(57)【要約】  血漿ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せからなる肝がん診断マーカー、該マーカーを含有するキット、及び肝がん（特に早期肝がん）を診断する新規な方法に関する。前記肝がん診断マーカーは、複数種類の核酸分子からなり、前記核酸分子はそれぞれ少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードし、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードする核酸分子からなることが好ましい。前記キットは、肝細胞がん、特に早期肝細胞がんの診断、或いは少なくとも１つの肝細胞がん患者の血漿と、少なくとも１つの健康な個体の血漿、少なくとも１つの慢性Ｂ型肝炎患者の血漿または少なくとも１つの肝硬変患者の血漿との区別に用いることが可能である。【選択図】図２
2013538583.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類の核酸分子からなり、前記核酸分子はそれぞれ少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする、肝細胞がんの診断マーカー。
【請求項２】
前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子を含む、請求項１に記載の肝細胞がんの診断マーカー。
【請求項３】
少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子、及び、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下される、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれる、請求項２に記載の肝細胞がんの診断マーカー。
【請求項４】
少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれ；且つ、
少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａまたはｈｓａ−ｍｉＲ−２２３をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれる、請求項３に記載の肝細胞がんの診断マーカー。
【請求項５】
前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変化がない、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子をさらに含む、請求項１に記載の肝細胞がんの診断マーカー。
【請求項６】
少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変化がない、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれる、請求項５に記載の肝細胞がんの診断マーカー。
【請求項７】
前記複数種類の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードする８個の核酸分子を含む、請求項１に記載の肝細胞がんの診断マーカー。
【請求項８】
前記少なくとも１種の対照血漿は、健康な個体、慢性Ｂ型肝炎患者または肝硬変患者からのものである、請求項２〜７のいずれか１項に記載の肝細胞肝がん診断マーカー。
【請求項９】
前記肝細胞肝がんが早期肝細胞がんである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の肝細胞肝がん診断マーカー。
【請求項１０】
前記肝細胞肝がんが早期肝細胞肝がんである、請求項８に記載の肝細胞肝がん診断マーカー。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の肝細胞肝がん診断マーカーを含む、肝細胞肝がん診断キット。
【請求項１２】
ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１を満たす１つの回帰モデルをさらに含み、
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出され、前記回帰モデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、請求項１１に記載の肝細胞肝がん診断キット。
【請求項１３】
前記肝細胞肝がんが早期肝細胞肝がんである、請求項１１に記載の肝細胞肝がん診断キット。
【請求項１４】
請求項２〜３及び４〜７のいずれか一項に記載の肝細胞肝がん診断マーカーを含み、
前記少なくとも１種の対照血漿は健康な個体からのものである、少なくとも１つの肝細胞肝がん患者の血漿と少なくとも１つの健康な個体の血漿とを区別するためのキット。
【請求項１５】
ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１を満たす１つの回帰モデルをさらに含み、
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルはｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出され、前記回帰モデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が、少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、請求項１４に記載の少なくとも１つの肝細胞肝がん患者の血漿と少なくとも１つの健康な個体の血漿とを区別するためのキット。
【請求項１６】
前記肝細胞肝がんが早期肝細胞肝がんである、請求項１４に記載の少なくとも１つの肝細胞肝がん患者の血漿と少なくとも１つの健康な個体の血漿とを区別するためのキット。
【請求項１７】
請求項２〜３及び４〜７のいずれか１項に記載の肝細胞肝がん診断マーカーを含み、
前記少なくとも１種の対照血漿は慢性Ｂ型肝炎患者からのものである、少なくとも１つの肝細胞肝がん患者の血漿と少なくとも１つの慢性Ｂ型肝炎患者の血漿とを区別するためのキット。
【請求項１８】
ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１を満たす１つの回帰モデルをさらに含み、
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルはｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出され、前記回帰モデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、請求項１７に記載の少なくとも１つの肝細胞肝がん患者の血漿と少なくとも１つの慢性Ｂ型肝炎患者の血漿とを区別するためのキット。
【請求項１９】
前記肝細胞がんが早期肝細胞がんである、請求項１７に記載の少なくとも１つの肝細胞がん患者の血漿と少なくとも１つの慢性Ｂ型肝炎患者の血漿とを区別するためのキット。
【請求項２０】
請求項２〜３及び４〜７のいずれか１項に記載の肝細胞がんの診断マーカーを含み、
前記少なくとも１種の対照血漿は肝硬変患者からのものである、少なくとも１つの肝細胞がん患者の血漿と少なくとも１つの肝硬変患者の血漿とを区別するためのキット。
【請求項２１】
ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１を満たす１つの回帰モデルをさらに含み、
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルはｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出され、前記回帰モデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、請求項２０に記載の少なくとも１つの肝細胞がん患者の血漿と少なくとも１つの肝硬変患者の血漿とを区別するためのキット。
【請求項２２】
前記肝細胞がんが早期肝細胞がんである、請求項２０に記載の少なくとも１つの肝細胞がん患者の血漿と少なくとも１つの肝硬変患者の血漿とを区別するためのキット。
【請求項２３】
（ａ）１つまたは複数の標的血漿において複数の核酸分子の発現レベルを確定するステップであって、前記核酸分子がそれぞれ少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードするステップ、
（ｂ）１つまたは複数の対照血漿において前記複数の核酸分子の発現レベルを確定するステップ、及び
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）で得られた複数の核酸分子の対応する発現レベルを比較することにより、前記複数の核酸分子の中から前記標的血漿及び前記対照血漿において差次的発現される１つまたは複数の核酸分子を同定し、前記標的血漿及び前記対照血漿において差次的発現される１つまたは複数の核酸分子を肝がん診断マーカーとするステップを含む、肝がん診断マーカーの確定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せからなる肝がん診断マーカー及び肝がん（特に、早期肝がん）を診断する新規な方法に関し、前記血漿ｍｉｃｒｏＲＮＡはｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１を含む。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞肝がん（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）は、世界中で最も一般的な悪性固形腫瘍の１つである。肝細胞肝がんは、肝がんの主な組織型を代表し、肝がん症例全体の７０％〜８５％を占め得る。世界規模で毎年約６０００００件の新たな症例及びほぼ同数の死亡例が発生しており、これは、肝細胞肝がんに対する効果的な早期診断及び治療方法が欠如していることを反映している（非特許文献１〜４）。
【０００３】
肝細胞がんは、予後が非常に悪いがんの１種である。このタイプの疾病の患者の予後は病期次第である。ＨＣＣ患者は、手術治療を受けない場合、５年生存率が５％未満であり、手術後の生存率が６０％〜７０％である。腫瘍のサイズが２ｃｍ未満でありかつ外科手術による切除を行った患者の５年生存率は８６％に達し得る。しかしながら、如何なる治療も受けなかった早期がん患者（腫瘍のサイズ５ｃｍ未満）の３年生存率は僅か１７〜２１％である。これは、早期がんの検出が治療及び患者の生存率の向上にとって非常に重要であることを示している（非特許文献５〜７）。
【０００４】
明確な肝がんの診断は、通常、組織学的な確認に基づく。組織は、針穿刺つまり生検によってサンプリング可能である。一部の肝がんは高分化型であり、これは、肝がんがほぼ完全に成長・成熟した肝細胞から構成されていることを意味する。よって、これらがんは顕微鏡下では非肝がん組織と非常に類似している。また、すべての病理学者が高分化型の肝がんと正常な肝組織との微細な差を識別できるわけではない。一部の病理学者は肝がんを肝腺がんと誤ることがある。腺がんは１種の異なるタイプのがんであり、肝外に由来する。転移性腺がんと原発性肝がんの治療方法は異なるため、患者の長期生存率を改善するためには、早期検出でこれら異なるタイプの腫瘍を区別し、ＨＣＣ患者の治療を導く必要がある。
【０００５】
肝臓穿刺、つまり、生検で最もよく見られるリスクは出血であり、これは肝がんが血管を非常に多く含む腫瘍であるためである。多くの場合では、おそらく組織生検または穿刺を行う必要がない。患者が肝がん発生の危険因子（例えば、肝硬変、慢性Ｂ型肝炎、または慢性Ｃ型肝炎）を有し、血漿におけるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）のレベルが顕著に高く、かつそれに符合する映像診断がある場合、医師は生検を行うことなく患者が肝がんに罹患しているとほぼ確定できる。現在、ＡＦＰは肝がんの早期診断に用いられる唯一の血清マーカーである（非特許文献８及び９）。しかしながら、このような単一のマーカーは感度が低く、かつ偽陽性結果がよく出現し、例えば、多くの肝硬変患者においても、ＡＦＰが上昇することがある。また、血清ＡＦＰは６０％の肝がん患者しか検出できない。このため、ＨＣＣを早期診断する新たな分子マーカーの発現及び高感度の検出方法を開発することは重要な意味を持つ。
【０００６】
バルセロナ臨床肝がん（ＢＣＬＣ）分類（非特許文献１０）は、ここ数年間で現れたものであり、ＨＣＣ患者の臨床病期分類に用いられる。ＢＣＬＣ分類は、腫瘍の進行段階と推奨される治療方針とを結びつけ、かつ腫瘍病期ごとのケア基準（非特許文献１１）を定義している。極早期ＨＣＣ患者（０期）は、手術的切除が最も適合する。早期ＨＣＣ患者（Ａ期）は、放射線治療（肝臓腫瘍切除、肝臓移植または局部焼灼）を行うのが最も適合する。中期ＨＣＣ患者（Ｂ期）は、肝動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）が最も適合する。中後期ＨＣＣ患者（Ｃ期）は、ソラフェニブ治療を用いることが可能である。終末期（Ｄ期）患者は対症療法を受けてもよい。
【０００７】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は１種の小さな内因性非コードＲＮＡ分子であり、大きさが２０〜２５個のヌクレオチド（ｎｔ）であり、これら小さなｍｉＲＮＡは通常１つまたは複数のｍＲＮＡをターゲティングし、翻訳レベルを通じた標的ｍＲＮＡｓの抑制または標的ｍＲＮＡｓの断裂により遺伝子の発現を調節する。これらはおよそ１０年前に発見され、細胞の発育、分化、増殖、及びアポトーシスにおいて重要な作用を発揮すると見なされている（非特許文献１２及び１３）。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡに比べて腫瘍バイオマーカーとしてより優位な側面を有する。ｍｉＲＮＡは体外で非常に安定であるためである（非特許文献１４及び１５）。
【０００８】
ｍｉＲＮＡは、一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）から生成され、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡはＲＮａｓｅ  ＩＩＩ  Ｄｒｏｓｈａによりステムループ構造を含む前躯体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）に加工される。続いて、Ｄｉｃｅｒ（１種のＲＮａｓｅ  ＩＩＩ）の作用下で、ヘアピン状のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが細胞質においてさらに切断されて成熟したｍｉＲＮＡを生成し、これら成熟したｍｉＲＮＡは他のタンパク質とともにｍｉＲＮＡ−タンパク質複合体（ｍｉＲＮＰ）を構成する。ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＰがそれらの標的ｍＲＮＡに達するように誘導し、ここでそれらは各自の機能を発揮する（総括的記述は非特許文献１６及び１７等を参照）。
