(57)【要約】  本発明は、抗体もしくは抗体フラグメントをアフィニティ精製するための、リガンド置換マトリックスの使用に関するものであって、このリガンド置換マトリックスは支持体材料、および支持体材料に共有結合した少なくとも1つのリガンドを含んでおり、そのリガンドは式（I）で表され、【化１】2013538798.tif 000191式中、Spはスペーサー基である；vは0もしくは1である；Amはアミド基 -NR1-C(O)- であって、NR1がAr1に結合し-C(O)-がAr2に結合しているか、または-C(O)-がAr1に結合しNR1がAr2に結合しているかのいずれかであり；さらにR1は水素もしくはC1-C4アルキルであるが、好ましくは水素もしくはメチルであって；より好ましくは水素である；Ar1は、2価の、置換もしくは非置換の5員もしくは6員芳香環である；Ar2は、5員もしくは6員複素環式芳香環であって、それが(a) 単結合を介して、もう1つの5員もしくは6員芳香環に結合している；または(b) 多環式環系の一部として、もう1つの5員もしくは6員芳香環と縮合している；または(c) C1-C4アルキル；C2-C4アルケニル；C2-C4アルキニル；ハロゲン；C1- C4ハロアルキル；ヒドロキシ置換C1-C4 アルキル；C1-C4アルコキシ；ヒドロキシ置換C1-C4アルコキシ；C1-C4アルキルアミノ；C1-C4アルキルチオ；およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの置換基に結合している、前記5員もしくは6員複素環式芳香環である。【選択図】  なし
2013538798.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体もしくは抗体フラグメントをアフィニティ精製するための、支持体材料および支持体材料に共有結合した少なくとも1つのリガンドを含んでなるリガンド置換されたマトリックスの使用、
ここで該リガンドは式（I）、
【化１】
2013538798.tif 000189
[式中、
Lはリガンドが結合される支持体材料上の連結ポイントである；
Spはスペーサー基である；
vは0もしくは1である；
Amはアミド基-NR1-C(O)-であり、NR1がAr1に結合し-C(O)-がAr2に結合しているか、または-C(O)-がAr1に結合していてNR1がAr2に結合しているかのいずれかであり；かつ、
R1は水素もしくはC1-C4アルキルであり、好ましくは水素もしくはメチルであり；より好ましくは水素である；
Ar1は、2価の、5員もしくは6員の置換もしくは非置換芳香環である；
Ar2は、5員もしくは6員複素環式芳香環であって、それが、
(a) 単結合を介して、さらなる5員もしくは6員芳香環に結合している；または
(b) 多環式環系の一部として、さらなる5員もしくは6員芳香環と縮合している；または
(c) C1-C4アルキル；C2-C4アルケニル；C2-C4アルキニル；ハロゲン；C1- C4ハロアルキル；ヒドロキシ置換C1-C4 アルキル；C1-C4アルコキシ；ヒドロキシ置換C1-C4アルコキシ；C1-C4アルキルアミノ；C1-C4アルキルチオ；およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの置換基に結合している、
前記5員もしくは6員複素環式芳香環である]
で表される前記使用。
【請求項２】
Ar1がフェニレン、好ましくはメトキシ置換フェニレンである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
C=OおよびNH基が互いにメタ位でAr1に結合している、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
Ar2の5員もしくは6員複素環式芳香環が、環員ヘテロ原子、好ましくは窒素もしくは酸素原子に隣接する環員炭素原子を介してC=O基と結合している、請求項１〜３のいずれか1つに記載の使用。
【請求項５】
Ar2の5員もしくは6員複素環式芳香環が、2個以上の窒素原子、または1個以上の窒素原子および1つの酸素原子を含有する、請求項１〜４のいずれか1つに記載の使用。
【請求項６】
Ar2の5員もしくは6員複素環式芳香環が、N-メチル置換ピラゾール、ピリジン、イソオキサゾール、またはオキサジアゾ-ルである、請求項１〜５のいずれか1つに記載の使用。
【請求項７】
支持体材料が、炭水化物または架橋炭水化物、好ましくはアガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、アルギン酸塩およびカラギーナン、セファロース（Sepharose）、セファデックス（Sephadex）；合成ポリマー、好ましくはポリスチレン、スチレン-ジビニルベンゼンコポリマー、ポリアクリレート、PEGポリアクリレートコポリマー、ポリメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアミド、およびパーフルオロカーボン；無機材料、好ましくはガラス、シリカ、および金属酸化物；ならびに複合材料から選択される材料を含む、請求項１〜６のいずれか1つに記載の使用。
【請求項８】
タンパク質が抗体、好ましくはIgG型抗体、またはFc融合タンパク質である、請求項１〜７のいずれか1つに記載の使用。
【請求項９】
リガンド置換されたマトリックスのリガンドと、抗体もしくは融合タンパク質の、Fcフラグメントまたはドメインとの結合によって精製が達成される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
Fcフラグメントもしくはドメイン、または抗体が、IgG抗体クラスに属し、より好ましくはヒトIgGに属し、またはヒト起源のポリクローナルもしくはモノクローナルIgG、特にIgG1、IgG2およびIgG4に属する、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１つに記載のリガンド置換されたマトリックス。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１つに記載の式（I）のリガンドを支持体材料に結合させる、請求項１１に記載のリガンド置換マトリックスを合成する方法。
【請求項１３】
タンパク質のアフィニティ精製、好ましくはアフィニティクロマトグラフィーのための方法であって、精製されるべきタンパク質を、請求項１〜７のいずれか１つに記載のリガンド置換マトリックスと接触させる、前記方法。
【請求項１４】
タンパク質が抗体もしくはFc融合タンパク質であって、リガンドが抗体もしくはFc融合タンパク質のFc領域に結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
次式（II）
【化２】
2013538798.tif 000190
（II）
[式中Sp、Ar1、Ar2、およびAmが請求項１〜７で定義される意味を有する]
に示すリガンド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の分離の分野に関するが、好ましくは、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびに免疫グロブリンFcセグメントを含有する融合タンパク質の、アフィニティ分離技術による精製、特に小分子リガンドを用いたクロマトグラフィーによる精製の分野に関する。
【０００２】
免疫グロブリンは、ヒトおよび他の脊椎動物の体液中に存在する可溶性タンパク質群である。免疫グロブリンは「抗体」とも呼ばれ、細胞の認識、結合、および接着に重要な役割を果たす。抗体は、抗原、一般に細菌およびウイルスを、認識して排除することによって、免疫系において最大の役割を果たすオリゴマー糖タンパク質である。
【０００３】
抗体のポリマー鎖は、抗体がいわゆる重鎖および軽鎖を含むように構成される。基本的な免疫グロブリンユニットは、ジスルフィド橋で連結された2つの同一の重鎖および2つの同一の軽鎖からなる。5タイプの重鎖（α、γ、δ、ε、μ）があり、これが免疫グロブリンクラス（IgA、IgG、IgD、IgE、IgM）を決定する。軽鎖群には2つのサブタイプλおよびκがある。
【０００４】
IgGは、血液および他の体液中に見いだされる可溶性抗体である。IgGは、細菌もしくは他の病原体に反応してそれを中和するように、B細胞由来の形質細胞によって作製される。IgGは、約150ｋDaの分子量を有するY字型の糖タンパク質であって、2つの重鎖および2つの軽鎖からなる。各鎖は、定常領域および可変領域に分けられる。重鎖の2つのカルボキシ末端ドメインは、Fcフラグメント（「定常フラグメント」）を形成しているが、重鎖および軽鎖のアミノ末端ドメインは抗原を認識することになっており、Fabフラグメント（「抗原結合フラグメント」）と命名されている。
【０００５】
Fc融合タンパク質は、抗体Fcフラグメントと、所与の薬剤標的に対する特異性を与えるタンパク質もしくはタンパク質ドメインとを組み合わせることによって作製される。例として、ドメイン抗体-Fc融合タンパク質があるが、このFcフラグメントの2つの重鎖は、特異抗体の重鎖（VH）もしくは軽鎖（VL）のいずれか一方の可変領域に連結されている。他のFc融合タンパク質は、任意のタイプの治療用タンパク質もしくはタンパク質ドメインとFcフラグメントの組み合わせである。このFc部分は、タンパク質性薬剤に安定性と送達可能性を与えると考えられる。
【０００６】
治療用抗体およびFc融合タンパク質は、さまざまな疾病の治療のために使用されるが、顕著な例としては、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、およびさまざまなタイプのがんがある。治療用抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。モノクローナル抗体は、単一の抗体産生細胞株に由来するものであって、単一抗原に対して同一の特異性を示す。がんについて考えられる治療は、腫瘍細胞特異抗原を中和する抗体に関する。ベバシズマブ（Avastin, Genentech）は、血管内皮増殖因子（VEGF）を中和し、それによって新生血管が腫瘍組織内へ成長しないようにする、モノクローナル抗体である。
【０００７】
治療用融合タンパク質、たとえばエタネルセプト（Etanercept）（商品名エンブレル（Enbrel）、アムジェン（Amgen）社、TNF受容体ドメインをFcフラグメントに結合）またはアレファセプト（Alefacept）（商品名アメビブ（Amevive）、バイオジェン・アイデック（Biogen Idec）社、LFA-3をヒトIgG1のFc部分に結合）が、自己免疫疾患に対する薬剤として使用され、または開発されている。
【０００８】
さまざまな生物学的供給の流れからタンパク質産物を回収および精製することを意味する、タンパク質バイオセパレーションは、食品、製薬、およびバイオテクノロジー産業において重要な単位操作である。ますます多くの治療用モノクローナル抗体（Mab）および融合タンパク質が市場に参入しようとしており、または現在臨床開発中である。このようなタンパク質は、精緻な多段階精製プロトコールによって達成される、並外れて高い純度を必要とする。下流の処理および精製が、製造コストの約50から80%を占めるので、新たな精製戦略の開発、または現行精製戦略の改良のために、相当な努力が行われている（1）。
【０００９】
アフィニティクロマトグラフィーは、タンパク質精製のためにもっとも有効なクロマトグラフィー法の１つである。それは高度に特異的なタンパク質-リガンド相互作用に基づいている。リガンドは、供給原料溶液から標的タンパク質を捕捉するために使用される固定相に、共有結合で固定化される。アフィニティリガンドは、高い特異性および選択性をもってその標的と結合することができ、複雑な混合物からでも高い収率で、1000倍に至るまでの高度な濃縮を可能にする。
【００１０】
典型的には、プロテインAによるアフィニティクロマトグラフィーが、ほとんどのMabおよびFc融合タンパク質の精製工程の第１段階である。プロテインAは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の表面上に露出した細胞壁結合タンパク質である。これはナノモルレベルの親和性で、さまざまな種に由来する免疫グロブリン、特にヒトのサブタイプIgG1、IgG2、およびIgG4の、定常部（Fcドメイン）に結合する（2）。しかしながら、消毒およびCIP（定置洗浄）工程に適用される過酷な条件下で、生成物中に浸出すること、および安定性に欠けることから、プロテインAの使用には限界がある。プロテインAの化学的安定性は、Mab精製のために遺伝子操作されたプロテインA変異体を使用することによって改善することができる。しかし、プロテインA樹脂が高コストであるため、適当な代替品、特に小分子から選択される代替品を探すことになった。
【００１１】
マブゾーベント（Mabsorbent）A2P（プロメティック・バイオサイエンス（Prometic Biosciences）社）は、免疫グロブリン精製のための小分子リガンドである。しかしながら、このリガンドは、適切な選択性を示さず（3）、プロセスクロマトグラフィーに適用されない。
【００１２】
もう1つのアプローチは、抗体精製の最初の捕捉ステップとして混合モードクロマトグラフィーを使用する。もっとも一般的な材料は、固定化された2-メルカプトエチルピリジン（MEP HyperCel, Pall Corporation）に基づくものであって、これは発酵ブロスから効果的にIgGを捕捉するが、プロテインAと比べて宿主細胞タンパク質（HCP）の除去率が低い（4）。
【００１３】
タンパク質ベースのリガンドより利用しやすく、好ましくは安価であって、厳しい条件下でプロテインAより強く、プロテインAと同等か、それ以上の選択性を有する合成アフィニティリガンドは、抗体およびFc融合タンパク質の精製に適した解決を与えると考えられる。
【００１４】
合成小分子アフィニティリガンドは、通常、化学的安定性が高く、製造コストが低いので、治療用タンパク質精製にとって特に興味深い。タンパク質ベースのリガンドより利用しやすく、好ましくは安価であって、厳しい条件下でプロテインAより強く、プロテインAと同等か、それ以上の選択性を有する合成アフィニティリガンドは、抗体およびFc融合タンパク質の精製に適した解決を与えると考えられる。標的タンパク質に応じて、このようなアフィニティリガンドは、IgG型免疫グロブリンおよびFc融合タンパク質の定常Fc領域を認識し、好ましくはプロテインAと同じく広範な適用可能性を提供するはずである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の根底にある問題は、抗体およびFc融合タンパク質のFc領域に結合する小分子アフィニティリガンドを含有するマトリックスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この問題は以下に挙げる本発明の実施形態によって解決される。
【００１７】
本発明は、タンパク質、好ましくは、抗体もしくは抗体のフラグメントのアフィニティ精製のために、支持体材料および支持体材料に共有結合した少なくとも１つのリガンドを含有する、リガンド置換マトリックスを使用することに関するものであって、このリガンドは式（I）で表され
（I）
【化１】
2013538798.tif 000003
【００１８】
式中
Lは、リガンドが結合している支持体材料上の連結ポイントである；
Spは、スペーサー基である；
vは、0もしくは1である；
Amは、アミド基-NR1-C(O)-であって、このNR1はAr1に結合し、-C(O)-はAr2に結合しており、または-C(O)-がAr1に結合し、NR1がAr2に結合している；ならびに
R1は水素もしくはC1 - C4アルキル、好ましくは水素もしくはメチルであるが；より好ましくは水素である；
Ar1は、2価の、5員もしくは6員の置換もしくは非置換芳香環である；
Ar2は、5員もしくは6員複素環式芳香環であって、それが、
(a) 単結合でもう1つの5員もしくは6員芳香環に結合している；または
(b) 多環式環系の一部として、もう1つの5員もしくは6員芳香環と縮合している；または
(c) C1 - C4アルキル；C2 - C4アルケニル；C2 - C4 アルキニル；ハロゲン；C1 - C4 ハロアルキル；ヒドロキシ置換C1 - C4 アルキル；C1 - C4 アルコキシ；ヒドロキシ置換C1 - C4 アルコキシ；C1 - C4 アルキルアミノ； C1 - C4 アルキルチオ；およびそれらの組み合わせから選択される、少なくとも1つの置換基に結合している、
前記5員もしくは6員複素環式芳香環である。
【００１９】
式（I）の本発明のリガンド置換マトリックスは、本発明のある実施形態において、式（Ia）の構造を有する。本発明のもう1つの実施形態において、式（I）の本発明のリガンド置換マトリックスは、式（Ib）の構造を有する。式（Ia）および（Ib）のいずれにおいても、L、Sp、N、R1、Ar1、およびAr2、ならびに整数vは、式（I）に関して上記で定義した意味を有する。
【化２】
2013538798.tif 000004
【化３】
2013538798.tif 000005
【００２０】
Ar1はAR1と表示してもよく、Ar2はAR2と表示してもよい。さらに、Spは、Vと表すこともできる。これは本出願が優先権を主張する特許出願EP 10008089.4で使用された命名である。なお、式（I）に関連して定義され、式（Ia）および（Ib）に示されるR1は、前記優先権文書で定義され示されるR4に相当する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明に記載のリガンドは、ヒト由来ポリクローナルおよびモノクローナルIgG、特にヒトIgG1、IgG2、およびIgG4、ならびに、ウサギおよびマウス免疫グロブリンのようなさまざまな動物種由来のポリクローナルおよびモノクローナルIgGと結合する。
【００２２】
本発明はまた、リガンド置換マトリックス、ならびに、連結ポイントLで、場合によってはスペーサー基Spを介してマトリックスに結合したリガンド（「化合物」と称することもできる）に関する。
【００２３】
上記式（I）のLは、連結ポイントであるが、「接続ポイント」とも称される。当業者は、適当な連結ポイント/接続ポイントを承知している。
【００２４】
当然のことながら、連結ポイントLは、直接、支持体材料と結合されているか、またはスペーサーを介して連結されている。典型的には、Lは、支持体材料上の適当な官能基と、リガンドを形成するためのリガンド前駆化合物上の対応する官能基との反応の結果として生じる部分の一部である。
【００２５】
ある実施形態において、Lは結合、好ましくは単結合であって、これは支持体材料にじかに結合しており、概してその材料上の適当な官能基を介して結合している。これに関連して、「支持体材料」という用語は、本発明の目的のために役立つ、当業者に周知の、市販のポリマーを表す。「支持体材料」の定義は、下記で与えられる。一般に、支持体材料は、分子、概して本発明の分子を結び付けるための官能基を含有する。本発明に関連して、支持体材料上の官能基は、支持体材料の一部と見なされる；このことは、本発明のリガンドが結合を介して支持体材料に結び付けられている（すなわち、Lが結合であって、スペーサー基Spを含有しない、下記参照）場合にも、当てはまるが、この場合、結合は本発明の個別のリガンドと支持体材料上の官能基の間で直接形成される。
【００２６】
本発明の文脈において「官能基」は、一方では支持体材料上の適当な基（「前駆体基」）を指し、他方では、本発明のリガンドに存在する（たとえば、C=O基に存在する、またはスペーサーSp上に存在する）適当な基（「前駆体基」）を表す。本発明の文脈において「官能基」はまた、スペーサー基Sp上の適当な基（「前駆体基」）を表す。本発明の文脈において「前駆体基」または「官能基」は、化学結合の形成に基づいて、相互補完的な「前駆体基」または「官能基」と化学反応する能力を有する基である。必要ならば、前記化学結合の形成のために追加の試薬を使用することができる。上記から明らかなように、反応時に官能基/前駆体基は、元の官能性を「最終的な官能性」もしくは「結合単位」に変換する中で、化学結合に変換される。上記から、官能基/前駆体基が「相互補完的な基」であること、または「相互補完的な基」とすることができることは明白である。
【００２７】
支持体材料上の官能基の例は当業者に知られており、-OH、-SH、-NH2、>NH、-COOH、-SO3H、-CHO、-NHNH2、-P(=O)(OH)2、-O-PH(=O)(OH)、-P(OH)2、-O-P(=O)(OH)2、エステル、エーテル、チオエーテル、エポキシド、天然もしくは非天然アミノ酸、カルボン酸アミド、マレイミド、ケトン、スルホキシド、スルホン、尿素、イソ尿素、イミド炭酸、スルホンアミド、スルホニルヒドラジド、スルホン酸エステル、リン酸、ホスホン酸、リン酸アミド、ホスホン酸アミド、アルキン、オキシムエーテル、オキシム、アジド、アルコキシアミン、セミカルバジド、スルホン酸ハロゲン化物、ホスホン酸ハロゲン化物、リン酸ハロゲン化物、カルボン酸活性エステル、スルホン酸活性エステル、ホスホン酸活性エステル、リン酸活性エステル、ホスホラミダイト、シアン酸、チオシアン酸、イソシアン酸、イソチオシアン酸、マレイミド、ビニルスルホニル、Cl、Br、I、アルケン、アルキルホスホニウムなどがあるがそれらに限定されない。
【００２８】
本発明のリガンド上の -C=O基に結合している官能基の例は、当業者に知られており、ヒドロキシ、チオール、F、Cl、Br、エステル、エーテル、チオエーテル、カルボン酸、エポキシド、アミン、アミド、アミノ酸、カルボン酸アミド、マレイミド、アルデヒド、ケトン、スルホン酸、スルホキシド、スルホン、尿素、イソ尿素、イミド炭酸、スルホンアミド、スルホン酸エステル、リン酸、ホスホン酸、リン酸アミド、ホスホン酸アミド、ヒドラジン、オキシム、アジド、アルケン、アルキン、ヒドロキシルアミン、チオ尿素、イソシアン酸、イソチオシアン酸、N-ヒドロキシスクシンイミジル、1-ヒドロキシベンゾトリアゾリル、7-アザ-1-ヒドロキシベンゾトリアゾリル、6-クロロ-1-ヒドロキシベンゾトリアゾリルなどがあるがそれらに限定されない。
【００２９】
本発明のこの実施形態において、支持体材料上の適当な官能基と、本発明のリガンド上の-C=O基に付いている適当な官能基（もしくは「前駆体基」）との反応の結果得られる化学結合もしくは化学的単位は、本発明のリガンドが支持体材料/マトリックスに結び付けられる連結ポイントとなる。したがって、支持体材料上の官能基と、本発明のリガンド上の-C=O基に付いた官能基（もしくは「相互補完的な基」）との化学反応は、本発明のリガンドと支持体材料とを、連結ポイントLで結び付ける。
【００３０】
本発明のもう1つの実施形態において、Lはスペーサー基 -Sp-に結合している。この実施形態において、Lは、支持体材料上の適当な官能基と、スペーサー基Sp上の適当な官能基（もしくは「前駆体基」）との反応の結果生じる結合または化学的単位である。したがって、支持体材料上の官能基と、スペーサー基Sp上の官能基（もしくは「相補的な基」）との化学反応は、本発明のリガンドと支持体材料とを、連結ポイントLで結び付ける。
【００３１】
式（I）のvが0である場合、リガンドは直接Lに結合している。他の実施形態では、リガンドは、スペーサー基Spを介して支持体材料に結合している。これは、式（I）のvが0とは異なる場合に当てはまる。
【００３２】
スペーサー基Spは好ましくは炭化水素基であるが、これはCおよびH原子に加えて、さらに他の原子を含有してもよい。適当な他の原子は当業者に知られている。好ましい原子はO、S、N、P、Siなどである。炭化水素基は直鎖または分岐鎖または環状とすることができる。Spは本発明のリガンドの-C=O基に結合しているが、概してSpは、-C=O基に対してα位に存在する。さらに、Spは官能基（前駆体基）を含有しており、この官能基によって本発明のリガンドは、最終的な官能性（結合単位とも称される）を形成する中で、化学反応においてマトリックスと共有結合することができる。
【００３３】
スペーサー基Spは、好ましくは、リガンドと支持体材料とを、連結ポイントLを介して共有結合させる結合単位/最終的な官能性を含んでいる。適当な結合単位/最終的な官能性は当業者に知られている。好ましくは、結合単位は、適当な前駆体基である、-NH2、-NH、-SH、-COOH、-SO3H、-CHO、-OH、-NHNH2、-P(=O)(OH)2、-O-PH(=O)(OH)、-P(OH)2、-O-P(=O)(OH)-NHNH2、天然もしくは非天然アミノ酸、カルボン酸アミド、エーテル、エステル、チオエーテル、エポキシド、マレイミド、ケトン、スルホキシド、スルホン、尿素、イソ尿素、イミド炭酸、スルホンアミド、スルホニルヒドラジド、スルホン酸エステル、リン酸、ホスホン酸、リン酸アミド、ホスホン酸アミド、ヒドラジン、オキシム、アジド、アルコキシアミン、セミカルバジド、スルホン酸ハロゲン化物、ホスホン酸ハロゲン化物、リン酸ハロゲン化物、カルボン酸活性エステル、スルホン酸活性エステル、ホスホン酸活性エステル、リン酸活性エステル、ホスホラミダイト、シアン酸、チオシアン酸、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、イソシアン酸、イソチオシアン酸、ビニルスルホニル、カルボン酸ハロゲン化物、アルケン、およびアルキン基などから誘導される。典型的には、結合単位は、炭素鎖に結び付けられており、この炭素鎖は酸素原子などの1つもしくは複数のヘテロ原子、またはカルボキサミド基などが間に入っていてもよい。ある実施形態において、結合単位はアルキレンもしくはアルキレン-ポリオキシアルキレン基、たとえば - CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x-に結合しており、このxは1から10まで、好ましくは1から6までである。
【００３４】
典型的には、スペーサー基上の官能基は炭化水素鎖に結合しており、この炭化水素鎖は1つもしくは複数のヘテロ原子、たとえばN、O、P、S、Siを含有してもよい。したがって、スペーサー基は、好ましくはN、O、P、S、Siから選択される、1つもしくは複数のヘテロ原子を含有する炭化水素基である。本発明のリガンドのC=O基に連結される原子は、窒素、酸素、炭素、もしくは硫黄であることが好ましい。Spに含まれる、適当な化学物質/化学的単位は、当業者に知られている。Spは概して、アルキレン、アルコール、アミン、アミド、カルボニル、アルキレンオキシ、およびリン酸から選択される、少なくとも1つの単位を含有する。アルキレン単位は、1-30、好ましくは1-12、特に1-6個の炭素原子を有することが好ましい。アルコールは、第一級、第二級または第三級アルコールとすることができる。アミンは、非有機または有機アミンとすることができる。さらにアミンは、ジアミンまたはトリアミンとすることができるが、ジアミンが好ましい。アミドは、非有機または有機アミドとすることができ、ジアミンまたはトリアミンから誘導することができるが、ジアミンが好ましい。アルキレンオキシ単位は、直鎖または分岐鎖アルキレン単位を含有することができる。アルキレンオキシ単位は、好ましくはエチレンオキシまたはプロピレンオキシ単位であるが、エチレンオキシ単位が好ましい。単位は、2つ以上の上記化学物質/単位、たとえばアミノ酸、を含んでいてもよい。アミノ酸は天然もしくは非天然アミノ酸とすることができる。アミノ酸は、直鎖または分岐鎖とすることができる。分岐鎖アミノ酸は、分岐点としての役割を果たす可能性があり、2つ以上のリガンド部分を1つの接合点（"L"）に結合することを可能にする。好ましいアミノ酸の例としては、6-アミノヘキサン酸、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、5-アミノ-3-オキサペンタン酸、グリシン、βアラニン、リジン、オルニチン、グルタミン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、2,4-ジアミノ酪酸、およびセリンがある。
【００３５】
スペーサー基Spは、前記の1単位で構成されてもよいが、2つ以上の単位からなることもある。スペーサー基Spが前記の2つ以上の単位で構成される場合、これらの単位は連結基によって相互に連結される。このような連結基には、アミド、尿素、ヒドラジド、シュウ酸ジアミド、オキシム、ヒドラゾン、トリアゾ-ル、チオ尿素、イソ尿素、エーテルがあり、アミドおよび尿素が好ましいがそれらに限定されない。リン酸基も同様に連結基として機能しうる。リン酸基は1つ、2つ、または3つの前記単位に結合することができる。リン酸基が3つの前記単位に連結される場合、それは分岐点として機能することができ、2つ以上のリガンド部分を1つの接続点（"L"）に結び付けることを可能にする。
