(57)【要約】抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせを含む治療組成物、ならびにＥＧＦＲ関連疾患（例えば、癌）を治療するためにそのような抗体および組成物を使用するための方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の抗体、第２の抗体、および第３の抗体を含む抗ＥＧＦＲ抗体のトリオを含む組成物であって、（ｉ）前記第１の抗体が、ｃａ、ｃｂ、およびｃｃからなる群から選択される抗体であるか、またはＥＧＦＲへの結合について該抗体と競合するか、または該抗体と同じエピトープに結合し、（ｉｉ）前記第２の抗体が、ｃｄ、ｃｅ、およびｃｆからなる群から選択される抗体であるか、またはＥＧＦＲへの結合について該抗体と競合するか、または該抗体と同じエピトープに結合し、かつ（ｉｉｉ）前記第３の抗体が、ｃｇ、ｃｈ、ｃｉ、ｃｊ、およびｃｋからなる群から選択される抗体であるか、またはＥＧＦＲへの結合について該抗体と競合するか、または該抗体と同じエピトープに結合する、前記組成物。
【請求項２】
（ｉ）前記第１の抗体が、抗体ｃａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３０、および３４にそれぞれ記載の重鎖ＣＤＲ１、２、および３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、４５、および４９にそれぞれ記載の軽鎖ＣＤＲ１、２、および３とを含む）であるか、またはＥＧＦＲへの結合について該抗体と競合するか、または該抗体と同じエピトープに結合し、（ｉｉ）前記第２の抗体が、抗体ｃｄ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３０、および３１にそれぞれ記載の重鎖ＣＤＲ１、２、および３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、５４、および５５にそれぞれ記載の軽鎖ＣＤＲ１、２、および３とを含む）であるか、またはＥＧＦＲへの結合について該抗体と競合するか、または該抗体と同じエピトープに結合し、かつ（ｉｉｉ）前記第３の抗体が、抗体ｃｈ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、２４、および２６にそれぞれ記載の重鎖ＣＤＲ１、２、および３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、４０、および４２にそれぞれ記載の軽鎖ＣＤＲ１、２、および３とを含む）であるか、またはＥＧＦＲへの結合について該抗体と競合するか、または該抗体と同じエピトープに結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
癌の治療のための薬物の製造のための、請求項１または２に記載の組成物の使用。
【請求項４】
前記癌の前記治療が、抗癌剤である追加の薬物との併用療法による治療である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記抗癌剤が、トポイソメラーゼ阻害剤を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ＥＧＦＲ細胞外ドメインに結合し、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、および１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２１、および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項７】
ＥＧＦＲ細胞外ドメインに結合し、かつ
（ａ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、
（ｂ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、
（ｃ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、
（ｄ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、
（ｅ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、
（ｆ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、
（ｇ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、
（ｈ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、
（ｉ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ならびに
（ｊ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、
単離されたモノクローナル抗体。
【請求項８】
ＥＧＦＲ細胞外ドメインに結合し、かつ重鎖および軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列を含む、単離されたモノクローナル抗体であって、前記重鎖および軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列が、以下から選択される、前記単離されたモノクローナル抗体：
（ａ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、２０、および２９の重鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、ならびにそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、４５、および４８の軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、
（ｂ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３６、および３５の重鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、ならびにそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、４５、および５０の軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、
（ｃ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、３６、および３５の重鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、ならびにそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、４５、および４８の軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、
（ｄ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、３０、および２９の重鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、ならびにそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、５４、および５３の軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、
（ｅ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、３０、および２９の重鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、ならびにそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、５４、および５３の軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、
（ｆ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、３０、および２９の重鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、ならびにそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、５４、および５３の軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、
（ｇ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、２４、および２３の重鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、ならびにそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、４０、および３９の軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、
（ｈ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、２４、および２３の重鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、ならびにそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、４０、および３９の軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、
（ｉ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、２４、および２３の重鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、ならびにそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、４０、および３９の軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、
（ｊ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、２４、および２３の重鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、ならびにそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、４５、および４４の軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、ならびに
（ｋ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、２４、および２３の重鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列、ならびにそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、４５、および４４の軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１配列。
【請求項９】
ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの結合について請求項７に記載の抗体のうちのいずれか１つと競合するか、またはそれと同じエピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項１０】
ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項５〜９のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項１１】
二重特異性抗体、イムノコンジュゲート、Ｆａｂ、Ｆａｂ'２、ＳｃＦｖ、アフィボディ、アビマー、ナノボディ、およびドメイン抗体からなる群から選択される、請求項５〜９または５〜１０のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項１２】
表２または表３に記載のペアから選択される抗体のペアを含む組成物であって、各抗体が、請求項５〜９または５〜１１のいずれか一項に記載の抗体である、前記組成物。
【請求項１３】
表４または表５に記載のトリオから選択される抗体のトリオを含む組成物であって、各抗体が、請求項５〜９または５〜１１のいずれか一項に記載の抗体である、前記組成物。
【請求項１４】
前記組成物を構成する前記抗体の各々が、１００ｎｍよりも良好なＫＤでＥＧＦＲに結合する、請求項５〜９または１２または１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
以下の特性のうちの少なくとも１つを示す、請求項５〜９または１２、または１３、または１４のいずれか一項に記載の組成物：
（ａ）細胞ベースのインビトロアッセイにおいて測定される、ＡＫＴリン酸化またはＥＲＫリン酸化の阻害、
（ｂ）インビトロでの、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞の増殖の阻害、
（ｃ）インビボでの、異種移植片モデルにおけるＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞の増殖の阻害、
（ｄ）インビトロでの、ＥＧＦＲ細胞外ドメインに結合するリガンドの阻害、
（ｅ）インビトロでの、ＥＧＦＲの二量体化の阻害、または
（ｆ）インビトロでの、細胞表面におけるＥＧＦＲの下方制御。
【請求項１６】
前記阻害が、前記組成物を構成する個々の抗体を、前記組成物中の合わせた抗体の合計量（モル）に等しい量（モル）で含む調製物と比較して、相加的または相乗的である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
２つ以上の抗体を含む組成物であって、該２つ以上の抗体のうちの２つが、以下からなる群から選択される、前記組成物：
（ａ）抗体ｃａ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａと競合するか、もしくは抗体ｃａと同じエピトープに結合する抗体、および抗体ｃｄ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｄと競合するか、もしくは抗体ｃｄと同じエピトープに結合する抗体、
（ｂ）抗体ｃａ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａと競合するか、もしくは抗体ｃａと同じエピトープに結合する抗体、および抗体ｃｅ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｅと競合するか、もしくは抗体ｃｅと同じエピトープに結合する抗体、
（ｃ）抗体ｃａ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａと競合するか、もしくは抗体ｃａと同じエピトープに結合する抗体、および抗体ｃｆ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｆと競合するか、もしくは抗体ｃｆと同じエピトープに結合する抗体、
（ｄ）抗体ｃａ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａと競合するか、もしくは抗体ｃａと同じエピトープに結合する抗体、および抗体ｃｇ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｇと競合するか、もしくは抗体ｃｇと同じエピトープに結合する抗体、
（ｅ）抗体ｃａ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａと競合するか、もしくは抗体ｃａと同じエピトープに結合する抗体、および抗体ｃｈ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｈと競合するか、もしくは抗体ｃｈと同じエピトープに結合する抗体、
（ｆ）抗体ｃａ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａと競合するか、もしくは抗体ｃａと同じエピトープに結合する抗体、および抗体ｃｉ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｉと競合するか、もしくは抗体ｃｉと同じエピトープに結合する抗体、
（ｇ）抗体ｃａ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａと競合するか、もしくは抗体ｃａと同じエピトープに結合する抗体、および抗体ｃｊ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｊと競合するか、もしくは抗体ｃｊと同じエピトープに結合する抗体、
（ｈ）抗体ｃａ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａと競合するか、もしくは抗体ｃａと同じエピトープに結合する抗体、および抗体ｃｋ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｋと競合するか、もしくは抗体ｃｋと同じエピトープに結合する抗体、
（ｉ）抗体ｃｂ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂと競合するか、もしくは抗体ｃｂと同じエピトープに結合する抗体、および抗体ｃｄ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｄと競合するか、もしくは抗体ｃｄと同じエピトープに結合する抗体、
（ｊ）抗体ｃｂ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａと競合するか、もしくは抗体ｃａと同じエピトープに結合する抗体、および抗体ｃｅ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｅと競合するか、もしくは抗体ｃｅと同じエピトープに結合する抗体、
（ｋ）抗体ｃｂ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂと競合するか、もしくは抗体ｃｂと同じエピトープに結合する抗体、および抗体ｃｆ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｆと競合するか、もしくは抗体ｃｆと同じエピトープに結合する抗体、
（ｌ）抗体ｃｂ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂと競合する抗体、および抗体ｃｇ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｇと競合するか、もしくは抗体ｃｇと同じエピトープに結合する抗体、
（ｍ）抗体ｃｂ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂと競合する抗体、および抗体ｃｈ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｈと競合するか、もしくは抗体ｃｈと同じエピトープに結合する抗体、
（ｎ）抗体ｃｂ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂと競合する抗体、および抗体ｃｉ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｉと競合するか、もしくは抗体ｃｉと同じエピトープに結合する抗体、
（ｏ）抗体ｃｂ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂと競合する抗体、および抗体ｃｊ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｊと競合するか、もしくは抗体ｃｊと同じエピトープに結合する抗体、
（ｐ）抗体ｃｂ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂと競合する抗体、および抗体ｃｋ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｋと競合するか、もしくは抗体ｃｋと同じエピトープに結合する抗体、
（ｑ）抗体ｃｃ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃと競合する抗体、および抗体ｃｄ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｄと競合するか、もしくは抗体ｃｄと同じエピトープに結合する抗体、
（ｒ）抗体ｃｃ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃと競合する抗体、および抗体ｃｅ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｅと競合するか、もしくは抗体ｃｅと同じエピトープに結合する抗体、
（ｓ）抗体ｃｃ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃと競合する抗体、および抗体ｃｆ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｆと競合するか、もしくは抗体ｃｆと同じエピトープに結合する抗体、
（ｔ）抗体ｃｃ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃと競合する抗体、および抗体ｃｇ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｇと競合するか、もしくは抗体ｃｇと同じエピトープに結合する抗体、
（ｕ）抗体ｃｃ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃと競合する抗体、および抗体ｃｈ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｈと競合するか、もしくは抗体ｃｈと同じエピトープに結合する抗体、
（ｖ）抗体ｃｃ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃと競合する抗体、および抗体ｃｉ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｉと競合するか、もしくは抗体ｃｉと同じエピトープに結合する抗体、
（ｗ）抗体ｃｃ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃと競合する抗体、および抗体ｃｊ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｊと競合するか、もしくは抗体ｃｊと同じエピトープに結合する抗体、
（ｘ）抗体ｃｃ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃと競合する抗体、および抗体ｃｋ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｋと競合するか、もしくは抗体ｃｋと同じエピトープに結合する抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、
（ａ）抗体ｖａおよびｖｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａおよびｖｄと競合するか、もしくは抗体ｖａおよびｖｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群から選択される、または
（ｂ）抗体ｖａおよびｖｅ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａおよびｖｅと競合するか、もしくは抗体ｖａおよびｖｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、または
（ｃ）抗体ｖａおよびｖｆ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａおよびｖｆと競合するか、もしくは抗体ｖａおよびｖｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｄ）抗体ｖａおよびｖｇ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａおよびｖｇと競合するか、もしくは抗体ｖａおよびｖｇと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｅ）抗体ｖａおよびｖｈ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａおよびｖｈと競合するか、もしくは抗体ｖａおよびｖｈと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｆ）抗体ｖａおよびｖｉ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａおよびｖｉと競合するか、もしくは抗体ｖａおよびｖｉと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｈ）抗体ｖａおよびｖｊ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａおよびｖｊと競合するか、もしくは抗体ｖａおよびｖｊと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｉ）抗体ｖｂおよびｖｄ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａおよびｖｉと競合するか、もしくは抗体ｖａおよびｖｉと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｊ）抗体ｖｂおよびｖｅ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂおよびｖｅと競合するか、もしくは抗体ｖｂおよびｖｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｋ）抗体ｖｂおよびｖｆ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂおよびｖｆと競合するか、もしくは抗体ｖｂおよびｖｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｌ）抗体ｖｂおよびｖｇ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂおよびｖｇと競合するか、もしくは抗体ｖｂおよびｖｇと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｍ）抗体ｖｂおよびｖｈ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂおよびｖｈと競合するか、もしくは抗体ｖｂおよびｖｈと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｎ）抗体ｖｂおよびｖｉ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂおよびｖｉと競合するか、もしくは抗体ｖｂおよびｖｉと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｏ）抗体ｖｂおよびｖｊ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂおよびｖｊと競合するか、もしくは抗体ｖｂおよびｖｊと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｐ）抗体ｖｃおよびｖｄ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃおよびｖｄと競合するか、もしくは抗体ｖｃおよびｖｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｑ）抗体ｖｃおよびｖｅ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃおよびｖｅと競合するか、もしくは抗体ｖｃおよびｖｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｒ）抗体ｖｃおよびｖｆ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃおよびｖｆと競合するか、もしくは抗体ｖｃおよびｖｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｓ）抗体ｖｃおよびｖｇ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃおよびｖｇと競合するか、もしくは抗体ｖｃおよびｖｇと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｔ）抗体ｖｃおよびｖｈ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃおよびｖｈと競合するか、もしくは抗体ｖｃおよびｖｈと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｕ）抗体ｖｃおよびｖｉ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃおよびｖｉと競合するか、もしくは抗体ｖｃおよびｖｉと同じエピトープに結合する抗体からなる群、ならびに
（ｖ）抗体ｖｃおよびｖｊ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃおよびｖｊと競合するか、もしくは抗体ｖｃおよびｖｊと同じエピトープに結合する抗体からなる群
である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
第３の抗体をさらに含む、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記抗体が、
（ａ）抗体ｃａ、ｃｇ、ｃｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａ、ｃｇ、およびｃｄと競合するか、または抗体ｃａ、ｃｇ、およびｃｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｂ）抗体ｃａ、ｃｇ、ｃｅ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａ、ｃｇ、およびｃｅと競合するか、または抗体ｃａ、ｃｇ、およびｃｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｃ）抗体ｃａ、ｃｇ、ｃｆ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａ、ｃｇ、およびｃｆと競合するか、または抗体ｃａ、ｃｇ、およびｃｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｄ）抗体ｃａ、ｃｈ、ｃｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａ、ｃｈ、およびｃｄと競合するか、または抗体ｃａ、ｃｈ、およびｃｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｅ）抗体ｃａ、ｃｈ、ｃｅ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａ、ｃｈ、およびｃｅと競合するか、または抗体ｃａ、ｃｈ、およびｃｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｆ）抗体ｃａ、ｃｈ、ｃｆ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａ、ｃｈ、およびｃｆと競合するか、または抗体ｃａ、ｃｈ、およびｃｆと同じエピトープに結合する抗体、
