(57)【要約】  本発明は、生物学的、生化学的、物理学的、生物物理学的および化学的分析において用いられる粒子の位置的自由度の検出のための方法および装置に関する。特に、本発明は、粒子／細胞の集団を、それらの検出された移動度に基づいて検出し、特徴づけることができる方法および装置に関する。本発明による一実施形態において、ある種の細胞の検出は、基板に結合した細胞の集団とより弱い結合力を示すものとにおいて検出された差異に基づく。最初に、細胞を基板上に沈降させ、引力、自然の熱力学的圧力変動および他のランダムまたは印加力の存在下で、粒子のうちの幾つかは並進移動を示し得る。本発明の方法および装置により、粒子移動を検出し、測定値を計算して、特異的な分析物の結合を決定する。
2013533469.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中における粒子と表面との間の結合度を測定する方法であって、
撮像装置を用いて前記粒子が相互作用する少なくとも１つの捕捉表面領域を有する試料チャンバを含む試料ホルダ内の流体中の複数の粒子を撮像すること；及び
前記少なくとも１つの捕捉表面領域への前記粒子の結合度の指標として、前記粒子の少なくとも一部についての位置的自由度を測定すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記複数の粒子を、前記撮像装置の照明光源からの照明の下で前記試料チャンバ内における前記流体中に懸濁させること、を更に含み、前記試料ホルダが流通機器の一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記流体中の前記粒子に活性化手段を適用することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記活性化手段を用いて前記位置的自由度の測定中に前記試料チャンバ内で前記流体を移動させることを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
重力系システム、遠心系システム、流通系システム、拡散系システム、磁気系システムまたはホログラフィー光学的ツィージングシステム（ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｗｅｅｚｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）のうちの１つにより、前記試料チャンバ内で前記粒子を沈降させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの捕捉表面領域が、複合体を形成し得るプローブと結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
分析物の有無または量を決定するために、前記プロセッサを用いて、前記粒子の各々の位置的自由度を決定すること、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記撮像装置が、ホログラフィー撮像装置を含む、光学顕微鏡装置である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記光学顕微鏡装置からのカメラを用いて前記粒子の画像の時系列を得て前記位置的自由度を決定すること；及び
前記プロセッサを用いて前記画像を分析すること、
を更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記位置的自由度の前記決定が、前記プロセッサを用いて、所定の時間、前記少なくとも１つの捕捉表面領域の所定の近傍内における前記粒子のうちの少なくとも１つから散乱する光の変化を測定することによって実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記位置的自由度は、前記所定の近傍内における前記粒子のうちの前記少なくとも１つの時間依存的位置的変化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を記載する統計的尺度であり、分散、標準偏差、二乗平均平方根（ＲＭＳ）移動、または観測結果の時系列に関連づけられた粒子位置の自己相関関数として表される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの捕捉表面領域の前記近傍は、動きが観測される前記粒子のうちの既知の１個の位置の周囲の所定の境界である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記位置的自由度が、前記プロセッサを用いて、前記粒子の多数の取得画像の平均を計算すること、前記粒子の連続画像フレームの間の平均差を計算すること、及び前記画像の時系列を通じて強度のピクセル的な変化を計算すること、によって決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ピクセル強度値の統計分布の分析が、前記粒子の各々について、前記プロセッサを用いて算出され、そこから位置的自由度の分布と前記粒子の各々の結合度の分布とが得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロセッサを用いて前記粒子の位置的自由度の分布を計算すること
を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記粒子が血液細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記血液細胞が赤血球であり、前記赤血球のオモテ試験（ｆｏｒｗａｒｄ  ｔｙｐｉｎｇ）が実施され、前記赤血球が、特異的抗体を含有する捕捉表面領域に結合する特異的抗原を含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記血液細胞が赤血球であり、血漿または血清試料のひとつのウラ試験（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）が実施され、前記赤血球が、前記捕捉表面領域上に配置された赤血球の抗原に結合する標的抗体に結合し得る特異的血液型抗原を含有するか、または欠いている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記粒子が平坦化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記粒子が分析物であり、前記分析物は検出されたまたは指標である抗体のうちの１つである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
抗体スクリーニングを実施する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
感染症スクリーニングを実施する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
分子のライブラリのスクリーニングを実施する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
顕微鏡を含む撮像装置；
粒子の試料が配置される、試料チャンバを有する透明試料ホルダ；および
前記撮像装置を用いて、前記試料チャンバ内に配置された前記粒子の位置的自由度を検出するための手段、
を含む、粒子の位置的自由度を検出するための装置。
【請求項２５】
前記試料ホルダが、入口と出口とを有する自動流通機器の試料チャンバである、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記試料ホルダが、前記試料ホルダ上に配置された少なくとも１つの捕捉表面領域を含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項２７】
前記検出アレイ（ｓｅｎｓｉｎｇ  ａｒｒａｙ）が、前記試料ホルダの下側表面に結合しており、特定の用途のための適切な化学処理を受けている、請求項２４に記載の装置。
【請求項２８】
前記試料ホルダが、ウェルプレートの一部を形成し、前記試料ホルダが、前記試料チャンバのためにその中心内に開口部を有し；
基板が、前記試料ホルダの下側表面に結合しており；および
前記基板が、特定の用途のための適切な化学処理を受けている、
請求項２４に記載の装置。
【請求項２９】
前記自動流通機器が、光学的に透明なキャップ、試料搬送領域、試料観察領域、封止ガスケットおよびオーバフローリザーバのうちの少なくとも１つを含む、カスタマイズされた構成を有する、請求項２５に記載の装置。
【請求項３０】
前記粒子が赤血球である、請求項２４に記載の装置。
【請求項３１】
前記自動流通機器がマイクロ流体カートリッジであり、前記試料チャンバが、
前記入口および前記出口のための２つの開口部を有する上層；
その上にチャネルのパターンを有し、前記上層に結合する底層；および
その上に適切な化学的特徴を有し、前記底層の下側表面に結合している基板、
を含み；
前記底層の前記チャネルが前記試料チャンバ内に入り；
前記試料を有する流体が、前記試料チャンバ内に前記入口を通って入り、そして前記出口を通る、
請求項２５に記載の装置。
【請求項３２】
前記マイクロ流体カートリッジが、結合のための捕捉表面領域として官能化されている前記基板上の複数の領域を含む、請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
前記マイクロ流体カートリッジがデータ取得および分析に対応している、請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
前記マイクロ流体カートリッジが、前記試料の自動化されかつ並列化可能な流体搬送のためのロボット機械と一体化される、請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
相対的に高い圧力源および相対的に低い圧力源を含むポンプ；および
所定の振動数または所定の速度のうちの１つで、前記試料チャンバ内の前記試料に一連の流れのうち少なくとも１つを生成する少なくとも１つのソレノイドバルブと、
を更に含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項３６】
所定の振動数および振幅で前記粒子に振動性流れを生成する圧電性油圧アクチュエータ
を更に含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項３７】
油圧油またはガス状媒体の１つによって活性化されるダイヤフラム膜
を更に含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項３８】
制御シグナルをその振動性運動に変換する前記アクチュエータに付着した移動ステージインサート、を更に含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項３９】
前記試料内における前記粒子を、前記マイクロ流体カートリッジを通って流すバルブ開閉／摂動機器を更に含み、前記マイクロ流体カートリッジが、前記バルブ開閉／摂動機器によって駆動されるオンチップダイヤフラム膜を含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項４０】
加熱素子、ダイヤフラム膜、およびそれらの間に封止されるガス状材料を含む熱アクチュエータ、を更に含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項４１】
前記試料チャンバを通して音響波を伝播させる音響源、を更に含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項４２】
前記マイクロ流体カートリッジのウェルを横切って前記ウェルキャップを前後に摺動させるウェルキャップ活性化機構、を更に含む、請求項２８に記載の装置。
【請求項４３】
前記試料チャンバを回転させてその中に前記粒子を沈降させる遠心分離機、を更に含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項４４】
前記試料チャンバの前記表面を横切って前記試料を流す流通機構、を更に含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項４５】
前記撮像装置が、前記試料チャンバを通して前記粒子をトラップし、移動させるホログラフィー光学的ツィージングシステムである、請求項２４に記載の装置。
【請求項４６】
前記試料ホルダおよび結合粒子の温度を特定範囲内に保持する熱制御機構、を更に含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項４７】
免疫診断用使い捨てカートリッジを受け入れるための複数の領域；
複数のチューブ台のための領域；
ピペット操作ステーション；
スナップイン液カートリッジ領域；
テストを実施する照明領域；
試験結果を読み取るためのリーダ；および
前記装置を完全に自動化するための手段、
を含む、免疫診断用自動装置。
【請求項４８】
スタット濾過または非スタット濾過セクションのうちの１つ
を更に含む、請求項４７に記載の自動装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２０１０年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／３４８，０７２号および２０１０年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／３４７，９４６号の優先権を主張するものであって、それらの両方の内容は、参照により本明細書に完全に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、生物学的、生化学的、生物物理学的、物理学的および化学的分析において用いられる粒子の位置的自由度の検出のための方法および装置に関する。本発明の主要な用途として、血液型判定および感染症スクリーニングのような免疫診断が含まれる。
【背景技術】
【０００３】
マイクロプレートやバイオチップのようなフォーマットにおけるアレイ分子の使用によって、自然界について取り出される情報量をますます増加させることが可能になっている。多くの改変が知られているものの、かかるアレイの使用は、典型的には、基板にプローブまたは分析物を固定すること、及び固定された分子と他の溶液相分子との相互作用を測定するための様々な技術を使用することを含む。かかるアレイ技術の具体例としては、マイクロプレート、市販の核酸バイオチップおよびタンパク質マイクロアレイまたはバイオチップにおいて実施される免疫測定法（例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ））が挙げられる。バイオチップは、ガラス基板を最も一般的に用いるが、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートは、たいていの場合、ガンマ線照射したポリスチレンから構成される。固定された分子のパッチが相互にまたは参照特徴に対して定められた位置に配置されたという意味では、アレイは典型的には「順序よく並べられる（ｏｒｄｅｒｅｄ）」ものの、いわゆる「溶液相アレイ」も商業化されてきている。溶液相アッセイ技術によって、ビーズの懸濁液への分析物の結合が測定される。懸濁液は、結合プローブ及び対応する比率を変えた２種の蛍光識別子分子の混合物とで共標識された多数の粒子を混合することによって生成される。フローサイトメータは、識別子比率と共に結合蛍光標識分析物を検出する。
【０００４】
個々の分子の検出に加えて、（生体細胞を含む）粒子は、アレイ技術を用いて分析されてきた。例えば、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリによって細胞表面抗原を検出することは、本技術分野において公知である。Ｏｂｅｒｈａｒｄｔの米国特許第６，２５１，６１５号には、共役抗体受容体を有する複数の捕捉表面領域のうちの１つに結合した細胞を検出するために顕微鏡検査を用いて細胞をテストすることが開示されている。
【０００５】
しかし、従来のアレイの主要な限界は、所望の感度を達成するため、通常、平衡に十分に近い結合度合いに達するために長いインキュベーション時間が必要とされるということである。これは、ＥＬＩＳＡマイクロプレートまたはバイオチップにおいて、試料または試薬が、長時間、場合によっては典型的な営業日の８時間より長い間、インキュベーションされることを伴う可能性がある。かかる遅延は、更なる出費を引き起こし、緊急事態における使用を妨げ、並びに長引くインキュベーション時間中の、試薬の劣化及び非特異的（背景）シグナルの増加によってデータの品質が低下する、可能性がある。従来のアプローチの他の限界としては、労働および機器に関して更なる費用をもたらす分析物の標識化ステップ及び厳しい（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）洗浄ステップの必要性が挙げられ、それらはデータの品質に影響を及ぼす可能性がある。更に、マイクロプレート系アプローチは、相対的に大量のテスト試料および試薬を使用する。
【０００６】
従来のアレイの１つの用途は、血液型を決定するため等の免疫診断においてである。血液型判定は、ヒト赤血球（ＲＢＣ）表面上の主要表面抗原の有無の決定および／またはＲＢＣ表面抗原に特異的な臨床的に関連のある抗体の有無の決定を伴う。従来のアッセイは、対応する抗体を加えた際の赤血球（ＲＢＣ）の凝集を検出することによって血液型判定を実施する（例えば、Ｈｉｌｌｙａｒｄらの米国特許第４，８９４，３４７号参照）。血液試料の凝集は、テストされる抗原に対して陽性の結果を示す。よって、血液型判定方法は、凝集／接着を決定するために大量で（ｉｎ  ｂｕｌｋ）行われ、間接的にＲＢＣの結合を測定する。「固相」方法と呼ばれる血液型判定のための幾つかの方法は、表面上の、ある種のタンパク質またはあるタンパク質を発現する細胞の固定を含む。これらの方法は、一般にバルクフォーマット（ｉｎ  ｂｕｌｋ  ｆｏｒｍａｔ）で行われる。例えば、カメラは、赤色がウェルの中央底部部分にまたは端部に沿ってあるのかどうかを見るために単一の低解像度の画像を撮影することによって、多くのＲＢＣがウェルの壁にまたはウェルの底部にあるのかどうかを検出し得る。平衡に近い強いシグナルおよびシステムについて、多くの細胞は、十分なシグナル強度およびインキュベーション時間のための信頼できる結果を引き起こす同様の状態で（多くが底部に、または多くが壁に）見出すことが可能である。
【０００７】
異なる個人からのＲＢＣがそれらの表面に異なる抗原を有する可能性があり、ある種のＲＢＣ抗原を有するドナーからそれらの抗原を欠く患者への全血またはある種の血液成分の輸血は、患者に有害な輸血反応を引き起こす可能性があるので、血液型判定を正確に実施することを確実にすることは、極めて重要である。これは、患者が適合しないＡＢＯ血液型によって生じる可能性がある所定の抗原に対する自然免疫を有する場合、または患者が以前の曝露によって血液抗原（例えば、ＫｅｌｌまたはＤｕｆｆｙ型抗原）に免疫されている場合、一般に生じる。よって、偽性の結果の可能性は、測定感度の限界のため、もしくは時間と共に免疫された患者の血液の中の抗体濃度（力価）が減少するために検出不可能な血液細胞抗原に対する免疫が起こり得るために生じ得るか、または抗体力価および人から人への反応性の変化が起こり得るため、もしくは試薬特異性が変動する可能性があるために生じる可能性がある。
【０００８】
血液型を決定するための現在の技術は、多数の分析物について試料をテストするそれらの感度、速度および能力において限定される。例えば、従来の血液型判定方法が多くのＲＢＣが結合しなければならない（また、多くの場合、多価アタッチメントを形成することによって強く結合しなければならない）凝集またはバルク表面結合を必要とするという事実は、テストの速度および感度を限定する。更に、現行の技術は、テストのために相対的に大量の血液（例えば、約３ｍＬ）を必要とする。より少量を利用しながら血液を型に分ける能力は、とりわけ新生児に対応する際に非常に有用であろう。より少ない結合細胞及び各結合細胞についてより少ないアタッチメントを有する、より弱い結合レベルを確実に測定する能力は、感度の増加（すなわち、より高い信頼度でより低い力価のためにテストすること）、更により短い時間でテストすること、または両方を合わせた有益性を可能にするだろう。
【０００９】
感度が増加すると、患者およびドナーの血液は、より大きな信頼度で適合させることができる。速度が増加すると、血液を至急に必要とする患者に、非常により速やかに適合する血液を安全に輸血することができる。多数の分析物をテストする能力が増加すると、テスト費用を減少させることが可能であり、更なるテストを採用することが可能であり、複数の個人からの複数の関連した抗体または試薬細胞に対してテストを行うことによって、特異性に関する問題を緩和することが可能である。例えば異なる民族的背景（しかるに遺伝子構成）を有する集団との比較の際によく認められる、遺伝子突然変異および他の変異体のための変異性は非常に一般的であるので、抗原変異体またはこれらの変異体に対する抗体のより多くのテストを含むようにテストパネルを拡張することは役立つ可能性がある。もしこれらの進歩がなされ得たら、幹細胞、血小板および癌細胞の表面抗原の特徴づけを含む、血液の型分け以外の多くの他の用途に有益性を伸長することもあり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、生物学的、生化学的、生物物理学的、物理学的および化学的分析において用いられる粒子の位置的自由度の検出のための方法および装置に関する。本発明の方法および装置は、粒子／細胞の集団を、それらの検出された移動度に基づいて検出し、特徴づけることができる。本発明による一実施形態において、細胞の集団の分析的特徴づけは、基板に結合した細胞の集団とより弱い結合力を示すものとにおいて検出された差異に基づく。最初に、細胞を基板に沈降させ、引力、ブラウン力および他のランダム力または印加力の存在下で、粒子のうちの幾つかは並進移動を示し得る。粒子移動を検出し、測定値を計算して、特異的な分析物の存在および／または濃度を決定する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の例示的な実施形態は、曝露された表面に会合した粒子の移動が粒子、表面または周囲の溶液における分析物の有無または量を正確に測定するという発見に基づいた生物学的、化学的または生化学的分析（すなわち、アッセイ）のための方法を特徴とする。
【００１２】
特に、粒子の「位置的自由度」として公知のこの移動、そして本発明の方法および装置によるこの移動の顕微鏡的測定値は、粒子−例えば、細胞、ウイルスまたは小さなポリマー物および無機物、例えば各種形状および組成のマイクロスフェアまたはマイクロビーズ−が結合表面（例えば基板）または他の粒子に関連する移動を示す程度を特徴づける。特に、位置的自由度は、結合表面に結合または会合した粒子の位置的変動の測定値に反映される。
【００１３】
本発明の実施形態において、顕微鏡装置は、本発明を実施するために用いられ、明視野もしくは暗視野顕微鏡検査、位相コントラスト顕微鏡検査、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）撮像もしくはノマルスキー顕微鏡検査、蛍光顕微鏡検査、ホログラフィー顕微鏡検査または本技術分野で周知のあらゆる他の顕微鏡検査技術を利用してもよい。
【００１４】
一実施形態において、粒子（すなわち細胞）の移動度を測定するように設計されたインライン顕微鏡装置が、表面相互作用（すなわち、特異的表面−粒子相互作用の有無）および／または粒子分散物の集団拡散／粘弾性（例えば有効粘性）を推定するために用いられる。別の一実施形態において、試料の異なる領域を撮像するため、かつ得られた結果の定量および分析を助け、粒子が配置された基板上の捕捉表面領域との粒子の結合反応を決定するために、カメラおよびコンピュータが顕微鏡装置内に含まれる。よって、本発明のアッセイ方法は、コンピュータシステムと共に使用するためのコンピュータプログラム製品として実行されてもよい。
【００１５】
本発明による別の一実施形態において、顕微鏡装置は、コヒーレント光をコリメータによって平行にし（ｃｏｌｌｉｍａｔｅｄ）、かつそのレーザービームが試料を照明するコヒーレント光源（例えば、レーザー、スーパールミネセントダイオード）を含む。この実施形態において、顕微鏡装置は、周知のホログラフィー顕微鏡検査技術に従って操作される。
【００１６】
本発明による別の一実施形態において、透明、半透明または部分的ミラー化粒子試料、および粒子がその中に位置する、反射コーティングを有する試料チャンバは、受光側から試料を照明するためのレーザー照明（または別の照明源）を用いる反射モードで測定することが可能であり、試料から反射された光から画像形成され、続いてコンピュータシステムのモニタ上に表示される。この撮像方法は、反射光撮像または落射照明顕微鏡検査とも呼ばれ得る。
【００１７】
一実施形態において、本発明の方法の実施において用いられる粒子は、様々な物理学的および化学的特性を有してよく、識別可能な画像を生じるサイズ、形状および材料に基づいて、異なったタイプであってよい。
【００１８】
本発明による一実施形態において、使用する粒子の試料は、測定の前、間または後に、試料ホルダに試薬または非反応性溶液を導入することによって更に修飾されてもよい。表面は、様々な機器および様々な方法−すなわち、透明度および反射度、ならびに水平度または生体分子による処理度等−で提供されてもよい。
【００１９】
一実施形態において、粒子の試料は、多くの方法で提供され得るか、または標識に基づいて識別され得る。
【００２０】
一実施形態において、粒子がコーティングされるか、または、それ以外の場合、蛍光性または発光性放出スペクトルに基づいて粒子型によって識別される埋め込まれた蛍光性もしくは発光性分子もしくはナノ粒子である場合、顕微鏡装置は、蛍光性、発光性の励起源、適切なフィルタおよび二色性素子ならびにカラー検出能（例えば、カラーカメラおよび／または放出フィルタ選択）を備える。
【００２１】
本発明による一実施形態において、試料ホルダは、ガラスまたはプラスチック製の単純な顕微鏡スライドを含み、その透明表面上には、粒子が配置されるか、または沈降される。
【００２２】
本発明による更に別の一実施形態において、透明試料ホルダは、ウェルプレート（標準的なマイクロタイタープレートまたはカスタムメイドのウェルプレート）または単純な受動的マイクロ流体カートリッジである。カバーガラスは、所望の特定の用途のための適切な化学処理を受ける。
【００２３】
本発明による更に別の一実施形態において、マイクロタイタープレートは、光学的に透明なキャップ、試料搬送領域、試料観察領域等を含むカスタマイズされた構成を有しても有さなくてもよい。例えば、マイクロタイタープレートは、キャップまたは蓋を有するオープンウェルディスポーザブルであってよい。キャップは、インキュベーションおよび測定ステップ中に上面を準備するためにウェル内に配置される。