【０００９】
ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの間の相補性の程度によって、ｍｉＲＮＡは異なる調節過程を導くことができる。ｍｉＲＮＡと高度に相補するそれら標的ｍＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と同じメカニズムにより特異的に分解される。このため、このような場合、ｍｉＲＮＡは低干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の役割を担い；ｍｉＲＮＡと相補性が比較的低い標的ｍＲＮＡは、誘導されて細胞分解ルートに進入するか、或いはｍＲＮＡレベルは影響されずにタンパク質の翻訳が抑制される。ただし、現在、ｍｉＲＮＡがその標的ｍＲＮＡ翻訳を抑制するメカニズムについてはまだ議論の余地がある。
【００１０】
ハイスループットのｍｉｃｒｏＲＮＡ定量技術（例えばｍｉｃｒｏＲＮＡマイクロアレイ）は、リアルタイム定量ＰＣＲに基づくｍｉｃｒｏＲＮＡ検出であり、がん遺伝子群におけるｍｉｃｒｏＲＮＡ発現プロファイルの研究のために有力な手段を提供している。利用可能な現有データに示すように、ｍｉＲＮＡ発現のアンバランスは、ある種のがんの発生及び／または進行と関連がある可能性がある。例えば、研究によると、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５及びｈｓａ−ｍｉＲ−１６−１はいずれも慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）において欠失した遺伝子座に位置しており、約７０％のＣＬＬ患者において、これら２種類のｍｉｃｒｏＲＮＡ遺伝子が欠失または低下していることが明らかになっている。また、結腸がんにおいて、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４５の発現が低下されるが、ｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７の発現は肺がんにおいてよく低下している（非特許文献１８及び１９）。事実、よく見られるがんにおいては関連するｍｉｃｒｏＲＮＡの発現がしばしば変動し、また、ｍｉｃｒｏＲＮＡは通常がんと関連するゲノム領域に位置するため、ｍｉＲＮＡががん抑制遺伝子とがん遺伝子の二重作用を発揮する可能性があると推測できる（非特許文献２０〜２２）。実証されているｍｉｃｒｏＲＮＡのヒトのがんにおける異常発現は、それらの診断及び予後予測のバイオマーカーとしての潜在的な応用価値をより極出たせている。
【００１１】
これまでに、一部の学者によりヒト肝細胞がんにおけるｍｉｃｒｏＲＮＡ発現プロファイルが報告されている（非特許文献２３〜２７）。これらの研究はいずれも、特定のｍｉｃｒｏＲＮＡが、正常肝細胞または組織に比べて悪性細胞または組織において異常発現していることを明らかにしている。このため、それらは腫瘍の悪性変換及び進行の過程をより深く理解する一助となっている。
【００１２】
様々なタイプの標本の中でも、血液は取得が容易であり、臨床操作が簡単であり、また創傷が小さく患者が受けるリスク及び苦痛が小さいため、高リスク群のスクリーニングに最も適合すると認められている。そのため、血液を用いて腫瘍を有する患者の早期発見、診断及び治療が行われている。腫瘍由来のｍｉｃｒｏＲＮＡは、人間の血漿または血清において非常に安定した形で存在し、内因ＲＮａｓｅ酵素活性の影響を受けないことが既に証明されている。これらの血清または血漿における腫瘍由来のｍｉｃｒｏＲＮＡの検出は十分可能であり、腫瘍バイオマーカーとすることが可能である。また、血漿と血清のｍｉｃｒｏＲＮＡレベルには密接な関連があり、血漿または血清におけるｍｉｃｒｏＲＮＡはいずれも腫瘍診断マーカーとして臨床に応用することが可能である（非特許文献２８〜３０）。
【００１３】
近年、ＨＣＣ患者の血清ｍｉｃｒｏＲＮＡに関する３つの研究が報告されている。Ｑｕらは、血清ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａの２８３個のサンプルにおける診断価値に関する研究を行い、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６が最もよい診断効果を有し、感度及び特異性がそれぞれ７２．１％と８８．８％であることを発見した（非特許文献３１）。Ｘｕらは、血液中のｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２３がＨＣＣ患者と健康な個体とを区別する潜在的マーカーであることを発見した（非特許文献３２）。しかしながら、これらｍｉｃｒｏＲＮＡではＨＣＣ患者とＢ型肝炎患者とを区別することができない。Ｌｉらは、血清ｍｉｃｒｏＲＮＡの顕著な診断価値について報告し、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７５の感度及び特異性はそれぞれ９６％と１００％であり、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆを併用した後、感度及び特異性はそれぞれ９７．９％と９９．１％であった（非特許文献３３）。以上の結果から示されるように、血清ｍｉｃｒｏＲＮＡのＨＣＣ診断は実行可能であるが、これら研究には、スクリーニングに用いられるｍｉｃｒｏＲＮＡの数に限りがあり、サンプルの量が少ないまたは独立した検証が足りないなどの様々な欠点が存在する。このため、依然としてＨＣＣ患者の血漿または血清において診断価値のあるｍｉｃｒｏＲＮＡバイオマーカーを発見する必要がある。複数のｍｉｃｒｏＲＮＡバイオマーカーの併用を通じて、迅速、正確かつ低コストでＨＣＣ患者を早期診断できる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｔｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ，  Ｓ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｇｒｉｓｈａｍ，  Ｊ．Ｗ．  （２００２）  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３１，  ３３９−３４６
【非特許文献２】Ｊｅｍａｌ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ６１：  ６９−９０
【非特許文献３】Ｂｏｓｃｈ  Ｆ．Ｘ．  ｅｔ  ａｌ  （２００４）  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２７，  Ｓ５−Ｓ１６
【非特許文献４】Ｐｅｒｚ  Ｊ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ４５，  ５２９−５３８）
【非特許文献５】Ｔａｎｇ，  Ｚ．Ｙ．  （２００１）  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ７，  ４４５−４５４
【非特許文献６】Ｃｈａｍｂｅｒｓ，  Ａ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２，  ５６３−５７２
【非特許文献７】Ｍｏｔｏｌａ−Ｋｕｂａ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５，  １６−２４
【非特許文献８】Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，  Ｇ．Ｊ．  （２００３）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２，  ７０９−７３５
【非特許文献９】Ｐａｕｌ，  Ｓ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ７２，  Ｓｕｐｐｌ．  １，  １１７−１２３
【非特許文献１０】Ｌｌｏｖｅｔ，  Ｊ．Ｍ．  （２００３）  Ｌａｎｃｅｔ  ３６２，  １９０７−１９１７
【非特許文献１１】Ｌｌｏｖｅｔ，  Ｊ．Ｍ．  （２００８）  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １００，  ６９８−７１１
【非特許文献１２】Ｂａｒｔｅｌ，  Ｄ．Ｐ．  （２００４）  Ｃｅｌｌ  １１６，  ２８１−２９７，  Ａｍｂｒｏｓ，  Ｖ．  （２００４）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３１，  ３５０−３５５
【非特許文献１３】Ｈｅ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ５，  ５２２−５３１
【非特許文献１４】Ｌｕ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３５，  ８３４−８３８
【非特許文献１５】Ｌｉｍ，  Ｌ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３３，  ７６９−７７３
【非特許文献１６】Ｂａｒｔｅｌ，  Ｄ．Ｐ．  （２００４）  Ｃｅｌｌ  ２３，  ２８１−２９２
【非特許文献１７】Ｈｅ，  Ｌ．  ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｎ，  Ｇ．Ｊ．  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ５，  ５２２−５３１
【非特許文献１８】Ｍｉｃｈａｅｌ，  Ｍ．Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １，  ８８２−８９１
【非特許文献１９】Ｍａｙｒ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５，  １５７６−１５７９
【非特許文献２０】Ｅｓｑｕｅｌａ−Ｋｅｒｓｃｈｅｒ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｓｌａｃｋ，  Ｆ．Ｊ  （２００６）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ６，  ２５９−２６９。
【非特許文献２１】Ｃａｌｉｎ，  Ｇ．Ａ．  ａｎｄ  Ｃｒｏｃｅ，  Ｃ．Ｍ．  （２００７）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７，  ２０５９−２０６６
【非特許文献２２】Ｂｌｅｎｋｉｒｏｎ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｍｉｓｋａ，  Ｅ．Ａ．  （２００７）  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １６，  Ｒ１０６−Ｒ１１３）
【非特許文献２３】Ｍｕｒａｋａｍｉ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５，  ２５３７−２５４５
【非特許文献２４】Ｌｉ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２３，  １６１６−１６２２
【非特許文献２５】Ｈｕａｎｇ，  Ｙ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２３，  ８７−９４
【非特許文献２６】Ｌａｄｅｉｒｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４７，  １９５５−１９６３
【非特許文献２７】Ｊｉａｎｇ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４，  ４１９−４２７
【非特許文献２８】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｐ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，  １０５１３-１０５１８
【非特許文献２９】Ｇｉｌａｄ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３，  ｅ３１４８
【非特許文献３０】Ｃｈｅｎ，  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １８，  ９９７−１００６
【非特許文献３１】Ｑｕ，  ＫＺ．  ｅｔ  ａｌ  （２０１１）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ４５：３５５−６０
【非特許文献３２】Ｘｕ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ  （２０１１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ５０：１３６−４２
【非特許文献３３】Ｌｉ，  ＬＭ．  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０，  ９７９８-８０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の第１の目的は、肝細胞がん（特に早期肝細胞がんＢＣＬＣ  ０期及びＡ期）の新規な診断マーカーを提供することで、新規な肝細胞がん診断方法を提供することである。
【００１６】
本発明の第２の目的は、肝細胞がん（特に早期肝細胞がんＢＣＬＣ  ０期及びＡ期）の診断に用いられるキットを提供することである。
【００１７】
本発明の第３の目的は、肝細胞がん患者の血漿と健康な人の血漿との区別に用いられるキットを提供することである。
【００１８】
本発明の第４の目的は、肝細胞がん患者の血漿と慢性Ｂ型肝炎患者の血漿との区別に用いられるキットを提供することである。
【００１９】
本発明の第５の目的は、肝細胞がん患者の血漿と肝硬変患者の血漿との区別に用いられるキットを提供することである。
【００２０】
本発明の第６の目的は、肝がん診断マーカーの確定方法を提供することである。
【００２１】
これら及び他の目的は、以下の説明により明確になり、それらは独立請求項の主題により実現される。本発明の一部の好ましい実施形態は、従属請求項の主題により限定される。
【００２２】
第１の態様において、本発明は、複数種類の核酸分子からなり、前記核酸分子はそれぞれ少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする肝細胞がんの診断マーカーを開示する。
【００２３】
好ましい実施形態において、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子を含む。
【００２４】
より好ましい実施形態において、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子、及び、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下される、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれる。
