(57)【要約】本発明は、アルキレンジアミンとヒアルロン酸の架橋ヒドロゲルを含む組織補強用充填組成物に関するものである。本発明の充填組成物は、生体内に長時間とどまることができるという有益な効果に加え、生体適合性や膨潤性など、組織補強に求められる有効な物性を示す。
2013530785.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを含むことを特徴とする組織増大用充填組成物：
［ＨＡ］m−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−［ＨＡ］n      （１）
式中、
ＨＡはカルボキシル基一つを除いたヒアルロン酸またはその塩を示し、
Ｒ１は、置換されていないＣ3−Ｃ10アルキレン基、または、ヒドロキシ、Ｃ1−Ｃ6アルキルもしくはＣ1−Ｃ6アルコキシで置換されたＣ3−Ｃ10アルキレン基を示し、
ｍ及びｎは、それぞれ１０，０００〜４，０００，０００の整数である。
【請求項２】
未修飾ヒアルロン酸を更に含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
リドカインを更に含む請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸の分子量が２０，０００ダルトン〜４，０００，０００ダルトンである請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記アルキレンジアミンが、ヘキサメチレンジアミンである請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸が、ｐＨ５．５〜６．５で、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤との存在下、ヒアルロン酸と、置換されていないＣ3−Ｃ10アルキレンジアミン化合物、または、ヒドロキシ、Ｃ1−Ｃ6アルキルもしくはＣ1−Ｃ6アルコキシで置換されたＣ3−Ｃ10アルキレンジアミン化合物とを反応させることにより製造されたものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記架橋ヒドロゲルの架橋率が５〜３５％である請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルが、組成物全重量に対して１〜３（ｗ／ｗ）％含まれている請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
皮膚のシワを除去または改善するためのものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
頬、唇、胸及び尻から選択される身体部位の容積を増大するためのものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物を製造するための方法であって、
（１）カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤との存在下、ヒアルロン酸と、置換されていないＣ3−Ｃ10アルキレンジアミン化合物、または、ヒドロキシ、Ｃ1−Ｃ6アルキルもしくはＣ1−Ｃ6アルコキシで置換されたＣ3−Ｃ10アルキレンジアミン化合物とを反応させることにより、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを調製する工程；
（２）調製されたヒドロゲルを均質化する工程；及び
（３）未反応物を除去する工程；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤を水に溶解し、３０分以内にヒアルロン酸とアルキレンジアミン化合物の混合物に添加する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１工程において、３０℃〜５０℃で９時間以上撹拌することなく放置することにより、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルが調製される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ｐＨ５．５〜６．５で、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルが調製される請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
下記式（１）で表される、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを含むことを特徴とする組織増大用充填剤：
［ＨＡ］m−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−［ＨＡ］n      （１）
式中、
ＨＡはカルボキシル基一つを除いたヒアルロン酸またはその塩を示し、
Ｒ１は、置換されていないＣ3−Ｃ10アルキレン基、または、ヒドロキシ、Ｃ1−Ｃ6アルキルもしくはＣ1−Ｃ6アルコキシで置換されたＣ3−Ｃ10アルキレン基を示し、
ｍ及びｎは、それぞれ１０，０００〜４，０００，０００の整数である。
【請求項１６】
前記アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸が、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤との存在下、ヒアルロン酸と、置換されていないＣ3−Ｃ10アルキレンジアミン化合物、または、ヒドロキシ、Ｃ1−Ｃ6アルキルもしくはＣ1−Ｃ6アルコキシで置換されたＣ3−Ｃ10アルキレンジアミン化合物とを反応させることにより製造されたものである請求項１５に記載の組織増大用充填剤。
【請求項１７】
前記アルキレンジアミンがヘキサメチレンジアミンである請求項１５に記載の組織増大用充填剤。
【請求項１８】
前記ヒアルロン酸の分子量が１０，０００ダルトン〜４，０００，０００ダルトンである請求項１５に記載の組織増大用充填剤。
【請求項１９】
前記架橋ヒドロゲルの架橋率が５〜３５％である請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の組織増大用充填剤。
【請求項２０】
皮膚のシワを除去または改善するためのものである請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の組織増大用充填剤。
【請求項２１】
頬、唇、胸及び尻から選択される身体部位の容積を増大するためのものである請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の組織増大用充填剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織の増大に有用な生体適合性の充填組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
軟部組織の増大のような組織増大は、医学及び美容目的のために使われてきた。このような増大は、成形手術を通して外科的に行われるか、または生体適合性物質を投与して軟部組織の容積を増大させる非外科的な方法で行われる。例えば、医学的な目的のため、ＨＩＶ陽性の患者に現れる顔面脂肪委縮症に使用できる。顔面脂肪委縮症は、こめかみ及び頬における皮下脂肪の損失を意味しており、非常に痩せた姿を示す。また、組織増大は、美容上の目的のため、頬、唇、胸、尻の容積を増やし、皮膚の小ジワと深いシワを低減するのに使われてきた。
【０００３】
ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸からなる繰り返し単位が直鎖状に連結されている生体高分子物質であり、眼球の硝子体液、関節の滑液、ニワトリの鶏冠などに多く存在し、優れた生体適合性を有しているため、眼科用手術助剤、関節機能改善剤、ドラッグデリバリー材料、点眼剤、シワ改善剤などとして、医療分野及び医療用具分野や化粧品分野で広く使われている。しかし、ヒアルロン酸自体は、体内に投与した後の半減期が数時間に過ぎないため、その適用に限界がある。そこで、架橋結合により半減期（体内持続性）を長くするための研究が行われてきた。例えば、ジビニルスルホン、ビスエポキシド、ビスハライド、ホルムアルデヒドなどのように官能基を二つ有する化合物を架橋剤として使用して、架橋結合されたヒアルロン酸誘導体を合成した例が数々の文献で報告されており、このような製法を基盤にした様々な製品が皮膚軟部組織増大用の充填剤（dermal filler）として市販されている。特許文献１には、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）を架橋剤として用いて架橋されたヒアルロン酸誘導体が開示されており、そのヒドロゲル体がＨｙｌａｆｏｒｍ（登録商標）の商品名で市販されている。特許文献２には、多官能エポキシ化合物を架橋剤として用いて架橋ヒアルロン酸誘導体を製造する方法が開示されている。その中で、多官能エポキシ化合物である架橋剤として１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を用いて製造した架橋ヒアルロン酸のヒドロゲル組成物であるＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）は、米国ＦＤＡの承認を受けて組織増大用充填剤として世界的に市販されている。これらの製品は、いずれもヒアルロン酸のヒドロキシ基と架橋剤とを結合させて生成されるもので、未架橋ヒアルロン酸に比べると、その生体内持続性が高いとはいうものの、６カ月以内に分解されるなど、生体持続性が依然として低いという問題がある。
【０００４】
このような市販製品の低い生体内持続性の問題を解決するために、本出願人は、ヒアルロン酸分解酵素の認識部位がヒアルロン酸のカルボキシル基であることに着眼し、ヒアルロン酸のカルボキシル基と結合するアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を架橋剤として用いて生体持続性の高いヒアルロン酸−ＡＤＨ架橋体を製造する方法を開発し、これを特許文献３として出願した。一方、ヒアルロン酸−ＡＤＨ架橋体ヒドロゲルは、市販の架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルに比べて顕著に高い生体内持続性を示したが、低粘弾性のために壊れやすく、それほど膨潤することはなく、また、組織内での不均等分布によって組織修正が容易でないという問題があった。また、架橋ヒアルロン酸は、体内で異質物として認識され得る化学物質を架橋剤として用いて製造されるため、生体に投与された後に分解される場合、残留架橋剤によって免疫反応が生じるといった問題がある。よって、製造過程の中で、異質物として作用しうる架橋剤や添加剤の量を最小化しなければならない。さらに、生体に投与される物質であるため、滅菌が可能でなければならず、滅菌後にも組織修正に必要な粘弾性などの物理化学的性質を維持しなければならない。
【０００５】
前述のように、優れた組織補正用充填剤として使用できるように、生体内持続性と生体適合性、及び滅菌後にも組織修正に必要な粘弾性などの物性が良好であり、容易に注射剤に充填され、生体組織に注入することができる、架橋結合されたヒアルロン酸ヒドロゲルに対する強い要望がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４，５８２，８６５号（１９８６年４月１５日公開）
