【事件の表示】
　特許第２６８０４６２号「核酸の単離方法」の請求項１ないし１１に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結論】
　訂正を認める。
　特許第２６８０４６２号の請求項１ないし１１に係る特許を維持する。
【理由】
１．手続の経緯
　特許第２６８０４６２号に係る発明についての出願は、平成２年３月２３日（パリ条約による優先権主張１９８９年３月２３日、オランダ国）に特許出願され、平成９年８月１日にその発明について特許の設定登録がなされ、その後、その特許について、異議申立人寶酒造株式会社より特許異議の申立てがなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１１年７月５日に訂正請求がなされたものである。
２．訂正の適否についての判断
（ａ）訂正の内容
　特許請求の範囲の請求項１中の「核酸を単離する」を「核酸を直接単離する」に訂正するものである。
（ｂ）訂正の目的の適否、拡張・変更の存否、及び新規事項の追加の有無
　上記訂正は、請求項１における前処理を介することを含む「核酸の単離」することを、前処理を介さずに「直接単離」することに限定したものであり、また、願書に添付した明細書（以下、特許明細書という。）には、「種々の生物材料……直接（前処理を介さずに）単離することが可能な方法を提供する」（３頁１３〜１７行、特許掲載公報第４欄、１２〜１８行）、及び実施例には、前処理を行っていない血清、全血、水様便等の出発材料から直接核酸を単離する方法が記載されているから、特許請求の範囲の減縮に該当し、特許明細書に記載された範囲内のものである。
　また、この訂正は実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものでもない。
（ｃ）独立特許要件の判断
　後述の３．特許異議申し立てについての判断に記載した理由により、訂正後の請求項１〜１１に係る発明は、独立して特許を受けることができる発明である。
　以上のとおりであるから、上記訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項で準用する第１２６条第２〜４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
３．特許異議申立についての判断
イ、本件特許発明
　本件請求項１〜１１に係る発明は、訂正された特許明細書の記載からみて、特許請求の範囲に記載されたとおりのものと認められ、その請求項１に係る発明は次のとおりである。
「　核酸を含有する複合生物出発材料から核酸を直接単離するための方法であって、複合生物出発材料、カオトロピック物質及びシリカ又はその誘導体を含む核酸結合性固相を混合し、核酸が結合した固相を液体から分離し、その後、こうして得られた固相−核酸複合体を洗浄し、必要に応じて核酸を該複合体から溶離することを特徴とする方法。」
ロ、異議申立の概要
　異議申立人は、甲第１号証（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１５，（１９８７）５５０７〜５５１６）、甲第２号証（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７６，（１９７９）６１５〜６１９）、甲第３号証（特開昭５９−２２７７４４号公報）、甲第４号証（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１２１，（１９８２）３８２〜３８７）、甲第５号証（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ１，（１９８２）１８８〜１９０）及び甲第６号証（特開昭６３−１０２６７７号公報）を提出して、
▲１▼　本件請求項１に係る発明は、甲第１号証に記載された発明であるから特許法第２９条第１項第３号に該当し、
▲２▼　請求項１〜１１に係る発明は、甲第１〜６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることできたものであるから、同法第２９条第２項の規定に違反してされたものであり、また、
▲３▼　特許明細書の特許請求の範囲の記載が不備であるので、本件特許は、同法第３６条第４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたものであり、
同法第１１３条第１項第２号又は第４号の規定により取り消されるべきであると主張している。ハ、特許法第２９条第１項第３号について
ａ）証拠記載の発明
　甲第１号証には、バクテリオファージＭ１３一本鎖ＤＮＡ配列決定鋳型を調製する方法に関して記載され、その方法として、ファージ懸濁液を増殖したファージ培地から遠心分離により細菌を除いて調製すること、ファージ懸濁液に氷酢酸を添加して沈殿させ、吸引濾過して焼結ガラス濾過ユニット上に置かれたガラス繊維フィルター上にファージの酢酸沈殿物を回収し、このフィルターに結合したＭ１３ファージの酢酸沈殿物をＮａＣｌＯ４を用いて、処理してファージＤＮＡを回収し、この処理後に、まずイソプロパノールを用いて、次に９６％エタノールを用いてフィルターに結合したＤＮＡを洗浄し、そして、ガラス繊維フィルターから０１ＴＥを用いてＤＮＡを溶離し、元のファージ懸濁液中に存在するＤＮＡの４０〜６０％を回収した旨か記載されている。（５５１１頁下から１４行〜５５１２頁２５行）
ｂ）対比・判断
　本件請求項１に係る発明と甲第１号証に記載されたものとを対比する。
　特許明細書の記載によれば、請求項１に係る発明において、「複合生物出発材料」、「核酸を直接単離する」、「カオトロピック物質」及び「シリカ又はその誘導体を含む核酸結合性固相」とは、それぞれ「広義には本発明はあらゆる核酸含有出発材料（ウイルス又は細菌に感染した食品及び類似製品、ワクチン及びミルクを含む）に適用できるが、使用される出発材料が全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織及び細胞培養物（例えば哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物）のような核酸含有生物材料である」（３頁末２行〜４頁３行、特許掲載公報第４欄３２〜３８行）、「種々の生物材料のような複雑な出発材料（複合出発材料ともいう）から核酸（すなわちＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を未曾有の迅速さで簡単且つ再現可能に、しかもその後、分子生物反応における反応剤として使用可能な非損傷状態及び高純度で直接（前処理を介さずに）単離することが可能な方法を提供することである（３頁１３〜１７行、同第４欄１３〜１９行）、「タンパク質及び核酸の二次、三次及び／又は四次構造を変えることが可能であり且つ少なくとも一次構造を無傷にしておくことが可能な任意な物質を意味する。具体例は（イソ）チオシアン酸グアニジニウム及び塩酸グアニジンである」（５頁末５〜２行、同第６欄１１〜１５行）及び「カオトロピック物質の存在下でＮＡと結合することが可能な核酸結合性固相、例えばシリカ粒子を使用する点にある。シリカなる用語は、ＳｉＯ２から構成されるケイソウ植物の骨格、無定形酸化ケイ素並びにガラス粉末を意味する。…フィルター材料も本発明の核酸結合相として使用できる」（４頁１１〜１８行、同第４欄末行〜第５欄１０行）ものである。
　そうすると、甲第１号証の記載の方法は、ファージＭ１３の培地から細菌を取り除き、上清から酢酸を用いてファージ酢酸沈殿物を沈殿させ、それをガラス繊維フィルター上に回収して、その後、ＮａＣｌＯ４を用いてファージＭ１３のＤＮＡを回収し、これを洗浄、溶離するものと認められるので、ＮａＣｌＯ４はカオトロピック物質、ガラス繊維フィルターは核酸結合性固相に相当するものと認められるが、このフィルター上で、ＮａＣｌＯ４と接触させているファージＭ１３は、カオトロピック物質に接触する前に、ファージを増殖させた培地から細菌を遠心分離して除き、酢酸で沈殿させ、濾過してガラス繊維フィルター上に回収したもの、つまり、前処理を介した出発材料であるので、両者は核酸を含有する出発材料、カオトロピック物質及びシリカ又はその誘導体を含む核酸結合性固相（以下、単に固相という。）を混合し、核酸か結合した固相を液体から分離し、その後、こうして得られた固相−核酸複合体を洗浄し、必要に応じて核酸を該複合体から溶離する点で一致しているが、前者は前処理を介さずに複合生物出発材料、カオトロピック物質及び固相を混合し、核酸が結合した固相を液体から分離する工程をもつのに対して、後者は前処理を介した出発材料と、カオトロピック物質、上記核酸結合性固相を混合する工程を有する点が相違する。
　したがって、請求項１に係る発明は、甲第１号証に記載されたものではない。
ニ、特許法第２９条第２項について
ｉ）請求項１に係る発明について
ａ）証拠記載の発明
　甲第１号証には、上記は、ハ、ａ）に示した事項が記載されている。
　甲第２号証には、ＤＮＡを含むアガロースゲルをカオトロピック物質（ＮａＩ）の溶液に溶解させたあと、ガラスパウダーを添加してＤＮＡをガラスに結合させ、ガラスパウダーを遠心分離して集め、ＤＮＡ−ガラス結合物をＮａＩを含む洗浄液、５０％緩衝液と５０％エタノールの混合液で洗浄し、さらにＤＮＡをガラスから溶離するＤＮＡを単離する旨が記載されている。
　甲第３号証には、ガラス粉粒物を用いてＤＮＡを含むアガロースゲルからＤＮＡを単離且つ効率にそして高分子のＤＮＡでも損なうことなく回収できる方法が記載されている。
　甲第４号証には、大腸菌培養物から処理して粗プラスミドＤＮＡを得て、この粗プラスミドＤＮＡを含有するペレットから、ガラスパウダーとカオトロピック物質であるＮａＣｌＯ４を含有する緩衝液を用いてプラスミドＤＮＡを単離する方法が記載されている。
　甲第５号証には、細胞を溶解させる方法として、塩酸グアニジニウムやイソチオシアン酸グアニジニウムのような強力なカオトロピック物質の溶液を用いた場合、これらの溶液にタンパク質が容易に溶解すること、そして細胞構造が破壊され、二次構造を失って核タンパク質が核酸から直ちに分離する旨が記載されている。
