(57)【要約】  本発明は、以下のステップ：（a）界面活性剤をある容量の水又は水溶液に溶解し、界面活性剤溶液を調製するステップ、及び、（b）前記界面活性剤溶液を、前記界面活性剤溶液よりも容量が多いある容量の水又は水溶液で希釈し、水相を調製するステップを含む、水中油型エマルションの製造のためのプロセスを提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：（a）界面活性剤をある容量の水又は水溶液に溶解し、界面活性剤溶液を調製するステップ、及び、（b）前記界面活性剤溶液を、前記界面活性剤溶液よりも容量が多い、ある容量の水又は水溶液により希釈し水相を調製するステップを含む、水中油型エマルションの製造のためのプロセス。
【請求項２】
界面活性剤溶液の容量が、水相の全容量の、約0.001%〜約40%、約0.01%〜約20%、約0.02%〜約15%、約0.03%〜約10%、約0.04%〜約5%、又は約0.05%（v/v）を構成する請求項1に記載のプロセス。
【請求項３】
製造される水中油型エマルションの容量が、約10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450、500、又は550リットル（L）より多く、例えば、50L、280L又は560Lスケールである、請求項1又は2に記載のプロセス。
【請求項４】
界面活性剤溶液を、界面活性剤溶液よりも容量が多いある容量の水又は水溶液に、ポンプ、特にぜん動性ポンプ又は膜ポンプを用いて添加する、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項５】
水相が、水中油型エマルションの、約80%〜約98%、約85%〜約97%、約89%〜約96%、又は約90%〜約95%、例えば約90%又は約95%（v/v）を構成する、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項６】
界面活性剤がモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（TWEEN 80／ポリソルベート80）である、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項７】
ステップ（a）の水溶液が、濃縮バッファーであって良いバッファーを含む、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項８】
水がステップ（b）において用いられる請求項7に記載のプロセス。
【請求項９】
水がステップ（a）において用いられる請求項1〜6のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１０】
ステップ（b）の水溶液が、濃縮バッファーであって良いバッファーを含む請求項9に記載のプロセス。
【請求項１１】
バッファーを含む水溶液がステップ（a）及びステップ（b）の両方において用いられる請求項1〜6のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１２】
バッファー又は濃縮バッファーが、クエン酸ナトリウム−クエン酸バッファーを含む請求項7〜11のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１３】
バッファー又は濃縮バッファーが、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液である請求項7〜11のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１４】
PBSが改変PBSである請求項13に記載のプロセス。
【請求項１５】
水相を混合装置に加えるステップ（c）をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１６】
油相を混合装置に加えるステップ（d）をさらに含む請求項15に記載のプロセス。
【請求項１７】
ステップ（c）及び（d）が実質的に同時に行われる請求項16に記載のプロセス。
【請求項１８】
ステップ（c）及び／又は（d）を油相及び／又は水相を含むタンク内を正圧にして行う請求項15〜17のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１９】
水相及び油相を約90:10の比（％、v/v）で加える請求項16〜18のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２０】
混合装置が高せん断ホモジナイザー又は高圧ホモジナイザーである請求項15〜19のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２１】
油相と水相を混合し、水中油型エマルションを形成するステップ（e）を含む請求項16〜20のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２２】
ステップ（e）の水中油型エマルションを高圧均質化に供し、サブミクロンの水中油型エマルションを形成するステップ（f）をさらに含む、請求項21に記載のプロセス。
【請求項２３】
ステップ（f）が2、3、4、5、又は6回行われる請求項22に記載のプロセス。
【請求項２４】
高圧均質化が、約10000〜約20000psi、約12000〜約18000psi、約14000〜約16000 psi、又は約15000±1000psiで行われる請求項22又は23に記載のプロセス。
【請求項２５】
