(57)【要約】  アルコール発酵プロセスにおいて、バイオマスに由来する油が、発酵ブロスからの、ブタノールなどの生成物アルコールの原位置除去のために利用可能な抽出剤へと化学的に転化される。油中のグリセリドは、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸グリコールエステル、および水酸化トリグリセリド、ならびにそれらの混合物などの反応生成物へと化学的に転化され得、これにより、生成物アルコールのためのバイオマスの油の分配係数より高い、生成物アルコールのための分配係数を有する発酵生成物抽出剤が形成される。アルコール発酵プロセスの原料に由来する油は、発酵生成物抽出剤へと化学的に転化され得る。油は、原料が発酵槽に供給される前に原料から分離され得、分離された油は、発酵生成物抽出剤に化学的に転化され得、次に、生成物アルコールを含む発酵生成物と接触され得、それによって、生成物アルコールは、発酵生成物から分離される。
2013533742.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料からアルコールを生成することが可能な組み換え微生物と；
アルコールと；
脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸エステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の抽出剤と
を含む組成物であって；
前記抽出剤が、前記原料から生成される組成物。
【請求項２】
前記抽出剤が、式Ｒ（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ’）（Ｒ”）の１種またはそれ以上の脂肪アミドを含み、式中、
Ｒが、独立して、１つまたはそれ以上の二重結合で場合により介在されるＣ３〜Ｃ２７のアルキル基からなる群から選択され、
Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素および１つまたはそれ以上のヒドロキシル基を場合により含むＣ１〜Ｃ６のアルキル基からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抽出剤は、式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＣＨＲ’ＣＨＲ”−ＯＨの１種またはそれ以上の脂肪酸エステルを含み、式中、
Ｒが、独立して、１つまたはそれ以上の二重結合で場合により介在されるＣ３〜Ｃ２７のアルキル基からなる群から選択され、
Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素およびＣ１〜Ｃ４のアルキル基からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抽出剤が、式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ’の１種またはそれ以上の脂肪酸エステルを含み、式中、
Ｒが、独立して、１つまたはそれ以上の二重結合で場合により介在されるＣ３〜Ｃ２７のアルキル基からなる群から選択され、
Ｒ’が、８個以下の炭素を有するアルキル基である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記抽出剤が、脂肪アミドの混合物であり、脂肪アミドの前記混合物が、リノレアミド、オレアミド、パルミトアミド、またはステアルアミドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抽出剤が、脂肪アミドと脂肪酸との混合物であり、脂肪アミドと脂肪酸との前記混合物が、リノレアミド、リノール酸、オレアミド、オレイン酸、パルミトアミド、パルミチン酸、ステアルアミド、またはステアリン酸を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記抽出剤が、水酸化トリグリセリド、アルコキシ化トリグリセリド、水酸化脂肪酸、アルコキシ化脂肪酸、水酸化脂肪アルコール、およびアルコキシ化脂肪アルコールから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記抽出剤が、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、飽和脂肪アルコール、不飽和脂肪アルコール、飽和脂肪アミド、不飽和脂肪アミド、飽和脂肪酸エステル、不飽和脂肪酸エステル、およびそれらの混合物から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記アルコールが、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記原料が、ライ麦、小麦、トウモロコシ、サトウキビ、大麦、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、またはそれらの混合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
抽出剤を生成するための方法であって：
油を含むバイオマスを提供する工程と；
脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸エステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される抽出剤へと前記油を化学的に転化することが可能な１種またはそれ以上の物質と前記油を接触させ、それによって、前記油の少なくとも一部が、前記抽出剤に転化される工程と
を含む方法。
【請求項１２】
前記１種またはそれ以上の物質が、水酸化アンモニウム水溶液、無水アンモニア、酢酸アンモニウム、アンモニア水、過酸化水素、トルエン、氷酢酸、リパーゼ、およびカチオン交換樹脂から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抽出剤が、前記油が抽出剤に転化される前の生成物アルコールのための前記油の分配係数より高い、前記生成物アルコールのための分配係数を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記生成物アルコールが、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記油を前記１種またはそれ以上の物質と接触させる工程の前に、前記バイオマスから前記油を分離する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記バイオマスが、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
生成物アルコールを生成するための方法であって：
（ａ）オリゴ糖および油を含むバイオマスを提供する工程と；
（ｂ）オリゴ糖を単糖類へと転化することが可能な糖化酵素と前記バイオマスを接触させる工程と；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の前記バイオマスから前記油を分離する工程と；
（ｄ）前記分離された油を、１種またはそれ以上の反応剤または溶媒と接触させて、抽出剤を形成する工程と；
（ｅ）前記単糖類を生成物アルコールに転化することが可能な組み換え微生物を含む発酵ブロスと前記バイオマスを接触させ、それによって、生成物アルコールが生成される工程と；
（ｆ）前記生成物アルコールを前記抽出剤と接触させる工程とを含み、
前記抽出剤が、前記生成物アルコールのための前記バイオマスの前記油の分配係数より高い、前記生成物アルコールのための分配係数を有する方法。
【請求項１８】
前記抽出剤が、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸エステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抽出剤が、式Ｒ（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ’）（Ｒ”）の１種またはそれ以上の脂肪アミドを含み、式中、
Ｒが、独立して、１つまたはそれ以上の二重結合で場合により介在されるＣ３〜Ｃ２７のアルキル基からなる群から選択され、
Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素および１つまたはそれ以上のヒドロキシル基を場合により含むＣ１〜Ｃ６のアルキル基からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抽出剤が、式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＣＨＲ’ＣＨＲ”−ＯＨの１種またはそれ以上の脂肪酸エステルを含み、式中、
Ｒが、独立して、１つまたはそれ以上の二重結合で場合により介在されるＣ３〜Ｃ２７のアルキル基からなる群から選択され、
Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素およびＣ１〜Ｃ４のアルキル基からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記抽出剤が、式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ’の１種またはそれ以上の脂肪酸エステルを含み、式中、
Ｒが、独立して、１つまたはそれ以上の二重結合で場合により介在されるＣ３〜Ｃ２７のアルキル基からなる群から選択され、
Ｒ’が、８個以下の炭素を有するアルキル基である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記抽出剤が、水酸化トリグリセリド、アルコキシ化トリグリセリド、水酸化脂肪酸、アルコキシ化脂肪酸、水酸化脂肪アルコール、およびアルコキシ化脂肪アルコールから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記抽出剤が、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、飽和脂肪アルコール、不飽和脂肪アルコール、飽和脂肪アミド、不飽和脂肪アミド、飽和脂肪酸エステル、不飽和脂肪酸エステル、およびそれらの混合物から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記１種またはそれ以上の反応剤または溶媒が、水酸化アンモニウム水溶液、無水アンモニア、酢酸アンモニウム、アンモニア水、過酸化水素、トルエン、氷酢酸、リパーゼ、およびカチオン交換樹脂から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記生成物アルコールが、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記油が、獣脂油、トウモロコシ油、キャノーラ油、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、ヒマシ油、ヤシ油、綿実油、魚油、ホホバ油、ラード、亜麻仁油、牛脚油、オイチシカ油、パーム油、ピーナッツ油、ナタネ油、米油、ベニバナ油、大豆油、ヒマワリ油、キリ油、ジャトロファ油、小麦油、ライ麦油、大麦油、および植物油ブレンドから選択される１種またはそれ以上の油を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
生成物アルコールを生成するための方法であって：
（ａ）発酵槽中で生成物アルコールを生成することが可能な組み換え微生物を含む発酵ブロスを提供し、それによって、生成物アルコールが生成される工程と；
（ｂ）前記発酵ブロスを抽出剤と接触させて、水相および有機相を含む二相混合物を形成する工程であって、前記有機相が、前記生成物アルコールおよび前記油を含むように、前記生成物アルコールおよび前記油が、前記有機相中に分配される工程と；
（ｃ）前記水相から前記有機相を分離する工程と；
（ｄ）前記有機相から前記生成物アルコールを分離する工程とを含み；
場合により工程（ｂ）および（ｃ）が同時に行われる方法。
【請求項２８】
前記抽出剤が、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸エステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抽出剤が、水酸化トリグリセリド、アルコキシ化トリグリセリド、水酸化脂肪酸、アルコキシ化脂肪酸、水酸化脂肪アルコール、およびアルコキシ化脂肪アルコールから選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抽出剤が、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、飽和脂肪アルコール、不飽和脂肪アルコール、飽和脂肪アミド、不飽和脂肪アミド、飽和脂肪酸エステル、不飽和脂肪酸エステル、およびそれらの混合物から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記生成物アルコールが、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
原料スラリーを生成する工程と；
（ｉ）水層、（ｉｉ）油層、および（ｉｉｉ）固体層を生成するように前記原料スラリーを分離する工程と；
前記水層を前記発酵槽に供給する工程と
をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸エステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される抽出剤へと前記油を化学的に転化することが可能な１種またはそれ以上の物質と前記油層の前記油を接触させ、それによって、前記油の少なくとも一部が、前記抽出剤に転化される工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記抽出剤が、前記生成物アルコールのための前記油層の前記油の分配係数より高い、前記生成物アルコールのための分配係数を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記生成物アルコールが、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記油が、獣脂油、トウモロコシ油、キャノーラ油、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、ヒマシ油、ヤシ油、綿実油、魚油、ホホバ油、ラード、亜麻仁油、牛脚油、オイチシカ油、パーム油、ピーナッツ油、ナタネ油、米油、ベニバナ油、大豆油、ヒマワリ油、キリ油、ジャトロファ油、小麦油、ライ麦油、大麦油、および植物油ブレンドから選択される１種またはそれ以上の油を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
抽出剤を生成するための方法であって：
油を含むバイオマスを提供する工程と；
前記油の少なくとも一部を、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸エステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される抽出剤へと転化する工程と
を含む方法。
【請求項３８】
前記油を抽出剤へと転化する工程が、テトラヒドロフランおよび水素化アルミニウムリチウムの存在下で前記油をインキュベートする工程；前記油を、水酸化ナトリウムを用いてインキュベートする工程；前記油を、硫酸およびメタノールを用いてインキュベートする工程；前記油を、酢酸アンモニウムの存在下で、無水アンモニアを用いてインキュベートする工程；前記油を、アンモニア水を用いてインキュベートする工程；前記油を、トルエン、カチオン交換樹脂、氷酢酸、リパーゼ、および過酸化水素と接触させる工程；前記油を高温条件下でインキュベートするか、または前記油を高圧条件下でインキュベートする工程のうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６，２９０号；２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４５１号；２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４３６号、２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４４４号；２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４２９号；２０１０年９月２日に出願された米国仮特許出願第６１／３７９，５４６号；および２０１１年２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／４４０，０３４号；２０１１年６月１５日に出願された米国特許出願第１３／１６０，７６６号の利益を主張するものであり；これらの内容全体が全て、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本出願に関連する配列表は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子書式で提出され、全体が参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本発明は、ブタノールなどの発酵アルコールの生成、特に抽出発酵用の抽出溶媒およびバイオマスに由来する油を抽出溶媒へと転化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ブタノールは、燃料添加剤として、プラスチック産業における原料化学物質として、ならびに食品および香料産業における食品グレードの抽出剤としての使用を含む様々な用途を有する重要な産業用化学物質である。したがって、ブタノールならびに効率的でかつ環境に優しい生成方法に対する高い需要がある。
【０００５】
微生物による発酵を用いたブタノールの生成は、１つの環境に優しい生成方法である。高収率でブタノールを生成するいくつかの微生物は、低いブタノール毒性閾値も有するため、ブタノールが生成されるにつれてブタノールを発酵槽から除去する必要がある。原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）（抽出発酵とも呼ばれる）は、ブタノールが生成されるにつれてブタノールを発酵槽から除去し、それによって、微生物が高収率でブタノールを生成することが可能になる。当該技術分野で説明されているＩＳＰＲのための１つの方法は、液液抽出（特許文献１）である。技術的および経済的に実行可能であるために、理想的に、液液抽出は、抽出剤中への生成物アルコールの効率的な物質移動のための抽出剤と発酵ブロスとの間の良好な接触；発酵ブロスからの抽出剤の良好な相分離（発酵中および発酵後）；抽出剤の効率的な回収および再利用；抽出剤が生成物アルコールを抽出する能力の低下が最小限であること（例えば、抽出剤中への生成物アルコールのための分配係数の低下を防ぐことによって）および長期間の運転にわたって分配係数を低下させる脂質による抽出剤の汚染が最小限であることを必要とする。
【０００６】
特に、抽出剤は、例えば、加水分解性でんぷんの原料として発酵槽に供給されるバイオマス中に存在する脂質の蓄積によって、再利用するごとに時間の経過とともに脂質により汚染され得る。例として、３０重量％の乾燥トウモロコシ固体で発酵槽に充填される液化トウモロコシマッシュが、同時糖化発酵（ＳＳＦ）（グルコースを生成するためのグルコアミラーゼの添加による発酵中に、液化されたマッシュの糖化が起こる）によるブタノールへのグルコースの転化の際に約１．２重量％のトウモロコシ油を含有する発酵ブロスをもたらし得る。ＩＳＰＲの際の抽出剤として働くオレイルアルコール（ＯＡ）へのトウモロコシ油脂質の溶解により、ＯＡの再利用ごとに脂質濃度が増加し、ＯＡ中の脂質濃度がＯＡの再利用ごとに増加するにつれて、ＯＡ中の生成物アルコールのための分配係数が低下され得る。
【０００７】
さらに、抽出発酵中の非溶解固体の存在は、アルコール生成の効率に悪影響を与え得る。例えば、非溶解固体の存在は、発酵槽の内部の物質移動係数を低下させることがあり、発酵槽中の相分離を妨げることがあり、抽出剤中の非溶解固体からのトウモロコシ油の蓄積を生じ、時間の経過とともに抽出効率の低下を招くことがあり、溶媒が固体に捕捉され、可溶物含有乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）として最終的に除去されるため、溶媒の損失を増加することがあり、発酵ブロスからの抽出剤液滴の離脱を遅くすることがあり、および／または発酵槽体積効率を低下させることがある。
【０００８】
抽出発酵に使用される抽出剤の分配係数の低下を抑えるためのいくつかの手法は、湿式粉砕、分画、および固体の除去を含んでいた。湿式粉砕は、各副産物から別々に価値を得るために、バイオマス（例えば、トウモロコシ）をその主要な構成要素の全て（胚芽、種皮繊維、でんぷん、およびグルテン）に分離する高コストの多工程プロセスである。このプロセスにより、精製されたでんぷん流が得られるが；このプロセスはコストがかかり、バイオマスを、発酵アルコール生成に不要なその非でんぷん構成要素に分離することを含む。分画により、磨砕された全粒トウモロコシ中に存在する脂質の大部分を含有する繊維および胚芽が除去され、より高いでんぷん（胚乳）含量を有するトウモロコシが得られる。乾式分画は、胚芽と繊維とを分離しないため、湿式粉砕よりコストが低い。しかしながら、分画は、繊維または胚芽の全体を除去せず、固体を完全に除去しない。さらに、分画の際にでんぷんをいくらか損失する。トウモロコシの湿式粉砕は、乾式分画よりさらにコストが高いが、乾式分画は、分画されていないトウモロコシの乾式磨砕よりコストが高い。例えば、２０１０年６月１８日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第６１／３５６，２９０号明細書に記載されるように、発酵に使用する前に、液化されたマッシュから、脂質を含有する胚芽を含む固体を除去すると、非溶解固体を実質的に除去することができる。しかしながら、非溶解固体の分画または除去さえ行わずに抽出剤の分配係数の低下を抑えることができれば有利であろう。したがって、抽出剤の分配係数の低下が抑えられた抽出発酵によって、ブタノールなどの生成物アルコールを生成するためのより効率的な方法およびシステムを開発することが引き続き必要とされている。
【０００９】
さらに、抽出剤（例えば、オレイルアルコール）は、通常、プロセス中の工程で生成されず、プロセスに加えられるため、抽出剤は原料コストである。抽出剤は、非発酵性固体上への吸着によって喪失され、プロセス中に導入される脂質によって希釈され得るため、アルコール生成プロセスの経済性は、抽出剤の回収および再利用の効率によって影響され得る。したがって、資本コストおよび／または運転コストを削減することによって、より経済的なプロセスを得ることができるＩＳＰＲのための代替的な抽出剤が引き続き必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ブタノールなどの生成物アルコールを生成するための方法であって、バイオマス中の脂質が、ＩＳＰＲに使用され得る抽出剤へと転化され、原料とともに、および／または抽出剤の再利用の際に発酵槽に供給される脂質の量が減少される方法を提供することによって、上記の必要性を満たす。本発明は、以下の実施形態の説明によって明らかになるようなさらなる関連する利点を提供する。
【００１２】
バイオマスに由来する脂質の、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸エステル、脂肪酸グリコールエステル、およびトリグリセリド、ならびにそれらの混合物を含む抽出剤（本明細書において、まとめて「脂肪酸抽出剤」と呼ばれる）への化学的転化により、ＩＳＰＲ抽出剤中に存在する脂質の量を減少させることができる。トリグリセリドは、水酸化またはアルコキシ化（例えば、メトキシ化、エトキシ化）され得る。脂肪酸抽出剤は、抽出剤相中へのイソブタノールなどの生成物アルコールの分配係数を脂質ほど低下させるとは予想されない。さらに、脂肪酸抽出剤は、ＩＳＰＲ抽出剤として使用することができる。脂肪酸抽出剤は、発酵槽に供給される発酵性炭素を供給するバイオマスに由来し得る。したがって、脂肪酸抽出剤は、アルコール生成プロセス中の工程において生成され、プロセス中に生成されない供給される外部からのＩＳＰＲ抽出剤（外部から供給されるオレイルアルコールなど）の代わりに、またはそれに加えて使用され得、それによって、ＩＳＰＲ抽出剤の原料コストを削減するかまたはなくすことさえできる。
【００１３】
さらに、抽出剤はまた、高温および／または高圧条件を用いて、バイオマスに由来する油または原料を脂肪酸へと転化することによって生成され得る。さらに、バイオマスに由来する油または原料は、１つ以上のリパーゼで処理されて、脂肪酸が生成されるか、または水素化に供されて、脂肪アルコールが生成され得る。
【００１４】
本発明は、原料からアルコールを生成することが可能な組み換え微生物と；アルコールと；脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸エステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の抽出剤とを含む組成物であって；抽出剤が、原料から生成される組成物に関する。一実施形態において、抽出剤は、脂肪アミドの混合物であり、さらなる実施形態において、脂肪アミドの混合物は、リノレアミド、オレアミド、パルミトアミド、またはステアルアミドを含む。別の実施形態において、抽出剤は、脂肪アミドと脂肪酸との混合物であり、さらなる実施形態において、脂肪アミドと脂肪酸との混合物は、リノレアミド、リノール酸、オレアミド、オレイン酸、パルミトアミド、パルミチン酸、ステアルアミド、またはステアリン酸を含む。一実施形態において、抽出剤は、水酸化トリグリセリド、アルコキシ化トリグリセリド、水酸化脂肪酸、アルコキシ化脂肪酸、水酸化脂肪アルコール、およびアルコキシ化脂肪アルコールから選択される。一実施形態において、トリグリセリドは、メトキシ化またはエトキシ化され得る。別の実施形態において、抽出剤は、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、飽和脂肪アルコール、不飽和脂肪アルコール、飽和脂肪アミド、不飽和脂肪アミド、飽和脂肪酸エステル、不飽和脂肪酸エステル、およびそれらの混合物から選択される。一実施形態において、抽出剤は、液体または固体であり得る。さらなる実施形態において、抽出剤は、ビーズの形態であり得る。一実施形態において、アルコールは、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールである。別の実施形態において、原料は、ライ麦、小麦、トウモロコシ、サトウキビ、大麦、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、またはそれらの混合物を含む。
【００１５】
一実施形態において、抽出剤は、式Ｒ（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ’）（Ｒ”）の１種以上の脂肪アミドを含み、式中、
Ｒが、独立して、１つ以上の二重結合で任意に介在されるＣ３〜Ｃ２７のアルキル基からなる群から選択され、
Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素および１つ以上のヒドロキシル基を任意に含むＣ１〜Ｃ６のアルキル基からなる群から選択される。
【００１６】
別の実施形態において、抽出剤は、式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＣＨＲ’ＣＨＲ”−ＯＨの１種以上の脂肪酸エステルを含み、式中、
Ｒが、独立して、１つ以上の二重結合で任意に介在されるＣ３〜Ｃ２７のアルキル基からなる群から選択され、
Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素およびＣ１〜Ｃ４のアルキル基からなる群から選択される。
【００１７】
一実施形態において、抽出剤は、式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ’の１種以上の脂肪酸エステルを含み、式中、
Ｒが、独立して、１つ以上の二重結合で任意に介在されるＣ３〜Ｃ２７のアルキル基からなる群から選択され、
Ｒ’が、８個以下の炭素を有するアルキル基である。
【００１８】
