(57)【要約】  本発明は、タンパク質のフォールディングプロセスを特性化及び多次元表示する新規の方法に関する（図９）。上記方法は、系統的に新規の組合せにおいて、リフォールディング及びそれにより修飾されたタンパク質の流体力学的サイズを動態配列することと、タンパク分解によって断片化された中間体を生体情報検出パターンに基づいて関連づけることと、中間体のフォールディング経路関連性を分類することと、フォールディング配列を特性化することと、特性化されたフォールディングプロセスをコンピュータを用いて多次元視覚化することとを含む。上記方法は、リフォールディング時に修飾され、それにより構造的にブロックされた全ての中間体を、該中間体の４つの個々の特性、すなわち流体力学的サイズ、形成時間、フォールディング経路関連性及び量に従って同定及びデジタル化することを特徴とする。上記の新規の方法は、タンパク質フォールディング及びタンパク質症の研究、タンパク質工学、抗体工学、分子生物学、治療薬、バイオテクノロジー、タンパク質医薬のバイオテクノロジー生産、タンパク質分類学、並びに新規の機能タンパク質材料の開発及び生成のためのナノテクノロジーの分野において多くの用途を有する。本発明によると、異なるアッセイキット、デバイス、ソフトウェア及び機械の形態の多くの多様な製品を作製及び使用して、上記の方法を行うことができる。【選択図】図９
2013538045.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質のフォールディング手順を特性化及び多次元視覚化する方法であって、リフォールディングプロセス中に様々な時間間隔で化学修飾によって捕捉された全ての中間体を、少なくとも４つの個々の特性、すなわちその流体力学的サイズ、形成時間、フォールディング経路同一性及び定量化可能な量によって同定及びデジタル化し、更にフォールディング経路が４つの相からなり、該方法が全てのタンパク質のフォールディング経路の特性化に適用可能であり、該方法が以下の工程：
１）理論的断片質量同定パターンを作成し、対応する手順及び実施方法を決定する、前記特性化対象のタンパク質の一次構造、二次構造及び場合によっては三次元構造、その生物学的性質及び物理化学的性質、並びにその目的に基づく前記特性化対象のタンパク質の解析と、
２）前記タンパク質を変性、適用可能な場合には、還元及び還元剤の除去、クロマトグラフ分離、並びに分光同定に供する、最大限の流体力学的サイズを有する前記タンパク質の最適にアンフォールディングされた画分の分離と、
３）リフォールディングバッチの一部を或る特定の時間間隔で分離し、生じる中間体を、アミノ酸の反応性に応じて適切な試薬をそれに応じた側鎖試薬ととともに用いて異なる程度に修飾し、それにより独自の個々の特性、すなわち流体力学的サイズ、形成時間、量、及び特定のフォールディング経路への帰属関係を有する構造的に比較的安定した中間体へと変換する、バックフォールディング、及び適用可能な場合には再酸化プロセス中の前記タンパク質中間体の動的修飾と、
４）前記リフォールディングプロセス中に修飾された前記中間体を、他の分光法、優先的には動的光散乱（ＤＬＳ）とともに電気泳動又はクロマトグラフィーを用いて研究して、前記中間体の個々の特性を解析及び定量化し、前記リフォールディングプロセスのフィンガープリントプロファイルを作成し、得られる修飾中間体を次の工程に使用する、前記中間体の分離及び定量化、並びにそれらの流体力学的サイズ、及び適用可能な場合、形成時間の関数としてのそれらの量の記述と、
５）前記修飾中間体を、それらの流体力学的サイズに従って分離するとともに、優先的にはトリプシン、並びに任意にエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃ及びＡｓｐ−Ｎ、並びに他のエキソプロテアーゼを用いてタンパク分解によって切断するか、又は断片の差別化を支持するために、必要に応じて化学的に切断する、前記中間体の断片化と、
６）同定を目的として、全ての断片、並びにジスルフィド架橋及び／又は架橋剤によって結合したより大きな断片の分子質量を質量分析によって測定し、データベースに文書化するとともに、断片質量同定表で分類し、これに関し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ（タンデム質量分析）及び／又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ＿ＭＳ＿ＰＳＤ（ポストソース分解post-source-decay））を類似断片の正確な差別化に用いる、断片化された前記中間体の検出と、
７）前記修飾のタイプ、数及び位置を、質量分析によって文書化した前記断片の数及び質量と、理論的断片質量同定パターンとを比較することによって決定した全中間体の特有の個々の特質とし、同じ特質を有する前記中間体をグループに割り当て、グループ化した前記中間体を更なるフォールディング経路に指向し、この結論をタンパク質フォールディング動態及びタンパク質進化に基づく基準を用いて補正及び補完する、前記中間体のフォールディング経路同一性の決定と、
８）全中間体をその個々の特性、すなわち流体力学的サイズ、形成時間、フォールディング経路同一性及び量によって同定し、グループに選別したこれらの同定された中間体を、或る特定のフォールディング経路に割り当て、これらの中間体が３つの更なる基準、すなわち同じ修飾特性、それらのグループ内のそれらの流体力学的サイズの減少、並びに独特のフォールディング経路内のそれらの経時的な形成及び喪失の過程を満たすことができる、前記中間体の同定及び分類と、
９）フォールディングプロセスの以下の特性：天然の構造に対する主要なフォールディング経路、最も速いフォールディング経路及び最も遅いフォールディング経路、ミスフォールディングをもたらす経路、全ての経路におけるフォールディング動態、ジスルフィド結合形成及び／又は架橋反応の順番、ノットの形成及びタンパク質フォールディングプロセスに対するそれらの影響、ジスルフィド再構成を含む分子内再構成、中間体形態のフォールディング経路の分枝、延長、交差及び同時発生を決定する、同定された特性に従って独特のフォールディング経路に割り当てられた全ての中間体の同時多次元グラフ表示を用いたフォールディングプロセスの特性化と、
１０）前記フォールディングプロセスを視覚化し、多次元座標系において４つの特性によって規定された座標にプロットするためにコンピュータグラフィックスを用いてアニメーション化し、視覚化の多様性をこれら４つの特性の組合せ及び変換によって更に拡張することができる、前記タンパク質フォールディングプロセスの多次元視覚化と、
を含むことを特徴とする、タンパク質のフォールディング手順を特性化及び多次元視覚化する方法。
【請求項２】
工程３）を、以下の実施形態の少なくとも１つ：
ジスルフィドを含有するタンパク質の動的修飾、
ジスルフィドを含まないタンパク質の動的修飾、
マルチドメインタンパク質の動的修飾、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートした翻訳後及び翻訳時の動的修飾、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートしたタンパク質フォールディング中の動的修飾、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質生合成中の動的修飾、
並びに以下の手順の少なくとも１つ：
１種類のアミノ酸の残基を、至適反応条件下で単一の側鎖試薬でマークする単一修飾、
２種類以上のアミノ酸を、種々の反応条件を用いて１つ又は複数のタイプの試薬と反応させるか、又は初めに別個に単一若しくは複数のバッチで標識を行い、次いで混合する、多重修飾、
１つのタンパク質内の２つのアミノ酸間の内部二重修飾を、多様な実施形態において調節された反応条件下で二官能性試薬を用いて行う、内部架橋剤修飾、
並びに以下の反応動態の少なくとも１つ：
水素結合の形成、二次構造的要素の形成、及びポリペプチド鎖の疎水性崩壊に対する数ミリ秒から数秒の時間スケールを含む、非常に速いタンパク質フォールディングプロセスに対する数ナノ秒及び数マイクロ秒から数ミリ秒の間の時間スケール、
速いフォールディング相及び別個のフォールディング経路に属する中間体の形成に対する数マイクロ秒から数分の時間スケールを含む、速いタンパク質フォールディングプロセスに対する数マイクロ秒から分の時間スケール、
中間体、「モルテングロビュール」、及び天然の状態が達成されるまでの更なるフォールディングの発生のための数分から数時間又は数日間の時間スケールを含む、遅いタンパク質フォールディングに対する数ミリ秒から数分までの時間スケール、
並びに以下の化学物質の少なくとも１つ：
タンパク質の変性剤、
ジスルフィドを含有するタンパク質の還元剤、
ジスルフィドを含有するタンパク質の修飾に特異的な様々な成分及び組成物を含む再酸化剤、
同位体標識を有しない及び／又は有する側鎖特異的な試薬、
蛍光標識及び／又はスピン標識されたレポーター基を有する側鎖特異的な試薬、例えばＤＩＧＥ（ディファレンスゲル電気泳動）用の試薬、
光親和性標識用の試薬を含む、内部架橋剤マーキングのための側鎖特異的なゼロ長のホモ二官能性試薬及びヘテロ二官能性試薬、
ビオチン化試薬、
翻訳時修飾及び翻訳後修飾のための試薬及び／又は酵素、
細胞抽出物、
フォルダーゼ及び／又はシャペロン、
フォルダーゼ及び／又はシャペロンの候補阻害剤、
タンパク質のフォールディング及び分解のための化学的及び生物学的な候補作用物質、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳時修飾のための化学的及び生物学的な候補試薬、
ｉｎ  ｖｉｒｔｏ翻訳後修飾のための化学的及び生物学的な候補試薬、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成のための化学的及び生物学的な候補試薬、
タンパク質のリフォールディングの補助物質及び安定化物質、
で行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程４）を手作業で又は自動的に、小規模で、本発明の概念及び設計に従って、以下の手順工程：
以下の少なくとも１つの改善を有する、電気泳動による、優先的には包括的な及び親水性のタンパク質を対象としたポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた達成、
緩衝溶液を充填し、カソードの緩衝液リザーバ内に配置した埋め込み透過性容器、又は所要の緩衝溶液を必要に応じた速度で連続的に、若しくは数回に分けて不連続的に送達するための細い管によって外部の容器と連結された、カソードの緩衝液リザーバ内の緩衝液マニホールドを用いた、電気泳動時の緩衝液のｐＨ、成分、又は強度の調節のための緩衝液送達系の連結、
タンパク質中間体の電荷分布及び極性分布の動的相違、並びに付加的なイオン流動を用いたそれらの相互作用を、緩衝液の強度、緩衝液の組成及び緩衝液のｐＨの調節によって増大させる、分離分解能の動的調節及び最適化、
中間体ゲルバンドに焦点を合わせ、中間体ゲルバンド間の距離を増大させるための、強い疎水性対イオンと組み合わせた、短期間の電圧の増大、短期間の緩衝液成分の極性及び／又はそれらの濃度の変化、並びに短期間の極性の逆転を用いたパルス電気泳動の適用、
様々なゲル組成物及びゲル形態の適用、
ゲルから氷を含有する冷却リザーバへの排熱のためのペルチェ冷却板及び循環液冷却系を用いた、熱作用によって引き起こされる中間体の拡散の抑制、
全てのタンパク質中間体の分離及びそれらの流体力学的サイズの識別、主として強酸性、強塩基性、疎水性の、又は膜タンパク質及び巨大タンパク質であるタンパク質等の電気泳動法に適さない中間体の分離及びサイズ分類のための、分光解析デバイス、優先的には動的光散乱（ＤＬＳ）及び静的光散乱（ＳＬＳ）と組み合わせた、マイクロ規模、解析規模及び半分取規模での以下の手順を用いる液体クロマトグラフィー、電気クロマトグラフィー及びフィールドフローフラクショネーション、
いずれの場合にも分光解析と組み合わせた、分離され、個別に回収された中間体の流体力学的サイズの順番の直接的決定のための、必要性若しくは選好性に応じて種々の分離固定相を充填したマイクロゲル濾過カラムの適用、又はマイクロフィールドフローフラクショネーションチャネルの適用による単一カラム液体クロマトグラフィー、
中間体、とりわけ非常に似た流体力学的半径を有するが、同じ又は異なるフォールディング経路に属する中間体の特異的な分離及びサイズ差別化のための、マイクロフィールドフローフラクショネーションチャネルを含む、ゲル濾過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーからなる、必要性及び要望に応じて並行又は連続して連結されたマイクロカラムの組合せである、分光測定と併用したマルチカラム液体クロマトグラフィー、
分離され、各々個々の容器又はマイクロタイタープレートに捕捉された中間体の流体力学的サイズの分光的差別化と、好ましくは蛍光、ＵＶ、ＣＤ、ＮＭＲ、ＥＰＲ及びフーリエ変換で補助したＤＬＳ（動的光散乱）及びＳＬＳ（静的光散乱）を用いたそれらの定量化との組合せ、
少なくとも１つの以下の付加的な機能を有する調節したＤＬＳデバイス及びＳＬＳデバイスを用いた、種々の流体力学的サイズで分布しているか、又は非常に似た流体力学的サイズを有し、種々のフォールディング経路に属する可能性がある、単一サンプル中の中間体の特異的な差別化、
測定時間の延長による差別化の分解能の増大、
プログラム制御された段階的な温度の上昇によるＴｍ（融点）差別化、
内部の真空蒸発又は通気によって達成される、希釈又は濃縮による個々のマイクロ容器又はマイクロタイタープレート内のサンプルの濃度の変化、
所望の緩衝液組成物の自動化されたマイクロタイトレーション又は手動ピペット操作によるｐＨプロファイル及び緩衝液系の変化、
中間体の更なる構造的差別化のためのサンプルの固有粘度及びゼータ電位の決定及び評価、
照射、加熱及び冷却、超音波、マイクロ波、電場及び磁場の形態でのエネルギーの供給又は放出によるサンプルの生物レオロジー性質の変化、
特別に開発されたソフトウェアによる差別化された中間体の解析及び分類、
中間体のオンラインでの自動化及び小型化された分離、並びにそれらの流体力学的サイズの差別化のための、好ましくはＤＬＳ分光分析及びＳＬＳ分光分析と組み合わせた、キャピラリー電気泳動による達成、
の少なくとも１つを用いて行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記フォールディングプロセスを、付加的な第５の特性、すなわち中間体の構造を有する全ての又は顕著な中間体の３次元構造を決定することによって特性化し、この統合された第５の座標によって多次元座標系において示し、多くの方法で視覚化することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
治療用タンパク質のバイオテクノロジー生産を改善又は最適化するための、種々の分子環境における、その基質に対するリフォールディングタンパク質の活性及び機能性の変化の調査、検査及び評価を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項６】
基礎的なタンパク質工学のフォールディングプロセス、並びに得られるタンパク質の機能性及び活性における変化に関する本発明の所見を検証、検査及び評価する、タンパク質工学における前記方法の使用を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートした動的翻訳時修飾及び翻訳後修飾のプロセスの特性化を規定の方法で行い、適切な比較及び評価に供するｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳後修飾されるタンパク質治療薬のバイオテクノロジー生産の条件の最適化、並びに翻訳時修飾及び／又は翻訳後修飾に対する化学的及び生物学的な補助物質又は阻害物質のスキャニングのための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートした生合成、及び場合によっては生じる翻訳時修飾及び翻訳後修飾のプロセスの動的特性化及び定量化を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項８】
タンパク質の修飾の特性化を規定の工程に従って行い、タンパク質固定化及びタンパク質チップ製作の技術を用いる、タンパク質のバイオテクノロジー生産のプロセス開発のための、それらのｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳後修飾時にｉｎ  ｖｉｔｒｏシミュレーションによって調査されるタンパク質のリフォールディングプロセスの動的特性化を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項９】
選択された生物学的及び／又は化学的な候補阻害剤及び／又は候補補助物質が、タンパク質のリフォールディングプロセスの特性化手順に含まれる、タンパク質フォールディングプロセスに影響を与える生物学的物質又は化学物質の探索を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項１０】
検査対象のフォルダーゼ又はシャペロンの存在下及び非存在下での特性化されたリフォールディング実験結果の比較によって効果を規定する、タンパク質フォールディングに対するフォルダーゼ又はシャペロンの影響の調査を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項１１】
検査対象のタンパク質を、初めにそれぞれの候補阻害剤の非存在下及び次いでその存在下での、各々の所与のフォルダーゼ、シャペロン及びタンパク質分解の作用物質に対する並行実験においてフォールディングプロセスの特性化、比較及び評価に供する、フォルダーゼ、シャペロンの生物学的及び化学的な阻害剤、並びにタンパク質分解の作用物質の探索を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項１２】
生物学的及び／又は化学的な因子の存在下での自己集合及び重合の初期事象を、様々な生理的及び生化学的な条件において特性化及び評価する、ナノタンパク質材料の開発及び生成のための、リフォールディングプロセス時のポリペプチド又はタンパク質の制御された自己集合及び重合の調査を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項１３】
アンフォールディングされたタンパク質に特異的に結合し、フォールディングを改善し、タンパク質構造を安定化させるか、又はミスフォールディングされたタンパク質の疎水性ドメインをマスキングし、溶解性を増大させ、アンフォールディングされたタンパク質の凝集を防止する或る特定の生物学的及び／又は化学的な安定化物質の影響を、タンパク質症タンパク質のリフォールディングの特性化によって検出する、タンパク質によって引き起こされる疾患（タンパク質症）に対する薬理学的シャペロンの探索を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項１４】
プリオンタンパク質のフォールディングプロセスを、フォールディングプロセスに影響を与える生物学的物質及び／又は化学物質を用いた並行実験において不安定化条件下で特性化し、その影響物質の非存在下で予め特性化されたフォールディングプロセスと比較する、病因を明らかにするか、又は治療選択及び防止可能性を探索するための、第１に凝集の発生を含むＰｒＰＣ（細胞プリオンタンパク質）からＰｒＰＳＣ（スクレイピープリオンタンパク質；プリオンタンパク質の病原型）へのリフォールディング、及び第２に凝集の喪失を含むＰｒＰＳＣからＰｒＰＣへの逆転のプロセスの特性化を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項１５】
検査対象のタンパク質を、そのリフォールディングプロセス中に、修飾を引き起こす触媒によって加速される異性化、脱アミド化及びラセミ化、又は光化学エネルギー及び熱エネルギーの供給、又はラジカル開始作用、酸化ストレス及び環境因子に供し、それにより変更されたそのリフォールディングプロセスを特性化し、影響因子の非存在下で予め特性化されたプロセスと比較する、異性化、脱アミド化及びラセミ化によるタンパク質老化、遊離ラジカル作用、酸化ストレス及び環境影響によって引き起こされるタンパク質分解の研究のための、前記検査対象のタンパク質のフォールディングプロセスの動的特性化を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項１６】
各々のタンパク質の個々のフィンガープリントとして特性化されたフォールディングプロセスが、タンパク質の機能的関係及び進化的関係をもたらし、これまでタンパク質の構造、トポロジー、相同性及び進化的関係によってのみ決定されていたタンパク質分類において付加的な基準として統合する、新たなレベルのタンパク質フォールディングに対するタンパク質の分類（分類学）及びタンパク質進化の調査を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項１７】
リフォールディングプロセスを初めにタンパク質及びその複合体についてのみ特性化し、次いでリフォールディングプロセス中に様々な時間間隔でタンパク質を複合体形成物質と合わせ、これらのアプローチの特性化を、このタンパク質複合体の基質を供給して及び供給せずに、様々な化学的及び生物学的な因子の下で解析し、比較する、形成プロセス並びにそれに伴う活性及び機能性の変化を調査し、複合体形成に作用する化学的及び生物学的な作用物質を発見するための、ヌクレオチドタンパク質、糖（glyko-）タンパク質及びリポタンパク質の複合体形成のフォールディングプロセスの動的特性化を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項１８】
疾患関連タンパク質のフォールディングプロセスにおける変化を特性化し、或る特定の疾患の診断及び予後診断の基準として規定する、タンパク質ミスフォールディングによって引き起こされる疾患の診断及び予後診断を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項１９】
検査対象のタンパク質のフォールディングプロセスを、初めに他のタンパク質及び／又は化学的及び生物学的な阻害剤の非存在下、次いでそれらの影響下で種々の分子環境において特性化し、結果を比較及び評価する、タンパク質凝集機構の解明、並びに化学的及び生物学的な阻害剤の探索のためのフォールディングタンパク質間又はフォールディングタンパク質と天然タンパク質との間の、リフォールディング時の同じタンパク質又は異なるタンパク質の凝集の初期プロセスの動的特性化を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項２０】
検査されるタンパク質の設計されたフォールディング操作を、至適分子環境において初めに他のタンパク質の非存在下で特性化し、次いでその影響下で特性化して、結果を比較及び評価する、治療用標的タンパク質を探索し、薬物の合理的設計を可能にし、バイオテクノロジープロセスを最適化するための特定のタンパク質の該タンパク質のリフォールディングに基づく配座挙動及び触媒性の研究のための、リフォールディングタンパク質間又はリフォールディングタンパク質と天然タンパク質との間での相互作用の影響下でのフォールディングプロセスの動的特性化を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項２１】
新たな設計された抗体及び抗原を、再設計された抗体の選択性、特異性、親和性、フォールディング効率、熱力学的安定性、薬理学的動態及び生物工学的生産性、並びに抗原の抗原性の調査のために、生理的及び生化学的な至適分子環境下、化学的及び生物学的な因子の非存在下及び／又は存在下で、初めに個々に、次いで合わせて特性化、比較及び評価に供する、抗体工学の最適化及び合理化のための、抗原抗体反応のプロセス及び抗原抗体複合体の分解プロセスの動的特性化を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項２２】
無細胞アプローチにおいて種々の長さで合成され、同位体標識を有する又は有しない必要なアミノ酸を供給することによって調節された生物学的及び物理化学的な至適因子の下で得られ、ミニ中間体として指定されるタンパク質のポリペプチド断片を、初めに合わせて回収し、次いでクロマトグラフィーによって特異的に分離し、次いでそれらのフォールディングプロセスの特性化及び比較に供する、その新生合成と同時に開始されたタンパク質のフォールディングの解明、及び開始されたタンパク質のフォールディングに影響を与える物質の探索のための、生合成によって生じ、場合によっては翻訳時修飾されるタンパク質のフォールディングプロセスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性化を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法の適用。
【請求項２３】
各々が前記方法の少なくとも１つの工程の手作業による又は自動化された実行に必要とされるキット、装置／デバイス及びソフトウェア、並びに考案及び設計された機械を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法を行うための手段又は請求項に５〜２２に記載の適用の実現のための手段。
【請求項２４】
調査されるタンパク質の修飾中間体である、請求項１〜４に記載の方法又は請求項５〜２２に記載の方法の適用において生成される生成物。
【請求項２５】
以下の方法：
新規の薬物の発見及び開発、バイオテクノロジー生産の改善及び最適化、標的タンパク質の復元及び保存のための、タンパク質フォールディング及びタンパク質分解に作用する化学的及び生化学的な作用物質のスクリーニング、
タンパク質の構造的特徴、活性及び薬物動態及び薬理学的性質の改善のための、予め特性化された融合タンパク質の修飾、再設計、合理的設計及びタンパク質の至適生成、
における、請求項２４に記載の生成物の使用。
【請求項２６】
タンパク質のフォールディング、ミスフォールディング、凝集、相互作用、自己集合、重合、老化、分解及び新生合成の機構の解明、抗体工学及びタンパク質工学の効率化並びにその効果の増大、タンパク質の活性及び機能性の改善、標的タンパク質のバイオテクノロジー生産の最適化、ナノタンパク質材料の開発、タンパク質分類学の発展、並びにタンパク質のフォールディング及び分解に影響を与える新規の生物学的及び化学的な作用物質及びタンパク質治療薬の探索のための、タンパク質の最適に完了したアンフォールディング、リフォールディング及びマニホールド修飾後の、種々の流体力学的サイズ及び比較的安定した構造的形状を特徴とし、多様な分子環境下並びに種々の生理化学的及び生化学的な条件下で行われたそれらのフォールディングプロセスの特性化及び多次元表示のための様々な実施形態において少なくとも４つの独立した特性を有する修飾中間体である、請求項１〜４に記載の方法において生成されるか、又は請求項５〜２２に記載の方法の適用において生成される生成物の使用。
【請求項２７】
多次元エネルギーランドスケープ系に移行可能であり、本発明の方法の手順工程のより良好な設計、検証及び最適化に使用することができる、実験に基づく４つのフォールディング相及び５つの機能的ゾーンを有するタンパク質フォールディングの過程に関する要約された新たな知識のグラフによる説明を特徴とする、請求項１〜４に記載の方法又は請求項５〜２２に記載の方法の適用の最適な実行のためのマルチフォールディング経路モデル。
【請求項２８】
請求項１〜４に記載の方法若しくは請求項５〜２２に記載の方法の適用を実行するか、又は請求項２７に記載のマルチフォールディング経路モデルを使用することによって決定される、フォールディングプロセスの説明を含有する構築されたデータベース。
【請求項２９】
タンパク質のフォールディングプロセスの特性化に基づくデータベースのデータベースセンター及びサービスセンターへの拡大を特徴とする、請求項２８に記載の構築されたデータベースの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［注釈］
タンパク質のフォールディング事象を特性化及び多次元表示する新たな方法。
【０００２】
［説明］