（ｇ）抗体ｃａ、ｃｉ、ｃｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａ、ｃｉ、およびｃｄと競合するか、または抗体ｃａ、ｃｉ、およびｃｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｈ）抗体ｃａ、ｃｉ、ｃｅ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａ、ｃｉ、およびｃｅと競合するか、または抗体ｃａ、ｃｉ、およびｃｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｉ）抗体ｃａ、ｃｉ、ｃｆ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａ、ｃｉ、およびｃｆと競合するか、または抗体ｃａ、ｃｉ、およびｃｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｊ）抗体ｃａ、ｃｊ、ｃｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａ、ｃｊ、およびｃｄと競合するか、または抗体ｃａ、ｃｊ、およびｃｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｋ）抗体ｃａ、ｃｊ、ｃｅ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａ、ｃｊ、およびｃｅと競合するか、または抗体ｃａ、ｃｊ、およびｃｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｌ）抗体ｃａ、ｃｊ、ｃｆ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａ、ｃｊ、およびｃｆと競合するか、または抗体ｃａ、ｃｊ、およびｃｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｍ）抗体ｃａ、ｃｋ、ｃｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａ、ｃｋ、およびｃｄと競合するか、または抗体ｃａ、ｃｋ、およびｃｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｎ）抗体ｃａ、ｃｋ、ｃｅ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａ、ｃｋ、およびｃｅと競合するか、または抗体ｃａ、ｃｋ、およびｃｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｏ）抗体ｃａ、ｃｋ、ｃｆ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃａ、ｃｋ、およびｃｆと競合するか、または抗体ｃａ、ｃｋ、およびｃｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｐ）抗体ｃｂ、ｃｇ、ｃｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂ、ｃｇ、およびｃｄと競合するか、または抗体ｃｂ、ｃｇ、およびｃｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｑ）抗体ｃｂ、ｃｇ、ｃｅ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂ、ｃｇ、およびｃｅと競合するか、または抗体ｃｂ、ｃｇ、およびｃｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｒ）抗体ｃｂ、ｃｇ、ｃｆ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂ、ｃｇ、およびｃｆと競合するか、または抗体ｃｂ、ｃｇ、およびｃｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｓ）抗体ｃｂ、ｃｈ、ｃｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂ、ｃｈ、およびｃｄと競合するか、または抗体ｃｂ、ｃｈ、およびｃｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｔ）抗体ｃｂ、ｃｈ、ｃｅ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂ、ｃｈ、およびｃｅと競合するか、または抗体ｃｂ、ｃｈ、およびｃｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｕ）抗体ｃｂ、ｃｈ、ｃｆ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂ、ｃｈ、およびｃｆと競合するか、または抗体ｃｂ、ｃｈ、およびｃｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｖ）抗体ｃｂ、ｃｉ、ｃｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂ、ｃｉ、およびｃｄと競合するか、または抗体ｃｂ、ｃｉ、およびｃｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｗ）抗体ｃｂ、ｃｉ、ｃｅ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂ、ｃｉ、およびｃｅと競合するか、または抗体ｃｂ、ｃｉ、およびｃｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｘ）抗体ｃｂ、ｃｉ、ｃｆ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂ、ｃｉ、およびｃｆと競合するか、または抗体ｃｂ、ｃｉ、およびｃｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｙ）抗体ｃｂ、ｃｊ、ｃｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂ、ｃｊ、およびｃｄと競合するか、または抗体ｃｂ、ｃｊ、およびｃｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｚ）抗体ｃｂ、ｃｊ、ｃｅ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂ、ｃｊ、およびｃｅと競合するか、または抗体ｃｂ、ｃｊ、およびｃｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ａａ）抗体ｃｂ、ｃｊ、ｃｆ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂ、ｃｊ、およびｃｆと競合するか、または抗体ｃｂ、ｃｊ、およびｃｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｂｂ）抗体ｃｂ、ｃｋ、ｃｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂ、ｃｋ、およびｃｄと競合するか、または抗体ｃｂ、ｃｋ、およびｃｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｃｃ）抗体ｃｂ、ｃｋ、ｃｅ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂ、ｃｋ、およびｃｅと競合するか、または抗体ｃｂ、ｃｋ、およびｃｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｃｃ）抗体ｃｂ、ｃｋ、ｃｆ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｂ、ｃｋ、およびｃｆと競合するか、または抗体ｃｂ、ｃｋ、およびｃｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｄｄ）抗体ｃｃ、ｃｇ、ｃｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃ、ｃｇ、およびｃｄと競合するか、または抗体ｃｃ、ｃｇ、およびｃｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｅｅ）抗体ｃｃ、ｃｇ、ｃｅ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃ、ｃｇ、およびｃｅと競合するか、または抗体ｃｃ、ｃｇ、およびｃｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｆｆ）抗体ｃｃ、ｃｇ、ｃｆ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃ、ｃｇ、およびｃｆと競合するか、または抗体ｃｃ、ｃｇ、およびｃｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｇｇ）抗体ｃｃ、ｃｈ、ｃｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃ、ｃｈ、およびｃｄと競合するか、または抗体ｃｃ、ｃｈ、およびｃｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｈｈ）抗体ｃｃ、ｃｈ、ｃｅ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃ、ｃｈ、およびｃｅと競合するか、または抗体ｃｃ、ｃｈ、およびｃｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｉｉ）抗体ｃｃ、ｃｈ、ｃｆ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃ、ｃｈ、およびｃｆと競合するか、または抗体ｃｃ、ｃｈ、およびｃｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｊｊ）抗体ｃｃ、ｃｉ、ｃｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃ、ｃｉ、およびｃｄと競合するか、または抗体ｃｃ、ｃｉ、およびｃｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｋｋ）抗体ｃｃ、ｃｉ、ｃｅ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃ、ｃｉ、およびｃｅと競合するか、または抗体ｃｃ、ｃｉ、およびｃｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｌｌ）抗体ｃｃ、ｃｉ、ｃｆ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃ、ｃｉ、およびｃｆと競合するか、または抗体ｃｃ、ｃｉ、およびｃｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｍｍ）抗体ｃｃ、ｃｊ、ｃｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃ、ｃｊ、およびｃｄと競合するか、または抗体ｃｃ、ｃｊ、およびｃｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｎｎ）抗体ｃｃ、ｃｊ、ｃｅ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃ、ｃｊ、およびｃｅと競合するか、または抗体ｃｃ、ｃｊ、およびｃｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｏｏ）抗体ｃｃ、ｃｊ、ｃｆ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃ、ｃｊ、およびｃｆと競合するか、または抗体ｃｃ、ｃｊ、およびｃｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｐｐ）抗体ｃｃ、ｃｋ、ｃｄ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃ、ｃｋ、およびｃｄと競合するか、または抗体ｃｃ、ｃｋ、およびｃｄと同じエピトープに結合する抗体からなる群、
（ｑｑ）抗体ｃｃ、ｃｋ、ｃｅ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃ、ｃｋ、およびｃｅと競合するか、または抗体ｃｃ、ｃｋ、およびｃｅと同じエピトープに結合する抗体からなる群、ならびに
（ｒｒ）抗体ｃｃ、ｃｋ、ｃｆ、ならびに、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｃｃ、ｃｋ、およびｃｆと競合するか、または抗体ｃｃ、ｃｋ、およびｃｆと同じエピトープに結合する抗体からなる群
である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記抗体が、
（ａ）抗体ｖａ、ｖｉ、ｖｄ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａ、ｖｉ、およびｖｄと競合するか、もしくは抗体ｖａ、ｖｉ、およびｖｄと同じエピトープに結合する抗体、
（ｂ）抗体ｖａ、ｖｉ、ｖｅ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａ、ｖｉ、およびｖｅと競合するか、もしくは抗体ｖａ、ｖｉ、およびｖｅと同じエピトープに結合する抗体、
（ｃ）抗体ｖａ、ｖｉ、ｖｆ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａ、ｖｉ、およびｖｆと競合するか、もしくは抗体ｖａ、ｖｉ、およびｖｆと同じエピトープに結合する抗体、
（ｄ）抗体ｖａ、ｖｊ、ｖｇ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａ、ｖｉ、およびｖｇと競合するか、もしくは抗体ｖａ、ｖｉ、およびｖｇと同じエピトープに結合する抗体、
（ｅ）抗体ｖａ、ｖｊ、ｖｈ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａ、ｖｉ、およびｖｈと競合するか、もしくは抗体ｖａ、ｖｉ、およびｖｈと同じエピトープに結合する抗体、
（ｆ）抗体ｖａ、ｖｊ、ｖｄ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａ、ｖｊ、およびｖｄと競合するか、もしくは抗体ｖａ、ｖｊ、およびｖｄと同じエピトープに結合する抗体、
（ｇ）抗体ｖａ、ｖｊ、ｖｅ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａ、ｖｉ、およびｖｅと競合するか、もしくは抗体ｖａ、ｖｉ、およびｖｅと同じエピトープに結合する抗体、
（ｈ）抗体ｖａ、ｖｊ、ｖｆ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａ、ｖｉ、およびｖｆと競合するか、もしくは抗体ｖａ、ｖｉ、およびｖｆと同じエピトープに結合する抗体、
（ｉ）抗体ｖａ、ｖｊ、ｖｇ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａ、ｖｊ、およびｖｇと競合するか、もしくは抗体ｖａ、ｖｊ、およびｖｇと同じエピトープに結合する抗体、
（ｊ）抗体ｖａ、ｖｊ、ｖｈ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖａ、ｖｊ、およびｖｈと競合するか、もしくは抗体ｖａ、ｖｊ、およびｖｈと同じエピトープに結合する抗体、
（ｋ）抗体ｖｂ、ｖｉ、ｖｄ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂ、ｖｉ、およびｖｄと競合するか、もしくは抗体ｖｂ、ｖｉ、およびｖｄと同じエピトープに結合する抗体、
（ｌ）抗体ｖｂ、ｖｉ、ｖｅ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂ、ｖｉ、およびｖｅと競合するか、もしくは抗体ｖｂ、ｖｉ、およびｖｅと同じエピトープに結合する抗体、
（ｍ）抗体ｖｂ、ｖｉ、ｖｆ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂ、ｖｉ、およびｖｆと競合するか、もしくは抗体ｖｂ、ｖｉ、およびｖｆと同じエピトープに結合する抗体、
（ｎ）抗体ｖｂ、ｖｉ、ｖｇ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂ、ｖｉ、およびｖｇと競合するか、もしくは抗体ｖｂ、ｖｉ、およびｖｇと同じエピトープに結合する抗体、
（ｏ）抗体ｖｂ、ｖｉ、ｖｈ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂ、ｖｉ、およびｖｈと競合するか、もしくは抗体ｖｂ、ｖｉ、およびｖｈと同じエピトープに結合する抗体、
（ｐ）抗体ｖｂ、ｖｊ、ｖｄ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂ、ｖｊ、およびｖｄと競合するか、もしくは抗体ｖｂ、ｖｊ、およびｖｄと同じエピトープに結合する抗体、
（ｑ）抗体ｖｂ、ｖｊ、ｖｅ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂ、ｖｊ、およびｖｅと競合するか、もしくは抗体ｖｂ、ｖｊ、およびｖｅと同じエピトープに結合する抗体、
（ｒ）抗体ｖｂ、ｖｊ、ｖｆ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂ、ｖｊ、およびｖｆと競合するか、もしくは抗体ｖｂ、ｖｊ、およびｖｆと同じエピトープに結合する抗体、
（ｓ）抗体ｖｂ、ｖｊ、ｖｇ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂ、ｖｊ、およびｖｇと競合するか、もしくは抗体ｖｂ、ｖｊ、およびｖｇと同じエピトープに結合する抗体、
（ｔ）抗体ｖｂ、ｖｊ、ｖｈ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｂ、ｖｊ、およびｖｈと競合するか、もしくは抗体ｖｂ、ｖｊ、およびｖｈと同じエピトープに結合する抗体、
（ｕ）抗体ｖｃ、ｖｉ、ｖｄ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃ、ｖｉ、およびｖｄと競合するか、もしくは抗体ｖｃ、ｖｉ、およびｖｄと同じエピトープに結合する抗体、
（ｖ）抗体ｖｃ、ｖｉ、ｖｅ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃ、ｖｉ、およびｖｅと競合するか、もしくは抗体ｖｃ、ｖｉ、およびｖｅと同じエピトープに結合する抗体、
（ｗ）抗体ｖｃ、ｖｉ、ｖｆ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃ、ｖｉ、およびｖｆと競合するか、もしくは抗体ｖｃ、ｖｉ、およびｖｆと同じエピトープに結合する抗体、
（ｘ）抗体ｖｃ、ｖｉ、ｖｇ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃ、ｖｉ、およびｖｇと競合するか、もしくは抗体ｖｃ、ｖｉ、およびｖｇと同じエピトープに結合する抗体、
（ｙ）抗体ｖｃ、ｖｉ、ｖｈ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃ、ｖｉ、およびｖｈと競合するか、もしくは抗体ｖｃ、ｖｉ、およびｖｈと同じエピトープに結合する抗体、
（ｚ）抗体ｖｃ、ｖｊ、ｖｄ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃ、ｖｊ、およびｖｄと競合するか、もしくは抗体ｖｃ、ｖｊ、およびｖｄと同じエピトープに結合する抗体、
（ａａ）抗体ｖｃ、ｖｊ、ｖｅ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃ、ｖｊ、およびｖｅと競合するか、もしくは抗体ｖｃ、ｖｊ、およびｖｅと同じエピトープに結合する抗体、
（ｂｂ）抗体ｖｃ、ｖｊ、ｖｆ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃ、ｖｊ、およびｖｆと競合するか、もしくは抗体ｖｃ、ｖｊ、およびｖｆと同じエピトープに結合する抗体、
（ｃｃ）抗体ｖｃ、ｖｊ、ｖｇ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃ、ｖｊ、およびｖｇと競合するか、もしくは抗体ｖｃ、ｖｊ、およびｖｇと同じエピトープに結合する抗体、あるいは
（ｄｄ）抗体ｖｃ、ｖｊ、ｖｈ、または、ＥＧＦＲへの結合について抗体ｖｃ、ｖｊ、およびｖｈと競合するか、もしくは抗体ｖｃ、ｖｊ、およびｖｈと同じエピトープに結合する抗体
である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２２】
追加の抗癌剤との併用療法による癌の治療のための薬物の製造のための、請求項８〜２１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２３】
前記追加の抗癌剤が、トポイソメラーゼ阻害剤を含む、請求項２２の組成物。
【請求項２４】
容器中に請求項８〜２３のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
【請求項２５】
前記容器が、単一バイアル中に前記組成物を収容している、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
ＥＧＦＲ細胞外ドメインに各々結合するモノクローナル抗体の組み合わせを選択するための方法であって、
ＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達を阻害するために８０ｎＭよりも良好なＩＣ９０を各々有し、かつＥＧＦＲ細胞外ドメインへの結合について互いに競合せず、かつ以下の特性のうちの少なくとも１つを各々示す、少なくとも２つの抗体
を選択することを含む、前記方法：
（ｉ）インビボでの、異種移植片モデルにおけるＥＧＦＲを発現する細胞の増殖の阻害、
（ｉｉ）インビトロでの、ＥＧＦＲ細胞外ドメインに結合するリガンドの阻害、
（ｉｉｉ）インビトロでの、ＥＧＦＲの二量体化の阻害、または
（ｉｖ）インビトロでの、細胞表面におけるＥＧＦＲの下方制御
（ｖ）細胞ベースのインビトロアッセイにおいて測定される、ＡＫＴリン酸化またはＥＲＫリン酸化の阻害。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
自然免疫系は、病原体の効率的な中和のための抗体を作るように進化してきた。免疫した動物から単離された自然の抗体調製物は、元々は多クローナル性であり、特定の抗原の１個または２、３個のエピトープに限定される個々の抗体と比較して免疫優性を示す。中和抗体は、それらが結合する抗原の生物学的機能を阻止することができる。中和抗体の混合物は、該混合物中のいずれかの個々の抗体よりも高い中和を達成し得る。
【０００２】
そのような結果は、上皮成長因子受容体ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）に対する２つ以上の中和抗体を組み合わせることによって達成されている。ＥＧＦＲに結合して阻害する抗体は、有用な抗癌効果を提供することが証明されており、医療的および商業的価値が非常に高い。拮抗性であるが非競合性である抗ＥＧＦＲ抗体のペアの特定の組み合わせは、いずれかの抗体を単独で適用した場合よりも急速かつより効果的なＥＧＦＲの下方制御をもたらした（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＰＮＡＳ  １０２：１９１５−１９２０（非特許文献１））。２つの交差競合する（すなわち、抗原への結合について互いに競合する）抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせは、非相乗的であることが示されている。ＥＧＦＲの異なるエピトープに対する複数の抗体の結合は、細胞表面に複雑な受容体の格子を形成し、単一のエピトープを標的とする抗体で得られるよりも効率的な内部移行および分解を引き起こすことが見込まれる。また、抗ＥＧＦＲ受容体抗体のペアの特定の組み合わせも、相加的な、またある場合には相乗的な、インビボでの抗腫瘍活性をもたらすことが報告されている（Ｐｅｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：６３９０−６３９９（非特許文献２））。変異体ｄｅ２−７ＥＧＦＲに対して産生させたモノクローナル抗体８０６を拮抗性抗体５２８と組み合わせると、神経膠腫異種移植片モデルにおいて、いずれかの抗体を単独で用いた治療よりも有意に高い抗腫瘍活性を示した。相乗的な抗腫瘍活性の機構は、ＥＧＦＲの急速な下方制御と関連していることが示され、個々の抗体を用いた治療によっては誘導されなかった。同様に、別の抗ＥＧＦＲ抗体のペアであるセツキシマブおよびＥＭＤ５５９００の存在下において、ＥＧＦＲのリン酸化が大きく減少した（Ｋａｍａｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７：７２６−３３（非特許文献３））。
【０００３】
また、関連する受容体ＥｒｂＢ２を標的とする抗体のある特定の組み合わせも、相乗的に機能することが示されている（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）（非特許文献１）。トラスツズマブをペルツズマブと組み合わせると、個々の抗体では効果を示さない用量でＢＴ４７４乳癌細胞の生存を阻害した（Ｎａｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：２３４３−２３４６（非特許文献４））。別の研究では、３つの非競合性の抗ＥｒｂＢ２抗体を組み合わせた場合に、個別の場合よりもはるかにより効果的なインビトロでのＢＴ４７４細胞の死滅が示され、ＢＴ４７４のインビボ異種移植片モデルにおいても同様の結果が得られた（Ｓｐｉｒｉｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８：１６９９−７０１（非特許文献５））。
【０００４】
１つより多くの抗体を組み合わせることによって、腫瘍細胞に対する抗体の増殖抑制（例えば、細胞傷害性）効果を増強させ得るという他の証拠が報告されている。例えば、腫瘍抗原１７−１Ａに対するモノクローナル抗体を組み合わせ、腫瘍細胞の溶解を調べたところ、モノクローナル抗体、および競合性抗体の組み合わせが効果を示さなかった一方で、２つ以上の非競合性抗体の組み合わせが、腫瘍細胞の完全な溶解をもたらしたことが分かった。
【０００５】
したがって、抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせに対する腫瘍の応答性を増強させるために、シグナル伝達の阻害を増強する組み合わせ、およびより効果的な細胞増殖抑制性または細胞傷害性効果を提供する組み合わせを含む、組み合わせ作用を生成するためのさらなるアプローチおよび方法が依然として必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＰＮＡＳ  １０２：１９１５−１９２０
【非特許文献２】Ｐｅｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：６３９０−６３９９
【非特許文献３】Ｋａｍａｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７：７２６−３３
【非特許文献４】Ｎａｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：２３４３−２３４６
【非特許文献５】Ｓｐｉｒｉｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８：１６９９−７０１
【発明の概要】
【０００７】
概要
ＥＧＦＲに結合し、種々のＥＧＦＲ機能を阻害する新規モノクローナル抗体を本明細書に提供する。これらの抗体は、互いにまたは他の抗ＥｒｂＢ受容体抗体（例えば、他の抗ＥＧＦＲ抗体）と組み合わせると、各抗体の単独投与と比較して相乗的または相加的な治療効果を示すことができる。これらの抗体は、特に、本明細書に提供される組み合わせで投与されると、ＥＧＦＲ媒介性細胞シグナル伝達と関連する様々な疾患（例えば、癌）を治療するために有用である。したがって、ＥＧＦＲに結合し、種々のＥＧＦＲ機能を阻害する単離された新規モノクローナル抗体の組み合わせも本明細書に提供する。また、本明細書に開示される抗体の組み合わせの使用とともに、診断および治療目的のためのこれらの抗体の使用も提供する。
【０００８】
一実施形態において、ＥＧＦＲに結合するモノクローナル抗体およびそのような抗体の組み合わせが提供される。これらの抗体および組み合わせは、以下の特性のうちの１つ以上を示す：
（ａ）細胞ベースのアッセイにおいて測定される、ＡＫＴリン酸化またはＥＲＫリン酸化、例えば、ＥＧＦＲ依存性ＡＫＴまたはＥＲＫリン酸化の阻害
（ｂ）ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖の阻害
（ｃ）ＥＧＦＲへのＥＧＦリガンドの結合の阻害（例えば、ＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、またはアンフィレギュリンを含む、ＥＧＦＲに結合する１つ以上のリガンドの結合の阻害）
（ｄ）ＥＧＦＲの二量体化の阻害、または
（ｅ）細胞表面におけるＥＧＦＲの下方制御（例えば、受容体の内部移行および再循環による、ならびに／または受容体の内部移行および分解による）。
【０００９】
特定の実施形態において、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）もしくはＦＡＣＳ、または他のそのようなアッセイを用いて測定した通り、抗体（すなわち、組み合わされた場合）は、非重複エピトープに結合する。別の特定の実施形態において、抗体は、上述の機能特性、すなわち、
（ａ）細胞ベースのアッセイにおいて測定される、ＡＫＴリン酸化またはＥＲＫリン酸化、例えば、ＥＧＦＲ依存性ＡＫＴまたはＥＲＫリン酸化の阻害
（ｂ）ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖の阻害
（ｃ）ＥＧＦＲに結合するリガンドの阻害（例えば、ＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、またはアンフィレギュリンを含む、ＥＧＦＲに結合する１つ以上のリガンドの結合の阻害）
（ｄ）ＥＧＦＲの二量体化の阻害、または
（ｅ）細胞表面におけるＥＧＦＲの下方制御（例えば、受容体の内部移行および再循環による、ならびに／または受容体の内部移行および分解による）
のうちの少なくとも１つを相加的にまたは相乗的に提供する。
【００１０】
別の実施形態において、個々のモノクローナル抗体は、ＥＧＦＲリガンドの作用を阻害するが、交差競合はしない（すなわち、それらは異なるエピトープに結合する）。
【００１１】
