(57)【要約】  本開示は、（本願で定義するように）ＨＥＲ３に対して指向しているアミノ酸配列、また同様に、化合物又はコンストラクト、特にタンパク質及びポリペプチドであって、１以上のかかるアミノ酸配列を含むか又は実質的にこれらからなるもの（本願では、それぞれ「本発明のアミノ酸配列」、「本発明の化合物」、及び「本発明のポリペプチド」とも称される）に関する。本開示はまた、かかるアミノ酸配列及びポリペプチドをコードする核酸（本願では「本発明の核酸」又は「本発明のヌクレオチド配列」とも称される）、かかるアミノ酸配列及びポリペプチドの製造方法、かかるアミノ酸配列又はポリペプチドを発現するか又は発現することができる宿主細胞、組成物、特に医薬組成物であってかかるアミノ酸配列、ポリペプチド、核酸及び／又は宿主細胞を含む組成物、及び、特に予防、療法又は診断用の目的、例えば本願で述べる予防、療法又は診断用の目的のためのかかるアミノ酸配列又はポリペプチド、核酸、宿主細胞及び／又は組成物の使用、にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＨＥＲ３（配列番号１）にそれぞれ指向しているかつ／又はヒトＨＥＲ３（配列番号１）にそれぞれ特異的に結合できる、少なくとも２つ（例えば、２又は３つ）の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にこれらからなるタンパク質又はポリペプチドにおいて、それぞれのかかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、
ａ）ＨＲＧのＨＥＲ−３への結合を阻害又は遮断することができるＩＳＶ、及び／又は
ｂ）ＨＥＲ−３のヘテロ二量体化を阻害又は遮断することができるＩＳＶ、及び／又は
ｃ）ＨＥＲ−３のドメインＩＩへ結合することができるＩＳＶ、
から独立して選択されているタンパク質又はポリペプチド。
【請求項２】
ａ）ＨＥＲ−３のヘテロ二量体化を阻害又は遮断することができる少なくとも１つの（例えば１つの）ＩＳＶ、及び
ｂ）ＨＲＧのＨＥＲ−３への結合を阻害又は遮断することができる少なくとも１つの（例えば１つの）ＩＳＶ
を含むか又は実質的にこれらからなる請求項１記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項３】
ａ）ＨＥＲ−３のヘテロ二量体化を阻害又は遮断することができる少なくとも１つの（例えば１つの）ＩＳＶ、及び
ｂ）ＨＥＲ−３のドメインＩＩへ結合することができる少なくとも１つの（例えば１つの）ＩＳＶ
を含むか又は実質的にこれらからなる請求項１記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項４】
ＨＥＲ−３のドメインＩＩへ結合できるＩＳＶが、ＨＥＲ−３のトランスリン酸化を阻害又は遮断することができる請求項１又は３記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項５】
ヒトＨＥＲ３（配列番号１）にそれぞれ指向しているかつ／又はヒトＨＥＲ３（配列番号１）にそれぞれ特異的に結合できる、少なくとも２つ（例えば、２又は３つ）の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にこれからなるタンパク質又はポリペプチドにおいて、それぞれのかかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、
２１Ｆ０６−様配列、０４Ｃ０７−様配列、１７Ｂ０５−様配列、１８Ｇ１１−様配列及び／又は３４Ｃ０７−様配列から独立して選択されているタンパク質又はポリペプチド。
【請求項６】
ａ）少なくとも１つの（例えば１つの）、１７Ｂ０５−様配列であるＩＳＶ、及び
ｂ）少なくとも１つの（例えば１つの）、２１Ｆ０６−様配列であるＩＳＶ
を含む、請求項１、２又は５記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項７】
ａ）少なくとも１つの（例えば１つの）、１７Ｂ０５−様配列であるＩＳＶ、及び
ｂ）少なくとも１つの（例えば１つの）、１８Ｇ１１−様配列であるＩＳＶ
を含む、請求項１、３、４又は５記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項８】
例えば官能化により及び／又はタンパク質又はポリペプチド中へと当該コンストラクトの半減期を増加する部分又は結合ユニットを含めることにより、増加した半減期を有している請求項１から７のいずれか１項記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項９】
例えば官能化により及び／又はタンパク質又はポリペプチド中へと血清タンパク質、例えば血清アルブミンに結合できるペプチド又は結合ユニットを含めることにより、増加した半減期を有している請求項１から８のいずれか１項記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１０】
ヒト血清アルブミンに指向しているＩＳＶを含む請求項１から９のいずれか１項記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１４７−３２７、好ましくは配列番号２８２、配列番号３１９又は配列番号３２２からなる群から選択されている請求項１から１０のいずれか１項記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１２】
ＩＳＶのアミノ酸配列が、配列番号１２−２６、好ましくは配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８又は配列番号２２からなる群から独立して選択されている請求項１から１１のいずれか１項記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１３】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つが、配列番号１２−２６の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する請求項１から１２のいずれか１項記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１４】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、
ｉ）配列番号１２−２６の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと、少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する、その際、アミノ酸同一性の程度を決定する目的で、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する、かつ、その際、
ｉｉ）好ましくは、Kabat numberingに応じた位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８にあるアミノ酸残基の１以上が、表Ｂ−２中で述べた特徴残基から選択される、
請求項１から１３のいずれか１項記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１５】
ヒトＨＥＲ３（配列番号１）に対して指向しているかつ／又はヒトＨＥＲ３（配列番号１）に特異的に結合できる、免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１６】
ＨＲＧのＨＥＲ−３への結合を阻害又は遮断することができる、請求項１５記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１７】
２１Ｆ０６−様配列及び０４Ｃ０７−様配列からなる群から選択されている、請求項１５又は１６記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１８】
ＨＥＲ−３のヘテロ二量体化を阻害又は遮断することができる、請求項１１記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１９】
１７Ｂ０５−様配列からなる群から選択されている、請求項１５、１６又は１８記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２０】
ＨＥＲ−３のトランスリン酸化を阻害又は遮断することができる、請求項１９記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２１】
ＨＥＲ−３のドメインＩＩへの結合をすることができる、請求項１５記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２２】
ＨＥＲ−３リン酸化を阻害又は遮断することができる、請求項１５から２１のいずれか１項記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２３】
１８Ｇ１１−様配列及び３４Ｃ０７−様配列からなる群から選択されている、請求項１５、２１又は２２記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２４】
ＩＳＶのアミノ酸配列が、配列番号１２−２６、好ましくは配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８又は配列番号２２からなる群から独立して選択されている、請求項１５から２３のいずれか１項記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）。
【請求項２５】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列が、配列番号１２−２６の少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する、請求項１５記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２６】
ｉ）配列番号１２−２６の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと、少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する、その際、アミノ酸同一性の程度を決定する目的で、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する、かつ、その際、
ｉｉ）好ましくは、Kabat numberingに応じた位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８にあるアミノ酸残基の１以上が、表Ｂ−２中で述べた特徴残基から選択される、
ポリペプチドから実質的になる、請求項１５項記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２７】
ＨＥＲ３（配列番号１）に結合するための、請求項１から２２のいずれか１項記載のタンパク質、ポリペプチド又はＩＳＶと競合するタンパク質又はポリペプチド。
【請求項２８】
請求項１から２７のいずれか１項記載のタンパク質又はポリペプチド又はＩＳＶをコードする核酸。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれか１項記載のタンパク質又はポリペプチド又はＩＳＶを含む医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１から２８のいずれか１項記載のタンパク質又はポリペプチド又はＩＳＶの有効量を必要とする患者に投与することを含む、癌又は神経再生に関連する疾病の治療方法。
【請求項３１】
癌又は神経再生に関連する疾病の療法における使用のための、請求項１から２８のいずれか１項記載のタンパク質又はポリペプチド又はＩＳＶ。
【請求項３２】
癌が、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、脳癌、レチノブラストーマ、メラノーマ、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、頭頸部癌、子宮頸癌、及び／又は食道癌である、請求項３１記載のタンパク質又はポリペプチド又はＩＳＶ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（本願で定義するように）ＨＥＲ３に対して指向しているアミノ酸配列、また同様に、化合物又はコンストラクト、特にタンパク質及びポリペプチドであって、１以上のかかるアミノ酸配列を含むか又は実質的にこれらからなるもの（本願では、それぞれ「本発明のアミノ酸配列」、「本発明の化合物」、及び「本発明のポリペプチド」とも称される）、に関する。
【０００２】
いくつかの特定の、しかし、限定しない観点（より詳細には本願で説明する）において、本発明は次のものを提供する：
−（本願で定義するように）ＨＥＲ３に対して指向している、かつ、ＨＲＧのＨＥＲ３への結合を阻害又は遮断（完全に又は部分的に、さらに本願で説明する）することができるアミノ酸配列（さらに本願で説明する）、
−（本願で定義するように）ＨＥＲ３に対して指向している、かつ、ＨＥＲ３のヘテロ二量体化を阻害又は遮断（完全に又は部分的に、さらに本願で説明する）することができるアミノ酸配列（さらに本願で説明する）、
−（本願で定義するように）ＨＥＲ３に対して指向している、かつ、ＨＥＲ３のドメインＩＩに結合することができるアミノ酸配列、及び／又は
−（本願で定義するように）ＨＥＲ３に対して指向している、かつ、ＨＥＲ３リン酸化を阻害又は遮断（完全に又は部分的に、さらに本願で説明する）することができるアミノ酸配列（さらに本願で説明する）。
【０００３】
本願でさらに説明するとおり、特定の好ましいが、限定しない観点において、（特定の観点に応じたものを含む）本願で説明するＨＥＲ３に対して指向している種々のアミノ酸配列は、好ましくは免疫グロブリン単一可変ドメイン（本願で「ＩＳＶ」とも称される）である。免疫グロブリン単一可変ドメインは、次のことが該当するアミノ酸配列である：
−免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件（例えば、生理学的条件）下で、免疫グロブリンフォールドを形成することができ（すなわち、フォールディングにより）、すなわち、免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨドメイン）を形成する、
かつ
−機能的抗原結合活性を含む免疫グロブリン可変ドメインを形成する（又は好適な条件下で形成することができる）（この意味では、機能的抗原結合部位を形成すべく、他の免疫グロブリン可変ドメインとの相互作用（例えばＶＨ−ＶＬ相互作用）を必要としない）。
【０００４】
ＩＳＶである本発明のアミノ酸配列は、本願で「本発明のＩＳＶ」とも称される。本発明における使用に好適な、免疫グロブリン単一可変ドメインのいくつかの好ましい例は、本願の更なる発明の詳細な説明から明らかになり、かつ、例えば、ＶHH及び／又は（他の）ナノボディ（Nanobodies）、（好ましくは）例えばヒト化ＶHH又はラクダ化（camelized）ＶH、例えばラクダ化ヒトＶH、ｄＡｂ及び（単一）ドメイン抗体を含む。
【０００５】
本願でさらに説明するとおり、（特定の観点に応じたものを含む）本願で説明するＨＥＲ３に対して指向している種々のアミノ酸配列は、有利には、多価の（本願で説明するとおり、例えば二価又は三価の）、多特異性の（multispecific）（本願で説明するとおり、例えば二特異性又は三特異性の）、又は、多パラトープ性の（本願で説明するとおり、例えばビパラトープ性の（biparatopic））、本発明のポリペプチドを提供するために、構成ブロックとして使用されてよく、かかる本発明のポリペプチドはさらに好ましいが、本発明を限定する観点ではない。やはり、本発明のこれら観点においても、かかるポリペプチド中に存在する本発明のアミノ酸配列は、好ましくはＩＳＶである（より好ましくは、本願で説明するとおり、ナノボディ）。
【０００６】
例示的に、かつ、限定することなく、本発明の特定の一観点において、かかるポリペプチドは、（本願で定義するとおり）ＨＥＲ３に対して指向しており、かつ、ＨＲＧのＨＥＲ３への結合を阻害又は遮断（完全に又は部分的に、さらに本願で説明する）することができる（さらに本願で説明する）、少なくとも１の（例えば１又は２の）ＩＳＶ（好ましくはナノボディ）、及び、（本願で定義するとおり）ＨＥＲ３に対して指向しており、かつ、ＨＥＲ３のヘテロ二量体化を阻害又は遮断（完全に又は部分的に、さらに本願で説明する）することができる（さらに本願で説明する）、少なくとも１の（例えば１又は２の）ＩＳＶ（好ましくはナノボディ）、を含んでよい。これらの及び他の本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、さらに本願で説明するように、ｉｎ  ｖｉｖｏで増加した半減期を有していてもよい。
【０００７】
本発明の種々のアミノ酸配列及びポリペプチドのいくつかの好ましいが、限定しない例は、本願の更なる発明の詳細な説明から明らかになる。
【０００８】
本発明はまた、かかるアミノ酸配列及びポリペプチドをコードする核酸（本願では「本発明の核酸」又は「本発明のヌクレオチド配列」とも称される）、かかるアミノ酸配列及びポリペプチドの製造方法、かかるアミノ酸配列又はポリペプチドを発現するか又は発現することができる宿主細胞、組成物、特に医薬組成物であってかかるアミノ酸配列、ポリペプチド、核酸及び／又は宿主細胞を含む組成物、及び、特に予防、療法又は診断用の目的、例えば本願で述べる予防、療法又は診断用の目的のためのかかるアミノ酸配列又はポリペプチド、核酸、宿主細胞及び／又は組成物の使用、にも関する。
【０００９】
本発明の他の観点、実施態様、利点及び適用は、本願の更なる発明の詳細な説明から明らかになる。
【００１０】
発明の背景
ＨＥＲ３（ヒト上皮成長因子レセプター３）は、ポリペプチド成長因子レセプターのＥｒｂＢ／ＨＥＲサブファミリーに属し、これは、上皮成長因子（ＥＧＦ）レセプター（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ１）、ｎｅｕ発癌遺伝子生成物（ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ２）、及び、より最近同定されたＥｒｂＢ３、ＨＥＲ３及びＥｒｂＢ４、ＨＥＲ４レセプタータンパク質（例えば、Plowman et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4905-4909; Hynes et. al. (1994) Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer 1198, 165-184を参照のこと）を含む。ＨＥＲ３は、多様なリガンド、例えばヘレグリン及びニューレグリン１及び２に結合できるが、固有のチロシンキナーゼ活性を欠くことが知られている（そして、キナーゼ不活性であるために、このレセプターは、別のＨＥＲファミリーメンバー、例えばＨＥＲ１、ＨＥＲ２又はＨＥＲ４と二量体化した場合にだけシグナルトランスダクションを開始できる）。
【００１１】
より具体的には、ＨＥＲ３は、膜結合タンパク質であり、かつ、ニューレグリン結合ドメインを有するが、活性キナーゼドメインを有しない。したがって、ＨＥＲ３は、このリガンドに結合できるが、タンパク質リン酸化を通じて細胞中へシグナルを伝達することができない。しかし、ＨＥＲ３は、キナーゼ活性を有しない他のＥＧＦレセプターファミリーメンバーとヘテロ二量体を形成する。ヘテロ二量体化は、細胞分裂、増殖、分化、移動及び他の細胞プロセスを導く、経路の活性化を導く。複雑な多層化シグナリング作成レセプタークロストーク及び横方向シグナリング（Complex multilayered signaling generated receptor cross-talk and lateral signaling）は、ＥＧＦＲファミリー及び他のレセプターチロシンキナーゼ、例えばＭＥＴ内で明白になりつつある（Engelmann et. al. (2007), Science 316, 1039-1043）。活性のあるオートクラインループの突然変異、増幅及び存在により、脱制御され、異常性であるシグナリングは、癌及び他の疾病の発達に関与してよい。この遺伝子の増幅及び／又はそのタンパク質の過剰発現は、数々の癌（前立腺、膀胱及び乳房腫瘍を含む）において報告されている（例えば、WO2008100624, WO2007077028, Horst et al. (2005) Int J Cancer, 115, 519-527; Xue et al. (2006) Cancer Res. 66, 1418-1426を参照）。ＨＥＲ３は、ＬＣＣＳ２；ＥｒｂＢ−３；ｃ−ｅｒｂＢ３；ｅｒｂＢ３−Ｓ；ＭＤＡ−ＢＦ−１；ＭＧＣ８８０３３；ｃ−ｅｒｂＢ−３；ｐｌ８０−ＥｒｂＢ３；ｐ４５−ｓＥｒｂＢ３；ｐ８５−ｓＥｒｂＢ３；ＥＲＢＢ３としても知られている。
【００１２】
癌におけるＨＥＲ３の役割となると、正常細胞を癌細胞に形質転換するために、ＨＥＲ２がＨＥＲ３を要する可能性がある点で、ＨＥＲ３は、ＨＥＲ２媒介した腫瘍形成に必要である可能性が示唆されている。例えば、ＨＥＲ３の増加した発現が、ＨＥＲ２のシグナリング効力を増加させるが、その一方で、減少したＨＥＲ３発現が、ＨＥＲ２活性の損失という結果になっていることが見出されている。このことは、ＨＥＲ３は、ＨＥＲ２との二量体化を通じてＨＥＲ２媒介した腫瘍形成に関与している可能性があるという仮説を導いている。
【００１３】
ＨＥＲ３が、他のＨＥＲレセプターの阻害から逃れることを可能にしてよいことも示唆されている。例えば、前臨床試験により、ＨＥＲ３活性の上方制御は、腫瘍細胞がＨＥＲファミリーレセプターのチロシンキナーゼ阻害から逃れることができる機構であってよいこと、及び、腫瘍細胞は、キナーゼ不活性であるＨＥＲ３の発現を増加させることによって、他のＨＥＲレセプターのチロシンキナーゼ阻害を補償してよいこと、が示されている。ＨＥＲ２：ＨＥＲ３ヘテロ二量体において、ＨＥＲ２がＨＥＲ３をトランスリン酸化することも見出されてもいる。
【００１４】
ＨＥＲ３は、いくつかの種類の癌（乳癌及び膵癌を含むが、これらに限定されない）において過剰発現していることも見出されており、かつ、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３の発現と非浸潤ステージから浸潤ステージへのプログレッションとの間には相関があってよいことが見出されている（Baselga et al., 2009 Nature Reviews Cancer 9, 463-475）。
【００１５】
癌及び発癌シグナリングにおけるＨＥＲ３の役割は、（以前に）示唆されているものの、抗癌治療におけるその重要性は、ＨＥＲ２がその成分である複雑なＥｒｂＢネットワークのために、明らかでないままである。最近の免疫療法は、主として、ＨＥＲ２の作用の阻害に、特にＨＥＲ２／ＨＥＲ３複合体のヘテロ二量体化に、焦点を当てている（Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665を参照のこと）。
【００１６】
本発明の課題は、ＨＥＲ３シグナリングを効率的に阻害し、かつ、種々の癌の治療及び診断に使用できる、改善された免疫療法を提供することであった。
【００１７】
発明の要約
本発明においては、数々の免疫グロブリン単一可変ドメイン（本願でさらに説明するとおり）であって、ＨＥＲ３に結合（特にＨＥＲ３に特異的に結合、本願でさらに定義するとおり）、及び、（本願で定義するとおり）ＨＥＲ３媒介したシグナリングを調節、及び／又は、ＨＥＲ３の（いくつか又は全ての）生物学的作用を調節、及び／又は、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ３媒介シグナリングが関与する（いくつか又は全ての）生物学的機構／経路を調節（するために使用される）できる、免疫グロブリン単一可変ドメインが、同定及び特性決定（及び、適した場合には、ヒト化及び／又は配列最適化）されている。本発明により提供される免疫グロブリン単一可変ドメインは、かかる調節のために自体で使用されることができるだけでなく、さらに有利には、相互に（すなわち、多価性の、多特異性の及び／又はビパラトープ性のコンストラクトを提供すべく、さらに本願で説明するとおり）、及び／又は、他の残基、結合ドメイン又は結合ユニットと、かかる調節のために使用されることができるタンパク質、ポリペプチド又は（他の）化合物又はコンストラクトを提供すべく、連結／組み合わせされてよいことも見出されている。
【００１８】
こうして、かかるタンパク質、ポリペプチド又は（他の）化合物又はコンストラクトを提供するための、「構成ブロック」としての、本発明により提供される免疫グロブリン単一可変ドメイン（又は「ＩＳＶ」）の使用は、本発明の重要な利点及び観点を形成する。
【００１９】
例えば、有利ではあるが、限定することなく、本発明により提供される種々の免疫グロブリン単一可変ドメイン又は「ＩＳＶ」は、異なる手法でＨＥＲ３に結合でき、こうして、ＨＥＲ３と相互作用する及び／又はＨＥＲ３媒介シグナリングを調節するように、異なる作用機序を提供することが見出されている。例えば、本発明により提供されるＩＳＶのいくつかは、ＨＥＲ３へのＨＲＧの結合を阻害でき、その一方で、他のものは、ＨＥＲ３のドメインＩＩへ結合できる及び／又はＨＥＲ３トランスリン酸化を遮断できる。さらに他のものは、自体とＨＥＲ３ファミリー（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３）の他のメンバーとの、ＨＥＲ３の二量体化を遮断できる。したがって、本発明のアミノ酸（又はＩＳＶ）は、構成ブロックと考慮される。
【００２０】
こうして、本発明は、ＨＥＲ３、ＨＥＲ３媒介シグナリング、及び／又は、ＨＥＲ３に及び／又はＨＥＲ３媒介シグナリングに関連した生物学的作用、に影響することができる、一連の異なるＩＳＶを提供する。
【００２１】
加えて、本発明により提供されるＩＳＶが、更なるタンパク質、ポリペプチド又は（他の）化合物又はコンストラクトを提供するための構成ブロックとして好適に使用又は組み合わせされる場合には、本発明は例えば、有利に、ＨＥＲ３との異なる相互作用及び／又は異なる作用機序を、単一の分子、化合物、コンストラクト、タンパク質又はポリペプチド中に組み合わせることを可能にする。これらの例は、本願の更なる発明の詳細な説明から明らかである。
【００２２】
本発明により提供される種々のＩＳＶ、タンパク質、ポリペプチド、化合物及び／又はコンストラクトがＨＥＲ３及びＨＥＲ３媒介シグナリングに有する影響又は作用（その機序／作用機序含む）は、種々の好適なアッセイを用いてかつｉｎ  ｖｉｖｏモデル中で、例えばＨＥＲ３インターナリゼーションアッセイ（例えば、好適な細胞、例えばＭＣＦ７及びＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞上でのＨＥＲ３表面発現の低下を測定）、リガンド遮断アッセイ（例えば、ＨＲＧ競合アルファスクリーン又はＦＡＣＳアッセイ）、ＨＲＧ誘発ＨＥＲ３シグナリング遮断アッセイ（例えば、ＨＥＲ３リガンド刺激したＭＣＦ７、ＣＨＯ−ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、ＢＴ４７４及びＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞中のｐＨＥＲ３の阻害を測定するアッセイ）、ヘテロ二量体化遮断を測定するアッセイ（例えば、ＴＧＦ−アルファ−刺激したＣＨＯ−ＥＧＦＲ−ＨＥＲ３、β−セルリン刺激したＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞のｐＨＥＲ３の遮断）、下流シグナリング阻害を測定するアッセイ（例えば、ＨＥＲ３リガンド刺激したＭＣＦ７、Ａ５４９及びＢＴ４７４細胞中のｐＡＫＴ及び／又はｐＭＡＰＫシグナリングを測定するアッセイ）、又は細胞移動アッセイ（例えば、Ａ４３１細胞のＨＲＧ誘発した移動を測定するアッセイ）を用いて決定されることができる。例えば、実験セクション及びその中に示された結果が参照される。
【００２３】
こうして、本発明のＩＳＶ、ポリペプチド及び組成物は、一般に、ヘレグリンへのＨＥＲ３の結合及び／又はＭＥＴ、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ２とのヘテロ二量体化（例えば、Hsieh and Moasser, 2007, British Journal of Cancerを参照）の遮断を調節、特に阻害及び／又は防止するために、そして、こうして、ＨＥＲ３及び／又はヘレグリンにより媒介されるシグナリングを調節、特に阻害又は防止するために、ＨＥＲ３及び／又はヘレグリンが関与する生物学的経路を調節するために、及び／又は、かかるシグナリング又はこれら経路に関連した生物学的機構、応答及び作用を調節するために、使用されてよい。
【００２４】
それ自体として、本発明のポリペプチド及び組成物は、種々の癌の診断及び治療に使用できる（本願で定義するとおり）。一般に、「種々の癌」は、必要な被験体（すなわち、疾病若しくは疾患又は少なくとも１のその症状を有する者及び／又は前記疾病又は疾患の誘引又は発達の危険がある者）に本発明のポリペプチド又は組成物のいずれかを（特に、その医薬的に活性のある量で）、及び／又は、ＨＥＲ３又はＨＥＲ３が関与する生物学的経路又は機構に対して活性のある既知の有効成分を（特に、その医薬的に活性のある量で）、好適に投与することにより、それぞれ予防及び／又は治療できる、疾病及び疾患として定義されることができる。かかる種々の癌の例は、当業者には本願の開示に基づき明らかであり、かつ、例えば以下の疾病及び疾患を含む：
癌(Sithanandam and Anderson review (2008) Cancer Gene Therapy 15(7), 413-448; 乳癌(Lemoine et. al. (1992) Br J Cancer 66, 1116-1121; Witton et al. (2003) J Pathol 200(3):290-297; Koutras et al (2010) Crit Rev Oncol Hematol.74(2):73-78);肺癌(Muelller-Tidow (2005) Cancer Res 65(5): 1778-1782; Timotheadou et al., (2007) Anticancer Res. 27 (6C):4481-4489);卵巣癌(Tanner et. al. (2006) J Clin Oncol 24(26): 4317-4323);前立腺癌(Lozano et.al.(2005) BMC Genomics 6:109; Soler et al., 2009. Int J Cancer 125(11):2565-2575): 膀胱癌(Rajkumar et. al. (1996) J Pathol, 179(4):381-385);脳癌(Addo-Yobo et. al. (2006) J Neuropathol Exp Neurol 65(8):769-775, Andersson et. al. (2004) Acta Neuropathol, 108(2): 135-142);レチノブラストーマ(Chakraborty et. al. (2007) Genomics 90(3):344-353);メラノーマ(Segal et. al. (2003) J Clin Oncol. 2003 May 1;21(9): 1775-1781; Schaefer et. al. (2004) Cancer Res 64:3395-3405; Reschke et al., 2008 Clin Cancer Res. 14(16):5188-97);結腸直腸癌(Grivas et. al. (2007) Eur J Cancer 43(17):2602-2611; Ciardiello et al. (1991) Proc Natl Acad Sci U S A. 88(17):7792-7796);膵癌(Friess et. al. (1995) Clin Cancer Res 1(11): 1413-20); Lemoine et al, 1992 J. Pathol.168: 269-273);胃癌(Sanidas (1993), Int J Cancer 54(6):935-40, Hayashi et. al. (2008) Clin Cancer Res 14(23):7843-7849; Hayashi et al., (2008) Clin Cancer Res. 14(23):7843-9);頭頸部癌(Funayama (1998) Oncology 55(2): 161-167, Erjala (2006) Clin Cancer Res 12(13):4103-4111);子宮頸癌(Fuchs et al., 2007 Anticancer Res.27(2):959-63);食道癌(Wei et al., 2007 Int J Oncol. 31(3):493-9.);及び／又は神経再生(Lindholm et. al. (2002) Exp Brain Res) 2002 Jan;142(l):81-90。
【００２５】
特に、本発明のポリペプチド及び組成物は、タンパク質のＥｒｂＢネットワークにより又は一般にＨＥＲ３が関与する任意の経路により媒介される過剰の及び／又は不要なシグナリングにより特徴付けられる種々の癌の診断及び治療に使用されることができる。かかる種々の癌の例は、やはり、本願の開示に基づき当業者には明らかである。
【００２６】
こうして、限定されることなく、本発明のポリペプチドが、かかる活性成分を用いた治療が現在開発されているか、提案されているか又は将来提案又は開発されるだろう全ての疾病及び疾患の予防及び／又は治療のために使用できることも想定されてもいる。加えて、本願でさらに説明するその好ましい特性のために、本発明のポリペプチドは、これら既知の活性成分が使用されているか又は提案若しくは開発されるだろう疾病及び疾患以外の他の疾病及び疾患の予防及び治療のために使用されてよいことが、かつ／又は、本発明のポリペプチドが、本願で説明する疾病及び疾患の治療のための新規方法及びレジメンを提供してよいことが、想定されている。
【００２７】
本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドの他の適用及び使用は、本願の更なる開示から当業者には明らかである。
【００２８】
一般に、本発明の一主題は、薬理学的に活性のある剤、また同様に、これを含有する組成物であって、本願で言及される種々の癌及び更なる疾病及び疾患の診断、予防及び／又は治療に使用されることができるものを提供すること、及び、かかる剤及び組成物の投与及び使用を伴う、かかる疾病及び疾患の診断、予防及び／又は治療の方法を提供すること、である。
【００２９】
特に、本発明の一課題は、当分野で現在使用及び／又は知られている、剤、組成物及び／又は方法に比較して、特定の利点を有する、かかる薬理学的に活性のある剤、組成物及び／又は方法を提供することである。これら利点は、以下の更なる発明の詳細な説明から明らかである。
【００３０】
より具体的には、本発明の一課題は、薬理学的に活性のある剤として使用できる治療用タンパク質、また同様に、これを含有する組成物を、本願で言及される種々の癌及び更なる疾病及び疾患の診断、予防及び／又は治療のために提供すること、及び、かかる治療用タンパク質及び組成物の投与及び使用を伴う、かかる疾病及び疾患の診断、予防及び／又は治療の方法を提供すること、である。
【００３１】
相応して、本発明の具体的な一課題は、（本願で定義するように）ＨＥＲ３に対して、特に温血動物由来のＨＥＲ３に対して、より具体的には哺乳類由来のＨＥＲ３に対して、特別にはヒトＨＥＲ３（配列番号１）に対して指向しているアミノ酸配列を提供すること、及び、少なくとも１つのかかるアミノ酸配列を含むか又は実質的にこれらからなるタンパク質及びポリペプチドを提供すること、である。
【００３２】
特に、本発明の特定の一課題は、温血動物、特に哺乳類、とりわけヒトにおける、予防、療法及び／又は診断的使用において好適な、かかるアミノ酸配列及びかかるタンパク質及び／又はポリペプチドを提供すること、である。
【００３３】
より具体的には、本発明の具体的な一課題は、温血動物、特に哺乳類、とりわけヒトにおいて、ＨＥＲ３に関連する及び／又はＨＥＲ３により媒介される、１又は複数の疾病、疾患又は症状（例えば、本願で言及される疾病、疾患及び症状）の予防、治療、緩和及び／又は診断のために使用できる、かかるアミノ酸配列及びかかるタンパク質及び／又はポリペプチドを提供すること、である。
【００３４】
温血動物、特に哺乳類、とりわけヒトにおいて、ＨＥＲ３に関連する及び／又はＨＥＲ３により媒介される、１又は複数の疾病、疾患又は症状（例えば、本願で言及される疾病、疾患及び症状）の、予防及び／又は治療のための医薬的又は獣医学的組成物の調製において使用できる、かかるアミノ酸配列及びかかるタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することも、本発明の具体的な一課題である。
【００３５】
本発明では、一般に、これら課題は、本願で説明する、アミノ酸配列、タンパク質、ポリペプチド及び組成物の使用により達成される。
【００３６】
本発明は、一般に、（本願で定義するとおり）ＨＥＲ３に対して指向している及び／又は（本願で定義するとおり）ＨＥＲに特異的に結合できるアミノ酸配列、また同様に、化合物及びコンストラクト、特にタンパク質及びポリペプチドであって、少なくとも１のかかるアミノ酸配列を含むもの、を提供する。
【００３７】
上述のとおり、いくつかの特定の、しかし、限定しない観点（より詳細に本願で説明する）において、本発明は次のものを提供する：
（本願で定義するとおり）ＨＥＲ３に対して指向している、かつ、リガンド結合を阻害又は遮断（完全に又は部分的に、さらに本願で説明する）、特にＨＲＧのＨＥＲ３への結合を阻害又は遮断（完全に又は部分的に、さらに本願で説明する）することができるアミノ酸配列（さらに本願で説明する）。これらアミノ酸配列は、本願では、「ＨＲＧ遮断アミノ酸配列」又は「ＨＲＧ遮断構成ブロック」とも称される。好ましくは、これらＨＲＧ遮断アミノ酸配列はＩＳＶであり（本願で説明するとおり）、この場合には、これらは「ＨＲＧ遮断ＩＳＶ」とも称される。
【００３８】
好ましくは、任意のＨＲＧ遮断アミノ酸配列、ＨＲＧ遮断構成ブロック又はＨＲＧ遮断ＩＳＶは、遮断活性を有するものであり、すなわち、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断し、これは、当業者に知られている任意の好適なアッセイにより決定されることができ、例えば、アルファスクリーンアッセイにより又はＦＡＣＳ競合アッセイにより（例えば、本願で説明するとおり）決定されることができる。好ましくは、遮断活性は、実施例９において説明するとおりのＦＡＣＳ競合アッセイにより決定される。好ましくは、ＩＳＶは、遮断活性又は競合能を、６００ｎＭ未満、しかし好ましくは５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ又はそれより低いＩＣ５０でもってＨＥＲ３へのＨＲＧ１−β１結合の遮断又は競合をＣＨＯ細胞において有する。
【００３９】
−例えば、０４Ｃ０７様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１００ｎＭ未満、より好ましくは７５ｎＭ、５０ｎＭ未満又はそれより低い、例えば２０ｎＭ又は１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ又は６ｎＭ未満又はよりいっそう好ましくは５ｎＭ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００４０】
−例えば、１７Ｂ０５様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１５０ｎＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ未満又はそれより低い、例えば７０ｎＭ又は６０ｎＭ、５０ｎＭ又は４０ｎＭ又はよりいっそう好ましくは３５ｎＭ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００４１】
−例えば、２１Ｇ０６様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１００ｎＭ未満、より好ましくは８０ｎＭ、７０ｎＭ未満又はそれより低い、例えば６０ｎＭ又は５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ又は１３ｎＭ未満又はよりいっそう好ましくは１１ｎＭ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００４２】
特定の、しかし限定しない一観点において、（いくつかの）「ＨＲＧ遮断アミノ酸配列」又は「ＨＲＧ遮断構成ブロック」は、（好ましくは）ＨＥＲ３シグナリングを阻害又は遮断できることができるものであってよく（実施例９及び１０参照）、例えば、実施例１０において使用されたリン酸化アッセイにおいてである。好ましくは、任意のＨＲＧ遮断アミノ酸配列、ＨＲＧ遮断構成ブロック又はＨＲＧ遮断ＩＳＶは、遮断活性を有するようなものであり、すなわち、ＨＲＧ媒介したＨＥＲ３リン酸化を部分的に又は完全に遮断又は阻害し、これは、当業者に知られている任意の好適なアッセイにより、例えば任意の好適なリン酸化アッセイにより、例えば、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ、ＡＫＴリン酸化アッセイ又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにより決定されることができる（本願で説明するとおり）。
【００４３】
好ましくは、リン酸化の遮断活性又は阻害能は、実施例１０において説明するとおり、ＨＥＲ３リン酸化アッセイにより決定される。好ましくは、ＩＳＶは、ＭＣＦ−７細胞におけるリガンド（例えばＨＲＧ−β１）誘発したｐＨＥＲ３リン酸化の遮断活性又は阻害能を６００ｎＭ未満、しかし好ましくは５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ又はそれより低いＩＣ５０でもって有する。
【００４４】
−例えば、０４Ｃ０７様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１００ｎＭ未満、より好ましくは７５ｎＭ、５０ｎＭ未満又はそれより低い、例えば２０ｎＭ又は１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ又は６ｎＭ未満又はよりいっそう好ましくは５、４、３又は２ｎＭ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００４５】
−例えば、１７Ｂ０５様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１５０ｎＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ未満又はそれより低い、例えば７０ｎＭ又は６０ｎＭ、５０ｎＭ又は４０ｎＭ又はよりいっそう好ましくは３５ｎＭ未満、例えば２０ｎＭ又は１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ又は７ｎＭ未満又はよりいっそう好ましくは６ｎＭ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００４６】
−例えば、２１Ｆ０６様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１５０ｎＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ未満又はそれより低い、例えば７０ｎＭ又は６０ｎＭ、５０ｎＭ又は４０ｎＭ又はよりいっそう好ましくは３５ｎＭ未満、例えば２０ｎＭ又は１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ未満又はよりいっそう好ましくは７ｎｍ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００４７】
好ましくは、シグナリングの遮断活性又は阻害能は、実施例１０．１に説明するとおりのＡＫＴリン酸化アッセイにより決定される。好ましくは、ＩＳＶは、ＭＣＦ−７細胞においてリガンド（例えばＨＲＧ−β１）により誘発されたＡｋｔリン酸化の遮断活性又は阻害能を６００ｎＭ未満、しかし好ましくは５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ又はそれより少ないＩＣ５０でもって有する。
【００４８】
−例えば、０４Ｇ０７様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１００ｎＭ未満、より好ましくは８０ｎＭ、７０ｎＭ未満又はそれより低い、例えば６０ｎＭ又は５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ又はよりいっそう好ましくは２０ｎＭ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００４９】
−例えば、１７Ｂ０５様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１５０ｎＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ未満又はそれより低い、例えば７０ｎＭ又は６０ｎＭ、５０ｎＭ又は４０ｎＭ又はよりいっそう好ましくは３５ｎＭ未満、例えば２０ｎＭ又は１５ｎＭ、１２ｎＭ、１１ｎＭ、１０ｎＭ又は９ｎＭＭ未満又はよりいっそう好ましくは８ｎＭ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００５０】
−例えば、２１Ｆ０６様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１５０ｎＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ未満又はそれより低い、例えば７０ｎＭ又は６０ｎＭ、５５ｎＭ又は５０ｎＭ又はよりいっそう好ましくは４５ｎＭ未満、例えば４０ｎＭ又は３５ｎＭ、３０ｎＭ、２７．５ｎＭ、２５ｎＭ未満又はよりいっそう好ましくは２４ｎｍ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００５１】
好ましくは、シグナリングの遮断活性又は阻害能は、実施例１０．２に説明するとおりのＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにより決定される。好ましくは、ＩＳＶは、ＭＣＦ−７細胞においてリガンド（例えばＨＲＧ１−β１）により誘発されたＥＲＫ１／２リン酸化の遮断活性又は阻害能を６００ｎＭ未満、しかし好ましくは５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ又はそれより少ないＩＣ５０Ｍでもって有する。
【００５２】
−例えば、０４Ｃ０７様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１５０ｎＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ未満又はそれより低い、例えば８０ｎＭ、７０ｎＭ又は６０ｎＭ、５５ｎＭ又は５０ｎＭ又はよりいっそう好ましくは４５ｎＭ未満、例えば４０ｎＭ又は３５ｎＭ又はよりいっそう好ましくは３０ｎｍ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００５３】
−例えば、１７Ｂ０５様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１５０ｎＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ未満又はそれより低い、例えば７０ｎＭ又は６０ｎＭ、５０ｎＭ又は４０ｎＭ又はよりいっそう好ましくは３５ｎＭ未満、例えば２０ｎＭ又は１５ｎＭ、１０ｎＭ、７．５ｎＭ、５ｎＭ又は４ｎＭ未満又はよりいっそう好ましくは３ｎＭ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００５４】
−例えば、２１Ｆ０６様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１５０ｎＭ未満、例えば１２０ｎＭ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００５５】
また別の特定の、しかし限定しない観点において、ＨＲＧ遮断アミノ酸配列（又はＨＲＧ遮断ＩＳＶ）は、ＨＥＲ３への結合に関してアミノ酸配列２１Ｆ０６（配列番号２２）及び／又はアミノ酸配列０４Ｃ０７（配列番号１５）のいずれかと競合する及び／又はＨＥＲ３への２１Ｆ０６及び／又は０４Ｃ０７の結合を交差遮断する（本願で定義するとおり）ことができるアミノ酸配列（又はＩＳＶ）であり、例えば、特に、実施例２に説明するアッセイにおいてである（セクション２．９）。かかるＨＲＧ遮断ＩＳＶのいくつかの好ましいが、限定しない例は、本願でさらに説明する、「２１Ｆ０６様配列」及び「０４Ｃ０７様配列」である。２１Ｆ０６様配列のいくつかは、リガンド結合の遮断／阻害もシグナリングの阻害／遮断も両方できる、本発明のＩＳＶの限定しない例であってよい。同様に、本願で説明する１７Ｂ０５様配列は、（トランス）リン酸化もリガンド／ＨＲＧ結合も遮断／阻害できる、本発明のＩＳＶの例である。
【００５６】
本発明は、（本願で定義するとおり）ＨＥＲ３に対して指向している、かつ、ＨＥＲ３の（ヘテロ）二量体化（本願で説明するとおり）、例えばＥＧＦＲ／ＨＥＲ１−ＨＥＲ３（ヘテロ）二量体化（例えば、実施例１３及び１６参照のこと）、例えばＨＥＲ−２／ＨＥＲ−３（ヘテロ）二量体化を、例えば実施例１３において使用されるＨＥＲ−１／ＨＥＲ−３（ヘテロ）二量体化アッセイにおいて、阻害又は遮断（完全に又は部分的に、さらに本願で説明する）することができる（さらに本願で説明する）アミノ酸配列を提供する。これらアミノ酸配列は、本願で、「二量体化遮断アミノ酸配列」又は「二量体化遮断構成ブロック」とも称される。好ましくは、これら二量体化遮断アミノ酸配列はＩＳＶであり（本願で説明するとおり）、この場合には、これらは「二量体化遮断ＩＳＶ」とも称される。好ましくは、任意の二量体化遮断アミノ酸配列、二量体化遮断構成ブロック又は二量体化遮断ＩＳＶは、（ヘテロ）二量体化を遮断又は阻害するものであり、すなわち、ＨＥＲ３とＭＥＴ、ＥＧＦＲ及び／又はＨＥＲ２との二量体化を部分的に又は完全に遮断又は阻害し、これは、当業者に知られている任意の好適なアッセイにより決定されることができ、例えば、トランスリン酸化アッセイにより決定されることができる（例えば、本願で説明するとおり）。好ましくは、遮断又は阻害能は、実施例１０又は１３において説明するトランスリン酸化により決定され、例えば、ＥＧＦＲリガンド（例えばＴＧＦ−α）により誘発されたＨＥＲ３トランスリン酸化により決定され、これは、ＭＤＡ  ＭＢ４６８細胞又はＣＨＯ  ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３細胞における細胞アッセイにおいて測定されるとおりである。
【００５７】
−好ましくは、ＩＳＶは、ＣＨＯ  ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３細胞において、ＨＥＲ３とＥＧＦＲとの二量体化の遮断又は阻害の６００ｎＭ未満、しかし好ましくは５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ未満又はそれより低いＩＣ５０でもって（ヘテロ）二量体化の遮断又は阻害活性を有する。
【００５８】
−例えば、１７Ｂ０５様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１００ｎＭ未満、より好ましくは７５ｎＭ、５０ｎＭ未満又はそれより低い、例えば２０ｎＭ又は１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ又は２ｎＭ未満又はよりいっそう好ましくは１ｎＭ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は阻害能を有する。
【００５９】
特定の、しかし限定しない一観点において、（いくつか）の二量体化遮断アミノ酸配列又は二量体化遮断構成ブロックは（好ましくは）、リガンド結合を遮断又は阻害（完全に又は部分的に、本願で説明するとおり）、特にＨＲＧのＨＥＲ３への結合を阻害又は遮断（完全に又は部分的に、本願で説明するとおり）できるものであってよい。特定の、しかし、限定しない一観点において、二量体化遮断アミノ酸配列（又は二量体化遮断ＩＳＶ）は、ＨＥＲ３への結合に関してアミノ酸配列１７Ｂ０５（配列番号１３）と競合する及び／又はＨＥＲへの１７Ｂ０５の結合を交差遮断できる（本願で定義するとおり）アミノ酸配列（又はＩＳＶ）であり、例えば、特に、実施例２（セクション２．９）及び実施例８に説明するアッセイにおいてである。かかる二量体化遮断ＩＳＶのいくつかの好ましいが、限定しない例は、本願でさらに説明する、「１７Ｂ０５様配列」である。これら１７Ｂ０５様配列の少なくともいくつかは、（トランス）リン酸化もリガンド／ＨＲＧ結合も両方遮断／阻害できる、本発明のＩＳＶの限定しない例でもある。本発明は、（本願で定義するように）ＨＥＲ３に対して指向している、かつ、ＨＥＲ３のドメインＩＩに結合することができるアミノ酸配列を提供する。これらアミノ酸配列は、本願では、「ドメインＩＩ結合アミノ酸配列」又は「ドメインＩＩ結合構成ブロック」とも称される。好ましくは、これらドメインＩＩ結合アミノ酸配列はＩＳＶであり（本願で説明するとおり）、この場合には、これらは「ドメインＩＩ結合ＩＳＶ」とも称される。好ましくは、任意のドメインＩＩ結合アミノ酸配列、ドメインＩＩ結合構成ブロック又はドメインＩＩ結合ＩＳＶは、ＨＥＲ３のドメインＩＩに結合するものであり、これは、当業者に知られている任意の好適なアッセイにより、例えばエピトープ競合又はドメイン交換アッセイ（例えば、本願で説明するとおり）により決定されることができる。好ましくは、ドメインＩＩへの結合能は、実施例８に説明するように、キメラＨＥＲ３タンパク質への結合により決定され、例えば、ヒトＨＥＲ３ドメインとニワトリＨＥＲ３ドメインの交換により決定される。
【００６０】
本発明により提供される、ドメインII結合アミノ酸配列／ＩＳＶ又はドメインＩＩ結合構成ブロック／ＩＳＶは、（限定／部分的であるか、又はより顕著であってよい）作用を、リガンド／ＨＲＧ結合（特に、これらは、限定／部分的な程度で、リガンド／ＨＲＧのＨＥＲ３への結合を阻害又は遮断できる）及び／又はＨＥＲ３の（ヘテロ）二量体化のいずれかに有してもよい。
【００６１】
特定の、しかし限定しない一観点において、（いくつかの）「ドメインＩＩ結合アミノ酸配列」又は「ドメインＩＩ結合構成ブロック」は、（好ましくは）ＨＥＲ３リン酸化を阻害又は遮断できることができるものであり（実施例１０参照）、例えば、実施例１０において使用されたリン酸化アッセイにおいてである。好ましくは、任意のドメインＩＩ結合アミノ酸配列又はドメインＩＩ結合構成ブロック又はドメインＩＩ結合ＩＳＶは、遮断活性を有するものであり、すなわち、ＨＲＧ媒介したＨＥＲ３リン酸化を部分的に又は完全に遮断又は阻害し、これは、当業者に知られている任意の好適なアッセイにより、例えば任意の好適なリン酸化アッセイにより、例えば、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ、ＡＫＴリン酸化アッセイ又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにより決定されることができる（本願で説明するとおり）。
【００６２】
好ましくは、リン酸化の遮断活性又は阻害能は、実施例１０において説明するとおりＨＥＲ３リン酸化アッセイにより決定される。好ましくは、ＩＳＶは、ＭＣＦ−７細胞におけるリガンド（例えばＨＲＧ−β１）誘発したｐＨＥＲ３リン酸化の遮断活性又は阻害能を６００ｎＭ未満、しかし好ましくは５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ又はそれより低いＩＣ５０でもって有する。
【００６３】
−例えば、１８Ｇ１１様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１５０ｎＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ未満又はそれより低い、例えば７０ｎＭ又は６０ｎＭ、５０ｎＭ又は４０ｎＭ又はよりいっそう好ましくは３５ｎＭ未満、例えば２０ｎＭ又は１５ｎＭ、１４ｎＭ、１３ｎＭ、１２ｎＭ未満又はよりいっそう好ましくは１１ｎｍ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００６４】
−例えば、３４Ｃ０７様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１５０ｎＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ未満又はそれより低い、例えば７０ｎＭ又は６０ｎＭ、５０ｎＭ又は４０ｎＭ又はよりいっそう好ましくは３５ｎＭ未満、例えば２０ｎＭ又は１６ｎＭ、１５ｎＭ、１４ｎＭ、１３ｎＭ未満又はよりいっそう好ましくは１２ｎｍ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００６５】
好ましくは、リン酸化の遮断活性又は阻害能は、実施例１０．１に説明するとおりのＡＫＴリン酸化アッセイにより決定される。好ましくは、ＩＳＶは、ＭＣＦ−７細胞においてリガンド（例えば、ＨＲＧ−β１）により誘発されたＡｋｔリン酸化の遮断活性又は阻害能を６００ｎＭ未満、しかし好ましくは５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ又はそれより少ないＩＣ５０でもって有する。
【００６６】
−例えば、１８Ｇ１１様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１５０ｎＭ未満、例えば１４０ｎＭ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００６７】
−例えば、３４Ｃ０７様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１５０ｎＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ又は９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ又はよりいっそう好ましくは５０ｎＭ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００６８】
好ましくは、リン酸化の遮断活性又は阻害能は、実施例１０．２に説明するとおりのＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにより決定される。好ましくは、ＩＳＶは、ＭＣＦ−７細胞においてリガンド（例えばＨＲＧ１−β１）により誘発されたＥＲＫ１／２リン酸化の遮断活性又は阻害能を６００ｎＭ未満、しかし好ましくは５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ又はそれより少ないＩＣ５０でもって有する。
【００６９】
−例えば、３４Ｃ０７様ＩＳＶは、このアッセイにおいて、１５０ｎＭ未満、例えば１２０ｎＭ未満のＩＣ５０でもって遮断活性又は競合能を有する。
【００７０】
特定の、しかし限定しない一観点において、ドメインＩＩ結合アミノ酸配列（又はドメインＩＩ結合ＩＳＶ）は、ＨＥＲ３への結合に関してアミノ酸配列１８Ｇ１１（配列番号１６）と及び／又はアミノ酸配列３４Ｃ０７（配列番号１８）と競合する及び／又はＨＥＲ３への１８Ｇ１１及び／又は３４Ｃ０７の結合を交差遮断する（本願で定義するとおり）ことができるアミノ酸配列（又はＩＳＶ）であり、例えば、特に、実施例２に説明するアッセイにおいてである（セクション２．９）。また、特定の、しかし限定しない一観点において、ドメインＩＩ結合アミノ酸配列は、ＨＥＲ３リン酸化を阻害又は遮断することができ（実施例９及び１０）、例えば、実施例１０において使用されるリン酸化アッセイにおいて、好ましくは、リガンド結合を実質的に遮断又は実質的に阻害しない。かかるドメインＩＩ結合ＩＳＶのいくつかの好ましいが、限定しない例は、本願でさらに説明する、「１８Ｇ１１様配列」及び「３４Ｃ０７様配列」である。無論、そのうち、いくつかの３４Ｃ０７様配列は、ドメインＩＩに結合するだけでなく、限定／部分的な程度で、リガンド／ＨＥＲ３結合を阻害することができる本発明のＩＳＶの例である。
【００７１】
また、本願の発明の詳細な説明及び特許請求の範囲において、以下の用語が以下のように定義される：
Ａ）２１Ｆ０６様配列：「２１Ｆ０６様配列」、「２１Ｆ０６様ＩＳＶ」又は「２１Ｆ０６様構成ブロック」は、次のものを含むＩＳＶとして定義されている（本願で説明するとおり）：
ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＬＮＡＭＧ（配列番号６７）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＬＮＡＭＧと３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義するとおり）のいずれかを含むか又は実質的にこれらからなるＣＤＲ１、及び／又は
ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９７）、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義するとおり）のいずれかを含むか又は実質的にこれらからなるＣＤＲ２、及び／又は
ｃ）（ｉ）アミノ酸配列ＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳ （配列番号１２７）、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義するとおり）のいずれかを含むか又は実質的にこれらからなるＣＤＲ３、
その際、かかるＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、さらに本願で定義するとおりであり、かつ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、２１Ｆ０６様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（本願で説明するとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００７２】
本願でも言及したとおり、（いくつかの）２１Ｆ０６様配列は、（好ましくは）、ＨＥＲ３リン酸化を、例えば、実施例１０において使用されるリン酸化アッセイにおいて、阻害又は遮断できる（実施例９及び１０参照）ものであってよい。好ましくは、かかる２１Ｆ０６様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）で定義されている；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）で定義されている；又はＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）で定義されている。より好ましくは、かかる２１Ｆ０６様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は全てそれぞれａ）、ｂ）及びｃ）で定義したとおりである。やはり、かかる２１Ｆ０６様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、２１Ｆ０６様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００７３】
例えば、かかる２１Ｆ０６様配列においては次のことが該当する：ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＬＮＡＭＧ（ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）で定義されている）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又はＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）で定義されている）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又はＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳ（ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）で定義されている）を含むか又は実質的にこれからなってよい；特に、２１Ｆ０６様配列が、この観点に応じている場合には：ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＬＮＡＭＧを含むか又は実質的にこれからなってよい、かつ、ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ３は、上でｃ）で定義されている）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又はＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＬＮＡＭＧを含むか又は実質的にこれからなってよい、かつ、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳ（ＣＤＲ２は、上でｂ）で定義されている）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又はＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧ を含むか又は実質的にこれからなってよい、かつ、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳ （ＣＤＲ１は、上でａ）で定義されている）を含むか又は実質的にこれからなってよい。やはり、かかる２１Ｆ０６様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、２１Ｆ０６様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。特別に好ましい一観点において、「２１Ｆ０６様配列」、「２１Ｆ０６様ＩＳＶ」又は「２１Ｆ０６様構成ブロック」は、次のものを含有するＩＳＶである：
ｄ）（ｉ）アミノ酸配列ＬＮＡＭＧ又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＬＮＡＭＧと３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義するとおり）のいずれかであるＣＤＲ１、及び／又は
ｅ）（ｉ）アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧ、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義するとおり）のいずれかであるＣＤＲ２、及び／又は
ｆ）（ｉ）アミノ酸配列ＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳ、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義するとおり）のいずれかであるＣＤＲ３、及び／又は
その際、かかるＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、さらに本願で定義するとおりであり、かつ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、２１Ｆ０６様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（本願で説明するとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。好ましくは、この特別に好ましい観点に応じた２１Ｆ０６様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）で定義されているとおりである；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれｄ）及びｆ）で定義されているとおりである；又はＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｅ）及びｆ）で定義されているとおりである。より好ましくは、かかる２１Ｆ０６様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は全てそれぞれｄ）、ｅ）及びｆ）で定義したとおりである。やはり、かかる２１Ｆ０６様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、２１Ｆ０６様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００７４】
例えば、この特に好ましい観点に応じた２１Ｆ０６様配列においては次のことが該当する：
ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＬＮＡＭＧである（ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｅ）及びｆ）で定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧである（ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれｄ）及びｆ）で定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳである（ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）で定義したとおりである）。特に、２１Ｆ０６様配列が、この観点に応じている場合には：ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＬＮＡＭＧであり、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧである（ＣＤＲ３は、上でｆ）で定義されている）；及び／又は、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＬＮＡＭＧであり、ＣＤＲ３はＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳである（ＣＤＲ２は、上でｅ）で定義されている）；及び／又は、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧであり、ＣＤＲ３はＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳである（ＣＤＲ１は、上でｄ）で定義されている）。やはり、かかる２１Ｆ０６様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、２１Ｆ０６様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００７５】
特に好ましい２１Ｆ０６様配列において次のことが該当する：ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＬＮＡＭＧであり、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧであり、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳである。
【００７６】
このパラグラフＡ）において説明する全ての２１Ｆ０６様配列において、フレームワーク配列はさらに本願で説明するとおりであってよい。好ましくは、フレームワーク配列は、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の、２１Ｆ０６のフレームワーク配列との配列同一性を有するフレームワーク配列である（これは、例えば、計算においてＣＤＲを無視しつつ、所定の配列と２１Ｆ０６の配列との全体的な配列同一性の程度を決定することにより決定されることができる）。やはり、所定の配列に存在するＣＤＲとフレームワークの組み合わせは、好ましくは、生じる２１Ｆ０６様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。特定の一観点において、２１Ｆ０６様配列は、少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、又は９５％超の、アミノ酸配列２１Ｆ０６（配列番号２２）との配列同一性を有するＩＳＶである。例えば、この観点に応じた２１Ｆ０６様配列において、ＣＤＲは、上述した特異的に好ましい観点に応じてよく、かつ、特に（限定することなく）、ＬＮＡＭＧ（ＣＤＲ１）、ＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ２）及びＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳ（ＣＤＲ３）であってよい。やはり、好ましくは、かかる２１Ｆ０６様ＩＳＶにおいて存在するＣＤＲとフレームワークの組み合わせは、好ましくは、生じる２１Ｆ０６様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００７７】
特別な一観点において、任意の２１Ｆ０６様配列は、ヒト化及び／又は配列最適化配列であってよく、これはさらに本願で説明するとおりである。
【００７８】
Ｂ）０４Ｃ０７様配列：ａ）「０４Ｃ０７様配列」、「０４Ｃ０７様ＩＳＶ」又は「０４Ｃ０７様構成ブロック」は、次のものを含むＩＳＶとして定義されている（本願で説明するとおり）：
ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＰＭＳ（配列番号６０）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＹＰＭＳと３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義するとおり）のいずれかを含むか又は実質的にこれらからなるＣＤＲ１、及び／又は
ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９０）、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義するとおり）のいずれかを含むか又は実質的にこれらからなるＣＤＲ２、及び／又は
ｃ）（ｉ）アミノ酸配列ＤＬＮＮ（配列番号１２０）、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＬＮＮと少なくとも５０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＬＮＮと２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義するとおり）をのいずれか含むか又は実質的にこれらからなるＣＤＲ３、
その際、かかるＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、さらに本願で定義するとおりであり、かつ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、０４Ｃ０７様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（本願で説明するとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００７９】
好ましくは、かかる０４Ｃ０７様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）で定義したとおりである；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）で定義したとおりである；又はＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）で定義したとおりである。より好ましくは、かかる０４Ｃ０７様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は全てそれぞれａ）、ｂ）及びｃ）で定義したとおりである。やはり、かかる０４Ｃ０７様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、０４Ｃ０７様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００８０】
例えば、かかる０４Ｃ０７様配列においては次のことが該当する：ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＳＹＰＭＳ（ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）で定義したとおりである）を含むか又はこれから実質的になってよい；及び／又はＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）で定義したとおりである）を含むか又はこれから実質的になってよい；及び／又はＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＬＮＮ（ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）で定義したとおりである）を含むか又はこれから実質的になってよい。特に、０４Ｃ０７様配列が、この観点に応じている場合には：ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＳＹＰＭＳを含むか又は実質的にこれからなってよい、かつ、ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ３は、上でｃ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい；ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＳＹＰＭＳを含むか又はこれから実質的になってよい、かつ、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＬＮＮ（ＣＤＲ２は、上でｂ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又はＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧを含むか又はこれから実質的になってよい、かつ、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＬＮＮ（ＣＤＲ１は、上でａ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい。やはり、かかる０４Ｃ０７様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、０４Ｃ０７様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおりである）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００８１】
特別に好ましい一観点において、「０４Ｃ０７様配列」、「０４Ｃ０７様ＩＳＶ」又は「０４Ｃ０７様構成ブロック」は、次のものを含有するＩＳＶである：
ｄ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＰＭＳ又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＹＰＭＳと３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義される）であるＣＤＲ１、及び／又は
