【事件の表示】
　特許第２５７５６０４号「沈澱異種蛋白質の精製及び活性化法」の特許請求の範囲第１項ないし第１９項に記載された発明の特許について、次のとおり決定する。
【結論】
　特許第２５７５６０４号の特許請求の範囲第１項ないし第１９項に記載された発明についての特許を取り消す。
【理由】
Ｉ．手続の経緯
　特許第２５７５６０４号に係る出願は、昭和５８年１２月２１日（パリ条約による優先権主張１９８２年１２月２２日、米国）の出願であって、平成８年１１月７日に設定登録されたものである。
ＩＩ．本件発明
　特許第２５７５６０４号に係る発明の要旨は、特許明細書の特許請求の範囲の請求項１及び請求項７に記載された次のとおりのものと認める。
「【請求項１】異種蛋白質発現産物を含有する屈折体を宿主細胞培養物から分離する方法であって、
▲１▼宿主細胞を緩衝溶液に懸濁するステップ、
▲２▼宿主細胞を破砕して屈折体を遊離させるステップ、及び
▲３▼顕微鏡により、細胞壁フラグメントを実質的に含んでいない屈折体のペレットが得られたことを確認できるまで低速遠心分離を１回またはそれ以上行うステップ、　　
を含む屈折体の分離方法。
　【請求項７】宿主細胞培養中の屈折体に含まれている異種蛋白質発現産物を賦活化する方法であって、
▲１▼宿主細胞を緩衝溶液に懸濁するステップ、
▲２▼宿主細胞を破砕して屈折体を遊離させるステップ、及び
▲３▼顕微鏡により、細胞壁フラグメントを実質的に含んでいない屈折体のペレットが得られたことを確認できるまで低速遠心分離を１回またはそれ以上行うステップ、
からなる方法により該屈折体を宿主細胞培養物から分離し、分離した屈折体を変性溶液と接触させることを特徴とする方法。」
（以下、上記請求項１及び請求項７に係る発明を、それぞれ本件発明１及び本件発明２という。）
ＩＩＩ．引用刊行物記載の発明
　先の取消理由通知において引用した刊行物１
（Ｋｌｅｉｄ，ｅｔ　ａｌ．，「Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１９８１），ｖｏｌ．２１４，ｐｐ．１１２５−１１２９）（以下、引用例という。）には、「口蹄疫用ウイルス蛋白質ワクチンのクローン：ウシおよびブタでの応答」との標題の下に、次の（ａ）〜（ｆ）に示す事項が記載されている。
（ａ）「成熟ウイルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）のＲＮＡから調製した口蹄疫ウイルスＡ１２の免疫原性キャプシド蛋白質ＶＰ３をコードするＤＮＡ配列を、大腸菌のトリプトファン　プロモータ　オペレータ系からキメラ蛋白質を発現するよう指定されたプラスミドに連結した。このプラスミドを用いて形質転換した大腸菌をトリプトファン欠失培地で生長させると、全細胞蛋白質の約１７％が不溶性かつ安定なキメラ蛋白質であることが判明した。精製したキメラ蛋白質は、口蹄疫ウイルスに特異的な抗体として、モルベースで対等にＶＰ３と競争した。この蛋白質を６頭のウシと２頭のブタに接種すると、高度の中和抗体および口蹄疫ウイルスの攻撃に対する高度の防御を誘発した。」（第１１２５頁の概要）
（ｂ）「我々は今回、ＦＭＤ（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅｓｓｅ）のための安全で、安定で且つ効果的なポリペプチドワクチンの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内における生合成を報告する。」（第１１２５頁右欄第６行〜第８行）