【００２４】
本発明による別の一実施形態において、単純なマイクロ流体試料カートリッジは、１種以上の溶液を導入するための入口、および必要に応じて所定のアッセイのための空気および溶液がシステムを出るための出口を含む。
【００２５】
本発明による別の一実施形態において、マイクロ流体試料カートリッジは、例えばカバーガラスまたは基板上に、結合実験のために機能する３つの領域を含む（すなわち、３つの捕捉表面領域を有する）。
【００２６】
一実施形態において、マイクロ流体カートリッジは自動流体機器であってよく、ウェルプレートはマイクロタイタープレート機器であってよく、各々は、本明細書において記載されているようにデータ収集および分析（すなわち、顕微鏡装置）に対応する。本明細書に概説される計器装備は、試料容器から各ウェルへの自動（および並列化可能な）流体搬送、試料混合およびインキュベーション能力、ならびにプログラム可能であってよく、かつ自動化されてよい並列化マイクロタイタープレート測定能力のためのロボットマイクロタイタープレートハンドリング機械と一体化されてもよい。よって、アッセイは、並列様式で、１つまたは多くの試料に対して複数のテストを実施するように設計されてもよい。
【００２７】
本発明による一実施形態によるチップ設計は、例えば、ＡＢＯ／Ｒｈ血液型判定、抗体スクリーニングおよび血漿濾過を実施することができ、更に、弱Ｄ抗原、拡大（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）表現型検査、直接抗グロブリンテスト（ＤＡＴ）および抗体同定を実施する免疫診断用使い捨てカートリッジを包含する。
【００２８】
濾過または他の血漿分離ディスポーザブル、ＡＢＯ／Ｒｈディスポーザブルおよび抗体スクリーニング（ＡｂＳ）ディスポーザブルをテストのために挿入した計器は、完全に自動化され、全血チューブおよびバイアルを受け入れ、従来のテストのような結果の手動読み取りを必要としない。更に、本発明のディスポーザブルは、インプットとしての遠心分離された血液を必要とせず（よって、それがディスポーザブルにおいて全血から血漿を分離するため外部遠心分離がない）、ディスポーザブルそのものの中に試薬および対照を有する。
【００２９】
結合相互作用が生じる程度を決定するために、物理的試料ホルダに、または試料中の流体に力を印加するために用いられる活性化方法を提供する本発明による幾つかの実施形態がある。具体的には、物理的力印加手段は、空気圧／油圧振動子、圧電性油圧アクチュエータ、圧電性ステージ振動子、空気圧または油圧バルブ開閉／摂動機器、熱アクチュエータ、音響放射機器およびウェルキャップ活性化機器によって引き起こされるもののような外部手段を用いた、移動ステージ、流体または試料ホルダの突然のまたは連続的な周期的移動を含む。
【００３０】
これらの活性化方法の長所としては、１）より強い（そして、しかるに、より頑健でかつ確信的な）結合および非結合粒子間の分離；２）照度変化、振動、わずかに焦点の合わない粒子、試料の平坦度における不完全性、ステージまたは試料の不完全な水平化、および測定値にノイズを導入する他の問題に対するより大きな頑健性、３）ＮＳＢが活性化方法の駆動力より低い結合力を有し得る場合にＮＳＢと特異的結合とを区別することによって非特異的結合（ＮＳＢ）を潜在的、能動的に克服すること、及び４）迅速な結合および／またはより強い結合を可能にし、それによってテスト測定の速度を上げる、粒子と基板との間の構成のより速い調査を促すことが挙げられる。しかるに、これらの活性化方法を用いて、相互作用および結合プロセスの速度を上げ、結合を区別し、測定ステップ中に各結合測定値について区別および信頼度を増強することができる。活性化の強度は、均一、可変的または間欠的であり得、所望の効果を最適に増強するために異なる時点で調整してよい。
【００３１】
本発明の方法を行う前に、最も良い結果を達成するために、顕微鏡検査機器の焦点合わせを実施してよい。伝統的な顕微鏡検査技術とは対照的に、粒子を照明するためのコヒーレント源の使用は、速い様式で粒子の正確な焦点面を決定するために試料の単一の焦点の合っていない画像の数値的処理を可能にする。
【００３２】
上記の装置において本発明を実施する方法は、顕微鏡的粒子の集団をチャンバに導入すること、及びあらゆる結合相互作用を測定するために表面上に粒子を沈降させることを含む。本発明は、基板上に粒子を沈降させるための各種システムを用いてよい。それらとしては、重力、遠心、流通系、拡散系、磁気系およびホログラフィーツィージング系システムが挙げられる。
【００３３】
本発明の方法において、粒子を含有する溶液はスライドに配置されるか、またはウェルプレートもしくはマイクロ流体機器のチャンバを通って、および基板にわたって流し、重力、遠心力等により表面に粒子が沈降する。粒子が基板上（または他の粒子上）の捕捉表面領域に結合するかどうかを同定するために、粒子を検討する。
【００３４】
一実施形態において、基板上の捕捉表面領域は、基板を所定の分析物または他の化学物質と特異的に相互作用し得るようにする結合プローブを含む。分析物は、基板の表面、粒子の表面または溶液中にあることができる。本発明において、ガラススライド、カバーグラス、プラスチックまたはシリコン基板は、ＤＮＡアレイ、タンパク質アレイまたは他のマイクロアレイのような検出アレイ（ｓｅｎｓｉｎｇ  ａｒｒａｙ）を形成するために特異的プローブを有する複数の捕捉表面領域を有してよい。
【００３５】
一実施形態において、粒子は基板上の捕捉表面領域に接触させられる。接触は、重力による粒子の沈降によって受動的に、あるいは能動的手段によって、例えば、遠心分離、電気泳動、上記の活性化方法によって、または光学的強制、もしくはとりわけ光学的トラッピング技術を用いて粒子を基板へ移動させることによって生じ得る。粒子のうちの少なくとも１つと基板の対応する捕捉表面領域との間の接触の後、特異的な化学物質が少なくとも１つの粒子の表面に存在する場合、特異的な結合相互作用がそれらの間で生じ得る。その場合、粒子と表面との間の結合は「表面会合（ｓｕｒｆａｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」粒子を生成し、それによって粒子と捕捉表面領域との間に複数の「テザー（ｔｅｔｈｅｒｓ）」を生成する。つまり、特異的結合相互作用は、特徴的なアビディティー（ａｖｉｄｉｔｙ）（すなわち、多価抗体のアビディティーに類似した複数の化学的／生化学的相互作用を理由とした協同的または累積的親和性）を示す。
【００３６】
本発明の一実施形態において、一旦結合すると、粒子は、捕捉表面領域等へのその結合を破断させず、むしろ、粒子が示す位置的自由度の程度は、分析物の有無または量を決定するために用いられ得る。
【００３７】
本発明の一実施形態において、粒子変動は、粒子の運動における複数の連続した変化を含む。例えば、粒子運動は、（完全に遊離した粒子に対するブラウン運動を引き起こすような）熱力学的圧力変動のため、または上記の活性化方法による力の周期的な印加のため、方向を変える可能性がある。かかる並進移動または位置的変動は、熱力学的変動または他の影響、例えば、振動性流量、対流（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ）、音響波または他の力（すなわち、活性化方法）の結果として生じ得る。
【００３８】
一実施形態において、粒子がまだ捕捉表面領域に結合したままである間、運動度を増強するために、上記の活性化方法によって粒子運動の量を増加させる。
【００３９】
捕捉表面領域の結合ポテンシャルが特定の温度範囲について粒子との特定の親和性に適切に調整される場合、粒子の位置的自由度の測定値は、捕捉表面領域と粒子との間の特異的結合相互作用の存在が位置的自由度の減少量と相関することを明らかにする。
【００４０】
本発明の顕微鏡装置を用いて粒子は照明され、明視野、暗視野、位相コントラスト、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）、ホログラフィー撮像および他の光学顕微鏡検査方法を用いてよい。粒子の画像は、カメラによって集められ、コンピュータによって分析される。視野内の粒子の画像の時系列は、カメラによって取得される（少なくともＮ＝２画像、しかしより多くの画像はより大きな精度を提供することが可能である）。選択され得る重要なパラメータは、粒子のタイプおよび撮像方法、ならびに作動方法を選択するかどうかにより、画像と粒子を観測した総時間との間の時間間隔を含む。
【００４１】
画像内において分析される粒子は、それらのサイズ、形状、配向性、外見、画像内に位置する場合に他の粒子に対する近接性等に基づいて選択してよく、１つの画像または幾つかの画像に基づくことができる。
【００４２】
位置的変動の指標は、刺激に対する表面会合粒子の応答の定量的指標であり、そこから所定の表面会合粒子の位置的自由度が推定される。粒子が、小さい力、例えばランダムな熱的力（すなわち、適切な状況において非結合粒子に対してブラウン運動を起こすことができるもの）、音響振動による、基板／試料容器の運動によって誘導される加圧力によって（すなわち、入口のバルブ開閉、もしくはそれ以外の場合、圧力を制御することから、または可動膜のような変位（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を用いることによって）引き起こされる懸濁流体のバルク運動、および上記の活性化方法からの他の力に応答して、どのように移動するかを観測し、定量する。
【００４３】
位置的変動の指標は、カテゴリー的または定性的測定値（例えば、二進値）であってよい。あるいは、位置的変動の指標は定量値であってよい。位置的変動の指標は、特定の近傍内における粒子の時間依存的位置的変化を記載する統計的指標であってよく、分散、標準偏差、二乗平均平方根（ＲＭＳ）移動、または観測値の時系列に関連づけられた粒子位置の自己相関関数として表されてもよい。
【００４４】
よって、捕捉表面領域に付着した粒子は、一定の時間または回数の観測の後で一定の程度より大きく移動しない場合、その表面上に存在する（または、それ以外の場合、粒子の表面領域への結合を可能にするように存在し、利用可能である）捕捉表面領域の特異的結合標的を有するように決定される。
【００４５】
位置的変動の指標は、デカルト座標系を用いる場合にｘ、ｙについて表されてもよい基板の表面の平面内の粒子の位置の記録された測定値の時系列から導き出し得る。記録された観測値の一部または全部は、位置的自由度の後処理および結合親和性のような関連する値の決定のためのタンジブル（ｔａｎｇｉｂｌｅ）コンピュータメモリまたはデータベースに保存されてもよい。あるいは、観測値は、コンピュータプログラムによって連続的に処理されてよい。
【００４６】
ｚ軸（すなわち、基板の表面によって規定される平面に対して直交方向）における位置的自由度の変化は、達成運動（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｍｏｔｉｏｎ）によって、ｘ、ｙ位置データから測定される位置的変動にも影響し得る。あるいは、ｚ軸における運動は、コンピュータプログラムによって直接測定し、位置的変動の決定において用いられてもよい。極座標を用いてもよい。時系列の位置データは、第一表面領域の、試料ホルダもしくは顕微鏡ステージの、または他の粒子もしくは顕微鏡の対象物の、基準マーク（ｆｉｄｕｃｉａｒｙ  ｍａｒｋｉｎｇ）（例えば、第一表面もしくは顕微鏡光学の）、に関連して測定されてもよい。任意に、粒子の経路を追跡してもよく、経路についてのデータは、以下に記載される粒子追跡方法に従ってタンジブルコンピュータメディアに保存されてもよい。
【００４７】
粒子の位置的変動の指標は、（複数の粒子の画像の並列処理によることを含めて）各粒子について個々に決定されてもよい、または複数の粒子の画像は、個々の粒子の同定を必要としない方法で数学的もしくはコンピュータ的に操作されてもよい。例えば、アルゴリズムは、一連の画像の中の総運動度を計算するために用いられてもよい。あるいは、１つのアルゴリズムは、運動が生じる領域を検出してもよく、これは、画像内の粒子の数についての他の情報と共に、またはそれから独立して用いられてもよい。
【００４８】
位置的変動の指標は、肉眼によって、または顕微鏡装置を用いることによって行われる。別の一実施形態において、位置的変動は、コヒーレント照明（ホログラフィー変動顕微鏡検査）を含む顕微鏡検査技術を用いて測定される。例えば、ホログラフィー顕微鏡検査は、高解像度三次元位置データの取得を可能にする。したがって、分析物の存在または量の信頼度のある決定をより速やかに行うことが可能である、または所定のデータ取得時間に関してより高い信頼度もしくは感度を達成することが可能である。
【００４９】
分析の方法は、結合度を決定するために粒子の位置的自由度の値を見出すことを含む。この位置的自由度は、取得された画像の配列から粒子の変動運動の程度を測定することによって推定することができる。これは、粒子認識および追跡、複数の画像の平均の計算、連続画像フレーム間の平均差の計算、ならびに画像の時系列の全体にわたる強度のピクセル的変化の計算を含む各種の方法によって行われてもよい。典型的には、計算は、運動の指標によって各粒子を特徴付けるような方法で行われる。
【００５０】
一実施形態において、最初に、１つ、２つまたは複数の試料について較正データを得る。２つの考えられる結果を有する単純なテストのためには、較正データを得るために２つの対照試料（または、各セットが同様の性質を有する２セットの対照試料）を測定することができる。連続的に変化する指標が所望され得る測定値（例えば、分析物の温度、Ｐｈ、濃度等の測定）等の、２つを超える考えられる結果を有するテストのためには、複数の較正試料を用いてもよい。
【００５１】
一実施形態においては、２つの較正試料を測定し、位置的自由度の測定値の単一の（較正）閾値を得る。テスト試料内の粒子の位置的自由度の測定値を閾値と比較し、それらが閾値を下回って減少する場合、結合相互作用が推定される。粒子が閾値を上回る測定値を有する場合、結合相互作用は推定されない。よって、テスト試料内における多くの粒子の測定により、より強く結合していると推定される粒子の数の総数（ｃｏｕｎｔ）と、より弱く結合しているものの総数とが得られ、それは、あるいは、強い結合のパーセンテージとして表すことができる。これらの総数またはこのパーセンテージを１つまたは複数の参照値と比較することによって、最終測定結果を、所定のテストについて「陽性」、「陰性」または「不確定」等と呼ぶことができる。
【００５２】
別の一実施形態において、粒子の位置的自由度の測定値のセットは、位置的自由度分布を含む。位置的自由度分布は、参照試料について（例えば、対照試料に対する多くの較正の実行から決定される）、ならびに問題のテスト試料について得られてもよい。テスト試料がどの対照試料に最も密接に似ているかを決定するために、テスト分布を参照分布のセットと比較してもよい。これは、投影、相関、ドット積、差の最小化、曲線の領域の積分、または他の方法を含む多くの方法により数値的に行ってもよい。この方法により、二値の結果（例えば、「陽性」または「陰性」）または二値でない結果（例えば、０（陰性）、１（極めて弱い）、１＋、２、２＋、３、３＋、４、４＋、または５（非常に強い））を得てもよい。しかるに、変動測定値の集合は、既知の性質の参照試料からの変動測定値の集合と比較することができる。
【００５３】
本発明は、（血液型判定を含む）少なくとも免疫診断の分野への、そして、その分野を越えて、医薬のための（すなわち、過去のスクリーニングの研究および診断テストのための）およびアレルギーテスト（例えば、ＩｇＥ抗体テスト）のための生細胞アッセイを含む他の診断への用途可能性を有する。特に、用途としては、オモテ試験（ｆｏｒｗａｒｄ  ｔｙｐｉｎｇ）、ウラ試験（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）および抗体スクリーニング（ＩｇＭおよびＩｇＧクラス抗体）が挙げられる。
【００５４】
本発明による他の実施形態において、本明細書に開示される方法および装置は、感染症スクリーニング（例えば、ヒト免疫不全（ＨＩＶ）ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、梅毒、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、梅毒（ｓｙｐｈｉｌｌｉｓ）等）の、これらの感染因子に対する抗体についてテストすることによる、または、幾つかの場合において、因子自体についてテストすることによるスクリーニングに適切である。更に、所望の分析に応じて、相補抗原の唯一の組み合わせを有する細胞（例えば、ある種の癌または幹細胞）の存在を検出するためにプローブの型および特異性を混合したものを用いてもよい。
【００５５】
他の例示的な実施形態において、本発明の方法は、以下のものを含む化学および技術上の改変を含んでもよい：細胞と捕捉表面領域との間の非特異的結合相互作用に最小または負の寄与を有するプローブ密度を減少させるための生体不活性部分；分析物を基板に共役させる直接アッセイ；プローブ複合体がある間接アッセイ；分析物もしくはリポータまたは他の分子の変位またはブロック化に関連する事象を検出することを含む競合アッセイ；捕捉表面領域が異なる分析物に対する特異性を有する分析物特異性；特異的に形成されたテザーを共有結合するために核酸オリゴ伸長およびライゲーションアッセイを用いることができる共有テザー；分子ライブラリのスクリーニング；位置的自由度の変化、ならびに陽性および陰性粒子の結果として生じる測定可能な位置的変動のために洗浄ステップをなくすこと；検出アレイ同定の使用；対照捕捉表面領域の使用；位置的自由度の分析を増強するために用いる粒子のサイズ設定；テザーの長さまたは基準参照の関係の制御、および粒子が、既定の一定の時間または既定の一定の数の観測の後で既定の一定の距離を超えて移動しない場合には、その表面上に存在する捕捉表面領域の特異的結合標的を有するように決定されるような参照値の使用。
【００５６】
本発明の更なる実施形態は、少なくとも幾つかのプローブの型について、沈降した粒子の非特異的結合が特異的結合とは異なる速度で生じるという発見に基づく。その結果、粒子の沈降後の初期の時点に基づいて位置的変動シグナルを測定することができるということを発見した。時間に伴う位置的変動測定値の変化の追跡は、特異的結合からの非特異的結合の向上した区別を可能にすることができる。あるいは、そのシステムは、異なる時間変化で（例えば、異なる特徴的時間尺度または進行速度で）生じる複数の効果を有すると考えることができ、時間と共にその変化を追跡することによって、各寄与のレベルを決定することができる。例えば、非特異的結合が特異的結合と比較して急速に生じることが分かる単純な場合において、初期の位置的変動は、後の時点に基づいた位置的変動測定値から減じられてもよい。つまり、位置的変動の計算は、コンピュータプログラムが、粒子位置の時間変化に関連した指標を算出するように作動し、任意に、非特異的結合についての時定数より大きなキネティック時定数で生じる非特異的結合について補正するステップを含んでもよい。上記のように、これは、曲線適合、またはキネティックもしくは分子アッセイ技術の分野において公知の他のアルゴリズムによって行われてもよい。
【００５７】
よって、本発明による幾つかの特性について、続くその詳細な説明をより良く理解するために、また本技術分野に対する本発明の寄与をより良く認識するために、概説している。もちろん、以下に記載され、かつ本明細書に添付した請求項の主題を形成する本発明による更なる特性がある。
【００５８】
この点で、本発明による少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、その用途において、構成の詳細に、かつ以下の説明において記載されるか、または図面に示される構成要素の配置に限定されないことを理解すべきである。本発明による方法および装置は、他の実施形態を可能にし、各種方法で実践し、かつ実施することが可能である。また、本明細書において用いられる表現および用語、ならびに以下に含まれる要約は、説明の目的のためであって、限定するものとみなしてはならないことも理解すべきである。
【００５９】
当業者は、本発明の幾つかの目的を実行するため、その他の構造、方法およびシステムを設計するための基礎として、この開示の基礎となる概念を容易に利用してもよいことを理解するであろう。ゆえに、請求項が、本発明による方法および装置の趣旨および範囲から逸脱しない限り、かかる同等の構成を含むとみなされることは、重要である。
【００６０】
前述の本発明の特徴は、添付の図面に関してなされる以下の詳細な説明を参照することでより容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】図１Ａは、顕微鏡装置がその最も単純な形態である、本発明による顕微鏡装置の第１の実施形態を示す概略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、顕微鏡装置がカメラ及びコンピュータを含む本発明による顕微鏡装置の第２の実施形態を示す概略図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、顕微鏡装置がレーザー照明、ならびにカメラおよびコンピュータを含む本発明による顕微鏡装置の第３の実施形態を示す概略図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、反射コーティングを有する粒子の試料および試料チャンバが反射モードで測定されてもよい、本発明による別の一実施形態を示す概略図である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、粒子の各型が粒子の不均一集団の移動度指標により観測される通りの表面との異なる相互作用を生じさせる、粒子の不均一混合物を各々有する、試料ホルダ表面の、区別して処理された表面領域をトップダウンで見た概略図である。
【図１Ｆ】図１Ｆは、斜視図Ａ、断面図Ｂ、上面図Ｃ、および検出アレイの上面図Ｄによる、本発明による一実施形態による例示的なマイクロ流体カートリッジの概略図を示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、斜視図Ａ、断面図Ｂおよび上面図Ｃによる、本発明による一実施形態による例示的なオープンウェル試料カートリッジの概略図を示す。
【図１Ｈ】図１Ｈは、本発明による一実施形態による、平坦面間の特定の間隙を規定するキャップを有するウェルプレートの概略図を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明による一実施形態による、流体圧力（しかるに、流体の流れ）を振動させるための例示的なシステムに接続されたマイクロ流体機器の概略図を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明による一実施形態による、例示的な圧電性油圧アクチュエータを有するマイクロ流体機器の概略図を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明による一実施形態による、例示的な圧電性ステージ振動子に接続されたマイクロ流体機器の概略図を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本発明による一実施形態による、流体力学的圧力および流量を振動させるための空気圧駆動（または油圧駆動）システムを組み込むマイクロ流体機器の概略図を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、本発明による一実施形態による、例示的な熱アクチュエータに接続されたマイクロ流体機器の概略図を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、本発明による一実施形態による、音響源に接続されたマイクロ流体機器の概略図を示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、本発明による実施形態による、所定の位置にキャップを有するウェルを示す図Ａ、活性化用キャップを振動させるための線形ソレノイドアクチュエータの使用を示す図Ｂ、粒子運動の活性化のためのキャップ運動を駆動する圧電性アクチュエータを示す図Ｃによる、ウェルを有するカートリッジにおいて用いられるキャップの概略図を示す。
【図３】図３は、本発明による一実施形態による、複数の捕捉表面領域に配置された粒子を有する検出アレイを含むマイクロ流体機器の試料ホルダまたは基板の概略図である。
【図４】図４は、本発明による一実施形態による、患者の血液型を決定するための（オモテ試験）検出アレイによって検出される表面抗原を有する赤血球を示す断面図における概略図である。
【図５】図５は、本発明による一実施形態による、沈降およびプローブとの会合後の図４の赤血球を示し、かつ特異的結合反応を示す、断面図における概略図である。
【図６】図６は、本発明による一実施形態によるオモテ試験における実験を示し、得られたグラフが、２つの異なるパッチに分散する細胞についての測定時間間隔の関数としてのＢ群赤血球の観測された平均二乗変位を示し、一方は表面に固定された抗Ａ抗体を有し、他方のパッチは表面に固定された抗Ｂを有する。Ｂ群細胞は、抗Ａ抗体パッチ上より抗Ｂ抗体パッチ上でのより低い位置的変動を有し、それは、抗ＢパッチへのＢ群細胞の結合、ならびに結合が活性化なしで生じるかどうかを認識するために必要な時間尺度を明らかにする。
【図７】図７は、アルゴリズムを用いて赤血球の正規化標準偏差（ＮＳＤ）の確率分布を算出する、本発明による一実施形態によるオモテ試験実験のグラフを示す。
【図８】図８は、本発明による一実施形態による、断面図における検出アレイまたは基板を示し、検出アレイは、血漿試料が例えば、ウラ試験テストにおいてその中に抗Ａおよび／または抗Ｂ抗体を有するかどうかを同定するために用られる。
【図９】図９は、本発明による一実施形態による、あるＩｇＧ−クラス血液型抗体についての抗体スクリーニングテストを実施する、断面図における検出アレイである。
【図１０】図１０は、本発明による一実施形態による、主に一定のｚ平面内に位置する試料についての最良の焦点の平面外ｚ位置を算出するためのコヒーレント照明「Ｌ１ノルム」方法の較正曲線を示す。
【図１１】図１１は、本発明による一実施形態による、最初の開始位置の範囲について３回の焦点合わせの繰り返しを実施する場合、図１０の較正曲線を用いた焦点合わせの実施を示す。
【図１２】図１２は、本発明による一実施形態による、抗Ａコーティング表面において測定した２種の異なる赤血球試料（Ａ抗原に対して陽性である細胞およびＡ抗原に対して陰性である細胞）の位置的自由度を測定する正規化標準偏差ヒストグラムのプロットを示す。
【図１３】図１３は、本発明による一実施形態による、抗Ｂコーティング基板表面において測定した、一方の試料がＢ抗原に対して陽性であり、一方がＢ抗原に対して陰性である、２種の異なる赤血球試料のＮＳＤヒストグラムのプロットを示す。