ｅ）（ｉ）アミノ酸配列ＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧ、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義される）のいずれかであるＣＤＲ２、及び／又は
ｆ）（ｉ）アミノ酸配列ＤＬＮＮ、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＬＮＮと少なくとも５０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＬＮＮと２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義される）のいずれかであるＣＤＲ３、
その際、かかるＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、さらに本願で定義するとおりであり、かつ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、０４Ｃ０７様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（本願で説明するとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００８２】
好ましくは、この特別に好ましい観点に応じた０４Ｃ０７様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）で定義したとおりである；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれｄ）及びｆ）で定義したとおりである；又はＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｅ）及びｆ）で定義したとおりである。より好ましくは、かかる０４Ｃ０７様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は全てそれぞれｄ）、ｅ）及びｆ）で定義したとおりである。やはり、かかる０４Ｃ０７様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、０４Ｃ０７様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００８３】
例えば、この特に好ましい観点に応じた０４Ｃ０７様配列においては次のことが該当する：ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＳＹＰＭＳである（ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｅ）及びｆ）で定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧである（ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれｄ）及びｆ）で定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＬＮＮである（ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）で定義したとおりである）。特に、０４Ｃ０７様配列が、この観点に応じている場合には：ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＳＹＰＭＳであり、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧである（ＣＤＲ３は、上でｆ）で定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＳＹＰＭＳであり、ＣＤＲ３はＤＬＮＮである（ＣＤＲ２は、上でｅ）で定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧであり、ＣＤＲ３はＤＬＮＮである（ＣＤＲ１は、上でｄ）で定義したとおりである）。やはり、かかる０４Ｃ０７様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、０４Ｃ０７様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００８４】
特に好ましい０４Ｃ０７様配列において次のことが該当する：ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＳＹＰＭＳであり、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧであり、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＤＬＮＮである。
【００８５】
このパラグラフＢ）において説明する全ての０４Ｃ０７様配列において、フレームワーク配列はさらに本願で説明するとおりであってよい。好ましくは、フレームワーク配列は、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の、０４Ｃ０７のフレームワーク配列との配列同一性を有するものである（これは、例えば、計算においてＣＤＲを無視しつつ、所定の配列と０４Ｃ０７の配列との全体的な配列同一性の程度を決定することにより決定されることができる）。やはり、所定の配列において存在するＣＤＲとフレームワークの組み合わせは、好ましくは、生じる０４Ｃ０７様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００８６】
特定の一観点において、０４Ｃ０７様配列は、少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、又は９５％超の、アミノ酸配列０４Ｃ０７（配列番号１５）との配列同一性を有するＩＳＶである。例えば、この観点に応じた０４Ｃ０７様配列において、ＣＤＲは、上述した特異的に好ましい観点に応じてよく、かつ、特に（限定することなく）、ＳＹＰＭＳ（ＣＤＲ１）、ＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ２）及びＤＬＮＮ（ＣＤＲ３）であってよい。やはり、好ましくは、かかる０４Ｃ０７様ＩＳＶにおいて存在するＣＤＲとフレームワークの組み合わせは、好ましくは、生じる０４Ｃ０７様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいてリン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００８７】
１つの特別な観点において、任意の０４Ｃ０７様配列は、ヒト化及び／又は配列最適化配列であってよく、これはさらに本願で説明するとおりである。
【００８８】
Ｃ）１７Ｂ０５様配列：「１７Ｂ０５様配列」、「１７Ｂ０５様ＩＳＶ」又は「１７Ｂ０５様構成ブロック」は、次のものを含むＩＳＶとして定義されている（本願で説明する）：
ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＬＮＡＭＡ（配列番号５８）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＬＮＡＭＡと３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義するとおり）のいずれかを含むか又は実質的にこれらからなるＣＤＲ１、及び／又は
ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８８）、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義するとおり）のいずれかを含むか又は実質的にこれらからなるＣＤＲ２、及び／又は
ｃ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹ（配列番号１１８）、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義するとおり）のいずれかを含むか又は実質的にこれらからなるＣＤＲ３、
その際、かかるＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、さらに本願で定義するとおりであり、かつ、その中でＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、１７Ｂ０５様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（本願で説明するとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいて（トランス）リン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、及び／又は、（ヘテロ）二量体化の遮断又は阻害活性を有する（ＥＧＦＲリガンド（ＥＧＦ）誘発されたＨＥＲ３リン酸化アッセイにより決定されるとおり）、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００８９】
本願で定義するとおり、（いくつかの）１７Ｂ０５様配列は（好ましくは）、リガンド結合を阻害又は遮断（完全に又は部分的に、さらに本願で説明する）することができる、特にＨＲＧのＨＥＲ３への結合を阻害又は遮断（完全に又は部分的に、さらに本願で説明する）することができる、ものであってよい。
【００９０】
好ましくは、かかる１７Ｂ０５様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）で定義したとおりである；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）で定義したとおりである；又はＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）で定義したとおりである。より好ましくは、かかる１７Ｂ０５様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は全てそれぞれａ）、ｂ）及びｃ）で定義したとおりである。やはり、かかる１７Ｂ０５様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、１７Ｂ０５様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（本願で説明するとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいて（トランス）リン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、及び／又は、（ヘテロ）二量体化の遮断又は阻害活性を有する（ＥＧＦＲリガンド（ＥＧＦ）誘発されたＨＥＲ３リン酸化アッセイにより決定されるとおり）、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００９１】
例えば、かかる１７Ｂ０５様配列においては次のことが該当する：ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＬＮＡＭＡ（ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又はＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又はＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹ（ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい。特に、１７Ｂ０５様配列は、この観点に応じている場合には：ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＬＮＡＭＡを含むか又は実質的にこれからなってよい、かつ、ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ３は、上でｃ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又はＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＬＮＡＭＡを含むか又は実質的にこれからなってよい、かつ、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹ（ＣＤＲ２は、上でｂ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又はＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧを含むか又は実質的にこれからなってよい、かつ、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹ（ＣＤＲ１は、上でａ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい。やはり、かかる１７Ｂ０５様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、１７Ｂ０５様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（本願で説明するとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいて（トランス）リン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、及び／又は（ヘテロ）二量体化の遮断又は阻害活性を有する（ＥＧＦＲリガンド（ＥＧＦ）誘発されたＨＥＲ３リン酸化アッセイにより決定されるとおり）、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００９２】
特別に好ましい一観点において、「１７Ｂ０５様配列」、「１７Ｂ０５様ＩＳＶ」又は「１７Ｂ０５様構成ブロック」は、次のものを含有するＩＳＶである：
ｄ）（ｉ）アミノ酸配列ＬＮＡＭＡ又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＬＮＡＭＡと３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義するとおり）のいずれかであるＣＤＲ１、及び／又は
ｅ）（ｉ）アミノ酸配列ＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧ、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義するとおり）のいずれかであるＣＤＲ２、及び／又は
ｆ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹ、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義するとおり）のいずれかであるＣＤＲ３；
その際、かかるＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、さらに本願で説明するとおりであり、かつ、その中でＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、１７Ｂ０５様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいて（トランス）リン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、及び／又は（ヘテロ）二量体化の遮断又は阻害活性を有する（ＥＧＦＲリガンド（ＥＧＦ）誘発されたＨＥＲ３リン酸化アッセイにより決定されるとおり）、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００９３】
好ましくは、この特別に好ましい観点に応じた１７Ｂ０５様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）で定義したとおりである；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれｄ）及びｆ）で定義したとおりである；又はＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｅ）及びｆ）で定義したとおりである。より好ましくは、かかる１７Ｂ０５様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は全てそれぞれｄ）、ｅ）及びｆ）で定義したとおりである。やはり、かかる１７Ｂ０５様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、１７Ｂ０５様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいて（トランス）リン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、及び／又は（ヘテロ）二量体化の遮断又は阻害活性を有する（ＥＧＦＲリガンド（ＥＧＦ）誘発されたＨＥＲ３リン酸化アッセイにより決定されるとおり）、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００９４】
例えば、この特に好ましい観点に応じた１７Ｂ０５様配列においては次のことが該当する：ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＬＮＡＭＡである（ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｅ）及びｆ）で定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧである（ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれｄ）及びｆ）で定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹである（ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）で定義したとおりである）。特に、１７Ｂ０５様配列は、この観点に応じている場合には：ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＬＮＡＭＡであり、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧである（ＣＤＲ３は、上でｆ）で定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＬＮＡＭＡであり、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹである（ＣＤＲ２は、上でｅ）で定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧであり、ＣＤＲ３はＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹである（ＣＤＲ１は、上でｄ）で定義したとおりである）。やはり、かかる１７Ｂ０５様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、１７Ｂ０５様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいて（トランス）リン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、及び／又は（ヘテロ）二量体化の遮断又は阻害活性を有する（ＥＧＦＲリガンド（ＥＧＦ）誘発されたＨＥＲ３リン酸化アッセイにより決定されるとおり）、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００９５】
特に好ましい１７Ｂ０５様配列において次のことが該当する：ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＬＮＡＭＡであり、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧであり、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹである。
【００９６】
このパラグラフＣ）において説明する全ての１７Ｂ０５様配列において、フレームワーク配列はさらに本願で説明するとおりであってよい。好ましくは、フレームワーク配列は、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の、１７Ｂ０５のフレームワーク配列との配列同一性を有するものである（これは、例えば、計算においてＣＤＲを無視しつつ、所定の配列と１７Ｂ０５の配列との全体的な配列同一性の程度を決定することにより決定されることができる）。やはり、所定の配列において存在するＣＤＲとフレームワークの組み合わせは好ましくは、生じる１７Ｂ０５様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいて（トランス）リン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、及び／又は（ヘテロ）二量体化の遮断又は阻害活性を有する（ＥＧＦＲリガンド（ＥＧＦ）誘発されたＨＥＲ３リン酸化アッセイにより決定されるとおり）、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００９７】
特定の一観点において、１７Ｂ０５様配列は、少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、又は９５％超の、アミノ酸配列１７Ｂ０５（配列番号１３）との配列同一性を有するＩＳＶである。例えば、この観点に応じた１７Ｂ０５様配列において、ＣＤＲは、上述した特異的に好ましい観点に応じてよく、かつ、特に（限定することなく）、ＬＮＡＭＡ（ＣＤＲ１）、ＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ２）及びＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹ（ＣＤＲ３）であってよい。
【００９８】
やはり、好ましくは、かかる１７Ｂ０５様ＩＳＶにおいて存在する、ＣＤＲとフレームワークの組み合わせは好ましくは、生じる１７Ｂ０５様ＩＳＶが遮断活性を有する、例えば、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を部分的に又は完全に遮断する（上で説明したとおり）、及び／又は、ＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいて（トランス）リン酸化の活性を遮断又は能力を阻害する、及び／又は（ヘテロ）二量体化の遮断又は阻害活性を有する（ＥＧＦＲリガンド（ＥＧＦ）誘発されたＨＥＲ３リン酸化アッセイにより決定されるとおり）、ものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【００９９】
特別な一観点において、任意の１７Ｂ０５様配列は、ヒト化及び／又は配列最適化配列であってよく、これはさらに本願で説明するとおりである。
【０１００】
Ｄ）１８Ｇ１１様配列：「１８Ｇ１１様配列」、「１８Ｇ１１様ＩＳＶ」又は「１８Ｇ１１様構成ブロック」は、次のものを含むＩＳＶとして定義されている（本願で説明する）：
ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＩＮＡＭＧ（配列番号６１）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＩＮＡＭＧと３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義する）を含むか又は実質的にこれらからなるＣＤＲ１、及び／又は
ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧ （配列番号９１）、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義する）を含むか又は実質的にこれらからなるＣＤＲ２、及び／又は
ｃ）（ｉ）アミノ酸配列ＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭ（配列番号１２１）、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義する）を含むか又は実質的にこれらからなるＣＤＲ３；
その際、かかるＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、さらに本願で説明するとおりであり、かつ、その中でＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、１８Ｇ１１様ＩＳＶがドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【０１０１】
本願で言及するとおり、（いくつかの）１８Ｇ１１様配列は、（限定／部分的であるか、又はより顕著であってよい）作用を、リガンド／ＨＲＧ結合（特に、これらは限定／部分的な程度で、リガンド／ＨＲＧのＨＥＲ３への結合を阻害又は遮断できてよい）及び／又はＨＥＲ３の（ヘテロ）二量体化のいずれかに対して有してよい。
【０１０２】
好ましくは、かかる１８Ｇ１１様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）で定義したとおりである；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）で定義したとおりである；又はＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）で定義したとおりである。より好ましくは、かかる１８Ｇ１１様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は全てそれぞれａ）、ｂ）及びｃ）で定義したとおりである。やはり、かかる１８Ｇ１１様配列においては、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、１８Ｇ１１様ＩＳＶが、ドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【０１０３】
例えば、かかる１８Ｇ１１様配列においては次のことが該当する：ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＩＮＡＭＧ（ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又はＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧ（ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又はＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭ（ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい。特に、１８Ｇ１１様配列がこの観点に応じる場合には；ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＩＮＡＭＧを含むか又は実質的にこれからなってよい、かつ、ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧ（ＣＤＲ３は、上でｃ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又は、ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＩＮＡＭＧを含むか又は実質的にこれからなってよい、かつ、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭ（ＣＤＲ２は、上でｂ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又は、ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧを含むか又は実質的にこれからなってよい、かつ、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭ（ＣＤＲ１は、上でａ）で定義したとおりである）を含むか又はこれから実質的になってよい。やはり、かかる１８Ｇ１１様配列においては、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、１８Ｇ１１様ＩＳＶが、ドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【０１０４】
特別に好ましい一観点において、「１８Ｇ１１様配列」、「１８Ｇ１１様ＩＳＶ」又は「１８Ｇ１１様構成ブロック」は、次のものを含有するＩＳＶである：
ｄ）（ｉ）アミノ酸配列ＩＮＡＭＧ又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＩＮＡＭＧと３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義したとおりである）であるＣＤＲ１、及び／又は
ｅ）（ｉ）アミノ酸配列ＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧ、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義する）であるＣＤＲ２、及び／又は
ｆ）（ｉ）アミノ酸配列ＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭ、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義する）であるＣＤＲ３；
その際、かかるＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、さらに本願で説明するとおりであり、かつ、その中でＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、１８Ｇ１１様ＩＳＶがドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【０１０５】
好ましくは、この特別に好ましい観点に応じた１８Ｇ１１様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）で定義したとおりである；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれｄ）及びｆ）で定義したとおりである；又はＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｅ）及びｆ）で定義したとおりである。より好ましくは、かかる１８Ｇ１１様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は全てそれぞれｄ）、ｅ）及びｆ）で定義したとおりである。やはり、かかる１８Ｇ１１様配列においては、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、１８Ｇ１１様ＩＳＶが、ドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。例えば、この特に好ましい観点に応じた１８Ｇ１１様配列においては次のことが該当する：ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＩＮＡＭＧである（ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、ｅ）及びｆ）でそれぞれ定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧである（ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、ｄ）及びｆ）でそれぞれ定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭである（ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、ｄ）及びｅ）でそれぞれ定義したとおりである）。特に、１８Ｇ１１様配列は、この観点に応じている場合には：ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＩＮＡＭＧであり、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧである（ＣＤＲ３は、上でｆ）で定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＩＮＡＭＧであり、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭである（ＣＤＲ２は、上でｅ）で定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧであり、ＣＤＲ３はＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭである（ＣＤＲ１は、上でｄ）で定義したとおりである）。やはり、かかる１８Ｇ１１様配列においては、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、１８Ｇ１１様ＩＳＶが、ドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【０１０６】
特に好ましい１８Ｇ１１様配列において次のことが該当する：ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＩＮＡＭＧであり、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧであり、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭである。
【０１０７】
このパラグラフＤ）において説明する全ての１８Ｇ１１様配列において、フレームワーク配列はさらに本願で説明するとおりであってよい。好ましくは、フレームワーク配列は、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の、１８Ｇ１１のフレームワーク配列との配列同一性を有するものである（これは、例えば、計算においてＣＤＲを無視しつつ、所定の配列と１８Ｇ１１の配列との全体的な配列同一性の程度を決定することにより決定されることができる）。やはり、所定の配列において存在する、ＣＤＲとフレームワークの組み合わせは好ましくは、生じる１８Ｇ１１様ＩＳＶが、ドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。特定の一観点において、１８Ｇ１１様配列は、少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、又は９５％超の、アミノ酸配列１８Ｇ１１（配列番号１６）との配列同一性を有するＩＳＶである。例えば、この観点に応じた１８Ｇ１１様配列において、ＣＤＲは、上述した特異的に好ましい観点に応じてよく、かつ、特に（限定されないが）、ＩＮＡＭＧ（ＣＤＲ１）、ＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧ（ＣＤＲ２）及びＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭ（ＣＤＲ３）であってよい。やはり、好ましくは、かかる１８Ｇ１１様ＩＳＶにおいて存在する、ＣＤＲとフレームワークの組み合わせは好ましくは、生じる１８Ｇ１１様ＩＳＶが、ドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【０１０８】
特別な一観点において、任意の１８Ｇ１１様配列は、ヒト化及び／又は配列最適化配列であってよく、これはさらに本願で説明するとおりである。
【０１０９】
Ｅ）３４Ｃ０７様配列：「３４Ｃ０７様配列」、「３４Ｃ０７様ＩＳＶ」又は「３４Ｃ０７様構成ブロック」は、次のものを含むＩＳＶとして定義されている（本願で説明する）：
ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＩＮＡＭＡ（配列番号６３）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＩＮＡＭＡと３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義する）を含むか又は実質的にこれらからなるＣＤＲ１、及び／又は
ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９３）、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義する）を含むか又は実質的にこれらからなるＣＤＲ２、及び／又は
ｃ）（ｉ）アミノ酸配列ＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹ（配列番号１２３）、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義する）を含むか又は実質的にこれらからなるＣＤＲ３；
その際、かかるＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、さらに本願で説明するとおりであり、かつ、その中でＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、３４Ｃ０７様ＩＳＶがドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【０１１０】
本願で言及するとおり、（いくつかの）３４Ｃ０７様配列は、（限定／部分的であるか、又はより顕著であってよい）作用を、リガンド／ＨＲＧ結合（特に、これらは限定／部分的な程度で、リガンド／ＨＲＧのＨＥＲ３への結合を阻害又は遮断できてよい）及び／又はＨＥＲ３の（ヘテロ）二量体化のいずれかに対して有してよい。特に、これらは、限定された程度で、ＨＥＲ３に対するリガンド／ＨＲＧ結合の阻害をすることができてよい。
【０１１１】
好ましくは、かかる３４Ｃ０７様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）で定義したとおりである；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）で定義したとおりである；又はＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）で定義したとおりである。より好ましくは、かかる３４Ｃ０７様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は全てそれぞれａ）、ｂ）及びｃ）で定義したとおりである。やはり、かかる３４Ｃ０７様配列においては、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、３４Ｃ０７様ＩＳＶが、ドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／３リン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【０１１２】
例えば、かかる３４Ｃ０７様配列においては次のことが該当する：ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＩＮＡＭＡ（ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又はＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又はＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹ（ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい。特に、３４Ｃ０７様配列は、この観点に応じている場合には：ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＩＮＡＭＡを含むか又は実質的にこれからなってよい、かつ、ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ３は、上でｃ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又は、ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＩＮＡＭＡを含むか又は実質的にこれからなってよい、かつ、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹ（ＣＤＲ２は、上でｂ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい；及び／又はＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧを含むか又は実質的にこれからなってよい、かつ、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹ（ＣＤＲ１は、上でａ）で定義したとおりである）を含むか又は実質的にこれからなってよい。やはり、かかる３４Ｃ０７様配列においては、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、３４Ｃ０７様ＩＳＶが、ドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／３リン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【０１１３】
特別に好ましい一観点において、「３４Ｃ０７様配列」、「３４Ｃ０７様ＩＳＶ」又は「３４Ｃ０７様構成ブロック」は、次のものを含有するＩＳＶである：
ｄ）（ｉ）アミノ酸配列ＩＮＡＭＡ又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＩＮＡＭＡと３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義する）であるＣＤＲ１、及び／又は
ｅ）（ｉ）アミノ酸配列ＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義する）であるＣＤＲ２、及び／又は
ｆ）（ｉ）アミノ酸配列ＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹ、又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％又は９５％超の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹと７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸相違のみを有するアミノ酸配列（本願で定義する）のいずれかであるＣＤＲ３；
その際、かかるＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、さらに本願で説明するとおりであり、かつ、その中でＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、３４Ｃ０７様ＩＳＶがドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【０１１４】
好ましくは、この特別に好ましい観点に応じた３４Ｃ０７様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）で定義したとおりである；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれｄ）及びｆ）で定義したとおりである；又はＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｅ）及びｆ）で定義したとおりである。より好ましくは、かかる３４Ｃ０７様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は全てそれぞれｄ）、ｅ）及びｆ）で定義したとおりである。やはり、かかる３４Ｃ０７様配列においては、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、３４Ｃ０７様ＩＳＶが、ドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／３リン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【０１１５】
例えば、この特に好ましい観点に応じた３４Ｃ０７様配列においては次のことが該当する：ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＩＮＡＭＡである（ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｅ）及びｆ）で定義されている）；及び／又は、ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧである（ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれｄ）及びｆ）で定義されている）；及び／又は、ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹである（ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）で定義されている）。特に、３４Ｃ０７様配列は、この観点に応じている場合には：ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＩＮＡＭＡであり、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧである（ＣＤＲ３は、上でｆ）で定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＩＮＡＭＡであり、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹである（ＣＤＲ２は、上でｅ）で定義したとおりである）；及び／又は、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧであり、ＣＤＲ３はＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹである（ＣＤＲ１は、上でｄ）で定義したとおりである）。やはり、かかる３４Ｃ０７様配列においては、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は好ましくは、３４Ｃ０７様ＩＳＶが、ドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／３リン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【０１１６】
特に好ましい３４Ｃ０７様配列において次のことが該当する：ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＩＮＡＭＡであり、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧであり、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹである。
【０１１７】
このパラグラフＥ）において説明する全ての３４Ｃ０７様配列において、フレームワーク配列はさらに本願で説明するとおりであってよい。好ましくは、フレームワーク配列は、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の、３４Ｃ０７のフレームワーク配列との配列同一性を有するものである（これは、例えば、計算においてＣＤＲを無視しつつ、所定の配列と３４Ｃ０７の配列との全体的な配列同一性の程度を決定することにより決定されることができる）。やはり、所定の配列において存在する、ＣＤＲとフレームワークの組み合わせは好ましくは、生じる３４Ｃ０７様ＩＳＶが、ドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【０１１８】
特定の一観点において、３４Ｃ０７様配列は、少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、又は９５％超の、アミノ酸配列３４Ｃ０７（配列番号１８）との配列同一性を有するＩＳＶである。例えば、この観点に応じた３４Ｃ０７様配列において、ＣＤＲは、上述した特異的に好ましい観点に応じてよく、かつ、特に（限定することなく）、ＩＮＡＭＡ（ＣＤＲ１）、ＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ２）及びＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹ（ＣＤＲ３）であってよい。やはり、好ましくは、かかる３４Ｃ０７様ＩＳＶにおいて存在する、ＣＤＲとフレームワークの組み合わせは好ましくは、生じる３４Ｃ０７様ＩＳＶが、ドメインＩＩ結合活性、リン酸化の遮断活性又は阻害能をＨＥＲ３リン酸化アッセイ及び／又はｐＡＫＴリン酸化アッセイ及び／又はＥＲＫ１／２リン酸化アッセイにおいて有するものである（これら全ては上で説明したとおりである）。
【０１１９】
１つの特別な観点において、任意の３４Ｃ０７様配列は、ヒト化及び／又は配列最適化配列であってよく、これはさらに本願で説明するとおりである。
【０１２０】
特別な一観点において、任意の３４Ｃ０７様配列は、ヒト化及び／又は配列最適化配列であってよく、これはさらに本願で説明するとおりである。
【０１２１】
親和性（ＫD値（実際の又は見掛けの）、ＫA値（実際の又は見掛けの）、ｋon速度及び／又はｋoff速度、又は代わりにＩＣ50値として、好適に測定及び／又は表現される、本願でさらに説明する）をもってＨＥＲ３に結合することができる、本願で説明する本発明のアミノ酸配列（本願で言及する特定の観点、例えば先行するパラグラフにおいて言及する観点によるものを含む）全ては、本願で定義するとおりである；また同様に化合物及びコンストラクト、特にタンパク質及びポリペプチドであって、少なくとも１のかかるアミノ酸配列を有するものである。
【０１２２】
特に、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは好ましくは次のものである：
−解離定数（ＫD）１０-5〜１０-12モル／リットル以下、好ましくは１０-7〜１０-12モル／リットル以下、より好ましくは１０-8〜１０-12モル／リットル（すなわち、会合定数（ＫA）１０5〜１０12リットル／モル以上、好ましくは１０7〜１０12リットル／モル以上、より好ましくは１０8〜１０12リットル／モル）でＨＥＲ３に結合する；
及び／又は：
−１０2Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1、好ましくは１０3Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1、より好ましくは１０4Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1、例えば１０5Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1のｋon速度でＨＥＲ３に結合する；
及び／又は：
−１ｓ-1（ｔ1/2＝０．６９ｓ）〜１０-6ｓ-1（複数の日のｔ1/2でもってほぼ不可逆的な複合体を提供する）、好ましくは１０-2ｓ-1〜１０-6ｓ-1、より好ましくは１０-3ｓ-1〜１０-6ｓ-1、例えば１０-4ｓ-1〜１０-6ｓ-1のｋoff速度でＨＥＲ３に結合する。
【０１２３】
好ましくは、本発明の一価のアミノ酸配列（又は本発明の唯一のアミノ酸配列を含むポリペプチド）は、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＨＥＲ３に結合するものである。
【０１２４】
ＨＥＲ３への本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドの結合のためのいくつかの好ましいＩＣ50値は、本願の更なる発明の詳細な説明及び実施例から明らかになる。
【０１２５】
ＨＥＲ３への結合のために、本発明のアミノ酸配列は通常は、そのアミノ酸配列内に１又は複数のアミノ酸残基又は１又は複数のアミノ酸残基伸長部を含むものであり（すなわち、各「伸長部」は、相互に隣接するか又は相互に近い近傍部にある、すなわち、アミノ酸配列の一次又は三次構造にある、２以上のアミノ酸残基を含む）、それを介して、本発明のアミノ酸配列はＨＥＲ３に結合することができ、そのアミノ酸残基又はアミノ酸残基伸長部はそうしてＨＥＲ３に対する結合のための「部位」を形成する（本願では「抗原結合部位」とも称される）。
【０１２６】
本発明により提供されるアミノ酸配列は、好ましくは、実質的に単離された形にある（本願で定義する）か、又は、本発明のタンパク質又はポリペプチドの部分を形成し（本願で定義する）、これは、本発明のアミノ酸配列１以上を含むか又は実質的にこれらからなり、かつ、任意にさらに更なるアミノ酸配列１以上を含んでよい（全て、１以上の好適なリンカーにより任意に連結されている）。例示的に、かつ、限定することなく、本発明のアミノ酸配列１以上は、かかるタンパク質又はポリペプチドにおいて結合ユニットとして使用されてよく、これは、結合ユニット（すなわち、ＨＥＲ３以外の１以上の他の標的に対する）として機能できる１以上の更なるアミノ酸配列を任意に含有してよく、その結果、一価、多価又は多特異性の本発明のポリペプチドをそれぞれ提供する（全て本願で説明する）。かかるタンパク質又はポリペプチドは、実質的に単離された形にあってもよい（本願で説明する）。
【０１２７】
このような本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、好ましくは、任意の他のアミノ酸配列又は鎖に対してジスルフィド架橋を介して連結していない（しかし、１以上の分子内ジスルフィド架橋を有しても又は有しなくてよい。例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はナノボディは、時として、−本願で説明するとおり−ＣＤＲ３とＣＤＲ１又はＦＲ２の間にジスルフィド架橋を有してよいことが知られている）単一アミノ酸鎖から実質的になる。しかし、本発明の１以上のアミノ酸配列は、本発明において有用であってもよいペプチドコンストラクト（例えば、Ｆａｂ′フラグメント、Ｆ（ａｂ′）２フラグメント、ＳｃＦｖコンストラクト、「ｄｉａｂｏｄｉｅｓ」及び他の多特異性コンストラクト、例えば、Holliger and Hudsonによる概要Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9): 1126-36が参照される）を提供すべく、相互に及び／又は他のアミノ酸配列に（例えばジスルフィド架橋を介して）連結してよいことに留意すべきである。
【０１２８】
一般に、本発明のアミノ酸配列（又は、化合物、コンストラクト又はポリペプチドであって前記配列を含むもの）について、被験体への投与が意図される場合（例えば、本願で説明する療法及び／又は診断目的のために）には、好ましくは、前記被験体中で天然に発生しないアミノ酸配列であるか、又は、前記被験体中で天然に発生する場合には、実質的に単離された形にある（本願で説明する）、のいずれかである。
【０１２９】
医薬用途のために、本発明のアミノ酸配列（また同様に化合物、コンストラクト及びポリペプチドであって前記配列を含むもの）が、好ましくはヒトＨＥＲ３に対して指向していることが当業者には明らかでもある。その一方で、獣医薬目的のために、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは好ましくは、治療すべき種からのＨＥＲ３に対して指向しているか、又は、治療すべき種からのＨＥＲ３と少なくとも交差反応性である。
【０１３０】
さらに、本発明のアミノ酸配列は、任意に、かつ、ＨＥＲ３に対する結合のための少なくとも１の結合部位に加えて、１以上の更なる結合部位を、他の抗原、タンパク質又は標的に対する結合のために有してもよい。
【０１３１】
本発明のアミノ酸配列及びポリペプチド、及び、これらを含有する組成物の効力は、任意の好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞ベースアッセイ、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ及び／又は自体既知の動物モデル、又はその任意の組み合わせを用いて、関連する特定の疾病又は疾患に応じて、試験されてよい。好適なアッセイ及び動物モデル、また同様に、以下の実験部分及び本願で引用する先行技術において使用されるアッセイ及び動物モデルは、当業者には明らかであり、かつ、例えば、［リガンド依存性ＨＥＲ３リン酸化（Wallasch et. Al. (1995) EMBO J 14(17): 4267-4275）及び異種移植腫瘍モデル（Schoeberl et. al. (2009) Sci. Signal. 2(77): ra 31）］を含む。
【０１３２】
また、本発明によれば、第１の種の温血動物からのＨＥＲ３に対して指向しているアミノ酸配列及びポリペプチドは、１以上の他の種の温血動物からのＨＥＲ３と交差反応性を示すか又は示さなくてよい。例えば、ヒトＨＥＲ３に対して指向しているアミノ酸配列及びポリペプチドは、１以上の他の種の霊長類（例えば、限定することなく、マカカ属のサル（例えば、特に、カニクイザル（Macaca fascicularis）及び／又はアカゲザル（Macaca mulatto））及びバブーン（Papio ursinus））からのＨＥＲ３と、及び／又は、疾病のための動物モデル（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ又はイヌ）において、特にＨＥＲ３関連疾病及び疾患のための動物モデルにおいてしばしば使用される１以上の種の動物（例えば、本願で言及される種及び動物モデル）からのＨＥＲ３と、交差反応性を示してよいか又は示さなくてよい。この関連において、かかる交差反応性は、存在する場合には、薬物開発観点から利点を有してよいことが当業者には明らかであり、というのも、これによって、ヒトＨＥＲ３に対するアミノ酸配列及びポリペプチドをかかる疾病モデルにおいて試験することが可能になるからである。
【０１３３】
より一般には、複数の種の哺乳類からのＨＥＲ３と交差反応性である本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、通常は、獣医薬適用における用途に有利であり、というのも、これによって、同じアミノ酸配列又はポリペプチドが複数の種を超えて使用されることが可能になるからである。こうして、本発明の範囲内に、動物の１の種からのＨＥＲ３に対して指向したアミノ酸配列及びポリペプチド（例えば、ヒトＨＥＲ３に対するアミノ酸配列及びポリペプチド）が、アミノ酸配列及び／又はポリペプチドの使用が、治療すべき種において所望の作用を提供する限り、別の種の動物の治療において使用できることも包含される。
【０１３４】
本発明は、その最も広い意味合いにおいては、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが指向するＨＥＲ３の、特定の抗原決定子、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又はコンフォメーション（適用可能な場合には）によって特に限定されたり又は定義されたりもしない。例えば、アミノ酸配列及びポリペプチドは、「相互作用部位」に対して指向してよいか又はしなくてよい（本願で定義する）。しかし、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが、好ましくは、（本願で定義するとおり）相互作用部位に対して、特にヘレグリン結合部位及び／又はヘテロ二量体化部位に対して指向することが一般に想定されかつ好まれている（Hsieh and Moasser（既述）を参照のこと）。こうして、本願でさらに説明するとおり、好ましいが、限定しない一観点において、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＨＥＲ３リガンド結合部位に対して及び／又はＨＥＲ３二量体化に対して指向し、かつ、これらは本願でさらに定義するとおりである。他のＨＥＲ３リガンドが、ヘレグリンの他に説明されていることに留意される（Sithanandam and Anderson (2008) Cancer Gene Therapy, 既述）。こうして、別の好ましいが、限定しない観点において、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ヘレグリン（本願で「ＨＲＧ」とも称される）結合部位に対して及び／又はＨＥＲ３のヘテロ二量体化部位に対して指向している。上述のとおり、ＨＲＧ結合部位に対して指向している本発明のアミノ酸配列は、本願で「ＨＲＧ遮断アミノ酸配列」、「ＨＲＧ遮断構成ブロック」とも、又はこれらがＩＳＶである場合には「ＨＲＧ遮断ＩＳＶ」とも称される。ＨＥＧ結合部位に対して指向している（かつ、最も好ましくは、ＨＥＲ３ヘテロ二量体化の阻害又は遮断が可能でもある、本願でさらに説明するとおり）本発明のアミノ酸配列は、本願で「二量体化遮断アミノ酸配列」、「二量体化遮断構成ブロック」とも、又はこれらがＩＳＶである場合には「二量体化遮断ＩＳＶ」とも称される。
【０１３５】
本願でさらに説明するとおり、本発明のポリペプチドは、ＨＥＲ３に対して指向している、２以上の本発明のアミノ酸配列を含んでよく、好ましい一観点においては、２つの異なるアミノ酸配列、例えばＨＥＲ３に対して指向している複数の免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでよい。一般に、かかるポリペプチドは、本発明の単一アミノ酸配列に比較して増加したアビディティでＨＥＲ３に結合するものである。かかるポリペプチドは、例えば、ＨＥＲ３の同じ抗原決定子、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又はコンフォメーション（適用可能な場合には）に対して指向している本発明のアミノ酸配列２つを含んでよい（これは１つの相互作用部位であってもよいし又はそうでなくてもよい）、又は、ＨＥＲ３の第１の同じ抗原決定子、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又はコンフォメーション（適用可能な場合には）に対して指向している少なくとも１の「第１の」本発明のアミノ酸配列（これは、例えばヘレグリン相互作用部位であってよい）、及び、第１のものとは異なる（かつ、例えば、ヘテロ二量体化部位に対して指向されていてよい）、第２の抗原決定子、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又はコンフォメーション（適用可能な場合には）に対して指向している少なくとも１の「第２の」本発明のアミノ酸配列を含んでよい、好ましくは、本発明のかかる「ビパラトープ性」ポリペプチドにおいては、少なくとも１の本発明のアミノ酸配列は、相互作用部位に対して指向しており（本願で定義するとおり）、しかし、本発明はその最も広い意味合いにおいてそれに限定されない。
【０１３６】
相応して、かつ、本願でさらに説明するように、特定の有利であるが限定しない一観点において、本発明は、ＨＲＧ結合部位に対して指向し、かつまた、ＨＥＲ３ヘテロ二量体化の遮断又は阻害もすることができる（例えば、１以上（例えば１又は２）のＨＲＧ遮断構成ブロックと１以上（例えば１又は２）の二量体化遮断構成ブロックを本発明の単一ポリペプチド中で組み合わせることにより）、本発明のポリペプチドを提供することを可能にする（このことは、さらに本願で説明してもよい）。
【０１３７】
また、標的（すなわち、ＨＥＲ３）が結合対（例えば、レセプター−リガンド結合対）の一部である場合には、このアミノ酸配列及びポリペプチドは、標的に対する結合のために同起源の結合パートナー（例えば、リガンド、レセプター又は他の結合パートナー、適用可能な場合には）と競合する、及び／又は、これらが（完全に又は部分的に）標的に対する結合パートナーの結合を中和する、ものであってよい。この観点において、やはり、上述のように、他のＨＥＲ３リガンドが、ヘレグリンの他に説明されていること（Sithanandam and Anderson (2008), Cancer Gene Therapy, 既述）、そして、本発明のアミノ酸配列が、ＨＥＲ３に対するかかるリガンドの結合と競合及び／又はこれを（完全に又は部分的に）中和して（も）よい、に留意すべきである。
【０１３８】
適用可能な場合には、本発明のアミノ酸配列は、２以上の、ＨＥＲ３の抗原決定子、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又はコンフォメーションに結合できることも本発明の範囲内にある。かかる場合に、本発明のアミノ酸配列及び／又はポリペプチドが結合する、ＨＥＲ３の抗原決定子、エピトープ、部分、ドメイン又はサブユニットは実質的に同じであってよい（例えば、ＨＥＲ３が、繰り返し構造モチーフを含有するか又は多量体の形で発生する場合）か、又は、異なってよい（後者の場合には、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、かかる異なる、ＨＥＲ３の抗原決定子、エピトープ、部分、ドメイン又はサブユニットに、同じか又は異なってよい親和性及び／又は特異性で結合してよい）。また、例えば、ＨＥＲ３が、活性化したコンフォメーションにおいて及び不活性なコンフォメーションにおいて存在する場合には、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、これらコンフォメーションのいずれか１つに結合してよいか、又はこれらコンフォメーションの両者に結合してよい（すなわち、同じか又は異なってよい親和性及び／又は特異性でもって）。また、例えば、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、適切なリガンドに結合している、ＨＥＲ３のコンフォメーションに結合してよいか、適切なリガンドに結合していない、ＨＥＲ３のコンフォメーションに結合してよいか、又は、かかるコンフォメーションの両方に結合してよい（やはり、同じか又は異なってよい親和性及び／又は特異性でもって）。
【０１３９】
本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが一般に、全ての天然に発生するか又は合成の、ＨＥＲのアナログ、変異体、突然変異体、アレル、部分及びフラグメントに、又は、少なくとも、ＨＥＲのアナログ、変異体、突然変異体、アレル、部分及びフラグメントであって１以上の抗原決定子又はエピトープを有するもの（これらは、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドがＨＥＲ３中で（例えば、野生型ＨＥＲ３中で）結合する１又は複数の抗原決定子又は１又は複数のエピトープと、実質的に同じである）に、結合するものであることも予期される。やはり、かかる場合には、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、かかるアナログ、変異体、突然変異体、アレル、部分及びフラグメントに、本発明のアミノ酸配列が（野生型）ＨＥＲ３に結合する親和性及び特異性と同じか又は異なる（すなわち、より高いか又はより低い）親和性及び／又は特異性でもって結合してよい。本発明の範囲内には、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが、ＨＥＲ３の、いくつかのアナログ、変異体、突然変異体、アレル、部分及びフラグメントに結合するが、他のものには結合しないことも含まれる。
【０１４０】
ＨＥＲ３がモノマー形及び１以上の多量形で存在する場合には、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが、モノマー形でＨＥＲ３にのみ結合するか、多量形でＨＥＲ３にのみ結合するか、又は、モノマー形及び多量形の両方に結合する、ことは本発明の範囲内である。やはり、かかる場合には、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、本発明のアミノ酸配列が多量形に結合する親和性及び特異性と同じか又は異なる（すなわち、より高いか又はより低い）親和性及び／又は特異性でもって前記モノマー形に結合してよい。
【０１４１】
また、ＨＥＲ３が、タンパク質複合体を形成するために他のタンパク質又はポリペプチドと（例えば、ＭＥＴ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２又はＨＥＲ４と）会合できる場合には、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが、その会合していない状態でＨＥＲ３に結合すること、その会合している状態でＨＥＲ３に結合すること、又は両方に結合すること、好ましくは、その会合していない状態に対してのみ又はこれに優先的に結合し、かつ、とにかく少なくとも部分的にヘテロ二量体化を妨げること、は本発明の範囲内である。これら全ての場合において、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが、そのモノマー状態及び非会合状態にあるＨＥＲ３に結合する親和性及び特異性と同じか又は異なる（すなわち、より高いか又はより低い）親和性及び／又は特異性でもってかかる多量体又は会合したタンパク質複合体に結合してよい。
【０１４２】
また、当業者には明らかであるように、ＨＥＲ３に対して指向している２以上のアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチドは、相応するモノマー状アミノ酸配列よりもより高いアビディティでＨＥＲ３に結合してよい。例示的に、かつ、限定することなく、ＨＥＲ３の異なるエピトープに対して指向している２以上のアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチドは、それぞれの異なるモノマーよりもより高いアビディティでもって結合してよく（通常は結合するものであり）、そして、ＨＥＲ３に対して指向している２以上のアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチドは、ＨＥＲ３の多量体により高いアビディティでもって結合してもよい（通常は結合するものである）。
【０１４３】
一般に、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、生物学的及び／又は療法的観点から最も関連のあるＨＥＲ３のそれら形態（モノマー状、多量体状の及び会合した形態）を含むに少なくとも結合するものであり、このことは、当業者に明らかであり、かつ、本願で好ましい一観点において説明するとおりである。
【０１４４】
本願で想定される使用に好適である限りは、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドの部分、フラグメント、アナログ、突然変異体、変異体、アレル及び／又は誘導体を使用すること、及び／又は、１以上のかかる部分、フラグメント、アナログ、突然変異体、変異体、アレル及び／又は誘導体を含むか又は実質的にこれらからなるタンパク質又はポリペプチドを使用すること、も、本発明の範囲内にある。かかる部分、フラグメント、アナログ、突然変異体、変異体、アレル及び／又は誘導体は、通常は、ＨＥＲ３に対する結合のための（少なくとも一部の）機能的抗原結合部位を含むものである。そして、より好ましくは、ＨＥＲ３に特異的に結合でき、よりいっそう好ましくはＨＥＲ３に、本願で定義する親和性（ＫD値（実際の又は見掛けの）、ＫA値（実際の又は見掛けの）、ｋon速度及び／又はｋoff速度、又は代わりにＩＣ50値として、好適に測定及び／又は表現される、本願でさらに説明するとおり）でもって結合できるものである。かかる部分、フラグメント、アナログ、突然変異体、変異体、アレル、誘導体、タンパク質及び／又はポリペプチドのいくつかの限定しない例は、本願の更なる発明の詳細な説明から明らかである。本発明の追加的なフラグメント又はポリペプチドは、本願で説明する１以上の（より小さい）部分又はフラグメントを好適に組み合わせることによって（すなわち、例えば、連結又は遺伝子融合によって）提供されてもよい。
【０１４５】
本発明の特定の、しかし限定しない一観点（本願でさらに説明する）において、かかるアナログ、突然変異体、変異体、アレル、誘導体は、これらが由来するアミノ酸配列に比較して、（本願でさらに説明する）増加した半減期を血清中で有する。例えば、本発明のアミノ酸配列は、本発明のアミノ酸配列の誘導体に増加した半減期を提供すべく、半減期を延長させる１以上の基又は部分（例えばＰＥＧ）に（化学的に又は他の手法で）連結されていてよい。
【０１４６】
特定の、しかし限定しない一観点において、本発明のアミノ酸配列は、免疫グロブリンフォールドを含有するアミノ酸配列であってよいか、又は、好適な条件（例えば、生理学的条件）下で、免疫グロブリンフォールドを（すなわち、フォールディングにより）形成することができるアミノ酸配列であってよい。特に、Halaby et al., J. (1999) Protein Eng. 12, 563-71による概要が参照される。好ましくは、免疫グロブリンを形成すべく適切にフォールディングされると、かかるアミノ酸配列は、ＨＥＲ３への特異的結合（本願で説明する）をすることができる。そして、より好ましくは、本願で更に定義する親和性（ＫD値（実際の又は見掛けの）、ＫA値（実際の又は見掛けの）、ｋon速度及び／又はｋoff速度、又は代わりにＩＣ50値として、好適に測定及び／又は表現される、本願でさらに説明する）でもってＨＥＲ３に結合することができる。また、かかるアミノ酸配列の部分、フラグメント、アナログ、突然変異体、変異体、アレル及び／又は誘導体は、好ましくは、免疫グロブリンフォールドを含むか、又は、好適な条件下で、免疫グロブリンフォールドを形成できるものである。
【０１４７】
特に、しかし限定することなく、本発明のアミノ酸配列は、実質的に、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）、又は、かかるアミノ酸配列の任意の好適なフラグメント（この場合に、これは通常は、少なくとも１つのＣＤＲｓを形成する少なくともいくつかのアミノ酸残基を含有する、本願で説明するとおり）からなるアミノ酸配列であってよい。
【０１４８】
本発明のアミノ酸配列は、特に、免疫グロブリン配列又はその好適なフラグメントであってよく、より好ましくは免疫グロブリン単一可変ドメイン配列又はその好適なフラグメント、例えば、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶL配列）又はその好適なフラグメント、又は重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶH配列）又はその好適なフラグメントであってよい。本発明のアミノ酸配列が、重鎖可変ドメイン配列である場合には、これは、慣用の四鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列（例えば、限定することなく、ヒト抗体に由来するＶH配列）、又は、ラクダ科の動物、例えばラマからのいわゆる「重鎖抗体」に由来するいわゆるＶHH配列（本願で定義するとおり）であってよい。
【０１４９】
しかし、本発明が、本発明のアミノ酸配列（又は、それを発現すべく使用される本発明のヌクレオチド配列）の起源に関して限定されたり、本発明のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が作成又は取得される（又は作成又は取得されている）手法に関して限定されたりしないことに留意すべきである。こうして、本発明のアミノ酸配列は、天然に発生するアミノ酸配列（任意の好適な種からの）又は合成又は半合成のアミノ酸配列であってよい。本発明の特定の、しかし限定しない一観点において、このアミノ酸配列は、天然に発生する免疫グロブリン配列（任意の好適な種からの）又は合成又は半合成の免疫グロブリン配列であり、これは、「ヒト化」（本願で定義するとおり）免疫グロブリン配列（例えば、部分的又は完全にヒト化したマウス又はウサギ免疫グロブリン配列、特に部分的又は完全にヒト化したＶHH配列又はナノボディ）、「ラクダ化」（本願で定義するとおり）免疫グロブリン配列、また同様に免疫グロブリン配列であって最適発現及び／又は安定性及び／又は溶解性について配列最適化したもの、また同様に、次の技術から獲得されている免疫グロブリン配列、例えば、親和性成熟化（例えば、合成、ランダム又は天然に発生する免疫グロブリン配列から出発して）、ＣＤＲグラフティング、ベニアリング（veneering）、異なる免疫グロブリン配列に由来するフラグメント組み合わせ、重複プライマーを用いるＰＣＲアセンブリー、及び、免疫グロブリン配列のエンジニアリングのための当業者によく知られている同様の技術、又は、前述の任意のものの任意の好適な組み合わせを含むが、これらに限定されない。例えば、標準的なハンドブック、また同様に更なる発明の詳細な説明及び本願で言及される先行技術が参照される。
【０１５０】
同様に、本発明のヌクレオチド配列は、天然に発生するヌクレオチド配列又は合成の又は半合成の配列であってよく、かつ、例えば、好適に天然に発生するテンプレートからＰＣＲにより単離された配列（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであって細胞から単離されたもの）、ライブラリー（特に、発現ライブラリー）から単離されたヌクレオチド配列、（任意の好適な自体既知の技術、例えばミスマッチＰＣＲを使用して）天然に発生するヌクレオチド配列中へと突然変異を導入することによって調製されたヌクレオチド配列、重複プライマーを用いてＰＣＲにより調製されたヌクレオチド配列、又は、自体既知のＤＮＡ合成のための技術を使用して調製されたヌクレオチド配列であってよい。
【０１５１】
本発明のアミノ酸配列は、特に、免疫グロブリン単一可変ドメイン（又は免疫グロブリン単一可変ドメインであって免疫グロブリン単一可変ドメインとしての使用に好適なもの）、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、又はナノボディ（本願で定義するとおり、かつ、ＶHH配列を含むが、これに限定されない）、他の単一可変ドメイン、又はこれらのうちのいずれかの任意の好適なフラグメントであってよい。（単一）ドメイン抗体の一般的な説明に関しては、上で引用した先行技術、また同様にＷＯ０３６８６８４も参照する。「ｄＡｂ」との用語に関しては、例えば、Ward et al. (Nature, 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6)、Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(l l):484-490、また同様にＷＯ０６／０３０２２０、ＷＯ０６／００３３８８及びDomantis Ltd.の他の公開された特許出願を参照する。哺乳類起源でないため、本発明の文脈においてあまり好ましくはないが、単一ドメイン抗体又は単一可変ドメインは、特定の種のサメに由来してよいことにも留意すべきである（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えばＷＯ０５／１８６２９参照のこと）。
【０１５２】
特に、本発明のアミノ酸配列は、免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ（本願で定義するとおり）又はその好適なフラグメントであってよい。ＨＥＲ３に対して指向しているかかるナノボディは、本願では「本発明のナノボディ」とも称される。
【０１５３】