本発明は、抽出剤を生成するための方法であって、油を含むバイオマスを提供する工程と；脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸エステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される抽出剤へと油を化学的に転化することが可能な１種以上の物質と油を接触させ、それによって、油の少なくとも一部が、抽出剤に転化される工程とを含む方法に関する。一実施形態において、トリグリセリドは、水酸化またはアルコキシ化（例えば、メトキシ化、エトキシ化）され得る。一実施形態において、抽出剤は、液体または固体であり得る。さらなる実施形態において、抽出剤は、ビーズの形態であり得る。一実施形態において、本方法は、油を１種以上の物質と接触させる工程の前に、バイオマスから油を分離する工程をさらに含む。一実施形態において、１種以上の物質は、水酸化アンモニウム水溶液、無水アンモニア、酢酸アンモニウム、アンモニア水、過酸化水素、トルエン、氷酢酸、リパーゼ、およびカチオン交換樹脂から選択される。別の実施形態において、抽出剤は、油が抽出剤に転化される前に、生成物アルコールのための油の分配係数より高い、生成物アルコールのための分配係数を有する。一実施形態において、生成物アルコールは、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールである。別の実施形態において、バイオマスは、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物を含む。
【００１９】
本発明は、生成物アルコールを生成するための方法であって：（ａ）オリゴ糖および油を含むバイオマスを提供する工程と；（ｂ）オリゴ糖を単糖類へと転化することが可能な糖化酵素とバイオマスを接触させる工程と；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のバイオマスから油を分離する工程と；（ｄ）分離された油を、１種以上の反応剤または溶媒と接触させて、抽出剤を形成する工程と；（ｅ）単糖類を生成物アルコールに転化することが可能な組み換え微生物を含む発酵ブロスとバイオマスを接触させ、それによって、生成物アルコールが生成される工程と；（ｆ）生成物アルコールを抽出剤と接触させる工程とを含み、抽出剤が、生成物アルコールのためのバイオマスの油の分配係数より高い、生成物アルコールのための分配係数を有する方法にも関する。一実施形態において、１種以上の反応剤または溶媒は、水酸化アンモニウム水溶液、無水アンモニア、酢酸アンモニウム、アンモニア水、過酸化水素、トルエン、氷酢酸、リパーゼ、およびカチオン交換樹脂から選択される。一実施形態において、抽出剤は、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸エステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物から選択される。一実施形態において、抽出剤は、水酸化トリグリセリド、アルコキシ化トリグリセリド（例えば、メトキシ化、エトキシ化）、水酸化脂肪酸、アルコキシ化脂肪酸、水酸化脂肪アルコール、およびアルコキシ化脂肪アルコールから選択される。別の実施形態において、抽出剤は、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、飽和脂肪アルコール、不飽和脂肪アルコール、飽和脂肪アミド、不飽和脂肪アミド、飽和脂肪酸エステル、不飽和脂肪酸エステル、およびそれらの混合物から選択される。一実施形態において、抽出剤は、液体または固体であり得る。さらなる実施形態において、抽出剤は、ビーズの形態であり得る。一実施形態において、アルコールは、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールである。別の実施形態において、油は、獣脂油、トウモロコシ油、キャノーラ油、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、ヒマシ油、ヤシ油、綿実油、魚油、ホホバ油、ラード、亜麻仁油、牛脚油、オイチシカ油、パーム油、ピーナッツ油、ナタネ油、米油、ベニバナ油、大豆油、ヒマワリ油、キリ油、ジャトロファ油、小麦油、ライ麦油、大麦油、および植物油ブレンドから選択される１種以上の油を含む。
【００２０】
一実施形態において、抽出剤は、式Ｒ（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ’）（Ｒ”）の１種以上の脂肪アミドを含み、式中、
Ｒが、独立して、１つ以上の二重結合で任意に介在されるＣ３〜Ｃ２７のアルキル基からなる群から選択され、
Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素および１つ以上のヒドロキシル基を任意に含むＣ１〜Ｃ６のアルキル基からなる群から選択される。
【００２１】
別の実施形態において、抽出剤は、式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＣＨＲ’ＣＨＲ”−ＯＨの１種以上の脂肪酸エステルを含み、式中、
Ｒが、独立して、１つ以上の二重結合で任意に介在されるＣ３〜Ｃ２７のアルキル基からなる群から選択され、
Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素およびＣ１〜Ｃ４のアルキル基からなる群から選択される。
【００２２】
一実施形態において、抽出剤は、式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ’の１種以上の脂肪酸エステルを含み、式中、
Ｒが、独立して、１つ以上の二重結合で任意に介在されるＣ３〜Ｃ２７のアルキル基からなる群から選択され、
Ｒ’が、８個以下の炭素を有するアルキル基である。
【００２３】
本発明は、生成物アルコールを生成するための方法であって：（ａ）発酵槽中で生成物アルコールを生成することが可能な組み換え微生物を含む発酵ブロスを提供し、それによって、生成物アルコールが生成される工程と；（ｂ）発酵ブロスを抽出剤と接触させて、水相および有機相を含む二相混合物を形成する工程であって、有機相が、生成物アルコールおよび油を含むように、生成物アルコールおよび油が、有機相中に分離する工程と；（ｃ）水相から有機相を分離する工程と；（ｄ）有機相から生成物アルコールを分離する工程とを含み；任意に工程（ｂ）および（ｃ）が同時に行われる方法に関する。一実施形態において、本方法は、原料スラリーを生成する工程と；（ｉ）水層、（ｉｉ）油層、および（ｉｉｉ）固体層を生成するように原料スラリーを分離する工程と；水層を発酵槽に供給する工程とをさらに含む。別の実施形態において、本方法は、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸エステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される抽出剤へと油を化学的に転化することが可能な１種以上の物質と油層の油を接触させ、それによって、油の少なくとも一部が、抽出剤に転化されることをさらに含む工程をさらに含む。
【００２４】
一実施形態において、抽出剤は、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸エステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物から選択される。別の実施形態において、抽出剤は、水酸化トリグリセリド、アルコキシ化トリグリセリド（例えば、メトキシ化、エトキシ化）、水酸化脂肪酸、アルコキシ化脂肪酸、水酸化脂肪アルコール、およびアルコキシ化脂肪アルコールから選択される。一実施形態において、抽出剤は、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、飽和脂肪アルコール、不飽和脂肪アルコール、飽和脂肪アミド、不飽和脂肪アミド、飽和脂肪酸エステル、不飽和脂肪酸エステル、およびそれらの混合物から選択される。一実施形態において、抽出剤は、液体または固体であり得る。さらなる実施形態において、抽出剤は、ビーズの形態であり得る。一実施形態において、生成物アルコールは、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールである。別の実施形態において、抽出剤は、生成物アルコールのための油層の油の分配係数より高い、生成物アルコールのための分配係数を有する。一実施形態において、生成物アルコールは、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールである。別の実施形態において、油は、獣脂油、トウモロコシ油、キャノーラ油、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、ヒマシ油、ヤシ油、綿実油、魚油、ホホバ油、ラード、亜麻仁油、牛脚油、オイチシカ油、パーム油、ピーナッツ油、ナタネ油、米油、ベニバナ油、大豆油、ヒマワリ油、キリ油、ジャトロファ油、小麦油、ライ麦油、大麦油、および植物油ブレンドから選択される１種以上の油を含む。
【００２５】
ある実施形態において、発酵プロセスからバイオマスに由来する油を除去する方法は、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸グリコールエステル、トリグリセリドおよびそれらの混合物からなる群から選択される抽出剤へと油を化学的に転化することが可能な１種以上の物質と、所定の量の油を含むバイオマス原料流を接触させ、それによって、油の少なくとも一部が、抽出剤に転化される工程を含む。トリグリセリドは、水酸化またはアルコキシ化（例えば、メトキシ化、エトキシ化）され得る。抽出剤は、発酵アルコールのための油の分配係数より高い、発酵アルコールのための分配係数を有する。ある実施形態において、バイオマス原料流は、粉砕されたトウモロコシであり、油はトウモロコシ油である。ある実施形態において、本方法は、抽出剤を有するバイオマス原料流を、発酵アルコールを含む発酵ブロスと接触させる工程であって、発酵アルコールが抽出剤中に分離する工程も含む。
【００２６】
本発明は、抽出剤を生成するための方法であって、油を含むバイオマスを提供する工程と；油の少なくとも一部を、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸エステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される抽出剤へと転化する工程とを含む方法に関する。一実施形態において、油を抽出剤へと転化する工程は、テトラヒドロフランおよび水素化アルミニウムリチウムの存在下で油を培養する工程；油を、水酸化ナトリウムを用いて培養する工程；油を、硫酸およびメタノールを用いて培養する工程；油を、酢酸アンモニウムの存在下で、無水アンモニアを用いて培養する工程；油を、アンモニア水を用いて培養する工程；油を、トルエン、カチオン交換樹脂、氷酢酸、リパーゼ、および過酸化水素と接触させる工程；油を高温条件下で培養するか、または油を高圧条件下で培養する工程のうちの１つ以上を含む。
【００２７】
ある実施形態において、生成物アルコールの原位置除去のための抽出剤を生成する原位置方法は、（ａ）発酵性糖および油を含むバイオマスを提供する工程であって、油がトリグリセリドを含む工程と；（ｂ）バイオマスから（ａ）の油を分離する工程と；（ｃ）脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪アミドと脂肪酸との混合物、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸グリコールエステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される反応生成物を得るようにトリグリセリドを化学的に反応させることが可能な１種以上の反応剤または溶媒と、分離された油を接触させて、それによって、油中のトリグリセリドが、反応生成物へと転化される工程とを含む。トリグリセリドは、水酸化またはアルコキシ化（例えば、メトキシ化、エトキシ化）され得る。反応生成物は、生成物アルコールのためのバイオマスの油の分配係数より高い、生成物アルコールのための分配係数を有する発酵生成物抽出剤を形成する。
【００２８】
ある実施形態において、ブタノールを生成するための方法は、（ａ）オリゴ糖および油を含むバイオマスを提供する工程であって、油がグリセリドを含む工程と；（ｂ）オリゴ糖を単糖類へと転化することが可能な糖化酵素とバイオマスを接触させる工程と；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のバイオマスから油を分離する工程と；（ｄ）分離された油を、１種以上の反応剤または溶媒を含む組成物と接触させ、それによって、油中のグリセリドが抽出剤を形成する工程と；（ｅ）単糖類をブタノールに転化することが可能な組み換え微生物とバイオマスを接触させ、それによって、ブタノールを含む発酵生成物が生成される工程と；（ｆ）発酵生成物を、（ｄ）の抽出剤と接触させ、それによって、ブタノールが、発酵生成物から分離される工程とを含む。抽出剤は、ブタノールのためのバイオマスの油の分配係数より高い、ブタノールのための分配係数を有する。ある実施形態において、工程（ｄ）の抽出剤は、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪アミドと脂肪酸との混合物、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸グリコールエステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される。トリグリセリドは、水酸化またはアルコキシ化（例えば、メトキシ化、エトキシ化）され得る。
【００２９】
ある実施形態において、方法は、原料から生成物アルコールを生成するためのプロセス中の工程において、生成物アルコールのための植物由来油の分配係数より高い、生成物アルコールのための抽出剤分配係数を有する抽出剤に、植物由来油の少なくとも一部を転化する工程を含む。ある実施形態において、植物由来油は、上記の原料に由来する。
【００３０】
ある実施形態において、生成物アルコールはイソブタノールであり、抽出剤分配係数は少なくとも約０．２８である。ある実施形態において、イソブタノールのための抽出剤分配係数は少なくとも約１である。ある実施形態において、イソブタノールのための抽出剤分配係数は少なくとも約２である。
【００３１】
ある実施形態において、原料から生成物アルコールを生成するための方法は、（ａ）原料スラリーを生成する工程と；（ｂ）（ｉ）水層、（ｉｉ）油層、および（ｉｉｉ）固体層を含む生成物を生成するように（ａ）の原料スラリーを分離する工程と；（ｃ）（ｂ）の水層を発酵槽に供給する工程とを含む。ある実施形態において、原料スラリーを分離する工程が、遠心分離によって行われる。ある実施形態において、油層は植物由来油層である。ある実施形態において、本方法は、植物由来油層から植物由来油の少なくとも一部を得る工程をさらに含む。
【００３２】
ある実施形態において、本方法は、抽出剤を発酵槽に加えて、水相および生成物アルコール含有有機相を含む二相混合物を形成し、それによって、生成物アルコールが、生成物アルコール含有有機相中に分離する工程をさらに含む。
【００３３】
ある実施形態において、本方法は、水相の糖を発酵させて、生成物アルコールを生成し、それによって、生成物アルコールが、生成物アルコール含有有機相中に分離する工程をさらに含む。
【００３４】
ある実施形態において、発酵プロセスからバイオマスに由来する油を除去する方法は、（ａ）生成物アルコールおよびバイオマスに由来する油を含む発酵ブロスを提供する工程であって、油がグリセリドを含む工程と；（ｂ）発酵ブロスを抽出剤と接触させて、水相および有機相を含む二相混合物を形成する工程であって、有機相が、生成物アルコールおよび油を含むように、生成物アルコールおよび油が、有機相中に分離する工程と；（ｃ）水相から有機相を分離する工程と；（ｄ）有機相から生成物アルコールを分離する工程と；（ｅ）有機相を、１種以上の反応剤または溶媒を含む組成物と接触させ、それによって、油中のグリセリドが、さらなる抽出剤を形成する工程と；（ｆ）発酵ブロスを、工程（ｅ）のさらなる抽出剤と接触させることによって、工程（ｂ）を繰り返す工程とを含む。
【００３５】
ある実施形態において、さらなる抽出剤は、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸グリコールエステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される。トリグリセリドは、水酸化またはアルコキシ化（例えば、メトキシ化、エトキシ化）され得る。
【００３６】
ある実施形態において、生成物アルコールはブタノールである。
【００３７】
ある実施形態において、原位置発酵用の抽出剤を形成する組成物は、（ａ）バイオマスに由来する油と；（ｂ）脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸グリコールエステル、およびトリグリセリドからなる群から選択される１種以上の生成物へと油を化学的に転化することが可能な１種以上の物質と；（ｃ）組成物の約５０重量％〜約９９重量％の量である１種以上の生成物とを含む。トリグリセリドは、水酸化またはアルコキシ化（例えば、メトキシ化、エトキシ化）され得る。
【００３８】
ある実施形態において、組成物は、ブタノールを生成することが可能な組み換え微生物と、ブタノールと、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸グリコールエステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の溶媒とを含む。トリグリセリドは、水酸化またはアルコキシ化（例えば、メトキシ化、エトキシ化）され得る。
【００３９】
ある実施形態において、組成物は、ブタノールを生成することが可能な組み換え微生物、ブタノール、および脂肪アルコールを含む。
【００４０】
ある実施形態において、組成物は、ブタノールを生成することが可能な組み換え微生物、ブタノール、および脂肪アミドの混合物を含み、脂肪アミドの混合物は、リノレアミド、オレアミド、パルミトアミド、およびステアルアミドを含む。
【００４１】
ある実施形態において、組成物は、ブタノールを生成することが可能な組み換え微生物、ブタノール、およびトウモロコシ油を含む組成物を含み、トウモロコシ油は、約２８％〜約６７％水酸化される。
【００４２】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を成す添付の図面は、本発明を例示し、さらに、本明細書とともに、本発明の原理を説明し、関連技術分野の当業者が本発明を行い、使用できるようにする働きを果たす。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】脂質が、発酵の前に、液化されたバイオマスから除去され、除去された脂質が、抽出剤へと転化され、発酵槽に供給される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図２】脂質が、発酵の前に、液化され、糖化されたバイオマスから除去され、除去された脂質が、抽出剤へと転化され、発酵槽に供給される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図３】脂質が、バイオマスから除去され、抽出剤へと転化され、それが発酵槽に供給される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図４】バイオマス原料流中の脂質が、抽出剤へと転化され、発酵槽に供給される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図５】発酵槽を出る第１の抽出剤中に存在する脂質が、第１の抽出剤から分離され、第２の抽出剤へと転化され、それが発酵槽に供給される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、定義を含めて本出願が優先するものとする。また、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書に記載される全ての刊行物、特許、および他の参照文献は、あらゆる目的のために、全体が参照により本明細書に援用される。
【００４５】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義が、本明細書において提供される。
【００４６】
本明細書において使用される際の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはそれらの任意の他の活用形は、記載される整数または整数の群を包含するが、任意の他の整数または整数の群を除外しないことを意味することが理解されよう。例えば、要素の列挙を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるわけではなく、明示的に列挙されていないかあるいはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素を含み得る。さらに、相反する明示的な記載がない限り、「または」は、排他的な「または」ではなく包括的な「または」を指す。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のうちの１つによって満たされる：Ａが真であり（または存在する）かつＢが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在しない）かつＢが真である（または存在する）、ＡおよびＢの両方とも真である（または存在する）。
【００４７】
また、本発明の要素または構成要素の前にある不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、事例の数、すなわち、要素または構成要素の出現の数に関して限定されないことが意図される。したがって、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと読まれるべきであり、要素または構成要素の単数語形は、数値が単数であることを明白に意味しない限り、複数も含む。
【００４８】
本明細書において使用される際の「発明」または「本発明」の用語は、非限定的な用語であり、特定の発明の任意の１つの実施形態を指すことは意図されず、本出願に記載される考えられる全ての実施形態を包含する。
【００４９】
本明細書において使用される際の、用いられる本発明の成分または反応剤の量を修飾する「約」という用語は、例えば、現実の世界で濃縮物または溶液を作製するのに使用される典型的な測定および液体処理手順によって；これらの手順における不注意による誤りによって；組成物を作製するかまたは方法を行うのに用いられる成分の製造、供給源、または純度の差などによって起こり得る数量の変動を指す。「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物のための平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されているか否かにかかわらず、特許請求の範囲は、量に対する均等物を含む。一実施形態において、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内、あるいは報告される数値の５％以内を意味する。
【００５０】
本明細書において使用される際の「バイオマス」は、トウモロコシ、サトウキビ、小麦、セルロース系またはリグノセルロース系材料ならびにセルロース、ヘミセルロース、リグニン、でんぷん、オリゴ糖、二糖類および／または単糖類、およびそれらの混合物を含む材料などの天然資源に由来する任意の糖類およびでんぷんを含む発酵性糖を提供する加水分解性多糖類を含有する天然産物を指す。バイオマスは、タンパク質および／または脂質などのさらなる成分も含み得る。バイオマスは、１つの供給源に由来してもよく、またはバイオマスは、２つ以上の供給源に由来する混合物を含み得る。例えば、バイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシの茎葉との混合物、または草と葉との混合物を含み得る。バイオマスとしては、以下に限定はされないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙からの汚泥、庭ごみ、木くずおよび林業廃棄物が挙げられる。バイオマスの例としては、以下に限定はされないが、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物が挙げられる。例えば、マッシュ、絞り汁、糖蜜、または加水分解物が、粉砕、処理、および／または液化などによる発酵のためのバイオマスを処理するための当該技術分野において公知の任意の処理によって、バイオマスから形成され得、発酵性糖を含み、水を含み得る。例えば、セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスは、当業者に公知の任意の方法によって発酵性糖を含有する加水分解物を得るように処理され得る。低アンモニア前処理が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号明細書に開示されている。セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスの酵素的糖化は、通常、セルロースおよびヘミセルロースを分解して、グルコース、キシロース、およびアラビノースを含む糖類を含有する加水分解物を生成するために酵素群（ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）を利用する。（セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスに適した糖化酵素は、Ｌｙｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６６：５０６−５７７，２００２）に概説されている。
【００５１】
マッシュ、絞り汁、糖蜜、または加水分解物は、本明細書に記載される原料１２および原料スラリー１６を含み得る。水性原料流が、粉砕、処理、および／または液化などによる発酵のためのバイオマスを処理するための当該技術分野において公知の任意の処理によって、バイオマスから誘導または形成され得、発酵性炭素基質（例えば、糖）を含み、水を含み得る。水性原料流が、本明細書に記載される原料１２および原料スラリー１６を含み得る。
【００５２】
本明細書において使用される際の「原料」は、発酵プロセスにおける原料であって、非溶解固体を含むかまたは含まずに発酵性炭素源を含有し、該当する場合、発酵性炭素源がでんぷんから遊離されたかあるいは液化、糖化、または他のプロセスなどによるさらなる処理によって複合糖類を分解することから得られる前または後に発酵性炭素源を含有する原料を意味する。原料は、バイオマスを含むかまたはバイオマスに由来する。好適な原料としては、以下に限定はされないが、ライ麦、小麦、トウモロコシ、サトウキビ、大麦、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、またはそれらの混合物が挙げられる。「トウモロコシ油」に言及される場合、この用語が、本発明の他の実施形態において、所与の原料から生成される油を包含することが理解されよう。
【００５３】
本明細書において使用される際の「発酵ブロス」は、水と、糖類と、溶解固体と、任意にアルコールを生成する微生物と、生成物アルコールと、存在する微生物による、アルコール、水、および二酸化炭素（ＣＯ２）への糖類の反応によって生成物アルコールが作製される発酵槽中に保持される材料の全ての他の成分との混合物を意味する。場合により、本明細書において使用される際の「発酵培地」および「発酵された混合物」という用語は、「発酵ブロス」と同義に使用することができる。
【００５４】
本明細書において使用される際の「発酵性炭素源」または「発酵性炭素基質」は、発酵アルコールの生成について本明細書に開示される微生物によって代謝されることが可能な炭素源を意味する。好適な発酵性炭素源としては、以下に限定はされないが、グルコースまたはフルクトースなどの単糖類；ラクトースまたはスクロースなどの二糖類；オリゴ糖；でんぷんまたはセルロースなどの多糖類；一炭素基質；およびそれらの混合物が挙げられる。
【００５５】
本明細書において使用される際の「発酵性糖」は、発酵アルコールの生成について本明細書に開示される微生物によって代謝されることが可能な糖を指す。
【００５６】
本明細書において使用される際の「発酵槽」は、ブタノールなどの生成物アルコールが糖類から作製される発酵反応が行われる槽を意味する。
【００５７】
本明細書において使用される際の「液化槽」は、液化が行われる槽を意味する。液化は、オリゴ糖が原料から遊離されるプロセスである。原料がトウモロコシである、ある実施形態において、オリゴ糖は、液化中にトウモロコシでんぷん含有物から遊離される。