本発明は、タンパク質のフォールディング事象を特性化及び多次元表示する新たな方法に関する。本発明の対象は、リフォールディングされ、それにより修飾されたタンパク質の流体力学的サイズの動態配置（kinetic arrangement）、生体情報認識モデルに基づく単離され、タンパク質分解によって断片化された中間体の配分（マッピング（mapping））、動的修飾された中間体のフォールディング経路の分類、フォールディングプロセスの解明、及び特性化されたフォールディング手順の多次元視覚化を組み合わせた数工程の包括的な方法である。
【０００３】
この新たな方法では、リフォールディング及び修飾されたタンパク質の中間体を、従来の方法のように、それらのジスルフィド結合のパターンによって同定するだけでなく、本発明に従って、それらの４つの個々の特性、すなわち流体力学的サイズ、形成時間、フォールディング経路同一性、及びフォールディング経路の数によっても同定及び多次元視覚化する。このようにして、ジスルフィド（disulfide）結合を含有するタンパク質だけでなく、ジスルフィドを含まないタンパク質についても検査し、それらのフォールディングプロセスの解明によって、それらの分子の種類、それらのタイプ及びそれらのサイズを制限することなく特性化し、多次元視覚化することができる。
【０００４】
この方法の実行のために、本発明に従って様々な製品を製造し、種々のアッセイキット、装置、ソフトウェア及び機械の形態で適用することができる。
【０００５】
［発明の分野］
本発明の領域には、タンパク質フォールディング及びタンパク質症の研究、タンパク質工学、抗体工学、分子生物学、免疫生物学、治療薬、バイオテクノロジー、タンパク質医薬のバイオテクノロジー生産、タンパク質分類学、並びに新たな機能タンパク質材料の開発のためのナノテクノロジーが含まれる。
【背景技術】
【０００６】
［技術的背景］
タンパク質は、それらの生物学的機能を発揮することが可能となるには、正確にフォールディングされる必要がある。リボソーム（ribosome）で合成された線状ポリペプチド鎖は、適切な二次構造、三次構造及び四次構造へと移行する必要がある。誤ってフォールディングされたタンパク質は、現在議論に上っている数多くの疾患に関与する。多数の筋肉疾患だけでなく、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、スクレイピー及びＢＳＥ（牛海綿状脳症（Bovine spongiforme Enzephalopathie））もこれに属する。
【０００７】
疾患の原因の説明及び新たなタンパク質治療剤の開発のために、タンパク質フォールディング機構を明らかにするのに効果的な方法の開発は、これまで、ライフサイエンス分野における大きな課題であった。タンパク質のリフォールディングに関するクリスチャン・アンフィンセン（アンフィンセン、１９７２年、ノーベル化学賞の実験以来、一次構造がタンパク質の構造についての全情報を含有することが知られている。しかしながら、これに関し、タンパク質がどのようにフォールディングされ、それらの天然の立体配座を見つけるかについては説明されていない。世界中の科学者は、この１０年間、「タンパク質フォールディング問題」を解決することに強い関心を抱いてきた。タンパク質フォールディングを検査、解明及び特性化するための多くの理論、並びに適切な方法及び技法が近年開発されている。
【０００８】
１．タンパク質の構造の予測
タンパク質の構造予測が、フォールディング機構の説明に用いられてきた。その結果、これまでに２つの適用可能な方法が知られている。第１の方法は、アミノ酸配列のアラインメントに基づく方法、したがってホモロジーモデリング（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）及びスレッディング（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）である。知識によって支持されるこれらの方法では、未知の構造に由来するアミノ酸配列を、既知のタンパク質構造との適合性によって検査する。明らかな一致が特定された場合、既知の構造をアウトプットモデルとして参考にすることができる。これまで、相同タンパク質の三次構造予測に用いられる実用的かつ効果的な方法は、この方法のみであった。第２の方法は、アミノ酸鎖のフォールディングを、他の既知のタンパク質構造に更に考慮することなく予測するものであるアブイニシオ（ab-initio：第一原理）予測（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）である。コンピュータによる計算を用いて、所与のアミノ酸配列に由来する構造の自由エンタルピーを最小化するか、又はフォールディングプロセスをシミュレートすることが試みられている。この目的で、世界的な構造予測のコンペティションであるＣＡＳＰ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ＯＦ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）（www.predictioncenter.org）が１９９４年に発足し、２年毎に行われている。このコンペティションでは、３Ｄ構造予測される直前のタンパク質配列が発表され、構造予測が募集され、その後実験的構造と比較される。
【０００９】
２．タンパク質フォールディング（folding）ための古典的モデル
主に実験的観察に依存するタンパク質フォールディングの古典的な態様には、モデルの全セットがある。最も簡単な場合では、２状態モデルがある。しかしながら、大抵のモデルはフォールディングを数工程で推測するものである。これら全てのモデルは、一部のタンパク質については正しく、一方で他のタンパク質については正しくないという点で共通している。概して、多くの場合、二次構造形成及び疎水性崩壊が初期のフォールディング事象であり、加えて、マイクロドメイン及びパズル（ジグソーパズルモデル）フォールディングモデル、及び／又はモルテングロビュールモデル（非特許文献１０）が、一部のタンパク質のフォールディングにおいて実現されている。
【００１０】
２状態モデルは、フォールディングされた状態又はアンフォールディングされた状態という２つの安定した状態のみが存在する、低分子タンパク質のフォールディングの最も簡単なモデルである。この連続モデルは、アンフォールディングされた状態からフォールディングされた状態へのフォールディングが中間体全体で進行することを示している。Tsong et al.は、一連の中間体が進路を規定するはずであると提示している（非特許文献１１）。フレームワークモデル（非特許文献１２）においては、二次構造の単一の独立した局所的要素のみが形成され、その後互いに拡散して、三次構造が形成される。対照的に、核形成モデル（非特許文献１３）はフォールディング核の形成に基づき、それにより天然の構造の形成が伝播する。疎水性崩壊モデル（非特許文献１４）では、側鎖の疎水性相互作用によるポリペプチド鎖の収縮が、局所的レベルでの天然の構造の再配向後の最初の工程であると主張される。
【００１１】
マイクロドメインフォールディングモデルでは、小さな構造サブドメインが初めにそれらの天然の立体配座をとる。次いで、これらのドメインは展開又は他のサブドメインとの衝突によって成長する。パズルモデルでは、全ての他のモデルと同様、１つの天然の立体配座しか存在しないが、この最終状態を達成するのに多くの様々な方法があり、幾つかの方法でパズルを達成することができる。モルテングロビュール仮説から、モルテングロビュール中間体が全てのタンパク質のフォールディング時に現れることが示唆される。このフォールディング中間体は、十分にフォールディングされたタンパク質の全ての二次構造を有するが、三次構造領域を有しない。
【００１２】
全てのモデルにおいて、フォールディングカスケードの初めに、二次構造要素（αヘリックス及びβシート）が、ナノ秒から最大で数秒の範囲内という驚くほど短い時間で形成される。タンパク質フォールディングの更なる過程は、二次構造の拡散、衝突及び収縮を受け、タンパク質の天然の構造をもたらし、数ミリ秒から数日という時間スケールを有する。
【００１３】
３．タンパク質フォールディングの熱力学的モデル
Ｃ．Anfinsenらが行った実験から、タンパク質の天然の構造が熱力学的に安定した状態であり、したがってギブズ自由エネルギーの大域的最小点に利用可能であると結論付けることができた。
【００１４】
C. Levinthal（非特許文献１５）は、タンパク質がそのフォールディング時にたどる特異的な進路（フォールディング経路）が存在するはずであり、好適な条件下で、タンパク質が最小のエネルギー状態を有する天然の状態に達するまでに、所定の一連の立体配座（中間体状態）を経ると記載している。特に、統計力学によるモデルによって、連続フォールディングプロセスのこの進路の概念を、並行事象のファネル概念（非特許文献１６）へと置き換えることが可能となる。
【００１５】
タンパク質フォールディングのファネル概念は、立体配座の分散度（横軸）の関数としての全ての可能なタンパク質構造の自由エネルギー（縦軸）を表す。上側のアンフォールディングされたタンパク質の様々な段階が、フォールディングファネルに該当する。これはタンパク質が該当し得る多くの極小値を有する。これらの極小値の一部は、タンパク質の天然状態の最小エネルギーへと向かう中間段階（中間体）を表す。この中間体の一部は、既に比較的安定した小型構造「モルテングロビュール」を表すが、それ以外は極小値トラップとして作用し、タンパク質をミスフォールディングされた状態に保持する。このファネルモデルに従う大抵のタンパク質分子は、滑らかなファネルのようにフォールディングされた状態へ向かって単に滑り落ちるのではなく、おそらくはより凹凸のある起伏の激しい地形を有し、谷間に行き着く前に全ての種類の隆起、溝、障壁及び窪みを乗り越える必要がある。
【００１６】
４．タンパク質フォールディングの動態
タンパク質フォールディングは、幾つかの相からなることが多いプロセスである。速いフォールディング相には、例えばポリペプチド鎖の疎水性崩壊、水素架橋の形成及び二次構造要素の発生が含まれる。
【００１７】
これらは数ナノ秒から数マイクロ秒までの範囲内で起こり、遅い相は数秒から数時間までの範囲内で起こる。遅いフォールディングの例は、ＲＮアーゼＡ（リボヌクレアーゼＡ）又はチオレドキシンであり、リゾチーム及びシトクロムｃについては、速い相がフォールディングプロセスの中心となる。しかしながら、遅いフォールディング相を全く有しないタンパク質はほとんどない。
【００１８】
巨大タンパク質が通常はより遅くフォールディングし、細胞中の大きなタンパク質のフォールディングが、フォルダーゼ及びシャペロンと呼ばれる２つの異なる種類の付加的なタンパク質によって支持されることが知られている。ＰＰＩ（ペリプラズム中のペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ）、ＰＤＩ及びＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、ＤｓｂＧ（ペリプラズム中のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）のようなフォルダーゼ（Foldase）は、明らかに規定された触媒活性を有し、ポリペプチド鎖の共有結合分枝の形成を加速する。シャペロンは一方で、多くの機能を果たし、その機能は、新生タンパク質鎖が自己会合の競合プロセスを引き起こすことなくフォールディングすることができる環境の構築にとって、おそらくは最も重要である。細菌シャペロンＧｒｏＥＬ（熱ショックタンパク質）は、例えばフォールディングにおいて、中型の（３０ｋＤａ〜６０ｋＤａ）、新たに合成される細菌タンパク質のおよそ半分を助ける。少なくともｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件で一部のタンパク質、例えばジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）がフォルダーゼ及びシャペロンとして効果的であるため、フォルダーゼとシャペロンとの差別化は、必ずしも明らかに規定されるとは限らない。
【００１９】
５．タンパク質フォールディングを研究するための方法及び技法
タンパク質フォールディングの実験的研究には、２つのタイプがあり得る。第１のタイプは、タンパク質の立体配座を変性剤の濃度又は温度の関数として示す、平衡状態での実験に関する。もう一方のタイプは、タンパク質の構造的変化を溶媒条件における急激な変化の時間の関数として表す動態研究に関する。タンパク質フォールディングの研究に現在適用されている技法、方法及び重要な化学物質は以下のとおりである：
アンフォールディング及びリフォールディングで形成され、任意にクロマトグラフィーによって分離することができるタンパク質中間体における動的構造的変化を研究するためのＮＭＲ（核磁気共鳴）分光法、Ｘ線結晶学、電子顕微鏡法及びＡＦＭ（原子間力顕微鏡法）、アンフォールディング及びリフォールディングにおけるタンパク質の構造的変化を研究するための蛍光分光法、ＵＶ（紫外線）／ＶＩＳ（可視スペクトル）分光法、ＥＳＲ（電子スピン共鳴）分光法、ＣＤ（円偏光二色性）分光偏光分析及びフーリエ変換赤外分光等の分光法、タンパク質の分子半径を測定するためのＤＬＳ（動的光散乱）及びＳＬＳ（静的光散乱）、タンパク質及び酵素的に切断したタンパク質断片の質量決定のための種々のタイプのＥＳＩ−ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化質量分析）及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析）。
分光法と併用されるストップトフロー法、クエンチフロー法及び勾配法、変動法及びジャンプ法。これらの方法は、数ミリ秒の時間分解能を達成する。ストップフロー実験については、タンパク質のリフォールディングを、変性溶液の急激な希釈又はｐＨの劇的な変化によって誘発する。いわゆる連続フロー法を用いて、フォールディングプロセスを最大で５０ｐｓ〜１００ｐｓの範囲で検査することができる。
タンパク質の動態フォールディング経路の研究のための分光法と組み合わせた水素重水素交換。
タンパク質のフォールディングにおける分子構造変化のコンピュータシミュレーションのためのＭＤ（分子動力学）。
タンパク質及び酵素的に切断されたタンパク質断片の単離された中間体の分離、解析及び検証のための２Ｄ濾紙電気泳動（Paperelektrophorese）、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動及びドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、並びに逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含む液体クロマトグラフィー。
細胞内のタンパク質フォールディング及びタンパク質輸送、タンパク質間相互作用、並びにフォールディング中のタンパク質の構造的変化の調査のための高空間時間分解能を有する蛍光顕微鏡法：蛍光偏光解消、共局在化測定、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、時間分解共鳴エネルギー移動（ＴＲＦＲＥＩＴ）、蛍光寿命イメージング（ＦＬＩＭ）、光漂白後蛍光回復（ＦＲＡＰ）、及び種々の変形形態の蛍光変動法、特に蛍光相関分光法（ＦＣＳ）。
ジスルフィド中間体の捕捉及び同定。これは、ジスルフィドタンパク質（酸化タンパク質）を、既知の還元剤及び変性剤を用いた変性及び還元によって還元及びアンフォールディングさせた後、還元剤及び変性剤から放出させ、その後タンパク質を再酸化に供し、その間に、捕捉試薬、例えばヨード酢酸を用いたシステイン残基のチオール基の修飾を行った後、中間体生成物を捕捉することによって行われる。次いで、中間体のようなこれらの中間生成物をクロマトグラフィーによって分離し、タンパク質分解し、一部シークエンシングし、任意にンパク質断片におけるジスルフィド形成の位置に応じて、分光法によって同定する（非特許文献１７）。
同定された中間体における単一ジスルフィド結合の割当て及びそれらの関係の図式的解釈によるフォールディングプロセスの特性化（非特許文献１８、非特許文献１９）。
原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質のフォールディングプロセスの直接観察（非特許文献２０、非特許文献２１）。
化学物質は、既知の変性剤、還元剤、再酸化剤、修飾剤、フォールディング安定化剤、フォルダーゼ、生化学的シャペロン及び化学的シャペロン、並びにフォールディングの阻害剤、並びに細胞抽出物等を含有する。
【００２０】
［タンパク質フォールディングプロセスの特性化の現行の技術水準］
１．タンパク質フォールディングプロセスを特性化する方法
タンパク質のフォールディングプロセスを特性化するのに効果的な方法を開発するための多数の先駆的研究がある。タンパク質のフォールディングプロセスの特性化のための、上記に記載の技法及び方法を組み合わせて、日常的な研究室業務のために標準化された方法として市販される商品の形態で提供される有望な方法は、これまで知られていない。
【００２１】
タンパク質のフォールディングプロセスを特性化する、この１０年間での世界的に主要な従来の方法は、大抵は低分子球状タンパク質を伴うものであり、既知のジスルフィドタンパク質、更には酸化的タンパク質に限定され、マルチドメインを有する巨大タンパク質に関係することは非常にまれである。この方法は、ジスルフィド架橋の形成の順番によってタンパク質のフォールディングプロセスを指標付けするという理論的仮定に基づく。この方法は、２つの技術概念の組合せ、すなわちリフォールディングされたタンパク質の単一ジスルフィドを含有する中間体の同定及び分類、並びにその後のジスルフィド結合の順番と、同定された中間体において検出される可能性がある分子内再構成との相関によるフォールディング経路の解釈によって実現することができる。
【００２２】
中間体のジスルフィド結合に基づく方法によるこの中間体の配置は、TE Creighton（非特許文献１７、非特許文献１８）によって初めて開発された。タンパク質を、変性剤（denaturising agents）ＧｄｍＣｌ（塩化グアニジン）及び還元剤ＤＴＥ（１，４−ジチオエリトリトール）を用いて１つのバッチで同時に変性及び還元し、ゲル濾過によって変性剤及び還元剤から放出させる。次いで、還元されたタンパク質を、ＧＳＨ及びＧＳＳＧ（還元型グルタチオン及び酸化型グルタチオン）を含む再酸化緩衝液中で再酸化に供して、ジスルフィド結合を形成する。これに化学捕捉剤ヨード酢酸又はヨードアセトアミドを様々な時間間隔で添加して、残存する遊離チオール基をブロックし、フォールディングプロセスを停止させる。これにより得られる捕捉されたリフォールディングの中間体を、その後ＩＥＣ（イオン交換クロマトグラフィー（chromatographie））を用いて単離し、更に断片へと酵素的に切断し、二次元濾紙電気泳動によって分離する。中間体の同定を、エドマン分解法（アミノ酸シークエンシング）による断片中の単一ジスルフィド結合の決定によって行う。その後のフォールディング経路の特性化は、断片中のジスルフィド結合の形成の順番の配分によって行う。
【００２３】
この従来の方法は、PS Kim及びその同業者（非特許文献１９）によって、中間体中のジスルフィド結合を決定するより迅速かつ高感度の方法を用いて改良された。
【００２４】
出発物質は、再酸化されたジスルフィド結合及び捕捉剤ヨード酢酸によってブロックされたチオール基を含有する精製中間体からなる。これらの中間体のジスルフィド結合を、初めに還元剤によって遊離チオール基へと還元し、次いで蛍光性ヨード酢酸誘導体ＩＡＥＤＡＮＳ（５−［２−（２−ヨードアセトアミド）エチルアミノ］−ナフタレン−１−スルホン酸）でマークして、共有結合による検出感度を増大させる。次いで、このタンパク質を酵素的に断片化する。標識されたシステイン残基は、元の断片のジスルフィド結合を示す。次いで、断片を、分離分解能及び速度を増大させたＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）によって分離する。分離された断片のエドマン分解法及びＮＭＲ解析によって、断片中のジスルフィド結合の位置を見つけ出す。それにより中間体を、それらの単一ジスルフィド結合の分布に従って同定する。最後に、中間体中のジスルフィド結合の順番と分子内再構成の解析結果との相関によって、フォールディング経路の図式的解釈を行うことができる。タンパク質のフォールディングプロセスは、そのように特性化される。
【００２５】
Creighton及びKimの研究によるこの先駆的方法は、２０年前から世界的にタンパク質フォールディングの特性化の実務の中心である。多数の刊行物において示されるタンパク質のフォールディング研究は、このプロセスの原理に基づいて、更には技術の構成の選好性に応じて様々な変更形態で達成される。この調査は、場合によっては数百ｍｇもの大量のタンパク質を必要とし、低分子タンパク質のフォールディングプロセスを解釈によって特性化することができるまで通常は数ヶ月かかる。特性化の結果は多くの場合多様であり、互いに補完しなければ解釈することができない。
【００２６】
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬの現在の詳細によると、現在では、必要とされるフォールディング研究を利用可能とするために、既に１１００万個のタンパク質の一次構造が特性化され、６６０００個を超えるタンパク質の３Ｄ構造が決定されているが（ＲＣＳＢタンパク質データバンク）、これまで、これらのタンパク質のごく一部しかこの方法によって調査することができなかった。
【００２７】
既知のモデルタンパク質である３つの低分子タンパク質、ＲＮアーゼＡ（リボヌクレアーゼＡ）、ＢＰＴＩ（ウシ膵臓トリプシン阻害剤）及びヒルジンのフォールディング経路が、この方法によって最良に研究されたが、限られた精度でしかなく、見解に或る程度の基本的相違があった（非特許文献２２）。このことは、フォールディングプロセスの特性化にとって現行の技術水準であるこの方法が、十分に効果的ではないことを証明している。その実施方法は複雑であり、労力及び時間がかかり、高価な装置を必要し、全体効率が低い。その結果は、利用者が用いる採用された技術によって異なる。したがって、標準化される市販の製品を開発することができなかった。この原因及び関連する問題は、この方法の好ましくない原理及びそれに起因し得る技術的限界にある。
【００２８】
２．現行の技術水準の処理上の問題
フォールディングプロセスを特性化する現在の方法の問題は、それがタンパク質中間体のジスルフィド形成の探索のみを対象にし、中間体の分離及び配置が一般にＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）及びＣＥ（キャピラリー電気泳動）の基本的方法のみに集中しているということである。このことは必然的に、以下のような方法の本質的限界につながる：
第１に、総タンパク質の約３０％がジスルフィド結合を有さず、酸化的タンパク質とは見なされず、したがってこのプロセスから除外され、したがって研究することができない。
第２に、原理上はフォールディングの指標であるジスルフィド形成は、単一ジスルフィド中間体の分離及び同定が、タンパク質サイズの増大及びジスルフィド結合数の増加に伴い困難となるため、低分子タンパク質の研究にしか好適ではなく、巨大タンパク質については好適ではない。３つの天然ジスルフィド結合を有するタンパク質は、１５個の単一ジスルフィド含有中間体を生成する可能性があり、４つの天然ジスルフィド結合を有するタンパク質では２８個、５つの天然ジスルフィド結合を有するタンパク質は４５個の中間体生じる可能性がある。中間体及びそれらの分子サイズの増加のようなこの急増は、低分子タンパク質の分離にしか好適でないというＨＰＬＣ法の分離限界に突き当たる。したがって、この方法は原則として、より巨大なタンパク質については機能しない。
第３に、リフォールディングの第１の相においてチオール基がジスルフィド架橋を形成しない、ジスルフィド含有タンパク質の重要中間体の多くが、中間体として実行されず、したがって人為的に研究から除外される。したがって、フォールディング経路は不完全にしか特性化及び表示することができない。
第４に、大抵は分子サイズの減少に応じて漸進的にグループ化される、単一ジスルフィドを含有する中間体の立体配座は、本発明によってフォールディング経路の起点の重要な証拠として示されるが、現行の技術水準方法によっては差別化、検討及び記録されない。このことは、フォールディング、特に速い相のフォールディングの詳細についての情報の大きな損失につながる。
第５に、還元後に変性剤から取り除き、更なる使用のために確保した再酸化されたタンパク質は、既に本質的（instinctive）、自発的かつ速いフォールディング相の結果として、僅かに小さいその天然タンパク質と類似の分子サイズを有するモルテングロビュール状態であることが多い。このことは、その後の特性化によるプロセスが、フォールディングプロセス全体ではなく、モルテングロビュール状態の最後の遅いフォールディング相から復元されたタンパク質までしか追跡しないことを意味する。
第６に、ＲＰ−ＨＰＬＣ法は、実際は小さな中間体を迅速に分離することができるが、様々な分離された中間体の形成の時間的順番についての関連情報を即座に提供するものではない。このことは、中間体の同定及びフォールディング経路の特性化のプロセスを極めて複雑にし、遅らせる。
第７に、解析されたタンパク質を、技法の組合せの選好性及び従来の方法の変更形態に応じて検査し、実際には例えばＥＲＩ−ＭＳ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ等の既知の新たな技法及び方法の全てに多少は関連するが、方法の本質的限界のために、それらの効率は悪く、したがって僅かしか利用されない。
第８に、費用のかかるエドマン分解法が、中間体の同定に不可欠のツールとして用いられる。
第９に、現行の技術水準の方法は、生じる全ての中間体ではなく、いわゆる重要中間体しか同定及び特性化しないため、ほとんどの場合、上記で示したようにフォールディングプロセスの限られた部分しか追跡せず、依然としてこのプロセスの過程を詳細に説明することが不可能である。
第１０に、タンパク質フォールディングプロセスによる調査の結果は、座標系において正しく表示することができず、概略的にしか解釈されない。
第１１に、方法は費用、時間がかかり、標準化、小型化及び自動化することが不可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】Guex, 1997
【非特許文献２】Swede, 2003
【非特許文献３】Kopp, 2004
【非特許文献４】Hendlich, 1990
【非特許文献５】Sippl, 1996
【非特許文献６】Madej, 1995
【非特許文献７】Karplus, 1990
【非特許文献８】Sippl, 1995
【非特許文献９】Shortle, 1997
【非特許文献１０】Ohgushi M & Wada A, 1983
【非特許文献１１】Tsong et al., 1972
【非特許文献１２】Kim and Baldwin, 1990
【非特許文献１３】Wetlaufer, 1973
【非特許文献１４】Dill ef al., 1995
【非特許文献１５】Levinthal, 1968
【非特許文献１６】Schultz, 2000
【非特許文献１７】Creighton, 1978
【非特許文献１８】Creighton, 1988
【非特許文献１９】Weissman & Kim, 1991
【非特許文献２０】Cecconi et al, 2005
【非特許文献２１】Walther, et al, 2007
【非特許文献２２】Disulfide Folding Pathway of BPTI, Science vol. 256, 3 April 1992
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
［本発明の目的］
本発明の基礎にある目的は、ジスルフィドを含有するタンパク質及びジスルフィドを含まないタンパク質の両方に対し、フォールディングプロセスの効果的かつ効率的な特性化のための新規の方法を提供することである。この新たな方法は、タンパク質フォールディングを、それらの種類、タイプ及びサイズを限定することなく研究し、生じる全てのフォールディング経路及び対応する分子内再構成を検出し、タンパク質ミスフォールディングプロセスを同定し、遅いフォールディング相及び速いフォールディング相の両方の完全な事象を特性化し、特性化の結果を記述的に様々な形態で多次元視覚化することが可能であるものとする。