免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディの一般的な説明に関しては（注意：「免疫グロブリン単一可変ドメイン」及び「ナノボディ」との用語は本願において相互に交換可能に使用される）、以下の更なる説明、また同様に本願で引用される先行技術が参照される。特に、ＷＯ０８／０２００７９又はＷＯ０９／０６８６２７で定義される、かつその中で説明されるナノボディとの用語は、一般に、ＶHHドメイン（例えば、ラクダ科において発生する「重鎖のみ」抗体に由来するＶHドメイン）の機能的及び／又は構造的な特徴を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを指し、特に、（天然）ＶHH、ヒト化ＶHH又はラクダ化ＶH、例えばラクダ化ヒトＶHであってよい。
【０１５４】
この観点において、しかし、本願の発明の詳細な説明及び先行技術は、主として、いわゆる「ＶH３クラス」のナノボディ（すなわち、ＶH３クラス、例えばＤＰ−４７、ＤＰ−５１又はＤＰ−２９のヒト生殖細胞系配列に対する高度の配列相同性を有するナノボディ）を説明していることに留意すべきであり、このナノボディは、本発明の好ましい一観点を形成する。しかし、本発明は、その最も広い意味合いにおいて、一般に、ＨＥＲ３に対して指向している任意の種類のナノボディをカバーすること、例えば、いわゆる「ＶH4クラス」に属するナノボディ（すなわち、ＶH４クラス、例えばＤＰ−７８のヒト生殖細胞系配列に対する高度の配列相同性を有するナノボディ）もカバーすることに留意すべきであり、このことは例えばＷＯ０７／１１８６７０に説明されている。
【０１５５】
一般に、ナノボディ（特に、ＶHH配列及び部分的にヒト化したナノボディ）は、特に、１以上のフレームワーク配列（やはり本願でさらに説明するとおり）中の１以上の「特徴残基（Hallmark residues）」（本願で説明するとおり）の存在により特徴付けられることができる。
【０１５６】
こうして、一般に、ナノボディは、次の（一般）構造を有するアミノ酸配列として定義されることができる
ＦＲｌ−ＣＤＲｌ−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
［式中、ＦＲ１〜ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１〜４を指し、そしてＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１〜３を指し、その中で、１以上の特徴残基は本願でさらに定義するとおりである］。
【０１５７】
特に、ナノボディは、次の（一般）構造を有するアミノ酸配列であることができる
ＦＲｌ−ＣＤＲｌ−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
［式中、ＦＲ１〜ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１〜４を指し、そしてＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１〜３を指し、その中で、フレームワーク配列は本願でさらに定義するとおりである］。
【０１５８】
特に、ナノボディは、次の（一般）構造を有するアミノ酸配列であることができる
ＦＲｌ−ＣＤＲｌ−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
［式中、ＦＲ１〜ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１〜４を指し、そしてＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１〜３を指し、その中で、それぞれ次のことが該当する：
ｉ）好ましくは、Kabat numberingに応じた位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８にある１以上のアミノ酸残基は、以下の表Ｂ−２で言及する特徴残基から選択される。これらナノボディ中で、ＣＤＲ配列は一般に本願でさらに定義するとおりである。］。
【０１５９】
表Ｂ−２：ナノボディ中の特徴残基
【表１】
2013529079.tif 000002
【表２】
2013529079.tif 000003
【０１６０】
本願でさらに説明するとおり、ＩＳＶがナノボディである場合に、これらは、一般に、ＷＯ０９／０６８６２の２５８〜２９７頁（参照により本願に組み込む）に説明されるとおりのフレームワーク配列を含んでよい。いくつかの特に好ましいが、限定しないフレームワーク配列（及びこの好ましい組み合わせ）は、本願の開示に基づいて当業者に明らかであり、かつ、例えば、表Ａ−１（表Ｂ−１も参照）に列記されるナノボディ中に存在するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４配列（及びその組み合わせ）、又は、その変異体であって限定された数のみ（例えば、各ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４ごとに、５未満、例えば４、３、２又は１つのみ）のアミノ酸相違（ＷＯ０９／０６８６２７及びＷＯ０８／０２００７９で定義されるとおり）を有するものを含み、前記アミノ酸相違は例えば、ヒト化置換及び／又は他のアミノ酸相違であって配列最適化の目的で導入されたものであってよい（前者及び後者の両方のいくつかの限定しない例は、本願の及びＷＯ０９／０６８６２７及びＷＯ０８／０２００７９中の開示に基づいて当業者に明らかである）。
【０１６１】
こうして、本発明は、ＨＥＲ３に結合できる（本願で定義するとおり）及び／又はＨＥＲ３に対して指向しているかかるナノボディ、その好適なフラグメント、また同様にポリペプチドであって１以上のかかるナノボディ及び／又は好適なフラグメントを含むか又は実質的にこれらからなるもの、にも関する。
【０１６２】
配列番号：１２−２６（表Ａ−１、参照）は、ＨＥＲ３に対して産生させた数々の免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【０１６３】
表Ａ−１：好ましい免疫グロブリン単一可変ドメイン又はナノボディ配列（本願では特定名称又は配列番号Ｘ（Ｘは、関連するアミノ酸配列を指す数である）を有する配列とも称される）：
【表３】
2013529079.tif 000004
【表４】
2013529079.tif 000005
【０１６４】
特に、本発明はいくつかの特定の観点において次のものを提供する：
−（本願で定義するとおり）ＨＥＲ３に対して指向している、かつ、配列番号１２−２６のアミノ酸配列（表Ａ１、参照）の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、例えば９０％又は９５％、又はそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列。これらアミノ酸配列は、さらに、ＨＥＲ３への同源リガンド（cognate ligand）の結合を中和する、及び／又は、ＨＥＲ３への結合のための同源リガンドと競合する、及び／又は、ＨＥＲ３上のヘテロ二量体化部位（本願で定義するとおり）に対して指向している、ものであってよい；
−ＨＥＲ３への配列番号１２−２６（表Ａ−１、参照）の少なくとも１のアミノ酸配列の結合を交差遮断する（本願で定義するとおり）及び／又はＨＥＲ３への結合のために配列番号１２−２６（表Ａ−１、参照）のアミノ酸配列少なくとも１と競合する、アミノ酸配列。やはり、これらアミノ酸配列は、さらに、ＨＥＲ３への同源リガンドの結合を中和する、及び／又は、ＨＥＲ３への結合のための同源リガンドと競合する、及び／又は、ＨＥＲ３上のヘテロ二量体化部位（本願で定義するとおり）に対して指向している、ものであってよい；
これらアミノ酸配列は、本願でさらに説明するとおりであってよい（かつ、例えばナノボディであってよい）、また同様に、１以上のかかるアミノ酸配列を含有する本発明のポリペプチド（これは、本願でさらに説明するとおりであってよい、かつ、例えば、本願で説明するとおり、二特異性及び／又はビパラトープ性ポリペプチドであってよい）及びかかるアミノ酸配列及びポリペプチドをコードする核酸配列であってよい。かかるアミノ酸配列及びポリペプチドは、いかなる天然に発生するリガンドをも含まない。
【０１６５】
いくつかの別の観点において、本発明は次のものを提供する：
−ＨＥＲ１、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ４に比較してＨＥＲ３について特異的である、本発明のアミノ酸配列；
この本発明のアミノ酸配列は、本願でさらに説明するとおりであってよい（かつ、例えばナノボディであってよい）、また同様に、１以上のかかるアミノ酸配列を含有する本発明のポリペプチド（これは、本願でさらに説明するとおりであってよい、かつ、例えば、本願で説明するとおり、二特異性及び／又はビパラトープ性であってよい）及びかかるアミノ酸配列及びポリペプチドをコードする核酸配列であってよい。かかるアミノ酸配列及びポリペプチドは、いかなる天然に発生するリガンドをも含まない。
【０１６６】
相応して、いくつかの特定の好ましい、本発明のナノボディは、ＨＥＲ３へと結合できる（本願で定義するとおり）及び／又はＨＥＲ３に対して指向しているナノボディであり、次のものに該当する：
ｉ）配列番号１２−２６のアミノ酸配列（表Ａ−１、参照）の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、その中で、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する。この観点において、表Ｂ−１も参照され、この表は、配列番号１２−２６（表Ａ−１、参照）のナノボディの、フレームワーク１配列（配列番号４２−５６）、フレームワーク２配列（配列番号７２−８８）、フレームワーク３配列（配列番号１０２−１１６）及びフレームワーク４配列（配列番号１３２−１４６）を列記する（フレームワーク１配列の位置１−４及び２７−３０にあるアミノ酸残基に関しては、以下のコメントも参照される。こうして、アミノ酸同一性の程度の決定のために、これら残基は好ましくは無視される）；
かつ、その中で、
ｉｉ）好ましくは、Kabat numberingに応じた位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８にある１以上のアミノ酸残基は、上の表Ｂ−２で言及する特徴残基から選択される。
【０１６７】
これらナノボディ中で、ＣＤＲ配列は一般に本願でさらに定義されるとおりである。
【０１６８】
やはり、かかるナノボディは、任意の好適な様式において、かつ、任意の好適な供給源から由来してよく、かつ、例えば、天然に発生するＶHH配列（すなわち、ラクダ科の好適な種由来）又は合成の又は半合成のアミノ酸配列であってよく、これは、「ヒト化」（本願で定義するとおり）ナノボディ、「ラクダ化」（本願で定義するとおり）免疫グロブリン配列（特に、ラクダ化重鎖可変ドメイン配列）、また同様に、技術、例えば、親和性成熟（例えば、合成、ランダム又は天然に発生する免疫グロブリン配列から出発する）、ＣＤＲグラフティング、ベニアリング、異なる免疫グロブリン配列に由来するフラグメント組み合わせ、重複プライマーを用いるＰＣＲアセンブリー、及び、免疫グロブリン配列のエンジニアリングのための当業者によく知られている同様の技術、又は、前述の任意のもののいずれかの好適な組み合わせ（本願でさらに説明する）により獲得されているナノボディ、を含むがこれらに限定されない。また、ナノボディがＶHH配列を含む場合には、前記ナノボディは、（部分的に又は完全に）ヒト化した本発明のナノボディ１以上を提供するために、本願でさらに説明するとおり、好適にヒト化されてよい。同様に、ナノボディが合成又は半合成の配列（例えば部分的にヒト化した配列）を含む場合には、前記ナノボディは、さらに、やはり（部分的に又は完全に）ヒト化した本発明のナノボディ１以上を提供するために、やはり本願で説明するとおり、任意に、さらに好適にヒト化されてよい。
【０１６９】
特に、ヒト化したナノボディは、以前の段落でナノボディについて一般に定義しているとおりのアミノ酸配列であってよいが、その中に、ヒト化置換（本願で定義するとおり）である及び／又はこれに相応する、少なくとも１のアミノ酸残基が（特に、少なくとも１のフレームワーク残基中に）存在する。いくつかの好ましいが、限定しないヒト化置換（及び好適なその組み合わせ）は、本願の開示に基づいて当業者に明らかになる。加えて、又は、代わりに、他の可能性のある有用なヒト化置換は、天然に発生するＶHH配列のフレームワーク領域の配列と、１以上の近接に関連するヒトＶH配列の相応するフレームワーク配列との比較により確認されることができ、その後で、こうして決定された１以上の可能性のある有用なヒト化置換（又はその組み合わせ）は、前記ＶHH配列中へと導入されることができ（自体既知の任意の様式で、本願で説明するとおり）、かつ、この生じるヒト化ＶHH配列は、標的に関して、安定性に関して、発現の容易さ及びレベルに関して、及び／又は、他の所望の特性に関して、親和性に関して試験されることができる。このようにして、限定された程度の試行錯誤によって、他の好適なヒト化置換（又は好適なその組み合わせ）は、本願の開示に基づいて当業者によって決定されることができる。また、以上のことに基づいて、ナノボディ（のフレームワーク領域）は、部分的にヒト化又は完全にヒト化されてよい。
【０１７０】
本発明の、いくつかの特に好ましい配列最適化ナノボディは、配列番号１２−２６（表Ａ−１、参照）のナノボディの配列最適化変異体であり、これらはいくつかの特に好ましい例である。
【０１７１】
こうして、本発明のいくつかの他の好ましいナノボディは、ＨＥＲ３に結合でき（本願でさらに説明するとおり）、かつ、次のことが該当するナノボディである：
ｉ）配列番号１２−２６（表Ａ−１、参照）の１のアミノ酸配列のヒト化変異体である、及び／又は
ｉｉ）配列番号１２−２６のアミノ酸配列（表Ａ−１、参照）の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、その中で、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する；
かつ、その中で、
ｉ）好ましくは、Kabat numberingに応じた位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８にある１以上のアミノ酸残基は、上の表Ｂ−２で言及する特徴残基から選択される。
【０１７２】
本発明の別の特定の観点によれば、本発明は、ＨＥＲ３への結合のために特に好適であるアミノ酸残基（すなわち、小ペプチド）の数々の伸長部を提供する。これらのアミノ酸残基伸長部は、特にこれらが本発明のアミノ酸配列の抗原結合部（の一部）を形成するように、本発明のアミノ酸配列中に存在及び／又は組み込まれてよい。アミノ酸残基のこれら伸長部が重鎖抗体又はＶHH配列のＣＤＲ配列であってＨＥＲ３に対して産生した（又は、かかるＣＤＲ配列を基礎とする及び／又はかかるＣＤＲ配列に由来してよい、本願でさらに説明するとおり）ものとして最初に作成されたので、これらはまた一般に、本願では「ＣＤＲ配列」とも称される（すなわち、それぞれ、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列として）。しかし、本発明は、その最も広い意味合いにおいて、これらのアミノ酸配列伸長部が、本発明のアミノ酸をＨＥＲ３に結合することを可能にする限り、本発明のアミノ酸配列においてアミノ酸残基のこれら伸長部が有してよい特定の構造的役割又は機能に限定されていないことに留意すべきである。こうして、一般に、本発明はその最も広い意味合いにおいて、ＨＥＲ３に結合でき、かつ、本願で説明するとおりの１以上のＣＤＲ配列、特に、２以上のかかるＣＤＲ配列の好適な組み合わせであって、全アミノ酸配列が、ＨＥＲ３に結合できる結合ドメイン及び／又は結合ユニットを形成するように、１以上の更なるアミノ酸配列を介して相互に好適に連結されているものを包含する、任意のアミノ酸配列を包含する。しかし、本発明のアミノ酸配列における唯一のかかるＣＤＲ配列の存在が、ＨＥＲ３に結合することができる本発明のアミノ酸配列を提供するのにそれ自体で既に十分であってよいことにも留意すべきである。例えば、やはり、ＷＯ０３／０５０５３１又はＷＯ２００９／１２７６９１に説明されるいわゆる「促進フラグメント（Expedite fragments）」が参照される。
【０１７３】
こうして、別の特定の、しかし限定しない観点において、本発明のアミノ酸配列は、本願で説明するとおりである、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸配列（又は、その任意の適した組み合わせ）を包含するアミノ酸配列であってよい。特に、本発明のアミノ酸配列は、少なくとも１の抗原結合部位を包含するアミノ酸配列であってよく、その際、この抗原結合部位は、本願で説明するとおりである、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸配列（又は、その任意の適した組み合わせ）を包含する。
【０１７４】
一般に、本発明のこの観点において、本発明のアミノ酸配列は、少なくとも１のアミノ酸残基伸長部を包含する任意のアミノ酸配列（その中で、このアミノ酸残基伸長部は、本願で説明する少なくとも１のＣＤＲ配列の配列に相応するアミノ酸配列を有する）であってよい。かかるアミノ酸配列は、免疫グロブリンフォールドを包含してよいか又は包含しなくてよい。例えば、限定することなく、かかるアミノ酸配列は、少なくとも１のかかるＣＤＲ配列を包含するが、しかし（完全な）免疫グロブリンフォールドを形成するには十分大きくない免疫グロブリン配列の好適なフラグメントであってよい（例えば、やはり、ＷＯ０３／０５０５３１又はＷＯ２００９／１２７６９１に説明される「促進フラグメント」が参照される）。代わりに、かかるアミノ酸配列は、かかるＣＤＲ配列に相応する少なくとも１のアミノ酸残基伸長部を包含する好適な「タンパク質足場」であってよい（すなわち、その抗原結合部位の一部として）。アミノ酸配列の提示のための好適な足場は、当業者に明らかであり、かつ、例えば、限定することなく、免疫グロブリンを基礎とするか又はこれに由来する結合足場（すなわち、本願で既に説明した免疫グロブリン配列以外）、タンパク質Ａドメインに由来するタンパク質足場（例えば、AffibodiesTM）、テンダミスタット、フィブロネクチン、リポカリン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞レセプター、設計されたアンキリンリピート、アビマー（avimer）及びＰＤＺドメイン（Binz et al., Nat. Biotech 2005, Vol 23: 1257）、及び、ＤＮＡ又はＲＮＡを基礎とする結合部分（ＤＮＡ又はＲＮＡアプタマーを含むが、これに限定されない）を包含する（Ulrich et al.Comb Chem High Throughput Screen 2006 9(8):619-32）。
【０１７５】
やはり、これらＣＤＲ配列の１以上を包含する本発明の任意のアミノ酸配列は、好ましくは、ＨＥＲ３に特異的に結合できる（本願で説明するとおり）、特に、親和性（好適には、ＫD値（実際の又は見掛けの）、ＫA値（実際の又は見掛けの）、ｋon速度及び／又はｋoff速度、又は代わりにＩＣ50値として好適に測定及び／又は表現、本願でさらに説明する）でもってＨＥＲ３に結合できるものであり、本願で定義するとおりである。
【０１７６】
特には、本発明のこの観点に応じたアミノ酸配列は、少なくとも１の抗原結合部位を包含する任意のアミノ酸配列であってよく、その際、前記抗原結合部位は、（ｉ）第１のアミノ酸配列が本願で説明するＣＤＲ１配列から選択される場合に、第２のアミノ酸配列が本願で説明するＣＤＲ２配列又は本願で説明するＣＤＲ３配列から選択される、（ｉｉ）第１のアミノ酸配列が本願で説明するＣＤＲ２配列から選択される場合に、第２のアミノ酸配列が本願で説明するＣＤＲ１配列又は本願で説明するＣＤＲ３配列から選択される、又は（ｉｉｉ）第１のアミノ酸配列が本願で説明するＣＤＲ３配列から選択される場合に、第２のアミノ酸配列が本願で説明するＣＤＲ１配列か又は本願で説明するＣＤＲ３配列から選択されるように、本願で説明するＣＤＲ１配列、本願で説明するＣＤＲ２配列及び本願で説明するＣＤＲ３配列からなる群から選択される、少なくとも２のアミノ酸配列を包含する。
【０１７７】
よりいっそう特には、本発明のアミノ酸配列は、少なくとも１の抗原結合部位を包含するアミノ酸配列であってよく、その際、第１のアミノ酸配列が本願で説明するＣＤＲ１配列から選択され、第２のアミノ酸配列が本願で説明するＣＤＲ２配列から選択され、そして、第３のアミノ酸配列が本願で説明するＣＤＲ３配列から選択されるように、この抗原結合部位は、本願で説明するＣＤＲ１配列、本願で説明するＣＤＲ２配列及び本願で説明するＣＤＲ３配列からなる群から選択される少なくとも３のアミノ酸配列を包含する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の好ましい組み合わせは、本願の更なる発明の詳細な説明から明らかになる。当業者に明らかであるとおり、かかるアミノ酸配列は好ましくは、免疫グロブリン配列（本願でさらに説明するとおり）であり、しかし、これは例えば、前記ＣＤＲ配列を提示するための好適な足場を包含する任意の他のアミノ酸配列であってよい。
【０１７８】
こうして、特定の、しかし限定しない一観点において、本発明は、次のものからなる群から選択されている、アミノ酸残基の伸長部１以上を包含する、ＨＥＲ３に対して指向しているアミノ酸配列に関する：
ａ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
ｇ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
又はこれらの任意の好適な組み合わせ。
【０１７９】
本発明のアミノ酸配列が、ｂ）及び／又はｃ）に応じた１以上のアミノ酸配列を含む場合には、
ｉ）  ｂ）及び／又はｃ）に応じたかかるアミノ酸配列における任意のアミノ酸置換が、好ましくは、相応する、ａ）に応じたアミノ酸配列に比較して、保存アミノ酸置換である（本願で説明するとおり）、
及び／又は
ｉｉ）  ｂ）及び／又はｃ）に応じたアミノ酸配列が、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、かつ、アミノ酸欠失又は挿入を含まない（相応する、ａ）に応じたアミノ酸）に比較して）、
及び／又は
ｉｉｉ）  ｂ）及び／又はｃ）に応じたアミノ酸配列が、自体既知である親和性成熟の技術１以上を用いた親和性成熟により、ａ）に応じたアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であってよい。
【０１８０】
同様に、本発明のアミノ酸配列が、ｅ）及び／又はｆ）に応じた１以上のアミノ酸配列を含む場合には、
ｉ）  ｅ）及び／又はｆ）に応じたかかるアミノ酸配列における任意のアミノ酸置換が、好ましくは、相応するｄ）に応じたアミノ酸配列に比較して、保存アミノ酸置換である（本願で説明するとおり）、
及び／又は
ｉｉ）  ｅ）及び／又はｆ）に応じたアミノ酸配列が、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、かつ、アミノ酸欠失又は挿入を含まない（相応する、ｄ）に応じたアミノ酸配列に比較して）、
及び／又は
ｉｉｉ）  ｅ）及び／又はｆ）に応じたアミノ酸配列が、自体既知である親和性成熟の技術１以上を用いた親和性成熟により、ｄ）に応じたアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であってよい。
【０１８１】
また同様に、本発明のアミノ酸配列が、ｈ）及び／又はｉ）に応じた１以上のアミノ酸配列を含む場合には、
ｉ）  ｈ）及び／又はｉ）に応じたかかるアミノ酸配列における任意のアミノ酸置換が、好ましくは、相応するｇ）に応じたアミノ酸配列に比較して、保存アミノ酸置換である（本願で説明するとおり）、
及び／又は
ｉｉ）  ｈ）及び／又はｉ）に応じたアミノ酸配列が、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、かつ、アミノ酸欠失又は挿入を含まない（相応する、ｇ）に応じたアミノ酸配列に比較して）、
及び／又は
ｉｉｉ）  ｈ）及び／又はｉ）に応じたアミノ酸配列が、自体既知である親和性成熟の技術１以上を用いた親和性成熟により、ｇ）に応じたアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であってよい。
【０１８２】
最後の先行する段落が、一般に、それぞれｂ）、ｃ）、ｅ）、ｆ）、ｈ）、又はｉ）に応じた１以上のアミノ酸配列を包含する、本発明の任意のアミノ酸配列にも適用されることが理解されるべきである。
【０１８３】
この特定の観点において、アミノ酸配列は、好ましくは、次のものからなる群から選択される、１以上のアミノ酸残基伸長部を包含する：
ｉ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列、及び
ｉｉｉ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列、
又はこれらの任意の好適な組み合わせ。
【０１８４】
また、好ましくは、かかるアミノ酸配列においては、アミノ酸残基の前記伸長部の少なくとも１は、ＨＥＲ３に対する結合のための抗原結合部位の部分を形成する。
【０１８５】
より具体的な、しかしやはり限定しない観点において、本発明は、次のものからなる群から選択されている、アミノ酸残基の伸長部２以上を包含する、ＨＥＲ３に対して指向しているアミノ酸配列に関する：
ａ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
ｇ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
その場合に、（ｉ）アミノ酸残基の第１の伸長部が、ａ）、ｂ）又はｃ）に応じた１のアミノ酸配列に相応する場合には、アミノ酸残基の第２の伸長部は、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）に応じたアミノ酸配列の１に相応する、（ｉｉ）アミノ酸残基の第１の伸長部が、ｄ）、ｅ）又はｆ）に応じた１のアミノ酸配列に相応する場合には、アミノ酸残基の第２の伸長部は、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）に応じたアミノ酸配列の１に相応する、又は、（ｉｉｉ）アミノ酸残基の第１の伸長部が、ｇ）、ｈ）又はｉ）に応じた１のアミノ酸配列に相応する場合には、アミノ酸残基の第２の伸長部は、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）に応じたアミノ酸配列の１に相応する。
【０１８６】
この特定の観点において、アミノ酸配列は、好ましくは、次のものからなる群から選択される、２以上のアミノ酸残基伸長部を包含する：
ｉ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列、及び
ｉｉｉ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列、
その場合に、（ｉ）アミノ酸残基の第１の伸長部が、配列番号５７−７１のアミノ酸配列の１に相応する場合には、アミノ酸残基の第２の伸長部は、配列番号８７−１０１又は配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列の１に相応する、（ｉｉ）アミノ酸残基の第１の伸長部が、配列番号８７−１０１のアミノ酸配列の１に相応する場合には、アミノ酸残基の第２の伸長部は、配列番号５７−７１又は配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列の１に相応する、又は、（ｉｉｉ）アミノ酸残基の第１の伸長部が、配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列の１に相応する場合には、アミノ酸残基の第２の伸長部は、配列番号５７−７１又は配列番号８７−１０１のアミノ酸配列の１に相応する。
【０１８７】
また、かかるアミノ酸配列においては、アミノ酸残基伸長部の少なくとも２は、やはり好ましくは、ＨＥＲ３に対する結合のための抗原結合部位の部分を形成する。
【０１８８】
よりいっそう具体的な、しかし限定しない観点において、本発明は、アミノ酸残基の伸長部３以上を包含する、ＨＥＲ３に対して指向しているアミノ酸配列に関し、その際、アミノ酸残基の第１の伸長部が次のものからなる群から選択されている：
ａ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
アミノ酸残基の第２の伸長部が次のものからなる群から選択されている：
ｄ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
及び、アミノ酸残基の第３の伸長部が次のものからなる群から選択されている：
ｇ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列。
【０１８９】
好ましくは、この特定の観点において、アミノ酸残基の第１の伸長部は、配列番号５７−７１のアミノ酸配列からなる群から選択され、アミノ酸残基の第２の伸長部は、配列番号８７−１０１のアミノ酸配列からなる群から選択され、そして、アミノ酸残基の第３の伸長部は、配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列からなる群から選択される。
【０１９０】
やはり、好ましくは、かかるアミノ酸配列においては、アミノ酸残基の前記伸長部の少なくとも３は、ＨＥＲ３に対する結合のための抗原結合部位の部分を形成する。
【０１９１】
アミノ酸配列のかかる伸長部の好ましい組み合わせは、本願の更なる開示から明らかである。
【０１９２】
好ましくは、かかるアミノ酸配列において、ＣＤＲ配列は、配列番号１２−２６のアミノ酸配列の少なくとも１のＣＤＲ配列と、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば、９５％以上のアミノ酸同一性又はよりいっそう好ましくは実質的に１００％のアミノ酸同一性を有する（表Ａ−１参照）。アミノ酸同一性のこの程度は、例えば、前記アミノ酸配列と、配列番号１２−２６（表Ａ−１参照）の配列１以上との間でのアミノ酸同一性の程度の決定（本願で説明するとおり）により決定されることができ、その際、フレームワーク領域を形成するアミノ酸残基は無視する。また、本発明のかかるアミノ酸配列は、本願でさらに説明することができる。
【０１９３】
また、かかるアミノ酸配列は好ましくはＨＥＲ３に特異的に結合できる（本願で説明するとおり）、特に、親和性（好適には、ＫD値（実際の又は見掛けの）、ＫA値（実際の又は見掛けの）、ｋon速度及び／又はｋoff速度、又は代わりにＩＣ50値として測定及び／又は表現、本願でさらに説明する）でもってＨＥＲ３に結合できるものであり、本願で定義するとおりである。
【０１９４】
本発明のアミノ酸配列が実質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）からなる場合には、本発明のアミノ酸配列は好ましくは次のことが該当する：
−ＣＤＲ１が、次のものからなる群から選択される：
ａ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
及び／又は
−ＣＤＲ２が、次のものからなる群から選択される：
ｄ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
及び／又は
−ＣＤＲ３が、次のものからなる群から選択される：
ｇ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列。
【０１９５】
特に、本発明のかかるアミノ酸配列は、ＣＤＲ１が、配列番号５７−７１のアミノ酸配列からなる群から選択されている、及び／又は、ＣＤＲ２が、配列番号８７−１０１のアミノ酸配列からなる群から選択されている、及び／又は、ＣＤＲ３が、配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列からなる群から選択されている、ものであってよい。
【０１９６】
特に、本発明のアミノ酸配列が実質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）からなる場合には、本発明のアミノ酸配列は好ましくは次のことが該当する：
−ＣＤＲ１が、次のものからなる群から選択される：
ａ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
及び
−ＣＤＲ２が、次のものからなる群から選択される：
ｄ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
及び
−ＣＤＲ３が、次のものからなる群から選択される：
ｇ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、又は、かかるアミノ酸配列の任意の好適なフラグメント。
【０１９７】
特に、本発明のかかるアミノ酸配列は、ＣＤＲ１が、配列番号５７−７１のアミノ酸配列からなる群から選択されている、及び／又は、ＣＤＲ２が、配列番号８７−１０１のアミノ酸配列からなる群から選択されている、及び、ＣＤＲ３が、配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列からなる群から選択されている、ものであってよい。
【０１９８】
やはり、ＣＤＲ配列の好ましい組み合わせは、本願の更なる発明の詳細な説明から明らかになる。
【０１９９】
また、かかるアミノ酸配列は好ましくは、ＨＥＲ３に特異的に結合できる（本願で説明するとおり）、特に、親和性（ＫD値（実際の又は見掛けの）、ＫA値（実際の又は見掛けの）、ｋon速度及び／又はｋoff速度、又は代わりにＩＣ50値として好適には測定及び／又は表現、本願でさらに説明する）でもってＨＥＲ３に結合できるものであり、本願で定義するとおりである。
【０２００】
好ましいが、限定しない一観点において、本発明は、実質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）からなるアミノ酸配列に関し、その中で、前記アミノ酸配列のＣＤＲ配列は、配列番号１２−２６のアミノ酸配列（表Ａ−１、参照）の少なくとも１のＣＤＲ配列と、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば９５％以上のアミノ酸同一性又はよりいっそう好ましくは実質的に１００％のアミノ酸同一性を有する。アミノ酸同一性のこの程度は、例えば、このアミノ酸配列と、配列番号１２−２６（表Ａ−１参照）の配列１以上との間でのアミノ酸同一性の程度の決定（本願で説明するとおり）により決定されることができ、その際、フレームワーク領域を形成するアミノ酸残基は無視する。本発明のかかるアミノ酸配列は、本願でさらに説明されることができる。
【０２０１】
本発明のかかるアミノ酸配列において、フレームワーク配列は、任意の好適なフレームワーク配列であってよく、かつ、好適なフレームワーク配列の例は、例えば、標準的なハンドブック及び本願で言及される更なる開示及び先行技術に基づいて、当業者に明らかである。
【０２０２】
フレームワーク配列は、好ましくは（好適な組み合わせの）免疫グロブリンフレーム配列又は（例えば、ヒト化又はラクダ化により）免疫グロブリン配列に由来するフレームワーク配列である。例えば、フレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えば、ＶL配列）及び／又は重鎖可変ドメイン（例えば、ＶH配列）に由来するフレームワーク配列であってよい。特定の好ましい一観点において、フレームワーク配列は、ＶHH配列に由来しているフレームワーク配列（この中で、前記フレームワーク配列は任意に、部分的に又は完全にヒト化していてよい）又はラクダ化している慣用のＶH配列のいずれかである（本願で定義するとおり）。
【０２０３】
フレームワーク配列は、好ましくは、本発明のアミノ酸配列がドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適であるアミノ酸配列）である、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適であるアミノ酸配列）である、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適であるアミノ酸配列である）である、又はナノボディ（ＶHH配列を含むが、これに限定されない）である、ものである。やはり、好適なフレームワーク配列は、例えば、標準的なハンドブック及び本願で言及される更なる開示及び先行技術に基づいて、当業者に明らかである。
【０２０４】
特に、本発明のアミノ酸配列中に存在するフレームワーク配列は、本発明のアミノ酸配列がナノボディであるように、１以上の特徴残基（本願で定義するとおり）を有してよい。（好適な組み合わせの）かかるフレームワーク配列のいくつかの好ましいが、限定しない例は、本願の更なる開示から明らかになる。
【０２０５】
特に、本発明のＩＳＶがｎＮｎｏｂｏｄｅｉｓ（本願で説明するとおり）である場合に、その中に存在するフレームワーク配列は、一般に、ＷＯ０９／０６８６２７の２５８〜２９７頁に説明されてよい（参照により、本願に組み込む）。例えば、これらは、ＷＯ０９／０６８６２７の表Ａ５に示される特徴残基の組み合わせ１以上を含んでよく、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、それぞれ、ＷＯ０９／０６８６２７の表Ａ−６、表Ａ−７、表Ａ−８及び表Ａ−９に示されるアミノ酸残基を含んでよい。また、本発明のＩＳＶがナノボディである場合には、これらはＫＥＲＥグループ（ＷＯ０９／０６８６２７の２８１〜２８４頁参照、このグループについてのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４配列のいくつかの代表物が、ＷＯ０９／０６８６２７の表Ａ−１１／Ａ−１５、Ａ−１２、Ａ−１３及びＡ−１４に示されている）、ＧＬＥＷグループ（ＷＯ０９／０６８６２７の２８５〜２８７頁参照、このグループについてのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４配列のいくつかの代表物が、ＷＯ０９／０６８６２７の表Ａ−１６／Ａ−２０、Ａ−１７、Ａ−１８及びＡ−１９に示されている）、又はＰ、Ｒ、Ｓ１０３グループ（ＷＯ０９／０６８６２７の２８７〜２９１頁参照、このグループについてのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４配列のいくつかの代表物が、ＷＯ０９／０６８６２７の表Ａ−２１／Ａ−２５、Ａ−２２、Ａ−２３及びＡ−２４に示されている）に属してよく、これらは全てＷＯ０９／０６８６２７に説明されるとおりであり、これらグループのそれぞれについてのいくつかの代表的な配列は、ＷＯ０９／０６８６２７の表Ａ−１０に示されている。
【０２０６】
ＷＯ０９／０６８６２７に説明されてもいるように、これらフレームワーク配列は、１以上の好適なヒト化置換又は（他の）置換を配列を最適化するために含んでよい（本願の更なる開示も参照のこと）。
【０２０７】
やはり、いくつかの特に好ましいが、限定しないＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４配列（及びこれらの組み合わせ）は、表Ｂ−１に説明するとおりのものであり、又は、それぞれ、かかるＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４配列の好適な変異体（例えば、表Ｂ−１において言及されるフレームワーク配列に比較して、かかるＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４における６未満、例えば１、２、３、４又は５つの好適なアミノ酸相違を有する、その際、このアミノ酸相違は、ＷＯ０９／０６８６２７に説明されてよい）であって、なお実質的にナノボディの所望の特性を維持しているものである。
【０２０８】
やはり、本発明のアミノ酸配列について本願で一般に説明するとおり、前述のものの任意の好適なフラグメント（又はフラグメントの組み合わせ）、例えば、１以上のＣＤＲ配列を含むフラグメントであって好適には１以上のフレームワーク配列を介して隣接及び／又は連結しているもの（例えば、これらＣＤＲ及びフレームワーク配列と同じ順序において、フラグメントが由来する完全長免疫グロブリン配列において発生してよい）、を使用することもできる。かかるフラグメントは、やはり、免疫グロブリンフォールドを包含するか又はこれを形成することができるもの、又は、代わりに、免疫グロブリンフォールドを包含しないか又は形成できないもの、であってもよい。
【０２０９】
特定の一観点において、かかるフラグメントは、本願で説明するとおりの単一ＣＤＲ配列（特に、ＣＤＲ３配列）を包含し、これは、各側に（一部の）フレームワーク配列が隣接している（特に、一部の（１又は複数の）フレームワーク配列であって、前記フラグメントが由来する免疫グロブリン配列において、前記ＣＤＲ配列に隣り合っているもの。例えば、ＣＤＲ３配列は、（一部の）ＦＲ３配列によって先行されてよく、その後に（一部の）ＦＲ４配列が続いてよい）。かかるフラグメントはまた、それぞれ、ジスルフィド架橋、特にジスルフィド架橋であってＣＤＲ配列に先行しかつその後にＣＤＲ配列が続く２のフレームワーク領域を連結するものを含んでもよい（かかるジスルフィド架橋の形成の目的のために、前記フレームワーク領域中で天然に発生するシステイン残基が使用されてよく、又は、代わりに、システイン残基は前記フレームワーク領域中へと合成により付加又は導入されてよい）。
【０２１０】
別の観点において、本発明は、化合物又はコンストラクト、特にタンパク質又はポリペプチド（本願では、それぞれ「本発明の化合物」又は「本発明のポリペプチド」とも称する）であって、１以上の本発明のアミノ酸配列（又はその好適なフラグメント）を含むか又は実質的にこれらからなり、かつ、任意にさらに１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットを包含するものに関する。本願の更なる開示から当業者には明らかであるとおり、かかる更なる基、残基、部分、結合ユニット又はアミノ酸配列は、本発明のアミノ酸配列（及び／又はそれが存在する化合物又はコンストラクト）に更なる官能性を提供してよいか又は提供しなくてよく、かつ、本発明のアミノ酸配列の特性を改変するか又は改変しなくてよい。
【０２１１】
例えば、かかる更なる基、残基、部分又は結合ユニットは、この化合物又はコンストラクトが、（融合）タンパク質又は（融合）ポリペプチドであるように、１以上の追加的なアミノ酸配列であってよい。好ましいが、限定しない一観点において、前記１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットは、免疫グロブリン配列であり、特にＩＳＶである。よりいっそう好ましくは、前記１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットは、ドメイン抗体、アミノ酸配列であってドメイン抗体としての使用に好適であるもの、単一ドメイン抗体、アミノ酸配列であって単一ドメイン抗体としての使用に好適であるもの、「ｄＡｂ」、アミノ酸配列であってｄＡｂとしての使用に好適であるもの、又はナノボディ、からなる群から選択されている。
【０２１２】
例えば、（ＨＥＲ３に対する１以上のＩＳＶに加えて）本発明のポリペプチド中に存在するかかる１以上の（例えば、１又は２の）更なるＩＳＶは、ＨＥＲ３とは異なる別の標的に対して指向されていてよく、この結果、本発明の「二特異性」タンパク質又はポリペプチドを提供する（すなわち、ＨＥＲ３に対して指向している少なくとも１の、例えば１又は２の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び、別の標的に対して指向している少なくとも１の、例えば１又は２の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む本発明のポリペプチド）。
【０２１３】
例えば、特定の、しかし限定しない一観点によれば、本発明のアミノ酸配列、コンストラクト、タンパク質又はポリペプチドは、例えば、好適な官能化（例えばペグ化）により、及び／又は、このコンストラクトの半減期を増加させる部分又は結合ユニットをコンストラクト中に含めることにより、増加した半減期を備えていてよい（本願で定義するとおりであり、同じコンストラクトを有するが、増加した半減期を提供するために作成された改変なし、例えば、官能化／ペグ化なし、又は、血清アルブミン結合ペプチド又は結合ドメイン／ＩＳＶなしのものに比較して）。かかる官能化、部分又は結合ユニットの例は、当業者に明らかであり、かつ、例えば、ペグ化、血清アルブミンへの融合、又は、血清タンパク質、例えば血清アルブミンへ結合できるペプチド又は結合ユニットへの融合を含んでよい。
【０２１４】
後者のコンストラクト（すなわち、少なくとも１の、例えば１又は２の本発明のアミノ酸配列及び少なくとも１の、例えば１又は２のペプチド又は結合ユニットであって、血清タンパク質、例えば血清アルブミンに結合できるものを包含する融合コンストラクト）の場合には、この血清アルブミン結合ペプチド又は結合ドメインは、任意の好適な血清アルブミン結合ペプチド又は結合ドメインであってコンストラクトの半減期を増加できるもの（血清アルブミン結合ペプチド又は結合ドメインなしの同じコンストラクトに比較して）であってよく、かつ、特に、出願人によりＷＯ２００８／０６８２８０（及び特にＷＯ２００９／１２７６９１及び未発行のＵＳ出願６１／３０１，８１９、両者出願人による）に説明される血清アルブミン結合ペプチド、又は、血清アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、血清アルブミン結合ナノボディ、例えば、Ａｌｂ−１又はヒト化版のＡｌｂ−１、例えばＡｌｂ−８（Ａｌｂ−１１又はＡＬＢ１１とも本願では称する）、これに関しては、例えばＷＯ０６／１２２７８７を参照する）であってよい。
【０２１５】
半減期に関して、本発明においては、本願で説明する種々の半減期延長技術（例えば、ＷＯ２００８／０６８２８０、ＷＯ２００９／１２７６９１及び／又は未発行のＵＳ出願６１／３０１，８１９に応じた血清アルブミン結合ペプチドを好適に選択することにより）を使用することにより、本発明のコンストラクト又はポリペプチドの半減期が、意図された（療法的及び／又は診断的）適用のために、及び／又は、所望の療法的及び／又は薬理学的作用及び可能性のある不所望な副作用の間の最良のバランスを獲得するために、（好ましくは）好適に「調節」されることができることに留意されるべきである。
【０２１６】
こうして、例えば、限定することなく、本発明の好ましい一観点は、本発明の二特異性ポリペプチドを提供すべく、それぞれ、ヒトＨＥＲ３に対して指向している１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（又は、代わりに、ヒトＨＥＲ３に対して指向している２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン、これは同じか又は異なっていてよく、すなわち、これらが同じか又は異なる場合には、本発明の「二価」ポリペプチドを、又は、これらが異なる場合には、本発明の「ビパラトープ性」ポリペプチドを提供すべく）、及び、ヒト血清アルブミンに対して指向している１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（これは、（本願で定義するとおり）ペプチドリンカーにより連結されている）から実質的になる「二特異性」ポリペプチドを提供し、これらは全て本願で説明する。かかるタンパク質又はポリペプチドは、実質的に単離された形にあってもよい（本願で説明するとおり）。
【０２１７】
別の特定の、しかし限定しない観点においては、本発明のアミノ酸配列（例えば、ナノボディ）又は本発明のポリペプチド（例えば、二価性、ビパラトープ性又は二特異性の、本発明のポリペプチド）は、トキシンに又は（細胞）毒性残基、部分又はペイロードに（やはり、化学的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを介して）好適に連結されていてよい。例えば細胞毒性化合物（すなわち、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドを基礎とする、抗体−薬物コンジュゲート又は「ＡＤＣ」）を提供すべく、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドに連結されることができる、好適な（細胞）毒性部分、化合物、ペイロード又は残基の例は、当業者に明らかである。
【０２１８】
例えば、Ducry and Stump, Bioconjugate Chem., 2010, 21 (1), pp 5-13による概要が参照される。かかる細胞毒性アミノ酸配列又はポリペプチドであって本発明のものは、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドが指向している標的を発現する細胞を殺すことが意図されているこれら適用において（例えば、癌の治療において）、又は、かかる細胞の成長及び／又は増殖を減少又は減速するために、特に有用／好適であってよい。通常は、しかし限定することなく、本発明の（細胞）毒性ポリペプチドは、半減期が延長されないか、又は、制限される及び／又は厳重に制御される半減期延長を有するに過ぎない。
【０２１９】
代わりに、本発明のポリペプチド中に存在してよい、かかる１以上の更なる基、残基、部分又は結合ユニットは、例えば、化学基、残基、部分であってよく、これらはそれら自体で生物学的及び／又は薬理学的に活性があるか又はなくてよい。例えば、限定することなく、かかる基は、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドの「誘導体」を提供すべく、本発明の１以上のアミノ酸配列に連結されていてよく、これはさらに本願で説明するとおりである。
【０２２０】
本願で説明するとおりの１以上の誘導体を含むか又は実質的にこれらからなる、及び、任意にさらに、１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニット（任意に、１以上のリンカーを介して結合している）を含む化合物又はコンストラクトも本発明の範囲内にある。好ましくは、前記１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットは、アミノ酸配列である。
【０２２１】
上で説明した化合物又はコンストラクトにおいては、本発明の１以上のアミノ酸配列及び１以上の基、残基、部分又は結合ユニットは、直接的に相互に及び／又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを介して結合されていてよい。例えば、１以上の基、残基、部分又は結合ユニットがアミノ酸配列である場合には、このリンカーは、生じる化合物又はコンストラクトが融合（タンパク質）又は融合（ポリペプチド）であるような、アミノ酸配列であってもよい。
【０２２２】
上記及びここでの更なる発明の詳細な説明から明らかであるように、このことは、本発明のアミノ酸配列が、本発明のポリペプチドを形成すべく「構成ブロック」として使用できることを意味し、すなわち、これらと他の基、残基、部分又は結合ユニットを好適に組み合わせることにより、１の分子内で１以上の所望の特性又は生物学的機能を組み合わせる、本願で説明する化合物又はコンストラクト（例えば、限定することなく、本願で説明する本発明のビパラトープ性、二／多価性及び二／多特異性ポリペプチド）を形成するためである。
【０２２３】
本発明のポリペプチドのいくつかの特定の例は、次のものを含むか又は実質的にこれらからなるポリペプチドである：
−ＨＥＲ３に対して指向している２つのアミノ酸配列（特にかつ好ましくはＩＳＶ）、これは、同じか又は異なっていてよく、好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−２つのＨＲＧ遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおりであり、かつ、これは異なっていてよいが、しかし好ましくは同じである）、特にかつ好ましくは、２のＨＲＧ遮断ＩＳＶ（本願で定義するとおりであり、これはやはり異なっていてよいが、しかし好ましくは同じである）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−２つの二量体化遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおりであり、かつ、これは異なっていてよいが、しかし好ましくは同じである）、特にかつ好ましくは、２の二量体化遮断ＩＳＶ（本願で定義するとおりであり、これはやはり異なっていてよいが、しかし好ましくは同じである）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−２つのドメインＩＩ結合アミノ酸配列（本願で定義するとおりであり、かつ、これは異なっていてよいが、しかし好ましくは同じである）、特にかつ好ましくは、２のドメインＩＩ結合ＩＳＶ（本願で定義するとおりであり、これはやはり異なっていてよいが、しかし好ましくは同じである）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−１つのＨＲＧ遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおりであり、特にかつ好ましくは１のＨＲＧ遮断ＩＳＶ、やはり本願で定義するとおり）及び１の他のアミノ酸配列（特にかつ好ましくはＩＳＶ以外のもの）であってＨＥＲ３に対して指向しており（本願で定義するとおり）、かつ、ＨＲＧ遮断アミノ酸配列（又はＩＳＶ）でないもの、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−１つの二量体化遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおりであり、特にかつ好ましくは１の二量体化遮断ＩＳＶ、やはり本願で定義するとおり）及び１の他のアミノ酸配列（特にかつ好ましくはＩＳＶ以外のもの）であってＨＥＲ３に対して指向しており（本願で定義するとおり）、かつ、二量体化遮断アミノ酸配列（又はＩＳＶ）でないもの、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−１つのドメインＩＩ結合アミノ酸配列（本願で定義するとおりであり、特にかつ好ましくは１のドメインＩＩ結合ＩＳＶ、やはり本願で定義するとおり）及び１の他のアミノ酸配列（特にかつ好ましくはＩＳＶ以外のもの）であってＨＥＲ３に対して指向しており（本願で定義するとおり）、かつ、ドメインＩＩ結合アミノ酸配列（又はＩＳＶ）でないもの、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−１つのＨＲＧ遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１のＨＲＧ遮断ＩＳＶ、やはり本願で定義するとおり）及び１の二量体化遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１の二量体化遮断ＩＳＶ、すなわち、本願で定義するとおり）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−１つのＨＲＧ遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１のＨＲＧ遮断ＩＳＶ、やはり本願で定義するとおり）及び１のドメインＩＩ結合アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１のドメインＩＩ結合ＩＳＶ、すなわち、本願で定義するとおり）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−１つの二量体化遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１の二量体化遮断ＩＳＶ、やはり本願で定義するとおり）及び１のドメインＩＩ結合アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１のドメインＩＩ結合ＩＳＶ、すなわち、本願で定義するとおり）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
及び、かかるポリペプチド（このうちいくつの限定しない例は本願の開示に基づいて当業者に明らかである）は本発明の更なる観点を形成する。
【０２２４】
また、言及したとおり、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチド（例えば、上で説明したポリペプチド）は、例えば、好適な官能化により、及び／又は、コンストラクトの半減期を増加させる部分又は結合ユニットをコンストラクト中に含めることにより、半減期延長されてよい。アミノ酸配列又はポリペプチドの半減期が、血清タンパク質、例えば血清アルブミンに結合できるペプチド又は結合ユニットへの融合により延長される場合には、本発明の生じるコンストラクト／ペプチドは、例えば、限定することなく、次のものを含むか又は実質的にこれらからなってよい：
−ＨＥＲ３に対して指向している１つのアミノ酸配列（特にかつ好ましくは１のＩＳＶ）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−１つのＨＲＧ遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり）、特にかつ好ましくは１のＨＲＧ遮断ＩＳＶ（本願で定義するとおり）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−１つの二量体化遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり）、特にかつ好ましくは１の二量体化遮断ＩＳＶ（本願で定義するとおり）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−１つのドメインＩＩ結合アミノ酸配列（本願で定義するとおり）、特にかつ好ましくは１のドメインＩＩ結合ＩＳＶ（本願で定義するとおり）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−ＨＥＲ３に対して指向している２つのアミノ酸配列（特にかつ好ましくは１のＩＳＶ）（同じか又は異なっていてよい）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−２つのＨＲＧ遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり、異なっていてよいが、しかし好ましくは同じである）、特にかつ好ましくは２のＨＲＧ遮断ＩＳＶ（本願で定義するとおり、やはり異なっていてよいが、しかし好ましくは同じである）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−２つの二量体化遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり、異なっていてよいが、しかし好ましくは同じである）、特にかつ好ましくは２の二量体化遮断ＩＳＶ（本願で定義するとおり、やはり異なっていてよいが、しかし好ましくは同じである）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−２つのドメインＩＩ結合アミノ酸配列（本願で定義するとおり、異なっていてよいが、しかし好ましくは同じである）、特にかつ好ましくは２のドメインＩＩ結合ＩＳＶ（本願で定義するとおり、やはり異なっていてよいが、しかし好ましくは同じである）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−１つのＨＲＧ遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１のＨＲＧ遮断ＩＳＶ、本願でも定義する）及び１の他のアミノ酸配列（特にかつ好ましくは１の他のＩＳＶ）であってＨＥＲ３に対して指向しており（本願で定義するとおり）、かつ、ＨＲＧ遮断アミノ酸配列（又はＩＳＶ）でない、及び、前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−１つの二量体化遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１の二量体化遮断ＩＳＶ、本願でも定義する）及び１の他のアミノ酸配列（特にかつ好ましくは１の他のＩＳＶ）であってＨＥＲ３に対して指向しており（本願で定義するとおり）、かつ、二量体化遮断アミノ酸配列（又はＩＳＶ）でない、及び、前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−１つのドメインＩＩ結合アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１のドメインＩＩ結合ＩＳＶ、本願でも定義する）及び１の他のアミノ酸配列（特にかつ好ましくは１の他のＩＳＶ）であってＨＥＲ３に対して指向しており（本願で定義するとおり）、かつ、ドメインＩＩ結合アミノ酸配列（又はＩＳＶ）でない、及び、前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−１つのＨＲＧ遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１のＨＲＧ遮断ＩＳＶ、本願でも定義する）及び１の二量体化遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１の二量体化遮断ＩＳＶ、本願でも定義する）、及び、前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−１つのＨＲＧ遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１のＨＲＧ遮断ＩＳＶ、本願でも定義する）及び１のドメインＩＩ結合アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１のドメインＩＩ結合ＩＳＶ、本願でも定義する）、及び、前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
−１つの二量体化遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１の二量体化遮断ＩＳＶ、本願でも定義する）及び１のドメインＩＩ結合アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１のドメインＩＩ結合ＩＳＶ、本願でも定義する）、及び、前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結してよい（本願で説明するとおり）；
及び、かかるポリペプチド（このうちいくつの限定しない例は本願の開示に基づいて当業者に明らかである、例えば、いくつかは以下の表Ａ−２に列記してある）もまた本発明の更なる観点を形成する。
【０２２５】
このうち、特に好ましいのは、次のことのいずれかが該当する本発明のポリペプチドである：
ａ）１のＨＲＧ遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１のＨＲＧ遮断ＩＳＶ、本願でも定義する）及び１の二量体化遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１の二量体化遮断ＩＳＶ、本願でも定義する）を含むか又は実質的にこれらからなる、かつ、任意に、さらに、前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミン、例えばＡｌｂ−８／Ａｌｂ−１１に対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）を含む、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）。かかるポリペプチドは、例えば、限定することなく、１の１７Ｂ０５様配列、１の２１Ｆ０６様配列、及び、血清アルブミン結合ＩＳＶ、例えばＡｌｂ−８を含んでよく、これは、任意に、相互に１以上の好適なスペーサー又はリンカーを介して好適に連結している。かかるポリペプチドの特定の好ましいが、限定しない例は、ＨＥＲ３ＭＳ００１３５（配列番号２８２）であるか、又は、次のことが該当する：
ｂ）１の二量体化遮断アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１の二量体化遮断ＩＳＶ、本願でも定義する）及び１のドメインＩＩ結合アミノ酸配列（本願で定義するとおり、特にかつ好ましくは１のドメインＩＩ結合ＩＳＶ、本願でも定義する）、及び、前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミン、例えばＡｌｂ−８／Ａｌｂ−１１に対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）を含むか又は実質的にこれらからなる、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）。かかるポリペプチドは、例えば、限定することなく、１の１７Ｂ０５様配列、１の１８Ｇ１１様配列、及び、血清アルブミン結合ＩＳＶ、例えばＡｌｂ−８を含んでよく、任意に、相互に１以上の好適なスペーサー又はリンカーを介して好適に連結している。かかるポリペプチドの特定の好ましいが、限定しない２つの例は、ＨＥＲ３ＭＳ００２１２（配列番号３１９）及びＨＥＲ３ＭＳ００２１５（配列番号３２２）である。
【０２２６】
既に本願でも言及したように、上記ポリペプチドの１つが（ｉ）ＨＲＧ遮断アミノ酸配列を含む場合には、これは好ましくは２１Ｆ０６様配列（本願で定義するとおり）又は０４Ｃ０７様配列（やはり本願で定義するとおり）のいずれかである、及び／又は、（ｉｉ）二量体化遮断配列を含む場合には、好ましくは１７Ｂ０５様配列である（本願で定義するとおり）、及び／又は、（ｉｉｉ）ドメインＩＩ結合配列を含む場合には、これは好ましくは１８Ｇ１１様配列又は３４Ｃ０７様配列のいずれかである。本発明のかかるポリペプチドのいくつかの特定の例は、次のものを含むか又は実質的にこれらからなるポリペプチドである：
−２つの２１Ｆ０６様配列（本願で定義するとおり、かつ、これは同じか又は異なっていてよい）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−２つの０４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり、かつ、これは同じか又は異なっていてよい）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−２つの１７Ｂ０５様配列（本願で定義するとおり、かつ、これは同じか又は異なっていてよい）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−２つの１８Ｇ１１様配列（本願で定義するとおり、かつ、これは同じか又は異なっていてよい）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−２つの３４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり、かつ、これは同じか又は異なっていてよい）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの２１Ｆ０６様配列（本願で定義するとおり）及び１の０４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの２１Ｆ０６様配列（本願で定義するとおり）及び１の１７Ｂ０５様配列（本願で定義するとおり）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの２１Ｆ０６様配列（本願で定義するとおり）及び１の１８Ｇ１１様配列（本願で定義するとおり）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの２１Ｆ０６様配列（本願で定義するとおり）及び１の３４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの０４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）及び１の１７Ｂ０５様配列（本願で定義するとおり）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの０４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）及び１の１８Ｇ１１様配列（本願で定義するとおり）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの０４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）及び１の３４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの１７Ｂ０５様配列（本願で定義するとおり）及び１の１８Ｇ１１様配列（本願で定義するとおり）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの１７Ｂ０５様配列（本願で定義するとおり）及び１の３４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの１８Ｇ１１様配列（本願で定義するとおり）及び１の３４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
及び、かかるポリペプチド（このうちいくつの限定しない例は本願の開示に基づいて当業者に明らかである、例えば、いくつかは以下の表Ａ−２に列記してある）はやはり本発明の更なる観点を形成する。
【０２２７】
また、やはり、かかるポリペプチドは半減期延長されていてよく、すなわち、例えば、好適な官能化により、及び／又は、このコンストラクトの半減期を増加させる部分又は結合ユニットをコンストラクト中に含めることにより半減期延長されてよい。アミノ酸配列又はポリペプチドの半減期が、血清タンパク質、例えば血清アルブミンに結合できるペプチド又は結合ユニットへの融合により延長される場合には、本発明の生じるコンストラクト／ペプチドは、例えば、限定することなく、次のものを含むか又は実質的にこれらからなってよい：
−２つの２１Ｆ０６様配列（本願で定義するとおり、かつ、これは同じか又は異なっていてよい）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−２つの０４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり、かつこれは同じか又は異なっていてよい）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−２つの１７Ｂ０５様配列（本願で定義するとおり、かつこれは同じか又は異なっていてよい）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−２つの１８Ｇ１１様配列（本願で定義するとおり、かつこれは同じか又は異なっていてよい）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−２つの３４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり、かつこれは同じか又は異なっていてよい）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの２１Ｆ０６様配列（本願で定義するとおり）及び１つの０４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの２１Ｆ０６様配列（本願で定義するとおり）及び１つの１７Ｂ０５様配列（本願で定義するとおり）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの２１Ｆ０６様配列（本願で定義するとおり）及び１つの１８Ｇ１１様配列（本願で定義するとおり）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの２１Ｆ０６様配列（本願で定義するとおり）及び１つの３４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの０４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）及び１つの１７Ｂ０５様配列（本願で定義するとおり）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの０４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）及び１つの１８Ｇ１１様配列（本願で定義するとおり）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの０４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）及び１つの３４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの１７Ｂ０５様配列（本願で定義するとおり）及び１つの１８Ｇ１１様配列（本願で定義するとおり）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの１７Ｂ０５様配列（本願で定義するとおり）及び１つの３４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
−１つの１８Ｇ１様配列（本願で定義するとおり）及び１つの３４Ｃ０７様配列（本願で定義するとおり）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）；
及び、やはり、かかるポリペプチド（このうちいくつの限定しない例は本願の開示に基づいて当業者に明らかである、例えば、いくつかは以下の表Ａ−２に列記してある）はやはり本発明の更なる観点を形成する。
【０２２８】
いくつかの特定の好ましいが、限定しない本発明のポリペプチドは、次のものを含むか又は実質的にこれらからなる：
ａ）１つの２１Ｆ０６様配列（本願で定義するとおり）及び１つの１７Ｂ０５様配列（本願で定義するとおり）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミン、例えばＡｌｂ−８に対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）。かかるポリペプチドの特定の好ましいが、限定しない例は、ＨＥＲ３ＭＳ００１３５（配列番号２８２）である、又は
ｂ）１つの１７Ｂ０５様配列（本願で定義するとおり）及び１つの１８Ｇ１１様配列（本願で定義するとおり）及び前記アミノ酸配列の半減期を増加させる基、残基、部分又は結合ユニット（好ましくは、血清タンパク質、特に血清アルブミン、例えばＡｌｂ−８に対して指向しているＩＳＶ、又は、血清タンパク質、特に血清アルブミンに対して指向しているペプチド）、これは好適には、直接的に又は１以上の好適なリンカー又はスペーサーを用いて連結している（本願で説明するとおり）。かかるポリペプチドの特定の好ましいが、限定しない２つの例は、ＨＥＲ３ＭＳ００２１２（配列番号３１９）及びＨＥＲ３ＭＳ００２１５（配列番号３２２）である。
【０２２９】
本発明のポリペプチドのいくつかの特定の好ましいが、限定しない本発明のポリペプチドの例は、ＨＥＲ３ＭＳ００１３５（配列番号２８２）、ＨＥＲ３ＭＳ００２１２（配列番号３１９）及びＨＥＲ３ＭＳ００２１２（配列番号３２２）である。こうして、本発明は次のものにも関する：
ａ）ポリペプチドＨＥＲ３ＭＳ００１３５（配列番号２８２）、また同様に、ＨＥＲ３ＭＳ００１３５（配列番号２８２）との配列同一性少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％及び９５％まで又はそれ以上（例えば９８％、９９％又はそれより多い）を有するポリペプチド、その際、かかるポリペプチド中に存在する２１Ｆ０６様配列及び１７Ｂ０５様配列は好ましくは本願で説明するとおりである；
ａ）ポリペプチドＨＥＲ３ＭＳ００２１２（配列番号３１９）、また同様に、ＨＥＲ３ＭＳ００２１２（配列番号３１９）との配列同一性少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％及び９５％まで又はそれ以上（例えば９８％、９９％又はそれより多い）を有するポリペプチド、その際、かかるポリペプチド中に存在する１８Ｇ１１様配列及び１７Ｂ０５様配列は好ましくは本願で説明するとおりである；
ｃ）ポリペプチドＨＥＲ３ＭＳ００２１５（配列番号３２２）、また同様に、ＨＥＲ３ＭＳ００２１５（配列番号３２２）との配列同一性少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％及び９５％まで又はそれ以上（例えば９８％、９９％又はそれより多い）を有するポリペプチド、その際、かかるポリペプチド中に存在する１８Ｇ１１様配列及び１７Ｂ０５様配列は好ましくは本願で説明するとおりである。
【０２３０】
本発明により提供されるいくつかのポリペプチドが、ＨＥＲ３インターナリゼーションに作用を有してよいことも見出されており、特に、ＨＥＲ３レセプターのインターナリゼーションを増加させてよい。このことは、例えば、細胞表面に存在するＨＥＲ３レセプターの数を減少させる作用を有してよく、こうして、細胞のリガンド感受性を減少する及び／又は細胞中の／細胞によりＨＥＲ３媒介されたシグナリングを減少する及び／又は前記細胞の他のＨＥＲ３関連生物学的作用を調節する。例えば、以下の実施例１７が参照される。本発明のポリペプチドにより示されたＨＥＲ３のインターナリゼーションに対するこの作用は特に意外なものであり、というのもこれまでのところ、前記インターナリゼーション促進ポリペプチド中に存在する相応する一価構成ブロックのいずれもがＨＥＲ３インターナリゼーションに対する同様の作用を有することが見出されていなかったからである。
【０２３１】
本発明のポリペプチドのいくつかの適用にとっては、（例えば、患者又は他の被験体へのこのポリペプチドの投与後に）かかるポリペプチドに曝露又は接触されたＨＥＲ３発現細胞のＨＥＲ３インターナリゼーションを促進又は増加することができる本発明のポリペプチドを使用することが有利であってよいことが当業者には明らかである。こうして、一観点において、本願で説明するポリペプチド（これは、本願で説明する任意の構成ブロック／ＩＳＶを含有してよく、かつ、例えば、前頁で説明した任意のポリペプチドであってよい）は、好ましくは、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも２５％、例えば５０％又は９０％以上（好適なアッセイ、例えば実施例１７及び２０のアッセイを用いて測定した場合に）、細胞のＨＥＲ３インターナリゼーションを促進又は増加することができるものである。
【０２３２】
本発明のポリペプチドの他の適用にとっては、（例えば、患者又は他の被験体へのこのポリペプチドの投与後に）かかるポリペプチドに曝露又は接触されたＨＥＲ３発現細胞のＨＥＲ３インターナリゼーションを実質的に改変、促進又は増加しない本発明のポリペプチドを使用することが有利であってよいことも当業者には明らかである。こうして、一観点において、本願で説明するポリペプチド（これは、本願で説明する任意の構成ブロック／ＩＳＶを含有してよく、かつ、例えば、前頁で説明した任意のポリペプチドであってよい）は、好ましくは、好適なアッセイ、例えば実施例１７及び２０のアッセイを使用して測定した場合に、細胞のＨＥＲ３インターナリゼーションを変更又は作用しないものである。
【０２３３】
本発明の化合物又はポリペプチドは、本発明の化合物又はポリペプチドを提供すべく、１以上の本発明のアミノ酸配列を、任意に１以上の好適なリンカーを介して、１以上の更なる基、残基、部分又は結合単位へと好適に連結させる少なくとも１の工程を含む方法により一般に製造できる。本発明のポリペプチドは、少なくとも、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する工程、前記核酸を好適な様式で発現する工程及び発現した本発明のポリペプチドを回収する工程を一般に含む方法によっても製造できる。かかる方法は、例えば、本願でさらに説明する方法及び技術を基礎として、当業者に明らかである自体既知の様式で実施できる。
