(57)【要約】  Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合可能であり且つ破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する単離抗体、又は該抗体の機能性断片。配列番号１０６に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＨ１と、配列番号１０７に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＨ２と、配列番号３５、４５、５５、６５、又は８０のいずれか一つに対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＨ３とを、前記抗体の重鎖は含む。配列番号７３又は８３に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＬ１と、配列番号１０８に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＬ２と、配列番号４０、５０、６０、７０、９０、１００、又は１０９のいずれか一つに対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＬ３とを、前記抗体の軽鎖は含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合可能であり且つ破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する単離抗体、又は該抗体の機能性断片であって：
（ａ）  配列番号１０６に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＨ１と、配列番号１０７に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＨ２と、配列番号８０、５５、６５、３５、又は４５のいずれか一つに対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＨ３と、を含む重鎖；及び
（ｂ）  配列番号８３又は７３に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＬ１と、配列番号１０８に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＬ２と、配列番号９０、６０、１００、７０、４０、５０、又は１０９のいずれか一つに対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＬ３と、を含む軽鎖、
を含む、単離抗体、又は該抗体の機能性断片。
【請求項２】
配列番号７８、５３、６３、３３、又は４３のいずれか一つに対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を、該ＣＤＲＨ１が含む、
請求項１に記載の単離抗体、又は該抗体の機能性断片。
【請求項３】
配列番号１０４、５４、９４、６４、３４、４４、又は７９のいずれか一つに対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を、該ＣＤＲＨ２が含む、
請求項１又は２に記載の単離抗体、又は該抗体の機能性断片。
【請求項４】
配列番号８８、５８、６８、３８、又は４８のいずれか一つに対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を、該ＣＤＲＬ１が含む、
請求項１乃至３のいずれか一つに記載の単離抗体、又は該抗体の機能性断片。
【請求項５】
配列番号８９、５９、６９、３９、又は４９のいずれか一つに対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を、該ＣＤＲＬ２が含む、
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の単離抗体、又は該抗体の機能性断片。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一つに記載の単離抗体又は該抗体の機能性断片であって、該抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の配列が：
ａ）  それぞれ、配列番号１０３、１０４、１０５、８８、８９、及び９０、又はそれらに対して少なくとも８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を持つ配列；
ｂ）  それぞれ、配列番号５３、５４、５５、５８、５９、及び６０、又はそれらに対して少なくとも８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を持つ配列；
ｃ）  それぞれ、配列番号９３、９４、９５、９８、９９、及び１００、又はそれらに対して少なくとも８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を持つ配列；
ｄ）  それぞれ、配列番号６３、６４、６５、６８、６９、及び７０、又はそれらに対して少なくとも８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を持つ配列；
ｅ）  それぞれ、配列番号３３、３４、３５、３８、３９、及び４０、又はそれらに対して少なくとも８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を持つ配列；
ｆ）  それぞれ、配列番号４３、４４、４５、４８、４９、及び５０、又はそれらに対して少なくとも８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を持つ配列；あるいは
ｇ）  それぞれ、配列番号７８、７９、８０、８８、８９、及び９０、又はそれらに対して少なくとも８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を持つ配列、
を含むことを特徴とする、単離抗体又は該抗体の機能性断片。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一つに記載の単離抗体あるいは該抗体の機能性断片であって、前記抗体が：
ａ１）  配列番号１０２に示される２０乃至１４０番目のアミノ酸残基、配列番号５２に示される２０乃至１３７番目のアミノ酸残基、配列番号９２に示される２０乃至１３８番目のアミノ酸残基、配列番号６２に示される２０乃至１３６番目のアミノ酸残基、配列番号３２に示される２０乃至１３６番目のアミノ酸残基、配列番号４２に示される２０乃至１３５番目のアミノ酸残基、又は配列番号７７に示される２０乃至１３８番目のアミノ酸残基、を含むアミノ酸配列と、
ａ２）  ａ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ａ３）  ａ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ａ４）  ａ１）のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列と、
からなる群から選択される重鎖可変領域；並びに
ｂ１）   配列番号８７に示される２０乃至１３４番目のアミノ酸残基、配列番号５７に示される２０乃至１２９番目のアミノ酸残基、配列番号９７に示される２０乃至１３３番目のアミノ酸残基、配列番号６７に示される２０乃至１２９番目のアミノ酸残基、配列番号３７に示される２０乃至１２９番目のアミノ酸残基、又は配列番号４７に示される２０乃至１２９番目のアミノ酸残基、を含むアミノ酸配列と、
ｂ２）  ｂ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ｂ３）  ｂ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ｂ４）  ｂ１）のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列と、
からなる群から選択される軽鎖可変領域、
を含む、単離抗体あるいは該抗体の機能性断片。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一つに記載の単離抗体あるいは該抗体の機能性断片であって、前記抗体が：
ａ１）  配列番号１０２、５２、９２、６２、３２、４２、又は７７のいずれか一つに示される配列を含むアミノ酸配列と、
ａ２）  ａ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ａ３）  ａ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ａ４）  ａ１）のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列と、
からなる群から選択される重鎖；並びに
ｂ１）  配列番号８７、５７、９７、６７、３７、又は４７のいずれか一つに示される配列を含むアミノ酸配列と、
ｂ２）  ｂ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ｂ３）  ｂ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ｂ４）  ｂ１）のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列と、
からなる群から選択される軽鎖、
を含むことを特徴とする、単離抗体あるいは該抗体の機能性断片。
【請求項９】
該抗体が、配列番号１０２を含むアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号８７を含むアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む、
請求項１乃至８のいずれか一つに記載の単離抗体又は該抗体の機能性断片。
【請求項１０】
該抗体が、配列番号５２を含むアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号５７を含むアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む、
請求項１乃至８のいずれか一つに記載の単離抗体又は該抗体の機能性断片。
【請求項１１】
該抗体が、配列番号９２を含むアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号９７を含むアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む、
請求項１乃至８のいずれか一つに記載の単離抗体又は該抗体の機能性断片。
【請求項１２】
該抗体が、配列番号６２を含むアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号６７を含むアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む、
請求項１乃至８のいずれか一つに記載の単離抗体又は該抗体の機能性断片。
【請求項１３】
該抗体が、配列番号３２を含むアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号３７を含むアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む、
請求項１乃至８のいずれか一つに記載の単離抗体又は該抗体の機能性断片。
【請求項１４】
該抗体が、配列番号４２を含むアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号４７を含むアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む、
請求項１乃至８のいずれか一つに記載の単離抗体又は該抗体の機能性断片。
【請求項１５】
該抗体が、配列番号７７を含むアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号８７を含むアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む、
請求項１乃至８のいずれか一つに記載の単離抗体又は該抗体の機能性断片。
【請求項１６】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、及びＦｖからなる群から選択される、
請求項１乃至１５のいずれか一つに記載の抗体の機能性断片。
【請求項１７】
ｓｃＦｖであることを特徴とする、
請求項１乃至７のいずれか一つに記載の抗体。
【請求項１８】
骨代謝異常を治療及び／又は予防するために使用される、請求項１乃至１７のいずれか一つに記載の単離抗体又は該抗体の機能性断片。
【請求項１９】
骨代謝異常を治療又は予防するための医薬を製造するための、請求項１乃至１７のいずれか一つに記載の単離抗体又は該抗体の機能性断片の使用。
【請求項２０】
請求項１乃至１７のいずれか一つに記載の単離抗体又は該抗体の機能性断片の治療上有効な量を投与する、骨代謝異常の患者を治療する方法。
【請求項２１】
請求項１乃至１７に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくとも一つを含む、医薬組成物。
【請求項２２】
骨代謝異常の治療及び／又は予防薬であることを特徴とする、
請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
骨代謝異常の治療及び／又は予防用医薬組成物であって：
請求項１乃至１７に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つ；並びに、
ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン製剤、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）製剤、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター製剤、抗ＴＮＦ−α抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の機能性断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の機能性断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つ、
を含有することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防用医薬組成物。
【請求項２４】
該骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、及び骨形成不全症からなる群から選択される、
請求項１８に記載の抗体又は機能性断片、請求項１９に記載の使用、請求項２０に記載の方法、あるいは請求項２２又は２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
該骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする、
請求項２４に記載の抗体、機能性断片、使用、方法、又は医薬組成物。
【請求項２６】
該骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする、
請求項２５に記載の抗体、機能性断片、使用、方法、又は医薬組成物。
【請求項２７】
ポリヌクレオチドであって：
ａ）  請求項１乃至１７に記載の抗体又は該抗体の機能性断片のいずれか一つをコードするヌクレオチド配列；あるいは
ｂ）  ａ）のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列、
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドであって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の配列をコードするヌクレオチド配列が:
ａ）  それぞれ、配列番号１０１に示される１４８乃至１６２番目のヌクレオチド、配列番号１０１に示される２０５乃至２６１番目のヌクレオチド、配列番号１０１に示される３５８乃至３８７番目のヌクレオチド、配列番号８６に示される１２４乃至１６５番目のヌクレオチド、配列番号８６に示される２１１乃至２３１番目のヌクレオチド、及び配列番号８６に示される３２８乃至３６３番目のヌクレオチド；
ｂ）  それぞれ、配列番号５１に示される１４８乃至１６２番目のヌクレオチド、配列番号５１に示される２０５乃至２５５番目のヌクレオチド、配列番号５１に示される３５２乃至３７８番目のヌクレオチド、配列番号５６に示される１２４乃至１５６番目のヌクレオチド、配列番号５６に示される２０２乃至２２２番目のヌクレオチド、及び配列番号５６に示される３１９乃至３４８番目のヌクレオチド；
ｃ）  それぞれ、配列番号９１に示される１４８乃至１６２番目のヌクレオチド、配列番号９１に示される２０５乃至２５５番目のヌクレオチド、配列番号９１に示される３５２乃至３８１番目のヌクレオチド、配列番号９６に示される１２４乃至１６５番目のヌクレオチド、配列番号９６に示される２１１乃至２３１番目のヌクレオチド、及び配列番号９６に示される３２８乃至３６０番目のヌクレオチド；
ｄ）  それぞれ、配列番号６１に示される１４８乃至１６２番目のヌクレオチド、配列番号６１に示される２０５乃至２５５番目のヌクレオチド、配列番号６１に示される３５２乃至３７５番目のヌクレオチド、配列番号６６に示される１２４乃至１５６番目のヌクレオチド、配列番号６６に示される２０２乃至２２２番目のヌクレオチド、及び配列番号６６に示される３１９乃至３４８番目のヌクレオチド；
ｅ）  それぞれ、配列番号３１に示される１４８乃至１６２番目のヌクレオチド、配列番号３１に示される２０５乃至２５５番目のヌクレオチド、配列番号３１に示される３５２乃至３７５番目のヌクレオチド、配列番号３６に示される１２４乃至１５６番目のヌクレオチド、配列番号３６に示される２０２乃至２２２番目のヌクレオチド、配列番号３６に示される３１９乃至３４８番目のヌクレオチド；
ｆ）  それぞれ、配列番号４１に示される１４８乃至１６２番目のヌクレオチド、配列番号４１に示される２０５乃至２５５番目のヌクレオチド、配列番号４１に示される３５２乃至３７２番目のヌクレオチド、配列番号４６に示される１２４乃至１５６番目のヌクレオチド、配列番号４６に示される２０２乃至２２２番目のヌクレオチド、配列番号４６に示される３１９乃至３４８番目のヌクレオチド；又は、
ｇ）  それぞれ、配列番号７６に示される１４８乃至１６２番目のヌクレオチド、配列番号７６に示される２０５乃至２５５番目のヌクレオチド、配列番号７６に示される３５２乃至３８１番目のヌクレオチド、配列番号８６に示される１２４乃至１６５番目のヌクレオチド、配列番号８６に示される２１１乃至２３１番目のヌクレオチド、及び配列番号８６に示される３２８乃至３６３番目のヌクレオチド、
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが：
ａ１）  配列番号１０１に示される５８乃至４２０番目のヌクレオチド、配列番号５１に示される５８乃至４１１番目のヌクレオチド、配列番号９１に示される５８乃至４１４番目のヌクレオチド、配列番号６１に示される５８乃至４０８番目のヌクレオチド、配列番号３１に示される５８乃至４０８番目のヌクレオチド、配列番号４１に示される５８乃至４０５番目のヌクレオチド、又は配列番号７６に示される５８乃至４１４番目のヌクレオチド、を含むヌクレオチド配列と、
ａ２）  ａ１）のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列と、
ａ３）  ａ１）のヌクレオチド配列に１若しくは数個のヌクレオチドが付加、欠失又は置換されたヌクレオチド配列と、
からなる群から選択される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列；並びに、
ｂ１）  配列番号８６に示される５８乃至４０２番目のヌクレオチド、配列番号５６に示される５８乃至３８７番目のヌクレオチド、配列番号９６に示される５８乃至３９９番目のヌクレオチド、配列番号６６に示される５８乃至３８７番目のヌクレオチド、配列番号３６に示される５８乃至３８７番目のヌクレオチド、又は配列番号４６に示される５８乃至３８７番目のヌクレオチド、を含むヌクレオチド配列と、
ｂ２）  ｂ１）のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列と、
ｂ３）  ｂ１）のヌクレオチド配列に１若しくは数個のヌクレオチドが付加、欠失又は置換されたヌクレオチド配列と、
からなる群から選択される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項２９に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが：
