【事件の表示】
 　特許第２７５１９９９号　「コラーゲン分解をモニターする方法」の請求項１ないし４に係る特許に対する特許異議の申立について、次のとおり決定する。
【結　論】
 　訂正を認める。
　特許第２７５１９９９号の請求項１ないし４に係る特許を維持する。
【理　由】
  Ｉ　手続の経緯
　本件特許第2,751,999号の発明は、1988年6月25日の英国出願8815174.1を基礎出願とする優先権を主張して、平成1年(1989年)6月26日に国際出願されたものであり、平成10年2月27日に設定登録されたものである。
　本件特許について、申立人青木健一郎より特許異議の申立があり、取消理由が通知され、それに対する意見書および訂正請求書が平成11年11月15日に提出された。
　
II　訂正請求の適否の検討
　前記訂正請求書による訂正請求の適否について以下検討する。
１．　訂正事項
　本件訂正は、つぎの訂正事項からなる。
(1)　訂正事項Ａ
　請求項１の「ヒト被験体から生体液試料を得る工程：」を「該被験体からの生体液試料において、」と訂正する。
(2)　訂正事項Ｂ
　請求項１〜請求項３の「グリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリン」を「ペプチドを含まないグリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリン」と訂正する。
(3)　訂正事項Ｃ
　請求項４の「尿」を「尿試料」と訂正する。
(4)　訂正事項Ｄ
　請求項５〜請求項１２を削除する。
　
２．　訂正の目的
(1)　訂正事項Ａについて
　明りょうでない記載の釈明を目的とするものに該当する。
(2)　訂正事項Ｂについて
　特許請求の範囲の減縮を目的とするものに該当する。
(3)　訂正事項Ｃについて
　明りょうでない記載の釈明を目的とするものに該当する。
(4)　訂正事項Ｄについて
　特許請求の範囲の減縮を目的とするものに該当する。
　
３．　明細書の記載事項の範囲内か否かの判断
(1)　訂正事項Ａについて
　「ヒト被験体から生体液試料」が「ヒト被験体から生体液試料を得る工程 」によって得られることは自明であるから、明細書の記載事項の範囲内である。
(2)　訂正事項Ｂについて
　「ペプチドを含まないグリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリン」を含有するコラーゲン断片を測定することは、願書に添付した明細書に記載されている（本件特許公報6欄〜8欄、および、実施例２参照）。
(3)　訂正事項Ｃについて
　「尿試料」という用語は、願書に添付した明細書の実施例１に明記されている。
(4)　本件訂正事項について
　そうすると、これらの訂正事項は、いずれも、願書に添付した明細書の記載事項の範囲内であるといえる。
　
４．　拡張・変更
　これらの訂正事項は、実質上特許請求の範囲を拡張するものでなく、また、変更するものでもない。
　
５．　独立特許要件
　訂正事項Ｂは、特許請求の範囲を減縮することを目的とするものであるので、本件訂正後における特許請求の範囲に記載されている事項により構成される発明（以下、この発明を「本件訂正発明」ということがある）が、特許出願の際に独立して特許を受けることができるものであるかどうかについて以下検討する。
５.１　本件訂正後の請求項１〜請求項４の発明
　本件訂正後の特許請求の範囲の請求項１〜請求項４は、以下のとおりである。
　本件訂正後の特許請求の範囲の請求項１〜請求項４の各発明は、各請求項の記載事項により構成される。
　【請求項１】
　ヒト被験体におけるコラーゲン分解をモニターする方法であって、以下の工程：
　該被験体からの生体液試料において、ペプチドを含まないグリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリンを含有する1つまたはそれ以上のコラーゲン断片の量を測定する工程；および
　測定された量を骨コラーゲン分解の指標として用いる工程；
を包含する、モニター方法。
　【請求項２】
　前記ペプチドを含まないグリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリンが、ガラクトシルヒドロキシリシルピリジノリンである、請求項１に記載の方法。
　【請求項３】