【図１４】図１４は、本発明による一実施形態による、抗Ｄコーティング基板表面において測定した、一方の試料は血液細胞がＤ抗原に対して陰性であり、他方はＤ抗原が細胞に存在する２種の異なる赤血球試料のＮＳＤヒストグラムのプロットを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、本発明による一実施形態による、異なる時点で取得された、抗Ａの存在下での、Ｂ抗原により調製された表面にわたって分散した赤血球の試料についての一連のＮＳＤヒストグラムを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、本発明による一実施形態による、表面がその上にＡ型抗原を有することを除いては、図１５Ａにおけるものと同様の条件下でのヒストグラムの時系列を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、本発明による一実施形態による、非常により低い抗体濃度を用いたことを除いては、図１５Ａにおいて測定された条件と同様の条件下でのヒストグラムである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、本発明による一実施形態による、非常により低い抗体濃度を用いたことを除いては、図１５Ｂにおいて測定された条件と同様の条件下でのヒストグラムである。
【図１７】図１７は、本発明による一実施形態による、プローブおよび生体不活性部分の両方を含む基板上の捕捉表面領域を示す断面図である。
【図１８Ａ】本発明による一実施形態によれば、図１８Ａは、分析物抗原が捕捉表面領域に結合し（または捕捉され）かつ固定された抗体プローブを有する粒子を捕捉表面領域に接触及び結合させた、直接アッセイの断面図である。
【図１８Ｂ】本発明による一実施形態によれば、図１８Ｂは、抗体が非結合抗原を認識しない（すなわち、結合が起こらない）状態を示す。
【図１９Ａ】本発明による一実施形態によれば、図１９Ａは、第１のプローブに結合して、読み出し粒子（ｒｅａｄｏｕｔ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）に対して同系の結合パートナーを示す複合体（例えば、生体分子複合体）を形成する第２のプローブの間接アッセイを示す断面図である。
【図１９Ｂ】本発明による一実施形態によれば、図１９Ｂは特異的結合反応の欠如を示す。
【図２０Ａ】本発明による一実施形態によれば、図２０Ａは、基板の捕捉表面領域で形成された３次サンドイッチ構造を示す競合アッセイの断面図である。
【図２０Ｂ】本発明による一実施形態によれば、図２０Ｂは、分析物分子が平衡に近づくための適切な時間を与えられた位置保持分子（ｐｌａｃｅｈｏｌｄｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を変位させる、または分析物分子が位置保持分子の前に導入される場合に結合を防ぎ得る、場合を示す。
【図２１】図２１は、本発明による一実施形態による、位置保持分子が分析物分子より低いプローブに対する親和性を有する競合アッセイについての反応スキームを示す断面図である。
【図２２】図２２は、本発明による一実施形態による、捕捉表面領域が異なる分析物に対する特異性を有する図２１に沿ったサンドイッチアッセイを示す断面図である。
【図２３】図２３は、本発明による一実施形態による、熱活性化および図２Ａのような計器による活性化の両方を用いて明視野照明で測定される通りの正規化標準偏差測定値の分布を示す、結合および非結合粒子の分布のグラフである。
【図２４】図２４は、本発明による実施形態による、免疫診断テストを実施するために用いるディスポーザブルの概略図の上面図である。
【図２５】図２５は、血液型テストの実施に含まれるプロセスステップを示すフローチャートである。
【図２６】図２６は、図２４のディスポーザブルが挿入される、本発明による一実施形態による、計器の斜視図である。
【図２７】図２７は、本発明による一実施形態による、顕微鏡下における、それぞれ１ｇおよび４００ｇ（重力）での遠心分離下の粒子（すなわち、赤血球）の２つのスライドを示す。
【図２８】図２８は、本発明による一実施形態による、５分間の０〜４００Ｇ’ｓでの遠心分離下で、単位面積当たりの粒子（すなわち、赤血球）を計数する異なる方法を表す高、中および低データポイントを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本発明は、生物学的、生化学的、物理学的、生物物理学的および化学的分析に用いられる粒子の位置的自由度の検出のための方法および装置に関する。特に、本発明は、検出された移動度に基づいて粒子／細胞の集団を検出し、特徴づけることができる方法および装置に関する。本発明による一実施形態において、ある細胞の検出は、基板に結合する細胞の集団とより弱い結合力を示すものとにおいて検出される差に基づく。最初に、細胞を基板上に沈降させ、重力、自然の熱力学的圧力変動、および他のランダムまたは印加力の存在下で、粒子のうちの幾つかは並進移動を示す可能性がある。本発明の方法および装置に従って、粒子移動を検出し、測定値を計算して、特異的な分析物の結合を決定する。
【００６３】
本発明の例示的な実施形態は、生物学的、化学的または生化学的分析（すなわち、アッセイ）のための方法を特徴とし、曝露された表面に会合した粒子の移動が、粒子、表面または周囲の溶液中の分析物の有無または量を正確に測定するという発見に関する。更に、これらの測定値は、温度、ｐＨまたは他の環境パラメータのような環境特性を明らかにするために用いることができる。
【００６４】
具体的には、粒子の「位置的自由度」として公知のこの移動、および本発明の方法および装置によるこの移動の顕微鏡的測定は、粒子−例えば、細胞、ウイルスまたは小さなポリマー物および無機物、例えば各種形状および組成のマイクロスフェアまたはマイクロビーズ−が結合表面（例えば基板）または他の粒子に対する移動を示す程度を特徴づける。具体的には、位置的自由度は、結合表面に結合または会合した粒子の位置的変動の測定値において反映される。
【００６５】
具体的には、結合表面は、分析物または粒子結合が可能な表面の部分である。結合表面（すなわち、基板または他の粒子の表面）は、粒子、捕捉表面領域もしくは周囲の溶液中の分析物の有無もしくは量を正確に測定するために、または結合度が感受性である環境もしくはシステム条件を測定するために、相互作用が粒子と結合表面との間で起きる「捕捉表面領域」として公知の領域を有してよい。しかるに、「表面会合粒子」は、特異的結合パートナーが存在する場合、結合のための適切な条件下で、粒子と捕捉表面領域との間の特異的結合相互作用が起こり得るように、捕捉表面領域にきわめて十分に接近している粒子である。
【００６６】
装置
本発明の目的を達成するために、以下の装置が用いられてもよい。しかし、当業者であれば、記載されている装置の変形または他の型の装置が所望の方法を達成し得ることを認識するだろう。
【００６７】
顕微鏡装置
本発明の実施形態において、顕微鏡装置は、本発明を実施するために用いられ、明視野もしくは暗視野顕微鏡検査、位相顕微鏡検査、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）撮像もしくはノマルスキー顕微鏡検査、蛍光顕微鏡検査、ホログラフィー顕微鏡検査または本技術分野で周知のあらゆる他の顕微鏡検査技術を利用してもよい。
【００６８】
実施形態１
例示的な一実施形態において、本発明の最も単純な形態において、図１Ａは、表面相互作用（すなわち、特異的な表面−粒子相互作用の有無）および／または粒子分散物の集団拡散／粘弾性体特性（例えば有効粘性）を推定するために、粒子（すなわち、細胞）の移動度を測定するように設計されたインライン顕微鏡装置１０を示す概略図を示す。
【００６９】
図１Ａの例示的な実施形態において、明視野顕微鏡検査を実施することができる顕微鏡装置１０Ａは、顕微鏡１０６の透明試料ホルダ１０５（すなわち、顕微鏡スライド）を照明する照明源１００Ａ（例えば、ＬＥＤ、白熱、アークランプ）を含む。透明試料ホルダ１０５は、粒子１０８（すなわち、細胞）を有する試料１０７が配置されている、処理または未処理の表面１０９を有する。顕微鏡装置１０は、照明源１００を含む支持構造またはベース（図示せず）を含み、平行（ｃｏｌｌｉｍａｔｉｎｇ）レンズまたは他の光学部品、（共に試料１０７の画像を形成する）対物レンズ１４２およびチューブレンズ１４１、接眼レンズ１４０（または双眼レンズ）、試料１０７を通過するように光を方向づけるコンデンサ１４４、並び試料ホルダ１０５の機械的移動を可能にする移動ステージ１１４が組み込まれてもよい。調整ノブ（図示せず）および焦点機構１４８は、焦点調整を実施する。視野絞り１４５は、照明光が方向づけられる試料領域１０５の部分を調整する。更に、コンデンサ１４４には、レンズだけでなく、照明光が試料１０７に接近する角度範囲（例えば開口数）を制御するためのアイリス、例えば開口絞り１４６、が組み込まれてもよい。更に、コンデンサ１４４には、光が試料１０７に接近する角度を限定するために用いることもできる位相リング１４７が組み込まれてもよい。位相リング１４７は、適切な対物レンズ１４２と共に用いられる場合、位相コントラスト撮像のために用いられてもよい。
【００７０】
更に、位相リング１４７または適切なコンデンサ１４４の構成は、コンデンサ１４４からの照明光が撮像光学部品によって集められない角度で試料１０７に達する暗視野顕微鏡検査を可能とし、撮像光学部品が、反射したか、屈折したか、散乱したか、または、そうでなければ、試料１０７によってその軌道の角度が変化した、光を受け入れるだけの状態が生じる。本実施形態において、装置１０には、より高い角度（より高い開口数（ＮＡ））の光線が対物レンズ１４２または全体的撮像システムのより低いＮＡの設定が理由で、画像面に達することができない試料１０７を照明するために位相リング１４７または開口部が含まれてもよい。あるいは、蛍光または落射蛍光撮像は、本技術分野において周知であるような、フィルタおよび照明（図示せず）の適切な使用によって行われてもよい。
【００７１】
最後に、観測される試料１０７の解像度を向上させるために、油浸対物レンズ１４２および特別な液浸油が、試料１０７を覆ったガラスカバー（図示せず）上に配置されてもよい。あるいは、適切に選択された対物レンズ１４２と共に水またはグリセリンのような異なる浸漬液が用いられてもよい。一般に、より高い開口数の対物レンズは、より高い解像度の利益を提供する。その利益は、最高のＮＡの対物レンズに必要とされる液体浸漬液を用いる追加の取組み、ならびにより低い倍率およびＮＡの対物レンズに利用可能な大きい視野を有する有益性との釣り合いである。単純化のため、空気対物レンズ１４２が選択されてもよい。
【００７２】
実施形態２
本発明による別の一実施形態において、カメラ１１２およびコンピュータ１１３は、図１Ｂに例示的に示されるように、顕微鏡装置１０に含まれる。細胞／粒子１０８は、画像処理等のためのコンピュータ１１３に接続されたＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラ１１２で、細胞／粒子１０８の拡大画像を形成するチューブレンズ１４１と共に顕微鏡対物レンズ１４１によって撮像されてもよい。カメラ１１２は、自動ズームハードウェアおよび制御機構を含んでもよい。本技術分野で周知である移動ステージ１１４（例えば、動力付顕微鏡移動ステージ）を用いて試料１０７を移動させることによって試料１０７の異なる領域が撮像されてもよい。（本明細書において更に考察される）各種活性化方法が用いられてもよい。
【００７３】
試料ホルダ１０５は、測定領域の全てまたは部分を温度制御することも可能であり、それによって、例えば生体分子相互作用が生じるための最適温度でインキュベーションを行うことも可能である。更に、顕微鏡１０６によって撮像される試料面は、（駆動されるモータであってもよい）焦点制御調整ノブを用いることによって調整されてもよい。当業者であれば、所望の結果を達成するために、これに対する他の改善または他の顕微鏡装置１０を用いてもよいことが分かるであろう。
【００７４】
なお、肉眼で、または図１Ａの接眼レンズ１４０で結合反応を見ることによって本発明を達成することが可能であるが、顕微鏡装置１０と共にカメラ１１２およびコンピュータシステム１１３を使用することは、表面１０９との粒子１０８の結合反応を決定するために、得られた結果を定量し、分析する際に有用でもある。
【００７５】
コンピュータシステム１１３に関して、システム１１３は、ディスプレイ手段（すなわち、モニタ、スクリーン等）及びインプット手段（すなわち、キーボード、音声活性等）を含み、本技術分野で周知の処理およびメモリ能力を有してよい。コンピュータシステム１１３は、クライアントおよび／またはサーバ環境、あるいは配布環境においてあってよい。
【００７６】
本発明のアッセイ方法は、コンピュータシステム１１３と共に使用するためのコンピュータプログラム製品として実施されてもよい。かかる実施は、コンピュータ可読メディア（例えば、ディスケット、ＣＤ−ＲＯＭ、ＲＯＭまたは固定ディスク）のようなタンジブル（ｔａｎｇｉｂｌｅ）メディアに固定されるか、またはモデムもしくは他のインタフェース機器、例えばメディアを通じてネットワークに接続された通信アダプタ、を介してコンピュータシステムに送ることのできる、一連のコンピュータ命令を含んでもよい。メディアは、タンジブルメディア（例えば、光学的またはアナログ通信ライン）またはワイヤレス技術で実行するメディア（例えば、マイクロ波、赤外線または他の伝送技術）であってよい。一連のコンピュータ命令は、システムに関してすでに本明細書に記載された機能性の全てまたは一部を実施する（ｅｍｂｏｄｉｅｓ）。当業者は、かかるコンピュータ命令が、多くのコンピュータアーキテクチャまたはオペレーティングシステムと共に使用される多くのプログラム言語で書き込まれ得ることを理解するはずである。
【００７７】
かかるコンピュータプログラム製品は、添付の印刷されたまたは電子ドキュメンテーションと共にリムーバブルメディア（例えば、圧縮包装ソフトウェア）として配布されてもよい、またはコンピュータシステムで（例えば、システムＲＯＭまたは固定ディスクで）あらかじめ組み込まれてもよい、またはネットワーク（例えば、インターネットまたはワールドワイドウェブ）を通じてサーバもしくは電子掲示板から配布されてもよいことが期待される。もとろん、本発明の幾つかの実施形態は、ソフトウェア（例えば、コンピュータプログラム製品）およびハードウェアの両方の組み合わせとして実施されてもよい。本発明の更に他の実施形態は、全面的にハードウェアまたは全面的にソフトウェア（例えば、コンピュータプログラム製品）として実施される。
【００７８】
実施形態３
本発明による別の一実施形態において、図１Ｃは、粒子の移動度を測定して表面相互作用を推定するようにも設計されている、例示的なインライン顕微鏡装置１０の概略図を示す。
【００７９】
図１Ｃで示されるような実施形態において、本発明を実施するために用いられる顕微鏡装置１０は、コリメータ（ｃｏｌｌｉｍａｔｏｒ）１０１によってコヒーレント光をコリメートし、かつそのレーザービーム１０４が顕微鏡１０６の透明試料ホルダ１０５（すなわち、顕微鏡スライド）を照明する、コヒーレント光源１００Ｂ（例えば、レーザー、超発光性ダイオード）を含む。コヒーレント光源１００からのレーザー光１０４は、「自由空間ビーム（ｆｒｅｅ  ｓｐａｃｅ  ｂｅａｍ）」として、または光学的繊維（例えば、繊維光学パッチコード１０２）を通じて、コリメータ１０１に進行することができる。任意で、非常に大きい領域を照明することから照明視野および関連した散乱光を減少させ、しかるに、視野絞りとして作動させ、ピンホールまたはアイリス／開口部１０３をコリメータ１０１と試料ホルダ１０５との間に配置してもよい。
【００８０】
本実施形態において、使用されたコヒーレントレーザー源１００は、短いコヒーレンス長（＜４００μｍ）を有し、６６０ｎｍで作動する。周知のホログラフィー顕微鏡検査技術を本実施形態に適用することができる。
【００８１】
図１Ａおよび１Ｂにおいて示される前の２つ実施形態と同様に、画像処理などのためのコンピュータ１１３に接続されている、ＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラ１１２に細胞／粒子１０８の拡大パターンを撮像することができる顕微鏡対物レンズ１４２およびチューブレンズ１４１によって細胞／粒子１０８は撮像されてもよい。カメラ１１２は、自動ズームハードウェアおよび制御機構を含んでもよい。上記のように、本技術分野で周知の移動ステージ１１４（例えば、動力付顕微鏡移動ステージ）と共に、試料１０７を移動することによって、試料１０７の異なる領域を撮像することができる。移動ステージ１１４を移動させる方法および装置は、更に以下に記載されている活性化方法を含んでもよい。また、上記のように、試料ホルダ１０５は、測定領域の全てまたは部分を温度制御することも可能であり、例えば生体分子相互作用が生じるための最適温度でインキュベーションを行うことが可能である。更に、顕微鏡１０６によって撮像される焦点面は、（駆動されるモータであってもよい）焦点制御部１４８を用いることによって調整されてもよい。
【００８２】
上記のように、コンピュータシステム１１３は、ハードウェアおよびソフトウェア要求、ならびに本技術分野で周知の処理およびメモリ性能を有し、クライアントおよび／またはサーバ、あるいは配布環境にあってよい。
【００８３】
本発明のアッセイ方法は、コンピュータシステム１１３と共に使用するためのコンピュータプログラム製品として実施されてもよい。上記のように、かかる実施は、コンピュータ可読メディア（例えば、ディスケット、ＣＤ−ＲＯＭ、ＲＯＭまたは固定ディスク）のようなタンジブルメディアに固定されるか、またはモデムもしくは他のインタフェース機器、例えばメディアを通じてネットワークに接続された通信アダプタ、を介してコンピュータシステムに送ることのできる、一連のコンピュータ命令を含んでもよい。上記のように、メディアは、タンジブルメディア（例えば、光学的またはアナログ通信ライン）またはワイヤレス技術で実施するメディア（例えば、マイクロ波、赤外線または他の伝送技術）であってよい。一連のコンピュータ命令は、システムに関してすでに本明細書に記載された機能性の全てまたは一部を実施する。当業者は、かかるコンピュータ命令が、多くのコンピュータアーキテクチャまたはオペレーティングシステムと共に使用するための多くのプログラム言語で書き込まれ得ることを理解するはずである。
【００８４】
上記のように、かかるコンピュータプログラム製品は、添付の印刷されたまたは電子ドキュメンテーションと共にリムーバブルメディア（例えば、圧縮包装ソフトウェア）として配布されてもよく、コンピュータシステムに（例えば、システムＲＯＭまたは固定ディスクにおいて）あらかじめ組み込まれていてもよく、またはネットワーク（例えば、インターネットまたはワールドワイドウェブ）を通じてサーバもしくは電子掲示板から配布されてもよい、ことが期待される。上記のように、本発明の幾つかの実施形態は、ソフトウェア（例えば、コンピュータプログラム製品）およびハードウェアの両方の組み合わせとして実行されてもよい。本発明の更に他の実施形態は、全面的にハードウェアまたは全面的にソフトウェア（例えば、コンピュータプログラム製品）として実行される。
【００８５】
反射モード
本発明による別の一実施形態において、透明、半透明または部分的ミラー化粒子１０８の試料、および反射または部分的反射コーティング１２０を有する試料チャンバ１１８（図１Ｄ参照）は、受光側から試料１０７を照明するためのレーザー照明１００Ｂ（または別の照明源）（図１Ｃ参照）を用いる反射モードで測定することが可能であり、試料１０７から反射された光から画像形成され、続いてそれはコンピュータシステム１１３のモニタ上に表示される。あるいは、明視野、暗視野、蛍光または他の撮像方法のようなインコヒーレント照明を用いてもよい。そうする場合、本技術分野で周知のような光学部品および試料チャンバの表面等の滑らかな界面からの鏡面反射光を減少させるために偏光フィルタを用いる場合、典型的に改善された結果が得られる。
【００８６】
粒子
本発明の方法の実施において用いられる粒子１０８は、様々な物理学的および化学的性状を有してよく、識別可能な画像を生じるサイズ、形状および材料に基づいて異なる型であってよい。例えば、粒子１０８は、いくらかの対称性を有する規則的に成形されたビーズ（例えば、球状、長球状体、偏球状体）、または不規則に成形されたビーズであってよい。粒子１０８は、１つの種類の材料または複数の種類の材料で作製されてよい。粒子１０８は、固形、多孔性であってよく、または中空コアを有してもよい。粒子１０８は、他の材料で、完全に、または部分的にコーティングされてよい。粒子１０８は、金属性または部分的に金属性であってよい。粒子１０８は、非金属性または部分的に非金属性であってよい。粒子の表面は、特性（ｔｅｘｔｕｒｅ）を適用するために処理してよい。粒子１０８は、表面にリンカー分子を有するシリカビーズ、または表面に付着している生体分子もしくは合成分子を有するシリカビーズであってよい。また、粒子１０８は、表面のリンカー分子に付着している生体分子または合成分子を有するシリカビーズであってもよい。粒子１０８は、共有的にまたは非共有的に付着しているまたは一体化されている、蛍光性標識分子または発光性標識分子によって、コーティングされているかまたはそうでなければ埋め込まれている、ビーズであってよく、それは、蛍光性または発光性放出スペクトルに基づいて粒子型を識別することもできる。粒子１０８は、共有的にまたは非共有的に付着しているまたは一体化されている、異なった蛍光性標識分子または発光性標識分子の組み合わせによって、コーティングされているかまたは埋め込まれている、ビーズであってよく、それは蛍光性または発光性放出スペクトルに基づいて粒子型を識別することもできる。粒子１０８は、それと共有的または非共有的に付着しているまたは一体化されている、ナノ粒子または磁気ナノ粒子または蛍光ナノ粒子を有するビーズであってよい。
【００８７】
更なる例において、粒子１０８は生体細胞であってよい。粒子１０８は、遺伝子操作されている生体細胞、または遺伝子操作されている生体細胞の子孫であってよい。粒子１０８は、生体分子および／または合成分子で処理されている細胞であってよい。粒子１０８は、リンカー分子で処理されている細胞であってよい。粒子１０８は、リンカー分子に付着している生体分子および／または合成分子で処理されるような細胞であってよい。粒子１０８は、共有的または非共有的に付着しているまたは一体化されている、蛍光性標識分子または発光性標識分子を有する細胞であってよい。粒子１０８は、共有的または非共有的に付着しているまたは一体化されている、異なった蛍光性標識分子または発光性標識分子の組み合わせを有する細胞であってよい。粒子１０８は、共有的または非共有的に付着しているまたは一体化されている、ナノ粒子を有する細胞であってよい。粒子１０８は、共有的または非共有的に付着しているまたは一体化されている、磁気ナノ粒子を有する細胞であってよい。粒子１０８は、共有的または非共有的に付着しているまたは一体化されている、蛍光ナノ粒子を有する細胞であってよい。粒子１０８は、天然に発現するかまたは蛍光タンパク質を発現するように遺伝子改変されている、細胞であってよい。粒子１０８は、抗体、タンパク質または他の分子もしくは材料によってコーティングされている細胞であってよい。
【００８８】
基板表面調製
本発明による一実施形態において、粒子１０８の試料１０７は、測定の前、間または後に、試料ホルダ１０５に試薬または非反応性溶液を導入することによって更に改変されてもよい。例えば、図１Ａ〜１Ｃに示されるように、細胞／粒子１０８の表面相互作用の測定のために、細胞／粒子１０８が沈降する試料ホルダ１０５の透明表面１０９（例えば、カバーグラス）に特別な処理を行ってもよい。よって、試料ホルダ１０５に配置された試料１０７は、処理または未処理の透明表面１０９（すなわち、カバーグラス）に配置された粒子１０８（すなわち、細胞）の分散物を含んでよい。手動で、または構造および操作が本技術分野で周知である（後で考察される）自動流体機器１１６によって、細胞／粒子１０８の試料１０７を試料ホルダ１０５に導入してよい。
【００８９】
粒子１０８を、粒子表面相互作用をテストするために表面１０９上に沈降してもよい。一実施形態において、粒子１０８を、重力に起因して表面１０９に沈降し得る。別の一実施形態において、粒子１０８を、遠心分離機によって試料チャンバ１１８に印加される遠心力（例えば、図１Ｆ参照）に起因して、表面１０９に沈降し得る。更に、別の一実施形態において、粒子１０８を、（本明細書において更に考察される）粒子１０８に印加される他の力に起因して、表面１０９に沈降し得る。
【００９０】
本発明による一実施形態において、遠心分離機を用いて、粒子１０８（すなわち、赤血球）を基板２００の表面１０９に遠心分離して、より密度の高いコーティングを形成することができる。図２７は、本発明による一実施形態による、顕微鏡下における、それぞれ１ｇおよび４００ｇ（重力）での遠心分離下で沈積された粒子（すなわち、赤血球）の２つのスライドのスクリーンショットを示す。
【００９１】
図２８は、本発明による一実施形態による、５分間の０〜４００Ｇ’ｓでの遠心分離下で、単位面積当たりの粒子（すなわち、抗体スクリーニングにおける赤血球）を計数する異なった方法を表す、高、中および低データポイントを示すグラフである。グラフから、計数方法に関係なく、傾向が基本的に同じであることを見て取ることができる。本実施形態は、固相血液型判定に適用される。
【００９２】
表面１０９は、様々な方法で提供されてもよい。一実施形態において、表面１０９は、平坦で、透明であってよい。更に、表面１０９は、平坦で、部分的に透明であってよい。また更に、表面１０９は、平坦で、完全にまたは部分的に反射型であってよい。表面１０９は、特性のある（ｔｅｘｔｕｒｅｄ）平坦な表面であってよい。表面１０９は、生体分子または合成分子によって処理されてよい。表面１０９は、リンカー分子によって処理されてよい。表面１０９は、リンカー分子に結合されている生体分子または合成分子で処理されてよい。表面１０９は、様々な分子で区別して処理されてよい。表面１０９は、様々なリンカー分子で区別して処理されてよい。表面１０９は、分子の混合物で処理されてよい。表面１０９は、マイクロ流体機器１１６の一部であってよい（例えば、図１Ｆ参照）。表面１０９は、マイクロタイタープレートまたは１つ以上のウェルもしくはチャンバを有する他の機器の一部であってよい。表面１０９は、透明なまたは部分的に透明な試料チャンバ１１８の一部であってよい（例えば、図１Ｆ参照）。表面１０９は、反射するかまたは部分的に反射する試料チャンバ１１８の一部であってよい（すなわち、反射するかまたは部分的に反射する表面）。表面１０９は、粒子１０８の撮像を可能にするために、十分に顕微鏡的に平滑であってよい。検出アレイ２００（図３参照）における捕捉表面領域の略（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ）平面アレイは、光学的検出を単純化することもできる。
【００９３】
