(57)【要約】  本発明は、炭水化物の還元的アミノ化のための２−ピコリンボラン（２−ＰＢ）の使用であって、２−ＰＢの濃度が炭水化物の匹敵する転換を得るのに必要とされるＮａＢＨ（ＯＡｃ）３又はＮａＢＨ３ＣＮの濃度よりも少ない使用を提供する。本発明はまた炭水化物を標識化する方法であって、炭水化物を２−ピコリンボラン（２−ＰＢ）の存在下で標識化剤と接触させて標識された炭水化物を製造することを含む方法を提供する。試料中の炭水化物を検出する方法もまた提供される。
2013506115.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭水化物の還元的アミノ化のための２−ピコリンボラン（２−ＰＢ）の使用であって、２−ＰＢの濃度が炭水化物の匹敵する転換を得るのに必要とされるＮａＢＨ（ＯＡｃ）３又はＮａＢＨ３ＣＮの濃度よりも少ない使用。
【請求項２】
炭水化物が２−ＰＢの存在下において標識化剤と反応させられる請求項１に記載の使用。
【請求項３】
炭水化物を標識化する方法であって、炭水化物を２−ピコリンボラン（２−ＰＢ）の存在下で標識化剤と接触させて標識された炭水化物を製造することを含み、２−ＰＢの濃度が炭水化物の匹敵する転換を得るのに必要とされるＮａＢＨ（ＯＡｃ）３又はＮａＢＨ３ＣＮの濃度よりも少ない方法。
【請求項４】
標識化剤がフルオロフォアのアミン置換発色団である請求項２又は３に記載の使用又は方法。
【請求項５】
フルオロフォアのアミン置換発色団が、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）、８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）、２−アミノピリジン（２−ＡＰ）、［Ｄ６］−２−ＡＰ、［Ｄ４］−２−ＡＡ、２，５−ジアミノピリジン及び２−アミノ−６−アミドビオチニルピリジン（ＢＡＰ）から選択される請求項４に記載の使用又は方法。
【請求項６】
フルオロフォアのアミン置換発色団が２−アミノ安息香酸２−ＡＡ、２−ＡＢ及びＡＰＴＳから選択される請求項４に記載の使用又は方法。
【請求項７】
炭水化物の本質的に同じ転換率を達成するために、２−ＰＢがＮａＢＨ（ＯＡｃ）３又はＮａＢＨ３ＣＮと比較して９０％より少ないモル量で使用される請求項１から６の何れか一項に記載の使用又は方法。
【請求項８】
２−ＰＢの濃度が約０．０１７Ｍから約１Ｍ、好ましくは約０．０３３Ｍから約０．３３Ｍである請求項１から７の何れか一項に記載の使用又は方法。
【請求項９】
使用又は方法が水性条件下で実施される請求項１から８の何れか一項に記載の使用又は方法。
【請求項１０】
炭水化物が、ヒト、動物又は植物由来から、又は組換え的に発現され又は生物工学的に発現されたタンパク質から誘導される請求項１から９の何れか一項に記載の使用又は方法。
【請求項１１】
炭水化物が、多糖類の完全な又は部分的な加水分解又は分解により調製される請求項１０に記載の使用又は方法。
【請求項１２】
炭水化物が完全な又は部分的な化学合成によって調製される請求項１０に記載の使用又は方法。
【請求項１３】
炭水化物が糖タンパク質及び糖脂質から誘導されるグリカンである請求項１０に記載の使用又は方法。
【請求項１４】
試料中の炭水化物を検出する方法において、
（ｉ）試料中の炭水化物を２−ピコリンボラン（２−ＰＢ）の存在下で標識化剤と接触させて、請求項３から１３の何れか一項に記載の標識化された炭水化物を製造し；
（ｉｉ）標識化された炭水化物を検出する
ことを含む方法。
【請求項１５】
検出工程が蛍光検出と連係された液体クロマトグラフィーを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
蛍光検出と連係された液体クロマトグラフィーが、蛍光検出と連係させた親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ−ＦＬ）である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
炭水化物を潜在的に含む複数の資料で同時に実施される請求項１から１６の何れか一項に記載の使用又は方法。
【請求項１８】
場合によっては実施例を参照して、明細書に一般的に記載された新規の方法又は使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は炭水化物の還元的アミノ化に関する。
【０００２】
タンパク質結合グリカン類は、細胞間相互作用、レセプター活性化及び分子輸送のような重要な生物学的プロセスに関与している（Ｏｈｔｓｕｂｏ等，Ｃｅｌｌ ２００６，１２６，８５５−６７）。薬剤療法におけるグリカン類の役割及び特定の疾患におけるバイオマーカーとしてのグリカン類の探索についての最近の研究は、速く感度の良いハイスループットな糖分析法に対する必要性をつくり出した（Ｐａｃｋｅｒ等，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００８，８，８−２０；及びＷｕｈｒｅｒ，Ｍ． Ｅｘｐｅｒｔ．Ｒｅｖ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００７，４，１３５−３６）。
【０００３】
そのような方法は、ＵＶ、蛍光又は質量分析検出に連結されたＨＰＬＣ（Ｒｏｙｌｅ等，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００８，３７６，１−１２；及びＲｕｈａａｋ等，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００８，８０，６１１９−２６）及びキャピラリー電気泳動（ＣＥ）（Ｋａｍｏｄａ等，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ２００６，１１３３，３３２−３９）を含む。あるいは、質量分析法は独立した技術として使用されうる（Ｑｉａｎ等，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００７，３６４，８−１８；及びＪａｎｇ−Ｌｅｅ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００６，４１５，５９−８６）。多くのアプローチ法は、ＵＶ吸収又は蛍光タグの導入のためのグリカン誘導体化を含む（Ａｎｕｍｕｌａ，Ｋ．Ｒ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００６，３５０，１−２３；及びＳｈｉｌｏｖａ等，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．２００３，２９，３３９−５５）。
