(57)【要約】  本発明は、ヘプシン活性化及びＭＳＰ／Ｒｏｎ経路を、特にヘプシンによりプロ-ＭＳＰ活性化を調節することにより、調節する方法及び組成物を提供する。
2013507967.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロ-マクロファージ刺激タンパク質（プロ-ＭＳＰ）のヘプシン活性化を阻害する候補インヒビター物質を同定する方法において、（ａ）ヘプシンとプロ−ＭＳＰ基質とを含有する第１のサンプルと候補物質を接触させ、（ｂ）サンプル中のプロ−ＭＳＰの活性化量を、第１のサンプルと同様の量であるが、前記候補物質と接触させられないヘプシンとプロ-ＭＳＰ基質を含有する参照サンプル中のプロ-ＭＳＰの活性化量と比較し、参照サンプルと比較して第１のサンプル中のプロ-ＭＳＰの活性化量の低減が、候補物質が単鎖ＭＳＰ（プロ-ＭＳＰ）のヘプシン活性を阻害可能であることを示す方法。
【請求項２】
サンプル中のヘプシンが、前記プロ-ＭＳＰ基質の活性化に有効な量である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プロ-ＭＳＰ基質が、プロ-ＭＳＰ、又はＡｒｇ４８３−Ｖａｌ４８４ペプチド結合の野生型形態を含むその断片を含むポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ヘプシンとプロ-ＭＳＰの相互作用を阻害するアンタゴニスト分子。
【請求項５】
分子が、抗体又はその断片を含む、請求項４に記載のアンタゴニスト分子。
【請求項６】
分子が、クニッツドメイン１配列を含むポリペプチドを含む、請求項４に記載のアンタゴニスト分子。
【請求項７】
分子が小有機分子を含む、請求項４に記載のアンタゴニスト。
【請求項８】
分子が、ヘプシンによりプロ-ＭＳＰ活性化を阻害可能なクニッツドメイン(ＫＤ)配列を含むポリペプチドを含む、請求項６に記載の分子。
【請求項９】
クニッツドメイン(ＫＤ)配列がクニッツドメイン１配列(ＫＤ-１)を含む、請求項８に記載の分子。
【請求項１０】
ＫＤ-１配列が、ヒト肝細胞増殖因子アクチベーターインヒビター-１、-１Ｂ(ＨＡＩ−１、ＨＡＩ−１Ｂ)、又はその変異体のものである、請求項９に記載の分子。
【請求項１１】
クニッツドメイン(ＫＤ)配列が、ヒト肝細胞増殖因子アクチベーターインヒビター-２(ＨＡＩ−２)、又はその変異体の一方又は双方である、請求項８に記載の分子。
【請求項１２】
分子が、ヒト肝細胞増殖因子アクチベーターインヒビター-１、-１Ｂ又は-２(ＨＡＩ−１、ＨＡＩ−１Ｂ又はＨＡＩ−２)の少なくとも一部、又はその変異体を含む、請求項６に記載の分子。
【請求項１３】
一部が、ヘプシンによりプロ-ＭＳＰ活性化を阻害可能なクニッツドメイン(ＫＤ)配列を含む、請求項１２に記載の分子。
【請求項１４】
クニッツドメイン(ＫＤ)配列が、
（ｉ）ヒト肝細胞増殖因子アクチベーターインヒビター-１、-１Ｂ(ＨＡＩ−１、ＨＡＩ−１Ｂ)のクニッツドメイン１配列(ＫＤ-１)、又はその変異体；又は
（ｉｉ）ヒト肝細胞増殖因子アクチベーターインヒビター-２(ＨＡＩ−２)のクニッツドメイン、又はその変異体の一方又は双方である、請求項１３に記載の分子。
【請求項１５】
分子がＲｏｎへの結合に対してヘプシンと競合する、請求項６に記載の分子。
【請求項１６】
分子がヘプシンへの結合に対してプロ-ＭＳＰと競合する、請求項６に記載の分子。
【請求項１７】
分子が、ヘプシンと結合可能であり、野生型ＭＳＰと比較して低減したＭＳＰ活性化活性を有する変異ＭＳＰを含む、請求項１６に記載の分子。
【請求項１８】
変異ＭＳＰがＭＳＰβ鎖の少なくとも一部を欠いている、請求項１７に記載の分子。
【請求項１９】
分子が毒素に結合している、請求項６から１８のいずれか一項に記載の分子。
【請求項２０】
請求項６から１８のいずれか一項に記載の分子をコードする単離された核酸。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸を含有するベクター。
【請求項２２】
請求項２０に記載の核酸、又は請求項２１に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項２３】
分子を発現可能な宿主細胞において請求項２１に記載のベクターを発現させることを含む、請求項６から１８のいずれか一項に記載の分子を作製する方法。
【請求項２４】
請求項６から１８のいずれか一項に記載の分子と担体を含有する組成物。
【請求項２５】
担体が薬学的に許容可能な担体である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
容器と、該容器に収容される組成物を含み、該組成物が請求項６から１８のいずれか一項に記載の分子を含有している製造品。
【請求項２７】
被検体におけるＲｏｎの活性化に関連した処置用としての、請求項６から１８又は２０のいずれか一項に記載の分子。
【請求項２８】
精製されたプロ-ＭＳＰとヘプシンタンパク質を含有する組成物。
【請求項２９】
プロ-ＭＳＰ／Ｒｏｎ活性化に関連した生物活性を阻害する方法であって、請求項４から１９及び２７のいずれか一項に記載のアンタゴニスト分子を有効量、細胞又は組織と接触させることを含む方法。
【請求項３０】
被検体におけるプロ-ＭＳＰ／Ｒｏｎ活性化に関連した病状を治療する方法であって、請求項４から１９及び２７のいずれか一項に記載のアンタゴニスト分子を有効量、被検体に投与することを含む方法。
【請求項３１】
病状が、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、又は免疫疾患である、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
癌が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、乳頭癌、結腸癌、膵臓感、卵巣癌、子宮頸癌、中枢神経系癌、前立腺癌、骨肉腫、腎癌、肝細胞癌、膀胱癌、胃癌、頭部及び頸部の扁平上皮癌、メラノーマ、又は白血病である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）ＭＳＰのヘプシンタンパク質分解的プロセシングを可能にする条件下で、サンプルをヘプシンと接触させ、（ｂ）ヘプシン活性化されたＭＳＰの存在を検出することを含む、サンプル中のヘプシンを検出する方法。
【請求項３４】
（ａ）ＭＳＰのヘプシンタンパク質分解的プロセシングを可能にする条件下で、サンプルをＭＳＰと接触させ、（ｂ）ヘプシン活性化されたＭＳＰの存在を検出することを含む、サンプル中のヘプシンを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
この出願は、その内容を出典明示によりここに援用する２００９年１０月２２日出願の米国仮出願第６１／２５３９９０号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的に分子生物学及び増殖因子調節の分野に関する。特に、本発明は、マクロファージ刺激タンパク質の酵素活性化のモジュレーター、及び該モジュレーターの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
マクロファージ刺激タンパク質 (ＭＳＰ)は、レセプターチロシンキナーゼＲｏｎ、Ｍｅｔ-癌原遺伝子ファミリーのメンバーの結合及び活性化を介して、その生物活性を媒介する(Leonard & Danilkovitch, 2000)。ＭＳＰとそのレセプターとの相互作用により、レセプターのリン酸化及びキナーゼの活性化に至る。ＭＳＰ/Ｒｏｎ経路は、種々の癌の腫瘍形成に関連している(例えば、Waghら, 2008を参照)。ＭＳＰは、主として、肝実質細胞で構造的に合成される血漿タンパク質であるが、肺、副腎及び胎盤でも、低レベルで発現する。ＭＳＰは不活性な単鎖前駆体(プロ-ＭＳＰ)であり、機能的活性を達成するための、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ４８３↓Ｖａｌ４８４(配列番号：１)結合でのタンパク質切断に必要である(Skeelら, 1991)(Yoshimuraら, 1993)。活性ＭＳＰは、ジスルフィド結合により互いに保持されるα-及びβ-サブユニットのヘテロダイマーである。ＭＳＰはいくつかのトリプシン-様セリンプロテアーゼにより血管外部位で活性化することが知られている(Bhattら, 2007；Kawaguchiら, 2009；Wangら, 1994b；Wangら, 1996；Wangら, 1994c)。
【０００４】
ヘプシンは、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼファミリーのメンバーであり(Netzel-Arnettら, 2003；Wu & Parry, 2007)、前立腺癌において最も高度に未制御の遺伝子の一つであると同定されている(Dhanasekaranら, 2001；Luoら, 2001；Mageeら, 2001；Stameyら, 2001；Stephanら, 2004；Welshら, 2001)。免疫組織化学染色により、後期腫瘍及び転移性骨病変で強く発現していることが明らかとなり(Morrisseyら, 2008；Xuanら, 2006)、腫瘍進行におけるヘプシンの役割が示唆される。さらに、遺伝子発現分析に基づき、ヘプシンは卵巣癌(Tanimotoら, 1997)、腎細胞癌(Betsunohら, 2007；Zacharskiら, 1998)及び子宮内膜癌(Matsuoら, 2008)にも関連している。Beliveauらは、ヘプシンが プロ-ＭＳＰを切断しないと述べている(Beliveauら, (2009) FEBS J.  276:2213-26)。
【０００５】
ヘプシンの生理学的基質の包括的理解が明らかに必要とされている。本発明はこの必要性を満たし、他の有益性を提供する。
特許出願及び文献を含む、ここに引用された全ての参照は、それらの全体が出典明記により援用される。
【発明の概要】
【０００６】
ヘプシンは、Ａｒｇ４８３−Ｖａｌ４８４ペプチド結合での切断により、プロ-マクロファージ刺激タンパク質(プロ-ＭＳＰ)は、マクロファージ刺激タンパク質 (ＭＳＰ)に効率的に転換されることがここに開示されている。ここで記載されるように、 ヘプシンのための生理学的基質は、レセプターチロシンキナーゼＲｏｎ、Ｍｅｔ-癌原遺伝子ファミリーのメンバーのリガンドである、プロ-マクロファージ刺激タンパク質である。ここでヘプシンは、強力な活性を有するプロ-ＭＳＰを切断し、正常な生物活性を示す活性化ＭＳＰになることが示されている。本発明は、ここで詳細に記載される、これらの発見を少なくとも部分的にベースにした方法及び組成物を提供する。ヘプシン及びそのプロ-ＭＳＰとの相互作用は、異常又は所望しないヘプシン及び／又はＭＳＰ／Ｒｏｎ媒介性生物活性に関連した病状に対する、予防的及び／又は治療的アプローチの設計におけるかなりの微調整にとって、唯一の有利な標的である。よって、本発明は、ＭＳＰ活性の調整に関与する分子相互作用の調節を介した、ヘプシン及び／又はＭＳＰ／Ｒｏｎ媒介性生物経路の調節が可能な基質を同定及び使用するための方法、組成物、キット及び製造品を提供する。
【０００７】
従って、一態様において、本発明は、プロ-ＭＳＰのヘプシン活性化を阻害する候補インヒビター(すなわち、アンタゴニスト)物質をスクリーニング(又は同定)する方法であって：(ａ)ヘプシンとプロ-ＭＳＰ基質とを含有する第１のサンプルと候補物質とを接触させ、(ｂ)サンプル中のプロ-ＭＳＰの活性化量と、第１のサンプルと同様であるが、該候補物質と接触させない、同量のヘプシンとプロ-ＭＳＰ基質を含有する参照サンプル中のプロ-ＭＳＰの活性化量とを比較し、参照サンプルに対する第１のサンプル中のプロ-ＭＳＰの活性化量の低減が、候補物質がプロ-ＭＳＰのヘプシン活性を阻害可能であることを示す方法を提供する。一実施態様において、サンプル中のヘプシンは、前記プロ-ＭＳＰ 基質の活性化に有効な量で存在する。これらの方法での使用に適したプロ-ＭＳＰ基質は、それがプロ-ＭＳＰにおけるヘプシン切断部位の特徴を模倣する限り、多くの形態とすることができる。
【０００８】
プロ-ＭＳＰ基質の例には、限定するものではないが、Ａｒｇ４８３−Ｖａｌ４８４ペプチド結合の野生型形態、及びこのペプチド結合を含むＭＳＰの任意の断片を含有する、全長単鎖ＭＳＰが含まれる。このような断片は任意の長さ、例えば少なくとも(約)５、７、１０、１５、２０、２５アミノ酸長、又は(約)４〜２５、５〜２０、７〜１５のアミノ酸長とすることができる。一般的に、また好ましくは、プロ-ＭＳＰ基質は、野生型ヘプシンにより切断可能なＡｒｇ４８３−Ｖａｌ４８４ペプチド結合を含む。いくつかの実施態様において、プロ−ＭＳＰ基質は合成プロ-ＭＳＰ基質である。
【０００９】
他の態様において、本発明は、ヘプシンによるプロ-ＭＳＰの活性化をブロックする物質をスクリーニングする方法であって、ヘプシン又はプロ-ＭＳＰに(好ましくは、必要ではないが特に)結合し、ヘプシンとプロ-ＭＳＰとの特異的相互作用(例えば、結合)をブロックする物質をスクリーニングすることを含む方法を提供する。いくつかの実施態様において、物質は、ヘプシンと結合するために、プロ-ＭＳＰと競合する。いくつかの実施態様において、物質は、アミノ酸残基Ｖａｌ４８４に結合したＡｒｇ４８３ペプチドを含有するヒトＭＰＳの断片等の、プロ-ＭＳＰ(例えばヒト)に対して、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を含む、からなる又は本質的になる。いくつかの実施態様において、物質がこのようなアミノ酸配列を含む、からなる又は本質的になる場合、断片は、Ｒｏｎの活性化等、活性に関連したＭＰＳ配列の少なくとも一部が変異又は欠失している。
【００１０】
当業者に明らかなように、上述したものに一致するスクリーニングアッセイは、候補調節物質の第１のセットを得るための、ヘプシン-ＭＳＰ複合体の形成をスクリーニングする第１の工程、続いて生物学的に活性な形態に、プロ-ＭＳＰの活性化及び／又はプロ-ＭＳＰの転換を調節するための、候補調節物質の第１のセットの能力に基づいてスクリーニングする第２の工程をさらに含む。適切な読み出しは、ヘプシン/ＭＳＰ/Ｒｏｎシグナル伝達経路に関連した、酵素-基質複合体の形成及び／又は生物活性の知識に基づき、当業者には明らかであろう任意のものとすることができる。酵素-基質複合体の形成は、例えば常套的な生化学アッセイ(例えば、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、ＮＭＲ等)を使用して測定することができる。
【００１１】
一態様において、本発明は、ヘプシン/ＭＳＰ相互作用を破壊するアンタゴニストを提供する。例えば、本発明はプロ-ＭＳＰのヘプシン切断(例えば、Ａｒｇ４８３−Ｖａｌ４８４位置での切断)を阻害する分子を提供する。分子は、限定するものではないが、プロ-ＭＳＰのヘプシン切断が阻害されるように、ヘプシン又はプロ-ＭＳＰのいずれかに結合すること、プロ-ＭＳＰの切断が阻害されるようにヘプシン-プロ-ＭＳＰ複合体に結合すること、及び／又はヘプシンによるＭＳＰ切断の影響が阻害されるように(例えば、ヘプシンによる切断の後の、ＭＳＰの放出を阻害)、プロ-ＭＳＰ又はヘプシン(単体で又は複合体で)に結合することを含む、任意の数の方法でその阻害機能に働きかけることができる。一実施態様において、本発明のアンタゴニスト分子は、プロ-ＭＳＰ/Ｒｏｎ活性に関連した生物活性を阻害する。
【００１２】
一態様において、本発明のアンタゴニストは、肝細胞増殖因子アクチベーターインヒビターからの断片(ＨＡＩ−１、ＨＡＩ−１Ｂ、ＨＡＩ−２)が、プロ-ＭＳＰのヘプシン活性化の強力なインヒビターであるという、ここに記載の発見に由来するものである。一実施態様において、本発明は、ヘプシンによるプロ-ＭＳＰ活性化のアンタゴニストを提供し、ここで該アンタゴニストは、ヒトＨＡＩ−１、ＨＡＩ−１Ｂ又はＨＡＩ−２の少なくとも一部(全部)を含む。一実施態様において、該一部は、ヘプシンによるプロ-ＭＳＰ活性化の阻害を可能にするクニッツドメイン(ＫＤ)配列を含む。一実施態様において、前記クニッツドメイン配列はＨＡＩ−１又はＨＡＩ−１Ｂのクニッツドメイン１(ＫＤ１)である。一実施態様において、本発明のアンタゴニストは、ヒトＨＡＩ−１の野生型ＫＤ１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する変異体ＫＤ１配列を含み、ここで該変異体配列は、ヒトプロ-ＭＳＰのヘプシン切断阻害において、野生型ＫＤ１に、少なくとも匹敵する能力を有している。一実施態様において、本発明のアンタゴニストは、ヒトＨＡＩ-１の野生型ＫＤ１と、約７０％〜９９％、約７５％〜９８％、約８０％〜９７％、８５％〜９５％の配列同一性を有する、変異体ＫＤ１配列を含み、ここで該配列は、ヒトプロ-ＭＳＰのヘプシン切断阻害において、野生型ＫＤ１に、少なくとも匹敵する能力を有している。一実施態様において、前記クニッツドメイン配列はＨＡＩ−２のクニッツドメインの一方又は双方である。一実施態様において、本発明のアンタゴニストは、野生型ヒトＨＡＩ−２の対応するクニッツドメインと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する変異体ＨＡＩ−２クニッツドメイン配列を含み、ここで該変異体配列は、ヒトプロ-ＭＳＰのヘプシン切断阻害において、野生型ＨＡＩ−２に、少なくとも匹敵する能力を有している。一実施態様において、本発明のアンタゴニストは、野生型ヒトＨＡＩ-２の対応するクニッツドメインと、約７０％〜９９％、約７５％〜９８％、約８０％〜９７％、８５％〜９５％の配列同一性を有する、変異体ＨＡＩ−２クニッツドメイン配列を含み、ここで該配列は、ヒトプロ-ＭＳＰのヘプシン切断阻害において、野生型ＨＡＩ−２に、少なくとも匹敵する能力を有している。
【００１３】
いくつかの実施態様において、本発明のアンタゴニストは、小分子、ペプチド、抗体、抗体断片、アプタマー、又はその組合せである、又は含む。ここに記載のアンタゴニストは、ここに記載のヘプシンとプロ-ＭＳＰの相互作用の発見に基づき、当該技術(以下にさらに詳細に記載するものを含む)で公知の技術を使用して常套的に得ることができる。例えば、いくつかの実施態様において、本発明のアンタゴニストは、プロ-ＭＳＰに結合するために、ヘプシンと競合するが、ヘプシン切断部位(例えば、Ａｒｇ４８３−Ｖａｌ４８４)でプロ-ＭＳＰを切断する能力は有していない。いくつかの実施態様において、本発明のアンタゴニストは、ヘプシンに結合するためにプロ-ＭＳＰと競合する。例えば、一実施態様において、前記アンタゴニストは、プロ-ＭＳＰ(例えば、ヒトプロ-ＭＳＰ)に対して、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を含む、からなる又は本質的になり、ヘプシンと実質的に結合可能であるが、ヘプシン切断部位(例えば、プロ-ＭＳＰ Ａｒｇ４８３−Ｖａｌ４８４ペプチド結合)を欠き、及び／又は生物活性を欠く(例えば、ＭＳＰ β鎖が、その機能が実質的に低減又は除去されるように変異している)。一実施態様において、本発明のアンタゴニストは、ヘプシンと結合可能なプロ-ＭＳＰ断片を含む、からなる又は本質的になり、ここで、該断片は、生物活性に関連したＭＳＰ配列の少なくとも一部を欠いている。
【００１４】
よって、本発明は、ヘプシンと実質的に結合可能であるが、野生型ＭＳＰ、例えばＭＳＰ活性のアンタゴニスト、又はＭＳＰ生物活性の低減を示すがないわけではないＭＳＰ変異体と比較して、低減したＭＳＰ生物活性を有するＭＳＰ(又はプロ-ＭＳＰ)変異体を提供する。一実施態様において、本発明のアンタゴニストは、野生型(インビトロ又はインビボ)ＭＳＰの生物活性(限定するものではないが、このような生物活性には、基質としてプラスミノーゲンに関連する生物活性が含まれる)を阻害可能である。一実施態様において、本発明のアンタゴニストは低減したＭＳＰ生物活性を提供する。
【００１５】
いくつかの実施態様において、本発明の抗体アンタゴニストは、プロ-ＭＳＰのヘプシン活性化をブロックする抗-ヘプシン抗体を含む。いくつかの実施態様において、抗-ヘプシン抗体は、(ａ)(ｉ)配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＡＶＡ(配列番号：２)を含有するＨＶＲ−Ｌ１；(ｉｉ)配列ＳＡＳＳＬＹＳ(配列番号：３)を含有するＨＶＲ−Ｌ２；及び(ｉｉｉ)配列ＱＱＹＹＳＳＹＹＬＬＴ(配列番号：４)を含有するＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖；及び／又は(ｂ)(ｉ)配列ＧＦＮＦＳＹＳＹＭＨ(配列番号：５)を含有するＨＶＲ−Ｈ１；(ｉｉ)配列ＡＳＩＹＳＹＹＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号：６)を含有するＨＶＲ−Ｈ２；及び配列ＡＲＳＤＳＷＳＹＫＳＧＹＴＱＫＩＹＳＫＧＬＤＹ(配列番号：７)を含有するＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖を有する。いくつかの実施態様において、抗-ヘプシン抗体は、配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＶＳＳＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＳＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＳＳＹＹＬＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ(配列番号：８)を含有する軽鎖可変領域、及び／又は配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＦＳＹＳＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＳＩＹＳＹＹＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＤＳＷＳＹＫＳＧＹＴＱＫＩＹＳＫＧＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ(配列番号：９)を含有する重鎖可変領域を有する。いくつかの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体である。他の実施態様において、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施態様において、抗体は、キメラ抗体、親和成熟抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体からなる群から選択される。ある実施態様において、抗体は抗体断片である。いくつかの実施態様において、抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、又はｓｃＦｖである。
【００１６】
いくつかの実施態様において、ヘプシンに、本発明の物質又は分子が結合することで、ヘプシン基質のヘプシン活性化が阻害される。いくつかの実施態様において、ヘプシンに、本発明の物質又は分子が結合することで、ヘプシン基質のヘプシン活性化が競合的に阻害される。一実施態様において、本物質はヘプシン活性(例えば、触媒的に)部位をブロック化合物の不在下でヘプシンに結合するが、ヘプシン活性部位をブロックする化合物の存在下ではヘプシンに結合しない。
【００１７】
いくつかの実施態様において、ヘプシンに、前記物質又は分子が結合することで、ＭＳＰにより誘発される細胞成長(例えば、細胞増殖、生存、血管新生、形態形成、遊走)が阻害される。いくつかの実施態様において、ヘプシンに、前記物質又は分子が結合することで、Ｒｏｎレセプター活性化が阻害される。いくつかの実施態様において、ヘプシンに、本発明の物質又は分子が結合することで、ヘプシンへの、ヘプシン基質結合性が阻害される。いくつかの実施態様において、ヘプシンに、本発明の物質又は分子が結合することで、ヘプシンへの基質結合性が阻害される。いくつかの実施態様において、ヘプシンに、本発明の物質又は分子が結合することで、ヘプシン活性、例えばヘプシン酵素活性が阻害される。いくつかの実施態様において、ヘプシン酵素活性は、ヘプシンのポリペプチド基質の切断を含む。一実施態様において、ヘプシンのポリペプチド基質はプロ-ＭＳＰである。
【００１８】
いくつかの実施態様において、本発明のアンタゴニストは、ここに記載の本発明のスクリーニング又は同定方法により得られる。
【００１９】
一態様において、本発明のアンタゴニスト分子は、毒素、例えば細胞傷害剤に結合する。これらの分子は、添加剤／増強剤、例えば放射線及び／又は化学治療剤と組合せて処方又は投与することができる。
【００２０】
また本発明は、ヘプシン／ＭＳＰ／Ｒｏｎ軸の調節不全に関連した病状の調節に有用な方法及び組成物を提供する。よって、一態様において、本発明は、被検体におけるプロ-ＭＳＰの活性化を調節する方法であって、本発明のヘプシン／ＭＳＰモージュレーター分子(例えば、プロ-ＭＳＰのヘプシン切断を阻害する、ここに記載のアンタゴニスト分子)を被検体に投与することを含み、それによりプロ-ＭＳＰの活性化を調節する方法を提供する。一実施態様において、前記分子はＭＳＰ活性を阻害するアンタゴニストである。一態様において、本発明は、被検体におけるＭＳＰの調節不全に関連した病状を処置する方法であって、本発明のアンタゴニスト(例えば、ここに記載の、ヘプシンによるプロ-ＭＳＰ切断の任意のアンタゴニスト)を被検体に投与することを含み、それによりプロ-ＭＳＰの活性化を阻害する方法を提供する。一態様において、本発明は、被検体におけるＲｏｎ活性化を調節する方法であって、本発明のＭＳＰ／Ｒｏｎモージュレーター分子(例えば、プロ-ＭＳＰのヘプシン切断を阻害する、ここに記載のアンタゴニスト分子)を被検体に投与することを含み、それによりＲｏｎの活性化を調節する方法を提供する。一実施態様において、前記分子は、ＭＳＰ／Ｒｏｎ活性を阻害する、ＭＳＰ／Ｒｏｎアンタゴニストである。一態様において、本発明は、被検体におけるＲｏｎの調節不全に関連した病状を処置する方法であって、本発明のＲｏｎアンタゴニスト(例えば、ここに記載の、ヘプシンによるプロ-ＭＳＰ切断の任意のアンタゴニスト)を被検体に投与することを含み、それによりＲｏｎの活性化を阻害する方法を提供する。
【００２１】
ＭＳＰ/Ｒｏｎシグナル伝達経路は、例えば細胞成長刺激(例えば、細胞増殖、細胞生存、細胞遊走、細胞形態形成)及び免疫応答(例えば、増加する炎症反応、マクロファージにより増加するＮＯ生成)を含む、複数の生物学的及び生理学的機能に関与している。
【００２２】
よって、一態様において、本発明は、Ｒｏｎ又はＭＳＰ又は双方を発現する細胞の成長(例えば、細胞の成長、増殖又は生存)を阻害する方法であって、該細胞の成長が、ヘプシン、Ｒｏｎ及び／又はＭＳＰに依存して少なくとも一部であり、本発明のアンタゴニストと該細胞を接触させ、よって該細胞の成長を阻害することを含む方法を提供する。
【００２３】
一態様において、本発明は、細胞の遊走を阻害する方法であって、該細胞の遊走が、ヘプシン、Ｒｏｎ及び／又はＭＳＰに依存して少なくとも一部であり、本発明の有効量のアンタゴニストと該細胞を接触させ、よって該細胞の成長を阻害することを含む方法を提供する。
【００２４】
よって、一態様において、本発明は、Ｒｏｎ又はＭＳＰ又は双方を発現する細胞のアポトーシスを促進する方法であって、該細胞の生存が、ヘプシン、Ｒｏｎ及び／又はＭＳＰに依存して少なくとも一部であり、本発明のアンタゴニストと該細胞を接触させ、よって該細胞の成長を阻害することを含む方法を提供する。
【００２５】
さらなる他の態様において、本発明は、免疫応答(例えば、炎症)を阻害する方法であって、免疫応答が、ヘプシン、Ｒｏｎ及び／又はＭＳＰに依存して少なくとも一部であり、本発明のアンタゴニストを、異常な免疫応答に関連した状態のある細胞、組織、及び／又は被検体に投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
一態様において、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍、細胞増殖疾患、及び／又は免疫(例えば、自己免疫)疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明のアンタゴニストの使用を提供する。アンタゴニストは、抗体、抗体断片、小分子(例えば、有機分子)、ポリペプチド(例えば、オリゴペプチド)、核酸(例えば、オリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド又は干渉ＲＮＡ)、アプタマー、又はその組合せを含む、任意の形態にすることができる。
【００２７】
一態様において、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍、細胞増殖疾患、及び／又は免疫(例えば、自己免疫)疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の核酸の使用を提供する。
【００２８】
一態様において、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍、細胞増殖疾患、及び／又は免疫(例えば、自己免疫)疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の発現ベクターの使用を提供する。
【００２９】
一態様において、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍、細胞増殖疾患、及び／又は免疫(例えば、自己免疫)疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の宿主細胞の使用を提供する。
【００３０】
一態様において、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍、細胞増殖疾患、及び／又は免疫(例えば、自己免疫)疾患、及び／又は血管新生関連疾患(創傷治癒)の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の製造品の使用を提供する。
【００３１】
一態様において、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍、細胞増殖疾患、及び／又は免疫(例えば、自己免疫)疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明のキットの使用を提供する。
【００３２】
本発明の方法は、任意の適切な病状、例えば、ヘプシン及び／又はＲｏｎ／ＭＳＰシグナル伝達経路の調節不全に関連した細胞及び／又は組織に影響を及ぼすために使用することができる。例示的な疾患がここで記載され、非小細胞肺癌、卵巣癌、甲状腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、頭部及び頸部の癌(例えば、頭部及び頸部の扁平上皮癌)、脳癌(例えば、神経芽細胞腫又は髄膜腫)、皮膚癌(例えば、メラノーマ、基底細胞癌、又は扁平上皮癌)、膀胱癌(例えば、移行上皮癌)、乳癌、胃癌、結腸直腸癌(ＣＲＣ)、肝細胞癌、子宮頸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、及び腎癌、及び子宮内膜癌が含まれる。
【００３３】
一実施態様において、本発明の方法にて標的とされる細胞は癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞(例えば、非小細胞肺癌細胞)、甲状腺癌細胞、多発性骨髄腫細胞、精巣癌細胞、乳頭癌細胞、結腸癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨肉腫細胞、胃癌細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞(例えば、移行上皮癌細胞)、胃癌細胞、頭部及び頸部の扁平上皮癌細胞、メラノーマ細胞、白血病細胞、子宮内膜癌細胞、及び結腸腺腫細胞からなる群から選択されるものとすることができる。一実施態様において、本発明の方法にて標的とされる細胞は、過剰増殖及び／又は過形成性細胞である。他の実施態様において、本発明の方法にて標的とされる細胞は形成異常細胞である。さらなる他の実施態様において、本発明の方法にて標的とされる細胞は転移性細胞である。
【００３４】
本発明の方法は、付加的な処置工程をさらに含むことができる。例えば、一実施態様において、本方法は、標的細胞及び／又は組織(例えば、癌細胞)を放射線治療又は化学治療剤に暴露させる工程をさらに含む。
【００３５】
ここに記載するように、Ｒｏｎ活性化は、多くの病状に至らしめる調節不全の、重要な生物学的プロセスである。従って、本発明の一実施態様において、標的とする細胞(例えば、癌細胞)は、Ｒｏｎの活性化が、同様の組織起源の正常な細胞と比較して高められているものである。一実施態様において、本発明の方法は、標的細胞の死亡を引き起こす。例えば、本発明のアンタゴニストとの接触により、Ｒｏｎ経路を介したシグナルに対し、細胞が不能になる可能性がある。
【００３６】
Ｒｏｎの活性化(よって、シグナル伝達)の調節不全は、例えばＭＳＰ(Ｒｏｎ同族リガンド)及び／又はＲｏｎそれ自体の過剰発現を含む、多くの細胞変化に起因している可能性がある。従って、いくつかの実施態様において、本発明の方法は、Ｒｏｎ又はＭＳＰ又は双方が、同様の組織起源の正常な細胞と比較して、該細胞(例えば、癌細胞)によりさらに異常に発現している細胞を標的にすることを含む。
【００３７】
プロ-ＭＳＰの活性化(よって、Ｒｏｎの活性化)の調節不全は、ヘプシン、プロ-ＭＳＰ、及び／又はＲｏｎの過剰発現を含む、多くに細胞変化に起因している可能性がある。従って、いくつかの実施態様において、本発明の方法は、ヘプシン、プロ-ＭＳＰ及び／又はＲｏｎが、正常な対応する細胞又は組織と比較して、該細胞又は組織(例えば、癌細胞又は組織)によりさらに異常に発現している細胞又は組織を標的にすることを含む。
【００３８】
一態様において、本発明は、本発明の一又は複数のアンタゴニスト及び担体を含有する組成物を提供する。一実施態様において、担体は薬学的に許容可能である。
【００３９】
一態様において、本発明は、本発明のアンタゴニストをコードする核酸を提供する。一実施態様において、本発明の核酸は、ポリペプチド(例えば、オリゴペプチド)である、又は含むアンタゴニストをコードする。一実施態様において、本発明の核酸は、抗体又はその断片である、又は含むアンタゴニストをコードする。
【００４０】
一態様において、本発明は、本発明の核酸を含有するベクターを提供する。
【００４１】