【００３６】
スペーサー基Spの好ましい単位としては、アミン、好ましくは有機アミン、ジアミン、たとえばエチレンジアミン、ピペラジン、ホモピペラジン、-(CH2)n-C(=O)-、-NH-((CH2)2O)n-(CH2)n-NH-；-NH-(CH2)n-NH-、-NH-(CH2)n-、-NH-CH-(C(=O)NH-、-NH-(O-C2H4)n-CH2-C(=O)- （nは1-30、好ましくは1-12までの整数）が挙げられるが、それらに限定されない。ある実施形態において、nは1-6までの整数、すなわち1、2、3、4、5、または6である。スペーサー基Spのさらに好ましい単位にはアミノ酸があり、これは天然アミノ酸でも非天然アミノ酸でもよく、特に6-アミノヘキサン酸、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、5-アミノ-3-オキサペンタン酸、リジン、およびグルタミン酸とすることができるが、それらに限定されない。このように、指定された単位および官能基は、スペーサー基Spおよび連結ポイントLの一部である。
【００３７】
スペーサー基Spの特に好ましい例は-NH-(CH2)nNH-、-NH-((CH2)2O)n-(CH2)2-NH-であって、式中nは1-30、好ましくは1-12までの整数である。ある実施形態において、nは1-6までの整数、すなわち1、2、3、4、5、または6である。
【００３８】
下記も、スペーサー基Spの特に好ましい例である：
-NH-CH2-CH2-CH2-NH （-NH- は連結ポイントLに結合する）；
-NH-(CH2)3-NH- （Nは連結ポイントLに結合し、もう一方のNがリガンドのC(=O)に結合する）；
-N’H-CH(C(=O)NH-(CH2)3-N’’H-)((CH2)2C(=O)NH-(CH2)3-N’’’H-) （N’ は連結ポイントLに結合し、N’’ およびN’’’ は双方とも、2つの個別のリガンドのC(=O)に結合する）；
-NH-(CH2)3-N’(CH3)- （Nは連結ポイントLに結合し、N’ はリガンドのC(=O)に結合する）；
-N’H-(CH2)3-NH-C(=O)-CH(-N’’H-)(-(CH2)4-N’’’H-) （N’ は連結ポイントLに結合し、N’’およびN’’’ は双方とも、2つの個別のリガンドのC(=O)に結合する）；
-N’H-(CH2)3-NH-C(=O)-CH(-NH-C(=O)-CH2-(O-C2H4)2-N’’H-)(-(CH2)4-NH-C(=O)-CH2-(O-C2H4)2-N’’’H-) （N’ は連結ポイントLに結合し、N’’およびN’’’ は双方とも、2つの個別のリガンドのC(=O)に結合する）；
-N’H-(CH2)3-NH-C(=O)-CH(-NH-C(=O)-CH2-O-C2H4-N’’H-)(-(CH2)4-NH-C(=O)-CH2-O-C2H4-N’’’H-) （N’ は連結ポイントLに結合し、N’’およびN’’’ は双方とも、2つの個別のリガンドのC(=O)に結合する）；
-N’H-(CH2)3-NH-C(=O)-CH2-(O-C2H4)2-N’’H- （N’ は連結ポイントLに結合し、N’’ はリガンドのC(=O)に結合する）；
-N’H-(CH2)3-NH-C(=O)-CH2-(O-C2H4)2-NH-C(=O)-CH2-(O-C2H4)2-N’’H- （N’ は連結ポイントLに結合し、N’’ はリガンドのC(=O)に結合する）；
-N’H-(C2H4-O)2-C2H4-NH-C(=O)-NH-C2H4-(O-C2H4)2-N’H- （N’ は連結ポイントLに結合し、もう一方のN’ はリガンドのC(=O)に結合する）；
-N’H-(CH2)5-C(=O)-NH-(CH2)3-N’’H- （N’ は連結ポイントLに結合し、N’’ はリガンドのC(=O)に結合する）；
-N’H-C2H4-(O-C2H4)2-NH-C(=O)-(CH2)5-N’’H- （N’ は連結ポイントLに結合し、N’’ はリガンドのC(=O)に結合する）；
-N’H-(CH2)6-NH-C(=O)-CH2-(O-C2H4)2-N’’H- （N’ は連結ポイントLに結合し、N’’ はリガンドのC(=O)に結合する）。
【００３９】
典型的には、スペーサー基Spの全体の長さは、100原子未満、好ましくは60原子未満、特に30原子未満である。
【００４０】
本発明のある実施形態において、Spは分岐していてもよい。本発明に関して「分岐」という用語は、式（II）の本発明のリガンドが2つ以上、スペーサー基上に存在することを意味する。この実施形態は、マトリックス接続ポイント（連結ポイント）Lに2つ以上のリガンドを結び付けることを可能にする。
【００４１】
この文脈において「最終的な官能性」または「結合単位」は、支持体材料上および本発明のリガンド上、および/またはスペーサー基Sp上で、前駆体基（官能基）間の反応で形成される単位を示す。結合単位は、支持体材料と本発明のリガンド（スペーサーSpを含む場合もある）との間の結合を含み、リガンド置換マトリックスを生じる。
【００４２】
Lおよび/またはSpに組み込まれる結合単位は当業者に知られているが、下記の基を含むことができる：エーテル、チオエーテル、C-C単結合、アルケニル、アルキニル、エステル、アミン、アミド、カルボン酸アミド、スルホン酸エステル、スルホン酸アミド、ホスホン酸エステル、ホスホン酸アミド、リン酸エステル、リン酸アミド、リン酸チオエステル、チオリン酸エステル、第二級アミン、第二級アルコール、第三級アルコール、2-ヒドロキシアミン、尿素、イソ尿素、イミド炭酸、アルキルチオスクシンイミド、ジアルキルスクシンイミド、トリアゾ-ル、ケトン、スルホキシド、スルホン、オキシムエーテル、ヒドラゾン、シリルエーテル、ジアシルヒドラジド、アシルスルホニルヒドラジド、N-アシルスルホンアミド、ヒドラジド、N-アルコキシアミド、アシルセミカルバジド、アシルオキシアミド、スルホニルオキシアミド、ホスホリルオキシアミド、アシルヒドラゾン、N-カルボキサミドイソ尿素、N-カルボキサミドイミド炭酸、N-カルボキサミドイソチオ尿素、N-カルボキサミドイミドチオ炭酸、アシル尿素、アシルチオ尿素、N-カルボキサミド尿素、アルキルチオエチルスルホニル、ヒドラジニルスクシンイミド、アシルヒドラジニルスクシンイミド、アルコキシアミノスクシンイミド、アミノスクシンイミド、ヒドラジニルエチルスルホニル、アシルヒドラジニルエチルスルホニル、アルコキシアミノエチルスルホニル、アミノエチルスルホニル、テトラゾール、アルコキシアミジン。
【００４３】
式（I）のvが0である場合、リガンドは直接Lに結合している。他の実施形態において、リガンドはスペーサー基Spを介して支持体材料に結合している。
【００４４】
本発明の実施形態において、R1は下記から選択される：水素；およびC1 -C4 アルキル、典型的には直鎖および分岐鎖C1 -C4 アルキルであってシクロアルキル単位を含んでいてもよい、たとえば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、シクロプロピル、メチルシクロプロピル。
【００４５】
R1は水素およびメチルから選択されることが好ましい。より好ましくはR1は水素である。
【００４６】
Ar1は、単素環式もしくは複素環式芳香環とすることができる；好ましくはAr1は単素環式芳香環であり、すなわちAr1はたとえばフェニレンである。さらに好ましい実施形態において、Ar1はフェニレンである。Ar1が複素環式芳香環であるならば、それは1つ、2つ、または3つ以上のヘテロ原子を含有し、それは好ましくはN、S、O、およびそれらの組み合わせから選択される。適当な5員もしくは6員複素環式芳香環の例には、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピラゾール、1,2,3-トリアゾ-ル、1,2,4-トリアゾ-ル（4H-1,2,4-トリアゾ-ル、および1H-1,2,4-トリアゾ-ル）、1H-テトラゾール、2H-テトラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、1,2,3-トリアジン、1,2,4-トリアジン、および1,3,5-トリアジンがあるがそれらに限定されない。好ましい5員もしくは6員複素環式芳香環は、イミダゾール、トリアゾ-ル、およびピリジンである。
【００４７】
式（I）において、Ar1は、C=O基およびHN基（式Iaを参照されたい）、または２つのC=O基（式Ibを参照されたい）に結合している。
【００４８】
式Iaで示される場合、一部の実施形態では、C=OおよびNH基は互いにメタの位置にある。Ar1がフェニレンである場合、C=O基およびNH基は、互いにメタもしくはパラの配置をとるが、メタが好ましい。芳香環がイミダゾールである場合、C=O基は典型的には2位に結合し、NH基は4位に結合する。芳香環がチアゾールであるならば、C=O基は典型的には4位に結合し、NH基は2位に結合する。芳香環がピリジンである場合、C=O基およびNH基は互いにメタの位置であることが好ましいが、環員窒素原子は、別の位置をとることができる。一部の実施形態において、C=O基は典型的にはピリジン環の3位に結合し、NH基は5位に結合する。上記の好ましい実施形態を含む2価の5員もしくは6員芳香環は、置換されていても、置換されていなくてもよい。典型的には5員もしくは6員芳香環は置換されており、好ましくは一置換である。適当な置換基の例は、C1 - C4アルコキシ、典型的には、直鎖および分岐鎖C1 - C4アルコキシ（シクロアルキル単位を含有してもよい）、たとえば、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、シクロプロポキシ、メチルシクロプロポキシ、およびシクロブトキシ；C1 - C4 アルキル、典型的には、直鎖および分岐鎖C1 - C4 アルキル（シクロアルキル単位を含有してもよい）、たとえば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、およびシクロブチル；ヒドロキシ；ならびにそれらの組み合わせである。好ましい置換基には、メトキシ、エトキシ、およびメチルがあるが、メトキシがもっとも好ましい。
【００４９】
もっとも好ましい実施形態において、Ar1はメトキシ置換フェニレンであって、このメトキシ基は、C=O基に対してオルト、NH基に対してパラの位置にある（C=O基およびNH基は互いにメタの位置にある）。他の好ましい実施形態において、Ar1は、メトキシ置換フェニレンであって、このメトキシ基は、C=O基に対してパラ、NH基に対してオルトの位置にある（C=O基およびNH基は互いにメタの位置にある）。さらに他の好ましい実施形態において、Ar1は、N-メチル置換イミダゾール環であって、C=O基は2位に結合し、NH基は4位に結合する。また他の好ましい実施形態において、Ar1は、チアゾールであって、C=O基は4位に結合し、NH基は2位に結合する。さらに他の好ましい実施形態において、Ar1は、メチル置換フェニレンであって、そのメチル基はC=O基に対してオルト、NH基に対してパラの位置にある（C=O基およびNH基は互いにメタの位置にある）。また他の好ましい実施形態において、Ar1は、メチル置換フェニレンであって、このメチル基は、C=O基に対してパラ、NH基に対してオルトの位置にある（C=O基およびNH基は互いにメタの位置にある）。さらに他の好ましい実施形態において、Ar1は、ピリジン環であって、C=O基は3位に、NH基は5位に結合する。また他の好ましい実施形態において、Ar1は、非置換フェニレンであって、C=O基およびNH基は互いにメタまたはパラの位置をとる。
【００５０】
式Ibで表される場合、ある実施形態では、2つのC=O基は互いにメタの位置にある。Ar1がフェニレンである場合、2つのC=O基は互いにメタまたはパラの位置にあるが、メタが好ましい。
【００５１】
Ar2は、5員もしくは6員の非置換もしくは置換複素環式芳香環であって、それが
(a) 単結合によってもう1つの5員もしくは6員の非置換もしくは置換複素環式芳香環と結合している；または
(b) もう一つの5員もしくは6員芳香環と縮合して、多環式環系の一部となっている；または
(c) C1 - C4 アルキル；C2 - C4 アルケニル；C2 - C4 アルキニル；ハロゲン；C1 - C4 ハロアルキル；ヒドロキシ置換C1 - C4 アルキル； C1 - C4 アルコキシ；ヒドロキシ置換C1 - C4 アルコキシ；C1 - C4 アルキルアミノ；C1 - C4 アルキルチオ；およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの置換基と結合している、
前記5員もしくは6員の非置換もしくは置換複素環式芳香環である。
【００５２】
Ar2はC=O基（式Iaを参照されたい）またはNR1基（式Ib）のいずれかと結合している。
【００５３】
Ar2の5員もしくは6員複素環式芳香環は、好ましくはN、S、O、およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つのヘテロ原子を含有する。より好ましくは、5員もしくは6員複素環式芳香環は、2つ以上の窒素原子、または1つの窒素原子および1つの酸素原子を含有する。C=O基は第1の芳香環の一部であってもよい。典型的には、Ar2の5員もしくは6員複素環式芳香環は環員炭素原子でC=O基に結合しており、この環員炭素原子は、環員ヘテロ原子、好ましくは窒素もしくは酸素原子に隣接している。ある実施形態において、Ar2の5員もしくは6員複素環式芳香環は環員炭素原子でNR1基に結合しており、この環員炭素原子は、環員ヘテロ原子、好ましくは窒素、酸素、もしくは硫黄原子に隣接している。
【００５４】
式（I）において直接C=O基と結合している、または直接NR1基と結合しているAr2の適当な5員もしくは6員複素環式芳香環の例には下記があるがそれらに限定されない：ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピラゾール、1,2,3-トリアゾ-ル、1,2,4-トリアゾ-ル（4H-1,2,4-トリアゾ-ルおよび1H-1,2,4-トリアゾ-ル）、1H-テトラゾール、2H-テトラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、1,2,3-トリアジン、1,2,4-トリアジン、1,3,5-トリアジン、1,2,4-オキサジアゾ-ル、1,3,4-オキサジアゾ-ル、1,2,4-チアジアゾ-ル、および1,3,4-チアジアゾ-ル。好ましい5員もしくは6員複素環式芳香環は、ピラゾール、イミダゾール、イソキサゾール、ピロール、フラン、1,2,4-トリアゾ-ル、ピリジン、1,2,4-トリアジン、ピリダジン、ピリミジン、1,2,4-オキサジアゾ-ル、1,3,4-オキサジアゾ-ル、チアゾール、および1,3,4-チアジアゾ-ルであるが、ピラゾール、イミダゾール、イソキサゾール、1,2,4-オキサジアゾ-ル、1,3,4-オキサジアゾ-ル、チアゾール、および1,3,4-チアジアゾ-ルがもっとも好ましい。ピラゾール環の場合、C=O基は典型的には、3位、4位、または5位でピラゾール環に結合するが、好ましくは3位に結合する。ピラゾール環の場合、NR1基のN原子は典型的には、3位、4位、または5位でピラゾール環に結合するが、好ましくは3位に結合する。イミダゾール環の場合、C=O基は典型的には、4位または2位でイミダゾール環に結合する。イソキサゾール環の場合、C=O基は典型的には、5位または3位でイソキサゾール環に結合する。ピロール環の場合、C=O基は典型的には、3位でピロール環に結合する。フラン環の場合、C=O基は典型的には、2位でフラン環に結合する。1,2,4-トリアゾ-ル環の場合、C=O基は典型的には、3位で1,2,4-トリアゾ-ル環に結合する。ピリジン環の場合、C=O基は典型的には、3位または2位でピリジン環に結合するが、2位および3位が好ましい。1,2,4-トリアジン環の場合、C=O基は典型的には、3位で1,2,4-トリアジン環に結合する。ピリダジンの場合、C=O基は典型的には、4位でピリダジン環に結合する。1,2,4-オキサジアゾ-ル環の場合、C=O基は典型的には、5位で1,2,4-オキサジアゾ-ル環に結合する。1,3,4-オキサジアゾ-ル環の場合、C=O基は典型的には、2位または5位で1,3,4-オキサジアゾ-ル環に結合する。チアゾール環の場合、NR1基のN原子は典型的には、2位でチアゾール環に結合する。1,3,4-チアジアゾ-ル環の場合、NR1基のN原子は典型的には、2位で1,3,4-チアジアゾ-ル環に結合する。
【００５５】
式（I）に関する上記Ar2の選択肢(a)において、5員もしくは6員複素環式芳香環は、もう1つの5員もしくは6員芳香環（以下「Ar2の第2の芳香環」）と単結合で結合している。これらの実施形態において、C=O基に直接結合している5員もしくは6員複素環式芳香環（以下「Ar2の第1の芳香環」）は、ピラゾール、ピリジン、イソキサゾール、1,2,4-オキサジアゾ-ル、または1,3,4-オキサジアゾ-ル環であることが特に好ましい。第1の芳香環がピラゾール環である場合、C=O基は典型的にはピラゾール環の3位に結合する。第2の芳香環は好ましくは、ピラゾール環の5位に結合する。他の実施形態において、C=O基はピラゾール環の5位に結合し、第2の芳香環は、ピラゾール環の3位に結合する。第1の芳香環がピリジンである場合、C=O基および第2の芳香環は互いにメタの位置にあることが好ましいが、他方、環員窒素原子は、異なる位置をとることができる。ある実施形態において、C=O基はピリジン環の3位に結合し、第2の芳香環はピリジン環の5位に結合する。他の実施形態において、C=O基はピリジン環の2位に結合し、第2の芳香環はピリジン環の4位に結合する。第1の芳香環がイソキサゾール環の場合、C=O基は典型的にはイソキサゾール環の3位に結合する。第2の芳香環はイソキサゾール環の5位に結合することが好ましい。他の実施形態において、C=O基はイソキサゾール環の5位に結合し、第2の芳香環はイソキサゾール環の3位に結合する。第1の芳香環が1,2,4-オキサジアゾ-ル環である場合、C=O基は典型的には、1,2,4-オキサジアゾ-ル環の5位に結合する。第2の芳香環は好ましくは1,2,4-オキサジアゾ-ル環の3位に結合する。第1の芳香環が1,3,4-オキサジアゾ-ル環である場合、C=O基は典型的には、1,3,4-オキサジアゾ-ル環の2位に結合する。第2の芳香環は好ましくは、1,3,4-オキサジアゾ-ル環の5位に結合する。ある実施形態において、NR1基のN原子に直接結合している5員もしくは6員複素環式芳香環（以下「Ar2の第1の芳香環」）は、ピラゾール、チアゾール、1,3,4-チアジアゾ-ル環であることが特に好ましい。第1の芳香環がピラゾール環である場合、NR1基のN原子は典型的にはピラゾール環の5位に結合する。第2の芳香環はピラゾール環の3位に結合することが好ましい。第1の芳香環がチアゾール環である場合、NR1基のN原子は典型的にはチアゾール環に2位で結合する。第2の芳香環は好ましくはチアゾール環の4位に結合する。他の実施形態において、第2の芳香環は好ましくはチアゾール環の5位に結合する。第1の芳香環が1,3,4-チアジアゾ-ル環である場合、NR1基のN原子は典型的には、1,3,4-チアジアゾ-ル環の2位に結合する。第2の芳香環は、好ましくは1,3,4-チアジアゾ-ル環の5位に結合する。
【００５６】
選択肢(b)において、第1の芳香環は、多環式、好ましくは二環式環系の一部として、第2の5員もしくは6員芳香環と縮合している。第1の芳香環がピラゾール環であって、縮合環系の一部となっている場合、C=O基は典型的には、ピラゾール環の3位に結合する。ピラゾール環は好ましくは、4位および5位で第2の芳香環と縮合している。他の場合では、C=O基は、ピラゾール環の4位に結合し、第2の芳香環は1位および5位でピラゾール環に結合している。他の場合には、C=O基は、ピラゾール環の3位に結合し、第2の芳香環は1位および5位でピラゾール環に結合している。第1の芳香環がイソキサゾール環であって、縮合環系の一部となっている場合、C=O基は典型的には、イソキサゾール環の5位に結合する。このイソキサゾール環は好ましくは、3位および4位で第2の芳香環と縮合している。第1の芳香環がイミダゾール環であって、縮合環系の一部となっている場合、C=O基は典型的にはイミダゾール環の4位に結合する。このイミダゾール環は好ましくは、1位および2位で第2の芳香環と縮合している。他の場合には、C=O基はイミダゾール環の2位に結合し、第2の芳香環は4位および5位でイミダゾール環と縮合している。1,2,4-トリアゾ-ルが第1の芳香環であって、縮合環系の一部となっている場合、C=O基は典型的には、1,2,4,-トリアゾ-ル環の3位に結合する。この1,2,4-トリアゾ-ル環は好ましくは、4位および5位で第2の芳香環と縮合している。ピリダジンが第1の芳香環であって、縮合環系の一部となっている場合、C=O基は典型的にはピリダジン環の4位に結合する。このピリダジン環は好ましくは、5位および6位で第2の芳香環と縮合している。ピロール環が第1の芳香環であって、縮合環系の一部となっている場合、C=O基は典型的には、ピロール環の3位に結合する。このピロール環は好ましくは、4位および5位で第2の芳香環と縮合している。ピリジン環が第1の芳香環であって、縮合環系の一部となっている場合、C=O基は典型的には、ピリジン環の2位に結合する。このピリジン環は好ましくは、3位および4位で第2の芳香環と縮合している。1,2,4-トリアジン環が第1の芳香環であって、縮合環系の一部となっている場合、C=O基は典型的には、1,2,4-トリアジン環の6位に結合する。この1,2,4-トリアジン環は好ましくは、3位および4位で第2の芳香環と縮合している。ピラゾール環が第1の芳香環であって、縮合環系の一部となっている場合、NR1基のN原子は典型的には、ピラゾール環の3位に結合する。このピラゾール環は好ましくは、4位および5位で第2の芳香環と縮合している。イミダゾール環が第1の芳香環であって、縮合環系の一部となっている場合、NR1基のN原子は典型的には、イミダゾール環の4位に結合する。このイミダゾール環は好ましくは1位および2位で第2の芳香環と縮合している。チアゾール環が第1の芳香環であって、縮合環系の一部となっている場合、NR1基のN原子は典型的には、チアゾール環の2位に結合する。このチアゾール環は好ましくは、4位および5位で第2の芳香環と縮合している。
【００５７】
上記の好ましい実施形態を含む、選択肢(a)および(b)のAr2の第2の芳香環は、典型的には5員もしくは6員の単素環もしくは複素環である。適当な5員もしくは6員芳香環の例には下記のものがあるが、それらに限定されない：ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピラゾール、1,2,3-トリアゾ-ル、1,2,4-トリアゾ-ル（4H-1,2,4-トリアゾ-ルおよび1H-1,2,4-トリアゾ-ル）、1H-テトラゾール、2H-テトラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、1,2,3-トリアジン、1,2,4-トリアジン、および1,3,5-トリアジン。好ましい第2の芳香環は、ベンゼン、フラン、チオフェン、ピロール、ピリジン、チアゾール、ピリミジン、およびピラゾールであるが、ベンゼン、チアゾール、フラン、およびチオフェンがもっとも好ましい。
【００５８】
選択肢(a)では、Ar2の第2の芳香環は、典型的には、フラン、チオフェン、ピロール、ベンゼン、ピリジン、またはチアゾールであるが、フラン、チオフェン、ベンゼン、およびチアゾールが好ましく、フランおよびチアゾールがもっとも好ましい。選択肢(a)で、第2の芳香環がフラン、チオフェン、ピロール、ベンゼン、またはチアゾール環である場合、それらの環は、第1の芳香環に、それら第2の芳香環の2位、3位、もしくは4位で結合しているが、2位および4位がもっとも好ましい。選択肢(a)の典型的な実施形態において、第1の芳香環はピラゾール環であり、第2の芳香環はフラン環であって、すなわちAr2は5-(2-フリル)ピラゾール-3-イルなどのフリルピラジルである。他の典型的な実施形態において、Ar2は、5-(2-メチルチアゾール-4-イル)イソキサゾール-3-イル、4-(2-フリル)ピリジン-2-イル、3-(4-メトキシフェニル)-[1,2,4]オキサジアゾ-ル-5-イル、3-(2-フリル)-[1,2,4]オキサジアゾ-ル-5-イル、または5-(2-フリル)-[1,3,4]オキサジアゾ-ル-2-イルである。
【００５９】
選択肢(b)では、Ar2の第2の芳香環は、好ましくはベンゼン、チアゾール、ピロール、ピリミジン、またはピリジンであるが、ベンゼンおよびチアゾールがもっとも好ましい。選択肢(b)の典型的な実施形態において、Ar2はベンゾ[c]イソキサゾール-3-イル、イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イル、シンノリン-4-イル、インドール-3-イル、インダゾール-3-イル、ベンゾ[c]フラン-1-イル、1-イソキノリニル、5-オキソ-5H-[1,3]チアゾール[3,2-a]ピリミジン-6-イル、ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル、[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリミジン-3-イル、およびピラゾロ[5,1-c][1,2,4]トリアジン-3-イルであるが、ベンゾ[c]イソキサゾール-3-イル、インダゾール-3-イルおよびイミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルが好ましい。
【００６０】
式（I）に関する上記Ar2の選択肢(c)において、5員もしくは6員複素環式芳香環は、少なくとも1つ（好ましくは1つもしくは2つ）の置換基に結合しており、この置換基は、C1 - C4 アルキル、典型的には直鎖もしくは分岐鎖C1 - C4 アルキル（これはシクロアルキル単位を含んでいてもよい）、たとえばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、およびシクロブチル；C2 - C4 アルケニル；C2 - C4 アルキニル、たとえばエチニル；ハロゲン、たとえばフルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨード；C1 - C4 ハロアルキル、たとえばトリフルオロメチル；ヒドロキシ置換C1 - C4 アルキル、典型的には、モノ-もしくはジヒドロキシアルキル、たとえば、モノ-もしくはジヒドロキシエチル、またはモノ-もしくはジヒドロキシプロピル；C1 - C4 アルコキシ、典型的には直鎖および分岐鎖C1 - C4 アルコキシ（これはシクロアルコキシ単位を含んでいてもよい）、たとえばメトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、シクロプロポキシ、メチルシクロプロポキシ、およびシクロブトキシ；ヒドロキシ置換C1 - C4 アルコキシ、典型的にはモノヒドロキシ置換C1 - C4 アルコキシ；C1 - C4 アルキルアミノ；C1 - C4 アルキルチオ、ならびにそれらの組み合わせから選択される。1つもしくは複数の置換基は、環員炭素原子および/または環員ヘテロ原子で環に結合しうるが、環員炭素および/または窒素原子が好ましい。選択肢(c)の5員もしくは6員複素環式芳香環の好ましい置換基は、シクロプロピル、エチニル、メチル、およびトリフルオロメチルである。少なくとも1つの置換基は、C=O基に対してメタの位置をとることが好ましい。選択肢(c)の典型的な実施形態において、Ar2は、3-シクロプロピルピリジン-5-イル、3-エチニルピリジン-5-イル、5-(トリフルオロメチル)ピラゾール-3-イル、5-(トリフルオロメチル)ピラゾール-3-イル、または1-メチル-5-(トリフルオロメチル)ピラゾール-3-イルである。
【００６１】
当然のことであるが、Ar2の芳香環、すなわち第1の芳香環、または第2の芳香環、またはその両者は、選択肢(a)および(b)では、必要に応じて1つもしくは複数の追加の置換基を有していてもよく、この置換基は典型的には、選択肢(c)のために上記で言及された置換基から選択される。1つもしくは複数の置換基は、1つもしくは複数の環に、環員炭素原子または環員ヘテロ原子で結合しうるが、炭素もしくは窒素原子が好ましい。Ar2の第1および/または第2の芳香環の好ましい置換基は、C1 - C4 アルキル、たとえばメチル；ハロ、たとえばブロモおよびクロロ；ヒドロキシアルキル、たとえばメトキシ、2-ヒドロキシエチル、もしくは2,3-ジヒドロキシプロピル；アルキルアミノ、たとえばアミノプロピル；およびハロアルキル、たとえばトリフルオロメチルである。第1の芳香環がピラゾール環である場合、それは典型的には、メチル置換、好ましくはN-メチル置換されており、より好ましくは1位で置換されている。ピラゾールのN-メチル置換は、選択肢(a)では特に好ましい。
