(57)【要約】  複合試料マトリックス中の、脂溶性対象被検体の濃度を検出する方法および装置が開示されている。この方法は、該試料から溶解した電解質を含む有機溶媒中に対象被検体を抽出すること、該有機溶媒中にフリーラジカル種、好ましくはフリー酸素ラジカル種、を供給すること、対象被検体を該フリーラジカル種と反応させること、およびフリーラジカルと反応した被検体の反応生成物濃度を検出するために測定を実施することを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複合試料マトリックス中の脂溶性対象被検体の濃度を検出する方法（１００）であって、
前記試料から、溶解した電解質を含む有機溶媒中に対象被検体を抽出すること（１３０）、
前記有機溶媒中にフリーラジカル種を供給すること（１５０）、
前記対象被検体を前記フリーラジカル種と反応させること（１６０）、および
前記フリーラジカルと反応した被検体の反応生成物濃度を検出するために測定を実施すること（１７０）
を含む方法。
【請求項２】
前記フリーラジカル種がフリー酸素ラジカル種である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記有機溶媒が、フリー酸素ラジカル前駆体をさらに含み、前記フリーラジカル種を供給する工程が前記種を前記酸素ラジカル前駆体から発生させることを含む、請求項１または２に記載の方法（１００）。
【請求項４】
前記フリー酸素ラジカル前駆体が前記溶解した電解質によって含まれる、請求項２に記載の方法（１００）。
【請求項５】
前記フリーラジカル種を発生させる前記工程が、前記有機溶媒を所定の電位で所定の時間保持することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法（１００）。
【請求項６】
前記発生工程に先立ち、基準測定を行なうこと（１４０）、および
前記脂溶性対象被検体の濃度を、前記測定から前記基準測定を差し引くことによって検出すること（１８０）
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法（１００）。
【請求項７】
前記方法が、前記測定を行う前に、前記フリーラジカルと反応した被検体反応生成物を含む前記有機溶媒を分析装置に移すことをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法（１００）。
【請求項８】
前記有機溶媒が、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルおよびジメチルスルホキシドからなる群から選択される非プロトン性溶媒である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法（１００）。
【請求項９】
前記電解質カチオンが、テトラアルキルアンモニウムカチオン、リチウムカチオン、ナトリウムカチオン、マグネシウムカチオン、スルホニウムカチオンおよびクリプテートカチオンからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法（１００）。
【請求項１０】
前記電解質アニオンが、塩化物アニオン、過塩素酸アニオン、テトラフルオロホウ酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロヒ酸アニオン、トリフルオロメタンスルホン酸アニオン、硝酸アニオン、芳香族スルホン酸アニオンおよびカルボン酸アニオンからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法（１００）。
【請求項１１】
前記測定が、電位掃引を含む電気化学的測定であって、前記掃引が前記フリーラジカルと反応した被検体反応生成物の酸化または還元電位を越える少なくとも１つの電圧値を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法（１００）。
【請求項１２】
前記対象被検体がプロポフォールである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法（１００）。
【請求項１３】
脂溶性対象被検体の濃度を検出する装置（２００、３００）であって、
有機溶媒であって前記有機溶媒の中に溶解した電解質をさらに含む有機溶媒中の、フリーラジカル種と対象被検体との、ラジカルと反応した被検体反応生成物の濃度を検出する測定を行う電気化学セルであって、複数の電極（２２１、２２２、２２３；３２１、３２２、３２３）を備える電気化学セル、
前記フリーラジカルと反応した被検体反応生成物の酸化または還元電位を越える少なくとも１つの電圧値を含む複数の電圧を、前記電極に提供するようにプログラムされた制御装置（２５０、３５０）、および
前記複数の電圧に応えて前記電極によって発生された信号から対象被検体の濃度を決定する、前記電極に連結した信号処理部
を備える装置。
【請求項１４】
前記有機溶媒中の干渉種の存在を検出する基準測定を規定する、さらなる複数の電圧を前記電極（２２１、２２２、２２３；３２１、３２２、３２３）に提供するように、前記制御装置（２５０、３５０）がさらにプログラムされ、前記信号処理部が、前記複数の電圧に応えて前記電極によって発生された前記信号と前記さらなる複数の電圧に応えて前記電極によって発生された信号の差から、前記対象被検体の濃度を決定するように適合される、請求項１３に記載の装置（２００、３００）。
【請求項１５】
前記制御装置（２５０、３５０）が、前記フリーラジカル種を発生するための所定の時間の間、一定の電圧信号を発生するようにさらに適合される、請求項１３または１４に記載の装置（２００、３００）。
【請求項１６】
前記フリーラジカル種がフリー酸素ラジカル種である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の装置（２００、３００）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複合媒質における脂溶性分子の電気化学的な検出を向上させる方法および装置に関するものである。具体的には、本発明は、麻酔薬であるプロポフォール（Ｐｒｏｐｏｆｏｌ）を全血中で選択的に測定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