一例において、図１Ｅは、粒子１０８の各型が（例えば、蛍光標識またはホログラフィー画像特性によって）識別可能である粒子１０８の不均一混合物を各々有するカバーグラスの、区別して処理されている表面領域（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）のトップダウンの図を示す。なお、各表面１０９は、粒子１０８の不均一集団の移動度の指標に関して、異なる相互作用を生じさせる（すなわち、異なる型の粒子１０８は各領域においてより高い移動度を示す）。図１Ｅは、本発明による、区別して処理されている表面１０９の領域を有するまたは有さない粒子１０８の、識別可能な不均一性を利用することによって、どれくらい多くの異なる型の相互作用を同時に調べる（ｐｒｏｂｅｄ）ことができるか（すなわち、マルチプレックス測定）について示す。
【００９４】
試料
一実施形態において、異なる量または同様の量におけるレジーム（ｒｅｇｉｍｅ）についての各型の粒子テストと共に、粒子１０８の不均一集団を同時に評価してもよい（例えば、マルチプレックス測定）。標識（例えば、蛍光、ナノ粒子）、粒子画像（異なる吸収、散乱、蛍光、ルミネセンス特性、蛍光もしくはルミネセンス発光プロファイル、蛍光もしくは発光分解期間、および／または粒子位置等（粒子型の制御されている沈積を仮定する）による）に基づいて、全てまたはいくつかの型の粒子１０８は識別されてもよい。全てまたはいくつかの型の粒子１０８は、各粒子１０８の多様なデータ収集によって識別されてもよい。粒子１０８の均一集団は同時に評価されてもよい。
【００９５】
一実施形態において、生体分子Ａでコーティングされた粒子１０８を含む試料１０７は、生体分子Ｂでコーティングされた表面（すなわち、固相）に接触する。試料１０７溶液は、生体分子Ａを含有してよく、他の型の生体分子（例えば、生体分子Ｃ、Ｄ、Ｅ等）を含有しても含有しなくてもよい。この方法の試料測定は、制御されているまたは熱的な力に応答した粒子移動度の分析によって、研究、産業および／または臨床目的のための、溶液の存在下における粒子１０８と表面１０９との間の生体分子相互作用の情報を生じさせる。
【００９６】
本発明による一実施形態において、血液型判定の用途に関して、粒子１０は、溶液中に存在する拡散部分に結合し得る表面抗原を有する細胞／ビーズ１０８である。更に、この部分は、適切に処理されている表面（固相）と同時に結合することが可能であり得る。このように、溶液中の部分の存在または量は、適切に処理されている表面１０９（固相）上の適切にコーティングされている粒子１０８の移動度を測定することによって測定され得る。かかる拡散種の存在は、濃度依存的方法で結合細胞／ビーズ１０８の移動度に影響を及ぼし得る。この型の測定は、粒子のための捕捉剤として作用する、自由に拡散している標的部分の有無および／または濃度を決定するために用いられ得る。
【００９７】
血液型判定の例示的な実施形態において、細胞／粒子表面上において特定の抗原をプローブする場合、透明表面１０９のための適切な表面処理は、適切なリンカー分子で表面１０９を化学修飾して、表面１０９に適切な抗体を付着させることが可能となり、透明表面１０９上に表面抗体を有する標的抗原を提示する細胞／粒子１０８の特異的結合を可能にすることを含んでよい。この場合、表面１０８ａ上に標的抗原を有さない細胞／粒子１０８は、透明表面１０９の表面と特異的に結合しない。例えば、細胞／粒子１０８の拡散特性（例えば、有効拡散係数、有効粘性または粘弾性特性）を測定する場合（後に考察される）、不活性表面１０９を用いることができる。
【００９８】
一実施形態において、粒子１０８がコーティングされるか、または、そうでなければ、蛍光性または発光性放出スペクトルに基づいて粒子型によって識別される、埋め込まれている蛍光性もしくは発光性分子もしくはナノ粒子を有する場合、顕微鏡装置１０は、蛍光性、発光性の励起源、適切なフィルタおよび二色性素子ならびにカラー検出能（例えば、カラーカメラ１１２および／または放出フィルタ選択）を備えるものとする。一意的（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）にコーティングされている各型を有する、異なった型の粒子１０８の導入は、測定をマルチプレックス（すなわち、同時に複数の型の相互作用の測定）することができる。陽性結合相互作用を示す所定の粒子１０８の存在ではなく、陽性結合を示す粒子の移動度測定であるため、多くの伝統的な蛍光定量的マルチプレックス測定と異なり、別の洗浄ステップが必須ではない。
【００９９】
試料ホルダおよび流体機器
以下は、前に記載された計器装備と共に、試料内の粒子の移動度を決定するための手段である。
【０１００】
実施形態１
本発明による一実施形態において、試料ホルダ１０５は、ガラスまたはプラスチック製の単純な顕微鏡スライドを含み、その透明表面１０９上には、粒子１０８が配置されるかまたは沈降される（図１Ａ〜１Ｃ参照）。典型的には、カバーグラスが試料の上に配置される。
【０１０１】
実施形態２
本発明による更に別の一実施形態において、透明試料ホルダ１０５は、単純な受動的マイクロ流体カートリッジ１１６（図１Ｆ参照）を含む。本実施形態において、閉じた試料マイクロ流体カートリッジ１１６は、２つのポート（すなわち、入口４０１、出口４０２）と、その間にチャンバ１１８とを含む（図Ａ参照）。検出アレイ２００は、捕捉表面領域２１０、２１１、２１２の下方に結合され、所望の、特定の用途のための適切な化学処理を受ける。粒子１０８の試料溶液１０７を入口４０１に導入し、粒子は、表面１０９および検出アレイ２００の捕捉表面領域２１０、２１１、２１２上に沈降する（図Ｂ〜Ｄ参照）。結合相互作用は、顕微鏡装置１０を用いて観測することができる。
【０１０２】
実施形態３
本発明による更に別の一実施形態において、透明試料ホルダ１０５は、ウェルプレート（標準的なマイクロタイタープレートまたはカスタムメイドのウェルプレートまたはウェルを有する他のカートリッジ）を含む。本実施形態において、オープンウェル試料カートリッジ１６１は、チャンバ１１８のための、中心に開口部を有する透明試料ホルダ１０５を含む（図１Ｇ、図Ａ参照）。カバーガラス１６２は下方に結合される。カバーガラス１６２は、所望の、特定の用途のための適切な化学処理を受ける。キャップ（例えば、図１Ｈのキャップ４１７等）は、チャンバ１１８の開口部を覆って配置されてよい。粒子１０８の試料溶液１０７は、チャンバ１１８内に配置され、捕捉表面領域２１０、２１１、２１２を含む表面１０９上に沈降し（図１Ｇ、図Ｂ〜Ｃ参照）、結合相互作用は、顕微鏡装置（ｍｉｃｒｏｓｏｐｙ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）１０を用いて観測することができる。
【０１０３】
実施形態４
本発明による別の一実施形態において、実施形態３のマイクロタイタープレートまたはウェルを有する適切な代替物は、光学的に透明なキャップ、試料搬送領域、試料観察領域等を含むカスタマイズされた構成を有しても有さなくてもよい。例えば、マイクロタイタープレートまたはウェルを有する別のカートリッジは、キャップまたは蓋を有するオープンウェルディスポーザブルであってよい。特に、キャップ４１７をマイクロ流体ウェルプレート４１６と共に用いて（図１Ｈ参照）もよく、それによって本発明を実施することができる。キャップ４１７は、一定のインキュベーション中および／または測定ステップ中に、上面を準備するためにウェル４１８内に配置される。任意で、ガスケット４５０は、キャップ４１７とウェルプレートまたはウェルを有する他のカートリッジ４１６との間の封止を作るために用いることができる。封止は、例えば所定の位置にキャップ４１７を保持するために、位置４５１または他の位置で形成されてもよく、オーバフローリザーバ４５２によって、過剰な溶液がウェルチャンバ１１８から移動する際に行く場所ができる。
【０１０４】
プローブ赤血球のような粒子１０８は、ウェル４１６の底部内に配置される。ウェル４１８内のキャップ４１７は、捕捉表面領域２１０等とウェルチャンバ１１８の天井を形成するキャップ４１７の底部表面との間の固定スペース（例えば、約１００ミクロン）を規定する。ウェル４１８内に配置されるキャップ４１７の利益は、液の高さが非常に短いことであり、それによって：１）粒子／ＲＢＣ１０８の沈殿が非常に速やかに生じることが可能になり、２）沈殿、結合または測定値を妨げ得る三次元流れ（ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｆｌｏｗｓ）を抑制し、３）蒸発が生じる可能性があり、かつ振動が表面波およびバルク対流を誘導する可能性がある、自由表面を除去するかまたは最小化し、４）マイクロ流体プレートの手動またはロボット動作中の流体の予想外の流れを抑制し、ならびに他の重要な利益である。
【０１０５】
実施形態５
本発明による別の一実施形態において、単純なマイクロ流体試料カートリッジ１１６は、１つまたは複数の溶液のための入口４０１及び出口４０２を含む（例えば、図１Ｆ、図Ａ参照）。マイクロ流体カートリッジ１１６は、前記入口４０１および出口４０２のための２つの開口部及び試料チャンバのための中心開口部１１８を有する上層を有するプラスチックの２枚の薄板を切断することによって作製される。第２の層は、その上にパターンを有し、チャネルが中心チャンバ１１８に入る。２枚の層を一緒に接着し、適切な化学的特徴をその上に有するカバーガラス２００を下方に接着する。溶液が入口開口部４０に加えられ、チャネルを通って、捕捉表面領域２１０〜２１２を有するカバーガラス２００に接触する中間試料チャンバ１１８に流れ、かつ出口チャネルおよび出口４０２に流れる。適切な量の流体が導入される場合、溶液は、それ自体で流れ、チャンバ１１８の内部に到着する際、または出口４０２に到着する際に停止する。あるいは、機器によって流体を能動的にポンプしてもよい。
【０１０６】
実施形態６
本発明による別の一実施形態において、マイクロ流体試料カートリッジ１１６は、結合実験のために官能化されている、カバーガラスまたは基板２００上の３つの領域２１０、２１１、２１２を含む（すなわち、３つの捕捉表面領域２１０、２１１、２１２を有する）（例えば、図３参照）。これは、本明細書において更に考察される血液型判定実験のために用いられる例である。
【０１０７】
更なる実施形態
マイクロ流体カートリッジは、自動流体機器またはウェル型機器であってよく、本明細書に記載されるように、各々はデータ取得および分析に対応している（すなわち、顕微鏡装置１０）。粒子１０８は、マイクロ流体機器の試料チャンバ１１８に流しこまれるか、または多くの試料１０７（溶液と共に粒子１０８）を異なるウェルに導入するロボットピペット操作装置によってウェル機器に導入される。ウェル機器において、各ウェルは、一意の表面化学的特徴を有してよく、位置によってインデックス付けされ、それによって独立した結合アッセイ等の複数のテストを実施することが可能になり、最終的に単一の試料１０７（または複数の試料１０７）を複数の表面１０９でテストすることが可能になる。
【０１０８】
本明細書に概説される計器装備は、試料容器から各ウェルへの自動（および並列化可能）流体搬送、試料混合およびインキュベーション能力、ならびにプログラム可能でかつ自動化されてよい並列化測定能力のためのロボット機械と一体化されてもよい。しかるに、アッセイは、並列様式で、１つまたは多くの試料１０７に対して複数のテストを実施するように設計され得る。更に、複数のマイクロ流体またはウェル機器は、適切に並列化された光学的系列（ｔｒａｉｎ）および検出機構（ｓｅｔ−ｕｐ）により並列様式で測定されてもよい。ロボット装置は、自動様式で測定のための検出領域内にマイクロ流体またはウェル機器を供給することができ、それによって、使用者の介入なしで多くの試料を測定することが可能になる。
【０１０９】
所定の試料チャンバ、マイクロ流体試料チャンバまたはウェル機器内における測定は、溶液、粒子もしくは混合物の添加、または溶液、粒子もしくは混合物の交換、および／または異なる温度でのインキュベーションの後で繰り返されてもよい。
【０１１０】
滴定測定は、更なる分析物をチャンバ／ウェル溶液に導入することによって、所定の試料チャンバ、マイクロ流体試料チャンバまたはカートリッジウェル内で実施されてもよい。
【０１１１】
更に、動力学実験は、粒子移動度測定値（例えば、本明細書で更に考察されている正常標準偏差（ｎｏｒｍａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）（ＮＳＤ））の時間経過を追うことによって、所定の試料チャンバ、マイクロ流体試料チャンバまたはマイクロタイタープレートウェル内で実施されてもよい。これは、更なる分析物をチャンバ／ウェル溶液に導入するかどうかにかかわらず、行われてもよい。
【０１１２】
ディスポーザブルおよび計器装備
本発明による一実施形態によるチップ設計は、例えば、ＡＢＯ／Ｒｈ血液型判定、抗体スクリーニングおよび血漿濾過または分離を実施することができ、弱Ｄ抗原に加えて、拡大（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）表現型検査、直接抗グロブリンテスト（ＤＡＴ）および抗体同定を実施することができる免疫診断用使い捨てカートリッジを包含する（これらの用途の更なる説明のについては下記参照）。使い捨て可能な設計は図２４に示され、それは、オモテ試験血液検査およびウラ試験血液検査のためのＡＢＯ／Ｒｈカートリッジ（８つの試料）、抗体スクリーニングのためのカートリッジ（８つの試料）、および濾過のためのもの（２つの試料）を示す。図２５のフローチャートは、オモテ試験、オモテ試験対照、ウラ試験、ウラ試験対照、抗体スクリーニングおよび抗体スクリーニング対照のためのプロセスステップの概要を示す。これらのプロセスステップは、示される通りの能動的ディスポーザブルまたは単純な受動的ディスポーザブルを含む各種の構成で実施されてもよい。フローチャートに示されるテストそれ自体は、本発明の用途に関して、更に以下で説明される。１セットのプロセスステップだけが示されるが、同様の結果を達成するための、またはある種のパフォーマンスまたは他の特性に最適化するために、これらのプロセスステップを変更するための多くの方法がある。
【０１１３】
本発明による一実施形態により、濾過ディスポーザブル６０１、ＡＢＯ／Ｒｈディスポーザブル６０２および抗体スクリーニング（ＡｂＳ）６０３ディスポーザブルをテストのために挿入した計器６００は、図２６に示される。ディスポーザブル６０１、６０２、６０３は特定の領域に挿入され、計器６００は、濾過ディスポーザブル６０１（１６０の試料）の８０のカートリッジ、ＡＢＯ／Ｒｈディスポーザブル（８００の試料）の１００のカートリッジ、およびＡｂＳディスポーザブル（８００の試料）の１００のカートリッジを収容することができる。
【０１１４】
計器６００は、（バーコードリーダを有する）チューブ台６０４用セクション、スタットテスト用ピペット操作ステーション６０５、非スタットテスト用ピペット操作ステーション６０６、３７℃インキュベーション領域６０７、２５℃インキュベーション領域６０８、スタット濾過ステーション６０９、非スタット濾過領域６１０、スナップイン液カートリッジ領域６１１、テスト実施照明領域６１２、及び結果読み取り用リーダ６１３とを有する。
【０１１５】
本発明の計器６００は、完全に自動化され、コンピュータ制御され、全血チューブおよびバイアルを受け入れ（チューブ台６０４参照）、従来のテストのような結果の手動読み取りを必要としない。更に、本発明のディスポーザブルは、インプットとしての遠心分離された血液を必要とせず（しかるに、それがディスポーザブルのうちの１つにおいて、全血から血漿を分離するので外部の遠心分離を必要せず）、幾つかの試薬、および、任意に、ディスポーザブル自体に幾つかの対照を有する。しかるに、たとえどんな処理が必要であろうとも、血漿抽出、溶液混合および細胞希釈等全てが、複合したコンピュータ制御の計器およびディスポーザブルによって、使用者の相互作用なしで行われる。
【０１１６】
単一のテストは１０分かかり、１時間当たり１２のテストのバッチを実施することができる。しかるに、本発明によって使用されているディスポーザブルによって、血液型判定およびスクリーニングのような用途は、従来方法より非常に速く実施することができる。
【０１１７】
活性化方法および装置
結合相互作用が生じるかどうかを決定するために、移動ステージ１１４、粒子１０８、または粒子１０８の周囲の液に、力を印加するために用いられる活性化方法を提供する本発明による幾つかの実施形態がある。具体的には、物理的力印加手段は、以下のいずれかのもの等の外部活性化手段を用いた、移動ステージ１１４、粒子１０８、または粒子１０８の周囲の液の、突然のまたは連続的に周期的な移動を含む。
【０１１８】
ａ）空気圧／油圧振動子
図２Ａは、それぞれ高圧力源および低圧力源４０３、４０４を含む、例示的な空気圧または油圧圧力ポンプ１１７に接続した、入口４０１と出口４０２とを有するマイクロ流体機器１１６の使い捨て測定チャンバ１１８を示す。ソレノイドバルブ４０５は、所定の振動数でチャンバ１１８内の試料１０７に一連の空気圧／油圧圧力パルスを作り出す。
【０１１９】
明視野照明下で行われる実験において、４×拡大倍率対物レンズで、自由に拡散しているまたは結合しているシリカビーズ（４．８μｍ）を、全体に振動圧力差が適用されたチャンバ１１８内部において水中で懸濁した。振動圧力差は、粒子１０８の周囲の液を穏やかに摂動させ、それによってランダム熱的力よりも大きな合力が粒子１０８に対して生じ、しかるに結合および非結合粒子１０８の動きにより大きな差が生じる。図２３に示すように、活性化非結合ビーズについての測定された正規化標準偏差（ＮＳＤ）値の分布は、より高い平均およびより狭い幅を有するが、一方で結合ビーズについては、それはほとんど変わっていない（ＮＳＤ方法の更なる説明については下記参照）。結合および非結合の分布のすそ（ｔａｉｌｓ）は、活性化なしではいくらかが重複しているが、活性化試料によって、２つの分布のすそを分離する大きな空間がある。しかるに、結合ビーズは、より容易に、かつ確実に非結合ビーズから識別することができる。測定の不確かさまたはノイズが懸念され得る状況において、この増幅シグナルは、信頼水準を大きく向上させることができる。
【０１２０】
ｂ）圧電性油圧アクチュエータ
図２Ｂは、所定の振動数および振幅でチャンバ１１８内の試料１０７への振動性の流れを生成するための、例示的な圧電性油圧アクチュエータ４０６に接続した、入口４０１と出口４０２とを有するマイクロ流体機器１１６の使い捨て測定チャンバ１１８を示す。ダイヤフラム膜４０７は、任意で、圧電性油圧アクチュエータ（ｐｅｉｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ−ｈｙｄｒａｕｌｉｃ  ａｃｔｕａｔｏｒ）４０６を作動さ得る油圧油またはガス状メディア４０８を用いてもよい。
【０１２１】
ｃ）圧電性ステージ振動子
図２Ｃは、制御シグナルをインサート４０９の振動性運動に変換し得る圧電性アクチュエータ４０６に付着した、移動ステージインサート４０９を含む、例示的な圧電性ステージ振動子を示す。次いで、インサート４０９の移動は、測定チャンバ１１８内部の粒子１０８の周期運動に転移されるようになる。
【０１２２】
ｄ）空気圧または油圧バルブ開閉／摂動
図２Ｄは、空気圧／油圧制御ライン４１１およびポート４１２による、加圧または真空システムによってオンチップダイヤフラム膜４０７を駆動させる、例示的な空気圧または油圧バルブ開閉／摂動機器を示す。膜バルブ４１３は、試料１０７をバルブ開閉するかまたはポンプするために動き、それにより流れを引き起こすダイヤフラム膜４０７を含む。
【０１２３】
ｅ）熱アクチュエータ
図２Ｅは、加熱素子４１４、ダイヤフラム膜４０７、及びそれらの間に封止されるガス状材料（または他の高熱膨張材料）４０８を含有する、例示的な熱アクチュエータを示す。温度が増加または減少することによって測定チャンバ１１８内部で試料１０７を振動させるために、膜４０７を動かすか、または収縮させる際に、サーモロイド（ｔｈｅｒｍｏｌｏｉｄ）材料の体積が著しく変化する可能性がある。
【０１２４】
ｆ）音響放射
図２Ｆは、試料１０またはチャンバ１１８内部で試料の周囲の液の周期的振動移動を引き起こす、測定チャンバ１１８を通して音響波を伝播させる、例示的な音響源４１５（すなわち、音波または超音波エミッタ）を示す。これは、示されているように、または試料１０７に対する音響源の代替の配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で行われてもよい。例えば、音響源４１５は、試料１０７の別の側または上部に沿って配置されてもよい。システムは、定常波パターンを避けるように、または複数または多くの振動数を一度に放出することによって時間と共にまたは一度で様々な状態を経験する広範な定常波パターンを有するように定常波パターンをセットアップするような方法で駆動されてもよい。
【０１２５】
ｇ）ウェルキャップ活性化
本実施形態において、「オープンウェル試料カートリッジ」は、１シートのプラスチックに孔をあけて、複数のパッチまたは捕捉表面領域２１０等を有する基板１６２を下方に付着することによって形成された、プラスチックカートリッジ１１６を含んで設計された（例えば、図１Ｇ参照）。キャップ７００（図２Ｇ、図Ａ参照）は、ウェル７０５の端部に張り出す一片の透明プラスチックから作製される。キャップ７００は、良好な光学的質を提供するために上部および底部において磨かれる。キャップ７００の底部は、基板７０１の上部から規定された距離であるべきである。この距離は、好ましくは少なくとも２５μｍ、１ｍｍ未満であるべきである。粒子１０８は、基板７０１とキャップ７００の底部との間に閉じ込められる。
【０１２６】
ウェル７０５においてキャップを前後に摺動させるための機構７０４と共に、ウェルキャップ７００を用いることができる。ウェルキャップ活性化機構は、関数発生器（ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）（図示せず）によって駆動されるソレノイドコイル（例えば、拡声器）にワイヤを介してウェルキャップ７００が接続されている、線形ソレノイドアクチュエータ７０４（図Ｂ参照）を使用することを含む、様々な方法で実行され得る。コントローラ７０３は、時間と共に電流を（そして、しかるに、時間と共に力を）制御する。キャップ７００の回転なしで１本の線形軸に沿った運動を制限するために、運動ガイド７０２がシステム内に含まれ得るが、それを行うために他の適切な方法を用いてもよい。
【０１２７】
本発明による別の一実施形態において、ウェルキャップ７００はマウントに堅固に付着し、圧電性アクチュエータ７０４はキャップ７００を左右に駆動する（図Ｃ参照）。より正確な移動を達成するために、あらゆる適切なアクチュエータを用いてよい。
【０１２８】
キャップ７００の使用は、対流、蒸発、輸送中の液のスロッシング、振動に対する感受性、粒子の非均一沈殿、底部表面（すなわち、捕捉表面領域）に沿った粒子の予期しない回転、および他の望ましくない交絡効果を大きく減少させる。キャップの使用はまたシステムの高さも制約し、それによって、粒子の落下が速ければ速いほど、すぐに捕捉表面領域と相互作用し、測定を行うことができるため、粒子が表面に沈殿する時間量が減少する。
【０１２９】
しかるに、ウェルキャップ７００のいずれの実施形態においても、波形（大部分の時間にわたって等速であるので三角波が最も単純である）、振動数（約１０年以内で、約１Ｈｚ）および振幅（係数が５または１０以内で、約２００ミクロン）を全て制御することができる。しかるに、移動の量ならびに印加した力の大きさは、全て制御することができる。特異的結合（ＳＢ）と非特異的結合（ＮＳＢ）との間を区別するために、力を投入することができ、−すなわち、ＮＳＢがＳＢより弱い場合、より弱いＮＳＢ結合を離断させ、より強いＳＢ結合を離断させない力が得られる。しかるに、より良好な別々の結合および非結合粒子／細胞１０８に、試料１０７を押しつける（ｊｏｓｔｌｅｄ）ことができる。これによって、結合の決定が、焦点合わせ、照明、ダストまたは不良等の測定ノイズに対して更により頑健になる。更に、機構４１９を利用する場合に非結合性粒子がより移動するので、それは、測定期間中に結合部位を見出すべきだったがそうならなかった粒子１０８が基板上に結合部位を見出すことに役立つ。この機構をインキュベーション段階中に連続的に、または断続的に用いることも可能であり、測定期間中またはそれ以外のどちらでも活性化を実施することができる。
【０１３０】
上記の実施形態が記載されているが、当業者は、測定チャンバ１１８内において物理的力を試料１０７に印加するために実現することが可能な他の活性化方法および装置があるということを知っているだろう。
【０１３１】
これらの活性化方法の長所としては、１）結合および非結合粒子間のより強い分離；２）照度変化、振動、わずかに焦点の合わない粒子、試料の平坦度における不完全性、ステージまたは試料の不完全な水平化、および測定にノイズを導入する他の問題に対するより大きな頑健性、３）ＮＳＢが活性化方法の駆動力より低い結合力を有し得る場合にＮＳＢと特異的結合とを区別することによって非特異的結合（ＮＳＢ）を潜在的、能動的に克服すること、及び４）迅速な結合および／またはより強い結合を可能にし、それによってテスト測定値の速度を上げる、粒子と基板との間の構成のより速い調査を促すこと、が挙げられる。
【０１３２】
方法
焦点合わせバックグラウンド
本発明の方法を行う前に、最も良い結果を達成するために、顕微鏡検査機器の焦点合わせを実施してよい。典型的な光学顕微鏡においてシャープな画像を達成することは、たいてい単一ミクロンスケールにおける焦点精度を必要とする。より少ない開口数は、若干、より少ない焦点精度を必要とするあまりシャープでない画像とより大きな焦点深度とを生じさせる可能性があり、適切なアルゴリズムの選択も、焦点に対する許容度をいくぶん低下させる可能性がある。しかし、焦点許容度は、典型的にはまだミクロンまたは数十ミクロンスケールである。
【０１３３】
伝統的な焦点合わせ技術は、複数の焦点シフトと、これらの異なる焦点位置で取得された画像の比較とを必要とする。焦点指標を各画像に適用することによって、焦点シフトが真の焦点位置に接近しているかどうかについての決定を行うことができる。ほとんどの場合、これは、顕微鏡検査の用途で必要とされる、焦点精度を与える時間のかかるプロセスであり得る。更に、複数の視野、試料チャンバ、マイクロ流体チャンバまたはマイクロタイタウェルプレートの測定は、複数の再焦点合わせ事象を必要とする可能性がある。焦点を決定するために試料を複数回物理的に移動させるという事実により、かかる技術は時間がかかるようになる。かかる測定システムの処理能力を増加させるためには、焦点合わせの時間を最小に維持するべきである。
【０１３４】
ホログラフィー焦点合わせ
伝統的な顕微鏡検査技術とは対照的に、粒子１０８を照明するためのコヒーレント源１００Ｂの使用は、速い様式で粒子１０８の正確な焦点面を決定するために試料１０７の単一の焦点の合っていない画像の数値的処理を可能にする（図１Ｃ参照）。例えばコヒーレント源１００Ｂを用いて、透明試料チャンバ１１８内の粒子１０８の試料１０７を照明することは、著しく焦点が合っていない場合でさえ、粒子１０８の回折パターンの撮像を可能にする。焦点合わせに対する数値的解決法は、長い範囲の焦点の合っていない距離にわたって、速い焦点合わせを可能にする。数値的焦点合わせは、焦点を数値的に決定することを可能にする異なった距離への焦点の合わない画像の伝播を含む。焦点指標を各数値的に伝播させた画像と関連づけることによって、焦点指標における極値を見出すことが可能になり、それによって、単一のステージの移動が、必要な焦点位置内で試料を位置づけることを可能にする。これは、いくつかの焦点指標に従って焦点位置を決定するために異なる焦点距離によって比較的時間のかかる試料の物理的走査を必要とする伝統的な焦点合わせ方法とは対照的である。