【０２３４】
本発明のアミノ酸配列から出発して、本発明の化合物又はポリペプチドを設計／選択及び／又は製造する方法は、本願では本発明のアミノ酸配列の「フォーマッティング」とも称される。本発明の化合物又はポリペプチドの一部を形成する本発明のアミノ酸は、「フォーマット化されている」か又は本発明の化合物又はポリペプチドの「フォーマットにある」と言われる。本発明のアミノ酸配列がフォーマット化されることができるやり方の例及びかかるフォーマットの例は、本願の開示に基づいて当業者には明らかである。そして、かかるフォーマット化されたアミノ酸配列は、本発明の更なる一観点を形成する。
【０２３５】
本発明の特定の一観点において、本発明の化合物又は本発明のポリペプチドは、本発明の相応するアミノ酸配列に比較して、増加した半減期を有してよい。かかる化合物及びポリペプチドのいくつかの好ましいが、限定しない例は、本願の更なる開示に基づいて当業者に明らかであり、例えば、その半減期を増加させるように化学的に修飾されている（例えば、ペグ化により）本発明のアミノ酸配列又はポリペプチド、少なくとも１の付加的な結合部位を血清タンパク質（例えば、血清アルブミン）への結合のために含む本発明のアミノ酸配列、又は、本発明のアミノ酸配列の半減期を増加させる少なくとも１の部分（特に少なくとも１のアミノ酸配列）に連結している本発明のアミノ酸配列少なくとも１を含む本発明のポリペプチドを含む。かかる半減期延長部分又はアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドの例は、本願の更なる開示に基づいて当業者には明らかである。そして、例えば、限定することなく、１以上の本発明のアミノ酸配列が１以上の血清タンパク質又はそのフラグメント（例えば、（ヒト）血清アルブミン又はその好適なフラグメント）に又は血清タンパク質に結合することができる１以上の結合ユニット（例えば、ドメイン抗体、アミノ酸配列であってドメイン抗体としての使用に好適なもの、単一ドメイン抗体、アミノ酸配列であって単一ドメイン抗体としての使用に好適なもの、「ｄＡｂ」、アミノ酸配列であってｄＡｂとしての使用に好適なもの、又は、ナノボディであって血清タンパク質、例えば血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に結合することができるもの、血清免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、又はトランスフェリン、更なる発明の詳細な説明及び本願で言及する参考文献が参照される）に好適に連結しているポリペプチド、本発明のアミノ酸配列がＦｃ部（例えば、ヒトＦｃ）又はその好適な部分又はフラグメントに連結しているポリペプチド、又は、１以上の本発明のアミノ酸配列が、血清タンパク質に結合できる１以上の小タンパク質又はペプチドに好適に連結しているポリペプチド（例えば、限定することなしに、ＷＯ９１／０１７４３、ＷＯ０１／４５７４６、ＷＯ０２／０７６４８９及びタイトル"Peptides capable of binding to serum proteins"と題されたAblynx N.V.のUS仮出願（２００６年１２月５日出願）（ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６３３４８も参照）に説明するタンパク質及びペプチド）を含む。
【０２３６】
一般に、増加した半減期を有する本発明の化合物又はポリペプチドは、好ましくは、相応する本発明のアミノ酸自体の半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍又は２０倍超より長い半減期を有する。例えば、増加した半減期を有する本発明の化合物又はポリペプチドは、相応する本発明のアミノ酸配列自体に比較して、１時間より多い、好ましくは２時間より多い、より好ましくは６時間より多い、例えば１２時間より多い、又は２４、４８又は７２時間より多い増加した半減期を有してよい。好ましいが、限定しない本発明の一観点において、半減期における上記増加は、哺乳類、例えばヒトにおいて、すなわち、好ましくはヒトにおいて達成される。
【０２３７】
好ましいが、限定しない本発明の一観点において、本発明のかかる化合物又はポリペプチドは、相応する本発明のアミノ酸配列自体に比較して、１時間より多く、好ましくは２時間より多く、より好ましくは６時間より多く、例えば１２時間より多く、又は２４、４８又は７２時間より多く増加した血清半減期を有する。好ましいが、限定しない本発明の一観点において、半減期における上記増加は、哺乳類、例えばヒトにおいて、すなわち、好ましくはヒトにおいて達成される。
【０２３８】
別の好ましいが、限定しない本発明の一観点において、本発明のかかる化合物又はポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、よりいっそう好ましくは少なくとも７２時間より多い、ヒトにおける血清半減期を示す。例えば、本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも５日（例えば約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば９〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば、約１０〜１５日）、又は少なくとも約１１日（例えば、約１１〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば、約１２〜１８日以上）、又は１４日より多い（例えば、約１４〜１９日）の半減期を有してよい。好ましいが、限定しない本発明の一観点において、上記血清半減期は、哺乳類、例えばヒトにおいて、すなわち、好ましくはヒトにおいて達成される。
【０２３９】
別の観点において、本発明は、本発明のアミノ酸配列又は本発明のポリペプチドをコードする核酸（又はその好適なフラグメント）に関する。かかる核酸は、本願では、「本発明の核酸」とも称され、そして、例えば、本願でさらに説明するとおり、遺伝子コンストラクトの形にあってよい。
【０２４０】
別の観点において、本発明は、本発明のアミノ酸配列及び／又は本発明のポリペプチドを発現する（又は好適な状況下で発現できる）及び／又は本発明の核酸を含む宿主又は宿主細胞に関する。かかる宿主又は宿主細胞のいくつかの好ましいが、限定しない例は、本願の更なる開示から明らかになる。
【０２４１】
本発明はさらに、生成物又は組成物であって、少なくとも１の本発明のアミノ酸配列、少なくとも１の本発明のポリペプチド（又はその好適なフラグメント）及び／又は少なくとも１の本発明の核酸、及び、任意に、自体既知であるかかる組成物の１以上のさらなる成分を、例えば、この組成物の意図する使用に応じて、含有するか又は含む生成物又は組成物に関する。かかる生成物又は組成物は、例えば、医薬組成物（本願で説明するとおり）、獣医薬組成物又は診断用途のための生成物又は組成物であってよい（本願でも説明するとおり）。かかる生成物又は組成物のいくつかの好ましいが、限定しない例は、本願の更なる開示から明らかになる。
【０２４２】
本発明は、ＨＥＲ３の調節（調節のための方法又は組成物）において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は細胞アッセイにおける）又はｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、単一細胞における又は多細胞生物における、特に哺乳類における、より好ましくはヒトにおける、例えば、種々の癌の危険にあるか又はこれを患うヒトにおける）のいずれかにおける、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチド、又は、これらを含む組成物の使用にも関する。
【０２４３】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は細胞アッセイにおける）又はｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、単一細胞における又は多細胞生物における、特に哺乳類における、より好ましくはヒトにおける、例えば、種々の癌の危険にあるか又はこれを患うヒトにおける）のいずれかにおける、ＨＥＲ３の調節のための方法にも関し、この方法は、少なくとも１の本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドを用いて、ＨＥＲ３を、少なくとも１の本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドと、又は、これらを含む組成物と、ＨＥＲ３を調節するのに好適な手法及び量において、接触させる工程を少なくとも含む。
【０２４４】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は細胞アッセイにおける）又はｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、単一細胞における又は多細胞生物における、特に哺乳類における、より好ましくはヒトにおける、例えば、種々の癌の危険にあるか又はこれを患うヒトにおける）のいずれかにおける、ＨＥＲ３の調節のための組成物（例えば、限定することなく、本願でさらに説明するとおりの医薬組成物又は調製物）の調製における、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドの使用にも関する。
【０２４５】
本発明の文脈において、「調節」又は「調節する」とは、好適にｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して測定した場合に（例えば、本願で言及するとおり）、ＨＥＲ３の活性の減少又は阻害、又は代わりに、ＨＥＲ３活性の増加のいずれかを一般に意味する。特に、「調節」又は「調節する」とは、好適にｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して測定した場合に（例えば、本願で言及するとおり）、同じ条件下だが本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドの非存在下で同じアッセイにおけるＨＥＲ３の活性に比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％又は少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上の、ＨＥＲ３の活性の減少又は阻害、又は代わりに、ＨＥＲ３活性の増加のいずれかを意味してよい。
【０２４６】
当業者に明らかであるとおり、「調節」は、同じ条件下だが本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドの非存在下に比較して、１以上のその標的、ヘテロ二量体化パートナー、リガンド又は基質に対するＨＥＲ３の親和性、アビディティ、特異性及び／又は選択性における変化（これは、増加又は減少のいずれかであってよい）に作用すること、及び／又は、ＨＥＲ３が存在する媒体又は周囲中の１以上の条件（例えば、ｐＨ、イオン強度、共因子の存在、その他）に対するＨＥＲ３の感受性における変化（これは、増加又は減少のいずれかであってよい）に作用すること、を伴ってもよい。当業者には明らかであるとおり、このことは、やはり、任意の好適な方式において及び／又は任意の好適なアッセイ（自体既知のもの）、例えば、本願又は本願で引用する先行技術において説明されるアッセイ、を用いて決定されてよい。
【０２４７】
「調節」は、ＨＥＲ３が関与する、１以上の生物学的又は生理学的機構、作用、応答、機能、経路又は活性（又は、その１又は複数の基質、１又は複数のリガンド、又は１又は複数の経路が関与する、例えば、シグナリング経路又は代謝経路、及びそれらの関連する生物学的又は生理学的作用）に関する変化（すなわち、それぞれアゴニスト、アンタゴニストとしての活性）に作用することも意味してよい。やはり、当業者に明らかであるとおり、アゴニスト又はアンタゴニストとしてのかかる作用は、任意の好適な方式において及び／又は任意の好適な（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び通常は細胞又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ）アッセイ（自体既知のもの）、例えば、本願又は本願で引用する先行技術において説明されるアッセイ、を用いて決定されてよい。特に、アゴニスト又はアンタゴニストとしての作用は、意図される生物学的又は生理学的活性が、同じ条件下だが本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドの非存在下で同じアッセイにおける生物学的又は生理学的活性に比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％又は少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上それぞれ増加又は減少するものであってよい。
【０２４８】
調節は、例えば、その基質又はリガンドの１へのＨＥＲ３の結合及び／又はＨＥＲ３への結合のための天然のリガンド、基質との競合の減少又は阻害を伴ってよい。調節は、ＨＥＲ３又はＨＥＲ３が関与する機構又は経路の活性化を伴ってもよい。調節は、可逆又は不可逆であってよいが、しかし、医薬及び薬理学目的のためには、通常は可逆の方式にある。
【０２４９】
本発明は、さらに、本願で説明するアミノ酸配列、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物の調製又は作成方法に関する。かかる方法のいくつかの好ましいが、限定しない例は、本願の更なる開示から明らかになる。
【０２５０】
一般に、これら方法は、次の工程を含んでよい：
ａ）アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリーの提供、及び
ｂ）ＨＥＲ３に結合できる及び／又はＨＥＲ３に親和性を有するアミノ酸配列について、アミノ酸配列の前記セット、コレクション又はライブラリーのスクリーニング、
及び
ｃ）ＨＥＲ３に結合できる及び／又はＨＥＲ３に親和性を有する１又は複数のアミノ酸配列の単離。
【０２５１】
かかる方法においては、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリーは、アミノ酸配列の任意の好適なセット、コレクション又はライブラリーであってよい。例えば、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリーは、免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリー（本願で説明する）、例えば、免疫グロブリン配列の天然のセット、コレクション又はライブラリー、免疫グロブリン配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリー、及び／又は、親和性成熟に供されている免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリーであってよい。
【０２５２】
また、かかる方法においては、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリーは、重鎖可変ドメイン（例えば、ＶHドメイン又はＶHHドメイン）又は軽鎖可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリーであってよい。例えば、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリーは、ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体のセット、コレクション又はライブラリーであってよく、又は、ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体として機能できるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリーであってよい。
【０２５３】
この方法の好ましい一観点においては、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリーは、免疫グロブリン配列の免疫セット、コレクション又はライブラリー、例えば、ＨＥＲ３を用いて又はそれに基づくか若しくはそれに由来する好適な抗原決定子、例えばその抗原部分、フラグメント、領域、ドメイン、ループ又はその他のエピトープを用いて好適に免疫化されている哺乳類に由来するものであってよい。特定の一観点において、前記抗原決定子は、細胞外部分、領域、ドメイン、ループ又は他の１又は複数の細胞外エピトープであってよい。
【０２５４】
上述の方法においては、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリーは、スクリーニングを容易にするために、ファージ、ファージミド、リボソーム又は好適な微生物（例えば、酵母）にディスプレイされていてよい。（セット、コレクション又はライブラリーの）アミノ酸配列のディスプレイ及びスクリーニングのための好適な方法、技術及び宿主生物は、例えば、本願の更なる開示を基礎として、当業者に明らかである。Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)におけるHoogenboomによる概要も参照される。
【０２５５】
別の観点において、アミノ酸配列の作成方法は、少なくとも次の工程を含む：
ａ）アミノ酸配列を発現する細胞のコレクション又はサンプルの提供、
ｂ）ＨＥＲ３に結合できる及び／又はＨＥＲ３に親和性を有するアミノ酸配列を発現する細胞について細胞の前記コレクション又はサンプルのスクリーニング、
及び
ｃ）（ｉ）前記アミノ酸配列の単離又は（ｉｉ）前記細胞から前記アミノ酸配列をコードする核酸配列の単離、その後に、前記アミノ酸配列の発現。
【０２５６】
例えば、所望のアミノ酸配列が免疫グロブリン配列である場合には、細胞のコレクション又はサンプルは、例えば、Ｂ細胞のコレクション又はサンプルであってよい。また、この方法において、細胞のサンプルは、ＨＥＲ３を用いて又はそれに基づくか若しくはそれに由来する好適な抗原決定子、例えばその抗原部分、フラグメント、領域、ドメイン、ループ又はその他のエピトープを用いて好適に免疫化されている哺乳類に由来してよい。特定の一観点において、前記抗原決定子は、細胞外部分、領域、ドメイン、ループ又は他の１又は複数の細胞外エピトープであってよい。
【０２５７】
上述の方法は、当業者に明らかになるとおり、任意の好適な方式において実施されてよい。例えば、ＷＯ０５４２８１０、ＷＯ０５／１９８２４、ＷＯ０４／０５１２６８及びＷＯ０４／１０６３７７が参照される。工程ｂ）のスクリーニングは好ましくはＦＡＣＳのようなフローサイトメトリーを用いて実施される。このために、例えばLieby et al., Blood, Vol. 97, No. 12, 3820 (2001)が参照される。
【０２５８】
別の観点において、ＨＥＲ３に対して指向しているアミノ酸配列の作成方法は、少なくとも次の工程を含む：
ａ）アミノ酸配列をコードする核酸のセット、コレクション又はライブラリーの提供、
ｂ）ＨＥＲ３に結合できる及び／又はＨＥＲ３に親和性を有するアミノ酸配列をコードする核酸について、核酸配列の前記セット、コレクション又はライブラリーのスクリーニング、
及び
ｃ）前記核酸配列の単離、その後に、前記アミノ酸配列の発現。
【０２５９】
かかる方法において、アミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリーは、例えば、免疫グロブリン配列の天然のセット、コレクション又はライブラリーをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリー、免疫グロブリン配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリーをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリー、及び／又は、親和性成熟に供されている免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリーをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリーであってよい。
【０２６０】
また、かかる方法においては、核酸配列のセット、コレクション又はライブラリーは、重鎖可変ドメイン（例えば、ＶHドメイン又はＶHHドメイン）又は軽鎖可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリーをコードしてよい。例えば、核酸配列のセット、コレクション又はライブラリーは、ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体のセット、コレクション又はライブラリーであってよく、又は、ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体として機能できるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリーであってよい。
【０２６１】
この方法の好ましい一観点において、核酸配列のこのセット、コレクション又はライブラリーは、核酸配列の免疫セット、コレクション又はライブラリー、例えば、ＨＥＲ３を用いて又はそれに基づくか若しくはそれに由来する好適な抗原決定子、例えばその抗原部分、フラグメント、領域、ドメイン、ループ又はその他のエピトープを用いて好適に免疫化されている哺乳類に由来するものであってよい。特定の一観点において、前記抗原決定子は、細胞外部分、領域、ドメイン、ループ又は他の１又は複数の細胞外エピトープであってよい。
【０２６２】
核酸配列の前記セット、コレクション又はライブラリーは、例えば、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインの免疫セット、コレクション又はライブラリーをコードしてよい。特定の一観点において、ヌクレオチド配列のセット、コレクション又はライブラリーは、ＶHH配列のセット、コレクション又はライブラリーをコードしてよい。
【０２６３】
上述の方法において、ヌクレオチド配列のセット、コレクション又はライブラリーは、スクリーニングを容易にするために、ファージ、ファージミド、リボソーム又は好適な微生物（例えば、酵母）に表示されていてよい。アミノ酸配列をコードする（セット、コレクション又はライブラリーの）ヌクレオチド配列のディスプレイ及びスクリーニングのための好適な方法、技術及び宿主生物は、例えば、本願の更なる開示を基礎として、当業者に明らかである。Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)におけるHoogenboomによる概要も参照される。
【０２６４】
別の観点において、ＨＥＲ３に対して指向しているアミノ酸配列の作成方法は、少なくとも次の工程を含む：
ａ）アミノ酸配列をコードする核酸のセット、コレクション又はライブラリーの提供、
ｂ）ＨＥＲ３に結合できる及び／又はＨＥＲ３に親和性を有する、及び、本発明のＩＳＶ又はナノボディ（例えば、配列番号１２−２６）（表Ａ−１）又は本発明のヒト化したＩＳＶ又はナノボディが交差遮断されているか又は交差遮断している、アミノ酸配列をコードする核酸について、核酸配列の前記セット、コレクション又はライブラリーのスクリーニング、及び
ｃ）前記核酸配列の単離、その後に、前記アミノ酸配列の発現。
【０２６５】
本発明は、上述の方法により、又は代わりに、上述の方法の１及び更に少なくとも、前記免疫グロブリン配列のヌクレオチド配列又又はアミノ酸配列の決定工程、及び、自体既知の方式における、例えば、好適な宿主細胞又は宿主生物における発現により又は化学的合成により、前記アミノ酸配列の発現又は合成工程を含む方法により得られるアミノ酸配列にも関する。
【０２６６】
また、上述の工程後に、１以上の本発明のアミノ酸配列は、本発明のポリペプチドを提供すべく、好適にヒト化（又は、代わりにラクダ化）されていてよい、及び／又は、こうして得られた１又は複数のアミノ酸配列は、相互に又は１以上の他の好適なアミノ酸配列に連結されていてよい（任意に、１以上の好適なリンカーを介して）。また、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、好適にヒト化（又は、代わりにラクダ化）され、かつ、好適に発現されてよく、及び／又は、本発明のアミノ酸配列をコードする１以上の核酸配列は、相互に又は他の好適なアミノ酸配列をコードする１以上の核酸配列に連結されていてよく（任意に、１以上の好適なリンカーをコードするヌクレオチド配列を介して）、その後、こうして得られたヌクレオチド配列は、本発明のポリペプチドを提供すべく好適に発現されてよい。
【０２６７】
本発明はさらに、本願で説明する、アミノ酸配列、化合物、コンストラクト、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物の適用及び使用、また同様に、ＨＥＲ３に関連する疾病及び疾患の予防及び／又は治療のための方法、に関する。いくつかの好ましいが、限定しない適用及び使用は、本願の更なる開示から明らかになる。
【０２６８】
本発明はまた、療法における使用のための、本願で説明する、アミノ酸配列、化合物、コンストラクト、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物にも関する。
【０２６９】
特に、本発明は、必要とする被験体に、本願で説明する、アミノ酸配列、化合物、コンストラクト又はポリペプチドの（医薬的に有効な量の）投与により予防又は治療できる疾病又は疾患の療法における使用のための、本願で説明する、アミノ酸配列、化合物、コンストラクト、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物にも関する。
【０２７０】
より具体的には、本発明は、種々の癌の療法における使用のための、本願で説明する、アミノ酸配列、化合物、コンストラクト、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物にも関する。
【０２７１】
本発明の他の観点、実施態様、利点及び適用もまた、本願の更なる発明の詳細な説明から明らかになり、その中で本発明はより詳細に、本発明のナノボディ、及び、これを含む本発明のポリペプチド（本発明の好ましい観点の幾つかを形成する）との関連で説明及び議論されるものである。
【０２７２】
本願の更なる発明の詳細な説明から明らかであるとおり、ナノボディは一般に、「ｄＡｂ」又は類似の（単一）ドメイン抗体又は免疫グロブリン配列に比較して特定の利点（本願で概略が説明される）を提供し、この利点もまた本発明のナノボディにより提供される。しかし、以下の教示のより一般的な観点が、本発明の他のアミノ酸配列に（直接的に又は類似的に）適用されてもよいことが当業者には明らかである。
【０２７３】
発明の詳説
本説明、実施例及び特許請求の範囲においては次のことが該当する。
【０２７４】
ａ）他のことが示されたり又は定義されたりしていない限り、使用される全ての用語は、この技術におけるその通常の意味合いを有し、これは、当業者には明らかである。例えば、ＷＯ０８／０２００７９の４６頁のパラグラフａ）において言及された標準的なハンドブックが参照される。
【０２７５】
ｂ）他のことが示されたりしていない限り、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」との用語は、一般的な用語として使用され、それぞれ、抗原結合ドメイン又はフラグメント、例えばＶHHドメイン又はＶH又はＶLドメインを含むがこれらに限定されない（本願で説明するとおり）。抗原結合分子又は抗原結合タンパク質との用語は、相互に交換可能に使用され、ナノボディとの用語をも含む。免疫グロブリン単一可変ドメインはさらに、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶL配列）、又は、重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶH配列）である。より具体的には、これらは、慣用の四鎖抗体（four-chain antibody）に由来する重鎖可変ドメイン配列又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であることができる。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ドメイン抗体、又は免疫グロブリン配列であってドメイン抗体としての使用に好適であるもの、単一ドメイン抗体、又は免疫グロブリン配列であって単一ドメイン抗体としての使用に好適であるもの、「ｄＡｂ」、又は免疫グロブリン配列であってｄＡｂとしての使用に好適であるもの、又は、ナノボディ、又は、免疫グロブリン配列であってナノボディとしての使用に好適なもの、であることができ、ＶHH配列を含むが、これに限定されない。本発明は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、サメ、ヒト及びラクダ化免疫グロブリン配列を含む、異なる起源の免疫グロブリン配列を含む。免疫グロブリン単一可変ドメインは、完全なヒト、ヒト化を含むが、さもなければ、最適化配列又はキメラ免疫グロブリン配列を含む。免疫グロブリン単一可変ドメイン及び免疫グロブリン単一可変ドメインの構造は、しかし、限定されることなく、４つのフレームワーク領域又は「ＦＲｓ」（これは、この分野及び本願では、それぞれ「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」、そして、「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と称される）から構成されると考えられることができる。このフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域又は「ＣＤＲｓ」（これは、この分野では、それぞれ「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」、そして「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」と称される）により中断される。ナノボディ（単数形又は複数形）との用語は、Ablynx N.V.の登録商標であり、Nanobody(R)及び／又はNanobodies(R)とも称されてよいことに留意されたい。
【０２７６】
ｃ）他のことが示されていない限り、「免疫グロブリン配列」、「配列」、「ヌクレオチド配列」及び「核酸配列」との用語は、ＷＯ０８／０２００７９の４６頁のパラグラフｂ）に説明されているとおりである。
【０２７７】
ｄ）他のことが示されていない限り、具体的に詳細には説明されていない全ての方法、工程、技術及び操作は、自体既知の方式で実施でき、かつ、実施されているものであり、当業者には明らかであるとおりである。例えば、やはり、標準的なハンドブック及び本願で言及される一般的な背景が、そして、本願で引用される更なる参考文献が、また同様に、例えば、以下の概要Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6): 640-56; Levin and Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57; Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45;Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S 10612, Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43が参照され、これらは、タンパク質工学のための技術、例えば親和性成熟化、及び、タンパク質、例えば免疫グロブリンの特異性及び所望の特性を改善するための他の技術を説明する。
【０２７８】
ｅ）アミノ酸残基は、標準的な３文字又は１文字のアミノ酸コードに応じて示される。"Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with 11-6 mediated signalling"と題されたAblynx N.V.の国際出願WO 08/020079の４８頁の表Ａ−２が参照される。
【０２７９】
ｆ）２以上のヌクレオチド配列の比較の目的のために、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の間の「配列同一性」のパーセンテージを、ＷＯ０８／０２００７９の４９頁のパラグラフｅ）（参照により本願に組み込む）に説明されているとおり、計算又は決定してよく、例えば、［第２のヌクレオチド配列中の相応する位置にあるヌクレオチドと同一の、第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数］を［第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの全数］で割り、かつ、［１００％］で乗じることによる（その中で、−第１のヌクレオチド配列に比較した−第２のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの各欠失、挿入、置換又は付加は、単一ヌクレオチド（位置）での相違として考慮される）、又は、やはりＷＯ０８／０２００７９の４９頁のパラグラフｅ）に説明されるとおりの、好適なコンピューターアルゴリズム又は技術を用いることによる（参照により本願に組み込む）。
【０２８０】
ｇ）２以上のアミノ酸配列の比較の目的のために、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列の間の「配列同一性」（本願で「アミノ酸同一性」とも称する）のパーセンテージを、ＷＯ０８／０２００７９の４９及び５０頁のパラグラフｆ）（参照により本願に組み込む）に説明されているとおり、計算又は決定してよく、例えば、［第２のアミノ酸配列中の相応する位置にあるアミノ酸残基と同一の、第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の全数］で割り、かつ、［１００％］で乗じることによる（その中で、−第１のアミノ酸配列に比較した−第２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の各欠失、挿入、置換又は付加は、単一アミノ酸残基（位置）での相違として、すなわち、本願で定義されるとおり「アミノ酸相違」として考慮される）、又は、やはりＷＯ０８／０２００７９の４９及び５０頁のパラグラフｆ）（参照により本願に組み込む）に説明されるとおりの、好適なコンピューターアルゴリズム又は技術を用いることによる。
【０２８１】
また、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度の決定においては、当業者は、いわゆる「保存」アミノ酸置換を考慮してよい（ＷＯ０８／０２００７９の５０頁に説明するとおり）。
【０２８２】
本願で説明するポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換もまた、Schulz et al., Principles of Protein Structure, SpringerVerlag, 1978により開発された、異なる種の相同性タンパク質間のアミノ酸変異の頻度の分析に、Chou and Fasman, Biochemistry 13:211, 1974及びAdv. Enzymol., 47: 45-149, 1978により開発された構造形成可能性の分析に、及び、Eisenberg et al., Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 198 1, and Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986により開発されたタンパク質中の疎水性パターンの分析に、基づいてよい（全ては、参照により完全に本願に組み込まれる）。ナノボディの一次、二次及び三次構造に関する情報は、本願の発明の詳細な説明及び上で引用した一般的な背景技術に与えられている。また、この目的のために、ラマからのＶHHドメインの結晶構造が、例えば、Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757及びDecanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999)により与えられている。慣用的なＶHドメインにおいてＶH／ＶLインターフェースを形成するアミノ酸残基のいくつか及びこれら位置にある可能性のあるラクダ化置換に関する更なる情報は、上で引用した先行技術に見出すことができる。
【０２８３】
ｈ）アミノ酸配列及び核酸配列は、これらがその全長にわたり１００％の配列同一性（本願で定義するとおり）を有する場合には、「正確に同じ」と言われる。
【０２８４】
ｉ）２つのアミノ酸配列を比較する場合には、「アミノ酸相違」との用語は、第２の配列に比較した、第１の配列の位置上の単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を指す。２つのアミノ酸配列が、１、２又はそれより多いかかるアミノ酸相違を有してよいことが理解される。
【０２８５】
ｊ）ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、それぞれ別のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を「含む」、又は、別のヌクレオチド配列又アミノ酸配列「から実質的になる」と言う場合には、このことは、ＷＯ０８／０２００７９の５１−５２頁のパラグラフ（ｉ）に与えられている意味合いを有する。
【０２８６】
ｋ）「実質的に単離された形にある」との用語は、ＷＯ０８／０２００７９の５２及び５３頁のパラグラフｊ）に与えられている意味合いを有する。
【０２８７】
ｌ）「ドメイン」及び「結合ドメイン」との用語は、ＷＯ０８／０２００７９の５３頁のパラグラフｋ）に与えられている意味合いを有する。
【０２８８】
ｍ）「抗原決定子」及び「エピトープ」との用語は、本願で相互に交換可能に使用されてもよいが、ＷＯ０８／０２００７９の５３頁のパラグラフｌ）に与えられている意味合いを有する。
【０２８９】
ｎ）ＷＯ０８／０２００７９の５３頁のパラグラフｍ）にさらに説明されるとおり、（特異的に）結合できる、特異的な抗原決定子、エピトープ、抗原又はタンパク質についての（又は、その少なくとも一部、フラグメント又はエピトープについての）親和性及び／又は特異性を有するアミノ酸配列（例えば、本発明のナノボディ、抗体、ポリペプチド、又は、一般に抗原結合タンパク質又はポリペプチド又はそのフラグメント）は、前記抗原決定子、エピトープ、抗原又はタンパク質「に対する」又は「に対して指向している」と言われる。
【０２９０】
ｏ）「特異性」との用語は、ＷＯ０８／０２００７９の５３−５６頁のパラグラフｎ）に与えられる意味合いを有する。そして、そこに言及されるとおり、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば、本発明のナノボディ又はポリペプチド）分子が結合できる、数々の異なるタイプの抗原又は抗原決定子を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、ＷＯ０８／０２００７９の５３−５６頁に説明されるとおり（参照により本願に組み込む）、親和性及び／又はアビディティに基づいて決定されることができ、前記公開物は、抗原結合分子（例えば、本発明のナノボディ又はポリペプチド）及び関連抗原の間の結合を測定するためのいくつか好ましい技術も説明する。典型的には、抗原結合タンパク質（例えば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチド）は、その抗原に、解離定数（ＫD）１０-5〜１０-12モル／リットル以下、好ましくは１０-7〜１０-12モル／リットル以下、より好ましくは１０-8〜１０-12モル／リットル以下（すなわち、会合定数（ＫA）１０5〜１０12リットル／モル以上、好ましくは１０7〜１０12リットル／モル以上、より好ましくは１０8〜１０12リットル／モル以上）で結合するものである。１０4モル／リットルより大きい任意のＫD値（又は１０4Ｍ-1より低い任意のＫA値）は、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価の免疫グロブリンは、所望の抗原に、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性で結合する。抗原又は抗原決定子への抗原結合タンパク質の特異的結合は、任意の好適な自体既知の方式（例えば、スキャッチャード分析及び／又は競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドウィッチ競合アッセイ、及び、この分野で自体既知の種々のその変形、また同様に、本願で言及する他の技術を含む）で決定されることができる。当業者に明らかであるとおり、かつ、ＷＯ０８／０２００７９の５３−５６頁に説明されるとおり、この解離定数は、実際の又は見掛けの解離定数であってよい。解離定数の決定のための方法は、当業者に明らかであり、かつ、例えばＷＯ０８／０２００７９の５３−５６頁に言及される技術を含む。
【０２９１】
ｐ）本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドの半減期は、一般に、ＷＯ０８／０２００７９の５７頁のパラグラフｏ）に説明されるとおりに定義されることができ、かつ、本願で言及するとおり、ｉｎ  ｖｉｖｏで５０％だけ減少するための、アミノ酸配列、化合物又はポリペプチドの血清濃度のために考慮した時間を指し、例えば、前記減少は、前記配列又は化合物の分解及び／又は天然の機構による配列又は化合物のクリアランス又はゼクエストレーションによる。本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、任意の好適な自体既知の方式において、例えば、ファーマコキネティック分析により決定されることができる。好適な技術は当業者に明らかであり、かつ、例えば、一般に、ＷＯ０８／０２００７９の５７頁のパラグラフｏ）に説明されるとおりであってよい。また、ＷＯ０８／０２００７９の５７頁のパラグラフｏ）に言及されるとおり、半減期は、パラメーター、例えば、ｔ１／２−アルファ、ｔ１／２−ベータ及び曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて表現されることができる。例えば、以下の実験部分、また同様に、標準的なハンドブック、例えば、Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists及びPeters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)が参照される。"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron（Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)により公開）も参照される。「半減期の増加」又は「増加した半減期」との用語もまたＷＯ０８／０２００７９の５７頁のパラグラフｏ）に定義されるとおりであり、かつ、特にｔ１／２−ベータにおける増加、ｔ１／２−アルファの増加あり又はなしで、及び／又は、ＡＵＣ又は両者、を参照する。
【０２９２】
ｑ）本発明の文脈において、「調節」又は「調節する」とは、好適にｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して測定した場合に、標的又は抗原の活性の減少又は阻害、又は代わりに、その増加のいずれかを一般に意味する。特に、「調節」又は「調節する」とは、好適にｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して測定した場合に（これは、通常は、関与する標的又は抗原に依存する）、同じ条件下だが本発明のコンストラクトの非存在下で同じアッセイにおける標的又は抗原の活性に比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％又は少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上の、標的又は抗原の（関連するか又は意図される）生物学的活性の減少又は阻害、又は代わりに、その増加のいずれかを意味してよい。
【０２９３】
当業者に明らかであるとおり、「調節」は、同じ条件下だが本発明のコンストラクトの非存在下に比較して、１以上のそのリガンド、結合パートナー、ホモ多量体又はヘテロ多量体の形への会合のためのパートナー、又は基質に対する標的又は抗原の親和性、アビディティ、特異性及び／又は選択性における変化（これは、増加又は減少のいずれかであってよい）に作用すること、及び／又は、標的又は抗原が存在する媒体又は周囲中の１以上の条件（例えば、ｐＨ、イオン強度、共因子の存在、その他）に対する標的又は抗原の感受性における変化（これは、増加又は減少のいずれかであってよい）に作用すること、を伴ってもよい。当業者には明らかであるとおり、このことは、やはり、関与する標的又は抗原に依存して、任意の好適な方式において及び／又は任意の好適なアッセイ（自体既知のもの）を用いて決定されてよい。
【０２９４】
「調節」は、標的又は抗原が関与する、１以上の生物学的又は生理学的機構、作用、応答、機能、経路又は活性（又は、その１又は複数の基質、１又は複数のリガンド、又は１又は複数の経路が関与する、例えば、シグナリング経路又は代謝経路、及びそれらの関連する生物学的又は生理学的作用）に関する変化（すなわち、標的又は抗原及び所望の生物学的又は生理学的作用に依存して、それぞれ、アゴニストとしての、アンタゴニストとしての、又は逆アゴニストとしての活性）に作用することも意味してよい。やはり、当業者に明らかであるとおり、アゴニスト又はアンタゴニストとしてのかかる作用は、関与する標的又は抗原に依存して、任意の好適な方式において及び／又は任意の好適な（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び通常は細胞又はアッセイ）アッセイ（自体既知のもの）を用いて決定されてよい。特に、アゴニスト又はアンタゴニストとしての作用は、意図される生物学的又は生理学的活性が、同じ条件下だが本発明のコンストラクトの非存在下で同じアッセイにおける生物学的又は生理学的活性に比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％又は少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上それぞれ増加又は減少するものであってよい。
【０２９５】
調節は、例えば、標的又は抗原のアロステリック調節及び／又は標的又は抗原の１のその基質又はリガンドへの結合の減少又は阻害及び／又は標的又は抗原への結合のための天然のリガンド、基質との競合を伴ってもよい。調節は、標的又は抗原又はこれらが関与する機構又は経路の活性化を伴ってもよい。調節は、例えば、標的又は抗原のフォールディング又はコンフォメーション（confirmation）に関する、又は、フォールドさせる、そのコンフォメーションを変化させる（例えば、リガンドの結合のとき）、他の（サブ）ユニットと会合する、又は解離する、標的又は抗原の能力に関する、変化に作用することを伴ってもよい。
【０２９６】
調節は、例えば、他の化合物を輸送させるための、又は、他の化合物（例えば、イオン）のためのチャネルとして働くための、標的又は抗原の能力における変化に作用することを伴ってもよい。
【０２９７】
調節は、可逆的又は不可逆的であってよいが、医薬的及び薬理学的目的から通常は可逆な方式にある。
【０２９８】
ｒ）標的又は抗原に関して、標的又は抗原上の「相互作用部位」との用語は、標的又は抗原上のアミノ酸残基の一部位、エピトープ、抗原決定子、部、ドメイン又は伸長部であって、リガンド、レセプター又は他の結合パートナーへの結合のための部位、触媒作用部位、開裂部位、アロステリック相互作用のための部位、標的又は抗原の多量化（例えば、ホモメリゼーション又はヘテロ二量体化、特にヘテロ二量体化）に関与する部位、又は、標的又は抗原上のアミノ酸残基の任意の他の部位、エピトープ、抗原決定子、部、ドメイン又は伸長部であって標的又は抗原の生物学的作用又は機構に関与するものを意味する。より一般的には、「相互作用部位」は、標的又は抗原上のアミノ酸残基の任意の部位、エピトープ、抗原決定子、部、ドメイン又は伸長部であって標的又は抗原（及び／又は、標的又は抗原が関与する任意の経路、相互作用、シグナリング、生物学的機構又は生物学的作用）が調節されるように本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドが結合できるものであってよい（本願で説明するとおり）。
【０２９９】
ｓ）アミノ酸配列又はポリペプチドは、前記アミノ酸配列又はポリペプチドが第２の標的又はポリペプチドに結合する親和性に比較して、少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、１００００倍以上の親和性（本願で説明するとおり、かつ、ＫD値、ＫA値、Ｋoff速度及び／又はＫon速度として好適に表現される）でより良好に第１の抗原に結合する場合に、第２の標的又は抗原に比較して、第１の標的又は抗原に対して「特異的」と言われている。例えば、第１の抗原は、前記アミノ酸配列又はポリペプチドが第２の標的又はポリペプチドに結合するＫDよりも、少なくとも１０倍少ない、例えば少なくとも１００倍少ない、好ましくは少なくとも１０００倍少ない、例えば１００００倍少ないか又はそれより少ないＫD値でもって標的又は抗原に結合してよい。好ましくは、アミノ酸配列又はポリペプチドが、第２の標的又は抗原に比較して、第１の標的又は抗原に「特異的」である場合には、これは、（本願で定義するとおり）前記第１の標的又は抗原に対して指向しているのであり、前記第２の標的又は抗原に対して指向しているのでない。
【０３００】
「交差遮断する」、「交差遮断した」及び「交差遮断」との用語は、直接的に又は間接的に、所定の標的に対する本発明の他の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドのアロステリック調節を介して結合に干渉する免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドの能力を意味すべく、本願では相互に交換可能に使用される。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドが別のものの標的への結合に干渉できる程度、そしてしたがって、これが、本発明に応じた交差遮断と言えるかどうかは、競合結合アッセイを用いて決定されることができる。特に好適な一の定量的交差遮断アッセイは、標的へのその結合の観点において、ラベル化（例えば、ヒスタグ化、ビオチン化又は放射性ラベル化）された本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドと、他の結合剤との間の競合を測定するために、ＦＡＣＳ−又はアルファスクリーンベースアプローチを用いる。この実験部分は、一般に、結合分子が、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドを交差遮断するか、又は、交差遮断可能であるかを決定するために好適なＦＡＣＳベースアッセイを説明する。このアッセイが、本願で説明する任意の免疫グロブリン単一可変ドメイン又は他の結合剤と一緒に使用されることができることが理解される。こうして、一般に、本発明の交差遮断アミノ酸配列又は他の結合剤は、例えば、上述の交差遮断アッセイにおいて、このアッセイの間かつ本発明の第２のアミノ酸配列又は他の結合剤の存在において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドの記録された変位が、０．４ｍＭ以下の量で存在する試験すべき可能性のある交差遮断剤（交差遮断剤は、別の慣用モノクローナル抗体、例えばＩｇＧ、典型的な一価抗体フラグメント（Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）であってよい）による、（例えば、ＦＡＣＳベース競合アッセイにおいて）最大理論変位（例えば、交差遮断されることが必要な、コールド（例えばラベル化してない）免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドによる変位）の１００％までであるように標的に結合するもの及び／又は変形（野生型又は改変型ダイアボディ（diabodies）、トリアボディ、ミニボディ、ＶＨＨｓ、ｄＡｂｓ、ＶＨｓ、ＶＬｓを含むが、これに限定されない）である。好ましい、限定しない一観点において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドは、１０％〜１００％、より好ましくは５０％〜１００％の（上述したとおりの）記録された変位を有する。
【０３０１】
ｕ）アミノ酸配列は、（本願で定義するとおり）これら両者の異なる抗原又は抗原決定子に対して特異的である場合に、２つの異なる抗原又は抗原決定子（例えば、２つの異なる哺乳類種からの血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン及びイヌ（cyno-）血清アルブミン）に対して「交差反応性」と言われている。
【０３０２】
ｖ）本願でさらに説明するとおり、ナノボディ中のアミノ酸残基の全数は、１１０〜１３０の領域にあってよい。しかし、ナノボディの部分、フラグメント、アナログ又は誘導体（本願でさらに説明するとおり）は、かかる部分、フラグメント、アナログ又は誘導体が、本願で概略した更なる要求に合致する、そして、好ましくは、本願で説明する目的に好適でもある限りは、その長さ及び／又はサイズについて特に限定されないことに留意されたい。
【０３０３】
ｗ）ＷＯ０８／０２００７９の５８及び５９頁のパラグラフｑ）にさらに説明されるとおり（参照により本願に組み込む）、ナノボディのアミノ酸残基は、Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195 (例えば、この公開物の図２参照)の文献においてラクダ科からのＶHHドメインについて適用されるとおり、Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)により与えられるＶHドメインに関する一般的なナンバリングに応じてナンバー付けされ、かつ、相応して、ナノボディのＦＲ１は、位置１−３０にあるアミノ酸残基を、ナノボディのＣＤＲ１は、位置３１−３５にあるアミノ酸残基を、ナノボディのＦＲ２は、位置３６−４９にあるアミノ酸を、ナノボディのＣＤＲ２は、位置５０−６５にあるアミノ酸残基を、ナノボディのＦＲ３は、位置６６−９４にあるアミノ酸残基を、ナノボディのＣＤＲ３は、位置９５−１０２にあるアミノ酸残基を、そして、ナノボディにＦＲ４は、位置１０３−１１３にあるアミノ酸残基を含む。
【０３０４】
ｘ）図面、配列表及び実験部分／実施例は、本発明をさらに例証するためにだけ与えられており、本願で別のことを明示的に示さない限りは、本発明の範囲及び／又は添付した特許請求の範囲の範囲を限定するものとして判断又は解釈してはならない。
【０３０５】
重鎖抗体及びその可変ドメインの一般的な説明に関しては、本願で引用する先行技術と、また同様に、ＷＯ０８／０２００７９の５９頁で言及される先行技術及び国際出願ＷＯ０６／０４０１５３の４１−４３頁に言及される参考文献一覧とが特に参照され、これら先行技術及び参考文献は、参照により本願に組み込む。
【０３０６】
この分野で使用する用語法と一致して（上の参照を参考のこと）、天然に発生する重鎖抗体中に存在する可変ドメインは、これらを慣用の四鎖抗体中に存在する重鎖可変ドメイン（以下では「ＶHドメイン」と称される）から、そして、慣用の四鎖抗体中に存在する軽鎖可変ドメイン（以下では「ＶLドメイン」と称される）から区別するために、「ＶHHドメイン」とも称される。
【０３０７】
上で参照した先行技術において言及されるとおり、ＶHHドメインは、数々のユニークな構造特徴及び機能的特性を有し、これによって、単離されたＶHHドメイン（また同様に、これに基づくナノボディであってこれらの構造特徴及び機能的特性を天然に発生するＶHHドメインと共有するもの）及びこれを含有するタンパク質は、機能的抗原結合ドメイン又はタンパク質としての使用のために高度に有利になる。特に、限定されることなく、ＶHHドメイン（軽鎖可変ドメインの存在なしに、かつ、これとのいかなる相互作用なしに、天然で抗原に機能的に結合するよう「設計」されている）及びナノボディは、単一の、比較的小さい、機能的抗原結合構造的単位、ドメイン又はタンパク質として機能することができる。このことは、ＶHHドメインを、慣用の四鎖抗体のＶH及びＶLドメインから区別し、これは自体では単一抗原結合タンパク質又はドメインとしての実際的な適用に一般に好適でないが、機能的抗原結合ユニットを提供すべく、同じか又は異なる形で組み合わせられる必要がある（例えば、慣用の抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメント、ＳｃＦｖフラグメント（これは、ＶLドメインに共有結合したＶHドメインからなる）のように）。
【０３０８】
これらのユニークな特性のために、単一抗原結合タンパク質として又は抗原結合ドメインとしての（すなわち、より大きなタンパク質又はポリペプチドの一部としての）ＶHH及びＩＳＶ又はナノボディの使用は、慣用のＶH及びＶLドメイン、ｓｃＦｖ又は慣用の抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ−又はＦ（ａｂ）2−フラグメント）の使用に対して数々の著しい利点（ＷＯ０８／０２００７９の６０及び６１頁に列記される利点を含む）を提供する。
【０３０９】
特定のかつ好ましい一観点において、本発明は、ＨＥＲ３に対するＩＳＶ又はナノボディ、特に温血動物由来のＨＥＲ３に対するＩＳＶ又はナノボディ、より好ましくは哺乳類由来のＨＥＲ３に対するＩＳＶ又はナノボディ、特別にはヒト由来のＨＥＲ３に対するＩＳＶ又はナノボディと、同様に、少なくとも１のかかるＩＳＶ又はナノボディを含むタンパク質及び／又はポリペプチドを提供する。
【０３１０】
特に、本発明は、ＨＥＲ３に対する慣用の抗体又はそのフラグメントに比較して、かかる慣用の抗体又は抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）2フラグメント、ＳｃＦｖコンストラクト、「ダイアボディ」及び他の多特異性コンストラクト（例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9): 1126-36)による概要参照））を基礎とできるコンストラクトに比較して、そしてまた、いわゆる「ｄＡｂ′ｓ」又は類似の（単一）ドメイン抗体であって慣用の抗体の可変ドメインに由来してよいものに比較して、改善された療法的及び／又は薬理学的特性及び／又は他の有利な特性（例えば、改善された調整容易性及び／又は減少された物品コスト）を有するＨＥＲ３に対するＩＳＶ又はナノボディ、及び、これらを含むタンパク質及び／又はポリペプチドものを提供する。これらの改善されかつ有利な特性は、更なる本願の発明の詳細な説明から明らかであり、例えば、限定することなく、次のものの１以上を含む：
−ＨＥＲ３に対する増加した親和性及び／又はアビディティ、その際、一価のフォーマット、多価のフォーマット（例えば、二価のフォーマット）及び／又は多特異性フォーマット（例えば、本願で以下に説明する多特異性フォーマットの１）のいずれかにある、
−多価フォーマット（例えば二価フォーマット）におけるフォーマッティングのための良好な好適性、
−多特異性フォーマット（例えば、本願で以下に説明する多特異性フォーマットの１）におけるフォーマッティングのための良好な好適性、
−「ヒト化」置換に対する改善された好適性又は感受性（本願で定義するとおり）、
−少ない免疫原性、その際、一価のフォーマット、多価のフォーマット（例えば、二価のフォーマット）及び／又は多特異性フォーマット（例えば、本願で以下に説明する多特異性フォーマットの１）のいずれかにある、
−増加した安定性、その際、一価のフォーマット、多価のフォーマット（例えば、二価のフォーマット）及び／又は多特異性フォーマット（例えば、本願で以下に説明する多特異性フォーマットの１）のいずれかにある、
−ＨＥＲ３に対する増加した選択性、その際、一価のフォーマット、多価のフォーマット（例えば、二価のフォーマット）及び／又は多特異性フォーマット（例えば、本願で以下に説明する多特異性フォーマットの１）のいずれかにある、
−異なる種からのＨＥＲ３との、減少したか、又は所望の場合には、増加した交差反応性、
及び／又は
−一価のフォーマット、多価のフォーマット（例えば、二価のフォーマット）及び／又は多特異性フォーマット（例えば、本願で以下に説明する多特異性フォーマットの１）のいずれかにある、医薬用途（予防用途及び／又は療法用途）及び／又は診断用途（イメージング用途を含むが、これに限定されない）に所望される、１以上の他の改善された特性。
【０３１１】
本発明のアミノ酸配列について本願で一般に説明するとおり、本発明のＩＳＶ又はナノボディは、好ましくは、実質的に単離された形（本願で定義するとおり）にあるか又は本発明のタンパク質又はポリペプチドの部分を形成し（本願で定義するとおり）、これは、本発明の１以上のＩＳＶ又はナノボディを含むか又はこれらから実質的になってよく、かつ、任意に、１以上の更なるアミノ酸配列をさらに含んでよい（全てのものは、任意に、１以上の好適なリンカーを介して連結される）。例示的に、かつ、限定することなく、本発明のアミノ酸配列１以上は、かかるタンパク質又はポリペプチドにおいて結合ユニットとして使用されてよく、これは、結合ユニット（すなわち、ＨＥＲ３以外の１以上の他のターゲットに対する）として機能できる１以上の更なるアミノ酸配列を任意に含有してよく、その結果、一価、多価又は多特異性の本発明のポリペプチドをそれぞれ提供する（全て本願で説明する）。特に、かかるタンパク質又はポリペプチドは、１以上の本発明のＩＳＶ又はナノボディ及び任意に１以上の（他の）ＩＳＶ又はナノボディ（すなわち、ＨＥＲ３以外の他の標的に対して指向している）を含むか又は実質的にこれらからなってよく、これらは、それぞれ、一価、多価又は多特異性ＩＳＶ又はナノボディコンストラクトを提供すべく、全て任意に１以上の好適なリンカーを介して連結しており、これは本願でさらに説明するとおりである。かかるタンパク質又はポリペプチドは、実質的に単離された形にあってもよい（本願で説明するとおり）。
【０３１２】
本発明のＩＳＶ又はナノボディにおいては、ＨＥＲ３に対する結合のための結合部位は、好ましくは、ＣＤＲ配列により形成される。任意に、本発明のＩＳＶ又はナノボディはまた、ＨＥＲ３に対する結合のための少なくとも１の結合部位に加えて、１以上の更なる結合部位を、他の抗原、タンパク質又は標的に対する結合のために有してもよい。かかる第２の結合部位を導入するための方法及び位置に関しては、例えば、Keck and Huston, Biophysical Journal, 71, October 1996, 2002-2011;  ＷＯ０６４０１３０及びＷＯ０６／０７２６０が参照される。
【０３１３】
本発明のアミノ酸配列について一般に説明するとおり、本発明のＩＳＶ又はナノボディ（又は、これらを含むポリペプチド）が、（例えば、本願で説明する、療法及び／又は診断目的のために）被験体への投与が意図されている場合に、これは好ましくはヒトＨＥＲ３に対して指向している。その一方で、獣医目的のためには、これは好ましくは治療すべき種由来のＨＥＲ３に対して指向している。また、本発明のアミノ酸配列を用いると、本発明のＩＳＶ又はナノボディは、交差反応性であってよいか又は交差反応性でなくてよい（すなわち、２以上の哺乳類種由来のＨＥＲ３に対して、例えば本願で言及する少なくとも１の哺乳類種由来のヒトＨＥＲ２及びＨＥＲ３に対して指向している）。
【０３１４】
また、やはり一般的に本願で本発明のアミノ酸配列について説明されているとおり、本発明のＩＳＶ又はナノボディは一般に、ＨＥＲ３の任意の抗原決定子、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又はコンフォメーション（適用可能な場合には）に対して指向されていてよい。しかし、本発明のＩＳＶ又はナノボディ（及びこれを含むポリペプチド）が、ヘレグリン（又は「ＨＲＧ」）結合部位及びヘテロ二量体化相互作用部位に対して指向していることが一般に推測されかつ好まれている。
【０３１５】
既に説明したとおり、ＩＳＶ又はナノボディのアミノ酸配列及び構造は、４つのフレームワーク領域又は「ＦＲｓ」（これは、しばしば「ＦＷｓ」とも称される）から構成されると考えられることができ（しかし、これに限定されることはない）、この分野及び本願では、これらはそれぞれ「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」、そして、「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と称される。このフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域又は「ＣＤＲｓ」（これは、この分野では、それぞれ「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」、そして「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」と称される）により分断される。本発明のＩＳＶ又はナノボディ中に存在する、いくつかの好ましいフレームワーク配列及びＣＤＲｓ（及びその組み合わせ）は本願で説明するとおりである。他の好適なＣＤＲ配列は、本願で説明する方法により得ることができる。
【０３１６】
本発明を限定しないが、好ましい一観点によれば、本発明のＩＳＶ又はナノボディ（中に存在するＣＤＲ配列）は次のことが該当するものである：
−ＩＳＶ又はナノボディは、ＨＥＲ３に解離定数（ＫD）１０-5〜１０-12モル／リットル以下、好ましくは１０-7〜１０-12モル／リットル以下、より好ましくは１０-8〜１０-12モル／リットル以下（すなわち、会合定数（ＫA）１０5〜１０12リットル／モル以上、好ましくは１０7〜１０12リットル／モル以上、より好ましくは１０8〜１０12リットル／モル以上）でもって結合することができる；
及び／又は：
−ＩＳＶ又はナノボディは、ＨＥＲ３にｋon速度１０2Ｍ-1ｓ-1〜約１０7Ｍ-1ｓ-1、好ましくは１０3Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1、より好ましくは１０4Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1、例えば１０5Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1でもって結合することができる；
及び／又は：
−ＩＳＶ又はナノボディは、ＨＥＲ３にｋoff速度１ｓ-1（ｔ1/2＝０．６９ｓ）〜１０-6ｓ-1（複数日数のｔ1/2ではほぼ不可逆な複合体を提供する）、好ましくは１０-2ｓ-1〜１０-6ｓ-1、より好ましくは１０-3ｓ-1〜１０-6ｓ-1、例えば１０-4ｓ-1〜１０-6ｓ-1でもって結合することができる。
【０３１７】
好ましくは、本発明のＩＳＶ又はナノボディ（中に存在するＣＤＲ配列）は、次のことが該当するものである：本発明の一価のＩＳＶ又はナノボディ（又は、本発明の唯一のＩＳＶ又はナノボディを含有するポリペプチド）は、好ましくは、５００ｎＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５ｎＭ未満の親和性でＨＥＲ３に結合するものである。
【０３１８】
ＨＥＲ３に対する本発明のＩＳＶ又はナノボディの親和性は、自体既知の方式において、例えば本願で言及するとおりのＫD、ＫA、ｋoff又はｋonを測定するための一般的な技術、また同様に、本願で説明する特異的なアッセイのいくつかを用いて、決定されることができる。
【０３１９】
ＨＥＲ３への本発明のＩＳＶ又はナノボディ（及びこれを含むポリペプチド）の結合のためのいくつかの好ましいＩＣ50値は、本願の更なる発明の詳細な説明及び実施例から明らかになる。
【０３２０】
好ましいが、限定しない一観点において、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）からなる、ＨＥＲ３に対するＩＳＶ又はナノボディ（本願で説明するとおり）に関し、その際、
−ＣＤＲ１が、次のものからなる群から選択される：
ａ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
及び／又は
−ＣＤＲ２が、次のものからなる群から選択される：
ｄ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
及び／又は
−ＣＤＲ３が、次のものからなる群から選択される：
ｇ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
又は、かかるアミノ酸配列の任意の好適なフラグメント。
【０３２１】
特に、この好ましいが、限定しない一観点において、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）からなる、ＨＥＲ３に対するＩＳＶ又はナノボディ（本願で説明するとおり）に関し、その際、
−ＣＤＲ１が、次のものからなる群から選択される：
ａ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
及び
−ＣＤＲ２が、次のものからなる群から選択される：
ｄ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
及び
−ＣＤＲ３が、次のものからなる群から選択される：
ｇ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
又は、かかるアミノ酸配列の任意の好適なフラグメント。
【０３２２】
本発明のアミノ酸配列について本願で一般に言及するとおり、本発明のＩＳＶ又はナノボディがｂ）及び／又はｃ）に応じた１以上のＣＤＲ１配列を含有する場合には、次のことが該当する：
ｉ）ｂ）及び／又はｃ）に応じたかかるＣＤＲにおける任意のアミノ酸置換が、好ましくは、ａ）に応じた相応するＣＤＲに比較して、保存アミノ酸置換である（本願で説明するとおり）；
及び／又は
ｉｉ）ｂ）及び／又はｃ）に応じたＣＤＲが、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、かつ、ａ）に応じた相応するＣＤＲに比較してアミノ酸欠失又は挿入を含まない；
及び／又は
ｉｉｉ）ｂ）及び／又はｃ）に応じたＣＤＲは、自体既知である親和性成熟の技術１以上を用いた親和性成熟により、ａ）に応じたＣＤＲに由来するＣＤＲであってよい。
【０３２３】
同様に、本発明のＩＳＶ又はナノボディが、ｅ）及び／又はｆ）に応じた１以上のＣＤＲ２を含む場合には、次のことが該当する：
ｉ）ｅ）及び／又はｆ）に応じたかかるＣＤＲにおける任意のアミノ酸置換が、好ましくは、ｄ）に応じた相応するＣＤＲに比較して、保存アミノ酸置換である（本願で説明するとおり）；
及び／又は
ｉｉ）ｅ）及び／又はｆ）に応じたＣＤＲが、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、かつ、ｄ）に応じた相応するＣＤＲに比較して、アミノ酸欠失又は挿入を含まない；
及び／又は
ｉｉｉ）ｅ）及び／又はｆ）に応じたＣＤＲは、自体既知である親和性成熟の技術１以上を用いた親和性成熟により、ｄ）に応じたＣＤＲに由来するＣＤＲであってよい。
【０３２４】
また、同様に、本発明のＩＳＶ又はナノボディが、ｈ）及び／又はｉ）に応じた１以上のＣＤＲ３を含む場合には、次のことが該当する：
ｉ）ｈ）及び／又はｉ）に応じたかかるＣＤＲにおける任意のアミノ酸置換が、好ましくは、ｇ）に応じた相応するＣＤＲに比較して、保存アミノ酸置換である（本願で説明するとおり）；
及び／又は
ｉｉ）ｈ）及び／又はｉ）に応じたＣＤＲが、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、かつ、ｇ）に応じた相応するＣＤＲに比較して、アミノ酸欠失又は挿入を含まない；
及び／又は
ｉｉｉ）ｈ）及び／又はｉ）に応じたＣＤＲは、自体既知である親和性成熟の技術１以上を用いた親和性成熟により、ｇ）に応じたＣＤＲに由来するＣＤＲであってよい。
【０３２５】
最後の３つの段落が、一般に、それぞれｂ）、ｃ）、ｅ）、ｆ）、ｈ）、又はｉ）に応じた１以上のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及び／又はＣＤＲ３配列を包含する、本発明の任意のＩＳＶ又はナノボディに適用されることが理解されるべきである。
【０３２６】
本発明のＩＳＶ又はナノボディのうち、上で明示的に列記された１以上のＣＤＲを含むＩＳＶ又はナノボディが好ましい。上で明示的に列記された２以上のＣＤＲを含むＩＳＶ又はナノボディは、特により好ましい。そして、上で明示的に列記された３つのＣＤＲを含むＩＳＶ又はナノボディは、特に最も好ましい。
【０３２７】
いくつかの特に好ましいが限定しないＣＤＲ配列組み合わせと、また同様に、ＣＤＲ配列とフレームワーク配列の好ましい組み合わせは、以下の表Ｂ−１に言及されており、これらは、数々の好ましい（しかし、限定しない）本発明のＩＳＶ又はナノボディ中に存在するＣＤＲ配列及びフレームワーク配列を列記する。当業者に明らかであるとおり、同じクローン中で発生するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列（すなわち、表Ｂ−１中の同じラインで言及されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）の組み合わせは、（本発明はその最も広い意味合いにおいて、これに限定されず、かつ、表Ｂ−１に言及されるＣＤＲ配列の他の好適な組み合わせをも包むとはいえ）通常は好ましい。また、同じクローン中で発生するＣＤＲ配列及びフレームワーク配列の組み合わせ（すなわち、表Ｂ−１中の同じラインで言及されるＣＤＲ配列及びフレームワーク配列）は、（本発明はその最も広い意味合いにおいて、これに限定されず、かつ、表Ｂ−１に言及されるＣＤＲ配列及びフレームワーク配列の他の好適な組み合わせ、また同様に、かかるＣＤＲ配列及び他の好適なフレームワーク配列の組み合わせ（例えば、本願で説明するとおり）をも包むとはいえ）通常は好ましい。
【０３２８】
また、表Ｂ−１中で言及されるＣＤＲ組み合わせを含む本発明のＩＳＶ又はナノボディにおいては、各ＣＤＲは、言及したＣＤＲｓとの配列同一性（本願で定義するとおり）少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲにより置き換えられることができ、その際、次のことが該当する：
ｉ）かかるＣＤＲ中の任意のアミノ酸置換が好ましくは、表Ｂ−１中で言及する相応するＣＤＲ配列に比較して、保存アミノ酸置換である（本願で説明するとおり）；
及び／又は
ｉｉ）任意のかかるＣＤＲ配列が、好ましくはアミノ酸置換のみを含み、かつ、表Ｂ−１に言及する相応するＣＤＲに比較して、アミノ酸欠失又は挿入を含まない；
及び／又は
ｉｉｉ）任意のかかるＣＤＲ配列は、特に、表Ｂ−１に言及する相応するＣＤＲ配列から出発して、自体既知である親和性成熟の技術を用いて取得される。
【０３２９】
しかし、当業者に明らかであるとおり、ＣＤＲ配列（の組み合わせ）、また同様に、表Ｂ−１に言及されるＣＤＲ配列及びフレームワーク配列（の組み合わせ）は、一般に好ましい。
【０３３０】
表Ｂ−１：ＣＤＲ配列の好ましい組み合わせ、フレームワーク配列の好ましい組み合わせ及びフレームワーク及びＣＤＲ配列の好ましい組み合わせ。（「ＩＤ」は、本願で使用する配列番号を指す）
【表５】
2013529079.tif 000006
【表６】
2013529079.tif 000007
【０３３１】
こうして、本発明のナノボディにおいて、存在する少なくとも１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列が、好適には、それぞれ、表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列からなる群から、又は、それぞれ、表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の少なくとも１と、それぞれ少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９９％の「配列同一性」（本願で定義するとおり）を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の群から、及び／又は、それぞれ、表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の少なくとも１と、それぞれ、３、２又は１のみの「（１又は複数の）アミノ酸相違」（本願で定義するとおり）を有するそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列からなる群から、選択されている。
【０３３２】
この文脈において、「好適に選択」とは、適用可能な場合には、それぞれ、ＣＤＲ１配列が好適なＣＤＲ１配列（すなわち、本願で定義するとおり）から選択され、ＣＤＲ２配列が好適なＣＤＲ２配列（すなわち、本願で定義するとおり）から選択され、そして、ＣＤＲ３配列が好適なＣＤＲ３配列（すなわち、本願で定義するとおり）から選択されることを意味する。より具体的には、ＣＤＲ配列は、好ましくは、本発明のナノボディが、本願で定義する親和性（ＫD値（実際の又は見掛けの）、ＫA値（実際の又は見掛けの）、ｋon速度及び／又はｋoff速度、又は代わりにＩＣ50値として好適には測定及び／又は表現、本願でさらに説明するとおり）でＨＥＲ３に結合するように選択される。
【０３３３】
特に、本発明のナノボディにおいて、存在する少なくともＣＤＲ３は、好適には、表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ３配列からなる群、又は、表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ３配列の少なくとも１と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ３配列からなる群、及び／又は、表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ３配列の少なくとも１と、それぞれ３、２又は１のみの（１又は複数の）アミノ酸相違を有するＣＤＲ３配列からなる群から選択されている。
【０３３４】
好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在する少なくとも２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ配列は、好適には、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列からなる群、又は、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の少なくとも１と、それぞれ少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列からなる群、及び／又は、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の少なくとも１と、３、２又は１のみの（１又は複数の）アミノ酸相違を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列からなる群から選択されている。
【０３３５】