　甲第６号証には、核酸が精製されていても未精製であっても核酸の増幅が可能である旨が記載されている。
ｂ）対比・判断
　本件請求項１に係る発明と甲第１号証に記載のものとを対比すると、上記ハ、ｂ）に述べたように、出発材料について、前者は核酸を含有する複合生物出発材料を前処理を介さずにカオトロピック物質、固相とを混合する工程を有するのに対して、後者は前処理を行った核酸を含有する出発材料をカオトロピック物質、固相とを混合する工程を有する点で相違し、その他の点は一致する。
　そこで、この相違点について検討する。
　甲第２〜４号証には、いずれも前処理を行って得た粗ＤＮＡとカオトロピック物質（ＮａＩ、ＮａＣｌＯ４など）と固相（ガラスパウダー、ガラス粉粒物）を混合してＤＮＡを単離する方法が記載されているが、請求項１に係る発明における出発材料である全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織及び細胞培養物（例えば哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物）のような核酸含有複合生物材料とカオトロピック物質、固相を混合すると、核酸が上記固相に結合すること、及び、核酸が結合した固相を直接液体から分離することは何ら記載されていない。
　そして、甲第５号証、甲第６号証には、カオトロピック物質の性質や、核酸についての増幅する際の性質が記載されているだけで、上記相違点については何等記載されていない。
　ところで、本件特許明細書をみると、実施例には、出発材料として前処理を施すことなく、血清、全血、尿、糞便、グラム陰性菌培養物、又はＥ．ｃｏｌｉの培養物を用いて、固相としてシリカ粒子、カオトロピック物質としてチオシアン酸グアニジン、ＫＩ、ＮａＩ、イソチオシアン酸ナトリウムを用いると、上記固相と核酸が結合し、核酸が結合した固相から洗浄、溶離してＤＮＡ、ＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡを単離したことが示され、単離されたＤＮＡがＰＣＲ法で増幅できたことが表Ｈ１に示されている。
　このことは、請求項１に係る発明か、甲第１〜４号証に記載されているような従来の方法では、核酸含有出発材料に多段階の前処理を行うことが必要であったものを、核酸含有出発材料とカオトロピック物質、上記固相を混合すると、核酸が上記固相に結合することを見出し、簡単な処理で核酸を単離できるという格別優れた効果を奏することを示しているものである。
　そうすると、甲第１号証〜甲第６号証に記載されている事項を組合わせても、核酸を含有する複合生物出発材料を前処理を介さずにカオトロピック物質、固相とを混合する工程を有すると、核酸を含有する複合生物出発材料から核酸を直接単離することは当業者が容易に予想できるものではない。
　したがって、本件請求項１に係る発明は、甲第１号証〜甲第６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとは認められない。
ｉｉ）請求項２〜１１に係る発明について
　請求項２〜１１に係る発明は、請求項１に係る発明をさらに限定したものであるから、甲第１〜６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものではない。
ホ、特許法第３６条第４項について
　異議申立人は、本件請求項１における「複合生物出発材料」の用語の意義が不明確である旨主張しているが、請求項１には「複合生物出発材料から核酸を直接単離する」と訂正され、「直接」の意味は上記に述べたように「前処理を介せず」に核酸の単離処理を行うことが明らかであるから、「複合生物出発材料」は特許明細書に例示されているような生物材料を意味するものと解され、用語の意義が不明確であるとはいえない。
　したがって、本件特許明細書には不備はない。
４．むすび
　以上のとおりであるから、本件特許が、特許法第２９条第１項第３号又は第２９条第２項に違反してされたものではなく、同法第３６条第４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものではない。
　また、本件特許については、他に取消理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１１年７月８日（１９９９．７．８）
【訂正の要旨】
　特許請求の範囲の減縮を目的として、特許請求の範囲の請求項１中の「核酸を単離する」を「核酸を直接単離する」　に訂正するものである。
（５４）【発明の名称】
核酸の単離方法
（５７）【特許請求の範囲】
（１）　核酸を含有する複合生物出発材料から核酸を直接単離するための方法であって、複合生物出発材料、カオトロピック物質及びシリカ又はその誘導体を含む核酸結合性固相を混合し、核酸か結合した固相を液体から分離し、その後、こうして得られた固相−核酸複合体を洗浄し、必要に応じて核酸を該複合体から溶離することを特徴とする方法。
（２）　使用される複合生物出発材料が全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織又は細胞培養物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
（３）　使用されるカオトロピック物質がグアニジニウム塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、尿素又はその相互の組み合わせから構成される群から選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
（４）　グアニジニウム塩が（イソ）チオシアン酸グアニジニウムであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
（５）　核酸結合性固相がシリカ粒子を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
（６）　０．０５〜５００μｍの範囲の粒径を有するシリカ粒子を使用することを特徴とする請求項５に記載の方法。
（７）　１〜２００μｍの範囲の粒径を有するシリカ粒子を使用することを特徴とする請求項５に記載の方法。
（８）　得られた固相−核酸複合体を沈澱させ、かつ上清を廃棄することにより液体から分離し、その後、カオトロピック物質を含有する洗浄用緩衝液て複合体を洗浄することを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
（９）　洗浄用緩衝液で洗った固相−核酸複合体を更に１種以上の有機溶剤て連続して洗浄し、その後、乾燥することを特徴とする請求項８に記載の方法。
（１０）　洗浄及び乾燥した固相−核酸複合体中に存在する核酸を溶離用緩衝液により溶離することを特徴とする請求項９に記載の方法。
（１１）　得られた固相−核酸複合体を増幅用の複数の成分の混合物と接触させ、該固相に結合しているか又は該固相から溶離した核酸を増幅することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
　本発明は核酸を含有する出発材料から核酸を単離するための方法及び手段の組み合わせ、並びに該方法により得られた核酸を増幅する（ａｍｐｌｉｆｙ）するためのテストキットに係る。より特定的には、本発明は全血、血清、バフィーコート（血液の炎症性痂皮又は白血球フラクション）、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織、細胞培養物等のような、核酸を含有する生物材料から核酸を単離するための方法及びキットに係る。上記生物材料から単離された核酸は、サンプルを採取した生物に内在する核酸及び外来性（ウイルス、真菌、細菌又は寄生虫に由来する）核酸も含有し得る。
　全血、血清、尿又は糞便のような複雑な出発材料から核酸（ＮＡ）を単離する既知の方法は通常、タンパク質分解酵素の存在下で生物材料を洗剤により溶解させた後、有機溶剤（例えばフェノール及び／又はクロロホルム）で数回抽出し、エタノール沈降させ、核酸を透析することにより実施される。例えば臨床材料から（二重鎖）ＤＮＡを単離するこれらの既知の方法は多大な労力と時間を必要とする。このような出発材料からＮＡを精製するためには比較的多数の段階が必要とされるので、数個の臨床サンプルを同時に処理する場合、サンプル間にＮＡが伝播される危険が大きい。核酸増幅法、例えば最も感受性の高いポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ，Ｓａｉｋｉ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３０
　汚染に対して感受性のこのような既知の方法の１例は、組織及び細胞培養物から全ＲＮＡを単離するための方法としてＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
１６２
　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
１６２
　しかしながら、これらの既知の方法は複雑な出発材料（例えば全血及ひ血清）中では首尾よく使用することができない。
　本発明の目的は、既知の方法の欠点を解消するような方法を提供することである。
　より特定的には本発明の目的は、種々の生物材料のような複雑な出発材料（複合出発材料ともいう）から核酸（即ちＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を未曾有の迅速さで簡単且つ再現可能に、しかもその後、分子生物反応における反応剤として使用可能な非損傷状態及び高純度で直接（前処理を介さずに）単離することが可能な方法を提供することである。
