(57)【要約】  本開示は、ポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞に関し、ここで、当該ポリペプチドは当該細胞にセロデキストリンを輸送する。本開示は、セロデキストリンを含んでいる培地における細胞の成長を促進させる方法、セルロースから得られた糖およびヘミセルロースから得られた糖を共発酵させる方法、ならびにポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備することによって、炭化水素または炭化水素の誘導体を製造する方法にさらに関し、ここで、当該ポリペプチドは当該細胞にセロデキストリンを輸送する。本開示は、ポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞、細胞へのペントースの輸送を促進させる方法、ペントース糖を含んでいる培地における細胞の成長を向上させる方法、およびポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備することによって、炭化水素または炭化水素の誘導体を製造する方法に関し、ここで、当該ポリペプチドは当該細胞にペントースを輸送する。
2013500019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項２】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス２は配列番号２を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項３】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項４】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス５は配列番号４を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項５】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス６は配列番号５を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項６】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７の間にある領域は配列番号６を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項７】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項８】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列は、配列番号８を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項９】
上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性を有している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記宿主細胞は、β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインを少なくともコードしている第２の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
上記β−グルコシダーゼはNeurospora crassaに由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記β−グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０によってコードされている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記宿主細胞は、ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
１つ以上の上記酵素は、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、およびキシトールデヒドロゲナーゼからなる群のうちの１つ以上から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記細胞は、ペントーストランスポータをコードしている第３の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
上記ペントーストランスポータは、ＮＣＵ００８２１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０６１３８、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３、ＸＵＴ１、およびＸＵＴ３からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞の成長を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでおり、上記ポリペプチドはセロデキストリントランスポータであり、
上記宿主細胞は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する、方法。
【請求項１８】
細胞の成長を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス２は配列番号２を含んでおり、上記ポリペプチドはセロデキストリントランスポータであり、
上記宿主細胞は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する、方法。
【請求項１９】
細胞の成長を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでおり、上記ポリペプチドはセロデキストリントランスポータであり、
上記宿主細胞は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する、方法。
【請求項２０】
細胞の成長を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス５は配列番号４を含んでおり、上記ポリペプチドはセロデキストリントランスポータであり、
上記宿主細胞は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する、方法。
【請求項２１】
細胞の成長を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス６は配列番号５を含んでおり、上記ポリペプチドはセロデキストリントランスポータであり、
上記宿主細胞は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する、方法。
【請求項２２】
細胞の成長を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７の間にある領域は配列番号６を含んでおり、上記ポリペプチドはセロデキストリントランスポータであり、
上記宿主細胞は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する、方法。
【請求項２３】
細胞の成長を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでおり、上記ポリペプチドはセロデキストリントランスポータであり、
上記宿主細胞は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する、方法。
【請求項２４】
細胞の成長を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列は、配列番号８を含んでおり、上記ポリペプチドはセロデキストリントランスポータであり、
上記宿主細胞は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する、方法。
【請求項２５】
上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性を有している、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
上記宿主細胞は、β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインを少なくともコードしている外因性または第２の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
上記β−グルコシダーゼはNeurospora crassaに由来する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
上記β−グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０によってコードされている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
セルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖を共発酵させる方法であって、
セロデキストリントランスポータをコードしている第１の組換えポリヌクレオチドおよびβ−グルコシダーゼの触媒作用ドメインをコードしている第２の組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
セルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
２つの上記組換えポリヌクレオチドの発現がセルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖の共発酵を可能にする、方法。
【請求項３０】
上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでいる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス２は配列番号２を含んでいる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでいる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス５は配列番号４を含んでいる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス６は配列番号５を含んでいる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７の間にある領域は配列番号６を含んでいる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでいる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列は、配列番号８を含んでいる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性を有している、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
上記β−グルコシダーゼはNeurospora crassaに由来する、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
上記β−グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０によってコードされている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
上記宿主細胞は、ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
１つ以上の上記酵素は、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、およびキシトールデヒドロゲナーゼからなる群のうちの１つ以上から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
上記宿主細胞は、ペントーストランスポータをコードしている第３の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項２９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
上記ペントーストランスポータは、ＮＣＵ００８２１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０６１３８、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３、ＸＵＴ１、およびＸＵＴ３からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
セルロース由来の上記糖は、セロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースからなる群から選択され、ヘミセルロース由来の上記糖はキシロースである、請求項２９〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでおり、上記ポリペプチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送し、
上記宿主細胞へのセロデキストリン輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される、方法。
【請求項４７】
宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス２は配列番号２を含んでおり、上記ポリペプチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送し、
上記宿主細胞へのセロデキストリン輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される、方法。
【請求項４８】
宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでおり、上記ポリペプチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送し、
上記宿主細胞へのセロデキストリン輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される、方法。
【請求項４９】
宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス５は配列番号４を含んでおり、上記ポリペプチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送し、
上記宿主細胞へのセロデキストリン輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される、方法。
【請求項５０】
宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス６は配列番号５を含んでおり、上記ポリペプチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送し、
上記宿主細胞へのセロデキストリン輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される、方法。
【請求項５１】
宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７の間にある領域は配列番号６を含んでおり、上記ポリペプチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送し、
上記宿主細胞へのセロデキストリン輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される、方法。
【請求項５２】
宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでおり、上記ポリペプチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送し、
上記宿主細胞へのセロデキストリン輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される、方法。
【請求項５３】
宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列は、配列番号８を含んでおり、上記ポリペプチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送し、
上記宿主細胞へのセロデキストリン輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される、方法。
【請求項５４】
上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性を有している、請求項４６〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
上記宿主細胞は、β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインを少なくともコードしている第２の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項４６〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
上記β−グルコシダーゼはNeurospora crassaに由来する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
上記β−グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０によってコードされている、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
上記セロデキストリン源はセルロースを含んでいる、請求項４６〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
上記炭化水素または炭化水素の誘導体は燃料として使用され得る、請求項４６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
上記炭化水素または炭化水素の誘導体はエタノールを含んでいる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
上記炭化水素または炭化水素の誘導体はブタノールを含んでいる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
上記培地は、改変された生物から得られた、セルラーゼ含有の酵素混合物を含んでおり、セルラーゼ含有の上記酵素混合物は、改変されていない生物から得られた、セルラーゼ含有の酵素混合物と比べて、低下したβ−グルコシダーゼ活性を有している、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
上記宿主細胞は、Saccharomyces sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces monacensis、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces pombe、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces marxiamus、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Pichia stipitis、Sporotrichum thermophile、Candida shehatae、Candida tropicalis、Neurospora crassa、Zymomonas mobilis、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Clostridium beijerinckii、Clostridium acetobutylicum、Moorella thermoacetica、Escherichia coli、Klebsiella oxytoca、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、およびBacillus subtilisからなる群から選択される、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
上記セロデキストリンは、セロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースからなる群のうちの１つ以上から選択される、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞であって、上記組換えポリヌクレオチドは、ＮＣＵ００８２１およびＳＴＬ１２／ＸＵＴ６からなる群から選択されるポリペプチドをコードしており、当該ポリペプチドは上記宿主細胞にキシロースを輸送する、宿主細胞。
【請求項６６】
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞であって、上記組換えポリヌクレオチドはＸＵＴ１であるポリペプチドをコードしており、上記ポリペプチドは上記宿主細胞にアラビノースを輸送する、宿主細胞。
【請求項６７】
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞であって、上記組換えポリヌクレオチドはＮＣＵ０６１３８であるポリペプチドをコードしており、上記ポリペプチドは上記宿主細胞にアラビノースおよびグルコースを輸送する、宿主細胞。
【請求項６８】
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞であって、上記組換えポリヌクレオチドは、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３およびＸＵＴ３からなる群から選択されるポリペプチドをコードしており、上記ポリペプチドは上記宿主細胞にキシロースおよびグルコースを輸送する、宿主細胞。
【請求項６９】
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞であって、上記組換えポリヌクレオチドはＮＣＵ０４９６３であるポリペプチドをコードしており、上記ポリペプチドは上記宿主細胞にキシロース、アラビノースおよびグルコースを輸送する、宿主細胞。
【請求項７０】
ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項６５〜６９に記載の宿主細胞。
【請求項７１】
１つ以上の上記酵素は、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、およびキシトールデヒドロゲナーゼからなる群のうちの１つ以上から選択される、請求項７０に記載の宿主細胞。
【請求項７２】
Saccharomyces sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces monacensis、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces pombe、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces marxiamus、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Pichia stipitis、Sporotrichum thermophile、Candida shehatae、Candida tropicalis、Neurospora crassa、Zymomonas mobilis、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Clostridium beijerinckii、Clostridium acetobutylicum、Moorella thermoacetica、Escherichia coli、Klebsiella oxytoca、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、およびBacillus subtilisからなる群から選択される、請求項６５〜７１に記載の宿主細胞。
【請求項７３】
細胞へのキシロースの輸送を促進させる方法であって、
ＮＣＵ００８２１およびＳＴＬ１２／ＸＵＴ６からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるように上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞への促進されたキシロースの輸送をもたらす、方法。
【請求項７４】
細胞へのアラビノースの輸送を促進させる方法であって、
ＸＵＴ１であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるように上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞への促進されたアラビノースの輸送をもたらす、方法。
【請求項７５】
細胞へのアラビノースまたはグルコースの輸送を促進させる方法であって、
ＮＣＵ０６１３８であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるように上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞への促進されたアラビノースまたはグルコースの輸送をもたらす、方法。
【請求項７６】
細胞へのキシロースまたはグルコースの輸送を促進させる方法であって、
ＮＣＵ０４９６３であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるように上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞への促進されたキシロースまたはグルコースの輸送をもたらす、方法。
【請求項７７】
細胞へのキシロース、アラビノースまたはグルコースの輸送を促進させる方法であって、
ＮＣＵ０４９６３であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるように上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞への促進されたキシロース、アラビノースまたはグルコースの輸送をもたらす、方法。
【請求項７８】
ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項７３〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
１つ以上の上記酵素は、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、およびキシトールデヒドロゲナーゼからなる群のうちの１つ以上から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
細胞の成長を促進させる方法であって、
キシロースを輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
キシロースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記ポリペプチドは、ＮＣＵ００８２１およびＳＴＬ１２／ＸＵＴ６からなる群から選択され、
上記宿主細胞は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する、方法。
【請求項８１】
細胞の成長を促進させる方法であって、
アラビノースを輸送するＸＵＴ１であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
アラビノースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記宿主細胞は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する、方法。
【請求項８２】
細胞の成長を促進させる方法であって、
アラビノースおよびグルコースを輸送するＮＣＵ０６１３８であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
アラビノースまたはグルコースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記宿主細胞は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する、方法。
【請求項８３】
細胞の成長を促進させる方法であって、
キシロースおよびグルコースを輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
キシロースまたはグルコースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記ポリペプチドは、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３およびＸＵＴ３からなる群から選択され、
上記宿主細胞は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する、方法。
【請求項８４】
細胞の成長を促進させる方法であって、
キシロース、アラビノースおよびグルコースを輸送するＮＣＵ０４９６３であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
キシロース、アラビノースまたはグルコースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記宿主細胞は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する、方法。
【請求項８５】
上記宿主細胞は、ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項８０〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
１つ以上の上記酵素は、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、およびキシトールデヒドロゲナーゼからなる群のうちの１つ以上から選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法であって、
ＮＣＵ００８２１およびＳＴＬ１２／ＸＵＴ６からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、キシロースまたはキシロース源を含んでいる培地において上記宿主を培養することを包含しており、
上記ポリペプチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために宿主細胞にキシロースを輸送し、
上記宿主細胞へのキシロースの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される、方法。
【請求項８８】
宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法であって、
ＸＵＴ１であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、アラビノースまたはアラビノース源を含んでいる培地において上記宿主を培養することを包含しており、
上記ポリペプチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために宿主細胞にアラビノースを輸送し、
上記宿主細胞へのアラビノースの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される、方法。
【請求項８９】
宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法であって、
ＮＣＵ０６１３８であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、アラビノースもしくはキシロースの源、アラビノースまたはグルコースを含んでいる培地において上記宿主を培養することを包含しており、
上記ポリペプチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために宿主細胞にキシロースまたはグルコースを輸送し、
上記宿主細胞へのアラビノースまたはグルコースの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される、方法。
【請求項９０】
宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法であって、
ＳＵＴ２、ＳＵＴ３およびＸＵＴ３からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、キシロースもしくはグルコースの源、キシロースまたはグルコースを含んでいる培地において上記宿主を培養することを包含しており、
上記ポリペプチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために宿主細胞にキシロースまたはグルコースを輸送し、
上記宿主細胞へのキシロースまたはグルコースの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される、方法。
【請求項９１】
宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法であって、
ＮＣＵポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、キシロース、アラビノースもしくはグルコースの源、キシロース、アラビノースまたはグルコースを含んでいる培地において上記宿主を培養することを包含しており、
上記ポリペプチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために宿主細胞にキシロース、アラビノースまたはグルコースを輸送し、
上記宿主細胞へのキシロース、アラビノースまたはグルコースの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される、方法。
【請求項９２】
グルコースの上記源はセルロースを含んでいる、請求項８９〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
キシロースまたはアラビノースの上記源はヘミセルロースを含んでいる、請求項８７〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
上記炭化水素または炭化水素の誘導体は燃料として使用され得る、請求項８７〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
上記炭化水素または炭化水素の誘導体はエタノールを含んでいる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
上記炭化水素または炭化水素の誘導体はブタノールを含んでいる、請求項８１に記載の方法。
【請求項９７】
上記宿主細胞は、Saccharomyces sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces monacensis、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces pombe、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces marxiamus、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Pichia stipitis、Sporotrichum thermophile、Candida shehatae、Candida tropicalis、Neurospora crassa、Zymomonas mobilis、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Clostridium beijerinckii、Clostridium acetobutylicum、Moorella thermoacetica、Escherichia coli、Klebsiella oxytoca、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、およびBacillus subtilisからなる群から選択される、請求項７３〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
細胞の成長を促進させる方法であって、
ＮＣＵ０７７０５であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を準備すること；および
グルコースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する、方法。
【請求項９９】
上記宿主細胞は、Saccharomyces sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces monacensis、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces pombe、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces marxiamus、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Pichia stipitis、Sporotrichum thermophile、Candida shehatae、Candida tropicalis、Neurospora crassa、Zymomonas mobilis、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Clostridium beijerinckii、Clostridium acetobutylicum、Moorella thermoacetica、Escherichia coli、Klebsiella oxytoca、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、およびBacillus subtilisからなる群から選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドと作動可能に連結されている誘導性のプロモータをさらに含んでいる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
セルラーゼの発現は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって上記宿主細胞において促進されている、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
バイオマス重合体に基づく細胞の成長を促進させる方法であって、
ＮＣＵ０５１７３であるポリペプチドをコードしている外因性のポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；
上記外因性のポリヌクレオチドの発現を抑制すること；および
上記バイオマス重合体を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記宿主細胞は、上記外因性のポリヌクレオチドの発現が抑制されていない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する、方法。
【請求項１０３】
上記宿主細胞は、Saccharomyces sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces monacensis、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces pombe、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces marxiamus、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Pichia stipitis、Sporotrichum thermophile、Candida shehatae、Candida tropicalis、Neurospora crassa、Zymomonas mobilis、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Clostridium beijerinckii、Clostridium acetobutylicum、Moorella thermoacetica、Escherichia coli、Klebsiella oxytoca、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、およびBacillus subtilisからなる群から選択される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
上記宿主細胞のセルラーゼ活性は上記外因性のポリヌクレオチドの発現を抑制することによって促進される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
上記宿主細胞のヘミセルラーゼ活性は上記外因性のポリヌクレオチドの発現を抑制することによって促進される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
上記外因性のポリヌクレオチドの発現を抑制することは、外因性の当該ポリヌクレオチドを含んでいる遺伝子を変異させること、または当該遺伝子を欠失させることを包含している、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０７】
上記バイオマス重合体はセルロースである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０８】
上記バイオマス重合体はヘミセルロースである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０９】
細胞の成長を促進させる方法であって、
ＮＣＵ０１５１７、ＮＣＵ０９１３３およびＮＣＵ１００４０からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；ならびに
ヘミセルロースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、より早く成長する、方法。
【請求項１１０】
上記宿主細胞は、Saccharomyces sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces monacensis、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces pombe、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces marxiamus、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Pichia stipitis、Sporotrichum thermophile、Candida shehatae、Candida tropicalis、Neurospora crassa、Zymomonas mobilis、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Clostridium beijerinckii、Clostridium acetobutylicum、Moorella thermoacetica、Escherichia coli、Klebsiella oxytoca、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、およびBacillus subtilisからなる群から選択される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドと作動可能に連結されている誘導性のプロモータをさらに含んでいる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
上記宿主細胞のヘミセルラーゼ活性は上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１３】
セルロースを分解する方法であって、
セルロースを含んでいる組成物を準備すること；および
上記組成物を、改変された生物から得られたセルラーゼ含有の酵素混合物と接触させることを包含しており、
セルラーゼを含有している上記酵素混合物は、改変されていない生物から得られたセルラーゼ含有の酵素混合物と比べて、低下したグルコシダーゼ活性を有しており、上記セルロースはセルラーゼ含有の上記酵素混合物によって分解される、方法。
【請求項１１４】
上記生物はβ−グルコシダーゼをコードしている遺伝子の変異によって改変されている、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
上記生物はβ−グルコシダーゼの発現を低下させることによって改変されている、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
上記生物は真菌および細菌からなる群から選択される、請求項１１３〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
上記生物は糸状菌である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
上記セルロースは植物材料に由来する、請求項１１３〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
上記植物材料は、スイッチグラス、Miscanthus、もみ殻、バガス、アマ、タケ、サイザル繊維、アバカ、麦わら、葉、刈り取った芝、トウモロコシの茎および葉、トウモロコシの穂軸、穀類の蒸留粕、マメ科の植物、サトウモロコシ、サトウキビ、テンサイの果肉、材木の切り屑、おが屑、ならびにバイオマス収穫物からなる群から選択される、請求項１１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本願は、参照によってそれらの全体が本明細書に援用される米国仮出願第６１／２８５，５２６号（出願日：２００９年１２月１０日）および米国仮出願第６１／２７１，８３３号（出願日：２００９年７月２４日）の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、細胞への糖の輸送を促進させる方法および組成物、細胞の成長を促進させる方法および組成物、炭化水素および炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法および組成物、ならびにセルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖を共発酵させる方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物燃料は、エネルギーの安全保障、資源の継続的維持および世界的な気候変動に対する関心の増大のために、集中的に研究されている（Lynd et al., 1991）。植物由来のリグノセルロース性材料の、燃料への生物変換は、化石燃料の化学的生成に変わる魅力的な代替物と見做されている（Lynd et al. 2008；Hahn-Hagerdal et al. 2006）。
【０００４】
エタノールへのリグノセルロース性のバイオマスの変換を、効率的に実施するための微生物の改変は、依然として生物燃料の分野の主な目標である。多大な探索は、単純な糖をアルコールへ天然に発酵させる微生物を遺伝的に改変して、１つの細胞内におけるリグノセルロース性のバイオマス重合体の分解およびエタノール産生を微生物にとって可能にさせるセルラーゼおよび他の酵素を発現させることに焦点が当てられている。しかし、十分に研究されていない領域は糖の輸送である。糖の取込み能を向上させるための糖輸送の制御の理解および微生物の遺伝的な改変は、効率を非常に向上させる（Stephanopoulos 2007）。さらに、セルラーゼ発現およびセルラーゼ活性の制御に関与する他の種類のタンパク質は、依然として十分に調査されるべき状態にある。
【０００５】
Saccharomyces cerevisiae（パン酵母としても知られている）は、エタノールへのヘキソース糖の生物変換のために、数千年間にわたって使用されている。また、Saccharomyces cerevisiaeは、エタノールへのＤ−グルコースの大規模な工業的発酵のために最も広く使用されている微生物である。S. cerevisiaeは、生物燃料へのリグノセルロース性のバイオマスの生物変換にとって最も好適な候補物である（van Maris et al., 2006）。S. cerevisiaeは、十分に研究されている遺伝的背景および生理学的背景、豊富な遺伝学的な手段、ならびにリグノセルロース性の加水分解物に見られる阻害物質および高濃度のエタノールに対する高い耐性を有している（Jeffries 2006）。また、低ｐＨにおけるS. cerevisiaeの発酵によって、発酵の間における細菌汚染が防止され得る。
【０００６】
残念ながら、野生型のS. cerevisiaeはペントース糖を利用できない（Hector et al., 2008）。この制限を解消させるために、ペントースを消化する生物に由来するペントース利用経路がS. cerevisiaeに導入されており、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースの発酵を可能にしている（Hahn-Hagerdal et al., 2007；Brat et al., 2009; Wisselink et al., 2007, 2009；Wiedemann and Boles 2008；Karhumma et al., 2006）。しかし、生物燃料へのペントース糖の効率的な変換は、複数の問題（細胞性の酸化還元反応の不均衡、ペントースリン酸化経路の低い作用、および細胞への効率的なペントース輸送の欠如が挙げられる）によって制限されている（Hector et al., 2008）。
【０００７】
さらに、天然の微生物および改変微生物は、グルコース発酵と比べて、キシロース発酵の間におけるエタノール許容性の低下を示す（Jeffries and Jin 2000）。より低い発酵速度と相まって、キシロース発酵の間におけるエタノール許容性の低下は、セルロース性の加水分解物に存在している高濃度のグルコース（７０〜１００ｇ／Ｌ未満）およびキシロース（４０〜６０ｇ／Ｌ未満）を含有している糖の混合物の発酵において重大な問題をもたらす。微生物はグルコースを優先的に利用するので、グルコースの枯渇時（細胞がキシロースを使用し始めるとき）に、すでにエタノール濃度はキシロースの発酵速度をさらに低下させるほど十分に高い。結果として、“グルコース抑制”のために、グルコース枯渇後に続いて起こるキシロースの利用は、セルロース性の加水分解物における混合糖を首尾よく利用するために解消されるべき重要な課題である。
【０００８】
したがって、リグノセルロースに基づく向上された成長およびリグノセルロース分解から生じる化合物の向上された取込みを目的として、リグノセルロースの分解および微生物の改変における利用に重要なさらなる遺伝子の同定に対する必要性がある。
【発明の概要】
【０００９】
これらの必要性を満たすために、本明細書に記載の本発明は、細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法、セロデキストリンを含有している培地における細胞の成長を促進させる方法、セルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖を共発酵させる方法、ならびにセロデキストリンを細胞に輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備することによって、炭化水素または炭化水素の誘導体を製造する方法を提供する。本明細書にさらに記載されているのは、セロデキストリンを細胞に輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞である。本明細書にさらに記載されているのは、ペントースを細胞に輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞、細胞へのペントースの輸送を促進させる方法、ペントース糖を含有している培地における細胞の成長を促進させる方法、ならびにペントースを細胞に輸送するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備することによって、炭化水素または炭化水素の誘導体を製造する方法を提供する。
【００１０】
本明細書に使用されるとき、セロデキストリンは、種々の長さのグルコース重合体を指し、当該セロデキストリンとしては、セロビオース（２つのグルコースの単量体）、セロトリオース（３つのグルコースの単量体）、セロテトラオース（４つのグルコースの単量体）、セロペンタオース（５つのグルコースの単量体）およびセロヘキサオース（６つのグルコースの単量体）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
したがって、一局面は、細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでいる。上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす。
【００１２】
他の局面は、細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス２は配列番号２を含んでいる。上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす。
【００１３】
他の局面は、細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでいる。上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす。
【００１４】
他の局面は、細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス５は配列番号４を含んでいる。上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす。
【００１５】
他の局面は、細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス６は配列番号５を含んでいる。上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす。
【００１６】
他の局面は、細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７の間にある配列は配列番号６を含んでいる。上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす。
【００１７】
他の局面は、細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでいる。上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす。
【００１８】
他の局面は、細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列は配列番号８を含んでいる。上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす。
【００１９】
上述の局面のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性を有している。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、Neurospora crassa由来のβ−グルコシダーゼの触媒作用ドメインを少なくともコードしている第２の組換えポリヌクレオチドを含んでいる。Neurospora crassa由来のβ−グルコシダーゼの触媒作用ドメインを少なくともコードしている第２の組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記β−グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０によってコードされている。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる宿主細胞を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、１つ以上の上記酵素は、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、およびキシトールデヒドロゲナーゼからなる群のうちの１つ以上から選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、ペントーストランスポータをコードしている第３の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。、ペントーストランスポータをコードしている第３の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる宿主細胞を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記ペントーストランスポータは、ＮＣＵ００８２１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０６１３８、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３、ＸＵＴ１、およびＸＵＴ３からなる群から選択される。
【００２０】
他の局面は、細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでいる。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【００２１】
他の局面は、細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス２は配列番号２を含んでいる。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【００２２】
他の局面は、細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでいる。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【００２３】
他の局面は、細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス５は配列番号４を含んでいる。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【００２４】
他の局面は、細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス６６は配列番号５を含んでいる。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【００２５】
他の局面は、細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７の間にある配列は配列番号６を含んでいる。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【００２６】
他の局面は、細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでいる。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【００２７】
他の局面は、細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および当該組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において細胞を培養することを包含している。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびそれらの間にある配列は配列番号を含んでいる。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【００２８】
上述の局面のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性を有している。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、Neurospora crassa由来のβ−グルコシダーゼの触媒作用ドメインを少なくともコードしている外因性または第２の組換えポリヌクレオチドを含んでいる。Neurospora crassa由来のβ−グルコシダーゼの触媒作用ドメインを少なくともコードしている外因性または第２の組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記β−グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０によってコードされている。
【００２９】
他の局面は、セルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖を共発酵させる方法を包含している。当該方法は、第１の組換えポリヌクレオチドおよび第２の組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、ならびにセルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記第１の組換えポリヌクレオチドはセロデキストリントランスポータをコードしており、第２の組換えポリヌクレオチドはβ−グルコシダーゼの触媒作用ドメインをコードしている。２つの上記組換えポリヌクレオチドの発現は、セルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖の共発酵を可能にする。一部の実施形態において、上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、ここで、膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでいる。一部の実施形態において、上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、ここで、膜貫通型のα−ヘリックス２は配列番号２を含んでいる。一部の実施形態において、上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、ここで、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでいる。一部の実施形態において、上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、ここで、膜貫通型のα−ヘリックス５は配列番号４を含んでいる。一部の実施形態において、上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリッ��ス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、ここで、膜貫通型のα−ヘリックス６は配列番号５を含んでいる。一部の実施形態において、上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、ここで、膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号６を含んでいる。一部の実施形態において、上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、ここで、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでいる。一部の実施形態において、上記第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、ここで、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列は配列番号８を含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性を有している。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記β−グルコシダーゼはNeurospora crassに由来する。Neurospora crassに由来するβ−グルコシダーゼの触媒作用ドメインをコードしている第２の組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記β−グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０によってコードされている。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上のポリヌクレオチドをさらに含んでいる。ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上のポリヌクレオチドをさらに含んでいる宿主細胞を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、１つ以上の上記酵素は、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、およびキシトールデヒドロゲナーゼからなる群のうちの１つ以上から選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、ペントーストランスポータをコードしている第３の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。ペントーストランスポータをコードしている第３の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる宿主細胞を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記ペントーストランスポータは、ＮＣＵ００８２１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０６１３８、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３、ＸＵＴ１、およびＸＵＴ３からなる群から選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、セルロース由来の上記糖は、セロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースからなる群から選択され、ヘミセルロース由来の糖はキシロースである。