ａ１）  配列番号１０１, ５１, ９１, ６１, ３１, ４１、又は７６のいずれか一つに示される配列のヌクレオチド配列と、
ａ２）  ａ１）のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列と、
ａ３）  ａ１）のヌクレオチド配列に１若しくは数個のヌクレオチドが付加、欠失又は置換されたヌクレオチド配列と、
からなる群から選択される重鎖をコードするヌクレオチド配列；及び
ｂ１）  配列番号８６、５６、９６、６６、３６、又は４６のいずれか一つに示される配列を含むヌクレオチド配列と、
ｂ２）  ｂ１）のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列と、
ｂ３）  ｂ１）のヌクレオチド配列に１若しくは数個のヌクレオチドが付加、欠失又は置換されたヌクレオチド配列と、
からなる群から選択される軽鎖をコードするヌクレオチド配列、
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項２７乃至３０のいずれか一つに記載の少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項３２】
請求項２７乃至３０のいずれか一つに記載の少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む、形質転換細胞。
【請求項３３】
請求項３１に記載の少なくとも一つのベクターを含む、形質転換細胞。
【請求項３４】
請求項３２又は３３に記載の形質転換細胞を培養し、培養物を回収し、前記培養物から抗体を精製する工程を含む、
請求項１乃至１７に記載の抗体の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨代謝異常の治療薬及び／又は予防薬として有用な物質に関する。本発明は、抗体等の医薬組成物、及び係る抗体をコードするポリヌクレオチドにも関する。さらに本発明は、骨代謝異常を治療及び／又は予防する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は、自らの形態変化や血中カルシウム濃度の維持のために、常に形成と吸収を繰り返して再構築を行う動的な器官として知られている。正常な骨では骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とは平衡関係にあり、骨量は一定に保たれている。一方、骨形成と骨吸収との平衡関係が崩れると、骨粗鬆症などの骨代謝異常になる（非特許文献１、及び非特許文献２）。
【０００３】
骨代謝を調節する因子としては、全身性のホルモンや局所性のサイトカインが数多く報告されており、それらの因子の共同作用により骨の形成と維持が営まれている（非特許文献１及び非特許文献３）。加齢による骨組織の変化としては、骨粗鬆症の発症が広く知られているが、その発症機構は性ホルモンの分泌低下やそのレセプター異常、骨局所におけるサイトカイン発現の変動、老化遺伝子の発現、破骨細胞や骨芽細胞の分化不全あるいは機能不全など多岐にわたっており、加齢による単純な生理現象として理解するのは困難である。原発性骨粗鬆症はエストロゲンの分泌低下による閉経後骨粗鬆症と加齢による老人性骨粗鬆症とに大別されているが、その発症機構の解明と治療薬開発の為には、骨吸収と骨形成の調節機構についての基礎的研究の進展が必須である。
【０００４】
破骨細胞は、造血幹細胞に由来する多核の細胞であり、破骨細胞と骨との接着面に塩素イオンと水素イオンとを放出することによって、破骨細胞と骨の表面との間の間隙を酸性化すると共に酸性プロテアーゼであるカテプシンＫなどを分泌する（非特許文献４）。この結果、リン酸カルシウムの分解、酸性プロテアーゼの活性化と骨基質蛋白質の分解が引き起こされ、骨吸収が起こる。
【０００５】
破骨細胞の前駆細胞は骨表面の骨芽細胞／ストローマ細胞の細胞膜上に発現するＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ）の刺激を受けて、破骨細胞へ分化することが明らかにされた（非特許文献５及び非特許文献６）。ＲＡＮＫＬは骨芽細胞／ストローマ細胞が産生する膜蛋白質である。その発現は骨吸収因子により調節され、ＲＡＮＫＬは破骨細胞前駆細胞から多核破骨細胞への分化などを誘導することなどが明らかにされた（非特許文献５及び非特許文献７）。さらに、ＲＡＮＫＬをノックアウトしたマウスが、大理石骨病様の病態を発症することが見出され、ＲＡＮＫＬが生理的な破骨細胞分化誘導因子であることが証明された（非特許文献８）。
【０００６】
骨代謝疾患の治療や治療期間の短縮を図る薬剤として、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン製剤、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、ＰＴＨ（副甲状腺ホルモン）製剤、及びカルシウム製剤等が使用されている。しかし、これらの薬剤は、治療効果において必ずしも満足できるものではなく、より治療効果の高い薬剤の開発が望まれていた。
【０００７】
免疫系細胞の細胞膜上はシアル酸などの多様な糖鎖によって高度に覆われており、それらは様々な糖鎖結合蛋白質によって認識されている。シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectins、以下、「Ｓｉｇｌｅｃｓ」という。）は、シアル酸含有糖鎖を認識して結合するＩ型膜蛋白質ファミリーである。Ｓｉｇｌｅｃｓは免疫系細胞の細胞膜上で多く発現しており、同じく免疫系細胞の細胞膜上に存在するシアル酸を認識して細胞間相互作用や細胞機能を調節し、免疫応答に関与していると考えられている（非特許文献９）が、生理的機能が明らかとなっていないＳｉｇｌｅｃ分子も多い。Ｓｉｇｌｅｃ−１５（Ｓｉａｌｉｃ−ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｌｅｃｔｉｎ  １５）は、Ｓｉｇｌｅｃｓに属することが新たに報告された分子で（非特許文献１０）、「ＣＤ３３  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ３」、「ＣＤ３３  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｌｉｋｅ  ３」、「ＣＤ３３−ｌｉｋｅ  ３」、又は「ＣＤ３３Ｌ３」と呼ばれる分子と同一である。この分子は魚類からヒトまで進化的な保存度が高く、ヒト脾臓及びリンパ節において、樹状細胞及び／又はマクロファージに強く発現することが明らかにされた。またシアル酸プローブを用いた結合試験の結果、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５はＮｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃと結合し、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５はＮｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃに加えてＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃとも結合することも明らかにされた（非特許文献１０）。最近まで、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の生理的役割は明らかではなかったが、破骨細胞の分化、成熟に伴ってＳｉｇｌｅｃ−１５の発現が亢進し、ＲＮＡ干渉によってＳｉｇｌｅｃ−１５の発現を低下させると破骨細胞の分化が抑制されることが報告された（特許文献１）。さらに、Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子は巨細胞腫において特異的に発現していることが見出された。また、Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子は単球由来細胞株が破骨細胞に分化する際に発現量が増加することも見出された（特許文献２）。破骨細胞分化を抑制するウサギ抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５ポリクローナル抗体及びラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体が開示されている（特許文献２）。また、破骨細胞分化を抑制するキメラ抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体も開示されている（特許文献３）。しかしヒトに投与可能なヒト型抗体については、これまで開示されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００７／０９３０４２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００９／０４８０７２号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１０／０１０４５７５号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「エンドクリノロジカル・レビュー（Endocrinological Review）」、１９９２年、第１３巻、ｐ．６６−８０
【非特許文献２】「プリンシプルズ・オブ・ボーン・バイオロジー（Principles of Bone Biology）」、ニューヨーク、アカデミック・プレス（Academic Press）、１９９６年、ｐ．８７−１０２
【非特許文献３】「エンドクリノロジカル・レビュー（Endocrinological Review）」、１９９６年、第１７巻、ｐ．３０８−３３２
【非特許文献４】「アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（American Journal of Physiology）」、１９９１年、第２６０巻、Ｃ１３１５−Ｃ１３２４
【非特許文献５】「米国科学アカデミー紀要（Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America）」、１９９８年、第９５巻、ｐ．３５９７−３６０２
【非特許文献６】「セル（Cell）」、１９９８年、第９３巻、ｐ．１６５−１７６
【非特許文献７】「ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・リサーチ（Journal of Bone and Mineral Research）、１９９８年、第２３巻、Ｓ２２２
【非特許文献８】「ネイチャー（Nature）」、１９９９年、第３９７巻、ｐ．３１５−３２３
【非特許文献９】「ネイチャー・レビューズ・イミュノロジー（Nature Reviews Immunology）」、２００７年、第７巻、ｐ．２５５−２６６
【非特許文献１０】「グリコバイオロジー（Glycobiology）」、２００７年、第１７巻、ｐ．８３８−８４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、破骨細胞の分化成熟と活性を阻害する物質、及び骨代謝異常の治療及び／又は予防薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、骨代謝異常の治療及び／又は予防効果を有する物質を発見する目的で、破骨細胞の分化、成熟及び活性化の機構の解明を目指した研究を行った結果、破骨細胞の分化、成熟に伴いＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子の発現が上昇することを見出した。また、本発明者らは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と特異的に結合する抗体により、破骨細胞の分化が抑制されることを見出し、本発明を完成させた。複数の実例において、本発明の抗体が破骨細胞に対して有する有効性は当技術分野で公知の抗体よりも高い。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
【００１３】
本発明の第１の態様においては、
（ａ）  配列番号７１に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＨ１と、配列番号７２に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＨ２と、配列番号３５、４５、５５、又は６５のいずれか一つに対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＨ３と、を含む重鎖；及び
（ｂ）  配列番号７３に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＬ１と、配列番号７４に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＬ２と、配列番号４０、５０、６０、又は７０のいずれか一つに対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＬ３と、を含む軽鎖、
を含む、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合可能であり且つ破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する単離抗体、又は該抗体の機能性断片を提供する。
【００１４】
本発明の第２の態様においては、
（ａ）  配列番号１０６に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＨ１と、配列番号１０７に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＨ２と、配列番号５５、３５、４５、６５、又は８０のいずれか一つに対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＨ３と、を含む重鎖；及び
（ｂ）  配列番号７３又は８３に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＬ１と、配列番号１０８に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＬ２と、配列番号６０、４０、５０、７０、９０、１００、又は１０９のいずれか一つに対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むＣＤＲＬ３と、を含む軽鎖、
を含む、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合可能であり且つ破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する単離抗体、又は該抗体の機能性断片を提供する。
【００１５】
好ましくは、前記ＣＤＲＨ３は配列番号３５に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含み、前記ＣＤＲＬ３は配列番号４０に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む。あるいは、前記ＣＤＲＨ３は配列番号４５に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含み、前記ＣＤＲＬ３は配列番号５０に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む。あるいは、前記ＣＤＲＨ３は配列番号５５に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含み、前記ＣＤＲＬ３は配列番号６０に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む。あるいは、前記ＣＤＲＨ３は配列番号６５に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含み、前記ＣＤＲＬ３は配列番号７０に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む。あるいは、前記ＣＤＲＨ３は配列番号８０に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含み、前記ＣＤＲＬ３は配列番号１０９に対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、配列番号９０又は１００のいずれか一つに対して少なくとも８０％の配列同一性）を持つ配列を含む。
【００１６】
好都合には、前記ＣＤＲＨ１は配列番号３３、４３、５３、６３、又は７８に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む。
【００１７】
好ましくは、前記ＣＤＲＨ２は配列番号３４、４４、５４、６４、７９、９４、又は１０４に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む。
【００１８】
有利には、前記ＣＤＲＬ１は配列番号３８、４８、５８、６８、又は８８に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む。
【００１９】
好都合には、前記ＣＤＲＬ２は配列番号３９、４９、５９、６９、又は８９に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む。
【００２０】
好ましくは、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の配列は、それぞれ配列番号３３、３４、３５、３８、３９、及び４０に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む。
【００２１】
あるいは、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の配列は、それぞれ配列番号４３、４４、４５、４８、４９、及び５０に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む。
【００２２】
あるいは、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の配列は、それぞれ配列番号５３、５４、５５、５８、５９、及び６０に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む。
【００２３】
あるいは、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の配列は、それぞれ配列番号６３、６４、６５、６８、６９、及び７０に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む。
【００２４】
あるいは、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の配列は、それぞれ配列番号７８、７９、８０、８８、８９、及び９０に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む。
【００２５】
あるいは、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の配列は、それぞれ配列番号９３、９４、９５、９８、９９、及び１００に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む。
【００２６】
あるいは、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の配列は、それぞれ配列番号１０３、１０４、１０５、８８、８９、及び９０に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む。
【００２７】
特に好ましくは、前記抗体又は機能性断片は、上記配列に対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を持つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及び／又はＣＤＲＬ３配列を含む。
【００２８】
好ましくは、前記抗体は：
ａ１）  配列番号３２に示される２０乃至１３６番目のアミノ酸残基、配列番号４２に示される２０乃至１３５番目のアミノ酸残基、配列番号５２に示される２０乃至１３７番目のアミノ酸残基、配列番号６２に示される２０乃至１３６番目のアミノ酸残基、配列番号７７に示される２０乃至１３８番目のアミノ酸残基、配列番号９２に示される２０乃至１３８番目のアミノ酸残基、又は配列番号１０２に示される２０乃至１４０番目のアミノ酸残基、を含むアミノ酸配列と、
