(57)【要約】本発明は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を適用してＧＬＰ−１ペプチド類似体を精製するためのプロセスを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を適用してＧＬＰ−１ペプチド類似体を精製するためのプロセスであって、溶出のために水性緩衝液と有機溶媒の混合物を用いる１回目および２回目のクロマトグラフィー工程を含み、２回目のクロマトグラフィー工程のための有機溶媒がアセトニトリルであり、そして２回目のクロマトグラフィーを８．０〜１１．０のｐＨの塩基性緩衝液を使用して実施することを特徴とするプロセス。
【請求項２】
アセトニトリルにさらに、有機修飾剤としてのメチルｔ−ブチルエーテルを混合することを特徴とする、請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
９９／１（ｖ／ｖ）から８０／２０（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／メチルｔ−ブチルエーテルの混合物を適用することを特徴とする、請求項２記載のプロセス。
【請求項４】
塩基性緩衝液が酢酸アンモニウムまたは炭酸水素アンモニウムから選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のプロセス。
【請求項５】
塩基性緩衝液が１０mMolから２５mMolの濃度で適用されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載のプロセス。
【請求項６】
１回目のクロマトグラフィー工程のための水性有機溶媒がアセトニトリルであり、そして１回目のクロマトグラフィーを１．０〜４．０のｐＨの酸性緩衝液を使用して実施することを特徴とする、請求項１記載のプロセス。
【請求項７】
酸性緩衝液がリン酸アンモニウムであることを特徴とする、請求項６記載のプロセス。
【請求項８】
ＲＰ−ＨＰＬＣは、固定相としてシリカゲル吸着剤を使用して実施されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載のプロセス。
【請求項９】
ＧＬＰ−１ペプチド類似体が、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、（Ｇｌｙ８）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｇｌｙ８）ＧＬＰ−１（７−３６）、（Ｓｅｒ３４）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｖａｌ８）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｖａｌ８、Ｇｌｕ２２）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、（Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ヘキサデカノイル）））−Ｌｙｓ２６Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ−Ａｌａ８Ｌｙｓ３７−（２−（２−（２−マレイミドプロピオンアミド（エトキシ）エトキシ）アセトアミド））ＧＬＰ−１（７−３７）、エキセンディン−３、エキセンディン−４、エキセンディン−４酸、エキセンディン−４（１−３０）、エキセンディン−４（１−３０）アミド、エキセンディン−４（１−２８）、エキセンディン−４（１−２８）アミド、１４Ｌｅｕ，２５Ｐｈｅエキセンディン−４アミドおよび１４Ｌｅｕ，２５Ｐｈｅエキセンディン−４（１−２８）アミドおよびＡＶＥ−００１０からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項記載のプロセス。
【請求項１０】
ＧＬＰ−１ペプチド類似体が（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２である、請求項１〜９のいずれか１項記載のプロセス。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載のプロセスを用いて得ることのできるＧＬＰ−１ペプチド類似体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の類似体の精製、特に、配列番号１：
His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2
（これらのアミノ酸の２６個は天然のＬ立体配置であるが、４つはキラルではない）
に記載のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１類似体の精製のためのプロセスに関する。Ａｉｂは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によるヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）のα−アミノイソ酪酸類似体を意味する。
【０００２】
このペプチドはまた（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２とも命名され、そしてその薬学的使用および固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）による調製が、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ２０００／３４３３１号に記載されている。
