(57)【要約】ヒトＦＧＦＲ２に結合して、生物学的活性を阻害するモノクローナル抗体が開示される。抗体を使用して、ＦＧＦＲ２の活性化および過剰発現と関係がある特定形態の癌をはじめとする、細胞増殖性疾患および障害を治療し得る。本発明の抗体は、ＦＧＦＲ２に特異的に結合する抗体のＣＤＲに基づく、ＦＧＦＲ２結合部位を含有する。治療薬として使用される場合、抗体は例えばヒト化されて改変され、ヒト患者に投与した際の免疫応答が低下または排除される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）配列番号５（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）および配列番号７（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号６（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号１１（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号１２（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号１３（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号１４（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｂ）（ｉ）配列番号５（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）および配列番号７（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号６（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号１１（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号４１（Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列ＣＤＲＬ１、配列番号４２（Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号１４（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｃ）（ｉ）配列番号５（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）および配列番号４７（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号３８（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号１１（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号４１（Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列ＣＤＲＬ１、配列番号４２（Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号１４（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域
からなる群から選択される、免疫グロブリン重鎖可変領域と免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単離抗体。
【請求項２】
前記ＣＤＲ配列が、ヒトおよびヒト化フレームワーク配列の間に挿入される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
【請求項４】
請求項１に記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
【請求項５】
請求項３に記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項６】
請求項４に記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸をさらに含んでなる、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項５に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項９】
請求項６に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１０】
請求項７に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１１】
請求項５に記載の発現ベクターをさらに含んでなる、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、請求項８または９に記載の宿主細胞を培養するステップと；
（ｂ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを精製するステップ
を含んでなる、免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを生成する方法。
【請求項１３】
（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域および／または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、請求項１０または１１に記載の宿主細胞を培養し、それによって抗体または抗体の抗原結合性断片を生成するステップと；
（ｂ）前記抗体または前記抗体の抗原結合性断片を精製するステップ
を含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する抗体または抗体の抗原結合性断片を生成する方法。
【請求項１４】
（ａ）配列番号２（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号３５（Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４０（Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号３７（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４４（Ｈｕ４Ｂ９−８２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；および
（ｄ）配列番号３７（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４６（Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域
からなる群から選択される、免疫グロブリン重鎖可変領域と免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単離抗体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
【請求項１６】
請求項１４に記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
【請求項１７】
請求項１５に記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１５に記載の核酸をさらに含んでなる、請求項１８に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１７に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１８に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１９に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１７に記載の発現ベクターをさらに含んでなる、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、請求項２０または２１に記載の宿主細胞を培養するステップと；
（ｂ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを精製するステップ
を含んでなる、免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを生成する方法。
【請求項２５】
（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域および／または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、請求項２２または２３に記載の宿主細胞を培養し、それによって抗体または抗体の抗原結合性断片を生成するステップと；
（ｂ）前記抗体または前記抗体の抗原結合性断片を精製するステップ
を含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する抗体または抗体の抗原結合性断片を生成する方法。
【請求項２６】
（ａ）配列番号２１（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号２３（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；
（ｂ）配列番号５４（Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号５８（Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；
（ｃ）配列番号５６（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号６０（Ｈｕ４Ｂ９−８２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；および
（ｄ）配列番号５６（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号６２（Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖
からなる群から選択される、免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単離抗体。
【請求項２７】
請求項２６に記載の免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
【請求項２８】
請求項２６に記載の免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
【請求項２９】
請求項２７に記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２８に記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項３１】
請求項２７に記載の核酸をさらに含んでなる、請求項３０に記載の発現ベクター。
【請求項３２】
請求項２９に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項３３】
請求項３０に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項３４】
請求項３１に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項３５】
請求項２９に記載の発現ベクターをさらに含んでなる、請求項３３に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、請求項３２または３３に記載の宿主細胞を培養するステップと；
（ｂ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを精製するステップ
を含んでなる、免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを生成する方法。
【請求項３７】
（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域および／または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、請求項３４または３５に記載の宿主細胞を培養し、それによって抗体または抗体の抗原結合性断片を生成するステップと；
（ｂ）前記抗体または前記抗体の抗原結合性断片を精製するステップ
を含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する抗体または抗体の抗原結合性断片を生成する方法。
【請求項３８】
前記抗体が、表面プラズモン共鳴による測定で５００ｐＭまたはそれ未満のＫＤを有する、請求項１、１４、または２６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３９】
細胞を請求項１、１４、または２６のいずれか一項に記載の有効量の抗体に曝露して、腫瘍細胞の増殖を阻害するまたは低下させるステップを含んでなる、腫瘍細胞の増殖を阻害するまたは低下させる方法。
【請求項４０】
哺乳類を請求項１、１４、または２６のいずれか一項に記載の有効量の抗体に曝露して、腫瘍の増殖を阻害するまたは低下させるステップを含んでなる、哺乳類において腫瘍の成長を阻害するまたは低下させる方法。
【請求項４１】
請求項１、１４、または２６のいずれか一項に記載の有効量の抗体をそれを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、哺乳類において癌を治療する方法。
【請求項４２】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、および頭頸部癌からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記哺乳類がヒトである、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１０年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／３３３，５９０号明細書の利益および優先権を主張する。
【０００２】
本発明の技術分野は、分子生物学、免疫学、および腫瘍学である。より具体的には、本分野は、ヒトＦＧＦＲ２に結合する抗体である。
【背景技術】
【０００３】
ＢＥＫ、ＢＦＲ−１、ＣＤ３３２、ＣＥＫ３、ＣＦＤ１、ＥＣＴ１、ＦＬＪ９８６６２、ＪＷＳ、ＫＧＦＲ（ＦＧＦＲ２（ＩＩＩｂ）としてもまた知られている）、Ｋ−ＳＡＭ、ＴＫ１４、およびＴＫ２５としてもまた知られている線維芽細胞成長因子受容体２（ＦＧＦＲ２）は、ＦＧＦに結合することで線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達を媒介する、４つの高度に保存された受容体チロシンキナーゼ（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４）の１つである。ＦＧＦ受容体は、２または３つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン（ＩｇＤ１、ＩｇＤ２、およびＩｇＤ３）、一回膜貫通型ドメイン、および細胞質チロシンキナーゼドメインによって特徴付けられる。ＦＧＦリガンド結合はＦＧＦ受容体二量体化およびチロシン自己リン酸化を誘導し、細胞増殖、分化、および移動がもたらされる（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
【０００４】
ＩｇＤ３ドメイン中の代案のスプライシングは、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、およびＦＧＦＲ３のＩＩＩｂまたはＩＩＩｃアイソフォームのどちらかをもたらす。ＦＧＦＲ４遺伝子は、ＩＩＩｃアイソフォームとしてのみ発現される。ＦＧＦ受容体の異なるアイソフォームは組織特異的発現を示し、それらは１８の哺乳類ＦＧＦの異なるスペクトルに応答する（非特許文献２）。ヘパラン硫酸プロテオグリカン存在下のＦＧＦとＦＧＦＲの結合は、特定の細胞内チロシン残基におけるＦＧＦＲの自己リン酸化を誘導する。これはＦＧＦＲ基質２α（ＦＲＳ２α）などのアダプター分子のリン酸化を引き起こし、それは他のタンパク質をリクルートして、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路およびホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路をはじめとする様々なシグナル伝達カスケードを活性化する（非特許文献２；非特許文献５；非特許文献１）。
【０００５】