【００３０】
他の局面は、宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記組換えポリヌクレオチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送するポリペプチドをコードしている。当該ポリペプチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでいる。上記培地は、上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる。上記宿主細胞へのセロデキストリンの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される。
【００３１】
他の局面は、宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記組換えポリヌクレオチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送するポリペプチドをコードしている。当該ポリペプチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス２は配列番号２を含んでいる。上記培地は、上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる。上記宿主細胞へのセロデキストリンの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される。
【００３２】
他の局面は、宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記組換えポリヌクレオチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送するポリペプチドをコードしている。当該ポリペプチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでいる。上記培地は、上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる。上記宿主細胞へのセロデキストリンの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される。
【００３３】
他の局面は、宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記組換えポリヌクレオチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送するポリペプチドをコードしている。当該ポリペプチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス５は配列番号４を含んでいる。上記培地は、上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる。上記宿主細胞へのセロデキストリンの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される。
【００３４】
他の局面は、宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記組換えポリヌクレオチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送するポリペプチドをコードしている。当該ポリペプチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス６は配列番号５を含んでいる。上記培地は、上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる。上記宿主細胞へのセロデキストリンの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される。
【００３５】
他の局面は、宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記組換えポリヌクレオチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送するポリペプチドをコードしている。当該ポリペプチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７の間にある配列は配列番号６を含んでいる。上記培地は、上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる。上記宿主細胞へのセロデキストリンの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される。
【００３６】
他の局面は、宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記組換えポリヌクレオチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送するポリペプチドをコードしている。当該ポリペプチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでいる。上記培地は、上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる。上記宿主細胞へのセロデキストリンの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される。
【００３７】
他の局面は、宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、および培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記組換えポリヌクレオチドは、炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にセロデキストリンを輸送するポリペプチドをコードしている。当該ポリペプチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列は配列番号８を含んでいる。上記培地は、上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる。上記宿主細胞へのセロデキストリンの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される。
【００３８】
上述の局面のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性を有している。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインを少なくともコードしている第２の組換えポリヌクレオチドを含んでいる。β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインを少なくともコードしている第２の組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記β−グルコシダーゼはNeurospora crassaに由来する。Neurospora crassa由来のβ−グルコシダーゼの触媒作用ドメインを少なくともコードしている第２の組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記β−グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０によってコードされている。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、セロデキストリン源はセルロースを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記炭化水素または炭化水素の誘導体は燃料として使用され得る。燃料として使用され得る炭化水素または炭化水素の誘導体を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記炭化水素または炭化水素の誘導体はエタノールを含んでいる。燃料として使用され得る炭化水素または炭化水素の誘導体を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記炭化水素または炭化水素の誘導体はブタノールを含んでいる。
【００３９】
上述の局面のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記培地は、改変された生物から得られた、セルラーゼ含有の酵素混合物を含んでおり、セルラーゼ含有の当該酵素混合物は、改変されていない生物から得られた、セルラーゼ含有の酵素混合物と比べて、低いセルラーゼ活性を有している。上述の局面のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces monacensis、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces pombe、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces marxiamus、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Pichia stipitis、Sporotrichum thermophile、Candida shehatae、Candida tropicalis、Neurospora crassa、Zymomonas mobilis、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Clostridium beijerinckii、Clostridium acetobutylicum、Moorella thermoacetica、Escherichia coli、Klebsiella oxytoca、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、およびBacillus subtilisからなる群から選択される。上述の局面のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、セロデキストリンは、セロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースからなる群から選択される。
【００４０】
他の局面は、ポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を包含している。当該ポリペプチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２、細胞内のＮ末端、細胞内のＣ末端、ならびに膜貫通型のα−ヘリックス１における配列番号１；膜貫通型のα−ヘリックス２における配列番号２；膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループにおける配列番号３；膜貫通型のα−ヘリックス５における配列番号４；膜貫通型のα−ヘリックス６における配列番号５；膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７の間にある配列における配列番号６；膜貫通型のα−ヘリックス７における配列番号７；ならびに膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列における配列番号８からなる群から選択される配列を有している。一部の実施形態において、上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性を有している。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインを少なくともコードしている第２の組換えポリヌクレオチドを含んでいる。β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインを少なくともコードしている第２の組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記β−グルコシダーゼはNeurospora crassaに由来する。Neurospora crassa由来のβ−グルコシダーゼの触媒作用ドメインを少なくともコードしている第２の組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記β−グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０によってコードされている。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる宿主細胞を有しているいくつかの実施形態において、１つ以上の上記酵素は、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、およびキシトールデヒドロゲナーゼからなる群のうちの１つ以上から選択される。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、ペントーストランスポータをコードしている第３の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。ペントーストランスポータをコードしている第３の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる宿主細胞を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記ペントーストランスポータは、ＮＣＵ００８２１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０６１３８、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３、ＸＵＴ１、およびＸＵＴ３からなる群から選択される。
【００４１】
上述の局面のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、１つ以上の上記組換えポリヌクレオチドと作動可能に連結されている１つ以上の誘導性のプロモータをさらに含んでいる。
【００４２】
他の局面は、ＮＣＵ００８２１およびＳＴＬ１２／ＸＵＴ６からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を包含しており、当該ポリペプチドは当該宿主細胞にキシロースを輸送すする。
【００４３】
他の局面は、ＸＵＴ１であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を包含しており、当該ポリペプチドはアラビノースを当該宿主細胞に輸送する。
【００４４】
他の局面は、ＮＣＵ０６１３８であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を包含しており、当該ポリペプチドはアラビノースおよびグルコースを当該宿主細胞に輸送する。
【００４５】
他の局面は、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３およびＸＵＴ３からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を包含しており、当該ポリペプチドはキシロースおよびグルコースを当該宿主細胞に輸送する。
【００４６】
他の局面は、ＮＣＵ０４９６３であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を包含しており、当該ポリペプチドは、キシロース、アラビノースおよびグルコースを当該宿主細胞に輸送する。
【００４７】
ペントーストランスポータをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を有している上述の局面のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる宿主細胞を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、１つ以上の上記酵素は、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、およびキシトールデヒドロゲナーゼからなる群のうちの１つ以上から選択される。
【００４８】
他の局面は、宿主細胞へのキシロースの輸送を促進させる方法を包含している。当該方法は、ＮＣＵ００８２１およびＳＴＬ１２／ＸＵＴ６からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を準備すること、ならびに上記組換えポリヌクレオチドが発現されるように上記宿主細胞を培養することを包含している。上記組換えポリヌクレオチドの発現は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのキシロースの促進された輸送をもたらす。
【００４９】
他の局面は、宿主細胞へのキシロースの輸送を促進させる方法を包含している。当該方法は、ＮＣＵ００８２１およびＳＴＬ１２／ＸＵＴ６からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を準備すること、ならびに上記組換えポリヌクレオチドが発現されるように上記宿主細胞を培養することを包含している。上記組換えポリヌクレオチドの発現は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのキシロースの促進された輸送をもたらす。
【００５０】
他の局面は、宿主細胞へのアラビノースまたはグルコースの輸送を促進させる方法を包含している。当該方法は、ＮＣＵ０６１３８であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を準備すること、ならびに上記組換えポリヌクレオチドが発現されるように上記宿主細胞を培養することを包含している。上記組換えポリヌクレオチドの発現は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのアラビノースまたはグルコースの促進された輸送をもたらす。
【００５１】
他の局面は、宿主細胞へのキシロースまたはグルコースの輸送を促進させる方法を包含している。当該方法は、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３およびＸＵＴ３からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を準備すること、ならびに上記組換えポリヌクレオチドが発現されるように上記宿主細胞を培養することを包含している。上記組換えポリヌクレオチドの発現は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのキシロースまたはグルコースの促進された輸送をもたらす。
【００５２】
他の局面は、宿主細胞へのキシロース、アラビノースまたはグルコースの輸送を促進させる方法を包含している。当該方法は、ＮＣＵ０４９６３であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を準備すること、ならびに上記組換えポリヌクレオチドが発現されるように上記宿主細胞を培養することを包含している。上記組換えポリヌクレオチドの発現は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのキシロース、アラビノースまたはグルコースの促進された輸送をもたらす。
【００５３】
細胞へのキシロース、アラビノースまたはグルコースの輸送を促進させる上述の局面のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記方法は、ペントース輸送に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。ペントース輸送に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる方法を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、１つ以上の上記酵素は、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、およびキシトールデヒドロゲナーゼからなる群のうちの１つ以上から選択される。
【００５４】
他の局面は細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、キシロースを輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を準備すること、およびキシロースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記ポリペプチドは、ＮＣＵ００８２１およびＳＴＬ１２／ＸＵＴ６からなる群から選択される。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【００５５】
他の局面は細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、アラビノースを輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を準備すること、およびアラビノースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記ポリペプチドはＸＵＴ１である。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【００５６】
他の局面は細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、アラビノースおよびグルコースを輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を準備すること、ならびにアラビノースおよびグルコースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記ポリペプチドは、ＮＣＵ０６１３８である。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【００５７】
他の局面は細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、キシロースおよびグルコースを輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を準備すること、ならびにキシロースおよびグルコースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記ポリペプチドは、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３およびＳＴＬ１２／ＸＵＴ１からなる群から選択される。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【００５８】
他の局面は細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、キシロース、アラビノースおよびグルコースを輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を準備すること、ならびにキシロース、アラビノースおよびグルコースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記ポリペプチドは、ＮＣＵ０４９６３である。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【００５９】
キシロース、アラビノースおよび／またはグルコースを輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を培養することによって細胞の成長を促進させる上述の局面のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている外因性のポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドの１つ以上をさらに含んでいる。ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている外因性のポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドの１つ以上をさらに含んでいる宿主細胞を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、およびキシトールデヒドロゲナーゼからなる群のうちの１つ以上から選択される。
【００６０】
他の局面は宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法を包含している。当該方法は、ＮＣＵ００８２１およびＳＴＬ１２／ＸＵＴ６からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、ならびに当該宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、キシロースまたはキシロース源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記ポリペプチドは、上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために当該宿主細胞にキシロースを輸送する。上記宿主細胞へのキシロースの輸送は上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される。
【００６１】
他の局面は宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法を包含している。当該方法は、ＸＵＴ１であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、ならびに当該宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、アラビノースまたはアラビノース源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記ポリペプチドは、上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために当該宿主細胞にアラビノースを輸送する。上記宿主細胞へのアラビノースの輸送は上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される。
【００６２】
他の局面は宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法を包含している。当該方法は、ＮＣＵ０６１３８であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、ならびに当該宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、アラビノースもしくはグルコースの源、アラビノースまたはグルコースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記ポリペプチドは、上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために当該宿主細胞にアラビノースまたはグルコースを輸送する。上記宿主細胞へのアラビノースまたはグルコースの輸送は上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される。
【００６３】
他の局面は宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法を包含している。当該方法は、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３およびＸＵＴ３からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、ならびに当該宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、キシロースもしくはグルコース源、キシロースまたはグルコースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記ポリペプチドは、上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために当該宿主細胞にキシロースを輸送する。上記宿主細胞へのキシロースの輸送は上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される。
【００６４】
他の局面は宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法を包含している。当該方法は、ＮＣＵ００８２１およびＳＴＬ１２／ＸＵＴ６からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、ならびに当該宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、キシロース、アラビノースもしくはグルコース源、キシロース、アラビノースまたはグルコースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記ポリペプチドは、上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために当該宿主細胞にキシロース、アラビノースまたはグルコースを輸送する。上記宿主細胞へのキシロース、アラビノースまたはグルコースの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される。
【００６５】
グルコースを輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を培養することによって炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる上述の局面のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記グルコース源はセルロースを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、キシロースまたはアラビノースの上記源はヘミセルロースを含んでいる。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記炭化水素または炭化水素の誘導体は燃料として使用され得る。燃料として使用され得る上記炭化水素または炭化水素の誘導体を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記炭化水素または炭化水素の誘導体はエタノール含んでいる。燃料として使用され得る上記炭化水素または炭化水素の誘導体を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記炭化水素または炭化水素の誘導体はブタノールを含んでいる。
【００６６】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記宿主細胞は、Saccharomyces sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces monacensis、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces pombe、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces marxiamus、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Pichia stipitis、Sporotrichum thermophile、Candida shehatae、Candida tropicalis、Neurospora crassa、Zymomonas mobilis、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Clostridium beijerinckii、Clostridium acetobutylicum、Moorella thermoacetica、Escherichia coli、Klebsiella oxytoca、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、およびBacillus subtilisからなる群から選択される。
【００６７】
他の局面は細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、ＮＣＵ０７７０５であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を準備すること、ならびにセルロースを含んでいる培地において当該宿主細胞を培養することを包含している。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。一部の実施形態において、上記宿主細胞は、Saccharomyces sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces monacensis、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces pombe、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces marxiamus、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Pichia stipitis、Sporotrichum thermophile、Candida shehatae、Candida tropicalis、Neurospora crassa、Zymomonas mobilis、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Clostridium beijerinckii、Clostridium acetobutylicum、Moorella thermoacetica、Escherichia coli、Klebsiella oxytoca、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、およびBacillus subtilisからなる群から選択される。一部の実施形態において、上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドと作動可能に連結されている誘導性のプロモータをさらに含んでいる。一部の実施形態において、セルラーゼの発現は上記組換えポリヌクレオチドの発現によって宿主細胞において促進される。
【００６８】
他の局面は、バイオマス重合体に基づく細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、ＮＣＵ０５１３７であるポリペプチドをコードしている外因性のポリヌクレオチドを含んでいる細胞を準備すること、当該外因性のポリヌクレオチドの発現を抑制すること、ならびにバイオマス重合体を含んでいる培地において当該宿主細胞を培養することを包含している。上記宿主細胞は、上記外因性のポリヌクレオチドの発現が抑制されていない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。一部の実施形態において、上記宿主細胞は、Saccharomyces sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces monacensis、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces pombe、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces marxiamus、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Pichia stipitis、Sporotrichum thermophile、Candida shehatae、Candida tropicalis、Neurospora crassa、Zymomonas mobilis、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Clostridium beijerinckii、Clostridium acetobutylicum、Moorella thermoacetica、Escherichia coli、Klebsiella oxytoca、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、およびBacillus subtilisからなる群から選択される。一部の実施形態において、上記宿主細胞のセルラーゼ活性は、上記外因性のポリヌクレオチドの発現を抑制することによって向上されている。一部の実施形態において、上記宿主細胞のヘミセルラーゼ活性は、上記外因性のポリヌクレオチドの発現を抑制することによって向上されている。一部の実施形態において、上記組換えポリヌクレオチドの発現を抑制することは、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいる遺伝子を変異させること、または当該遺伝子を欠失させることを包含している。一部の実施形態において、上記バイオマス重合体はセルロースである。一部の実施形態において、上記バイオマス重合体はヘミセルロースである。
【００６９】
他の局面は細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、ＮＣＵ０１５１７、ＮＣＵ０９１３３およびＮＣＵ１００４０からなる群から選択されるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる細胞を準備すること、ならびにセルロースを含んでいる培地において当該宿主細胞を培養することを包含している。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。一部の実施形態において、上記宿主細胞は、Saccharomyces sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces monacensis、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces pombe、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces marxiamus、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Pichia stipitis、Sporotrichum thermophile、Candida shehatae、Candida tropicalis、Neurospora crassa、Zymomonas mobilis、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Clostridium beijerinckii、Clostridium acetobutylicum、Moorella thermoacetica、Escherichia coli、Klebsiella oxytoca、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、およびBacillus subtilisからなる群から選択される。一部の実施形態において、上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドと作動可能に連結されている誘導性のプロモータをさらに含んでいる。一部の実施形態において、ヘミセルラーゼ活性は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって向上されている。
【００７０】
他の局面はセルロースを分解させる方法を包含している。当該方法は、セルロースを含んでいる組成物を準備すること、ならびに当該組成物を、改変された生物から得られた、セルラーゼ含有の酵素混合物と接触させることを包含している。セルラーゼ含有の上記酵素混合物は、改変されていない生物から得られた、セルラーゼ含有の酵素混合物と比べて、低下したβ−グルコシダーゼ活性を有しており、上記セルロースは、セルラーゼ含有の上記酵素混合物によって分解される。一部の実施形態において、上記生物はβ−グルコシダーゼをコードしている遺伝子の変異によって改変されている。一部の実施形態において、上記生物はβ−グルコシダーゼの発現を低下させることによって改変されている。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記生物は真菌および細菌からなる群から選択される。真菌および細菌からなる群から選択される上記生物を有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記生物は糸状菌である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記セルロースは植物材料に由来する。植物材料に由来するセルロースを有している上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記植物材料は、スイッチグラス、Miscanthus、もみ殻、バガス、アマ、タケ、サイザル繊維、アバカ、麦わら、葉、刈り取った芝、トウモロコシの茎および葉、トウモロコシの穂軸、穀類の蒸留粕、マメ科の植物、サトウモロコシ、サトウキビ、テンサイの果肉、材木の切り屑、おが屑、ならびにバイオマス収穫物からなる群から選択される。
【００７１】
他の局面は宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、ならびに当該宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるための化合物の原料を含んでいる培地において当該宿主細胞を培養することを包含している。上記組換えポリヌクレオチドは、ＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ００９８８、ＮＣＵ０１２３１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０５５１９、ＮＣＵ０５８５３、ＮＣＵ０５８９７、ＮＣＵ０６１３８、ＮＣＵ００８０９、ＮＣＵ０８１１４、ＮＣＵ１００２１および表１５に記載の遺伝子のうちのいずれかからなる群から選択される配列によってコードされているポリペプチドをコードしている。上記宿主細胞への上記化合物の輸送は上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される。一部の実施形態において、上記宿主細胞は、Saccharomyces cerevisiae、Escherichia coli、Zymomonas mobilis、Neurospora crassa、Candida shehatae、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Moorella thermocetica、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、Klebsiella oxytoca、およびPichia stipitisからなる群から選択される。一部の実施形態において、上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドと作動可能に連結されている誘導性のプロモータをさらに含んでいる。一部の実施形態において、上記組換えポリヌクレオチドは、ＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ００９８８、ＮＣＵ０１２３１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０５５１９、ＮＣＵ０５８５３、ＮＣＵ０５８９７、ＮＣＵ０６１３８、ＮＣＵ００８０９、ＮＣＵ０８１１４、ＮＣＵ１００２１、および表１５に記載のいずれかの遺伝子からなる群から選択される配列によってコードされているポリペプチドに対する少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有しているポリペプチドをコードしている。いくつかの実施形態において、上記炭化水素または炭化水素の誘導体は燃料として使用され得る。一部の実施形態において、上記培地はセルロースを含んでいる。他の実施形態において、上記培地はヘミセルロースを含んでいる。一部の実施形態において、上記化合物は糖である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記糖はペントースである。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記糖はヘキソースである。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記糖は二糖である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記糖はオリゴ糖である。他の実施形態において、上記化合物は植物性のフェノールである。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記植物性のフェノールはキナ酸である。上述の実施形態のいずれかと組み合わせられ得る一部の実施形態において、上記植物性のフェノールはニコチンアミドである。他の実施形態において、上記化合物はピルビン酸または乳酸である。
【００７２】
他の局面はバイオマス重合体に基づく細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、ならびに上記バイオマス重合体を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記組換えポリヌクレオチドは、表１０に記載のNeurosporaもしくはPichia stipitisの遺伝子、Tian et al., PNAS, 2009, vol. 106, no. 52, 22157-22162（その開示事項は参照によって本明細書に援用される）における第３頁のSupplemental Data、Dataset S1に記載のNeurosporaもしくはPichia stipitisの遺伝子、表１５に記載のNeurosporaもしくはPichia stipitisの遺伝子、またはＮＣＵ０１５１７、ＮＣＵ０９１３３もしくはＮＣＵ１００４０によってコードされているポリペプチドをコードしている。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、より早く成長する。一部の実施形態において、上記組換えポリヌクレオチドは、ＮＣＵ００１３０．２、ＮＣＵ００２４８．２、ＮＣＵ００３２６．２、ＮＣＵ００７６２．２、ＮＣＵ００８１０．２、ＮＣＵ００８９０．２、ＮＣＵ０３３２８．２、ＮＣＵ０３４１５．２、ＮＣＵ０３７３１．２、ＮＣＵ０３７５３．２、ＮＣＵ０４１９７．２、ＮＣＵ０４２４９．２、ＮＣＵ０４２８７．２、ＮＣＵ０４３４９．２、ＮＣＵ０４４７５．２、ＮＣＵ０４９９７．２、ＮＣＵ０５０５７．２、ＮＣＵ０５１５９．２、ＮＣＵ０５４９３．２、ＮＣＵ０５７５１．２、ＮＣＵ０５７７０．２、ＮＣＵ０５９３２．２、ＮＣＵ０６００９.２、ＮＣＵ０６４９０．２、ＮＣＵ０７３４０．２、ＮＣＵ０７８５３．２、ＮＣＵ０７９９７．２、ＮＣＵ０８７４４．２、ＮＣＵ０８７４６．２、ＮＣＵ０８７６０．２、ＮＣＵ０９１０８．２、ＮＣＵ０９４９５.２、ＮＣＵ０９６８０．２、またはＮＣＵ１００４５．２の配列のいずれかによってコードされているポリペプチドをコードしている。一部の実施形態において、上記組換えポリヌクレオチドは、ＮＣＵ０７７０５によってコードされているポリペプチドをコードしている。一部の実施形態において、上記組換えポリヌクレオチドは、表１０に記載のNeurosporaもしくはPichia stipitisの遺伝子、Tian et al., 2009における第３頁のSupplemental Data, Dataset S1に記載のNeurosporaもしくはPichia stipitisの遺伝子、または表１５に記載のNeurosporaもしくはPichia stipitisの遺伝子のいずれかによってコードされているポリペプチドに対する少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有しているポリペプチドをコードしている。一部の実施形態において、上記組換えポリヌクレオチドは、ＮＣＵ００１３０．２、ＮＣＵ００２４８．２、ＮＣＵ００３２６．２、ＮＣＵ００７６２．２、ＮＣＵ００８１０．２、ＮＣＵ００８９０．２、ＮＣＵ０３３２８．２、ＮＣＵ０３４１５．２、ＮＣＵ０３７３１．２、ＮＣＵ０３７５３．２、ＮＣＵ０４１９７．２、ＮＣＵ０４２４９．２、ＮＣＵ０４２８７．２、ＮＣＵ０４３４９．２、ＮＣＵ０４４７５．２、ＮＣＵ０４９９７．２、ＮＣＵ０５０５７．２、ＮＣＵ０５１５９．２、ＮＣＵ０５４９３．２、ＮＣＵ０５７５１．２、ＮＣＵ０５７７０．２、ＮＣＵ０５９３２．２、ＮＣＵ０６００９.２、ＮＣＵ０６４９０．２、ＮＣＵ０７３４０．２、ＮＣＵ０７８５３．��、ＮＣＵ０７９９７．２、ＮＣＵ０８７４４．２、ＮＣＵ０８７４６．２、ＮＣＵ０８７６０．２、ＮＣＵ０９１０８．２、ＮＣＵ０９４９５.２、ＮＣＵ０９６８０．２、またはＮＣＵ１００４５．２の配列のいずれかによってコードされているポリペプチドに対する少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有しているポリペプチドをコードしている。一部の実施形態において、上記組換えポリヌクレオチドは、ＮＣＵ０７７０５によってコードされているポリペプチドに対する少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有しているポリペプチドをコードしている。一部の実施形態において、上記バイオマス重合体はセルロースである。一部の実施形態において、上記バイオマス重合体はヘミセルロースである。一部の実施形態において、上記宿主細胞は、Saccharomyces cerevisiae、Escherichia coli、Zymomonas mobilis、Neurospora crassa、Candida shehatae、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Moorella thermocetica、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、Klebsiella oxytoca、およびPichia stipitisからなる群から選択される。一部の実施形態において、上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドと作動可能に連結されている誘導性のプロモータをさらに含んでいる。一部の実施形態において、セルラーゼの発現は上記組換えポリヌクレオチドの発現によって上記宿主細胞において向上されている。他の実施形態において、ヘミセルラーゼの発現は上記組換えポリヌクレオチドの発現によって上記宿主細胞において向上されている。
【００７３】
他の局面はバイオマス重合体に基づく細胞の成長を促進させる方法を包含している。当該方法は、外因性のポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること、ならびに上記バイオマス重合体を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含している。上記宿主細胞は、上記外因性のポリヌクレオチドが抑制されていない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。上記外因性のポリヌクレオチドは、表１０に記載のNeurosporaもしくはPichia stipitisの遺伝子、Tian et al., PNAS, 2009における第３頁のSupplemental Data、Dataset S1に記載のNeurosporaもしくはPichia stipitisの遺伝子、表１５に記載のNeurosporaもしくはPichia stipitisの遺伝子、または上記外因性のポリヌクレオチドの発現を抑制するNeurosporaもしくはPichia stipitisの遺伝子のうちのいずれかによってコードされているポリペプチドをコードしている。一部の実施形態において、上記外因性のポリヌクレオチドは、ＮＣＵ００１３０．２、ＮＣＵ００２４８．２、ＮＣＵ００３２６．２、ＮＣＵ００７６２．２、ＮＣＵ００８１０．２、ＮＣＵ００８９０．２、ＮＣＵ０３３２８．２、ＮＣＵ０３４１５．２、ＮＣＵ０３７３１．２、ＮＣＵ０３７５３．２、ＮＣＵ０４１９７．２、ＮＣＵ０４２４９．２、ＮＣＵ０４２８７．２、ＮＣＵ０４３４９．２、ＮＣＵ０４４７５．２、ＮＣＵ０４９９７．２、ＮＣＵ０５０５７．２、ＮＣＵ０５１５９．２、ＮＣＵ０５４９３．２、ＮＣＵ０５７５１．２、ＮＣＵ０５７７０．２、ＮＣＵ０５９３２．２、ＮＣＵ０６００９.２、ＮＣＵ０６４９０．２、ＮＣＵ０７３４０．２、ＮＣＵ０７８５３．２、ＮＣＵ０７９９７．２、ＮＣＵ０８７４４．２、ＮＣＵ０８７４６．２、ＮＣＵ０８７６０．２、ＮＣＵ０９１０８．２、ＮＣＵ０９４９５.２、ＮＣＵ０９６８０．２、またはＮＣＵ１００４５．２の配列のいずれかによってコードされているポリペプチドをコードしている。一部の実施形態において、上記外因性のポリヌクレオチドは、ＮＣＵ０５１３７によってコードされているポリペプチドをコードしている。一部の実施形態において、上記組換えポリヌクレオチドは、表１０に記載のNeurosporaもしくはPichia stipitisの遺伝子、Tian et al., PNAS, 2009における第３頁のSupplemental Data、Dataset S1に記載のNeurosporaもしくはPichia stipitisの遺伝子または表１５に記載のNeurosporaもしくはPichia stipitisの遺伝子のいずれかによってコードされているポリペプチドに対する少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有しているポリペプチドをコードしている。一部の実施形態において、上記外因性のポリヌクレオチドは、ＮＣＵ００１３０．２、ＮＣＵ００２４８．２、ＮＣＵ００３２６．２、ＮＣＵ００７６２．２、ＮＣＵ００８１０．２、ＮＣＵ００８９０．２、ＮＣＵ０３３２８．２、ＮＣＵ０３４１５．２、ＮＣＵ０３７３１．２、ＮＣＵ０３７５３．２、ＮＣＵ０４１９７．２、ＮＣＵ０４２４９．２、ＮＣＵ０４２８７．２、ＮＣＵ０４３４９．２、ＮＣＵ０４４７５．２、ＮＣＵ０４９９７．２、ＮＣＵ０５０５７．２、ＮＣＵ０５１５９．２、ＮＣＵ０５４９３．２、ＮＣＵ０５７５１．２、ＮＣＵ０５７７０．２、ＮＣＵ０５９３２．２、ＮＣＵ０６００９.２、ＮＣＵ０６４９０．２、ＮＣＵ０７３４０．２、ＮＣＵ０７８５３．２���ＮＣＵ０７９９７．２、ＮＣＵ０８７４４．２、ＮＣＵ０８７４６．２、ＮＣＵ０８７６０．２、ＮＣＵ０９１０８．２、ＮＣＵ０９４９５.２、ＮＣＵ０９６８０．２、またはＮＣＵ１００４５．２の配列のいずれかによってコードされているポリペプチドに対する少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有しているポリペプチドをコードしている。一部の実施形態において、上記組換えポリヌクレオチドは、ＮＣＵ０５１３７によってコードされているポリペプチドに対する少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有しているポリペプチドをコードしている、一部の実施形態において、上記宿主細胞は、Saccharomyces cerevisiae、Escherichia coli、Zymomonas mobilis、Neurospora crassa、Candida shehatae、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Moorella thermocetica、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、Klebsiella oxytoca、およびPichia stipitisからなる群から選択される。一部の実施形態において、上記バイオマス重合体はセルロースである。他の実施形態において、上記バイオマス重合体はヘミセルロースである。一部の実施形態において、上記宿主細胞のセルラーゼ活性は、上記外因性のポリヌクレオチドの発現を抑制することによって向上されている。他の実施形態において、上記宿主細胞のヘミセルラーゼ活性は、上記外因性のポリヌクレオチドの発現を抑制することによって向上されている。一部の実施形態において、上記外因性のポリヌクレオチドの発現を抑制することは、上記外因性のポリヌクレオチドを含んでいる遺伝子を変異させること、または当該遺伝子を欠失させることを包含している。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ＮＣＵ０７７０５によってコードされているポリペプチドのドメイン構造を示す図である。
【図２】ＮＣＵ０５１３７の系統発生学的な分析を示す図である。N. crassaの予測される相同分子種が、ＢＬＡＳＴによって有意な類似性を示すアミノ酸配列に基づいてＮＣＢＩおよびＪＧＩから検索された。同定されたすべての糸状菌の相同分子種が示されており；ＮＣＢＩのＥ値は、９ｅ−１７５であったB. fuckelianaを除いて、０．０であった。また、ＮＣＵ０５１３７の相同物を多くの細菌において同定した（Ｅ値〜ｅ−３０）。Polaromonas naphthalenivorans（ベータプロテオバクテリウム）由来のＹＰ９８１８７５は外集団として使用された。A.＝Aspergillus；N.＝Neosartorya；P. chyrosogenum＝Penicillium；S.＝Sclerotinia；B.＝Botryotinia；P.＝Pyrenophora；C.＝Cochliobolus；N. haematococca＝Nectria；P. anserina＝Podospora；N.＝Neurospora。系統樹はMEGA3, NJによって作成された。バー＝アミノ酸部位につき０．２の置換。
【図３】単独の炭素源としてのMiscanthusおよびAvicelに基づいて成長させたときの、N. crassaのＦＧＳＣ２４８９およびT. reeseiのＱＭ９４１４の分析を示している図である。N. crassaの野生株ＦＧＳＣ２４８９およびT. reeseiのＱＭ９４１４の培養ろ過物におけるエンドグルカナーゼ活性。N. crassaは、単独の炭素源としてMiscanthusまたはAvicelの粉末のいずれかを２％含んでいるVogel's最少培地に基づいて２５℃において成長させた。T. reesei株は、単独の炭素源としてMiscanthusまたはAvicelの粉末のいずれかを２％含んでいる単独の炭素源としてMiscanthusまたはAvicelの粉末のいずれかを１％含んでいるＭＡ培地、２５℃において播種された。両方の株は同量（１００ｍＬの培養物において１×１０６／ｍＬ）の分生子を用いて播種された。異なる時点の培養物におけるエンドグルカナーゼ活性が、製造者（Megazyme、Ireland）の取扱説明書にしたがって、基質としてアゾ−ＣＭ−セルロースを用いてｐＨ４．５において測定された。
【図４】MiscanthusおよびAvicelに基づいて成長させたN. crassaの転写プロファイルを示す図である。（Ａ）Miscanthus培養物において異なる発現を示している７６９の遺伝子の分類体系的なクラスタ分析。暗部は相対的に高い発現を示しており、明部は相対的に低い発現を示している。レーン１：１６時間にわたるVogel's最少培地におけるN. crassaの培養物の発現プロファイル（Vogel 1956）。レーン２：１６時間にわたる単独の炭素源としてのMiscanthusに基づいて成長させた培養物のプロファイル。レーン３、４、５：５時間、５日間および１０日にわたってMiscanthusに基づいて成長させた培養物のプロファイル。３つのクラスタは、Ｃ１、Ｃ２およびＣ３と示されている。ほとんどのセルラーゼ遺伝子およびヘミセルラーゼ遺伝子の発現レベルの増加を示したクラスタに囲みを付した（Ｃ３クラスタ）。（Ｂ）MiscanthusおよびAvicelに基づいて成長させたN. crassaの培養物の間における発現プロファイルにおける重複の分析（上部）。MiscanthusおよびAvicelに基づいて成長させたN. crassaの培養ろ過物において検出されたタンパク質の、タンデム型質量分析による分析および重複。（Ｃ）Miscanthus培養物における相対的な発現レベルの増加を示した２３１の遺伝子の機能的なカテゴリ（FunCat）の向上分析（Ruepp 2004）。有意な向上を示した（ｐ＜０．００１）機能的なカテゴリ（未分類の群を含んでいる）が示されている。
【図５】１６時間、４０時間、５日間および１０日にわたって最少培地（ＭＭ）およびMiscanthusに基づいて成長させたときの、N. crassaのセルラーゼ遺伝子（Ａ）およびヘミセルラーゼ遺伝子（Ｂ）の発現レベルを示す図である。
【図６】ＭＳによって同定された分泌タンパク質をコードしている遺伝子の欠失を含んでいる株から得られた培養上清のタンパク質プロファイルおよび酵素活性を示す図である。（Ａ）７日にわたってAvicelに基づいて成長させたときに、野生型と比較した、１６の欠失変異株の培養ろ過物に存在しているタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。欠失株は、MiscanthusおよびAvicelの培養ろ過物の両方における質量分析によるタンパク質の同定に基づいて選択された。株は遺伝子のＮＣＵ番号に基づいて順序付けられており、野生株はＦＧＳＣ２４８９である。欠失した遺伝子と対応する消失したタンパク質バンドは囲みを用いて印を付けた。（Ｂ）１６の欠失株および野生型の親株（ＦＧＳＣ２４８９）について（Ａ）と同じサンプルを用いて実施された、総分泌タンパク質、アゾ−ＣＭＣａｓｅおよびβ−グルコシダーゼ活性のアッセイ（実施例５を参照）。活性およびタンパク質濃度は、野生型のレベルと比べて標準化されており、３組の生物学的測定の平均として表した。（Ｃ）（Ａ）と同じサンプルを用いた１６の欠失株から得られた培養ろ過物のセルラーゼ活性。培養ろ過物は１０倍に希釈され、５ｍｇ／ｍＬのAvicelと混合されて（実施例５を参照）、Avicelase活性について評価した。グルコース（黒）およびセロビオース（白）は８時間にわたる４０℃におけるインキュベーションの後に測定された。
【図７】単独の炭素源としてAvicelに基づいて成長させた培養物から得られた変異体の分析に基づくN. crassaの分泌タンパク質の同定を示す図である。７日にわたって２５℃の１００ｍＬの振とうフラスコに入っている２％のAvicelに基づいて成長させたＷＴのN. crassaから分泌タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。１５μＬの未濃縮の培養ろ過物をCriterionの４〜１５％の２６ウェルのゲルにロードした。National Diagnosticsが提供しているProto Blue Safe（クーマシー）を用いてゲルを染色した。タンパク質のバンドは、欠失株における分泌タンパク質の分析に基づいて図６Ａに示されているように、本試験において同定された。
【図８】ΔＮＣＵ０４９５２およびΔＮＣＵ０５１３７における、分泌タンパク質およびｃｂｈ−１（ＮＣＵ０７３４０）およびｇｈ６−２（ＮＣＵ０９６８０；ＣＢＨＩＩ）の発現プロファイルを示す図である。培養物は分生子からAvicelに基づいて成長させられ、３０時間後、２日後（４８時間後）および３日後（７２時間後）に回収された（実施例５を参照）。レーン１〜３：ＷＴ株、ΔＮＣＵ０４９５２株およびΔＮＣＵ０５１３７株のそれぞれに由来する３０時間にわたるAvicelに基づく成長後の２０倍に濃縮した培養ろ過物。レーン４〜６：ＷＴ株、ΔＮＣＵ０４９５２株およびΔＮＣＵ０５１３７株のそれぞれに由来する２日間にわたる成長後の未濃縮の培養ろ過物。レーン７〜９：ＷＴ株、ΔＮＣＵ０４９５２株およびΔＮＣＵ０５１３７株のそれぞれに由来する３日間にわたる成長後の未濃縮の培養ろ過物。（Ｂ）Avicelに基づく成長の間の、ＷＴ株、ΔＮＣＵ０４９５２株およびΔＮＣＵ０５１３７株におけるｃｂｈ−１（ＮＣＵ０７３４０）およびｇｈ６−２（ＮＣＵ０９６８０；ＣＢＨＩＩ）のＲＴ−ＰＣＲ。ＷＴ株および欠失株は分生子からAvicelに基づいて成長させ、４８時間後および７２時間後に回収した（実施例５を参照）。単独の炭素源としてスクロースを有している最少培地（ＭＭ）の培養物を１６時間にわたって成長させた（同様の発育時点）。ｃｂｈ−１およびｇｈ６−２の誘導倍率は、すべてのサンプルにおいて対照として使用されたアクチン遺伝子の発現とともに、ＭＭ条件におけるこれらの遺伝子の発現と相関していた。
