態、コロニー色、耐抗生剤性の存在有無、重合酵素連鎖反応による与えられたＤＮＡシーケンスの存在有無、栄養要求性の存在有無、酵素、コロニー核酸交雑、抗体スクリーニングなどの存在有無など（しかしながら、これらに限定されない）のスクリーニング可能な表現型を用いて選択して取得或いは識別できる。用語「キャンベルイン」及び「キャベルアウト」は、上述した方法又は工程を指すために多様な時制の動詞としても使用できる。
【０１６７】
「キャンベルイン」又は「キャンベルアウト」を引き起こす相同組み換えイベントは、相同ＤＮＡシーケンス内のＤＮＡ塩基の範囲で発生しうる。相同シーケンスが少なくとも前記範囲の部分では互いに同一であるため、交配(crossover)イベントが発生したところを正確に知ることは通常不可能である。言い換えれば、どのシーケンスが挿入されたＤＮＡからきたか、どれが染色体ＤＮＡからきたかは正確に知ることができないという意味である。また、第１相同ＤＮＡシーケンス及び第２相同ＤＮＡシーケンスが通常部分的非相同関係部位で分離され、それが「キャンベルアウト」細胞の染色体に残余する非相同関係部位である。
【０１６８】
実現可能性のために、Ｃ．グルタミカム(C. glutamicum)では、典型的な第１及び第２相同ＤＮＡシーケンスの長さが少なくとも約２００塩基対であり、幾千塩基対であってもよいが、より短い或いはより長いシーケンスが利用できるようにする手順を行うことができる。例えば、第１及び第２相同シーケンスの長さが５００〜２０００塩基であってもよく、「キャンベルイン」から「キャンベルアウト」を取得することは、第１及び第２相同シーケンスを長さが殆ど同等となるように、好ましくは２００塩基対より少ない差が生ずるように、最も好ましくは両方のうちさらに短い方がさらに長い塩基対の長さの少なくとも７０％となるように配列することにより可能となる。「キャンベルイン及びキャンベルアウト方法(Campbell in and-Out method)」は、国際公開２００７／０１２０７８号及び文献［Eggeling and Bott (eds) Handbook of Corynebacterium (Taylor and Francis Group, 2005)］のチャプター２３に開示されている。好ましいＣ．グルタミカム組み換えプロトコルは下記の実施例で説明する。
【０１６９】
下記の実施例において、本発明についてさらに詳しく説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためのもので、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１７０】
下記の実施例において、組み換え型ＤＮＡ技術及び分子生物学の標準技術の説明は、例えば、文献［Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, or Ausubel et al. (2007), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Protein Science, edition as of 2002, Wiley Interscience］などにも開示されている。別途の言及がない限り、全ての細胞、試薬、装置及びキットは製造会社の指示に従って使用した。
【０１７１】
材料及び方法
バクテリア菌株
Ｃ．グルタミカム(C. glutamicum)の全ての菌株は、安定的遺伝子変異によって野生型ＡＴＣＣ１３０３２(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)から誘導された。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した大腸菌(Escherichia coli)ＤＨ５ａ及びＮＭ５２２を、それぞれベクター増幅及びＤＮＡメチル化に使用した。全ての菌株を表２に示す。
【０１７２】
【表２】
2013533740.tif 000004
【０１７３】
文献［American Type Culture Collection (Manassas, USA)）］によって野生型Ｃ．グルタミカム(C. glutamicum)ＡＴＣＣ１３０３２が取得された。
【０１７４】
プライマー及びプラスミド
Ｃ．グルタミカムの形質転換は、それぞれ統合ベクターｐＫ１９又はｐＣｌｉｋ（図１及び図２）(Becker, et al., 2005)を用いて行った。原ベクターは、サイズが４ｋｂｐであり、大腸菌(E. coli)のための複製起点（ＯＲＩ）、多重クローニングサイト（ＭＣＳ）、カナマイシン耐性選択マーカー（ＫａｎR）及びＢ．サブチリス（B. subtilis)のレバンスクラーゼ(levansucrase)をコードするｓａｃＢ遺伝子のオープンリーディングフレームを含有する。ＫａｎR及びｓａｃＢは２つの組み換えイベントに陽性選択マーカー(positive selection marker)として使用される(Jager, et al., 1995; Jager, et al., 1992)。
【０１７５】
Ｃ．グルタミカムの遺伝子変異のための各ＤＮＡ断片はＰＣＲで取得した。次いで、選択された制限酵素の認識部位を介して基本ベクターＭＣＳに挿入した。菌株の構築に使用されたプラスミド及びプライマーシーケンスをそれぞれ表３及び表４に示す。プライマーデザイン及び複製戦略の開発にはソフトウェアＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ １０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。
【０１７６】
【表３】
2013533740.tif 000005
【０１７７】
Ｃ．グルタミカムＢＳ８７の菌株構築に使用されたプラスミドを表４に示す。
【０１７８】
【表４】
2013533740.tif 000006
【０１７９】
ここで言及された遺伝子のヌクレオチドシーケンスは、例えば HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov" www.ncbi.nlm.nih.govなどの公共データベースを介してもアプローチ可能である。
【０１８０】
コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)の完全なゲノムは、配列順序が解明されており、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＢＡ００００３６．３で利用可能である。
【０１８１】
化学物質
酵母抽出物、肉汁、トリプトン、ペプトン及び寒天は、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＵＳＡ）から購入した。他の全ての化学物質は分析用等級であり、Ｓｉｇｍａ、Ｆｌｕｋａ又はＭｅｒｃｋから購入した。標識されたグルコースはＣａｍｐｒｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。制限酵素はＦｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【０１８２】
培地組成
複合培地
ＬＢ培地
大腸菌(E.coli)の寒天平板培地或いは液体培養における培養を、ＬＢ(Luria-Bertani)培地で行った。これはリットル当たり：５ｇの酵母抽出物、１０ｇのトリプトン及び５ｇのＮａＣｌを含有した。１８ｇ Ｌ-1の寒天を添加して寒天平板培地を製造した。２０分間１２１℃で高圧蒸気滅菌によって滅菌した。適切であれば、カナマイシン及びテトラサイクリンを、それぞれ最終濃度５０μｇｍＬ-1又は１２．５μｇｍＬ-1に添加した。
【０１８３】
ＳＯＣ培地
熱ショック形質転換の後に大腸菌(E.coli)ＤＨ５ａ及びＮＭ５２２の再生を３つの溶液からなる強化ＳＯＢ培地(Super Optimized Broth)で行った。溶液１は総量９７５ｍＬ中にトリプトン２０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ０．５ｇ及びＫＣｌ（２５０ｍＭ）１０ｍＬを含有し、高圧蒸気滅菌で滅菌した。常温に冷却した後、滅菌したＭｇＣｌ2（２Ｍ）５ｍＬ及び滅菌したグルコース（１Ｍ）２０ｍＬを添加した。
【０１８４】
ＣＭ培地
コリネバクテリウムグルタミカムの最初前培養はＣＭ培地で成長した。製造のために、１０ｇのペプトン、５ｇの肉汁、５ｇの酵母抽出物及び２．５ｇのＮａＣｌを９２５ｍＬの水に溶解させ、１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌した。そして、２５ｍＬのグルコース（４００ｇＬ-1、０．２μｍのＵＩｔｒａｆｒｅｅ-ＭＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅで濾過によって滅菌された）及び５０ｍＬの尿素（４０ｇＬ-1、０．２μｍのＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅで濾過によって滅菌された）を添加した。１８ｇＬ-1の寒天を添加して寒天平板培地を製造した。選択目的のために、菌株構築の間、高圧蒸気滅菌の前に１００ｇのスクロースを添加して、ＣＭSAC寒天平板培地を製造した。ＣＭKan寒天は最終濃度５０μｇｍＬ-1を有するカナマイシンを含有した。高圧蒸気によって滅菌された寒天を５０〜６０℃まで冷却した後、５０ｍｇ ｍＬ-1の母液からカナマイシンを添加した。
【０１８５】
ＢＨＩ++培地
エレクトロポレーション(electroporation)のための細胞を培養することに用いられるＢＨＩ++培地は、３７ｇのＢＨＩ(Brain-Heart-Infusion)を８５０ｍＬの水に溶解させて製造した。高圧蒸気滅菌（２０分、１２１℃）の後、５０ｍＬの滅菌された２Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4及び１００ｍＬの滅菌された４０％グルコースを添加した。
【０１８６】
ＢＨＩＳ培地
エレクトロポレーション後の細胞再生のために、ＢＨＩＳ培地にＣ．グルタミカムを選択圧なしで９０分間培養した。１ＬのＢＨＩＳは濾過で滅菌し、高圧蒸気滅菌の後に添加した２５０ｍＬの２Ｍソルビトール及び３７ｇのＢＨＩを含有した。
【０１８７】
最小培地
代謝フラックス分析(metabolic flux analysis)を含む生理学的研究のために、最小培地を使用した（表５）。これは使用の前に新鮮に配合された他の溶液から構成された。
【０１８８】
【表５】
2013533740.tif 000007
【０１８９】
溶液Ａ〜Ｄ及び水を１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌して滅菌した。溶液Ｆ〜Ｈを濾過（０．２μｍ、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）して滅菌した。アンモニウム濃度及び緩衝容量を高め、基質濃度を低めることにより、選択された実験で最小培地を変異した。
【０１９０】
産業的生産培地
ビタミン及び微量元素で補充された糖蜜ベース複合培地で、５ＬのＳａｒｔｏｒｉｕｓ
ｆｅｒｍｅｎｔｅｒにおける流加発酵を行った。バッチ培地の組成を表６に示す。供給溶液の製造には２００ｇの糖蜜及び８００ｇのグルコース＊Ｈ2Ｏを、１．８Ｌの水に溶解させ、１２１℃で２０分高圧蒸気滅菌して滅菌した。次いで、滅菌された２００ｍＬの（ＮＨ4）2ＳＯ4溶液（４００ｇＬ-1）、０．８ｍＬの溶液Ｅ及び２ｍＬの泡抑制剤（Ｔｅｇｏ ａｎｔｉｆｏａｍ ＫＳ９１１、Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ ＧｍｂＨ、Ｅｓｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した。
【０１９１】
【表６】
2013533740.tif 000008
【０１９２】
溶液Ｅは、３００ｍｇＬ-1のビオチン、５００ｍｇＬ-1のチアミン＊ＨＣｌ、２ｇＬ-1のパントテン酸カルシウム−塩及び６００ｍｇＬ-1のニコチンアミドを含有した。ＦｅＳＯ4−クエン酸溶液は２０ｇＬ-1のＦｅＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ及び１８．１４ｇＬ-1のクエン酸塩から構成された。溶液Ａ〜Ｄ及び水は１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌して滅菌した。溶液Ｅは濾過（０．２μｍ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって滅菌した。
【０１９３】
菌株保存
複合液体培養（大腸菌(E. coli)はＫＢ、Ｃ．グルタミカムはＣＢ）からの対数増殖する細胞１ｍＬを１ｍＬの滅菌された６０％グリセロールに混合し、−８０℃で貯蔵した。
【０１９４】
菌株構築
核酸の単離
Ｃ．グルタミカムからのＤＮＡの単離
精製されたゲノムＤＮＡの分離のために、３０℃で２日間培養された寒天平板培地の細胞を滅菌された接種ループを用いて収集し、５００μＬの滅菌された水に溶解させた。２薬さじのガラスビーズ（０．４５〜０．５ｍｍ）及び７００μＬのフェノール−クロロホルム−イソアミル−アルコール混合物（Ｃａｒｌ−Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した後、ｒｉｂｏｌｙｚｅｒ（ＭＭ３０１、Ｒｅｔｓｃｈ、Ｈａａｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて３０Ｈｚで１分間細胞破壊を行った、水相及び気相（５分、１３０００ｒｐｍ、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４１５Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の分離後、６５μＬの酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ５．５）及び１．３ｍＬのエタノール（１００％）の添加、及び遠心分離段階（１０分、１３０００ｒｐｍ、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４１５Ｒ）によって水相からのＤＮＡを沈殿させた。次いで、上澄み液を除去し、ゲノムＤＮＡを１００μＬの滅菌された水に溶解させた。ＤＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標） Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＮＤ−１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）で測定し、ゲノムＤＮＡを４℃に貯蔵した。菌株構築の間、スクリーニング目的のためのＤＮＡの早い分離のために、単一コロニーを滅菌された楊枝で取って、５００μＬの滅菌された水に溶解させ、前述したとおり細胞破壊を行った。細胞残骸を遠心分離で除去し、１０μＬの上澄み液をＰＣＲ分析に使用した。
【０１９５】
大腸菌(E. coli)からのプラスミドの分離
大腸菌(Escherichia coli)ＮＭ５２２及びＤＨ５αからのプラスミドＤＮＡの分離を、それぞれＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔｓ ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＧＦＸ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。ＧＦＸ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いたプラスミド分離は、指針書に説明されたとおりＬＢKan培地で培養されたＤＨ５αの一晩の培養３ｍＬを用いて行った。ＮＭ５２２からの分離プラスミドは、１０ｍＬの前培養（ＬＢTet+Kan）を寒天平板培地からの単一コロニーで接種し、８時間培養した。前培養からの細胞を５０ｍＬ ＬＢTet+Kanで行い、一晩培養した本培養を接種することに使用した。細胞収集及びプラスミド分離は、ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｐｒｅｐマニュアルに従って行った。ＤＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定し、分離されたプラスミドは２つの異なる制限酵素を用いた切断によって調節し、−２０℃で貯蔵した。全ての培養は、回転振盪機（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ ＡＧ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のバッフル付シェークフラスコで３７℃、２３０ｒｐｍにて振動直径５ｃｍで行った。
【０１９６】
重合酵素連鎖反応
挿入体の生産及び菌株の確認は、ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ＥＰ ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＰＣＲによって行った。挿入体の生産(insert construction)及びシーケンシングのために設計されたＰＣＲ産物には校正(proof reading)機能を有するＰＷＯ ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、菌株確認はＴａｑ重合酵素を含有するＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。ベクター生産のための所定のＤＮＡ断片の取得、遺伝子欠失の誘導、点突然変異の導入、形質転換ベクターを用いた指定結紮(ligation)のための制限酵素の認識部位の人為的追加は、従来の方法によって行った。各反応の後、ＰＣＲ産物をＧＦＸTM ＰＣＲ ＤＮＡ及びＧｅｌ Ｂａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。増幅は初期変性段階（９５℃で５分間）で開始して標準温度プロフィールを用いて行った。次いで、９５℃で０．５分の変性、０．５分のアニーリング及び７２℃で１分間の伸長(elongation)を１サイクルとして３０サイクル繰り返し行った。７２℃で５分の最終伸長の後、サイクラーを１５℃まで冷却させた。アニーリング温度はプライマーにそれぞれ個別的に合わせ、下記の式にしたがってＧＣ含量に基づいて計算した：
【０１９７】
【数１】
2013533740.tif 000009
【０１９８】
反応は総量５０μＬで典型的な方法によって行った。プライマーを４００ｎＭの最終濃度に添加した。１μＬの精製されたゲノムＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡを鋳型として添加した。コロニーＰＣＲは、迅速な分離からの鋳型ＤＮＡを使用し、その量を１０μＬに増やした。陰性対照群は鋳型ＤＮＡなしで行った。
【０１９９】
ゲル電気泳動法(Gel Electrophoresis)
重合酵素連鎖反応又は酵素切断からの生産物を、１％アガロースゲルで電気泳動を用いて分離した。電気泳動は１００〜１２０Ｖで１〜１．５時間１×ＴＡＥ緩衝剤（Ｂ１Ａ ｅａｓｙ ｃａｓｔ ｍｉｎｉ ｇｅｌ又はＤ２ ｗｉｄｅ ｇｅｌ ｓｙｓｔｅｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＳＡ ｗｉｔｈ Ｐｏｗｅｒ Ｐａｃｋ Ｐ２５Ｔ、Ｂｉｏｍｅｔｒａ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。バンドサイズは１ｋｂ ＤＮＡラダー（Ｏ’ＧｅｎｅＲｕｌｅｒTM １ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。ゲルローディングの前に、サンプルを１／１０ ｖｏｌｕｍｅ ＯｒａｎｇｅＧローディング緩衝剤と混合した。ＴＡＥ緩衝剤及びＯｒａｎｇｅＧの組成を表７に示す。
【０２００】
【表７】
2013533740.tif 000010
【０２０１】
ゲルは臭化エチジウム染浴（０．５μｇ ｍＬ-1の臭化エチジウム）で着色した。ＤＮＡ検出はＧｅｌ Ｉｘ Ｉｍａｇｅｒ（Ｉｎｔａｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の紫外線下で行った。
【０２０２】
酵素切断
形質転換ベクターの生産のために、融合ＰＣＲによって取得された空ベクター(empty vector)ｐＣｌｉｋ及び挿入体を、２つの異なる制限酵素を用いて切断した。ベクターの切断のための反応は総量２５μＬで行い、各酵素１μＬ、２．５μＬの反応緩衝剤（１０×）、５μＬのプラスミドＤＮＡ及び１５．５μＬの水を含有した。切断はＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用したとき、３７℃で一晩又は２０分間行った。次いで、ベクターの再結紮を回避するために、線形化されたベクターからのホスフェート残基を、常温で１時間アルカリ性ホスファターゼ処理（ＳＡＰ(Shrimp alkaline phosphatase)、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）によって除去した。ＮＭ５２２からのプラスミド分離後の切断をＳＡＰ処理なしで行った。挿入体の切断を、融合ＰＣＲからのＰＣＲ産物２５μＬ、各酵素２μＬ、１０×反応緩衝剤５μＬ及び水１６μＬを用いて行った。
【０２０３】
ＤＮＡ結紮
結紮のために、異なるベクター−挿入体の比率を有する２つの混合物を製造した。反応はＲａｐｉｄＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行い、０．５μＬ又は１μＬの線形化されたベクター、２μＬの挿入体ＤＮＡ、２μＬの希釈緩衝剤、１０μＬの結紮緩衝剤、１μＬのＴ４連結酵素、及び４μＬ又は４．５μＬの水を含有した。混合物を常温で３０分間培養した後、大腸菌(E. coli)ＤＨ５αの熱ショック形質転換に適用した。
【０２０４】
形質転換
熱ショック受容性(competent)大腸菌(E.coli)(Inoue, et al., 1990)の製造
一つの前培養及び１つの本培養において、２３℃で回転振盪機（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ）の２３０ｒｐｍにて、細胞を培養した。前培養（２０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有する５ｍＬのＬＢ培地）を寒天平板培地からの単一コロニーで接種し、一晩培養した。ｐＴＣプラスミドを保有する大腸菌(E. coli)ＮＭ５２２には１２．５μｇｍＬ-1テトラサイクリンを添加した。２ｍＬの一晩の培養を用いて、２５０ｍＬの培地を有する２Ｌのバッフル付シェークフラスコで行われた本培養を接種した。０．４〜０．６のＯＤ600で、細胞を氷上に１０分間置いた後、予め冷却された５０ｍＬの滅菌済みファルコンチューブに移し、１０分間遠心分離した（５０００ｒｐｍ、４℃、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。氷のように冷たいＴＢ緩衝剤（表８）４０ｍＬで洗浄した後、細胞を同じ緩衝剤２０ｍＬ及び１．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解させ、１０分間氷上に置き、最後に予め冷却した１．５ｍＬのエペンドルフチューブの分取液２２０μＬから分裂させた後、エタノール−ドライアイス浴で衝撃冷却した。受容性細胞を−８０℃で貯蔵した。
【０２０５】
【表８】
2013533740.tif 000011
【０２０６】
熱ショック形質転換
氷上で溶かした後、５０μＬの受容性大腸菌(E.coli)細胞を３μＬのプラスミドＤＮＡと混合し、３０分間氷上で培養した。熱ショックはｔｈｅｒｍｏ ｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、４５秒間４５℃で行った後、細胞を直ちに氷に２分間置いた。そして、９００μＬのＳＯＣ培地を添加し、細胞再生をｔｈｅｒｍｏ ｍｉｘｅｒで５００ｒｐｍにて（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）選択圧力なしで、６０分間３７℃で行った。選択目的のために、細胞をＬＢKan又はＬＢTet+Kan平板培地に設置し、３７℃で一晩培養した。単一コロニーを選択した。プラスミド分離及びベクター切断は上述したとおり行った。所定のベクターを含有する菌株を−８０℃に貯蔵した。
【０２０７】
電気受容性(electro-competent)Ｃ．グルタミカムの製造
グリセロールストック(glycerol stocks)からの細胞を寒天平板培地に広げ、３０℃で４８時間培養した。初前培養（５ｍＬ ＢＨＩ++培地）を一晩３０℃で２３０ｒｐｍの回転振盪機（振動直径５ｃｍ、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ ＡＧ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で培養した単一コロニーで接種し、本培養のシード(seed)として使用した。これは５０ｍＬ ＢＨＩ++培地で行い、０．３のＯＤ660で接種した。１．２〜１．５のＯＤ660で細胞を、予め冷却された５０ｍＬの滅菌済みファルコンチューブで収集し（７５００×ｇ、３分、４℃）、氷のように冷たい１０％グリセロールで４回洗浄し、細胞湿潤重量（ＣＷＷ）グラム当たり４ｍＬのグリセロールに溶解させた。細胞懸濁液をエレクトロポレーション時間（ｔE）のテストに使用した。適切であれば（ｔE＜８ｍｓ）、細胞懸濁液を１０％グリセロールでさらに希釈させる。
【０２０８】
エレクトロポレーションによる形質転換
Ｃ．グルタミカムのエレクトロポレーションを、２００μＬの細胞懸濁液及び２．５μｇ及び５μｇのプラスミドＤＮＡを用いて、ＢｉｏＲａｄ ｇｅｎｅ ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅｌｌTM（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳ）によって、２ｍｍのエレクトロポレーション用キュベットでそれぞれ２．５ｋＶ、２５μＦ及び４００Ωで行った。ＤＮＡのない反応を陰性対照群として用いた。電子パルス後直ちに、１ｍＬのＢＨＩＳ培地を添加し、細胞懸濁液をエペンドルフチューブに移し、選択圧力なしで９０分間培養した（３０℃、５００ｒｐｍ、Ｔｈｅｒｍｏ ｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ｐＣｌｉｋ及びｐＫ１９は、Ｃ．グルタミカムで複製することができないため、ベクターの遺伝伝達には相同組み換えによるプラスミドＤＮＡのゲノムへの挿入が要求される。第１組み換えイベントを経た形質転換株の選択を２日間３０℃で、ＣＭKan寒天平板培地で行った。ＣＭKanからの単一コロニーを第２組み換えに使用した。
【０２０９】
第２組み換え
Ｃ．グルタミカムのマーカーがない変異のために、エレクトロポレーションにより導入されたベクターを第２組み換えイベント及びスクロースの選択によって除去した(Jager, et al., 1992)。前記目的のために、第１組み換えイベントからの単一コロニーを一晩５ｍＬのＢＨＩ++培地（３０℃、２３０ｒｐｍ）で培養し、１：１０００−希釈液それぞれ１００μＬ及び２００μＬをＣＭSacに設置した。スクロースにおけるＣ．グルタミカムの培養中のｓａｃＢ発現の致命性のため、ｓａｃＢを含むプラスミドが第２相同組み換えイベントによって除去された組み換え型菌株のみが成長しうる。ＣＭSacで培養された単一コロニーを楊枝で取ってＣＭSac及びＣＭKanレスタープレートにバッチした。カナマイシンに対して敏感であり且つスクロースに対して耐性がある、ランダムに選択された１０〜１５個のクローンを所望の変異についてさらに実験した。
【０２１０】
スクリーニング及び菌株検証
変異に応じて、スクリーニング及び菌株検証はＰＣＲ分析、酵素活性の測定又はシーケンシングを含む。プロモーター交換及び遺伝子欠失は、一般にＰＣＲを介してスクリーニングし、酵素比活性の測定によって検証した。ところが、開始コドン置換のスクリーニングは酵素活性実験で行った。変化した酵素比活性を有する有望なクローンはシーケンス分析でさらに詳しく調査した。
【０２１１】
菌株特性化
最小培地でのバッチ培養
シェークフラスコでの培養は、回転振盪機（振動直径５ｃｍ、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ ＡＧ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で３０℃、２３０ｒｐｍにて行った。第１前培養（５００ｍＬのバッフル付フラスコに５０ｍＬの培地）を２日経過の寒天平板培地からの単一コロニーで接種し、８時間培養した。細胞を遠心分離法（８８００×ｇ、２分、４℃）で収集し、滅菌された０．９％ＮａＣｌで洗浄し、第２前培養の接種源として使用した。これは後続の本培養の炭素源を含有する５００ｍＬのバッフル付フラスコの５０ｍＬ最小培地で行った。接種源として第２前培養からの細胞を用いて三回（２５０ｍＬのバッフル付フラスコに２５ｍＬ、或いは２Ｌのバッフル付フラスコに２００ｍＬ）本培養を行った。フラスコに溶解された酸素は、Ｏ2依存発光性減衰時間を有するフルオロフォア(fluorophore)を含有する固定化センサースポットを介してモニタリングした(Wittmann, et al., 2003)。溶解された酸素レベルは、細胞の十分な酸素供給が確保されるように各培養中の飽和度が２０％以上であった。ｐＨは全体培養中に７．０±０．２の範囲であった。トレーサー実験では、自然的に標識されたグルコースを、９９％［１−13Ｃ］グルコース、９９％［６−13Ｃ］グルコース、又は自然的に標識されたグルコースと９９％［Ｕ−13Ｃ］グルコースとの同モル量の混合物で置換した。最小培地でのバイオリアクター発酵は３０±０．１℃、ｐＨ７．０±０．１及び８００ｒｐｍにて１００ｍＬの作業量で２５０ｍＬのバイオリアクター（Ｍｅｒｅｄｏｓ、Ｂｏｖｅｎｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。溶解された酸素レベルは全体培養中に飽和度が２０％であった。空気供給量は質量流量計（Ｂｒｏｏｋｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって１００ｍＬ ｍｉｎ-1に維持した。空気供給及び排気ガスの組成は四重極質量分析器（Ｏｍｎｉｓｔａｒ、Ｂａｌｚｅｒｓ、Ｖａｄｕｚ、Ｌｉｅｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ）を用いて、２分間隔でオンラインにて測定した。
【０２１２】
流加発酵(Fed-Batch Fermentation)
糖蜜ベースの生産培地における流加発酵は、５Ｌの容器でＢｉｏｓｔａｔ Ｂ ｐｌｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｕｎｉｔを用いてＳａｒｔｏｒｉｕｓバイオリアクターで行った。空気供給量は統合ガス流量計によって２．５Ｌ ｍｉｎ-1に設定した。ｐＨ電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ、Ｇｉｅｓｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をｐＨモニタリングに使用した。ｐＨを６．９に維持するために、２５％ＮＨ4ＯＨをＢｉｏｓｔａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｕｎｉｔの連動式ポンプシステムを用いて添加した。添加された量は重量測定（Ｌａｂ Ｂａｌａｎｃｅ Ｃｕｐｉｓ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。溶解された酸素をｐＯ2電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ、Ｇｉｅｓｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定し、攪拌器の速度変化によって２０％の飽和度を維持した。これはプロセス制御ソフトウェアＢａｓｅＬａｂ（ＢＡＳＦ ＳＥ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって制御した。ｐＯ2電極の校正(calibration)は、培地をそれぞれ合成の空気及び窒素を用いて順次空気が通じるようにした。冷却ジャッキ(cooling jacket)を用いて温度を３０℃に合わせた。排気ガス内のＣＯ2及びＯ2を、質量分析計を用いて分析した。全ての手順のデータをオンラインでモニタリングし、５分間隔でプロセス制御ソフトウェアＢａｓｅＬａｂによって記録した。ｐＯ2信号によって注入を開始した。１０％ｍｉｎ―1より高い速度を持つ溶解酸素の変化はＢｉｏｓｔａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｕｎｉｔの連動式注入ポンプを活性化させた。重量測定方式で測定された追加注入量を介してプロセス制御ソフトウェアによって、注入量を制御した。