　本発明の別の目的は、他のサンプル及び人体に対する汚染の危険が低いという点で既知の方法と異なり、即ち異なるサンプル間におけるＮＡの伝播の危険を最小にしながら数個の臨床サンプルを同時に処理することが可能な方法、並びに被処理サンプル中に存在し得るウイルス又は細菌が人体に伝染する危険を最小にすることが可能な手段を提供することである。
　これらの目的は本発明に従い、出発材料をカオトロピック物質及び核酸結合性固相と混合し、核酸が結合した固相を液体から分離し、その後、こうして得られた固相−核酸複合体を洗浄し、必要に応じて核酸を該複合体から溶離することを特徴とする、核酸を含有する出発材料から核酸を単離するための方法により実現される。
　広義には本発明はあらゆる核酸含有出発材料（ウイルス又は細菌に感染した食品及び類似製品、ワクチン及びミルクを含む）に適用できるが、使用される出発材料が全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織及び細胞培養物（例えば哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物）のような核酸含有生物材料であるような方法に特に適用される。しかしながら、核酸含有生物材料の種類によっては（例えば植物材料、ある種のグラム陽性菌並びにある種の酵母及びカビ）は特殊な細胞壁構造によりカオトロピック物質に溶解しないため、出発材料として本発明の方法で直接使用することはできない。従って、このような出発材料は入手形態の細胞に前処理を施す必要があり、例えば予め細胞を溶解させてから得られた溶解物に本発明の方法を実施すればよい。
　核酸（ＮＡ）なる用語は、任意の可能な構造、即ち二重鎖（ｄｓ）核酸、又は一重鎖（ｓｓ）核酸、又はその組み合わせ（部分的ｄｓ又はｓｓ）としてのＤＮＡ及びＲＮＡを意味する。
　本発明の主眼は、カオトロピック物質の存在下でＮＡと結合することが可能な核酸結合性固相、例えばシリカ粒子を使用する点にある。シリカなる用語は、ＳｉＯ２結晶及び他の形態の酸化ケイ素、ＳｉＯ２から構成されるケイソウ植物の骨格、無定形酸化ケイ素並びにガラス粉末を意味する。アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム（ゼオライト）、−ＮＨ２を有する活性シリカ、ラテックス粒子、キュベットもしくは微量滴定プレートの内壁を形成するある種のポリマー材料、又は例えばニトロセルロースから構成されるフィルター材料も本発明の核酸結合性固相として使用できる。
　シリカ粒子の使用に関しては、カオトロピック塩ＮａＩ（ヨウ化ナトリウム）の高濃度溶液中のｄｓＤＮＡをアガロースから遊離させ、ガラスに結合できることがＰＮＡＳ
７６
　本発明によると、結合し、その後、溶離される高純度の核酸を不純な出発材料から直接得られるように、適当に選択した粒径を有するシリカ粒子を使用することが好ましい。
　本発明の好適態様は、実質的に０．０５〜５０μｍの範囲の粒径を有するシリカ粒子を使用することを特徴とする。「実質的に」なる用語は、シリカ粒子の８０％以上、好ましくは９０％が規定された粒径範囲に該当することを意味する。結合したＮＡを容易に処理できるようにするためには、使用されるシリカ粒子は実質的に０．１〜２００μｍの範囲の粒径を有すると好適であり、使用されるシリカ粒子が実質的に１〜２００μｍの範囲の粒径を有するような方法が最適である。実際に、シリカ粒子のＮＡ結合能は粒子が小さければ小さいほど高いが、特にＮＡ含有量の高い出発材料の場合、及びＮＡ分子が比較的長い場合は、過度に小さいシリカ粒子を使用すると、形成されるＮＡ−シリカ複合体をそれ以上有効に再分散することかできなくなる。換言するならば、結合したＮＡを純粋な形で複合体から回収することができない。人血を出発材料として使用する場合、０．２〜１０μｍの範囲の粒径を有する非分画シリカを使用すると、このような問題が生じることがある。それ以上再分散することができない凝集物の形成は、粒径が１〜１０μｍの範囲の分画したシリカを使用することにより避けることができる。しかしながら、細菌培養物のように細胞中の濃度が高い出発材料を使用する場合、このような粗いシリカフラクションの使用は再分散し難い凝集物の形成を避けるためには不十分であり、２〜２００μｍの粒径を有するケイソウ土のようなもっと粗いシリカを使用すると、最適の結果が得られることが判明した。
　別の好適態様によると、ＮＡ結合性固相はフィルター形態であるか、又はサンプルとカオトロピック物質とを収容する容器の一部を形成する。ＮＡ結合性固相を後者の形態に選択すると、その後のサンプル処理及びＮＡ単離のために遠心分離又は濾過を実施する必要がなくなる。
　本発明によると、シリカ粒子のような上記核酸結合性固相以外にカオトロピック物質を使用することが不可欠である。カオトロピック物質なる用語は、タンパク質及び核酸の二次、三次及び／又は四次構造を変えることが可能であり且つ少なくとも一次構造を無傷にしておくことが可能な任意の物質を意味する。具体例は（イソ）チオシアン酸グアニジニウム及び塩酸グアニジンである。核酸を含有する出発材料からＮＡを単離するために、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、尿素又はその相互の組み合わせも核酸結合性固相と組み合わせて使用すると非常に好適である。本発明によると、使用されるカオトロピックグアニジニウム塩は好ましくはチオシアン酸グアニジニウム（ＧｕＳＣＮ）である。
　本発明は通常、出発材料を十分大きい量のカオトロピック物質（例えばグアニジニウム塩）及び例えばシリカ粒子と混合し、出発材料中に存在する核酸のほぼ全体を遊離させ、該シリカ粒子に結合させるように実施される。適当なプロトコールによると、例えば、反応容器中に存在するＧｕＳＣＮ緩衝溶液にシリカ粒子懸濁液を加え、その後、サンプルを加えて十分に混合する。やがて、細胞が溶解し、ウイルスが存在する場合はウイルスも溶解し、遊離したＮＡがほとんど即座にシリカ粒子に結合する。次に、形成されたシリカ−核酸複合体を例えば迅速沈澱（遠心分離）及び上清の廃棄（例えば吸引による）により液体から分離し、その後、複合体（例えばシリカ−核酸ペレットの形態）を例えばボルテックスミキサーを使用してカオトロピックグアニジニウム塩を含有する洗浄用緩衝液で洗浄（再分散又は均質化）し、再ひ沈澱させる。好ましくは、洗浄用緩衝液で洗ったシリカ−核酸複合体を更にアルコール水溶液（収率の損失を制限するために最適には約７０％エタノール）及びアセトンで洗い、その後、（例えば加熱下に）乾燥してアセトンを除去する。次に、洗浄及び乾燥したシリカ−核酸複合体中に存在するＮＡを水性溶離用緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ）により溶離する。溶離用緩衝液の選択は単離されるＮＡの使用目的に応じて決定される。適当な溶離用緩衝液の例はＴＥ緩衝液、２回蒸留水（ａｑｕａｂｉｄｅｓｔ）及びＰＣＲ緩衝液（「材料及び方法」の項参照）である。好ましくは、これら全段階を単一の反応容器（例えば容量１．５ｍｌのポリプロピレン製エッペンドルフチューブ）中で実施し、比較的少量、例えば１００μ１未満の精製ＮＡを回収する。こうして単離したＮＡは核酸分解酵素を含有せず、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば
Ｔａｑ
　本発明の方法によると、ＰＣＲ法又はヨーロッパ特許第ＥＰ０３２９８２２号に記載されている所謂ＮＡＳＢＡ法（ＮＡＳＢＡ＝核酸配列に基づく増幅）のような増幅方法によりＮＡ配列を証明できる程に、例えば血漿及び血球を予め分離することなく約４５分間に５０μ１の全血から十分な量のＮＡを単離することができる。一方、本発明は血清、糞便、尿等のようなＮＡを含有する他の種々の生物材料にも適用することができる。このため、本発明は細菌及びウイルス感染の診断において、並びに出生前診及び遺伝性腫瘍体質の診断の領域における遺伝的多形性の研究において有用である。
　発明のＮＡ単離方法は、全手順を単一の反応容器中で実施することがき、方法の第１段階で粗出発材料から遊離したＮＡが完全な別の精製過程の間に少なくとも固相の大部分に結合するので、汚染の危険が非常に低い。ウイルス又は細菌に感染している可能性のある材料の処理に伴う人体への危険は、サンプルを反応容器に入れる単離過程の第１段階にほぼ限定される。この第１の処理において、潜在的に存在する病原体は有効に不活化される。本発明の方法は特殊な周辺技術（ボルテックスミキサー、１２０００ｇエッペンドルフ型の遠心分離機及び水浴又はエッペンドルフ加熱ブロックが標準実験技術に属する）も生化学の専門的知識も必要としないので、多数のサンプルから機械的にＮＡを単離するため、換言するなら自動化に非常に適している。本発明の方法を使用すると、１０個以上、あるいは２４個以上の異なるサンプルを約１時間で処理することができる。
　本発明は核酸を含有する出発材料から核酸を単離するための方法のみならず、そのための手段の組み合わせ及び該方法により得られた核酸を増幅するためのテストキットにも係る。
　１態様によると、本発明の手段の組み合わせは、（ａ）（イソ）チオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解用緩衝液（１ｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ）、（ｂ）実質的に０．０５〜５００μｍ、好ましくは０．１〜２００μｍ、最適には１〜２００μｍの範囲の粒径を有するシリカ粒子の水性懸濁液、（ｃ）（イソ）チオシアン酸グアニジニウムを含有する洗浄用緩衝液、及び必要に応じて（ｄ）溶離用緩衝液を含む。
　即ち、本発明の手段の組み合わせは例えば次の４成分、即ち
成分１：（イソ）チオシアン酸グアニジニウム緩衝溶液、
成分２：シリカ粒子の懸濁液、
成分３：洗浄用緩衝液、及び（場合によって）
成分４：溶離用緩衝液
から構成され得る。
　必要に応じて成分１及び２を一緒にしてもよいが、その場合、貯蔵寿命か制限される。
　本発明のＮＡ単離方法で使用することが好ましい他の反応剤、例えばエタノール及びアセトンは標準実験技術に属する。
　以下、多数の実施例により本発明を説明する。先ず、使用される材料と方法について説明する。