【００３１】
この新たな方法は、タンパク質のフォールディング、ミスフォールディング、凝集、相互作用、自己集合、重合、老化、消耗（erosion）及び新生合成の機構の解明、抗体工学及びタンパク質工学の合理化並びにそれらの効率の増大、タンパク質の活性及び機能性の改善、標的タンパク質のバイオテクノロジー生産の最適化、ナノタンパク質材料の開発、並びにタンパク質分類学の充実等のために、様々な物理化学的条件及び生化学的条件を有する種々の分子環境及び実施の形態において様々な用途で使用することができる。
【００３２】
特に、この方法は、タンパク質フォールディング及び分解に対する影響によって新規の生物学的及び化学的な作用物質、並びにタンパク質治療薬を探索するために、翻訳後修飾されるタンパク質として既に知られているｉｎ  ｖｉｖｏでシミュレートしたタンパク質のバイオテクノロジー生産プロセスの開発に用いられる。
【００３３】
この新たなプロセスは、使用するタンパク質材料がより少なく、使用が容易であり、時間を節約し、更には標準化、自動化及び小型化されるものでなくてはならない。本発明の実行に使用される機器は、詳細設計及びプロセスの自動化のための設計を含む、種々のアッセイキット、装置及びソフトウェアの形態で利用可能でなくてはならない。上記方法の最適な設計及び適用のための多次元エネルギーランドスケープに移行可能なフォールディングの多方向モデル系を確立しなくてはならない。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
［問題の解決策］
上述の目的は、本発明の特許請求の範囲の特性に従って達成される。この解決策の特色は、リフォールディングされ、したがって修飾されたタンパク質の中間体を、従来の方法のように、それらのジスルフィド結合のパターンによって同定するだけでなく、本発明に従って、それらの４つの個々の特性、すなわち流体力学的サイズ、形成時間、フォールディング経路所属、及び量によっても同定するという点にある。これに基づき、特性化の全効率は高くなる。このようにして、特性化されたタンパク質フォールディングプロセスは、従来の技術水準のように、概略的に解釈されるのではなく、より高い精度で表示され、その多様性が多次元視覚化される。プロセス工程の設計、検証、最適化及び合理化は、新たに確立されたマルチフォールディング経路モデルによって支持される。したがって、本発明に基づく方法は、タンパク質フォールディングの特性化に関する現行の技術水準よりも明らかに優れている。
【００３５】
［発明の概要］
本発明は、リフォールディングされ、したがって修飾されたタンパク質の流体力学的サイズの動態集合、分離され、タンパク分解によって断片化された中間体の生体情報認識パターンに基づく割当て、修飾中間体のフォールディング経路の所属の分類、フォールディングプロセスの特性化、及び多座標系における特性化されたフォールディングプロセスのコンピュータを用いた視覚化を組み合わせた多工程方法である。この方法は、リフォールディングタンパク質の設計された複数の動的修飾、中間体分離の主要技術の修正及び改良、並びに中間体のフォールディング経路の同定のための確立された新たな方法を指す。本発明は主として、以下の基本的な概念の発明者によって作成された組成物、したがって確立された新たなマルチフォールディング経路モデルに基づく。
【００３６】
１）最適な予め十分にアンフォールディングされたタンパク質のリフォールディングプロセスを、そのエネルギー状態の低下に対応して徐々に減少する流体力学的サイズに従って指標付けすることができる。この場合、フォールディングタンパク質の空間的無秩序によって変化する構造に、様々な時間間隔で化学的修飾又は酵素的修飾を行った。それらをフォールディング状態で停止させ、固定し、中間体として分離し、それらの流体力学的サイズの順番で示した。
【００３７】
流体力学的サイズは、本明細書では、主としてタンパク質特有の流体力学的半径によるサイズとして定義され、構造に関する連続情報、分子表面上の電荷分布、極性、親水性、疎水性等によって更に強化することができる。流体力学的半径Ｒｈ（すなわちストークス半径）は、流体力学的に同等な球状タンパク質の半径であり、したがってポリマーの統計解析による他の既知の数値とは異なり、統計的にではなく、現象論的に規定される。本発明によると、流体力学的半径によって直接示した流体力学的サイズは、輸送プロセスにおけるタンパク質の影響（粘度、拡散、浸透）を表し、タンパク質の形状及び形態に強く依存する。したがって、個々の立体配座を有する、特定の時点で形成されたタンパク質の中間体は、種々のエネルギー状態に対応する、それらの流体力学的サイズを用いて容易に差別化することができる。
【００３８】
流体力学的サイズは、粒子の実際のサイズとは大幅に異なる場合があり、通常は粒子の有効サイズよりも小さい。このことは方法に何ら影響を及ぼさず、試験すべきタンパク質の中間体に対する指標としての流体力学的サイズが示される。これは、主に流体力学的サイズと、中間体の得られるサイズの順番との相対性についての問題はあるが、絶対的なサイズについての問題はないためである。
【００３９】
修飾によって遮断されたこれらの流体力学的サイズは、修飾の時点での実際の流体力学的サイズとは異なり得る。ただし、これらの変動は、連続して隣接する中間体間の構造的変動に限定され、中間体の実際の流体力学的サイズの順番を変化させることはできず、したがって方法の原理に悪影響を与えることはない。この理由は、リフォールディング時に異なる時間間隔で行われる修飾が、構造の段階的な減少、したがってより限られた試薬のアクセシビリティのために、通常は中間体の表面で行われるためである。このことは、高エネルギーのアンフォールディングの発生をもたらさず、中間体のリフォールディング及び更なる捕捉を妨げるだけである。これらの妨げによって引き起こされる構造的変化は、実際の流体力学的サイズの順序を変化させ、基本的なエネルギー障壁を乗り越えるのに十分に強くはないとされる低いエネルギー差に限定される。流体力学的サイズは、分光学的に（光散乱、蛍光相関、電子常磁性共鳴、核磁気共鳴分光法及び蛍光偏光等）、好ましくはＤＳＬ（動的光散乱）を用いて決定することができる。
【００４０】
流体力学的サイズは、本明細書では同等の旋回半径（ＲＭＳ半径、二乗平均平方根半径）を用いて規定され、分光学的に、好ましくはＳＬＳ（静的光散乱）を用いて測定することができる。
【００４１】
中間体の流体力学的サイズは、原則としてそれらのエネルギーレベルに比例し、したがって必要に応じて、それらの分光測定によって決定された熱力学的パラメータに置き換えることができる。
【００４２】
２）リフォールディング時に生じたタンパク質の中間体は多様であり、異なるグループにおいて共通する特性によって、それぞれのフォールディング経路に従って配列することができる。それらは異なる流体力学的サイズを有するだけでなく、標的とする修飾のアクセシビリティ及び有効性を決定し、中間体の差別化及び同定のための基準となる様々な構造的設計も有する。これにより、フォールディングタンパク質のこれらのアミノ酸残基、例えばリジン残基、システイン残基、チロシン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、トリプトファン残基、メチオニン残基、グルタミン酸残基及びアスパラギン酸残基を、特定の時間間隔で特異的な側鎖試薬を用いて、それらの構造的アクセシビリティのために動的及び共有結合的に修飾することが可能となる。
【００４３】
遮断された構造を有する得られる修飾中間体は、流体力学的サイズが異なり、修飾の多様な配置、並びに構造の減少及びその後の試薬のアクセシビリティの減少による修飾効率の一時的減少の両方に基づく。共通するインプリントを有する中間体は、特定のフォールディング経路に属する特定のグループに配列される。結果として、捕捉された中間体は、流体力学的サイズ及び形成時間だけでなく、そのフォールディング経路も異なる。
【００４４】
異なる時間間隔で遮断されたこれらの中間体は、本発明に従って、修正及び改良されたネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離され、中間体の第４の特性に指定されるそのサイズ及び量について差別化され、動力学的に追跡され、フォールディング時間の関数としてのそれらの流体力学的サイズを用いて二次元的に表示されるか、又は初めに液体クロマトグラフィーによって分離され、定量化され、次いで必要性及び要求に従って分光学的プロセス及び／又は熱力学的プロセスを用いて、それらの流体力学的サイズによって差別化され、次いでフォールディング時間の関数としての流体力学的サイズとして（場合によっては定量化可能な量を用いて）同様に二次元的に表示することができる。
【００４５】
この二次元表示は、とりわけ中間体の３つの特性である流体力学的サイズ、それらの形成時間及び定量化される量によって説明される、タンパク質のリフォールディングのフィンガープリントプロファイルを示す。
【００４６】
リフォールディングにおける全ての捕捉及び分離された中間体のフォールディング経路は、進化理論及びタンパク質フォールディング動態によっても支持される、以下の基準を用いて分類することができる：
最大の量を有する初めに現れる中間体は、大抵は天然の主要なフォールディング経路に属し、このフォールディング経路で現れる中間体は最も少ない。
天然のフォールディング経路に属する中間体は、大抵は収束構造を有するが、天然のフォールディング方法又はミスフォールディング経路に属しない中間体は多くの場合、ＤＬＳによって検出可能な発散構造を有する。
同じ定量化される量で現れる中間体は、大抵は同じフォールディング経路に属し、この量によってフォールディング経路（way）の幅又はフォールディングチャネルの直径、したがってフォールディング経路の能力が決定する。
【００４７】
フォールディング経路の所属のより厳密な分類は、単離された中間体のタンパク質分解的及び化学的な断片化から始まる。その後の断片の分類は、理論的断片質量パターンの認識に対する生体情報比較に基づく。ここで、断片の分類は、フォールディング経路に属するグループ化された中間体を同定し、フォールディングに属する経路（paths）についての結論を得るために、修飾のタイプ及び程度に基づくそれらの特定の分子量の分布、並びに生じる可能性があるジスルフィド形成の互いの結合パターン及び／又は挿入される架橋剤に基づく。
【００４８】
これに関し、質量分析ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析）及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析）を用いて、断片の数及びそれらの分子量を測定する。
【００４９】
得られる中間体を、それらの共通する特性に従ってそれぞれのグループに割り当てることができる。いずれの場合にも経時的にグループ化した中間体によって、フォールディング経路が指標付けされる。存在する全てのフォールディング経路が同定されると、タンパク質のフォールディングプロセスは完全に特性化されている。
【００５０】
これに関し、本発明に従って以下の点が見出された：
最適な十分にランダムコイルのアンフォールディングされたタンパク質は、少なくともごく一部の構造的に僅かに成形したプライマー集団を含有する。これらの集団は各々、それらの自身のマイクロドメイン中に異なる初期二次構造を有し、階層的に分布し、非常に低いエネルギー差でグループ化され、したがってフォールディング経路の起点又はフォールディングチャネルの起源を示す初期中間体の混合物と見なすことができる。
タンパク質のリフォールディングは、４つの独立した時間スケール及びペースの連続である継続して起こる相：フォールディング経路の構築を開始するシード構造の集団の形成のための数ナノ秒〜数ミリ秒の特に速い第１相、並行フォールディング経路の構築のための数マイクロ秒〜数秒の速い第２相、構築された進路に沿ったその後のフォールドの通過のための数秒〜数分の第３相、並びにそれぞれのタンパク質の構造組成に応じて様々なテンポで起こる、マイクロ領域の更なる分子内再構成及び三次構造の進化のための第４相に分けることができる。
第１相における種々のシード構造の集団は、偶然には形成されず、タンパク質の一次構造によって規定されている。さらに、これらは以下のフォールディング経路を決定する。第２相において発生する並行フォールディング経路は様々であり、互いに独立する。各々のフォールディング経路は、それぞれのフォールディング経路の足掛かりとなる幾つかのグループ化された準安定中間体からなる。第２相は、復元されたタンパク質が生じ、最多数の中間体が現れる時点で完了する。第３相におけるリフォールディングは、第２相において構築される独立したフォールディング経路と並行し、アンフォールディングされたタンパク質のプールにおける初めに構造化されていない集団の全て、及びフォールディング経路における大抵の中間体がもはや利用可能ではなくなる時点まで、同じ時間で第２相において生じる動態の後に続く。第４相において復元されるタンパク質の天然の構造が完成する。
各々の得られる中間体は、少なくとも４つの独自の個々の特性、すなわち流体力学的サイズ、形成時間、フォールディング経路の所属、及び量を用いて同定及び説明することができる。
フォールディング経路は、それらの全体的なフォールディング能力に従って３つのタイプに分類することができ、各々一次フォールディング、二次フォールディング及びミスフォールディングされる経路と称される。これらのフォールディング経路は、独自の下位フォールディング経路で並行して継続する。一次フォールディング経路のフォールディングは、フォールディングプロセスの中心となる。二次フォールディング経路に沿ったフォールディングは最終的に、分子内再構成において天然のタンパク質へと変換することができる、柔軟な天然様構造を有する適切な中間体をもたらす。ミスフォールディング経路に沿ったフォールディングは、分子内再構成において非常に遅く天然のタンパク質へと変換されるか、又はフォールディングの終わりまでミスフォールディングされたタンパク質のままである誤った中間体をもたらす。
二次フォールディング経路及びミスフォールディング経路は、それらの分枝を介して互いに一体化するか、又は一次フォールディング経路で、エネルギーの低い方向に沿って互いに結合することができる。下位フォールディング経路も、分枝によってその本線と合併することができ、これによって、２つのフォールディング経路に属する或る特定の中間体が生じる。
並行フォールディング経路の比率は、反応条件、例えば変性剤、再酸化剤及び安定化剤の濃度、ｐＨ及びイオン強度、温度、シャペロン又はフォルダーゼの使用等を調節することによって変化させることができる。これにより、タンパク質のリフォールディングを、復元によって得られるタンパク薬物の生産性を増大させるために、例えば一次フォールディング経路に沿ったフォールディングを優先して加速させるか、又はタンパク質凝集を減少させるため、若しくはフォールディングプロセスの特性化を容易にするために、遅らせるように制御することができる。ただし、タンパク質の一次構造によって規定される主なフォールディング経路及びそれらの下位フォールディング経路は、これによってそれぞれ変化させることはできず、その結果消失するフォールディング経路はない。これに関し、それにより増強されるフォールディング経路を、新たなフォールディング経路として同定すべきではなく、これにより弱くなるフォールディング経路を無視すべきではない。ミスフォールディング経路の一部であり、その天然のタンパク質よりも小さい流体力学的サイズ及びしたがってエネルギー状態を有する中間体も存在し得る。
リフォールディングタンパク質の構造的不均一性は、初めに第１相の終わりまでに特に急速に漫然と減少し、次いで第４相の終わりまでに概してより遅く、徐々に低減する。構造的不均一性の減少の動力学的転換点は、中間体の比較的安定した構造による速度限界のレベルに従って明らかとなり、第１相〜第３相の終わりに位置する。それにより、構造的不均一性の減少が徐々に現れ、これは概してリフォールディングタンパク質の流体力学的サイズの減少に比例する。タンパク質のリフォールディング時の構造的不均一性の減少プロセスは、その性質、そのタイプ及びしたがってそのフォールディング経路によって決まる。タンパク質のフォールディングプロセスは、主としてフォールディングの第１相及び第２相において生じる標準条件下の全ての中間体の全特性によって特性化することができ、タンパク質のフォールディングフィンガープリントと称される。
この新たに見出された知識に基づいて、ファネルエネルギーランドスケープに対応する多方向フォールディングモデル（図１１）が確立される。このモデルは多次元座標系に移行可能である。４相フォールディングを、このモデルにおいて、実験中によく現れる５つの機能的ゾーンを用いて各々異なるグラフ形状で更に説明するが、この場合、エネルギー状態及び流体力学的サイズを、それに応じてフォールディング時間の関数としてプロットする。これは下記のように説明及び解釈される。
最も高いゾーンＡは、一部僅かに異なる構造化集団を有するアンフォールディングされたタンパク質中のランダムコイルのプールとなる。本質的動因（instinctual drive）及び構造的アベイラビリティのために、数ミリ秒の特に急速な第１相のリフォールディングが生じる。ゾーンＢ形態におけるリフォールディングは、天然の初期二次構造、並びに類似の流体力学的サイズ及びエネルギーレベルを有する一部の主要な構造的集団を形成する。リフォールディングされたタンパク質は、好ましい二次構造の生成の減少のためにその最初の速度限界に達する。
第２相におけるマルチフォールディング経路の構築は、ゾーンＢの終わりに最初に生じる中間体から始まり、ゾーンＥにおける復元されたタンパク質の出現に終わる。それぞれのフォールディング経路のシード集団としても知られる天然の初期二次構造の集団は、初めに個々の主要エネルギー障壁を乗り越え、幾らかの構造的に準安定なレベルを超える独自の速度でフォールディングし、これは中間体の形態で現れ、復元された構造までのモルテングロビュール状態によって、それぞれのフォールディング経路に対する顕著な足掛かりとみなされる。
一次フォールディング経路に沿った、その潜在的な亜集団を含む集団のフォールディングは、リフォールディングの中心となる同時に形成された天然の二次構造である。非常に急速な速度を有するこの経路に沿ったリフォールディングは、中間体をほとんど生じない。二次フォールディング経路が、一部形成された天然の二次構造を有する集団から生じ、したがって多少の天然の中間体からなる。ミスフォールディング経路が、誤って形成された非天然の二次構造を有する集団から生じ、多くの場合幾つかの非天然中間体を伴う。主なフォールディング経路と並行する付随の下位フォールディング経路が、それぞれ逸脱した二次構造形成を有する構造的亜集団から生じ、通常はフォールディング時に分子内再構成によって主なフォールディング経路へと戻る。
このモデルにおけるマルチフォールディング経路の潜在的な複雑性を、象徴的に表す。各々が象徴的な一次フォールディング経路、二次フォールディング経路及びミスフォールディング経路の形成に関与する任意の形態のシード集団が、フォールディング経路への接近を達成するために初めに３つの異なる強度によって規定されるエネルギー障壁を乗り越えなければならず、次いで、いずれの場合にも３つの代替的なフォールディング経路にそって個々の副次的なエネルギー障壁によってリフォールディングし、対応する中間体が発生することが示される。これにより、生じる分枝したフォールディング経路を考慮せずに、少なくとも２７個のフォールディング経路が生じ得る。しかし、タンパク質のリフォールディングは、通常は或る特定の関連する並行フォールディング経路について非常に限られた独自の性質のみに応じて起こり得る。
フォールディング経路は、ゾーンＤにおいてモルテングロビュール状態で集まる。中間体の天然の配向したジスルフィド再構成を含む大抵の分子内再構成は、種々のフォールディング経路から起こる。
マルチフォールディング経路に沿ってモルテングロビュール状態でリフォールディングし、初めにゾーンＥで復元されたタンパク質は、タンパク質進化に基づく様々な柔軟な構造的領域を有し、基質に対するその適応性及び機能性の保持に関与する。この復元されたタンパク質は、第３相及び第４相の終わりまでフォールディングの連続フロー中に連続的にその天然の構造において完全に再構成する。ゾーンＥは、復元された天然の構造のタンパク質だけでなく、流体力学的サイズ及びエネルギー状態が天然よりもはるかに低い場合がある、ミスフォールディングされた構造を含む、分子内再構成によって構造的変異体も表す。
このモデルは、タンパク質フォールディングの４つの速度限界を示す。第１の速度限界は、第１相の終わりにあり、同時にフォールディング経路のエネルギー障壁の主な入口にある。第２の速度限界は、フォールディング経路で連続的な中間体の形態で現れる、段階的に生じる副次的エネルギー障壁である。第３の速度限界は、分子内再構成の障壁及び復元されたタンパク質への崩壊の障壁の結果としてモルテングロビュール状態で生じる。第４の速度限界では、タンパク質の完全な天然の構造への再構成の障壁へと戻る。第１及び第３の速度限界は強いボトルネック効果を有する。これらは主として、タンパク質のフォールディング速度を決定する。異なる強度の速度限界は、限られた時間段階で累積された中間体の各々の分布量を解析することによって定量的に決定される。
このモデルは、タンパク質のフォールディングプロセスを、速度限界段階に並行な、その間に得られる中間体の同定により特性化することができることを意味する。フォールディング経路及び関与する中間体からなる集合（muster）を、これによりフォールディングの実験的フィンガープリントの基礎として得ることができる。
このモデルは、マルチフォールディング経路でのフォールディングが原理上は協調的でないことを意味する。協調的な挙動は、フォールディングが一次フォールディング経路において主要である場合にのみ起こる。
このモデルは全てのタンパク質に適用可能である。単一フォールディング経路でフォールディングされるか、若しくはマルチフォールディング経路でフォールディングされるか、特に急速に若しくは遅くフォールディングされるか、又は最初に特に急速に、次いで遅くフォールディングされるか、又は単に遅くフォールディングされるかに関わらず、各々のタンパク質をこのモデルにおいて独自のフォールディング経路に従って見つけ出すことができる。したがって、このモデルはとりわけ設計の改良、プロセス工程の最適化の検討及び指針の合理化、並びにしたがって本発明の方法の最適な設計及び適用のために用いられる。
【００５１】
３）これにより、特性化されたフォールディングプロセスを、初めに全ての中間体の特性及び全ての中間体の流体力学的サイズを、各々の場合のその形成時間、フォールディング経路及び場合によってはそれらの定量化される量に対してデジタル化することによって、多次元座標系において多次元表示することができる。フォールディングプロセスの表示は、これらの４つの特性について規定された座標の新たな組合せ及びコンピュータグラフィックスの使用によって、多様性において視覚化することができる。これにより、例えばフォールディング経路（フォールディングチャネルの構築）、それらの動態プロセス、それらのフォールディングに対する寄与率、ミスフォールディングのプロセス、分子間再構成の形成、ジスルフィド形成の順番、フォールディングに影響を与える生物学的及び化学的な因子の影響、タンパク質凝集の開始のプロセス、タンパク質の活性、機能及び分解に対するフォールディング阻害剤又はシャペロンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートした動的翻訳時修飾及び翻訳後修飾の手順等を、特性化されたフォールディングプロセスのグラフィック表示によって容易に決定することが可能である。リフォールディングタンパク質の全ての中間体の三次元構造とエネルギーランドスケープとの間の関係は、ファネル概念（非特許文献１６）に従って定性的及び定量的に表示し、またエネルギーランドスケープの他の様々な形態で多次元視覚化することができる。
【００５２】
以下の図面によって本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔのＮＭＲ構造、その正面及び背面の親水性の分極した分子表面、並びに２つのジスルフィド架橋から得られるその２つのループ構造を示す図である。
【図２】２次元座標系におけるＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの特性化のタスク図、リフォールディングにおける天然及び非天然のジスルフィド形成によって生じる８つの理論的に可能な中間体、及び修飾に選択された側鎖特異的試薬のヨウ素アセトアミド、及び最大の流体力学的サイズを有する最適に変性されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔのサンプル回収を示す図である。
【図３】様々な時間間隔でのリフォールディングＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの動的修飾の実施方法、並びにネイティブポリアクリルアミドゲルにより分離された種々の流体力学的サイズを有する中間体、並びにｙ座標として対応する種々のゲルバンド、及びｘ座標として種々の時間間隔でのフォールディング時間を示す図である。本発明により規定された４つのフォールディング相及びリフォールディングのフィンガープリントプロファイルを図３に提示する。
【図４】リフォールディングにおける天然及び非天然のジスルフィド形成によって生じる８つの理論的に可能な中間体のトリプシン切断パターン、及びそれらの断片の質量検出パターンを、各々の断片の分子質量を表示した表形態で示す図である。
【図５】ＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定による１０個のゲルバンドからの全ての中間体のタンパク質分解断片の質量検出の結果を示す図である。
【図６】理論的な断片の質量パターン認識の検出された断片の質量を比較することによって、１０個のゲルバンドから差別化及び同定され、４つのグループ及び４つのフォールディング経路に関連する１２個の中間体の表である。
【図７】Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔの図示されたフォールディングプロセスの図示されたゲル画像に対応する２次元特性化を示す図である。
【図８】２次元座標系における最大で６０分間のＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔのフォールディングプロセスの特性化及び視覚化を示す図である。
【図９】３次元座標系において最大で６０分間のＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔのフォールディング経路及びそれらの簡略化したプロセスの視覚化を示す図である。
【図１０】本発明の自動化された設計プロセスのための機械の概念及び設計を示す図である。
【図１１】多次元エネルギーランドスケープ座標系に割り当て可能なマルチフォールディング経路モデルを示す図である。このモデルは、実験に基づくグラフ表示、並びに４つのフォールディング相及び５つの機能的ゾーンに要約されるタンパク質フォールディングの過程の新たな所見によって説明される。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明によるプロセスを、第１にそれぞれの工程の簡単な説明、及び第２に詳細な説明によって提示する。
【００５５】
１．特性化されるタンパク質の一般解析
タンパク質の一次構造、二次構造、及び適用可能な場合に三次元構造、並びに生物学的性質及び物理化学的性質の解析に基づいて、質量スペクトル断片化を予測した後、どのアプローチを初めに適用すべきか、例えばどのアミノ酸特異的修飾用試薬を使用すべきか、又はどの方法を中間体の分離に用いるべきかを決定する。
【００５６】
２．最大の流体力学的サイズを有するアンフォールディングされた最適なタンパク質サンプルの分離
タンパク質を変性させ、還元し、必要とあれば還元試薬を除去する。クロマトグラフィーによって分離されたタンパク質サンプルは、最大の流体力学的サイズを有し、一方でジスルフィド結合を含有するタンパク質のジスルフィド架橋は、遊離チオール基まで完全に還元されている。このようにして、タンパク質を完全に変性させる。
【００５７】