ＦＧＦシグナル伝達の調節不全は、癌細胞増殖を直接駆動して、癌幹細胞の生存を促進し、腫瘍の血管新生を支援し得ることが提案されている（非特許文献１）。ＦＧＦＲ２シグナル伝達は、癌の一因であると思われる。ＦＧＦＲ２遺伝子中のミスセンス変異は、子宮内膜癌（Ｐｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＯＮＣＯＧＥＮＥ  ２６：７１５８−７１６２；Ｄｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ  １０５：８７１３−８７１７）、卵巣癌、乳癌、肺癌（Ｇｒｅｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ４４６：１５３−１５８；Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＮＡＴＵＲＥ  ４５５：１０６９−１０７５；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳ．６５：７５９１−７５９５）、および胃癌（Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳ．６１：３５４１−３５４３）をはじめとする様々な癌において発生する。これらの活性化変異のいくつかは、骨障害がある患者においてもまた報告されている（Ｄｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，前出）。２つの独立したゲノムワイド関連研究が、ＦＧＦＲ２遺伝子中の特定単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）を乳癌に対する易罹患性増大に関係づけている（Ｅａｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＮＡＴＵＲＥ  ４４７：１０８７−１０９３；Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＮＡＴ．ＧＥＮＥＴ．３９：８７０−８７４）。これらの癌関連ＳＮＰは、ＦＧＦＲ２遺伝子発現を増大させると思われる（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＬＯＳ  ＢＩＯＬ．６：ｅ１０８）。ヒト染色体１０ｑ２６に位置するＦＧＦＲ２遺伝子は、乳癌（Ａｄｎａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＯＮＣＯＧＥＮＥ  ６：６５９−６６３；Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２９：２０１３−２０２３）および胃癌（Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＬＡＢ．ＩＮＶＥＳＴ．７８：１１４３−１１５３；Ｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＣＡＮＣＥＲ  ＧＥＮＥＴ．ＣＹＴＯＧＥＮＥＴ．６５：１１１−１１４）のサブセット中で増幅される。
【０００６】
天然抗体は、４本のポリペプチド鎖を含有する多量体タンパク質である（図１）。ポリペプチド鎖の内２本は免疫グロブリン重鎖（Ｈ鎖）と称され、ポリペプチド鎖の内２本は免疫グロブリン軽鎖（Ｌ鎖）と称される。免疫グロブリン重軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって結合する。免疫グロブリン重鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって結合する。軽鎖は、１つの可変領域（図中のＶＬ）と１つの定常領域（図１中のＣＬ）からなる。重鎖は、１つの可変領域（図１のＶＨ）と少なくとも３つの定常領域（図１のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）からなる。可変領域は、抗体特異性を左右する。天然抗体は、キメラ抗体およびヒト化抗体などの改変抗体のための出発原料として使用されている。
【０００７】
各可変領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られている４つの比較的保存された領域で挟まれた、相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られている３つの超可変領域を含有する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲは、抗体結合特異性に寄与する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ＮＡＴＵＲＥ  ＲＥＶＩＥＷＳ  ＣＡＮＣＥＲ（２０１０）１０：１１６−１２９
【非特許文献２】Ｂｅｅｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＮＡＴＵＲＥ  ＲＥＶＩＥＷＳ  ＤＲＵＧ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（２００９）８：２３５−２５４
【非特許文献３】Ｇｏｍｅｚ−Ｒｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＣＬＩＮ．ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳ．（２００５）１１：４５９−６５
【非特許文献４】Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ＢＬＯＯＤ（２００５）１０６：３５３−６
【非特許文献５】Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＣＹＴＯＫＩＮＥ  ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲ  ＲＥＶ．１６：１３９−４９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ヒトＦＧＦＲ２に特異的な阻害抗体は、マウスとヒトＦＧＦＲ２の間の高い相同性のために作成が困難であった。特にマウスおよびヒトＦＧＦＲ２のリガンド結合ドメインは、およそ９８％の配列同一性を有する（Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ  ２５：１１５−１２４）。従って治療薬として使用し得る、改善されたＦＧＦＲ２抗体に対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ヒトＦＧＦＲ２と特異的に結合する抗体ファミリーの発見に基づく。抗体は、ＦＧＦＲ２に特異的に結合する抗体のＣＤＲに基づく、ＦＧＦＲ２結合部位を含有する。治療薬として使用される場合、抗体は例えばヒト化されて改変され、ヒト患者に投与した際の免疫応答が低下または排除される。
【００１１】
本発明の抗体は、ヒトＦＧＦＲ２の活性化を予防しまたは阻害する（すなわち中和する）。本発明の抗体を使用して、生体外または生体内で腫瘍細胞の増殖を阻害し得る。ヒト癌患者（または動物モデル）に投与されると、抗体は、ヒト患者（または動物モデル）において腫瘍成長を阻害しまたは低下させる。
【００１２】
本発明のこれらのおよびその他の態様および利点は、以下の図、詳細な説明、および特許請求の範囲によって例証される。本明細書の用法では、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、制限を意図せず、言及される例は非限定的である。
【００１３】
以下の図面を参照して、本発明をより完全に理解し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（先行技術）典型的な抗体の概略図である。
【図２】ＦＧＦ２（●）、ＦＧＦ７（▽）、ＦＧＦ９（□）、およびＦＧＦ１０（ｘ）による、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ−発現ＦＤＣＰ−１細胞の増殖刺激を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図３】ＦＧＦ２（●）、ＦＧＦ７（▽）、ＦＧＦ９（□）、およびＦＧＦ１０（ｘ）による、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ−発現ＦＤＣＰ−１細胞の増殖刺激を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図４】抗体４Ｂ９での処理による、野性型ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ（□）、野性型ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ（▽）、またはトランケート型ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ（＊）を発現するＦＤＣＰ−１細胞の増殖阻害を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図５】抗体４Ｂ９での処理による、野性型ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ（□）、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂＳ２５２Ｗ（■）、またはＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂＮ５５０Ｋ（▲）を発現するＦＤＣＰ−１細胞の増殖阻害を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図６】２０ｍｐｋ（◆）のｍＩｇＧを陰性対照とした、２ｍｇ／ｋｇ（本明細書では「ｍｐｋ」とも称される）（○）、５ｍｐｋ（△）、１０ｍｐｋ（ｘ）または２０ｍｐｋ（＊）の抗体４Ｂ９での処理による、ＳＮＵ−１６異種移植腫瘍の成長阻害を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図７】ＦＧＦＲ２増幅乳癌細胞系ＭＦＭ−２２３（マウスＩｇＧ（◆））の生体内成長に対する、抗体４Ｂ９（○）の効果を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図８】４Ｂ９の完全長マウス免疫グロブリン重鎖可変領域（配列番号２）と、Ｈｕ４Ｂ９−６５（配列番号３５）およびＨｕ４Ｂ９−８２、−８３（配列番号３７）と表記される完全長ヒト化重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す概略図である。各重鎖可変領域のアミノ酸配列は互いに配列比較され、相補性決定配列（ＣＤＲ）（Ｋａｂａｔ定義）であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３がボックス内で同定される。ボックスで囲まれない配列は、フレームワーク（ＦＲ）配列に相当する。
【図９】図８に示す各可変領域配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（Ｋａｂａｔ定義）を示す概略図である。
【図１０】４Ｂ９の完全長マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域（配列番号４）と、Ｈｕ４Ｂ９−６５（配列番号４０）、Ｈｕ４Ｂ９−８２（配列番号４４）、およびＨｕ４Ｂ９−８３（配列番号４６）と表記される完全長ヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す概略図である。各軽鎖可変領域のアミノ酸配列は互いに配列比較され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（Ｋａｂａｔ定義）がボックス内に同定される。ボックスで囲まれない配列は、フレームワーク（ＦＲ）配列に相当する。
【図１１】図１０に示す各可変領域配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（Ｋａｂａｔ定義）を示す概略図である。
【図１２】抗体４Ｂ９（□）、Ｈｕ４Ｂ９−６５（▲）、Ｈｕ４Ｂ９−８２（▼）、およびＨｕ４Ｂ９−８３（◆）での処理による、野性型ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂを発現するＦＤＣＰ−１細胞の増殖阻害を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のＦＧＦＲ２抗体は、ヒトＦＧＦＲ２ポリペプチドの生物学的活性の中和に基づいて選択された、モノクローナル抗体の抗原結合部位をベースとする。抗体はヒトＦＧＦＲ２結合部位を画定する、免疫グロブリン可変領域ＣＤＲ配列を含有する。
【００１６】
これらの抗体は中和活性があることから、特定の癌細胞および腫瘍の成長および／または増殖阻害のために有用である。抗体を改変して、ヒト患者に投与した際の免疫応答を最小化または排除し得る。本発明の様々な特徴および態様を下でより詳細に考察する。
【００１７】
本明細書の用法では、特に断りのない限り、「抗体」という用語は、無処理抗体または修飾、遺伝子改変、または化学的にコンジュゲートされた抗原結合性断片をはじめとする、無処理抗体（例えば無処理モノクローナル抗体）または抗体の抗原結合性断片（例えばモノクローナル抗体の抗原結合性断片）を意味する。修飾または遺伝子改変されている抗体の例は、キメラ抗体、ヒト化抗体、および多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）である。抗原結合性断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、および二特異性抗体が挙げられる。毒素部分にコンジュゲートした抗体は、化学的にコンジュゲートした抗体の一例である。
【００１８】
ヒトＦＧＦＲ２に結合する抗体
本発明の抗体は、（ａ）構造ＣＤＲＨ１−ＣＤＲＨ２−ＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、（ｂ）構造ＣＤＲＬ１−ＣＤＲＬ２−ＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなり、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は組み合わさって、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単一結合部位を画定する。
【００１９】
本明細書で開示されるように、抗体は、（ａ）構造ＣＤＲＨ１−ＣＤＲＨ２−ＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、（ｂ）免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなってもよく、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は組み合わさって、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単一結合部位を画定する。ＣＤＲＨ１は、配列番号５（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）、配列番号７（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５）、および配列番号４７（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり；ＣＤＲＨ２は、配列番号６（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５）および配列番号３８（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり；ＣＤＲＨ３はアミノ酸配列ＦＤＹ（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）および配列番号１１（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。明細書全体を通じて、特定の配列番号に続いて、配列がそれに由来する抗体を括弧内に示す。例えば「配列番号４７（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）」は、配列番号４７が、Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３で示されるヒト化抗体４Ｂ９に由来することを意味する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号５または配列番号７（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号６（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号１１（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号５（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）または配列番号４７（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号３８（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号１１（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる。
【００２２】
好適には、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列は、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンＦＲの間に挿入される。抗体は、無処理抗体または抗原結合性抗体断片であり得る。
【００２３】
別の実施形態では、抗体は、（ａ）構造ＣＤＲＬ１−ＣＤＲＬ２−ＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域と、（ｂ）免疫グロブリン重鎖可変領域とを含んでなり、ＩｇＧ軽鎖可変領域とＩｇＧ重鎖可変領域は組み合わさって、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単一結合部位を画定する。ＡＣＤＲＬ１は配列番号１２（４Ｂ９）および配列番号４１（Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり；ＣＤＲＬ２は配列番号１３（４Ｂ９）および配列番号４２（Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり；ＣＤＲＬ３は配列番号１４（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１２（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１；配列番号１３（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２；および配列番号１４（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号４１（Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１；配列番号４２（Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２；および配列番号１４（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる。