ａ２）  ａ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ａ３）  ａ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ａ４）  ａ１）のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列と、
からなる群から選択される重鎖可変領域；並びに
ｂ１）  配列番号３７に示される２０乃至１２９番目のアミノ酸残基、配列番号４７に示される２０乃至１２９番目のアミノ酸残基、配列番号５７に示される２０乃至１２９番目のアミノ酸残基、配列番号６７に示される２０乃至１２９番目のアミノ酸残基、配列番号８７に示される２０乃至１３４番目のアミノ酸残基、又は配列番号９７に示される２０乃至１３３番目のアミノ酸残基、を含むアミノ酸配列と、
ｂ２）  ｂ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ｂ３）  ｂ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ｂ４）  ｂ１）のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列と、
からなる群から選択される軽鎖可変領域、
を含む。
【００２９】
特に好ましくは、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は上記配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を持つ。
【００３０】
有利には、前記抗体は：
ａ１）  配列番号３２、４２、５２、６２、７７、９２、又は１０２のいずれか一つに示される配列を含むアミノ酸配列と、
ａ２）  ａ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ａ３）  ａ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ａ４）  ａ１）のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列と、
からなる群から選択される重鎖；並びに
ｂ１）  配列番号３７、４７、５７、６７、８７、又は９７いずれか一つに示される配列を含むアミノ酸配列と、
ｂ２）  ｂ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ｂ３）  ｂ１）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を持つアミノ酸配列と、
ｂ４）  ｂ１）のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列と、
からなる群から選択される軽鎖、
を含む。
【００３１】
特に好ましくは、前記重鎖及び軽鎖は、上記の配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を持つ。
【００３２】
好都合には、前記抗体は、配列番号３２を含むアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号３７を含むアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む。
【００３３】
あるいは、前記抗体は、配列番号４２を含むアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号４７を含むアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む。
【００３４】
あるいは、前記抗体は、配列番号５２を含むアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号５７を含むアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む。
【００３５】
あるいは、前記抗体は、配列番号６２を含むアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号６７を含むアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む。
【００３６】
あるいは、前記抗体は、配列番号７７を含むアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号８７を含むアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む。
【００３７】
あるいは、前記抗体は、配列番号９２を含むアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号９７を含むアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む。
【００３８】
あるいは、前記抗体は、配列番号１０２を含むアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号８７を含むアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む。
【００３９】
好都合には、本発明の抗体の前記機能性断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、及びＦｖからなる群から選択される。
【００４０】
好ましくは、前記抗体はｓｃＦｖである。
【００４１】
本発明の第３の態様においては、骨代謝異常を治療及び／又は予防するために使用される、本発明の第１又は第２の態様に記載の単離抗体又は該抗体の機能性断片を提供する。
【００４２】
本発明の第４の態様においては、骨代謝異常を治療又は予防するための医薬を製造するための、本発明の第１又は第２の態様に記載の単離抗体又は該抗体の機能性断片の使用法を提供する。
【００４３】
本発明の第５の態様においては、本発明の第１又は第２の態様に記載の単離抗体又は該抗体の機能性断片の治療上有効な量を投与することを含む、骨代謝異常の患者を治療する方法を提供する。
【００４４】
本発明の第６の態様においては、本発明の第１又は第２の態様に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくとも一つを含む医薬組成物を提供する。
【００４５】
好都合には、前記医薬組成物は骨代謝異常の治療及び／又は予防薬である。
【００４６】
本発明の第７の態様においては、本発明の第１又は第２の態様の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン製剤、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）製剤、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター製剤、抗ＴＮＦ−α抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の機能性断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の機能性断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防用医薬組成物を提供する。
【００４７】
好ましくは、前記骨代謝異常は、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、及び骨形成不全症からなる群から選択される。
【００４８】
有利には、前記骨代謝異常は、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊である。
【００４９】
好都合には、前記骨粗鬆症は、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症である。
【００５０】
本発明の第８の態様においては、
ａ）  本発明の第１又は第２の態様に記載の抗体又は該抗体の機能性断片をコードするヌクレオチド配列；あるいは
ｂ）  ａ）のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列、
を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００５１】
好都合には、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３の配列をコードする前記ヌクレオチド配列は：
ａ）  それぞれ、配列番号３１に示される１４８乃至１６２番目のヌクレオチド、配列番号３１に示される２０５乃至２５５番目のヌクレオチド、配列番号３１に示される３５２乃至３７５番目のヌクレオチド、配列番号３６に示される１２４乃至１５６番目のヌクレオチド、配列番号３６に示される２０２乃至２２２番目のヌクレオチド、及び配列番号３６に示される３１９乃至３４８番目のヌクレオチド；
ｂ）  それぞれ、配列番号４１に示される１４８乃至１６２番目のヌクレオチド、配列番号４１に示される２０５乃至２５５番目のヌクレオチド、配列番号４１に示される３５２乃至３７２番目のヌクレオチド、配列番号４６に示される１２４乃至１５６番目のヌクレオチド、配列番号４６に示される２０２乃至２２２番目のヌクレオチド、及び配列番号４６に示される３１９乃至３４８番目のヌクレオチド；
ｃ）  それぞれ、配列番号５１に示される１４８乃至１６２番目のヌクレオチド、配列番号５１に示される２０５乃至２５５番目のヌクレオチド、配列番号５１に示される３５２乃至３７８番目のヌクレオチド、配列番号５６に示される１２４乃至１５６番目のヌクレオチド、配列番号５６に示される２０２乃至２２２番目のヌクレオチド、及び配列番号５６に示される３１９乃至３４８番目のヌクレオチド；
ｄ）  それぞれ、配列番号６１に示される１４８乃至１６２番目のヌクレオチド、配列番号６１に示される２０５乃至２５５番目のヌクレオチド、配列番号６１に示される３５２乃至３７５番目のヌクレオチド、配列番号６６に示される１２４乃至１５６番目のヌクレオチド、配列番号６６に示される２０２乃至２２２番目のヌクレオチド、及び配列番号６６に示される３１９乃至３４８番目のヌクレオチド；
ｅ）  それぞれ、配列番号７６に示される１４８乃至１６２番目のヌクレオチド、配列番号７６に示される２０５乃至２５５番目のヌクレオチド、配列番号７６に示される３５２乃至３８１番目のヌクレオチド、配列番号８６に示される１２４乃至１６５番目のヌクレオチド、配列番号８６に示される２１１乃至２３１番目のヌクレオチド、及び配列番号８６に示される３２８乃至３６３番目のヌクレオチド；
ｆ）  それぞれ、配列番号９１に示される１４８乃至１６２番目のヌクレオチド、配列番号９１に示される２０５乃至２５５番目のヌクレオチド、配列番号９１に示される３５２乃至３８１番目のヌクレオチド、配列番号９６に示される１２４乃至１６５番目のヌクレオチド、配列番号９６に示される２１１乃至２３１番目のヌクレオチド、及び配列番号９６に示される３２８乃至３６０番目のヌクレオチド；又は
ｇ）  それぞれ、配列番号１０１に示される１４８乃至１６２番目のヌクレオチド、配列番号１０１に示される２０５乃至２６１番目のヌクレオチド、配列番号１０１に示される３５８乃至３８７番目のヌクレオチド、配列番号８６に示される１２４乃至１６５番目のヌクレオチド、配列番号８６に示される２１１乃至２３１番目のヌクレオチド、及び配列番号８６に示される３２８乃至３６３番目のヌクレオチド、
を含む。
【００５２】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは：
ａ１）  配列番号３１に示される５８乃至４０８番目のヌクレオチド、配列番号４１に示される５８乃至４０５番目のヌクレオチド、配列番号５１に示される５８乃至４１１番目のヌクレオチド、配列番号６１に示される５８乃至４０８番目のヌクレオチド、配列番号７６に示される５８乃至４１４番目のヌクレオチド、配列番号９１に示される５８乃至４１４番目のヌクレオチド、又は配列番号１０１に示される５８乃至４２０番目のヌクレオチド、を含むヌクレオチド配列と、
ａ２）  ａ１）のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列と、
ａ３）  ａ１）のヌクレオチド配列に１若しくは数個のヌクレオチドが付加、欠失又は置換されたヌクレオチド配列と、
からなる群から選択される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列；並びに、
ｂ１）  配列番号３６に示される５８乃至３８７番目のヌクレオチド、配列番号４６に示される５８乃至３８７番目のヌクレオチド、配列番号５６に示される５８乃至３８７番目のヌクレオチド、配列番号６６に示される５８乃至３８７番目のヌクレオチド、配列番号８６に示される５８乃至４０２番目のヌクレオチド、又は配列番号９６に示される５８乃至３９９番目のヌクレオチド、を含むヌクレオチド配列と、
ｂ２）  ｂ１）のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列と、
ｂ３）  ｂ１）のヌクレオチド配列に１若しくは数個のヌクレオチドが付加、欠失又は置換されたヌクレオチド配列と、
からなる群から選択される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、
を含む。
【００５３】
有利には、前記ポリヌクレオチドは：
ａ１）  配列番号３１、４１、５１、６１、７６、９１、又は１０１のいずれか一つに示される配列のヌクレオチド配列と、
ａ２）  ａ１）のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列と、
ａ３）  ａ１）のヌクレオチド配列に１若しくは数個のヌクレオチドが付加、欠失又は置換されたヌクレオチド配列と、
からなる群から選択される重鎖をコードするヌクレオチド配列；及び
ｂ１）  配列番号３６、４６、５６、６６、８６、又は９６のいずれか一つに示される配列を含むヌクレオチド配列と、
ｂ２）  ｂ１）のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列と、
ｂ３）  ｂ１）のヌクレオチド配列に１若しくは数個のヌクレオチドが付加、欠失又は置換されたヌクレオチド配列と、
からなる群から選択される軽鎖をコードするヌクレオチド配列、
を含む。
【００５４】
本発明の第９の態様においては、本発明の第８の態様に記載の少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００５５】
本発明の第１０の態様においては、本発明の第８の態様に記載の少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む形質転換細胞を提供する。
【００５６】
本発明の第１１の態様においては、本発明の第９の態様に記載の少なくとも一つのベクターを含む形質転換細胞を提供する。
【００５７】
本発明の第１２の態様においては、本発明の第１０又は第１１の態様に記載の形質転換細胞を培養し、培養物を回収し、前記培養物から抗体を精製する工程を含む、
本発明の第１又は第２の態様に記載の抗体の生産方法を提供する。
【００５８】
本明細書において、２個の配列間の「同一性」の％は、デフォルトのパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムｖｅｒ．２．２．２（Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｔ．Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ、Ａ．Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ、Ｊ．Ｚｈａｎｇ、Ｚ．Ｚｈａｎｇ、Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ、及びＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ著、「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ-ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９７年）、第２５巻、ｐ．３３８９−３４０２）を用いて測定される。特にＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔというＵＲＬを用いてインターネット上でアクセスできる。
【発明の効果】
【００５９】
本発明によれば、破骨細胞の分化成熟、及びその活性の阻害を作用機序とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防薬を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ、及びヒトＦｃに対する、抗体ＭＯＲ０９２８１、ＭＯＲ０９８９２、ＭＯＲ０９８９８、ＭＯＲ１０１１０、ＭＯＲ０９０１２、ＭＯＲ０８６５６、ＭＯＲ０８６６２、及びヒトＩｇＧ（陰性コントロール）の結合を、ＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示すグラフである。
【図２】抗体ＭＯＲ０９２８１の存在下において形成されたマウス破骨細胞のＴＲＡＰ活性を示すグラフである。
【図３】抗体ＭＯＲ０９０１２（ＭＯＲ０９８９２の親抗体）の存在下において形成されたマウス破骨細胞のＴＲＡＰ活性を示すグラフである。
【図４】抗体ＭＯＲ０９８９２の存在下において形成されたマウス破骨細胞のＴＲＡＰ活性を示すグラフである。
【図５】抗体ＭＯＲ０８６５６（ＭＯＲ０９８９８の親抗体）の存在下において形成されたマウス破骨細胞のＴＲＡＰ活性を示すグラフである。
【図６】抗体ＭＯＲ０８６６２（ＭＯＲ１０１１０の親抗体）の存在下において形成されたマウス破骨細胞のＴＲＡＰ活性を示すグラフである。
【図７】抗体ＭＯＲ０９８９８の存在下において形成されたマウス破骨細胞のＴＲＡＰ活性を示すグラフである。
【図８】抗体ＭＯＲ１０１１０の存在下において形成されたマウス破骨細胞のＴＲＡＰ活性を示すグラフである。
【図９】抗体ＭＯＲ０９２８１の存在下において培養された際に、ヒト破骨前駆細胞により分解されたプレートから遊離したコラーゲン断片の量を示すグラフである。
【図１０】抗体ＭＯＲ０８６５６（ＭＯＲ０９８９８の親抗体）の存在下において培養された際に、ヒト破骨前駆細胞により分解されたプレートから遊離したコラーゲン断片の量を示すグラフである。
【図１１】抗体ＭＯＲ０９８９８の存在下において培養された際に、ヒト破骨前駆細胞により分解されたプレートから遊離したコラーゲン断片の量を示すグラフである。
【図１２】抗体ＭＯＲ０９０１２（ＭＯＲ０９８９２の親抗体）及びＭＯＲ０９８９２の存在下において培養された際に、ヒト破骨前駆細胞により分解されたプレートから遊離したコラーゲン断片の量を示すグラフである。
【図１３】ＭＯＲ０８６６２（ＭＯＲ１０１１０の親抗体）及びＭＯＲ１０１１０の存在下において培養された際に、ヒト破骨前駆細胞により分解されたプレートから遊離したコラーゲン断片の量を示すグラフである。
【図１４】抗体ＭＯＲ０８６５６の重鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を示した図である。
【図１５】抗体ＭＯＲ０８６５６の重鎖のアミノ酸配列（配列番号２）を示した図である。
【図１６】抗体ＭＯＲ０８６５６の軽鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号６）を示した図である。
【図１７】抗体ＭＯＲ０８６５６の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号７）を示した図である。
【図１８】抗体ＭＯＲ０８６６２の重鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号１１）を示した図である。
【図１９】抗体ＭＯＲ０８６６２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２）を示した図である。
【図２０】抗体ＭＯＲ０８６６２の軽鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号１６）を示した図である。
【図２１】抗体ＭＯＲ０８６６２の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１７）を示した図である。
【図２２】抗体ＭＯＲ０９０１２の重鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号２１）を示した図である。
【図２３】抗体ＭＯＲ０９０１２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号２２）を示した図である。
【図２４】抗体ＭＯＲ０９０１２の軽鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号２６）を示した図である。