（ｃ）「ＶＰ３蛋白質のほぼ全てをコードする配列を、制限酵素（制限エンドヌクレーゼ）ｐｓｔＩおよびＰｖｕＩＩ（図１、図２）を用いた切断によって、プラスミドｐＴ４６５から回収した。ＶＰ３蛋白質のコドン８〜２１１（図２）は、前記２カ所の切断部位の間に位置する６１０の塩基対（ｂｐ）の中にある。このフラグメントを、トリプトファン（ｔｒｐ）先端（Ｌ）遺伝子およびｔｒｐＥ蛋白質遺伝子（図３）の最終から３番目の遺伝子からコードされる大腸菌蛋白質ｔｒｐ△ＬＥ１４１３（１４）に結合するＶＰ３の合成を指令するよう指定されたｔｒｐプロモータ　オペレータを用いて、プラスミドｐＦＭ１の中に取り込んだ。１９０個のアミノ酸（１５）を有するＬＥセグメントは、細菌中では不溶性であり蛋白質分解に耐性である（１６）ために、融合蛋白質の一部として極めて有用である。この蛋白質は、位相差顕微鏡によって生きた細菌中で屈折体として見ることができ、大腸菌溶解物の細胞破片中に回収される。（１６）」（第１１２６頁左欄第３行〜同中欄第１０行）
（ｄ）「シェーカーフラスコ（Ａ５５０ｎｍ＝２）内で３７゜Ｃの温度下、トリプトファン欠失培地（１９）で増殖した８００ｍｌの培養組織中の組換え細菌（大腸菌２９４／ｐＦＭ１）を、４０００ｇで遠心分離して採取した。細菌を８０ｍｌのＴＥＮ
［５０ｍＭ　ｔｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．３Ｍ　ＮａＣ１］中に再懸濁し、氷上でリゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて１５分間処理してＮＰ−４０で０．２％とした。１０分後、１２０ｍｌの１．５ＭＮａＣｌおよび１２ｍＭＭｇＣｌ２で希釈し、氷上でデオキシリボヌクレアーゼ（２μｇ／ｍｌ、最終濃度）と
共に１時間撹拌した。この処理によって、不溶性ＬＥ’−ＶＰ３蛋白質を含む大腸菌溶菌物を生じ、不溶性ＬＥ’−ＶＰ３蛋白質は、４℃の温度下４０００ｇで１５分間の遠心分離によって回収され、次に３０ｍｌのＴＥＮに再懸濁して３回洗浄した。沈殿物はＢｉｏＲａｄ染色−結合アッセイによる蛋白質を４５０ｍｇ（全蛋白質の約４５％）を含み、その内１７０ｍｇ、すなわち全大腸菌蛋白質の約１７％は、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析スキャニング（２０）によるＬＥ’−ＶＰ３融合蛋白質であった。（図４）」（第１１２６頁右欄第８行〜３４行）
（ｅ）「融合蛋白質を、８Ｍ尿素中で厚さ１ｃｍの１０％スラブゲルを用いて、２回の連続する硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥを実施することによって精製した（２１）。ゲルを冷やすことによって見える（２０）蛋白質含有帯域を取り除き、蛋白質を電気溶離または微粉砕することによって回収した（２２）。ＰＡＧＥゲルスラリーをｔｒｉｓ−ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ８．３）および０．０５Ｍβ−メルカプトエタノールを含有する０．１％ＳＤＳに溶解（ｂｅ　ｔａｋｅｎ　ｕｐ）し、５分間１００℃まで熱して蛋白質の可溶化を促進した。」（第１１２６頁右欄３５行〜４７行）
（ｆ）「この産物は、ＶＰ３に特異的な抗体の１２５Ｉウイルスに対する競合アッセイ、および家畜のワクチン接種のために使用した。図４は、大腸菌蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離した後の、オートラジオグラフィによるＬＥ’−ＶＰ３融合蛋白質のＶＰ３抗原反応性を示している。融合蛋白質ＬＥ’−ＶＰ３（レーン３ａと４ａ）とＦＭＤＶからのＶＰ３（レーン５ａ）のみが、１２５ＩでラベルしたＶＰ３に特異的な抗体との反応性を示している。」（第１１２６頁右欄４８行〜５８行）
ＩＶ．対比・判断
（本件発明１について）