【特許文献２】米国特許第５，８２７，９３７号（１９９８年１０月２７日公開）
【特許文献３】韓国特許出願第１０−２００８−００７４２６０号（２００９年２月５日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前述のような従来技術の問題点を解決するためのものであり、優れた組織修正用充填剤として使用できるように、生体内持続性と生体適合性に優れ、滅菌後にも粘弾性などの物性を良好に示すものであり、容易に注射剤に充填され、生体組織に投与することが可能な架橋結合されたヒアルロン酸ヒドロゲルを含む組成物と、その製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための本発明は、下記式（１）で表される、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを含む組織増大用充填組成物を提供する。
［ＨＡ］m−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−［ＨＡ］n      （１）
式中、
ＨＡはカルボキシル基一つを除いたヒアルロン酸またはその塩を示し、
Ｒ１は、置換されていないＣ3−Ｃ10アルキレン基、または、ヒドロキシ、Ｃ1−Ｃ6アルキルもしくはＣ1−Ｃ6アルコキシで置換されたＣ3−Ｃ10アルキレン基を示し、
ｍ及びｎは、それぞれ１０，０００〜４，０００，０００の整数であり、好ましくは２０，０００〜３，０００，０００である。
【０００９】
好ましくは、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルは、組成物全重量に対して１〜３（ｗ／ｗ）％含まれる。
【００１０】
好ましくは、本発明に係る組成物は、未修飾（例えば、非架橋）ヒアルロン酸を更に含む。また、本発明組成物は、シリンジに充填することができ、押出圧力が減ぜられていることにより組織へ容易に注入することができる。
【００１１】
好ましくは、未修飾ヒアルロン酸は、組成物全重量に対して０．０５〜１（ｗ／ｗ）％含まれる。
【００１２】
好ましくは、本発明に係る組成物は、滅菌後の弾性低下が防止されており、且つ局所麻酔効果を発現するために、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルと未修飾ヒアルロン酸に加え、リドカインを更に含む。
【００１３】
好ましくは、上記リドカインは、組成物全重量に対して０．１〜０．４（ｗ／ｗ）％含まれる。
【００１４】
本発明組成物の残部は、水や生理食塩水など、薬学上許容される担体からなる。
【００１５】
本発明の組成物において、ヒアルロン酸の分子量としては、２０，０００ダルトン〜４，０００，０００ダルトンが好ましい。
【００１６】
本発明の組成物において、アルキレンジアミンは、好適にはヘキサメチレンジアミンである。
【００１７】
本発明の組成物において、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルとしては、ｐＨ５．５〜６．５で、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤との存在下、ヒアルロン酸と、置換されていないＣ3−Ｃ10アルキレンジアミン化合物、または、ヒドロキシ、Ｃ1−Ｃ6アルキルもしくはＣ1−Ｃ6アルコキシで置換されたＣ3−Ｃ10アルキレンジアミン化合物とを反応させることにより製造されたものが好ましい。
【００１８】
本発明の組成物において、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルの架橋率としては、５〜３５％が好ましい（ＴＮＢＳアッセイによる）。
【００１９】
本願明細書で、“増大”の語は、組織容積の増加（例えば、組織の拡張）及び／又は組織機能の向上を意味する。従って、本発明の組織増大用充填剤は、軟部組織の容積の増大または組織機能を向上することにより医学的または美容的に使用でき、特に皮膚のシワを除去または改善するか；頬、唇、胸、尻などの身体部位の容積を増大するために使用できる。
【００２０】
また、本願明細書において、“ヒアルロン酸”の語は、ヒアルロン酸自体はもちろん、ヒアルロン酸の塩及び誘導体をも含む意味である。従って、以下で使われる“ヒアルロン酸水溶液”の語は、ヒアルロン酸の水溶液、ヒアルロン酸塩の水溶液、及びこれらの混合物水溶液の全てを含む。
【００２１】
また、本発明は、上記本発明に係る組成物を製造するための方法であって、
（１）カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤との存在下、ヒアルロン酸と、置換されていないＣ3−Ｃ10アルキレンジアミン化合物、または、ヒドロキシ、Ｃ1−Ｃ6アルキルもしくはＣ1−Ｃ6アルコキシで置換されたＣ3−Ｃ10アルキレンジアミン化合物とを反応させることにより、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを調製する工程；
（２）調製されたヒドロゲルを均質化する工程；及び
（３）未反応物を除去する工程；
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００２２】
好ましくは、本発明方法は、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤を水に溶解し、３０分内にヒアルロン酸とアルキレンジアミン化合物の混合物に添加することによって、滅菌後にも弾性係数などの物性に優れたアルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを製造することができる。
【００２３】
好ましくは、本発明方法は、ヒアルロン酸とアルキレンジアミンを十分かつ完全に架橋するために、３０℃〜５０℃で９時間以上撹拌することなく放置することにより、滅菌後にも弾性係数などの物性に優れたアルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを製造することができる。
【００２４】
好ましくは、本発明方法は、ｐＨ５．５〜６．５で、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを調製することによって、少量の架橋剤（アルキレンジアミン）及び触媒（カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤）を用いて、滅菌後にも弾性係数などの物性に優れ、且つ生体適合性の高い、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを製造することができる。
【００２５】
好ましくは、本発明方法は、製造されたヒドロゲルを篩にかけて、均質なサイズと狭い粒子分布を有する均質化されたヒドロゲルを得ることによって、滅菌後にも比較的低い押出圧力を示し、容易に注射器に充填でき、組織内へ注入可能な組成物を製造することができる。
【００２６】
好ましくは、本発明方法では、Ｃ1−Ｃ6アルコール水溶液で沈殿させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または塩化ナトリウムバッファーで洗浄することによって、短い時間内に、アルキレンジアミン、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤などの未反応物質を容易に除去することができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係るアルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを用いた組成物は、組織の増大に必要な物性に優れ、生体内での優れた持続性により、その交換回数を低減することができるという有利な効果を示す。また、未修飾ヒアルロン酸及び局所麻酔剤を更に含む組成物は、上記効果の外にも、弾性係数の低下など滅菌後において組織増大に必要な物性の劣化が起らないことから、容易に滅菌して使用することができ、また、押出圧力が低減されていることから、容易に注射器に充填して組織に注入することができるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、本発明に係るＨＡ−ＨＭＤＡ架橋体の合成過程及び合成された架橋体構造に関する概略図である。
【図２】図２は、本発明に係るＨＡ−ＨＭＤＡ架橋体のヒドロゲルを含む組成物の滅菌後における弾性係数（Ｇ’）を示したグラフである（●：実施例８，▲：実施例９，■：実施例１１）。
【図３】図３は、本発明のＨＡ−ＨＭＤＡ架橋体のヒドロゲルを含む組成物であって滅菌されたものと、比較品であるＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）リドカイン製品の、ヒアルロニダーゼ酵素による分解効果として、弾性係数（Ｇ'）に関連付けて示すグラフである（○：実施例１１、●：比較品）。
【図４】図４は、サンプルの投与から１１週後に観察したシワ誘発陰性対照群マウス、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）で処置された陽性対照群マウス及び本発明に係る実施例４、５のヒドロゲルで処置された群のマウスの、背部表皮シワ改善程度を撮影した写真である。
【図５】図５は、本発明に係るＨＡ−ＨＭＤＡ架橋体のヒドロゲルを含む組成物の組織に及ぼす効果を対照群と比較して示すためのものであり、各群マウスの皮膚組織のサンプルを、Ｈ＆Ｅを用いて染色した後、光学顕微鏡で撮影した結果であり、表示されたスケールバーは２０μｍを示す（（Ａ）：正常群，（Ｂ）:シワ誘発陰性対照群，（Ｃ）：Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）で処置された陽性対照群，（Ｄ）：実施例２のＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルで処置された群，（Ｅ）：実施例３のＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルで処置された群，Ｅ：表皮，Ｄ：真皮，Ｈ：皮下）。
【図６】図６は、サンプルの投与から１３週後に各群マウスのレプリカを写したイメージである（Ａ：正常群，Ｂ：シワ誘発陰性対照群，Ｃ：Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）リドカインで処置された陽性対照群，Ｄ：実施例１１のＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルで処置された投与群）。
【図７】図７は、サンプルの投与から１３週後に各群マウスのレプリカを写したイメージを、Ｖｉｓｉｏｌｉｎｅ（登録商標）を利用して分析した結果である（Ｎｏｒｍａｌ  Ｃ：正常群，Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃ：シワ誘発陰性対照群）。