一態様において、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含有する宿主細胞を提供する。ベクターは、任意の種類、例えば組換えベクター、特に発現ベクターとすることができる。任意の多様な宿主細胞を使用することができる。一実施態様において、宿主細胞は原核細胞、例えば大腸菌である。一実施態様において、宿主細胞は真核細胞、例えば哺乳動物細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞である。
【００４２】
一態様において、本発明は、本発明のアンタゴニストを作製する方法を提供する。例えば、本発明は、抗体(又はその断片)である、又は含むアンタゴニストを作製する方法であって、該抗体(又はその断片)をコードする配列を含む本発明の組換えベクターを、適切な宿主細胞で発現させ、該抗体(又はその断片)を回収することを含む方法を提供する。他の実施例において、本発明は、ポリペプチド(例えば、オリゴペプチド)である、又は含むアンタゴニストを作製する方法であって、該ポリペプチド(例えば、オリゴペプチド)をコードする本発明の組換えベクターを、適切な宿主細胞で発現させ、該ポリペプチド(例えば、オリゴペプチド)を回収することを含む方法を提供する。
【００４３】
一態様において、本発明は、容器：及び容器に収容された組成物を含み、該組成物が本発明の一又は複数のアンタゴニストを含有している製造品を提供する。一実施態様において、組成物は本発明の核酸を含有する。一実施態様において、アンタゴニストを含有する組成物は、いくつかの実施態様では薬学的に許容可能な担体をさらに含有する。一実施態様において、本発明の製造品は、被検体に組成物(例えば、アンタゴニスト)を投与するための使用説明書をさらに含む。
【００４４】
一態様において、本発明は、本発明の一又は複数のアンタゴニストを含有する組成物を収容する第１の容器；及びバッファーを収容する第２の容器を具備するキットを提供する。一実施態様において、バッファーは薬学的に許容可能である。一実施態様において、アンタゴニストを含有する組成物は、いくつかの実施態様では薬学的に許容可能な担体をさらに含有する。一実施態様において、キットは、被検体に組成物(例えば、アンタゴニスト)を投与するための使用説明書をさらに含む。
【００４５】
一実施態様において、本発明は精製されたプロ-ＭＳＰ及びヘプシンを含有する組成物を提供する。いくつかの実施態様において、組成物は細胞発現性Ｒｏｎをさらに含有する。
【００４６】
一態様において、本発明は、(１)ＭＳＰのヘプシンタンパク質分解的プロセシングを可能にする条件下で、サンプルとヘプシンとを接触させ、(２)ヘプシン活性化したＭＳＰの存在を検出することを含む、サンプル中のヘプシンを検出する方法を提供する。
【００４７】
一態様において、本発明は、(１)ＭＳＰのヘプシンタンパク質分解的プロセシングを可能にする条件下で、サンプルとプロ-ＭＳＰとを接触させ、(２)ヘプシン活性化したＭＳＰの存在を検出することを含む、サンプル中のヘプシンを検出する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、ヘプシンによるプロ-ＭＳＰのインビトロ活性化を示す。３７℃で１時間インキュベートした時の、用量依存方式での、組換えヘプシン活性化プロ-ＭＳＰ。還元条件下で、生成物をＳＤＳ-ＰＡＧＥにおいて分離した。〜２５ｋＤａバンド(図示)のＮ末端配列決定は、これがβ-鎖であり、よってヘプシンがＡｒｇ４８３−Ｖａｌ４８４ 結合でプロ-ＭＳＰを切断したことが示された。図１は配列番号：１７を開示している。
【図２】図２は、ＬｎＣａｐ-３４細胞において、細胞表面発現ヘプシンによる、プロ-ＭＳＰの活性化を示す。ヘプシンが安定して過剰発現したＬｎＣａｐ-３４細胞は、餓死させ、１２５Ｉ-プロ-ＭＳＰ単独又は種々のインヒビターと組合せて用い、３時間処置した血清である。組換えヘプシン(１０ｎＭ)は正の対照体として使用した。プロ-ＭＳＰプロセシングにおける著しい増加が、実験の開始に対して３時間後に観察された。インヒビターＫＱＬＲ(配列番号：１０)、ＫＤ１、及び抗-ヘプシン抗体Ｆａｂ２５は、プロ-ＭＳＰの活性化を効果的にブロックした。
【図３】図３は、Ｒｏｎに対するヘプシン-活性化ＭＳＰの結合性を示す。(ａ)表面プラズモン共鳴実験について、抗-Ｆｃ特異性抗体とアミンカップリングしたＣＭ５チップを、バイオセンサーにおいて、Ｒｏｎ-Ｆｃを捕捉するために使用した。Ｒｏｎへのプロ-ＭＳＰ(１μＭ)の検出可能な結合は観察されず、ヘプシン-活性化ＭＳＰは高親和性結合(ＫＤ ７ｎＭ)を示し、データを１：１結合モデルと適合させた。(ｂ)Ｒｏｎに対するＭＳＰの結合を測定するＥＬＩＳＡ実験において、半最大結合を付与するための有効濃度(ＥＣ５０)を測定したところ、０．５１９ｎＭであった。
【図４】図４は、Ｓ６及びＭＡＰキナーゼのリン酸化を示す。ヘプシン又はプロ-ＭＳＰ単独のいずれも、Ｒｏｎシグナル伝達経路の活性に効果的ではなく、一方、プロ-ＭＳＰのヘプシン処理により、用量依存方式において、ＭＡＰキナーゼ及びＳ６キナーゼの双方に、強いリン酸化が示された。
【図５】図５は、腹膜マクロファージ形態変化アッセイを示す。ヘプシン-活性化ＭＳＰでの刺激時に、腹膜マクロファージは、突起及び伸長により示される、細胞形状における明確な変化を受ける。ヘプシン-活性化ＭＳＰの影響は、商業的に入手可能なＭＳＰ、並びにＨＧＦＡ-活性化ＭＳＰのものに匹敵する。
【図６】図６は、走化性アッセイを示す。ヘプシンを用いたプロ-ＭＳＰの処理により、腹膜マクロファージの遊走にて、かなりの増加(ｐ＜０．００１)に至った。抗-ヘプシンインヒビター(抗-ヘプシン抗体Ｆａｂ２５)を用いた前処理により、マクロファージの遊走にかなりの低減が示された。
【図７】図７は、一酸化窒素合成の阻害を示す。原発性マウス骨髄マクロファージは、ＬＰＳに応答して、一酸化窒素を強く生成することが示された。ヘプシン-活性化ＭＳＰは、骨髄由来のマクロファージにおいて、ＮＯ生成をかなり減弱させた。ヘプシン-活性化ＭＳＰの影響は、商業的に入手可能なＭＳＰのものに匹敵する。プロ-ＭＳＰ、又はヘプシン及び抗-ヘプシン抗体Ｆａｂ２５と混合されたプロ-ＭＳＰを用いた処理により、ＬＰＳに応答して、一酸化窒素の強力な生成を阻害しなかった。
【図８】図８は、天然ヒトヘプシン(配列番号：１８)のアミノ酸配列の一実施態様を示す。
【図９Ａ】図９(Ａ)は、天然ヒトヘプシン(配列番号：１９)のアミノ酸配列の他の実施態様を示す。
【図９Ｂ】図９(Ｂ)は、天然ヒトヘプシン(配列番号：１９)のアミノ酸配列の他の実施態様を示す。
【図１０】図１０は、天然ヒトプロ-マクロファージ刺激タンパク質(プロ-ＭＳＰ)のアミノ酸配列(配列番号：２０)の一実施態様を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
(発明の詳細な説明)
本発明は、ＭＳＰ／Ｒｏｎシグナル伝達系路のモジュレーターを含む方法、組成物、キット及び製造品を提供し、このようなモジュレーターを使用する方法も含む。
これらの方法、組成物、キット及び製造品の詳細を、ここに提供する。
【００５０】
一般的技術
本発明の実施には、別段の記載がない限り、当業者の技量の範囲内にある分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来からの技術を使用する。かかる技術は、例えば「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 2版 (Sambrook等, 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」 (M. J. Gait編, 1984)；「Animal Cell Culture」 (R. I. Freshney編, 1987)；「Methods in Enzymology」 (Academic Press, Inc.)；「Current Protocols in Molecular Biology」 (F. M. Ausubel等編, 1987,及び定期的改訂版); 「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullis等, eds., 1994)；「A Practical Guide to Molecular Cloning」(Perbal Bernard V., 1988);「Phage Display: A Laboratory Manual」(Barbas等, 2001)のような文献で十分に説明されている。
【００５１】
(定義)
ここで使用される場合、「ヘプシン」なる用語は、天然配列ポリペプチド、ポリペプチド変異体、及び天然配列ポリペプチドの断片及びポリペプチド変異体(ここでさらに定義)で、野生型ヘプシンに類似した方式で、プロ-ＭＳＰ切断可能なものを含む。ここに記載のヘプシンポリペプチドは、種々の供給源、例えばヒト組織型、又は他の供給源から単離されたもの、又は組換えもしくは合成方法により調製されたものであってよい。「ヘプシン」、「ヘプシンポリペプチド」、「ヘプシン酵素」，及び「ヘプシンタンパク質」なる用語は、ここに開示のヘプシンポリペプチドの変異体をさらに含む。
【００５２】
「天然配列ヘプシンポリペプチド」は、天然由来の対応するヘプシンポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一実施態様において、天然配列ヘプシンポリペプチドは、図８のアミノ酸配列を含む。一実施態様において、天然配列ヘプシンポリペプチドは、図９のアミノ酸配列を含む。このような天然配列ポリペプチドは天然から単離することができ、又は組換え又は合成手段によって生産できる。「天然配列ヘプシンポリペプチド」なる用語は、特に、特定のヘプシンポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じた変異形態(例えば、他のスプライシング形態)、及びポリペプチドの自然に生じる対立変異体を包含する。
【００５３】
「ヘプシンポリペプチド変異体」又はその変異語は、ここに開示された任意の天然配列ヘプシンポリペプチド配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有することがここに定義されたヘプシンポリペプチド、一般的には活性化ヘプシンポリペプチドを意味する。このようなヘプシンポリペプチド変異体には、例えば、天然アミノ酸配列のＮ又はＣ末端で、一又は複数のアミノ酸残基が付加、又は欠失したヘプシンポリペプチドが含まれる。通常、ヘプシンポリペプチド変異体は、ここに開示された天然配列ヘプシンポリペプチド配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。通常、ヘプシン変異ポリペプチドは、少なくとも約１０のアミノ酸長、又は少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００のアミノ酸長又はそれ以上である。通常、ヘプシン変異ポリペプチドは、天然ヘプシンポリペプチド配列と比較して１を超える保存アミノ酸置換、又は天然ヘプシンポリペプチド配列と比較して２、３、４、５、６、７、８、９又は１０を越える保存アミノ酸置換を有さないであろう。
【００５４】
ペプチド又はポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、特定のペプチド又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、米国特許第6,828,146号に記載されているように、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。
【００５５】
ここで使用される場合、「ベクター」なる用語は、それが結合している他の核酸を輸送可能な核酸分子を称することを意図している。ベクターの一タイプは、そこに付加的なＤＮＡセグメントが結合していてもよい、環状の二重鎖ＤＮＡループと称される「プラスミド」である。他のタイプのベクターはファージベクターである。さらに他のタイプのベクターは、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに結合していてもよいウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製可能である(例えば、複製の細菌起源を有する細菌性ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞へ導入されると、宿主細胞のゲノムに結合可能で、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが操作的に結合している遺伝子の発現に指向可能である。ここでは、このようなベクターは「組換え発現ベクター」(又は単に、「組換えベクター」)と称される。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、多くの場合プラスミドの形態をしている。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、最も一般的には、プラスミドがベクターの形態で使用される場合に、交換可能に使用され得る。
【００５６】
ここで交換可能に使用される場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドポリマーを称し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。もし存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識と結合することによりさらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ」、類似体による自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電性結合(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダーゼ、カルバマート等)及び荷電性結合(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジン等)を含むもの、介入物を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤を含むもの(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等)、アルキル化剤を含むもの、修飾された結合を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基により置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる結合を調製するために活性化されてもよく、もしくは固体状又は半固体状支持体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはリン酸化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有するアミン又は有機キャッピング基部分で置換することもできる。また他のヒドロキシル類は標準的な保護基に誘導されてもよい。さらにポリヌクレオチドは当該技術で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ-又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、α-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び脱塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル結合は代替の結合基により置き換えてもよい。これらの代替の結合基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)により置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての架橋が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、ここで引用された全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００５７】
ここで使用される場合、「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの合成のポリヌクレオチドを称する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
【００５８】
ここで使用される「マクロファージ刺激タンパク質」及び「ＭＳＰ」、又は「プロ-マクロファージ刺激タンパク質」及び「プロ-ＭＳＰ」は、特にまた文脈上に他の定義がなされないない限り、そのようなプロセスが生じることを可能にする条件下で、プラスミノーゲンを活性化可能な任意の天然又は変異(天然に生じるものでも合成でも)ＭＳＰポリペプチド、又は活性化可能な活性化ＭＳＰポリペプチドにヘプシンにより活性化され得るＭＳＰポリペプチドを意味する。「野生型ＭＳＰ」なる用語は、一般的に、例えば図１０に記載され、SwissProt受託番号P26927(この受託番号が列挙される文献は、出典明示によってここに援用する)で列挙される、天然に生じるＭＳＰタンパク質のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを称する。
【００５９】
「抗体」及び「免疫グロブリン」は、広義において相互に交換可能に使用され、モノクローナル抗体(例えば、全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、所望の生物活性を示す限り二重特異性抗体)が含まれ、さらにある種の抗体断片(ここに詳細に記載されるもの)も含まれ得る。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化及び／又は親和成熟したものであってよい。
【００６０】
「抗体断片」は無傷抗体の一部のみを含み、該一部は、無傷抗体に存在する場合に、その一部に通常関連している機能の少なくとも一部、好ましくはほとんど又は全ての機能を保持している。一実施態様において、抗体断片は、無傷抗体の抗原結合部位を含み、よって抗原に結合する能力を保持している。他の実施態様において、抗体断片、例えばＦｃ領域を含むものは、特にＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合等、無傷抗体に存在する場合に、Ｆｃ領域に通常関連している少なくとも一の生物学的機能を保持している。一実施態様において、抗体断片は、無傷抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、断片に対し、インビボ安定性を付与可能なＦｃ配列に結合する抗原結合手において含み得る。
【００６１】
ここで使用される場合、「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一のアミノ酸配列を本質的に含む。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原に対するものである。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物に対し、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。
【００６２】
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、このような抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似するものである(米国特許第4,816,567号；及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。
【００６３】
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。またここに引用する次の文献及び参照を参考のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
【００６４】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここに開示されたヒト抗体を作製する任意のの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。
【００６５】
「親和成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較し、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、抗体の一又は複数のＣＤＲにおける一又は複数の変化を伴うものである。好ましい親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られる手順によって生産される。Marksら. Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメイン混合による親和成熟について記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier 等, Gene, 169：147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
【００６６】
「ブロック」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物機能を抑制又は低減するものである。好ましいブロック抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的に又は完全に抑制する。
【００６７】
ここで使用される場合、「アゴニスト抗体」は、関心あるポリペプチドの少なくとも一の機能的活性を模倣する抗体である。
【００６８】
「疾患」とは、本発明の組成物及び／又は方法を用いた処置が有益である任意の状態である。これには、慢性及び急性の疾患、又は当該問題の疾患に哺乳動物がかかりやすい病的状態を含む疾病が含まれる。ここで処置される疾患の非限定的例には、悪性及び良性の腫瘍；非白血病及びリンパ系腫瘍；神経細胞、グリア、アストロサイト、視床下部及び他の腺性、マクロファージ、上皮、間質及び胞胚腔の疾患；及び他の血管形成関連疾患が含まれる。
【００６９】
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」なる用語は、ある程度異常な細胞増殖に関連した疾患を称する。一実施態様において、細胞増殖性疾患は癌である。
【００７０】
ここで使用される場合、「腫瘍」とは、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を称する。「癌」、「癌腫」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語は、ここで称される場合、相互排他的である。
【００７１】
「癌」及び「癌性」なる用語は、典型的には制御されない細胞成長／増殖及び／又は侵襲性を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を称するか記述する。癌の例には、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌(hepatocellular cancer)、胃腸癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌(liver cancer)、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞癌(hepatic carcinoma)、及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
【００７２】
ここで使用される場合、「処置」とは、処置される個人又は細胞の自然経過を変化させる試みにおける臨床的介入を称し、予防のため、又は臨床病理経過中に実施することができる。処置に所望する効果には、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾病の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾病の進行速度の低減、病状の回復又は緩和、及び緩解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の組成物及び／又は方法は、疾病又は疾患の発症を遅延化させるために使用される。
【００７３】
「有効量」とは、所望する治療的又は予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を称する。
【００７４】
本発明の分子の「治療的有効量」は、病状、年齢、性別、個人の体重、及び個人に所望する反応を引き出すための分子(例えば、アンタゴニスト)の能力等の要因に応じて変わり得る。また、治療的有効量とは、分子(例えば、アンタゴニスト)の任意の毒性又は有害な影響を、治療的に有益な効果が上回る量である。「予防的有効量」は、所望する予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を称する。必然ではないが、典型的には、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に患者に使用されるために、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
【００７５】
ここで使用される場合、「細胞傷害剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は阻止する、及び／又は細胞破壊をもたらす物質を称す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学治療剤、例えばメトトキサレート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、又は他の挿入剤、酵素、及びその断片、例えば核酸分解酵素、抗生物質、及び細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素又は小分子毒素などの毒素、又はそれらの断片及び／又は変異体、及び以下に開示する種々の抗腫瘍剤又は抗癌剤を含むことを意図する。他の細胞傷害剤を以下に記載する。殺腫瘍剤により、腫瘍細胞の破壊が引き起こされる。
【００７６】
「化学治療剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学治療剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone))；デルタ-９-テトラヒドロカンナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標))；ベータ-ラパコン(lapachone)；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)(HYCAMTIN(登録商標))、ＣＰＴ-１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標)、アセチルカンプトセシン、スコポレクチン(scopolectin)、及び９-アミノカンプトセシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；ポドシロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin )(合成類似体、KW-2189及びCBI-TM1を含む)；エレトロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、及びラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１(例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと)；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)を含むダイネミシン(dynemicin)；エスペラマイシン(esperamicin)；同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルフォリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射(DOXIL(登録商標)及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピ���ビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート、ゲンシタビン(gemcitabine)(GEMZAR(登録商標))、テガフール(UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(XELODA(登録商標))、エポシロン、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラエリン(nitraerine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(ABRAXANEＴＭ)、及びドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ��似体；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン(oxaliplatin)；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン(NAVELBINE(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；上述した任意のものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体；並びにＣＨＯＰ等、上述したものの２又はそれ以上の組合せ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニソロンの併用療法用の略語、及びFOLFOX、５-ＦＵ及びロイコボビンと組合せてオキサリプラチン(ELOXATINＴＭ)を用いた治療計画用の略語が含まれる。
【００７７】
また、この定義には、癌の増殖を促進可能なホルモン効果を調整、低減、ブロック又は抑制するように働く抗ホルモン剤が含まれ、多くの場合は組織的又は全身処置の形態である。それらはホルモンそれ自体であってもよい。具体例には、抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(ＳＥＲＭ)など、例えばタモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)(EVISTA(登録商標))、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(FARESTON(登録商標))；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプターダウン-レギュレーター(ＥＲＤｓ)；エストロゲンレセプターアンタゴニスト、例えばフルベストラント(FASLODEX(登録商標))；卵巣を抑制又は活動停止させるように機能する薬剤、例えば黄体化(leutinizing)ホルモン-放出ホルモン(ＬＨＲＨ)アゴニスト、例えば酢酸ロイプロリド(LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標))、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；他の抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)及びビカルタミド；及びアロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、メゲストロールアセテート(MEGASE(登録商標))、エキセメスタン(AROMASIN(登録商標))、ホルメスタニエ(formestanie)、ファドロゾール、ボロゾール(RIVISOR(登録商標))、レトロゾール(FEMARA(登録商標))、及びアナストロゾール(ARIMIDEX(登録商標))が含まれる。さらに、化学治療剤のこのような定義には、ビスホスホナート、例えばクロドロナート(例えば、BONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、エチドロナート(DIDROCAL(登録商標))、ＮＥ-５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロナート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロナート(FOSAMAX(登録商標))、パミドロナート(AREDIA(登録商標))、チルドロナート(SKELID(登録商標))又はリゼドロナート(ACTONEL(登録商標))；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に付粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ-アルファ、ラルフ及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)；ワクチン、例えばTHERATOPE(登録商標)ワクチン、及び遺伝子治療用ワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン及びVAXID(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１インヒビター(例えば、LURTOTECAN(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えば、ABARELIX(登録商標))；ラパチニブジトシラート(ＥｒｂＢ-２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子インヒビターで、ＧＷ５７２０１６としても公知のもの)；ＣＯＸ-２インヒビター、例えばセレコキシブ(CELEBREX(登録商標)；４-(５-(４-メチルフェニル)-３-(トリフルオロメチル)-１Ｈ-ピラゾール-１-イル)ベンゼンスルホンアミド；及び上述した任意のものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００７８】