【図９】N. crassaにおける植物細胞壁の分解モデルを示す図である。誘導：低レベルに発現された酵素は、植物細胞壁を分解する酵素をコードしている遺伝子の発現レベルを著しく向上させるためのN. crassaに対するシグナルになる二次代謝物（大部分が分泌される）をもたらす。利用：細胞壁の分解産物の移動に特異的な細胞外酵素およびトランスポータは、N. crassaによる植物細胞の材料の、成長への利用を可能にする。いくつかの細胞外タンパク質（ＮＣＵ０５１３７、ＮＣＵ０５０５７およびＮＣＵ０４９５２）は、利用段階におけるセルラーゼおよびヘミセルラーゼの遺伝子発現を調節する代謝物を生成し得る；二重の六角形（セロビオース）、二重の五角形（キシロビオース）、六角形（グルコース）および五角形（キシロース）。示されている植物細胞壁の酵素としては、ＣＢＨ（Ｉ）、ＣＢＨ(ＩＩ)、ＥＧ２、ＥＧ１、ＥＧ６およびキシラナーゼが挙げられる。さらなるセルロース分解性の酵素は示されていない。矢印の濃さは相対的な応答の強度を示している。
【図１０】S. thermophileのタンパク質配列のデータベース対する、N. crassaの推定のトランスポータの配列の検索、またはN. crassaのタンパク質配列のデータベース対する、S. thermophileの推定のトランスポータの配列の検索からのＢＬＡＳＴの結果を示す図である。
【図１１】ＮＣＵ０８１１４を欠失しているN. crassaの株の成長表現型を示す図である。（Ａ）炭素源として結晶性セルロースを用いて３日にわたって成長させた、N. crassaのＷＴ（左）およびΔＮＣＵ０８１１４（右）の振とうフラスコ。（Ｂ）炭素源としてスクロースまたは結晶性セルロースのいずれかを用いて１６時間または２８時間にわたってそれぞれを成長させたN. crassaの培養物からの、Alamar Blue（商標）蛍光発光の平均。蛍光発光はＷＴを１００％に設定して標準化された。エラーバーは３つの生物学的な同型物に基づく測定間における標準誤差であった。ＮＣＵ００８０１を欠失しているN. crassaは明らかな表現型を有していなかった。N. crassaはセロデキストリンをグルコースに加水分解するβ−グルコシダーゼを分泌し（Tian et al., 2009）、当該グルコースは続いて単糖のトランスポータによって取り込まれた（Scarborough 1973）。代替的な消費のこの経路によって、これらの欠失株におけるセロデキストリン輸送の異常の影響が、見かけ上、少なくなった。
【図１２】（Ａ）ＮＣＵ００１３０とともにＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ０５８５３またはＮＣＵ０８１１４を発現しているS. cerevisiaeの株にとってのセロビオース消費、（Ｂ）ＮＣＵ００１３０とともにＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ０５８５３またはＮＣＵ０８１１４を発現しているS. cerevisiaeの株にとってのセロトリオース消費、（Ｃ）ＮＣＵ００１３０とともにＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ０５８５３またはＮＣＵ０８１１４を発現しているS. cerevisiaeの株にとってのセロテトラオース消費、ならびに（Ｄ）ＮＣＵ００１３０とともにＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ０５８５３またはＮＣＵ０８１１４を発現しているS. cerevisiaeの株にとってのセロヘキサオース消費を示す図である。
【図１３】ＮＣＵ００８１１４またはＮＣＵ００８０１を欠失しているN. crassa株によるセロデキストリン消費を示す図である。示されているN. crassa株は、９０μＭのそれぞれの糖とともに１５分にわたってインキュベートされた。バーは、インキュベーション後に上清に残存している、２つの独立した実験から得られた糖の濃度の平均を示している。エラーバーはこれらの実験の間における標準偏差であった。
【図１４】ＮＣＵ００８０１／ｃｂｔ１を発現しているS. cerevisiae株によるセロビオース輸送を示す図である。示されているのは、ＣＢＴ１あり（○）またはＣＢＴ１なし（●）の酵母によるセロビオース輸送である。両方の株は、細胞内β−グルコシダーゼ（ＮＣＵ００１３０）を発現した。セロビオースの開始濃度は５０μＭであった。すべての値は２つの測定の平均であり、エラーバーはこれらの測定間の標準偏差を示している。
【図１５】ＣＢＴ１およびＣＢＴ２に融合させたＧＦＰの局在化および定量化を示す図である。（Ａ）それらのＣ末端にＧＦＰを融合させたｃｂｔ１（左）またはｃｂｔ２（右）を発現しているS. cerevisiaeの画像。（Ｂ）セロビオーストランスポータなしの酵母株、またはそれらのＣ末端にＧＦＰを融合させたｃｂｔ１もしくはｃｂｔ２を発現している酵母株のＧＦＰ蛍光発光。値は、３つの生物学的な同型物からの平均であり、エラーバーはこれらの同型物の間における標準偏差を示している。
【図１６】S. cerevisiaeにおいて発現されているN. crassaの輸送系によるセロデキストリン輸送を示す図である。（Ａ）ＮＣＵ００８０１遺伝子（○、ｃｂｔ１と名づけられている）、ＮＣＵ０８１１４（黒塗りの逆三角、ｃｂｔ２と名づけられている）、またはトランスポータなし（●）を発現している酵母株の、セルロースを介した成長。また、すべての株は、細胞内β−グルコシダーゼ（ＮＣＵ００１３０）を発現していた。それぞれの実験が示されている。３つの独立した実験から得られた成長速度は、ｃｂｔ１、０．０３４１±０．００１０／時間；ｃｂｔ２、０．０１３１±０．０００８／時間；トランスポータなし、０．００２６±０．０００１／時間であった。（Ｂ）セロトリオースおよびセロテトラオースにおける酵母株の成長。炭素源としての役割を果たす０．５％（ｗ／ｖ）のセロトリオース（Ｇ３）またはセロテトラオース（Ｇ４）を用いて、細胞内β−グルコシダーゼ（ＮＣＵ００１３０）および説明文に記載のトランスポータを発現している株を成長させた。それぞれの実験が示されている。３つの独立した実験から得られた成長速度は、ｃｂｔ１  セロトリオース、０．０３３２±０．０００４／時間；ｃｂｔ１  セロテトラオース、０．０２６３±０．００２０／時間；トランスポータなし  セロトリオース、０．００４３±０．００１５／時間；ｃｂｔ２  セロトリオース、０．０１７８±０．０００５／時間；ｃｂｔ２  セロテトラオース０．００４１±０．０００３／時間；トランスポータなし  セロテトラオース、０．００３１±０．０００８／時間であった。（Ｃ）セロビオース（Ｇ２）、セロトリオース（Ｇ３）およびセロテトラオース（Ｇ４）の、精製されたＮＣＵ００１３０による加水分解から生じたグルコース。３つの独立した実験の平均および標準偏差が示されている。酵素なし（２ｎｍｏｌ）のインキュベーションにおける残余のグルコースは示されている値から差し引かれている。
【図１７】ｃｂｔ１（○）、ｃｂｔ２（黒塗りの逆三角）、またはトランスポータなしを発現しているS. cerevisiaeの、グルコースに基づく成長を示す図である。すべての株はβ−グルコシダーゼ（ＮＣＵ００１３０）を発現していた。それぞれの実験が示されている。
【図１８】２５０ｍＬのフラスコにおけるS. cerevisiae株の、セロビオースを介した成長を示す図である。値は、ＮＣＵ００１３０、ｃｂｔ１もしくはｃｂｔ２を発現している酵母株、またはＮＣＵ００１３０を発現しているが、任意のトランスポータを欠失している株の２つの同型培養物の間の平均のＯＤを示している。エラーバーは同型物における標準偏差を示している。
【図１９】ＣＢＴ１およびＣＢＴ２によるセロビオース輸送の動態を示す図である。セロビオース輸送率は、ｃｂｔ１またはｃｂｔ２のいずれかを発現している酵母株によるセロビオース濃度に比例して決定された。輸送率はトランスポータの存在量について標準化された。
【図２０】Neurosporaの遺伝子の組合せを発現しているS. cerevisiaeの、セロビオース、セロトリオースまたはセロテトラオースに基づく成長能（ｘ軸に示されている）を示す図である。
【図２１】ｃｂｔ１またはｃｂｔ２を保持している株におけるセロビオース輸送に関するセロデキストリンによる競合を示す図である。５倍量の非標識の糖のそれぞれは、［３Ｈ］−セロビオース輸送のアッセイの間に含められた。ＣＢＴ１またはＣＢＴ２の基質は、結合の競合によって［３Ｈ］−セロビオース輸送を抑制させる。バーは３つの同型物の平均を示している。エラーバーは３つの同型物の間における標準偏差を示している。値は競合する糖なしの［３Ｈ］−セロビオース輸送率を１００に設定することによって標準化された。
【図２２】精製されたＮＣＵ００１３０のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。レーン１、ｋＤａにおけるタンパク質の分子量の基準。レーン２、ニッケル−ＮＴＡ樹脂における精製後のＮＣＵ００１３０。ｋＤａにおける分子量は左に示されている。
【図２３】セロビオーストランスポータのＮＣＵ０８１１４およびＮＣＵ００８０１の、最尤系統発生解析を示す図である。S. cerevisiaeのＨＸＴ１およびK. lactisのＬＡＣＰを除いて、タンパク質をコードしている示されている遺伝子のすべては、真菌が植物の細胞壁の材料またはセロビオースと接触しているときに、発現レベルを上昇させていると報告されている（Tian et al., 2009; Noguchi et al., 2009; Wymelenberg et al., 2010; Martin et al., 2010）。親和性の低いグルコーストランスポータであるS. cerevisiaeのＨＸＴ１（Reifenberger et al., 1997）が外集団として使用された。
【図２４】N. crassa由来のセロビオーストランスポータを発現しているS. cerevisiaeによる、セロビオース発酵ならびに同時に起こるセルロースの糖化および発酵を示す図である。（Ａ）エタノールへのセロビオースの発酵。ＣＢＴ１あり（●）またはＣＢＴ１なし（○）の酵母株によって産生されたエタノール。ＣＢＴ１あり（黒塗りの逆三角）またはＣＢＴ１なし（△）の酵母株を用いた発酵反応の間におけるセロビオース濃度。（Ｂ）ＣＢＴ１あり、およびＣＢＴ１なしの酵母株を用いたＳＳＦ。ＣＢＴ１を有している株の存在下におけるセロビオース濃度（●）およびグルコース濃度（黒塗りの逆三角）、ならびにＣＢＴ１欠失株の存在下におけるセロビオース濃度（○）およびグルコース濃度（△）。注記、０．１ｍｇ／ｍＬのセロビオース＝２９２μＭ。（Ｃ）ＣＢＴ１あり（●）またはＣＢＴ１なし（○）の株を用いたＳＳＦの間に産生されたエタノール。すべてのパネルにおける値は３つの生物学的な同型物の平均である。エラーバーはこれらの同型物の間における標準偏差を示した。また、すべての株は細胞内β−グルコシダーゼ（ＮＣＵ００１３０）を発現していた。
【図２５】酵母によるグルコースの同時の糖化および発酵の間における糸状菌に由来するセロデキストリン輸送経路の利用を示す図である。セロデキストリン（Ｃｄｅｘ）輸送経路（黒）は、セロデキストリントランスポータ（ＣＢＴ）および細胞内β−グルコシダーゼ（βＧ）を含んでいる。標準的な酵母に存在している糖の異化作用の経路はヘキソーストランスポータを含んでいる。ＳＳＦにおいて、セルラーゼ（ＧＨ）および細胞外β−グルコシダーゼ（βＧ）の両方が利用されている。
【図２６ａ】ｃｂｔ１／ＮＣＵ００８０１のＡｌａ−スキャンを示す図である。
【図２６ｂ】ｃｂｔ１／ＮＣＵ００８０１のポリペプチド配列（重要な残基に印を付した）およびＮＣＵ００８０１における機能にとって重要な残基を示す図である。
【図２６ｃ】ｃｂｔ２／ＮＣＵ０８１１４のポリペプチド配列（重要な残基に印を付した）およびＮＣＵ０８１１４における機能にとって重要な残基を示す図である。
【図２７】P. stipitisに由来するセロビオーストランスポータを発現しているS. cerevisiae株の比較を示す図である。（Ａ）β−グルコシダーゼ、ならびにセロビオーストランスポータＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ０８１１４およびＮＣＵ０５８５３の相同分子種を発現しているS. cerevisiae株の細胞増殖。（Ｂ）P. stipitisに由来するセロビオーストランスポータの比較：β−グルコシダーゼおよびセロビオーストランスポータを発現しているS. cerevisiae株の細胞増殖。（Ｃ）P. stipitisに由来するセロビオーストランスポータの比較：β−グルコシダーゼおよびセロビオーストランスポータを発現しているS. cerevisiae株によるキシロース消費およびエタノール産生。
【図２８】セロビオーストランスポータの整列化させた相同分子種を示す図である。（Ａ）試験された条件下においてトランスポータ機能を有していないと思われるものを含んでいる、セロビオーストランスポータの整列化させた相同分子種。（Ｂ）トランスポータ機能を有していた、セロビオーストランスポータの整列化させた相同分子種。（Ｃ）整列化させたＮＣＵ００８０１およびＮＣＵ０８１１４。
【図２９】ＮＣＵ００８０１およびＮＣＵ０８１１４の同一性モデルにおいて際立って、機能的に重要なモチーフを示す図である。（Ａ）ＮＣＵ００８０１の同一性モデルにおけるセロビオーストランスポータの位置。モチーフは黒によって強調されている。モチーフ［ＬＩＶＭ］−Ｙ−［ＦＬ］−ｘ（１３）−［ＹＦ］−Ｄは、パネルａおよびｂに示されている。モチーフ［ＹＦ］−ｘ（２）−Ｇ−ｘ（５）−［ＰＶＦ］−ｘ（６）−［ＤＱ］は、パネルｃおよびｄに示されている。モチーフＧ−Ｒ−［ＲＫ］はパネルｅおよびｆに示されている。モチーフＲ−ｘ（６）−［ＹＦ］−Ｎパネルｇおよびｈに示されている。モチーフはＷＲ−［ＩＶＬＡ］−Ｐ−ｘ（３）−Ｑはパネルｉおよびｊに示されている。モチーフＰ−Ｅ−Ｓ−Ｐ−Ｒ−ｘ−Ｌ−ｘ（８）−Ａ−ｘ（３）−Ｌ−ｘ（２）−Ｙ−Ｈは、パネルｋおよびｌに示されている。モチーフＦ−［ＧＳＴ］−Ｑ−ｘ−Ｓ−Ｇ−Ｎ−ｘ−［ＬＩＶ］はパネルｍおよびｎに示されている。モチーフＬ−ｘ（３）−[ＹＩＶ]−ｘ(２)−Ｅ−ｘ−Ｌ−ｘ(４)−Ｒ−［ＧＡ］−Ｋ−Ｇは、パネルｏおよびｐに示されている。なお、これらのイメージにおいて膜貫通型のヘリックス６および７をつないでいる残基は、それらが細孔を塞いでしまうので、理解を容易にするために除去されている。（Ｂ）ＮＣＵ０８１１４の同一性モデルにおけるセロビオーストランスポータのモチーフの位置。モチーフは黒によって強調されている。モチーフ［ＬＩＶＭ］−Ｙ−［ＦＬ］−ｘ（１３）−［ＹＦ］−Ｄは、パネルａおよびｂに示されている。モチーフ［ＹＦ］−ｘ（２）−Ｇ−ｘ（５）−［ＰＶＦ］−ｘ（６）−［ＤＱ］は、パネルｃおよびｄに示されている。モチーフＧ−Ｒ−［ＲＫ］はパネルｅおよびｆに示されている。モチーフＲ−ｘ（６）−［ＹＦ］−Ｎはパネルｇおよびｈに示されている。モチーフＷＲ−［ＩＶＬＡ］−Ｐ−ｘ（３）−Ｑはパネルｉおよびｊに示されている。モチーフＰ−Ｅ−Ｓ−Ｐ−Ｒ−ｘ−Ｌ−ｘ（８）−Ａ−ｘ（３）−Ｌ−ｘ（２）−Ｙ−Ｈはパネルｋおよびｌに示されている。モチーフＦ−［ＧＳＴ］−Ｑ−ｘ−Ｓ−Ｇ−Ｎ−ｘ−［ＬＩＶ］はパネルｍおよびｎに示されている。モチーフＬ−ｘ（３）−［ＹＩＶ］−ｘ（２）−Ｅ−ｘ−Ｌ−ｘ（４）−Ｒ−［ＧＡ］−Ｋ−Ｇは、パネルｏおよびｐに示されている。なお、これらのイメージにおいて膜貫通型のヘリックス６および７をつないでいる残基は、それらが細孔を塞いでしまうので、理解を容易にするために除去されている。
【図３０】推定のトランスポータ（Ａ）およびトランスポータ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するプラスミドの構築に使用されたクローニング過程を示す図である。
【図３１】グルコース取込み活性を有していると同定された推定のトランスポータのペントース輸送活性を示す図である。
【図３２】グルコース取込み活性を有していないと同定された推定のトランスポータのペントース輸送活性を示す図である。
【図３３】ＮＣＵ００８２１（ＡＮ２５）、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６（Ｘｙｐ２９）、およびＸＵＴ１（Ｘｙｐ３２）のペントース取込みを示す図である。（Ａ）部分はキシロース取込みを示し、（Ｂ）部分はアラビノース取込みを示す。
【図３４】ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６（Ｘｙｐ２９）を発現しているS. cerevisiaeによる１４Ｃ−標識した糖の取込みを示す図である。
【図３５】ＧＦＰ蛍光発光によって観察したときの、S. cerevisiae細胞において発現されたトランスポータの局在化を示す図である。左から右へ：第１列はＮＣＵ００８２１−ＧＦＰ蛍光発光、ＮＣＵ００８２１  核；第２列はＳＴＬ１２／ＸＵＴ６−ＧＦＰ蛍光発光、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６  核。
【図３６】（ａ）ＮＣＵ００８２１（ＡＮ２５）、（ｂ）ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６（Ｘｙｐ２９）、および（ｃ）ＸＵＴ１（Ｘｙｐ３２）を発現している細胞の非緩衝化の懸濁液に対するマルトースの添加による、ｐＨに対する作用を示す図である。黒の矢印はマルトースを添加した時点を示している。
【図３７】ＮＣＵ００８２１、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６、およびＸＵＴ１の共輸送体アッセイの結果を示す図である。（Ａ）部分はキシロースにとってのＮＣＵ００８２１を示し、（Ｂ）部分はアラビノースにとってのＮＣＵ００８２１を示し、（Ｃ）部分はアラビノースにとってのＸＵＴ１を示し、（Ｄ）部分はキシロースにとってのＸＵＴ１を示し、（Ｅ）部分はアラビノースにとってのＳＴＬ１２／ＸＵＴ６を示し、（Ｆ）部分はキシロースにとってのＳＴＬ１２／ＸＵＴ６を示す。黒の矢印はマルトースが添加された時点を示している。
【図３８】トランスポータの過剰発現の表現型分析を示す図である。Ａ部分はＯＤを示し、Ｂ部分はキシロース濃度を示し、Ｃ部分は０．５％のキシロースを含有している培地におけるキシロース消費を示す。Ｄ部分はＯＤを示し、Ｅ部分はキシロース濃度を示し、Ｆ部分は５％のキシロースを含有している培地におけるキシロース消費を示す。Ｇ部分は、多コピーのプラスミドｐＲＳ４２４に導入されたペントーストランスポータを含んでいるS. cerevisiaeの成長曲線を示す。
【図３９】異種のトランスポータのクローニングに使用したプラスミドのマップを示す図である。
【図４０】ペントーストランスポータの相同分子種を発現しているS. cerevisiaeによる糖の取込みアッセイの結果を示す図である。
【図４１】Clustal W（１．８１）によるペントーストランスポータの相同分子種の整列化配列を示す図である。（ａ）整列化させたキシローストランスポータの相同分子種。（ｂ）整列化させたアラビノーストランスポータ。（ｃ）整列化させたキシローストランスポータおよびアラビノーストランスポータ。コンセンサスキー：“＊”完全に保存されている単一の残基；“：”優勢な集団の保存；“．”優勢ではない集団の保存。
【図４２】キシロース利用酵素を発現させるために改変させた異なるS. cerevisiae株を説明する図である。
【図４３】キシロース利用経路の酵素を含んでいる同一のカセットを発現している、異なる背景の３つのS. cerevisiae株のキシロース代謝（キシロース消費、エタノール産生によって観察されたときの）を示す図である。
【図４４】キシロース利用経路の酵素を含んでいる同一のカセットを発現している、異なる背景の３つのS. cerevisiae株のキシロース取込み率および代謝物の収率を示す図である。
【図４５】種々の条件下におけるS. cerevisiae株ＤＡ２４によるキシロース発酵を示す図である。（ａ）振とうフラスコにおける４０ｇ／Ｌのキシロース、（ｂ）振とうフラスコにおける８０ｇ／Ｌのキシロース、（ｃ）バイオリアクターにおける８０ｇ／Ｌのキシロース。記号：キシロース（黒塗りの四角）、エタノール（◆）およびＯＤ６００（●）。
【図４６】（ａ）S. cerevisiae株ＤＡ２４および（ｂ）P. stipitisの間におけるキシロース消費およびエタノール産生の比較を示す図である。記号：キシロース（黒塗りの四角）、エタノール（◆）およびＯＤ６００（●）。
【図４７】改変されたS. cerevisiaeにおけるキシロース代謝に対する、ＸＹＬ２の過剰発現の作用を試験するために設計された実験を説明する図である。
【図４８】キシロースを発酵させる改変されたS. cerevisiaeのゲノムにおけるさらなるＸＹＬ組込みの作用（すなわちＸＹＬ２の発現レベルの増大）を示す図である。
【図４９】改変されたS. cerevisiaeによるキシロース発酵に対する、ＸＹＬ２およびＸＹＬ３のさらなる同時の過剰発現の作用を示す図である。
【図５０】異なるレベルのキシロース発酵酵素を発現しているS. cerevisiaeを説明する図である。
【図５１】改変されたS. cerevisiaeによる発酵の特異なＸＹＬ１発現の作用を示す図である。
【図５２】同一のＸＹＬ２ＸＹＬ３を発現させ、異なる還元酵素（ＸＹＬ１対ＧＲＥ３）を発現させるために改変されたS. cerevisiae株を説明する図である。
【図５３】４０ｇ／Ｌのキシロースに基づいて成長させた改変されたS. cerevisiaeによるキシロース発酵に対する、ＸＹＬ１対ＧＲＥ３の過剰発現の作用を示す図である。
【図５４】８０ｇ／Ｌのキシロースに基づいて成長させた改変されたS. cerevisiaeによるキシロース発酵に対する、ＸＹＬ１対ＧＲＥ３の過剰発現の作用を示す図である。
【図５５】異なる野生型のＬＡＤ酵素：ａｎＬＡＤ（黒塗りの四角）、ｔＬＡＤ（◆）およびｐｃＬＡＤ（●）の温度依存的な特性およびｐＨ依存的な特性を示す図である。（ａ）温度依存的な触媒活性、（ｂ）長期間にわたる５０℃における熱不活性化、（ｃ）ｐＨ依存的な触媒活性。エラーバーは平均（ｎ＝３）の標準偏差を示している。
【図５６】整列化された、N. crassa由来のＸＤＨ（ｎｃＸＤＨ）およびP. stipitis由来のＸＤＨ（ｐｓＸＤＨ）を示す図である。
【図５７】N. crassaのＬＡＤおよびＸＤＨのｐＨ変化率のプロファイルの比較を示す図である。ＬＡＤの性質決定から取得されたデータは、ＭＥＳ／Ｔｒｉｓ／グリシンの一般的な緩衝液において実施され、低ｐＨ値のための酢酸／ＭＥＳ／Ｔｒｉｓの一般的な緩衝液において実施されたｎｃＸＤＨ（黒塗りの三角）およびｎｃＬＡＤ（●）のデータと重なっていた。
【図５８】Bacteroids stercorisに由来するキシロースイソメラーゼ（ＢｔＸＩ）、Bifidobacterium longumに由来するキシロースイソメラーゼ（ＢｆＸＩ）、およびコドンが最適化されたＢｔＸＩをコードしているＢｔＸＩＯを用いて形質転換したS. cerevisiae株Ｌ２６１２によるエタノール産生を示す図である。ＸＩ遺伝子はｐＲＳ４２４ＴＥＦベクターにクローニングされた。
【図５９】ｐＲＳ４０３ＴＥＦベクターによってゲノムに組み込まれたＢｔＸＩを有しているS. cerevisiae株Ｄ４５２−２によるキシロース消費およびエタノール産生を示す図である。また、プラスミドからＢｔＸＩを発現しているS. cerevisiae株Ｌ２６１２によるキシロース発酵と比較されている。
【図６０】ＸＹＬ２、ＸＹＬ３、または両方（ＸＹＬ２およびＸＹＬ３）を発現しており、組み込まれたＢｔＸＩを含んでいるS. cerevisiae株によるキシロース発酵を示す図である。
【図６１】効率的にキシロースを代謝させるためのペントースリン酸化経路に関与する酵素を過剰発現させるために改変されたS. cerevisiaeにおけるＸＹＬ３発現の必要性を示す図である。
【図６２】E. coli、S. cerevisiaeおよびP. stipitisにおけるＮＣＵ０９７０５の相同物の過剰発現の、発酵パラメータに対する影響を示す図である。（Ａ）セロビオース消費、成長およびエタノール産生、ならびに（Ｂ）エタノールの収率および生産性に対するｇａｌＭ、ＧＡＬ１０−Ｓｃ、ＧＡＬ１０−Ｐｓ、ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃ。
【図６３】糸状菌（N. crassa）に由来するセロデキストリン消化経路、およびキシロースを発酵させる酵母P. stipitisに由来する変更されたキシロース代謝経路の、S. cerevisiaeへの組込みを介した、グルコース抑制なしのセロビオースおよびキシロースの同時の共発酵を可能にする実験的な計画を示す図である。（ａ）代謝によって変換不可能な２つの糖（セロビオースおよびキシロース）を発酵させ得る酵母株を設計するための株の改良方法。セロデキストリンの消化経路は、N. crassaに由来するセロデキストリントランスポータ（ＮＣＵ００８０１）および細胞内β−グルコシダーゼ（ＮＣＵ００１３０）からなる。変更されたキシロース代謝経路は、キシロースリダクターゼのイソ酵素（野生型のＸＲおよび変異体のＸＲＲ２７６Ｈ）、キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＹＬ２）、およびキシルロキナーゼ（ＸＫＳ１）を利用する。（ｂ）本研究において開発された改変されたS. cerevisiaeによる、グルコースおよびキシロースを含んでいる糖の混合物の発酵プロファイル。グルコース発酵はキシロース発酵を完全に抑制し、したがってキシロース発酵はグルコースの枯渇後にのみ始まった。（ｃ）本研究において開発された改変されたS. cerevisiaeによる、セロビオースおよびキシロースを含んでいる糖の混合物の発酵プロファイル。セロビオースおよびキシロースは、炭素源がいずれも互いの消費を抑制しないので、同時に利用された。
【図６４】プラスミド構築のための手順を示す図である。ｐＲＳ４２５シャトルベクターが直鎖化された後に、ＤＮＡ構築方法（Shao et al., 2009）を用いてセロビオーストランスポータおよびβ−グルコシダーゼの遺伝子を組み合わせた。
【図６５】S. cerevisiae株（ａ）ＳＬ０１、（ｂ）ＳＬ０４、（ｃ）ＳＬ０２、（ｄ）ＳＬ０５、（ｅ）ＳＬ０３、（ｆ）ＳＬ０６および（ｇ）ＳＬ００による、時間に応じた４％のセロビオースおよび５％のＤ−キシロースの共発酵の間におけるセロビオースの濃度変化（黒塗りの四角）、グルコースの濃度変化（●）、Ｄ−キシロースの濃度変化（黒塗りの三角）、エタノールの濃度変化（黒塗りの逆三角）およびバイオマスの濃度変化（□）を示す図である。
【図６６】セロビオースおよびキシロースの混合物の入った振とうフラスコ（ａ、ｂ）またはバイオリアクター（ｃ、ｄ）において成長させたS. cerevisiae株のＳＬ０１（ａ、ｃ）およびＳＬ００（ｂ、ｄ）における、時間に応じてプロットした、セロビオースの濃度変化（黒塗りの四角）、グルコースの濃度変化（●）、Ｄ−キシロースの濃度変化（黒塗りの三角）、エタノールの濃度変化（黒塗りの逆三角）およびバイオマスの濃度変化（□）を示す図である。
【図６７】５ｇ／Ｌのグルコース−４０ｇ／Ｌのセロビオース−５０ｇ／Ｌのキシロースの混合物（ａ、ｂ）または１０ｇ／Ｌのグルコース−４０ｇ／Ｌのセロビオース−５０ｇ／Ｌのキシロースの混合物（ｃ、ｄ）を含有している培地の入ったバイオリアクターにおいて成長させたS. cerevisiae株のＳＬ０１（ａ、ｃ）およびＳＬ００（ｂ、ｄ）における、時間に応じてプロットした、セロビオースの濃度変化（黒塗りの四角）、グルコースの濃度変化（●）、Ｄ−キシロースの濃度変化（黒塗りの三角）、エタノールの濃度変化（黒塗りの逆三角）およびバイオマスの濃度変化（□）を示す図である。
【図６８】（ａ）ＮＣＵ００８０１、（ｂ）ＮＣＵ００８０９および（ｃ）ＮＣＵ０８１１４を発現している、β−グルコシダーゼ（ＮＣＵ００１３０）を含んでいるS. cerevisiae株によるセロビオース利用の比較を示す図である。記号：セロビオース（黒塗りの四角）、エタノール（◆）およびＯＤ６００（●）。
【図６９】種々の濃度の２つの糖：（ａ）それぞれ２０ｇ／Ｌのセロビオースおよびキシロース、（ｂ）それぞれ３０ｇ／Ｌのセロビオースおよびキシロース、ならびに（ｃ）それぞれ４０ｇ／Ｌのセロビオースおよびキシロースを含んでいる混合物において成長させたS. cerevisiae株ＤＡ２４−１６ＢＴ３によるセロビオースおよびキシロースの共発酵を示す図である。記号：セロビオース（黒塗りの逆三角）、キシロース（黒塗りの四角）、エタノール（◆）、およびＯＤ６００（●）。
【図７０】S. cerevisiae株ＤＡ２４−１６ＢＴ３によるセロビオースおよびキシロースの共発酵の相乗効果を示す図である。記号：セロビオース（黒塗りの三角）、キシロース（黒塗りの四角）、エタノール（◆）およびＯＤ６００（●）：（ａ）４０ｇ／Ｌのセロビオース、（ｂ）それぞれ４０ｇ／Ｌのセロビオースおよびキシロース、（ｃ）４０ｇ／Ｌのキシロース。
【図７１】S. cerevisiae株ＤＡ２４−１６ＢＴ３および野生型のP. stipitis株によるグルコース、セロビオースおよびキシロースの共発酵を示す図である。記号：セロビオース（黒塗りの三角）、キシロース（黒塗りの四角）、エタノール（◆）、ＯＤ６００（●）およびグルコース（黒塗りの逆三角）。（ａ）ＤＡ２４−１６ＢＴ３、（ｂ）P. stipitis。
【図７２】S. cerevisiae株ＤＡ２４−１６ＢＴ３によるセロビオースおよびキシロースの共発酵の間におけるセロトリオースおよびセロテトラオースの蓄積を示唆する、各時点から得られたＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図７３】セロビオースおよびキシロースの共発酵の間におけるS. cerevisiae株ＤＡ２４−１６ＢＴ３による２２時間にわたる発酵後の発酵培地におけるセロデキストリンの蓄積を証明するＨＰＡＥＣ分析を示す図である。
【図７４】それぞれ４０ｇ／Ｌのセロビオースおよびキシロースの共発酵の間における、組み込まれている１コピーのＮＣＵ００８０１（ａ）および多コピーのプラスミドにおけるＮＣＵ００８０１を発現しているS. cerevisiaeの形質転換体による糖の利用の比較を示す図である。記号：セロビオース（黒塗りの三角）、キシロース（黒塗りの四角）、エタノール（◆）およびＯＤ６００（●）。
【図７５】２つの異なる酵母株の培養によるエタノール産生を示す図である。（ａ）異なるS. cerevisiae株：ＤＡ２４−１６およびＤ４５２ＢＴが試験に使用された。キシロース分子は五角形として示されており、セロビオース分子は２つの六角形として示されていり、（ｂ）キシロースを発酵させる株およびセロビオースを発酵させる株の混合された培養物。
【図７６】N. crassaにおける、キシランに誘導された３５４の遺伝子の表を示す図である。
【図７７】N. crassaの種々のノックアウト株にとっての分泌タンパク質レベル、還元糖、およびアゾ−キシラナーゼ活性を示す図である。
【図７８】野生型、ΔＮＣＵ０５１３７およびΔＮＣＵ０５１３７／ΔＮＣＵ０５１３７−ＧＦＰのNeurospora株にとっての総分泌タンパク質およびＣＭＣ活性を示す図である。
【図７９】分生子におけるＮＣＵ０５１３７−ＧＦＰの局在化を示す図である。
【図８０】菌糸の先端におけるＮＣＵ０５１３７−ＧＦＰの局在化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
本開示は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞に関し、ここで、以下の１つ以上：膜貫通型のα−へリックス１は配列番号１を含んでいる、膜貫通型のα−へリックス２は配列番号２を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでいる、膜貫通型のα−へリックス５は配列番号４を含んでいる、膜貫通型のα−へリックス６は配列番号５を含んでいる、膜貫通型のα−へリックス７は配列番号７を含んでいる、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１およびそれらの間の配列は配列番号８を含んでいる、が満たされており、上記ポリペプチドは、細胞にセロデキストリンを輸送する。本明細書にさらに記載されているのは、細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法、セルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖を共発酵させる方法、ならびに宿主細胞を用いて炭化水素または炭化水素の誘導体を製造する方法である。本明細書にさらに記載されているのは、細胞にペントースを輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞、細胞へのペントースの輸送を促進させる方法、ペントース糖を含んでいる培地における細胞の成長を促進させる方法、および細胞にペントースを輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備することによって炭化水素または炭化水素の誘導体を製造する方法である。
【００７６】
本明細書に使用されるとき、セロデキストリンは、種々の長さのグルコース重合体を指し、セロビオース（２つのグルコースの単量体）、セロトリオース（３つのグルコースの単量体）、セロテトラオース（４つのグルコースの単量体）、セロペンタオース（５つのグルコースの単量体）およびセロヘキサオース（６つのグルコースの単量体）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
本明細書に使用されるとき、糖は、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース）、二糖（例えば、セロビオース、スクロース、ラクトース、マルトース）、およびオリゴ糖（典型的に３〜１０の単糖を含んでいる）を指す。
【００７８】
〔本発明のポリヌクレオチド〕
本明細書における発明は、宿主細胞および当該宿主細胞を使用する方法に関し、ここで、当該宿主細胞は、種々の糖を輸送可能なポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。
【００７９】
本明細書に使用されるとき、“ポリヌクレオチド”、“核酸配列”、“核酸の配列”、およびそれらの変化形は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含んでいる）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含んでいる）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチド、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡに見出だされるような、塩基の対合および塩基の積み重なりを可能にする構成において核酸塩基を含んでいるときの非ヌクレオチドの骨格を含んでいる他の重合体を総称する。したがってこれらの用語は知られている種類の核酸配列の修飾を包含している。当該修飾は、例えば、天然に存在する１つ以上のヌクレオチドの、類似物を用いた置換；例えば、ヌクレオチド内修飾（例えば、無電荷の結合（例えば、メチルホスホン酸塩、ホスホトリエステル、ホスホラミダート、カルバミン酸塩など）を有している、負電荷の結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）を有している、および正電荷の結合（例えば、ホスホラミジン酸アミノアルキル、アミノアルキルホスホトリエステル）を用いた修飾など）を有している；ペンダント部分（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどが挙げられる））を含んでいる修飾を有している；挿入物（例えばアクリジン、ソラレンなど）を有している；およびキレート剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含んでいる修飾である。本明細書に使用されるとき、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの記号は、生化学命名法のＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会によって推奨されている記号である（Biochem. 9:4022, 1970）。
【００８０】
本明細書に使用されるとき、“ポリペプチド”は、重合されている連続する複数のアミノ酸残基（例えば少なくとも約１５の連続する重合されているアミノ酸残基、必要に応じて少なくとも約３０の連続する重合されているアミノ酸残基、少なくとも約５０の連続する重合されているアミノ酸残基）を含んでいるアミノ酸配列である。多くの場合に、ポリペプチドは、トランスポータ、転写因子、未知の機能の未知のタンパク質、またはそれらのドメイン、部分もしくは断片である、重合されているアミノ酸残基の配列を含んでいる。トランスポータは、イオン、小分子、または炭化水素のような巨大分子の、生物学的な膜を通過する移動に関与する。転写因子は、遺伝子発現を制御可能であり、宿主細胞における遺伝子発現を促進させ得るか、または低下させ得る。ポリペプチドは、修飾されているアミノ酸残基、コドンによってコードされていない天然に存在するアミノ酸残基、および非天然に存在するアミノ酸残基を必要に応じて含んでいる。
【００８１】
本明細書に使用されるとき、“タンパク質”は、天然に存在するか、または合成の、アミノ酸配列、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはそれらの部分を指す。
【００８２】
本発明の組換えポリヌクレオチドは、表１０、Tian et al., 2009における第３頁のSupplemental Data, Dataset S1、表１４、１５、１６、２９、または図７６に挙げられている遺伝子のうちのいずれかによってコードされているポリペプチドをコードしている任意のポリヌクレオチドを含んでいる。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、以下の配列：ＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ００８０９、ＮＣＵ０８１１４、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ００８２１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０６１３８、ＳＴＬ１２/ＸＵＴ６、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３、ＸＵＴ１、ＸＵＴ３、ＮＣＵ０７７０５、ＮＣＵ０５１３７、ＮＣＵ０１５１７、ＮＣＵ０９１３３またはＮＣＵ１００４０のうちのいずれかによってコードされているポリペプチドをコードしている任意のポリヌクレオチドを含んでいる。
【００８３】
【表１】
2013500019.tif 000003
【００８４】
一部の実施形態において、本発明の組換えポリヌクレオチドは、少なくとも約２０％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約１００％の、表１０、Tian et al., 2009における第３頁のSupplemental Data, Dataset S1、表１４、１５、１６、２９、または図７６に挙げられている遺伝子の列挙されている任意の遺伝子によってコードされているポリペプチドに対するアミノ酸残基配列の同一性を有しているポリペプチドをコードしている。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも約２０％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約１００％の、ＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ００８０９、ＮＣＵ０８１１４、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ００８２１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０６１３８、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３、ＸＵＴ１、ＸＵＴ３、ＮＣＵ０７７０５、ＮＣＵ０５１３７、ＮＣＵ０１５１７、ＮＣＵ０９１３３またはＮＣＵ１００４０の任意の配列によってコードされているポリペプチドに対するアミノ酸残基配列の同一性を有しているポリペプチドをコードしている。
【００８５】
本発明のポリペプチドは、以上において挙げられている遺伝子によってコードされているポリペプチドの保存的に修飾されたバリアントをコードしているポリヌクレオチドをさらに含んでいる。本明細書に使用されるとき、“保存的に修飾された変異”は、化学的に類似するアミノ酸へのあるアミノ酸の置換を生じるポリペプチドに対する個々の置換、欠失または付加を包含している。機能的に類似のアミノ酸をもたらす保存的な置換の一覧は当業者によく知られている。そのような保存的に修飾された置換は、開示されているものの多形のバリアント、種間の相同物および対立形質であり、これらのを除外しない。以下の８つの群：（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、（７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）は、互いに保存的な置換体であるアミノ酸を含んでいる（例えばCreighton, Proteins （1984）を参照）。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチドは、表１０、Tian et al., 2009における第３頁のSupplemental Data, Dataset S1、表１４、１５、１６、２９、または図７６に挙げられている任意の遺伝子によってコードされているポリペプチドの相同物または相同分子種をコードしているポリヌクレオチドをさらに含んでいる。本明細書に使用されるとき、“相同性”は、基準配列と第２の配列の少なくとも断片との間における配列の類似性を指す。相同物は、単一の第２の配列、配列の断片または配列のデータベースに対して基準配列を比較するための、当該分野に公知の任意の方法、好ましくはＢＬＡＳＴツールを用いることによって特定され得る。後述されている通り、ＢＬＡＳＴは、同一性および類似性の百分率に基づいて配列を比較する。本明細書に使用されるとき、“相同分子種性”は、共通する祖先の遺伝子に由来する、異なる種における遺伝子を指す。
【００８７】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の関係における“同一”または“同一性”百分率という用語は、同一である２つ以上の配列または部分配列を指す。後述する配列比較の演算手順のうちの１つを用いてか、もしくは手動の整列化と視覚的な検査とによって評価されるときに指定される領域の全体、または比較ウインドウの全体にわたる最大の一致性のために比較され、整列化されたときに、２つの配列は、２つの配列が、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の百分率（すなわち２９％の同一性、任意に３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性）を有している場合に、“実質的に同一”である。必要に応じて、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）の長さである領域の全体にわたってか、またはより好ましくは１００〜５００ヌクレオチドの長さ、１０００ヌクレオチドの長さ、または１０００ヌクレオチドを超える長さ（または２０アミノ酸の長さ、５０アミノ酸の長さ、２００アミノ酸の長さまたは２００アミノ酸を超えるの長さ）の領域の全体わたってに存在している。
【００８８】
配列比較のために、１つの配列は、試験配列が比較される基準配列としての役割を典型的に果たす。配列比較の演算手順を用いるとき、試験配列および基準配列は、コンピュータに入力され、必要に応じて部分配列調整が指示され、配列の演算手順プログラムの変数が指示される。初期設定のプログラムのパラメータが使用され得るか、または代替的なパラメータが指示され得る。それから、配列比較の演算手順は、プログラムのパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列にとっての配列同一性の百分率を算出する。２つの配列を同一性について比較するとき、配列は必ずしも連続している必要はないが、任意のギャップは、全体の同一性の百分率を低下させる不利な条件をもたらす。ｂｌａｓｔｎにとって、初期値の変数は、Ｇａｐ開始ペナルティ＝５およびＧａｐ伸長ペナルティ＝２である。ｂｌａｓｔｐにとって、初期値のパラメータはＧａｐ開始ペナルティ＝１１およびＧａｐ伸長ペナルティ＝１である。
【００８９】
本明細書に使用されるとき、“比較ウィンドウ”は、連続する位置の数（２つの配列が最適に整列化された後に、連続する位置の同じ数の基準配列と配列が比較され得る２０〜６００、一般的には約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０が挙げられるが、これらに限定されない）のいずれか１つの部分に対する参照を包含している。比較のための配列の整列化の方法は当該技術において公知である。比較のための配列の最適な整列化は、例えば、Smith and Waterman (1981)の局所的な同一性の演算手順、Needleman and Wunsch (1970) J Mol Biol 48 (3):443−453の同一性整列化の演算手順、Pearson and Lipman (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85 (8) : 2444−2448の類似性の方法のための検索、これらの演算手順の機械化された実施（Wisconsin Genetics Software PackageにおけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびFASTA（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI））、または手動の整列化および視覚的な検査によって、実施され得る（例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. （Ringbou Ed）を参照）。
【００９０】
配列同一性および配列類似性の百分率を決定するために好適な演算手順の２つの例は、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res 25 (17):3389-3402およびAltschul et al. (1990) J. Mol Biol 215 (3)-403-410にそれぞれ記載されている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０の演算手順である。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターを通じて公然と入手可能である。この演算手順は、データベース配列における同じ長さのワードとともに整列化されたときに正とみなされるいくつかの閾値Ｔに一致するか、または閾値Ｔを満たすクエリ配列における長さＷの短いワードを識別することによって、高得点の配列対（ＨＳＰｓ）を特定することに第１に関する。Ｔは、近接するワードの得点の閾値と呼ばれている（上述のAltschul et al.,）。これらの初期の近接するワードのヒット（word hits）は、それらを含んでいるより長いＨＳＰｓを検出するための検索を開始させるのためのもととして機能する。ワードのヒットは、累積の整列化得点が上昇し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積の得点は、ヌクレオチドの配列について、変数Ｍ（整合する残基の対にとっての報酬得点；常に０を超える）および変数Ｎ（整合しない残基のペナルティ得点；常に０未満）を用いて算出される。アミノ酸配列について、採点法のマトリクスは、累積の得点を算出するために使用される。ワードのヒットの各方向への伸長は、累積の整列化得点が最大達成値から数量Ｘまで低下したとき；累積の得点が１つ以上の負に得点される残基の整列化によって０以下に達するとき；または配列のいずれかの端部に達したときに、停止される。ＢＬＡＳＴ演算手順の変数Ｗ、Ｔ、およびＸは、整列化の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を、初期設定として使用する。アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＵＳＵＭ６２採点法マトリクス（Henikoff and Henikoff, (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89 (22):10915-10919を参照）５０のアラインメント、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。
【００９１】
また、ＢＬＡＳＴ演算手順は、２つの配列の間における類似性の統計分析を実施する（例えば、Karlin and Altschul, (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90 (12):5873-5877を参照）。ＢＬＡＳＴ演算手順によってもたらされる類似性の１つの基準は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間における整合が偶然に生じる確率の指標を与え得る最小合計確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））である。例えば、基準配列に対する試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは０．００１である場合に、核酸は基準配列と類似すると見做される。
【００９２】
上述の配列同一性の百分率以外の、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの他の指標は、後述されるように、第１の核酸によってコードされているポリペプチドが、第２の核酸によってコードされているポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的な置換のみによって異なっている場合、典型的に、ポリペプチドは第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの他の指標は、後述されるされるように、２つの分子またはそれらの相補物がストリンジェントな条件の下にハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに他の証拠は、同じプライマーが配列の増幅に用いられ得るということである。
【００９３】
本明細書に記載の通り、本発明のポリヌクレオチドは、メジャーファシリテータスーパーファミリー（Major Facilitator Superfamily）の糖トランスポータファミリー（ＮＣＵ００９８８、ＮＣＵ１００２１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０６１３８、ＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ０８１１４およびＮＣＵ０５８５３が挙げられる）を包含している。トランスポータのメジャーファシリテータスーパーファミリー（ＭＦＳ）のメンバー（トランスポータ分類番号  ２．Ａ．１）のほとんどすべては、細胞内のＮ末端およびＣ末端とともに、膜貫通型の１２のα−ヘリックスからなっている（S. S. Pao, I. T. Paulsen, M. H. Saier, Jr., Microbiol Mol Biol Rev 62, 1 (Mar, 1998)）。ＭＦＳトランスポータの１次配列は非常に異なっている一方で、ＭＦＳトランスポータのすべてはE. coliのラクトースパーミアーゼ（ＬａｃＹ）（J. Abramson et al., Science 301, 610 (Aug 1, 2003)）およびE. coliのＰｉ／グリセロール−３−ホスペート（ｐｈｏｓｐａｔｅ）（ＧｌｐＴ）（Y. Huang, M. J. Lemieux, J. Song, M. Auer, D. N. Wang, Science 301, 616 (Aug 1, 2003)）の四次構造を共有していると考えられている。これらの例において、６つのＮ末端ヘリックスおよび６つのＣ末端へリックスは、へリックス６およびへリックス７の間にある細胞質内の長いループによって接続されている２つの異なるドメインを形成している。この対称性は、ＭＦＳに生じていると考えられる重複現象に対応している。基質は、Ｎ末端のドメインのへリックス１、２、４および５、ならびにＣ末端のドメインのへリックス７、８、１０および１１によって形成される親水性の空洞内に結合する。この空洞は、へリックス３、６、９および１２によって安定化されている。
【００９４】
ＭＦＳ（トランスポータ分類番号  ２．Ａ．１．１）の糖トランスポータファミリーは、膜貫通型のへリックス６および１２（ＰＥＳＰＲ（配列番号９）／ＰＥＴＫ（配列番号１０））、ならびにループ２および８（ＧＲＲ／ＧＲＫ）に見られるモチーフによって特徴付けられている（M. C. Maiden, E. O. Davis, S. A. Baldwin, D. C. Moore, P. J. Henderson, Nature 325, 641 (Feb 12−18, 1987)）。このファミリーとっての全体のHidden Markov Model（ＨＭＭ）は、pfam.janelia.org/family/PF00083#tabview=tab3に見られ得る。PROSITE（N. Hulo et al., Nucleic Acids Res 34, D227 (Jan 1, 2006)）は、このファミリーのメンバーを同定するために２つのモチーフを用いる。第１のモチーフは、［ＬＩＶＭＳＴＡＧ］−［ＬＩＶＭＦＳＡＧ］−“ＳＨ”−“ＲＤＥ”−［ＬＩＶＭＳＡ］−［ＤＥ］−｛ＴＤ｝−［ＬＩＶＭＦＹＷＡ］−Ｇ−Ｒ−［ＲＫ］−ｘ（4，6）−［ＧＳＴＡ］（配列番号１１）である。第２のモチーフは、［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡ］−｛Ｖ｝−ｘ−Ｇ−｛ＫＰ｝−ｘ（７）−［ＬＩＦＹ］−ｘ（２）−［ＥＱ］−ｘ（６）−［ＲＫ］（配列番号１２）である。PROSITEモチーフの読み方の例として、下記のモチーフ：［ＡＣ］−ｘ−Ｖ−ｘ（４）−｛ＥＤ｝は、［ＡｌａまたはＣｙｓ］−任意−Ｖａｌ−任意−任意−任意−任意−｛ＧｌｕまたはＡｓｐを除いて任意｝（配列番号１３）として解釈される。
【００９５】
本明細書に記載の通り、ＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ００８０９、ＮＣＵ０８１１４、ＸＰ＿００１２６８５４１．１、およびＬＡＣ２は、セロデキストリンを輸送するポリペプチドをコードしていると見出された。さらに、アラニンスキャニング実験および配列解析を用いて、膜貫通型の１２のα−へリックス、ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群より選択される１つ以上の配列を含んでいる組換えポリペプチドが、セロデキストリンを輸送するポリペプチドをコードしていることを決定した。
【００９６】
したがって、一局面において、本発明は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−へリックス１は配列番号１を含んでいるポリぺプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供する。他の局面において、本発明は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリぺプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供する。ここで、膜貫通型のα−へリックス２は配列番号２を含んでいる。他の局面において、本発明は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供する。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでいる。他の局面において、本発明は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリぺプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供する。ここで、膜貫通型のα−へリックス５は配列番号４を含んでいる。他の局面において、本発明は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリぺプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供する。ここで、膜貫通型のα−へリックス６は配列番号５を含んでいる。他の局面において、本発明は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリッ��ス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリぺプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供する。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−へリックス７の間にある配列は配列番号６を含んでいる。他の局面において、本発明は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリぺプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供する。ここで、膜貫通型のα−へリックス７は配列番号７を含んでいる。他の局面において、本発明は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリぺプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供する。ここで、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１およびそれらの間の配列は配列番号８を含んでいる
上述の局面のそれぞれは、任意の数の組合せにおいて組み合わせられ得る。これらの局面のうちのいずれかに係るポリヌクレオチドは、配列番号１〜８のうちのいずれか１、２、３、４、５、６もしくは７つを含んでいるポリペプチド、または配列番号１〜８のすべてを含んでいるポリペプチドをコードし得る。例えば、ポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードし得、ここで、膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでいる。また、他の例において、ポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードし得、ここで、膜貫通型のα−ヘリックス２は配列番号２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス３は配列番号３を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス６は配列番号５を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列は配列番号８を含んでいる。
【００９７】
上述の局面の一部の実施形態において、上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性をもつ。
【００９８】
本明細書にさらに記載されているように、ＮＣＵ０８２２１およびＳＴＬ１２／ＸＵＴ６は、キシロースを輸送するポリペプチドをコードしていることが見出された。ＸＵＴ１は、アラビノースを輸送するポリペプチドをコードしていることが見出された。ＮＣＵ０６１３８は、アラビノースまたはグルコースを輸送するポリペプチドをコードしていることが見出された。ＳＵＴ２、ＳＵＴ３およびＸＵＴ３は、キシロースまたはグルコースを輸送するポリペプチドをコードしていることが見出された。ＮＣＵ０４９６３は、キシロース、アラビノース、またはグルコースを輸送するポリペプチドをコードしていることが見出された。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、キシロースを輸送するＮＣＵ０８２２１またはＳＴＬ１２／ＸＵＴ６であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。他の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、アラビノースを輸送するＸＵＴ１であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。他の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、グルコースを輸送するＮＣＵ０６１３８であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。他の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、キシロースまたはグルコースを輸送するＳＵＴ２、ＳＵＴ３、またはＸＵＴ３であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。他の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、キシロース、アラビノースまたはグルコースを輸送するＮＣＵ０４９６３であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。
【００９９】
ＮＣＵ０７７０５によってコードされているポリペプチドをコードしている本発明のポリヌクレオチドは、FunCat（Ruepp, 2004; webpage broad.mit.edu/annotation/genome/neurospora/Home.html）によって、未分類のタンパク質をコードしていると予想されている。しかし、ＮＣＵ０７７０５によってコードされている上記ポリペプチドのＢＬＡＳＴ解析によって、当該ポリペプチドはＣ６ジンクフィンガードメインを含んでいる多くの転写因子と高い類似性を有していることが明らかになった。（図１を参照；例示的な相同物の一覧は、関連する米国特許出願第６１／２７１，８３３号の図２３に見られ得る）。本発明のポリヌクレオチドとしては、ＮＣＵ０７７０によってコードされているポリペプチドのこれらの相同物、または当該分野に公知の任意の方法を用いて同定される任意の他の相同物をコードしているポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１００】
本発明の他の局面において、本発明のポリペプチドは、ＮＣＵ０５１３７によってコードされているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。ＮＣＵ０５１３７によってコードされているポリペプチドは、FunCatによって、未分類のタンパク質と分類されている。しかし、ＮＣＵ０５１３７は、多く糸状子嚢真菌のゲノムにおいて高度に保存されている（図２を参照）。本発明のポリヌクレオチドとしては、ＮＣＵ０５１３７によってコードされているポリペプチドの相同物または当該分野に公知の任意の方法を用いて同定される任意の他の相同物をコードしているポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１０１】
本発明の他の局面において、本発明のポリヌクレオチドは、ＮＣＵ０１５１７、ＮＣＵ０９１３３またはＮＣＵ１００４０によってコードされているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。ＮＣＵ０１５１７によってコードされているポリペプチドは、FunCatによってグルコアミラーゼ前躯体と分類されている。ＮＣＵ０９１３３およびＮＣＵ１００４０によってコードされているポリペプチドは、FunCatによって未分類のタンパク質と分類されている。本発明のポリヌクレオチドとしては、ＮＣＵ０５１３７、ＮＣＵ０９１３３もしくはＮＣＵ１００４０によってコードされているポリペプチドの相同物、または当該分野に公知の任意の方法を用いて同定される任意の他の相同物をコードしているポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１０２】
これらのポリペプチドの推定される機能は、ポリヌクレオチドおよびそのコードされているタンパク質の機能的な分析を実施することによって確認され得る。これらの分析としては、例えば、上記ポリヌクレオチドの欠失を含んでいる株の表現型分析、遺伝学的な相補性実験、上記ポリヌクレオチドの野生型のコピーを過剰発現している株の表現型分析、上記ポリペプチドの組換え体の発現および精製、ならびにこれに続く組換えポリペプチドの生化学的な特性および活性の特徴付けが挙げられる。
【０１０３】
本発明のポリヌクレオチドの配列は、当業者にとって公知の任意の好適な方法（例えば、直接の化学合成またはクローニングが挙げられる）によって調製される。直接の化学合成について、核酸の重合体の形成は、伸長するヌクレオチド鎖の末端５’水酸基に対する３’ブロックヌクレオチド単量体および５’ブロックヌクレオチド単量体の連続的な付加に典型的に関し、ここで、付加のそれぞれは、典型的に亜リン酸誘導体（例えば、リン酸トリエステルまたはホスホラミダイトなど）である付加された単量体の３’位に対する、伸長している鎖の末端５’水酸基の求核攻撃によってもたらされる。そのような方法論は、当業者にとって公知であり、関連する教科書および文献に記載されている（例えば、例えば、Matteucci et al., (1980) Tetrahedron Lett 21 : 719−722 ；米国特許第４，５００，７０７号；米国特許第５，４３６，３２７号；および米国特許第５，７００，６３７号）。さらに、所望される配列は、適切な制限酵素を用いてＤＮＡを開裂させること、電気泳動を用いて断片を分離すること、その後に当業者にとって公知の方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、米国特許第４，６８３，１９５号））を介して所望の核酸配列をゲルから回収することによって、天然資源から単離され得る。