　前記ペプチドを含まないグリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリンが、グリコシルガラクトシルヒドロキシリシルピリジノリンである、請求項１に記載の方法。
　【請求項４】
　前記生体液試料が尿試料である、請求項１に記載の方法。
　
５.２　本件訂正発明の優先日
(1)グリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリン
　本件基礎出願明細書（甲第１号証の１）には、グリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリンに関連する記載としては、次の4頁の下から4行目〜1行目の記載事項（実施例の方法の４．）が唯一のものである。
（異議申立人訳）
「４．単離した成分を高速原子衝撃マススペクトロメトリーおよびアミノ酸配列分析により特性付けた；グリコシル化部位は、これらペプチドのアルカリ加水分解物のガス液体クロマトグラフィーにより同定された。」
　なお、この記載事項は、本件出願当初の明細書の実施例１に対応する（本件公表公報4頁左上欄5行目〜8行目のｄ．参照）。
　ここに記載の「グリコシル化部位」というのは、ペプチド断片における部位であるから、「ペプチドを含まないグリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリン」を意味するものではない。
　そうすると、「ペプチドを含まないグリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリン」を含有するコラーゲン断片について、本件基礎出願の明細書に記載されているということはできない。
　
(2)　測定対象
　本件基礎出願明細書（甲第１号証の１）には、次のモノクローナル抗体による診断についての記載がある（5頁最下段参照）。
（異議申立人訳）。
　「様々な組織の代表的なコア配列を含む、多種類の３つのペプチドを、抗体を作成させるために選んだ。各々の生成されたペプチド（１μmol）は、・・・卵白アルブミン（０．２５μmol）に共有結合させた。
　Balb／cマウスを卵白アルブミン複合体で免疫し、Ａｇ8.653骨髄細胞を用いて、融合を行った後、モノクローナル抗体を生成させた。・・・このようにして生成したモノクローナル抗体は、様々な種類の骨障害および変性関節疾患の診断およびモニターのための免疫検定試験に使用され得る(may be used)。」
　上記のように、このモノクローナル抗体の測定対象は、「精製ペプチド」であり、ペプチドを含まないグリコシル化ヒドロキシリシルビリジノリンを測定対象とするものでない。
　
(3)　優先日
　そうすると、本件基礎出願明細書には、生体試料においてペプチドを含まないグリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリンを含有するコラーゲン断片の量を測定することは記載されていないので、 本件訂正発明は、英国出願8815174.1を基礎出願とする優先権を享受することはできない。
　
５．３　特許法第２９条柱書き違反について
　請求項１〜１２の発明が診断方法の発明であり産業上利用できる発明ではないとの取消理由通知に指摘した事項については、上記訂正請求書による訂正によって解消した。
　
５．４　特許法第２９条第２項違反について
５．４−１　取消理由通知に引用の刊行物
　取消理由通知には、本件国際出願日前に頒布されたつぎの刊行物が引用されている。
(1)刊行物１：
　国際公開ＷＯ89／04491パンフレット(国際公開日1989年5月18日)
（対応する公表特許公報特表平3-500818号公報を翻訳文とする）
(2)刊行物２：
　Biochemical Journal(1983) Vol.215,　p167〜173
(3)刊行物３：
　Calcified Tissue International Vol.44, NO.5, May, 1989, p343〜347
　
５．４−２　引用刊行物の記載事項
(1)　刊行物１
　刊行物１には、下記の事項が記載されている。
(1a)　刊行物１の請求項１〜請求項５
「1.　骨コラーゲン吸収に由来し、3−ヒドロキシピリジニウム架橋をもつペプチド断片の体液中濃度を定量することから成る絶対的骨吸収速度測定法。
　2.　3−ヒドロキシピリジニウム架橋がリジルピリジノリンである請求項1記載の方法。
　3.　3−ヒドロキシピリジニウム架橋がヒドロキシリシルピリジノリンである請求項1記載の方法.