【００５８】
本明細書において使用される際の「糖化槽」は、糖化（すなわち、オリゴ糖の単糖類への分解）が行われる槽を意味する。発酵および糖化が同時に行われる場合、糖化槽および発酵槽は、同じ槽で１つであり得る。
【００５９】
本明細書において使用される際の「糖」は、オリゴ糖、二糖類、および／または単糖類を指す。
【００６０】
本明細書において使用される際の「糖化酵素」は、多糖類および／またはオリゴ糖、例えば、グリコーゲン、またはでんぷんのα−１，４−グルコシド結合を加水分解することが可能な１種以上の酵素を意味する。糖化酵素は、セルロース系またはリグノセルロース系材料を加水分解することが可能な酵素も含み得る。
【００６１】
本明細書において使用される際の「非溶解固体」は、原料の非発酵性部分、例えば、胚芽、繊維、およびグルテンを意味する。
【００６２】
本明細書において使用される際の「生成物アルコール」は、発酵性炭素基質の供給源としてバイオマスを用いる発酵プロセスにおいて微生物によって生成され得る任意のアルコールを指す。生成物アルコールとしては、以下に限定はされないが、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールが挙げられる。ある実施形態において、生成物アルコールはＣ２〜Ｃ８のアルキルアルコールである。他の実施形態において、生成物アルコールはＣ２〜Ｃ５のアルキルアルコールである。Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールとしては、以下に限定はされないが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、およびペンタノールが挙げられることが理解されよう。同様に、Ｃ２〜Ｃ８のアルキルアルコールとしては、以下に限定はされないが、エタノール、プロパノール、ブタノール、およびペンタノールが挙げられる。「アルコール」はまた、生成物アルコールに関連して本明細書において使用される。
【００６３】
本明細書において使用される際の「ブタノール」は、特に、ブタノール異性体１−ブタノール（１−ＢｕＯＨ）、２−ブタノール（２−ＢｕＯＨ）、および／またはイソブタノール（ｉＢｕＯＨまたはＩ−ＢＵＯＨ、２−メチル−１−プロパノールとしても知られている）を、個々にまたはそれらの混合物として指す。
【００６４】
本明細書において使用される際の「プロパノール」は、プロパノール異性体イソプロパノールまたは１−プロパノールを指す。
【００６５】
本明細書において使用される際の「ペンタノール」は、ペンタノール異性体１−ペンタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、３−ペンタノール、２−ペンタノール、３−メチル−２−ブタノール、または２−メチル−２−ブタノールを指す。
【００６６】
本明細書において使用される際の「アルコール当量」という用語は、所定の量のアルコールエステルの完全な加水分解および回収によって得られるであろうアルコールの重量を指す。
【００６７】
本明細書において使用される際の「水相力価」という用語は、発酵ブロス中の特定のアルコール（例えば、ブタノール）の濃度を指す。
【００６８】
本明細書において使用される際の「有効力価」という用語は、発酵によって生成される特定のアルコール（例えば、ブタノール）または発酵培地のリットル当たりの、アルコールエステル化によって生成されるアルコールエステルのアルコール当量の総量を指す。例えば、発酵の単位体積におけるブタノールの有効力価は：（ｉ）発酵培地中のブタノールの量；（ｉｉ）有機抽出剤から回収されるブタノールの量；（ｉｉｉ）ガスストリッピングが使用される場合、気相から回収されるブタノールの量；および（ｉｖ）有機相または水相中のブタノールエステルのアルコール当量を含む。
【００６９】
本明細書において使用される際の「原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）」は、生成物が生成される際に、生物学的プロセスにおける生成物濃度を制御するために、発酵などの生物学的プロセスから特定の発酵生成物を選択的に除去することを意味する。
【００７０】
本明細書において使用される際の「抽出剤」または「ＩＳＰＲ抽出剤」は、ブタノール異性体などの任意の生成物アルコールを抽出するのに使用される有機溶媒を意味する。抽出剤は、発酵温度において固体または液体であり得る。場合により、本明細書において使用される際の「溶媒」という用語は、「抽出剤」と同義に使用することができる。
【００７１】
本明細書において使用される際の「脂肪酸抽出剤」は、天然油中のグリセリドを、１種以上の溶媒または反応剤と化学的に反応させて、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸グリコールエステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される１種以上の反応生成物を得ることによって、天然油から誘導される抽出剤を意味する。トリグリセリドは、水酸化またはアルコキシ化（例えば、メトキシ化、エトキシ化）され得る。
【００７２】
本明細書において使用される際の「天然油」は、植物（例えば、バイオマス）または動物から得られる脂質を指す。本明細書において使用される際の「植物由来油」は、特に植物から得られる脂質を指す。場合により、「脂質」は、「油」および「グリセリド」と同義に使用することができる。天然油としては、以下に限定はされないが、獣脂、トウモロコシ油、キャノーラ油、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、ヒマシ油、ヤシ油、綿実油、魚油、ホホバ油、ラード、亜麻仁油、牛脚油、オイチシカ油、パーム油、ピーナッツ油、ナタネ油、米油、ベニバナ油、大豆油、ヒマワリ油、キリ油、ジャトロファ油、および植物油ブレンドが挙げられる。
【００７３】
本明細書において使用される際の「脂肪酸」という用語は、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２８の炭素原子（最も一般的にはＣ１２〜Ｃ２４の炭素原子）を有するカルボン酸（例えば、脂肪族モノカルボン酸）を指す。脂肪酸はまた、分枝鎖状または非分枝鎖状であってもよい。脂肪酸は、動物性または植物性脂肪、油、またはワックスに由来するか、あるいはそれらの中にエステル化された形態で含まれ得る。脂肪酸は、脂肪および脂肪油中のグリセリドの形態で天然に存在するものであってもよく、あるいは脂肪の加水分解によってまたは合成によって得られる。脂肪酸という用語は、単一の化学種または脂肪酸の混合物を表し得る。さらに、脂肪酸という用語は、遊離脂肪酸も包含する。
【００７４】
本明細書において使用される際の「脂肪アルコール」という用語は、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２２の炭素原子の脂肪族長鎖を有するアルコールを指す。
【００７５】
本明細書において使用される際の「脂肪アルデヒド」という用語は、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２２の炭素原子の脂肪族長鎖を有するアルデヒドを指す。
【００７６】
本明細書において使用される際の「脂肪アミド」という用語は、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２２の炭素原子の脂肪族長鎖を有するアミドを指す。
【００７７】
本明細書において使用される際の「脂肪酸エステル」という用語は、飽和または不飽和のいずれかである、Ｃ４〜Ｃ２２の炭素原子の脂肪族長鎖を有するエステルを指す。
【００７８】
「水不混和性」という用語は、１つの液相を形成するように、発酵ブロスなどの水溶液と混合することができない抽出剤または溶媒などの化学成分を指す。
【００７９】
本明細書において使用される際の「水相」という用語は、発酵ブロスを水不混和性有機抽出剤と接触させることによって得られる二相混合物の水相を指す。発酵抽出を含む本明細書に記載されるプロセスの一実施形態において、「発酵ブロス」という用語は、この場合、二相性発酵抽出における水相を特に指す。
【００８０】
本明細書において使用される際の「有機相」という用語は、発酵ブロスを水不混和性有機抽出剤と接触させることによって得られる二相混合物の非水相を指す。
【００８１】
本明細書において使用される際の「分離」という用語は、「回収」と同義であり、初期混合物から化学化合物を除去して、初期混合物中の化合物の純度または濃度より高い純度またはより高い濃度の化合物を得ることを指す。
【００８２】
本明細書において使用される際の「組み換え微生物」は、例えば、ブタノールなどのアルコールを生成するための生合成経路などの生合成経路を含むように宿主細胞を改変することによる、組み換えＤＮＡ技術の使用によって改変される、細菌または酵母などの微生物を指す。
【００８３】
本発明は、バイオマスに由来する油の化学的転化によって得られる抽出剤および抽出剤を生成する方法を提供する。特に、油中のグリセリドは、本明細書において、まとめて脂肪酸抽出剤と呼ばれる、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸グリコールエステル、およびトリグリセリド、ならびにそれらの混合物を含む１種以上の生成物へと化学的に転化され得る。トリグリセリドは、水酸化またはアルコキシ化（例えば、メトキシ化、エトキシ化）され得る。脂肪酸抽出剤は、発酵ブロスからの、ブタノールなどの生成物アルコールの原位置除去のための抽出剤として働き得る。したがって、本発明は、バイオマス油から生成された抽出剤を用いた抽出発酵によって、ブタノールなどの生成物アルコールを生成するための方法も提供する。本発明は、原料に由来する油を分離することによって、アルコール発酵プロセスから油を除去するための方法も提供する。原料は、油の除去のまえに、液化されて、スラリーが形成され得る。したがって、スラリーは、発酵性炭素源、油、および非溶解固体を含む。油、およびある実施形態において、非溶解固体は、スラリーが発酵槽に供給される前にスラリーから除去され得る。油およびある実施形態において、非溶解固体の除去により、発酵槽中の油（およびある実施形態において固体）の存在に起因する経時的な抽出剤の分配係数の減少、低下を抑えることができる。さらに、分離された油は、脂肪酸抽出剤へと化学的に転化され得、それが発酵槽に供給され得る。脂肪酸抽出剤は、発酵アルコールのための油の分配係数より高い、発酵アルコールのための分配係数を有し得る。さらに、脂肪酸抽出剤は、本発明の方法にしたがって上記原料から化学的に転化されなかったオレイルアルコールなどの市販の外部からの抽出剤の代わりにまたはそれに加えて使用され得る。したがって、本発明の方法により、原料に由来する油の化学的転化によって、発酵プロセス中の工程において抽出剤を生成することによって、外部からの抽出剤に関連する原料コストを削減することができる。
【００８４】
本発明は、図を参照して説明される。図１は、本発明の一実施形態に係る発酵アルコールの生成のための例示的なプロセス流れ図を示す。図示されるように、原料１２は、液化槽１０の入口に導入され、液化されて、原料スラリー１６が生成され得る。原料１２は、発酵性炭素源（例えば、グルコースなどの発酵性糖）を供給する加水分解性でんぷんを含有し、以下に限定はされないが、ライ麦、小麦、トウモロコシ、サトウキビ、大麦、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、またはそれらの混合物などのバイオマスであり得、あるいはバイオマスに由来し得る。ある実施形態において、原料１２は、分画されたバイオマスの１つ以上の成分であり得、他の実施形態において、原料１２は、粉砕された、分画されていないバイオマスであり得る。ある実施形態において、原料１２は、乾式粉砕された、分画されていないトウモロコシの実などのトウモロコシであり得、非溶解粒子は、胚芽、繊維、およびグルテンを含み得る。非溶解固体は、原料１２の非発酵性部分である。図に示される実施形態を参照した本明細書における説明のために、原料１２は、非溶解固体が分離されていない、粉砕された、分画されていないトウモロコシであるものとして説明されることが多い。しかしながら、当業者に明らかなように、本明細書に記載される例示的な方法およびシステムは、分画されるか否かにかかわらず様々な原料向けに変更することができることを理解されたい。ある実施形態において、原料１２は、高オレイン酸トウモロコシであり得るため、それに由来するトウモロコシ油は、少なくとも約５５重量％のオレイン酸のオレイン酸含量を有する高オレイン酸トウモロコシ油である。ある実施形態において、約２４重量％である通常のトウモロコシ油中のオレイン酸含量と比較して、高オレイン酸トウモロコシ油中のオレイン酸含量は、最大で約６５重量％であり得る。油の加水分解により、発酵ブロスと接触させるための高いオレイン酸含量を有する脂肪酸抽出剤を得ることができるため、高オレイン酸油は、本発明の方法に使用するのにいくつかの利点を提供し得る。ある実施形態において、脂肪酸またはその混合物は、不飽和脂肪酸を含む。不飽和脂肪酸の存在は、融点を低下させ、取り扱いの際の利点を提供する。不飽和脂肪酸のうち、単不飽和であるもの、すなわち、１つの炭素−炭素二重結合を有するものが、プロセス検討の際に好適な熱安定性および酸化安定性を犠牲にせずに融点に関する利点を提供し得る。
【００８５】
原料１２を液化するプロセスは、原料１２中のでんぷんを、例えば、デキストリンおよびオリゴ糖を含む糖類へと加水分解することを含み、従来のプロセスである。酸プロセス、酸−酵素プロセス、または酵素プロセスを含むがこれらに限定されない、当業界で通常用いられる任意の公知の液化プロセス、ならびに対応する液化槽が使用され得る。このようなプロセスは、単独でまたは組み合わせて使用され得る。ある実施形態において、酵素プロセスを用いることができ、適切な酵素１４、例えば、α−アミラーゼが、液化槽１０の入口に導入される。水も液化槽１０に導入することができる。
【００８６】
原料１２の液化から生成される原料スラリー１６は、原料に由来する糖、油、および非溶解固体を含む。原料スラリー１６は、液化槽１０の出口から排出され得る。ある実施形態において、原料１２は、トウモロコシまたはトウモロコシの実であるため、原料スラリー１６はトウモロコシマッシュスラリーである。
【００８７】
原料スラリー１６は、原料スラリー１６中に存在する油の一部、または好ましくは実質的に全てを除去するように構成される分離器２０の入口に導入される。除去された油は、流れ２６として反応槽４０に提供され、糖および水を含む残りの原料は、水流２２として発酵槽３０に排出される。水流２２は、スラリー１６の非溶解固体を含み得るが、油２６が分離器２０によって除去されたため、発酵槽３０中の発酵ブロスには、減少された量の油が残っている。分離器２０から排出される油流２６は、所定の量のグリセリド、特にトリグリセリドを有し、それが、反応槽４０中で１種以上の物質４２と接触される。物質４２は、油２６中のグリセリドの少なくとも一部を脂肪酸抽出剤２８へと化学的に転化することが可能な反応剤または溶媒である。ある実施形態において、物質４２によるグリセリドの化学的転化からの油中の脂肪酸抽出剤２８の量は、少なくとも約１７重量％、少なくとも約２０重量％、少なくとも約３０重量％、少なくとも約４０重量％、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約６５重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約７５重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約８５重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、または少なくとも約９９重量％であり得る。
【００８８】
分離器２０は、以下に限定はされないが、サイフォニング、吸入、デカンテーション、遠心分離、重力沈降器の使用、膜支援相分離などを含む、水性原料流から油を除去するための、当該技術分野において公知の任意の好適な分離器であり得る。ある実施形態において、分離器２０は、原料スラリー１６中の非溶解固体も除去し、非溶解固体を固相またはウェットケーキ２４として排出し得る。例えば、ある実施形態において、分離器２０は、フィルタープレス、真空ろ過、または原料スラリー１６から非溶解固体を分離するための遠心分離機を含み得る。例えば、ある実施形態において、分離器２０は、糖および水を含有する水層（すなわち、流れ２２）、非溶解固体を含有する固体層（すなわち、ウェットケーキ２４）、および油層（すなわち、油流２６）を含む遠心分離生成物を生成するように原料スラリー１６を撹拌または回転させるトリカンター（ｔｒｉｃａｎｔｅｒ）遠心分離機２０を含む。スラリー１６がトウモロコシマッシュスラリーである場合、油は２６は、フリートウモロコシ油（ｆｒｅｅ  ｃｏｒｎ  ｏｉｌ）である。本明細書において使用される際のフリートウモロコシ油という用語は、トウモロコシの胚芽を含まないトウモロコシ油を意味する。原料スラリー１６としてのトウモロコシマッシュスラリーについて、ウェットケーキ２４は、原料スラリー中に存在する少なくとも約５０重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約５５重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約６０重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約６５重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約７０重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約７５重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約８０重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約８５重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約９０重量％の非溶解粒子、原料スラリー中に存在する少なくとも約９５重量％の非溶解粒子、または原料スラリー中に存在する約９９重量％の非溶解粒子を含む。
【００８９】
ウェットケーキ２４が、遠心分離機２０によって除去される場合、ある実施形態において、原料がトウモロコシである場合トウモロコシ油などの原料１２に由来する油の一部が、ウェットケーキ２４中に残る。このような場合、ウェットケーキ２４は、ウェットケーキ２４の乾燥固形分の約２０重量％未満の量のトウモロコシ油を含む。ウェットケーキ２４は、遠心分離機２０の底部の近くに位置する出口から排出され得る。ウェットケーキ２４は、発酵性炭素の一部および水も含み得る。水溶液２２が遠心分離機２０から排出されてから、ウェットケーキ２４は、遠心分離機においてさらなる水で洗浄され得る。ウェットケーキ２４の洗浄により、ウェットケーキ中に存在する糖（例えば、オリゴ糖）を回収し、回収された糖および水は、液化槽１０に再利用され得る。洗浄後、ウェットケーキ２４は、任意の好適な公知の方法によって、乾燥されて、可溶物含有乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）が形成され得る。遠心分離機２０において形成されるウェットケーキ２４からのＤＤＧＳの形成にはいくつかの利点がある。非溶解固体が発酵槽に送られず、ＤＤＧＳは、捕捉された抽出剤および／またはブタノールなどの生成物アルコールを有さないため、発酵槽の条件に供されず、発酵槽中に存在する微生物と接触しない。これらの利点により、例えば動物飼料としてのＤＤＧＳの処理および販売が容易になる。遠心分離によって原料１６から非溶解固体を除去するための方法およびシステムが、全体が参照により本明細書に援用される、２０１０年６月１８日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第６１／３５６，２９０号明細書に詳細に記載されている。
【００９０】
ある実施形態において、油２６は、ウェットケーキ２４から別々に排出されず、むしろ、油２６は、ウェットケーキ２４の一部として含まれ、最終的にＤＤＧＳ中に存在する。このような場合、油は、ＤＤＧＳから分離され、同じかまたは異なるアルコール発酵プロセスにおいてその後の使用のために脂肪酸抽出剤に転化され得る。いずれの場合も、発酵槽中に存在する油が、ＩＳＰＲ抽出剤を希釈し得、有機相中への発酵アルコールの分配係数を低下させ得るため、原料の油成分の除去が、ブタノール生成などのアルコール生成に有利である。また、油は、脂肪酸およびグリセリンへと分解され得、それが水中に蓄積し、システム全体を通して再利用のために利用可能な水の量を減少させ得る。したがって、原料の油成分の除去により、システムを通して再利用され得る水の量を増加させることによって、生成物アルコール生成の効率を高めることもできる。
【００９１】
水流２２および微生物３２が、発酵槽３０中に保持される発酵ブロスに含まれるべく発酵槽３０に導入される。発酵槽３０は、水流２２を発酵させて、ブタノールなどの生成物アルコールを生成するように構成される。特に、微生物３２は、スラリー１６中の発酵性糖を代謝し、生成物アルコールを排出する。微生物３２は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌、および酵母からなる群から選択される。ある実施形態において、微生物３２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌であり得る。ある実施形態において、微生物３２は、発酵性組み換え微生物であり得る。水溶液２２は、例えばオリゴ糖の形態の糖、および水を含んでいてもよく、約２０ｇ／Ｌ未満のモノマーグルコース、より好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満または約５ｇ／Ｌ未満のモノマーグルコースを含み得る。モノマーグルコースの量を決定するための好適な方法は、当該技術分野において周知である。当該技術分野において公知のこのような好適な方法は、ＨＰＬＣを含む。
【００９２】
ある実施形態において、流れ２２中の複合糖類（例えば、オリゴ糖）を、微生物３２によって容易に代謝され得る単糖類へと分解するために、水流２２が、糖化プロセスに供される。酸プロセス、酸−酵素プロセス、または酵素プロセスを含むがこれらに限定されない、当業界で通常用いられる任意の公知の糖化プロセスが使用され得る。ある実施形態において、同時糖化発酵（ＳＳＦ）は、発酵槽３０の内部で行われ得る。ある実施形態において、でんぷんを、微生物３２によって代謝可能なグルコースに分解するために、グルコアミラーゼなどの酵素３８が、発酵槽３０の入口に導入され得る。
【００９３】
原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）を用いて、生成物アルコールが微生物３２によって生成されるにつれて、生成物アルコールを発酵槽３０から除去することができる。抽出発酵では、このようなＩＳＰＲは液液抽出を含む。液液抽出は、開示内容の全体が、本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書に記載される方法にしたがって行われ得る。米国特許出願公開第２００９／０３０５３７号明細書には、抽出発酵を用いて発酵ブロスからブタノールを生成し、回収するための方法が記載され、この方法は、発酵ブロスを水不混和性抽出剤と接触させる工程を含む。通常、抽出剤は、水相および有機相を含む二相混合物を形成するための、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪アミドと脂肪酸との混合物、脂肪酸のエステル、脂肪アルデヒド、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸グリコールエステル、トリグリセリドおよびそれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であり得る。図１の実施形態を参照すると、発酵槽３０は、槽４０からの脂肪酸抽出剤２８を含む１種以上の水不混和性ＩＳＰＲ抽出剤を受け入れるための１つ以上の入口を有する。脂肪酸抽出剤２８は、発酵ブロスと接触し、水相および有機相を含む二相混合物を形成する。発酵ブロス中に存在する生成物アルコールは、有機相中に分離する。二相混合物は、流れ３９として発酵槽３０から除去され、槽３５に導入され得、その中で、水相および有機相の分離が行われて、アルコール含有有機相３６および水相３４が生成される。アルコール含有有機相３６は、以下に限定はされないが、サイフォニング、デカンテーション、遠心分離、重力沈降器の使用、膜支援相分離などを含む当該技術分野において公知の方法を用いて、二相混合物３９の水相３４から分離される。水相３４の全てまたは一部が、発酵培地（図示される）として発酵槽３０中に再利用されるか、あるいは廃棄され、新しい培地と交換されるか、または残っている生成物アルコールを除去するために処理され、次に発酵槽３０へと再利用され得る。アルコール含有有機相３６は、生成物アルコールを回収するように処理され、次に、得られたアルコール希薄抽出剤が、生成物アルコールのさらなる抽出のために、通常、新鮮な補給（ｍａｋｅ−ｕｐ）抽出剤２８と通常組み合わされて、発酵槽３０中に戻されて再利用され得る（図示せず）。あるいは、新鮮な抽出剤２８は、二相混合物流３９中で除去された抽出剤の代わりに発酵槽に連続して加えられ得る。
【００９４】
ある実施形態において、図３〜５の実施形態に示される抽出剤２９などの１種以上のさらなるＩＳＰＲ抽出剤は、発酵槽３０に導入されて、水相および有機相を含む二相混合物が形成され得、生成物アルコールは、有機相中に分離する。このような１種以上のさらなる抽出剤２９は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、１−ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリン酸アルデヒド、２０−メチルウンデカナール、およびそれらの混合物などの別の脂肪酸抽出剤および／または外部からの有機抽出剤であり得る。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、カルボン酸であり得、ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、遊離脂肪酸であり得る。ある実施形態において、カルボン酸または遊離脂肪酸は、４〜２８個の炭素、他の実施形態において４〜２２個の炭素、他の実施形態において８〜２２個の炭素、他の実施形態において１０〜２８個の炭素、他の実施形態において７〜２２個の炭素、他の実施形態において１２〜２２個の炭素、他の実施形態において４〜１８個の炭素、他の実施形態において１２〜２２個の炭素、さらに他の実施形態において１２〜１８個の炭素の鎖を有し得る。
【００９５】
ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、以下の脂肪酸：アゼライン酸、カプリン酸、カプリル酸、ヒマシ油、ヤシ油（すなわち、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、カプリル酸、カプリン酸、ステアリン酸、カプロン酸、アラキジン酸、オレイン酸、およびリノール酸を含む脂肪酸の天然に存在する組合せとして）、二量体酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、亜麻仁油、ミリスチン酸、オレイン酸、パーム油、パルミチン酸、パーム核油、ペラルゴン酸、リシノール酸、セバシン酸、大豆油、ステアリン酸、トール油、獣脂、および＃１２ヒドロキシステアリン酸のうちの１つ以上である。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、二酸、例えば、アゼライン酸およびセバシン酸のうちの１つ以上である。したがって、ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、２種以上の異なる脂肪酸の混合物であり得る。ある実施形態において、ＩＳＰＲ抽出剤２９は、例えば、２０１０年７月２８日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第６１／３６８，４４４号明細書に記載されるバイオマス脂質などの天然油の酵素加水分解から生成される遊離脂肪酸であり得る。このような実施形態において、抽出剤２９を生成するためのバイオマス脂質は、原料１２が得られる同じかまたは異なるバイオマス源に由来し得る。例えば、ある実施形態において、抽出剤２９を生成するためのバイオマス脂質は、大豆に由来し得るが、原料１２のバイオマス源はトウモロコシである。当業者に明らかであるはずであるように、原料１２に対する抽出剤２９のための異なるバイオマス源の考えられるあらゆる組合せを使用することができる。