【０１０４】
本発明のポリヌクレオチドは発現ベクターに組み込まれ得る。“発現ベクター”または“ベクター”は、宿主細胞に形質導入するか、宿主細胞を形質転換するか、または宿主細胞を感染させ、それによって細胞にとって本来のものではない核酸および／またはタンパクを発現させるか、または細胞にとって本来の様式ではない様式において核酸および／またはタンパクを発現させる化合物および／または組成物を指す。“発現ベクター”は、宿主細胞によって発現されるべき核酸の配列（通常はＲＮＡまたはＤＮＡ）を含んでいる。また、発現ベクターは、宿主細胞への核酸の侵入を補助する物質（例えば、ウイルス、リポソーム、またはタンパク質外被など）を、必要に応じて含んでいる。本発明における用途について考慮される発現ベクターとしては、任意の好ましい作動性エレメントまたは任意の必要な作動性エレメントとともに、核酸が挿入され得るベクターが挙げられる。さらに、発現ベクターは宿主細胞に移送され得、宿主細胞において複製され得るベクターである必要がある。好ましい発現ベクターは、プラスミド、特に十分に実証されており、核酸配列の転写にとって好ましいか、または必要な作動性エレメントを含んでいる制限酵素認識部位を有しているプラスミドである。そのようなプラスミドおよび他の発現ベクターは、当業者にとって周知である。
【０１０５】
個別のポリヌクレオチドの組込みは、公知の方法（発現ベクター（例えばプラスミド）の特定の部位を切断するための制限酵素（例えば、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｈａＩ、ＸｈｏＩおよびＸｍａＩなど）の使用が挙げられる）によって達成され得る。制限酵素は、切断された発現ベクターの末端に対して相補的な配列を有しているポリヌクレオチドとアニールされ得るか、当該配列を有するために合成され得る一本鎖の末端をもたらす。アニーリングは適切な酵素（例えばＤＮＡリガーゼ）を用いて行われる。当業者によって適切に理解される通り、発現ベクターおよび所望のポリヌクレオチドの両方は、同じ制限酵素を用いてしばしば切断され、これによって当該発現ベクターの末端および当該ポリヌクレオチドの末端が互いに相補的であることを保証する。さらに、ＤＮＡリンカーは、発現ベクターへの核酸配列の連結を容易にするために使用され得る。
【０１０６】
また、一組の個別のポリヌクレオチドは、当業者にとって公知の方法を利用することによって組み合せられ得る（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号）。
【０１０７】
例えば、所望のポリヌクレオチドのそれぞれは、別々のＰＣＲにおいてまず生成され得る。その後、特異的なプライマーは、ＰＣＲ産物の末端が相補的な配列を含んでいるように設計される。上記ＰＣＲ産物が混合され、変性され、ふたたびアニールされるとき、それらの３’末端において一致配列を有している鎖は、重なり合い、互いにプライマーとして機能し得る。ＤＮＡポリメラーゼによるこの重複の伸長は、元の配列がともに“スプライス”されている分子を生成する。この方法において、一組の個別のポリヌクレオチドは、ともに“スプライス”されており、続いて同時に宿主細胞に形質導入される。したがって、複数のポリヌクレオチドのそれぞれの発現は、関連付けられている。
【０１０８】
それから、個別のポリヌクレオチドまたは“スプライス”されたポリヌクレオチドは、発現ベクターに組み込まれる。本発明は、ポリヌクレオチドが発現ベクターに組み込まれる過程について限定されない。当業者は、発現ベクターにポリヌクレオチドを組み込むために必須の工程に精通している。典型的な発現ベクターは、リボソーム結合部位とともに１つ以上の制御領域（例えば、E. coliにおいて開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流が配置されている３〜９ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列）が上流に存在している所望のポリヌクレオチドの配列を含んでいる。Shine and Dalgarno (1975） Nature 254（5495）:34-38およびSteitz (1979) Biological Regulation and Development (ed. Goldberger, R. F.), 1:349 - 399 (Plenum, New York)を参照すればよい。
【０１０９】
本明細書に使用されるとき、“作動可能に連結されている”という用語は、制御配列が、ＤＮＡ配列のコーディング配列、または当該制御配列がポリペプチドの発現を指揮するようなポリヌクレオチドに対する適切な位置に配置されている構成を指す。
【０１１０】
制御領域としては、例えばプロモータおよびオペレータを含んでいる領域が挙げられる。プロモータは、所望のポリヌクレオチドに対して作動可能に連結されており、これによって、ＲＮＡポリメラーゼ酵素を介してポリヌクレオチドの転写を開始させる。オペレータは、抑制因子タンパク質が結合し得るタンパク質結合ドメインを含んでいる、プロモータに隣接している核酸の配列である。抑制因子タンパク質の非存在下において、転写はプロモータを介して開始する。抑制因子タンパク質が存在しているとき、上記オペレータのタンパク質結合ドメインに特異的な抑制因子タンパク質が当該オペレータに結合し、これによって転写を阻害する。この方法によって、使用される特定の制御領域および対応する抑制因子タンパク質の存在または非存在に基づいて、転写の制御が達成される。例としては、ラクトースプロモータ（ラクトースと接触しているときにＬａｄ抑制因子タンパク質は構造を変化させ、これによって、Ｌａｄ抑制因子タンパク質がオペレータに結合することを防止する）、およびトリプトファンプロモータ（トリプトファンと複合化されているときに、ＴｒｐＲ抑制因子タンパク質はオペレータと結合しない立体配座を有している）が挙げられる。他の例は、tacプロモータである（de Boer et al., (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80 (1) : 21-25を参照）。当業者によって適切に理解される通り、これらの発現ベクターおよび他の発現ベクターは、本発明において使用され得、本発明はこの点について限定されない。
【０１１１】
任意の好適な発現ベクターは、所望の配列を組み込むために使用され得るが、容易に入手可能な発現ベクターとしては、限定されることなく、プラスミド（例えば、ｐＳＣｌＯｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＢＲｌＭＣＳ−３、ｐＵＲ、ｐＥＸ、ｐＭＲｌＯＯ、ｐＣＲ４、ｐＢＡＤ２４、ｐＵＣ１９）；ファージ（例えば、Ｍｌ  ３ファージおよびλファージ）が挙げられる。もちろん、そのような発現ベクターは、特定の宿主細胞にとってのみ好適であり得る。しかし、当業者は、任意の特定の発現ベクターが所定の任意の宿主細胞に適しているか否かをどうか、通常の実験によって容易に決定し得る。例えば、発現ベクターは宿主細胞に導入され、それから当該宿主細胞は、生存能力およびベクターに含まれている配列の発現について観察される。さらに、発現ベクターおよび任意の特定の宿主細胞に対するそれらの適合性について説明している関連する教科書および文献が参照され得る。
【０１１２】
〔本発明の宿主細胞〕
本明細書における発明は、セロデキストリンまたはペントースを細胞に輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞に関する。本明細書にさらに記載されているのは、宿主細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法、セロデキストリンを含んでいる培地における宿主細胞の成長を促進させる方法、セルロース由来およびヘミセルロース由来の糖を共発酵する方法、ならびにセロデキストリンを細胞に輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備することによって、炭化水素または炭化水素の誘導体を製造する方法である。本明細書にさらに記載されているのは、宿主細胞へのペントースの輸送を促進させる方法、ペントースを含んでいる培地における宿主細胞の成長を促進させる方法、およびペントースを細胞に輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備することによって、炭化水素または炭化水素の誘導体を製造する方法である。
【０１１３】
“宿主細胞”および“宿主微生物”は、組換えのＤＮＡまたはＲＮＡの挿入を介して形質転換され得る生体の生物学的な細胞を指して、本明細書において交換可能に使用される。そのようなＤＮＡまたはＲＮＡは発現ベクターに存在し得る。したがって、本明細書における宿主生物または細胞は、原核生物（例えば、Eubacteria界）または真核細胞であり得る。当業者によって適切に理解される通り、真核細胞は膜に区切られている核を有しているが、原核細胞は膜に区切られている核を欠いている。
【０１１４】
任意の原核宿主細胞または真核宿主細胞は、核酸の配列を用いて形質転換された後に生存性を維持する限り、本発明に使用され得る。宿主細胞は、必要な核酸配列の形質導入、タンパク質（例えばトランスポータ）または中間生成物のそれに続く発現に悪影響を及ぼさないことが好ましい。好適な真核細胞としては、真菌、植物、昆虫、または動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
好ましい実施形態において宿主細胞は真菌株である。本明細書に使用されるとき、“真菌”は、phyla Ascomycota、Basidiomycota、ChytridiomycotaおよびZygomycota（Hawksworth et al., Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKに定義付けられているような）、ならびにOomycota（Hawksworth et al., 1995, supra, page 171に挙げられているような）およびすべての栄養胞子形成菌（Hawksworth et al., 1995, supra）を包含している。
【０１１６】
一部の実施形態において、真菌の宿主は酵母株である。本明細書に使用されるとき、“酵母”は、有子嚢胞子酵母（エンドマイセス属）、担子胞子酵母、および不完全真菌（分芽菌属）に属する酵母を包含している。酵母の分類は将来的に変化し得るので、本発明の目的のために、酵母はBiology and Activities of Yeast（Skinner, F. A., Passmore, S. M., and Davenport, R. R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980)に記載の通りに定義付けられる。
【０１１７】
より好ましい実施形態において、酵母宿主は、Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、またはYarrowia株である。
【０１１８】
一部の実施形態において、酵母の宿主は、Saccharomyces carlsbergensis株（Todkar, 2010）、Saccharomyces cerevisiae株（Duarte et al., 2009）、Saccharomyces diastaticus株、Saccharomyces douglasii株、Saccharomyces kluyveri株、Saccharomyces norbensis株、Saccharomyces monacensis株（GB−Analysts Reports, 2008）株、Saccharomyces bayanus株（Kristen Publicover, 2010）、Saccharomyces pastorianus株（Nakao et al., 2007）、Saccharomyces pombe株（Mousdale, 2008）、またはSaccharomyces oviformis株である。他の好ましい実施形態において、酵母の宿主は、Kluyveromyces lactis（O.W. Merten, 2001）、Kluyveromyces fragilis（Pestal et al., 2006; Siso, 1996）、Kluyveromyces marxiamus（K. Kourkoutas et al., 2008）、Pichia stipitis（Almeida et al., 2008）、Candida shehatae（Ayhan Demirbas, 2003）、または Candida tropicalis（Jamai et al., 2006）である。他の実施形態において、酵母の宿主は、Yarrowia lipolytica（Biryukova E.N., 2009）、Brettanomyces custersii（Spindler D.D. et al., 1992）、またはZygosaccharomyces roux（Chaabane et al., 2006）であり得る。
【０１１９】
他の一部の実施形態において、真菌の宿主は糸状菌株である。“糸状菌”は、亜門であるEumycotaおよびOomycotaのすべての糸状の形態を包含している（上述のHawksworth et al., 1995によって定義付けられているように）。糸状菌は、一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナンおよび複合的な他の多糖によって構成されている菌糸体の壁によって一般的に特徴付けられている。栄養生長は菌糸の伸長によるものであり、炭素異化は必須に好気性である。対照的に、酵母（例えばSaccharomyces cerevisiae）による栄養生長は、単細胞の葉状体の出芽によるものであり、炭素異化は発酵性であり得る。
【０１２０】
好ましい実施形態において、糸状菌宿主は、Acremonium株、Aspergillus株、Fusarium株、Humicola株、Mucor株、Myceliophthora株、Neurospora株、Penicillium株、Scytalidium株、Thielavia株、Tolypocladium株、またはTrichoderma株であるが、これらに限定されない。
【０１２１】
一部の実施形態において、糸状菌宿主は、Aspergillus awamori株、Aspergillus foetidus株、Aspergillus japonicus株、Aspergillus nidulans株、Aspergillus niger株または Aspergillus oryzae株である。他の実施形態において、糸状菌宿主は、Fusarium bactridioides株、Fusarium cerealis株、Fusarium crookwellense株、Fusarium culmorum株、Fusarium graminearum株、Fusarium graminum株、Fusarium heterosporum株、Fusarium negundi株、Fusarium oxysporum株、Fusarium reticulatum株、Fusarium roseum株、Fusarium sambucinum株、Fusarium sarcochroum株、Fusarium sporotrichioides株、Fusarium sulphureum株、Fusarium torulosum株、Fusarium trichothecioides株、またはFusarium venenatum株である。さらに好ましい他の実施形態において、糸状菌宿主は、Humicola insolens株、Humicola lanuginosa株、Mucor miehei株、Myceliophthora thermophila株、Neurospora crassa株、Penicillium purpurogenum株、Scytalidium thermophilum株、Sporotrichum thermophile株（Topakas et al., 2003)、またはThielavia terrestris株である。さらなる実施形態において、糸状菌宿主は、Trichoderma harzianum株、Trichoderma koningii株、Trichoderma longibrachiatum株、Trichoderma reesei株、またはTrichoderma viride株である。
【０１２２】
他の好ましい実施形態において、宿主細胞は原核生物であり、一部の実施形態において、原核生物はE. coli（Dien, B.S. et al.,  2003; Yomano, L. P. et al., 1998; Moniruzzaman et al., 1996）、Bacillus subtilis（Susana Romero et al., 2007）、Zymomonas mobilis（B. S. Dien et al, 2003; Weuster Botz, 1993; Alterthum and Ingram, 1989）、Clostridium sp.（Zeikus, 1980; Lynd et al., 2002; Demain et al., 2005）、Clostridium phytofermentans（Leschine S., 2010)、Clostridium thermocellum （Lynd et al., 2002）、Clostridium beijerinckii（Giles Clark, 2008)、Clostridium acetobutylicum（Moorella thermoacetica）（Huang W.C. et al., 2004; Dominik et al., 2007）、Thermoanaerobacterium saccharolyticum（Marietta Smith, 2009）、またはKlebsiella oxytoca（Dien, B.S. et al., 2003; Zhou et al., 2001; Brooks およびIngram, 1995）である。他の実施形態において、原核宿主細胞は、Carboxydocella sp.（Dominik et al., 2007）、またはCorynebacterium glutamicum （Masayuki Inui, et al., 2004）、Enterobacteriaceae（Ingram et al., 1995）、Erwinia chrysanthemi （Zhou および Ingram, 2000; Zhou et al., 2001)、Lactobacillus sp. （McCaskey, T.A., et al., 1994）、Pediococcus acidilactici（Zhou, S. et al., 2003)、Rhodopseudomonas capsulata（X.Y. Shi et al., 2004）、Streptococcus lactis（J.C. Tang et al., 1988)、Vibrio furnissii（L.P. Wackett, 2010)、Vibrio furnissii M1 （Park et al, 2001)、Caldicellulosiruptまたは saccharolyticus （Z. Kadar et al., 2004）、または Xanthomonas campestris（S.T. Yang et al., 1987）である。他の実施形態において、宿主細胞はシアノバクテリアである。細菌性の宿主細胞のさらなる例としては、限定されることなく。Escherichia、Enterobacter、Azotobacter、Erwinia、Bacillus、Pseudomonas、Klebsiella、Proteus、Salmonella、Serratia、Shigella、Rhizobia、Vitreoscilla、Synechococcus、Synechocystis、およびParacoccusの分類学的な分類に割り当てられている種が挙げられる。
【０１２３】
本発明の特に好ましい実施形態において、宿主細胞は、Saccharomyces sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces monacensis、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces pombe、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces marxiamus、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Pichia stipitis、Sporotrichum thermophile、Candida shehatae、Candida tropicalis、Neurospora crassa、Zymomonas mobilis、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Clostridium beijerinckii、Clostridium acetobutylicum、Moorella thermoacetica、Escherichia coli、Klebsiella oxytoca、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、または Bacillus subtilisである。Saccharomyces sp.としては工業的なSaccharomyces株が挙げられる。Argueso et al.は、バイオエタノール産生に一般的に使用される工業的なSaccharomyces株のゲノム構造、およびバイオエタノール産生に重要な特定の遺伝子多型について議論している（Genome Research, 19: 2258−2270, 2009）。
【０１２４】
本発明の宿主細胞は、組換え核酸が宿主細胞に導入されて、遺伝学的に変更され得る。したがって、そのような遺伝的に変更された宿主細胞は天然に存在しない。好適な宿主細胞は、機能について異なっている１つ以上のタンパク質をコードしている１つ以上の核酸コンストラクトを発現可能な細胞である。
【０１２５】
本明細書に使用されるとき、“組換え核酸”または“異種核酸”または“組換えポリヌクレオチド”は、以下の少なくとも１つ：（ａ）所定の宿主細胞にとって核酸の配列が外来性である（すなわち、天然には細胞に見られない）；（ｂ）配列は所定の宿主細胞において天然に見られ得るが、異常な（例えば予想を超えた）量において認められ得る；または（ｃ）核酸の配列は互いに同じ関係において天然に見られない２つ以上の部分配列を含んでいる、を満たしている核酸の重合体を指す。例えば、例（ｃ）に関して、組換え核酸配列は、新たな機能的な核酸を作製ために配置されている無関係な遺伝子に由来する２つ以上の配列を有している。特に、本発明は、宿主細胞への発現ベクターの導入について説明しており、当該発現ベクターは、宿主細胞において通常には見られないタンパク質をコードしている核酸配列を含んでいるか、または細胞において通常に見られるが、異なる制御配列の制御下にあるタンパク質をコードしている核酸配列を含んでいる。その結果として、宿主細胞のゲノムに関して、タンパク質をコードしている核酸配列は組換え体である。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされている任意のタンパク質を必然的に生成する。所望のタンパク質をコードしている遺伝子は宿主細胞にとって異種であり得るか、またはこれらの遺伝子は宿主細胞にとって内因性であり得るが、宿主細胞の遺伝子のさらなる高発現をもたらす異種のプロモータおよび／または制御領域と作動可能に連結されている。他の実施形態において、宿主細胞は、所望のタンパク質を自然には生成せず、それらの分子の生成に必要な１つ以上の遺伝子の発現が可能な異種の核酸コンストラクトを含んでいる。
【０１２７】
核酸分子もしくはポリペプチドおよび特定の細胞もしくは微生物に言及して本明細書に使用されるとき、“内因性”は、組換え改変技術を用いて細胞内に導入されなかった、細胞に存在している核酸配列またはペプチド（例えば、細胞が天然から最初に単離されたときに、細胞に存在した遺伝子）を指す。
【０１２８】
“遺伝学的に改変された”または“遺伝学的に変更された”は、上昇したレベル、低下したレベル、または変異された形態においてタンパク質を発現する原核宿主細胞または真核宿主細胞を作製するために用いられる任意の組換えＤＮＡ法もしくは組換えＲＮＡ法を指す。言い換えると、宿主細胞は、組換えポリヌクレオチド分子を用いて形質移入されるか、形質転換されるか、または形質導入され、それによって細胞が所望のタンパク質の発現を変更するように変えられている。宿主細胞を遺伝学的に改変させる方法およびベクターは、当業者によく知られている；例えば種々の技術が、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds.（Wiley & Sons, New York, 1988, and quarterly updates）に示されている。遺伝学的改変技術としては、発現ベクター、標的化された相同性組換えおよび遺伝子活性化（例えば、Chappelの米国特許第５，２７２，０７１号を参照）、ならびに改変された転写因子によるトランス活性化（例えば、, Segal et al., (1999） Proc Natl Acad Sci USA 96（6）:2758−2763参照）が挙げられるが、これらに限定されない
遺伝子の発現または機能の促進をもたらす遺伝子の修飾は、遺伝子の増幅、過剰生産、過剰発現、活性化、促進、増強、付加または上方制御と呼ばれ得る。より詳細には、本明細書において述べられている酵素または他のタンパク質の作用（または活性）を促進することに対する言及は、酵素またはタンパク質の促進された発現および／または機能性（生物学的な活性）をもたらす、該当する宿主細胞の遺伝学的な任意の修飾を指し、タンパク質のより高い活性もしくは作用（例えば、特異的な活性または生体内の酵素活性）、タンパク質の低下した阻害もしくは分解、およびタンパク質の過剰発現を包含している。例えば、遺伝子のコピー数が増加され得るか、天然のプロモータと比べて高い発現レベルをもたらすプロモータの使用によって発現レベルは増加され得るか、または遺伝子は、遺伝的な改変もしくは古典的な変異生成によって変更されて、酵素の生物学的な活性もしくはタンパク質の作用を増強させ得る。また、これらの修飾のうちいくつかの組合せが可能である。
【０１２９】
遺伝子の発現、遺伝子の機能、または遺伝子産物（すなわち、遺伝子によってコードされているタンパク質）の機能の抑制をもたらす遺伝子の修飾は、不活性化（完全または部分的な）、欠失、中断、妨害、サイレンシング、または下方制御（すなわち遺伝子の発現の減弱）を指し得る。例えば、遺伝子によってコードされているタンパク質の機能の低下をもたらす遺伝子の遺伝学的な修飾は、遺伝子の完全な欠失（すなわち、遺伝子が存在せず、したがってタンパク質が存在しない）、タンパク質の不完全な翻訳もしくは翻訳の消失（例えばタンパク質は発現されない）をもたらす遺伝子の変異、またはタンパク質の天然の機能を低下させるか、もしくは消失させる（例えば、低下しているかもしくは消失している酵素活性もしくは作用を有しているタンパク質が発現される）遺伝子の変異の結果であり得る。より詳細には、本明細書に述べられているタンパク質の活性の低下に対する言及は、タンパク質の低下した発現および／または機能性（生物学な活性）をもたらす、該当の宿主細胞の任意の遺伝学的な修飾を一般的に指しており、タンパク質の発現の低下または消失と同時に、タンパク質の低下した活性（例えば低下した輸送）、タンパク質の増強された阻害または分解を包含している。例えば、本発明のタンパク質の作用または活性は、タンパク質の産生を阻害こともしくは低下させること、タンパク質の作用を低下させること、またはタンパク質の作用を抑制することによって低下させられ得る。また、これらの修飾のうちいくつかの組合せが可能である。タンパク質の産生を阻害することまたは低減させることは、成長培地における誘導性化合物の存在を要求するプロモータの調節下に、タンパク質をコードしている遺伝子を配置することを包含し得る。誘導物質が培地から枯渇するような条件を確立することによって、タンパク質をコードしている遺伝子の発現（したがってタンパク質合成）は停止され得る。また、タンパク質の作用を阻害することまたは低下させることは、参照によって本明細書に援用される米国特許第４，７４３，５４６号に記載のような切除技術手法を用いることを包含し得る。この手法を用いるために、対象のタンパク質をコードしている遺伝子は、ゲノムからの上記遺伝子の特異的な調節された切除を可能にする、特異的な遺伝学的な配列の間にクローン化される。切除は、例えば、米国特許第４，７４３，５４６号にあるような培養の培養温度の変更、またはいくつかの他の物理的シグナルもしくは栄養性のシグナルによって促進され得る。
【０１３０】
一般的に、本発明によれば、変異タンパク質または修飾タンパク質の所定の特性（例えば酵素活性、化合物の輸送能）の向上または低下は、同一または同等の条件において測定されるか、または明らかにされる、同じ生物（同一の起源または親配列）に由来する野生型の（すなわち改変されていない通常の）タンパク質の同じ特性を基準にしてなされている。同様に、遺伝学的に修飾された宿主細胞の性質（例えばタンパク質の発現および／または生物学的な活性、または生成物の生成）の向上または低下は、同一または同等の条件におけるの同じ種、好ましくは同じ株の野生型の宿主細胞の同じ性質を基準にしてなされている。そのような条件としては、タンパク質の活性（例えば発現または生物学的な活性）または宿主細胞の他の性質が測定されるアッセイまたは培養の条件（例えば培地の成分、温度、ｐＨなど）、ならびに用いられるアッセイの種類、評価される宿主細胞などが挙げられる。上述のように、同等の条件は、同じ条件においてなされる比較に照らして、細胞増殖、酵素の発現または生物学的な活性に対する影響を実質的に変更させない、必ずしも同一ではないが、類似する（例えばいくつかの保存的な条件の変化が許容され得る）条件（例えば培養条件）である。
【０１３１】
所定のタンパク質（例えばトランスポータ、酵素）の活性を向上させるか、または低下させる遺伝学的な修飾を有している遺伝学的に変更された宿主細胞は、野生型の宿主細胞における野生型のタンパク質の活性と比較して、少なくとも５％、およびより好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約３５％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約５５％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、または５％〜１００％の間にある全整数における任意のパーセンテージ（例えば６％、７％、８％など）の、タンパク質の活性または作用（例えば発現、産生および／または生物学的な活性）の向上または低下をそれぞれ示す。単離された修飾核酸分子または修飾タンパク質を、単離された野生型の核酸またはタンパク質と直接的に比較する場合（例えば比較がインビボと比べてインビボに対してなされる場合）、同じ差異が好ましい。
【０１３２】
本発明の他の局面において、所定のタンパク質（例えばトランスポータ、酵素）の活性を向上させるか、または低下させる遺伝学的な修飾を有している遺伝学的に変更された宿主細胞は、野生型の宿主細胞における野生型タンパク質の活性と比べて、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍、より好ましくは少なくとも約３０倍、より好ましくは少なくとも約４０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、より好ましくは少なくとも約７５倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約１２５倍、より好ましくは少なくとも約１５０倍、または少なくとも約２倍から始まる任意の全整数の増加（例えば３倍、４倍、５倍、６倍など）の、タンパク質の活性または作用（例えば発現、生産および／または生物学的な活性）の向上または低下をそれぞれ示す。
【０１３３】
（宿主細胞の構成要素）
一局面において、本発明の宿主細胞は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。ここで、膜貫通型のα−へリックス１は配列番号１を含んでいる。他の局面において、本発明の宿主細胞は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。ここで、膜貫通型のα−へリックス２は配列番号２を含んでいる。他の局面において、本発明の宿主細胞は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでいる。他の局面において、本発明の宿主細胞は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス５は配列番号４を含んでいる。他の局面において、本発明の宿主細胞は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス６は配列番号５を含んでいるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。他の局面において、本発明の宿主細胞は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７の間にある配列は配列番号６を含んでいる。他の局面において、本発明の宿主細胞は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでいる。他の局面において、本発明の宿主細胞は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびそれらの間にある配列は配列番号８を含んでいる。
【０１３４】
上述の局面のそれぞれは、任意の数の組合せにおいて組み合わせられ得る。宿主細胞は、配列番号１〜８のうちのいずれか１、２、３、４、５、６または７つの配列を含んでいるポリペプチド、または配列番号１〜８のすべての配列を含み得るポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含み得る。例えば、宿主細胞は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含み得る。ここで、膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでいる。他の例において、宿主細胞は、膜貫通型のα−へリックス１、膜貫通型のα−へリックス２、膜貫通型のα−へリックス３、膜貫通型のα−へリックス４、膜貫通型のα−へリックス５、膜貫通型のα−へリックス６、膜貫通型のα−へリックス７、膜貫通型のα−へリックス８、膜貫通型のα−へリックス９、膜貫通型のα−へリックス１０、膜貫通型のα−へリックス１１、膜貫通型のα−へリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含み得る。ここで、膜貫通型のα−へリックス２は配列番号２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス３は配列番号３を含んでおり、α−ヘリックス６は配列番号５を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列は配列番号８を含んでいる。
【０１３５】
上述の局面の一部の実施形態において、上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性を有している。
【０１３６】
好ましい実施形態において、上記宿主細胞は、β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインをコードしているポリヌクレオチドをさらに含んでいる。本明細書に使用されるとき、β−グルコシダーゼは、β−Ｄ−グルコースの放出にともなう、末端の非還元性のβ−Ｄ−グルコース残基の加水分解を触媒するβ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）を指す。β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインは、例えばVenturi et al., 2002.によって説明されている基礎的な手法にしたがって、決定されるようなβ−グルコシダーゼ活性を有している。β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインは、β−Ｄ−グルコースの遊離をともなう、末端の非還元性のβ−Ｄ−グルコース残基の加水分解を触媒する任意の領域である。好ましい実施形態において、β−グルコシダーゼはグリコシルヒドロラーゼファミリー１のメンバーである。このグループのメンバーは、モチーフ［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］−［ＬＩＶＦＹＳ］−［ＬＩＶ］−［ＬＩＶＭＳＴ］−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡＲ］−［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１４）によって同定され得る。ここで、Ｅは触媒作用性のあるグルタミン酸である （ウェブページexpasy.org/cgi−bin/prosite−search−ac?PDOC00495）。一部の実施形態において、β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインをコードしているポリヌクレオチドは宿主細胞にとって異種である。好ましい実施形態において、β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインは宿主細胞において細胞内に局在している。好ましい実施形態において、β−グルコシダーゼはN. crassaに由来し、特に好ましい実施形態において、β−グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０である。一部の実施形態において、β−グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０の相同分子種であり得る。ＮＣＵ００１３０の相同分子種の例としては、限定されることなく、T. melanosporum、ＣＡＺ８２９８５．１；A. oryzae、ＢＡＥ５７６７１．１；P. placenta、ＥＥＤ８１３５９．１；P. chrysosporium、ＢＡＥ８７００９．１；Kluyveromyces lactis、ＣＡＧ９９６９６．１；Laccaria bicolor、EDR09330；Clavispora lusitaniae、ＥＥＱ３７９９７．１；およびPichia stipitis、ＡＢＮ６７１３０．１が挙げられる。使用され得る他のβ−グルコシダーゼとしては、グリコシルヒドロラーゼファミリー３に由来するβ−グルコシダーゼが挙げられる。これらのβ−グルコシダーゼは、PROSITEにしたがってモチーフ：［ＬＩＶＭ］（２）−［ＫＲ］−ｘ−［ＥＱＫＲＤ］−ｘ（４）−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＴＣ］−［ＬＩＶＴ］−［ＬＩＶＭＦ］−［ＳＴ］−Ｄ−ｘ（２）−［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号１５）によって同定され得る。したがって、Ｄは触媒作用性のアスパラギン酸である。ＮＣＢＩ配列ＣＯＧ２７２３に見られるβ−グルコシダーゼ／６−ホスホ−β−グルコシダーゼ／β−グルコシダーゼの保存された領域を含んでいる任意のβ−グルコシダーゼが、使用され得る。特定のβ−グルコシダーゼから得られた触媒作用領域は、宿主細胞に含まれているセロデキストリントランスポータに依存して選択され得る。
【０１３７】
一部の実施形態において、宿主細胞は、ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上のポリヌクレオチドを含んでいる。１つ以上のポリヌクレオチドは内因性または宿主細胞にとって異種であり得る。本明細書に使用されるとき、ペントースは５つの炭素源子を有している単糖を指す。ペントースの例としては、限定されることなく、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、およびラムノースが挙げられる。ペントース利用に関与する１つ以上の酵素は、限定されることなく、例えば、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、およびキシトールデヒドロゲナーゼの任意の組合せが挙げられる。これらの酵素は、天然にペントース糖を代謝させる任意の生物に由来し得る。そのような生物の例としては、例えば、Kluyveromyces sp.、Zymomonas sp.、E. coli、Clostridium sp.、およびPichia sp.が挙げられる。
【０１３８】
実施例１２〜１５には、宿主細胞におけるペントース利用経路を促進させるか、またはより効率化させる方法が説明されている。宿主細胞の株の背景は、そのペントース利用経路の効率に影響し得る。宿主細胞がSaccharomyces sp.である本発明の実施形態において、好ましいペントース利用経路は、ＤＡ２４−１６（実施例１３参照）およびＬ２６１２（実施例１６参照）を含んでいる。ペントース利用経路に関与する酵素をコードしているポリヌクレオチドを含んでいる他の宿主細胞としては、DuPont Zymomonas 株（WO 2009/058927）およびSaccharomyces株（米国特許第５，７８９，２１０号）が挙げられる。
【０１３９】
本発明の一部の実施形態において、宿主細胞は、ペントーストランスポータをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。一部の実施形態において、ペントーストランスポータとしては、本明細書において見いだされ、かつ記載されているトランスポータ（ＮＣＵ００８２１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０６１３８、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３、ＸＵＴ１、およびＸＵＴ３（実施例１１参照）が挙げられる）が挙げられる。他の実施形態において、ペントーストランスポータとしては、C. intermedia由来のＧｘｓ１、P. stipitis由来のＡｕｔ１、D. hansenii由来のＸｙｌｈｐ（Nobre et al., 1999）、K. marxianus由来のキシローストランスポータ（Stambuk et al., 2003)、Ambrosiozyma monospora由来のＬＡＴ１およびＬＡＴ２（それぞれＥＭＢＬ  ＡＹ９２３８６８およびＡＹ９２３８６９、R. Verho et al.）、C. arabinofermentans由来のＡＲＴ１（Fonseca et al., 2007）、K. marxiamus由来のＫｍＬＡＴ１（Knoshaug et al., 2007）、P. guilliermondii由来のＰｇＬＡＴ２（Knoshaug et al., 2007）、ならびにP. stipitis由来のａｒａＴ（Boles & Keller, 2008)が挙げられ得る。
【０１４０】
〔本発明の宿主細胞の生成方法および培養方法〕
本発明は、セロデキストリンまたはペントースを細胞に輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞に関する。本明細書にさらに記載されているのは、宿主細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法、セロデキストリンを含有している培地における細胞の成長を促進させる方法、セルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖を共発酵させる方法、ならびにセロデキストリンを細胞に輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備することによって、炭化水素または炭化水素の誘導体を製造する方法である。本明細書にさらに記載されているのは、宿主細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法、セロデキストリンを含有している培地における細胞の成長を促進させる方法、セロデキストリンを細胞に輸送するポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備することによって、炭化水素または炭化水素の誘導体を製造する方法である。
【０１４１】
本発明の宿主細胞を製造し、培養する方法は、本発明の組換えポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクターの、宿主細胞への導入または移入を包含し得る。発現ベクターを宿主細胞に移入させるそのような方法は、当業者にとって公知である。例えば、発現ベクターを用いてE. coliを形質転換させる１つの方法は、カルシウム沈降を介して発現ベクターが導入される塩化カルシウム処理に関する。また、他の塩（例えば、リン酸カルシウム）が、類似の手法にしたがって用いられ得る。さらに、電気穿孔法（すなわち、核酸配列による細胞の透過性を増大させる電流の使用）は、宿主細胞に形質移入するために用いられ得る。また、核酸配列のマイクロインジェクションは、宿主細胞に形質移入する能力をもたらす。また、他の手段（例えば、脂質複合体、リポソーム、およびデンドリマー）が採用され得る。当業者は、これらの方法または他の方法を用いて所望の配列を宿主細胞に形質移入し得る。
【０１４２】
ベクターは、自律的に複製するベクター（すなわち、染色体外の構成要素として存在しており、その複製が染色体の複製と独立しているベクター）（例えば、プラスミド、染色体外因子、小染色体または人工染色体）であり得る。ベクターは、自律的な複製を確保する任意の手段を含み得る。代替的に、ベクターは、宿主細胞に導入されるときにゲノムに組み込まれ、組み込まれたゲノムの染色体と共に複製されるベクターであり得る。さらに、宿主細胞のゲノムに導入される総ＤＮＡをともに含んでいる、単一もしくは２つ以上のベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンが用いられ得る。
【０１４３】
ベクターは、形質転換された宿主細胞の容易な選択を可能にする１つ以上の選択可能なマーカーを好ましく含んでいる。選択可能なマーカーは、例えば、殺生物性もしくはウイルスに対する耐性、重金属に対する耐性、および栄養要求性に対する原栄養性などである。細菌細胞の選抜は、遺伝子（例えば、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏ、およびｈｙｇ遺伝子）によって付与された抗生物質耐性に基づいてなされ得る。
【０１４４】
酵母宿主にとって好適なマーカーは、例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。糸状菌宿主における使用に好適なマーカーは、ａｍｄＳ（アセタミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチン  カルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシン  アセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシン  ホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸塩  レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸塩デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸塩アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸塩シンターゼ）などである。Aspergillusにおける使用にとって好ましいのは、Aspergillus nidulansまたはAspergillus oryzaeのａｍｄＳ遺伝子およびｐｙｒＧ遺伝子であり、Streptomyces hygroscopicusのｂａｒ遺伝子である。Trichodermaにおける使用にとって好ましいのはｂａｒおよびａｍｉｄＳである。
【０１４５】
ベクターは、宿主ゲノムへのベクターの組込み、またはゲノムと非依存的に細胞におけるベクターの自律的な複製を可能にする（複数の）因子を含んでいることが好ましい。
【０１４６】
宿主ゲノムへの組込みのために、ベクターは、相同性組換えまたは非相同性によるゲノムへのベクターの組込みのための、遺伝子の配列またはベクターの任意の他のエレメントに依存し得る。代替的に、ベクターは、宿主のゲノムへの相同性組換えによる直接の組込みのためにさらなるヌクレオチドを含んでいる。さらなるヌクレオチド配列は、染色体の正確な位置にベクターを組み込むことを可能にする。正確な位置への組込みの可能性を増大させるために、組込みエレメントは、対応する標的配列に対して高い同一性を有して、相同性組換えの可能性を増大させる十分な数（例えば、１００〜１００００塩基対、好ましくは４００〜１００００塩基対、最も好ましくは８００〜１００００塩基対）の核酸を含んでいる。組込みエレメントは、宿主のゲノムの標的配列と相同性の任意の配列であり得る。さらに、組込みエレメントは、非翻訳領域または翻訳領域のヌクレオチド配列を有しているヌクレオチドの配列であり得る。一方、ベクターは非相同性組換えによって宿主のゲノムに組み込まれ得る。
【０１４７】
自律的な複製のために、ベクターは、該当する宿主においてベクターを自律的に複製させることを可能にする複製の開始点をさらに含んでいる。複製の開始点は、細胞において機能する自律的な複製を媒介する任意のプラスミドレプリケータであり得る。“複製の開始点”または“プラスミドレプリケータ”という用語は、インビボにおけるプラスミドまたはベクターの複製を可能にする配列として本明細書において定義付けられる。酵母宿主における使用のための複製の開始点の例は、複製の２ミクロン開始点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１およびＣＥＮ３の組み合わせ、ならびにＡＲＳ４およびＣＥＮ６の組合せである。糸状菌細胞に有用な複製の開始点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１（Gems et al., 1991; Cullen et al., 1987；国際公開第００／２４８８３号）である。ＡＭＡ１遺伝子の単離、および当該遺伝子を含んでいるプラスミドもしくはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号に開示されている方法によってなされ得る。
【０１４８】
他の宿主にとって、形質転換の手法は、例えば、KluyveromycesについてJeremiah D. Read, et al., Applied and Environmental Microbiology, Aug. 2007, p. 5088-5096、ZymomonasについてOsvaldo Delgado, et al., FEMS Microbiology Letters 132, 1995, 23-26、Pichia stipitisについて米国特許第７，５０１，２７５号、およびClostridiumについて国際公開第２００８／０４０３８７号に見出され得る。
【０１４９】
２コピー以上の遺伝子は、遺伝子産物の生産を促進するために宿主に挿入されて、遺伝子産物の産生を増強させ得る。遺伝子のコピー数の増加は、宿主のゲノム内への少なくとも１コピーのさらなる遺伝子の組込みによって実現され得る。代替的に、遺伝子のコピー数の増加は、増幅されたコピー数の選択的なマーカー遺伝子を含んでいる細胞に、ヌクレオチド配列とともに増幅可能な選択的なマーカー遺伝子を含めるて、これによって遺伝子のさらなるコピーが、適切な選択試薬の存在下における細胞の培養によって選択され得ることによって、実現され得る。
【０１５０】
本発明の組換え発現ベクターの構築のために上述のエレメントを連結させるために使用される方法は、当業者にとって公知である（例えば、上述のSambrook et al., 1989参照）。
【０１５１】
宿主細胞は、少なくとも１つの発現ベクターを用いて形質転換される。１つの発現ベクターのみが用いられるとき（媒介物の添加なしに）、ベクターは、必要な核酸配列のすべてを含んでいる。
【０１５２】
いったん宿主細胞が発現ベクターを用いて形質転換されると、宿主細胞は成長可能になる。本発明の方法は、細胞において組換え核酸が発現されている宿主細胞を培養することを包含している。微生物宿主にとって、この過程は好適な培地における細胞の培養を必然的にともなう。細胞は、３５℃、適切な培地において典型的に成長させられる。本発明における好ましい成長培地としては、通常の市販の調製培地（例えば、Luria Bertani（ＬＢ）培地、Sabouraudデキストロース（ＳＤ）培地または酵母培地（ＹＭ）培地）が挙げられる。また、組成の明らかな他の成長培地または他の合成の成長培地が使用され得、特定の宿主細胞の成長にとって適切な培地は、微生物学または発酵科学の当業者にとって公知である。温度の幅および他の成長に適切な条件は当該分野において公知である（例えばBailey and Ollis 1986参照）。
【０１５３】
本発明のいくつかの局面によれば、培養培地は、宿主細胞のための炭素源を含んでいる。そのような“炭素源”は、原核細胞または単純な真核細胞の成長のための炭素源としての使用に適切な基質または化合物を指す。炭素源は、種々の形態（重合体、炭化水素、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。これらのとしては、例えば、単糖（例えば、グルコース）、オリゴ糖、多糖、バイオマス重合体（例えばセルロースまたはヘミセルロース）、キシロース、アラビノース、二糖（例えばスクロース）、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、コハク酸塩、乳酸塩、酢酸塩、エタノールなど、またはこれらの混合物が挙げられる。炭素源は、さらに光合成の産物（グルコースが挙げられるが、こらに限定されない）であり得る。
【０１５４】
好ましい実施形態において、炭素源はバイオマス重合体（例えばセルロースまたはヘミセルロース）である。本明細書に説明されるとき、“バイオマス重合体”は、生物学的な材料に含まれている任意の重合体である。生物学的な物質は、生存しているか、または死亡している。バイオマス重合体としては、例えばセルロース、キシラン、キシロース、ヘミセルロース、リグニン、マンナン、およびバイオマスに通常に見られる他の物質が挙げられる。非限定的なバイオマス重合体の原料の例としては、草本（例えばスイッチグラス、Miscanthus）もみ殻、バガス、綿、ジュート、麻、アマ、竹、サイザル麻、マニラ麻、麦、葉、刈り取った芝、トウモロコシの茎と葉、トウモロコシの穂軸、穀類の蒸留粕、マメ科の植物、ソルガム、サトウキビ、サトウダイコン繊維、材木の切り屑、おが屑、およびバイオマス収穫物（例えば、Crambe）が挙げられる。
【０１５５】
適切な炭素源に加えて、培地は、好適なミネラル、塩、補助因子、緩衝液および他の構成要素を含んでいる必要がある。当該他の構成要素は、種々の糖の発酵ならびに炭化水素および炭化水素の誘導体の製造にとって必要な酵素的な経路の促進、ならびに培養物の成長にとって好適な、当業者にとって公知の構成要素である。反応は、好気性条件または嫌気性条件のもとに実施され得、ここで、好気性、無酸素性または嫌気性の条件は、微生物の必要性に基づいて選択される。宿主細胞の成長および／または増殖にしたがって、種々の糖もしくはバイオマス重合体に基づく成長、糖発酵、または炭化水素もしくは炭化水素の誘導体の合成に必要な酵素、トランスポータ、または他のタンパク質の発現は、作用を受ける。
【０１５６】
〔細胞への糖の輸送を促進させる方法〕
本発明は細胞への糖の輸送を促進させる方法を提供する。一局面において、本発明は、宿主細胞を準備する第１のステップを包含している、細胞への糖の輸送を促進させる方法を提供する。当該宿主細胞は組換えポリヌクレオチドを含んでいる。当該組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしている。上記第１のステップを包含している上記方法は、以下の１つ以上：膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでいる；膜貫通型のα−ヘリックス２は配列番号２を含んでいる；膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでいる；貫通型のα−ヘリックス３は配列番号３を含んでいる；膜貫通型のα−ヘリックス５は配列番号４を含んでいる；膜貫通型のα−ヘリックス６は配列番号５を含んでいる；膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７の間にある領域は配列番号６を含んでいる；膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでいる；膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列は配列番号８を含んでいる、を満たしている。上記方法は、上記組換えポリヌクレオチドが発現されるように上記宿主細胞を培養する第２のステップを包含しており、上記組換えポリヌクレオチドの発現は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす。細胞へのセロデキストリンの輸送は、当業者にとって公知の方法（実施例９に記載の方法が挙げられる）によって測定され得る。実施例９に記載の方法は、例えば細胞への［３Ｈ］−セロビオースの取込みを測定する方法またはセロビオースが単一の炭素源であるときのS. cerevisiae宿主細胞の成長能を測定する方法である。上記組換えポリヌクレオチドを含んでいる上記宿主細胞および上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない宿主細胞は、それ以外の点では遺伝的背景において典型的に同一である。
【０１５７】
一部の実施形態において、上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性を有している。一部の実施形態において、宿主細胞は、β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。そのような実施形態は、セロデキストリンの内因性の利用能を欠いている宿主細胞にとって有用である。好ましくは、β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインは細胞内存性であることが好ましい。好ましい実施形態において、β−グルコシダーゼはNeurospora crassa由来である。特に好ましい実施形態において、β−グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０によってコードされている。
【０１５８】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法において、上記細胞は、改変された細胞から得られた、セルラーゼ含有の酵素混合物を含んでいる培地において培養され得、セルラーゼ含有の当該酵素混合物は、改変されていない生物から得られた、セルラーゼ含有の酵素混合物と比べて、低いセルラーゼ活性を有している。上記生物は、例えばβ−グルコシダーゼをコードしている遺伝子の変異または標的化されたＲＮＡ干渉などによって、β−グルコシダーゼ発現を低下させるために改変され得る。
【０１５９】
他の局面において、本発明は、ＮＣＵ００８２１またはＳＴＬ１２／ＸＵＴ６であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備するステップ；当該組換えポリヌクレオチドが発現されるように当該宿主細胞を培養するステップを包含している、細胞へのキシロースの輸送を促進させる方法を提供する。上記方法において、上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて細胞へのキシロースの促進された輸送をもたらす。
他の局面において、本発明は、ＸＵＴ１であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備するステップ；当該組換えポリヌクレオチドが発現されるように当該宿主細胞を培養するステップを包含している、細胞へのアラビノースの輸送を促進させる方法を提供する。上記方法において、上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて細胞へのアラビノースの促進された輸送をもたらす。
さらなる他の局面において、本発明は、ＮＣＵ０６１３８であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備するステップ；当該組換えポリヌクレオチドが発現されるように当該宿主細胞を培養するステップを包含している、細胞へのグルコースの輸送を促進させる方法を提供する。上記方法において、上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて細胞へのグルコースの促進された輸送をもたらす。
さらなる他の局面において、本発明は、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３またはＸＵＴ３であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備するステップ；当該組換えポリヌクレオチドが発現されるように当該宿主細胞を培養するステップを包含している、細胞へのキシロースまたはグルコースの輸送を促進させる方法を提供する。上記方法において、上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて細胞へのキシロースまたはグルコースの促進された輸送をもたらす。他の局面において、本発明は、ＮＣＵ０４９６３ポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備するステップ；当該組換えポリヌクレオチドが発現されるように当該宿主細胞を培養するステップを包含している、細胞へのキシロース、アラビノースまたはグルコースの輸送を促進させる方法を提供する。上記方法において、上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて細胞へのキシロース、アラビノースまたはグルコースの促進された輸送をもたらす。
【０１６０】
細胞へのキシロース、アラビノースまたはグルコースの輸送は、当該分野に公知の任意の方法（実施例１１に記載されている方法が挙げられる）によって測定され得る。これらの方法としては、例えば、蓄積したＤ−キシロースとキシリトールと、またはＬ−アラビノースとアラビニトールとを、上記細胞から浸透圧を用いて抽出し、高速液体クロマトグラフィーを用いてそれを分析することによってＤ−キシロースまたはＬ−アラビノースの輸送を測定すること、ならびに単独の炭素源としてのグルコースに基づく成長能を欠いている宿主細胞細胞を用いてグルコースの輸送を測定することが挙げられる。
【０１６１】
また、一部の実施形態において、上記宿主細胞は、ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドを含んでいる。１つ以上の上記酵素は、例えば、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、およびキシトールデヒドロゲナーゼ、または当該分野に公知の任意の他のペントース利用酵素であり得る。
【０１６２】
〔細胞の成長を促進させる方法〕
本発明は、細胞の成長を促進させる方法をさらに提供する。一局面において、本発明は、宿主細胞を準備する第１のステップを包含している細胞の成長を促進させる方法を提供する。上記宿主細胞は、ポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでおり、当該ポリペプチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびα−ヘリックス１２を含んでおり、ここで、以下の１つ以上：膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス２は配列番号２を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス５は配列番号４を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７の間にある配列は配列番号６を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列は配列番号８を含んでいる、ならびに上記ポリペプチドはセロデキストリンを輸送するが、満たされている。上記方法は、セロデキストリンを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養する第２のステップを包含しており、ここで、上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。宿主細胞細胞の成長速度は当業者にとって公知の任意の方法によって測定され得る。典型的に、細胞の成長速度は、懸濁物における細胞の濃度の、吸光度による評価によって測定される。上記組換えポリヌクレオチドを含んでいる上記宿主細胞および上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない宿主細胞は、それ以外の点では遺伝的背景において同一であることが好ましい。セロデキストリンを含んでいる培地はバイオマス重合体（例えばセルロース）の酵素処理に基づいて生じ得る。
【０１６３】
一部の実施形態において、上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性を有している。また、一部の実施形態において、上記宿主細胞は、β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。当該実施形態は、セロデキストリンの利用能を欠いている宿主細胞にとって有用である。β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインは細胞内存性であることが好ましい。好ましい実施形態において、上記β−グルコシダーゼはNeurospora crassaに由来する。特に好ましい実施形態において、上記β−グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０によってコードされている。