【００２６】
好適には、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列は、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンＦＲの間に挿入される。抗体は、無処理抗体または抗原結合性抗体断片であり得る。
【００２７】
いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）構造ＣＤＲＨ１−ＣＤＲＨ２−ＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、（ｂ）構造ＣＤＲＬ１−ＣＤＲＬ２−ＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなり、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は組み合わさって、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単一結合部位を画定する。ＣＤＲＨ１は配列番号５または配列番号７（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり；ＣＤＲＨ２は配列番号６（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５）および配列番号３８（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり；ＣＤＲＨ３はアミノ酸配列ＦＤＹおよび配列番号１１（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）からなる群から選択されるアミノ酸配列である。ＣＤＲＬ１は配列番号１２（４Ｂ９）および配列番号４１（Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり；ＣＤＲＬ２は、配列番号１３（４Ｂ９）および配列番号４２（Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり；ＣＤＲＬ３は配列番号１４（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなる。
【００２８】
別の実施形態では、抗体は、配列番号２（４Ｂ９）、配列番号３５（Ｈｕ４Ｂ９−６５）、および配列番号３７（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４（４Ｂ９）、配列番号４０（Ｈｕ４Ｂ９−６５）、配列番号４４（Ｈｕ４Ｂ９−８２）、および配列番号４６（Ｈｕ４Ｂ９−８３）からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３５（Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４０（Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３７（Ｈｕ４Ｂ９−８２，−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４４（Ｈｕ４Ｂ９−８２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３７（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４６（Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００３３】
別の実施形態では、抗体は、（ｉ）配列番号２１（４Ｂ９）、配列番号５４（Ｈｕ４Ｂ９−６５）、および配列番号５６（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖と、（ｉｉ）配列番号２３（４Ｂ９）、配列番号５８（Ｈｕ４Ｂ９−６５）、配列番号６０（Ｈｕ４Ｂ９−８２）、および配列番号６２（Ｈｕ４Ｂ９−８３）からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００３４】
特定の実施形態では、抗体は、（ｉ）配列番号２１（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、（ｉｉ）配列番号２３（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００３５】
特定の実施形態では、抗体は、（ｉ）配列番号５４（Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、（ｉｉ）配列番号５８（Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００３６】
特定の実施形態では、抗体は、（ｉ）配列番号５６（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、（ｉｉ）配列番号６０（Ｈｕ４Ｂ９−８２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００３７】
特定の実施形態では、抗体は、（ｉ）配列番号５６（Ｈｕ４Ｂ９−８２，−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、（ｉｉ）配列番号６２（Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００３８】
別の実施形態では、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単離抗体は、配列番号２（４Ｂ９）、配列番号３５（Ｈｕ４Ｂ９−６５）、および配列番号３７（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）の全可変領域またはフレームワーク領域配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である、アミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなる。
【００３９】
別の実施形態では、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単離抗体は、配列番号４（４Ｂ９）、配列番号４０（Ｈｕ４Ｂ９−６５）、配列番号４４（Ｈｕ４Ｂ９−８２）、および配列番号４６（Ｈｕ４Ｂ９−８３）の全可変領域またはフレームワーク領域配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である、アミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなる。
【００４０】
相同性または同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に利用可能なコンピュータソフトウェアの使用など、当該技術分野の技術範囲内である様々なやり方で判定されてもよい。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘプログラムによって用いられるアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）分析（Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ８７，２２６４−２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９３）Ｊ．ＭＯＬ．ＥＶＯＬ．３６，２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．２５，３３８９−３４０２）は、配列類似性検索の目的に合わせられる。ＢＬＡＳＴプログラムによって使用されるアプローチは、最初にクエリー配列とデータベース配列間の類似断片を検討し、次に同定された全てのマッチの統計的有意性を評価し、最後に事前に選択した有意性閾値を満たしたマッチのみを要約する。配列類似性検索における基本的問題の考察については、その全体を参照によって援用するＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ６，１１９−１２９を参照されたい。当業者は、比較される配列の完全長全体にわたって、最大の整列を達成するのに必要なあらゆるアルゴリズムをはじめとする、配列比較測定に適したパラメータを判定し得る。ｈｉｓｔｏｇｒａｍ、ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ、ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ、ｅｘｐｅｃｔ（すなわちデータベース配列に対する報告されたマッチの統計的有意性閾値）、ｃｕｔｏｆｆ、ｍａｔｒｉｘ、およびｆｉｌｔｅｒの検索パラメータは、デフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘによって使用されるデフォルト重み行列は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列である（その全体を参照によって援用するＨｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ  ８９，１０９１５−１０９１９）。４つのｂｌａｓｔｎパラメータは次のように調節してもよい：Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティ）；Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティ）；ｗｉｎｋ＝１（クエリーに沿ってｗｉｎｋ番目の位置ごとにワードヒットを作製する）；およびｇａｐｗ＝１６（ギャップを含むアラインメントを作製する範囲内でウィンドウ幅を設定する）。同等のＢｌａｓｔｐパラメータ設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；およびｇａｐｗ＝３２であってもよい。検索はまた、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ＢＬＡＳＴ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｐｔｉｏｎパラメータを使用して実施してもよい。（例えばＧ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ）［整数値］：デフォルト＝ヌクレオチドでは５／タンパク質では１１；Ｅ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ）［整数値］：デフォルト＝ヌクレオチドでは２／タンパク質では１；ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｓｍａｔ��ｈ）［整数値］：デフォルト＝−３；ｒ（ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍａｔｃｈ）［整数値］：デフォルト＝１；ｅ（ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）［実数値］：デフォルト＝１０；Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）［整数値］：デフォルト＝ヌクレオチドでは１１／ｍｅｇａｂｌａｓｔでは２８／タンパク質では３；ｙ（Ｄｒｏｐｏｆｆ  （Ｘ）ｆｏｒ  ｂｌａｓｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）：デフォルト＝ｂｌａｓｔｎでは２０／他では７；Ｘ（Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（ｉｎ  ｂｉｔｓ））：デフォルト＝全てのプログラムで１５、ｂｌａｓｔｎには適用されず；およびＺ（ｆｉｎａｌ  Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（ｉｎ  ｂｉｔｓ））：ｂｌａｓｔｎでは５０、他では２５））。ペアワイズタンパク質間配列比較のためのＣｌｕｓｔａｌＷもまた、使用してもよい（デフォルトパラメータとしては、例えばＢｌｏｓｕｍ６２行列およびＧａｐ  Ｏｐｅｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１０およびＧａｐｅ  Ｅｘｔｅｎｓｔｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．１が挙げられる）。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で利用できる配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較は、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）およびＬＥＮ＝３（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）を使用し、タンパク質比較における同等の設定はＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
【００４１】
前述の各実施形態では、組み合わさってヒトＦＧＦＲ２に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域配列は、重鎖および／または軽鎖可変領域のフレームワーク領域にアミノ酸の変更（例えば少なくとも１、２、３、４、５、または１０個のアミノ酸の置換、欠損、または付加）を含有してもよいことが本明細書で熟考された。
【００４２】
いくつかの実施形態では、単離抗体は、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、９５０ｐＭ、９００ｐＭ、８５０ｐＭ、８００ｐＭ、７５０ｐＭ、７００ｐＭ、６５０ｐＭ、６００ｐＭ、５５０ｐＭ、５００ｐＭ、４５０ｐＭ、４００ｐＭ、３５０ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたはそれ未満のＫＤで、ヒトＦＧＦＲ２と結合する。特に断りのない限り、ＫＤ値は、例えば実施例５および９に記載される条件下で、表面プラズモン共鳴法によって測定される。
【００４３】
抗体の生成
本発明の抗体を生成する方法は、当該技術分野で知られている。例えば本明細書で提供される配列情報を使用して、軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするＤＮＡ分子を化学的に合成し得る。合成ＤＮＡ分子は、例えば定常領域コード配列および発現調節配列をはじめとするその他の適切なヌクレオチド配列にライゲートして、所望される抗体をコードする、従来の遺伝子発現コンストラクトを生成し得る。定義された遺伝子コンストラクトの生成は、当該技術分野の通例の技術範囲内である。代案としては、本明細書で提供される配列は、その配列が、本明細書で提供される配列情報、またはハイブリドーマ細胞中のマウス抗体重軽鎖をコードする遺伝子に関する先行技術の配列情報に基づく、合成核酸プローブを使用して、従来のハイブリダイゼーション技術またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって、ハイブリドーマからクローンし得る。
【００４４】
所望の抗体をコードする核酸は、発現ベクターに組み込み（ライゲートし）得て、それは従来の形質移入または形質転換技術を通じて宿主細胞に導入し得る。例示的な宿主細胞は、さもなければＩｇＧタンパク質を産生しない、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、幼若ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎培養細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐＧ２）、および骨髄腫細胞である。形質転換宿主細胞は、宿主細胞が免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域をコードする遺伝子を発現できるようにする条件下で培養し得る。
【００４５】
特定の発現および精製条件は、用いられる発現系次第で変化する。例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で遺伝子を発現させる場合、改変遺伝子を例えばＴｒｐまたはＴａｃなどの適切な細菌プロモーター、および原核生物シグナル配列から下流に配置させることで、それを最初に発現ベクターにクローンする。発現された分泌タンパク質は、光屈折小体または封入小体中に蓄積し、フレンチプレスまたは超音波処理による細胞の破砕後に採取し得る。次に光屈折小体を可溶化し、当該技術分野で既知の方法によって、タンパク質を再び折り畳んで切断する。
【００４６】