ここで使用される場合、「成長阻害剤」は、細胞の成長を阻害し、その成長が、インビトロ及び／又はインビボのいずれかでＭＳＰの活性化に依存している化合物又は組成物を称する。よって、成長阻害剤は、Ｓ期で、ＭＳＰ依存性細胞のパーセンテージを有意に減少させるものであってよい。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)ブロックする薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン、及びトポイソメラーゼＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１を停止するこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも溢流し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel編, Chapter 1, 表題「Cell cycle reguration, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakamiら, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類(例えば、パクリタキセル及びドセタキセル(doxetaxel))は、双方ともイチイから誘導される抗癌剤である。ヨーロッパイチイから誘導されるドセタキセル(TAXOTERE(登録商標), Rhone-Poulenc Rorer)は、パクリタキセル(TAXOL(登録商標), Bristol-Myers Squibb)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリンダイマーからの微小管のアセンブリを促進させ、脱重合を防止することにより微小管を安定化させ、細胞に有糸分裂の阻害をもたらす。
【００７９】
「ドキソルビシン」は、アントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの正式な化学名は(８Ｃ-シス)-１０-[(３-アミノ-２,３,６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７,８,９,１０-テトラヒドロ-６,８,１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５,１２-ナフタセンジオンである。
【００８０】
本発明の組成物及び方法
Ａ．抗体
一実施態様において、本発明は、治療用及び／又は診断剤として、ここでの使用が見出されているアンタゴニスト抗体を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
【００８１】
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質に、関連する抗原(特に、合成ペプチドが使用される)をコンジュゲートさせることが有用である。例えば、抗原は、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介してコンジュゲート)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲのものを使用し、コンジュゲートさせることができる。
【００８２】
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。数日ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために適切に使用される。
【００８３】
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
【００８４】
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。免疫化後、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press, 1986))。
【００８５】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞(融合パートナーとも称される)の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培養培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００８６】
好ましい融合パートナー骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、未融合の親細胞に対して選択される選択培地に対して感受性である。好ましい骨髄腫細胞系は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア、USAから入手し得るＳＰ-２及び誘導体、例えばＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞である。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞系もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【００８７】
ハイブリドーマ細胞が生育している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【００８８】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonら, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【００８９】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させてもよい(Goding, Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, pp.59-103(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培養培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで、例えばマウスに細胞をip注射することにより増殖させることができる。
【００９０】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティクロマトグラフィー(例えば、プロテインＡ又はプロテインＧ-セファロース)、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析等の、従来からの抗体精製手順により、培養培地、腹水、又は血清から適切に分離される。
【００９１】
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、従来からの手段を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源である。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成をなすことができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)が含まれる。
【００９２】
さらなる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCaffertyら, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marksら, J.Mol.Biol.,222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouseら, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の単離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な別法である。
【００９３】
抗体をコードするＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(ＣＨ及びＣＬ)のコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第4,816,567号；Morrisonら, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチド(異種ポリペプチド)のコード配列の全部又は一部を融合させることで、キメラ又は融合抗体ポリペプチドが産出されるように修飾できる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００９４】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含み得る。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【００９５】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒトである供給源からの一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に、Winter及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的にはいくつかのＣＤＲ残基及び場合によってはいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００９６】
ヒト化抗体を作るのに使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖でも重鎖でも、抗原性、及び抗体がヒト治療用途を意図している場合はＨＡＭＡ応答(ヒト抗-マウス抗体)を低減させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット（best-fit）」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーからスクリーニングされる。齧歯類の配列に最も近いヒトＶドメイン配列が同定され、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(ＦＲ)として受容される(Simsら. J. Immunol., 151:2296 (1993) ；Chothiaら.J. Mol. Biol. 196:901 (1987))。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来した特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用することができる(Carterら.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaら.J.Immunol, 151:2623(1993))。
【００９７】
抗体は抗原への高親和性及び他の好ましい生物学的性質を保持したままヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法では、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能で、当業者にはなじみが深い。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体構造を例証し表示するコンピュータプログラムを利用することができる。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能中で残基の可能な役割の分析、つまり、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大のような、所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選び、組み合わせることができる。一般に、高頻度可変領域残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的かつ最も実質的に関与している。
【００９８】
種々の形態のヒト化抗体が考慮される。例えば、ヒト化抗体は、イムノコンジュゲートを作製するために、場合によっては一又は複数の細胞傷害剤とコンジュゲートされる、Ｆａｂ等の抗体断片であってよい。また、ヒト化抗体は無傷抗体、例えば無傷ＩｇＧ１抗体であってよい。
【００９９】
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合欠損が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993); Bruggemannら, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及び米国特許第5,545,806号、同5,569,825号、同5,591,669号(全てGenPharm)；同5,545,807号、及び国際公開第97/17852号を参照。
【０１００】
あるいは、ファージディスプレイ技術（McCafferty等, Nature 348：552-553[1990]）を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術に従えば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄのメジャー又はマイナーコートタンパク質遺伝子の何れかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として示される。繊維状粒子がファージゲノムの単一ストランドのＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージ表示は多様な形式で行うことができる；例えばJohnson及びChiswell, David J. Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリからの抗-オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第5,565,332号及び同5,573,905号を参照のこと。
【０１０１】
上で論議したように、ヒト抗体は、活性化Ｂ細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第5,567,610号及び同5,229,275号を参照)。
【０１０２】
４．抗体断片
ある種の環境では、全抗体よりも、抗体断片を使用する方が有利である。より小さい断片であると、急速なクリアランスが可能であり、固形腫瘍へのアクセス改善に至る。
【０１０３】
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)；及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、大腸菌で発現し、そこから分泌可能であり、よってこれらの断片を多量に、容易に生成することができる。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を有するインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片が、米国特許第5,869,046号に記載されている。抗体断片の生産のための他の技術は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第93/16185号；米国特許第5,571,894号；及び米国特許第5,587,458号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷結合部位を有する唯一の種であり；よって、インビボでの使用中、非特異的結合の低減に適してる。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のいずれかに、エフェクタータンパク質が融合することで構成され、作製される。Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 上掲を参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。
【０１０４】
５．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ヘプシン、ＭＳＰ、及び／又はここに記載のヘプシン：ＭＳＰ複合体の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体は、他のポリペプチドに対する結合部位を有するこれらの実体上の結合部位に結合可能である。また抗体アームは、ヘプシン及び／又はＭＳＰ発現及び／又は結合細胞に対する細胞防御メカニズムを集中させるように、また局在化するように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は、ヘプシン、ＭＳＰ、及び／又はヘプシン：ＭＳＰ複合体を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体は、細胞傷害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗-インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアーム、及びポリペプチド結合アームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
【０１０５】
国際公開第96/16673号には二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第5,837,234号には二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体が記載されている。二重特異性抗−ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は、国際公開第98/02463号に示されている。米国特許第5,821,337号は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示している。
【０１０６】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において公知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開93/08829号及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０１０７】
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体−抗原結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が、所望する二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が、所望の鎖の組合せの収率において重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１０８】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第94/04690号に開示されている。二重特異性抗体を産生するさらなる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照。
【０１０９】
米国特許第5,731,168号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１１０】
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第4,676,980号)、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された(国際公開第91/00360号、国際公開第92/00373号、及び欧州特許第03089号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、いくつかの架橋技術と共に米国特許第4,676,980号に開示されている。
【０１１１】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science,229:81 (1985) は無傷な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生産された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
【０１１２】
最近の進歩により、化学的にカップリングさせて二重特異性抗体を形成することができるＦａｂ'-ＳＨ断片を大腸菌から直接回収することが容易になった。Shalabyら,J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の生成を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学カップリングを受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、またヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の細胞溶解活性を誘因する。組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し単離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、あまりに短くて、同一鎖上の２つのドメイン間に対形成できないリンカーにより、ＶＬにＶＨを結合させてなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１１３】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１１４】
６．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体も本発明の範疇に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため（米国特許第4,676,980号)、及びＨＩＶ感染の治療のために（国際公開第91/00360；国際公開第92/200373；欧州特許第03089号）提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されたものが含まれる。
【０１１５】
７．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも素早く内部移行(及び／又は異化)することができる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の抗原結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)(例えば、四価抗体)であってよく、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により、容易に生成することができる。多価抗体は、ダイマー化ドメインと、３又はそれ以上の抗原結合部位を有することができる。好ましいダイマー化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を含む(又はからなる)。この状況において、抗体は、Ｆｃ領域と該Ｆｃ領域にアミノ末端の３又はそれ以上の抗原結合部位を含むであろう。ここで好ましい多価抗体は、３〜約８、好ましくは４の抗原結合部位を含む(又はからなる)。多価抗体は少なくとも一のポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を含み、ここでポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖(類)は、ＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを含み、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の一ポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖は：ＶＨ-ＣＨ１-可動性リンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を含むことができる。ここで、多価抗体は、少なくとも２(好ましくは４)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含むことができる。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含むことができる。ここで考慮される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを含み、場合によっては、ＣＬドメインをさらに含む。
【０１１６】
８．エフェクター機能工学
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば抗体の、抗原依存性細胞媒介性細胞傷害(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)を向上させることが望ましい。このことは、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸置換基を導入することにより達成される。別に、又は付加的にシステイン残基(類)をＦｃ領域に導入して、この領域における鎖間ジスルイド結合を形成させる。このようにして産生されたホモダイマー抗体は改善された内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ＡＤＣＣ)を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。抗腫瘍活性が高められたホモダイマー抗体は、Wolff等, Cancer Research 53:2560-2565(1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは二重Ｆｃ領域を有し、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有しうる抗体を設計することができる。Stevensonら,Anti-cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。抗体の血清半減期を増加させるために、例えば米国特許第5,739,277号に記載されているようにして、抗体(特に抗体断片)にサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで用いられる場合、用語「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を向上させる原因となるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを称する。
【０１１７】
９．イムノコンジュゲート
また、本発明は、細胞傷害剤、例えば化学治療剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、又は動物由来の酵素的に活性な毒素、又はその断片)、又は放射性同位元素(すなわち、放射性コンジュゲート)にコンジュゲートした抗体を含有する、イムノコンジュゲート、又は抗体-薬剤コンジュゲート)に関連する。
【０１１８】
癌の処置において、腫瘍細胞を殺す又は阻害するために、細胞傷害又は細胞分裂阻害剤、すなわち薬剤を局所送達させるための抗体-薬剤コンジュゲートの使用(Syrigos 及び Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz 及び Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; 米国特許第4,975,278号)により、腫瘍への薬剤部分のターゲティング送達、及びコンジュゲートしていない薬剤の全身投与により、正常な細胞、並びに除外しようと探索している腫瘍細胞に、許容できないレベルの毒性が付与される箇所への、細胞内蓄積が理論的に可能になる(Baldwinら, (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (編), pp. 475-506)。よって、最小毒性での最大効果が探求されている。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の双方は、これらの方法で有用であると報告されている(Rowlandら, (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87)。これらの方法に使用されている薬剤には、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、及びビンデシンが含まれる(Rowlandら, (1986) 上掲)。抗体-毒素コンジュゲートに使用される毒素には、細菌毒素、例えばジフテリア毒素、植物性毒素、例えばリシン、小分子毒素、例えばゲルダナマイシン(Mandlerら (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandlerら (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandlerら (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(欧州特許第1391213号; Liuら,(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lodeら (1998)Cancer Res. 58:2928; Hinmanら (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)が含まれる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含むメカニズムにより、それらの細胞傷害及び細胞分裂阻害効果に働きかける。このような細胞傷害剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性になる又はあまり活性にならない傾向にある。
【０１１９】
ゼバリン(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン、Biogen/Idec)は、正常及び悪性のＢリンパ球の表面に見出されるＣＤ２０抗原に対して指向するマウスＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体からなる抗体-放射性同位元素コンジュゲート、及びチオ尿素リンカー-キレート剤により見出される１１１Ｉｎ又は９０Ｙ放射性同位元素である(Wisemanら (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wisemanら (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)に対する活性を有しているが、投与により、多くの患者において、重度の長期にわたる血球減少に至る。マイロターグＴＭ(ゲムツズマブオゾガマイシン、Wyeth Pharmaceuticals)、カリケアマイシンに結合したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体-薬剤コンジュゲーは、注射による急性骨髄性白血病の処置について、2000年に承認されている(Drugs of the Future (2000) 25(7):686; 米国特許第4970198号; 同5079233号; 同5585089号; 同5606040号; 同5693762号; 同5739116号; 同5767285号; 同5773001号)。カンツズマブメルタンシン(Immunogen, Inc.)、メイタンシノイド薬剤部分、ＤＭ１にジスルフィドリンカーＳＰＰを介して結合したｈｕＣ２４２抗体からなる抗体-薬剤コンジュゲートは、ＣａｎＡｇを発現する癌、例えば結腸、膵臓、胃、及び他の癌を処置するための第ＩＩ相試験において提案されている。ＭＬＮ-２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)、メイタンシノイド薬剤部分、ＤＭ１に結合した抗-前立腺特異性膜抗原(ＰＳＭＡ)モノクローナル抗体からなる抗体-薬剤コンジュゲートは、前立腺腫瘍の有望な処置法としての開発下にある。オーリスタチン(auristatin)ペプチド、オーリスタチンＥ(ＡＥ)及びモノメチルオーリスタチン(ＭＭＡＥ)、ドラスタチンの合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６(細胞腫においてルイスＹに特異的)及びｃＡＣ１０(血液液腫瘍においてＣＤ３０に特異的)(Doroninaら (2003) Nature Biotechnol. 21(7):778-784)は、治療開発下にある。
【０１２０】
このようなイムノコンジュゲートの生成に有用な化学治療剤は上述されている。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、α-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性コンジュゲート抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアナート(トルエン２,６-ジイソシアナート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲートのためのキレート剤の例である。国際公開第94/11026号参照。
【０１２１】
抗体と、一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコテセン、及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体とのコンジュゲートが、ここで考察される。
【０１２２】
メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施態様において、本発明の抗体(全長又は断片)は、一又は複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートしている。
【０１２３】