【０１６４】
細胞の成長を促進させる方法において、培養培地は、改変された生物から得られた、セルラーゼ含有の酵素混合物を含み得、当該混合物は、改変されていない生物から得られた、セルラーゼ含有の酵素混合物と比べて、低いセルラーゼ活性を有している。上記生物は、例えばβ−グルコシダーゼをコードしている遺伝子の変異または標的化されたＲＮＡ干渉などによって、β−グルコシダーゼ発現を低下させるために改変され得る。
【０１６５】
他の局面において、本発明は、宿主細胞を準備するステップ、およびキシロースを含んでいる培地において当該宿主細胞を培養するステップを包含している、細胞の成長を促進させる方法を提供する。当該宿主細胞は、ＮＣＵ００８２１またはＳＴＬ１２／ＸＵＴ６であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。当該ポリペプチドはキシロースを輸送し、上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。他の局面において、本発明は、宿主細胞を準備するステップ、およびアラビノースを含んでいる培地において当該宿主細胞を培養するステップを包含している、細胞の成長を促進させる方法を提供する。当該宿主細胞は、ＸＵＴ１であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。当該ポリペプチドはアラビノースを輸送し、上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。他の局面において、本発明は、宿主細胞を準備するステップ、ならびにアラビノースおよびグルコースを含んでいる培地において当該宿主細胞を培養するステップを包含している、細胞の成長を促進させる方法を提供する。当該宿主細胞は、ＮＣＵ０６１３８であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。当該ポリペプチドはアラビノースおよびグルコースを輸送し、上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。他の局面において、本発明は、宿主細胞を準備するステップ、ならびにキシロースまたはグルコースを含んでいる培地において当該宿主細胞を培養するステップを包含している、細胞の成長を促進させる方法を提供する。当該宿主細胞は、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３またはＸＵＴ３であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。当該ポリペプチドはキシロースまたはグルコースを輸送し、上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。他の局面において、本発明は、宿主細胞を準備するステップ、ならびにキシロース、アラビノースおよびグルコースを含んでいる培地において当該宿主細胞を培養するステップを包含している、細胞の成長を促進させる方法を提供する。当該宿主細胞は、ＮＣＵ０４９６３であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。当該ポリペプチドは、キシロース、アラビノースおよびグルコースを輸送し、上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【０１６６】
宿主細胞の成長速度は当業者にとって公知の任意の方法によって測定され得る。典型的に、細胞の成長速度は、懸濁物における細胞の濃度の、吸光度による評価によって測定される。上記組換えポリヌクレオチドを含んでいる上記宿主細胞および上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない宿主細胞は、それ以外の点では遺伝的背景において同一であることが好ましい。キシロースまたはアラビノースを含んでいる培地は、バイオマス重合体（例えばヘミセルロース）の酵素処理に基づいて生じ得る。グルコースを含んでいる培地はバイオマス重合体（例えばセルロース）の酵素処理に基づいて生じ得る。
【０１６７】
また、一部の実施形態において、上記宿主細胞は、ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドを含んでいる。１つ以上の上記酵素は、例えばＬ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、キシトールデヒドロゲナーゼ、または当該分野に公知の他のペントース利用酵素であり得る。
【０１６８】
一局面において、本発明は、バイオマス重合体に基づく細胞の成長を促進させる方法を提供する。好ましい実施形態において、上記バイオマス重合体はセルロースである。好ましい他の実施形態において、上記バイオマス重合体はヘミセルロースである。本発明の一局面によれば、上記方法は、ＮＣＵ０７７０５であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備することを包含している。本発明の他の局面によれば、上記方法は、上記バイオマス重合体を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、当該宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【０１６９】
本発明の他の局面において、本発明は、宿主細胞を準備するステップ、およびヘミセルロースを含んでいる培地において当該宿主細胞細胞を培養するステップを包含している、細胞の成長を促進させる方法を提供する。ここで、上記宿主細胞は、ＮＣＵ０１５１７、ＮＣＵ０９１３３またはＮＣＵ１００４０であるポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでおり、上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【０１７０】
本発明の他の局面によれば、上記方法は、ＮＣＵ０５１３７であるポリペプチドをコードしている外因性のポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備することを包含している。本発明の他の局面によれば、上記方法は、上記外因性のポリヌクレオチドの発現を抑制すること、およびバイオマス重合体を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、ここで、上記宿主細胞は、上記外因性のポリヌクレオチドが抑制されていない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【０１７１】
本発明の方法は、上記宿主細胞において組換え体の核酸が発現されるように当該宿主細胞を培養することを包含し得る。微生物の宿主にとって、この過程は好適な培地における細胞の培養を必然的にともなう。典型的に、細胞は、好適な培地、３５℃において成長させられる。本発明において好ましい成長培地としては、例えば市販されている通常の好ましい培地（例えばLuria Bertani（ＬＢ）ブロス、Sabouraud Dextrose（ＳＤ）ブロスまたはYeast medium（ＹＭ）ブロス）が挙げられる。また、特徴付けられている他の成長培地または合成の他の成長培地が使用され得、特定の宿主細胞の成長にとって適切な培地は微生物学または発酵科学の分野における当業者によって知られている。成長にとって好適な温度範囲および他の条件は当該分野において公知である（例えば、Bailey and Ollis 1986を参照すればよい）。
【０１７２】
上記培地における上記バイオマス重合体の供給源としては、例えば、草本（例えばスイッチグラス、Miscanthus）、もみ殻、バガス、綿、ジュート、麻、アマ、サイザル繊維、タケ、麦わら、葉、刈り取った芝、トウモロコシの茎および葉、トウモロコシの穂軸、穀類の蒸留粕、マメ科の植物、サトウモロコシ、サトウキビ、テンサイの果肉、材木の切り屑、おが屑、ならびにバイオマス収穫物（例えばCrambe）が挙げられ得る。バイオマス重合体に加えて、上記培地は、培養物の成長にとって好適な、ミネラル、補助因子、緩衝液、および当業者にとって公知の他の構成要素を含んでいる必要がある。上記宿主細胞の成長速度は当業者にとって公知の任意の方法によって測定され得る。
【０１７３】
本発明の一部の実施形態において、セルラーゼの発現は、組換えポリヌクレオチドの発現によって上記宿主細胞細胞において向上されている。本明細書に使用されるとき“セルラーゼ”は、より短いセロ−オリゴ糖のオリゴマー、セロビオースおよび／またはグルコースに、セルロース重合体を加水分解できる酵素のカテゴリを指す。セルラーゼとしては、限定されることなく、エキソグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼおよびグルコシダーゼが挙げられる。
【０１７４】
本発明の一部の実施形態において、ヘミセルラーゼの発現は、組換えポリヌクレオチドの発現によって上記宿主細胞において向上している。本明細書に使用されるとき“ヘミセルラーゼ”は、ヘミセルロース重合体を加水分解できる酵素のカテゴリを指す。ヘミセルラーゼとしては、限定されることなく、キシラナーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ（エンドおよび／またはエキソの種の両方）、およびそれらの対応するグルコシダーゼキシラナーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ（エンドおよび／またはエキソの種の両方）、およびそれらの対応するグルコシダーゼが挙げられる。ヘミセルラーゼの発現はＲＴ−ＰＣＲまたは当該分野に公知の他の方法によって測定され得る。
【０１７５】
上記外因性のポリヌクレオチドの発現の抑制は、例えば遺伝子の発現、当該遺伝子の機能、または遺伝子産物（すなわち当該遺伝子によってコードされているタンパク質）の機能の低下をもたらす遺伝学的な修飾によって、実現され得る。当該遺伝学的な修飾は、遺伝子の（完全または部分的な）不活性化、欠失、中断、阻害、サイレンシング、または下方制御もしくは遺伝子発現の低下と呼ばれ得る。例えば、そのような遺伝子によってコードされているタンパク質の機能の低下をもたらす遺伝子における遺伝学的な修飾は、（１）当該遺伝子の完全な欠失（すなわち当該遺伝子が存在しておらず、したがってタンパク質が存在しない）、（２）当該タンパク質の不完全な翻訳もしくは翻訳の消失をもたらす（例えば当該タンパク質が発現されない）当該遺伝子における変異、または（３）当該タンパク質の本来の機能を低下させるか、もしくは破壊する（例えば、酵素活性または酵素作用の低下しているか、または消失しているタンパク質が発現される）当該遺伝子における変異の結果であり得る。より詳細には、本明細書において述べられているタンパク質の作用を低下させることに対する言及は、当該タンパク質の低下した発現および／または機能性（生物学的活性）をもたらす、該当する上記宿主細胞における任意の遺伝学的な修飾を一般的に指しており、当該タンパク質の低下した活性（例えば低下した輸送）、当該タンパク質の促進された抑制、または当該タンパク質の促進された分解、ならびに当該タンパク質の発現の低下または消失を包含している。例えば、本発明のタンパク質の作用または活性は、当該タンパク質の産生の抑制もしくは減少、当該タンパク質の低下した作用、または当該タンパク質の作用の抑制によって、低下させられ得る。また、これらの修飾のうちいくつかの組合せが考えられる。タンパク質の産生の阻害または低下は、成長培地における誘導性化合物の存在を必要とするプロモータの制御下に、当該タンパク質をコードしている遺伝子を配置することを包含し得る。誘導物質が培地から枯渇させるような条件を確立することによって、上記タンパク質をコードしている上記遺伝子の発現（したがってタンパク質合成）は、停止させられ得る。また、タンパク質の作用の阻害または低下は、米国特許第４，７４３，５４６号に記載されているものと類似の切取り技術の手法を用いることを包含している。この手法を用いるために、所定の上記タンパク質をコードしている上記遺伝子は、ゲノムからの当該遺伝子の制御された特異的な切取りを可能にする特定の遺伝子配列の間にクローン化される。切取りは、例えば米国特許第４，７４３，５４６号に記載のような培養物の培養温度の変更、またはいくつかの他の物理的シグナルまたは栄養性シグナルによって、刺激され得る。
【０１７６】
本発明の一部の実施形態において、上記宿主細胞のセルラーゼ活性は外因性のポリヌクレオチドの発現を抑制することによって向上する。セルラーゼ活性は、実施例５に記載のように測定され得るか、または当該分野に公知の任意の他の方法によって測定され得る。
【０１７７】
本発明の一部の実施形態において、上記宿主細胞のヘミセルラーゼ活性は、外因性のポリヌクレオチドの発現を抑制することによって向上される。ヘミセルラーゼ活性は、実施例１７に記載のように測定され得るか、または当該分野に公知の任意の他の方法によって測定され得る。
【０１７８】
〔共発酵の方法〕
本発明の一局面は、セルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖を共発酵させる方法を提供する。本明細書に使用されるとき、共発酵は、同じ容器における２以上の糖の、宿主細胞による同時の使用を指す。上記方法は、宿主細胞を準備するステップ、およびセルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖を含んでいる培地において当該宿主細胞を培養するステップを包含している。ここで、上記宿主細胞は、セロデキストリントランスポータをコードしている第１の組換えポリヌクレオチドおよびβ−グルコシダーゼの触媒作用ドメインをコードしている第２の組換えポリヌクレオチドを含んでいる。上記組換えポリヌクレオチドの発現は、セルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖の共発酵を可能にする。
【０１７９】
第１の組換えポリヌクレオチドは、細胞にセロデキストリンを輸送可能な任意のタンパク質をコードし得る。セロデキストリン輸送は当業者にとって公知の任意の方法（実施例９に記載の方法が挙げられる）によって測定され得る。好ましい実施形態において、第１の組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、ここで、以下の１つ以上：膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス２は配列番号２を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス５は配列番号４を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７の間にある配列は配列番号６を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列は配列番号８を含んでいる、ならびに上記ポリペプチドはセロデキストリンを輸送する、が満たされている。そのようなポリペプチドの例としては、ＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ００８０９、ＮＣＵ０８１１４、ＸＰ＿００１２６８５４１．１およびＬＡＣ２が挙げられる。好ましい実施形態において、上記第１の組換えポリヌクレオチドはＮＣＵ００８０１をコードしている。
【０１８０】
上記第２のポリヌクレオチドは、グルコースの放出をともなうβ−Ｄ−グルコシドにおける末端にある非還元性残基の加水分解を触媒可能な任意の触媒作用ドメインをコードし得る。上記β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインは上記宿主細胞の細胞内に存在していることが好ましい。好ましい実施形態において、β−グルコシダーゼの供給源はＮＣＵ００１３０である。異なる供給源からの触媒作用ドメインは、異なるセロデキストリントランスポータをともなって最良に機能する。
【０１８１】
また、一部の実施形態において、上記宿主細胞は、ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドを含んでいる。代替的に、ペントース利用に関与する１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドは、上記宿主細胞にとって外因性であり得る。１つ以上の上記酵素としては、例えば、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、キシトールデヒドロゲナーゼ、または当業者にとって公知の任意の他のペントース利用酵素が挙げられ得る。
【０１８２】
一部の実施形態において、上記宿主細胞はペントーストランスポータをコードしている第３の組換えポリヌクレオチドを含んでいる。代替的に、上記宿主細胞はペントーストランスポータをコードしている外因性のポリヌクレオチドを含み得る。好ましい実施形態において、上記ペントーストランスポータは、上記宿主細胞にキシロースおよび／またはアラビノースを輸送する。一部の実施形態において、上記第３の組換えポリヌクレオチドは、ＮＣＵ００８２１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０６１３８、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３、ＸＵＴ１またはＸＵＴ３といったポリペプチドをコードしている。ペントースとともにグルコースが存在している成長培地である場合に、上記宿主細胞細胞におけるペントーストランスポータの発現は、共発酵の効率を向上させ得る。
【０１８３】
本明細書に記載の共発酵の方法において、セルロース由来の糖としては、セロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースが好ましく挙げら、ヘミセルロース由来の糖としては、キシロースおよびアラビノースが好ましく挙げられる。典型的に、宿主細胞による共発酵のための上記セルロース由来の糖およびヘミセルロース由来の糖を調製するために、リグノセルロース性のバイオマスはまず前処理されてその構造を変化させ、セルロースのより良好な酵素的加水分解を可能にする。前処理は、物理的または化学的な方法（例えば、アンモニア繊維／凍結爆発（ammonia fiber/freeze explosion）、水酸化カルシウムもしくは水酸化ナトリウムに基づく石灰法、および酸触媒ありもしくはなしの蒸気爆発が挙げられる）を包含し得る。酸処理は、リグノセルロース性のバイオマスのヘミセルロース成分からキシロースおよびアラビノースを放出させる。次に、前処理されたバイオマスのセルロース成分は、セルラーゼ混合物によって加水分解されることが好ましい。市販のセルラーゼの例としては、Celluclast 1.5L（登録商標）（Novozymes）、Spezyme CP（登録商標）（Genencor）（Scott W. Pryor, 2010, Appl Biochem Biotechnol）、およびCellulyve 50L（Lyven）が挙げられる。
【０１８４】
セルラーゼ混合物は、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼを典型的に含んでいる。本明細書に記載の共発酵の方法において、上記セルラーゼ混合物におけるβ−グルコシダーゼ活性の程度は、可能な限り最小化されるべきである。例えば、培養培地は、改変された生物から得られた、セルラーゼ含有の酵素混合物を含み得る。当該混合物は、改変されていない生物から得られた、セルラーゼ含有の酵素混合物と比べて、低下したβ−グルコシダーゼ活性を有している。上記生物は、例えばβ−グルコシダーゼをコードしている遺伝子の変異または標的化されたＲＮＡ干渉などによって、β−グルコシダーゼの発現を低下させるために改変され得る。
【０１８５】
実施例１７に記載の通り、意外にも本発明の方法によるセルロースおよびキシロースの共発酵は、上記宿主細胞による糖消費およびエタノール産生に対する相乗効果をもたらした。
【０１８６】
〔炭化水素または炭化水素の誘導体の合成方法〕
本発明の一局面は、宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法を提供する。
【０１８７】
本明細書に使用されるとき“炭化水素”は、全体的に水素および炭素からなる有機化合物である。炭化水素としては、限定されることなく、メタン、エタン、エテン、エチン、プロパン、プロペン、プロピン、シクロプロパン、アレン、ブタン、イソブタン、ブテン、ブチン、シクロブタン、メチルシクロプロパン、ブタジエン、ペンタン、イソペンタン、ネオペンタン、ペンテン、ペンチン、シクロペンタン、メチルシクロブタン、エチルシクロプロパン、ペンタジエン、ヘキサン、ヘキセン、ヘキシン、シクロヘキサン、メチルシクロペンタン、エチルシクロブタン、プロピルシクロプロパン、ヘキサジエン、ヘプタン、ヘプテン、ヘプチン、シクロヘプタン、メチルシクロヘプタン、ヘプタジエン、オクタン、オクテン、オクチン、シクロオクタン、オクタジエン、ノナン、ノネン、ノニン、シクロノナン、ノナジエン、デカン、デセン、デシン、シクロデカンおよびデカジエンが挙げられる。
【０１８８】
本明細書に使用されるとき“炭化水素の誘導体”は、炭素、および水素以外である少なくとも１つの他の元素の有機化合物である。炭化水素の誘導体としては、限定されることなく、アルコール（例えば、アラビニトール、ブタノール、エタノール、グリセロール、メタノール、１，３−プロパンジオール、ソルビトールおよびキシリトール）；有機酸（例えば、酢酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸、蟻酸、フマル酸、グルカル酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタル酸、３−ヒドロプロピオン酸、イタコン酸、乳酸、リンゴ酸、マロン酸、プロピオン酸、コハク酸およびキシロン酸）；エステル；ケトン（例えば、アセトン）；アルデヒド（例えば、フルフラール）；アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リジン、セリンおよびスレオニン）；気体（例えば、二酸化炭素および一酸化炭素）が挙げられる。
【０１８９】
好ましい実施形態において、上記炭化水素または炭化水素の誘導体は燃料として使用され得る。特に好ましい実施形態において、上記炭化水素または炭化水素の誘導体はエタノールまたはブタノールである。
【０１９０】
本発明の一局面によれば、宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法は、宿主細胞を準備する第１のステップを包含している。当該宿主細胞は、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでおり、ここで、以下の１つ以上：膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス２は配列番号２を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス５は配列番号４を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７の間にある配列は配列番号６を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでいる、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列は配列番号８を含んでいる、が満たされている。上記ポリペプチドは炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のためのセロデキストリンを上記宿主細胞に輸送する。上記方法は、上記宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、セロデキストリンまたはセロデキストリン源を含んでいる培地において当該宿主細胞を培養する第２のステップを包含している。ここで、上記宿主細胞へのセロデキストリンの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進される。一部の実施形態において、上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性を有している。また、一部の実施形態において、上記宿主細胞はっβ−グルコシダーゼの触媒作用ドメインをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる。そのような実施形態は、内因性のセロデキストリンの利用能を欠いている宿主細胞にとって有用である。好ましい実施形態において、上記β−グルコシダーゼはNeurospora crassaに由来する。特に好ましい実施形態において、上記β−グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０によってコードされている。上記宿主細胞へのセロデキストリンの輸送は、当業者にとって公知の任意の方法（実施例９に記載の方法が挙げられる）によって測定され得る。典型的に、上記セロデキストリン源はセルロースである。
【０１９１】
培養培地は、改変された生物から得られた、セルラーゼ含有の酵素混合物を含み得る。当該混合物は、改変されていない生物から得られた、セルラーゼ含有の酵素混合物と比べて、低下したβ−グルコシダーゼ活性を有している。上記生物は、例えばβ−グルコシダーゼをコードしている遺伝子の変異または標的化されたＲＮＡ干渉などによって、β−グルコシダーゼの発現を低下させるために改変され得る。
【０１９２】
本発明の他の局面によれば、宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法は、宿主細胞を準備するステップ、ならびに当該宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、キシロースまたはキシロース源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養するステップを包含している。上記宿主細胞は、ＮＣＵ００８２１またはＳＴＬ１２／ＸＵＴ６であるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。上記ポリペプチドは炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のために上記宿主細胞にキシロースを輸送する。上記宿主細胞細胞へのキシロースの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進されている。
【０１９３】
他の局面によれば、宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法は、宿主細胞を準備するステップ、ならびに当該宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、アラビノースまたはアラビノース源を含んでいる培地において上記宿主細胞を培養するステップを包含している。上記宿主細胞は、ＸＵＴ１であるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。上記ポリペプチドは炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のためのアラビノースを上記宿主細胞に輸送する。上記宿主細胞細胞へのアラビノースの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進されている。
【０１９４】
他の局面によれば、宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法は、宿主細胞を準備するステップ、ならびに当該宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、アラビノースもしくはグルコースの源、アラビノースまたはグルコースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養するステップを包含している。上記宿主細胞は、ＮＣＵ０６１３８であるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。上記ポリペプチドは炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のためのアラビノースまたはグルコースを上記宿主細胞にを輸送する。上記宿主細胞細胞へのアラビノースまたはグルコースの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進されている。
【０１９５】
他の局面によれば、宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法は、宿主細胞を準備するステップ、ならびに当該宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、キシロースもしくはグルコースの源、キシロースまたはグルコースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養するステップを包含している。上記宿主細胞は、ＳＵＴ２、ＳＵＴ３またはＸＵＴ３であるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。上記ポリペプチドは炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のためのキシロースまたはグルコースを上記宿主細胞に輸送する。上記宿主細胞細胞へのキシロースまたはグルコースの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進されている。
【０１９６】
他の局面によれば、宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させる方法は、宿主細胞を準備するステップ、ならびに当該宿主細胞による炭化水素または炭化水素の誘導体の合成を促進させるために、キシロース、アラビノースもしくはグルコースの源、キシロース、アラビノースまたはグルコースを含んでいる培地において上記宿主細胞を培養するステップを包含している。上記宿主細胞は、ＮＣＵ０４９６３であるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。上記ポリペプチドは炭化水素または炭化水素の誘導体の合成のためのキシロース、アラビノースまたはグルコースを上記宿主細胞に輸送する。上記宿主細胞細胞へのキシロース、アラビノースまたはグルコースの輸送は、上記組換えポリヌクレオチドの発現によって促進されている。
【０１９７】
上記宿主細胞へのキシロース、アラビノースまたはグルコースの輸送は当業者にとって公知の任意の方法（実施例１に記載の方法が挙げられる）によって測定され得る。典型的に、グルコース源はセルロースであり、キシロースおよびアラビノースの源はヘミセルロースである。
【０１９８】
〔セルロースを分解させる方法〕
本発明の一局面はセルロースを分解させる方法を提供する。当該方法は、セルロースを含んでいる組成物を準備する第１のステップを包含している。上記セルロースは、植物材料（例えば、スイッチグラス、Miscanthus、もみ殻、バガス、アマ、タケ、サイザル繊維、アバカ、麦わら、葉、刈り取った芝、トウモロコシの茎および葉、トウモロコシの穂軸、穀類の蒸留粕、マメ科の植物、サトウモロコシ、サトウキビ、テンサイの果肉、材木の切り屑、おが屑、ならびにバイオマス収穫物）に由来することが好ましい。
【０１９９】
上記方法は、上記組成物を、改変された生物から得られた、セルラーゼ含有の酵素混合物と接触させる第２のステップを包含している。セルラーゼ含有の上記酵素混合物は、改変されていない生物から得られたセルラーゼ含有の酵素混合物と比べて、低下したβ−グルコシダーゼ活性を有している。上記生物は、β−グルコシダーゼをコードしている遺伝子の変異、または例えばＲＮＡ干渉といった手法を用いて、β−グルコシダーゼの発現を低下させることによって改変され得る。上記生物は真菌または細菌であり得る。好ましい実施形態において、上記生物は糸状菌（例えばT. reesei）である。
【０２００】
代替的に、上記方法は、上記組成物を、改変されてβ−グルコシダーゼ活性が低下しているセルラーゼ含有の酵素混合物と接触させる第２のステップを包含している。例えば、セルラーゼ含有の上記酵素混合物は、アフィニティークロマトグラフィーによって変化させられ得る。ここで、β−グルコシダーゼ酵素は、クロマトグラフィーの間に捕捉され、したがって上記混合物から除去される。他の例において、セルラーゼ含有の上記酵素混合物は、当該混合物におけるβ−グルコシダーゼ酵素の、阻害剤を用いた不活性化によって変化させられ得る。市販のセルラーゼ混合物の例としては、Celluclast 1.5L（登録商標）（Novozymes）、Spezyme CP（登録商標）（Genencor）（Scott W. Pryor, 2010, Appl Biochem Biotechnol）、およびCellulite 50L（Lyven）が挙げられる。
【０２０１】
本発明はそれらの好ましい特定の実施形態と関連付けて説明されているが、以上の記載は、例証することを目的としており、本発明の範囲を限定しないことが理解されるべきである。本発明の範囲内における他の局面、利点、および変更は、本発明が属する分野における当業者にとって明らかである。
【０２０２】
説明されている本発明および以下の実施例は、限定ではなく例証を目的とした本願の説明のために与えられている。
【実施例】
【０２０３】
〔実施例１：MiscanthusおよびAvicelに基づいて成長させたN. crassaのトランスクリプトーム分析〕
本実施例において、N. crassaのゲノムの発現プロファイルを、MiscanthusおよびAvicelに基づく成長の間に調べた。単独の炭素源である結晶性セルロース（Avicel）を含んでいるVogel's最少培地において培養したN. crassa（FGSC 2489）の成長およびセルラーゼ活性は、T. reesei（ＱＭ９４１４）と類似していた（図３）；N. crassaは約４日間のうちにAvicelを完全に分解した。また、N. crassaはすり潰したMiscanthusの茎に基づいて急速に成長し、機能性のセルラーゼおよびセミセルラーゼの分解能を示した。N. crassaにおける植物の細胞壁の分解に関連するトランスクリプトームを決定するために、我々は、全ゲノムマイクロアレイ（Kasuga and Glass 2008; Tian et al., 2007; Kasuga et al., 2005）を用いて、すり潰したMiscanthusの茎に基づくN. crassaの成長の間における遺伝子発現プロファイルを観察した。スクロースに基づく成長の１６時間後に回収したＲＮＡを、Miscanthus培地に基づいて成長させたN. crassaから１６時間後、４０時間後、５日後および１０日後に単離したＲＮＡと比較した（図４；Tian et al., 2009のSupplemental Data, Dataset S1の第１頁を参照；またデータはbioinfo.townsend.yale.edu/browse.jsp, Experiment IDs 52 and 53に見られる）。
【０２０４】
合計７６０のN. crassa遺伝子は、４つのMiscanthusサンプル間の相対的な発現レベルにおいて、スクロースのサンプルと比べて、統計学的に有意な相違を示した（Tian et al., 2009における第３頁の、Supplemental Data, Dataset S1を参照）。階層クラスタリングによって、これらの遺伝子は３つの主なクラスタに分類されることが示された（図４Ａ）。遺伝子の第１のクラスター（Ｃ１；３００の遺伝子）は炭素源であるスクロースを含んでいる最少培地において最も高い発現レベルを示した。これらの遺伝子の機能的なカテゴリ（FunCat）解析（Ruepp 2004）によって、リボソームタンパク質および一次代謝に関連する他の機能的なカテゴリー（例えば、呼吸、電子伝達およびアミノ酸代謝）が多く含まれていることが示された（Tian et al., 2009における第４頁の、Supplemental Data, Dataset S1を参照）。第２のクラスター（Ｃ２）は、Miscanthusに基づく培養におけるより後の時点（４０時間後、１０日後）において、最も高い発現レベルを示した３２７の遺伝子を包含している（図４Ａ）。このクラスターには、Miscanthusに基づく培養のすべての時点において高い相対的な発現レベルを示した８９の遺伝子があった。さらなる分析のため、これらの８９の遺伝子を、１６時間後のMiscanthusに基づく培養から、最も高い発現レベルを示す遺伝子のクラスターに加えた（Ｃ３クラスター、下記を参照）。残りの２３８の遺伝子のFunCat解析（Ruepp 2004）は、１つの機能的なカテゴリー（Ｃ−化合物および炭水化物代謝）がいくぶん多いことを示した（Tian et al., 2009における第５頁の、Supplemental Data, Dataset S1を参照）。
【０２０５】
１４２の遺伝子の第３のクラスターは、N. crassaのMiscanthusに基づく成長から１６時間後に最も高い相対的な発現レベルを示した（Ｃ３、図４Ａ）。Miscanthusに基づく培養のすべての時点において相対的に高い発現レベルを示した８９の遺伝子に加えて、これらの１４２の遺伝子（Ｃ３＋クラスター；合計２３１の遺伝子）のFunCat解析（Ruepp 2004）によって、炭素代謝の関連タンパク質（予想のセルラーゼおよびヘミセルラーゼが挙げられる）が多く含まれていることが示された（図４Ｃ；Tian et al., 2009における第６頁の、Supplemental Data, Dataset S1を参照）。N. crassaゲノムの２３の予想されているセルラーゼ遺伝子のうちの１８が、N. crassaのMiscanthusに基づく成長の間に、特に１６時間後の時点における発現レベルの有意な増加を示した（図５）。５の遺伝子が、２００倍を超える発現レベルの上昇を示した（ｃｂｈ−１（ＣＢＨ（Ｉ）；ＮＣＵ０７３４０、ｇｈ６−２（ＣＢＨ（ＩＩ）様遺伝子；ＮＣＵ０９６８０）、ｇｈ６−３（ＮＣＵ０７１９０）および２つのＧＨ６１遺伝子（ｇｈ６１−４；ＮＣＵ０１０５０およびＮＣＵ０７８９８）））。
【０２０６】
植物の細胞壁は、セルロース微小繊維、ヘミセルロース、リグニン、ペクチン、クチンおよびタンパク質から構成される複合構造である。それゆえ、我々は、Miscanthusに基づいて成長させたN. crassaの発現プロファイルを、Avicel（結晶性セルロースの純粋な形態）に基づいて成長させたN. crassaの発現プロファイルと比較した（Tian et al., 2009における第２頁の、Supplemental Data, Dataset S1を参照；また、データはbioinfo.townsend.yale.edu/browse.jsp, Experiment IDs 52 and 53に見られる）。１８７を超える遺伝子がAvicelに基づくN. crassaの成長の間における相対的な発現レベルの有意な増加を示した。これらの遺伝子のうちの１１４がＣ３＋クラスターにおける２３１の遺伝子と共通していた（図４Ｂ）。共通する１１４の遺伝子セットのFunCat解析によって、炭素代謝に関連すると予想されている遺伝子が多く含まれていることが明確に示された（Tian et al., PNAS, 2009における第６頁の、Supplemental Data, Dataset S1を参照）。この遺伝子セットの範囲内において、分泌性タンパク質がさらに多く含まれていた（１１４の遺伝子産物のうち５３が分泌されると予想された）。これらの５３の遺伝子のうち３２は、植物の細胞壁の分解を担うという注釈を有している予想タンパク質（predicted protein）をコードしている。一方、これらの５３の遺伝子のうち１６は、いずれも未知機能の推定タンパク質（putative protein）または仮定のタンパク質（hypothetical protein）をコードしている。残りの６１の遺伝子は、メジャーファシリテータスーパーファミリーの予想されている１０のトランスポータ（ＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ００９８８、ＮＣＵ０１２３１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０５５１９、ＮＣＵ０５８５３、ＮＣＵ０５８９７、ＮＣＵ０６１３８、ＮＣＵ０８１１４、およびＮＣＵ１００２１）および２３の推定タンパク質または仮定のタンパク質を包含する予想されている細胞内タンパク質をコードしている。
【０２０７】
Miscanthus特異的なクラスター（図４Ｂ）における１１７の遺伝子のうち、３７は、分泌されると予想タンパク質をコードしている。９の予想されているヘミセルラーゼ、またはヘミセルロースの分解に関連する酵素を同定した（ＮＣＵ００７１０、ＮＣＵ０４２６５、ＮＣＵ０４８７０、ＮＣＵ０５７５１、ＮＣＵ０５９６５、ＮＣＵ０９１７０、ＮＣＵ０９７７５、ＮＣＵ０９９２３、およびＮＣＵ０９９７６）（Tian et al., 2009の表２）。残り８０のMiscanthus特異的な遺伝子は、予想されている細胞内タンパク質（例えば、ＮＣＵ００８９１（キシリトール脱水素酵素）およびＮＣＵ００６４３（予想されているアラビニトール脱水素酵素））をコードしている遺伝子（ペントース糖の代謝に関連する遺伝子が挙げられる）、予想されている糖トランスポータ（ＮＣＵ０１１３２）をコードしている遺伝子、および４８の機能未知のタンパク質をコードしている遺伝子である。
【０２０８】
〔実施例２：MiscanthusおよびAvicelに基づいて成長させたN. crassaのセクレトーム分析〕
菌類によるリグノセルロース分解は、細胞外において生じ、細胞壁成分の脱重合に関連するタンパク質の分泌を必要とする（Lynd et al., 2002）。トランスクリプトームのプロファイリングデータ（N. crassaをMiscanthusおよびAvicelに基づいて成長させたとき、予想されているセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、および他の分泌されるタンパク質をコードしている遺伝子の発現レベルが増加することを示した）を比較するために、我々はショットガンプロテオミクスの手法を用いてN. crassaのセクレトームを分析した（図４Ｂ）。７日間が経過したMiscanthusおよびAvicelにおける培養物に由来する上清をトリプシン処理し、タンデムの液体クロマトグラフィー−ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＭＳ；実施例５を参照）によって解析した。リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）に結合している分泌タンパク質を濃縮し、同様にＭＳによって解析した。
【０２０９】
合計５０のタンパク質を、タンデムＭＳによって高い信頼性において同定した（表２および３）。Miscanthusによって成長させたN. crassaの培養物において３４のタンパク質が検出され、一方Avicelに基づいて成長させた培養物から３８のタンパク質が同定された。これらの２２のタンパク質のうち２１は、コンピュータによる解析に基づいて、分泌されると予想され、１９はMiscanthusおよびAvicelに基づいて成長させた培養物の両方において発現レベルの増加を示した（表２）。重複しているデータセットは、N. crassaにおける２３の予想されているセルラーゼのうちの８を包含していた（表３）。また、５のヘミセルラーゼ、１の予想されているβ−グルコシダーゼ（ｇｈ３−４；ＮＣＵ０４９５２）、炭水化物に対する活性が予想されている５のタンパク質、および機能未知の２のタンパク質（ＮＣＵ０７１４３およびＮＣＵ０５１３７）があった（表４〜５）。
【０２１０】
表２に関して、注釈は、ウェブページbroad.mit.edu/annotation/genome/neurospora/Home.html.における広範な研究機関によってもたらされた。“検出されたサンプル”は、ペプチドが特定のタンパク質に関して検出されたサンプルである。ペプチドを手動の検査によって確認した。少なくとも１つのペプチドが生物学的な繰返しのそれぞれにおいて検出された場合に、タンパク質は存在していると判断した。“TOTAL”はすべての細胞外タンパク質のトリプシンによる分解から検出されたペプチドを指す。“PASC BOUND”は、リン酸膨潤セルロースに結合するタンパク質を濃縮した後に検出されたペプチドを指す。“UNBOUND”は、ＰＡＳＣ結合タンパク質の除去後に溶液に残っていたタンパク質を指す。
【０２１１】
【表２】
2013500019.tif 000004
【０２１２】
【表３】
2013500019.tif 000005
【０２１３】
【表４】
2013500019.tif 000006
【０２１４】
【表５】
2013500019.tif 000007
【０２１５】
【表６】
2013500019.tif 000008
【０２１６】
【表７】
2013500019.tif 000009
【０２１７】
Avicelに基づく培養物においてのみ確認された同定された１６のタンパク質があり、これらのうち１４（２の予想されているセルラーゼ（ｇｈ６１−１；ＮＣＵ０２２４０およびｇｈ４５−１；ＮＣＵ０５１２１）、１のキシラナーゼ（ｇｈ１１−１；ＮＣＵ０２８５５）、１の予想されているプロテアーゼ（ＮＣＵ０４２０５）、炭水化物に対する活性が予想されている他の３のタンパク質（ＮＣＵ０８９０９、ＮＣＵ０５９７４およびｇｈ３０−１（ＮＣＵ０４３９５））、３のNeurospora特異的な機能未知のタンパク質、および４の保存された仮定のタンパク質（セルロース結合ドメインを有している１のタンパク質（ＮＣＵ０９７６４）が挙げられる）が挙げられる）が分泌されると予想された（表６）。１２のタンパク質がMiscanthusにおける培養物の培養ろ過物に特異的であり、これらのうちの７は分泌されると予想された（表３）。５の予想されている細胞内タンパク質のうちの３は、保存された仮定のタンパク質であった。残りの２としては、予想されているグリオキサルオキシダーゼ（ＮＣＵ０９２６７、N. crassaのMiscanthusにおけるトランスクリプトームから同定された）およびヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ｎｄｋ−１；ＮＣＵ０４２０２、N. crassaのトランスクリプトームにおいて同定されなかった）が挙げられる。分泌されると予想される７のタンパク質としては、３の予想されているエステラーゼ（ＮＣＵ０４８７０、ＮＣＵ０５１５９、およびＮＣＵ０８７８５）、２の予想されているキシラナーゼ（ＧＨ５１；ＮＣＵ０２３４３およびＧＨ５４；ＮＣＵ０９７７５）、１のβ−キシロシダーゼ（ｇｈ３−７；ＮＣＵ０９９２３）および保存されている仮定のタンパク質（ＮＣＵ０５７５１）が挙げられる。
【０２１８】
【表８】
2013500019.tif 000010
【０２１９】
【表９】
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【０２２０】
多くの植物の細胞壁分解酵素は、基質に対する酵素の結合を補助するセルロース結合モジュール（ＣＢＭ）を有している（Linder and Teeri 1996）。N. crassaのゲノムにおいて、１９の遺伝子によってコードされているタンパク質が、ＣＢＭ１ドメインを有していると予想されている（Cantarel et al., 2009）。これらの１９の遺伝子のうち１６は、Miscanthusに基づいて成長させた培養物において相対的な遺伝子発現の増加を示した。
【０２２１】
【表１０】
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【０２２２】
ＭＳによって同定された５０のタンパク質のうち１１は、ＣＢＭ１ドメインを有していた。セルロースに結合するタンパク質を濃縮させるためにＰＡＳＣを用いた（方法に関して実施例４を参照）。９のタンパク質が、Miscanthusに基づいて成長させたN. crassaの培養物の上清に由来するＰＡＳＣに結合することがＭＳによって確認され、一方、Avicelにおける上清に由来する８のタンパク質が同定された（７のセルロース結合タンパク質が両方において同定された）（表２、３、８）。これらとしては、ＮＣＵ００２０６、予想されているセロビオースデヒドロゲナーゼ；ｇｈ５−１（ＮＣＵ００７６２），予想されているエンドグルカナーゼ；ＮＣＵ０５９５５、予想されているＧＨ７４ｋシログルカナーゼ；ｇｈ１１−２（ＮＣＵ０７２２５）、予想されているエンドキシラナーゼ；ｃｂｈ−１（ＮＣＵ０７３４０）；ｇｈ６１−５（ＮＣＵ０８７６０）、予想されているエンドグルカナーゼ；およびｇｈ６−２（ＮＣＵ０９６８０）、予想されているセロビオースヒドロラーゼ２前駆体が挙げられる。
【０２２３】
【表１１】
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【０２２４】
【表１２】
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【０２２５】
〔実施例３：トランスクリプトーム／セクレトームのデータセットの重複において同定された複数の遺伝子に欠失を含んでいる株における、細胞外タンパク質およびセルラーゼ活性の性質決定〕
MiscanthusおよびAvicelに基づいて成長させた培養物の両方において検出された２２の細胞外タンパク質のうち、１６をコードしている遺伝子における欠失を含んでいる同核共存体株（homokaryotic strains）は、一般的に利用可能である（Dunlap et al., 2007）。これらの１６の欠失株はいずれも、植物の細胞壁またはセルロース分解に対するそれらの影響のために、N. crassaにおいてこれまで性質決定されていない。１６の欠失株を、好ましい炭素源としてスクロースまたはAvicelを含んでいる培地の両方おいて成長させた。すべての株がスクロースに基づく野生型の成長特性を示した。Avicelを含んでいる培地において、１６の欠失株のバルク成長を、７日にわたって観察した。７日後、培養ろ過液における分泌された総タンパク質、エンドグルカナーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性、および総Avicerase（Avicelase）活性を測定し、すべての変異体の起源である野生型株と比較した（図６）。また、分泌タンパク質の相対的な存在量を調べるために、濃縮していない培養上清に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【０２２６】
２の予想されているエキソグルカナーゼ（ｃｂｈ−１；ＮＣＵ０７３４０およびｇｈ６−２；ＮＣＵ０９６８０）および予想されているβ−グルコシダーゼ（ｇｈ３−４；ＮＣＵ０４９５２）の欠失を含んでいる株について、Avicelに基づく成長は不良であった。ｃｂｈ−1の変異体は最も重大な影響を受けており、７日後に多量のAvicelが残っていたが、野性株において同時期にすべてのAvicelが分解されていた。１６の欠失株のうち１０について、分泌タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、単一のバンドが消失した変異した細胞外タンパク質プロファイルを示した。それゆえ、特定のタンパク質のバンドは予想された遺伝子に基づいていた（図６Ａの囲み；図７）。これらとしては、ＮＣＵ００７６２（ｇｈ５−１）、ＮＣＵ０４９５２（ｇｈ３−４）、ＮＣＵ０５０５７（ｇｈ７−１）、ＮＣＵ０５１３７、ＮＣＵ０５９２４（ｇｈ１０−１）、ＮＣＵ０５９５５、ＮＣＵ０７１９０（ｇｈ６−３）、ＮＣＵ０７３２６、ＮＣＵ０７３４０（ｃｂｈ−１）、およびＮＣＵ０９６８０（ｇｈ６−２）が挙げられる。
【０２２７】
欠失株のほとんどについて、培養上清に分泌された総タンパク質、エンドグルカナーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性、およびAvicerase活性は、野生型株と類似していた（図６Ｂ、Ｃおよび表９）。
【０２２８】
【表１３】
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【０２２９】
この傾向からの逸脱していることが、Δｇｈ５−１（ＮＣＵ００７６２）、Δｇｈ３−４（ＮＣＵ０４９５２）、ΔＮＣＵ０５１３７、Δｃｂｈ−１（ＮＣＵ０７３４０）、およびΔｇｈ６−２（ＮＣＵ０９６８０）変異体に認められた。Δｇｈ５−１（ＮＣＵ００７６２）、Δｇｈ３−４（ＮＣＵ０４９５２）、およびΔｃｂｈ−１（ＮＣＵ０７３４０）において、Avicerase、エンドグルカナーゼまたはΔ−グルコシダーゼ活性が、対応する野生型の活性より低かった。特に、Avicerase酵素アッセイにおけるより高いレベルのセロビオースおよびより低いグルコース、ならびにＰＮＰＧアーゼ活性によって示されるように、ＮＣＵ０４９５２の欠失はすべてのβ−グルコシダーゼ活性を培養上清から消失させた（図６Ｂ、Ｃ）。エンドグルカナーゼ活性が低下したにもかかわらず、Δｇｈ５−１（ＮＣＵ００７６２）由来の培養ろ過液は、Avicerase活性において野生型株と比較して顕著な欠損を示さなかった（図６Ｃ）。予測された通り、Δｃｂｈ−１（ＮＣＵ０７３４０）における変異体は、成長不良に起因して、エンドグルカナーゼ活性およびAvicerase活性の低下を生じた。また、Δｃｂｈ−１変異体について見られたように、ＮＣＵ０９６８０（ＣＢＨ（ＩＩ）様タンパク質（ｇｈ６−２）をコードしている）の欠失を含んでいる株は、セロビオースの蓄積の減少を示した（図６Ｃ）。
【０２３０】
３つの株における変異は分泌タンパク質（特にＣＢＨ（Ｉ）；ｇｈ３−４（ＮＣＵ０４９５２）、ｇｈ７−1（ＮＣＵ０５０５７）および仮定のタンパク質の遺伝子（ＮＣＵ０５１３７））のレベルの上昇を引き起こした（図６Ａ）。分泌タンパク質のレベルの上昇に加え、ΔＮＣＵ０５１３７変異体はエンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、およびAvicerase活性の上昇を示した（図６Ｂ、Ｃ）。ＮＣＵ０５１３７は、多数の糸状子嚢菌（セルロース分解性の他の真菌）のゲノムにおいて高度に保存されているが、特にT. reeseiにおいて相同物を有していない（図２）。Δｇｈ３−４、Δｇｈ７−１、およびΔＮＣＵ０５１３７において見られるＣＢＨ（Ｉ）のレベルの上昇は、分泌の増加、タンパク質の安定性、またはそうでなければｃｂｈ−１の発現における上昇を引き起こすフィードバックのいずれか一方に起因すると可能性がある。これらの可能性を明確にするために、ΔＮＣＵ０５１３７およびΔｇｈ３−４（ＮＣＵ０４９５２）によって産生される細胞外タンパク質のプロファイルを、定量ＲＴ−ＰＣＲによって分析して、ｃｂｈ−１（ＮＣＵ０７３４０）およびｇｈ６−２（ＣＢＨ（ＩＩ）；ＮＣＵ０９６８０）の遺伝子発現レベルと比較した（図８）。Avicelに基づいて成長させた培養物において、早くも２日後に、ΔＮＣＵ０５１３７およびΔｇｈ３−４の株は、ＣＢＨ（Ｉ）タンパク質のレベルがより高くなった。Avicelに基づいて成長させた培養物由来のｃｂｈ−１およびｇｈ６の定量ＲＴ−ＰＣＲによって、両方の遺伝子について野生型、ΔＮＣＵ０５１３７変異体およびΔｇｈ３−４変異体は、成長から２日後に高い発現レベルを示すことがわかった。しかし、これらの遺伝子の発現は野生株において３日後に著しく減少したが、ｃｂｈ−１およびｇｈ６−２の発現レベルはΔＮＣＵ０５１３７変異体において増加し、Δｇｈ３−４において野生型よりも減少した（図８）。
【０２３１】
ΔＮＣＵ０５１３７およびΔｇｈ３−４変異体におけるｃｂｈ−１およびｇｈ６−２遺伝子の持続発現は、ＣＢＨ（Ｉ）およびＣＢＨ（ＩＩ）タンパク質レベルにおいてみられる増加をもたらし得る。
【０２３２】
〔実施例４：トランスクリプトームおよびセクレトームの研究のための材料および方法〕
（株）
すべてのNeurospora crassa株を、Fungal Genetics Stock Center（ＦＧＳＣ；ウェブページfgsc.net）から入手した（Tian et al., 2009における第１頁の、Supplemental Data, Dataset S1）。遺伝子欠失株を、N. crassaの機能ゲノムプロジェクト（N. crassa functional genomics project）に由来する（Dunlap et al., 2007）。Trichoderma reesei ＱＭ９４１４はMonika Schmoll博士（ウィーン工科大学）から頂いた。株を、２％の（ｗ／ｖ）の炭素源（Miscanthus，スクロースまたはAvicel（Sigma））を含んでいるVogel'sの塩（Vogel 1956）において成長させた。Miscanthus x giganteus（〜０．１ｍｍに粉砕した茎）をイリノイ大学から頂いた。
【０２３３】
（酵素活性測定）
細胞外タンパク質の総含有量を、Bio-Rad DC Protein Assayキット（Bio-Rad）を用いて測定した。培養上清におけるエンドグルカナーゼ活性を、azo-CMCキット（Megazyme SCMCL）を用いて測定した。β−グルコシダーゼ活性を、１０倍に希釈した培養上清を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）における５００μＭの４−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドとともに４０℃において１０分にわたって混合することによって測定した。５％のｗ／ｖの炭酸ナトリウムを用いて反応を停止させ、４００ｎｍにおける吸光度を測定した。Avicerase活性を、２倍に希釈した培養上清を５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）および５ｍｇ／ｍＬのAvicelと４０℃において混合することによって測定した。上清を、グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼによる共役酵素アッセイを用いてグルコース含有量について分析した。１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、１０Ｕ／ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ、１０Ｕ／ｍＬのグルコースオキシダーゼおよび１ｍＭのｏ−ジアニシジンを含んでいる１５０μＬのグルコース検出試薬に、５０μＬのAvicerase反応液を移した。５４０ｎｍにおける吸光度を３０分後に測定した。セロビオースの濃度を、Sporotrichum thermophile由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ（ＣＤＨ）による共役酵素アッセイを用いて測定した。これまでの研究報告書（Canevascini 1988）と同様にS. thermophileからＣＤＨを単離した。１２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、２５０μＭのジクロロフェノールインドフェノール、および０．０３ｍｇ／ｍＬのＣＤＨを含んでいる２５０μＬのセロビオース検出試薬に５０μＬのAvicerase反応液を移した。５３０ｎｍにおける吸光度を１０分後に測定した。
【０２３４】
（ＲＮＡの単離、マイクロアレイ分析、およびシグナルペプチド予測）
菌糸体を、ろ過によって回収し、液体窒素において瞬間冷凍した。トリゾールを用いて総ＲＮＡを単離した（Tian et al., 2007；Kasuga et al., 2005）。マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびデータ分析は、これまでに説明されている通りである（Tian et al., 2007）。標準化した発現値をＢＡＧＥＬ（遺伝子発現レベルのベイズの解析、Bayesian analysis of gene expression levels）を用いて分析した（Townsend 2004；Townsend and Hartl 2002）。ＢＡＧＥＬは、実験の各時点における各遺伝子について相対的な遺伝子発現レベルおよび信頼区間を推測するものである。シグナルペプチドを、シグナルＰ３プログラム（ウェブページcbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）によって予想されている各タンパク質のＮ末端の７０アミノ酸を用いて予想した。元のプロファイリングデータは、（ウェブページyale.edu/townsend/Links/ffdatabase/）において入手可能である。
【０２３５】
（タンパク質のゲル電気泳動）
特に断りがない限り、Criterionの４〜１５％のＴｒｉｓ−ＨＣｌポリアクリルアミドゲルにロードする前に、濃縮していない培養上清を５×ＳＤＳローディング染色液および５分間にわたる煮沸によって処理した。クマシー染色液を染色のために用いた。
【０２３６】
（セクレトーム分析のためのトリプシンペプチドの調製）
10 kDa MWCO PESスピン濃縮器を用いて培養上清を濃縮した。タンパク質に結合しているセルロースを、リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）の添加によって培養上清から単離した。１０ｍｇ／ｍＬのＰＡＣＳのうち５ｍＬの上清を１０ｍＬの培養上清に加えた。４℃において５分にわたってインキュベートした後、混合物を遠心分離し、それから沈殿したＰＡＳＣを２０倍容積の１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を用いて洗浄した。ＰＡＳＣによる処理後の上清を、非結合画分として収集し、濃縮した。それから、３６ｍｇの尿素、５μＬの１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）、および５μＬの１００ｍＭのＤＴＴを、１００μＬの濃縮した培養上清またはタンパク質と結合させたＰＡＳＣに加え、混合物を６０℃において１時間にわたって加熱した。加熱後に、７００μＬの２５ｍＭの炭酸水素アンモニウムおよび１４０μＬのメタノールを上記溶液に加え、それから、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）における５０μＬの１００μｇ／ｍＬのトリプシンによって処理した。ＰＡＳＣ結合タンパク質について、ＰＡＳＣを加熱後に遠心分離によって除去し、それから上清をトリプシンによって処理した。トリプシンを残したままで３７℃において一晩にわたって反応させた。消化後、容積をスピードバック（speedvac）によって減らし、ミリＱ水を用いて３回にわたって洗浄した。製造者の手順にしたがってＯＭＩＸ微量抽出ピペットチップを用いることによって、サンプル中に残存している塩を除去した。
【０２３７】
（トリプシンペプチドの液体クロマトグラフィー）
超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）とタンデムに接続したタンデム質量分析装置を用いて、トリプシン消化したタンパク質を分析した。Ｃ１８トラッピング（１８０μｍ×２０ｍｍ）、分析（１００μｍ×１００ｍｍ）カラムおよび１０μＬのサンプルループを備えているnanoAcquity UPLC（Waters、Milford、MA）を用いてペプチドを分離した。溶液Ａは０．１％の蟻酸／９９．９％の水であり、溶液Ｂは０．１％の蟻酸／９９．９％のアセトニトリル（ｖ／ｖ）であった。隔壁のキャップを用いて密閉した０．３ｍＬのポリプロピレン製の分水栓バイアル（Wheaton Science, Millville, NJ）に入っているサンプル溶液を、分析前にnanoAcquity自動試料採取器にロードした。サンプルの注入（２μＬ、部分的なループ）後、トラッピングを３μＬ／分において１００％のＡによって５分にわたって行った。サンプル間の相互の汚染を避けるために、注入後、注射針を７５０μＬの溶媒ＡおよびＢのそれぞれを用いて洗浄した。溶出のプログラムは、５００ｎＬ／分の流速において、５５分間にわたる５％〜３０％までのＢの直線勾配、２０分間にわたる４０％までのＢの直線勾配、０．３３分間にわたる９５％までのＢの直線勾配、１１．６７分間にわたる９５％のＢの定組成状態、０．３３分間にわたる１％までのＢの直線勾配、および１１．６７分間にわたる１％のＢの定組成状態から構成された。分析カラムおよびサンプル容器はそれぞれ３５℃および８℃に維持した。
【０２３８】
（質量分析）
四重極子飛行時間型質量分析計（Q-Tof Premier、Waters）のナノフローイオン源に搭載させたNanoEaseナノエレクトロスプレーイオン化（ナノＥＳＩ）放射源にカラムを接続した。ナノＥＳＩ源のパラメーターは以下の通りである：２．３ｋＶのナノＥＳＩキャピラリー電圧、０．１５ｍｂａｒの噴霧気体（窒素）圧、３０Ｖのサンプルコーン電圧、５Ｖの抽出コーン電圧、３Ｖのイオン導入圧力、８０℃の電源ブロック温度。分析装置のＴは“Ｖ”モードにおいて操作した。これらの条件において１．０×１０４の質量分解能（ｍ／ｚ＝７７１において測定した）を通常に達成したが、これは、本研究において１価または多価の電荷を有しているペプチドイオンの同位体分布の分析にとって十分である。このように、イオンの質量および電荷を独立して決定し得た。すなわち、イオン電荷をｍ／ｚスペクトルにおける隣接している同位体ピークの間隔の逆数から決定した。分析の直前に蟻酸ナトリウムを用いて外的に質量補正を行った。０．９５秒間のスキャン積分および０．０５秒間のスキャンごとの間隔を用いて、ｍ／ｚ＝４５０〜１８００の範囲にわたる陽イオンモードにおいて測量スキャンを得た。タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）に関して、データ従属モードにおいて、３５カウント／秒間（ｃｐｓ）の強度閾値を超えている５までの前駆イオンを、各測量スキャンから選択した。ＭＳ／ＭＳに関して、２＋、３＋、４＋、５＋、および６＋の電荷状態の前駆イオンを選択するために、実時間の脱同位体化（real-time deisotoping）および電荷状態認識を用いた。衝突活性化分離（ＣＡＤ）のための衝突エネルギーを、質量および所定の前駆イオンの電荷状態に基づいて自動的に選択した。０．９５秒間のスキャン積分および０．０５秒間のスキャンごとの間隔を用いて、ｍ／ｚ＝５０〜２５００の範囲にわたってＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。累積ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて３００００ｃｐｓの最小総イオン電流（ＴＩＣ）を達成するために、最大３秒にわたってイオンを分裂させた。不要なＭＳ／ＭＳ測定の発生の回避を目的として、前に分析した前駆イオンの再選択を排除するために、１８０秒間、０．２５ｍ／ｚユニットの排除幅にわたって、リアルタイム排除を用いた。