本明細書に提供される特定の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２〜１７および１９〜２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものを含む。また、本明細書に提供される抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含むものも含む。
【００１２】
【表１】
2013533211.tif 000002
*抗体の名称、すなわち、ｖａ、ｖｂ、ｖｃ等
【００１３】
表１に記載される抗体のうちのいずれかと同じＥＧＦＲ上のエピトープに結合する抗体も、本明細書に開示される抗体の組み合わせにおける使用のために企図される。
【００１４】
本明細書における他の特定の抗体は、以下の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ１の配列を含むものを含む（この表２中の各２桁の数字は、下の表６および表７に記載されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯを表す）。
【００１５】
【表２】
2013533211.tif 000003
**抗体の名称、すなわち、ｃａ、ｃｂ、ｃｃ等
【００１６】
表２に記載される抗体のうちのいずれかと同じＥＧＦＲ上のエピトープに結合する抗体も、本明細書に開示される抗体の組み合わせにおける使用のために企図される。
【００１７】
後に本明細書に記載する特定の抗体のうちのいずれかによって結合される、同じかまたは重複するエピトープに結合するモノクローナル抗体も、本発明に包含される。
【００１８】
本明細書に開示される抗体は、全ての既知の形態の抗体および抗体様特性を有する他のタンパク質骨格を含む。例えば、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、イムノコンジュゲート、キメラ抗体、または抗体様特性を有するタンパク質骨格、例えば、フィブロネクチンまたはアンキリン反復であってもよい。また、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'２、ＳｃＦｖ、アフィボディ、ナノボディ、またはドメイン抗体であってもよい。また、抗体は、以下のアイソタイプのうちのいずれかを含む任意のアイソタイプを有することができる：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ。ＩｇＧ抗体が好ましい。
【００１９】
本明細書に提供される２つの抗体の例示的な組み合わせ（これ以降、「ペア（ｐａｉｒ）」または「ペア（ｐａｉｒｓ）」と称する）は、以下を含む。
【００２０】
【表３】
2013533211.tif 000004
各指定されたペアは、EGFRへの結合について該ペアの指定された抗体の各々と競合する抗体のうちの１つずつからなるペアも包含する。
***抗体ペアの名称
【００２１】
上の表に記載されるように、指定された抗体は、自身と競合する抗体であると考えられる。また、表３に記載される抗体のペアと、ＥＧＦＲへの結合について競合するか、または同じＥＧＦＲ上のエピトープに結合する、抗体のペアも企図される。
【００２２】
３つ以上の抗体の例示的な組み合わせは、すぐ上にａ〜ｘで示される各ペアと、その特定のペア中には存在しないｃｄ、ｃｅ、ｃｆ、ｃｇ、ｃｈ、ｃｉ、ｃｊ、およびｃｋから選択される第３の抗体とを組み合わせて含み、さらに、上でｙ、ｚ、ａａ、ａｂ、ａｃ、ａｄ、ａｅ、ａｇ、ａｈ、ａｉ、ａｊ、ａｋ、ａｌ、ａｍ、ａｏ、ａｐ、ａｑ、ａｒ、ａｓ、ａｔ、ａｕ、またはａｖとして示される二語組み合わせのそれぞれと、その特定のペア中には存在しないｖｄ、ｖｅ、ｖｆ、ｖｇ、ｖｈ、ｖｉ、およびｖｊから選択される第３の抗体とを組み合わせて含む。
【００２３】
本明細書に提供される３つの抗体の例示的な組み合わせ（これ以降、「トリオ（ｔｒｉｏ）」または「トリオ（ｔｒｉｏｓ）」と称される）は、下の表４および表５に指定されるものを含み、ならびに下の表４および表５に指定される各トリオにつき、ＥＧＦＲへの結合についてその指定されたトリオの抗体の各々と競合する抗体のうちの１つずつを含むトリオも含む。本明細書に開示される抗体は、競合結合実験に基づいて群または「ビン」に分類され、実施例および図面においてそのように記載される。ビン１の抗体は全て互いに、ＥＧＦＲの細胞外ドメインへの結合について競合し、ビン２の抗体は全て互いに、ＥＧＦＲの細胞外ドメインへの結合について競合し、ビン３の抗体は全て互いに、ＥＧＦＲの細胞外ドメインへの結合について競合する。しかしながら、ビン１の抗体は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインへの結合についてビン２の抗体またはビン３の抗体と競合せず、ビン２の抗体は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインへの結合についてビン１の抗体またはビン３の抗体と競合せず、ビン３の抗体は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインへの結合についてビン１の抗体またはビン２の抗体と競合しない。したがって、各ビンは、そのビンの抗体が結合する異なるエピトープに対応する。ビン１、ビン２、およびビン３の抗体は、下の表４および５において、それぞれ「第１の抗体」、「第３の抗体」、および「第２の抗体」と称される。
【００２４】
【表４】
2013533211.tif 000005
2013533211.tif 000006
【００２５】
【表５】
2013533211.tif 000007
【００２６】
上の表１〜５に記載されるように、指定された抗体は、ＥＧＦＲへの抗体について自身と競合する抗体であると考えられる。
【００２７】
また、上の表４に記載される抗体のトリオのうちのいずれかと、ＥＧＦＲへの結合について競合するか、または同じＥＧＦＲ上のエピトープに結合する抗体のトリオも、本発明に包含される。
【００２８】
表４に記載されるように、ビン１の抗体は、抗体ｖａ、ｖｂ、およびｖｃ（表１に定義される）、ならびに抗体ｃａ、ｃｂ、およびｃｃ（表２に定義される）を含む。ビン２の抗体は、抗体ｖｄ、ｖｅ、ｖｆ、ｖｇ、およびｖｈ（表１に定義される）、ならびに抗体ｃｄ、ｃｅ、およびｃｆ（表２に定義される）を含む。ビン３の抗体は、抗体ｖｉおよびｖｊ（表１に定義される）、ならびに抗体ｃｇ、ｃｈ、ｃｉ、ｃｊ、およびｃｋ（表２に定義される）を含む。
【００２９】
また、ペアのうちの１つの抗体が、本明細書に定義されるビン１の抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、ペアのうちの第２の抗体が、本明細書に定義されるビン２の抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合する、抗ＥＧＦＲ抗体のペア（２つの抗体、または抗体の２つ組）の組成物も提供される。したがって、一実施形態において、第１の抗体および第２の抗体を含む抗ＥＧＦＲ抗体のペアの組成物であって、（ｉ）第１の抗体が、ｖａ、ｖｂ、およびｖｃからなる群から選択される抗体、もしくはｃａ、ｃｂ、およびｃｃからなる群から選択される抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、（ｉｉ）第２の抗体が、ｖｄ、ｖｅ、ｖｆ、ｖｇ、およびｖｈからなる群から選択される抗体、もしくはｃｄ、ｃｅ、およびｃｆからなる群から選択される抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合する、組成物が提供される。
【００３０】
また、ペアのうちの１つの抗体が、本明細書に定義されるビン１の抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、ペアのうちの第２の抗体が、本明細書に定義されるビン３の抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合する、抗ＥＧＦＲ抗体（２つの抗体、または抗体の２つ組）のペアの組成物も提供される。したがって、一実施形態において、第１の抗体および第２の抗体を含む抗ＥＧＦＲ抗体のペアの組成物であって、（ｉ）第１の抗体が、ｖａ、ｖｂ、およびｖｃからなる群から選択される抗体、もしくはｃａ、ｃｂ、およびｃｃからなる群から選択される抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、（ｉｉ）第２の抗体が、ｖｉおよびｖｊからなる群から選択される抗体、もしくはｃｇ、ｃｈ、ｃｉ、ｃｊ、およびｃｋからなる群から選択される抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合する、組成物が提供される。
【００３１】
また、ペアのうちの１つの抗体が、本明細書に定義されるビン２の抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、ペアのうちの第２の抗体が、本明細書に定義されるビン３の抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合する、抗ＥＧＦＲ抗体のペア（２つの抗体、または抗体の２つ組）の組成物も提供される。したがって、一実施形態において、第１の抗体および第２の抗体を含む抗ＥＧＦＲ抗体のペアの組成物であって、（ｉ）第１の抗体が、ｖｄ、ｖｅ、ｖｆ、ｖｇ、およびｖｈからなる群から選択される抗体、もしくはｃｄ、ｃｅ、およびｃｆからなる群から選択される抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、（ｉｉ）第２の抗体が、ｖｉおよびｖｊからなる群から選択される抗体、もしくはｃｇ、ｃｈ、ｃｉ、ｃｊ、およびｃｋからなる群から選択される抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合する、組成物が提供される。
【００３２】
また、トリオのうちの１つの抗体が、本明細書に定義されるビン１の抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、トリオのうちの第２の抗体が、本明細書に定義されるビン２の抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、トリオのうちの第３の抗体が、本明細書に定義されるビン３の抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合する、抗ＥＧＦＲ抗体のトリオ（３つの抗体、または３つ組の抗体）の組成物も提供される。したがって、一実施形態において、第１の抗体、第２の抗体、および第３の抗体を含む抗ＥＧＦＲ抗体のトリオの組成物であって、（ｉ）第１の抗体が、ｖａ、ｖｂ、およびｖｃからなる群から選択される抗体、またはｃａ、ｃｂ、およびｃｃからなる群から選択される抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、（ｉｉ）第２の抗体が、ｖｄ、ｖｅ、ｖｆ、ｖｇ、およびｖｈからなる群から選択される抗体、またはｃｄ、ｃｅ、およびｃｆからなる群から選択される抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、（ｉｉｉ）第３の抗体が、ｖｉおよびｖｊからなる群から選択される抗体、またはｃｇ、ｃｈ、ｃｉ、ｃｊ、およびｃｋからなる群から選択される抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合する、組成物が提供される。
【００３３】
例えば、第１の抗体、第２の抗体、および第３の抗体を含む抗ＥＧＦＲ抗体のトリオを含む組成物であって、（ｉ）第１の抗体が、抗体ｃａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３０、および３４にそれぞれ記載の重鎖ＣＤＲ１、２、および３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、４５、および４９にそれぞれ記載の軽鎖ＣＤＲ１、２、および３とを含む）と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、（ｉｉ）第２の抗体が、抗体ｃｄ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３０、および３１にそれぞれ記載の重鎖ＣＤＲ１、２、および３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、５４、および５５にそれぞれ記載の軽鎖ＣＤＲ１、２、および３とを含む）と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、（ｉｉｉ）第３の抗体が、抗体ｃｈ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、２４、および２６にそれぞれ記載の重鎖ＣＤＲ１、２、および３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、４０、および４２にそれぞれ記載の軽鎖ＣＤＲ１、２、および３とを含む）と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合する、組成物が提供される。抗体ｃａ、ｃｄ、およびｃｈのトリオの組み合わせはまた、表４に記載の抗体トリオ４ｃとして本明細書に記載される。
【００３４】
下の表６および表７において、ＣＤＲのアミノ酸配列は、各列の対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯのすぐ上に記載され、対応する完全重鎖または軽鎖可変配列は、左側の列の上行にＳＥＱ ＩＤ ＮＯで示される。
【００３５】
【表６】
2013533211.tif 000008
【００３６】
【表７】
2013533211.tif 000009
【００３７】
企図される組成物は、追加の治療薬、例えば、追加の抗癌剤との併用療法における薬物としての使用をさらに含んでもよいか、または該使用のために調製される。「抗癌剤」は、腫瘍、癌、悪性腫瘍等を治療するために使用される薬剤である。薬物療法（例えば、本明細書に開示される抗体組成物を用いた）は、他の治療を伴わずに、または手術、温熱療法、もしくは放射線療法（例えば、電離放射線を伴う）等の他の治療と組み合わせて、施行することができる。関与する器官または組織の性質に応じて、いくつかのクラスの抗癌剤が癌治療に使用されてもよい。例えば、乳癌は、一般にエストロゲンによって刺激され、性ホルモンを不活性化する薬剤を用いて治療することができる。同様に、前立腺癌は、アンドロゲンを不活性化する薬剤を用いて治療することができる。本明細書に開示される抗体組成物との組み合わせにおける使用のための抗癌剤は、とりわけ、付表Ａに列挙するものを含むが、それらは限定的であると解釈されるべきではない。１つ以上の抗癌剤が、同時に、または本明細書に開示される抗体組成物の投与前もしくは投与後に投与されてもよい。本明細書に開示される抗体組成物は、順次に、または追加の抗癌剤、例えば、下の付表Ａに開示される抗癌剤と同時に投与することができる。
【００３８】
また、特定の抗体の組み合わせを選択するための方法も提供される。一実施形態において、そのような方法は、ＥＧＦＲの活性または機能に対して特定のＩＣ５０および／またはＩＣ９０（例えば、ＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達を阻害するための８０ｎＭよりも良好なＩＣ９０、例えば、７０ｎＭまたはそれよりも低いＩＣ９０）を有する抗ＥＧＦＲ抗体を選択することを含む。次いで、そのような抗体を、併用して（例えば、一緒に）または順次に投与することができる。別の実施形態において、方法は、ＥＧＦＲへの結合について互いに競合しない抗体の組み合わせをさらに選択するステップを含む。追加の選択基準は、以下の特性のうちの少なくとも１つを含む：
（ｉ）インビボでの、異種移植片モデルにおけるＥＧＦＲを発現する細胞の増殖の阻害、
（ｉｉ）インビトロでの、ＥＧＦＲリガンドのＥＧＦＲへの結合の阻害、
（ｉｉｉ）インビトロでの、ＥＧＦＲの二量体化の阻害、または
（ｉｖ）インビトロでの、細胞表面におけるＥＧＦＲの下方制御。
【００３９】
また、任意選択的に、単一バイアル中に収容され、かつ／または、ＥＧＦＲと関連する疾患、例えば癌の治療もしくは診断における使用のための指示を含む、本明細書に開示される１つ以上の抗体または組成物を含むキットも企図される。そのようなキットは、単一用量バイアルまたは単一用量の予め充填した注射器等の単一剤形で抗体組成物を含んでもよい。
【００４０】
本明細書に開示される抗体および組成物は、多種多様な治療および診断用途、特に腫瘍学的用途において使用することができる。したがって、別の態様において、本明細書に記載される１つ以上の抗体または組成物を、ＥＧＦＲ媒介性活性を阻害するのに十分な量で投与することによって対象におけるＥＧＦＲ活性を阻害するための方法が、本明細書に提供される。治療することができる特定の治療適応は、例えば、皮膚、脳および中枢神経系、頭頸部、食道、胃、結腸、直腸、肛門、肝臓、膵臓、胆管、胆嚢、肺もしくは気管支、乳房、卵巣、子宮、子宮頸部、膣、睾丸、生殖細胞、前立腺、腎臓、尿管、膀胱、副腎、下垂体、甲状腺、骨、筋肉もしくは他の結合組織等の、器官または組織の癌、白血病、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫を含む。
【００４１】
また、本明細書に開示される抗体は、例えば、明細書に開示される１つ以上の抗体、抗体ペア、または抗体トリオを（例えば、エクスビボまたはインビボで）対象由来の細胞と接触させ、細胞上のＥＧＦＲへの結合レベルを測定することによって、ＥＧＦＲと関連する疾患（例えば、癌）の診断または予後予測のために使用することができ、ＥＧＦＲへの異常に高い結合レベルは、該対象がＥＧＦＲと関連する癌を有することを示唆する。
【００４２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を構成する重鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。ＦＲ３の末端からＪＨ領域の開始部まで及ぶ配列は、ＣＤＲ３を含む。重鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図２】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を構成する重鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。ＦＲ３の末端からＪＨ領域の開始部まで及ぶ配列は、ＣＤＲ３を含む。重鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図３】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９を構成する重鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。ＦＲ３の末端からＪＨ領域の開始部まで及ぶ配列は、ＣＤＲ３を含む。重鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図４】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９を構成する重鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。ＦＲ３の末端からＪＨ領域の開始部まで及ぶ配列は、ＣＤＲ３を含む。重鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図５】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１を構成する重鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。ＦＲ３の末端からＪＨ領域の開始部まで及ぶ配列は、ＣＤＲ３を含む。重鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図６】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１を構成する重鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。ＦＲ３の末端からＪＨ領域の開始部まで及ぶ配列は、ＣＤＲ３を含む。重鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図７】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４を構成する軽鎖可変領域（Ｖκ）のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図８】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図９】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図１０】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図１１】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図１２】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図１３】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６を構成する軽鎖可変のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図１４】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図１５】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＩＭＧＴデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図１６】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を構成する軽鎖可変領域のアミノ酸配列。配列は、ＶｂａｓｅデータベースによるＣＤＲの位置を示すように区切られている。軽鎖定常領域のアミノ酸配列も記載されている。
【図１７】図１７Ａ〜Ｄ：直接ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴による抗ＥＧＦＲ抗体のエピトープマッピング。図１７Ａ〜１７Ｃは、野生型（図１７Ａ）、ビン１エピトープ変異体（図１７Ｂ）、またはビン３エピトープ変異体（図１７Ｃ）のＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ）を捕捉試薬として用いたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。Ｘ軸は、抗体の濃度を示し、Ｙ軸は、相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図１７Ｄは、ビン１、２、および３の抗体が、異なる非重複エピトープを有するＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合することを示す表面プラズモン共鳴アッセイの結果である。抗体ｃｈ（ビン３）を、ＢＩＡＣＯＲＥチップの表面に結合させた。野生型ＥＧＦＲ−ＥＣＤ（０．５μＭ）の注入後、抗体ｃｄ（ビン２）、ｃｂ（ビン１）を連続的に注入し、対照として、チップに結合させたのと同じ抗体であるｃｈ（ビン３）を注入した。その結果を、Ｘ軸が時間（秒）を示し、Ｙ軸がＢＩＡＣＯＲＥ応答単位（ＲＵ）を示すセンサーグラムとして表す。
【図１８】図１８Ａ〜Ｃ：非重複エピトープの２つの抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせによるホスホ−ＥＲＫシグナル伝達の阻害。示した等モル濃度のビン１＋ビン３（図１８Ａおよび１８Ｂ）またはビン１＋ビン２の抗体（図１８Ｃ）の組み合わせとともにＡ４３１細胞を２時間インキュベートし、細胞溶解物をホスホ−ＥＲＫのＥＬＩＳＡによって分析した。Ｘ軸は、抗体の濃度を示し、Ｙ軸は、＋ＥＧＦリガンド対照に観察される大きさに対して正規化されたホスホ−ＥＲＫの活性の大きさを示す。実線は、各組み合わせからのデータに対する５パラメータロジスティック当てはめを表す。各グラフの下の表は、データに当てはめるように用いられたロジスティック関数から計算した、各組み合わせの効力（抗体の飽和濃度でのホスホ−ＥＲＫの活性比）、ＩＣ５０値、およびＩＣ９０値を含む。
【図１９】図１９Ａ〜Ｂ：非重複エピトープの２つまたは３つの抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせによるホスホ−ＥＲＫシグナル伝達の阻害。等モル濃度の３つのビン１、ビン２、およびビン３の抗体（図１９Ａ）の組み合わせを用いてＡ４３１細胞を処理した。次いで、抗体（ビン１）およびｃｄ（ビン２）の２つ組の組み合わせを既知の抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブと比較したところ（図１９Ｂ）、当該技術分野において既知であるこの抗体よりもホスホ−ＥＲＫを減少させるのにより効果的であることが示された。実験を行い、そのデータを図１８として図示する。
【図２０】図２０Ａ〜Ｄ：非重複エピトープの２つの抗ＥＧＦＲ抗体の等モル濃度および非等モル濃度の組み合わせによるホスホ−ＥＲＫシグナル伝達の阻害。異なる比率（μｇ／ｍＬ）の抗体ペアｃｂおよびｃｄ（図２０Ａ）、ｃｂおよびｃｈ（図２０Ｂ）、ｃｂおよびｃｉ（図２０Ｃ）、ならびにｃａおよびｃｄ（図２０Ｄ）を用いてＡ４３１細胞を処理した。実験を行い、そのデータを図１８として図示する。
【図２１】図２０Ａ〜Ｄのホスホ−ＥＲＫシグナル伝達の阻害データをヒートマップに表す：Ｘ軸（列）は、抗体の濃度を示し、Ｙ軸（行）は、示す比率で組み合わせた抗体のペアを示し、Ｚ軸（平面内）は、ホスホ−ＥＲＫの活性比をグレースケールで示す。Ｚ軸のカラーマップは、高いホスホ−ＥＲＫ活性を白色で、低い活性を黒色で表し、そして中間的な活性を灰色の色調で表す。試料の値は、それらが分析されるＥＬＩＳＡプレート上の＋ＥＧＦリガンド対照の平均値に対して独立して正規化し、全プレートにわたるＥＧＦリガンド対照（＋／−）の平均値を左上に示す。
【図２２】図２２Ａ〜Ｃ：単一によるおよびビン１＋ビン２またはビン１＋ビン３の抗体のペアの組み合わせによるホスホ−ＥＧＦ受容体およびホスホ−ＥＲＫのシグナル伝達の阻害、ならびにセツキシマブ、ニモツズマブ、およびザルツムマブ等の他の既知の抗ＥＧＦＲ抗体との比較。図２２Ａは、ビン１／２の抗体ｃｂおよびｃｄによるＥＲＫ活性の阻害を示す。図２２Ｂは、ビン１／２の抗体およびｃｄによるＥＧＦＲ活性の阻害を示す。図２２Ｃは、ビン１／３の抗体ｃｂおよびｃｈによるＥＲＫ活性の阻害を示す。実験を行い、そのデータを図１８として図示する。
【図２３】図２３Ａ〜Ｄ：ＥＧＦありまたはなしで、ビン１／ビン２／ビン３のｍＡｂペアまたはトリオで処理した細胞のＣＴＧ発光細胞生存率アッセイの結果を示す４つのグラフである。図２３Ａは、ビン１／３の抗体ｃａおよびｃｈで処理したＨ１９７５細胞のＣＴＧアッセイの結果を示す。図２３Ｂは、ビン１／２の抗体ｃａおよびｃｄで処理したＨ１９７５細胞のＣＴＧアッセイの結果を示す。図２３Ｃ（Ｈ１９７５細胞）および２３Ｄ（Ａ４３１細胞）は、ビン１／２／３の抗体トリオｃａ＋ｃｄ＋ｃｈで処理した細胞のＣＴＧアッセイの結果を示す。対照は、１％ウシ胎仔血清（１％ＦＣＳ）を含む培地で処理した細胞および無血清培地（ＳＦＭ）で処理した細胞を含む。
【図２４】図２４Ａ〜Ｂ：類表皮腫瘍細胞株Ａ４３１（図２４Ａ）およびＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）腫瘍細胞株Ｈ１９７５（図２４Ｂ）を用いたマウス異種移植片腫瘍モデルにおける、抗体ｃｂと、抗体ｃａ＋ｃｄまたはｃｂ＋ｃｈまたはｃａ＋ｃｈのペアによる腫瘍増殖の阻害を示す２つのグラフである。Ｘ軸は、移植後の日数を表し、Ｙ軸は、腫瘍サイズをｍｍ３で表す。
【図２５】セツキシマブまたはＥＧＦリガンド単独と比較した、抗体ｃａ、ｃｆ、ｃｈ、またはｃｂ単独（２μＭの濃度）によるＡ４３１細胞に結合するビオチン化ＥＧＦリガンドの阻害を示すフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析の結果のグラフである。Ｙ軸は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、Ｘ軸は、ビオチン化ヒトＥＧＦリガンドの様々な濃度（ｎＭ）を示す。抗体ｃｈは、ＥＧＦ結合のある程度の阻害を示し、抗体ｃｆは、ＥＧＦ濃度２０ｎＭまでＥＧＦ結合の本質的に完全な阻害を示し、ｃａおよびｃｂは、ＥＧＦ濃度２００ｎＭまでＥＧＦ結合の本質的に完全な阻害を示した。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
詳細な説明
Ｉ．定義
「ＥＧＦＲ」、「ＥｒｂＢ１」、および「ＥＧＦ受容体」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、ヒトＥＧＦＲタンパク質（「ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ００５３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）を参照）を指す。
【００４５】
本明細書で使用される「阻害」という用語は、活性の完全阻止を含む、生物学的活性のあらゆる統計的に有意な減少を指す。例えば、「阻害」は、生物学的活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または約１００％の統計的に有意な減少を指すことができる。
【００４６】
リン酸化の阻害は、本明細書で使用される場合、抗体の非存在下（対照）でのシグナル伝達と比較して、抗体が基質タンパク質のリン酸化を統計的に有意に減少させる能力を指す。当該技術分野において知られているように、細胞内シグナル伝達経路は、例えば、ホスホイノシチド３′−キナーゼ／Ａｋｔ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＰＴＥＮもしくは「ＡＫＴ」）および／またはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫもしくは「ＥＲＫ」）経路を含む。当該技術分野において知られているように、ＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達は、基質のリン酸化のレベル（例えば、ＡＫＴおよび／もしくはＥＲＫのリン酸化または非リン酸化）をアッセイすることによって測定することができる。したがって、一実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせおよび組成物は、そのような抗体の非存在下（対照）におけるＡＫＴおよび／またはＥＲＫのリン酸化レベルと比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または約１００％のＡＫＴおよびＥＲＫのいずれかまたは両方のリン酸化レベルの統計的に有意な阻害を提供する。そのようなＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達は、ＥＧＦＲが関与する細胞カスケードのタンパク質を測定する当該技術分野で認識されている技術、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、または多重法（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）等）を用いて測定することができる。
【００４７】
「ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖の阻害」という句は、本明細書で使用される場合、インビボまたはインビトロのいずれかで、抗体の非存在下（対照）における細胞の増殖と比較して、抗体がＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を統計的に有意に減少させる能力を指す。一実施形態において、細胞を本明細書に開示される組み合わせの抗体組成物に接触させると、ＥＧＦＲを発現する細胞（例えば、癌細胞）の増殖は、組み合わせの抗体組成物の非存在下（対照）で測定される増殖と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または約１００％減少させることができる。細胞増殖は、細胞分化の速度、細胞分化中の細胞集団における細胞の割合、および／または最終分化もしくは細胞死に起因する細胞集団からの細胞消失の速度を測定する（例えば、細胞力価増殖アッセイまたはチミジン取り込みを用いて）当該技術分野で認識されている技術を用いてアッセイすることができる。
【００４８】
「ＥＧＦＲへのＥＧＦＲリガンド結合の阻害」という句は、本明細書で使用される場合、抗体の非存在下（対照）におけるＥＧＦＲリガンド結合と比較して、抗体が、ＥＧＦＲリガンドのその受容体、ＥＧＦＲへの結合を統計的に有意に減少させる能力を指す。このことは、抗体の存在下において、対照（抗体を含まない）と比較して、ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲリガンドの量が統計的に有意に減少されることを意味する。ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲリガンドの量は、本明細書に開示される抗体組成物または組み合わせの存在下において、抗体の非存在下（対照）における量と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または約１００％減少させることができる。ＥＧＦＲリガンド結合の減少は、抗体の存在下または非存在下（対照）において、標識されたＥＧＦＲリガンド（例えば、放射標識したＥＧＦまたは放射標識したベータセルリン）とＥＧＦＲを発現する細胞との結合レベルを測定する当該技術分野で認識されている技術を用いて測定することができる。
【００４９】
「ＥＧＦＲの二量体化の阻害」という句は、本明細書で使用される場合、抗体の非存在下（対照）におけるＥＧＦＲの二量体化と比較して、抗体がＥＧＦＲの二量体化（ホモ二量体、例えばＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ１のペア、またはヘテロ二量体、例えばＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３のペアを形成するための別のＥｒｂＢ受容体との対形成）を統計的に有意に減少させる能力を指す。一実施形態において、ＥＧＦＲを発現する細胞を本明細書に開示される抗体組成物または組み合わせに接触させると、ＥＧＦＲの二量体化は、抗体の非存在下（対照）で測定されるＥＧＦＲの二量体化と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または約１００％減少させることができる。ＥＧＦＲの二量体化の減少は、抗体の存在下または非存在下（対照）においてＥＧＦＲの二量体化のレベルを測定する当該技術分野で認識されている技術を用いて測定することができる。
【００５０】
「ＥＧＦＲ発現の下方制御」という句は、本明細書で使用される場合、例えば、抗体の非存在下（対照）におけるＥＧＦＲ発現と比較してＥＧＦＲの内部移行を増加させることによって、抗体が細胞表面におけるＥＧＦＲの発現を統計的に有意に減少させる能力を指す。一実施形態において、ＥＧＦＲを発現する細胞を本明細書に開示される組み合わせの抗体組成物に接触させると、ＥＧＦＲの発現は、抗体の非存在下（対照）で測定される細胞表面におけるＥＧＦＲの発現と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または約１００％減少させることができる。細胞表面におけるＥＧＦＲの発現の下方制御は、例えば、受容体の内部移行／再循環の増加、および／または受容体の内部移行／分解の増加を含む。ＥＧＦＲ内部移行の増加は、抗体の存在下または非存在下（対照）においてＥＧＦＲ内部移行のレベルを測定する当該技術分野で認識されている技術を用いて測定することができる。
【００５１】
ＥＧＦＲ抗体の組み合わせ（本明細書に記載される）に関して、「相加的」または「相加性」という語は、本明細書で使用される場合、それらの合わせた活性（特定の機能、例えば、細胞増殖の阻害に関する）がそれらの個々の活性の和に等しい２つ以上の抗体の活性を指す。すなわち、本明細書に提供される２つ以上の抗体の活性（ＥＧＦＲを発現する細胞上で個別に作用する場合）の和は、同じ細胞上で一緒に作用する同じ抗体の合わせた効果とほぼ等しいということである。一実施形態において、相加的効果は、上記特性のうちのいずれかに関して測定される（例えば、ＡＫＴまたはＥＲＫのリン酸化の阻害、ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖の阻害等）。
【００５２】
「相乗作用」または「相乗的」という語は、本明細書で使用される場合、それらの合わせた活性（特定の機能、例えば、細胞増殖の阻害に関する）がそれらの個々の活性の予測される相加的効果よりも大きい２つ以上の抗体の活性を指す。例えば、予測される相加的効果は、Ｂｌｉｓｓ非依存性基準（Ｂｌｉｓｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）に従って定義することができる。Ｂｌｉｓｓ基準によれば、２つ以上の薬剤（例えば、抗体）の効果は、個々の薬剤の効果の和から個々の薬剤の効果の積を差し引いたものに等しい。
Ｅ１２＝Ｅ１＋Ｅ２−Ｅ１＊Ｅ２
式中、Ｅ１は薬剤１による阻害率（％）、Ｅ２は薬剤２による阻害率（％）、Ｅ１２は、この組み合わせによって予測される阻害率（％）である。
【００５３】
相乗効果は、本明細書で論じられる特性のうちのいずれにも適用することができる（例えば、ＥＧＦＲ非依存性ＡＫＴまたはＥＲＫリン酸化の阻害、ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖の阻害等）。特定の実施形態において、それらの個々の活性の相加的効果と比較して、合わせた抗体の活性における少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、またはそれより高い増加が達成される。
【００５４】
本明細書において交換可能に使用される「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、全抗体およびその任意の抗原結合断片（抗原結合部分）または一本鎖の同族を含む。「抗体」は、少なくとも１つの重（Ｈ）鎖および１つの軽（Ｌ）鎖を含む。例えば、自然に生じるＩｇＧにおいては、これらの重鎖および軽鎖は、ジスフィルド結合によって相互接続され、２対の重鎖および軽鎖が存在し、これら２つもジスフィルド結合によって相互接続される。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、ＣＬという１つのドメインからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）または連結（Ｊ）領域（それぞれ重鎖および軽鎖においてＪＨまたはＪＬ）と称される保存性のより高い領域とともに散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域にさらに細分化され得る。各ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、Ｊの順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される３つのＣＤＲ、３つのＦＲ、および１つのＪドメインから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原に結合する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）または古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）等の体液性因子を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。したがって抗原（例えば、ＥＧＦＲ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片が、本明細書に開示される組み合わせに用いられてもよい。完全長抗体の断片は、抗体の抗原結合機能を行うことができることが示されている。抗体の抗原結合部分または断片と表記される結合断片の例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインを含む一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスフィルド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ'）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の１つのアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨおよびＶＬドメインを含むｄＡｂ、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６）、（ｖｉｉ）ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂ、ならびに（ｖｉｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または（ｉｘ）合成リンカーによって任意選択的に連結され得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせが挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、ＶＬおよびＶＨ領域が対を形成して一価分子を形成する単一タンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる免疫グロブリン断片の一本鎖の同族等）としてそれらを形成することができる合成リンカーを用いた組換え法によって、それらを連結させることができる。そのような一本鎖抗体も、「抗体」という用語に包含されることが意図される。抗体断片は、当業者に既知であ��コンビナトリアル技術を用いて得られ、断片は、インタクト抗体と同じ一般様式において実用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素切断もしくは化学切断によって生成することができる。
【００５５】
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、微量で存在し得る自然に生じる可能性がある変異を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一である抗体を指す。そのような免疫グロブリンの抗原結合断片（ｓｃＦｖを含む）も、本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語に包含される。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原部位に対するものである。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対するものである。モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法、トランスジェニック動物、組換えＤＮＡ法等の任意の当該技術分野で認識されている技術および本明細書に記載される技術を用いて（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）、または、例えば、米国特許第７，３８８，０８８号および米国特許出願第０９／８５６，９０７号（ＰＣＴ国際公開公報第００／３１２４６号）に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーを使用して調製することができる。モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体を含み、自然に生じ得るか、または組換えによって生成することができる。
【００５６】
「組換え抗体」という用語は、（ａ）免疫グロブリン遺伝子（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）についてトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）、またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から（例えば、トランスフェクトーマから）単離された抗体、（ｃ）ファージディスプレイを用いて組換えコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト抗体配列を含む）から単離された抗体、および（ｄ）他のＤＮＡ配列への免疫グロブリン遺伝子配列（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）のスプライシングを伴う任意の他の手段によって、調製、発現、作製、または単離された抗体等の、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体を指す。そのような組換え抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有し得る。しかしながら、ある特定の実施形態において、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発に供され得、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来しかつ関連があるが、インビボではヒト抗体生殖系列のレパートリー内に天然には存在しない場合がある配列である。
【００５７】
「キメラ免疫グロブリン」またはキメラ抗体という用語は、その可変領域が第１の種に由来し、その定常領域が第２の種に由来する免疫グロブリンまたは抗体を指す。キメラ免疫グロブリンまたは抗体は、例えば遺伝子操作によって、異なる種に属する免疫グロブリンの遺伝子セグメントから構築することができる。
【００５８】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、Ｋａｂａｔらによって記載されるような、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する対応する可変領域を有する抗体を含むことが意図される（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）。さらに、抗体が定常領域を含む場合、その定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的な変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含んでもよい。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で用いられる場合、マウス等の別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列上にグラフトされている抗体を含むことは意図されない。
【００５９】
ヒト抗体は、アミノ酸残基、例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされない活性を増強させるアミノ酸残基で置換された少なくとも１つ以上のアミノ酸を有し得る。典型的には、ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の一部ではないアミノ酸残基で置換された２０個までの位置を有することができる。特定の実施形態において、これらの置換は、以下に詳述するようにＣＤＲ領域内に存在する。
【００６０】
「ヒト化抗体」という用語は、少なくとも１つのヒト化抗体鎖（すなわち、少なくとも１つのヒト化軽鎖または重鎖）を含む抗体を指す。「ヒト化抗体鎖」（すなわち、「ヒト化免疫グロブリン軽鎖」）という用語は、ヒト抗体に実質的に由来する可変フレームワーク領域と、非ヒト抗体に実質的に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ、２つのＣＤＲ、または３つのＣＤＲ）とを含む可変領域を有し、かつ定常領域（例えば、軽鎖の場合は１つの定常領域またはその一部、および重鎖の場合は好ましくは３つの定常領域）をさらに含む抗体鎖（すなわち、それぞれ軽鎖または重鎖）を指す。
【００６１】
「単離された」とは、本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない、抗体または２つ、３つ、もしくは４つの抗体の組み合わせを指すことが意図される（例えば、各々がＥＧＦＲと特異的に結合する抗体ｃａ、ｃｆ、およびｃｈの単離された組成物は、他のＥＧＦＲ以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離された抗体は、典型的には他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない。本発明の一実施形態において、異なるＥＧＦＲ結合特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせが、明確に定義された組成物中に組み合わされる。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるモノクローナル抗体組成物は、ＩｇＧ１アイソタイプの抗体のみを含む。他の実施形態において、本明細書に提供されるモノクローナル抗体組成物は、ＩｇＧ２アイソタイプの抗体のみを含む。他の実施形態において、本明細書に提供されるモノクローナル抗体組成物は、２つまたは３つの異なるアイソタイプの抗体を含む。
【００６３】
「抗原」は、抗体が結合する実体（例えば、タンパク質性実体またはペプチド）である。本発明の種々の実施形態において、抗原は、ＥＧＦである。本発明に従う特定の実施形態において、抗原はヒトＥＧＦＲである。
【００６４】
したがって、本明細書に記載される組み合わせの特定の抗体によって認識されるエピトープの全てまたは一部を含むＥＧＦＲ上のエピトープに結合する抗体の組み合わせも、本発明の開示に包含される。別の実施形態において、ＥＧＦＲへの結合について本明細書に記載される抗体と競合する抗体が提供される。競合する抗体および同じエピトープまたは重複するエピトープを認識する抗体は、例えば、標的抗原への別の抗体の結合を阻止する１つの抗体の能力を示すことによる免疫アッセイ、すなわち、競合結合アッセイ等の日常的技術を用いて同定することができる。競合結合は、下の実施例に記載されるアッセイを用いて測定することができる。
【００６５】
「特異的結合」、「特異的に結合する」、「選択的結合」、および「選択的に結合する」という用語は、抗体が特定の抗原またはエピトープに対してはっきりと認識できる親和性を示し、一般に、他の抗原およびエピトープとは有意な交差反応を示さないことを意味する。「はっきりと認識できる」または好ましい結合は、１０６、１０７、１０８、１０９、もしくは１０１０Ｍ−１またはそれよりも良好なＫＤを有する結合を含む。抗体抗原の相互作用のＫＤ（親和性定数）は、抗体および抗原分子の５０％がともに結合する抗体の濃度を意味する。したがって、好適な固定の抗原濃度では、より高い（すなわち、より強い）親和性の抗体の５０％は、より親和性の低い抗体と同じ割合の結合を達成するために必要とされる抗体濃度よりも低い抗体濃度で、抗原分子に結合する。したがって、より低いＫＤ値は、より高い（より強い）親和性を意味する。本明細書で用いられる場合、「より良好な」親和性は、より強い親和性であり、それらの比較対象よりも数値が低く、ＫＤ１０７Ｍ−１は、ＫＤ１０６Ｍ−１より低い数値であり、したがってより良好な親和性を示す。１０７Ｍ−１よりも良好な（すなわち、より低いＫＤ値を有し、したがってより強い）親和性、好ましくは１０８Ｍ−１よりも低い親和性が一般に好ましい。本明細書に記載される値の中間の値も企図され、好ましい結合親和性は親和性の範囲として示すことができ、例えば、本明細書に開示される抗ＥＧＦＲ抗体に対する好ましい結合親和性は、１０６〜１０１２Ｍ−１、好ましくは１０７〜１０１２Ｍ−１、より好ましくは１０８〜１０１２Ｍ−１である。「有意な交差反応を示さない」抗体は、標的ではない抗原（例えば、非ＥＧＦＲタンパク質）に対してはっきりと認識できるようには結合しない抗体である。例えば、一実施形態において、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体は、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）以外のＥｒｂＢ分子または非ＥｒｂＢタンパク質またはペプチドに対してよりも、ＥＧＦＲに対して、少なくとも２桁、好ましくは３桁または４桁以上より良好な結合（すなわち、２桁、３桁、または４桁以上低いＫＤ値を示す結合）を示す。特異的または選択的結合は、そのような結合を測定するための任意の当該技術分野において認識されている手段に従って、例えば、スキャッチャード解析および／または本明細書に記載される競合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）（競合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ））結合アッセイに従って、測定することができる。
【００６６】
「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数、または抗原に対する抗体の親和性を指すことが意図される。一実施形態において、本発明に従う抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイ、細胞結合アッセイ、または平衡透析アッセイによって測定した場合、１００ｎＭまたはそれよりも良好な（すなわち、低い）親和性（ＫＤ）（例えば、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、もしくは１０ｎＭまたはそれ未満）で抗原（例えば、ＥＧＦＲ）に結合する。特定の実施形態において、抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイにより測定した場合、８ｎＭまたはそれよりも良好な（例えば、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ、１．４ｎＭ、１．３ｎＭ、１．２ｎＭ、１．１ｎＭ、１ｎＭまたはそれよりも低い）親和性（解離定数ＫＤによって表される）でＥＧＦＲに結合する。他の実施形態において、抗体は、分析物として組換えＥＧＦＲ、リガンドとして抗体を使用したＢＩＡＣＯＲＥ３０００機器における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって測定した場合、１０−７Ｍ未満、例えば、およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ未満またはさらにそれよりも低い親和性（ＫＤ）で抗原（例えば、ＥＧＦＲ）に結合し、所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合の親和性よりも少なくとも２倍高い親和性で、所定の抗原に結合する。ＫＤを測定するための他の方法は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によるかまたはＫｉｎＥｘＡ（登録商標）技術を用いた溶液中での、ＥＧＦＲを発現する生細胞への平衡結合を含む。
【００６７】
「Ｋｏｆｆ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体／抗原複合体からの抗体の解離のオフ速度定数を指すことが意図される。
【００６８】
「ＩＣ５０」および「ＩＣ９０」という用語は、本明細書で使用される場合、生物学的または生化学的な機能（例えば、ＥＧＦＲの機能または活性）をそれぞれ５０％および９０％阻害する際の化合物（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体）の有効性の尺度を指す。例えば、ＩＣ５０は、ＥＧＦＲの活性（例えば、ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖）を半分に阻害するためにどれくらい多くの抗ＥＧＦＲ抗体が必要であるかを意味する。すなわち、これは、抗ＥＧＦＲ抗体の半数（５０％）阻害濃度（ＩＣ）（５０％ＩＣ、またはＩＣ５０）である。ＦＤＡによれば、ＩＣ５０は、インビトロで５０％の阻害に必要な薬剤の濃度を表す。ＩＣ５０およびＩＣ９０は、当該技術分野で既知の技術によって、例えば、用量反応曲線を構築し、異なる濃度のアンタゴニスト（すなわち、抗ＥＧＦＲ抗体）がＥＧＦＲ活性の逆転に与える影響を調べることによって、測定することができる。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「グリコシル化パターン」は、タンパク質、より具体的には免疫グロブリンタンパク質に共有結合される炭水化物単位のパターンとして定義される。
【００７０】
「核酸分子」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００７１】
「単離された核酸分子」という用語は、抗体または抗体断片（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関連して本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列が、他のゲノムヌクレオチド配列（例えば、ＥＧＦＲ以外の抗原に結合する抗体をコードするもの。ここで、他の配列は、天然ではヒトゲノムＤＮＡの該核酸に隣接していてもよい）を本質的に含まない、核酸分子を指すことが意図される。
【００７２】
「改変すること」または「改変」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体またはその抗原結合部分において１つ以上のアミノ酸を変化させることを指すことが意図される。変化は、１つ以上の位置でアミノ酸を付加、置換、または欠失させることによって生じさせることができる。変化は、ＰＣＲ変異誘発等の既知の技術を用いて生じさせることができる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の方法を用いて同定された抗体またはその抗原結合部分を改変することができ、それによって、ＥＧＦＲに対する抗体またはその抗原結合部分の結合親和性を改変することができる。
【００７３】
抗体の配列における「保存的アミノ酸置換」、すなわち、ヌクレオチド配列によってコードされるかまたはアミノ酸配列を含む抗体の、抗原すなわちＥＧＦＲへの結合を無効にしない、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の改変が提供される。保存的アミノ酸置換は、あるクラスのアミノ酸の、同じクラスのアミノ酸による置換を含み、クラスは、例えば、標準的なデイホフ頻度交換マトリクスまたはＢＬＯＳＵＭマトリクスによって測定した場合に自然に見出される、相同なタンパク質に共通の物理化学的なアミノ酸側鎖特性および高い置換頻度によって定義される。アミノ酸側鎖の６つの一般的なクラスが分類されており、それは、クラスＩ（Ｃｙｓ）、クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）、クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）、クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）、およびクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）を含む。例えば、ＡｓｐからＡｓｎ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕ等のクラスＩＩＩの別の残基への置換は、保存的置換である。よって、抗ＥＧＦＲ抗体において予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じクラスの別のアミノ酸残基で置換される。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該技術分野において周知である。
【００７４】
「非保存的アミノ酸置換」という用語は、あるクラスのアミノ酸の、別のクラスのアミノ酸による置換を指し、例えば、クラスＩＩ残基Ａｌａの、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎ等のクラスＩＩＩ残基による置換が挙げられる。
【００７５】
代替として、別の実施形態において、変異（保存的または非保存的）は、飽和変異誘発によって等、抗ＥＧＦＲ抗体をコードする配列の全部または一部に沿って無作為に導入することができ、結果として生じる改変された抗ＥＧＦＲ抗体は、結合活性についてスクリーニングすることができる。
【００７６】
「コンセンサス配列」は、関連する配列のファミリーにおいて最も頻繁に発生するアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列である。タンパク質のファミリーにおいて、コンセンサス配列中の各位置は、ファミリーの中で最も頻繁にその位置で発生するアミノ酸によって占有される。２つのアミノ酸が等しい頻度で発生する場合、いずれかをコンセンサス配列に含むことができる。免疫グロブリンの「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列のフレームワーク領域を指す。同様に、ＣＤＲに対するコンセンサス配列は、本発明のＥＧＦＲ抗体のＣＤＲアミノ酸配列の最適なアライメントによって誘導することができる。
【００７７】
核酸に関して、「実質的な相同性」という用語は、２つの核酸、またはその指定された配列が、最適に整列させて比較したときに、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を有し、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常、ヌクレオチドの少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは少なくとも約９８％〜９９．５％が同一であることを意味する。代替として、実質的な相同性は、セグメントが、鎖の相補体に対して選択的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合に存在する。
【００７８】
核酸は、全細胞、細胞溶解物、または部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当該技術分野において周知である他の技術を含む標準的な技術によって、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞の核酸またはタンパク質から切り離して精製された場合に、「単離されている」かまたは「実質的に純粋である」。
【００７９】