【０００４】
先に刊行された文献の列挙又は検討あるいは明細書中のあらゆる背景技術は、文献又は背景が従来技術の一部であるか又は一般的な常識であることを認めていると必ずしもとってはならない。
【０００５】
広く使用されている標識化技術は、還元的アミノ化によるオリゴ糖のアミン置換発色団又はフルオロフォアへのカップリングを含む。可逆反応において、炭水化物の開環型がアミン基と反応し、水を除去してシッフ塩基を形成する。第二の不可逆反応において、シッフ塩基が還元されて第二級アミンを形成する。この反応において最も広く使用されている還元剤はシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）である。この試薬の主な欠点は、加水分解時に毒性の揮発性化合物であるシアン化水素を直ぐに形成することである。この試薬の更なる欠点は、余りに強い還元剤であると思われるので、還元的アミノ化よりも少なくとも幾らかのオリゴ糖の直接的還元を生じることである。
【０００６】
代替の還元剤であるトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）が、４−アミノ−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］ベンズアミド（ＤＥＡＥＡＢ）での炭水化物の還元的アミノ化のために導入されており、このアプローチ法は、あらゆるアミン標識に適していると仮定されている（Ｄａｌｐａｔｈａｄｏ等，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００５，３８１，１１３０−３７）。しかしながら、この還元剤は、グリカン分析においては広くは使用されていない。これは、それが十分に反応性ではないためであると思われる。
【０００７】
本発明は、炭水化物の還元的アミノ化のための２−ピコリンボラン（２−ＰＢ）の使用を提供することにより上記及び他の不具合に取り組んでいる。驚いたことに、本発明者は、２−ＰＢが炭水化物の標識化のための還元的アミノ化試薬として特に有効かつ有用であることを見出した。よって、本発明は、炭化水素を標識化する方法であって、２−ＰＢの存在下で炭水化物を標識化剤と接触させ、標識された炭水化物を製造することを含む方法をまた提供する。
【０００８】
理論に拘束されるものではないが、炭水化物の還元的アミノ化（例えば標識化）のための２−ＰＢの使用は、次の予測できない利点を有していると思われる：
（ｉ）ＮａＢＨ３ＣＮと比較して炭水化物の還元的アミノ化に対する改善されていなくとも匹敵する転換率及び／又は選択性；及び／又は
（ｉｉ）ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３と比較して炭水化物の還元的アミノ化に対する改善された転換率及び／又は選択性；及び／又は
（ｉｉｉ）ＮａＢＨ３ＣＮと比較して減少した毒性。
【０００９】
好ましい実施態様では、炭水化物は２−ＰＢの存在下で標識化剤と反応させられる。任意の適した標識化剤を本発明において使用することができる。典型的には、標識化剤は、炭水化物の還元端の開環型と反応しうるアミン基を含むであろう。例はアミン置換発色団又はフルオロフォア及びアラニン及び［１３Ｃ６］−アラニンのような標識化剤を含む他のアミンを含む。アミン置換発色団又はフルオロフォアは現在好ましい標識化剤である。
【００１０】
適切なアミン置換発色団又はフルオロフォアの例は、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）、８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）、２−アミノピリジン（２−ＡＰ）、［Ｄ６］−ＡＰ、及び［Ｄ４］−２−ＡＡを含む。アミン置換発色団又はフルオロフォアは更なる反応性の官能基を担持しうる。そのような多官能性タグの例は、２，５−ジアミノピリジン及び２−アミノ−６−アミドビオチニルピリジン（ＢＡＰ）を含む。２−ＡＡ、２−ＡＢ及びＡＰＴＳは、現在、好ましいアミン置換発色団又はフルオロフォア（例えばＡＰＴＳ）である。他の適切なアミン置換発色団又はフルオロフォアは、例えばここに出典明示により援用されるＡｎｕｍｕｌａ，Ｋ．Ｒ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００６，３５０，１−２３から、当業者に明らかであろう。
【００１１】
「炭水化物」なる用語には、典型的には１から４０成分糖を含む、一又は複数の単糖類、オリゴ糖及び多糖類、又はそのような糖の混合物を含む。
【００１２】
適切な炭水化物は、ヒト、動物又は植物由来から、又は組換え的に発現され、又は生物工学的に発現されたタンパク質から誘導されうる。
【００１３】
炭水化物を調製するための適切な合成方法は、有機合成、及び多糖類の完全な又は部分的な加水分解又は分解を含む。例は、デキストランの部分的酸加水分解により調製された（ここではグルコースラダーとも称される）オリゴ糖を含む。オリゴ糖を合成する他の方法は当業者に知られているであろう（例えば、出典明示によりここに援用されるＳｅｅｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｈ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８，３４３，１８８９−１８９６、及びＳｅｅｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｈ．，Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．２００８，３７，１９−２８を参照）。
【００１４】
例えばヒト血漿から調製されるＮ−グリカン類のような、糖タンパク質及び糖脂質から誘導されるものを含むグリカン類（例えばＮ−グリカン類）は、本発明で使用することができる炭水化物の更なる例である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】２−ＡＡ標識でのデキストランから誘導されたオリゴグルコースの還元的アミノ化の反応機構を示す図である。
【図２−１０】実施例に関連する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図１は２−ＡＡ標識でのデキストランから誘導されたオリゴグルコースの還元的アミノ化の反応機構を示している。非標識オリゴグルコースの直接的検出もまた知られている。