　4.　体液が尿である請求項1記載の方法。
　5.　定量段階が体液を、骨コラーゲン吸収に由来する3−ヒドロキシピリジニウム架橋をもつペプチド断片に特異的な免疫学的結合パートナーと接触させることを含んで成る請求項1記載の方法。」
　
(2)　刊行物２
　刊行物２は、その表題が「コラーゲンの架橋：ピリジノリンの単離、構造決定及びグリコシル化」という学術論文である。刊行物２には、下記の事項が記載されている。
(2a)　ガラクトシルピリジノリン（要約欄8行〜16行）（167頁）
「数種の異なる組織のアルカリ加水分解物から、ゲル濾過とイオン交換クロマトグラフィーによって蛍光性化合物が精製され、ガラクトシルピリジノリンであることが示された。この誘導体は、二官能性架橋類似体と比較すると酸処理に対して大変不安定であり、0.1M-HCI中108℃で8時間加熱することによって、完全に遊離のピリジノリンに転換された。ガラクトシルピリジノリンはまた、長時間のアルカリ加水分解によっても部分的に遊離のピリジノリンに転換された。他の多官能性架橋誘導体においてもあてはまる、この不安定性はピリジノリンの二糖誘導体が単離されなかったという事実を説明し得る。」
(2b)不安定なグリコシル化形態の架橋物(167頁右欄4行〜6行)
「　また、異常に不安定なグリコシル化形態の架橋物の存在についての証拠も提示される。」
(2c)　ピリジノリンの単離(167頁右欄下から4行〜168頁4行)
「ピリジノリンの単離
　粉末化した脱灰骨(125g)を6M　HC1(3リットル)中で、N2流での還流下で加水分解した。冷却した加水分解物を濾過し、エバボレートして乾燥させ、そしてクエン酸三ナトリウム2水和物(138g)を含む溶液中に溶解した。これを、次いで、6M　HClでpH2.3に滴定した(最終容量7リットル)。」
(2d)　ピリジノリンのグリコシル化(170頁右欄18行〜22行）
「ピリジノリンのグリコシル化
　凍結乾燥した組織サンプルを2M NaOH(25mgの組織/ml)において、115℃(大気圧を超える70kPa(10 1bf/in2))でのオートクレープ中で、6時間または22時間のいずれかにわたって、加水分解した。」
(2e)　酵素標識免疫測定法（170頁右欄下から6行〜下から3行）
「この成分〔異議申立人注：化合物X〕は、クロマトグラムの各フラクションの試料(10μｌ)について行われた酵素標識免疫測定法(ロビンス、1982b)において、ピリジノリン抗体と反応した。」
(2f)　ピリジノリンのO−ガラクトシル誘導体（172頁左欄46行〜50行）
「ピリジノリンのグリコシル化コラーゲンのアルカリ加水分解物から得られる化合物Ｘの分析は、それが側鎖の水酸基において置換されたピリジノリンのO−ガラクトシル誘導体であることを示した。」
(2g)極端に不安定なガラクトシルピリジノリン(172頁右欄1行〜12行)
「　ガラクトシルピリジノリンは、二官能性架橋物のグリコシル化誘導体と比較すると、マイルドな酸処理に対して極端に不安定であった。(ロビンズおよびベイリ、1974)。単離された化合物はまた、さらにアルカリ処理することによって部分的に分解されることが示された。したがって、ガラクトシルピリジノリンの加水分解が、組織の加水分解物から得られるこの成分の低収量についての主な理由であると思われる。結果として、これらの実験結果からは、分析した種々の組織中に存在するグリコシル化ピリジノリンの割合に関しては何ら結論付けることはできない。」
(2h)二糖誘導体の存在（172頁右欄17行〜19行）
「二糖誘導体の存在についての或る種の証拠が得られたが、その収量は分析には不十分なものであった。」
(2j)「ピリジノリン」の構造式Fig.３（169頁）
　構造式Fig.３には、「ヒドロキシリシルピリジノリン」を示す構造式が「ピリジノリン」として記載されている。
(2k)Fig.６（171頁）
　Fig.６には、アルカリ加水分解物中のピリジノリン誘導体のクロマトグラフィーが示されている。73分のところで溶出しているのが、未知の蛍光成分Ｘである。
　
(3)刊行物３
　刊行物３は、「増加する骨吸収のマーカーとしての、卵巣切除ラットにおける、コラーゲンのピリジニウム架橋物の分泌」という表題の学術論文である。刊行物３には、下記の事項が記載されている。
(3a)　架橋物の濃度（344頁左上欄12行〜21行）
「ピリジノリン及びデオキシピリジノリンの尿中濃度は、CFIパーティションクロマトグラフィーによる予備的分画の後、逆相HPLCによって測定した。架橋物の全量は等量の濃塩酸を添加し、107℃で18時間加熱して加水分解した尿試料にて測定した、遊離の架橋物濃度は、加水分解していない尿試料を分画及び分析操作に供して測定した。結合型架橋物(conjugated cross-links)の量は[異議申立人註：架橋物の全量と遊離の架橋物の]差から計算した。」