【００６２】
選択肢(a)の置換Ar2の典型例は、5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イルである。
【００６３】
第1の芳香環がピリジン環である場合、それは典型的には、それ以上置換基を持たない。
【００６４】
選択肢(b)の置換Ar2の典型例は、5-クロロ-1H-インダゾール-3-イル、1-メチルインドール-3-イル、1-メチルインダゾール-3-イル、5,7-ジメチル-[1,2,4]トリアゾロ [4,3-a]ピリミジン-3-イル、4,7-ジメチルピラゾロ[5,1-c][1,2,4]トリアジン-3-イル、1-エチルインダゾール-3-イル、1-(2-ヒドロキシエチル)インダゾール-3-イル、および1-(2,3-ジヒドロキシプロピル)インダゾール-3-イルである。
【００６５】
選択肢(a)においても、(b)においても、第2の芳香環はベンゼンなどの他の芳香環と適宜、縮合していてもよいということも、本発明に含まれる。他の芳香環と縮合した第2の芳香環の例は、典型的にはベンゾチオフェンである。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態において、カルボニル基に対してα位にある基はアミノ基NR2であって、このR2は下記のさまざまな意味を持つ可能性がある。本発明のリガンド置換マトリックスは、これらの場合、下記の式(II)、(IIa)、および(IIb)に記載のように表されるが、これらは上記式(I)、(Ia)、および(Ib)に含まれる。
【００６７】
【化４】
2013538798.tif 000006
【化５】
2013538798.tif 000007
【化６】
2013538798.tif 000008
【００６８】
上記の式(II)、(IIa)、および(IIb)において、NR2基は、明確にするために、連結ポイントLまたはスペーサー基Spの一部としてではなく、このようにリガンドの一部として示される。しかしながら、NR2は、式（I）、（Ia）、および（Ib）に示すように、Vとともにスペーサー基Spを形成していること、もしくは連結ポイントLの一部であることには留意すべきである。
【００６９】
本発明のある実施形態において、R2は下記から選択される：水素；ならびにC1 - C4 アルキル、典型的には直鎖および分岐鎖C1 - C4 アルキル（これはシクロアルキル単位を含んでいてもよい）、たとえばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、シクロプロピル、メチルシクロプロピル。
【００７０】
好ましくはR2は水素およびメチルから選択される。より好ましくはR2は水素である。
【００７１】
他の記号Ar1、Ar2、およびAmは、式（I）、（Ia）、および（Ib）に関して上記で定義された意味、しかも好ましい意味を有する。
【００７２】
式（II）に関して定義され、式（IIa）および（IIb）に示されるR2は、本明細書が優先権を主張する特許出願EP 10008089.4で定義され示されるR3に相当する。
【００７３】
本発明はまた、支持体材料と結合した後に、支持体材料とともにリガンド置換マトリックスを形成する本発明のリガンドを含むが、このリガンド置換マトリックスは本発明の方法に使用されるものである。リガンドは以下の式に基づくものであって、式中の記号Sp、Ar1、Ar2、およびAmは上記で定義された意味を有するが、これは好ましい意味を含む：
【化７】
2013538798.tif 000009
【化８】
2013538798.tif 000010
【化９】
2013538798.tif 000011
【００７４】
式（III）、（IIIa）、および（IIIb）に基づくリガンドは、リガンドに結合したスペーサー基Spを含んでいる。
【００７５】
式（III）、（IIIa）、および（IIIb）に基づくリガンドは、スペーサー基を結合していない他の化合物を合成するための前駆体として機能を果たすことができる。指定の化合物は、スペーサー基を切断し、場合によっては、抗体に結合する分子の一部に存在する-C=Oを含む官能基を当業者に知られている他の任意の適当な官能基に変換した後に、生成される。その目的に適した反応は当業者に知られている。その結果生じる化合物も本発明に包含される。
【００７６】
本発明のマトリックスの好ましいリガンドを以下に示すが、それぞれの式で、いちばん左のN原子は、示されていない連結ポイントLに連結されている。以下の式はすべて、リガンドに結合したスペーサー基を示す：
5-[5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L1)
【化１０】
2013538798.tif 000012
【００７７】
5-[5-(4-ブロモ-2-チエニル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L2)
【化１１】
2013538798.tif 000013
【００７８】
5-[5-(2,5-ジメチル-3-チエニル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L3)
【化１２】
2013538798.tif 000014
【００７９】
5-(5-クロロ-1H-インダゾール-3-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L4)
【化１３】
2013538798.tif 000015
【００８０】
2-メトキシ-5-[3-(2-チエニル)ピリジン-5-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L5)
【化１４】
2013538798.tif 000016
【００８１】
2-メトキシ-5-[1-メチル-5-(2-チエニル)ピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L6)
【化１５】
2013538798.tif 000017
【００８２】
5-[5-(3-クロロフェニル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L7)
【化１６】
2013538798.tif 000018
【００８３】
2-メトキシ-5-[1-メチル-5-(3-チエニル)ピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L8)
【化１７】
2013538798.tif 000019
【００８４】
2-メチル-3-[1-メチル-5-(2-チエニル)ピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L9)
【化１８】
2013538798.tif 000020
【００８５】
4-メチル-3-[1-メチル-5-(2-チエニル)ピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L10)
【化１９】
2013538798.tif 000021
【００８６】
2-メトキシ-5-(3-フェニルピリジン-5-イル)カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L11)
【化２０】
2013538798.tif 000022
【００８７】
2-メトキシ-5-{3-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]ピリジン-5-イル}カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L12)
【化２１】
2013538798.tif 000023
【００８８】
5-[3-(2-フリル)ピリジン-5-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L13)
【化２２】
2013538798.tif 000024
【００８９】
5-[3-(2-ベンゾチエニル)ピリジン-5-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L14)
【化２３】
2013538798.tif 000025
【００９０】
2-メトキシ-5-(1-メチル-5-フェニルピラゾール-3-イル)カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L15)
【化２４】
2013538798.tif 000026
【００９１】
2-メトキシ-5-[5-(1-メチル-2-ピロリル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L16)
【化２５】
2013538798.tif 000027
【００９２】
3-[5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L17)
【化２６】
2013538798.tif 000028
【００９３】
4-[5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L18)
【化２７】
2013538798.tif 000029
【００９４】
2-[1-メチル-5-(2-チエニル)ピラゾール-3-イル]カルボキサミドチアゾール-4-カルボン酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L19)
【化２８】
2013538798.tif 000030
【００９５】
5-[5-(2-フリル)ピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L20)
【化２９】
2013538798.tif 000031
【００９６】
3-{N-[5-(2-フリル)ピラゾール-3-イル]カルバモイル}安息香酸 N’-(3-アミノプロピル)アミド (L21)
【化３０】
2013538798.tif 000032
【００９７】
5-[3-(3-フリル)ピリジン-5-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L22)
【化３１】
2013538798.tif 000033
【００９８】
5-(3-シクロプロピルピリジン-5-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L23)
【化３２】
2013538798.tif 000034
【００９９】
5-(3-エチニルピリジン-5-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L24)
【化３３】
2013538798.tif 000035
【０１００】
2-メトキシ-5-(1-メチルインドール-3-イル)カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L25)
【化３４】
2013538798.tif 000036
【０１０１】
5-(インドール-3-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L26)
【化３５】
2013538798.tif 000037
【０１０２】
2-メトキシ-5-(1-メチルインダゾール-3-イル)カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L27)
【化３６】
2013538798.tif 000038
【０１０３】
5-[5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)-N-メチルアミド (L28)
【化３７】
2013538798.tif 000039
【０１０４】
5-[5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-エトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L29)
【化３８】
2013538798.tif 000040
【０１０５】
5-[5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-ヒドロキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L30)
【化３９】
2013538798.tif 000041
【０１０６】
5-(ベンゾ[c]イソオキサゾール-3-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L31)
【化４０】
2013538798.tif 000042
【０１０７】
5-(ベンゾ[c]フラン-1-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L32)
【化４１】
2013538798.tif 000043
【０１０８】
5-(1,5-ジメチルピラゾール-3-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L33)
【化４２】
2013538798.tif 000044
【０１０９】
2-メトキシ-5-[1-メチル-5-(トリフルオロメチル)ピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L34)
【化４３】
2013538798.tif 000045
【０１１０】
5-(1-イソキノリニル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L35)
【化４４】
2013538798.tif 000046
【０１１１】
5-(インダゾール-3-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L36)
【化４５】
2013538798.tif 000047
【０１１２】
5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L37)
【化４６】
2013538798.tif 000048
【０１１３】
5-(1-エチルインダゾール-3-イルカルボキサミド)-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L38)
【化４７】
2013538798.tif 000049
【０１１４】
5-[N-(1-メチルインダゾール-3-イル)カルバモイル]-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L39)
【化４８】
2013538798.tif 000050
【０１１５】
(RS)-5-[1-(2,3-ジヒドロキシ-1-プロピル)インダゾール-3-イルカルボキサミド]-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L40)
【化４９】
2013538798.tif 000051
【０１１６】
5-(3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-2-イルカルボキサミド)-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L41)
【化５０】
2013538798.tif 000052
【０１１７】
2-メトキシ-5-[5-(2-メチルチアゾール-4-イル)イソオキサゾール-3-イルカルボキサミド]安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L42)
【化５１】
2013538798.tif 000053
【０１１８】
2-メトキシ-5-([1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン-3-イルカルボキサミド)安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L43)
【化５２】
2013538798.tif 000054
【０１１９】
2-メトキシ-5-(1-メチルピラゾロ[3,4-b]ピリジン-3-イルカルボキサミド)安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L44)
【化５３】
2013538798.tif 000055
【０１２０】
5-[5-(2-フリル)イソオキサゾール-3-イルカルボキサミド]-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L45)
【化５４】
2013538798.tif 000056
【０１２１】
2-メトキシ-5-(ピラゾロ[1,5-a]ピリジン-2-イルカルボキサミド)安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L46)
【化５５】
2013538798.tif 000057
【０１２２】
5-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イルカルボキサミド)-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L47)
【化５６】
2013538798.tif 000058
【０１２３】
5-(イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-イルカルボキサミド)-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L48)
【化５７】
2013538798.tif 000059
【０１２４】
(S)-2,6-ビス[5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]ヘキサン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L49)
【化５８】
2013538798.tif 000060
【０１２５】
(S)-2,6-ビス{8-[5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクタノイルアミド}ヘキサン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L50)
【化５９】
2013538798.tif 000061
【０１２６】
2-メトキシ-5-(3-フェニルイソオキサゾール-5-イルカルボキサミド)安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L51)
【化６０】
2013538798.tif 000062
【０１２７】
5-[4-(2-フリル)ピリジン-2-イルカルボキサミド]-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L52)
【化６１】
2013538798.tif 000063
【０１２８】
(S)-2,6-ビス{5-[5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]-3-オキサペンタノイルアミド}ヘキサン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L53)
【化６２】
2013538798.tif 000064
【０１２９】
2-メトキシ-5-[3-(4-メトキシフェニル)-1,2,4-オキサジアゾール-5-イルカルボキサミド]安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L54)
【化６３】
2013538798.tif 000065
【０１３０】
5-[3-(2-フリル)-1,2,4-オキサジアゾール-5-イルカルボキサミド]-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L55)
【化６４】
2013538798.tif 000066
【０１３１】
2-メトキシ-5-(ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-2-イルカルボキサミド)安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L56)
【化６５】
2013538798.tif 000067
【０１３２】
5-(イミダゾ[1,2-a]ピリジン-2-イルカルボキサミド)-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L57)
【化６６】
2013538798.tif 000068
【０１３３】
5-[5-(2-フリル)-1,3,4-オキサジアゾール-2-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L58)
【化６７】
2013538798.tif 000069
【０１３４】
5-[1-(2-ヒドロキシエチル)インダゾール-3-イルカルボキサミド]-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L59)
【化６８】
2013538798.tif 000070
【０１３５】
8-[2-メトキシ-5-(1-メチルインダゾール-3-イルカルボキサミド)フェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクタン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L60)
【化６９】
2013538798.tif 000071
【０１３６】
8-{8-[2-メトキシ-5-(1-メチルインダゾール-3-イルカルボキサミド)フェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクタノイルアミド}-3,6-ジオキサオクタン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L61)
【化７０】
2013538798.tif 000072
【０１３７】
(S)-2,6-ビス{8-[5-(イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクタノイルアミド}ヘキサン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L62)
【化７１】
2013538798.tif 000073
【０１３８】
5-(イミダゾ[1,2-a]ピリミジン-2-イルカルボキサミド)-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L63)
【化７２】
2013538798.tif 000074
【０１３９】
(S)-1-アミノプロパン-1,3-ジカルボン酸 ビス{3-[5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]プロピル}アミド (L64)
【化７３】
2013538798.tif 000075
【０１４０】
8-{8-{5-[5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イルカルボキサミド]-2-メトキシフェニルカルボキサミド}-3,6-ジオキサオクタノイルアミド}-3,6-ジオキサオクタン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L65)
【化７４】
2013538798.tif 000076
【０１４１】
8-{8-[5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクタノイルアミド}-3,6-ジオキサオクタン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L66)
【化７５】
2013538798.tif 000077
【０１４２】
8-{8-{5-[5-(2-フリル)-1,3,4-オキサジアゾール-2-イルカルボキサミド]-2-メトキシフェニルカルボキサミド}-3,6-ジオキサオクタノイルアミド}-3,6-ジオキサオクタン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L67)
【化７６】
2013538798.tif 000078
【０１４３】
8-{8-{2-メトキシ-5-[5-(2-メチルチアゾール-4-イル)イソオキサゾール-3-イルカルボキサミド]フェニルカルボキサミド}-3,6-ジオキサオクタノイルアミド}-3,6-ジオキサオクタン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L68)
【化７７】
2013538798.tif 000079
【０１４４】
N-(8-アミノ-3,6-ジオキサオクチル)-N’-{8-[5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクチル}尿素 (L69)
【化７８】
2013538798.tif 000080
【０１４５】
イソフタル酸 N-(3-アミノプロピル)-N’-[5-(2-フリル)-1,3,4-チアジアゾール-2-イル]アミド (L70)
【化７９】
2013538798.tif 000081
【０１４６】
イソフタル酸 N-(3-アミノプロピル)-N’-(1-メチルインダゾール-3-イル)アミド (L71)
【化８０】
2013538798.tif 000082
【０１４７】
イソフタル酸 N-(3-アミノプロピル)-N’-(ベンゾチアゾール-2-イル)アミド (L72)
【化８１】
2013538798.tif 000083
【０１４８】
イソフタル酸 N-(3-アミノプロピル)-N’-(4-フェニルチアゾール-2-イル)アミド (L73)
【化８２】
2013538798.tif 000084
【０１４９】
イソフタル酸 N-(3-アミノプロピル)-N’-(5-フェニルチアゾール-2-イル)アミド (L74)
【化８３】
2013538798.tif 000085
【０１５０】
5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシ安息香酸 [3-(6-アミノヘキサノイルアミド)-1-プロピル]アミド (L75)
【化８４】
2013538798.tif 000086
【０１５１】
6-[5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]ヘキサン酸 (8-アミノ-3,6-ジオキサ-1-オクチル)アミド (L76)
【化８５】
2013538798.tif 000087
【０１５２】
8-[5-(イミダゾ-[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクタン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L77)
【化８６】
2013538798.tif 000088
【０１５３】
8-[5-(イミダゾ-[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクタン酸 (6-アミノ-1-ヘキシル)アミド (L78)
【化８７】
2013538798.tif 000089
【０１５４】
リガンド（II）の合成は、たとえば、樹脂（たとえばポリスチレン樹脂）としても知られている不溶性担体上で行うことが可能であって、この担体には、スペーサー基、たとえばFmoc保護アミノ酸をアミド生成によって結合することができる反応性基、たとえばアミノ基を有する、望ましいリンカーがあらかじめ組み込まれていることが好ましい。スペーサー基を脱保護した後、分子の残りの部分を、適当な結合形成をもたらす任意の反応、および、必要ならば、追加の合成ステップ、たとえば求核置換反応により結合させる。最終的に、スペーサー基（リンカー部分）を含むリガンドが、当業者に知られている適当な切断プロトコールで、前記不溶性担体/樹脂から遊離され、やはり当業者に知られているクロマトグラフィー法によって精製される。
【０１５５】
適当な固相合成プロトコールが特定のリガンドに適用できないならば、その代わりに合成を溶液中で行うことができる。典型的には、このような液相合成は、リガンド前駆体と適当なスペーサー基との結合反応（たとえばアミド生成）、ならびにリガンドそれ自体の構築に必要な合成ステップからなる。場合によっては、保護基は、副反応が起こらないようにするために必要である。
【０１５６】