【００１７】
図１に示されるように、還元的アミノ化は二工程で進行する：炭水化物が第一級アミンと反応してシッフ塩基を形成する第一の（可逆）反応と、続くシッフ塩基が還元されて第二級アミンを形成する第二の（不可逆）反応である。本発明はこれらの二つの反応に対応する二つの別個の工程で実施されうる。しかしながら、好ましくは、両方の反応はワンポット（つまり、二つの別個の工程よりもむしろ一工程）で実施される。これは、プロセスを迅速化しハンドリング時間を減少させるという効果を有する。
【００１８】
炭水化物の還元的アミノ化（例えば標識化）における２−ＰＢの使用は、ＮａＢＨ３ＣＮ及び／又はＮａＢＨ（ＯＡｃ）３のような既存の還元的アミノ化剤と比較して、炭水化物の望まれない直接還元産物よりも（シッフ塩基イミンを介する）所望のアミン産物に対してより大きな選択性をもたらすと考えられる。
【００１９】
２−ＰＢはまたＮａＢＨ３ＣＮ及び／又はＮａＢＨ（ＯＡｃ）３のような既存の還元的アミノ化剤と比較して、（シッフ塩基イミンを介する）所望のアミン産物に対してより大きな転換率をもたらすと考えられる。
【００２０】
ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３及びＮａＢＨ３ＣＮのような既知の試薬と比較したときの、２−ＰＢの炭水化物の還元的アミノ化（例えば標識化）における改善された活性及び／又は選択性の結果として、２−ＰＢはそれらの試薬と比較して低減された量で使用されうる。これは、ＮａＢＨ３ＣＮと比較して２−ＰＢの固有の減少した毒性に対してかつそれ以上に、炭水化物の還元的アミノ化（例えば標識化）の毒性（及び研究者に対する健康リスク）及び環境への影響を更に低減させる。
【００２１】
一実施態様では、本発明の方法における２−ＰＢの濃度は、炭水化物の匹敵する転換率を得るために必要とされるＮａＢＨ（ＯＡｃ）３又はＮａＢＨ３ＣＮ（好ましくはＮａＢＨ３ＣＮ）の濃度よりも少ない。例えば、２−ＰＢは、炭水化物の本質的に同じ転換率を達成するために、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３又はＮａＢＨ３ＣＮ（好ましくはＮａＢＨ３ＣＮ）と比較して、モル量で、９０％未満、例えば７０％未満、好ましくは５０％未満、例えば３０％未満で使用されうる。
【００２２】
典型的には、本発明の方法において使用される２−ＰＢの濃度は、約０．０１７Ｍから約１Ｍ、好ましくは約０．０３３Ｍから約０．３３Ｍ、例えば約０．０６７Ｍから約０．２５Ｍである。これらの範囲の値の組み合わせもまた使用することができ、例えば約０．０１７Ｍから約０．３３Ｍ、又は約０．０３３Ｍから約０．２５Ｍである。
【００２３】
当業者は、使用される２−ＰＢの濃度が、使用される標識化剤のような要因に依存しうることも理解するであろう。例えば、標識化剤がＡＰＴＳである場合、２−ＰＢの濃度は典型的には約０．０１７Ｍから約０．３３３Ｍ、例えば約０．０３３Ｍから約０．０６７Ｍ（又はこれらの範囲の組み合わせ）の範囲である。
【００２４】
ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３及びＮａＢＨ３ＣＮのような既知の試薬と比較したときの、２−ＰＢの炭水化物の還元的アミノ化（例えば標識化）における更なる利点は、２−ＰＢがより堅牢な標識プロファイルをもたらしうることである（例えば実施例２を参照）。理論に拘束されるものではないが、２−ＰＢは、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３及びＮａＢＨ３ＣＮのような既知の試薬と比較して、電荷のような構造的特徴に対する標識化効果の依存性の低減を示すと考えられる。
【００２５】
本発明は、試料中の炭水化物を容易かつ安全に検出することを可能にする。従って、本発明は、試料中の炭水化物を検出する方法であって、
（ｉ）試料中の炭水化物を２−ピコリンボラン（２−ＰＢ）の存在下で標識化剤と接触させて、ここに記載の標識化された炭水化物を製造し；そして
（ｉｉ）標識化された炭水化物を検出する
ことを含む方法を提供する。
【００２６】
例えば蛍光検出と連係させた液体クロマトグラフィー、ＵＶ吸光度検出、及び／又は質量分析による検出のような、任意の適切な検出方法を工程（ｉｉ）に対して使用することができる。好ましい方法は蛍光検出と連係させた親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ−ＦＬ）である。
【００２７】
（先行技術と比較して）本発明の容易さ、効果、減少した毒性及び／又は減少したコストは、それがハイスループットの分析に適用できることを意味する。よって、本発明は潜在的に炭水化物を含んでいる複数の試料について同時に実施することができる。例えば、上述の炭水化物を検出する方法は複数の試料に同時に適用されうる。
【００２８】
標識化剤及び２−ＰＢとの炭水化物の反応は、任意の適切な長さの時間の間、任意の適切な反応温度で実施されうる。典型的な反応時間は約１分から約１０時間、例えば約５分から約５時間である。典型的な反応温度は、約０から約１００℃、例えば約２０から約８０℃である。好ましくは、反応はワンポットで実施される。
【００２９】
反応は、水、ＤＭＳＯ、（氷）酢酸、アセトニトリル、エタノール、又は上記の一又は複数の混合物を含む、任意の適切な溶媒中で実施されうる。反応は水性又は無水条件下で実施することができる。
【００３０】
水性条件下では、本発明の方法において存在する水の量は典型的には約１から約９０％（体積／体積）、例えば約１０から約８０％ｖ／ｖ、好ましくは約５０から約６７％ｖ／ｖの範囲である。
【００３１】
驚いたことに、２−ＰＢは還元的アミノ化に典型的に使用される他の還元剤（例えばＮａＢＨ（ＯＡｃ）３又はＮａＢＨ３ＣＮ）よりも本発明の方法において水性条件下でより効果的な還元剤であることが見出された。
【００３２】
好ましい実施態様では、酸が還元的アミノ化を補助するために使用される。例えば有機酸（例えば酢酸）のような、任意の適切な酸を使用することができる。理論に拘束されるものではないが、酸は還元的アミノ化の効率を増加させると思われる。
【００３３】
一実施態様では、使用される酸は、酢酸、クエン酸、マロン酸、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、トリフルオロ酢酸及びその混合物から選択される。好ましくは、酸はクエン酸及び酢酸から選択される。
【００３４】
以下、本発明を次の非限定的な実施例によって例証する。