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂インヒビターである。メイタンシンは、最初、東アフリカの低木であるMaytenus serrataから単離された(米国特許第3,896,111号)。その後、メイタンシノイド、例えばメイタンシノール、及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成するある種の微生物が発見された(米国特許第4,151,042号)。合成のメイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、その開示が参照として明らかにここに導入される、例えば米国特許第4,137,230号; 同4,248,870号; 同4,256,746号; 同4,260,608号; 同4,265,814号; 同4,294,757号; 同4,307,016号; 同4,308,268号; 同4,308,269号; 同4,309,428号; 同4,313,946号; 同4,315,929号; 同4,317,821号; 同4,322,348号; 同4,331,598号; 同4,361,650号; 同4,364,866号; 同4,424,219号; 同4,450,254号; 同4,362,663号; 及び同4,371,533号に開示されている。
【０１２４】
メイタンシノイド-抗体コンジュゲート
治療係数を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体にコンジュゲートしている。メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、それらの治療的使用は、例えば、ここでの開示が明確に参照として導入される、米国特許第5,208,020号, 同5,416,064号、及び欧州特許第0 425 235 B1号に開示されている。Liuら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)は、ヒト結腸直腸癌に指向するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲートを記載している。コンジュゲートは、培養された結腸癌細胞に対して高度に細胞傷害性であることが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗癌活性を示す。Chariら,Cancer Research 52:127-131 (1992)には、メイタンシノイドが、ヒト結腸癌細胞系における抗原に結合するマウス抗体Ａ７に、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に、ジスルフィドリンカーを介してコンジュゲートしているイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞傷害性は、細胞当たり、３ｘ１０５のＨＥＲ-２表面抗原を発現する、ヒト乳癌細胞系ＳＫ-ＢＲ-３において、インビトロでテストされる。薬剤コンジュゲートは、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることによって増加可能な、遊離のメイタンシノイド剤に類似した程度の細胞傷害性を達成する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートは、マウスにおいて、低い全身細胞傷害性を示す。
【０１２５】
抗体-メイタンシノイドコンジュゲート(イムノコンジュゲート)
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれかの生物活性をあまり低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることによって調製される。抗体分子当たりのコンジュゲートした、平均３-４のメイタンシノイド分子は、抗体の機能又は溶解度に負の影響を与えることなく、標的細胞の細胞傷害性を高める効果を示すが、毒素／抗体の一分子でさえ、ネイキッド抗体の使用を超えて細胞傷害性を高めることが予期されている。メイタンシノイドは当該技術でよく知られており、公知の技術で合成可能であり、天然源から単離することができる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5,208,020号、及び上述した他の特許及び非特許文献に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、又は芳香環、又はメイタンシノール分子の他の位置、例えば種々のメイタンシノールエステルにおいて修飾されたメイタンシノール類似体である。
【０１２６】
例えば、米国特許第5,208,020号、又は欧州特許第0 425 235 B1号、Chariら, Cancer Research 52:127-131 (1992)に開示されたものを含み、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するための、多くの連結基が当該技術で公知である。連結基には、上述した特許に開示されているような、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチターゼに不安定な基、又はエステラーゼに不安定な基を含み、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０１２７】
抗体とメイタンシノイドのコンジュゲートは、種々の二官能性のタンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ)、活性エステル(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアナート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアナート)、及びビス-活性化フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlssonら, Biochem. J. 173:723-737[1978])、及びＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)が含まれ、ジスルフィド結合が提供される。
【０１２８】
リンカーは、リンカーの種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合可能である。例えば、エステル結合は、従来からのカップリング技術を使用して、ヒドロキシル基と反応させることにより形成させることができる。反応は、ヒドロキシル基を有するＣ-３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位置、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位置、ヒドロキシル基を有するＣ-２０位置で生じることができる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノール類似体のＣ-３位置で形成される。
【０１２９】
カリケアマイシン
関心ある他のイムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子にコンジュゲートした抗体を含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、サブ-ピコモル濃度での二本鎖ＤＮＡを破壊可能である。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートを調製するには、米国特許第5,712,374号、同5,714,586号、同5,739,116号、同5,767,285号、同5,770,701号、同5,770,710号、同5,773,001号、同5,877,296号(全てAmerican Cyanamid Company)を参照。使用可能なカリケアマイシンの構造的類似体には、限定されるものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinmanら, Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lodeら, Cancer Research 58:2925-2928 (1998)、及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体がコンジュゲート可能な他の抗-腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗剤であるＱＦＡである。カリケアマイシンとＱＦＡの双方は、作用の細胞内部位を有しており、細胞膜を容易に通過できない。よって、抗体媒介性の内部移行を介したこれらの薬剤の細胞取り込みは、それらの細胞傷害効果をかなり高める。
【０１３０】
他の細胞傷害剤
本発明の抗体にコンジュゲート可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン、ビンクリスチン、及び５-フルオロウラシル、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリーで、米国特許第5,053,394号、同5,770,710号に記載されているもの、並びにエスペラミシン(米国特許第5,877,296号)が含まれる。
【０１３１】
使用可能な酵素的に活性な毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α-サルシン、アレウリテス・フォーディタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナタンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・チャランチアインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリスインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンが含まれる。例えば、1993年10月28日に公開の国際公開第93/21232号を参照のこと。
【０１３２】
本発明は、さらに、核酸分解性活性を有する化合物(例えば、リボムクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮＡ分解酵素)と抗体との間で形成されたイムノコンジュゲートについて考慮する。
【０１３３】
腫瘍の選択的破壊のために、抗体は高度に放射活性のある原子を有することができる。多様な放射性同位元素は、放射コンジュゲート抗体の生成に有用である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出のために使用される場合、例えばシンチグラフ検査のための放射活性原子、例えばｔｃ９０ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)画像(磁気共鳴画像、ｍｒｉとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含む。
【０１３４】
放射性-又は他の標識を、公知の方法でコンジュゲートに導入することができる。例えば、ペプチドは、水素の代わりにフッ素-１９を有する、適切なアミノ酸前駆体を使用する、化学的アミノ酸合成法により合成する、又は生合成することができる。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドにおいて、システイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。ＩＯＤＯＧＥＮ法(Frakerら (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)は、ヨウ素-１２３を導入するために使用することができる。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」 (Chatal,CRC Press 1989)には、他の方法が詳細に記載されている。
【０１３５】
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ)、活性エステル(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアナート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアナート)、及びビス-活性化フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲートのためのキレート剤の例である。国際公開第94/11026号参照。リンカーは、細胞に細胞傷害剤を容易に放出する「切断性リンカー」である。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチターゼに敏感なリンカー、光に不安定なリンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー(Chariら, Cancer Research 52:127-131 (1992); 米国特許第5,208,020号)を使用することができる。
【０１３６】
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ-ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＫＭＵＳ、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、及びスルホ-ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ(スクシンイミジル-(４-ビニルスルホン)ベンゾアート)で、商業的に入手可能なものを用いて調製されたＡＤＣが考慮される(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aからのもの)。頁467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalogを参照。
【０１３７】
抗体薬剤コンジュゲートの調製
本発明の抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)において、抗体(Ａｂ)は、リンカー(Ｌ)を介して、一又は複数の薬剤部分(Ｄ)、例えば抗体当たり約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートしている。式ＩのＡＤＣは、(１)二価のリンカー試薬と抗体の求核基とを反応させ、共有結合を介して、Ａｂ-Ｌを形成させ、続いて薬剤部分と反応させ；(２)二価のリンカー試薬と薬剤部分の求核基とを反応させ、共有結合を介して、Ｄ-Ｌを形成させ、続いて抗体の求核基と反応させることを含む、当業者に公知の有機化学反応、条件、及び試薬を使用し、いくつかの経路により調製することができる。
Ａｂ-(Ｌ-Ｄ)ｐ      Ｉ
【０１３８】
抗体における求核基には、限定されるものではないが：(ｉ)Ｎ末端アミノ基、(ｉｉ)側鎖アミン基、例えばリジン、(ｉｉｉ)側鎖チオール基、例えばシステイン、及び(ｉｖ)抗体がグリコシル化されている場合、糖ヒドロキシル又はアミノ基が含まれる。アミン、チオール、及びヒドロキシル基は求核であり、リンカー部分の求電子基と、(ｉ)活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、及びハロホルマート及び酸ハロゲン化物；(ｉｉ)アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド類；(ｉｉｉ)アルデヒド類、ケトン類、カルボキシル、及びマレイミド基を含むリンカー試薬とを反応させ、共有結合を形成させることができる。ある種の抗体は、還元性鎖間ジスルイド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は還元剤、例えばＤＴＴ(ジチオスレイトール)で処理することにより、リンカー試薬とコンジュゲートさせるための反応を行うことができる。よって、各システイン架橋は、理論的に２つの反応性チオール求核剤を形成するであろう。付加的な求核基は、アミンをチオールに転換させる２-イミノチオラート(トラウト試薬)を用いたリジンの反応を介して、抗体に導入することができる。
【０１３９】
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、リンカー試薬又は薬剤において、求核置換基と反応可能な求電子部分を導入するために、抗体を修飾することにより生成可能である。グリコシル化抗体の糖類は、例えば、過ヨウ素酸化試薬を用いて酸化させ、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応可能なアルデヒト又はケトン基を形成させることができる。得られたイミンシッフ塩基基は、安定した結合を形成でき、又はホウ化水素試薬により還元されて、安定したアミン結合を形成することができる。一実施態様において、ガラクトースオキシダーゼ又はメタ-過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかと、グリコシル化抗体の炭水化物部分とを反応させることによって、薬剤の適切な基と反応可能なタンパク質において、カルボニル(アルデヒド又はケトン)基が生じる(Hermanson, Bioconjugate Techniques)。他の実施態様において、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を有するタンパク質は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応可能で、第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドが生成される(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852)。このようなアルデヒドは薬剤部分又はリンカー求核剤と反応可能である。
【０１４０】
同様に、薬剤部分の求核基には、限定されるものではないが：アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシラート、及びアリールヒドラジド基で、(ｉ)活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルマート及び酸ハロゲン化物、(ｉｉ)アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド類；(ｉｉｉ)アルデヒド類、ケトン類、カルボキシル、及びマレイミド基を含むリンカー試薬と、リンカー部分における求電子基とで、共有結合が形成されるように反応可能なものが含まれる。
【０１４１】
また、抗体と細胞傷害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製することができる。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間した、又は互いに隣接した２つのコンジュゲート部分をコードする反応性領域を含む。
【０１４２】
さらなる他の実施態様において、抗体は、腫瘍の事前標的に利用される「レセプター」(例えば、ストレプトアビジン)にコンジュゲートすることができ、ここで抗体-レセプターのコンジュゲートが患者に投与され、続いて洗浄剤を使用し、循環から未結合のコンジュゲートが除去され、ついで、細胞傷害剤(例えば、放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートした「リガンド」(例えばアビジン)が投与される。
【０１４３】
１０．免疫リポソーム
ここに開示の抗体は免疫リポソームとして調製されてもよい。「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。抗体を含有するリポソームは、当該技術で公知の方法により調製され、例えばEpsteinら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwangら Proc. Natl  Acad. Sci. USA 77:4030(1980) ; 米国特許第4,485,045号；同4,544,545号;1997年10月23日に公開された国際公開第97/38731号に記載されている。循環期間が高められたリポソームは米国特許第5,013,556号に開示されている。
【０１４４】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、定められた孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の組成物のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martinら J. Biol. Chem. 257: 286-288(1982)に記載されているようにして、リポソームにコンジュゲートされ得る。化学治療剤は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizonら J. National Cancer Inst. 81(19)：1484(1989)を参照。
【０１４５】
Ｂ．結合オリゴペプチド
本発明の結合オリゴペプチドは、ヘプシン、ＭＳＰ、及び／又はここに記載のヘプシン：ＭＳＰ複合体に好ましくは特異的に結合するオリゴペプチドである。結合オリゴペプチドは、公知のオリゴペプチド合成方法を使用して化学的に合成してもよいし、又は組換え技術を使用し、調製及び精製されてもよい。結合オリゴペプチドは、少なくとも約５のアミノ酸長、又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長又はそれ以上であり、このようなオリゴペプチドは、関心ある標的に、好ましくは特異的に結合する。結合オリゴペプチドはよく知られている技術を使用し、過度の実験をすることなく同定することができる。この点に関し、標的に特異的に結合可能なオリゴペプチド用のオリゴペプチドライブラリをスクリーニングするための技術は、当該技術でよく知られていることを記しておく(例えば、米国特許第5,556,762号、同5,750,373号、同4,708,871号、同4,833,092号、同5,223,409号、同5,403,484号、同5,571,689号、同5,663,143号; PCT公開国際公開第84/03506号及び国際公開第84/03564号; Geysenら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysenら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysenら, Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysenら, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofsら, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E.ら. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B.ら. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T.ら. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D.ら. (1991),  J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S.ら. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668を参照)。
【０１４６】
この点に関し、バクテリオファージ(ファージ)ディスプレイは、標的に特異的に結合可能な、そのライブラリのメンバー(類)を同定するための大規模なオリゴペプチドライブラリのスクリーニングを可能にする、よく知られた技術の一つである。ファージディスプレイは、変異体ポリペプチドが、バクテリオファージ粒子の表面におけるコートタンパク質に対する融合タンパク質として表示されることによる技術である(Scott, J.K.及びSmith, G. P. (1990) Science, 249: 386)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体(又はランダムにクローンされたｃＤＮＡ)の大規模なライブラリが、高親和性を有する標的分子に結合するそれらの配列に対して、急速かつ効率的に選別されるという事実にある。ファージにおけるペプチド(Cwirla, S. E.ら. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378)又はタンパク質(Lowman, H.B.ら. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T.ら. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D.ら. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S.ら. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363)ライブラリは、結合特異性を有するものに対し、数百万のポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている(Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668)。ランダム突然変異体の選別ファージライブラリには、多数の変異体を作製して増殖させるための方法、標的レセプターを使用する親和精製のための手順、及び結合性の結果を上昇させるための手段が必要である。米国特許第5,223,409号、同5,403,484号、同5,571,689号及び同5,663,143号。
【０１４７】
ほとんどのファージディスプレイ法では、繊維状ファージを使用しているが、ラムダ型ファージのディスプレイシステム(国際公開第95/34683号; 米国特許第5,627,024号)、Ｔ４ファージディスプレイシステム(Renら, Gene, 215: 439 (1998); Zhuら, Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiangら, Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Renら,  Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimovら, Virus Genes, 10: 173 (1995))及びＴ７ファージディスプレイシステム(Smith及びScott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); 米国特許第5,766,905号)も公知である。
【０１４８】
基本的なファージディスプレイコンセプトの多くの他の改善及び変更が今もなされている。これらの改善により、選択された標的分子に対し、結合のためのペプチドライブラリをスクリーニングする、また所望する特性に対してこれらのタンパク質をスクリーニングする可能性を有する機能的タンパク質を表示する、ディスプレイシステムの能力が高められる。ファージディスプレイ反応のための組合せ反応装置が開発されており(国際公開第98/14277号)、ファージディスプレイライブラリは、二分子の相互作用(国際公開第98/20169号；国際公開第98/20159号)及び拘束らせん型ペプチド(国際公開第98/20036号)の特性を分析及び制御するために使用されている。国際公開第97/35196号には、親和性リガンドの単離方法が記載されており、ここでファージディスプレイライブラリは、リガンドが標的分子と結合するであろう第１溶液、及び親和性リガンドが標的分子と結合しないであろう第２の溶液と接触させられ、結合リガンドが選択的に単離される。国際公開第97/46251号には、親和精製抗体を用い、ランダムファージディスプレイライブラリをバイオパニングさせ、ついで結合ファージを単離し、その後マイクロプレートウェルを使用するマイクロパニングプロセスにより、高親和結合ファージを単離する方法が記載されている。親和タグとしてStaphlylococcus aureusのプロテインＡを使用することが報告されている(Liら. (1998) Mol Biotech., 9:187)。国際公開第97/47314号には、基質サブトラクションライブラリを使用して、ファージディスプレイライブラリであってよい組合せライブラリを用い酵素特異性を識別することが記載されている。ファージディスプレイを使用し、洗浄剤での使用に適した酵素を選択するためのスクリーニング法は、国際公開第97/09446号に記載されている。特異的結合タンパク質を選択するためのさらなる方法は、米国特許第5,498,538号、同5,432,018号、及び国際公開第98/15833号に記載されている。
【０１４９】
また、ペプチドライブラリを作製し、これらのライブラリをスクリーニングする方法は、米国特許第5,723,286号、同5,432,018号、同5,580,717号、同5,427,908号、同5,498,530号、同5,770,434号、同5,734,018号、同5,698,426号、同5,763,192号、及び同5,723,323号に開示されている。
【０１５０】
Ｃ．結合小分子
結合小分子は、ヘプシン、ＭＳＰ、及び／又はここに記載のヘプシン：ＭＳＰ複合体に好ましくは特異的に結合する、ここに記載のオリゴペプチド又は抗体以外の好ましい有機分子である。結合有機小分子は公知の方法を使用して同定され、化学的に合成されてよい(例えば、PCT公開国際公開第00/00823号及び国際公開第00/39585号)。結合有機小分子は、通常約２０００ダルトン未満の大きさ、又は約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満の大きさであり、このような有機小分子は、よく知られている技術を使用し、過度の実験をすることなく同定可能である、ここに記載の標的に好ましくは特異的に結合可能である。この点に関し、標的に結合可能な分子に対して有機小分子ライブラリをスクリーニングするための技術は、当該技術においてよく知られている(例えば、PCT公開国際公開第00/00823号及び国際公開第00/39585号を参照)。結合有機小分子は、例えばアルデヒド類、ケトン類、オキシム類、ヒドラゾン類、セミカルバゾン類、カルバジド類、第１級アミン類、第２級アミン類、第３級アミン類、Ｎ置換されたヒドラジン類、ヒドラジド類、アルコール類、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド類、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバマート類、カルボナート類、ケタール類、チオケタール類、アセタール類、チオアセタール類、アリールハロゲン化物、スルホン酸アリール、アルキルハロゲン化物、スルホン酸アルキル、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン類、アルケン類、アルキン類、ジオール類、アミノアルコール、オキサゾリジン類、オキサゾリン類、チアゾリジン類、チアゾリン類、エナミン類、スルホンアミド類、エポキシド類、アジリジン類、イソシアナート類、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、酸塩化物等であってよい。
【０１５１】
Ｄ．所望の特性を有する抗体、結合オリゴペプチド及び結合小分子のスクリーニング
本発明の抗体、オリゴペプチド及び小分子を生成するための技術は上述している。また、所望する場合、ある種の生物学的特徴を有する抗体、オリゴペプチド又は他の小分子をさらに選択することができる。
【０１５２】
本発明の抗体、オリゴペプチド又は他の小分子の阻害効果は、ヘプシン及び／又はプロ-ＭＳＰを発現する細胞を使用し、内因的、又はそれぞれの遺伝を用いて形質移入した後に、当該技術で公知の方法により評価することができる。例えば、適切な腫瘍細胞系、及びヘプシン及び／又はプロ-ＭＳＰポリペプチド-形質移入細胞を、数日(例えば２-７)、種々の濃度で、本発明のモノクローナル抗体、オリゴペプチド又は他の小分子で処理し、以下の実施例に従い評価された生物活性を含む、ＭＳＰ活性に関連していることが公知の生物活性について分析してもよい。抗体、結合オリゴペプチド又は結合小分子は、未処理の腫瘍細胞と比較して、約２５-１００％、約３０-１００％、好ましくは約５０-１００％又は７０-１００％まで、インビトロ又はインビボで、ヘプシン及び／又はＭＳＰ発現腫瘍細胞の活性を阻害し、一実施態様において、抗体の濃度は約０．５〜３０μｇ／ｍｌである。活性阻害は、細胞培養又は他の適切な実験システムにおいて、約０．５〜３０μｇ／ｍｌ、又は約０．５ｎＭ〜２００ｎＭの抗体濃度で測定可能であり、ここで活性阻害は抗体に腫瘍細胞を暴露して１-１０日後に測定される。抗体は、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重で抗体を投与した場合に、抗体の最初の投与から約５日〜３ヶ月、好ましくは約５〜３０日以内に、腫瘍サイズの低下、腫瘍細胞感染度の低下に至ったならば、抗体は阻害性である。
【０１５３】
関心ある標的において、エピトープに結合する抗体、オリゴペプチド又は他の有機小分子についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988) に記載されているような常套的なクロス-ブロッキングアッセイを実施することができる。テスト抗体、オリゴペプチド、又は有機小分子が、公知の抗体と同じ部位又はエピトープに結合する場合、このアッセイは測定に使用することができる。代替的に、又は付加的に、エピトープマッピングは当該技術で公知の方法により実施することができる。例えば抗体配列は、接触残基を同定するために、アラニンスキャンニングにより変異誘発させることができる。変異抗体は、適切な折り畳みを確実にするために、最初はポリクローナル抗体との結合についてテストされる。種々の方法において、ポリペプチドの種々の領域に対応するペプチドは、テスト抗体、又はテスト抗体と特徴付けられた公知のエピトープを有する抗体を用いた、競合アッセイに使用することができる。
【０１５４】
Ｅ．抗体依存性酵素媒介性薬剤治療(ＡＤＥＰＴ)
また、抗体を、プロドラッグ(例えばペプチジル化学治療剤、国際公開第81/01145号を参照)を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートさせることにより、本発明の抗体をＡＤＥＰＴに使用してもよい。例えば、国際公開第88/07378号及び米国特許第4,975,278号を参照。