【００２５】
少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれ：且つ、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａまたはｈｓａ−ｍｉＲ−２２３をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれることが特に好ましい。
【００２６】
好ましい実施形態において、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変化がない、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子をさらに含む。
【００２７】
より好ましい実施形態において、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変化がない、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれる。
【００２８】
最も好ましい実施形態において、前記複数種類の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードする８個の核酸分子の組合せを含む。
【００２９】
より好ましい実施形態において、前記少なくとも１種の対照血漿は、健康な個体、慢性Ｂ型肝炎患者または肝硬変患者からのものである。
【００３０】
好ましい実施形態において、前記肝細胞がんは早期肝細胞がん（ＢＣＬＣ  ０期及びＡ期）である。
【００３１】
第２の態様において、本発明は、複数種類の核酸分子からなり、前記核酸分子はそれぞれ少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする肝細胞がんの診断マーカーを含む、肝細胞がんの診断キットを開示する。
【００３２】
好ましい実施形態において、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子を含む。
【００３３】
より好ましい実施形態において、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、ｍｉｃｒｏＲＮＡの配列をコードする少なくとも１種の核酸分子、及び、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下される、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれる。
【００３４】
少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれ；且つ、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａまたはｈｓａ−ｍｉＲ−２２３をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれることが特に好ましい。
【００３５】
好ましい実施形態において、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変化がない、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子をさらに含む。
【００３６】
より好ましい実施形態において、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変化がない、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれる。
【００３７】
最も好ましい実施形態において、前記複数種類の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードする８個の核酸分子の組合せを含む。前記キットは、ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の１つの回帰モデルをさらに含み、ここで、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出され、モデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される。
【００３８】
より好ましい実施形態において、前記少なくとも１種の対照血漿は、健康な個体、慢性Ｂ型肝炎患者または肝硬変患者からのものである。
【００３９】
好ましい実施形態において、前記肝細胞がんは早期肝細胞がん（ＢＣＬＣ  ０期及びＡ期）である。
【００４０】
第３の態様において、本発明は、肝細胞がんの診断マーカーを含む、少なくとも１つの肝細胞がん患者の血漿と少なくとも１つの健康な個体の血漿とを区別するためのキットを開示し、前記肝細胞がんの診断マーカーは複数種類の核酸分子からなり、前記核酸分子はそれぞれ少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードし、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子を含み、前記少なくとも１種の対照血漿は健康な個体からのものである。
【００４１】
好ましい実施形態において、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子を含む。
【００４２】
より好ましい実施形態において、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、ｍｉｃｒｏＲＮＡの配列をコードする少なくとも１種の核酸分子、及び、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下される、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれる。
【００４３】
少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれ；且つ、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａまたはｈｓａ−ｍｉＲ−２２３をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれることが特に好ましい。
【００４４】
好ましい実施形態において、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変化がない、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子をさらに含む。
【００４５】
より好ましい実施形態において、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変化がない、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれる。
【００４６】
最も好ましい実施形態において、前記複数種類の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードする８個の核酸分子の組合せを含む。前記キットは、ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の１つの回帰モデルをさらに含み、ここで、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出され、モデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される。
【００４７】
好ましい実施形態において、前記肝細胞がんは早期肝細胞がん（ＢＣＬＣ  ０期及びＡ期）である。
【００４８】
第４の態様において、本発明は、肝細胞がんの診断マーカーを含む、少なくとも１つの肝細胞がん患者の血漿と少なくとも１つの慢性Ｂ型肝炎患者の血漿とを区別するためのキットを開示しており、前記肝細胞がんの診断マーカーは複数種類の核酸分子からなり、前記核酸分子はそれぞれ少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードし、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子を含み、前記少なくとも１種の対照血漿は慢性Ｂ型肝炎患者からのものである。
【００４９】
好ましい実施形態において、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子を含む。
【００５０】
より好ましい実施形態において、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子、及び、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下される、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれる。
【００５１】
少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれ；且つ、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａまたはｈｓａ−ｍｉＲ−２２３をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれることが特に好ましい。
【００５２】
好ましい実施形態において、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変化がない、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子をさらに含む。
【００５３】
より好ましい実施形態において、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変化がない、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれる。
【００５４】
最も好ましい実施形態において、前記複数種類の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードする８個の核酸分子の組合せを含む。前記キットは、ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の１つの回帰モデルをさらに含み、ここで、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルはｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出され、モデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される。
【００５５】
好ましい実施形態において、前記肝細胞がんが早期肝細胞がん（ＢＣＬＣ  ０期及びＡ期）である。
【００５６】
第５の態様において、本発明は、肝細胞がんの診断マーカーを含む、少なくとも１つの肝細胞がん患者の血漿と少なくとも１つの肝硬変患者の血漿とを区別するためのキットを開示し、前記肝細胞がんの診断マーカーは複数種類の核酸分子からなり、前記核酸分子はそれぞれ少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードし、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子を含み、前記の少なくとも１種の対照血漿は肝硬変患者からのものである。
【００５７】
好ましい実施形態において、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子を含む。
【００５８】
より好ましい実施形態において、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子、及び、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下される、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれる。
【００５９】
少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれ；且つ、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下される、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａまたはｈｓａ−ｍｉＲ−２２３をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれることが特に好ましい。
【００６０】
好ましい実施形態において、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変化がない、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子をさらに含む。
【００６１】
より好ましい実施形態において、少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変化がない、少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする前記少なくとも１種の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードする少なくとも１種の核酸分子から選ばれる。
【００６２】
最も好ましい実施形態において、前記複数種類の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードする８個の核酸分子の組合せを含む。前記キットは、ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の１つの回帰モデルをさらに含み、ここで、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルはｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出され、モデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される。
【００６３】
好ましい実施形態において、前記肝細胞がんは早期肝細胞がん（ＢＣＬＣ  ０期及びＡ期）である。
【００６４】
第６の態様において、本発明は、
（ａ）１つまたは複数の標的血漿において複数の核酸分子の発現レベルを確定するステップであって、前記核酸分子がそれぞれ少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードするステップ、
（ｂ）１つまたは複数の対照血漿において前記複数の核酸分子の発現レベルを確定するステップ、及び