実施例１：ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３及び２−ＰＢを使用する２−ＡＡ及び２−ＡＢでのヒト血漿由来のグルコースラダー及びＮ−グリカン類の標識化
材料
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、水酸化アンモニウム、ギ酸、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）、ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３及び２−ピコリンボラン（２−ＰＢ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得た。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）はＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から購入した。ＰＮＧａｓｅＦはＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。氷酢酸はＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。アセトニトリルはＢｉｏｓｏｌｖｅ（Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。デキストラン１０．０００はＰｈａｒｍａｃｉａ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から得た。
【００３５】
オリゴ糖の調製
グルコースラダーは、１ｍｌの１ＭのＴＦＡ中における１０ｍｇのデキストラン１０．０００の部分的酸加水分解によって製造した（８０℃で１時間）。試料をついで４ｍｌの水を使用して希釈した。ヒト血漿由来のＮ−グリカン類を、出典明示によりここに援用されるＲｕｈａａｋ等，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００８，８０，６１１９−２６に記載されているようにして調製した。まとめると、１０μｌの血漿からのタンパク質を、６０℃で１０分のインキュベーションにより、２０μｌの２％ＳＤＳの添加後に変性させた。続いて、１０μｌの５×ＰＢＳ中の０．５ｍＵのＰＮＧａｓｅ Ｆ及び１０μｌの４％ＮＰ−４０を試料に添加した。Ｎ−グリカン放出のために試料を３７℃で一晩インキュベートした。
【００３６】
オリゴ糖の標識化
５０μｌのオリゴ糖溶液（先の精製を伴わないグルコースラダー又は血漿Ｎ−グリカン類の何れか）を２５μｌの標識（２−ＡＡ又は２−ＡＢ；１５％の氷酢酸を含むＤＭＳＯ中に４８ｍｇ／ｍｌ）の新鮮に調製した液と混合した。２５μｌアリコートの新鮮に調製した還元溶液（ＤＭＳＯ中に１ＭのＮａＢＨ３ＣＮ、２−ピコリンボラン、又はＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）を加え、ついで５分振盪し、６５℃で２時間インキュベーションした。本発明の上記方法における還元剤の最終濃度は、オリゴ糖溶液及び標識溶液での還元剤溶液の希釈によって、括弧に示したものの四分の一（つまり約０．２５Ｍ）であった。これらの水性標識化実験は約５０％の水（ｖ／ｖ）を含んでいた。
【００３７】
他の研究との比較を可能にするために、出典明示によりここに援用されるＢｉｇｇｅ等，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５，２３０，２２９−３８に記載されたようにして、２−ＡＢ標識化を無水条件下でまた実施した。まとめると、５０μｌのグルコースラダー試料を、真空遠心分離を使用して乾固させた。ついで、オリゴ糖試料を、１５％氷酢酸を含むＤＭＳＯ中の２５μｌの新鮮に調製した９６ｍｇ／ｍｌの２−ＡＢの溶液と混合した。２５μｌアリコートの新鮮に調製した還元剤溶液（ＤＭＳＯ中の２ＭのＮａＢＨ３ＣＮ、２−ピコリンボラン、又はＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）を加え、ついで５分振盪し、６５℃で２時間インキュベーションした。各還元剤の本発明の上記方法における最終濃度は、２５μｌの還元剤溶液の２５μｌの２−ＡＢ溶液との組み合わせによって１Ｍであった。
【００３８】
反応混合物を室温まで冷却させた。蛍光検出と連係させた親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ−ＦＬ）による分析の前に、試料をアセトニトリルで１：３（ｖ／ｖ）希釈した。
【００３９】
黒鉛化カーボン固相抽出（ＰＧＣ−ＳＰＥ）による精製
遊離標識及び還元剤を、多孔性黒鉛カーボンＳＰＥを使用して試料から除去した。カルボグラフ（ｃａｒｂｏｇｒａｐｈ）ＳＰＥカートリッジ（Ｇｒａｃｅ，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、水中２ｍｌの８０％アセトニトリルと、続く３ｍｌ水での平衡化によって条件付けした。試料を３００μｌの水と混合し、カートリッジに充填した。４ｍｌの水での洗浄後、オリゴ糖を、０．１％のＴＦＡを含む１ｍｌの５０％アセトニトリルを使用して溶離させた。溶離液を、イオントラップＭＳ検出と共にエレクトロスプレーイオン化に連係させた親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ−ＥＳＩ−ＩＴ−ＭＳ（／ＭＳ））による分析の前にアセトニトリルで１：１（ｖ／ｖ）希釈した。
【００４０】
ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ−ＦＬ
標識されたＮ−グリカン類を、蛍光検出を伴うＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣを使用して分析した。Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）は、Ｆａｍｏｓオートサンプラー、充填ポンプを備えたＳｗｉｔｃｈｏｓモジュール、及びＵｌｔｉｍａｔｅポンプモジュールから構成されていた。該システムを蛍光検出器（ＦＰ−２０２０プラス；Ｊａｓｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，ＭＤ）に連結し、これを励起波長３６０ｎｍ及び発光波長４２０ｎｍで操作した。該システムはＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアによって制御され、２．０ｍｍ×１０ｍｍのＴＳＫゲル−アミド８０トラップカラム及び２．０ｍｍ×２５０ｍｍのＴＳＫゲル−アミド８０分析カラムを備えていた（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００４１】