【０２３９】
（質量分析のデータ分析）
トリプシン消化されたタンパク質のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析から得られたデータを、ProteinLynx Global Serverソフトウェア（version 2.3、Waters）を用いて処理した。このソフトウェアは、質量スペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルの、バックグランウド減算（閾値３５％および５次多項式）、平滑化（１０回のSavitzky-Golay2、３チャンネル以上）、および重心化（上位８０％の各ピークおよび半分の高さの４チャンネルにおける最小ピーク幅）を行うものであった。処理したデータをN. crassaのデータベース（Broad Institute）に対して、次の基準を用いて調べた：５つまでの開裂不良を有しているトリプシン断片、前駆イオン質量の５０ｐｐｍの誤差、断片イオン質量の０．１Ｄａの誤差、および種々の翻訳後修飾（Ｎ末端およびＬｙｓ側鎖のカルバミル化、Ｍｅｔの酸化、ならびにＳｅｒ／Ｔｈｒの脱水）。ペプチドをＭＳ／ＭＳスペクトルに割り当てるために、同じ組に由来する少なくとも３つの連続した断片イオン（すなわちｂ型またはｙ型の断片イオン）の同定を必要とした。一義的にペプチドを同定する断片イオンの存在を確認するために、ＭＳ／ＭＳスペクトルを手動で検定した。
【０２４０】
（定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
Qiagenからの試薬（SYBR-green RT-PCR kit（Cat No. 204243））を用いて、ABI7300においてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＣＢＨＩ（ＮＣＵ０７３４０）用プライマー：順方向5’-ATCTGGGAAGCGAACAAAG-3’（配列番号１６）および逆方向5’-TAGCGGTCGTCGGAATAG-3’（配列番号１７）。ＣＢＨＩＩ（ＮＣＵ０９６８０）用プライマー；順方向5’-CCCATCACCACTACTACC-3’（配列番号１８）および逆方向5’-CCAGCCCTGAACACCAAG-3’（配列番号１９）。アクチンを標準化のための対照として用いた。アクチン用プライマー；順方向5’-TGA TCT TAC CGA CTA CCT -3’（配列番号２０）および逆方向5’-CAG AGC TTC TCC TTG ATG -3’（配列番号２１）。Dementhon et al., (2006)にしたがって定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０２４１】
〔実施例５：トランスクリプトームおよびセクレトームの研究の考察〕
植物バイオマスの分解は、多くの異なった酵素活性の産生を必要とするが、この酵素活性は、利用可能な植物材料の種類および複合度によって調節される（図９）（Bouws et al., 2008）。セルロース分解性の真菌による植物の細胞壁の分解における最初の体系的な分析についてここに説明する。当該分析は、トランスクリプトーム分析、セクレトーム分析、および変異体分析を包含している。プロファイリングデータは、N. crassaをMiscanthusまたはAvicelに基づく成長によって試験したとき、多数の細胞外および細胞内タンパク質を協調的に発現することを示した（図９）。セルロース性基質に基づく成長の間に最も多く発現された遺伝子の多くは、植物の細胞壁の多糖の代謝に関与すると予想タンパク質（その多くがＭＳ分析によって同定された）をコードしている。糸状菌のゲノム比較は、種々の数（N. crassaと近縁の肥料分解種であるT. reeseiにおける１０（Martinez et al., 2008）からPodospora anserinaにおける６０（Espagne et al., 2008）まで）の予想されているセルラーゼを含む多数のグリコシルヒドロラーゼ（〜２００）を示す。これらの結果および白腐担子菌のPhanerochaete chrysosporiumにおける近年のトラスクリプトーム／セクレトーム研究（Wymelenberg et al., 2009）の間の比較は、両方の種が純粋なセルロースに基づいて成長したときに、調節遺伝子（１８の遺伝子）および分泌タンパク質（２のタンパク質）におけるわずかな重複を示した。これらのデータは、異なる真菌が植物の細胞壁の分解のために異なる遺伝子セットを利用することを示唆する。しかし、両研究に共通していた１つの局面は、性質決定されていない、セルロース分解に関与する非常に多くの遺伝子／タンパク質であった。セルロース分解性の他の真菌（P. chrysosporiumが挙げられる）は、N. crassaにおいて直ちに利用可能な遺伝子ツールおよび分子ツールを有していない。N. crassaにおいて利用可能な機能的なゲノムツールを用いて、植物の細胞壁の分解酵素系の機能および重複の両方を、リグノセルロースバイオマス由来の液体燃料の工業製品に最適な酵素混合物を作製するために検討し得る。
【０２４２】
本研究において、N. crassaにおけるセロビオヒドロラーゼ（Ｉ）（ＣＢＨＩ）が、AvicelまたはMiscanthusに基づく成長期間に最も多く産生される細胞外タンパク質であること、およびこの遺伝子の欠失がセルロース性基質において最も深刻な成長不全を引き起こすことを見出した。また、これらの結果はT. reeseiにおいて報告されたもの（Suominen et al., 1993, Seiboth et al., 1997）と類似する。セロビオヒドロラーゼ（ＩＩ）の欠失は、セルロース性基質に基づく成長不良を引き起こすが、ＣＢＨ（Ｉ）よりかなり程度が小さく、N. crassaにおけるエキソグルカナーゼ活性がＣＢＨ（Ｉ）にほとんどが由来すること、および他のＣＢＨがＣＢＨ（Ｉ）の欠失を補わないことを示唆している。ここで、セルロース性基質に基づく成長期間に最も多く産生される３つのエンドグルカナーゼが、ＮＣＵ０５０５７、ＮＣＵ００７６２、およびＮＣＵ０７１９０によってコードされているタンパク質であることが示されていた。これらのタンパク質は、それぞれ、エンドグルカナーゼＥＧ１、ＥＧ２、およびＥＧ６と相同性を有している。これらの遺伝子の欠失は、Avicelに基づく成長に影響を与えなかったが、分泌タンパク質のレベルおよびエンドグルカナーゼ活性に差異が認められた。意外にも、ΔＮＣＵ０５０５７株において、細胞外タンパク質（特にＣＢＨ（Ｉ））のレベルは非常に高く、結晶性セルロースにおける野生型の成長特性を維持するために、この変異体は、他のセルラーゼの産生を促進しているか、またはＮＣＵ０５０５７の触媒作用の生成物がセルラーゼ産生を抑制し得ることを示唆する。N. crassaにおけるエンドグルカナーゼはいずれも、純粋なセルロースに基づく成長に必要ではなく、異なるエンドグルカナーゼは、重複した基質特異性を有していると結論付けた。
【０２４３】
グリコシドヒドロラーゼファミリー６１酵素は、T. reeseiと比較してN. crassaにおいて非常に拡大されている（Martinez et al., 2008）。これらの酵素は生物学的機能が十分には明確となっていないが、セルロースを分解できる菌におけるそれらの普遍的な保存性および存在量は植物の細胞壁の代謝における重要な役割を示唆している。ここで、１４のＧＨ６１のうちの１０個に関する遺伝子はN. crassaのトランスクリプトームにおいて同定され、セルロースのバイオマスに基づく成長期間にこれらの酵素が利用されることを示唆した。試験した４のＧＨ６１欠失株は、分泌タンパク質のレベル、エンドグルカナーゼ、および全セルラーゼ活性において、野生型と比較してほんのわずかな違いを示すだけであった。しかし、追加のＧＨ６１変異体の分析およびN. crassaにおける交雑による複数の変異を有している株の作製可能性は、重複性に取り組み、このファミリーの機能分析を促進し得る。
【０２４４】
予想されているセルラーゼ遺伝子に加え、ヘミセルラーゼをコードしている遺伝子、炭水化物エステラーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、および炭水化物に対する活性を有していると予想されている他のタンパク質は、MiscanthusおよびAvicelの両方からのN. crassaのトランスクリプトームにおいて同定された。Avicelがヘミセルロース成分を含んでいないという事実は、セルロースがおそらくN. crassaにおいて植物の細胞壁の分解酵素をコードしている遺伝子の一次誘導物質であることを示唆する。しかし、いくつかのヘミセルラーゼおよび炭水化物エステラーゼをコードしている遺伝子は、Miscanthusに基づく成長期間にのみ発現する。同様に、T. reeseiおよびAspergillus nigerなどのセルロースを分解できる他の菌において、いくつかのセルラーゼおよびヘミセルラーゼをコードしている遺伝子は協同的に調節され、一方、他は別々に調節される（Stricker et al., 2008）。予想した通り、セルラーゼでない遺伝子の欠失は、ＮＣＵ０５１３７およびｇｈ３−４を除いて、Avicelに基づく成長またはセルラーゼ活性にほとんど影響を与えなかった。より多くのタンパク質が分泌されたΔＮＣＵ０５１３７株は、野生型よりも、高いセルラーゼ活性を有しており、高いｃｂｈ−１（ＣＢＨ（Ｉ））およびｇｈ６−２（ＣＢＨ（ＩＩ））の発現を示した。ＮＣＵ０５１３７は、機能既知のタンパク質と相同性を有していない分泌される仮定のタンパク質をコードしているが、セルラーゼを分解できる他の菌において高度に保存されている（図２；Ｅ値０．０）。また、ＮＣＵ０５１３７は、多くの真正細菌において、より遠縁の相同物（同様に機能未知）を有している。ＮＣＵ０５１３７のタンパク質産物は、N. crassaのセルラーゼ遺伝子発現の誘導と関連するシグナル伝達の過程を妨害し得る（図９）。同様に、ｇｈ３−４（ＮＣＵ０４９５２）における変異体もＣＢＨ（Ｉ）活性が増加した。この遺伝子に欠失はＰＮＰＧアーゼ活性を完全に取り除き、Δｇｈ３−４培養ろ過物を用いたインビトロにおけるセルラーゼアッセイにおいてセロビオースを蓄積した。すべてのデータが、N. crassaにおいて、ＮＣＵ０４９５２が一次的な細胞外β−グルコシダーゼをコードしていることを総合的に示唆した。
【０２４５】
セルロースおよびヘミセルロースの細胞外分解は、細胞内へ次いで輸送される可溶性の炭水化物の形成を引き起こす（図９）。本研究において、パーミアーゼ／トランスポータをコードしている１０の遺伝子を、N. crassaがMiscanthusまたはAvicelに基づいて成長した際に顕著に増加した発現を示すことを同定しており、それは植物の細胞壁の分解産物の細胞への輸送に関係していることを示唆している。インビトロにおけるセルラーゼおよびヘミセルラーゼによる主な分解産物は、セロビオース、グルコース、キシロビオース、およびキシロースである。これらのトランスポータのいくつかは、機能的に重複し得るか、またはオリゴ糖を輸送し得る。これらの推定トランスポータの機能をさらに調べた（実施例７〜９を参照）。N. crassaトランスポータの非相同的発現によってオリゴ糖を輸送できる下流の構成を処理している株は、バイオマスの加水分解産物の工業的発酵を改良し得る。これらのトランスポータまたは輸送し得るものはいずれも、任意の糸状菌において、分子または機能レベルにおいて性質決定がなされていない。
【０２４６】
MiscanthusおよびAvicelに基づく成長期間に発現レベルの増加が示された多くの遺伝子は、セルロースを分解できる他の菌において保存されている機能未知のタンパク質をコードしている。わずか１６株の表現型を評価することによって、セルラーゼ活性に顕著に影響を与える機能未知のタンパク質をコードしている遺伝子における変異体が同定された。公知の遺伝学およびN. crassaにおける機能的ゲノム資源の利用可能性は、N. crassaを、これらのタンパク質の生物学的機能、同様にセルラーゼおよびセミセルラーゼ産物の調節形態の決定するため、ならびに植物の細胞壁の分解に関係する細胞外酵素間の重複および相乗作用を分析するための理想的なモデル生物にする。
【０２４７】
〔実施例６：Miscanthusに基づく成長期間に上方制御された遺伝子の変異体のスクリーニング〕
転写のプロファイリング実験において同定された別の遺伝子を分析するために、Miscanthusに基づいて１６時間にわたって成長させたNeurosporaにおいて上方制御された１８８の遺伝子の変異体の表現型を分析した（実施例１を参照）。各遺伝子のノックアウト変異体をVogel's最少培地に基づいて１０〜１４日にわたって成長させた。２ｍＬのｄｄＨ２Ｏを用いて分生子を回収し、２５０ｍＬフラスコに入っている１００ｍＬ培地に、１ｍＬあたり１０６分生子の濃度において播種した。３つの異なる炭素源のうち１つを各フラスコに加えた：２％のスクロース、２％のAvicel、または２％のMiscanthus（カリフォルニア州バークリーにあるカリフォルニア大学のカルビン研究室からの１ｍｍの粒子）。培養物は２２０ｒｐｍの振とうをしながら、２５℃において４日にわたって成長させた。
【０２４８】
表１０は、セルラーゼ活性およびMiscanthusまたはAvicelに基づく成長において野生型と比較して顕著な違いを示した変異体の表現型を列挙している。MiscanthusまたはAvicelに基づく成長を、“＋”得点法を用いて肉眼によって評価した。培養上清における総タンパク質を、Bradfordアッセイ（１００μｌの上清を９００μｌBradford染色液へ入れる）によって測定した。エンドグルカナーゼ活性をMegazyme製のAzo-CMCキットを用いて測定し、野性型と比較した変異体におけるエンドグルカナーゼ活性のパーセンテージとして表１０に示した。全セルラーゼ活性を、実施例４に記載したように上清におけるセロビオースのレベルを検出することによって測定した。結果を野生型のパーセンテージとして表１０に示した。
【０２４９】
【表１４】
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【０２５０】
【表１５】
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【０２５１】
【表１６】
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【０２５２】
【表１７】
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【０２５３】
【表１８】
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【０２５４】
〔実施例７：トランスポータ遺伝子のさらなる分析〕
実施例１に記載したように、予想されている糖輸送タンパク質をコードしている１０の遺伝子は、Neurospora をMiscanthusおよびAvicelに基づいて成長された際に発現レベルの増加を示した：ＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ００９８８、ＮＣＵ０１２３１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０５５１９、ＮＣＵ０５８５３、ＮＣＵ０５８９７、ＮＣＵ０６１３８、ＮＣＵ０８１１４およびＮＣＵ１００２１。これらの遺伝子のうち９個についての欠失株が、Fungal Genetics Stock Centerから入手できた。ＮＣＵ１００２１の欠失株は入手できなかった。
【０２５５】
ＮＣＵ０５８５３、ＮＣＵ０５８９７、またはＮＣＵ０８１１４の欠失株は、MiscanthusまたはAvicelに基づく成長不全を示す、および／もしくは、セルラーゼ酵素が欠失している株となった（実施例６；表１０を参照）。ΔＮＣＵ０５８５３は、野生型と比べて、Avicelに基づく成長の減少およびエンドグルカナーゼ活性の低下を示した。ΔＮＣＵ０５８９７は、野生型と比べて、Avicelに基づく成長の減少およびエンドグルカナーゼ活性の低下を示した。また、ΔＮＣＵ０８１１４は、野生型と比べて、Avicelに基づく成長の減少およびセロビオースのレベルの低下を示した。特に、Sporotrichum thermophile（別の糸状菌）の発現分析との比較において、S. thermophileをAvicelに基づいて成長させた際に、グルコースと比べて、ＮＣＵ０５８５３（ＳＴ８４５４）およびＮＣＵ０８１１４（ＳＴ５１９４）の相同物も上方制御され（実施例８、表１１を参照）、セロビオース利用におけるそれらの重要性をさらに示した。
【０２５６】
【表１９】
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【０２５７】
各予想されているトランスポータの基質の同一性を絞り込むために、ＮＣＵ０５８５３またはＮＣＵ０８１１４の欠失変異を有している株をグルコース、キシロース、セロビオース、キシランおよびAvicelに基づいて培養した（表１２）。培養培地は２％の炭素源を足したVogel's最少培地から構成された。両方の変異体は、Avicelに基づく成長の大きな減少を示したが、キシラン、グルコース、キシロース、またはセロビオースにおいては示さなかった。
【０２５８】
【表２０】
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【０２５９】
ヘミセルロースの利用におけるこれらのトランスポータの役割を調べるために、Neurosporaをキシランに基づいて成長させた際に、１０のトランスポータ遺伝子の発現を試験した。２％（ｗ／ｖ）のキシランを含んでいるVogel'sの塩に基づいて成長させたことを除いて、株を実施例４に記載した方法を用いた。１０個すべてのトランスポータの発現はキシランに基づく成長期間に上方制御され（表１３）、それらがセルロース分解に由来する糖（例えば、セロビオース、グルコース、セロ−オリゴ糖）だけでなく、ヘミセルロース分解に由来する糖（例えば、キシロビオース、キシロース、アラビノース、キシロオリゴ糖）を輸送し得ることを示唆した。変異体の成長結果および発現分析は、少なくとも２つの予想されているトランスポータ（ＮＣＵ０５８５３およびＮＣＵ０８１１４）が二糖（セロビオース、キシロビオース）および／またはオリゴ糖（セロデキストリン）を輸送し得ることを示唆した。
【０２６０】
【表２１】
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【０２６１】
〔実施例８：種々の炭素源に基づく成長期間におけるN. crassaトランスポータのSporotrichum thermophile相同物の発現分析〕
異なる糸状菌由来の相同遺伝子の発現を比較するために、Sporotrichum thermophileの発現プロファイルを、グルコース、Avicel、または綿のに基づいて成長させた培養物から分析した。グルコース、Avicel、または綿を含んでいる最少培地に基づいて１６〜３０時間にわたって成長させた培養物からｃＤＮＡを単離した。
【０２６２】
まず、S. thermophileゲノムにおける、Neurosporaトランスポータタンパク質の相同物を同定するために、ＢＬＡＳＴを用いて、各Neurosporaの配列をS. thermophileタンパク質のデータベースと比較した。次いで、この方法によってみつけたS. thermophileタンパク質の配列を、ＢＬＡＳＴを用いて、Neurosporaタンパク質のデータベースを比較した。これらの結果を図１０に列挙している。同定された推定NeurosporaトランスポータのすべてのS. thermophile相同物についてのアミノ酸配列を配列番号２２〜３２にみつけられる。
【０２６３】
次いで、S. thermophile相同物の発現プロファイルを試験した。データを表１１に示す。１列目は、Joint Genome Institute S. thermophile集団からのS. thermophile遺伝子名に相当する。２列目は、Neurosporaにおける最も近縁の推定トランスポータについてのＮＣＵ番号に相当する。３列目は、ヌクレオチドにおけるS. thermophile遺伝子の遺伝子長に相当する。４から６列目は、炭素源として２％のグルコース、Avicel、また脱脂綿を補ったVogel's最少培地に基づく成長期間の発現レベル（絶対的な発現レベルと比較可能な読み取りの数）に相当する。７から９列目は、標準化した発現データ（データセットにおける全読み取りによって分割された読み取りの♯）に相当する。最後の２列は、Avicel／グルコースまたは綿／グルコースの比とした、各遺伝子についての相対的な発現レベルのデータに相当する。ＮＣＵ０５８５３、ＮＣＵ０８１１４、およびＮＣＵ００８０１の相同物は、Avicelおよび綿の両方に基づいて成長させた場合に上方制御された。ＮＣＵ０６１３８の相同物は、綿に基づいて成長させた場合に上方制御され、ＮＣＵ０４９６３の相同物は、Avicelに基づいて成長させた場合に上方制御された。これらのデータは、推定トランスポータＮＣＵ０５８５３、ＮＣＵ０８１１４、ＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ０６１３８、およびＮＣＵ０４９６３がセルロースの利用に重要であるという、さらなる支持を提供する。
【０２６４】
〔実施例９：セロデキストリントランスポータの同定および分析〕
純粋なセルロースに基づいて成長させた場合、N. crassaは、細胞内β−グルコシダーゼだけでなく、７の主要輸送促進体スーパーファミリー糖トランスポータの転写が増加することが示された（実施例１；Tian et al., PNAS, 2009のSupplemental Data, Dataset S1の第６頁を参照）。特に、このセットからの各トランスポータを欠いているノックアウト株は結晶性セルロースに基づいてより遅く成長し、セルロースを加水分解できる条件下において、それらがセロオリゴ糖の吸収において直接役割を果たし得ることを示唆する（実施例７；表１０、１２）。例えば、ＮＣＵ０８１１４の欠失はN. crassaの成長の深刻な遅滞（図１１）、およびN. crassaのセロビオース消費の減少（図１２〜１３）を引き起こした。本実施例において、トランスポータ遺伝子ＮＣＵ００８０１／ｃｂｔ１およびＮＣＵ０８１１４／ｃｂｔ２を、セロデキストリンのトランスポータをコードすることをさらに分析および同定した。
【０２６５】
各トランスポータの機能をそれぞれ分析するために、セロビオースがS. cerevisiaeによって触媒されず、その細胞質に蓄積されないという事実を利用した（図１４）。セロビオースが単独の炭素源として与えられる場合に、細胞内β−グルコシダーゼと共役した機能性セロビオーストランスポータの発現がS. cerevisiaeを成長させ得ることが考えられた。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合したトランスポータＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４、および推定細胞内β−グルコシダーゼＮＣＵ００１３０を発現するよう酵母株を処理した。両方のトランスポータが発現し、細胞質膜に正確に配置された（図１５）。ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４を発現している株は、それぞれ０．０３４１ｈｒ−１および０．０１３１ｈｒ−１の比成長速度において酵母を成長させた（図１６Ａ）。これらの成長速度は、それぞれグルコースに基づく成長速度の３０％および１２％に当たる（図１７）。推定細胞内β−グルコシダーゼのみを発現している株が０．００２６ｈｒ−１の速度において成長し（図１６Ａ）、大規模培養においては成長しなかった（図１８）ため、セロビオースからグルコースへの細胞内加水分解、続く輸送によって成長を説明し得ない。これらの観察に基づき、ＮＣＵ００８０１およびＮＣＵ０８１１４（ＣＢＴ１およびＣＢＴ２を名付けられた）は、セロビオーストランスポータとして機能すると結論付けた。
【０２６６】
トランスポータ機能を直接分析するために、酵母細胞への［３Ｈ］−セロビオースの吸収を測定した。ＣＢＴ１およびＣＢＴ２の両方が、それぞれ４．０±０．３μＭおよび３．２±０．２μＭのＫｍ値を有している高い親和性セロビオーストランスポータであることがわかった（図１９）。ＣＢＴ１の発現標準化したＶｍａｘは、ＣＢＴ２のものの２．２倍であり、酵母の成長アッセイにおいてみられた違いを説明する事実であった。特に、セロビオースより長いセロデキストリン分子がｃｂｔ１およびｃｂｔ２を発現している酵母の成長を支えた（図２０；図１６Ｂ）。これは、セロデキストリン分子がＣＢＴ１およびＣＢＴ２によって輸送されることを示唆している。同様にして、ＣＢＴ１およびＣＢＴ２によるセロビオース輸送は過剰のセロトリオースによって阻害され、ＣＢＴ１活性もセロトリオースによって阻害された（図２１）。その上、精製において、β−グルコシダーゼ、ＮＣＵ００１３０（図２２）は、セロビオース、セロトリオース、およびセロテトラオースを加水分解することがわかった（図１６Ｃ）。
【０２６７】
相同分子種ｃｂｔ１およびｃｂｔ２は、真菌界に広く行き渡っていることを同定し、見出した（図２３）。最近の発現データによって、真菌および植物の間における種々の相互作用に対するそれらの重要性が示されている。例えば、子嚢菌のTuber melanosporumまたは担子菌のLaccaria bicolorが根の先端と共生的に相互作用して、外性菌根を形成するとき、ｃｂｔ１の相同分子種は両方において上方制御される（Martin et al., 2010）。同様に、腐生菌のAspergillus oryzae（Noguchi et al., 2009）、Postia placenta（Vanden Wymelenberg et al., 2010）およびPhanerochaete chrysosporium（Vanden Wymelenberg et al., 2010）は、植物の壁の材料と接触すると、ｃｂｔ２の相同分子種を上方制御する。一部の酵母（例えば、Kluveromyces lactisおよびPichia stipitis）は、セロビオースに基づいて成長し（Freer, 1991; Preez et al., 1986）、セロビオース輸送がClavispora lusitaniaeにおいて報告されている（Freer and Greene 1990）。これらの酵母のすべては、ｃｂｔ１、ｃｂｔ２または両方の相同分子種を含んでいることが、本研究において決定された（方法については後の記載を参照）。セロビオース輸送はHypocrea jecorina(Trichoderma reesei）において観察されている。しかし、トランスポータは同定されていないので、この活性がｃｂｔ１またはｃｂｔ２の相同分子種に帰せられ得るか否かは明らかではない（Kubicek et al., 1993）。
【０２６８】
セルロース分解性の真菌によるセロビオース輸送の利用は、それらがセルロースに基づく最適な成長に必須であることを示唆している。セルロースの異化作用が酵母のエタノール産生を向上させ得るか否かを試験するために、以上において構築された酵母株を発酵条件下において成長させた。わずかな至適化をともなって、N. crassaから移した完全なセロビオース異化経路を有している酵母は、８６％の理論値（Bai et al., 2008）である０．４７のエタノールの収率を有して、セロビオースをエタノールへと効率的に発酵させると示された（図２４Ａ）。これは、９０〜９３％のグルコースから得られた工業的な収率に匹敵した（Basso et al., 2008）。セロビオースに対するＣＢＴ１およびＣＢＴ２の高い親和性は、S. cerevisiaeのヘキソーストランスポータに匹敵し（Reifenberger et al., 1997）、細胞外のβ−グルコシダーゼと報告された（Chauve et al., 2010）。例えば、セロビオース／セロデキストリンの輸送は、グルコースへのセロビオースの完全な加水分解に対する要求性を低下させ、セルロース分解性の酵素のセロビオース媒介性の抑制を低減させ、グルコース依存性の生物による混入の危険性を下げる。実際に、セロビオース／セロデキストリンの輸送系を発現している酵母は、セロビオースおよびグルコースの両方の定常状態における濃度を低下させることおよびエタノールの産生速度を上昇させることによって、ＳＳＦ反応の効率を顕著に向上させた（図２４Ｂ、Ｃ）。
【０２６９】
セルロースからの生物燃料の製造は、改良された宿主細胞による燃料の生成と協調した、糖への植物バイオマスの効率的かつ経済的な脱重合を必要とする（Kumar et al., 2008）。セルロース分解性の真菌は、植物バイオマスに基づく最適な成長のためにセロ−オリゴ糖輸送経路を利用することが示された。さらに、酵母におけるこれらの経路の再構築は、トランスポータおよび細胞内のセロ−オリゴ糖ヒドロラーゼによって構成されている最小の経路を用いて、セロビオースの異化を向上させるために、基本単位の様式においてそれらが移されることを明らかにした（図２５）。酵母および他の生物の生物燃料を生成する株におけるセロデキストリン輸送の利用は、セルロース性の生物燃料の処理をより経済的に実現可能にするために重要である。
【０２７０】
（トランスポータおよびβ−グルコシダーゼの相同分子種）
セロデキストリントランスポータに対するGenBankアクセション番号またはJoint Genome Institute（ＪＧＩ）タンパク質ＩＤ（ＰＩＤ）番号は、Tuber melanosporum、ＣＡＺ８１９６２．１；Pichia stipitis、ＡＢＮ６５６４８．２；Laccaria bicolor、ＥＤＲ０７９６２；Aspergillus oryzae、ＢＡＥ５８３４１．１；Phanerochaete chrysosporium、ＰＩＤ１３６６２０（ＪＧＩ）（Martinez et al., 2004）；Postia placenta、ＰＩＤ１１５６０４（ＪＧＩ）（Martinez et al., 2009）である。Saccharomyces cerevisiaeのＨＸＴ１およびKluyveromyces lactisのＬＡＣＰに対するGenBankアクセション番号は、それぞれＤＡＡ０６７８９．１およびＣＡＡ３００５３．１である。P. chrysosporiumおよびP. placentaのゲノムはそれぞれ、genome.jgi-psf.org/Phchr1/Phchr1.home.htmlおよびgenome.jgi-psf.org/Pospl1/Pospl1.home.htmlにおいて利用可能であり得る。
【０２７１】
ＮＣＵ００１３０の相同分子種であるセロデキストリンヒドロラーゼに対するGenBankアクセション番号は、T. melanosporum、ＣＡＺ８２９８５．１；A. oryzae、ＢＡＥ５７６７１．１；P. placenta、ＥＥＤ８１３５９．１；およびP. chrysosporium、ＢＡＥ８７００９．１である。セロデキストリントランスポータの相同分子種を含んでいる他の生物は、細胞内β−グルコシダーゼであると推定されているＧＨ３ファミリーにおける遺伝子を含んでおり（Bendtsen et al., 2004; Cantarel et al., 2009）、当該他の細胞は、Kluyveromyces lactis、ＣＡＧ９９６９６．１；Laccaria bicolor、ＥＤＲ０９３３０；Clavispora lusitaniae、ＥＥＱ３７９９７．１；およびPichia stipitis、ＡＢＮ６７１３０．１である。
【０２７２】
（株および培地）
本研究に使用された酵母株は、遺伝子型：ＭＡＴａ  ｕｒａ３-５２  Ｌｙｓ２−８０１＿ａｍｂｅｒ  ａｄｅ２-１０１＿ｏｃｈｒｅ  ｔｒｐ１−Δ６３  ｈｉｓ３−Δ２００  ｌｅｕ２−Δ１を有しているＹＰＨ４９９であった（Sikorski et al., 1989）。１００ｍｇ／Ｌのアデニンヘミサルフェートを補ったＹＰＤ培地において、上記酵母株を成長させた。１００ｍｇ／Ｌのアデニンヘミサルフェートを補った適切な完全最少ドロップアウト（dropout）培地において形質転換された株（Becker et al., 2001）を成長させた。本研究に使用されたNeurospora crassaの株は、Fungal Genetics Stock Center（McCluskey 2004）から入手され、ＷＴ（ＦＧＳＣ２４８９）、およびセロビオーストランスポータの２つの欠失株（ＦＧＳＣ１６５７５、ΔＮＣＵ００８０１．２およびＦＧＳＣ１７８６８、ΔＮＣＵ０８１１４．２（Colot et al., 2006）を含んでいた。
【０２７３】
（プラスミドおよびクローニング）
トランスポータを、２μプラスミドｐＲＳ４２６にクローン化した。ｐＲＳ４２６は、改変されて、プライマー：ATATATGAGCTCGTGAGTAAGGAAAGAGTGAGGAACTATC（配列番号５３）およびATATATACTAGTTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAGATAATTACTTCC（配列番号５４）を用いて、ＳａｃＩおよびＳｐｅＩの間に挿入されたS. cerevisiaeのＰＧＫ１プロモータを含んでいた。上述および後述のプライマーのすべてにおいて制限酵素部位には下線が付されている。それから、Ｃ末端にＭｙｃタグおよび最適化されたKozak配列（Miyasaka 1999）を有しているＮＣＵ００８０１を、プライマー：ATGGATCCAAAAATGTCGTCTCACGGCTCC（配列番号５５）およびATGAATTCCTACAAATCTTCTTCAGAAATCAATTTTTGTTCAGCAACGATAGCTTCGGAC（配列番号５６）を用いて、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの間に挿入した。Ｃ末端にＭｙｃタグおよび最適化されたKozak配列を有しているＮＣＵ０８１１４を、プライマー：ATACTAGTAAAAATGGGCATCTTCAACAAGAAGC（配列番号５７）およびGCATATCGATCTACAAATCTTCTTCAGAAATCAATTTTTGTTCAGCAACAGACTTGCCCTCATG（配列番号５８）を用いて、ＳｐｅＩおよびＣｌａＩの間に挿入した。ＧＦＰ融合体を作製するために、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＳｅｒのＮ末端リンカーを有しているスパーフォルダーＧＦＰ（Pedelacq et al., 2006）を、プライマー：TATTAAATCGATGGTAGTGGTAGTGTGAGCAAGGGCGAGGAG（配列番号５９）およびTATTAAGTCGACCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC（配列番号６０）を用いて、ＰＧＫ１プロモータを含んでいるｐＲＳ４２６プラスミドのＣｌａＩおよびＳａｌＩの間にまず挿入した。それから、トランスポータを以下のようにＧＦＰに対して融合させた。プライマー：GCATGGATCCATGTCGTCTCACGGCTCC（配列番号６１）およびTATAATGAATTCAGCAACGATAGCTTCGGAC（配列番号６２）を用いて、ＮＣＵ００８０１をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの間に挿入した。プライマー：TATTAAACTAGTATGGGCATCTTCAACAAGAAGC（配列番号６３）およびTTATAAGAATTCAGCAACAGACTTGCCCTCATG（配列番号６４）を用いて、ＮＣＵ０８１１４をＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩの間に挿入した。
【０２７４】
β−グルコシダーゼＮＣＵ００１３０を２μプラスミドｐＲＳ４２５にクローン化し、改変して、上述のＰＧＫ１プロモータを含めさせた。最適化されたKozak配列およびＣ末端の６×Ｈｉｓタグを有しているＮＣＵ００１３０を、プライマーGCATACTAGTAAAAATGTCTCTTCCTAAGGATTTCCTCT（配列番号６５）およびATACTGCAGTTAATGATGATGATGATGATGGTCCTTCTTGATCAAAGAGTCAAAG（配列番号６６）：を用いて、ＳｐｅＩおよびＰｓｔＩの間に挿入した。すべてのコンストラクトは、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩの間にＣｙｃ転写ターミネータを含んでいた。すべてのN. crassa遺伝子をｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅させた。当該ｃＤＮＡは、単独の炭素源として純粋なセルロース（Avicel）を有している最少培地において培養したN. crassa（ＦＧＳＣ２４８９）から単離されたｍＲＮＡから合成された。
【０２７５】
（酵母成長アッセイ）
セロ−オリゴ糖に基づく成長を観察するために、適切なドロップアウトを有している５ｍＬの完全な最少培地において、一晩にわたって改変した株を成長させた。２５ｍＬのｄｄＨ２Ｏを用いて３回にわたって、これらの開始培養物を洗浄し、酵母窒素原礎培地（ＹＮＢ）、適切な完全補助培地（Complete Supplemental Media）（ＣＳＭ）ならびに０．１％（ｗ／ｖ）のセロビオース、または０．５％（ｗ／ｖ）のセロトリオースもしくはセロテトラオースにおいて０．１のＯＤ（６００ｎｍにおける）まで再懸濁させた。０．４ｍＬの最終のアッセイ容積および３０℃において、最大振幅の一定速度において振とうさせながら、Bioscreen C（商標）においてアッセイを実施した。６００ｎｍにおいてか、または４５０〜５８０ｎｍの広帯域のフィルタを用いて、ＯＤの変化を測定した。成長速度を、成長曲線の直線部分から取り、独立した３つの実験の平均±これらの実験の間の標準偏差として記録した。セロビオースおよびセロトリオースを、Seikagaku Biobusiness Corporation（Tokyo, Japan）から入手した。
【０２７６】
（ＮＣＵ００１３０の精製およびその活性のアッセイ）
ｃｂｔ１およびＮＣＵ００１３０を発現しているS. cerevisiaeの１Ｌの培養物を、完全最少培地において２．０ＯＤまで成長させた。細胞を、遠心分離によって回収し、３０ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４［ｐＨ８．０］、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、２ｍＭのβ−ＭＥ、Complete（商標） Mini、ＥＤＴＡを含んでいないプロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁させた。超音波によって細胞を溶解させ、溶解物を３０分間にわたる１５０００ｇにおける遠心分離することによって不要物を取り除いた。溶解物を重力にしたがって流すことによって、ニッケル−ＮＴＡ樹脂と結合させ、２５ｍＬの洗浄緩衝液（溶解緩衝液と同一であるが、２０ｍＭのイミダゾールを有している）を用いて３回にわたって洗浄した。５ｍＬの溶出緩衝液（溶解緩衝液と同一であるが、１５０ｍＭのイミダゾールを有している）を用いてＮＣＵ００１３０を溶出させ、適切な画分をプールし、保存緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））に交換し、等量に分注し、液体窒素において凍結させ、−８０℃において保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度を決定し（図２２）、１０８７５０Ｍ−１ｃｍ−１の減衰係数を用いて２８０ｎｍの吸光度からタンパク質濃度を決定した。
【０２７７】
異なるセロデキストリン基質を用いた加水分解活性に基づいて、精製されたＮＣＵ００１３０をアッセイした。１５０μＬのＰＢＳおよび３ｍＭのＤＴＴにおける５００μＭの各糖とともに、５ｐｍｏｌの酵素をインキュベートすることによって活性を測定した。１００μＬであった、４０分にわたって３０℃において処理した反応物を移し、４００μＬの０．１ＭのＮａＯＨにおいて反応を停止させた。CarboPac PA200カラムを有しているDionex ICS-3000用いたイオンクロマトグラフィーによって結果物を分析した。
【０２７８】
（トランスポータの相同分子種の系統学的な分析）
ＣＢＴ１およびＣＢＴ２のアミノ酸配列をネットワーク上のデータベースから入手した。T-Coffee（Notredame et al., 2000）を用いて、複数の配列の整列化を行った。PhyML version 3.0（Guindon and Gascuel 2003）を用いて、１００のBootstrapsによって最大尤度の系統発生を決定した。両方のプログラムには、Phylogeny.fr（ウェブページphylogeny.fr/）を介してアクセスした。FigTree v.1.2.1（ウェブページtree.bio.ed.ac.uk/）を用いて結果の系統樹を可視化した。
【０２７９】
（発酵およびＳＳＦ）
発酵実験およびＳＳＦ実験において、ＮＣＵ００１３０を発現しており、かつＭｙｃ−タグつきのｃｂｔ１を発現しているか、またはトランスポータを発現していない酵母の間において比較を行った。完全最少培地において一晩にわたって好気性条件においてこれらの株を成長させ、２５ｍＬの水を用いて３回にわたって洗浄し、適切なＣＳＭおよび２％（ｗ／ｖ）のセロビオースもしくは３％（ｗ／ｖ）の純粋なセルロース（Avicel）を加えた５０ｍＬのＹＮＢにおいて最終のＯＤが２．０になるまで、密閉した血清フラスコにおいて再懸濁させた。また、ＳＳＦ反応物は、β−グルコシダーゼを補うことなく、５０Filter Paper Units／ｇセルロースのろ過滅菌したCelluclast（Sigma C2730）を含んでいた。振とうさせながら３０℃において嫌気的に反応を行った。示されている時点において、１ｍＬのサンプルを取り出し、０．２μｍのシリンジフィルタに通してろ過した。Aminex HPX-87Hカラムを用いたＨＰＬＣおよび屈折率の検出によって、ろ過物におけるエタノール、グルコースおよびセロビオースの濃度を決定した。
【０２８０】
（N. crassaの成長およびAlamar Blue（登録商標）アッセイ）
ＷＴのN. crassa（FGSC 2489）および同核状態のＮＣＵ０８１１４（ＦＧＳＣ１７８６８）（Colot et al., 2006）を、Fungal Genetics Research Center（McCluskey 2003）から入手し、バッフルなしの２５０ｍＬのフラスコに入っている、２％のスクロースまたは純粋なセルロース（Avicel）を加えた５０ｍＬのVogel's塩および２５℃において成長させた。１６または２８時間後にそれぞれ、１００μＬのAlamar Blue（登録商標）を加え、培養物を２０分にわたって室温において培養した。このときに、１ｍＬのサンプルを取り出し、細胞片をペレット化させ、Beckman Coulter Paradigmプレート読取り器において５３５／５９５ｎｍの励起波長／放射波長を用いて、１００μＬの上清の蛍光発光を決定した。
【０２８１】
（N. crassaのセロビオース輸送アッセイ）
ＷＴのN. crassa（ＦＧＳＣ２４８９）、ならびにＮＣＵ００８０１（ＦＧＳＣ１６５７５）およびＮＣＵ０８１１４（ＦＧＳＣ１７８６８）の同核状態の欠失株（Colot et al., 2006）を、Fungal Genetics Stock Center（McCluskey 2003）から入手し、１０６分生子／ｍＬの播種物から始めて１６時間にわたって、２％（ｗ／ｖ）のスクロースを加えた５０ｍＬのVogel's塩および２５℃において、成長させた。遠心分離によって菌糸を回収し、Vogel's塩を用いて４回にわたって洗浄し、０．５％（ｗ／ｖ）の純粋なセルロース（Avicel）を加えたVogel's塩に移して、４時間にわたってトランスポータ発現を誘導させた。１０ｍＬの培養物を遠心分離によって回収し、Vogel's塩を用いて３回にわたって洗浄し、シクロヘキサン（１００μｇ／ｍＬ）および９０μＭのそれぞれのセロデキストリン（セロビオース、セロトリオースまたはセロテトラオース）を加えた１ｍＬのｄｄＨ２Ｏに再懸濁させた。セロデキストリン消費を測定するために、１５分後に１００μＬを取り出し、遠心分離によって不要物を除去し、９００μＬの０．１ＭのＮａＯＨに移した。CarboPac PA200カラムを用いた、Dionex ICS-3000を有しているＨＰＬＣによって上清に残っている糖の量を決定した。電気化学検出器を用いてピークを検出した。
【０２８２】
（ＧＦＰ蛍光発光および共焦点蛍光顕微鏡研究）
４８５／５３５ｎｍの励起波長／放射波長を用いたBeckman Coulter Paradigmプレート読取り器において、Bulk-cellのＧＦＰ蛍光発光の測定を行った。４８８ｎｍのレーザをともなうYokogawa CSU-X1の回転板ヘッドに取りつけられたLeica SD6000顕微鏡に基づく開口数１．４の１００倍の油浸対物レンズを用いた、０．８〜１．２のＯＤ（６００ｎｍ）を有している細胞の共焦点蛍光顕微鏡実験を実施し、Metamorphソフトウェアによって制御した。２００ｎｍの間隔の大きさでもってＺ系列を記録し、ImageJを用いて分析した。
【０２８３】
（［３Ｈ］セロビオース輸送アッセイおよび動態パラメータ）
オイルストップ法（Arendt et al., 2007）を改良して、輸送アッセイを実施した。ＧＦＰと融合されたｃｂｔ１またはｃｂｔ２のいずれかを発現している酵母株を、選択培地において１．５〜３．０のＯＤ（６００ｎｍ）まで成長させ、氷冷したアッセイ緩衝液（３０ｍＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ［ｐＨ５．６］および５０ｍＭのエタノール）を用いて３回にわたって洗浄し、２０のＯＤまで再懸濁させた。輸送反応を開始させるために、５０μＬの細胞を、１００μＬのシリコンオイル（Sigma 85419）の上に層状化された５０μＬの［３Ｈ］セロビオースに加えた。１７０００ｇにおいて１分にわたってオイルを介して細胞を回転させることによって反応を停止させ、チューブをエタノール／ドライアイスにおいて凍結させ、チューブの底に入っている細胞のペレットを、０．５ＭのＮａＯＨに取り去った。ペレットを一晩にわたって可溶化させ、５ｍＬのUltima Goldシンチレーション液を加え、Tri-Carb 2900TRシンチレーションカウンターにおいてＣＰＭを決定した。［３Ｈ］セロビオースは、Moravek Biochemicals, Inc.から購入され、４Ｃｉ／ｍｍｏｌの特定の活性および９９％を超える純度を有していた。種々のセロビオース濃度に対する３分間の全体における直線的な［３Ｈ］セロビオース取込み率を測定することによって、動態パラメータを決定した。SigmaPlot（登録商標）における非線形回帰による比率対セロビオース濃度のプロットに対して２変数の単一の直角双曲線関数を適合させることによって、ＶｍａｘおよびＫｍ値を決定した。輸送アッセイを始める直前に、ＯＤ２０における１００μＬの細胞からのＧＦＰ蛍光発光を測定することによって、トランスポータの存在量における差異について、Ｖｍａｘ値を標準化させた。文字として記録した動態パラメータは、独立した３つの実験からの平均±標準偏差である。２５０μＭのそれぞれの競合物の存在下における２０秒間にわたる全体の５０μＭの［３Ｈ］セロビオースの輸送を測定することによって、比較アッセイを行った。
【０２８４】
（大規模な酵母成長）
異なる炭素源に基づく成長を観察するために、適切なドロップアウトを有している５ｍＬの完全最少培地において改変株を成長させた。２５ｍＬのｄｄＨ２Ｏを用いて３回にわたってこれらの開始培養物を洗浄し、完全補助培地（ＣＳＭ）および２％（ｗ／ｖ）のセロビオースを加えた５０ｍＬの酵母窒素原礎培地において０．１ＯＤ（６００ｎｍにおける）まで再懸濁させた。２００ｒｐｍにおいて攪拌しながら、３０℃においてバッフルなしの２５０ｍＬのフラスコにおいて培養物を成長させた。ＯＤ（６００ｎｍにおける）の変化を定期的に取り出すことによって観察した。
【０２８５】
〔実施例１０：セロデキストリンのトランスポータ機能にとって重要な残基の同定〕
本実施例では、配列決定分析および変異生成研究を用いてセロデキストリントランスポータにおける保存されている残基および機能的に重要な残基を同定した。さらなるトランスポータをさらに同定した。
【０２８６】
セロデキストリントランスポータの種々の変異体ＮＣＵ００８０１（ｃｂｔ１）またはＮＣＵ０８１１４（ｃｂｔ２）ならびに野生型のβ−グルコシダーゼＮＣＵ００１３０を発現している酵母株の成長速度を、単独の炭素源としてセロビオースを用いて成長させた。QuickChange（登録商標） II Site-directed Mutagenesis Kit（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて製造者の指示にしたがって、ＮＣＵ００８０１の９６位およびＮＣＵ０８１１４の９６位の残基を個々に変異させた。２％のセロビオースを有している−ｕｒａ  −ｌｅｕの１００ｍｇ／Ｌの合成の限定培地において株を成長させた。培養を独立した２つのコロニーから開始した。
【０２８７】
図２６（ａ、ｂ）に示されている結果が表している通り、Ｗ６６、Ｌ７３、Ｙ７４、Ｎ８７、Ｙ８９、Ｄ９０、Ｑ１０４、Ｆ１０７、Ｇ１１３、Ｆ１２０、Ｙ１２３、Ｄ１３９、Ｇ１４２、Ｋ１４４、Ｍ１４７、Ｇ１５０、Ｑ１６９、Ｆ１７０、Ｇ１７３、Ｒ１７４、Ｇ１７８、Ｇ１８０、Ｐ１８９、Ｙ１９１、Ｅ１９４、Ｐ１９８、Ｒ２０１、Ｙ２０８、Ｗ２３５、Ｒ２３６、Ｑ２４２、２５７ＰＥＳＰＲＦ２６２（配列番号６７）、Ｙ２７９、Ｇ２８３、Ｅ２９６、Ｄ３０７、Ｋ３０８、Ｗ３１０、Ｄ３１２、Ｒ３２５、Ｇ３３６、Ｙ３４５、Ｎ３６９、Ｄ３８５、Ｆ４６２、Ｐ４６８、Ｅ４７６、Ｔ４８０、またはＧ４８６に置換を有しているＮＣＵ００８０１を発現している変異株は、野生株と比べて、２５％の成長不良を示した。
【０２８８】
ＮＣＵ０８１１４に対するアラニンスキャニング実験は、以下の残基：Ｌ３８、Ｙ３９、Ｇ５４、Ｄ５６、Ｆ７３、Ｇ９１、Ｐ１００、Ｄ１０４、Ｇ１０７、Ｒ１０８、Ｍ１１８、Ｒ１３９、Ｆ１４４、Ｑ１５０、Ｐ１５４、Ｅ１５９、Ｐ１６３、Ｈ１６５、Ｒ１６６、Ｙ１７３、Ｎ１７４、Ｗ１９９、Ｑ２１４、２２２ＰＥＳＰ２２５（配列番号６８）、Ｙ２４４、Ｈ２４５、Ｄ２４９、Ｅ２５８、Ｅ２６８、Ｑ３０２、Ｗ３０３、Ｓ３０４、Ｎ３０６、Ｙ３１２、Ｆ３５９、Ｌ３６０、Ｆ４０２、Ｙ４０３、Ｓ４０４、Ｙ４１４、Ｅ４１７、Ｐ４２０、Ｙ４２１、Ｋ４２６、Ｎ４４２、Ｎ４４６、Ｐ４４７、Ｗ４５９、Ｋ４６０、Ｅ４８２、Ｔ４８３、Ｌ４８８、Ｅ４８９、Ｅ４９０、Ｄ４９６、およびＧ４９７が機能的に重要であることを示した（図２６ｂ）。
【０２８９】
特に、モチーフ７３ＬＹＦ７５、２５７ＰＥＳＰ２６０（配列番号６９）および２７８ＫＹＨ２８０（ＮＣＵ００８０１の残基の番号付与）は、２９％のアミノ酸配列同一性を有している両方のトランスポータ（ＮＣＵ００８０１の残基２５７ＰＥＳＰ２６０（配列番号６９）およびＮＣＵ０８１１４の残基２２２ＰＥＳＰ２２５（配列番号６８））において機能的に重要であると考えられた。トランスポータにおいて全体的に保存されている残基（図２６ｂ、ｃにおける斜字体）、または特にβ結合型のトランスポータにおいて保存されているいくつかの残基（二重下線）（例えば、Ｄ９０（ＮＣＵ００８０１）、Ｄ５６（ＮＣＵ０８１１４）、Ｌ７３（ＮＣＵ００８０１）およびＬ３８（ＮＣＵ０８１１４））は、トランスポータ機能にとって重要である（下線）と実験的に示された。また、変異生成実験の結果は、ＮＣＵ００８０１／ＮＣＵ０８１１４の分岐群に保存されている残基（キャップ）（例えば、Ｑ１６８（ＮＣＵ００８０１）およびＱ２１４（ＮＣＵ０８１１４））が機能的に重要であることを示唆している。さらに、本実験において機能的に重要であると決定された複数の残基（例えば、Ｌ７３（ＮＣＵ００８０１）およびＬ３８（ＮＣＵ０８１１４））は、S. cerevisiaeの糖トランスポータ（Ｈｘｔ１/Ｈｘｔ３）に保存されていることがこれまでに示されている。
【０２９０】
また、異なる生物に由来するN. crassaのセロデキストリントランスポータの相同分子種を試験した（図２７）。代表的な相同分子種を、Genescriptによって合成し、Ｃｕｐ１プロモータを含んでいる発現ベクターｐＲＳ４２６にＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いてクローン化した。細胞内β−グルコシダーゼ（ＮＣＵ００１３０）をともなっている酵母株ＹＰＨ４９９を、これらのコンストラクトを用いて形質転換した。単独の炭素源としてセロビオースが存在しているときのこれらの株の成長速度を測定することによって、トランスポータ活性を決定した。
【０２９１】
代替的に、推定の相同分子種を含んでいる異なる真菌株を、セロデキストリンを補った富栄養培地において培養した。総ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに逆転写させた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ｃＤＮＡから直接に推定のトランスポータ遺伝子を増幅させた。しかし、制御機構および発現パターンが真菌の種におけるセロデキストリントランスポータについて未知であるため、推定のトランスポータをコードしているｃＤＮＡは、培養条件の変更にもかかわらず必ずしも入手可能ではなかった。この場合に、GenBankから得たｃＤＮＡ配列にしたがってプライマーを設計し、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いてエキソンを増幅させるために当該プライマーを使用した。それから、重複伸長ＰＣＲを用いて、エキソンを全長遺伝子にした。ＨＸＴ７プロモータおよびＨＸＴ７ターミネータを含んでいるｐＲＳ４２４シャトルベクターに、ＤＮＡアセンブラ法を用いて生じたＰＣＲ産物をクローン化した。形質転換体から単離された酵母のプラスミドを用いてE. coliＤＨ５αを形質転換し、元のトランスポータ遺伝子を増幅させるために使用したプラスミドを用いて、単離されたE. coliのプラスミドを確認用のＰＣＲによってまず検査した。全体のオープンリーディングフレームを塩基配列決定法に供して、プラスミドの正しい構築を確認した。P. stipitis由来の相同分子種ＬＡＣ２、ＬＡＣ３、ＨＸＴ２．１およびＨＸＴ２．６において、１つ以上の選択的なコドン（alternative codons）はＳｅｒをＬｅｕに置換する。酵母の相同性組換えを介したＤＮＡアセンブラ法を用いて、クローニング操作のほとんどを行った。ｐＲＳ４２４−ＨＸＴ７−ＧＦＰプラスミドを推定のセロデキストリントランスポータのクローニングに使用した。このプラスミドにおいてＨＸＴ７プロモータ、両方の末端にＥｃｏＲＩ部位を用いてフランキングしたＧＦＰ遺伝子、およびＨＸＴ７ターミネータを、ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩによって直鎖化されているｐＲＳ４２４シャトルベクター（New England Biolabs）に組み込んだ。ＨＸＴ７プロモータおよびＨＸＴ７ターミネータと同一の配列を共有しているＤＮＡ断片を用いてフランキングさせた推定のトランスポータのＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ消化したｐＲＳ４２４−ＨＸＴ７−ＧＦＰを用いてＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃに、標準的な酢酸リチウム法にしたがってコトランスフェクションさせた。２％のグルコースを補ったＳＣ−Ｔｒｐプレートに生じた形質転換体の混合物を播いて、形質転換体を回復させた。推定のセロデキストリントランスポータの相同分子種、およびＮＣＵ００１３０を発現している酵母を、単独の炭素源としてのセロビオースに基づく成長について試験した。
【０２９２】
推定のセロデキストリントランスポータの一覧および研究から得られた結果を表１４に示す。
【０２９３】
【表２２】
2013500019.tif 000024
【０２９４】
【表２３】
2013500019.tif 000025
【０２９５】
【表２４】
2013500019.tif 000026
【０２９６】
【表２５】
2013500019.tif 000027
【０２９７】
【表２６】
2013500019.tif 000028
【０２９８】
ある場合において、クローン化した相同分子種の配列が正確であることを確認し、これらのクローンを発現している酵母はセロビオースを利用可能であった。したがって、これらのクローンPichia stipitis由来のＬＡＣ２およびAspergillus clavatus由来のＸＰ＿００１２６８５４１．１は、機能的なセロビオーストランスポータであることを確認した。他のクローンにおける公開されている配列から得られた異なる配列（例えば、挿入、欠失などを有している配列）を有しているクローン化した相同分子種を、ふたたびクローニングし、ふたたび配列決定し、S. cerevisiaeにおいてそれらを発現させることおよび成長速度を観察することによってセロビオーストランスポータ活性について同様に試験した。
【０２９９】
ＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ０８１１４およびこれらのトランスポータの機能的な相同分子種の整列化配列を図２８に示す。図２８ａにおける整列化配列は推定のトランスポータおよび確認済のトランスポータの両方を含んでおり、図２８ｂにおける整列化配列は確認済のセロデキストリントランスポータのみを含んでいる。さらに、図２８ｃはＮＣＵ００８０１およびＮＣＵ０８１４４の整列化配列を示している。２つのトランスポータは２９％のアミノ酸配列同一性を共有している。
【０３００】
セロデキストリントランスポータの機能にとって重要なモチーフを、糖トランスポータの間における複数の整列化配列を視覚的に検出することによって同定した。推定のセロデキストリントランスポータの相同分子種と確認済のセロデキストリントランスポータとの間の、T-COFFEEにおいて生成された複数の整列化配列から、セロデキストリントランスポータに共通のモチーフを同定した。これらのモチーフがセロデキストリントランスポータにとって非常に特異であることを確かめるために、S. cerevisiaeのヘキソーストランスポータと、ヒトのグルコーストランスポータＧｌｕｔ１と、N. crassaの単糖トランスポータとの間の、T-COFFEEにおいて生成された複数の整列化配列から、それらの非存在を確認した。
【０３０１】
同定されたモチーフを以下に示す。モチーフにおいて、ＮＣＵ００８０１の機能にとって重要である認められた残基に下線を付した。ＮＣＵ０８１１４の機能にとって重要である残基に上付き文字の“†”を付した。両方のトランスポータの機能にとって重要である残基に上付き文字の“＊”を付した。すべてのモチーフをPROSITE表記法を用いて表した。PROSITEモチーフの読み方の一例として、次のモチーフ：［ＡＣ］−ｘ−Ｖ−ｘ（４）−｛ＥＤ｝は、［ＡｌａまたはＣｙｓ］−任意−Ｖａｌ−任意−任意−任意−任意−｛ＧｌｕまたはＡｓｐを除いて任意｝（配列番号１１）を解釈される。
【０３０２】
セロデキストリントランスポータ、類似のすべての糖トランスポータは、膜貫通型の１２のα−ヘリックスを有している。セロデキストリントランスポータのＮ末端およびＣ末端の両方は細胞内にある。
膜貫通型のヘリックス１の前にある配列は顕著な特徴を有していなかった。
膜貫通型のヘリックス１は、モチーフ［Ｌ＊ＩＶＭ］−Ｙ＊−［ＦＬ］−ｘ（１３）−［ＹＦ］−Ｄ＊（配列番号１）を含んでいた。
膜貫通型のヘリックス２は、モチーフ［ＹＦ］−ｘ（２）−Ｇ†−ｘ（５）−［ＰＶＦ］−ｘ（６）−［ＤＱ］＊（配列番号２）を含んでいた。
ループによって接続されている膜貫通型のヘリックス２および膜貫通型のヘリックス３は、モチーフＧ＊−Ｒ†−［ＲＫ］＊（配列番号３）を含んでいた。
膜貫通型のヘリックス４は顕著な特徴を有していなかった。
膜貫通型のヘリックス５は、モチーフＲ＊−ｘ（６）−［ＹＦ］＊−Ｎ†（配列番号４）を含んでいた。
膜貫通型のヘリックス６は、モチーフＷ＊Ｒ−［ＩＶＬＡ］−Ｐ−ｘ（３）−Ｑ（配列番号５）を含んでいた。
膜貫通型のヘリックス６および膜貫通型のヘリックス７の間にある配列は、モチーフＰ＊−Ｅ＊−Ｓ＊−Ｐ＊−Ｒ−ｘ−Ｌ−ｘ（８）−Ａ−ｘ（３）−Ｌ−ｘ（２）−Ｙ＊−Ｈ†（配列番号６）を含んでいた。
膜貫通型のヘリックス７は、モチーフＦ†−［ＧＳＴ］−Ｑ＊−ｘ−Ｓ†−Ｇ−Ｎ†−ｘ−［ＬＩＶ］（配列番号７）を含んでいた。
膜貫通型のヘリックス８は顕著な特徴を有していなかった。
膜貫通型のヘリックス９は顕著な特徴を有していなかった。
膜貫通型のヘリックス１０、膜貫通型のヘリックス１１およびこれらの間にある配列は、モチーフＬ−ｘ（３）−［ＹＩＶ］†−ｘ（２）−Ｅ＊−ｘ−Ｌ−ｘ(４)−Ｒ−［ＧＡ］−Ｋ†−Ｇ（配列番号８）を含んでいた。
膜貫通型のヘリックス１２は顕著な特徴を有していなかった。
膜貫通型のヘリックス１２の後ろに続く配列は顕著な特徴を有していなかった。
【０３０３】
zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/におけるI-TASSERサーバ(Roy et al., 2010).を用いて、ＮＣＵ００８０１およびＮＣＵ０８１１４の一次アミノ酸配列から、ＮＣＵ００８０１およびＮＣＵ０８１１４の同一性モデルを生成した。また、モチーフのマッピングをPYMOL（ウェブページpymol.org/）において行った。セロデキストリントランスポータの際立ったモチーフを有しているＮＣＵ００８０１およびＮＣＵ０８１１４の同一性モデルを図２９（ａ、ｂ）に示す。図２９（ｃ）はＮＣＵ００８０１およびＮＣＵ０８１１４の二次構造を示している。
【０３０４】
〔実施例１１：Neurospora crassaおよびPichia stipitisに由来するペントース特異的な新規のトランスポータの、Saccharomyces cerevisiaeにおける性質決定〕
本実施例において、バイオインフォマティックスの手法が、N. crassaおよびP. stipitisにおけるペントース特異的な新規のトランスポータを同定するために採用された。
【０３０５】
（ペントース特異的なトランスポータのゲノムマイニング（mining））
バイオインフォマティックス研究
Ｄ−キシロース特異的なトランスポータを見つけるために、C. intermedia由来のＤ−グルコース／Ｄ−キシロース共輸送体のＧｘｓｌをコードしている遺伝子（Leandro et al., 2006）、およびP. stipitis由来の性質決定されていない推定のＬ−アラビノース−プロトン共輸送体Ａｕｔ１をコードしている遺伝子（遺伝子座タグＰＩＣＳＴ＿８７１０８）は、効率的にキシロースを利用する２つの異なる種N. crassaおよびP. stipitisの配列決定されたゲノム（Galagan et al., 2003; Jeffries et al., 2007）に対する、ＢＬＡＳＴ検索（ウェブページncbi.nlm.nih.gov/）におけるプローブとして使用した。公知のＤ−グルコース輸送活性または糖の輸送以外の活性を有している任意のタンパク質を分析から排除した。２５％の最小の配列同一性の切捨てを用いて、１７の推定のペントーストランスポータ遺伝子を、P. stipitis由来のＡＵＴ１に加えて、同定した（表１５）。これらの推定のペントーストランスポータ遺伝子はC. intermediaのＧｘｓｌまたはP. stipitisのＡｕｔ１のいずれかと２５〜５０％の同一性を共有していた。推定の１７のペントーストランスポータのすべては、糖輸送タンパク質または未知の活性を有している未知のタンパク質のいずれかとの注釈が付されていた。また、P. stipitisに由来するＤ−グルコーストランスポータ遺伝子ＳＵＴ１およびＳＵＴを、比較のためにクローニングした。
【０３０６】
【表２７】
2013500019.tif 000029
【０３０７】
【表２８】
2013500019.tif 000030
【０３０８】
推定のペントーストランスポータのクローニング
Ｄ−キシロースまたはＬ−アラビノースを炭素源として補った富栄養培地において、N. crassaおよびP. stipitisを培養した。総ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに逆転写した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、推定のトランスポータ遺伝子をｃＤＮＡから直接に増幅させた。しかし、真菌の種における調節機構および発現パターンが未知であるため、上記推定のペントーストランスポータをコードしているｃＤＮＡは、培養条件の変更にもかかわらず、必ずしも入手可能ではなかった。これらの場合、ＧｅｎＢａｎｋから提供されている対応するｃＤＮＡ配列にしたがってプライマーを設計し、使用して、ゲノムＤＮＡを鋳型として用いてエキソンを増幅させた。酵母の相同性組換えを介したＤＮＡアセンブラ構築法（Shao et al., 2009）を用いて、生じたＰＣＲ産物をｐＲＳ４２４−ＨＸＴ７−ＧＦＰシャトルベクターにクローニングした。このプラスミドにおいて、ＨＸＴ７プロモータ、両端にＥｃｏＲＩ部位をフランキングさせたＧＦＰ遺伝子、およびＨＸＴ７ターミネータを、ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩによって直鎖化したｐＲＳ４２４シャトルベクター（New England Biolabs）に組み込んだ。ＨＸＴ７のプロモータおよびターミネータと同一の配列を共有しているＤＮＡ断片を用いてフランキングした推定のペントーストランスポータのＰＣＲ産物（図３０ａ）を、ＥｃｏＲＩによって消化したｐＲＳ４２２４−ＨＸＴ７−ＧＦＰとともにEuroscarf（Frankfurt, Germany）から購入したS. cerevisiaeのＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃ（ＭＡＴα  ｌｅｕ２−３、１１２  ｕｒａ３−５２、ｔｒｐ１−２８９、ｈｉｓ３−ΔＭＡＬ２−８ｃ）に、標準的な酢酸リチウム法を用いてコトランスフェクションした。２％のＤ−グルコースを補ったＳＣ−Ｔｒｐプレートに、生じた形質転換混合物を播いた。
【０３０９】
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II（(Zymo Research, Orange, CA）を用いて形質転換体から単離した酵母のプラスミドを、Escherichia coliのＤＨ５ａ細胞（Cell Media Facility, Urbana-Champaignにあるイリノイ大学, Urbana, IL）に再びトランスフェクションした。QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN, Valencia, CA）を用いて、上記プラスミドを単離し、それから元のトランスポータ遺伝子の増幅に使用したプライマーを用いた確認的なＰＣＲによって確認した。また、オープンリーディングフレームの全体をＤＮＡ配列決定に供して、正しい構成を確認した（Core Sequencing Facility, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL）。ＤＮＡ配列決定の結果を、Sequencher 4.7（Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI）を用いて、データベースにおける配列と比較した。クローン化された推定のトランスポータのすべての配列は配列番号３３〜５２に記載されている。