「抗体」という用語は、免疫グロブリンを意味するが、これには天然のもの、または完全に、もしくは部分的に、合成されたものがいずれも含まれており、さらに、特異的結合活性を維持している、それらのあらゆるフラグメントおよび誘導体も含まれる。典型的なフラグメントは、Fc、Fab、重鎖、および軽鎖である。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに対して、アミノ酸配列を比較したときに、相同もしくはおおむね相同、たとえば少なくとも95%同一である結合ドメインを有する、任意のポリペプチドを含んでいる。これらのポリペプチドは、天然起源から得ることができるが、部分的に、もしくは完全に、合成によって作製してもよい。抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、ヒトもしくは非ヒト起源のものである場合もあり、キメラタンパク質である場合もあるが、この場合、ヒトFc部分はマウスFabフラグメントと融合しており（末尾に・・・ximab（・・・キシマブ）がつく治療用抗体、たとえばリツキシマブ）、または、ヒトおよびマウス配列を含むFabフラグメントと融合しており（末尾に・・・zumab（・・・ズマブ）がつく治療用抗体、たとえばベバシズマブ）、または、異なるFabフラグメントに結合している（二重特異性抗体）。抗体は、任意の免疫グロブリンクラスのメンバーとすることができるが、IgGが優先され、ヒト抗体の場合には、IgG1、IgG2、およびIgG4が優先される。
【０１５７】
本発明のもっとも好ましい実施形態において、抗体は、本発明のリガンドが抗体のFc部分に結合するとされているので、Fcフラグメントもしくはドメインを含んでいる。したがって、本発明の抗体は、免疫グロブリンクラス、好ましくはIgG、より好ましくはヒトIgG、またはヒト起源のポリクローナルもしくはモノクローナルIgG、特にIgG1、IgG2およびIgG4のFcフラグメントもしくはドメインを含有する抗体であることがもっとも好ましい。
【０１５８】
「Fc融合タンパク質」という用語は、Fcフラグメントと、1つもしくは複数のタンパク質もしくはタンパク質ドメインとの任意の組み合わせを意味する。Fc融合タンパク質の例には、ヒトIgG1 Fcドメインと可溶性受容体ドメインとのキメラ（末尾に・・・cept（・・・セプト）がつく治療用タンパク質）、たとえば、エタネルセプト（ヒトIgG1と2つの腫瘍壊死因子受容体ドメインとの組み合わせ）またはリロナセプト（インターロイキン1受容体ドメインと融合したヒトIgG1）があるがそれらに限定されない。Fc融合タンパク質は、どのような手段で作製されてもよい。たとえば、Fc融合タンパク質は、Fcフラグメントを適当なタンパク質もしくはタンパク質ドメインと結合させることによって酵素的もしくは化学的に作製することができるが、Fcおよびタンパク質/タンパク質ドメインの配列をコードする遺伝子から、組み合え技術によって作製することもできる。あるいはまた、Fc融合タンパク質は、完全に、または部分的に、合成によって作製することもできる。Fc融合タンパク質はまた、多分子複合体であってもよい。機能的なFc融合タンパク質は、典型的には、少なくとも約50アミノ酸からなり、より典型的には、少なくとも約200アミノ酸からなるものである。
【０１５９】
本発明は、本明細書の他の箇所に記載の式（I）のアフィニティリガンドならびにその好ましい実施形態を使用して、たとえば発酵上清、またはヒトもしくは動物起源の血漿といった複雑な混合物から、抗体もしくはFc融合タンパク質を、好ましくはアフィニティクロマトグラフィーによって、アフィニティ精製するために作成される。
【０１６０】
したがって、好ましい実施形態において、本発明は、タンパク質、好ましくは免疫グロブリンまたはFc融合タンパク質を、アフィニティ精製、好ましくはアフィニティクロマトグラフィーで精製するための方法を含む。本発明のアフィニティリガンドは、抗体のFc領域に結合する。
【０１６１】
ベバシズマブ（アバスチン（Avastin）(登録商標）、Genentech/Roche)は、ヒト化モノクローナル抗体である。これは、新生血管形成（血管新生）を促進するタンパク質である血管内皮細胞増殖因子A（VEGF-A）の機能を標的として阻害することで新生血管の形成を妨げることによって、腫瘍の増殖を止める。
【０１６２】
トシリズマブ（アクテムラ（RoActemra）（登録商標）、Genentech/Roche）は、ヒト化モノクローナル抗体である。これは、インターロイキン6受容体に対するものであって、炎症性サイトカインであるインターロイキン6の作用を阻害する。これは関節リウマチの治療のために認可されている。
【０１６３】
パリビズマブ（シナジス（Synagis）（登録商標）、Abbott）は、RSウイルス（RSV）Fタンパク質のAエピトープに対するヒト化モノクローナル抗体である。これは、RSV感染の予防に使用される。
【０１６４】
免疫グロブリンをFc部分によってアフィニティ精製するための、記載されたリガンドが、あらゆる状況で適用可能であることを実証するために、ヒトおよびウサギポリクローナルIgGを調べる。
【０１６５】
本発明を実施する場合、一般式（I）のリガンドは、適当な支持体材料の支持マトリックスに結合されて、結果としてリガンド置換マトリックスを生じるが、これは典型的にはタンパク質分離のためのアフィニティ精製、好ましくはアフィニティクロマトグラフィー用のマトリックスである（本発明の文脈においてアフィニティマトリックスとも称される）。一般式のリガンドは、Lで支持マトリックスに連結されるが、これはスペーサー -Sp-を含んでいてもよい。
【０１６６】
したがって、本発明は、タンパク質分離のためのリガンド置換マトリックス（アフィニティマトリックス）を含んでいるが、これは支持体材料および、本明細書上記に記載の少なくとも1つのリガンドを含んでなり、このリガンドはLによってそれに結合している。
【０１６７】
支持マトリックス（Mと称することもある）は、当業者に知られている任意の適当な支持体材料を含有することができる。その材料は、可溶性もしくは不溶性で、粒子状もしくは非粒子状であって、あるいは繊維および膜などの一体構造のものであってもよく、多孔性もしくは無孔性とすることができる。それは、接触している溶液中の溶質から、本発明のリガンドを分離する、簡便な手段を提供する。支持マトリックスの例には、炭水化物および架橋炭水化物マトリックス、たとえばアガロース、セファロース、セファデックス、セルロース、デキストラン、デンプン、アルギン酸塩およびカラギーナン；合成ポリマーマトリックス、たとえばポリスチレン、スチレン-ジビニルベンゼンコポリマー、ポリアクリレート、PEGポリアクリレートコポリマー、ポリメタクリレート（たとえばポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、ポリアミド、もしくはパーフルオロカーボン；無機マトリックス、たとえばガラス、シリカもしくは金属酸化物；ならびに複合材料がある。
【０１６８】
アフィニティマトリックスは、適当な支持体材料の支持マトリックスを提供すること、ならびに、それに式（I）のリガンドを結合することによって調製される。リガンド（I）を支持体材料に結合するための方法は、当業者に知られている。
【０１６９】
本発明はまた、精製すべきタンパク質を上記リガンド置換マトリックスと接触させる、タンパク質のアフィニティ精製、好ましくはアフィニティクロマトグラフィーの方法に関する。
【０１７０】
「アフィニティ精製」という用語（「アフィニティ分離」という用語と区別せずに使用される）は、式（I）のリガンドによるタンパク質の分子認識を伴う、任意の分離技術を表す。リガンドは、後にリガンド-抗体複合体の分離を容易にする、固体担体上に固定化されていてもよい。分離技術には、充填カラム、一体構造物、もしくは膜でのアフィニティクロマトグラフィーが挙げられるがそれに限定されない。この用語にはさらに、バッチモードでの吸着、またはアフィニティ沈殿が含まれる。
【０１７１】
特徴とは無関係に、精製技術は、リガンドが粗製抗体と接触する最初の認識段階によって構成される。第２段階では、不純物がリガンド-抗体複合体から分離されるか（たとえば、カラムクロマトグラフィー）、またはリガンド-抗体複合体が不純物から分離される（たとえば、アフィニティ沈殿）。第３段階で、抗体は、化学的および/または物理的条件の変更、たとえば、pH、イオン強度の変化、および/または有機溶媒、界面活性剤もしくはカオトロープのようなモディファイアーの添加によって、リガンド-抗体複合体から遊離される。
【０１７２】
本発明は下記の実施例によって説明されるが、それらは本発明を限定すると考えられるべきでない。
【０１７３】
本明細書に引用された文献：
1.  A.Cecilia, A.Roque, C.R. Lowe, M.A. Taipa: Antibodies and Genetically Engineered  Related Molecules: Production and Purification,  Biotechnol. Prog. 2004, 20, 639-654
2.  K.L.Carson: Flexibility-the guiding principle for antibody manufacturing, Nature Biotechnology, 2005, 23, 1054-1058; S.Hober, K.Nord, M. Linhult: Protein A chromatography for antibody purification, J. Chromatogr. B. 2007, 848, 40-47
3.  T.Arakawa, Y.Kita, H.Sato, D. Ejima, Protein Expression and Purification. 2009, 63, 158-163
4.  S. Ghose, B. Hubbard, S.M. Cramer, Journal of Chromatography A, 2006, 1122, 144-152。
【０１７４】
（実施例）
材料および方法
特に指示のない限り、すべての化学物質および溶媒は、実施例２を除いて、分析グレードとした。実施例２に使用された試薬は、粒子の必要条件および入手しやすさに応じて、調製用から分析用のグレードとした。
【０１７５】
平均孔径0.45μmの親水性メンブランフィルターを有する96および384ウェルフィルタープレートは、Pall GmbH (Dreieich/Germany)から購入した。平均孔径10μmのポリエチレン製の上部フリットは、Porex (Bautzen/Germany)によって供給された。画分の収集および分析アッセイ用の多目的マイクロタイタープレートは、Greiner Bio One GmbH (Frickenhausen/Germany)に注文した。分析アッセイは、BMG Labtech GmbH (Offenburg/Germany)製のFluostar Galaxyプレートリーダーを使用して読み取りを行った。
【０１７６】
抗体によるカラムクロマトグラフィーおよび抗体フラグメントの精製は、Waters HPLCシステムで行った（Waters GmbH, Eschborn/Germany）。カラムの充填のためにOmnifitカラムハウジング（Diba Industries Ltd, Cambridge/United Kingdom）を使用した。NHS-活性化セファロース4 FF（NMS-activated Sepharose 4 FF）、組換えプロテインAセファロースFF（rProtein A Sepharose FF）およびスーパーデックス70（Superdex 70）クロマトグラフィー媒体は、GE Healthcare (Uppsala/Sweden)から購入した。マブゾーベント（Mabsorbent）A2P HFはPrometic Life Sciences (Cambridge/United Kingdom)から購入し、MEPハイパーセル（Hypercel）はPall Corporation (Port Washington NY, USA)から購入した。
【０１７７】
リガンドの分析用クロマトグラフィーは、ダイオードアレイ検出器およびシングル四重極質量分析計を含めたShimazu HPLCシステム（Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg/Germany）で行った。一体型C18逆相カラムは、Merck KGaA (Darmstadt/Germany)から購入した。分析に使用した溶媒は、質量分析グレードとした。
【０１７８】
本発明で使用した抗体は、ベバシズマブ（Bevacizumab）（アバスチン（Avastin）、F. Hoffmann-La Roche, Switzerland）、トシリズマブ（Tocilizumab）（アクテムラ（RoActemra）、F. Hoffmann-La Roche, Switzerland）、パリビズマブ（Palivizumab）（シナジス（Synagis）、Abbott, USA）、ヒト血清由来ポリ-IgG（Sigma-Aldrich, USA）およびウサギ血清由来ポリ-IgG（Sigma-Aldrich, USA）である。抗体フラグメントを調製するための固定化パパインはThermo Scientific (Bonn/Germany)から購入した。
【０１７９】
プロテインAクロマトグラフィーからの素通り画分（宿主細胞タンパク質とされる）は、無血清培地での抗体産生CHO細胞培養物の上清から得られた。
【０１８０】
ブラッドフォードアッセイ用のクマシーブリリアントブルー染色試薬は、Thermo Scientific (Bonn/Germany)から購入した。
【実施例１】
【０１８１】
化合物マイクロアレイのSPRスクリーニング
Graffinity社は、金チップ上に固定化された数千個の低分子を含有する高密度化合物マイクロアレイを開発した。このアレイは、高密度ピンツールスポッティングと組み合わせてマレイミド-チオールカップリング反応によって構築される。構築のために、アレイあたり最大9,216個のセンサーフィールドの境界を画定するため、フォトリソグラフィー法でガラスプレートを微小構築する。その後に適用される金コーティングは、SPR効果に基礎を与え、2つの異なるチオールの２成分混合の自己組織化単分子層（SAM）の形成を可能にする。一方のチオールは、反応性マレイミド部分を示し、チオール標識アレイ化合物はピンツールスポッティング時に、これに対してカップリングすることができる。得られたマイクロアレイは、9，216個のセンサーフィールドを有し、それぞれが品質管理された規定のアレイ化合物の多重コピーを含有する。
【０１８２】
表面プラズモンは、金属表面での電子の集団振動であって、それは適当な波長および入射角の偏光によって共鳴励起することができる。表面プラズモン共鳴条件で、金チップから反射される光強度は、急激な減衰を示す（SPR極小値）。この反射率極小値の角度および波長のポジションは、金属表面に隣接する媒体の屈折率に強く左右される。したがって、金属表面にごく近接した局所的な屈折率を変化させるプロセス（たとえば、固定化リガンドへの抗体結合）を敏感にモニターすることができる。SPR検出のために、最適化されたスクリーニング条件下で、化合物マイクロアレイを標的タンパク質とともにインキュベートする。標的が固定化フラグメントに結合したら、バッファー対照に対して、SPR極小値に応じた波長のシフト（SPRシフトと称される）が起こるので、タンパク質-リガンド相互作用が示される。SPRイメージングアプローチは、固定角でマイクロアレイセンサー全体を照射するために、平行光の拡大ビームを利用する。次に、反射光をCCDカメラを用いて捕捉する。SPR共鳴条件をカバーする波長の範囲にわたって、スキャンする一方で、反射像を段階的に記録する。得られた画像の、自動化されたスポット発見手順およびその後のグレースケール解析によって、チップ当たり9,216個のセンサーフィールドすべてのSPR共鳴曲線が、同時並行で導き出される。
【０１８３】
抗体およびそのフラグメントのSPRによるスクリーニング
プラットフォームは、タンパク質、抗体およびその断片を110，000個の小分子のGraffinity固定化化合物ライブラリーに対して、高速大量にスクリーニングすることを可能にした。それぞれの標的に関して、ライブラリー全体に対して標的をスクリーニングする前に、SPRスクリーニング条件を個別に最適化した。そのように最適化されたスクリーニングパラメーターの中には、a)適当な界面活性剤を含むスクリーニングバッファーの組成、b)抗体もしくはタンパク質標的の溶液中の濃度、ならびにc)チップ表面上に固定化されたリガンドの表面密度、があった。Neumannら（1）は、スクリーニングされた標的、ならびに適用された対応するスクリーニング条件をまとめている。全部で4つの異なる全長抗体をスクリーニングして比較した。それに加えて、2つの抗体のFcおよびFabフラグメントが、タンパク質分解によって得られ、同様にアレイスクリーニングに供された。抗体特異的リガンドを同定するために、一連のスクリーニングには、抗体を含まないCHO細胞株の宿主細胞タンパク質（HCP）も対照として含めた。
【０１８４】
一連のマイクロアレイスクリーニングの実験結果は、社内で開発したソフトウェアルーチンを用いた手動ヒット選択、ならびに市販のデータマイニングツールによる掘り下げたデータ解析によって、分析した。分析の結果、抗体およびそのFcフラグメントに対して明確な結合を示すがHCP対照にたいしては弱いか無視できるほどわずかな結合しか示さない、いくつかのヒットシリーズが得られた。このような一次ヒットシリーズを、二次アッセイでヒットの確認のために使用し、一次ヒットを中心とする集中的なライブラリーを合成するための出発点として使用することができた。たとえば、Fc特異的リガンドL1は、全長ベバシズマブおよびそのFcフラグメントに対して明確な結合を示したが、ベバシズマブFabフラグメントに対しては少しの結合しか示さなかった。その上、それは、他の全長抗体抗RhD IgG、トシリズマブ、およびパリビズマブと明確に結合した。
【実施例２】
【０１８５】
リガンド合成
基本手順A：5-アリールカルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド（L1, L2, L3, L6, L8, L7, L15, L16, L5, L11, L20, L27, L25, L4, L26, L31, L32, L33, L34, L35, L36, L42, L44, L45, L46, L47, L48, L51, L56, L57, L63）
N-Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（0.2-0.5 mmol）およびHOAt（カルボン酸に対して１当量）をDMF、NMP、DMF/DMSOまたはNMP/DMSO混合物（1-3 mL）中に溶解し、DIC（カルボン酸に対して１当量）で処理した。2-5分間撹拌後、その混合物を、トリチルポリスチレン樹脂もしくは2-クロロトリチルポリスチレン樹脂と結合した0.1-0.15 mmolの1,3-ジアミノプロパンに添加した。混合物は数時間または一晩振盪した。次に、樹脂を洗浄し（DMFもしくはDMF、ジクロロメタンもしくはDMF、メタノール、ジクロロメタン、各溶媒数回）、DMF中25%ピペリジン（1-5 mL）で15-30分間処理した。その後、樹脂を完全に洗浄し（DMF、ジクロロメタンもしくはDMF、メタノール、ジクロロメタン、各溶媒数回）、窒素気流下または高真空で風乾した。
【０１８６】
アリールカルボン酸（0.2-0.5 mmol）およびHOAt（カルボン酸に対して１当量）をDMF、NMP、DMF/DMSOまたはNMP/DMSO混合物（1-3 mL）中に溶解し、DIC（カルボン酸に対して１当量）で処理した。2-5分間撹拌後、その混合物を樹脂に添加し、数時間または一晩振盪した。その後洗浄した後（DMF、ジクロロメタンもしくはDMF、メタノール、ジクロロメタン、各溶媒数回）、適当な切断混合物（トリチル樹脂用には、ジクロロメタン、TFA、トリエチルシラン85:10:5、2-クロロトリチル樹脂用には45:45:10）で処理することによって、標的化合物を担体から切断した。典型的には、切断ステップを１回繰り返し、その後樹脂をジクロロメタンですすいだ。溶媒を蒸発させた後、粗製残渣を調製用逆相HPLCで精製した。
【０１８７】
アミドカップリング化学の高いロバスト性に関して、他のカップリングプロトコールを、同等もしくは同一の結果で適用することができる。具体的には、TBTUまたはHATUカップリング（カルボン酸に対して１当量；追加して２当量のDIPEAを添加しなくてはならない）は、DIC/HOAtカップリングに対する信頼性のある代替法にあたり、これはより速く進行する（典型的な反応時間：30分から3時間）；しかしながら、一部のカルボン酸、特にインドールもしくは（ベンゾ）ピラゾールのような遊離アリールNHを有するカルボン酸については、塩基性条件下のカップリングは、望ましくない副生成物をもたらす可能性がある。
【０１８８】
5-[5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L1)
【化８８】
2013538798.tif 000090
【０１８９】
基本手順Aにしたがって5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 398 (M+1)。
【０１９０】
5-[5-(4-ブロモ-2-チエニル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L2)
【化８９】
2013538798.tif 000091
【０１９１】
基本手順Aにしたがって5-(4-ブロモ-2-チエニル)-1-メチルピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 493, 495 (M+1)。
【０１９２】
5-[5-(2,5-ジメチル-3-チエニル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L3)
【化９０】
2013538798.tif 000092
【０１９３】
基本手順Aにしたがって5-(2,5-ジメチル-3-チエニル)-1-メチルピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 442 (M+1)。
【０１９４】
2-メトキシ-5-[1-メチル-5-(2-チエニル)ピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L6)
【化９１】
2013538798.tif 000093
【０１９５】
基本手順Aにしたがって1-メチル-5-(2-チエニル)ピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 414 (M+1)。
【０１９６】
2-メトキシ-5-[1-メチル-5-(3-チエニル)ピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L8)
【化９２】
2013538798.tif 000094
【０１９７】
基本手順Aにしたがって1-メチル-5-(3-チエニル)ピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 414 (M+1)。
【０１９８】
5-[5-(3-クロロフェニル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L7)
【化９３】
2013538798.tif 000095
【０１９９】
基本手順Aにしたがって5-(3-クロロフェニル)-1-メチルピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 442, 444 (M+1)。
【０２００】
2-メトキシ-5-(1-メチル-5-フェニルピラゾール-3-イル)カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L15)
【化９４】
2013538798.tif 000096
【０２０１】
基本手順Aにしたがって1-メチル-5-フェニルピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 408 (M+1)。
【０２０２】
2-メトキシ-5-[5-(1-メチル-2-ピロリル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L16)
【化９５】
2013538798.tif 000097
【０２０３】
基本手順Aにしたがって5-(1-メチル-2-ピロリル)-1-メチルピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 411 (M+1)。
【０２０４】
2-メトキシ-5-[3-(2-チエニル)ピリジン-5-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L5)
【化９６】
2013538798.tif 000098
【０２０５】
基本手順Aにしたがって3-(2-チエニル)ピリジン-5-カルボン酸から調製。ESI-MS: 411 (M+1)。
【０２０６】
2-メトキシ-5-(3-フェニルピリジン-5-イル)カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L11)
【化９７】
2013538798.tif 000099
【０２０７】
基本手順Aにしたがって3-フェニルピリジン-5-カルボン酸から調製。ESI-MS: 405 (M+1)。
【０２０８】
5-[5-(2-フリル)ピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L20)
【化９８】
2013538798.tif 000100
【０２０９】
基本手順Aにしたがって5-(2-フリル)ピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 384 (M+1)。
【０２１０】
2-メトキシ-5-(1-メチルインダゾール-3-イル)カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L27)
【化９９】
2013538798.tif 000101
【０２１１】
基本手順Aにしたがって1-メチルインダゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 382 (M+1)。
【０２１２】
2-メトキシ-5-(1-メチルインドール-3-イル)カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L25)
【化１００】
2013538798.tif 000102
【０２１３】
基本手順Aにしたがって1-メチルインドール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 381 (M+1)。
【０２１４】
5-(5-クロロ-1H-インダゾール-3-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L4)
【化１０１】
2013538798.tif 000103
【０２１５】
基本手順Aにしたがって5-クロロ-1H-インダゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 402, 404 (M+1)。
【０２１６】
5-(インドール-3-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L26)
【化１０２】
2013538798.tif 000104
【０２１７】
基本手順Aにしたがってインドール-3-カルボン酸から調製。インドール-3-カルボン酸を、HOBt（１当量）およびDIC（１当量、カルボン酸に対して）で活性化することによってカップリングした；カップリング時間：１時間。ESI-MS: 367 (M+1)。
【０２１８】
5-(ベンゾ[c]イソオキサゾール-3-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L31)
【化１０３】
2013538798.tif 000105
【０２１９】
基本手順Aにしたがってベンゾ[c]イソオキサゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 369 (M+1)。
【０２２０】
5-(ベンゾ[c]フラン-1-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L32)