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）で得られた複数の核酸分子の対応する発現レベルを比較することにより、前記複数の核酸分子の中から前記標的血漿及び前記対照血漿において差次的発現される１つまたは複数の核酸分子を同定し、前記標的血漿及び前記対照血漿において差次的発現される１つまたは複数の核酸分子を肝がん診断マーカーとするステップを含む、肝がん診断マーカーの確定方法を開示する。
【００６５】
本発明の他の実施形態は、以下の詳細な説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、肝細胞肝がんを示す少なくとも１つの標的血漿、特に早期肝細胞肝がん（ＢＣＬＣ  ０期及びＡ期）の存在を同定するための本発明のｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せのスクリーニング、トレーニング及びバリデーション段階の実験計画フローチャートである。
【図２】図２は、本発明における、肝細胞肝がんの診断、特に早期肝細胞肝がん（ＢＣＬＣ  ０期及びＡ期）患者を診断するための血液中のｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せを確定する主な方法の工程図である。対照群には、健康、慢性Ｂ型肝炎及び肝硬変の被験者を含まれる。
【図３】図３は、本発明における、少なくとも１つの肝細胞肝がんの標的血漿を確定するための好適なｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１）を含む論理的回帰モデルに対して説明している。Ａ）トレーニングセット（ｎ＝４０７）におけるＨＣＣ群と対照群とを比較するときのｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せの診断価値のＲＯＣグラフである。ＡＦＰ（ＡＵＣ＝０．７６）に比べて、ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せはＨＣＣ群の血漿と対照群の血漿とを区別するときに明らかに高い診断正確度（ＡＵＣ＝０．８６）を有する。Ｂ）バリデーションセット（ｎ＝３９０）におけるＨＣＣ群と対照群とを比較するときのｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せの診断価値のＲＯＣグラフである。ＡＦＰ（ＡＵＣ＝０．６８）に比べて、ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せはＨＣＣ群の血漿と対照群の血漿とを区別するときに有意に高い診断正確度（ＡＵＣ＝０．８９）を有する。
【図４】図４は、本発明における、肝細胞がん患者の血漿と健康な個体、慢性Ｂ型肝炎患者または肝硬変患者の血漿とをさらに区別するための好適なｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１）を含む論理的回帰モデルに対して説明している。Ａ）バリデーションセット（ｎ＝３９０）におけるＨＣＣ群と健康群とを比較するときのｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せの診断価値のＲＯＣグラフである。ＡＦＰ（ＡＵＣ＝０．６４）に比べて、ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せはＨＣＣ患者の血漿と健康な個体の血漿とを区別するときに明らかに高い診断正確度（ＡＵＣ＝０．９５）を有する。Ｂ）バリデーションセット（ｎ＝３９０）におけるＨＣＣ群と慢性Ｂ型肝炎群とを比較するときのｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せの診断価値のＲＯＣグラフである。ＡＦＰ（ＡＵＣ＝０．６２）に比べて、ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せはＨＣＣ患者の血漿と慢性Ｂ型肝炎患者の血漿とを区別するときに有意に高い診断正確度（ＡＵＣ＝０．８５）を有する。Ｃ）バリデーションセット（ｎ＝３９０）におけるＨＣＣ群と肝硬変群とを比較するときのｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せの診断価値のＲＯＣグラフである。ＡＦＰ（ＡＵＣ＝０．７８）に比べて、ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せはＨＣＣ患者の血漿と肝硬変患者の血漿とを区別するときに明らかに高い診断正確度（ＡＵＣ＝０．８９）を有する。
【図５】図５は、本発明における、異なるＢＣＬＣ病期における肝細胞がんの少なくとも１つの標的血漿を同定するための好適なｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１）を含む論理的回帰モデルに対して説明している。Ａ）極早期ＨＣＣ（ＢＣＬＣ  ０）と対照群とを比較するときのｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せの診断価値のＲＯＣグラフである。ＡＦＰ（ＡＵＣ＝０．６８）に比べて、ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せは極早期ＨＣＣ患者の血漿と対照群の血漿とを区別するときにより高い診断正確度（ＡＵＣ＝０．９４）を有する。Ｂ）早期ＨＣＣ（ＢＣＬＣ  Ａ）と対照群とを比較するときのｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せの診断価値のＲＯＣグラフである。ＡＦＰ（ＡＵＣ＝０．６５）に比べて、ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せは早期ＨＣＣ患者の血漿と対照群の血漿とを区別するときにより高い診断正確度（ＡＵＣ＝０．９０）を有する。Ｃ）中期ＨＣＣ（ＢＣＬＣ  Ｂ）と対照群とを比較するときのｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せの診断価値のＲＯＣグラフである。ＡＦＰ（ＡＵＣ＝０．７４）に比べて、ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せは中期ＨＣＣ患者の血漿と対照群の血漿とを区別するときにより高い診断正確度（ＡＵＣ＝０．８５）を有する。Ｄ）進行期ＨＣＣ（ＢＣＬＣ  Ｃ）と対照群とを比較するときのｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せの診断価値のＲＯＣグラフである。ＡＦＰ（ＡＵＣ＝０．７９）に比べて、ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せは進行期ＨＣＣ患者の血漿と対照群の血漿とを区別するときに有意な差がない（ＡＵＣ＝０．８０）。
【図６】図６は、本発明における、ＡＦＰ≦２０ｎｇ／ｍｌ及びＡＦＰ＞２０ｎｇ／ｍｌの肝細胞がんの少なくとも１つの標的血漿を同定するための好適なｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１）を含む論理的回帰モデルに対して説明している。Ａ）ＡＦＰ≦２０ｎｇ／ｍｌのＨＣＣ群と対照群とを比較するときのｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せの診断価値のＲＯＣグラフである。ＡＦＰ（ＡＵＣ＝０．６３）に比べて、ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せはＡＦＰ≦２０ｎｇ／ｍｌのＨＣＣ群の血漿と対照群の血漿とを区別するときにより高い診断正確度（ＡＵＣ＝０．８７）を有する。Ｂ）ＡＦＰ＞２０ｎｇ／ｍｌのＨＣＣ群と対照群とを比較するときのｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せの診断価値のＲＯＣグラフである。ＡＦＰ（ＡＵＣ＝０．６９）に比べて、ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せはＡＦＰ＞２０ｎｇ／ｍｌのＨＣＣ群の血漿と対照群の血漿とを区別するときにより高い診断正確度（ＡＵＣ＝０．９０）を有する。
【図７】図７は、７個の選ばれたｍｉｃｒｏＲＮＡとＡＦＰ手術期間における変動のボックスプロットである。それぞれ術前と術後の６日目に、肝切除手術を行った５４人のＨＣＣ患者の血液サンプルを取る。術後の６日目に、ＡＦＰと３個のｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２３）の発現レベルに明らかな変動がある。外科的切除手術後、ＡＦＰと２個のｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２１及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２）の発現レベルが有意に低下し、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３の発現が顕著に増加する。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明は、高い診断正確度を有する肝がん診断マーカーにより、肝細胞がんが確実に同定可能であるという思いがけない発見に基づくものである。典型的には、本明細書において定義する肝がん診断マーカーは、発現が上昇または低下されるヒトｍｉｃｒｏＲＮＡを含む。より具体的には、血漿におけるｍｉｃｒｏＲＮＡ全体の発現パターンおよび／または単独のｍｉｃｒｏＲＮＡの発現レベルを分析することにより、前記肝がん診断マーカーは、肝細胞がんの早期疾病状態での検出を可能とし、肝細胞がん患者の血漿と健康な個体、慢性Ｂ型肝炎患者及び肝硬変患者の血漿とが区別されるようにすることができる。
【００６８】
以下に例を挙げて説明する本発明は、本明細書で特に提示していないいずれか１つまたは複数の要素または制限が欠けた条件下で適切に実施できる。
【００６９】
本発明について、特定の実施形態に基づいて、かつ、図面を参照して説明するが、本発明はそれに制限されるものではなく、請求の範囲にのみ制限される。説明する図面は単に模式的なものであり、非制限性的であると見なされる。
【００７０】
術語「含む」が本発明の明細書または請求の範囲に使用される場合、それは他の要素またはステップを排除しない。本発明の目的を実現するために、術語「…からなる」は術語「含む」の好ましい実施形態と見なされる。以下の文において、ある１組が少なくとも一定の数の実施形態を含むと定義されていれば、これはまた、１つの好ましい、これら実施形態のみからなる組を示していることを理解すべきである。
【００７１】
特に明示していない限り、単数形式の名詞を言及する場合に使用する不定冠詞または定冠詞、例えば「１つ」または「１種」、「前記」は、該名詞の複数形式を含む。
【００７２】
本発明における術語「約」は、当業者が理解できる、かかる特徴の技術効果をなおも保証できる正確度の区間を示す。該術語は通常、指示数値の±１０％、好ましくは±５％を外れることを示す。
【００７３】
また、明細書及び請求の範囲における術語の第１、第２、第３、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及びその他のこれに類するものは、類似している要素を区別するためのものであり、順序または時間的順序を説明することに必要なものではない。このように適用する術語は適切な状況において置き換え可能であるとともに、本発明において説明する実施形態は、本明細書で説明または例を挙げて説明したことによるのとは異なるほかの順序で実施できることを理解すべきである。
【００７４】
適用される言語環境における術語の更なる定義は下記に明示する。
【００７５】
以下の術語または定義は単に本発明の理解に役立つように提供するものである。これらの定義は、当業者の理解範囲より狭い範囲を有すると理解されてはならない。
【００７６】
本明細書で使用する術語「がん」（「がん腫」ともいう）は通常、いずれかのタイプの悪性新生物、即ち、影響を受けていない（健康な）野生型対照細胞に比べて、がん発生の特徴傾向を表示または有する標的細胞のいずれかの形態的学および／または生理学的変動（遺伝子のリプログラミングによる）を示す。このような変動は、細胞の大きさと形状（大きくまたは小さくなる）、細胞の増殖（細胞数の増加）、細胞の分化（生理学的状態変動）、アポトーシス（プログラム細胞死）または細胞生存に関するものであっても良い。
【００７７】
本明細書で使用する術語「肝細胞」は、肝臓の細胞を意味する。よって、術語「肝細胞肝がん」は、肝臓におけるがん性の成長を意味する。
【００７８】
肝がんにおいて最もよく見られるタイプは、肝細胞肝がん（肝がんとも称し、通常ＨＣＣと略称する）である。本明細書で使用する術語「肝細胞肝がん」は、肝臓原発性悪性腫瘍である。大多数のＨＣＣはウイルス性肝炎の感染（Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎）或いは肝硬変（アルコール依存症は肝硬変を招く最も良く見られている要素である）に続発する。肝炎が風土病でない国家において、大多数の肝臓悪性がんは原発性ＨＣＣではなく、人体のほかの部位、例えば結腸のがんから転移（伝播）される。ＨＣＣの治療選択と予後は多くの要素に依存するが、特に腫瘍の大きさと病期に依存する。通常、結果が不良であるのは肝細胞がんの１０％〜２０％のみが手術を通じて切除できるためである。がんを完全に切除できない場合、該疾病は通常３〜６ヶ月以内で命にかかわる。
【００７９】
他のいずれかのがんと同様に、肝細胞がんは、細胞の急速な複製を引き起こし、かつ／または、細胞のアポトーシスの回避を招く細胞の突然変異が存在する時に発生する。特に、Ｂ型肝炎および／またはＣ型肝炎の慢性ウイルス感染は人体自身の免疫系における肝細胞（そのうちの一部がウイルスに感染され、他は単なるバイスタンダー細胞である）への攻撃を繰り返し引き起こすことにより肝細胞がんの発生に寄与する。このような損傷−修復−再損傷の循環は修復期間のミスを招く可能性があり、最終的にがん化を招くことになるが、現在、このような仮説はＣ型肝炎により適用される。しかしながら、Ｂ型肝炎において、ウイルスゲノムが感染された細胞に整合されることは、悪性腫瘍の発生に最も関連する要素である。また、大量の飲酒を繰り返すことは類似作用を有する。
【００８０】
バルセロナ臨床肝がん（ＢＣＬＣ）病期案は、５つの時期を含む。極早期（０期）は、臨床症状のない単発の２ｃｍ未満のＨＣＣを有する患者を含む。早期（Ａ期）は、臨床症状のない単発または３つの３ｃｍ以下のＨＣＣを有する患者を含む。中期（Ｂ期）は臨床症状のない複数のＨＣＣ結節を有する患者を含む。進行期（Ｃ期）は臨床症状のある腫瘍および／または侵襲性腫瘍パターン（血管進侵入または肝外散布）を有する患者を含む。末期（Ｄ期）は、極めて憂慮される予後を有する患者を含む。
【００８１】
よって、本発明の範囲において、Ｂ型肝炎の感染あるいは肝硬変は腫瘍病因学の危険因子と見なされるだけでなく、腫瘍への進行の早期／中期（即ち、「前がん状態」）でもあり、（通常は良性の）非侵襲性新生物の過剰増殖組織成長（今後ＨＣＣのような悪性腫瘍に進行しうる）と関連する。
【００８２】