核酸組成物は、ｃＤＮＡ、ゲノム、またはそれらの混合物のいずれかに由来する天然の配列（改変された制限部位等を除く）を含んでいることが多いが、あるいは、変更された遺伝子配列を提供するための標準的な技術に従って変異させることができる。コード配列については、これらの変異は、コードされたアミノ酸配列を所望の通りに改変することができる。具体的には、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチ、および本明細書に記載される他のそのような配列と実質的に相同であるＤＮＡ配列が企図される。
【００８０】
「機能的に連結された」という用語は、別の核酸配列と機能的な関係で配置された核酸配列を指す。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、それはポリペプチドのＤＮＡと機能的に連結されており、プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響を与える場合、それはコード配列と機能的に連結されており、またはリボソーム結合部位が翻訳を促進するように配置される場合、それはコード配列と機能的に連結されている。一般的に、「機能的に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が隣接していること、分泌リーダーの場合は、隣接し、かつリーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接していなくてもよい。連結は、都合のよい制限部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の実践法に従って用いられる。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係で配置されたときに「機能的に連結されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響を与える場合、それはコード配列と機能的に連結されている。転写制御配列に関して、機能的に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、２つのタンパク質のコード領域を結合させることが必要な場合は、隣接しかつリーディングフレームにあることを意味する。スイッチ配列の場合、機能的に連結しているとは、配列がスイッチ組換えをもたらすことができることを意味する。
【００８１】
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、そこに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。ベクターの一種は「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得る。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入される際に宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよく、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、そこに機能的に連結されている遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用性のある発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。「プラスミド」および「ベクター」という用語は、互換可能に用いられ得る。しかしながら、同等の機能を供給するウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）等の、他の形態の発現ベクターも企図される。
【００８２】
「組換え宿主細胞」（または、単に「宿主細胞」）という用語は、本明細書で使用される場合、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すことが意図される。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことを理解されたい。特定の改変は、変異または環境的影響のいずれかに起因して後続世代において発生する場合があるため、このような子孫は、実際には親細胞と同一でなくてもよいが、それでもなお、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【００８３】
「治療する」、「治療すること」、および「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載される治療的または予防的な手段を指す。「治療」の方法は、例えば、疾患もしくは障害または再発性の疾患もしくは障害の１つ以上の症状を予防、治癒、遅延、重症度の軽減、または改善するために、あるいは、そのような治療の非存在下で予想される以上に対象の生存を延長するために、例えば、ＥＧＦＲ依存性シグナル伝達と関連する疾患もしくは障害を患っているか、またはそのような疾患もしくは障害に罹患し易い対象等の対象への、本明細書に開示される抗体または抗体のペアもしくはトリオの投与を用いる。
【００８４】
「ＥＧＦＲ依存性シグナル伝達と関連する疾患」または「ＥＧＦＲ依存性シグナル伝達と関連する障害」という用語は、本明細書で使用される場合、ＥＧＦＲレベルの上昇および／もしくはＥＧＦＲが関与する細胞カスケードの活性化が見られる病態および／または病態と関連する症状を含む。「ＥＧＦＲ依存性シグナル伝達と関連する疾患」という用語は、代替のＥＧＦＲシグナル経路の活性化と関連する病態および／または症状も含む。一般に、「ＥＧＦＲ依存性シグナル伝達と関連する疾患」という用語は、ＥＧＦＲの関与を必要とする任意の障害、発症、進行、または症状の持続を指す。例示的なＥＧＦＲ媒介性障害は、例えば、癌を含むが、これに限定されない。
【００８５】
「癌」および「癌性」という用語は、典型的には制御されない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは説明する。癌の例として、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられる。そのような癌のより具体的な例として、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫および神経線維腫症等のグリア細胞腫瘍、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、メラノーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、および種々の種類の頭頸部癌が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に開示される方法を用いて治療または診断される癌は、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、腎癌、消化管癌／結腸癌、肺癌、および前立腺癌から選択される。
【００８６】
「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、対象に投与されたときに、本明細書に記載されるようにＥＧＦＲ依存性シグナル伝達と関連する疾患の治療、予後予測、または診断を達成させるのに十分な、ＥＧＦＲに結合する抗体またはその抗原結合部分の量を指す。本明細書に提供される抗体の治療的に有効な量は、単独でまたは組み合わせて使用される場合、抗体および組み合わせの相対的な活性（例えば、細胞増殖の阻害における）、ならびに、治療を受ける対象および病態、対象の体重および年齢、病態の重症度、投与様式等に応じて変化し、それらは当業者によって容易に判定され得る。投与のための投与量は、例えば、約１ｎｇ〜約１０，０００ｍｇ、約５ｎｇ〜約９，５００ｍｇ、約１０ｎｇ〜約９，０００ｍｇ、約２０ｎｇ〜約８，５００ｍｇ、約３０ｎｇ〜約７，５００ｍｇ、約４０ｎｇ〜約７，０００ｍｇ、約５０ｎｇ〜約６，５００ｍｇ、約１００ｎｇ〜約６，０００ｍｇ、約２００ｎｇ〜約５，５００ｍｇ、約３００ｎｇ〜約５，０００ｍｇ、約４００ｎｇ〜約４，５００ｍｇ、約５００ｎｇ〜約４，０００ｍｇ、約１μｇ〜約３，５００ｍｇ、約５μｇ〜約３，０００ｍｇ、約１０μｇ〜約２，６００ｍｇ、約２０μｇ〜約２，５７５ｍｇ、約３０μｇ〜約２，５５０ｍｇ、約４０μｇ〜約２，５００ｍｇ、約５０μｇ〜約２，４７５ｍｇ、約１００μｇ〜約２，４５０ｍｇ、約２００μｇ〜約２，４２５ｍｇ、約３００μｇ〜約２，０００、約４００μｇ〜約１，１７５ｍｇ、約５００μｇ〜約１，１５０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１，１２５ｍｇ、約１ｍｇ〜約１，１００ｍｇ、約１．２５ｍｇ〜約１，０７５ｍｇ、約１．５ｍｇ〜約１，０５０ｍｇ、約２．０ｍｇ〜約１，０２５ｍｇ、約２．５ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約３．０ｍｇ〜約９７５ｍｇ、約３．５ｍｇ〜約９５０ｍｇ、約４．０ｍｇ〜約９２５ｍｇ、約４．５ｍｇ〜約９００ｍｇ、約５ｍｇ〜約８７５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約８２５ｍｇ、約３０ｍｇ〜約８００ｍｇ、約４０ｍｇ〜約７７５ｍｇ、約５０ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約７２５ｍｇ、約２００ｍｇ〜約７００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約６７５ｍｇ、約４００ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約５００ｍｇ、または約５２５ｍｇ〜約６２５ｍｇの抗体の範囲であり得る。投与計画は、最適な治療反応を提供するように調節されてもよい。また、有効量は、抗体の任意の毒性または有害な作用（すなわち、副作用）が最小限に抑えられ、かつ／または有益な効果が上回る量である。
【００８７】
「治療薬」という用語は、疾患もしくは障害の症状の重症度を減少させるかまたは阻害するか、あるいは疾患もしくは障害の無症状期間または症状軽減期間の頻度および／または長さを増加させるか、あるいは疾患もしくは障害の苦痛による機能障害または身体障害を阻害または予防するか、あるいは疾患もしくは障害の進行を阻害するかまたは遅延させるか、あるいは疾患もしくは障害の発症を阻害するかまたは遅延させるか、あるいは感染性の疾患もしくは障害の感染を阻害または予防する能力を有する、ありとあらゆる化合物を包含することが意図される。治療薬の非限定的な例として、有機低分子、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、組換え技術によって作られた生物製剤、ＲＮＡｉ化合物、チロシンキナーゼ阻害剤、および市販の抗体が挙げられる。特定の実施形態において、チロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、現在市販されている医薬品であるエルロチニブ、ゲフィチニブ、およびラパチニブのうちの１つ以上を含む。市販の薬学的な抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブおよびパニツムマブを含む。他の薬学的な抗ＥＧＦＲ抗体は、現在開発中であるザルツムマブ、ニモツズマブ、およびマツズマブを含む。
【００８８】
「患者」という用語は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物の対象を含む。
【００８９】
「対象」という用語は、任意の哺乳動物、例えば霊長類を含む。例えば、本明細書に開示される方法および組成物は、癌を有する対象を治療するために用いることができる。特定の実施形態において、対象はヒトである。
【００９０】
「試料」という用語は、患者または対象から採取した組織、体液、もしくは細胞（または上記のうちのいずれかの画分）を指す。通常、組織または細胞が患者から取り出されるが、インビボでの診断も企図される。固形腫瘍の場合、組織試料は、外科的に除去された腫瘍から採取することができ、従来技術によって検査のために調製することができる。リンパ腫および白血病の場合、リンパ球、白血病細胞、またはリンパ組織を得ることができ（例えば、血液から白血病細胞）、適切に調製することができる。尿、涙、血清、血漿、脳脊髄液、糞便、痰、細胞抽出物等を含む他の試料も、特定の腫瘍の場合には有用であり得る。
【００９１】
本開示の種々の態様を、以下の小節に詳述する。
【００９２】
ＩＩ．抗体を生成するための方法
（ｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術、Ｂリンパ球のウイルス性もしくは発癌性の形質転換、またはヒト抗体遺伝子のライブラリーを用いたファージディスプレイ技術等の様々な既知の技術を用いて生成することができる。特定の実施形態において、抗体は、完全なヒトモノクローナル抗体である。
【００９３】
したがって、一実施形態において、ＥＧＦＲに結合する抗体を生成するためにハイブリドーマ法が用いられる。この方法では、免疫化のために用いられる抗原に特異的に結合する抗体を生成するかまたは生成することができるリンパ球を誘発するために、マウスまたは他の適切な宿主動物を好適な抗原で免疫することができる。代替として、リンパ球は、インビトロで免疫されてもよい。次いで、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコール等の好適な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させることができる。ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の生成についてアッセイする。所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を生成するハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈法によってクローンをサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させることができる。この目的に好適である培地として、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。また、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させてもよい。サブクローンから分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地、腹水、または血清から分離することができる。
【００９４】
別の実施形態において、ＥＧＦＲに結合する抗体は、例えば、Ｌａｄｎｅｒらに対する米国特許第５，２２３，４０９号、５，４０３，４８４号、および５，５７１，６９８号、Ｄｏｗｅｒらに対する米国特許第５，４２７，９０８号および５，５８０，７１７号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらに対する米国特許第５，９６９，１０８号および６，１７２，１９７号、ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらに対する米国特許第５，８８５，７９３号、６，５２１，４０４号、６，５４４，７３１号、６，５５５，３１３号、６，５８２，９１５号、および６，５９３，０８１号に記載されるような周知の技術を用いて産生させた抗体ファージライブラリーから単離することができる。また、チェインシャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の生成、ならびに非常に巨大なファージライブラリーを構築するためのストラテジーとしてのコンビナトリアルインフェクションおよびインビボでの組換えも用いることができる。例えば、米国特許出願第０９／８５６，９０７号（ＰＣＴ国際公開公報第００／３１２４６号）を参照。
【００９５】
特定の実施形態において、ＥＧＦＲに結合するモノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて生成される。この技術は、ヒトドナーから単離された免疫グロブリン配列の特有の組み合わせを有し、かつ重鎖ＣＤＲにおける合成多様性を有するヒトＦａｂライブラリーの産生を伴う。次いで、ライブラリーは、ＥＧＦＲに結合するＦａｂについてスクリーニングされる。
【００９６】
さらに別の実施形態において、ＥＧＦＲに対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を担持するトランスジェニックマウスまたはトランスクロモソミックマウスを用いて産生することができる（例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、５，５６９，８２５号、５，６２５，１２６号、５，６３３，４２５号、５，７８９，６５０号、５，８７７，３９７号、５，６６１，０１６号、５，８１４，３１８号、５，８７４，２９９号、および５，７７０，４２９号（全てＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｋａｙに対するもの）、Ｓｕｒａｎｉらに対する米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ国際公開公報第９２／０３９１８号、第９３／１２２２７号、第９４／２５５８５号、第９７／１３８５２号、第９８／２４８８４号、および第９９／４５９６２号（全てＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｋａｙに対するもの）、ならびにＫｏｒｍａｎらに対するＰＣＴ国際公開公報第０１／１４４２４号を参照）。
【００９７】
別の実施形態において、ヒト抗体は、ヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランスクロモソームを担持するマウス等の、トランスジーンおよびトランスクロモソームにヒト免疫グロブリン配列を担持するマウスを用いて産生させることができる（例えば、Ｉｓｈｉｄａらに対するＰＣＴ国際公開公報第０２／４３４７８号を参照）。
【００９８】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスジェニック動物系が当該技術分野において利用可能であり、抗ＥＧＦＲ抗体を産生させるために用いることができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と称される代替のトランスジェニック系を用いることができる：そのようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらに対する米国特許第５，９３９，５９８号、６，０７５，１８１号６，１１４，５９８号、６，１５０，５８４号、および６，１６２，９６３号に記載される。
【００９９】
また、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスクロモソミック動物系が当該技術分野において利用可能であり、抗ＥＧＦＲ抗体を産生させるために用いることができる。例えば、ヒト重鎖トランスクロモソームおよびヒト軽鎖トランスクロモソームの両方を担持するマウスを用いることができる。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモソームを担持するウシが、当該技術分野において記載されており、抗ＥＧＦＲ抗体を産生させるために用いることができる。
【０１００】
さらに別の実施形態において、抗体は、そのような抗体を生成するトランスジェニック植物および／または培養植物の細胞（例えば、タバコ、トウモロコシ、およびアオウキクサ）を用いて調製することができる。例えば、抗体を発現するトランスジェニックタバコの葉は、例えば、誘導プロモーターを用いることによって、そのような抗体を生成するために用いることができる。また、そのような抗体およびその抗原結合部分を発現させるために、トランスジェニックトウモロコシを用いることができる。また抗体は、例えば、タバコ種子およびジャガイモ塊茎を用いて、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等の抗体部分を含むトランスジェニック植物の種子から大量に生成することができる。
【０１０１】
本明細書に開示される技術を含む任意の技術を用いて調製されたＥＧＦＲに結合するモノクローナル抗体（またはその一部）の結合特異性は、免疫沈降によって、または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロでの結合アッセイによって、測定することができる。モノクローナル抗体またはその一部の結合親和性は、スキャッチャード解析によって測定することができる。
【０１０２】
特定の実施形態において、上で論じた方法のうちのいずれかを用いて生成されたＥＧＦＲ抗体は、本明細書に記載される技術等の当該技術分野で認識されている技術を用いて、所望の結合特異性および／または親和性を達成するためにさらに変更または最適化されてもよい。
【０１０３】
一実施形態において、ＥＧＦＲ抗体に由来する部分的な抗体配列が、構造的および機能的に関連する抗体を生成するために用いられてもよい。例えば、抗体は、主として６つの重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間においてより多様である。ＣＤＲ配列は、大部分の抗体−抗原相互作用に寄与するため、異なる特性を有する異なる抗体からフレームワーク配列上にグラフトされた特定の自然に生じる抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の自然に生じる抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である。そのようなフレームワーク配列は、生殖系列の抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースから得ることができる。
【０１０４】
したがって、ＣＤＲ等の抗ＥＧＦＲ抗体の１つ以上の構造的特徴は、少なくとも１つの所望の機能特性、例えば、ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖の阻害を保持する、構造的に関連する抗ＥＧＦＲ抗体を作製するために用いることができる。
【０１０５】
特定の実施形態において、さらなる組換え操作された抗ＥＧＦＲ抗体を作製するために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３〜５６から選択される１つ以上のＣＤＲ領域が、既知のヒトフレームワーク領域およびＣＤＲと組換えによって組み合わされる。重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、同じかまたは異なる抗体配列に由来し得る。
【０１０６】
抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３ドメインが抗原に対する抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たすことは、当該技術分野において周知である。したがって、特定の実施形態において、本明細書に記載される特定の抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体が産生される。抗体は、本明細書に記載される抗体の重鎖ならびに／または軽鎖のＣＤＲ１および／もしくはＣＤＲ２をさらに含むことができる。
【０１０７】
上述の操作された抗体のＣＤＲ１、２、および／または３領域は、本明細書に開示されるものと全く同じアミノ酸配列を含むことができる。しかしながら、当業者は、特に、エピトープ特異性を変更することなく、ＣＤＲ３配列よりも多くの変動に耐えることができるＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列の場合、全く同じＣＤＲ配列からのいくらかのずれがあり得ることを理解するであろう（そのようなずれは、例えば、保存的アミノ酸置換である）。したがって、別の実施形態において、操作された抗体は、例えば、本明細書において指定される抗体の対応するＣＤＲに９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．５％同一な１つ以上のＣＤＲ１およびＣＤＲ２から構成されてもよい。
【０１０８】
別の実施形態において、より有利な結合のオン速度を達成するために、ＣＤＲの１つ以上の残基が、結合を改変するように変更されてもよい。このストラテジーを用いて、例えば１０１０Ｍ−１以上の極めて高い結合親和性を有する抗体を得ることができる。当該技術分野において周知であり、本明細書に記載される親和性成熟技術は、ＣＤＲ領域を変更し、その後、結果として得られた結合分子を結合における所望の変化についてスクリーニングするために用いることができる。このように、ＣＤＲが変更されると、最良の組み合わせの結合および低い免疫原性のために最適化された抗体が得られるように、結合親和性および免疫原性の変化をモニタリングしてスコア化することができる。
【０１０９】
また、これらの改変後の抗原結合親和性が１０６Ｍ−１よりも良好である限り、抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のフレームワークまたは結合領域のうちの１つ以上において改変を行うこともできる。
【０１１０】
別の実施形態において、例えば、癌の治療における抗体の有効性を増強するために、抗体は、エフェクター機能に関してさらに改変される。例えば、システイン残基がＦｃ領域に導入されてもよく、それによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成が可能になる。このように産生されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力ならびに／または増加された補体媒介性細胞死および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有し得る。抗腫瘍活性が増強されたホモ二量体抗体は、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製されてもよい。代替として、二重のＦｃ領域を有し、それによって増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能を有し得る抗体を操作することができる。
【０１１１】
また、以下に論じるように、二重特異性抗体およびイムノコンジュゲートも提供する。
【０１１２】
（ｉｉ）二重特異性抗体
本明細書において二重特異性抗体は、好ましくは非重複または非競合エピトープに結合する、ＥＧＦＲに対する少なくとも２つの結合特異性部を含む。そのような二重特異性抗体は、さらなる結合特異性部、例えば、第３のＥＧＦＲ結合特異性部および／または別のＥｒｂＢ受容体（例えば、ＥｒｂＢ３）もしくは癌遺伝子の生成物等の別の抗原に対する結合特異性部を含むことができる。二重特異性抗体は、完全長の抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ'）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０１１３】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、国際公開公報第０５１１７９７３号および国際公開公報第０６０９１２０９号を参照）。例えば、完全長の二重特異性抗体の生成は、２つの対になった免疫グロブリン重鎖−軽鎖の同時発現に基づいてもよく、その場合、２つの鎖は異なる特異性を有する。組換え細胞培養物から直接、二重特異性抗体断片を作製および単離するための種々の技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体が、ロイシンジッパーを用いて生成されている。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体断片を作製するための別のストラテジーも報告されている。
【０１１４】
特定の実施形態において、二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を産生するように、別の機能性分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質（例えば、別の抗体もしくは受容体のリガンド）と誘導体化または連結されたＥＧＦＲに結合する第１の抗体（またはその結合部分）を含む。抗体は、２つより多くの異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を産生するように、１つより多くの他の機能性分子と誘導体化または連結させてもよく、そのような多重特異性分子も、本明細書で使用される「二重特異性分子」という用語に包含されることが意図される。二重特異性分子を作製するために、本明細書に開示される抗体を、結果として二重特異性分子が得られるように、１つ以上の他の結合分子、例えば別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合性模倣物等と（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合、または他の方法によって）機能的に連結させることができる。
【０１１５】
したがって、ＥＧＦＲに対する少なくとも１つの第１の結合特異性部および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性部を含む二重特異性分子が企図される。特定の実施形態において、第２の標的エピトープは、Ｆｃ受容体、例えば、ヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）またはヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）である。したがって、ＦｃγＲ、ＦｃαＲ、またはＦｃεＲを発現するエフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージ、もしくは多形核球細胞（ＰＭＮ））およびＥＧＦＲを発現する標的細胞の両方と結合することができる二重特異性分子も提供される。これらの二重特異性分子は、ＥＧＦＲを発現する細胞をエフェクター細胞に標的化し、ＥＧＦＲを発現する細胞の食作用、抗体依存性細胞媒介性の細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出、またはスーパーオキシド陰イオンの産生等のＦｃ受容体媒介性のエフェクター細胞活性を誘発する。
【０１１６】
一実施形態において、二重特異性分子は、結合特異性部として、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖ等を含む。また、抗体は、軽鎖もしくは重鎖の二量体、またはその任意の最小断片、例えば、ＦｖまたはＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号に記載されるような一本鎖構築物であってもよい。
【０１１７】
二重特異性分子は、当該技術分野において既知の方法を用いて、成分の結合特異性部、例えば、抗ＦｃＲ結合特異性部と抗ＥＧＦＲ結合特異性部をコンジュゲートすることによって調製することができる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性部を別々に生じさせ、次いで互いにコンジュゲートさせることができる。結合特異性部がタンパク質またはペプチドである場合、共有結合性のコンジュゲーションのために様々なカップリング剤または架橋剤を用いることができる。架橋剤の例として、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる。好ましいコンジュゲート剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、どちらもＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能である。