【０２１３】
発酵は１Ｌの量で開始した。これに、ＣＭ培地で回転振盪機（回転直径５ｃｍ、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ ＡＧ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の上で２３０ｒｐｍ、３０℃にて６時間培養された細胞を接種した。６００ｍＬの前培養からの細胞を遠心分離法（８８００×ｇ、２分、ＲＴ）で収集し、５０ｍＬの滅菌されたＮａＣｌ（０．９％）に溶解させ、接種に使用した。吸光度１０でバッチ発酵を開始した。供給段階を９時間後に開始し、総３０時間発酵を行った。
【０２１４】
ベクターの順次構築及びバクテリアへの形質転換に対する一般的概要
変異されたアスパラギン酸キナーゼ遺伝子を保有する形質転換ベクターＮｏ４（ｐＣｌｉｋ＿ｌｙｓＣT311I）の構築
表３（上記参照）で言及されたベクターＮｏ４（ｐＣｌｉｋ＿ｌｙｓＣT311I）を、プライマーＰ１〜Ｐ４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ：３５〜３８）を用いて構築し、対立形質置換によって、例えば野生型Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のバックグラウンドにおける点突然変異を導入する。
【０２１５】
野生型ＬｙｓＣ−ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の３１１位のトレオニンからイソロイシンへのアミノ酸置換を引き起こす点突然変異を保有するＣ．グルタミカム菌株の製造のために、アスパラギン酸キナーゼ遺伝子（ｌｙｓＣ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）をコードするＯＲＦを増幅させた。
【０２１６】
このために、Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の分離されたゲノムＤＮＡを、野生型ｌｙｓＣ遺伝子の９３２位における核酸変異を導入する適切なプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。
【０２１７】
変異されたｌｙｓＣ／ＬｙｓＣのアミノ酸シーケンス及びヌクレオチドシーケンスを、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及び４で表示する。
【０２１８】
より詳しくは、２つの異なるＤＮＡ断片をそれぞれプライマー対Ｐ１／Ｐ２（ＰＣＲ１）及びＰ３／Ｐ４（ＰＣＲ２）を用いてまずＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ１及びＰＣＲ２は、それぞれＰ２及びＰ３を介してのｌｙｓＣ遺伝子のヌクレオチドシーケンスにおける９３２位で点突然変異を行うことに使用する。プライマーＰ１及びＰ４は例えばＸｈｏＩ及び
ＳｐｅＩなどの制限酵素の認識部位を追加することに使用する。
【０２１９】
ＰＣＲ１において、９３２位での点突然変異を含む、約９４６ｂｐのｌｙｓＣ遺伝子のシーケンス及び約５００ｂｐのｌｙｓＣのアップストリームシーケンス、並びにＸｈｏＩ
の認識部位を含有する１４６７ｂｐのＤＮＡ断片を取得する。
【０２２０】
ＰＣＲ２において、ｌｙｓＣ遺伝子の９３２位でのヌクレオチド交換を含むｌｙｓＣ遺伝子の一部、人為的に付加されたｓｐｅＩの認識部位と共に約１５０ｂｐのｌｙｓＣ遺伝
子のダウンストリームシーケンスを含有する４４９ｂｐのＤＮＡ断片を取得する。
【０２２１】
次の段階で、それぞれＰＣＲ１及びＰＣＲ２で生産された精製ＤＮＡだけでなくプライマー組み換えＰ１及びＰ４を鋳型として用いて、前記２つのＤＮＡ断片をＰＣＲ３で融合する。その結果、生成されたＤＮＡ断片は、そのサイズが１９１６ｂｐであり、約５００ｂｐのｌｙｓＣのアップストリームシーケンス、９３２位での点突然変異を含むｌｙｓＣの完全なＯＲＦ及び約１５０ｂｐのｌｙｓＣのダウンストリームシーケンスだけでなく、人為的に付加されたＸｈｏＩ及びＳｐｅＩの認識部位を含有する。
【０２２２】
他の方法では、プライマーＰ１及びＰ４、並びに既にｌｙｓＣ遺伝子内に所望のヌクレオチド交換を含有しているＤＮＡ鋳型を用いて、所望のベクター構築物を取得する。
【０２２３】
増幅段階に続いて、ＰＣＲ産物を制限酵素ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩを用いて切断し、ベク
ターｐＣｌｉｋに挿入した後、これを用いて大腸菌(E.coli)ＤＨ５αを形質転換する。形質転換された大腸菌(E.coli)ＤＨ５αの培養に続いて、ベクターを分離して大腸菌(E.coli)ＮＭ５２２を形質転換することに使用する。この菌株は、既にＣ．グルタミカムのＤＮＡ−メチル転移酵素の発現ベクターであるｐＴＣプラスミド（前記表３参照）を含む。大腸菌(E.coli)ＮＭ５２２内の２つのプラスミドの共存は、正確にメチル化された形質転換ベクターの増幅を引き起こす。
【０２２４】
正確にメチル化されたｌｙｓＣT311I遺伝子を含有するプラスミドｐＣｌｉｋ＿ｌｙｓＣT311Iを用いてエレクトロポレーションによって、野生型菌株ＡＴＣＣ１３０３２を形質転換する。第１及び第２組み換えの手順を上述したとおり行う。ランダムに選択された菌株をシーケンス分析によって調査する。下記の菌株１として表示された、陽性と明らかにされた組み換え体を、後の遺伝子変異に使用する。
【０２２５】
ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするｄｄｈ遺伝子の２つのコピーを含む形質転換ベクターＮｏ５（ｐＫ１９＿２ｘｄｄｈ）の構築
Ｐ５〜Ｐ８（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ：３９〜４２）と命名されたプライマーを用いてベクターＮｏ．５（表３参照）を構築し、上述した菌株１のバックグラウンドでｄｄｈの第２遺伝子コピーを対立形質置換によって導入する。
【０２２６】
ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）をコードする野生型ｄｄｈ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を増幅させるために、例えばＣ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の分離されたゲノムＤＮＡをＰ５、Ｐ６、Ｐ７及びＰ８を用いてＰＣＲ増幅する。
【０２２７】
ＰＣＲ１において、完全なｄｄｈシーケンスだけでなく、２４５ｂｐのｄｄｈ遺伝子のアップストリームシーケンス及び８４ｂｐのｄｄｈ遺伝子のダウンストリームシーケンスを、Ｐ５及びＰ６を用いて増幅する。その結果、生成されたＰＣＲ産物は、そのサイズが１３０５ｂｐであり、Ｐ５によって導入されたＥｃｏＲＩの認識部位を含有する。
【０２２８】
ＰＣＲ２において、ｄｄｈの完全なシーケンスは、２４５ｂｐのｄｄｈ遺伝子のアップストリーム及び８４ｂｐのｄｄｈ遺伝子のダウンストリームと共にプライマーＰ７及びＰ８を用いて増幅する。その結果、生成されたＤＮＡ断片は、そのサイズが１３０５ｂｐであり、Ｐ８によって添加されたＳａｌＩの認識部位を含有する。
【０２２９】
次の段階において、それぞれＰＣＲ１及びＰＣＲ２で取得された２つの精製されたＤＮＡ産物を鋳型として使用し、ＰＣＲ３でプライマー組み合わせＰ５及びＰ８を用いて融合する。
【０２３０】
その結果、生成されたＤＮＡ断片は、そのサイズが２５３０ｂｐであり、それぞれサイズ２４５ｂｐのアップストリーム部分及びサイズ８４ｂｐのダウンストリーム部分を側面に配置した２つの完全なｄｄｈ遺伝子だけでなく、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：７参照）の認識部位を含有する。
【０２３１】
増幅段階の後、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩを用いてＰＣＲ産物を切断させ、大腸
菌(E.coli)ＤＨ５αの形質転換に使用したベクターｐＫ１９に挿入した。培養段階の後、ベクターを、分離し、且つ正確にメチル化された形質転換ベクターの増幅を可能とするｐＴＣプラスミドを保有する大腸菌(E.coli)ＮＭ５２２の形質転換に使用した。
【０２３２】
正確にメチル化されたｄｄｈ遺伝子を含むプラスミドｐＫ１９＿２ｘｄｄｈを、エレクトロポレーションを用いて上述の菌株１の形質転換に使用する。第１及び第２組み換えの手順を上述したとおり行う。ランダムに選択された菌株をＰＣＲ分析及び酵素活性測定によって調査する。下記の菌株２として表示された、陽性と明らかにされた組み換え体は、後の遺伝子変異に使用する。
【０２３３】
部分的に欠失されたＰＥＰカルボキシナーゼを含む形質転換ベクターＮｏ６（ｐＣｌｉｋ＿Δｐｃｋ）の構築
形質転換ベクターＮｏ６（ｐＣｌｉｋ＿Δｐｃｋ：前記表３を参照）の構築のために、プライマーＰ９〜Ｐ１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３〜４６）を用いて、対立形質の置換によって上述の菌株２のバックグラウンドにおいて末端の切られたＰＥＰ−カルボキシキナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）をコードする、破壊された形態の遺伝子ｐｃｋ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）を導入した。
【０２３４】
ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）をコードする野生型ｐｃｋ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に導入された部分欠失のために、Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡをプライマーＰ９、Ｐ１０、Ｐ１１、及びＰ１２を用いてＰＣＲ増幅する。
【０２３５】
プライマーＰ９及びＰ１０を用いて、ＰＣＲ１でｐｃｋ遺伝子のヌクレオチド１１１〜５０９を含有する４２０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。Ｐ１０を用いて２１ｂｐのプライマーＰ１１に相互補完的な２１ｂｐを人為的に加える。取得されたシーケンスはＢａｍＨＩの自然認識部位を含有する。
【０２３６】
ＰＣＲ２において、ｐｃｋ遺伝子のヌクレオチド１４３７〜１８３３を含む４１７ｂｐのＤＮＡ断片を、プライマー対Ｐ１１及びＰ１２を用いて増幅する。Ｐ１１を用いて２１ｂｐのＰ１０に相互補完的な２１ｂｐを人為的に加える。認識部位ＢａｍＨＩを人為的に
加えるためにＰ１２を使用する。
【０２３７】
次の段階において、それぞれＰＣＲ１及びＰＣＲ２で取得された２つの精製されたＤＮＡ断片をプライマー組み合わせＰ９及びＰ１２を用いて、ＰＣＲ３で融合する。その結果として生成されたＤＮＡ断片は、サイズが８０７ｂｐであり、ｐｃｋ遺伝子のヌクレオチド１１１〜５０９及び１４３７〜１８３３、プライマーＰ１１及びＰ１２によって添加された２１個の追加的な塩基対だけでなく、ＢａｍＨＩの２つの認識部位を含有する。
【０２３８】
増幅段階の後、ＰＣＲ産物を、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて切断し、大腸菌(E.coli)Ｄ
Ｈ５αの形質転換に使用されるベクターｐＣｌｉｋに挿入する。次いで、前記ベクターを形質転換された大腸菌(E.coli)ＤＨ５αから分離し、上述したとおり正確にメチル化された形質転換ベクターの増幅を引き起こす大腸菌(E.coli)ＮＭ５２２の形質転換に使用する。プラスミドｐＣｌｉｋ＿Δｐｃｋが含む正確にメチル化されたＤＮＡは、エレクトロポレーションを用いて上述の菌株２に形質転換した。第１及び第２組み換えの手順を上述したとおり行う。ランダムに選択された菌株をＰＣＲ分析及びサザンブロッティング(Southern Blotting)で検査する。下記の菌株３として表示された、陽性と明らかにされた組み換え体を、後続の遺伝子変異に使用する。
【０２３９】
変異されたジヒドロジピコリン酸リダクターゼを含む形質転換ベクターＮｏ７（ｐＫ１９＿ＰsodｄａｐＢ）の構築
ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）をコードするｄａｐＢ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）及びｄａｐＢ遺伝子のアップストリーム内で、ｓｏｄプロモーターで特異的に結合するプライマーを用いて形質転換ベクターＮｏ７（ｐＫ１９＿ＰsodｄａｐＢ；前記表３を参照）を構築して、上述の菌株３のバックグラウンドでプロモーター変異を対立形質の置換によって導入する。
【０２４０】
より詳しくは、ｄａｐＢ遺伝子のプロモーター交換は、Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを、それぞれｓｏｄプロモーター、ｄａｐＢ遺伝子、ｄａｐＢ遺伝子のアップストリームのシーケンス内で特異的に結合するプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。Ｐ１３、Ｐ１４、Ｐ１５、Ｐ１６、Ｐ１７及びＰ１８に指定された適切なプライマーシーケンスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：４７〜５２に説明されている。
【０２４１】
ＰＣＲ１において、ｓｏｄプロモーターのシーケンスを含有する約２００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。これはＰ１３及びＰ１４によった達成されたが、これはｄａｐ遺伝子と重複するシーケンスが３’末端に人為的に付加されるようにする。
【０２４２】
ＰＣＲ２において、開始コドン及び遺伝子の５’部分を含むｄａｐβ遺伝子の部分を増幅する。これはｓｏｄプロモーターと重複するシーケンスを開始コドンの５’末端に人為的に付加するプライマーＰ１５及びＰ１６によって影響を受ける。
【０２４３】
次の段階において、それぞれＰＣＲ１及びＰＣＲ２で取得された２つの精製されたＤＮＡ断片を、ＰＣＲ３でｓｏｄ及びｄａｐＢ特異プライマーシーケンスを用いて融合する。
【０２４４】
ＰＣＲ４でｄａｐＢ遺伝子のアップストリームシーケンスの部分を増幅する。これは３’末端でｓｏｄプロモーターと重複するシーケンスを、人為的に付加するプライマーＰ１７及びＰ１８を用いて達成される。
【０２４５】
次の段階において、それぞれＰＣＲ３及びＰＣＲ４で取得された、精製されたＤＮＡ断片をプライマーＰ１７及びＰ１６を用いて融合する。このプライマーは最終ＤＮＡ断片を側面に置き、ベクター−挿入体−結紮に適した制限酵素の認識部位を人為的に付加する。
【０２４６】
ベクター−挿入体−結紮のために、ＰＣＲ産物及びベクターを選択された制限酵素で切断し、結札した後、これを用いて大腸菌(E. coli)ＤＨ５αを形質転換する。培養段階の後、ベクターを分離し、これを、正確にメチル化された形質転換ベクターの増幅を可能とするｐＴＣプラスミドを保有する大腸菌(E. coli)ＮＭ５２２の形質転換に使用する。
【０２４７】
正確にメチル化されたプラスミドｐＫ１９＿ＰsodｄａｐＢを、エレクトロポレーションを用いて上述の菌株３の形質転換に使用する。第１及び第２組み換えの手順を上述のとおり行う。ランダムに選択された菌株をＰＣＲ分析で調査する。下記の菌株４として表示された、陽性と明らかにされた組み換え体は、後の遺伝子変異に使用する。
【０２４８】
ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの２つのコピーを含む形質転換ベクターＮｏ８（ｐＫ１９＿２ｘｌｙｓＡ及びａｒｇＳ）の構築
形質転換ベクターＮｏ８（ｐＫ１９＿２ｘａｒｇＳｌｙｓＡ：前記表３を参照）をｌｙｓＡ遺伝子内及びそのダウンストリームだけでなく、アルギニル−ｔＲＮＡシンターゼをコードするａｒｇＳ遺伝子内及びそのアップストリームに、特異的に結合するプライマーの助けで構築し、対立形質の置換によって菌株４に導入されたａｒｇＳのシーケンスと共にｌｙｓＡの２番目の遺伝子コピーを取得する。ａｒｇＳｌｙｓＡ遺伝子群はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で表示される。ＬｙｓＡのアミノ酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で表示される。
【０２４９】
ｌｙｓＡ及びａｒｇＳの２番目の遺伝子コピーを行うために、例えば、Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅する。このために、全体のクラスターをカバーする３つの別途増幅されたＤＮＡ断片からａｒｇＳｌｙｓＡ群の各コピーが構築される。前記断片は分離されたＰＣＲで取得される。前記目的のために使用するプライマーシーケンスは、Ｐ１９、Ｐ２０、Ｐ２１、Ｐ２２、Ｐ２３、Ｐ２４、Ｐ２５及びＰ２６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：５３〜６０）である。
【０２５０】
ＰＣＲ１において、プライマーＰ１９及びＰ２０を用いて、ａｒｇＳ遺伝子の５’部分をａｒｇＳ遺伝子の約５００ｂｐのアップストリームと共に増幅する。５’部分はａｒｇＳのプロモーターシーケンスを含む。プライマーＰ１９はまた、ＢａｍＨＩの認識部位を
人為的に付加することにも使用する。プライマーＰ２０は、ＥｃｏＲＩの自然的に発生す
る認識部位に位置する。取得されたＤＮＡ断片のサイズは１４１０ｂｐである。
【０２５１】
ＰＣＲ２において、プライマーＰ２１及びＰ２２を用いて、ａｒｇＳ遺伝子の３’部分をｌｙｓＡ遺伝子の５’部分と共に増幅する。プライマーＰ２１はＥｃｏＲＩの自然的に
発生する認識部位に位置する。プライマーＰ２２はＳａｌＩの自然的に発生する認識部位
に局限される。取得されたＤＮＡ断片のサイズは約９３５ｂｐである。
【０２５２】
ＰＣＲ３において、プライマーＰ２３及びＰ２４を用いて、ｌｙｓＡ遺伝子の３’部分を約８０ｂｐのｌｙｓＡのダウンストリームシーケンスと共に増幅する。プライマーＰ２３はＳａｌＩの自然的に発生する認識部位に位置する。プライマーＰ２４はＸｂａＩの認
識部位を添加することに使用する。取得されたＤＮＡ断片のサイズは約１２９０ｂｐである。次いで、ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩの認識部位を介して連結させる。ＰＣ
Ｒ１、ＰＣＲ２及びＰＣＲ３からの連結されたＤＮＡ断片は、ａｒｇｓＳｌｙｓＡ群の一番目のコピーを示す。次の段階で、２番目のａｒｇＳｌｙｓＡ群を構築する。
【０２５３】
ＰＣＲ４において、プライマーＰ２５及びＰ２０を用いて、ａｒｇＳ遺伝子の５’部分を約５００ｂｐのａｒｇＳ遺伝子のアップストリームと共に増幅する。このアップストリーム部分はａｒｇＳのプロモーターシーケンスを含む。Ｐ２５を用いてＸｂａＩの認識部
位を人為的に付加する。Ｐ２０はＥｃｏＲＩの自然的に発生する認識部位に位置する。取
得されたＤＮＡ断片のサイズは約１３７４ｂｐである。
【０２５４】
ＰＣＲ５において、プライマーＰ２１及びＰ２２を用いて、ａｒｇｓＳ遺伝子の３’部分をｌｙｓＡ遺伝子の５’部分と共に増幅する。Ｐ２１はＥｃｏＲＩの自然的に発生する
認識部位に位置し、Ｐ２２はＳａｌＩの自然的に発生する認識部位に位置する。取得され
たＤＮＡ断片のサイズは約９３５ｂｐである。
【０２５５】
ＰＣＲ６において、プライマーＰ２３及びＰ２６を用いて、ｌｙｓＡ遺伝子の３’部分を約７０ｂｐのｌｙｓＡのダウンストリームシーケンスと共に増幅する。Ｐ２３はＳａｌＩの自然的に発生する認識部位に位置する。Ｐ２６を用いてＨｉｎｄIIIの認識部位を追加する。取得されたＤＮＡ断片のサイズは約１２５６ｂｐである。
【０２５６】
次いで、ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びｓａｌＩの認識部位を介して連結させる。ＰＣＲ
４、ＰＣＲ５及びＰＣＲ６からの連結されたＤＮＡ断片はａｒｇＳｌｙｓＡ群の２番目のコピーを示す。
【０２５７】
ａｒｇＳｌｙｓＡのコピー１及びコピー２それぞれを、プライマーＰ２４及びＰ２５によって追加されたＸｂａＩの認識部位を介して連結する。連結されたコピー（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１６）をそれぞれプライマーＰ１９及びｐ２６を介して追加されたＢａｍＨＩ
及びＨｉｎｄIIIの認識部位を介して形質転換ベクターｐＫ１９に挿入する。取得されたベクターを用いて大腸菌(E.coli)ＤＨ５αを形質転換する。培養段階の後、ベクターを分離し、正確にメチル化された形質転換ベクターの増幅を可能とするｐＴＣプラスミドを保有する大腸菌(E. coli)ＮＭ５２２の形質転換に使用する。プラスミドｐＫ１９＿２ｘａｒｇＳｌｙｓＡが含む正確にメチル化された構築物を用いてエレクトロポレーションで菌株４を形質転換する。第１及び第２組み換えの手順を上述したとおり行う。ランダムに選択された菌株をＰＣＲ分析で調査する。下記の菌株５として表示された、陽性と明らかにされた組み換え体は、後続の遺伝子変異に使用する。
【０２５８】
ｓｏｄプロモーターを用いたアスパラギン酸キナーゼ遺伝子を含む形質転換ベクターＮｏ９（ｐＣｌｉｋ＿ＰsodＬｙｓＣ）の構築
ｓｏｄプロモーター、ｌｙｓＣ遺伝子及びｌｙｓＣ遺伝子のアップストリーム内で特異的に結合するプライマーを用いて形質転換ベクターＮｏ９（ｐＣｌｉｋ＿ＰsodｌｙｓＣ：前記表３を参照）を構築し、菌株５のバックグラウンドにおけるプロモーターの変異及び開始コドンＧＴＧからＡＴＣへの伴われる置換を対立形質の置換によって導入する。開始コドンの変異、ｓｏｄプロモーター及び置換Ｔ３１１Ｉを保有するｌｙｓＣのＤＮＡシーケンスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で表示される。
【０２５９】
ｌｙｓＣ遺伝子のプロモーター交換のために、例えばＣ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡをそれぞれｓｏｄプロモーター、ｌｙｓＣ遺伝子、及びｌｙｓＣ遺伝子のアップストリーム内で特異的に結合するプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。適切なプライマーをＰ２７、Ｐ２８、Ｐ２９、Ｐ３０、Ｐ３１及びＰ３２と指定する（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１〜６６）。
【０２６０】
ＰＣＲ１において、ｓｏｄプロモーターのシーケンスを含有するサイズ約２００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。これはプライマーＰ２７及びＰ２８を用いることにより達成されるが、これはｌｙｓＣ遺伝子と重複するシーケンスが３’末端に人為的に付加されるようにする。Ｐ２８は、開始コドンＧＴＧからＡＴＧへの交換が行われるようにｌｙｓＣの開始コドンの位置で所定のヌクレオチド交換をもたらす。
【０２６１】
ＰＣＲ２において、遺伝子の開始コドン及び５’部分を含むｌｙｓＣ遺伝子の部分を増幅する。これはプライマーＰ２７及びＰ２８を用いることにより達成されるが、これにより、ｓｏｄプロモーターと重複するシーケンスが、開始コドンに付着した５’末端に人為的に付加される。Ｐ２９は開始コドンの置換のための所定のヌクレオチド交換をさらに含む。次の段階において、ＰＣＲ１及びＰＣＲ２で生産された、取得及び精製された２つのＤＮＡ断片をＰＣＲ３で、それぞれＰＣＲ１及びＰＣＲ２で以前に使用されたｓｏｄ及びｌｙｓＣ特異プライマーシーケンスの助けで融合する。
【０２６２】
ＰＣＲ４において、Ｐ３１及びＰ３２の助けでｌｙｓＣ遺伝子のアップストリームシーケンスの部分を増幅するが、これによりｓｏｄプロモーターと重複するシーケンスが３’末端に人為的に付加される。
【０２６３】
次の段階において、プライマーＰ３１及びＰ３０だけでなく、鋳型としてＰＣＲ３及びＰＣＲ４からの精製されたＤＮＡを用いてＰＣＲ３及びＰＣＲ４からのＤＮＡ断片を融合する。
【０２６４】
末端プライマー（Ｐ３１及びＰ３０）を用いて、ベクター−挿入体−結紮に適した制限酵素の認識部位を人為的に付加する。このために、選択された制限酵素を用いてＰＣＲ産物及びベクターを切断し結紮した後、大腸菌(E.coli)ＤＨ５αの形質転換に使用する。培養段階の後、ベクターを分離し、これを、正確にメチル化された形質転換ベクターの増幅を可能とするｐＴＣプラスミドを保有する大腸菌(E.coli)ＮＭ５２２の形質転換に使用する。ｐＣｌｉｋ＿ＰsodｌｙｓＣが含む正確にメチル化された構築物は、エレクトロポレーションを用いて菌株５を形質転換することに使用する。第１及び第２組み換えの手順を上述したとおり行う。ランダムに選択された菌株をＰＣＲ分析で調査する。下記の菌株６として表示された、陽性と明らかにされた組み換え体を、後続の遺伝子変異に使用する。
【０２６５】
突然変異化されたホモセリンデヒドロゲナーゼを含む形質転換ベクターＮｏ１０（ｐＣｌｉｋ＿ｈｏｍV59A）の構築
プライマーＰ３３〜Ｐ３６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７〜７０）を用いて形質転換ベクターＮｏ１０（ｐＣｌｉｋ＿ｈｏｍV59A、前記表３を参照）を構築し、対立形質の置換によって菌株６のバックグラウンドでのｈｏｍ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）における点突然変異を導入する。
【０２６６】
Ｈｏｍ−ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）の５９位におけるバリンからアラニンへのアミノ酸置換を引き起こす点突然変異を保有するＣ．グルタミカム菌株の製造のために、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするＯＲＦを増幅する。
【０２６７】
このために、例えばＣ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを野生型ｈｏｍ遺伝子の１７６位での核酸変異を引き起こす適切なプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。これはＰ３３、Ｐ３４、Ｐ３５及びＰ３６を用いて達成される。変異されたｈｏｍ／Ｈｏｍのヌクレオチドシーケンス及びポリペプチドシーケンスはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０及び２１で表示される。
【０２６８】
より詳しくは、２つの分離されたＤＮＡ断片を、まずそれぞれプライマーＰ３３／Ｐ３４（ＰＣＲ１）及びＰ３５／Ｐ３６（ＰＣＲ２）を用いて増幅する。
【０２６９】
それぞれＰＣＲ１及びＰＣＲ２を用いてプライマー３４及び３５の助けにより、ｈｏｍ遺伝子のヌクレオチドシーケンスで位置１７６における点突然変異を行う。
【０２７０】
このプライマー組み合わせが使用されると、１７６位における点突然変異を含む約１８６ｂｐのｈｏｍ遺伝子及び約５００ｂｐのｈｏｍ遺伝子のアップストリームシーケンスを含有する６８６ｂｐのＤＮＡ断片が、ＰＣＲ１で取得される。
【０２７１】
ＰＣＲ２において、ｈｏｍ遺伝子の１７６位におけるヌクレオチド交換を含むｈｏｍ遺伝子の部分を含有する約１０５４ｂｐのＤＮＡ断片が取得される。
【０２７２】
次の段階において、前記２つのＤＮＡ断片を、それぞれプライマー組み合わせＰ３３及びＰ３６、並びにＰＣＲ１及びＰＣＲ２で取得された２つの精製されたＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲ３で融合する。その結果として作られたＤＮＡ断片は、サイズが１７１８ｂｐであり、１７６位における点突然変異を含む約１２１８ｂｐの不完全なｈｏｍ遺伝子及び約５００ｂｐのｈｏｍのアップストリームシーケンスを含有する。
【０２７３】
代案的に、プライマーＰ３３及びＰ３６並びにｈｏｍ遺伝子内の所定のヌクレオチド交換を既に含有するＤＮＡ鋳型を用いて、所定の構築物を取得する。プライマーＰ３３〜Ｐ３６を用いると、増幅されたＤＮＡ断片は自然的にＸｍａＩ及びＮｈｅＩの認識部位を含
有する。
【０２７４】
増幅段階の後、制限酵素ＸｍａＩ及びＮｈｅＩを用いてＰＣＲ産物を切断させ、その結
果として作られた断片を、以前にＸｍａＩ及びＳｐｅＩで切断されたベクターｐＣｌｉｋ
に挿入する。ＳｐｅＩ及びＮｈｅＩはＤＮＡ切断の間に相補的な粘着性末端を形成する。
ベクターを用いて大腸菌(E.coli)ＤＨ５αを形質転換する。培養段階の後、ベクターを分離し、これを、正確にメチル化された形質転換ベクターの増幅を可能とするｐＴＣプラスミドを保有する大腸菌(E.coli)ＮＭ５２２の形質転換に使用する。プラスミドｐＣｌｉｋ＿ｈｏｍV59Aが含む正確にメチル化されたｈｏｍV59A遺伝子を用いてエレクトロポレーションで菌株６を形質転換する。第１及び第２組み換えの手順を上述したとおり行った。ランダムに選択された菌株をシーケンス分析で調査した。下記の菌株７として表示された、陽性と識別された組み換え体を用いて、後続の遺伝子変異を行った。
【０２７５】
突然変異体ピルビン酸カルボキシラーゼを含む形質転換ベクターＮｏ１１（ｐＣｌｉｋ＿ｐｙｃP458S）の構築
形質転換ベクターＮｏ１１（ｐＣｌｉｋ＿ｐｙｃP458S、前記表３を参照）を、対立形質の置換によって菌株７のバックグラウンドにおけるｐｙｓ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）の点突然変異の導入に適したプライマーＰ３７〜Ｐ４０を用いて構築する。
【０２７６】
Ｐｙｃ−ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）の４５８位でのプロリンからセリンへのアミノ酸置換を引き起こす点突然変異を保有するＣ．グルタミカム菌株の製造のために、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＯＲＦを増幅させた。
【０２７７】
このために、例えばＣ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の分離されたゲノムＤＮＡを、野生型ｐｙｃ遺伝子の１３７２位での核酸変異を引き起こす適切なプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。これはＰ３７、Ｐ３８、Ｐ３９及びＰ４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：７１〜７４）に指定されたプライマーを用いて達成される。変異されたｐｙｃ／Ｐｙｃのヌクレオチドシーケンス及びポリペプチドシーケンスはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４及び２５で表示される。
【０２７８】
より詳しくは、２つの分離されたＤＮＡ断片をそれぞれ３７Ｐ／Ｐ３８（ＰＣＲ１）及びＰ３９／Ｐ４０（ＰＣＲ２）を用いて先ず生産する。この場合、ＰＣＲ１及びＰＣＲ２はそれぞれＰ３８及びＰ３９の助けでｐｙｃ遺伝子のヌクレオチドシーケンスにおける１３７２位で点突然変異を導入することに使用する。
【０２７９】
ＰＣＲ１において、遺伝子の１３７２位での点突然変異を含む不完全なｐｙｃ遺伝子を含有する７４５ｂｐのＤＮＡ断片が取得される。
【０２８０】
ＰＣＲ２において、ｐｙｃ遺伝子の１３７２位でのヌクレオチド交換を含むｐｙｃ遺伝子の部分を含有する７４４ｂｐのＤＮＡ断片が取得される。
【０２８１】