特に、本発明のナノボディにおいて、存在する少なくとも２のＣＤＲ３配列は、好適には、表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ３配列からなる群から、又は、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ３配列の少なくとも１と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ３配列の群から選択され、及び、存在するＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列の少なくとも１は、好適には、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列からなる群から、又は、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列の少なくとも１と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列それぞれの群から、及び／又は、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列の少なくとも１と、それぞれ３、２又は１のみの（１又は複数の）アミノ酸相違を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列からなる群から選択される。
【０３３６】
最も好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在する全部で３つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、好適には、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列からなる群から、又は、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の少なくとも１と、それぞれ少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の群から、及び／又は、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の少なくとも１と、それぞれ３、２又は１のみの（１又は複数の）アミノ酸相違を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列からなる群から選択されている。
【０３３７】
よりいっそう好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の少なくとも１は、好適には、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、からなる群から選択される。好ましくは、この観点において、少なくとも１の又は好ましくは両者の別の２のＣＤＲ配列が存在し、これは好適には、それぞれ表Ｂ−１に列記される相応するＣＤＲ配列の少なくとも１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列から、及び／又は、それぞれ表Ｂ−１に列記される相応する配列の少なくとも１と、３、２又は１のみの（１又は複数の）アミノ酸相違を有するＣＤＲ配列からなる群から選択される。
【０３３８】
特に、本発明のナノボディにおいて、存在する少なくともＣＤＲ３配列は、好適には、表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ３からなる群から選択される。好ましくは、この観点において、存在する少なくとも１の、好ましくは両者のＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列は好適には、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列それぞれの群から、及び／又は、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列の少なくとも１と、３、２又は１のみの（１又は複数の）アミノ酸相違を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列それぞれからなる群から選択される。
【０３３９】
よりいっそう好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在する少なくとも２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、好適には、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、からなる群から選択される。好ましくは、この観点において、存在する残りのＣＤＲ配列は、好適には、表Ｂ−１に列記される相応するＣＤＲ配列の少なくとも１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列の群から、及び／又は、表Ｂ−１に列記される相応する配列の少なくとも１と、３、２又は１のみの（１又は複数の）アミノ酸相違を有するＣＤＲ配列からなる群から選択される。
【０３４０】
特に、本発明のナノボディにおいて、少なくともＣＤＲ３配列が好適には、表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ３配列からなる群から、そして、ＣＤＲ１又はＣＤＲ２のいずれかが、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列からなる群から好適に選択される。好ましくは、この観点において、存在する残りのＣＤＲ配列は、好適には、表Ｂ−１に列記される相応するＣＤＲ配列の少なくとも１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列の群から、及び／又は、表Ｂ−１に列記される相応する配列と、３、２又は１のみの（１又は複数の）アミノ酸相違を有するＣＤＲ配列からなる群から選択される。
【０３４１】
さらにいっそう好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在する全部で３つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、好適には、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列からなる群から選択される。
【０３４２】
また、一般に、表Ｂ−１に列記されるＣＤＲの組み合わせ（すなわち、表Ｂ−１において同じラインで言及されるもの）が好ましい。こうして、本発明のナノボディ中のＣＤＲが、表Ｂ−１に言及されるＣＤＲ配列であるか、又は、好適には、表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列の群から、及び／又は、表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ配列と、３、２又は１のみの（１又は複数の）アミノ酸相違を有するＣＤＲ配列からなる群から好適に選択されていること、少なくとも１の、好ましくは両者のＣＤＲが、好適には、表Ｂ−１中の同じ組み合わせ（すなわち、表Ｂ−１中の同じ列で言及したもの）に属するか、又は、好適には、この同じ組み合わせに属する（１又は複数の）ＣＤＲ配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、よりいっそう好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列の群から選択されているＣＤＲ配列から、及び／又は、同じ組み合わせに属する（１又は複数の）ＣＤＲ配列と、３、２又は１のみの（１又は複数の）アミノ酸相違を有するＣＤＲ配列からなる群から選択されていることが、一般に好ましい。上述の段落において示した他の好ましい態様は、表Ｂ−１に言及したＣＤＲの組合せにも該当する。
【０３４３】
こうして、限定しない例によって、本発明のナノボディは、例えば、表Ｂ−１に言及されるＣＤＲ１配列の１と８０％より多い配列同一性を有するＣＤＲ１配列、表Ｂ−１に言及される（が、異なる組合せに属する）ＣＤＲ２配列の１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するＣＤＲ２配列、及び、ＣＤＲ３配列を含むことができる。
【０３４４】
本発明のいくつかの好ましいナノボディは、例えば次のものを含んでよい：
（１）表Ｂ−１中に言及されるＣＤＲ１配列の１と８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ１配列、表Ｂ−１に言及される（が、異なる組み合わせに属する）ＣＤＲ２配列の１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するＣＤＲ２配列、及び、表Ｂ−１中に言及される（が、異なる組み合わせに属する）ＣＤＲ３配列の１と８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ３配列；又は、
（２）表Ｂ−１中に言及されるＣＤＲ１配列の１、ＣＤＲ２配列、及び、表Ｂ−１中に列記されるＣＤＲ３配列の１と８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ１配列、又は、（３）ＣＤＲ１配列、表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ２配列の１と８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ２配列、及び、ＣＤＲ２配列と同じ組み合わせに属する表Ｂ−１に言及されるＣＤＲ３配列と３、２又は１のアミノ酸相違を有するＣＤＲ３配列。
【０３４５】
特に好ましい本発明のナノボディは、例えば次のものを含んでよい：（１）表Ｂ−１中に言及されるＣＤＲ１配列の１と８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ１配列、同じ組合せに属する表Ｂ−１に言及されるＣＤＲ２配列の１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するＣＤＲ２配列、及び、同じ組合せに属する表Ｂ−１中に言及されるＣＤＲ３配列と８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ３配列。（２）ＣＤＲ１配列、表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ２配列及び表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ３配列（その際、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列は異なる組み合わせに属してよい）。
【０３４６】
本発明のいくつかのより好ましいナノボディは、例えば次のものを含んでよい：（１）表Ｂ−１に言及されるＣＤＲ１配列の１と８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ１配列、同じ組み合わせに属する表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ２配列、及び、異なる組み合わせに属する表Ｂ−１に言及されるＣＤＲ３配列、又は、（２）表Ｂ−１に言及されるＣＤＲ１配列、同じ組み合わせに属する表Ｂ−１に言及されるＣＤＲ２配列と３、２又は１のアミノ酸相違を有するＣＤＲ２配列、及び、同じか又は異なる組み合わせに属する表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ３配列と８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ３配列。
【０３４７】
本発明の特に好ましいナノボディは、例えば、表Ｂ−１に言及されるＣＤＲ１配列、同じ組み合わせに属する表Ｂ−１に言及されるＣＤＲ２配列と８０％超の配列同一性を有するＣＤＲ２配列、及び、同じ組み合わせに属する表Ｂ−１に言及されるＣＤＲ３配列を含んでよい。
【０３４８】
本発明の最も好ましいナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列が、好適には、それぞれ表Ｂ−１に列記されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の組み合わせの１から選択される。
【０３４９】
別の好ましいが、限定しない本発明の観点によれば、（ａ）ＣＤＲ１は、１〜１２アミノ酸残基、通常は２〜９アミノ酸残基、例えば５、６又は７アミノ酸残基の長さを有する、及び／又は、（２）ＣＤＲ２は、１３〜２４アミノ酸残基、通常は１５〜２１アミノ酸残基、例えば１６〜１７アミノ酸残基の長さを有する、及び／又は、（３）ＣＤＲ３は、２〜３５アミノ酸残基、通常は３〜３０アミノ酸残基、例えば６〜２３アミノ酸残基の長さを有する。
【０３５０】
別の好ましいが、限定しない観点においては、本発明は、ＣＤＲ配列（本願で定義するとおり）が、配列番号１２−２６のアミノ酸配列（表Ａ−１参照）の少なくとも１のＣＤＲ配列と８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の配列同一性（本願で定義するとおり）を有するナノボディに関する。
【０３５１】
一般に、上述のＣＤＲ配列を有するナノボディは、さらに本願で説明してよく、かつ、好ましくは、本願でさらに説明もするフレームワーク配列を有してよい。
【０３５２】
例えば、既に言及したとおり、ナノボディ中に存在するフレームワーク配列は、一般に、ＷＯ０９／０６８６２７の２５８〜２９７頁に説明されてよい（参照により本願に組み込む）。例えば、これらは、ＷＯ０９／０６８６２７の表Ａ−５に示される特徴残基の組み合わせ１以上を含んでよく、かつ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、それぞれ、ＷＯ０９／０６８６２７の表Ａ−６、表Ａ−７、表Ａ−８及び表Ａ−９に示されるアミノ酸残基を含んでよい。また、本発明のＩＳＶがナノボディである場合には、これらはＫＥＲＥグループ（ＷＯ０９／０６８６２７の２８１〜２８４頁参照、このグループについてのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４配列のいくつかの代表物が、ＷＯ０９／０６８６２７の表Ａ−１１／Ａ−１５、Ａ−１２、Ａ−１３及びＡ−１４に示されている）、ＧＬＥＷグループ（ＷＯ０９／０６８６２７の２８５〜２８７頁参照、このグループについてのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４配列のいくつかの代表物が、ＷＯ０９／０６８６２７の表Ａ−１６／Ａ−２０、Ａ−１７、Ａ−１８及びＡ−１９に示されている）、又はＰ、Ｒ、Ｓ１０３グループ（ＷＯ０９／０６８６２７の２８７〜２９１頁参照、このグループについてのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４配列のいくつかの代表物が、ＷＯ０９／０６８６２７の表Ａ−２１／Ａ−２５、Ａ−２２、Ａ−２３及びＡ−２４に示されている）に属してよく、これらは全てＷＯ０９／０６８６２７に説明されるとおりであり、これらグループのそれぞれについてのいくつかの代表的な配列は、ＷＯ０９／０６８６２７の表Ａ１０に示されている。また、ＷＯ０９／０６８６２７に説明されるとおり、これらフレームワーク配列は、１以上の好適なヒト化置換又は（他の）置換を配列最適化のために有してよい（本願の更なる開示も参照）。
【０３５３】
やはり、いくつかの特に好ましいが、限定しないＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４配列（及びその組み合わせ）は、それぞれ表Ｂ−１に説明するものであるか、又はかかるＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４配列の好適な変形（例えば、表Ｂ−１に言及されるフレームワーク配列に比較して、かかるＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４において、５未満、例えば１、２、３、４又は５個の好適なアミノ酸相違を有する、その際、アミノ酸相違は、ＷＯ０９／０６８６２７に説明されてよい）であって、なお、実質的にナノボディの所望の特性を維持するものである。
【０３５４】
こうして、例示的にかつ本願で言及するとおり、かかるナノボディは、天然に発生するナノボディ（任意の好適な種に由来）、天然に発生するＶHH配列（すなわち、ラクダ科の好適な種に由来）、又は、合成又は半合成アミノ酸配列又はナノボディであってよく、この場合に、部分的にヒト化したナノボディ又はＶHH配列、完全にヒト化したナノボディ又はＶHH配列、ラクダ化重鎖可変ドメイン配列、また同様に、本願で言及した技術により獲得されるナノボディを含むが、これらに限定されない。
【０３５５】
こうして、特定の、限定しない一観点において、本発明は、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４、それぞれ）及び３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３、それぞれ）からなるヒト化したナノボディに関し、その際、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、本願で定義するとおりであり、かつ、前記ヒト化したナノボディは、少なくとも１のヒト化置換（本願で定義するとおり）、特に、少なくとも１のヒト化置換を少なくとも１のそのフレームワーク配列中に含む（本願で定義するとおり）。
【０３５６】
また、本願で説明するヒト化置換に加えて、本発明のＩＳＶ、特にナノボディは、１以上の他の／更なる置換を含有してよい。やはり、かかる他の／更なる置換のいくつかの好ましいが、限定しない例は、本願の更なる発明の詳細な説明から明らかになり、例えば、以下の置換の１以上を含んでよい（好ましくは、実質的にこれらからなってよい）：
（ａ）１以上の保存アミノ酸置換、及び／又は
（ｂ）１以上の置換、その際、特定の位置にある「ラクダ科」アミノ酸残基は、前記位置で生じる異なる「ラクダ科」アミノ酸残基により置換され、これに関して、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６６３６５（ＷＯ０９／０６８６２７として２００９年６月４日公開）からの表Ａ−６〜Ａ−９が参照され、前記公開物は、野生型ＶＨＨ中の各アミノ酸位置として発生する種々のラクダ科残基について言及する。かかる置換は、野生型ＶＨＨにおける特徴位置で発生する別のアミノ酸残基と共に特徴位置で発生するアミノ酸残基の好適な置換を含んでもよい（これに関しては、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６６３６５からの表Ａ−６〜Ａ−９が参照される）、及び／又は
（ｃ）前記タンパク質の（他の）特性を改善する１以上の置換、例えば、タンパク質の貯蔵下の長期間安定性及び／又は特性を改善する置換。これらは、例示的にかつ限定することなく、（例えばメチオニン残基の）酸化事象を防止又は減少させる、ピログルタミン酸形成を防止又は減少させる、及び／又は、アスパラギン酸又はアスパラギン（例えば、ＤＧ、ＤＳ、ＮＧ又はＮＳモチーフ）のイソマー化又は脱アミド化を防止又は減少させる置換であってよい。かかる置換については、例えば、国際出願ＷＯ０９／０９５２３５が参照され、これは、一般に、単一免疫グロブリン可変ドメインを、かかる置換により安定化する方法に関し、また、いくつかの特定の例の好適な置換をも説明する（例えば、４〜５頁及び１０〜１５頁を参照のこと）。かかる置換の一例は、ＮＮモチーフを用いて位置８２ａ及び８２ｂのＮＳモチーフを置換することであってよい。
【０３５７】
別の好ましいが、限定しない観点において、本発明は、ＣＤＲ配列が、配列番号１２−２６（表Ａ−１参照）のアミノ酸配列の少なくとも１のＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば、９５％以上のアミノ酸同一性、又は実質的に１００％すらのアミノ酸同一性を有するナノボディに関する。アミノ酸同一性のこの程度は、例えば、このナノボディと、配列番号１２−２６（表Ａ−１参照）の配列１以上との間でのアミノ酸同一性の程度の決定（本願で説明するとおり）により決定されることができ、その際、フレームワーク領域を形成するアミノ酸残基は無視する。かかるナノボディは、さらに本願で説明できる。
【０３５８】
別の好ましいが、限定しない観点において、本発明は、配列番号１２−２６（表Ａ−１参照）からなる群から、又は、配列番号１２−２６（表Ａ−１参照）のアミノ酸配列少なくとも１つと８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の配列同一性（本願で定義するとおり）を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するナノボディに関する。
【０３５９】
別の好ましいが、限定しない本発明の観点は、相応する天然ＶHH配列に比較して、少なくとも１のヒト化置換（本願で定義するとおり）、特に少なくとも１のヒト化置換を、そのフレームワーク配列（本願で定義するとおり）の少なくとも１に含む、配列番号１２−２６（表Ａ−１参照）のナノボディのヒト化した変形に関する。
【０３６０】
本発明のポリペプチドは、本発明のナノボディ少なくとも１を含むか又は実質的にこれらからなる。いくつかの好ましいが、限定しない本発明のポリペプチドの例は、配列番号１４７−３２７、より好ましくはＨＥＲ３ＭＳ００１３５（配列番号２８２）、ＨＥＲ３ＭＳ００２１２（配列番号３１９）又はＨＥＲ３ＭＳ００２１５（配列番号３２２）（表Ａ−２参照）に示されている。以下表に列記するいくつかの配列（配列番号２２４−２３１、２４１−２８１、３１８及び配列番号３２３−３２７）は、Ｃ末端タグ（例えば、６Ｈのヒスタグ）を含むことに留意されたい。実際には、これらポリペプチドは、（Ｃ末端）タグなしに使用されてもよく（例えば、療法目的のために好ましくは使用される）、そして、（Ｃ末端）タグは、これら配列の各々に対する配列同一性の程度の決定の目的のために無視されるべきでもある。
【０３６１】
表Ａ−２：好ましいポリペプチド又は化合物配列（本願で特定名又は配列番号Ｘ（Ｘは、関連のあるアミノ酸配列を指す数である）を有する配列とも称される）：
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【０３６２】
本願で「好ましい」（又は「より好ましい」、「よりいっそう好ましい」等）と言及されるナノボディは、本願で説明するポリペプチドにおける使用のためにも好ましい（又はより好ましい、又はよりいっそう好ましい等）ことが当業者には明らかである。こうして、１以上の本発明の「好ましい」ナノボディを含むか又は実質的にこれらからなるポリペプチドは、一般に好ましく、かつ、１以上の本発明の「より好ましい」ナノボディを含むか又は実質的にこれらからなるポリペプチドは、一般により好ましい等である。
【０３６３】
一般に、単一ナノボディ（例えば、本発明の単一ナノボディ）を含むか又は実質的にこれらからなるタンパク質又はポリペプチドは、本願では、「一価」タンパク質又はポリペプチドと、又は「一価コンストラクト」と称される。２以上のナノボディ（例えば、少なくとも２の本発明のナノボディ又は少なくとも１の本発明のナノボディ及び少なくとも１の他のナノボディ）を含むか又は実質的にこれらからなるタンパク質及びポリペプチドは、本願では、「多価」タンパク質又はポリペプチドと、又は「多価コンストラクト」と称され、かつ、これらは特定の利点を、相応する一価の本発明のナノボディに比較して提供してよい。かかる多価コンストラクトのいくつかの限定しない例は、本願の更なる説明から明らかになる。
【０３６４】
特定の、しかし限定しない一観点によれば、本発明のポリペプチドは、少なくとも２の本発明のナノボディ、例えば２又は３の本発明のナノボディを含むか又は実質的にこれらからなる。本願で説明するとおり、かかる多価コンストラクトは、特定の利点を、例えば、ＨＥＲ３に関するより改善されたアビディティを、単一の本発明のナノボディを含むか又は実質的にこれらからなるタンパク質又はポリペプチドに比較して提供することができる。かかる多価コンストラクトは、本願の開示に基づいて当業者には明らかである。
【０３６５】
いくつかの好ましいが、限定しないかかる多価ナノボディコンストラクトの例は、配列番号１４７−３２７、より好ましくはＨＥＲ３ＭＳ００１３５ （配列番号２８２）、ＨＥＲ３ＭＳ００２１２ （配列番号３１９）又はＨＥＲ３ＭＳ００２１５ （配列番号３２２）のコンストラクトである。別の特定の、しかし限定しない一観点によれば、本発明のポリペプチドは、少なくとも１の本発明のナノボディ及び少なくとも１の他の結合ユニット（すなわち、別のエピトープ、抗原、標的、タンパク質又はポリペプチドに対して指向している）を含むか又は実質的にこれらからなり、これは好ましくはナノボディでもある。かかるタンパク質又はポリペプチドは、本願で「多特異性」タンパク質又はポリペプチドと、又は「多特異性コンストラクト」とも称され、そして、これらは、相応する一価の本発明のナノボディに比較して特定の利点を提供してよい（このことは、多特異性コンストラクトの、いくつかの好ましいが、限定しない本願の更なる議論から明らかになるとおりである）。かかる多特異性コンストラクトは、本願の開示に基づき当業者に明らかである。いくつかの好ましいが、限定しないかかる多特異性ナノボディコンストラクトの例は、配列番号１４７−３２７、より好ましくはＨＥＲ３ＭＳ００１３５ （配列番号２８２）、ＨＥＲ３ＭＳ００２１２ （配列番号３１９）又はＨＥＲ３ＭＳ００２１５ （配列番号３２２）のコンストラクトである。
【０３６６】
また別の特定の、しかし限定しない一観点によれば、本発明のポリペプチドは、少なくとも１の本発明のナノボディ、任意に１以上の更なるナノボディ、及び、少なくとも１の他のアミノ酸配列（例えば、タンパク質又はポリペプチド）であって、本発明のナノボディに及び／又は生じる融合タンパク質に少なくとも１の所望の特性を付与するものを含むか又は実質的にこれらからなる。やはり、かかる融合タンパク質は、相応する一価の本発明のナノボディに比較して特定の利点を提供してよい。かかるアミノ酸配列及びかかる融合コンストラクトのいくつかの限定しない例は、本願の更なる説明から明らかになる。
【０３６７】
上述の観点の２以上を組み合わせることも可能であり、これは例えば、２の本発明のナノボディ及び１の他のナノボディ及び任意に１以上の他のアミノ酸配列を含む、三価二特異性コンストラクトを提供するためである。かかるコンストラクトの更に限定しない例、また同様に、本発明の文脈内で特に好ましいいくつかのコンストラクトは、本願の更なる説明から明らかである。
【０３６８】
上述のコンストラクトにおいて、１以上のナノボディ及び／又はアミノ酸配列は、直接的に相互に連結及び／又は好適には１以上のリンカー配列を介して相互に連結していてよい。かかるリンカーのいくつかの好ましいが、限定しない例は、本願の更なる開示から明らかになる。
【０３６９】
本発明の特定の一観点において、本発明のナノボディ又は本発明の化合物、コンストラクト又はポリペプチドであって少なくとも１の本発明のナノボディを含むものは、本発明の相応するアミノ酸配列に比較して、増加した半減期を有してよい。かかるナノボディ、化合物及びポリペプチドのいくつかの好ましいが、限定しない例は、本願の更なる開示に基づいて当業者に明らかであり、例えば、その半減期を増加させるように化学的に修飾されている（例えば、ペグ化により）本発明のナノボディ配列又はポリペプチド、少なくとも１の付加的な結合部位を血清タンパク質（例えば、血清アルブミン、例えばＥＰ０３６８６８４  Ｂ１、４頁参照）への結合のために含む本発明のアミノ酸配列、又は、本発明のナノボディの半減期を増加させる少なくとも１の部分（特に少なくとも１のアミノ酸配列）に連結している本発明のナノボディ少なくとも１を含む本発明のポリペプチドを含む。かかる半減期延長残基又はアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドの例は、本願の更なる開示に基づいて当業者には明らかであり、例えば、限定することなく、１以上の本発明のナノボディが１以上の血清タンパク質又はそのフラグメント（例えば、血清アルブミン又はその好適なフラグメント）に、又は、血清タンパク質（例えば、ナノボディ又は（単一）ドメイン抗体であって血清タンパク質、例えば血清アルブミン、血清免疫グロブリン、例えばＩｇＧに結合できるもの、又はトランスフェリン）に結合できる１以上の結合ユニットに好適に連結しているポリペプチド、本発明のナノボディがＦｃ部分（例えば、ヒトＦｃ）に連結しているポリペプチド又はその好適な部分又はフラグメント、又は、１以上の本発明のナノボディが１以上の小タンパク質又はペプチドであって血清タンパク質に結合できるものに好適に連結しているポリペプチドを含む。
【０３７０】
やはり、当業者に明らかであるとおり、かかるナノボディ、化合物、コンストラクト又はポリペプチドは、１以上の付加的な基、残基、部分又は結合ユニットを含有してよく、例えば、１以上の更なるアミノ酸配列、特に１以上の付加的なナノボディ（すなわち、ＨＥＲ３に対して指向していない）を含有してよく、これは、三特異性又は多特異性ナノボディコンストラクトを提供するためである。
【０３７１】
一般に、増加した半減期を有する本発明のナノボディ（又は、これを含む化合物、コンストラクト又はポリペプチド）は、好ましくは、相応する本発明のアミノ酸配列自体の半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍又は２０倍超より長い半減期を有する。例えば、増加した半減期を有する本発明のナノボディ、化合物、コンストラクト又はポリペプチドは、相応する本発明のアミノ酸配列自体に比較して、１時間より多く、好ましくは２時間より多く、より好ましくは６時間より多く、例えば１２時間より多く、又は２４、４８又は７２時間より多く増加している半減期を有してよい。
【０３７２】
好ましいが、限定しない本発明の一観点において、本発明のかかるナノボディ、化合物、コンストラクト又はポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、よりいっそう好ましくは少なくとも７２時間より多い、ヒトにおける血清半減期を示す。例えば、本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも５日（例えば約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば９〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば、約１０〜１５日）、又は少なくとも約１１日（例えば、約１１〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば、約１２〜１８日以上）、又は１４日より多い（例えば、約１４〜１９日）の半減期を有してよい。かかる半減期延長されたコンストラクトは、本願の開示に基づき当業者に明らかである。いくつかの好ましいが、限定しないかかる多選択性ナノボディの例は、配列番号１４７−３２７、より好ましくはＨＥＲ３ＭＳ００１３５ （配列番号２８２）、ＨＥＲ３ＭＳ００２１２ （配列番号３１９）又はＨＥＲ３ＭＳ００２１５ （配列番号３２２）のコンストラクトである。
【０３７３】
特に、１以上の本発明のナノボディを含むポリペプチドは、好ましくは次のことが該当する：
−解離定数（ＫD）：１０-5〜１０-12モル／リットル以下、好ましくは１０-7〜１０-12モル／リットル以下、より好ましくは１０-8〜１０-12モル／リットル（すなわち、会合定数（ＫA）１０5〜１０12リットル／モル以上、好ましくは１０7〜１０12リットル／モル以上、より好ましくは１０8〜１０12リットル／モル）でＨＥＲ３に結合する、
及び／又は：
−ｋon速度：１０2Ｍ-1ｓ-1〜約１０7Ｍ-1ｓ-1、好ましくは１０3Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1、より好ましくは１０4Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1、例えば１０5Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1でＨＥＲ３に結合する、
及び／又は：
−ｋoff速度：１ｓ-1（ｔ1/2＝０．６９ｓ）〜１０-6ｓ-1（複数の日のｔ1/2でもってほぼ不可逆的な複合体を提供する）、好ましくは１０-2ｓ-1〜１０-6ｓ-1、より好ましくは１０-3ｓ-1〜１０-6ｓ-1、例えば１０-4ｓ-1〜１０-6ｓ-1でＨＥＲ３に結合する。
【０３７４】
好ましくは、本発明のアミノ酸配列１つのみを含むポリペプチドは、好ましくは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば１ｎＭ未満の親和性でＨＥＲ３に結合するものである。この観点において、２以上の本発明のナノボディを含むポリペプチドが、本発明のアミノ酸配列１のみを含むポリペプチドに比較して、ＨＥＲ３に対して増加したアビディティでもって結合してよいことが当業者には明らかである。
【０３７５】
ＨＥＲ３への本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドの結合のためのいくつかの好ましいＩＣ50値は、本願の更なる発明の詳細な説明及び実施例から明らかになる。
【０３７６】
本発明のこの観点に応じた他のポリペプチドは、例えば、配列番号１４７−３２７、より好ましくはＨＥＲ３ＭＳ００１３５ （配列番号２８２）、ＨＥＲ３ＭＳ００２１２ （配列番号３１９）又はＨＥＲ３ＭＳ００２１５ （配列番号３２２）（表Ａ−２参照）の１以上のアミノ酸配列と、８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の「配列同一性」（本願で定義するとおり）を有するアミノ酸配列からなる群から選択されてよく、その際、前記アミノ酸配列内に包含されるナノボディは、好ましくは本願でさらに定義されるとおりである。
【０３７７】
本発明の別の観点は、本発明のアミノ酸配列（例えば、本発明のＩＳＶ又はナノボディ）をコードする核酸又はこれを含む本発明のポリペプチドに関する。やはり、本願で本発明の核酸について一般に説明したとおり、かかる核酸は、本願で定義するとおり、遺伝子コンストラクトの形にあってよい。
【０３７８】
本発明の好ましい一観点に応じた他の核酸は、例えば、配列番号２７−４１（図１参照）の核酸配列１以上と、８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の「配列同一性」（本願で定義するとおり）を有する核酸配列からなる群から選択されてよい。
【０３７９】
別の観点において、本発明は、本発明のアミノ酸配列（例えば、ナノボディ）及び／又はこれを含む本発明のポリペプチドを発現する又は好適な状況下で発現できる及び／又は本発明の核酸を含む宿主又は宿主細胞に関する。かかる宿主又は宿主細胞のいくつかの好ましいが、限定しない例は、本願の更なる開示から明らかになる。
【０３８０】
本発明の別の観点は、生成物又は組成物であって、すなわち、組成物の意図される用途に応じて、少なくとも１の本発明のアミノ酸配列、少なくとも１の本発明のポリペプチド及び／又は少なくとも１の本発明の核酸、及び、任意に、かかる組成物の、自体既知の更なる１以上の成分を含有するか又はこれらを含むものに関する。かかる生成物又は組成物は、例えば、医薬組成物（本願で説明するとおり）、獣医薬組成物又は診断用途のための生成物又は組成物であってよい（本願でも説明するとおり）。かかる生成物又は組成物のいくつかの好ましいが、限定しない例は、本願の更なる発明の詳細な説明から明らかになる。
【０３８１】
本発明は、さらに、本願で説明するアミノ酸配列、化合物、コンストラクト、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物の製造又は作成方法に関する。かかる方法のいくつかの好ましいが、限定しない例は、本願の更なる発明の詳細な説明から明らかになる。
【０３８２】
本発明はさらに、本願で説明する、アミノ酸配列、化合物、コンストラクト、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物の適用及び使用、また同様に、ＨＥＲ３に関連する疾病及び疾患の予防及び／又は治療のための方法、に関する。いくつかの好ましいが、限定しない適用及び使用は、本願の更なる発明の詳細な説明から明らかになる。
【０３８３】
本発明の他の観点、実施態様、利点及び適用もまた、以下の本願の更なる発明の詳細な説明から明らかになる。
【０３８４】
一般に、本願で使用する場合にナノボディとの用語は、その最も広い意味合いにおいて、特定の生物学的供給源又は特定の調製方法に限定されないことに留意すべきである。例えば、以下で詳細に議論するとおり、本発明のナノボディは、一般に、ＷＯ０８／０２００７９の６１及び６２頁に言及される技術（１）〜（８）のいずれかにより、又は自体既知の他の任意な好適な技術により得られることができる。ナノボディの１の好ましいクラスは、ＨＥＲ３に対して指向している天然に発生する重鎖抗体のＶHHドメインに相応する。本願でさらに説明するとおり、かかるＶHH配列は、一般に、ＨＥＲ３を用いてラクダ科の種を好適に免疫化すること（すなわち、免疫応答及び／又はＨＥＲ３に対して指向している重鎖抗体を惹起すべく）により、前記ラクダ科から好適な生物学的試料（例えば、血液試料、血清試料又はＢ細胞の試料）を獲得することにより、及び、前記試料から出発して、自体既知の任意な好適な技術を用いて、ＨＥＲ３に対して指向しているＶHH配列を作成することにより、作成又は取得されることができる。かかる技術は、当業者に明らかである及び／又は更に本願で説明する。
【０３８５】
代わりに、ＨＥＲ３に対するかかる天然に発生するＶHHドメインは、ラクダ科ＶHH配列の天然のライブラリーから、例えば、ＨＥＲ３を用いてかかるライブラリーをスクリーニングすることにより、又は、自体既知の１以上のスクリーニング技術を用いてその少なくとも１の部分、フラグメント、抗原決定子又はエピトープをスクリーニングすることにより、獲得されることができる。かかるライブラリー及び技術は、例えば、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ０１／９０１９０、ＷＯ０３／０２５０２０及びＷＯ０３／０３５６９４に説明されている。
【０３８６】
代わりに、天然のＶHHライブラリー由来の改善した合成又は半合成ライブラリーが使用されてよく、例えば、天然のＶHHライブラリーから、ランダム突然変異作成及び／又はＣＤＲシャッフリング（例えば、ＷＯ００／４３５０７に説明されている）といった技術により獲得されるＶHHライブラリーが使用されてよい。
【０３８７】
こうして、別の観点において、本発明は、ＨＥＲ３に対して指向しているナノボディを作成するための方法に関する。一観点において、前記方法は、少なくとも次の工程を含む：
ａ）ナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリーの提供、及び
ｂ）ＨＥＲ３に結合できる及び／又は親和性を有するナノボディ配列について、ナノボディ配列の前記セット、コレクション又はライブラリーのスクリーニング、
及び、
ｃ）ＨＥＲ３に結合できる及び／又は親和性を有する前記１又は複数のナノボディの単離。
【０３８８】
かかる方法において、ナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリーは、ナノボディ配列の天然のセット、コレクション又はライブラリー、ナノボディ配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリー、及び／又は、親和性成熟に供されているナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリーであってよい。
【０３８９】
この方法の好ましい一観点において、ナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリーは、ナノボディ配列の免疫セット、コレクション又はライブラリー、特に、ＶHH配列の免疫セット、コレクション又はライブラリーであってＨＥＲ３を用いて又はそれに基づくか若しくはそれに由来する好適な抗原決定子、例えばその抗原部分、フラグメント、領域、ドメイン、ループ又はその他のエピトープを用いて好適に免疫化されているラクダ科の種に由来するものであってよい。特定の一観点において、前記抗原決定子は、細胞外部分、領域、ドメイン、ループ又は１又は複数の他の細胞外エピトープであってよい。
【０３９０】
上述の方法においては、ナノボディ又はＶHH配列のセット、コレクション又はライブラリーは、例えばスクリーニングを容易にするために、ファージ、プラスミド、リボソーム又は好適な微生物（例えば、酵母）に表示されていてよい。（セット、コレクション又はライブラリーの）ナノボディ配列のディスプレイ化及びスクリーニングのための好適な方法、技術及び宿主生物は、例えば本願の更なる発明の詳細な説明を基礎として、当業者に明らかである。Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)におけるHoogenboomによる概要も参照される。
【０３９１】
別の観点において、ナノボディ配列の作成方法は、少なくとも次の工程を含む：
ａ）免疫グロブリン配列を発現するラクダ科の種由来の細胞のコレクション又はサンプルの提供、
ｂ）ＨＥＲ３に結合できる及び／又は親和性を有する免疫グロブリン配列を発現する細胞（ｉ）及び重鎖抗体を発現する細胞（ｉｉ）について細胞の前記コレクション又はサンプルのスクリーニング、その際、サブステップ（ｉ）及び（ｉｉ）は、ＨＥＲ３に結合できる及び／又は親和性を有する重鎖抗体を発現する少なくとも１の細胞を提供すべく、実質的に単一スクリーニング工程として、又は、２つの別個のスクリーニング工程として任意の好適な順番で、実施されてよい、
及び
ｃ）（ｉ）前記細胞から前記重鎖抗体中に存在するＶHH配列の単離、又は、（ｉｉ）前記細胞から前記重鎖抗体中に存在するＶHH配列をコードする核酸配列の単離、その後、前記ＶHHドメインの発現。
【０３９２】
この観点に応じた本方法において、細胞のコレクション又はサンプルは、例えば、Ｂ細胞のコレクション又はサンプルであってよい。また、この方法において、細胞のサンプルは、ＨＥＲ３を用いて又はそれに基づくか若しくはそれに由来する好適な抗原決定子、例えばその抗原部分、フラグメント、領域、ドメイン、ループ又はその他のエピトープを用いて好適に免疫化されているラクダ科に由来してよい。特定の一観点において、前記抗原決定子は、細胞外部分、領域、ドメイン、ループ又は他の１又は複数の細胞外エピトープであってよい。
【０３９３】
上述の方法は、当業者に明らかになるとおり、任意の好適な方式において実施されてよい。例えば、ＥＰ０５４２８１０、ＷＯ０５／１９８２４、ＷＯ０４／０５１２６８及びＷＯ０４／１０６３７７が参照される。工程ｂ）のスクリーニングは好ましくはＦＡＣＳのようなフローサイトメトリー技術を用いて実施される。これに関して、例えば、Lieby et al., Blood, Vol. 97, No. 12, 3820が参照される。特に、Ablynx N.V.による国際出願ＷＯ０６／０７９３７２に説明されるいわゆる「Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ(R)」技術が参照される。
【０３９４】
別の観点において、ＨＥＲ３に対して指向しているアミノ酸配列の作成方法は、少なくとも次の工程を含んでよい：
ａ）重鎖抗体又はナノボディ配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリーの提供、
ｂ）ＨＥＲ３に結合できる及び／又は親和性を有する重鎖抗体又はナノボディ配列をコードする核酸配列について、核酸配列の前記セット、コレクション又はライブラリーのスクリーニング、
及び
ｃ）前記核酸配列の単離、その後、それぞれ前記重鎖抗体中に存在するＶHH配列の発現又は前記ナノボディ配列の発現。
【０３９５】
かかる方法において、重鎖抗体又はナノボディ配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリーは、例えば、重鎖抗体又はＶHH配列の天然のセット、コレクション又はライブラリーをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリー、ナノボディ配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリーをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリー、及び／又は、親和性成熟に供されているナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリーをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリーであってよい。
【０３９６】
この方法の好ましい一観点において、核酸配列のセット、コレクション又はライブラリーは、核酸配列の免疫セット、コレクション又はライブラリーであって、ＨＥＲ３を用いて又はそれに基づくか若しくはそれに由来する好適な抗原決定子、例えばその抗原部分、フラグメント、領域、ドメイン、ループ又はその他のエピトープを用いて好適に免疫化されているラクダ科に由来する重鎖抗体又はＶHH配列をコードするものであってよい。特定の一観点において、前記抗原決定子は、細胞外部分、領域、ドメイン、ループ又は他の１又は複数の細胞外エピトープであってよい。
【０３９７】
ヌクレオチド配列の上述の方法、セット、コレクション又はライブラリーにおいては、例えばスクリーニングを容易にするために、ファージ、ファージミド、リボソーム又は好適な微生物（例えば、酵母）に表示されていてよい。アミノ酸配列をコードする（セット、コレクション又はライブラリーの）ヌクレオチド配列のディスプレイ化及びスクリーニングのための好適な方法、技術及び宿主生物は、例えば、本願の更なる開示を基礎として、当業者に明らかである。Ｗ００３０５４０１６及びNature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)におけるHoogenboomによる概要も参照される。
【０３９８】
当業者に明らかなとおり、本願で説明する方法のスクリーニング工程は、選択工程としても実施できる。したがって、本願明細書で使用される「スクリーニング」との用語は、選択、スクリーニング、又は、選択及び／又はスクリーニング技術の任意の好適な組み合わせを含むこともできる。また、配列のセット、コレクション又はライブラリーが使用される場合には、これは、任意の好適な数の配列、例えば、１、２、３又は約５、１０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8個又はそれより多い配列を含んでよい。
【０３９９】
また、アミノ酸配列の上述のセット、コレクション又はライブラリー中の１又は複数又は全ての配列は、合理的な、又は半経験的なアプローチ、例えば、コンピューターモデリング技術又は生物静力学又はデータマイニング技術により獲得又は定義されてよい。
【０４００】
さらに、かかるセット、コレクション又はライブラリーは、互いに変形である１、２又はそれより多い配列（例えば、設計された点突然変異又はランダム化された位置を有する）、天然多様化配列の多様なセットに由来する妥協複数配列（compromise multiple sequence）（例えば、免疫ライブラリー）、又は、多様配列の任意の他の供給源（例えば、Hoogenboom et al, Nat Biotechnol 23:1105, 2005及びBinz et al, Nat Biotechnol 2005, 23:1247に説明されるとおり）を含むことができる。かかる配列のセット、コレクション又はライブラリーは、ファージ粒子、リボソーム、細菌、酵母細胞、哺乳類細胞の表面にディスプレイされることができ、かつ、それら担体内でアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に連結していることができる。これによって、かかるセット、コレクション又はライブラリーは、本発明の所望のアミノ酸配列を単離するために、選択手順に適用させることができる。より一般には、配列が、好適な宿主又は宿主細胞上にディスプレイされる場合には、まず、前記宿主又は宿主細胞から所望の配列をコードするヌクレオチド配列を単離し、次に、好適な宿主生物中に前記ヌクレオチド配列を好適に発現させることによって所望の配列を獲得することも可能に（かつ慣用的に）なる。やはり、このことは、当業者に明らかであるとおり、任意の好適な自体既知の方式で実施できる。
【０４０１】
本発明は、上述の方法により、又は代わりに、上述の方法の１及び更に少なくとも、前記ＶHH配列又はナノボディ配列のヌクレオチド配列又又はアミノ酸配列の決定工程、及び、自体既知の方式における、例えば、好適な宿主細胞又は宿主生物における発現により又は化学的合成により、前記ＶHH配列又はナノボディ配列の発現又は合成工程を含む方法により得られるＶHH配列又はナノボディ配列にも関する。
【０４０２】
本願で言及するとおり、本発明のナノボディの特定の好ましいクラスは、天然に発生するＶHHドメインのアミノ酸配列に相応するが、例えば「ヒト化」されているか又はさもなければ、より良好な製造収率又はより良好な安定性の観点において配列最適化されているアミノ酸配列を有するナノボディを含み、すなわち、これは、さらに説明するとおり、前記天然に発生するＶHH配列のアミノ酸配列中の（特に、フレームワーク配列中の）１以上のアミノ酸残基を、ヒト由来の慣用の四鎖抗体（上で示すとおり）からのＶHドメイン中の（複数の）相応する位置で発生する１以上のアミノ酸残基で置き換えること及びＷＯ０８／０２００７９の６３頁に言及される技術を用いることによるものである。本発明のナノボディの別の特に好ましいクラスは、天然に発生するＶHドメインのアミノ酸配列に相応するが、「ラクダ化」されているアミノ酸配列を有するナノボディを含み、すなわち、これは、さらに説明するとおり、慣用の四鎖抗体からの天然に発生するＶHドメインのアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶHHドメイン中の（複数の）相応する個位置で発生する１以上のアミノ酸残基で置き換えること及びＷＯ０８／０２００７９の６３頁に言及される技術を用いることによるものである。
【０４０３】
本発明のナノボディ及び／又はこれをコードする核酸を獲得するための他の好適な方法及び技術は、天然に発生するＶH配列又は好ましくはＶHH配列から出発して、当業者には明らかであり、かつ、例えば、ＷＯ０８／００２７９の６４頁に言及される技術を含む。本願で説明するとおり、ナノボディは、特に、１以上のフレームワーク配列中の１以上の「特徴残基」（本願で説明する）の存在により特徴付けられてよい。
【０４０４】
本発明は、その最も広い意味合いにおいて、本発明のナノボディの誘導体をも包含する。かかる誘導体は、一般に、本発明のナノボディ及び／又は本発明のナノボディを形成する１以上のアミノ酸残基の改変により、特に化学的及び／又は生物学的（例えば、酵素による）改変により獲得できる。
【０４０５】
かかる改変の例、また同様に、（すなわち、タンパク質骨格上の、しかし好ましくは側鎖上の）かかる方式において改変できるナノボディ配列内のアミノ酸残基、かかる改変を導入することができる方法及び技術の例及びかかる改変の可能性のある使用及び利点は、当業者には明らかである。
【０４０６】
例えば、かかる改変は、１以上の官能基、残基又は部分の、特に、本発明のナノボディに１以上の所望の特性又は官能性を付与する１以上の官能基、残基又は部分の本発明のナノボディ中への又は本発明のナノボディ上への、導入（例えば、共有結合又は他の好適な方式において）を伴ってよい。かかる官能基の例は、当業者に明らかである。
【０４０７】
例えば、かかる改変は、１以上の官能基であって本発明のナノボディの半減期、溶解性及び／又は吸収を増加させる、本発明のナノボディの免疫原性及び／又は毒性を減少させる、本発明のナノボディの任意の不所望の副作用を消失又は減弱する、及び／又は、本発明のナノボディ及び／又はポリペプチドに他の有利な特性を付与及び／又は本発明のナノボディ及び／又はポリペプチドの不所望な特性を減少するもの、又は、前述のものの２以上の任意の組み合わせの導入（例えば、共有結合により又は任意の他の好適な方式において）を伴ってよい。
【０４０８】
かかる官能基及びこれらを導入するための技術の例は、当業者に明らかであり、かつ、一般に、本願で上で引用される一般的な背景技術で言及される全ての官能基及び技術、また同様に、医薬タンパク質の改変、特に、抗体又は抗体フラグメント（ＳｃＦｖ及び単一ドメイン抗体含む）の改変のために自体既知である官能基及び技術、を含んでよく、これに関しては、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)が参照される。かかる官能基は、例えば、本発明のナノボディへと直接的に（例えば共有により）、又は、任意に、好適なリンカー又はスペーサーを介して連結されてよく、このことはやはり当業者に明らかである。
【０４０９】
半減期増加及び／又は医薬タンパク質の免疫原性減少のための最も広く使用されている技術の１つは、好適な薬理学的に許容可能なポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体（例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）又はｍＰＥＧ）の取付を含む。一般に、ペグ化の任意の好適な形、例えば、抗体及び抗体フラグメントの技術において使用されるペグ化が使用できる（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖを含むが、これに限定されない）；例えば、Chapman, Nat. BiotechnoL, 54, 531-545 (2002);Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003)及びＷＯ  ０４／０６０９６５が参照される。タンパク質のペグ化のための種々の試薬は市販でも入手でき、例えば、Nektar Therapeutics, USAから入手できる。
【０４１０】
好ましくは、部位指向したペグ化が使用され、特にこれは、システイン残基を介する（例えば、Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003)を参照）。例えば、この目的のために、ＰＥＧは、本発明のナノボディ中で天然に発生するシステイン残基に取り付けられていてよく、本発明のナノボディは、１以上のシステイン残基をＰＥＧの取付のために好適に導入すべく改変されていてよく、又は、ＰＥＧ取付のための１以上のシステイン残基を含むアミノ酸は、本発明のナノボディのＮ及び／又はＣ末端に融合していてよく、これら全ては、当業者に自体既知であるタンパク質工学の技術を使用する。
【０４１１】
好ましくは、本発明のナノボディ及びタンパク質に関しては、分子量５０００超、例えば１００００超、そして２０００００未満、例えば１０００００未満を有するＰＥＧが使用される。例えば２００００〜８００００の範囲にある。
【０４１２】
別の、通常はあまり好ましくない改変は、通常は同時翻訳及び／又は後翻訳改変の一部として、Ｎ連結又はＯ連結グリコシル化を含み、これは、本発明のナノボディ又はポリペプチドを発現するために使用される宿主細胞に依存する。
【０４１３】
また別の改変は、ラベル化ナノボディの意図される使用に依存して、１以上の検出可能なラベル又は他のシグナル生成基又は部分の導入を含んでよい。この取付、使用及び検出のための好適なラベル及び技術は、当業者に明らかであり、例えば、蛍光ラベル、りん光ラベル、化学発光ラベル、生物発光ラベル、ラジオアイソトープ、金属、金属キレート、金属性カチオン、クロモフォア及び酵素（例えば、ＷＯ０８／０２００７９の１０９頁に言及するもの）を含むが、これらに限定されない。他の好適なラベルは、当業者に明らかであり、例えば、ＮＭＲ又はＥＳＲ分光法を用いて検出できる部分を含む。
【０４１４】
本発明のかかるラベル化ナノボディ及びポリペプチドは、特異的ラベルの選択に依存して、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｓｉｔｕアッセイ（自体既知の免疫アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ及び他の「サンドウィッチアッセイ」その他を含む）、また同様にｉｎ  ｖｉｖｏ診断及びイメージング目的のために使用されてよい。
【０４１５】
当業者に明らかであるとおり、別の改変は、例えば、上で参照されるような金属又は金属性カチオンの１をキレートすべく、キレート基の導入を伴ってよい。好適なキレート基は、例えば、限定することなく、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。
【０４１６】
また別の改変は、特異的結合対の１つの対、例えばビオチン−ストレプト（アビジン）結合対である官能基の導入を含んでよい。かかる官能基は、本発明のナノボディを別のタンパク質、ポリペプチド又は化学化合物であってこの結合対の他の半分に結合しているものに連結するために、すなわち、結合対の形成を介して連結するために、使用されてよい。例えば、本発明のナノボディは、ビオチンにコンジュゲートされていてよく、かつ、他のタンパク質、ポリペプチド、化合物又はキャリアであってアビジン又はストレプトアビジンにコンジュゲートしたものに連結していてよい。例えば、かかるコンジュゲートしたナノボディは、リポーターとして使用されてよく、例えば、検出可能なシグナル生成剤が、アビジン又はストレプトアビジンにコンジュゲートしている診断システムにおいて使用されてよい。かかる結合対は、例えば、医薬目的に好適なキャリアを含むキャリアへの本発明のナノボディの結合のために使用されてもよい。限定しない一例は、Cao and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000)により説明されるリポソーム処方物である。かかる結合対は、本発明のナノボディへと治療学的に活性のある剤を連結させるべく使用されてもよい。
【０４１７】
いくつかの適用のために、特に、本発明のナノボディが指向する標的を発現する細胞を死滅する（例えば、癌治療において）こと、又は、かかる細胞の成長及び／又は増殖の減少又は減速が意図されている適用のために、本発明のナノボディは、毒素に対して又は毒性のある残基又は部分に対して連結されていてもよい。
【０４１８】
−例えば−細胞毒性のある化合物を提供すべく、本発明のナノボディへと連結されることができる毒性部分、化合物又は残基の例は、当業者に明らかであり、かつ、例えば、上で引用した先行技術において及び／又は本願の更なる詳細な説明において見出すことができる。１つの例は、ＷＯ０３／０５５５２７に説明されているいわゆるＡＤＥＰＴ(TM)  技術である。
【０４１９】
他の可能性のある化学的及び酵素的改変は、当業者に明らかである。かかる改変は、研究目的のために導入されてもよい（例えば、機能−活性関係を研究するために）。例えば、Lundblad and Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997)が参照される。
【０４２０】
好ましくは、誘導体は、ＨＥＲ３に本願で本発明のナノボディに関して定義する親和性（ＫD値（実際の又は見掛けの）、ＫA値（実際の又は見掛けの）、ｋon速度及び／又はｋoff速度、又は代わりにＩＣ50値として好適に測定及び／又は表現、本願でさらに説明するとおり）で結合するように選択される。
【０４２１】
本願で説明するとおり、本発明は、本発明のナノボディ少なくとも１を含むか又は実質的にこれらからなるタンパク質又はポリペプチドにも関する。「実質的に・・・からなる」とは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が、本発明のナノボディのアミノ酸配列と正確に同じであるか、又は、限定された数のアミノ酸残基、例えば、１〜２０個のアミノ酸残基、例えば１〜１０個のアミノ酸残基、好ましくは１〜６個のアミノ酸残基、例えば、１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸残基を、ナノボディのアミノ酸配列のアミノ末端に、カルボキシ末端に、又はアミノ末端及びカルボキシ末端の両末端に付加して有する、本発明のナノボディのアミノ酸配列に相応するか、のいずれかを意味する。
【０４２２】
前記アミノ酸残基は、ナノボディの（生物学的）を変化、変更又はさもなければ影響を及ぼすか、そのようにしなくてよく、かつ、ナノボディの更なる機能性を付加するか又は付加しなくてよい。例えば、かかるアミノ酸残基は次のことが該当する：
−Ｎ末端にＭｅｔ残基を、例えば異種宿主細胞又は宿主生物中への発現の結果として含んでよい、
−合成の際の宿主細胞からのナノボディの分泌を指向させるシグナル配列又はリーダー配列を形成してよい。好適な分泌リーダーペプチドは、当業者に明らかであり、かつ、本願でさらに説明するとおりである。通常、かかるリーダー配列は、ナノボディのＮ末端に連結されるが、本発明はその最も広い意味合いにおいてそれに限定されない、
−ナノボディが、特異的な器官、組織、細胞、又は部分又は細胞コンパートメントに対して指向する及び／又は侵透するか又は侵入することを可能にする、及び／又はナノボディが、生物学的バリヤー、例えば細胞膜、細胞層、例えば、上皮細胞層、腫瘍（固形腫瘍含む）又は脳血液関門に侵入するか又は横切ることを可能にする、配列又はシグナルを形成してよい。かかるアミノ酸配列の例は、当業者に明らかであり、かつ、ＷＯ０８／０２００７９の１１２頁のパラグラフｃ）に言及されているものを含む、
−「タグ」、例えば、ナノボディの精製を可能又は容易化するアミノ酸配列又は残基を、例えば、前記配列又は残基に対して指向している親和性技術を用いて、形成してよい。その後、前記配列又は残基は、ナノボディ配列を提供すべく、（例えば、化学的又は酵素的開裂により）除去されてよい（この目的には、タグは、任意に、開裂可能なリンカー配列を介してナノボディ配列に連結しているか又は開裂可能なモチーフを有していてよい）。かかる残基のいくつかの好ましいが、限定しない例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基及びｍｙｃタグである（例えば、ＷＯ０６／１２２８２の配列番号３１を参照のこと）、
−官能化している及び／又は官能基の取付のための部位として機能できる１以上のアミノ酸残基であってよい。好適なアミノ酸残基及び官能基は、当業者に明らかであり、かつ、本発明のナノボディの誘導体について本願で言及されたアミノ酸残基及び官能基を含むが、これらに限定されない。
【０４２３】
別の観点によれば、本発明のポリペプチドは、本発明のナノボディを含み、これは、少なくとも１の更なるアミノ酸配列へとそのアミノ末端に、そのカルボキシ末端に、又はそのアミノ末端及びそのカルボキシ末端の両者に融合しており、すなわち、本発明のナノボディ及び１以上の更なるアミノ酸配列を含む融合タンパク質を提供するためである。かかる融合は、本願では「ナノボディ融合」とも称される。
【０４２４】
１以上の更なるアミノ酸配列は、任意の好適な及び／又は所望のアミノ酸配列であってよい。更なるアミノ酸配列は、ナノボディの（生物学的）を変化、変更、又はさもなければ影響を及ぼすか又はそのようにしなくてよく、かつ、本発明のポリペプチド又はナノボディに更なる官能性を付加するか又は付加しなくてよい。好ましくは、この更なるアミノ酸配列は、１以上の所望の特性又は官能性を、本発明のナノボディ又はポリペプチドに付与するものである。
【０４２５】
例えば、更なるアミノ酸配列は、第２の結合部位を提供してもよく、この結合部位は、任意の所望のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定子又はエピトープ（本発明のナノボディが指向している同じタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定子又はエピトープ、又は、異なるタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定子又はエピトープを含むが、これに限定されない）に対して指向していてよい。
【０４２６】
かかるアミノ酸配列の例は当業者に明らかであり、かつ、一般に、慣用の抗体及びそのフラグメントを基礎とするペプチド融合において使用される全てのアミノ酸配列を含んでよい（ＳｃＦｖ及び単一ドメイン抗体を含むが、これに限定されない）。例えば、Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005)におけるHolliger and Hudsonによる概要も参照される。
【０４２７】
例えば、かかるアミノ酸配列は、本発明のナノボディ自体に比較して、本発明のポリペプチドの半減期、溶解性又は吸収を増加させる、免疫原性又は毒性を減少させる、不所望の副作用を消失又は減弱する、及び／又は、他の有利な特性を付与及び／又は不所望な特性を減少する、アミノ酸配列であってよい。かかるアミノ酸配列のいくつかの限定しない例は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（例えば、ＷＯ００／２７４３５）又はハプテン分子（例えば、循環する抗体により認識されるハプテン、例えばＷＯ９８／２２１４１を参照のこと）である。
【０４２８】
特に、この分野においては、血清アルブミン又はそのフラグメントへの免疫グロブリン（例えば、ＶHドメイン）のフラグメントの連結は、半減期を増加させるために使用できると説明されている。ＷＯ００／２７４３５及びＷＯ００／０７７１３７が参照される。本発明によれば、本発明のナノボディは、好ましくは、直接的に又は好適なリンカーを介して、特に好適なペプチドであって本発明のポリペプチドが遺伝子融合（タンパク質）として発現できるように連結している好適なペプチドを介して、血清アルブミン（又はその好適なフラグメント）に連結している。特定の一観点によれば、本発明のナノボディは、血清アルブミン又はその部分のドメインＩＩＩを少なくとも含む血清アルブミンのフラグメントに連結していてよい。例えば、Ablynx N.V.のＷＯ０７／１１２９４０が参照される。
【０４２９】
代わりに、更なるアミノ酸配列は、血清中の増加した半減期を提供すべく、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン又は別の血清タンパク質、例えばＩｇＧ）に対して指向している第２の結合部位又は結合ユニットを提供してよい。かかるアミノ酸配列は、例えば、以下に説明するナノボディ、また同様に、ＷＯ９１／０１７４３、ＷＯ０１／４５７４６及びＷＯ０２／０７６４８９に説明する小ペプチド及び結合タンパク質及びＷＯ０３／００２６０９及びＷＯ０４／００３０１９に説明するｄＡｂを含む。Harmsen et al., Vaccine, 23 (41); 4926-42, 2005も、また同様に、ＥＰ０３６８６８４も、また同様に、ＷＯ０８／０２８９７７、ＷＯ０８／０４３８２１、ＷＯ０８／０４３８２２、ＷＯ２００８／０６８２８０及びＷＯ２００９／１２７６９１も参照される。
【０４３０】
かかるアミノ酸配列は、特に、血清アルブミン（特にヒト血清アルブミン）及び／又はＩｇＧ（特にヒトＩｇＧ）に対して指向していてよい。例えば、かかるアミノ酸配列は、次のアミノ酸配列であってよい：（ヒト）血清アルブミンに対して指向しているアミノ酸配列及びＦｃＲｎへの血清アルブミンの結合に関与しない（ヒト）血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合できるアミノ酸配列（例えば、ＷＯ０６／０１２２７８７を参照のこと）、及び／又は、血清アルブミンのドメインＩＩＩの部分を形成しない血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合できるアミノ酸配列（例えば、やはりＷＯ０６／０１２２７８７を参照のこと）；増加した半減期を有するか又は提供できるアミノ酸配列（例えば、Ablynx N.V.によるＷＯ０８／０２８９７７を参照のこと）；少なくとも１の種の哺乳類由来の血清アルブミンと、特に少なくとも１の種の霊長類（例えば、限定することなく、マカカ属からのサル（例えば、特に、カニクイザル（Macaca fascicularis））及び／又はアカゲザル（Macaca mulatto)）及びバブーン（Papio ursinus））と交差反応性であるヒト血清アルブミンに対するアミノ酸配列、再度ＷＯ０８／０２８９７７を参照する；ｐＨ非依存性の方式で血清アルブミンに結合できるアミノ酸配列（例えば、Ablynx N.V.による"Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH, compounds comprising the same, and uses thereof"と題されたWO 08/043821を参照のこと）及び／又は条件付き結合剤（conditional binder）であるアミノ酸配列（例えば、Ablynx N.V.による"Amino acid sequences that bind to a desired molecule in a conditional manner"と題されたＷＯ０８／０４３８２２を参照のこと）。
【０４３１】
別の観点によれば、１以上の更なるアミノ酸配列は、慣用の四鎖抗体（特にヒト抗体）及び／又は重鎖抗体の１以上の部分、フラグメント又はドメインを含んでよい。例えば、通常あまり好まれないが、本発明のナノボディは、慣用の（好ましくはヒトの）ＶH又はＶLドメインに、又は、ＶH又はＶLドメインの天然又は合成のアナログに、やはり任意にリンカー配列（他の（単一）ドメイン抗体を含むが、これに限定されない、例えば、Ward et al.（既述）により説明されるｄＡｂ）を介して連結されていてよい。
【０４３２】
この少なくとも１のナノボディは、任意にリンカー配列を介して、１以上の（好ましくはヒトの）ＣH１、ＣH２及び／又はＣH３ドメインに連結されていてもよい。例えば、好適なＣH１ドメインに連結したナノボディは、例えば、−好適な軽鎖と一緒に−慣用のＦａｂフラグメント又はＦ（ａｂ′）2フラグメントに類似する抗体フラグメント／構造を作成すべく、使用されてよいが、その場合に、１の又は（Ｆ（ａｂ′）2フラグメントの場合には）１又は両者の慣用のＶHドメインは、本発明のナノボディにより置換されている。また、２つのナノボディは、ｉｎ  ｖｉｖｏで増加した半減期を有するコンストラクトを提供すべく、ＣH３ドメインに（任意にリンカーを介して）結合してよい。
【０４３３】
本発明のポリペプチドの特定の一観点によれば、１以上の本発明のナノボディは、（任意には、好適なリンカー又はヒンジ領域を介して）１以上の定常ドメイン（例えば、Ｆｃ部の部分として又はＦｃ部を形成するために使用できる２又は３の定常ドメイン）に、Ｆｃ部に及び／又は１以上の抗体部、フラグメント又はドメインであって本発明のポリペプチドに対する１以上のエフェクター機能を付与する及び／又は１以上のＦｃレセプターに結合する能力を付与してよいものに、連結されてよい。例えば、この目的のために、そして、それに限定されることなく、１以上の更なるアミノ酸配列は、抗体の、例えば重鎖抗体（本願で説明する）由来の、そしてより好ましくは慣用のヒト四鎖抗体由来の、１以上のＣH２及び／又はＣH３ドメインを含んでよい、及び／又は、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）由来の、ＩｇＥ由来の、又は、別のヒトのＩｇ由来の、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＭ由来の、Ｆｃ領域（の部分）を形成してよい。例えば、ＷＯ９４／０４６７８は、ラクダ科ＶHHドメイン又はそのヒト化誘導体（すなわち、ナノボディ）を含む重鎖抗体を説明し、その際、ラクダ科ＣH２及び／又はＣH３ドメインは、ナノボディ及びヒトＣH２及びＣH３ドメイン（しかし、ＣH１ドメインでない）をそれぞれ含む２つの重鎖からなる免疫グロブリンを提供するために、ヒトＣH２及び／又はＣH３ドメインにより置き換えられており、この免疫グロブリンは、ＣH２及び／又はＣH３ドメインにより提供されたエフェクター機能を有し、かつ、免疫グロブリンはいかなる軽鎖の存在もなく機能できる。エフェクター機能を提供すべく、本発明のナノボディに好適に連結できる他のアミノ酸配列は、当業者に明らかであり、かつ、（複数の）所望のエフェクター機能を基礎として選択されてよい。例えばＷＯ０４／０５８８２０、ＷＯ９９／４２０７７、ＷＯ０２／０５６９１０及びＷＯ０５／０１７１４８が、また同様に、Holliger and Hudson（既述）による概要、そして、"Constructs comprising single variable domains and an Fc portion derived from IgE"と題された前に公開されていないAblynx N.V.のUS仮出願（出願日２００７年１２月４日）が参照される。Ｆｃ部への本発明のナノボディのカップリングはまた、相応する本発明のナノボディに比較して、増加した半減期を生じてもよい。いくつかの適用に関しては、任意の生物学的に顕著なエフェクター機能なしに増加した半半減期を付与するＦｃ部及び／又は定常ドメイン（すなわち、ＣH２及び／又はＣH３ドメイン）の使用は、好適であってもよく又はより好ましいこともある。増加した半減期をｉｎ  ｖｉｖｏで有する、１以上のナノボディ及び１以上の定常ドメインを含む他の好適なコンストラクトは、当業者に明らかであり、かつ、例えば、任意にリンカー配列を介して、ＣH３ドメインに連結している２つのナノボディを含んでよい。一般に、増加した半減期を有する任意の融合タンパク質又は誘導体は、好ましくは、５０ｋＤ超の分子量（腎吸収のためのカットオフ値）を有する。
【０４３４】
別の特定の、しかし限定しない一観点において、本発明のポリペプチドを形成すべく、１以上の本発明のアミノ酸配列は、天然に発生する、合成又は半合成の定常ドメイン（又は、そのアナログ、変異体、突然変異体、部分又はフラグメント）であって二量体へと自己会合する傾向が（すなわち、慣用の四鎖抗体中で天然に発生する定常ドメインに比較して）減少した（又は実質的にない）ものへと（任意に、好適なリンカー又はヒンジ領域を介して）連結されていてよい。かかるモノマー状（すなわち、自己会合しない）Ｆｃ鎖変異体又はそのフラグメントは、当業者に明らかである。例えば、Helm et al., J Biol Chem 1996 271 7494,は、本発明のポリペプチド鎖において使用できるモノマー状Ｆｃε鎖変異体を説明する。
【０４３５】
また、かかるモノマー状Ｆｃ鎖変異体は、好ましくは、相補する又は関連する（複数の）Ｆｃレセプターになお結合することができるもの（これらの由来するＦｃ部に依存して）、及び／又は、これらが由来するＦｃ部のいくつか又は全てのエフェクター機能をなお有する（又は減少したレベルで意図される使用になお好適である）ものである。代わりに、本発明のかかるポリペプチド鎖において、モノマー状Ｆｃ鎖は、ポリペプチド鎖へと増加した半減期を付与するために使用されてよく、その場合に、モノマー状Ｆｃ鎖は、エフェクター機能も有しないか又は実質的に有しない。
【０４３６】
本発明の二価／多価、二選択的／多選択的又はビパラトープ性／マルチパラトープ性の本発明のポリペプチドは、"immunoglobulin constructs"と題された前に公開されていないUS仮出願ＵＳ  ６１／００５，３３１（出願日２００７年１２月４日）において説明される種類のポリペプチドコンストラクトを提供すべく、Ｆｃ部へと連結されてもよい。
【０４３７】
更なるアミノ酸配列は、シグナル配列又はリーダー配列であって合成の際に宿主細胞からの本発明のナノボディ又はポリペプチドの分泌を指向させるものを形成してもよい（例えば、本発明のポリペプチドを発現するために使用される宿主細胞に依存して、本発明のポリペプチドのプレ−、プロ−又はプレプロフォームを提供するため）。
【０４３８】
更なるアミノ酸配列は、本発明のナノボディ又はポリペプチドが、特異的な器官、組織、細胞又は部分又は細胞コンパートメントに対して指向する及び／又は侵透するか又は侵入することを可能にする、及び／又は、本発明のナノボディ又はポリペプチドが、生物学的バリヤー、例えば細胞膜、細胞層、例えば、上皮細胞層、腫瘍（固形腫瘍含む）又は脳血液関門に侵入するか又は横切ることを可能にする、配列又はシグナルを形成してもよい。かかるアミノ酸配列の好適な例は、当業者に明らかであり、かつ、例えば、ＷＯ０８／０２００７９の１１８頁に言及されるものを含むが、これらに限定されない。いくつかの適用のために、特に、本発明のナノボディが指向する標的を発現する細胞を死滅する（例えば、癌治療において）こと、又は、かかる細胞の成長及び／又は増殖の減少又は減速が意図されている適用のために、本発明のナノボディは、（細胞）毒性タンパク質又はポリペプチドに連結されていてもよい。−例えば−本発明の細胞毒性のあるポリペプチドを提供すべく、本発明のナノボディへと連結されることができるかかる毒性タンパク質又はポリペプチドの例は、当業者に明らかであり、かつ、例えば、上で引用した先行技術において及び／又は本願の更なる詳細な説明において見出すことができる。１つの例は、ＷＯ０３／０５５５２７に説明されているいわゆるＡＤＥＰＴTM  技術である。
【０４３９】
好ましいが、限定しない一観点によれば、前記の１以上の更なるアミノ酸配列は、少なくとも２、例えば３、４、５又はそれより多いナノボディを含む本発明のポリペプチドを提供すべく、少なくとも１の更なるナノボディを含み、その際、前記ナノボディは、１以上のリンカー配列を介して任意に連結されてよい（本願で定義するとおり）。ＷＯ０８／０２００７９の１１９及び１２０頁に説明されるとおり、２以上のナノボディを含み、そのうち少なくとも１つが本発明のナノボディである本発明のポリペプチドは、本願では本発明の「多価」ポリペプチドとも称され、かかるポリペプチドにおいて存在するナノボディは本願では「多価フォーマット」にあるとも称される。例えば、本発明の「二価」及び「多価」ポリペプチドは、さらにＷＯ０８／０２００７９の１１９及び１２０頁に説明されてよい。
【０４４０】
少なくとも２のナノボディを含み、その際、少なくとも１のナノボディが第１抗原に対して（すなわち、ＨＥＲ３に対して）、そして、少なくとも１のナノボディが第２抗原（すなわち、ＨＥＲ３と異なるもの）に対して指向している本発明のポリペプチドは、本発明の「多特異性」ポリペプチドとも称され、かかるポリペプチド中に存在するナノボディは、本願で「多特異性フォーマット」とも称される。こうして、例えば、本発明の「二特異性」ポリペプチドは、第１抗原（すなわち、ＨＥＲ３）に対して指向している少なくとも１のナノボディ及び第２抗原（すなわち、ＨＥＲ３とは異なる）に対して指向している少なくとも１の更なるナノボディを含むポリペプチドであり、一方で、本発明の「三特異性」ポリペプチドは、第１抗原（すなわち、ＨＥＲ３）に対して指向している少なくとも１のナノボディ、第２抗原（すなわち、ＨＥＲ３とは異なる）に対して指向している少なくとも１の更なるナノボディ、及び、第３抗原（すなわち、ＨＥＲ３とも、第２抗原とも異なる）に対して指向している少なくとも１の更なるナノボディを含むポリペプチド等である。
【０４４１】
相応して、その最も簡易な形では、本発明の二特異性ポリペプチドは、本発明の二価ポリペプチド（本願で定義する）であり、これは、ＨＥＲ３に対して指向している第１ナノボディ、第２抗原に対して指向している第２ナノボディを含み、その際、前記の第１及び第２ナノボディは、任意に、リンカー配列を介して連結されていてよい（本願で定義する）。その一方で、
その最も簡易な形では、本発明の三特異性ポリペプチドは、本発明の三価ポリペプチド（本願で定義する）であり、これは、ＨＥＲ３に対して指向している第１ナノボディ、第２抗原に対して指向している第２ナノボディ及び第３抗原に対して指向している第３ナノボディを含み、その際、前記の第１、第２及び第３ナノボディは、任意に、１以上の、特に１以上の、とりわけ２のリンカー配列を介して連結されていてよい。
【０４４２】
しかし、本願の上の説明から明らかであるとおり、本発明は限定されることなく、ある意味、本発明の多特異性ポリペプチドは、ＨＥＲ３に対する少なくとも１のナノボディ、及び、任意の数のナノボディであってＨＥＲ３とは異なる１以上の抗原に対して指向しているものを含んでよい
。
【０４４３】
さらに、本発明のポリペプチド中の種々のナノボディの特異的順序又は配置が本発明の最終ポリペプチドの特性（ＨＥＲ３についての、又は、１以上の他の抗原に対する親和性、特異性又はアビディティを含むが、これに限定されない）に対していくばくかの影響を有してよいことが本発明の範囲内に包含されるものの、前記順序又は配置は、通常は重要でなく、かつ、好適には、任意に、本願の開示に基づくいくつかの限定されたルーチーン実験後に、当業者により選択されてよい。こうして、本発明の特異的な多価又は多特異性ポリペプチドが参照され、これが、別のことが明示的に示されない限り、関連のあるナノボディの任意の順序又は配列を包含することに留意すべきである。
【０４４４】
最後に、本発明のポリペプチドが、２以上のナノボディ及び１以上の更なるアミノ酸配列を含むことも本発明の範囲内にある（本願で言及するとおり）。