【０１１８】
結合特異性部が抗体である場合、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合形成を介してそれらをコンジュゲートすることができる。特に好ましい実施形態において、ヒンジ領域は、コンジュゲーションの前に、奇数の、好ましくは１つのスルフヒドリル残基を含むように改変される。
【０１１９】
代替として、両方の結合特異性部を同じベクター中でコードし、同じ宿主細胞中で発現および集合させることができる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ  ｘ  ｍＡｂ、ｍＡｂ  ｘ  Ｆａｂ、Ｆａｂ  ｘ  Ｆ（ａｂ'）２、またはリガンド  ｘ  Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および１つの結合決定基を含む一本鎖分子であるか、または２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含むことができる。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，４５５，０３０号、米国特許第４，８８１，１７５号、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４７６，７８６号、米国特許第５，０１３，６５３号、米国特許第５，２５８，４９８号、および米国特許第５，４８２，８５８号に記載される。
【０１２０】
二重特異性分子のそれらの特異的標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）、またはウエスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイの各々は、一般に、対象となる複合体に特異的な標識された試薬（例えば、抗体）を用いることによって、特定の対象となるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば、抗体−ＦｃＲ複合体を認識して特異的に結合する酵素と連結した抗体または抗体断片を用いて検出することができる。代替として、様々な他の免疫アッセイのうちのいずれかを用いて複合体を検出することができる。例えば、抗体を放射標識して、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）に用いることができる。放射性同位体は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用等の手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
【０１２１】
（ｉｉｉ）イムノコンジュゲート
本明細書に提供されるイムノコンジュゲートは、本明細書に記載される抗体を別の治療薬とコンジュゲートすることによって形成することができる。好適な薬剤として、例えば、細胞傷害性剤（例えば、化学療法剤）、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片）、および／あるいは放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）が挙げられる。
【０１２２】
そのようなイムノコンジュゲートの生成において有用な化学療法剤を上述した。用いることができる酵素的に活性な毒素およびその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性の活性断片、外毒素Ａ鎖（緑濃菌から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンシンタンパク質、ヨシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含む。様々な放射性核種が、放射性コンジュゲート抗ＥＧＦＲ抗体の生成のために利用可能である。その例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０１２３】
イムノコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオレン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネート等）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）等の様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。炭素１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドと抗体とのコンジュゲーションのための典型的なキレート剤である（例えば、国際公開公報第９４／１１０２６号を参照）。
【０１２４】
ＩＩＩ．抗体をスクリーニングするための方法
抗体を生成した後、それらは、当該技術分野において周知である様々なアッセイを用いて、本明細書に記載される種々の特性についてスクリーニングすることができる。
【０１２５】
一実施形態において、抗体は、例えば、精製したＥＧＦＲおよび／またはＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１細胞等）を用いて、（例えば、フローサイトメトリーまたはＥＬＩＳＡによって）ＥＧＦＲとの結合についてスクリーニングされる。抗ＥＧＦＲ抗体によって結合されるエピトープは、例えば、非競合抗体（例えば、異なるエピトープに結合する抗体）、ならびに結合について競合するおよび／または同じもしくは重複するエピトープに結合する抗体を同定するために、さらに同定および比較することができる。
【０１２６】
競合抗体（上の表１および表２中に特定される抗体のうちのいずれかと、ＥＧＦＲとの競合について競合する抗体等）および非競合抗体は、日常的技術を用いて同定することができる。そのような技術は、例えば、別の抗体の標的抗原への結合を阻止する（または阻止しない）１つの抗体の能力を示す免疫アッセイ、すなわち、競合結合アッセイを含む。競合結合は、検査される免疫グロブリンが、ＥＧＦＲ等の共通の抗原への基準抗体の特異的結合を阻害するアッセイにおいて測定される。多くの種類の競合結合アッセイが知られており、例えば、固相直接または間接放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ、固相直接１２５Ｉ標識ＲＩＡ、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ、および直接標識ＲＩＡが挙げられる。実施例の材料および方法ならびに下の実施例２に記載される表面プラズモン共鳴技術も、この目的のために有利に用いることができる。典型的には、そのようなアッセイは、非標識試験免疫グロブリンおよび標識基準免疫グロブリンのいずれかを担持する固体表面および細胞に結合する精製抗原の使用を伴う。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を判定することによって測定される。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、該抗体は、基準抗体の共通抗原への特異的結合を少なくとも５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％またはそれ以上阻害する。
【０１２７】
本明細書に開示される抗体によって結合されるエピトープを決定するための他のスクリーニング技術として、例えば、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のＸ線分析が挙げられる。他の方法は、抗体と抗原断片または抗原変異体との結合をモニタリングし、その場合、抗原配列内のアミノ酸残基の改変に起因する結合の消失は、エピトープ成分を示唆すると見なされることが多い。また、エピトープマッピングのための計算によるコンビナトリアル法も用いることができる。これらの方法は、抗体がコンビナトリアルファージディスプレイ・ペプチドライブラリーから特異的な短いペプチドを親和性単離する能力に依存する。次いで、ペプチドは、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために用いられる抗体に対応するエピトープの決定のための手掛かりと見なされる。エピトープマッピングのために、立体構造的に不連続なエピトープをマッピングすることが示されている計算アルゴリズムも開発されている。
【０１２８】
別の実施形態において、抗体（例えば、非競合抗体、抗ＥＧＦＲ抗体）は、リガンド、例えばＥＧＦに結合する際に曝露されるエピトープに結合する（すなわち、ＥＧＦＲ結合リガンドのＥＧＦＲへの結合を阻害しない）能力についてスクリーニングされる。そのような抗体は、例えば、抗ＥＧＦＲ抗体の非存在下（対照）または存在下で、ＥＧＦＲを発現する細胞（例えば、Ａ４３１細胞）を標識されたＥＧＦＲリガンド（例えば、放射標識されたかまたはビオチン化されたＥＧＦ）と接触させることによって同定することができる。抗体が、ＥＧＦのＥＧＦＲへの結合を阻害しない場合、抗体の不在下における量と比較して、回収された標識の量に統計的に有意な減少は観察されない。一方で、抗体が、ＥＧＦのＥＧＦＲへの結合を阻害した場合、抗体の不在下における量と比較して、回収された標識の量に統計的に有意な減少が観察される。
【０１２９】
また、抗体は、それらの結合親和性についてもスクリーニング（試験）することができる。これは、例えば、プラズモン共鳴アッセイ（例えば、後に記載するような）を用いて行うことができる。
【０１３０】
また、抗体は、本明細書に記載されるシグナル伝達アッセイを用いて、抗体がＥＧＦＲを介したシグナル伝達を阻害する能力についてもスクリーニングすることができる。例えば、抗体がＥＧＦＲリガンド媒介性のＥＧＦＲのリン酸化を阻害する能力は、抗体の非存在下または存在下で、ＥＧＦＲを発現する細胞をＥＧＦＲリガンド（例えばＥＧＦ）で処理することによってアッセイすることができる。次いで、細胞を溶解させ、粗溶解物を遠心分離して不溶性物質を除去し、例えば、ウエスタンブロッティングの後に、抗ホスホチロシン抗体でプローブすることによってＥＧＦＲのリン酸化を測定することができる。
【０１３１】
代替として、抗体がＥＧＦＲによる下流のシグナル伝達を阻害する能力は、例えば、ＡＫＴおよび／またはＥＲＫ等のＥＧＦＲの既知の基質についてのキナーゼアッセイの後、ＥＧＦリガンドによるＥＧＦＲ刺激を行うことによって測定することができる。例えば、ＥＧＦＲを発現する細胞をＥＧＦリガンドで刺激し、候補抗体とともにインキュベートすることができる。そのような細胞から続いて調製される細胞溶解物は、抗ＡＫＴ抗体等のＥＧＦＲの基質に対する抗体（またはＥＧＦＲに関与する細胞経路内のタンパク質）で免疫沈降させ、当該技術分野で認識されている技術を用いてキナーゼの活性（例えば、ＡＫＴキナーゼの活性）についてアッセイすることができる。抗体の非存在化におけるレベルまたは活性と比較した、抗体の存在下におけるＥＧＦＲに関与する経路内のＥＧＦＲ基質またはタンパク質のレベルまたは活性（例えば、キナーゼの活性）の減少または完全な消失は、ＥＧＦＲのシグナル伝達を阻害する抗体を示唆する。
【０１３２】
細胞表面におけるＥＧＦＲのレベルを減少させる抗体は、それらが腫瘍細胞上でＥＧＦＲの発現を下方制御または阻害する能力によって同定することができる。特定の実施形態において、抗体は、ＥＧＦＲの内部移行を誘導する（またはエンドサイトーシスを増加させる）ことによって細胞表面におけるＥＧＦＲを減少させる（例えば、受容体の内部移行および再循環による、ならびに／または受容体の内部移行および分解による）。このことを調べるために、ＥＧＦＲをビオチン化することができ、例えば、抗体の存在下または非存在下において培養物中の細胞の単分子層上のビオチン量を測定し、続いて、ＥＧＦＲの免疫沈降およびストレプトアビジンによるプローブを行うことによって、細胞表面におけるＥＧＦＲ分子の数を容易に測定することができる。抗体の存在下におけるビオチン化したＥＧＦＲの検出量の経時的な減少は、細胞表面におけるＥＧＦＲのレベルを減少させる抗体を示唆する。
【０１３３】
また、抗体および抗体の組み合わせは、下の実施例に記載される細胞力価増殖アッセイまたはトリチウム標識チミジン取り込みアッセイを含む当該技術分野で認識されている技術を用いて、それらが腫瘍細胞等のＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を（インビボまたはインビトロのいずれかで）阻害する能力について検査することができる。また抗体は、それらがＥＧＦＲを発現する細胞の球状体増殖を阻害する能力についてスクリーニングすることもできる。これは、本明細書に記載される腫瘍増殖を促進する条件に近付けるアッセイを用いて行うことができる。
【０１３４】
別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせが、ＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、または多重法、例えばＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）等によって測定される）等の特定のＥＧＦＲの活性または機能の阻害に対するＩＣ５０および／またはＩＣ９０値についてスクリーニングされる。次いで、それらの各々が特に望ましいＩＣ５０および／またはＩＣ９０値（例えば、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害には約８０ｎＭのＩＣ９０）を保持する抗体の組み合わせを選択することができる。一実施形態において、組み合わせは、既知の基準抗体（例えば、セツキシマブ）よりも高いＩＣ５０またはＩＣ９０値を有する。別の実施形態において、組み合わせは、相加的なＩＣ５０またはＩＣ９０を有する（すなわち、ＥＧＦＲを発現する細胞に対して個別に作用する場合の抗体の活性の和は、同じ細胞に対して一緒に作用する同じ抗体の効果を合わせたものとほぼ等しい）。別の実施形態において、組み合わせは、相乗的なＩＣ５０またはＩＣ９０を有する（すなわち、ＥＧＦＲを発現する細胞に対して個別に作用する場合の抗体の効果の和は、同じ細胞に対して一緒に作用する同じ抗体の効果を合わせたものよりも低い）。
【０１３５】
ＩＶ．医薬組成物
別の態様において、薬学的に許容される担体とともに配合される、モノクローナル抗体のうちの１つまたはその組み合わせを含む組成物、例えば、医薬組成物が本明細書において提供される。一実施形態において、組成物は、ＥＧＦＲ上の異なるエピトープに結合する、複数（例えば、２つ以上）の単離された抗体の組み合わせを含む。そのような抗体は、好ましくは、ＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達等の特定のＥＧＦＲの活性または機能を阻害することに対して相加的または相乗的な効果を有する。
【０１３６】
本明細書中で用いられる場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または表皮投与（例えば、注射または点滴による）に好適である。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、二重特異性および多重特異性分子は、酸の作用、および化合物を不活性化し得る他の天然の条件から化合物を保護する物質で被覆されてもよい。
【０１３７】
医薬組成物は、単独で、または併用治療において、すなわち、他の薬剤と組み合わせて、投与することができる。例えば、併用治療は、本明細書に提供される組成物を、少なくとも１つ以上の追加の治療薬、例えば、本明細書に記載される抗癌剤とともに含むことができる。また、組成物は、放射線治療および／または手術と併せて投与することもできる。また、抗ＥＧＦＲ抗体の特定の組み合わせが、追加の治療薬の有無にかかわらず、別々にまたは連続的に投与されてもよい。
【０１３８】
組成物は、当該技術分野において既知である様々な方法によって投与することができる。当業者には理解されるように、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に応じて異なる。抗体は、例えば、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化された送達システムを含む徐放剤等の、急速な放出から抗体を保護する担体とともに調製することができる。例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような配合物の調製のための多くの方法は、特許を取得しているか、または当業者に一般的に知られている。
【０１３９】
ある特定の投与経路により組成物を投与するために、その失活を防止する物質で成分（例えば抗体）を被覆するか、または組成物を該成分と同時投与することが必要である場合がある。例えば、組成物は、適切な担体、例えばリポソーム、または希釈剤中で対象に投与されてもよい。許容される希釈剤は、生理食塩水および水性緩衝溶液を含む。リポソームは、水中油中水ＣＧＦエマルジョン、および従来のリポソームを含む。
【０１４０】
許容される担体は、無菌の水溶液または分散液、ならびに無菌の注射液または分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において既知である。任意の従来の媒体または薬剤が抗体と不適合性でない限り、本明細書に提供される組成物におけるその使用が企図される。また、補助的な活性成分も組成物に組み込むことができる。
【０１４１】
治療組成物は、典型的には、無菌でなければならず、製造および保存条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として配合することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、ならびにそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散の場合は必要とされる粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、砂糖、多価アルコール類（例えばマンニトール、ソルビトール等）、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含ませることによって、注射用組成物の長期にわたる吸収をもたらすことができる。
【０１４２】
無菌の注射液は、必要に応じて、上で列挙した成分のうちの１つまたはその組み合わせとともに必要な量のモノクローナル抗体を適切な溶媒に組み込み、その後、滅菌精密濾過を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒体と、上に列挙したもので必要な他の成分とを含む無菌ビヒクルに抗体を組み込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は、有効成分と、事前に滅菌濾過したその溶液からの任意の追加の所望の成分との粉末を生じる真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０１４３】
投与計画は、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するように調節される。例えば、単一ボーラスが投与されてもよいか、いくつかに分割された用量が経時的に投与されてもよいか、または、治療状況の危急性によって示されるように用量を比例的に減少もしくは増加させてもよい。例えば、ヒト抗体は、皮下注射によって週に１回もしくは２回、または皮下注射によって月に１回または２回投与されてもよい。
【０１４４】
投与の簡便性および投与量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形に配合することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形とは、治療を受ける対象に対する単一の投与量として適切である物理的に異なった別個の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体を伴って所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の抗体を含む。本明細書に提供される単位剤形の仕様は、（ａ）抗体の固有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）そのような抗体を個体の治療感受性に合わせて調合する当該技術分野に固有の限界によって決定され、また直接的に依存する。薬学的に許容される抗酸化剤の例として、（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等、（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、αトコフェロール等、および（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が挙げられる。
【０１４５】
治療組成物の場合、配合物は、経口、鼻腔、局所（口腔内および舌下を含む）、直腸、および非経口投与に好適なものを含む。非経口投与は、抗体を含む治療組成物の最も一般的な投与経路である。配合物は、都合よく単位剤形で存在してもよく、また薬学の分野において既知である任意の方法によって調製されてもよい。単一剤形を生成するために担体物質と組み合わせることができる抗体の量は、治療を受ける対象および特定の投与様式に応じて異なる。抗体の量は、一般に、治療効果をもたらすのに十分な量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、約０．００１質量パーセント〜約９０質量パーセント、好ましくは約０．００５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約０．０１パーセント〜約３０パーセントの抗体の範囲である。
【０１４６】
本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口的に投与される」という句は、経腸的および局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、および胸骨内注射および点滴が挙げられるが、これらに限定されない。ここで提供される医薬組成物中に用いられてもよい好適な水性および非水性の担体の例として、水、エタノール、多価アルコール類（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油等の植物油、ならびにオレイン酸エチル等の注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング剤の使用によって、分散の場合は必要とされる粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【０１４７】
また、これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳濁剤、および分散剤等のアジュバントを含んでもよい。当該技術分野において周知であるアジュバントの具体的な例として、例えば無機アジュバント（アルミニウム塩、例えば、リン酸アルミニウムおよびアルミニウム水酸化物等）、有機アジュバント（例えば、スクアレン）、油性アジュバント、ビロゾーム（例えば、インフルエンザウイルス由来の膜結合ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを含むビロゾーム）が挙げられる。
【０１４８】
微生物の存在の予防は、滅菌手順によって、ならびに、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の種々の抗菌剤および抗真菌剤の含有の両方によって確実にすることができる。また、糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を含むことが望ましい場合がある。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の吸収を遅延させる１つ以上の薬剤の含有によって、注射用組成物の長期にわたる吸収をもたらすことができる。
【０１４９】
組成物が医薬としてヒトおよび動物に投与される場合、それらは、単独で、または、薬学的に許容される担体と組み合わせて、例えば０．００１〜９０％（より好ましくは、０．００５〜７０％、例えば０．０１〜３０％）の有効成分を含む医薬組成物として与えることができる。
【０１５０】
選択した投与経路にかかわらず、本明細書に提供される組成物は、好適な水和物の形態で用いられてもよく、またそれらは、当業者に既知である従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に配合されてもよい。
【０１５１】
本明細書に提供される医薬組成物中の抗体の実際の投与量レベルは、患者に対して毒性を示すことなく、特定の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療反応を達成するために効果的な有効成分の量を得るために異なり得る。選択された投与量レベルは、用いられる特定の組成物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、用いられる特定の化合物の排出速度、治療期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物および／または物質、治療を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、総体的な健康、および以前の医療歴等の、医療の分野において周知である因子を含む様々な薬物動態的因子に依存する。当該技術分野において通常の技術を有する医師または獣医師は、必要とされる組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも少ないレベルで抗体の投与を開始し、所望の効果が得られるまで投与量を次第に増加させることができる。一般に、本明細書に提供される組成物の好適な１日用量は、治療効果をもたらすために効果的な最低用量である抗体の量である。そのような有効用量は、通常、上述の因子に依存する。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であることが好ましく、好ましくは標的部位の近位に投与される。必要に応じて、治療組成物の有効な１日用量は、任意選択的に単位剤形で、１日を通して適切な間隔で、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上のサブ用量として別々に投与されてもよい。抗体を単独で投与することが可能であるが、抗体を製剤（組成物）として投与することが好ましい。
【０１５２】
治療組成物は、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号、第４，５９６，５５６号、第４，４８７，６０３号、第４，４８６，１９４号、第４，４４７，２３３号、第４，４４７，２２４号、第４，４３９，１９６号、および第４，４７５，１９６号に開示されるような、当該技術分野において既知である医療機器を用いて投与することができる。
【０１５３】
特定の実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするように配合することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性の化合物を排除する。抗体がＢＢＢを横断することを確実にするために（所望の場合）、それらを例えばリポソーム中に配合することができる。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、第５，３７４，５４８号、第５，３９９，３３１号、第５，８９１，４６８号、第６，０５６，９７３号、第６，２１０，７０７号、第６，２２４，９０３号、第６，３１６，０２４号、第７，１２２，２０２号、第７，１３５，１７７号、および第７，５０７，４０７号、ならびに米国特許出願第２００７０１１６７５３号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または器官に付着する、および／またはその中に選択的に輸送される、ひいては標的化薬物送達を増強する、１つ以上の部分を含んでもよい。
【０１５４】
本発明は、抗ＥＧＦＲ抗体のトリオを含む医薬組成物、すなわち、３つの異なる抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくは、ＥＧＦＲへの結合について互いに競合せず、かつ／またはＥＧＦＲ上で互いに異なるエピトープに結合する３つの異なる抗体を含む組成物を提供する。３つの抗体に加えて、これらの医薬組成物は、上に詳述したような薬学的に許容される担体および／または他の賦形剤を含むことができる。医薬組成物は、３つ全部の抗体を収容する単一容器中に供給されてもよいか、または代替として、医薬組成物は、各々が３つの異なる抗ＥＧＦＲ抗体のうちの１つ（ならびに上に詳述したような薬学的に許容される担体および／または他の賦形剤）を収容する３つの異なる容器を含むパッケージを含んでもよい。
【０１５５】
例えば、本発明は、トリオのうちの１つの抗体が、本明細書に定義されるビン１の抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、トリオのうちの第２の抗体が、本明細書に定義されるビン２の抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、トリオのうちの第３の抗体が、本明細書に定義されるビン３の抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合する、抗ＥＧＦＲ抗体のトリオ（３つの抗体、または３つ組の抗体）の医薬組成物を提供する。したがって、一実施形態において、本発明は、第１の抗体、第２の抗体、および第３の抗体を含む抗ＥＧＦＲ抗体のトリオの医薬組成物であって、（ｉ）第１の抗体が、ｖａ、ｖｂ、およびｖｃからなる群から選択される抗体、またはｃａ、ｃｂ、およびｃｃからなる群から選択される抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、（ｉｉ）第２の抗体が、ｖｄ、ｖｅ、ｖｆ、ｖｇ、およびｖｈからなる群から選択される抗体、またはｃｄ、ｃｅ、およびｃｆからなる群から選択される抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、（ｉｉｉ）第３の抗体が、ｖｉおよびｖｊからなる群から選択される抗体、またはｃｇ、ｃｈ、ｃｉ、ｃｊ、およびｃｋからなる群から選択される抗体と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合する、医薬組成物を提供する。
【０１５６】