８００μｌのｖ底ポリプロピレン製９６ウェルプレート（Ｗｅｓｔｂｕｒｇ，Ｌｅｕｓｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の試料含有ウェルを、シリコン製の蓋（Ｌａｂｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で密封し、オートサンプラーに配した。２０μｌのアリコートを、フルループ注入手順を使用して注入した。標識されたオリゴ糖をトラップカラムに移し、１５０μｌ／分の流量で３分間、アセトニトリル：５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ４．４；体積８０：２０）を使用して洗浄した。ついで、トラップカラムから分析カラムにラインを切り替え、これを、１５０μｌ／分の流量の７０％アセトニトリル（溶媒Ａ）、３０％のギ酸アンモニウム（５０ｍＭ，ｐＨ４．４（溶媒Ｂ））で平衡化した。線形勾配を適用し、溶媒Ｂを３０％（０分）から６０％（８７分）に増加させ、ついで６０％溶媒Ｂで５分均一濃度で溶離させ、３０％の溶媒Ｂで１５分間カラムを再平衡化させた。
【００４２】
ＨＩＬＩＣ−ＥＳＩ−ＩＴ−ＭＳ（／ＭＳ）
ＨＩＬＩＣ−ナノＬＣ−ＥＳＩ−イオントラップ（ＩＴ）−ＭＳ／ＭＳを、ガードカラム（５μｍアミド−８０ １７０μｍ×１０ｍｍ）を備えたＵｌｔｉｍａｔｅ３０００ナノＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ）を使用して、アミド−８０カラム（３μｍ粒子；７５μｍ×１５０ｍｍ；Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施した。試料を７５％のアセトニトリル含有量にし、１０μｌの試料をガードカラムに移し、これをアセトニトリル：５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ４．４，９０：１０，ｖ／ｖ）で５分間洗浄した。ついで、ガードカラムをナノカラムとのラインにし、これを４００ｎｌ／分の流量で操作し、１７．５％溶媒Ａ（５０ｍＭギ酸アンモニウム，ｐＨ４．４）及び８２．５％溶媒Ｂ（アセトニトリル：５０ｍＭギ酸アンモニウム，ｐＨ４．４，８０：２０，ｖ／ｖ）で平衡化させた。２５％溶媒Ａへの即時の工程後、３０分以内に線形勾配を４０％溶媒Ａに適用し、ついで１００％溶媒Ａで４分洗浄し、更に２５分後、１７．５％溶媒Ａで再平衡化させた。ナノＬＣシステムは、陽イオンモードで操作されるオンラインナノスプレー源を装備したＥｓｑｕｉｒｅ高容量トラップ（ＨＣＴｕｌｔｒａ）ＥＳＩ−ＩＴ−ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）に直接連結した。
【００４３】
エレクトロスプレー（９００−１２００Ｖ）では、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）からのキャピラリー（３６０μｍＯＤ，２０μｍＩＤで１０μｍの開口を有する）を使用した。溶媒は６ｌ／分の窒素流を用いて１６５℃で蒸発させた。ｍ／ｚ４００からｍ／ｚ２０００のイオンを記録した。自動断片化解析がｍ／ｚ１１７０とｍ／ｚ１１８０の間の前駆体に対して可能になり、減少したＧｌｃ７−種のタンデム質量スペクトルが得られた。
【００４４】
データ処理
ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ−ＦＬデータに対して、ｍＶでのピーク強度を、グルコース標準からの５つのピークに対して決定した。二通りの分析の結果を平均化した。再現間の差は１０％未満であった。ＨＩＬＩＣ−ＥＳＩ−ＩＴ−ＭＳデータを、データ解析バージョン４．０ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用して解析した。Ｇｌｃ４からＧｌｃ８のプロトン、アンモニウム、ナトリウム及びカリウムイオンのピーク強度を、標識種及び非標識種の双方に対して決定した。一重及び二重荷電イオンの双方を考慮した。全ての付加物の強度を合計し、標識グリカン対非標識グリカンの相対存在量を計算した。
【００４５】
結果
還元剤トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、２−ピコリン−ボラン及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムを、還元的アミノ化によるＮ−グリカン類の標識化において比較した。デキストラン誘導オリゴグルコース及びヒト血漿由来のＮ−グリカン類を、上述の３種の還元剤を使用して標識化した。オリゴブドウ糖をアミン類２−ＡＡ及び２−ＡＢの双方で標識する一方、血漿由来Ｎ−グリカン類を２−ＡＡのみで標識した。全ての試料を、ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ−ＦＬを使用して分析した。オリゴブドウ糖ラダーをまた黒鉛化カーボン−ＳＰＥによって精製し、ＨＩＬＩＣ−ＬＣ−ＥＳＩ−ＩＴ−ＭＳを使用して分析した。
【００４６】
異なった還元剤及び標識を使用する標識化後のグルコースラダーのＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ−ＦＬクロマトグラムを図２Ａ、Ｂ及びＣに示す。これらのデータから、Ｇｌｃ４からＧｌｃ８オリゴマーの平均ピーク高さを決定した（以下の表１を参照）。
【００４７】
2013506115.tif 000003
蛍光的に標識されたグルコースオリゴマーの観察された強度は（１５の標識化グルコースオリゴマーの一つを除いて全てについて２−ＰＢに対して顕著に高いけれども）２−ピコリン−ボラン及びＮａＢＨ３ＣＮに対して同様であったが、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３の使用は更に低い強度となった。これは、水性条件及び非水性条件双方における２−ＡＡ標識化並びに２−ＡＢ標識化に対してもしかりである。
【００４８】
２−ＡＢでのオリゴグルコースの標識化は、水性条件下においてシアノ水素化ホウ素ナトリウム及び２−ピコリン−ボランの双方に対して、非水性条件下と丁度同じであった。
【００４９】