【００９６】
図１の実施形態において、生成物アルコールは、発酵ブロスから原位置で抽出され、二相混合物３９の分離が、別個の槽３５で起こる。原位置抽出発酵は、発酵槽３０中でバッチモードまたは連続モードで行われ得る。原位置抽出発酵では、有機抽出剤を、発酵の開始時点で発酵培地と接触させ、二相発酵培地を形成することができる。あるいは、微生物が所望の量の増殖（培地の光学密度を測定することによって決定され得る）を達成した後、有機抽出剤を発酵培地と接触させることができる。さらに、発酵培地中の生成物アルコールレベルが、予め選択したレベルに達した時点で、有機抽出剤を発酵培地と接触させることができる。例えば、ブタノール生成の場合、ブタノール濃度が、有毒なレベルに達する前の時点で、ＩＳＰＲ抽出剤を発酵培地と接触させることができる。発酵培地をＩＳＰＲ抽出剤と接触させた後、ブタノール生成物が抽出剤中に分離し、微生物を含有する水相中のブタノールの濃度が低下し、それによって、抑制性のブタノール生成物への生成微生物の曝露が抑えられる。
【００９７】
使用されるＩＳＰＲ抽出剤の体積は、後述されるように、発酵培地の体積、発酵槽のサイズ、ブタノール生成物のための抽出剤の分配係数、および選択される発酵モードを含むいくつかの要因に応じて決まる。抽出剤の体積は、発酵槽の使用体積の約３％〜約６０％であり得る。抽出の効率に応じて、発酵培地中のブタノールの水相力価は、例えば、約５ｇ／Ｌ〜約８５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌまたは約２０ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌであり得る。理論に制約されるものではないが、より高いブタノール力価は、抽出発酵方法を用いて、発酵培地から毒性ブタノール生成物を除去し、それによって、微生物に対して有毒なレベルより低いレベルを保つことから得られると考えられる。
【００９８】
原位置抽出発酵のバッチモードにおいて、所定の体積の有機抽出剤が発酵槽に加えられ、抽出剤は、プロセス中に除去されない。このモードは、発酵培地中の抑制性のブタノール生成物の濃度を最小限に抑えるために、より大きい体積の有機抽出剤を必要とする。その結果、発酵培地の体積は、より小さく、生成される生成物の量は、連続モードを用いて得られる量より少ない。例えば、バッチ式モードにおける抽出剤の体積は、一実施形態において発酵槽の使用体積の２０％〜約６０％であり、別の実施形態において約３０％〜約６０％であり得る。
【００９９】
ガスストリッピング（図示せず）を、有機抽出剤と同時に用いて、生成物アルコールを発酵培地から除去することができる。
【０１００】
ある実施形態において、二相混合物の分離は、後述される図４および５の実施形態に示されるように、発酵槽で行うことができる。特に、原位置抽出発酵の連続モードにおいて、一実施形態において、抽出剤２８は、発酵槽３０に導入されて、その中で二相混合物が得られ、アルコール含有有機相流３６が、発酵槽３０から直接出る。水相流３４も発酵槽３０から直接出ることができ、一切の残っている生成物アルコールを除去するために処理され、再利用され、または廃棄され、新しい発酵培地と交換され得る。ＩＳＰＲ抽出剤によるアルコール生成物の抽出は、発酵ブロスからの微生物３２の除去を伴うかまたは伴わずに行うことができる。微生物３２は、以下に限定はされないが、ろ過または遠心分離を含む、当該技術分野において公知の手段によって、発酵ブロスから除去され得る。例えば、水相流３４は、酵母などの微生物３２を含み得る。微生物３２は、例えば、遠心分離機（図示せず）において、水相流から容易に分離され得る。その後、微生物３２は、発酵槽３０に再利用することができ、発酵槽３０は、時間の経過とともにアルコール生成の生成速度を上げ、それによって、アルコール生成の効率を高めることができる。
【０１０１】
原位置抽出発酵の連続モードにおいて、抽出剤の体積は、一実施形態において発酵槽の使用体積の約３％〜約５０％であり、別の実施形態において約３％〜約３０％であり、別の実施形態において３％〜約２０％であり；別の実施形態において３％〜約１０％であり得る。生成物は、反応器から連続して除去されるため、より小さい体積の抽出剤が必要とされ、より大きい体積の発酵培地の使用が可能になる。
【０１０２】
原位置抽出発酵の代わりとして、生成物アルコールは、発酵槽３０の下流の発酵ブロスから抽出され得る。このような場合、発酵ブロスは、発酵槽３０から除去され、槽３５に導入され得る。次に、抽出剤２８は、槽３５に導入され、発酵ブロスと接触されて、槽３５中で二相混合物３９が得られ、次に、これは、有機相３６と水相３４とに分離される。あるいは、抽出剤２８は、槽３５に導入される前に、別個の槽（図示せず）中で発酵ブロスに加えられ得る。
【０１０３】
脂肪酸抽出剤２８は、生成物アルコールのための油２６の分配係数より高い、生成物アルコールのための分配係数を有する。例えば、原料１２がトウモロコシである場合、トウモロコシ油２６は、発酵ブロス中に存在する場合、約０．２８未満の生成物アルコールのための分配係数を有し得る一方、トウモロコシ油２６に由来する脂肪酸抽出剤２８は、約０．２８以上の分配係数を有し得る。一実施形態において、脂肪酸抽出剤２８は、少なくとも約１、別の実施形態において少なくとも約２、別の実施形態において少なくとも約２．５、別の実施形態において少なくとも約２．７５、別の実施形態において少なくとも約３の、ブタノールなどの生成物アルコールのための分配係数を有する。したがって、原料の油成分の除去により、ＩＳＰＲ抽出剤の分配係数の低下に対するおそれを軽減するだけでなく、油自体より生成物アルコールを水相からより多く分離し得る脂肪酸抽出剤の生成のための原料としての役割も果たすことによって、抽出発酵における生成物アルコール生成の効率を高める。さらに、原料１２中の油２６に由来する脂肪酸抽出剤２８は、単独でまたは外部からの抽出剤（例えば、外部から供給されるオレイルアルコール）と組み合わせて使用することができ、それによって、外部からの抽出剤に関連するコストを削減するかまたはなくすことができる。
【０１０４】
さらに、脂肪酸抽出剤２８が遊離脂肪酸を含む場合、発酵槽３０中の微生物３２によるグルコース消費率は、このような遊離脂肪酸がない場合よりこのような遊離脂肪酸の存在下でより高くなり得る。したがって、本発明のある実施形態において、発酵ブロスは、遊離脂肪酸を有する脂肪酸抽出剤と接触させることができ、それによって、遊離脂肪酸は、遊離脂肪酸（例えば、オレイルアルコール）を伴わないＩＳＰＲ抽出剤が抽出発酵において使用される場合のグルコース取り込みと比較して、微生物３２によるグルコース取り込みを増加させ得る。例えば、後述される実施例２の表１に示されるように、抽出発酵において脂肪酸抽出剤として使用される脂肪アミド／脂肪酸混合物は、オレイルアルコールを抽出剤として用いた場合より、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ブタノロジェン（ｂｕｔａｎｏｌｏｇｅｎ）による高いグルコース取り込み率を提供し得る。発酵プロセスから生成物アルコールを生成するための方法であって、遊離脂肪酸がプロセス中の工程において生成され、微生物増殖速度およびグルコース消費を向上するために発酵槽中の微生物培地と接触される方法が、全体が参照により本明細書に援用される、２０１０年７月２８日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第６１／３６８，４５１号明細書に記載されている。
【０１０５】
当業者に明らかであるはずであるように、ある実施形態において、図１のシステムおよび方法は、発酵槽３０中の同時糖化発酵が、分離器２０と発酵槽３０との間の別個の糖化槽６０に置き換えられるように変更され得る。
【０１０６】
さらに他の実施形態において、例えば図２の実施形態に示されるように、糖化が、分離器２０と液化槽１０との間に位置する別個の糖化槽６０で行われ得る。図２は、酵素３８を受け入れる別個の糖化槽６０を含み、油流２６が、液化され、糖化された原料流６２から分離される以外は図１とほぼ同一である。原料スラリー１６が、グルコアミラーゼなどの酵素３８とともに糖化槽６０に導入され、それによって、スラリー１６中のオリゴ糖の形態の糖類が、単糖類へと分解され得る。液化され、糖化された原料流６２が、糖化槽６０を出て、分離器２０に導入される。原料流６２は、原料に由来する、単糖類、油、および非溶解固体を含む。分離器２０において、原料流６２は、油流２６および実質的に水流２３中に分離され、それが発酵槽３０に供給される。示される実施形態において、水流２３は非溶解固体を含む。あるいは、図１の実施形態を参照して記載されるように、固体は、分離器２０においてウェットケーキ２４として取り出され得る。分離器２０から排出される油流２６は、所定の量のグリセリド、特にトリグリセリドを有し、それが、反応槽４０において１種以上の物質４２と接触される。物質４２は、油２６に由来するグリセリドの少なくとも一部を脂肪酸抽出剤２８へと化学的に転化し、それが、発酵槽３０に供給される。図２の実施形態の残りのプロセス作業は、図１と同一であるため、再度詳細に説明しない。
【０１０７】
本発明のある実施形態において、例えば図３の実施形態に示されるように、抽出発酵は、原料１２のバイオマス源と同じかまたは異なるバイオマス源に由来するが、原料１２に含まれる実際の油に由来しない脂肪酸抽出剤２８’を用い得る。例えば、原料１２がトウモロコシである場合、脂肪酸抽出剤２８’は、トウモロコシ油に由来し得るが、抽出剤２８’を生成するトウモロコシ油は、原料１２に含まれるトウモロコシ油ではなく、図１の実施形態において提供される反応槽４０に分離される。別の例として、脂肪酸抽出剤２８’は、バイオマス源としてのダイズ（または大豆）に由来し得る一方、原料１２のバイオマス源はトウモロコシである。当業者に明らかであるはずであるように、原料１２に対して抽出剤２８’の異なるバイオマス源の考えられるあらゆる組合せを使用することができる。
【０１０８】
ある実施形態において、脂肪酸抽出剤２８’は、任意の天然油に由来するため、バイオマス源あるいは、動物源のいずれかに由来し得る。
【０１０９】
図３の実施形態において、液化された水流２２が、糖化酵素３８および微生物３２とともに発酵槽３０に供給され、それによって、生成物アルコールが、同時糖化発酵（ＳＳＦ）によって生成される。ある実施形態において、糖化は、例えば図２の実施形態を参照して記載されるものなどの別個の槽で行われ得る。ある実施形態において、好ましくは、液化された水流２２は、分離器２０（図１を参照）によって取り出された油２６を少なくとも有し、ある実施形態において、発酵槽３０（図１を参照）に導入する前に、ウェットケーキ２４として取り出される非溶解固体も有する。植物由来油などの天然油が、油２６’の少なくとも一部を脂肪酸抽出剤２８’に化学的に転化するための物質４２とともに流れ２６’として反応槽４０に導入される。油流２６’は、上流の原料スラリー１６（図１を参照）に由来する油２６ではない。任意の植物由来油またはＩＳＰＲ用の脂肪酸抽出剤２８’に化学的に転化され得る他の天然油が、油流２６’の供給源であり得る。次に、反応槽４０からの脂肪酸抽出剤２８’は、発酵槽３０に導入され、それによって、生成物アルコールは、脂肪酸抽出剤２８’中にかなり分離するため、生成物アルコールは、油２６’が発酵槽中に存在する場合、その中に分離するであろう。
【０１１０】
したがって、ある実施形態において、生成物アルコールは、原料１２によってプロセスに元々導入されるのと同じ油２６ではない植物由来油２６’から得られる脂肪酸抽出剤２８’を用いて抽出される。任意に、１種以上のさらなる抽出剤２９が、水相から生成物アルコールを優先的に分離するための発酵槽３０に導入され得る。１種以上のさらなる抽出剤２９は、プロセスにおいて生成されなかった外部から供給されるオレイルアルコールなどの外部からの抽出剤であり得、および／または別の脂肪酸抽出剤であり得る。ある実施形態において、このような他の脂肪酸抽出剤２９は、発酵槽原料流２２および油流２６’のバイオマス源のいずれかと同じかまたは異なるバイオマス源に由来する油から生成され得る。
【０１１１】
図３の実施形態の残りのプロセス作業は、水相３４が発酵槽３０に戻って供給されるものとして示されていないことを除いて図１および２と同一であるため、再度詳細に説明しない。しかしながら、本明細書に示される実施形態のいずれにおいても、図１を参照して上述したように、水相３４の全てまたは一部が再利用され、廃棄され、および／または生成物アルコールを除去するようにさらに処理され得ることを理解されたい。
【０１１２】
本発明のある実施形態において、原料１２に由来する油は、分離器２０において分離されないが、例えば、液化前または液化中のいずれかで原料１２中で、スラリー１６中で、または糖化流６２（図２を参照）中で、原位置で脂肪酸抽出剤へと化学的に転化される。例えば図４の実施形態において、原料１２は、原料１２中のでんぷんを加水分解して、液化された原料を生成するための適切な酵素１４、例えば、α−アミラーゼとともに液化槽１０に供給される。原料１２の液化前、液化中、または液化後のいずれかに、原料１２中に存在する油を脂肪酸抽出剤２８に化学的に転化するための１種以上の物質４２も液化槽１０に導入される。物質４２は、酵素１４の添加前または添加後のいずれかに液化槽１０に導入され得、原料１２中の油は、原料１２の液化前、液化中、または液化後のいずれかに、抽出剤２８に転化され得る。いずれの場合も、二相流１８が液化槽１０を出るように、原料１２中の油が、脂肪酸抽出剤２８に転化される。二相流１８は、脂肪酸抽出剤２８ならびに液化された水相２２を形成する糖、水、および非溶解固体の両方を含む。ある実施形態において、脂肪酸抽出剤が脂肪酸を含む場合、二相流１８の水相２２は、油中のグリセリドの、脂肪酸への転化に由来するグリセロール（グリセリン）を含み得る。ある実施形態において、このようなグリセロールが存在する場合、それは、発酵槽３０中に導入される前に流れ１８から除去され得る。
【０１１３】
図４を参照すると、二相流１８（すなわち、流れ２２、２８）が、発酵槽３０中で発酵ブロスと接触されて、二相混合物が形成される。発酵槽３０において、ＳＳＦによって生成される生成物アルコールは、脂肪酸抽出剤２８を含む有機相中へと分離する。あるいは、ある実施形態において、プロセスは、図２に関連して説明されるように、別個の糖化槽を含むように変更され得る。二相混合物の分離は、発酵槽３０中で行われ、それによって、アルコール含有有機相流３６および水相流３４が、発酵槽３０から直接出る。あるいは、二相混合物の分離は、図１〜３の実施形態において提供されるように、別個の槽３５中で行われ得る。任意に、１種以上のさらなる抽出剤２９が、発酵槽３０に導入されて、水相から生成物アルコールを優先的に分離する有機相が形成され得る。図４の実施形態の残りのプロセス作業は、上述した図と同一であるため、再度詳細に説明しない。
【０１１４】
本発明のある実施形態において、原料１２中に存在するバイオマス油は、アルコール発酵の後の工程においてプロセス流から分離され得る。次に、発酵後に分離された油は、脂肪酸抽出剤に転化され、発酵槽中でＩＳＰＲ抽出剤として導入され得る。例えば図５の実施形態において、原料１２は、液化されて、原料に由来する油２６を含む原料スラリー１６が生成される。原料スラリー１６は、原料に由来する非溶解固体も含み得る。あるいは、非溶解固体は、遠心分離機（図示せず）などの分離器によってスラリー１６から分離され得る。油２６を含有する原料スラリー１６は、糖化酵素３８および微生物３２を含む発酵ブロスを含む発酵槽３０に直接導入される。生成物アルコールが、発酵槽３０中のＳＳＦによって生成される。あるいは、ある実施形態において、プロセスは、図２に関連して説明されるように、別個の糖化槽を含むように変更され得る。
【０１１５】
ＩＳＰＲ抽出剤２９が、発酵槽３０に導入されて、二相混合物が形成され、生成物アルコールは、ＩＳＰＲ抽出剤２９の有機相中に分離することによって除去される。油２６も有機相中に分離する。ＩＳＰＲ抽出剤２９は、天然油（例えば、オレイルアルコール）に由来しない１種以上の脂肪酸抽出剤および／または外部からの有機抽出剤であり得る。抽出剤２９が脂肪酸抽出剤である場合、抽出剤２９は、原料１２によってプロセスに元々導入されるのと同じ油ではない植物由来油などの天然油から生成される脂肪酸抽出剤２８’（図３を参照）であり得る。
【０１１６】
二相混合物の分離は、発酵槽３０中で行われ、それによって、アルコール含有有機相流３６および水相流３４が、発酵槽３０から直接出る。あるいは、二相混合物の分離は、図１〜３の実施形態において提供されるように、別個の槽３５中で行われ得る。油２６を含む有機相流３６は、分離器５０に導入されて、抽出剤２９から生成物アルコール５４が回収される。得られたアルコール希薄抽出剤２７は、回収された抽出剤２９および油２６を含む。油２６を含む抽出剤２７は、反応槽４０に導入され、１種以上の物質４２（例えば、反応剤および／または溶媒）と接触され、それが、油２６の少なくとも一部を脂肪酸抽出剤２８へと化学的に転化する。
【０１１７】
次に、脂肪酸抽出剤２８を含む抽出剤２７は、発酵槽３０中に戻って再利用され得る。このような再利用される抽出剤流２７は、別個の流れまたは新鮮な、補給抽出剤流２９と組み合わされた流れであり得る。次に、アルコール含有有機相３６の後の引き抜きは、油２６および生成物アルコールに加えて、脂肪酸抽出剤２８およびＩＳＰＲ抽出剤２９を含み得る。次に、有機相３６は、生成物アルコールを回収するように処理され、油と反応して脂肪酸抽出剤を形成し、得られたアルコール希薄脂肪酸抽出剤２８およびアルコール希薄抽出剤２９として発酵槽３０中に戻って再利用され得る。ある実施形態において、プロセス自体が生成物アルコールを抽出するための十分な量の脂肪酸抽出剤２８を生成し得るため、発酵プロセスが時間とともに運転されるにつれて、抽出剤２９の使用を段階的に停止することができる。したがって、ＩＳＰＲ抽出剤は、反応槽４０を介して補給ＩＳＰＲ抽出剤としての、再利用される抽出剤２７および脂肪酸抽出剤２８であり得る。
【０１１８】
あるいは、ある実施形態において、油２６を含む有機相流３６が、分離器５０中の生成物アルコールの回収５４の前に、反応槽４０に導入され得る。このような実施形態において、有機相流３６は、反応槽５０に導入され、脂肪酸抽出剤２８を生成するための１種以上の物質４２と接触され得る。次に、脂肪酸抽出剤２８を含む得られた有機相流３６は、分離器５０に導入されて、生成物アルコール５４が回収され得、次に、得られたアルコール希薄抽出剤が、脂肪酸抽出剤２８を含む抽出剤流２７として発酵槽３０中に戻って再利用され得る。さらに他の実施形態において、脂肪酸抽出剤２８を生成するための物質４２と油２６を接触させる前に、油２６は、有機相流３６または抽出剤流２７から分離され得る。次に、脂肪酸抽出剤２８は、発酵槽３０、異なる発酵槽（例えば、アルコール製造プラント中で発酵槽３０と並行してまたは連続して動作する）に供給されるＩＳＰＲ抽出剤として使用され、または後の使用のために貯蔵され得る。
【０１１９】
したがって、図１〜５は、発酵プロセスを含む方法およびシステムの様々な非限定的な実施形態およびバイオマス由来の油２６から生成される脂肪酸抽出剤２８、および抽出発酵において生成物アルコールを除去するのに使用され得る植物由来油２６’などの天然油から生成される脂肪酸抽出剤２８’を提供する。これらの脂肪酸抽出剤２８および２８’は、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸グリコールエステル、トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択され得る。トリグリセリドは、水酸化またはアルコキシ化（例えば、メトキシ化、エトキシ化）され得る。天然油から本明細書に記載される脂肪酸抽出剤へのグリセリドの化学的転化は、当該技術分野において公知の任意の反応スキームを用いて行うことができる。例えば、トウモロコシ油などの植物由来油に関して、ある実施形態において、脂肪酸抽出剤２８または２８’としての水酸化トリグリセリドが、油２６または２６’としてのトウモロコシ油を様々な反応剤および溶媒４２（詳細については以下の実施例１を参照）と接触させて、式Ｉに示される水酸化を行うことによって生成され得る：
【化１】
2013533742.tif 000003
【０１２０】
ある実施形態において、例えば、Ｒｏｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２９：１８−２２，１９５２に記載され、式ＩＩに示されるように、油２６または２６’としてのトウモロコシ油トリグリセリドが、反応剤４２としての水酸化アンモニウム水溶液と反応されて、脂肪アミドおよび脂肪酸が得られ、それを一緒にまたは別々に、脂肪酸抽出剤２８または２８’として使用することができる：
【化２】
2013533742.tif 000004
【０１２１】
ある実施形態において、水酸化アンモニウム水溶液は、約２８重量％のアンモニア水である。ある実施形態において、式（ＩＩ）にしたがって生成されるトウモロコシ油脂肪アミドとトウモロコシ油脂肪酸との混合物は、単一の脂肪酸抽出剤２８または２８’を生成するのに使用され得る。ある実施形態において、脂肪アミドと脂肪酸との混合物は、リノレアミド、リノール酸、オレアミド、オレイン酸、パルミトアミド、パルミチン酸、ステアルアミド、およびステアリン酸を含み得る。このような実施形態において、このような混合物は、約３７重量％のリノレアミド、約１８％のリノール酸、約１９重量％のオレアミド、約９重量％のオレイン酸、約８．７重量％のパルミトアミド、約４．３重量％のパルミチン酸、約１．２重量％のステアルアミド、および約０．７重量％のステアリン酸から構成され得る。他の組成物の量が可能であり、使用されるトウモロコシ油中のリノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸の天然に存在する量に応じて変わり得ることを理解されたい。例えば、油２６または２６’としての高オレイン酸トウモロコシ油（例えば約６５重量％以下のオレイン酸含量を有し得る）は、オレイン酸含量が約２４重量％である通常のトウモロコシ油を用いた場合に生成され得るより、式（ＩＩ）の反応にしたがって、オレアミドおよびオレイン酸がより多い混合物を生成するであろうことが予測されるであろう。ある実施形態において、式（ＩＩ）にしたがって生成されるトウモロコシ油脂肪アミドおよびトウモロコシ油脂肪酸を、脂肪酸と混合して、脂肪酸抽出剤２８または２８’中の脂肪アミド対脂肪酸の比率を変化させることができる。ある実施形態において、脂肪アミド対脂肪酸の混合物は、約２：１〜約１：２の混合物の比率であり得る。
【０１２２】
ある実施形態において、例えば、Ｋｏｈｌｈａｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．４８：２６５−２７０，１９７１に記載されるように、物質４２として、反応剤としての無水アンモニアを、触媒としての酢酸アンモニウムとともに用いて、脂肪酸抽出剤２８または２８’としての純粋なトウモロコシ油脂肪アミドが、油２６または２６’としてのトウモロコシ油から合成され得る。ある実施形態において、純粋なトウモロコシ油脂肪アミドは、リノレアミド、オレアミド、パルミトアミド、およびステアルアミドを含み得る。このような実施形態において、純粋なトウモロコシ油脂肪アミドは、約５５重量％のリノレアミド、約２８重量％のオレアミド、約１３重量％のパルミトアミド、および約２重量％のステアルアミドから構成され得る。上述したように、他の組成物の量が可能であり、使用されるトウモロコシ油中のリノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸の天然に存在する量に応じて変わり得ることを理解されたい。
【０１２３】
ある実施形態において、脂肪酸抽出剤２８または２８’は、式Ｒ（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ’）（Ｒ”）の脂肪アミドを含むことができ、式中、Ｒが、独立して、１つ以上の二重結合で任意に介在されるＣ３〜Ｃ２７のアルキル基からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素および１つ以上のヒドロキシル基を任意に含むＣ１〜Ｃ６のアルキル基からなる群から選択される。
【０１２４】
ある実施形態において、脂肪酸抽出剤２８または２８’としてのトウモロコシ油脂肪酸は、例えば式ＩＩＩの反応にしたがって、物質４２としてＮａＯＨおよび水（例えば、以下の実施例４を参照）を用いた塩基加水分解によって、油２６または２６’としてのトウモロコシ油から合成され得る：
【化３】
2013533742.tif 000005
【０１２５】
ある実施形態において、純粋なトウモロコシ油脂肪アミドおよび純粋なトウモロコシ油脂肪酸は、混合されて、単一の脂肪酸抽出剤２８または２８’が生成され得る。脂肪アミド対脂肪酸のこのような混合物は、例えば、２：１の混合物、他の実施形態において１：２の混合物であり得る。
【０１２６】
ある実施形態において、例えば式ＩＶの反応にしたがって、物質４２としてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびＬｉＡｌＨ４（例えば、以下の実施例３を参照）を用いた還元によって、脂肪酸抽出剤２８または２８’としての脂肪アルコールは、油２６または２６’としてのトウモロコシ油から生成され得る：
【化４】
2013533742.tif 000006
【０１２７】
ある実施形態において、油２６または２６’としてのトウモロコシ油は、物質４２としてのメタノールおよび酸触媒と接触されて、脂肪酸抽出剤２８または２８’としての脂肪酸エステルが生成され得る。例えば、トウモロコシ油は、式Ｖの反応にしたがって、硫酸の存在下で、限定はされないが、８個以下の炭素を有するアルコールを含むアルコールと反応されて、脂肪酸エステル（例えば、以下の実施例４を参照）が得られる：
【化５】
2013533742.tif 000007
【０１２８】
ある実施形態において、例えば式ＶＩの反応にしたがって、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）（上記の式Ｖを参照）を生成し、さらなる物質４２（例えば、以下の実施例５を参照）としてのエチレングリコールとＦＡＭＥをさらに反応させることによって、油２６または２６’としてのトウモロコシ油は、脂肪酸抽出剤２８または２８’としてのトウモロコシ油エチレングリコールエステル（ＦＡＧＥ）に転化され得る：
【化６】
2013533742.tif 000008
【０１２９】
ある実施形態において、脂肪アルコールは、水酸化されてもよく、抽出剤として使用され得る。例えば、脂肪アルコールは、過酢酸と、次に酸水溶液と反応されて、式ＶＩＩに示されるように、鎖に沿って二重結合が水酸化され得る（例えば、実施例８を参照）：
【化７】
2013533742.tif 000009
【０１３０】
ある実施形態において、抽出剤は、液体またはビーズなどの固体であり得る。ビーズなどの固体の形態で得られるであろう抽出剤は、製造プロセス中、容易に取り扱うことができるであろう。さらに、生成物アルコール（例えば、ブタノール）は、例えば、ガスストリッピング、別の溶媒への溶解、または当業者に公知の任意の他の利用可能な方法によって、この抽出剤から回収され得る。
【０１３１】
図１〜５を参照して記載される上述した実施形態のいずれかを含むある実施形態において、発酵槽３０中の発酵ブロスは、少なくとも１つの発酵性炭素源からブタノールへの生合成経路を介してブタノールを生成するように遺伝子組み換え（すなわち、遺伝子操作）された少なくとも１種の組み換え微生物３２を含む。特に、組み換え微生物は、好適な炭素基質を含有する発酵ブロス中で増殖され得る。さらなる炭素基質としては、以下に限定はされないが、フルクトースなどの単糖類；ラクトース、マルトース、またはスクロースなどのオリゴ糖；でんぷんまたはセルロースなどの多糖類；あるいはそれらの混合物、ならびに乳清透過液、コーンスティープリカー、サトウダイコン糖蜜、および大麦麦芽などの再生可能な原料からの精製されていない混合物が挙げられる。他の炭素基質としては、エタノール、乳酸塩、コハク酸塩、またはグリセロールが挙げられる。
【０１３２】
さらに、炭素基質は、主要な生化学中間体への代謝的転化が示された、二酸化炭素またはメタノールなどの一炭素基質でもあり得る。一炭素基質および二炭素基質に加えて、メチロトローフ生物は、メチルアミン、グルコサミン、および代謝活性のための様々なアミノ酸などのいくつかの他の炭素含有化合物を用いることも知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を用いて、トレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ（１９９３）、４１５−３２，Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の様々な種が、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５−４８９，１９９０）。したがって、本発明に用いられる炭素の供給源が、多種多様な炭素含有基質を包含してもよく、生物の選択のみによって限定されると考えられる。