【０００３】
発明の背景
ＧＬＰ−１類似体の合成は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）および溶液中におけるフラグメントカップリングの両方を包含するハイブリッドなアプローチに従い得る。例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ２００７／１４７８１６号は、３つのフラグメントを調製し、そして溶液中においてこれらのフラグメントをカップリングすることによる、（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の調製を記載する。
【０００４】
個々の合成工程は通常、非常に選択的であるが、多工程の化学合成の終了時には、生成物は典型的には薬物として使用するに十分なほど純粋ではない。それ故、粗生成物を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）にかけて、ペプチドをさらに精製し、そして９６〜９９％（領域）の範囲の純度を達成することができる。ＲＰ−ＨＰＬＣ段階の後、生成物は、通常、溶液の形態で、典型的には１〜１５％（ｗ／ｗ）のペプチドの濃度で得られる。
【０００５】
薬物製剤に適した乾燥最終生成物を得るために、溶液を沈降、凍結乾燥または噴霧乾燥技術のいずれかにかけ得る。
【０００６】
ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）のためのＲＰ−ＨＰＬＣ精製は当技術分野において広く記載されている。
【０００７】
例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ２００７／１４７８１６号によると、ＧＬＰ−１類似体を、以下の２工程のＲＰ−ＨＰＬＣプロセスにかける；
移動相として、アセトニトリル（１５％）、水（８５％）および少量のＴＦＡからなる混合物Ａ、およびテトラヒドロフラン（１５％）、アセトニトリル（７０％）、水（１５％）および少量のＴＦＡから構成される混合物Ｂを適用するｐＨ２における１回目のクロマトグラフィー、並びに
移動相として、アセトニトリル（１５％）、水（８５％）および酢酸アンモニウム緩衝液からなる混合物Ａ、およびテトラヒドロフラン（１５％）、アセトニトリル（６０％）、水（２５％）および酢酸アンモニウム緩衝液から構成される混合物Ｂを適用するｐＨ８．８における２回目のクロマトグラフィー。
【０００８】
テトラヒドロフランは過酸化物を形成する傾向があるので、溶出液は大規模でのＲＰ−ＨＰＬＣにとって重要である。
【０００９】
EP-B1 1664 109は、溶出液としてｐＨ緩衝化アルコール、特にエタノールを用いて、グルカゴン様ペプチドを精製するためのＲＰ−ＨＰＬＣ法を開示し、それによりｐＨ範囲はｐＨ４からｐＨ１０に設定され得るが、ｐＨ設定値から＋／−１．０ｐＨユニット以上は変動しないだろう。
【００１０】
従って、所望の純度を達成するために、方法は厳密なｐＨ制御を必要とする。
【００１１】
しかしながら、溶出液としてエタノールを用いると所望の純度を達成することができず、特に不純物であるｄｅｓ−Ｓｅｒ１７，Ｓｅｒ１８−［Ａｉｂ８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を効率的に除去できないことが判明した。
【００１２】
それ故、本発明の目的は、技術的規模で容易に適用可能であり、溶媒に関して安全であり、そして優れた純度でＧＬＰ−１溶液を提供することのできる、ＲＰ−ＨＰＬＣプロセスを開発することである。
【００１３】
発明の詳細な説明
この目的に、以下に概略を示した本発明のプロセスを用いて到達できることが判明した。
【００１４】
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を適用してＧＬＰ−１ペプチド類似体を精製するためのプロセスは、溶出のための水性緩衝液と有機溶媒との混合物を用いた１回目および２回目のクロマトグラフィー工程を含み、２回目のクロマトグラフィー工程のための有機溶媒がアセトニトリルであり、そして２回目のクロマトグラフィーは、８．０〜１１．０のｐＨの塩基性緩衝液を使用して実施されることを特徴とする。
【００１５】
水性緩衝液は、ｐＨの変化を防ぐ緩衝剤を含む水溶液である。使用される緩衝剤に依存して、緩衝液は酸性または塩基性であり得る。
【００１６】
「ＧＬＰ−１ペプチド類似体」という用語は、天然のヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）類似体ＧＬＰ−１（７−３７）およびＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、およびＧＬＰ−１ペプチドの合成類似体（ＧＬＰ−１類似体）を包含する。
【００１７】
好ましいＧＬＰ−１類似体は、配列番号１：
His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2
に記載のアミノ酸配列を有するヒトＧＬＰ−１類似体、すなわち（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、およびＰＣＴ公開公報第ＷＯ２０００／３４３３１号に記載のようなさらに他の類似体である。（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２が特に関心が高い。この短い形態は、アミノ酸残基１番から６番を欠失させ、Ｃ末端をアミド化し、そして８位（Ａｌａ）および３５位（Ｇｌｙ）の天然に存在するアミノ酸残基をα−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）で置換することによって、天然のヒトＧＬＰ−１（１−３７）から正式に誘導された類似体を指定する。