現代のヘルスケアは、様々な化学物質、ならびに疾病の診断、治療および管理を可能とする、種々の体液についての生化学的分析試験に広く依存している。医学的および技術的進歩は、過去数十年にわたって診断試験の範囲を大幅に拡大した。さらに、マイクロシステムやナノテクノロジーのような発展中の技術の出現とともに、人体への理解が高まることで、診断技術への重大な影響を有すると期待されている。
【０００３】
病院における診断試験は、特に、迅速な応答が最重要検討事項であって治療判断がすぐになされるべきである状況において、ますますポイント・オブ・ケア（ＰｏＣ）で行われる。ＰｏＣ試験における最近の進歩にもかかわらず、複数の切実な要求が満たされていないままである。例えば、生体試料中の小分子の検出は、特に十分な特異性が存在する適切な受容体（例えば、酵素、抗体、アプタマー）が無い場合、しばしばとても難易度が高い。この困難さは、分子が脂溶性であり、細胞、脂質およびタンパク質のような試料マトリックスの疎水性成分との関連によって、被検体の大部分が分析に利用できない場合により大きい。
【０００４】
複合媒質（例えば、血液、血漿、唾液、尿、廃水およびそれらの抽出物）における脂溶性分子の検出は、被検体と試料マトリックス成分（例えば、血漿タンパク質および脂質膜）との会合によって、しばしば困難である。自由分子、すなわち被結合分子、の濃度は、ピコモルの範囲である可能性があり、最も一般的に用いられる測定技術、例えば電気化学的、光学的技術、の感度限界をしばしば下回る。この理由から、複合媒質における脂溶性分子検出の最先端技術は、有機溶媒中への試料の希釈／抽出、遠心分離、蒸発および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析のような徹底的な試料調製をしばしば伴う。被検体分子の特有の性質に応じて、溶出化合物のＨＰＬＣ後カラム検出は、吸光分光法または蛍光測定法のような電気化学的または光学的方法を用いて行われる。
【０００５】
複合試料中の脂溶性分子のＨＰＬＣ試験の複雑且つ時間のかかる性質は、これらの試験が非常に小数の専門的な研究所によって日常的に行われていることを意味し、この理由から、これらの試験の実用性がかなり制限されている。例えば、多くの脂溶性薬品に関して、代替の、小型試験の開発の明確な必要性がある。このことで、ポイント・オブ・ケア（ＰｏＣ）でのリアルタイムの測定および臨床的介入が可能になるであろう。
【０００６】
電気化学的技術は、そのより低い費用および複雑さから、しばしば光学的技術に比べてポイント・オブ・ケア利用により修正しやすい。しかし、従来の電気化学的分析を用いて水溶液中の脂溶性分子を検出することはしばしば困難または不可能である。これらの困難さについての原因には、疎水性分子および／または電気化学的に発生した反応生成物の表面吸着によるセンサーの汚染（および付随する感度の低下）、タンパク質／脂質のような試料マトリックス成分の疎水性吸着による溶液中の分子の乏しい利用可能性、および高い酸化／還元電位の要求とそれによる試料中の他の分子が被検体信号と干渉する可能性の増加が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０００７】
プロポフォールのようなフェノール化合物は、これらの困難性のよい実例である。フェノキシラジカル中間体の酸化に際し、分子がお互いに反応してダイマーを形成するか、またはキノンにさらに酸化される可能性がある。更なる酸化サイクルによりラジカルダイマーおよびモノマーが発生し、これらがお互いに反応してポリマーを形成する。度重なる測定は、作用電極上に築かれる電気絶縁性ポリマーに起因する感度の低下をしばしばもたらす。より複雑な生体試料において、試料マトリックス成分（例えば、タンパク質、脂質および細胞）の作用電極への疎水性吸着も、感度の深刻な低下をもたらす可能性がある。これらの問題は、水媒体中でフェノール化合物および他の脂溶性化合物に対する信頼性のある試験を開発することが通常は非常に困難であることを意味する。
【０００８】
非水性溶媒は電気化学的検出に関して有用であり、これはこれらの媒質の特性が、上述の問題の多くを軽減するか、あるいは取り除くことができるからである。例えば、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含む、非プロトン性有機媒質のプロトンの不足は、フェノキシラジカルのようなフリーラジカル反応生成物がより一層安定であり、それにより反応系の説明を簡略化することを意味する。疎水性吸着による電極汚染も、これらの溶媒の使用を通じて取り除かれる。
【０００９】
しかしながら、有機溶媒の使用を通じて、水中での測定に関連する問題の全てが回避されるわけではない。例えば、いくつかの被検体には検出に高い酸化および還元電位がそれでも必要であるし、汚染は、特にプロポフォールのようなフェノール化合物に対していまだに起こり得る。したがって、特に分子が、例えば生体試料に由来する、複合試料マトリックスから有機媒質中に抽出される場合、有機媒質中の脂溶性分子の検出および濃度測定の信頼性を改善する必要がある。
【００１０】
多くの脂溶性分子が強力なフリーラジカル捕捉剤である。電気化学的技術を用いて、これらの分子のフリーラジカル捕捉能を研究することは可能である。今までに提示された調査のほとんどは、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２●−）の電気化学的な発生に依存している。このフリーラジカルは、酸素分子の電気化学的還元によってか、または超酸化カリウム（ＫＯ２）の溶媒和によって、水溶媒または有機溶媒中で発生されることができる。Ｏ２●−の反応性は、水中と非プロトン性有機溶媒中で異なる。水性環境中では、Ｏ２●−−は強力な求核試薬として振る舞い、自発的に水と反応してヒドロペルオキシドおよび酸素分子を生み出す。
【化１】
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【００１１】
しかしながら、非プロトン性媒質中では、Ｏ２●−は最大４０分間安定であり、反応する種に応じて、求核試薬、酸化剤、還元剤または塩基として振る舞うことができる。非プロトン性溶媒中でのこれらの種の安定性および多様な反応性は、プロブコール（Ｐｒｏｂｕｃｏｌ）、エブレセン（Ｅｂｌｅｓｅｎ）およびトコフェロール（ビタミンＥ）のような、脂溶性フリーラジカル捕捉剤の活性を測定するために利用されてきた。これらの試験は、これらのフリーラジカル捕捉剤の存在下または不存在下で、スーパーオキシドの減少を測定した。これらの試験の短所は、例えば診断目的のような、臨床環境における使用のために設計されていない点である。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、臨床環境において使用できる、脂溶性対象被検体の濃度を検出する方法を提供しようとするものである。