【０１３３】
上記の炭素基質およびそれらの混合物の全てが好適であると考えられるが、ある実施形態において、炭素基質は、グルコース、フルクトース、およびスクロース、あるいはこれらと、Ｃ５糖類を使用するように改変された酵母細胞のためのキシロースおよび／またはアラビノースなどのＣ５糖類との混合物である。スクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、スイートソルガム、およびそれらの混合物などの再生可能な糖源に由来し得る。グルコースおよびデキストロースは、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、およびそれらの混合物などの穀類を含むでんぷんベースの原料の糖化によって、再生可能な穀類源から誘導され得る。さらに、発酵性糖は、例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／００３１９１８  Ａ１号明細書に記載されるような、前処理および糖化のプロセスによって、再生可能なセルロース系またはリグノセルロース系バイオマスから誘導され得る。適切な炭素源（水流２２からの）に加えて、発酵ブロスは、培養物の成長およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）を含む酵素経路の促進に適した、当業者に公知の、好適な無機物、塩、補因子、緩衝液および他の成分を含有しなければならない。
【０１３４】
生合成経路を介してブタノールを生成する組み換え微生物としては、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウイニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピヒア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、またはサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーが挙げられる。一実施形態において、組み換え微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択され得る。一実施形態において、組み換え微生物は、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）のいくつかの種から選択されるクラブトリー陽性酵母である。クラブトリー陽性酵母の種としては、以下に限定はされないが、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロマイセス・バイアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・ミカタエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｋａｔａｅ）、サッカロマイセス・パラドキサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、ジゴサッカロマイセス・ルーキシィ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、およびカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）が挙げられる。例えば、微生物による発酵を用いたブタノールの生成、ならびにブタノールを生成する微生物は公知であり、例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第��００９／０３０５３７０号明細書に開示されている。ある実施形態において、微生物は、ブタノール生合成経路を含む。好適なイソブタノール生合成経路は、当該技術分野において公知である（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書を参照）。ある実施形態において、経路の基質−生成物転化を触媒する少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのポリペプチドが、微生物中の異種のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態において、経路の基質−生成物転化を触媒する全てのポリペプチドが、微生物中の異種のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態において、微生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を実質的に含まない微生物が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書に記載されている。ＧＰＤ２などのＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を実質的に含まない微生物も、この文献に記載されている。
【０１３５】
実施例に使用されるものを含む特定の株の構造が、本明細書に提供される。
【０１３６】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＰ１０６４およびイソブタノロジェン（ｉｓｏｂｕｔａｎｏｌｏｇｅｎ）ＢＰ１０８３（ＮＧＣＩ−０７０）の作成
株ＢＰ１０６４は、ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ（ＣＢＳ  ８３４０；Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得られ、以下の遺伝子の欠失を含む：ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびＧＰＤ２。ＢＰ１０６４を、プラスミドｐＹＺ０９０（配列番号１、その作成が、参照により本明細書に援用される、２００９年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／２４６，８４４号明細書に記載されている）およびｐＬＨ４６８（配列番号２）で形質転換して、イソブタノロジェン株ＮＧＣＩ−０７０（ＢＰ１０８３）を生成した。
【０１３７】
標的遺伝子および形質転換体の選択のためのＧ４１８耐性マーカーまたはＵＲＡ３遺伝子のいずれかの上流および下流の相同領域を含むＰＣＲ断片による相同的組み換えによって、全コード配列を完全に除去した欠失を作り出した。ｌｏｘＰ部位が側面にあるＧ４１８耐性マーカーを、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて除去した。ＵＲＡ３遺伝子を相同的組み換えによって除去して、無瘢痕（ｓｃａｒｌｅｓｓ）欠失を作り出し、またはｌｏｘＰ部位が側面にある場合、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて除去した。
【０１３８】
無瘢痕欠失の手順を、Ａｋａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｙｅａｓｔ  ２３：３９９−４０５，２００６）から適応させた。一般に、各無瘢痕欠失のためのＰＣＲカセットを、ＰＣＲを重複させることによって、４つの断片、Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを組み合わせることによって作製した。ＰＣＲカセットは、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の上流の２５０ｂｐ）およびターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の下流の１５０ｂｐ）とともに、天然ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  ＵＲＡ３遺伝子からなる、選択可能な／対抗選択可能な（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）マーカー、ＵＲＡ３（断片Ｕ）を含有していた。それぞれ長さ５００ｂｐの断片ＡおよびＣは、標的遺伝子のすぐ上流の５００ｂｐ（断片Ａ）および標的遺伝子の３’５００ｂｐ（断片Ｃ）に対応していた。断片ＡおよびＣを、相同的組み換えによる、染色体へのカセットの組み込みに使用した。断片Ｂに対応する配列の直接の繰り返しが、染色体へのカセットの組み込みの際に生成された際、断片Ｂ（長さ５００ｂｐ）は、標的遺伝子のすぐ下流の５００ｂｐに対応し、それを、相同的組み換えによる、染色体からのＵＲＡ３マーカーおよび断片Ｃの切除に使用した。ＰＣＲ産物ＡＢＵＣカセットを用いて、ＵＲＡ３マーカーを、相同的組み換えによって、まず染色体に組み込み、次に染色体から切除した。最初の組み込みにより、３’５００ｂｐを除いて、遺伝子を欠失させた。切除の際、遺伝子の３’５００ｂｐ領域も欠失させた。この方法を用いた遺伝子の組み込みでは、組み込まれる遺伝子が、断片ＡとＢとの間のＰＣＲカセットに含まれていた。
【０１３９】
ＵＲＡ３の欠失
内因性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるために、ｕｒａ３：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットを、ｐＬＡ５４鋳型ＤＮＡ（配列番号３）からＰＣＲで増幅した。ｐＬＡ５４は、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターおよびｋａｎＭＸマーカーを含有し、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組み換えおよびマーカーの除去を可能にするｌｏｘＰ部位が側面にある。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマーＢＫ５０５およびＢＫ５０６（配列番号４および５）を用いて、ＰＣＲを行った。ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰマーカーの組み込みが、ＵＲＡ３コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのＵＲＡ３部分を、ＵＲＡ３プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得た。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物をＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄへと形質転換し、３０℃でＧ４１８（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＹＰＤにおいて形質転換体を選択した。プライマーＬＡ４６８およびＬＡ４９２（配列番号６および７）ならびに指定されるＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸを用いたＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正確な組み込みを確認した。
【０１４０】
ＨＩＳ３の欠失
無瘢痕ＨＩＳ３欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ、キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ａを、ＨＩＳ３断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４）およびプライマーｏＢＰ４５３（配列番号１５）を用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂを、ＨＩＳ３断片Ａの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５４（配列番号１６）、およびＨＩＳ３断片Ｕの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５５（配列番号１７）を用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ｕを、ＨＩＳ３断片Ｂの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５６（配列番号１８）、およびＨＩＳ３断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５７（配列番号１９）を用いて増幅した。ＨＩＳ３断片Ｃを、ＨＩＳ３断片Ｕの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５８（配列番号２０）、およびプライマーｏＢＰ４５９（配列番号２１）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＨＩＳ３断片ＡおよびＨＩＳ３断片Ｂを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４）およびｏＢＰ４５５（配列番号１７）を用いて増幅することによって、ＨＩＳ３断片ＡＢを生成した。ＨＩＳ３断片ＵおよびＨＩＳ３断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４５６（配列番号１８）およびｏＢＰ４５９（配列番号２１）を用いて増幅することによって、ＨＩＳ３断片ＵＣを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いてＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。ＨＩＳ３断片ＡＢおよびＨＩＳ３断片ＵＣを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４）およびｏＢＰ４５９（配列番号２１）を用いて増幅することによって、ＨＩＳ３  ＡＢＵＣカセットを生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１４１】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸのコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＨＩＳ３  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養（ｐｌａｔｅ）した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ４６０（配列番号２２）およびｏＢＰ４６１（配列番号２３）によるＰＣＲによって、ｈｉｓ３ノックアウトを有する形質転換体をスクリーニングした。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸ  Δｈｉｓ３：：ＵＲＡ３として選択した。
【０１４２】
Δｕｒａ３部位からのＫａｎＭＸマーカー除去およびΔｈｉｓ３部位からのＵＲＡ３マーカー除去
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号６６、米国仮特許出願第６１／２９０，６３９号明細書に記載される）でＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸ  Δｈｉｓ３：：ＵＲＡ３を形質転換し、３０℃で２％のグルコースが補充されたヒスチジンおよびウラシル欠損合成完全培地において平板培養することによって、ＫａｎＭＸマーカーを除去した。形質転換体を、３０℃で約６時間にわたって１％のガラクトースが補充されたＹＰ中で増殖させて、ＣｒｅリコンビナーゼおよびＫａｎＭＸマーカー切除を誘発し、回収のために３０℃でＹＰＤ（２％のグルコース）プレートに平板培養した。分離株を、ＹＰＤ中で一晩増殖させ、３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（５−ＦＯＡ、０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。５−ＦＯＡ耐性分離株を、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドを除去するために、ＹＰＤにおいて増殖させ、平板培養した。ＹＰＤ＋Ｇ４１８プレート、ウラシル欠損合成完全培地のプレート、およびヒスチジン欠損合成完全培地のプレートにおける増殖をアッセイすることによって、ＫａｎＭＸマーカー、ＵＲＡ３マーカー、およびｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの損失について分離株を調べた。Ｇ４１８に対して感受性であり、かつウラシルおよびヒスチジンに対して栄養要求性であった正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３として選択し、ＢＰ８５７として表した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、Δｕｒａ３についてはプライマーｏＢＰ４５０（配列番号２４）およびｏＢＰ４５１（配列番号２５）、およびΔｈｉｓ３についてはプライマーｏＢＰ４６０（配列番号２２）およびｏＢＰ４６１（配列番号２３）によるＰＣＲおよび配列決定によって、欠失およびマーカー除去を確認した。
【０１４３】
ＰＤＣ６の欠失
無瘢痕ＰＤＣ６欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ａを、ＰＤＣ６断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４０（配列番号２６）およびプライマーｏＢＰ４４１（配列番号２７）を用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ｂを、ＰＤＣ６断片Ａの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４２（配列番号２８）、およびＰＤＣ６断片Ｕの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４３（配列番号２９）を用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ｕを、ＰＤＣ６断片Ｂの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４４（配列番号３０）、およびＰＤＣ６断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４５（配列番号３１）を用いて増幅した。ＰＤＣ６断片Ｃを、ＰＤＣ６断片Ｕ３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４６（配列番号３２）、およびプライマーｏＢＰ４４７（配列番号３３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＤＣ６断片ＡおよびＰＤＣ６断片Ｂを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号２６）およびｏＢＰ４４３（配列番号２９）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ６断片ＡＢを生成した。ＰＤＣ６断片ＵおよびＰＤＣ６断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４４４（配列番号３０）およびｏＢＰ４４７（配列番号３３）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ６断片ＵＣを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いてＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。ＰＤＣ６断片ＡＢおよびＰＤＣ６断片ＵＣを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号２６）およびｏＢＰ４４７（配列番号３３）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ６  ＡＢＵＣカセットを生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１４４】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＰＤＣ６  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。ｐｄｃ６ノックアウトを有する形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号３４）およびＢＰ４４９（配列番号３５）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３として選択した。
【０１４５】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３を、ＹＰＤ中で一晩増殖させ、３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号３４）およびｏＢＰ４４９（配列番号３５）によるＰＣＲおよび配列決定によって、欠失およびマーカー除去を確認した。ＰＤＣ６、ｏＢＰ５５４（配列番号３６）およびｏＢＰ５５５（配列番号３７）のコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性ＰＣＲ結果によって、分離株からのＰＤＣ６遺伝子がないことを実証した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６として選択し、ＢＰ８９１として表した。
【０１４６】
ＰＤＣ１欠失ｉｌｖＤＳｍ組み込み
ＰＤＣ１遺伝子を欠失させ、ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７００６１０に由来するｉｌｖＤコード領域で置換した。Ａ断片、続いて、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みのためのＰＣＲカセットのミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）に由来するｉｌｖＤコード領域を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＮＹＬＡ８３（本明細書および米国仮特許出願第６１／２４６，７０９号明細書に記載される）ゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ（配列番号１３８）を、ＰＤＣ１断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１３（配列番号３８）およびプライマーｏＢＰ５１５（配列番号３９）を用いて増殖した。ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組み込みのためのＰＣＲカセットのＢ、Ｕ、およびＣ断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＧｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製された、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ＰＤＣ１断片Ｂを、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１６（配列番号４０）、およびＰＤＣ１断片Ｕの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１７（配列番号４１）を用いて増幅した。ＰＤＣ１断片Ｕを、ＰＤＣ１断片Ｂの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１８（配列番号４２）、およびＰＤＣ１断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１９（配列番号４３）を用いて増幅した。ＰＤＣ１断片Ｃを、ＰＤＣ１断片Ｕの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５２０（配列番号４４）、およびプライマーｏＢＰ５２１（配列番号４５）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍおよびＰＤＣ１断片Ｂを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号３８）およびｏＢＰ５１７（配列番号４１）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−Ｂを生成した。ＰＤＣ１断片ＵおよびＰＤＣ１断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５１８（配列番号４２）およびｏＢＰ５２１（配列番号４５）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ１断片ＵＣを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いて、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａ��ｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢおよびＰＤＣ１断片ＵＣを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号３８）およびｏＢＰ５２１（配列番号４５）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ１  Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣカセット（配列番号１３９）を生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１４７】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＰＤＣ１  Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。ｐｄｃ１ノックアウトｉｌｖＤＳｍ組み込みを有する形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号４６）およびｏＢＰ５１２（配列番号４７）によるＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＤＣ１、ｏＢＰ５５０（配列番号４８）およびｏＢＰ５５１（配列番号４９）のコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性ＰＣＲ結果によって、分離株からのＰＤＣ１遺伝子がないことを実証した。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３として選択した。
【０１４８】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３を、ＹＰＤ中で一晩増殖させ、３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。ＰＤＣ１の欠失、ｉｌｖＤＳｍの組み込み、およびマーカー除去を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号４６）およびｏＢＰ５１２（配列番号４７）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍとして選択し、ＢＰ９０７として表した。
【０１４９】
ＰＤＣ５欠失ｓａｄＢ組み込み
ＰＤＣ５遺伝子を欠失させ、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に由来するｓａｄＢコード領域で置換した。ＰＤＣ５欠失−ｓａｄＢ組み込みのためのＰＣＲカセットのセグメントを、まずプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローニングした。
【０１５０】
ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳは、ｐＵＣ１９をベースとしており、多重クローニング部位（ＭＣＳ）に位置するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するＵＲＡ３遺伝子の配列を含む。ｐＵＣ１９は、ｐＭＢ１レプリコンおよび大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における複製および選択のためのβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含む。ＵＲＡ３のためのコード配列に加えて、この遺伝子の上流および下流の配列が、酵母におけるＵＲＡ３遺伝子の発現のために含まれていた。ベクターを、クローニングプロセスに使用することができ、酵母組み込みベクターとして使用することができる。
【０１５１】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡに由来するＵＲＡ３コード領域の上流の２５０ｂｐおよび下流の１５０ｂｐとともにＵＲＡ３コード領域を含むＤＮＡを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて、ＢａｍＨＩ、ＡｓｃＩ、ＰｍｅＩ、およびＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ４３８（配列番号１２）、およびＸｂａＩ、ＰａｃＩ、およびＮｏｔＩ制限部位を含有するｏＢＰ４３９（配列番号１３）を用いて増幅した。ゲノムＤＮＡを、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製した。ＰＣＲ産物およびｐＵＣ１９（配列番号１４０）を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによる消化の後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートして、ベクターｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳを生成した。プライマーｏＢＰ２６４（配列番号１０）およびｏＢＰ２６５（配列番号１１）によるＰＣＲおよび配列決定によって、ベクターを確認した。
【０１５２】
ｓａｄＢおよびＰＤＣ５断片Ｂのコード配列を、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローニングして、ＰＤＣ５  Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣ  ＰＣＲカセットのｓａｄＢ−ＢＵ部分を生成した。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３０（配列番号５０）、およびＰＤＣ５断片Ｂの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５３１（配列番号５１）とともに、鋳型としてｐＬＨ４６８−ｓａｄＢ（配列番号６７）を用いて、ｓａｄＢのコード配列を増幅した。ＰＤＣ５断片Ｂを、ｓａｄＢの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５３２（配列番号５２）、およびＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３３（配列番号５３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ｓａｄＢおよびＰＤＣ５断片Ｂ  ＰＣＲ産物を混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５３０（配列番号５０）およびｏＢＰ５３３（配列番号５３）を用いて増幅することによって、ｓａｄＢ−ＰＤＣ５断片Ｂを生成した。得られたＰＣＲ産物を、ＡｓｃＩおよびＰｍｅＩによって消化させ、適切な酵素による消化の後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。得られたプラスミドを、ＰＤＣ５断片Ｃの５’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５３６（配列番号５４）およびｏＢＰ５４６（配列番号５５）を用いて、ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの増幅のための鋳型として使用した。ＰＤＣ５断片Ｃを、ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの３’末端に対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５４７（配列番号５６）、およびプライマーｏＢＰ５３９（配列番号５７）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片ＵおよびＰＤＣ５断片Ｃを混合することによってＰＣＲを重複させ、プライマーｏＢＰ５３６（配列番号５４）およびｏＢＰ５３９（配列番号５７）を用いて増幅することによって、ＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを生成した。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル、続いて、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において精製した。天然のＰＤＣ５コード配列のすぐ上流の５０ヌクレオチドに対して相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５４２（配列番号５８）、およびｏＢＰ５３９（配列番号５７）を用いてＰＤＣ５  ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを増幅することによって、ＰＤＣ５  Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣカセット（配列番号１４１）を生成した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１５３】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍのコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてＰＤＣ５  Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃で１％のエタノール（グルコースではない）が補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。ｐｄｃ５ノックアウトｓａｄＢ組み込みを有する形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号５９）およびｏＢＰ５４１（配列番号６０）によるＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＤＣ５、ｏＢＰ５５２（配列番号６１）およびｏＢＰ５５３（配列番号６２）のコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性ＰＣＲ結果によって、分離株からのＰＤＣ５遺伝子がないことを実証した。正確な形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３として選択した。
【０１５４】
ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３を、ＹＰＥ（１％のエタノール）中で一晩増殖させ、エタノール（グルコースではない）が補充され、かつ３０℃で５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地において平板培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。ＰＤＣ５の欠失、ｓａｄＢの組み込み、およびマーカー除去を、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ．キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号５９）およびｏＢＰ５４１（配列番号６０）によるＰＣＲによって確認した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢとして選択し、ＢＰ９１３として表した。
【０１５５】
ＧＰＤ２の欠失
内因性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるために、ｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセット（配列番号１４２）を、鋳型ＤＮＡとしてｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ（配列番号６８）を用いて、ＰＣＲで増幅した。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰは、ｌｏｘＰリコンビナーゼ部位が側面にある（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７７１０７）に由来するＵＲＡ３マーカーを含有する。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマーＬＡ５１２およびＬＡ５１３（配列番号８および９）を用いて、ＰＣＲを行った。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰマーカーの組み込みが、ＧＰＤ２コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのＧＰＤ２部分を、ＧＰＤ２コード領域の上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得た。ＰＣＲ産物をＢＰ９１３に形質転換し、形質転換体を、１％のエタノール（グルコースではない）が補充されたウラシル欠損合成完全培地において選択した。プライマーｏＢＰ５８２およびＡＡ２７０（配列番号６３および６４）を用いたＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングして、正確な組み込みを確認した。
【０１５６】
ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号６６）を用いた形質転換、および３０℃で１％のエタノールが補充されたヒスチジン欠損合成完全培地における平板培養によって、ＵＲＡ３マーカーを再利用した。形質転換体を、１％のエタノールが補充され、かつ５−フルオロ−オロチン酸（０．１％）を含有する合成完全培地においてストリークし（ｓｔｒｅａｋ）、３０℃で培養して、ＵＲＡ３マーカーを喪失した分離株を選択した。５−ＦＯＡ耐性分離株を、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの除去のためにＹＰＥ（１％のエタノール）中で増殖させた。欠失およびマーカー除去を、プライマーｏＢＰ５８２（配列番号６３）およびｏＢＰ５９１（配列番号６５）によるＰＣＲによって確認した。正確な分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ  Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ  Δｈｉｓ３  Δｐｄｃ６  Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ  Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ  Δｇｐｄ２：：ｌｏｘＰとして選択し、ＰＮＹ１５０３（ＢＰ１０６４）として表した。
【０１５７】
ＢＰ１０６４を、プラスミドｐＹＺ０９０（配列番号１）およびｐＬＨ４６８（配列番号２）で形質転換して、株ＮＧＣＩ−０７０（ＢＰ１０８３；ＰＮＹ１５０４）を生成した。
【０１５８】
株ＮＹＬＡ７４およびＮＹＬＡ８３の作成
Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の内因性ＰＤＣ１およびＰＤＣ６遺伝子の挿入不活化。ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子は、以下に記載されるピルビン酸デカルボキシラーゼの３つの主なアイソザイムをコードする：
【０１５９】
ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢの作成
アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に由来するブタノールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片（配列番号７０）（米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書に開示されている）をクローニングした。第２級アルコールデヒドロゲナーゼのためのｓａｄＢと呼ばれるこの遺伝子のコード領域（配列番号６９）を、それぞれ順方向および逆方向プライマーＮ４７３およびＮ４６９（配列番号７４および７５）を用いてグラム陰性菌のために推奨されるプロトコルにしたがって、Ｇｅｎｔｒａ（登録商標）Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製される、Ａ．キシロソキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ゲノムＤＮＡから、標準条件を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ（登録商標）４  ＢＬＵＮＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へとＴＯＰＯ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔでクローニングを行って、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ：：ｓａｄＢを生成し、それを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｃｈ−１細胞へと形質転換した。次に、プラスミドを４つのクローンから単離し、配列を確認した。
【０１６０】
ｓａｄＢコード領域を、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ：：ｓａｄＢからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲプライマーは、酵母ＧＰＭ１プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーター（配列番号７６および７７として提供されるＮ５８３およびＮ５８４）と重複し得る追加の５’配列を含んでいた。次に、ＰＣＲ産物を、以下のように、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における「ギャップ修復（ｇａｐ  ｒｅｐａｉｒ）」方法を用いてクローニングした（Ｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５８：２０１−２１６，１９８７）。ＧＰＭ１プロモーター（配列番号７２）、乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に由来するｋｉｖＤコード領域（配列番号７１）、およびＡＤＨ１ターミネーター（配列番号７３）を含有する酵母−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ：：ｋｉｖＤ：：ＡＤＨ（米国特許出願公開第２００７／００９２９５７  Ａ１号明細書の実施例１７に記載される）を、ＢｂｖＣＩおよびＰａｃＩ制限酵素で消化して、ｋｉｖＤコード領域を放出した。約１μｇの残っているベクター断片を、１μｇのｓａｄＢ  ＰＣＲ産物とともに、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＹ４７４１へと形質転換した。形質転換体を、ロイシン欠損合成完全培地において選択した。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（配列番号１２４）を生成する適切な組み換え事象を、プライマーＮ１４２およびＮ４５９（配列番号１０８および１０９）を用いたＰＣＲによって確認した。
【０１６１】
ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ組み込みカセットの作成およびＰＤＣ６の欠失：
ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組み込みカセットを、ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（配列番号７８）に由来するＧＰＭ−ｓａｄＢ−ＡＤＨｔセグメント（配列番号７９）を、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒに由来するＵＲＡ３ｒ遺伝子に結合することによって作製した。ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ（配列番号８０）は、インビボででの相同的組み換えおよびＵＲＡ３マーカーの除去を可能にする、７５ｂｐの相同反復配列が側面にあるｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７７１０７）に由来するＵＲＡ３マーカーを含む。２つのＤＮＡセグメントを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマー１１４１１７−１１Ａ〜１１４１１７−１１Ｄ（配列番号８１、８２、８３、および８４）、ならびに１１４１１７−１３Ａおよび１１４１１７−１３Ｂ（配列番号８５および８６）とともに、ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢおよびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡを鋳型として用いたＳＯＥ  ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７７：６１−６８，１９８９に記載される）によって結合した。
【０１６２】
ＳＯＥ  ＰＣＲ（１１４１１７−１３Ａおよび１１４１１７−１３Ｂ）のための外部プライマーは、それぞれＰＤＣ６プロモーターおよびターミネーターの上流および下流の領域に相同な約５０ｂｐの５’および３’領域を含んでいた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、完成されたカセットＰＣＲ断片を、ＢＹ４７００（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２００８６６）へと形質転換し、形質転換体を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で維持した。形質転換体を、プライマー１１２５９０−３４Ｇおよび１１２５９０−３４Ｈ（配列番号８７および８８）、ならびに１１２５９０−３４Ｆおよび１１２５９０−４９Ｅ（配列番号８９および９０）を用いたＰＣＲによってスクリーニングして、ＰＤＣ６コード領域の欠失を有するＰＤＣ６遺伝子座における組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、ＵＲＡ３ｒマーカーを、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地において平板培養することによって再利用した。５−ＦＯＡプレートからのコロニーを、ＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、マーカーの除去を確認した。得られた同定株は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔを有する。
【０１６３】
ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ組み込みカセットの作成およびＰＤＣ１の欠失：
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマー１１４１１７−２７Ａ〜１１４１１７−２７Ｄ（配列番号１１０、１１１、１１２、および１１３）とともに、ｐＬＨ４６８およびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡを鋳型として用いたＳＯＥ  ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７７：６１−６８，１９８９によって記載される）によって、ｐＬＨ４６８（配列番号２）に由来するｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔセグメント（配列番号９１）を、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒに由来するＵＲＡ３ｒ遺伝子に結合することによって、ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組み込みカセットを作製した。
【０１６４】
ＳＯＥ  ＰＣＲ（１１４１１７−２７Ａおよび１１４１１７−２７Ｄ）のための外部プライマーは、ＰＤＣ１プロモーターの下流およびＰＤＣ１コード配列の下流の領域に相同な約５０ｂｐの５’および３’領域を含んでいた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、完成されたカセットＰＣＲ断片を、ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔへと形質転換し、形質転換体を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で維持した。形質転換体を、プライマー１１４１１７−３６Ｄおよび１３５（配列番号９２および９３）、ならびにプライマー１１２５９０−４９Ｅおよび１１２５９０−３０Ｆ（配列番号９０および９４）を用いたＰＣＲによってスクリーニングして、ＰＤＣ１コード配列の欠失を有するＰＤＣ１遺伝子座における組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、ＵＲＡ３ｒマーカーを、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地において平板培養することによって再利用した。５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、マーカーの除去を確認した。得られた同定株「ＮＹＬＡ６７」は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔを有する。
【０１６５】
ＨＩＳ３の欠失
内因性ＨＩＳ３コード領域を欠失させるために、ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３ｒ２カセットを、ＵＲＡ３ｒ２鋳型ＤＮＡ（配列番号９５）からＰＣＲ増幅した。ＵＲＡ３ｒ２は、インビボでの相同的組み換えおよびＵＲＡ３マーカーの除去を可能にする、５００ｂｐの相同反復配列が側面にあるｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７７１０７）に由来するＵＲＡ３マーカーを含む。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマー１１４１１７−４５Ａおよび１１４１１７−４５Ｂ（配列番号９６および９７）を用いてＰＣＲを行い、約２．３ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。各プライマーのＨＩＳ３部分は、ＵＲＡ３ｒ２マーカーの組み込みがＨＩＳ３コード領域の置換をもたらすように、ＨＩＳ３プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得られた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＮＹＬＡ６７へと形質転換し、形質転換体を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で選択した。形質転換体をスクリーニングして、３０℃で２％のグルコースが補充されたヒスチジン欠損合成完全培地において形質転換体をレプリカ平板培養することによって、正確な組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地において平板培養することによって、ＵＲＡ３ｒマーカーを再利用した。５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、マーカーの除去を確認した。ＮＹＬＡ７３と呼ばれる得られた同定株は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３を有する。
【０１６６】
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ組み込みカセットの作成およびＰＤＣ５の欠失：
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４カセットを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマーＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＦおよびＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＲ（配列番号９８および９９）を用いて株ＹＬＲ１３４Ｗ染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４０３４０９１）からＰＣＲ増幅し、約２．２ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。各プライマーのＰＤＣ５部分は、ｋａｎＭＸ４マーカーの組み込みがＰＤＣ５コード領域の置換をもたらすように、ＰＤＣ５プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得られた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＮＹＬＡ７３へと形質転換し、形質転換体を、３０℃で１％のエタノールおよびジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（２００μｇ／ｍＬ）が補充されたＹＰ培地上で選択した。形質転換体をＰＣＲによってスクリーニングして、プライマーＰＤＣ５ｋｏｆｏｒおよびＮ１７５（配列番号１００および１０１）を用いたＰＤＣ５コード領域の置換によりＰＤＣ遺伝子座における正確な組み込みを確認した。同定された正確な形質転換体は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３  ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４を有する。株はＮＹＬＡ７４と称された。
【０１６７】
ＨＸＫ２（ヘキソキナーゼＩＩ）の欠失：
ｈｘｋ２：：ＵＲＡ３ｒカセットを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）ならびにプライマー３８４および３８５（配列番号１０２および１０３）を用いてＵＲＡ３ｒ２鋳型（上記）からＰＣＲ増幅し、約２．３ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。各プライマーのＨＸＫ２部分は、ＵＲＡ３ｒ２マーカーの組み込みがＨＸＫ２コード領域の置換をもたらすように、ＨＸＫ２プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得られた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＮＹＬＡ７３へと形質転換し、形質転換体を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で選択した。形質転換体をＰＣＲによってスクリーニングして、プライマーＮ８６９およびＮ８７１（配列番号１０４および１０５）を用いたＨＸＫ２コード領域の置換によりＨＸＫ２遺伝子座における正確な組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、３０℃で２％のグルコースおよび５−ＦＯＡが補充された合成完全培地において平板培養することによって、ＵＲＡ３ｒ２マーカーを再利用した。５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ−ＵＲＡ培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、およびＰＣＲによって、プライマーＮ９４６およびＮ９４７（配列番号１０６および１０７）を用いて正確なマーカーの除去を確認することによって、マーカーの除去を確認した。ＮＹＬＡ８３と称される、得られた同定株は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３  Δｈｘｋ２を有する。