【０１５５】
ＡＤＥＰＴに有用なイムノコンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、このような方法でプロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
【０１５６】
この発明の方法に有用な酵素には、限定されるものではないが、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」として作用し、また公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328：457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
【０１５７】
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(例えばNeubergerら, Nature 312：604-608(1984)参照。
【０１５８】
Ｆ．抗体変異体
ここに記載の抗体に加えて、抗体変異体の調製が可能であることも考慮される。抗体変異体は、コード化ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入して、又は所望の抗体の合成により調製されうる。当業者であれば、アミノ酸変化が抗体の翻訳後プロセスを変え、例えばグリコシル化部位の数又は位置を変化させ、膜アンカー特性を変えると理解しているであろう。
【０１５９】
ここに記載の抗体における変異は、例えば米国特許第5,364,934号に説明されている、保存及び非保存変異のための、任意の技術及び指針を使用してなすことができる。変異は、天然配列抗体又はポリペプチドと比較して、アミノ酸配列が変化する、抗体をコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入である。場合によっては、変異は、抗体の一又は複数のドメインにおいて、少なくとも一のアミノ酸を、他のアミノ酸残基で置換することによりなされる。アミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、相同性の知られたタンパク質分子の配列と、抗体の配列を比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入又は欠失は、場合によっては約１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を親配列によって提示された活性について試験することにより決定される。
【０１６０】
抗体及びポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然抗体又はタンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。ある種の断片は、抗体又はポリペプチドの所望の生物活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
【０１６１】
抗体及びポリペプチド断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによる、抗体又はポリペプチド断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により、所望の抗体又はポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、抗体及びポリペプチド断片は、ここに開示の天然抗体又はポリペプチドと少なくとも一の生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【０１６２】
特定の実施態様において、関心ある保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。これらの置換により生物学的活性に変化が生じる場合、この表に「例示的置換」と題した又はアミノ酸の分類を参照して以下にさらに記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。
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【０１６３】
抗体又はポリペプチドの機能及び生物学的同定における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩における影響に、かなりの差異がある置換を選択することにより達成される。アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従ってグループ化することができる(A. L. Lehninger, Biochemistry, 2版, pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975))：
(１)無極性：Ａｌａ(Ａ)、Ｖａｌ(Ｖ)、Ｌｅｕ(Ｌ)、Ｉｌｅ(Ｉ)、Ｐｒｏ(Ｐ)、Ｐｈｅ(Ｆ)、Ｔｒｐ(Ｗ)、Ｍｅｔ(Ｍ)
(２)無電荷極性：Ｇｌｙ(Ｇ)、Ｓｅｒ(Ｓ)、Ｔｈｒ(Ｔ)、Ｃｙｓ(Ｃ)、Ｔｙｒ(Ｙ)、Ａｓｎ(Ｎ)、Ｇｌｎ(Ｑ)
(３)酸性：Ａｓｐ(Ｄ)、Ｇｌｕ(Ｅ)
(４)塩基性：Ｌｙｓ(Ｋ)、Ａｒｇ(Ｒ)、Ｈｉｓ(Ｈ)
別法では、天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
(２)中性で親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
(３)酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
(４)塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
(５)鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
(６)芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０１６４】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、このような置換された残基は保存的置換部位又は残存する(非保存的)部位に導入することができる。
【０１６５】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位指向性)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位指向性突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、抗体又はポリペプチド変異体ＤＮＡを作成することもできる。
【０１６６】
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し、変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cuningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に頻繁に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman &  Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【０１６７】
抗体又はポリペプチドの適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基は、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止するために、一般的にセリンと置換してもよい。逆に、システイン結合は、その安定性を改善するために、抗体又はポリペプチドに添加されてもよい(特に、抗体が抗体断片、例えばＦｖ断片である場合)。
【０１６８】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体(例えば、ヒト化又はヒト抗体)の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体(類)は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和成熟である。簡潔に言えば、いくつかの高頻度可変領域部位(例えば６-７部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として、一価種類にディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾に対する候補高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施することができ、抗原結合に特異的一因である、高頻度可変領域残基が同定される。代替的に、又は付加的に、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原ポリペプチドの接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体をさらなる開発のために選択する。
【０１６９】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又はオリゴヌクレオチド媒介性(又は部位指向性)突然変異誘発による調製、ＰＣＲ突然変異誘発、及び前もって調製された変異体又は抗体の非変異型のカセット突然変異誘発を含む。
【０１７０】
Ｇ．抗体及びポリペプチドの修飾
抗体及びポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型には、抗体又はポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、抗体又はポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることが含まれる。二官能性試薬による誘導体化は、例えば抗体又はポリペプチドを、抗体の精製方法で用いる水不溶性支持体マトリクス又は表面と架橋させるために有用であり、その逆も同じである。通常用いられる架橋剤には、例えば、１,１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸を有するエステル、３,３'-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬が含まれる。
【０１７１】
他の修飾には、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１７２】
本発明の範囲内に含まれる抗体又はポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、抗体又はポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、この目的で意図されるのは、天然配列抗体又はポリペプチドに見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失(潜在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる)、及び／又は天然配列抗体又はポリペプチドに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この語句は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
【０１７３】
抗体及び他のポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を称する。トリペプチド配列であるアスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン、ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸である、は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ-結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを称するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
【０１７４】
抗体又はポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ-結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便には達成される。該変化は、元の抗体又はポリペプチドの配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。抗体又はポリペプチドアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、抗体又はポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
【０１７５】
抗体又はポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行された国際公開第 87/05330号、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
【０１７６】
抗体又はポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド-及びエキソ-グリコシダーゼを用いることにより達成することができる。
【０１７７】
抗体又はポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；同4,496,689号；同4,301,144号；同4,670,417号；同4,791,192号又は同4,179,337号に記載された方法での結合を含む。また、抗体又はポリペプチドは、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル(例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術はRemington's Pharmaceutical Science 第16版, Osol, A. Ed.(1980)に開示されている。
【０１７８】
本発明の抗体又はポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した抗体又はポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾されてもよい。
【０１７９】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと、抗体又はポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には抗体又はポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このような抗体又はポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ-ヒスチジン(ｐｏｌｙ−ｈｉｓ)又はポリ-ヒスチジン-グリシン(ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ)タグ；ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ(ｇＤ)タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
【０１８０】
それに換わる実施態様では、キメラ分子は、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域と、抗体又はポリペプチドとの融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態(「イムノアドヘシン」とも呼ばれる)については、そのような融合体はＩｇＧ１分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも一可変領域に換えて抗体又はポリペプチドの可溶化(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化)形態の置換を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【０１８１】
Ｈ．抗体及びポリペプチドの調製
以下の記述は、主として、抗体又はポリペプチドコード化核酸を含有するベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することにより、抗体又はポリペプチドを生産することに関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いて、抗体又はポリペプチドを調製することができると考えられる。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(Foster City, CA)を用いて、製造者の指示により実施してもよい。抗体又はポリペプチドの種々の部分は別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて、所望の抗体又はポリペプチドを生産してもよい。
【０１８２】
１．抗体又はポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
抗体又はポリペプチドをコードするＤＮＡは、抗体又はポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒト抗体又はポリペプチドは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。また抗体又はポリペプチドコード化遺伝子は、ゲノムライブラリ、又は既知の合成手順(例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。
【０１８３】
ライブラリは、関心ある遺伝子あるいはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(例えば、少なくとも約２０-８０塩基のオリゴヌクレオチド)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。抗体又はポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の手段はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【０１８４】
ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする技術は、当該技術でよく知られている。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の緊縮性及び高度の緊縮性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
【０１８５】
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBank等の公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され利用可能とされている周知の他の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の定められた領域内又は全長配列に渡っての(アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの)配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
【０１８６】
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【０１８７】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、抗体又はポリペプチドの生産のための、ここに記載した発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された従来の栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
【０１８８】
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは、通常、当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、このような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。上掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開の国際公開第 89/05859号に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法を使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いられる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【０１８９】
ここのベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞を含む。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ATCC31,446)；大腸菌Ｘ１７７６(ATCC31,537)；大腸菌株Ｗ３１１０(ATCC27,325)及びＫ５７７２(ATCC53,635)である。他の適切な原核動物宿主細胞は、エシュリキア、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日公開のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異に影響を与えるように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｒｔ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴｋａｎを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７(ATCC 55,244)；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ ｉｌｖＧｋａｎを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が適している。
【０１９０】
全長抗体、抗体断片、及び抗体融合タンパク質は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合、例えば治療用抗体が、腫瘍細胞破壊において、それ自体で有効性を示すことにより、細胞傷害剤(例えば毒素)にコンジュゲートする場合、細菌内で生成させることができる。全長抗体は、より長い循環半減期を有する。大腸菌では、より速く、より費用効果よく生成される。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば最適な発現及び分泌についての翻訳開始領域(ＴＩＲ)及びシグナル配列を記載した、米国特許第5,648,237号 (Carterら)、米国特許第5,789,199号 (Jolyら)、米国特許第5,840,523号 (Simmonsら)を参照、これらの特許は参照としてここに導入される。発現後、抗体は、可溶性フラクションにおいて、大腸菌細胞ペーストから単離され、アイソタイプに応じて、例えばプロテインＡ又はＧカラムを通して精製することができる。最終的な精製は、例えばＣＨＯ細胞において発現する抗体を精製するための、類似したプロセスを実施することができる。
【０１９１】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体又はポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他には、シゾサッカロミセス・プロンブ(Schizosaccharomyces prombe)(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日公開の欧州特許第139,383号)；クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)(米国特許第4,943,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991))、例えばケーラクチス(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 154(2)737-742 [1983])、ケーフラギリス(K. fragilis)(ATCC 12,424)、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、ケーワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、ケーテモトレランス(K. themotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)(欧州特許第 402,226号)；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)(欧州特許第183,070号; Sheekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988])；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)(欧州特許第244,234号)；アカパンカビ(Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979])；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)(1990年10月31日公開の欧州特許第394,538号)；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日公開の国際公開第91/00357号)；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌(Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])及びクロカビ(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])が含まれる。ここではメチロトロピック(methylotropic)酵母が適切であり、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に見出される。
【０１９２】
グリコシル化抗体又はポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞、例えばメン、トウモロコシ、ポテト、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコの細胞培養体が含まれる。多くのバキュロウイルスの菌株及び変異体、及び宿主、例えばヨトウガ(イモムシ)、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウショウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコからの対応する許容的昆虫宿主細胞が同定されている。形質移入用の様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ-１変異体、及びカイコＮＰＶのＢｍ-５株も公に入手可能であり、このようなウイルスは、本発明では、特にヨウトガ細胞の形質移入用のウイルスとして使用されてよい。
【０１９３】
しかしながら、脊椎動物細胞にもかなりの関心があり、培養体(組織培養)における脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順でなされる。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１);ヒト胚腎臓細胞(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ベビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ 1０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaubら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サル腎臓細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎臓細胞(ＶＥＲＯ-７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２)；イヌ腎臓細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４)；バッファロラット肝臓細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５); ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５); マウス乳房腫瘍(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＴＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Matherら., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982))；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞腫(Ｈｅｐ Ｇ２)である。
【０１９４】
宿主細胞は、上述した、抗体又はポリペプチド生成用の発現又はクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターを含有するように適切に修飾された従来からの栄養培地において培養され、形質転換体を選択するか、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅させる。
【０１９５】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
抗体又はポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入され得る。様々なベクターが公に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子又はファージの形態であってよい。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに限定されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術が用いられる。
【０１９６】
ポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドであってよい異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入される抗体又はポリペプチドコード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母菌の分泌に関しては、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日公開の欧州特許第362,179号)、又は1990年11月15日に公開された国際公開第 90/13646号に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１９７】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は種々の細菌、酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
【０１９８】
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０１９９】
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、抗体又はポリペプチドコード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【０２００】
発現及びクローニングベクターは、通常、抗体又はポリペプチドコード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成に指向するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); 欧州特許第36,776号］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまた抗体又はポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン-ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【０２０１】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例には、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【０２０２】
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースを利用する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に用いられる適切なベクターとプロモータは欧州特許第73,657号にさらに記載されている。
【０２０３】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体又はポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開の英国特許第2,211,504号)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノム、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【０２０４】