【００１８】
ＧＬＰ−１ペプチドの適切な類似体はさらに、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、（Ｇｌｙ８）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｇｌｙ８）ＧＬＰ−１（７−３６）、（Ｓｅｒ３４）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｖａｌ８）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｖａｌ８、Ｇｌｕ２２）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ヘキサデカノイル）））−Ｌｙｓ２６Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）（リラグルチド）およびＤ−Ａｌａ８Ｌｙｓ３７−（２−（２−（２−マレイミドプロピオンアミド（エトキシ）エトキシ）アセトアミド））ＧＬＰ−１（７−３７）（ＣＪＣ−１１３１）から選択され得る。
【００１９】
ＧＬＰ−１ペプチドのまたさらなる類似体は、エキセンディン−３、配列番号２：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
に記載のアミノ酸配列を有するエキセンディン−４（エクセナチド）、エキセンディン−４酸、エキセンディン−４（１−３０）、エキセンディン−４（１−３０）アミド、エキセンディン−４（１−２８）、エキセンディン−４（１−２８）アミド、１４Ｌｅｕ，２５Ｐｈｅエキセンディン−４アミド、および１４Ｌｅｕ，２５Ｐｈｅエキセンディン−４（１−２８）アミド並びにＡＶＥ−００１０、配列番号３：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
に記載のアミノ酸配列を有するエキセンディン類似体から選択されたエキセンディン類似体であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１ａ】（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の２回目のクロマトグラフィーのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム；２０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝９．２；Kromasil C18 100-16；エタノール（１００％）。
【図１ｂ】（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の２回目のクロマトグラフィーのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム；２０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝９．５；Kromasil C18 100-16；アセトニトリル（１００％）。図１ａ）と比較して、不純物のｄｅｓ−Ｓｅｒ１７，Ｓｅｒ１８−［Ａｉｂ８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２は、溶出液としてのアセトニトリルを用いて効率的に除去された。
【図２ａ】（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の２回目のクロマトグラフィーのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム；２０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝９．５；Kromasil C18 100-16；アセトニトリル（１００％）。
【図２ｂ】（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の２回目のクロマトグラフィーのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム；２０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝９．５；Kromasil C18 100-16；アセトニトリル／メチルｔ−ブチルエーテル（９５：５ ｖ：ｖ）。純度および収率は、有機修飾剤としてのメチルｔ−ブチルエーテルを使用して増加させ得る。
【００２１】
本発明の特定の態様は、以下に概略を示した通りである。
【００２２】
２回目のクロマトグラフィー工程を、前記に概略を示した通りに、有機溶媒としてアセトニトリルを用いて、そして８．０〜１１．０のｐＨ、より特定すると９．０〜１０．０のｐＨ、さらにより特定すると９．５＋／−０．２のｐＨの塩基性緩衝液を使用して実施する。
【００２３】
本発明の特定の態様において、アセトニトリルを有機修飾剤としてのメチルｔ−ブチルエーテルと混合する。
【００２４】