サブミクロンの水中油型エマルションを、ステップ（f）が行われる各回の後に、約15℃〜約30℃、約16℃〜約29℃、約17℃〜約28℃、約16℃〜約27℃、又は約16℃〜約28℃まで冷却する、請求項22〜24のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２６】
油相がスクアレンを含む請求項16〜25のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２７】
油相が界面活性剤を含む請求項16〜26のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２８】
界面活性剤がトリオレイン酸ソルビタン（SPAN 85）である請求項27に記載のプロセス。
【請求項２９】
油相がトコールを含む請求項16〜26のいずれかに記載のプロセス。
【請求項３０】
トコールがα−トコフェロールである請求項29に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水中油型エマルション、特に、スクアレンを含むサブミクロンの水中油型エマルションの製造のための改善されたプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は水中油型エマルションの製造のためのプロセスに関する。製造方法は、Ott et al., 2000 (The Adjuvant MF59: A 10-year Perspective. Vaccine Adjuvants: Preparation methods and Research Protocols [Methods in Molecular medicine, Vol. 42, Chapter 12, p211-228]）、Ott et al., 1995 (MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines: Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach [Pharmaceutical Biotechnology volume 6] eds. Powell & Newman）、 WO06/100110A1、及び、Lidgate et al., 1992 (Sterile Filtration of a Parenteral Emulsion. Pharmaceuticals Research 9(7): 860-863)に開示されている。
【０００３】
水中油型エマルションは、ワクチン／免疫原性組成物において、アジュバントとして用いることができる。これらのエマルションはヒトに投与されるので、エマルションが無菌であることが必要である。アジュバントとして用いられる水中油型エマルションはサブミクロンのエマルションであり、その油滴は0.2μmのフィルターで滅菌ろ過するのに、十分に小さい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO06/100110A1
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ott et al., 2000 (The Adjuvant MF59: A 10-year Perspective. Vaccine Adjuvants: Preparation methods and Research Protocols [Methods in Molecular medicine, Vol. 42, Chapter 12, p211-228]）
【非特許文献２】Ott et al., 1995 (MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines: Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach [Pharmaceutical Biotechnology volume 6] eds. Powell & Newman）
【非特許文献３】Lidgate et al., 1992 (Sterile Filtration of a Parenteral Emulsion. Pharmaceuticals Research 9(7): 860-863)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的はサブミクロンの水中油型エマルションの製造のためのプロセスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、水中油型エマルションの製造のためのプロセスに関し、特に、以下のステップ：(a)界面活性剤をある容量の水又は水溶液に溶解し、界面活性剤溶液を調製するステップ、及び、(b)前記界面活性剤溶液を、前記界面活性剤溶液よりも容量が多いある容量の水又は水溶液で希釈し、水相を調製するステップを含む、水中油型エマルションの製造のためのプロセスに関する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
水中油型エマルションは、油相（一以上の油、及び任意に一以上の界面活性剤を含む）を、界面活性剤を含む水相と組み合わせ、混合することによって調製される。界面活性剤は、安定なエマルション（すなわち、短い時間で油相と水相に分離しないエマルション）の形成を可能とする。
【０００９】
本発明者は、界面活性剤を少量の液体に溶解し、その後、生じた界面活性剤溶液をより多量の液体に添加することで、界面活性剤が水相に、完全に、かつ確実に溶解する事を示した。界面活性剤を多量の液体に直接添加すると、界面活性剤は多量の液体を含む容器（例えばタンク）の底に集まり、溶解が困難になる。界面活性剤がタンクの底に留まれば、エマルションの組成及び安定性に影響が及び得る。