より高等な真核生物による抗体又はポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、抗体又はポリペプチドコード化配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０２０５】
また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５'、時には３'の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、抗体又はポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【０２０６】
組換え脊椎動物細胞培養での抗体又はポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第117,060号; 及び欧州特許第117,058号に記載されている。
【０２０７】
４．宿主細胞の培養
この発明の抗体又はポリペプチドの生成に使用される宿主細胞は、様々な培地で培養されてよい。商業的に入手可能な培地、例えばハム(Ｈａｍ)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ)、(Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ)、Sigma)が、宿主細胞の培養に適している。さらに、 Hamら, Meth. Enz. 58:44(1979)、Barnesら.,Anal. Biochem.102:255(1980)、米国特許第4,767,704号；同4,657,866号；同4,927,762号；同4,560,655号；又は同5,122,469号；国際公開第90/03430号；国際公開第87/00195号；又は米国特許第Re. 30,985号に記載されている任意の培地も、宿主細胞用の培養培地として使用可能である。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えばゲンタマイシンＴＭ剤)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)、及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０２０８】
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いてもよい。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施してよく、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【０２０９】
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はポリペプチドＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０２１０】
６．抗体及びポリペプチドの精製
抗体又はポリペプチドの形態は、培養培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。抗体及びポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
【０２１１】
抗体及びポリペプチドを、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドから精製することが望ましい。次の手順が適切な精製手順の例である：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及び抗体及びポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された種々のタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される抗体又はポリペプチドの性質に依存する。
【０２１２】
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞膜周辺腔で細胞内で産生されるか、あるいは直接培地へ分泌されるかである。第１の工程として、抗体が細胞内で生成される場合、粒子状デブリ、宿主細胞又は溶菌断片のいずれかは、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carterら, Bio/Technology 10:163-167 (1992)には、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される、抗体を単離するための手順が記載されている。簡単には、細胞ペーストは、酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)の存在下、約３０分以上かけて解凍される。細胞片は遠心分離により除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、このような発現システムからの上清は、一般的に商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pellicon 限外濾過ユニットを使用して濃縮される。プロテアーゼインヒビター、例えばＰＭＳＦは、タンパク質分解を阻害するために、先の工程のいずれかに含めることができ、抗生物質は不定汚染物質の増殖を防止するために含めることができる。
【０２１３】
細胞から調製された抗体組成物は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製可能であり、アフィニティークロマトグラフィーは典型的には、好ましい精製工程である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、ヒトγ２、又はヒトγ４の重鎖(Lindmarkら, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))をベースにした抗体を精製するのに使用可能である。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３について推奨されている(Gussら, EMBO J. 5:15671575 (1986))。親和性リガンドが結合するマトリックスは最も多くはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定したマトリックス、例えば制御多孔質ガラス(controlled pore glass)又はポリ(スチレンジビニル)ベンゼンにより、アガロースで達成されるよりも、流速がより速くなり、プロセシング時間が短縮される。抗体がＣＨ３ドメインを含有している箇所においては、BAKERBOND ABXＴＭ樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)が精製に有用である。タンパク質を精製するための他の技術、例えばイオン交換カラムにおける分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカにおけるクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース(SEPHAROSE)ＴＭにおけるクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂におけるクロマトグラフィー(例えば、ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０２１４】
任意の予備精製工程(類)に続き、関心ある抗体と汚染物質とを含有する混合物を、約２．５-４．５のｐＨの溶出バッファーを使用する、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけ、好ましくは低塩分濃度(例えば、約０-０．２５Ｍの塩)にて実施してもよい。
【０２１５】
Ｉ．製薬用製剤
本発明で使用される抗体、結合オリゴヌクレオチド、結合有機又は無機小分子及び／又はポリペプチドの治療用製剤は、所望の純度を有する抗体、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、又は有機／無機小分子を、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより保管用に調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A. Ed. (1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、アセタート、トリス、ホスファート、シタラート、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；トレハロース及び塩化ナトリウム等の等張化剤(tonicifiers)；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類；ポリソルバート等の界面活性剤；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はトゥイーン(TWEEN)(登録商標)、プルロニクス(PLURONICS)(登録商標)、又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。製剤は５-２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０-１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、抗体を含有できる。
【０２１６】
また、ここでの製剤は、特定の兆候を処置するのに必要な一以上の活性化合物、好ましくはお互い負に作用しない相補的活性を持つものを含みうる。例として、抗体、結合オリゴヌクレオチド、又は結合有機又は無機小分子に加えて、付加的な抗体、例えば同じポリペプチドにおいて異なるエピトープに結合する第２の抗体、又はいくつかの他の標的に対する抗体、特定の癌の成長に影響を与える増殖因子を、一つの製剤に含めることが所望されている。代替的又は付加的に、組成物は、化学治療剤、細胞傷害剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤をさらに含有してよい。このような分子は、意図する目的に有効な量で組合せて、適切に存在している。
【０２１７】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルションにおいて、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに包括されていてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０２１８】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリラート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド類(米国特許第3,773,919号)、Ｌグルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-ビニルアセタート、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０２１９】
インビボ投与に用いる製剤は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって容易く達成できる。
【０２２０】
Ｊ．抗体、結合オリゴヌクレオチド及び結合有機／無機小分子を用いた処置
癌におけるポリペプチド(ヘプシン及び／又はＭＳＰ)発現を測定するために、種々の傑出アッセイが利用される。一実施態様において、ポリペプチドの過剰発現は、免疫組織化学(ＩＨＣ)により分析可能である。腫瘍バイオプシーからのパラフィン包埋された組織切片をＩＨＣアッセイにかけ、以下に示すようなポリペプチド染色強度基準に従う：
スコア０    染色が観察されないか、又は膜染色が１０％未満の腫瘍細胞に観察される。
スコア１＋  かすかに／わずかに知覚できる程度の染色が、１０％以上の腫瘍細胞で検出される。細胞はそれらの膜の一部でのみ染色される。
スコア２＋  弱から中程度の完全な膜染色が、１０％以上の腫瘍細胞で観察される。
スコア３＋  中程度から強度の完全な膜染色が、１０％以上の腫瘍細胞で観察される。
【０２２１】
ポリペプチドの過剰発現に対して、スコア０又は１＋を有するそれらの腫瘍は、ポリペプチドの過剰発現がないと特徴付けることができるが、スコア２＋又は３＋を有するそれらの腫瘍は、ポリペプチドの過剰発現があると特徴付けることができる。
【０２２２】
代替的に、又は付加的に、ＦＩＳＨアッセイ、例えばＩＮＦＯＲＭ(登録商標)(Ventana, Arizonaから販売)、又はＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ(登録商標)(Vysis, Illinois)は、ホルマリン固定、パラフィン包埋された腫瘍組織において実施され、腫瘍におけるポリペプチドの過剰発現の程度(もしあれば)が測定される。
【０２２３】
ポリペプチドの過剰発現又は増幅は、インビボ検出アッセイ、例えば検出される分子に結合し、検出可能な標識でタグ化され(例えば、放射性アイソトープ又は蛍光標識)る分子(例えば、抗体、オリゴペプチド又は有機小分子)を投与し、標識の局在化について、患者を外的にスキャンすることにより評価することができる。
【０２２４】
上述したように、本発明の抗体、オリゴペプチド及び有機／無機小分子は、種々の非治療的用途を有する。本発明の抗体、オリゴペプチド及び有機／無機小分子は、ポリペプチド発現性癌の病期分類(例えば放射性イメージング)に有用である。抗体、オリゴヌクレオチド及び有機／無機小分子も、細胞からのポリペプチドの精製及び免疫沈降、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット等、インビトロにおけるポリペプチドの検出及び定量、他の細胞を精製する抗体としての混合細胞集団におけるポリペプチド発現細胞の殺傷及び除去に有用である。
【０２２５】
現在、癌の段階に応じて、癌治療は、次の治療：癌組織を取り除くための外科手術、放射線治療、及び化学療法の一又は組合せを含む。抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子治療は、化学療法の副作用及び毒性に対する十分な耐性のない高齢の患者、放射線治療が限定された実用性しか有さない転移性疾患において、特に所望されている。本発明の抗体、オリゴペプチド及び有機／無機小分子が標的とする腫瘍は、疾患の初期診断時、又は再発中、ポリペプチド-発現性癌の軽減に有用である。治療的用途において、抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子は、単独で、又はホルモン、血管新生抑制、又は放射標識された化合物、又は外科手術、凍結療法、及び／又は放射線治療との併用治療に使用することができる。抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子治療は、他の形態の従来からの治療法と同時に、従来からの治療法の前又は後に投与することができる。化学治療剤、例えばTAXOTERE(登録商標)(ドセタキセル)、TAXOL(登録商標)(パクリタキセル)、エストラムスチン、及びミトキサントロンは、癌治療、特にグッドリスク患者に使用される。癌を治療又は軽減するための本発明の方法において、癌患者には、上述した一又は複数の化学治療剤を用いた併用治療と共に、抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を投与することができる。特に、パクリタキセル及び修飾された誘導体を用いた併用治療(例えば、欧州特許第0600517号を参照)が考慮される。抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子は、治療的有効量の化学治療剤と共に投与される。他の実施態様において、抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子は、パクリタキセル等の化学治療剤の活性及び効能が高まるように、化学療法と併用して投与される。医療用卓上参考書(ＰＤＲ)には、種々の癌治療に使用されるこれらの薬剤の用量が開示されている。治療的に有効な、上述したこれらの化学治療剤の投与計画及び用量は、処置される特定の癌、疾病の広がり、医師には精通している他の要因に依存し、医師により決定することができる。
【０２２６】
特定の一実施態様において、細胞傷害剤とコンジュゲートした抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含有するコンジュゲートが患者に投与される。好ましくは、タンパク質に結合したイムノコンジュゲートは細胞により内部移行し、それが結合する癌細胞の殺傷において、イムノコンジュゲートの治療効果が増加する。好ましい実施態様において、細胞傷害剤は、癌細胞の核酸を標的とするか又は干渉する。このような細胞傷害剤の例には、メイタンシノイド、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼ、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。
【０２２７】
抗体、オリゴペプチド、有機／無機小分子は、公知の方法に従い、例えばボーラスとしての静脈内投与、又は一定期間にわたる連続的な注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、くも膜腔内、経口、局所的、又は吸入の経路によりヒト患者に投与できる。抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子の静脈内又は皮下投与が好ましい。
【０２２８】
他の治療計画を、抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子の投与と併用してもよい。併用投与は、別々の製剤、又は単一の製薬用製剤を使用して、同時投与、及び、何れの順序での連続的な投与を含み、好ましくは、両方の(または全ての)活性剤が同時に生物学的活性を発揮する期間があるものである。好ましくはこのような併用治療により、相乗的治療効果に至る。
【０２２９】
また、特定の癌に関連する他の腫瘍抗原に指向する抗体の投与と、抗体又は抗体類、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子の投与を組合せることも望ましい。
【０２３０】
他の実施態様において、本発明の治療方法は、種々の化学治療剤の混合物の同時投与を含む、一又は複数の化学治療剤又は成長阻害剤と、抗体(又は抗体類)、オリゴペプチド又は有機／無機小分子の併用投与を含む。化学治療剤には、リン酸エストラムスチン、プレドニムスチン、シスプラチン、５-フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシウレア、及びヒドロキシウレアタキサン(例えば、パクリタキセル及びドセタキセル(doxetaxel))及び／又はアントラサイクリン系抗生物質が含まれる。このような化学治療剤の調製及び投与スケジュールは、製造者の使用説明書に従うか、又は当業者が経験的に決定して使用してもよい。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)に記載されている。
【０２３１】
抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子は、抗ホルモン化合物；例えば抗エストロゲン化合物、例えばタモキシフェン；抗プロゲステロン、例えばオナプリストン(onapristone)(例えば欧州特許第616812号を参照)；又は抗アンドロゲン、例えばフルタミドと、このような分子に公知の用量で組合せてもよい。処置される癌がアンドロゲン非依存性癌である場合、患者は、抗アンドロゲン治療を予め受けていてもよく、癌がアンドロゲン非依存性になった後に、抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子(場合によっては、ここに記載の他の薬剤)を患者に投与してもよい。
【０２３２】
時々、患者には、心臓保護剤(治療に伴う心筋機能不全を防止又は低減するため)、又は一又は複数のサイトカインを同時投与することも有用であり得る。上述した治療計画に加えて、患者は、抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子治療の前、同時又は後に、癌細胞の外科的除去及び／又は放射線治療を受けてもよい。上述した同時投与される任意の薬剤の適切な用量は、現在使用されている量であり、薬剤と抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子との併用作用(相乗効果)の故に低減してもよい。
【０２３３】
疾患の予防及び処置のために投与される用量及び方式は、公知の基準に従い、医者により選択されるであろう。抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子の適切な用量は、上述したような処置される疾患の種類、重篤度及び病歴、抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子が治療又は予防目的で投与されるかどうか、事前治療、患者の臨床的病歴、及び抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子に対する反応性、及び主治医の裁量に依存するであろう。抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子は、一回又は連続した処置において、患者に適切に投与される。好ましくは、抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子は、静脈内注入又は皮下注射により投与される。一又は複数回の別々の投与又は連続注入であってもなくても、疾患の種類及び重篤度に応じて、体重当たり約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ(約０．１−１５ｍｇ／ｋｇ／用量)の抗体を、患者へ投与するための、最初の候補用量とすることができる。投与計画には、当初の負荷用量約４ｍｇ／ｋｇ、続いて約２ｍｇ／ｋｇの週間維持用量の抗体の投与が含まれる。しかしながら、他の投与計画も有用である。典型的な毎日の用量は、上述した要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であってよい。数日間又はそれ以上にわたる繰り返し投与については、病状に応じて、疾病の兆候が所望される程度に抑制されるまで、処置は継続される。この治療の進展度合いは、医者又は他の当業者に公知の基準に基づき、従来からの方法及びアッセイにより、容易にモニターすることができる。
【０２３４】
患者への抗体タンパク質の投与の他に、本出願では、遺伝子治療によるモジュレータ投与が考察されている。抗体をコードする核酸のこのような投与は、「治療的有効量の抗体の投与」なる表現に含まれる。細胞内に抗体を生じせしめるための、遺伝子治療の用途に関連している、1996年3月14日に公開された国際公開第96/07321号を参照。
【０２３５】
核酸(場合によってはベクター内に含まれたもの)を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常は抗体が必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する(例えば、米国特許第4,892,538号及び同5,283,187号参照)。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は意図している宿主の細胞にインビボで移入されるかに応じて変化する。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
【０２３６】
現在好ましいインビボ核酸移入技術には、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス)、及び脂質ベースの系(例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)の形質移入を含む。現在知られている遺伝子作製及び遺伝子治療プロトコルの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公開第93/25673及びそこに引用された参考文献も参照。
【０２３７】
本発明の抗体は、ここでの「抗体」の定義に包含される種々の形態で存在可能である。例えば、抗体には、全長又は無傷抗体、抗体断片、天然配列抗体又はアミノ酸変異体、ヒト化、キメラ又は融合抗体、イムノコンジュゲート、及びその機能的断片が含まれる。融合抗体において、抗体配列は異種ポリペプチド配列に融合している。抗体は、所望のエフェクター機能を提供するＦｃ領域で修飾することができる。この項でさらなる詳細を論議するっように、適切なＦｃ領域を用い、細胞表面に結合したネイキッド抗体は、例えば抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)を介して、又は補体依存性細胞傷害に補体を補充することにより、又はいくつかの他のメカニズムにより、細胞傷害を誘発させることができる。また、副作用を又は治療合併症が最小になるように、エフェクター機能の除去又は低減が所望されている場合は、ある種の他のＦｃ領域を使用してもよい。
【０２３８】
一実施態様において、抗体は、本発明の抗体と同じエピトープへの結合に競合するか、又は実質的に結合する。本発明の親抗体の生物学的特徴を有する抗体も考慮され、特にインビボ腫瘍ターゲティング、及び任意の細胞増殖阻害又は細胞傷害特性を含む。
【０２３９】
上述した抗体の生成方法をここで詳細に記載する。
本発明の抗体、オリゴペプチド及び有機／無機小分子は、ヘプシン及び／又はＭＳＰ発現性癌の処置、又は哺乳動物における一又は複数の癌の徴候の軽減に有用である。本発明の方法は、これらの癌に関連した転移性癌の徴候の処置及び／又は軽減における、アンタゴニストの使用を含む。抗体、オリゴペプチド及び有機／無機小分子アンタゴニストは、哺乳動物においてポリペプチド(類)(ヘプシン及び／又はＭＳＰ)を発現する癌細胞に、少なくとも部分的に結合可能である。一実施態様において、抗体、オリゴペプチド及び有機／無機小分子は、ポリペプチドへの結合時に、ポリペプチド発現性及び／又は反応性腫瘍細胞の破壊又は殺傷の誘発、又はインビトロ又はインビボでの、このような腫瘍細胞の成長及び／又は浸潤の阻害に効果的である。このような抗体にはネイキッド抗体(任意の薬剤にコンジュゲートしない)が含まれる。細胞傷害又は他の阻害特性を有するネイキッド抗体は細胞傷害剤をさらに利用可能であり、腫瘍細胞破壊においてより強力になる傾向にある。細胞傷害性は、例えば細胞傷害剤と抗体をコンジュゲートさせ、ここに記載の免疫コンジュゲートを形成させることにより、抗体に付与することができる。いくつかの実施例において、細胞傷害剤又は成長阻害剤は小分子である。いくつかの実施態様において、毒素、例えばカリケアマイシン又はメイタンシノイド及びその類似体又は誘導体が使用される。
【０２４０】
本発明は、本発明の抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子、及び担体を含有する組成物を提供する。癌を処置する目的において、組成物は、このような処置が必要とされる患者に投与することができ、ここで、組成物は、イムノコンジュゲート又はネイキッド抗体として存在する、一又は複数の抗体を含有可能である。さらなる実施態様において、組成物は、他の治療剤、例えば細胞傷害剤又は成長阻害剤、特に化学治療剤と組合せて、これらの抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子を含有可能である。また本発明は、本発明の抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子、及び担体を含有する製剤を提供する。一実施態様において、製剤は薬学的に許容可能な担体を含有する治療用製剤である。
【０２４１】
本発明の他の態様は、抗体をコードする単離された核酸である。Ｈ及びＬ鎖の双方をコードする核酸、特に高頻度可変領域残基、天然配列抗体、並びに抗体の変異体、修飾及びヒト化バージョンをコードする鎖も含まれる。
【０２４２】
また本発明は、哺乳動物に治療的有効量の抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子を投与することを含む、哺乳動物における癌を処置、又は一又は複数の癌の徴候を軽減するのに有用な方法を提供する。抗体、オリゴペプチド、又は有機／無機小分子の治療用組成物は、短期間(急性)又は慢性的に、又は医者が指示する場合は断続的に投与することができる。また、ポリペプチド(ヘプシン及び／又はＭＳＰ)発現性及び／又は反応性細胞の成長及び殺傷を阻害する方法も提供される。
【０２４３】
また、本発明は、少なくとも一の抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含有するキット又は製造品を提供する。抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含有するキットは、例えば細胞死滅アッセイ、腫瘍細胞浸潤の阻害、及び細胞からのポリペプチドの精製又は免疫沈降のための使用が見出されている。例えばポリペプチド単離及び精製用に、キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）と連結させた抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含み得る。インビトロ、例えば、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットで定量又は検知するための、抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含有するキットも提供され得る。検出に有用なこのような抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子は、標識、例えば蛍光もしくは放射標識と共に提供されてもよい。
【０２４４】
Ｋ．製造品及びキット
本発明の他の実施態様は、ポリペプチド(ヘプシン及び／又はＭＳＰ)発現性癌、例えば前立腺癌及び卵巣癌の処置に有用な物質を含む製造品にある。製造品は容器と該容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されてもよい。容器は、癌の病状の処置に有用な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の処置のために使用されることを示している。ラベル又はパッケージ挿入物は、患者に抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子組成物を投与するための使用説明書をさらに含むであろう。さらに、薬学的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する第２の容器をさらに具備していてもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０２４５】
さらに、種々の目的、例えばポリペプチド発現又は細胞死滅アッセイ、細胞からのポリペプチドの精製又は免疫沈降に有用なキットも提供される。ポリペプチドの単離及び精製用に、キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）と連結させた抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含み得る。インビトロ、例えば、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットでポリペプチドを定量又は検知するための、抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含有するキットも提供され得る。製造品と同様、キットも容器と該容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。容器は、少なくとも一の本発明の抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含有する組成物を収容する。例えば希釈液及びバッファー、対照抗体を収容している付加的な容器が具備されていてもよい。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物についての記載、並びに意図したインビトロ又は検出用途のための使用説明書を提供し得る。
【０２４６】
Ｌ．ポリペプチド及びポリペプチドをコードする核酸−特異的形態及び適用
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(及び／又はそれらの相補鎖)は、分子生物学の分野において、並びに治療用に種々の用途を有している。また、ポリペプチドをコードする核酸も、ここに記載される組換え技術によるポリペプチドの調製に有用であり、ここでそられのポリペプチドは、ここに記載の抗体の調製における使用が見出されている。
【０２４７】
全長天然配列ポリペプチド遺伝子、又はその一部は、ここに記載の天然ポリペプチド配列全長に対して所望の配列同一性を持つ他のｃＤＮＡ(例えば、ポリペプチドの天然発生変異体又は他の種からのポリペプチドをコードするもの)の単離のためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリッド形成プローブとして使用してよい。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド形成プローブは、少なくとも部分的に、全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列ポリペプチドのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から決定され得る。例えば、スクリーニング法は、ポリペプチド遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のポリペプチド遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例においてさらに詳細に記載する。本出願に開示の任意のＥＳＴ配列は、ここに開示の方法を使用して、同様にプローブとして使用される。