【０３１０】
合成のドロップアウト培地（アミノ酸および硫酸アンモニウムなしの０．１７%のDifco yeast nitrogen base、０．５％の硫酸アンモニウム、０．０５％のアミノ酸のドロップアウト混合物）において酵母株を培養して、プラスミドを保持させた。２％の糖を補ったYPA培地（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、０．０１％のアデニンヘミサルフェートスルフェート）を使用して、プラスミドを有していない酵母株を成長させた。S. cerevisiae株を、好気性成長のために３０℃および２５０ｒｐｍにおいて培養し、酸素制限条件のために３０℃および１００ｒｐｍにおいて培養した。特に説明がない限り、細胞操作のために好気性条件下において酵母株を成長させた。３７℃、２５０ｒｐｍおよびLuriaブロス（Fisher Scientific, Pittsburg, PA）においてE. coli株を培養した。すべての制限酵素をNew England Biolabs（Ipswich, MA）から購入した。すべての化学薬品をSigma Aldrich（St. Louis, MO）またはFisher Scientificから購入した。
【０３１１】
（クローン化した推定のトランスポータのトランスポータ活性アッセイ）
ペントース糖の細胞内蓄積
クローン化した推定のペントーストランスポータを、S. cerevisiaeの糖トランスポータ欠失株において過剰発現させ、ペントース糖の取込みが測定された。推定のペントーストランスポータのＤ−キシロース取込み能を、細胞内のＤ−キシロースおよびキシリトールの濃度の総和によって決定した。S. cerevisiae内に蓄積したＤ−キシロースは、内因性のアルドースリダクターゼの存在のために、キシリトールへと部分的に変換され得る。Ｄ−キシロースおよびキシリトールの両方を、浸透圧を利用して抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析した。
【０３１２】
E. Boles教授の研究室（Institut fur Mikrobiologie, Heinrich-Heine-Universitat, Universitatsstr. 1, Geb. 26.12.01, D-40225 Dusseldorf, Germany）から贈られた糖トランスポータのノックアウトS. cerevisiae株のＥＢＹ．ＶＷ４０００（ＣＥＮ．ＰＫ２−１ｃ  Δｈｘｔ１−１７、Δｓｔｌ１、Δａｇｔ１、Δｙｄｌ２４７ｗ、Δｙｊｒ１６０ｃ、Δｇａｌ２）は、２０を超える糖のトランスポータおよびセンサ（HXT1-17およびGAL2が挙げられる）の同時のノックアウトを有していた。単独の炭素源としてのＤ−グルコースに基づく成長は、この株において消失しており、異なる糖の輸送系を介したマルトースの取込みが保持されていた。また、ＥＢＹ．ＶＷ４０００株は、ＨＰＬＣアッセイの条件下において最小のペントース取込みを示し、組換え体のＤ−キシロース取込みを試験するために好適な宿主になった。標準的な酢酸リチウム法を用いて、クローン化された推定のペントーストランスポータを過剰発現するプラスミドをＥＢＹ．ＶＷ４０００株にトランスフェクションし、糖の取込み活性を測定するために使用した。
【０３１３】
２％のマルトースを補った２ｍＬのSC-Trp培地において細胞をまず培養した。それから、種菌培養物を使用して、２５０ｍＬのフラスコにおける５０ｍＬの培養物に播種した。成長の２４時間後に遠心分離によって細胞を回収し、２％のＤ−キシロースまたはＬ−アラビノースを補ったYPA培地に再懸濁させて、最終的なＯＤ６００を１０にした。３０分間、６０分間、１２０分間、および２４時間における５ｍＬの培養物を細胞内の糖の濃度を測定するために採取した。氷冷した水を用いて培養物のサンプルを洗浄し、３ｍＬの脱イオン化水に再懸濁した。２５０ｒｐｍにおいて攪拌しながら２日にわたって３７℃において、細胞の懸濁物をインキュベートした。ＨＰＬＣ分析の前に０．２２μｍのPESフィルタ（Corning, Lowell, MA）に、生じた細胞の懸濁物を通してろ過した。BioRad HPX-87Cカラム（BioRad Laboratories, Hercules, CA）および低温−蒸発光散乱検出器Shimadzu ELSD-LTII（Shimadzu）を備えているShimadzu HPLCを用いて、糖および対応する糖アルコールの濃度（後述されている）の濃度を、製造者のプロトコルにしたがって測定した。ＯＤ１０未満における細胞培養物の１ｍＬについて浸透圧を介して抽出された糖のｍｇ数として、糖の取込み活性を算出した。
【０３１４】
種々の推定のペントーストランスポータは、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロースまたは両方の取込みにおいて活性を示すことが同定された。Ｄ−グルコースは酵母内においていったん代謝され得るので、Ｄ−グルコース輸送活性は、細胞内のＤ−グルコース濃度を測定することによって決定され得ない。しかし、通常、ＥＢＹ．ＶＷ４０００株は、単独の炭素源としてＤ−グルコースを含んでいる培地において成長できないので、推定のペントーストランスポータを用いて形質転換された株の、Ｄ−グルコースに基づく成長は、推定のトランスポータがＤ−グルコース輸送活性を有していることを示した。
【０３１５】
ＳＵＴ３（Ｘｙｐ３７）、ＸＵＴ３（Ｘｙｒ３３）、ＳＵＴ２（Ａｐ３１）、ＮＣＵ０４９６３（Ａｎ２９−２）およびＮＣＵ０６１３８（Ｘｙ３１）は、Ｄ−グルコースに基づくＥＢＹ．ＶＷ４０００株の成長を回復させ、したがってグルコース輸送活性を発揮させた。また、ＳＵＴ３、ＸＵＴ３、ＳＵＴ２およびＮＣＵ０４９６３は、キシロース輸送活性を有しており、ＮＣＵ０４９６３およびＮＣＵ０６１３８はアラビノース輸送活性を示した（図３）。残りの推定のトランスポータはＤ−グルコースに基づく成長を可能にすることができず、またそれらのほとんどは任意のペントース輸送活性を示さなかった。しかし、ＮＣＵ００８２１およびＳＴＬ１２／ＸＵＴ６はキシロース輸送活性を示し、ＸＵＴ１はアラビノース輸送活性を示し、それらがペントースに特異的な糖トランスポータであり得ることを示していた（図３２）。
【０３１６】
P. stipitisに由来するＳＴＬ１２／ＸＵＴ６およびＸＵＴ１がＤ−グルコース輸送活性なしで、実際にペントース特異的なトランスポータであることをさらに確認するために、１４Ｃ標識したＤ−グルコース、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースを基質として用いて、糖取込みアッセイを実施した。ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６およびＮＣＵ００８２１を過剰発現しているＥＢＹ．ＶＷ４０００株のＤ−グルコース取込み活性およびＬ−アラビノース取込み活性は、両方のトランスポータのＤ−キシロース取込み動態を決定するために使用されたアッセイの条件下において測定されるには低すぎることが分かった。
【０３１７】
１４Ｃ標識したＤ−グルコース、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースを、９０％のエタノールにおける溶液としてAmerican Radiolabeled Chemicals（St. Louis, MO）から購入した。放射線標識した糖を、ドラフトにおいてまず乾燥させ、それから水に再懸濁させた。約４００００ｄｐｍ／μＬの固有の放射能を有している１．３３Ｍおよび１Ｍの濃度における糖の溶液、ならびに約２００００ｄｐｍ／μＬの固有の放射能を有している５００ｍＭ、３５０ｍＭ、２５０ｍＭ、１００ｍＭおよび５０ｍＭの濃度における糖の溶液を糖の取込みアッセイに使用した。対数期における細胞の培養物を、回収し、氷冷した水を用いて２回にわたって洗浄し、ｐＨ５における１００ｍＭのＴｒｉｓ−クエン酸緩衝液の１ｍＬにつき約６０ｍｇの乾燥細胞重量（ＤＣＷ）まで再懸濁させた。１６０μＬの細胞懸濁物の３つの分取物を２４時間にわたって６５℃において乾燥させて、ＤＣＷを決定した。残りの細胞懸濁物を使用前まで氷上に静置しておいた。糖の取込みアッセイのために、細胞懸濁物を、４０μＬの放射性標識した糖の溶液と４０または６０秒にわたって（正確に時間を測定した）混合した。反応を、シリンジによって１０ｍＬの氷冷した水を加えることによって停止させた。０時点のサンプルを、放射性標識した溶液の入っている培養チューブに対して、氷冷した水および細胞懸濁物を同時に加えることによって入手した。それから、混合物を、４０％の糖溶液にあらかじめ浸しておいたWhatman GF/Cフィルタ（Whatman, Florham Park, NJ）に通して直ちにろ過し、氷冷した１５ｍＬの水を用いて洗浄した。ろ過物を、３ｍＬのEcono Iシンチレーションカクテル（Fisher Scientific）に入れ、Beckman LS6500シンチレーションカウンター（Beckman Coulter, Brea, CA）を用いて１分にわたってカウントした。すべての時点のデータは３つの独立した実験において測定された。輸送された糖のｍｍｏｌ数／時間／乾燥細胞重量の１グラムとして、糖の取込みを算出した。
【０３１８】
また、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６、ＮＣＵ００８２１またはＸＵＴ１を過剰発現しているＥＢＹ．ＶＷ４０００株におけるＤ−キシロースおよびＬ−アラビノースの細胞内における蓄積を、ＨＰＬＣを用いて測定した。３０分間、６０分間、１２０分間および２４時間にわたってペントース糖とともにインキュベートした細胞培養物をＨＰＬＣによって分析した。２４時間のインキュベーションの後に、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６またはＮＣＵ００８２１を過剰発現しているＥＢＹ．ＶＷ４０００株は、Ｄ−キシロース取込み活性を示し、ＸＵＴ１を過剰発現しているＥＢＹ．ＶＷ４０００株は、Ｌ−アラビノース取込み活性を示した（図３３）。
【０３１９】
細胞内における糖の蓄積のＨＰＬＣ分析をともなった、１４Ｃ標識した糖の取込みアッセイによって、リグノセルロース性の加水分解物における最も豊富な３つの単糖（Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノース）のなかでも、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６およびＮＣＵ００８２１はＤ−キシロースの取込みを担っており、ＸＵＴ１はＬ−アラビノースの取込みを担っていることが確認された。注目すべき点は、Ｄ−キシロースの取込みについて最も研究されている糖トランスポータは、Ｄ−キシロースに対してより、Ｄ−グルコースに対して高い取込み活性を有している。適応性の進化の後にTrichoderma reesei由来のＴｒｘｌｔ１のみは、Ｄ−キシロース特異的な取込み活性を示した（Saloheimo et al., 2007）。このデータによって、P. stipitis由来のＳＴＬ１２／ＸＵＴ６およびN. crassa由来のＮＣＵ００８２１は、S. cerevisiaeに導入され、かつ実験的に初めて確認された天然に存在しているＤ−キシロース特異的なトランスポータであることが示された。同様に、P. stipitis由来のＸＵＴ１はS. cerevisiaeに導入され、かつ実験的に初めて確認された天然に存在しているＬ−アラビノース特異的なトランスポータであることが示された。
【０３２０】
動態パラメータ
１４Ｃ標識した糖の取込みアッセイを用いて、ＮＣＵ００９２１、ＳＴＬ１２／ＸＵＴＲ６およびＸＵＴ１を介したＤ−キシロース輸送の動態パラメータを決定した。アッセイ条件下における糖の取込みは、始めの６０秒間において直線的な連なりであった（図３４）。ＮＣＵ００８２１、ＳＴＬ１２／ＸＵＴＲ６またはＸＵＴ１を過剰発現しているＥＢＹ．ＶＷ４０００株を、標識したＤ−キシロースまたはＬ−アラビノースとともに、４０秒間または６０秒にわたってインキュベートした後に、氷冷した水を加えて、さらなる糖の取込みを停止させた。それから、液体シンチレーションカウンターを用いた測定の前に反応混合物を、ろ過し、洗浄した。Originソフトウェア（OriginLab Corporation, Northampton, MA）を用いた非線形回帰によって糖の取込み率および基質の濃度を、ミカエリス−メンテンの方程式に適合させた。ＮＣＵ００８２１またはＳＴＬ１２／ＸＵＴ６のみを有しているＥＢＹ．ＶＷ４０００株によるＤ−キシロース取込みに関するＫｍ値は、それぞれ１７５．７±２１．４および５６．０±９．４ｍＭであった。対応するＶｍａｘ値はそれぞれ３６．７±２．８および４１．５±２．３μｍｏｌ／ＤＣＷの１ｇであった。同様に、ＸＵＴ１を有しているＥＢＹ．ＶＷ４０００株によるＤ−キシロース取込みに関するＫｍ値およびＶｍａｘ値は、それぞれ４８．０±１３．２ｍＭおよび５．６±１．６μｍｏｌ／ＤＣＷの１ｇであった。
【０３２１】
Ｄ−キシロースを消化する天然に存在する真菌の種において、高い親和性のＤ−キシロース−プロトンの共輸送系および低い親和性のＤ−キシロース促進性の拡散系の両方が存在している。これらの２つの系のＫｍ値は、上記共輸送系について０．４〜４ｍＭであり、促進性の拡散系について約１４０ｍＭであると決定された（Leandro et al., 2006; Stambuk et al., 2003）。これらの値はS. cerevisiaeにおけるＤ−グルコース取込みの親和性に近く、Ｄ−グルコース取込みは高い親和性の系について１．５ｍＭのＫｍを有しており、低い親和性の系について２０ｍＭのＫｍを有している（Lang and Cirillo 1987; Ramos et al., 1988）。残念ながら、野生型のS. cerevisiaeのＤ−キシロース取込みの親和性は、Ｄ−キシロースに対する親和性より２桁低い大きさである。S. cerevisiaeにおけるＤ−キシロース取込みについてＫｍ値は、高い親和性の系についてわずか１９０ｍＭであり、低い親和性の系についてわずか１．５ｍＭである（Kotter and Ciriacy, 1993）。新たに見出されたＤ−キシロース特異的なトランスポータの親和性は、天然に存在するＤ−キシロースを消化する酵母における高い親和性のＤ−キシロース取込みの系と比べて低かった。しかし、野生型のS. cerevisiaeと比べて、ＮＣＵ００８２１およびＳＴＬ１２／ＸＵＴ６はＤ−キシロースに対してより高い親和性を示した。特にＳＴＬ１２／ＸＵＴ６およびＸＵＴ１によるＤ−グルコース取込みのＫｍは、野生型のS. cerevisiaeにおけるトランスポータによるキシロース取込みのＫｍのわずか１／４であった。また、Ｄ−キシロース特異的なトランスポータのＫｍ値は、Ｇｘｆ１（８８ｍＭのＫｍ）およびＳｕｔ１（１４５ｍＭのＫｍ）のＫｍ値と近く、組換えS. cerevisiaeにおけるＤ−キシロース発酵を向上させていることを示している（Runquist et al., 2009; Katahira et al., 2008）。したがってＤ−キシロース発酵は、新たに見出されたＤ−キシロース特異的なこれらのトランスポータをS. cerevisiaeに導入することによって向上され得る。
【０３２２】
（糖トランスポータの細胞内の局在化）
糖トランスポータは膜貫通型のタンパク質であり、細胞膜における正しいフォールディングおよび局在化はそれらが機能的であるために必要である。推定のペントーストランスポータがクローン化されたときにシグナルペプチドを特に加えていないので、Ｄ−キシロース特異的なトランスポータが細胞膜に正しく局在化していることを確認することが重要であった。これは、S. cerevisiaeと比べて非常に異なる生理機能を示す糸状菌N. crassaからクローン化されたＮＣＵ００８２１のような推定のペントーストランスポータに対して特にあてはまる。S. cerevisiaeにおけるＤ−キシロース特異的なトランスポータの細胞への局在化を調べるために、ＮＣＵ００８２１、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６およびＸＵＴ１のＣ末端にリンカーを介して緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を融合させ、それらの局在化を蛍光発光イメージングによって観察した。
【０３２３】
Ｃ末端にＧＦＰを有しているペントース特異的なトランスポータの融合タンパク質をトランスポータ局在化研究のために構築した。ＧＳリンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号７０））を、トランスポータおよびＧＦＰの間に挿入した。ＰＣＲプライマーによってＧＦＰのオープンリーディングフレームのＮ末端にＧＳリンカーを付加させ、５’末端におけるトランスポータと相同なヌクレオチド配列および３’末端におけるＨＸＴ７ターミネータを用いてフランキングされているＧＳリンカー−ＧＦＰのＰＣＲ産物を生じた。元のｐＲＳ４２４−ＨＸＴ７トランスポータのコンストラクトからトランスポータ遺伝子を増幅させて、５’末端におけるＨＸＴ７プロモータおよび３’末端におけるＧＳリンカー−ＧＦＰと同一のヌクレオチド配列を用いてフランキングされたトランスポータのＤＮＡ断片を生成させた。それから、ＥｃｏＲＩを用いて消化したｐＲＳ４２４−ＨＸＴ７−ＧＦＰとともに、これらの２つの断片をS. cerevisiae株のＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃにコトランスフェクションした。生じた形質転換混合物を２％のＤ−グルコースを補ったＳＣ−Ｔｒｐプレートに播いた。
【０３２４】
２％のマルトースを補った２ｍＬのＳＣ−Ｔｒｐ液体培地に単一のコロニーを播種した。細胞培養物を対数期に回収した。遠心分離チューブにおいて、１０μＬのHoechst 33342核染料（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて１０分にわたって室温において、２５０μＬの細胞培養物を染色した。それから、細胞培養物の小さな液滴を一片のカバーガラス上に移し、Andor Technology Revolution System Spinning Disk Confocal Microscope（Core facilities, Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL）を用いて、蛍光画像を撮影した。画像分析および可視化のソフトウェアImaris（Bitplane, Saint Paul, MN）を用いて、画像を処理した。
【０３２５】
ペントース特異的なトランスポータを過剰発現している酵母株は、細胞の周辺領域に特有の蛍光発光の円光を示した（図３５）。ＮＣＵ００８２１およびＸＵＴ１について、ほとんどすべてのＧＦＰ蛍光発光は細胞膜に現れ、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６を過剰発現している細胞における蛍光発光の大部分は、細胞質に留まっていた。これは、膜タンパク質の上昇した発現に起因するＳＴＬ１２／ＸＵＴ６の非効率的な輸送を示し得る。また、すべての細胞が蛍光発光を示し、トランスポータの発現は最適ではなかったことを示していたことに注意されたい。発現レベルを変更すること、および／または組換えS. cerevisiaeのゲノムにトランスポータ遺伝子を組み込むことによって、トランスポータの発現のさらなる向上を実現し得る。
【０３２６】
（ペントーストランスポータの種類の決定）
S. cerevisiaeには２種類の糖トランスポータ、共輸送体およびファシリテータ（facilitators）がある。通常、糖の共輸送体は糖に対する高い親和性を示す。一方で、ファシリテータを介した糖の取込みはプロトン輸送と連動しておらず、通常、ファシリテータは糖取込みの低い親和性を示す（Leandro et al., 2006）。ＥＢＹ．ＶＷ４０００株において発現されているＮＣＵ００８２１、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６およびＸＵＴ１について、共輸送体アッセイを実施した。
【０３２７】
トランスポータの種類を決定するために、ＵＳＢ通信モジュールおよびDirect pHソフトウェアを備えているSeven MultiのｐＨメータ（Mettler Toledo, Columbus, OH）を用いて、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノースまたはＤ−グルコースを含んでいる非緩衝化の細胞懸濁液において、ペントース特異的なトランスポータを過剰発現しているＥＢＹ．ＶＷ４０００株のｐＨ変化を測定した。ペントース特異的なトランスポータをコードしているプラスミドをＥＢＹ．ＶＷ４０００株に入れ、２％のマルトースを補ったＳＣ−Ｔｒｐ培地に播いた。２％のマルトースを補ったＳＣ−Ｔｒｐ培地に単一のコロニーを播種した。それから種培養物を用いて２Ｌのフラスコに入っている４００ｍＬの培養物に播種した。ＯＤ１以下の培養物を回収し、氷冷した水を用いて２回にわたって洗浄した。細胞のペレットを４ｍＬの水に再懸濁させ、使用するまで氷上に静置した。共輸送体アッセイのために、５０ｍＬの容量の水ジャケットつきの（water-jacketed）ビーカーにｐＨ電極を挿入した。当該ビーカーは、２５℃に維持されており、電磁攪拌機を備えている。２５℃に保たれている２３ｍＬの脱イオン水および１ｍＬの細胞懸濁物をビーカーに加えた。ｐＨを５に調節し、基底線を得た。ｐＨ５を有している１ｍＬの５０％の糖溶液を加えながら、ｐＨ変化を記録した。
【０３２８】
図３６には、マルトースを加えた後における非緩衝化の細胞懸濁物におけるｐＨ変化が示されている。報告されていた通り、非緩衝化のS. cerevisiae細胞の懸濁物におけるｐＨはマルトースの添加にしたがって上昇した。非緩衝化の細胞懸濁物に１ｍＬの５０％のマルトースを加えて、ｐＨ記録システムが機能していることを確認した。サンプルにおいて観察されたｐＨ上昇は、ｐＨ記録計が実験環境における一過性のｐＨ変化を観察可能であることを示していた。
【０３２９】
非緩衝化の細胞懸濁物におけるｐＨの上昇は、ペントース特異的なトランスポータのいずれについても観察されず、これらのトランスポータを介したペントース取込みはプロトン輸送と関連していないことが示された（図３７）。したがって、ＮＣＵ００８２１、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６およびＸＵＴ１はペントースのファシリテータであると決定された。
【０３３０】
この結果は、ＮＣＵ００８２１およびＳＴＬ１２／ＸＵＴ６の動態パラメータが、Ｄ−キシロースを消化する天然に存在する酵母におけるＤ−キシロースの促進性の低い親和性の拡散系の動態パラメータと類似しているという事実と一致していた。共輸送体がＤ−キシロースに対するより高い親和性を有しているという事実にもかかわらず、共輸送体の過剰発現は、プロトンの勾配を作り出すためのＡＴＰ要求に起因して、Ｄ−キシロースを消化する株による糖の利用を常に促進する訳ではない。実際に、Ｄ−キシロース発酵に有益であると示されているトランスポータのほとんどは、ファシリテータである（Runquist et al., 2009; Katahira et al., 2008）。
【０３３１】
（ｐ−キシロース特異的なトランスポータの異種性の過剰発現）
また、過剰発現がキシロース利用を向上させるか否かを決定するために、Ｄ−キシロース利用経路を含んでいるS. cerevisiaeａ株における活性な異種のＤ−キシロース特異的なトランスポータの過剰発現について調べた。好気性条件において振とうフラスコを用いてキシロース利用を試験した。キシローストランスポータのＮＣＵ００８２１、ＮＣＵ０４９６３、ＸＵＴ１、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６、およびＨｘｔ７を発現するプラスミドを、ＨＺＥ６３株（ＣＥＮ．ＰＫ２  ｕｒａ３：：キシロース利用経路）に導入した。この株は、染色体上のＵＲＡ３部位に組み込まれたキシロース利用経路を有していた。それは、N. crassaに由来するキシロースリダクターゼ（ＸＲ）およびキシロースデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）ならびにP. stipitisに由来する（ＸＫＳ）を含んでいる、これまでの研究から得られたプラスミドを用いて構築された。このプラスミドは、ＡｐａＩを用いて消化され、ＣＥＮ．ＰＫ２を形質転換させて、ＨＺＥ６３株を生成した。
【０３３２】
キシローストランスポータをコードしているプラスミドを用いて形質転換されたＨＺＥ６３株を、２％のグルコースを補ったＳＣ−Ｔｒｐプレート上に播くことによって選択した。形質転換株を、２％のグルコースを有しているＳＣ−Ｔｒｐ−Ｕｒａにおいて前培養し、それから０．５％または５％のキシロースを補ったＳＣ−Ｔｒｐ−Ｕｒａに、最初のＯＤ６００が１．０になるまで播種した。
【０３３３】
形質転換体の酵母のプラスミドを用いて、E. coliのｐＤＨ５α細胞を形質転換した。それから、プラスミドを単離し、確認用のＰＣＲによって調べ、塩基配列決定に供して正しいコンストラクトであることを確認した。プラスミドマップは図３９に見られる。
【０３３４】
残念ながら、ペントース特異的なトランスポータの過剰発現の利点は、発現方法、培養条件、Ｄ−キシロース利用経路の選択の変更にもかかわらず、観察され得なかった。考えられる可能性がいくつかある。第１に、膜タンパク質（例えば糖トランスポータ）の過剰発現は、細胞膜の完全性に影響し、結果的に細胞の成長を阻害し得る（Wagner et al., 2006）。トランスポータ過剰発現株は、Ｄ−グルコースが炭素源として使用される場合でさえ、より遅い成長速度を示すことが観察された。グルコース含有のＳＣ−ｕｒａ培地において成長させた、トランスポータを有している株の２日間にわたる培養の最終的なＯＤはわずかに４であり、ネガティブコントロールのＯＤは約６であった。第２に、ヘキソーストランスポータを介した野生型のS. cerevisiaeのＤ−キシロース取込み活性は、ヘキソーストランスポータのノックアウト株において過剰発現されているＤ−キシローストランスポータのＤ−キシロース取込み活性よりはるかに高い。新たに見出されたＤ−キシロース特異的なトランスポータの低い糖の取込み活性は、糖の取込み能の向上を観察することを困難にさせ得る。第３に、新たなＤ−キシロース特異的なトランスポータの導入がS. cerevisiae細胞におけるＤ−キシロースの取込みを向上させ得るにしても、Ｄ−キシロース利用の利点は、Ｄ−キシロース利用経路が糖の取込みを限定的な方法にするために十分に有効である場合にのみ観察され得る。糖トランスポータの過剰発現の作用は株の背景および培養条件に依存することが示されている（Runquist et al., 2010）。後述の実施例１２〜１５は酵母におけるキシロース降りようの最適化を説明している。
【０３３５】
（ペントース特異的なさらなるトランスポータのクローニング）
ＮＣＵ００８２１、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６およびＸＵＴ１の相同分子種をクローン化し、ペントース取込みについて試験した。グルコースまたはペントースを補った富栄養培地において異なる真菌株を培養した。総ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに逆転写させた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、推定のトランスポータ遺伝子をｃＤＮＡから直接に増幅させた。しかし、調節機構および発現パターンが真菌の種におけるペントーストランスポータについて未知であったので、推定のペントーストランスポータをコードしているｃＤＮＡは、培養条件の変更にもかかわらず必ずしも入手可能ではなかった。この場合に、GenBankから提供されている対応するｃＤＮＡ配列にしたがってプライマーを設計し、当該プライマーを用いてゲノムＤＮＡを鋳型としてエキソンを増幅させた。それから、重複伸長ＰＣＲを用いてエキソンを全長遺伝子として組み合わせた。ＤＮＡアセンブラ法を用いてＨＸＴ７プロモータおよびＨＸＴ７ターミネータを含んでいるｐＲＳ４２４シャトルベクターに、生じたＰＣＲ産物をクローン化した。形質転換体から単離した酵母のプラスミドを用いて、E. coliＤＨαを形質転換し、もとのトランスポータ遺伝子を増幅するために使用されたプライマーを用いて確認用のＰＣＲによって、単離したE. coliのプラスミドをまず検査した。
【０３３６】
酵母の相同性組換えを介したＤＮＡアセンブラ法を用いてクローニング操作のほとんを実施した。推定のペントーストランスポータのクローニングにｒＰＳ４２４−ＨＸＴ７−ＧＦＰプラスミドを使用した。このプラスミドにおいて、ＨＸＴ７ターミネータおよび両方の末端におけるＥｃｏＲＩ部位を用いてフランキングされたＧＦＰ遺伝子を、ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩによって直鎖化されたｐＲＳ４２４シャトルベクター（New England Biolabs）に組み込んだ。ＨＸＴ７プロモータおよびＨＸＴ７ターミネータと同一の配列を有しているＤＮＡ断片を用いてフランキングされた、推定のペントーストランスポータのＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ消化したｐＲＳ４２４−ＨＸＴ７−ＧＦＰとともに、標準的な酢酸リチウム法を用いてＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃにコトランスフェクションした。２％のＤ−グルコースを補ったＳＣ−Ｔｒｐプレート上に、生じた形質転換混合物を播いた。それから、形質転換体をペントース輸送活性について試験した。
【０３３７】
結果を図４０および表１６に示す。８つの推定のペントース特異的なトランスポータ（ＸＰ＿９６００００（ＮＣ５２）、ＣＡＧ８８７０９（ＤＨ４８）、ＸＰ＿４５７５０８（ＤＨ６１）、ＸＰ＿６８１６６９（３２−１０）、ＸＰ＿００１４８７４２９（２９−６）、ＸＰ＿００１７２７３２６（２９−９)、ＸＰ＿６５７８５４（３２−８）、ＸＰ＿７２０３８４（２９−４））のうち、ＮＣ５２のみがグルコースプレートに基づく成長が可能であり、他の７つのトランスポータはペントース特異的であり得るか、または不活性であり得ることを示唆している。ＨＰＬＣに基づくペントース取込みアッセイを用いて、４つのキシロース特異的なトランスポータ（ＸＰ＿４５７５０８（ＤＨ６１）、ＸＰ＿６８１６６９（３２−１０）、ＸＰ＿００１７２７３２６（２９−９)、ＸＰ＿７２０３８４（２９−４））が見出された。さらに、１つのアラビノース特異的なトランスポータ（ＸＰ＿６５７８５４（３２−８））が同定された（図４０；上部）。また、さらなる５つの推定のペントース特異的なトランスポータ（ＸＰ＿００２４８８２２７、ＡＢ０７０８２４．１、ＸＰ＿００１３８９３００、ＸＰ＿００２４８８２２７、ＥＥＱ４３６０１．１）が試験され、グルコースプレートに基づいて成長可能なものはなかった。さらなるペントース取込みアッセイによって、ＸＰ＿００２４８８２２７およびＡＢ０７０８２４．１はキシロース特異的なトランスポータであることが示された（図４０；下部）。これらの結果の要約は表１６Ｄに示されている。
【０３３８】
【表２９】
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【０３３９】
【表３０】
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【０３４０】
【表３１】
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【０３４１】
【表３２】
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【０３４２】
データベースにおける配列と不一致な配列を有している相同分子種（例えば、変異を有している分子種）を、ふたたびクローン化し、配列決定し、酵母株において発現させ、糖の取込み機能について試験した。また同様に、配列決定の結果のない相同分子種をトランスポータ機能について試験した。
【０３４３】
ペントーストランスポータの相同分子種の整列化配列を分析して、トランスポータ機能における潜在的な役割を有し得る保存されている残基を同定した。キシローストランスポータ（ＮＣＵ００８２１、ＳＴＬ１２／ＸＵＴ６、ＸＰ＿００２４８８２２７．１およびＸＰ＿００２３８２５７３．１）およびアラビノーストランスポータ（ＸＵＴ１およびＥＥＱ４３６０１．１）のサンプルの整列化は、図４１（ａ、ｂ）にそれぞれ示されている。キシローストランスポータおよびアラビノーストランスポータの配列の全体的な比較（図４１ｃ）によって、２種類のペントーストランスポータに保存されている残基があり、ペントース取込みにおける機能的な役割を一般的に示してることがわかる。
【０３４４】
実施例１２〜１５は酵母におけるキシロース利用経路の最適化に関する。
【０３４５】
〔実施例１２：ペントースを利用するS. cerevisiae株の改変〕
イソ酵素の概念を活用することによって効率的なキシロース代謝経路を再構成した。イソ酵素は、異なる動態特性または制御特性を有している同じ化学反応を触媒し、細胞基質の環境の動的な変化に応じて代謝の流れの精密に調整された制御をもたらすと知られている。しかし、イソ酵素を採用して、所望の流れを促進させる代謝改変手法はこれまで存在しなかった。本研究は、野生型および変異体のキシロースリダクターゼ（ＸＲ）の両方の同時発現が、キシロースの蓄積を低減させ得、全体のキシロース発酵速度を向上させ得ることを証明している。
【０３４６】
生体の系におけるイソ酵素の分布によって示唆されているように、野生型のＸＲおよび変異体のＲＸ（Ｒ２７６Ｈ）を、キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）とともに、S. cerevisiaeにおいて共発現させて、S. cerevisiaeにおいて機能的なキシロース代謝経路を構築した。ＸＲ変異体は、ＮＡＤＨよりはるかに低い選択性をＮＡＤＰＨに対して示し、野生型のＸＲは、ＮＡＤＨを超えてＮＡＤＰＨに対する１１６倍高い選択性を有していると報告されている（Watanabe et al., 2007）。
【０３４７】
P. stipitisに由来するキシロース代謝遺伝子（野生型のＸＹＫ１、２および３ならびに変異体ＸＹＬ１）をＰＣＲ増幅し、構造的なプロモータの制御下において、発現カセットを構築した。これらの組込みカセットをＤ４５２−２株のゲノムに組み込んだ。
【０３４８】
キシロース代謝経路を構築するための発現カセットによる形質転換を、酵母EZ-Transformationキット（BIO 101, Vista, CA）を用いて実施した。アミノ酸栄養要求性マーカーを用いて形質転換体を選択するために、６．７ｇ／リットルの酵母窒素原礎培地、２０ｇ／リットルのグルコース、２０ｇ／リットルの寒天、およびＣＳＭ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｕｒａ（BIO 101）を含んでおり、適切なヌクレオチドおよびアミノ酸を補った酵母の合成完全（ＹＳＣ）培地を使用した。２０ｇ／リットルのグルコースを有しているＹＰ培地（１０ｇ／リットルの酵母抽出物、２０ｇ／リットルのBactoペプトン）、３０℃において、酵母株を定法にしたがって培養した。
【０３４９】
また、最適化されたキシロース利用経路の酵素を含んでいる同一のコンストラクトをいくつかの異なる酵母株において発現させることによって、キシロース代謝の効率に対するS. cerevisiae株のバックグラウンドの影響を試験した。使用した３つの研究室株は、Ｄ４５２−２（ＭＡＴα、ｌｅｕ２、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｃａｎ１）、Ｌ２６１２（ＭＡＴａ、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｕｒａ３−５２、ｔｒｐ１−２９８、ｃａｎ１、ｃｙｎ１、ｇａｌ＋）およびＣＥＮ．ＰＫであった。キシリトール、酢酸塩、およびエタノールの産生をキシロースおよびＯＤ６００とともに観察した。その結果は、Ｄ４５２−２株は３つの試験した株のなかで最も良好であった（図４２〜４４）。本試験に使用した株およびプラスミドを表１７に記載している。
【０３５０】
【表３３】
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【０３５１】
キシロースを発酵させる改変されたS. cerevisiae株は、キシロースを消費し、無視し得る量のキシリトールの蓄積をともなってエタノールを産生した。４０および８０ｇ／Ｌのキシロースを単独の使用した場合、ＤＡ２４株は、振とうフラスコおよびバイオリアクターの発酵実験の両方において、一貫した収量を有してエタノール（ＹＥｔｈａｎｏｌ／Ｘｙｌｏｓｅ＝０．３１〜０．３２ｇ／ｇ）を産生した（図４５）。しかし、ＤＡ２４株は、キシロースを発酵させる天然に存在する酵母P. stipitisより緩やかにキシロースを消費した。進化的な改変手法（Sauer 2001）を用いて、ＤＡ２４のキシロース発酵能をさらに向上させた。キシロースを含有している培地においてＤＡ２４を繰返して継代培養した後に単離された１つの株（ＤＡ２４−１６）は、種々の培養条件下において親株と比べてはるかに早い発酵速度を示した（表１８）。
【０３５２】
【表３４】
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【０３５３】
興味深いことに、ＤＡ２４−２株は、最も速やかにキシロースを発酵させる酵母であると知られているP. stipitisと同程度の速度においてキシロースを消費した。しかし、ＤＡ２４によるエタノールの収率はP. stipitisよりわずかに少なかった（図４６）。
【０３５４】
ゲノムライブラリを用いて形質転換された、キシロース利用酵素を発現しているS. cerevisiae株Ｌ２６１２（ＹＳＸ３株）を用いてスクリーニングの準備をした。形質転換の後に、キシロースの利用について効率的な株を濃縮するための酸素制限条件下の４０ｇ／Ｌのキシロースに継代培養を移行させた。酸素制限条件の５０ｍＬのＹＰＸ培地において発酵を実施し、ＯＤ６００＝１０に達したときに、十分に成長した細胞培養物の０．１％（５０μＬ）を次の継代培養に移した。１０回の継代培養の後に、細胞をＹＰＸ（４０ｇ／Ｌ）寒天培地に対して段階希釈物を用いて広げた。５ｍＬのＹＰＸ培地を用いた発酵実験を全体を通して、低いキシリトール形成および高いエタノール形成についてコロニーをスクリーニングした。ＤＮＡの配列決定によって、最も効率的な２つの株は、多コピーの組み込まれたＸＹＬ２を含んでいたことが明らかになり、それから、当該ＸＹＬ２を相同性組換えによって他コピーのプラスミドにクローン化され、ＹＳＸ３細胞を形質転換した。
【０３５５】
ＸＹＬ２遺伝子を、組込みベクターにおける、異なる強度のプロモータ（例えばＴＤＨｐまたはＰＧＫｐ）の制御下に配置し、ＹＳＸ３細胞を形質転換した（図４７）。形質転換された酵母細胞におけるキシロースおよびエタノールの形成に対するこれらのプラスミドの作用を観察するために、試験を実施した。結果は、より高レベルのＸＹＬ２（ＰＧＫｐ下にある）を発現しているＹＳＸ３細胞は、エタノール産生においてより効率的であり、さらにより少ない量のキシリトールを産生することを示していた（図４８）。さらなるＸＹＬ３がこれらの細胞において発現されている場合、産生されるキシリトールの量は、生じた株ＳＲｕ−２３においてさらに低下した（図４９）。したがって、改変されたS. cerevisiae株におけるＸＹＬ２の発現レベルはキシロース発酵を実施するための重要な要素であり、当該株は、発現が強力なプロモータに基づく場合により少ないキシリトール蓄積を高いエタノールの収率を有していると考えられる。ＸＹＬ２およびＸＹＬ３の同時の共発現によって、キシリトールの蓄積量はさらに低下する。しかし、ＸＹＬ２およびＸＹＬ３を過剰発現している株においてＸＹＬ１をさらに過剰発現させた場合、相当な量のキシリトールが蓄積し、結果として低下したキシロース発酵をもたらす。したがって、効率的なキシロース発酵にとって最適なレベルのＸＹＬ１があったと考えられる。
【０３５６】
また、ＸＹＬ２およびＸＹＬ３を過剰発現しているS. cerevisiaeにおける外因性のＧＲＥ３の過剰発現がキシロース発酵を促進し得るか否かを試験するために、実験を行った。ｐＲＳ４０３−ＧＲＥ３の構築のために、ＧＲＥ３遺伝子をS. cerevisiaeのＤ４５２−２から増幅させ、ＴＤＨ３プロモータおよびＣＹＣターミネータを有しているｐＲ４０３ベクターに挿入した。ｐＲ４０３−ＧＲＥ３の直鎖化の後に、Ｄ４５２−２のゲノムに組み込んだ。キシロース利用遺伝子を酵母株Ｄ４５２−２に導入し（図５２）、キシロース発酵パラメータを観察した。結果は、ＧＲＥ３の過剰発現は、特に、高いＯＤの播種物として８０ｇ／Ｌのキシロースに基づいて細胞を成長させる場合に、エタノール産生およびキシロース蓄積におけるＸＹＬ１と同程度の効率であったことを示していた。
【０３５７】
〔実施例１３：ＬＡＤおよびＸＤＨの改変〕
ＮＡＤＰＨ依存性のＸＲとＮＡＤ＋依存性のＸＤＨおよびＬＡＤとの間における補助因子の不均衡によって引き起こされると考えられているＬ−アラビニトールおよびキシリトールの蓄積は、ペントース利用酵素を発現している改変されたS. cerevisiaeにおけるキシロース発酵の間における主要な障害と見做されている。ＸＲおよびＸＤＨの間における不均衡は、逆転した補助因子の選択性を有している改変された酵素によって補正されており（Watanabe et al., 2007；Matsushika et al., 2008；Bengtsson et al., 2009）、この手法は、修飾した酵素が低下した特異的活性を有しているため、低下した流れを生じた。P. stipitisのＸＲ変異体は、ＮＡＤＨよりはるかに低いＮＡＤＰＨに対する選択性を示し、野生型のｐｓＸＲがＮＡＤＰＨに対して２倍の選択性を示したと報告されている（Watanabe et al., 2007）。
【０３５８】
本研究において、類似の試験がN. crassaに由来するＬ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ（ＬＡＤ）およびＸＤＨに対してなされて、補助因子の特異性を変更させ、したがって、改変されたS. cerevisiaeにおけるキシロース発酵を向上させた。
【０３５９】
（推定のＬＡＤをコードしている遺伝子の同定）
ＬＡＤをコードしている推定遺伝子の同定方法、ならびにＬＡＤコードしている遺伝子およびＬＡＤコードしている推定遺伝子のクローニング方法が説明されている。
【０３６０】
推定のＬＡＤをコードしている遺伝子の同定
ｎｃＬＡＤ（ＥＡＡ３６５４７．１）をプローブとして用いたタンパク質ＢＬＡＳＴ検索から、２つの推定遺伝子を、それぞれP. chrysogenum（ＸＰ＿００２５６９２８６．１）およびP. guilliermondii（ＥＤＫ３７１２０．２）において同定した。ｎｃＬＡＤを有しているこれらの２つのタンパク質のアミノ酸配列の同一性は、それぞれ７１％および４６％であった。
【０３６１】
ＬＡＤをコードしている遺伝子および推定のＬＡＤをコードしている遺伝子のクローニング
A. niger（ＮＲＲＬ  ３２６）、P. guilliermondii（ＮＲＲＬ  Ｙ２０７５）およびP. chrysogenum（ＮＲＲＬ  ８０７）を米国農務省の農業安定保全局（Peoria, IL）から入手した。T. longibrachiatum（T. reesei、ＹＳＭ  ７６８）を独国のResource Centre for Biological Material（ＤＳＭＺ）から入手した。
【０３６２】
１％の酵母抽出物、２％のペプトンおよび２％のＬ−アラビノースを含んでいる液体培地または寒天プレートにおいて、A. niger、T. longibrachiatum、P. chrysogenumおよびP. guilliermondiiを成長させた。総ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを単離するために、液体窒素において細胞を凍結させた。A. niger、T. longibrachiatum、P. chrysogenumおよびP. guilliermondiiから単離されたｍＲＮＡに対して、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施して、ｃＤＮＡを入手し、ＰＣＲを用いてＬＡＤ（推定）をコードしている遺伝子を得た。A. nigerについて、推定のＬＡＤ遺伝子は、未知の理由のためにｃＤＮＡから増幅され得なかった。したがって、重複伸長ＰＣＲ（ＯＥ−ＰＣＲ）を用いて、単離したゲノムＤＮＡからこのイントロンを含んでいる遺伝子をクローン化した。これらの遺伝子をクローン化するために使用されたすべてのプライマー配列は表１９に挙げられている。
【０３６３】
【表３５】
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【０３６４】
ＰＣＲ産物をｐＥＴ−２８ａベクターにサブクローニングし、それぞれクローニングおよび発現のために電気穿孔法によって、そのコンストラクトを用いて２つのE. coli株のＤＨ５αおよびＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。A. niger、T. longibrachiatumおよびP. guilliermondiiから得られた予想される遺伝子のサブクローニングのためにＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩの制限酵素部位を使用し、P. chrysogenumから得られた予想される遺伝子のサブクローニングのためにＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩの制限酵素部位を使用した。コンストラクトは、Ｎ末端のＨｉｓ６−タグつきの融合体としてＬＡＤ（推定）をコードしていた。プラスミドを、BIGDYE（商標） Terminator配列決定法を用いて配列決定し、Urbana-ChampaignにあるUniversity of Illinois内のBiotechnology Center（Urbana, IL）において、3730xL Genetic Analyzer（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて分析した。
【０３６５】
タンパク質の発現および精製
ｐｃＬＡＤ（ＸＰ＿００２５６９２８６．１）、ｐｇＬＡＤ（ＥＤＫ３７１２０．２）、ａｎＬＡＤ（ＣＡＨ６９３８３．１）およびｔｌＬＡＤ（ＡＡＬ０８９４４．１）をコードしている遺伝子をｐＥＴ２８ａにクローン化し、E. coliのＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させた。２５０ｒｐｍ、回転式の振とう培養機、３０℃において一晩にわたって、ＬＡＤ遺伝子を含んでいるE. coliのＢＬ２１（ＤＥ３）を成長させた。一晩を経過した培養物（５０μＬ）を用いて新たな培養物（５ｍＬ）に播種し、６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）が０．６〜１．０に達するまで、２５０ｒｐｍにおいて振とうさせながら３０℃において成長させた。それから、０．３ｍＭのＩＰＴＧを用いて、３〜５時間にわたって３０℃においてか、または２０時間にわたって１８℃において、培養物を誘導した。
【０３６６】
誘導させた細胞（１ｍＬ）を、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームを有している１ｍＬのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にそれらを再懸濁させること、ならびに３０℃および２５０ｒｐｍにおいて３０分にわたって振とうさせることよって溶解させた。一晩にわたって８０℃に細胞を維持し、室温において融解させた。生じた細胞溶解物を１３２００ｒｐｍにおいて１５分にわたって遠心分離し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、タンパク質発現について上清および沈殿物を分析した。
【０３６７】
タンパク質精製のために、誘導させた細胞（４００ｍＬ）を、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームを有している１５ｍＬの緩衝液Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、０．５ＭのＮａＣｌ、２０％のグリセロール、ｐＨ７．６）を用いて処理し、３０℃および２５０ｒｐｍにおいて３０分にわたって振とうさせた。１回の凍結融解の後に、生じた生成物を超音波処理によってさらに溶解させ、続いて１２０００ｒｐｍにおいて２０分にわたって遠心分離して細胞片を除去した。上清をＣｏ２＋を固定化させた金属親和性クロマトグラフィー樹脂を用いて充填されているカラムにかけて、製造者の取扱説明書にしたがってＨｉｓ６タグつきのタンパク質を精製した。精製したタンパク質を、限外ろ過（Amicon Ultra, Millipore, Billerica, MA）によって脱塩し、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１５％のグリセロールを含んでいるＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて洗浄し、−２０℃に維持した。タンパク質濃度を、製造者のプロトコルにしたがってBradford法（Bradford 1976）によって決定した。
【０３６８】
（ＬＡＤタンパク質の性質決定）
ＬＡＤ酵素の、定常状態の動態、分子量、四次構造、温度依存性、ｐＨ依存性、Ｌ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ活性、および金属含有量を分析した。
【０３６９】
Ｌ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ活性
P. chrysogenum、P. guilliermondii、A. nigerおよびT. longibrachiatumに由来するＬＡＤを発現している宿主細胞から溶解物を調製した。５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）における基質として２００ｍＭのＬ−アラビニトールおよび２ｍＭのＮＡＤ＋を用いた活性アッセイのために、１０マイクロリットルの細胞溶解物を使用した。Cary 300 Bio UV-vis分光光度計（Varian, Cary, NC）を用いて３４０ｎｍにおける吸光度（ε＝６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１）を測定することによって、ＮＡＤＨ産生を観察した。
【０３７０】
定常状態の動態
異なるＬＡＤ酵素の動態パラメータを決定した。５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）および室温においてUV-vis分光光度計を用いて３４０ｎｍにおける吸収の変化を測定することによって、初期の割合を決定した。種々の濃度の基質（Ｌ−アラビニトール）および補助因子（ＮＡＤ＋／ＮＡＤＰ＋）（Ｌ−アラビニトールについて５〜３２０ｍＭ、補助因子について０．５ｍＭ〜３．２ｍＭ）における初期の割合を測定した。ミカエリス−メンテンの反応速度論を用いて基質および補助因子についての酵素動態を分析し、ラインウィーバー−バークのプロットにデータを適合させることによって動態パラメータを決定した。飽和した補助因子の濃度（３．２ｍＭ）における初期の割合を測定することによって基質についてのパラメータを決定し、飽和した基質の濃度（３２０ｍＭ）において補助因子についてのパラメータを決定した。アッセイを３組において実施した。
【０３７１】
クローン化したＬＡＤは、Ｌ−アラビニトールに対する異なる結合親和性および触媒活性を示した（ＬＡＤのなかでもＫｍは２倍ほど異なっており、ｋｃａｔは３倍ほど異なっていた）。Ｌ−アラビニトールについて、ａｎＬＡＤ、ｔｌＬＡＤおよびｐｃＬＡＤのＫｍ値は、それぞれ２５±１、１８±１および３７±２ｍＭであり、ｋｃａｔ値は、５０７±２２、３４６±４１および１０８５±７１分−１であった（表２０）。ｔｌＬＡＤ酵素は最も低いを有しており、ｐｃＬＡＤは、最も高いＫｍを有しているにもかかわらず、最も高い触媒活性（ｋｃａｔ）および効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を示した（表２０）。補助因子のＮＡＤ＋の動態について、クローン化したＬＡＤは０．２〜０．３ｍＭの範囲におけるＫｍ値を示し、２５２６〜３４６０ｍＭ−１分−１の範囲における触媒効率を示した（表２１）。クローン化したすべてのＬＡＤは、ＮＡＤＰ＋に対して最小の活性を示した（表２０、２１）。初期の割合は、高いＫｍのために、最も高い基質濃度および補助因子濃度（３２０ｍＭのＬ−アラビニトールおよび３．２ｍＭのＮＡＤＰ＋）において飽和しなかった。したがって、０．１もしくは０．２ｍＭのＮＡＤＰ＋および１０もしくは２０ｍＭのＬ−アラビニトールを用いて（Ｋｍ＞＞［Ｓ］）、酵素について触媒効率のみを決定した（表２０、２１）。
【０３７２】
【表３６】
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【０３７３】
【表３７】
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【０３７４】
分子量および四次構造
４つのタンパク質のサブユニットの算出された分子量は、４３ｋＤａ（ａｎＬＡＤ）、４１ｋＤａ（ｔｌＬＡＤ）、４２ｋＤａ（ｐｃＬＡＤ）および４２ｋＤａ（ｐｇＬＡＤ）であった。Shimadzu HPLCシステム（Shimadzu, Kyoto, Japan）におけるBio-Sil SEC-250 column（３００×７．８ｍｍ、Bio-Rad, Hercules, CA）を用いて、タンパク質の分子量を決定した。移動相は、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＮａＮ３（ｐＨ６．８）からなり、流速は１．０ｍＬ／分であった。タンパク質の分子量基準と滞留時間とを比較することによって、分子量を算出した。
【０３７５】
ＨＰＬＣによって観察された分子量およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定された単量体サブユニットの分子量に基づいて、四次構造を決定した。ａｎ−、ｔｌ−およびｐｃＬＡＤの分子量をそれぞれ１７８、１９４および１７３ｋＤａと決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定したサブユニットの分子量との比較によって、結果は、ＬＡＤが未変性の形態において非共有結合的に連結された四量体であることを示した。
【０３７６】
温度依存性およびｐＨ依存性
１０〜７０℃の範囲の温度において酵素活性をアッセイすることによって、タンパク質の至適温度を決定した。５０℃のリン酸緩衝液における種々のインキュベーション時間の後における酵素活性を測定することによって、熱不活性化を決定した。２ｍＭのＮＡＤ＋および２００ｍＭのＬ−アラビニトールを用いて酵素活性を測定した。一次の指数関数的な減衰関数を用いて酵素活性の半減期を決定した。UV-vis分光光度計に接続されたCary温度制御器（Varian, Cary, NC）によって温度を制御した。一般的な緩衝液（５０ｍＭのモルホリンエタンスルホン酸／５０ｍＭのＴｒｉｓ／５０ｍＭのグリシン）（Ellis and Morrison 1982）、飽和濃度のＮＡＤ＋（２ｍＭ）およびＬ−アラビニトール（２００ｍＭ）、５．０〜１１．０の間のｐＨにおいて活性を測定することによって、温度依存性の酵素活性を決定した。
【０３７７】
ａｎＬＡＤおよびｐｃＬＡＤの至適温度は４０〜５０℃の間にあり、ｔｌＬＡＤは５５〜６５℃の範囲のより高い至適温度を示した（図５５ａ）。ＬＡＤの触媒活性は、５０℃におけるインキュベーション時間の長さにしたがって指数的に低下し、１００分後にほぼ完全に不活性化された（図５５ｂ）。ｔｌＬＡＤは、５０℃において２０分間の半減期を有して最も熱的に安定であり、ａｎＬＡＤは、５０℃において２０分未満の半減期を有して最も不安定であった。性質決定されたすべてのＬＡＤは、約ｐＨ９．４において最大の活性を有して、７〜１１のｐＨ範囲において活性を示した（図５５ｃ）。９〜１０を外れるｐＨ範囲において活性は有意に低下し、２０％の活性がｐＨ７．０において残っていた（図５５ｃ）。ｐＨ５．０未満において活性は検出されなかった。
【０３７８】
金属分析
緩衝液交換および凍結乾燥によって、金属分析のための２組のサンプルを、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）において調製した。各サンプルは１ｍＬの緩衝溶液に１〜２ｍｇのタンパク質を含んでいた。Urbana-Champaignにあるイリノイ大学のMicroanalytical Laboratory（Urbana, IL）における誘導結合高周波プラズマ原子発光分析（OES Optima 2000 DV, Perkin Elmer, Boston, MA）によって、金属の同一性および含有量を分析した。
【０３７９】
測定されたＺｎ２＋の重量％は、１：１のモル比に基づいて算出された重量％と近かった（表２２）。
【０３８０】
【表３８】
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【０３８１】
（変更された補助因子特異性を有しているＬＡＤ酵素の改変）
ＬＡＤの補助因子特異性を変更させる方法が決定され、変異生成されたＬＡＤは、変更された補助因子特異性および他の特性について分析された。
【０３８２】
変更された補助因子特異性を有しているＬＡＤ酵素の生成
ａｎＬＡＤ、ｔｌＬＡＤおよびｐｃＬＡＤの補助因子特異性をＮＡＤ＋からＮＡＤＰ＋に変更させるために、部位特異的な変異生成を実施した。天然に存在するｔｌＬＡＤのアミノ酸番号の２２４、２２５および３６２のそれぞれを、セリン、アルギニンおよびスレオニンに置換して、変更された補助因子特異性を有しているｔｌＬＡＤを生成させた。クローン化されたａｎＬＡＤおよびｐｃＬＡＤのアミノ酸配列を、T. longibrachiatumのＬＡＤ（ｔｌＬＡＤ）配列と整列化させ、ｔｌＬＡＤのアミノ酸番号の２２４、２２５および３６２に対応するアミノ酸を変異させた。変更された補助因子特異性を有しているＬＡＤのすべてについて、補酵素結合ドメインのβ−α−βモチーフ内の２つのアミノ酸残基（ａｍＬＡＤのＤ２１３およびＩ２１４、ｔｌＬＡＤのＤ２２４およびＩ２２５、ならびにｐｃＬＡＤのＤ２１２およびＩ２１３）をそれぞれセリンおよびアルギニンに置き換え（Korkhin et al., 1998; Pauly et al., 2003; Watanabe et al., 2005）、３番目の変異を、ａｎＬＡＤのＡ３５９、ｔｌＬＡＤのＡ３６２、ｐｃＬＡＤのＳ３５８に導入して、スレオニンに置換した（プライマー配列については表２３を参照）。メガプライマーＰＣＲ法を使用して、鋳型として野生型のＬＡＤコンストラクトを用いて部位特異的な変異を導入した（Sarkar and Sommer 1990）。ＤＮＡ配列分析によって正しい変異生成を確認した。
【０３８３】
【表３９】
2013500019.tif 000041
【０３８４】
本実施例において“ｔｌＬＡＤ変異体”は、変異Ｄ２２４Ｓ／Ｉ２２５Ｒ／Ａ３６２Ｔを有しているｔｌＬＡＤと定義づけられ、“ａｎＬＡＤ変異体”は、変異Ｄ２１３Ｓ／Ｉ２１４Ｒ／Ａ３６２Ｔを有しているａｎＬＡＤと定義づけられ、“ｐｃＬＡＤ変異体”は、変異Ｄ２１２Ｓ／Ｉ２１３Ｒ／Ｓ３５８Ｔを有しているｐｃＬＡＤと定義づけられる。ｔｌＬＡＤ変異体は、ＮＡＤ＋からＮＡＤＰ＋へ有意に変更された補助因子特異性を示した。また、それは最も高い触媒活性について証明された。ＮＡＤＰ＋を有しているＬ−アラビニトールに対するｔｌＬＡＤ変異性のＫｍおよびｋｃａｔはそれぞれ４６±４ｍＭおよび１７０±９分−１であった（表２４）。飽和したＮＡＤ＋とともにｔｌＬＡＤ変異体を含んでいるすべてのアッセイにおいて、反応速度のプラトーは、試験された濃度範囲において観察されず、したがって、触媒効率は、ＮＡＤ＋に対して０．８ｍＭおよびＬ−アラビニトールに対して８０ｍＭと決定された（表２４、２５）。補助因子について、ａｎＬＡＤ変異体およびｐｃＬＡＤ変異体は、ＮＡＤ＋を超えてＮＡＤＰ＋に対する有意に高い選択性を示した（表２５）。ａｎＬＡＤ変異体およびｐｃＬＡＤ変異体のＫｍ値は０．４６±０．０９および０．１０±０．０１ｍＭであり、ａｎＬＡＤ変異体およびｐｃＬＡＤ変異体のｋｃａｔ値は５５．７±６．４および９０．５±９．２分−１であった。ａｎＬＡＤ変異体およびｐｃＬＡＤ変異体の触媒効率は１３０±３２および９３４±７２ｍＭ−１分−１であり、ＮＡＤ＋に対するＮＡＤＰ＋の触媒効率の割合は１００および１６１であった。ｔｌＬＡＤ変異体について、ＮＡＤ＋に対するＮＡＤＰ＋の触媒効率の割合は２．５×１０４倍まで上昇した（表２１、２５）。ｐｃＬＡＤ変異体はＮＡＤ＋に対する活性を示さなかった。
【０３８５】
【表４０】
2013500019.tif 000042
【０３８６】
【表４１】
2013500019.tif 000043
【０３８７】
（変更された補助因子特異性を有しているN. crassaのＸＤＨ（ｎｃＸＤＨ）の改変）
推定のｎｃＸＤＨのクローニングおよび性質決定
P. stipitisのキシリトールデヒドロゲナーゼ（ｐｓＸＤＨ）酵素をクエリ配列として用いたNational Center for Biotechnology Informationのウェブサイト（ウェブページncbi.nlm.nih.gov）におけるタンパク質ＢＬＡＳＴ検索を用いて、N. crassaの推定のキシリトールデヒドロゲナーゼ（ｎｃＸＤＨ）の配列を見出した。ClustalWの演算手順を用いて２つの酵素を完全に整列化させ、４４％の同一性および６０％の類似性を共有していることを見出した（図５６）。Neurospora crassaの全体のゲノム配列が公開されており（Galagan et al., 2003）、当該ゲノム配列を推定のキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子のクローニング用のプライマーの設計に利用した。
【０３８８】
Ｄ−キシロースによって誘導されたN. crassaの１０３３３から単離された総ＲＮＡに対して実施されたＲＴ−ＰＣＲは、予想されたサイズの遺伝子の生成物（〜１．１ｋｂ）を示した。ＮｄｅＩおよびＳａｃＩの制限酵素部位を用いて、ＲＴ−ＰＣＲの産物をｐＥＴ−２８ａベクターにクローン化し、E. coliのＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。このコンストラクト（ｐＥＴ−２８ａ  ｎｃＸＤＨ）は、トロンビン切断部位とともにＮ末端のＨｉｓ６−タグつきの融合物としてｎｃＸＤＨを発現した。これらの細胞のＩＰＴＧ誘導した培養物の溶解物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ＸＤＨ活性についてアッセイした。それから、製造者のプロトコルにしたがってTalon（登録商標） Co2+ Superflow樹脂（Clontech, Mountain View, CA）を用いた固定化された金属イオンの親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によってＸＤＨを精製した。１５％のグリセロールを加えた５０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液の数回にわたる洗浄をともなう限外ろ過によって精製されたタンパク質を、脱塩し、−８０℃において凍結させて保存した。タンパク質濃度をBradford法（Bradford 1976）によって決定した。
【０３８９】
ｎｃＸＤＨは忠実にＮＡＤ＋を選択する酵素である。また、ｎｃＸＤＨは高い安定性（５０℃における〜２００分間の半減期）および発現を示した。Watanabe et al. (2005b)によるこれまでの研究はｐｓＸＤＨの補助因子特異性を逆転させることを目的としていた。
【０３９０】
変更された補助因子特異性を有しているｎｃＸＤＨの生成
配列の整列化を介して、ｎｃＸＤＨのＤ２０４、Ｉ２０５およびＶ２０６のそれぞれをアラニン、アルギニンおよびセリンへの部位特異的な変異生成のために標的化して、ｎｃＸＤＨ−ＡＲＳを生成した。表２６は、ｎｃＸＤＨ−ＡＲＳが、完全に逆転された補助因子特異性を有しており、ＮＡＤＰ＋を選択することを示している。
【０３９１】
【表４２】
2013500019.tif 000044
【０３９２】
ｎｃＸＤＨ変異体の動態
変異体ｎｃＸＤＨは、補助因子特異性の顕著な反転を有している。ＮＡＤＰ＋に対する変異体ｎｃＸＤＨのＫｍは、ＮＡＤ＋に対する野生型のｎｃＸＤＨのＫｍより約２．５倍だけ高く、ｋｃａｔ値も同様であった（表２７）。
【０３９３】
【表４３】
2013500019.tif 000045
【０３９４】
図５７に示されているように、ＸＤＨ活性は、ｐＨ４．０に至るまで活性を有しており、より酸性の条件に対するより高い耐性を示し、ＬＡＤ活性はインビトロ活性アッセイにおいてｐＨ５．０において破壊される。
【０３９５】
〔実施例１４：Bacteroides stercoris由来のキシロースイソメラーゼの、S. cerevisiaeにおける発現〕
細菌のキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）はキシロースのキシルロースへの変換に関与する。近年、嫌気性真菌（Piromyces sp.およびOrpinomyces sp.）の２つの種、および嫌気性細菌（Clostridium phytofermentans）から活性なＸＩを発現させることに成功した３つの事例が報告されている。Piromyces sp.のＥ２に由来する真菌のＸＹＬＡ遺伝子はS. cerevisiaeにおいて機能的に発現されており、最大で１．１Ｕ／１ｍｇのタンパク質のＸＩ活性が３０℃において得られた（Kuyper et al., 2003）。また、Piromyces sp.に由来する遺伝子と９４％の同一性を有している、Orpinomycesに由来する他の真菌のＸＹＬＡ遺伝子は、S. cerevisiaeにおいて機能的に発現されていた（Madhavan et al., 2009）。近年において、Clostridium phytofermentansに由来する第１の原核生物のｘｙｌＡ遺伝子はS. cerevisiaeにおいて機能的に発現された（Brat et al., 2009）。
【０３９６】