このような悪性腫瘍は他の組織を侵襲して転移がよく発生する。悪性細胞は通常、進行性と制御不能な成長を特徴とする。肉眼で見ると、ＨＣＣは結節性または湿潤性腫瘍に見える。結節型腫瘍は、単発性（大体積を有する）または多発性（硬変合併症に進行した場合）があり得る。腫瘍結節は円形ないし楕円形であり、境界が明瞭であるが被膜はない。びまん型は境界が不明瞭で、かつ門静脈に湿潤し、肝静脈に湿潤することは少ない。
【００８３】
本発明で用いる哺乳動物の標的血漿は、ヒトまたは非ヒト由来のものであってもよい。しかしながら、本発明は、典型的にはヒトの血漿を用いて行う。本明細書で使用する術語「１種または複数種類の血漿」は個体血漿のみを含むのではないと理解すべきである。本明細書で使用する術語「標的血漿」は、少なくとも肝細胞がんを示すと見なされる血漿を意味し、術語「対照血漿」は、典型的には、健康な個体、慢性Ｂ型肝炎患者及び肝硬変患者から得られたこのようながん特徴を有していない血漿を意味する。ただし、一部の応用において、例えば異なるがんタイプの血漿間で比較する場合は、肝細胞がん表現型を有していない血漿が典型的に「対照血漿」と見なされる。
【００８４】
本発明で使用する術語「血漿」は、血液における黄色液体成分であり、そのうち、全血における血液細胞は通常懸濁状態で存在すし、通常、血液総体積の約５５％を占める。その大部分は水（体積の９０％を占める）であり、溶解されたタンパク質、グルコース、血液凝固因子、ミネラルイオン、ホルモン及び二酸化炭素（血漿は排出物の搬送の主なルートである）を含む。血漿は、１管分の鮮血を遠心分離機において血液細胞が管底に沈殿するまで遠心分離してから、血漿を注出または抽出する方法で調製する。血漿の密度は、約１０２５ｋｇ／ｍ３、つまり１．０２５ｋｇ／ｌである。最近の研究によると、ｍｉｃｒｏＲＮＡが血漿において安定していることが明らかになった。術語「血漿サンプル」は、検査対象である個体または対照群から取得された血漿を意味する。
【００８５】
本発明で使用する術語「患者」は、少なくとも、肝細胞がんに罹患していると見なされた人を意味し、本発明で使用する「標的血漿」は、患者から採集した血漿を意味する。術語「健康な個体」は典型的には、がんに罹患していない健康な人を一般的に意味する。本発明で使用する「対照血漿」は、健康な個体、慢性Ｂ型肝炎患者及び肝硬変患者から採集した血漿である。ただし、一部の応用において、例えば、異なるがんタイプの間で比較する場合は、他のがんタイプに罹患している個体及びこれら個体から採集した血漿が典型的に対照と見なされる。
【００８６】
典型的には、使用する血漿サンプルは、肝細胞がんに罹患していると診断された被験者から採集した生体サンプル由来のものである。また、取得したデータを確認するために、対比するサンプルは既知の疾病状態を有する被験者から採集してもよい。前記生体サンプルは、組織、血清、血液細胞、痰、及び、尿等の人体組織及び体液を含んでもよい。また、生体サンプルは、肝細胞がんまたはがんが疑われる個体から取得してもよい。また、前記サンプルは必要に応じて、取得された人体組織または体液から精製してから生体サンプルとして使用してもよい。本発明によれば、本発明の核酸マーカーの発現レベルは検査対象から採取された生体サンプルにおいて確定される。
【００８７】
本発明の体外方法において、検出対象サンプルは通常臨床で受け入れ可能な方法で採集すべきであり、核酸（特にＲＮＡ）またはタンパク質の形態で保存することが好ましい。分析対象サンプルは典型的には血液からのものである。また、肝組織または他のタイプのサンプルも使用可能である。サンプルは、特に初期処理を経た後にプール可能である。ただし、プールされていないサンプルを使用してもよい。
【００８８】
本発明で使用する術語「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」（または「ｍｉＲＮＡ」）は、本分野における通常の概念（Ｂａｒｔｅｌ，  Ｄ．Ｐ．  （２００４）  Ｃｅｌｌ  ２３，  ２８１−２９２；  Ｈｅ，  Ｌ．  ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｎ，  Ｇ．Ｊ．  （２００４）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ５，  ５２２−５３１）を有する。よって、「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」は遺伝子座からのＲＮＡ分子を意味し、それは部分的ＲＮＡ前躯体ｍｉＲＮＡ構造を形成可能な転写産物から加工して得られる。成熟したｍｉＲＮＡは、他の数、例えば１８、１９、２６または２７個のヌクレオチドも存在できるが、通常は長さが２０、２１、２２、２３、２４または２５個のヌクレオチドである。
【００８９】
ｍｉＲＮＡコード配列はフランキングゲノム配列と対合する潜在力を有し、成熟したｍｉＲＮＡを非完全に対合したＲＮＡ二本鎖体内（本明細書では、ステムループまたはヘアピン構造またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとも称する）に配置し、前記二本鎖体はより長い前躯体転写産物からｍｉＲＮＡ処理を行う中間体とされる。この処理は典型的には、それぞれＤｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒと呼ばれる２種類の特定のエンドヌクレアーゼの連続作用を通じて生じる。Ｄｒｏｓｈａは、一次転写産物（本明細書では、「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」とも称する）から典型的にはヘアピン状またはステムループ構造に折り畳まれるｍｉＲＮＡ前躯体（本明細書では、「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」とも称する）を生成する。Ｄｉｃｅｒ法を用いてこのｍｉＲＮＡ前躯体を切断してｍｉＲＮＡが得られ、そのヘアピンまたはステムループ構造の１本の腕に成熟したｍｉＲＮＡが含まれており、もう１本の腕に類似した大きさのセグメント（通常、ｍｉＲＮＡ＊と称する）が含まれる。前記ｍｉＲＮＡはその後、その標的ｍＲＮＡに誘導されてその機能を発揮し、ｍｉＲＮＡ＊は分解される。また、ｍｉＲＮＡは典型的には予測したタンパク質のコード領域とは異なるゲノムセグメントから誘導される。
【００９０】
本発明で使用する術語「ｍｉＲＮＡ前躯体」（または「前躯体ｍｉＲＮＡ」または「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」）は、ｍｉＲＮＡ一次転写産物の一部を意味し、成熟したｍｉＲＮＡは該ｍｉＲＮＡ一次転写産物から処理して得られる。典型的には、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは安定したヘアピン（即ち、二本鎖体）またはステムループ構造に折り畳まれる。ヘアピン構造は、典型的には長さが５０〜８０個のヌクレオチドであり、６０〜７０個のヌクレオチド（ｍｉＲＮＡ残基、ｍｉＲＮＡと対合する残基、及びいずれかの介在するセグメントをすべて含んで計算するが、より遠端の配列は排除する）が好ましい。
【００９１】
本発明で使用する術語「ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする核酸分子」は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする任意の核酸分子を意味する。よって、該術語は成熟したｍｉＲＮＡを示すだけでなく、対応する上述したような前躯体ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ一次転写産物をも意味する。また、本発明はＲＮＡ分子に限らず、対応するｍｉｃｒｏＲＮＡをコードするＤＮＡ分子、例えば、ｍｉＲＮＡ配列を逆転写して発生するＤＮＡ分子も含む。本発明のｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする核酸分子は、典型的には単独のｍｉＲＮＡ配列（即ち、個体ｍｉＲＮＡ）をコードする。ただし、このような核酸分子が２つまたは複数のｍｉＲＮＡ配列（即ち、２つまたは複数のｍｉＲＮＡ）をコードする可能性もあり、例えば、１つの転写単位は、プロモーターまたは転写ターミネータのような常用の調節配列の制御下の２つまたは複数のｍｉＲＮＡ配列を含む。
【００９２】
本発明で使用する術語「ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする核酸分子」は、「センス核酸分子」（即ち、核酸配列（５’(R)３’）がコードされるｍｉＲＮＡ（５’(R)３’）配列にマッチまたは対応する分子）及び「アンチセンス核酸分子」（即ち、核酸配列がコードされるｍｉＲＮＡ（５’(R)３’）配列と相補的、言い換えれば、コードされるｍｉＲＮＡ配列の逆方向の相補配列（３’(R)５’）とマッチする分子）を含むとも理解される。本発明で使用する術語「相補」とは、「アンチセンス」核酸分子配列と対応する「センス」核酸分子配列（アンチセンス配列と相補的な配列を有する）が塩基対（好ましくはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対）を形成する能力を有することを意味する。
【００９３】
本発明の範囲内において、２つの核酸分子（即ち、「センス」及び「アンチセンス」分子）は完全に相補的、すなわち、何らかの塩基ミスマッチおよび／または追加または欠失のヌクレオチドを含まない。或いは、２つの分子は１つまたは複数の塩基ミスマッチを含み、或いはそれらのヌクレオチドの総数において異なる（添加または欠失に起因する）。「相補」核酸分子が、対応する「センス」核酸分子に含まれている配列と完全相補性を示す少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含むことが好ましい。
【００９４】
よって、本発明の診断キットに含まれているｍｉＲＮＡ配列をコードする複数の核酸分子は、１つまたは複数の「センス核酸分子」および／または１つまたは複数の「アンチセンス核酸分子」を含んでいてもよい。前記診断キットは１つまたは複数の「センス核酸分子」（即ち、ｍｉＲＮＡ配列自身）を含む場合があり、前記分子は、差次的発現されるｍｉＲＮＡ（即ち、分子マーカー）全体または少なくとも１つのサブ集合を組成すると見なされ、前記差次的発現されるｍｉＲＮＡは特定状況の存在または発生傾向の指標であり、本発明において、前記の特定状況は肝細胞がんを意味する。一方、診断キットに１つまたは複数の「アンチセンス核酸分子」（即ち、ｍｉＲＮＡ配列と相補的な配列）が含まれている場合、前記分子は、既定サンプルにおける１つまたは複数の特定（相補）ｍｉＲＮＡ配列の検出および／または定量に適合するプローブ分子（ハイブリダイゼーション測定に用いられる）および／またはオリゴヌクレオチドプライマー（例えば逆転写またはＰＣＲ応用に用いられる）等を含んでいてもよい。
【００９５】
本発明で定義する複数の核酸分子は、少なくとも２個、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも１００００個または少なくとも１０００００個の核酸分子を含んでいてもよく、各分子は少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列をコードする。
【００９６】
本発明で使用する術語「差次的発現」は、特定ｍｉｃｒｏＲＮＡの標的血漿における発現レベルが対照血漿における場合に比べて変動していることを意味し、前記対照血漿は、健康な個体の血漿または他のタイプの疾病患者の血漿であってもよく、上昇（即ち、標的血漿においてｍｉｃｒｏＲＮＡの濃度が増加する）または低下（即ち、標的血漿においてｍｉｃｒｏＲＮＡの濃度が減少または消失する）であってもよい。言い換えれば、核酸分子が標的血漿において、対照血漿における場合に比べてより高いまたはより低いレベルまで活性化される。
【００９７】
本発明の範囲内において、核酸分子の標的血漿と対照血漿における対応する発現レベルが、典型的に少なくとも５％または少なくとも１０％異なり、好ましくは少なくとも２０％または少なくとも２５％異なり、最も好ましくは少なくとも３０％または少なくとも５０％異なる場合、該核酸分子は差次的発現されていると見なされる。このため、後者の値は既定の核酸分子に対応して、標的血漿における発現レベルが対照細胞に比べて少なくとも１．３倍または少なくとも１．５倍上昇し、または逆に、標的血漿における発現レベルが少なくとも０．７倍または少なくとも０．５倍低下する。
【００９８】
本発明で使用する術語「発現レベル」は、特定のｍｉＲＮＡ配列のそのゲノム遺伝子座から転写される程度を意味し、即ち、１つまたは複数の分析される血漿におけるｍｉＲＮＡの濃度を意味する。
【００９９】
上述のように、術語「対照血漿」は典型的には、肝細胞がんの表現性特徴を有していない個体から採集した血漿である。ただし、一部の応用において、例えば異なるがんを比較する場合、他のがん患者から採集した血漿は典型的には「対照血漿」と見なされる。
【０１００】
発現レベルの測定は典型的には、本分野において周知の既に構築されている標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  ＮＪ）に従う。前記測定はＲＮＡレベルで行ってもよく、例えば、ｍｉＲＮＡ特異性プローブを用いてＮｏｒｔｈｅｒｎブロット分析を行い、或いはＲＮＡ逆転写（及びクローニング）後のＤＮＡレベルで行い、例えば定量ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ技術によって行う。本発明で使用する術語「測定」は、上記の少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードするいずれかの核酸分子の分析を含む。ただし、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｒｅ−ｍＲＮＡ半減期が短いため、典型的には成熟したｍｉＲＮＡの濃度のみを計測する。
【０１０１】
特定の実施形態において、１つの既定サンプルの数回の独立した計測（例えば、２回、３回、５回または１０回の計測）および／または幾つかの標的血漿または対照血漿内の数回の計測で得られた発現レベルの標準値が分析に用いられる。標準値は、本分野の既知のいずれかの方法で得ることが可能である。例えば、平均値±２  ＳＤ（標準偏差）または平均値±３  ＳＤの範囲を標準値として用いてもよい。
【０１０２】
得られた標的血漿と対照血漿の発現レベルの間の差異は、対照核酸でさらに標準化してもよく、例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルであり、既知のハウスキーピング遺伝子の発現レベルは採集サンプルの個体の疾病状態によって異なるものではない。典型的には、ハウスキーピング遺伝子はβ−アクチン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及びリボソームタンパク質Ｐ１等を含む。好ましい実施形態において、対照核酸は既知の、異なる非がん及び（前）がん状態における採集サンプルの個体において安定的に発現される他種のｍｉＲＮＡである。
【０１０３】