標識効果を決定するために、試料を黒鉛化カーボン固相抽出によって精製し、ＨＩＬＩＣ−ＥＳＩ−ＩＴ−ＭＳによって分析し、標識されたグルコースオリゴマー、未標識種、並びに標識化反応の副産物のパラレルな登録が可能になった。得られたデータの一例として、２−ＡＡ−標識Ｇｌｃ７、並びに残りのＧｌｃ７の質量スペクトルを図３に示す。
【００５０】
ＮａＢＨ３ＣＮ及び２−ピコリン−ボランは、２−ＡＡ標識Ｇｌｃ７のプロトン付加物（ｍ／ｚ１２７４．３）並びにナトリウム付加物（ｍ／ｚ１２９６．３）に対して高強度シグナルを伴って（図３Ｂ及びＤ）、ほぼ完全な標識化を示す一方、ほんの少ない量の未標識Ｇｌｃ７が検出された（図３Ａ及びＣにおけるｍ／ｚ１１７０．３のアンモニウム付加物及びｍ／ｚ１１７５．３のナトリウム付加物）。これに対して、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３には殆ど標識化Ｇｌｃ７は観察されず（図３Ｆ）、Ｇｌｃ７の殆どは未標識形態で存在していた（図３Ｅ）。ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ−ＦＬデータによれば、表１にまとめられている標識対未標識Ｇｌｃ４、Ｇｌｃ５、Ｇｌｃ６及びＧｌｃ７のＬＣ−ＭＳデータは、シアノ水素化ホウ素ナトリウム及び２−ピコリン−ボラン双方に対して効率的な標識化を示す一方、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３は非常に非効果的な還元剤であると思われた。
【００５１】
ヒト血漿由来のＮ−グリカン類を、ＮａＢＨ３ＣＮ、２−ピコリン−ボラン及びＮａＢＨ（ＯＡｃ）３を使用して標識化した。図２Ｄに示されるＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ−ＦＬＵクロマトグラムは、ＮａＢＨ３ＣＮ及び２−ピコリン−ボランの同様の標識化性能を示した。再び、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３はそれほど効率的ではないようであった。
【００５２】
実施例２：ＮａＢＨ３ＣＮ及び２−ＰＢを使用するＡＰＴＳ（８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸）でのヒト血漿由来のＮ−グリカン類の標識化
材料
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ＡＰＴＳ、ＮａＢＨ３ＣＮ及び２−ピコリン−ボランはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得た。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）はＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から購入した。ＰＮＧａｓｅＦはＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。氷酢酸はＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ−１０はＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得、クエン酸及びエタノールはＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。アセトニトリルはＢｉｏｓｏｌｖｅ（Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。
【００５３】
オリゴ糖の調製
ヒト血漿由来のＮ−グリカン類を、出典明示によりここに援用されるＲｕｈａａｋ等，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００８，８０，６１１９−２６に記載されているようにして調製した。１０μｌの血漿からのタンパク質を、６０℃で１０分のインキュベーションにより、２０μｌの２％ＳＤＳの添加後に変性させた。続いて、１０μｌの５×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．５ｍＵのＰＮＧａｓｅ Ｆ及び１０μｌの４％ＮＰ−４０を試料に添加した。Ｎ−グリカン放出のために試料を３７℃で一晩インキュベートした。
【００５４】
オリゴ糖の標識化
２μｌのＮ−グリカン糖溶液をｖ底の９６ウェルプレートにおいて２μｌの標識（ＡＰＴＳ；３．６Ｍのクエン酸中２０ｍＭ）の新鮮に調製した液と混合した。２μｌアリコートの新鮮に調製した還元溶液（ＤＭＳＯ中に異なったモル濃度のＮａＢＨ３ＣＮ又は２−ピコリンボラン）を加え、ついで５分振盪し、３７℃で１６時間インキュベーションした。反応を停止させるために、５０μｌのアセトニトリル：水（８０：２０ｖ／ｖ）を添加し、試料を５分間混合した。これらの水性標識化実験は約６７％の水（ｖ／ｖ）を含んでいた。
【００５５】
ＨＩＬＩＣ−ＳＰＥ
遊離標識及び還元剤を、ＨＩＬＩＣ−ＳＰＥを使用して試料から除去した。水：ＥｔＯＨ：アセトニトリル（７０：２０：１０ｖ／ｖ）中の１００μＬ量の１００ｍｇ／ｍＬのＢｉｏｇｅｌ Ｐ−１０懸濁液を、０．４５μｍのＧＨＰフィルタープレート（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）の各ウェルに塗布した。溶媒を、真空マニフォールド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して真空を適用して除去した。全てのウェルを、５×２００μＬの水を使用して予め洗浄し、ついで、３×２００μＬのＡＣＮ／水（８０：２０ｖ／ｖ）を使用して平衡にした。試料をウェルに充填し、プレートをシェーカーで５分間振盪して、グリカン結合を亢進した。ついで、ウェルを、１００ｍＭのＴＥＡを含む５×２００μＬのＡＣＮ／水（８０：２０ｖ／ｖ）と、続いて３×２００μＬのＡＣＮ／水（８０：２０ｖ／ｖ）を使用して洗浄した。標識されたＮ−グリカン類を、続いて１００（バイオゲル粒子を膨潤させるため）、２００及び２００μＬの水を使用して溶離させ、溶離液を９６ウェルのＶ底の深いウェルプレートに集めた。
【００５６】
ＡＢＩ−３７３０ ＤＮＡ配列解析装置を使用するレーザー誘起蛍光を備えたキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ−ＬＩＦ）