(3b)架橋物の分泌の増加(344頁右欄第一パラグラフ)
「加水分解した尿において、ピリジノリンおよびデオキシピリジノリンの両方のクレアチニンとの相対的な総量は、卵巣切除ラットにおいて有意に高かった(表2)。しかし、興味深いことに、架橋物の分泌の増加は、遊離形態としてのみ生じ、そして結合体化したピリジニウム成分の濃度は実質的に変化しなかった　(表2)。」
(3c)　座骨骨コラーゲンにおけるピリジニウム化合物(344頁右欄第二パラグラフ)
「　座骨骨コラーゲンにおけるピリジニウム化合物の直接の分析の結果(表3)は、卵巣切除した群とコントロール群との間の架橋物濃度において有意な差異を示さず、そして2つの架橋物アナログの間の比には何ら変化を示さなかった。両群について、小柱網骨は、皮質骨よりも有意に少ないピリジノリン(P＜0.01)を含んでいたが、この差異は、デオキシアナログについては有意ではなかった。関節軟骨におけるピリジノリンの量における卵巣切除群とコントロール群との間には差異は存在しなかった。」
(3d)　尿中の架橋物の結合（conjugation）の形態（345頁右欄7行〜14行）
「尿中ピリジニウム架橋物の結合（conjugation）の形態は現在知られていない。軟骨のアルカリ加水分解はグリコシル化誘導体の存在を明らかにした[11]。このグリコシル化誘導体は尿中に無傷(intact)で排泄されると考えられる。予備的分画実験(エス　ピー　ロビンス、未発表の結果)によれば尿中のピリジニウム含有ペプチドは比較的小さい。(Mr＜2,000)」
(3e)　参照文献[11]
　Robins SP (1983) Crosslinking of collagen: isolation,structural characterization and glycosylation of pyridinoline（コラーゲンの架橋：ピリジノリンの単離、構造決定およびグリコシル化） Bioch J　215: 167−173
　
５．４−３　本件訂正発明の概要
イ）本件訂正発明（訂正請求項１〜４の発明）について、本件訂正明細書では、下記(ａ)〜(ｄ)のように説明されている。
(ａ) グリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリン
　グリコシル化には、ガラクトース(Ｇａｌ)のみ、あるいは二糖グルコシルガラクトース(Ｇａｌ．Ｇｌｃ)という２つのタイプがある。したがって、下記に示すように、グリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリンは、２つのＰｙｄ‐ＧａｌおよびＰｙｄ‐Ｇａｌ．Ｇｌｃ．という形を取り得る（本件特許公報６欄12行〜16行参照）。
　　構造式IおよびII　省略
　　（構造式は本件特許公報４頁参照）
　
(ｂ)　主組織における糖誘導体の相対的割合
　ヒドロキシリジンの二糖誘導体に対する単糖誘導体の相対的な割合は、組織により異なる。重要な主組織(すなわち、ピリジノリンを含むもの)については、骨コラーゲンでは、単糖誘導体が豊富であるのに対し、軟骨は、ほとんど全てがＧａｌ．Ｇｌｃを含む。（本件特許公報７欄25行〜29行参照）
　
(ｃ)　尿中における糖誘導体
　ピリジノリンの単糖誘導体および二糖誘導体(構造ＩおよびII)の両方は、ヒトの尿から単離され、同定された。これらの成分は、通常、尿の中に存在するが、様々な骨の疾患および関節炎では多量に存在することがわかった。（本件特許公報７欄30行〜34行参照）
　
(ｄ)　これらの知見の主な重要点
　これらの知見の主な重要点は、以下のとおりである：
１　構造式ＩおよびIIの成分は、加水分解処理を行わなくても、尿中に存在する。したがって、分析方法を直接、尿に適用し得る。
２　上記の２成分を分析することにより、コラーゲン分解に関する組織特異的な情報が得られる。Ｐｙｄ‐Ｇａｌを測定することにより、骨のコラーゲン再吸収の指標が提供される：尿中のＰｙｄ−Ｇａｌ．Ｇｌｃ量は、主として、骨あるいは軟骨の分解の指標となる。そして、Ｐｙｄ‐ＧａｌおよびＰｙｄ−Ｇａｌ．Ｇｌｃの相対量は、骨および軟骨の相対的な分解度に関する情報を提供する。
３　糖グループの存在により、上記成分の抗原性(それにより、良好な抗体を生じさせることのできる容易さ)が増大する。各構造に特異的な抗体が産生されるように、糖質部分は、抗体認識部位の一部を形成する。（本件特許公報７欄35行〜49行参照）
　
ロ)　本件訂正発明の特徴
　以上の訂正明細書の説明からすると、本件発明者は、下記の知見を得て、そして、これらの知見に基づいて、本件訂正発明を完成したものである。