【図２５】抗体ＭＯＲ０９０１２の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２７）を示した図である。
【図２６】抗体ＭＯＲ０９２８１の重鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号３１）を示した図である。
【図２７】抗体ＭＯＲ０９２８１の重鎖のアミノ酸配列（配列番号３２）を示した図である。
【図２８】抗体ＭＯＲ０９２８１の軽鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号３６）を示した図である。
【図２９】抗体ＭＯＲ０９２８１の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３７）を示した図である。
【図３０】抗体ＭＯＲ０９８９２の重鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号４１）を示した図である。
【図３１】抗体ＭＯＲ０９８９２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号４２）を示した図である。
【図３２】抗体ＭＯＲ０９８９２の軽鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号４６）を示した図である。
【図３３】抗体ＭＯＲ０９８９２の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４７）を示した図である。
【図３４】抗体ＭＯＲ０９８９８の重鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号５１）を示した図である。
【図３５】抗体ＭＯＲ０９８９８の重鎖のアミノ酸配列（配列番号５２）を示した図である。
【図３６】抗体ＭＯＲ０９８９８の軽鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号５６）を示した図である。
【図３７】抗体ＭＯＲ０９８９８の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５７）を示した図である。
【図３８】抗体ＭＯＲ１０１１０の重鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号６１）を示した図である。
【図３９】抗体ＭＯＲ１０１１０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６２）を示した図である。
【図４０】抗体ＭＯＲ１０１１０の軽鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号６６）を示した図である。
【図４１】抗体ＭＯＲ１０１１０の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６７）を示した図である。
【図４２】抗体ＭＯＲ０９２６８の存在下で培養された際に、ヒト破骨前駆細胞により分解されたプレートから遊離したコラーゲン断片の量を示すグラフである。
【図４３】抗体ＭＯＲ１２５７４の存在下で培養された際に、ヒト破骨前駆細胞により分解されたプレートから遊離したコラーゲン断片の量を示すグラフである。
【図４４】抗体ＭＯＲ１３１５４の存在下で培養された際に、ヒト破骨前駆細胞により分解されたプレートから遊離したコラーゲン断片の量を示すグラフである。
【図４５】抗体ＭＯＲ１３１５６の存在下で培養された際に、ヒト破骨前駆細胞により分解されたプレートから遊離したコラーゲン断片の量を示すグラフである。
【図４６】抗体ＭＯＲ０９２６８及びＭＯＲ１２５７４の重鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号７６）を示した図である。
【図４７】抗体ＭＯＲ０９２６８及びＭＯＲ１２５７４の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７７）を示した図である。
【図４８】抗体ＭＯＲ０９２６８の軽鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号８１）を示した図である。
【図４９】抗体ＭＯＲ０９２６８の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号８２）を示した図である。
【図５０】抗体ＭＯＲ１２５７４及びＭＯＲ１３１５６の軽鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号８６）を示した図である。
【図５１】抗体ＭＯＲ１２５７４及びＭＯＲ１３１５６の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号８７）を示した図である。
【図５２】抗体ＭＯＲ１３１５４の重鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号９１）を示した図である。
【図５３】抗体ＭＯＲ１３１５４の重鎖のアミノ酸配列（配列番号９２）を示した図である。
【図５４】抗体ＭＯＲ１３１５４の軽鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号９６）を示した図である。
【図５５】抗体ＭＯＲ１３１５４の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号９７）を示した図である。
【図５６】抗体ＭＯＲ１３１５６の重鎖をコードするＤＮＡ配列（配列番号１０１）を示した図である。
【図５７】抗体ＭＯＲ１３１５６の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０２）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡも含まれるものとする。
【００６２】
本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。
【００６３】
本明細中において、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
【００６４】
本明細書中において、「ＲＮＡ画分」という語は、ＲＮＡを含んでいる画分をいう。
【００６５】
本明細中において、「細胞」という語には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
【００６６】
本明細中において、「Ｓｉｇｌｅｃ−１５」という語は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５蛋白質と同じ意味で用いている。
【００６７】
本明細書中において、「破骨細胞の形成」は、「破骨細胞の分化」又は「破骨細胞の成熟」と同じ意味で用いている。
【００６８】
本明細書中における「抗体の機能性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びｓｃＦｖ等を含む。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も「抗体の機能性断片」に含まれる。但し、抗原との結合親和性を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの機能性断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理した断片のみならず、遺伝子改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。
【００６９】
抗体分子の重鎖又は軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）があることが知られている。相補性決定領域は超可変ドメインとも呼ばれ、重鎖又は軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、抗体の重鎖又は軽鎖のポリペプチド内のそれぞれ３ヶ所に分離して存在している。本明細書中においては、重鎖の各ＣＤＲを、重鎖ポリペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）側から順にＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記する。軽鎖の各ＣＤＲを、軽鎖ポリペプチドのアミノ末端側から順にＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの６箇所のＣＤＲは抗体の立体構造内で相互に近接し、抗原結合の特異性を決定している。
【００７０】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて市販のハイブリダイゼーション溶液（例えばＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製））中、６８℃でハイブリダイズするか、又は、０．７−１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１−２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣとは１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００７１】
「結合可能」という語は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に関する抗体について用いる場合、抗体が生理条件で優先的にＳｉｇｌｅｃ−１５と結合できることを意味している。実施形態の一部においては、「特異的」という語と同義である。すなわち実施形態の一部においては、抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対して他の関連ポリペプチドに対するよりも大きい親和性（例えば、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍大きい親和性）を有する。
【００７２】
本明細書の一部の形態において、「数個の」とは、２乃至４の数を意味する。
１. Ｓｉｇｌｅｃ−１５
Ｓｉｇｌｅｃ−１５を免疫原として用いる場合、ヒト、ヒト以外の哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）あるいはニワトリの単球細胞あるいは骨髄細胞からＳｉｇｌｅｃ−１５を直接精製して使用するか、あるいは上記の細胞の細胞膜画分を調製して使用することができる。また、Ｓｉｇｌｅｃ−１５をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、より具体的には、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質、及びエネルギー物質を含む溶液中でＳｉｇｌｅｃ−１５を合成する、あるいは他の原核生物又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＳｉｇｌｅｃ−１５を発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。
【００７３】
ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＮＭ＿２１３６０２で登録されている。マウスＳｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＸＭ＿８８４６３６で登録されている。
２. 抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体
通常の抗体の構造は当分野で公知であるため、簡単に概略を述べるに留める。免疫グロブリンのモノマーは、ジスルフィド結合で連結した２つの重鎖と２つの軽鎖とを含む。各重鎖は、２つの軽鎖のうち１つとジスルフィド結合で直接結合してペアになっている。各重鎖は定常領域（抗体のアイソタイプによって異なる）及び可変領域を含んでいる。可変領域は３つの超可変領域（相補性決定領域）を含んでおり、これらの超可変領域はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３と表記され、フレームワーク領域内に保持されている。各軽鎖は定常領域及び可変領域を含んでおり、可変領域は重鎖可変領域と同様にフレームワーク領域に保持された３つの超可変領域（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３と表記する）を含んでいる。
【００７４】
重鎖と軽鎖との各ペアが持つこれらの超可変領域は協同して、標的抗原に結合可能な抗原結合部位をつくる。重鎖と軽鎖とのペアが持つ結合特異性は、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列によって決まる。したがって、特定の結合特異性をもたらすＣＤＲ配列（すなわち、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列）のセットが明らかになると、そのＣＤＲ配列のセットを、任意の抗体定常領域に連結された任意の別の抗体フレームワーク領域内の適当な位置に挿入することによって、原則的に、同じ抗原結合特異性を持つ異なる抗体を提供することができる。
【００７５】
好ましい形態においては、抗体ＭＯＲ０９２８１、ＭＯＲ０９８９２、ＭＯＲ０９８９８、ＭＯＲ１０１１０、ＭＯＲ１２５７４、ＭＯＲ１３１５４、及びＭＯＲ１３１５６を提供する。これらの抗体のアミノ酸配列の詳細は、表４乃至７及び１０乃至１２に示す。ただし、本発明はこれらの好ましい抗体に限定されない。
【００７６】
通常、本発明の抗Ｓｉｇｌｅｃ １５抗体においては、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２の配列は配列番号７１乃至７４に示されるコンセンサス配列に従う。あるいは、重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列の配列は配列番号１０６及び１０７に示されるコンセンサス配列に従ってもよく、軽鎖ＣＤＲ２配列の配列は配列番号１０８に従ってもよく、軽鎖ＣＤＲ１配列の配列は配列番号７３又は８３に従ってもよい。
【００７７】
軽鎖ＣＤＲ３配列の配列は、配列番号１０９に示されるコンセンサス配列に従ってもよい。特に好ましくは、抗体は、配列番号１０９に示されるコンセンサス配列に従う軽鎖ＣＤＲ３配列を有し、重鎖ＣＤＲ３配列は、配列番号８０に示される配列を有する。
【００７８】
本発明の好適な抗体の一部（ＭＯＲ０９２８１、ＭＯＲ０９８９２、ＭＯＲ０９８９８、及びＭＯＲ１０１１０）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を、具体的に表８に示す。本発明のその他の好適な抗体（ＭＯＲ１２５７４、ＭＯＲ１３１５４、及びＭＯＲ１３１５６）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を、具体的に表１３に示す。すなわち、そのような好適な抗体類由来の配列を持つＣＤＲ１〜３を含む抗体を提供する。但し本発明の好適な抗体類の配列間には高レベルの配列同一性が存在するため、別々の好適な抗体に由来するＣＤＲ配列を持つ抗体を提供することも本発明の範囲に含まれる。例えば、ＭＯＲ０９２８１のＣＤＲ１配列とＭＯＲ０９８９２のＣＤＲ２配列とＭＯＲ０９８９８のＣＤＲ３配列とを持つ重鎖、及びＭＯＲ１０１１０のＣＤＲ１配列とＭＯＲ０９２８１のＣＤＲ２配列とＭＯＲ０９８９２のＣＤＲ３配列とを持つ軽鎖を含む抗体を提供してもよい。
【００７９】
本発明の形態の一部においては、ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が表８及び１３に示されるものから異なるが、尚少なくとも８０％（あるいは、実施形態の一部においては少なくとも９０％又は９５％）の配列同一性を保持することも理解されよう。形態の一部においては、１つの抗体のあるＣＤＲのある位置のアミノ酸残基が、別の抗体の同じＣＤＲの相当する位置のアミノ酸残基と交換される。例えば、アミノ酸配列ＮＹＡＭＳ（配列番号７５）を含むＣＤＲ１配列（すなわち、ＭＯＲ０９８９２の重鎖ＣＤＲ１配列の３番目のアミノ酸で３番目のアミノ酸が置換されたＭＯＲ０９２８１の重鎖ＣＤＲ１配列）を含む重鎖を含む抗体を提供してもよい。別の実施形態においては、ＣＤＲ中の１つ又は複数のアミノ酸残基が別のアミノ酸で置換される。置換は、同一のアミノ酸ファミリー内における置換であるという意味で「保存的」であり得る。天然のアミノ酸は以下の４つのファミリーに分類でき、保存的置換はこれらのファミリー内で起こると予想される。
【００８０】
１）  塩基性側鎖を持つアミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン。
【００８１】
２）  酸性側鎖を持つアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸
３）  非荷電極性側鎖を持つアミノ酸：アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン。
【００８２】
４）  非極性側鎖を持つアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン。
【００８３】
別の実施形態においては、抗体が持つＣＤＲの１つ又は複数に１つ又は複数のアミノ酸残基を付加又は欠失させる。そのような付加又は欠失は、ＣＤＲのＮ又はＣ末端あるいはＣＤＲ内部の位置に生じる。
【００８４】
アミノ酸を付加、欠失、又は置換して抗体のＣＤＲのアミノ酸を改変することによって、標的抗原に対する結合親和性の増大や凝集の低下などの様々な効果を得ることができる。
【００８５】
このように改変したＣＤＲ配列を含む本発明の抗体もＳｉｇｌｅｃ−１５に結合し、破骨細胞の形成及び／破骨細胞の骨吸収を抑制することは理解されよう。本明細書の実施例５及び６に開示される結合試験及び生物活性試験で検定することができる。
【００８６】
抗体の定常領域は、抗体ＭＯＲ０９２８１、ＭＯＲ０９８９２、ＭＯＲ０９８９８、ＭＯＲ１０１１０、ＭＯＲ１２５７４、ＭＯＲ１３１５４、及びＭＯＲ１３１５６について具体的に開示されるものとは異なっていてもよい。例えば、任意のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ）のＦｃ領域を有する抗体を提供してもよい。
【００８７】
好ましくは、前記抗体はヒト抗体である。
【００８８】
抗体、抗体の作製法、及び抗体の使用法は一般的に公知であり、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ及びＤ．Ｌａｎｅ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９年）等に開示されている。
【００８９】
抗体の作製は、当分野で公知の標準的な方法を用いて行うことができる。抗体としてはモノクローナル抗体、一本鎖抗体、抗体の機能性断片などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
抗体の「機能性断片」には標的抗原に結合可能な任意の抗体断片が包含され、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、及びＦｖ断片が包含される。
【００９１】
抗体の生産は、種々の宿主（例えば、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等）を用いて行うことができる。これらの宿主の免疫化は、標的抗原（本発明においてはＳｉｇｌｅｃ−１５）あるいは該抗原の断片又はオリゴペプチド（免疫原性を持つもの）を注射することによって行うことができる。宿主種ごとに、種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増大させることができる。これらのアジュバントとしては、フロイントアジュバント、ミネラルゲル（水酸化アルミニウム等）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール）が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトに用いるアジュバントとしては、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍが特に有用である。
【００９２】
Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対するモノクローナル抗体の調製は、培養した継代細胞株に抗体分子を生産させる任意の方法で行うことができる。例えばハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、ＥＢＶハイブリドーマ法（Ｋｏｅｈｌｅｒら著、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５年）、第２５６巻、ｐ．４９５−４９７；Ｋｏｓｂｏｒら著、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ（１９８３年）、第４巻、ｐ．７２；Ｃｏｔｅら著、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（１９８３年）、第８０巻、ｐ．２０２６−２０３０；Ｃｏｌｅら著、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．７７−９６、１９８５年）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
あるいは、一本鎖抗体の生産法を用いることができる。一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、リンカーペプチド（通常は約５〜２５アミノ酸の長さ）で連結された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。ｓｃＦｖの合成は、遺伝子組み換え法を用いて、例えばｓｃＦｖをコードするベクターを大腸菌などの宿主生物中で発現させることによって行うことができる。
【００９４】
抗体の生産は、ｉｎ  ｖｉｖｏでリンパ球集団による生産を誘導することによっても、又は組み換え体免疫グロブリンライブラリーや特異性が高い結合試薬のセットをスクリーニングすることによっても行うことができる（Ｏｒｌａｎｄｉら著、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（１９８９年）、第８６巻、ｐ．３８３３−３８３７；Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒら著、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１年）、第３４９巻、ｐ．２９３−２９９）。
【００９５】
抗原結合断片（例えば、抗体分子をペプシン消化して生産可能なＦ（ａｂ’）２断片や、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元して作製可能なＦａｂ断片）を作製することもできる。あるいはＦａｂ発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速簡便に同定することもできる（Ｈｕｓｅら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９年）、第２５６巻、ｐ．１２７５−１２８１）。
【００９６】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングを行い、所望の特異性を有する抗体を同定する事ができる。当分野では、特異性が既知のポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いた競合的結合アッセイや免疫放射線アッセイ用の多数のプロトコールが公知である。通常、これらのイムノアッセイでは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５あるいはその任意の断片又はオリゴペプチドと特異的抗体との間で起こる複合体形成を測定する。互いに干渉しない２種類のＳｉｇｌｅｃ−１５エピトープに特異的なモノクローナル抗体を利用して、モノクローナル系のｔｗｏ-ｓｉｔｅイムノアッセイを用いることができるが、競合的結合アッセイを採用してもよい（Ｍａｄｄｏｘら著、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８３年）、第１５８巻、ｐ．１２１１−１２１６）。
３．抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を含有する医薬
上述の「２．抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体」の項に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の生物活性を中和する。Ｓｉｇｌｅｃ−１５の生物活性を中和するそのような抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳｉｇｌｅｃ−１５の生物活性（すなわち、破骨細胞の分化及び／又は成熟）を阻害することから、破骨細胞の分化及び／又は成熟の異常に起因する骨代謝異常の治療及び／又は予防薬として用いることができる。ここで骨代謝異常は、正味の骨喪失（骨減少症又は骨溶解症）によって特徴付けられるいずれの障害であってもよい。一般に、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体による治療及び／又は予防効果は、骨吸収を抑制する必要がある場合に適用される。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体で治療及び／又は予防可能な骨代謝異常としては、骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症）、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、骨形成不全症などを挙げることができる。但し破骨細胞による正味の骨喪失を伴う疾患であれば、これらに限定されない。
【００９７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体によるＳｉｇｌｅｃ−１５の生物活性の中和活性は例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５を過剰発現している細胞の破骨細胞への分化の抑制活性で測定することができる。例えば、マウス単球由来細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞又はＲＡＷ２６４細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加し、ＲＡＮＫＬあるいはＴＮＦ−α刺激による破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。また、骨髄由来初代培養細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加し、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ−α、又は活性型ビタミンＤ３刺激による破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。さらに、正常ヒト破骨前駆細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｃｅｌｌｓ、三光純薬より購入可能、カタログ番号２Ｔ−１１０）に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加し、ＲＡＮＫＬ又はＭ−ＣＳＦ刺激による破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。このような破骨細胞の分化抑制効果は、破骨細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性の抑制を指標として測定できる。また、ＴＲＡＰ陽性多核破骨細胞の形成の抑制、すなわち破骨細胞の細胞融合の抑制を指標としても、破骨細胞の分化抑制効果を測定することができる。さらに、大腿骨及び／又は脛骨由来の細胞を用いたピットアッセイ実験（Ｔａｋａｄａら著、Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ（１９９２年）、第１７巻、ｐ．３４７-３５９）において、大腿骨及び／又は脛骨由来の細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加して象牙切片上のピットの形成を観察することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける破骨細胞による骨吸収の抑制活性を測定することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける破骨細胞による骨吸収の抑制活性の測定系としては、ユーロピウムが結合したヒトコラーゲンをコーティングしたプレートを使用することも可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の骨代謝異常に対する治療又は予防効果は、骨粗鬆症モデル動物又はＳｉｇｌｅｃ−１５を過剰発現しているトランスジェニック動物に抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を投与し、破骨細胞の変化を測定することで確認することができる。
【００９８】
Ｓｉｇｌｅｃ−１５の生物活性を中和する上記の抗体は、医薬として、特に骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌の骨転移に伴う骨破壊等の骨代謝異常の治療又は予防を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用である。
【００９９】
関節リウマチ（ＲＡ）の治療において、疾患の発症に伴って発生する骨喪失が大きな課題になっている。ＲＡに伴うこの骨喪失においては、破骨細胞が中心的な役割を果たしていることが報告されている。ＲＡにおける破骨細胞の誘導（分化、成熟）、活性化、及び骨破壊の原因に最も重要と考えられているサイトカインはＲＡＮＫＬとＴＮＦ−αである（Ｅ．Ｒｏｍａｓら著、Ｂｏｎｅ（２００２年）、第３０巻、ｐ．３４０−３４６）。ＲＡＮＫＬのデコイレセプターであるＯＣＩＦ／ＯＰＧではＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成は抑制できるが、ＴＮＦ−αで誘導される破骨細胞形成は抑制されない。その一方で、本発明における抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体によって、ＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成とＴＮＦ−αで誘導される破骨細胞形成の両方が効果的に抑制される。したがって、本発明の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体によって、ＲＡなどにおけるＴＮＦ−αで誘導される骨喪失と骨破壊が、ＲＡＮＫＬブロッカー（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、抗ＲＡＮＫＬ抗体など）以上に強力に抑制できることが期待される。
【０１００】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は、一つの例としては、骨代謝異常の治療又は予防に対しては該抗体単独で、あるいは少なくとも一つの他の骨疾患治療剤と併用して投与することができる。また一つの例として、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は治療上有効な量の骨代謝異常治療薬剤と併用して投与することができる。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と治療薬剤とは同時投与、別時投与、あるいは連続投与してもよい。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と併用して投与できる治療剤としては、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン製剤、ＳＥＲＭｓ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）製剤、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター製剤、抗ＴＮＦ−α抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の機能性断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の機能性断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）等を挙げることができるがこれらに限定されない。別の例としては、治療薬剤は本発明の別の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体である。すなわち、本発明の２種類の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を投与する。骨代謝異常の状態やどの程度の治療及び／又は予防を目指すかによって、２、３あるいはそれ以上の種類の治療薬剤を投与することもできるし、それらの治療薬剤は同じ製剤の中に封入することによって同時に供給することができる。それらの治療薬剤と抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体とは同じ製剤の中に封入することによって同時に供給することもできる。また、それらの治療薬剤は治療及び／又は予防用キットとして封入することによって同時に供給することもできる。また、それらの治療薬剤と抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は別々に供給することもできる。遺伝子治療において投与する場合には、蛋白質性の骨疾患治療剤の遺伝子と抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の遺伝子は、同じあるいは別々のプロモーター領域の下流に挿入することができ、同じあるいは別々のベクターに導入することができる。
【０１０１】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体又は該抗体の断片に対して骨疾患治療剤を結合させることによって、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ」（Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ著、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００１年）、第５３巻、ｐ．１７１−２１６）に記載の標的型薬物複合体を製造することができる。この目的には、抗体分子のほか、破骨細胞の認識性を完全消失していない限り、任意の抗体断片を適用可能であるが、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等の断片を例として挙げることができる。本発明においても同様に、抗体及び該断片を使用することができる。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体又は該抗体の断片と骨疾患治療剤との結合様式は、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ」（Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ著、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００１年）、第５３巻、ｐ．１７１−２１６）、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９９６年）、及び「Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」（Ｐｕｔｎａｍ及びＪ．Ｋｏｐｅｃｅｋ著、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５年）、第１２２巻、ｐ．５５-１２３）等に記載される種々の形態があり得る。すなわち、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と骨疾患治療剤とが化学的に直接あるいはオリゴペプチド等のスペーサーを介して結合される様式や、適当な薬物担体を介して形成される複合体を挙げることができる。薬物担体の例としては、リポソームや水溶性ポリマーを挙げることができる。これら薬物担体を介して形成される複合体としては、より具体的には、抗体と骨疾患治療剤とが１つのリポソームに包含され、該リポソームと抗体とが相互に結合した様式、及び、骨疾患治療剤が水溶性ポリマー（分子量１０００乃至１０万程度の化合物）に化学的に直接あるいはオリゴペプチド等のスペーサーを介して結合され、該水溶性ポリマーに抗体が結合した様式、を例として挙げることができる。抗体（又はその断片）と骨疾患治療剤又は薬物担体（リポソーム、水溶性ポリマー等）との結合は、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９９６年）及び「Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」（Ｐｕｔｎａｍ及びＪ．Ｋｏｐｅｃｅｋ著、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５年）、第１２２巻、ｐ．５５−１２３）に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。骨疾患治療剤のリポソームへの包含は、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ著、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９９３年）等に記載の方法等の当業者周知の方法に���り実施することができる。骨疾患治療剤の水溶性ポリマーへの結合は、「Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」（Ｄ．Ｐｕｔｎａｍ及びＪ．Ｋｏｐｅｃｅｋ著、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５年）、第１２２巻、ｐ．５５−１２３）に記載の方法等の当業者周知の方法により、実施することができる。抗体（又はその断片）と蛋白質性の骨疾患治療剤（又はその断片）との複合体は、上記の方法のほか、遺伝子工学的に、当業者周知の方法により作製することができる。
【０１０２】
本発明は、治療及び／又は予防に有効な量の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、及び／又は補助剤とを含む医薬組成物も提供する。
【０１０３】
本発明は、治療及び／又は予防に有効な量の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と治療及び／又は予防に有効な量の少なくとも一つの骨疾患治療剤と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、及び／又は補助剤とを含む医薬組成物も提供する。骨疾患治療剤としては、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン製剤、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）製剤、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター製剤、抗ＴＮＦ−α抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の機能性断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の機能性断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）等を挙げることができるがこれらに限定されない。別の例としては、治療剤は本発明の別の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体である。すなわち、前記医薬組成物は本発明の２種類の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を含んでなる。
【０１０４】
本発明の医薬組成物において許容される製剤に用いる物質としては、投与量や投与濃度において、医薬組成物を投与される者に対して非毒性のものが好ましい。
【０１０５】