３．動的タンパク質修飾
リフォールディングタンパク質を、アミノ酸側鎖のアクセシビリティに応じてそれらと反応する試薬を用いて、影響因子の存在下又は非存在下のリフォールディング時に様々な時間間隔をおいて修飾する。修飾の程度及びパターンは、その多様な立体配座及び比較的安定した立体配座とともに、中間体の個々の特性、すなわち流体力学的サイズ、形成時間、フォールディング経路同一性及び量によって決まる。これらの特性を用いることで、各々の中間体が同定され、分離が可能になる。
【００５８】
４．中間体の分離及び定量化、並びに形成時間の関数としての流体力学的サイズ及び量の二次元表示
修飾によってリフォールディング時に様々な時間間隔をおいて捕捉された中間体を、好ましくは本発明による改良ゲル電気泳動によって分離し、ゲルバンドの強度をスキャニングすることによって定量化する。異なるゲルバンドは、リフォールディングプロセスに応じて異なる流体力学的サイズを有する中間体を含有し、これがゲル上に二次元表示される。これら（中間体）を流体力学的サイズによって差別化し、その量を定量化するために、初めに液体クロマトグラフィーによって分離することができ、次いで分光法によって解析することができる。その後の解析によって、４相多経路フォールディングモデルの多次元表示が可能となり、流体力学的サイズ及び量はリフォールディング中の時間の関数である。全ての中間体を流体力学的サイズ、量及び形成時間に応じて作表する。中間体の流体力学的サイズは、それらの個々の分離後に任意の他の熱力学的パラメータに交換することができる。
【００５９】
リフォールディングの終わりまでに形成し、流体力学的サイズ、量及び形成時間によって差別化される全ての中間体によるタンパク質リフォールディングのフィンガープリントは、二次元ゲル電気泳動、又は液体クロマトグラフィーによる分離及び定量化後の解析のデジタル（グラフ）表示によって生成することができる。
【００６０】
５．ゲル内消化又は液中消化による中間体の断片化
断片化では、フォールディング経路同一性をより正確に差別化することを目的とする。ゲル電気泳動又はマイクロクロマトグラフィーによって流体力学的サイズで分離される全ての中間体を、好ましくは初めにトリプシンによって消化する。必要な場合には、他のエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃ及びＡｓｐ−Ｎ、又は他のエキソプロテアーゼ、又は化学プロービングを用いて断片化を行うことができる。
【００６１】
６．断片化された中間体の質量分析検出
ジスルフィド結合及び／又は架橋剤によって連結されているためにサイズがより大きい断片を含む、全ての断片の分子量を、質量分析（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析）及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）で検出した後、データバンクにおいて作表する。類似断片のより正確な差別化のために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ（タンデムＭＳ）若しくはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＰＳＤ（ポストソース分解）、又は付加的な細胞外酵素加水分解及び／又は化学的加水分解を用いることができる。
【００６２】
７．中間体のフォールディング経路同一性の解析
実験的質量分析断片パターンと、予測される理論的に可能なパターンとの比較は、各々の中間体の個々の特性を示す修飾のタイプ、数及び配置の解析を可能にする。これらの特性を同定することによって、中間体を他の中間体との類似性に応じてグループ化することができ、それらのグループ帰属関係に応じて特定のフォールディング経路に割り当てることができる。中間体をグループ帰属関係に割り当てた後、特定のフォールディング経路同一性にも割り当てる。かかる解析は、前述のタンパク質進化及びタンパク質フォールディング動態の理論によって支持される基準によって補正及び補完される。
【００６３】
８．中間体の同定及び分類
各々の中間体を、測定された流体力学的サイズ、形成時間、定量化される量、並びにフォールディング経路同一性によって割り当てることができ、各々の中間体を、これらの４つの特性によって規定することができる。同定された全ての中間体を、それらの共通する特徴に従ってグループに分け、種々のフォールディング経路に更に分類することができる。同じフォールディング経路に属する中間体は、同じ修飾パターンの存在、流体力学的サイズの漸減、及び同じグループの各々の中間体の形成時間を特徴とする。
【００６４】
９．フォールディングプロセスの特性化
異なるフォールディング経路に属する全ての中間体を、多次元座標系において、それらの同定された特性によって並列表示することで、天然のフォールディングの主要な経路、速いフォールディング及び遅いフォールディングの経路、ミスフォールディング経路、全ての経路におけるフォールディング動態、ジスルフィド結合形成及び／又は架橋剤結合形成の順序、分子内再構成、並びにフォールディング経路の分枝、拡大、交差、横断及び合流を示すことが可能であり、関与する全ての中間体が直接決定される。
【００６５】
このようにして、タンパク質フォールディング経路が特性化される。
【００６６】
１０．タンパク質フォールディングプロセスのグラフ表示及び視覚的表示
コンピュータグラフィックスを用いて、特性化されたフォールディングプロセスを、多次元座標系において種々の表示形式で視覚化することができ、又はアニメーションに使用することができ、一方でフォールディング経路を、フォールディングファネルのフォールディングチャネルとして示すこともできる。
【００６７】
方法の実現は、段階的に手作業で行い、及び／又は完全に自動化することができ、達成手段は種々のアッセイキット、デバイス及びソフトウェア、並びに特別に開発及び設計した機械である。
【００６８】
１．特性化されるタンパク質の一般解析
最初の工程は、特性化されるタンパク質の一次構造、二次構造及び三次構造の解析、並びに物理化学的性質の解析である。これに基づいて、どの手順が特性化に適切であるか決定される。選ばれる手順及び概念には、反応条件、例えばタンパク質濃度、溶媒、イオン強度、ｐＨ及び温度を含む、全ての個々の操作による全ての工程の内容、修飾形式、側鎖特異的な試薬、及び中間体の分離方法、及びそれらの流体力学的サイズに応じたそれらの差別化が含まれる。
【００６９】
本発明によると、特別に開発されたプログラムを、分子サイズ、ジスルフィド結合の含有量、親水性一貫性又は疎水性一貫性のタイプ、単一ドメイン又は多重ドメインによるタンパク質の分類、側鎖特異的な修飾試薬の選択、修飾されたタンパク質中間体のタンパク質分解消化に基づく理論的質量分析断片パターンの合成及び解析、並びに全てのタイプの本発明による修飾と相関する理論的質量分析断片パターンの表示、差別化及び解析に使用することができる。
【００７０】
本発明の適用に関連する解析については、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳後修飾及びタンパク質分解切断した中間体の理論的質量分析断片パターンの表示及び解析のため、並びに化学的因子及び／又は生物学的因子の下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートした、修飾及びタンパク質分解切断した中間体のリフォールディングの質量分析断片パターンの表示及び解析のための付加的なプログラムを使用することが可能である。
【００７１】
２．最大の流体力学的サイズを有する最適なアンフォールディングされたタンパク質サンプルの分離
最適なアンフォールディングされたタンパク質は、最大の流体力学的サイズを有する。このタンパク質サンプルの分離は、タンパク質の変性及び還元後に行われ、ジスルフィド結合を有するタンパク質及びジスルフィド結合を有しないタンパク質に適用可能である。ジスルフィド結合を有するタンパク質を、初めに変性試薬及び還元試薬で変性させる。その後、還元試薬をクロマトグラフィーによって除去し、同時にタンパク質を、それらの流体力学的サイズによって差別化される種々のサンプル中で分離する。急速な分子間再酸化の可能性を有する特定のタンパク質についての還元試薬の除去は、徐々に行うものとする。例えばＤＬＳを用いた分光解析、及び既知のエルマン試薬を用いた分子内の還元されるチオール残基の決定によって、解析されるタンパク質が完全に変性されているか否か、及びそのジスルフィド結合が完全に還元されているか否かを決定することが可能である。確実に十分に還元及び変性されたタンパク質を含む、最適な分離されたタンパク質サンプルは、最大の流体力学的サイズを有し、その後の動的修飾の出発物質として使用される。
【００７２】
変性及び還元は、既知の変性試薬及び還元試薬、例えば塩化グアニジン及びＤＴＥ（１，４−ジチオエリトリトール）を含む同じ緩衝溶液中で行われる。いずれの場合にも、濃度はタンパク質については最大で２０ｍｇ／ｍｌ、変性試薬については最大で８Ｍ、還元試薬については最大で０．４Ｍである。タンパク質の最適なアンフォールディングは、温度の増大、ｐＨ値の変化及び他の試薬の添加によって改善することができる。還元試薬の除去に用いられるクロマトグラフィーは、好ましくは低ｐＨ値を有する高濃度の変性試薬を含有する緩衝液を用いて行われる。ジスルフィド結合を有しないタンパク質の変性及び／又はアンフォールディングは、還元試薬を用いずに行われる。最大の流体力学的サイズを有するタンパク質サンプルの制御及び決定は、好ましくは液体クロマトグラフィーによる分離後のＤＬＳを用いた分光法によって行われる。
【００７３】
３．動的タンパク質修飾
完全に変性させたタンパク質は最大の流体力学的サイズを有する。希釈後の変性試薬濃度の急速な変化、又は温度若しくはｐＨの変化によって、変性させたタンパク質はリフォールディングを開始し、流体力学的サイズが徐々に減少する。タンパク質のフォールディングは、側鎖の立体的ブロッキングによる化学的修飾又は生物学的修飾を用いて経時的に捕捉される。タンパク質は可変性の構造的に比較的安定した中間体へと変換されるが、中間体の構造は、ジスルフィド結合を有する還元されたタンパク質に使用される再酸化試薬、又はジスルフィド結合を有しないタンパク質に対する架橋剤試薬のいずれかに加えて、新たに形成されるジスルフィド結合及び架橋剤結合の個々の特性によって決まる。本発明によると、タンパク質の修飾パターンの多様性が、タンパク質フォールディングプロセスの完全な特性化に対して基本的かつ必要不可欠な要件であることが見出された。さらに、本発明によると、とりわけ急速なフォールディング相のタンパク質フォールディングプロセスの特性化の正確さ及び精度が、方法の試薬及び反応速度によって決まることが見出された。この概念では、リフォールディングタンパク質の修飾可能性が多様であることから、リフォールディング時に存在する全ての中間体を、適切な試薬を用いて修飾することができ、それらの構造的特性によって差別化することができ、それらの個々の特性によって同定することができることが確実となる。
【００７４】
修飾は、目的とする特性化、並びに特性化されるタンパク質の様式（way）、タイプ及びサイズに応じて、適切なアプローチ及び方法、並びに組み合わせて使用される選ばれた化学物質及び材料を用いて種々の形態で行うことができる。タンパク質修飾は、本発明によると、リフォールディングタンパク質のＮ末端及びＣ末端を含む、例えばシステイン、リジン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン及びアスパラギン酸の残基で特異的に行われる。タンパク質修飾は、適用のタイプ、程度及び目的に応じて、以下のような異なるグループに分類することができる：
ジスルフィド結合を有するタンパク質の動的修飾、
ジスルフィド結合を有しないタンパク質の動的修飾、
マルチドメインタンパク質の動的修飾、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートした動的な翻訳時修飾及び翻訳後修飾、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートしたタンパク質フォールディング中の動的修飾、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質生合成中の動的修飾。
【００７５】
本発明によると、ジスルフィド結合を有するタンパク質の動的修飾は、ジスルフィド結合を有する還元及び変性させたタンパク質を再酸化し、再酸化中に様々な時間間隔をおいてサンプルの一部を単離して、修飾を行う（好ましくはタンパク質の遊離チオール基をブロックする側鎖特異的な試薬を用いた単一修飾を行う）ことを意図する。本発明によると、リフォールディング構造の動的修飾は、異なる構造的特性及び流体力学的サイズを有する様々な中間体の捕捉をもたらす。この際、タンパク分解によって切断された断片の特定のパターンの相互連結をもたらす様々な天然及び非天然のジスルフィド結合が生成し、一方で残存するチオール基が側鎖特異的な試薬との反応によってブロックされる。リフォールディング時に形成されるこれらのジスルフィド結合は、フォールディング経路同一性による中間体の分類の基準となる。フォールディング経路及び対応する中間体の厳密な差別化については、様々な（maltimanner）修飾を適用するものとし、システイン、ヒスチジン、リジン、メチオニン及びアルギニンの残基を、例えばｐＨ値が段階的に変動する制御された反応条件下で、別個に複数の側鎖特異的な試薬、又は排他的に唯一の試薬、例えばヨウ素アセトアミドと反応させるものとする。
【００７６】
本発明によると、ジスルフィド結合を有しないタンパク質の動的修飾は、ジスルフィド結合を形成するチオール基を有しない変性させたタンパク質をリフォールディングし、様々な時間間隔をおいてサンプルの一部を単離し、次いでタンパク質を、配列の特性及び修飾された側鎖の構造的アクセシビリティ、並びにそれらの単一修飾、多重（multi）修飾及び／又は内部架橋剤修飾の酵素的切断パターンに応じて修飾することを意図する。単一修飾を、タンパク質配列中に高頻度で存在し、特異的な単一側鎖修飾試薬を用いて修飾することができる個々のアミノ酸に向けて行う。多重修飾は、個別ではなく、まとまって配列中に豊富にあり、少なくとも１つの単一側鎖修飾試薬を用いて容易に修飾することができるアミノ酸に好適である。次いで、これらの選択されたアミノ酸を、反応条件を変化させるか、又は複数の異なる特異的な側鎖試薬を混合することによって修飾する。内部架橋剤修飾は、ジスルフィド架橋様結合の形成をもたらし、したがってタンパク質分解断片が連結されることとなる。かかる修飾は、リフォールディングタンパク質の微小環境によって決まる、側鎖に挿入される修飾試薬の個々のタイプ、数及び部位、並びにタンパク分解によって生じる断片の個々の質量分析パターンによる個々の特性を中間体に与える。個々の修飾パターンとリフォールディングタンパク質の構造との相互依存性は、流体力学的サイズによる中間体の差別化及びジスルフィド結合を有しない中間体の分類の基本である。
【００７７】
本発明によると、マルチドメインタンパク質の動的修飾は、マルチドメインタンパク質の独立する単離されたタンパク質ドメイン、又は固有のタンパク質の分子内で依存するドメインを、変性後にリフォールディングし、様々な時間間隔をおいてサンプルの一部を分離することを意図する。続いて、選択的な単一修飾又は多重修飾及び／又は架橋剤修飾を、タンパク質の個々の特性、その配列特性、構造特性及びタンパク質分解特性に応じて行う。この目的で、後にタンパク分解によって生じる断片の間に架橋剤を挿入するために単官能性試薬及び多官能性試薬、並びにビオチン化試薬、又は他の試薬を使用することが可能であり、とりわけ巨大マルチドメインタンパク質の最適な変性のための試薬を使用することが可能である。
【００７８】
ジスルフィド結合を含有するマルチドメインタンパク質については、リフォールディング及び修飾を開始する前に完全に還元し、変性させ、その後還元試薬を除去する必要がある。
【００７９】
本発明によると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートした動的翻訳時修飾及び翻訳後修飾は、以下のようにして規定される：
第１に、ジスルフィド結合を有しない完全に変性させたタンパク質、並びに還元剤を除いた、ジスルフィド結合を有する完全に還元及び変性させたタンパク質を、本発明に従って特性化する。次いで、タンパク質リフォールディングを、化学試薬若しくは酵素試薬、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳後修飾に特異的な細胞抽出物を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳後修飾によって行う。リフォールディング及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳後修飾の間、様々な時間間隔をおいてタンパク質サンプルの一部を分離する。次いで、中間体をゲル電気泳動又はクロマトグラフィー法を用いて分離する。更なる工程において、フォールディングプロセスを本発明に従って特性化し、翻訳後修飾の有無によって比較する。
第２に、翻訳後修飾の特性化を、１５Ｎ及び／又は１３Ｃ同位体標識タンパク質の添加、並びに質量分析を用いた解析による更なる定量化によって行う。この目的で、同位体標識を有するタンパク質及び同位体標識を有しないタンパク質を、規定の比率で混合した後、特性化を本発明に従って行う。
第３に、本発明に従って特性化したタンパク質を、タンパク質の生合成、及び存在する場合に翻訳時修飾に特異的な細胞抽出物と反応させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成中に解析する。解析は、ゲル電気泳動及び／又はクロマトグラフィー法によって分離し、変性及び還元し、還元試薬を除去し、次いでリフォールディングを行い、必要に応じて再酸化を導入し、次の工程で本発明に従う特性化を行い、本発明に従って解析したフォールディングプロセスを、翻訳後修飾の有無によって比較した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生合成され、可能であれば翻訳時修飾されたタンパク質の比較によって、タンパク質の翻訳時修飾のプロセス及び程度を特性化し、翻訳時修飾及び翻訳後修飾を差別化するために行われる。
第４に、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートした翻訳時修飾及び／又は翻訳後修飾について本発明に従って特性化したタンパク質を、かかる修飾に対する化学的及び生物学的な添加剤及び阻害剤について精査し、タンパク質フォールディングに対するそれらの影響を解析するために、生理的条件及び生化学的条件の調節に関与する異なる候補試薬を用いた同じ無細胞反応によって解析する。かかる添加剤及び阻害剤の影響を解析するために、解析を行い、比較する。
このようにして導入されたｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートした翻訳後修飾は全て、タンパク質の固定化及びハイスループットスクリーニングに利用されるタンパク質チップの開発の技術と併用することができ、本発明に従って更なる適用に使用することができ、目的に応じて、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳後修飾される生物製剤の合成の最適化のために、種々の方法で組み合わせて、展開することができる。
【００８０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートしたタンパク質フォールディングの動的修飾は、本発明によると以下のように規定される：
第１の実施形態では、先にタンパク質フォールディングプロセスを本発明に従って特性化した、ジスルフィド結合を有しない完全に変性させたタンパク質、又は還元試薬を除いた完全に還元及び変性させたタンパク質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートしたフォールディングプロセスに対するリフォールディング中のタンパク質の凝集を特性化するために、タンパク質濃度、温度（凍結及び解凍（unfreezing）を含む）、溶媒、イオン強度、ｐＨ値、並びにタンパク質の安定化及び／又は不安定化のための付加的な試薬の変化を有する、種々の分子環境条件を用いた並行反応において解析することを意図する。凝集を生じない反応を陰性対照として使用する。この目的で、タンパク質をリフォールディングし、様々な時間間隔をおいてサンプルの一部を分離する。その後、特異的な側鎖試薬を用いた選択的な修飾を行い、サンプルを特性化のための他の適用に備える。
第２の実施形態では、本発明に従って特性化した、還元試薬を除いた２つ以上の完全に変性させ、還元したタンパク質を、リフォールディング中の特定のタンパク質の相互作用を特性化するために、タンパク質濃度、温度（凍結及び解凍を含む）、溶媒、イオン強度、ｐＨ値、及びタンパク質の安定化及び／又は不安定化のための他の試薬を変化させることによって、種々の分子環境条件を用いた並行反応において解析することを意図する。相互作用を生じない反応を陰性対照として使用する。この目的で、リフォールディングタンパク質を個々の実験で別個に解析するか、又は１つの実験で解析し、様々な時間間隔をおいてサンプルの一部を分離し、次いで混合し、いずれの場合にも対応する側鎖試薬を用いる選択された修飾を行い、続いてサンプルをプロセスの更なる特性化に備える。
第３の実施形態では、先に本発明に従って特性化した、ジスルフィド結合を有しない完全に変性させたタンパク質、及び還元試薬を除いた、ジスルフィド結合を有する完全に変性させ、還元したタンパク質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートしたフォールディングプロセスについて、タンパク質フォールディングに対して影響を与える生物試薬及び化学試薬を探索するために、異なる生物学的及び／又は化学的な阻害剤又は添加剤を用いた並行反応において解析することを意図する。阻害剤又は添加剤を用いない実験を陰性対照として使用する。この目的で、特性化、及び他のタンパク質フォールディングプロセスとの比較を得るために、様々な時間間隔をおいてリフォールディングタンパク質を一部分離し、対応する側鎖試薬を用いた選択的な修飾を行い、その後の分離及びタンパク質分解切断及び質量分析測定を行う。
第４の実施形態では、先に本発明に従って特性化した、ジスルフィド結合を有しない完全に変性させたタンパク質、又は還元試薬を除いた、ジスルフィド結合を有する完全に変性させ、還元したタンパク質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートしたタンパク質フォールディングプロセス中のタンパク質フォールディングに対するフォルダーゼ及びシャペロンの影響を解析するために、異なる既知のフォルダーゼ及び／又はシャペロンを用いた並行実験において解析することを意図する。フォルダーゼ及びシャペロンを用いない実験を陰性対照として使用する。この目的で、タンパク質フォールディングプロセスを特性化し、比較するために、様々な時間間隔をおいてリフォールディングタンパク質をサンプルの一部で分離し、対応する側鎖試薬を用いた選択された修飾、その後の分離及び更なるタンパク質分解切断及び質量分析測定を行う。
第５の実施形態では、フォルダーゼ及び／又はシャペロンの影響に関して本発明に従って特性化した、ジスルフィド結合を有しない完全に変性させたタンパク質、又はジスルフィド結合を有し、還元試薬を除いた完全に変性させ、還元したタンパク質を、フォルダーゼ及びシャペロンの効果的な阻害剤を探索するために更に解析し、それらの候補阻害剤をシミュレートしたリフォールディング時に解析することを意図する。種々の候補試薬を並行して解析することができ、候補試薬を用いない１回の実験を陰性対照として使用する。この目的で、様々な時間間隔をおいてタンパク質を一部分離し、対応する側鎖試薬を用いた選択的な修飾を行う。全てのタンパク質フォールディングプロセスのその後の特性化及び比較の後、フォルダーゼ及び／又はシャペロンを阻害する候補試薬の能力を解析することができる。本発明によると、これらの実験に使用されるフォルダーゼ及びシャペロンは、反応に直接添加しても、又はタンパク質フォールディングの開始前の無細胞タンパク質合成のための細胞抽出物の適用によって添加してもよい。本発明によると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートしたタンパク質フォールディングプロセス中の動的修飾の適用を用いて、新たな生物製剤の開発のためにタンパク質フォールディング及びタンパク質分解の生物学的及び化学的な添加剤及び阻害剤を探索することができる。
第６の実施形態では、本発明に従って特性化した、完全に変性させたポリペプチド鎖又はタンパク質を、それらのリフォールディング中のポリペプチド又はタンパク質の規定の自己集合及び重合を解析するため、並びにナノタンパク質材料を開発及び合成するために、フォールディングに影響を与える生物試薬及び／又は化学試薬、並びに可能であればペプチド結合の形成に影響を与える試薬を用いた並行反応において、制御条件下で解析することを意図する。ペプチド結合の形成に影響を与える試薬を用いない実験を陰性対照として使用する。この目的で、リフォールディングタンパク質、並びに同時に自己集合タンパク質及び／又は重合タンパク質を様々な時間間隔をおいて一部分離し、対応する側鎖試薬を用いた選択的な修飾を行い、一部をフォールディングプロセスの更なる特性化に備える。
第７の実施形態では、フォールディングプロセスを予め本発明に従って特性化した疾患原因タンパク質を、その不正確なフォールディングのために、アンフォールディングされたタンパク質に特異的に結合し、それによりタンパク質構造を安定化させ、ミスフォールディングされたタンパク質の疎水性ドメインのフォールディング又はマスキングを改善することにより、それらの溶解性を増大させ、アンフォールディングされたタンパク質の凝集を防止する生物学的及び／又は化学的な候補フォールディング安定化物質を用いた並行アプローチにおいて、タンパク質症に対する薬理学的シャペロンを求めて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートしたフォールディングプロセスに適合させることができることが示される。フォールディングを安定化させる生物学的及び／又は化学的な物質の候補を用いないアプローチを陰性対照とする。ここで、フォールディング安定化因子の影響を受けたリフォールディングタンパク質を様々な時間間隔をおいて一部分離し、適切な側鎖試薬を用いた選択された修飾に供し、その後のこのプロセスに対する本発明の特性化及び評価に備える。
第８の実施形態では、フォールディングプロセスを本発明に従って予め特性化した特定のプリオンタンパク質を、病因を明らかにし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートしたフォールディングプロセスを防止する治療選択及び方法を探索するために、生物学的及び／又は化学的なフォールディング影響物質を用いた並行反応において、第１にその時点での凝集を含む、ＰｒＰｃ（正常プリオンタンパク質＝細胞プリオンタンパク質）からＰｒＰＳｃ（スクレイピープリオンタンパク質；プリオンタンパク質の病原型）へのリフォールディング、及び第２に凝集の減少を含む、ＰｒＰＳからＰｒＰｃへの逆転についてのプロセスの特性化のための温度、ｐＨ及びイオン強度等の不安定条件の調節下でもたらすことが示される。タンパク質フォールディングに影響を与える生物学的及び／又は化学的な物質を用いないアプローチを、ここで陰性対照として使用する。この場合、フォールディング影響物質の影響を受けたリフォールディングプリオンタンパク質を、様々な時間間隔をおいて一部分離し、適切な側鎖試薬を用いる選択された修飾を行い、更なるアプローチに備える。
第９の実施形態では、フォールディングプロセスを本発明に従って予め特性化した完全に変性させ、還元し、還元剤を含まないタンパク質を、そのリフォールディングにおいて、触媒によって加速される異性化、光化学エネルギー及び熱エネルギーを供給することによる脱アミド化及びラセミ化、又はラジカル反応、酸化ストレス及び環境影響のいずれかによって開始する修飾に供し、リフォールディングタンパク質を様々な時間間隔をおいて一部分離し、次いで同じ側鎖試薬を用いた修飾に供することが示される。異性化、脱アミド化及びラセミ化、又はフリーラジカル曝露、酸化ストレス及び環境因子のない混合物を陰性対照とする。フォールディング事象のプロセスの更なる特性化及び比較の際に、電荷条件及び立体配座及びタンパク質老化の変化を検査する。これは、老化プロセスの研究、生物学的抗酸化剤及び化学的抗酸化剤の発見及び開発である。