次の段階において、それぞれＰＣＲ１及びＰＣＲ２で取得された２つのＤＮＡ断片をプライマー組み合わせＰ３７及びＰ４０を用いてＰＣＲ３で融合する。その結果として生成されたＤＮＡ断片は、そのサイズが１４６１ｂｐであり、遺伝子の１３７２位での所定の点突然変異を含むｐｙｃ遺伝子の不完全なシーケンスを含有する。
【０２８２】
代案的に、プライマーＰ３７及びＰ４０、並びにｐｙｃ遺伝子における所定のヌクレオチド交換を既に含むＤＮＡ鋳型を用いて、所定の構築物を取得する。増幅されたＤＮＡ断片はＭｌｕＩ及びＳａｌＩなどの制限酵素の適切な認識部位を介してベクターｐＣｌｉｋ
へ挿入できる。
【０２８３】
突然変異ピルビン酸カルボキシラーゼを含むベクターを大腸菌(E.coli)ＤＨ５αの形質転換に使用する。培養段階の後、ベクターを分離し、これを、正確にメチル化された形質転換ベクターの増幅を可能とするｐＴＣプラスミドを保有する大腸菌(E.coli)ＮＭ５２２の形質転換に使用する。プラスミドｐＣｌｉｋ＿ｐｙｃＰ458Sが含む正確にメチル化されたｐｙｃP458S遺伝子を用いてエレクトロポレーションで菌株７を形質転換する。第１及び第２組み換えの手順を上述したとおり行う。ランダムに選択された菌株をシーケンス分析で調査する。菌株８として表示された、陽性と明らかにされた組み換え体を用いて、後続の遺伝子変異を行う。
【０２８４】
ｓｏｄプロモーターを用いたピルビン酸カルボキシラーゼを含む形質転換ベクターＮｏ１２（ｐＣｌｉｋ＿Ｐsodｐｙｃ）の構築
ｐｙｃ遺伝子及びｐｙｃ遺伝子のアップストリーム内、ｓｏｄプロモーター内で特異的に結合するプライマーの助けで形質転換ベクターＮｏ１２（ｐＣｌｉｋ＿Ｐsodｐｙｃ）を構築し、対立形質の置換によって菌株８のバックグラウンドでプロモーター交換を導入する。ｓｏｄプロモーターを有するｐｙｃシーケンスはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で表示される。前記シーケンスは上述した４５８位でのアミノ酸置換も含有する。
【０２８５】
ｐｙｃ遺伝子のプロモーター交換のために、例えばＣ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを、それぞれｐｙｃ遺伝子のアップストリームだけでなく、ｓｏｄプロモーターのシーケンス及びｐｙｃ遺伝子のシーケンス内で特異的に結合するプライマーを用いてＰＣＲ増幅させた。適切なプライマーシーケンスは、Ｐ４１、Ｐ４２、Ｐ４３、Ｐ４４、Ｐ４５及びＰ４６（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ ７５〜８０）と指定されたプライマーをコードする配列に現れる。
【０２８６】
ＰＣＲ１において、ｓｏｄプロモーターのシーケンスを含有する約２００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。これはＰ４１及びＰ４２を用いて達成されるが、これにより、ｐｙｃ遺伝子と重複するシーケンスが人為的に３’末端に付加される。
【０２８７】
ＰＣＲ２において、開始コドン及び遺伝子の５’部分を含むｐｙｃ遺伝子の部分を増幅する。これはＰ４３及びＰ４４を用いて達成されるが、これにより、ｓｏｄプロモーターと重複するシーケンスが、開始コドンに付着した５’末端に人為的に付加される。
【０２８８】
次の段階において、取得された２つのＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ１及びＰＣＲ２で使用されたｓｏｄ及びｐｙｃ特異プライマーシーケンス、並びにＰＣＲ１及びＰＣＲ２からの精製されたＤＮＡを用いて、ＰＣＲ３で融合する。
【０２８９】
ＰＣＲ４でｐｙｃ遺伝子のアップストリームシーケンスの部分を増幅する。これはプライマーＰ４５及びＰ４６によって達成できるが、これにより、ｓｏｄプロモーターと重複するシーケンスが人為的に３’末端に付加される。
【０２９０】
その後、鋳型としてＰＣＲ３及びＰＣＲ４からの精製されたＤＮＡ、並びにプライマーＰ４５及びＰ４４を用いて、ＰＣＲ３及びＰＣＲ４から生成されたＤＮＡ断片を融合する。プライマーＰ４５及びＰ４４を用いて、ベクター−挿入体−結紮を助ける制限酵素の認識部位を人為的に付加する。このために、ＰＣＲ産物及びベクターを選択された制限酵素で切断し、結紮した後、これを用いて大腸菌(E.coli)ＤＨ５αを形質転換する。培養段階の後、ベクターを分離し、これを用いて、正確にメチル化された形質転換ベクターの増幅を可能とするｐＴＣプラスミドを保有する大腸菌(E.coli)ＮＭ５２２を形質転換する。プラスミドｐＣｌｉｋ＿Ｐsodｐｙｃが含む正確にメチル化された構築物を用いてエレクトロポレーションで菌株８を形質転換する。第１及び第２組み換えの手順を上述したとおり行う。ランダムに選択された菌株をＰＣＲ分析によって調査する。下記の菌株９として表示された、陽性と明らかにされた組み換え体を用いて、後続の遺伝子変異を行う。
【０２９１】
変異されたイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む形質転換ベクターＮｏ１３（ｐＣｌｉｋ＿ｉｃｄA1G）の構築
形質転換ベクターＮｏ１３（ｐＣｌｉｋ＿ｉｃｄA1G；前記表３を参照）をプライマーＰ４７〜Ｐ５０の助けで構築し、対立形質の置換によって菌株９のバックグラウンドで開始コドンの交換を導入する。
【０２９２】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）をコードするｉｃｄ遺伝子において開始コドン交換ＡＴＧ→ＧＴＧを保有するＣ．グルタミカム菌株の製造のために、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）をコードするＯＲＦを増幅する。
【０２９３】
このために、以前に分離されたＣ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡをｉｃｄ遺伝子の開始コドン位置で核酸変異を導入する適切なプライマーを用いてＰＣＲ増幅させた。プライマーＰ４７、Ｐ４８、Ｐ４９及びＰ５０を使用する（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１〜８４）。変異されたｉｃｄ遺伝子のヌクレオチドシーケンスはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で表示される。
【０２９４】
さらに詳しくは、２つの分離されたＤＮＡ断片を、それぞれＰＣＲプライマーＰ４７／Ｐ４８（ＰＣＲ１）及びＰ４９／Ｐ５０（ＰＣＲ２）を用いて、まず増幅する。Ｐ４８及びＰ４９を用いてｉｃｄ遺伝子のヌクレオチドシーケンスの開始コドン位置での点突然変異を行うことに、ＰＣＲ１及びＰＣＲ２を使用する。Ｐ４７を用いてＸｈｏＩの認識部位
を追加し、Ｐ５０を用いてＭｌｕＩの認識部位を追加した。
【０２９５】
ＰＣＲ１において、開始コドン位置での点突然変異を含む約１８ｂｐのｉｃｄ遺伝子及び５０２ｂｐのｉｃｄのアップストリームシーケンス並びにＸｈｏＩの認識部位を含有し
た約５２０ｂｐのＤＮＡ断片が取得された。
【０２９６】
ＰＣＲ２において、ＭｌｕＩの認識部位及び約７ｂｐのｉｃｄ遺伝子のアップストリー
ムシーケンス並びにｉｃｄ遺伝子の開始コドン位置でのヌクレオチド交換を含むｉｃｄ遺伝子の部分を含有する５２０ｂｐのＤＮＡ断片が取得される。
【０２９７】
次の段階で、鋳型としてそれぞれプライマー組み合わせＰ４７及びＰ５０、並びにＰＣＲ１及びＰＣＲ２からの精製されたＤＮＡを用いて、２つの取得されたＤＮＡ断片をＰＣＲ３で融合する。その結果として生成されたＤＮＡ断片は、そのサイズが１０１４ｂｐであり、ＸｈｏＩ及びＭｌｕＩの認識部位だけでなく、約５００ｂｐのｉｃｄのアップスト
リームシーケンス、開始コドン置換及び約５００ｂｐのｉｃｄ遺伝子を含有する。増幅段階の後、制限酵素ＸｈｏＩ及びＭｌｕＩを用いてＰＣＲ産物を切断させ、追って大腸菌(E
.coli)ＤＨ５αの形質転換に使用されるベクターｐＣｌｉｋに挿入する。培養段階の後、ベクターを分離し、これを、正確にメチル化された形質転換ベクターの増幅を可能とするｐＴＣプラスミドを保有する大腸菌(E.coli)ＮＭ５２２の形質転換に使用する。
【０２９８】
プラスミドｐＣｌｉｋ＿ｉｃｄA1Gが含む、正確にメチル化されたｉｃｄA1G遺伝子を用いて、エレクトロポレーションで菌株９を形質転換する。第１及び第２組み換えの手順を上述したとおり行う。ランダムに選択された菌株を酵素活性及びシーケンス分析で調査する。下記の菌株１０として表示された、陽性と明らかにされた組み換え体を用いて、後続の遺伝子変異を行う。
【０２９９】
ｅｆｔｕプロモーターを用いたフルクトース１，６−ビスホスファターゼを含む形質転換ベクターＮｏ１４（ｐＣｌｉｋ＿Ｐeftuｆｂｐ）の構築
形質転換ベクターＮｏ１４（ｐＣｌｉｋ＿Ｐeftuｆｂｐ；前記表３を参照）をｅｆｔｕプロモーター、ｆｂｐ遺伝子、及びｆｂｐ遺伝子のアップストリームに特異的に結合するプライマーを用いて構築する。前記ベクターを用いて対立形質の置換によって、上述の菌株１０のバックグラウンドでプロモーター交換を導入する。
【０３００】
フルクトース１，６−ビスホスファターゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）をコードする野生型ｆｂｐ遺伝子（ｆｂｐ遺伝子及び自然型プロモーターのシーケンスを示すＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）のプロモーター交換のために、Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅させた。それぞれｅｆｔｕプロモーター及びｆｂｐ遺伝子（ｅｆｔｕプロモーターと再結合したｆｂｐヌクレオチドシーケンスはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で表す）のシーケンス内にだけでなく、ｆｂｐ遺伝子のアップストリームに特異的に結合するプライマーを使用する。適切なプライマーシーケンスが、Ｐ５１、Ｐ５２、Ｐ５３、Ｐ５４、Ｐ５５及びＰ５６に指定されたプライマーをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５〜９０で表示される。
【０３０１】
ＰＣＲ１において、Ｐ５１及びＰ５２を用いて、ｅｆｔｕプロモーターのシーケンスを含有する約２００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲ２において、遺伝子の５’部分及び開始コドンを含むｆｂｐ遺伝子の部分を増幅する。これはＰ５３及びＰ５４を用いて達成されるが、これにより、ｅｆｔｕプロモーターと重複するシーケンスが、開始コドンに付着した５’末端に人為的に付加される。
【０３０２】
次の段階において、それぞれＰＣＲ１及びＰＣＲ２で取得された２つの精製されたＤＮＡ断片をＰＣＲ３で、それぞれＰＣＲ１及びＰＣＲ２で使用されたｅｆｔｕ及びｆｂｐ特異プライマーを用いて融合する。
【０３０３】
ＰＣＲ４において、ｆｂｐ遺伝子のアップストリームシーケンスの部分を増幅する。これはプライマーＰ５５及びＰ５６を用いて達成されるが、これにより、ｅｆｔｕプロモーターと重複するシーケンスが人為的に３’末端に付加される。
【０３０４】
次の段階において、鋳型としてＰＣＲ３及びＰＣＲ４からの精製されたＤＮＡだけでなく、プライマーＰ５５及びＰ５４を用いて、ＰＣＲ３及びＰＣＲ４からのＤＮＡ断片を融合する。プライマーＰ５５及びＰ５４は、また、ベクター−挿入体−結紮に使用できるＭｌｕＩ及びＳａｌＩなどの制限酵素の人為的な認識部位の付加に適する。このために、Ｐ
ＣＲ産物及びベクターを選択された制限酵素で切断し、結紮して大腸菌(E.coli)ＤＨ５αの形質転換に使用する。培養段階の後に、ベクターを分離し、これを、正確にメチル化された形質転換ベクターの増幅を可能とするｐＴＣプラスミドを保有する大腸菌(E.coli)ＮＭ５２２の形質転換に使用する。プラスミドｐＣｌｉｋ＿Ｐeftuｆｂｐが含む正確にメチル化された構築物を用いてエレクトロポレーションで菌株１０を形質転換する。第１及び第２組み換えの手順を上述したとおり行う。ランダムに選択された菌株をＰＣＲ分析で調査する。下記の菌株１１として表示される、陽性と明らかにされた組み換え体を用いて、後続の遺伝子変異を行う。
【０３０５】
ｔｋｔオペロン及びｓｏｄプロモーターを含む形質転換ベクターＮｏ１５（ｐＣｌｉｋ＿Ｐsodｔｋｔ）の構築
菌株１１のバックグラウンドにおけるプロモーター交換を引き起こすｓｏｄプロモーター、ｔｋｔ遺伝子及びｔｋｔ遺伝子のアップストリームで特異的に結合するプライマーを用いて、対立形質の置換によって形質転換ベクターＮｏ１５（ｐＣｌｉｋ＿Ｐsodｔｋｔ）を構築する。
【０３０６】
詳しくは、ｔｋｔオペロン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２はｔｋｔオペロンの一番目の遺伝子であるｔｋｔ遺伝子及びｔｋｔプロモーターのシーケンスを示す）のプロモーター交換を実現するために、例えばＣ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを、ｔｋｔオペロンの一番目の遺伝子であり且つｔｋｔ遺伝子のアップストリームだけでなく、トランスケトラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）をコードするｔｋｔ遺伝子及びｓｏｄプロモーターのシーケンス内に特異的に結合するプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。適切なプライマーシーケンスは、Ｐ５７、Ｐ５８、Ｐ５９、Ｐ６０、Ｐ６１及びＰ６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１〜９６）と命名したプライマーシーケンスに示される。
【０３０７】
ＰＣＲ１において、ｓｏｄプロモーターのシーケンスを含有する約２００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。これはＰ５７及びＰ５８を用いて達成される。ｓｏｄプロモーターシーケンス及びｔｋｔ遺伝子の組み換えはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で表示される。
【０３０８】
ＰＣＲ２において、開始コドン及び遺伝子の５’部分を含むｔｋｔ遺伝子の部分を増幅する。これはＰ５８及びＰ５９を用いて達成されるが、これにより、ｓｏｄプロモーターと重複するシーケンスが、開始コドンに付着した５’末端に人為的に付加される。
【０３０９】
次の段階において、ＰＣＲ１及びＰＣＲ２で取得された２つのＤＮＡ断片を精製し、ＰＣＲ３で鋳型として用いて、２つの断片を、ＰＣＲ１及びＰＣＲ２で使用されたｓｏｄ及びｔｋｔ特異プライマーシーケンスと融合した。
【０３１０】
ＰＣＲ４において、ｔｋｔ遺伝子のアップストリームシーケンスの部分を増幅する。これはＰ６１及びＰ６２を用いて達成されるが、これにより、ｓｏｄプロモーターと重複するシーケンスが人為的に３’末端に付加される。
【０３１１】
次の段階において、ＰＣＲ３及びＰＣＲ４からのＤＮＡ断片を、ＰＣＲ３及びＰＣＲ４で取得された精製ＤＮＡを鋳型として、Ｐ６１及びＰ６０をプライマーとして用いて融合する。Ｐ６１及びＰ６０を用いてＭｌｕＩ及びＳａｌＩなどのベクター−構築物−結紮に
適した制限酵素の認識部位を人為的に付加する。このために、ＰＣＲ産物及びベクターを選択された制限酵素で切断し、結紮して大腸菌(E.coli)ＤＨ５αの形質転換に使用する。培養段階の後に、ベクターを分離し、これを、正確にメチル化された形質転換ベクターの増幅を可能とするｐＴＣプラスミドを保有する大腸菌(E.coli)ＮＭ５２２の形質転換に使用する。
【０３１２】
プラスミドｐＣｌｉｋ＿Ｐsodｔｋｔが含む正確にメチル化された構築物を用いて、エレクトロポレーションで菌株１１を形質転換する。第１及び第２組み換えの手順を上述したとおり行う。ランダムに選択された菌株をＰＣＲ分析で調査する。陽性と明らかにされた組み換え体を下記で菌株１２とする。
【０３１３】
テーラーメイド型リシン高生産源の構築
本発明の好適な実施態様において、Ｃ．グルタミカムを用いてリシン生産を合理的に最適化する他の戦略を成功的に行った。
【０３１４】
親菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ１及びＣ．グルタミカムＢＳ８７の例を挙げると、リシン生合成の主経路からの幾つかの標的の利点、ＮＡＤＰＨ代謝、前駆体供給及びＣＯ2形成を調査した。野性型ベースの高生産源の構築目的をもって、解明された変異を単一菌株で結合した。
【０３１５】
野生型Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に基づいて、産業的生産菌株に現れる有害な副作用を最小化するために、有益な変異のみを行った。
【０３１６】
菌株構築及び生産性
高生産源(hyper-producer)の創出のための第一段階は、リシン及びトレオニンによるフィードバック制御からアスパラギン酸キナーゼを放出させる、アミノ酸交換Ｔ３１１Ｉを導入することであった(Becker, et al., 2005)。これは上述したｄｄｈの過発現によって補完された。前記２つの変異の単独遂行及び追加の培地最適化は、既に１２５ｍｍｏｌのリシン（ｍｏｌ ｇｌｕｃｏｓｅ）-1を生産したリシン生産源を創出した。
【０３１７】
リシン生合成経路内のボトルネック現象を回避するために、ｄｄｈだけでなく、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ（ｄａｐＢ）、アスパラギン酸キナーゼ（ｌｙｓＣ）及びジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ｌｙｓＡ）を過発現させた。前記酵素はリシン生合成の共通経路の全ての部分である。よって、リシン生産への効果はスクシニラーゼとデヒドロゲナーゼブランチとの間を分割するフラックスと関係ない。
【０３１８】
追加の菌株の最適化は幾つかの追加的な遺伝子変異によって行われた。これは、自然ホモセリンデヒドロゲナーゼのアミノ酸交換Ｖ５９Ａを示す突然変異変異体への置換を含む。この突然変異は、リシン生合成と直接競争するトレオニン経路へ向かう炭素フラックスを減少させてリシン生産を増進させる(Ohnishi, et al., 2002)。リシン形成のためのオキサロ酢酸の十分な供給を確保するために、追加の変異は前駆体供給に重点を置いた。これは主要補充酵素ピルビン酸カルボキシラーゼの過発現及び変異(Ohnishi, et al., 2002; Peters-Wendisch, et al., 2001)と、ＯＡＡ−消費反応ＰＥＰカルボキシキナーゼの欠失を示唆した(Petersen, et al., 2001)。よって、その結果として生成された菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ８７は、リシン生合成内での９つの変異及び前駆体供給を含む（図３２）。
【０３１９】
ｌｙｓＣ遺伝子における調節点突然変異とｄｄｈ遺伝子の２番目のコピーのみを示す初期祖先菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ２２２とを比較すると、Ｃ．グルタミカムＢＳ８７における追加の変異はリシン生産の軽微な増加のみを提供するということが明らかになる（図１８）。よって、代謝の特異部分に重点を置いた変異戦略は、効率的な生産菌株を生産するには適さない。ところが、代謝工学による増加したリシン生産のための菌株最適化の歴史は、前記戦略によって明らかに示される。最適化されたリシン生産源の概念における主要反応としての主要経路ＴＣＡ回路及びＮＡＤＰＨ代謝は今まで殆ど等閑視された。この点に関連し、本発明は、前記限界点を克服して優れた生産菌株を構築するために、従来の戦略を完璧に補完する遺伝子標的を開示した。よって、意図する高生産源の生成のための次の段階はＴＣＡ回路に焦点を合わせた。上述したように、Ｃ．グルタミカムＢＳ８７のバックグラウンドのイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄatt）の減衰は、ＴＣＡ回路から補充カルボキシル化への効率的なフラックス転換によってリシン生産を大きく増加させた。リシン生産において、前記変異戦略は、ＣＯ2形成による炭素損失の減少だけでなく、オキサロ酢酸の増加された供給から利益を得る。ＮＡＤＰＨ代謝の後続の変異を２つの異なる戦略によって行った。最初に、ＮＡＤＰＨの供給増進に大きい影響を与えると解明されたグルコース新生合成酵素フルクトース１，６−ビスホスファターゼを過発現させた(Becker, et al., 2005)。上述したように、このアプローチはグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼの増幅された発現でよく補完する。トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの制限された容量によるＰＰＰにおける追加限界を最初から回避するために、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの過発現に伴い、上述したとおりｓｏｄプロモーターを介した完全なｔｋｔオペロンの上方調節によるＧ６ＰＤＨの過発現を行った。前記プロモーター交換に応えて、Ｇ６ＰＤＨ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの比活性が大きく増加した。変異戦略の概念が図３２に示されている。前記変異の利点は取得された系譜の炭素転換率と比較すれば明確になる（図１８）。
【０３２０】
野生型Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から始めて、次の有益な変異は野生型ベースのリシン高生産源を引き起こした。本発明は、全ての関連経路が考慮された完璧な合理的菌株の初報告である。主要調節酵素のフィードバック制御を克服するために、アスパラギン酸キナーゼ内で最初に導入された変異が重要であった。ｄｄｈ過発現から引き起こされる略５０％の増進という大きい利点は、Ｃ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）の遺伝子バックグラウンドにおけるリシン生合成経路の全体容量が強くリシン生産を制限したことを明らかに示した。ところが、以前の研究(Ohnishi, et al., 2002; Peters-Wendisch, et al., 2001; Petersen, et al., 2001)において有益であると説明された前駆体供給の変異だけでなく、リシン経路の追加変異はここでは普通の成功に過ぎなかった。これは、他のボトルネック現象が、リシン生産を損傷させるＣ．グルタミカムの中枢代謝内で起こったことを明確に示す。よって、本発明において、リシン生産の追加変異に関する関心は中間代謝の他の部分に移された。この概念の成功は直ちにイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄatt）の減衰に対する対応によって反映された。ｉｃｄの開始コドンでの単一ヌクレオチド交換の遂行はリシン収率をＣ．グルタミカムＢＳ８７における１４１ｍｍｏｌ ｍｏｌ-1から当該ｉｃｄ突然変異体における２００ｍｍｏｌ ｍｏｌ-1まで増加させたが、これは４０％の増加を示す。以前にＮＡＤＰＨ提供ＰＰＰへの効率的なフラックス再指定を引き起こすものを生じた(Becker, et al., 2005)フルクトース１，６−ビスホスファターゼの後続の過発現は、リシン生産を１８％さらに強化した（図１８）。最後に導入された、ここで説明した系譜における変異はｔｋｔオペロンのプロモーター交換を含む。これは前記オペロンによってコードされる酵素Ｇ６ＰＤＨ、ＴＫＴ及びＴＡＬの活性を大きく増加させ、その結果としてリシン収率を１３％増加させた。ｆｂｐ及びｔｋｔオペロンの過発現からの利得はＮＡＤＰＨの不十分な供給がＣ．グルタミカムにおけるリシン生産を強く制限し、増加したＰＰＰフラックスを目標とした変異戦略は効率的なリシン高生産菌株の生産を目標とすることと共に非常に重要であることを明らかに示す。ペントースリン酸経路遺伝子の増幅された発現の追加利点は、成長挙動に関連して観察された。比成長率０．２３ｈ-1を示す祖先Ｃ．グルタミカムＢＳ２４２（Ｐeftuｆｂｐ）と比較して、ｔｋｔ突然変異体は成長率が０．３２ｈ-1であった。Ｃ．グルタミカムＢＳ２４４の改善された成長挙動と結合してより高い炭素転換率（ＹLys/S＝２６％）は、減少した発酵時間に効果的なリシン生産を可能にして、この菌株の全体的な生産性を増加させた。最後の３つの変異の実現により、リシン生産が略９０％も増加した。これは、只３回の遺伝子変化から引き起こされた、注目すべきかつ驚くべき利得である。よって、このような変異戦略は、例えばリシン生合成内のボトルネック現象の除去など、以前に行われた突然変異から部分的に利益を得ると仮定することができる。
【０３２１】
調査された菌株の生産特性は、今まで最小培地で対数増殖する細胞用シェークフラスコ培養で実験した。このような条件の下で最も良い生産源Ｃ．グルタミカムＢＳ２４４は、低い基質濃度での最小培地内のシェークフラスコ培養を含む実験構成がその生産性を確実に制限するが、既に２６％の驚くべきリシン収率を示した。よって、産業的に関連した生産培地上における流加発酵工程でリシン高生産源の生産性を調査することが適切であったが、これはこの培養戦略が産業的生産に最も近いためである。また、この戦略は特に従来の方法で誘導された生産菌株と比較して新しい高生産源の潜在力のより現実的な評価を可能とする。最も良い生産源Ｃ．グルタミカムＢＳ２４４（Ｐsodｔｋｔ）を、糖蜜ベースの複合培地における流加発酵を含む産業的条件の下で調査した。
【０３２２】
産業的発酵条件下における生産性
Ｃ．グルタミカムＢＳ２４４の流加発酵の培養プロフィールを図１９に示す。リシン生産は初期に開始し、培養上澄み液のリシン濃度は非常に高い最終力価１２０ｇＬ-1まで３０時間内に連続的に増加した。主要増加はバッチ培地（１００ｇＬ-1）で供給された初期の糖が消費された後、開始した供給段階の間に達成された。自動化された供給の信号として、溶解された酸素（ｐＯ2）ベース信号が工程中に使用された。発酵器内のＯ2飽和度は、攪拌器の速度によって調節され、２０％と一定に維持された。培地での炭素制限はｐＯ2増加が１０％ｍｉｎ-1を超過したときに供給ポンプを活性化したｐＯ2の即核的かつ早い増加を引き起こした。糖蜜及びグルコースに基づいた供給溶液をリシン生産のための十分なアンモニウム供給を確保するために、硫酸アンモニウムでさらに強化した。この戦略によって供給段階における糖濃度が１０ｇＬ-1未満に維持された。
【０３２３】
吸光度により反映されたバイオマス濃度の時間経路(time course)は、リシン濃度とは確然な差異を示した（図３４）。バッチ段階(batch phase)中に、吸光度は５倍増加したが、これに対し、供給段階では僅か３倍の増加が観察された。また、バイオマス濃度は培養段階が終わるまで増加しなかったが、２４時間後に最大値に到達した。
【０３２４】
菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ２４４の生産特性の精密観察は、発酵段階がさらに分けられることを示した。図３５に示すように、他の段階は達成されたリシン収率に基づいて区別できる。ここで、供給段階２(feed-phase 2)と命名された最も良い生産段階で、リシン高生産源は５５％のリシン収率を示した。この段階の他の特性は殆ど沈滞したバイオマス濃度である。よって、消費された糖はリシン生合成経路へ効率よく送られる。発酵手順が開始するとき、リシン収率はさらに低かった。バッチ段階及び供給段階１を含む該間隔は過度なバイオマス形成を特徴とする主要成長段階であると分明に説明できる（図３４）。興味深いことに、この段階で２５％のリシン収率が達成されたが、これは対数増殖期におけるシェークフラスコ培養実験で達成されたリシン収率と非常によく対応する。
【０３２５】
本発明で生産されたリシン高生産源は、今まで説明した野生型系生産菌株のうち最も良い生産菌株である。炭素及び空間−時間収率だけでなく、最終リシン力価を考慮するとき、上述した合理的に生産された菌株(Ikeda, et al., 2006)より確実に優れる。１２０ｇＬ-1の最終リシン力価及び５５％の炭素転換率を有する該菌株は、従来の方法で誘導された菌株の報告された４０〜５０％の炭素収率(Leuchtenberger, et al., 2005)及び８０〜１２０ｇＬ-1のリシン力価(Anastassiadis, 2007)の最大限界に位置する生産特性を示す。ところが、従来の生産源の生産性は典型的に時間空間収率を大きく損傷させる１００時間までの長い発酵時間(Anastassiadis, 2007)に関連している。これは一般に非特異突然変異の生成によって菌株発達の間に蓄積される多くの有害な２次的突然変異によって引き起こされる弱い成長と関連がある。只１２個の独占的有益な変異のセットを単独で行い、このような非所望の副作用を野生型系生産菌株で回避することができた。早い成長及びそれにより短くなった３０時間の発酵時間は、従来の生産源による流加発酵中に達成された２．１ｇＬ-1ｈ-1の空間−時間収率(Hirao, et al., 1989)より一層高い４ｇＬ-1ｈ-1の時間空間収率を引き起こす。ここで取得された生産性は、追加の遺伝子変異又は工程手順の改善によりさらに増加できる。この点に関連して、特に最適化された供給戦略は生産性を大きく向上させることができる(Hirao, et al., 1989; Ikeda, 2003)。
【０３２６】
本発明の野生型系リシン高生産源は、菌株最適化の方法としてシステム代謝工学(systems metabolic engineering)の潜在力を示す。菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ２４４は産業的適用に非常に適した完全な合理的生産菌株の概念及び価値の立派な証拠である。
【０３２７】
分析方法
細胞濃度
サンプリング
シェークフラスコからの吸光度の測定のために、１ｍＬのサンプルを、ピペットを用いて滅菌条件の下におき、エペンドルフチューブに移した。細胞濃度の重量測定のために、１０〜１５ｍＬのサンプルを、滅菌したワンウェイリサーチピペット(one-way research pipette)（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で取って、予め乾燥した１５ｍＬのファルコンチューブに移した。正確な培養量を分析用秤（ＣＰ２２５Ｄ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。バイオリアクター培養からのフォアショット(foreshots)及びサンプルを、三方コックを介して注射器で取ってファルコンチューブに移した。
【０３２８】
数量化
細胞濃度を、１．５ｍＬのポリスチレンキュベット（Ｐｌａｓｔｉｂｒａｎｄ、Ｗｅｒｔｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、６６０ｎｍで水をレファレンスとして用いて光度測定（Ｌｉｂｒａ Ｓ１１、Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ ａｎｄ Ｎｏｖａｓｐｅｃ（登録商標）II、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃ
ｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）によって測定した。適切であれば、０．０５〜０．３の吸光度を得るために、細胞懸濁液を分析用秤（ＣＰ２２５Ｄ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で希釈させた。全ての測定は重複的に行った。吸光度と細胞乾燥量（ＣＤＭ）との相関関係を得るために、細胞濃度をさらに重量測定（ＣＰ２２５Ｄ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって測定した。後者のために、１５ｍＬのファルコンチューブを８０℃で恒量(constant weight)となるまで乾燥させ、これを用いて遠心分離（１０分、９８００×ｇ、Ｂｉｏｆｕｇｅ ｓｔｒａｔｏｓ、Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｈａｎａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって１５ｍＬの培養培地から細胞を収集した。細胞物質の損失を防ぐために、上澄み液を注意深く廃棄した。水で細胞を３回洗浄し、恒量となるまで８０℃で乾燥させた。３つの菌株の相関関係をそれぞれ生物学的に３回繰り返し測定した。その結果として取得したＯＤ660（Ｌｉｂｒａ Ｓ１１、Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）とＣＤＭとの相関関係は図３に示されている。該当する相関関係の因数はＣＤＭ＝０．２５５×ＯＤ（ｇ／Ｌで与えられる）への直接回帰で測定された。