材料及び方法
Ａ）シリカ粗材（ＳＣ）の懸濁液
　粒径分布０．５〜１０μｍで且つその８０％が１〜５μｍの、Ｓｉｇｍａ製の二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を使用した。
　シリカ６０ｇを直径５ｃｍのシリンダーに入れた２回蒸留水（最高５００ｍ１）中に懸濁させると、水柱の高さは２７．５ｃｍとなった。室温で２５時間１ｘｇ沈降させた後に、７０ｍｌを残して上澄み射を吸引して除去した。２回蒸留水を５００ｍｌになるなで加え、シリンダーを振盪することにより粒子を再度懸濁させた。５時間１ｘｇ沈降させた後、６０ｍｌを残して上澄みを吸引して除去した。３２％（ｗ／ｖ）ＨＣ１６００μ１を加た後、渦形成することにより再度懸濁させた。この懸濁液を６ｍｌ容器に入れて４ｍｌアリコートをつくり、密封し、オートクレーブ内で１２１℃で２０分間加熱した。この沈降プロトコルによって、粒径１μｍ以上のより大きなシリカ粒子を豊富に得ることができた。これは電子顕微鏡検査によって立証された。更に、酸性（ｐＨ約２）のシリカをオートクレーブ処理すると、任意に存在する核酸が完全に分解される結果となる。このように得られたシリカ粗材の懸濁液を以下ＳＣと表記する。
シリカ誘導体の懸濁液
　２〜１８個の炭素原子の長さのアルキル末端を有するメチルアクリルアミド二酸化ケイ素を用いてシリカを誘導体化した。誘導体化したシリカの粒径は６３〜２００μＭであった。使用した粒子の孔径は５００Åであった。上記シリカ誘導体（１２ＭＡＡＣ２−Ｃ１８）はＤｉｏｓｙｎｔｈ，Ｏｓｓから供給された。
　ＮＡ単離のために（実施例Ｈ１）、誘導体化したシリカ粒子０．５ｇを２回蒸留水１ｍｌ中に懸濁させた。このシリカ懸濁液を、３２％（ｗ／ｖ）ＨＣｌ　１２０μｌを用いて９０℃で３０分間予備処理した。
ポリスチレンラテックス粒子の懸濁液
　２種類のポリスチレンラテックス粒子を便用した。ポリスチレンラテックスＶＱ６９レットはナトリウム−ドデシルスクシネートスルフェート基を吸収させてあり、粒径は４２４ｎｍを有した。ポリスチレンラテックスＶＱ５８Ｂはより小さい粒径（３２８ｎｍ）を有し、外側にスルフェート基を吸収していなかった。
　３種の親水性のグリシジルメタクリレートポリスチレンラテックス粒子を使用した。ＡＧＦ２７Ｇ、ＡＣＮ３レッド及びＡＧＹ１５１５の粒径はそれぞれ９３３ｎｍ、２０６ｎｍ及び８４６ｎｍであった。上記全てのポリスチレン粒子はＡＲＬＡ−Ａｒｎｈｅｍより供給のものであった。
市販フィルター
以下のものを使用した。
１．ＰＶＤＦ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　提供のＩｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ（疎水性）、
２．Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｕｅｌｌ　提供のＮｉｔｒｏ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　（０．２μＭ参照番号４０１．３９６）、
３．Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ　Ａｍｅｒｓｈａｍ　提供のＮｙｌｏｎ　Ｈｙｂｉｒｉｄｉ−ｚａｔｉｏｎ　膜（０．４５ミクロン、ロット：１６８７２）。
Ｂ）Ｌ２緩衝液
　ＴＲＩＳ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）１２．１ｇを２回蒸留水８００ｍｌ中に溶解し、３７％（ｗ／ｖ）ＨＣｌ　８．１ｍｌを加え、さらに容積１リットルになるまで２回蒸留水を加えることにより、Ｌ２緩衝液（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ｐＨ６．４）を調製した。
Ｃ）洗浄液Ｌ２
　ＧｕＳＣＮ（Ｆｌｕｋａ製のチオシアン酸グアニジン）１２０ｇをＬ２緩衝液１００ｍｌ中に溶解することにより、洗浄液Ｌ２を調製した。
　洗浄液Ｌ２＊
　ＫＩ（Ｍｅｒｃｋ製のヨウ化カリウム）１２．４５ｇをＬ２緩衝液２５ｍｌ中に溶解することにより洗浄液Ｌ２＊を調製した。
　ＮａＩベースのカオトロピック物質を調製するために、ＮａＩ（Ｍｅｒｃｋ製のヨウ化ナトリウム）１１．２５ｇをＬ２緩衝液２５ｍ１中に溶解した。チオシアン酸ナトリウムベースのカオトロピック物質を調製するために、ＮａＳＣＮ（Ｂａｋｅｒ）６．１ｇをＬ２緩衝液２５ｍｌ中に溶解した。
　ＫＩ及び尿素（８Ｍ）を含有するカオトロピック物質を調製するために、Ｋ１１２．４５ｇ及び尿素１２．０ｇをＬ２緩衝液（２５ｍｌ）中に溶解した。同様に、尿素及びＮａＩを併有するカオトロピック物質と、尿素及びＮａＳＣＮを併有するカオトロピック物質とを調製した。
Ｄ）溶解用緩衝液Ｌ５
　ＧｕＳＣＮ　１２０ｇをＬ２緩衝液１００ｍｌ中に（約６０℃の温水浴中で静かに振盪させて）溶解し、次いで４０％（ｗ／ｖ）デキストランスルフェート（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ）溶液２６．０ｇ、０．２Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８　２２ｍｌ及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（（Ｐａｃｋａｒｄ）２．６ｇを加え、次に溶液を均質化することにより、溶解用緩衝液Ｌ５を調製した。０．２Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８溶液は、ＥＤＴＡ３７．２ｇ（Ｍｅｒｃｋ製のＴｉｔｒｉｐｌｅｘ）３７．２ｇ及びＮａＯＨ（Ｍｅｒｃｋ）４．４ｇを水５００ｍｌ中に溶解することにより調製した。
Ｅ）溶解用緩衝液Ｌ６
　ＧｕＳＣＮ　１２０ｇをＬ２緩衝液１００ｍｌ中に（６０℃の水浴中で静かに振盧させて）溶解し、次いで０．２Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８　２２ｍｌ及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（Ｐａｃｋａｒｄ）２．６ｇを加え、次に溶液を均質化することにより、溶解用緩衝液Ｌ６を調製した。
溶解用緩衝液Ｌ６＊
　ＫＩ（ヨウ化カリウム、Ｍｅｒｃｋ）１２．４５ｇをＬ２緩衝液２５ｍｌ中に（４０℃の水浴中で静かに振盪させて）溶解し、次いで０．２Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）５．５ｍｌ及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　７８９７０４）０．６５ｇを加え、最後にこの溶液を均質化することにより、溶解用緩衝液Ｌ６＊を調製した。同じ方法を適用してＮａＩ（ヨウ化ナトリウム、Ｍｅｒｃｋ）を含む溶解用緩衝液Ｌ６＊、及びＮａＳＣＮ（チオシアン酸ナトリウム、Ｂａｋｅｒ）を含む溶解用緩衝液Ｌ６＊を調製した。
　ＫＩ及び尿素を併有する溶解用緩衝液Ｌ６＊を、ＫＩ（ヨウ化カリウム、Ｍｅｒｃｋ）１２．４５ｇ及び尿素（Ｇｌｂｃｏ　ＢＲＬ）１２．０ｇをＬ２緩衝液２５ｍｌ中に溶解することにより調製した。次いで、０．２Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）５．５ｍｌ及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）０．６５ｇを加え、この混合物を均質化した。同じ方法を使用してＮａＩ／尿素及びＮａＳＣＮ／尿素を調製した。
Ｆ）溶解用緩衝液ＧＥＤＴＡ
　ＧＥＤＴＡとは、ＧｕＳＣＮ　１２０ｇを０．２Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８　１００ｍｌ中に溶解した溶液を意味する。
Ｇ）ＴＥ緩衝液
　溶出（ｅｌｕｔｌｏｎ）に適した緩衝液は、所望であればＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５Ｕ／μｌを含有する、ｐＨ７．５の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（ＴＥ緩衝液）である。
Ｈ）試験管
　溶解用緩衝液９００μｌ及びＮＡキャリヤ（ラテックスビーズもしくはＳＣのごときシリカ、または珪藻土）４０μｌをＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ遠心分離管（タイプ３８１０、１．５ｍｌ）に加えることにより、抽出過程と同じ日に試験管を準備した。
Ｉ）洗浄方法
　洗浄液１ｍｌを加え、次いでペレットが再度懸濁するまて渦形成し、１２０００ｘｇで１５秒間遠心分離し、更に吸引によって上澄みを廃棄することにより、ペレットを洗浄した。
Ｊ）溶出方法
　溶出は、少なくとも２５μｌ、好ましくは少なくとも４０μｌの溶出用緩衝液を加え、短時間（２秒間）渦形成し、５６℃で１０分間インキュベートすることにより実施した。
Ｋ）プロトコルＢ
　このプロトコルは、ヒト血清、全血、水様便または尿といった複合出発材料からｄｓＤＮＡを単離するのに適しており、ＧＥＤＴＡ　９００μｌ及びＳＣ４０μｌを含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ試験管を使用した。
１．ペレットが再度懸濁するまて試験管に渦形成し、
２．出発材料（例えば血清、全血、便または尿）５０μｌを加え、直ぐに渦形成して（５〜１０秒間）均質化し、
３．室温に１０分間放置し、５秒間渦形成し、
４．１２０００ｘｇで１５秒間遠心分離し、吸引によって上澄みを廃棄し、
５．ペレットをＧＥＤＴＡで１回洗浄し、
６．ペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、
７．ペレットをアセトンで１回洗浄し、
８．ペレットを、蓋を開放して５６℃で１０分間乾燥し、
９．ＲＮＡｓｉｎを含まないＴＥ緩衝液５０μｌを用いてＮＡを溶出し、