【０１６８】
ＮＹＬＡ９３の作成
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の内在性ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子の挿入不活性化が後述される。ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの３つの主要なアイソザイムをコードする。得られたＰＤＣ不活性化株を、発現ベクターｐＹＺ０６７（配列番号１２９）およびｐＹＺ０９０（配列番号１）のための宿主として使用した。その作成は、参照により本明細書に援用される、２００９年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／２４６，８４４号明細書に記載されている。
【０１６９】
ＮＡＤ依存性グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼの欠失
ｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセットを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマーＬＡ５１２およびＬＡ５１３（配列番号８および９）を用いてｐＵＣ１９：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰプラスミド鋳型からＰＣＲ増幅し、約１．６ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。ｐＵＣ１９：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ（配列番号１３０）は、ｌｏｘＰリコンビナーゼ部位が側面にある（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７７１０７）からのＵＲＡ３マーカーを含む。各プライマーのＧＰＤ２部分は、ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰマーカーの組み込みがＧＰＤ２コード領域の置換をもたらすように、ＧＰＤ２プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得られた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＮＹＬＡ８３へと形質転換し、形質転換体を、３０℃で２％のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で選択した。形質転換体をＰＣＲによってスクリーニングして、プライマーＬＡ５１６およびＮ１７５（配列番号１３２および１０１）を用いたＨＸＫ２コード領域の置換によりＧＰＤ２遺伝子座における正確な組み込みを確認した。ＵＲＡ３マーカーを、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号１３１）による形質転換および３０℃で２％のグルコースが補充されたヒスチジン欠損合成完全培地における平板培養によって再利用した。コロニーを３０℃でＹＰ（１％のガラクトース）プレート上にパッチして、ＵＲＡ３マーカーの除去を誘発し、回収のために３０℃でＹＰＤプレートに移した。ＹＰＤプレートからのコロニーをウラシル欠損合成完全培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、ＵＲＡ３マーカーの除去を確認した。同定された正確なクローンは、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３  Δｈｘｋ２  Δｇｐｄ２：：ｌｏｘＰを有する。株はＮＹＬＡ９２と称された。
【０１７０】
ｐｄｃ５：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰ組み込みカセットの作成およびＰＤＣ５の欠失
ｐｄｃ５：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマーＬＡ２４９およびＬＡ３９７（配列番号１３６および１３７）を用いてプラスミドｐＵＣ１９：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰ（配列番号１３５）からＰＣＲ増幅し、約２．２ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。ｐＵＣ１９：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰ（配列番号１３５）は、ｐＦＡ６に由来するｋａｎＭＸ遺伝子（Ｗａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  １０：１７９３−１８０８，１９９４）ならびにｌｏｘＰリコンビナーゼ部位が側面にあるＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターおよびターミネーターを含む。各プライマーのＰＤＣ５部分は、ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰマーカーの組み込みがＰＤＣ５コード領域の置換をもたらすように、ＰＤＣ５プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域から得られた。標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＮＹＬＡ９２へと形質転換し、形質転換体を、３０℃で１％のエタノールおよびジェネティシン（２００μｇ／ｍｌ）が補充されたＹＰ培地上で選択した。形質転換体をＰＣＲによってスクリーニングして、プライマーＬＡ３６３およびＬＡ３６４（配列番号１３３および１３４）を用いたＰＤＣ５コード領域の置換によりＰＤＣ５遺伝子座における正確な組み込みを確認した。同定された正確な形質転換体は、遺伝子型：ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３  Δｈｘｋ２  Δｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ  Δｐｄｃ５：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰを有する。株はＮＹＬＡ９３と称された。
【０１７１】
ＮＹＬＡ９３（ｐＹＺ０６７／ｐＹＺ０９０）
プラスミドベクターｐＹＺ０６７およびｐＹＺ０９０を、標準的な遺伝子組み換え技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を用いて、株ＮＹＬＡ９３（ＢＹ４７００  ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ  ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ  Δｈｉｓ３  Δｈｘｋ２  Δｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ  Δｐｄｃ５：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰ）へと同時に形質転換し、得られた株（イソブタノロジェンＮＹＬＡ９３、ＮＧＣＩ−０６５とも呼ばれる）を、３０℃で１％のエタノールが補充されたヒスチジンおよびウラシル欠損合成完全培地において維持した。
【０１７２】
発現ベクターｐＬＨ４６８
ｐＬＨ４６８プラスミド（配列番号２）を、酵母におけるＤＨＡＤ、ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）およびウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（ＨＡＤＨ）の発現のために作成した。
【０１７３】
乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）のケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）およびウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（ＨＡＤＨ）のためのコード領域（それぞれ配列番号７１および１１７）を、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のために最適化されたコドンに基づいて、ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．によって合成し、プラスミドｐＫｉｖＤｙ−ＤＮＡ２．０およびｐＨａｄｈｙ−ＤＮＡ２．０において提供した。コードされるタンパク質は、それぞれ配列番号１１６および１１８である。ＫｉｖＤおよびＨＡＤＨのための個々の発現ベクターを作成した。ｐＬＨ４６７（ｐＲＳ４２６：：ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔ）を構築するために、ベクターｐＮＹ８（配列番号１２０；ｐＲＳ４２６．ＧＰＤ−ａｌｄ−ＧＰＤｔとも称され、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書の実施例１７に記載されている）を、ＡｓｃＩおよびＳｆｉＩ酵素で消化し、それによって、ＧＰＤプロモーターおよびａｌｄコード領域を切断した。５’プライマーＯＴ１０６８および３’プライマーＯＴ１０６７（配列番号１２２および１２３）を用いて、５’末端にＡｓｃＩ部位および３’末端にＳｐｅＩ部位を付加するために、ｐＮＹ８に由来するＴＤＨ３プロモーター断片（配列番号１２１）をＰＣＲ増幅した。ＡｓｃＩ／ＳｆｉＩで消化されたｐＮＹ８ベクター断片を、ＡｓｃＩおよびＳｐｅＩで消化されたＴＤＨ３プロモーターＰＣＲ産物とライゲートし、コドン最適化されたｋｉｖＤコード領域を含むＳｐｅＩ−ＳｆｉＩ断片を、ベクターｐＫｉｖＤ−ＤＮＡ２．０から単離した。３通りのライゲーションにより、ベクターｐＬＨ４６７（ｐＲＳ４２６：：ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔ）が生成された。ｐＬＨ４６７を、制限マッピング（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ）および配列決定によって確認した。
【０１７４】
ｐＬＨ４３５（ｐＲＳ４２５：：ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔ）は、参照により本明細書に援用される米国仮特許出願第６１／０５８９７０号明細書の実施例３に記載されるベクターｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（配列番号７８）から得られた。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢは、ＧＰＭ１プロモーター（配列番号７２）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼに由来するコード領域（ｓａｄＢ；ＤＮＡ配列番号６９；タンパク質配列番号７０：米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書に開示されている）、およびＡＤＨ１ターミネーター（配列番号７３）を含むキメラ遺伝子を有するｐＲＳ４２５ベクター（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７７１０６）である。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭｐ−ｓａｄＢは、ｓａｄＢコード領域の５’および３’末端においてそれぞれＢｂｖＩおよびＰａｃＩ部位を含む。プライマーＯＴ１０７４およびＯＴ１０７５（配列番号１２５および１２６）を用いた部位特異的突然変異誘発法によって、ＮｈｅＩ部位をｓａｄＢコード領域の５’末端に付加して、ベクターｐＲＳ４２５−ＧＰＭｐ−ｓａｄＢ−ＮｈｅＩを生成し、それを配列決定によって確認した。ｐＲＳ４２５：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＮｈｅＩをＮｈｅＩおよびＰａｃＩで消化して、ｓａｄＢコード領域を除外し、ベクターｐＨａｄｈｙ−ＤＮＡ２．０に由来するコドン最適化されたＨＡＤＨコード領域を含むＮｈｅＩ−ＰａｃＩ断片とライゲートして、ｐＬＨ４３５を生成した。
【０１７５】
単一のベクター中でＫｉｖＤおよびＨＡＤＨ発現カセットを組み合わせるために、酵母ベクターｐＲＳ４１１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．８７４７４）を、ＳａｃＩおよびＮｏｔＩで消化し、３通りのライゲーション反応において、ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔカセットを含むｐＬＨ４３５に由来するＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片とともに、ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔカセットを含むｐＬＨ４６７に由来するＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片とライゲートした。これにより、ベクターｐＲＳ４１１：：ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＰＧＰＭ１−Ｈａｄｈｙ（ｐＬＨ４４１）が生成され、それを制限マッピングによって確認した。
【０１７６】
低級イソブタノール経路における全ての３つの遺伝子：ｉｌｖＤ、ｋｉｖＤｙ、およびＨａｄｈｙのための同時発現ベクターを生成するために、ＩｌｖＤ遺伝子の供給源として、米国仮特許出願第６１／１００，７９２号明細書に記載されるｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）（配列番号１２７）を使用した。このシャトルベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における維持のためのＦ１複製起点（ｎｔ  １４２３〜１８７９）および酵母における複製のための２ミクロンの起点（ｎｔ  ８０８２〜９４２６）を含む。ベクターは、ＦＢＡ１プロモーター（ｎｔ  ２１１１〜３１０８；配列番号１１９）およびＦＢＡターミネーター（ｎｔ  ４８６１〜５８６０；配列番号１２８）を有する。さらに、ベクターは、酵母における選択のためのＨｉｓマーカー（ｎｔ  ５０４〜１１６３）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択のためのアンピシリン耐性マーカー（ｎｔ  ７０９２〜７９４９）を有する。ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７００６１０）に由来するｉｌｖＤコード領域（ｎｔ  ３１１６〜４８２８；配列番号１１５４；タンパク質配列番号１１５）は、ＦＢＡプロモーターとＦＢＡターミネーターとの間にあり、発現のためのキメラ遺伝子を形成する。さらに、ｉｌｖＤコード領域（ｎｔ  ４８２９〜４８４９）に融合されたｌｕｍｉｏタグがある。
【０１７７】
第１の工程は、ＳａｃＩおよびＳａｃＩＩ（ＳａｃＩＩ部位はＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化された）を用いて、ｐＲＳ４２３  ＦＢＡ  ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）（ｐＲＳ４２３−ＦＢＡ（ＳｐｅＩ）−ＩｌｖＤ（ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ））−Ｌｕｍｉｏとも呼ばれる）を線状化して、９，４８２ｂｐの全長を有するベクターを得ることであった。第２の工程は、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ（ＫｐｎＩ部位はＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化された）を用いて、ｋｉｖＤｙ−ｈＡＤＨｙカセットをｐＬＨ４４１から単離し、６，０６３ｂｐの断片を得ることであった。この断片を、ｐＲＳ４２３−ＦＢＡ（ＳｐｅＩ）−ＩｌｖＤ（ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ））−Ｌｕｍｉｏに由来する９，４８２ｂｐのベクター断片とライゲートした。これにより、ベクターｐＬＨ４６８（ｐＲＳ４２３：：ＰＦＢＡ１−ｉｌｖＤ（Ｓｔｒｅｐ）Ｌｕｍｉｏ−ＦＢＡ１ｔ−ＰＴＤＨ３−ｋｉｖＤｙ−ＴＤＨ３ｔ−ＰＧＰＭ１−ｈａｄｈｙ−ＡＤＨ１ｔ）が生成され、それを、制限マッピングおよび配列決定によって確認した。
【０１７８】
ｐＹＺ０９０およびｐＹＺ０６７
ｐＹＺ０９０を、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の発現のために、酵母ＣＵＰ１プロモーター（ｎｔ  ２〜４４９）、続いてＣＹＣ１ターミネーター（ｎｔ  ２１８１〜２４３０）から発現される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するａｌｓＳ遺伝子のコード領域（ｎｔ位置４５７〜２１７２）を有するキメラ遺伝子、およびケト酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）の発現のために、酵母ＩＬＶ５プロモーター（２４３３〜３６２６）、続いてＩＬＶ５ターミネーター（ｎｔ  ４６７０〜５２９２）から発現される乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に由来するｉｌｖＣ遺伝子のコード領域（ｎｔ  ３６３４〜４６５６）を有するキメラ遺伝子を含むように作成した。
【０１７９】
ｐＹＺ０６７を、以下のキメラ遺伝子：１）ＤＨＡＤの発現のための、酵母ＦＢＡ１プロモーター（ｎｔ  １１６１〜２２５０）、続いてＦＢＡターミネーター（ｎｔ  ４００５〜４３１７）から発現されるミュータンス連鎖球菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９に由来するｉｌｖＤ遺伝子のコード領域（ｎｔ位置２２６０〜３９７１）、２）アルコールデヒドロゲナーゼの発現のための、酵母ＧＰＭプロモーター（ｎｔ  ５８１９〜６５７５）、続いてＡＤＨ１ターミネーター（ｎｔ  ４３５６〜４６７１）から発現されるＨＡＤＨのためのコード領域（ｎｔ  ４６８０〜５８０７）、および３）ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼの発現のための、酵母ＴＤＨ３プロモーター（ｎｔ  ８８３０〜９４９３）、続いてＴＤＨ３ターミネーター（ｎｔ  ５６８２〜７１６１）から発現される乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）に由来するＫｉｖＤ遺伝子のコード領域（ｎｔ  ７１７５〜８８２１）を含むように作成した。
【０１８０】
さらに、本発明の様々な実施形態を上に説明してきたが、それらは例として示されたに過ぎず、限定するものではないことを理解されたい。本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに本発明の形態および細部の様々な変更を行うことができることが、関連技術の当業者に明らかであろう。したがって、本発明の広さおよび範囲は、上述した例示的実施形態のいずれによって限定されるものでもなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物のみにしたがって規定されるものである。
【０１８１】
本明細書に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関する技術分野の当業者の技能のレベルを示し、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により援用されることが具体的にかつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【０１８２】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに例示し、実施例において、ブタノールのための脂肪酸抽出剤の分配係数が示される。上記の化学的転化および以下の実施例が、脂肪酸抽出剤を生成するための植物由来油としてトウモロコシ油を含む一方、本発明から逸脱せずに、植物由来油などの他の天然油が使用され得ることを理解されたい。上記の説明およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明から逸脱せずに様々な用途および条件に適合させるように本発明の様々な変形および変更を行うことができる。
【０１８３】
本明細書において使用される際、使用される略語の意味は以下のとおりであった：「ｇ」はグラムを意味し、「ｋｇ」はキログラムを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「ｍＬ／Ｌ」はミリリットル／リットルを意味し、「ｍＬ／分」はミリリットル／分を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ＤＩ」は脱イオン化されていることを意味し、「ｕＭ」はマイクロメートルを意味し、「ｎＭ」はナノメートルを意味し、「ｗ／ｖ」は重量／体積を意味し、「ＧＣ」はガスクロマトグラフを意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎＭの波長における光学密度を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥菌体重量を意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「℃」は摂氏温度を意味し、「℃／分」は摂氏温度／分を意味し、「ｓｌｐｍ」は標準リットル／分を意味し、「ｐｐｍ」は百万分率を意味し、「ｐｄｃ」はピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素を意味し、後ろに酵素番号が付く。
【０１８４】
実施例１〜６は、トウモロコシ油を以下の脂肪酸抽出剤へと化学的に転化するための例示的な方法を説明する：水酸化トリグリセリド（実施例１）、脂肪アミドおよび脂肪酸との混合物（実施例２）、脂肪アルコール（実施例３）、脂肪酸（実施例４）、脂肪酸メチルエステル（実施例５）；および脂肪酸グリコールエステル（実施例６）。例７は、表３および７〜１０に列挙される水不混和性抽出剤を用いて行った抽出発酵実験の一連の比較例を提供し、性能データが、表１１にまとめられている。
【０１８５】
実施例１
トウモロコシ油に由来する水酸化トリグリセリド
Ａ．トウモロコシ油の水酸化（６３％の水酸化）
機械的撹拌器および滴下漏斗を備えた５００ｍＬの三つ口フラスコに、トウモロコシ油（５０．０ｇ）、トルエン（２５．０ｍＬ）、Ａｍｂｅｒｌｙｔｅ  ＩＲ−１２０樹脂（１２．５ｇ）、および氷酢酸（７．５ｇ）を加えた。得られた混合物を６０℃まで加熱し、次に、過酸化水素（水中４１．８ｇの３０％のＨ２Ｏ２）を１時間かけて滴下して加えた。混合物を６０℃で２時間撹拌し、その時点で反応混合物を以下のように処理した：樹脂をろ過によって除去し、ろ液を酢酸エチル（７５ｍＬ）と水（５０ｍＬ）とに分液した。層を分離した後、有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）、および塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、４８．９ｇの黄色の油が得られた。粗反応生成物の１Ｈ  ＮＭＲ分析により、二重結合の６３％がエポキシ化されたことが示された。
【０１８６】
５００ｍＬの丸底フラスコに、エポキシ化トウモロコシ油（２０．０ｇ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１００．０ｍＬ）、および硫酸（５０ｍＬの１．７Ｍの水溶液）を加えた。濁った混合物を５０℃で２時間撹拌し、次に、水（１００ｍＬ）と酢酸エチル（２００ｍＬ）とに分液することによって処理した。有機層を、水（３×５０ｍＬ）、次に塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、１９．９ｇの暗黄色の油（６３％の水酸化トウモロコシ油）が得られた。
【０１８７】
Ｂ．トウモロコシ油の水酸化（４７％の水酸化）
機械的撹拌器および滴下漏斗を備えた５００ｍＬの三つ口フラスコに、トウモロコシ油（５０．０ｇ）、トルエン（２５．０ｍＬ）、Ａｍｂｅｒｌｙｔｅ  ＩＲ−１２０樹脂（１２．５ｇ）、および氷酢酸（７．５ｇ）を加えた。得られた混合物を６０℃まで加熱し、次に、過酸化水素（水中４１．８ｇの３０％のＨ２Ｏ２）を１時間かけて滴下して加えた。混合物を６０℃で１時間撹拌し、その時点で反応混合物を以下のように処理した：樹脂をろ過によって除去し、ろ液を酢酸エチル（７５ｍＬ）と水（５０ｍＬ）とに分液した。層を分離した後、有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）、および塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、４９．８ｇの黄色の油が得られた。粗反応生成物の１Ｈ  ＮＭＲ分析により、二重結合の４７％がエポキシ化されたことが示された。
【０１８８】
５００ｍＬの丸底フラスコに、エポキシ化トウモロコシ油（２０．０ｇ）、ＴＨＦ（１００．０ｍＬ）、および硫酸（５０ｍＬの１．７Ｍの水溶液）を加えた。濁った混合物を５０℃で２時間撹拌し、次に、水（１００ｍＬ）と酢酸エチル（２００ｍＬ）とに分液することによって処理した。有機層を、水（３×５０ｍＬ）、次に塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、１９．２ｇの暗黄色の油（４７％の水酸化トウモロコシ油）が得られた。
【０１８９】
Ｃ．トウモロコシ油の水酸化（２８％の水酸化）
機械的撹拌器および滴下漏斗を備えた５００ｍＬの三つ口フラスコに、トウモロコシ油（５０．０ｇ）、トルエン（２５．０ｍＬ）、Ａｍｂｅｒｌｙｔｅ  ＩＲ−１２０樹脂（１２．５ｇ）、および氷酢酸（７．５ｇ）を加えた。得られた混合物を６０℃まで加熱し、次に、過酸化水素（水中４１．８ｇの３０％のＨ２Ｏ２）を１時間かけて滴下して加えた。混合物を６０℃で２時間撹拌し、その時点で反応混合物を以下のように処理した：樹脂をろ過によって除去し、ろ液を酢酸エチル（７５ｍＬ）と水（５０ｍＬ）とに分液した。層を分離した後、有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）、および塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、４７．２ｇの黄色の油が得られた。粗反応生成物の１Ｈ  ＮＭＲ分析により、二重結合の２８％がエポキシ化されたことが示された。
【０１９０】
５００ｍＬの丸底フラスコに、エポキシ化トウモロコシ油（２０．０ｇ）、ＴＨＦ（１００．０ｍＬ）、および硫酸（５０ｍＬの１．７Ｍの水溶液）を加えた。濁った混合物を５０℃で２時間撹拌し、次に、水（１００ｍＬ）と酢酸エチル（２００ｍＬ）とに分液することによって処理した。有機層を、水（３×５０ｍＬ）、次に塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、２０．３ｇの暗黄色の油（２８％の水酸化トウモロコシ油）が得られた。
【０１９１】
分配係数の測定