【００８１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質生合成における動的修飾において、本発明によると、フォールディングプロセスを先に本発明に従って特性化した、無細胞アプローチにおいて生合成されるタンパク質を、その急激な生合成中に様々な時間間隔をおいて冷却保存を用いて一部分離した後、混合し、変性させ、任意に還元し、還元剤を除き、種々のポリペプチド断片においてアミノ酸鎖の規定の長さに従って、ゲル電気泳動又はクロマトグラフィーによって選択的に分離し、ここで、これらの断片の各々が或る特定の長さのアミノ酸配列を有し、同等の分子質量を有するが、同等でない構造的設計を有する場合があり、ミニ中間体と称されることが理解される。次いで、これらの分離されたポリペプチド断片を、生合成及び翻訳時修飾中のフォールディングプロセスの特性化に適切な側鎖試薬を用いて任意に修飾し、同位体標識を有する又は有しない必要とされるアミノ酸の使用の調節によって、生合成されたミニ中間体の長さによる翻訳時修飾が達成され、生じたかかるミニ中間体の形成のタイミングを、全アミノ酸配列に対するそれらの長さの比率によって再規定する。
【００８２】
選ばれる修飾方法は、本発明によると下記のように規定される：
単一修飾：至適反応条件下での単一試薬を用いた、単一タイプのアミノ酸残基の選択的な修飾と規定される。
多重修飾：反応条件を変化させることによる単一又は２つ以上のタイプの試薬を用いた、２種類以上のアミノ酸における残基の選択的な修飾と規定される。初めに単一又は幾つかのバッチにおいて別個に行い、次いで混合してもよい。
内部架橋剤修飾：様々な実施形態における調節された反応条件での二官能性試薬を用いた選択的な内部二重修飾と規定される。
【００８３】
適用される既知の修飾方法は多様であり、適切な修飾のためのタンパク質フォールディングの特定の時間スケールに応じて利用可能である。方法の選択によって、本発明によると、主として側鎖試薬の反応速度及び修飾されるタンパク質の性質に依存して修飾速度（speed rate）が決定される。したがって、この方法は修飾の反応速度に応じて、以下の３つのグループに分けることができる：
数ナノ秒、数マイクロ秒〜数ミリ秒の時間スケールを用いた修飾速度。これは、数ミリ秒〜数秒の時間スケールを用いたタンパク質フォールディングの研究に有用である。これらの最も速いフォールディング相は、水素結合の形成、二次構造要素の形成、及びポリペプチド鎖の疎水性崩壊を含む。これらの最も速い修飾は、例えば特異的な側鎖試薬を用いて、又はプロリン及びアスパラギン酸の異性化並びにアスパラギンの脱アミド化のための光化学エネルギー及び熱エネルギーの供給によって達成することが可能である。
数マイクロ秒〜分の時間スケールを用いた修飾速度。マイクロ波技術を用いて、数ミリ秒〜数分の時間スケールを用いたタンパク質フォールディングの研究に適用可能な修飾反応速度を達成することができる。これは速いフォールディング相、及び種々の中間体に関連する種々の経路の発生の初期段階に関する。
数ミリ秒〜数分の時間スケールを用いた修飾反応速度。これは、数秒〜数時間又は数日間の時間スケールを用いたタンパク質フォールディングの研究に有用であり、通常は遅いタンパク質フォールディング相、並びに経路が関連する中間体の形成、比較的安定した小型のモルテングロビュール構造の形成、及び最小のエネルギーレベルを有する天然状態への中間体の更なるフォールディングである。
【００８４】
速いフォールディング相のための時間スケールでの修飾は、本発明に従って必要に応じて、マイクロ波ミニ装置及び分光検出とともにクエンチフロー法、ストップトフロー法及び連続フロー法、並びに乱流混合法を用いて、それぞれの反応混合物中で使用することができる。遅いフォールディング相の修飾は従来の方法を用いて行うことができる。リフォールディングタンパク質の修飾の成功の基本的基準は、修飾及び捕捉された全ての中間体生成物が、個々の特性によって分離することができる構造的に比較的安定した中間体によって示されているかどうかである。
【００８５】
本発明によると、修飾に選択される試薬は以下の例を含む：
既知の及び知られていないが、作用するタンパク質の変性剤、
既知の及び知られていないが、作用するジスルフィド結合の還元剤、
既知の及び未知であるが、作用する再酸化試薬（ジスルフィドを含有するタンパク質の修飾に特異的なそれらの様々な成分及び組成物を含む）、
同位体標識を有する及び有しない、既知の及び未知であるが、機能的に同一な側鎖特異的な試薬、
蛍光標識、好ましくはタンパク質に対して電荷変化の影響を有しない小分子試薬、特に既知のＤＩＧＥ（ディファレンスゲル電気泳動）試薬のスピン標識レポーター基、
光標識用の試薬を含む、既知の及び知られていないが、機能的に同一な内部標識用の無官能性架橋剤試薬、ホモ二官能性架橋剤試薬及びヘテロ二官能性架橋剤試薬、
既知の及び知られていないが、機能的に同一なビオチン化試薬。
【００８６】
本発明によると、修飾及び／又は酸化中の天然のフォールディング効率の安定化、改善及び増大のために必要とされ、選択される補助物質、とりわけ巨大タンパク質は、以下のものを含む：
フォルダーゼ及びシャペロンという名のフォールディング因子として既知の及び知られていないが、機能的に同一な試薬、
ミスフォールディングの低減に使用され、凝集の減少に使用され、及び／又は適用される生物学的物質及び化学物質の熱安定性を増大させるための、バイオテクノロジーによって生産された治療用タンパク質の最適な復元のための既知の及び知られていないが、同等に作用する補助物質。これらは、タンパク質修飾のために本発明の全ての実施形態に適切に適用される。
【００８７】
種々の手順及び実施形態において必要とされる修飾を行うために、本発明による手段は、一連の（series）アッセイキット、特別な実験装置、及び適切な場合には、特定のソフトウェアの形態で使用される。修飾反応溶液の修飾されたタンパク質の分離を促進するために、タンパク質を必要性に応じて、初めに基質上に化学的に固定化し、次いで修飾後に反応の他の成分をすすぐことによって分離し、その後化学的切断又は光化学的切断によって基質から放出させ、中間体の更なる分離に備える。このことは、修飾対象の全てのタンパク質に当てはまる。
【００８８】
４．中間体の分離及び定量化、並びにそれらの形成時間の関数としてのそれらの流体力学的サイズ及び材料の量の二次元表示
これらの上記に記載の中間体の修飾は全て、本発明よると、達成されるそれらの流体力学的サイズ、及び手作業で分離されるか、又は本発明により自動的に定量化される量に従って２つの方法に分けられ、それらの形成時間の関数としてのそれらの流体力学的サイズ、又は適切な場合には熱力学的パラメータ及び量によって分類することができ、４相マルチフォールディング経路モデルを２つの次元に従って表示する。種々の経路の種々のフォールディング相に関するタンパク質フォールディングのフィンガープリントプロファイルを、これにより生成することができる。
【００８９】
第１の実施方法は電気泳動法に基づく。この形態の実施方法は、好ましいキャピラリー電気泳動を指し、好ましくは包括的な及び親水性のタンパク質を対象とする、本発明者によって修正された特別なネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動を指し、その形態の処理されるタンパク質のタイプ、サイズ及び量は様々に設計される。中間体の流体力学的サイズ及びそれらの量は、本明細書では例えば、直接ゲル上での二次元電気泳動後に、それらの形成時間に対して異なる染色強度を有するバンドの形態で表示され、更なる調査のためのスキャニング及びデジタル化に備えられる。異なる時間で生じ、同じ流体力学的サイズ又は同じゲルバンドを有する同じゲルバンドは、ここでは同じ中間体を表す。
【００９０】
２つ以上の中間体が単一バンド中に存在する場合、中間体をゲルの結合から電気泳動溶出した後、本発明者によって構築されたマイクロカラムクロマトグラフィーを用いて、分子表面上のそれらの電荷分布、疎水性及び親水性の差に従って分離し、次いでＤＬＳ（動的光散乱）、ＳＬＳ（静的光散乱）、ＣＤ、蛍光を用いた分光分析を、差別化のために適用する。
【００９１】
この本発明によって修正されたネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、個々のタンパク質に由来する中間体の流体力学的サイズの僅かな差によって差別化する従来のタンパク質分離とは対照的に、個々の中間体間の分離能力を増大させて、最大の分離効率を達成し、電気泳動の期間を短縮することを目的とする。これは少なくとも５つの技術的に関連する改善点を含む。
第１に、所望の緩衝溶液で充填され、カソードに対する緩衝液リザーバの隣に位置する透過性容器を組み込むこと、又はカソードに対する緩衝液リザーバ内に位置し、細い管によって外容器と連結されている緩衝液分配デバイスによる、電気泳動中の緩衝液濃度、組成及びｐＨ値の適切な調節のための緩衝溶液の送達系の連結。これによって、所望の緩衝溶液を所望の速度に従って連続的又は不連続的に供給すること、及び注入が可能となる。
第２に、電気泳動中に供給する緩衝溶液を調節することによる分離分解能の動的制御及び最適化。緩衝液濃度、組成及びｐＨ値についての設定は、タンパク質の中間体間の電荷及び極性の差の増大、並びにイオン電流をもたらす。本明細書で改善された分解能は、タンパク質の電荷及び形態だけでなく、新たに導入された差別化因子にも基づき、中間体の動的に変化させた電荷及び極性の分布、並びに付加的なイオン電流とのそれらの多様な相互作用を効果的に決定する。
第３に、単一バンドの集中及び中間体バンドの除去の拡大のための高度に疎水性の対イオンと組み合わせた電圧の一時的な増大、緩衝液成分の極性及び／又はそれらの濃度の短期変化、並びに短期の極性反転によるパルス電気泳動の適用。
第４に、特に大きなサイズのタンパク質の中間体の分離のための、例えば多孔性勾配ゲルによる多様なゲル組成及び形状の使用。
第５に、バンド間の中間体の拡散によって引き起こされる熱作用を抑制するために、行われるゲル電気泳動の温度は、１０℃を超えないものとし、ここで、電気泳動装置は十分に効果的な冷却サーモスタットに直接連結されているか、又は本発明に従って、ゲルからの同時熱除去及び熱放散のために、ペルチェ冷却板及び既存の循環液冷却装置から氷含有冷却リザーバへと組み立てることができる。
【００９２】
実施方法の第２の形態は、本発明者によって設計される、流体力学的サイズの分光的差別化、好ましくはＤＬＳ及びＳＬＳと併用した、小型化したフィールドフローフラクショネーション（ＦＦＦ）及び必要とされるマイクロカラム電気泳動を含む、モノカラム液体クロマトグラフィー及びマルチカラム液体クロマトグラフィーである。これらは全てのタンパク質の中間体サイズによる分離及び差別化に好適であるが、主に、非常に巨大なタンパク質を含む、電気泳動法に好適でないタンパク質、強酸性、強塩基性、疎水性及び膜のタンパク質を対象とし、それらの中間体はゲル電気泳動を用いて効果的に分離することができない。流体力学的サイズ、又は場合によっては熱力学的パラメータによる分光的差別化によって個々のマイクロ容器に分離された中間体は各々、更なる工程のために、通常はマイクロタイタープレートに配列された２つの次元で、それらの形成時間の関数として割り当てられ、データベースに保存される。モノカラム液体クロマトグラフィーでは、個々の溶出液の各々に分離された中間体の流体力学的サイズの順番の直接的決定のための分光的検査と組み合わせた、所望又は必要に応じて種々の分離媒体を充填した各々の、又は個々のマイクロゲル濾過カラム又はマイクロフィールドフローフラクショネーションカナルの好ましい使用が意図される。
【００９３】
マルチカラム液体クロマトグラフィーは、主として非常に似た流体力学的サイズを有し、同じ又は異なるフォールディング経路に属する中間体の特異的な単離のためのマイクロフローフィールドフラクショネーションチャネルを含む、ゲル濾過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーの要求又は必要に応じて連続する及び／又は並行するマイクロカラムの組合せと定義される。
【００９４】
単離された中間体の流体力学的変数を、通常は初めに連続的に又はマイクロタイタープレートにおいてマイクロ容器を用いるマルチカラムクロマトグラフィーによって分光的に差別化し、次いでそれらのサイズの順番で配置し、データベースに保存した後、それらの形成時間の関数として２つの次元で分類する。
【００９５】
異なる個々のマイクロ容器に分離された中間体の流体力学的サイズの組み合わせた分光的差別化及びそれらの定量化は、好ましくはＤＬＳ（動的光散乱）及びＳＬＳ（静的光散乱）を用いて行われ、これは、市販の補助物（supplements）において様々な形態で提供される蛍光分光法、ＵＶ（紫外線放射）／ＶＩＳ（可視スペクトル）分光法、ＣＤ（円偏光二色性）分光法、ＮＭＲ（核磁気共鳴）分光法、フーリエ変換赤外分光法及びＥＳＲ（電子スピン共鳴）分光法等を用いて実施される。
【００９６】
異なる流体力学的サイズ、又は非常に似た流体力学的サイズで分布しているが、異なるフォールディング経路に属する中間体の単一サンプル部分における特異的な差別化は、本発明によって修正されたＤＬＳデバイス及びＳＬＳデバイスを用いて行うことができ、それらの差別化能を、以下の付加的な機能の少なくとも１つによって改良することができる：
測定時間の延長による差別化分解能の増大、
温度の漸増によって制御されるプログラムによるＴｍ（融点）差別化、
希釈又は内部の真空蒸発若しくは通気によって行われる濃縮による個々のマイクロ容器又はマイクロタイタープレート中のサンプルの濃度変化、
所望の緩衝液組成物のマイクロオートタイトレーション（Microautotitration）又は手動ピペット操作によるｐＨプロファイル及び緩衝系の変化、
連続構造の中間体の更なる差別化のためのサンプルの固有粘度及びゼータ電位の決定及び評価、
照射、加熱及び冷却、超音波、マイクロ波、電場及び磁場の形態でのエネルギーの供給又はエネルギーの除去によるサンプルの生物レオロジー性質の変化、
それにより差別化された中間体の特別に開発されたソフトウェアによる評定及び配置。
【００９７】
中間体の流体力学的サイズの分布表示のためのＤＬＳの改善された機能によって、本発明に従って規定されるフォールディング相におけるフォールディングチャネルの構築の動作を示す、タンパク質のフォールディングのフィンガープリントプロファイルを、クエンチフロー又はストップトフロータンデムミキサーの機器と連結して規定の条件下で決定し、グラフィックスソフトウェアを用いて視覚化することができる。ここで、最適な完全にアンフォールディングされたタンパク質は、第１のミキサーによってリフォールディングが誘導され、次いで様々な時間間隔をおいて第２のミキサーによって動的修飾が開始し、その際、これらの時間間隔で得られる中間体の流体力学的サイズの分布をＤＬＳ測定に供して決定する。
【００９８】
流体力学的サイズの分光的差別化と併用されるこの液体クロマトグラフィーは、タンパク質の物理化学的性質及び各々の調査の目的に応じて、本発明者によって規定されるマイクロ規模、解析規模及び半分取規模で行われる。
【００９９】
マイクロ規模での実施方法は、非常に僅かなタンパク質しか必要とせず、１００μｇ未満のタンパク質を含有するタンパク質修飾のマイクロアプローチの迅速な処理が有用となり、個々のポート、又は連続若しくは並行するポートで、本発明者によって構築されたマイクロゲル濾過カラムと並行して行われる。
【０１００】
溶出液の大部分をマイクロタイタープレートに回収し、それらの流体力学的サイズ及び濃度差の分光的確認によってタンパク質分解的切断のために準備する。解析規模の実施方法は、最大で１ｍｇのタンパク質を必要とし、類似の流体力学的サイズのためにマイクロ規模の実施方法では完全に除去することができない中間体の分離を特に目的とするか、又はそれらのフォールディング経路同一性を更に差別化する。この規模での中間体の分離は、マルチ液体カラムクロマトグラフィーを用いて行われ、反復ＤＬＳ規定、分光測定による構造解析、その後のタンパク質分解断片化及び他の必要な調査に十分なタンパク質材料をもたらす。
【０１０１】
半分取規模での実行は、１ｍｇ超のタンパク質を必要とし、先にマイクロ規模又は解析規模で首尾よく実証された分離と同じ概念に基づき、構造的変化の個々の特性をより詳細に差別化することによって中間体のフォールディング経路を差別化するために、主に分離された中間体のＮＭＲ又は結晶構造決定のためのサンプルの調製に用いられる。この実施方法は、クロマトグラフィーの既知知識であり、それに従って調製される市販の製品を用いて行うことができる。
【０１０２】
この２つの適用様式は、本発明に従って、好ましくはＤＬＳ及びＳＬＳによって標準化し、部分的又は完全に自動化し、小型化し、本発明のプロセスとオンライン又はオフラインで連結した、電気泳動、液体クロマトグラフィー、電気クロマトグラフィー、フィールドフローフラクショネーション及び分光分析等の既知知識である装置の選択的コンパイルによって標準化することができる。
【０１０３】
５．ゲル内消化又は液中消化による中間体の断片化
断片化は、中間体のフォールディング経路の厳密な同一性の更なる差別化のための第１の工程である。流体力学的サイズ及び形成時間を設定した、電気泳動及びクロマトグラフィーによって分離された中間体の断片化は、好ましくはトリプシンを用いた酵素的消化によって行われる。トリプシンに加えて、トリプシンに対する可能性のあるプロテアーゼ耐性が修飾によって引き起こされる場合、及び望ましい付加的な切断部位の保存のために通常は使用されるＬｙｓ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃ及びＡｓｐ−Ｎのような他のエンドプロテアーゼを使用することができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＰＳＤ（ポストソース分解）の代替であるエキソプロテアーゼ切断及び化学的切断は、同じ分子量を有する断片を差別化するために、酵素的に切断された断片のＮ末端及び／又はＣ末端からのアミノ酸の加水分解に用いられる。全てのタンパク質分解断片化は、手作業で若しくは市販の消化ロボットを用いて、又は平均的なサンプル処理量を有する、本発明者によって特別に設計されたマイクロ波消化装置によって行うことができる。マイクロタイタープレート中の断片化されたサンプルは、質量分析計とオンライン又はオフラインで連結することができる。
【０１０４】
様々な時間間隔をおいてゲルバンドに分離される、電気泳動によって分離された中間体を、クマシーブリリアントブルー染色又は銀染色によって染色し、二次元ゲル上に展開し（displayed）、撮影し、精査してデジタル化する。染色強度の定量的評価及び中間体の定量化を、密度計を用いて行う。ここでは（this）、中間体間の動態関係を適切なソフトウェアを用いて定性的に解釈することができる。単独の又は異なる蛍光色素を用いて標識し、ゲル電気泳動によって分離した中間体を、蛍光スキャナーによって検出し、デジタル化する。バンドが２つ以上の中間体を含有する場合、中間体混合物を初めにマイクロカラムを用いて、クロマトグラフィーによって分離し、次いで別個に断片化する。バンド中の全ての中間体を、本発明に従って、特定のツールを用いて手作業で、又はゲルバンドピッカーを用いて自動的に分離し、それらを酵素的に切断された断片におけるゲル内消化のための多機能マイクロプレートにおいて標準的な方法を用いて又は新規の消化装置を用いて切断する。付加的な細胞外タンパク質分解的（exoproteolytic）切断又は化学的切断が、最初の質量分析研究によるゲル内消化からの他の溶液中で行われる。
【０１０５】
クロマトグラフィーによって分離された中間体の断片化は、マイクロタイタープレート内での液中消化のための標準方法を用いて、又はゲル電気泳動によって分離された中間体の操作の最終工程と同様に、本発明者によってゲル内消化に特異的に構築した消化装置によって行うことができる。
【０１０６】
６．断片化された中間体の質量分析検出
質量分析検出は、各々の中間体のフォールディング経路同一性のより正確な差別化のための第２の工程である。選択される方法には、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析）、ＭＡＬＤ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（Flugzeit-Massenspektrometrie））、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ（タンデム質量分析）及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＰＳＤ（ポストソース分解質量分析）等が含まれる。
【０１０７】
断片化された中間体の質量分析検出は、個々の断片全て、並びにジスルフィド架橋によって結合した及び／又は架橋剤によって連結された大きな断片の分子量の測定によって行う。収集した全てのデータをデータベースに保存する。このデータベースは、本発明に従って、市販の又は特別に開発したソフトウェアを用いて設計及び保存した、全ての可能な中間体の断片、及び相互連結した断片である大きな断片を含む全ての得られる断片の理論的解析値を含有する。
【０１０８】
７．中間体のフォールディング経路同一性の決定
中間体のフォールディング経路同一性を決定するのに極めて重要な工程は、小数の小さな断片、並びにジスルフィド架橋及び／又は架橋剤によって結合した断片の数及び質量について収集した質量分析情報と、理論的断片質量検出パターンのデータベースに保存されたデータとの比較である。ここで、タンパク質進化の理論及びタンパク質フォールディング動態に基づく上記で説明した基準が、中間体のフォールディング経路同一性の定義を完成させるのに必要とされる。修飾に基づく各々の断片化された中間体の特性を比較によって検出し、特異的な標識（title）でマークする。各々が種々の時点に由来する分離された中間体も比較し、その標識（names）の個々の特性に応じて選択する。それによって、特別なソフトウェアを用いて自動的に表が作成される。この表においては、最初の欄の流体力学的サイズは上から下に向かって減少し、他の欄の特定された形成時間は時間間隔によって左から右に向かって増大する。
【０１０９】
全ての中間体を、それらの流体力学的サイズ、形成時間、及び必要に応じて量に従って表に規定する。表の他の欄に、全ての中間体についての種々のマーク又は標識を明記する。同じように標識された中間体は、自然数を用いてグループに分類することができる。数多くのグループの帰属関係によって割り当てられた全ての中間体は、最終欄の前の欄に掲載する。或る中間体がかかる自然数による中間体グループに属する場合、そのフォールディング経路の帰属関係はこの数によって決定され、最終欄に記入される。
【０１１０】
フォールディング経路同一性がそれまで明らかに規定されていない分離された中間体を、必要に応じてＣＤ研究、ＵＶ研究、ＮＭＲ研究及び蛍光研究等の構造的研究及び熱力学的研究を用いる、改良されたＤＬＳデバイス及びＳＬＳデバイスと併用した、第４の工程に記載の液体クロマトグラフィーの使用によって解析規模及び半分取規模で更に解析し、それらのフォールディング経路同一性に関して差別化することができる。
【０１１１】
このことは、中間体のフォールディング経路同一性は、単独では規定することができないが、特定のフォールディング経路のグループ帰属関係によって規定することができることを示す。
【０１１２】
８．中間体の同定及び分類
中間体の同定は、その予め確立された流体力学的サイズ、形成時間、定量化されたその量、及び同定されたフォールディング経路同一性を決定することによって行われる。
【０１１３】
全ての中間体は、特定のフォールディング経路のそれらのグループ帰属関係のそれらの個々の名称に従って同定することができる。そのグループに関連する中間体は、或る特定の共通する特性を有するものとする。特徴は、以下の説明にあるような様々な形でグループの多様性に応じて明らかとなる。
【０１１４】
これらは類似の修飾パターンを有するものとする。それらの流体力学的サイズは、天然の構造ヘ向かう時間間隔とともに段階的に減少するものとする。これらは、モルテングロビュールと称される場合がある比較的安定した小型構造を有する、少なくとも１つの重要な中間体を有し得る。これらは流体力学的サイズが非常に似た、その間で分子内再構成が起こる中間体も含み得る。さらに、これらは、経路（road）の分岐、延長、分岐及び交差がこれらの中間体によって挿入されるはずであるために２つ以上のグループに属する中間体も含有し得る。
【０１１５】
これらは多くの場合、動態フォールディング経路の能力を決定する、同じ定量化される量を有する。速いフォールディングにグループ化される中間体は多くの場合、天然の立体配座を含み、遅いフォールディング中間体へのグループ化は一方で、ほとんどの非天然の立体配座を含む。速いフォールディングのグループは通常、分子内再構成が僅かである、最も少ない中間体を有する。遅いフォールディングのグループは通常、幾つかの中間体を有し、ほとんどの場合、マイクロ環境の変化をもたらし、それにより中間体間の修飾特性の変化ももたらす構造の分子内再構成を伴う。分子内再構成はモルテングロビュール状態で起こることが多い。分子内再構成を受けた中間体は類似の流体力学的サイズを有し、修飾に起因する構造的特性の相違によって差別化される。
【０１１６】
異なるグループに割り当てられた全ての中間体は、それらのグループの独自の特性によって、異なるフォールディング経路に更に分類することができる。これにより、全ての中間体の経路が差別化され、同定される。全ての中間体の流体力学的サイズ、形成時間、定量化される量、フォールディング経路同一性、及び適切な場合にはＮＭＲ構造がここで表に規定され、その後のフォールディングプロセスの特性化に備えられる。
【０１１７】
９．フォールディングプロセスの特性化
フォールディングプロセスの特性化は、本発明によると、最も簡単なフォールディングプロセスについての二次元座標系における、フォールディング経路によってグループ化した中間体の全ての並行表示によって行われ、ここで、各々の場合の形成時間に対するそれらの流体力学的変数が入力され、これらの系統的評価が行われる。フォールディングプロセスが２つ以上の経路を含有する場合、フォールディングプロセスの特性化を、同じ原理に基づき、フォールディングチャネル又はフォールディング経路として付加的に挿入された座標を含む多次元座標系において示すことができる。
【０１１８】
この表示において、タンパク質リフォールディングプロセスが４つの相、すなわちフォールディング経路のシード構造の形成に対する特に速いフォールディング、フォールディング経路又はチャネルの形成、その後の構築された経路又はチャネルに沿ったフォールディングの経過、及びタンパク質の天然の構造を完成させる分子内再構成によるより広範な再構築を経る。タンパク質のフォールディングプロセスは、主としてフォールディングの最初の２つの相において生じる全ての中間体の全特性によって特性化され、これら２つの相におけるフォールディング経路又はカナルの形成は、タンパク質フォールディングプロセスのフィンガープリントと称される。経路の分岐、延長、交わり、交差、横断、及び合流を含む、異なる速度での並行事象としての種々のフォールディング経路を、この表示内に明確に見ることができる。これにより、全ての中間体についてフォールディング経路同一性、それらの動態プロセス、フォールディングに対するそれらの寄与率、ミスフォールディングプロセス、分子内再構成の起点及び過程、天然及び非天然のジスルフィド結合、天然のジスルフィド結合の順序を同定することが可能であり、フォールディング速度を決定する中間体を同定することが可能である。このことにより、本発明によるタンパク質の完全なフォールディングプロセスの特性化が可能となる。
【０１１９】
形成時間に対する中間体の量の変化についてのこれにより決定されたデータは、タンパク質フォールディングプロセスの動態を示し、詳細な特性化及び視覚化に対する付加的な次元をもたらすために使用することができる。
【０１２０】