改変遺伝子が例えばＣＨＯ細胞などの真核宿主細胞中で発現される場合、それは最初に、適切な真核生物プロモーター、分泌シグナル、ＩｇＧエンハンサー、および様々なイントロンを含有する発現ベクターに挿入される。この発現ベクターは、定常領域の全部または一部をコードする配列を任意に含有して、重鎖または軽鎖の全部またはその一部が発現できるようにする。遺伝子コンストラクトは、従来の（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）技術を使用して、真核生物宿主細胞に導入し得る。宿主細胞は、ＶＬまたはＶＨ断片、ＶＬ−ＶＨヘテロ二量体、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ一本鎖ポリペプチド、完全長重または軽免疫グロブリン鎖、またはその部分を発現し、そのそれぞれが別の機能（例えば細胞毒性）を有する部分に付着してもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、重鎖（例えば重鎖可変領域）または軽鎖（例えば軽鎖可変領域）の全部または一部を発現するポリペプチドを発現する、単一ベクターで形質移入される。別の実施形態では、宿主細胞は、（ａ）重鎖可変領域を含んでなるポリペプチドおよび軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドをコードし、または（ｂ）免疫グロブリン重鎖全体および免疫グロブリン軽鎖全体をコードする単一ベクターで形質移入される。なおも別の実施形態では、宿主細胞は１つを超える発現ベクター（例えば重鎖または重鎖可変領域の全体または一部を含んでなるポリペプチドを発現する１つの発現ベクターと、軽鎖または軽鎖可変領域の全体または一部を含んでなるポリペプチドを発現する別の発現ベクター）で同時形質移入される。
【００４７】
免疫グロブリン重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドは、ポリペプチドを発現できるようにする条件下において、このような可変領域をコードする発現ベクターによって形質移入された宿主細胞を培養することで生成し得る。発現に続いて、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびヒスチジンタグのような親和性タグなど、当該技術分野で良く知られている技術を使用して、ポリペプチドを収集して精製し得る。
【００４８】
ヒトＦＧＦＲ２に結合するモノクローナル抗体または抗体の抗原結合性断片は、（ａ）完全長または部分的免疫グロブリン重鎖をコードする発現ベクターと、完全長または部分的免疫グロブリン軽鎖をコードする別個の発現ベクター；または（ｂ）双方の鎖（例えば完全長または部分的重鎖および軽鎖）をコードする単一発現ベクターで形質移入された宿主細胞を、双方の鎖が発現できるようにする条件下で培養することにより生成し得る。無処理抗体（または抗体の抗原結合性断片）は、例えばプロテインＡ、プロテインＧ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やヒスチジンタグのような親和性タグなどの当該技術分野で良く知られている技術を使用して、収集し精製し得る。単一発現ベクターから、または２つの別個の発現ベクターから重鎖および軽鎖を発現することは、当該技術分野の通常の技術の範囲内である。
【００４９】
抗体の修飾
抗体および抗体断片の抗原性を低下させまたは排除する方法は、当該技術分野で知られている。抗体がヒトに投与されると、抗体は、好適には「ヒト化」されて、ヒトにおける抗原性が低下しまたは排除される。好適には、ヒト化抗体は、抗原に対して、それが由来する非ヒト化マウス抗体と同一のまたは実質的に同一の親和性を有する。
【００５０】
１つのヒト化アプローチでは、その中でマウス免疫グロブリン定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域で置換されている、キメラタンパク質が作られる。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，ＰＲＯＣ．ＮＡＴ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ  ８１：６８５１−６８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４、ＮＡＴＵＲＥ  ３１２：６０４−６０８；米国特許第６，８９３，６２５号明細書（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）；米国特許第５，５００，３６２号明細書（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）；および米国特許第４，８１６，５６７号明細書（Ｃａｂｉｌｌｙ）を参照されたい。
【００５１】
ＣＤＲグラフトとして知られているアプローチでは、軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲが、別の種からのフレームワークにグラフトされる。例えばマウスＣＤＲをヒトＦＲにグラフトし得る。本発明のいくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲが、ヒトＦＲまたはコンセンサスヒトＦＲ上にグラフトされる。コンセンサスヒトＦＲを作り出すために、いくつかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列からのＦＲを配列比較して、コンセンサスアミノ酸配列を同定する。ＣＤＲグラフトは、米国特許第７，０２２，５００号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；米国特許第６，９８２，３２１号明細書（Ｗｉｎｔｅｒ）；米国特許第６，１８０，３７０号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；米国特許第６，０５４，２９７号明細書（Ｃａｒｔｅｒ）；米国特許第５，６９３，７６２号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；米国特許第５，８５９，２０５号明細書（Ａｄａｉｒ）；米国特許第５，６９３，７６１号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；米国特許第５，５６５，３３２号明細書（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）；米国特許第５，５８５，０８９号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；米国特許第５，５３０，１０１号明細書；（Ｑｕｅｅｎ）；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＮＡＴＵＲＥ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＮＡＴＵＲＥ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＳＣＩＥＮＣＥ  ２３９：１５３４−１５３６；およびＷｉｎｔｅｒ（１９９８）ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴ  ４３０：９２−９４に記載される。
【００５２】
「ＳＵＰＥＲＨＵＭＡＮＩＺＡＴＩＯＮ（商標）」と称されるアプローチでは、ヒトＣＤＲとヒト化されるマウス抗体との構造的な類似性に基づいて、ヒトＣＤＲ配列がヒト生殖細胞系遺伝子から選択される。例えば米国特許第６，８８１，５５７号明細書（Ｆｏｏｔｅ）；およびＴａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ  １６９：１１１９−１１２５を参照されたい。
【００５３】
免疫原性を低下させるその他の方法としては、「再形成」、「ハイパーキメラ化」、および「ベニアリング／表面再構成」が挙げられる。例えばＶａｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＡＮＮＡＬＳ  ＯＦ  ＡＬＬＥＲＧＹ，ＡＳＴＨＭＡ，＆  ＩＭＭＵＮＯＬ  ８１：１０５；Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ＰＲＯＴ．ＥＮＧＩＮＥＥＲ  ９：８９５−９０４；および米国特許第６，０７２，０３５号明細書（Ｈａｒｄｍａｎ）を参照されたい。ベニアリング／表面再構成アプローチでは、マウス抗体中の表面接近可能アミノ酸残基が、ヒト抗体中の同一位置でより頻繁に見られるアミノ酸残基によって置換される。このタイプの抗体表面再構成は、例えば米国特許第５，６３９，６４１号明細書（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）に記載される。
【００５４】
マウス抗体をヒトにおける医療用途に適した形態に転換する別のアプローチは、ＡＣＴＩＶＭＡＢ（商標）技術（Ｖａｃｃｉｎｅｘ、Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）として知られており、それはワクシニアウィルスベースのベクターが哺乳類細胞内で抗体を発現することを伴う。ＩｇＧ重軽鎖に高レベルのコンビナトリアル多様性が生じるとされている。例えば米国特許第６，７０６，４７７号明細書（Ｚａｕｄｅｒｅｒ）；米国特許６，８００，４４２号明細書（Ｚａｕｄｅｒｅｒ）；よび米国特許６，８７２，５１８号明細書（Ｚａｕｄｅｒｅｒ）を参照されたい。
【００５５】
マウス抗体をヒトでの使用に適した形態に転換する別のアプローチは、ＫａｌｏＢｉｏｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって商業的に実施される技術である。この技術は、抗体を選択するための「エピトープ注目」ライブラリーを作成する、独自仕様のヒト「受容体」ライブラリーの使用を伴う。
【００５６】
マウス抗体をヒトでの医療用途に適した形態に修飾する別のアプローチは、ＸＯＭＡ（ＵＳ）ＬＬＣ．によって商業的に実施されるＨＵＭＡＮ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（商標）技術である。例えば国際公開第９３／１１７９４号パンフレット、および米国特許第５，７６６，８８６号明細書；米国特許第５，７７０，１９６号明細書；米国特許第５，８２１，１２３号明細書；および米国特許第５，８６９，６１９号明細書を参照されたい。
【００５７】
上のアプローチのいずれかをはじめとするあらゆる適切なアプローチを使用して、本明細書で開示されるヒト抗体の免疫原性を低下させ、または排除し得る。
【００５８】
抗体が治療薬として使用される場合、それは標準生体外共役化学を使用して、小分子毒素または放射性核種などのエフェクター部分にコンジュゲートし得る。エフェクター部分がポリペプチドである場合、抗体をエフェクターに化学的にコンジュゲートさせ、またはエフェクターに融合タンパク質として結合させ得る。融合タンパク質の構築は、当該技術分野の通常の技術の範囲内である。
【００５９】
抗体の使用
本明細書で開示される抗体を使用して、例えば乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、および頭頸部癌などの様々な形態の癌を治療し得る。癌細胞は、癌細胞の増殖を阻害しまたは低下させるように、治療的有効量の抗体に曝露される。いくつかの実施形態では、抗体は、癌細胞の増殖を少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％阻害する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、開示される抗体をヒト患者において腫瘍成長を阻害する方法で使用し得る。方法は、治療的有効量の抗体を患者に投与するステップを含んでなる。ＦＧＦＲ２の過剰発現および／または活性化と関連づけされている癌としては、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、肺癌、ある種の脳癌、メラノーマ、および胃腸癌（例えば結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、頭頸部癌）が挙げられる。
【００６１】
本明細書の用法では、疾患を「治療する」とは、（ａ）疾患の症状を低減し；（ｂ）疾患の進行を阻害し；（ｃ）疾患の退縮を引き起し；または（ｄ）疾患を治癒させることを意味する。
【００６２】
概して活性構成要素の治療的有効量は、例えば１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇなど、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。投与量は、疾患のタイプと程度、または治療される適応症、患者の全般的健康、抗体の生体内効力、製剤処方、および投与経路などの変数に左右される。初期用量は、所望される血液レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、上限レベルを越えて増大させ得る。代案としては、初期用量は最適用量よりも低くあり得て、治療過程において１日量を徐々に増大させてもよい。ヒト用量は、例えば０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇで行われるようにデザインされた、従来の第Ｉ相用量漸増試験中で最適化し得る。投与回数は、投与経路、投与量、および治療される疾患などの要素に応じて変動し得る。例示的な投与回数は、日に１回、週に１回、および隔週で１回である。望ましい投与経路は、例えば静脈輸液などの非経口経路である。モノクローナル抗体ベースの薬剤の処方は、当該技術分野の通常の技術の範囲内である。本発明のいくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は凍結乾燥されて、投与時に緩衝食塩水で戻される。
【００６３】
治療用途では、抗体は、好適には薬学的に許容できるキャリアと組み合わせられる。本明細書の用法では、「薬学的に許容できるキャリア」とは、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答、またはその他の問題または合併症がなく、利点／リスク比が釣り合った、ヒトおよび動物の組織と接触する用途に適した、緩衝液、キャリア、および賦形剤を意味する。キャリアは、製剤のその他の成分と適合性であり、受容者にとって有害でないという意味で、「許容可能」でなくてはならない。薬学的に許容できるキャリアとしては、製薬投与に適合する、緩衝液、溶剤、分散媒、コーティング、等張剤、および吸収遅延剤などが挙げられる。薬理的活性物質のためのこのような媒体および作用物質の使用は、当該技術分野で知られている。
【００６４】
本発明の抗体を含有する医薬組成物は、投薬単位形態で提供し得て、あらゆる適切な方法で調製し得る。医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように処方されなくてはならない。投与経路の例は、静脈内（ＩＶ）、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜、および直腸内投与である。モノクローナル抗体投与の望ましい経路は、ＩＶ輸液である。有用な製剤は、製薬技術で良く知られている方法によって調製し得る。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）を参照されたい。非経口投与に適した製剤構成要素としては、注射用水、食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶剤などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧調節剤が挙げられる。
【００６５】
静脈内投与のための適切なキャリアとしては、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。キャリアは、製造および保存条件下で安定しているべきであり、微生物から保護されていなくてはならない。キャリアは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）グリコール）、およびそれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。
【００６６】
医薬製剤は、好適には無菌である。滅菌は、例えば滅菌濾過膜を通した濾過によって達成し得る。組成物が凍結乾燥されている場合、濾過滅菌は凍結乾燥と水戻しに先だって、またはそれに続いて実施し得る。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例は単に例証的であり、本発明の範囲または内容をどのようにも制限することは意図されない。
【００６８】
実施例１：細胞系および試薬
ＫＡＴＯ  ＩＩＩ、ＨＥＣ−１−Ａ、ＡＮ３  ＣＡ、ＳＮＵ−１６、およびヒト肺癌細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得られた。ＦＤＣＰ−１およびＢａ／Ｆ３、ＭＦＭ−２２３、ＭＦＥ−２９６、ＭＦＥ−２８０、ＭＦＥ−３１９、およびＥＳＳ−１細胞は、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓから得られた。全てのヒト細胞系は、供給業者が規定する使用説明書に従って、５％ＣＯ２含有雰囲気中、３７℃で培養した。全てのＦＧＦは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入された。
【００６９】
機能性ＦＧＦＲ２抗体をスクリーニングする細胞ベースアッセイを確立するために、最初に野性型ＦＧＦＲ２とＦＧＦＲ２の癌関連変異体または変種を発現するように、Ｂａ／Ｆ３およびＦＤＣＰ−１細胞を遺伝子操作した。以下の方法によって、ＦＧＦＲ駆動性ＦＤＣＰ細胞およびＢａ／Ｆ３細胞を得た。ＦＤＣＰ−１細胞を電気穿孔によって、ＩＩＩｂ、ＩＩＩｃアイソフォームまたはヒトＦＧＦＲ２のＣ−末端トランケート型変種、ならびに癌関連ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ  Ｓ２５２ＷまたはＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ  Ｎ５５０Ｋ変異体をコードするプラスミドで形質移入した。Ｇ４１８（６００μｇ／ｍｌ）を用いた選択に続いて単一クローンを単離し、ＭＴＴ［３−（４、５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２、５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］アッセイ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって、ＩＬ３不在下でそれらのＦＧＦ１依存性増殖について試験した。ＭＴＴ試薬（１０μｌ）を細胞に添加し、４時間後に２ＮのＨＣＬを添加した１００μｌの１０％ＳＤＳで反応を停止させた。プレートを翌日分析した。ＩＬ３不在下で、強いＦＧＦ−１依存性増殖を示すクローンを引き続く試験で使用した。ＦＧＦＲ２を発現するレトロウィルスを作成するために、ｃＤＮＡをコードする様々なヒトＦＧＦＲ２変種をそれぞれレトロウィルスベクターに挿入した。レトロウィルスは、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞を形質移入して作成された。レトロウィルスを含有する上清を使用して、８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）存在下、２５００ｒｐｍで９０分間の遠心分離によってＢａ／Ｆ３細胞を感染させた。個々のクローンを限界希釈によって単離し、細胞表面受容体の発現をフローサイトメトリーよって確認した。