【０１３５】
しかるに、取得した焦点の合わない回折パターンを、焦点指標を最大にする距離を決定するために距離の範囲にわたって数値的に伝播させてもよい（例えば、Ｗ．Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．Ａ，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１０，３０５４−６２，２００７参照）。一旦この距離が数値的に決定されると、必要な焦点位置に試料１０７を位置づけるために単一ステージ移動を実施することができる。
【０１３６】
専用の焦点合わせカメラ（図示せず）を、数値的伝播算出を実施する画像の取得に用いることができる。一実施形態において、このカメラは、移動度測定値のために用いられるカメラ１１２とは異なる撮像面に配置されてもよい。しかるに、焦点合わせ算出は、測定カメラ１１２と比較して焦点の合わない面内に配置されたこの別の焦点合わせカメラから回収された画像から実施される。
【０１３７】
焦点合わせならびに移動度測定の両方のために単一のカメラ１１２を用いることも可能である。焦点のはずれた試料１０７が制御された後に、焦点合わせ目的のための画像を回収することができる。
【０１３８】
図１０は、真の焦点位置より１ｍｍ上から真の焦点位置の１ｍｍ下まで走査された較正試料１０７（図１Ｃ参照）からの数値的に伝播している画像から作成された較正曲線を示す。画像を、焦点位置から１ｍｍ離れてずらされた（ｄｉｓｐｌａｃｅｄ）、専用の焦点合わせカメラに回収した。用いた対物レンズ１４２は、低拡大倍率および低数値的開口部対物レンズを有した。また、校正曲線は、同様に、別の対物レンズ１４２およびＣＣＤ位置によって作成されてもよい。較正曲線のｘ軸は、焦点位置に対して較正試料１０７が移動した実際の距離を示し、ｙ軸値は、数値的に伝播されている焦点の合わない画像の焦点指標のピークの位置を示す。焦点位置からはるかに著しく焦点がずれた試料１０７については、所望の焦点合わせ精度を達成するために、１回を超える数値的焦点繰り返しを必要とする可能性がある。より一般的には、とりわけメディア界面（例えば、空気−ガラス界面またはガラス−水界面）が真の焦点位置と焦点の合わない位置との間に生じる場合、所望の精度を確保するために、１回を超える再焦点合わせステップを用いることができる。
【０１３９】
図１１は、３回の焦点合わせの繰り返しを＋ｌｍｍから−１ｍｍまでの範囲で最初の開始位置の範囲について実施する場合の、図１０の較正曲線を用いた焦点合わせの実施を示す。真の焦点位置は、視覚的に決定されたが、約±１μｍの誤差を有する。焦点面に対する最終位置の値は、視覚的に決定された焦点位置測定値の推定誤差の範囲内まで正確である。
【０１４０】
沈降
上記の装置において本発明を実施する方法は、顕微鏡的粒子の集団をチャンバに導入すること、及びあらゆる結合相互作用を測定するために表面上に粒子を沈降させることを含む。
【０１４１】
本発明は、基板２００上に粒子１０８を沈降するための各種システムを用いてよい。それらとして、本技術分野において周知の重力、遠心、流通系、拡散系、磁気系およびホログラフィーツィージングシステム（ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｔｗｅｅｚｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ）が挙げられる。
【０１４２】
重力系システム
一実施形態において、粒子は、重力に応答して基板上に速やかに沈降するのに、十分に大きく、十分な密度がある。この目的のために、粒子１０８は５００ｎｍより大きくてよく、１μｍと同じくらい大きい粒子が利用される。本実施形態において、スライドまたはチャンバを逆にし、非結合粒子（すなわち、細胞／コロイド）を表面１０９から落下させる。粒子１０８を沈殿させてパターン化基板２００と接触させる。スライドまたはチャンバをリアルタイムにモニタすることができるか、または粒子を設定時間の間落下させることでき、次いで結合材料についてスライドまたはチャンバを検討する（すなわち、画像分析を実施する）。このシステムの長所は、外部の試薬の必要がなく、ほとんど移動部品がなく、費用効果的であり、外力機構が必要とされないということである。
【０１４３】
遠心系システム
一実施形態において、遠心系システムが用いられ、表面１０９から粒子を除去するために遠心力を用いることを除いては、上方の重力系システムと同様である。スライドまたはチャンバを回転させ、設定時間後、遠心システムを停止し、結合について検討する（すなわち、画像分析を実施する）。このシステムは、重力系システムと同じ効果を有し、非常に大きなダイナミックレンジを実施することができるという更なる長所がある。
【０１４４】
流通系システム
一実施形態において、表面１０９に結合した粒子を過ぎて溶液を流し、結合を探索するために粘性抵抗力を用いる、流通系システムを用いる。流れは、シリンジポンプまたは電気泳動的な流れ（例えば、個別テストを用いる）によって生じる。検出システムがフロー−サイトメータセットアップを含んでよい、または粒子除去をモニタするために単純なＣＣＤ／画像分析を用いてよい。このシステムにおいて較正を必要とする場合がある。このシステムは、相対的に安価であるという長所を有し、非常に大きなダイナミックレンジを有し、非常に速い。
【０１４５】
拡散系システム
一実施形態においては、粒子１０８を官能化表面１０９に沈殿させ、撮像分析を用いてブラウン運動の振幅を測定する、拡散系システムを利用する。このシステムの長所は、それが費用効果的であり、外力機構を必要とせず、外部試薬が必要ではなく、移動部品がないことである。
【０１４６】
磁気系システム
一実施形態においては、粒子（すなわち、細胞、常磁性コロイド）を官能化表面１０９に沈殿させる、磁気系システムを用いる。細胞の場合、次いで官能化磁気コロイドが溶液内に分散され、細胞表面に結合する。次いで磁場勾配を適用される（バルク、または試料細胞の外側のプローブで）。非結合細胞／コロイドを除去し、Ｂ視野顕微鏡における撮像分析またはフィードバックループを用いて結合をモニタする。長所としては、非撮像系検出のポテンシャル、相対的に大きなダイナミックレンジ、バルクおよび顕微鏡的適用視野のポテンシャル、ならびにそれが速いことが挙げられる。
【０１４７】
ホログラフィー光学的ツィージング
一実施形態において、公知の方法によるホログラフィー光学的ツィージングは、チャンバ１１８の表面に粒子を光学的にトラップし、移動させることができる。結合相互作用を検出するために画像分析を実施する。長所としては、ほとんど移動部品がないこと、外部試薬がないこと、連続的に調節可能な印加力が挙げられる。
【０１４８】
結合技術
図１Ａ〜１Ｃは、本発明を実施するための顕微鏡装置１０を示す。粒子１０８を含有する溶液を、スライドに配置するか、またはウェルプレートもしくはマイクロ流体機器１１６のチャンバ１１８を通って、基板２００を横切って流し、粒子は、（上記に記載されるように）重力、遠心力等に従って表面１０９上に沈降する。粒子１０８が基板２００上（または他の粒子１０８上）の捕捉表面領域２１０、２１１、２１２等に結合するかどうかを同定するために粒子１０８を検討する（図３参照）。
【０１４９】
一実施形態において、基板２００上の捕捉表面領域２１０等は、基板２００を所定の分析物または他の化学物質と特異的に相互作用し得るようにする結合プローブを含む。「プローブ」は、その所定の標的粒子、分子、集合体、リガンドまたは部分に対する特異的結合選好性（「特異性」）を有する分子構成要素、粒子、または分子構成要素の集合体である。分析物は、基板２００の表面上、粒子の表面上または溶液中にあり得る。捕捉表面領域２１０等は、複合体；例えば１個以上の共有結合または非共有結合分子または粒子を有する固定分子の一部であるプローブを含んでよい。基板２００はまた、１回または複数回であろうと、そして規則正しく間隔を置かれるか、周期的に間隔を置かれるか、またはそれ以外の場合であろうと、基板２００上の別々の空間位置で配置されたプローブのアレイまたは複数の集合の要素を含んでもよい。基板または検出アレイ２００は、異なる特異性を有し得る複数の捕捉表面領域２１０、２１１、２１２等を含むことができる。
【０１５０】
粒子１０８の表面は、構成要素、例えばいずれかの分子、分子集合体、マクロ分子、マクロ分子集合体または部分である「化学種」を含む。「化学種」という用語は、明示的に、生物学的および非生物学的マクロ分子、例えば、ペプチド、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質、抗体、核酸、ポリマー、薬物複合体等を含む。
【０１５１】
本発明において、ガラススライド１０５、カバーグラス、プラスチックまたはシリコン基板は、検出アレイ２００、例えばＤＮＡアレイ、タンパク質アレイまたはマイクロアレイを形成するために特異的プローブを有する複数の捕捉表面領域２１０等を有してよい。捕捉表面領域２１０等のあらゆるスケールは、本発明の範囲内である。より詳しくは、捕捉表面領域２１０は、マイクロメートルからセンチメートルの範囲内であってよく、粒子１０８より大きくてもよく、その場合、それは溶液中で複数の粒子１０８と相互作用することができる。その上、スケールは、検出アレイ２００の全体にわたって均一である必要はない。本明細書に記載される例は平面基板２００に関して述べられているが、捕捉表面領域２１０等は非平面基板または第２の粒子の表面であってもよく；例えば、より小さい粒子は、捕捉表面領域２１０を形成するようにコーティングされたより大きな粒子と相互作用することが観測され得る。
【０１５２】
一実施形態において、粒子１０８を含有する溶液を基板２００を横切ってチャンバ１１８内に流し、粒子１０８を基板２００上の捕捉表面領域２１０、２１１、２１２等に接触させる。上記のように、接触は、重力による粒子の沈降によって受動的に、あるいは遠心分離、電気泳動、上記の活性化方法のようなは能動的手段によって、または光学的強制、もしくはとりわけ光学的トラッピング技術を用いて粒子を基板へ移動させることによって生じる場合がある。捕捉表面領域２１０等、または基板２００のより大きな部分は、基板２００にわたって溶液を保持するために水不浸透性バリアで囲まれてもよい。例えば、マイクロ流体機器の技術分野で公知であるように、基板２００はウェル４１８を形成する壁を含んでよく、または捕捉表面領域２１０等は疎水性領域で囲まれてもよい。
【０１５３】
粒子１０８の内の少なくとも１つと基板２００の対応する捕捉表面領域２１０等との間の接触の後、特異的な化学物質が少なくとも１つの粒子１０８の表面上に存在する場合、特異的な結合相互作用がそれらの間で生じる可能性がある。その場合、粒子１０８と表面１０９との間の結合は「表面会合」粒子を生成する。大部分の分析の目的のために、結合相互作用は非共有性であるが、特異的共有結合相互作用も考えられる。更に、複数のプローブ分子が捕捉表面領域２１０等によって提示される場合、この粒子１０８との相互作用は多価性であってよい。
【０１５４】
以下でより詳細に記載されるように、溶液中における分子の分析のためには、特異的化学物質を基板２０上の表面上に提供することができる（それは典型的には存在する）が、一方で粒子表面（例えば、細胞表面）の分析のためには、特異的化学物質の存在または量は、もちろん対照または較正反応の場合を除いて、一般に未知である。
【０１５５】
溶液中における粒子１０８の沈降のため、重力または他の方法の下で、捕捉表面領域２１０等との接触または近接性を確保することができる。必須の結合パートナー種が捕捉表面領域２１０および粒子表面上で見出される場合、表面１０９への粒子の近接性は、パートナー化学種が急速な結合相互作用を促進するように近接することを確保するように作用する。これは、遊離分子拡散が必要とされ、かつ生じる可能性があり、それによって表面への結合の機会が限定されるあらゆる従来のアッセイと比較して有利である。しかるに、この方法は、結合を達成するための速度、ならびに達成される結合度の両方において有利であり得る。
【０１５６】
一実施形態において、粒子１０８の各々は、捕捉表面領域２１０等上の結合分子の集合（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）に、相補的な分子の集合を有する（例えば、受容体−リガンドまたはプローブ−標的対）。その結果、複数の特異的結合反応が粒子１０８と捕捉表面領域２１０等との間に生じ、それによって粒子１０８と捕捉表面領域２１０等との間に複数の「テザー」４００を生成する。つまり、特異的結合相互作用は、特徴的なアビディティー（すなわち、多価抗体のアビディティーに類似した複数の化学的／生化学的相互作用による協同的または累積的親和性）を示す。テザー４００の相補的結合パートナーは、特異的結合反応の強さを超える結合力を有する粒子１０８および表面に付着されてもよい（例えば、共有結合で結合するか、またはビオチン−アビジン相互作用のような強い非共有結合相互作用で結合する）。上記のものは、１つの捕捉表面領域２１０等に、または異なる化学物質に対して対応する親和性を有する複数の捕捉表面領域２１０、２１１、２１２に結合する複数の粒子１０８を有する集合を含むことができる。
【０１５７】
粒子変動
本発明の一実施形態において、一旦結合した場合、粒子１０８は、捕捉表面領域２１０等へのその結合を破断せず、むしろ、粒子１０８が示す位置的自由度の程度は、分析物の有無または量を決定するために用いられ得る。
【０１５８】
本発明の一実施形態において、粒子変動は、粒子の運動の複数の連続した変化を含む。例えば、粒子１０８の運動は、ブラウン運動のため、または上記の活性化方法による力の周期的印加のため、方向を変える場合がある。かかる並進移動または位置的変動は、熱力学的変動または他の影響、例えば、ブラウン運動、対流、音響波または他の力（すなわち、活性化方法）の結果として生じる場合がある。特定の一実施形態において、粒子１０８の運動は、十分に長い時間にわたってほぼ相殺する力の結果であり；すなわち、粒子１０８に及ぼされる合力は、ほぼゼロである。相殺する力の例としては、ランダムおよび非ランダムな力、例えば周期力が挙げられる。例えば、位置的変動は、単に圧力の変動または熱エネルギーからの移動だけから生じる。
【０１５９】
一実施形態において、粒子１０８がまだ捕捉表面領域２１０等に結合したままである間、検出を増強するために、上記の活性化方法によって粒子運動の量を増加させる。本実施形態において、粒子１０８は、実質的な回転なしで、捕捉表面領域２１０等に移動することができる。別の一実施形態において、活性化方法に関して上述したように、たとえ力の印加によって運動が刺激されるとしても、この回転の結合／欠如を維持することができ、これによって測定の感度が増加する。上記のように、活性化方法からの力は、捕捉表面領域２１０への粒子１０８の特異的結合を回転／破断することなく運動を増加させるように選択される。
【０１６０】
捕捉表面領域２１０等の結合ポテンシャルが特定の温度範囲について粒子１０８との特定の親和性に適切に調整される場合、粒子１０８の位置的自由度の測定値は、捕捉表面領域２１０等と粒子１０８との間の特異的結合相互作用の存在が位置的自由度の減少量と相関することを明らかにする。測定を最も正確に実施するために、特定の温度範囲は、例えば、０℃〜４０℃、または、より詳しくは、２０℃〜４０℃であってよい。基板２００および付着した粒子１０８の温度は、熱制御機構（例えば、商業的に入手可能な温度制御顕微鏡ステージ）、水浴、インキュベータ、制御温度の空気ジェット、または他の方法を用いてこの特定範囲内で保持することができる。
【０１６１】
本発明において、チャンバ１１８内における分析物の有無または量の測定は、結合ポテンシャルのかかる条件下で行われてもよい。重力または他の手段（すなわち、遠心、光学的トラッピング等）による基板２００上の沈降の後、粒子１０８は、溶液中における局所的圧力変動の影響のために明らかにランダムな並進移動を示す可能性がある。かかる並進移動は、粒子１０８の質量中心の位置的変動を指し、回転が関連する粒子１０８の質量中心の周りの運動を指すという点で、回転とは異なる。
【０１６２】
画像取得および処理
上記の顕微鏡装置１０（図１Ａ〜１Ｃ）を用いて粒子を照明し、明視野、暗視野、位相コントラスト、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）、ホログラフィー撮像および他の光学顕微鏡検査方法が用いられてよい。レーザー照明（図１Ｃ参照）の１つの長所は、より高いコントラストであるが、明視野は、その頑健性、およびアーチファクトの散乱からのノイズの欠如の効果がある。ＤＩＣおよび位相コントラスト顕微鏡検査は、単色光干渉に関連した通常のスペックルおよびアーチファクトを示さないという効果を有する。
【０１６３】
粒子１０８の画像は、カメラ１１２によって回収され、コンピュータ１１３によって分析される。上記の活性化方法を含むランダムな熱的力および他の印加力を含む力が、粒子１０８に印加されてもよい。視野内の粒子の画像の時系列は、カメラ１１２によって取得される（少なくともＮ＝２画像、しかしより多くの画像はより高い精度を提供することができる）。選択され得る重要なパラメータは、粒子の型および撮像方法により、画像と粒子を観測した総時間との間の時間間隔を含む。
【０１６４】
画像内で分析される粒子１０８は、それらのサイズ、形状、配向性、外見、画像内に位置する場合に他の粒子に対する近接性等に基づいて選択されてよく、１つの画像または幾つかの画像に基づくことができる。粒子結合相互作用の統計的サンプリングの有意性は、測定された粒子の数に依存し、統計的有意性の増加は、分析された粒子の数が大きくなることで達成される。幾つかのシステムは、１００未満のＮで高い信頼水準を生じることができるが、他のシステムは、１，０００〜１０，０００または更にそれ以上のＮを必要とする場合がある。
【０１６５】
位置的変動の測定
位置的変動の測定は、刺激に対する表面会合粒子１０８の応答の定量的測定であり、それから所定の表面会合粒子１０８の位置的自由度が推定される。どのように粒子が、小さい力、例えばランダムな熱的力（すなわち、ブラウン運動）、音響振動による、基板／試料容器の運動によって誘導される加圧力（すなわち、バルブ）によって引き起こされる懸濁液のバルク運動、および上記の活性化方法からの他の力に応答して移動するかを観測し、定量する。
【０１６６】
位置的変動の測定は、カテゴリー的または定性的測定値（例えば、二進値）であってよい。あるいは、位置的変動の測定は定量値であってよい。例えば、位置的変動の測定は、特定の時間、捕捉表面領域２１０等の（以下に記載される）特定の「近傍」内において、１個以上の粒子１０８から散乱した光の変化を測定することによって得ることができる。位置的変動の測定は、特定の近傍内における粒子１０８の時間依存的位置的変化を記載する統計的指標であってよく、分散（ｖａｒｉａｎｃｅ）、標準偏差、二乗平均平方根（ＲＭＳ）移動、または観測値の時系列に関連づけられた粒子位置の自己相関関数として表すことができる。
【０１６７】
捕捉表面領域２１０等の「近傍」は、運動が観測される捕捉表面領域２１０等において既知の粒子１０８の位置の周囲の境界の中の領域（例えば、円形または正方形の領域）として予め決定され、コンピュータ１１３内にプログラムされてよい。捕捉表面領域２１０等の近傍のサイズの選択は、統計分析（すなわち、較正データから）を必要とする可能性があり、所定の実験時間の間、粒子１０８の全ての可能な位置を含むように規定されてよく、用いる測定技術に応じて位置的自由度測定の感度を最大にするのに、十分小さくなるように規定されてよい。
【０１６８】
位置的変動は、観測期間にわたる粒子１０８の位置の予想される範囲を包含する、捕捉表面領域２１０等の特定領域（近傍）の中で観測される。しかるに、捕捉表面領域２１０等に付着した粒子１０８は、一定の時間または回数の観測の後で、一定の距離より大きく移動することができない場合、その表面上に存在する捕捉表面領域２１０の特異的結合標的を有するように決定される。
【０１６９】
位置的変動の測定は、デカルト座標系を用いる場合に、ｘ、ｙに関して表すことができる基板２００の表面の平面の粒子１０８の位置の記録された測定値の時系列から導き出すことができる。記録された観測値の一部または全部は、位置的自由度の後処理および結合親和性等の関連の値の決定のためのタンジブルコンピュータメモリまたはデータベースに保存することができる。あるいは、観測値は、コンピュータプログラムによって連続的に処理してよい。
【０１７０】
ｚ軸（すなわち、基板２００の表面によって規定される平面に対して直交方向）における位置的自由度の変化は、共役運動によって、ｘ、ｙ位置データから測定される位置的変動にも影響し得る。あるいは、ｚ軸における運動は、コンピュータプログラムによって直接測定し、位置的変動の決定において用いることができる。極座標を用いてもよい。時系列の位置データは、（例えば、第一表面もしくは顕微鏡光学部品の）、第一表面領域の、試料ホルダもしくは顕微鏡ステージの、または他の粒子もしくは顕微鏡の対象物の、基準マークに関して測定してよい。任意で、粒子の経路を追跡することができ、経路についてのデータは、以下に記載される粒子追跡方法に従ってタンジブルコンピュータメディアに保存することができる。
【０１７１】
粒子１０８の位置的変動の指標は、（複数の粒子の画像の並列処理による場合を含めて）各粒子について個々に決定することができるか、または複数の粒子１０８の画像は、個々の粒子１０８の同定を必要としない方法で数学的もしくはコンピュータ的に操作することができる。例えば、複数の粒子の連続画像を、２回以上で、時間依存的自己相関関数または時間依存的確率関数をパラメータ化するために用いた画像のデジタル比較（例えば、画像差分）で取得することができる。
【０１７２】
位置的変動の指標は、肉眼によって、または上記の顕微鏡装置１０を用いることによって行われる。別の一実施形態において、位置的変動は、コヒーレント照明（図１Ｃの装置を用いるホログラフィー変動顕微鏡検査）を含む顕微鏡検査技術を用いて測定される。例えば、ホログラフィー顕微鏡検査は、高解像度三次元位置データの取得を可能にする。したがって、分析物の存在または量の信頼度のある決定をより速やかに行うことができるか、または所定のデータ取得時間でより高い信頼度もしくは感度を達成することができる。
【０１７３】
しかるに、一実施形態において、試料１０７を検出アレイ２００上にのせ、アレイ２００を装置１０内に取り付け、粒子を沈降させて捕捉表面領域に接触させた後、手動で、または（物理的またはＧＵＩを介して）ボタンを押してコンピュータプログラムを開始することによって、分析を開始することができる。
【０１７４】
利用される装置のいずれにおいて、画像をカメラ１１２で撮影し、コンピュータシステム１１３の一部を形成するモニタまたはスクリーン上で見る。本明細書に記載されるあらゆるコンピュータ分析は、本明細書に記載される顕微鏡装置１０の一部を形成するコンピュータプログラムの一部として行うことができる。コンピュータプログラムは、コンピュータ１１３によって実行され、顕微鏡装置１０によって得られた全てのデータを処理し、コンピュータのメモリまたは外部データベース内にセーブすることができる。
【０１７５】
自動測定装置において、一旦分析が開始されると、顕微鏡装置１０のコンピュータプログラムは、捕捉表面領域２１０等に自動的に焦点を合わせる。次いで、コンピュータプログラムは、１個以上の粒子１０８を自動的に見つけ出し、次いで、即時の分析のためのそれらを選択する。任意で、コンピュータプログラムは、粒子１０８を撮像するための装置１０を利用して、それが基準の特定のセットを満たすかどうかを決定する。
【０１７６】
装置１０は、この決定を行うために、パターン認識ルーチン、サイズおよび形状データ（例えば、赤血球または他の粒子についての特定の外見範囲の中の対象物の検出）、吸光度データ（例えば、赤血球の赤色の検出）、蛍光顕微鏡検査データ（例えば、染料または標識抗体の存在）、ならびに他のスペクトルデータまたは他の非スペクトル測定を用いることができる。
【０１７７】
カメラ１１２によって画像の時系列を取得し（少なくともＮ＝２、より多くの画像が好ましい）、画像と時系列の長さとの間の経過時間を、粒子の型、撮像方法、および測定される粒子によりコンピュータ１１３によって決定する。視野は、観測および測定のための多くの粒子を含むべきである。更に、単一の捕捉表面領域２１０等の中か、または複数の捕捉表面領域２１０、２１１、２１２内において、複数の視野をサンプリングすることができる。幾つかの分析技術に関して、所定の時点でメモリ内に保存することによって１つまたは２つのみのフレームが必要である。
【０１７８】
用いることができる検出モードとしては、デジタルビデオ顕微鏡検査（自動顕微鏡検査が含まれる）、四分割フォトダイオードの使用、コヒーレント照明による顕微鏡検査、散乱光の測定、ホログラフィー顕微鏡検査およびエバネッセント波技術が挙げられる。
【０１７９】
後続の分析のために、コンピュータプログラムは、コンピュータメモリ、データベースまたは他のコンピュータ可読メディア内に、それが関連づけられた捕捉表面領域２１０等を記録する。捕捉表面領域の同一性は、参照マーキングまたは他の方法に対するカートリッジの配向性についての知識から、機械可読マーカーから決定することができる。終止閾値を満たすまで、上記の任意のオートフォーカスステップによって、粒子１０８の選択および分析を繰り返す。閾値は、例えば、全体が分析される所定の数の粒子１０８、各捕捉表面領域２１０、２１１、２１２において分析された所定の数の粒子１０８、最大時間の経過、または誤差の統計的指標を上回ってよい。
【０１８０】
結合検出アルゴリズム
分析の方法は、結合度を決定するために粒子の位置的自由度の値を見出すことを含む。この位置的自由度の程度は、取得された画像の連続するものから粒子の変動運動の程度を測定することによって推定することができる。これは、粒子認識および追跡、複数の画像の平均の計算、連続画像フレームの間の平均差の計算、ならびに画像の時系列の全体にわたる強度のピクセル的変化の計算を含む各種の方法によって行うことができる。典型的には、計算は、運動の測定によって各粒子を特徴付けるような方法で行う。
【０１８１】
一実施形態において、ピクセル強度値の統計分布の分析を各粒子について算出し、それから位置的自由度の分布が得られ、よって粒子の結合度の分布が得られる。結合相互作用の性質を示すために、粒子変動指標の確率分布の形における統計量を処理する。この分布を処理する際、積分した確率分布、閾値の上／下の測定された位置的自由度を有する粒子の分率、分布が後続の測定値間でどのように変化するのか、もしくは変化するのかどうか、確率分布のモーメント（平均、分散等）、参照／較正分布に対する分布の比較、または結合度を特徴づけるための他の分析を用いることができる。結合度から、または移動分布の直接分析から、対象（ｉｎｔｅｒｅｓｔ）の指標（例えば、温度、粘性、ｐＨ、分析物の濃度、粒子の性質等）を推定することができる。