例えば、本発明は、第１の抗体、第２の抗体、および第３の抗体を含む抗ＥＧＦＲ抗体のトリオを含む医薬組成物であって、（ｉ）第１の抗体が、抗体ｃａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３０、および３４にそれぞれ記載の重鎖ＣＤＲ１、２、および３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、４５、および４９にそれぞれ記載の軽鎖ＣＤＲ１、２、および３とを含む）と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、（ｉｉ）第２の抗体が、抗体ｃｄ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３０、および３１にそれぞれ記載の重鎖ＣＤＲ１、２、および３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、５４、および５５にそれぞれ記載の軽鎖ＣＤＲ１、２、および３とを含む）と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合し、（ｉｉｉ）第３の抗体が、抗体ｃｈ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、２４、および２６にそれぞれ記載の重鎖ＣＤＲ１、２、および３と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、４０、および４２にそれぞれ記載の軽鎖ＣＤＲ１、２、および３とを含む）と、結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合する、医薬組成物を提供する。抗体ｃａ、ｃｆ、およびｃｈのトリオの組み合わせはまた、表４に記載の抗体トリオ４ｃとして本明細書に記載される。
【０１５７】
また本発明は、ＥＧＦＲ依存性シグナル伝達と関連する疾患の治療のための薬物の製造における上記抗ＥＧＦＲ抗体のトリオの使用も提供する。また本発明は、癌、例えば、ＥＧＦＲを発現する癌、例えば、限定されないが、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、腎癌、消化管癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、前立腺癌、ならびに他の固形腫瘍および／または転移性腫瘍を含む癌の治療のための薬物の製造における上記抗ＥＧＦＲ抗体のトリオの使用も提供する。
【０１５８】
Ｖ．抗体の使用方法
また、様々な癌を含むＥＧＦＲに依存するシグナル伝達が関与する様々なエクスビボおよびインビボの診断用途および治療用途において、ＥＧＦＲに結合する抗体を使用する方法も提供する。
【０１５９】
したがって、一実施形態において、疾患を治療するために有効な量の本明細書に提供される抗体、または好ましくは抗体の組み合わせを対象に投与することによって、ＥＧＦＲ依存性シグナル伝達と関連する疾患を治療するための方法が提供される。好適な疾患として、例えば、限定されないが、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、腎癌、消化管癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、前立腺癌、ならびに他の固形腫瘍および／または転移性腫瘍を含むが、これらに限定されない様々な癌が挙げられる。
【０１６０】
抗体は、ＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達と関連する疾患を治療するために、単独で、または抗体と一緒にまたはそれと相乗的に作用する別の治療薬とともに投与することができる。このような治療薬は、本明細書に記載されるもの、例えば、有機低分子、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、組換え操作された生物製剤、ＲＮＡｉ化合物、チロシンキナーゼ阻害剤、および市販の抗体、ならびに抗癌剤（例えば、細胞毒、化学療法剤、低分子、および放射線）を含む。
【０１６１】
また、任意選択的に単一バイアル中に収容され、例えば、ＥＧＦＲの上方制御および／またはＥＧＦＲ依存性シグナル伝達と関連する疾患の治療または診断において使用するための指示を含む、１つ以上の抗ＥＧＦＲ抗体を含むキットも提供される。キットは、キットの内容物の意図される使用を示すラベルを含んでもよい。ラベルという用語は、キット上にもしくはキットとともに供給されるか、または他の方法でキットに添付される、任意の書面、マーケティング資料または記録資料を含む。
【０１６２】
他の実施形態を、以下の非限定的な実施例に記載する。
【実施例】
【０１６３】
実施例１〜５の材料および方法
別途記載のない限り、実施例１〜５を通して以下の材料および方法が用いられる。
【０１６４】
一般に、別途指定のない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば、抗体技術）の従来技術、およびポリペプチド調製の標準的な技術が用いられる。
【０１６５】
細胞株
以下に記載される実験で用いられる全ての細胞株は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅまたはＡＴＣＣより調達する。
細胞株：
Ａ４３１−類表皮癌
ＯＶＣＡＲ−３−卵巣癌
Ｄｕ１４５−前立腺癌
ＡＤＲｒ−乳癌
【０１６６】
腫瘍細胞の粉砕
腫瘍の粉砕のために凍結粉砕機（ＣＯＶＡＲＩＳ  Ｉｎｃ）を用いる。特殊な袋（腫瘍の添加前に予め計量した）に腫瘍を保存し、それらを取り扱う間は液体窒素に入れる。小さな腫瘍の場合、袋からの腫瘍の回収率を向上させるために、腫瘍を収容している袋に２００μＬの溶解バッファーを初めに添加し、液体窒素中で凍結させ、次いで粉砕する。粉砕した腫瘍は、２ｍＬエッペンドルフチューブに移し、さらなる処理の直前まで液体窒素に入れておく。
【０１６７】
腫瘍細胞の溶解
プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を補充した溶解バッファー中に腫瘍を溶解させる。腫瘍アリコートに溶解バッファーを添加して最終濃度約６２．５ｍｇ／ｍＬとする。腫瘍試料を３０秒間ボルテックスで撹拌して均質化し、氷上で約３０分間インキュベートする。試料のさらなる均質化のために、Ｑｉａｇｅｎ社製ＱＩＡＳＨＲＥＤＤＥＲカラム中で溶解物を約１０分間回転させる。さらなる処理のために、透明な溶解物を新しいチューブに分注する。
【０１６８】
ＢＣＡアッセイ
全ての腫瘍試料について、製造業者のプロトコルに従ってＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を行う。各腫瘍試料の合計タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、後に、ＥＬＩＳＡの結果の正規化に用いる。
【０１６９】
ＥＬＩＳＡアッセイ
完全ＥＬＩＳＡおよびホスホ−ＥＧＦＲ  ＥＬＩＳＡ用の全てのＥＬＩＳＡ試薬は、ＤｕｏｓｅｔキットとしてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入する。９６ハーフウェルのＧＲＥＩＮＥＲ高結合プレート（カタログ番号６７５０７７、ＧＲＥＩＮＥＲ  ＢＩＯ−ＯＮＥ、Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣ）を５０μＬの抗体で被覆し、室温で一晩インキュベートする。翌朝、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャーで１０００μＬ／ウェルでプレートを３回洗浄する。その後、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡを用いて、約１時間室温でプレートをブロックする。ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャーで１０００μＬ／ウェルでプレートを３回洗浄する。５０％溶解バッファーおよび１％ＢＳＡ中で希釈した５０μＬの細胞溶解物および標準物質を、さらなる処理のために二連で用いる。振盪させながら４℃で２時間試料をインキュベートし、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）を用いて、ＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャーで１０００μＬ／ウェルでプレートを３回洗浄する。約５０μＬの検出抗体を２％ＢＳＡに希釈し、ＰＢＳＴを添加し、室温で約１時間インキュベートする。ホスホ−ＥＧＦＲの場合、検出抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と直接結合させ、室温で２時間インキュベートする。ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャーで１０００μＬ／ウェルでプレートを３回洗浄する。約５０μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、室温で３０分間インキュベートする（ｐＥｒｂＢ３を除く）。ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャーで１０００μＬ／ウェルでプレートを３回洗浄する。約５０μＬのＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ  ＰＩＣＯ  ＥＬＩＳＡ基質を添加し、Ｆｕｓｉｏｎプレートリーダーを用いてプレートを読み取る。ＥＸＣＥＬを用いてデータを分析する。二連の試料を平均し、エラーバーを用いて２つの繰り返しの標準偏差を表す。
【０１７０】
ＡＫＴおよび／またはＥＲＫシグナル伝達の阻害
ＡＫＴまたはＥＲＫを介したＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達を、そのようなタンパク質のためのキナーゼアッセイを用いる当該技術分野で認識されている技術を用いて測定する。例えば、米国特許出願第２０１０−００５６７６１を参照されたい。
【０１７１】
ＥＧＦＲ二量体化アッセイ
細胞におけるＥＧＦＲのホモ二量体化の程度を測定するために、２種類のエピトープタグ化ＥＧＦＲ構築物、例えば、ＥＧＦＲのＣ末端領域にそれぞれＦｌａｇおよびＭｙｃタグを含むＥＧＦＲ−ｆｌａｇおよびＥＧＦＲ−ｍｙｃが用いられる共沈降アッセイを用いる。ＥＧＦＲ−ｆｌａｇおよびＥＧＦＲ−ｍｙｃを細胞、例えば、ＣＯＳ−７細胞に同時導入し、無血清培地中でインキュベートする。細胞溶解物を抗Ｆｌａｇ抗体で沈降させ、沈殿物質を抗Ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロッティングによって分析するか、または逆の場合も同様に行う。抗体の存在下および非存在下（対照）におけるＥＧＦＲ−ｍｙｃの抗Ｆｌａｇ抗体による共沈降、および抗Ｍｙｃ抗体によるＥＧＦＲ−ｆｌａｇの共沈降の量を測定して比較する。
【０１７２】
ＥＧＦＲ内部移行アッセイ
ＥＧＦＲの内部移行（すなわち、ＥＧＦＲ発現の減少）の程度を測定するために、放射（例えば、１２５Ｉ）標識したＥＧＦＲを発現する細胞を抗体の存在下および非存在下（対照）でインキュベートする。内部移行した放射活性と表面の放射活性との比率を測定して比較する。
【０１７３】
結合親和性
抗ＥＧＦＲ抗体の解離定数は、２つの独立した技術、例えば、表面プラズモン共鳴アッセイおよびＡ４３１細胞を用いた細胞結合アッセイを用いて測定することができる。また、抗体の親和性および交差反応性も、ＫｉｎＥｘＡ計測手段（ＳＡＰＩＤＹＮＥ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）を用いて、組換えＥＧＦ受容体を含む溶液中で測定される。手順では、１２個の５ｍＬチューブ内に調製したＥｒｂＢ１．６ｈｉｓの３倍に用量設定した希釈物（１０００ｎＭ、３３３ｎＭ、１１１ｎＭ、３７ｎＭ、１２．３ｎＭ、４．１ｎＭ、１．３７ｎＭ、４５０ｐＭ、１５０ｐＭ、５０ｐＭ、１７ｐＭ）を用いて、各チューブ内の抗体濃度を２５０ｐＭで一定に維持する。原液（２ｍｇ／ｍＬ）の１：１０００希釈により、２μｇ／ｍＬのＣｙ５標識ＧαヒトＩｇＧ二次抗体１５ｍＬを調製する。ＥｒｂＢ１．６ＨＩＳ結合ＰＭＭＡビーズをＳＡＰＩＤＹＮＥのＫｉｎＥｘＡプロトコルに従ってカップリングさせる。ＰＭＭＡビーズ２００ｍｇの予め測定したアリコートに１００μｇのＥｒｂＢ１−６ｈｉｓを添加する。次いで、１×ＰＢＳを溶液に添加し、最終体積を１ｍＬとする。次いで、この溶液を室温で１時間インキュベートする。次いで、２７ｍＬの１×ＰＢＳを含むビーズバイアルにビーズを移す。次いで、ＫｉｎＥｘＡ  Ｐｒｏソフトウェアのパラメータを入力することにより、実験を設定する。
【０１７４】
表面プラズモン共鳴アッセイ
表面プラズモン共鳴アッセイを以下のように行う。
【０１７５】
抗体または抗原（３００ＲＵ）のいずれかをアミンカップリングによりＣＭ５チップ上に固定化する。次いで、異なる濃度の抗体または抗原を、固定化タンパク質とそれらの会合および解離を調べるために注入する。異なる注入の間に、好適な再生バッファー（ｐＨ２．５グリシン等）を用いてチップを再生する。Ｋｏｆｆ（解離定数）を測定するために、方程式１を用いて解離相を適合させる。
Ｒ＝Ｒ０＊ｅｘｐ（−Ｋｏｆｆ＊ｔ）              （１）
Ｋｏｎ（会合速度）およびＫＤ（平衡定数）を測定するために、このＫｏｆｆの値および方程式２を用いて解離相を適合させる。
2013533211.tif 000010
式中、Ｃは溶液中の抗原または抗体のいずれかの濃度を表し、Ｒｍａｘは飽和信号を表し、ｔは時間を表す。
【０１７６】
細胞結合アッセイ
ＫＤ値を測定するための細胞結合アッセイを以下の通り行う：３７℃で５分間、３ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡでＡ４３１を剥離させる。トリプシン処理した細胞に完全ＤＭＥＭ（１０ｍＬ）をすぐに添加し、穏やかに再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離機で５分間１１００ｒｐｍで遠沈させる。１ｍＬ当たり２×１０６細胞の濃度で細胞を染色バッファー（ＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡ＋０．１％アジ化ナトリウム）に再懸濁し、５０μＬ（１×１０５細胞）アリコートを９６ウェルタイタープレートに入れる。
【０１７７】
染色バッファー中で２０００ｎＭ抗ＥＧＦＲ抗体の原液３００μＬを調製し、そのうち１００μＬを２００μＬの染色バッファー中で連続的に希釈する。希釈された抗体の濃度は、２０００ｎＭ〜０．１ｎＭの範囲である。次いで、異なるタンパク質希釈物の１５０μＬのアリコートを５０μＬの細胞懸濁液に直接添加し、１５００ｎＭ、５００ｎＭ、１６６．７ｎＭ、５５．６ｎＭ、１８．５ｎＭ、６．１７ｎＭ、２．０５ｎＭ、０．６８ｎＭ、０．２３ｎＭ、および０．０７６ｎＭの抗体の最終濃度を得る。
【０１７８】
９６ウェルプレートに分注した細胞を、振盪させながら室温で２時間タンパク質希釈物とともにインキュベートし、３００μＬの染色バッファーで３回洗浄する。次いで、ＢＤ染色バッファー中のＡｌｅｘａ６４７標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧの１：７５０希釈物１００μＬで、振盪させながら４℃で４５分間細胞とともにインキュベートする。最後に細胞を２回洗浄し、ペレット化し、２５０μＬの染色バッファー＋０．５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムに再懸濁する。ＦＬ４チャネルを用いたＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲフローサイトメーターで１０，０００個の細胞の分析を行う。抗ＥＧＦＲ−抗体のＭＦＩ値および対応する濃度を、それぞれＹ軸およびＸ軸上にプロットする。非線形回帰曲線のための１部位結合モデルを用いたＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して、分子のＫＤを決定する。
【０１７９】
ＫＤ値は、式Ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／ＫＤ＋Ｘ（Ｂｍａｘ＝飽和時の蛍光、Ｘ＝抗体濃度、Ｙ＝結合の程度）に基づいて計算する。
【０１８０】
腫瘍細胞増殖の阻害
ＥＧＦＲを発現する細胞（例えば、癌細胞）の細胞増殖の阻害を、以下の通りに試験する：Ｄｕ１４５、Ａ４３１、またはＯＶＣＡＲ−３細胞を２０，０００細胞／ウェルで９６ウェル組織培養プレートに播種し、抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中、２４時間３７℃および５％二酸化炭素で増殖させる。次いで、２００ｎＭ、２０ｎＭ、２ｎＭ、０．２ｎＭ、０．０２ｎＭ、および０ｎＭの濃度で抗体を含むかまたは含まないＲＰＭＩ−１６４０（抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．５％ＦＢＳを含む）に培地を交換する（アイソタイプ対照として対照ＩｇＧを使用）。３６時間３７℃および５％二酸化炭素で細胞を増殖させる。次いで、３Ｈ−チミジンの１：４０希釈物（２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１ｍＣｉ／ｍＬ）２５μＬで細胞をパルスし、一晩（１８時間）インキュベーションし、ＦＩＬＴＥＲＭＡＴＳに回収し、βカウンター上で読み取る。
【０１８１】
腫瘍細胞におけるＥＧＦＲリン酸化の阻害
インビボでのＥＧＦＲのリン酸化の阻害を評価するために、試料を溶解し、上述のようにＢＣＡおよびＥＬＩＳＡアッセイを行う。
【０１８２】
ＥＧＦ誘導性ＥＧＦＲリン酸化の阻害
ＥＧＦ誘導性ＥＧＦＲリン酸化の阻害を以下の通り調べる：ＯＶＣＡＲ−３およびＡＤＲｒ細胞を３５，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種する。細胞を１０％血清中で２４時間インキュベートし、次いで、１４時間血清飢餓させる。次いで、異なる濃度の抗ＥＧＦＲ抗体とともに細胞を４０分間プレインキュベートする。プレインキュベーション後、培地を除去し、５０ｎＭヒトＥＧＦを用いて５分間３７℃、５％ＣＯ２で細胞を刺激する。ＥＧＦ対照（５分、５ｎＭ）、１０％血清、および０％血清対照も用いる。１Ｘ冷ＰＢＳで細胞を洗浄し、氷上で３０分間インキュベートすることにより、５０μＬ氷冷溶解バッファー（新しく添加したプロテアーゼ阻害剤を含むＲ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  Ｂｕｆｆｅｒ１２）中に溶解させる。溶解物は、すぐに分析するか、または後に使用するまで−８０℃で冷蔵する。
【０１８３】
腫瘍細胞におけるＥＧＦ媒介性シグナル伝達の阻害
リガンド媒介性腫瘍細胞シグナル伝達の阻害を以下のように調べる：ＯＶＣＡＲ−３またはＤｕ１４５細胞を９６ウェル組織培養プレートに播種し、抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中、２４時間３７℃および５％二酸化炭素で増殖させる。細胞は、抗生物質および２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中、２４時間３７℃および５％二酸化炭素で血清飢餓させる。細胞を１μＭ、２５０ｎＭ、６３ｎＭ、１６ｎＭ、４．０ｎＭ、１．０ｎＭ、２４０ｐＭ、および６１ｐＭの濃度の抗ＥＧＦＲ抗体を用いるかまたは用いずに３０分間前処理し、次いで、１０分間３７℃および５％二酸化炭素で、ＥＧＦリガンドを用いて刺激する。冷ＰＢＳで細胞を洗浄し、次いで、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、５０ｍＭフェナラルシン、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、およびプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７１４）を含む哺乳動物タンパク質抽出（ＭＰＥＲ）溶解バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ、７８５０５）を用いて回収する。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水中の４％ウシ血清アルブミンで細胞溶解物を２倍に希釈し、次いで、ＥＬＩＳＡによりＡＫＴ（ＥＧＦＲの下流エフェクター）およびＥＧＦＲのリン酸化について分析する。
【０１８４】
ＡＫＴのリン酸化について検査するために、ＡＫＴに特異的な捕捉抗体およびＡＫＴのセリン４７３上のリン酸化部位に特異的なビオチニル化検出抗体を用いて、ＥＬＩＳＡプレート上で溶解物を調べた。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたストレプトアビジンが化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ、３７０７０）と反応すると信号が発生する。
【０１８５】
実施例１：抗体の生成
ヒト抗ＥＧＦＲ抗体を得るために、米国特許公開第２０１０００５６３８６号および第２００９０１８１８５５号に開示される方法に従って発現ライブラリーをスクリーニングする。
【０１８６】
実施例２：結合親和性／エピトープビニング
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して結合親和性を分析する。具体的には、タンパク質のうちの１つ（抗体または標的）をチップの表面に（本明細書に記載されるように）固定化し、他のタンパク質を添加する。２つのタンパク質の会合／解離相互作用を測定する。溶液中のタンパク質が固定化タンパク質と会合すると、屈折率の増加が生じ、共鳴信号によって捕らえられる。タンパク質が解離すると信号の低下が生じる。
【０１８７】
上述のようにＢＩＡＣＯＲＥ解析を用いてエピトープビニング（ＥＧＦのブロッキング）を分析する。抗体のうちの１つをチップの表面に固定化する。ＥＧＦＲが抗体と会合すると、共鳴信号が増加する。次いで、チップを再生し、ＥＧＦＲおよび別の抗体（例えば、以前にＥＧＦＲに結合することが分かった抗体）の混合物を注入する。抗体が、注入された抗体と重複するエピトープに結合すると、単独で注入されたＥＧＦＲと比較して信号は低い。次いで、チップを再び再生し、ＥＧＦリガンドおよびＥＧＦＲの混合物を注入する。共鳴信号を測定する。シグナルの減少は、ＥＧＦリガンドと重複するエピトープを意味する。最終的にチップを再生し、ＥＧＦＲとともに注入して抗体の活性を確認する。
【０１８８】
実施例３：腫瘍細胞におけるＥＧＦＲリン酸化の阻害
特定の抗ＥＧＦＲ抗体によるＡＤＲｒ、Ｏｖｃａｒ３、およびＡ４３１細胞におけるＥＧＦＲのリン酸化の阻害を上述のように分析する。
【０１８９】
実施例４：腫瘍細胞におけるＡＫＴリン酸化の阻害
抗体の組み合わせについて、Ｄｕ１４５およびＯｖｃａｒ３細胞におけるＡＫＴのリン酸化の阻害を上述のように分析する。（１）ＥｒｂＢ１の高い発現（１０５受容体／細胞超）および（２）５倍以上のｐＡＫＴ誘導の動的範囲という２つのパラメータに基づいて２つの細胞株を検査する。
【０１９０】
エピトープマッピングとは関係なく、全ての抗ＥＧＦＲ抗体を別の抗ＥＧＦＲ抗体と組み合わせる。６点の阻害曲線を作成する。多くのペアおよびトリオは１０Ｘ連続希釈して２μＭのピーク濃度とし、いくつかは４点希釈曲線を用いてスクリーニングする。
【０１９１】
相加的または相乗的にｐＡＫＴを阻害する全ての抗体を異なるエピトープにマッピングする。いくつかのペアは、セツキシマブよりも強力な阻害剤である。２つの細胞株における結果は互いに酷似しており、変異した受容体またはシグナル伝達経路（例えば、ｋＲＡＳ）の非存在下において、ＥｒｂＢ１の高い発現（おそらくはＥｒｂＢ１＞ＥｒｂＢ２／３）が相乗作用の開始基準であることを示唆している。
【０１９２】
抗体の４０分間のプレインキュベーションにより、抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせを用いて短期間および長期間の阻害試験を行う。４０分でアッセイを繰り返し、２４時間の抗体のプレインキュベーションと比較する。データは、ＥＧＦＲの内部移行および分解による変化測定値を示す。
【０１９３】
実施例５：腫瘍細胞増殖の阻害
腫瘍細胞増殖の阻害を上述のように分析する。本明細書に提供されるペアおよびトリオがＤＵ１４５細胞に与える阻害作用は、好ましくは強力である。また、好ましい抗体のペアおよびトリオは、等モル濃度のセツキシマブよりも高いＤｕ１４５細胞増殖の阻害を示す。ペアおよびトリオは、ｐＥＲＫアッセイにおいても評価される。好ましいペアおよびトリオは、ｐＥＲＫシグナル伝達の強力な拮抗薬である。
【０１９４】
実施例６〜１２の材料および方法
別途記載のない限り、実施例６〜１３を通して以下の材料および方法が用いられる。
【０１９５】
一般に、別途指定のない限り、本発明の実践は、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば抗体技術）の従来技術、およびポリペプチド調製の標準的な技術を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照されたい。ＨＣＶ生物学を評価するためのインビトロおよびインビボのモデル系は、例えば、Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｐａｒｔ  ＩＩ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ，Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．（ＮＹ）．；３４（２）：３９−４７（２００５）およびＴｈｅ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ＩＬＡＲ  Ｊ．；４２（２）：１１７−２６（２００１）に記載される。
【０１９６】
細胞株
以下に記載される実験で用いられる全ての細胞株は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅまたはＡＴＣＣより調達する。
細胞株：
Ａ４３１−類表皮癌
Ｄｕ１４５−前立腺癌
Ｈ１９７５−非小細胞肺癌
【０１９７】
ＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ）変異体のタンパク質精製
ｍＡｂエピトープビニングのためにＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ）の変異体を産生させる。変異体は、セツキシマブ（Ｌｉ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．７：３０１−３１１，２００５）およびＨ１１（Ｓｐａｎｇｌｅｒ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ．１０７：１３２５２−１３２５７，２０１０）のエピトープ、ならびにＥＧＦＲ−ＥＣＤ構造の構造解析（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ＩＤ：１ＮＱＬ；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｋ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．１１：５０７−５１７，２００３）に基づいて設計した。この出願に含まれるタンパク質配列に記載されるように残基をアラニンに変異させる。発現構築物のＤＮＡ合成は、ＤＮＡ２．０によって完了する（ｗｗｗ．ｄｎａ２０．ｃｏｍ）。その後のＤＮＡサブクローニング、２９３Ｆ細胞におけるタンパク質の発現、およびタンパク質の精製は、以前に記載されるように完了する。
【０１９８】
腫瘍細胞におけるＥＧＦＲまたはＥＲＫのＥＧＦ媒介性シグナル伝達の阻害
リガンド媒介性腫瘍細胞シグナル伝達の阻害を以下のように調べる：Ａ４３１またはＤｕ１４５細胞を３５，０００細胞／ウェルまたは１７，５００細胞／ハーフウェルの密度で９６ウェル組織培養プレートに播種し、抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０倍地中、２４時間３７℃および５％二酸化炭素で増殖させる。細胞は、抗生物質および２ｍＭのＬ−グルタミンを含む１％ＦＢＳ培地中、約２０時間３７℃および５％二酸化炭素で血清飢餓させる。次いで、様々な濃度の抗ＥＧＦＲ抗体で細胞を２時間プレインキュベートし、次いで、１０分間３７℃および５％二酸化炭素で、ヒトＥＧＦリガンド（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号ＡＦ−１００−１５）を用いて刺激する。細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、氷上で３０分間インキュベートすることにより、５０μＬの氷冷溶解バッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７１４）で改良した哺乳動物タンパク質抽出溶解バッファー（ＭＰＥＲ−Ｐｉｅｒｃｅ，７８５０５））中に溶解させる。溶解物は、ＥＲＫ（ＥＧＦＲの下流エフェクター）およびＥＧＦＲのリン酸化についてＥＬＩＳＡによりすぐに分析するか、または後に使用するまで−８０℃で冷蔵する。
【０１９９】
ＥＬＩＳＡアッセイ
ホスホ−ＥＧＦＲサンドイッチＥＬＩＳＡのために、９６ハーフウェルのＧＲＥＩＮＥＲ高結合プレート（カタログ番号６７５０７７、ＧＲＥＩＮＥＲ  ＢＩＯ−ＯＮＥ、Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣ）を５０μＬのＥＧＦＲ抗体（ＥＧＦＲ  Ａｂ−１１、Ｃｌｏｎｅ：１９９．１２（ＢＳＡおよびアジドを含まない）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＭＳ３９６Ｐ１ＡＢＸ）で被覆し、室温で一晩インキュベートする。翌朝、ＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャー上で、１００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）でプレートを３回洗浄する。その後、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡを用いて、約１時間室温でプレートをブロックする。ＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャー上で、１００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）でプレートを３回洗浄する。５０％溶解バッファーおよび１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（製造業者の推奨に従って）に希釈した細胞溶解物（５０μＬ）または標準物質（ｐＥＧＦＲ  ｐＹ１０６８  ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹＣ３５７０）を２通りプレートに添加し、振盪させながら室温で２時間または４℃で一晩インキュベートする。次いで、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）を用いて、ＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャーで１００μＬ／ウェルでプレートを３回洗浄する。２％ＢＳＡに希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ｐＥＧＦＲ  ｐＹ１０６８  ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹＣ３５７０）と結合された約５０μＬの検出抗体、ＰＢＳを添加し、室温で約２時間インキュベートする。ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャーで１００μＬ／ウェルでプレートを３回洗浄する。約５０μＬのＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ  ＰＩＣＯ  ＥＬＩＳＡ基質を添加し、（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）プレートリーダーを用いてプレートを読み取る。データを分析し、二連の試料を平均し、エラーバーを用いて２つの繰り返しの標準偏差を表す。
【０２００】