【００７０】
ＦＧＦＲが増幅された癌細胞系は、次のようにして同定された。ＦＧＦＲ２増幅（遺伝子コピー数＞７）のためには、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）のＣＧＰコピー数データベースが必要であった。ＦＧＦＲ２特異的プライマー（５’−ＡＣＴＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＡＴＴＴＧ−３’（配列番号２４）および５’−ＡＡＴＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣＴＴＣＣ−３’（配列番号２５））および参照遺伝子（トランスケトラーゼ）プライマー（５’−ＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＧＣＴＧＡＧＣＡＧＡ−３’（配列番号２６）および５’−ＧＡＡＡＣＡＧＧＣＣＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡ−３’（配列番号２７））を使用して、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、ＦＧＦＲ２増幅の可能性がある細胞系のコピー数を分析した。本質的にＴｏｙｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ＯＮＣＯＬ．ＲＥＰ．２１：８７５−８８０で説明されるようにして、ＦＧＦＲ２遺伝子のコピー数を計算した。
【００７１】
ＦＧＦＲ遺伝子発現分析は、次のようにして実施した。ＲＮｅａｓｙ（商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって、全ＲＮＡを単離した。ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ、およびＨＰＲＴに対して特異的なプライマーを用いて、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（商標）ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。発現レベルをＨＰＲＴに正規化した。
【００７２】
以前の研究は、ＦＧＦＲの異所性発現が、マウスｐｒｏ−Ｂ  Ｂａ／Ｆ３または骨髄ＦＤＣＰ−１細胞中において、ＩＬ−３不在下のＦＧＦ１依存性増殖をもたらすことを実証している（Ｔａｎｎｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，ＢＲＥＡＳＴ  ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳ．２：３１１−３２０；Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２７１：１５２９２−１５２９７）。予期されたように、ＩＬ−３およびＦＧＦ１不在下において、野生型ＦＧＦＲ２を安定して発現するＦＤＣＰ−１細胞の顕著な増殖はなかった。ＦＧＦ１、３、７、１０、および２２は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂを通じてシグナルを伝達し、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃは、ＦＧＦ１、２、４、６、９、１６、１７、１８、および２０をはじめとする幅広いリガンドのパネルに応答することが知られている（Ｔａｎｎｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，前出；Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，前出；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２８１：１５９６４−１５７００）。ＦＧＦＲ２のＩＩＩｂアイソフォームを発現するＦＤＣＰ−１細胞の増殖は、ＦＧＦ７およびＦＧＦ１０によって刺激されるが、ＦＧＦ２およびＦＧＦ９によっては刺激されない（図２）。ＩＩＩｃアイソフォームを発現する細胞の増殖は、ＦＧＦ２およびＦＧＦ９によって特異的に高められた（図３）。
【００７３】
実施例２：抗ＦＧＦＲ２モノクローナル抗体の生成
Ｃ−末端でヒトＦｃ部分と融合した、ヒトＦＧＦＲ２  ＩｇＤ２−ＩｇＤ３（ＩＩＩｂ）およびヒトＦＧＦＲ２  ＩｇＤ２−ＩｇＤ３（ＩＩＩｃ）の１：１混合物で、マウスを免疫化した。マウスの免疫化および細胞融合は、商業的供給業者（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）によって実施された。
【００７４】
一次スクリーニングでは、ＥＬＩＳＡ形式を使用してハイブリドーマ上清をスクリーニングし、ヒトＦＧＦＲ２  ＩｇＤ２−ＩｇＤ３への結合を検出した。一次スクリーニングを通過した抗体には、（下の）実施例３に記載される細胞ベース増殖アッセイである二次スクリーニングを実施した。
【００７５】
一次スクリーニングは、ヒトＦＧＦＲ２の細胞外ドメインで免疫化されたマウスの脾臓融合から得られたマウスハイブリドーマクローン上清を使用して実施した。アッセイプレートを１００ｎｇ／ウェルの組換え可溶性ＦＧＦＲ２細胞外ドメインで被覆し、次にＰＢＳ中の５％ミルクによって室温で１時間ブロックした。次に５０μｌのハイブリドーマ上清を各ウェルに添加して、抗体を室温で１時間結合させた。プレートを洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０添加ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ重鎖および軽鎖二次抗体とのインキュベーションがそれに続いた。ＴＭＢ（テトラメチルベンゼン）を基質として使用してアッセイを発色させ、吸光度を６２０ｎｍで読み取った。
【００７６】
実施例３：ＦＧＦＲ２拮抗抗体の同定
ＦＧＦＲ２拮抗抗体をスクリーニングするために、ＦＧＦＲ２抗体を含有するハイブリドーマ上清を以下の５つのＦＧＦＲ２の形態の１つを異所性発現するＦＤＣＰ細胞に添加した：（１）野性型ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ；（２）野性型ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ；（３）ＦＧＦＲ２−ＩＩＩ（ｂ）Ｓ２５２Ｗ；（４）ＦＧＦＲ２−ＩＩＩ（ｂ）Ｎ５５０Ｋ；および（５）Ｃ−末端トランケーションがあるＦＧＦＲ２−ＩＩＩ（ｂ）。平底９６ウェルプレート（７０，０００細胞／ウェル）内のＦＧＦＲ２発現細胞に、ヘパリン（５μｇ／ｍｌ）±ＦＧＦ１（８ｎｇ／ｍｌ）と共に、上清を１：１の比率（容積）で添加した。３７℃で２日間のインキュベーション後に、上述のようにＭＴＴアッセイを実施した。
【００７７】
クローン４Ｂ９の上清は、ＦＧＦＲ２のＩＩＩｂ−アイソフォームによって駆動されるＦＤＣＰ−１増殖に対する、強力な選択的阻害を実証した。クローン４Ｂ９によって産生される抗体４Ｂ９（抗体ＧＰ３６９とも称される）をさらなる特性解析のために、従来の技術によって精製した。表面プラズモン共鳴分析は、抗体４Ｂ９がヒトＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂに対して強力な親和性を示し、ヒトＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃに対して検出可能な結合を示さなかったことを示唆した。ヒトＧＦＲ１−ＩＩＩｃまたはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂに対する抗体４Ｂ９の結合は、検出されなかった。
【００７８】
実施例４：配列分析
ＩｓｏＳｔｒｉｐ（商標）マウスモノクローナル抗体アイソタイプ判定キットを使用し、製造会社（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の使用説明書に従って、実施例１の抗体４Ｂ９の軽鎖アイソタイプおよび重鎖アイソタイプを判定した。抗体は、κ軽鎖およびＩｇＧ１重鎖と判定された。
【００７９】
５’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）を使用して、抗体４Ｂ９の重鎖および軽鎖可変領域を配列決定した。ＲＮｅａｓｙ（商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して、供給業者（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）の使用説明書に従って、４Ｂ９モノクローナルハイブリドーマ細胞系から全ＲＮＡを抽出した。ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、製造会社の使用説明書に従って、５’ＲＡＣＥ用ランダムプライマー使用して、完全長第一鎖ｃＤＮＡ含有５’末端を作成した。
【００８０】
ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ（商標）ポリメラーゼ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）を使用して、製造会社の使用説明書に従って、κ鎖および重ＩｇＧ１鎖の可変領域をＰＣＲで増幅した。５’ｃＤＮＡ末端の増幅では、ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）ＲＡＣＥｃＤＮＡ増幅キットと併せて、５’ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ３’（配列番号２８）と５’ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ３’（配列番号２９）の混合物であるＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ  Ａプライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を５’プライマーとして使用した。上の５’プライマーおよび３’ＩｇＧ１定常領域特異的プライマーである５’ＴＡＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡ３’（配列番号３０）を使用して、重鎖可変領域を増幅した。上の５’プライマーおよび３’κ定常領域特異的プライマーであるＣＧＡＣＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＴ３’（配列番号３１）によって、κ鎖可変領域を増幅した。
【００８１】
個々のＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動によって単離し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（商標）ゲル精製キットを使用して、製造会社（Ｑｉａｇｅｎ）の使用説明書に従って精製した。引き続いてＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキットを使用して、製造会社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用説明書に従って、ＰＣＲ生成物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔプラスミドにクローンし、標準分子生物学技術を通じてＤＨ５−α細菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。標準ジデオキシＤＮＡ配列決定法を使用して、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）からのＭ１３順方向（５’ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’）（配列番号３２）およびＭ１３逆方向プライマー（５’ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ３’）（配列番号３３）を使用し、形質転換細菌クローンから単離されたプラスミドＤＮＡを配列決定して、可変領域配列の配列を同定した。Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔウェブサーバーを使用して配列を分析し、可変領域配列を同定および確認した。
【００８２】
４Ｂ９抗体の可変領域をコードする核酸配列、およびそれを画定するタンパク質配列を下に要約する（アミノ末端シグナルペプチド配列は示されない）。ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ定義）は、アミノ酸配列中で太字／下線で示される。
【００８３】
４Ｂ９抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１）
【化１】
2013529076.tif 000002
【００８４】
４Ｂ９抗体の重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号２）
【化２】
2013529076.tif 000003
【００８５】
４Ｂ９抗体のκ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号３）
【化３】
2013529076.tif 000004
【００８６】
４Ｂ９抗体のκ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号４）
【化４】
2013529076.tif 000005
【００８７】
表１は、本明細書の実施例で考察される各配列の配列番号を示す、一致度チャートである。
【００８８】
【表１】
2013529076.tif 000006
【００８９】
マウスモノクローナル抗体重鎖ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴ定義）を表２に示す。
【００９０】
【表２】
2013529076.tif 000007
【００９１】
マウスモノクローナル抗体κ軽鎖ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴ定義）を表３に示す。
【００９２】
【表３】
2013529076.tif 000008
【００９３】
完全長重鎖またはκ鎖抗体配列を作り出すために、上の各可変配列をそれぞれの定常領域と組み合わせる。例えば完全長重鎖は、重可変配列とそれに続くマウスＩｇＧ１重鎖定常配列を含んでなり、完全長κ鎖は、κ可変配列とそれに続くマウスκ軽鎖定常配列を含んでなる。
【００９４】
マウスＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする核酸配列（配列番号１６）
【化５】
2013529076.tif 000009
【００９５】
マウスＩｇＧ１重鎖定常領域を画定するタンパク質配列（配列番号１７）
【化６】
2013529076.tif 000010
【００９６】
マウスκ軽鎖定常領域をコードする核酸配列（配列番号１８）
【化７】
2013529076.tif 000011
【００９７】
マウスκ軽鎖定常領域を画定するタンパク質配列（配列番号１９）
【化８】
2013529076.tif 000012
【００９８】
以下の配列は本実施例で説明される各抗体について、実際のまたは熟考された完全長重鎖および軽鎖配列（すなわち可変および定常領域配列の双方を含有する）を表わす。抗体の適切な分泌のためのシグナル配列もまた、ＤＮＡ配列の５’末端、またはタンパク質配列のアミノ末端に含まれる。可変領域配列を他の定常領域配列にライゲートして、活性完全長ＩｇＧ重鎖および軽鎖を生成し得る。
【００９９】
４Ｂ９の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号２０）
【化９】
2013529076.tif 000013
【０１００】
４Ｂ９の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号２１）
【化１０】
2013529076.tif 000014
【０１０１】
４Ｂ９の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）をコードする核酸配列（配列番号２２）
【化１１】
2013529076.tif 000015
【０１０２】
４Ｂ９の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号２３）
【化１２】
2013529076.tif 000016
【０１０３】
表４は、本実施例で考察する抗体の完全長配列と、配列表に示すものとの対応を示す。
【０１０４】
【表４】
2013529076.tif 000017
【０１０５】
実施例５：結合親和性
以下のタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に対するモノクローナル抗体４Ｂ９の結合親和性および結合動態を測定した：