【図８】図８は、本発明に係るＨＡ−ＨＭＤＡ架橋体ヒドロゲルを含む組成物であって滅菌されたものが組織に及ぼす効果を対照群と比較して示すものであり、各群マウスの皮膚組織のサンプルを、Ｈ＆Ｅを用いて染色した後、光学顕微鏡で撮影した結果であり、表示されたスケールバーは１００μｍを示す（Ａ：正常群，Ｂ：シワ誘発陰性対照群，Ｃ：Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）リドカインで処置された陽性対照群，Ｄ：実施例１１のＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルで処置された群，Ｅ：表皮，Ｄ：真皮，Ｈ：皮下）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下では、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲル、これを含む組成物及びその製法を具体的に説明する。
【００３０】
１）アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルの製造
アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルは、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤との存在下に、ヒアルロン酸をアルキレンジアミン化合物と反応させることにより製造される。
【００３１】
用いられるヒアルロン酸（ＨＡ）の分子量は、１０，０００〜４，０００，０００ダルトン、より好ましくは、２０，０００〜３，０００，０００ダルトンである。製造される架橋ヒドロゲルの分解率は、ＨＡの分子量または濃度を調節することにより調節することができる。通常、ＨＡの初期濃度が高いほど製造される架橋ヒドロゲルの架橋率が高く、これに伴い、架橋ヒドロゲルは低い生体内分解率を示す。ＨＡは、好ましくは、１〜３．５（ｗ／ｗ）％の濃度、より好ましくは、３（ｗ／ｗ）％の濃度で使用する。当該濃度が１（ｗ／ｗ）％未満の場合には、所望の程度の生体分解率を得ることが困難であり、３．５（ｗ／ｗ）％を超える場合には、製造されたヒドロゲルが乾燥して壊れ易くなる。
【００３２】
アルキレンジアミン化合物は、置換されていないか、或いは、ヒドロキシ、Ｃ1−Ｃ6アルキルまたはＣ1−Ｃ6アルコキシで置換されたＣ3−Ｃ10アルキレンジアミン化合物であり、好ましくは、Ｃ3−Ｃ7アルキレンジアミン、より好ましくは、Ｃ4−Ｃ6アルキレンジアミン、最も好ましくは、Ｃ6アルキレンジアミン（ヘキサメチレンジアミン）である。アルキレンジアミン化合物は、ヒアルロン酸の繰り返し単位に対して、３．５〜８０モル％、好ましくは１０〜３０モル％、最も好ましくは１０〜２５モル％で使用する。
【００３３】
カルボキシル基活性化剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）のような１−アルキル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；１−エチル−３−（３−（トリメチルアンモニオ）プロピル）カルボジイミド（ＥＴＣ）のような１−アルキル−３−（３−（トリメチルアンモニオ）プロピル）カルボジイミド；１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）のような１−シクロアルキル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドなどの水溶性カルボジイミドのカルボジイミドを使用する。より好ましくは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を使用する。カルボキシル基活性化剤は、ヒアルロン酸１モルに対して、モル比で１〜５倍使用することが好ましい。
【００３４】
ペプチド結合促進剤としては、例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）、Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）を使用する。好ましくは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を使用する。ペプチド結合促進剤は、ヒアルロン酸１モルに対して、モル比で１〜５倍使用することが好ましい。
【００３５】
好ましくは、アルキレンジアミン化合物としてヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）を用いて製造したヒアルロン酸−ヘキサメチレンジアミン架橋体を図１に示す。図１で示されるように、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤との存在下に、ヒアルロン酸のカルボキシル基とアルキレンジアミン化合物のアミン基がアミド結合により架橋されていることが分かる。架橋結合は分子内または分子間で起こる。ヒアルロン酸のカルボキシル基は、ヒアルロン酸分解酵素であるヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の認識に関与する重要な基である。本発明に係るアルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルでは、ヒアルロン酸のカルボキシル基が架橋に用いられることによって、生体内に投与された後、分解酵素によるヒアルロン酸分解が最小化し、生体持続性が増大される。また、カルボキシル基の（−）電荷は、組織の増大に大きく寄与するヒドロゲルの膨潤性などの物性に影響を及ぼす。
【００３６】
上記架橋反応は、通常、水中で行われる。ヒアルロン酸、アルキレンジアミン化合物、カルボキシル基活性化剤及びペプチド結合促進剤は、それぞれ水に溶解して混合してもよいし、ヒアルロン酸及びアルキレンジアミン化合物を溶解した溶液と、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤を溶解した溶液を混合してもよい。特に、カルボキシル基活性化剤として用いられるＥＤＣの場合、弱酸性条件でＮ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）ウレア（ＥＤＵ）に変わり得る。その結果、ＥＤＣを水に溶解して、架橋されるべきヒアルロン酸とアルキレンジアミンの混合物への添加が遅れると、製造された架橋ヒドロゲルの物性、特に滅菌後における組成物の弾性係数が低くなる等、物性が劣化され得る。好ましくは、溶解から添加時までに必要とされる時間は、１０〜３０分以内、より好ましくは１０〜２０分以内である。
【００３７】
また、反応温度は、３０〜５０℃、好ましくは４３〜４５℃に維持することができる。前記温度においてヒドロゲル化反応が効率的に進行し、通常３０分内にヒドロゲルが形成される。また、前記温度で少なくとも９時間維持することにより、良好な粘弾性を有するヒドロゲルを製造できる。この際、撹拌なしで放置することが好ましい。追加反応時間が増加するに伴い、粘弾性などの物性が増加する。しかし、９時間以上では製造されたヒドロゲルの粘弾性などの物性にはほとんど変化が見られない。
【００３８】
また、製造された架橋ヒドロゲルの架橋率は、製造時におけるｐＨによって変わり得、また、それにより物性が変わることがある。ｐＨはＮａＯＨ水溶液を反応溶液に添加して調整することができる。好ましくは５．５〜６．５、より好ましくは６．０〜６．３である。特に、ｐＨを５．５〜６．５に調整することによって、たとえ比較的少量の架橋剤（例えばヘキサメチレンジアミン）及び反応触媒（例えば、ＥＤＣのようなカルボキシル基活性化剤とＨＯＢｔのようなペプチド結合促進剤）を使用した場合であっても、優れた粘弾性などの物性を有し、滅菌後にも粘弾性などの物理化学的性質の変化のない、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを製造することができる。ｐＨが５．５未満の酸性環境で製造されたヒドロゲルは、比較的低い弾性係数（Ｇ'）を示し、滅菌時、弾性が更に低下され得る。
【００３９】
２）ヒドロゲルの均質化
製造されたヒドロゲルは篩にかけるか、ホモジェナイザーを用いて均質な粒子形態になる。特に、篩にかけて均質化することが好ましく、狭い粒子分布と低い押出圧力を有するヒドロゲルを得ることができる。
【００４０】
３）未反応物質の除去
架橋反応の後、未反応物質は、ＰＢＳ中、２４時間〜３日間透析膜を用いて透析するか、エタノール水溶液及び／又はバッファーを用いて、検出限界（２ｐｐｍ）未満まで除去することができる。ただし、ＨＯＢｔのような促進剤は、有機溶媒によく溶ける傾向があるので、透析膜とＰＢＳを利用する透析法によってはよく精製できないが、エタノール水溶液及び／又はバッファーを利用して容易に検出限界未満まで除去することができる。この際、バッファーとしては、好ましくはＰＢＳ溶液または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液を使用する。より好ましくは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液を使用する。用いられるＮａＣｌの濃度が高いほど精製が容易である。ＮａＣｌの濃度は、好ましくは０．５〜１．５％、最も好ましくは、１〜１．３％である。また、エタノール水溶液、例えば８０％エタノール水溶液を添加する場合、ヒドロゲル粒子が沈澱物として形成され、この過程で、未反応物質が容易に除去される。沈澱されたヒドロゲルは、窒素ガスで乾燥して粉末化でき、粉末になったヒドロゲルは、生理学的に適した水溶液で再水和することができる。この際、生理学的に適した水溶液としてはＰＢＳまたは生理食塩水が好ましく、ヒアルロン酸−アルキルジアミン架橋体ヒドロゲル粉末に対して２０〜３０倍（体積比）の割合の生理学的に許容される水溶液で再水和して、使用することができる。
【００４１】
本発明に係るヒアルロン酸−アルキレンジアミン架橋体のヒドロゲルは、５〜３５％の架橋率を有し、好ましくは１０〜２０％の架橋率を有する。架橋率が５％未満の場合には、ヒアルロン酸内架橋結合に関与しない未反応ＣＯＯＨ基の割合の増加によって、ヒアルロン酸の分解酵素であるヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）により容易に分解されるので、所望の程度の生体内持続性を得ることは困難である。架橋率が３５％を超える場合には、組織増大に有用な程度の膨潤性及び粘弾性を示すことは困難であり、生体内分解後の残余架橋剤の高含量によって炎症反応などを起こす可能性が大きくなる等、生体適合性が低い。また、ヒドロゲルの架橋率が低い場合、滅菌後における粘弾性などの物性が劣化され得る。
【００４２】
本発明に係るヒアルロン酸−アルキレンジアミン架橋体の架橋率は、全体ヒアルロン酸含量に対し、架橋に関与したヒアルロン酸含量の百分率を意味するものである。当該架橋率は、架橋剤として用いられるアルキレンジアミンのヒアルロン酸全体に対する使用割合を調節するか、製造時におけるｐＨを調節するなどして、調節することができる。架橋率の測定は、当業界で公知の方法、例えば、ＮＭＲ分析及びＴＮＢＳアッセイ（Habeeb，A.F.S.A.，Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid．Anal．Biochem．，1966，14：pp．328-333参照）により容易に行うことができる。
【００４３】
上記の本発明に係るヒアルロン酸−アルキレンジアミン架橋体からなるヒドロゲルは、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）を架橋剤として用いたＨＡ−ＤＶＳ架橋体ヒドロゲルに比べて顕著に低い分解率を示し、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を架橋剤として用いたＨＡ−ＡＤＨ架橋体ヒドロゲルに比べて約２倍の膨潤性を示す。