【０４４５】
１以上のＶHHドメインを含む多価及び多特異性ポリペプチド及びその調製に関しては、Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302も、また同様に、例えば、ＷＯ９６／３４１０３及びＷＯ９９／２３２２１も参照される。いくつかの特定の本発明の多特異性及び／又は多価ポリペプチドのいくつかの例は、本願で参照するAblynx N.V.による出願中に見出すことができる。
【０４４６】
本発明の多特異性ポリペプチドの好ましいが、限定しない一例は、少なくとも１の本発明のナノボディ及び少なくとも１のナノボディであって増加した半減期を提供するものを含む。かかるナノボディは、例えば、血清タンパク質、特にヒト血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、チロキシン結合タンパク質、（ヒト）トランスフェリン、フィブリノゲン、免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ又はＩｇＭに対して、又は、ＷＯ０４／００３０１９に列記されている血清タンパク質の１に対して指向しているナノボディであってよい。これらのうち、血清アルブミン（特に、ヒト血清アルブミン）に又はＩｇＧ（特に、ヒトＩｇＧ、例えばMuyldermans（既述）による概要に説明されるナノボディＶＨ−１）に結合できるナノボディは特に好ましい（例えば、マウス又は霊長類における実験に関しては、それぞれ、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）又は前記霊長類由来の血清アルブミンに対するか又はこれと交差反応性であるナノボディが使用できるが、しかし、医薬用途のためには、ヒト血清アルブミン又はヒトＩｇＧに対するナノボディが通常は好ましい）。増加した半減期を提供し、かつ、本発明のポリペプチドにおいて使用できるナノボディは、ＷＯ０４／０４１８６５に、ＷＯ０６／１２２７８７に、そして、Ablynx N.V.による更なる特許出願（例えば、上述のもの）に説明された、血清アルブミンに対するナノボディを含む。
【０４４７】
例えば、本発明における使用のために増加した半減期を提供するいくつかの好ましいナノボディは、次のものを含む：
ＦｃＲｎへの血清アルブミンの結合に関与しない（ヒト）血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合できるナノボディ（例えば、ＷＯ０６／０１２２７８７を参照のこと）；
血清アルブミンのドメインＩＩＩの部分を形成しない血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合できるナノボディ（例えば、ＷＯ０６／０１２２７８７を参照のこと）；
増加した半減期を有するか又は提供できるナノボディ（例えば、Ablynx N.Vによる、本願で言及するＷＯ０８／０２８９７７を参照のこと）；
少なくとも１の種の哺乳類由来の血清アルブミンと、特に少なくとも１の種の霊長類（例えば、限定することなく、マカカ属からのサル（例えば、特に、カニクイザル（Macaca fascicularis）及び／又はアカゲザル（Macaca mulatto)及びバブーン（Papio ursinus））と交差反応性であるヒト血清アルブミンに対するナノボディ（例えば、Ablynx N.VによるＷＯ０８／０２８９７７を参照のこと）；
ｐＨ非依存性に血清アルブミンに結合できるナノボディ（例えば、Ablynx N.Vによる、本願で言及するＷＯ２００８／０４３８２１を参照のこと）、及び／又は、
条件付き結合剤であるナノボディ（例えば、Ablynx N.V.によるＷＯ０８／０４３８２２を参照のこと）。
【０４４８】
増加した半減期を提供し、かつ、本発明のポリペプチドにおいて使用できるいくつかの特に好ましいナノボディは、ＷＯ０６／１２２７８７（表ＩＩ及びＩＩＩを参照のこと）に開示されたナノボディＡＬＢ−１〜ＡＬＢ−１０を含み、そのうち、ＡＬＢ−８（ＷＯ０６／１２２７８７中の配列番号６２、本願の配列番号１１も参照）が特に好ましい。
【０４４９】
本発明の少なくとも１のナノボディ及び増加した半減期を提供する少なくとも１のナノボディを含む本発明のポリペプチドのいくつかの好ましいが、限定しない例は、配列番号１４７〜３２７に挙げられ、より好ましくは、ＨＥＲ３ＭＳ００１３５（配列番号２８２）、ＨＥＲ３ＭＳ００２１２（配列番号３１９）又はＨＥＲ３ＭＳ００２１５（配列番号３２２）である。
【０４５０】
本発明の特定の、しかし限定しない観点によれば、本発明のポリペプチドは、１以上の本発明のナノボディの他に、ヒト血清アルブミンに対する少なくとも１のナノボディを含む。
【０４５１】
一般に、１以上の本発明のナノボディを含む増加した半減期を有する本発明の任意のポリペプチド、及び、本発明のナノボディの任意の誘導体又はかかるポリペプチドの任意の誘導体であって増加した半減期を有するものは、好ましくは、本発明の相応するナノボディ自体の半減期よりも、少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍又は２０倍超より長い半減期を有する。例えば、増加した半減期を有するかかる誘導体又はポリペプチドは、本発明の相応するナノボディ自体に比較して、１時間より多い、好ましくは２時間より多い、より好ましくは６時間より多い、例えば１２時間より多い、又は２４、４８又は７２時間より多い増加した半減期を有してよい。
【０４５２】
好ましいが、本発明を限定しない一観点において、かかる誘導体又はポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、よりいっそう好ましくは少なくとも７２時間以上の、ヒトにおける血清半減期を示してよい。例えば、かかる誘導体又はポリペプチドは、少なくとも５日（例えば約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば、約１０〜１５日）、又は少なくとも約１１日（例えば、約１１〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば、約１２〜１８日以上）、又は１４日より多い（例えば、約１４〜１９日）の半減期を有してよい。
【０４５３】
本発明の一観点によれば、ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドの半減期を増加できる１以上の分子に結合できる。
【０４５４】
本発明のポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定化され、かつ、その半減期は、分解及び／又はクリアランス又はゼクエストレーションに抵抗する分子への結合により増加される。典型的には、かかる分子は、自体がｉｎ  ｖｉｖｏで長い半減期を有する天然に発生するタンパク質である。
【０４５５】
本発明のポリペプチドにおいては、１以上のナノボディ及び１以上のポリペプチドが、直接的に相互に連結してよく（例えば、ＷＯ９９／２３２２１に説明されるとおり）及び／又は１以上の好適なスペーサー又はリンカー、又はその任意の組み合わせを介して相互に連結してよい。
【０４５６】
多価及び多特異性ポリペプチドにおける使用のための好適なスペーサー又はリンカーは、当業者に明らかであり、かつ、一般に、アミノ酸配列を連結させるのに当分野において使用される任意のリンカー又はスペーサーであってよい。好ましくは、前記リンカー又はスペーサーは、医薬用途において意図されるタンパク質又はポリペプチドの構築における使用において好適である。
【０４５７】
いくつかの特に好ましいスペーサーは、抗体フラグメント又は抗体ドメインを連結させるのに当分野において使用されるスペーサー及びリンカーを含む。これらは、上で引用した一般的な背景技術において言及したリンカーも、同様に、例えば、ダイアボディ又はＳｃＦｖフラグメントを構築するのに当分野で使用されるリンカーも含む（この関連において、しかし、ダイアボディ及びＳｃＦｖフラグメントにおいて、使用されるリンカー配列は、該当するＶH及びＶLドメインが、完全な抗原結合部位を形成するために一緒にすることを可能にする長さ、柔軟度及び他の特性を有すべきである一方で、本発明のポリペプチドにおいて使用されるリンカーの長さ又は柔軟度には特段の限定がないことに留意されたい、というのも、各ナノボディはそれ自体で完全な抗原結合部位を形成するからである）。
【０４５８】
例えば、リンカーは、好適なアミノ酸配列、特に、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、例えば１〜１０個のアミノ酸配列のアミノ酸配列であってよい。かかるアミノ酸配列のいくつかの好ましい例は、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、例えば、タイプ（ｇｌｙxｓｅｒy）zｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、例えば（例えば（ｇｌｙ4ｓｅｒ）3又は（ｇｌｙ3ｓｅｒ2）3（ＷＯ９９／４２０７７に説明されるとおり）、及び、本願で言及する、Ablynxによる出願において説明されるＧＳ３０、ＧＳ１５、ＧＳ９及びＧＳ７リンカー（例えば、ＷＯ０６／０４０１５３及びＷＯ０６／１２２８２５も参照のこと））、また同様に、ヒンジ状領域、例えば、天然に発生する重鎖抗体のヒンジ領域又は類似の配列（例えば、ＷＯ９４／０４６７８に説明されるとおり）を含む。
【０４５９】
いくつかの他の特に好ましいリンカーは、ポリアミン（例えばＡＡＡ）、また同様にリンカーＧＳ３０（ＷＯ０６／１２２８２５に説明される配列番号８５）及びＧＳ９（ＷＯ０６／１２２８２５中の配列番号８４）である。
【０４６０】
他の好適なリンカーは、一般に、有機化合物又はポリマー、特に医薬用途のためのタンパク質における使用のために好適なものを含む。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分が抗体ドメインを連結するために使用されており、例えば、ＷＯ０４／０８１０２６を参照されたい。
【０４６１】
使用される（複数の）リンカーの長さ、柔軟度及び／又は他の特性は、（ＳｃＦｖフラグメントにおいて使用されるリンカーに関して通常であるとおり、決定的ではないが）、本発明の最終ポリペプチドの特性（ＨＥＲ３への、又は１以上の他の抗原への親和性、特異性又はアビディティを含むが、これに限定されない）にいくばくかの影響を有してよいことが本発明の範囲内に包含されている。本願の開示に基づいて、当業者は、任意に、いくつかの限定されたルーチーン実験後に、本発明の特定のポリペプチドにおける使用のための最適な（複数の）リンカーを決定することができる。
【０４６２】
例えば、多量体抗原（例えば、多量体レセプター又は他のタンパク質）に対して指向しているナノボディを含む本発明の多価ポリペプチドにおいては、リンカーの長さ及び柔軟度は好ましくは、ポリペプチド中に存在する本発明の各ナノボディが、多量体の各サブユニット上の抗原決定子に結合することを可能にするようなものである。同様に、同じ抗原上の２以上の異なる抗原決定子に対して（例えば、多量体レセプター、チャネル又はタンパク質の抗原の異なるエピトープに対して及び／又は異なるサブユニットに対して）指向しているナノボディを含む本発明の多特異性ポリペプチドにおいては、リンカーの長さ及び柔軟度は、好ましくは、その意図される抗原決定子に各ナノボディが結合することを可能にするようなものである。やはり、本願の開示に基づいて、当業者は、任意に、いくつかの限定されたルーチーン実験後に、本発明の特定のポリペプチドにおける使用のための最適な（複数の）リンカーを決定することができる。
【０４６３】
使用される（複数の）リンカーが１以上の他の好ましい特性又は官能性を本発明のポリペプチドに付与すること、及び／又は、誘導体の形成のための及び／又は官能基の取付のための１以上の部位を官能基の提供すること（例えば、本発明のナノボディの誘導体について本願で説明したとおり）も本発明の範囲内にある。例えば、１以上の荷電したアミノ酸残基を含むリンカー（例えば、国際出願ＷＯ０８／０２００７９の４８頁の表Ａ−２を参照のこと）は、改善された親水特性を提供できる一方で、小エピトープ又はタグを形成又は含むリンカーは、検出、同定及び／又は精製の目的で使用できる。やはり、本願の開示に基づいて、当業者は、任意に、いくつかの限定されたルーチーン実験後に、本発明の特定のポリペプチドにおける使用のための最適なリンカーを決定することができる。
【０４６４】
最後に、２以上のリンカーが本発明のポリペプチドにおいて使用される場合には、これらリンカーは、同じか又は異なっていてよい。やはり、本願の開示に基づいて、当業者は、任意に、いくつかの限定されたルーチーン実験後に、本発明の特定のポリペプチドにおける使用のための最適なリンカーを決定することができる。
【０４６５】
通常、発現及び生産の簡易化のためには、本発明のポリペプチドは線状ポリペプチドである。しかし、本発明はその最も広い範囲においてそれに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドが３つのより多いナノボディを含む場合には、これらを３以上の「アーム」を有するリンカーを用いて連結させることが可能であり、各「アーム」は、「星形」コンストラクトを提供すべく、ナノボディに連結されている。通常あまり好まれないが、環形コンストラクトを使用することも可能である。
【０４６６】
本発明は、本発明のナノボディの誘導体に本質的に類似してよい、すなわち、本願で説明するとおりである、本発明のポリペプチドの誘導体も含む。
【０４６７】
本発明は、本発明のポリペプチド「から実質的になる」タンパク質又はポリペプチドも包含する（その際、「から実質的になる」とは、上で示したのと実質的に同じ意味合いを有する）。
【０４６８】
本発明の一観点に応じて、本発明のポリペプチドは、本願で定義するとおり、実質的に単離された形にある。
【０４６９】
本発明のアミノ酸、ナノボディ、ポリペプチド及び核酸は、自体既知の方式により調製されることができ、このことは、当業者には本願の更なる説明から明らかである。例えば、本発明のナノボディ及びポリペプチドは、抗体の調製のために、特に抗体フラグメント（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含むが、これに限定されない）の調製のために自体既知である任意の方式において調製されることができる。いくつかの好ましいが、限定しない、アミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ、ポリペプチド及び核酸の調製方法は、本願で説明する方法及び技術を含む。
【０４７０】
当業者に明らかであるとおり、本発明のアミノ酸、ＩＳＶ、ナノボディ及び／又はポリペプチドの特に有用な調製方法は、一般に、次の工程を含む：
ｉ）本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドをコードする核酸（本願では、「本発明の核酸」とも称される）の、好適な宿主細胞又は宿主生物（本願では、「本発明の宿主」とも称される）における、又は、別の好適な発現システムにおける発現、その後、任意に、
ｉｉ）こうして得られた本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドの単離及び／又は精製。特に、かかる方法は、次の工程を含んでよい：
ｉ）本発明の宿主が、本発明の少なくとも１のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及び／又はポリペプチドを発現及び／又は生産するような条件下で本発明の宿主の培養及び／又は維持、任意に、その後、
ｉｉ）こうして得られた本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドの単離及び／又は精製。
【０４７１】
本発明の核酸は、一重鎖又は二重鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの形にあってよく、かつ、好ましくは二重鎖ＤＮＡの形にある。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ゲノム性ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡであってよい（例えば、意図される宿主細胞又は宿主生物における発現に関して特異的に適合されているコドン利用を有するＤＮＡ）。
【０４７２】
本発明の一観点に応じて、本発明の核酸は、本願で定義するとおり、実質的に単離された形にある。
【０４７３】
本発明の核酸は、ベクター、例えばプラスミド、コスミド又はＹＡＣの形にあるか、その中に存在するか、かつ／又はその一部であってもよく、これらはやはり実質的に単離された形にあってよい。
【０４７４】
本発明の核酸は、本願で与えられる本発明のポリペプチドのためのアミノ酸配列に基づく情報を基礎として、自体既知の方式で調製又は獲得されてよく、及び／又は、好適な天然の供給源から単離されてよい。アナログを提供するために、天然に発生するＶHHドメインをコードする核酸は、前記アナログをコードする本発明の核酸を提供すべく、例えば、指定部位突然変異に供せられてよい。また、当業者に明らかであるとおり、本発明の核酸を調製すべく、いくつかのヌクレオチド配列、例えば、ナノボディをコードする少なくとも１のヌクレオチド配列、及び、例えば、１以上のリンカーをコードする核酸は、好適な方式で一緒に連結されることができる。
【０４７５】
本発明の核酸を作成するための技術は、当業者に明らかであり、かつ、例えば、自動化ＤＮＡ合成、指定部位突然変異、２以上の天然に発生する及び／又は合成の配列（又は２以上のその部分）の組み合わせ、短縮した発現生成物の発現を生じる突然変異の導入、１以上の制限部位の導入（例えば、好適な制限酵素を用いて容易に消化及び／又はライゲーションされてよいカセット及び／又は領域を作出するために）、及び／又は、例えば、テンプレートとしてＨＥＲ３の天然に発生する形の配列を用いた、１以上の「ミスマッチ」プライマーを用いたＰＣＲ反応を用いた突然変異の導入、を含んでよいが、これらに限定されない。これらの及び他の技術は当業者に明らかであり、やはり、上で言及した標準的なハンドブック、例えば、Sambrook et al.及びAusubel et al.や、以下の実施例が参照される。
【０４７６】
本発明の核酸は、遺伝子コンストラクトの形にあるか、その中に存在するか、かつ／又はその一部であってもよく、このことは、当分野の当業者に明らかであり、かつ、ＷＯ０８／０２００７９の１３１−１３４頁に説明されるとおりである（参照により本願に組み込まれる）。かかる遺伝子コンストラクトは、一般に、本発明の少なくとも１の核酸を含み、これは、自体既知の遺伝子コンストラクトの１以上の要素、例えば１以上の好適な調節要素（例えば、好適な（複数の）プロモーター、（複数の）エンハンサー、（複数の）ターミネーター、その他）及び本願で参照される遺伝子コンストラクトの更なる要素、に任意に連結されている。少なくとも１の本発明の核酸を含むかかる遺伝子コンストラクトは、本願では「本発明の遺伝子コンストラクト」とも称される。
【０４７７】
本発明の遺伝子コンストラクトは、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよく、かつ、好ましくは二重鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝子コンストラクトは、また、意図される宿主細胞又は宿主生物のトランスフォーメーションに好適な形に、意図される宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への組込に好適な形に、又は、意図される宿主生物中への非依存性複製、維持及び／又は遺伝に好適な形にあってもよい。例えば、本発明の遺伝子コンストラクトは、ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウィルスベクター又はトランスポゾンの形にあってよい。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、好適な宿主、宿主生物及び／又は発現システム中で）発現を提供できるベクターであってよい。
【０４７８】
好ましいが、限定しない一観点において、本発明の遺伝子コンストラクトは、
ｉ）少なくとも１の本発明の核酸、これは、次のものに操作可能に結合している、
ｉｉ）１以上の調節要素、例えばプロモーター及び任意に好適なターミネーター、
及び任意に
ｉｉｉ）自体既知の遺伝子コンストラクトの１以上の更なる要素
を含み、
その際、「操作可能に結合」及び「操作可能に連結」との用語は、ＷＯ０８／０２００７９の１３１−１３４頁に記載の意味合いを有し、「調節要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」及び「更なる要素」とは、ＷＯ０８／０２００７９の１３１−１３４頁に説明されるとおりであり、かつ、遺伝子コンストラクトはさらにＷＯ０８／０２００７９の１３１−１３４頁に説明されるとおりであってよい。
【０４７９】
本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子コンストラクトは、宿主細胞又は宿主生物を形質転換するために、すなわち、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドの発現及び／又は生産のために、使用されてよい。好適な宿主又は宿主細胞は当業者に明らかであり、かつ、例えば任意の好適な菌類、原核又は真核の細胞又は細胞株、又は、任意の好適な菌類、原核又は真核の生物であってよく、例えば、ＷＯ０８／０２００７９の１３４及び１３５頁に説明されるものであり、また同様に、抗体及び抗体フラグメント（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含むが、これに限定されない）の発現及び生産に自体既知の全ての他の宿主又は宿主細胞であってよく、これは当業者には明らかである。本願で上で引用した一般的な背景技術、また同様に、例えば、ＷＯ９４／２９４５７；ＷＯ９６／３４１０３；ＷＯ９９／４２０７７；Frenken et al., (1998)（既述）;Riechmann and Muyldermans, (1999)（既述）;van der Linden, (2000)（既述）; Thomassen et al., (2002)（既述）; Joosten et al., (2003)（既述）;Joosten et al., (2005)（既述）が、また、本願で引用される更なる参考文献が参照される。
【０４８０】
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、例えば予防及び／又は療法目的（例えば遺伝子療法）のために、多細胞生物の１以上の細胞、組織又は器官中へと導入及び発現されることもでき、このことは、さらにＷＯ０８／０２００７９中の１３５頁及び１３６頁に、及び、ＷＯ０８／０２００７９に引用される更なる参考文献に説明されるとおりである。
【０４８１】
細胞中のＩＳＶ又はナノボディの発現のために、これらは、いわゆる「イントラボディ」として発現されてもよく、例えば、ＷＯ９４／０２６１０、ＷＯ９５／２２６１８及びＵＳ−Ａ−７００４９４０；ＷＯ０３／０１４９６０;Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies:Development and Applications. Landes and Springer-Verlag;及びKontermann, Methods 34, (2004), 163-170に説明されるとおりである。
【０４８２】
本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドは、例えば、トランスジェニック哺乳類のミルク中で、例えばウサギ、ウシ、ヤギ又はヒツジのミルク中で（哺乳類中への導入遺伝子の導入のための一般的技術に関しては、例えば、ＵＳ−Ａ−６，７４１，９５７、ＵＳ−Ａ−６，３０４，４８９及びＵＳ−Ａ−６，８４９，９９２を参照のこと）、植物又は植物部分中で、例えば、限定されないが、その葉、花、果実、種、根又は塊根（turber）（例えば、タバコ、トウモロコシ、ダイズ又はアルファルファ）中で、又は、例えば蚕（Bombix mori）の蛹中で生産されてもよい。
【０４８３】
さらに、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドは、細胞不含発現システム中で発現及び／又は生産されてもよく、かつ、かかるシステムの好適な例は当業者に明らかである。いくつかの好ましいが、限定しない例は、小麦麦芽システム中、ウサギ網状赤血球ライセート中又は大腸菌（E. coli）Ｚｕｂａｙシステム中の発現を含む。
【０４８４】
上で説明したとおり、ＩＳＶ又はナノボディの使用の利点の１は、それを基礎とするポリペプチドが、好適な細菌システム及び好適な細菌発現システム、ベクター、宿主細胞、調節要素その他中の発現を介して調製されることができることであり、このことは、例えば上で引用した参考文献から当業者には明らかである。しかし、本発明はその最も広い意味合いにおいて、細菌システム中の発現に限定されないことに留意されたい。
【０４８５】
好ましくは、本発明において、（ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ）発現システム、例えば細菌発現システムは、医薬用途に好適である形において本発明のポリペプチドを提供するべく使用され、かかる発現システムはやはり当業者に明らかである。当業者に明らかであるとおり、医薬用途に好適である本発明のポリペプチドは、ペプチド合成のための技術を使用して調製されることができる。
【０４８６】
工業的規模での生産には、ＩＳＶ、ナノボディ又はナノボディ含有タンパク質医薬品の（工業的）生産のための好ましい異種宿主は、大腸菌（E.coli）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）の株であって大規模発現／生産／発酵に、特に大規模医薬品（すなわち、ＧＭＰグレード）発現／生産／発酵に好適であるものを含む。かかる株の好適な例は、当業者に明らかである。かかる株及び生産／発現システムは、例えば、Biovitrum社(Uppsala, Sweden)といった会社により入手可能でもある。
【０４８７】
代わりに、哺乳類細胞株、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、大規模発現／生産／発酵のために、特に大規模医薬品発現／生産／発酵のために使用できる。やはり、かかる発現／生産システムは、上で言及される会社のいくつかによって入手可能にもなる。
【０４８８】
特異的な発現システムの選択は、部分的に、特定の後翻訳修飾、より具体的にはグリコシル化のための要求に依存する。グリコシル化が所望又は要求される、ＩＳＶ−又はナノボディ含有組み換えタンパク質の生産は、発現されたタンパク質をグリコシル化するための能力を有する哺乳類発現宿主の使用を必要とする。この関連において、当業者には、得られるグリコシル化パターン（すなわち、取付られた残基の種類、数及び位置）が発現に使用される細胞又は細胞株に依存することが明らかである。好ましくは、ヒト細胞又は細胞株のいずれかが使用され（すなわち、ヒトグリコシル化パターンを実質的に有するタンパク質を生じる）、又は、別の哺乳類細胞株が使用され、これは、ヒトグリコシル化と実質的に及び／又は機能的に同じであるグリコシル化パターンを提供できるか、又は、少なくともヒトグリコシル化を模倣する。一般に、原核宿主、例えば大腸菌は、タンパク質をグリコシル化する能力を有さず、かつ、低級真核生物、例えば酵母の使用は、ヒトグリコシル化とは異なるグリコシル化パターンを通常は生じる。にもかかわらず、獲得すべき、所望のアミノ酸配列、ＩＳＶ又はポリペプチドに応じて、全ての前述の宿主細胞及び発現システムが本発明において使用できることが理解されるべきである。
【０４８９】
こうして、本発明の限定しない一観点によれば、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドは、グリコシル化される。別の、本発明の限定しない一観点によれば、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドは、グリコシル化されない。
【０４９０】
好ましいが、本発明を限定しない一観点によれば、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドは、細菌細胞、特に大規模医薬生産に好適である細菌細胞、例えば、上述の細胞株において生産される。
【０４９１】
別の好ましいが、本発明を限定しない観点によれば、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドは、酵母細胞、特に大規模医薬生産に好適である酵母細胞、例えば、上述の細胞種において生産される。
【０４９２】
別の好ましいが、本発明の限定しない一観点によれば、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドは、哺乳類細胞、特にヒト細胞、又はヒト細胞株の細胞、特にヒト細胞、又は、ヒト細胞株の細胞であって大規模医薬生産に好適であるもの、例えば上で言及した細胞株中で、生産される。
【０４９３】
ＷＯ０８／０２００７９の１３８及び１３９頁に更に説明されるとおり、宿主細胞中の発現が、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドを生産するために使用される場合には、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドは、細胞内で（例えば、サイトゾル、周辺質又は封入体中で）生産され、次いで、宿主細胞から単離され、任意に、更に精製されることができるか、又は、細胞外で（例えば、宿主細胞が培養される培地中で）生産され、次いで、培養培地から単離され、任意に、更に精製されることができる。こうして、本発明の限定しない一観点に応じて、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドは、細胞内で生産され、かつ、宿主細胞から、特に細菌細胞又は細菌細胞中の封入体から単離されているアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドである。本発明の別の限定しない一観点に応じて、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドは、アミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドであって細胞外で生産され、かつ、宿主細胞が培養されている培地から単離されているものである。
【０４９４】
これら宿主細胞を用いた使用のためのいくつかの好ましいが、限定しないプロモーターは、ＷＯ０８／０２００７９の１３９及び１４０頁に言及されるものを含む。
【０４９５】
これら宿主細胞を用いた使用のためのいくつかの好ましいが、限定しない分泌配列は、ＷＯ０８／０２００７９の１４０頁に言及されるものを含む。
【０４９６】
本発明の宿主又は宿主細胞を形質転換するための好適な技術は、当業者に明らかであり、かつ、意図される宿主細胞／宿主生物及び使用すべき遺伝子コンストラクトに依存してよい。やはり、上で言及したハンドブック及び特許出願が参照される。
【０４９７】
形質転換後に、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子コンストラクトで成功して形質転換されている主細胞又は宿主生物の検出及び選択工程が実施されてよい。これは、本発明の遺伝子コンストラクト中に存在する選択可能なマーカーを基礎とする選択工程、又は、例えば特定の抗体を用いた、本発明のアミノ酸配列の検出を伴う工程であってよい。
【０４９８】
この形質転換された宿主細胞（これは、その形又は安定な細胞株にあってよい）又は宿主生物（これは、安定な突然変異株又は細胞株の形にあってよい）は、本発明の更なる観点を形成する。
【０４９９】
好ましくは、これら宿主細胞又は宿主生物は、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチド（宿主細胞の場合には、少なくとも１のその細胞、部分、組織又は器官中で）を（例えば好適な条件下で）発現するか、又は（少なくとも）発現できるものである。本発明は、さらに、例えば、細胞分割により又は有性又は無性生殖により獲得されてよい、本発明の宿主細胞又は宿主生物の世代、子及び／又は子孫をも含む。
【０５００】
本発明のアミノ酸配列の発現の生産／獲得のために、この形質転換された宿主細胞又は形質転換された宿主生物は、一般に、本発明の（所望の）アミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドが発現／生産されるような条件下で保たれ、維持され及び／又は培養されてよい。好適な条件は当業者に明らかであり、通常は使用される宿主細胞／宿主生物に、また同様に、本発明の（関連のある）ヌクレオチド配列の発現を制御する調節因子に依存する。やはり、上で本発明の遺伝子コンストラクトの段落で言及したハンドブック及び特許出願が参照される。
【０５０１】
一般に、好適な条件は、好適な培地の使用、好適な食物源及び／又は好適な栄養の存在、好適な温度の使用、及び、任意に、好適な誘導因子又は化合物の存在を含んでよい（例えば、本発明のヌクレオチド配列が、誘導可能なプロモーターの制御下にある場合）。これら全ては、当業者により選択されてよい。やはり、かかる条件下では、本発明のアミノ酸配列は、構成的に、一過的に又は好適に誘導された場合にだけ、発現されてよい。
【０５０２】
本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドは、（上で言及したとおり）未成熟な形で（まず）作成されてよく、これは次いで、使用される宿主細胞／宿主生物に依存して、後翻訳修飾に供されてよいことが当業者には明らかでもある。また、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドは、やはり、使用される宿主細胞／宿主生物に依存して、グリコシル化されてよい。
【０５０３】
本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドは、次いで、宿主細胞／宿主生物から、及び／又は、前記宿主細胞又は宿主生物が培養された培地から、自体既知であるタンパク質単離及び／又は精製技術を使用して、例えば（分取）クロマトグラフィ及び／又は電気泳動技術、示差沈殿技術、親和性技術（例えば、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドと融合した、特定の、分解可能なアミノ酸配列を用いて）及び／又は分取免疫学的技術（すなわち、単離すべきアミノ酸配列に対する抗体を用いて）単離されてよい。
【０５０４】
一般に、医薬用途のためには、本発明のポリペプチドは、少なくとも１の本発明のポリペプチド及び少なくとも１の医薬的に許容可能な担体、希釈剤又は付形剤及び／又は助剤、及び、任意に１以上の更なる医薬的に活性のあるポリペプチド及び／又は化合物を含む医薬調製物又は組成物として処方されてよい。限定しない例として、かかる処方物は、経口投与に、非経口投与に（例えば、静脈、筋肉又は皮下注射又は静脈輸液により）、局所投与に、吸入による投与に、スキンパッチにより、インプラントにより、坐剤により、その他により、好適な形に存在してよい。このような好適な剤形−投与の仕方に依存して、固形、半固形又は液状であってよい−、また同様に、その調製における使用のための方法及び担体は、当業者には明らかであり、さらに、本願で説明する。
【０５０５】
こうして、更なる一観点において、本発明は、少なくとも１の本発明のアミノ酸、少なくとも１の本発明のＩＳＶ、少なくとも１の本発明のナノボディ又は少なくとも１の本発明のポリペプチド及び少なくとも１の好適な担体、希釈剤又は付形剤（すなわち、医薬用途に好適なもの）、及び、任意に、１以上の更なる活性のある物質を含む医薬組成物に関する。
【０５０６】
一般に、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドは、自体既知の任意の好適な方法により処方及び投与されることができ、例えばこの点に関して、上で引用した一般的な背景技術（特に、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６７及びＷＯ０８／０２００７９）が、また同様に、標準的なハンドブック、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005);又はthe Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007（例えば、２５２−２５５頁参照）が参照される。
【０５０７】
例えば、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドは、慣用の抗体及び抗体フラグメント（ＳｃＦｖ及びジアボディを含む）及び他の医薬的に活性のあるタンパク質に関して、任意の自体既知の方式で、処方及び投与されてよい。かかる処方物及びこれを調製するための方法は当業者に明らかであり、かつ、例えば、非経口投与（例えば、静脈、腹腔内、皮下、筋肉内、腔内、動脈内又は髄腔内投与）のために又は局所（すなわち、経皮又は皮内）投与のために好適な調製物を含む。
【０５０８】
非経口投与のための調製物は、例えば、滅菌溶液、懸濁液、分散液又はエマルションであって輸液又は注射に好適なものであってよい。かかる調製物のための好適な担体又は希釈剤は、例えば、限定することなく、ＷＯ０８／０２００７９の１４３頁に言及されるものを含む。通常は、水性溶液又は懸濁液が好ましい。
【０５０９】
本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドは、遺伝子療法運搬方法を用いて投与されることもできる。例えば、米国特許５，３９９，３４６号を参照されたく、この文献はその完全な範囲において参照により組み込まれる。遺伝子療法運搬方法を用いて、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドをコードする遺伝子でトランスフェクションしたプライマリー細胞は、さらに、特異的な器官、組織、グラフト、腫瘍、又は細胞を標的とすべく組織特異的プロモーターでトランスフェクションされてよく、かつ、さらに、細胞下の局所化した発現のためのシグナル及び安定化配列でトランスフェクションされてよい。
【０５１０】
こうして、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドは、全身投与されてよく、例えば、医薬的に許容されるビヒクル、例えば不活性希釈剤又は同化性食用担体と組み合わせて、経口投与されてよい。これらは、ハード又はソフトなシェルゼラチンカプセル内に封入されていてよいか、タブレットに圧縮されてよいか、又は、患者の食餌療法の食餌に直接的に組み込まれてよい。経口療法的投与のためには、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドは、１以上の付形剤と組み合わされ、かつ、消化可能なタブレット、バッカルタブレット、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、オブラート剤及び類似物の形で使用されてよい。かかる組成物及び調製物は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを少なくとも０．１％含むべきである。組成物及び調製物中のそのパーセンテージは、無論変動してよく、かつ、都合に合わせて、所定のユニット剤形の質量の約２〜約６０％であってよい。かかる療法上有用な組成物中の本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドの量は、有効な投与量レベルが得られるような量である。
【０５１１】
タブレット、トローチ、ピル、カプセル及び類似物は、バインダー、付形剤、崩壊剤、潤滑剤及び甘味料又はフレーバー剤を含んでもよく、例えば、ＷＯ０８／０２００７９の１４３−１４４頁に言及されるものである。ユニット剤形がカプセルである場合には、これは、上述のタイプの材料に加えて、液体担体、例えば植物油又はポリエチレングリコールを含んでよい。種々の他の材料が、コーティングとして、又はさもなければ、固形のユニット剤形の物理学的形態を変更するために存在してよい。例えば、タブレット、ピル又はカプセルは、ゼラチン、ワックス、シェラック又は糖及び類似物でコーティングされてよい。シロップ又はエリキシル剤は、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチド、甘味料としてスクロース又はフルクトース、保存料としてメチル及びプロピルパラベン、染料及びフレーバー剤、例えばチェリー又はオレンジフレーバーを含んでよい。無論、任意のユニット剤形を調製するのに使用される任意の材料が、医薬的に許容可能であり、かつ、使用される量において実質的に非毒性であるべきである。加えて、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドは、徐放性調製物及びデバイス中に組み込まれてよい。
【０５１２】
経口投与のための調製物及び処方物は、本発明のコンストラクトが胃環境に耐え、かつ、腸を通過することを可能にする腸溶性コーティングを備えていてもよい。より一般的には、経口投与のための調製物及び処方物は、好適には、胃腸管の任意の所望の部分への運搬のために好適に処方されていてよい。加えて、好適な坐剤が、胃腸管中への運搬のために使用されてよい。
【０５１３】
本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドは、輸液又は注射により、静脈内又は腹腔内に投与されてもよく、このことは、ＷＯ０８／０２００７９の１４４及び１４５頁に更に説明されるとおりである。
【０５１４】
局所的投与には、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、液体である場合には、純粋な形で適用されてよい。しかし、これらを、ＷＯ０８／０２００７９の１４５頁に更に説明されるとおり、皮膚科学的に許容可能な担体（固形又は液体であってよい）と組み合わせて、組成物又は処方物として皮膚に投与することが一般に所望される。
【０５１５】
一般に、液体組成物、例えばローション中の、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドの濃度は、約０．１〜２５質量％、好ましくは約０．５〜１０質量％である。半固形又は固形組成物、例えばゲル又はパウダー中の濃度は、約０．１〜５質量％、好ましくは０．５〜２．５質量％である。
【０５１６】
治療における使用のために要求される本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドの量は、選択された特定のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドによって変動するだけでなく、投与経路、治療される症状の性質及び患者の年齢及び症状によっても変動し、かつ、最終的には、指導医（attendant physician）又は臨床医の裁量による。本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドの用量もまた、標的細胞、腫瘍、組織、グラフト又は器官に依存して変動する。
【０５１７】
所望される用量は簡易には、単一用量において示されるか、又は、適当な間隔、例えば、１日あたり２、３、４以上の部分量（subdose）で投与される分割された用量として示されてよい。部分量自体は、さらに分割されてよく、例えば、離散的に散漫に間隔をおいた投与の数に分割されてよく、例えば、吸入器からの複数の吸入、又は、眼への複数の点眼適用によって、分割されてよい。
【０５１８】
投与レジメンは、長期の、毎日の治療を含んでよい。「長期」とは、少なくとも２週、好ましくは数週、数月又は数年の期間を意味する。用量範囲における必要な改変は、本願で教示するルーチーン実験のみを用いて通常の当業者の１人によって決定されてよい。Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed 4), Mack Publishing Co., Easton, PAを参照のこと。用量は、任意の合併症現象の場合には、個々の医師により調節されてもよい。
【０５１９】
別の観点において、本発明は、本発明のアミノ酸配列、本発明のＩＳＶ、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又は、これらを含む医薬組成物、の医薬的に活性のある量を、必要とする被験体に投与することを含む、少なくとも１の種々の癌の予防及び／又は治療の方法に関する。
【０５２０】
本発明の文脈において、「予防及び／又は治療」との用語は、疾病の予防及び／又は治療を含むだけでなく、疾病の開始の予防、疾病の進行の減速又は逆戻り、疾病と関連した１以上の症状の開始の予防又は減速、疾病と関連した１以上の症状の減少及び／又は緩和、疾病の及び／又はそれと関連した任意の症状の深刻度及び持続期間の減少、及び／又は、疾病及び／又はそれと関連した任意の症状の深刻度の更なる増加の予防、疾病により引き起こされた任意の生理学的ダメージの予防、減少又は逆戻り、及び、一般に、治療される患者にとって有益である任意の薬理学的作用をも一般に包含する。
【０５２１】
治療すべき被験体は、任意の温血動物であってよいが、特に哺乳類、とりわけヒトである。当業者に明らかであるとおり、治療すべき被験体は特に、本願で言及する疾病及び疾患を患うか、又は、その危険を有する者である。
【０５２２】
本発明は、ＨＥＲ３に、その生物学的又は薬理学的活性に、及び／又は、ＨＥＲ３が関与する生物学的経路又はシグナリングに関連している疾病又は疾患少なくとも１の予防及び／又は治療方法であって、本発明のアミノ酸配列、本発明のＩＳＶ、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又は、これらを含む医薬組成物、の医薬的に活性のある量を、必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。特に、本発明は、ＨＥＲ３を、その生物学的又は薬理学的活性を、及び／又は、ＨＥＲ３が関与する生物学的経路又はシグナリングを調節することにより治療できる疾病又は疾患少なくとも１の予防及び／又は治療方法であって、本発明のアミノ酸配列、本発明のＩＳＶ、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又は、これらを含む医薬組成物、の医薬的に活性のある量を、必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。特に、前記医薬的に有効な量は、ＨＥＲ３を、その生物学的又は薬理学的活性を、及び／又は、ＨＥＲ３が関与する生物学的経路又はシグナリングを調節するのに十分な量、及び／又は、循環中で、ＨＥＲ３を、その生物学的又は薬理学的活性を、及び／又は、ＨＥＲ３が関与する生物学的経路又はシグナリングを調節するのに十分な、本発明のアミノ酸配列、本発明のＩＳＶ、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチドのレベルを提供する量、であってよい。
【０５２３】
本発明は、さらに、本発明のアミノ酸配列、本発明のＩＳＶ、本発明のナノボディ又は本発明のポリペプチドを患者に投与することにより予防及び／又は治療されることができる少なくとも１の疾病又は疾患の予防及び／又は治療方法であって、本発明のアミノ酸配列、本発明のＩＳＶ、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又は、これらを含む医薬組成物の、医薬的に活性のある量を、これを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。
【０５２４】
より具体的には、本発明は、本願で列記される疾病及び疾患からなる群から選択される少なくとも１の疾病又は疾患の予防及び／又は治療方法であって、本発明のアミノ酸配列、本発明のＩＳＶ、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又は、これらを含む医薬組成物、の医薬的に活性のある量を、必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。
【０５２５】
別の観点において、本発明は、本発明のアミノ酸配列、本発明のＩＳＶ、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又は、これらを含む医薬組成物、の医薬的に活性のある量を、本願で言及する疾病及び疾患に苦しむか又はその危険にある被験体に投与することを含む、免疫療法、特に受動免疫療法のための方法に関する。
【０５２６】
上述の方法において、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及び／又はポリペプチド及び／又はこれらを含む組成物は、使用すべき特定の医薬処方物又は組成物に依存して、任意に好適な方式で投与されることができる。こうして、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及び／又はポリペプチド及び／又はこれらを含む組成物は、やはり使用すべき特定の医薬処方物又は組成物に依存して、例えば、経口に、腹腔内に（例えば、静脈内、皮下、筋肉内に、又は、胃腸管を回避する他の任意の投与経路により）、鼻腔内に、経皮に、局所に、坐剤の利用により、吸入により、投与されることができる。臨床医は、予防又は治療すべき疾病又は疾患及び臨床医に良く知られている他の因子に依存して、好適な投与経路及びかかる投与において使用すべき好適な医薬処方物又は組成物を選択することができる。
【０５２７】
本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及び／又はポリペプチド及び／又はこれらを含む組成物は、予防又は治療すべき疾病又は疾患の予防及び／又は治療に好適である治療レジメンに応じて投与される。臨床医は、一般に、因子、例えば、予防又は治療すべき疾病又は疾患、治療すべき疾病の深刻度及び／又はその症状の深刻度、使用すべき特定の本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチド、使用すべき特定の投与経路及び医薬処方物又は組成物、患者の年齢、性別、体重、食餌療法、一般的な症状、及び、臨床医に良く知られている類似の因子に応じて、好適な治療レジメンを決定することができる。
【０５２８】
一般に、治療レジメンは、本発明の１以上のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及び／又はポリペプチド、又は、これらを含む１以上の組成物の、１以上の医薬的に有効な量又は用量での投与を含む。投与すべき特定の量又は用量は、やはり上述の因子を基礎として、臨床医によって決定できる。
【０５２９】
一般に、本願で言及した疾病及び疾患の予防及び／又は治療には、治療すべき特定の疾病又は疾患、使用すべき特定の本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドの効力、使用される特定の投与経路及び特定の医薬処方物又は組成物に依存して、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドは、一般に、１日あたり体重ｋｇあたり１グラム〜０．０１ミリグラム、好ましくは１日あたり体重ｋｇあたり０．１グラム〜０．０１ミリグラム、例えば、１日当たり体重ｋｇあたり約０．１、１、１０、１００又は１０００ミリグラムの量で、連続的に（例えば、輸液により）に単一１日量として、又は、１日の間に複数に分割された用量として、投与される。臨床医は、一般に、本願で言及する因子に依存して、好適な１日量を決定する。特定の場合には、臨床医は、例えば上述の因子及びその専門的判断を基礎として、これらの量から逸脱することを選択してもよい。一般に、投与すべき量に関するいくばくかの指標が、実質的に同じ経路を介して投与される同じ標的に対する比較可能な慣用の抗体又は抗体フラグメントのために通常投与される量から獲得することができるが、しかし、親和性／アビディティ、効力、生体内分布、半減期及び当業者に良く知られている類似の因子の相違が考慮される。
【０５３０】
通常、上述の方法において、単一の本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドが使用される。しかし、２以上の本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及び／又はポリペプチドを組み合わせて使用することが、本発明の範囲内にある。
【０５３１】
本発明のＩＳＶ、ナノボディ、アミノ酸配列及びポリペプチドは、１以上の更なる医薬的に活性のある化合物又は成分と組み合わせて使用されてもよく、すなわち、組み合わされた治療レジメンとしてであってもよく、これは、相乗効果を生じるか又は生じなくてよい。やはり、臨床医は、かかる更なる化合物又は成分、また同様に好適な組み合わされた治療レジメンを、上述の因子及びその専門的判断に基づいて選択できる。
【０５３２】
特に、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ及びポリペプチドは、本願で引用する疾病及び疾患の予防及び／又は治療に使用されることができる他の医薬的に活性のある化合物又は成分と組み合わせて使用されてよく、その結果、相乗作用は得られてもよいし又は得られなくてもよい。かかる化合物及び成分、また同様に、これらを投与するための経路、方法及び医薬処方物又は組成物の例は、臨床医には明らかである。
【０５３３】
２以上の物質又は成分が組み合わされた治療レジメンの一部として使用されるべき場合には、これらは、同じ投与経路を介して又は異なる投与経路を介して、実質的に同じ時間で又は異なる時間で投与されることができる（例えば、実質的に同時に、連続的に又は交代するレジメンに応じて）。物質又は成分を同じ投与経路を介して同時に投与すべき場合には、これらは異なる医薬処方物又は組成物、又は、組み合わされた医薬処方物又は組成物の一部、として投与されてよく、このことは当業者に明らかであるとおりである。
【０５３４】
また、２以上の活性物質又は成分を組み合わされた治療レジメンの一部として使用すべき場合には、各物質又は成分は同じ量で、かつ、それ自体で化合物又は成分が使用される場合に使用される同じレジメンに応じて投与されてよく、そして、かかる組み合わされた使用は、相乗作用を導くか又は導かなくてよい。しかし、２以上の活性のある物質又は成分の組み合わされた使用が相乗作用を導く場合には、所望の治療的作用をやはり達成する一方で、１、それ以上又は全ての物質又は成分の投与すべき量を減少してもよい。これは例えば、所望の医薬的又は治療的作用をやはり達成する一方で、その通常の量で使用される場合の１以上の物質又は成分の使用に関連した任意の不所望な副作用の回避、制限又は減少に有用であってよい。
【０５３５】
本発明により使用される治療レジメンの有効性は、関連する疾病又は疾患のために自体既知である任意の方式において決定される及び／又はこれに従うものであってよく、このことは臨床医に明らかであるとおりである。臨床医は、適切でありかつケースバイケースの基礎に基づく場合には、所望の治療効果を達成するため、不所望な副作用を回避、制限又は減少するため、及び／又は、一方で所望の治療効果を達成し、他方で不所望な副作用の回避、制限又は減少する適度なバランスを達成するために、特定の治療レジメンを変更又は改変することもできる。
【０５３６】
一般に、治療レジメンは、所望の治療効果が達成される及び／又は所望の治療効果を維持すべき限り、続けられる。やはり、このことは臨床医により決定されることができる。
【０５３７】
別の観点において、本発明は、少なくとも１の種々の癌の予防及び／又は治療のための医薬組成物の調製における及び／又は本願で言及した１以上の治療方法における使用のための、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドの使用に関する。
【０５３８】
治療すべき被験体は、任意の温血動物であってよいが、特に哺乳類、とりわけヒトである。当業者に明らかであるとおり、治療すべき被験体は特に、本願で言及する疾病及び疾患を患うか、又は、その危険を有する者である。
【０５３９】
本発明は、患者への本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドの投与により予防及び／又は治療できる、少なくとも１の疾病又は疾患の予防及び／又は治療のための医薬組成物の調製における本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドの使用にも関する。
【０５４０】
より具体的には、本発明は、種々の癌の予防及び／又は治療のための、特に本願で列記した１以上の疾病及び疾患の予防及び治療のための、医薬組成物の調製における本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドの使用に関する。
【０５４１】
やはり、かかる医薬組成物においては、１以上の本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ又はポリペプチドは、１以上の他の活性成分、例えば本願で言及したものと好適に組み合わされてもよい。
【０５４２】
最後に、本発明のＩＳＶ又はナノボディの使用（本願で定義するとおり）及び本発明のポリペプチドの使用が、極めて好ましいが、本願の説明を基礎として当業者には、他のアミノ酸配列、特にＨＥＲ３に対する（単一）ドメイン抗体、また同様に、かかる（単一）ドメイン抗体を含むポリペプチドを同じように設計及び／又は作成することもできることが明らかである。
【０５４３】
例えば、当業者には、本発明のナノボディに関して言及した１以上のＣＤＲを、かかる（単一）ドメイン抗体又は他のタンパク質足場（ヒト足場又は非免疫グロブリン足場を含むが、これに限定されない）へと「グラフト」してもよいことも明らかである。かかるＣＤＲグラフトのための好適な足場及び技術は当業者に明らかであり、かつ、当分野において良く知られており、これに関しては例えば、ＷＯ０８／０２００７９に言及されているものを参照のこと。例えばマウス又はラットＣＤＲをヒトのフレームワーク及び足場へとグラフトするために自体既知である技術は、同じようにして、本発明のナノボディのＣＤＲ  １以上と、ヒトのフレームワーク領域又は配列１以上を含むキメラタンパク質を提供するために使用されることができる。
【０５４４】
本発明のナノボディが本発明で上述した好ましいＣＤＲ配列以外の１以上の他のＣＤＲ配列を含む場合には、これらＣＤＲ配列は自体既知の任意の方式で、例えば、ＷＯ０８／０２００７９に説明される１以上の技術を使用して得ることができることに留意されたい。
【０５４５】
本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶ、ナノボディ、ポリペプチド、核酸、遺伝子コンストラクト及び宿主及び宿主細胞の更なる使用は、本願の開示を基礎として当業者には明らかである。例えば、限定することなく、本発明のアミノ酸配列は、ＨＥＲ３をこれを含む組成物及び調製物から精製するために自体既知である方式において使用できる媒体を提供すべく、好適な担体又は固形支持体へと連結されることができる。好適な検出可能なラベルを含む本発明のアミノ酸配列の誘導体もまた、組成物又は調製物中にＨＥＲ３の存在を（定性的に又は定量的に）決定するためのマーカーとして、又は、細胞又は組織の表面上のＨＥＲ３の存在を選択的に検出するためのマーカーとして、使用されることもできる（例えば、好適な細胞選別技術と組み合わせて）。
【０５４６】
本発明を、以下の限定しない好ましい観点、実施例及び図面により、更に説明する：
好ましい観点：
観点Ａ−１：ＨＥＲ３に対して指向している及び／又はＨＥＲ３に特異的に結合できる免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５４７】
観点Ａ−２：実質的に単離された形にある、観点Ａ−１に応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５４８】
観点Ａ−３：被験体への投与のための、観点Ａ−１又はＡ−２に応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、前記免疫グロブリン可変ドメインは、前記被験体中で自然発生しない。
【０５４９】
観点Ａ−４：解離定数（ＫD）１０-5〜１０-12モル／リットル以下、好ましくは１０-7〜１０-12モル／リットル以下、より好ましくは１０-8〜１０-12モル／リットルでＨＥＲ３に特異的に結合できる、免疫グロブリン単一可変ドメイン。かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインであってよい。
【０５５０】
観点Ａ−５：１０2Ｍ-1ｓ-1〜約１０7Ｍ-1ｓ-1、好ましくは１０3Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1、より好ましくは１０4Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1、例えば１０5Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1の会合速度（ｋon速度）でＨＥＲ３に特異的に結合できる免疫グロブリン単一可変ドメイン。かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインであってよい。
【０５５１】
観点Ａ−６：１ｓ-1〜１０-6ｓ-1、好ましくは１０-2ｓ-1〜１０-6ｓ-1、より好ましくは１０-3ｓ-1〜１０-6ｓ-1、例えば１０-4ｓ-1〜１０-6ｓ-1の解離速度（ｋoff速度）でＨＥＲ３に特異的に結合できる免疫グロブリン単一可変ドメイン。かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインであってよい。
【０５５２】
観点Ａ−７：５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば１ｎＭ未満の親和性でＨＥＲ３に特異的に結合できる免疫グロブリン単一可変ドメイン。かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインであってよい。
【０５５３】
観点Ａ−８：（任意の好適な種由来の）自然発生する免疫グロブリン単一可変ドメインであるか又は合成又は半合成の免疫グロブリン単一可変ドメインである、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５５４】
観点Ａ−９：免疫グロブリンフォールドを含むか又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成できる、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５５５】
観点Ａ−１０：４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から実質的になる、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５５６】
観点Ａ−１１：免疫グロブリン配列である、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５５７】
観点Ａ−１２：（任意の好適な種由来の）自然発生する免疫グロブリン配列であるか又は合成又は半合成の免疫グロブリン配列である、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５５８】
観点Ａ−１３：ヒト化した免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列又は親和性成熟のような技術により得られた免疫グロブリン配列である、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５５９】
観点Ａ−１４：軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）、又は、重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）、から実質的になる、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５６０】
観点Ａ−１５：慣用の四鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から実質的になるか又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から実質的になる、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５６１】
観点Ａ−１６：ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適である免疫グロブリン単一可変ドメイン）から、単一ドメイン抗体（又は単一ドメインとしての使用に好適である免疫グロブリン単一可変ドメイン）から、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適である免疫グロブリン単一可変ドメインから）、又は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）から、実質的になる、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５６２】
観点Ａ−１７：免疫グロブリン単一可変ドメインから実質的になる、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５６３】
観点Ａ−１８：好ましくは１以上のアミノ酸残基を、表Ｂ−２で言及した特徴残基から選択したKabat numberingに応じた位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８に有する免疫グロブリン単一可変ドメインから実質的になる、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５６４】
観点Ａ−１９：次のポリペプチドから実質的になる、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン：
ｉ）配列番号１２−２６の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、その中で、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する、
かつ、その中で、
ｉｉ）好ましくは、Kabat numberingに応じた位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８にある１以上のアミノ酸残基は、表Ｂ−２で言及する特徴残基から選択される。
【０５６５】
観点Ａ−２０：次の免疫グロブリン単一可変ドメインから実質的になる、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン：
ｉ）配列番号１２−２６の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、その中で、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する、
かつ、その中で、
ｉｉ）好ましくは、Kabat numberingに応じた位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８にある１以上のアミノ酸残基は、表Ｂ−２で言及する特徴残基から選択される。
【０５６６】
観点Ａ−２１：ヒト化又はさもなければ配列最適化した免疫グロブリン単一可変ドメインから実質的になる、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５６７】
観点Ａ−２２：ＨＥＲ３に対する／ＨＥＲ３への結合のための少なくとも１の結合部位に加えて、他の抗原、タンパク質又は標的に対する／これらへの結合のための１以上の更なる結合部位を含む、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５６８】
観点Ｂ−１：ＨＥＲ３に対して指向している及び／又はこれに特異的に結合でき、かつ、次のものからなる群から選択されるアミノ酸残基の１以上の伸長部を含む、免疫グロブリン単一可変ドメイン：
ａ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
ｇ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
又はこれらの任意の好適な組み合わせ。かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、観点Ａ−１〜Ａ−２２のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインであってよい。
【０５６９】
観点Ｂ−２：少なくとも１の前記アミノ酸残基伸長部が、ＨＥＲ３に対する／ＨＥＲ３への結合のための抗原結合部位の一部を形成する、観点Ｂ−１に応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５７０】
観点Ｂ−３：ＨＥＲ３に対して指向している及び／又はこれに特異的に結合でき、かつ、次のものからなる群から選択されるアミノ酸残基の２以上の伸長部を含む、免疫グロブリン単一可変ドメイン配列：
ａ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
ｇ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
この場合に、（ｉ）アミノ酸残基の第１伸長部が、ａ）、ｂ）又はｃ）に応じたアミノ酸配列の１に相応する場合には、アミノ酸残基の第２伸長部が、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）に応じたアミノ酸配列の１に相応し、（ｉｉ）アミノ酸残基の第１伸長部が、ｄ）、ｅ）又はｆ）に応じたアミノ酸配列の１に相応する場合には、アミノ酸残基の第２伸長部が、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）に応じたアミノ酸配列の１に相応し、又は、（ｉｉｉ）アミノ酸残基の第１伸長部が、ｇ）、ｈ）又はｉ）に応じたアミノ酸配列の１に相応する場合には、アミノ酸残基の第２伸長部が、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）に応じたアミノ酸残基の１に相応する。かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１又はＢ−２のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインであってよい。
【０５７１】
観点Ｂ−４：少なくとも２の前記アミノ酸残基伸長部が、ＨＥＲ３に対する結合のための抗原結合部位の一部を形成する、観点Ｂ−３に応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５７２】
観点Ｂ−５：ＨＥＲ３に対して指向している及び／又はＨＥＲ３に特異的に結合でき、かつ、アミノ酸残基の３以上の伸長部を含む、免疫グロブリン単一可変ドメイン配列、その際、アミノ酸残基の第１の伸長部は、次のものからなる群から選択されている：
ａ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号５７−７１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
アミノ酸残基の第２の伸長部が次のものからなる群から選択されている：
ｄ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号８７−１０１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列、
及び、アミノ酸残基の第３の伸長部が次のものからなる群から選択されている：
ｇ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１１７−１３１のアミノ酸配列少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列。かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、観点Ａ−１〜Ａ−２２及び／又はＢ−１〜Ｂ−４のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインであってよい。
【０５７３】
観点Ｂ−６：少なくとも３の前記アミノ酸残基伸長部が、ＨＥＲ３に対する及び／又はＨＥＲ３への結合のための抗原結合部位の一部を形成する、観点Ｂ−５に応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５７４】
観点Ｂ−７：ＨＥＲ３に対して指向している、及び／又は、ＨＥＲ３に特異的に結合できる、免疫グロブリン単一可変ドメイン、その際、前記免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ配列が、配列番号１２−２６の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１のＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば、９５％以上のアミノ酸同一性、又は実質的に１００％すらのアミノ酸同一性を有する。かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に、観点Ａ−１〜Ａ−２２及び／又はＢ−１〜Ｂ−６のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインであってよい。
【０５７５】
観点Ｃ−１：ＨＥＲ３に対して指向しており、かつ、配列番号１２〜２６の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１のＨＥＲ３に対する結合を交差遮断する、免疫グロブリン単一可変ドメイン。かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に観点Ａ−１〜Ａ−２２及び／又は観点Ｂ−１〜Ｂ−７のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインであってよい。また、好ましくは、かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＨＥＲ３に特異的に結合できる。
【０５７６】
観点Ｃ−２：ＨＥＲ３に対して指向しており、かつ、配列番号１２〜２６の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１によるＨＥＲ３に対する結合から交差遮断されている、免疫グロブリン単一可変ドメイン。かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは特に、観点Ａ−１〜Ａ−２２及び／又は観点Ｂ−１〜Ｂ−７のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインであってよい。また、好ましくは、かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは特異的にＨＥＲ３に結合できる。
【０５７７】
観点Ｃ−３：観点Ｃ−１又はＣ−２のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、その際、前記免疫グロブリン単一可変ドメインの交差遮断する能力又は交差遮断される能力は、例えば実験部分に説明するようなＦＡＣＳ競合アッセイにおいて検出される。
【０５７８】
観点Ｃ−４：観点Ｃ−１〜Ｃ−３のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、その際、前記免疫グロブリン単一可変ドメインの交差遮断する能力又は交差遮断される能力は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて検出される。
【０５７９】
観点Ｄ−１：実質的に単離された形にある、観点Ｂ−１〜Ｂ−７又はＣ−１〜Ｃ−４のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５８０】
観点Ｄ−２：被験体への投与のための、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４及び／又はＤ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、前記被験体中で自然発生しない。
【０５８１】
観点Ｄ−３：解離定数（ＫD）１０-5〜１０-12モル／リットル以下、好ましくは１０-7〜１０-12モル／リットル以下、より好ましくは１０-8〜１０-12モル／リットルでＨＥＲ３に特異的に結合できる、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４及び／又はＤ−１〜Ｄ−２のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５８２】
観点Ｄ−４：１０2Ｍ-1ｓ-1〜約１０7Ｍ-1ｓ-1、好ましくは１０3Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1、より好ましくは１０4Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1、例えば１０5Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1の会合速度（ｋon速度）でＨＥＲ３に特異的に結合できる、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４及び／又はＤ−１〜Ｄ−３のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５８３】
観点Ｄ−５：１ｓ-1〜１０-6ｓ-1、好ましくは１０-2ｓ-1〜１０-6ｓ-1、より好ましくは１０-3ｓ-1〜１０-6ｓ-1、例えば１０-4ｓ-1〜１０-6ｓ-1の解離速度（ｋoff速度）でＨＥＲ３に特異的に結合できる、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４及び／又はＤ−１〜Ｄ−４のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５８４】
観点Ｄ−６：５００ｎＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば１ｎＭ未満の親和性でＨＥＲ３に特異的に結合できる、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４及び／又はＤ−１〜Ｄ−５のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。観点Ｄ−１〜Ｄ−６に応じた免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に観点Ａ−１〜Ａ−２２のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインであってよい。
【０５８５】
観点Ｅ−１：（任意の好適な種由来の）自然発生する免疫グロブリン単一可変ドメインであるか又は合成又は半合成の免疫グロブリン単一可変ドメインである、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４及び／又はＤ−１〜Ｄ−６のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５８６】
観点Ｅ−２：免疫グロブリンフォールドを含むか又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成できる、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６及び／又はＥ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５８７】