ただし、いずれかの実験において１つまたは複数の血漿サンプルの発現レベルを確定することの代わりに、実験証拠および／または現有の技術データに基づいて特定疾病表現型（即ち、疾病状態）に対する１つまたは複数の臨界値を定義してもよい。このような場合、１つまたは複数の標的血漿の対応する発現レベルは、１つの安定的に表現される対照ｍｉＲＮＡを用いて標準化して確定できる。算出した「標準化」の発現レベルが対応する定義された臨界値より高い場合、遺伝子の発現が上昇したことを説明する。逆に、算出した「標準化」の発現レベルが対応する定義された臨界値より低い場合、ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現が低下したことを説明する。
【０１０４】
本発明において、術語「肝細胞がんの同定および／または他のＨＢＶ感染関連疾病の区別」は、予測と可能性分析（「診断」の意味における）も含むことを意味する。本発明で開示する組成物と方法は、臨床応用して治療形態を決定することを意図し、治療的介入、疾病段階のような診断標準、及び疾病モニタリングと疾病監視を含む。本発明によれば、被験者の状態の検査に用いられる中間結果を提供できる。このような中間結果は追加情報と組み合わせて、医師、看護師または他の従業人員が、該対象が該疾病に罹患していることを診断するのに役立ち得る。或いは、本発明は、血漿サンプルを通じてがん化を検出し、医師に有用な情報を提供して診断を行うようにすることに用いることが可能である。また、本発明は、肝細胞がんと慢性Ｂ型肝炎及び肝硬変を含む他のＨＢＶ感染関連疾病との区別にも用いられる。
【０１０５】
本発明において、同定された１つまたは複数の差次的発現される核酸分子は共に１種のマーカーを表し、該マーカーは血漿サンプルにおける肝細胞がんの指標である。本発明で使用する術語「マーカー」は、１組の核酸分子（例えば、ｍｉＲＮＡ）を意味し、ここで、各核酸分子の発現レベルは肝細胞がん患者の血漿と対照血漿において異なる。本発明において、前記マーカーは、１組のマーカーを意味するとともに最小数の（異なる）核酸分子も表しており、各種の核酸分子は個体の表現型の状態を同定できる少なくとも１種のｍｉＲＮＡ配列をコードする。
【０１０６】
第１の態様において、本発明は、複数種類の核酸分子からなり、前記核酸分子がそれぞれ少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする、肝細胞がんの診断マーカーを開示する。
【０１０７】
典型的には、肝細胞がんの診断マーカーにおける核酸分子はヒト配列であり、以下では「ｈｓａ」（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））と称する。前記複数の核酸分子が、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及び内部パラメータｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）をコードする１つまたは複数の核酸分子を含むことが特に好ましい。
【０１０８】
表１に、上記で言及したｍｉｃｒｏＲＮＡの核酸配列を列挙する。
【表１】
2013538583.tif 000003
【０１０９】
本発明に開示されている全てのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列は、いずれも既にｍｉＲＢａｓｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６，  Ｄ１５４−Ｄ１５８も参照）に格納されている。
【０１１０】
ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１をコードするいずれか１つまたは複数の核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇され、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａまたはｈｓａ−ｍｉＲ−２２３をコードするいずれか１つまたは複数の核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下され、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードするいずれか１つまたは複数の核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変動していない。
【０１１１】
本発明で使用する術語「いずれか１つまたは複数の核酸分子」または「前記複数の核酸分子における１つまたは複数」は、いずれか１個、いずれか２個、いずれか３個、いずれか４個、いずれか５個、いずれか６個、いずれか７個、いずれか８個、いずれか９個、いずれか１０個などの核酸分子のような、前記複数の核酸分子のいずれか１つのサブセットを意味し、各核酸分子は少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする。
【０１１２】
最も好ましい実施形態において、前記複数の核酸分子は、それぞれｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）をコードする８個の核酸分子の組合せを含む。前記８個の核酸分子の組合せは、ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１のようなロジスティック回帰モデルに含まれており、ここで、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出されたものである。
【０１１３】
上記で言及したｍｉｃｒｏＲＮＡの核酸配列を表１に列挙する。
【０１１４】
前記のモデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇され、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変動していない。
【０１１５】
本発明で使用する術語「核酸分子の組合せ」は、少なくとも２つの核酸の発現レベルを１つの全体として使用することを示す。相対変化または１つの公式を通じて算出した結果を１つの全体として使用することが好ましい。
【０１１６】
第２の態様において、本発明は、複数種類の核酸分子からなり、各種の核酸分子が少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする肝細胞がんの診断マーカーを含む、肝がんの診断キットを開示している。
【０１１７】
前記複数種類の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及び内部パラメータｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）をコードする１つまたは複数の核酸分子を含むことが特に好ましい。
【０１１８】
上記で言及したｍｉｃｒｏＲＮＡの核酸配列を表１に列挙する。
【０１１９】
ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１をコードするいずれか１つまたは複数の核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現は、少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇され、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａまたはｈｓａ−ｍｉＲ−２２３をコードするいずれか１つまたは複数の核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下され、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードするいずれか１つまたは複数の核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変動していない。
【０１２０】
最も好ましい実施形態において、前記複数の核酸分子は、それぞれｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）をコードする８個の核酸分子の組合せを含む。本発明のキットは、上記８個の核酸分子の組合せを含んでいるロジスティック回帰モデル：ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１をさらに含み、ここで、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルはｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出されたものである。
【０１２１】
上記で言及したｍｉｃｒｏＲＮＡの核酸配列は表１に列挙する。
【０１２２】
前記のモデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇され、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８の少なくとも１種の標的血漿における発現は少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変動していない。
【０１２３】
第３の態様において、本発明は、肝細胞がんの診断マーカーを含む、少なくとも１つの肝細胞がん患者の血漿と少なくとも１つの健康な人の血漿とを区別するためのキットを開示し、前記肝細胞がんの診断マーカーは複数種類の核酸分子からなり、前記核酸分子はそれぞれ少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードし、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子を含み、前記の少なくとも１種の対照血漿は健康な人からのものである。
【０１２４】
前記複数種類の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及び内部パラメータｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）をコードする１つまたは複数の核酸分子を含むことが特に好ましい。
【０１２５】
上記で言及したｍｉｃｒｏＲＮＡの核酸配列を表１に列挙する。
【０１２６】
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１をコードするいずれか１つまたは複数の核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇され、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａまたはｈｓａ−ｍｉＲ−２２３をコードするいずれか１つまたは複数の核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下され、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードするいずれか１つまたは複数の核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変動していない。
【０１２７】
最も好ましい実施形態において、前記複数の核酸分子は、それぞれｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）をコードする８個の核酸分子の組合せを含む。本発明のキットは、上記８個の核酸分子の組合せを含むロジスティック回帰モデル：ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１をさらに含み、ここで、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出されたものである。
【０１２８】
上記で言及したｍｉｃｒｏＲＮＡの核酸配列を表１に列挙する。
【０１２９】
前記モデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇され、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変動していない。
【０１３０】
第４の態様において、本発明は、肝細胞がんの診断マーカーを含む、少なくとも１つの肝細胞がん患者の血漿と少なくとも１つの慢性Ｂ型肝炎患者の血漿とを区別するためのキットを開示し、前記肝細胞がんの診断マーカーは複数種類の核酸分子からなり、各種の核酸分子は少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードし、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子を含み、前記の少なくとも１種の対照血漿は慢性Ｂ型肝炎患者からのものである。
【０１３１】
前記複数種類の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及び内部パラメータｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）をコードする１つまたは複数の核酸分子を含むことが特に好ましい。
【０１３２】
上記で言及したｍｉｃｒｏＲＮＡの核酸配列を表１に列挙する。
【０１３３】
ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１またはｈｓａ−ｍｉＲ−２１をコードするいずれか１つまたは複数の核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇され、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａまたはｈｓａ−ｍｉＲ−２２３をコードするいずれか１つまたは複数の核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下され、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードするいずれか１つまたは複数の核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変動していない。
【０１３４】
最も好ましい実施形態において、前記複数の核酸分子は、それぞれｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）をコードする８個の核酸分子の組合せを含む。本発明のキットは、上記８個の核酸分子の組合せを含んでいるロジスティック回帰モデル：ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１をさらに含み、ここで、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルはｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出されたものである。
【０１３５】
上記で言及したｍｉｃｒｏＲＮＡの核酸配列を表１に列挙する。
【０１３６】