組換えヒトＦＧＦＲ１β（ＩＩＩｂ）／Ｆｃキメラ（ｒｈＦＧＦＲ１β−ＩＩＩｃ−Ｆｃ）、組換えヒトＦＧＦＲ２β（ＩＩＩｂ）／Ｆｃキメラ（ｒｈＦＧＦＲ２β−ＩＩＩｂ−Ｆｃ）、組換えヒトＦＧＦＲ２β（ＩＩＩｃ）／Ｆｃキメラ（ｒｈＦＧＦＲ２β−ＩＩＩｃ−Ｆｃ）、組換えヒトＦＧＦＲ３β（ＩＩＩｂ）／Ｆｃキメラ（ｒｈＦＧＦＲ３β−ＩＩＩｂ−Ｆｃ）、および組換えヒトＦＧＦＲ２β（ＩＩＩｂ）／Ｆｃバージョン（その中でＦｃ領域が酵素的に除去されている）。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、表面プラズモン共鳴によって、結合親和性および結合動態を測定した。
【０１０６】
標準カップリングプロトコルを使用して、供給業者の使用説明書（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に従って、アミンカップリングによって、ウサギ抗マウスＩｇＧｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をカルボキシメチル化デキストランＣＭ４センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定化した。０．０５％の界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するＰＢＳを泳動用緩衝液として使用して、２５℃および３７℃で分析を実施した。
【０１０７】
流速１０μｌ／分で、個々のフローセル内において抗体を捕捉した。各抗体毎に注入時間を変えて、３０〜６０ＲＵのＲｍａｘを得た。緩衝液、および泳動用緩衝液で希釈したＦＧＦＲタンパク質を参照表面（抗体捕捉なし）および活性表面（試験抗体）上に６０μｌ／分で２４０秒間逐次注入した。解離相を９００秒までモニターした。次に１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．７）を流速６０μｌ／分で６０秒間にわたり２回注入して、表面を再生した。試験されたＦＧＦＲタンパク質の濃度範囲は、５０〜３．１２５ｎＭ（２倍希釈）であった。
【０１０８】
ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の動態学機能を使用して、二重参照減法で動態学パラメータを測定した。各抗体の動態学パラメータ、ｋａ（結合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）、およびＫＤ（平衡解離定数）を測定した。２５℃および３７℃における、ＦＧＦＲタンパク質に対するモノクローナル抗体の動力学値を表５に要約する。
【０１０９】
【表５】
2013529076.tif 000018
【０１１０】
表５の結果は、抗体４Ｂ９が、約５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、７５０ｐＭ、６５０ｐＭ、６１０ｐＭ以下のＫＤで、ｒｈＦＧＦＲ２β−ＩＩＩｂに結合することを実証する。結果はまた、抗体４Ｂ９が、ｒｈＦＧＦＲ１β−ＩＩＩｂ、ｒｈＦＧＦＲ２β−ＩＩＩｃ、およびｒｈＦＧＦＲ３β−ＩＩＩｂに結合しないことも実証する。
【０１１１】
実施例６：抗増殖性活性
抗体４Ｂ９の効力を定量的に評価するために、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂまたはＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃを発現するＦＤＣＰ−１細胞を使用して、用量反応試験を実施した。ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂまたはＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃを発現するＦＤＣＰ−１細胞をＩＬ３不在下で、９６ウェルプレートに接種した。様々な量のＦＧＦおよびヘパリンを添加した。ＭＴＴアッセイを２〜３日後に実施した。ＦＧＦ１およびヘパリン存在下において、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ、またはＣ−末端トランケート型ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂを発現するＦＤＣＰ−１細胞に、様々な量の抗体４Ｂ９含有上清を添加した。ＭＴＴアッセイを２日後に実施した。ＦＧＦ１およびヘパリン存在下において、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ  Ｓ２５２ＷまたはＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ  Ｎ５５０Ｋを発現するＦＤＣＰ−１細胞に、様々な量の精製抗体４Ｂ９を添加した。ＭＴＴアッセイを２日後に実施した。
【０１１２】
抗体４Ｂ９は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂによって駆動されるＦＤＣＰ−１細胞のＦＧＦ１誘導性増殖を用量依存的様式で強力に阻害する一方、４Ｂ９は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃを発現するＦＤＣＰ細胞のＦＧＦ１誘導性増殖に対しては、顕著な効果がなかった（図４）。ＦＲＳ２アダプター分子の構成的リン酸化と、下流シグナル伝達の活性化を引き起こすＣ−末端トランケート型ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂは、胃癌および乳癌細胞系に見られる（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳ．５４：３２３７−３２４１；Ｍｏｆｆａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＭＯＬ．ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳ．２：６４３−６５２）。抗体４Ｂ９は、Ｃ−末端トランケート型ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂによって駆動されるＦＤＣＰ−１細胞の増殖を強力に阻害する（図４）。
【０１１３】
ＦＧＦＲ２変異は子宮内膜腫瘍標本のおよそ１２％で報告されている（Ｐｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，前出；Ｄｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，前出）。ＦＧＦＲ２中の体細胞活性化変異は、ＩｇＤ２およびＩｇＤ３間のリンカー領域、細胞外膜近傍ドメイン、またはキナーゼドメイン内に密集する。子宮内膜腫瘍における最も一般的な変異の２つは、（リガンド特異性を変化させてリガンド結合親和性を増大させる）Ｓ２５２Ｗ変異、および（キナーゼ活性を増大させる）キナーゼドメイン中のＮ５５０Ｋ変異である。精製抗体４Ｂ９は、野性型ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ、ならびにＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ  Ｓ２５２ＷおよびＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ  Ｎ５５０Ｋによって駆動される細胞増殖をそれぞれ０．３ｎＭ、３．０ｎＭ、および８．１ｎＭのＩＣ５０値で強力に阻害する（図５）。
【０１１４】
実施例７：ＦＧＦＲ２活性化シグナル伝達経路の阻害
ＦＧＦＲ２活性化シグナル伝達経路に対する、抗体４Ｂ９の効果を調べた。ＦＧＦＲ２のチロシンリン酸化に対する抗体４Ｂ９の効果を調べるために、ＳＮＵ−１６細胞を用量５μｇ／ｍｌの抗体によって３７℃で１時間処理し、ヘパリン単独（２０μｇ／ｍｌ）またはヘパリン−プラス−ＦＧＦ７（３０ｎｇ／ｍｌ）による１５分間の刺激がそれに続いた。１％ＮＰ−４０、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭのＥＤＴＡを含有し、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）およびＨａｌｔホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が添加されたＮＰ−４０溶解緩衝液に、細胞を溶解した。
【０１１５】
抗ＦＧＦＲ（Ｙ６５３／Ｙ６５４）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、抗ＦＧＦＲ２（ｓｃ−１２２）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ）、抗ホスホ−ＥＲＫ１／２および抗ＥＲＫ１／２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、抗β−チューブリン、クローンＡＡ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）抗体を用いて、ウエスタンブロットによって溶解産物を分析した。化学発光基質（ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（商標），Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって、免疫ブロットを検出した。製造会社の使用説明書（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、ヒトホスホ−ＲＴＫおよびＭＡＰＫキナーゼアレイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を実施した。ホスホ−ＲＴＫアレイでは、細胞をＮＰ−４０溶解緩衝液中で溶解した。Ａｒｒａｙ緩衝液１で希釈した細胞溶解産物を添加する１時間前に、アレイをＡｒｒａｙ緩衝液１によって室温でブロックし、次に４℃で一晩インキュベートした。アレイを化学発光によって視覚化した。ホスホ−ＭＡＰＫアレイでは、Ｌｙｓｉｓ緩衝液６で細胞を溶解した。希釈細胞溶解産物をアレイに添加した。４℃で一晩のインキュベーション後に、アレイを抗ホスホ−ＭＡＰＫ抗体と室温で２時間混合し、上述のように視覚化した。
【０１１６】
ＦＧＦ７は、ＦＧＦＲ２を過剰発現するＢａ／Ｆ３細胞中、およびＦＧＦＲ２増幅ＳＮＵ−１６細胞中において、ＦＧＦＲ２のチロシンリン酸化と、引き続く細胞外シグナル調節性キナーゼ１および２（ＥＲＫ１／２）の活性化を誘導した。抗体４Ｂ９は、これらの細胞中で、ＦＧＦＲ２のリガンド誘導性チロシンリン酸化、およびＥＲＫ１／２の活性化を効果的に抑制した。これに加えて、抗体４Ｂ９は、ＳＮＵ−１６細胞中においてＦＧＦＲ２タンパク質レベルを下方制御した。抗体への曝露の早くも２時間後に、ＦＧＦＲ２タンパク質レベルのわずかな低下が観察された。タンパク質レベルの劇的な低下は、６時間の時点で見られた。
【０１１７】
ＥＲＫ、ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＡＫＴ、およびそれらの下流エフェクター分子のリン酸化を測定するホスホ−ＭＡＰＫアレイを使用して、これらの細胞系中において、下流シグナル伝達経路の活性化を調査した。リガンド刺激の不在下では、ＥＲＫ１／２のわずかなリン酸化のみが見られた。ＦＧＦ７によるＳＮＵ−１６細胞の刺激は、ＥＲＫ１／２のリン酸化を顕著に増大させた。マイトジェン活性化およびストレス活性化キナーゼ２（ＭＳＫ２）、ｐ３８αＭＡＰＫ、９０−ｋＤリボソームタンパク質キナーゼ１（ＲＳＫ１）、Ａｋｔ１、およびｐ７０Ｓ６キナーゼ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）のリン酸化の増大が観察された。抗体４Ｂ９は、ＦＧＦ７によって活性化された全ての下流シグナル伝達タンパク質のリン酸化を効果的にブロックした。
【０１１８】
実施例８：腫瘍異種移植成長の阻害
抗体４Ｂ９の生体内活性を評価するために、ＦＧＦＲ２遺伝子の増幅を持つヒト癌異種移植片の成長に対する抗体４Ｂ９の効果を試験した。試験した４種のＦＧＦＲ２−増幅細胞系の内、ＳＮＵ−１６およびＭＦＭ−２２３のみがマウスに腫瘍を生じた。そのため、ＳＮＵ−１６およびＭＦＭ−２２３異種移植腫瘍に対する抗体４Ｂ９の有効性を試験した。
【０１１９】
全てのマウスは、ＯＬＡＷ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐｏｌｉｃｙ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  および  ＩＬＡＲ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従って取り扱かった。全ての生体内研究は、ＡＶＥＯ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可されたプロトコルに従って実施した。ＳＮＵ−１６生体内研究では、１０週齢のメスＣ．Ｂ−１７  ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）の右脇腹に、１：１のＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）／マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）中の５×１０６個の細胞を皮下接種した。ノギスを使用して、腫瘍測定を週に２回実施した。腫瘍体積は、次の式を使用して計算した：Ｖ＝０．５×幅×幅×長さ。腫瘍が２００ｍｍ３の体積に近づいたら、マウスを無作為に１０匹ずつの５群に分けた。翌日、マウスを２０ｍｇ／ｋｇのｍＩｇＧ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ；Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）、２ｍｇ／ｋｇの４Ｂ９、５ｍｇ／ｋｇの４Ｂ９、１０ｍｇ／ｋｇの４Ｂ９、または２０ｍｇ／ｋｇの４Ｂ９で、腹腔内注射によって処理した。マウスには実験の実施期間中、週２回投薬した。最終投与の７２時間後、腫瘍成長阻害を計算するために、腫瘍体積を再度測定した。全ての統計学的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）バージョン４．００を使用して実施した。一元配置分散分析およびチューキー多重比較試験を使用して（ｕｓｉｎｇ  ｗｉｔｈ）、最終腫瘍体積を分析した。
【０１２０】
ＳＮＵ−１６異種移植腫瘍は、２０ｍｇ／ｋｇの対照マウスＩｇＧ、または２、５、１０または２０ｍｇ／ｋｇの抗体４Ｂ９で処理した。図６に示すように、各４Ｂ９処理群は、対照群が実験に残る最終日である４３日目に、ｍＩｇＧ処理対照と比較して、有意な腫瘍成長阻害を示した（それぞれ７０、７２、７７、および８２％、ｐ＜０．００１）。全ての処理は良好に耐えられ、顕著な体重低下はなかった。腫瘍溶解産物もまた分析した。ＦＧＦＲ２のチロシンリン酸化の阻害と同時に、抗体４Ｂ９は、腫瘍中のＦＧＦＲ２タンパク質の総量を下方制御した。実験終了時に採取された腫瘍からの対照ＩｇＧまたは４Ｂ９処理腫瘍サンプル中において、全ＥＲＫ１／２またはホスホ−ＥＲＫ１／２に、有意差は検出されなかった。生体外のＳＮＵ−１６細胞のホスホ−受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）プロフィールとは対照的に、ＳＮＵ−１６異種移植片のＲＴＫアレイ分析は、ＦＧＦＲ２が生体内でチロシンリン酸化された主要ＲＴＫであることを明らかにし、４Ｂ９は、試験した４Ｂ９処理ＳＮＵ−１６腫瘍の２つで、ＦＧＦＲ２チロシンリン酸化を顕著に阻害した。生体外では、ＳＮＵ−１６細胞増殖は、４Ｂ９処理に対して感受性でなかった。生体内におけるＳＮＵ−１６細胞中のＦＧＦＲ２のチロシンリン酸化は、生体内における活性化ＦＧＦＲ２シグナル伝達に対するＳＮＵ−１６異種移植片の依存性が、抗体４Ｂ９処理に対するそれらの感受性を説明することを示唆する。
【０１２１】
抗体４Ｂ９の効果はまた、ＦＧＦＲ２増幅乳癌細胞系ＭＦＭ−２２３の生体内成長に対しても調査された。これらの研究のために、５週例のメスＮＣｒヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ；Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）の左脇腹の皮下に０．７２ｍｇの９０日間放出１７−βエストラジオール錠剤（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を埋め込み、右脇腹に１：１のＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）／マトリゲル中の１０×１０６個のＭＦＭ−２２３細胞を皮下接種した。腫瘍が２００ｍｍ３の体積に近づいたら、マウスを無作為に１０匹ずつの２群に分けで、２０ｍｇ／ｋｇのｍＩｇＧ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ；Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）または２０ｍｇ／ｋｇの４Ｂ９でＩＰ処理した。マウスには実験の実施期間中、週２回投薬した。全ての統計学的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）バージョン４．００を使用して実施した。本実験は２群のみで実施されたので、最終腫瘍体積および重量（２７日目、最終投与の４８時間後）は、対応のない両側ｔ検定を用いて分析した。
【０１２２】
２５日目には、ＭＦＭ−２２３異種移植片では、ｍＩｇＧ処理対照と比較して、４Ｂ９処理マウスでは、腫瘍体積（ｐ＝０．００１５；図７）および最終腫瘍重量（ｐ＝０．０１８８）に６６％を上回る阻害があった。全ての処理は良好に耐えられ、顕著な体重低下はなかった。ＳＮＵ−１６異種移植片で観察されたのと同様に、４Ｂ９は、腫瘍中で、ＦＧＦＲ２のチロシンリン酸化阻害と同時に、全ＦＧＦＲ２タンパク質を強力に下方制御した。実験終了時に採取された腫瘍からの対照ＩｇＧまたは４Ｂ９のどちらかで処理された腫瘍サンプル中において、全またはホスホ−ＥＲＫ１／２（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＥＲＫ１／２）に、有意差は検出されなかった。
【０１２３】
実施例９：抗ＦＧＦＲ２抗体のヒト化
Ａ．ヒト化ＦＧＦＲ２抗体の構築