【００１３】
本発明は、さらに脂溶性対象被検体の濃度を検出する装置を提供しようとするものである。
【００１４】
本発明の第一の側面によれば、複合試料マトリックス中の脂溶性対象被検体の濃度を検出する方法であって、前記試料から溶解した電解質を含む有機溶媒中に対象被検体を抽出すること、前記有機溶媒中にフリーラジカル種を供給すること、前記対象被検体を前記フリーラジカル種と反応させること、および前記フリーラジカルと反応した被検体の反応生成物濃度を検出するために測定を実施することを含む、方法が提供される。
【００１５】
本発明は、脂溶性の対象被検体が、体液、例えば血液、のような複合試料マトリックスから媒質であって、フリーラジカル、好ましくはスーパーオキシドラジカル、が、例えばスーパーオキシドラジカルと脂溶性の対象被検体の反応生成物濃度を測定することによって対象被検体の間接濃度測定を行うのに十分長く安定である媒質、中に抽出することができるという見識に基づくものである。これには、複合試料マトリックス中の対象被検体の濃度が容易に決定でき、その結果、手術室のような臨床環境において脂溶性対象被検体の濃度測定に用いらることができるという利点がある。さらに、求められる試料調製はＨＰＬＣのような技術に要求される調製よりも簡素であり、装置の複雑さ、金銭上のコストおよび測定時間において相当な節約をもたらす。
【００１６】
また、光学的検出法よりもむしろ電気化学的検出法を用いることは、小型化への道を提供する。複合試料マトリックスからの吸着した疎水性材料による電極汚染に関連する一般的な問題も、有機溶媒へ交換することによって避けられる。このことによって、フリーラジカルと反応した被検体が、未反応の被検体と比較して低い電位でいっそう容易に酸化されることがさらに保証される。したがって、他の酸化可能な種による干渉の見込みは、より低い検出電位を用いることで低減される。
【００１７】
本発明の背景において、複合試料マトリックスは、例えばマトリックスが複雑な組成、例えば明らかに（未知の）成分を未知の濃度で有する組成、対象被検体の濃度の決定を妨げる少なくとも一つの成分を有する組成、例えば測定電極を汚染することによって対象被検体の正確な濃度決定を妨害する一つ以上の成分を含む組成などを有しているために、対象被検体の濃度の直接決定が容易でないかまたはむしろ不可能な試料である。
【００１８】
好ましい態様において、好ましい脂溶性の対象被検体はプロポフォールである。プロポフォールは、短時間作用型の、静脈投与される催眠剤である。プロポフォールの使用には、全身麻酔の誘導および維持、人工呼吸器につながれた成人に対する鎮静、および処置上の鎮静が含まれる。プロポフォール濃度のモニタリングは、投薬下の患者の安全および福利にとって決定的に重要である。
【００１９】
一態様において、有機溶媒はフリーラジカル前駆体をさらに含み、ここで、フリーラジカル種を供給する工程が該種をラジカル前駆体から発生させることを含む。フリーラジカル前駆体は、溶解した電解質によって含まれていてもよい。このことには、フリーラジカル種が要求に応じて発生されることができ、それにより脂溶性対象被検体との反応に利用可能なフリーラジカル種の濃度を最大化できるという利点がある。
【００２０】
フリーラジカル種を発生させる工程が、有機溶媒を所定の電位で所定の時間保持することを含んでいてもよい。このことには、簡素、かつ、直接的な方法でフリーラジカル種を発生させるという利点がある。
【００２１】
好ましい態様において、本方法は該発生工程に先立ち、基準測定を行なうこと、および脂溶性対象被検体の濃度をその測定から基準測定を差し引くことによって検出することをさらに含む。このことにより、例えば複合試料マトリックスからも抽出される干渉する種によって発生される信号も、この方法によってフィルターにかけられて取り除かれ得るため、有機溶媒中での脂溶性対象被検体の濃度の正確な決定が可能となる。
【００２２】
こうして、そうでなければ同じ電位での測定で干渉したであろう種からの信号を測定することによって、対象被検体に対する選択性が高められる。特に、フェノールの検出に関して、先行技術に対して著しい改善がある。この場合、種々の電気化学的特性を有するフリーラジカルと反応した生成物への転換は、従来の電気化学的検出に一般的に関連付けられる、フェノールラジカル重合および電極不動態化の問題を回避する。例えば、スーパーオキシドと反応したフェノールが電気化学的に酸化される場合、不動態化は起こらず、したがって、測定の繰り返しに伴って発生する感度の低下がない。
【００２３】
任意に、抽出された対象被検体を含む有機溶媒が、該発生工程に先立ち、ラジカル発生チャンバーに移されてもよく、および／または、フリーラジカルと反応した被検体反応生成物を含む有機溶媒が、該測定の実施に先立ち分析装置に移されてもよい。
【００２４】
適切な有機溶媒には、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルおよびジメチルスルホキシドからなる群から選択される非プロトン性溶媒が含まれるが、これはこれらの溶媒がフリー酸素ラジカル種を安定化するのに特に適しているからである。
【００２５】
好ましくは、電解質カチオンは、テトラアルキルアンモニウムカチオン、リチウムカチオン、ナトリウムカチオン、マグネシウムカチオン、スルホニウムカチオンおよびクリプテートカチオンからなる群から選択される。
【００２６】
好ましくは、電解質アニオンは、塩化物アニオン、過塩素酸アニオン、テトラフルオロホウ酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロヒ酸アニオン、トリフルオロメタンスルホン酸アニオン、硝酸アニオン、芳香族スルホン酸アニオンおよびカルボン酸アニオンからなる群から選択される。上記のカチオンおよびアニオンは、非プロトン性溶媒を用いる場合に好ましい。しかし、適切なカチオンおよびアニオンの選択は、溶媒および行われるべき反応に応じて決まることが理解されるべきである。
【００２７】