【０１８２】
位置的変動を決定する方法としては、限定されるものではないが、１）粒子追跡方法等を用いて測定され得る粒子１０８の変位、２）特定の期間内における複数の時点で観測される粒子位置のセットについて算出される分散（標準偏差）等の粒子位置の時間変化の統計的指標、および３）適切な照明下における粒子１０８または複数の粒子１０８による光散乱を理由とした、粒子１０８または粒子１０８の集合の近傍における光の強度の変動等の位置的変動の変化から生じる物理的現象の指標が挙げられる。
【０１８３】
一実施形態において、位置的変動は、コンピュータ１１３を用いてＮ個の画像のピクセル的標準偏差を計算することによって、カメラ１１２によって撮影された、サイズＷ×ＨのＮ個の画像の連続（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）から測定される。しかるに、出力画像における第１ピクセルは、Ｗ×Ｈの出力画像における各ピクセルについての、Ｎ個の入力画像における第１ピクセルの標準偏差等である。あるいは、出力画像における第１ピクセルは、コンピュータプログラムによって、例えば、それに、Ｎ個の入力画像における第１ピクセルの平均で除算した、Ｎ個の入力画像における第１ピクセルの標準偏差を割り当てることによって、正規化値を与えることができる。入力画像連続において観測される各粒子について、粒子の規定された近傍（捕捉表面領域の領域）において、この出力画像を合計するか、または平均する。しかるに、位置的変動の指標が各粒子に割り当てられる。
【０１８４】
別の一実施形態において、連続した入力画像のピクセル的差の絶対値として、コンピュータプログラムによって計算されるＮ−１個の中間画像の連続を生成するために、Ｎ個の入力画像の連続を用いる。これらのＮ−１個の中間画像を平均することによって、最終出力画像が決定される。各粒子の規定された近傍内における出力画像の値を平均するか、または合計することによって、個々の粒子変動値を割り当てる。
【０１８５】
別の一実施形態において、Ｎ個のフレームの各々における対象の粒子の正確な位置を認識するために、物体認識コンピュータプログラムが用いられる。Ｎ個のフレームを通して見出されたＭ個の粒子の追跡位置を得るため、コンピュータプログラムによって追跡アルゴリズムが用いられる。フレーム間移動、ｄｘ（ｔ）およびｄｙ（ｔ）の二乗平均平方根値を算出することによって、個々の粒子変動値が割り当てられる。
【０１８６】
別の一実施形態において、Ｎ−１フレーム間隔にわたるＭ個の粒子の正確な実空間フレーム間変位を計算するために、Ｎ個のフレームにわたるＭ個の粒子の追跡位置がコンピュータプログラムにより用いられる。これらのＭ粒子変位をＮ−１フレーム間隔の各々において平均して、Ｎ−１フレーム間隔の各々における平均粒子移動、ｄｘ＿ａｖ（ｔ）およびｄｙ＿ａｖ（ｔ）を得る。ランダム強制、熱活性化を経験する、またはランダム活性化方法によるシステムについては、平均粒子移動は、システムに対する振動またはインパルスの非存在下でゼロに近くなるべきである。実システムにおいて、振動、インパルスまたは他の予想外の状況は、ｄｘ＿ａｖ（ｔ）およびｄｙ＿ａｖ（ｔ）によって観測可能な著しい相関移動を起こす可能性がある。所定の粒子のフレーム間移動、ｄｘ（ｔ）およびｄｙ（ｔ）は、コンピュータプログラムによって算出され、補正フレーム間移動ｄｘ’（ｔ）およびｄｙ’（ｔ）は、相関移動：ｄｘ’（ｔ）＝ｄｘ（ｔ）−ｄｘ＿ａｖ（ｔ）、ｄｙ’（ｔ）＝ｄｙ（ｔ）−ｄｙ＿ａｖ（）ｔを減算することによって計算される。しかるに、作動のランダム性と関連していない予想外の相関移動が減算される。
【０１８７】
別の一実施形態において、追跡位置が用いられ、平均フレーム間変位、ｄｘ＿ａｖ（ｔ）およびｄｙ＿ａｖ（ｔ）が、コンピュータプログラムによって計算され、平均（すなわち、相関）フレーム間変位が、誤った読み取り、計器損傷または他の不都合な結果を生じ得るシステムに対する予想外の振動または衝撃の程度を示し得る、容認できないほどの高いレベルを達成する場合において、誤差条件を示すために用いられる。
【０１８８】
他の実施形態において、より高い強制度、またはランダム熱活性化によって利用可能となり得るものより周期的なもしくは制御された強制に、接近し得る良好に制御された活性化の下で粒子変動値のより正確なセットを生じさせるために、（上記の）活性化方法と共に追跡位置を用いる。
【０１８９】
かかる一実施形態において、強制が所定の間隔内で均一である複数の強制間隔を達成するために、上記の方法のうちの１つで活性化が達成される。所定の強制間隔中に粒子の位置を同定することによって所定の規定された力に対する応答を同定するために、コンピュータプログラムによって粒子追跡方法が用いられる。複数の間隔でこれを行うことによって、複数の強制レベルまたは方向に対する粒子の位置応答の測定値を得ることが可能であり、それによって、結合の性質および程度に関するより完全な情報が与えられ、その粒子変動測定値のより正確な指標が生じる。
【０１９０】
結果の決定
一実施形態において、最初に、１つ、２つまたは複数の試料１０７について較正データを得る。２つの可能な結果を有する単純なテストについて、較正データを得るために２つの対照試料を測定することができる。２つを超える可能な結果を有するテストについて、たとえば連続的に変化する指標が所望され得る測定値（例えば、分析物の温度、ｐＨ、濃度等の測定）等、複数の較正試料を用いることができる。
【０１９１】
一実施形態において、２つの較正試料を測定し、位置的自由度の測定の単一の（較正）閾値が得られる。テスト試料１０７内の粒子１０８の位置的自由度の測定値を閾値と比較し、それらが閾値を下回って減少する場合、結合相互作用が推定される。粒子１０８が閾値を上回る測定値を有する場合、結合相互作用は推定されない。しかるに、テスト試料１０７内における多くの粒子１０８の測定値により、より強く結合していると推定される粒子１０８の数の計数と、より弱く結合しているものの計数とが得られ、それは、あるいは、強い結合のパーセンテージとして表すことができる。これらの計数またはこのパーセンテージを１つまたは複数の参照値と比較することによって、最終測定結果を、所定のテストについて、たとえば「陽性」、「陰性」または「不確定」等と呼ぶことができる。
【０１９２】
別の一実施形態において、粒子１０８の位置的自由度の測定値のセットは、位置的自由度の分布を含む。位置的自由度分布は、（例えば、対照試料に対する多くの較正の実行から決定される）参照試料について、ならびに問題となっているテスト試料について得ることができる。テスト試料がどの対照試料に最も密接に似ているかを決定するために、テスト分布を参照分布のセットと比較することができる。これは、投影、相関、ドット積、差の最小化、曲線の領域の積分、または他の方法を含む多くの方法により数値的に行うことができる。この方法により、二値の結果（例えば、「陽性」または「陰性」）または二値でない結果（例えば、０（陰性）、１（極めて弱い）、１＋、２、２＋、３、３＋、４、４＋、５（非常に強い））を得ることができる。しかるに、変動測定値の集合は、既知の性質の参照試料からの変動測定値の集合と比較することができる。
【０１９３】
更に、得られた曲線は、比較を実施する前に処理され得る。例えば、曲線のローエンドに最も関心があるので、全ての分布（すなわち、テスト分布および参照分布）は、位置的自由度が０で最も高く、かつ位置的自由度のより高い指標については０に向かって減少する関数によって乗算され得る。しかるに、かかるスケーリングされた分布は、曲線のローエンドでより高い重要性（ｗｅｉｇｈｔ）を置く。これは、多数の弱く結合した粒子の存在下における，少数の強く結合した粒子の重要性を強調することが望まれる状況に有利であり得る。
【０１９４】
あるいは、多数のより強く結合した粒子１０８と少数のより弱く結合した粒子１０８とを有する場合、より小さい位置的自由度測定値に対して低く、かつより高い位置的自由度測定値に対して増加する関数によって、分布がスケーリングされ得る。この重み付けを分布特性およびそれらの互いの類似点の算出に組み込むことによって、同様の重み付け効果を達成することができる。しかるに、測定された分布は、テストの報告結果を生じるために様々な方法で処理されてよく、処理および判断の詳細は、最も重要で区別を生じさせる分布の特性を強調するように調整されるべきである。
【０１９５】
上記のもの等の方法は、システムの範囲のために有用であり得るが、特定のシステムについては、判断基準を更に最適化し、信頼間隔または「不確定な」結果の可能な報告を判断するために、対照分布のセット（ならびに測定誤差の特性）に注目するべきである。なお、更に、上記の測定および比較ステップは、コンピュータ１１３によってコンピュータ化し、自動化されてもよい。
【０１９６】
用途−免疫診断
血液型判定
本発明は、（血液型判定を含む）少なくとも免疫診断の分野への、そして、その分野を越えて、医薬のための（すなわち、過去のスクリーニングの研究および診断テストのための）生細胞アッセイを含む他の診断への適用可能性を有する。特に、本発明の例示的な一実施形態は、血液型判定の決定を含む。
【０１９７】
背景
国際輸血学会（ＩＳＢＴ）によって認められている３０のヒトの血液型があり、最も重要なものは、ヒトの輸血におけるＡＢＯ血液型群系である。血液型としては、Ａ、Ｂ、ＡＢおよびＯが挙げられる。２番目に重要な血液型群系は、Ｒｈ系である。３０の血液型群の全体にわたって、６００を超える血液型抗原があり、Ｒｈ系は、現在５０の抗原を有し、最も重要なものはＤ抗原である。
【０１９８】
しかるに、赤血球（ＲＢＣ）は、それらの表面に多くの抗原を有し、その一部は、血液「型」（Ａ、Ｂ、ＡＢおよびＯ型）に関連づけることができ、Ａ、ＢおよびＤ抗原として公知の最も一般的な抗原によって、献血する人々のためのドナーカードにおいて一般に説明されている、人のＡＢＯ  Ｒｈ血液型が生じる（例えば、Ａ−、Ａ＋、Ｂ−、Ｂ＋、Ｏ−、Ｏ＋、Ｒｈ＋、Ｒｈ−）。
【０１９９】
それらの表面抗原についてのテストは、「オモテ試験」（ＦＴ）または「ＡＢＯ／Ｒｈ抗原型判定」と一般に呼ばれる。これは、典型的には余剰のために（ｆｏｒ  ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）少なくとも２回、あらゆる血液ドナーおよび予想されるドナーレシピエントにおいて実施される。人がそのＲＢＣ上にＡ抗原を有さない場合かつその場合に限って、その血漿中に抗Ａ抗体を有する。同様に、人がそのＲＢＣ上にＢ抗原を有さない場合かつその場合に限って、その血漿中に抗Ｂ抗体を有する。換言すれば、人が、そのＲＢＣ上にＡ抗原のみを有する（そして、しかるに、抗Ｂ抗体が存在する）場合、その血液型はＡ型であり、そのＲＢＣ上にＢ抗原のみを有する（そして、抗Ａ抗体のみが存在する）場合、Ｂ型血液を有する。ＡＢ型は、ＲＢＣ上にＡおよびＢ抗原の両方を有するが、抗体は存在せず、Ｏ型は、ＲＢＣ上に抗原を有さず、かつ抗Ａおよび抗Ｂ抗体の両方が存在する。
【０２００】
「ウラ試験」（ＲＧ）またはウラ判定（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｙｐｉｎｇ）は、人の血漿がその中に抗Ａおよび／またはそれの抗Ｂ抗体を有するかどうかを決定することを指す。事実上、これは、オモテ試験に対する追加の（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）情報であり、しかるにオモテ試験の結果に対する別のチェックである。多くの詳細があるが、大部分は、これは単純な対応である。しかるに、完全な「ＡＢＯ／Ｒｈ血液型」を行うため、オモテ試験を実施してＲＢＣ上のＡ、ＢおよびＤ抗原を、ならびにウラ試験によって血漿中に抗Ａおよび抗Ｂ抗体を、探す。
【０２０１】
上記のように、ＲＢＣ上に多くの他の抗原があるが、焦点は、最も強くはＡ、ＢおよびＤ抗原にあり、その理由は、それらが臨床的に最も重要であるからであり、−すなわち、適合がない場合、輸血された患者は、致死的であり得る輸血反応を経験する可能性がある。しかし、それらの臨床的な意義（抗体／抗原が適合しない場合、人々が輸血反応を経験する可能性がある）に基づくと、６００を超える抗原の中で、Ａ、ＢおよびＤの後で、２番目の重要性の階層にある１８の他の抗原の一覧がある。これらの抗原についてテストを実施する場合、それは、１８個全てについて無差別に探す（拡大（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）表現型検査）のか、関心の特異的なものを標的とする（抗原特性決定）のかに応じて、「拡大表現型検査」または「抗原特性決定」と呼ばれる。
【０２０２】
ある者が生まれると、ＲＢＣ上に抗原を発現するのかどうかとは無関係に、これらの１８の抗原に対する抗体を通常は有さない。しかし、ある者がこれらの１８のＲＢＣ表面抗原のいずれかに曝露される場合、これらの抗原に対する抗体を発生させることができる−すなわち、「免疫化」。これは、妊娠によって起きる可能性があり（ある者がその子の血液に、しかるにその子のＲＢＣ上の抗原に曝露され得る）、または輸血によって起きる可能性がある。人が輸血を受ける場合、その人が有さないこれらの１８の抗原のいくつかを有する血液が与えられる可能性があり、身体は、それらの抗原に対する免疫応答を有する（すなわち、抗体の産生を開始する）可能性がある。免疫がある抗原を有するより多くの血液（すなわち、別々の輸血）にその人が曝露されない限り、これは必然的でない。２回目には、免疫応答が強くなる可能性があり、および／または、抗体が、輸血された血液を攻撃する可能性があり、それによって、ドナーＲＢＣが破壊され、各種の臨床的問題が生じる。これらの理由のために、これらの１８の抗原に対する抗体を有するかどうかを決定するために、輸血を受ける人は誰でもスクリーニングされる。これは、「抗体スクリーニング」（ＡｂＳ）と呼ばれる。
【０２０３】
これらの１８の抗体から１種以上の「予想外の抗体」に対して陽性または陰性として、人はスクリーニングされる。陽性とスクリーニングした場合、次いでそれまたはそれらの抗体の特異性を決定することが必要である。このプロセスは、「抗体同定」（ＡｂＩＤ）と呼ばれる。しかるに、陽性のＡｂＳを示す患者試料は、存在する抗体の特異性を同定するためにＡｂＩＤを受けることになる。次いで、病院または研究室は、多くのＡＢＯ／Ｒｈ適合血液単位における拡大表現型検査または抗原特性決定測定を用いて、対応する抗原を有さない血液を見つけなければならない。最後に、輸血前に、病院は、米国において、典型的には、反応（ＲＢＣの凝集）を探すために患者およびドナーの血液を一緒に混合することが必要である「交差適合試験」を行う。交差適合試験に合格した場合、血液は輸血のためにリリースされる。
【０２０４】
ゆえに、最も幅広い意味で、血液型判定は、ＲＢＣ表面抗原に対する幾つかの数の抗体と共に、幾つかの数のＲＢＣ表面抗原を探索することである。細胞における抗原（または受容体／結合部位）の存在／非存在、および溶液中における抗体（またはおそらく他の分子）の存在／非存在／濃度を同定し得る技術は、医学的診断スクリーニングおよびテスト、医薬等において役立つ。
【０２０５】
上記のように、従来の技術において、かかるテストのための最も一般的な歴史的方法は、ＲＢＣと抗体を有する血漿または血清溶液とを混合し、細胞凝集（血球凝集（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）または凝固）を探すことである。例えば、ＡまたはＢ抗原についてのＲＢＣのＦＴテストを実施するため、ＲＢＣを抗Ａまたは抗Ｂ抗体の溶液とそれぞれ混合して、血球凝集があるかどうかを決定する。血球凝集がある場合、その人は、それぞれＡ型またはＢ型血液を有する。抗Ａおよび抗Ｂ抗体（または抗ＡＢ）と混合した場合にＲＢＣが凝集する場合、その人はＡＢ型血液を有する。しかし、抗Ａまたは抗Ｂ抗体のいずれかと混合した場合にＲＢＣが一緒に膠着しない場合、その人はＯ型血液を有する。
【０２０６】
第１のテスト（すなわち、Ａ抗原についての）の後で血球凝集がない場合、Ｂ抗原があるかどうか決定するために第２のテストが必要とされ、血液型を決定するため、Ｄ抗原（Ｒｈ）についての第３のテストを行い、完全なオモテ試験を完了させる。例えば、Ｒｈ型判定によって、抗Ｒｈ血清と混合される際にＲＢＣが凝集する場合、その人はＲｈ陽性の血液を有する。抗Ｒｈ血清と混合される際に血液が凝固しない場合、その人はＲｈ陰性の血液を有する。
【０２０７】
ウラ試験テストは、同様である。既知の抗原プロファイルを有するＲＢＣを血漿または血清の試料に加えた際に、血球凝集を探す。例えば、ＡまたはＢ抗原を有するＲＢＣを試料に加えた際にのみ血液試料が凝集する場合、その人は、それぞれ抗Ａまたは抗Ｂ抗体を有し、しかるに、それぞれＡまたはＢ型血液を有する。ＡまたはＢ抗原のいずれかを有するＲＢＣを試料に加えた際に血液試料が凝集する場合、その人はＯ型血液を有する。試料を（ＡおよびＢ抗原を含有する）両方の血液型と混合する際に血液細胞が凝集する場合、その人はＡＢ型血液を有する。
【０２０８】
ＡｂＳテストを実施するために、典型的には、２または３人の人々からのＲＢＣのパネルが用いられる（すなわち、３人の人）。それを実施する方法の幾つかの変形があるが、本質的には、テスト血漿を、凝集を探すために細胞型のうちの１種と混合し、次いで、他の細胞型について繰り返す。
【０２０９】
例示的実施形態−オモテ試験
図３〜５は、例えば、図１Ａ〜１Ｃの顕微鏡装置を用いて、検出アレイ２００に配置された血液細胞の位置的自由度を決定することによって血液型を同定するための本発明の例示的実施形態を概略的に示す。具体的には、検出アレイ２００は、抗体を含有する捕捉表面領域２１０、２１１、２１２（すなわち、パッチ）上のプローブまたはプローブ複合体を結合可能な官能性リンカー３１０でスライド２００を洗浄およびシラン処理することを含む、本技術分野において周知の技術によって調製されるガラス顕微鏡スライドである。上記のように、プローブは、所定の標的粒子、分子、集合体、リガンドもしくはその部分に対する特異的結合選好性を有する、粒子、分子構成要素、または分子構成要素の集合体である。この場合、プローブ３００、３００’は、血液抗原に対する特異性を有する。プローブ３００、３００’は、リンカー３１０を介してガラススライドまたは基板２００に対する頑健な（例えば、共有性の）アタッチメントを用いて固定される（図４参照）。
【０２１０】
本例は血液型判定に関連するが、記載の方法は、他の細胞型または非細胞粒子に、および他の型の表面分子または部分に適用可能である。
【０２１１】
本例において、血液型を決定するため（すなわち、オモテ試験）、検出アレイ２００は、３つの捕捉表面領域２１０、２１１、２１２を含み、各々は、異なる赤血球（ＲＢＣ）表面抗原（すなわち、Ａ、ＢまたはＲｈ）に対する親和性を有する。検出アレイは、チャンバ１１８内に配置され、（任意で適切な緩衝液で希釈された）血液が入口４０１を通ってチャンバ１１８に入り（図２参照）、検出アレイ２００上に配置される。本明細書に以前に記載されているように、血液を、重力、またはあらゆる他の適切な手段（すなわち、遠心分離等）によって沈降させることができる。
【０２１２】
図３は、捕捉表面領域２１０〜２１２の表面上に沈降させた複数の赤血球２２０および白血球２３０を有する検出アレイ２００を示す。任意で、血液からの過剰な細胞および破片は、リンス緩衝液による洗浄によって除去され、出口４０２を通って出る（図２Ａ参照）。
【０２１３】
図４に示されるように、かつ上記のように、赤血球２２０は、患者の血液型を決定する（オモテ試験）ために検出アレイ２００によって検出される表面抗原２２５を有する。本例における赤血球は一人の患者に由来するので、表面抗原２２５のセットは、試料１０７中の全ての赤血球について一般に同じである。図４の断面図に示され、スケーリングされていない検出アレイ２００は、例えば、それぞれプローブ３００および３００’を有する第１の捕捉表面領域２１０および第２の捕捉表面領域２１１を有する（捕捉表面領域２１２は簡略化のため示されない）。しかるに、本例において、プローブ３００、３００’は、赤血球抗原に対するモノクローナル抗体であるが、本技術分野において公知のあらゆる適切な生物特異性または化学特異性プローブ分子（例えば、ポリクローナル抗体、核酸プローブ、アプタマ、完全合成プローブ等）であり得る。
【０２１４】
図５は、沈降およびプローブ３００、３００’との会合の後の図４の赤血球２２０を示す。沈降後、抗原２２５およびプローブ３００、３００’は、互いに空間的に近接となり、それによって特異的結合反応が生じる。結合相互作用の結果は、「テザー」４００と呼ばれる１つ以上のアタッチメント部分である。捕捉表面領域２１０、２１１が、赤血球２２０の表面上に存在する抗原に対して特異的なプローブ３００，３００’を有する場合、テザー４００は、排他的にまたはより多い量で形をなす。結合反応は、速やかに、効率的に生じ、速度は、図１Ａ〜１Ｃの顕微鏡装置１０を含む上記のもの等の適切な検出装置によって測定され得る。
【０２１５】
具体的には、上記のように、検出装置１０は、捕捉表面領域２１０、２１１等に会合した複数の赤血球２２０の位置的変動の指標を検出するために用いられる。位置的変動は、形成されるテザー４００の数に依存するべきであり、テザー４００の数がより多くなり、粒子の移動がより小さくなれば、抗原がその赤血球上に存在する可能性が大きくなる。しかるに、測定された位置的変動は、特定の分析物の有無を決定するために用いられる。
【０２１６】
適切な分析物の複数のかかる測定を行うことによって、検出装置１０は血液型を決定することができる。例えば、上記のように、粒子または赤血細胞位置における標準偏差を、血液細胞または血液細胞模倣体（例えば、ＲＢＣ抗原を有する粒子）を有する対照反応から予め定められるかまたは導き出される閾値と比較することができる。（粒子の統計学的により少ない移動を示す）閾値より低い測定された位置的変動は、細胞上の抗原の存在を示す。
【０２１７】
図６は、抗Ａ抗体パッチ（すなわち、図４の捕捉表面領域２１０上に配置されている）および抗Ｂ抗体パッチ（すなわち、図４の捕捉表面領域２１１上に配置されている）における位置的変動についてＢ型血液のＲＢＣ２２０をテストしたオモテ試験における実験を示す。得られたグラフは、抗Ａおよび抗Ｂ抗体コーティング（それぞれ、パッチ２１０、２１１）を有する基板２００上のＢ型（抗原Ｂに対して陽性）赤血球２２０についての時間平均拡散速度を示す。結果は、測定時間間隔の関数としてのテストＢ型のＲＢＣ２２０の観測平均二乗変位を示す。
【０２１８】
具体的には、図６の各ラインは、ＲＢＣ２２０を表す。Ｂ型細胞２２０は、抗Ｂ抗体パッチ（すなわち、捕捉表面領域２１１）に結合するが、抗Ａ抗体パッチ（すなわち、捕捉表面領域２１０）には結合しない。しかるに、抗Ａ抗体パッチ２１０上のＲＢＣ２２０は、全体的により高い変位、およびより長い測定間隔の間に着実に増加する変位を示し、それはＢ型ＲＢＣ２２０の遊離拡散を示す（ＲＢＣはグラフ内で実質的に直線の上方へのラインとして現れる）のに対して、抗Ｂ抗体パッチ上のＲＢＣ２２０は、より長い測定時間で変位の横ばい状態を示すが、その理由は、それらの移動距離が基板２００への結合によって限定されるからである。抗Ｂ抗体パッチ２１１上のＢ型ＲＢＣ２２０が表面に拘束されるにもかかわらず、短い時間スケールにおいて、それらは抗Ａ抗体パッチ２１０上のＲＢＣと同様に現れるが、より長い時間スケールでは、それらは横ばいになる。したがって、グラフの特徴的特性と、Ｂ型細胞の結合を示すＢ型細胞２２０が抗Ｂ抗体パッチ２１１上により低い位置的変動を有するという結果とを見るために、約５〜１０秒間の、粒子またはＲＢＣの位置的変動を見るための特徴的時間スケールがある。
【０２１９】
図７は、例えば顕微鏡装置１０が用いられ、かつ上記で考察されたアルゴリズムを用いてＲＢＣの正規化標準偏差（ＮＳＤ）の確率分布が算出される本発明によるオモテ試験実験のグラフを示す。
【０２２０】
オモテ試験実験は、図６の実験と同様の、抗Ａおよび抗Ｂ抗体パッチ２１０、２１１上に配置されたＡ型血液細胞２２０を含んだ。得られたグラフは、それぞれ抗Ａおよび抗Ｂ抗体がコーティングされた基板２００の捕捉表面領域２１０、２１１上のＡ型（Ａ抗原を有する）赤血球２２０の正規化標準偏差（ＮＳＤ）についての確率分布を示す。上記のように、ＮＳＤは位置的自由度の指標であり、抗Ａ抗体捕捉表面領域２１０等についての狭い低値分布は、移動度をほとんど有さない粒子またはＲＢＣ２２０を示す。換言すれば、ほとんどのＡ型赤血球２２０が基板２００に結合する。対照的に、抗Ｂ抗体捕捉表面領域２１１等についての広い分布は、粒子またはＲＢＣ２２０のほとんどまたは全てが自由に拡散し、結合していないことを示す。
【０２２１】
本発明の方法および装置の長所は、ある種の例における速度だけでなく、従来の技術を用いて達成する時間が通常はかかる測定を平衡に達する前に行うことでもある。従来方法において、例えば、技術者は、均一に赤色の表面、または赤色のクランプを有する白色の表面等を含む、たいてい肉眼で見える、細胞の大きなクランプ（血球凝集）を探すだろうが、それは、ある種の例において、長い時間がかかっていた。しかし、本発明において、必要とされる全ては、平衡を超えた肉眼的で見える平均の結合レベルではなく、多くの個々の細胞の結合事象の統計的に有意なレベルを決定することであり、それは、効率的に、かつ速やかに実施することができる。
【０２２２】
例−ウラ試験
本発明による別の一実施形態において、図８は、血漿が、例えば、抗Ａおよび／または抗Ｂ抗体をその中に有するかどうかを同定する（すなわち、ウラ試験（ＲＧ））ために用いられる検出アレイまたは基板２００を表す。ウラ試験技術は、上記のオモテ試験と本質的に同じであるが、抗体は、基板または検出アレイ２００の捕捉表面領域２１０、２１１上に配置された赤血球２２０の抗原２２５に結合した抗体３２０に結合する赤血球２２０の位置的自由度の決定に基づいて検出される。オモテ試験の例と同様に、顕微鏡装置１０を用いることができる。
【０２２３】
更に具体的には、図８において示されるようなこの例示的な実施形態において、検出アレイ２００は、基板またはスライド２００の捕捉表面領域２１０、２１１、２１２上の赤血球２２０を結合し得る官能性リンカー３１０（図８に示されない）でスライド２００を洗浄およびシラン処理することを含む、本技術分野で周知の技術によって調製され、かつ上記の通りのガラス顕微鏡スライドである。各捕捉表面領域２１０、２１１、２１２は、特定の抗体を特異的に検出させることができる。
【０２２４】
赤血球２２０の水溶液は、チャンバ１１８に導入され、重力によって、または遠心分離もしくは上記の他の技術等によって検出アレイ２００の捕捉表面領域２１０、２１１、２１２（すなわち、パッチ）上に沈降し、リンカー３１０によって捕捉表面領域２１０、２１１、２１２に結合または膠着する。赤血球２００の水溶液をチャンバ１１８から除去し、赤血球２２０を検出アレイ２００上に平坦に置いて、捕捉表面領域２０１、２１１、２１２上に広がり、全ボイドを実質的に充填するように、脱イオン水をチャンバ１１８内に加えることによって、結合赤血球２２０を溶解させる。次いで脱イオン水を、出口４０２（図２Ａ参照）を通して除去し、保存剤溶液（すなわち、水に溶解させたデキストロース）を加え、検出アレイ２００を空気乾燥させるか、または乾燥器内で乾燥させる。得られた検出アレイ２００は、平坦化した赤血球２２０で覆われ、その上に、赤血球２２０上の抗原２２５の反応性を保存するのに役立ち、かつそれらの貯蔵寿命を増加させる保存剤の薄い乾燥層を有する。