本発明の医薬組成物は、医薬組成物又はその成分のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、色、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸収率、又は浸透率を変えたり、保持したりできる製剤用の物質を含むことができる。製剤用の物質としては以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない。グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリジン等のアミノ酸類；抗菌剤；アスコルビン酸、硫酸ナトリウム、又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；リン酸、クエン酸、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム、トリス−塩酸（Tris-Hcl）溶液等の緩衝剤； マンニトールやグリシン等の充填剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤；カフェイン、ポリビニルピロリジン、β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等の錯化剤；グルコース、マンノース、及びデキストリン等の増量剤；単糖類、二糖類等の他の炭水化物；着色剤；香味剤；希釈剤；乳化剤；ポリビニルピロリジン等の親水ポリマー；低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸、及び過酸化水素等の防腐剤；グリセリン、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコール等の溶媒；マンニトール及びソルビトール等の糖アルコール；懸濁剤；ソルビタンエステル、ポリソルベート２０やポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン、及びコレステロール等の界面活性剤；スクロースやソルビトール等の安定化増強剤；塩化ナトリウム、塩化カリウム、及びマンニトール・ソルビトール等の弾性増強剤；輸送剤；希釈剤；賦形剤；及び／又は薬学上の補助剤。これらの製剤用の物質の添加量は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の重量に対して０．０１〜１００倍添加するのが好ましく、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。
【０１０６】
医薬組成物中の賦形剤や担体の形態は液体でも固体でもよい。適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩水、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。また、中性の生理食塩水や血清アルブミンを含む生理食塩水を担体に用いることもできる。医薬組成物にはｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝液を含むことができる。また、これらの緩衝液にソルビトールや他の化合物を含むこともできる。本発明の医薬組成物には抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を含む医薬組成物並びに、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体及び少なくとも一つの骨疾患治療剤を含む医薬組成物を挙げることができる。本発明の医薬組成物は選択された組成と必要な純度とを持つ薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を含む医薬組成物並びに、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体及び少なくとも一つの骨代謝異常治療薬剤を含む医薬組成物は、スクロースのような適当な賦形剤を用いた凍結乾燥品として成型されることもできる。
【０１０７】
本発明の医薬組成物は非経口投与用に調製することもできるし、経口による消化管吸収用に調製することもできる。製剤の組成及び濃度は投与方法によって決定することができる。本発明の医薬組成物に含まれる、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体のＳｉｇｌｅｃ−１５に対する親和性が高い（即ち、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対する解離定数（Ｋｄ値）が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なくしても薬効を発揮することができるので、この結果に基づいて本発明の医薬組成物のヒトに対する投与量を決定することもできる。投与量は、ヒト抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体をヒトに対して投与する際には、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜１８０日間に１回投与すればよい。
【０１０８】
本発明の医薬組成物の剤形としては、注射剤、点滴剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などを挙げることができる。
４．本発明のその他の発明物
上記「２. 抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体」の項目に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチドも提供する。好ましい抗体（ＭＯＲ０９２８１、ＭＯＲ０９８９２、ＭＯＲ０９８９８、ＭＯＲ１０１１０、ＭＯＲ１２５７４、ＭＯＲ１３１５４、及びＭＯＲ１３１５６）をコードするヌクレオチド配列の詳細は、表４乃至７及び１０乃至１２に示されている。但し、本発明のポリヌクレオチドが表４乃至７及び１０乃至１２に示されるものに限定されないことは理解されよう。具体的には、上記の項目２に記載の通り、複数のＣＤＲが別々の好適な抗体に由来する抗体やＣＤＲに１つ又は複数のアミノ酸が付加、欠失、又は置換された抗体も、本発明の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体に含まれる。本発明のポリヌクレオチドとしては、そのような抗体をコードするものも含まれる。また、核酸コードの縮重が原因で、表４乃至７及び１０乃至１２に示されるヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列も同じアミノ酸配列をコードする。
【０１０９】
上記の項目２に示される抗体の一つをコードするヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをも提供する。尚、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」という語の定義は上記されている。
【０１１０】
前記ポリヌクレオチドは、その他のヌクレオチド配列としてプロモーター及び／又はその他の発現調節配列、ポリ（Ａ）尾部をコードする配列、最小限の非翻訳領域、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列等を含んでいてもよい。
【０１１１】
一部の実施形態においては、このようなポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。ベクターの例としては、プラスミド、コスミド、ウィルスベクターが挙げられ、バクテリオファージも包含される。これらのベクターは、前記ポリヌクレオチド自体に加えて、複製開始点、遺伝マーカー、抗生物質耐性遺伝子、ｃｏｓ部位、クローニング部位、ターゲティング配列などの配列を含有していてもよい。実施形態の多くにおいては、ベクターは、宿主細胞内で複製し、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体をコードするポリヌクレオチド配列を宿主細胞に発現させるのに充分なエレメントを含んでなる。
【０１１２】
よって、別の実施形態においては、上記のポリヌクレオチド（例えば、細胞ゲノムに組み込まれる）又は上記のベクターを含有する形質転換細胞を提供する。適当な宿主細胞としては、バクテリア細胞（大腸菌等）や真核細胞（酵母細胞、ヒト細胞株等）が挙げられる。これらの形質転換細胞を用いて、細胞を培養し、本発明のＳｉｇｌｅｃ−１５抗体をコードするヌクレオチド配列を発現させ、培地から抗体を精製することによって、本発明のＳｉｇｌｅｃ−１５抗体を合成することができる。
【実施例】
【０１１３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は、「モレキュラークローニング（Molecular Cloning）」（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には附属の指示書に従って使用した。
【実施例１】
【０１１４】
細胞培養及び一過性形質転換
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ細胞をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地（インビトロジェン社）中で培養した。細胞パニングの目的には、使用説明書に従って２９３ｆｅｃｔｉｎ（インビトロジェン社）を用い、プラスミドＤＮＡ（プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５（ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５をコードする：アクセッション番号Ｑ６ＺＭＣ９）、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）／マウスＳｉｇｌｅｃ−１５（マウスＳｉｇｌｅｃ−１５をコードする：アクセッション番号ＮＰ＿００１０９４５０８）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）等）でＨＥＫ  ２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ細胞を形質転換した。形質転換したＨＥＫ  ２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ細胞を２日間培養した後に回収し、さらに細胞パニングを行った。
組み換え体ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ及びマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃの調製
可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐｈＩｇＦｃ用の発現ベクターを、Ｇａｔｅｗａｙテクノロジー（インビトロジェン社）によって構築した。ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５の細胞外ドメイン（アクセッション番号Ｑ６ＺＭＣ９、１−２６０）をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅し、ｐＤＮＯＲ２２１ (インビトロジェン社）に対するエントリークローンを構築した。次にこのエントリークローンとヒトＦｃ配列をコードするＤＮＡを含有するデスティネーションベクターとの間でＬＲ反応を行った。こうして構築したプラスミド中のヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−ＦｃのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列解析によって確認した。可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐｈＩｇＦｃの発現ベクターを含有するＨＥＫ  ２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ内で、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃは一過的に発現した。可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃを発現するＨＥＫ  ２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ細胞の培養液１．５ＬをＳｔｅｒｉｖｅｘ−ＧＶフィルター（ミリポア社）でろ過し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ、インビトロジェン社製）で予め平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（アマシャムバイオサイエンス社）にろ液をかけた。ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃを０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出し、１ＭのＴｒｉｓで中和した。ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ画分を２．５ｍｌ分取して、５０ｍＭ塩酸アルギニンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０、Ａ−ＰＢＳ）で平衡化しておいたＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャムバイオサイエンス社）にかけ、Ａ−ＰＢＳで溶出して、溶媒をＡ−ＰＢＳに置換したサンプル３．５ｍＬを得た。以上の操作で調製したサンプルは、使用するまで−８０℃で凍結保存した。
【０１１５】
可溶型マウスＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐｈＩｇＦｃ用の発現ベクターを、Ｇａｔｅｗａｙテクノロジー（インビトロジェン社）によって構築した。マウスＳｉｇｌｅｃ−１５の細胞外ドメイン（アクセッション番号ＮＰ＿００１０９４５０８、１−２５８）をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅し、ｐＤＮＯＲ２２１ (インビトロジェン社）に対するエントリークローンを構築した。次に、このエントリークローンとヒトＦｃ配列をコードするＤＮＡを含有するデスティネーションベクターとの間でＬＲ反応を行った。こうして構築したプラスミド中のマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−ＦｃのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列解析で確認した。可溶型マウスＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐｈＩｇＦｃの発現ベクターを含有するＨＥＫ  ２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭにおいて、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃは一過的に発現した。マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃを発現するＨＥＫ  ２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ細胞の培養液１．８ＬをＳｔｅｒｉｖｅｘ−ＧＶフィルター（ミリポア社）でろ過し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ、インビトロジェン社）で予め平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（アマシャムバイオサイエンス社）にろ液をかけた。０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）でマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃを溶出して１ＭのＴｒｉｓで中和した。回収したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ画分を、メンブレンを用いた遠心濃縮器Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（ミリポア社）で２．５ｍｌまで濃縮した。緩衝液を、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０を加えたＯｔｓｕｋａ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｌｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（大塚製薬）と交換した。このサンプルは、使用するまで−８０℃で凍結保存した。
ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤライブラリー由来の抗体作製
Ａ．ファージディスプレイライブラリー
治療用の抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５抗体を作製する目的で、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤファージディスプレイライブラリーを用いたセレクションを行った。ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）はＨｕＣＡＬ（登録商標）コンセプトに基づくＦａｂライブラリーであり（Ｋｎａｐｐｉｋら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００年）、第２９６巻、ｐ．５７−８６；Ｋｒｅｂｓら著、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１年）、第２５４巻, ｐ．６７−８４；Ｒｏｔｈｅら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００８年）、第３７６巻、第４号、ｐ．１１８２−２００）、６種類のＣＤＲが何れも多様化（diversification）しており、ＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭ法を用いてＦａｂ断片をファージ表面に連結している（ＷＯ０１/０５９５０）。
Ｂ．ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）を用いたパニング
ＭＯＲ０９０１２、ＭＯＲ０８６５６、及びＭＯＲ０８６６２を以下のように単離した。セレクションには、２９３ｆｅｃｔｉｎ（インビトロジェン社）を用い、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５又はプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）／マウスＳｉｇｌｅｃ−１５で形質転換したＨＥＫ  ２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ細胞を用いてＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）抗体ライブラリーに対して生細胞パニングを行った後、ｐＨ溶出し、Ｓｉｇｌｅｃ−１５陰性のＨＥＫ  ２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ細胞を用いたポスト吸着（post-adsorption）ステップを行って無関係な抗体ファージを除去した。最後に残った抗体ファージを用いて大腸菌細胞を形質転換し、寒天プレートに播種して一晩インキュベートした。翌日にプレートからバクテリアのコロニーをかき取り、ファージを回収して増幅した。９６穴Ｍａｘｉ−ｓｏｒｐプレート（ヌンク社、透明）上のヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社, カタログ番号１０９−００５−０９８）でキャプチャーした組み換え体ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃを用いて、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）抗体ライブラリーのキャプチャーパニングを行った。ヒトＦｃ及びヤギＩｇＧのバインダーを除去するために、ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号００９−０００−００３）及びヤギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号００５−０００−００３）の両方をセレクション溶液に添加した。Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ及びＰＢＳで洗浄した後、結合したファージを溶出した。溶出したファージで対数増殖期中期の大腸菌細胞を形質転換し、グルコース及びクロラムフェニコールを添加したＬＢ（ＬＢ−ＣＧ）寒天に播種した。一晩インキュベートした後、コロニーをかき取り、１５％グリセロールを添加したＬＢ−ＣＧ中で保存した。