一態様において、測定は、電位掃引を含む電気化学的測定であって、該掃引がフリーラジカルと反応した被検体反応生成物の酸化または還元電位と一致するか、または越える少なくとも１つの電圧値を含む。この文脈においては、そのような電位を超える電圧は、正の電位値よりもより正でよく、または、負の電位値よりもより負であってもよい、すなわち、酸化または還元電位の絶対値よりも大きな絶対値を有することが十分に理解されるべきである。そのような電位の選択は、対象被検体とフリーラジカル種の間の反応が進むことを保証する。
【００２８】
本発明の他の側面によれば、脂溶性対象被検体の濃度を検出する装置であって、有機溶媒であって前記有機溶媒の中に溶解した電解質をさらに含む有機溶媒中の、フリーラジカル種と対象被検体との、ラジカルと反応した被検体反応生成物の濃度を検出する測定を行う電気化学セルであって、複数の電極を備える電気化学セル、フリーラジカルと反応した被検体反応生成物の酸化または還元電位を越える少なくとも１つの電圧値を含む複数の電圧を、該電極に提供するようにプログラムされた制御装置、ならびに該複数の電圧に応えて該電極によって発生された信号から対象被検体の濃度を決定する、該電極に連結した信号処理部を備える装置が提供される。
【００２９】
そのような装置は、脂溶性対象被検体の濃度が、前述のように、正確、かつ、速い方法で検出されることができるという利点を有する。
【００３０】
好ましい態様において、有機溶媒中の干渉種の存在を検出する基準測定を規定する、複数の電圧を該電極に提供するように、制御装置がさらにプログラムされ、信号処理部が、該複数の電圧に応えて該電極によって発生された信号と該更なる複数の電圧に応えて該電極によって発生された信号の差から、脂溶性対象被検体の濃度を決定するように適合される。このことにより、脂溶性対象被検体の濃度決定の正確さが、上述のように、さらに改善される。
【００３１】
制御装置が、フリーラジカル種を発生するための所定の時間の間、一定の電圧信号を発生するようにさらに適合されてもよい。これには、ラジカル種がその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で発生されることができるという利点がある。この装置は、フリー酸素ラジカル種を発生させるために電圧掃引が行われている電気化学セルと、液体で接触している別個の電気化学セルを有していてもよい。あるいは、フリーラジカル種が、脂溶性対象被検体の濃度決定に用いられる電気化学セルの中で発生されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
発明の態様は、添付図面を参照して、非制限例によってより詳細に説明される。
【図１】本発明の方法の一態様のフローチャートである。
【図２】本発明の一態様による装置を模式的に描くものである。
【図３】本発明の他の態様による装置を模式的に描くするものである。
【図４】アセトニトリル（ＭｅＣＮ）中でサイクリックボルタンメトリーによって得られた、０．１ｍＭのプロポフォールと０．１ｍＭのテトラエチルアンモニウムクロライド（ＴＥＡＣ）の陰性対照波形を描くものである。
【図５】プロポフォールの存在下、窒素パースの前後の、ＭｅＣＮ中での０．１ｍＭのＴＥＡＣのサイクリックボルタンメトリープロットを描くものである。
【図６】プロポフォールの不存在下、窒素パースの前後の、ＭｅＣＮ中での０．１ｍＭのＴＥＡＣのサイクリックボルタンメトリープロットを描くものである。
【図７】本発明の方法で測定した、一連のプロポフォール濃度の矩形波ボルタンメトリープロットを描くものである。
【図８】図７に描かれた測定から抽出されたプロポフォール濃度のプロットを描くものである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
（図面の詳細な説明）
図面は単に模式的なものであり、実寸で描かれていないと理解されるべきである。同じ参照数字が全図面について用いられ、同一のまたは同様の部分を示すこともまた理解されるべきである。
【００３４】
図１は、本発明の方法１００の一態様のフローチャートを描くものである。図１において破線のボックス中に示された方法工程は、本発明の方法から逸脱せずに削除することができる任意の方法工程である。本発明は、本発明の方法において対象被検体を捕捉するために選択されるラジカル種として、フリー酸素ラジカル種の使用を参照して説明される。しかしながら、これは非制限例としてのみ用いられ、本発明から逸脱せずに他のフリーラジカル種が代わりに用いられてもよいことが理解されるべきである。
【００３５】
方法１００は、工程１１０に開始し、そして工程１９０に終了する。工程１１０で始まった後、この方法は、工程１２０における、脂溶性対象被検体を潜在的に含む複合試料マトリックスの提供に移る。そのような試料は、例えば、医療専門家が任意の適切な方法で患者から試料を収集した後に提供されてもよい。この収集工程は本発明の一部を形成しないことが明確に言及される。代替試料源、例えば非医学的な背景で収集された試料、が同様に実現可能である。
【００３６】
この方法はその後、工程１３０に進み、そこで脂溶性対象被検体が試料マトリックスから抽出され、適切な有機溶媒中に移される。
【００３７】
いかなる適切な抽出方法もこの目的で用いられてよい。交換方法、例えば固相抽出（ＳＰＥ）、 に応じて、測定に干渉し得る任意の種に対して被検体の何らかの精製がこの段階で達成される。好ましい態様において、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む非プロトン性有機溶媒が用いられるが、これらに限定されるものではない。この好ましさの理由は、発生されるフリーラジカル種は、低プロトン活量の溶媒中でずっと長く持ちこたえるからである。しかし、対象被検体分子の、使用中のフリーラジカルに対する反応性に応じて、メタノールを含むプロトン性溶媒を用いることも可能であるが、これに限定されるものではない。溶媒は、溶媒和した電解質も、好ましくは０．１Ｍの濃度で、含むべきである。電解質は、本質的に電気的に絶縁されている非プロトン性溶媒に、フリーラジカル種の（例えば、電気化学的な）発生またはラジカル捕捉反応生成物の電気化学的検出に求められるバックグラウンド伝導性が提供されることを保証する。電解質の濃度は、溶液中に十分なレベルのバックグラウンド伝導性が確立されるように選択される。電解質の選択は、所望の溶媒中での溶解度および対象被検体の電気化学的挙動、例えば下記参照のようにラジカル捕捉形態での酸化電位、によって決定される。加えて、選択された電解質は、好ましくは発生されたフリーラジカル種と（容易に）反応すべきではない。