５ｍＬの容器に、０．９１０ｇの６７％の水酸化トウモロコシ油、および０．９１０ｍＬの３重量％のｉＢｕＯＨ水溶液を加えた。二相混合物を、Ｖｏｒｔｅｘ  Ｇｅｎｉｅ（登録商標）を用いて１０分間、激しく撹拌した。混合した直後、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｅｎｔｒｉｆｉｃ  ２２８遠心分離機（３３００ｒｐｍ）を用いて混合物を１０分間遠心分離することによって層の分離を補助した。０．１００ｇの両方の層を取った。有機上層を、エチレングリコールジエチルエーテル（１０．１ｍｇ／ｍＬ）のトルエン溶液で１．００ｍＬまで希釈し、水層を、エチレングリコールジエチルエーテル（１０．２ｍｇ／ｍＬ）のメタノール溶液で１．００ｍＬまで希釈した。両方の相中のｉ−ＢｕＯＨの濃度を、較正されたガスクロマトグラフ（ＧＣ）を用いて測定した。同じ手順を、４７％および２８％の水酸化トウモロコシ油について繰り返した。このように測定された分配係数は、６７％の水酸化トウモロコシ油について３．２、４７％の水酸化トウモロコシ油について２．３、２８％の水酸化トウモロコシ油について２．１であった。
【０１９２】
上で概説した手順を、６％のｉ−ＢｕＯＨ水溶液を用いて繰り返した。６７％、４７％、および２８％の水酸化トウモロコシ油についての分配係数は、それぞれ２．９、２．９、および２．０であった。
【０１９３】
実施例２
トウモロコシ油に由来する脂肪アミドおよび脂肪酸、および純粋な脂肪アミド
Ｒｏｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２９：１８−２２，１９５２によって記載されるのと同様の方法で、トウモロコシ油を、水酸化アンモニウム水溶液と反応させた。Ｍａｚｏｌａ（登録商標）トウモロコシ油（０．８１８Ｌ、７５５ｇ）を、１ガロンのステンレス鋼反応器に入れ、この反応器に、１．７１Ｌ（１５４０ｇ）の水酸化アンモニウム水溶液（ＮＨ３として２８％）を加えた。反応器を、撹拌しながら１６０℃まで加熱し、撹拌しながら７時間その温度に保ち、その間に圧力が４００ｐｓｉに達した。反応器を冷却し、生成物である、乳白色の固体を取り出し、反応器を酢酸エチルですすいだ。生成物を、５Ｌの酢酸エチルに溶解させ、それぞれ５００ｍＬの水で５回洗浄し、それをＨ２ＳＯ４で中和した。次に、酢酸エチルを無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ロータリーエバポレータで溶媒を除去したところ、淡褐色の軟質の固体が残った。
【０１９４】
ＣＤＣｌ３中の１３Ｃ  ＮＭＲにより、生成物が脂肪アミド対脂肪酸の約２：１の比率を含み、生成物へのトウモロコシ油の転化が定量的であったことが示された。生成物は５７〜５８℃の融点を有していたが、水で飽和される場合、約１１℃低下した。
【０１９５】
触媒としての酢酸アンモニウムとともに無水アンモニアを用いて、Ｋｏｈｌｈａｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．４８：２６５−２７０，１９７１にしたがって、純粋なトウモロコシ油脂肪アミドをトウモロコシ油から合成した。
【０１９６】
３グラムの酢酸アンモニウムを、４００ｍＬのステンレス鋼振とう器管に入れ、それに５１．８ｇのトウモロコシ油を加えた。次に、無水アンモニア（８９．７ｇ）を加え、反応器を密閉し、１２５℃で７時間加熱し、その間に圧力が１３００ｐｓｉに達した。反応器を冷却し、淡色の固体を除去し、反応器を酢酸エチルですすいだ。次に、酢酸エチルに溶解させた生成物を、上記の脂肪アミド／脂肪酸混合物の場合と同様に処理した。
【０１９７】
脂肪酸を、実施例４に後述されるようにＮａＯＨを用いた塩基加水分解によって、トウモロコシ油から合成した。
【０１９８】
３つの調製物：（１）アンモニア水からのトウモロコシ油脂肪アミドとトウモロコシ油脂肪酸との２：１混合物、（２）純粋なトウモロコシ油脂肪アミド：純粋なトウモロコシ油脂肪酸の２：１混合物、および（３）純粋なトウモロコシ油脂肪アミド：トウモロコシ油脂肪酸の１：２混合物の全てを、３％の水溶液からイソブタノールを抽出するそれらの能力について試験した。それぞれ７００ミリグラムを、２０ｍＬのシンチレーション容器中の３％のイソブタノールを含有する２．１ｍＬの水に加え、３０℃で一晩回転振とう器に入れた。３つの場合の全てにおいて、有機相は、この温度で液体になり、これは、イソブタノールの取り込みによる融点のさらなる低下を示す。５０マイクロリットルの上相を、ＧＣ標準としてエチレングリコールジエチルエーテル（１０．０６８ｍｇ／ｍＬ）を含有する２００μＬのトルエンまたは同じ濃度のエチレングリコールジエチルエーテルを含有する２００μＬのイソプロパノールのいずれかで希釈した。５０マイクロリットルの下相を、同じ濃度のエチレングリコールジエチルエーテルを含有する１５０μＬのメタノールおよび５０μＬのイソプロパノールで希釈した。両方の相中のイソブタノールの濃度を、較正されたＧＣを用いて測定した。測定された分配係数は：（１）について３．８１、（２）について４．３１、（３）について３．５８であった。
【０１９９】
脂肪アミド／脂肪酸アンモニア水の調製物（１）、および純粋なトウモロコシ油脂肪酸と１：１で混合された調製物（１）によって構成される調製物（１ａ）（１：２の脂肪アミド：脂肪酸に相当する）を、３部のブロス対１部のアミド／酸混合物の比率でサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ブタノロジェンＮＧＣＩ−０７０を含有する発酵ブロスを入れた振とうフラスコ中で培養した。調製物（１）は軟質の固体であった一方、調製物（１ａ）は３０℃で液体であった。次に、８．３５ｇ／Ｌのグルコース濃度から開始して、振とうフラスコを、培養器振とう器において２５時間培養し、グルコースの消費を、時間の関数として追跡した。表１は、両方の比率における脂肪アミド／脂肪酸混合物が、ブタノロジェンに対して有毒でなかったことを示し、オレイルアルコールを用いた場合より高いグルコース取り込み率も示した。
【０２００】
【表１】
2013533742.tif 000010
【０２０１】
実施例３
トウモロコシ油に由来する脂肪アルコール
トウモロコシ油から脂肪アルコールを生成するための上式ＩＶの反応を参照して、機械的撹拌器、Ｎ２源を備えた還流冷却器、滴下漏斗、内部熱電対、およびゴム隔膜を備えた２２Ｌの丸底フラスコを、窒素下で火力乾燥させた。フラスコに、１３２ｇ（３．３０モル）の９５％水素化アルミニウムリチウム粉末を投入し、それをドライボックス中で秤量し、固体滴下漏斗に入れた。２２Ｌのフラスコを氷浴で冷却し、９．０リットルの無水ＴＨＦを、カニューレを介して反応器に加えた。得られたスラリーを、０〜５℃に冷却し、１．００リットルの無水ＴＨＦ中の９５６ｇ（１．１０モル）のＷｅｓｓｏｎ（登録商標）トウモロコシ油の溶液を、反応温度を５〜２０℃に保持しながら２〜３時間かけて滴下して加えた。トウモロコシ油を加えた後、スラリーを、周囲温度で一晩撹拌した。ＴＬＣクロマトグラフィーによって確認した際に、反応が終わったとき、３７０ｍＬのＴＨＦに溶解させた１３０ｇの水の溶液の滴下添加によってそれを急冷した。次に、１３０ｇの１５％のＮａＯＨ水溶液を加えた後、４００ｇの水を加えた。混合物を、室温に温めながら激しく撹拌し、白色の粒状の固体を生成した。フリットガラスのろ過用漏斗を用いて、固体をろ過して取り除き、さらなるＴＨＦで洗浄した。ＴＨＦをロータリーエバポレータで除去し、残渣を、３．００リットルの酢酸エチル中に取った。生成物溶液を、２×１．００Ｌの水、１×１．００Ｌの塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮したところ、８３６ｇ（９７％）の脂肪アルコールが黄色の油として得られた。次に、粗脂肪アルコール混合物を蒸留し（１４０℃／１ｍｍＨｇ）、以下の分配係数の実験に使用した。
【０２０２】
分配係数の実験
５つの５ｍＬの容器のそれぞれに、１ｍＬの脂肪アルコール混合物、および１ｍＬの３重量％のｉＢｕＯＨ水溶液を加えた。二相混合物を、Ｖｏｒｔｅｘ  Ｇｅｎｉｅ（登録商標）を用いて、それぞれ１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、および６０分間、激しく撹拌した。混合した直後、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｅｎｔｒｉｆｉｃ  ２２８遠心分離機（３３００ｒｐｍ）を用いて混合物を１０分間遠心分離することによって層の分離を補助した。０．１００ｍＬの両方の層を取った。有機上層を、エチレングリコールジエチルエーテルのトルエン溶液で１．００ｍＬまで希釈し、水層を、エチレングリコールジエチルエーテルのメタノール溶液で１．００ｍＬまで希釈した。両方の相中のｉ−ＢｕＯＨの濃度を、較正されたＧＣを用いて測定した。このように測定された分配係数は２．７０であった。
【０２０３】
上述したのと同じ分配係数の測定を、６重量％のｉ−ＢｕＯＨ濃度について実行した。このように測定された分配係数３．０６であった。
【０２０４】
以下の実施例４〜６において、抽出剤の分配係数を決定するのに使用される方法は、静的（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ）方法であった。静的方法では、５ｍＬの３％または６％（ｗ／ｖ）のいずれかの、水中のイソブタノールの溶液をバイアルに入れ、５ｍＬの対象の溶媒を、物理相を混合しないように、水溶液の上に注意深く加えた。指定の期間の後、溶媒相および水相の透明部分の試料を取り出し、ＧＣによってイソブタノール含量について分析した。あらゆるエマルジョン層をこの分析では無視した。ＧＣ分析では、１００ｕＬの試料を４００ｕＬのイソプロパノールに加えた。５００ｕＬの、ジエチレングリコールジエチルエーテルの溶液（内部標準）を加え、ＦＩＤ検出器を用いて溶液をＣａｒｂｏｗａｘ（登録商標）カラムに噴射し、イソブタノールの濃度を測定した。
【０２０５】
当該技術分野において公知の他の方法も、本発明にしたがって抽出剤の分配係数を決定するのに使用することができる。例えば、振とう方法を使用することができる。振とう方法の例として、５ｍＬの、３％または６％（ｗ／ｖ）のいずれかの、水中のイソブタノールの溶液が、５ｍＬの対象の溶媒とともに遠心分離管に加えられ得る。管は、１分間激しく振とうされ得る。次に、管は、遠心分離機において約１２５００Ｇで１５分間回転され得る。透明の溶媒層および透明の水層の試料が、除去され、上記の方法によってイソブタノールについて分析され得る。
【０２０６】
実施例４
トウモロコシ油脂肪酸
丸底フラスコ（５Ｌ）は、機械的撹拌器、熱電対、加熱マントル、凝縮器、および窒素ティー（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｔｅｅ）を備えていた。５００ｇの食品グレードのトウモロコシ油、１Ｌの水および７５ｇの水酸化ナトリウムを投入した。混合物を９０℃まで加熱し、３時間保持し、その間に、混合物は、１つの高粘度の、エマルジョン状の単相になった。この時間の終了時に、ＴＬＣは、混合物中に残っているトウモロコシ油がないことを示す。次に、混合物を７２℃に冷却し、５００ｍＬの２５％の硫酸を加えて、混合物を酸性化した。次に、混合物を室温に冷まし、２Ｌのジエチルエーテルを加えた。エーテル層を、１％の硫酸で洗浄し（３×１Ｌ）、飽和塩水で洗浄し（１×１Ｌ）、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過した。エーテルをロータリーエバポレータ（ｒｏｔｏｖａｐ）によって除去し、次に、油を窒素で一晩パージしたところ、４７０ｇの黄色の油が得られ、それを一晩部分的に結晶化させた。ＡＯＣＳ方法Ｃａ  ５ａ−４０による遊離脂肪酸の滴定により、オレイン酸として表される９５％の脂肪酸含量が示される。１０４ｍｇを１ｍＬの乾燥ピリジン中の１００ｕＬのＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドと反応させることによって、試料をシラン処理した。シラン処理された生成物のガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣＭＳ）は、１６：０、１８：２、１８：１、１８：０、および２０：０の酸のＴＭＳ誘導体の存在を示す。
【０２０７】
静的方法によって測定した際の１６８時間後の初期の６％のＩ−ＢｕＯＨ濃度におけるＣＯＦＡ／水系中のイソブタノールの分配係数は２．８である。
【０２０８】
実施例５
トウモロコシ油脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）
丸底フラスコ（５Ｌ）は、機械的撹拌器、熱電対、加熱マントル、凝縮器、および窒素ティーを備えていた。１５００ｇの食品グレードのトウモロコシ油、１５００ｇのメタノール、および３０ｇの濃硫酸を投入した。混合物を２４時間還流させた後、薄層クロマトグラフィーを行った。次に、反応物を冷却し、層を分離した。有機層を、水（１×１Ｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム（１×１Ｌ）、水（２×１Ｌ）、飽和塩水（１×１Ｌ）で洗浄し、次にＭｇＳＯ４上で乾燥させた。収量は１４１６ｇの淡黄色の油であった。ＧＣＭＳ分析は、酸１６：０、１８：２、１８：１、１８：０、２０：１、および２０：０のメチルエステルの存在を示す。ＡＯＣＳ方法Ｃａ  ５ａ−４０による遊離脂肪酸の滴定により、オレイン酸として表される０．２％の脂肪酸含量が示される。
【０２０９】
静的方法によって測定した際の２３６時間後の初期の６％のＩ−ＢｕＯＨ濃度におけるＦＡＭＥ／水系中のイソブタノールの分配係数は１．０６である。
【０２１０】
実施例６
トウモロコシ油エチレングリコールエステル（ＦＡＧＥ）
丸底フラスコ（３Ｌ）は、機械的撹拌器、熱電対、加熱マントル、ディーン・スタークトラップ、凝縮器、窒素パージ、および窒素ティーを備えており；このフラスコに、１０００ｇのトウモロコシ油脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）および１０００ｇのエチレングリコールを投入した。２ｇの清浄なナトリウムを混合物に加え、６０℃まで加熱する。９０分後、温度を１００℃まで上昇させ、窒素を反応物中に表面下でゆっくりとスパージする。メタノールを、ディーン・スタークトラップに収集する。温度を３時間かけて１６０℃までゆっくりと上昇させると、メタノールは、反応物から蒸留し続ける。さらに２時間後、合計で１００ｍＬのメタノールを収集した。反応物を室温に冷まし、２０ｇの２５％の硫酸で中和した。層を分離し、上層を４×２００ｍｌの１０％の塩化カルシウム溶液で洗浄した。エマルジョンが形成されたが、時間とともに分離するであろう。有機層を、２５０ｍＬの飽和塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過したところ、９１６ｇの透明の黄色の油が得られた。ＡＯＣＳ方法Ｃａ  ５ａ−４０による遊離脂肪酸の滴下により、オレイン酸として表される２．９％の酸が存在していることが示される。１０９ｍｇを、１ｍＬの乾燥ピリジン中の１００ｕＬのＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドと反応させることによって、試料をシラン処理した。シラン処理された生成物のＧＣＭＳ分析は、１６：０、１８：２、１８：１、および１８：０のエチレングリコールモノエステルとともに、１６：０、１８：２、および１８：１の酸のＴＭＳ誘導体の存在を示す。
【０２１１】
静的方法によって測定した際の１９２時間後の初期の６％のＩ−ＢｕＯＨ濃度におけるＦＡＧＥ／水系中のイソブタノールの分配係数は２．３である。
【０２１２】
例７
発酵の比較例
表２に列挙される材料を、例７の比較例に使用した。全ての市販の試薬を、入手したままの状態で使用した。トウモロコシ油から合成された溶媒を、入手したままの状態で使用した。
【０２１３】
【表２】
2013533742.tif 000011
【０２１４】
一般的な方法
光学密度を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ２１００  Ｐｒｏ分光光度計を用いて測定した。測定は、通常、６００ナノメートルの波長で行った。
【０２１５】
グルコース濃度を、ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２７００  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定した。発酵試料を、１．７ｍＬの微小遠心分離管において１３，２００ｒｐｍで２分間遠心分離し、水性の上清をグルコース濃度について分析した。
【０２１６】
発酵条件：３０％のｐＯ２；温度：３０℃；ｐＨ５．５（特に断りのない限り）；初期バッチグルコース：２０ｇ／Ｌ、これらは生成中に維持される。
【０２１７】
ＨＰＬＣおよびＧＣ分析の両方を、それぞれ水相および溶媒相中のイソブタノールの量子化（ｑｕａｎｔｉｚａｔｉｏｎ）に使用した。水相中のイソブタノールを、以下の条件下で、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００，Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて、０．２ｕｍのナイロンフィルターによるろ過の後に測定した：
カラム：Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ、Ｎｏ．１２５−０１４３
移動相：０．０１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ＝８．０
注入量：１０ｕＬ
流量：０．６ｍＬ／分
実行時間：２２．５分間
カラム温度：６５℃
検出器：屈折率
検出器温度：４０℃
ＵＶ検出：２１０ｎｍ、４ｎｍの帯域幅、Ｒｅｆ  ３６０ｎｍ、１００ｎｍの帯域幅。
【０２１８】
溶媒相を、以下の条件下で、ＧＣ（ＨＰ６８９０，Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて測定した：
カラム：Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＤＢ  Ｗａｘｔｅｒ（５０ｍ×０．３２ｍｍの内径（ＩＤ）、１ｕｍのフィルム）
ガス担体：ヘリウム４ｍＬ／分
注入量：２ｕＬ
補給流量：４０ｍＬ／分
実行時間：２９分間
オーブン温度：４０℃で５分間、１０℃／分で４０℃〜２３０℃、２３０℃で５分間
注入器スプリット：２５０℃で１：５
炎イオン化検出：２５０℃。
【０２１９】
トウモロコシ油に由来する抽出剤およびそれらの成分の比較例：ＧＬＮＯＲ６３５Ａ〜６４０Ａ
一連の比較例を、表３に列挙される水不混和性抽出剤を用いて行った。発酵の期間にわたって培地を溶媒に曝す時間がゼロの時点で、抽出剤を発酵ブロスに加えた。水相および有機相の両方におけるイソブタノール濃度を測定して、抽出溶媒の分配係数を計算した。グルコースの利用を用いて、抽出剤に対する微生物の生体適合性を測定した。
【０２２０】
【表３】
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【０２２１】
発酵を、株ＮＧＣＩ−０６５に関して記載されるように行った。接種材料を２段階で調製し、培養振とう器（Ｉｎｎｏｖａ  ４２００，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）において３０℃および２５０ｒｐｍで培養した。第１の段階またはプレシード（ｐｒｅ−ｓｅｅｄ）を、冷凍されたグリセロールシードストックから接種し、２つのバイアルを、３０ｍＬのろ過滅菌したプレシード培地（表４）を入れた２５０ｍＬのフラスコに入れ、ＯＤが約２になるまで２４時間増殖させた。次に、２４時間培養する第２の段階のために、１５ｍＬのプレシードを、２７０ｍＬのろ過滅菌したシード培地（表５）を入れた２Ｌのフラスコに移した。次に、３０ｍＬのろ過滅菌した１０Ｘ  ＹＥＰおよび３００ｍＬのろ過滅菌した９０〜９５％のオレイルアルコールを加え、シード培地の水相中の最終的なＯＤが約５〜１０になるまでさらに２４時間培養した。例ＧＬＮＯＲ６３９およびＧＬＮＯＲ６４０では、ｐＨは４．５であった。
【０２２２】
【表４】
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【０２２３】
【表５】
2013533742.tif 000014
【０２２４】
発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  ＡＤ１０１０  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ，Ａｐｐｌｉｋｏｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｏｖｅｒ，ＮＪ）を、脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）で３０分間殺菌した（Ａｍｓｃｏ  Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ  ３０３３  Ｒｅｖａｓ  Ｓｔｅａｍ  Ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｒ，Ｓｔｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ）。オートクレーブ中で槽の殺菌を終えてから、３０℃に冷却し、殺菌した脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）を除去し、ろ過滅菌した発酵培地を、２８０ｍＬの体積に加えた。最終的な水性体積が３５０ｍＬになるように、第２の段階のシードフラスコからの７０ｍＬの水相を発酵槽に加えた。接種の直後、最終的な溶媒対ブロスの比率が約１：１になるように、４５０ｍＬのそれぞれの抽出溶媒だけでなく、１００ｍＬの１０Ｘ  ＹＥＰ培地の補充を追加した。発酵設定値条件は、３０℃の温度、ｐＯ２３０％、ＧＬＮＯＲ６３５Ａ−６３８ＡについてｐＨ５．５およびＧＬＮＯＲ６３９Ａ〜６４０ＡについてｐＨ４．５であった。発酵物を、接種の時点から約８時間ごとに採取して、グルコース濃度を監視し、それを、５０％  ｗ／ｗのグルコース溶液の添加によって５〜２０ｇ／Ｌに維持し、水相および抽出剤相の両方におけるイソブタノール蓄積について分析した。各時点で十分な試料の体積を取って、相の両方からの試料を得て、次に、それらの試料を、それぞれの明確な輪郭を確実にするために遠心分離した。
【０２２５】
【表６】
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【０２２６】
トウモロコシ油に由来する抽出剤およびそれらの成分の比較例：ＧＬＮＯＲ６６１Ａ〜６６６Ａ
比較例ＧＬＮＯＲ６６１Ａ〜６６６Ａを、表７に列挙される水不混和性抽出剤を用いて行った。この組の例を、菌株、ｐＨ、およびゼロの時点での補充添加を除いて、上記の例ＧＬＮＯＲ６３５Ａ〜６４０Ａと同じように行った。株ＮＧＣＩ−０７０を使用し、ｐＨ設定値は５．５であり、４ｍＬのニコチン酸／チアミン培地の補充を、この一連の例についての１００ｍＬの酵母抽出物ペプトンの代わりに追加した。
【０２２７】
【表７】
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【０２２８】
トウモロコシ油に由来する抽出剤およびそれらの成分の比較例：ＧＬＮＯＲ６９０Ａ〜６９５Ａ
比較例ＧＬＮＯＲ６９０Ａ〜６９５Ａを、表８に列挙される水不混和性抽出剤を用いて行った。この組の例を、上記の例ＧＬＮＯＲ６６１Ａ〜６６６Ａと同じように行った。株ＮＧＣＩ−０７０を使用した。
【０２２９】
【表８】
2013533742.tif 000017
【０２３０】
トウモロコシ油に由来する抽出剤およびそれらの成分の比較例ＧＬＮＯＲ７２１Ａ〜７２６Ａ
比較例ＧＬＮＯＲ７２１Ａ〜７２６Ａを、表９に列挙される水不混和性抽出剤を用いて行った。この組の例を、上記の例ＧＬＮＯＲ６９０Ａ〜６９５Ａと同じように行った。株ＮＧＣＩ−０７０を使用した。
【０２３１】
【表９】
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【０２３２】
トウモロコシ油に由来する抽出剤およびそれらの成分の比較例：ＧＬＮＯＲ７４９Ａ〜７５４Ａ
比較例ＧＬＮＯＲ７４９Ａ〜７５４Ａを、表１０に列挙される水不混和性抽出剤を用いて行った。この組の例を、上記の例ＧＬＮＯＲ７２１Ａ−７２６Ａと同じように行った。株ＮＧＣＩ−０７０を使用した。
【０２３３】
【表１０】
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【０２３４】
発酵例ＧＬＮＯＲ６３５Ａ〜６４０Ａ、ＧＬＮＯＲ６６１Ａ〜６６６Ａ、ＧＬＮＯＲ６９０Ａ〜６９５Ａ、ＧＬＮＯＲ７２１Ａ〜７２６Ａ、ＧＬＮＯＲ７４９Ａ〜７５４Ａについての性能データが、表１１にまとめられており、表１１は、オレイルアルコールおよびＩｓｏｆｏｌ（商標）の従来の市販の溶媒と比較した際の、例示的なトウモロコシ油に由来する抽出剤およびそれらの成分についての、水性イソブタノール濃度（ｇ／Ｌ）、溶媒イソブタノール濃度（ｇ／Ｌ）、および溶媒の分配係数（Ｋｐ）を示す。
【０２３５】
【表１１】
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【０２３６】
実施例８
脂肪アルコールの水酸化（６５％の水酸化）
機械的撹拌器および滴下漏斗を備えた２５０ｍＬの三つ口フラスコに、脂肪アルコール混合物（４３ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、トルエン（２５．０ｍＬ）、Ａｍｂｅｒｌｙｔｅ  ＩＲ−１２０樹脂（１２．５ｇ）、および氷酢酸（７．５ｇ）を加えた。得られた混合物を６０℃まで加熱し、次に、過酸化水素（４１．８ｇの水中３０％のＨ２Ｏ２）を、３０分間にわたって滴下して加えた。混合物を６０℃で２時間撹拌し、その時点で反応混合物を処理した：樹脂をろ過によって除去し、ろ液を酢酸エチル（７５ｍＬ）と水（５０ｍＬ）とに分液した。層を分離した後、有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）、および塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、５０ｇの黄色の油が得られた。粗反応生成物の１Ｈ  ＮＭＲ分析により、二重結合の６５％がエポキシ化されたことが示された。得られた混合物を、精製せずに次の工程に使用した。
【０２３７】
５００ｍＬの丸底フラスコに、エポキシ化脂肪アルコール（１４．５ｇ）、ＴＨＦ（２００．０ｍＬ）、および硫酸（１００ｍＬの１．７Ｍの水溶液）を加えた。濁った混合物を５０℃で一晩撹拌し、次に、水（１００ｍＬ）と酢酸エチル（２００ｍＬ）とに分液することによって処理した。有機層を、水（２×１００ｍＬ）、続いて飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）、次に塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、１４．７ｇの高粘度の透明の液体と白色の固体との混合物が得られた。
【０２３８】
分配係数の測定
水中の３％のｉ−ＢｕＯＨ溶液の１ｍＬの溶液に、１ｍＬの水酸化脂肪アルコール混合物を加え、得られた二相混合物を、１０分間にわたってボルテックスを用いて激しく撹拌した。６％のｉ−ＢｕＯＨ溶液においても同様に、実験を２通り行った。混合後、層を分離し、試料を両方の層から取って、ＧＣを用いてｉ−ＢｕＯＨ濃度を測定した（表１２）。３．７の分配係数が観察された。
【０２３９】
【表１２】
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【０２４０】
本発明の様々な実施形態を上に説明してきたが、それらは例として示されたに過ぎず、限定するものではないことを理解されたい。本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに本発明の形態および細部の様々な変更を行うことができることが、関連技術の当業者に明らかであろう。したがって、本発明の広さおよび範囲は、上述した例示的実施形態のいずれによって限定されるものでもなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物のみにしたがって規定されるものである。
【０２４１】
本明細書に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関する技術分野の当業者の技能のレベルを示し、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により援用されることが具体的にかつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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