前記モデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇され、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変動していない。
【０１３７】
第５の態様において、本発明は、肝細胞がんの診断マーカーを含む、少なくとも１つの肝細胞がん患者の血漿と少なくとも１つの肝硬変患者の血漿とを区別するためのキットを開示しており、前記肝細胞がんの診断マーカーは複数種類の核酸分子からなり、各種の核酸分子は少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードし、前記複数種類の核酸分子は、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする少なくとも１種の核酸分子を含み、前記の少なくとも１種の対照血漿は肝硬変患者からのものである。
【０１３８】
前記複数種類の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及び内部パラメータｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）をコードする１つまたは複数の核酸分子を含むことが特に好ましい。
【０１３９】
上記で言及したｍｉｃｒｏＲＮＡの核酸配列を表１に列挙する。
【０１４０】
ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１をコードするいずれか１つまたは複数の核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇され、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａまたはｈｓａ−ｍｉＲ−２２３をコードするいずれか１つまたは複数の核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下され、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードするいずれか１つまたは複数の核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変動していない。
【０１４１】
最も好ましい実施形態において、前記複数の核酸分子は、それぞれｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）をコードする８個の核酸分子の組合せを含む。本発明のキットは、上記８個の核酸分子の組合せを含んでいるロジスティック回帰モデル：ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１をさらに含み、ここで、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルはｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出されたものである。
【０１４２】
上記で言及したｍｉｃｒｏＲＮＡの核酸配列を表１に列挙する。
【０１４３】
前記のモデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇され、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変動していない。
【０１４４】
第６の態様において、本発明は、
（ａ）１つまたは複数の標的血漿において複数の核酸分子の発現レベルを確定するステップであって、前記各核酸分子が少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードするステップ、
（ｂ）１つまたは複数の対照血漿において前記複数の核酸分子の発現レベルを確定するステップ、及び
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）で得られた複数の核酸分子の対応する発現レベルを比較することにより、前記複数の核酸分子から前記標的血漿及び前記対照血漿において差次的発現される１つまたは複数の核酸分子を同定し、前記標的血漿及び前記対照血漿において差次的発現される１つまたは複数の核酸分子を肝がん診断マーカーとして、１つまたは複数の肝がん患者の標的血漿を同定するステップを含む、肝がん診断マーカーの確定方法を開示している。
【０１４５】
図面及び以下の実施例に基づいて、本発明についてさらに説明するが、前記図面及び実施例は本発明を例示する特定の実施形態に過ぎず、何らかの方式で本発明の範囲を制限することを意味すると理解してはならない。
【実施例】
【０１４６】
実施例１：血漿サンプルの採集及び調製：
本発明における試験は、当地倫理委員会の許可を得て、かつ全ての患者のインフォームドコンセントを取得している。本発明において、ｍｉｃｒｏＲＮＡバイオマーカーのスクリーニング段階、トレーニング段階、及びバリデーション段階の実験計画は、図１に示すとおりである。推奨された血漿ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せを用いて、肝細胞がん患者の血漿サンプルを識別する主な方法のステップは、図２に示すとおりである。
【０１４７】
２００８年８月から２０１０年６月までの間、９３４個の合格基準（図２）を満たす血液サンプルが予め上海中山病院及び公衆衛生センターから採集された。これらサンプルは、１６７人の健康なドナー（健康群）、１６９人の慢性Ｂ型肝炎患者（ＣＨＢ群）、１４１人のＨＢＶ感染後の肝硬変患者（肝硬変群）、及び４５７人のＨＢＶ感染関連ＨＣＣ患者（ＨＣＣ群）から採取されたものである。これらサンプルは時間的な順序に基づいて３つの段階（図１）に帰属する。患者の臨床表現は表３及び表４に総括する。
【表２】
2013538583.tif 000004
【表３】
2013538583.tif 000005
【表４】
2013538583.tif 000006
【表５】
2013538583.tif 000007
【表６】
2013538583.tif 000008
【０１４８】
末梢血（４ｍｌ）を取ってＥＤＴＡ管に入れて、３０分以内に、ＥＤＴＡ管を８２０ｇの条件下で１０分間遠心する。その後、１ｍｌの血漿を１．５ｍｌの管に移して、１６，０００ｇの条件下で１０分間遠心して、残留した細胞破片を除去する。続いて、上澄みを清潔な管に移して、−８０℃で貯蔵する。
【０１４９】
ｍｉｒＶａｎａ  ＰＡＲＩＳ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ分離キット（ｍｉｒＶａｎａ  ＰＡＲＩＳ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）を用いて、メーカー（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）が提供する使用説明に基づいてＴｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてその濃度を定量的検出する。
【０１５０】
実施例２：ｍｉｃｒｏＲＮＡマイクロアレイ分析：
Ａｇｉｌｅｎｔ  ｍｉｃｒｏＲＮＡマイクロアレイプラットフォーム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、特定の血漿サンプルにおけるｍｉｃｒｏＲＮＡに対して定性分析を行う。該マイクロアレイは、Ｓａｎｇｅｒ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｖ．１０．１からの７２３個のヒトｍｉｃｒｏＲＮＡのプローブを含む。標識として単色ＣＹ３を１３７個の血漿サンプルのうちのいずれか１個からのＴｏｔａｌＲＮＡ（１００ｎｇ）に取り込む。ＸＤＲスキャナ（ＰＭＴ１００，ＰＭＴ５）を用いて遺伝子チップに対してスキャンを行い、Ａｇｉｌｅｎｔ  ｍｉｃｒｏＲＮＡマイクロアレイシステムの規定に基づいて標識及びハイブリダイゼーションを行う。Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｒｅｖ．  ９．５．３  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を通じて、マイクロアレイ映像情報を光点強度値に変換する。バックグラウンドを除去した信号を安定した内部パラメータｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を用いて標準化を行う。その後、基底数が２であるｌｏｇ変換を行う。１つのアレイにおける重複点のチップ間の変動係数（ＣＶ）が１５％を超えるかまたは検出可能な信号が５％未満であれば信頼できないサンプルであり、上記信頼できないサンプルを排除してから、さらなる分析を行う。
【０１５１】
被験者の人工統計学的特性は記述統計学によって報告される。カイ二乗またはＴ−検定はトレーニングセットとバリデーションセットとの間の比較（表５）に用いられる。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定は、ＨＣＣ群、健康群、ＣＨＢ群及び肝硬変群の間の全体的な比較に用いられる。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙアンペアード検定は２つの群の間の比較に用いられる。これらの検定で得られたｐ値は全てＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法によって多重検定と校正を行う。全てのｐ値はいずれも両側のものである。
【０１５２】
以下の基準を採用して、マイクロアレイに検出可能な信号がある候補ｍｉｃｒｏＲＮＡを選択して検証に用いる：（１）ＨＣＣ群、健康群、ＣＨＢ群及び肝硬変群の間のＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定の校正後のｐ値が０．００１未満；（２）ＨＣＣ群と健康群との間のＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙアンペアード検定の校正後のｐ値が０．０５未満；（３）ＨＣＣ群とＣＨＢ群との間のＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙアンペアード検定の校正後のｐ値が０．０００００００１未満；及び（４）ＨＣＣ群と肝硬変群との間のＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙアンペアード検定の校正後のｐ値が０．０００１未満。
【０１５３】
実施例３：１３７個のサンプルのマイクロアレイデータ
更なる検証に用いられる１５個の候補ｍｉｃｒｏＲＮＡのマイクロアレイ分析における発現は表５に示すとおりであり、選択基準を満たすｍｉｃｒｏＲＮＡをボールド体で示す。
【表７】
2013538583.tif 000009
【０１５４】
実施例４：１０２個の血漿サンプルによる１５個の候補ｍｉｃｒｏＲＮＡの評価
１０２個の血漿サンプルの独立したグループ群及び異なる技術基盤を採用して、マイクロアレイでスクリーニングした１５個の候補ｍｉｃｒｏＲＮＡに対して評価を行う。ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ検出キット（ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、メーカーの使用説明に基づいて操作する。全ての検出はいずれも３回繰り返す。ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８の発現レベルを内部パラメータとする。１０２個のサンプルの２０％を超えて、ＣＴ値が３５サイクルより大きく発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡは排除され、さらなる分析は行わない。
【０１５５】
Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定は、ＨＣＣ群、健康群、ＣＨＢ群及び肝硬変群の間の全体的な比較に用いられる。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定は２つの群の間の比較に用いられる。これらの検定で得られたｐ値は全てＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法によって多重検定と校正を行う。全てのｐ値はいずれも両側のものである。
【０１５６】
１５個の候補ｍｉｃｒｏＲＮＡのマイクロアレイ分析における発現は表５に示すとおりである。１５個のｍｉｃｒｏＲＮＡのうちの１２個が品質管理過程を経ている。それらのうちの７個（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１）のＨＣＣ群と対照群との間における発現レベルは有意な差異を有する。１５個の候補ｍｉｃｒｏＲＮＡの定量ＲＴ−ＰＣＲにおける発現プロファイルは表６に示すとおりである。特に好ましいｍｉｃｒｏＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１  ｔｏ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）をボールド体で示す。
【表８】
2013538583.tif 000010
【０１５７】
実施例５：４０７個のサンプルを含んでいるトレーニングセットにおける１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ診断モデルの構築
他の３０５個の血漿サンプルに定量ＲＴ−ＰＣＲ検出方法を用いて、７個の差次的発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現プロファイルをさらに評価する。
【０１５８】
４０７個の血漿サンプルは結合されてトレーニングセットとして用いられてＨＣＣ診断ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せを構築する。同様に、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定は、ＨＣＣ群、健康群、ＣＨＢ群及び肝硬変群の間の全体的な比較に用いられる。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙアンペアード検定は２つの群の間の比較に用いられる。これらの検定で得られたｐ値は全てＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法によって多重検定と校正を行う。全てのｐ値はいずれも両側のものである。
【０１５９】
段階的ロジスティック回帰モデルは、トレーニングセットに基づいてｍｉｃｒｏＲＮＡ診断マーカーを選択することに用いられる。ＨＣＣに罹患していると診断される予測確率は、マーカーの代わりに受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を構築することに用いられる。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、血清ＡＦＰとｍｉｃｒｏＲＮＡの組み合わせの診断効果の評価に用いられる。ＭｅｄＣａｌｃ（１０．４．７．０）ソフトウェアはＲＯＣ及び回帰分析を行うことに用いられる。