【００３８】
電解質に好ましいアニオンは、塩化物アニオン、過塩素酸アニオンおよびテトラフルオロホウ酸アニオンである。他の可能な候補には、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロヒ酸アニオン、トリフルオロメタンスルホン酸アニオン、硝酸アニオン、芳香族スルホン酸アニオンおよびカルボン酸アニオンが含まれるが、これらに限定されるものではない。カチオンについては、テトラエチルアンモニウムイオンまたはテトラブチルアンモニウムイオンのようなテトラアルキルアンモニウムイオンが好ましい（ただし、他のテトラアルキルアンモニウムイオンも同様に使用されることができる）。他の候補カチオンには、リチウムイオン、ナトリウムイオンおよびマグネシウムイオン、ならびにスルホニウムイオンおよびクリプテートイオンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
抽出工程は、対象被検体とフリーラジカル種の間の反応に干渉し得る、複合試料マトリックスからの種を取り除くように調整されることができる。例えば、対象被検体がプロポフォールである場合、試料調製／抽出工程は、溶液中でのラジカルの存続期間が対象被検体濃度の正確な決定を可能にするほど十分に長く、あるいはより一般的には、ラジカル被検体反応生成物の検出または被検体ラジカル反応自体と干渉し得る種を取り除くような方法に調整される。たとえ、いくらかのラジカルが溶液の一部と反応したとしても、意図されたものでない反応によるいくつかのラジカルの喪失が濃度測定に影響しないような、過剰な濃度でラジカルは発生されるため、通常は問題にならない。
【００４０】
対象被検体を含む、有機溶媒中の複合媒質の抽出物は、典型的にはラジカル反応／被検体検出モジュールに送られる。この工程は図１には明確に示されていない。このモジュールは、ＳＰＥカラムから分離しているか、またはＳＰＥカラムに流体接続によって直接接続しているかのいずれかであってよく、フリーラジカルと対象被検体の反応に適した環境を提供するべきである。好ましい態様において、このモジュールはラジカルと反応した生成物の検出手段も提供するであろう。しかし、検出モジュールは、図２および図３を用いてより詳細に説明されるように、ラジカル反応モジュールから独立した存在であることもできる（下記参照）。
【００４１】
ラジカル反応／被検体検出モジュール中へ抽出物を移行した後、この方法は、相関または基準測定が行われてもよい任意工程１４０に進んでもよい。そのような測定は、例えば、複合媒質の粗抽出物がフリーラジカル捕捉生成物の測定に干渉しそうな物質を含む場合、有用であり得る。そのような場合、基準または校正測定は、フリーラジカル種の不存在下で行うことができる。例えば、スーパーオキシドラジカルアニオンの電気化学的な発生を利用する好ましい態様において、酸素還元電位より小さい負の電位からスーパーオキシド捕捉被検体酸化電位を越える正の電位に及ぶ正電位ボルタンメトリースキャンが工程１５０、１６０および１７０に進む前に行われることができる。そして、以下により詳細に説明するように、得られる信号は工程１７０で得られる測定から差し引かれることができる。
【００４２】
対象被検体に対するいくぶんかの選択性が、工程１２０において説明された抽出に加えて達成されることが保証されるため、工程１４０が本発明の方法の一部を形成することが好ましい。
【００４３】
工程１５０において、フリー酸素ラジカル種が発生され、脂溶性被検体分子と工程１６０で反応して脂溶性対象被検体とフリー酸素ラジカル種との反応生成物、すなわちラジカル捕捉形態の被検体分子、を形成する。フリー酸素ラジカル種は、いかなる適切な方法によって発生されてもよい。
【００４４】
主要目的は、対象被検体と反応するフリーラジカル種を発生させ、ラジカル捕捉形態の被検体分子である生成物を提供することにある。フリーラジカル発生の可能な方法には、化学的、電気化学的および酵素的方法が含まれるが、これに限定されるものではない。これらの方法は当業者に知られるであろう。最適な方法は、用いられている溶媒系、関連するフリーラジカルおよび対象分析物の反応性によって決まる。
【００４５】
好ましい態様において、スーパーオキシドラジカルアニオン（Ｏ２●−）が電気化学的に発生される。これは適切な電気化学セルの電極を、負の電位で規定の期間保持することで達成されてもよい。例えば、標準カロメル参照電極に対して−２Ｖと−０．６Ｖの間の負の電位を用いて、溶媒和した酸素分子を還元してもよい。
【化２】
2013507609.tif 000004
【００４６】
フリー酸素ラジカル種の発生に続いて、脂溶性対象被検体は電気化学的に発生されたスーパーオキシドアニオンを捕捉して、より容易に酸化可能な種を作り出すであろう。スーパーオキシド捕捉のメカニズムは、被検体自体の性質および用いられる溶媒／電解質系に応じて決まる。Ｏ２●−は、例えば"Organic Chemistry" by H. Lund and O. Hammerich, CRC Press 2000という教科書で知られているように、例えば、酸化剤、還元剤、塩基または求核試薬として振る舞うことができる。
【００４７】
別の態様において、溶媒／電解質系は、超酸化カリウム（ＫＯ２）のようなＯ２●−の源を既に含んでいてもよい。この場合、酸素の電気化学的還元は必要ではないため、工程１５０は省略されてよく、スーパーオキシドと反応した被検体の検出、すなわち工程１７０、がラジカル捕捉形態の被検体分子の形成直後に行われてもよい。
【００４８】
上述のように、フリーラジカルと反応した被検体の検出は、図１に示した本発明の態様方法の工程１７０において行われる。通常、対象被分析分子によるフリーラジカル捕捉の生成物は、未反応の被検体に関連する信号に比べて改善された検出信号を有する。
【００４９】
例えば、電気化学的検出が用いられる場合、フリーラジカル捕捉被検体は、未反応の被検体に関連する信号に比べて、より低い酸化電位および改善された電気化学的信号を有して得る。この電位での電流信号をモニタリングすることによって、このフリーラジカル反応生成物の存在および濃度、従って試料中の元の被検体の存在および濃度、が決定できる。
【００５０】