１０．１２０００ｘｇで２分間遠心分離すると、上澄みはＮＡを含有した。
Ｌ）プロトコルＹ
　このプロトコルは、ヒト血清、全血、水様便または尿といった複合出発材料からＮＡを単離する（同時にｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡを精製する）のに適しており、Ｌ６　９００μｌ及びＳＣ４０μｌを含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ試験管を使用した。
１．ペレットが再度懸濁するまで試験管に渦形成し、
２．出発材料（血清、全血、便または尿）５０μｌを加え、直ぐに渦形成（約５秒間）して均質化し、
３．室温に１０分間放置し、５秒間渦形成し、
４．１２０００ｘｇで１５秒間遠心分離し、吸引によって上澄みを廃棄し、
５．ペレットをＬ２で２回洗浄し、
６．ペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、
７．ペレットをアセトンで１回洗浄し、
８．ペレットを、蓋を開放して５６℃で１０分間乾燥し、
９．必要によってはＲＮＡｓｉｎの存在下に、ＴＥ緩衝液５０μｌを用いてＮＡを溶出し、
１０．１２０００ｘｇで２分間遠心分離すると、上澄みはＮＡを含有した。
プロトコルＹ＊
　このプロトコルは、ヒト血清、尿またはバクテリア培養液といった複合出発材料からＮＡを単離するのに適している。
方法：
Ｌ６＊９００μｌ及びＳＣ４０μｌを含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ試験管を使用した。
１．ペレットが再度懸濁するまで試験管に渦形成し、
２．出発材料（血清−プラスミド、尿−プラスミド混合物または一晩培養したバクテリア培養液）５０μｌを加え、直ぐに渦形成（５秒間）して均質化し、
３．混合しながら室温に１０分間放置し、
４．１４，０００ｇで１５秒間遠心分離し、吸引によって上澄みを廃棄し、
５．ペレットをＬ２＊洗浄液で２回洗浄し、
６．ペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、
７．ペレットをアセトンで１回洗浄し、
８．ペレットを、蓋を開放して５６℃て１０分間乾燥し、
９．必要によってはＲＮＡｓｉｎの存在下に、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０）５０μｌを用いてＮＡを溶出し、
１０．１４，０００ｇで２分間遠心分離すると、上澄みはＮＡを含有した。
プロトコルＹ＊＊
　このプロトコルは、カオトロピック物質としてのＧｕＳＣＮ、及びＮＡを結合できるフィルター（材料及び方法の項参照）の存在下に、ＮＡを単離するのに適している。ＮＡ検出は、このフィルターをポリメラーゼ連鎖反応混合物に直接適用することによる、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施し、従ってフィルターからＮＡを予め溶出しない。
方法：
Ｌ６溶解用緩衝液９００μｌ及びフィルター（寸法１ｃｍ／１ｃｍ）を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ試験管を使用した。
１．核酸含有溶液５０μｌを加え、試験管を短時間渦形成し、
２．混合しなから室温に１０分間放置し、
３．上澄みを廃棄し、
４．フィルターをＬ２洗浄液て２回洗浄し、
５．フィルターを７０％エタノールで２回洗浄し、
６．フィルターを、蓋を開放して５６℃で１０分間乾燥し、
７．フィルターの小片をポリメラーゼ連鎖反応溶液に直接加えた。
Ｍ）プロトコルＺ
　このプロトコルは、ヒト血清、全血、水様便または尿といった複合出発材料からＮＡを単離するのに適しており、Ｌ５　９００μｌ及びＳＣ４０μｌを含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ試験管を使用した。単離したＮＡはハイブリッド形成反応に使用することができるが、制限酵素に対する基質としてはやや適当でない。しかしながらＴ４ＤＮＡリガーゼは活性である。プロトコルＹと比較してプロトコルＺではＮＡの収率が高くなる。
１．ペレットが再度懸濁するまて試験管に渦形成し、
２．出発材料（血清、全血、便または尿）５０μｌを加え、直ぐに渦形成（約５秒間）して均質化し、
３．室温に１０分間放置し、５秒間渦形成し、
４．１２０００ｘｇで１５秒間遠心分離し、吸引によって上澄みを廃棄し、
５．ペレットをＬ２で２回洗浄し、
６．ペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、
７．ペレットをアセトンで１回洗浄し、
８．ペレットを、蓋を開放して５６℃で１０分間乾燥し、
９．必要によってはＲＮＡｓｉｎの存在下で、ＴＥ緩衝液５０μｌを用いてＮＡを溶出し、
１０．１２０００ｘｇで２分間遠心分離すると、上澄みはＮＡを含有した。
Ｎ）出発材料
　実施例は、出発材料の性質に応じて（特にセクションＡ〜Ｄ）、以下のようなセクションに分割した。
セクションＡ：ヒト血清
セクションＢ：ヒト全血
セクションＣ：ヒト尿
　上記セクションＡ、Ｂ及びＣは特に、ｄｓＤＮＡ及びｓｓＲＮＡの両方を純粋形態で単離できることを示す意味がある。
セクションＤ：ヒト便
　このセクションＤは、特にｄｓＲＮＡも単離できることを示す。
セクションＥ：一重鎖ＤＮＡ
　このセクションＥは、本発明が、ｓｓＤＮＡを単離するために使用できることを示す実験からなる。
セクションＦ：珪藻土
　このセクションＦは、珪藻土の骨格が本発明に使用するシリカ粒子として非常に有効であることを示す。更に、本発明が、種々のグラム陰性菌からＮＡを単離するために使用できることも示す。
　セクションＧは、種々のカオトロピック物質を使用し、細菌細胞からＮＡを精製できることを示す。
　セクションＨ及びＩは、別の固相を使用するＤＮＡの単離を示す。
　常に５０μｌの量で使用した。セクションＢ及びＦに使用した血液は常に、凝固を防止するためにＥＤＴＡの存在下に採取した鮮血とした（Ｔｅｒｕｍｏ　Ｎ．Ｖ．，Ｌｏｕｖａｉｎ，ベルギーのＶｅｎｏＪｅｃｔ装置、タイプＶＴ−５７４ＴＫＺの採取管を使用）。他のセクションに使用した出発材料（血清、尿及び便）は冷凍物であった。実施例Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ５、Ｂ７及びＦ１において、血清または血液は同じ被検体由来であった。
Ｏ）他の方法
　ゲル電気泳動調査に対して、溶出した量のＮＡの一部を、Ａａｉｊ及びＢｏｒｓｔが記載した（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　
２６９
　いくつかの実験において、既知量の精製ＤＮＡ（インプットＤＮＡ）を臨床試料に加えた。これらのケースにおいて、抽出効率１００％に対応する量のインプットＤＮＡを同じゲルにロードした。
　Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ及びＢｕｒｋｅが記載したように（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．
９
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏｌｉ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏｌｉ
３０
　ｐＧｅｍ３ｐ２４は１．４５ｋｂＨＩＶ配列を含むが、ｐＧｅｍ３ｐ２４の構成は以下に記述する。
　ＨＩＶ　ＨｘＢ２　ＤＮＡの配列は数人が記述している（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６１，６３３−６３７（１９８７）；Ｎａｔｕｒｅ３２６，７１１−７１３（１９８７），Ａｉｄｓ　Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ３，４１−５５（１９８７）；Ａｉｄｓ　Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　３，３３−３９（１９８７）及びＳｉｅｎｃｅ２３７，８８８−８９３（１９８７））
　ＨＩＶ　ＨｘＢ２　ＤＮＡの一部をＦｏｋＩで、もとのＨＩＶ　ＨｘＢ２配列の１１８９及び２６１３部位で切断した。ヌクレオチド番号は遺伝子バンク指定を参照されたい。
　このフラグメントのＦｏｋＩ部位を、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｎｉａｔｉａｓ，上記参照）を使用して充填し、プラスミドｐＵＣ−１９のボリリンカーＳｍａＩ部位においてクローニングした（Ｍａｎｉａｔｉａｓ，前記参照）。ＨＩＶ　ＨｘＢ２　ＤＮＡフラグメントを担う得られたプラスミドをｐＵＣ１９−Ｐ２４と称した。
　プラスミドｐＧｅｍ３ｐ２４を得るために、ｐＵＣ１９−Ｐ２４の１４５０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ベクターｐＧｅｍ３においてクローニングした（２８６７ｂｐ；Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ　ＵＳＡ）。
　ＰＣＲ法に使用したプライマーをオリゴシンセサイザー（ｏｌｉｇｏ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ製）において合成した。プライマーＥＳ４７（２５ｍｅｒ）及びＥＳ７５（４７ｍｅｒ）のヌクレオチド配列を以下に示す。
　ほとんどのＲＮＡ単離実験において（実施例Ａ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｃ２、Ｄ１、Ｅ１、Ｆ１及びＦ２）、精製過程の間のＲＮＡの分解を回避するために溶出用緩衝液中にＲＮＡｓｉｎを任意的に使用する以外には、予防策を講じなかった。臨床試料を試験管に付加する際にのみ手袋をはめ、試薬の調製に対してはＲＮＡｓｅ阻害剤を使用せず、オートクレーブ処理しないＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ容器及びピペットチップを使用した。特に実施例Ｆ１及びＦ２は、溶出の際のＲＮＡｓｉｎの存在は厳密には必要でないことを示した。