【００４４】
本発明に係る組織増大用充填組成物は、好ましくは、上記のアルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを、組成物全重量に対して１〜３（ｗ／ｗ）％、好ましくは１．８〜２．４（ｗ／ｗ）％含む。当該ヒドロゲルの含量が１（ｗ／ｗ）％未満の場合、製造される組成物が所望の程度の生体内持続性と押出圧力を有することができないことがあり、３（ｗ／ｗ）％を超えた場合、組成物の押出圧力が過度に高くなり、組織への注入が難しくなることある。
【００４５】
一方、本発明の組成物は、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルに加え、未修飾の（即ち、架橋されていない）ヒアルロン酸を更に含んでいてもよい。未修飾ＨＡは、通常、ヒアルロン酸−アルキレンジアミン架橋体のヒドロゲルの製造時に使用したものと同じヒアルロン酸である。未修飾ＨＡは、潤滑剤として作用して、組成物の押出圧力を低減することによって、注射器に充填し、低い圧力で組成物を組織内へ注入することができる。好ましくは、未修飾ヒアルロン酸は、組成物全重量に対して０．０５〜１（ｗ／ｗ）％、より好ましくは０．１〜０．４（ｗ／ｗ）％で含まれる。未修飾ヒアルロン酸の含量が０．０５（ｗ／ｗ）％未満の場合、所望の程度まで押出圧力を低減するのが難しくなり得、１（ｗ／ｗ）％を超えた場合、押出圧力が過度に低くなり、一度の圧力負荷でも組成物が継続して少しずつ押し出されることになる可能性があり、また、滅菌後における弾性係数が過度に低くなる等、物性が劣化され得る。
【００４６】
また、本発明の組成物は、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲル及び未修飾ヒアルロン酸に加え、リドカインのような局所麻酔剤を更に含み、麻酔効果とともに、滅菌後においてより良い物性を示すことができる。アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルに未修飾ＨＡを混合する場合、組成物の押出圧力は低くなるが、滅菌後における組成物の弾性係数（Ｇ'）も未混合ヒドロゲルを含まないヒドロゲルの弾性係数より低くなる。しかし、リドカインを混合する場合、組成物の押出圧力には何ら影響はなく、単に、滅菌後における弾性係数が１．２８倍以上増加した。即ち、本発明に係るアルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルに未修飾ＨＡを混合することによって、組成物の押出圧力を低下させることができ、また、リドカインを混合することによって、未修飾ヒアルロン酸による滅菌後の弾性低下を防止することができる。リドカインは、組成物全重量に対して、好ましくは０．１〜０．４（ｗ／ｗ）％、より好ましくは０．２〜０．３（ｗ／ｗ）％で含まれる。当該含量が０．１（ｗ／ｗ）％未満の場合、所望の程度に未修飾ヒアルロン酸による滅菌後弾性低下を相殺することができなくなり得、また、０．４（ｗ／ｗ）％を超えた場合、過度に組織を麻酔させ、不快感が誘発され得る。
【００４７】
組成物の残部は、水、生理食塩水など薬学的に許容されるキャリアからなる。
【実施例】
【００４８】
実施例１：本発明に係るヒアルロン酸−ヘキサメチレンジアミン（ＨＡ−ＨＭＤＡ）架橋体のヒドロゲルの製造
分子量約２３０ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ，Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｃｏｒｅ社製）を１（ｗ／ｗ）％の濃度で蒸留水に完全に溶解した後、ＨＡのカルボキシル基との反応により架橋するためにヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）を添加した。ＨＭＤＡは、ＨＡの繰り返し単位の７２モル％で添加した。カルボキシル基の活性化剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を、ＨＡの繰り返し単位の１．４倍の量で蒸留水に溶解した後、前記ＨＡとＨＭＤＡの混合液に添加した。ＨＡ−ＨＭＤＡ架橋体の完全な架橋反応のために、前記混合溶液を３７℃で１時間反応させた。溶液のｐＨは５．０〜５．５であった。その後、製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを予め洗浄した透析膜（７ｋＤａの分子量カット−オフ）で密封し、０．０１Ｍ  ＰＢＳ（リン酸緩衝液，ｐＨ７．４）で２４時間透析して、残留ＥＤＣ、ＨＯＢｔ及びＨＭＤＡを除去した。製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルの架橋度は８〜９％であった。
【００４９】
実施例１−１
分子量約２３０ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ，Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｃｏｒｅ社製）を１（ｗ／ｗ）％の濃度で蒸留水に完全に溶解した後、ＨＡのカルボキシル基との反応により架橋するためにヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）を添加した。ＨＭＤＡは、ＨＡの繰り返し単位の７２モル％で添加した。カルボキシル基の活性化剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を、ＨＡの繰り返し単位の１．４倍の量で蒸留水に溶解した後、前記ＨＡとＨＭＤＡの混合液に添加した。ＨＡ−ＨＭＤＡ架橋体の完全な架橋反応のために、前記混合溶液を３７℃で１時間反応させた。溶液のｐＨは５．０〜５．５であった。製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを一次的に粉砕した後、２００μｍ細孔径の篩にかけて、均質なヒドロゲルを得た。８０％エタノールを加え、沈殿物としてヒドロゲル粉末を取得し、１００倍体積量の１．３％ＮａＣｌ溶液を加え、１時間撹拌した。また、８０％エタノールを再度加えて沈澱を得、１００％エタノールに１０分間入れた後、４０℃で１２時間減圧乾燥して残留ＥＤＣ、ＨＯＢｔ及びＨＭＤＡを除去した。製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルの架橋度は８〜９％であった。
【００５０】
実施例１−２
ＨＭＤＡをＨＡの繰り返し単位の２５モル％添加したことを除いては、実施例１−１と同様にして、ＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを製造した。製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルの架橋度は６〜７％であった。
【００５１】
実施例２：本発明に係るヒアルロン酸−ヘキサメチレンジアミン（ＨＡ−ＨＭＤＡ）架橋体のヒドロゲルの製造
分子量が約１，０００ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ，Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｃｏｒｅ社製）を１（ｗ／ｗ）％の濃度で用い、溶液のｐＨを５．５〜５．９にしたことを除いては、実施例１と同様にして、ＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを製造した。製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルの架橋度は１１〜１３％であった。
【００５２】
実施例３：本発明に係るヒアルロン酸−ヘキサメチレンジアミン（ＨＡ−ＨＭＤＡ）架橋体のヒドロゲルの製造
分子量が約１，０００ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ，Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｃｏｒｅ社製）を１．５（ｗ／ｗ）％の濃度で用い、ＨＭＤＡをＨＡの繰り返し単位の２５モル％添加したことを除いては、実施例１と同様にして、ＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを製造した。製造されたヒドロゲルのｐＨは５．０〜５．５であった。製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルの架橋度は１１〜１３％であった。
【００５３】
実施例４：本発明に係るヒアルロン酸−ヘキサメチレンジアミン（ＨＡ−ＨＭＤＡ）架橋体のヒドロゲルの製造
分子量１，０００ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ，Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｃｏｒｅ社製）を３（ｗ／ｗ）％の濃度で蒸留水に完全に溶解した後、ＨＡのカルボキシル基との反応により架橋するためにヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）を添加した。ＨＭＤＡは、ＨＡの繰り返し単位の２０モル％で添加した。０．２５Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を添加して、ｐＨを６．０〜６．５に調整した。カルボキシル基の活性化剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を、ＨＡの繰り返し単位の１.０倍の量で蒸留水に溶解した後、前記ＨＡとＨＭＤＡ水溶液の混合液に添加した。０．２５Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を添加して、ｐＨを６．０〜６．５に調整した。ＨＡ−ＨＭＤＡ架橋体の完全な架橋反応のために、前記混合溶液を４５℃で１時間反応させた。その後、製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを予め洗浄した透析膜（７ｋＤａの分子量カット−オフ）で密封し、０．０１Ｍ  ＰＢＳ（リン酸緩衝液，ｐＨ７．４）で２４時間透析して、残留ＥＤＣ、ＨＯＢｔ及びＨＭＤＡを除去した。製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルの架橋度は１０〜１４％であった。
【００５４】
実施例４−１