観点Ｅ−３：免疫グロブリン配列である、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６及び／又はＤ−１又はＤ−２のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５８８】
観点Ｅ−４：（任意の好適な種由来の）自然発生する免疫グロブリン単一可変ドメインであるか又は合成又は半合成の免疫グロブリン配列である、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６及び／又はＥ−１〜Ｅ−３のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５８９】
観点Ｅ−５：ヒト化した免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列又は親和性成熟のような技術により得られた免疫グロブリン配列である、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６及び／又はＥ−１〜Ｅ−４のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５９０】
観点Ｅ−６：軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶL配列）、又は、重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶH配列）、から実質的になる、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６及び／又はＥ−１〜Ｅ−５のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５９１】
観点Ｅ−７：慣用の四鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から実質的になるか又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から実質的になる、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６及び／又はＥ−１〜Ｅ−６のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５９２】
観点Ｅ−８：ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適である免疫グロブリン単一可変ドメイン）から、単一ドメイン抗体（又は単一ドメインとしての使用に好適である免疫グロブリン単一可変ドメイン）から、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適である免疫グロブリン単一可変ドメイン）から、又は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＶHH配列を含むが、これに限定されない）から、実質的になる、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６及び／又はＥ−１〜Ｅ−７のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５９３】
観点Ｅ−９：ＶＨＨ又は改変したＶＨＨから実質的になる、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６及び／又はＥ−１〜Ｅ−８のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５９４】
観点Ｅ−１０：表Ｂ−２で言及した特徴残基から選択したKabat numberingに応じた位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８に好ましくは１以上のアミノ酸残基を有するＶＨＨ又は改変したＶＨＨから実質的になる、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６及び／又はＥ−１〜Ｅ−９のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５９５】
観点Ｅ−１１：次のことが該当する、ＶＨＨ又は改変したＶＨＨから実質的になる、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６及び／又はＥ−１〜Ｅ−１０のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン：
ｉ）配列番号１２−２６の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、その中で、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する、
かつ、その中で、
ｉｉ）好ましくは、Kabat numberingに応じた位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８にある１以上のアミノ酸残基は、表Ｂ−２で言及する特徴残基から選択される。
【０５９６】
観点Ｅ−１２：ＶＨＨ又は改変したＶＨＨから実質的になる、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４Ｄ−１〜Ｄ−６及び／又はＥ−１〜Ｅ−１１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５９７】
観点Ｅ−１３：少なくとも１のアミノ酸残基伸長部又はＣＤＲ配列により形成される結合のための結合部位に加えて、他の抗原、タンパク質又は標的に対する結合のための１以上の更なる結合部位を含む、観点Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６及び／又はＥ−１〜Ｅ−１１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。観点Ｅ−１〜Ｅ−１３に応じた免疫グロブリン単一可変ドメインは、特に観点Ａ−１〜Ａ−２２のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインであってよい。
【０５９８】
観点Ｆ−１：次のことが該当する、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から実質的になる、免疫グロブリン単一可変ドメイン：
−ＣＤＲ１が、次のものからなる群から選択される：
ａ）配列番号５７〜７１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｂ）配列番号５７〜７１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｃ）配列番号５７〜７１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
及び／又は
−ＣＤＲ２が、次のものからなる群から選択される：
ｄ）配列番号８７〜１０１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｅ）配列番号８７〜１０１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｆ）配列番号８７〜１０１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
及び／又は
−ＣＤＲ３が、次のものからなる群から選択される：
ｇ）配列番号１１７〜１３１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｈ）配列番号１１７〜１３１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｉ）配列番号１１７〜１３１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０５９９】
かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくはＨＥＲ３に対して指向しており、及び／又は、ＨＥＲ３に特異的に結合できる免疫グロブリン単一可変ドメインである。また、かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくは、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６及び／又はＥ−１〜Ｅ−１３のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインである。
【０６００】
観点Ｆ−２：次のことが該当する、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から実質的になる、免疫グロブリン単一可変ドメイン：
−ＣＤＲ１が、次のものからなる群から選択される：
ａ）配列番号５７〜７１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｂ）配列番号５７〜７１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１の少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｃ）配列番号５７〜７１の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
及び
−ＣＤＲ２が、次のものからなる群から選択される：
ｄ）配列番号８７〜１０１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｅ）配列番号８７〜１０１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｆ）配列番号８７〜１０１の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
及び
−ＣＤＲ３が、次のものからなる群から選択される：
ｇ）配列番号１１７〜１３１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｂ）配列番号１１７〜１３１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｉ）配列番号１１７〜１３１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン。かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくはＨＥＲ３に対して指向しており、及び／又は、ＨＥＲ３に特異的に結合できる免疫グロブリン単一可変ドメインである。また、かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくは、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６及び／又はＥ−１〜Ｅ−１３のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインである。
【０６０１】
観点Ｆ−３：観点Ｆ−１及びＦ−２のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、その際、前記免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ配列が、配列番号１２−２６の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１のＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば、９５％以上のアミノ酸同一性、又は実質的に１００％すらのアミノ酸同一性を有する。かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくはＨＥＲ３に対して指向しており、及び／又は、ＨＥＲ３に特異的に結合できる免疫グロブリン単一可変ドメインである。また、かかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくは、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６及び／又はＥ−１〜Ｅ−１３のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインである。
【０６０２】
観点Ｆ−４：ＨＥＲ３に対して指向しており、かつ、配列番号１２〜２６の免疫グロブリン単一可変ドメインのいずれかの観点に応じた免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１の結合を交差遮断する、観点Ｆ−１〜Ｆ−３のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６０３】
観点Ｆ−５：ＨＥＲ３に対して指向しており、かつ、配列番号１２〜２６の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１によるＨＥＲ３に対する結合から交差遮断されている、観点Ｆ−１〜Ｆ−３のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６０４】
観点Ｆ−６：観点Ｆ−４又はＦ−５のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、その際、前記免疫グロブリン単一可変ドメインの交差遮断する能力又は交差遮断される能力は、例えば実験部分に説明するようなＦＡＣＳ競合アッセイにおいて検出される。
【０６０５】
観点Ｆ−７：観点Ｆ−４又はＦ−５のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、その際、前記免疫グロブリン単一可変ドメインの交差遮断する能力又は交差遮断される能力は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて検出される。
【０６０６】
観点Ｆ−８：実質的に単離された形にある、観点Ｆ−１〜Ｆ−７のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６０７】
観点Ｆ−９：被験体への投与のための、観点Ｆ−１〜Ｆ−８のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、前記免疫グロブリン可変ドメインは、前記被験体中で自然発生しない。
【０６０８】
観点Ｆ−１０：解離定数（ＫD）１０-5〜１０-12モル／リットル以下、好ましくは１０-7〜１０-12モル／リットル以下、より好ましくは１０-8〜１０-12モル／リットルでＨＥＲ３に特異的に結合できる、観点Ｆ−１〜Ｆ−９のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６０９】
観点Ｆ−１１：１０2Ｍ-1ｓ-1〜約１０7Ｍ-1ｓ-1、好ましくは１０3Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1、より好ましくは１０4Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1、例えば１０5Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1の会合速度（ｋon速度）でＨＥＲ３に特異的に結合できる、観点Ｆ−１〜Ｆ−１０のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６１０】
観点Ｆ−１２：１ｓ-1〜１０-6ｓ-1、好ましくは１０-2ｓ-1〜１０-6ｓ-1、より好ましくは１０-3ｓ-1〜１０-6ｓ-1、例えば１０-4ｓ-1〜１０-6ｓ-1の解離速度（ｋoff速度）でＨＥＲ３に特異的に結合できる、観点Ｆ−１〜Ｆ−１１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６１１】
観点Ｆ−１３：５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば１ｎＭ未満の親和性でＨＥＲ３に特異的に結合できる、観点Ｆ−１〜Ｆ−１２のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６１２】
観点Ｆ−１４：（任意の好適な種由来の）自然発生する免疫グロブリン単一可変ドメインであるか又は合成又は半合成の免疫グロブリン単一可変ドメインである、観点Ｆ−１〜Ｆ−１３のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６１３】
観点Ｆ−１５：免疫グロブリンフォールドを含むか又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成できる、観点Ｆ−１〜Ｆ−１４のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６１４】
観点Ｆ−１６：免疫グロブリン配列である、観点Ｆ−１〜Ｆ−１５のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６１５】
観点Ｆ−１７：（任意の好適な種由来の）自然発生する免疫グロブリン配列であるか又は合成又は半合成の免疫グロブリン配列である、観点Ｆ−１〜Ｆ−１６のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６１６】
観点Ｆ−１８：ヒト化した免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列又は親和性成熟のような技術により得られた免疫グロブリン配列である、観点Ｆ−１〜Ｆ−１７のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６１７】
観点Ｆ−１９：軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶL配列）、又は、重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶH配列）、から実質的になる、観点Ｆ−１〜Ｆ−１９のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６１８】
観点Ｆ−２０：慣用の四鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から実質的になるか又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から実質的になる、観点Ｆ−１〜Ｆ−１９のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６１９】
観点Ｆ−２１：ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適である免疫グロブリン単一可変ドメイン）から、単一ドメイン抗体（又は単一ドメインとしての使用に好適である免疫グロブリン単一可変ドメイン）から、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適である免疫グロブリン単一可変ドメイン）から、又は、ＶＨＨ又は改変したＶＨＨから、実質的になる、観点Ｆ−１〜Ｆ−２０のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６２０】
観点Ｆ−２２：ＶＨＨ又は改変したＶＨＨから実質的になる、観点Ｆ−１〜Ｆ−２１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６２１】
観点Ｆ−２３：表Ｂ−２で言及した特徴残基から選択したKabat numberingに応じた位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８に好ましくは１以上のアミノ酸残基を有するＶＨＨ又は改変したＶＨＨから実質的になる、観点Ｆ−１〜Ｆ−２２のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６２２】
観点Ｆ−２４：次のことが該当する、免疫グロブリン単一可変ドメインから実質的になる、観点Ｆ−１〜Ｆ−２３のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン：
ｉ）配列番号１２−２６の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、その中で、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する、
かつ、その中で、
ｉｉ）好ましくは、Kabat numberingに応じた位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８にある１以上のアミノ酸残基は、表Ｂ−２で言及する特徴残基から選択される。
【０６２３】
観点Ｆ−２５：配列最適化したＶＨＨから実質的になる、観点Ｆ−１〜Ｆ−２４のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６２４】
観点Ｇ−１：ＣＤＲ配列により形成される結合のための少なくとも１の結合部位に加えて、他の抗原、タンパク質又は標的に対する結合のための１以上の更なる結合部位を含む、前述の観点のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６２５】
観点Ｈ−１：ＨＥＲ３に対して指向している、及び／又は、特異的に結合できるＶＨＨ。
【０６２６】
観点Ｈ−２：実質的に単離された形にある、観点Ｈ−１に応じたＶＨＨ。
【０６２７】
観点Ｈ−３：解離定数（ＫD）１０-5〜１０-12モル／リットル以下、好ましくは１０-7〜１０-12モル／リットル以下、より好ましくは１０-8〜１０-12モル／リットルでＨＥＲ３に特異的に結合できる、観点Ｈ−１〜Ｈ−２のいずれかに応じたＶＨＨ。
【０６２８】
観点Ｈ−４：１０2Ｍ-1ｓ-1〜約１０7Ｍ-1ｓ-1、好ましくは１０3Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1、より好ましくは１０4Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1、例えば１０5Ｍ-1ｓ-1〜１０7Ｍ-1ｓ-1の会合速度（ｋon速度）でＨＥＲ３に特異的に結合できる、観点Ｈ−１〜Ｈ−３のいずれかに応じたＶＨＨ。
【０６２９】
観点Ｈ−５：１ｓ-1〜１０-6ｓ-1、好ましくは１０-2ｓ-1〜１０-6ｓ-1、より好ましくは１０-3ｓ-1〜１０-6ｓ-1、例えば１０-4ｓ-1〜１０-6ｓ-1の解離速度（ｋoff速度）でＨＥＲ３に特異的に結合できる、観点Ｈ−１〜Ｈ−４のいずれかに応じたＶＨＨ。
【０６３０】
観点Ｈ−６：５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＨＥＲ３に特異的に結合できる、観点Ｈ−１〜Ｈ−５のいずれかに応じたＶＨＨ。
【０６３１】
観点Ｈ−７：（例えばラマから）自然発生するＶＨＨ又は合成又は半合成ＶＨＨである、観点Ｈ−１〜Ｈ−６のいずれかに応じたＶＨＨ。
【０６３２】
観点Ｈ−８：ＶHH配列、部分的にヒト化したＶHH配列、完全にヒト化したＶHH配列、ラクダ化重鎖可変ドメイン又は親和性成熟のような技術により得られたＶＨＨである、観点Ｈ−１〜Ｈ−７のいずれかに応じたＶＨＨ。
【０６３３】
観点Ｈ−９：表Ｂ−２で言及する特徴残基から選択される、Kabat numberingに応じた位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８にある１以上のアミノ酸残基を好ましくは有する観点Ｈ−１〜Ｈ−８のいずれかに応じたＶＨＨ。
【０６３４】
観点Ｈ−１０：次のことが該当する、観点Ｈ−１〜Ｈ−９のいずれかに応じたＶＨＨ：
ｉ）配列番号１２−２６の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、その中で、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する、
かつ、その中で、
ｉｉ）好ましくは、Kabat numberingに応じた位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８にある１以上のアミノ酸残基は、表Ｂ−２で言及する特徴残基から選択される。
【０６３５】
観点Ｈ−１１：次のことが該当する、Ｈ−１〜Ｈ−１０のいずれかに応じたＶＨＨ：
−ＣＤＲ１が、次のものからなる群から選択される：
ａ）配列番号５７〜７１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｂ）配列番号５７〜７１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｃ）配列番号５７〜７１の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
及び／又は
−ＣＤＲ２が、次のものからなる群から選択される：
ｄ）配列番号８７〜１０１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｅ）配列番号８７〜１０１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｆ）配列番号８７〜１０１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
及び／又は
−ＣＤＲ３が、次のものからなる群から選択される：
ｇ）配列番号１１７〜１３１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｈ）配列番号１１７〜１３１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｉ）配列番号１１７〜１３１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６３６】
観点Ｈ−１２：次のことが該当する、観点Ｈ−１〜Ｈ−１１のいずれかに応じたＶＨＨ：
−ＣＤＲ１が、次のものからなる群から選択される：
ａ）配列番号５７〜７１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｂ）配列番号５７〜７１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｃ）配列番号５７〜７１の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
及び
−ＣＤＲ２が、次のものからなる群から選択される：
ｄ）配列番号８７〜１０１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｅ）配列番号８７〜１０１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｆ）配列番号８７〜１０１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
及び
−ＣＤＲ３が、次のものからなる群から選択される：
ｇ）配列番号１１７〜１３１の免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｈ）配列番号１１７〜１３１の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、
ｉ）配列番号１１７〜１３１の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１と３、２又は１のアミノ酸相違を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【０６３７】
観点Ｈ−１３：観点Ｈ−１及びＨ−１２のいずれかに応じたＶＨＨ、その際、このＣＤＲ配列が、配列番号１２−２６の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１のＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば、９５％以上のアミノ酸同一性、又は実質的に１００％すらのアミノ酸同一性を有する。
【０６３８】
観点Ｈ−１４：部分的にヒト化したＶＨＨである、観点Ｈ−１〜Ｈ−１３のいずれかに応じたＶＨＨ。
【０６３９】
観点Ｈ−１５：完全にヒト化したＶＨＨである、観点Ｈ−１〜Ｈ−１４のいずれかに応じたＶＨＨ。
【０６４０】
観点Ｈ−１６：配列番号１２−２６からなる群から、又は、配列番号１２−２６の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１と８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の配列同一性（本願で定義するとおり）を有する免疫グロブリン単一可変ドメインからなる群から、選択される、観点Ｈ−１〜Ｈ−１５のいずれかに応じたＶＨＨ。
【０６４１】
観点Ｈ−１７：ヒト化したＶＨＨである、観点Ｈ−１〜Ｈ−１６のいずれかに応じたＶＨＨ。
【０６４２】
観点Ｈ−１８：配列番号１２−２６からなる群から選択される、観点Ｈ−１〜Ｈ−１７のいずれかに応じたＶＨＨ。
【０６４３】
観点Ｈ−１９：配列番号１２〜２６の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１のＨＥＲ３に対する結合を交差遮断するＨＥＲ３に対して指向しているＶＨＨ。
【０６４４】
観点Ｈ−２０：配列番号１２〜２６の免疫グロブリン単一可変ドメイン少なくとも１によりＨＥＲ３に対する結合が交差遮断されているＨＥＲ３に対して指向しているＶＨＨ。
【０６４５】
観点Ｈ−２１：観点Ｈ−１９又はＨ−２０のいずれかに応じたＶＨＨ、その際、ＶＨＨの交差遮断する能力又は交差遮断される能力は、例えば実験部分に説明するようなＦＡＣＳ競合アッセイにおいて検出される。
【０６４６】
観点Ｈ−２２：観点Ｈ−１９〜Ｈ−２１のいずれかに応じたＶＨＨ、その際、ＶＨＨの交差遮断する能力又は交差遮断される能力は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて検出される。
【０６４７】
観点Ｋ−１：観点Ａ−１〜Ａ２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５、Ｇ−１のいずれかに応じた１以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じた１以上のＶＨＨを含むか又は実質的にこれらからなる（さらに、任意に、１以上のペプチドリンカー及び／又は以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットを含む）ポリペプチド。
【０６４８】
観点Ｋ−２：観点Ｋ−１に応じたポリペプチド、その際、前記の１以上の結合ユニットは、免疫グロブリン配列、特にＩＳＶである。
【０６４９】
観点Ｋ−３：観点Ｋ−１又はＫ−２のいずれかに応じたポリペプチド、その際、前記の１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットは、ドメイン抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインであってドメイン抗体としての使用に好適なもの、単一ドメイン抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインであって単一ドメイン抗体としての使用に好適なもの、「ｄＡｂ」、免疫グロブリン単一可変ドメインであってｄＡｂとしての使用に好適なもの、又はＶＨＨからなる群から選択される。
【０６５０】
観点Ｋ−４：観点Ｋ−１〜Ｋ−３のいずれかに応じたポリペプチド、その際、前記の１以上の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、免疫グロブリン配列である。
【０６５１】
観点Ｋ−５：観点Ｋ−１〜Ｋー４のいずれかに応じたポリペプチド、その際、前記の１以上の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ドメイン抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインであってドメイン抗体としての使用に好適なもの、単一ドメイン抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインであって単一ドメイン抗体としての使用に好適なもの、「ｄＡｂ」、免疫グロブリン単一可変ドメインであってｄＡｂとしての使用に好適なもの、又はＶＨＨからなる群からなる群から選択される。
【０６５２】
観点Ｋ−６：観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じた１以上のナノボディを含むか又はこれから実質的になり、その際、前記１以上の他の結合ユニットはナノボディである、観点Ｋ−１〜Ｋ−５のいずれかに応じたポリペプチド。
【０６５３】
観点Ｋ−７：観点Ｋ−１〜Ｋ−６のいずれかに応じたポリペプチド、その際、少なくとも１の結合ユニットは多価コンストラクトである。
【０６５４】
観点Ｋ−８：観点Ｋ−１〜Ｋ−７のいずれかに応じたポリペプチド、その際、少なくとも１の結合ユニットはマルチパラトープ性コンストラクトである。
【０６５５】
観点Ｋ−９：観点Ｋ−１〜Ｋ−８のいずれかに応じたポリペプチド、その際、少なくとも１の結合ユニットは多特異性コンストラクトである。
【０６５６】
観点Ｋ−１０：それぞれ、観点Ａ−１〜Ａ２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５、又はＧ−１自体のいずれかに応じた相応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又は観点Ｈ−１〜Ｈ−２２自体のいずれかに応じたＶＨＨに比較して、増加した半減期を有する、観点Ｋ−１〜Ｋ−９のいずれかに応じたポリペプチド。
【０６５７】
観点Ｋ−１１：前記の１以上の他の結合ユニットが、それぞれ、観点Ａ−１〜Ａ２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５、又はＧ−１自体のいずれかに応じた相応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又は観点Ｈ−１〜Ｈ−２２自体のいずれかに応じたＶＨＨに比較して、増加した半減期をポリペプチドに提供する、観点Ｋ−１０に応じたポリペプチド。
【０６５８】
観点Ｋ−１２：ポリペプチドに増加した半減期を提供する前記の１以上の他の結合ユニットが、血清タンパク質又はそのフラグメント、血清タンパク質に結合できる結合ユニット、Ｆｃ部、及び、血清タンパク質に結合できる小タンパク質又はペプチド、からなる群から選択されている、観点Ｋ−１０又はＫ−１１に応じたポリペプチド。
【０６５９】
観点Ｋ−１３：ポリペプチドに増加した半減期を提供する前記の１以上の他の結合ユニットが、ヒト血清アルブミン又はそのフラグメントからなる群から選択されている、観点Ｋ−１０〜Ｋ−１２のいずれかに応じたポリペプチド。
【０６６０】
観点Ｋ−１４：ポリペプチドに増加した半減期を提供する前記の１以上の他の結合ユニットが、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）に結合できる結合ユニットからなる群から選択されている、観点Ｋ−１０〜Ｋ−１３のいずれかに応じたポリペプチド。
【０６６１】
観点Ｋ−１５：観点Ｋ−１０〜Ｋ−１４のいずれかに応じたポリペプチド、その際、ポリペプチドに増加した半減期を提供する前記の１以上の他の結合ユニットは、ドメイン抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインであってドメイン抗体としての使用に好適なもの、単一ドメイン抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインであって単一ドメイン抗体としての使用に好適なもの、「ｄＡｂ」、免疫グロブリン単一可変ドメインであってｄＡｂとしての使用に好適なもの、又はＶＨＨであって血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）に結合できるものからなる群から選択される。
【０６６２】
観点Ｋ−１６：ポリペプチドに増加した半減期を提供する前記の１以上の他の結合ユニットが、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）に結合できるＶＨＨである、観点Ｋ−１０〜Ｋ−１５のいずれかに応じたポリペプチド。
【０６６３】
観点Ｋ−１７：それぞれ、観点Ａ−１〜Ａ２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５、Ｇ−１自体のいずれかに応じた相応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又は観点Ｈ−１〜Ｈ−２２自体のいずれかに応じたＶＨＨの半減期に比較して、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍又は２０倍超より長い、血清半減期を有する観点Ｋ−１０〜Ｋ−１６のいずれかに応じたポリペプチド。
【０６６４】
観点Ｋ−１８：それぞれ、観点Ａ−１〜Ａ２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５、Ｇ−１自体のいずれかに応じた相応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又は観点Ｈ−１〜Ｈ−２２自体のいずれかに応じたＶＨＨに比較して、１時間超、より好ましくは２時間超、よりいっそう好ましくは６時間超、例えば１２時間超、好ましくは２４、４８又は７２時間超増加した血清半減期を有する、観点Ｋ−１０〜Ｋ−１７のいずれかに応じたポリペプチド。
【０６６５】
観点Ｋ−１９：少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、よりいっそう好ましくは少なくとも７２時間以上の、例えば、少なくとも５日（例えば約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば、約１０〜１５日）、又は少なくとも約１１日（例えば、約１１〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば、約１２〜１８日以上）、又は１４日より多い（例えば、約１４〜１９日）のヒト中血清半減期を有する、観点Ｋ−１〜Ｋ−１８のいずれかに応じたポリペプチド。
【０６６６】
観点Ｌ−１：観点Ａ−１〜Ａ２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた１以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じた１以上のＶＨＨを含むか又は実質的にこれらからなる（さらに、任意に、１以上のリンカーを介して連結した、１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットを含む）化合物又はコンストラクト。
【０６６７】
観点Ｌ−２：前記の１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットが、免疫グロブリン単一可変ドメインである、観点Ｌ−１に応じた化合物又はコンストラクト。
【０６６８】
観点Ｌ−３：前記の１以上のリンカーが、存在する場合には、１以上の免疫グロブリン単一可変ドメインである、観点Ｌ−１又はＬ−２に応じた化合物又はコンストラクト。
【０６６９】
観点Ｌ−４：前記の１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットが、免疫グロブリン配列である、観点Ｌ−１〜Ｌ−３のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト。
【０６７０】
観点Ｌ−５：観点Ｌ−１〜Ｌ−４のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト、その際、前記の１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットは、ドメイン抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインであってドメイン抗体としての使用に好適なもの、単一ドメイン抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインであって単一ドメイン抗体としての使用に好適なもの、「ｄＡｂ」、免疫グロブリン単一可変ドメインであってｄＡｂとしての使用に好適なもの、又はＶＨＨからなる群から選択される。
【０６７１】
観点Ｌ−６：観点Ｌ−１〜Ｌ−５のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト、その際、前記の１以上の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、免疫グロブリン配列である。
【０６７２】
観点Ｌ−７：観点Ｌ−１〜Ｌー６のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト、その際、前記の１以上の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ドメイン抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインであってドメイン抗体としての使用に好適なもの、単一ドメイン抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインであって単一ドメイン抗体としての使用に好適なもの、「ｄＡｂ」、免疫グロブリン単一可変ドメインであってｄＡｂとしての使用に好適なもの、又はＶＨＨからなる群からなる群から選択される。
【０６７３】
観点Ｌ−８：観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じた１以上のＶＨＨ又はナノボディを含むか又は実質的にこれらからなり、その際、前記の１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットがＶＨＨである、化合物又はコンストラクト。
【０６７４】
観点Ｌ−９：多価コンストラクトである、観点Ｌ−１〜Ｌ−８のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト。
【０６７５】
観点Ｌ−１０：多特異性コンストラクトである、観点Ｌ−１〜Ｌ−９のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト。
【０６７６】
観点Ｌ−１１：それぞれ、観点Ａ−１〜Ａ２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５、又はＧ−１自体のいずれかに応じた相応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又は観点Ｈ−１〜Ｈ−２２自体のいずれかに応じたＶＨＨに比較して、増加した半減期を有する、観点Ｌ−１〜Ｌ−１０のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト。
【０６７７】
観点Ｌ−１２：前記の１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットが、それぞれ、観点Ａ−１〜Ａ２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５、又はＧ−１自体のいずれかに応じた相応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又は観点Ｈ−１〜Ｈ−２２自体のいずれかに応じたＶＨＨに比較して、増加した半減期を化合物又はコンストラクトに提供する、観点Ｌ１〜Ｌ１１のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト。
【０６７８】
観点Ｌ−１３：化合物又はコンストラクトに増加した半減期を提供する１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットが、血清タンパク質又はそのフラグメント、血清タンパク質に結合できる結合ユニット、Ｆｃ部、及び、血清タンパク質に結合できる小タンパク質又はペプチド、からなる群から選択されている、観点Ｌ−１２に応じた化合物又はコンストラクト。
【０６７９】
観点Ｌ−１４：化合物又はコンストラクトに増加した半減期を提供する前記の１以上の前記他の基、残基、部分又は結合ユニットが、ヒト血清アルブミン又はそのフラグメントからなる群から選択されている、Ｌ−１２又はＬ−１３に応じた化合物又はコンストラクト。
【０６８０】
観点Ｌ−１５：化合物又はコンストラクトに増加した半減期を提供する前記の１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットが、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）に結合できる結合ユニットからなる群から選択されている、観点Ｌ−１２〜Ｌ−１４のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト。
【０６８１】
観点Ｌ−１６：観点Ｌ−１２〜Ｌ−１４のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト、その際、化合物又はコンストラクトに増加した半減期を提供する前記の１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットは、ドメイン抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインであってドメイン抗体としての使用に好適なもの、単一ドメイン抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインであって単一ドメイン抗体としての使用に好適なもの、「ｄＡｂ」、免疫グロブリン単一可変ドメインであってｄＡｂとしての使用に好適なもの、又はＶＨＨであって血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）に結合できるものからなる群から選択される。
【０６８２】
観点Ｌ−１７：化合物又はコンストラクトに増加した半減期を提供する前記の１以上の他の基、残基、部分又は結合ユニットが、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）に結合できるＶＨＨである、観点Ｌ−１２〜Ｌ−１４のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト。
【０６８３】
観点Ｌ−１８：それぞれ、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１自体のいずれかに応じた相応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又は観点Ｈ−１〜Ｈ−２２自体のいずれかに応じたＶＨＨの半減期に比較して、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍又は２０倍超より長い、血清半減期を有する観点Ｌ−１２〜Ｌ−１７のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト。
【０６８４】
観点Ｌ−１９：それぞれ、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１自体のいずれかに応じた相応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又は観点Ｈ−１〜Ｈ−２２自体のいずれかに応じたＶＨＨに比較して、１時間超、より好ましくは２時間超、よりいっそう好ましくは６時間超、例えば１２時間超、好ましくは２４、４８又は７２時間超増加した血清半減期を有する、観点Ｌ−１２〜Ｌ−１８のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト。
【０６８５】
観点Ｌ−２０：少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、よりいっそう好ましくは少なくとも７２時間以上又はそれより多い、例えば、少なくとも５日（例えば約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば、約１０〜１５日）、又は少なくとも約１１日（例えば、約１１〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば、約１２〜１８日又はそれより多い）、又は１４日より多い（例えば、約１４〜１９日）のヒト中血清半減期を有する、観点Ｌ−１２〜Ｌ−１９のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト。
【０６８６】
観点Ｌ−２１：観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたＶＨＨを含むか又は実質的にこれらからなる、一価コンストラクト。
【０６８７】
観点Ｌ−２２：観点Ｌ−２１に応じた一価コンストラクト、その際、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ドメイン抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインであってドメイン抗体としての使用に好適なもの、単一ドメイン抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインであって単一ドメイン抗体としての使用に好適なもの、「ｄＡｂ」、免疫グロブリン単一可変ドメインであってｄＡｂとしての使用に好適なもの、又はＶＨＨからなる群から選択される。
【０６８８】
観点Ｌ−２３：観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じた１のＶＨＨを含むか又は実質的にこれらからなる、一価コンストラクト。
【０６８９】
観点Ｍ−１：核酸又はヌクレオチド配列であって観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメインをコードするもの、ＶＨＨであって観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたもの、いずれかの観点に応じた化合物又はコンストラクトであってこれをコードする核酸又はヌクレオチド配列、例えば配列番号２７−４１の核酸又はヌクレオチド配列の少なくとも１の配列と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、例えば９５％以上の配列同一性、又は実質的に１００％すらの配列同一性を有する核酸又はヌクレオチド配列の発現により得られることができるもの。
【０６９０】
観点Ｍ−２：遺伝子コンストラクトの形にある、観点Ｍ−１に応じた核酸又はヌクレオチド。
【０６９１】
観点Ｎ−１：宿主又は宿主細胞であって、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたＶＨＨ、観点Ｋ−１〜Ｋ−１９のいずれかに応じたポリペプチド、観点Ｌ−１〜Ｌ−２１のいずれかに応じた化合物又はコンストラクトであってこれをコードする核酸又はヌクレオチド配列の発現により得られることができるもの、又は観点Ｌ−２２又はＬ−２３のいずれかに応じた一価コンストラクト、を発現するか又は好適な環境下で発現することができ、かつ／又は、観点Ｍ−１に応じた核酸又はヌクレオチド配列又は観点Ｍ−２に応じた遺伝子コンストラクトを含む、宿主又は宿主細胞。
【０６９２】
観点Ｏ−１：少なくとも１の、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたＶＨＨ、観点Ｋ−１〜Ｋ−１９のいずれかに応じたポリペプチド、観点Ｌ−１〜Ｌ−２１のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト、観点Ｌ−２２又はＬ−２３のいずれかに応じた一価コンストラクト、又は、観点Ｍ−１又はＭ−２に応じた核酸又はヌクレオチド配列、を含む組成物。
【０６９３】
観点Ｏ−２：医薬組成物である、観点Ｏ−１に応じた組成物。
【０６９４】
観点Ｏ−３：少なくとも１の医薬的に許容可能な担体、希釈剤又は付形剤及び／又は助剤、及び、任意に１以上の更なる医薬的に活性のあるポリペプチド及び／又は化合物をさらに含む医薬組成物である、観点Ｏ−２に応じた組成物。
【０６９５】
観点Ｐ−１：観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたＶＨＨ、観点Ｋ−１〜Ｋ−１９のいずれかに応じたポリペプチド、観点Ｌ−１〜Ｌ−２１のいずれかに応じた化合物又はコンストラクトであってこれをコードする核酸又はヌクレオチド配列の発現により得ることができるもの、又は、観点Ｌ−２２又はＬ−２３のいずれかに応じた一価コンストラクト、の製造方法であって、少なくとも次の工程を含む製造方法：
ａ）好適な宿主細胞又は宿主生物中に又は別の好適な発現システム中に、観点Ｍ−１に応じた核酸又はヌクレオチド配列、又は、観点Ｍ−２に応じた遺伝子コンストラクトを発現させる工程、
任意にその後、
ｂ）こうして得られた、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたＶＨＨ、観点Ｋ−１〜Ｋ−１９のいずれかに応じたポリペプチド、観点Ｌ−１〜Ｌ−２１のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト、又は、観点Ｌ−２２又はＬ−２３のいずれかに応じた一価コンストラクトを単離及び／又は精製する工程。
【０６９６】
観点Ｐ−２：観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたＶＨＨ、観点Ｋ−１〜Ｋ−１９のいずれかに応じたポリペプチド、観点Ｌ−１〜Ｌ−２１のいずれかに応じた化合物又はコンストラクトであってこれをコードする核酸又はヌクレオチド配列の発現により得ることができるもの、又は、観点Ｌ−２２又はＬ−２３のいずれかに応じた多価コンストラクト、の製造方法であって、少なくとも次の工程を含む製造方法：
ａ）観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたＶＨＨ、観点Ｋ−１〜Ｋ−１９のいずれかに応じたポリペプチド、観点Ｌ−１〜Ｌ−２１のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト、又は、観点Ｌ−２２又はＬ−２３のいずれかに応じた一価コンストラクトを宿主又は宿主細胞が発現及び／又は生産する条件下で、観点Ｎ−１に応じた宿主又は宿主細胞を培養及び／又は維持する工程、
任意にその後、
ｂ）こうして得られた、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたＶＨＨ、観点Ｋ−１〜Ｋ−１９のいずれかに応じたポリペプチド、観点Ｌ−１〜Ｌ−２１のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト、又は、観点Ｌ−２２又はＬ−２３のいずれかに応じた一価コンストラクトを単離及び／又は精製する工程。
【０６９７】
観点Ｑ−１：少なくとも次の工程を含む、ＨＥＲ３に対して指向している免疫グロブリン単一可変ドメインをスクリーニングする方法：
ａ）免疫グロブリン単一可変ドメインをコードする核酸のセット、コレクション又はライブラリーの提供、
ｂ）ＨＥＲ３に結合できる及び／又はＨＥＲ３に親和性を有する、かつ、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば配列番号１２−２６）（表Ａ−１）又は本発明のヒト化した免疫グロブリン単一可変ドメインが交差遮断されているか又は交差遮断している免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は、本発明のヒト化免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は、本発明のポリペプチド又はコンストラクト、例えば配列番号１４７−３２７、より好ましくはＨＥＲ３ＭＳ００１３５（配列番号２８２）、ＨＥＲ３ＭＳ００２１２（配列番号３１９）又はＨＥＲ３ＭＳ００２１５（配列番号３２２）（表Ａ−２参照）をコードする核酸配列について核酸配列の前記セット、コレクション又はライブラリーのスクリーニングをする工程、
ｃ）前記核酸配列の単離、その後に、前記免疫グロブリン単一可変ドメインの発現をする工程。
【０６９８】
観点Ｒ−１：少なくとも１の、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたＶＨＨ、観点Ｋ−１〜Ｋ−１９のいずれかに応じたポリペプチド、観点Ｌ−１〜Ｌ−２１のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト、観点Ｌ−２２又はＬ−２３のいずれかに応じた一価コンストラクト、又は、観点Ｏ−２又はＯ−３に応じた組成物、の医薬的に活性のある量を、必要とする被験体に投与することを含む、少なくとも１の種々の癌の予防及び／又は治療のための方法。
【０６９９】
観点Ｒ−２：少なくとも１の、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたＶＨＨ、観点Ｋ−１〜Ｋ−１９のいずれかに応じたポリペプチド、観点Ｌ−１〜Ｌ−２１のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト、観点Ｌ−２２又はＬ−２３のいずれかに応じた一価コンストラクト、又は、観点Ｏ−２又はＯ−３に応じた組成物の医薬的に活性のある量を、必要とする被験体に投与することを含む、ＨＥＲ３に、その生物学的又は薬理学的活性に、及び／又は、ＨＥＲ３が関与する生物学的経路又はシグナリングに関連している少なくとも１の疾病又は疾患の予防及び／又は治療のための方法。
【０７００】
観点Ｒ−３：少なくとも１の、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたＶＨＨ、観点Ｋ−１〜Ｋ−１９のいずれかに応じたポリペプチド、観点Ｌ−１〜Ｌ−２１のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト、観点Ｌ−２２又はＬ−２３のいずれかに応じた一価コンストラクト、又は、観点Ｏ−２又はＯ−３に応じた組成物の医薬的に活性のある量を、必要とする被験体に投与することを含む、少なくとも１の、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたＶＨＨ、観点Ｋ−１〜Ｋ−１９のいずれかに応じたポリペプチド、観点Ｌ−１〜Ｌ−２１のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト、観点Ｌ−２２又はＬ−２３のいずれかに応じた一価コンストラクト、又は、観点Ｏ−２又はＯ−３に応じた組成物を、これを必要とする被験体に投与することにより予防及び／又は治療できる少なくとも１の疾病又は疾患の予防及び／又は治療のための方法。
【０７０１】
観点Ｒ−４：少なくとも１の、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたＶＨＨ、観点Ｋ−１〜Ｋ−１９のいずれかに応じたポリペプチド、観点Ｌ−１〜Ｌ−２１のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト、観点Ｌ−２２又はＬ−２３のいずれかに応じた一価コンストラクト、又は、観点Ｏ−２又はＯ−３に応じた組成物の医薬的に活性のある量を必要とする被験体に投与することを含む、免疫療法のための方法。
【０７０２】
観点Ｒ−５：少なくとも１の種々の癌の予防及び／又は治療のための医薬組成物の製造における、及び／又は、観点Ｒ−１〜Ｒ−３に応じた１以上の方法における使用のための、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたＶＨＨ、観点Ｋ−１〜Ｋ−１９のいずれかに応じたポリペプチド、観点Ｌ−１〜Ｌ−２１のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト、又は、観点Ｌ−２２又はＬ−２３のいずれかに応じた一価コンストラクト、の使用。
【０７０３】
観点Ｒ−６：少なくとも１の種々の癌の予防及び／又は治療のための、観点Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−４、Ｄ−１〜Ｄ−６、Ｅ−１〜Ｅ−１３、Ｆ−１〜Ｆ−２５又はＧ−１のいずれかに応じた免疫グロブリン単一可変ドメイン、観点Ｈ−１〜Ｈ−２２のいずれかに応じたＶＨＨ、観点Ｋ−１〜Ｋ−１９のいずれかに応じたポリペプチド、観点Ｌ−１〜Ｌ−２１のいずれかに応じた化合物又はコンストラクト、観点Ｌ−２２又はＬ−２３のいずれかに応じた一価コンストラクト、又は、観点Ｏ−２又はＯ−３に応じた組成物。
【図面の簡単な説明】
【０７０４】
【図１】図１は、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドのいくつかをコードするヌクレオチド配列を示す図である。
【図２】図２は、完全長細胞外ニワトリＨＥＲ３又はキメラニワトリ−ヒト−ＨＥＲ３への、ＨＥＲ３特異的ナノボディ及びコントトールポリクローナル（ＰＣ）及びモノクローナル（ＭＣ）抗体及び関係のないナノボディ（irr nb）のＦＡＣＳ結合データを示す図である。
【図３】図３（Ａ〜Ｄ）は、多価配列最適化ナノボディがＨＥＲ３へ結合するが、他のＨＥＲタンパク質へ結合しないことを示す結合曲線を示す図である（実施例２５参照）。
【図４】図４は、本願の発明の詳細な説明及び特許請求の範囲において参照されるいくつかのタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】図５（Ａ及びＢ）は、フォーマット化された配列最適化されたナノボディによる、ＢＴ−４７４乳癌細胞中のｐＨＥＲ３及び下流シグナリングの阻害を示すウェスタンブロットを示す図である（実施例２８）
【図６】図６（Ａ〜Ｃ）は、フォーマット化された配列最適化されたナノボディによる、ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞中のｐＨＥＲ３及び下流シグナリングの阻害を示すウェスタンブロットを示す図である（実施例２８）。
【図７】図７（Ａ〜Ｃ）は、それぞれ、ナノボディＨＥＲ３ＭＳ００１３５（図７Ａ）、ＨＥＲ３ＭＳ００２１２（図７Ｂ）及びＨＥＲ３ＭＳ００２１５（図７Ｃ）、で処理したＡ５４９異種移植片腫瘍の腫瘍成長（期間にわたるメディアン腫瘍体積）の阻害を示す図である。
【０７０５】
実験部分
実施例１：材料
１．１  ｈＨＥＲ３  ＥＣＤ（＝ヒトＨＥＲ３細胞外ドメイン）−配列番号４
ヒトＨＥＲ３細胞外ドメインをコードする遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成により作成した。オープンリーディングフレームは、ＨＥＲ３遺伝子の同族のシグナルペプチドのコード配列、その後の、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の６２４アミノ酸、及び、Ｃ末端の６ヒスタグを含んだ（配列番号４参照）。この遺伝子を、ｐＥＡＫ１２ｄ発現ベクター（Edge Biosystems）中にクローニングした。ＨＥＲ３  ＥＣＤを、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（Invitrogen）の一過的トランスフェクションにより生産した。簡単にいうと、ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（４ｍｌ／Ｌのインスリン−トランスフェリン−セレン−Ｘサプリメント及び１％のウシ胎児血清（全てInvitrogen）を含む）中の懸濁成長に適合させた細胞をプラスミドＤＮＡ及びポリエチレンイミン（PEI, PolySciences）の混合物でインキュベーションした。９０分後に、トランスフェクションした細胞を１：１でFreestyle培地（Invitrogen）中で希釈し、そして、１６０ｒｐｍでの撹拌下で５％のＣＯ2インキュベーター中のオービタルシェーカー上に３７℃で配置した。上清を６日後に回収し、０．２２μｍのメンブランカートリッジ（Millipore）を通じて滅菌フィルター処理した。組み換えタンパク質を、Ｎｉイオンを負荷したPoros 20 MC金属キレート親和性クロマトグラフィカラム（Applied Biosystems）で、その後、GE HealthcareからのHiLoad Superdex 75 prepgrade 16/60カラムでＰＢＳ中でサイズ排除クロマトグラフィカラムにより精製した。
【０７０６】
１．２  ｃＨＥＲ３  ＥＣＤ（＝カニクイザル（Macaca fascicularis）ＨＥＲ３細胞外ドメイン＝ｃｙｎｏ  ＨＥＲ３  ＥＣＤ）−配列番号３
ｃｙｎｏＨＥＲ３配列を、ＲＴ−ＰＣＲ及びｃＤＮＡ配列決定により決定した。オープンリーディングフレームは、ｃＨＥＲ３遺伝子の同族のシグナルペプチドのコード配列、その後の、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の６２４アミノ酸、及び、Ｃ末端の６ヒスタグを含んだ（配列番号３）。この遺伝子を、ｐＥＡＫ１２ｄ発現ベクター（Edge Biosystems）中にクローニングした。
【０７０７】
ＨＥＲ３  ＥＣＤを、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（Invitrogen）の一過的トランスフェクションにより生産した。簡単にいうと、ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（４ｍｌ／Ｌのインスリン−トランスフェリン−セレン−Ｘサプリメント（全てInvitrogen）を含む）中の懸濁成長に適合させた細胞をプラスミドＤＮＡ及びポリエチレンイミン（PEI, PolySciences）で、予備混合なしに、インキュベーションした。１５０分後に、トランスフェクションした細胞を１：３でFreestyle培地（Invitrogen）中で希釈し、そして、８０ｒｐｍでの撹拌下で５％のＣＯ2インキュベーター中のオービタルシェーカー上に３７℃で配置した（半径２．５ｃｍ）。温度を２４時間インキュベーション後に３４℃に低下させた。上清を５日後に回収し、０．２２μｍのメンブランカートリッジ（Millipore）を通じて滅菌フィルター処理した。組み換えタンパク質を、Ｎｉイオンを負荷した、HisTrap HP金属キレート親和性クロマトグラフィカラム（GE Healthcare）で精製し、その後、ＰＢＳに対して透析した。
【０７０８】
１．３  ｈＨＥＲ３  完全長配列−配列番号１
ヒトＨＥＲ３配列（配列番号１）を合成により生産し、それぞれpcDNA3.1及び pcDNA5/FRT（Invitrogen）中にクローニングした。最終発現プラスミドpcDNA3.1-hHER3を、ＨＥＲ３発現するトランスフェクションした細胞株を作成すべく使用した。
【０７０９】
１．４  ＨＥＲ３発現トランスフェクタントの作成
ＨＥＫ２９３  Ｔ細胞（ＤＳＭＺ）を、Fugene HD（Roche）をトランスフェクション剤として使用して、pcDNA3.1-hHER3を用いて一過的トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、ラマを免疫化するために使用した。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ）をpcDNA3.1-hHER3でトランスフェクションし、単一細胞ソーティングし、かつ、ＨＥＲ３特異的モノクローナル抗体（R&D Systems）及びＦＡＣＳ分析を用いて細胞を染色することにより、高度かつ均質なＨＥＲ３発現について選択した。１のクローンを選択し、ヒトＨＥＲ２（配列番号９）をコードするpcDNA3.1-hygroでトランスフェクションし、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ダブルトランスフェクション細胞を獲得した。細胞を単一細胞ソーティングし、そして、ＨＥＲ２特異的モノクローナル抗体（R&D Systems）及びＦＡＣＳ分析を用いた細胞の染色により、クローンを高度かつ均質なＨＥＲ２発現で選択した。これら細胞を、結合及び競合実験において使用した。
【０７１０】
ＦｌｐＩｎ  ＣＨＯ細胞(Invitrogen, #R-758-7)を、pcDNA5/FRT-hHER3プラスミドでトランスフェクションし、ヒグロマイシン選択下で成長させた。
【０７１１】
ラクダ細胞株（CAKI; Nguyen et al. 2001. Adv. Immunol. 79: 261-296）をpcDNA3.1-hHER3（配列番号１）でトランスフェクションし、そして、単一細胞ソーティングしたクローンを選択し、選択実験において使用した。
【０７１２】
実施例２：ＨＥＲ３特異的ナノボディの同定
２．１免疫化
the Ethical Committee of the Faculty of Veterinary Medicine (University Ghent, Belgium)の承認を得た後に、標準プロトコルに応じて８匹のラマを免疫化した。３匹のラマ（３４０、３４２、３４５）に、自家作成したHER3-ECD（ＥＣＤ；細胞外ドメイン）配列番号４の筋肉内注射４回を隔週（biweekly）の間隔で、用量１００、５０、２５及び２５マイクログラムで行った。５匹のラマ（４１９、４２０、４２１、４２９、４３０）に、２×１０7の一過的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３−ＨＥＲ３細胞の皮下注射４回を隔週の間隔で行った。
【０７１３】
２．２  ラマ中の誘発した応答の評価
免疫化手順の終了時に、全ての動物から血清試料を回収し、ＥＬＩＳＡによりＨＥＲ３に対する免疫応答の誘発を評価した。要するに、組み換えヒトＨＥＲ３／Ｆｃキメラを、９６ウェルMaxisorpプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）中で固定化させた。血清希釈の遮断及び添加後に、特異的に結合した免疫グロブリンを、ラマＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３に特異的なモノクローナル抗体及びウサギ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートを用いて検出した。著しいＨＥＲ３特異的免疫応答が全ての動物において観察された。この抗体応答は両者とも慣用かつ重鎖だけの抗体Ｂ細胞レパートリーにより高められ、というのも、特異的に結合した免疫グロブリンは、慣用のラマＩｇＧ１抗体又は重鎖だけのラマＩｇＧ２及びＩｇＧ３抗体を特異的に認識する抗体を用いて検出されることができるからである。
【０７１４】
表Ｃ−１；ＨＥＲ３特異的血清力価の概要。血清力価は、シグナル対ノイズ１≧２を生じる最高血清希釈として定義されている。
【表５０】
2013529079.tif 000051
【０７１５】
１  シグナル対ノイズを、免疫化後（４９、５０又は６４日）の１日の血液回収のＯＤ４５０ｎｍ吸収対免疫前（０日）血清試料の比として定義してある。
【０７１６】
２．３  ライブラリー構築
末梢血由来単核細胞を、製造者支持に従って、Ficoll-Hypaqueを用いて血液試料から調製した。これら細胞から及びリンパ節から抽出した全ＲＮＡを、ナノボディをコードする遺伝子フラグメントを増幅するための、ＲＴ−ＰＣＲのための出発材料として使用した。これらフラグメントを、ファージミドベクターpAX50中にクローニングした。ファージを、標準的プロトコル（Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press; 1st edition (October 28, 1996)）に応じて調製し、更に使用するまでフィルター滅菌後４℃で貯蔵した。全部で、８つのライブラリーが構築され（３４０、３４２、３４５、４１９、４２０、４２１、４２９及び４３０）、ライブラリーサイズは３×１０8〜８．５×１０8であり、インサートのパーセンテージは９１〜１００％であった。
【０７１７】
２．４  ＨＥＲ３特異的ナノボディの研究における選択
ヒトＨＥＲ３を認識するナノボディを同定するために、ファージライブラリーを、溶解性ビオチン化ＨＥＲ３−ＥＣＤ（配列番号４）でインキュベーションした。タンパク質を実施例１に説明するとおりに生産し、Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce)を用いてビオチン化した。ビオチン化ＨＥＲ３及びファージの複合体を溶液からストレプトアビジンコートした磁気ビーズ上で捕捉した。ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いた強力な洗浄後に、結合したファージを１ｍｇ／ｍｌのトリプトシン又は１μＭのＨＲＧ（R&D systems）の添加により溶出した。ファージライブラリー３４０、３４２及び３４５を、溶解性ビオチン化ヒトＨＥＲ３−ＥＣＤ（０．１〜１００ｎＭ）で、ファージライブラリー４１９、４２０、４２１、４２９及び４３０を、溶解性ビオチン化ヒトＨＥＲ３−ＥＣＤ（１−１０−１００−１０００ｎＭ）で２回の連続的なラウンドにおいてインキュベーションした。これら選択のアウトプットを、濃縮係数（コントロールに相対的に溶出物中に存在するファージの数）について分析し、かつ、これらの第１のラウンドのアウトプットからの個々のクローンを取り出した。全てのファージライブラリーを、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ）又はラクダ細胞株（ＣＡＫＩ細胞；Nguyen et al.2001. Adv. Immunol. 79: 261-296)）であってｈＨＥＲ３（ｈＨＥＲ３＝ヒトＨＥＲ３＝配列番号１）で又はｈＨＥＲ２及びｈＨＥＲ３（ｈＨＥＲ２＝ヒトＨＥＲ２＝配列番号９）（５×１０6細胞）でトランスフェクションしたものも用いて２回の連続的なラウンドにおいてインキュベーションもした。第３の選択戦略は、ＨＥＲ３特異的ナノボディ（０４Ｃ０７及び２１Ｆ０６、１０μｇ／ｍｌ）でのプレートコーティング、ＨＥＲ３−ＥＣＤ（５−１００ｎＭ）の捕捉及び異なるエピトープへのファージ結合の濃縮のためのファージライブラリーの添加からなった。トリプシンをファージを溶出すべく使用し、アウトプットを、同じか又は代わりのナノボディを用いてコーティングしたプレート上の第２ラウンドの選択のためのインプットとして使用した。個々のクローンを、異なる選択条件から回収した。
【０７１８】
全ての個々のクローンを９６ディープウェルプレート中で成長させた（１ｍｌ体積）。ナノボディ発現を、１ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧの添加により誘導した。周辺質抽出物を、細胞ペレットの凍結及び１００μｌ  ＰＢＳ中への溶解により調製した。細胞デブリを遠心分離により除去した。
【０７１９】
２．５  ｈＨＥＲ３に結合するナノボディのスクリーニング
ｈＨＥＲ３へのナノボディの結合能を決定すべく、周辺質抽出物を、細胞ベース結合ＦＡＣＳアッセイ（FACS Array, BectonDickinson）においてスクリーニングした。試料を、ｈＨＥＲ３又はｈＨＥＲ２／ｈＨＥＲ３でトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣細胞とインキュベーションし、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、抗ｃ−ｍｙｃ−特異的抗体（Serotec）を用いてナノボディの結合を検出した。ｈＨＥＲ３へのナノボディ結合を同定した。
【０７２０】
２．６  ＨＲＧ１−β１結合と競合するナノボディについてのスクリーニング
ナノボディのＨＲＧ１−β１（ｈＨＲＧ＝ヒトヘレグリン）遮断能を決定するために、周辺質抽出物を、ＦＭＡＴ技術（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いた細胞ベース競合アッセイにおいてスクリーニングした。ＨＲＧ１−β１−ＥＧＦ（R&D Systems, #396-HB, Accession # NP_039250）をＡ６４７でラベル化し、ナノボディの存在下でｈＨＥＲ２／ｈＨＥＲ３でトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣細胞とインキュベーションした。全ＦＬ１シグナル中の減少は、ラベル化ＨＲＧ１−β１の結合が周辺質抽出物中に存在するナノボディにより遮断されていることを示す。ナノボディを、１００％遮断から遮断なしまでにわたる、リガンド−レセプター相互作用の遮断の様々なレベルで同定した。ＨＥＲ３結合及びＨＲＧ１−β１競合スクリーニングに基づいて、ＨＥＲ３ナノボディのセットを選択し、かつ配列決定した。配列分析により、ＨＥＲ３特異的ナノボディの２０４個の異なるファミリーが明らかになった。
【０７２１】
２．７  ｈＨＥＲ３での周辺質抽出物の表面プラズモン共鳴分析
抗ＨＥＲ３ナノボディを含む周辺質抽出物のオフ速度を、Biacore T100機器を用いて表面プラズモン共鳴分析（ＳＰＲ）により測定した。ヒトＨＥＲ３−ＥＣＤ（配列番号４）をＣＭセンサーチップ表面にアミンカップリングを介して活性化のためにＥＤＣ／ＮＨＳを、不活性化のためにエタノールアミンＨＣｌを用いて共有結合させた。ＨＥＲ３特異的ナノボディを含む周辺質抽出物を流速４５μｍｌ／分で２分間注入し、チップ結合抗原への結合を可能にさせた。次に、周辺質抽出物なしの結合緩衝液をチップへと同じ流速で送入し、結合したナノボディの自然な解離を可能にさせた。異なる周辺質抽出物から得られたセンサーグラムから、ｋoff値（ｋd）を計算した。
【０７２２】
２．８  リガンド依存性ＨＥＲ３リン酸化を阻害するナノボディについてのスクリーニング
ＨＥＲ３リン酸化を遮断する能力を有するＨＥＲ３特異的ナノボディを同定すべく、周辺質抽出物を血清不足にしたＭＣＦ−７細胞で、その後５ｎＭのＨＲＧ１−β１−ＥＧＦ刺激で１５分間インキュベーションした。細胞ライセートが作成され、ＨＥＲ３のリン酸化をDuoSet 1C human phospho-HER3 ELISA (R&D systems, DYC 1769-2)を用いて測定した。ナノボディを、１００％遮断から阻害なしまでにわたる、リガンド誘発ｐＨＥＲ３阻害の様々なレベルで同定した。
【０７２３】
２．９  ナノボディのエピトープビニング
６つのＨＥＲ３特異的ナノボディをビオチン化し、かつ、アルファスクリーン及び／又はＦＡＣＳ競合アッセイにおいて使用し、ナノボディファミリーを異なるエピトープビンへとグループ分けする。ＦＡＣＳアッセイにおいて、ＨＥＲ３特異的ナノボディを含む周辺質抽出物を６つのビオチン化ナノボディのうちの１の存在下でインキュベーションした（使用した濃度は表Ｃ−２に示されている）。インキュベーション混合物を引き続き、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３トランスフェクションしたＣＨＯ細胞に添加した。インキュベーション９０分後、細胞を洗浄し、ビオチン化ナノボディの結合をストレプトアビジンＰＥを用いて検出した。この得られた蛍光シグナルを、周辺質抽出物ナノボディなしにビオチン化ナノボディが細胞に添加された条件から得られたシグナルに比較した。
【０７２４】
アルファスクリーン競合アッセイのために、製造者の支持に応じて調製した（PerkinElmer）、抗ヒトＦｃナノボディをコンジュゲートしたAcceptorビーズの上にヒトＨＥＲ３−Ｆｃ（R&D Systems, 348-RB）を捕捉した。抗ＨＥＲ３ナノボディの遮断能を評価するために、周辺質抽出物の希釈をビオチン化ナノボディの１に添加した（表Ｃ−２参照）。この混合物に、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃ−Acceptorビーズを添加し、１時間室温でインキュベーションした。次いで、ストレプトアビジンカップリングしたDonorビーズを添加し、さらに１時間室温でインキュベーションした。蛍光を、６８０ｎｍの励起波長及び５２０ｎｍの発光波長を用いてEn Vision Multilabel Plate Reader (PerkinElmer)を使用して測定した。
【０７２５】