　使用した酵素は市場入手可能であり、製造業者が推奨するままに使用した。
ＲＮＡｓｅ　Ａ　同様に全ての制限酵素Ｔ４リガーゼ及びＡＭＶ逆転写酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）製であった。
Ｔａｇ
　種々の用途に対しては、本発明の方法に使用する試薬、特にＮＡキャリヤー（例えばシリカ粒子）及びカオトロピック物質を含む溶解用及び洗浄用緩衝液は、核酸（例えばＮＡ含有の細菌またはウイルス）によって汚染されるべきではないことは基本的に重要である。これは、ＮＡキャリヤーに対しては、これをオートクレーブ内で１２１℃で２０分間加熱することにより保証され得る。しかしながら、この方法ＧｕＳＣＮ含有の溶解用及び洗浄用緩衝液（ＧＥＤＴＡ、Ｌ５、Ｌ６及びＬ２）においては、活性が失われる可能性があること、及び環境に対する付随的な危険性があることから有効ではない。上記試薬を（出来る限り）核酸を含有しないようにするために、かかる試薬を本発明のシリカ粒子のカラムに通すことができる。ＧｕＳＣＮ含有緩衝液の溶解（ｌｙｓｉｎｇ）特性、及びカオトロピック物質ＧｕＳＣＮの存在下にＮＡを結合するシリカの特性に起因し、かかる方法でＮＡ非含有の緩衝液か得られる。カラム自体は、例えば５００℃またはそれ以上で１時間以上加熱することにより、核酸非含有にすることができる。
Ｐ）ＤＮＡタイプ
ＣＩ　　　：共有結合閉環状ＤＮＡ（プラスミド）、
ＣＩＩ　　：緩和（ニック）環状ＤＮＡ（プラスミド）、
ＣＩＩＩ　：線状ＤＮＡ（線状化プラスミド）、
ＬＭＷ　　：低分子量ＤＮＡ（＜０．５ｋｂ）；ｐＨＣ６２４の
Ｈｐａ
ＭＭＷ　　：中分子量ＤＮＡ（０．５〜２９ｋｂ）；ファージλＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化、２３ｋｂ、９．４ｋｂ、６．７ｋｂ、４．４ｋｂ、２．３ｋｂ、２．０ｋｂ及び０．５６ｋｂのフラグメント、
ＨＭＷ　　：高分子量ＤＮＡ（＞２９ｋｂ）、
ｓｓＤＮＡ：ファージＭ１３ｍｐ９一重鎖ＤＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）。
セクションＡ：ヒトの血清からのＤＮＡ／ＲＮＡの精製
　ヒトの血清には例えばウイルス又は細菌中にＮＡが存在し得る。これらの有機体は共に遊離形態で生じ得、更には免疫複合物中に結合して生じ得る。ＮＡの量は通常非常に少ないので、アガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロミド／ＮＡ複合体の紫外線照射を通じての検出は不可能である。ＤＮＡをヒトの血清から精製できることを示すために、微量の精製ＤＮＡを血清に加え、次いでプロトコルＢに基づいてＤＮＡを単離した（実施例Ａ１，Ａ２）。ＤＮＡ及びＲＮＡをヒトの血清から同時に精製できることを示すために、培養した哺乳動物細胞又は（小さなプラスミドを有する）細菌を血清に加え、次いでプロトコルＹに基づいてＮＡを単離した（実施例Ａ３）。最後に実施例Ａ４は、プロトコルＹによりヒトの血清に存在するＲＮＡをＨＩＶ（ヒトの免疫不全ウイルス）から精製でき、またＰＣＲ法により検出できることを示している。実施例Ａ５は、ヒトの血清中のＤＮＡをプロトコルＹ＊により、核酸結合性固相としてのシリカと共に種々のカオトロピック物質を使用して精製できることを示している。
実施例Ａ１：ヒトの血清からのＤＮＡの精製
　ヒトの血清（５００μｌ）を既知量の精製ＤＮＡ［１００μｌ　ＬＭＷ（４５μｇ）、２０μｌ　ＭＭＷ（２０μｇ）、４０μｌＣＩ／ＩＩ（２０μｇ）］と混合し、１０個の６６μｌ試料をプロトコルＢに基づき１０個のＤＮＡ抽出物用インプット材料（ｉｎｐｕｔ　ｍａｔｅｒｉａｌ）として使用した。この実験では試験管中に存在するＳＣ（Ｓｉｌｉｃａ　Ｃｏａｒｓｅの懸濁液）の量を２．５〜４０μｌで変動させた。抽出を二重に実施し、各試料からの溶離ＤＮＡの半分（３０μｌ）を１％アガロースゲルを支持体とする電気泳動にかけた。比較として、インプットＤＮＡの半分の量を同様にコントロールレーン（ｌａｎｅｓ）の同一ゲル上にロードした。
　ＳＣの量が１０μｌを越えると、二重鎖ＤＮＡ、線状（２３ｋｂ〜約６０ｂｐ）共有結合閉鎖（ＣＩ）ＤＮＡも緩和環状（ＣＩＩ）ＤＮＡも効率的に単離された。最大ＭＭＷフラグメント（約２３ｋｂ）の収率はより小さなフラグメントと比較して比較的低いようである。このことは他の実験から考慮すると、分子量の大きいフラグメントのせん断のせいであろう。
　コントロールレーンはそれぞれ、１００％の抽出効率の場合のＬＭＷ，ＣＩＩ／Ｃ１及びＭＭＷＤＮＡの量を示している。前述した如く、ＣＩＩに富む（ＤＮＡｓｅ　Ｉで処理した）３ｋｂプラスミド（ｐＥＢＶ−１０）をインプット材料として使用した。
実施例Ａ２：ヒトの血清から単離したＤＮＡは制限酵素及びＴ４ＤＮＡリガーゼに対して良好な基質であること
　精製ＤＮＡ調製物を５０μｌのヒトの血清試料１２個に加えた。プロトコルＢに基づいてこれら１２個の混合物からＤＮＡを単離した。５０μｌのＴＥで溶離を実施した。溶離したＤＮＡの半分を以下の３種の制限酵素：
Ｅｃｏ
Ｂａｍ
Ｂｇｌ
　Ｔ４リガーゼ処理（３７℃で１時間、３０μｌの反応容量中に３単位のＴ４リガーゼ）の結果は、ＤＮＡフラグメントの分子量のシフトを示すと共に、ヒトの血清から単離したＤＮＡがエキソヌクレオリティックな（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）分解の影響をそれほど受けないことを示している。
　精製プラスミド（ｐＣＭＶ−Ｅ；３．３μｇ；１．５μｌ）を加えた８個の血清試料の結果はそれぞれ、
Ｅｃｏ
Ｂａｍ
Ｂｇｌ
実施例Ａ３：ヒトの血清からのＤＮＡ及びｓｓＲＮＡの同時単離
　ヒトの：清には（例えばウイルス、細菌又は細胞中に）、エチジウムブロミドで染色したゲルの紫外線照射によっては検出することのできない非常に少量のＲＮＡしか存在しないので、外因性ＲＮＡ源をヒトの血清試料に加えた。哺乳動物の細胞又は細菌を外因性ＲＮＡ源として使用した。プロトコルＹに基づいてＮＡを試料から単離し、ＲＮＡｓｅＡ（４０ｎｇ／μｌの溶離用緩衝液）の存在下で又は不在下で、０．５Ｕ／μｌのＲＮＡｓｉｎを含む５０μｌのＴＥで溶離した。１％アガロースゲルを支持体とするその後の電気泳動の結果は、ＲＮＡ及びＤＮＡが検出できることを示している。５０μｌの血清試料に対して加えた哺乳動物の細胞は５ｘ１０５ラット１０Ｂ細胞（Ｂｏｏｍ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．
６９
Ｅ．ｃｏｌｉ
実施例Ａ４：ヒトの血清から単離したヒトの免疫不全ウイルスＲＮＡの検出用ポリメラーゼ連鎖反応
　プロトコルＹに基づいて各々か５０μｌのヒトの血清試料２個（患者Ｆ，Ｈ）からＮＡ（７５μｌ）を単離した。患者Ｆの血清は（Ａｂｂｏｔｔ研究所のＨＩＶ　Ｐ２４抗原固相免疫検定法に基づく）多量（２７００Ｐｇ／ｍｌ）のＨＩＶ抗原Ｐ２４を含んでいたが、（Ａｂｂｏｔｔ研究所のＨＩＶ抗体ＥＬＩＳＡに基づく）ＨＩＶ抗体に対しては陰性であった。患者Ｈの血清は両方の試験で陰性であった。
　単離したＮＡの一部（４３μｌ）を３７℃で９０分ＲＮＡｓｅを含まないＤＮＡｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ；１Ｕ　ＤＮＡｓｅ／μｌ）で処理した。エタノールでの沈澱及び６８℃び１５分間の熱不活化の後に、ＲＮＡを１５μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。このＲＮＡ調製物の一部５μｌを、ＨＩＶ特異的プライマーの存在下において、０．４Ｕ／μｌのＡＭＶ逆転写酵素（４２℃で３０分；反応容量２０μｌ）で処理するか又は処理しなかった。次いで、ｄＮＴＰｓを含む８０μｌの１．２５×濃縮ＰＣＲ緩衝液を加えて、反応容量を１００μｌにした。１Ｕの
Ｔａｑ
実施例Ａ５：数種のカオトロピック物質を用いるＤＮＡ精製
　５０μ１のヒトの血清試料１０個を、ＣＩ及びＣＩＩ形態（方法の項参照）からなるそれぞれが１０μｇの精製ｐＧｅｍ３ｐ２４ＤＮＡと混合した。これら１０個のプラスミド／血清混合物を、プロトコルＹ＊に基づいて抽出用インプット材料として使用した。使用したカオトロピック物質の濃度については表Ａ５．１を参照のこと。
　抽出後に、各試料から溶離したＤＮＡの２５％を０．８％アガロースゲル上で分析した。プラスミドＤＮＡ回収の定量化を可能とするために、インプットＤＮＡを同様に同一ゲル上に直接ロードした。
　電気泳動後にゲルを紫外線照射下で撮影し、ＤＮＡ回収効率をプラスミド帯強度（表Ａ５．１の表の説明を参照）を基に視覚的に評価した。
　カオトロピック物質としてＮａＩ及びＮａＳＣＮを使用して、同様に実験を実施した（下記の試料の説明を参照）。
表の説明
　表に記載のカオトロピック物質を使用して、前述したように１０個の検出可能試料を製造した。
−：回収されない。
±：ほとんど回収されない。
＋：目に見えるほど回収される。
＋＋：定量的に回収される。
　表Ａ５．１での結果は、８Ｍ尿素を組み合わせた３Ｍ　ＫＩ、３Ｍ　ＮａＩ又は３Ｍ　ＮａＳＣＮをカオトロピック物質として使用すると、共有結合閉鎖（ＣＩ）及び緩和環状（ＣＩＩ）ｐＧｅｍ３ｐ２４ＤＮＡが効率的に単離されることを示している。ＣＩＩの収率はＣＩと比較して比較的高いようである。
セクションＢ：ヒトの全血からのＤＮＡ／ＲＮＡの精製
　１ｍｌのヒトの血液は、核生成せず従って血液のＮＡ量に寄与しない約５×１０９の赤血球を含んでいる。血液のＮＡ量は主に白血球細胞（約４−１０×１０６／ｍｌ）により決定される。多量のタンパク質（血液中、約７０ｍｇ／ｍｌ）を含む水性媒体（血漿）にこれらの細胞が埋め込まれている。従って、全血はＮＡ精製にとって極めて不純な源である。セクションＢの実施例は、にもかかわらずＮＡをプロトコルＢ及びＹにより全血から単離することができることを示している。