本実施例は、４Ｂ９と命名されたマウス抗体のヒト化と、得られたヒト化抗体の特性解析について述べる。ヒト化抗ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂ抗体は、当該技術分野で良く知られている方法を使用してデザインされた。デザインされたアミノ酸配列はコドン最適化ＤＮＡ配列に転換され、ＤＮＡ２．０、Ｉｎｃ．によって合成され、以下を（この順で）含む：５’ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、コザックコンセンサス配列、アミノ末端シグナル配列、ヒト化可変領域、ヒトＩｇＧ１またはκ定常領域、停止コドン、および３’ＥｃｏＲＩ制限部位。
【０１２４】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＰＣＲクローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を通じて、ヒト化重鎖をｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にサブクローニングした。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＰＣＲクローニングを使用して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を通じて、ヒト化κ軽鎖をｐＥＥ１４．４（Ｌｏｎｚａ）にサブクローニングした。
【０１２５】
ヒト化抗体鎖を２９３Ｔ細胞に一過性に形質移入して、抗体を作成した。引き続く生体外分析のために、抗体を精製した。ヒト化抗体とヒトＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂの結合は、下述するようにして測定された。結果を表１２および１３に要約する。
【０１２６】
ヒト化免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖可変領域の可能な各組み合わせを下の表６に示す。
【０１２７】
【表６】
2013529076.tif 000019
【０１２８】
ヒト化４Ｂ９抗体の可変領域をコードする核酸配列、およびそれを画定するタンパク質配列を下に要約する（アミノ末端シグナルペプチド配列は示されない）。ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ定義）は、アミノ酸配列中で太字で示され下線付きである。
【０１２９】
Ｈｕ４Ｂ９−６５重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号３４）
【化１３】
2013529076.tif 000020
【０１３０】
Ｈｕ４Ｂ９−６５重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号３５）
【化１４】
2013529076.tif 000021
【０１３１】
Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号３６）
【化１５】
2013529076.tif 000022
【０１３２】
Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号３７）
【化１６】
2013529076.tif 000023
【０１３３】
Ｈｕ４Ｂ９−６５κ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号３９）
【化１７】
2013529076.tif 000024
【０１３４】
Ｈｕ４Ｂ９−６５κ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号４０）
【化１８】
2013529076.tif 000025
【０１３５】
Ｈｕ４Ｂ９−８２κ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号４３）
【化１９】
2013529076.tif 000026
【０１３６】
Ｈｕ４Ｂ９−８２κ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号４４）
【化２０】
2013529076.tif 000027
【０１３７】
Ｈｕ４Ｂ９−８３κ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号４５）
【化２１】
2013529076.tif 000028
【０１３８】
Ｈｕ４Ｂ９−８３κ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号４６）
【化２２】
2013529076.tif 000029
【０１３９】
実施例９で作成された抗体について、免疫グロブリン重鎖可変領域を画定するアミノ酸配列を図８で配列比較する。（適切な発現／分泌のための）アミノ末端シグナルペプチド配列は、示されない。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ定義）は、ボックスによって同定される（図９を参照されたい）。
【０１４０】
実施例９の抗体について、免疫グロリン軽鎖可変領域を画定するアミノ酸配列を図１０で配列比較する。（適切な発現／分泌のための）アミノ末端シグナルペプチド配列は、示されない。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ定義）は、ボックスによって同定される（図１１を参照されたい）。
【０１４１】
表７は、本明細書の実施例で考察される各配列の配列番号を示す、一致度チャートである。
【０１４２】
【表７】
2013529076.tif 000030
【０１４３】
【表８】
2013529076.tif 000031
【０１４４】
マウスおよびヒト化モノクローナル抗体重鎖ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴ定義）を表８に示す。
【０１４５】
【表９】
2013529076.tif 000032
【０１４６】
マウスおよびヒト化モノクローナル抗体κ軽鎖ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴ定義）を表９に示す。
【０１４７】
【表１０】
2013529076.tif 000033
【０１４８】
完全長ヒト化重鎖またはκ鎖抗体配列を作り出すために、上の各可変配列をそれぞれのヒト定常領域と組み合わせる。例えば完全長重鎖は、重可変配列と、それに続くヒトＩｇＧ１重鎖定常配列を含んでなる。完全長κ鎖は、κ可変配列と、それに続くヒトκ軽鎖定常配列を含んでなる。
【０１４９】
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする核酸配列（配列番号４９）
【化２３】
2013529076.tif 000034
【０１５０】
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を画定するタンパク質配列（配列番号５０）
【化２４】
2013529076.tif 000035
【０１５１】
ヒトκ軽鎖定常領域をコードする核酸配列（配列番号５１）
【化２５】
2013529076.tif 000036
【０１５２】
ヒトκ軽鎖定常領域を画定するタンパク質配列（配列番号５２）
【化２６】
2013529076.tif 000037
【０１５３】
以下の配列は本実施例で説明される各抗体について、実際のまたは熟考された完全長重鎖および軽鎖配列（すなわち可変および定常領域配列の双方を含有する）を表わす。抗体の適切な分泌のためのシグナル配列もまた、ＤＮＡ配列の５’末端、またはタンパク質配列のアミノ末端に含まれる。可変領域配列をその他の定常領域配列にライゲートして、活性完全長ＩｇＧ重鎖および軽鎖を生成し得ることも本明細書で熟考された。
【０１５４】
完全長ヒト化Ｈｕ４Ｂ９−６５重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号５３）
【化２７】
2013529076.tif 000038
【０１５５】
完全長ヒト化Ｈｕ４Ｂ９−６５重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号５４）
【化２８】
2013529076.tif 000039
【０１５６】
完全長ヒト化Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号５５）
【化２９】
2013529076.tif 000040
【０１５７】
完全長ヒト化Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号５６）
【化３０】
2013529076.tif 000041
【０１５８】
完全長ヒト化Ｈｕ４Ｂ９−６５軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）をコードする核酸配列（配列番号５７）
【化３１】
2013529076.tif 000042
【０１５９】
完全長ヒト化Ｈｕ４Ｂ９−６５軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号５８）
【化３２】
2013529076.tif 000043
【０１６０】
完全長ヒト化Ｈｕ４Ｂ９−８２軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）をコードする核酸配列（配列番号５９）
【化３３】
2013529076.tif 000044
【０１６１】
完全長ヒト化Ｈｕ４Ｂ９−８２軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号６０）
【化３４】
2013529076.tif 000045
【０１６２】
完全長ヒト化Ｈｕ４Ｂ９−８３軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）をコードする核酸配列（配列番号６１）
【化３５】
2013529076.tif 000046
【０１６３】
完全長ヒト化Ｈｕ４Ｂ９−８３軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号６２）
【化３６】
2013529076.tif 000047
【０１６４】
便宜のため、表１０は、本実施例で考察される各配列の配列番号を示す一致度チャートを提供する。
【０１６５】
【表１１】
2013529076.tif 000048
【０１６６】
下の表１１は、完全長ヒト化免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可能な各組み合わせを含有する抗体を示す。
【０１６７】
【表１２】
2013529076.tif 000049
【０１６８】
ヒト化可変領域を含有する完全長免疫グロブリン重鎖および軽鎖を含有する可能な抗体コンストラクトの内３つを下に示す：
Ｈｕ４Ｂ９−６５＝ヒト化Ｈｕ４Ｂ９−６５重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号５４）プラスＨｕ４Ｂ９−６５軽鎖可変領域およびヒトκ定常領域（配列番号５８）
Ｈｕ４Ｂ９−８２＝ヒト化Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号５６）プラスＨｕ４Ｂ９−８２軽鎖可変領域およびヒトκ定常領域（配列番号６０）
Ｈｕ４Ｂ９−８３＝ヒト化Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号５６）プラスＨｕ４Ｂ９−８３軽鎖可変領域およびヒトκ定常領域（配列番号６２）
【０１６９】
Ｂ．ヒト化抗ＦＧＦＲ２モノクローナル抗体の結合親和性
単量体組換えヒトＦＧＦＲ２β  ＩＩＩｂ（ｒｈＦＧＦＲ２β−ＩＩＩｂ−切断）に対する、実施例９で作成されたモノクローナル抗体の結合親和性および相互作用動態をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）装置を使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した。
【０１７０】
標準カップリングプロトコルを使用して、供給業者の使用説明書に従って、アミンカップリング（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００５−０９８）をカルボキシメチル化デキストランＣＭ４センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）上に固定化した。０．０５％の界面活性剤Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ）を含有するＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を泳動用緩衝液として使用して、２５℃および３７℃で分析を実施した。
【０１７１】
流速１０μｌ／分で、個々のフローセル内において精製抗体を捕捉した。各抗体毎に注入時間を変えて、３０〜９０ＲＵのＲｍａｘを得た。緩衝液、または泳動用緩衝液で希釈した切断ｒｈＦＧＦＲ２β−ＩＩＩｂを参照表面（抗体捕捉なし）および活性表面（試験抗体）上に６０μｌ／分で２４０秒間逐次注入した。解離相を９００秒までモニターした。次にｐＨ２．２５のグリシン（グリシンｐＨ２．０（Ｂｉａｃｏｒｅ）およびｐＨ２．５（Ｂｉａｃｏｒｅ）から作成された）を３０μｌ／分で６０秒間にわたり２回注入して、表面を再生した。２０〜１．２５ｎＭの濃度（２倍連続希釈）のｒｈＦＧＦＲ２β−ＩＩＩｂ−切断を使用して、実験を実施した。
【０１７２】
ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）の動態学機能を使用して、二重参照減法で動態学パラメータを測定した。各抗体の動態学パラメータ、ｋａ（結合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）、およびＫＤ（平衡解離定数）を測定した。２５℃におけるｒｈＦＧＦＲ２β−ＩＩＩｂ−切断に対する特定の精製モノクローナル抗体（すなわちＨｕ４Ｂ９−６５、Ｈｕ４Ｂ９−８２、およびＨｕ４Ｂ９−８３）の動力学値を表１２に要約する。
【０１７３】
【表１３】
2013529076.tif 000050
【０１７４】
表１２の結果は、２５℃で試験すると、精製抗体が、約２６０ｐＭ〜約４９０ｐＭの範囲にわたる親和性を有することを実証する。
【０１７５】
３７℃におけるｒｈＦＧＦＲ２β−ＩＩＩｂ−切断に対する特定の精製モノクローナル抗体（すなわちＨｕ４Ｂ９−６５、Ｈｕ４Ｂ９−８２、およびＨｕ４Ｂ９−８３）の動力学値を表１３に要約する。
【０１７６】
【表１４】
2013529076.tif 000051
【０１７７】
表１３の結果は、３７℃で試験すると、精製抗体が、約８９０ｐＭ〜約９３０ｐＭの範囲にわたる親和性を有することを実証する。
【０１７８】
実施例１０：ヒト化抗ＦＧＦＲ２モノクローナル抗体の抗増殖性活性
ヒト化抗ＦＧＦＲ２抗体の効力を細胞ベース増殖アッセイで評価した。９６ウェルプレート内の８ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１および５μｇ／ｍｌのヘパリンを含有するＩＬ−３非含有培地に、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂを発現するＦＤＣＰ−１細胞を接種した。抗体の連続希釈を調製して、プレートに添加した。２日間のインキュベーション後に、実施例１で上述したようにＭＴＴアッセイによって細胞増殖を調べた。
【０１７９】
図１２に示すように、ヒト化抗体（Ｈｕ４Ｂ９−６５、Ｈｕ４Ｂ９−８２、およびＨｕ４Ｂ９−８３）は、ＦＧＦ１誘導性ＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ細胞増殖の用量依存的阻害を実証した。３回の独立した実験からの４Ｂ９、Ｈｕ４Ｂ９−６５、Ｈｕ４Ｂ９−８２、およびＨｕ４Ｂ９−８３の平均ＩＣ５０は、それぞれ１．４、４．９、５．７、および４．７ｎＭである。
【０１８０】
参照による援用
本明細書で言及される各特許文献および科学論文の開示全体は、あらゆる目的のために参照によって援用する。
【０１８１】
同等物
本発明は、その趣旨または本質的特性を逸脱することなく、その他の特定形態で具現化されてもよい。したがって前述の実施形態は、本明細書に記載される本発明を限定せず、全ての点で例証的と見なされる。したがって本発明の範囲は、前述の説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の同等物の意義と範囲内に入る全ての変更は、その中に包含されることが意図される。
【図１】
2013529076.tif 000052
【図２】
2013529076.tif 000053
【図３】
2013529076.tif 000054
【図４】
2013529076.tif 000055
【図５】
2013529076.tif 000056
【図６】
2013529076.tif 000057
【図７】
2013529076.tif 000058
【図８】
2013529076.tif 000059
【図９】
2013529076.tif 000060
【図１０】
2013529076.tif 000061
【図１１】
2013529076.tif 000062
【図１２】
2013529076.tif 000063
【配列表】
2013529076000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月13日(2012.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明の抗体は、ヒトＦＧＦＲ２の活性化を予防しまたは阻害する（すなわち中和する）。本発明の抗体を使用して、生体外または生体内で腫瘍細胞の増殖を阻害し得る。ヒト癌患者（または動物モデル）に投与されると、抗体は、ヒト患者（または動物モデル）において腫瘍成長を阻害しまたは低下させる。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