分子量１，０００ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ，Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｃｏｒｅ社製）を３（ｗ／ｗ）％の濃度で蒸留水に完全に溶解した後、ＨＡのカルボキシル基との反応で架橋するためにヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）を添加した。ＨＭＤＡは、ＨＡの繰り返し単位の２０モル％で添加した。０．２５Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を添加し、ｐＨを６．０〜６．５に調整した。カルボキシル基の活性化剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を、ＨＡの繰り返し単位の１．０倍の量で蒸留水に溶解し、前記ＨＡとＨＭＤＡの混合液に添加した。当該混合液を４５℃で３０分間撹拌した後、撹拌せず４５℃で１０時間放置し、ＨＡ−ＨＭＤＡ架橋体が完全に架橋されるようにした。製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを一次的に粉砕した後、２００μｍ細孔径の篩にかけ均質なヒドロゲルを得た。８０％エタノールを加え、沈澱物としてヒドロゲル粉末を取得し、１００倍体積量の１．３％ＮａＣｌ溶液を加え、１時間撹拌した。また８０％エタノールを更に加えて沈澱を得て、得られたヒドロゲル沈澱物を１００％エタノールに添加して１０分間後、４０℃で１２時間減圧乾燥して、残留したＥＤＣ、ＨＯＢｔ及びＨＭＤＡを除去した。ＬＣ分析の結果、未反応原料は検出限界である２ｐｐｍ未満にコントロールされていることを確認した。製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルの架橋度は１０〜１４％であった。
【００５５】
実施例４−２〜４−４
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）をそれぞれ蒸留水に添加し、３０分、４０分、６０分間撹拌した後、ＨＡとＨＭＤＡの混合液に添加したことを除いては、実施例４−１と同様にして、ＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを製造した。
【００５６】
実施例４−５〜４−８
混合溶液を撹拌することなく、４５℃で、３、５、７、９時間放置することを除いては、実施例４−１と同様にして、ＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを製造した。
【００５７】
実施例４−９
篩にかける代わりに、ホモジェナイザー（Ｔ−１８  ｂａｓｉｃ，ＩＫＡ）を用い、８、０００ｒｐｍで５分間ヒドロゲルを均質化したことを除いては、実施例４−１と同様にしてＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを製造した。
【００５８】
実施例４−１０
製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを透析膜（７ｋＤａの分子量カット−オフ）で密封し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２４時間透析したことを除いては実施例４−１と同様にして、ＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを製造した。
【００５９】
実施例５：本発明に係るヒアルロン酸−ヘキサメチレンジアミン（ＨＡ−ＨＭＤＡ）架橋体のヒドロゲルの製造
分子量が約１，０００ｋＤａのヒアルロン酸を３（ｗ／ｗ）％の濃度で用い、ＨＭＤＡの添加量をＨＡの繰り返し単位の２０モル％としたことと、０．２５Ｎ  ＮａＯＨ溶液を添加してｐＨを５．５〜５．９に調整したことを除いては、実施例４と同様にして、ＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを製造した。製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルの架橋度は１０〜１２％であった。
【００６０】
実施例６：本発明に係るヒアルロン酸−ヘキサメチレンジアミン（ＨＡ−ＨＭＤＡ）架橋体のヒドロゲルの製造
分子量が約１，０００ｋＤａのヒアルロン酸を３（ｗ／ｗ）％の濃度で用い、ＨＭＤＡをＨＡの繰り返し単位の１０モル％の添加量で使用したことを除いては実施例４と同様にして、ＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを製造した。製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルの架橋度は５〜７％であった。
【００６１】
実施例７：本発明に係るヒアルロン酸−ヘキサメチレンジアミン（ＨＡ−ＨＭＤＡ）架橋体のヒドロゲルの製造
分子量が約１，０００ｋＤａのヒアルロン酸を３（ｗ／ｗ）％の濃度で用い、ＨＭＤＡをＨＡの繰り返し単位の４０モル％の添加量で使用したことを除いては実施例４と同様にして、ＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを製造した。製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルの架橋度は３２〜３５％であった。
【００６２】
実施例８：本発明に係るヒアルロン酸−ヘキサメチレンジアミン（ＨＡ−ＨＭＤＡ）架橋ヒドロゲル組成物
実施例４−１の方法によって製造及び乾燥されたヒアルロン酸−アルキレンジアミンヒドロゲル粉末２０ｍｇを１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した後、５時間撹拌して、本発明のヒドロゲルを含有する組成物を得た。
【００６３】
実施例９：本発明に係るヒアルロン酸−ヘキサメチレンジアミン（ＨＡ−ＨＭＤＡ）架橋ヒドロゲル組成物
実施例４−１の方法によって製造及び乾燥されたヒアルロン酸−アルキレンジアミンヒドロゲル粉末１８ｍｇに、分子量１，０００ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ）２ｍｇを加えた。得られた混合物を１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した後、５時間撹拌して、本発明に係るヒドロゲルと未修飾ヒアルロン酸を含有する組成物を得た。
【００６４】
実施例１０：本発明に係るヒアルロン酸−ヘキサメチレンジアミン（ＨＡ−ＨＭＤＡ）架橋ヒドロゲル組成物
実施例４−１の方法によって製造及び乾燥されたヒアルロン酸−アルキレンジアミンヒドロゲル粉末１６ｍｇに、分子量１，０００ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ）４ｍｇを加えた。得られた混合物を１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した後、５時間撹拌して、本発明に係るヒドロゲルと未修飾ヒアルロン酸を含有する組成物を得た。
【００６５】
実施例１１：本発明に係るヒアルロン酸−ヘキサメチレンジアミン（ＨＡ−ＨＭＤＡ）架橋ヒドロゲル組成物
実施例４−１の方法によって製造及び乾燥されたヒアルロン酸−アルキレンジアミンヒドロゲル粉末１８ｍｇに、分子量１，０００ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ）２ｍｇ及びリドカイン３ｍｇを加えた。得られた混合物を１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した後、５時間撹拌して、本発明のヒドロゲル、未修飾ヒアルロン酸及びリドカインを含有する組成物を得た。
【００６６】
実施例１２：本発明に係るヒアルロン酸−ヘキサメチレンジアミン（ＨＡ−ＨＭＤＡ）架橋ヒドロゲル組成物
実施例４−１の方法によって製造及び乾燥されたヒアルロン酸−アルキレンジアミンヒドロゲル粉末１６ｍｇに、分子量１、０００ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ）４ｍｇ及びリドカイン３ｍｇを加えた。得られた混合物を１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に混合した後、５時間撹拌して、本発明のヒドロゲル、未修飾ヒアルロン酸及びリドカインを含有する組成物を得た。
【００６７】
比較例１：アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を架橋剤として用いたヒアルロン酸−アジピン酸ジヒドラジド（ＨＡ−ＡＤＨ）架橋ヒドロゲルの製造
Ｈａｈｎら（Hahn SK et al．，Int．J．Biol．Macromol．，2007；40；pp．374-380）の方法に従って、分子量約２３４ｋＤのヒアルロン酸（ＨＡ，Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｃｏｒｅ社製）１００ｍｇを水２０ｍＬに溶解し、５ｍｇ／ｍＬのＨＡ水溶液を調製した。前記ＨＡ水溶液に、ＨＡに対するモル比で４０倍過量のアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）粉末（１．７３６ｇ）を添加し、１０分間かけて完全に溶解した。得られたＨＡ／ＡＤＨ混合水溶液のｐＨを、１ＮＨＣｌ水溶液で４．８に調整した後、３０分間十分に撹拌した。そこに、ＨＡのカルボキシル基を活性化させるために、よく撹拌しながら、モル比で４倍過量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ，０．１９１ｇ）粉末を加えた。当該水溶液に１Ｎ  ＨＣｌ水溶液を加えて、ｐＨを４．８に保持しながら２時間反応させた。２時間後に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを７．０に上げて、反応を停止した。得られた生成物の粘性と不純物（結合していないＡＤＨ）を低減するために、生成物を予め洗浄した透析膜（７ｋＤａの分子量カット−オフ）に入れ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ水溶液で６０時間透析した。その後、２５％エタノールと蒸留水でそれぞれ透析を繰り返した。透析の後、水溶液を３日間凍結乾燥して、ＨＡ−ＡＤＨ誘導体を得た。上記の方法で得られたＨＡ−ＡＤＨを０．０１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に２時間かけて溶解した。ヒドラジドに特異的な架橋剤であるビス［スルホスクシンイミジル］スベラート（ＢＳ３）をＰＢＳに溶解し、ＨＡ−ＡＤＨ溶液に加えた。この際、ＢＳ３の添加量は、ＨＡ−ＡＤＨのヒドラジドの２０モル％に相当する量であった。上記の水溶液を完全に混合した後、架橋反応を完全にするために３７℃で１時間反応させて、ＨＡ−ＡＤＨ架橋ヒドロゲルを製造した。
【００６８】
比較例２：ジビニルスルホン（ＤＶＳ）を架橋剤として用いたヒアルロン酸−ジビニルスルホン（ＨＡ−ＤＶＳ）架橋ヒドロゲルの製造
Ｏｈら（Oh EJ et al．，J．Biomed．Mater．Res A．，2008；86；pp．685-693）の方法に従って、分子量約２３０ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ，Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｃｏｒｅ社製）６８ｍｇを０．２Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨ１３）１．６８ｍＬに溶解した。完全に溶解した後、ＨＡのヒドロキシル基との反応で架橋するために、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）を加えた。この際、ヒアルロン酸のヒドロキシル基と添加されたＤＶＳのモル比は１：１であった。前記溶液を３７℃で１時間反応させて、ＨＡ−ＤＶＳヒドロゲルを製造した。製造されたヒドロゲルを予め洗浄した透析膜（７ｋＤａの分子量カット−オフ）で密封し、ＰＢＳで２４時間透析して、イオン（Ｎａ+とＯＨ-）を、透析膜を通して拡散放出し、密封されているＨＡ−ＤＶＳ架橋体を中和した。