【０３２９】
アミノ酸
サンプリング
アミノ酸の数量化に使用された上澄み液を遠心分離段階（エペンドルフチューブで１３０００×ｇ、５分、４℃、ファルコンチューブで８５００×ｇ、５分、４℃）でバイオマスの分離によって取得した。発酵培地が遠心分離法によって完全に除去されていない高いバイオマス濃度を示したので、バイオマスの完全な除去を確保するために流加発酵からのサンプルをさらに滅菌濾過した（０．２μｍ Ｍｉｎｉｓａｒｔ ｆｉｌｔｅｒ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０３３０】
数量化
最小培地における培養からのアミノ酸の測定のために、培養上澄み液を内部標準としてα−アミノ酪酸（２３７．１８μｍ）で１：１０に希釈させた。分析はＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｅｒｉｅｓ １１００、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって行った。プロトコルはｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）を用いたプレカラム誘導体化(pre-column derivatization)及び溶離液Ａ（４０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．８）及び溶離液Ｂ（４５％メタノール、４５％アセトニトリル、１０％モル）の勾配を用いた４０℃でのＣ１８カラム（Ｇｅｍｉｎｉ５ｕ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ａｃｓｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）における分離を含む(Kromer, et al., 2005)。全てのタンパク質生成アミノ酸の分離は上述した標準方法の時間プロフィールによって行った。上澄み液が少量のグルタミン酸及びグリシンだけでなくリシンを含有する場合には、測定時間を減らすために勾配を変異した（表９）。
【０３３１】
表９：Ｇｅｍｉｎｉ５ｕカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）におけるＨＰＬＣによるアミノ酸の分離及び数量化のための溶離液Ａ及び溶離液Ｂの勾配プロフィール
【０３３２】
【表９】
2013533740.tif 000012
【０３３３】
流加発酵からのサンプルのリシン濃度を、ＲＩ検出器を用いてＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｅｒｉｅｓ １１００、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によってリシン−ＨＣｌとして１：２０に希釈された上澄み液で測定した。分離はＩｏｎｏｓｐｈｅｒ ５Ｃカラム（１００×３．０ｍｍ；Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ、Ｅｎｇｓｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で４０℃、流量１．５ｍＬ ｍｉｎ-1で行った。移動相は５％メタノール及び９５％水で１．８０ｍＭのクエン酸塩、４．８８ｍＭのエチレンジアミン及び２０ｍＭの２，３−ジヒドロキシコハク酸から構成された。
【０３３４】
糖及び有機酸
サンプリング
糖及び有機酸の数量化に使用された上澄み液は、上述したとおり、遠心分離段階及び濾過によって取得した。
【０３３５】
数量化
最小培地における培養液からの上澄み液を１：１０に希釈し、これを有機酸だけでなく、基質グルコース及びフルクトース及び副産物トレハロース、グリセロール、ＤＨＡのＨＰＬＣ（Ｋｏｎｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｕｆａｈｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）による測定に利用した。Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ ｃｏｌｕｍｎ（３００×７．８ｍｍ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）で４５℃にて移動相として５ｍＭ Ｈ2ＳＯ4を用いて０．５ｍＬ ｍｉｎ―1の流量で分離を行った。屈折率（糖、グリセロール）及び２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収（有機酸、ＤＨＡ）を検出に使用した。スクロースの数量化のために、カラム温度を１５℃まで低めた。溶離液の濃度を１０ｍＭのＨ2ＳＯ4で増加させた。グルコースは生化学分析機（ＹＳＩ ２７００ Ｓｅｌｅｃｔ、Ｋｒｅｉｅｎｂａｕｍ、Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて代案的に数量化した。
【０３３６】
流加発酵からの糖及び有機酸の濃度を希釈していない上澄み液サンプルでＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｅｒｉｅｓ １１００、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって測定した。陽イオンＨ前置カラムを有するＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ ｃｏｌｕｍｎ（３００×７．８ｍｍ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）を移動相として、５ｍＭのＨ2ＳＯ4と共に流量０．５ｍＬ ｍｉｎ-1にて３０℃で使用した。供給溶液の糖濃度は１：１０の希釈で測定した。検出のために屈折率を利用した。
【０３３７】
ＧＣ−ＭＳによるマスアイソトポマー
サンプリング
細胞を対数増殖期（１３０００ｒｐｍ、Ｂｉｏｆｕｇｅ ｆｒｅｓｃｏ、Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｈａｎａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で収集し、水で２回洗浄し、−２０℃で貯蔵した。上澄み液を遠心分離段階での細胞分離によって取得し、−２０℃で別途貯蔵した。
【０３３８】
数量化
約１ｍｇのＣＤＭと同一の細胞を５０μＬのＨＣｌ（６Ｍ）に溶解させ、細胞タンパク質を２４時間１０５℃で加水分解した。加水分解物を６ＭのＮａＯＨを添加して中和させ、細胞残骸を濾過（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＵＳＡ）で除去した。ラベリングパターンを以前に開示されたとおりＧＣ−ＭＳで測定した(Wittmann, et al., 2002)。ＧＣ−ＭＳはＨＰ−５−ＭＳカラム（５％フェニル−メチル−シロキサン−ジフェニルポリシロキサン；６０ｍ×０．２５１ｍｍ×０．２５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びキャリアガスとしてヘリウムと共にＨＰ６８９０ガスクロマトグラフィー（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｏｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｅｎ）で構成された。検出はｑｕａｄｒｕｐｏｌ ＭＳ ５９７３ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて行った。サンプル製造は凍結乾燥及び誘導体化を含む。凍結乾燥した加水分解物を５０μＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ＋０．１％ピリジン）及び５０μＬのＮ−メチル−Ｎ−ｔ−ブチル−ジメチルシリル−トリフルオロアセトアミド（ＭＢＤＳＴＦＡ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に溶解させ、３０分間８０℃で培養した。適切であれば、測定の前に遠心分離によって塩を除去した。アミノ酸の識別は滞留時間及びアミノ酸標準を用いた断片化パターンを介して行った。ＭＢＤＳＴＦＡで誘導体化されたアミノ酸は、マスフラグメント［Ｍ−５７］、［Ｍ−８５］及び［Ｍ−１５９］を含む典型的な断片化パターンを示すが、これにより［Ｍ−５７］はアミノ酸の完全なカーボンバックボーンを含有する。アミノ酸残基の分離は、各アミノ酸の炭素源子Ｃ1及びＣ2を含有するマス３０２を有する断片の形成を引き起こす。フラックスの測定に使用されたマスフラグメントを表１０に示す。
【０３３９】
トレハロースのマスアイソトポマー分配は、凍結乾燥された５０μＬの培養上澄み液で測定した。誘導体化は５０μＬのメトキシルアミン（ピリジンに２５ｍｇ ｍＬ-1のメトキシルアミン）及び５０μＬのＢＳＴＦＡ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて３０分間８０℃で行った(Kiefer, et al., 2004)。
【０３４０】
表１０：フラックス測定にＴＢＤＭＳ誘導体としてタンパク質生成アミノ酸のマスフラグメントを用いた。与えられた質量はラベルされていないＣ、Ｏ、Ｈ、Ｎ、Ｓ及びＳｉのマスアイソトポマーを含む断片Ｍ0を示す。
【０３４１】
【表１０】
2013533740.tif 000013
【０３４２】
ＮＭＲによるポジショナルアイソトポマー(positional isotopomers)
サンプリング
細胞を２回の前培養及び１回の本培養で上述したとおり培養した。自然的に標識されたグルコースを［６−13Ｃ］グルコースで置換した。上澄み液を遠心分離（１３０００ｒｐｍ、Ｂｉｏｆｕｇｅ ｆｒｅｓｃｏ、Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｈａｎａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で取得し、窒素フラックスの下に乾燥させた。
【０３４３】
数量化
不安定プロトン(labile protons)を３ｍＬの９９．９％（Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐ、Ｓａｉｎｔ−Ａｕｂａｉｎ Ｃｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）で２回凍結乾燥させて、デューテリウムで交換し、最終サンプルを６００μＬの１００ｍＭ ＤＣｌ（Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐ）に懸濁させた。５ｍｍ ｚ−ｇｒａｄｉｅｎｔ ＢＢＩプローブを備えたＡｖａｎｃｅ５００ＭＨｚ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｗｉｓｓｅｍｂｏｕｒｇ、Ｃｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）で全ての１Ｄ及び２Ｄ ＮＭＲスペクトルを取得した。ＴＯＰＳＰＩＮ（登録商標）１．３ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてデータを取得し、処理した。温度は２９８Ｋであった。１Ｄプロトンスペクトルを定量的条件(quantitative conditions)を用いて記録した。フルシグナルリカバリー(full signal recovery)を有するために、スキャン間の緩和遅延は３０秒であり、パルスアングルは３０°であった。スイープ幅は５０００Ｈｚであり、取得時間は１．６秒であった。総１６スキャンが蓄積された。選択的な励起(excitations)は形成されたパルスを用いて行った。励起範囲は、より大きい多重線幅(multiple width)のため、１００Ｈｚのγプロトンを除いては６０Ｈｚであった。１Ｄ13Ｃ−ｄｅｃｏｕｐｌｅｄ ＤＡＮＴＥ−Ｚシーケンスは、８個の連続的なｏｎ−ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ＢＵＲＰ（Ｉ−ＢＵＲＰ）パルススキャン、及び続く８個の連続的なｏｆｆ−ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉ−ＢＵＲＰパルス(Geen and Freeman, 1991)スキャンから構成された。この周期が４回繰り返し行われた。選択的励起の後、０．７Ｇｍｍ-1のパージ勾配(purge gradient)を適用した。１Ｄ 13Ｃ−ｄｅｃｏｕｐｌｅｄ ＤＰＦＧＳＥシーケンスは２つのＲＥｆｏｕｃｕｓｉｎｇ ＢＵＲＰ（ＲＥ−ＢＵＲＰ）パルスから構成された。勾配動力はそれぞれ０．７及び０．３Ｇｍｍ-1と設定した。選択的パルスの間の13Ｃ ｎｕｃｌｅｉのデカップリング(decoupling)は、ＧＡＲＰ４シーケンスを用いて３．８ｋＨｚの動力で行った。13Ｃ−ｄｅｃｏｕｐｌｅｄ ＤＡＮＴＥ−Ｚパルスモジュールを以前に公知となったＺＱＦＴＯＣＳＹシーケンス(Massou, et al., 2007)に挿入して13Ｃ−ｄｅｃｏｕｐｌｅｄ ＤＡＮＴＥ−Ｚ、Ｚｅｒｏ−Ｑｕｎａｔｕｍ Ｆｉｌｔｅｒｅｄ ＴＯＣＳＹ（ＤＡＮＴＥ−Ｚ ＺＱＦ−ＴＯＣＳＹ）シーケンスを生成した。13Ｃ−ｄｅｃｏｕｐｌｅｄ ＤＡＮＴＥ−Ｚパルスを前述のパラメータを用いて適用した。２０ｍｓの間、１０ｋＨｚのフィールド幅で適用されたＤＩＰＳＩ−２ミキシングシーケンスを用いてＴＯＣＳＹトランスファーを行った。ミキシング期間の終わりに、平面磁化(in-plane magnetization)をｓｑｕａｒｅ ２．６Ｇｍｍ-1パージ勾配で圧縮した。１０％の平滑度を有する１８０°ＣＨＩＲＰ断熱パルス、２０ｋＨｚスイープ幅、及び３３０Ｈｚの最大限のＲＦ動力での３０ｍｓの持続期間からなるＺｅｒｏ−Ｑｕａｎｔｕｍ Ｆｉｌｔｅｒ(Thrippleton and Keeler, 2003)を、取得の前に適用した。断熱パルス(adiabatic pulse)の間にｓｑｕａｒｅ ０．２Ｇｍｍ-1勾配パルスを適用した。全てのＮＭＲ測定は機関Ｉｎｇｅｎｉｅｒｉｅ ｄｅｓ ｓｙｓｔｅｍｅｓ ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ ｅｔ ｄｅｓ ｐｒｏｃｅｄｅｓ（ＩＮＳＡ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）で行った。
【０３４４】
細胞内代謝産物
サンプリング
メタノール急冷のために、１２ｍＬの細胞懸濁液（ＯＤ660＝５）をプラスチック注射器に吸収させ、予め冷却した、６０％メタノール（−５８℃、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７）２４ｍＬで充填されたファルコンチューブに注入させた後、直ちに激しく混合し、５分間遠心分離（１００００×ｇ、−１９℃、Ｂｉｏｆｕｇｅ Ｓｔｒａｔｏｓ、Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）した。サンプリングはアルカリだけでなく酸の抽出のために４回行った。
【０３４５】
全体培養急冷(culture quenching)は、対数増殖期の細胞を有する１０ｍＬの培養を液体窒素に培養されたガラス瓶に移すことにより行った。同時に、上澄み液(Bolten, et al., 2007)から発生する代謝産物を説明するために、濾過（孔径０．２μｍ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって細胞分離して上澄み液のサンプルを採取した。ヌクレオチドサンプリングのためにメタノール急冷を行い、全体培養の急冷からのサンプルを、それぞれグルコース６−リン酸及びフルクトース６−リン酸の測定に使用した。
【０３４６】
抽出
９００μＬのＨＣｌＯ4（ｐＨ１）を細胞ペレットに添加し、水浴で５５℃にて７分間培養し、直ちに氷上に置いて代謝産物の不安定性を除去することにより、メタノール仕上げからの酸化ヌクレオチドを抽出した。過塩素酸サンプルを１０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離して細胞残骸を分離した。上澄み液の中和はｐＨが７．０となるまで５Ｍ Ｋ2ＣＯ3を注意深く添加して達成した。その結果として生成された沈殿物（ＫＣｌＯ4）を遠心分離（５分間、１３０００×ｇで）によって除去した。減少したヌクレオチドのアルカリ抽出は９００μＬのエタノールＫＯＨ溶液（２００ｍＬ １Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4＋５０ｍＬ ＥｔＯＨ＋２０ｍＬ ５Ｍ ＫＯＨ、ｐＨ１２．４）を細胞ペレットに添加し、水浴で５５℃にて２分間培養し、次いで氷水で培養し、細胞残骸を除去するために最後に遠心分離（５分間１００００×ｇ、４℃で）をして行った。最終ｐＨ１．２に１０ＭのＨＣｌを添加して全体培養の急冷からの代謝産物を抽出した。次いで、細胞を解凍し、水浴で５０℃にて８分間抽出し、１０ＭのＫＯＨを用いて中和し、遠心分離（１５分、１０００×ｇ、４℃）によって細胞残骸を除去した。
【０３４７】
数量化
５４０ｎｍの９６ウェルプレート（ｉＥＭＳ Ｒｅａｄｅｒ ＭＦ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で酵素的サイクリング検査(Bernofsky and Swan, 1973)によってリン酸化ヌクレオチドＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨを数量化した。測定のために５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、２５０ｍＭのグルコース６−リン酸、０．５ｍＭのチアゾリルブルー、２ｍＭのフェナジンエトスルファート及び１００ｍＵ ｍＬ-1のグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼを含有する１１０個の反応のためのマスター混合物を準備した。２５μＬのサンプル又は標準溶液（それぞれＮＡＤＰ又はＮＡＤＰＨ）をウェルプレートに提供した。反応は１７５μＬのマスター混合物を添加することにより開始した。吸光度の変化を１０分間観察した。ヌクレオチド標準品を有するキャリブレーションカーブを用いて数量化を行った。
【０３４８】
グルコース６−リン酸（Ｇ６Ｐ）及びフルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ）を多段階反応(Bergmeyer and Hohorst, 1970)で酵素的に測定した。測定のために、２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．２ｍＭのＮＡＤＰ、５ｍＭのＭｇＣｌ2及び５００μＬのサンプルを含有する総量１ｍＬの反応混合物を５分間培養し、３４０ｎｍにおける塩基吸光度(basic absorbance)を測定した（ＥＯ）。そして、５μＬのグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（３４Ｕ ｍＬ-1）を添加し、５分後にＥ１を測定した。１０μＬのＰＧＩ（３５ＵｍＬ）を添加してＦ６Ｐの転換を開始し、３４０ｎｍでの最終吸光度を５分後に測定した（Ｅ２）。Ｇ６ＰとＦ６Ｐの混合物を含有する標準溶液で陽性対照群を行い、陰性対照群は水で行った。ＮＡＤＰＨの吸光係数ε340＝６．２２Ｌ ｍｍｏｌ-1ｃｍ-1及びサンプルの希釈因数（dilution factor：ＤＦ）を考慮し、Ｇ６Ｐ及びＦ６Ｐの濃度は下記の式によって計算できる：
【０３４９】
【数２】
2013533740.tif 000014
【０３５０】
酵素活性
サンプリング
対数増殖期において、細胞を遠心分離（５分、９８００×ｇ、Ｂｉｏｆｕｇｅ ｓｔｒａｔｏｓ、Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｈａｎａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で収集し、破壊緩衝剤で１回洗浄し、最後に０．２５ｇ ＣＷＷ／ｍＬに懸濁させた。破壊は、氷水浴で２０ミクロン、５回の１５秒パルスで超音波処理（ＭＳＥ ｓｏｎｉｐｒｅｐ１５０、Ｓａｎｙｏ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、或いは機械的に行った。このために、細胞懸濁液を、ガラスビーズを含有する２ｍＬのエペンドルフチューブに７５０μＬの量だけ分取した。ｒｉｂｏｌｙｓｅｒ（ＭＭ３０１、Ｒｅｔｓｃｈ、Ｈａａｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、３０Ｈｚ（２×５分；途中で５分の休みを挟む）で破壊を行った。ｒｉｂｏｌｙｓｅｒ破壊のために１０分間１３０００ｒｐｍ（Ｂｉｏｆｕｇｅ ｓｔｒａｔｏｓ、Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｈａｎａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）での遠心分離によって、或いは超音波処理による破壊のために８５００ｒｐｍ（Ｂｉｏｆｕｇｅ Ｆｒｅｓｃｏ、Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｈａｎａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）での２×３０分間の遠心分離によって粗細胞抽出物を取得した。ＢｉｏＲａｄ（Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｄｙｅ、ＢｉｏｒＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）の試薬溶液及びＢＳＡタンパク質標準を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ(Bradford, 1976)方法でタンパク質の含量を測定した。
【０３５１】
数量化
全ての測定は、吸光度の変化をオンラインでモニタリングして分光測定器（Ｓｐｅｃｏｒｄ４０、Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ ｏｒ Ｈｅｌｉｏｓ ａｌｐｈａ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｌａｔｈａｍ、ＵＳＡ）によって総量１ｍＬで３回行った。陰性対照群は、それぞれ基質又は細胞抽出物なしで行った。活性は、３０℃で１Ｕ＝１μｍｏｌ ｍｉｎ-1を有する比酵素活性［Ｕ ｍｇ-1］として与えられた。吸光度［Ａ ｍｉｎ―1］の変化及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈの比吸光係数ε340＝６．２２Ｌ ｍｍｏｌ-1ｃｍ-1から計算した。一般的な手順として、基質及び細胞抽出物のないマスター混合物を反応緩衝剤、ＭｇＣｌ2、補助因子（ＮＡＤＰ、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＡＤＰ、ＴＰＰ、ＣｏＡ）及びカップリング酵素（ＬＤＨ、Ｇ６ＰＤＨ、ＰＧＩ、リボース５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）、リブロース５−リン酸エピメラーゼ（ＲＰＥ）、ＴＰＩ／ＧＤＨ）の母液から製造し、１０分間３０℃で培養した。基質溶液及び細胞抽出物を１．５ｍＬのポリスチレンキュベット（Ｐｌａｓｔｉｂｒａｎｄ、Ｗｅｒｔｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍｎａｙ）に提供した。マスター混合物を直ちに添加して反応を開始した。
【０３５２】
グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）(Moritz, et al., 2000)
細胞破壊を１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2及び０．７５ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝剤で行った。ＤＴＴを１００ｍＭの母液として新たに製造し、破壊の前に細胞懸濁液に添加した。酵素の不安定性のため、細胞破壊後直ちに活性を測定した。Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼ活性の数量化のための反応混合物は１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、２００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＮＡＤＰ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、５ｍＭのＧ６Ｐ及び５０μＬの細胞抽出物を含有した。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ親和定数を、それぞれ基質、Ｇ６Ｐ又はＮＡＤＰの濃度を異ならしめて測定した。エフェクターの活性への影響を測定するために、反応混合物を多様な濃度のＡＴＰ、ＰＥＰ、ＦＢＰ又はＮＡＤＰＨでさらに補充した。
【０３５３】
ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）(Netzer, et al., 2004)
ピルビン酸キナーゼ活性の測定のために、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有する１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で細胞を破壊させた。カップリング酵素として乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を用い、Ａ340のオンラインモニタリングを用いて活性を測定した。検査を１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＡＤＰ、０．２５ｍＭのＮＡＤＨ、５．５ＵのＬＤＨ、１０ｍＭのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及び１０μＬの粗細胞抽出物を用いてｐＨ７．０で行った。基質（１Ｍ ＰＥＰ）の母液を使用の前にＨ７．０に合わせた。
【０３５４】
リンゴ酸酵素（ＭａｌＥ）(Gourdon, et al., 2000)
リンゴ酸酵素活性の測定のための破壊緩衝剤は、１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）及び２００ｍＭのＫＣｌを含有した。ＭａｌＥ活性を２ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＮＡＤＰ、４０ｍＭのリンゴ酸塩及び５０μＬの細胞抽出物をさらに含有する同緩衝剤で測定した。母液として濃度１ｍｏｌ Ｌ-1及びｐＨ７．８のリンゴ酸塩を製造した。
【０３５５】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤ）
細胞破壊及び活性測定を、１０ｍＭのＭｇＣｌ2を含有する１００ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）で行った。酵素活性測定のための反応混合物はさらに１ｍＭのイソクエン酸(isocitrate)、０．５ｍＭのＮＡＤＰ及び２５μＬの粗細胞抽出物を含有した。
【０３５６】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）
１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2及び３ｍＭのシステイン(Blombach, et al., 2007)で破壊を行った。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の数量化のための反応混合物は、５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、０．０１ｍＭのＣａＣｌ2、０．３ｍＭのＴＰＰ、０．１２ｍＭのＣｏＡ、２ｍＭのＮＡＤ、３ｍＭのシステイン、５ｍＭのピルビン酸塩、及び５０μＬの細胞抽出物を含有し、ｐＨ７．４で行った(Guest and Creaghan, 1974)。
【０３５７】
ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）(Dominguez, et al., 1998)
ＰＧＩの測定のために、１０ｍＭのＭｇＣｌ2を含有する１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）で細胞を破壊させた。カップリング酵素としてグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）及び３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨ形成のオンラインモニタリングを用いて、活性を数量化した。検査はｐＨ７．８で１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのＮＡＤＰ、１．２５ＵのＧ６ＰＤＨ、４ｍＭのフルクトース６−リン酸及び１０μＬの粗細胞抽出物を用いて行った。
【０３５８】
ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＤＤＨ）(Cremer, et al., 1988)
ＤＤＨ活性測定のための破壊緩衝剤は、１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ及び１０ｍＭのＭｇＣｌ2を含有し、ｐＨを７．８に合わせた。ＤＤＨ活性をメソ−ジアミノピメリン酸酸化及び伴われるＮＡＤＰＨ形成の方向に測定した。この方向を裏付けるためにアルカリｐＨ１０．５で反応を行った。２００ｍＭのグリシン／ＮａＯＨ（ｐＨ１０．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのＮＡＤＰ、４ｍＭのメソ−ジアミノピメリン酸及び５０μＬの細胞抽出物を用いて反応を行った。
【０３５９】
フルクトース１，６−ビスホスファターゼ（ＦＢＰａｓｅ）
ＦＢＰａｓｅのインビトロ活性の測定は、若干の修正をしたＳｕｇｉｍｏｔｏとＳｈｉｉｏのプロトコル(Sugimoto and Shiio, 1989)に基づいた。反応混合物は１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのＮＡＤＰ、１ｍＭのフルクトース１，６−ビスリン酸、２Ｕのホスホグルコイソメラーゼ、１Ｕのグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ及び５０μＬの細胞抽出物を含有した。細胞破壊はｐＨ７．８で１００ｍＭのトリス／ＨＣｌで行った。
【０３６０】
トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）
粗細胞抽出物を１００ｍＭのトリス／ＨＣｌで、ｐＨ７．８で製造した。ＴＫＴ活性の測定は幾つかのカップリング酵素の適用を要求した。ＲＰＩ及びＲＰＥがカップリング酵素の役割をして、検査に供給されたリボース５−リン酸（Ｒ５Ｐ）からの基質リブロース５−リン酸及びキシルロース５−リン酸を提供した。３４０ｎｍでのオンラインモニタリングは、トリオースリン酸イソメラーゼ及びグリセロリン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＰＵ／ＧＤＨ）によるＴＫＴ反応の産物としてのグリセルアルデヒド３−リン酸の追加転換によって可能であった。上述した手順とは逆に、２つの別個のマスター混合物を製造した。混合物Ａは総量６５０μＬに緩衝剤、ＴＰＩ、ＲＰＩ、ＲＰＥ及びＮＡＤＨを含有し、混合物Ｂは総量３００μＬに緩衝剤、ＴＰＰ、ＭｇＣｌ2及び細胞抽出物を含有した。両者とも１０分間３０℃で予め加熱した。キュベットにリボース５−リン酸を提供し、混合物Ｂ及び混合物Ａの添加によって反応が始まった。最終反応混合物は５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、１ＵのＲＰＩ、０．５ＵのＲＰＥ、１ＵのＴＰＩ／ＧＤＨ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２ｍＭのＴＰＰ、２０ｍＭのＲ５Ｐ及び５０μＬの粗細胞抽出物を含有した。