【化１０４】
2013538798.tif 000106
【０２２１】
基本手順Aにしたがってベンゾ[c]フラン-1-カルボン酸から調製。ESI-MS: 368 (M+1)。
【０２２２】
5-(1,5-ジメチルピラゾール-3-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L33)
【化１０５】
2013538798.tif 000107
【０２２３】
基本手順Aにしたがって1,5-ジメチルピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 346 (M+1)。
【０２２４】
2-メトキシ-5-[1-メチル-5-(トリフルオロメチル)ピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L34)
【化１０６】
2013538798.tif 000108
【０２２５】
基本手順Aにしたがって1-メチル-5-(トリフルオロメチル)ピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 400 (M+1)。
【０２２６】
5-(1-イソキノリニル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L35)
【化１０７】
2013538798.tif 000109
【０２２７】
基本手順Aにしたがってイソキノリン-1-カルボン酸から調製。ESI-MS: 379 (M+1)。
【０２２８】
5-(インダゾール-3-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L36)
【化１０８】
2013538798.tif 000110
【０２２９】
基本手順Aにしたがってインダゾール-3-カルボン酸から調製。インダゾール-3-カルボン酸を、HOBt（１当量）およびDIC（１当量、カルボン酸に対して）で活性化することによってカップリングした；カップリング時間：１時間。ESI-MS: 368 (M+1)。
【０２３０】
2-メトキシ-5-[5-(2-メチルチアゾール-4-イル)イソオキサゾール-3-イルカルボキサミド]安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L42)
【化１０９】
2013538798.tif 000111
【０２３１】
基本手順Aにしたがって5-(2-メチルチアゾール-4-イル)イソオキサゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 416 (M+1)。
【０２３２】
2-メトキシ-5-(1-メチルピラゾロ[3,4-b]ピリジン-3-イルカルボキサミド)安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L44)
【化１１０】
2013538798.tif 000112
【０２３３】
基本手順Aにしたがって1-メチルピラゾロ[3,4-b]ピリジン-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 383 (M+1)。
【０２３４】
5-[5-(2-フリル)イソオキサゾール-3-イルカルボキサミド]-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L45)
【化１１１】
2013538798.tif 000113
【０２３５】
基本手順Aにしたがって5-(2-フリル)イソオキサゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 385 (M+1)。
【０２３６】
2-メトキシ-5-(ピラゾロ[1,5-a]ピリジン-2-イルカルボキサミド)安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L46)
【化１１２】
2013538798.tif 000114
【０２３７】
基本手順Aにしたがってピラゾロ[1,5-a]ピリジン-2-カルボン酸から調製。ESI-MS: 368 (M+1)。
【０２３８】
5-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イルカルボキサミド)-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L47)
【化１１３】
2013538798.tif 000115
【０２３９】
基本手順Aにしたがって1H-ベンゾイミダゾール-2-カルボン酸から調製。ESI-MS: 368 (M+1)。
【０２４０】
5-(イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-イルカルボキサミド)-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L48)
【化１１４】
2013538798.tif 000116
【０２４１】
基本手順Aにしたがってイミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボン酸から調製。ESI-MS: 369 (M+1)。
【０２４２】
2-メトキシ-5-(3-フェニルイソオキサゾール-5-イルカルボキサミド)安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L51)
【化１１５】
2013538798.tif 000117
【０２４３】
基本手順Aにしたがって3-フェニルイソオキサゾール-5-カルボン酸から調製。ESI-MS: 395 (M+1)。
【０２４４】
2-メトキシ-5-(ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-2-イルカルボキサミド)安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L56)
【化１１６】
2013538798.tif 000118
【０２４５】
基本手順Aにしたがってピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-2-カルボン酸から調製。ESI-MS: 369 (M+1)。
【０２４６】
5-(イミダゾ[1,2-a]ピリジン-2-イルカルボキサミド)-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L57)
【化１１７】
2013538798.tif 000119
【０２４７】
基本手順Aにしたがってイミダゾ[1,2-a]ピリジン-2-カルボン酸 臭化水素酸塩から調製。HATU/DIPEAを用いてカルボン酸 臭化水素酸塩をカップリングさせるとき追加の1当量のDIPEAを添加した。ESI-MS: 368 (M+1)
5-(イミダゾ[1,2-a]ピリミジン-2-イルカルボキサミド)-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L63)
【化１１８】
2013538798.tif 000120
【０２４８】
基本手順Aにしたがってイミダゾ[1,2-a]ピリミジン-2-カルボン酸から調製。ESI-MS: 369 (M+1)。
【０２４９】
基本手順B：鈴木カップリングによる5-[3-(アリールまたはシクロプロピル)ピリジン-5-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミドの合成（L12, L13, L14, L22, L23）
0.1 mmolの1,3-ジアミノプロパン-トリチル-ポリスチレン樹脂に、N-Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸および5-ブロモピリジン-3-カルボン酸を、基本手順Aにしたがってカップリングさせた。その結果得られた、ブロモピリジンカルボン酸アミドの結合した樹脂を完全に乾燥させ、ガラス製バイアルに移した。炭酸セシウムもしくは炭酸カリウム（0.3 mmol）、およびそれぞれのボロン酸（1 mmol）を添加後、無水DMF（1 mL）を添加し、混合物をアルゴンで十分に洗い流した。その後、テトラキス-トリフェニルホスフィンパラジウム（0）（10μmol）を添加し、その混合物を再びアルゴンで洗い流して、バイアルをしっかりと密閉した。混合物を100℃に加熱し、一晩振盪した。その後、樹脂を完全に洗浄し（DMF、ジクロロメタン、各溶媒数回）、小量のサンプルを切断した（条件、下記を参照されたい）。LCMSが不完全な変換を示した場合、カップリングステップを繰り返すか、またはもっと高い温度で実施した。そうでなければ、樹脂をジクロロメタン-TFA-トリエチルシラン85:10:5で処理し（2回切断）、次に樹脂をジクロロメタンですすいだ。蒸発乾固した後、残渣を調製用逆相HPLCで精製した。
【０２５０】
2-メトキシ-5-{3-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]ピリジン-5-イル}カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L12)
【化１１９】
2013538798.tif 000121
【０２５１】
基本手順Bにしたがって4-(トリフルオロメチル)フェニルボロン酸から調製。ESI-MS: 473 (M+1)。
【０２５２】
5-[3-(2-フリル)ピリジン-5-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L13)
【化１２０】
2013538798.tif 000122
【０２５３】
基本手順Bにしたがって2-フリルボロン酸から調製。ESI-MS: 395 (M+1)。
【０２５４】
5-[3-(2-ベンゾチエニル)ピリジン-5-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L14)
【化１２１】
2013538798.tif 000123
【０２５５】
基本手順Bにしたがって2-ベンゾチエニルボロン酸から調製。ESI-MS: 461 (M+1)。
【０２５６】
5-[3-(3-フリル)ピリジン-5-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L22)
【化１２２】
2013538798.tif 000124
【０２５７】
基本手順Bにしたがって3-フリルボロン酸から調製。ESI-MS: 395 (M+1)。
【０２５８】
5-(3-シクロプロピルピリジン-5-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L23)
【化１２３】
2013538798.tif 000125
【０２５９】
基本手順Bにしたがってシクロプロピルボロン酸から調製。ESI-MS: 369 (M+1)。
【０２６０】
5-(3-エチニルピリジン-5-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L24)
【化１２４】
2013538798.tif 000126
【０２６１】
0.1 mmolの1,3-ジアミノプロパン-トリチル-ポリスチレン樹脂に、N-Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸および5-ブロモピリジン-3-カルボン酸を、基本手順Aにしたがってカップリングさせた。その結果得られた、ブロモピリジンカルボン酸アミドの結合した樹脂を完全に乾燥させて、ガラス製バイアルに移した。塩化銅（I）（40μmol）、トリフェニルホスフィン（40μmol）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）二塩化物（10μmol）、およびTHF（1 mL）を添加し、混合物をアルゴンで洗い流した。次に、トリメチルシリルアセチレン（1 mmol）およびトリエチルアミン（0.5 mL）を添加し、混合物を再びアルゴンで洗い流した後、バイアルをしっかり密閉し、50℃で一晩振盪した。その後、樹脂をDMFおよびジクロロメタンで完全に洗浄した（各溶媒数回）。TMS脱保護のために、THF（1 mL）および水（50μL）を添加し、次にフッ化テトラブチルアンモニウム（1 M溶液、THF中、0.5 mL）を添加した。混合物を2時間撹拌した後、樹脂をDMFおよびジクロロメタンで洗浄した（各溶媒数回）。樹脂からの標的化合物の切断は、ジクロロメタン-TFA-トリエチルシラン85:10:5（2回切断）で処理することによって実施され、続いてジクロロメタンで洗浄した。蒸発乾固した後、残渣を調製用逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 353 (M+1)。
【０２６２】
基本手順C：5-[5-(2-チエニルまたは2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミドアリール カルボン酸 N-(3-アミノプロピル)アミドの合成(L19, L9, L10, L17, L18)
それぞれの（N-Fmoc保護）アミノアリールカルボン酸（0.2-0.5 mmol）およびHOAt（カルボン酸に対して１当量）をDMF、NMP、DMF/DMSO、またはNMP/DMSO混合物（1-3 mL）に溶解し、DIC（カルボン酸に対して１当量）で処理した。2-5分間撹拌した後、混合物を、トリチル-ポリスチレン樹脂または2-クロロトリチルポリスチレン樹脂に結合した0.1-0.15 mmol 1,3-ジアミノプロパンに添加した。混合物を数時間もしくは一晩振盪した。次に、樹脂を洗浄し（DMFもしくはDMF、ジクロロメタンもしくはDMF、メタノール、ジクロロメタン、各溶媒数回）、DMF中25%ピペリジン（1-5 mL）で15-30分間処理した。その後、樹脂を完全に洗浄し（DMF、ジクロロメタンもしくはDMF、メタノール、ジクロロメタン、各溶媒数回）、窒素気流もしくは高真空で風乾した。
【０２６３】
1-メチル-5-(2-チエニル)ピラゾール-3-カルボン酸または5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-カルボン酸（0.2-0.5 mmol）、およびHOAt（カルボン酸に対して１当量）を、DMF、NMP、DMF/DMSO、もしくはNMP/DMSO混合物（1-3 mL）に溶解し、DIC（カルボン酸に対して１当量）で処理した。2-5分間撹拌した後、混合物を樹脂に添加し、数時間もしくは一晩振盪した。続いて洗浄した後（DMF、ジクロロメタンもしくはDMF、メタノール、ジクロロメタン、各溶媒数回）、適当な切断混合物（トリチル樹脂用にはジクロロメタン、TFA、トリエチルシラン85:10:5、2-クロロトリチル樹脂用には45:45:10）で処理することによって、標的化合物を担体から切断した。典型的には、切断ステップはもう1回繰り返し、次いで樹脂をジクロロメタンですすいだ。溶媒を蒸発させた後、粗製残渣を調製用逆相HPLCで精製した。
【０２６４】
2-[1-メチル-5-(2-チエニル)ピラゾール-3-イル]カルボキサミドチアゾール-4-カルボン酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L19)
【化１２５】
2013538798.tif 000127
【０２６５】
基本手順CにしたがってN-Fmoc-2-アミノチアゾール-4-カルボン酸および1-メチル-5-(2-チエニル)ピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 391 (M+1)。
【０２６６】
2-メチル-3-[1-メチル-5-(2-チエニル)ピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L9)
【化１２６】
2013538798.tif 000128
【０２６７】
基本手順CにしたがってN-Fmoc-3-アミノ-2-メチル安息香酸および1-メチル-5-(2-チエニル)ピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 398 (M+1)。
【０２６８】
4-メチル-3-[1-メチル-5-(2-チエニル)ピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L10)
【化１２７】
2013538798.tif 000129
【０２６９】
基本手順CにしたがってN-Fmoc-3-アミノ-4-メチル安息香酸および1-メチル-5-(2-チエニル)ピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 398 (M+1)。
【０２７０】
3-[5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L17)
【化１２８】
2013538798.tif 000130
【０２７１】
基本手順CにしたがってN-Fmoc-3-アミノ安息香酸および5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 368 (M+1)。
【０２７２】
4-[5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L18)
【化１２９】
2013538798.tif 000131
【０２７３】
基本手順CにしたがってN-Fmoc-4-アミノ安息香酸および5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-カルボン酸から調製。ESI-MS: 368 (M+1)。
【０２７４】
3-{N-[5-(2-フリル)ピラゾール-3-イル]カルバモイル}安息香酸 N’-(3-アミノプロピル)アミド (L21)
【化１３０】
2013538798.tif 000132
【０２７５】
1,3-ジアミノプロパン-トリチル樹脂（0.1 mmol）をジクロロメタン中で膨潤し、過剰量のDIPEAおよびm-ベンゼンジカルボン酸ジクロリドで処理した。数分後、樹脂をすばやくジクロロメタンで洗浄し（3回）、ただちにNMP中、過剰量の3-アミノ-5-(2-フリル)ピラゾールおよびDIPEAで処理した。切断された（条件、下記参照）小量の樹脂サンプルのLCMSが完全な変換を示したら、樹脂を洗浄し（DMF、ジクロロメタン、各溶媒数回）、ジクロロメタン-TFA-トリエチルシランで処理した（85:10:5；2回切断、続いてジクロロメタンで樹脂をすすいだ）。切断溶液を蒸発させて乾固した後、残渣を調製用逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 354 (M+1)。
【０２７６】
5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イル)カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L37)
【化１３１】
2013538798.tif 000133
【０２７７】
1,3-ジアミノプロパン-トリチル樹脂（0.15 mmol）をNMP中であらかじめ膨潤した。N-Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（0.2 mmol）およびHATU（0.2 mmol）をNMP（1.5 mL）に溶解し、DIPEA（0.4 mmol）で処理した。2分後、その溶液を樹脂に加え、反応混合物を30分間振盪した。樹脂をDMFで（3回）洗浄した後、DMF中25%ピペリジンを添加して30分間振盪を続けた。次に、樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで完全に洗浄し（各溶媒3回）、風乾した。
【０２７８】
イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-カルボン酸 臭化水素酸塩（0.2 mmol）およびHATU（0.2 mmol）をNMP（1.5 mL）中に溶解もしくは懸濁し、DIPEA（0.8 mmol）で処理した。2分後、その溶液を樹脂に添加し、一晩振盪した。樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各溶媒3回）後、ジクロロメタン-TFA-トリエチルシラン85:10:5で処理することによって、標的化合物を樹脂から切断し（2回切断）、次にジクロロメタンですすいだ。蒸発乾固した後、残渣を調製用逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 374 (M+1)。
【０２７９】
5-[5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)-N-メチルアミド (L28)
【化１３２】
2013538798.tif 000134
【０２８０】
2-クロロトリチルクロリド樹脂（150μmol）をNMP中であらかじめ膨潤し、NMP（1.5 mL）で処理した後、3-アミノプロパノール（1.5 mL）で処理した。樹脂を2時間振盪した後、DMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄し（各溶媒数回）、風乾した。次に、ジクロロメタン（2 mL）およびDIPEA（2 mmol）を加え、続いてメタンスルホン酸クロリド（1 mmol）を滴加した。樹脂を2時間撹拌した後、ジクロロメタンですばやく洗浄し（3回）、NMP（1 mL）中で膨潤させた。メチルアミン溶液（エタノール中8M、1 mL）の添加後、樹脂を一晩振盪し、次いでそれをDMF、メタノール、およびジクロロメタン（各溶媒数回）で洗浄し風乾した。
【０２８１】
N-Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（250μmol）およびHOAt（250μmol）をNMP（約1.5 mL）中に溶解し、DIC（250μmol）で処理した。2分後、溶液を樹脂に加え、5時間振盪した。DMFおよびジクロロメタンで洗浄した（各溶媒数回）後、樹脂をDMF中25%ピペリジンで処理した（30分、続いて前記のように洗浄した）。
【０２８２】
5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-カルボン酸（250μmol）およびHOAt（250μmol）をNMP（約1.5 mL）中に溶解し、DIC（250μmol）で処理した。2分後、溶液を樹脂に添加し、一晩振盪した。その後、樹脂を上記のように洗浄し、ジクロロメタン-TFA-トリエチルシラン45:45:10で処理することによって樹脂から標的化合物を切断した（2回切断）後、ジクロロメタンですすいだ。蒸発乾固した後、残渣を調製用逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 412 (M+1)。
【０２８３】
5-[5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-エトキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L29)
【化１３３】
2013538798.tif 000135
【０２８４】
5-ニトロサリチル酸（0.3 mmol）およびHOBt（0.3 mmol）をDMSO（約1.5 mL）中に溶解し、DIC（0.3 mmol）で処理した。2分後、溶液を1,3-ジアミノプロパン-トリチル樹脂（0.15 mmol）に添加し、1時間振盪し、それから樹脂をDMF、水、薄い炭酸ナトリウム溶液、水、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各溶媒数回）。小量の樹脂サンプルを塩化ベンゾイルおよびDIPEAで処理し、洗浄して切断し（条件、下記参照）、得られた生成物をHPLC-MSで分析したが、不完全なローディングを示した。したがって、カップリングステップを再度30分間行った。その間に形成された全量のカルバモイルーニトロフェニルエステルを加水分解するために、次にその樹脂をTHF（1 mL）、メタノール（0.5 mL）およびNaOH水溶液（1 M、0.5 mL）で5分間処理したが、上清が黄色に変わることでエステル加水分解がうまくいったことが示された。DMF、メタノールおよびジクロロメタンで洗浄（各溶媒3回）後、DMSO（2 mL）、炭酸セシウム（1 mmol）、および臭化エチル（1 mmol）を加え、樹脂を約2時間振盪した後、その反応を再度一晩行った（水0.2 mLを添加して炭酸塩を溶解した）。変換がまだ不十分であったので、0.5 mL臭化エチルおよび水（0.2 mL）を用いて反応を繰り返して、3日後に十分な反応進行をもたらし、その後、樹脂をDMF、水、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各溶媒数回）。
【０２８５】
NMP（1 mL）、ピリジン（0.5 mL）、および塩化スズ(II)（1 mmol）のNMP溶液（1 mL）を添加してニトロ基を還元した。混合物を一晩振盪した後、樹脂をDMF、水、およびメタノールで洗浄し、メタノール中での浮選によって不溶性副生成物を注意深く除去した。ジクロロメタンによる洗浄後、樹脂を乾燥した。
【０２８６】
5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-カルボン酸（0.25 mmol）およびHOAt（0.25 mmol）をNMP（約1.5 mL）中に溶解し、DIC（0.25 mmol）で処理した。2分後、その溶液を樹脂に添加し、一晩振盪した。その後樹脂をDMFおよびジクロロメタンで洗浄し（各溶媒数回）、ジクロロメタン-TFA-トリエチルシラン85:10:5で処理することによって標的化合物を樹脂から切断し（2回切断）、続いてジクロロメタンですすいだ。蒸発乾固した後、残渣を調製用逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 412 (M+1)。
【０２８７】
5-[5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イル]カルボキサミド-2-ヒドロキシ安息香酸 N-(3-アミノプロピル)アミド (L30)
【化１３４】
2013538798.tif 000136
【０２８８】
5-ニトロサリチル酸（0.3 mmol）およびHOBt（0.3 mmol）をDMSO（約1.5 mL）中に溶解し、DIC（0.3 mmol）で処理した。2分後、溶液を1,3-ジアミノプロパン-トリチル樹脂（0.15 mmol）に添加し、1時間振盪し、それから樹脂をDMF、水、薄い炭酸ナトリウム溶液、水、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各溶媒数回）。小量の樹脂サンプルを塩化ベンゾイルおよびDIPEAで処理し、洗浄して切断し（条件、下記参照）、得られた生成物をHPLC-MSで分析したが、不完全なローディングを示した。したがって、カップリングステップを再度30分間行った。その間に形成された全量のカルバモイルーニトロフェニルエステルを加水分解するために、次にその樹脂をTHF（1 mL）、メタノール（0.5 mL）およびNaOH水溶液（1 M、0.5 mL）で5分間処理したが、上清が黄色に変わることでエステル加水分解がうまくいったことが示された。DMF、メタノールおよびジクロロメタンで洗浄（各溶媒3回）後、DMSO（2 mL）、炭酸セシウム（1 mmol）、および臭化アリル（1 mmol）を加え、樹脂を1時間振盪した後、その反応を再度一晩行った（水0.2 mLを添加した）。変換がまだ不十分であったので、反応を再度3日間繰り返した後、樹脂をDMF、水、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各溶媒数回）。
【０２８９】
NMP（1 mL）、ピリジン（0.5 mL）、および塩化スズ(II)（1 mmol）のNMP溶液（1 mL）を添加してニトロ基を還元した。混合物を一晩振盪した後、樹脂をDMF、水、およびメタノールで洗浄し、メタノール中での浮選によって不溶性副生成物を注意深く除去した。ジクロロメタンで洗浄後、樹脂を乾燥した。
【０２９０】
5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-カルボン酸（0.25 mmol）およびHOAt（0.25 mmol）をNMP（約1.5 mL）中に溶解し、DIC（0.25 mmol）で処理した。2分後、その溶液を樹脂に添加し、一晩振盪した。その後樹脂をDMFおよびジクロロメタンで洗浄した（各溶媒数回）。
【０２９１】