【００６９】
比較例３：ヒアルロン酸−ヘキサメチレンジアミン（ＨＡ−ＨＭＤＡ）架橋ヒドロゲルの製造
分子量が約１，０００ｋＤａのヒアルロン酸を３（ｗ／ｗ）％の濃度で用い、ＨＭＤＡをＨＡの繰り返し単位の５モル％の添加量で添加したことを除いては、実施例４と同様にして、ＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを製造した。製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルの架橋度は２〜４％であり、粘弾性が低過ぎて皮膚充填剤としての使用は困難であった。
【００７０】
比較例４：ヒアルロン酸−ヘキサメチレンジアミン（ＨＡ−ＨＭＤＡ）架橋ヒドロゲルの製造
分子量が約１，０００ｋＤａのヒアルロン酸を３．３（ｗ／ｗ）％の濃度で用い、ＨＭＤＡをＨＡの繰り返し単位の５０モル％の添加量で添加したことを除いては、実施例４と同様にして、ＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを製造した。製造されたＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルの架橋度は４０〜４５％であり、乾燥し過ぎて壊れ易いため、皮膚充填剤としての使用は困難であった。
【００７１】
試験例１：ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの分解及び膨潤性に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの生体内持続性を予測するために、実施例１と比較例１及び２のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルに対して、ヒアルロン酸分解酵素による分解試験を行った。
【００７２】
実施例１と比較例１及び２のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを各バイアルに同じ質量で入れた。ヒアルロン酸分解酵素（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙａｌｕｒｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のヒアルロニダーゼ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０Ｕを含む０．２Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ６．２）を加えた。この混合物を、３７℃で、あらかじめ定めておいたとおり４８時間反応させた。その後、上清を完全に除去し、残留するヒアルロン酸架橋体の質量を測定した。架橋体の分解程度は、残留する架橋体と本来の架橋体の質量比率（％）で算出した。時間経過に伴う分解率（％）を表１に示す。表１に示されるように、比較例２のＨＡ−ＤＶＳ架橋体は約２５時間内に完全に分解されるのに対して、本発明に係るヒアルロン酸−アルキレンジアミン架橋ヒドロゲルは４０時間後でも部分的に分解されたのみであった。かかる結果より、本発明に係るヒアルロン酸−アルキレンジアミン架橋ヒドロゲルは、市販のヒドロゲルよりも優れた生体内持続性を有していることを確認することができた。
【００７３】
また、本発明に係るヒアルロン酸−アルキレンジアミン架橋ヒドロゲルは、同様の分解率を示す比較例１のＨＡ−ＡＤＨ架橋体に比べて、２倍以上の高い膨張率を示すことを確認することができた。かかる結果より、本発明に係るヒアルロン酸−アルキレンジアミン架橋ヒドロゲルは、高い生体内持続性と膨潤性を示す優れた組織増大用充填剤であることを確認することができた。
【００７４】
【表１】
2013530785.tif 000003
【００７５】
試験例２：ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの分解に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの生体内持続性を予測するために、実施例１〜実施例７のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルに対して、ヒアルロン酸分解酵素による分解試験を遂行した。
【００７６】
Ｉｂｒａｈｉｍａら（Polymer Degradation and Stability 2007；92：pp．915-919）の方法に従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分解実験を行った。実施例１〜７のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを各バイアルに同じ質量入れた。ヒアルロン酸分解酵素（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙａｌｕｒｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のヒアルロニダーゼ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）６０８０Ｕを含む０．２Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）をバイアルに添加した。この混合物を３７℃で２時間反応させた。酵素反応を止めるために、０．８Ｍホウ酸カリウム（ｐＨ９．１）を添加した後、１００℃で３分間加熱した。分解産物であるＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）の量を測定するために、エールリッヒ試薬をＲｅｉｓｓｉｇら（J. Biol．Chem；1955；217：pp．959-996）の方法に従って調製した。この試薬を前記バイアルに添加した後、３７℃で２０分間反応させた。遠心分離後、上清を採取し、分解された架橋体中のＮＡＧの量を吸光度５８５ｎｍでＵＶにより測定した。架橋体の分解程度は、実施例６の分解率を１００％として、残りの実施例の分解率を下記表２に示す。
【００７７】
【表２】
2013530785.tif 000004
【００７８】
表２で示されるように、ＨＡの分子量、初期濃度及びｐＨによって架橋率が影響を受けていることが分かった。ＨＡの初期濃度が高いほど、架橋率の高い架橋体が製造された。添加された架橋剤の量が多くても、ｐＨによって架橋率が同程度であるか、更に低い場合も観察された。また、架橋率が高いほど分解率が低いことが分かった。前記結果に基づき、所望の物性のヒドロゲルを製造できることが分かった。
【００７９】
試験例３：ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの濃度による分解率、押出圧力及び弾性係数に関する試験
本試験は、本発明のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを含む組成物の最適のヒドロゲル製造濃度を確認するために行った。実施例４−１のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを、それぞれ１％、１．５％、２％、２．４％の濃度でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した後、５時間撹拌した。これら溶液を注射器に充填し、１２１℃、１．５ａｔｍで２０分間滅菌した。後、この滅菌組成物に対して、ヒアルロン酸分解酵素に対する分解率、押出圧力及び弾性係数（Ｇ'）を測定した。
【００８０】
【表３】
2013530785.tif 000005
【００８１】
表３で示されるように、ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの濃度の増加によって、滅菌後の押出圧力も増加された。ヒドロゲル濃度が２．０％及び２．４％の場合、弾性係数（Ｇ'）は、機器の１０％偏差を考慮すればほとんど同じであり、分解率も等しかった。ヒドロゲル濃度が２．４％の場合、製造された後、滅菌されたヒドロゲルの押出圧力が２．０％の場合より１．３倍程度高かった。従って、ヒドロゲルの適正濃度は２．０％として選択されることができ、これに基づき、所望の組成物の組み合わせを製造することができる。
【００８２】
試験例４：ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを含む組成物の滅菌後の押出圧力と平均粒径
本発明のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを含む組成物の注射器及び注射針に応じた押出圧力を予測するために、本試験を行った。
【００８３】
実施例４〜９のヒドロゲル１８ｍｇと分子量１，０００ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ）２ｍｇをＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍＬに溶解した後、５時間撹拌した組成物、及び、実施例８〜１２の撹拌された組成物を、３ｍＬシリンジに同質量で充填した後、湿式滅菌（１２１℃，１．５ａｔｍ，２０分）した。滅菌された各組成物に対して平均粒径と押出圧力を測定した。結果を下記表４に示す。
【００８４】
平均粒径及び分布の測定にはマラバーンマスタサイザー２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，英国）を使用し、分散溶媒として０．９％ＮａＣｌ溶液を用いた。押出圧力は、２７ゲージ及び３０ゲージ針を取り付け、ＥＺ−Ｓ  ＳＨＩＭＡＤＺＵ装置を使用して、１ｍｍ／ｍｉｎの一定の速度で６ｍｍまで測定した。
【００８５】
【表４】
2013530785.tif 000006
【００８６】
表４で示されるように、未修飾ＨＡの組成比率によって押出圧力が影響を受けた。即ち、組成物内における未修飾ＨＡの含量が高くなると、未修飾ＨＡが潤滑剤として作用し、押出圧力が低減された。用いた針のゲージに従って、３ｍＬシリンジの場合、３０ゲージと２７ゲージの差は約１．６倍であった。一方、リドカインの添加は、押出圧力にほとんど影響を及ぼさなかった。組成物内未修飾ＨＡの含量が高い実施例１０及び１２の場合、圧力負荷を停止した後にも、組成物が継続的に流れ出る現象が観察された。また、篩にかけずにホモジェナイザー（均質器）で均質化した実施例４〜９の組成物の場合、篩にかけて均質化した場合に比べて押出圧力が高かった。ホモジェナイザーで均質化する場合、粒子分布の広いヒドロゲルが得られた。このような不規則な大きさのヒドロゲル粒子によって押出圧力が高まるものと考えられた。
【００８７】
試験例５：ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを含む組成物の滅菌後の弾性係数
本発明のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを含む組成物の滅菌後物性変化を観察するために、本試験を行った。
【００８８】