【０３６１】
トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）
トリス／ＨＣｌ緩衝剤（１００ｍＭ、ｐＨ７．８）で細胞破壊を行った。トランスアルドラーゼの測定のための反応は、さらに１ｍＭのフルクトース６−リン酸、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、４ｍＭのエリトロース４−リン酸、６ＵのＴＰＩ／ＧＤＨ及び５０μＬの粗細胞抽出物を含有する５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ緩衝剤（ｐＨ７．８）で行った。ＴＰＩ／ＧＤＨはカップリング酵素としての役割をして３４０ｎｍでオンラインモニタリングを可能とした。
【０３６２】
代謝フラックス分析
システムワイドの［１３Ｃ］代謝フラックス分析
グルコースで培養されたＣ．グルタミカムによる成長及びリシン生産のための代謝ネットワークは、全ての中枢代謝経路、すなわちグリコリシス、ＰＰＰ、トリカルボン酸回路、並びに補充カルボキシル化及び脱カルボキシル化を含む。また、中間前駆体からバイオマスまでの同化経路だけでなく、リシン及び他の副産物の生合成経路を行った。グリシン合成のために、２つの可能な経路、すなわちセリンによる経路及びトレオニンアルドラーゼによる経路(Simic, et al., 2002)を考慮した。以前の結果に基づいて、グリオキシル酸経路は不活性であると仮定した(Wittmann and Heinzle, 2002)。Ｃ．グルタミカムにおいて、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸酵素及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼは、Ｃ3及びＣ4の代謝産物の相互変換(inter conversion)を介してグリコリシスとＴＣＡ回路を連結する(Wittmann and Becker, 2007)。基本モデルにおいて、カルボキシル化及び脱カルボキシル化はそれぞれランプフラックス(lumped flux)と見做した。ところが、拡張アプローチでは、全ての単一酵素を個別反応と見做した。前記目的のために、ＰＥＰ及びピルビン酸塩を個別代謝プールに分けた。他の前駆体の同化作用の需要に対する計算は、細胞のジアミノピメリン酸の含量に基づいた細胞壁合成に対する特異同化作用の需要を考慮したＣ．グルタミカムのバイオマス組成のデータに基づいた(Wittmann and de Graaf, 2005)。タンパク質生成アミノ酸及びトレハロースのラベリングするデータ及び３つの併行培養からの化学量論的データの平均値を代謝フラックスの計算のために結合した。実験的（Ｍｉ、ｅｘｐ）及び模擬的（Ｍｉ、Ｃａｌｃ）マスアイソトポマー分率間の偏差が最も少なかったフラックスのセットを最も良い細胞内フラックス分布評価値と見做した。ネットワークは最小二乗法が可能であるように過測定した(over-determined)。最小二乗法の加重値の和を誤差基準として使用した(Wittmann and Heinzle, 2002)。取得されたフラックスの統計学的分析をＭｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏアプローチで行った(Wittmann and Heinzle, 2002)。取得されたデータより、単一パラメータの９０％信頼限界を計算した。全ての代謝的シミュレーションをＭａｔｌａｂ ７．０又はＭａｔｌａｂ ９．０（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．）を用いたパーソナルコンピュータで行った(Wittmann and Heinzle, 2001a; Wittmann and Heinzle, 2001b; Wittmann and Heinzle, 2002)。フラックス分配比(flux partitioning ratio(Φ))及びフラックス可逆性(flux reversibility (ζ))はそれぞれ２つのブランチのうちいずれか一つへの相対的フラックス及びフォワード方向における正味フラックス(net flux)に対するバックワード又は交換フラックスの比率として定義された(Wittmann and Heinzle, 2002)。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣＫ）及びリンゴ酸酵素（ＭＡＥ）によって促進された反応を有するピルビン酸ノードにおいて、定義は次のとおりである：
【０３６３】
【数３】
2013533740.tif 000015
【０３６４】
また、リシン生合成経路の分配比を、リシンからの炭素源子Ｃβ及びＣσの比13Ｃ強化、及び［６−13Ｃ］グルコースで培養されたＣ．グルタミカムの培養上澄み液からのアセテートからのＣβから、下記式のとおり測定した：
【０３６５】
【数４】
2013533740.tif 000016
【０３６６】
化学量論に基づくフラックス測定
相対的クエン酸シンターゼフラックス（υCIS）及び相対的ビルピン酸デヒドロゲナーゼフラックス（υPDH）のリシン収率（ＹLys/S）及びバイオマス収率（ＹX/S）との密接な相関関係が、化学量論的データに基づいたフラックス測定に堅牢な基本を提供した。
【０３６７】
必須の化学量論的相関関係は、１８つの独立フラックス評価値の豊富なデータセットの放物面接合(paraboloid fitting)で達成された。υCIS及びυPDHの計算を下記のとおり可能にした：
【０３６８】
【数５】
2013533740.tif 000017
【０３６９】
同様に、補充反応による正味フラックス（υPYC）は、化学量論的特徴と密接な相関関係がある(Wittmann and Heinzle, 2002)。ここから観察されたように、ＴＣＡ回路からの副産物形成の欠乏が同化作用及びリシン合成のためのＴＣＡ回路からの炭素の離脱によるυPYCの計算を可能にした：
【０３７０】
【数６】
2013533740.tif 000018
【０３７１】
オキサロ酢酸（υOAA,Analbolism）及びα−ケトグルタレート（υAKG,Analbolism）同化作用の需要をバイオマス収率及び表Ａ．４に与えられたＣ．グルタミカムの細胞の組成から測定した(Wittmann and de Graaf, 2005)。このようなフラックスパラメータの平均値及び信頼区間をＭｏｎｔｅ−Ｃａｒｌｏアプローチを用いてバイオマス、リシン収率及び同化作用フラックスの１００個の多様な値から計算した。フラックス値をソフトウェアオリジン（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｏｒｉｇｉｎ ６．０）を用いてｔ−テストによって統計的に測定した。
【０３７２】
酸化還元反応（Ｒｅｄｏｘ）のバランシング
補助因子の代謝に関するより綿密な洞察のために、完全な酸化還元反応バランス（式１２）をフラックスデータ及びＣ．グルタミカムの代謝ネットワークに基づいて設定した。計算のために、酸化性リン酸化(oxidative phosphorylation)中の全ての可能な酸化還元反応を考慮した(Yang, et al., 2006a)。
【０３７３】
【数７】
2013533740.tif 000019
【０３７４】
ここで、ｖO2は酸素消費フラックスを示し、ｖXADH及びｖNADPHはそれぞれＮＡＤＨ、ＦＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの純生産量を示す。全ての関連反応を計算に入れてＣ．グルタミカムの代謝ネットワークのフラックスから同化作用のＮＡＤＰＨ消費ＹNADH/X＝１６．４ｍｍｏｌ ｇ-1(Wittmann and de Graaf, 2005)及び同化作用のＮＡＤＨ生産ＹNADH/X＝３．２ｍｍｏｌ ｇ-1(Yang, et al., 2006a)を用いてｖXADH及びｖNADPHを計算することができる：
【０３７５】
【数８】
2013533740.tif 000020
【０３７６】
Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼ（ｖ2）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ｖ3）及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｖ24）を主要ＮＡＤＰＨ供給酵素として見做す(Wittmann and de Graaf, 2005)。酸素消費フラックスを、実験的に測定された呼吸率（respiratory quotient：ＲＱ）及び二酸化炭素生産フラックス（ｖCO2）によって計算した：
【０３７７】
【数９】
2013533740.tif 000021
【０３７８】
ＶCO2の計算のために、中央炭素代謝及び同化作用からの全てのＣＯ2生産及び消費反応を考慮した：
【０３７９】
【数１０】
2013533740.tif 000022
【０３８０】
前記式（１６）は補充正味フラックスを示し、Ｃ．グルタミカムの同化作用ＣＯ2生産量はＹCO2/X＝１０２５μｍｏｌ ｇ-1である(Yang, et al., 2006a)。
【０３８１】
【数１１】
2013533740.tif 000023
【０３８２】
リシン生産Ｃ．グルタミカムの代謝フラックス分析
インビボフラックスの分解(resolution)は、調査された有機体の遺伝子的又は環境的障害に対する代謝反応についての重要情報を提供する。これは、生細胞の複雑性が遺伝子変異のインパクトに対する正確な予測を遅延させるから、特に合理的菌株最適化のために重要である。
【０３８３】
前提条件
本発明において、代謝フラックス分析は、ＧＣ−ＭＳによる加水分解された細胞タンパク質から取得されたラベリング情報を用いた、固定されたフラックス分析として行われた。このアプローチは定数バッチパラメータ、すなわちｐＨ及びｐＯ2が必須的な、調査された培養の代謝及び同位元素の定常状態を要求する。図４Ａに示されているように、菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）において、選択された培養条件は適用されたバッフル付シェークフラスコに吸光度１０までの十分な酸素供給だけでなく、Ｃ．グルタミカムの対数増殖及びｐＨの維持を裏付けた（ＮｏｖａｓｐｅｃIII）。また、代謝定常状態の存在は調査された菌株の絶えず続く成長及び生産挙動から確保される（図４Ｂ）。
【０３８４】
相異なる培養時点でサンプリングした２つの併行トレーサー研究からの異なるタンパク質生成アミノ酸の例を挙げたように、代謝産物の13Ｃラベルパターンは一定に維持された（図５）。これは、取得されたフラックス分布が全体培養期間を代表することができるものと見做されるようにする培養中の同位元素定常状態を示す。
【０３８５】
代謝フラックスの計算は、実験的に測定されたマスアイソトポマー分率とシミュレーションしたマスアイソトポマー分率の偏差を最小化することに基づいた。前記アプローチは、３つの併行培養からの成長及び産物形成の化学量論的データ及びバイオマス前駆体の同化作用の需要を考慮して各段階での代謝バランシングを含む(Wittmann and de Graaf, 2005)。
【０３８６】
Ｃ．グルタミカムｌｙｓＣT311Iの代謝フラックス
Ｃ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）の代謝経路活性を、トレーサー基質として［１−13Ｃ］グルコースを用いてラベル実験から測定した。フラックスモデルはＣ．グルタミカムの全ての関連代謝経路、すなわちリシン生合成経路だけでなく、ペントースリン酸経路、グリコリシス、ＴＣＡ回路、補充カルボキシル化及び脱カルボキシル化を含む。以前の結果に基づいて、グリオキシル酸シャント(glyoxylic acid shunt)をグルコースでの培養中に不活性と仮定した(Wittmann and Heinzle, 2002)。それぞれピルビン酸塩及びＰＥＰ及びオキサロ酢酸及びリンゴ酸塩をランプフール(lumped pool)と見做した。よって、インターコネクティング反応、すなわちピルビン酸カルボキシラーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸酵素及びＰＥＰカルボキシキナーゼを、それぞれカルボキシル化及び脱カルボキシル化によるランプフラックスとして測定した。取得された適合性と関連して、実験的に測定されたマスアイソトポマー分率及び計算されたマスアイソトポマー分率間の優れた一致が達成された（表１１）。
【０３８７】
表１１：９９％［１−13Ｃ］グルコースで培養されたリシン生産Ｃ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）の分泌されたトレハロース及び細胞タンパク質からのアミノ酸の相対的マスアイソトポマー分率。データは実験的ＧＣ−ＭＳデータ（Ｅｘｐ）及びフラックスの最適化セットに該当する数学的モデルの解決によって予測された値（Ｃａｌｃ）を含む。
【０３８８】
【表１１】
2013533740.tif 000024
【０３８９】
その結果形成されたフラックスマップを参照すると、中枢経路活性、特にペントースリン酸経路によるフラックス及び糖分解フラックスが高い正確性をもって測定されたことが確実に分かる。
【０３９０】
野生型と比較するとき(Kim, et al., 2006; Kromer, et al., 2008)、Ｃ．グルタミカムのリシン及びトレオニンによるフィードバック制御からアスパラギン酸キナーゼの解除が大きなフラックス変化を引き起こした。最も確実な違いは、脱調節されたリシン生産の直接的な結果である８％増加したリシンフラックスである。補充カルボキシル化による正味フラックスは大きく増加してリシン生産に必要かつ十分なオキサロ酢酸を供給した。また、脱調節突然変異体はペントースリン酸経路及びＴＣＡ回路を介しての変化したフラックスを示した。Ｃ．グルタミカムＢＳ１におけるバイオマス形成の減少のため、同化作用の需要に合わせるために中間代謝からより少ない量の炭素を回収する。フラックス測定のためにここで適用されたアプローチ法は、相対的に少ない努力でこのような全般的フラックス変化を解決することに完全に適する。よって、２９個のマスアイソトポマー分率からのラベル情報を含むフラックスモデルだけでなく、実験構成は遺伝子的変化又は環境的条件の効果を調べるルーチン13Ｃ ＭＦＡに効果的に適用できた。
【０３９１】
拡張されたフラックス分析
ところが、幾つかの場合に、フラックス測定のために適用された前記アプローチが十分ではなかった。ピルビン酸カルボキシラーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、リンゴ酸酵素及びＰＥＰカルボキシキナーゼを含むピルビン酸ノード周囲の完全な代謝ネットワークの解決は一層さらに精巧である。Ｃ．グルタミカムのリシン生産について、このような反応は相当な重要性を持っている。したがって、ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）だけでなく、ＰＥＰカルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）及びリンゴ酸酵素（ＭａｌＥ）による全てのフラックスを解決するために、フラックスモデルを拡張させた。
【０３９２】
ネットワークデザイン及び実験準備
モデル適応のための第１段階は、ＰＥＰ及びピルビン酸塩を別個のプールと見做し、ＰＣ、ＰＥＰＣ、ＰＥＰＣＫ及びリンゴ酸酵素を別個の酵素反応と見做して代謝ネットワークを拡張する段階であった。このシナリオにおいて、［１−13Ｃ］グルコースを用いた単独トレーサー研究からのラベルデータを用いる上述のアプローチを拡張したが、これはそれが前記全てのフラックスを完全に解決することはできず、ランプカルボキシル化及び脱カルボキシル化フラックスのみを解決することができるためである(Kim, et al., 2006)。中枢代謝経路に関連して、[１−13Ｃ]グルコースは代謝の上部、特に酸化的ＰＰ経路、グリコリシス、そしてもし存在するならば、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路の解決に重要であり、［Ｕ−13Ｃ］グルコースとラベルしていないグルコースとの混合物の使用は特にＰＥＰのフラックスダウンストリーム、特にピルビン酸ノードで解決することに有用である(Fischer, et al., 2004; Wittmann and Heinzle, 2001b)。このため、実験戦略は、フラックス計算のための異なるトレーサー基質からの代謝産物のＧＣ−ＭＳラベル分析から利用可能な情報を結合するために、（ｉ）［１−13Ｃ］グルコース、及び（ii）［Ｕ−13Ｃ］グルコースと自然的に標識されたグルコースとの混合物を用いた２つの併行トレーサー研究に基づいた。フラックス計算のためのより詳細な情報を分析物の炭素骨格の特定部分のみを含有する断片イオンの追加分析によるＧＣ−ＭＳを用いて取得することができると知られているため、原核生物(Klapa, et al., 2003)及び真核生物(Frick and Wittmann, 2005)の複合代謝ネットワークのフラックス分析に有用であると以前に証明された、タンパク質生成アミノ酸からの多くの断片イオンをさらに考慮した。全体的に、ここで各菌株に１９７個の異なるマスアイソトポマー分率を考慮したと共に、単一トレーサー実験及びより少ない測定された断片を用いた元来の単純化されたアプローチは２９個のマスアイソトポマー分率を考慮した。拡張されたアプローチは、さらに考慮されたラベル情報が追加的に導入された、ピルビン酸ノード周辺の自由フラックスを測定するために使用できるか否かを判断するために、コンピュータ基盤模擬実験研究で実験した。前記目的のために、利用可能なマスアイソトポマー分率及び関心フラックスパラメータの敏感性を以前に開示された方法(Wittmann and Heinzle, 2001b)で部分誘導体から誘導した。新たに考慮された多くの断片イオンのラベルパターンは、ピルビン酸ノード周囲の自由フラックスの変異に影響された。よって、このような関心フラックスパラメータを測定するための感度の高い情報を含有する。これはトレーサー基質としての［Ｕ−13Ｃ］グルコース及びラベルしていないグルコース及び分析された代謝産物のラベルパターンに強い影響を及ぼす自由フラックスパラメータΦＰＥＰＣ（ＰＥＰＣとＰＣの間を分割するフラックス）、ζＰＥＰＣ／ＰＥＰＣＫ（ＰＥＰＣ及びＰＥＰＣＫによるフラックスの交換）及びζＣ／ＭａｌＥ（ＰＣ及びリンゴ酸酵素によるフラックスの交換）の変異（図６）を用いた研究の例となる。
【０３９３】
ＰＥＰＣ（ΦＰＥＰＣ＝１００％）の単一寄与におけるラベルパターン及びピルビン酸ノード（ζＰＥＰＣ／ＰＥＰＣＫ＝ζＰＣ／ＭａｌＥ＝１０）での非常に可逆可能なフラックスを基準点として、１００％と設定する。合成ラベルデータセットを用いて、自由フラックスのための固有解法を、ネットワークの全ての自由フラックスの観測性及び認識可能性及び開発された拡張アプローチの適合性を示す、任意抽出した多様な開始値を用いた多数のパラメータ評価によって取得した。生物学的システムの適用可能性を菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）及びＣ．グルタミカムＢＳ１３（ｌｙｓＣT311I Ｄpyk）を用いて立証した。
【０３９４】
トレーサー研究及びパラメータ評価
上述した同位元素の定常状態だけでなく、絶えず続く成長及び生産特性は、タンパク質細胞からのタンパク質生成アミノ酸の13Ｃ強化からフラックス測定を可能とした。代謝フラックス分布を、実験的に測定されたマスアイソトポマー分率と計算されたマスアイソトポマー分率との偏差を最小化して取得した。確実に、Ｃ．グルタミカムＢＳ１のラベルパターンのマッチングが図７に示されているように、優れた適合性が達成された。
【０３９５】
ここで適用された代謝ネットワークモデルは、リンゴ酸塩及びオキサロ酢酸を単一プール、すなわち２つのプール間の完全に平衡させたラベル交換と見做す。ラベルデータの優れた適合性は、リンゴ酸塩及びオキサロ酢酸間の可逆可能な相互変換の存在を裏付ける。細胞質関連（ＭＤＨ）及び薄膜結合性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＱＯ）の協同作用によるリンゴ酸塩及びオキサロ酢酸間の可逆可能な相互変換を説明するＣ．グルタミカムに対するインビトロ研究(Molenaar, et al., 2000)から追加の証拠を得ることができた。実験的ラベルパターンと模擬ラベルパターンとの偏差が最も少ない細胞内フラックスのセットを細胞内フラックス分布の最も良い推定値と見做した。図８はピルビン酸ノード周囲の複合ネットワーク及びＣ．グルタミカムＢＳ１のために測定されたインビボフラックスを詳細に示す。
【０３９６】
拡張モデルを用いて、ＰＥＰＣ、ＰＣ、ＰＥＰＣＫ及びリンゴ酸酵素によるインビボフラックスを非常に詳しく測定したが、統計的評価で取得された狭い信頼区間がこれを反映する。ＰＣはＣ．グルタミカムＢＳ１の主要補充酵素であるが、これに対し、ＰＥＰＣは補充カルボキシル化に微弱な寄与をする。これはＣ．グルタミカムのリシン生産がピルビン酸カルボキシラーゼの発現レベルに大きく依存(Peters-Wendisch, et al., 2001)するが、これに対し、ＰＥＰカルボキシラーゼの活性はリシン生産に不要である(Peters-Wendisch, et al., 1993)という以前の研究結果に非常によく適合する。また、拡張アプローチはリンゴ酸酵素による重要なフラックスを示した。これはリンゴ酸酵素が今まではフルクトース−培養Ｃ．グルタミカムのためにのみ仮定された生理学的役割である(Dominguez, et al., 1998; Kiefer, et al., 2004)、グルコースでの培養中にＮＡＤＰＨソースとしての役割をすることの一番目のヒントを提供した。拡張モデルによって測定された、カルボキシル化及び脱カルボキシル化による正味フラックスは、それぞれ単純モデルによって取得されたランプフラックスと非常によく一致する。よって、この複合ネットワークの完全な解決のために必要な追加の努力は、関連したフラックスのうちいずれか一つの正確な測定を要求する幾つかの場合でのみ価値がある。
【０３９７】
代謝工学のツールとしてのコドン適応(codon adaptation)
近年、代謝工学及び遺伝子工学は、コリネバクテリウムグルタミカムを用いたリシン生産において、優れた菌株を生産するための有力なアプローチとして現れている。前記アプローチは、上述した中枢代謝経路活性を解明する方法論などの菌株特性化の精巧なツールボックスを要求する。ところが、菌株最適化のための意図された変異は、また、遺伝子ツールによって達成されなければならない。この点に関連して、細胞内の酵素活性の標的調節(modulation)は、選択された代謝経路によって炭素転換を増加又は減少させるために重要である。前記目的のために適用された遺伝子変化は典型的に強い。すなわち、遺伝子欠失又はプラスミドに基づいた遺伝子過発現による多くの増幅を介して完全な経路遮断を引き起こす。多くの場合に、このような激しい変化は不利な副作用を引き起こす。例えば、中枢糖分解作用酵素ホスホグルコイソメラーゼの欠失は、激しいＣ．グルタミカムの成長欠乏を引き起こした(Marx, et al., 2003)。Ｃ．グルタミカムのピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠失突然変異体は、糖ベースの生産培地で成長することができず、広範囲な副産物形成を示す(Blombach, et al., 2007)。本発明において、この頃代謝工学に使用される上述のツールボックスは、Ｃ．グルタミカムの比酵素活性の変更のために開始コドンの交換を使用するより緩やかなアプローチによって補完された。
【０３９８】
コリネバクテリウムグルタミカムにおける開始コドンの使用
Ｃ．グルタミカムにおいて、翻訳開始部位を開始コドンＡＴＧ、ＧＴＧ又はＴＴＧのいずれか一つで表示する。正確な開始コドン分布の測定のために、全体のゲノムシーケンスをＮＣＢＩデータベースからＦＡＳＴＡ−ｆｉｌｅの形でダウンロードしたとともに、開始コドンの位置で初期ヌクレオチドとしてのＡ、Ｇ及びＴの正確な数を、Ｅｘｃｅｌ（ＭＳ ｏｆｆｉｃｅ、２００３）を用いて検索した。Ａ、Ｇ及びＴの正確な数は、それぞれ２２１５、６２７及び２１５であった。これは７２％、２１％及び７％の相対度数に該当する。前記開始コドンの頻度は、Ｃ．グルタミカムの中枢代謝における頻度である８１％ＡＴＣ、１５％ＧＴＧ及び４％ＴＴＧとは若干異なる。
【０３９９】
中枢代謝経路の遺伝子から、ＡＴＧをＧＴＧで置換するための３つの遺伝子及び自然ＧＴＧをＡＴＧで置換するための１つの遺伝子を選択した。選択された酵素ＰＧＩ、ＰＤＨ、ＩＣＤ及びＧ６ＰＤＨを主要分岐点に位置させる。このようなノード、例えばペントースリン酸経路（ＰＰＰ）、補充カルボキシル化及びＴＣＡ回路でのフラックス再指定は、目標としたリシンの過生産に全体的に非常に重要である(Wittmann and Becker, 2007; Wittmann and Heinzle, 2002)。
【０４００】
開始コドンの交換による酵素活性の調節
Ｃ．グルタミカムＢＳ８７の遺伝子バックグラウンドで開始コドンの交換を行った。２つの相同組み換えイベントを介して、野性型対立遺伝子を突然変異対立遺伝子で置換した。根本的な複製プロトコルに基づいて、２番目の組み換えイベントから形成されたクローンは親菌株又は開始コドン突然変異体をさらに反映することができる。開始コドンでの点突然変異を保有する組み換え菌株のスクリーニングをそれぞれＩＣＤ、ＰＧＩ、ＰＤＨ又はＧ６ＰＤＨの比酵素活性の測定によって行った。図９に示されているように、幾つかのクローンは親菌株ＢＳ８７と比較するときに標的酵素の変化した活性を示した。
【０４０１】
前記クローンは、シーケンス分析によってさらに詳しく調査した。選択されたクローン及び親菌株のシーケンスは開始コドンヌクレオチドを除いた１００％一致を示した。ここで、変化したインビトロ活性を示す全ての菌株は、また、開始コドンにおけるヌクレオチド交換を示した。シーケンシングによるヌクレオチド交換の確認後、単独炭素源としてグルコースを用いて最小培地で比活性を測定した（表１２）。
【０４０２】
表１２：イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤ）、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）及びグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）のＣ．グルタミカムにおける開始コドンの役割としての比活性。数値は３つの生物学的複製からの平均値を当該偏差と共に示す。
【０４０３】
【表１２】
2013533740.tif 000025
【０４０４】
酵素活性への顕著な効果がｉｃｄ遺伝子で発見された。当該突然変異体において、ＩＣＤ比活性が７０％減少した。ａｃｅＥ及びｐｇｉの翻訳開始位置の交換はピルビン酸デヒドロゲナーゼ及びホスホグルコイソメラーゼの比活性を、それぞれ５６％及び４７％減少させた。Ｇ６ＰＤＨの場合、比活性は、ＧＴＧの代わりにＡＴＧ開始コドンの使用により２０％増加した。ＩＣＤ活性の翻訳下方調節(translational down-regulation)のための追加戦略は、グリシンのためのレアコドンＧＧＧの遂行及びイソロイシンのためのＡＵＡの遂行を含む。効果を極大化するために、３つの隣接したグリシンの自然コドンをレアＧＧＧ変異体で置換した。これらは５７０〜５７２位に局所化された。イソロイシンの場合、７８位及び７９位で２回のコドン置換を行った。ｉｃｄ遺伝子をコードする上で成功的に行われたが、シーケンシングで立証されたように、比酵素活性に影響がなかった。これは変異菌類でのコドン最適化において最小の役割を果たすものと解明されたヌクレオチド交換遂行の局所化と関連できる(Vervoort, et al., 2000)。
【０４０５】
遺伝子発現の調節の方法としてのコドン交換は新しいアプローチではない。ところが、この戦略は、今まで異種遺伝子の発現を含む過程で主にコドン−最適化に重点を置いた。ここでは、コドンの宿主菌株における相対的外観への適応(Jo, et al., 2007; Wiedemann and Boles, 2008)、又は最近適用されたｔＲＮＡ補完(Lee, et al., 2009)が改善された発現を引き起こした。このような時間が多くかかる迂回方法と比較して、本発明で行われる開始コドンの交換は、単一コドンに集中するため、確かにより簡単で容易である。コドン悪化、すなわちグリシンのためのＧＧＧ遂行及びイソロイシンのためのＡＵＡ遂行の結果は、開始コドンの適応が成功するための優れた方法であることを示す。代謝工学と関連して、所望しない経路の脱調節は些細なことではないので、特に翻訳開始を悪化させることにより遺伝子発現を減らすことができるということが興味深い。今まで、炭素フラックスは、多くの場合、激しい成長欠乏又は所望しない栄養要求性を引き起こす遺伝子欠失により完全に遮断された(Blombach, et al., 2007; Marx, et al., 2003)。最近、アンチセンスＲＮＡのプラスミド関連発現は、グルタミン酸(glutamate)生産Ｃ．グルタミカムにおける２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＯＤＨＣ）の活性を減らすことに成功的に適用された(Kim, et al., 2009)。ところが、このアプローチは永久的選択圧(selective pressure)を要求した。よって、産業的生産工程に適さない(Kim, et al., 2009)。開始コドンの交換はこのような妨害要因なしで選択された酵素の標的減衰の機会を提供する。Ｃ．グルタミカムにおける開始コドンＡＴＧの高い頻度（７２％）のため、この方法は代謝工学の全般的なツールとして大きな潜在力を有する。Ｃ．グルタミカムのリシン生産最適化のための当該戦略の２つの成功的な例を下記でさらに詳しく説明する。
【０４０６】
以前の２チャプター(chapter)は、菌株特性化及び遺伝子操作における基本として主要方法に関するものであった。下記の内容はＣ．グルタミカムによる改善されたリシン生産のための他の変異戦略について取り扱う。Ｃ．グルタミカムにおけるリシン生産の主経路、すなわちＮＡＤＰＨ代謝、リシン生合成、前駆体供給及びＴＣＡ回路は改善されたリシン生産のために成功的に操作された。
【０４０７】
ＮＡＤＰＨ代謝の変異
補助因子ＮＡＤＰＨのためのリシンの生合成経路の高い必要性のため、Ｃ．グルタミカムにおけるＮＡＤＰＨ代謝は、合理的変異のための主要目標中の一つである。それは以前に主要ＮＡＤＰＨソースとして解明された(Wittmann and Heinzle, 2002)ペントースリン酸経路によるフラックスの強化に有望である。これは最初にフルクトース１，６−ビスホスファターゼをコードする遺伝子ｆｂｐの過発現によって補完された、速度制限酵素グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼの過発現及び変異によってアプローチされた。代案的アプローチとして、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼの上方調節(up-regulation)は何よりもコードする遺伝子ｚｗｆ、ｔａｌ及びｔｋｔを含むｔｋｔオペロンのプロモーター交換によるトランスアルドラーゼ及びトランスケトラーゼの過発現によって達成された。また、今までよく理解できなかったリシン生産Ｃ．グルタミカムのＮＡＰＤＨ供給のためのリンゴ酸酵素の役割を調査した。
【０４０８】
グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼの過発現及び変異