【０１１６】
ＭＯＲ０９２８１の単離は以下の通り行った。改善した親和性を持つＦａｂを得るためには、固相Ｆｃキャプチャー及びディファレンシャル生細胞パニング（differential whole cell pannings）で得られたファージを用いてＬＣＤＲ３の多様化を行った後、さらにセレクション・ラウンド（selection rounds）を行った。全パニング法の産物を、組み換え体ヒトＳｉｇｌｅｃ１５−ｈＦｃを用いたＥＬＩＳＡで１次スクリーニングした。陽性クローンについては、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳで２次スクリーニングを行った。セレクションされたクローンをまとめ、精製した。
Ｃ．大腸菌によるＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂ抗体のミクロスケール発現（micro expression）
ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ２３＿ＦａｂがコードするＦａｂ断片の大腸菌によるミクロスケール発現は、丸底９６穴培養プレート（コーニング社）上で行った。大腸菌コロニーを培地に植菌した。培養液が僅かに濁るまで培養プレートをインキュベートした。次に、追加の培地を添加した。培養プレートをさらに一晩インキュベートした。翌日に、リゾチーム（Ｒｏｃｈｅ社）２．５ｍｇ／ｍｌを添加したＢＥＬ緩衝液（プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社、カタログ番号１１８７３５８０００１））を培養プレートの各ウェルに添加し、培養プレートを振とうした。大腸菌を溶菌した後、スキムミルク／ＴＢＳ (Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）溶液を添加し、培養プレートをさらに振とうした。調製された大腸菌溶菌液を用いて、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５バインダーのＥＬＩＳＡスクリーニングを行った。
Ｄ．Ｓｉｇｌｅｃ−１５バインダーのＥＬＩＳＡスクリーニング
９６穴ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭマイクロタイタープレート（ヌンク社）のウェルを、１．２５μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号１０９−００５−０９８）で一晩コーティングした。翌日にＰＢＳで洗浄後、マイクロタイタープレートをスキムミルク／ＰＢＳでブロッキングした。ＰＢＳで洗浄後、１μｇ／ｍｌの組み換え体ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃをマイクロタイタープレートに添加した。ウェルをＴｗｅｅｎ−２０／Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社、（ＴＢＳＴ））で３回洗浄した後、上記の大腸菌溶菌液を添加した。プレートを緩やかに振とうした後、ＴＢＳＴで洗浄した。次に、アルカリフォスファターゼを結合した抗ヒトＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号１０９−０３５−０９７）をＴＢＳＴで希釈し、プレートに添加した。プレートを緩やかに振とうした後、ＴＢＳＴで洗浄した。Ａｔｔｏｐｈｏｓ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｅｔ（Ｒｏｃｈｅ社）によって結合を検出し、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５）を用いて蛍光（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４４０ｎｍ、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：５５０ｎｍ）を測定した。
【実施例２】
【０１１７】
ＨｕＣＡＬ（登録商標）ＩｇＧ２の構築、発現、及び精製
Ａ．ＩｇＧ２への変換
全長ＩｇＧを発現するために、ｐＭＯＲＰＨｘ（登録商標）９  Ｆａｂ発現ベクター中の重鎖可変ドメイン断片（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン断片（ＶＬ）を、適当なヒトＩｇＧ２用ｐＭＯＰＲＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇベクターにサブクローニングした。ＶＨドメイン断片をｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿ＩｇＧ２にサブクローニングするには制限酵素ＭｆｅＩ及びＢｌｐＩを用い、ＶＬドメイン断片をｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿ＩｇκにサブクローニングするにはＥｃｏＲＶ及びＢｓｉＷＩを用い、ＶＬドメイン断片をｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇλ２にサブクローニングするにはＥｃｏＲＶ及びＨｐａＩを用いた。ライゲーション、形質転換、及びＤＮＡ調製を行った後に得られたＩｇＧ発現プラスミドを、制限酵素解析及びシーケンシングで確認した。
Ｂ．ヒトＩｇＧ２の一過性発現及び精製
ＨＫＢ１１真核細胞を等量のＩｇＧ重鎖及び軽鎖発現ベクター（ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２）で形質転換した。細胞培養上清の回収を通常は形質転換後３〜７日目に行った。滅菌ろ過後、溶液を標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳＵＲＥ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にかけた。特に断りのない限り、１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２、インビトロジェン社）又はクエン酸緩衝液（１００ｍＭクエン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）で緩衝液交換し、サンプルを滅菌ろ過した（孔径０．２μｍ）。蛋白質濃度をＵＶ分光光度法で測定した。変性条件、還元条件、非還元条件のＳＤＳ-ＰＡＧＥ、又はＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを用いた非変性条件のＨＰ-ＳＥＣで、ＩｇＧの純度を分析した。
【実施例３】
【０１１８】
スクリーニング及び抗体の解析
Ａ．Ｓｉｇｌｅｃ−１５−ＦＣを用いたキャプチャーＥＬＩＳＡ
３８４穴ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭマイクロタイタープレートのウェルをヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ社、カタログ番号１０９−００５−０９８、ＰＢＳで１：１，０００希釈したもの）でコーティングした。翌日にマイクロタイタープレート振とう機上でウェルを洗浄し、ＭＰＢＳＴでブロッキングした。ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、組み換え体ヒト又はマウスＳｉｇｌｅｃ１５-ヒトＦｃ融合蛋白質を添加した。インキュベート後、プレブロッキングしたＢＥＬ  ｅｘｔｒａｃｔ（調製については実施例１Ｃ参照）又は精製Ｆａｂ／ＩｇＧを添加した。マイクロタイタープレート振とう機上でプレートをインキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄した。
【０１１９】
Ｆａｂが結合した抗原を検出するためには、ＰＢＳＴでプレートを洗浄し、抗Ｆａｂ-ＡＰ （Ｄｉａｎｏｖａ社、カタログ番号１０９-０５５-０９７、ＰＢＳで１：５０００希釈したもの）を添加した。
【０１２０】
インキュベート後にプレートをＴＢＳＴで洗浄し、ＡｔｔｏＰｈｏｓ（ＡｔｔｏＰｈｏｓ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｅｔ、Ｒｏｃｈｅ社＃１１６８１９８２００１、ＴＢＳで１：１０希釈したもの）を添加し、ＴＥＣＡＮマイクロタイタープレートリーダー（Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：５３５ｎｍ、Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４３０ｎｍ）で蛍光を測定した。
Ｂ．ＦＡＣＳ解析
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞 をＶｅｒｓｅｎｅ（インビトロジェン社＃１５０４００６６）で剥離して洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／３％ＦＣＳ）に再懸濁した。ＨＥＫ２９３  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ非付着細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。１×１０５〜１×１０６細胞／ウェルになるように丸底９６穴プレートに移し、３００ｇで５分間ペレット化し、希釈したＢＥＬ  ｅｘｔｒａｃｔ（実施例１Ｃ参照）又は精製抗体に再懸濁した。細胞と抗体との混合物を４℃で１時間インキュベートした。細胞を３００ｇで５分間遠心してからＦＡＣＳ緩衝液に懸濁するという洗浄を２回行った。（本研究の過程で、非形質転換細胞に抗体が結合するのを防ぐために洗浄ステップを５回に増やした。）検出抗体溶液（ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したもの）に細胞を再懸濁した。４℃で１時間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ装置で解析した。データ解析はＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて行った。陰性コントロールとしてはＭＯＲ０３２０７（抗リゾチーム）抗体を用いた。ヒト抗体はヤギ抗ヒトＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社＃１０９−１１６−０９７）を用いて検出した。
【実施例４】
【０１２１】
候補抗体の親和性増強（affinity maturation）
Ａ．親和性増強ライブラリーの作製
選択された抗体断片の親和性と生物活性とを増大させる目的で、トリヌクレオチドに基づく変異導入法（trinucleotide directed mutagenesis）（Ｖｉｒｎｅｋａｓら著、１９９４年）を用いたカセット変異導入法によって、ＣＤＲ３Ｌ及びＣＤＲＨ２領域の最適化を並行して行った。但しフレームワーク領域には変更を加えなかった。親和性増強用のクローニング前に、各親Ｆａｂ断片を、それぞれの発現ベクター（ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ９＿ＦＨ）からＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２５＿ＬＨＣにＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで移し替えた。ＣＤＲＬ３又はＣＤＲＨ２を多様化した後、得られた７種類のライブラリーに由来するライゲーション混合物を４ｍｌの大腸菌細胞（インビトロジェン社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）にエレクトロポレーションし、１種類のライブラリーにつき約１０７〜１０８個の独立コロニーを得た。このライブラリーサイズによって、ライブラリーが理論上の多様性をカバーしていることが保証された。ライブラリーの増幅は以前に報告された通り（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒら著、２００３年）行った。品質管理の目的で、シングルクローンをランダムに回収してシーケンシングを行った。
Ｂ．固相Ｆｃキャプチャーパニング
上記のように親和性増強ライブラリーから回収された１×１０１２個のファージに対して、固相Ｆｃキャプチャーパニングによるセレクションを下記のように行った。
【０１２２】
ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭプレート（Ｆ９６  ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ、ヌンク社＃４４２４０２）の適当数のウェルを３３０μｌのＦｃγ断片特異的抗ヒトＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ中）、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号１０９−００５−０９８）で一晩コーティングした。コーティングしたウェルを翌日にマイクロタイタープレート振とう機上でＰＢＳで洗浄し、ＭＰＢＳＴでブロッキングした。次にウェルをＰＢＳで洗浄し、３３０μｌの抗原溶液を加えてインキュベートした。ローテーター上で室温で２時間、ミルクパウダーとＴｗｅｅｎ２０と０．１ｍｇ／ｍｌヤギγグロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号００９−０００−００２）とを添加したＰＢＳ溶液でファージをプレブロッキングした。セレクション工程を行うためには、ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭプレートから抗原溶液を除去し、ウェルをＰＢＳで洗浄した。プレブロッキングしたファージをそれぞれの対応するウェルに添加し、プレートをマイクロタイタープレート振とう機上でインキュベートした。インキュベート後にファージ溶液を除去し、ＰＢＳＴ及びＰＢＳでウェルを数回洗浄した。最後の洗浄ステップ後にＰＢＳを除去し、続けて溶出を行った。特異的に結合したファージを、インキュベート時間１０分、室温でＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のＤＴＴで溶出した。溶出液を用いて、対数増殖期の大腸菌ＴＧ１  Ｆ＋を形質転換した。形質転換した大腸菌をクロラムフェニコール及びグルコースを添加したＬＢ寒天プレートに播種してインキュベートした。翌日にバクテリアのコロニーをかき取り、ＹＴ培地に再懸濁した。
【０１２３】
ＣＤＲＬ３の増強パニング（maturation panning）及びＣＤＲＨ２の増強パニングにおいては、複数のセレクション・ラウンドを行った。セレクション・ラウンド毎に、抗原濃度を下げて洗浄回数と強度とを上げることでパニングのストリンジェンシーを強めた。
Ｃ．ディファレンシャル生細胞パニング（Differential Whole Cell Pannings）
ディファレンシャル生細胞マチュレーションパニング（Differential Whole Cell maturation Pannings）は、本質的に以下の通り行った。
【０１２４】
ディファレンシャル生細胞パニング（ｄＷＣＰ）は、組み換え体抗原を用いた固相Ｆｃキャプチャーパニング（実施例４Ｂを参照）及び形質転換細胞を用いた下記の生細胞パニングを改変して設計された。
【０１２５】
生細胞パニング（ＷＣＰ）は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５で一過的に形質転換したＨＥＫ２９３  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ細胞を用いて行った。このＳｉｇｌｅｃ−１５発現細胞を洗浄し、再懸濁し、プレブロッキングした。各増強ライブラリーから回収した約１×１０１２個のファージをプレブロッキングした。ブロッキング後、１×１０６個のＳｉｇｌｅｃ−１５発現細胞をペレット化し、プレブロッキングしたファージ溶液に再懸濁し、インキュベートした。次のセレクション・ラウンドでは、細胞数を減らして５×１０５個とした。洗浄ステップで非特異的ファージを除去することによりパニング工程中の洗浄ストリンジェンシーを強めた。洗浄のためには、細胞を遠心してペレット化し、再懸濁し、ローテーター上でインキュベートした。洗浄後、特異的に結合したファージを細胞から溶出した。遠心した後、細胞ペレットから上清を分離し、２ＭのＴｒｉｓ塩基（緩衝化されていないもの）でｐＨを中和した。セレクションされたファージを用いた大腸菌ＴＧ１Ｆ＋の形質転換は、固相パニングの記載と同様に行った（実施例４Ｂ参照）。セレクション・ラウンドはＦｃキャプチャーパニング又は生細胞パニングと同様に行った。
Ｄ．親抗体
ＭＯＲ０９０１２、ＭＯＲ０８６５６、及びＭＯＲ０８６６２は、それぞれＭＯＲ０９８９２、ＭＯＲ０９８９８、又はＭＯＲ１０１１０の親抗体である。親和性増強のステップを経ずにその後の分析を行う候補として、ＭＯＲ０９２８１を選択した。
【０１２６】
前記抗体のアミノ酸配列、それらをコードする核酸配列、及びそれらの構造に関する情報を、表１乃至７にまとめた。
【０１２７】
【表１】
2013543382.tif 000003
【０１２８】
【表２】
2013543382.tif 000004
【０１２９】
【表３】
2013543382.tif 000005
【０１３０】
【表４】
2013543382.tif 000006
【０１３１】
【表５】
2013543382.tif 000007
【０１３２】
【表６】
2013543382.tif 000008
【０１３３】
【表７】
2013543382.tif 000009
各抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を、表８に示す。
【０１３４】
【表８】
2013543382.tif 000010
抗体ＭＯＲ０９２８１、ＭＯＲ０９８９２、ＭＯＲ０９８９８、及びＭＯＲ１０１１０において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列は、以下に示すコンセンサス配列に従う。
【０１３５】
重鎖ＣＤＲ１のコンセンサス配列は、
Ｘ１ＹＸ２ＭＸ３  （配列番号７１）
である（Ｘ１はＮ又はＳであり、Ｘ２はＷ又はＡであり、Ｘ３はＳ、Ｈ、Ｔ、又はＮである）。
【０１３６】
重鎖ＣＤＲ２のコンセンサス配列は、
Ｘ４ＩＳＹＳＸ５ＳＸ６ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ  （配列番号７２）
である（Ｘ４はＬ、Ｙ、又はＦであり、Ｘ５はＳ又はＧであり、Ｘ６はＴ又はＮである）。
【０１３７】
軽鎖ＣＤＲ１のコンセンサス配列は、
ＳＧＤＸ７ＬＸ８Ｘ９Ｘ１０ＹＸ１１Ｘ１２  （配列番号７３）
である（Ｘ７はＮ又はＡであり、Ｘ８はＧ、Ｐ、又はＲであり、Ｘ９はＳ又はＮであり、Ｘ１０はＹ、Ｒ、又はＫであり、Ｘ１１はＡ又はＶであり、Ｘ１２はＹ、Ｈ、又はＳである）。
【０１３８】
軽鎖ＣＤＲ２のコンセンサス配列は、
Ｘ１３Ｘ１４ＮＸ１５ＲＰＳ  （配列番号７４）
である（Ｘ１３はＧ又はＤであり、Ｘ１４はＴ又はＤであり、Ｘ１５はＮ、Ｄ、又はＫである）。
【実施例５】
【０１３９】
結合活性分析
Ａ．ＥＬＩＳＡによる結合活性分析
９６穴Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ  ａｍｉｎｏプレート（ヌンク社）のウェルに１μｇ／ｍｌの組み換え体ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ、又はヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、＃００９-０００-００８）を０．１ｍＬ添加し、一晩４℃に置いた。 翌日に０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄後、室温で１．５時間、５％ＢＳＡ／ＰＢＳでプレートをブロッキングした。ＰＢＳＴで洗浄後、プレートに１μｇ／ｍｌの抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体（ＭＯＲ０９２８１、ＭＯＲ０９８９２、ＭＯＲ０９８９８、ＭＯＲ１０１１０、ＭＯＲ０９０１２、ＭＯＲ０８６５６、ＭＯＲ０８６６２）及びヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号００９−０００−００３、陰性コントロールとして使用）を０．１ｍＬ添加し、室温で１時間置いた。ＰＢＳＴで洗浄後、ペルオキシダーゼを結合した抗ヒトＦａｂ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号１１２−０３５−０９７）をＰＢＳＴで５,０００倍希釈したものをプレートに０．１ｍＬ添加し、プレートを室温に１．５時間置いた。ＰＢＳＴで洗浄後、ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ  ＡＢＴＳ  Ｋｉｔ  （ナカライテスク社、カタログ番号０２８９３−６０）を用いて結合を検出した。反応時間は４分であった。プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５）を用いて、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡの結果を図１に示す。ＭＯＲ０９２８１、ＭＯＲ０９８９２、ＭＯＲ０９８９８、ＭＯＲ１０１１０、ＭＯＲ０９０１２、ＭＯＲ０８６５６、及びＭＯＲ０８６６２は、組み換え体ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−ＦｃにもマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃにも結合したが、ヒトＦｃには結合しないことが示された。