　本件発明１と引用例に記載の発明を対比すると、引用例に記載の「不溶性ＬＥ’−ＶＰ３蛋白質」は、本件発明１の「異種蛋白質発現産物を含有する屈折体」に相当し、また、引用例に記載の「細菌を８０ｍｌのＴＥＮ［５０ｍＭ　ｔｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ］中に再懸濁させ」、「氷上でリゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて１５分間処理してＮＰ−４０で０．２％とした。１０分後、１２０ｍｌの１．５ＭＮａＣｌおよび１２ｍＭＭｇＣｌ２で希釈し、氷上でデオキシリボヌクレアーゼ（２μｇ／ｍｌ、最終濃度）と共に１時間撹拌した」、及び「不溶性ＬＥ’−ＶＰ３蛋白質は、４℃の温度下４０００ｇで１５分間の遠心分離によって回収され、次に３０ｍｌのＴＥＮに再懸濁して３回洗浄した」は、それぞれ本件発明１の［▲１▼宿主細胞を緩衝溶液に懸濁するステップ」、「▲２▼宿主細胞を破砕して屈折体を遊離させるステップ」、及び「▲３▼……低速遠心分離を１回またはそれ以上行うステップ」に相当することから、両者は、異種蛋白質発現産物を含有する屈折体を宿主細胞培養物から分離する方法であって、宿主細胞を緩衝溶液に懸濁するステップ、宿主細胞を破砕して屈折体を遊離させるステップ、及び低速遠心分離を１回またはそれ以上行うステップ、を含む屈折体の分離方法の点で一致し、次の点で相違する。
　相違点
　本件発明１は、ステップ▲３▼において、顕微鏡により、細胞壁フラグメントを実質的に含んでいない屈折体のペレットが得られたことを確認できるまで低速遠心分離を１回またはそれ以上行うのに対して、引用例には、顕微鏡により、細胞壁フラグメントを実質的に含んでいない屈折体のペレットが得られたかどうかを確認することについて記載されていない点。
　上記相違点について検討する。
　宿主細胞培養物から屈折体をペレットとして分離、回収する際に、宿主細胞由来の細胞壁フラグメント等を分離、除去して、できる限り他の夾雑物を含まない調製物をペレットとして回収しようとすることは、当業者なら当然に考えることである。
　そして、ＬＥ’−ＶＰ３融合蛋白質は、顕微鏡により、生きた細菌中において屈折体として見ることができることが引用例に記載されており、かかる記載は、顕微鏡により、宿主細胞破砕物中で上記屈折体を細胞壁フラグメント等の他の細胞破砕物から識別できることを教示するものであるから、低速遠心分離により回収したペレット中に細胞壁フラグメントが含まれないようにするために、顕微鏡により、細胞壁フラグメントを実質的に含んでいない屈折体のペレットが得られたことを確認できるまで低速遠心分離を１回またはそれ以上行うことは、当業者が容易になし得ることである。
　そして、上記相違点を勘案するに、本件発明１は、引用例に記載の発明に比較して格別顕著な効果を奏するものではない。
（本件発明２について）
　本件発明２は、本件発明１の上記▲１▼〜▲３▼のステップに、更に「分離した屈折体を変性溶液と接触させる」工程を付加して、宿主細胞培養中の屈折体に含まれている異種蛋白質発現産物を賦活化する方法の発明である。
　本件発明２と引用例に記載の発明を対比すると、引用例に記載の「ＳＤＳ」及び「尿素」の溶液は、本件発明２の「変性溶液」に相当し、また精製して得られた「ＬＥ’−ＶＰ３融合蛋白質」がＶＰ３に特異的な抗体と反応することが引用例に記載され、引用例において得られた「ＬＥ’−ＶＰ３融合蛋白質」は、賦活化されたものであるといえることから、両者は、本件発明１の上記対比で摘記したとおりの点で相違し、その余の点で両者は一致している。
　したがって、本件発明２は、本件発明１と同様の理由で、当業者において容易になし得ることである。
Ｖ．むすび
　以上のとおり、本件の請求項１及び請求項７に係る発明は、引用例に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、当該発明の特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものであり、同法第１１３条第２号に該当し、取り消されるべきものである。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１１年１月２９日（１９９９．１．２９）