過発現は、ｚｗｆ遺伝子の自然型プロモーター遺伝子の、スーパーオキサイドディスムターゼをコードするｓｏｄ遺伝子の強いプロモーターを介したゲノム置換によって達成された。また、Ａ２４３Ｔ点突然変異をＧ６ＰＤＨに導入した。この突然変異は、以前に野生型及び伝統方法によって誘導された生産菌株間の比較シーケンシングによって発見された。この突然変異の正確な代謝結果が今までさらに詳しく説明されたことがなかったにも拘わらず、リシン生産の増加をもたらすことを示した(Zelder, et al., 2005)。次いで、このような標的が以前にはＰＰＰへ向かうフラックス転換によってリシン生産を裏付けると解明された(Becker, et al., 2005)フルクトース１，６−ビスホスファターゼ遺伝子の過発現によって補完できるかについて実験した。全ての菌株を細胞成長及びリシン生産に対して特性化した。前記研究はＡ２４３Ｔ突然変異の導入の結果を調べるための野性型及び突然変異体Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼの特性化によって補完された。追加的に、遺伝子変異の代謝的結果を解決し且つ全体細胞挙動を理解するために、中枢炭素代謝による代謝フラックス及び細胞内代謝産物レベルを分析した。
【０４０９】
インビトロ活性
Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼのインビトロ比活性は、コードするｚｗｆ遺伝子の過発現によって確実に影響を受ける（図１０Ａ）。野生型及び菌株ＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）は、同様の活性を示すが、ｚｗｆ遺伝子の自然型プロモーターの、スーパーオキサイドディスムターゼをコードするｓｏｄのプロモーターへの置換は、酵素活性の４倍の増加をもたらした。これはｓｏｄプロモーターの使用が細胞内のＧ６Ｐデヒドロゲナーゼの量を増やすことを示す。点突然変異Ａ２４３ＴはＢＳ５（Ｐsodｚｗｆ）及びＢＳ６（ＰsodｚｗｆA243T）に対して観察される同様の数値から分かるように、Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼの比活性に大きく影響を及ぼさなかった。
【０４１０】
野生型及びＡ２４３Ｔ−変異体の動力学的特性
ｚｗｆ遺伝子での点突然変異の結果を理解するために、２つの酵素変異体を動力学的挙動について比較した。突然変異の行われた酵素は他の態様で優れた特性を示した。これはその基質中の一つであるＮＡＤＰに対する高い親和度を含む（表１５）。また、中枢代謝の代謝産物による抑制に対する強い抵抗性が観察された。５ｍＭ ＡＴＰ及びＰＥＰの添加後に一層さらに高い活性が突然変異体酵素に対して維持されたが、ＦＢＰ追加に対しては若干弱い影響が示された。１〜２ｍＭの生理学的濃度の３つの代謝産物を全て結合させて添加することにより、Ａ２４３Ｔ点突然変異が代謝レベルのＧ６Ｐデヒドロゲナーゼの調節制御を弱化させるということが明らかになった。基質Ｇ６Ｐに対する２つの酵素の親和度（表１３）及びＮＡＤＰＨによる抑制（図１０Ｂ）においては大きい変化が観察されなかった。
【０４１１】
表１３：Ｃ．グルタミカムからのＧ６Ｐデヒドロゲナーゼの野生型及びＡ２４３Ｔ変異体の動力学的特性化：Ｇ６Ｐ（ＫM.G6P）及びＮＡＤＰ（ＫM.NADP）のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ親和度定数及び同モル量で添加されたＡＴＰ、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びフルクトース１，６−ビスリン酸（ＦＢＰ）の合同作用による酵素活性の制御。データは炭素源としてグルコースを有する最小培地で培養された細胞からの細胞抽出物を用いた３つの異なる測定からの平均値を示す。
【０４１２】
【表１３】
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【０４１３】
ｚｗｆ遺伝子内のＡ２４３Ｔ突然変異の利得は、コードされたＧ６Ｐデヒロゲナーゼの改善された動力学的挙動のためであり、増加した比活性によるものではない。突然変異体酵素の非常に弱い抑制は、実験されたＣ．グルタミカムにおける代謝産物ＰＥＰ、ＦＢＰ及びＡＴＰで発見された生理学的範囲内である濃度１ｍＭで既に観察された(Moritz, et al., 2002)。よって、突然変異体酵素変異体はより高いインビボ(in vivo)活性を示すものと見える。また、実際ＮＡＤＰレベルが１００μｍの範囲内であるから、ＮＡＤＰに対するより高い親和度はその効果に影響を及ぼすことができる(Moritz, et al., 2002)。
【０４１４】
産物形成及び代謝フラックス
異なる突然変異体を成長及び生産特性について比較した（表１４及び１５）。このために、菌株をそれぞれ炭素源としてのグルコース、フルクトース及びスクロースのいずれか一つを含有する標準最小培地で培養した。フィードバック内耐性親菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ１のために、リシン収率は、フルクトース培養細胞における７４ｃ−ｍｍｏｌｃ−ｍｏｌ-1とグルコース培養細胞における８５ｃ−ｍｍｏｌ ｃ−ｍｏｌ-1との間であった(Becker, et al., 2005)。
【０４１５】
表１４：グルコース、フルクトース及びスクロースにおけるリシン生産Ｃ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）、Ｃ．グルタミカムＢＳ５（Ｐsodｚｗｆ）、Ｃ．グルタミカムＢＳ６（ＰsodｚｗｆA243T）及びＣ．グルタミカムＢＳ７（Ｐsodｆｂｐ＿ｚｗｆA243T）の成長及び生産特性。与えられたデータは、リシン収率（ＹLys/S）及びバイオマス収率（ＹX/S）であり、３つの並列培養実験からの平均値を示す。
【０４１６】
【表１４】
2013533740.tif 000027
【０４１７】
ｓｏｄプロモーターによるｚｗｆ遺伝子の過発現は著しくリシン生産を増加させた。当該菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ５におけるリシン生産への肯定的影響が、この全ての実験された炭素源から観察された。これにより、グルコースで培養された細胞においては３０％以上という最も大きい増加を引き起こした（表１６）。ｚｗｆ遺伝子がＡ２４３Ｔアミノ酸交換によってさらに変異されたＣ．グルタミカムＢＳ６は一層さらに高いリシン生産を示した。これは炭素源としてのフルクトース及びスクロースで最も確然であった。ｆｂｐ遺伝子の追加過発現によって、リシン生産は全ての炭素源でさらに強化された。導入された変異の重要な影響は３つの突然変異を全てもたらすＣ．グルタミカムＢＳ７と菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ１のリシン収率を比較すれば確実になる。変異の結合された導入は、グルコース及びフルクトースにおけるリシン収率を約５０％増加させ、スクロースにおけるリシン収率を約７０％増加させるなど、全体的なリシン収率を増加させた。リシン収率の増加と共に、グルコース及びスクロースにおけるバイオマス収率は連続的に減少し、フルクトースにおけるバイオマス収率はほぼ同様に維持された（表１４）。比速度(specific rates)に関連して、グルコース吸収は遺伝子変異に殆ど影響されていないままに維持されるため（表１５）、突然変異体の間で観察された変化は炭素フラックスの再分布を示す。それに応えて、比成長率(specific growth rate)はリシン生産の増加と共に減少した。
【０４１８】
表１５：グルコースで培養されたＣ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）、Ｃ．グルタミカムＢＳ５（Ｐsodｚｗｆ）、Ｃ．グルタミカムＢＳ６（ＰsodｚｗｆA243T）及びＣ．グルタミカムＢＳ７（Ｐsodｆｂｐ＿ｚｗｆA243T）の成長（μ）、グルコース吸収（ｑGlc）、リシン生産（ｑLys）及び呼吸率（ＲＱ）の比速度
【０４１９】
【表１５】
2013533740.tif 000028
【０４２０】
どのように遺伝子変異がＰＰＰ及びＣ．グルタミカムの他の代謝経路によるインビボ(in vivo)フラックスに影響を及ぼしたかを詳しく調べるために、13Ｃ代謝フラックス分析を、異なる菌株に対して行った。前記目的のために、［１−13Ｃ］グルコースでトレーサー研究を行った。グルコースで培養された異なる突然変異体における中枢代謝反応の取得された主要フラックスを図１１に要約したが、各フラックスパラメータに与えられた偏差は９０％信頼区間を示す。模擬及び測定されたラベルパターン間の優れた適合が取得された。自由フラックスパラメータにおいて、開始値を統計学的に異ならしめてパラメータの測定を２０倍繰り返し行ったことは各菌株において同一の結果であったが、これは全体最小値の識別を確保した。
【０４２１】
菌株ＢＳ５及びＢＳ６は、親菌株と比較したとき、非常に強化されたＰＰＰフラックスを示したが、糖分解フラックスは多く減少した。よって、ｚｗｆ遺伝子の過発現はＧ６Ｐノードでの確実なフラックス転換を引き起こした。フルクトース１，６−ビスホスファターゼの追加的過発現はＰＰＰへのフラックスの追加的増加を引き起こした。ＰＰＰだけでなく、他の重要なＣ．グルタミカムにおけるＮＡＤＰＨ供給経路としてのＴＣＡ回路によるフラックスが大きく強化された。異なるｚｗｆ突然変異体におけるＴＣＡ回路及びＮＡＤＰＨ供給経路ＰＰＰの一般に高い活性が同化作用及びリシン生産に必要な実際需要より一層さらに高いＮＡＤＰＨ供給を引き起こし、全てのｚｗｆ突然変異体でＮＡＤＰＨの大きい超過を引き起こした。ＰＰＰ変異された突然変異体の補助因子代謝の精密審査を、拡張された酸化還元反応バランスによって行った。これは炭素代謝の異化作用及び同化作用経路に形成される還元当量（ＮＡＤＨ、ＦＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ）の酸化を引き起こす酸化的リン酸化中の全ての可能な反応を考慮した。全ての突然変異体はＮＡＤＨ／ＦＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの大きい超過を示した。全体酸素消費は形成された全ての還元当量の酸化を完全に説明する程度と十分ではなかった。すなわち、酸化還元バランスは予想の如く閉鎖されていない。これは補助因子の酸化を引き起こす追加的代謝反応の確実な表示である（下記でさらに詳しく取り扱う）。興味深いことに、最適化された菌株におけるリシンのための前駆体としてのオキサロ酢酸のさらに高い需要は、補充カルボキシル化を介して増加したフラックスによって反映されなかった（図１１）。これは減少したバイオマス収率のために減少した同化作用のオキサロ酢酸の需要と関連があるであろう（表１４）。
【０４２２】
グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼの過発現及び変異の戦略によって、Ｃ．グルタミカムのリシン生産は、産業的に関連のある炭素源であるグルコース及びスクロースを含む異なる炭素源で大きく改善された。ところが、酵素のインビトロ活性の４倍増加は、当該インビボ活性の１．４倍増加、すなわちＧ６Ｐデヒドロゲナーゼインビボ(Moritz, et al., 2000)の強い代謝調節を示すフラックスによって反映された。取得されたグルコースの系譜学の異なる菌株のリシン生産を比較すると、ｓｏｄプロモーターによる過発現が生産の最も大きい増加を引き起こし、点突然変異Ａ２４３Ｔの追加導入は多くの増進をもたらしていないため（表１４）、一目してはｓｏｄプロモーターによる過発現が最も有益であると考えることができる。ところが、導入された突然変異の順序を交換すると、完全に異なる像が得られる。自然型プロモーターと共に突然変異された酵素のみを含有する、追加的に構築された菌株ＢＳ３は１２０ｃ−ｍｍｏｌ ｃ−ｍｏｌ-1の高いリシン収率を示したが、これはｚｗｆ遺伝子がｓｏｄプロモーターによって追加的に過発現されたときにさらに増進しなかった。これは遺伝子摂動に対する代謝反応が導入された変異に依存的であるうえ、宿主菌株の遺伝的バックグラウンドにもさらに依存的であることを確実に示す。
【０４２３】
副産物の形成
リシン生産の増進だけでなく、代謝操作は、グルコースで培養されたときにＣ．グルタミカムの主副産物であるトレハロースの形成にも影響を及ぼした。トレハロースの排泄は、この化合物が当該吸収システムの欠乏に起因して細胞によって吸収できないため、リシンの生産に不要である。Ｃ．グルタミカムの異なるｚｗｆ突然変異体は、ＰＰＰフラックスの代謝変異の肯定的副作用である減少したトレハロース形成を示した。表１７に示すように、ｚｗｆ遺伝子過発現は親菌株ＢＳ１に比べて菌株ＢＳ５で５３％減少したトレハロース形成を示す。菌株ＢＳ６において、トレハロース生産は６７％も減少した。Ｃ．グルタミカムにおいて、トレハロースは基質としてＧ６Ｐを使用する３つの異なる経路を介して形成できる(Tzvetkov, et al., 2003)。細胞内代謝産物の分析は、菌株ＢＳ５及びＢＳ６内の減少したトレハロースフラックスがＧ６Ｐの減少した有用性に関わっていることを示した（表１６）。
【０４２４】
【表１６】
2013533740.tif 000029
【０４２５】
表１６：グルコースでリシン生産Ｃ．グルタミカムＢＳ１、Ｃ．グルタミカムＢＳ５、Ｃ．グルタミカムＢＳ６及びＣ．グルタミカムＢＳ７を培養する間のトレハロース形成並びにＧ６Ｐ及びＦ６Ｐの細胞内レベル。トレハロース収率は３つの併行培養から測定した。細胞内のＧ６Ｐ及びＦ６Ｐレベルはそれぞれ２つで分析した２つの独立的な細胞抽出物で測定した。
【０４２６】
高いＧ６ＰＤＨ活性によるＧ６ＰのＰＰＰへの加速した転換は、この前駆体の有用性を減少させてトレハロースの形成を減少させる。ｆｂｐ遺伝子の伴う過発現はｚｗｆ操作の効果を弱化させてトレハロース形成の減少が確実になったが、トリプル−突然変異菌株はやや減少が減った（２８％）。これは、前記操作がＧ６Ｐプールを介してＰＰＰへ炭素を「押し」、Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼの変異がＧ６Ｐプールからこの経路へ炭素を「引く」という事実に起因しなければならない。よって、この突然変異体内のＧ６Ｐプールは実質的にさらに高かった。それにより、Ｆ６ＰプールもＢＳ７菌株で一層さらに高かった（表１６）。
【０４２７】
酸化還元バランシング及びＮＡＤＰＨ代謝
代謝フラックス分析によって分かるように、遺伝子操作は、細胞のＮＡＤＰＨ代謝の激しい変化をもたらした。ＰＰＰ及びＴＣＡ回路によるフラックス増加は、ＮＡＤＰＨ供給の大きな増加を引き起こした。前記フラックスの変化に関連した、増加したリシン収率は、ケモスタット培養(chemostat cultures)に対する仮定と異なるが、ＮＡＤＰＨ供給がＣ．グルタミカムのバッチ培養におけるリシン生産に限られた役割を果たすことを示す(Sahm, et al., 2000)。親菌株ＢＳ１が若干の明確なＮＡＤＰＨ欠乏を示すが(Kim, et al., 2006)、これに対し、ＰＰＰ変異菌株へのＮＡＤＰＨ供給はその需要より一層さらに高かった（表１７）。その結果、形成される明白なＮＡＤＰＨのこのような菌株での超過は、行われた変化がリシン生産に完全に活用できなかったが、追加の最適化のために潜在力を残すことを示す。この潜在力の程度はリシン経路に全ての超過ＮＡＤＰＨを送ることができれば最も良い突然変異体Ｃ．グルタミカムＢＳ７の生産量が２倍になれるという事実によって説明される。その可能性はカルボキシル化の方向で活動するリンゴ酸酵素によるＮＡＤＰＨの部分的酸化によって、ある程度低くなるおそれがある。ｚｗｆ突然変異体の消費されていないか或いは間違って送られたＮＡＤＰＨは、ＰＰＰフラックス操作によって発生する代謝ネットワークの他の部分の限界を示す。特に、Ｃ．グルタミカムの補充フラックスの増加は、リシン生産の増加を引き起こすことが示されるため、このような限界はオキサロ酢酸の供給と関連がありうる(Koffas, et al., 2003; Peters-Wendisch, et al., 2001)。事実、補充正味フラックス(anaplerotic net flux)は、ここで調査された菌株でほぼ一定に残っていたため、同化オキサロ酢酸需要の減少のみが前記前駆体のリシン経路へのより高い流入を可能とした。
【０４２８】
ＰＰＰ突然変異体における高い明白なＮＡＤＰＨ過剰は、ＮＡＤＰＨを消費する追加反応を示す。可能な候補としては、呼吸鎖における過酸化物を生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化酵素(Matsushita, et al., 2001)又はカルボキシル化方向におけるリンゴ酸酵素作用を含む(de Graaf, 2000; Petersen, et al., 2000)。このような反応中のいずれか一つの役割を裏付ける明白な実験的証拠は今まで取得されていない。ところが、脱カルボキシル化方向で作用するリンゴ酸酵素が、外見上のＮＡＤＰＨ欠乏と共に、菌株で追加的ＮＡＤＰＨソースとして作用することができると仮定された(Dominguez, et al., 1998)。ＰＰＰ変異突然変異体の補助因子の代謝についてさらに詳しく分かるために、酸化的リン酸化の間にできる限り全ての酸化還元反応を考慮した完全なバランスを設定した（表１７）。
【０４２９】
【表１７】
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【０４３０】
表１７：測定されたフラックスから計算された、ＰＰＰ変異されたＣ．グルタミカムＢＳ５、Ｃ．グルタミカムＢＳ６及びＣ．グルタミカムＢＳ７のＰＰＰの酸化還元バランス（図１１）、同化作用ＣＯ2及びＮＡＤＨの生産、同化作用ＮＡＤＰＨ需要及び呼吸率（表１５）。
【０４３１】
いずれの菌株においても、補助因子バランスは閉鎖されていない。これは今まで［Ｈ］酸化の指定されていないフラックスの追加的存在はバランスが閉鎖されることを要求するということを示す。３つの菌株ともにおいて、この［Ｈ］酸化フラックスは明白なＮＡＤＰＨ過剰とほぼ同様に高かった。呼吸鎖の部分としてのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化酵素の活性は酸素を消費する。よって、閉鎖された酸化還元バランスを引き起こすため、呼吸鎖のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化酵素のＮＡＤＰＨ酸化への大きな寄与は除外できる。この考慮事項はリンゴ酸酵素にも適用される。カルボキシル化方向に作用するリンゴ酸酵素の活性によるＮＡＤＰＨ酸化はオキサロ酢酸に転換されるリンゴ酸塩の形成を引き起こし、これによりＮＡＤＨを形成する。呼吸連鎖内の完全なＮＡＤＨ酸化は結果的に酸素消費と関連する。ところが、野生型及び異なるリシン生産源におけるリンゴ酸酵素の比活性の調査は、リシン生産Ｃ．グルタミカムにおけるリンゴ酸酵素の生理学的重要性の上昇に対する一番目のヒントを与えた（図１３）。よって、その生理学的役割をさらに詳しく観察した。
【０４３２】
ｔｋｔオペロンの過発現
Ｃ．グルタミカムでグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｚｗｆ遺伝子は、Ｇ６ＰＤＨの推定上、サブユニットをコードする遺伝子ｏｐｃＡ、トランスアルドラーゼをコードするｔａｌ、トランスケトラーゼをコードするｔｋｔ、及び６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするｐｇｌと共に、ｔｋｔオペロンに位置している。上述したアプローチの代案として、Ｇ６ＰＤＨの過発現は完全なオペロンの増幅された発現によって達成できる。よって、ペントースリン酸経路の拡大された酵素セットを上方調節することができる。
【０４３３】
グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼは、ＰＰＰの速度制御酵素と見做されるが(Moritz, et al., 2000)、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの制限された容量のため、ｚｗｆの過発現に対応してＰＰＰの非酸化部分に他のボトルネック現象が発生するということは除外できない。この点と関連して、ｔｋｔの過発現は非酸化経路による炭素転換を効果的に増加させるものと明らかになった(Ikeda and Katsumata, 1999)。よって、ＰＰＰの酸化及び非酸化部分の酵素の結合された過発現はＰＰＰによる効果的なフラックス増加を確保する。よって、リシン生産のための増加したＮＡＤＰＨ供給を確保する。
【０４３４】
菌株構築及び比酵素活性
ｔｋｔオペロンの野生型プロモーターの、強いｓｏｄプロモーターへの対立形質置換によって過発現が達成された。プロモーター置換はＰＣＲ分析によって立証された。このために、プロモーター内で結合する部位特異プライマーがｔｋｔオペロン内で結合するプライマーと結合された。このアプローチは、ゲノム内のプロモーター交換を示す突然変異体からのＰＣＲ産物を生産しただけである。関連酵素に行われたプロモーター交換の効果を調査するために、比活性(specific activity)を測定した。ｓｏｄプロモーターによるｔｋｔオペロンの転写上方調節に対応して、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの比活性が大きく増加した（図１２）。
【０４３５】
ｔｋｔオペロンの遺伝子の基本発現レベルは共通プロモーターによって確実に制御されるが、前記共通プロモーターのより強いｓｏｄプロモーターへの交換は基底発現レベルを増加させる。よって、コードされた酵素の比活性を増加させる。これは複数の遺伝子変異の代わりに単一プロモーター交換のみを要求するので、ｚｗｆ、ｔｋｔ及びｔａｌの伴う過発現を確実に単純化する。ペントースリン酸経路による制限されていない炭素フラックスを達成するために、全体ｔｋｔオペロンの過発現が最も有望で効果的な戦略である。
【０４３６】
ＮＡＤＰＨ代謝におけるリンゴ酸酵素の機能的役割
上述した菌株の代謝フラックス分析は、調査された菌株のいずれもＮＡＤＰＨ−消費反応としてバイオマス及びリシン形成、ＮＡＤＰＨ提供反応としてＰＰＰ及びＩＣＤのみを考慮する閉じたＮＡＤＰＨバランスを達成していないことを示した。ＮＡＤＰＨ供給が菌株最適化関連主要問題中の一つであるため、確実にＮＡＤＰＨ欠乏を示す菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）が、どのようにそのＮＡＤＰＨ需要を完全に満足させることができるかを確認することは特に興味深い。潜在的候補は今までの役割がよく理解されていないリンゴ酸酵素である。よって、リンゴ酸酵素のＮＡＤＰＨ代謝への役割をさらに詳しく調査した。このために、コードする遺伝子ｍａｌＥをＣ．グルタミカムＢＳ１及びＰＰＰ−変異菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ６のバックグラウンドで欠失させて成長及び生産特徴についての効果を研究した。
【０４３７】
菌株構築及び確認
野生型ｍａｌＥ遺伝子の、４００ｂｐのｍａｌＥシーケンスが欠乏した短縮ＤＮＡ断片への対立形質置換によってリンゴ酸酵素の欠失を達成した。ＰＣＲ分析及び比リンゴ酸酵素活性の測定によって確認を行った。欠失突然変異株におけるＭａｌＥ活性は検出限界の下であった（＜０．０１Ｕｍｇ-1）。
【０４３８】
リンゴ酸酵素の活性
リンゴ酸酵素の比活性は遺伝子バックグラウンド及び栄養状態に強く依存する。野生型と比較して、リシン生産Ｃ．グルタミカムＢＳ１は大きく増加したリンゴ酸酵素の活性を示した（図１３）。Ｃ．グルタミカムＢＳ１における成長条件がリンゴ酸酵素の活性に及ぼす影響をさらに調査した。ここで、ＭａｌＥ活性はグルコースで培養された細胞と比較してフルクトース培養細胞で増加した（図１３）。
【０４３９】
以前の研究において、ｍａｌＥの発現レベルは栄養状態に大きく依存する(Dominguez, et al., 1998; Hayashi, et al., 2002; Polen, et al., 2007)と知られている。間接的に酵素容量に、そして発現レベルに影響を及ぼす、ここで観察された異なるインビトロ活性は遺伝子摂動(genetic perturbation)のためにリンゴ酸酵素の増加した発現を示唆する。
【０４４０】
ｍａｌＥ欠失に対する生理的反応
リンゴ酸酵素の生理的役割を調査するために、親菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ１及びそのΔｍａｌＥ誘導体を、標準最小培地での成長及びリシン生産を考慮して比較した。図１４に示すように、リシン及びバイオマス収率は欠失突然変異株で減少した。ところが、成長はｍａｌＥ欠失に若干の影響のみを及ぼした。ＰＰＰによる増加したＮＡＤＰＨ供給と共に、ＮＡＤＰＨ−変異菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ６では像が異なった。グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼの過発現及び変異のため、この菌株へのＮＡＤＰＨ供給は、成長及び生産特性の変化を引き起こしたＣ．グルタミカムＢＳ１と比較して大きく増加した。この菌株のリンゴ酸酵素欠失はリシン及びバイオマス形成に何の影響も与えなかった（図１４）。
【０４４１】
Ｃ．グルタミカムのＮＡＤＰＨ−代謝への結果をさらに調査するために、バイオマス形成及びリシン生産に対する菌株の全体ＮＡＤＰＨ需要を１６．４ｍｍｏｌ ＮＡＤＰＨ（ｇ細胞乾量）-1及び４ｍｏｌ ＮＡＤＰＨ（ｍｏｌリシン）-1の同化作用の需要を考慮して計算した。ｍａｌＥ欠失菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ４４及びその親Ｃ．グルタミカムＢＳ１の各ＮＡＤＰＨ需要の比率は０．９３であった。これは該補助因子の消費が欠失菌株で減ったことを示す。ＮＡＤＰＨ−変異菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ６及び当該ｍａｌＥ欠失菌株のバイオマス及びリシン形成は同一であった。よって、両菌株とも産物合成へのＮＡＤＰＨ必要量において異ならず、よって、それらの各ＮＡＤＰＨ消費の比率は１．００であった。拡張されたフラックスモデルを用いた、取得されたデータセット及び13Ｃ代謝フラックスの分析は、リンゴ酸酵素がリシン生産Ｃ．グルタミカムＢＳ１へのＮＡＤＰＨ供給に寄与することを確実に示す。野生型と比較して、ＭａｌＥ活性は増加したＮＡＤＰＨ需要についてリシン生産源で増加し、ｍａｌＥの欠失はＮＡＤＰＨ消費産物であるリシン及びバイオマスの減少した形成を引き起こした。１００％と設定されたグルコース比吸収率に正常化された相対的フラックス［％］としてのＮＡＤＰＨ必要量を発現することにより、Ｃ．グルタミカムＢＳ１の全体ＮＡＤＰＨ消費フラックスはｍａｌＥ欠乏誘導体の全体ＮＡＤＰＨ消費より１３％高かった。この差異は、拡張されたフラックスモデルで測定されたＣ．グルタミカムＢＳ１におけるリンゴ酸酵素による１５％のインビボ(in vivo)フラックス（図２０）及び欠失菌株におけるリンゴ酸酵素によるゼロフラックスに非常によく対応する。リンゴ酸酵素による該インビボフラックスが閉鎖ＮＡＤＰＨバランスを達成するためにリシン生産Ｃ．グルタミカムＢＳ１に必要であるということが、ＮＡＤＰＨバランス（図１５）から自明になる。
【０４４２】
ところが、Ｃ．グルタミカムの野生型において、グルコースにおける成長の間、ＰＰＰ及びＴＣＡ回路のみが、細胞成長のための十分なＮＡＤＰＨを供給するといことが最近立証された(Kromer, et al., 2008)。これは野生型バックグラウンドでリンゴ酸酵素の欠失が該炭素源における成長特性に影響を及ぼさないことを説明する(Gourdon, et al., 2000)。Ｃ．グルタミカムは、増加したＮＡＤＰＨ需要に合わせるために、リシン生産条件の下でリンゴ酸酵素を確実に活性化するが、これは増加したＭａｌＥ比活性だけでなく、増加した発現レベルにも反映される。ｍａｌＥ発現の調節のための根本的な調節戦略は未だ解明されていない。ここで、幾つかの研究は幾つかの調節遺伝子によって発現調節を示した。例えば、ｍａｌＥがｒａｍＢ−レギュロンに属する(Gerstmeir, et al., 2004)という証拠があり、栄養状態への依存性が説明され(Dominguez, et al., 1998; Hayashi, et al., 2002; Polen, et al., 2007)、全体窒素調節ａｍｔＲへの連結が最近発見された(Buchinger, et al., 2009)。ところが、細胞内信号は依然として不確実である。Ｃ．グルタミカムのＮＡＤＰＨ代謝へのリンゴ酸酵素の確実な関連のため、細胞の酸化還元反応状態を誘発因子として考えることができる。よって、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰの比は細胞の酸化還元反応状態の可能な信号体系として測定された。
【０４４３】
発現制御信号としての細胞内ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰの比
細胞内ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ比の測定は、調査された菌株間で大きい差異を示した。Ｃ．グルタミカムＢＳ１におけるＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰの比は０．８２±０．１０であった。この遺伝子バックグラウンドにおけるリンゴ酸酵素活性の欠乏は何らの影響も与えなかったが、これはＣ．グルタミカムＢＳ４４で類似の値である０．７６±０．１０によって反映される。ところが、ＰＰＰ変異によるＮＡＤＰＨの増加した供給は確実にＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰの比に影響を及ぼした。Ｃ．グルタミカムＢＳ６における測定値（１．４５±０．４０）は、それの親菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ１と比較して一層高かった。Ｃ．グルタミカムＢＳ５２はＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰの比１．７６±０．２０を示した。このようにそれの親菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ６とは異ならなかった。図１６から分かるように、ＭａｌＥ活性は明らかにＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰの比と相関関係がある。最も高い比２．３５を示すＣ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２(Kromer, et al., 2008)は最も低いＭａｌＥ活性を示した。
【０４４４】
ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ比の減少、すなわちＮＡＤＰＨ限界の細胞内信号としてのＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ比の減少はｍａｌＥ発現を誘発し、これは調査されたリシン生産源における増加した比活性で反映される。以前の研究は、大腸菌(E.coli)で、細胞におけるＮＡＤＰＨの有用性によって反映された酸化還元反応の状態は、スーパーオキサイドディスムターゼ発現の調節信号として認識されるということを明らかにした(Gardner and Fridovich, 1993)。ＰＰＰ変異菌株への増加したＮＡＤＰＨ供給のため、リンゴ酸酵素によるＮＡＤＰＨの追加的供給は不要であるが、これはこの菌株におけるＭａｌＥの低い活性を説明する。この仮定はこの菌株においてｍａｌＥ欠失に対する対応によって確実になる。リシン生産及びバイオマス形成はリンゴ酸酵素活性の欠乏に影響されなかったが、これはＰＰＰによるＮＡＤＰＨ供給が該菌株の完全なＮＡＤＰＨ需要に合わせることに十分であることを示す。
【０４４５】
取得されたデータはＣ．グルタミカムが、ＭａｌＥ活性の調節によって、異なる細胞の必要条件に確実に適応するということを明らかに示す。例えばフルクトースにおける成長又はリシン生産など制限されたＮＡＤＰＨの条件下で、ｍａｌＥ発現は増加し、Ｃ．グルタミカムにおける重要な追加ＮＡＤＰＨソースを示す。これに関連して、ＭａｌＥは変化する細胞必要条件に対処する代謝柔軟性及び強健性を裏付ける。ところが、リンゴ酸酵素がＰＰＰ操作菌株においてＮＡＤＰＨ過多形成と共に酸化還元バランシングに寄与するか、或いはどのように寄与するかは確実ではない。これに関連して確実なことは、ｍａｌＥが明白なＮＡＤＰＨ超過の酸化に責任があれば、仮定できるように、リンゴ酸酵素の欠失はＮＡＤＰＨを要求する産物としてのリシン及びバイオマスの増加した生産を引き起こさないことである。ところが、ｍａｌＥ欠乏菌株がＰＰＰ及びＴＣＡ回路を介したフラックスを含む代謝フラックスの全体的再配列によって対応し、これにより全体ＮＡＤＰＨ供給を減少させたということは除外できない。本発明は、拡張的アプローチを用いた代謝フラックス分析、完全な酸化還元及びＮＡＤＰＨバランスの測定を含む追加的な調査を要求するであろう。