フォールディングプロセスの特性化は、全ての中間体の三次元構造的レベルでも行うことができる。ここで、フォールディングプロセスを本発明に従って特性化したタンパク質の全ての中間体を、いずれの場合にも同じ原理によってＮＭＲ及び／又は結晶構造解析に必要とされる量で修飾し、吸着させ、液体クロマトグラフィーによって分離し、構造決定を行う。この中間体の半分取生成は、大きな濃度差を有する捕捉された中間体の効率的な分離を特に対象とする、本発明者によって特別に開発されたプロセスを用いて半分取規模で行うことができる。
【０１２１】
本発明の方法によるフォールディングプロセスの特性化は、様々な適用のための種々の実施形態においてタンパク質の機能レベルで拡張することができる。ここで、このタンパク質のフォールディングプロセスを初めに本発明に従って特性化し、次いでこのタンパク質の変更された機能性及び活性を調査するために、更に独自の構造的変化、又は変更した生物学的環境及び化学的環境の影響下で特性化する。この拡張は例えば、動的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳後（post-）及び翻訳時修飾をシミュレートするプロセスの特性化、シミュレートしたｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質フォールディングにおける動的修飾の手順、及びモデル化したｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質生合成のプロセスを含む。
【０１２２】
１０．タンパク質フォールディングプロセスのグラフ表示及び視覚的表示
タンパク質のフォールディングプロセスを本発明に従って特性化する場合、各々がその４つの個々の特性、すなわち流体力学的サイズ、形成時間、フォールディング経路同一性、及びリフォールディングに対する寄与率を有する、関与する全ての中間体を、マルチ座標系において表示し、３次元的又は４次元的にデジタル化することができる。例えば、それらの流体力学的サイズ及びゲルバンドによる中間体のエネルギー状態をｙ座標、形成時間をｘ座標、フォールディング経路同一性、又はそれらのフォールディング経路同一性によって規定したチャネルをｚ座標、並びに適切な場合には、リフォールディングに対する寄与率を統合した第４次元としてプロットする。これにより、フォールディングプロセスを表示するための適切なコンピュータグラフィックソフトウェアを用いた多様な方法でのグラフィック視覚化及びアニメーションが可能となる。
【０１２３】
様々な実施形態において本発明の方法を用いて特性化された全てのフォールディング事象に対して、同じ原理を適用して、多次元視覚化及び／又はアニメーションを行うことができる。
【０１２４】
４つの特性によって規定される座標の全ての変換可能性（transformability）及びこれらの座標の新たな組合せから、フォールディングプロセスを多様な多次元座標系で示す多くの可能性が存在し、上記で言及した特性化されたタンパク質フォールディングの実施形態及びプロセスを、多くの異なる方法で示すことができることが示される。４つの座標の変換可能性とは、例えば流体力学的サイズ又はゲルバンドとフォールディングのエネルギー状態、フォールディングの時間とフォールディングにおける構成の減少、フォールディング経路同一性と方向性のあるフォールディングの方向、中間体の量とフォールディングの寄与率の置き換えを意味する。組合せ可能性（combinability）とは座標の混成を意味し、例えばフォールディングの時間及び中間体の量からフォールディング動態が得られる。中間体のエネルギー状態及び量からフォールディングの寄与が得られ、経路の方向及び中間体の量からフォールディングの能力が得られるなどである。
【０１２５】
リフォールディングタンパク質の中間体の包括的構造とエネルギー状態との間で得られる関係は、多次元エネルギーランドスケープモデルにおいて様々な形態で定量的に示すことができる。フォールディングプロセスのフォールディング経路は、例えば頂上から谷底までのスキーのルートによって表される座標系の象限、又は高い位置から谷間の最下点までの跡のようなフォールディングの寄与に応じて規定される２つ若しくは４つの象限、及び一般的なファネルモデルで示すことができる（非特許文献１６）。
【０１２６】
本発明の方法が、中間体の同定のための付加的な第５の特性を用いた、全ての中間体又は重要な中間体のみのＮＭＲ又はＸ線解析による３次元構造の決定によって拡張されること、並びにタンパク質のフォールディングプロセスが、中間体の５つの特性、すなわち流体力学的サイズ、形成時間、フォールディング経路同一性、リフォールディングの寄与率、及び３次元構造に基づいて特性化され、少なくとも５つの座標を用いた多次元座標系において表示され、全ての多様性において視覚化されることが理解されよう。
【０１２７】
［本発明の方法の利点］
本発明は、本発明の特許請求の範囲の特徴に従って従来技術の問題を取り除くことが可能である。従来技術と比べた本発明の方法の利点を以下の節にまとめる。
【０１２８】
本発明の方法は、中間体の少なくとも４つの個々のデジタル化可能な特性、すなわち流体力学的サイズ、形成時間、フォールディング経路同一性及び量に基づく。したがって、多数の生物分析方法を、技術の柔軟な組合せによって最適かつ効率的に用いることができる。このため、フォールディングプロセスの特性化は、僅かな量のタンパク質材料しか必要とせず、使用が容易であり、時間が節約され、標準化し、日常的に行うことができる。
【０１２９】
この実施方法は、広範に自動化及び小型化することができる。本発明の方法は、特定のフォールディング経路に対する中間体の所属の決定のための修飾の多様性に基づく。リフォールディングタンパク質の様々な修飾可能性によって、得られる各々の中間体をそれに従って修飾し、それにより個々にマークし、したがって他と区別可能にすることが確実となる。これには全てのタンパク質が含まれる。
【０１３０】
このため、例えば低分子タンパク質及び巨大タンパク質、ジスルフィド結合を有するタンパク質及び有しないタンパク質、強酸性及び強塩基性、親水性及び疎水性の、膜タンパク質及びマルチドメインタンパク質が包含される。中間体の分離、並びにそれらの流体力学的サイズ、形成時間及び量の決定は、親水性及び球状のタンパク質に対する本発明のゲル電気泳動によって直接、並びに液体クロマトグラフィー、及びその後の分光調査（好ましくはＤＬＳ（動的光散乱）による）によって効果的に実行することができる。その際、上記に掲載される全てのタンパク質が検査に関与するとされる。
【０１３１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ（タンデム質量分析）及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＰＳＤ（ポストソース分解質量分析）と併用した、トリプシンに加えてＬｙｓ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ及びエキソプロテアーゼの構造化タンパク質分解系、並びに化学的切断によって、適切な断片中に存在する全ての中間体を、それらのタンパク質分解処理後に、断片パターンの同定のための好適な修飾を用いて分光的に検出し、更なる研究のために適切にデジタル化することを確実にすることができる。
【０１３２】
それにより特性化されたタンパク質フォールディングプロセスを様々な多次元描写で表示することができ、ファネル概念（非特許文献１６）に対応する、タンパク質フォールディング中間体の空間的構造とエネルギーランドスケープとの間の関係の定量的視覚化が可能となる。
【０１３３】
本発明の方法の利点は、その様々な用途にもある。第１の好ましい本発明の用途では、全てのタイプ及びサイズのタンパク質のフォールディングの特性化、フォールディング経路を含むフォールディング機構の解明、ミスフォールディングのプロセス及び分子内再構成のプロセス、更には或る特定のタンパク質症の原因の検出のための方法が提供される。
【０１３４】
第２の本発明の用途では、上記方法は、そのバイオテクノロジー生産を改善又は最適化するために、その基質に対するリフォールディングタンパク質の活性及び機能の変化の調査及び評価に用いられる。この目的で、検査対象のタンパク質のフォールディングプロセスを、本発明による様々な分子環境で基質の存在下及び非存在下で特性化し、結果を比較及び評価する。
【０１３５】
第３の本発明の用途では、上記方法は、タンパク質工学に用いられ、この場合、例えば特性化されたフォールディングプロセスの所見に基づく修飾、タンパク質の再設計及び融合、並びに再設計によるタンパク質の機能性及び活性におけるその後の変化を、本発明に従って解析、検査及び評価する。
【０１３６】
第４の本発明の用途では、上記方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳後修飾されるタンパク質治療薬のバイオテクノロジー生産の条件の最適化、並びに化学的及び生物学的な補助化合物、又は翻訳時修飾若しくは翻訳後修飾の阻害剤のスキャニング等のｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートした生合成のプロセス、及び場合によっては発生する翻訳時修飾及び翻訳後修飾の動的特性化及び定量化に用いられる。これにより、翻訳時修飾及び翻訳後修飾のｉｎ  ｖｉｔｒｏシミュレーションの際の動的プロセスの特性化を本発明に従って行い、結果を対応する比較及び評価研究に供する。
【０１３７】
第５の本発明の用途では、上記方法は、タンパク質のバイオテクノロジー生産のプロセス開発のための、それらのｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートした既知のｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳後修飾におけるタンパク質のリフォールディングプロセスの動的特性化に用いられる。これらのプロセスの特性化は、本発明によって規定される工程に従う。タンパク質の固定化及びタンパク質チップの調製の技術の組合せにおいて、調査対象のタンパク質を支持体上に固定化し、シミュレートした翻訳後ｉｎ  ｖｉｖｏ修飾の後に化学抽出物、酵素抽出物又は細胞抽出物を含有する反応溶液からそれらを分離し、次いでタンパク質を熱的、光化学的、化学的又は酵素的な切断によって支持体から切断し、それらを本発明のプロセスの更なる工程において使用することが可能である。
【０１３８】
第６の本発明の用途では、上記方法は、タンパク質フォールディングにおける生物学的又は化学的な作用物質の探索に用いられ、この場合、選択された生物学的及び／又は化学的な阻害剤及び／又は補助タンパク質を、所望のタンパク質のリフォールディングの本発明の特性化に組み込む。
【０１３９】
第７の本発明の用途では、上記方法は、タンパク質フォールディングに対するフォルダーゼ又はシャペロンの影響の調査に用いられ、この場合、検査対象のフォルダーゼ又はシャペロンの影響は、それらの存在下及び非存在下での本発明によって特性化されたフォールディングプロセスの比較によって規定する。
【０１４０】
第８の本発明の用途では、上記方法は、タンパク質分解に影響を与えるタンパク質を含む、フォルダーゼ／シャペロンの生物学的及び化学的な阻害剤に属する新規の医薬品の探索に用いられ、この場合、検査対象のタンパク質のフォールディングプロセスの本発明の特性化は、シャペロン又はフォルダーゼの阻害剤候補の存在下及び非存在下でのシャペロン又はフォルダーゼを含有する並行実験において達成される。その後のフォールディングプロセスの比較によって、フォルダーゼ／シャペロンの阻害及びタンパク質分解に対する候補化合物の効果が確認される。
【０１４１】
第９の本発明の用途では、上記方法は、ナノタンパク質材料の開発及び生成のためのポリペプチド又はタンパク質のリフォールディングプロセス時の制御された自己集合及び重合の調査に用いられ、この場合、検査対象のタンパク質の自己集合及び重合の初期プロセスを、本発明に従って生物学的及び／又は化学的な因子の存在下で特性化する。
【０１４２】
第１０の本発明の用途では、上記方法は、タンパク質症に対する薬理学的シャペロンの探索に用いられ、この場合、タンパク質症を引き起こすタンパク質のリフォールディング機構に対する、アンフォールディングされたタンパク質に特異的に結合する、フォールディングプロセスを改善して、タンパク質構造を安定化させる、又はミスフォールディングされたタンパク質の疎水性ドメインをマスキングし、溶解性を増大させ、したがってアンフォールディングされたタンパク質の凝集を防止する或る特定の生物学的物質及び／又は化学物質の効果を、本発明の特性化によって決定する。
【０１４３】
第１１の本発明の用途では、上記方法は、病因を明らかにするために、一方で以下の凝集を含むＰｒＰＣ（細胞プリオンタンパク質）からＰｒＰＳｃ（スクレイピープリオンタンパク質；プリオンタンパク質の病原型）へのリフォールディング、及び他方で凝集の減少を含むＰｒＰＳｃからＰｒＰＣへの逆転の特性化に用いられ、治療選択及び予防の可能性の探索を可能にする。
【０１４４】
プリオンタンパク質のフォールディングプロセスは、本発明による温度、ｐＨ及びイオン強度等の不安定条件の調節下でフォールディングプロセスに影響を与える生物学的物質及び／又は化学物質を用いた並行実験において利用され、活性物質の非存在下でのその予め特性化されたフォールディングプロセスと比較される。
【０１４５】
第１２の本発明の用途では、上記方法は、異性化、脱アミド化及びラセミ化によるタンパク質老化の研究、並びにラジカル作用、酸化ストレス及び環境影響によって引き起こされるタンパク質分解の研究のための標的とするタンパク質のフォールディングプロセスの動的特性化に用いられる。これに関し、特異的なタンパク質を、そのリフォールディングプロセス時に、光化学エネルギー及び熱エネルギーの供給によって、触媒によって加速される異性化、脱アミド化及びラセミ化に供するか、又はラジカル開始作用、酸化ストレス及び環境影響による修飾に供する。次いで、これにより変更したフォールディングプロセスを、本発明の方法の更なる工程において特性化し、この特性に影響する因子の非存在下でのフォールディングプロセスと比較する。
【０１４６】
第１３の本発明の用途では、上記方法は、タンパク質の分類（分類学）、及び新たなレベルの動的タンパク質フォールディングへのタンパク質進化の研究に用いられ、この場合、各々のタンパク質の個々のフィンガープリントとして特性化された本発明のフォールディングプロセスは、タンパク質の機能的関係及び進化的関係をもたらし、構造、トポロジー、相同性及び進化的関係に基づくこれまでの分類において付加的な基準として統合することができる。
【０１４７】
第１４の本発明の用途では、上記方法は、複合体の形成プロセス並びに付随する活性及び機能性の変化を研究し、複合体形成に対して作用する化学物質及び生物学的物質を見出すために、ヌクレオチド、グリコシド及び脂質との複合体形成時のタンパク質のフォールディングプロセスの動的特性化に用いられる。これに関し、例えば初めに本発明に従って各々単離したタンパク質及びそのタンパク質−核酸複合体のフォールディングプロセスを特性化し、次いでこのタンパク質及び対応する核酸を、それらのリフォールディングの際に複合体形成のための連続実験において様々な時間間隔で合わせ、様々な化学的因子及び生物学的因子の下で、タンパク質−核酸複合体の基質を供給して又は供給せずに、繰り返し新規の特性化、比較及び評価に供する。その際に、断片質量パターンの作成時の核酸画分、脂質画分及び炭水化物画分の付加質量をそれに従って計算する。これらのタンパク質の非共有結合画分の定性的決定及び定量的決定のために、タンパク質分解切断後及び質量分析測定前のバッチを、初めにクロマトグラフ分離、次いで断片の流体力学的サイズ及び質量の分光決定に供する。
【０１４８】
第１５の本発明の用途では、上記方法は、タンパク質ミスフォールディングによって引き起こされる疾患の診断及び予後診断に用いられ、この場合、疾患関連タンパク質のフォールディングプロセスの変化を特性化し、フォールディングプロセスのフィンガープリントプロファイルの形で示し、或る特定の疾患の診断及び予後診断の基準として規定する。
【０１４９】
第１６の本発明の用途では、上記方法は、凝集機構を解明し、タンパク質凝集の化学的及び生物学的な阻害剤を探索するために、フォールディングタンパク質間、又はフォールディングタンパク質と天然タンパク質との間で、同じタンパク質又は異なるタンパク質のリフォールディング時の凝集の初期プロセスの動的特性化に用いられ、この場合、検査対象のタンパク質のフォールディングプロセスを、初めに他のタンパク質及び／又は化学的及び生物学的な阻害剤の非存在下、次いでそれらの影響下で、種々の分子環境でそれぞれ本発明に従って特性化し、比較し、評価する。
【０１５０】
第１７の本発明の用途では、上記方法は、特定のタンパク質のリフォールディングレベルでの配座挙動及び触媒性の解析、薬物の合理的設計を可能にする治療用標的タンパク質の探索、並びにバイオテクノロジープロセスの最適化のために、リフォールディングタンパク質間、及び／又はリフォールディングタンパク質と天然タンパク質との間の相互作用のフォールディングプロセスの動的特性化に用いられ、この場合、検査対象のタンパク質の設計されたフォールディング操作を、初めに他のタンパク質の非存在下、次いでそれらの影響下で、至適分子環境でそれぞれ本発明に従って特性化し、比較し、評価する。
【０１５１】
第１８の本発明の用途では、上記方法は、抗体工学の最適化及び合理化のために、抗原−抗体反応のプロセス及び抗原−抗体複合体の分解プロセスの動的特性化に用いられる。ここで、再設計された抗体及び抗原の選択性、特異性、親和性、フォールディング効率、熱力学的安定性、薬理学的動態及び生物工学的生産性を調査するために、新たに設計された抗体及び抗原を化学的因子及び生物学的因子の非存在下及び／又は存在下で、生理的及び生化学的な至適分子環境で初めに単独で、次いで合わせて本発明の特性化、比較及び解析に供する。
【０１５２】
第１９の本発明の用途では、上記方法は、タンパク質の新生合成中に開始するフォールディングを調査し、開始されたタンパク質のフォールディングに影響を与える化学的及び／又は生物学的な物質を探索するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生合成され、場合によっては翻訳時修飾されたタンパク質のフォールディングプロセスの特性化に用いられ、この場合、同位体標識した又は標識していない必須アミノ酸の供給を調節することによって、至適な生物学的因子及び物理化学的因子の下で得られ、ミニ中間体と称される、無細胞のバッチ中で合成した異なる長さを有するタンパク質断片を、初めに合わせて回収し、次いでクロマトグラフィーによって特異的に分離し、その後それらのフォールディングプロセスを本発明に従って特性化及び比較する。ここで、ミニ中間体の形成時間を、全アミノ酸配列と比較したそれらの長さ比に従って再規定する。
【０１５３】
別の本発明の用途では、上記方法は、新たな用途の更なる開発のためのサービスセンターとして利用可能である、特性化されたタンパク質のフォールディングプロセスに基づくデータベースの構築及びそれにより生じる用途に用いられる。
【０１５４】
これらの用途としては、例えば特性化されたタンパク質フォールディングの結果に基づく治療用タンパク質の新たな修飾、再設計及び融合、並びに新たに構築されたタンパク質のフォールディングプロセスのフィンガープリントプロファイルの予測が挙げられる。
【０１５５】
本発明の特定の利点は、上記方法の実施形態を、方法及び技法の個々の組合せ及び追加によって目的に応じて拡張することができることである。
【０１５６】
タンパク質の修飾中間体の多様性によって特性化されるプロセスの生成物、及びこれに関し、異なる用途において異なる物理化学的因子及び生化学的因子の下で、種々の分子環境で決定され、特性化された全てのタンパク質のフォールディングプロセスのデータベースに系統的に収集された所見を、タンパク質フォールディングに対する化学的及び生化学的な作用物質のスクリーニング、バイオテクノロジー生産の改善及び最適化、標的タンパク質の最適な復元及び保存、効率的な修飾、再設計、タンパク質の合理的融合、並びにそれらの構造的機能、活性及び薬物動態及び薬理学的性質の改善のために設計し、使用することができる。
【０１５７】
本発明の方法は、新たな材料、すなわち各々が少なくとも４つの独立した特性を有する中間体の形態である、最適かつ完全なリフォールディング後の様々な時間間隔で多様な修飾が達成されたタンパク質の使用を伴う。この本発明により様々な実施形態で回収されたタンパク質材料は、タンパク質のフォールディング、ミスフォールディング、凝集、相互作用、自己集合、重合、老化、損耗及び生合成の機構の解明、タンパク質の活性及び機能性の改善、バイオテクノロジー生産の最適化、ナノタンパク質材料の開発、タンパク質分類学の充実のため、並びにタンパク質フォールディングに対する影響に基づく活性を有する新規の生物学的及び化学的な作用物質、及びタンパク質治療薬の探索を可能にするために、種々の物理化学的及び生化学的な条件下で多様な環境で行われるそれらのフォールディングプロセスの特性化及び多次元表示に使用される。
【０１５８】
［方法を行う手段］
本発明のプロセスを行うために、アッセイキット、特別な実験装置及び特定のソフトウェアの形態の手段が使用される。本発明のプロセスは、手作業で段階的に、又は本発明者らによる構想及び設計に従って特別に開発及び製造された、部分的及び／又は完全に自動化及び小型化されたデバイスを用いて達成することができる。
【０１５９】
［アッセイキット］
新規の一連のアッセイキットは、主として従来の化学物質、材料、成分及び本発明による使用説明書からなる。これらの製品は、全ての種類及びタイプのタンパク質のリフォールディングの系統的特性化の手段が開発されるまでの各々の実験的工程の実験的条件及び操作の開発、最適化及び標準化によって得られる。これらは本発明の方法の実行工程、方法、実施形態及び用途に応じて使用される。種々の用途のための種々のタイプのアッセイキットを以下に説明及び分類する：
最大の流体力学的サイズを有する最適なアンフォールディングされたタンパク質の生成のため、
各々多様な側鎖試薬を用いたリフォールディングプロセス時の固定化されたタンパク質の動的修飾のため、
１つ又は複数の蛍光色素を用いたリフォールディングタンパク質の動的修飾のため、
同位体標識又はスピン標識された側鎖試薬を用いたリフォールディングタンパク質の動的修飾のため、
タンパク質のリフォールディング時のビオチンタグを用いた動的修飾のため、
各々多様な側鎖試薬を用いたジスルフィドを含有するタンパク質の動的修飾、及びそれらのリフォールディングフィンガープリントプロファイルの作成のため、
ゼロ長試薬、ホモ二官能性試薬及びヘテロ二官能性試薬、並びに光親和性標識用の試薬を含む各々多様な側鎖試薬を用いた、ジスルフィド結合を有しないリフォールディングタンパク質の動的な単一、多重及び／又は内部の架橋修飾、並びにそれらのリフォールディングフィンガープリントプロファイルの作成のため、
各々多様な側鎖試薬を用いたリフォールディング球状及び親水性タンパク質の動的修飾、並びにそれらのリフォールディングフィンガープリントプロファイルの作成のため、
多様な側鎖試薬を用いたリフォールディングプロセス時の疎水性の強いタンパク質及び膜タンパク質の動的修飾、並びにそれらのリフォールディングフィンガープリントプロファイルの作成のため、
多様な側鎖試薬を用いたリフォールディングプロセス時の強酸性又は強塩基性のタンパク質の動的修飾、及びそれらのリフォールディングフィンガープリントプロファイルの作成のため、
多様な側鎖試薬を用いたリフォールディングプロセス時の互いに独立したマルチドメインタンパク質の単離されたタンパク質ドメインの動的修飾、及びそれらのリフォールディングフィンガープリントプロファイルの作成のため、
リフォールディングプロセス時の相互依存的な複合マルチドメインタンパク質の動的修飾、及びそれらのリフォールディングフィンガープリントプロファイルの作成のため、
そのリフォールディングプロセス時の活性及び機能性の変化の調査及び検証のための、種々の選択された物理化学的及び生化学的な条件下、バッチ中でのその基質又はその潜在的基質を用いたリフォールディングタンパク質の動的特性化のため、
再設計された若しくはバイオテクノロジーによって修飾されたタンパク質、又は融合タンパク質のリフォールディングプロセスの動的特性化、並びに言及したタンパク質のリフォールディングプロセスの特性化のデータとの比較に基づく、このタンパク質修飾によって引き起こされる機能及び活性の変化の解析のため、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳後修飾されるタンパク質治療薬のバイオテクノロジー生産条件の最適化のための、選択された物理化学的及び生化学的な分子環境下、無細胞アプローチでのｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートした生合成、及び場合によっては生じるタンパク質の翻訳時修飾又は翻訳後修飾の機構の動的特性化のため、
そのバイオテクノロジー生産のプロセス開発のための選択された物理化学的及び生化学的な条件下、生物学的アプローチ又は無細胞アプローチでの、選択されたｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートしたｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳後修飾時のタンパク質のリフォールディングプロセスの動的特性化のため、
タンパク質フォールディングに対する潜在的な薬物の調査及び検証のための、選択された生物学的物質及び／又は化学物質の影響下でのタンパク質のリフォールディングプロセスの動的特性化のため、
タンパク質フォールディングに対するその補助効果の調査及び検証のための、選択されたフォルダーゼ又はシャペロンを用いた実験におけるタンパク質のリフォールディングプロセスの動的特性化のため、
タンパク質フォールディングに対するそれらの阻害効果の調査及び検査のための、選択されたフォルダーゼ又はシャペロン、及びそれらの潜在的な生物学的阻害剤及び化学的阻害剤を用いた実験におけるタンパク質のリフォールディングプロセスの動的特性化のため、制御された自己集合及び重合の調査のための、付加的な生物学的物質及び／又は化学物質を用いた実験におけるポリペプチド又は低分子タンパク質のリフォールディングプロセスの動的特性化のため、
タンパク質症に対するシャペロンとしてのその薬理学的効果の試験及び検証のための、リフォールディングプロセスを安定化させる可能性のある潜在的な生物学的物質及び／又は化学物質を用いた実験における、タンパク質症タンパク質のリフォールディングプロセスの動的特性化のため、
その病因を調査し、可能な治療及び予防の選択肢を検証するための、不安定化条件の調節下でのフォールディングプロセスに対して影響を有する生物学的物質及び／又は化学物質を用いた並行アッセイにおける、プリオンタンパク質のリフォールディングプロセスの動的特性化のため、
異性化、脱アミド化及びラセミ化によって引き起こされるタンパク質老化の調査、並びにラジカル作用、酸化ストレス及び環境影響によって引き起こされるタンパク質分解の調査のための光化学エネルギー及び／又は熱エネルギーの供給、フリーラジカル曝露、酸化ストレス、及び変更した分子環境の影響下での各々の場合の実験における標的とするタンパク質のリフォールディングプロセスの動的特性化のため、
タンパク質分類（分類学）及びタンパク質進化についての情報の取得のための、分子環境を用いた、調査されるタンパク質のタイプ及びサイズに至適な標準化された物理化学的及び生化学的な条件下での実験における、タンパク質のリフォールディングプロセスの動的特性化のため、
形成プロセス並びに関連する活性及び機能性の変化の調査のために、様々な化学的及び生物学的な因子並びに潜在的な基質の定期的な供給の影響下でのヌクレオチド、グリコシド及び脂質とのその複合体形成を調査するため、並びに更には化学物質及び生物学的物質の添加によって複合体形成反応に加えられる圧力を調査するための、実験におけるタンパク質のリフォールディングプロセスの動的特性化のため、
その診断及び予後診断の基準としてのそのリフォールディングフィンガープリントプロファイルの作成のための、最適化及び標準化された物理化学的及び生化学的な条件下での実験における、疾患関連タンパク質のリフォールディングプロセスの動的特性化のため、
フォールディングタンパク質間、又はフォールディングタンパク質と天然タンパク質との間のリフォールディングプロセス時の同じタンパク質又は異なるタンパク質の凝集機構の調査及び検証のための、様々な分子環境、並びにタンパク質凝集の化学的阻害剤及び生物学的阻害剤（潜在的な阻害剤を含む）の定期的な添加の下での他のタンパク質の非存在下又は存在下の実験における、タンパク質のリフォールディングプロセスの動的特性化のため、