実施例４〜９のヒドロゲル粉末１８ｍｇと分子量１，０００ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ）２ｍｇを１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した後、５時間撹拌した組成物、及び、実施例８〜１２の撹拌された組成物を３ｍＬシリンジに同質量で充填した後、湿式滅菌（１２１℃，１．５ａｔｍ，２０分）した。滅菌された各組成物に対して、Ｇｈｏｓｈら（Biomacromolecules，2005；6：pp．2857-2865）の方法に従って、レオロジー特性試験を行った。ＡＲ２０００応力制御式レオメータ（Ｔ．Ａ．Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製，ＵＳＡ）と４−ｃｍ，２°−円錐平板ジオメトリーを利用して、１％張力と振動モードで０．１〜２０Ｈｚまで測定した。３Ｈｚで測定された弾性係数（Ｇ'）値を下記表５に示す。機器の偏差は±１０％であり、試験は２５℃で行った。
【００８９】
【表５】
2013530785.tif 000007
【００９０】
表５で示されるように、未修飾ＨＡの組成比率によって弾性係数が影響を受けた。潤滑剤の役割を果たす未修飾ＨＡの濃度が高くなると、滅菌後においても弾性係数の低い組成物が製造された。リドカインが追加的に添加された場合、ＨＡのみが添加された場合に比べて、滅菌された組成物の弾性係数が２５．６％程度増加した。一方、ホモジェナイザーで均質化した場合（実施例４〜９）、篩にかけて均質化した場合に比べて弾性係数が多少（４．９％）減少した。図２に実施例８、実施例９、実施例１１の滅菌された組成物の０．１〜２０Ｈｚの弾性係数を示す。
【００９１】
試験例６：ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの製造方法に応じた物性の試験（弾性係数：Ｇ'）
本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの製造方法に応じた物性（弾性係数：Ｇ'）を確認するために、実施例４−１〜４−４の組成物に対して、滅菌後の弾性係数を測定した。実施例４−１〜４−４のヒドロゲルは、それぞれ反応触媒であるＥＤＣ／ＨＯＢｔの撹拌時間が２０、３０、４０、６０分と異なっている。
【００９２】
製造された各ヒドロゲル粉末をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で加え、５時間撹拌した後、３ｍＬのシリンジに入れて、湿式滅菌（１２１℃，１．５ａｔｍ，２０分）した。ＡＲ２０００応力制御式レオメータ（Ｔ．Ａ．Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製，ＵＳＡ）と４−ｃｍ，２°−円錐平板ジオメトリーを利用して、１％張力と振動モードで０．１〜２０Ｈｚまで測定した。３Ｈｚで測定された弾性係数（Ｇ'）値を表６に示す。機器の偏差は±１０％であり、試験は２５℃で行った。
【００９３】
【表６】
2013530785.tif 000008
【００９４】
表６で示されるように、ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの製造はＥＤＣ／ＥＤＵの溶解から反応へ投入するまでの時間に影響を受けていることが分かった。２０〜３０分内に反応触媒の溶解から投入までを完了して製造されたヒアルロン酸架橋ヒドロゲルは、滅菌後、同様の弾性係数を示した。その反面、溶解から投入まで４０分以上かけて製造されたヒアルロン酸架橋ヒドロゲルは、滅菌後の物性が低下した。６０分以上かかった場合、滅菌後の弾性係数がほとんど水と同様である低水準のヒドロゲルが製造された。これらの結果から、ヒアルロン酸−アルキレンジアミン架橋ヒドロゲルの製造時、ＥＤＣ／ＨＯＢｔの溶解から投入までの時間が非常に重要な要素であることが分かる。
【００９５】
試験例７：製造方法に応じた、ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの物性試験（弾性係数：Ｇ'）
本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの製造方法に応じた物性変化（弾性係数：Ｇ'）を確認するために、実施例４−１、４−５〜４−８の組成物に対して、滅菌後の弾性係数を測定した。実施例４−１、４−５〜４−８のヒドロゲルは、ヒアルロン酸架橋体の完全な架橋反応のために、追加放置時間をそれぞれ３、５、７、９、１２時間にした。
【００９６】
製造された各ヒドロゲル粉末をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で加え、５時間撹拌した後、３ｍＬのシリンジに入れて、湿式滅菌（１２１℃，１．５Ａｔｍ，２０分）した。ＡＲ２０００応力制御式レオメータ（Ｔ．Ａ．Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製，ＵＳＡ）と４−ｃｍ，２°−円錐平板ジオメトリーを利用して、１％張力と振動モードで０．１〜２０Ｈｚまで測定した。３Ｈｚで測定された弾性係数（Ｇ'）値を表７に示す。機器による偏差は±１０％であり、実験は２５℃で行った。
【００９７】
【表７】
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【００９８】
表７で示されるように、放置時間が増加するほど、組成物の滅菌後における弾性係数が増加しており、９時間以上の場合、ほとんど同様の弾性係数を示していることが分かる。この結果から、前記温度で９時間以上放置した場合、架橋反応が完全かつ十分に進行することによって、滅菌後にも良好な弾性係数を有するヒドロゲルが製造されることを確認することができた。前記結果から、ヒアルロン酸−アルキレンジアミン架橋体の製造時、完全な架橋反応のために一定時間以上放置することが重要であることが分かる。
【００９９】
試験例８：ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの精製方法に依存した未反応物の除去
本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの製造方法に依存した未反応物の除去の差を確認するために、実施例４−１及び４−１０で製造されたヒアルロン酸架橋ヒドロゲルに対して、残余未反応物を液体クロマトグラフィーにて分析した。サンプルをヒアルロン酸分解酵素（Ｈａｓｅ）で処理して分解した。ＨＭＤＡの未反応物は、Ｃ18−カラム、移動相としてＡＣＮ／０．１％  ＴＦＡ、およびＵＶ検出器を使用して定量した。ＥＤＣ及びＨＯＢｔの未反応物は、ＧＰＣカラム、移動相として２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、およびＵＶ検出器を使用して分析した。ＨＭＤＡとＥＤＣの場合、透析膜を利用して未反応物を除去して得た実施例４−１０のヒドロゲルや、エタノール及びバッファーを利用して除去した実施例４−１のヒドロゲルで、未反応物は検出限界（２ｐｐｍ）未満にコントロールされていることが確認された。しかし、ＨＯＢｔの場合は、実施例４−１のヒドロゲルでは検出限界である２ｐｐｍ未満であったが、透析膜を利用して未反応物を除去して得た実施例４−１０の場合、約１０倍も多いＨＯＢｔが検出された。これは、ＨＯＢｔが有機溶媒により容易に溶解する傾向があり、透析によってはうまく精製されないためと考えられる。
【０１００】
試験例９：本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲル組成物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分解程度と物性（Ｇ'）による持続効果に関する試験
本発明のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを含む滅菌組成物のヒアルロン酸分解酵素に対する感受性を、Ｇ'値に関連して、市販の組織増大用充填剤であるＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）リドカインと比較して評価した。Ｇ'値に関連した経時的な分解程度を観察するために、本発明に係る実施例１１の滅菌された組成物とＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）リドカインを１．５ｍＬ試験管に８００μＬずつ分注した。ヒアルロン酸分解酵素（Ｈａｓｅ，Ｂｏｖｉｎｅ  Ｔｅｓｔｅｓ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を２ｍｇ／ｍＬの濃度（２０００Ｕ）でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した後、１５μＬずつの当該酵素溶液を各試験管に分注した。３７℃で各所定時間反応させた後、３Ｈｚで弾性係数（Ｇ'）を測定した。弾性係数（Ｇ'）の変化を図３に示す。Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）リドカインは、３Ｈｚで６２０Ｐａの初期弾性係数を示し、実施例１１の滅菌された組成物は３Ｈｚで４１０Ｐａの初期弾性係数を示した。弾性係数の変化は、２５時間かけて確認した。図３で示されるように、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）リドカインの場合は、初期弾性係数（Ｇ'）は高いが、３時間までに極めて急激にヒアルロン酸分解酵素により分解され、非常に低い弾性係数を示した。それに対して実施例１１の滅菌組成物は、２５時間までも分解に対する安定性を示した。また、架橋されたヒアルロン酸（ＨＡ）の分解は、初期弾性係数Ｇ'と無関係であることが確認された。
【０１０１】
試験例１０：本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの組織増大（シワ改善）効果と生体適合性に関する試験
本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの組織増大効果と生体適合性を、市販の組織増大（シワ改善）用充填剤であるＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）と比較して評価した。
【０１０２】
組織増大（シワ改善）効果
Ｆｕｊｉｍｕｒａら（Fujimura T et al．，J．Dermatol．Sci．，2000；24；pp．105-111）の方法に従って、誘発されたシワの表面積を測定するために、６週齢の雌性無毛マウス（ｔｙｐｅ  ＳＫＨ，Ｊｕｎｇ−Ａｎｇ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌ社製，韓国）の背部に矩形（１．５×１．５ｃｍ2）の刺青をし、０．２μｇのカルシトリオール（エタノール中）を１日に１回ずつ週６回、４週間にわたり塗布し、人為的にシワを誘発した。シワ誘発剤の塗布を中止してから３日後、本発明のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルと対照である市販品Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）を、前記シワが誘発された矩形刺青内に皮下投与した。本発明のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルとしては、実施例２、３、４及び５のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを、ホモジェナイザー（Ｔ−１８  ｂａｓｉｃ，ＩＫＡ，東京，日本）により８，０００ｒｐｍで５分間均質化した後、各ヒドロゲル０．４ｍＬを、シワ誘発マウスの背部皮下層の刺青された矩形内に３０ゲージ注射針を用いて注入した。陽性対照として、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）（製造元：Ｑ−Ｍｅｄ  ＡＢ；２０ｍｇ／ｍＬ）０．４ｍＬを３０−ゲージ注射針を用いて注入した。シワ改善の程度を分析するために、同じ距離と照明で写真撮影をした後、イメージ分析器（Ａｒｔｉｍａｇｅ  2 ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してシワが改善された面積の平均値を算出した。