【００１０】
したがって、本発明は、以下のステップ：(a)界面活性剤をある容量の水又は水溶液に溶解し、界面活性剤溶液を調製するステップ、及び、（b）前記界面活性剤溶液を、前記界面活性剤溶液よりも容量が多いある容量の水又は水溶液で希釈し、水相を調製するステップを含む、水中油型エマルションの製造のためのプロセスを提供する。
【００１１】
本発明のプロセスは、多量の水中油型エマルションを調製し、それ故に多量の水相を用いる際に特に有益である。したがって、本発明の特定の実施形態では、製造される水中油型エマルションの容量が、約10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450、500、又は550リットル（L）より多く、例えば、50L、280L又は560Lスケールである、本明細書に記載のプロセスを提供する。
【００１２】
界面活性剤溶液は、界面活性剤溶液よりも容量が多いある容量の水又は水溶液に対して、注ぐ等、どんな方法でも添加できる。特定の実施形態では、界面活性剤溶液を、界面活性剤溶液よりも容量が多いある容量の水又は水溶液に対して、ポンプ、特にぜん動性ポンプ又は膜ポンプを用いて添加する。
【００１３】
本発明のプロセスは、多量の水相を用いる際に特に有益であり、したがって一実施形態では、水相が水中油型エマルションの、約80%〜約98%、約85%〜約97%、89%〜96%、又は約90%〜95%、例えば約90%又は約95%（v/v）を構成する、本明細書に記載のプロセスを提供する。
【００１４】
本発明における界面活性剤溶液の容量（すなわち、ステップ（a）の産物）は、ステップ（b）において希釈に用いる水又は水溶液の容量よりも少ない。したがって、一実施形態では、界面活性剤溶液は水相の全容量の、約0.001%〜約40%、約0.01%〜約20%、約0.02%〜約15%、約0.03%〜約10%、約0.04%〜約5%、例えば、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10%（v/v）を構成する。
【００１５】
界面活性剤は水又は水溶液のどちらかに溶解する。特に、水は注射用水（WFI）、すなわち非経口的な使用に適した水、であっても良い。あるいは、界面活性剤はバッファー等の水溶液に溶解する。前記バッファーもまた非経口的な使用に適している。
【００１６】
好適なバッファーは当業者によく知られており、限定するものではないが、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、トリスバッファー、コハク酸バッファー、マレイン酸バッファー又はホウ酸バッファーを含む。特定の実施形態では、バッファーは、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、改変PBS（PBS−mod）及びクエン酸バッファー、のグループから選択される。
【００１７】
バッファーをステップ（a）において用いる際には、特定の実施形態で、バッファーを水相における最終濃度に対して濃縮しても良く、例えばバッファーを約5〜25倍、例えば、5、10、15、20、25、30倍濃縮しても良い。水をステップ（a）において用いる際は、特定の実施形態で、界面活性剤溶液を希釈するのにバッファーを用い、このバッファーは濃縮しても濃縮しなくても良い。
【００１８】
本発明の特定の実施形態では、以下のステップ：（a）界面活性剤（例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）をある容量の濃縮バッファー（例えば、PBS-mod）に溶解し、界面活性剤溶液を調製するステップ、及び、（b）前記界面活性剤溶液を、前記界面活性剤溶液よりも容量が多いある容量の注射用水（WFI）で希釈し、水相を調製するステップを含む、水中油型エマルションの製造のためのプロセスを提供する。
【００１９】
本発明の特定の実施形態では、以下のステップ：（a）界面活性剤（例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）をある容量のWFIに希釈し、界面活性剤溶液を調製するステップ、及び、（b）前記界面活性剤溶液を、前記界面活性剤溶液よりも容量が多く、濃縮バッファーであっても良い、ある容量のバッファー（例えば、クエン酸バッファー）で希釈し、水相を調製するステップを含む、水中油型エマルションの製造のためのプロセスを提供する。
【００２０】
一実施形態では、バッファーをステップ（a）及び（b）の両方において用いても良く、特定の実施形態では、同じバッファーをステップ（a）及び（b）の両方において用いる。そのような場合、バッファーは概して濃縮しない。しかしながら一実施形態では、ステップ（a）におけるバッファーは濃縮バッファーである一方で、ステップ（b）におけるバッファーは希釈バッファーである。
【００２１】
好適な界面活性剤は当業者によく知られており、限定するものではないが、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（TWEEN 80、ポリソルベート80）、トリオレイン酸ソルビタン（SPAN 85）、ホスファチジルコリン（レシチン）、及びオクトキシノール−9（TRITON X−100）を含む。本発明の特定の実施形態では、ステップ（a）で用いられる界面活性剤は、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（TWEEN 80、ポリソルベート80）である。
【００２２】