【０１６０】
７個の候補ｍｉｃｒｏＲＮＡのトレーニングセットにおける発現プロファイル及び診断効果は、表７に示すとおりである。ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せのＡＵＣはＡＦＰのＡＵＣより有意に大きい（０．８６ｖｓ．０．７６、ｐ＜０．００１、図３Ａ）。
【表９】
2013538583.tif 000011
【０１６１】
実施例６：３９０個のサンプルのバリデーションセットにおける上記ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せの検証
トレーニングセットから推測されたパラメータは、独立したバリデーションセット（３９０個の血漿サンプル）に用いられて、ＨＣＣに罹患していると診断される確率を予測する。同様に、定量ＲＴ−ＰＣＲ検出方法を用いて実験を行う。予測確率は、受信者動作特性曲線の構築に用いられる。
【０１６２】
ＭｉｃｒｏＲＮＡの組合せとＡＦＰとの間のＡＵＣのバリデーションセットにおける比較が示すように、ｍｉｃｒｏＲＮＡの組合せの診断正確度がＡＦＰより有意に高い（ＡＵＣ：０．８９ｖｓ．０．６８、ｐ＜０．００１、図３Ｂ）。
【０１６３】
ＭｉｃｒｏＲＮＡの組合せとＡＦＰのＨＣＣ群と健康群、ＣＨＢ群、及び肝硬変群を区別する効果に対しても比較（図４）を行った。該分析により、ＭｉｃｒｏＲＮＡの組合せとＡＦＰはいずれもＨＣＣ群と非ＨＣＣとを区別できることが証明された。しかしながら、ＭｉｃｒｏＲＮＡの組合せのＡＵＣはＡＦＰより有意に大きい（ＨＣＣと健康群：０．９５ｖｓ．０．６４、ｐ＜０．００１、ＨＣＣとＣＨＢ：０．８５ｖｓ．０．６２、ｐ＜０．００１  ａｎｄ  ＨＣＣと肝硬変群：０．８９ｖｓ．０．７８、ｐ＝０．００２）。
【０１６４】
実施例７：ＭｉｃｒｏＲＮＡの組合せとＡＦＰの異なるＢＣＬＣ病期における診断性能
ＭｉｃｒｏＲＮＡの組合せとＡＦＰの異なるＢＣＬＣ病期における診断性能がさらに評価された（図５）。早期及び中期ＨＣＣ（ＢＣＬＣ  ０、Ａ及びＢ期）の診断方面において、ＭｉｃｒｏＲＮＡの組合せの診断性能はＡＦＰより有意に高い（ＢＣＬＣ  ０期、ＡＵＣ  ０．９４ｖｓ．０．６８、ｐ＜０．００１；ＢＣＬＣ  Ａ期、ＡＵＣ  ０．９０ｖｓ．０．６５、ｐ＜０．００１；ＢＣＬＣ  Ｂ期、ＡＵＣ  ０．８５ｖｓ．０．７４、ｐ＜０．００１；図５Ａ、５Ｂ  ａｎｄ５Ｃ）。ＭｉｃｒｏＲＮＡの組合せとＡＦＰとの間の比較がＢＣＬＣ  Ｃ期の患者に集中する場合、その診断性能は有意な差異がない（ＡＵＣ  ０．８０  ｖｓ．  ０．７９、ｐ＝０．２４、図５Ｄ）。
【０１６５】
実施例８：ＭｉｃｒｏＲＮＡの組合せのＡＦＰ正常（２０ｎｇ／ｍｌ以下）群及び高ＡＦＰ（２０ｎｇ／ｍｌ超過）群における診断性能
ＡＦＰレベルに基づいてＭｉｃｒｏＲＮＡの組合せの診断正確度を評価する。ＡＦＰ正常（≦２０ｎｇ／ｍｌ）組において、ＭｉｃｒｏＲＮＡの組合せのＡＵＣはＡＦＰのＡＵＣより有意に高い（０．８７  ｖｓ．  ０．６３、ｐ＜０．００１、図６Ａ）。高ＡＦＰ（＞２０ｎｇ／ｍｌ）組において、ＭｉｃｒｏＲＮＡの組合せのＡＵＣは依然としてＡＦＰのＡＵＣより有意に高い（０．９０  ｖｓ．  ０．６９、ｐ＜０．００１、図６Ｂ）。
【０１６６】
実施例９：ＨＣＣ切除術前後のＭｉｃｒｏＲＮＡ発現の変化
それぞれ術前及び術後の６日目に、肝臓の外科的切除術を受けた５４人のＨＣＣ患者の血液サンプルを取る。定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてｍｉｃｒｏＲＮＡ発現プロファイルの変化をモニタリングする。全ての検出は、いずれも３回繰り返して、誤差を減少させる。Ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８の発現レベルを内部パラメータとして用いる。
【０１６７】
Ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２及びＡＦＰの発現レベルは、ＨＣＣ切除術後に有意に低下していることが観察される（平均差異は、それぞれ０．７７、１．７４及び６．６６、ｐ値はそれぞれｐ＜０．００１、ｐ＝０．０３及びｐ＜０．００１、図７）。Ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａの術後の発現レベルは術前の発現レベルに比べて多少高くなっている（平均差異は、それぞれ−０．６１、−０．８１及び−０．５５、ｐ値は、それぞれｐ＝０．０２、０．０６及び０．０６）。Ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルは、手術によって有意な変化は発生していない。
【０１６８】
得られた結果は、肝細胞がん患者の血漿におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの特異的発現を実証している。よって、本明細書で規定されるｍｉｃｒｏＲＮＡセットはユニークなｍｉｃｒｏＲＮＡバイオマーカーとして、肝細胞がん血漿のｍｉｃｒｏＲＮＡ発現プロファイルを通じて分析でき、肝がんの発生を早期診断できるだけでなく、肝細胞がんと慢性Ｂ型肝炎及び肝硬変とを区別できる。
【０１６９】
本発明は、血漿のｍｉｃｒｏＲＮＡ発現バイオマーカーの識別と検証に対して、血液サンプルにおいて肝細胞がんをスクリーニング、早期診断、区別診断することが可能であるユニークな分子マーカーを提供する。
【０１７０】
本願明細書において例を挙げて説明した本発明は、本明細書で特に提示していないいずれかの要素、制限が存在しない条件下で適切に実施できる。このため、例えば、術語「含み」、「含む」、「含有する」などは、幅広い意味を有しかつ無制限であると理解すべきである。また、本明細書で適用する術語と表現は説明のためのものであり、本発明を制限するものではなく、かつこれら術語及び表現を用いて表現または説明した特徴のいずれかの等価形式またはその組成部分を排除する意図はないが、本発明において保護を請求する範囲内で各種の修正を行うことが可能であると意識すべきである。よって、本発明は実施形態及び選択的特徴を通じて特に提示されているが、当業者は本発明に対する改変及び変更を取得可能であり、このような改変及び変更は本発明の範囲内に属していると理解すべきである。
【０１７１】
本発明について広範かつ上位概念的な説明を行った。上位概念の説明範囲内に属するそれぞれの狭い下位概念と上位に次ぐ概念も本発明の一部分を構成する。除去された主題が本発明で特に引用説明されているか否かにかかわらず、いずれかの主題が除去された条件または制限の否定を有する上位説明を含む。
【０１７２】
他の実施形態は特許請求の範囲内に属する。また、本発明のそれぞれの特徴または態様がマーカッシュグループを用いた形式で説明される場合、当業者は、本発明がマーカッシュグループのいずれかの構成要素または構成要素に次ぐグループの形式でも説明されることを理解できる。
【図１】
2013538583.tif 000012
【図２】
2013538583.tif 000013
【図３】
2013538583.tif 000014
【図４】
2013538583.tif 000015
【図５】
2013538583.tif 000016
【図６】
2013538583.tif 000017
【図７】
2013538583.tif 000018
【配列表】
2013538583000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年4月8日(2013.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類の核酸分子からなり、前記核酸分子はそれぞれ少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ配列をコードする肝細胞がん診断マーカーであって、
前記複数種類の核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードする８個の核酸分子を含み、且つ、少なくとも１種の標的血漿及び少なくとも１種の対照血漿において差次的発現される、肝細胞がん診断マーカー。
【請求項２】
ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２及びｈｓａ−ｍｉＲ−２１をコードする前記核酸分子の少なくとも１種の標的血漿における発現が、少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇され、
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２３をコードする前記核酸分子の前記少なくとも１種の標的血漿における発現が、前記少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて低下される、請求項１に記載の肝細胞がん診断マーカー。
【請求項３】
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８をコードする前記核酸分子の前記少なくとも１種の標的血漿における発現が、前記少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて変化がない、請求項１に記載の肝細胞がん診断マーカー。
【請求項４】
前記少なくとも１種の対照血漿は、健康な個体、慢性Ｂ型肝炎患者または肝硬変患者からのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の肝細胞肝がん診断マーカー。
【請求項５】
前記肝細胞肝がんが早期肝細胞がんである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の肝細胞肝がん診断マーカー。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の肝細胞肝がん診断マーカーを含む、肝細胞肝がん診断キット。
【請求項７】
請求項６に記載の肝細胞肝がん診断キットであって、
前記診断は、ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１を満たす１つの回帰モデルを用いて行われ、
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルはｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出され、前記回帰モデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、肝細胞肝がん診断キット。
【請求項８】
前記少なくとも１種の対照血漿は、健康な個体、慢性Ｂ型肝炎患者、または肝硬変患者からのものである、請求項６に記載の肝細胞肝がん診断キット。
【請求項９】
前記肝細胞肝がんが早期肝細胞肝がんである、請求項６に記載の肝細胞肝がん診断キット。
【請求項１０】
請求項１に記載の肝細胞肝がん診断マーカーを含み、
前記少なくとも１種の対照血漿は健康な個体からのものである、少なくとも１つの肝細胞肝がん患者の血漿と少なくとも１つの健康な個体の血漿とを区別するためのキット。
【請求項１１】
請求項１０に記載のキットであって、
前記区別はｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１を満たす１つの回帰モデルを用いて行われ、
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルはｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出され、前記回帰モデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、キット。
【請求項１２】
前記肝細胞肝がんが早期肝細胞肝がんである、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
請求項１に記載の肝細胞肝がん診断マーカーを含み、
前記少なくとも１種の対照血漿は慢性Ｂ型肝炎患者からのものである、少なくとも１つの肝細胞肝がん患者の血漿と少なくとも１つの慢性Ｂ型肝炎患者の血漿とを区別するためのキット。
【請求項１４】
請求項１３に記載のキットであって、
前記区別は、ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１を満たす１つの回帰モデルを用いて行われ、
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルはｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出され、前記回帰モデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、キット。
【請求項１５】
前記肝細胞がんが早期肝細胞がんである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
請求項１に記載の肝細胞がん診断マーカーを含み、
前記少なくとも１種の対照血漿は肝硬変患者からのものである、少なくとも１つの肝細胞がん患者の血漿と少なくとも１つの肝硬変患者の血漿とを区別するためのキット。
【請求項１７】
請求項１６に記載のキットであって、
前記区別は、ｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）＝−１．４２４−０．２９２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２＋０．４５１１＊ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２＋０．６１１２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−０．１７９６＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−０．２４８７＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−０．３５４２＊ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ＋０．２０９＊ｈｓａ−ｍｉＲ−８０１を満たす１つの回帰モデルを用いて行われ、
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−８０１の発現レベルはｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８を内部パラメータとして検出され、前記回帰モデルにおけるｌｏｇｉｔ（ｐ＝ＨＣＣ）値の少なくとも１種の標的血漿における発現が少なくとも１種の対照血漿における発現に比べて上昇される、キット。
【請求項１８】
前記肝細胞がんが早期肝細胞がんである、請求項１６に記載のキット。
【国際調査報告】
2013538583.tif 000019
2013538583.tif 000020
2013538583.tif 000021
2013538583.tif 000022
2013538583.tif 000023