【実施例６】
【０１４０】
バイオアッセイ
Ａ．マウス破骨細胞形成試験
Ａ-１．マウス骨髄非付着細胞の調製
５〜８週齢の雄ｄｄＹマウスより大腿骨と脛骨を摘出し、軟組織を除去した。この大腿骨あるいは脛骨の両端を切り落とし、２３ゲージの注射針付きシリンジによりＤ−ＰＢＳを注入して骨髄細胞を押し出した。室温で１,０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を捨てた。細胞のペレットに１ｍｌのｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、シグマ社製）を加えて懸濁し、得られた懸濁液を室温で５分間放置した。１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＭＥＭ−α培地（インビトロジェン社製）２０ｍｌを加え、懸濁液を室温で１,０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を捨てた。細胞のペレットに５ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）と１０％のＦＢＳとを含有するＭＥＭ−α培地１０ｍｌを加えて懸濁した。次いで、得られた懸濁液をセルストレイナー（４０μｍ  Ｎｙｌｏｎ、ＢＤファルコン社製）に通して凝集物を除いた。この細胞を７５ｃｍ２−Ｔフラスコ（付着細胞用）に移して、ＣＯ２インキュベーター中で１晩培養した。１晩培養後、Ｔ−フラスコに付着していない細胞を回収して、マウス骨髄非付着細胞として使用した。
Ａ−２．マウス骨髄非付着細胞から破骨細胞への分化に抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が及ぼす影響（ＲＡＮＫＬによる刺激）
実施例１及び４において調製した抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の影響を、マウス骨髄非付着細胞を用いた破骨細胞分化試験によって評価した。実施例６Ａ−１の上記方法によって調製したマウス骨髄非付着細胞を１０％のＦＢＳと１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦとを含むα−ＭＥＭ培地で１．５×１０５細胞／ｍｌに調製したものを、９６穴プレートの各ウェルに２００μｌ播種して、ＣＯ２インキュベーター中で２日間培養した。９６穴プレート中の古い培養液を除去して、ヒトＲＡＮＫＬ（ＲＡＮＫＬ、ぺプロテック社製）を終濃度２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍ−ＣＳＦを１０ｎｇ／ｍｌになるように添加した１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ−α培地１００μｌを各ウェルに添加した。この細胞培養液に、各抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体（ＭＯＲ０９２８１、ＭＯＲ０９０１２、ＭＯＲ０９８９２、ＭＯＲ０８６５６、ＭＯＲ０９８９８、ＭＯＲ０８６６２、及びＭＯＲ１０１１０）を３〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度になるように添加して、更に３日間ＣＯ２インキュベーター中で培養した。培養終了後に、形成された破骨細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を次の方法で測定した。９６穴プレートの各ウェルの培地を吸引除去して、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）５０μｌを各ウェルに加えた。次にプレートをプレート振とう機で５分間振とうして細胞を溶解した。これらの各ウェルに基質溶液（５ｍｇ／ｍｌのｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ及び０．４６％の酒石酸ナトリウムを含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１））５０μｌを加えてプレートを室温で１０分間インキュベートした。インキュベート後に９６穴プレートの各ウェルに１Ｎ水酸化ナトリウム溶液５０μｌを加えて酵素反応を停止した。酵素反応停止後に各ウェルの４０５ｎｍの吸光度を測定してＴＲＡＰ活性の指標にした。結果を図２乃至８に示す。ＭＯＲ０９０１２（ＭＯＲ０９８９２の親抗体）、ＭＯＲ０８６５６（ＭＯＲ０９８９８の親抗体）、及びＭＯＲ０８６６２（ＭＯＲ１０１１０の親抗体）については、有意なＴＲＡＰ活性の抑制は認められなかった。一方、ＭＯＲ０９２８１、ＭＯＲ０９８９２、ＭＯＲ０９８９８、及びＭＯＲ１０１１０については、１３ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で用量依存的なＴＲＡＰ活性の抑制が有意に認められた。この結果より、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体（ＭＯＲ０９２８１、ＭＯＲ０９８９２、ＭＯＲ０９８９８、及びＭＯＲ１０１１０）は破骨細胞の形成（破骨細胞の分化と成熟）を抑制する活性を有することが示された。また、親抗体（ＭＯＲ０９０１２、ＭＯＲ０８６５６、及びＭＯＲ０８６６２）を親和性増強することによって、破骨細胞形成の抑制活性がより高い抗体（それぞれＭＯＲ０９８９２、ＭＯＲ０９８９８、及びＭＯＲ１０１１０）が得られたことが示された。
Ｂ．ヒト破骨細胞を用いたＯｓｔｅｏＬｙｓｅ  Ａｓｓａｙ
Ｂ）ヒト型抗ヒト Ｓｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体添加が正常ヒト破骨前駆細胞の骨吸収活性に及ぼす影響（コラーゲンコートプレートを用いた評価）
破骨細胞はカテプシンＫなどのプロテアーゼを放出して、骨組織の構成成分であるＩ型コラーゲンを分解することが知られている。ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社製、カタログ番号ＰＡ−１５００）は、ユーロピウムが結合したヒトコラーゲンをコーティングした９６穴プレート（９６−ｗｅｌｌ  ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）を提供しており、同プレート上で破骨細胞を培養した際に上清に遊離される蛍光コラーゲン断片量を測定することにより、破骨細胞の骨吸収活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することが可能である。
【０１４１】
正常ヒト破骨前駆細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｃｅｌｌｓ、三光純薬より購入、カタログ番号２Ｔ−１１０）を、細胞に添付のプロトコールに従い９６−ｗｅｌｌ  ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅに１×１０４細胞／ウェルとなるように播種した。なお培地は、ウシ胎児血清（終濃度１０％）、ヒトＲＡＮＫＬ（終濃度１０又は２０ｎｇ／ｍｌ）、及びヒトＭ−ＣＳＦ（終濃度３３ｎｇ／ｍｌ）等を含むＯＰＧＭ添加因子セット（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔＴＭ  Ｋｉｔ、三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−９５０１）を添加した破骨前駆細胞用基礎培地（ＯＰＢＭ、三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−８２０１）を用いた。この培養上清中に、実施例１及び４で調製したヒト型抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（ＭＯＲ０９２８１、０９０１２、０９８９２、０８６５６、０９８９８、０８６６２、及び１０１１０）を終濃度４、２０、１００、又は５００ｎｇ／ｍｌとなるように添加して、ＣＯ２インキュベーター中で４又は５日間培養した。培養上清１０μｌを採取し、ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔを２００μｌ添加して、時間分解蛍光光度計（ＡＬＶＯ  ＭＸ、パーキンエルマー社製、Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：３４０ｎｍ、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：６１５ｎｍ）を用いて蛍光強度（ＲＦＵ）を測定することにより、培養上清中に放出された遊離蛍光コラーゲン断片量を定量した。結果を図９乃至１３に示す。その結果、ＲＡＮＫＬ添加により増加する蛍光コラーゲン断片量が、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体によって、４ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌの範囲で濃度依存的に減少した。重要な発見は、親和性が改善された抗体（ＭＯＲ０９８９２、０９８９８、及び１０１１０）がそれぞれの親抗体（ＭＯＲ０９０１２, ０８６５６、及び０８６６２）よりも低濃度で骨吸収活性を抑制したことである。このことから、抗体の結合親和性を改善することによって生物活性の改善ももたらされることが示唆される。
【実施例７】
【０１４２】
その他の抗体の調製とアッセイ
Ａ．抗体の調製
ＭＯＲ０９２８１を得た実施例１と同様にしてＭＯＲ０９２６８を調製し、実施例２に従ってＩｇＧ２に変換した。ＭＯＲ０９２６８は、ＭＯＲ１２５７４、ＭＯＲ１３１５４、及びＭＯＲ１３１５６の親抗体である。これらの３つの抗体を作製するための親和性増強は、実施例４に記載のプロトコールに従って行った。
【０１４３】
前記抗体のアミノ酸配列、それらをコードする核酸配列、及びそれらの構造に関する情報を、表９乃至１２にまとめた。
【０１４４】
【表９】
2013543382.tif 000011
【０１４５】
【表１０】
2013543382.tif 000012
【０１４６】
【表１１】
2013543382.tif 000013
【０１４７】
【表１２】
2013543382.tif 000014
前記各抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を、表１３に示す。
【０１４８】
【表１３】
2013543382.tif 000015
抗体ＭＯＲ０９２８１、ＭＯＲ０９８９２、ＭＯＲ０９８９８、ＭＯＲ１０１１０、ＭＯＲ０９２６８、ＭＯＲ１２５７４、ＭＯＲ１３１５４、及びＭＯＲ１３１５６において、重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２並びに軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、以下のコンセンサス配列に従う。
【０１４９】
重鎖ＣＤＲ１のコンセンサス配列は、
Ｘ１６ＹＸ１７ＭＸ１８  （配列番号１０６）
である（Ｘ１６はＮ、Ｓ、又はＴであり、Ｘ１７はＷ又はＡであり、Ｘ１８はＳ、Ｈ、Ｔ、又はＮである）。
【０１５０】
重鎖ＣＤＲ２のコンセンサス配列は、
Ｘ１９ＩＸ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７ＴＸ２８ＹＡＸ２９Ｘ３０ＶＫＧ  （配列番号１０７）
である（Ｘ１９はＬ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、又はＴであり、Ｘ２０はＳ、Ａ、Ｆ、又はＥであり、Ｘ２１はＹ、Ｇ、又はＩであり、Ｘ２２はＫ又はアミノ酸無しであり、Ｘ２３はＥ又はアミノ酸無しであり、Ｘ２４はＳ又はＡであり、Ｘ２５はＳ又はＧであり、Ｘ２６はＳ又はＹであり、Ｘ２７はＴ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、又はＡであり、Ｘ２８はＹ又はＮであり、Ｘ２９はＤ又はＡであり、Ｘ３０はＳ又はＧである）。
【０１５１】
軽鎖ＣＤＲ２のコンセンサス配列は、
Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４ＲＰＳ  （配列番号１０８）
である（Ｘ３１はＧ、Ｄ、又はＹであり、Ｘ３２はＴ、Ｄ、又はＶであり、Ｘ３３はＮ又はＴであり、Ｘ３４はＮ、Ｄ、又はＫである）。
【０１５２】
抗体ＭＯＲ１２５７４、ＭＯＲ１３１５４、及びＭＯＲ１３１５６は、いずれも同じ軽鎖ＣＤＲ１配列の、
ＴＧＴＳＳＤＶＧＤＹＮＹＶＳ  （配列番号８３）
を持つ。
【０１５３】
抗体ＭＯＲ１２５７４、ＭＯＲ１３１５４、及びＭＯＲ１３１５６は、いずれも同じ軽鎖ＣＤＲ２配列の、
ＹＶＴＮＲＰＳ  （配列番号８９）
を持つ。
【０１５４】
抗体ＭＯＲ１２５７４、ＭＯＲ１３１５４、及びＭＯＲ１３１５６は、いずれも同じ重鎖ＣＤＲ３配列の、
ＲＧＰＧＭＧＮＭＤＩ  （配列番号８０）
を持つ。
【０１５５】
抗体ＭＯＲ１２５７４、ＭＯＲ１３１５４、及びＭＯＲ１３１５６において、軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は下記のコンセンサス配列に従う。
【０１５６】
ＱＳＹＡＸ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１Ｖ  （配列番号１０９）
（Ｘ３５はＰ又はＧであり、Ｘ３６はＬ又はＡであり、Ｘ３７はＳ又はＰであり、Ｘ３８はＳ又はＦであり、Ｘ３９はＳ又はＮであり、Ｘ４０はＨ又はアミノ酸無しであり、Ｘ４１はＩ又はＬである）
Ｂ．ヒト破骨細胞を用いたＯｓｔｅｏＬｙｓｅ  Ａｓｓａｙ
ヒト型抗ヒト Ｓｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体が正常ヒト破骨前駆細胞の骨吸収活性に及ぼす影響（コラーゲンコートプレートを用いた評価）
正常ヒト破骨前駆細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｃｅｌｌｓ、三光純薬より購入、カタログ番号２Ｔ−１１０）を、細胞に添付のプロトコールに従い９６−ｗｅｌｌ  ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ（Ｌｏｎｚａ社、カタログ番号ＰＡ−１５００）に１×１０４細胞／ウェルとなるように播種した。なお培地は、ウシ胎児血清（終濃度１０％）、ヒトＲＡＮＫＬ（終濃度１０又は２０ｎｇ／ｍｌ）、及びヒトＭ−ＣＳＦ（終濃度３３ｎｇ／ｍｌ）等を含むＯＰＧＭ添加因子セット（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔＴＭ  Ｋｉｔ、三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−９５０１）を添加した破骨前駆細胞用基礎培地（ＯＰＢＭ、三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−８２０１）を用いた。この培養上清にＭＯＲ０９２６８を終濃度３又は３０μｇ／ｍｌとなるように添加し、ＣＯ２インキュベーター中で６日間培養した。同様に、ＭＯＲ１２５７４、ＭＯＲ１３１５４、又はＭＯＲ１３１５６を終濃度４、２０、１００、又は５００ｎｇ／ｍｌとなるように培養上清に添加して、ＣＯ２インキュベーター中で５日間培養した。培養上清１０μｌを採取し、ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔを２００μｌ添加した。時間分解蛍光光度計（ＡＬＶＯ  ＭＸ、パーキンエルマー社製、Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：３４０ｎｍ、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：６１５ｎｍ）を用いて蛍光強度（ＲＦＵ）を測定することにより、培養上清中に放出された遊離蛍光コラーゲン断片量を定量した。ＭＯＲ０９２６８、ＭＯＲ１２５７４、ＭＯＲ１３１５４、及びＭＯＲ１３１５６の結果を、それぞれ図４２、４３、４４、及び４５に示す。図４２乃至４５に示すように、ＲＡＮＫＬ添加により増加する蛍光コラーゲン断片数が、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体によって濃度依存的に減少した。
【実施例８】
【０１５７】
卵巣摘出ラットを用いた抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体の生物活性評価
Ａ．動物実験のプロトコール
１２週齢雌性Ｆ３４４ラット（日本チャールス・リバー社より入手）に両側卵巣摘除を施術し、溶媒投与群及び抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体投与群の２群に分ける。また偽手術群についても１群設定する。抗体投与群については、実施例２又は７の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体を、各１ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内に週３回、手術翌日から４週間反復投与する。溶媒投与群及び偽手術群には、溶媒として０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳを腹腔内に投与する。投与開始４週後に絶食下で２４時間採尿を行い、尿検体は測定まで−８０℃で保存する。採尿終了後にラットを安楽死させ、各ラットから腰椎を摘出する。
Ｂ．腰椎骨密度の測定
摘出した腰椎に付着している軟組織を除去し、第４〜６腰椎を切り出す。エタノール中で振とう後に風乾することにより得られた腰椎を脱脂及び脱水し、骨密度測定装置（ＤＣＳ−６００ＥＸ、アロカ社製）を用いて骨密度を測定する。偽手術群に対し、卵巣摘除群では有意な腰椎骨密度の減少が認められ、抗体投与群では卵巣摘除による骨密度の減少が有意に抑制されるであろう。
Ｃ．尿中デオキシピリジノリン排泄量の測定
Ｉ型コラーゲン架橋の各種代謝産物は骨の代謝回転、特に骨吸収を鋭敏に反映する。なかでもデオキシピリジノリンは主として骨のコラーゲンに局在することから、骨吸収の指標として信頼性が高いとされている。
【０１５８】
凍結保存していた尿検体を融解し、遠心操作により不溶物質を沈殿させて上清を得る。この上清中に含まれるデオキシピリジノリン量を、オステオリンクス「ＤＰＤ」（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いて測定する。また、クレアチニン−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて上清中のクレアチニン含量も測定し、クレアチニン補正を行ったデオキシピリジノリン量を算出する。偽手術群に対し、卵巣摘除群では尿中デオキシピリジノリン排泄量が有意に増加し、卵巣摘除ラットでは破骨細胞による骨吸収が亢進していることが示唆されるであろう。一方、抗体投与群では、卵巣摘除によるデオキシピリジノリン排泄量の増加が抑制されるであろう。この結果から、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合するモノクローナル抗体が破骨細胞の骨吸収を抑制することが動物モデルでも確認され、この骨吸収抑制作用により卵巣摘除ラットの腰椎骨密度減少が抑制されることが強く示唆されるであろう。
【産業上の利用可能性】
【０１５９】
本発明の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は破骨細胞の分化又は骨吸収活性の抑制能を有し、該抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を含む医薬組成物は骨代謝異常疾患の治療又は予防薬となり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013543382.tif 000075
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