それらのリフォールディング時の立体配座及び触媒作用の特性及び治療標的効果の調査及び検証のための、潜在的な基質又は因子を含む及び含まないバッチにおける、至適分子環境下でのリフォールディングタンパク質間、及び／又はリフォールディングタンパク質と天然タンパク質との間での相互作用の形成プロセスの動的特性化のため、
抗体の選択性、特異性、親和性、フォールディング効率、熱力学的安定性、薬理学的動態及び生物工学的生産性、並びに抗原の抗原性の変化の調査及び検証のための、化学的及び生物学的な因子を含むバッチにおける、抗原抗体反応のプロセス及び抗原抗体複合体の分解プロセスの動的特性化のため、
最適化された生物学的及び物理化学的な因子、及びその新生合成時のタンパク質の開始フォールディングの調査及び制御のための同位体標識を有しない又は有する必要なアミノ酸の調節された供給、及びそれに作用する化学物質及び／又は生物学的物質の存在下での生合成によって生成し、場合によっては翻訳時修飾されたタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏフォールディングプロセスの特性化のため、
ネイティブポリアクリルアミドゲルの生成、及びリフォールディングプロセス時に動的修飾されたタンパク質中間体の電気泳動分離のため、
ポリアクリルアミドゲルの使用によるタンパク質のリフォールディングプロセス時に動的修飾された中間体の電気泳動分離のため、
並行及び連続した使い捨てマイクロカラム及び／又はマイクロカラムモジュールを用いた、タンパク質のリフォールディング時に修飾された中間体の多次元液体クロマトグラフ分離のため、
個々の並行及び連続したマイクロカラム電気クロマトグラフィーを用いた、タンパク質のリフォールディング時に修飾された中間体の分離のため、
使い捨てマイクロカラム及び／又は使い捨てマイクロカラムモジュールを用いた、タンパク質のリフォールディング時に修飾された中間体の緩衝液交換のため、
使い捨てマイクロ限外濾過カラム及び／又はマイクロ限外濾過カラムモジュールを用いた、タンパク質のリフォールディング時に修飾及び分離された中間体の濃縮のため、
分離されたゲルバンドの手作業による処理のための特別なツールを用いた、特別に製造された多機能マイクロタイタープレート内での中間体のマイクロ波支援ゲル内消化のため、
多機能マイクロタイタープレート内での中間体の多重ゲル内タンパク質分解消化及び付加的な化学的切断のため、
多機能マイクロタイタープレート内での中間体のマイクロ波支援液中消化のため。
【０１６０】
上記に記載の配置可能なアッセイキットは各々、以下の化学物質、材料又は本発明の成分の少なくとも１つを多様な形態で含有する：
種々の緩衝溶液、変性剤、還元剤、それらの様々な成分及び組成物を含む再酸化のための作用物質、同位体を有しない又は有する側鎖特異的な試薬、スピン標識及び蛍光標識、ビオチン化試薬、内部架橋剤標識のための試薬、ゲル電気泳動のための試薬、フォルダーゼ及びシャペロンと呼ばれるフォールディングプロセスに作用する因子、フォルダーゼ及びシャペロンの潜在的な阻害剤、生物学的及び化学的な補助物質、並びにタンパク質フォールディング及びタンパク質分解の阻害剤、タンパク質フォールディングの安定化剤、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質合成及び翻訳後修飾の方法のための特異的な細胞抽出物等、
種々のボトル、試験管、反応容器、多機能マイクロタイタープレート、ゲルバンドピッカー、勾配ゲルの調製のための特別なシリンジ、既製のネイティブゲル、液体クロマトグラフィー及び電気クロマトグラフィー用の使い捨てマイクロカラム及びマイクロカラムモジュール、使い捨てマイクロ限外濾過カラム及び使い捨てマイクロ限外濾過カラムモジュール、タンパク質固定化の補助物、並びに対応する補助ソフトウェア等。
【０１６１】
アッセイキットは、既存のアッセイキットによる機能的成分を組み合わせて、補完又は共有することによって、新たなアッセイキットを必要に応じて更に開発及び製造して、本発明の方法の或る特定の工程を行うことができるため、上記で述べた実施例に限定されない。
【０１６２】
［特別な実験装置］
本発明によるタンパク質フォールディングの特性化のための方法の実行に使用される実験装置は、以下のものを含む：
中間体の動的再酸化及び同時修飾のためのマイクロ波支援クエンチフロー装置、
中間体の修飾のための、クエンチフロープローブヘッドと連結することができるマイクロ波ミニ装置、
修飾された中間体の電気泳動分離のための本発明のゲル電気泳動装置、
修飾された中間体の電気クロマトグラフ分離のための本発明の装置、
分離され、染色されたゲルバンドの画像記録及び定量化のためのデジタルゲルスキャナー、
分離された蛍光ゲルバンドの画像記録及び定量化、特に類似の流体力学的サイズを有する種々の中間体のデジタル差別化のためのデジタルマイクロ蛍光スキャナー、
ゲル内消化のサンプル調製のためのゲルバンドピッカー、
ゲル内消化及び液中消化のためのマイクロ波消化装置、
修飾中間体のクロマトグラフ分離のための連続マイクロ濾過カラムの自動化モジュール、
多機能マイクロタイタープレートにおける中間体の流体力学的サイズの系統的同定及び差別化のための、本発明による改良されたＤＬＳ測定装置及びＳＬＳ測定装置（動的光散乱及び静的光散乱）。
【０１６３】
［自動化されたプロセスの実行のための概念及び設計］
上記方法の実行は、本発明者の概念及び設計に従って製造された機械において自動化することができる。図１０に示されるように、この機械は、各々がパート１〜パート６として示される６つの機能ユニットからなる。これらの機能を下記に詳細に説明する。
【０１６４】
機能ユニット１の目的は、最適なアンフォールディングされたタンパク質の単離である。この機能は、ポンプ、バルブ、クロマトグラフィーカラム又はフィールドフローフラクショネーションチャネル、並びに種々の変性試薬及びアンフォールディングバッチの供給のための一連の詰め替え可能な及び／又は使い捨ての容器によって達成される。反応容器はサーモスタットを備えていてもよい。変性剤に予め適切に溶解したタンパク質を、初めに第２のバルブに接続するポンプによって供給し、次いで第１のバルブに切り替えることによって容器に運び、これにより選択された変性溶液のフローを生じさせ、超音波又は振盪による更なる混合プロセスに供する。プログラムした条件に従って変性させた変性タンパク質は種々の構造サイズを有し、ポンプによってクロマトグラフィーカラム又はフィールドフローフラクショネーションチャネルへと運ばれる。流体力学的サイズによって分離されたタンパク質グループの流体力学的サイズ及び分布を、ＤＬＳによって分光測定により解析し、得られるデータをデータベースに保存する。このプロセスを種々の変性溶液を用いて予めプログラムした条件下で繰り返す。次いで、最良の反応条件を用いるアプローチを決定して、比較的安定した最大の流体力学的サイズを有する最適な割合のアンフォールディングされたタンパク質を得る。最後に、コンピュータによって検出された最適なアプローチを再度行い、タンパク質の最大の流体力学的サイズを有する得られる溶出液をＤＬＳによって検出し、ポンプによって機能ユニット２に導入する。
【０１６５】
機能ユニット２はタンパク質の最適化及び動的修飾のためのものである。機能キャリアは機能ユニット１におけるデバイスに類似しているが、より小さい容量に好適である。小さな使い捨て容器モジュールを、様々な修飾試薬の供給のために適用することもできる。機能ユニット１から送達される溶出液は反応容器に分配される。数秒から数分の種々の時間間隔の後、様々な修飾試薬の溶液を溶出液に添加する。これはリフォールディングチャネルの形成時に中間体を捕捉するためである。次いで、修飾バッチを１つずつ、種々の流体力学的サイズを有する捕捉されたリフォールディング中間体の液体クロマトグラフ分離に適用する。溶出液の分光解析によって、全修飾アプローチについての流体力学的半径の分布パターンが検出される。これらのデータを用いて、比較的安定なクロマトグラフィーによって分離可能な中間体の広範な分布をもたらす、最適な修飾試薬を有するアプローチを同定する。同定された最適な条件を、機能ユニット３における動的クエンチフロー修飾に用いる。
【０１６６】
機能ユニット３の使用目的はタンパク質の動的クエンチフロー修飾である。機能キャリアはクエンチフローモジュール、マイクロ波モジュール及びサンプル回収モジュール、並びにバルブ等を含む。機能ユニット１からの最適な溶出液は、クエンチフローモジュールの４つのシリンジのうち１つに直接導入される。リフォールディング緩衝溶液又は再酸化溶液、機能ユニット２によって決定された最適な修飾試薬溶液、及び安定化溶液を各々別のシリンジに供給する。タンパク質のリフォールディングプロセスを第１のミキサーにおいて開始する。動的修飾を、第２のミキサーにおいて修飾試薬の溶液を混合することによって種々の時間間隔で行い、ここで、ミキサー及び遅延管を特別なマイクロ波ユニットで処理して反応速度を加速する。遅延管において数回に分けて連続的に修飾され、同時に捕捉された中間体を、更なる構造的安定化のために第３のミキサーを介して導くか、又は自動化サンプル回収モジュールのマイクロ容器に直接移し、更なる分離のために機能ユニット４に導く。
【０１６７】
機能ユニット４は、動態修飾された中間体の液体クロマトグラフ分離のためのものである。機能部分は使い捨てマイクロカラムモジュール、使い捨て限外濾過モジュール、マイクロタイタープレート、ポンプ及びバルブ等である。第１のアプローチでは、機能ユニット４のマイクロ容器に保管される修飾バッチをマイクロカラムに供給し、中間体の液体クロマトグラフ分離に供する。クロマトグラフ分離を、各々の修飾バッチについて継続して実行する。溶出液を使い捨て限外濾過モジュールにおいて濃縮し、分離された中間体の溶出液をＤＬＳによって解析し、続いて機能ユニット５へと送達する。他のアプローチでは、修飾バッチを初めに使い捨てモジュールのマイクロカラムに継続して導入する。次いで、ポンプによって駆動される、分離及び濃縮された中間体の溶出液を、ＤＬＳ解析を行うことなく直接マイクロタイタープレートに適用し、その後のオフライン操作に備える。（逐語訳ではないが、このような意味である
【０１６８】
機能ユニット５は、断片化された中間体のタンパク質分解切断及び質量分光的解析のために考案されている。連続して配列した機能部分は、マイクロ波ユニットと連結したオンライン消化ロボット及びオフライン消化ロボット、ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、マイクロタイタープレート、ＤＬＳ検出器との連結部等である。機能ユニット４によって供給される溶出液は、初めにタンパク質分解切断のためのオンライン消化ロボットへと送達される。次いで、それにより断片化された中間体を、全ての溶出液中の中間体の断片の数及び質量のデータ取得のためにオンラインでＥＳＩ−ＭＳへと導入する。機能ユニット４の第２の手順によってマイクロタイタープレート上で回収される分離された中間体を、連結されたＤＬＳ及びＵＶ測定器によって検出、識別及び定量化し、続いてオフライン消化ロボットにおいてタンパク質分解切断に供する。全ての中間体の断片のデータ収集を、マイクロタイタープレートにおける選択された溶出液のオフラインＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定によって行う。この２つの消化ロボットは各々マイクロ波ユニットを備える。
【０１６９】
機能ユニット６は３つのタスク、すなわち適用プログラムのセットアップ、プロセス制御、データ解析、及び結果のグラフ表示を行うためのものである。機能部分は制御要素及び連結要素、コンピュータシステム、並びに自動化、解析及び表示のためのソフトウェアを含む。選択された適用プログラムのセットアップ時に、プロセス計画が作成され、確認され、操作時に変更可能なフローチャートとして視覚化され、自動的に実行される。プロセス計画の過程は視覚化され、そのモニタリング及び制御の際に作成及び達成される。ＤＬＳ−ＵＶ測定及び質量分析測定から得られたデータは自動的に記録され、多くの方法で解析される。全ての中間体はここでそれらの４つの特性によって同定され、それらのフォールディング経路の所属によって分類される。これらの事実に基づいて、タンパク質のフォールディングプロセスの特性化及びその多次元視覚化を、特別なソフトウェアを用いて自動的に行う。
【０１７０】
この設計の利点は、機能ユニット１〜機能ユニット５を各々別個の機械として構築し、本発明の方法の特定の工程を行うことができることである。したがって、全て機能ユニットを機能ユニット６と接続し、機能ユニット１〜機能ユニット５を複雑な操作の自動化のために互いに連結することができる。この概念及び設計に基づいて、連続的な機械の小型化が可能である。
【０１７１】
［特別なソフトウェア］
本発明のプロセスのそれぞれの工程の達成に使用される特定のソフトウェアは、以下のものを含む：
タンパク質の分子量のサイズ、タンパク質のタイプ、ジスルフィド結合の含有量、親水性又は疎水性、単一ドメイン又はマルチドメイン特性、及び物理化学的性質、並びにそれらに基づく分離方法、緩衝液系並びに物理化学的及び生化学的な条件の決定に応じたタンパク質の分類のためのプログラム、
タンパク質の一次構造及び三次元構造に基づく側鎖特異的な修飾試薬の選択のためのプログラム、
クエンチフロー装置と組み合わせた、中間体の急激な修飾のためのマイクロ波ミニ装置の操作のためのプログラム、
デジタルゲルスキャナー、マイクロ蛍光スキャナー及びゲルバンドピッカーと組み合わせた、特定の改良されたゲル電気泳動装置の操作のためのプログラム、
連続したマイクロ濾過カラム及びマイクロ限外濾過カラムの使い捨てモジュールセットを用いた、修飾された中間体のクロマトグラフ分離の操作のためのプログラム、
分光データに基づく、中間体のフォールディングプロセスの関数としての、流体力学的サイズ及び量の差別化、分類及び二次元グラフ表示のためのプログラム、
そのリフォールディングの本発明に従って規定した最初の２相又は全ての４相からの測定データに基づく、タンパク質のリフォールディングフィンガープリントプロファイルのマニホールドグラフ表示の作成のためのプログラム、
ゲルバンドピッカー、並びに連続したマイクロ濾過カラム及びマイクロ限外濾過カラムと組み合わせた、ゲル内消化及び液中消化の媒体サンプル処理量のマイクロ波消化装置の操作のためのプログラム、
タンパク質及びタンパク分解によって切断された中間体の一次構造及び三次元構造に基づく理論的断片パターンの予測、それに基づく分光測定によって測定されたデータの比較、並びに高度な評価のためのプログラム、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳後修飾され、タンパク分解によって切断された中間体の理論的断片パターンの予測、それに基づく分光測定によって測定されたデータの比較、並びに更なる解析のためのプログラム、
化学的及び／又は生物学的な因子の存在下での修飾され、タンパク分解によって切断された中間体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートしたリフォールディングの理論的断片パターンの予測、並びにそれに基づく分光測定によって測定されたデータの比較、並びに更なる解析のためのプログラム、
いずれの場合にも、全ての既知の及び知られていない同じ効果を有する、同位体標識、蛍光標識及びスピン標識を有する又は有しない側鎖特異的な試薬、ゼロ長試薬、ホモ二官能性試薬及びヘテロ二官能性試薬、並びに光親和性標識及びビオチン化のための試薬を用いた、単一修飾、マルチ修飾及び内部架橋剤修飾に関する、タンパク分解によって切断された中間体の理論的断片パターンの予測、差別化及び評価のためのプログラム、
同定された中間体のグループ帰属関係の分類のためのプログラム、
グループに分類された中間体のフォールディング経路同一性の決定のためのプログラム、
タンパク質の特性化されたフォールディングプロセスの多次元座標系におけるグラフ表示のためのプログラム、
特性化されたタンパク質のフォールディングプロセスの多次元アニメーションのためのプログラム、
タンパク質の特性化されたフォールディングプロセス及び同時に行われるｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳後修飾の多次元アニメーションのためのプログラム、
相同タンパク質の特性化されたフォールディングプロセスに基づくタンパク質のフォールディングプロセスのシミュレート及び予測、並びに構造的要素のデノボ予測のためのプログラム。ウェブベースのソフトウェアをイントラネットサービス又はインターネットサービスで提供することができる。
タンパク質フォールディングの特性化のためのロボットのためのプログラムバンドル。
【０１７２】
これらのプログラムを適用目的に応じて、各々独立した製品として分離するか、又は上記に言及したアッセイキット及び実験装置の一部として様々なバンドルで提供することができる。
【０１７３】
［実施形態］
ここで本発明を以下の実施例によって説明する。これらは、本発明の或る特定の好ましい実施形態及び態様を説明するのに役立つが、本発明の範囲を限定すると解釈されるものではない。
【０１７４】
本実施形態は、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）ＴＫ２４におけるストレプトミセス・パルブルス（Streptomyces parvulus）ＦＨ−１６４１に由来する過剰発現したα−アミラーゼ阻害剤Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔ（Ｚ−２６８５）のフォールディングプロセスの特性化に関する。Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔは、その明らかに規定されたファーマコフォア（pharmakophor）構造、酵素に対する不可逆的結合、及び２．８×１０−１１Ｍ／Ｌという低い解離定数のために、腸による血中へのグルコース取り込みを低減及び遅延させ、したがって潜在的なＩＩ型糖尿病用の抗糖尿病剤であるα−アミラーゼの効果的な阻害剤である。その三次元構造はＮＭＲ解析によって解明されている（Rehm et al, 2009、Ｐｄｂ  ２ＫＥＲ）。Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔのフォールディングプロセスの特性化は、そのバイオテクノロジー生産及びその薬物動態性質の調査に対して重要な意味を有する。
【実施例】
【０１７５】
［実施例１］
（Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔの構造的性質及び物理化学的性質の解析）
Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔ（図１Ａ）は、７８個のアミノ酸からなり、８２８２．０９Ｄａの分子量を有する。そのアミノ酸配列は、
ＡＴＧＳＰＶＡＥＣＶＥＹＦＱＳＷＲＹＴＤＶＨＮＧＣＡＤＡＶＳＶＴＶＥＹＴＨＧＱＷＡＰＣＲＶＩＥＰＧＧＷＡＴＦＡＧＹＧＴＤＧＮＹＶＴＧＬＨＴＣＤＰＡＴＰＳＧＶである。Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔは、４つのシステイン残基、５つのプロリン、２つのアルギニン、３つのトリプトファン、５つのチロシン、２つのフェニルアラニン、３つのβ−シート、６つのβ−ターン、及び２つのジスルフィド架橋の結果として、各々がシステイン９、２５及び４３、７０を介して結合する２つのループ構造を有する（図１Ｃ）。Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔは、４つアスパラギン酸、４つのグルタミン酸及び２つのアルギニンに由来する、８つの負に帯電した残基及び２つの正に帯電した残基を有する。そのファーマコフォアとしての三つ組Ｔｒｐ１６Ａｒｇ１７Ｔｙｒ１８におけるα−アミラーゼ阻害活性中心は、最初のループ構造中のβ−シート構造のβ−ターンに位置する。その等電点は４．３である。ｐＨ７．０では５．９という正味の負電荷を有する。親水性残基と疎水性残基との比率は１：３である。その分子表面は親水性であり、分極している（図１Ｂ）。Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔは、７Ｍ塩酸グアニジン溶液中で完全に変性し、その後の復元により活性を喪失することなく天然の状態にリフォールディングすることができる小さな小型タンパクである（図２Ａ）。
【０１７６】
コンピュータ支援解析の結果によると、Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔはリフォールディング時に８つの理論的に可能な、天然及び非天然のジスルフィド形成によって得られる中間体を有することができ（図２Ｂ）、断片質量検出パターン（図４Ｂ）が予測された。中間体の分離、それらの流体力学的サイズの差別化及びこれらの量の順番の決定が、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動によって同時に行われ、リフォールディングされたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの修飾が、システイン残基のチオール基に対して電荷が中性の側鎖特異的な試薬であるヨウ素アセトアミドを用いて行われ、ゲルバンド中の分離された中間体のその後のタンパク質分解断片化がトリプシンによるゲル内消化によって行われることも決定された（図４Ａ）。Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔのフォールディングプロセスを、本発明に従ってこれに基づいて連続的に特性化した。
【０１７７】
［実施例２］
（最大限の流体力学的サイズを有するアンフォールディングされたタンパク質サンプルの最適な分離）
Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔを完全に変性させ、還元し、還元剤を放出させた。これにより、最大の流体力学的サイズを有し、そのジスルフィド結合が遊離チオール基まで完全に還元した、最適なアンフォールディングされたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの画分を液体クロマトグラフィーによって分離し、次の工程における再酸化及び動的修飾に備えた。
【０１７８】
Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔの変性及び還元は、６Ｍの既知の変性剤ＧｄｍＣｌ（塩化グアニジン）、０．２ＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．７）を含有する変性緩衝液、及び０．２Ｍの既知の還元剤ＤＴＥ（１，４−ジチオエリトリトール）、６ＭのＧｄｍＣｌ、０．２ＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．７）の還元緩衝液を用いて行った。Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔは、分子表面上の高度に分極したその電荷のために溶液中で容易に凝集する。したがって、６Ｍの塩酸グアニジンＧｄｍＣｌ溶液中での変性時のその最高濃度は、Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔを完全に変性させ、還元し、分子間ジスルフィド形成を防止するためには２．４ｍｇ／ｍｌを超えないものとする。１．５ｍｌ容のエッペンドルフキャップに入れた５ｍｇのＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔを、初めに１．２５ｍｌの変性緩衝液で２分間処理し、５分間ボルテックスし、３７℃で１５分間超音波処理し、次いで４ｍｌ容のチューブに移し、それに上記の１．２５ｍｌの還元緩衝液を移した後、混合及び５分間の超音波処理の後、室温で更に１時間置き、ジスルフィド架橋の変性及び還元を完了させた。この溶液中のＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの濃度は２ｍｇ／ｍｌである。
【０１７９】
変性及び還元の後、還元されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔは、還元剤ＤＴＥから完全に分離されていなければならない。Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔ溶液中のＤＴＥは微量であってもその後の調査に多大な影響を及ぼし得る。還元剤ＤＴＥの除去は、２つの連続したゲル濾過カラムを用いて行われる。２つのＰＤ−１０カラムを初めに各々２０ｍｌの分離緩衝液を用いてｐＨ２で平衡化した。次いで、２．５ｍｌの還元されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔ溶液を第１のカラムに移した。浸漬後、２．５ｍｌの分離緩衝液を添加し、同時に溶出した２．５ｍｌのＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔ溶液を直接第２のＰＤ−１０カラムに滴下した。最後に、２．５ｍｌの分離緩衝液を第２のカラムに導入し、Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔ溶液を５×１．５ｍｌ容チューブに０．５ｍｌずつ回収した後、還元されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの濃度及び還元されたシステインチオール基（−ＳＨ）の数を決定する。
【０１８０】
還元されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの濃度を用いて、溶液中のＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔ材料の含有量を制御し、分子中の遊離チオール基の数を算出した。ここで、２８０ｎｍのＵＶ範囲の光度測定を好ましい方法として用いた。この方法は、Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔの３つのトリプトファン、５つのチロシン及び２つのジスルフィド架橋の芳香族アミノ酸の吸収を用いる。１ｍｇ／ｍｌの濃度でのそのＡ２８０値は２．９２であり、０．５〜１．５という大抵のタンパク質によって得られる値よりもはるかに高い。したがって、Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔ濃度の吸収値の依存性の直線性を維持するために、測定されるＡ２８０値は１を超えないものとする。測定される緩衝溶液中のＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの濃度は、２０ｐｇ／ｍｌ〜５００ｐｇ／ｍｌに相当する範囲であり、通常は溶液の適切な希釈によって達成される。測定時に最初のＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔサンプルを１０倍に希釈した。５つのサンプルが還元され、ＤＴＥが除去されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔ溶液を各々０．１ｍｌ、予め０．９ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７）を充填した５×１．５ｍｌ容チューブに移した。混合した後、５つの溶液の吸光度値Ａ２８０をＵＶ分析計において測定した。吸収係数ε２８０は、以下の第１の方程式を用いて決定することができる（Pace et al., 1995）。Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔの濃度は、検量線法を用いることなく、下記の第２の方程式を用いて直接算出した。
ε２８０＝（トリプトファン）（５，５００）＋チロシン（１，４９０）＋（ジスルフィド結合）（１２５）
＝（３）（５，５００）＋（５）（１，４９０）＋（２）（１２５）＝２４２００（Ｍ−１ｃｍ−１）
Ｃ（ｍｇ／ｍｌ）＝１０．Ａ２８０／ε２８０．ｄ＝Ａ２８０×８２８６０ｍｇＭ−１ｃｍ−１／２４２００Ｍ−１ｃｍ−１＝３．４２×Ａ２８０
【０１８１】