【０２４８】
ポリペプチドをコードする核酸の他の有用な断片は、標的ポリペプチドｍＲＮＡ(センス)又はポリペプチドＤＮＡ(アンチセンス)配列に結合できる一本鎖核酸配列(ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか)を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、ヘプシン、プロ-ＭＳＰ、又はここに記載の結合断片をコードするＤＮＡのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Stein及びCohen(Cancer Res. 48: 2659: 1988)及び van der Krol等(BioTechniques 6: 958, 1988)に記載されている。
【０２４９】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含むいくつかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。このような方法は本発明に含まれる。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質の発現を阻止するのに用いられ、ここでタンパク質は哺乳動物における癌の誘発における役割を担っている。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖-ホスホジエステル骨格(又は他の糖結合、国際公開第91/06629号に記載のもの等)を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが(即ち、酵素分解に耐えうるが)、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【０２５０】
アンチセンス結合に好ましい遺伝子内部位には、遺伝子のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)の翻訳開始(initiation)／出発(start)コドン(５'-ＡＵＧ／５'-ＡＴＧ)又は終結／停止コドン(５'-ＵＡＡ、５'-ＵＡＧ及び５-ＵＧＡ／５'-ＴＡＡ、５'-ＴＡＧ及び５'-ＴＧＡ)が導入された領域が含まれる。これらの領域は、翻訳開始又は終結コドンからいずれかの方向(すなわち５'又は３')に、約２５〜約５０の近接ヌクレオチドを含む、ｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を称する。アンチセンス結合のための他の好ましい領域は、イントロン；エクソン；イントロン-エクソン接合；オープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)又は「コード化領域」で、翻訳開始コドンと翻訳終結コドンとの間の領域；５'-５'トリホスファート結合を介してｍＲＮＡの５'のほとんどの残基に結合したＮ７-メチル化グアノシン残基を含む、ｍＲＮＡの５'キャップを含み、また、５'キャップ構造それ自体並びにキャップに隣接する最初の５０ヌクレオチド；５'非翻訳領域(５'ＵＴＲ)、翻訳開始コドンから５'方向へのｍＲＮＡの一部、よってｍＲＮＡの翻訳開始コドンと５'キャップ部位との間のヌクレオチド、又は遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの；及び３'非翻訳領域(３'ＵＴＲ)、翻訳終結コドンから３'方向へのｍＲＮＡの一部、よってｍＲＮＡの翻訳終結コドンと３'末端との間のヌクレオチド、又は遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むものを含む。
【０２５１】
ポリペプチドの発現抑制に有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例には、修飾骨格又は非天然のヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチド類が含まれる。修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格内にリン原子を保持するもの、及び骨格内にリン原子を有さないものが含まれる。この明細書の目的、また当該技術で時折参照されているように、それらのヌクレオシド骨格内にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオシドとみなすこともできる。好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えばホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリ-エステル、３'-アルキレンホスホナート、５’-アルキレンホスホナート及びキラルホスホナートを含むメチル及び他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、３'-アミノホスホルアミダート及びアミノアルキルホスホルアミダート、チオノホスホルアミダートを含むホスホルアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスファート、及び正常な３'-５'結合を有するブラノ-ホスファート、これらの２'-５'結合類似体、及び逆の極性を有するものが含まれ、ここで一又は複数のヌクレオチド間結合は３'-３'、５’-５'又は２'-２'結合である。逆位極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、３'のほとんどのヌクレオチド間結合で単一の３'-３'結合、すなわち脱塩基していてもよい単一の逆位ヌクレオシド残基を有する(核酸塩基が欠失しているか、又はその場所にヒドロキシル基を有する)。また種々の塩、混合塩及び遊離酸の形態も含まれる。リン含有結合の調製について教示している代表的な合衆国特許には、限定されるものではないが、それぞれ参照としてここに導入される、米国特許第3,687,808号;同 4,469,863号; 同4,476,301号; 同5,023,243号; 同5,177,196号; 同5,188,897号; 同5,264,423号; 同5,276,019号; 同5,278,302号;同5,286,717号; 同5,321,131号; 同5,399,676号; 同5,405,939号; 同5,453,496号; 同5,455,233号; 同5,466,677号; 同5,476,925号; 同5,519,126号; 同5,536,821号; 同5,541,306号; 同5,550,111号; 同5,563,253号; 同5,571,799号; 同5,587,361号; 同5,194,599号; 同5,565,555号; 同5,527,899号; 同5,721,218号; 同5,672,697号及び同5,625,050号が含まれる。
【０２５２】
リン原子を有さない好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は一又は複数の短鎖ヘテロ原子又は複素環ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有するものである。これらには、モルホリノ結合(ヌクレオシドの糖部分から一部形成される)；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホナート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及び混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ.sub.２成分部分を有する他のものが含まれる。このようなヌクレオシドの調製について教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれ参照としてここに導入される、米国特許第5,034,506号; 第5,166,315号; 第5,185,444号; 第5,214,134号; 第5,216,141号; 第5,235,033号; 第5,264,562号; 第5,264,564号; 第5,405,938号; 第5,434,257号; 第5,466,677号; 第5,470,967号; 第5,489,677号; 第5,541,307号; 第5,561,225号; 第5,596,086号; 第5,602,240号; 第5,610,289号; 第5,602,240号; 第5,608,046号; 第5,610,289号; 第5,618,704号; 第5,623,070号; 第5,663,312号; 第5,633,360号; 第5,677,437号; 第5,792,608号; 第5,646,269号及び第5,677,439号が含まれる。
【０２５３】
他の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合、すなわち骨格は、新規の基で置き換えられている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物でのハイブリダイゼーションのために保持されている。このようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸(ＰＮＡ)と称されている。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖-骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。核酸塩基が保持されて、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製について教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれ参照としてここに導入される、米国特許第5,539,082; 同5,714,331号; 及び同5,719,262号が含まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Nielsenら, Science, 1991, 254, 1497-1500に見出すことができる。
【０２５４】
好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアート骨格及び／又はヘテロ原子骨格、特に-ＣＨ２-ＮＨ-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ３)-Ｏ-ＣＨ２- [メチレン(メチルイミノ)又はＭＭＩ骨格として公知]、-ＣＨ２-Ｏ-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ３)-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-及び-Ｏ-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-ＣＨ２- [天然ホスホジエステル骨格は、-Ｏ-Ｐ-Ｏ-ＣＨ２-として表せる]で、上で参照された米国特許第5,489,677号に記載のもの、及び上で参照された米国特許第5,602,240号のアミド骨格が組み込まれる。また、上で参照された米国特許第5,034,506号のモルホリノ骨格構造を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。
【０２５５】
修飾オリゴヌクレオチドは、一又は複数の置換された糖部分をさらに含む。好ましいオリゴヌクレオチドは、２'位置に次の：ＯＨ；Ｆ；Ｏ-アルキル、Ｓ-アルキル、又はＮ-アルキル；Ｏ-アルケニル、Ｓ-アルキニル、又はＮ-アルケニル；Ｏ-アルキニル、Ｓ-アルキニル又はＮ-アルキニル；又はＯ-アルキル-Ｏ-アルキルで、アルキル、アルケニル及びアルキニルが置換又は未置換のＣ１ないしＣ１０アルキル又はＣ２ないしＣ１０アルケニル及びアルキニルであってよいものの一つを含む。特に好ましくは、Ｏ[(ＣＨ２)ｎＯ]ｍＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、Ｏ(ＣＨ２)ｎＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＮＨ２、及びＯ(ＣＨ２)ｎＯＮ[(ＣＨ２)ｎＣＨ３)]２であり、ここでｎ及びｍは１〜約１０である。他の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２'位置に次の：Ｃ１ないしＣ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ-アルカリル又はＯ-アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２、ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善する基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基、及び類似した特性を有する他の置換基の一つを含む。好ましい修飾には、２'-メトキシエトキシ(２'-Ｏ-ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２'-Ｏ-(２-メトキシエチル)又は２'-ＭＯＥとしても公知)(Martinら, Helv. Chim. Acta, 1995, 78,486-504)、すなわちアルコキシアルコキシ基が含まれる。さらなる好ましい修飾には、２'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち２'-ＤＭＡＯＥとしても公知のＯ(ＣＨ２)２ＯＮ(ＣＨ３)２基、及び２'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(２'-Ｏ-ジメチルアミノエトキシエチル又は２'-ＤＭＡＥＯＥとしても当該技術で公知)、すなわち２'-Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ２)が含まれる。
【０２５６】
さらに好ましい修飾には、２'-ヒドロキシル基が糖環の３'又は４'炭素原子に結合し、よって二環式糖部分を形成する、ロックされた核酸(ＬＮＡ)(Locked Nucleic Acids)が含まれる。結合は、２'酸素原子及び４'炭素原子に結合するメチレン(-ＣＨ２-)ｎ基が好ましく、ここでｎは１又は２である。ＬＮＡ及びその調製物は、国際公開第98/39352号及び国際公開第99/14226号に記載されている。
【０２５７】
他の好ましい修飾には、２'-メトキシ(２'-Ｏ-ＣＨ３)、２'-アミノプロポキシ(２'-ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２)、２'-アリル(２'-ＣＨ２-ＣＨ=ＣＨ２)、２'-Ｏ-アリル(２'-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ=ＣＨ２)及び２'-フルオロ(２'-Ｆ)が含まれる。２'-修飾は、アラビノ(上流)位置又はリボ(下流)位置にあってよい。好ましい２'-アラビノ修飾は２'-Ｆである。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に２'-５'結合したオリゴヌクレオチド、又は３'末端ヌクレオチドにおける糖の３'位置、及び５'末端ヌクレオチドの５'位置でもなされる。またオリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖に代えて、例えばシクロブチル部分等の糖模倣体を有していてもよい。このような修飾された糖構造の調製について教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれその全体が参照としてここに導入される、米国特許第4,981,957号; 同5,118,800号; 同5,319,080号; 同5,359,044号; 同5,393,878号; 同5,446,137号; 同5,466,786号; 同5,514,785号; 同5,519,134号; 同5,567,811号; 同5,576,427号; 同5,591,722号; 同5,597,909号; 同5,610,300号; 同5,627,053号; 同5,639,873号; 同5,646,265号; 同5,658,873号; 同5,670,633号; 同5,792,747号; 及び同5,700,920号が含まれる。
【０２５８】
また、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基(多くの場合、当該技術では単に「塩基」と称される)の修飾又は置換を含んでよい。ここで使用される場合、「未修飾」又は「天然」核酸塩基には、プリン塩基のアデニン(Ａ)及びグアニン(Ｇ)、及びピリミジン塩基のチミン(Ｔ)、シトシン(Ｃ)及びウラシル(Ｕ)が含まれる。修飾された核酸塩基には、他の合成及び天然核酸塩基、例えば５-メチルシトシン(５-ｍｅ-Ｃ)、５-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６-メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２-プロピル及び他のアルキル誘導体、２-チオウラシル、２-チオチミン、及び２-チオシトシン、５-ハロウラシル及びシトシン、５-プロピニル(-Ｃ=Ｃ-ＣＨ３又は-ＣＨ２-Ｃ=ＣＨ)ウラシル及びシトシン、及びピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６-アゾウラシル、シトシン及びチミン、５-ウラシル(シュードウラシル)、４-チオウラシル、８-ハロ、８-アミノ、８-チオール、８-チオアルキル、８-ヒドロキシル、及び他の８-置換されたアデニン類及びグアニン類、５-ハロ、特に５-ブロモ、５-トリフルオロメチル及び他の５-置換されたウラシル類及びシトシン類、７-メチルグアニン及び７-メチルアデニン、２-Ｆ-アデニン、２-アミノ-アデニン、８-アザグアニン、及び８-アザアデニン、７-デアザグアニン、及び７-デアザアデニン、及び３-デアザグアニン及び３-デアザアデニンが含まれる。さらなる修飾された核酸塩基には、三環式のピリミジン類、例えばフェノキサジンシチジン(１Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾオキサジン-２(３Ｈ)-オン)、フェノチアジンシチジン(１Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾチアジン-２(３Ｈ)-オン)、Ｇ-クランプ、例えば置換されたフェノキサジンシチジン(例えば、９-(２-アミノエトキシ)-Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾオキサジン-２(３Ｈ)-オン)、カルバゾールシチジン(２Ｈ-ピリミド[４,５-ｂ]インドール-２-オン)、ピリドインドールシチジン(Ｈ-ピリド[３',２':４,５]ピロール[２,３-ｄ]ピリミジン-２-オン)が含まれる。また修飾された核酸塩基には、プリン又はピリミジン塩基が、例えば７-デアザ-アデニン、７-デアザグアノシン、２-アミノピリジン及び２-ピリドン等、他の複素環で置き換えられたものも含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 頁858-859、Kroschwitz, J. I編, John Wiley & Sons, 1990に開示されているもの、及びEnglischら, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されているものが含まれる。ある種のこれらの核酸塩基は、特に本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに有用である。これらには、５-置換されたピリミジン類、６-アザピリミジン類、及びＮ-２、Ｎ-６及びＯ-６置換されたプリン類、特に２-アミノプロピルアデニン、５-プロピニルウラシル、及び５-プロピニルシトシンが含まれる。５-メチルシトシン置換は、０．６-１．２℃で核酸二本鎖の安定性を増加させることが示されており(Sanghviら, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, 頁276-278)、例えば２'-Ｏ-メトキシエチル糖修飾と組合た場合の、好ましい塩基置換である。修飾された核酸塩基の調製について教示している代表���な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれが参照としてここに導入される、米国特許第3,687,808号、並びに米国特許第4,845,205号; 同5,130,302号; 同5,134,066号; 同5,175,273号; 同5,367,066号; 同5,432,272号; 同5,457,187号; 同5,459,255号; 同5,484,908号; 同5,502,177号; 同5,525,711号; 同5,552,540号; 同5,587,469号; 同5,594,121号, 同5,596,091号; 同5,614,617号; 同5,645,985号; 同5,830,653号; 同5,763,588号; 同6,005,096号; 同5,681,941号及び同5,750,692号が含まれる。
【０２５９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの細胞取込度、細胞分布、活性度を高める一又は複数の部分及びコンジュゲートを、オリゴヌクレオチドに化学的に結合させることを含む。本発明の化合物は、第１級又は第２級ヒドロキシル基等の官能基に共有結合したコンジュゲート基を含むことができる。本発明のコンジュゲート基には、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン類、ポリアミド類、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を高める基、及びオリゴマーの薬物動態学的特性を高める基が含まれる。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール類、脂質、カチオン性脂質、リン脂質、カチオン性リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、及び染料が含まれる。この発明において、薬力学的特性を高める基には、オリゴマーの取込を改善し、分解に対するオリゴマー耐性を高め、及び／又はＲＮＡとの配列特異性ハイブリッド形成を強化する基が含まれる。この発明において、薬物動態学的特性を高める基には、オリゴマーの取込、分布、代謝又は排泄を改善する基が含まれる。コンジュゲート部分には、限定されるものではないが、脂質部分、例えばコレステロール部分(Letsingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)、コール酸(Manoharanら, Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060)、チオエーテル、例えばヘキシル-Ｓ-トリチルチオール(Manoharanら, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharanら, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauserら, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538)、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基(Saison-Behmoarasら, EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanovら, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchukら, Biochimie, 1993, 75, 49-54)、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-ｒａｃ-グリセロール又はトリエチル-アンモニウム １,２-ジ-Ｏ-ヘキサデシル-ｒａｃ-グリセロ-３-Ｈ-ホスホナート(Manoharanら, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Sheaら, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖(Manoharanら, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973)、又はアダマンタン酢酸(Manoharanら, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654)、パルミチル部分(Mishraら, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237)、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が含まれる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、活性製剤原料、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(Ｓ)-(＋)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２,３,５-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツラート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤又は抗生物質にコンジュゲートしていてもよい。オリゴヌクレオチド薬剤コンジュゲート及びそれらの調製物は、それぞれが参照としてここに導入される、米国特許出願シリアル番号09/334,130(1999年6月15日に出願)、及び米国特許第 4,828,979号; 同4,948,882号; 同5,218,105号; 同5,525,465号; 同5,541,313号; 同5,545,730号; 同5,552,538号; 同5,578,717号; 同5,580,731号; 同5,580,731号; 同5,591,584号; 同5,109,124号; 同5,118,802号; 同5,138,045号; 同5,414,077号; 同5,486,603号; 同5,512,439号; 同5,578,718号; 同5,608,046号; 同4,587,044号; 同4,605,735号; 同4,667,025号; 同4,762,779号; 同4,789,737号; 同4,824,941号; 同4,835,263号; 同4,876,335号; 同4,904,582号; 同4,958,013号; 同5,082,830号; 同5,112,963号; 同5,214,136号; 同5,082,830号; 同5,112,963号; 同5,214,136号; 同5,245,022号; 同5,254,469号; 同5,258,506号; 同5,262,536号; 同5,272,250号; 同5,292,873号; 同5,317,098号; 同5,371,241号; 同5,391,723号; 同5,416,203号; 同5,451,463号; 同5,510,475号; 同5,512,667号; 同5,514,785号; 同5,565,552号; 同5,567,810号; 同5,574,142号; 同5,585,481号; 同5,587,371号; 同5,595,726号; 同5,597,696号; 同5,599,923号; 同5,599,928号及び同5,688,941号に記載されている。
【０２６０】
一様に修飾された付与化合物における全ての位置で必要ではないが、実際には、一以上の上述した修飾は、単一化合物又はオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに導入されてよい。また本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。この発明において、「キメラ」アンチセンス化合物又は「キメラ」は、２又はそれ以上の化学的に異なる領域を含み、それぞれが少なくとも一のモノマー単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物のケースではヌクレオチドから作製されるアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の向上、細胞取込の増加、及び／又は標的核酸に対する結合親和性の増加が、オリゴヌクレオチドに付与されるようにオリゴヌクレオチドを修飾した、少なくとも一の領域を有する。オリゴヌクレオチドの付加的な領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断可能な酵素の基質として提供され得る。例えば、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡストランドを切断する細胞エンドヌクレアーゼである。よって、ＲＮａｓｅＨの活性化により、結果的にＲＮＡ標的が切断され、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド抑制の効果性がかなり向上する。その結果、多くの場合、同様の標的領域に対してハイブリッド形成されるホスホロチオアートデオキシオリゴヌクレオチドと比較し、キメラオリゴヌクレオチドが使用される場合、同様の結果がより短いオリゴヌクレオチドを用いて得ることができる。本発明のキメラアンチセンス化合物は、上述した２又はそれ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造体として形成されてよい。好ましいキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドには、３'末端に少なくとも一の２'修飾された糖(好ましくは２'-Ｏ-(ＣＨ２)２-Ｏ-ＣＨ３)が導入されて、少なくとも４の近接する２'-Ｈ糖類を有する領域及びヌクレアーゼ耐性が付与され、ＲＮａｓｅＨ活性が付与される。このような化合物は、当該技術ではハイブリッド又はギャップマー(gapmer)とも称されている。好ましいギャップマーは、少なくとも４の近接した２'-Ｈ糖類を有する少なくとも一の領域により離間した５'末端及び３'-末端で、２'修飾された糖類(好ましくは２'-Ｏ-(ＣＨ２)２-Ｏ-ＣＨ３)の領域を有し、好ましくはホスホロチオアート骨格結合が導入されていてもよい。このようなハイブリッド構造の調製について教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれその全体が参照としてここに導入される、米国特許第5,013,830号; 同5,149,797号; 同5,220,007号; 同5,256,775号; 同5,366,878号; 同5,403,711号; 同5,491,133号; 同5,565,350号; 同5,623,065号; 同5,652,355号; 同5,652,356号; 及び同5,700,922号が含まれる。
【０２６１】
この発明で使用されるアンチセンス化合物は、固相合成でよく知られている技術により、簡便にまた常套的に作製される。このような合成のための設備は、例えばApplied Biosystems(Foster City, Calif.)を含む、いくつかの供給元から販売されている。当該技術で公知のこのような合成方法の任意の他の手段が、付加的又は代替的に使用され得る。ホスホロチオアート類及びアルキル化誘導体等のオリゴヌクレオチド類を調製するため、同様の技術を使用することがよく知られている。また本発明の化合物は、取込、分布及び／又は吸収性を補助するため、他の分子、分子構造又は化合物の混合物、例えばリポソーム、レセプター標的分子、経口用、直腸用、局所用又は他の調製物と混合、カプセル化、コンジュゲート、又は他のことをなしてもよい。取込、分布及び／又は吸収性が補助された製剤の調製について教示している代表的な米国特許には、限定されるものではないが、それぞれが参照としてここに導入される、米国特許第5,108,921号; 同5,354,844号; 同5,416,016号; 同5,459,127号; 同5,521,291号; 同5,543,158号; 同5,547,932号; 同5,583,020号; 同5,591,721号; 同4,426,330号; 同4,534,899号; 同5,013,556号; 同5,108,921号; 同5,213,804号; 同5,227,170号; 同5,264,221号; 同5,356,633号; 同5,395,619号; 同5,416,016号; 同5,417,978号; 同5,462,854号; 同5,469,854号; 同5,512,295号; 同5,527,528号; 同5,534,259号; 同5,543,152号; 同5,556,948号; 同5,580,575号; 及び同5,595,756号が含まれる。
【０２６２】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、国際公開第90/10048号に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドが含まれる。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
【０２６３】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えばＣａＰＯ４-媒介性ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子移入方法により、又はエプスタイン・バーウイルス等の遺伝子移入ウイルスを使用し、標的核酸配列を含有する細胞に導入され得る。好ましい手順において、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含有する細胞は、インビボ又はエキソビボのいずれかで、組換えレトロウイルスベクターと接触される。適切なレトロウイルスベクターには、限定されるものではないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶ、Ｎ２(Ｍ-ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス)、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名された二重コピーベクターが含まれる(国際公開第90/13641号を参照)。