実施例Ｂ１：ヒトの全血からのＤＮＡの単離
　ヒトの血液（５００μｌ）を、既知量の精製ＤＮＡ［１００μｌのＬＭＷ（４５μｇ）、８０μｌのＣＩ／ＩＩ（４０μｇ）］と混合し、６８μｌの試料１０個をプロトコルＢにおける１０個のＤＮＡ抽出用インプット材料として使用した。この実験では、試験管に存在するＳＣ（シリカ粗材の懸濁液）の量を２．５〜４０μｌの間で変動させた。抽出を二重に行い、各試料からの溶離ＤＮＡの半分（３０μｌ）を、１％アガロースゲルを支持体とする電気泳動にかけた。比較のために、インプットＤＮＡの半分の量を同様に同一ゲル上にロードした。
　１０μｌを越えるＳＣを使用すると、二重鎖ＤＮＡ、線状共有結合閉鎖（ＣＩ）ＤＮＡも緩和環状（ＣＩＩ）ＤＮＡもヒトの全血から効率的に単離された。全血から回収されるＤＮＡの量は、約１０μｌまではＳＣの量に比例していた。量が多くなると飽和するようである。
実施例Ｂ２：ヒトの全血から単離したＤＮＡは制限酵素及びＴ４ＤＮＡリガーゼに対して良好な基質であること
　精製ＤＮＡ調製物を、５０μｌのヒトの血液試料１２個に加えた。プロトコルＢに従ってこれら１２個の混合物からＤＮＡを単離した。５０μｌのＴＥで溶離が生じた。溶離したＤＮＡの半分を以下の３種の制限酵素：
Ｅｃｏ
Ｂａｍ
Ｂｇｌ
　Ｔ４リガーゼ処理（３７℃で１時間、３０μｌの反応容量中に３単位のＴ４リガーゼ）の結果は、ＤＮＡフラグメントの分子量の増加を示すと共に、ヒトの血液から単離したＤＮＡがエキソヌクレオリティックな分解の影響をそれほど受けないことを示している。
　精製プラスミド（ｐＣＭＶ−Ｅ；３．３μｇ，１．５μｌ）を加えた８個の血液試料の結果はそれぞれ、
Ｅｃｏ
Ｂａｍ
Ｂｇｌ
実施例Ｂ３：１０個の異なる血液試料からのＤＮＡの単離
　この実施例では、血液バンクから無作為に選択したヒトの血液の異なる１０個の試料を出発材料として使用した。各試料において白血球細胞（ＷＢＣ）の数は知られていた。プロトコルＢに従って５０μｌの試料からＤＮＡを精製し、７５μｌのＴＥで溶離が生じた。単離したＤＮＡの三分の一を１％アガロースゲルに直接適用し、残余部分（２μｌ）をＰＣＲ用に使用した。
　３μｌのＬＭＷ−ＤＮＡ（６μｇ）を５０μｌの各試料に加えた後に、同一の試料で同一の単離作業を実施した。この場合も２５μｌの溶出液（ｅｌｕａｔｅ）（７５μｌ）をゲルに直接適用した。２５μｌの溶出液の他の部分を最初にＴ４ＤＮＡリガーゼで処理し（３７℃で１時間、３０μｌの反応容量中に２Ｕ）、次いで同一ゲルに適用した。
　血液試料１〜１０の白血球細胞（ＷＢＣ）の含量は以下の通りであった。
実施例Ｂ４：ヒトの白血球細胞中のヒトのβ−クロヒン遺伝子検出用ポリメラーゼ連鎖反応
　プロトコルＢに基づいてヒトの全血から単離したＤＮＡが
Ｔａｑ
実施例Ｂ５：ヒトの血液からのＤＮＡ及びｓｓＲＮＡの同時精製（再現性）
　ＤＮＡ及びＲＮＡを再現し得る形でヒトの血液から精製できることを示すために、一人のヒトから得た各々が５０μｌの６個の血液試料をプロトコルＹに基づいて処理し、ＲＮＡｓｉｎ（０．５Ｕ／μｌ）を含む７５μ１のＴＥでＮＡを溶離した。溶出液の一部２５μｌを中性１％アガロースゲルに適用して、電気泳動にかけた。結果は、ＤＮＡ及びＲＮＡが検出できることを示している。
実施例Ｂ６：ヒトの血液（１０個の異なる試料）からのＤＮＡ及びｓｓＲＮＡの同時精製
　１０人の異なるヒトから得た５０μｌの血液試料（実施例Ｂ３参照）をプロトコルＹに基づいて処理し、０．５Ｕ／μｌのＲＮＡＳｉｎを含む４０μｌのＴＥでＮＡを溶離した。溶出液の一部３０μｌを中性１％アガロースゲルを支持体とする電気泳動にかけた。結果は、ＤＮＡ及びＲＮＡが検出できることを示している。
実施例Ｂ７：ヒトの血液からのＤＮＡ及びｓｓＲＮＡの同時精製
　外因性ＲＮＡ源をヒトの血液試料に加えた。哺乳動物の細胞又は細菌を外因性ＲＮＡ源として使用した。プロトコルＹに基づいて試料からＮＡを単離し、ＲＮＡｓｅＡ（４０ｎｇ／μｌの溶離用緩衝液）の不存在下又は存在下において、５０μｌＴＥ＋０．５Ｕ／μｌ　ＲＮＡＳｉｎで溶離した。５０μｌの血液試料に対して５×１０５ラット１０Ｂ細胞（Ｂｏｏｍ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ１．６９，１９８８，１１７９）を哺乳動物細胞として加え、５０μｌの血液に対してプラスミドｐＣＭＶ−Ｅを含む
Ｅ．ｃｏｌｉ
　結果は、哺乳動物のｓｓＲＮＡ（１８Ｓ及び２８ＳリボソームＲＮＡ）も細菌性ｓｓＲＮＡ（１６Ｓ及び２３ＳリボソームＲＮＡ）もヒトの全血から精製され得ることを示している。
　更には、ゲノムＤＮＡ及びプラスミド（形態１）ＤＮＡが効率的に回収される。
セクションＣ：ヒト尿からのＤＮＡ／ＲＮＡ精製
　ヒトの尿ではＮＡは、例えばウイルスまたは細菌中や尿路由来の細胞中に存在し得る。量は普通、エチジウムブロミド／ＮＡ複合体のアガロースゲル電気泳動及びＵＶ照射による検出が不可能なほど少ない。ヒト尿からＤＮＡを精製し得ることを示すために、マイクログラム量の精製ＤＮＡを尿に添加し、続いてプロトコルＢに従ってＤＮＡを単離した（実施例Ｃ１）。ヒト尿からＤＮＡとＲＮＡとを同時に精製し得ることを示すために、培養した細菌（小プラスミド保有）を尿に添加し、続いてＮＡをプロトコルＹに従って単離した（実施例Ｃ２）。
　実施例Ｃ３は、プロトコルＹ＊により核酸結合性固相としてシリカと共に、ＧｕＳＣＮに替えてＫＩ、ＮａＩ及びＮａＳＣＮのような別のカオトロピック物質を用いてもヒト尿からＤＮＡを精製し得ることを示す。
実施例Ｃ１：ヒト尿からのＤＮＡ精製
　３μｌのＬＭＷ　ＤＮＡ（６μｇ）を、任意に選択した１０の、様々な混濁度の５０μｌヒト尿試料に添加した（試料第４号、第５号、第６号及び第７号は澄明であり、試料第１号、第２号、第３号及び第８号は僅かに混濁し、試料第９号及び第１０号は非常に混濁していた）。ＤＮＡをプロトコルＢに従って単離し、７５μｌのＴＥ緩衝液で溶離した。各溶出物の１／３を１％アガロースゲルに適用した。別の部分２５μｌを１．８ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼで（反応量３０μｌにおいて３７℃で１時間）処理し、やはり上記ゲルに適用した。マーカーレーンはＬＭＷ　ＤＮＡ及びＭＭＷ　ＤＮＡをそれぞれ含有する。マーカーレーン中のＬＭＷ　ＤＮＡの量（２μｇ）は、抽出効率１００％で観察されるべき量を表す。
　実験結果は、プロトコルＢでヒト尿からＤＮＡを有効に精製し得、得られるＤＮＡはＴ４ＤＮＡリガーゼのための優れた基質であることを示す。
　尿試料第１０号から単離したＬＭＷ　ＤＮＡは明らかに分解されていた。しかし、（この実験で用いたような）裸のＤＮＡは尿試料中にヌクレアーゼが豊富であれば分解されるだろうと予想できた。従って、分解は精製時にではなく、それ以前の尿／ＤＮＡ混合物調製時に起こったと考えられる。次の実施例（Ｃ２）は、（裸の場合に反して）細胞中に存在するＤＮＡは、特にｓｓＲＮＡまでもが尿試料第１０号から有効に回収できることを示す。
実施例Ｃ２：ヒト尿からのＤＮＡとｓｓＲＮＡとの同時精製
　この実験では、実施例Ｃ１で用いたのと同じ１０の尿試料を、２．４ｋｂのプラスミド（ｐＣＭＶ−Ｅ）を保有する細菌と混合した。混合物からＮＡをプロトコルＹに従って単離し、かつ７５μｌのＴＥ緩衝液中に０．５Ｕ／μｌ　ＲＮＡｓｉｎを用いて溶離した。溶出物の１／３を１％アガロースゲルでの電気泳動に掛けた。溶出物の別の部分２５μｌを１０Ｕの、ｐＣＭＶ−Ｅを直鎖化する制限酵素
Ｅｃｏ
実施例Ｃ３：他のカオトロピック物質を用いるＤＮＡ精製
　ヒト尿（５０μｌ）を、４００μｌのカオトロピック物質、溶菌（ｌｙｓｉｓ）緩衝液Ｌ６＊及び１μｇのｐＧｅｍ３ｐ２４ＤＮＡと混合した。得られた懸濁液を全部、プロトコルＹ＊によりＤＮＡを精製するべく５００μｌのカオトロピック物質（表Ｃ３．１参照）及び４０μｌのＳｉＯ２に混合添加した。尿から単離したＤＮＡの量を、アガロースゲル電気泳動を用いて解析した。ＤＮＡ回収効率を実施例Ａ５に述べたようにして判定した結果を表Ｃ３．１にまとめる。
　表Ｃ３．１は、ＣＩ型及びＣＩＩ型プラスミドＤＮＡのＤＮＡバンドの収率が同じであったことを示す。
実施例Ｄ１：ヒト糞便からのロタウイルスｄｓＲＮＡ精製
　レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｄａｅ）科のウイルスは、二重鎖ＲＮＡから成るゲノムを有する。この科に属する重要な病原体は、重症の下痢を惹起し得、従って糞便試料中に大量に存在するロタウイルスである。ロタウイルスのゲノムは１１個のｄｓＲＮＡセグメントから成り（Ｈｉｓｈｉｎｏ　ｉｎ　Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
２１
　ロタウイルスに感染したことが（Ｗｅｌｌｃｏｍｅロタウイルスラテックス試験びＫａｌｌｅｓｔａｄ　Ｐａｔｈｆｉｎｄｅｒ　ロタウイルス直接抗原検出系によって）確認された６人の異なる患者から採取した試料を用いた結果、ｄｓＲＮＡを抽出できることが判明した。
　最初の遠心分離ステップを省略し、糞便試料を直接プロトコルＢまたはＹのためのインプット物質として直接用いても同様の結果（普通、ロタウイルスｄｓＲＮＡ収率はより高い）が得られた。
実施例Ｅ１：ヒト血液、血清及び尿からのｓｓＤＮＡ精製
　臨床試料から一重鎖ＤＮＡも単離できることを示すために、１μｇ（４μｌ）の精製ファージＭ１３ＤＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社のＭ１３ｍｐ９　ＤＮＡ）を５０μｌのヒト血清、ヒト血液またはヒト尿に添加し、プロトコルＢまたはプロトコルＹによって精製した。いずれの抽出作業も４回ずつ行なった。ＤＮＡを５０μｌのＴＥ緩衝液中に溶離し、２５μｌを１％アガロースゲルでの電気泳動に掛けた。マーカーレーンは５００ｎｇのＭ１３ｓｓＤＮＡを含有する。
　この実験の結果から、一重鎖ＤＮＡをヒト血液、血清または尿からプロトコルＹによって、また程度はより低いがプロトコルＢによっても単離できることが判明した。