（電気化学的）測定スペクトル中の、特定の電圧でのピーク電流は、典型的には反応した対象被検体、つまりラジカル複合体、の存在と関連する。副反応で形成される他の種に属する他のピークが電気化学的スペクトルの中に存在することは排除できないが、それらのピークは、典型的にはそれらの異なる酸化または還元電位によって、対象被検体の反応生成物から識別されることができる。したがって、反応した対象被検体、つまりラジカル複合体、と関連する電気化学的スペクトルにおけるピークの付近で、基準測定が信頼できるバックグラウンド測定を提供する限り、対象被検体濃度の正確な決定が得られる。
【００５１】
対象被検体に関して、捕捉されたラジカル種は典型的には未反応の種とは異なる電位、すなわち通常はより低い電位、で酸化され、その結果、未反応の対象被検体は対象の電圧の領域で反応しないか、または基準信号に寄与しないかのいずれかであり、一方で、反応した種は対象の電圧領域で測定スペクトルに寄与することを保証するように、本発明の方法は構成されることができる。そのような構成は、例えば、電極電圧、掃引終点および／または分析に用いられる電圧の適切な選択によって達成されてもよい。
【００５２】
好ましい態様において、これらに限定されるものではないが、電位掃引、例えば、線形掃引、矩形波または正の値へ高まる微分パルス、または所望のフリーラジカルと反応した被検体の酸化電位を超える値への１つ以上の電位段階を含む電気化学的方法が用いられる。しかし、検出されようとしている種の特性に応じて、代わりの電気化学的および／または光学的検出技術のような、他の検出技術が用いられることもできることが理解されるべきである。そしてそのような技術は当業者にとって明らかになるであろう。
【００５３】
加えて、上述のようなその電気化学的酸化よりもむしろその電気化学的還元によって反応生成物を検出することが、同様に実現可能であることが理解されるべきである。
【００５４】
図２は、本発明による装置２００の第一の態様を模式的に描いたものである。装置２００は、キャリア２２０上に取り付けられた複数の電極２２１〜２２３を備え、例えば、キャリアは半導体基板、ガラスまたはプラスチック基板のような絶縁基板などであってよい。電極２２１〜２２３は、注入口２１２および排出口２１４を有する第一の試料チャンバー２１０の内部に設置される。あるいは、注入口２１２は排出口としても使用されてよく、その場合、排出口２１４は削除されてもよい。電極２２１〜２２３を含む試料チャンバー２１０は、第一の電気化学セルを形成する。
【００５５】
電極２２１〜２２３は、ラジカル捕捉形態の被検体分子の酸化電位を越える少なくとも１つの電圧を含む複数の電圧を電極に提供するようにプログラムされた制御装置２５０に伝導的に連結され、その結果、その電圧で、ラジカル捕捉形態の被検体分子から電子が取り除かれ、過渡電流の発生を引き起こす。この電流の強度は、有機溶媒中のラジカル捕捉形態の対象被検体の濃度に相関し、この濃度は複合試料マトリックス中の脂溶性対象被検体の濃度と相関する。過渡電流は処理装置（図示せず）によって処理、例えば測定、されてもよく、その後制御装置２５０において統合されてもよいが、これは必須ではない。
【００５６】
好ましい態様において、制御装置２５０は、図１に示される本方法の工程１４０を実行するようにも構成され、すなわち電極２２１〜２２３に更なる複数の電圧を提供して基準測定または校正測定を行って、有機溶媒中の干渉種の存在の検出を促進する。この態様において、信号処理装置は信号、例えばこの校正工程の間に発生する過渡電流、を測定するために適応されることができ、そして、例えば、脂溶性対象被検体の濃度を、ラジカル捕捉形態の被検体分子が酸化する間に該電極によって発生される信号と校正測定の間に該電極によって発生される信号との差から測定するために、つまり決定するためにさらに適応されることができる。このためには、信号処理装置は、例えば校正または基準測定、および実際の測定結果を保存して後処理工程において差分信号を発生させるためのメモリーを備えていてもよい。
【００５７】
試料チャンバー２１０および電極２２１〜２２３によって形成された図２の電気化学的セルも、もし未だ有機溶媒中に存在しないのであれば、フリー酸素ラジカル種を発生させるために用いられてよい。統合されたラジカル発生およびラジカル捕捉被検体検出モジュールの一例は、白金作用電極および対電極ならびに銀／銀イオン（Ａｇ／Ａｇ＋）疑似参照電極からなる三電極電気化学セルを含むが、これに限定されるものではない。しかし、他の電極構造も同様に適していることが理解されるべきである。用いられている溶媒および電解質系に応じて、他の候補参照電極には、飽和カロメル電極（ＳＣＥ）、銀／塩化銀（Ａｇ＋／ＡｇＣｌ）および酸ヨウ化物／ヨウ化物電極（Ｐｔ／Ｉ３−／Ｉ−）が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい作用電極の候補には、金、銀、白金、他の金属および炭素が含まれるが、これらに限定されるものではない。制御装置２５０は、一定の負の電圧を電極２２１〜２２３にわたって規定の時間の間供給し、ラジカル種を発生させるようにさらに構成される。
【００５８】
しかしながら、フリーラジカル種の発生およびラジカル捕捉被検体の検出が同一の電気化学的セルの中で行われる必要はない。図３には、装置３００の態様が描かれ、そこには、ラジカル捕捉被検体検出を行うように構成された試料チャンバー２１０および電極２２１〜２２３によって形成される第１の電気化学セルと共に、さらなる電極３２１〜３２３を備える第２の試料チャンバー３１０によって規定される第２の電気化学的セルが、フリーラジカル種を発生させるために存在する。これらの電気化学的セルは、液体連結器３２０、例えばチューブ、によって互いに流体連絡にある。
【００５９】
制御装置３５０は制御装置２５０と同じ方法で構成され、異なる点は制御装置３５０がフリーラジカル種発生のための一定の電圧信号をさらなる電極３２１〜３２３（すなわち電極３２１、３２２および３２３）に提供するために適合され、そして、もし適用される場合、ラジカル捕捉被検体検出および校正測定を行うための電圧掃引を電極２２１〜２２３（すなわち、電極２２１、２２２および２２３）に提供するためにさらに適合される点である。
【００６０】
図３において、電極２２１〜２２３およびさらなる電極３２１〜３２３は、非制限例としての目的でのみ、同一のキャリヤ２２０によって支えられる。電極２２１〜２２３およびさらなる電極３２１〜３２３は、同様に別個のキャリヤに取り付けられてもよいことが理解されるべきである。さらに他の態様（図示せず）において、異なる電気化学的セルが互いに流体連絡しておらず、この場合、フリーラジカル種が発生されるとすぐに形成する発生したラジカル捕捉被検体を含む試料は、別個の輸送装置および／または容器によって、一方のセルから他方のセルに移動される。装置２００または３００へのさらなる変化が当業者にとって明らかになるであろう。