【０２６４】
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第91/04753号に記載されるように、リガンド結合分子とのコンジュゲートの形成により標的ヌクレオチド配列を含有する細胞に導入されてもよい。適切なリガンド結合分子には、これらに限定されないが、細胞表面レセプター、増殖因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが含まれる。好ましくは、リガンド結合分子のコンジュゲートは、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲート体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
【０２６５】
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第90/10448号に記載されるように、オリゴヌクレオチド-脂質複合体の形成により標的核酸配列を含有する細胞に導入されてもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド-脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
【０２６６】
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、一般的に少なくとも約５ヌクレオチド長、又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０又は１０００ヌクレオチド長であり、ここで「約」なる用語は、基準長さのプラスマイナス１０％の基準ヌクレオチド配列長であることを意味する。
【０２６７】
また、プローブをＰＣＲ技術に使用し、密接に関連したポリペプチドをコードする配列を同定ために、配列プールを作製することができる。
【０２６８】
また、ポリペプチドをコードする核酸配列を使用し、ポリペプチドをコードする遺伝子をマッピングし、遺伝的疾患を患っている個人の遺伝分析するための、ハイブリダイゼーション用プローブを構成することができる。ここで提供されるヌクレオチド配列は、公知の技術、例えばインサイツハイブリダイゼーション、公知の染色体マーカーに対する連鎖解析、及びライブラリを用いたハイブリダイゼーションスクリーニングを使用し、染色体、又は染色体の特定の領域にマッピングされる。
【０２６９】
ポリペプチドは、ポリペプチドとの結合性相互作用に係る他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用のインヒビターを同定することができる。このような結合性相互作用に関与するタンパク質も、結合性相互作用小分子インヒビター又はペプチドのスクリーニングに用いることができる。スクリーニングアッセイは、天然ポリペプチド又はポリペプチドのレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計することができる。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングに基づくアッセイを含み、小分子候補薬剤の同定に特に適したものである。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く特徴付けられているタンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施可能である。
【０２７０】
また、ポリペプチド又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのにも使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングにも有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施態様では、ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術によりポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や同4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのポリペプチド導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたポリペプチドをコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物は、ポリペプチドをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療的処置の可能性が示される。
【０２７１】
あるいは、ポリペプチドの非ヒト相同体は、動物の胚性幹細胞に導入されたポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、ポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する遺伝子「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用可能な選択マーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される［例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson編. (IRL, Oxford, 1987), 頁113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、例えば、ポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【０２７２】
また、ポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために、細胞に遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている(Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986])。オリゴヌクレオチドは、例えばそれらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾することができる。
【０２７３】
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス(典型的にはレトロウイルス)ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質移入である(Dzau等, Trends, in Biotechnology 11, 205-210[1993])。いくつかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられ得る。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-2232 (1987); 及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子マーキング及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【０２７４】
ここに記載したポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体同定に有用である。この点において、実際の配列データに基づく染色体マーキング試薬は、現在殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要性が存在している。本発明の各核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
【０２７５】
本発明のポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに診断的に使用でき、ポリペプチドは一方の組織で他方に比較して、好ましくは、疾患のある組織で、同じ組織型の正常な組織に対して異なる発現をする。核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
【０２７６】
本発明は、ポリペプチドの効果を阻害する(アンタゴニスト)ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又はコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用に干渉する、例えば細胞からのポリペプチドの発現を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
【０２７７】
このアッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野でよく特徴付けられたものを含む種々の方式で実施することができる。
【０２７８】
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬を、ポリペプチド又はポリペプチド複合体と、これらの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
【０２７９】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出することができる。特別な実施態様では、ポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体を使用することによって検出できる。
【０２８０】
候補化合物が相互作用するが、ポリペプチに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者等(Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991))に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)に開示されているようにして監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系(一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定のタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKERＴＭ)は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用に係るアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０２８１】
ここで同定されたポリペプチドをコードする遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で、含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブ対照を提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合(複合体形成)は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【０２８２】
アンタゴニストをアッセイするために、ポリペプチドを特定の活性についてスクリーニングする化合物とともに細胞に添加してよく、ポリペプチド存在下での関心ある活性を阻害する化合物の能力は、化合物がポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ポリペプチド及び膜結合ポリペプチドレセプター又はコード化レセプターを持つ潜在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ポリペプチドは放射性等で標識でき、レセプターに結合したポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートにより同定できる。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。ガラススライド上で増殖させた形質移入細胞を標識したポリペプチドに暴露する。ポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的プロテインキナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０２８３】
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、限られないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、単鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってポリペプチドの作用を競合的に阻害するポリペプチドの変異形態であってもよい。
【０２８４】
他の潜在的なアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され(トリプルへリックス−Lee等, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney等, Science, 241: 456 (1988); Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)参照)、それによりポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリッド形成して、ｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳を阻止する(アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988))。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に送達され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０２８５】
潜在的アンタゴニストは、ポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は増殖因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
【０２８６】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。さらなる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、国際公開第97/33551号(1997年9月18日公開)を参照。
【０２８７】
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、国際公開第97/33551号, 上掲を参照。
【０２８８】
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【０２８９】
単離されたポリペプチドをコードする核酸は、当該技術でよく知られており、ここに記載の技術を使用して、ポリペプチドを組換え的に生成するために使用することができる。同様に、生成されたポリペプチドは 、当該技術でよく知られており、ここに記載の技術を使用して、抗体を生成するために使用することができる。
【０２９０】
ここで同定されるポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、癌を含む種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
【０２９１】
ポリペプチドが細胞内にあり、全抗体がインヒビターとして用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に送達するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。
【０２９２】
ここでの製剤は、治療される特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。代替的に、又は付加的に、組成物は、その機能を増強させる薬剤、例えば細胞傷害剤、サイトカイン、化学治療剤又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
以下の実施例は例示目的でのみ提供されるものであって、何らかの方法においても、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０２９３】
材料及び方法
組換えタンパク質のクローニング、発現及び精製：ヒト組換えヘプシンの細胞外ドメインを、記載されたように発現させ、精製した(Moranら, 2006)。抗-ヘプシン抗体Ｆａｂ２５を、同時係属、共同所有、2009年10月22日に出願された、米国仮特許出願第61/253,953号に記載されたように、発現させ、精製した。発現性及び収率を改善するために、Ｃ６７２Ａ変異を含む組換えヒトＭＳＰを、記載されたようにして、チャイニーズハムスター卵巣細胞において発現させた(Wahlら, 1997)。ＫＤ１を、記載されたようにして、発現させ、精製した(Shiaら, 2005)。
【０２９４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用する、ヘプシンによるプロ-ＭＳＰのインビトロ活性化のアッセイ：プロ−ＭＳＰ(２５μｇ／ｍｌ）を、３７℃で、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のトリトン−Ｘ１００、及び２ｍＭのＣａＣｌ２を含有するバッファーにおいて、種々の濃度のヘプシン(１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ及び１０ｎＭ）と共にインキュベートした。異なる時点で、反応混合物のアリコートを、６Ｘ−ＳＤＳサンプルバッファーと混合し、サンプルを９５℃で５分煮沸させ、４−２０％の勾配ゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させた。SimplyBlue Safe Stain(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて染色した後、タンパク質を可視化させた。同様の実験を、Ａｒｇ４８３−Ｖａｌ４８４ で切断しないように変異させたプロ-ＭＳＰ(プロ−ＭＳＰ−Ｒ４８３Ｅ）を用いて実施し、タンパク質分解性切断部位が、プロ-ＭＳＰにおける予測Ａｒｇ４８３−Ｖａｌ４８４結合から離間した種々の部位で生じているかどうかを評価した。
【０２９５】
ＬｎＣａｐ細胞において、細胞表面発現ヘプシンによるプロ-ＭＳＰ活性化：親ＬｎＣａ細胞と同程度に、比較的低レベルで内在性ヘプシンを発現するのみのＬｎＣａＰ−１７細胞と比較して、ヘプシン細胞表面発現が５倍増加し、ヘプシン酵素活性が３倍増加するよう、安定して過剰発現させるために、ＬｎＣａＰ−３４細胞を記載されたようにして生成させた(Moranら, 2006)。２４-ウェルプレートで培養されたコンフルエントなＬｎＣａｐ−３４細胞を無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄し、１２５Ｉ標識されたプロ-ＭＳＰ(２５μｇ／ｍｌ)を添加する前に、３７℃で１５分、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地において、種々の抗-ヘプシンインヒビター(１μＭの抗-ヘプシン抗体Ｆａｂ２５／１μＭのＫＤ１／１μＭのＡｃ−ＫＱＬＲ−ｃｍｋ(配列番号：１０として開示されている‘ＫＬＱＲ”）と共に、又は単独でインキュベートした。３７℃で３時間インキュベートした後、アリコートを取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(４−２０％勾配ゲル）(Invitrogen, Carlsbad, CA)、続いてＸ線フィルムに暴露した。
【０２９６】
表面プラズモン共鳴及びＥＬＩＳＡによる、Ｒｏｎに対するヘプシン-活性化プロ-ＭＳＰの結合：ヒトＲｏｎに対する、ヘプシン-活性化ＭＳＰの結合親和性を測定するために、バイアコア(BIAcore)(商標)−３０００機器(GE Health Care, NJ)において、表面プラズモン共鳴測定を実施した。ウサギ抗-ヒトＩｇＧをＣＭ５バイオセンサーチップに化学的に固定化し(アミノカップリング)、Ｒｏｎ(Sema IPT1)−ＩｇＧ融合タンパク質を捕捉すると、約２５０反応単位(ＲＵ）が付与された。動力学的測定のため、種々の濃度のヘプシン−活性化ＭＳＰ、又は商業的に入手可能なＭＳＰ(R&D systems)を、３０μｌ／分の流速で、２５℃にてＨＢＳ−Ｐバッファーに注射した。会合速度(ｋｏｎ）及び解離速度(ｋｏｆｆ）を、簡単な１：１ラングミュラー結合モデル(BIA-Evaluation)を使用して得、平衡解離定数(ＫＤ）を算出した(ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）。ＥＬＩＳＡ実験用に、マキシソープ(maxiSorp)マイクロタイタープレート(Nunc, Roskilde, Denmark)を、５０ｍＭの炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ９．６において、２μｇ／ｍｌのウサギ抗-ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異性抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, PA)で、４℃にて一晩コーティングした。アッセイ用バッファー(ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％のＢＳＡ及び０．０５％のトゥイーン−２０、１５ＰＰＭのプロクリン）でブロックした後、１μｇ／ｍｌのＲｏｎ(Sema IPT1)−ＩｇＧ融合タンパク質を添加し、プレートを、ゆっくり振揺しつつ、室温で１時間インキュベートした。洗浄用バッファー(ＰＢＳ、０．０５％のポリソルバート２０）で洗浄した後、ＨｉｓタグＭＳＰタンパク質を１時間添加した。結合したＭＳＰを抗-Ｈｉｓ-ＨＲＰ(Qiagen, Valencia, CA)を使用し、続いてＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２基質(KPL, Gaithersburg, MD)を添加することにより検出した。１ＭのＨ３ＰＯ４を用いて反応を停止させ、分子装置(Sunnyvale, CA)スペクトラマックスプラス(SpectraMax Plus)３８４マイクロプレートリーダーにおいて、Ａ４５０を測定した。半最大結合を付与する有効濃度(ＥＣ５０）を、カレイダグラフ(Kaleidagraph)(Synergy Software, Reading, PA)を使用し、４つのパラメーターにより測定した。
【０２９７】
腹膜マクロファージの走化性及び形態変化アッセイ：マウスの腹膜在住マクロファージを、マウス当たり１５ｍｌの無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて腹腔を洗浄することにより、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得た。細胞を洗浄し、１ｘ１０６細胞・ｍＬ−１の濃度で、２５ｍＭのヘペス(Hepes)を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁させた。マクロファージの走化性アッセイを、５μｍの孔サイズ(Millipore)を有するＱＣＭ走化性アッセイキットを使用して実施した。１００マイクロリットルの腹膜懸濁液(すなわち、１０５細胞）を、走化性細胞の上部ウェルに添加した。底部ウェルに、３７℃で２時間ヘプシン処理された、又は単独のいずれかで、精製されたプロ-ＭＳＰを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地を充填した。組換え活性形態のヒトＭＳＰ(R&D Systems)をポジティブコントロールとして使用した。３７℃で４時間インキュベートした後、膜の上面の細胞を、コットンスワブで拭き取り、遊走した細胞を、製造者の推薦に従い、剥離用バッファーを使用して剥離させた。異なるウェルからのアリコートを、１５分間、溶解用バッファーとＣＹＰＲＯ染料との混合物と共にインキュベートした。励起波長４８０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍにて、マイクロタイターリーダー(Spectramax-M5, Molecular devices, Sunnyvale, CA)を使用し、蛍光を測定することで、遊走を定量した。
【０２９８】
形態学において、ＭＳＰの効果を評価するために、腹膜マクロファージ(１ｘ１０６細胞・ｍＬ−１）を、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地で一晩培養させた。インキュベート後、非付着性細胞を除去し、単独で、又はヘプシンで前処理されたプロ-ＭＳＰを培養培地に添加した。３７℃で１時間、付加的にインキュベートした後、マクロファージの形態変化を、位相差顕微鏡により観察した。
【０２９９】
成熟ＭＳＰによるＮＯ合成の阻害：収集したマウスの大腿から得られた骨髄細胞を、単個細胞懸濁液にピペットし、ついでスピンダウンさせた。室温で５分、溶血用バッファーと共にインキュベートすることにより、赤血球細胞を溶解させた。ついで、細胞をマクロファージ分化培地(１０％のＦＢＳ、１Ｘ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及び５０ｎｇ／ｍｌの組換えｍＣＳＦ−１を含有する、グルタミンが入ったＤＭＥＭ）に再懸濁させた。ついで、細胞を滅菌２４ウェル非組織培養皿に播種した。次の日、続いて２日毎に培地を交換した。培養して６日後、マクロファージは成熟し、これらの成熟細胞を無血清ＤＭＥＭで洗浄し、さらに２時間インキュベートした。組換えＭＳＰ(１０ｎｇ／ｍｌ）、プロ−ＭＳＰ(１０ｎｇ／ｍｌ）、ヘプシン(１ｎＭ）及びＦａｂ２５(５００ｎＭ）からなる、図に示したような種々の反応体(全用量３００μＬ）をそれぞれのウェルに添加し、組織培養インキュベーターにおいて、３７℃で２４時間培養した。製造者の推薦に従い、グリース反応(Molecular Probes)を使用し、ＮＯ生成を定量した。
【０３００】
リン酸化キナーゼを検出するための免疫ブロット：ヒトＲｏｎを過剰発現しているヒト卵巣癌細胞系を使用し、Ｒｏｎ及び他の下流キナーゼのリン酸化を研究した。２ｘ１０５細胞／ウェル密度の細胞を１２ウェルプレートで培養し、２４時間血清不足にさせた。ついで、細胞を、プロ−ＭＳＰ(１０及び５０ｎｇ／ｍｌ）単独、又は１０ｎＭのヘプシンの存在下で１時間、刺激させた。市販されている供給源からの成熟ＭＳＰ及びヘプシンを、コントロールとして使用した。冷ＰＢＳで２回細胞を洗浄することによりサンプルを調製し、２００ｕｌの溶解用バッファーを添加した。ついで、サンプルを、４−１２％のトリス−グリシンゲル(Invitrogen, Carlsbad, CA)において、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分析した。ニトロセルロース膜にタンパク質を移し、抗-Ｒｏｎ抗体又は抗-ホスホ-ＡＫＴ抗体又は抗-ホスホ-ＭＡＰＫ抗体又は抗-ホスホ-Ｓ６抗体で、４℃で一晩処理した。洗浄後、ＩＲＤｙｅ８００−コンジュゲートヤギ抗-マウスＩｇＧ(Rockland, Gilbertsville, PA)、及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０ヤギ抗-ウサギＩｇＧ(Invitrogen)と共に、膜を１時間インキュベートした。オデッセイ(Odyssey)赤外線画像システム(LI-COR Biosciences, Lincoln, NE)を使用し、タンパク質を検出した。
【０３０１】
結果
組換えヘプシンによるプロ-ＭＳＰのインビトロ活性化
ＰＳ−ＳＣＬＡ(位置スキャンニング-合成コンビナトリアルライブラリ)による、ヘプシン用の基質プロファイリングに基づくコンセンサス配列で、(Ｐ／Ｋ）−（Ｋ／Ｑ）−（Ｔ／Ｌ／Ｎ）−ＲとしてＰ４−Ｐ１に対する優先性が明らかとなった(HerterＲ, 2005)。以前に同定されているヘプシン-基質のリスト(Kazamaら, 1995；Kirchhoferら, 2005；Moranら, 2006；Tripathiら, 2008)(表１)から、切断部位配列が、ＰＳ−ＳＣＬ基質プロファイリングにほぼ一致していることが明らかである。特に、プロＨＧＦ(ＫＱＬＲ↓Ｖ）(配列番号：１１）及びＬｎ−３３２(ＳＱＬＲ↓Ｌ）(配列番号：１２）の基質認識配列は、プロ−ＭＳＰ(ＳＫＬＲ↓Ｖ）(配列番号：１）の切断配列との密接な類似点を有する。しかしながら、このような論拠では、何故チモーゲン、プロ−ｔＰＡがヘプシン基質に乏しいかの説明はできず、これは認識部位が、プロ-ＨＧＦ及びプロ-ｕＰＡからのもののハイブリッドであるからである(表1)。
2013507967.tif 000004
【０３０２】
ヘプシンは、３７℃、種々の濃度のヘプシンとのインキュベートにおいて、用量依存及び時間依存方式にてプロ-ＭＳＰを活性化した。活性化を還元条件下で、４−２０％勾配のトリス-グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ゲル移動性シフトによりモニターした(図１)。切断生成物をＮ末端配列決定により分析し、プロセシング部位を同定した。ヘプシンによるプロ-ＭＳＰのタンパク質分解的切断は、Ａｒｇ４８３−Ｖａｌ４８４結合で生じており、活性化ＭＳＰ(α／β）ヘテロダイマーの形成に至る。プロ−ＭＳＰ(プロ−ＭＳＰ−Ｒ４８３Ｅ）の切断部位変異体を発現させ、生成し、ヘプシンによるタンパク質分解的プロセシングにかけた。長時間にわたるインキュベート(２４時間)にかかわらず,ヘプシンはこの変異プロ-ＭＳＰを切断せず、活性化の特異性が再確認された。
【０３０３】
細胞表面発現ヘプシンによるプロ-ＭＳＰの活性化
細胞表面において、自然に発現したヘプシンによるプロ-ＭＳＰのタンパク質分解的プロセシングを、ＬｎＣａｐ−３４細胞系においてモニターした(Moranら, 2006)。ヘプシンを発現するＬｎＣａｐ−３４細胞は、１２５Ｉ−プロ−ＭＳＰのプロセシングを可能にした(図２）。プロ-ＭＳＰプロセシングのタンパク質分解活性は、主として、３つ全てのヘプシンインヒビター(Ａｃ−ＫＱＬＲ−クロロメチルケトン(‘ＫＱＬＲ；配列番号：１０として開示）、ＫＤ１及びＦａｂ２５）がタンパク質分解的切断を効果的にブロックすることから、ヘプシンに起因している。
【０３０４】
ヘプシン活性化ＭＳＰの生物学的活性
Ｒｏｎに対するＭＳＰ結合性
我々は、ヒトＲｏｎに対する、ＭＳＰの結合親和性を測定するために、表面プラズモン共鳴(バイアコア）を使用した。単鎖プロ-ＭＳＰのタンパク質分解的切断は、レセプターＲｏｎへの結合にとって重要である。プロ-ＭＳＰも切断部位変異(プロ−ＭＳＰ−Ｒ４８３Ｅ）も、１μＭの濃度までは、Ｒｏｎに対して検出可能な結合は何もなかった。対して、ヘプシン-活性化ＭＳＰは、Ｒｏｎに対して、高い親和結合性を示した(ＫＤ＝７ｎＭ）(図３ａ）。ヘプシン-活性化ＭＳＰの親和性は、商業的に入手可能なＭＳＰ(ＫＤ＝４．４ｎＭ）に非常に類似していた。さらに、我々は、ＥＬＩＳＡ実験において、Ｒｏｎに対するＭＳＰの結合性を測定した。付与された半最大結合(ＥＣ５０）に対する、測定された効果的な濃度は０．５１９ｎＭであった(図３ｂ）。
【０３０５】
ＭＳＰ／ＲＯＮ経路における下流キナーゼのリン酸化
Ｒｏｎシグナル伝達経路における、ヘプシン処理されたプロ-ＭＳＰの生物学的効果を、マイトジェン活性化タンパク質(ＭＡＰ)キナーゼ、及びリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼを含む、下流キナーゼのリン酸化を追随することによりモニターした。ヘプシンもプロ-ＭＳＰ単独も、Ｒｏｎシグナル伝達経路の活性化に有効ではなかったが、ヘプシン処理されたプロ-ＭＳＰは、用量依存方式で、ＭＡＰキナーゼ及びＳ６キナーゼの双方において、強力なリン酸化を示した。ヘプシン処理されたプロ-ＭＳＰにおけるリン酸化の程度は、市販されている供給源からの成熟ＭＳＰサンプルのものに匹敵した。
【０３０６】
腹膜マクロファージ形態変化及び走化性アッセイ
ヘプシン-活性化ＭＳＰの生物活性を、初代マクロファージ培養において、さらに評価した。成熟ＭＳＰは、マクロファージにおける特徴的形態変化の原因であることが知られている。ヘプシン-活性化ＭＳＰでの刺激時に、腹膜マクロファージは、突起及び伸長により示される、細胞形状における明確な変化を受ける。ヘプシン-活性化ＭＳＰの影響は、商業的に入手可能なＭＳＰ、並びにＨＧＦＡ-活性化ＭＳＰのものに匹敵する。
【０３０７】
走化性アッセイにおいて、ヘプシンを用いたプロ-ＭＳＰの処理により、腹膜マクロファージの遊走がかなり増加(ｐ＜０．００１)し(図６)、その効果は、市販されている供給源からの成熟ＭＳＰに匹敵するものであった。抗-ヘプシンインヒビターを用いた前処理により、マクロファージの遊走にかなりの低減が示された。
【０３０８】
一酸化窒素(ＮＯ)合成の阻害
Wangらは、成熟ＭＳＰが、マクロファージ一酸化窒素シンターゼにおける増加、種々の刺激に対する反応における、ＮＯの生成に関連した増加をブロック可能であることを示している(Wangら, 1994a)。原発性マウス骨髄マクロファージは、ＬＰＳに応答して、一酸化窒素を強く生成することが示された。ヘプシン-活性化ＭＳＰは、骨髄由来のマクロファージにおいて、ＮＯ生成をかなり減弱させ(図７)、この効果は、抗-ヘプシン抗体の存在下で完全に阻害されるが、プロ-ＭＳＰ単独では、この反応を阻害しなかった。
【０３０９】
部分的参照リスト
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【０３１０】
上記発明は、理解をより明確にするために例証と実施例によりある程度詳細に説明したが、説明及び実施例は本発明の範囲を限定すると解してはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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