嫌気性細菌Bacteroides stercorisに由来するイソメラーゼ遺伝子ｘｙｌＡ（ＢｔＸＩ）は、Piromyces sp.に由来するイソメラーゼ遺伝子と高い同一性を共有している（８２％）。ＢｔＸＩをｐＲＳ４２４ＴＥＦベクターにクローン化し、S. cerevisiaeＬ２６１２株を形質転換させた。また、ｐＲＳ４０３ＴＥＦベクターを用いることによって、S. cerevisiaeＤ４５２−２株に上記遺伝子を組み込んだ。ＢｔＸＩを発現している両方の株におけるエタノール産生（Ｌ２６１２において５ｇ／ＬおよびＤ４５２−２において７．８ｇ／Ｌ）を観察した（図５８〜５９）。しかし、産生の速度は、ＸＹＬ遺伝子を発現している改変された株の速度と比べて、相対的に低かった。
【０３９７】
低いエタノール産生は、蓄積した任意のキシリトール（内因性の酵母のアルドースリダクターゼによってキシロースから形成された）の抑制性の作用のためであり得る。キシリトール蓄積を減少させるために、ＢＴＸＩを発現している酵母株においてＸＤＨおよびＸＫを発現させた（ＤＢｔＸＩ）。生じた株はわずかに向上したエタノール産生および低下したキシリトール産生を示した（図６０）。ＤＢｔＸＩにおけるこれらの２つのＸＹＬ遺伝子の共発現は好気性条件下においてさえエタノール産生を起こした。
【０３９８】
〔実施例１５：ペントースリン酸化経路（ＰＰＰ）における酵素の過剰発現〕
P. stipitisに由来するＰＰＰ酵素グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＺＷＦ１）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＮ１）、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ１）、およびトランスケトラーゼ（ＴＫＴ１）を、強力なプロモータ（ＰＧＰＤ）の制御下において組込みベクター（ｐＲＳ４０６）にクローン化した。そのプラスミドを酵素ＳｔｕＩによって直鎖化し、S. cerevisiaeの染色体に組み込んだ。
【０３９９】
しかし、ＰＰＰ酵素を過剰発現させる有益な作用を得るために、ＸＹＬ３（ＸＫ）を過剰発現させる必要があった（図６１）。また、ＸＹＬ３およびＰＰＰ酵素はＹＰキシルロース培地におけるエタノール産生を向上させた。
【０４００】
〔実施例１６：アルドース−１−エピメラーゼの発現〕
β−グルコシダーゼによるセロビオースの加水分解はβ−Ｄ−グルコースを放出する。しかし、酵母のヘキソキナーゼはα−Ｄ−グルコースを選択し（または排他的に利用し）、α−Ｄ−グルコースに対するβ−Ｄ−グルコースの変旋光の割合は、代謝速度を実質的に低下させる。変換を促進させる１つの方法は、推定のアルドース−１−エピメラーゼＮＣＵ０９７０５を過剰発現させることであった。この仮説は、ＮＣＵ０９７０５の相同物：E. coliにおけるｇａｌＭ；S. cerevisiaeにおけるＧＡＬ１０、ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃ；ならびにP. stipitisにおけるＧＡＬ１０を過剰発現させることによって試験された。それから、株は、セロビオース消費およびエタノール産生について試験された（図６２）。結果は、S. cerevisiaeにおける相同物の過剰発現がセロビオース消費およびエタノール産生のわずかな向上を起こさせることを示した。
【０４０１】
〔実施例１７：キシロースおよびセロビオースの共発酵〕
本実施例において、新たな方法を用いて、グルコースの二量体セロビオースがキシロースとともに共発酵されるときのグルコース抑制を解消させた。セロビオースは、セルロースの酵素的な加水分解からの中間生成物であり、セルラーゼ（エキソセルラーゼ、エンドセルラーゼおよびβ−グルコシダーゼが挙げられる）のカクテルにおけるβ−グルコシダーゼによってグルコースにさらに変換される。ペントース糖は、ヘミセルロースの希酸加水分解の生成物である。野生型のS. cerevisiaeは、セロビオーストランスポータおよびセロビオースをグルコースに加水分解可能なβ−グルコシダーゼの両方を欠いているため、セロビオースを消化できない。実施例９に記載の新たに見出されたセロデキストリントランスポータ遺伝子、およびN. crassa由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子がS. cerevisiaeにおいて共発現されると、キシロースおよびセロビオースの混合物は、炭素源として利用された（図６３）。類似の手法は、S. cerevisiaeによるセロビオース発酵を可能にさせるために、β−グルコシダーゼの分泌または細胞表面における提示のいずれかを採用している（van Rooyen et al., 2005；Skory et al., 1996；Kotaka et al., 2008；Katahira et al., 2006）。これらの場合、セロビオースは、S. cerevisiaeの内因性のヘキソース輸送系よって輸送される前に、細胞外においてグルコースに加水分解された。対照的に、この方法において、セロビオースは輸送に続いて細胞内において加水分解された。
【０４０２】
S. cerevisiaeにおける混合糖の発酵のための従来の方法において、リグノセルロースに由来するグルコースおよびペントース糖の混合物が使用されている。しかし、この新しい方法においてセロビオースおよびペントース糖が使用された。セロビオースは、異種のセロデキストリントランスポータによって酵母細胞の内部に輸送され、ペントースは、内因性のヘキソーストランスポータによって酵母細胞の内部に輸送され、したがって、グルコース抑制を部分的に担っている現象である同じトランスポータにとってのグルコースおよびペントースの間における直接の競合を排除している。いったん酵母細胞の内部に入ると、セロビオースは、β−グルコシダーゼによってグルコースに変換され、酵母細胞によって直ちに消費され、細胞内の低いグルコース濃度を生じることによって、グルコース抑制をさらに軽減する。
【０４０３】
キシロースを利用する改変された酵母株Ｌ２６１２を、セロデキストリントランスポータおよびβ−グルコシダーゼ遺伝子を共発現する宿主として使用した。この株において、Pichia stipitisに由来するキシロースリダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼからなるＤ−キシロース利用経路が染色体に組み込まれている。Neurospora crassaに由来するセロデキストリントランスポータ（ＮＣＵ００８２１、ＮＣＵ０８１１４およびＮＣＵ００８０９が挙げられる）、ならびに２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子、Neurospora crassaに由来するβ−グルコシダーゼ遺伝子およびAspergillus aculeatusに由来するβ−グルコシダーゼ遺伝子を評価した。
【０４０４】
S. cerevisiaeのＬ２６１２（ＭＡＴα、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｕｒａ３−５２、ｔｒｐ１−２９８、ｃａｎ１、ｃｙｎ１、ｇａｌ＋）を、合成のドロップアウト培地（アミノ酸および硫酸アンモニウムなしの０．１７％のDifco酵母窒素原礎培地、０．５％の硫酸アンモニウム、０．０５％のアミノ酸のドロップアウト混合物）において培養して、プラスミドを維持させた。２％の糖を有しているＹＰＡ培地（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、０．０１％のヘミ硫酸アデニン）を用いて酵母株を成長させた。
【０４０５】
Pichia stipitisに由来するＤ−キシロースリダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼからなるＤ−キシロース利用経路を組み込むために、対応する遺伝子を、ＰＣＲによって増幅させ、ＤＮＡアセンブラ法（Shao et al., 2009）を用いてｐＲＳ４１６プラスミドにクローン化した。ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、Ｄ−キシロース利用経路をコードしているＤＮＡ断片を取り出し、それから２つの同じ制限酵素によって消化したｐＲＳ４０６プラスミドに連結した。それから、生じたプラスミドをＡｐａＩによって直鎖化し、Ｌ２６１２の染色体上のＵＲＡ３遺伝子座に組み込んだ。
【０４０６】
ｐＲＳ４２５プラスミド（New England Biolabs, Ipswich, MA）を使用して、セロデキストリントランスポータ遺伝子およびβ−グルコシダーゼ遺伝子を共発現させた。図６４に示されているように、ｐＲＳ４２５プラスミドをＢａｍＨＩおよびＡｐａＩによって消化した。セロデキストリントランスポータのＮ末端およびＣ末端にそれぞれＰＹＫ１プロモータおよびＡＤＨターミネータを加え、β−グルコシダーゼのＮ末端およびＣ末端にそれぞれＴＥＦ１プロモータおよびＰＧＬ１ターミネータを加えた。ＤＮＡアセンブラ法（Shao et al., 2009）を用いてこれらの遺伝子断片を、直鎖化したｐＲＳ４２５シャトルベクターに組み合わせた。３つのセロデキストリントランスポータ遺伝子、Neurospora crassaに由来するＮＣＵ００８０１（ＸＭ＿９５８７０８）、ＮＣＵ０８１１４（ＸＭ＿９５８７８０）およびＮＣＵ００８０９（ＸＭ＿９５９２５９）、ならびに２つのβ−グルコシダーゼ遺伝子、Neurospora crassaに由来するＮＣＵ００１３０（ｙｙ）およびAspergillus aculeatusに由来するＢＧＬ１（Ｄ６４０８８）を使用した。
【０４０７】
それから、酵母のプラスミドをE. coliＤＨ５αに移し、組換えＤＮＡ操作のために使用した。００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含んでいるLuriaブロスプレートに形質転換体を播いた。それから、E. coli形質転換体の単一のコロニーをLuriaブロス培地（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）に播種し、３７℃および２５０ｒｐｍにおいて成長させた。QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いてプラスミドをE. coliから単離した。これらのプラスミドを用いてＬ２６１２株を形質転換して、以下の株：ＳＬ０１（Neurospora crassaに由来するセロデキストリントランスポータ遺伝子ＮＣＵ００８０１およびβ−グルコシダーゼ遺伝子ＮＣＵ００１３０を有しているプラスミドを含んでいる）、ＳＬ０２（Neurospora crassaに由来するセロデキストリントランスポータ遺伝子ＮＣＵ００８０９およびβ−グルコシダーゼ遺伝子ＮＣＵ００１３０を有しているプラスミドを含んでいる）、ＳＬ０３（Neurospora crassaに由来するセロデキストリントランスポータ遺伝子ＮＣＵ０８１１７およびβ−グルコシダーゼ遺伝子ＮＣＵ００１３０を有しているプラスミドを含んでいる）、ＳＬ０４（セロデキストリントランスポータ遺伝子ＮＣＵ００８０１およびAspergillus aculeatusに由来するＢＧＬ１遺伝子を有しているプラスミドを含んでいる）、ＳＬ０５（セロデキストリントランスポータ遺伝子ＮＣＵ００８０９およびAspergillus aculeatusに由来するＢＧＬ１遺伝子を有しているプラスミドを含んでいる）、およびＳＬ０６（セロデキストリントランスポータ遺伝子ＮＣＵ０８１１４およびAspergillus aculeatusに由来するＢＧＬ１遺伝子を有しているプラスミドを含んでいる）をそれぞれ生じさせた。空のｐＲＳ４２５プラスミドを用いてＬ２６１２株を形質転換させて、ＳＬ００株を生じさせ、ネガティブコントロールとして使用した。標準的な酢酸リチウム法（Gietz et al., 1995）を用いて酵母の形質転換を実施した。２％のＤ−グルコースを補ったＳＣ−Ｕｒａ−Ｌｅｕ培地に、生じた形質転換体の混合物を播いた。
【０４０８】
ＤＮＡアセンブラ法を用いてプラスミドの適切な構成を確認するために、Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep IIキット（Zymo Research, Orange, CA）を用いて、酵母細胞からプラスミドを単離し、それから、E. coliのＤＨ５α細胞に移した。１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含んでいるＬＢプレートに生じた細胞を播いた。E. coliの単一のコロニーをＬＢ液体培地に播種した。QIAprep Spin Miniprepキット（QIAGEN, Valencia, CA）を用いて、E. coliからプラスミドを単離し、確認用のＰＣＲ、またはＣｌａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限酵素消化によって確認した。すべての制限酵素をNew England Biolabs（Ipswich, MA）から購入した。すべての化学薬品をSigma AldrichまたはFisher Scientificから購入した。
【０４０９】
各酵母株について、２％のグルコースを含んでいる２ｍＬのＳＣ−Ｕｒａ−Ｌｅｕ培地において単一のコロニーをまず成長させ、それから、２５０ｍＬの振とうフラスコに入っている５０ｍＬの同じ培地に播種して、混合糖の発酵試験のために十分な細胞を得た。成長の１日後に、細胞を遠心沈殿させた。それから、４％のセロビオースおよび５％のＤ−キシロース；４％のセロビオース、５％のキシロースおよび０．５％のグルコース；または４％のセロビオース、５％のキシロース、および１％のグルコースを補った、２５０ｍＬのバッフルのない振とうフラスコに入っている５０ｍＬのＹＰ培地に細胞を播種した。１以下の初期のＯＤ６００から開始して、細胞培養物を、酸素制限条件下の発酵のために３０℃および１００ｒｐｍにおいて成長させた。ＯＤ６００の読み取りおよび細胞培養物のサンプルの取得を種々の時点において行った。ＨＰＬＣを用いて糖濃度を分析し、Ethanolキット（R-biopharm, Darmstadt, Germany）を用いてエタノール産生を分析した。各データポイントについて、３組のサンプルを利用した。ＳＬ００〜ＳＬ０６の株についての混合糖の発酵の結果を図６５に示す。最良の株ＳＬ０１をさらなる性質決定のために選択した。
【０４１０】
１つのセロデキストリントランスポータ遺伝子および１つのβ−グルコシダーゼ遺伝子を有しているｐＲＳ４２５プラスミドをＬ２６１２株に導入することによって、ＳＬ０１〜ＳＬ０６の６つの異なる株のすべてを構築した。各プラスミドにおいて、セロデキストリントランスポータ遺伝子およびβ−グルコシダーゼ遺伝子を、酵母のプロモータおよびターミネータをとともに加え、ＤＮＡ１０アセンブラ法（Shao et al., 2009）によって多コピーのプラスミドｐＲＳ４２５に組み込んだ（図６４）。空のｐＲＳ４２５プラスミドをＬ２６１２株に導入して、ネガティブコントロールとして使用したＳＬ００株を生成した。４０ｇ／Ｌのセロビオースおよび５０ｇ／ＬのＤ−キシロースの混合物とともに振とうフラスコにおいて、すべての株を培養し、それらの糖の消費速度、細胞増殖速度、エタノール力価を決定した（図６５）。すべての株のうち、Neurospora crassaに由来するβ−グルコシダーゼおよびセロデキストリントランスポータＮＣＵ００８０１を含んでいるＳＬ０１株は、最も高い糖の消費速度、およびエタノール生産性を示した。したがってこの株をさらなる性質決定のために選択した。
【０４１１】
振とうフラスコおよびバイオリアクターの両方に入っている４０ｇ／Ｌのセロビオースおよび５０ｇ／ＬのＤ−キシロースの混合物を用いて、ＳＬ０１およびＳＬ００の両方を培養した（図６６）。振とうフラスコの培養において（図６６ａ〜ｂ）、ＳＬ０１は、９６時間において８３％セロビオースを消費し、ＳＬ１００（０．３３ｇ／Ｌ／時間〜０．４６ｇ／Ｌ／時間）と比べて４１．２％高い平均のＤ−キシロース消費速度を示した。上昇した糖の消費速度と一致して、１．３２倍に増した平均の生物量の増加速度が観察された（０．０３１ｇの乾燥細胞重量／Ｌ／時間〜０．０７２ｇの乾燥細胞重量／Ｌ／時間）。エタノール生産性は、０．０７ｇ／Ｌ／時間〜０．２３ｇ／Ｌ／時間であり、２．１倍を超えて増加した。４８時間後に、糖１ｇにつき０．３１ｇの最も高いエタノールの収率に達し、平均のエタノールの収率は糖１ｇにつき０．２８ｇであり、ＳＬ００株と比べて２３％の増加を示した。ＳＬ０１の培養において、グルコースおよびＤ−キシロースの共発酵におけるグルコース抑制の特徴である遅延期を示すことなく、より速やかなＤ−キシロース消費速度が観察された。さらにまた、促進された生物量の増加およびエタノール産生が認められた。
【０４１２】
バイオリアクターにおける混合糖の発酵のためにMultiforsシステム（Infors-HT, Bottmingen, Switzerland）を用いた。各容器は７５０ｍＬの総容積を有していた。各容器に対して、ｐＯ２センサ、エアスパージャー、排気ガス冷却器、温度センサ、播種ポート、予備ポート、消泡センサ、ｐＨセンサ、駆動軸、加熱器の区画、流量計測器、および蠕動ポンプシステムのセットを個々に備えつけた。全体のバイオリアクターシステムは、冷却システム、ThermoFlex900（Thermo Scientific, Waltham, MA）を備えている。
【０４１３】
２％のグルコースを含んでいる２ｍＬのＳＣ−Ｕｒａ−Ｌｅｕ培地において、酵母株の単一のコロニーをまず成長させ、それから２５０ｍＬの振とうフラスコに入っている５０ｍＬの同じ培地に播種されて、混合糖の発酵試験にとって十分な細胞を得た。成長の１日後に、４％のセロビオースおよび５％のＤ−キシロース；４％のセロビオース、５％のキシロースおよび０．５％のグルコース；または４％のセロビオース、５％のキシロースおよび１％のグルコースを補ったＹＰＡ培地に、１０ｍＬの飽和した培養物を播種した。温度を３０℃に維持させ、ｐＨを、２規定のＨ２ＳＯ４または４規定のＮａＯＨのいずれかの添加によって調節された５．５に維持させた。最初の４８時間において、２５０ｒｐｍのインペラの速度を用いて空気の流量を０．５Ｌ／分に維持させた。その後に、空気の流量を０．２Ｌ／分に調節して、酸素制限条件下における高いエタノール産生を実現させた。３組のサンプルを種々の時点において採取し、ＯＤ６００、糖濃度、およびエタノール濃度を上述のように決定した。
【０４１４】
バイオリアクターの培養において（図６６ｃ〜ｄ）、ほとんどすべてのセロビオースおよび６６％のＤ−キシロースを４８時間に消費し、４４％の増加したＤ−キシロースの消費速度（０．４７ｇ／Ｌ／時間〜０．６８ｇ／Ｌ／時間）、および１．１倍に増加した生物量の増加速度（０．０８ｇの乾燥細胞重量／Ｌ／時間〜０．１７ｇの乾燥細胞重量／Ｌ／時間）を示した。エタノール生産性は、４．３倍（０．０９ｇ／Ｌ／時間〜０．５０ｇ／Ｌ／時間）を超えて増加し、エタノールの収率は糖１ｇにつき０．３９ｇであった。振とうフラスコの培養と比べて、バッチ培養の開始時における低い細胞密度に起因して、最初の２４時間における糖の消費速度が低くかった。
【０４１５】
予想外にも、発酵にグルコースが加えられていなくとも、少量のグルコースが検出された（図６６ａ〜ｂ）。グルコース濃度は、約２４時間後に振とうフラスコ（１２．１ｇ／Ｌ）およびバイオリアクター（１７．５ｇ／Ｌ）の両方において最大に達し、それから非常に低レベルまで低下した。ＳＬ００株においてグルコースが検出されなかったので、細胞外のグルコースは、解糖に使用されるグルコースの主な形態であるエピマーのα−グルコースへのβ−グルコースの緩やかな変換を生じ得る。典型的に、グルコースにおける相対的に低い濃度のために、β−グルコースは酵素的または化学的のいずれかにおいてα−グルコースに効率的に変換され得る（Bouffard et al., 1994）。しかし、改変されたＳＬ０１株において、β−グルコシダーゼによって触媒された過剰量のβ−グルコースは、細胞内においてセロビオースから生成され、わずかな部分が細胞外に分泌され得、これはβ−ガラクトースを用いた観察と同様である（Bouffard et al., 1994）。
【０４１６】
また、工業的な条件においてリグノセルロース性の加水分解物には少量のグルコース（糖の総量の１０％未満）が典型的に存在しているので、改変されたＳＬ０１株の発酵能力を、セロビオースＤ−キシロースおよびグルコースの混合物を用いて調べた。２つの濃度５ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌのグルコースを、バイオリアクターにおける混合糖の炭素源として、４０ｇ／Ｌのセロビオースおよび５０ｇ／ＬのＤ−キシロースと組み合わせた。５ｇ／Ｌのグルコースの場合（図６７ａ〜ｂ）、ＳＬ０１によって、バッチ培養における４８時間後に、８１．７％のセロビオースが消費され、６７．８％のＤ−キシロースが消費された。Ｄ−キシロースの消費速度は１．１９倍（０．３２ｇ／Ｌ／時間〜０．６９ｇ／Ｌ／時間）まで上昇した。エタノール生産性は３．３倍（０．１１ｇ／Ｌ／時間〜０．４６ｇ／Ｌ／時間）まで増加し、エタノールの収率は糖１ｇにつき０．２６ｇ〜糖１ｇにつき０．３３ｇであった。１０ｇ／Ｌのグルコースの場合（図６７ｃ〜ｄ）、ＳＬ０１によって、バッチ培養における４８時間後に、８３．８％のセロビオースが消費され、７４．７％のＤ−キシロースが消費された。Ｄ−キシロースの消費速度は６８％（０．４５ｇ／Ｌ／時間〜０．７６ｇ／Ｌ／時間）上昇した。エタノール生産性は２．１倍（０．１６ｇ／Ｌ／時間〜０．５０ｇ／Ｌ／時間）まで増加し、エタノールの収率は糖１ｇにつき０．３０ｇ〜糖１ｇにつき０．３３ｇであった。予想通り、改変されたＳＬ０１株は、野生型のＳＬ００株より、高効率の糖消費および高い割合のエタノール生産性の両方を示した。より重要なことに、糖の総量の１０％までグルコースを有していてさえ、３つの糖の共発酵において顕著なグルコース抑制を示さず、これは、この手法が工業的な用途に発展させ得ることを示唆している。
【０４１７】
３つのN. crassaのセロデキストリントランスポータＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ０８１１４およびＮＣＵ００８０９を、β−グルコシダーゼＮＣＵ００１３０とともに導入したS. cerevisiae株Ｄ４５２−２において、同様の研究を実施した。細胞内β−グルコシダーゼ（ＮＣＵ００１３０）を発現している形質転換体を、２０ｇ／リットルのセロビオースを含んでいるＹＳＣ培地おいて選択した。この作業に使用した株およびプラスミドは表１７に記載されている（実施例１２）。使用したプライマーを表２８に示す。
【０４１８】
【表４４】
2013500019.tif 000046
【０４１９】
２０ｇ／Ｌのグルコースまたは２０ｇ／Ｌのセロビオースを含んでいるＹＰ培地において酵母を成長させて、それぞれキシロースまたはセロビオースの発酵実験のための播種物を調製した。２０ｇ／Ｌのグルコースまたはセロビオースを含んでいるＹＰ培地から対数期にある細胞を回収し、滅菌水を用いて２回にわたって洗浄した後に播種した。２５０ｍＬのフラスコに入っている４０ｇ／Ｌまたは８０ｇ／Ｌのキシロースを含んでいる５０ｍＬのＹＰ培地を用いて、酸素制限条件下、１．０の初期のＯＤ６００、３０℃において、すべてのフラスコ発酵実験を実施した。Sixfors Bioreactors（Appropriate Technical Resources, Inc）を用いて、適量の糖を含んでいる４００ｍＬのＹＰ培地において、酸素の制限された２５０の条件下、２００ｒｐｍの攪拌速度、３０℃においてバイオリアクター発酵を実施した。初期の細胞密度をＯＤ６００＝１．０に調節した。
【０４２０】
UV-visible Spectrophotometer（Biomate 5, Thermo, NY）用いて、細胞の成長を６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）によって観察した。Rezex ROA-Organic Acid H+（８％）カラム（Phenomenex Inc., Torrance, CA）を用いた、屈折率の検出器を備えている高速液体クロマトグラフィー（HPLC, Agilent Technologies 1200 Series）によって、グルコース、キシロース、キシリトール、グリセロール、酢酸塩およびエタノールの濃度を決定した。０．００５規定のＨ２ＳＯ４を用いて、０．６ｍＬ／分の流速、５０℃においてカラムを溶出した。
【０４２１】
３つの形質転換体のすべては、セロビオースが単独の炭素源であるとき、成長可能であり、エタノールを産生可能であったが、３つの形質転換体は、セロビオースの異なる発酵速度（ＮＣＵ００８０１＞ＮＣＵ０８１１４＞ＮＣＵ００８０９）を示した。ＮＣＵ００８０１およびＮＣＵ００１３０を発現している、最も早くセロビオースを発酵させる形質転換体（Ｄ８０１−１３０）は、４時間以内に４０ｇ／Ｌのセロビオースを消費し、１６．８ｇ／Ｌのエタノールを産生した。同一の培養条件下において、セロビオース発酵の容積測定の生産性（ＰＥｔｈａｎｏｌ／Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ＝０．７ｇ／Ｌ／ｈ）は、グルコース発酵の容積測定の生産性（ＰＥｔｈａｎｏｌ／Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ＝１．２ｇ／Ｌ／ｈ）より低く、セロビオースからのエタノールの収率（ＹＥｔｈａｎｏｌ／Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ＝０．４２ｇ／ｇ）は、グルコースからのエタノールの収率（ＹＥｔｈａｎｏｌ／Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ＝０．４３ｇ／ｇ）とほぼ同じであった。しかし、Ｄ８０１−１３０によるセロビオースの消費速度およびエタノールの収率は、β−グルコシダーゼの表面提示を介したセロビオースを発酵させるために改変したS. cerevisiae株を超えて改善が認められた（Kotaka et al., 2008; Nakamura et al., 2008）。これらの結果は、S. cerevisiaeにおけるＮＣＵ００８０１およびＮＣＵ００１３０の同時発現が効率的なセロビオース発酵をもたらすことを示唆している。
【０４２２】
キシロースを効率的に発酵させるＤＡ２４−１９株の開発の後に、セロデキストリントランスポータをコードしている遺伝子、およびβ−グルコシダーゼ酵素をコードしている遺伝子（ＮＣＵ００８０１およびＮＣＵ００１３０）を、セロビオースおよびキシロースを同時に消費可能にさせる株に導入した。セロビオースの細胞内の加水分解のために、キシロース利用のグルコース抑制がこの株において緩和され得ると仮定された。ＮＣＵ００８０１遺伝子をＤＡ２４−１６のゲノムに組み込み、ＮＣＵ００１３０を多コピーのプラスミドから発現させた。単独の炭素源としてセロビオースを含んでいる寒天プレートにおいて、生じた形質転換体ＤＡ２４−１８−ＢＴ３を選択した。
【０４２３】
種々の量のセロビオースおよびキシロースを含んでいる培地において成長させたＤＡ２４−１６−ＢＴ３株は、試験されたすべての条件において、セロビオースおよびキシロースを共発酵させ、０．３８〜０．３９ｇ／ｇの収率を有してエタノールを産生した（図６９）。３つの異なる条件：４０ｇ／Ｌのセロビオース、４０ｇ／Ｌのキシロースおよび４０ｇ／Ｌの両方の糖（合計８０ｇ／Ｌの糖）の下にＤＡ２４−１６−ＢＴ３を培養することによって、共発酵の潜在的な相乗効果を試験した。驚くべきことに、ＤＡ２４−１６−ＢＴ３は、４０ｇ／Ｌのセロビオースまたは４０ｇ／Ｌのキシロースを別個に消費するために必要な期間と同じ期間内に、８０ｇ／Ｌのセロビオース／キシロースを共発酵させることができた（図７０）。さらに、ＤＡ２４−１６−ＢＴ３は、単独の糖発酵（セロビオースまたはキシロース）からのエタノールの収率（０．３１〜０．３３ｇ／ｇ）と比べて、セロビオースおよびキシロースの混合物からより高い収率（０．３９ｇ／ｇ）を有して、エタノールを産生した。また、エタノール生産性は、共発酵の間に０．２７ｇ／Ｌ／時間から０．６５ｇ／Ｌ／時間まで顕著に増加した。これらの結果は、セロビオースおよびキシロースの共発酵が全体的なエタノールの収率および生産性を向上させ得ることを証明した。また、この改変したS. cerevisiae株（ＤＡ２４−１６−ＢＴ３）を、セロビオースおよびキシロースを効率的に共発酵可能なP. stipitisと比較するために、発酵実験を行った。
【０４２４】
エネルギーケインの組成物に基づく擬似の加水分解物（１０ｇ／Ｌのグルコース、８０ｇ／Ｌのセロビオース、４０ｇ／Ｌのキシロース）を使用した。異なるリグノセルロース性の植物の組成は広範な範囲において変わる。例えば、米国エネルギー省のバイオマスデータベースは、１５０のバイオマスサンプルの組成を一覧にしている（ウェブページeere.energy.gov/biomass/m/feedstock_databases.html）。これらのサンプルのセルロース対ヘミセルロースの割合は１．４〜１９であり、その平均は２．３である。エネルギー農作物は、木質のバイオマスより高いヘミセルロースの含有量を典型的に有している。サトウキビのバガス、トウモロコシの茎および葉、モロコシのセルロース対ヘミセルロースの割合の平均は、それぞれ２．０、１．８５および２．１４である。したがって、われわれは、われわれの擬似の糖の実験計画において、２のグルカン／キシランの割合を使用した。改変した酵母は、生物燃料産生のためにβ−グルコシダーゼ活性について欠失している従来のセルラーゼカクテルとともに使用した。不完全なセルラーゼカクテルを用いた６〜３０％の、グルコースへのグルカンの変換が報告されている（Medve et al., 1998）通り、バイオマスの加水分解過程は、リグノセルロース性の加水分解物において少量のグルコースを生じ得る。上述のすべての要因を考慮して、１０ｇ／Ｌのグルコース、８０ｇ／Ｌのセロビオースおよび４０ｇ／Ｌのキシロースの糖の組合せを擬似の糖の実験において選択した。
【０４２５】
ＤＡ２４−１６ＢＴ３は、セロビオースおよびキシロースを急速に共発酵させる前にグルコースをまず消費した。わずかな播種物（ＯＤ６００＝１）を使用してさえ６０時間以内に合計１３０ｇ／Ｌの糖が消費された。対照的に、P. stipitisは、同一の培養条件における同じ期間内に糖の混合物の発酵を完了させ得なかった（図７１）。ＤＡ２４−１６ＢＴ３は、６０時間以内に４８ｇ／Ｌのエタノール（ＹＥｔｈａｎｏｌ／Ｓｕｇａｒｓ＝０．３７ｇ／ｇおよびＰＥｔｈａｎｏｌ／Ｓｕｇａｒｓ＝０．７９ｇ／Ｌ／ｈ）を産生した。
【０４２６】
セロビオース消費の間の培地におけるセロデキストリンの一時的な蓄積を観察した（図７２〜７３）。蓄積したセロトリオースおよびセロテトラオースはセロビオースの枯渇後に同様に消費された。蓄積したセロデキストリンは、β−グルコシダーゼ（ＮＣＵ００１３０）のグリコシル転移活性（Christakopoulos et al., 1994）によって生成され、両方向性（細胞内←→細胞外）のセロデキストリン輸送を容易にし得るセロデキストリントランスポータ（ＮＣＵ００８０１）によって分泌されたと考えられる。蓄積したセロデキストリンが改変された酵母によって結果的に消費されるので、一時的なセロデキストリンのこの蓄積は収率をおそらく低下させない。しかし、セロトリオースおよびセロテトラオースの輸送率がセロビオースの輸送率より低下し得るので、それは生産性を低下させ得る。
【０４２７】
少量のグルコースは共発酵の間に培地において常に検出された。少量でさえグルコースはキシロース発酵を抑制し得るので、グルコースのレベルを最小に維持する必要がある。セロデキストリントランスポータおよびβ−グルコシダーゼの相対的な発現レベルがグルコースの蓄積におそらく影響すると仮定された。この点を支持するように、ＮＣＵ００８０１が酵母のゲノムに組み込まれている場合よりＮＣＵ００８０１が多コピーのプラスミドにおいて導入されている場合に、より多くのグルコースが培地に蓄積されることを観察した。多コピーのプラスミド上にＮＣＵ００８０１およびＮＣＵ００１３０の両方を含んでいる株（ＤＡ２４−１６ＢＴ３）は、ＤＡ２４−１６−ＢＴ３に認められるキシロース利用率より相対的に低いキシロース利用率を有しており、考えられる理由はグルコース抑制であった。セロデキストリントランスポータおよびβ−グルコシダーゼの発現レベルのさならる調節、または低下したグリコシル転移活性を有しているβ−グルコシダーゼの同定によって、共発酵の間におけるグルコースおよびセロデキストリンの蓄積を低下させることが可能であり得る。
【０４２８】
また、２つの異なる酵母株：キシロースを発酵させるＤＡ２４−１６株およびセロビオースを発酵させるＤＡ４５２ＢＴの混合培養によって、キシロースおよびセロビオースの共発酵を実現し得た（図７５）。上述のように、酵母株ＤＡ２４−１６は、複数のキシロース利用酵素（野生型のキシロースリダクターゼ（ＸＹＬ１）、変異体のキシロースリダクターゼ（ｍＸＹＬ１）、キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＹＬ２）、およびキシルロキナーゼ（ＸＫＳ１））を発現していた。セロデキストリントランスポータＮＣＵ００８０１およびβ−グルコシダーゼ（ＮＣＵ００１３０）を発現させるためにＤ４５２を改変することによって、Ｄ４５２ＢＴを形成した。混合培養において、ＤＡ２４−１６株はキシロースを取込み（図７５ａにおいてキシロース分子は緑の五角形として示されている）、酵素ＸＹＬ１（野生型および変異体）、ＸＹＬ２およびＸＹＬ３を用いてキシロースを代謝させ、他の株Ｄ４５２ＢＴは、トランスポータＮＣＵ００１３０を用いてセロビオースを取込み可能であり（図７５ａにおいてセロビオース分子は２つの赤の六角形として示されている）、酵素ＮＣＵ００１３０を用いてセロビオースをグルコースに変換させた。したがって、混合培養は、キシロースおよびセロビオースの両方を共発酵させて、エタノールを産生可能であった（図７５ｂ）。
【０４２９】
本研究において、新規な方法によってS. cerevisiaeによるヘキソース糖およびペントース糖の共発酵が可能なことを証明した。キシロース利用経路をセロデキストリン輸送系と組み合わせることによって、グルコース抑制が引き起こす問題を解消させた。結果として、改変された酵母は、セルロース性の加水分解物における代謝不可能な２つの糖をエタノールへと相乗的に共発酵させた。本明細書に記載の新規な共発酵方法は、糖化および発酵の両方に関するリグノセルロースに関する手法を進歩させる。最も伝統的な真菌のセルラーゼカクテルは、β−グルコシダーゼについて不完全であり、酵母によって効率的に発酵されないセロビオースをともなうセルロース加水分解を停止させる。結果として、セロビオースをグルコースに変換するためには、過剰のβ−グルコシダーゼを加える必要がある。セロビオース／キシロースを共発酵させる酵母によって、わずかなβ−グルコシダーゼ活性を有しているこれらのセルラーゼカクテルを使用すること、酵素の使用量の低下、およびセルロースの糖化処理に関する費用の低下が可能になる。さらに、セロビオースおよびキシロースの共発酵の間における相乗効果は、エタノールの生産性を有意に高め、したがって発酵の経済的側面を改善させる。リグノセルロース性材料の前処理および加水分解に由来する少量のグルコースの存在は、改変された酵母の能力に影響を与えずに、ヘキソース糖およびペントース糖の混合物をエタノールに変換させる。
【０４３０】
本研究は、植物のバイオマスから得られた加水分解物を模倣するように意図されている種々の糖の混合物を発酵させる、改変されたS. cerevisiaeの能力を評価することを含んでいた。セロデキストリンおよびキシロースを共発酵させるこの株の能力は、前処理された植物のバイオマスの同時の糖化および共発酵（ＳＳＣＦ）において特に有用である。ＳＳＣＦの間において、ヘミセルロースは、酸の前処理によってまず加水分解され、キシロースおよび未だ結晶性のセルロースを生じる。それから、真菌のセルラーゼおよび本明細書に記載の酵母株が加えられ、キシロースおよびセロビオースをともにエタノールに変換可能になる。この手順における細胞外グルコースのわずかな産生のために、キシロース利用の抑制が低減され、共発酵は速やかかつ相乗的に進行する。
【０４３１】
本研究に使用されたS. cerevisiae株は研究室株であるが、改変された株の発酵の性能は、発表済の結果と比べて非常に目覚しい。重要な発酵パラメータ（収率および生産性）は、プラットフォームとして産業用株を使用することによってさらに向上されている。この共発酵の方法の用途はエタノール産生に限定されない。これは基礎的な技術であるため、本明細書に示されている方法は、任意の他の製品多様化技術と組み合わせて、商品としての化学物質および先進的な生物燃料を生成し得る。
【０４３２】
〔実施例１８：キシランに基づいて成長させたN. crassaのトランスクリプトーム分析〕
リグノセルロースのバイオマスは、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンによって構成されている。実施例１〜３には、N. crassaのトランスクリプトームおよびセクレトームの分析を介した、セルロースに基づく成長にとって重要な遺伝子の発見について説明されている。本実施例では、遺伝子がヘミセルロースの利用に重要であることを決定するために、キシランに基づく成長の間における、N. crassaゲノムの発現プロファイルを試験した。
【０４３３】
１００ｍＬの１倍のVogel's塩の最少培地（２％のスクロース）に対してＷＴまたはΔｘｌｎＲ株の１０日齢の分生子を、１０６の分生子／ｍＬにおいて播種し、１６時間にわたって恒明下の２５℃において成長させ、１倍のVogel'sのみの培地を用いて洗浄した。それから、培地において２％のスクロースまたは２％のブナ材のキシランを単独の炭素源として有している１倍のVogel's塩に分生子を移し、４時間にわたって放置して成長させた。ろ過によって菌糸を回収し、液体窒素において直ちに瞬間冷凍した。製造者の指示にしたがってTRIzol（Invitrogen）を用いて、総ＲＮＡを単離し、ＤＮａｓｅ（Turbo DNA‐free kit; Ambion）（Kasuga, Townsend et al., 2005）を用いて処理した。
【０４３４】
ｃＤＮＡ合成および標識のために、使用した総ＲＮＡがサンプルごとに１０μｇであった点を除いて、製造者の仕様書にしたがってProntoキット（カタログＮｏ．４００７６；Corning）を使用した。
【０４３５】
上述のようにマイクロアレイハイブリダイゼーションおよびデータ分析を行った（Tian, Kasuga et al., 2007）。画像の取得のためにGenePix 4000Bスキャナ（Axon Instruments）を使用し、ハイブリダイゼーションシグナルの定量化および未加工データの収集にGenePix Pro6ソフトウェアを使用した。BAGEL（Bayesian analysis of gene expression levels）ソフトウェアプログラム（Townsend and Hartl 2002; Townsend 2004）を用いることによって、標準化した発現値を分析した。３５４の遺伝子は、キシランに基づいて成長させたN. crassaにおいて２倍を超えて誘導されていることが分かった。図７６にその一覧を示す。
【０４３６】
〔実施例１９：キシランに基づいて成長させたN. crassaのセクレトーム分析〕
ショットガンプロテオミクス（shotgun proteomics）手法を用いて、キシランに基づく成長の間におけるN. crassaのセクレトームを分析した。キシラン培養物から得られた上清を、トリプシン処理し、タンデムの液体クロマトグラフィーナノエレクトロスプレーイオン化質量分析によって分析した。
【０４３７】
質量分析のサンプルを以下のように調製した。N. crassaの野生株を、２％のキシランの培地において４または７日にわたって成長させた。培養上清を遠心分離によって単離し、０．２２μｍのフィルタに通してろ過し、MWCO PESスピン濃縮器を用いて１０倍に濃縮させた。それから、３．３６ｍｇの尿素、５μＬの１ＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．５および５μＬの１００ｍＭのＤＴＴを、１００μＬの濃縮された培養上清に加え、混合物を１時間にわたって６０℃において加熱した。加熱後、７００μＬの２５ｍＭのジカルボン酸アンモニウムおよび１４０μＬのメタノールを溶液に加え、その後に５０ｍＭの酢酸ナトリウム  ｐＨ５．０における５０μＬの１００μｇ／ｍＬのトリプシンを用いて処理した。トリプシンを残したまま、基底のｐＨにおいて８〜９時間にわたって転倒させながら、３７℃において一晩にわたって反応させた。消化の後に、スピードバックによって乾燥するまで容積を減らし、３００μｌのMilliQ水を用いて３回にわたって洗浄した。最終容積は１００μｌであった。製造者の指示にしたがって、OMIX微量抽出ピペットチップを用いることによって、サンプルにおける残余の塩を除去した。アセトニトリルを蒸発によって除去した。サンプル溶液は、０．１％〜１％のＴＦＡを有している水性溶液であり、最終容積は１０マイクロリットルを超えていた。
【０４３８】
〔実施例２０：分泌タンパク質をコードすると予測されているキシラン誘導遺伝子の分析〕
トランスクリプトームおよびセクレトームの分析結果は、合計７１の遺伝子を示し、このうち５５の遺伝子が分泌されていた。これらの遺伝子の一覧を表２９に示す。欠失株は６９遺伝子のうち４６遺伝子について入手可能であった。これらの４６遺伝子のうちの６つの株は異核共存体であり、したがって、分泌タンパク質の総量、キシロースの存在量およびアゾ−エンド−キシラナーゼ活性について、残りの４０の株を分析した。結果を図７７に示す。
【０４３９】
【表４５】
2013500019.tif 000047
【０４４０】
【表４６】
2013500019.tif 000048
【０４４１】
サンプルを以下のように調製した。２％のキシランのVogel's培地の１００ｍＬにおいて、１０６の分生子／ｍＬの１０日齢の分生子を成長させた。各株について２組を調製した。培養物を遠心分離によって単離し、アッセイに使用した。
【０４４２】
Bradfordのタンパク質濃度を測定して、分泌タンパク質の総量を決定した。ＢＳＡ標準物：０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、および５００μｇ／ｍＬを用いてストックを調製した。複数のチャネルのあるピペットを使用して、２００μＬのBradford溶液を９６ウェルのプレートに移した。１０μＬのサンプルおよび１０μＬの標準物を１０分にわたって室温においてインキュベートした。５９５ｎｍにおける吸光度を読み取り、タンパク質濃度を決定した。
【０４４３】
キシロースを測定するために利用したアッセイは、Bailey et al., 1992（J Biotech 23: 257-270）から変更した。キシロース標準物をＨ２Ｏにおいて調製した。濃縮された０．８Ｍのキシロース（１０ｍＬに１．２ｇ）について、標準物は、０ｍＭ、８ｍＭ（１：１００希釈；９９０μｌ＋１０μｌ）、２０ｍＭ（１：１００希釈；９７５μｌ＋２５μｌ）、４０ｍＭ（１：１００希釈；９５０μｌ＋５０μｌ）、８０ｍＭ（１：１００希釈；９００μｌ＋１００μｌ）、および１６０ｍＭ（１：１００希釈；８００μｌ＋２００μｌ）を含んでいた。複数のチャネルのあるピペットを使用して、深いウェルの９６ウェルプレートに９００μＬの基質溶液を加えた。１００μＬの培養上清および標準物を加え、放置して５分にわたって５０℃においてインキュベートした。サンプルを３４００ｒｐｍにおいて１０分にわたって遠心分離した。複数のチャネルのあるピペットを使用して９６ウェルのＰＣＲプレートに７５μＬのＤＮＳ溶液を加えた。５μＬの溶液を反応物から取り出し、ＤＮＳ溶液の入っているＰＣＲプレートに加えた。サンプルの冷却後に、それらを透明な平底プレートに移し、５４０ｎｍにおける吸光度を読み取った。基質溶液（５００ｍＬ）は、ブナ材のキシラン（５ｇ；１０ｍｇ／ｍＬ）、３ＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０（８．３３ｍＬ；５０ｍＭ）、水（４９１ｍＬ）を含んでおり、２０分にわたって乾熱滅菌された。ＤＮＳ溶液（１００ｍＬ）は、３，５−ジニトロサリチル酸（７０７ｍｇ）、Rochelle塩（Ｎａ  Ｋの酒石酸塩）（２０．４ｇ）、メタ重亜硫酸ナトリウム（５５３ｍｇ）、フェノール（５０７μＬ）、および水（９４．４ｍＬ）を含んでいた。
【０４４４】
Megazymeが提供しているキットを用いてアゾ−エンド−キシラナーゼ活性を測定した。このアッセイは、色素と複合化させたキシラン鎖から遊離した色素の量を分光光度に基づいて測定することによって、サンプルにおけるエンド−キシラナーゼ活性の程度を直接的に測定する。存在している酵素が多いほど、多くの色素が放出される。別々のFalconチューブに入っている４５０μＬの酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ４．５）に５０μＬの上清を加えることによって、すべての上清サンプルを希釈した。次に、Falconチューブを１０分にわたって予熱した。基質溶液をすべてのサンプル（５００μＬ／サンプル）についてチューブに加えた。サンプルおよび基質溶液を１０分にわたって４０℃の水槽にいれ、あらかじめそれらを平衡化させた。５００μＬの基質溶液を１：１０に希釈したサンプルに加え、１０秒にわたってボルテックスにかけ、１０分にわたって４０℃においてインキュベートした。各サンプルに２．５ｍＬの沈降溶液（９５％のエタノール）を加えることによって反応を停止させ、１０秒にわたってボルテックスにかけた。チューブを１０分にわたって室温において静置した。チューブを１０秒にわたってボルテックスにかけ、それから１０分にわたって１０００ｒｐｍおよび室温において遠心分離にかけた。各チューブからの１ｍＬの上清溶液をキュベットへ直接に入れ、５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。この手順のために使用したブランクは２．５ｍＬの沈降物溶液に加えられた５００μＬの基質溶液から得られた上清であった。
【０４４５】
結論として、N. crassaにおけるヘミセルロースの分解に影響を与えると、ここで同定された遺伝子の調節は、植物の細胞壁を崩壊させる向上した能力、および植物の細胞壁の構成要素（例えばヘミセルロース）に基づく促進された成長を有している株の作製を容易にすると予想される。興味深い遺伝子としては、推定のグルカミラーゼをコードしているＮＣＵ０５１５７；推定のアラビノフラノシダーゼをコードしているＮＣＵ０２３４３；保存されている推定のタンパク質をコードしているＮＣＵ０５１３７；推定のアセチルキシランエステラーゼ前駆体をコードしているＮＣＵ０５１５９；保存されている機能未知のタンパク質をコードしているＮＣＵ０９１３３；および機能未知のタンパク質をコードしているＮＣＵ１００４０が挙げられる。
【０４４６】
ヘミセルロースに基づく細胞の成長は、ＮＣＵ０１５１７、ＮＣＵ０９１３３またはＮＣＵ１００４０によってコードされているポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備することによって促進される。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような、ヘミセルロースを含んでいる培地において培養される。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【０４４７】
〔実施例２１：ΔＮＣＵ０５１３７株のさらなる分析〕
実施例１〜３および１８〜２０に記載のように、ＮＣＵ０５１３７は、Miscanthus、Avicelまたはキシランのうちのいずれかに基づくN. crassaの成長の間に過剰発現された推定の分泌タンパク質である。Avicelに基づいて成長させた、ＮＣＵ０５１３７を欠いているN. crassaの欠失株は、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼおよびAvicelaseの増大した活性を示した。キシランに基づいて成長させたＮＣＵ０５１３７欠失株は、アゾ−エンド−キシラナーゼの増大した活性を示した。本実施例に述べられるように、ΔＮＣＵ０５１３７株に認められた表現型がＮＣＵ０５１３７遺伝子の消失に起因することを確認するために、ΔＮＣＵ０５１３７の補完を行った。
【０４４８】
ｃｃｇＩプロモータの制御下にあるＣ末端にＧＦＰタグを有しているＮＣＵ０５１３７を含んでいるプラスミドを生成した。ＮＣＵ０５１３７−ＧＦＰコンストラクトを用いてN. crassaの分生子を形質転換した。Neurosporaの手順（ウェブページfgsc.net/Neurospora/NeurosporaProtocolGuide.htm）にしたがって実験を行った。
【０４４９】
野生型、ΔＮＣＵ０５１３７、ΔＮＣＵ０５１３７−ＮＣＵ０５１３７−ＧＦＰ株の総分泌タンパク質およびカルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）活性を測定した。各株の培養物から得られた１００μＬの上清を取り、当該上清を９００μＬのBradford Dyeに加え、５９５ｎｍにおける吸光度を測定することによって、総分泌タンパク質を測定した。各株の培養物から得られた上清の２０倍希釈物およびＣＭＣキット（Megazyme SCMCL）を用いて、アゾ−ＣＭＣ活性を測定した。ΔＮＣＵ０５１３７ノックアウト株は分泌タンパク質およびＣＭＣ活性の増大したレベルを示した。ΔＮＣＵ０５１３７株へのＧＦＰタグつきのＮＣＵ０５１３７の導入は、これらのレベルを低下させ、野生型のレベルに戻した（図７８）。
【０４５０】
さらに、補完された株におけるＮＣＵ０５１３７−ＧＦＰの局在を観察した。ＮＣＵ０５１３７−ＧＦＰは、分生子の細胞壁、菌糸の先端に局在した（図７９〜８０）。これらのデータは、ＧＦＰタグつきのＮＣＵ０５１３７タンパク質が、十分に機能的であり、精製およびこのタンパク質の生化学的活性を扱う実験に使用され得ることを示している。
【０４５１】
したがって、ＮＣＵ０５１３７の通常の機能は、セルラーゼ遺伝子およびヘミセルラーゼ遺伝子の発現の誘導と関連付けられているシグナリング過程を阻害することであり得る。細胞におけるＮＣＵ０５１３７またはＮＣＵ０５１３７相同物の発現の低下は、当該細胞におけるセルラーゼ活性およびヘミセルラーゼ活性を低下させ、続いてセルロースまたはヘミセルロースに基づく当該細胞の成長を抑制すると考えられる。セルロースまたはヘミセルロースに基づく細胞の成長は、ＮＣＵ０５１３７によってコードされているポリペプチドをコードしている外因性のポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備することによって、促進される。上記外因性のポリヌクレオチドの発現が抑制され、上記細胞はセルロースまたはヘミセルロースを含んでいる培地において培養される。上記宿主細胞細胞は、上記外因性のポリヌクレオチドの発現が抑制されていない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【０４５２】
〔実施例２２：ＮＣＵ０７７０５のさらなる分析〕
ＮＣＵ０７７０５の発現は、セルロースに基づくN. crassaの成長の間に上方制御されることがわかった。ＮＣＵ０７７５０によってコードされているポリペプチドのＢＬＡＳＴ分析によって、当該ポリペプチドは、Ｃ６ジンクフィンガードメインを含んでいる多くの転写因子と高い類似性を有していることが明らかになった（図１）。セルロースの利用におけるＮＣＵ０７７０５の役割をさらに調べるために、ＮＣＵ０７７０５を欠いている欠失株の表現型を評価した。
【０４５３】
ΔＮＣＵ０７７０５株は、単独の炭素源としての２％のセルロース（Avicel）、ＰＡＳＣまたはＣＭＣに基づいて成長できなかった（表３０）が、スクロース、キシランおよびキシロースに基づいて野生型の株と同様の動態を示して成長した。ＮＣＵ０７７０５がセルラーゼの発現の制御に役割を果たしているか否かを決定するために、セルロースに基づくΔＮＣＵ０７７０５の成長の間におけるセルラーゼ遺伝子およびヘミセルラーゼ遺伝子の発現が試験された。野生型の株（ＦＧＳＣ２４８９）およびΔＮＣＵ０７７５株から得られた１０日齢の分生子をVogel'sの液体ＭＭ（Vogel 1956）に播種し、１６時間にわたって成長させた。菌糸を遠心分離し、１倍のVogel's塩を用いて洗浄し、それから２％のスクロースまたは２％のAvicelを含んでいるVogel's培地のいずれかに移し、４時間にわたって恒明下において成長させた。それらをろ過によって回収し、液体窒素において直ちに凍結させた。製造者の指示にしたがってTRIzol（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて総ＲＮＡを単離し、ＤＮａｓｅ（Turbo DNA-free kit, Ambion/Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて処理した（Kasuga et al., 2005）。ChipShot（商標）Indirect Labeling/Clean-Up System（カタログＮｏ．Ｚ４０００、Promega, Madison, WI）およびCyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack（カタログＮｏ．ＲＰＮ５６６１、GE Healthcare, Piscataway, NJ）を使用して、ＲＮＡの使用量が１０μｇであることを除いて、製造者の指示にしたがってｃＤＮＡを合成し、標識した。製造者の仕様書にしたがって、マイクロアレイハイブリダイゼーションのために、Pronto! Hybridization Kit（カタログＮｏ．４００７６、Corning, Lowell, MA）を使用した。
【０４５４】
上述のようにデータ分析を行った（Tian et al., 2007）。GenePix 4000Bスキャナ（Axon Instruments, Union City, CA）を使用して、画像を取得し、GenePix Pro6ソフトウェアを使用して、ハイブリダイゼーションシグナルを定量化し、未加工のデータを収集した。BAGEL（Bayesian Analysis of Gene Expression Levels）を用いることによって、標準化された発現値を分析した（Townsend and Hartl, 2002）。推定のセルラーゼ遺伝子はΔＮＣＵ０７７０５において誘導されないにもかかわらず、推定のヘミセルラーゼ遺伝子の誘導は影響されなかった（以下の表３０を参照）。したがって、ＮＣＵ０７７０５は、ｃｄｒ−１（cellulose degradation regulator 1）と名づけられている。
【０４５５】
したがって、セルロースに基づく細胞の成長は、ＮＣＵ０７７０５によってコードされているポリペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備することによって、促進される。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような、セルロースを含んでいる培地において培養される。上記宿主細胞は、上記組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記培地においてより早く成長する。
【０４５６】
【表４７】
2013500019.tif 000049
【０４５７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１０−９】
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【図１０−１０】
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【図１０−１１】
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【図１０−１２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２６ｃ】
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【図２７】
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【図２８（ａ）−１】
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【図２８（ａ）−２】
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【図２８（ａ）−３】
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【図２８（ｂ）】
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【図２８（ｃ）−１】
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【図２８（ｃ）−２】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４１−３】
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【図４１−４】
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【図４１−７】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年3月27日(2012.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項２】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス２は配列番号２を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項３】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項４】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス５は配列番号４を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項５】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス６は配列番号５を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項６】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７の間にある領域は配列番号６を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項７】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項８】
細胞へのセロデキストリンの輸送を促進させる方法であって、
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を準備すること；および
上記組換えポリヌクレオチドが発現されるような培地において上記宿主細胞を培養することを包含しており、
上記組換えポリヌクレオチドは、膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでいるポリペプチドをコードしており、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列は、配列番号８を含んでおり、
上記組換えポリヌクレオチドの発現は、当該組換えポリヌクレオチドを含んでいない細胞と比べて、上記宿主細胞へのセロデキストリンの促進された輸送をもたらす、方法。
【請求項９】
上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性を有している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記宿主細胞は、β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインを少なくともコードしている第２の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
上記宿主細胞は、ペントース利用に関与している１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
１つ以上の上記酵素は、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、およびキシトールデヒドロゲナーゼからなる群のうちの１つ以上から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記細胞は、ペントーストランスポータをコードしている第３の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
上記培地は、改変された生物から得られた、セルラーゼ含有の酵素の混合物を含んでおり、セルラーゼ含有の上記混合物は、改変されていない生物から得られたセルラーゼ含有の混合物と比べて、低下したβ−グルコシダーゼ活性を有している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
上記宿主細胞は、Saccharomyces sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces monacensis、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces pombe、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces marxiamus、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Pichia stipitis、Sporotrichum thermophile、Candida shehatae、Candida tropicalis、Neurospora crassa、Zymomonas mobilis、Clostridium sp.、Clostridium phytofermentans、Clostridium thermocellum、Clostridium beijerinckii、Clostridium acetobutylicum、Moorella thermoacetica、Escherichia coli、Klebsiella oxytoca、Thermoanaerobacterium saccharolyticum、およびBacillus subtilisからなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
上記セロデキストリンは、セロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースからなる群のうちの１つ以上から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
組換えポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞であって、
上記組換えポリヌクレオチドは、以下のポリペプチド：
膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス１は配列番号１を含んでいる、ポリペプチド；
膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス２は配列番号２を含んでいる、ポリペプチド；
膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス２および膜貫通型のα−ヘリックス３を接続しているループは配列番号３を含んでいる、ポリペプチド；
膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス５は配列番号４を含んでいる、ポリペプチド；
膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス６は配列番号５を含んでいる、ポリペプチド；
膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス６および膜貫通型のα−ヘリックス７の間にある配列は配列番号６を含んでいる、ポリペプチド；
膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス７は配列番号７を含んでいる、ポリペプチド；または
膜貫通型のα−ヘリックス１、膜貫通型のα−ヘリックス２、膜貫通型のα−ヘリックス３、膜貫通型のα−ヘリックス４、膜貫通型のα−ヘリックス５、膜貫通型のα−ヘリックス６、膜貫通型のα−ヘリックス７、膜貫通型のα−ヘリックス８、膜貫通型のα−ヘリックス９、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１、膜貫通型のα−ヘリックス１２を含んでおり、膜貫通型のα−ヘリックス１０、膜貫通型のα−ヘリックス１１およびこれらの間にある配列は配列番号８を含んでいる、ポリペプチド
をコードしている、宿主細胞。
【請求項１８】
上記ポリペプチドは、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４に対するアミノ酸同一性を有している、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
β−グルコシダーゼの触媒作用ドメインを少なくともコードしている第２の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１７または１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
ペントース利用に関与している１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
１つ以上の上記酵素は、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−Ｐ  ４  エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、アルドースリダクターゼ、Ｌ−アラビニトール  ４−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−キシルロースリダクターゼ、およびキシトールデヒドロゲナーゼからなる群のうちの１つ以上から選択される、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
ペントーストランスポータをコードしている第３の組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【国際調査報告】
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