樹脂をジクロロメタン（2 mL）、ピペリジン（0.4 mL）、およびテトラキス-トリフェニルホスフィンパラジウム(0)（約10 mg）で約2時間処理することによって、アリールエーテルを切断した。その後、樹脂をDMF、水、メタノール、およびジクロロメタンで完全に洗浄し（各溶媒数回）、ジクロロメタン-TFA-トリエチルシラン85:10:5で処理することによって標的化合物を樹脂から切断し（2回切断）、続いてジクロロメタンですすいだ。蒸発乾固した後、残渣を調製用逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 384 (M+1)。
【０２９２】
5-(1-エチルインダゾール-3-イルカルボキサミド)-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L38)
【化１３５】
2013538798.tif 000137
【０２９３】
1,3-ジアミノプロパン（150μmol）をあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレン樹脂をNMPであらかじめ膨潤した。Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（200μmol）およびHATU（200μmol）（NMP中1.5 mL）をDIPEA（400μmol）で処理した。2分後、溶液を樹脂に添加し、混合物を室温で3時間振盪した。樹脂をDMFで洗浄した後、ピペリジン（DMF中25%、約2 mL）を加え、樹脂を約30分間振盪した後、DMFおよびジクロロメタンで完全に洗浄した。インダゾール-3-カルボン酸（0.5 mmol）およびHOBt（0.5 mmol）をNMP（1.5 mL）中に溶解した。DIC（0.5 mmol）を加え、その溶液を2分後に樹脂に加えた。混合物を1時間振盪した後、樹脂をDMFおよびジクロロメタンで洗浄した。炭酸セシウム（1 mmol）および無水DMF（1.5 mL）を樹脂に添加した後、臭化エチル（1.5 mmol）を加えた。混合物を一晩振盪した後DMF、水、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した。炭酸セシウム/臭化エチルのステップをもう一度3日間にわたって行った後、樹脂を完全に洗浄した。ジクロロメタン中でトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理することによって標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 396 (M+1)。
【０２９４】
5-[N-(1-メチルインダゾール-3-イル)カルバモイル]-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L39)
【化１３６】
2013538798.tif 000138
【０２９５】
1,3-ジアミノプロパン（150μmol）をあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレン樹脂をNMPであらかじめ膨潤した。5-ホルミルサリチル酸（0.5 mmol）およびHOAt（0.5 mmol）をNMP（1.5 mL）中に溶解し、DIC（0.5 mmol）で処理した。2分後、溶液を樹脂に添加し、混合物を2時間撹拌し、それから樹脂をDMFおよびDCMで数回洗浄した。その後、樹脂を室温にて1時間、THF（1 mL）、メタノール（1 mL）、およびNaOH水溶液（2M、0.5 mL）で処理し、次に樹脂をメタノール/水、DMF、メタノール/水、DMF、およびDCMで洗浄した。アセトニトリル（1 mL）、tert-ブタノール（1 mL）、および2-メチル-2-ブテン（200μL）を添加した後、樹脂を0℃に冷却し、亜塩素酸ナトリウム（0.25 mmol）およびリン酸一ナトリウム（0.2 mmol）の水溶液（0.2 mL）を滴下して処理した。30分後、アセトニトリル（1 mL）、およびtert-ブタノール（1 mL）を加え、さらに亜塩素酸ナトリウム（1 mmol）およびリン酸一ナトリウム（0.8 mmol）の水溶液（0.4 mL）を滴下して加えて、その混合物を室温に暖めておいた。樹脂をメタノール/水、DMF、メタノール/水、DMF、およびDCMで洗浄した。完全に乾燥させた後、トリフェニルホスフィン（1 mmol）、THF（2 mL）、およびメタノール（0.2 mL）を添加し、続いてアゾジカルボン酸ジエチル（1 mmol）を加えた。樹脂を室温で1時間撹拌した後、それを数回、DMFおよびジクロロメタンで洗浄した。THF（1 mL）、メタノール（1 mL）、およびNaOH水溶液（2M、0.5 mL）を添加し、混合物を室温にて4日間振盪した後、樹脂をメタノール/水、DMF、メタノール/水、DMF、およびDCMで洗浄した。HATU（0.25 mmol）およびDIPEA（0.5 mmol）のNMP溶液（1 mL）を添加し、混合物を室温で15分間振盪した。その後、3-アミノ-1-メチルインダゾール（0.25 mmol）のNMP溶液（0.5 mL）を添加し、反応混合物を一晩振盪した後、DMFおよびジクロロメタンで洗浄した。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理することによって、標的化合物を樹脂から切断し、次に樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 382 (M+1)。
【０２９６】
(RS)-5-[1-(2,3-ジヒドロキシ-1-プロピル)インダゾール-3-イルカルボキサミド]-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L40)
【化１３７】
2013538798.tif 000139
【０２９７】
1,3-ジアミノプロパン（150μmol）をあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレン樹脂をNMPであらかじめ膨潤した。Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（200μmol）およびHATU（200μmol）（NMP中1.5 mL）をDIPEA（400μmol）で処理した。2分後、溶液を樹脂に添加し、混合物を室温で3時間振盪した。樹脂をDMFで洗浄した後、ピペリジン（DMF中25%、約2 mL）を加え、樹脂を約30分間振盪した後、DMFおよびジクロロメタンで完全に洗浄した。インダゾール-3-カルボン酸（0.5 mmol）およびHOBt（0.5 mmol）をNMP（1.5 mL）中に溶解した。DIC（0.5 mmol）を加え、その溶液を2分後に樹脂に加えた。混合物を1時間振盪した後、樹脂をDMFおよびジクロロメタンで洗浄した。炭酸セシウム（1 mmol）および無水DMF（1.5 mL）を樹脂に添加した後、臭化アリル（1 mmol）を加えた。混合物を一晩振盪した後DMF、水、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した。炭酸セシウム/臭化アリルのステップを1回繰り返して一晩行った後、樹脂を完全に洗浄し、乾燥して、ガラス製バイアルに移した。アセトン（2 mL）および水（0.5 mL）に溶解したN-メチルモルホリンオキシド（0.5 mmol）を樹脂に加えた。酸化オスミウム（VIII）（tert-ブタノール中2.5%、50μL）を添加してからバイアルをしっかりと密閉し、室温で一晩振盪した。もう一度改めて酸化オスミウム（VIII）（tert-ブタノール中2.5%、50μL）を加えて、さらに2時間振盪した後、反応を亜ジチオン酸ナトリウム水溶液（水1 mL中174 mg）で反応を止め、30分間振盪した。次に樹脂を数回、水、DMF、水、メタノール、DMF、およびジクロロメタンで洗浄した。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）による2回処理によって標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 442 (M+1)。
【０２９８】
5-(3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン-2-イルカルボキサミド)-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L41)
【化１３８】
2013538798.tif 000140
【０２９９】
1,3-ジアミノプロパン（150μmol）をあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレン樹脂をNMPであらかじめ膨潤した。Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（200μmol）およびHATU（200μmol）（NMP中1.5 mL）をDIPEA（400μmol）で処理した。2分後、溶液を樹脂に添加し、混合物を室温で2時間振盪した。樹脂をDMFおよびジクロロメタンで洗浄した後、ピペリジン（DMF中25%、約2 mL）を加え、樹脂を約30分間振盪した後、DMFおよびジクロロメタンで完全に洗浄した。樹脂をジクロロメタン（1 mL）で膨潤してから、DIPEA（1 mmol）を添加し、続いてジクロロメタン（1 mL）中のシュウ酸モノエチルエステルモノクロリド（0.5 mmol）を加えた。5分間振盪した後、樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。NMP（2 mL）に溶解した2,3-ジアミノピリジン（0.5 mmol）を添加し、その混合物を約100℃で4日間振盪した。樹脂を洗浄した（DMF、メタノール、ジクロロメタン）後、反応をもう一度約120℃で一晩行った。上記のように洗浄後、THF（1 mL）、メタノール（0.5 mL）、およびNaOH水溶液（2 M、0.5 mL）を樹脂に添加し、その混合物を15分間撹拌した後、樹脂をメタノール（5回）およびジクロロメタン（3回）で洗浄した。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）による2回処理によって標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 369 (M+1)。
【０３００】
2-メトキシ-5-([1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン-3-イルカルボキサミド)安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L43)
【化１３９】
2013538798.tif 000141
【０３０１】
1,3-ジアミノプロパン（150μmol）をあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレン樹脂をNMPであらかじめ膨潤した。Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（200μmol）およびHATU（200μmol）（NMP 1.5 mL中）をDIPEA（400μmol）で処理し、2分後、混合物を樹脂に添加し、それを3時間撹拌した。樹脂をDMFで洗浄した後、ピペリジン（DMF中25%、約2 mL）を加え、樹脂を約30分間振盪した。その後、樹脂をDMFおよびジクロロメタンで完全に洗浄し、ジクロロメタン中で膨潤させた。ジクロロメタン（1.5 mL）、DIPEA（1 mmol）、およびシュウ酸モノエチルエステルモノクロリド（0.5 mmol）を加え、混合物を10分間撹拌した後、樹脂を数回、DMFおよびジクロロメタンで洗浄した。エチレングリコール（1 mL）、2-ピリジルヒドラジン（1 mmol）、およびDIPEA（1 mmol）を添加し、混合物を4時間100℃に加熱した後、樹脂を数回DMFおよびジクロロメタンで洗浄した。トリフェニルホスフィン（0.5 mmol）、N-メチルモルホリン（0.5 mmol）、およびジクロロメタン（2 mL）を樹脂に添加した後、トリクロロアセトニトリル（0.4 mmol）を滴下して加えた。その混合物を48時間振盪した後、トリフェニルホスフィン（0.5 mmol）、およびN-メチルモルホリン（1 mmol）のジクロロメタン溶液（2 mL）を、四塩化炭素（0.5 mL）とともに添加した。混合物を2時間40℃に保持した後、THF（2 mL）および炭酸ナトリウム水溶液（2M、0.5 mL）を添加し、混合物を一晩撹拌した。最後に、樹脂をDMF、水、メタノール、およびジクロロメタンで完全に洗浄した。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）による2回処理によって標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 369 (M+1)。
【０３０２】
(S)-2,6-ビス[5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]ヘキサン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L49)
【化１４０】
2013538798.tif 000142
【０３０３】
1,3-ジアミノプロパン（150μmol）をあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレン樹脂をNMPであらかじめ膨潤した。次に(S)-ビス-Fmoc-リジン（200μmol）およびHATU（200μmol）をNMP（約1.5 mL）中に溶解して、DIPEA（400μmol）で2分間処理した後、その溶液を樹脂に加え、混合物を室温で撹拌した。1時間後、樹脂をDMFで洗浄し、ピペリジン（DMF中25%、2 mL）を加えて、樹脂を30分間撹拌した。その後、樹脂を洗浄した（DMF、メタノール、およびジクロロメタン）。Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（400μmol）およびHATU（400μmol）をNMP（約2 mL）中に溶解し、DIPEA（800μmol）で2分間処理した後、溶液を樹脂に添加し、その混合物を1時間振盪した。樹脂をDMFで洗浄した後、DMF中25%ピペリジンで処理して脱保護を行った後、上記のように洗浄した。イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-カルボン酸（400μmol）およびHATU（400μmol）をNMP（約2 mL）中に溶解し、DIPEA（800μmol）で2分間処理した後、その溶液を樹脂に加えた。混合物を1時間振盪した後、樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理して、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 801 (M+1), 401 ((M+2)/2)。
【０３０４】
(S)-2,6-ビス{8-[5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクタノイルアミド}ヘキサン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L50)
【化１４１】
2013538798.tif 000143
【０３０５】
1,3-ジアミノプロパン（150μmol）をあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレン樹脂をNMPであらかじめ膨潤した。次に(S)-ビス-Fmoc-リジン（200μmol）およびHATU（200μmol）をNMP（約1.5 mL）中に溶解して、DIPEA（400μmol）で2分間処理した後、その溶液を樹脂に加え、混合物を室温で撹拌した。1時間後、樹脂をDMFで洗浄し、ピペリジン（DMF中25%、2 mL）を加えて、樹脂を30分間撹拌した。その後、樹脂を洗浄した（DMF、メタノール、およびジクロロメタン）。Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（400μmol）およびHATU（400μmol）をNMP（約2 mL）中に溶解し、DIPEA（800μmol）で2分間処理した後、溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した。樹脂をDMFで洗浄した後、DMF中25%ピペリジンで処理して脱保護を行った後、上記のように洗浄した。Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（400μmol）およびHATU（400μmol）をNMP（約2 mL）中に溶解し、DIPEA（800μmol）で2分間処理した後、溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した。樹脂をDMFで洗浄した後、DMF中25%ピペリジンで処理して脱保護を行い、その後上記のように洗浄した。イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-カルボン酸（400μmol）およびHATU（400μmol）をNMP（約2 mL）中に溶解し、DIPEA（800μmol）で2分間処理した後、その溶液を樹脂に加えた。混合物を1時間振盪した後、樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理して、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 547 ((M+2)/2)。
【０３０６】
5-[4-(2-フリル)ピリジン-2-イルカルボキサミド]-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L52)
【化１４２】
2013538798.tif 000144
【０３０７】
1,3-ジアミノプロパン（150μmol）をあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレン樹脂をNMPであらかじめ膨潤した。Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（200μmol）およびHATU（200μmol）（NMP 1.5 mL中）をDIPEA（400μmol）で処理し、2分後にその溶液を樹脂に添加した。105分間振盪した後、樹脂をDMFで洗浄し、続いてピペリジン（DMF中25%、2 mL）で1時間処理した後、DMF、メタノール、およびジクロロメタンで完全に洗浄した。NMP（3 mL）中に溶解した4-ブロモピリジン-2-カルボン酸（0.3 mmol）およびHOAt（0.3 mmol）をDIC（0.3 mmol）で処理した。2分後にその溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した後、樹脂を上記のように洗浄し、乾燥窒素気流で完全に乾燥した後、ガラス製バイアルに移した。炭酸セシウム（0.3 mmol）および2-フリルボロン酸（0.5 mmol）をDMF（2 mL）とともに添加した。混合物をアルゴンで完全に洗い流した。テトラキス-トリフェニルホスフィンパラジウム-0（10μmol）を添加した後、混合物をもう一度アルゴンで洗い流してから、バイアルをしっかりと密閉し、混合物を100℃にて一晩撹拌した。その後、樹脂をDMF、水、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理して、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 395 (M+1)。
【０３０８】
(S)-2,6-ビス{5-[5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]-3-オキサペンタノイルアミド}ヘキサン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L53)
【化１４３】
2013538798.tif 000145
【０３０９】
1,3-ジアミノプロパン（150μmol）をあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレン樹脂をNMPで膨潤した。次に(S)-ビス-Fmoc-リジン（200μmol）およびHATU（200μmol）をNMP（約1.5 mL）中に溶解して、DIPEA（400μmol）で2分間処理した後、その溶液を樹脂に加え、混合物を室温で撹拌した。1時間後、樹脂をDMFで洗浄し、ピペリジン（DMF中25%、2 mL）を加えて、樹脂を30分間撹拌した。その後、樹脂を洗浄した（DMF、メタノール、およびジクロロメタン）。Fmoc-5-アミノ-3-オキサペンタン酸（400μmol）およびHATU（400μmol）をNMP（約2 mL）中に溶解し、DIPEA（800μmol）で2分間処理した後、溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した。樹脂をDMFで洗浄した後、DMF中25%ピペリジンで処理して脱保護を行い、次に上記のように洗浄した。Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（400μmol）およびHATU（400μmol）をNMP（約2 mL）中に溶解し、DIPEA（800μmol）で2分間処理した後、溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した。樹脂をDMFで洗浄した後、DMF中25%ピペリジンで処理して脱保護を行い、その後上記のように洗浄した。イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-カルボン酸（400μmol）およびHATU（400μmol）をNMP（約2 mL）中に溶解し、DIPEA（800μmol）で2分間処理した後、その溶液を樹脂に加えた。混合物を1時間振盪した後、樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理して、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 503 ((M+2)/2)。
【０３１０】
2-メトキシ-5-[3-(4-メトキシフェニル)-1,2,4-オキサジアゾール-5-イルカルボキサミド]安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L54)
【化１４４】
2013538798.tif 000146
【０３１１】
1,3-ジアミノプロパンをあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレン樹脂（450μmol、約0.5 g）をジクロロメタン、続いてNMPで、あらかじめ膨潤した。NMP（4.5 mL）中に溶解したFmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（0.6 mmol）およびHATU（0.6 mmol）をDIPEA（1.2 mmol）で2分間処理した。その後、溶液を樹脂に添加し、混合物を40分間撹拌した後、DMFで3回洗浄した。ピペリジン（DMF中25%、6 mL）を加えた後、樹脂を30分間撹拌し、その後、DMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。樹脂を高真空で乾燥させた後、ジクロロメタン（3 mL）およびDIPEA（3 mmol）を添加し、それからジクロロメタンに溶解したシュウ酸モノエチルエステルモノクロリド（1.5 mmol）を慎重に加えた。混合物を2分間振盪した後、樹脂をジクロロメタン、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。樹脂を乾燥後、150 mgを取り出した。残量をTHF（4 mL）、メタノール（2 mL）およびNaOH水溶液（2M、2 mL）で室温にて2時間処理した。樹脂を洗浄した（DMF、酢酸[DMF中2.5%]、メタノール、およびジクロロメタン；各3回）。この樹脂のうち150 mgを、NMP（1 mL）中でHOAt（0.5 mmol）およびDIC（0.5 mmol）と反応させた。その後、NMP（1 mL）中に溶解した4-メトキシ-N-ヒドロキシベンズアミジン（0.5 mmol）を添加した。樹脂を1時間撹拌した後、DIC（0.5 mmol）を添加し、混合物を一晩振盪した。樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄（各3回）した後、カップリングステップを繰り返した。2回目のDIC添加の3時間後、樹脂を上記のように洗浄し、乾燥してガラス製バイアルに移した。NMP（2 mL）およびDIC（0.5 mmol）を加え、混合物を30分間120℃に加熱した。その後、樹脂を上記のように洗浄した。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理して、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 426 (M+1)。
【０３１２】
5-[3-(2-フリル)-1,2,4-オキサジアゾール-5-イルカルボキサミド]-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L55)
【化１４５】
2013538798.tif 000147
【０３１３】
N-ヒドロキシ-2-フリルカルボキサミジンの合成：撹拌している2-シアノフラン（5 mmol）のエタノール（5 mL）溶液に、ヒドロキシルアミン水溶液（50%、5 mmol）を添加した後、反応混合物にわずかな発熱が観察された。約20分後、追加のヒドロキシルアミン水溶液（0.5 mmol）を添加した。1時間撹拌した後、溶媒を窒素気流で蒸発させ、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（NH2-修飾固定相、0-5% メタノール（ジクロロメタン中）、1% トリエチルアミン）で精製し、不透明な油状物が与えられたが、これは放置すると凝固した。
【０３１４】
標的化合物の合成：乾燥した2-クロロトリチルクロリド樹脂（150μmol）を1,3-ジアミノプロパン（2 mL）、続いてジクロロメタン（2 mL）で処理した。5分後、樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで（各3回）洗浄し、NMP中で膨潤させた。Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（200μmol）およびHATU（200μmol）（NMP 1.5 mL中）をDIPEA（400μmol）で処理し、2分後にその溶液を樹脂に添加し、それを室温で30分間振盪した。樹脂をDMFで（3回）洗浄してから、ピペリジン（DMF中25%、約4 mL）で30分間処理した後、樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄し（各3回）、ジクロロメタン中で膨潤させた。ジクロロメタン（2 mL）およびDIPEA（1 mL）を添加した後、シュウ酸モノエチルエステルモノクロリド（0.5 mmol）のジクロロメタン（1 mL）溶液を慎重に添加し、混合物を5分間撹拌した後、樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで（各3回）洗浄し、乾燥して、ガラス製バイアルに移した。炭酸カリウム（0.5 mmol）、トルエン（2 mL）、およびN-ヒドロキシ-2-フリルカルボキサミジン（0.5 mmol；合成：上記参照）を添加し、バイアルをしっかりと密閉して、100℃で一晩、さらに110℃で2時間撹拌した後、樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで（各3回）洗浄した。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（45%）およびトリエチルシラン（10%）で2回処理することによって、標的化合物を担体から切断し、その後樹脂をジクロロメタンで完全にすすいでから、溶媒を窒素気流により除去した。残渣を調製用逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 386 (M+1)。
【０３１５】
5-[5-(2-フリル)-1,3,4-オキサジアゾール-2-イル]カルボキサミド-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L58)