【００６１】
本発明は以下の例によって、これからより詳細に説明される。これらの例は説明の目的のみのために選択され、本発明の範囲を規定または制限することが意図されていないことが理解されるべきである。
【実施例】
【００６２】
例１
この例において、麻酔薬プロポフォールが固相抽出（ＳＰＥ）を用いて全血から検出され、続いてスーパーオキシドと反応した薬品のサイクリックボルタンメトリー（電気化学）検出を行なう。従来のプロポフォール検出技術は、時間の掛かるＨＰＬＣ技術に依存している。この例において説明される技術の低い複雑さおよび費用によって、患者に近い設定(near-patient setting)で行うことができるプロポフォール分析が可能となる。
【００６３】
プロポフォールを含む血液試料（好ましくは１ｍｌ）を、水の中へ１：２に希釈し、次いで試料全体を３０ｍｇのＳｔｒａｔａＴＭ−ｘ  ＳＰＥカラムに適用する。カラムを（好ましくは２ｍｌの）水とメタノールの１：１混合物で洗浄し、弱く結合した不純物を除去する。次いで、０．１Ｍのテトラエチルアンモニウムクロライドを含む既知の量（好ましくは０．５ｍｌ）のアセトニトリルを用いて、プロポフォールをＳＰＥカラムから溶出する。プロポフォールのアセトニトリル中への固相抽出は、他の場所で詳述されている（L. McGaughran, L.J. Voss, R. Oliver, M. Petcu, P. Schaare, J.P.M. Barnard, and J.W. Sleigh, "Rapid measurement of blood Propofol levels: A proof of concept study," Journal of Clinical Monitoring and Computing, vol. 20, 2006, pp. 381 -381参照）。
【００６４】
次いで、白金作用電極、白金対電極およびＡｇ／Ａｇ＋疑似参照電極を備える電気化学的測定セルに溶離液を移す。サイクリックボルタンメトリーを用いて、抽出物中のプロポフォール濃度を測定する。最初に、１００ｍＶ〜８００ｍＶに電位を掃引することで、不純物を検出する。プロポフォールはこの電位窓の中では酸化せず、フリーラジカル種が未だ発生していないため、スーパーオキシド捕捉プロポフォール生成物は存在していない。従って、図４に示される得られたグラフは「陰性対照波形(negative control trace)」としての機能を果たす。
【００６５】
次に、電位を−１Ｖに規定の時間、好ましくは１０秒と６０秒の間、保持して、溶解した酸素をＯ２●−に還元する。プロポフォールは強力なフリーラジカル捕捉活性を有することが知られており、例えばGulcin, H.A. Alici, and M. Cesur, "Determination of in vitro antioxidant and radical scavenging activities of Propofol," Chemical & pharmaceutical bulletin, Vol. 53, 2005, pp. 281-285, G.L. Volti, P. Murabito, G. Attaguile, L. F. Rodella, M. Astuto, C. Di Giacomo, and A. Gullo, "Antioxidant properties of Propofol when oxidative stress sleeps with patients. Excli J. 2006; 5: 25-32," Linksに開示されている。その結果、電気化学的に発生したＯ２●−は従って薬品と容易に反応する。
【００６６】
そして電極電位を＋０．８Ｖまで掃引し、図５に示されるように、酸化ピークを約３５０ｍＶで観測する。このピークは、スーパーオキシド捕捉形態のプロポフォールに起因する。測定波形から「陰性対照波形」を差し引くと、任意の不純物信号が取り除かれる。３５０ｍＭで、差分波形のピーク電流値と溶媒中における既知濃度のプロポフォールの校正プロットを比較することで、未知の濃度をもたらす。
【００６７】
あるいは、この同一ピークの電流対電位プロット上の面積は、応答対プロポフォール濃度の校正プロットを発生させるのに用いることができる。同様にして、この校正プロットは、未知の量のプロポフォールを含む試料によって生じたピーク面積と比較して、この試料中の分子の濃度を測定することができる。
【００６８】
使用する溶媒系に応じて異なる反応経路が生じて、スーパーオキシド捕捉プロポフォール（Ｒ−ＯＨ）生成物が発生し、これは例えばP.G. Murphy, D.S. Myers, M.J. Davies, N.R. Webster, and J. G. Jones, "The Antioxidant Potential of Propofol (2,6-diisopropylphenol)," Br. J. Anaesth., vol. 68, Jun. 1992, pp. 613-618 and D. Hauchard, C. Lagrost, and P. Hapiot, "Superoxide Protonation by Weak Acids in Imidazolium Based Ionic Liquids," The Journal of Physical Chemistry B, vol. 113, Mar. 2009, pp. 2826-2831から知られている。
【００６９】
これらの反応の例として、必ずしも限定されるものではないが、以下の２つの反応が挙げられる：
【化３】
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【００７０】
第一の反応において、プロポフォール（Ｒ−ＯＨ）は、薬品のフェノール性水酸基から水素を引き抜いてフェノキシラジカルを生み出すプロセスによって、フリーラジカルを捕捉する。第二の反応において、スーパーオキシドアニオンは、電解発生塩基として作用し、フェノレートアニオンを生成する。
【００７１】