適切には、９９／１（ｖ／ｖ）から８０／２０（ｖ／ｖ）、特に９７．５／２．５（ｖ／ｖ）から９０／１０（ｖ／ｖ）、さらにより特定すると９５／５（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／メチルｔ−ブチルエーテルの混合物を適用する。
【００２５】
塩基性緩衝液は、当業者に公知の市販の緩衝液から選択され得る。酢酸アンモニウムまたは炭酸水素アンモニウムが特に適切であることが判明した。
【００２６】
緩衝液の濃度は、１０〜２５mMの範囲で変動し得、２０mMの緩衝液の濃度が好ましい。
【００２７】
１回目のクロマトグラフィー工程を、有機溶媒としてアセトニトリル、および１．０〜４．０のｐＨ、より特定すると２．０〜３．０のｐＨ、さらにより特定すると２．３〜２．５のｐＨ、最も特定すると２．５のｐＨの酸性緩衝液を用いて実施する。
【００２８】
酸性緩衝液は当業者に公知の市販の緩衝液から選択され得る。リン酸アンモニウムが特に適切であることが判明した。緩衝液の濃度は、１００〜４００mMの範囲で変動し得、３００mMの緩衝液濃度が好ましい。
【００２９】
ＲＰ−ＨＰＬＣは、好都合には、固定相としてシリカゲル吸着剤を使用して実施される。
【００３０】
適切なシリカゲルのタイプは、以下のシリカゲル吸着剤から選択され得るが、それらに限定されない：Kromasil（商標）C18 100 - 16、Kromasil（商標）C18 100 - 10、Kromasil（商標）C8 100 - 16、Kromasil（商標） C4 100 - 16、Kromasil（商標） Phenyl 100 - 10、Kromasil（商標） C18 Eternity 100 - 5、Kromasil（商標） C4 Eternity 100 - 5、Chromatorex（商標）C18 SMB 100-15 HE、Chromatorex（商標）C8 SMB 100-15 HE、Chromatorex（商標）C4 SMB 100-15 HE、Daisopak（商標）SP 120-15 ODS-AP、Daisopak（商標）SP 120-10-C4-Bio、Daisopak（商標）SP 200-10-C4-Bio、Zeosphere（商標）C18 100-15、Zeosphere（商標）C8 100-15、Zeosphere（商標）C4 100-15、SepTech ST 150-10 C18、Luna C18 100-10、Gemini C18 110-10、YMC Triart C18 120-5およびYMC Triart C8 200-10。
【００３１】
前記に列挙したKromasil（商標）シリカゲルタイプが特に適切であることが判明した。
【００３２】
あるいは、ＲＰ−ＨＰＬＣを、ポリマーをベースとした固定相を使用して実施することができる。適切なポリマー相は、PLRP-S 100-10またはAmberchrom（商標）Profile XT20から選択され得るがそれらに限定されない。
【００３３】
１回目および２回目のクロマトグラフィー工程の両方のためのＲＰ−ＨＰＬＣを、移動相勾配を用いて、原則としてより低い濃度の有機溶媒で開始して、溶出時間を経過して、より高い濃度の有機溶媒で終わるように流す。イベント時間、移動相勾配およびローディング態様などの溶出パラメーターは、精製を最適化するために当業者によって変更され得る。
【００３４】
精製された（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含む画分を場合により濃縮し、その後、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ２００７／１４７８１６号に記載のように凍結乾燥し得る。あるいは、精製された（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２は、沈降によってまたは当業者に公知の噴霧乾燥技術によってＲＰ−ＨＰＬＣ画分から単離され得る。
【００３５】
以下の実施例は、本発明の範囲を制限することなく本発明のプロセスをより詳細に説明する。
【００３６】
実施例
実施例Ａ：
ペプチドの調製
粗ペプチド（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２は、ＷＯ２００７／１４７８１６およびＷＯ２００９／０７４４８３に記載の方法に従って、３つのフラグメントを産生し、そしてこれらのフラグメントを溶液中でカップリングすることによって調製され得る。
【００３７】
精製は、ｐＨ２．５における１回目に通過するクロマトグラフィー精製、次いでｐＨ９．５における２回目の通過を含む。
【００３８】
実施例Ｂ１：
ＲＰ−ＨＰＬＣの技術的パラメーター：
【００３９】
【表１】
2013529608.tif 000002
【００４０】
１回目のクロマトグラフィー工程：
粗（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を水／アセトニトリル／酢酸（９０／９／１ ｖ／ｖ／ｖ）に溶解し、そしてＨＰＬＣカラムにのせ（２０ｇ/Ｌまでローディング、床深さ約２５cm）、そして精製プログラムを開始する。画分を回収し、そして水で希釈し得るか、または水酸化アンモニウム溶液で希釈し得る。
【００４１】
表１
１回目のクロマトグラフィー工程のパラメーターおよび精製プログラム：
【００４２】
【表２】
2013529608.tif 000003
【００４３】
ＡおよびＣの比率は、主要なピーク（ペプチド（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２）の最小の保持を達成するために変更され得る。イベント時間、勾配およびローディング態様は精製を最適化するために変更され得る。プールした画分は、２回目のクロマトグラフィーの条件によってさらに精製される。