【化１４６】
2013538798.tif 000148
【０３１６】
1,3-ジアミノプロパン（150μmol）をあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレン樹脂をNMPであらかじめ膨潤し、その後、余分な溶媒を除去した。NMP（1.5 mL）に溶解したFmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（200μmol）およびHATU（200μmol）を、DIPEA（400μmol）で処理した。2分後、その溶液を膨潤した樹脂に加え、混合物を室温で2時間振盪した。樹脂をDMFで洗浄した後、ピペリジン（DMF中25%、約2 mL）を加え、樹脂を約30分間振盪した後、DMFおよびジクロロメタンで完全に洗浄した。次に、樹脂をジクロロメタン中で膨潤し、シュウ酸モノエチルエステルモノクロリド（0.5 mmol）およびDIPEA（1 mmol）のジクロロメタン（1.5 mL）溶液で10分間処理した後、DMFおよびジクロロメタンで繰り返し洗浄した。樹脂をTHF（1.5 mL）中で膨潤した後、ヒドラジン水和物（0.5 mL）を加え、樹脂を室温にて3時間撹拌した後、DMFおよびジクロロメタンで洗浄した。フラン-2-カルボン酸（0.5 mmol）およびHOAt（0.5 mmol）をNMP（1.5 mL）中に溶解し、DIC（0.5 mmol）で処理した。2分後、その溶液を樹脂に添加し、混合物を室温で2時間撹拌した後、DMFおよびジクロロメタンで洗浄した。その後、ジクロロメタン（2 mL）に溶解したトリフェニルホスフィン（0.5 mmol）およびN-メチルモルホリン（1 mmol）の溶液を添加し、続いて四塩化炭素（0.5 mL）を添加した。混合物を、完全に密閉したガラス製バイアル中で2時間40℃に加熱した。THF（2 mL）およびNa2CO3（2M、0.5 mL）を添加した後、混合物を室温にて一晩撹拌し、その後DMF、水、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理することによって、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 386 (M+1)。
【０３１７】
5-[1-(2-ヒドロキシエチル)インダゾール-3-イルカルボキサミド]-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L59)
【化１４７】
2013538798.tif 000149
【０３１８】
1,3-ジアミノプロパン（150μmol）をあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレン樹脂をNMPであらかじめ膨潤した。NMP（1.5 mL）に溶解したFmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（200μmol）およびHATU（200μmol）を、DIPEA（400μmol）で処理した。2分後、その溶液を樹脂に加え、混合物を室温で1時間振盪した。樹脂をDMFで洗浄した後、ピペリジン（DMF中25%、約2 mL）を加え、樹脂を1時間振盪した後、DMF、メタノール、およびジクロロメタンで完全に洗浄した。インダゾール-3-カルボン酸（0.5 mmol）およびHOBt（0.5 mmol）をNMP（1.5 mL）中に溶解した。DIC（0.5 mmol）を添加し、2分後に溶液を樹脂に加えた。混合物を40分間振盪し、その後樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。樹脂をガラス製バイアルに移し、ブロモ酢酸メチルエステル（0.5 mmol）およびDIPEA（1 mmol）をNMP（2 mL）に溶解した溶液を添加した。バイアルを完全に密閉し、80℃で75分間振盪した。その後、樹脂を洗浄し（DMF、メタノール、ジクロロメタン、各3回）、THF（2 mL）およびメタノール（0.5 mL）中で膨潤し、水素化ホウ素ナトリウム（大過剰、何回かに分けて添加）で処理した。最後の添加後、混合物を室温で30分間振盪し、次に樹脂をメタノールおよびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理することによって、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 412 (M+1)。
【０３１９】
8-[2-メトキシ-5-(1-メチルインダゾール-3-イルカルボキサミド)フェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクタン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L60)
【化１４８】
2013538798.tif 000150
【０３２０】
1,3-ジアミノプロパン（150μmol）をあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレンをNMPであらかじめ膨潤した。NMP（1.5 mL）に溶解したFmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（200μmol）およびHATU（200μmol）を、DIPEA（400μmol）で処理し、2分後、その溶液を樹脂に加え、それを室温で1時間振盪した後、それをDMFで洗浄した（3回）。ピペリジン（DMF中25%、約2 mL）を加え、混合物を約30分間振盪した。樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。次に、カップリング/脱保護プロトコールを、Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（上記と同じ量）に適用した。最後に、1-メチルインダゾール-3-カルボン酸を、上記HATUカップリングプロトコールを用いて、カップリングした。樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理することによって、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 527 (M+1)。
【０３２１】
8-{8-[2-メトキシ-5-(1-メチルインダゾール-3-イルカルボキサミド)フェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクタノイルアミド}-3,6-ジオキサオクタン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L61)
【化１４９】
2013538798.tif 000151
【０３２２】
1,3-ジアミノプロパン（150μmol）をあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレンをNMPであらかじめ膨潤した。NMP（1.5 mL）に溶解したFmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（200μmol）およびHATU（200μmol）を、DIPEA（400μmol）で処理し、2分後、その溶液を樹脂に加え、それを室温で1時間振盪した後、それをDMFで洗浄した（3回）。ピペリジン（DMF中25%、約2 mL）を加え、混合物を約30分間振盪した。樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。次に、カップリング/脱保護プロトコールを、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸を用いてもう1回行った後、Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（上記と同じ量）に適用した。最後に、1-メチルインダゾール-3-カルボン酸を、上記HATUカップリングプロトコールを用いて、カップリングした。樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理することによって、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 672 (M+1)。
【０３２３】
(S)-2,6-ビス{8-[5-(イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクタノイルアミド}ヘキサン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L62)
【化１５０】
2013538798.tif 000152
【０３２４】
1,3-ジアミノプロパン（150μmol）をあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレン樹脂をNMPで膨潤した。(S)-ビス-Fmoc-リジン（200μmol）およびHATU（200μmol）をNMP（約1.5 mL）中に溶解して、DIPEA（400μmol）で2分間処理した後、その溶液を樹脂に加え、混合物を室温で撹拌した。1時間後、樹脂をDMFで洗浄し、ピペリジン（DMF中25%、2 mL）を加えて、樹脂を30分間撹拌した。その後、樹脂を洗浄した（DMF、メタノール、およびジクロロメタン）。Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（400μmol）およびHATU（400μmol）をNMP（約2 mL）中に溶解し、DIPEA（800μmol）で2分間処理した後、溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した。樹脂をDMFで洗浄した後、DMF中25%ピペリジンで処理して脱保護を行い、次に上記のように洗浄した。Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（400μmol）およびHATU（400μmol）をNMP（約2 mL）中に溶解し、DIPEA（800μmol）で2分間処理した後、溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した。樹脂をDMFで洗浄した後、DMF中25%ピペリジンで処理して脱保護を行い、その後上記のように洗浄した。イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボン酸（400μmol）およびHATU（400μmol）をNMP（約2 mL）中に溶解し、DIPEA（800μmol）で2分間処理した後、その溶液を樹脂に加えた。混合物を1時間振盪した後、樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理して、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 542 ((M+2)/2)。
【０３２５】
(S)-1-アミノプロパン-1,3-ジカルボン酸 ビス{3-[5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]プロピル}アミド (L64)
【化１５１】
2013538798.tif 000153
【０３２６】
5-アミノ-2-メトキシ安息香酸メチルエステルの合成：2-メトキシ-5-ニトロ安息香酸メチルエステル（1 mmol）およびパラジウム（0）炭素（5%、25 mg [約50% w/wの水を含有]）をメタノール（5 mL）中とし、10分かけてトリエチルシラン（1 mL）を滴下し、次にメタノール（2 mL）で処理した。さらに5分間撹拌した後、混合物をセライトで濾過し、次にセライト層を完全にすすいだ。濾液を濃縮し、高真空で乾燥し、残渣をそれ以上精製せずに使用した。
【０３２７】
アミノプロピル-結合リガンド（L37に同じ）の液相合成：イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-カルボン酸（1 mmol）およびTBTU（1 mmol）をDMF（2 mL）中に溶解し、DIPEA（2 mmol）で5分間処理した。次に、その混合物を、前に得られた5-アミノ-2-メトキシ安息香酸メチルエステルの全量に加え、さらにその混合物を30分間撹拌した。飽和炭酸ナトリウム水溶液（1 mL）および水（3 mL）を添加後、混合物を酢酸エチルで4回抽出した。有機層を合わせて、クエン酸水溶液（5%）で2回洗浄し、飽和炭酸ナトリウム水溶液で1回、さらに水で2回洗浄した。残った有機層を濃縮し、乾燥窒素気流で一晩乾燥した。残渣に1,3-ジアミノプロパン（2 mL）を加え、混合物を4時間80℃に加熱した。その後、溶液を濃縮乾固し、残渣をメタノール中に再溶解して、濃縮し、高真空で乾燥すると、油状物が与えられたが、これは冷却すると凝固した。収量：453μmol（45%）。
【０３２８】
標的化合物の合成：N-Boc-グルタミン酸（227μmol）およびTBTU（453μmol）をDMF（2 mL）に溶解し、DIPEA（906μmol）で3分間処理した後、その溶液を上記で得られた残渣に添加した。90分後、新たにTBTU活性化N-Boc-グルタミン酸（0.2 mmol）をDMFに溶解し（1 mL；上記のように2分間活性化）、添加した。45分後、溶媒を窒素気流により一晩蒸発させた。残渣をメタノール中に再溶解し、蒸発乾固して、トリフルオロ酢酸（ジクロロメタン中25%）で処理し、次に蒸発乾固して、残渣を調製用逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 858 (M+1), 430 ((M+2)/2)。
【０３２９】
基本手順D：2つのAdoユニットおよび1つの1,3-ジアミノプロパンに結合した5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（ベース樹脂）の合成
1,3-ジアミノプロパンをあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレン樹脂を、DCMおよびNMP中であらかじめ膨潤した。Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（200μmol）およびHATU（200μmol）をNMP（1.5 mL）に溶解し、DIPEA（400μmol）で2分間処理した後、その溶液を樹脂に添加し、混合物を30分から数時間撹拌した。樹脂をDMF、またはDMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した後、ピペリジン（DMF中25%、約2 mL）を添加し、樹脂を少なくとも20分間撹拌した。その後、樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで完全に洗浄し（各3回）、このカップリング/脱保護手順をもう一回繰り返した。上記のHATUカップリングプロトコールを用いて、Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（200μmol）を樹脂にカップリングさせた後、上記のようにピペリジンで脱保護した。樹脂を風乾した後、追加の合成ステップを行った。
【０３３０】
8-{8-{5-[5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-イルカルボキサミド]-2-メトキシフェニルカルボキサミド}-3,6-ジオキサオクタノイルアミド}-3,6-ジオキサオクタン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L65)
【化１５２】
2013538798.tif 000154
【０３３１】
5-(2-フリル)-1-メチルピラゾール-3-カルボン酸（200μmol）およびHATU（200μmol）をNMP（1.5 mL）中に溶解し、DIPEA（400μmol）で2分間処理した。次に、その溶液を基本手順Dで得られたベース樹脂に添加した。混合物を約2時間撹拌した後、樹脂を洗浄した（DMF、メタノール、ジクロロメタン、各3回）。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理して、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 688 (M+1)。
【０３３２】
8-{8-[5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクタノイルアミド}-3,6-ジオキサオクタン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L66)
【化１５３】
2013538798.tif 000155
【０３３３】
イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-カルボン酸（200μmol）およびHATU（200μmol）をNMP（1.5 mL）中に溶解し、DIPEA（400μmol）で2分間処理した。次に、その溶液を基本手順Dで得られたベース樹脂に添加した。混合物を約2時間撹拌した後、樹脂を洗浄した（DMF、メタノール、ジクロロメタン、各3回）。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理して、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 664 (M+1)。
【０３３４】
8-{8-{5-[5-(2-フリル)-1,3,4-オキサジアゾール-2-イルカルボキサミド]-2-メトキシフェニルカルボキサミド}-3,6-ジオキサオクタノイルアミド}-3,6-ジオキサオクタン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L67)
【化１５４】
2013538798.tif 000156
【０３３５】
基本手順Dで得られた、乾燥したベース樹脂をジクロロメタン（2 mL）およびDIPEA（1 mmol）で処理した後、ジクロロメタンに溶解したシュウ酸モノエチルエステルモノクロリド（0.5 mmol）を滴下して添加した。混合物を室温にて10分間撹拌した後、樹脂をDMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。次に、樹脂をNMP（2 mL）中で膨潤して、室温にて50分間ヒドラジン水和物で処理した後、上記のように洗浄した。2-フロ酸（200μmol）およびHATU（200μmol）をNMP（1.5 mL）中に溶解し、DIPEA（400μmol）で2分間処理した後、その溶液を樹脂に添加した。約1時間後に樹脂を上記のように洗浄した。次に、ジクロロメタン（約2 mL）に溶解した塩化4-トルエンスルホニル（0.5 mmol）およびDIPEA（1 mmol）を加え、環化が完了するまで混合物を撹拌した。樹脂を上記のように洗浄した。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理して、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 676 (M+1)。
【０３３６】
8-{8-{2-メトキシ-5-[5-(2-メチルチアゾール-4-イル)イソオキサゾール-3-イルカルボキサミド]フェニルカルボキサミド}-3,6-ジオキサオクタノイルアミド}-3,6-ジオキサオクタン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L68)
【化１５５】
2013538798.tif 000157
【０３３７】
5-(2-メチルチアゾール-4-イル)イソオキサゾール-3-カルボン酸（200μmol）およびHATU（200μmol）をNMP（1.5 mL）中に溶解し、DIPEA（400μmol）で2分間処理した。次に、その溶液を基本手順Dで得られたベース樹脂に添加した。混合物を約2時間撹拌した後、樹脂を洗浄した（DMF、メタノール、ジクロロメタン、各3回）。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理して、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 706 (M+1)。
【０３３８】
N-(8-アミノ-3,6-ジオキサオクチル)-N’-{8-[5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクチル}尿素 (L69)
【化１５６】
2013538798.tif 000158
【０３３９】
塩化2-クロロトリチル ポリスチレン樹脂（150μmol）に、1,8-ジアミノ-3,6-ジオキサオクタン（2 mL）を添加した。混合物を5分間振盪した後、ジクロロメタン（1 mL）を添加して、確実に十分膨潤させた。25分後、樹脂を洗浄した（DMF、メタノール、ジクロロメタン、各3回）。樹脂をジクロロメタン中で膨潤した後、ジクロロメタン（2 mL）およびDIPEA（1 mmol）を添加し、続いてジクロロメタン（1 mL）に溶解したクロロギ酸 (4-ニトロフェニル)エステル（0.5 mmol）を加えた。混合物を5分間撹拌した後、樹脂を濾別し、ただちに1,8-ジアミノ-3,6-ジオキサオクタン（2 mL）で20分間処理した。その後、樹脂を上記のように洗浄した。
【０３４０】
Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸（200μmol）およびHATU（200μmol）をNMP/DCM（1.5 + 1.5 mL）中に溶解し、DIPEA（400μmol）で2分間処理した後、その溶液を樹脂に添加した。混合物を5時間撹拌した後、樹脂を上記のように洗浄して、ピペリジン（DMF中25%、約2 mL）で30分間処理し、続いて上記のように洗浄した。最後に、上記のHATUカップリングプロトコール（純粋NMP、約1.5 mL；反応時間：一晩）を用いてイミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-カルボン酸（200μmol）をカップリングさせた後、樹脂を上記のように洗浄した。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（45%）およびトリエチルシラン（10%）で2回処理して、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 622 (M+1), 312 ((M+2)/2)。
【０３４１】
基本手順E：イソフタル酸 N-(3-アミノ-1-プロピル)-N'-アリール アミドの合成
1,3-ジアミノプロパン（150μmol）をあらかじめ結合したプレロード型の乾燥トリチルポリスチレン樹脂を、ジクロロメタン（1.5 mL）中で、塩化イソフタロイル（1 mmol）およびDIPEA（2 mmol）により3分間処理した。ただちに樹脂をジクロロメタンまたはNMPで洗浄した（2もしくは3回）。その後、それぞれの芳香族アミン（0.3 mmol）およびDIPEA（0.3 mmol）をNMP（1.5 mL）中に溶解して加え、混合物を1時間撹拌した後、DMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理して、標的化合物を担体から切断した後、樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。化合物の溶解性がかなり低いため、場合によっては、切断もしくは洗浄溶液にメタノールを加える必要があった。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。
【０３４２】
イソフタル酸 N-(3-アミノプロピル)-N’-[5-(2-フリル)-1,3,4-チアジアゾール-2-イル]アミド (L70)
【化１５７】
2013538798.tif 000159
【０３４３】
基本手順Eにしたがって、2-アミノ-5-(2-フリル)-1,3,4-チアジアゾールから調製。ESI-MS: 372 (M+1)。
【０３４４】
イソフタル酸 N-(3-アミノプロピル)-N’-(1-メチルインダゾール-3-イル)アミド (L71)
【化１５８】
2013538798.tif 000160
【０３４５】
基本手順Eにしたがって、3-アミノ-1-メチルインダゾールから調製。ESI-MS: 352 (M+1)。
【０３４６】
イソフタル酸 N-(3-アミノプロピル)-N’-(ベンゾチアゾール-2-イル)アミド (L72)
【化１５９】
2013538798.tif 000161
【０３４７】
基本手順Eにしたがって、2-アミノベンゾチアゾールから調製。ESI-MS: 355 (M+1)。
【０３４８】
イソフタル酸 N-(3-アミノプロピル)-N’-(4-フェニルチアゾール-2-イル)アミド (L73)
【化１６０】
2013538798.tif 000162
【０３４９】
基本手順Eにしたがって、2-アミノ-4-フェニルチアゾールから調製。ESI-MS: 381 (M+1)。
【０３５０】
イソフタル酸 N-(3-アミノプロピル)-N’-(5-フェニルチアゾール-2-イル)アミド (L74)
【化１６１】
2013538798.tif 000163
【０３５１】
基本手順Eにしたがって、2-アミノ-5-フェニルチアゾールから調製。ESI-MS: 381 (M+1)。
【０３５２】
5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシ安息香酸 [3-(6-アミノヘキサノイルアミド)-1-プロピル]アミド (L75)
【化１６２】
2013538798.tif 000164
【０３５３】
イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-カルボン酸、および150μmolの1，3-ジアミノプロパン-プレロード型トリチルポリスチレン樹脂から、基本手順Aにしたがって、5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシ安息香酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L37)を調製した。担体結合リガンドの酸分解で得られた粗生成物を、窒素気流で乾燥した。飽和炭酸ナトリウム水溶液（3 mL）を添加し、混合物を酢酸エチル（3回）およびジクロロメタン（4回）で抽出した。有機層を合わせて、蒸発乾固した。Boc-6-アミノヘキサン酸（100μmol）およびHATU（100μmol）をDMF（1 mL）に溶解して、DIPEA（200μmol）で処理し、2分後に溶液を上記で得られた残渣に添加した。混合物を20分間撹拌した後、水（2 mL）および飽和炭酸ナトリウム水溶液（1 mL）を加え、その混合物を酢酸エチルで2回抽出した。有機層を合わせて、クエン酸水溶液（5%、2回）、飽和炭酸ナトリウム、および水で洗浄し、濃縮乾固した。残渣をジクロロメタン（1 mL）およびトリフルオロ酢酸（1 mL）で40分間処理した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を調製用逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 487 (M+1)。
【０３５４】
6-[5-(イミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]ヘキサン酸 (8-アミノ-3,6-ジオキサ-1-オクチル)アミド (L76)
【化１６３】
2013538798.tif 000165
【０３５５】
塩化2-クロロトリチル ポリスチレン樹脂（150μmol）を、1,8-ジアミノ-3,6-ジオキサオクタン（500μL）で処理した。混合物を3分間振盪した後、ジクロロメタン（1 mL）を添加して、振盪を15分間続行した後、DMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。次に、樹脂をNMP中で膨潤させた。Fmoc-6-アミノヘキサン酸（200μmol）およびHATU（200μmol）をNMP（1.5 mL）中に溶解し、DIPEA（400μmol）で処理した。2分後、溶液を樹脂に添加し、混合物を2時間振盪した。その後、樹脂を上記のように洗浄し、続いてピペリジン（DMF中25%、約2 mL）で1時間処理して、上記のように洗浄した。このカップリング/脱保護サイクルの後、Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸を樹脂に結合し（カップリング時間：一晩；脱保護時間：30分）、次にイミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-カルボン酸を結合した（カップリング時間：3時間）。上記のように最終的に洗浄した後、ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（45%）およびトリエチルシラン（10%）で2回処理して、標的化合物を担体から切断し、続いて樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 561 (M+1)。