　知見Ａ：
「　重要な主組織(すなわち、ピリジノリンを含むもの)については、骨コラーゲンでは、単糖誘導体が豊富であるのに対し、軟骨は、ほとんど全てがＧａｌ．Ｇｌｃを含む」という知見
　知見Ｂ：
「　ピリジノリンの単糖誘導体および二糖誘導体(構造ＩおよびII)の両方は、ペプチドを含まない形態で、尿中に排泄される」という知見
　
５.４−３　本件訂正発明と刊行物１発明との対比
　　そこで、本件訂正後の請求項１の発明と刊行物１発明とを対比する。
１）本件訂正後の請求項１の発明と刊行物１発明とは、次の点で一致する。
（一致点）
「　ヒト被験体におけるコラーゲン分解をモニターする方法であって、以下の工程：
　該被験体からの生体液試料において、ヒドロキシリシルピリジノリンを含有する1つまたはそれ以上のコラーゲン断片の量を測定する工程；および
測定された量を骨コラーゲン分解の指標として用いる工程；
を包含する、モニター方法。」
２）そして、本件訂正後の請求項１の発明と刊行物１発明とは、次の点で相違する。
（相違点）
　「ヒドロキシリシルピリジノリンを含有する1つまたはそれ以上のコラーゲン断片」が、本件訂正後の請求項１の発明では、「ペプチドを含まないグリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリンを含有する断片で」あるのに対し、刊行物１発明では、「ペプチド断片」であると同時にこの「ペプチド断片」がグリコシル化されることについてはなにも記載されていない点。
　
５．４−４　相違点についての検討
　そこで、この相違点について以下検討する。
(1)　グリコシル化について
　ヒドロキシリシルピリジノリンのグリコシル化については、刊行物２に記載がある（刊行物２では「ヒドロキシリシルピリジノリン」は、「ピリジノリン」と記載されている）が、刊行物２に記載された「グリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリン」は、組織サンプル（のコラーゲン）を加水分解した物に含まれる一成分である（前記(2d)参照）。
　したがって、刊行物２に記載の「グリコシル化」は「被験体からの生体液試料」とはいえない組織のコラーゲン架橋において、グリコシル化がされていることが示されているにとどまるので、被験体からの生体液試料に対する刊行物１の方法の被測定対象成分につき、グリコシル化されたものへと変更を加えることを直ちに教示するするものではない。
　
(2)　尿中に排泄されたグリコシル誘導体
　「ピリジニウム化合物のグリコシル化誘導体」が尿中に無傷(intact)で排泄されるという予想が、刊行物３に記載されている（前記(3d)参照）。
　しかしながら、この予想は、生体液試料ではない軟骨のアルカリ加水分解による知見からの参照文献[11]を引用して行われている（前記(3e)参照）。参照文献[11]は、刊行物２であり、刊行物２では、尿中のグルコシル誘導体を測定するものでないことは上述のとおりであるから、刊行物３のこの記載も、尿中のグリコシル誘導体の測定と骨コラーゲン分解の指標としてその測定量が用いることが出来ることまでも意味するものでないことは明らかである。
　そして、刊行物３では、尿中のピリジニウム化合物のペプチドの結合の形態は知られていないとしており（前記(3d)参照）、尿中に排泄されることが予想されるグリコシル誘導体は、むしろ尿中のピリジニウム含有ペプチドの結合形態と大きさについてしか言及していないことからして、ペプチドを含むものであることを示唆しているものと解される。
　
(3)　尿中のピリジニウム化合物の測定
　尿中のピリジニウム化合物を測定することは、刊行物３に言及がある。
　すなわち、刊行物３では、「加水分解した尿において、ピリジノリンおよびデオキシピリジノリンの両方のクレアチニンとの相対的な総量は、卵巣切除ラットにおいて有意に高かった」としている（前記(3b)参照）。そして、「興味深いことに、架橋物の分泌の増加は、遊離形態としてのみ生じ、そして結合体化したピリジニウム成分の濃度は実質的に変化しなかった」としている（前記(3b)参照）。
（なお、刊行物３でも「ヒドロキシリシルピリジノリン」は、「ピリジノリン」と記載されている）。
　そうすると、刊行物３では、尿中の遊離形態の（すなわち、ペプチドを含まない）「ピリジノリンおよびデオキシピリジノリン」が、卵巣切除ラットにおいて有意に高かったことが記載されていると言える。
　しかしながら、尿中の測定されるピリジニウム化合物の「グリコシル化」については記載がなく、この尿中の「ペプチドを含まないピリジノリンおよびデオキシピリジノリン」の量と卵巣切除ラットとに関係があるという前述の記載が、尿中の「ペプチドを含まないグリコシル化したピリジノリン」の量と卵巣切除ラットにおけるいかなる現象と関係があるかを示唆するものではない。