標識されたＮ−グリカン類を、蛍光検出を備えたＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣを使用して分析した。６０μＬのＤＭＳＯをＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｖｉａ Ｗｅｓｔｂｕｒｇ，Ｌｅｕｓｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に分配した。６μＬのＮ−グリカン溶離液をＤＭＳＯに加え、試料を、ＡＢＩ−３７３０ＤＮＡシークエンサーを使用して分析した。注入電圧は７．５ｋＶに設定され、流通電圧は１０ｋＶであった。システムは、５０ｃｍのキャピラリーを備えた４８チャンネルのアレイを装備し、キャピラリーにはＰＯＰ−７バッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を満たした。流通バッファーはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【００５７】
データ処理
データファイルを．ｘｍｌファイルに変換し、ついでＭａｔｌａｂバージョン２００７ａ（Ｔｈｅ Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）にアップロードした。バックグラウンドのサブトラクション後、ピーク高さを１５の最も豊富なピークに対して決定した。
【００５８】
結果
ＣＥ−ＬＩＦ又はＣＥ−ＭＳによるグリカン分析のために、ＡＰＴＳ標識でのグリカン類の誘導体化が、それが３つの負の電荷を生じる３つのスルホン酸を有しているため、好ましい。最近、ＤＮＡ−シークエンサーの助けを借りてＮ−グリカンパターンの速やかなプロファイリングのための方法が開発された（出典明示によりここに援用されるＬａｒｏｙ Ｗ，Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ Ｒ，Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ Ｎ（２００６）Ｇｌｙｃｏｍｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １：３９７−４０５）。このアプリケーションを使用して、我々は現在約１時間の１回の実行で４８の試料をスクリーニングすることができる。
【００５９】
血漿Ｎ−グリカン類を、ＤＮＡ−シークエンサーを使用してＡＰＴＳ標識形態で分析した。ピーク数の注記と幾つかのグリカン構造と共に特徴的な電気泳動図を図４に含める。
【００６０】
２−ピコリンボラン及びＮａＢＨ３ＣＮを、ＡＰＴＳでの血漿Ｎ−グリカン類の還元的アミノ化標識化におけるその効果について比較した。ＡＰＴＳ標識されたＮ−グリカンプロファイル並びに５つの異なった濃度のＮａＢＨ３ＣＮ（２Ｍ、１Ｍ、０．２Ｍ、０．１Ｍ及び０．０５Ｍ）及び４つの異なった濃度の２−ピコリンボラン（１Ｍ、０．２Ｍ、０．１Ｍ及び０．０５Ｍ）で得られた収率を比較し、定まった位置に移動する１３のピークの強度を決定した。図５は、様々な濃度のシアノ水素化ホウ素ナトリウムでの１３のピークの相対強度を示す。顕著なことに、プロファイルは、還元剤の濃度が増加すると変動が顕著となるこをを示していた。これに対して、２−ピコリンボランで実施された同様の実験は、還元剤の濃度が異なるとＡＰＴＳ−グリカンプロファイルがほんの僅か変動することを示していた（図６）。
【００６１】
上記段落及び図５及び６において言及するＮａＢＨ３ＣＮ及び２−ＰＢの濃度は、２μｌの還元剤溶液の濃度である。もちろん、上に記載したように、これらの溶液を２μｌのＮ−グリカン溶液及び２μｌのＡＰＴＳ標識に加えた。従って、本発明の実証された方法における最終２−ＰＢ及びＮａＢＨ３ＣＮ濃度は上記段落及び図５及び６（また図７及び８）に示されたものの三分の一である。例えば、最終２−ＰＢ濃度は約０．０１７Ｍ，約０．０３３Ｍ，約０．０６７Ｍ，又は約０．３３３Ｍであった。
【００６２】
様々な濃度の還元剤での個々のピークの相対強度の変動を明らかにするために、同じデータの更なるグラフを作成した（図７）。シアノ水素化ホウ素ナトリウムと２−ピコリンボランの双方に対して、個々のピークの相対強度を、様々な濃度の還元剤を用いて示した。ピーク１及び３は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの濃度が増加するにつれて、増加した相対量を示した。ピーク６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの濃度が増加するにつれて、減少した相対強度を示した。これに対して、２−ピコリンボランに対して得られたデータは、還元剤の濃度に対する相対ピーク強度の如何なる依存性も殆ど示さなかった。
【００６３】
得られたプロファイルの堅牢性（相対標識効率）の比較と同様に、様々な濃度の２つの還元剤を用いてピーク２に対して得られた絶対標識化効率もまた比較した（図８）。最も大きい差は０．１Ｍ及び０．２Ｍの濃度の還元剤に対して観察された。０．１Ｍの還元剤濃度では、２−ピコリンボランで得られたピーク２の収率は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムで得られた収率の２倍高かった。０．２Ｍの還元剤濃度では、効率の差は更に高かった。
【００６４】
様々なシアノ水素化ホウ素ナトリウム濃度でのある種のグリカン類の偏った標識化が、比ピーク２／ピーク１２（非フコシル化グリカン１２（Ｈ５Ｎ４）に対する非フコシル化ビシアル化グリカン２（Ｈ５Ｎ４Ｓ２）の比）の変化によってまた例証される。図９に示されているように様々なシアノ水素化ホウ素ナトリウム濃度とは異なり、選択的な標識化は還元剤として１、０．５、０．２、０．１及び０．０５Ｍの２−ピコリンボランを使用した場合には観察されなかった。
【００６５】
図９は、ＡＰＴＳでのＮ−グリカン類の標識化に対して５種の異なった酸を触媒として適用した場合の結果をまた示している：酢酸（ｐＫａ＝４．７４）、クエン酸（ｐＫａ＝３．１３、４．７６、６．４０）、マロン酸（ｐＫａ＝２．８３、５．１３）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ、ｐＫａ＝０．７０）及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ｐＫａ＝０．３０）で、全て１．２Ｍの濃度である。クエン酸が最も高い収率となったことが観察された。クエン酸の使用はまたシアル化グリカン類と非シアル化グリカン類の間の比（ピーク２／ピーク１２）によってモニターされるシアル酸の非常に少ない消失を生じた。クエン酸をついで４通りの異なった濃度で適用した（図９を参照）。酸加水分解はより高い酸濃度でより顕著であったことが観察された。しかしながら、標識されたグリカン類の収率（ピーク２の強度）はまた酸濃度の増加と共に増加した。