図５および図６に示されるように、スーパーオキシド捕捉プロポフォール種（フェノキシラジカルまたはフェノレートアニオンのいずれか）は、−１Ｖ〜０．８Ｖに電位を掃引する間に容易に酸化可能である。図５には、−１Ｖから０．８Ｖそして−１Ｖ（波形５１０）に掃引するサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）の間に、Ｏ２／Ｏ２●−の酸化還元対が示されている。Ｏ２は−６００ｍＶで還元され、Ｏ２●−は−１２０ｍＶでＯ２に再酸化される。溶液から溶解した酸素を除去した、窒素パージ（波形５２０）ではピークが弱まる。このことから、酸化還元対の原因が、実際には溶解した酸素であることが裏付けられる。図６には、プロポフォールの存在下での同様の測定が示されている。スーパーオキシド捕捉プロポフォールに起因する他の不可逆酸化ピークが波形６１０において３５０ｍＶで出現していることに気付く。窒素パージ（波形６２０）は全てのピークを弱め、３５０ｍＶでのピークが実際にプロポフォールによるＯ２●−捕捉の生成物であることを裏付ける。１００ｍＶ〜８００ｍＶの「陰性対照」スキャンが図４に示され、スーパーオキシドの不在下でこれらの低い電位ではプロポフォールは検出できないことを裏付ける。この方法が、ラジカル種と反応することによって、脂溶性被検体のような被検体の電気化学的信号を強めるために使用できることが、この例から実証される。
【００７２】
例２
本例において、麻酔薬であるプロポフォールを、サイクリックボルタンメトリーの代わりに矩形波ボルタンメトリーを用いて、例１でスーパーオキシドと反応した薬剤を検出するために説明したように試料中で検出する。プロポフォールを含んでいる（好ましくは１ｍｌの）試料を３０ｍｇのＳｔｒａｔａＴＭ−ｘＳＰＥカラムに適用する。このカラムをの水とメタノールの１：１混合物（好ましくは２ｍｌ）で洗浄し、弱く結合された不純物を除去する。プロポフォールを次いで、０．１ＭのＴＥＡＣを含む既知量（好ましくは０．５ｍｌ）のアセトニトリルを用いてＳＰＥカラムから溶出する。
【００７３】
次いで、溶離液を例１で説明した電気化学的反応セル（白金作用電極、白金対電極およびＡｇ／Ａｇ＋疑似参照電極）に移す。矩形波ボルタンメトリーを用いて、スーパーオキシド捕捉薬を検出する。この技術は当業者によく知られており、この理由から、本明細書では詳細については説明しない。各々の試料について、２５ｍＶの矩形波振幅、８Ｈｚの周波数、および１０ｍＶの電位ステップを用いて＋８００ｍＶの電位に掃引する前に、このシステムを−１Ｖの電位で３０秒間保持し、酸素分子をスーパーオキシドラジカルアニオン（Ｏ２●−）に還元する。これらの特定の溶液中には不純物が存在しないので、スーパーオキシドの不存在下の「陰性対照」スキャンは行われない。先の例においてのように、スーパーオキシドと反応したプロポフォール種を〜３５０ｍＶの電位で検出する。
【００７４】
このピークの最大電流および面積を基準線補正し、記録する。そして、この試料を反応セルから取り除き、他の試料を同様に測定する。試料中の未知のプロポフォール濃度の測定についてのこの実例方法の有用性は、図７および図８において実証する。矩形波ボルタンメトリーで測定したスーパーオキシド捕捉プロポフォールのピーク電流の濃度依存性を図７に示し、一方で、基準線補正されたピーク電流の得られる校正プロットを図８に示す。明確な直線状の依存性が、アセトニトリル溶離液中の３０ｍＭと２５０ｍＭの間のプロポフォール濃度で観測される。このことにより、この測定方法が予測可能な方法で薬品の濃度によって変化する信号を作り出すことが実証される。したがって、薬品の未知濃度の測定に適用することができる。
【００７５】
要約すると、本発明の方法および装置は、先行技術に対して複数の利点を有する。第一に、複合試料マトリックスから対象被検体を抽出するために要求される資料調製が、ＨＰＬＣのような技術に求められるものに比べて簡素であり、装置の複雑さ、金銭上のコストおよび測定時間における相当な節約をもたらす。
【００７６】
また、光学的方法の代わりに電気化学的濃度測定方法を使用することは、小型化への道を提供する。
【００７７】
さらに、複合試料マトリックスからの吸着された疎水性物質によって汚染された電極に関連する通常の問題も、有機溶媒に交換することで避けられる。
【００７８】
加えて、フリーラジカルと反応した被検体は、未反応の被検体に対してより低い電位でさらにより容易に酸化される。したがって、他の酸化可能な種による干渉の可能性は、より低い検出電位を用いることで減少する。
【００７９】
先行技術に対する他の重要な利点は、陰性対照測定をフリーラジカルの不存在下で行なう本発明の方法の一態様（ステップ１４０）において提供される。これにより、そうでなければ同じ電位で測定に干渉し得る種からの信号を測定することで、対象被検体の選択性が高められる。
【００８０】
最後に、フェノールの検出に関して先行技術に対して顕著な改善がある。本発明において、種々の電気化学的特性を有する、フリーラジカルと反応した生成物への転換は、フェノールラジカル重合、および従来の電気化学的検出に通常関連する電極不動態化の問題を回避する。例えば、スーパーオキシドと反応したフェノールが電気化学的に酸化される場合は不動態化は生じず、したがって、上記の例で実証されるように、繰り返し測定での感度の低下は起こらない。
【００８１】
上述の態様は本発明を限定するよりもむしろ説明し、当業者が添付の請求項の範囲から逸脱することなく、多数の代替態様を設計することができるようになることに注目すべきである。請求項の中で、括弧の間に配置されたいかなる引用符号も、請求項を限定するものとして構成するものではない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語は、請求項に記載された要素または工程以外の要素または工程の存在を排除するものではない。ある要素に先行する「ａ」または「ａｎ」という語は、そのような要素が複数存在することを排除するものではない。本発明は、複数の異なる要素を備えるハードウェアを用いて実施されることができる。複数の手段を列挙する装置の請求項において、それらの手段のいくつかはハードウェアの全く同一のアイテムによって具体化されることができる。ある測定がお互いに異なる従属項に記載されているという単なる事実は、それらの測定の組合せが有利に使用することができないことを示すものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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