　
５．４−５　相違点についての検討の結果
　以上検討したところによれば、刊行物２及び３には上記相違点につき記載ないし示唆するものはなく、また刊行物１〜刊行物３のいずれにも、上記本件発明の発明者の知見Ａおよび知見Ｂ（前記５.５の(5)参照）に基づいた本件訂正後の請求項１の発明を示唆するものを見出すことはできない。
　そうすると、本件訂正後の請求項１の発明は、刊行物１〜刊行物３に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということはできない。
　
５．４−６　また、請求項２〜４に係る発明は、請求項１を引用し更に限定を付加するものであるから、上述した請求項１に係る発明と同様の理由で、刊行物１〜刊行物３に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということはできない。
　
５．５　明細書の記載（特許法第３６条違反について）
(1)　「コラーゲン断片の測定」
　モノクローナル抗体を使用したコラーゲン断片の測定にする具体的な記載が、実施例１に記載されている（本件特許公報8欄〜9欄参照）。そして、ここに記載のコラーゲン断片は、ペプチドを含まないグリコシル化物ではないが、抗体を使用する測定法は、明細書に説明されている（本件特許公報8欄29行〜36行参照）一般的な免疫アッセイである。そして本件訂正明細書には、ペプチドを含まないグリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリンを含有するコラーゲン断片を精製単離することが実施例２として記載されているし、「これら成分の免疫検定法は、アミノ基・・・によって、卵白アルブミンと結合させることにより、ペプチドについて述べたように、精度よく実施される。」と明細書に説明されている。（本件特許公報10欄41行〜44行参照）
　これらの記載が本件明細書にあり、本件国際出願日当時にそのような免疫アッセイがこの分野において広く知られていたという技術水準を考慮すれば、本件明細書にペプチドを含まないグリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリンを含有する１つまたはそれ以上のコラーゲン断片を測定することが、実施例などとして具体的に記載されていないからといって、当業者が容易に本件訂正発明を測定できない不備があるともいえない。
(2)　「骨コラーゲン分解の指標」
　骨コラーゲン分解の指標とすることが本件明細書に記載されていることは、前記の５.４−２で、特に(ｄ)２で、本件明細書を引用したところから明らかである。
　
５.６　独立特許要件についての検討結果
　以上独立特許要件について検討したところによれば、本件訂正発明は、本件特許出願の際、独立して特許が得られるものといえる。
　
６．　訂正適否の検討結果
　前記５．での検討によれば、本件訂正は、特許法１２０条の４、２項および３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
III　特許異議の申立
１．　本件発明
　本件請求項１〜請求項４の各発明は、それぞれ、本件訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１〜請求項４の記載事項により構成される。
　その特許請求の範囲は前述のとおりである（前記II５.１参照）。
　
２．　申立の概要
　申立人青木健一郎の申立の概要は、以下のとおりである。
(1)　２９条２項違反
　本件訂正前の、請求項１〜請求項１２の各発明は、前記刊行物１〜刊行物３に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
(2)　３６条違反
　本件訂正前の特許請求の請求の範囲に記載の工程「グリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリンを含有する1つまたはそれ以上のコラーゲン断片の量を測定する工程」および「測定された量を骨コラーゲン分解の指標として用いる工程」について、本件明細書に具体的に記載されていない。
　
３．申立(1)についての検討
　本件特許請求の範囲は、前述のとおり訂正されたので、本件訂正後の請求項１〜請求項４の各発明について、申立(1)について検討する。
　本件請求項１〜請求項４の各発明は、前述のとおり（前記II５.３〜５.４参照）、刊行物１〜刊行物３に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということもできない。