本発明の一実施形態では、水相中に混合される界面活性剤の量は、水中油型エマルション中の前記界面活性剤の最終濃度が、約0.1%〜約1.5%、例えば約0.5%〜約1%となる量（w/v）である。一以上の他の界面活性剤を油相に対して添加しても良く、例えばトリオレイン酸ソルビタンを（例えばスクアレンを含む）油相に添加した後に、油相と水相を共に混合しても良い点に留意されたい。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、水相（すなわち、ステップ（b）の産物）を混合装置へ加えるステップ（c）をさらに含む、本明細書に記載のプロセスを提供する。
【００２４】
本明細書で使用される用語「混合装置」は油相と水相を混合し、エマルションを形成するのに適した装置を意味する。本発明の特定の実施形態では、混合装置は高せん断混合装置である。好適な高せん断混合装置は当業者に知られており、限定するものではないが、高速のブレードホモジナイザー、インラインホモジナイザー、コロイドミル又はソノレーター（sonolator）を含む。本発明の特定の実施形態では、混合装置は高圧ホモジナイザーである。好適な高圧ホモジナイザーは当業者に知られており、限定するものではないが、固定形状（fixed geometry）マイクロフルイダイザー又は可変形状（variable geometry）高圧ホモジナイザーを含む。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、油相を、本明細書に記載の混合装置に加えるステップ（d）をさらに含む、本明細書に記載のプロセスを提供する。
【００２６】
本発明の特定の実施形態では、水相（ステップ（c））及び油相（ステップ（d））の添加は実質的に同時に行われる。
【００２７】
特定の実施形態では、ステップ（c）及び／又はステップ（d）を油相及び／又は水相を含むタンク内を正圧にして行う。
【００２８】
油相は一以上の代謝可能な油を含んでも良い。特定の実施形態では、油相はスクアレン又はスクアラン、特にスクアレンを含む。本発明の別の実施形態では、油相はトコールを含み、本発明の特定の実施形態では油相はα−トコフェロールを含む。本発明の別の実施形態では油相はスクアレン及びα−トコフェロールを含む。
【００２９】
油相は本明細書に記載の界面活性剤をさらに含んでも良い。本発明の特定の実施形態では、油相はトリオレイン酸ソルビタン（SPAN 85）を含み、本発明の特定の実施形態では、油相はスクアレン及びトリオレイン酸ソルビタン（SPAN 85）を含む。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の水相及び油相は約90:10又は約95:5（％v/v）の比で加える。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、油相及び水相を混合し、水中油型エマルションを形成するステップ（e）をさらに含む、本明細書に記載のプロセスを提供する。
【００３２】
ステップ（e）における混合に続いて、例えば高せん断混合装置等において混合する場合には、水中油型エマルションは粗い水中油型エマルションであっても良い。水中油型エマルション中の油滴のサイズを小さくし、例えば滅菌ろ過に適したものとするために、ステップ（e）のエマルションを、例えば高圧ホモジナイザーでさらに処理しても良い。
【００３３】
したがって、本発明のさらなる実施形態では、ステップ（e）の水中油型エマルションを高圧均質化に供し、サブミクロンの水中油型エマルションを調製するステップ（f）をさらに含む、本明細書に記載のプロセスを提供する。
【００３４】
当業者は、エマルションが高圧ホモジナイザーを通過する回数を変化させることで、所望の油滴サイズを得ることができる。なぜならば、油滴サイズが各サイクル後に小さくなるからである。したがって、本発明の一実施形態では、エマルションを1、2、3、4、5、6、7、8回又はそれ以上高圧均質化に供するステップ（f）を含む、本明細書に記載のプロセスを提供する。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、高圧均質化を、約10000〜約20000psi、約12000〜約18000psi、約14000〜約16000psi、又は15000±1000psiの圧力で行う。
【００３６】
高圧均質化の間、水中油型エマルションの温度は概して上昇し、したがって本発明の一実施形態では、一以上の均質化の後、少なくとも最後にエマルションを高圧均質化に供した後に、水中油型エマルションを約15℃〜約30℃、約16℃〜約29℃、約17℃〜約28℃、約16℃〜約27℃、又は約16℃〜約28℃に冷却する。
【００３７】
本明細書の用語「含む」「から成る」及びそのバリエーション等は、全ての場合において、用語「構成される」及びそのバリエーション等に任意に置換可能であると理解されたい。
【００３８】
単語「実質的に」は「完全に」を除外せず、例えばYを「実質的に含まない」組成物は完全にYを含まなくても良い。必要な場合、単語「実質的に」は本発明の定義から除外されても良い。
【００３９】
数値Xに対する用語「約」は±5%又は10%を意味する。
【００４０】
本発明を、以下の制限するものではない実施例を参照し、さらに記載する。
【実施例】
【００４１】
1.1 水相の調製
ステンレス鋼タンクを、水相の調製のために（タンク1とする）、及びエマルション循環のために（タンク2とする）用い、使用前に窒素（N2）で不活性化した。
【００４２】
水相は、以下の二つのステップで調製した：
（a）ポリソルベート80を、瓶又はビニール袋に入れた、濃縮等張リン酸緩衝生理食塩水溶液（PBS-modバッファー20×（表1参照））に溶解した。
【００４３】