表Ｃ−２：エピトープ競合ＦＡＣＳ及びアルファスクリーンにおいて使用されたビオチン化ナノボディの濃度及びアルファスクリーンにおいて使用されたヒトＨＥＲ３−Ｆｃの濃度。ＮＡ：適用可能でない。
【表５１】
2013529079.tif 000052
【０７２６】
非競合ナノボディを異なるエピトープグループにグループ分けした。５つの異なるグループを、アルファスクリーン及びＦＡＣＳ競合結果をもとにして同定した。
【０７２７】
実施例３：ｈＨＥＲ３特異的ナノボディの発現及び精製
説明したスクリーニングアッセイをもとにして、１５つのナノボディを更なる特性決定のために選択した。これらナノボディは、１３つの異なるファミリー及び５つの異なるエピトープビンに属する。配列は表Ａ−１中に示される（配列番号１２−２６）。
【０７２８】
ｃ−ｍｙｃとして大腸菌ＴＧ１細胞中でナノボディを、５００ｍｌの培養体積中でヒス６タグ化タンパク質を発現させた。発現を１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘導し、３時間３７℃で継続させた。細胞培養物のスピニング後に、周辺質抽出物をペレットの凍結融解及びｄＰＢＳ中への再懸濁により調製した。これら抽出物を、Histrap FF crude columns (GE Healthcare)を用いた固定化した金属親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）のための出発材料として使用した。ナノボディを２５０ｍＭのイミダゾールを用いてカラムから溶出させ、引き続き、ｄＰＢＳ（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline）に向けて脱塩させた。
【０７２９】
実施例４：ＥＬＩＳＡにおけるｈＨＥＲ３への精製したナノボディの結合能
５つの異なるエピトープビンに属する１４つの精製したナノボディの結合能を、ＥＬＩＳＡ中で決定した。９６ウェルプレートをｈＨＥＲ３−ＥＣＤ（１μｇ／ｍｌ）でコーティングした。５００ｎＭから開始して６ｐＭと低下する各ナノボディの希釈系列を試験し、かつ、マウス抗ｃ−ｍｙｃ（Roche）及び抗−マウス−ＨＲＰ（Dako cytomation）を用いて検出した。全てのナノボディはｈＨＥＲ３−ＥＣＤに結合し、かつ、こうして得られたＥＣ５０値を表Ｃ−３に示す。
【０７３０】
表Ｃ−３：ＥＬＩＳＡにより決定した、ｈＨＥＲ３−ＥＣＤへの種々の抗ＨＥＲ３ナノボディに関するＥＣ５０値及びその９５％信頼区間（ＣＩ）
【表５２】
2013529079.tif 000053
【０７３１】
実施例５：精製したナノボディの親和性
親和性測定を、Biacore T100機器を用いて、抗ヒトＦｃ抗体（GE Healthcare）をＣＭセンサーチップ表面にアミンカップリングを介して、活性化のためにＥＤＣ／ＮＨＳを、不活性化のためにエタノールアミンＨＣｌを用いてコーティングさせることにより、実施した。ＨＥＲ３−Ｆｃ（R&D systems, 348-RB ５μｇ／ｍｌ；１２０ｓ；１０μｌ／分）を注入して、このコーティングした抗Ｆｃ抗体により捕捉させた。次いで、精製したナノボディを流速１０μｍｌ／分で２分間注入し、チップ結合抗原への結合を可能にさせた。次に、ナノボディなしの結合緩衝液をチップへと同じ流速で送入し、結合したナノボディの自然な解離を可能にさせた。キネティックパラメーターｋon値（ｋa）、ｋoff値（ｋd）、及びＫD値を、異なるナノボディについて獲得したセンサーグラムから計算した（表Ｃ−４）。
【０７３２】
表Ｃ−４：精製したＨＥＲ３特異的ナノボディについてのキネティックパラメーター
【表５３】
2013529079.tif 000054
*  ヘテロ曲線（Heterogenous curve）：主たる相互作用（８９％）の結果を示す。
**  ヘテロ曲線（Heterogenous curve）：主たる相互作用（８４％）の結果を示す。
【０７３３】
実施例６：ＥＬＩＳＡにおけるｃｙｎｏＨＥＲ３への精製したナノボディの結合能
選択した精製したナノボディの結合能をＥＬＩＳＡにおいて決定した。９６ウェルプレートをｃＨＥＲ３−ＥＣＤ（１μｇ／ｍｌ）（配列番号４）でコーティングした。５００ｎＭから開始して６ｐＭと低下する各ナノボディの希釈系列を試験し、かつ、マウス抗ｃ−ｍｙｃ（Roche）及び抗−マウス−ＨＲＰ（Dako cytomation）を用いて検出した。全てのナノボディはｃｙｎｏＨＥＲ３−ＥＣＤに結合し、かつ、こうして得られたＥＣ５０値を表Ｃ−５に示す。
【０７３４】
表Ｃ−５：ＥＬＩＳＡにより決定した、ｃｙｎｏＨＥＲ３−ＥＣＤへの種々の抗ＨＥＲ３ナノボディに関するＥＣ５０値及びその９５％信頼区間
【表５４】
2013529079.tif 000055
【０７３５】
実施例７：精製したナノボディのＨＥＲ３特異性
精製したナノボディのオフ標的結合（Off-target binding）を、ＦＡＣＳにより、ヒトＨＥＲ１（配列番号８）、ヒトＨＥＲ２（配列番号９）、又はヒトＨＥＲ４（配列番号１０）でトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）へのその結合能の測定により評価した。トランスフェクションしてない細胞を、細胞バックグラウンドに対する結合を確認するために使用した。精製したＨＥＲ３特異的ナノボディ（２０００−６６６−２２２ｎＭ）を２×１０5細胞に添加し、３０分間４℃でインキュベーションし、かつ、マウス抗ｃ−ｍｙｃ（Serotec）及びヤギ抗マウス−ＰＥ（Jackson Immune-Research Laboratories）を用いて検出した。ポリクローナル抗体（抗ＨＥＲ１、R&D Systems AF231；抗ＨＥＲ２、R&D Systems AF1129；抗ＨＥＲ４、R&D Systems AF1131）の結合をポジティブコントロールとして使用した。低レベル結合が、ＨＥＲ２へのナノボディ２１Ｂ０２に関して観察され、その一方で、他の精製したナノボディはＨＥＲ１、ＨＥＲ２及びＨＥＲ４トランスフェクションした細胞へは結合しなかった（表Ｃ−６）。
【０７３６】
表Ｃ−６：ＦＡＣＳにより決定した、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、又はＨＥＲ４でトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣細胞への精製したナノボディ及びコントロールポリクローナル抗体の結合（データはＭＣＦ値を示す）。
【表５５】
2013529079.tif 000056
【０７３７】
実施例８：精製したナノボディパネルのエピトープマッピング
異なるエピトープビンへのナノボディの分類は、精製及び更なる特性決定のためにナノボディを選択するために重要な尺度であった（実施例２．９及び３参照）。ビオチン化ナノボディ０４Ｃ０７（４Ｃ０７とも称される）、２１Ｂ０２、２３Ｆ０５、１８Ｅ０８、１７Ｃ０８及び０４Ｆ１０（４Ｆ１０とも称される）を用いたＦＡＣＳ競合アッセイを、１４つの選択された精製したナノボディの３つの異なる濃度（４００、１００及び２５ｎＭ）を用いて繰り返した。グループ１及びグループ２に属するナノボディは、極めて類似するが、ナノボディ０４Ｆ１０と競合するその能力において異なる（表Ｃ−７）。グループ３及びグループ４のナノボディもまた、極めて類似するが、０４Ｆ１０及び１７Ｃ０８と競合するその能力において異なる。１のエピトープグループに分類されたナノボディは、同一のエピトープに結合すると考えられるが、その一方で、異なるエピトープグループのナノボディは、部分的に重複している（グループ１−２及びグループ３−４）又は重複しないエピトープに結合すると考えられる。
【０７３８】
表Ｃ−７：ビオチン化ナノボディに対する、１４つの選択された精製したナノボディのエピトープ競合ＦＡＣＳ。データは、４００ｎＭの濃度の非ビオチン化ナノボディでのパーセンテージの競合を示す。ＮＤ：決定せず
【表５６】
2013529079.tif 000057
【０７３９】
選択された精製したナノボディにより認識されるエピトープにおけるより詳細な洞察を得るべく、４つの別個のドメインへとＨＥＲ３細胞外ドメインを分割することに基づいて、種々のヒト−ニワトリＨＥＲ３キメラタンパク質を改変した。ニワトリＨＥＲ３の膜貫通及び細胞外領域をコードするプラスミドを構築し（配列Genbank アクセッション番号:DQ358720に基づく）、そして、ヒトのＨＥＲ３からの個々のドメインを有する変異体をニワトリ骨組へとスワッピングしたが、ヒトシグナル配列を用いた：
−ニワトリＨｅｒ３：ＡＡ１−２５ヒト、ＡＡ２６−６４２ニワトリ（配列番号２）、
−キメラニワトリＨｅｒ３−ヒトドメイン１：ＡＡ１−２０６ヒト、ＡＡ２０７−６４２ニワトリ（配列番号５）、
−キメラニワトリＨｅｒ３−ヒトドメイン２：ＡＡ１−２５ヒト、ＡＡ２６−２０６ニワトリ、ＡＡ２０７−３２８ヒト、ＡＡ３２９−６４２ニワトリ（配列番号６）、
−キメラニワトリＨｅｒ３−ヒトドメイン４：ＡＡ１−２５ヒト、ＡＡ２６−４９５ニワトリ、ＡＡ４９６−６４２ヒト（配列番号７）。
【０７４０】
ＨＥＲ３をコードするフラグメントを合成により生産し、ｐｃＤＮＡ３．１ (Invitrogen)中にクローニングした。ＨＥＫ２９３（DSMZ）細胞を、ニワトリ又はキメラＨＥＲ３コンストラクトを用いて一過的にトランスフェクションした。このコンストラクトの表面発現を、ヤギ抗ｈＨＥＲ３ポリクローナル抗体（R&D systems）を用いて確認した。ナノボディを一過的にトランスフェクションした細胞でインキュベーションし、抗ｃ−ｍｙｃ及びヤギ抗マウスＰＥを用いて結合を検出した。結合研究の結果を図２に示す。要約すると、ナノボディ１７Ｂ０５、１７Ｅ０８、１８Ｂ０５、１８Ｆ０５及び０４Ｃ０７（エピトープグループ１及び２）は、ヒトドメイン１を認識するが、その一方で、ナノボディ１８Ｅ０８及び１８Ｇ１１（エピトープグループ３）はヒトドメイン２に結合する。ナノボディ１７Ｃ０８（エピトープグループ４）は、ドメイン１及びドメイン２の両方を認識する。３つのナノボディ（２１Ｂ０２、２１Ｆ０６及び２３Ｆ０５（エピトープグループ５））は、ニワトリ交差反応性を示し、したがって、相応するエピトープは特定のヒトＨＥＲ３ドメインにはマッピングされることができなかった。
【０７４１】
ドメイン１は、リガンド結合に関与する一方で、ＨＥＲ二量体に関与する二量体ループはドメイン２に局在した（Baselga and Swain, 2009 Nature Reviews Cancer Vol 9, p 463-475）。したがって、ドメイン１へ結合するナノボディの作用機序は、リガンド結合の阻害に関連されることができ、ドメイン２へ結合するナノボディの作用機序は、ＨＥＲ二量体化の遮断に関連されることができる。
【０７４２】
実施例９：ＦＡＣＳにおける精製したナノボディのＨＲＧ１−β１競合能
精製したＨＥＲ３特異的ナノボディのＨＲＧ１−β１競合能をＦＡＣＳ競合実験においてｈＨＥＲ３でトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ、FlpIn, Invitrogen）を用いて決定した。６００ｎＭから開始して０．０３ｎＭ及び０．８ｎＭのＨＲＧ１−β１−ＥＧＦ（R&D systems, #396-HB）へと低下させた各ナノボディの希釈系列を、細胞（２×１０5）に添加し、９０分間の間４℃でインキュベーションした。ＦＡＣＳ緩衝液での細胞の洗浄後、検出をヤギ抗ＨＲＧ  ＥＣＤ（R&D systems）及びロバ抗ヤギＰＥ（Jackson ImmunoRe search Laboratories）を用いて実施した。ナノボディは、ＨＥＲ３結合に関してＨＲＧ１−β１−ＥＧＦとの完全な競合を示し、但し、ナノボディ１８Ｅ０８及び１８Ｇ１１は競合せず、ナノボディ１７Ｃ０８はナノボディ濃度６００ｎＭで部分的にのみ遮断した（７５％）。この得られたＩＣ５０値を表Ｃ−８に示す。エピトープグループ３に、そしてより少ない程度でグループ４にも属するナノボディのより低いＨＲＧ１−β１遮断能は、作用機序としてのドメイン２へのその結合及びＨＥＲトランスリン酸化の遮断に一致している。
【０７４３】
表Ｃ−８：ＦＡＣＳにより決定された、ＨＥＲ３でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞に対するＨＲＧ１−β１−ＥＧＦと種々の抗ＨＥＲ３ナノボディの間の競合に関するＩＣ５０値及びその９５％信頼区間。ＮＡ：適用可能でない。
【表５７】
2013529079.tif 000058
【０７４４】
実施例１０：精製したナノボディによるＨＥＲ３、Ａｋｔ及びＥＲＫ１／２リン酸化の阻害
リガンド誘発したＨＥＲ３リン酸化及び下流シグナリング阻害における一価ナノボディの効力を決定するために、ナノボディを以下に説明するとおりの細胞ベースアッセイにおいて試験した。
【０７４５】
ＭＣＦ−７細胞におけるリガンド誘発したｐＨＥＲ３（ｐｈｏｓｐｈｏＨＥＲ３）の阻害（細胞ベースの電気化学発光アッセイ（ＥＣＬＡ））：ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  ２２）を血清不足にさせ、３７℃、５％ＣＯ2中で６０分間血清不含媒体中でナノボディを用いてプレインキュベーションした（段階希釈、開始濃度６６６ｎＭ）。細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ１−β１  ＥＧＦドメイン（R&D Systems, #396-HB）で１０分間刺激し、上清を廃棄し、細胞を、冷たいＮＰ−４０溶解緩衝液（１％  ＮＰ−４０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（Calbiochem）、ホスファターゼ阻害剤カクテルセットＩＩ（Calbiochem））中で溶解させた。ＭＡ６０００  ９６ウェルプレート（MSD, # L15XB）を、３％のブロックＡ（ＭＳＤ）でＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ中で遮断し、かつ、ＨＥＲ３特異的捕捉抗体（R&D Systems, # MAB3481）でコーティングした。細胞ライセートを添加し、２時間室温（ＲＴ）でインキュベーションした。ビオチン化抗ホスホチロシン抗体（R&D Systems, # BAM1676）及びスルホタグストレプトアビジン試薬（MSD, #R32AD）を検出のために使用した（表Ｃ−９）。
【０７４６】
１０．１  下流シグナリングの阻害（ｐＡｋｔ／ｐＥＲＫ１／２）：
ＭＣＦ−７細胞をナノボディでプレインキュベーションし、上で説明したとおり刺激した。細胞ライセートを、製造者の指示に応じて、Phospho-Akt (Ser473) Whole Cell Lysate Kit (MSD, # K151CAD)及びPhospho-ERKl/2 Whole Cell Lysate Kit (MSD, # K111DWD)において試験した（表Ｃ−１０）。
【０７４７】
１０．２  ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３及びＨＥＲ２／ＨＥＲ３トランスリン酸化の阻害：
ＭＤＡ  ＭＢ４６８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  １３２）及びＣＨＯ  ＨＥＲ２／ＨＥＲ３細胞を血清不足にし、上で説明したように処理した（５０ｎｇ／ｍｌ  ＨＲＧ１−β１  ＥＧＦドメインでＭＤＡ  ＭＢ４６８刺激；１００ｎｇ／ｍｌ  ＨＲＧ１−β１  ＥＧＦドメインでＣＨＯ  ＨＥＲ２／ＨＥＲ３細胞刺激）。細胞ライセートをｐＨＥＲ３  ＥＣＬＡにおいて試験した（表Ｃ−９）。
【０７４８】
表Ｃ−９  精製したナノボディによるＨＲＧ１−β１依存性ＨＥＲ３リン酸化の阻害
【表５８】
2013529079.tif 000059
＜５０％＝５０％未満の阻害。
【０７４９】
表Ｃ−１０：ＨＲＧ１−β１誘発したｐＡＫＴ及びｐＥＲＫ１／２の阻害
【表５９】
2013529079.tif 000060
＜５０％＝５０％未満の阻害。
【０７５０】
精製したナノボディは、ＭＣＦ−７細胞、及び、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３（ＭＤＡ  ＭＢ４６８）又はＨＥＲ２／ＨＥＲ３を発現する細胞（ＣＨＯ  ＨＥＲ２／ＨＥＲ３）それぞれにおいてＨＲＧ１−β１誘発したＨＥＲ３リン酸化を有効に阻害したが、但し、１８Ｅ０８、０５Ａ０９、２１Ｂ０２、及び１７Ｃ０８（ＣＨＯ  ＨＥＲ２／ＨＥＲ３細胞におけるｐＨＥＲ３の５０％未満の阻害を示した）を除く。ＰＩ３キナーゼ経路（ｐＡｋｔ）阻害は、全てのナノボディで検出できた。より少ない程度でｐＥＲＫ１／２を通じた下流シグナリングがナノボディにより遮断できた。
【０７５１】
実施例９及び１０に示したデータは、グループ３のナノボディがリガンド結合の遮断なしにＨＥＲ３のトランスリン酸化を遮断することを示唆する。
【０７５２】
実施例１１：精製したナノボディの移動遮断能
ＨＲＧ１−β１依存性細胞移動を阻害するためのナノボディの能力を以下のアッセイにおいて評価した。Ａ４３１細胞（CRL 1555）を、ナノボディの存在下で（段階希釈；６６６ｎＭで開始）、ＨＴＳ Fluoroblock 96ウェルプレートインサート（BD Falcon #351164）において播種した。培地＋５００ｎＭ  ＨＲＧ１−β１細胞外ドメイン（R&D Systems, #377-HB）をこのボトムウェルに添加した。移動した細胞をカルセインＡＭで染色し、蛍光をプレートリーダーにより検出した。リガンド依存性癌細胞移動を阻害するナノボディが同定できた（表Ｃ−１１）。
【０７５３】
表Ｃ−１１；ＨＲＧ１−β１誘発した細胞移動の阻害
【表６０】
2013529079.tif 000061
＜５０％＝５０％未満の阻害。
【０７５４】
実施例１２：フォーマット化したナノボディの作成
多特異性に関する構造的要求は、異なる標的エピトープへの同時の結合を可能にすべく十分な柔軟性でもって２以上の結合ドメインを一緒に融合させること及び／又は異なる作用機序（リガンド結合遮断及びＨＥＲ二量体化遮断）でもって結合ドメインを１の分子に組み合わせることである。
【０７５５】
異なるエピトープに結合するナノボディを１の分子に組み合わせ、この分子の半減期を増加させるべく抗アルブミン結合ナノボディへと融合させた。ＧＳリンカーをナノボディ構成ブロックの間に挿入した。２つのＨＥＲ３特異的ナノボディ構成ブロックの結合は、標的に対するエントロピー増大した結合親和性の著しい損失なく同時に遮断し、より高い効力及び／又はより高い特異性を生じた。結合ドメインの最大限の柔軟性を可能にすべく、抗原を標的とするエピトープの注意深い選択及びリンカーの最適な設計は、標的の２以上の決定的部位の遮断を生じた。選択したフォーマット化したナノボディコンストラクトのアミノ酸配列を表Ａ−２に示す。
【０７５６】
実施例１３：一価ナノボディ１７Ｂ０５のＨＥＲ１−ＨＥＲ３ヘテロ二量体化遮断能の分析
ＥＧＦＲリガンド誘発したＨＥＲ３リン酸化阻害における一価ナノボディの効力を決定するために、ナノボディを以下に説明するとおりの細胞ベースアッセイにおいて試験した。
【０７５７】
ＣＨＯ  ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ３細胞におけるＥＧＦＲリガンド誘発したｐＨＥＲ３（ｐｈｏｓｐｈｏＨＥＲ３）の阻害（細胞ベースの電気化学発光アッセイ（ＥＣＬＡ））：ＣＨＯ  ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ３細胞を血清不足にさせ、３７℃、５％ＣＯ2中で６０分間血清不含媒体中でナノボディ又はＥＧＦＲ抗体セツキシマブ（段階希釈、６６６ｎＭ又は１６７ｎＭの開始濃度）を用いてプレインキュベーションした。細胞を１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＧＦα（R&D Systems, #239-HB）、ＥＧＦ（Sigma#E-9644）、又はｒｈエピレグリン（R&D Systems, #1195EP）それぞれで１０分間刺激し、上清を廃棄し、細胞を、冷たいＮＰ−４０溶解緩衝液（１％  ＮＰ−４０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（Calbiochem）、ホスファターゼ阻害剤カクテルセットＩＩ（Calbiochem））中で溶解させた。ＭＡ６０００  ９６ウェルプレート（MSD, # L15XB）を、３％のブロックＡ（ＭＳＤ）でＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中で遮断し、かつ、ＨＥＲ３特異的捕捉抗体（R&D Systems, # MAB3481）でコーティングした。細胞ライセートを添加し、２時間室温（ＲＴ）でインキュベーションした。ビオチン化抗ホスホチロシン抗体（R&D Systems, # BAM1676）及びスルホタグストレプトアビジン試薬（MSD, #R32AD）を検出のために使用した（表Ｃ−１２）。一価ナノボディ１７Ｂ０５は、ＥＧＦＲリガンド誘発したＨＥＲ３リン酸化を有効に遮断できたが、その一方で、ドメインＩＩバインダー１８Ｇ１１及び３４Ｃ０７はＥＧＦＲリガンド誘発したＨＥＲ３リン酸化を遮断できなかった。
【０７５８】
表Ｃ−１２：ＥＧＦＲリガンド誘発したＨＥＲ３リン酸化の阻害
【表６１】
2013529079.tif 000062
＜５０％＝５０％未満の阻害。
【０７５９】
実施例１４：半減期延長（ＨＬＥ）を有する親の多価ＨＥＲ３特異的ナノボディの作成
ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を遮断し、かつ、ＨＥＲ３のヘテロ二量体化も遮断する、半減期延長したナノボディ生成物を作成すべく、一価リードパネル（lead panel）ナノボディ（４Ｃ０７、１７Ｃ０８、１８Ｇ１１、２１Ｆ０６、３４Ｃ０７及び１７Ｂ０５）を二価及び多価分子へとフォーマット化した。
【０７６０】
半減期延長のために、コンストラクトを抗ＨＳＡナノボディＡＬＢ１１に融合させることが選択された。ライブラリーアプローチを、全ての可能性のあるナノボディ１−３５ＧＳ−ナノボディ２−９ＧＳ−ＡＬＢ１１組み合わせを生じるために、使用した。多価ナノボディをｃ−ｍｙｃ、Ｈｉｓ６タグ化タンパク質としてピキア・パストリス（Pichia pastoris）中で発現した。メタノールの段階的添加によりナノボディ発現の誘導が発生した。分泌したナノボディを有する清澄化培地を、固定化した金属親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）のための出発材料として使用し、その後、脱塩し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価して少なくとも９０％の純度を生じた。この精製した親の多価ＨＥＲ３特異的ナノボディを、２０ｎＭのＨＲＧ及び０．０５ｎＭ  ＨＥＲ３−Ｆｃを用いたＨＲＧ遮断アルファスクリーンにおいて試験した。この結果は、最良のナノボディ構成ブロックがフォーマット化したナノボディの効力を決定することを示唆した（表Ｃ−１３）。ナノボディ２１Ｆ０６は、このアッセイにおいて最も有効な多価構成ブロックであり（ＩＣ５０  １．３５Ｅ−１１Ｍ）、構成ブロックとして２１Ｆ０６を含む全てのコンストラクトは、５．６９Ｅ−１２Ｍ〜５．７７Ｅ−１１Ｍの間でＩＣ５０を有する。
【０７６１】
表Ｃ−１３：親の多価抗ＨＥＲ３ナノボディのＨＲＧ競合アルファスクリーン結果
【表６２】
2013529079.tif 000063
【表６３】
2013529079.tif 000064
【０７６２】
実施例１５：細胞アッセイにおけるＡＬＢ１１  ＨＬＥを用いた親の多価ナノボディのＨＲＧ誘発したシグナリング遮断能の分析
リガンド誘発したＨＥＲ３リン酸化及びＥＧＦＲ／Ｈｅｒ３及びＨｅｒ２／Ｈｅｒ３トランスリン酸化の阻害における多価ナノボディの効力を決定するために、以下に説明するとおり、ナノボディを細胞ベースアッセイにおいて試験した。ＭＣＦ−７細胞におけるリガンド誘発したｐＨＥＲ３（ｐｈｏｓｐｈｏＨＥＲ３）の阻害（細胞ベースの電気化学発光アッセイ（ＥＣＬＡ））：ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  ２２）を血清不足にさせ、３７℃、５％ＣＯ2中で６０分間血清不含媒体中でナノボディを用いてプレインキュベーションした（段階希釈、開始濃度６６６ｎＭ又は１６７ｎＭ）。細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ１−β１  ＥＧＦドメイン（R&D Systems, #396-HB）で１０分間刺激し、上清を廃棄し、細胞を、冷たいＮＰ−４０溶解緩衝液（１％  ＮＰ−４０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（Calbiochem）、ホスファターゼ阻害剤カクテルセットＩＩ（Calbiochem））中で溶解させた。ＭＡ６０００  ９６ウェルプレート（MSD, # L15XB）を、３％のブロックＡ（ＭＳＤ）でＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中で遮断し、かつ、ＨＥＲ３特異的捕捉抗体（R&D Systems, # MAB3481）でコーティングした。細胞溶解物を添加し、２時間室温（ＲＴ）でインキュベーションした。ビオチン化抗ホスホチロシン抗体（R&D Systems, # BAM1676）及びスルホタグストレプトアビジン試薬（MSD, #R32AD）を検出のために使用した（表Ｃ−１４）。ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３及びＨＥＲ２／ＨＥＲ３トランスリン酸化の阻害：ＭＤＡ  ＭＢ４６８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  １３２）及びＣＨＯ  ＨＥＲ２／ＨＥＲ３細胞を血清不足にし、上で説明したように処理した（５０ｎｇ／ｍｌ  ＨＲＧ１−β１  ＥＧＦドメインでＭＤＡ  ＭＢ４６８刺激；１００ｎｇ／ｍｌ  ＨＲＧ１−β１  ＥＧＦドメインでＣＨＯ  ＨＥＲ２／ＨＥＲ３細胞刺激）。細胞溶解物をｐＨＥＲ３  ＥＣＬＡにおいて試験した（表Ｃ−１４）。
【０７６３】
ＡｌｂＩＩを有する親の多価ナノボディは、ＭＣＦ−７細胞、また同様にＨＥＲ２／ＨＥＲ３を発現する細胞（ＣＨＯ  ＨＥＲ２／ＨＥＲ３）及びＥＧＦＲ／ＨＥＲ３を発現する細胞（ＭＤＡ−ＭＢ４６８）においてＨＲＧ１−β１誘発したＨＥＲ３シグナリングを有効に阻害した。
【０７６４】
表Ｃ−１４：Ａｌｂ１１  ＨＬＥを有する親の多価ナノボディによるＨＲＧ誘発したＨＥＲ３リン酸化の阻害
【表６４】
2013529079.tif 000065
【表６５】
2013529079.tif 000066
【０７６５】
実施例１６：細胞アッセイにおいてＡＬＢ  １１  ＨＬＥを有する親の多価ナノボディのＥＧＦＲ−ＨＥＲ３ヘテロ二量体化遮断能の分析
１の構成ブロックとして１７Ｂ０５を含む親の多価ナノボディ、Ａｌｂ１１、及び、第２のＨＥＲ３ナノボディ（０４Ｃ０７、１８Ｇ１１、２１Ｆ０６、３４Ｃ０７又は１７Ｂ０５）を、ＥＧＦＲリガンド誘発したＨｅｒ３リン酸化を遮断するためのその能力について試験した。全ての１７Ｂ０８を含む親の多価ナノボディは、一価１７Ｂ０５に関して実証したように、ＣＨＯ  ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３細胞においてＴＧＦα誘発したｐＨＥＲ３を有効に遮断した。
【０７６６】
ＣＨＯ  ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３細胞を血清不足にさせ、３７℃、５％ＣＯ2中で６０分間血清不含媒体中でナノボディ又はＥＧＦＲ抗体セツキシマブ（段階希釈、１６６．７ｎＭの開始濃度）を用いてプレインキュベーションした。細胞を１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＧＦα（R&D Systems, #239-A）で１０分間刺激し、上清を廃棄し、細胞を、冷たいＮＰ−４０溶解緩衝液（１％  ＮＰ−４０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（Calbiochem）、ホスファターゼ阻害剤カクテルセットＩＩ（Calbiochem））中で溶解させた。ＭＡ６０００  ９６ウェルプレート（MSD, # L15XB）を、３％のブロックＡ（ＭＳＤ）でＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中で遮断し、かつ、ＨＥＲ３特異的捕捉抗体（R&D Systems, # MAB3481）でコーティングした。細胞ライセートを添加し、２時間室温（ＲＴ）でインキュベーションした。ビオチン化抗ホスホチロシン抗体（R&D Systems, # BAM1676）及びスルホタグストレプトアビジン試薬（MSD, #R32AD）を検出のために使用した（表Ｃ−１５）。
【０７６７】
表Ｃ−１５：Ａｌｂ  １１  ＨＬＥ及び１７Ｂ０５を有する親の多価ナノボディによるＴＧＦα誘発したＨＥＲ３リン酸化の阻害
【表６６】
2013529079.tif 000067
＜５０％＝５０％未満の阻害。
【０７６８】
実施例１７：ＡＬＢ  １１  ＨＬＥを有する親の多価ナノボディによりＨＥＲ３インターナリゼーションの誘発
ＨＥＲ３インターナリゼーションに対するＨＥＲ３特異的ナノボディの作用を、ＭＣＦ−７及びＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞を用いて評価した。細胞を濃度１０5細胞／ｍｌの濃度で６ウェルプレート中に播種し、細胞インキュベーター中で３７℃で２日間インキュベーションした。次いで、１００ｎＭのナノボディを５μＭのＨＳＡ（Sigma, A8763）あり又はなしで添加し、細胞を２時間４℃又は３７℃でインキュベーションした。コントロールＭＡｂ１を有するウェル及びいかなるナノボディ又はＭＡｂも有さないウェルを、それぞれポジティブ及びネガティブコントロールとして考慮した。細胞洗浄後、これらを回収し、抗ＨＥＲ３（R&D systems, #AF234）及びロバ抗ヤギＰＥ（Jackson ImmunoResearch Laboratories）で染色した。試料をＦＡＣＳアレイ（Becton Dickinson）を用いて測定し、パーセンテージインターナリゼーションを、４℃でのネガティブコントロール条件中のものと３７℃条件にあるものとのＨＥＲ３表面発現の得られたシグナルを比較することにより決定した。いずれの一価ナノボディもＨＥＲ３インターナリゼーションを誘発できなかったが、その一方で、二価１７Ｂ０５は１７．８％インターナリゼーションを誘発した。二価１８Ｇ１１、３４Ｃ０７、４Ｃ０７及び２１Ｆ０６は６０−７０％インターナリゼーションを誘発し、これは、ポジティブコントロールＭＡｂ１（５７％インターナリゼーション）よりもわずかに高かった。ビパラトープ性のコンストラクトによるＨＥＲ３インターナリゼーションの誘発は、そのそれぞれの組成に依存した。２１Ｆ０６がコンストラクト中に存在する場合にはインターナリゼーションは観察されなかった。２１Ｆ０６なしのコンストラクトにおいては、インターナリゼーション（４０−７０％）は、Ｎ末端位置に１７Ｂ０５又は０４Ｃ０７が局在する場合にだけ観察された。同一の結果は、両方の細胞株で獲得された。
【０７６９】
実施例１８：配列最適化
ナノボディ４Ｃ０７、１７Ｂ０５、２１Ｆ０６、１８Ｇ１１及び３４Ｃ０７を、更に配列最適化のために考慮した。これは、親のナノボディ配列が、ヒトＶＨ３−ＪＨ生殖細胞系コンセンサス配列により同一であるナノボディ配列を生じるために突然変異されるプロセスである。ナノボディとヒトＶＨ３−ＪＨ生殖細胞系コンセンサスの間で異なるＦＲにおいて、いわゆる特徴残基を除き、特異的なアミノ酸は、タンパク質構造、活性及び安定性が完全なままに維持されるように、ヒトの対応物へと変更されている。親のナノボディアミノ酸配列は、ナノボディのラマＩＧＨＶ生殖細胞系アミノ酸配列（ラマＩＧＨＶ生殖細胞系に対するナノボディのＢｌａｓｔＰ分析からのトップヒットとして同定されている）へとアラインメントされてもおり、かつ、特定の場合には、ラマ生殖細胞系に対する突然変異が、ナノボディの安定化を増加させるため導入され、これはラマ化と定義される。加えて、後翻訳修飾（Post Translational Modifications、脱アミド化、異性体化、メチオニン酸化としてのＰＴＭ）のための可能性のある部位は、化学的安定性を保証するために変更されている。この分析は２回のラウンドで発生し、第１のラウンドではベーシック変異体での単一突然変異及び組み合わせ突然変異が評価された。これら結果に基づき、許容可能な置換が第２ラウンド変異体で組み合わされ、これは更に特性決定される。
【０７７０】
０４Ｃ０７中の６つのアミノ酸残基は、ヒト化目的のために置換されることができる。配列最適化プロセスにおいて、４つの０４Ｃ０７バージョン（ベーシックバージョン及び３つの付加的な変異体）を構築した。ベーシック変異体（ＨＥＲ３ＭＳ００４２）は、４つの置換を含む：Ａ１４Ｐ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ及びＱ１０８Ｌ。これら変化に加えて、Ａ４６Ｅ及びＬ９３Ａ置換を導入し、付加的な変異体中で調査した。このコンストラクトを大腸菌中で発現させ、ＩＭＡＣ及び脱塩により精製した。
【０７７１】
精製した分子を、アルファスクリーンを用いてそのＨＲＧ遮断能に関して評価した。この変異体の熱安定性をも、Lightcycler (Roche)を用いて熱シフトアッセイにおいて試験した。このアッセイにおいて、ナノボディ変異体を異なるｐＨでsypro orangeの存在下でインキュベーションし、温度勾配を適用した。ナノボディが変性を開始すると、sypro orangeが結合し、測定された蛍光が突然増加する。溶融温度は、特定のｐＨについて決定できる。結果をＣ−１６にまとめる。
【０７７２】
表Ｃ−１６：０４Ｃ０７の第１ラウンド配列最適化変異体の結果
【表６７】
2013529079.tif 000068
【０７７３】
ベーシック変異体は、親の０４Ｃ０７ナノボディと類似する効力をＨＲＧ遮断アルファスクリーンにおいて有し、このことは、位置１４、７４、８４及び１０８の突然変異が許容されたことを意味する。３〜４倍より低い効力が、変異体ＨＥＲ３ＭＳ００４３（Ａ４６Ｅ）及びＨＥＲ３ＭＳ００４４  （Ｌ９３Ａ）で観察され、これは、組み合わされた場合に、１８倍の効力減少と増える。全ての変異体は安定性にポジティブな影響を有し、というのも、親の０４Ｃ０７ナノボディについてよりもより高いＴｍ値が獲得されたからである。後翻訳修飾部位の分析は、位置Ｎ１０１での脱アミド化を示した（４０℃で４週間の貯蔵後の２２−２９％脱アミド化及びｐＨ９及び２５℃で３日間の貯蔵後の９−１４％脱アミド化）。Ｎ１０１Ｘのライブラリーを作成し、大腸菌中でトランスフェクションし、そして、ナノボディ含有周辺質ライセートをそのＨＲＧ遮断能に関して競合ＦＭＡＴにおいて、また同様に、組み換えＨＥＲ３のそのオフ速度に関して試験した。全ての試験した変異体は、９９−１００％の遮断と、２〜３倍より高いオフ速度を、親の０４Ｃ０７ナノボディに比較して生じた。変異体Ｎ１０１Ｇ及びＮ１０１Ｓを、更なる特性決定のために選択した。ピログルタマート形成は４０℃での４週間貯蔵後に６．６％であり、これは許容可能であり、かつ、位置１でのアミノ酸置換を必要としなかった。４つの変異体を第２ラウンド配列最適化において作成した。これらはベーシック変異体と置換Ａ４６Ｅ、Ｎ１０１Ｇ又はＮ１０１Ｓの組み合わせであった（表Ｃ−１７）。置換Ａ４６Ｅの導入は、ＨＲＧ競合アルファスクリーンにおいて、そしてＭＣＦ細胞中のｐＨＥＲ３遮断アッセイにおいて著しい効力減少を生じ、しかし、他方では、４．５℃のＴｍ増加としての増加した安定性が観察された。これら結果は、第１ラウンド配列最適化の結果と一致している。Ｎ１０１のＧ又はＳへの突然変異は、５〜６倍の効力減少及び１．５−２℃のＴｍ減少を生じた。変異体ＨＥＲ３ＭＳ００１２９及びＨＥＲ３ＭＳ００１３０を、更なる特性決定のために選択し、というのも、フォーマット化は一価フォーマット中のそのより低い効力をマスクできるからである。ＡｂＭ定義に基づくと、ＨＥＲ３ＭＳ００１２９についてのフレームワーク領域中のパーセンテージフレームワーク同一性は９５．５％であり、ＨＥＲ３ＭＳ００１３０については９４．４％であった。
【０７７４】
表Ｃ−１７：０４Ｃ０７の第２ラウンド配列最適化変異体の結果
【表６８】
2013529079.tif 000069
【０７７５】
２１Ｆ０６中の５つのアミノ酸残基をヒト化／ラマ化目的のために置換することができ、５つのアミノ酸置換を化学的安定性目的のために分析できた。配列最適化プロセスにおいて、４つの２１Ｆ０６バージョン（ベーシックバージョン及び３つの付加的な変異体）を構築した。ベーシック変異体（ＨＥＲ３ＭＳ００４６）は、４つの置換を含む：Ａ１４Ｐ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ及びＱ１０８Ｌ。これら変化に加えて、Ｇ４０Ａ及びＤ４４Ｅ置換を導入し、付加的な変異体中で調査した。このコンストラクトを大腸菌中で発現させ、ＩＭＡＣ及び脱塩により精製した。精製した分子を、アルファスクリーンを用いてそのＨＲＧ遮断能に関して評価した。変異体の熱安定性も熱シフトアッセイにおいてsypro orangeを使用しかつ温度勾配を適用して試験した。ナノボディが変性し始めると、sypro orangeが結合し、測定された蛍光が突然増加する。溶融温度は、特定のｐＨについて決定できる。結果をＣ−１８にまとめる。
【０７７６】
表Ｃ−１８：第１ラウンド配列最適化における２１Ｆ０６ヒト化変異体の結果
【表６９】
2013529079.tif 000070
【０７７７】
全ての試験した変異体は、親の２１ｆ０６ナノボディと類似する効力をＨＲＧ遮断アルファスクリーンにおいて有し、このことは、位置１４、４０、４４、７４、８４及び１０８の突然変異が許容されたことを意味する。Ｇ４０Ａ置換は、増加したＴｍ値を生じ、このことは、これがナノボディの安定性に対するポジティブな影響を有することを示唆する。２つの可能性のある異性体化部位及び１のＭｅｔ酸化部位を取り扱うために、アミノ酸Ｄ５４、Ｇ５５、Ｍ１００ｂ、Ｄ１０１及びＳ１０２がランダム化されているライブラリーを作成した。ライブラリーをＴＧ１に形質転換し、個々のコロニーを取り出して９６ウェルプレート中で成長させた。周辺質抽出物を調製し、配列決定し、スクリーニングした。全ての試験した変異体も２１Ｆ０６親も、ＨＲＧ競合ＦＭＡＴ実験において完全な遮断を生じ、かつ、オフ速度分析もこれら変異体と２１Ｆ０６親との間で区別をしなかった（６．２Ｅ-４−８．３Ｅ-４）。幾つかの変異体を、精製し、かつ、その熱安定性に関して試験するために、（起源及び置換したアミノ酸の類似する特性に基づいて）選択した。結果をＣ−１９に示す。
【０７７８】
表Ｃ−１９：第１ラウンド配列最適化における２１Ｆ０６化学的安定性のＴｍ結果
【表７０】
2013529079.tif 000071
【０７７９】
後翻訳修飾部位の分析は４０℃での４週間の貯蔵後に１４％のピログルタマートを示唆し、位置１には置換は導入されなかった。１３％の一酸化された材料が、室温で３時間１０ｍＭのＨ2Ｏ2で処理された後に観察された。Ｍ１００ｂの置換が必要とされ、突然変異Ｍ１００ｂＬがスクリーニングデータ及びＭ及びＬの物理的類似性に基づいて選択された。強制的な脱アミド化条件（４０℃で４週間又はｐＨ９で２５℃で３日間）下の親の２１Ｆ０６の貯蔵は、位置Ｎ７３で２０％の脱アミド化を誘発した。しかし、脱アミド化パーセンテージは２５℃での３週間の貯蔵後に３．２だけであった。ベーシック突然変異Ａ７４Ｓを含む２１Ｆ０６変異体の分析は、脱アミド化のわずかにより高いパーセンテージを示した：強制的な脱アミド化条件（３日間ｐＨ９及び２５℃で）下の貯蔵後に３７．１％及び２５℃での３週間の貯蔵後に４．９％。Ａ７４Ｓを更なる特性決定のために第２ラウンドの配列最適化において維持することが結論付けられ、というのも、これはヒト抗体に比較したパーセンテージのフレームワーク同一性を増加させ、かつ、脱アミド化はＤＳＰ／ＵＳＰの間に制御されることができるためであり、なぜなら、脱アミド分画＜５％だけが２５℃の条件下で観察されたからである。最後に、１２．９％の脱アミド化がＤ５４で観察され、スクリーニングデータ及びＤとＥの間の物理的類似性に基づいて突然変異Ｄ５４Ｅが選択された。
【０７８０】
第２ラウンド２１Ｆ０６配列最適化変異体ＨＥＲ３ＭＳ００１２２を作成し、これは置換Ａ１４Ｐ、Ｇ４０Ａ、Ｄ４４Ｅ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ及びＱ１０８Ｌを組み合わせている。この変異体及び親の２１Ｆ０６は、類似のＩＣ５０をＨＲＧアルファスクリーン競合アッセイにおいて、また同様に、ＭＣＦ７細胞を用いたｐＨＥＲ３遮断アッセイにおいて与え、かつ、同一のＴｍ値を示した。２１Ｆ０６変異体ＨＥＲ３ＭＳ００１２２は、ＡｂＭ定義に応じてフレームワーク領域において９１％のフレームワーク同一性を有する。
【０７８１】
これら結果に基づいて、ＨＥＲ３ＭＳ００１２２を最終配列最適化２１Ｆ０６ナノボディとして選択した。
【０７８２】
１８Ｇ１１中の５つのアミノ酸残基をヒト化目的のために置換でき、４つのアミノ酸置換を化学的安定性目的のために分析できた。この場合に、突然変異Ｋ８３Ｒ及びＱ１０８Ｌを含むベーシック変異体を作成した。次いで、位置４４、６１、６４、７４、７５及び７７に２6＝６４個の順列を有するベーシック変異体のミニライブラリーを構築した。突然変異Ｈ９３Ａを調査せず、というのも、この突然変異は、ヒト化がナノボディの効力に作用するだろう機会を増加させるＣＤＲ３に近いからである。
【０７８３】
このライブラリーをＴＧ１に形質転換し、個々のコロニーを取り出して９６ウェルプレート中で成長させた。周辺質抽出物を調製し、配列決定し、組み換えＨＥＲ３−Ｆｃに結合するためのビオチン化親１８Ｇ１１との競合に関してスクリーニングした。親の１８Ｇ１１ナノボディ及びそのベーシック変異体ＨＥＲ３ＭＳ００５０ は、アルファスクリーン（ＩＣ５０  ３．２Ｅ-９Ｍ）において同一の効力及び７２℃の同一Ｔｍを示した。この置換Ｗ７５Ｋは寛容されず、というのも、ＨＥＲ３結合における全損失が観察されたからである。３３つのユニークな競合物を組み換えＨＥＲ３−ＥＣＤに対するオフ速度に関して試験した。大抵のクローンは、親の１８Ｇ１１（ｋd  ６．２−７．７Ｅ-４ｓ-1）に比較して２倍より高いｋdの範囲にあり、３つの変異体のみが２−３倍より高いオフ速度を示した。この結果は、置換Ｅ６４Ｋ、Ｔ７４Ｓ、Ａ７７Ｔ、Ｋ８３Ｒ、Ｑ１０８Ｌが、１８Ｇ１１の効力又は安定性に作用を有しないことを示唆し、その一方で、効力における２８％の減少が置換Ｒ４４Ｑの存在で観察された。しかし、Ｒ４４Ｑ置換は約４℃でもってＴｍ値を増加させ、このことは、分子の安定性が改善されたことを示唆する。
【０７８４】
後翻訳修飾位置の分析は、位置１で、４０℃での４週間の貯蔵後に１２．３％のピログルタマート形成を明らかにしたが、このレベルはＥ１の置換を必要としなかった。位置９５での異性体変異体は、４０℃での４週間の貯蔵後に検出されることはできず、かつ、著しい酸化が、アミノ酸Ｍ９９及びＭ１０２でだけ観察された（室温で３時間の間１０ｍＭのＨ2Ｏ2を用いた強制的な酸化後に３０−４０％の一酸化された変異体）。２つの置換ライブラリーは、これらＭｅｔ酸化部位を取り扱うべく作成された（Ｍ９９Ｘ及びＭ１０２Ｘ）。このライブラリーをＴＧ１中に形質転換し、個々のコロニーを取り出して９６ウェルプレート中で成長させた。周辺質抽出物を調製し、配列決定し、組み換えＨＥＲ３−Ｆｃに結合するためのビオチン化親１８Ｇ１１との競合に関してスクリーニングした。引き続き、１８つのユニークな競合物を組み換えＨＥＲ３−ＥＣＤに対するオフ速度スクリーニングにおいて試験した。１６つのクローンが親の１８Ｇ１１と同一のｋd値を示した（６．１０Ｅ-４ｓ-1）。７つの変異体を、精製と、ＭＣＦ７細胞におけるｐＨＥＲ３シグナリングを遮断するためのその能力及び熱シフトアッセイを用いたその安定性に関する更なる特性決定とのために選択した。この結果を表Ｃ−２０に示す。置換Ｍ９９Ｌ及びＭ１０２Ｌを、効力、安定性及びロイシン及びメチオニンの類似の物理的特性に基づいて第２ラウンド配列最適化において試験するために選択した。
【０７８５】
表Ｃ−２０：第１ラウンド配列最適化における１８Ｇ１１変異体の結果
【表７１】
2013529079.tif 000072
【０７８６】
第２ラウンド１８Ｇ１１配列最適化において、２つの変異体を作成し、これはヒト化及び化学的安定性目的のための選択された置換を組み合わせる。両方の変異体の間の唯一の相違は、Ｒ４４Ｑの存在／非存在であった。両方の変異体は、親のナノボディに比較して約６℃のＴｍ値の増加を示した（表Ｃ−２１）。最後に、１８Ｇ１１変異体ＨＥＲ３ＭＳ００２１１をＲ４４Ｑ突然変異の非存在として選択し、わずかにより良好な効力を生じた。フレームワーク領域中の得られたパーセンテージフレームワーク同一性は、ＡｂＭ定義に応じて８７．６であった（Antibody Engineering, Vol 2、Kontermann & Duebel (Eds), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010を参照のこと）。
【０７８７】
表Ｃ−２１：第２ラウンド配列最適化における１８Ｇ１１変異体の結果
【表７２】
2013529079.tif 000073
【０７８８】
３４Ｃ０７中の７つのアミノ酸残基は、ヒト化目的のために置換されることができる。この場合に、突然変異Ｋ８３Ｒ及びＱ１０８Ｌを含むベーシック変異体を作成した。次いで、６つの変動可能な位置（２5×３＝９６順列）にわたる、７つの付加的なユニークな突然変異を有するベーシック変異体のミニライブラリーを構築した。突然変異Ｈ９３Ａは調査せず、というのも、この突然変異は、ヒト化がナノボディの効力に与えるだろう機会を増加させたＣＤＲ３に近いからである。ライブラリーをＴＧ１において形質転換し、個々のコロニーを取り出し、９６ウェルプレート中で成長させた。周辺質抽出物を調製し、配列決定し、組み換えＨＥＲ３−Ｆｃに結合するためのビオチン化親の３４Ｃ０７との競合に関してスクリーニングした。１２つのユニークな競合物を組み換えＨＥＲ３−ＥＣＤに対するオフ速度に関して試験した。大抵のクローンは、親の３４Ｃ０７に比較して２倍より高いｋdの範囲内にあった（ｋd  ３．７Ｅ-４−３．９Ｅ-４ｓ-1）。突然変異Ｗ７５Ｋは、３４Ｃ０７競合アルファスクリーンにおいて４０％未満の阻害及び親の３４Ｃ０７に比較して９５倍のオフ速度増加を示した。置換Ｇ１９Ｒ、Ｖ２３Ａ、Ｖ７１Ｒ、Ａ７４Ｓ、Ｖ８４Ｐ及びＶ８４Ａは、ＨＥＲ３に対する結合に作用しなかった。
【０７８９】
後翻訳修飾部位の分析は、４０℃での４週間の貯蔵後に４２％のピログルタマート形成を明らかにした。したがって、ナノボディ効力に対する置換Ｅ１Ｄの作用を第２ラウンド配列最適化において分析した。酸化（１０ｍＭ  Ｈ2Ｏ2、室温で３時間の間）、脱アミド化（４週間、４０℃で）又はＡｓｐ異性体化（４週間、４０℃で）は同定されず、このため、化学的安定性目的のために付加的なアミノ酸を置換する必要はなかった。
【０７９０】
４つのコンストラクトを、第２ラウンド配列最適化において作成した。これらは全て置換Ｇ１９Ｒ、Ｖ２３Ａ、Ｖ７１Ｒ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ及びＱ１０８Ｌを含むが、Ｅ１Ｄ、Ｖ８４Ａ及びＶ８４Ｐとは異なった（表Ｃ−２２）。コンストラクトを大腸菌中で発現させ、ＩＭＡＣ及び脱塩により精製した。精製した分子を３４Ｃ０７競合アルファスクリーン、ＨＥＲ３−ＥＣＤに対するオフ速度分析及びＨＲＧ刺激したＭＣＦ−７細胞におけるｐＨＥＲ３遮断アッセイを用いて特性決定した。結果を表Ｃ−２２にまとめる。
【０７９１】
表Ｃ−２２：第２ラウンド配列最適化における３４Ｃ０７変異体の結果
【表７３】
2013529079.tif 000074
【０７９２】
検査した置換が結合に著しく影響しないことが確認された。加えて、ｐＨＥＲ３遮断、オフ速度及びＴｍは、全ての試験した変異体及び親の３４Ｃ０７ナノボディにとって類似であった。最終変異体は、ＨＥＲ３ＭＳ００１２３及びＨＥＲ３ＭＳ００１２７になった（ナノボディが多価コンストラクト中Ｎ末端に局在する場合にＥ１Ｄ突然変異を含む）。ＡｂＭ定義に基づくと、ＨＥＲ３ＭＳ００１２３についてのフレームワーク領域中のパーセンテージフレームワーク同一性は８９．９％であり、ＨＥＲ３ＭＳ００１２７については８８％であった。
【０７９３】
１７Ｂ０５中の６つのアミノ酸残基をヒト化目的のために置換でき、２つのアミノ酸置換を化学的安定性目的のために分析できた。この場合に、突然変異Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ及びＱ１０８Ｌを含むベーシック変異体を作成した。次いで、ベーシック突然変異及び３つの付加的な突然変異の組み合わせを含む９つのコンストラクトを作成し、これを検査した（Ｉ７３Ｎ、Ｆ７９Ｙ及びＲ９３Ａ）。
【０７９４】
コンストラクトを大腸菌中で発現させ、ＩＭＡＣ及び脱塩により精製した。精製した分子を、アルファスクリーンを用いたＨＥＲ３−ＦｃへのＨＲＧ結合を遮断するためのその能力、ＨＥＲ３−ＥＣＤに対するオフ速度及び熱シフトアッセイを用いた安定性に関して試験した。結果をＣ−２３にまとめる。
【０７９５】
表Ｃ−２３：第１ラウンド配列最適化における１７Ｂ０５変異体の結果
【表７４】
2013529079.tif 000075
【０７９６】
置換Ｒ９３Ａがコンストラクト中に導入された場合に、効力における少なくとも９倍の減少がＨＲＧ遮断アルファスクリーンにおいて観察され、その一方で、他の置換は親の１７Ｂ０５に比較して類似のＩＣ５０を生じた。この観察をオフ速度データにより確認した。大抵の突然変異は、Ｔｍ値に少しのポジティブな影響も有した。
【０７９７】
後翻訳修飾部位の分析は、４０℃での４週間の貯蔵後に２５％のピログルタマート形成を明らかにした。したがって、ナノボディ効力に対する置換Ｅ１Ｄの作用を第２ラウンド配列最適化において分析した。酸化（１０ｍＭ  Ｈ2Ｏ2、室温で３時間の間）又はＡｓｎ脱アミド化（４週間、４０℃で）は同定されず、このため、化学的安定性目的のために付加的なアミノ酸を置換する必要はない。
【０７９８】
４つのコンストラクトを、第２ラウンド配列最適化において作成した。これらは全て置換Ｉ７３Ｎ、Ｆ７９Ｙ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ及びＱ１０８Ｌを含むが、Ｅ１Ｄ、Ｓ８４Ａ及びＳ８４Ｐとは異なった（表Ｃ−２４）。コンストラクトを大腸菌中で発現させ、ＩＭＡＣ及び脱塩により精製した。精製した分子をＨＥＲ３−Ｆｃに対するＨＲＧ競合アルファスクリーン、ＨＥＲ３−ＥＣＤに対するオフ速度分析及びＭＣＦ−７細胞におけるｐＨＥＲ３遮断アッセイを用いて特性決定した。結果を表Ｃ−２４にまとめる。
【０７９９】
表Ｃ−２４：第２ラウンド配列最適化における１７Ｂ０５変異体の結果
【表７５】
2013529079.tif 000076
【０８００】
検査した置換が結合及びＨＲＧ競合に著しく影響しないことが確認された。加えて、ｐＨＥＲ３遮断のためのＩＣ５０は、全ての試験した変異体及び親の１７Ｂ０５ナノボディにとって類似であった。Ｓ８４Ｐの導入はＴｍにポジティブな影響を有した。最終変異体は、ＨＥＲ３ＭＳ００１１９及びＨＥＲ３ＭＳ００１２１になった（ナノボディが多価コンストラクト中Ｎ末端に局在する場合にＥ１Ｄ突然変異を含む）。ＡｂＭ定義に基づくと、ＨＥＲ３ＭＳ００１１９についてのフレームワーク領域中のパーセンテージフレームワーク同一性は８９．９％であり、ＨＥＲ３ＭＳ００１２１については８８．８％であった。
【０８０１】
実施例１９：ＨＬＥを用いｔ多価配列最適化したＨＥＲ３特異的ナノボディの作成及び発現レベル分析
組み合わせを、ＨＥＲ３へのＨＲＧ結合を遮断する配列最適化ナノボディ（２１Ｆ０６、０４Ｃ０７及び１７Ｂ０５）、ＨＥＲ３ヘテロ二量体化を遮断するナノボディ（１７Ｂ０５）及びＨＥＲ３のドメインＩＩへ結合するナノボディ（１８Ｇ１１）から作成した。ＡＬＢ半減期延長部は、中央（Ｎｂ１−ＡＬＢ−Ｎｂ２）中に又はＣ末端位置（Ｎｂ１−Ｎｂ２−ＡＬＢ）に局在していた。異なる構成ブロックを２つの９ＧＳリンカー又は３５ＧＳリンカーと連結した。このコンストラクトを、タグなしタンパク質としてのピキア・パストリスにおいて生産し、ＭＥＰハイパーセル又はタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィにより精製し、その後脱塩した。コピー数スクリーンを実施し、小スケール培養物に基づいて最高コピー数を有するクローンに関して発現収量を予想した（表Ｃ−２５）。予期された収量に対するナノボディ構成ブロックの位置及びリンカー長さのわずかな影響が観察された。
【０８０２】
表Ｃ−２５：ＡＬＢ  １１  ＨＬＥを用いた精製された多価配列最適化抗ＨＥＲ３ナノボディの発現レベル分析の結果
【表７６】
2013529079.tif 000077
【表７７】
2013529079.tif 000078
【０８０３】
実施例２０：ＡＬＢ  １１  ＨＬＥを用いた多価配列最適化ナノボディによるＨＥＲ３インターナリゼーションの誘発
ＨＥＲ３インターナリゼーションに対する、ＨＬＥを用いたＨＥＲ３特異的多価配列最適化ナノボディの作用を、以前の例において説明したとおり、ＭＣＦ−７及びＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞を用いて評価した。２１Ｆ０６が多価コンストラクト中に存在する場合にはインターナリゼーションは観察されなかった。２１Ｆ０６なしのコンストラクトにおいては、インターナリゼーション（３６−７１％）は、Ｎ末端位置に１７Ｂ０５又は０４Ｃ０７が存在する場合にだけ観察された。この結果（表Ｃ−２６）は、両方の細胞株において同一であった。コンストラクトＨＥＲ３Ｍ００２０９は、ＡＬＢ１１に連結された配列最適化された１７Ｂ０５からなり、インターナリゼーションを示さなかった。これら結果は、親の多価コンストラクトで得られたものに類似し、かつ、選択された多価パネルが異なる作用機序を有する分子を含有したことを示唆する。２つのコントロール抗体をインターナリゼーションアッセイにおいても試験し、そして、これらは両者ＨＥＲ３のインターナリゼーションを誘発した。
【０８０４】
表Ｃ−２６：ＭＣＦ−７及びＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞に対する多価配列最適化ナノボディ又はコントロールＭＡｂにより誘発されたパーセンテージＨＥＲ３インターナリゼーション
【表７８】
2013529079.tif 000079
【０８０５】
実施例２１：細胞アッセイにおいてＡＬＢ１１  ＨＬＥを用いた多価配列最適化ナノボディによるＨＲＧ誘発したｐＨＥＲ３及び下流シグナリングの阻害
リガンド誘発したＨＥＲ３リン酸化及びＥＧＦＲ／ＨＥＲ３及びＨＥＲ２／ＨＥＲ３トランスリン酸化の阻害における多価配列最適化ナノボディの効力を決定するために、以下に説明するとおり、ナノボディを、以下に説明するとおり、細胞ベースアッセイにおいて試験した。
【０８０６】
ＭＣＦ−７細胞におけるリガンド誘発したｐＨＥＲ３（ｐｈｏｓｐｈｏＨＥＲ３）の阻害（細胞ベースの電気化学発光アッセイ（ＥＣＬＡ））：ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  ２２）を血清不足にさせ、３７℃、５％ＣＯ2中で６０分間血清不含媒体中でナノボディを用いてプレインキュベーションした（段階希釈、開始濃度６６６ｎＭ又は１６７ｎＭ）。細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ１−β１  ＥＧＦドメイン（R&D Systems, #396-HB）で１０分間刺激し、上清を廃棄し、細胞を、冷たいＮＰ−４０溶解緩衝液（１％  ＮＰ−４０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（Calbiochem）、ホスファターゼ阻害剤カクテルセットＩＩ（Calbiochem））中で溶解させた。ＭＡ６０００  ９６ウェルプレート（MSD, # L15XB）を、３％のブロックＡ（ＭＳＤ）でＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中で遮断し、かつ、ＨＥＲ３特異的捕捉抗体（R&D Systems, # MAB3481）でコーティングした。細胞ライセートを添加し、２時間室温（ＲＴ）でインキュベーションした。ビオチン化抗ホスホチロシン抗体（R&D Systems, # BAM1676）及びスルホタグストレプトアビジン試薬（MSD, #R32AD）を検出のために使用した（表Ｃ−２７）。
【０８０７】
２１．１  ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３及びＨＥＲ２／ＨＥＲ３トランスリン酸化の阻害
ＭＤＡ  ＭＢ４６８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  １３２）及びＣＨＯ  ＨＥＲ２／ＨＥＲ３細胞を血清不足にし、上で説明したように処理した（５０ｎｇ／ｍｌ  ＨＲＧ１−β１  ＥＧＦドメインでＭＤＡ  ＭＢ４６８刺激；１００ｎｇ／ｍｌ  ＨＲＧ１−β１  ＥＧＦドメインでＣＨＯ  ＨＥＲ２／ＨＥＲ３細胞刺激）。細胞ライセートをｐＨＥＲ３  ＥＣＬＡにおいて試験した（表Ｃ−２７）。
【０８０８】
Ａｌｂ１１を有する多価の配列最適化ナノボディは、ＭＣＦ−７細胞、また同様に、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３を発現する細胞（ＣＨＯ  ＨＥＲ２／ＨＥＲ３）又はＥＧＦＲ／ＨＥＲ３を発現する細胞（ＭＤＡ−ＭＢ４６８）においてＨＲＧ誘発したＨＥＲ３シグナリングを有効に阻害した。加えて、下流シグナリングは有効に阻害された。Ａｌｂ  １１は、試験したフォーマットにおいて効力を消失させなかった。
【０８０９】
２１．２  下流シグナリングの阻害（ｐＡｋｔ／ｐＥＲＫ１／２）：
下流シグナリングの阻害（ｐＡｋｔ／ｐＥＲＫ１／２）：ＭＣＦ−７細胞におけるリガンド誘発したｐＡＫＴ及びｐＥＲＫ（ｐｈｏｓｐｈｏＨＥＲ３）の阻害（細胞ベースの電気化学発光アッセイ（ＥＣＬＡ））：ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  ２２）を血清不足にさせ、３７℃、５％ＣＯ2中で６０分間血清不含媒体中でナノボディを用いてプレインキュベーションした（段階希釈、開始濃度６６６ｎＭ又は１６７ｎＭ）。細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ１−β１ＥＧＦドメイン（R&D Systems, #396-HB）で１０分間刺激し、上清を廃棄し、細胞を、冷たいＮＰ−４０溶解緩衝液（１％  ＮＰ−４０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（Calbiochem）、ホスファターゼ阻害剤カクテルセットＩＩ（Calbiochem））中で溶解させた。細胞ライセートを、製造者の指示に応じて、Phospho-Akt (Ser473) Whole Cell Lysate Kit (MSD, # K151CAD)及びPhospho-ERKl/2 Whole Cell Lysate Kit (MSD, # K111DWD)において試験した（表Ｃ−２８）。フォーマット化した配列最適化ナノボディは、ＨＲＧ誘発した、ＨＥＲ３の下流シグナリングを有効に遮断できた。
【０８１０】
表Ｃ−２７：ＨＲＧ誘発したｐＨＥＲ３の阻害
【表７９】
2013529079.tif 000080
【０８１１】
表Ｃ−２８：ＨＲＧ誘発したｐＡｋｔ及びｐＥＲＫの阻害
【表８０】
2013529079.tif 000081
【０８１２】
実施例２２：細胞アッセイにおけるＡＬＢ１１  ＨＬＥを有する多価配列最適化ナノボディのＨＥＲ１−ＨＥＲ３ヘテロ二量体化遮断能の分析
ＥＧＦＲリガンド誘発したＨＥＲ３リン酸化阻害における多価配列最適化ナノボディの効力を決定するために、ナノボディを以下に説明するとおりの細胞ベースアッセイにおいて試験した。
【０８１３】
ＣＨＯ  ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３細胞におけるＥＧＦＲリガンド誘発したｐＨＥＲ３（ｐｈｏｓｐｈｏＨＥＲ３）の阻害（細胞ベースの電気化学発光アッセイ（ＥＣＬＡ））：ＣＨＯ  ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３細胞を血清不足にさせ、３７℃、５％ＣＯ2中で６０分間血清不含媒体中でナノボディ（段階希釈、６６６ｎＭ又は１６７ｎＭの開始濃度）を用いてプレインキュベーションした。細胞を１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＧＦα（R&D Systems, #239-A）で１０分間刺激し、上清を廃棄し、細胞を、冷たいＮＰ−４０溶解緩衝液（１％  ＮＰ−４０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（Calbiochem）、ホスファターゼ阻害剤カクテルセットＩＩ（Calbiochem））中で溶解させた。ＭＡ６０００  ９６ウェルプレート（MSD, # L15XB）を、３％のブロックＡ（ＭＳＤ）でＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中で遮断し、かつ、ＨＥＲ３特異的捕捉抗体（R&D Systems, # MAB3481）でコーティングした。細胞ライセートを添加し、２時間室温（ＲＴ）でインキュベーションした。ビオチン化抗ホスホチロシン抗体（R&D Systems, # BAM1676）及びスルホタグストレプトアビジン試薬（MSD, #R32AD）を検出のために使用した（表Ｃ−２９）。構成ブロックとして１７Ｂ０５を含む多価配列最適化ナノボディは、ＥＧＦＲリガンド誘発したＨＥＲ３リン酸化を有効に遮断した。構成ブロックとして１７Ｂ０５を含まない多価ナノボディ２１４（ＨＥＲ３ＭＳ００２１４）でもって部分阻害が観察された。
【０８１４】
表Ｃ−２９：ＥＧＦＲリガンド誘発したＨＥＲ３リン酸化の阻害
【表８１】
2013529079.tif 000082
*部分阻害。
【０８１５】
実施例２３：ＡＬＢ  １１ＨＬＥを用いた多価配列最適化ナノボディの移動遮断能
ＨＲＧ１−β１依存性細胞移動を阻害するためのフォーマット化した配列最適化ナノボディの能力を以下のアッセイにおいて評価した。Ａ４３１細胞（CRL 1555）を、ナノボディの存在下で（段階希釈；６６６ｎＭで開始）、ＨＴＳFluoroblock 96ウェルプレートインサート（BD Falcon #351164）において播種した。培地＋５００ｎＭ  ＨＲＧ１−β１細胞外ドメイン（R&D Systems, #377-HB）をボトムウェルに添加した。移動した細胞をカルセインＡＭで染色し、蛍光をプレートリーダーにより検出した。ナノボディＨＥＲ３ＭＳ００１３５、ＨＥＲ３ＭＳ００２１２及びＨＥＲ３ＭＳ００２１５は、Ａ４３１細胞移動を有効に阻害した（表Ｃ−３０）。全ての試験したフォーマット化した配列最適化ナノボディは、リガンド誘発した細胞移動を有効に遮断する。
【０８１６】
表Ｃ−３０：ＨＲＧ誘発したＡ４３１細胞移動の阻害
【表８２】
2013529079.tif 000083
【０８１７】
実施例２４：ＨＬＥを用いた多価配列最適化ＨＥＲ３特異的ナノボディのＨＥＲ３特異性
ＨＬＥを用いた多価ＨＥＲ３特異的ナノボディのオフ標的結合を、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした、Ｆｃ−ＨＥＲ１（R&D Systems, 344-ER）、Ｆｃ−ＨＥＲ２（R&D Systems, 1129-ER）及びＦｃ−ＨＥＲ４（R&D Systems, 1131-ER）へのその結合能を測定することにより評価した。濃度５００ｎＭで開始するナノボディの連続希釈を試験し、ビオチン化ＡＬＢ特異的ナノボディ０２Ｈ０５及びストレプトアビジン−ＨＲＰ（Dako, P0397）を用いて検出を行った。Ｆｃ−ＨＥＲ３（R&D Systems, 348-RB）への結合を、ＨＥＲ３特異的ナノボディのためのポジティブコントロールとして使用した。ポリクローナル抗体  抗ＨＥＲ１（R&D Systems, AF231）、抗ＨＥＲ２（R&D Systems, AF1129）、抗ＨＥＲ３（R&D Systems, AF234）及び抗ＨＥＲ４（R&D Systems, AF1131）を、プレート上のＨＥＲコーティングの品質コントロールとして使用した。図３Ａ〜３Ｄの結果は、多価配列最適化ナノボディがＨＥＲ３に結合する（図３Ｂ）が、他のＨＥＲタンパク質には結合しない（図３Ａ、３Ｃ及び３Ｄ）ことを示す。
【０８１８】
実施例２５：ＨＬＥを用いた多価配列最適化ＨＥＲ３特異的ナノボディの種交差反応性
ＨＬＥを用いた多価配列最適化ＨＥＲ３特異的ナノボディの種交差反応性を、ヒトＨＥＲ３、マウスＨＥＲ３又はカニクイザルＨＥＲ３でトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞へのこれら分子の結合能をＦＡＣＳにより測定することにより分析した。濃度１μＭで開始する段階希釈を細胞でインキュベーションし、ビオチン化ＡＬＢ特異的ナノボディ０２Ｈ０５及びストレプトアビジン−ＰＥ（BD Pharmingen, 554061）を用いて検出を行った。得られたＥＣ５０値は、ヒトＨＥＲ３への結合をマウスＨＥＲ３又はカニクイザルＨＥＲ３と比較すると、最大で４．４倍異なり、このことは、ヒト、マウス及びカニクイザルＨＥＲ３の間の交差反応性を示唆する（表Ｃ−３１）。
【０８１９】
表Ｃ−３１：ヒト、マウス及びカニクイザルＨＥＲ３トランスフェクションしたＣＨＯ−ＦｌｐＩｎ細胞へのＦＡＣＳ結合アッセイにおける、ＨＬＥを用いた多価配列最適化ＨＥＲ３特異的ナノボディのＥＣ５０値
【表８３】
2013529079.tif 000084
【０８２０】
実施例２６：血清アルブミンへのＡＬＢ  １１  ＨＬＥを有する多価配列最適化ＨＥＲ３特異的ナノボディの結合
ヒト、マウス及びカニクイザル血清アルブミンへのＡＬＢ  １１半減期延長を有する３つの多価配列最適化ＨＥＲ３特異的ナノボディの結合親和性を、Biacoreを用いて表面プラズモン共鳴を用いて決定した。ヒト（Sigma#A3782）、カニクイザル（自家製造）及びマウス（Sigma#A3559）由来の血清アルブミンを、活性化のためにＥＤＣ／ＮＨＳを、不活性化のためにエタノールアミンＨＣｌを用いて、アミンカップリングを介してセンサーチップ表面に共有結合させた。ナノボディを流速４５μｍｌ／分で２分間注入し、チップ結合抗原への結合を可能にさせた。次に、結合緩衝液をチップへと同じ流速で送入し、結合したナノボディの自然な解離を可能にさせた。キネティックパラメーターｋon値（ｋa）、ｋoff値（ｋd）、及びＫD値を、異なるナノボディについて獲得したセンサーグラムから計算した（表Ｃ−３２）。
【０８２１】
表Ｃ−３２：多価配列最適化ＨＥＥ３特異的ナノボディのためのキネティックパラメーター
【表８４】
2013529079.tif 000085
【０８２２】
実施例２７：ヒト癌細胞株におけるｐＨＥＲ３及び下流シグナリングの阻害
フォーマット化した配列最適化ナノボディは、ＭＣＦ−７（上の実施例２１）及び他のもの、例えばＢ×ＰＣ３膵臓癌細胞株及びＢＴ−４７４乳癌細胞株に示すとおりに、ヒト癌細胞株におけるｐＨＥＲ３及び下流シグナリングを有効に阻害した。
【０８２３】
１７Ｂ０５及びフォーマット化したナノボディ（配列最適化１７Ｂ０５（ＨＥＲ３ＭＳ００１１９）を構成ブロックトして含む）は、ＨＥＲ３シグナリングを、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３駆動された（Ｂ×ＰＣ３細胞において）において、また同様に、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３（ＢＴ−４７４、Ｈｅｒ２過剰発現細胞株）細胞株において両方阻害する。
【０８２４】
Ｂ×ＰＣ３（ATCC CRL-1687）及びＢＴ−４７（ATCC HTB-20）細胞を血清不足にし、かつ、ナノボディ（連続希釈、開始濃度１６７ｎＭ）で、６０分間３７℃、５％ＣＯ2でプレインキュベーションした。細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ１−β１  ＥＧＦドメイン（R&D Systems, #396-HB）で１０分間刺激し、上清を廃棄し、細胞を、冷たいＲＩＰＡ溶解緩衝液（１％  ＮＰ−４０（Nonidet P40）、０．５％（Ｖ／Ｖ）ナトリウム−デオキシコラート、０．１％（Ｖ／Ｖ）ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（Calbiochem）、ホスファターゼ阻害剤カクテルセットＩＩ（Calbiochem））中で４５分間４℃で溶解した。遠心分離後、４×試料緩衝液（Biorad #161-0791）をこの上清に添加し、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Criterion XT precast get, 4-12%, Bis Tris, Biorad #345-0125）により、その後ＷＢにより分析した。検出抗体：ｐＨＥＲ３  Ｔｙｒ  １２８９（Cell Signalling ＃4791）、ｐＨＥＲ３  ｐＴｙｒ  １１９７（Cell Signalling #4561）、ｐＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（Cell Signalling ＃4060）、ｐＥＲＫｌ／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｈｒ２０４）（Cell Signalling ＃9101）、ＨＥＲ３（Millipore  ＃05−390）、Ａｋｔ（Cell Signalling ＃9272）、ＥＫＲ１／２（Cell Signalling ＃4695）。
【０８２５】
この結果を図５Ａ及び５Ｂに、また同様に図６Ａ〜６Ｃに示す。図５は、フォーマット化した配列最適化ナノボディによるＢＴ−４７４乳癌細胞中のｐＨＥＲ３及び下流シグナリングの阻害を示す（図５Ａ）：レーン１−６  ナノボディＨＥＲ３ＭＳ００１３５（０、０．６５、２．７、１０、４２、１６７ｎＭ）、レーン７−１２  ナノボディＨＥＲ３ＭＳ００２１２（０、０．６５、２．７、１０、４２、１６７ｎＭ）、レーン１３−１８  ナノボディＨＥＲ３ＭＳ００２１５（０、０．６５、２．７、１０、４２、１６７ｎＭ）、レーン１９  未処理、未刺激の細胞、図５Ｂ）。レーン７−１２  ナノボディＨＥＲ３ＭＳ００１１９（０、０．６５、２．７、１０、４２、１６７ｎＭ）。図６は、フォーマット化した配列最適化ナノボディによるＢ×ＰＣ３乳癌細胞中のｐＨＥＲ３及び下流シグナリングの阻害を示す（図６Ａ）：レーン１３−１８  ナノボディＨＥＲ３ＭＳ００１１９（０、０．６５、２．７、１０、４２、１６７ｎＭ）、レーン１９−２４  ＨＥＲ３ＭＳ００１３５（０、０．６５、２．７、１０、４２、１６７ｎＭ）。図６Ｂ）  レーン１−６  ＨＥＲ３ＭＳ００２１３（０、０．６５、２．７、１０、４２、１６７ｎＭ）、レーン７−１２  ＨＥＲ３ＭＳ００２１４（０、０．６５、２．７、１０、４２、１６７ｎＭ）。図６Ｃ）：レーン１−６  ＨＥＲ３ＭＳ００２０９（０、０．６５、２．７、１０、４２、１６７ｎＭ）、レーン７−１２  ＨＥＲ３ＭＳ００２１２（０、０．６５、２．７、１０、４２、１６７ｎＭ）、レーン１３−１８  ＨＥＲ３ＭＳ００２１５（０、０．６５、２．７、１０、４２、１６７ｎＭ）、レーン１９未処理、未刺激の細胞、レーン２０−２４  無関係のコントロールナノボディ（０．６５、２．７、１０、４２、１６７ｎＭ）。
【０８２６】
実施例２８：Ａ５４９  ｉｎ  ｖｉｖｏモデル：フォーマット化した配列最適化ナノボディによる腫瘍成長の阻害
フォーマット化した配列最適化ナノボディの効力を評価するために、ヒト肺癌のＡ５４９異種移植モデルをヌードマウス中で確立し、腫瘍成長の阻害を複数用量で評価した。Ｔ細胞欠失ヌード／ヌードマウス（ＮＩＨを起源とする６週齢メスマウス、異種交配、アルビノバックグラウンド）を、異種移植研究のためにCharles River Laboratories (Wilmington, MA)から購入した。Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１８５）を、培養培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ；Ｌ−グルタミン、３７℃、５％ＣＯ2）中で成長させた。マウスに５Ｅ＋６細胞を１００μｌＰＢＳ中で右横に皮下注射した。初期腫瘍成長及び体重を観察した。１３日後に腫瘍は平均体積１７４ｍｍ3に達し、マウスを１０個のグループにランダム化した。マウスに３日ごとに、それぞれナノボディＨＥＲ３ＭＳ００１３５、ＨＥＲ３ＭＳ００２１２又はＨＥＲ３ＭＳ００２１５を１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。Ａｌｂ１１を１０ｍｇ／ｋｇでコントロールとして使用した。ＰＢＳをビヒクルコントロールとして使用した。処置期間は２０日間であった。腫瘍体積及び体重を週２回記録した。パーセントの体重データをOne Way ANOVAにより分析し、その後、コントロールに対するDunnett'の事後比較をした。腫瘍体積データを、Repeated Measures ANOVAにより分析し、その後、事後Bonferrioni対式比較をした（α＝０．０５）。
【０８２７】
各コントロール及び治療群からのメディアン腫瘍体積を、図７Ａ〜７Ｃにおいて示す（それぞれ、ＨＥＲ３ＭＳ００１３５、ＨＥＲ３ＭＳ００２１２及びＨＥＲ３ＭＳ００２１５に関して）。
【０８２８】
ナノボディの投与は、ＰＢＳビヒクルコントロール又はＡｌｂ１１で処置した腫瘍に比較して、ヒト肺癌異種移植モデルの著しい用量依存的な腫瘍成長阻害を生じた。
【図１−１】
2013529079.tif 000086
【図１−２】
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【図１−３】
2013529079.tif 000088
【図１−４】
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【図１−５】
2013529079.tif 000090
【図１−６】
2013529079.tif 000091
【図１−７】
2013529079.tif 000092
【図１−８】
2013529079.tif 000093
【図１−９】
2013529079.tif 000094
【図１−１０】
2013529079.tif 000095
【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図１−２５】
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【図１−２６】
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【図１−２７】
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【図１−２８】
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【図１−２９】
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【図１−３０】
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【図１−３１】
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【図１−３２】
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【図１−３３】
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【図１−３４】
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【図１−３５】
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【図１−３６】
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【図１−３７】
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【図１−３８】
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【図１−３９】
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【図１−４０】
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【図１−４１】
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【図１−４２】
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【図１−４３】
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【図１−４４】
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【図１−４５】
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【図１−４６】
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【図１−４７】
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【図１−４８】
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【図１−４９】
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【図１−５０】
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【図１−５１】
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【図１−５２】
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【図１−５３】
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【図１−５４】
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【図１−５５】
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【図１−５６】
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【図１−５７】
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【図１−５８】
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【図１−５９】
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【図１−６０】
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【図１−６１】
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【図２】
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【図３】
2013529079.tif 000148
【図４−１】
2013529079.tif 000149
【図４−２】
2013529079.tif 000150
【図４−３】
2013529079.tif 000151
【図４−４】
2013529079.tif 000152
【図４−５】
2013529079.tif 000153
【図４−６】
2013529079.tif 000154
【図４−７】
2013529079.tif 000155
【図４−８】
2013529079.tif 000156
【図５Ａ】
2013529079.tif 000157
【図５Ｂ】
2013529079.tif 000158
【図６】
2013529079.tif 000159
【図７−１】
2013529079.tif 000160
【図７−２】
2013529079.tif 000161
【図７−３】
2013529079.tif 000162
【配列表】
2013529079000001.app
【国際調査報告】
2013529079.tif 000163
2013529079.tif 000164
2013529079.tif 000165
2013529079.tif 000166