検査されるタンパク質のジスルフィド結合を、完全に遊離したチオール基まで十分に変性及び還元することは、フォールディングプロセスの特性化の成功に重要である。５つのサンプルの遊離チオール基の決定を用いて、全ての４つの遊離チオール基（−ＳＨ）を含み、したがって最大の流体力学的サイズを有する、明らかに十分に還元されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔを含む５つの最良のサンプルを、その後の中間体の再酸化、修飾及び遮断の出発物質として得る。遊離チオール基の決定は、２ｍｇ／ｍｌの５．５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）のエルマン試薬を用いて行う。５つのサンプルの還元されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔ溶液を各々０．１ｍｌ、予め０．８ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を充填した５つの１．５ｍｌ容チューブに移し、チッピング（tipping）によって静かに混合した。次いで、この５つのチューブの各々に、０．１ｍｌのエルマン試薬を添加した。混合した後、５つの溶液の吸光度値を４１２ｎｍの波長で分析計において測定した。ここで、エルマン試薬（ＤＴＮＢ）により、還元されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔから、ＳＨ−ＳＳ交換反応によって４１２ｎｍで１３６００Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸収係数を有する鮮黄色のＴＮＢ２−の同じ化学量論生成物が得られた。色の強度は、Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔ分子中の遊離チオール基に比例する。したがって、サンプル溶液中のＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの遊離チオール残基の数は、以下の方程式を用いて溶液中のＴＮＢ２−及びＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの濃度を除算することによって化学量論的に決定される（Riddles et al., 1983）。これにより、最初の０．５ｍｌの溶出液中Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔは、４つの十分に還元されたチオール基の濃度が１．２ｍｇ／ｍｌであり、したがって最大の分子流体力学的サイズを有することが特定された（図２Ｃ）。したがって、その後の実験はこのサンプルを用いて行った。
遊離−ＳＨの数＝ＴＮＢ２の濃度／Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔの濃度
＝（ＡＴＮＢ−２（４１２ｎｍ）／１３６００Ｍ−１ｃｍ−１）／（Ａｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔ／２４２００Ｍ−１ｃｍ−１）
【０１８２】
［実施例３］
（還元されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの再酸化及び動的修飾）
４つの十分に還元されたチオール基を有するジスルフィドを含有するＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの動的修飾は、その再酸化中に行われる。再酸化を用いて、そのリフォールディング時に還元され遊離したシステインチオール基からＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの天然及び可能な非天然のジスルフィド架橋を形成する。チオール間のこの結合の形成は、それらが直接隣接していたとしても自発的には起こらない。これは特定の酸化還元電位、すなわちチオール付近の適切な電子供与体及び電子受容体の有効濃度に依存する。ジスルフィド結合の形成に好適な電子受容体が存在し得る。
【０１８３】
これに関し、多数の既知の利用可能な酸化剤が存在する。再酸化実験において効果的な、使用されることの多い酸化剤であるグルタチオンの還元型（ＧＳＨ）及び酸化型（ＧＳＳＧ）（Creighton & Goldenberg, 1984）を、本明細書で還元型グルタチオン（ＧＳＨ）対酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）が１０：１という好ましい比率で使用した。
【０１８４】
再酸化は、０．１ＭのＴｒｉｓ／Ａｃ、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）の再酸化緩衝液、再酸化緩衝液中の１０ｍＭのＧＳＨ及び１ｍＭのＧＳＳＧの再酸化溶液、並びに最初の溶出液からの十分に還元されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔを混合することによって行った。０．１５ｍｌの再酸化溶液を、初めに４ｍｌ容チューブ内で１．１６ｍｌの再酸化緩衝液と混合する。次いで、再酸化を、０．１９ｍｌの最初の溶出液を添加し、短時間ボルテックスことによって開始する。この溶液中のＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの濃度は０．１８ｍｇ／ｍｌである。この１．５ｍｌの再酸化混合物は、捕捉されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの中間体を含む、動的修飾のための１５×１００μｌのサンプルをもたらす。中間体を捕捉するその後の修飾のための全てのサンプルを慎重に調製するして、再酸化を開始する。
【０１８５】
動的修飾は、様々な時間間隔で行われ、この場合、再酸化混合物の一部を分離し、カルボキシアミドメチル化によってリフォールディング及び再酸化において残存する接近可能なチオール基の全てと不可逆的に反応し、それによりシステイン残基を中性アミド基へと変換する既知の側鎖特異的な修飾試薬ヨウ素アセトアミドと混合する。初めに、０．６Ｍのヨウ素アセトアミド（０．２５ＭでｐＨ７．５）の各々２０μｌの修飾剤を、１４個の１．５ｍｌ容チューブにピペットで移し、次いで再酸化を上記に記載のように１．５ｍｌのアプローチで開始し、続いていずれの場合にも１００μｌの再酸化混合物を１分、３分、６分、９分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分及び２４０分という合わせて１４個の時間の計画された時間間隔の後で即座に取り出し、２０μｌの修飾剤を含有するチューブに移し、混合し、室温で５分間のインキュベーションの後、液体窒素で処理し、冷凍庫に保管した（図３Ａ）。これらのサンプル中の濃度は、それぞれおよそ１００μｌ中１２μｌのＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔである。リフォールディング及び再酸化されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔは、システイン残基のチオール基のアクセシビリティに応じて様々な程度で、各々が独自の個々の特性を有する構造的に比較的安定した中間体へと修飾され、次いでゲル電気泳動による分離及び更なる同定に備えられる。
【０１８６】
［実施例４］
（中間体の分離及び定量化、並びにそれらの形成時間の関数としてのそれらの流体力学的サイズの二次元表示）
修飾中間体の分離及びそれらの流体力学的サイズの同時表示は、本発明によって改良された不連続ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、Davis及びOrnsteinの方法によってHoefer Scientific製の装置ＳＥ６００において行う。
【０１８７】
ネイティブゲル電気泳動では、タンパク質の移動は、それらの正味の電荷及び立体配座によって決まる。したがって、このタイプの電気泳動は、ほぼ同一な分子量を有するが、構造的に異なる流体力学的サイズで存在する、タンパク質リフォールディング時に修飾された中間体の分離及び視覚化にとりわけ好適である。ゲルは好ましくは完全な重合のために使用の前日に調製し、冷蔵庫に保管するものとする。大きなゲル（１６ｃｍ×１８ｃｍ×０．１ｃｍ）は１６個のサンプルウェルを有する。いずれの場合にも、１２μｇ〜１５μｇのタンパク質を含有する最大で１２０μｌのサンプルをロードする。
【０１８８】
ゲルの最初及び最後のウェルには、頻繁に見られるエッジ効果のためにサンプルをアプライしなかった。いずれの場合にも、ゲルの２番目及び３番目のウェルに天然のＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの１００μｌのサンプル、及び十分に還元され、ヨウ素アセトアミドで修飾されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの１００μｌのサンプルを、２０μｌのサンプル緩衝液と混合した後に適用した。リフォールディング及びカルボキシアミドメチル化による再酸化時に１４個のサンプルうち１分、３分、６分、９分、１５分、３０分、４５分、６０分、１２０分、１８０分及び２４０分という上記に言及した時間計画で修飾されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの１１個のサンプルを冷凍庫から取り出した後、ＳｐｅｅｄＶａｃにおいて１００μｌまで濃縮する。次いで、２０μｌのサンプル緩衝液を１１個のサンプルの全てに移し入れた。混合した後、いずれの場合にもこれらのサンプルの１００μｌをゲルの１１個のウェルにアプライした。ゲル（Ａ２０％、Ｔ３．２５％）を、冷却サーモスタット、及び４℃の冷蔵室での泳動用緩衝液の不連続交換と組み合わせて、濃縮ゲルに対して１２０Ｖで２時間、次いで分離ゲルに対して１８０Ｖで４時間泳動する。
（図３Ｂ）。
【０１８９】
ゲル泳動、並びにクマシー染色及び脱染色の後、リフォールディング時に指定の時間間隔で修飾によって捕捉された中間体を、それらのリフォールディング及びそれらの同時に設計された流体力学的サイズによって、連続したゲルバンドの形態で４相マルチフォールディング経路モデルで表示し、それに従って二次元的に分離して示した（図３Ｂ）。
【０１９０】
このゲル画像（図３Ｂ）では、リフォールディング時に得られる分子内中間体が全て、１０個のバンドで種々の流体力学的サイズで現れ、リフォールディング時の中間体のタイプ、数及び量は変化し、特に速いフォールディングの第１相において本質的に形成されたフォールディング経路のシード構造が第１のゲルバンドに表示され、第２相で起こるフォールディング経路又はチャネルの構築が１５分〜３０分で達成され、これによりリフォールディングフィンガープリントプロファイルが形成され、第３相におけるこれらの経路又はチャネルに沿ったフォールディングは２時間超かかり、最終的な天然構造の完成までの更なる分子内再構成には約４時間かかることに留意すべきである。
【０１９１】
完全に変性及び還元し、再酸化の開始直後にヨウ素アセトアミドで修飾されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔが、４つの拡大されたシステイン残基のかさ高性の増大のために最高の流体力学的分子サイズ、したがってゲル内での最も遅い移動を有し、天然のＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔ及び復元されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔが、それらの小型構造のために同じ速度でゲル内を移動することは依然として明らかではない。さらに、リフォールディングの種々の時点からの同一な高さを有するゲルバンドは同一な中間体を有し、ゲルバンド１０中の中間体の流体力学的サイズは、ゲルバンド９中の天然のＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔよりも小さいことが分かる。ゲル画像を精査し、ゲルバンド中の中間体の更なる同定に利用可能とした。
【０１９２】
［実施例５］
（ゲル内消化による中間体の断片化）
ゲルバンドからの中間体の断片化は、トリプシンゲル内消化によって行われる。トリプシン（２３．２３ｋＤａ）は、タンパク質解析において、とりわけペプチドパターンの作成に最も一般的に使用されるセリンプロテアーゼの１つである。これはアルギニン及びリジンのペプチド結合のＣ末端の特異的な切断を触媒する。Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔは２つのアルギニンを有するが、リジンを有しない。最初のアルギニンは阻害剤活性中心Ｔｒｐ１６−Ａｒｇ１７−Ａｒｇ４４−Ｔｈｒ１８の中央にあり、他方のアルギニンはジスルフィド架橋Ｃｙｓ４３−Ｃｙｓ７０のすぐ隣にある。修飾された中間体はトリプシンによって３つの断片へと切断され、ここで２つの主要断片が断片間のジスルフィド結合の付加的な結合によって生じる。したがって、５つの断片を有する各々の中間体を厳密な質量で記載した（図４Ａ）。
【０１９３】
トリプシン消化は、本発明に従って、Sigma（ｔｒｙｐｓｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｇｒａｄｅ、製品コードＴ６５６７）の改良されたゲル内消化によって行われる。６０分のリフォールディング時間での１０個のゲルバンドを、各々慎重に切り出し、付加的なマイクロ波処理及び超音波処理を用いたトリプシン消化に１回供した。最後に、全ての消化混合物を各々ピペットによってエッペンドルフチューブに移し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳサンプルとしてＳｐｅｅｄ  Ｖａｃにおいて２０μｌまで濃縮した。これらの２０μｌのサンプルはゲルバンドに応じて、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定の要件を完全に満たす０．３μｇ〜１．５μｇのＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔ断片を含有していた。
【０１９４】
Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔが８つの理論的に可能な、リフォールディング時に天然及び非天然のジスルフィドによって生じる中間体を有し（図２Ｂ）、全てのこれらの中間体が各々厳密な質量を有する５つの断片で存在すると仮定すると、全ての中間体の断片検出パターンは、測定される質量スペクトルデータとの比較及び補助ツールのために、対応する中間体及びそれらの５つの断片を用いた図表の形態で作成される（図４Ｂ）。
【０１９５】
［実施例６］
（断片化された中間体の質量分析検出）
ゲルバンドからの全ての中間体のタンパク質分解断片の質量検出は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定を用いて行われる（図５）。ゲルバンド１〜ゲルバンド７の中間体は比較的大きな流体力学的サイズを有し、全てタンパク質分解による消化が容易である。切断された断片間の結合は、安定した二次構造の支持がないために比較的弱く、したがってＭＡＬＤＩ測定による解明が容易である。このことは、全てのこれらの中間体がＭＡＬＤＩスペクトルにおいて３つの別個の断片に存在することを意味する。ゲルバンド８における中間体の第２の断片欠如は、ジスルフィド結合の分子内再構成、すなわちＣｙｓ２５−Ｃｙｓ４３とＣｙｓ２５−Ｃｙｓ７０との非天然ジスルフィド架橋から天然ジスルフィド結合Ｃｙｓ４３−Ｃｙｓ７０への更なる再構成の存在を示す。ゲルバンド８及びゲルバンド９における中間体の混合の３つを超える断片についての示唆的な傾向が、ゲルバンドの電気溶出及びその後のマイクロカラムを用いたクロマトグラフ分離によって確認された。
【０１９６】
トリプシン消化によって得られる全ての断片の測定された質量は、表中のそれらの調査した１０個のゲルバンドに従い、流体力学的サイズは最初の欄において対応するゲルバンド１からゲルバンド１０まで上から下に向かって漸減し、その行のそれらの断片は断片質量パターンとしての順番で左から右に向かって記録される（図６）。次いで、中間体をそれらの独自の断片質量パターンに基づいて、理論的断片検出パターンとの比較によって特性化し、差別化し、認識された中間体について与えられる特定の名称によって隣接セルに位置付けた。
【０１９７】
［実施例７］
（中間体のフォールディング経路同一性の発見）
フォールディング経路同一性は中間体の極めて重要な特性であり、その点で本発明による方法は全ての既知の従来の方法と重要な特性として異なる。フォールディング経路同一性は単独では規定することができないが、その分類されたグループ帰属関係から或る特定のフォールディング経路を同定することができる。
【０１９８】
中間体の経路同一性の決定は、同定された中間体のグループの割当てから始める。上記に記載の表において、１０個のゲルバンドに由来する１２個の安定した中間体全てを、それらの個々の質量断片パターンによって差別化した。いずれの場合にも、ゲルバンド２、ゲルバンド４、ゲルバンド６及びゲルバンド７に由来する、ＣＣＣＣ−１、ＣＣＣＣ−２、ＣＣＣＣ−３及びＣＣＣＣ−４として標識されるジスルフィド結合形成を有しない還元された中間体の４つの立体配座、各々ゲルバンド３、ゲルバンド５、ゲルバンド８、ゲルバンド９及びゲルバンド１０に由来する、Ｃ２５−Ｃ４３−１、Ｃ２５−Ｃ４３−２、Ｃ２５−Ｃ４３−３、Ｃ２５−Ｃ４３−４及びＣ２５−Ｃ４３−５として標識される非天然ジスルフィド結合Ｃｙｓ２５−Ｃｙｓ４３を有する中間体の５つの非天然の立体配座、ゲルバンド８に由来する、Ｃ２５−Ｃ７０として標識される非天然ジスルフィド結合形成Ｃｙｓ２５−Ｃｙｓ７０を有する１つの一時的に現れる非天然中間体、並びに各々ゲルバンド８及びゲルバンド１０に由来する、Ｃ９−Ｃ２５及びＣ４３−Ｃ７０として標識される２つの天然中間体Ｃｙｓ９−Ｃｙｓ２５及びＣｙｓ４３−Ｃｙｓ７０が存在する。ゲルバンド１において十分に発現及び修飾されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔは、中間体として検討しなかった。
【０１９９】
全ての発見された中間体は、それらの名称及び共通する構造的状況の各々に従って４つのグループに分類することができる（図６）。ＣＣＣＣ−１、ＣＣＣＣ−２、ＣＣＣＣ−３及びＣＣＣＣ−４として標識されたジスルフィド結合を有しない４つの中間体は、第１のグループに属する。Ｃ２５−Ｃ４３−１、Ｃ２５−Ｃ４３−２及びＣ２５−Ｃ４３−３として標識された３つの非天然中間体は、第２のグループに属する。これには、中間体Ｃ２５−Ｃ４３−４の分子内再構成の生成物である他の非天然中間体Ｃ２５−Ｃ７０も含まれる。中間体Ｃ２５−Ｃ４３−４及びＣ２５−Ｃ４３−５、並びに再構成された天然中間体Ｃ９−Ｃ２５は第３のグループを形成する。最も顕著な天然中間体Ｃ４３−Ｃ７０は第４のグループである。したがって、１２個の中間体全てについて、その流体力学的サイズの減少を考慮してフォールディング経路について結論付け、それによりそれらの独自のグループ同一性を同定し、したがって４つグループを４つのフォールディング経路に同定することが可能である。このようにして、１２個の中間体全てを検出し、各々自体を差別化した。
【０２００】
［実施例８］
（中間体の同定及び分類）
１２個の中間体の同定は、それらの流体力学的サイズ、リフォールディング時の形成時間及び決定されるフォールディング経路同一性を決定することによって行った。さらに、これらの１２個の中間体を、中間体に従って４つグループ及びフォールディング経路に分類し、それらが経路の分岐、延長、交わり、交差及び同時発生に対して果たす役割に応じて分類した。
【０２０１】
１２個の中間体の相対的流体力学的サイズを、１０個のゲルバンドの種々の高さに応じて規定する。リフォールディングの開始から６０分までのそれらの形成時間が重要である。それらのフォールディング経路同一性は最終節において発見した。このため、表（図６）においてそれらの量を定量化していない全ての１２個の中間体を、それらの３つの特性によって規定する。
【０２０２】
図示したゲル画像から、Ｃ４３−Ｃ７０と称される第４のカテゴリーに属する中間体が、リフォールディングの開始後３分で構築され、したがって最も速いフォールディング経路に属し、ＣＣＣＣ−１、ＣＣＣＣ−２、ＣＣＣＣ−３及びＣＣＣＣ−４として標識された第１のグループの中間体が、リフォールディングの開始後６分で構築され、したがって速いフォールディング経路に属し、Ｃ２５−Ｃ４３−１、Ｃ２５−Ｃ４３−２、Ｃ２５−Ｃ４３−３、Ｃ２５−Ｃ４３−４として標識された第２のグループの中間体が、リフォールディングの開始後１５分で構築され、遅いフォールディング経路に属し、Ｃ９−Ｃ２５として表示された第３のグループの中間体が、リフォールディングの開始後３０分で生じ、最大で３時間続いて現れ、したがって最も遅いフォールディング経路に属し、同時発生、分岐、延長、交差、交わり等の全ての状態のフォールディング経路が、ゲルバンド８においてモルテングロビュール状態まで起こることが決定される（図７）。
【０２０３】
最も速いフォールディング経路が、天然のジスルフィド架橋を有し、分子内ジスルフィド再構成が生じない中間体Ｃｙｓ４３−Ｃｙｓ７０のみにおいて起こり、ＣＣＣＣ−１、ＣＣＣＣ−２、ＣＣＣＣ−３及びＣＣＣＣ−４として標識される急激なフォールディングにグループ化された中間体において、ジスルフィド架橋を有しない還元されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの天然の立体配座が、遅いフォールディング経路とは対照的に、非天然ジスルフィド架橋を有する中間体Ｃｙｓ２５−Ｃｙｓ４３全体に生じ、Ｃｙｓ２５−Ｃｙｓ４３からＣｙｓ２５−Ｃｙｓ７０への分子内ジスルフィド再構成を伴い、ゲルバンド８と類似した流体力学的サイズを有するモルテングロビュール状態において分子内ジスルフィド再構成が起こることが更に見出された。
【０２０４】
［実施例９］
（２次元座標系及び３次元座標系におけるＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔのフォールディングプロセスの特性化及び視覚化）
Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔのフォールディングプロセスの特性化は、初めに２次元座標系における４つのフォールディング経路でグループ化された１２個の中間体の全ての並列表示によって行い、ここで、１２個の中間体の流体力学的サイズに対応するゲルバンドを、いずれの場合にも、６０分までのその最初の出現の時点に対してプロットする（図８）。この関連で、３つのタイプに分けられた中間体を、それらの流体力学的サイズ及び経路同一性に応じて、この座標系において、様々な灰色の色合いで徐々に減少するサイズを有する各々連続する小さな象徴的グラフで表示し、ここで、論理上のフォールディング経路を様々な灰色の色合い及び強度のラインを用いて実証のために説明した。この座標系において、中間体のエネルギー状態が、ゲル上の種々のバンドに対応するそれらの流体力学的サイズに比例することから、ｙ座標を、座標のｘ軸のフォールディング配列の時間に対する中間体のエネルギー状態／ゲルバンドに指定した。
【０２０５】
この二次元表示において、３つのタイプに分けられる１２個の中間体、すなわちジスルフィド架橋を有しない還元されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの４つの立体配座、６つの立体配座における天然のジスルフィド結合を有する２つの中間体及び非天然のジスルフィド架橋を有する２つの中間体が、Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔのリフォールディング時に形成し、これらの中間体が、種々の速度で並行事象としての４つのフォールディング経路において天然のＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔへとフォールディングされ、フォールディング経路１の基礎として初めに形成された天然のジスルフィド結合（Ｃｙｓ４３−Ｃｙｓ７０）を有する中間体がフォールディング手順の中心となり、非天然のジスルフィド架橋Ｃｙｓ２５−Ｃｙｓ４３によって引き起こされるミスフォールディングが、数時間かかるＣｙｓ２５−Ｃｙｓ４３からＣｙｓ２５−Ｃｙｓ７０への、続いてＣｙｓ４３−Ｃｙｓ７０及びＣｙｓ２５−Ｃｙｓ４３からＣｙｓ９−Ｃｙｓ２５への分子内ジスルフィド再構成を誘発し、したがってフォールディング手順を遅延させ、この分子内ジスルフィド再構成の全てにおいて、小型分子容がバンド８におけるモルテングロビュール状態と同じ構造レベルまで起こり、フォールディング経路２及びフォールディング経路３が天然のＣｙｓ４３−Ｃｙｓ７０を有する中間体で交わり、フォールディング経路１が交差し、復元されたＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔまで拡張し、フォールディング経路４が経路３から分枝し、ジスルフィド再構成へと至り、天然のジスルフィド架橋Ｃｙｓ９−Ｃｙｓ２５を有する中間体が、最終的に生じる中間体のリフォールディングであり、この最後の分子内ジスルフィド再構成によって得られる中間体が、天然よりも小さい流体力学的サイズを有し、すなわち天然のＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔよりも低いエネルギー状態を有することが明確に表示される。Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔのフォールディング手順を、これにより完全に特性化した。
【０２０６】
特性化されたフォールディングプロセスを、マルチ座標系においても３次元表示し（図９）、各々ゲルバンド及び流体力学的サイズに従うエネルギー状態をｙ座標、形成時間をｘ座標、それらのフォールディング経路同一性に従うフォールディング経路又はチャネルをｚ座標と規定して視覚化し、ここで、Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔのフォールディング経路及びその簡略化したプロセスを、６０分間のリフォールディングに対して表示した。
【０２０７】
［実施例１０］
（プロセスの生成物）
Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔに関する本発明のプロセスの生成物は、１２個の動的修飾され、分離され、それらの４つの特性が同定された中間体等を含み、したがって、Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔのシステイン２５が、非天然のジスルフィド架橋Ｃｙｓ２５−Ｃｙｓ４３の形成に関与し、２つの遅いフォールディング経路における中間体のミスフォールディングに関与し、これらのミスフォールディングがＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔの第１のループにおけるβ−シート構造から生じるファーマコフォアの形成を防止し、全フォールディングプロセスを非常に遅延させ、これらのミスフォールディングされた中間体の異常な活性、及びしたがって細胞内分解の開始のために、天然のＰａｒｖｕｌｕｓｔａｔのｉｎ  ｖｉｖｏ生合成に大きな損失をもたらすという証拠を提供する。
【０２０８】
［実施例１１］
（プロセスの生成物の使用）
Ｐａｖｕｌｕｓｔａｔのミスフォールディングの原因及び結果に対するプロセスの生成物として上記で記載した所見を本明細書で用いて、その薬物動態特性を改善し、Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔの特異的な修飾、再設計及び融合についてのその生物学的生産性を増大させ、ここで、例えば非天然のジスルフィド架橋Ｃｙｓ２５−Ｃｙｓ４３によって引き起こされるミスフォールディング及び得られる異常な効果を、Ｐａｒｖｕｌｕｓｔａｔのアミノ酸システイン２５のアラニン及びトレオニンへの標的化遺伝子交換によって排除する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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