（b）注射用水をステンレス鋼タンク（タンク1）に満たし、使用前にN2で不活性化した。少量スケール（70Lまで）のプロセスのためには、その後、PBS-modバッファー20×／ポリソルベート80混合物を上板の開口からタンクに注ぎ、タンク1に入っているWFIで希釈し、均一になるまで攪拌した。あるいは、大きなスケール（70L以上）では、リン酸緩衝生理食塩水で希釈したポリソルベート80を、タンク1に入れた約5Lの水でさらに希釈し、その後希釈溶液をタンク1にぜん動性ポンプで送り出した。この場合、ポンプ送出が可能な粘稠性がより低い溶液を得るのに、WFIでの希釈は不可欠であった。
【表１】
2013533797.tif 000002
【００４４】
1.2 油相の調製
油相を、ステンレス鋼の油タンクに入ったスクアレンに対してD,L−α−トコフェロールを添加することによって調製した。各成分の量は製造するエマルションの最終容量に依存し、重量で決定した。混合物は均一になるまで攪拌した。混合物に対して窒素置換を行った。
【００４５】
1.3 乳化
乳化は室温で行った。
【００４６】
水相と油相を、注入比10%油相／90%水相（v/v）で、同時に高せん断ホモジナイザーに加えた。
【００４７】
高せん断ホモジナイザーの後、エマルションを直接高圧ホモジナイザーに加え、液滴サイズを小さくした。窒素置換を、油タンクで1回目の通過の間、そして全乳化プロセスを通してタンク1及びタンク2において維持した。
【００４８】
1回目の通過後、生じたエマルションを非発熱性のステンレス鋼タンク（タンク2）に回収した。
【００４９】
バッチの全容量が高圧ホモジナイザーを通過したとき、そのバッチをタンク2からタンク1へ通過させ、同じ設備により二回目の処理を行った（2回目の通過）。
【００５０】
高圧ホモジナイザーを3回通過したバッチを、タンク2に回収した（3回目の通過）。
【００５１】
タンクに入ったエマルションは上部の空間の窒素置換によって不活性化し、ろ過前は窒素圧力下で保管した。
【手続補正書】
【提出日】平成25年2月8日(2013.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）ある容量の水又は水溶液に界面活性剤を溶解させて界面活性剤溶液を調製するステップ、及び、（b）前記界面活性剤溶液を、界面活性剤溶液の前記容量より大きい容量の水又は水溶液により希釈して水相を調製するステップを含む水中油型エマルションの製造のためのプロセスであって、製造される水中油型エマルションの容量が、約25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450、500、又は550リットル（L）より大きく、例えば、50L、280L又は560Lスケールである前記プロセス。
【請求項２】
界面活性剤溶液の容量が、水相の全容量の、約0.001%〜約40%、約0.01%〜約20%、約0.02%〜約15%、約0.03%〜約10%、約0.04%〜約5%、又は約0.05%（v/v）を構成する請求項1に記載のプロセス。
【請求項３】
界面活性剤溶液を、界面活性剤溶液の容量より大きい容量の水又は水溶液に、ポンプ、特にぜん動性ポンプ又は膜ポンプを用いて添加する、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項４】
水相が、水中油型エマルションの約80%〜約98%、約85%〜約97%、89%〜96%、又は約90%〜95%、例えば約90%又は約95%（v/v）を構成する、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項５】
界面活性剤がモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（TWEEN 80／ポリソルベート80）である、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項６】
ステップ（a）の水溶液が、濃縮バッファーであってもよいバッファーを含む、前記請求項のいずれかに記載のプロセス。
【請求項７】
水がステップ（b）において用いられる請求項6に記載のプロセス。
【請求項８】
水がステップ（a）において用いられる請求項1〜5のいずれかに記載のプロセス。
【請求項９】
ステップ（b）の水溶液が、濃縮バッファーであってもよいバッファーを含む、請求項8に記載のプロセス。
【請求項１０】
バッファーを含む水溶液がステップ（a）及びステップ（b）の両方において用いられる請求項1〜5のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１１】
バッファー又は濃縮バッファーが、クエン酸ナトリウム−クエン酸バッファーを含むか、又は、改変PBS等のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液である請求項6〜10のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１２】
水相を混合装置に導入するステップ（c）及び／又は、油相を混合装置に導入するステップ（d）をさらに含む、前記請求項いずれかに記載のプロセス。
【請求項１３】
ステップ（c）及び／又は（d）を、油相及び／又は水相が入っているタンク内を正圧にして行う請求項12に記載のプロセス。
【請求項１４】
油相と水相を混合して水中油型エマルションを形成するステップ（e）を含む請求項12又は13に記載のプロセス。
【請求項１５】
ステップ（e）の水中油型エマルションを高圧均質化に供してサブミクロンの水中油型エマルションを形成するステップ（f）をさらに含む、請求項14に記載のプロセス。
【国際調査報告】
2013533797.tif 000003
2013533797.tif 000004