【００４４】
２回目のクロマトグラフィー工程：
（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２のクロマトグラフィー１からのプールし希釈した画分をＨＰＬＣカラムにのせ、そして精製プログラム（表２の４．６mmのカラムについての例を参照）を開始する。
【００４５】
表２
２回目のクロマトグラフィー工程のパラメーターおよび精製プログラム
【００４６】
【表３】
2013529608.tif 000004
【００４７】
主要な画分における（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の計算された純度は９７．０％であった。計算された収率は８７％であった（図１ｂ、２ａ参照）。
【００４８】
実施例Ｂ２：
２回目のクロマトグラフィー工程では炭酸水素アンモニウム緩衝液（２０mM（ｐＨ９．５＋／−０．２））を使用した以外、実施例Ｂ１の手順を繰り返した。
【００４９】
主要な画分における（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の計算された純度は９７．２％であった。計算された収率は９３％であった。
【００５０】
実施例Ｂ３：
２回目のクロマトグラフィー工程ではアセトニトリルを、アセトニトリル／メチルｔ−ブチルエーテル９５：５の混合物で置き換えた以外は、実施例Ｂ１の手順を繰り返した。
【００５１】
主要な画分における（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の計算された純度は９７．４％であった。計算された収率は９８％であった（図２ｂ参照）。
【００５２】
実施例Ｂ４：
実施例Ｂ１の手順を、以下のパラメーターを適用して繰り返した。
【００５３】
【表４】
2013529608.tif 000005
【００５４】
主要な画分における（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の計算された純度は９７．１％であった。計算された収率は９９％であった。
【００５５】
実施例Ｂ５（比較）
２回目のクロマトグラフィー工程ではアセトニトリルをエタノールによって置き換えた以外は、実施例Ｂ１の手順を繰り返した。
【００５６】
主要な画分における（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の計算された純度は９６．７％であった。計算された収率は８６％であった。主要な画分は、不純物としてｄｅｓ−Ｓｅｒ１７，Ｓｅｒ１８−［Ａｉｂ８，３５］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を含んでいた（図１ａ参照）。
【図１ａ】
2013529608.tif 000006
【図１ｂ】
2013529608.tif 000007
【図２ａ】
2013529608.tif 000008
【図２ｂ】
2013529608.tif 000009
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年4月7日(2012.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を適用して（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を精製するためのプロセスであって、溶出のために水性緩衝液と有機溶媒の混合物を用いる１回目および２回目のクロマトグラフィー工程を含み、２回目のクロマトグラフィー工程のための有機溶媒がアセトニトリルであり、そして２回目のクロマトグラフィーを８．０〜１１．０のｐＨの塩基性緩衝液を使用して実施することを特徴とするプロセス。
【請求項２】
アセトニトリルにさらに、有機修飾剤としてのメチルｔ−ブチルエーテルを混合することを特徴とする、請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
９９／１（ｖ／ｖ）から８０／２０（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／メチルｔ−ブチルエーテルの混合物を適用することを特徴とする、請求項２記載のプロセス。
【請求項４】
塩基性緩衝液が酢酸アンモニウムまたは炭酸水素アンモニウムから選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のプロセス。
【請求項５】
塩基性緩衝液が１０mMolから２５mMolの濃度で適用されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載のプロセス。
【請求項６】
１回目のクロマトグラフィー工程のための水性有機溶媒がアセトニトリルであり、そして１回目のクロマトグラフィーを１．０〜４．０のｐＨの酸性緩衝液を使用して実施することを特徴とする、請求項１記載のプロセス。
【請求項７】
酸性緩衝液がリン酸アンモニウムであることを特徴とする、請求項６記載のプロセス。
【請求項８】
ＲＰ−ＨＰＬＣは、固定相としてシリカゲル吸着剤を使用して実施されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載のプロセス。
【国際調査報告】
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