【００６６】
本発明の方法の反復性を評価するために、健常なドナーからの単一の血漿試料の４８のアリコートを含む９６ウェルプレートを、異なった日に調製された３つのバッチにおいて（上述のような）Ｎ−グリカン放出、ＡＰＴＳ標識化及びＨＩＬＩＣ精製に供した。
【００６７】
キャピラリー当たりの反復性測定の定量のために、バッチ１を、連続する３日にＣＧＥ−ＬＩＦによって分析した。このために、ＨＩＬＩＣ精製後の試料をフリーザーに保存し、第二及び第三のＣＧＥ−ＬＩＦ実験のために２日で解凍した。そのアリコートは連続分析の各々に対して新鮮に取り上げた。特に、試料当たり、同じキャピラリーを３日の分析に対して使用した。
【００６８】
データを整列させ、ピーク高さを１２の主ピークに対して決定した（図１０Ａ）。相対標準偏差（ＲＳＤｓ）を、特定のプレート位置（ウェル）に対して３連続日にＣＧＥ−ＬＩＦ分析から得られたシグナルを比較し、それによってキャピラリー間の変動の影響を排除することにより、決定した。特定のウェル位置のＲＳＤｓを４８全ての試料に対して平均して、キャピラリー当たりのバッチ内反復性を得、図１０ｂにプロットする。ＲＳＤ値は７つの早期の溶離ピークに対しておよそ２％であり、５つの後期溶離ピークに対しておよそ５％であり、分析した１２ピークに対して３．２％の平均ＲＳＤであった。
【００６９】
全体的バッチ内及びバッチ間反復性を評価するために、同じ単一の血漿試料の４８の複製を含む２つのバッチを、グリカン放出、ＡＰＴＳ標識化、ＨＩＬＩＣ、及びマルチプレックスＣＧＥ−ＬＩＦを含め異なった日に分析した。バッチ内反復性では、ＲＳＤｓは一回の実験から得られた４８のＣＧＥ−ＬＩＦ電気泳動図のピーク毎に決定した。これは３つのバッチに対して行い、結果を平均した。ＲＳＤ値は７つの早期の溶離ピークに対しておよそ４％であり、５つの後期溶離ピークに対しておよそ９％であり（図１０Ｂ）、分析した１２ピークに対して６．２％の平均ＲＳＤであった。
【００７０】
バッチ間反復性では、３つの異なったバッチに対して得られた３×４８の電気泳動図に対してピーク毎にＲＳＤｓを計算した。再び、早期の溶離ピークは後期溶離ピークよりも低いバッチ間ＲＳＤを示した。１２の選択されたピークの平均バッチ間ＲＳＤは１５．８％であることが分かった。
【００７１】
これらの結果は、本発明の方法を、潜在的に炭水化物を含む複数の試料について（例えばハイスループットのスクリーニングのために）同時に実施することができることを証明している。全体の手順は２．５時間の操作時間（ｈａｎｄｓ−ｏｎ ｔｉｍｅ）で実施することができる。プロトコルは自動化に適切であり、２プレートを平行して実施すると、プレート当たり少なくとも３０分、真の労働割当を減じる。Ｎ−グリカン類の放出に一晩とＮ−グリカン類の標識に一晩の二晩のインキュベーション工程が必要であるので、全体の手順は２．５日かかる。
【００７２】
結論として、実施例２は、２−ピコリンボランがＮ−グリカン類の（例えばＡＰＴＳでの）標識においてシアノ水素化ホウ素ナトリウムよりもより効率的であることを示している。更に、ＡＰＴＳ標識化Ｎ−グリカン類の得られたプロファイルは、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いる場合よりも２−ピコリンボランを用いた場合に更により堅牢である。０．１Ｍ及び０．２Ｍの準最適な濃度では、シアノ水素化ホウ素ナトリウムは、後期溶離種（ピーク６から１３）よりも低い効率で、速い移動性のＡＴＰＳ移動Ｎ−グリカン類（ピーク１から３）をつくり出すようである。シアノ水素化ホウ素ナトリウムの場合、標識化効果はＮ−グリカン類の電荷によって影響されるようである：シアル化Ｎ−グリカン類に対応することが知られている速い移動性のピークは、この還元剤のより低い濃度でむしろ非効率的に標識される一方、中性Ｎ−グリカン類に対応する遅い移動性種（ピーク６−１３）はシアノ水素化ホウ素ナトリウムの低い濃度では不完全な標識化になる傾向が少ない。再び、電荷のような構造的特徴に対する標識効果の依存性のなさが２−ピコリンボランに対して観察された。
【００７３】
本発明における２−ピコリンボランの使用は、ＮａＢＨ３ＣＮの一般的な使用と比較して二つの主要な利点を有している。一つは、２−ピコリンボランの適用がＨＣＮガスの放出を生ぜず、よって研究者及び環境に、特にハイスループットな形式を使用する場合に、害がより少ないことである。二つ目は、ＮａＢＨ３ＣＮを使用する（例えばＡＰＴＳでの）Ｎ−グリカン類の標識化は、還元剤の濃度に強く依存する特定のグリカン類の偏向した標識化を生じる。そのような偏向した標識化は２−ピコリンボランでは観察されなかった。よって、本発明の方法は、試薬濃度の差のためにグリコシル化パターンの変化を受けにくく、よってより堅牢である。
【００７４】
発明は次の特許請求の範囲によって定まる。
【図１】
2013506115.tif 000004
【図２−１】
2013506115.tif 000005
【図２−２】
2013506115.tif 000006
【図３−１】
2013506115.tif 000007
【図３−２】
2013506115.tif 000008
【図４】
2013506115.tif 000009
【図５−１】
2013506115.tif 000010
【図５−２】
2013506115.tif 000011
【図５−３】
2013506115.tif 000012
【図６−１】
2013506115.tif 000013
【図６−２】
2013506115.tif 000014
【図７−１】
2013506115.tif 000015
【図７−２】
2013506115.tif 000016
【図７−３】
2013506115.tif 000017
【図７−４】
2013506115.tif 000018
【図７−５】
2013506115.tif 000019
【図８】
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【図９】
2013506115.tif 000021
【図１０】
2013506115.tif 000022
【国際調査報告】
2013506115.tif 000023
2013506115.tif 000024
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