【０３５６】
8-[5-(イミダゾ-[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクタン酸 (3-アミノ-1-プロピル)アミド (L77)
【化１６４】
2013538798.tif 000166
【０３５７】
1,3-ジアミノプロパンをあらかじめ結合したプレロード型トリチルポリスチレン樹脂（150μmol）を、NMP中であらかじめ膨潤した。Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（200μmol）およびHATU（200μmol）をNMP（1.5 mL）に溶解し、DIPEA（400μmol）で処理した。2分後、その溶液を樹脂に添加し、混合物を2時間振盪した。次に、樹脂を上記のように洗浄した後、ピペリジン（DMF中25%、約2 mL）で1時間処理し、上記のように洗浄した。このカップリング/脱保護サイクルの後、Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸を樹脂に結合し（カップリング時間：一晩；脱保護時間：30分）、続いてイミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-カルボン酸を結合した（カップリング時間：3時間）。上記のように最終的に洗浄した後、ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（10%）およびトリエチルシラン（5%）で2回処理して、標的化合物を担体から切断し、続いて樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 519 (M+1)。
【０３５８】
8-[5-(イミダゾ-[2,1-b]チアゾール-6-イルカルボキサミド)-2-メトキシフェニルカルボキサミド]-3,6-ジオキサオクタン酸 (6-アミノ-1-ヘキシル)アミド (L78)
【化１６５】
2013538798.tif 000167
【０３５９】
塩化2-クロロトリチル ポリスチレン樹脂（150μmol）を1,6-ジアミノヘキサン（500μL）で処理した。混合物を3分間振盪した後、ジクロロメタン（1 mL）を添加して、15分間振盪を続け、その後DMF、メタノール、およびジクロロメタンで洗浄した（各3回）。次に、樹脂をNMP中で膨潤させた。Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（200μmol）およびHATU（200μmol）をNMP（1.5 mL）に溶解し、DIPEA（400μmol）で処理した。2分後に溶液を樹脂に添加し、混合物を2時間振盪した。次いで、樹脂を上記のように洗浄した後、ピペリジン（DMF中25%、約2 mL）で1時間処理し、上記のように洗浄した。このカップリング/脱保護サイクルの後、Fmoc-5-アミノ-2-メトキシ安息香酸を樹脂に結合し（カップリング時間：一晩；脱保護時間：30分）、続いてイミダゾ[2,1-b]チアゾール-6-カルボン酸を結合した（カップリング時間：3時間）。上記のように最終的に洗浄した後、ジクロロメタンに溶解したトリフルオロ酢酸（45%）およびトリエチルシラン（10%）で2回処理して、標的化合物を担体から切断し、続いて樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を逆相HPLCで精製した。ESI-MS: 561 (M+1)。
【実施例３】
【０３６０】
リガンドの固定化
実験
乾燥したリガンドを、重量分析に基づいて約100 mMの濃度でDMSO中に再溶解した。保存溶液の正確な濃度は、o-フタルジアルデヒドアッセイで測定した（２）。色素-リガンド分子は、340 nmでの吸光度測定によって定量した。測定値は、1-(3-アミノプロピル)イミダゾールを用いて検量した。
【０３６１】
カップリング反応では、1 M N,N-ジイソプロピルエチルアミン含有90% DMSO＋10% N-メチル-2-ピロリドン中におおよその濃度で15から20 mMとして溶解したリガンドの1容を、イソプロパノールで平衡化した、沈降したNMS-活性化セファロース 4 FF（GE Healthcare）の1容に加えた。反応は激しく撹拌しながら25℃にて2時間行った。反応上清を除去し、樹脂を適当な溶媒で2回洗浄した。樹脂上に残存する活性基を、1 M エタノールアミンを用いて25℃にて1時間ブロックした。最後に樹脂を洗浄し、以後の実験に使用するまで20%エタノール中で4℃にて保存した。反応収率は、すべての画分でリガンド濃度を分析した後、物質収支に基づいて確定された。
【０３６２】
概要および結果
次のクロマトグラフィーおよびバッチ吸着実験のために、実施例２から得られたリガンドをNHS-活性化セファロース 4 FF上に固定化した。リガンド上のアミノプロピルリンカーのアミノ基と、あらかじめ活性化された樹脂のNHS-活性化カルボキシル基との間でアミド結合を形成することによって、カップリングを達成した。
【０３６３】
以下の表は、実施例2で得られたリガンドによるカップリング反応の結果を与える。平均して、樹脂mlあたり15.5μmolの固定化リガンド密度が得られた。反応収率は平均すると74.5%となった。
【表１】
2013538798.tif 000168
2013538798.tif 000169
【表２】
2013538798.tif 000170
2013538798.tif 000171
【実施例４】
【０３６４】
クロマトグラフィーによるリガンド（実施例２）の評価
実験
マイクロタイタープレートクロマトグラフィーによって、充填された状態で樹脂を評価した。各カラムに向けて、約30μLの樹脂を384ウェルフィルタープレートに移し、適当なトップフリットでシールした。組換えプロテインA セファロース FFおよびマブゾーベントA2P HFによるカラムを対照として含めた。
【０３６５】
カラムは、サンプル導入前に、6.7カラム容（cv）のリン酸緩衝食塩水（0.15 M NaCl、20 mMリン酸ナトリウム、pH 7.3; PBS）で平衡化した。3.3 cvの、0.75 mg/mLの全IgG、0.25 mg/mLのFabもしくはFc（3つともPBSに溶解）、または宿主細胞タンパク質（HCP）をカラム上に導入した。ベバシズマブの抗体フラグメント（FabおよびFc）は、メーカーの指示に従って全IgGをパパインプロテアーゼ（3）で切断することにより調製した。結合していないタンパク質を、5 cvのPBSでカラムから洗い流した後、5 cvのグリシンバッファー、pH 2.5で溶出した。移動容積を、カラムに通して50 gで1-2分間回転させた。サンプル導入時には、加速度は10 gに減らし、遠心時間は5-10分に増やした。溶出画分を384ウェルプレートに集め、タンパク質の濃度をBradfordアッセイで分析した。タンパク質の質量mi、mft、およびme（下記を参照されたい）は、画分容積および測定されたタンパク質濃度の積として算出された。
【０３６６】
概要および結果
いくつかの抗体の結合および溶出を示した。その中には、3つのヒト化された治療用抗体ベバシズマブ、トシリズマブ、およびパリビズマブ、ならびにヒト血清から分離されたヒトpoly-IgG（h-poly-IgG）混合物があった。一部の例では、精製されたベバシズマブFabおよびFcフラグメント、またはウサギIgG（h-poly-IgG、血清から分離）を追加的な供給材料として使用した。リガンドの抗体に対する選択性は、宿主細胞タンパク質の結合作用を調べることによって判定した。比較のために、市販の樹脂、組換えプロテインA セファロース FF (rProtein A)、マブゾーベントA2P (A2P)、およびMEPハイパーセル(Hyper)に関する結果を含めた。
【０３６７】
「結合した」タンパク質の割合は、導入されたタンパク質の全質量miと、素通り画分で検出されたタンパク質の質量mftとの差を、導入されたタンパク質の全質量で割ったものとして算出された。
【数１】
2013538798.tif 000172
【０３６８】
タンパク質の「収率」は、溶出されたタンパク質の質量meを、導入されたタンパク質の全質量miで割ったものとして算出された。
【数２】
2013538798.tif 000173
【０３６９】
樹脂の「選択性」は、結合した抗体の割合BAbを、結合した宿主タンパク質の割合BHCPで割ったものとして算出された。
【数３】
2013538798.tif 000174
【０３７０】
「結合した」タンパク質の割合、およびタンパク質の「収率」は、全IgG抗体に関するデータに基づいて、各樹脂について算出された。ベバシズマブ フラグメントおよび宿主細胞タンパク質の場合、「結合した」タンパク質の割合のみが与えられる。樹脂の選択性は、ベバシズマブ全IgGおよび宿主細胞タンパク質に関するデータから算出された。実験の正確さには限りがあるので、選択性は10を越えたら切り捨てた。
【０３７１】
実施例３から得られた樹脂、ならびに基準となる樹脂に関するクロマトグラフィー結果は、以下の表で与えられる。L53に関する値は、近縁の類似体L49およびL50に基づいて予想された推定値である。
【表３】
2013538798.tif 000175
2013538798.tif 000176
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【表４】
2013538798.tif 000178
2013538798.tif 000179
2013538798.tif 000180
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【０３７２】
対照は、すべての抗体とほとんど100％近くまで結合した。プロテインAは宿主細胞タンパク質（HCP）とまったく結合しなかったが、A2Pおよびハイパーセルはそれに対して高い結合性を示した。その結果もたらされた選択指数は、プロテインAについては10.0、A2Pについては1.0、ハイパーセルについては1.3であった。
【０３７３】
実施例２からのテスト済みサンプルのうち、L1、L27、L31、およびL37は、抗体結合および選択性についてはもっとも良い結果を示した。それらはすべて、テストしたすべてのヒトIgG抗体と、90%を越えるまで結合したので、包括的なFcバインダーの結合特性を有している。これと合致して、L1およびL27はベバシズマブのFcフラグメントと結合したが、Fabフラグメントとは結合しなかった。それに加えて、L1については、ウサギpoly-IgGの効率的な結合が実証された。ベバシズマブ、トシリズマブ、およびパリビズマブのクロマトグラフィー後の収率は、87%から100%までの間でさまざまであった。poly-IgGの収率はわずかに低く、70%から90%までの範囲であった。選択指数は、L1については3.3、L27については2.9、L31については4.4、L37については3.4であった。実施例２からの他のリガンドは、テストした抗体のうち少なくとも1つの結合の低下を示すか、または40%を越えるまでのHCPの結合を示した（その結果もたらされた選択指数は2.5以下となった）。
【実施例５】
【０３７４】
結合の等温式および時間尺度
実験
実験は抗体としてベバシズマブを用いて行った。精製抗体に関するラングミュア（Langmuir）等温式のパラメーターは、96ウェルマイクロタイタープレートでのバッチ吸着実験によって決定された。各ウェル内で、吸着剤スラリー（50% v/v）10μLを100μLのタンパク質溶液と混合した。初濃度はリン酸緩衝食塩水（0.15 M NaCl、20 mMリン酸バッファー、pH 7.3; PBS）中で0.05から5 mg/mLまでさまざまとした。反応は25℃にて少なくとも3時間、激しく撹拌して行った。その後、Bradfordアッセイにより上清中の抗体濃度を測定した。
【０３７５】
取り込み速度は、96ウェルフィルタープレートでバッチ吸着により同様に調べた。この場合もやはり、吸着剤スラリー（50% v/v）10μLを100μLのタンパク質溶液と混合した。しかしながら、PBS中、一定の初濃度の0.75 mg/mLベバシズマブを使用した。反応は25℃にて最大80分まで、激しく撹拌して行った。2.5、5、10、20、40、および80分後にフィルターを通して遠心することによって上清を速やかに分離し、分析用にサンプリングした。抗体濃度はBradfordアッセイにより分析した。
【０３７６】
概要および結果
実施例３の固定化リガンドのサブセットの特徴を、ベバシズマブに対する親和性および最大容量について明らかにした。さらに、L1については結合に必要な時間尺度を決定した。市販の樹脂、組換えプロテインA セファロース FF (組換えプロテインA) およびマブゾーベントA2P (A2P)を比較のために含めた。
【０３７７】
ラングミュア等温式のパラメーター、すなわち解離定数Kdおよび最大容量qmは、上清で測定された濃度から決定された。パラメーターはChase（4）によって導き出されたモデル方程式に数値を当てはめて推定した。
【０３７８】
取り込み速度は、結合の時間尺度t0.8によって特徴付けられるが、この時間尺度は、樹脂が抗体と80%の平衡飽和に達した時間として定義された。t0.8を決定するために、上清中で測定された濃度を、二重指数関数のフィッティングによって内挿し（5）、グラフからt0.8の値を読み取った。当社製の樹脂ならびに基準とする樹脂に関する、ラングミュア等温式のパラメーター、および結合の時間尺度を下記の表において報告する。
【表５】
2013538798.tif 000182
【０３７９】
もっとも高い親和性は組換えプロテイン Aについて観察され、そのKdは4.7μg/mLであった。A2P（49μg/mL）、樹脂L1（61μg/mL）、およびL27（92μg/mL）の解離定数は一桁低い。残りの樹脂の解離定数は二桁低く、103μg/mL（L23）から252μg/mL（L17）までの範囲であった。最大容量については、もっとも高い容量はA2Pについて測定された（樹脂mLあたり69 mg）。組換えプロテインAの最大容量は樹脂mLあたり41 mgであった。当社製の樹脂の最大容量は、樹脂mLあたり26から37 mgまでさまざまであった。抗体の取り込みは、組換えプロテインAで最も早く（8.9分）、次にA2P（9.3分）およびL1（9.9分）であった。
【実施例６】
【０３８０】
動的結合容量
実験
精製ベバシズマブを用いたカラムクロマトグラフィーによって動的結合容量を測定した。長さ25 mm、内径3 mmの分析用カラムに樹脂を充填した。リン酸緩衝食塩水（150 mM NaCl、20 mMリン酸バッファー、pH 7.3）中1 mg/mLの抗体を一定の流速でカラムに供給し、溶出液の抗体濃度を280 nmの吸光度によりオンラインでモニターした。溶出液濃度が供給濃度の少なくとも10%に達するまで、抗体をロードした。動的結合容量は、空のカラム滞留時間が3分に相当する、50 cm/hの流速で測定した。50 cm/hの流速で、抗体が完全に通り抜けるまでロードすることによって、平衡容量も測定した。pH 3.0のクエン酸ナトリウム、つづいてpH 2.5のグリシン塩酸塩で洗浄することによって、結合した抗体をカラムから取り除いた。
【０３８１】
概要および結果
流速の関数としてのベバシズマブの動的（結合）容量を、L1（実施例３より）および組換えプロテイン A セファロース 4 FF（組換えプロテイン A）について測定した。
【０３８２】
「動的容量（動的キャパシティー）」は、溶出濃度が供給濃度の10%に達するまで一定の流速でカラム上に導入することができる抗体の量として定義された。それは、10%の流出が生じるまでの時間t0.1に流速Fおよび供給濃度Cfを乗じて算出された。
【数４】
2013538798.tif 000183
【０３８３】
平衡容量（平衡キャパシティー）は、与えられた供給流の濃度に関する、カラムに結合する抗体の最大量として定義される。それは、供給濃度Cf、経時的な溶出濃度c(t)、および流速Fを含む、以下の積分方程式で算出された。
【数５】
2013538798.tif 000184
【０３８４】
その積分は数値として求められた。積分法は完全な通り抜けが起こるまでの時間に限定された。動的容量および平衡容量の計算はいずれも、カラムおよびクロマトグラフィー系の残留液について補正された。容量は、カラム内の樹脂の容積によって標準化された。
【０３８５】
流速の関数としてのL1および組換えプロテイン A セファロース 4 FFに関する動的結合容量、および1 mg/mLベバシズマブの供給濃度に対する平衡結合容量は、下記の表で与えられる。
【０３８６】
組換えプロテイン Aについては、樹脂mLあたり28.4 mgの動的結合容量が測定された。L1の動的容量は樹脂mLあたり20.2 mgであった。算出された平衡容量は、組換えプロテイン Aについては40 mg/mL樹脂であり、L1については25.7 mg/mL樹脂であった。
【表６】
2013538798.tif 000185
【実施例７】
【０３８７】
アルカリ安定性
実施例２から得られたリガンドL1のアルカリ安定性を8日間にわたって調べた。L1は25℃にて、0.1 Mまたは0.5 M水酸化ナトリウムで処理した。加水分解をLC-MS分析でモニターした。
【０３８８】
0.5 M NaOHでは、L1の半減期は288時間であった。0.1 M NaOHでは、リガンドの分解は検出されなかった。
【実施例８】
【０３８９】
細胞培養上清からの抗体の精製
実験
実施例3と同様のマイクロタイタープレートクロマトグラフィー、または通常のカラムクロマトグラフィーのいずれかによって、細胞培養上清からの抗体精製のための樹脂の適合性を、充填された状態で評価した。いずれの場合も、宿主細胞タンパク質に0.05 mg/mLの濃度で添加したベバシズマブを供給材料として使用した。それに加えて、宿主細胞タンパク質（マイクロタイタープレートおよびカラムクロマトグラフィー）および精製抗体（マイクロタイタープレートクロマトグラフィーのみ）だけを用いたクロマトグラフィー分析を実行した。マイクロタイタープレートクロマトグラフィー用には、分析ごとに25カラム容を注入した。カラムクロマトグラフィー用には、100カラム容を注入した。カラムは注入の前後にPBSで平衡化し、洗浄した。結合したタンパク質は、pH 3.0のクエン酸ナトリウムで溶出した。供給材料およびカラム溶出液中のタンパク質濃度は、Bradfordアッセイまたは280 nmのUV吸収で分析した。
【０３９０】
概要および結果
抗体は、実施例3の樹脂L1によるにクロマトグラフィーによって、細胞培養上清から精製した。比較のために、市販の樹脂、組換えプロテイン A セファロース 4 FF（組換えプロテイン A）およびマブゾーベントA2P（A2P）によるクロマトグラフィーも含めた。マイクロタイタープレートクロマトグラフィーについては、同一条件下で3つのクロマトグラフィー分析を、それぞれの樹脂上で、抗体、宿主細胞タンパク質、または後者の混合物を注入して行った。カラムクロマトグラフィーについては、分析は、宿主細胞タンパク質中に抗体を添加したもの、または宿主細胞タンパク質だけを用いて、2回のみ行った。
【０３９１】
混合物のクロマトグラフィー後の工程収率は、混合物の注入後に溶出で回収される全タンパク質の質量mmix,e、宿主タンパク質のみを注入後に回収される質量mHCP,e、および注入された抗体の質量mAb,iから算出された。
【数６】
2013538798.tif 000186
【０３９２】
混合物をクロマトグラフィーにかけた後の抗体の純度は、混合物注入後に溶出で回収された全タンパク質の質量mmix,e、および宿主細胞タンパク質の注入後に回収された質量mHCP,eから算出された。
【数７】
2013538798.tif 000187
【０３９３】
実施例３の樹脂L1、および対照となる樹脂によるクロマトグラフィー後に得られた純度および収率を下記の表に示す。
【０３９４】
実験精度の範囲内で、収率は、マイクロタイタープレートクロマトグラフィー後、組換えプロテイン Aについては100%、L1については85%、ならびにA2Pについては12%であった。A2Pからの回収（12%）は、溶出時のpHが中程度の酸性である3.0であったため低かった。純度は、組換えプロテイン Aでのクロマトグラフィー後がもっとも高く（100%）、次が樹脂L1によるクロマトグラフィー（74%）であった。A2Pでのクロマトグラフィー後の純度が最も低く、わずか32%であった。カラムクロマトグラフィー後の結果は、同様の範囲となった。ここで、組換えプロテイン Aは収率97%ならびに純度100%を示した。L1は収率90%ならびに純度83%を示した。
【表７】
2013538798.tif 000188
【０３９５】
実施例に引用された文献：
1. T. Neumann, HD Junker, K. Schmidt, R. Sekul, SPR Based Fragment Screening: 
Advantages and Applications, Current Topics in Medicinal Chemistry 2007; 7: 1630-1642
2. Roth M. Fluorescence reaction for amino acids. Anal Chem 197; 43(7):880-2.
3. Rousseaux J, Rousseaux-Prevost R, Bazin H. Optimal conditions for the preparation of Fab and F(ab')2 fragments from monoclonal IgG of different rat IgG subclasses. J. Immunol. Methods 1983; 64(1-2):141-146.
4. Chase HA. Prediction of the performance of preparative affinity chromatography. J Chromatogr 1984; 297:179-202.
5. Coffman JL, Kramarczyk JF, Kelley BD. High-throughput screening of chromatographic separations: I. Method development and column modeling. Biotechnology and Bioengineering 2008; 100(4):605-618.
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月4日(2012.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体もしくは抗体フラグメントをアフィニティ精製するための、支持体材料および支持体材料に共有結合した少なくとも1つのリガンドを含んでなるリガンド置換されたマトリックスの使用、
ここで該リガンドは式（I）、
【化１】
2013538798.tif 000192
[式中、
Lはリガンドが結合される支持体材料上の連結ポイントである；
Spはスペーサー基である；
vは0もしくは1である；
Amはアミド基-NR1-C(O)-であり、NR1がAr1に結合し-C(O)-がAr2に結合しているか、または-C(O)-がAr1に結合していてNR1がAr2に結合しているかのいずれかであり；かつ、
R1は水素もしくはC1-C4アルキルであり、好ましくは水素もしくはメチルであり；より好ましくは水素である；
Ar1は、2価の、5員もしくは6員の置換もしくは非置換芳香環であり、ここで該置換基はC1-C4アルコキシ、C1-C4アルキルおよびそれらの組み合わせから選択され；
Ar2は、5員もしくは6員の置換もしくは非置換複素環式芳香環であって、それが、
(a) 単結合を介して、さらなる5員もしくは6員芳香環に結合している；または
(b) 多環式環系の一部として、さらなる5員もしくは6員芳香環と縮合している；または
(c) C1-C4アルキル；C2-C4アルケニル；C2-C4アルキニル；ハロゲン；C1- C4ハロアルキル；ヒドロキシ置換C1-C4 アルキル；C1-C4アルコキシ；ヒドロキシ置換C1-C4アルコキシ；C1-C4アルキルアミノ；C1-C4アルキルチオ；およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの置換基に結合しており、
ここで(a)および(b)における第１の芳香環もしくは第２の芳香環またはその両方は、場合により(c)において言及されたさらなる置換基を１以上有しうる、
前記5員もしくは6員複素環式芳香環である]
で表される前記使用。
【請求項２】
Ar1がフェニレン、好ましくはメトキシ置換フェニレンである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
C=OおよびNH基が互いにメタ位でAr1に結合している、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
Ar2の5員もしくは6員複素環式芳香環が、環員ヘテロ原子、好ましくは窒素もしくは酸素原子に隣接する環員炭素原子を介してC=O基と結合している、請求項１〜３のいずれか1つに記載の使用。
【請求項５】
Ar2の5員もしくは6員複素環式芳香環が、2個以上の窒素原子、または1個以上の窒素原子および1つの酸素原子を含有する、請求項１〜４のいずれか1つに記載の使用。
【請求項６】
Ar2の5員もしくは6員複素環式芳香環が、N-メチル置換ピラゾール、ピリジン、イソオキサゾール、またはオキサジアゾ-ルである、請求項１〜５のいずれか1つに記載の使用。
【請求項７】
支持体材料が、炭水化物または架橋炭水化物、好ましくはアガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、アルギン酸塩およびカラギーナン、セファロース（Sepharose）、セファデックス（Sephadex）；合成ポリマー、好ましくはポリスチレン、スチレン-ジビニルベンゼンコポリマー、ポリアクリレート、PEGポリアクリレートコポリマー、ポリメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアミド、およびパーフルオロカーボン；無機材料、好ましくはガラス、シリカ、および金属酸化物；ならびに複合材料から選択される材料を含む、請求項１〜６のいずれか1つに記載の使用。
【請求項８】
タンパク質が抗体、好ましくはIgG型抗体、またはFc融合タンパク質である、請求項１〜７のいずれか1つに記載の使用。
【請求項９】
リガンド置換されたマトリックスのリガンドと、抗体もしくは融合タンパク質の、Fcフラグメントまたはドメインとの結合によって精製が達成される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
Fcフラグメントもしくはドメイン、または抗体が、IgG抗体クラスに属し、より好ましくはヒトIgGに属し、またはヒト起源のポリクローナルもしくはモノクローナルIgG、特にIgG1、IgG2およびIgG4に属する、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１つに記載のリガンド置換されたマトリックス。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１つに記載の式（I）のリガンドを支持体材料に結合させる、請求項１１に記載のリガンド置換マトリックスを合成する方法。
【請求項１３】
タンパク質のアフィニティ精製、好ましくはアフィニティクロマトグラフィーのための方法であって、精製されるべきタンパク質を、請求項１〜７のいずれか１つに記載のリガンド置換マトリックスと接触させる、前記方法。
【請求項１４】
タンパク質が抗体もしくはFc融合タンパク質であって、リガンドが抗体もしくはFc融合タンパク質のFc領域に結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
次式（II）
【化２】
2013538798.tif 000193
（II）
[式中Sp、Ar1、Ar2、およびAmが請求項１〜７で定義される意味を有する]
に示すリガンド。
【国際調査報告】
2013538798.tif 000194
2013538798.tif 000195
2013538798.tif 000196