（ａ）（ｉ）配列番号５（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）および配列番号７（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号６（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号１１（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号１２（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号１３（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号１４（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｂ）（ｉ）配列番号５（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）および配列番号７（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号６（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号１１（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号４１（Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列ＣＤＲＬ１、配列番号４２（Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号１４（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｃ）（ｉ）配列番号５（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）および配列番号４７（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号３８（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号１１（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号４１（Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列ＣＤＲＬ１、配列番号４２（Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号１４（４Ｂ９；Ｈｕ４Ｂ９−６５；Ｈｕ４Ｂ９−８２；Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域
からなる群から選択される、免疫グロブリン重鎖可変領域と免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単離抗体。
（項目２）
上記ＣＤＲ配列が、ヒトおよびヒト化フレームワーク配列の間に挿入される、項目１に記載の抗体。
（項目３）
項目１に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
（項目４）
項目１に記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
（項目５）
項目３に記載の核酸を含有する発現ベクター。
（項目６）
項目４に記載の核酸を含有する発現ベクター。
（項目７）
項目５に記載の核酸をさらに含んでなる、項目６に記載の発現ベクター。
（項目８）
項目５に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目９）
項目６に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目１０）
項目７に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目１１）
項目５に記載の発現ベクターをさらに含んでなる、項目９に記載の宿主細胞。
（項目１２）
（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、項目８または９に記載の宿主細胞を培養するステップと；
（ｂ）上記免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを精製するステップ
を含んでなる、免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを生成する方法。
（項目１３）
（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域および／または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、項目１０または１１に記載の宿主細胞を培養し、それによって抗体または抗体の抗原結合性断片を生成するステップと；
（ｂ）上記抗体または上記抗体の抗原結合性断片を精製するステップ
を含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する抗体または抗体の抗原結合性断片を生成する方法。
（項目１４）
（ａ）配列番号２（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号３５（Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４０（Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号３７（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４４（Ｈｕ４Ｂ９−８２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；および
（ｄ）配列番号３７（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４６（Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域
からなる群から選択される、免疫グロブリン重鎖可変領域と免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単離抗体。
（項目１５）
項目１４に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
（項目１６）
項目１４に記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
（項目１７）
項目１５に記載の核酸を含有する発現ベクター。
（項目１８）
項目１６に記載の核酸を含有する発現ベクター。
（項目１９）
項目１５に記載の核酸をさらに含んでなる、項目１８に記載の発現ベクター。
（項目２０）
項目１７に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目２１）
項目１８に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目２２）
項目１９に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目２３）
項目１７に記載の発現ベクターをさらに含んでなる、項目２１に記載の宿主細胞。
（項目２４）
（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、項目２０または２１に記載の宿主細胞を培養するステップと；
（ｂ）上記免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを精製するステップ
を含んでなる、免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを生成する方法。
（項目２５）
（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域および／または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、項目２２または２３に記載の宿主細胞を培養し、それによって抗体または抗体の抗原結合性断片を生成するステップと；
（ｂ）上記抗体または上記抗体の抗原結合性断片を精製するステップ
を含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する抗体または抗体の抗原結合性断片を生成する方法。
（項目２６）
（ａ）配列番号２１（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号２３（４Ｂ９）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；
（ｂ）配列番号５４（Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号５８（Ｈｕ４Ｂ９−６５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；
（ｃ）配列番号５６（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号６０（Ｈｕ４Ｂ９−８２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；および
（ｄ）配列番号５６（Ｈｕ４Ｂ９−８２、−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号６２（Ｈｕ４Ｂ９−８３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖
からなる群から選択される、免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単離抗体。
（項目２７）
項目２６に記載の免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
（項目２８）
項目２６に記載の免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
（項目２９）
項目２７に記載の核酸を含有する発現ベクター。
（項目３０）
項目２８に記載の核酸を含有する発現ベクター。
（項目３１）
項目２７に記載の核酸をさらに含んでなる、項目３０に記載の発現ベクター。
（項目３２）
項目２９に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目３３）
項目３０に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目３４）
項目３１に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目３５）
項目２９に記載の発現ベクターをさらに含んでなる、項目３３に記載の宿主細胞。
（項目３６）
（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、項目３２または３３に記載の宿主細胞を培養するステップと；
（ｂ）上記免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを精製するステップ
を含んでなる、免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを生成する方法。
（項目３７）
（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域および／または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、項目３４または３５に記載の宿主細胞を培養し、それによって抗体または抗体の抗原結合性断片を生成するステップと；
（ｂ）上記抗体または上記抗体の抗原結合性断片を精製するステップ
を含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する抗体または抗体の抗原結合性断片を生成する方法。
（項目３８）
上記抗体が、表面プラズモン共鳴による測定で５００ｐＭまたはそれ未満のＫＤを有する、項目１、１４、または２６のいずれか一項に記載の抗体。
（項目３９）
細胞を項目１、１４、または２６のいずれか一項に記載の有効量の抗体に曝露して、腫瘍細胞の増殖を阻害するまたは低下させるステップを含んでなる、腫瘍細胞の増殖を阻害するまたは低下させる方法。
（項目４０）
哺乳類を項目１、１４、または２６のいずれか一項に記載の有効量の抗体に曝露して、腫瘍の増殖を阻害するまたは低下させるステップを含んでなる、哺乳類において腫瘍の成長を阻害するまたは低下させる方法。
（項目４１）
項目１、１４、または２６のいずれか一項に記載の有効量の抗体をそれを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、哺乳類において癌を治療する方法。
（項目４２）
上記癌が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、および頭頸部癌からなる群から選択される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
上記哺乳類がヒトである、項目４１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号５および配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号３８のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列ＣＤＲＬ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域
とを含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単離抗体。
【請求項２】
（ｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号３８のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列ＣＤＲＬ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域
とを含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単離抗体。
【請求項３】
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号３８のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列ＣＤＲＬ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域
とを含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単離抗体。
【請求項４】
前記ＣＤＲ配列が、ヒトおよびヒト化フレームワーク配列の間に挿入される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域
とを含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単離抗体。
【請求項６】
（ａ）配列番号５６のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、
（ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖
とを含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する単離抗体。
【請求項７】
前記抗体が、表面プラズモン共鳴による測定で５００ｐＭまたはそれ未満のＫＤを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の有効量の抗体を含んでなる、腫瘍細胞の増殖を阻害するまたは低下させるための組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の有効量の抗体を含んでなる、哺乳類において腫瘍の成長を阻害するまたは低下させるための組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の有効量の抗体を含んでなる、哺乳類において癌を治療するための組成物。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１１に記載の核酸をさらに含んでなる、請求項１４に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１３に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１４に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１５に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１３に記載の発現ベクターをさらに含んでなる、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、請求項１６または１７に記載の宿主細胞を培養するステップと；
（ｂ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを精製するステップ
を含んでなる、免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを生成する方法。
【請求項２１】
（ａ）宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、請求項１８または１９に記載の宿主細胞を培養し、それによって抗体または抗体の抗原結合性断片を生成するステップと；
（ｂ）前記抗体または前記抗体の抗原結合性断片を精製するステップ
を含んでなる、ヒトＦＧＦＲ２に結合する抗体または抗体の抗原結合性断片を生成する方法。
【国際調査報告】
2013529076.tif 000064
2013529076.tif 000065