【０１０３】
対照群及び試験群として、それぞれ３匹ずつを用いた。それぞれのシワ改善面積を計算して平均した。シワ改善程度を評価するために、１１週間にわたり１週に１回イメージ分析器を使用して、マウスの刺青された矩形の表面積を分析した。
【０１０４】
経時的なシワ改善面積を表８に示す。表８に示されるように、陽性対照群としてシワ誘発後にＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）で処理した群と、実施例２と３のＨＡ−ＨＭＤＡ架橋ヒドロゲルで処理した群は、シワ誘発後、何も処置しない陰性対照群に比べて優れたシワ改善効果を示した。
【０１０５】
【表８】
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【０１０６】
４週までは、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）と実施例２及び３のＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルで処置した全ての群では、同等のシワ改善効果が見られた。しかし、４週以降には、本発明のＨＡ−ＨＭＤＡ架橋ヒドロゲルを投与した群で、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）を投与した陽性対照群に比べて、経時的により高いシワ改善効果が見られた。また、本発明の実施例４及び実施例５のＨＡ−ＨＭＤＡ架橋ヒドロゲルも、実施例２及び実施例３のヒドロゲルと同等程度のシワ改善効果を示した。図４は、サンプルの投与から１１週後に、陰性対照群であるシワ誘発群無毛マウス、陽性対照群であるＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）処置無毛マウス、及び実施例４と５のＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルで処置した無毛マウスの表皮の状態を示した写真である。表８と図４で示されているように、本発明のＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを含む組成物は、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）より優れたシワ改善効果を示した。
【０１０７】
生体適合性
組織学的検査は、ヒアルロン酸架橋ヒドロゲル投与から１２週後に、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を用いて行った。各マウスから皮膚サンプルを取り、１０％（ｖ／ｖ）緩衝ホルムアルデヒドで固定し、エタノールで脱水した後、パラフィンに埋設してサンプルを作製し、これらを４μｍに薄く切断し、Ｈ＆Ｅで染色した。染色されたサンプルを光学顕微鏡を使用して撮影した結果を図５に示す。図５で示されるように、実施例のヒドロゲルを投与したマウスは、シワを誘発しない対照群マウスと同様に何の炎症反応を示さなかった（Ｈ＆Ｅの場合、ヘマトキシリンは炎症反応時青色に染色され、エオシンはヘマトキシリンとは対照的に赤く染色される）。
【０１０８】
一方、シワ誘発陰性対照群（５Ｂ）を正常群（５Ａ）と比較すると、シワ誘発に伴う皮膚損傷により表皮（Ｅ）が扁平になり、真皮（Ｄ）が太くなり、荒くなったことを確認することができる。
【０１０９】
それに対して、実施例２及び３のＨＡ−ＨＭＤＡ架橋ヒドロゲルで処置した場合（図５Ｄ及び図５Ｅ）、表皮、真皮、そして皮下で明確な改善効果が観察されており、表皮は正常群マウスの表皮と同様に変化した。真皮の場合、シワ誘発陰性対照群及びＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）処置陽性対照群は、一部炎症反応を示したが、本発明ヒドロゲル処置群は、正常群マウスと同様に溶血も炎症反応も観察されず、真皮組織が再生されていた。再生された真皮の厚さは、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）を投与した陽性対照群及びシワ非誘発対照群と同等であった。以上のような真皮厚さの増大は、組織増大に效果的に寄与する。皮下組織においても、シワ誘発陰性対照群、およびＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）処置陽性対照群では、その皮下組織の内腔が目立つように膨張されたのに対して、実施例３のＨＡ−ＨＭＤＡ架橋ヒドロゲルを注入し、再生された皮下組織の内腔は、シワを誘発しない対照群の皮下組織の内腔とほとんど同じ形態に再生された。
【０１１０】
試験例１０−１
本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲル組成物の組織増大効果と生体適合性を、市販の組織増大（シワ改善）用充填剤であるＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）リドカインと比較して評価した。
【０１１１】
組織増大（シワ改善）効果
Ｆｕｊｉｍｕｒａら（Fujimura T et al．，J．Dermatol．Sci．，2000；24；pp．105-111）の方法に従って、６週齢の雌性無毛マウス（ｔｙｐｅ  ＳＫＨ，Ｊｕｎｇ−Ａｎｇ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌ社製，韓国）の背部に、シワが誘発された表面積を測定するために、矩形（１．５×１．５ｃｍ2）の刺青をし、０．２μｇのカルシトリオール（エタノール中）を１日に１回ずつ週６回、４週間にわたり塗布し、人為的にシワを誘発させた。シワ誘発剤の塗布を中止してから３日後に、３ｍＬシリンジと２７ゲージ針を使って、実施例１１のヒアルロン酸架橋ヒドロゲル０．４ｍＬをシワが誘発されたマウスの背部皮下層の刺青された矩形内に注入した。陽性対照群として、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）リドカイン（製造元：Ｑ−Ｍｅｄ  ＡＢ；２０ｍｇ／ｍｌ）０．４ｍＬを、２７−ゲージ注射針を使って注入した。
【０１１２】
正常群、陰性／陽性対照群及び試験群として、マウスをそれぞれ７匹ずつ用いた。１３週間観察後、シリコン系再生樹脂（Ｓｉｌｆｌｏ，Ｆｌｅｘｉｃｏ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製，英国）を用いて、シワが形成された背部皮膚部分のレプリカを作製し、イメージ分析器（Ｖｉｓｉｏｌｉｎｅ  ＳＶ６５０，ＣＫ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社製，ドイツ）を使用して、シワの改善面積を測定及び計算し、平均を算出した。マウス背部の刺青された矩形部分のレプリカのイメージを図６に示す。図６で示されるように、実施例１１のＨＡ−ＨＭＤＡ架橋ヒドロゲルを含む滅菌組成物で処置されたマウスは、シワ誘発後、無処置マウス（Ｂ）に比べて、優れたシワ改善効果を示した。このような優れた組織増大（シワ改善）効果は、本発明に係るＨＡ−ＨＭＤＡ架橋ヒドロゲルを含む滅菌組成物の優れた膨潤性と、優れた真皮及び皮下再生効果に起因するものと考えられる。また、Ｖｉｓｉｏｌｉｎｅ（登録商標）を利用して上記のレプリカを分析することにより得られたシワ面積の結果を図７に示す。図６及び図７で示されるように、本発明に係るＨＡ−ＨＭＤＡヒドロゲルを含む滅菌組成物で処置された無毛マウスは、ほとんど正常群と同じ程度まで、背部表皮のシワが顕著に改善され、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）リドカインに比べ、非常に優れたシワ改善効果を示していることが分かる。
【０１１３】
生体適合性
組織学的試験は、ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの投与から１４週後に、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を利用して行った。各マウスから皮膚サンプルを取得し、１０％（ｖ／ｖ）緩衝ホルムアルデヒドで固定し、エタノールで脱水し、パラフィンに埋設して試料を作製し、これらを４μｍに薄く切断し、Ｈ＆Ｅで染色した。染色された試料を、光学顕微鏡を使用して撮影した結果を図８に示す。実施例１１の滅菌されたヒドロゲル組成物を投与されたマウスは、シワを誘発されてない対照群マウスと同様に、何の炎症反応も示さなかった（Ｈ＆Ｅの場合、ヘマトキシリンは炎症反応時青色に染色され、エオシンはヘマトキシリンとは対照的に赤く染色される）。
【０１１４】
一方、シワ誘発陰性対照群（Ｂ）を正常群（Ａ）と比較すると、シワの誘発に伴う皮膚損傷により表皮（Ｅ）が扁平になり、また、真皮（Ｄ）が厚くなり、荒くなっていることが分かる。それに対して、本発明に係るＨＡ−ＨＭＤＡ架橋ヒドロゲルを含む滅菌組成物で処置した場合（Ｄ）、表皮、真皮、そして皮下で明確な改善効果が観察されており、表皮は正常群の表皮と同様の程度まで変化した。真皮の場合、シワ誘発陰性対照群及びＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）リドカイン投与陽性対照群では、一部で炎症反応が見られたが、本発明のヒドロゲルで処置した群では、正常群と同様にシワも溶血または炎症反応も観察されなかった。再生された真皮の厚さは、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）リドカインを投与した陽性対照群及び正常群と同等であった。以上のような真皮厚さの増大は、組織増大に效果的に寄与する。皮下組織については、シワ誘発陰性対照群とＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）リドカインで処置された陽性対照群では、その皮下組織の内腔が目立つように膨張したのに対して、実施例１１の滅菌組成物の注入により再生された皮下組織の内腔は、正常群の皮下組織内腔とほとんど同じ形態にまで再生された。
【０１１５】
以上の結果から、本発明に係るアルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲル及び滅菌されたヒドロゲルは、非常に優れた生体適合性を有しており、また、適切な膨潤性と真皮及び皮下組織の再生により優れた組織増大効果（シワ改善効果）を示し、さらに、市販の組織増大用充填剤に比べて、生体内においてより長く持続するので、組織増大用充填剤として效果的に使用できることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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