【０２２５】
ウラ試験（ＲＧ）テストを実施するため、例示的な一実施形態において、チャンバ１１８に血漿を加えて、約２５℃でアレイ２００をインキュベーションする。血漿の抗体３２０が落下して、検出アレイ２００の捕捉表面領域２１０、２１１、２１２の表面をコーティングする。抗体３２０は、その上に５種のリアクタを有するＩｇＭ（免疫グロブリンＭ）抗体であり、これらのリアクタのうちの１種または２種がチャンバ１１８の底部表面から膠着する抗原２２５に結合し、それによってリアクタの残りは遊離したままになる。抗体３２０が、平坦化した赤血球２２０の抗原２２５に結合または膠着せず、底部表面をコーティングしない場合、それは抗体がその特異的抗原に存在することを示しており、血漿は、緩衝溶液を用いて出口４０２を通じて洗い流され、それは、必須の抗体が存在しないことを意味する。（なお、このテストについて、洗浄ステップは任意である。）
【０２２６】
血漿からの抗体３２０が、平坦化した赤血球２２０に結合するかまたは膠着する場合、次いで、所望の抗原２２５を有するプローブ赤血球２２０の水溶液をチャンバ１１８に導入し、プローブ赤血球２２０は落下し、底部表面上の平坦化した赤血球２２０の抗原２２５に結合する抗体３２０に結合し、それによってサンドイッチアッセイを形成する。
【０２２７】
したがって、血漿が、特定の抗原に対する抗体（すなわち、チャンバ１１８内において、底部表面上の赤血球２２０上のＡ抗原に、およびプローブ赤血球２２０上のＡ抗原に、サンドイッチアッセイにおいて結合した抗Ａ抗体）を有する場合、結合反応（すなわち、テザー４００の数）は高く、位置的自由度は低だろう。プローブ赤血球２２０の位置的自由度の程度が高い場合、血漿は、特定の抗原を含まず（すなわち、抗Ａ抗体がなく）、結合反応の数は低いだろう。赤血球２２０の位置的自由度の決定において、検出装置（すなわち、顕微鏡装置１０）は、所望の抗体の非存在の存在を決定するために、閾値と比較して赤血球位置の標準偏差を計算する。本発明の長所は、オモテ試験に関して上記で示される。
【０２２８】
例−細胞の平坦化
一実施形態において、特異的に結合した粒子１０８は、印加した力の下に従う場合、テザー形成プロセスにおいて連続したテザー４００を形成する際に平坦化され得る（伸張、平坦化、または形態の他の変化を含む）。粒子１０８（すなわち、赤血球）のこの平坦化は、顕微鏡装置１０を用いて顕微鏡的に観測することができ、捕捉表面領域２１０、２１１等が特異性を有する分析物（すなわち、赤血球抗原）の有無または量をそれ自体で示すことができる。
【０２２９】
血液型判定の用途に関して、粒子１０８の平坦化は、赤血球の中央のくぼみの消失と関連して観測され、捕捉表面領域２１０等が特異性を有する赤血球抗原の有無または量を示すためにこの特性を用いることができる。平坦化およびくぼみの消失は、（例えば、図１Ｃの顕微鏡装置の自動顕微鏡検査およびパターン認識ソフトウェアを用いて）自動的に検出することができる。この平坦化効果は、自動的に血液型を判定するために、単独で、または位置的変動測定と共に用いることができる。
【０２３０】
例示的な実施形態−抗体スクリーニング
ａ．ＩｇＭクラス抗体
本発明による別の一実施形態において、抗体スクリーニング（ＩｇＭクラス抗体）は、上記のウラ試験（ＲＧ）と同じ方法で実施される。更に、人々は、曝露直後にのみＩｇＭクラス抗体を産生するので、これは、あまり頻繁に行うテストではない。
【０２３１】
ｂ．ＩｇＧクラス抗体
しかし、より一般に実施される（しかし、より困難な）テストに関して、ＩｇＧ免疫グロブリンＧ、クラス抗体スクリーニング（ＩｇＭおよびＲＧテストと比較して、抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）を利用する）は、例えば、１８の異なるヒト抗体を探すために実施される。本実施形態において、その技術は、ウラ試験（ＲＧ）のものと同様であり、例えば、図１Ａ〜１Ｃの顕微鏡装置１０を用いることができる。しかし、このテストは、他の型のテスト（すなわち、ＩｇＭ、ＲＧ）において必要でない洗浄ステップ（下記参照）を必要とするのである。
【０２３２】
更に具体的には、図９において示されるような例示的な本実施形態において、検出アレイ２００は、基板またはスライド２００の捕捉表面領域２１０、２１１、２１２上の赤血球２２０を結合し得る官能性リンカー３１０（図９に示されない）でスライド２００を洗浄およびシラン処理することを含む、本技術分野で周知の技術によって調製され、かつ上記の通りのガラス顕微鏡スライドである。捕捉表面領域２１０、２１１、２１２は、そのうちで、１８の抗体全てを発現する幾人かの人からの血液パネルを含む。
【０２３３】
ウラ試験（ＲＧ）と同様に、赤血球２２０の水溶液は、チャンバ１１８に導入され、重力によって、または遠心分離もしくは他の技術等によって検出アレイ２００の捕捉表面領域２１０、２１１、２１２（すなわち、パッチ）上に沈降し、リンカー（図９に示されない）によって捕捉表面領域２１０、２１１、２１２に結合または膠着する。赤血球２００の水溶液をチャンバ１１８から除去し、赤血球２２０が検出アレイ２００上に平坦に置かれて、捕捉表面領域２０１、２１１、２１２上に広がり、全ボイドを実質的に充填するように、脱イオン水をチャンバ１１８内に加えることによって、結合赤血球２２０を溶解させる。次いで脱イオン水を、出口４０２（図２Ａ参照）を通じて除去し、保存剤溶液（すなわち、水に溶解させたデキストロース）を加え、検出アレイ２００を空気乾燥させるか、または乾燥器内で乾燥させる。得られた検出アレイ２００は、平坦化した赤血球２２０で覆われ、その上に、赤血球２２０上の抗原２２５の反応性を保存するのに役立ち、かつそれらの貯蔵寿命を増加させる保存剤の薄い乾燥層を有する。
【０２３４】
ＩｇＧ抗体テストを実施するため、例示的な一実施形態において、増強剤を混合した血漿をチャンバ１１８に加える。約３７℃でアレイ２００をインキュベーションする。増強剤は、検出アレイ２００の捕捉表面領域２１０、２１１、２１２の表面上のある種の抗体／抗原反応間の反応を加速する。増強剤は、静電手段等の多くの異なる手段によって、または本技術分野において周知の促進的手段によって反応を引き起こすように選択され得る。
【０２３５】
インキュベーションの後、血漿を、緩衝溶液を用いて、出口４０２（図２Ａ参照）を通じて非常に完全に洗い流して、残ったＩｇＧが抗ＩｇＧ抗体粒子３２０を飽和するのを防止する。その後、プローブ粒子３３０を、重力、遠心または他の技術等によってチャンバ１１８に導入し、平坦化した赤血球２２０の表面上に沈降させる。プローブ粒子３３０は、適切な表面化学的特徴を有するコロイド（ガラスマイクロビーズ）３３０またはＲＢＣ（図９に示されない）であってよい。基板（平坦化）ＲＢＣ２２０に膠着した抗ＩｇＧ抗体３２０とプローブ粒子３３０自体との間に架橋を形成するために、抗ＩｇＧ抗体３２０を用いることができる。
【０２３６】
しかるに、抗ＩｇＧ抗体粒子３２０は、平坦化したＲＢＣ２２０の表面に結合する。抗ＩｇＧ抗体３２０は、最初に、遊離であり得るか、プローブ粒子３３０に結合し得る。いずれの場合においても、プローブ粒子３３０は、テスト血漿からの関心の抗ＩｇＧ抗体３２０を介して、またはプローブ粒子３３０上の抗ＩｇＧ抗体３２０を介して、チャンバ１１８の底部表面上において抗原２２５に結合して終了する。
【０２３７】
他の方法を用いてもよく、この方法を異なる型の抗原に適用することができる。
【０２３８】
しかるに、全クラスの抗体（すなわち、１８の抗体）は、どのプローブ赤血球３３０がどの捕捉表面領域２１０、２１１、２１２に結合するのか、および１８の抗原のいずれかが存在するのかどうかを確かめるために検査され得る。
【０２３９】
スクリーニングの他の形態と共に上記で述べられているように、プローブ粒子３３０の位置的自由度の程度が高い場合、特定の１８の抗原は存在せず、結合反応の数は低いだろう。プローブ粒子３３０の位置的自由度の決定において、検出装置（すなわち、顕微鏡装置１０）は、所望の抗体の有無を決定するために、閾値と比較して、上記のアルゴリズムを用いて、プローブ粒子３３０の標準偏差を計算する。本発明の長所は、オモテ試験に関して上記で示される。
【０２４０】
感染症スクリーニング
本発明による他の実施形態において、本明細書に開示される方法および装置は、感染症（例えば、ヒト免疫不全（ＨＩＶ）ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、梅毒、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、梅毒等）の、これらの感染因子に対する抗体についてテストすることによるスクリーニングに適切である。これらの感染症の多くは、その疾患が存在するのかどうかを決定するため、および血液供給システムがそれらの疾患を含むことを防止するために複数のスクリーニングを必要とする。
【０２４１】
一実施形態において、標的抗体を血液試料から採取し、一意的に処理した表面のアレイに対してテストを行い、抗体プロファイルを決定する。具体的には、ウイルス感染を検出する目的のために、血液試料から標的抗体を採取する。所定のウイルスの表面上に生じるタンパク質を表面上に固定してよく（すなわち、固相）、それによって、そのウイルスに対する特異的抗体を捕捉することが可能になる。更に、ウイルス抗体の別の領域に相補的な抗体でコーティングされた粒子がテストに存在し、その結果、標的ウイルス抗体の存在下で粒子の固定化が生じる場合があり、それによって血液試料内の抗体の存在のシグナルが出される。かかる測定は、感染を診断するために、または適切な対照によって標的抗体濃度を定量するために実施される。
【０２４２】
本発明において、用いられた装置および方法は、血液型判定に関して上記で記載したものと同様である。
【０２４３】
ａ）ＨＩＶ
ＨＩＶテストは、現在は、西欧諸国により用いられる抗体、抗原および核酸テスト（ＮＡＴ）である。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）テストが用いられ、次いで、１９８５年以降米国においてＮＡＴが用いられている。
【０２４４】
対照的に、例示的な本実施形態において、スライド２００を洗浄およびシラン処理することを含む、本技術分野において周知で、かつ上記の通りの技術によって基板２００（すなわち、ガラス顕微鏡スライド）を調製した後、基板または検出アレイ２００に、各種の公知の方法によって、例えばリンカー３１０を用いることによって、組換えＨＩＶ抗原を付着させる。
【０２４５】
ＲＢＣ２２０の血清をチャンバ１１８に導入することによって、基板２００を患者血清に曝露させる。重力または遠心分離法等によってＲＢＣ２２０を基板２００の表面上に沈降させ、ＨＩＶ抗体３３５が存在する場合、上記した、かつ例えば図８に示される通りの方法に従って、ＨＩＶ抗体３３５が基板２００上のＨＩＶ抗原３３６に結合する。
【０２４６】
上記のように、患者血清を、緩衝溶液による洗浄によって出口４０２を通して除去し、それによって、特異的に結合したＨＩＶ抗体３３５を実質的に妨げないようにする。ヒト抗体に対して特異的な粒子標識抗体３４０（例えば、ウサギ抗ヒトＩｇＧ）をチャンバ１１８に導入し、粒子３４０の位置的変動の指標を介してＨＩＶ抗体３３５への特異的結合についてテストする。
【０２４７】
１つの型のみ、または少しの型のみの粒子標識プローブ３４０が、多くの型の分析物分子を決定するために必要である可能性があるので、この型のアッセイは、マルチプレックスの事情において特に有利である。しかるに、抗体結合のための十分な時間を可能にした後、粒子標識抗ヒト抗体３４０（例えば、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＭ、抗ＩｇＧおよびＩｇＡ、またはそれらの組み合わせ）の溶液を加えて、捕捉表面領域に結合させることができる。次いで、患者の過去の病原体曝露、免疫化状態、癌の予後、または他の医学的状態についての結論に達するために粒子３４０の応答を探索するために、図１Ａ〜１Ｃの顕微鏡装置１０によって実施される位置的変動の測定を用いることができる。
【０２４８】
少し標識された粒子の型；例えば、１から４の間の標識された粒子の型を用いて、この技術を、同時に、幾つかの、数十の、または数百もの抗原に適用することできる。粒子型はほとんど必要でないので、結果を解析するために、例えば異なる励起または発光波長のフルオロフォアで粒子型の各々を標識することは、相対的に容易である。例えば、抗ＩｇＧおよび抗ＩｇＭ抗体が、異なるフルオロフォアで標識され得る。なお、（例えば、蛍光抗体で標識され得る）固体粒子および細胞を含むもの含む各種実施形態に記載されている他のアッセイ型に、標識を用いるマルチプレックスを適用し得る。別の一実施形態において、アレルギーを診断する目的のために、多くの抗原に関して患者の抗体プロファイルを決定することができる。
【０２４９】
ｂ）病原体
別の一例において、プローブを介して分析物を基板に共役させる。一般に病原体（細菌またはウイルス）に存在する抗原に対する特異性を有するプローブ抗体は、基板に共有結合で共役して、捕捉表面領域を形成する。細菌またはウイルスを含有することが疑われる試料をチャンバに加えて、（重力、遠心または他の手段によって）沈降させ、結合反応を進行させる。病原体に対して特異的な共有結合した抗体を有するプローブ粒子を加え、それらの結合度を、顕微鏡装置１０を用いたそれらの位置的変動の顕微鏡的観測および定量化によって決定する。あるいは、図１９Ａおよび１９Ｂに関連して一般に記載される通りの間接アッセイを用いて結合病原体を検出することができる。
【０２５０】
相補的抗原の一意の組み合わせの検出
所望の分析に応じて、プローブの型および特異性の混合を用いることもできる。例えば、相補的抗原の一意の組み合わせを有する細胞（例えば、ある種の癌または幹細胞）の存在を検出するために、複数の固定モノクローナル抗体を有する検出アレイ２００の捕捉表面領域２１０／２１１／２１２を用いることができる。
【０２５１】
化学的特徴における例示的実施形態
他の例示的な実施形態において、本発明の方法は、図４〜５および８〜９を参照して、以下のように、化学的特徴および技術上の改変を含むことができる。
【０２５２】
生体不活性部分
図１７は、両プローブ３００、３００’と生体不活性部分８２０とを含む、基板２００上の捕捉表面領域２１４および２１５を示す。生体不活性部分８２０は、例えば、シラン結合３１０を介して基板２００に結合したポリエチレングリコール部分等の親水性ポリマーであってよい。リンカー３１０は、生体不活性であってもよいか、または生体不活性成分を有してもよい。生体不活性部分８２０は、細胞（図示せず）と捕捉表面領域２１４、２１５との間の非特異的結合相互作用に対する寄与が最小またはマイナスであるプローブ３００、３００’密度を減少させる役割を果たす。
【０２５３】
捕捉表面領域２１４、２１５間の領域２１６上に生体不活性部分８２０を含んでもよい。プローブ３００、３００’と、反応性であるが生体不活性の試薬−例えば、アミン−反応性架橋剤を用いる場合はグリシン、またはスルフヒドリル反応性架橋剤を用いる場合はシステイン、とを組み合わせることによって、プローブ３００，３００’の面密度を変更することもできる。
【０２５４】
直接アッセイ−基板に共役する分析物
本発明による一実施形態において、以下の図１８Ａ〜１９Ｂに関して記載されるように、分析物２２６を最初に基板２００に付着させ、粒子８００、または更なるプローブおよび粒子で探索することができる。
【０２５５】
図１８Ａ〜８Ｂに概略的に図示される実施形態において、直接アッセイは、基板２００上の分析物２２６、２２６’を結合または捕捉し、その表面に付着したプローブ３００、３００’を有するレポーティング粒子８００の位置的変動を測定することを含む。例えば、固定抗体を有する０．０１〜１００ミクロンの直径のガラスまたはプラスチックビーズ８００は、例えば、基板２００に特異的または非特異的に結合している（または捕捉された）標的分析物２２６’を探索するために用いられ得る。分析物２２６、２００６’は、基板２００に、共有的、または非共有的に付着することができる。プローブ３００、３００’および標識８００は、単一の生物学的構成要素；例えば、プローブとして作用する表面タンパク質を発現する天然または遺伝子操作した細胞内に組み合わせることもできる。
【０２５６】
特に、図１８Ａにおいて、分析物抗原２２６は、例えば、捕捉表面領域２１０に結合し、固定抗体プローブ３００を有する粒子８００は、捕捉表面領域２１０に接触し、結合する。次いで、位置的変動を、顕微鏡装置１０を用いて上記の公知の方法によって測定する。図１８Ａに示されるように抗体３００が抗原２２６を認識する場合、それらの間に結合があり、しかるに、抗体３００が非結合抗原２２６’を認識しない（すなわち、結合が起こらない）図１８Ｂに示される状況より小さい位置的変動がある。
【０２５７】
あるいは、標的分析物２２６は抗体であってよく、粒子８００上のプローブ３００は、抗原（例えば、図５参照）であってよい。分析物２２６は、細胞が基板２００に付着する細胞表面の一部でもあり得る。
【０２５８】
間接アッセイ−プローブ複合体
間接アッセイは、第１のプローブ３２０に結合して、読み出し粒子８００に対して同族の結合パートナーを示す複合体（例えば、生体分子複合体）を形成する第２のプローブ３００（図１９Ａ参照）の特性を検出することを含む。第２のプローブ３００は、第１のプローブ３２０の化学的部分に対して、または第１のプローブ３２０（粒子状等）の標識に対して特異的であってよい。更なる（三元、四元等）複合体を用いてもよい。複合体の更なる例も、図２０〜２１の実施形態に関連して挙げられる。上記の直接アッセイのように、観測された粒子８００の特性は、その位置的自由度の指標を提供する粒子８００の位置的変動である。
【０２５９】
図１９Ａに示される例示的実施形態において、非標識モノクローナルマウス抗体３２０を第１のプローブ３２０として用いてよく、（例えば、基板２００上に直接固定された、または固定細胞に一体化された）固定標的抗原２２６と接触させてよい。第２のプローブ３００は、ポリクローナルウサギ抗マウス抗体である付着したプローブ部分３００で標識した粒子８００であってよい。第２のプローブ粒子３００を、上記の方法に従って第１のプローブ抗体３２０と接触させてよく、結合させてよく、適切な顕微鏡装置１０を用いて（すなわち、ブラウン運動の影響下の）粒子８００の変動応答を観測することによって特異的結合相互作用についてテストしてよい。
【０２６０】
図１９Ｂに示されるように、特異的結合反応の欠如は、位置的変動の測定値および結果として生じる粒子８００のより大きな位置的自由度の対応する差異をもたらす。
【０２６１】
競合アッセイ
従来の競合アッセイは、結合した分析物もしくはリポータまたは他の分子の変位に関連した事象を検出することを含む。しかし、競合アッセイは、通常、ほとんどデータポイントを生じない連続した方法で実施される。
【０２６２】
対照的に、本明細書に記載されるような本発明の競合アッセイは、パラレルな方法で、すなわち、並行してまたは迅速に連続して複数の粒子についての位置的変動測定値を得ることによって実施され得る。その結果、より高い信頼度の結果のためにより多くのデータポイントを得ることができ、および／またはより多くの型の標的をテストすることができる。
【０２６３】
図２０および２１は、結合相互作用を決定するために粒子の位置的自由度の決定を利用するアッセイ構成の幾つかの例示的実施形態を示す。
【０２６４】
図２０Ａに示されるように、基板２００の捕捉表面領域２１４、２１５において三元サンドイッチ構造が形成される。サンドイッチ構造は、（ｉ）基板２００に結合したプローブ３００’、（ｉｉ）位置保持分子２２７、及び（ｉｉｉ）粒子８００上に固定された粒子結合プローブ３２とを含む。位置保持分子２２７は、それぞれ基板結合および粒子結合プローブ３００、３２０の両方に対する特異的親和性を有する。位置保持分子２２７は、標的試料内の対象の分析物のものと同様のプローブ３００、３２０に対する結合ポテンシャルを有することができる。
【０２６５】
例えば、位置保持体２２７は、対象の抗原の組換え形態であってよい。更に、基板結合プローブ３００は、対象の各種分析物に対する異なる親和性または特異性を有してよく、適切な位置保持分子２２７および粒子結合プローブ３２０を有する（テザー４００の形態である）三元複合体として予め構築され得る。
【０２６６】
図２０Ｂに示されるように、プローブ３００、３２０に対する親和性を有する分析物分子２２６を有する試料を加える場合、分析物分子２２６は、相対的な結合定数および質量作用に応じた程度に、平衡に近づく適切な時間を与えられた位置保持分子２２７を変位させる傾向がある。粒子８００および捕捉表面領域２１４、２１５上のサンドイッチ構造が多価方法（すなわち、アビディティーを有する）で相互作用する場合、加えた分析物２２６の中間濃度下で、位置保持分子２２７の一部のみが競合的に変位する傾向があり、対応してテザー４００が離断する。この競合的変位状態は、上記のように、顕微鏡装置１０による位置的変動測定値の差異として検出可能であり得る。
【０２６７】
別の一実施形態において、図２１は、位置保持分子２２７が分析物分子２２６より低いプローブ３００、３２０に対する親和性を有する競合アッセイについての反応スキームを示す。基板２００上の捕捉表面領域２１４および２１５はプローブ３００を有し、粒子８００は、位置保持分子２２７に対して特異的であるが、分析物２２６に対して親和性がより大きいプローブ３２０を有する。その結果、位置保持分子２２７が、加えられた試料からの標的分析物２２６によって競合的に変位する場合、捕捉表面領域２１５と粒子８００との間の結合相互作用は、強度が増加する。これは、捕捉表面領域２１４と比較して、捕捉表面領域２１５内の粒子８００の測定された位置的変動の減少として、顕微鏡装置１０によって検出され得る。捕捉表面領域２１４が非交差反応分析物に対する親和性を有する場合、この捕捉表面領域２１４内のサンドイッチ構造の結合力は落ち着く。他のアッセイ実施形態と同様に、このプロセスは、複数の粒子（例えば３個、５個、１０個、１００個またはそれ以上の粒子）において並列方法で実施され得る。
【０２６８】
分析物特異性
図２２は、競合アッセイに関して上記で考察された線に沿ったサンドイッチアッセイを示す。基板２００の捕捉表面領域２１４、２１５は、異なる分析物に対する特異性を有し、捕捉表面領域２１５は、分析物２２６に対する特異的親和性を有し、捕捉表面領域２１４は、異なる分析物に対する特異性を有する。
【０２６９】
分析物２２６を含有する液体を、チャンバ１１８内、および捕捉表面領域２１４、２１５上に分注する。正しい条件（すなわち、インキュベーション等）を考えると、分析物２２６は、捕捉表面領域２１５内のプローブ３００に結合する。分析物２２６に対する特異的親和性を有する、プローブ３２０を有するレポーティング粒子８００を加える。また、レポーティング粒子８００は、捕捉表面領域２１４に相補的な分析物に対する親和性も有するか、または、他に、かかる親和性を有する別の粒子も含まれる。重力、遠心または他の手段による沈降の後、顕微鏡装置１０を用いて粒子８００の位置的変動を決定する。捕捉表面領域２１５内の粒子８００の移動度が小さいことは、結合と、サンドイッチ構造内の分析物２２６の存在とを示す。捕捉表面領域２１４内のように、粒子８００の移動度が相対的により大きい場合、結合反応はない。
【０２７０】
共有結合テザー
図２０は非共有結合テザーの使用を示すが、共有結合テザーの使用も可能であってよい。例えば、核酸オリゴ伸長およびライゲーションアッセイは、特異的に形成されたテザーを共有結合するために用いられ得る。本技術分野において公知の他の酵素学的、化学的または光化学的結合機構を用いることもできる。
【０２７１】
スクリーニング分子ライブラリ
本実施形態において、図１８Ａ〜１８Ｂのアッセイは、例えば、分子のライブラリをスクリーニングするために用いられる。分子のライブラリは、しばしば組み合わせ化学アプローチ（すなわち、リガンドのための）を用いて、または物質のライブラリの購入等の他の方法により生成される。しかるに、ライブラリは、小分子（例えば、可能な薬物リード）、生体分子、または情報をコードすることに関する可能なリガンドのコンジュゲート（例えば、ビーズ上のＤＮＡコード小分子ライブラリまたは抗体の酵母ディスプレイライブラリ）を含有することができる。
【０２７２】
分子のライブラリは、空間的に分解された方法で用いることが可能であり、その場合、位置（例えば、基板２００上のパッチもしくは捕捉表面領域２１０等、またはウェルプレートもしくはマイクロ流体カートリッジの特定のウェル）は、どの物質が陽性のシグナルを生じたのかについて明らかにする。
【０２７３】
一実施形態において、物質のライブラリを粒子に結合させ、次いで粒子を一緒に混合する。しかるに、何千もの化合物のライブラリから取得された単一化合物で各粒子をコーティングした多数の粒子があるだろう。単一化合物に対する数千の実験ではなく、一度に数千の化合物に対して単一の実験を実施することが可能であるように、粒子は一緒に混合される。
【０２７４】
実験終了時、どの物質が結合（または、場合によっては、結合の防止）を引き起こしたのかについて同定するために、次のステップ：
（ａ）本発明の装置および方法を用いて、結合した（または非結合の）粒子を測定すること（すなわち、顕微鏡装置１０を用いて粒子の結合を決定すること）；
（ｂ）マイクロピペット、ビーズの磁気操作、または光学的トラッピングシステム等の公知の技術を用いて、対象のそれらの粒子（すなわち、対象の物質でコーティングされた）を抽出すること；および
（ｃ）どの物質または複数の物質が所望の応答を与えるのかを決定するために、粒子をコーティングする物質の性質を決定すること（すなわち、それがＤＮＡである場合、それを配列決定することによって、または他の公知の方法によって）
がとられる。
【０２７５】
所望の特性を有する粒子は、更に特性評価され得るか、増幅され得るか、または他のテストのために使用され得る。しかるに、例えば、診断のテストのための、または薬物開発のための所定の特異性を有する分子を同定することができる。
【０２７６】
洗浄ステップ
位置的自由度の変化、ならびに陽性および陰性粒子の得られた測定可能な位置的変動のため、これらは、洗浄ステップの必要なしに識別され得る。しかるに、一般に、本発明の装置および方法を用いて実施されるアッセイは、洗浄ステップを必要としない（洗浄ステップがプローブ粒子の導入に先行するプロセスの一部である場合の例外は、上記で示される）。
【０２７７】
洗浄ステップは、標的への分析物の、または分析物へのプローブの特異的結合を離断することができる。従来の技術においては、ラベルの非結合部分を洗い流すが、本発明においては、表面に落ちて、見ることができるより大きな粒子に標識を付着させるので、これらの実施形態において洗浄ステップの要件はない。
【０２７８】