【０４４６】
リシン生合成の変異
菌株最適化において、リシン生合成経路を形成する酵素が代謝工学における主要ターゲットである。ところが、リシン形成の異なるルートは、分離された経路が高い柔軟性を与えるため、菌株デザインを妨げる。本発明において、焦点はＣ．グルタミカムにおけるリシン経路のデヒドロゲナーゼブランチを収集するジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼにある。ｄｄｈ遺伝子をコードする２番目のコピーの実現によって、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼはフィードバック脱調節された菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ１のバックグラウンドで過発現された。
【０４４７】
ｄｄｈ過発現の比酵素活性へのインパクト
ｄｄｈ遺伝子の２番目のコピーの実現は、親菌株ＢＳ１に比べて、Ｃ．グルタミカムＢＳ２２２の粗細胞抽出物におけるＤＤＨの活性を大きく増加させた。図１７に示すように、ｄｄｈ−突然変異体は４４０ｍＵ ｍｇ-1の比活性を示し、ＢＳ１は２１０ｍＵ ｍｇ-1の比活性を示した。酵素活性への影響はジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの追加的な遺伝子コピーを反映する。
【０４４８】
ｄｄｈ過発現の成長及び生産への影響
２倍に増加したＤＤＨの活性がリシン生産及び成長挙動に及ぼした影響を調べるために、グルコースにおける標準最小培地での培養実験を行った。２つの菌株とも全体培養期間中にバランスの取れた成長及び代謝安定性を示した。菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ２２２におけるＤＤＨ活性の増加はリシン収率の２３％増加をもたらした（表１８）。
【０４４９】
【表１８】
2013533740.tif 000031
【０４５０】
表１８：単一炭素源としてグルコースを用いた標準最小培地におけるＣ．グルタミカムＢＳ１及びＣ．グルタミカムＢＳ２２２の成長及び生産特性。グルコース消費及び産物形成間の線形最適合の勾配として収率を測定した。
【０４５１】
追加の遺伝子コピーは、成長だけでなく、バイオマス形成に影響を及ぼした（表１９）。両者とも親菌株と比較してＣ．グルタミカムＢＳ２２２で若干減少した。これは０．３８ｈ-1の比速度で成長し、ｄｄｈ突然変異体において、μは０．３１ｈ-1に減少した。
【０４５２】
リシン生合成経路のスクシニラーゼブランチとは異なり、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼは直接アンモニウムを使用する。（ＮＨ4）+に対するＤＤＨの低い親和度(Wehrmann, et al., 1998)のため、培地における濃度がＤＤＨのインビボ活性に影響を及ぼし易い。よって、ｄｄｈ過発現がリシン生産に影響を及ぼし易い。追加のシェークフラスコ培養においても、このような理由により成長する間に相異なる硫酸アンモニウム濃度で２つの菌株を比較した。
【０４５３】
硫酸アンモニウムの濃度増加による成長促進
異なる硫酸アンモニウム濃度における菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ１の培養は、濃度と比成長速度との分明な相関関係を示した。図１８に示されているように、比成長速度は硫酸アンモニウムの有用性の増加と共に増加した。
【０４５４】
最も低い濃度２ｇ Ｌ-1において、Ｃ．グルタミカムＢＳ１は０．３２ｈ-1の比成長速度を示し、１５ｇ Ｌ-1の濃度で最大成長率０．４３ｈ-1に到達した。成長挙動とは逆に、Ｃ．グルタミカムＢＳ１のリシン及びバイオマス形成は培地の多様な硫酸アンモニウム濃度に影響されなかった（表１９）。
【０４５５】
【表１９】
2013533740.tif 000032
【０４５６】
表１９：最小培地で培養されたＣ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）の多様な硫酸アンモニウム濃度におけるリシン収率及びバイオマス収率
【０４５７】
増加したアンモニウム有用性によるリシン生産の向上
ｄｄｈ変異菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ２２２の像は完全に異なった。ここで、リシン生産は、培地での硫酸アンモニウム濃度に極めて依存した。図１９に示すように、ＢＳ２２２のリシン収率は硫酸アンモニウムの利用可能性の増加と共に連続的に増加した。硫酸アンモニウムの濃度２ｇＬ-1で、菌株は８９．４ｍｍｏｌ ｍｏｌ-1のリシン収率を示した。これは１０ｇＬ-1の硫酸アンモニウム濃度で１２５．２ｍｍｏｌ ｍｏｌ-1まで増加した。硫酸アンモニウムへの追加補充は追加の生産向上をもたらさなかったが、これは濃度１０ｇＬ-1が変異されたジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの飽和に十分であることを示唆し、これはアンモニウムに対するＤＤＨのｋm値３４ｍＭと一致する(Wehrmann, et al., 1998)。
【０４５８】
Ｃ．グルタミカムＢＳ１とは逆に、ｄｄｈ突然変異体の比成長速度は培地の硫酸アンモニウムの濃度に影響されなかった。菌株は平均０．３０ｈ-1±０．０１の速度で成長した。成長速度が０．２６ｈ-1と若干減少した硫酸アンモニウム濃度２ｇＬ-1での培養が唯一な例外であった。これは親菌株ＢＳ１の最も悪い成長を引き起こした濃度でもあった。前記低いアンモニウム量は最適の成長を裏付けず、バイオマス形成を制限する(Silberbach, et al., 2005b)。これは２．７５ｇＬ-1未満の濃度ではアンモニウム同化に参加した幾つかの遺伝子がアンモニウム調節を確保するために上方調節されるという研究結果と一致する。ところが、バイオマス形成は硫酸アンモニウム濃度１０ｇＬ-1以上で減少したが（表２０）、これは大きく増加するリシン収率と関連がある。
【０４５９】
【表２０】
2013533740.tif 000033
【０４６０】
表２０：最小培地で培養されたＣ．グルタミカムＢＳ２２２の多様な硫酸アンモニウム濃度における比成長速度及びバイオマス収率
【０４６１】
２種のリシン生合成経路と共に、Ｃ．グルタミカムを多様な硫酸アンモニウム濃度に適応するようによく準備する。ＮＨ4+に対する低い親和度を有するデヒドロゲナーゼ経路は高い濃度で活性となるが、これに対し、スクシニラーゼ経路はアンモニウムの利用可能性が少ないときに成長を確保する。また、これは多様な硫酸アンモニウム濃度における成長中の２個の経路間のフラックス分割にも反映される(Eikmanns, et al., 1993; Sonntag, et al., 1993)。全体的窒素調節遺伝子ａｍｔＲによるスクシニラーゼブランチの第１酵素をコードするｄａｐＤの脱調節は、このエネルギー消費経路が、アンモニウム供給が高いときに軽微な重要性を有することを確保する(Buchinger, et al., 2009; Silberbach, et al., 2005b)。これはＣ．グルタミカムＢＳ１における変化のないリシン収率を説明する。スクシニラーゼ及びデヒドロゲナーゼブランチを含むそれのリシン経路は、一定の容量を有する。ここで、硫酸アンモニウムの変化はこれらの２ブランチ間のフラックス変化のみを引き起こす。ＮＭＲ分析によるフラックス分配比の測定は５ｇＬ-1の硫酸アンモニウム濃度でデヒドロゲナーゼブランチがリシンに対する全体フラックスの約４０％に寄与することを示した。この硫酸アンモニウム濃度で、ＤＤＨはＮＨ4+に対する低い親和度のため、ＤＤＨが最大のときに作用しない。よって、このブランチによる炭素フラックスを制限する。ＮＨ4+の利用可能性を増加させることはＤＤＨ活性を増加させ、これによりそれの全体リシンフラックスへの寄与を増加させるが(Sonntag, et al., 1993)、スクシニラーゼブランチを形成する酵素の発現を減少させ(Buchinger, et al., 2009)、全体リシンフラックスが増加しなくする。ところが、Ｃ．グルタミカムＢＳ２２２において、リシン経路の全体容量はｄｄｈの過発現によって増加する。ＮＨ4+に対するジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの低い親和度のために、この容量はより高い濃度でのみ完全に利用できる。Ｃ．グルタミカムＢＳ１とは異なり、Ｃ．グルタミカムＢＳ２２２は、リシン経路の前記増加した容量をリシン生産に使用し、加速成長に対応しない。高いアンモニウム濃度でのＣ．グルタミカムにおけるリシン生産時のｄｄｈの重要性は以前に行われた欠失実験によってさらに強調される(Schrumpf, et al., 1991)。ここで、欠失は激しく減少したリシン生産性を引き起こした。
【０４６２】
ところが、十分なアンモニウム供給が確保されたが、ｄｄｈのプラスミド関連過発現はリシン生産において有益ではなかった(Cremer, et al., 1991)。ここで、２つの可能な説明に注目すべきである：アンモニウム利用可能性への依存度だけでなく、リシン生合成経路のフラックス分配比はまた重要な時間依存度を示した(Sonntag, et al., 1993)。高い硫酸アンモニウム濃度で、デヒドロゲナーゼ経路は培養の最初１２時間内に全体リシンフラックスに７０％以上寄与するが、これは本研究で調査された培養段階と一致する。ところが、以前の研究で研究された以後の培養段階で、デヒドロゲナーゼ経路の寄与は１２％と顕著に減少する(Sonntag, et al., 1993)。また、過発現は遺伝子的に定義されていない生産源で行われた。これは、化学的突然変異生成によって取得されたとともに、フィードバック調節されていないアスパラギン酸キナーゼについて選択された(Menkel, et al., 1989)。よって、ｄｄｈ過発現の肯定的な効果を回避する追加突然変異の蓄積は除外できない。このような研究結果から、変異戦略の利点は、重要変数として実験条件だけでなく変異された菌株の遺伝子バックグラウンドを考慮して注意深く証明されるべきであることが確実になる。
【０４６３】
ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの比活性は、培養培地の硫酸アンモニウムの濃度に影響されなかった。それぞれ２ｇＬ-1又は１５ｇＬ-1で培養されたとき、２つの菌株とも同一の比活性を示した（図２０）。これは、リシン生産性について観察された差異は培地へのＮＨ4+供与によって裏付けられるＤＤＨのインビボ活性と相関関係があり、変化したＮＨ4+濃度に対する反応としてのｄｄｈの発現レベル変化の結果ではないことを確かに示す。
【０４６４】
ある程度まで、高いアンモニウム濃度で達成された増進は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｙｓＡの発現レベルによっても影響され得る。低いアンモニウム利用可能性において、ｌｙｓＡ発現はａｍｔＲによって抑制され、リシン形成の代わりに成長を支持する。ところが、この抑圧は増加する硫酸アンモニウム濃度で廃止され、これによりｌｙｓＡ(Silberbach, et al., 2005b)発現を増加させる。よって、ｄｄｈ変異菌株におけるリシン生産を支持することが可能なより高い酵素容量を引き起こす。
【０４６５】
前駆体供給の変異
ＮＡＤＰＨの過剰供給のために、上述したＰＰＰ変異菌株は、リシン生産における重要な残余潜在力を持った。ここで、リシン合成は変わらない補充正味フラックスで反映されるオキサロ酢酸の不十分な供給によって制限される（図２４）。これに関連した菌株増進は、ピルビン酸カルボキシラーゼ又はＰＥＰカルボキシラーゼの過発現によるＯＡＡ供給の増加によって達成された(Peters-Wendisch, et al., 2001; Sano, et al., 1987)。本研究で適用された戦略は、ＯＡＡの直接的な炭素前駆体としてのピルビン酸塩及びホスホエノールピルビン酸塩を巡って競争する代謝経路を介した炭素転換減少によるＯＡＡ供給増加のための新しい標的に焦点を合わせた。
【０４６６】
ピルビン酸キナーゼ欠失に対する代謝反応
ピルビン酸キナーゼは、中間代謝のフラックス調節において重要な役割を果たす。それはホスホエノールピルビン酸塩のピルビン酸塩への不可逆性転換を促進させ、ＡＴＰ及びＡＭＰのアロステリック調節(allosteric control)の下にある(Jetten, et al., 1994b)。ピルビン酸キナーゼ欠乏菌株において、２つのリシン前駆体オキサロ酢酸塩及びピルビン酸塩の必要な同モル比は、ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）の合奏作用(concerted action)によって達成でき、これにより減少した量の炭素がＴＣＡ回路への減ったフラックスに起因してＣＯ2として損失できるため、リシン生産Ｃ．グルタミカムにおけるピルビン酸キナーゼの欠失は菌株改良の有望な戦力として考えられる。以前の研究で、リシン生産Ｃ．グルタミカムにおけるピルビン酸キナーゼの欠失は確実な像を出さなかったため、正確な代謝結果が完全に理解されなかった(Gubler, et al., 1994; Ozaki and Shiio, 1969; Shiio, et al., 1990)。ここで、ピルビン酸キナーゼ欠失に対するＣ．グルタミカムの代謝反応は、上述した拡張モデルを用いてインビボフラックスのレベルを詳しく調査された。ピルビン酸キナーゼ欠乏菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ１３を、リシン生産源Ｃ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）のバックグラウンドにおけるコードするｐｙｋ遺伝子の欠失によって構築した。
【０４６７】
ピルビン酸キナーゼの活性
ｐｙｋ欠失突然変異体Ｃ．グルタミカムＢＳ１３はインビトロピルビン酸キナーゼ活性（＜０．６ｍＵ ｍｇ-1）の完全な不在を示したが、これに対し、親菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ１はこの酵素に対する強い比活性１０９９ｍＵ ｍｇ-1を示した。ＰＹＫ活性の欠乏はＣ．グルタミカムＢＳ１３での活性のような残余ピルビン酸キナーゼがないことを示した。欠株菌株において、ＰＥＰのピルビン酸塩への直接的転換はホスホトランスフェラーゼシステムによるグルコース吸収に制限された。
【０４６８】
欠失の成長及び生産特性への影響
ピルビン酸キナーゼ欠失の定量的生理学的効果を調べるために、リシン生産Ｃ．グルタミカムＢＳ１及びそのピルビン酸キナーゼ欠乏誘導体Ｃ．グルタミカムＢＳ１３をバッチ培地で培養した（図２１Ａ〜Ｄ）。
【０４６９】
２つの菌株とも相対的に同様の比成長率、比グルコース吸収率又はバイオマス収率を示した。ところが、リシン生産の収率及び比速度はＣ．グルタミカムＢＳ１３でややさらに低かった（表２１）。また、ピルビン酸キナーゼ活性の欠乏はオーバーフロー代謝産物ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）及びグリセロールの形成を誘導した。トレハロース形成は若干減少した。
【０４７０】
【表２１】
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【０４７１】
表２１：リシン生産Ｃ．グルタミカムＢＳ１及びＢＳ１３のグルコースにおけるバッチ培養中の成長及び生産特性。与えられたデータはバイオマス収率（ＹX/S）、リシン収率（ＹLys/S）、グリセロール収率（ＹGly/S）、ジヒドロキシアセトン収率（ＹDHA/S）、トレハロース収率（ＹTre/S）だけでなく、比成長率（μ）、比グルコース吸収率（ｑGlc）、及び比リシン生産率（ｑLys）である。全ての数値は３つの併行培養実験からの平均値を示す。収率は図２１に示すように３つの生物学的複製からの産物形成と基質消費をフロートするときの線形最適合(linear best fit)の勾配として測定された。
【０４７２】
比成長率及びバイオマス収率、リシン及び副産物を含む主要動力学的及び化学量論的パラメータは、培養中に一定に維持した（図２１Ａ〜Ｄ）。これは２つの菌株とも代謝フラックスの溶解のための上述した拡張フラックスモデルの使用を許容する代謝定常状態にあったことを確実に示す。
【０４７３】
ピルビン酸キナーゼ欠失に対応した代謝フラックス
ピルビン酸キナーゼ欠失に対するリシン生産Ｃ．グルタミカムの反応を代謝炭素フラックスのレベルで調査した。どのようにＣ．グルタミカムＢＳ１３が中央糖分解遺伝子の損失を補償するか、親菌株の成長及び生産特性を大体維持するかを詳細に観察することが興味深いことであった。
【０４７４】
ここで、ＰＥＰの代謝産物プール及びピルビン酸の分離、並びにカルボキシル化及び脱カルボキシル化に参加した全てのフラックスの解決(resolution)が重要であったため、９９％［１−13Ｃ］グルコース及び５０％［Ｕ−13Ｃ］グルコースを用いた標識化実験からのラベル情報及び拡大された代謝ネットワークを用いた代謝フラックス分析を行った。遺伝子変異に対する直接的反応として、ＰＥＰからピルビン酸塩への全体転換フラックスは１３８％から１００％に顕著に減少したが、これはグルコース吸収へのホスホトランスフェラーゼシステムによるＰＥＰのピルビン酸塩への独占的転換を反映する。図２２の代謝フラックス分布は、ピルビン酸キナーゼの欠失が、ピルビン酸ノード周囲のフラックスがＰＥＰからピルピン酸塩への制限された直接転換を迂回させる局地的経路変更をさらに引き起こしたことを示す。ペントースリン酸経路及びＴＣＡ回路の反応は寧ろ弱かった。詳しくは、前記２つの菌株はＰＣ及びＰＥＰＣのＴＣＡ回路の補充代謝供給への相対的寄与において大きく異なった。Ｃ．グルタミカムＢＳ１においてＰＣが主要補充酵素である反面、この目的でＰＥＰＣを用いた欠失突然変異株では完全に不活性であった。脱カルボキシル化酵素ＰＥＰＣＫ及びリンゴ酸酵素を介したフラックスは、２つの菌株間で若干の差異を示した。全体的にみて、ピルビン酸キナーゼ欠失はピルビン酸塩からの補充正味フラックスのＰＥＰカルボキシル化への強い移動を引き起こしたと共に、ＰＥＰＣ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸酵素を含むピルビン酸塩に対するオキサロ酢酸及びリンゴ酸塩によるＰＥＰからの代謝迂回を引き起こした（図２３）。この迂回はピルビン酸塩が十分に供給されるようにした。よって、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ及びＴＣＡ回路による高いフラックスが維持された。全体Ｃ．グルタミカムＢＳ１３は補充酵素の柔軟的使用を含む局部フラックス再配列によって遺伝子欠失を補償することができた。狭い信頼区間は全ての炭素フラックスが非常に高い正確性を持って測定されたことを強調する（図２２）。したがって、ここで言及されたフラックスの差異は、ピルビン酸キナーゼの欠失と確かに関係がある。２つの菌株の比グルコース吸収率がほぼ同一であったため（表２２）、相対的フラックスに対する全ての結論は、絶対的フラックス値においても適用される。２つの菌株において、実験で測定されたマスアイソトポマーと模擬マスアイソトポマー間の優れた適合性が達成された。
【０４７５】
代謝迂回路の部分としてのオキサロ酢酸のリンゴ酸塩への転換は、正味ＴＣＡ回路フラックスの反対方向であり、むしろリンゴ酸塩からオキサロ酢酸を形成し、この両代謝産物の可逆的相互変換を要求する。上述したように、ここで適用された拡張フラックスモデルは単一プールとしてリンゴ酸塩及びオキサロ酢酸を考慮し、ラベルデータの立派な適合性はリンゴ酸塩とオキサロ酢酸間の可逆的相互変換の存在を裏付ける。この迂回路の活性化はピルビン酸キナーゼの活性損失を補償し、ＴＣＡ回路だけでなく、ＰＰＰ、糖分解又は同化作用を含む他の中枢経路による炭素フラックスを維持する必須要素である。また、同じ代謝迂回路は、グルコースでの培養中のピルビン酸キナーゼ欠乏大腸菌(E.coli)で活性化され(Al Zaid Siddiquee, et al., 2004; Emmerling, et al., 2002)、ＰＥＰＣ及びＰＣを所有する微生物の一般的戦略を確実に示す。逆に、ＰＥＰＣ欠乏Ｂ．サブチリス(B.subtilis)は、ピルビン酸キナーゼがなければグルコースで成長することができない(Diesterhaft and Freese, 1973; Fry, et al., 2000)。
【０４７６】
Ｃ．グルタミカムＢＳ１及びｐｙｋ欠失突然変異株は、全てＣ．グルタミカム代謝の柔軟性におけるリンゴ酸酵素の重要な役割を示すリンゴ酸酵素による重要なフラックスを示す。欠失突然変異株において、リンゴ酸酵素は精製された代謝迂回路の部分である。よって、遺伝的摂動に対する代謝のロバスト性に寄与する。２つの菌株におけるリンゴ酸酵素のフラックス、すなわちインビボ活性はリンゴ酸酵素がＣ．グルタミカムでの補助因子代謝の柔軟性において重要な役割を果たすことを示し、上述したように該酵素のリシン生産菌株Ｃ．グルタミカムにおけるＮＡＤＰＨソースとしての重要性を示す。ＮＡＤＰＨバランス（図２４）によって分かるように、リンゴ酸酵素は、２つの菌株において細胞のＮＡＤＰＨ需要に合わせるために必要であり、該補助因子の供給に大きく寄与する。グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ及び６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＰＰ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤ）及びリンゴ酸酵素（ＭａｌＥ）は、１６．４ｍｍｏｌ ＮＡＤＰＨ（ｇ細胞乾燥重量）-1の化学量論的需要を有するＮＡＤＰＨ供給反応及び同化作用(Wittmann and de Graaf, 2005)と見做されとともに、ＮＤＰＨ消費反応として４ｍｏｌＮＡＤＰＨ（ｍｏｌ ｌｙｓｉｎｅ）-1の化学量論的需要を有するリシン生産と見做された。これはリンゴ酸酵素の生理的役割に対する本研究の結論を相当裏付ける。
【０４７７】
ピルビン酸キナーゼ欠失菌株においてＰＰＰだけでなくリンゴ酸酵素を介したより低いフラックスは、ＴＣＡ回路を介した強化されたＮＡＤＰＨ供給を引き起こすイソクエン酸デヒドロゲナーゼによるフラックス増加と関連がありうる。全体供給のバランスを取るＮＡＤＰＨ供給経路の共同調節はリシン生産Ｃ．グルタミカムで以前に観察された(Wittmann and Heinzle, 2002)。
【０４７８】
Ｃ．グルタミカムにおけるリシン生産に対するピルビン酸キナーゼの欠失の正確な影響は、培養条件だけでなく、生産菌株によって確実に異なる。ところが、ピルビン酸キナーゼの欠失後、リシン生産はＢ．フラブム(B.flavum)の異なる菌株で強化され(Ozaki and Shiio, 1969; Shiio, et al., 1990)、Ｃ．ラクトフェルメンツム(C.lactofermentum)では生産が減少したが(Gubler, et al., 1994)、ある程度までは本研究においてもそうである。ＮＡＤＰＨの全体供給が大きく変わらなかったため、可能な説明はリシン前駆体オキサロ酢酸の制限された利用可能性でありうる。ここで研究されたＣ．グルタミカムＢＳ１及びＣ．グルタミカムＢＳ１３の生理的特性及び細胞内炭素フラックスは可能な説明を指す。これと関連して、特にピルビン酸キナーゼの欠失に関連したジヒドロキシアセトン及びグリセロールの蓄積が興味深く見える。このオーバーフロー代謝産物は、より低い糖分解鎖に流入するフラックスが例えばフルクトースで培養する間にグリセルアルデヒド３−リン酸のダウンストリーム反応の容量を超過するときにＣ．グルタミカムによって形成される(Dominguez, et al., 1998; Kiefer, et al., 2004)。この条件下で、ボトルネット現象は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼに起因し、この酵素能を減少させる否定的なＮＡＤ／ＮＡＤＨの比によって引き起こされる。ところが、観察されたＣ．グルタミカムＢＳ１及びｐｙｋ欠失突然変異株の代謝フラックスはグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素能を減少させることが可能なピルビン酸キナーゼ欠失菌株でＮＡＤ／ＮＡＤＨの比の大きい変化を示唆しない。この酵素によるインビボフラックスがここで研究された２つの菌株で同一であったので、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの、観察された限界への寄与は可能性がないように見える。他の候補はより有望である。示すように、補充フラックスは欠失突然変異株におけるＰＥＰＣへ完全に移動する。親菌株に比べて、この酵素による全体フラックスは約２．５倍増加したが、これはこの条件下で該酵素が作用しうる最大能を示すことができる。この点において、以前にピルビン酸キナーゼ欠失後に強化されたリシン生産を示す菌株Ｃ．グルタミカムは、アスパラギン酸(aspartate)によるアロステリック制御に敏感ではないＰＥＰＣのフィードバック耐性変数をさらに含有したが(Shiio, et al., 1987)、ピルビン酸キナーゼ及びＰＥＰＣが欠乏した二重突然変異体は、激しく損傷したグルコースの使用を示した(Park, et al., 1997)。リンゴ酸酵素の制限された能力は観察された限界に関連するということが可能なように見える。ピルビン酸キナーゼ欠乏の野生型Ｃ．グルタミカムにおけるリンゴ酸酵素活性は酢酸塩又はクエン酸塩における成長を可能とするのに十分ではないが、成長は該酵素の過発現によって回復できる(Netzer, et al., 2004)。
【０４７９】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼの減衰
Ｃ．グルタミカムでのリシン生産において、ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、リシン前駆体オキサロ酢酸の主要ソースとしての補充酵素ピルビン酸カルボキシラーゼと直接競争する(Peters-Wendisch, et al., 2001)。この中枢糖分解遺伝子のうちいずれか一つのサブユニットをコードするａｃｅＥの欠失は、Ｃ．グルタミカムでのリシン生産を向上させる。ところが、この欠失はＴＣＡ回路へ向かう炭素フラックスを完全に防ぎ、激しい成長欠乏を引き起こしたうえ、典型的糖系生産培地で突然変異体が成長することができないようにした。また、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の欠乏は広範囲な副産物形成を誘導した(Blombach, et al., 2007)。本研究において、ＰＤＨを介しての炭素フラックス及びＴＣＡ回路前駆体アセチル−ＣｏＡの供給を減少させる。よって、有害な副作用なしでリシン生産を増加させるために、ＰＤＨの発現は開始コドンの交換によって脱調節された。
【０４８０】
菌株の構築及び確認
ａｃｅＥ遺伝子における開始コドンの交換は、相同組み換えを用いて突然変異体を介した野生型対立遺伝子の置換によって達成された。変異はＣ．グルタミカムＢＳ８７の遺伝子バックグラウンドで行った。この菌株は、ピルビン酸カルボキシラーゼの過発現及び変異並びにＰＥＰカルボキシキナーゼの欠失による変異された前駆体供給だけでなく、リシン生合成経路内の幾つかの変異を既に含む（表１）。第２組み換えからのクローンを、上述したように比ＰＤＨ活性についてスクリーニングした（図２１）。約１０００ｂｐの幅を含むａｃｅＥの開始コドン部位のシーケンシングによる突然変異体の追加分析は、開始コドンヌクレオチドのみを除いては野生型に１００％シーケンス一致を示した。減少したＰＤＨ活性を有する２つの突然変異体は、開始コドン内におけるヌクレオチド交換をもたらした（図２５）。菌株構築過程中に突然変異が発生しなかったため、突然変異体の減少した比ＰＤＨ活性は施行された点突然変異の結果であるといえる。Ｃ．グルタミカムＢＳ２３８と表示されるクローン２で追加実験を行った。
【０４８１】
開始コドン交換の比酵素活性への影響
組み換え菌株ＢＳ２３８及び親菌株ＢＳ８７の比ＰＤＨ活性は、単一炭素源としてグルコースを用いて最小培地で測定した。図２６に示しているように、頻出するＡＴＧの代わりにレア開始コドンＧＴＧの使用がピルビン酸デヒドロゲナーゼの顕著な比活性減少を引き起こした。親菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ８７が約３０ｍＵ ｍｇ-1の比ＰＤＨ活性を示す反面、Ｃ．グルタミカムＢＳ２３８では僅か１３ｍＵ ｍｇ-1であった。
【０４８２】
産業的工程における開始コドンの交換によるＰＤＨ減衰の成功的適用のために、施行された点突然変異の安定性は重要な要素である。これはバッチ培養で幾何級数的に成長する細胞の以後の転移を含む長期間の培養実験で確認された。突然変異体Ｃ．グルタミカムＢＳ２３８における比ＰＤＨ活性はこの手順に影響されなかった。５０世代後、突然変異体の菌株は、低くなったピルビン酸デヒドロゲナーゼの比活性を依然として示したが（図２６）、これは変異が安定的にゲノムに施行され、復帰突然変異がなされていないことを示す。
【０４８３】
成長及び生産特性への影響
ＰＤＨ活性の脱調節は、Ｃ．グルタミカムＢＳ８７における１４２ｍｍｏｌ ｍｏｌ-1からＣ．グルタミカムＢＳ２３８における１６５ｍｍｏｌ ｍｏｌ-1へのリシン収率の増加を引き起こしたが、これは１７％の増加に該当する。バイオマス形成は変異された酵素活性に殆ど影響されなかった（図２７）。
【０４８４】
ところが、Ｃ．グルタミカムＢＳ２３８の比成長率（μ＝０．２５ｈ-1）はＣ．グルタミカムＢＳ８７（μ＝０．３３ｈ-1）に比べてやや減少した。組み換え菌株は、副産物の形成において栄養要求性だけでなく相当な差異を示しておらず、少ない量のトレハロースのみが生産された（＜１０ｍｍｏｌ ｍｏｌ-1）。比成長率だけでなく、リシン及びバイオマスの収率は全体培養中に一定であった。これは菌株が代謝定常状態にあったことを示す。よって、両菌株間の観察された変化は変化した開始コドンシーケンスに起因し、これによりピルビン酸デヒドロゲナーゼの減少した比活性に起因する。
【０４８５】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼの脱調節に対するフラックスの反応
ピルビン酸デヒドロゲナーゼの減少した比活性による菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ２３８の変化した生理は、ピルビン酸ノード周囲の変化したフラックスを示唆する。変更された酵素活性の該代謝経路への影響をさらに詳しく研究するために、ピルビン酸カルボキシラーゼによるＰＤＨフラックス及び正味フラックスをＣ．グルタミカムＢＳ２３８及びその親菌株で測定した。ここで、Ｃ．グルタミカムを用いた１８個の独立的な13Ｃラベル実験で取得されたリシン収率、バイオマス収率及びＰＤＨフラックス間の化学量論的相関関係は、計算の基本の役割を果たした（図１３）。これは変異された酵素ピルビン酸デヒドロゲナーゼによる、小さいが重要なフラックス減少を示した（表２３）。ピルビン酸カルボキシラーゼによる正味フラックスの増加と共に（表２２）、これはＰＤＨから補充反応へのフラックス変化を引き起こす。観察されたフラックス差の有意度はＰＤＨフラックス及びＰＹＣフラックスを考慮するｔ−テストによって確認された（表２２）。
【０４８６】
【表２２】
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【０４８７】
表２２：ピルビン酸デヒドロゲナーゼによるインビボフラックス（νPDH）及びグルコース培養Ｃ．グルタミカムＢＳ８７（親菌株）及びＣ．グルタミカムＢＳ２３８（ａｃｅＥatt）の同化カルボキシル化によるランプ正味フラックス（lumped net flux；νPYC）。偏差はＭｏｎｔｅ−Ｃａｒｌｏ分析によって取得された９０％信頼区間を示す。
【０４８８】