ホスホ−ＥＲＫのＥＬＩＳＡは、以下の変更を伴ってホスホ−ＥＧＦＲのＥＬＩＳＡと同様に行う：Ｈｕｍａｎ  ｐＥＲＫ  ＥＬＩＳＡ  ＤｕｏｓｅｔキットをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＤＹＣ１０１８−５）から購入し、製造者によって推奨されるように使用する。
【０２０１】
ＥＧＦＲ−ＥＣＤ野生型（ＷＴ）、ビン１エピトープ変異体、またはビン３エピトープ変異体を捕捉試薬（４μｇ／ｍＬ）として用いて直接ＥＬＩＳＡを行う。９６ハーフウェルのＧＲＥＩＮＥＲ高結合プレート（カタログ番号６７５０７７、ＧＲＥＩＮＥＲ  ＢＩＯ−ＯＮＥ、Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣ）を５０μＬの捕捉試薬で被覆し、一晩室温でインキュベートした。翌朝、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢＩＯＴＥＫプレートウォッシャーで１００μＬ／ウェルでプレートを３回洗浄し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ（ｐＨ７．２）を用いて、室温で約１時間プレートをブロックする。ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ（ｐＨ７．２）に希釈した様々な濃度（１、０．２５、０．０６、および０．０２μｇ／ｍＬ）のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を捕捉試薬とともに室温で２時間インキュベートした後、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ（ｐＨ７．２）中のＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０９−０３５−００８）の１：５０，０００希釈物を用いて２時間検出を行った。約５０μＬのＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  ＰＩＣＯ  ＥＬＩＳＡ基質を添加し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）プレートリーダーを用いてプレートを読み取る。データを分析し、二連の試料を平均し、エラーバーを用いて２つの繰り返しの標準偏差を表す。２μＭ、６６６．６ｎＭ、２２２．２ｎＭ、７４ｎＭ、２４．７ｎＭ、８．２ｎＭ、２．７ｎＭ、９１４ｐＭ、および３０４ｐＭの濃度の抗ＥＧＦＲ抗体を用いるかまたは用いずに、細胞を２時間前処理する。
【０２０２】
結合親和性：速度論的排除アッセイ（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）（ＫｉｎＥｘＡ）
抗体の親和性および交差反応性も、ＫｉｎＥｘＡ計測手段（ＳＡＰＩＤＹＮＥ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）を用いて、組換えＥＧＦ受容体を含む溶液中で測定する。このアッセイに使用される材料は、ＫｉｎＥｘＡ３０００機器およびソフトウェア（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）ビーズ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ヒト抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ、組換えヒトＥＧＦＲ、Ｃｙ５結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、およびＰＢＳ（１００ｍｇ／ｍＬ）中のウシ血清アルブミンである。
【０２０３】
組換えＥＧＦ受容体をＰＭＭＡビーズにカップリングさせるために、２００ｍｇのＰＭＭＡビーズの予め測定したアリコートに１００μｇの組換えＥＧＦＲを添加し、ＰＢＳを添加して合計体積を１ｍＬとする。ビーズを回転ホイール上、室温で１時間インキュベートする。次いで、ビーズを短時間遠心分離し、上清を除去する。ＰＢＳ中１００μＬの１００ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡをビーズに添加し、ＰＢＳをさらに添加して合計体積を１ｍＬとする。再び、ビーズを回転ホイール上、室温で１時間インキュベートする。次いで、ビーズを２７ｍＬのＰＢＳを含むガラス瓶に移す。
【０２０４】
一価抗体の結合親和性を測定するために、一定濃度の抗ＥＧＦＲ抗体を有する５ｍＬのＰＢＳ中に組換えＥＧＦＲの１２段階希釈系列（７５ｎＭ、２５ｎＭ、８．３ｎＭ、２．８ｎＭ、０．９ｎＭ、０．３ｎＭ、１００ｐＭ、３３ｐＭ、１１ｐＭ、４ｐＭ、１．３ｐＭ、０ｐＭ）を調製する。正確な親和性の測定のために、全抗体結合部位濃度（「ＡＢＣ」、原子価に起因して抗体のモル濃度の２倍）は、ＥＧＦＲに対する抗体の一価親和性より低くあるべきである。平衡を達成するために、抗体−受容体混合物を室温で２時間インキュベートする。抗体−受容体複合体の予想される親和性に応じて、この平衡時間を調節してもよい。ＰＢＳ中の原液（２ｍｇ／ｍＬ）抗体の１：１０００希釈物を用いて、別のチューブ内に２μｇ／ｍＬのＣｙ５結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体１５ｍＬを調製する。次いで、ＫｉｎＥｘＡ機器ラインを１２本の抗体−受容体溶液チューブの各々に取り付ける。充填したＥＧＦＲビーズカラムを通して各溶液を注入する（ＫｉｎＥｘＡ機器は、各注入ごとに新しいビーズカラムを自動的に充填する）。洗浄ステップの後、標識化した二次抗体をカラムに通過させる。最後に、異なる受容体濃度の複合体を形成していない受容体の測定量を用いて、平衡滴定データをＫｉｎＥｘＡソフトウェアの１：１結合モデルに当てはめて親和性値Ｋｄを得る。
【０２０５】
ＫｉｎＥｘＡの「直説法」を用いて結合オン速度を測定するために、上記アプローチおよび全抗体結合部位濃度（ＡＢＣ）を用いて平衡一価結合親和性（ＫＤ）を決定する。次いで、「Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｕｒｖｅ  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ」ソフトウェア（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、速度論実験のための出発抗原濃度（Ｌ０）を決定する。これを行うために、一価結合親和性実験において決定された親和性およびＡＢＣ値を入力し、平衡状態で抗体の約２０％が抗原に結合しない濃度として出発抗原濃度を選択する。これにより、実験中、良好なシグナル対ノイズ比を確保する。ＰＢＳ中の原液（２ｍｇ／ｍＬ）抗体の１：１０００希釈物を用いて、２μｇ／ｍＬのＣｙ５結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体１５ｍＬを調製する。別のチューブに、８ｍＬの抗ＥＧＦＲ抗体溶液を２ｘＡＢＣの濃度で調製する。これは、実験前に８ｍＬの抗原溶液と混合されるため、この濃度は実験濃度の２倍である。別のチューブに、８ｍＬの組換えＥＧＦＲ溶液を２ｘＬ０の濃度で調製する。これは、実験前に８ｍＬの抗体溶液と混合されるため、この濃度も実験濃度の２倍である。次いで、ＥＧＦＲで被覆したビーズおよび二次抗体溶液を、それぞれ適切な容器およびラインに配置する。抗体および抗原溶液を十分に混合し、すぐに適切なラインに接続し、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを使用して、時間の関数として得られた溶液内の遊離抗体の量を測定する。会合定数Ｋｏｎ（Ｋｏｎ）を決定するために、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを使用して、可逆性二分子反応速度式に対する時間の関数として遊離抗体の量の欠乏を当てはめる。解離定数Ｋｏｆｆ（Ｋｏｆｆ）は、Ｋｏｎ＊ＫＤ（Ｋｄ）と等しい。
【０２０６】
結合親和性：表面プラズモン共鳴アッセイ
表面プラズモン共鳴アッセイを以下のように行う。
【０２０７】
抗体または抗原（３００ＲＵ）のいずれかをアミンカップリングによりＣＭ５チップ上に固定化する。次いで、異なる濃度の抗体または抗原を、固定化タンパク質とそれらの会合および解離を調べるために注入する。異なる注入の間に、好適な再生バッファー（ｐＨ２．５グリシン等）を用いてチップを再生する。Ｋｏｆｆ（解離定数）を測定するために、方程式１を用いて解離相を適合させる。
Ｒ＝Ｒ０＊ｅｘｐ（−Ｋｏｆｆ＊ｔ）              （１）
Ｋｏｎ（会合速度）およびＫＤ（平衡定数）を測定するために、このＫｏｆｆの値および方程式２を用いて解離相を適合させる。
2013533211.tif 000011
式中、Ｃは溶液中の抗原または抗体のいずれかの濃度を表し、Ｒｍａｘは飽和信号を表し、ｔは時間を表す。
【０２０８】
細胞結合アッセイ
ＫＤ値を測定するための細胞結合アッセイを以下の通り行う：３７℃で５分間、３ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡでＡ４３１を剥離させる。トリプシン処理した細胞に完全ＤＭＥＭ（１０ｍＬ）をすぐに添加し、穏やかに再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離機で５分間１１００ｒｐｍで遠沈させる。１ｍＬ当たり２×１０６細胞の濃度で細胞を染色バッファー（ＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡ＋０．１％アジ化ナトリウム）に再懸濁し、５０μＬ（１×１０５細胞）アリコートを９６ウェルタイタープレートに入れる。
【０２０９】
染色バッファー中で２０００ｎＭ抗ＥＧＦＲ抗体の原液３００μＬを調製し、そのうち１００μＬを２００μＬの染色バッファー中で連続的に希釈する。希釈された抗体の濃度は、２０００ｎＭ〜０．１ｎＭの範囲である。次いで、異なるタンパク質希釈物の１５０μＬのアリコートを５０μＬの細胞懸濁液に直接添加し、１５００ｎＭ、５００ｎＭ、１６６．７ｎＭ、５５．６ｎＭ、１８．５ｎＭ、６．１７ｎＭ、２．０５ｎＭ、０．６８ｎＭ、０．２３ｎＭ、および０．０７６ｎＭの抗体の最終濃度を得る。
【０２１０】
９６ウェルプレートに分注した細胞を、振盪させながら室温で２時間タンパク質希釈物とともにインキュベートし、３００μＬの染色バッファーで３回洗浄する。次いで、ＢＤ染色バッファー中のＡｌｅｘａ６４７標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧの１：７５０希釈物１００μＬで、振盪させながら４℃で４５分間細胞をインキュベートする。最後に細胞を２回洗浄し、ペレット化し、２５０μＬの染色バッファー＋０．５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムに再懸濁する。ＦＬ４チャネルを用いたＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲフローサイトメーターで１０，０００個の細胞の分析を行う。抗ＥＧＦＲ−抗体のＭＦＩ値および対応する濃度を、それぞれＹ軸およびＸ軸上にプロットする。非線形回帰曲線のための１部位結合モデルを用いたＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して、分子のＫＤを決定する。
【０２１１】
ＫＤ値は、式Ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／ＫＤ＋Ｘ（Ｂｍａｘ＝飽和時の蛍光、Ｘ＝抗体濃度、Ｙ＝結合の程度）に基づいて計算する。
【０２１２】
インビトロでの腫瘍細胞増殖の阻害
ＥＧＦＲを発現する細胞（例えば、癌細胞）の細胞増殖の阻害を以下のようにインビトロで調べる：Ｈ１９７５またはＡ４３１細胞を２５０、５００、１０００、または２，０００細胞／ウェルで９６ウェル組織培養プレートに播種し、抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中、２４時間３７℃および５％二酸化炭素で増殖させる。次いで、１μＭの抗体（最終濃度）の存在下または非存在下で５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを補充したＲＰＭＩ−１６４０（抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％ＦＢＳを含む）に培地を交換する。３７℃および５％二酸化炭素で６日間細胞を増殖させる。製造者の指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（ＣＴＧ）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、細胞生存率を測定する。ＣＴＧアッセイは、代謝的に活性な細胞の指標である、存在するＡＴＰの定量化に基づいて培養物中の生存細胞の数を測定する。対照処理は、抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％ＦＣＳを含むが、５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦは補充されていないＲＰＭＩ−１６４０で処理した細胞（１％ＦＣＳ処理と称される）、ならびに抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミンを含むが、ＦＣＳまたはＥＧＦのいずれも補充されていないＲＰＭＩ−１６４０で処理した細胞（無血清培地またはＳＦＭ処理と称される）を含む。
【０２１３】
マウス異種移植片インビボ試験
Ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）に３．５ｘ１０６のＡ４３１細胞または２．０ｘ１０６のＨ１９７５細胞を皮下注射し、結果として生じる腫瘍を平均サイズ２００ｍｍに達するまで増殖させる。次いで、以下のように投薬を開始する。マウスＥＧＦＲと交差反応性の抗体を２日毎（ｑ２ｄ）に与え、非交差反応性の抗体を４日毎（ｑ４ｄ）に与える。３日間隔で測定を行う。それぞれ、５回および７回投与後に、Ａ４３１およびＨ１９７５の投与を中止する。両方の試験について回復期間を維持する。均一な血清半減期を表すように抗体の用量を正規化した。
【０２１４】
実施例６：結合親和性／エピトープビニング
上述のようにＢＩＡＣＯＲＥ解析を用いてエピトープビニングを分析する。抗体のうちの１つをチップの表面に固定化する。ＥＧＦＲが抗体と会合すると、共鳴信号が増加する。３つのビン１、２、および３に属する抗体の連続注入を行う。抗体が、注入した抗体と重複するエピトープに結合すると、以前の注入と比較して信号は変化しない。抗体が、非重複エピトープに結合すると、チップ上の信号が以前の注入よりも高くなる。最終的に、チップに結合させた抗体を遊離リガンドとして注入し、重複エピトープとの結合がないことを確認する（図１７Ｄ）。
【０２１５】
ビンは、選択された抗体がＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）上の３つの異なる非重複エピトープにまたがるように設計した。これらは、３つのビンにグループ化される：ビン１は、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩにマッピングされ、ｃ２２５エピトープを表し（セツキシマブが結合する部位）、ビン２は、ドメインＩにマッピングされ、ＩＣＲ１０エピトープを表し（Ａｂｃａｍ  Ａｂ２３１）（Ｃｏｃｈｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８７：１４７−１５８）、ビン３は、ドメインＩＩＩにマッピングされ、クローンＨ１１エピトープを表す（Ｓｐａｎｇｌｅｒ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ．１０７：１３２５２−１３２５７，２０１０）。ＥＧＦＲ細胞外ドメイン中の、下に太字で示すアミノ酸位置でのエピトープマッピングのために、ビン１（Ｂ１−７ＭＴ−Ａｌａ）およびビン３（Ｂ３−４ＭＴ）変異体を産生させた。
ＥＧＦＲ  ＥＣＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）
2013533211.tif 000012
【０２１６】
以下の置換変異体は、以下の変異体残基を有するビン１（Ｂ１）およびビン３（Ｂ３）エピトープ変異体を作製するために、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて示されるアミノ酸位置で作製した。
変異体
ビン１（Ｂ１）変異体残基
Ｂ１−７ＭＴ−Ａｌａ：Ｑ４０８Ａ、Ｑ４３２Ｍ、Ｈ４３３Ｅ、Ｋ４６７Ａ、Ｋ４８９Ａ、Ｉ４９１Ａ、Ｎ４９７Ａ
ビン３（Ｂ３）変異体残基
Ｂ３−４ＭＴ：Ｓ３８０Ａ、Ｆ３８１Ｇ、Ｔ３８２Ａ、Ｈ３８３Ｇ
【０２１７】
ＥＧＦＲ−ＥＣＤ野生型（ＷＴ）、ビン１エピトープ変異体（ｃ２２５エピトープ）、またはビン３エピトープ変異体（Ｈ１１エピトープ）を捕捉試薬として用いて直接ＥＬＩＳＡを行った。様々な濃度の（１、０．２５、０．０６、および０．０２μｇ／ｍＬ）のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ｃａ（ビン１）、ｃｄ（ビン２）、およびｃｈ（ビン３）を捕捉試薬とともに室温で２時間インキュベートした後、ＨＲＰ結合抗ヒトＦｃポリクローナル抗体を用いて１時間検出を行った。図１７Ａに示すように、３つ全ての抗体がＥＧＦＲのＷＴ細胞外ドメインに結合した一方で、ビン１の抗体ｃａは、ビン１変異体エピトープに結合せず（図１７Ｂ）、ｃｈ抗体は、ビン３変異体エピトープに結合しなかった（図１７Ｃ）。
【０２１８】
抗ＥＧＦＲ抗体をさらに特徴付けるために、ｍＡｂ  ｃｈ（ビン３）をＢＩＡＣＯＲＥチップの表面に結合させた。０．５μＭのＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ）を注入した後、ｍＡｂ  ｃｄ（ビン２）、ｍＡｂ  ｃｂ（ビン１）、そして最後にチップ表面に結合させたビン３の抗体へのＥＧＦＲ  ＥＣＤの結合によってブロックされたエピトープに対する負の対照としてｍＡｂ  ｃｈ（ビン３）を連続的に注入した。図１７Ｄに示すように、３つのビンからの抗体は、順次ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、ビン１、２、および３に属するｍＡｂのエピトープが、重複しない異なるものであることを示すものであった。
【０２１９】
ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡＣＯＲＥによるエピトープマッピングの概要は下の表８に見出され、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）によって測定した結合親和性の概要は、下の表９に見出される。全ての親和性は、０．８ｎＭよりも良好であった。
【０２２０】
【表８】
2013533211.tif 000013
ｎ．ｄ．：決定せず（実験を行わなかった）。
有り：非重複エピトープに対応する結合事象を示す。
無し：重複エピトープに対応する結合事象の欠落を示す。
【０２２１】
【表９】
2013533211.tif 000014
【０２２２】
実施例７：非重複エピトープの２つの抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせによるホスホ−ＥＲＫシグナル伝達の阻害
２つまたは３つのビン（上述のビン１、ビン２、および３）の各々から１つの抗体を選択することにより、非重複抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせが、Ａ４３１腫瘍細胞中のｐＥＲＫ阻害によって測定されるＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達を阻害する能力について、その組み合わせを試験した。ビン１＋ビン３（図１８Ａおよび１８Ｂ）またはビン１＋ビン２の抗体（図１８Ｃ）の図示される等モル濃度の組み合わせとともにＡ４３１細胞を２時間インキュベートし、ホスホ−ＥＲＫのＥＬＩＳＡにより細胞溶解物を分析した。結果は、全てのペアの組み合わせがｐＥＲＫシグナル伝達の完全な阻害を引き起こすが、阻害曲線のＩＣ９０で異なる有効性を示すことを示すものである。
【０２２３】
実施例８：非重複エピトープの２つまたは３つの抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせによるＥＲＫリン酸化の阻害
抗体の組み合わせが、ｐＥＲＫ阻害によって測定されるＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する能力について、実施例７および上記方法の節に記載されるようにさらなる実験を行い、Ａ４３１細胞を等モル濃度のビン１／ビン２の抗体（図１９Ａ）、ビン１／ビン２、もしくはビン１／ビン３の抗体のダブルの（ペアの）組み合わせ（図１９Ｂ）、またはビン１、ビン２、およびビン３の抗体の３つの組み合わせ（図１９Ａ）を用いて処理した。ビン１＋ビン２の抗体、ビン１＋ビン３の抗体、またはビン１＋ビン２＋ビン３の抗体の組み合わせを用いた処理は、全て、ｐＥＲＫの生成における用量依存性の減少を示した。図１９Ａに示すように、非重複エピトープの等モル濃度の３つの抗体の組み合わせは、ＥＲＫの活性化を完全に阻害した。抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブと比較した場合、抗体ｃｂ（ビン１）およびｃｄ（ビン２）の２つ組の組み合わせは、阻害曲線のＩＣ５０およびＩＣ９０でｐＥＲＫシグナル伝達の減少において１００倍および１０００倍高い有効性を示した（図１９Ｂ）。さらに、２つ組の混合物がｐＥＲＫシグナル伝達を完全に阻害したのに対し、セツキシマブは、最も多い用量でも最大阻害には達しなかった（５０％のみ）。
【０２２４】
実施例９：非重複エピトープの２つの抗ＥＧＦＲ抗体の等モル濃度および非等モル濃度の組み合わせによるホスホ−ＥＲＫシグナル伝達の阻害
異なる比率（μｇ／ｍＬ）の抗体ペアｃｂおよびｃｄ（図２０Ａ）、ｃｂおよびｃｈ（図２０Ｂ）、ｃｂおよびｃｉ（図２０Ｃ）、ならびにｃａおよびｃｄ（図２０Ｄ）を用いてＡ４３１細胞を処理し、抗体ペアの組み合わせがＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する能力（ｐＥＲＫ阻害によって測定される）を測定した。個別に用いた場合（第２の抗体を含まず単独で３００μｇ／ｍＬ）、ビン２（ｃｄ）ならびにビン３（ｃｈおよびｃｉ）からの抗ＥＧＦＲ抗体は、ｐＥＲＫシグナル伝達の減少において効力を示さなかったのに対し（図２０Ａ、２０Ｂ、および２０Ｃ）、ビン１からの抗体（ｃｂおよびｃａ）は、有効性の向上を示した。全ての場合において、２つ組の組み合わせは、ｐＥＲＫシグナル伝達の完全な阻害をもたらした。等モル濃度から遠ざかるように比率を推移させた場合、ｃａおよびｃｄの２つ組を除いて、混合物の効力において等しい推移は見られなかった（図２０Ｄ）。これらの結果は、単一抗体成分に対する混合物の強度の向上と、インビトロでのシグナル伝達の完全な阻害に寄与する各成分の少なくとも１０％の認容性を示している。（すなわち、ｃｂ＋ｃｈの２７０＋３０μｇ／ｍＬの比率は、１５０＋１５０μｇ／ｍＬの組み合わせに対する強度に等しい）。これらのデータの概要を、ヒートマップによって表す（図２１）：Ｘ軸（列）は、抗体の濃度を示し、Ｙ軸（行）は、示す比率で組み合わされた抗体のペアを示し、Ｚ軸（平面内）は、ホスホ−ＥＲＫの活性比をグレースケールで示す。Ｚ軸のカラーマップは、高いホスホ−ＥＲＫ活性を白色で、低い活性を黒色で表し、そして中間的な活性をグレーの色調で表す。試料の値は、それらが分析されるＥＬＩＳＡプレート上の＋ＥＧＦリガンド対照の平均値に対して独立して正規化し、全プレートにわたるＥＧＦリガンド対照（＋／−）の平均値を左上に示す。
【０２２５】
実施例１０：単一によるおよびビン１＋ビン２またはビン１＋ビン３の抗体のペアの組み合わせによるホスホ−ＥＧＦ受容体およびホスホ−ＥＲＫのシグナル伝達の阻害、ならびにセツキシマブ、ニモツズマブ、およびザルツムマブ等の他の既知の抗ＥＧＦＲ抗体との比較
Ａ４３１細胞を単一抗体または抗体ペアで処理し、それらがＥＧＦＲ依存性シグナル伝達を阻害する能力を、既知の抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブ、ニモツズマブ、またはザルツムマブの能力と比較した。ｐＥＲＫおよびｐＥＧＦＲのシグナル伝達について上述のように実験を行い、その結果を図２２Ａ〜Ｃに示す。当該技術分野で既知である抗体、ならびに混合物の個々の成分ｃｂ、ｃｄ、およびｃｈと比較して、ホスホ−ＥＲＫシグナル伝達を完全に阻害する上で、ビン１／ビン２の抗体ｃｂおよびｃｄ（図２２Ａ）ならびにビン１／ビン３の抗体ｃｂおよびｃｈ（図２２Ｃ）のみが有効であった。ニモツズマブを除いて、混合物を含む全ての抗体は、ホスホ−ＥＧＦ受容体のシグナル伝達の完全な阻害に有効であった（図２２Ｂ）。
【０２２６】
実施例１１：インビトロでの腫瘍細胞増殖の阻害
上述の方法またはそれらを若干変更した方法によって、インビトロでの腫瘍細胞増殖の阻害を分析する。Ａ４３１細胞（類表皮）またはＨ１９７５細胞（ＮＳＣＬＣ）を２５０、５００、１０００、または２００細胞／ウェルで播種し、１μＭの抗体の組み合わせで処理した。図２３Ａ〜Ｄは、代謝的に活性な細胞の指標である、存在するＡＴＰの定量化に基づいて培養物中の生存細胞の数を測定するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（ＣＴＧ）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた細胞増殖の阻害を示す。図２３Ａは、ＥＧＦリガンドの存在下または非存在下において、ビン１および３の抗体ｃａ抗体ｃａで、またはＥＧＦＲ細胞外ドメインへの結合について抗体ｃａおよびｃｈと競合するが、無血清培地（ＳＦＭ）またはアッセイ培地単独（１％ＦＣＳ）では競合しない抗体で処理したＨ１９７５細胞の増殖の阻害を示す。図２３Ｂは、図２３Ａと同様の結果を示すが、ビン１および２の抗体ｃａおよびｃｄの組み合わせである。図２３Ｃ（Ｈ１９７５細胞）および２３Ｄ（Ａ４３１細胞）は、ビン１／２／３の抗体のトリオｃａ＋ｃｄ＋ｃｈで処理した細胞の細胞増殖の阻害を示す。この実施例で用いた全ての組み合わせは、抗体混合物がインビトロで腫瘍細胞の増殖を阻害する能力を明確に示している。
【０２２７】
実施例１２：インビボでの異種移植片モデルにおける腫瘍増殖の阻害
インビボでの腫瘍増殖の阻害を評価するために、類表皮腫瘍細胞株Ａ４３１（図２４Ａ）およびＮＳＣＬＣ腫瘍細胞株Ｈ１９７５（図２４Ｂ）を用いたマウス異種移植片腫瘍モデルにおいて、抗体ペアを用いる。７５匹の４〜５週齢のｎｕ／ｎｕマウスに、３．５ｘ１０６細胞／マウスのＡ４３１細胞または２．０ｘ１０６細胞／マウスのＨ１９７５細胞を皮下注射（移植）する。移植後８日目（Ａ４３１細胞）または４日目（Ｈ１９７５細胞）に開始してマウスに抗体ペアを投与する。前述の方法またはそれらを若干変更した方法を用いたところ、ビン１／２（ｃｂ＋ｃｄ）およびビン１／３（ｃｂ＋ｃｈ、ｃａ＋ｃｈ）の抗体ペアは、Ａ４３１細胞において少なくともセツキシマブと同じだけ腫瘍増殖の阻害に効果的であった。全ての処置は、腫瘍の停止状態をもたらし、それは、投与計画を中止した後の回復期間を通じて維持された。しかしながら、Ｈ１９７５細胞では、全ての処置が腫瘍の停止状態をもたらしたが、ｃａ＋ｃｈペアで処置したマウスを除く全てのマウスにおいて、投薬中止後に腫瘍が急速に退縮した。
【０２２８】
実施例１３：抗ＥＧＦＲ抗体による、細胞へのＥＧＦの結合の阻害
Ａ４３１細胞を、Ｔ−１５０ｃｍ２組織培養フラスコ内の（上述の）ＤＭＥＭ完全培地中でコンフルエントに増殖させ、１０ｍＬの氷冷ＰＢＳで洗浄し、細胞表面タンパク質のトリプシン処理を最小限に抑えるために注意深く剥離をモニタリングしながら、５ｍＬの０．２５％トリプシンで剥離させる（約５〜７分）。細胞が浮き上がり始めたら、すぐに１５ｍＬの完全培地を添加してトリプシンを希釈し、懸濁液中の細胞を５０ｍＬ円錐形遠心分離管に移し、１２００ｒｐｍで７分間遠心分離する。上清を廃棄し、細胞ペレットをフローサイトメトリー用バッファー（２％ウシ胎仔血清、１ＸＰＢＳバッファー中の０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．２）に再懸濁させる。１００μＬの体積中、３０，０００細胞／ウェルの密度で細胞を９６ウェルＶ底プレートに移す。各技術的複製物のために合計１２個のウェルに播種し（リガンド希釈曲線用に１１個、リガンドのみの対照用に１個）、各ウェルに４μＭの濃度の抗体反応混合物１００μＬを添加するが（ウェル内の最終濃度は２μＭ）、例外として、リガンドのみの対照ウェルにはフローサイトメトリーバッファーのみを添加する。細胞を抗体とともに室温で１時間インキュベートした後、ビオチン−ＸＸ−ＥＧＦリガンドのフローサイトメトリー用バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｅ３４７７）の３倍希釈物１００μＬを、６００ｎＭから開始して添加し（ウェル内の最終濃度は２００ｎＭ〜０．００３ｎＭの範囲）、室温で１０分間インキュベートする。次いで、１００μＬの氷冷フローサイトメトリー用バッファーで細胞を洗浄し、１８００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を廃棄する。次いで、フローサイトメトリー用バッファー中のＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７結合体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｓ２１３７４）の１：５００希釈物１００μＬ中、３０分間室温で細胞をインキュベートする。このステップの後、１００μＬの氷冷フローサイトメトリー用バッファー中で細胞を洗浄し、１８００ｒｐｍで２分間遠心分離した後、上清を廃棄する。洗浄ステップを繰り返し、８０μＬの固定バッファー（２％ウシ胎仔血清、１ＸＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド、ｐＨ７．２）に細胞を再懸濁し、９６ウェルＵ底プレートに移す。結合したリガンドを有する細胞をフローサイトメトリーにより検出し、生細胞およびＦＬ４チャネル（Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ６４７の信号を測定する）陽性細胞をゲートでコントロールする（ＦＳＣ／ＳＳＣ）。本明細書に開示される方法またはそれらを若干変更した方法を用いて得られた結果を図２５に示し、成果をその説明で記載する。
【０２２９】
均等物
当業者は、日常的な実験を用いるだけで、本明細書に記載される特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが企図される。いずれかの複数の従属請求項に開示される実施形態のいずれの組み合わせも、本開示の範囲内であることが企図される。
【０２３０】
参照による組み込み
上文で言及した全ての特許、係属中の特許出願、および特許公報は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３１】
付表Ａ
抗癌剤
2013533211.tif 000015
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【０２３２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８（ヒトＥＧＦＲ）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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