あるいは、従来のアッセイについてよりも厳しくない洗浄を用いることができる。誤って保持された粒子を除去するために、従来のイムノアッセイのように、付着した粒子を洗浄することができる。この場合、本明細書に記載される位置的変動の測定値に基づいて結合および非結合粒子を識別することができるので、洗浄は、従来のイムノアッセイのために必要であろうものよりも穏やかであってよい。その結果、アッセイデータは、従来の技術を用いて達成されるものよりも高い質（例えば、より高い感度またはダイナミックレンジ）となり得る。その結果、より大きなシグナルおよび／またはダイナミックレンジを達成することができる。
【０２７９】
識別された（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）検出アレイ（Ｉ．Ｄ．）。
上記の方法によって用いられる検出アレイ２００または他の基板は、バーコードまたは高周波同定（ＲＦＩＤ）標識等の機械可読識別子２０５を含むことができる（図３参照）。識別子２０５は、一意の識別子（例えば、シリアルナンバ）を含むことができる。識別子２０５は、（例えば、コンパクトディスク、インターネット等から）チップの源、ロット番号、検出アレイ２００上の捕捉表面領域２１０、２１１等の特異性、較正データ、または他の品質管理データ、機械操作もしくは分析プロトコルに関する情報を調べるために用いることができる。識別子２０５は、最終的なアッセイ結果および医療記録システムにおける患者識別子と関連づけることができる。識別子２０５において、幾つかのかかるデータを直接コードすることもできる。識別子２０５は、溶液中の分子のアッセイのために、本明細書に記載されるものを含む本発明の他の実施形態と共に用いることもできる。識別子２０５は、例えば、自動顕微鏡検査システム１０のカスタマイズされた操作を可能にする情報を含むこともできる。例えば、識別子２０５は、検出アレイ２００上の捕捉表面領域２１０、２１１、２１２の座標、較正データ、示唆された照度等を含むことができる。
【０２８０】
上記のように、検出アレイ２００は、本技術分野で公知の各種技術を用いて調製され得る。例えば、ガラス顕微鏡スライド２００（例えば、図３参照）は、本技術分野で周知のように、プローブまたはプローブ複合体（すなわち、２２０）を結合し得る官能化リンカー３１０で洗浄およびシラン処理することができる。（また、それらの内容が参照により完全に組み込まれている“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”ｂｙ  Ｔｏｎｅｙ  Ｃａｓｓ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｅｓ  Ｌｉｇｌｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８、ならびに米国特許公開第２００５／００４８２１９号を含むマイクロアレイ、バイオチップおよびタンパクアレイの分野における各種の出版物も参照すること。）
【０２８１】
対照捕捉表面領域
本発明による別の一実施形態において、複数の固定モノクローナル抗体を有する捕捉表面領域２１０、２１１、２１２は、２つ以上の型の細胞のうちの１つを検出するために用いてよく、その場合、所望により、少なくとも１つの更なる分析ステップが、細胞型を決定するために必要である。一般に、品質管理のために、対照およびダミー／ブランクの捕捉表面領域２１０、２１１、２１２および粒子を含むこともできる。
【０２８２】
粒子サイズ
粒子８００（例えば、図２１参照）のサイズは、位置的自由度の分析を増強するように選択され得る。可能な結合部位の数は、粒子の断面積およびディスク（例えば、ＲＢＣ）のｒ２のスケールに比例し、球状粒子に対して線形である。その結果、より小さい粒子８００のために、より大きな数の粒子８００を検討する必要があるかもしれない。あまりに小さい粒子８００（所定の粒子密度のための）を用いることによって、沈降を減速させることができるものの、表面に沿った粒子８００の移動は減少する。十分な粒子サイズおよび密度は、基板２００からの拡散を防止することも可能であり、それによって、位置的自由度の分析を単純化させることができる。しかるに、本明細書で開示される本発明の実施形態は、速く、正確な分析のための十分な移動度を有すると共に、急速な沈降を達成するために十分な粒子サイズを用いる特性を有することができる。
【０２８３】
テザーの長さ
本発明による一実施形態において、粒子８００の位置は、基準参照（図示せず）に関して測定され得る。参照は、基板２００、または分析顕微鏡の光学部品に関連づけられ得る。
【０２８４】
本発明による別の一実施形態において、位置的自由度を決定するために用いる粒子運動は、テザー４００の非常により大きなその長さである。例えば、テザー４００はおよそ１０ｎｍの長さ（例えば、２ｎｍから５０ｎｍの間の範囲）であってよく、検出された運動はおよそ１００ｎｍ以上である。
【０２８５】
本発明による更に別の一実施形態において、位置的自由度の検出は、テザー４００の長さを推定することと、細胞２２０または粒子８００が、テザーの長さより大きな距離を移動するかどうかを決定することとを含む。顕微鏡装置１０からの記録データは、かかる所定の閾値距離より小さい移動を除外するためにコンピュータプログラムによってフィルタされ得る。例えば、かかる移動は、データベース内に「事象」として記録され得る。かかる複数の事象（例えば、１００〜１０，０００の事象）をデータベース内に記録し、コンピュータプログラムによって分析して、統計学的に満足な測定値を得ることができる。テザーの長さおよび閾値に応じて、統計学的に満足なデータセットは、１から３０秒の間、粒子を観測することによって、コンピュータプログラムによって得ることができる。
【０２８６】
参照値
本発明による別の一実施形態において、捕捉表面領域２１０等に付着した粒子（例えば、ＲＢＣ２２０、粒子８００）は、所定の一定の時間または所定の一定の数の観測の後、所定の一定の距離より大きく移動することができない場合、その表面上に存在する捕捉表面領域２１０の特異的結合標的を有するように決定される。
【０２８７】
また、上記のように、顕微鏡装置１０で測定された粒子変動を、（すなわち、対照試料に対する多くの較正の実行から統計学的に決定される）所定の参照値と比較して、それが結合または非結合粒子に対応する可能性があるかどうかを決定することができる。別の一実施形態において、変動測定値の集合を、公知の性質の参照試料からの変動測定値の集合と比較することができる。
【実施例】
【０２８８】
実験例
以下の実施例は、（更に本明細書において考察される）血液型判定に関する。
【０２８９】
図１２は、抗Ａ抗体コーティング表面において測定した２種の異なる試料の、（位置的自由度を測定する）正規化標準偏差（「ＮＳＤ」）ヒストグラムのプロットを示す。黒色のヒストグラムは、Ａ抗原（すなわち、Ａ型）に対して陽性である赤血球の測定値からである。これらの細胞は、固定された抗Ａ抗体を有する表面上に分散された。赤色のヒストグラムは、Ａ抗原に対して陰性（すなわち、Ｂ型またはＡ陰性）である赤血球の測定値からのものである。これらの細胞は、固定された抗Ａ抗体を有する別の表面上に分散された。各細胞のＮＳＤをプロットし、それは、各細胞が表面上にある間に生じた強度変動の大きさを示し、表面における細胞の移動の量を反映する。
【０２９０】
Ｂ型細胞（赤色のヒストグラム）は高い正規化標準偏差値を示し、それは、細胞が自由に拡散することを示し、赤血球表面上のＢ型抗原と固体基板（すなわち、カバーグラス）に付着した抗Ａ抗体との間のあらゆる固定化相互作用の欠如が確認される。Ａ型細胞（黒色のヒストグラム）は低正規化標準偏差値の狭い分布を示し、それは、これらの細胞が、赤血球表面上のＡ型抗原と固体基板に付着した抗Ａ抗体との間に形成された特異的結合の存在を理由として固定されたことを示す。これらのプロットは、ＮＳＤ測定プロトコルを用いて非結合細胞から（すなわち、Ａ抗原／抗Ａ抗体結合形成による）特異的に結合した赤血球を識別する能力を明確に示す。よって、これらのプロットは、Ａ抗原の存在について赤血球をオモテ試験する本発明の実施形態の能力も示す。
【０２９１】
本実施例において、試料チャンバ内に細胞を分散させた後１０〜２０分間測定を行い、約１０秒間データを取得し、６０のフレームから算出したピクセル強度変動の統計画像（すなわち、正規化標準偏差画像）を得た。
【０２９２】
図１３は、抗Ｂ抗体コーティング基板表面において測定した、この場合においては、一方がＡ型血液（赤色のヒストグラム）及び他方がＢ型血液（黒色のヒストグラム）の２種の異なる試料のＮＳＤヒストグラムのプロットを示す。赤色のヒストグラムは、Ｂ抗原に対して陰性（すなわち、Ａ型またはＢ陰性）である赤血球の測定値からである。これらの細胞は、固定抗Ｂ抗体を有する別の表面上に分散された。各細胞のＮＳＤをプロットし、それは、各細胞が表面上にある間に生じた強度変動の大きさを示し、表面における細胞の移動の量を反映する。
【０２９３】
Ａ型細胞（赤色のヒストグラム）は高いＮＳＤ値を示し、それは、細胞が自由に拡散することを示し、赤血球表面上のＡ型抗原と固体基板（すなわち、カバーグラス）に付着した抗Ｂとの間のあらゆる固定化相互作用の欠如が確認される。他方で、Ｂ型細胞（黒色のヒストグラム）は低ＮＳＤ値の狭い分布を示し、それは、これらの細胞が、赤血球表面上のＢ型抗原と固体基板に付着した抗Ｂとの間に形成された特異的結合の存在を理由として固定されたことを示す。これらのプロットは、ＮＳＤ測定プロトコルを用いて非結合細胞から（すなわち、Ｂ抗原／抗Ｂ結合形成による）特異的に結合した赤血球を識別する能力を明確に示す。よって、このデータは、Ｂ抗原の存在についての赤血球をオモテ試験における本発明の実施形態の能力を示す。
【０２９４】
本実施例において、試料チャンバ内に細胞を分散させた後１０〜２０分間測定を行い、約１０秒間データを取得し、６０のフレームから算出したピクセル強度変動の統計画像（すなわち、正規化標準偏差画像）を得た。
【０２９５】
図１４は、２種の異なる試料：抗Ｄコーティング基板表面において測定した、一方がＤ陰性血液（赤色のヒストグラム）および他方がＤ陽性の血液（黒色のヒストグラム）のＮＳＤヒストグラムのプロットを示す。各型の赤血球は、固定された抗Ｄ抗体を有する別々の表面上に分散された。各細胞のＮＳＤをプロットし、それは、各細胞が表面上にある間に生じた強度変動の大きさを示し、ゆえに、表面における細胞の移動の量を反映する。
【０２９６】
Ｄ陰性型細胞（赤色のヒストグラム）は高い正規化標準偏差値を示し、それは、細胞が全体的に自由に自由に拡散することを示し、赤血球表面上の抗原と固体基板（すなわち、カバーグラス）に付着した抗Ｄ抗体との間のあらゆる主要な（ｄｏｍｉｎａｎｔ）固定化相互作用の欠如が確認される。Ｄ陽性型細胞（黒色のヒストグラム）は、より低いＮＳＤ値を示し、それは、これらの細胞のより多くが、赤血球表面上のＤ陽性型抗原と固体基板に付着した抗Ｄ抗体との間に形成された特異的結合の存在を理由として固定されたことを示す。これらの分布は、各分布の手段がｉまだ明確に異なるにもかかわらず、いくらかの重複を示す。それにもかかわらず、プロットは、ＮＳＤ測定プロトコルを用いて、大きく非特異的に結合した細胞群から（すなわち、Ｄ抗原／抗Ｄ抗体結合形成による）大きく特異的に結合した赤血球群を識別する能力を明確に示す。よって、データは、Ｄ抗原の存在について赤血球の集合をオモテ試験する本発明の実施形態の能力を示す。
【０２９７】
本実施例において、試料チャンバ内に細胞を分散させた後１０〜２０分間測定を行い、約１０秒間データを取得し、６０のフレームから算出したピクセル強度変動の統計画像（すなわち、正規化標準偏差画像）を得た。
【０２９８】
図１５Ａは、異なる時点で取得された、赤血球の試料についての一連のＮＳＤヒストグラムを示す。試料は、ガラスカバーグラス表面上のＢ抗原を有する表面に、合成血漿中における高濃度の抗Ａ  ＩｇＭクラス抗体（１００ｎΜ）の存在下での、Ａ型赤血球から成る。溶解したＢ型赤血球でガラスカバーグラスをコーティングすることによって、Ｂ抗原表面を調製した。この測定構成は、公知の抗原の型の表面における公知の型の血液細胞の間の結合の程度を検出することによって、天然に存在する抗体の有無について被験者の血漿をテストするウラ試験方法に類似する。ウラ試験方法における結合の存在は、血液細胞および表面に同時に結合することが可能であり、それによってそれらを固定する（すなわち、それらの位置的変動を減少させる）抗体の存在を示す。
【０２９９】
図１５Ａにおける底部ヒストグラムは、１００ｎＭ抗Ａ抗体を有する合成血漿中に分散したＡ型細胞を、Ｂ抗原を有する表面に導入した１３分後に測定された。１秒につき５フレームの速度で取得される一連の４０の画像フレームの分析（細胞ＮＳＤ算出）によって各ヒストグラムを生成した。観測可能なＮＳＤの高い平均値によって証明されるように、細胞は拡散することが可能である。２１、２９、３７および４５分の時間点（ｔｉｉｍｅ  ｍａｒｋｓ）で測定されるヒストグラムの類似性によってみられるように、細胞は、同様に、後の時点において類似の拡散挙動を示す。
【０３００】
図１５Ｂは、（図１５ＡのＢ型抗原表面測定と異なり）表面がその上にＡ型抗原を有するように、溶解したＡ型赤血球によりそれを調製することによって調製されたこと以外は、図１５Ａにおけるものと同様の条件下でのヒストグラムの時系列を示す。Ａ細胞がＡ型表面に結合したことを確実にするように（視覚的に確認されたように）高濃度の抗Ａ抗体（１００ｎΜ）を選択した。
【０３０１】
細胞を表面に導入した１４分後に取得された、最初に測定したヒストグラム（底部ヒストグラム）は、細胞が固定されること（低い平均ＮＳＤおよび狭い幅）を示す。２２、３０、３８および４６分の測定における同様のＮＳＤヒストグラムにみられるように、後の時点で、細胞は、同様に結合したままである。図１５Ａおよび１５Ｂのヒストグラムの比較によって、細胞が結合しているか否かを決定するためにＮＳＤに対する閾値を選択することができる。これらの条件下で７％のＮＳＤの閾値が適切であり、図１５Ａの非結合集団における大部分の細胞はこの閾値を上回り、図１５Ｂの結合集団における大部分の細胞はこの閾値を下回る。
【０３０２】
非常により低い濃度の抗体を用いたこと；わずか１ｎＭの抗Ａ抗体が合成血漿中に存在したこと、を除いては、図１６Ａおよび１６Ｂは、図１５Ａおよび１５Ｂにおいて測定された条件と同様である。図１６Ａにおいて、ＮＳＤ測定プロトコルは、試料を表面に導入した１９分後に最初に測定した場合にＢ型表面上に分散された１ｎＭの抗Ａ抗体を含有する合成血漿におけるＡ型細胞が大部分で非結合であることを示す。２５、３１、３７、４３、４９および５５分の点における後続の測定は、類似の挙動を示す。
【０３０３】
図１６Ｂにおいて、１ｎＭの抗Ａ抗体を含有する合成血漿中のＡ型細胞は、Ａ型抗原を有する表面に導入した後に測定された。１８分後、図１６Ａにおいて測定される細胞の対照セット（すなわち、非結合細胞）にわたって、低いＮＳＤ値を有する、わずかにより高い細胞の分率（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を検出することができる。ヒストグラムにおける累進的な左へのシフトに見ることができるように、時間と共に、この低ＮＳＤ分率の大きさが増加する。１００ｎＭの抗Ａ抗体を用いた場合の細胞と表面との間の非常により速い結合相互作用と比較して、抗Ａの低い１ｎＭの濃度は、細胞と表面との間に結合を作る速度を減少させる（図１５Ｂ参照、事実上全ての細胞が１４分以内に結合することが分かった）。
【０３０４】
要約すると、図１５Ａ、１５Ｂ、１６Ａおよび１６Ｂは、抗原コーティング表面における赤血球のＮＳＤ測定値を用いて、血漿溶液中において抗体濃度の範囲を検出することができることを示す。
【０３０５】
本発明の更なる実施形態は、少なくとも幾つかのプローブ型について、沈降した粒子の非特異的結合が特異的結合より速い速度で生じるという発見に基づく。その結果、粒子の沈降後の初期の時点に基づいて位置的変動シグナルを測定することができるということを発見した。この初期の位置的変動は、後の時点に基づく位置的変動測定値から減算されてもよい。
【０３０６】
つまり、位置的変動の計算は、コンピュータプログラムが作動して粒子位置の時間変化に関連した指標を算出し、かつ、任意に、非特異的結合についての時定数より大きな動力学的時定数で生じる非特異的結合を補正するステップを含んでもよい。上記のように、これは、動力学または分子アッセイ技術の技術分野において公知の曲線適合または他のアルゴリズムによって行われてもよい。
【０３０７】
しかるに、本発明の上記の実施形態は、本発明の原理の明瞭な理解のために記載した実施の単なるなし得る例であることが強調されるべきである。本発明の趣旨および原理を逸脱することなく、本発明の上記の実施形態に対して変更および改変を行ってもよい。全てのかかる改変および変更は、本発明の範囲内で本明細書に含まれ、以下の請求項によって保護されることが意図される。
【符号の説明】
【０３０８】
１０  顕微鏡装置
１０Ａ  顕微鏡装置
４０  入口開口部
１００  照明源
１００Ａ  照明源
１００Ｂ  コヒーレント光源
１０１  コリメータ
１０２  繊維光学パッチコード
１０３  アイリス／開口部
１０４  レーザービーム
１０５  試料ホルダ
１０６  顕微鏡
１０７  試料
１０８  粒子
１０８ａ  表面
１０９  表面
１１２  カメラ
１１３  コンピュータ
１１４  移動ステージ
１１６  マイクロ流体機器
１１７  空気圧または油圧圧力ポンプ
１１８  試料チャンバ
１２０  反射または部分的反射コーティング
１４０  接眼レンズ
１４１  チューブレンズ
１４２  対物レンズ
１４４  コンデンサ
１４５  視野絞り
１４６  開口絞り
１４７  位相リング
１４８  焦点機構
１６１  オープンウェル試料カートリッジ
１６２  カバーガラス
２００  基板
２０１  捕捉表面領域
２０５  機械可読識別子
２１０  捕捉表面領域
２１１  捕捉表面領域
２１２  捕捉表面領域
２１４  捕捉表面領域
２１５  捕捉表面領域
２１６  領域
２２０  赤血球
２２５  抗原
２２６  分析物
２２６’  分析物
２２７  位置保持分子
２３０  白血球
３００  プローブ
３００’  プローブ
３１０  リンカー
３２０  抗体
３３０  プローブ粒子
３３５  ＨＩＶ抗体
３３６  ＨＩＶ抗原
３４０  粒子標識抗体
４００  テザー
４０１  入口
４０２  出口
４０３  高圧力源
４０４  低圧力源
４０５  ソレノイドバルブ
４０６  圧電性油圧アクチュエータ
４０７  ダイヤフラム膜
４０８  油圧油またはガス状メディア
４０９  移動ステージインサート
４１１  空気圧／油圧制御ライン
４１２  ポート
４１３  膜バルブ
４１４  加熱素子
４１５  音響源
４１６  マイクロ流体ウェルプレート
４１７  キャップ
４１８  ウェル
４１９  機構
４５０  ガスケット
４５１  位置
４５２  オーバフローリザーバ
６００  計器
６０１  濾過ディスポーザブル
６０２  ＡＢＯ／Ｒｈディスポーザブル
６０３  抗体スクリーニング（ＡｂＳ）ディスポーザブル
６０４  チューブ台
６０５  スタットテスト用ピペット操作ステーション
６０６  非スタットテスト用ピペット操作ステーション
６０７  ３７℃インキュベーション領域
６０８  ２５℃インキュベーション領域
６０９  スタット濾過ステーション
６１０  非スタット濾過領域
６１１  スナップイン液カートリッジ領域
６１２  テスト実施照明領域
６１３  結果読み取り用リーダ
７００  キャップ
７０１  基板
７０２  運動ガイド
７０３  コントローラ
７０４  機構
７０５  ウェル
８００  粒子
８２０  生体不活性部分
２００６’  分析物
【図１Ａ】
2013533469.tif 000003
【図１Ｂ】
2013533469.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
2013533469.tif 000008
【図１Ｇ】
2013533469.tif 000009
【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
2013533469.tif 000011
【図２Ｂ】
2013533469.tif 000012
【図２Ｃ】
2013533469.tif 000013
【図２Ｄ】
2013533469.tif 000014
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
2013533469.tif 000033
【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
2013533469.tif 000037
【図２１】
2013533469.tif 000038
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年1月29日(2013.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中における粒子と表面との間の結合度を測定する方法であって、
撮像装置を用いて前記粒子が相互作用する少なくとも１つの捕捉表面領域を有する試料チャンバを含む試料ホルダ内の流体中の複数の粒子を撮像すること；及び
前記少なくとも１つの捕捉表面領域への前記粒子の結合度の指標として、前記粒子の少なくとも一部についての位置的自由度を測定すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記複数の粒子を、前記撮像装置の照明光源からの照明の下で前記試料チャンバ内における前記流体中に懸濁させること、を更に含み、前記試料ホルダが流通機器の一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記流体中の前記粒子に活性化手段を適用することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記活性化手段を用いて前記位置的自由度の測定中に前記試料チャンバ内で前記流体を移動させることを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
重力系システム、遠心系システム、流通系システム、拡散系システム、磁気系システムまたはホログラフィー光学的ツィージングシステム（ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｗｅｅｚｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）のうちの１つにより、前記試料チャンバ内で前記粒子を沈降させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの捕捉表面領域が、複合体を形成し得るプローブと結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
分析物の有無または量を決定するために、前記プロセッサを用いて、前記粒子の各々の位置的自由度を決定すること、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記撮像装置が、ホログラフィー撮像装置を含む、光学顕微鏡装置である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記光学顕微鏡装置からのカメラを用いて前記粒子の画像の時系列を得て前記位置的自由度を決定すること；及び
前記プロセッサを用いて前記画像を分析すること、
を更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記位置的自由度の前記決定が、前記プロセッサを用いて、所定の時間、前記少なくとも１つの捕捉表面領域の所定の近傍内における前記粒子のうちの少なくとも１つから散乱する光の変化を測定することによって実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記位置的自由度は、前記所定の近傍内における前記粒子のうちの前記少なくとも１つの時間依存的位置的変化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を記載する統計的尺度であり、分散、標準偏差、二乗平均平方根（ＲＭＳ）移動、または観測結果の時系列に関連づけられた粒子位置の自己相関関数として表される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの捕捉表面領域の前記近傍は、動きが観測される前記粒子のうちの既知の１個の位置の周囲の所定の境界である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記位置的自由度が、前記プロセッサを用いて、前記粒子の多数の取得画像の平均を計算すること、前記粒子の連続画像フレームの間の平均差を計算すること、及び前記画像の時系列を通じて強度のピクセル的な変化を計算すること、によって決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ピクセル強度値の統計分布の分析が、前記粒子の各々について、前記プロセッサを用いて算出され、そこから位置的自由度の分布と前記粒子の各々の結合度の分布とが得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロセッサを用いて前記粒子の位置的自由度の分布を計算すること
を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記粒子が血液細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記血液細胞が赤血球であり、前記赤血球のオモテ試験（ｆｏｒｗａｒｄ  ｔｙｐｉｎｇ）が実施され、前記赤血球が、特異的抗体を含有する捕捉表面領域に結合する特異的抗原を含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記血液細胞が赤血球であり、血漿または血清試料のひとつのウラ試験（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）が実施され、前記赤血球が、前記捕捉表面領域上に配置された赤血球の抗原に結合する標的抗体に結合し得る特異的血液型抗原を含有するか、または欠いている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記粒子が平坦化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記粒子が分析物であり、前記分析物は検出されたまたは指標である抗体のうちの１つである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
抗体スクリーニングを実施する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
感染症スクリーニングを実施する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
分子のライブラリのスクリーニングを実施する、請求項１７に記載の方法。
【国際調査報告】
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2013533469.tif 000047
2013533469.tif 000048