向上したリシン生産を目的とする合理的代謝変異アプローチの主要目的は、所望しない有害な副作用を引き起こさず、純粋に有益な突然変異の識別及び導入である(Ohnishi, et al., 2002)。これは妨害される成長挙動又は損傷したストレス耐性がない優れた細胞工場を期待させる(Park and Lee, 2008)。ところが、われわれは適用された遺伝子変化が典型的に強いため、意図された有益な変化だけでなく、このようなよく定義された標的変異のうち多くの変異は依然として有益でない副作用を生むことを認識する。有効な例は、最近説明された、増加された副産物形成を導入するリシン生産Ｃ．グルタミカムにおけるピルビン酸デヒドロゲナーゼの欠失、及び産業的に適した糖ベース生産培地での成長不能である(Blombach, et al., 2007)。これは肯定的効果及び否定的効果のバランスが取れるようにすることが可能なより漸進的な経路変異に対する需要をさらに想起される。以前の研究を越えて、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの６０％減衰は、リシン生産を増進させるが、依然として産業的に適した糖におけるよくバランスの取れた成長を可能とする。また、欠失突然変異株から発見されたピルビン酸ノードにおける過度な副産物形成(Blombach, et al., 2007)は完全に防止できる。ピルビン酸ノード周囲の代謝フラックスの測定は減少した活性の利点が確実にピルビン酸デヒドロゲナーゼから補充カルボキシル化へのフラックス変化のためでありうることを示した。変異された菌株は、ｐｙｃ遺伝子における主要突然変異体Ｐ４５８Ｓだけでなく、増幅されたピルビン酸カルボキシラーゼの発現を含む変異前駆体の供給を既に示す。２つの突然変異とも、増加した補充カルボキシル化フラックスによってリシン生産の増加をもたらすということが明らかにされた(Ohnishi, et al., 2002; Peters-Wendisch, et al., 2001)。この変異及びそれによるピルビン酸カルボキシラーゼの能力増加は、効率的なフラックス転換を引き起こすことにより、リシン生産を増進させることができる。６０％減少したピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性は、唯一つのヌクレオチドの交換によって、すなわち転写開始コドンの変異によって達成された。この方法は、遺伝子摂動に敏感で成長及び生存力を維持するために必要な酵素及び経路にアプローチするようにする。
【０４８９】
ＴＣＡ回路の変異
ＮＡＤＰＨ代謝、前駆体供給及びリシン生合成だけでなく、ＴＣＡ回路はＣ．グルタミカムにおけるリシン生産の変異の有望な代謝経路であるが、これはリシンフラックスとＴＣＡ回路フラックスとの相関関係に反映される（図１２）(Wittmann and Becker, 2007; Wittmann and Heinzle, 2002)。ところが、ＴＣＡ回路が遺伝子欠失による完全なブロックを防ぐ細胞成長に重要であるため、該経路による炭素転換の減少を目標とする遺伝子変異は些少なことではない。本研究において、イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードするｉｃｄの発現は合理的に減衰した。他の微生物とは逆に、Ｃ．グルタミカムにおけるＩＣＤ発現レベルは成長期または成長条件と関係ない(Eikmanns, 2005)。約１Ｕｍｇ-1(Eikmanns, et al., 1995)の比活性と共に、ＩＣＤは最も高く発現したＴＣＡ回路酵素である。よって、脱調節の有望な候補である。これはコードする遺伝子ｉｃｄの開始コドン交換によって達成された。変異はリシン生産源Ｃ．グルタミカムＢＳ８７のバックグラウンドで実現された。次いで、酵素活性、生産特性及びＴＣＡ回路フラックスへの影響を調査した。
【０４９０】
菌株構築及び確認
２つの相同組み換えイベントにおいて、ＡＴＧ開始コドンを含有するイソクエン酸デヒドロゲナーゼの野生型対立遺伝子を突然変異体ＧＴＧ−開始−コドン−対立遺伝子で置換した。２つの組み換えイベントからの成長するクローンの比酵素活性の測定によって上述のとおりスクリーニングを行った（図２１）。次いで、行われた顕著に減少した比ＩＣＤ活性を有するクローンのシーケンス分析は該クローンがＧＴＧ開始コドンのキャリア(carrier)であることを確実に確認した（図２８）。
【０４９１】
相同組み換えイベントに関連した完全なシーケンスの解決(resolution)は、菌株構築過程でいずれの突然変異も発生していないことを確保した。ここで、シーケンス配列は開始コドンのヌクレオチド交換を除いては１０００ｂｐの完全なスパンで選択された突然変異体と親菌株ＢＳ８７との１００％一致を示した。酵素活性の観察された減少はレア開始コドンＧＴＧの使用の直接的結果であった。
【０４９２】
開始コドン交換の酵素活性への影響
シーケンシングによる菌株確認に続いて、親菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ８７及び開始コドン突然変異体Ｃ．グルタミカムＢＳ２０５の比ＩＣＤ活性を発酵培地での培養中に比較した。図２９に示すように、頻出するＡＴＧの代わりにレア開始コドンＧＴＧの使用はイソクエン酸デヒドロゲナーゼの比活性を顕著に減少させた。親菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ８７が約１．３Ｕｍｇ-1の比ＩＣＤ活性を示す反面、Ｃ．グルタミカムＢＳ２０５では僅か０．３Ｕｍｇ-1であった。
【０４９３】
菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ２０５におけるＩＣＤ活性の減少は開始コドン交換の結果であるといえ、よって、遺伝子発現の転写減衰を反映する。ｉｃｄの野生型対立遺伝子と比較して、ＧＴＧ突然変異体での開始コドンの認識は損傷して、リボソームに結合するｍＲＮＡを伴う転写開始過程の妨害を引き起こす(O'Donnell and Janssen, 2001; Vellanoweth and Rabinowitz, 1992)。これはｍＲＮＡ安定性だけでなく翻訳の頻度を大幅減少させるが、この２種ともは機能的に活性なイソクエン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の完成を減少させる。よって、酵素活性を減少させた。順次バッチにおける長期間培養によって確認されたように、産業的適用において重要な必須要素である変異及びそれの酵素活性への影響は安定的であった（図２９）。
【０４９４】
成長及び生産特性への影響
変化した酵素活性の生産特性に対する影響を研究するために、変異された最小培地での培養中に、異なる菌株の成長、リシン生産及びバイオマス形成を比較するための培養実験を行った。ＩＣＤの脱調節によって、グルコースでの培養中のリシン収率はＢＳ８７における１４１ｍｍｏｌ ｍｏｌ-1からＣ．グルタミカムＢＳ２０５における２００ｍｍｏｌ ｍｏｌ-1へ増加したが、これは４２％の増加に該当する。バイオマス形成は殆ど影響されなかった（表２３）。ところが、比成長率は突然変異体菌株で減少した。親菌株ＢＳ８７は０．３２ｈ-1の成長率で成長し、ＢＳ２０５は０．２８ｈ-1の比成長率を示した。
【０４９５】
表２３：グルコースでの培養中のリシン生産Ｃ．グルタミカムＢＳ８７及びＣ．グルタミカムＢＳ２０５（ｉｃｄatt）の生産特性。与えられたデータはバイオマス収率（ＹX/S）及びリシン収率（ＹLys/S）である。基質消費に対する生産物の形成をグラフで示すとき、線形最適合の勾配としての３つの生物学的複製から収率を測定した（図３０）。
【０４９６】
【表２３】
2013533740.tif 000036
【０４９７】
十分な酸素供給が酸素欠乏によって誘導された副産物の形成を防止した(Inui, et al., 2004)。最も少ない量のトレハロース（＜１０ｍｍｏｌ ｍｏｌ-1）が両菌株で生産された。比成長率だけでなく、リシン及びバイオマスの収率も全体培養期間中に一定であったが、これは菌株が代謝定常状態にあったことを示す（図３０）。よって、両菌株の間で観察された差異は変化した開始コドンシーケンスに確実に起因し、これによりイソクエン酸デヒドロゲナーゼの比活性を減少させた。
【０４９８】
ｉｃｄの脱調節に対する代謝フラックス反応
酵素活性の測定及び比較培養実験のデータは、ＡＴＧの代わりにレア開始コドンＧＴＧの使用が菌株の細胞生理学を大きく変化させたことを確実に示した。代謝経路への変異された酵素活性の影響をさらに詳しく調べるために、ＴＣＡ回路によるフラックス及びピルビン酸カルボキシラーゼによる正味フラックスをＣ．グルタミカムＢＳ８７及びＣ．グルタミカムＢＳ２０５で測定した。このため、リシン収率、バイオマス収率及びＴＣ回路フラックス間の化学量論的相関関係を確立した（図１２）。クエン酸シンターゼによる進入フラックス(entry flux)は、ピルビン酸カルボキシラーゼによる正味フラックスの増加と共に、ｉｃｄ突然変異体で減少した（図３１）。行われたｔ−テストはそれぞれＴＣＡ回路フラックス（ｔ＝−１０．１）を考慮する菌株とＰＹＣフラックス（ｔ＝４３．６）を考慮する菌株との大きい差異を確実に示した。要するに、このフラックス変化はＴＣＡ回路から補充反応へのフラックス転換を引き起こした。
【０４９９】
ＰＤＨ減衰について既に仮定したように、補充カルボキシル化へ向かうフラックス移動は変異したピルビン酸カルボキシラーゼによって裏付けられる可能性が高い。ここで達成された４０％リシン収率の増進はａｃｅＥ遺伝子における開始コドンの交換に起因する増加より一層さらに高い。これは全体酵素活性の減少を反映することができ、ｉｃｄ遺伝子での減少が７０％と最も確然である。減少した酵素活性がリシンの生産に与える利点にも拘らず、変異は関連経路によって生産又は炭素転換を大きく損傷させず、これにより副産物の形成において現れる。開始コドン突然変異体における３００ｍＵ ｍｇ-1という高い残余ＩＣＤ活性は追加的な脱調節による連続的最適化に対する余地を残す。ＴＣＡ回路内での誘導されたボトルネック現象の結果として副産物形成がないことは、Ｃ．グルタミカムＢＳ２０５のピルビン酸ノード周囲の代謝ネットワークが一層さらに厳しい減衰を充足させる能力があることを示唆する。一つの可能な戦力は最も希な開始コドン変異体ＴＴＧの実現であってもよい。本研究を超えて、ＴＣＡ回路によるＣＯ2形成を介しての高い炭素損失は所定の産物の炭素収率において一般に好ましくないため、ＴＣＡ回路の標的脱調節は他の多様な産物に対しても有望に見える。この点に関連して確実な産物は、アスパラギン酸系の他のアミノ酸又は脱カルボキシル化によるリシンから直接形成されたジアミノペンタンの生産である。上述したピルビン酸デヒドロゲナーゼの減衰にも同様に適用される。
【０５００】
テーラーメイド型リシン高生産源の構築
以前のチャプターでは、Ｃ．グルタミカムによるリシン生産を合理的に最適化するための異なる戦略が成功的に適用された。親菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ１及びＣ．グルタミカムＢＳ８７の例を挙げると、ＮＡＤＰＨ代謝、前駆体供給及びＣＯ2形成、並びにリシン生合成の主要経路からの幾つかの標的の利点について研究した。産業的生産に適切な菌株としての野生型ベースの高生産源を生産する目標を有し、確認された変異が単一菌株で結合した。この作業は産業的生産菌株に現れる有害な副作用を最小化し、有益な変異のみを行うために野生型Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に基づいた。
【０５０１】
菌株構築及び生産能
高生産源の生産のための第１段階は、アミノ酸交換Ｔ３１１Ｉを導入してリシン及びトレオニンによるフィードバック制御からアスパラギン酸キナーゼを放出することであった(Becker, et al., 2005)。これは上述したｄｄｈの過発現で補完された。この２種の変異及び追加の培地最適化のみの遂行により、１２５ｍｍｏｌのリシン（ｍｏｌグルコース）-1を既に生産したリシン生産源を作った。リシン生合成経路内の追加的なボトルネット現象を回避するために、ｄｄｈだけでなく、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ（ｄａｐＢ）。アスパラギン酸キナーゼ（ｌｙｓＣ）及びジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ｌｙｓＡ）を過発現させた。この酵素はいずれもリシン生合成のための共通ルートの全ての部分である。よって、リシン生産への影響は、スクシニラーゼとデヒドロゲナーゼブランチの間を分割するフラックスとは関係がなくすべきである。近年、既に価値があると証明された幾つかの遺伝子変異の遂行によって追加の菌株最適化を行った。これは自然ホモセリンデヒドロゲナーゼの、アミノ酸交換Ｖ５９Ａを示す突然変異変異体への置換を含む。この突然変異は直接リシン生合成と競争するトレオニン経路への炭素フラックスを減らしてリシン生産を増進させる(Ohnishi, et al., 2002)。リシン形成のためのオキサロ酢酸の十分な供給を確保するために、追加変異は前駆体の供給に集中した。これは主要補充酵素ピルビン酸カルボキシラーゼの過発現及び変異(Ohnishi, et al., 2002; Peters-Wendisch, et al., 2001)、及びＯＡＡ消費反応ＰＥＰカルボキシキナーゼの欠失(Petersen, et al., 2001)を示唆した。その結果、生成された菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ８７はリシン生合成及び前駆体供給内での９つの変異を含む（図３２）。
【０５０２】
ｌｙｓＣ遺伝子及びｄｄｈ遺伝子の第２コピーでの調節機能の点突然変異のみを示す祖先菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ２２２と比較すると、Ｃ．グルタミカムＢＳ８７における追加変異はリシン生産に軽微な増進のみをもたらすということが確実になる（図１８）。よって、代謝の特定部分にのみ焦点を合わせた変異戦略は効率的な生産菌株の生産に適さない。ところが、代謝変異による増進したリシン生産のための菌株最適化の歴史はこの戦略によって確実に特定付けられる。最適化されたリシン生産源の概念で主要反応としての主要経路ＴＣＡ回路及びＮＡＤＰＨ代謝は今まで殆ど無視された。この点において、本発明はこのような限界を克服し、以前の戦略を完璧に補完して優越な生産菌株を構築する遺伝子目標を現した。よって、意図された高生産源の生産のための次の段階はＴＣＡ回路に焦点を合わせた。上述したように、Ｃ．グルタミカムＢＳ８７のバックグラウンドにおけるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄatt）の減衰は、ＴＣＡ回路から補充カルボキシル化への効率的フラックス転換によってリシン生産を大きく増進させた。リシン生産について、この変異戦略は、ＣＯ2形成による炭素損失の減少だけでなく、オキサロ酢酸の供給増加によって利益を受ける。ＮＡＤＰＨ代謝の以後の変異は２つの異なる戦略によって行われた。先ず、以前に増進されたＮＡＤＰＨ供給に大きく寄与するものと現れた(Becker, et al., 2005)グルコース新生合成酵素フルクトース１，６−ビスホスファターゼを過発現させた。上述したように、このアプローチはグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼの増幅された発現をよく補完する。最初からトランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの制限された容量によってＰＰＰにおける追加制限を回避するために、上述したようにｓｏｄプロモーターを介しての完全なｔｋｔオペロンの上方調節によるトランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの過発現を伴い、Ｇ６ＰＤＨの過発現を実現した。プロモーター交換に応えて、Ｇ６ＰＤＨ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの比活性は大きく増加した。変異戦略の概念は図３２に示されている。前記変異の利点は得られた系譜の炭素転換率の比較から明らかになる（図１８）。
【０５０３】
野生型Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から始めて、以後の有益な変異は野生型ベースのリシン高生産源を引き起こした。本発明は、全ての関連経路が考慮されたこのような完全に合理的な菌株の初報告である。この主要調節酵素のフィードバック阻害を克服するために、アスパラギン酸キナーゼ内に最初に導入された変異が非常に重要であった。ｄｄｈ過発現の結果、略５０％の増進という大きな利得はＣ．グルタミカムＢＳ１（ｌｙｓＣT311I）の遺伝子バックグラウンドでリシン生合成経路の全体性能がリシン生産を大きく制限したことを確実に示した。ところが、以前の研究で有益なものと明らかにされたリシン経路の追加変異だけでなく、前駆体供給の変異(Ohnishi, et al., 2002; Peters-Wendisch, et al., 2001; Petersen, et al., 2001)は、ここではわずか中間程度の成功であった。これはリシン生産を損傷させるＣ．グルタミカムの中枢代謝内で他のボトルネック現象が起こったことを明らかに示す。よって、本研究において、リシン生産の追加変異に対する関心は中間代謝の他の部分へ移った。この概念の成功はイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄatt）の減衰に対する反応によって直ちに反映された。ｉｃｄの開始コドンにおける単一ヌクレオチド交換の実現はリシン収率をＣ．グルタミカムＢＳ８７における１４１ｍｍｏｌ ｍｏｌ-1から相応ｉｃｄ突然変異体における２００ｍｍｏｌ ｍｏｌ-1まで増加させたが、これは４０％の増加である。以前の研究でＮＡＤＰＨ供給ＰＰＰへの効率的フラックス転換を引き起こすものと見做された(Becker, et al., 2005)フルクトース１，６−ビスホスファターゼの後続の過発現はリシン生産を１８％さらに増進させた（図１８）。ここで説明された系譜において最後に導入された変異はｔｋｔオペロンのプロモーター交換を含む。これはこのオペロンによってコードされた酵素Ｇ６ＰＤＨ、ＴＫＴ及びＴＡＬの活性を大きく増加させた。これは結果的にリシン収率を１３％増加させた。ｆｂｐ及びｔｋｔオペロンの過発現の利得は、ＮＡＤＰＨの不十分な供給がＣ．グルタミカムにおけるリシン生産を大きく制限し、増加したＰＰＰフラックスを目標とする変異戦略が効率的なリシン高生産菌株を生産する目標と共に重要であることを確実に示す。ペントースリン酸経路遺伝子の増幅された発現の追加的な利点は成長挙動と関連して観察された。比成長率０．２３ｈ-1を示すそれの祖先Ｃ．グルタミカムＢＳ２４２（Ｐeftuｆｂｐ）と比較すると、ｔｋｔ−突然変異体は０．３２ｈ-1の速度で成長した。Ｃ．グルタミカムＢＳ２４４の増進した成長挙動と結合してより高い炭素転換率（ＹLys/S＝２６％）は、短い発酵時間に効率的なリシン生産を可能とするから、この菌株の全体生産能力を増加させた。最後の３変異の実現によって、全体リシン生産がほぼ９０％増加した。これは３つの遺伝的変化から引き起こされる、注目すべき且つ驚くべき利得である。したがって、この変異戦略が以前に行われた突然変異、例えばリシン生合成内のボトルネック現象の除去から部分的に利得を受けるということが仮定できる。
【０５０４】
調査された菌株の生産特性は今まで最小培地で幾何級数的に成長する細胞のためのシェークフラスコ培養でテストされた。低い基質濃度の最小培地におけるシェークフラスコ培養を含む実験設定が生産性を分明に制限したにも拘わらず、これらの条件下で最も良い生産源Ｃ．グルタミカムＢＳ２４４は、既に２６％の注目すべきリシン収率を示した。産業的に適切な生産培地における流加発酵過程でリシン高生産源の生産性を調査する方法が産業的生産に最も近いため、この方法が適切であった。しかも、それは特に従来の方法で誘導された生産菌株と比較して新しい高生産源の潜在力がより現実的な評価を可能とする。最も良い生産源Ｃ．グルタミカムＢＳ２４４（Ｐsodｔｋｔ）を糖蜜ベース複合培地での流加発酵を含む産業的条件下で調査した。
【０５０５】
産業的発酵条件下での生産性
Ｃ．グルタミカムＢＳ２４４の流加発酵の培養プロフィールが図１９に示されている。リシン生産を早く開始し、培地の上澄み液におけるリシン濃度は３０時間内に驚くべき程度と高い最終力価１２０ｇＬ-1まで連続的に増加した。主要増加は、バッチ培地（１００ｇＬ-1）に供給された初期糖が消費された後に開始した供給段階で主に行われた。自動供給の信号として、溶解された酸素（ｐＯ2）ベース信号を工程中に使用した。発酵器における酸素飽和度は、攪拌器の速度によって制御され、２０％と一定に維持された。培地における炭素制限は、ｐＯ2増加が１０％ｍｉｎ―1を超過したときに供給ポンプを活性化したｐＯ2の即刻的かつ早い増加を引き起こした。糖蜜及びグルコースベースの供給溶液はリシン生産のための十分なアンモニウム供給を確保するために硫酸アンモニウムでさらに強化した。この戦略により、供給段階の糖濃度は１０ｇＬ-1未満に維持された。
【０５０６】
吸光度によって反映されたバイオマス濃度の生育曲線は、リシン濃度とは明らかに異なった（図３４）。バッチ段階中に、吸光度は５倍増加したが、供給段階ではわずか３倍の増加が観察された。それだけでなく、バイオマス濃度は培養期間の最後まで増加していないが、２４時間後に最大値に到達した。
【０５０７】
菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ２４４の生産特性に対するより精密な観察は、発酵工程がさらに分けられうることを示した。図３５に示しているように、他の段階は達成されたリシン収率に基づいて区別できる。ここで、供給段階２と指定された最も良い生産段階で、リシン高生産源はリシン収率５５％を示した。この段階の追加的特性はほぼ沈滞するバイオマス濃度である。よって、消費された糖はリシン生合成経路へ効率的に送られる。発酵段階の初めに、リシン収率はさらに低かった。バッチ段階及び供給段階１を含む該間隔は、広範囲なバイオマス形成で特定付けられる主要成長段階であると説明できる（図３４）。興味深いことには、この段階で対数増殖期におけるシェークフラスコ培養実験で達成されたリシン収率と非常によく対応する２５％のリシン収率が達成された。
【０５０８】
この研究で生産されたリシン高生産源は、今まで開示された最も良い野生型ベースの生産菌株である。炭素及び区間−時間収率だけでなく、最終リシン力価を考慮するとき、以前に開示された合理的に生産された菌株(Ikeda, et al., 2006)より確実に優れる。最終リシン力価１２０ｇＬ-1及び５５％までの炭素転換率と共に、この菌株は報告された炭素収率４０〜５０％(Leuchtenberger, et al., 2005)及びリシン力価８０〜１２０ｇＬ-1(Anastassiadis, 2007)の従来の方法で誘導された菌株の最大値に位置する生産特性を示す。ところが、従来の生産源の生産性は、時間−空間収率を大きく損傷させる１００時間までの長い発酵時間(Anastassiadis, 2007)と典型的に関連がある。これは、一般に非特異突然変異性のため、菌株開発中に蓄積された多くの有害な二次的突然変異によって引き起こされた弱い成長と関連がある。１２個の有益な変異の独占的セットの単一遂行のみによって、このような所望しない副作用は野生型ベースの生産菌株において防止できる。早い成長及びそれによる３０時間という減少した発酵時間は従来の生産源による流加発酵中に達成された２．１ｇＬ-1ｈ-1の時間空間収率(Hirao, et al., 1989)より一層高い４ｇＬ-1ｈ-1の高い時間−空間収率を引き起こす。
【０５０９】
本発明の野生型ベースのリシン高生産源は、菌株最適化の方法としてシステム代謝変異の潜在力を示す。菌株Ｃ．グルタミカムＢＳ２４４は、産業的適用に非常に適した完全な合理的生産菌株の概念及び価値の優れた証拠である。
【０５１０】
用語の定義
略語
２−ＯＸＯ：２−オキソグルタル酸
ＡＡ：アミノ酸
Ａｃ−ＣｏＡ：アセチル−コエンザイムＡ
Ａｃｅ：アセテート
ａｃｅＥ：一つのピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体サブユニットをコードする遺伝子
ＡＤＰ：アデノシン二リン酸
ａｍｔＲ：全体的窒素レギュレータをコードする遺伝子
ａｍｙＡ：α−アミラーゼをコードする遺伝子
ａｒａ：アラビノース利用のための遺伝子群
ａｓｄ：アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
ａｒｇＳ：アルギニル−ｔＲＮＡ−シンターゼをコードする遺伝子
ＡＴＣＣ：American type culture collection
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸
ＢａｍＨＩ：バチルスアミロリ(Bacillus amyloli)からの制限酵素
ｂｐ：塩基対
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＢＳＴＦＡ：Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロ−アセトアミド
ＣＤＭ：細胞乾量
ＣＩＴ：クエン酸塩(citrate)
ＣｏＡ：コエンザイムＡ
ＣＷＷ：細胞湿潤重量
ｄａｐＡ：ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子
ｄａｐＢ：ジヒドロジピコリン酸リダクターゼをコードする遺伝子
ｄａｐＣ：スクシニル−アミノ−ケトピメリン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子
ｄａｐＤ：テトラヒドロジピコリン酸シクシニラーゼをコードする遺伝子
ｄａｐＥ：スクシニル−ジアミノピメリン酸ジスクシニラーゼをコードする遺伝子
ｄａｐＦ：ジアミノピメリン酸エピメラーゼをコードする遺伝子
ｄｄｈ：ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
ＤＤＨ：ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ
ＤＨＡ：ジヒドロキシアセトン
ＤＨＡＰ：ジヒドロキシアセトンリン酸
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＮａｓｅ：ジオキシリボヌクレアーゼ
ＤＴＴ：ジチオトレイトール
Ｅ４Ｐ：エリトロース−リン酸
ｅｆｔｕ：延長因子ｔｕをコードする遺伝子
Ｆ１Ｐ：フルクトース１−リン酸
Ｆ６Ｐ：フルクトース６−リン酸
ＦＢＰ：フルクトース１，６−ビスリン酸
ｆｂｐ：フルクトース１，６−ビスホスファターゼをコードする遺伝子
ＦＢＰａｓｅ：フルクトース１，６−ビスホスファターゼ
ｆｂｒ：フィードバック耐性
Ｆｒｕ：フルクトース
Ｇ６Ｐ：グルコース６−リン酸
Ｇ６ＰＤＨ：グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ
ＧＡＰ：グリセルアルデヒド３−リン酸
ＧＣ−ＭＳ：ガスクロマトグラフィー／質量分析法
ＧＤＨ：グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ
Ｇｌｕ：グルコース
ｇｌｔＡ：クエン酸シンターゼをコードする遺伝子
Ｇｌｙ：グリセロール
ＧＲＡＳ：一般に安全であると思われる
ｈｏｍ：ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
ＨＰＬＣ：高性能液体クロマトグラフィー
ｉｃｄ：イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
ＩＣＤ：イソクエン酸デヒドロゲナーゼ
Ｋａｎ：カナマイシン
Ｌａｃ：乳酸
ＬＤＨ：乳酸デヒドロゲナーゼ
Ｌｙｓ：リシン
ｌｙｓＡ：ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子
ｌｙｓＣ：アスパラギン酸キナーゼ（アスパルトキナーゼ）をコードする遺伝子
ｌｙｓＥ：リシンパルミアーゼをコードする遺伝子
ｍａｌＥ：リンゴ酸酵素をコードする遺伝子
ＭａｌＥ：リンゴ酸酵素
ＭＢＤＳＴＦＡ：Ｎ−メチル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−トリフルオロ−アセトアミド
ＭＣＳ：多重クローニングサイト
ＭＤＶ：マス分布ベクター
ＭＤＨ：細胞質リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
ＭＦＡ：代謝フラックス分析
ＭＱＯ：膜結合性リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
ＮＡＤ／ＮＡＤＨ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化／還元
ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化／還元
ＯＡＡ：オキサロ酢酸
ＯＤ：吸光度
ＯＤＨＣ：２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体
ＯＰＡ：オルト−フタルジアルデヒド
ｏｐｃＡ：Ｇ６ＰＤＨの推定サブユニットをコードする遺伝子
ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム
ＯＲＩ：複製起点
ＰＣ：ピルビン酸カルボキシラーゼ
ｐｙｃ：ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子
ｐｃｋ：ＰＥＰカルボキシキナーゼをコードする遺伝子
ＰＣＲ：重合酵素連鎖反応
ＰＤＨ：ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体
ＰＥＰ：ホスホエノールピルビン酸
ＰＥＰＣ：ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
ＰＥＰＣＫ：ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ
ｐｇｉ：ホスホグルコイソメラーゼをコードする遺伝子
ＰＧＩ：ホスホグルコイソメラーゼ
ＰＰＰ：ペントースリン酸経路
ＰＴＳ：ホスホトランスフェラーゼシステム
Ｐｗｏ：バイロコッカスヴェッセイ(Pyrococcus woesei)からのＤＮＡポリメラーゼ
ｐｙｋ：ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子
Ｐｙｒ：ピルビン酸塩(pyruvate)
Ｒ５Ｐ：リボース５−リン酸
ＲＮａｓｅ：リボヌクレアーゼ
ＲＰＥ：リブロース５−リン酸エピメラーゼ
ＲＰＩ：リボース５−リン酸イソメラーゼ
ＲＱ：呼吸率
Ｓ７Ｐ：セトヘプツロース７−リン酸
ｓａｃＢ：バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)のレバンスクラーゼをコードする遺伝子
ＳＡＰ：エビのアルカリホスファターゼ(Shrimp alkaline phosphatase)
ｓｏｄ：スーパーオキサイドディスムターゼをコードする遺伝子
Ｓｕｃ：スクロース
ＳＵＣ：スクシネート(succinate)
ｔａｌ：トランスアルドラーゼをコードする遺伝子
ＴＡＬ：トランスアルドラーゼ
Ｔａｑ：サーマスアクアチクス(Thermus aquaticus)からのＤＮＡポリメラーゼ
ＴＣＡ ｃｙｃｌｅ：トリカルボン酸回路
Ｔｅｔ：テトラサイクリン
ｔｋｔ：トランスアルドラーゼ／トランスアルドラーゼオペロンをコードする遺伝子
ＴＫＴ：トランスケトラーゼ
ＴＰＩ：トリオ−スリン酸イソメラーゼ
ＴＰＰ：チアミンピロリン酸
ＳＬＳ：最小二乗の和
Ｔｒｅ：トレハロース
ｒｐｍ：分当たりの回転
ＸｈｏＩ：キサントモナスホルキコラ(Xanthomonas holcicola)からの制限酵素
ｘｙｌ：キシロース使用のための遺伝子群
【０５１１】
記号
Ｃ：能力［Ｆ］
ｃ：濃度［ｍｏｌＬ-1］又は［ｇＬ-1］
ｍ：質量［ｇ］
μ：比成長率［ｈ-1］
ｎ：物質の量［ｍｏｌ］
ｑs：比吸収率［ｍｍｏｌｇ-1ｈ-1］
ｑp：比生産率［ｍｍｏｌｇ-1ｈ-1］
Ｒ：耐性［Ω］
Ｔ：温度［℃］
ｔ：時間［ｈ］
Ｕ：ユニット［μｍｏｌ ｍｉｎ―1］
ｖ：フラックス［％］
λ：波長［ｎｍ］
ＹP/S：産物収率［ｍｏｌ ｍｏｌ-1］
ＹX/S：バイオマス収率［ｇ ｍｏｌ-1］
【０５１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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