セクションＦ：ＮＡのケイ藻土への結合
　ケイ藻土の組織はほぼ完全にＳｉＯ２から成るので、ケイ藻土が使用シリカとして有用であるかどうか調べた。５種の異なる市販ケイ藻製品［Ｊａｎｓｓｅｎ　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ，Ｌｏｕｖａｉｎ，ＢｅｌｇｉｕｍのＣｅｌａｔｏｍ　ＦＷ１４、Ｃｅｌａｔｏｍ　ＦＷ５０、Ｃｅｌａｔｏｍ　ＦＷ６０、Ｃｅｌｉｔｅ（ＡＫ）及びＣｅｌｉｔｅ５２１］各１０ｇを５０ｍｌの２回蒸留水及び５００μｌの３７％ＨＣｌと混合し、得られた懸濁液をオートクレーブで２０分間１２１℃に加熱した。実施例Ｆ１及びＦ２において、上記のように生成した懸濁液をプロトコルＹによるＮＡ抽出に用いた。
実施例Ｆ１：ヒト血液からのＮＡ単離
　ヒト血液を、プラスミドＰＣＭＶ−Ｅを保有する
Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｂａｍ
　マーカーレーンは１μｇのＭＭＷ　ＤＮＡを含有する。
　得られた結果から、ケイ藻土懸濁液かＳＣに類似のＮＡ結合特性を有することが判明した。ｄｓＤＮＡ（成分Ｉ分子）とｓｓＲＮＡ（２３Ｓ及び１６Ｓ　ｒＲＮＡ）との両方が結合した。プラスミドＤＮＡは、ＢａｍＨＩによって完全に直鎖化される（成分ＩＩＩ）ほど十分に純粋であった。
実施例Ｆ２：グラム陰性菌からのＮＡ精製
　ヒトにおいて疾病を惹起することが知られている９種類の異なるグラム陰性菌種を固形寒天プレート上で培養した。上記各細菌種を５〜１０μｌずつプレートから掻き取って、プロトコルＹによるＮＡ抽出のためのインプット物質として用い、また４０μｌのＳＣかまたは４０μｌのＣｅｌｉｔｅ５２１懸濁液をＮＡキャリヤーとして用いた。
　ＳＣを用いた抽出は最初の洗浄の間に停止しなければならなかったが、これは、たとえ（３分を越える）長時間渦形成を行なったとしてももはやＮＡシリカ複合体を均質化し得なくなったからである。他方、Ｃｅｌｉｔｅ５２１を用いた抽出は問題無く続行することがてきたが、これはおそらくケイ藻土の粒径がＳＣ粒子の粒径より大きかったためであろう。ＮＡを７０μｌのＴＥ緩衝液で、ＲＮＡｓｉｎを用いずに溶離し、溶出物の一部（２０μｌ）を１％アガロースゲルての電気泳動に掛けた。
　マーカーレーンは１μｇのＭＭＷ　ＤＮＡを含有する。次のような細菌に関する結果を得た。
１：
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ
ｐｙｌｏｒｉ
２：
Ｙｅｒｓｉｎｉａ
ｅｎｔｅｒｏｌｙｔｉｃａ
３：
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ
４：
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ
５：
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
６：
Ｋｅｌｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
７：
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
８：
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
９：
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌ
　この方法でＨＭＷ細菌ＤＮＡ及びｒＲＮＡを検出することができた。
セクションＧ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０１のＤＮＡ／ＲＮＡ精製
　グラム陰性菌からのＮＡの単離が、本発明により可能である。細菌細胞中には、レベルの高分子量ＤＮＡ（ＨＭＷ　ＤＮＡ）及びリボゾームＲＮＡが存在する。実施例Ｇ１は、細菌細胞からＮＡを、ＮＡ結合性固相としてシリカと共に様々なカオトロピック物質を用いて精製できることを示す。
実施例Ｇ１：ＮＡ結合性固相として様々なカオトロピック物質及びシリカを用いて行なう細菌細胞からのＮＡ単離／精製（内在）
　一晩経過した細菌培養物ＪＭ１０１　５０μｌからＮＡを、９００μｌのカオトロピック物質及び４０μｌのＳｉＯ２の存在下に単離した。高レベルのＨＭＷ　ＤＮＡ及び内在リボソームＲＮＡ（１６Ｓ及び２３Ｓ）か、エチジウムブロミドで染色したゲルのＵＶ照射によって単離ＮＡを検出することを可能にする。単離はプロトコルＹ＊に従って行ない、溶出ＮＡの２５％（４０μｌ部分）をアガロースゲル上で解析した。
凡例：
　アガロースゲル解析の結果を表Ｇ１にまとめる。ＨＭＷ　ＤＮＡ及びｒＲＮＡ回収の定量を、シリカと共に用いるカオトロピック物質がＧｕＳＣＮであった場合と比較した。表Ｇ１中の“１”は、ＤＮＡまたはＲＮＡ回収の効率か同等てあることを表す。表Ｇ１中の“＞１”は回収効率がより高いことを表す。
　細菌細胞からの内在ＲＮＡ単離のための基準として、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｒＲＮＡマーカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いた。
セクションＨ：カオトロピック物質としてグアニジニウムチオシアネートと、ＮＡを結合させ得る別の固相とを用いるＤＮＡ精製
　ＧｕＳＣＮ及び幾つかのシリカ誘導体またはラテックス粒子（参考例）（“材料及び方法”参照）を用いてＮＡ単離／精製を行ない得ることを示すために、純粋なプラスミドを低塩緩衝液（Ｔｒｉｓ　１０ｍＭ−ＥＤＴＡ　１ｍＭ，ｐＨ８．０）に添加し、その後プロトコルＹに従って単離したが、その際ステップ７及び９は省略した（ＴＥでの溶離を行なわなかった）。結合したＮＡを伴ったシリカ／ラテックス粒子をＰＣＲ反応混合物中に導入した。単離したＤＮＡはＰＣＲ法によって検出し得る。実施例Ｈ１は、カオトロピック物質としてのＧｕＳＣＮと共に別の固相を用い、かつＰＣＲ法で検出を行なうことによってＮＡを精製し得ることを示す。
実施例Ｈ１：ＧｕＳＣＮ及び別の固相を用いるＤＮＡ精製
　５０μｌのＴｒｉｓ　１０ｍＭ／ＥＤＴＡ１ｍＭ（ｐＨ８．０）中に存在する０．５μｇのｐＧｅｍ３ｐ２４を、８０μｌのシリカ懸濁液または８０μ１のラテックス懸濁液（参考例）（“材料及び方法”参照）及び９００μｌの溶菌緩衝液Ｌ６と混合した。
　プロトコルＹにより洗浄し、かつ５６℃で乾燥した後（溶離ステップ省略）、ペレットを５０μｌの水に再懸濁した。プラスミド−シリカ懸濁液の２０μｌ部分を、ＨＩＶ特異的プライマー（“材料及び方法”参照）の存在下にＰＣＲ混合物中に用い、５μｌの１０倍濃縮ＰＣＲ緩衝液と、１μｌの１０ｍＭ　ｄＮＴＰと、２単位の
Ｔａｑ
　３０周期後、反応混合物から１０μｌアリコートを取り分け、２％アガロースゲル上で解析した。ラテックス粒子でＮＡを単離した場合、シリカで単離した場合のようなペレットは得られなかった。
　１ｍｌの洗浄液Ｌ２を３００μｌの７０％ＥｔＯＨと混合したところ、二つの液相間にラテックス含有バンドが見いだされた。ラテックス粒子はその色によって検出可能である。単離したラテックス含有画分を７０％ＥｔＯＨで２回洗浄し、遠心分離すると、該画分はＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ管内で小さいペレットを形成した。
凡例：
　結果を表Ｈ１にまとめる。３０周期後、予想した２９０ｂｐＨＩＶアンプライマーフラグメントを総ての事例で観察した。フラグメントのサイズを、やはりゲル上に載置したマーカーφｘ１７４ＲＦ　ＤＮＡ　ＨａｅＩＩＩ　ｄｉｇｅｓｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と比較した。
＋＋：固相として粗シリカを用いた場合（対照）と同じレベルのＨＩＶ特異的２９０ｂｐフラグメントをアガロースゲル上に検出したことを表す。
　＋：２９０ｂｐフラグメントの検出レベルが対照の粗シリカの場合より低いことを表す。
セクションＩ（参考例）：ＮＡ結合フィルター及びＧｕＳＣＮを用いる精製
　プロトコルＹ＊＊による核酸の単離では、ＳｉＯ２の替わりにＮＡ結合フィルター（“材料及び方法”参照）を用い得る。
　低塩緩衝液（Ｔｒｉｓ　１０ｍＭ−ＥＤＴＡ　１ｍＭ，ｐＨ８．０）中では通常ＤＮＡの放出が起こらないが、場合によって生起するこの問題点は、ＤＮＡを結合させたフィルターからＤＮＡを溶離する替わりに該フィルターをＰＣＲ反応混合物中に挿入することによって排除できる。実施例Ｉ１は、ＮＡ結合フィルター及びカオトロピック物質としてのＧｕＳＣＮを用い、かつＰＣＲ法で解析することによってＮＡを精製し得ることを示す。
実施例ＩＩ：ＤＮＡ結合フィルターを用い、かつＰＣＲ増幅による検出を行なうＤＮＡ単離／精製　Ｔｒｉｓ　１０ｍＭ／ＥＤＴＡ　１ｍＭ（ｐＨ８．０）５０μｌ中の純粋なｐＧｅｍ３ｐ２４ＤＮＡ（濃度１μｇ、０．０１μｇ及び０．００５μｇ）を、寸法１ｃｍ×１ｃｍの３個のＤＮＡ結合フィルター及び９００μｌのＧｕＳＣＮ（溶菌緩衝液Ｌ６）に添加した。
　（プロトコルＹ＊＊による）洗浄（遠心分離ステップ省略）及び５６℃での乾燥の後、ＤＮＡを結合させたフィルターを直接ＰＣＲ混合物中に導入した。ＨＩＶ特異的プライマーの存在下に、ＰＣＲサイクラーて増幅を行なった。
　反応混合物は更に、５μｌの１０倍濃縮ＰＣＲ緩衝液と、１μｌの１０ｍＭ　ｄＮＴＰと、２単位の
Ｔａｑ
　３０周期後、反応混合物から１０μｌアリコートを取り分け（実施例Ｈ１参照）、２％アガロースゲル上で解析した。
凡例：
　結果を表Ｉ１にまとめた。予想した２９０ｂｐＨＩＶアンプライマーフラグメントを観察した。フラグメントを市販φｘＨａｅＩＩと比較した。
＋＋：アガロースゲル上で、エチジウムブロミドで強度に染色された２９０ｂｐフラグメントを検出
　＋：２９０ｂｐフラグメントを検出
　０：２９０ｂｐフラグメント検出せず
　比較として：ＰＣＲ増幅混合物に添加した７ｎｇの精製ｐＧｅｍ３ｐ２４　ＤＮＡは、“＋＋”として定量される２９０ｂｐフラグメントをもたらす。