　
４．申立(2)についての検討
　本件訂正明細書の記載は、前述のとおり（前記II５．５参照）、特許法第３６条に規定する要件を満たしていない明細書の記載不備があるとは認められない。
　
５．　申立についての検討結果
　以上検討したところによれば、異議申立人の申立は、いずれも理由がない。
　
IV　むすび
　前記IIで検討したように、本件訂正は、特許法１２０条の４、２項および３項の規定に適合する。
　前記IIIで検討したように、本件特許異議申立の理由によっては、本件請求項１〜請求項４の各発明に係る特許を取り消すことができない。
　また、他に本件請求項１〜請求項４の各発明に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１２年２月４日（２０００．２．４）
【訂正の要旨】
　　　　　　　　　　　　訂正の要旨
（１）　訂正事項Ａ
　明りょうでない記載の釈明を目的として、請求項１の「ヒト被験体から生体液試料を得る工程：」を「該被験体からの生体液試料において、」と訂正する。
（２）　訂正事項Ｂ
　特許請求の範囲の減縮を目的として、請求項１〜請求項３の「グリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリン」を「ペプチドを含まないグリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリン」と訂正する。
（３）　訂正事項Ｃ
　明りょうでない記載の釈明を目的として、請求項４の「尿」を「尿試料」と訂正する。
（４）　訂正事項Ｄ
　特許請求の範囲の減縮を目的として、請求項５〜請求項１２を削除する。
（５４）【発明の名称】
コラーゲン分解をモニターする方法
（５７）【特許請求の範囲】
　　【請求項１】　ヒト被験体におけるコラーゲン分解をモニターする方法であって、以下の工程：
　
該
の
において、ペプチドを含まない
　測定された量を骨コラーゲン分解の指標として用いる工程；
を包含する、モニター方法。
　　【請求項２】　前記
ペプチドを含まない
　　【請求項３】　前記
ペプチドを含まない
　　【請求項４】　前記生体液試料が尿
試料
【発明の詳細な説明】
　本発明は，特に，オステオポローシスおよびリウマチ関節炎に関する診断補助としての，コラーゲン分解をモニターする方法に関する。
　コラーゲンは，全ての組織の中に，様々な形で存在する。コラーゲンは，ピリジノリンにより架橋されたアミノ酸鎖の形を有するということが明かにされている（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら，　（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ　ｖｏｌ．８４，５２−５７）。ピリジニウム架橋は，２つのヒドロキシリジン残基から形成される。２つの反応前に酵素によりアルデヒドに転換されるコラーゲン分子の末端（非らせん構造の）ペプチドに由来し，３つめは，隣接するコラーゲン分子のらせん部分に存在するヒドロキシリジンに由来する。Ｒｏｂｉｎｓら（Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　１９８６，４５，９６９−９７３）は，ピリジノリンに特異的な抗体を使用することにより尿中のピリジノリンを測定する技術について記載しており，酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により検出した。しかしながら，この技術では，試料中のヒドロキシリシルピリジノリンを測定し得るだけであり，リシルデオキシピリジノリンは検出できない。前者は骨および組織中に存在し，後者は骨のみの中に存在する。したがって，この技術を用いれば，コラーゲン分解の発生を知ることができる関与する組織の種類まではわからないが，成人病の存在を示す。
　本発明は，リシルピリジノリンおよびヒドロキシリシルピリジノリンが，尿のような生体液中に，アミノ酸原鎖の断片あるいは糖質に結合して存在するという認識に基づいている。しかしながら，原鎖がどこで切れるかについては不確定である。しかし，実質的には，全ての場合に，特定のコラーゲンが由来する組織の種類を同定するために充分なアミノ酸が存在する。
　したがって，本発明は，リシルピリジノリンまたはヒドロキシリシルピリジノリンあるいはそれらの置換体を含むコラーゲン断片を含有する生体液試料を分析することを包含する，コラーゲン分解をモニターする方法を提供する。
　さらに，本発明によれば，生体液試料を分析し，分解コラーゲンの組織起源に特異的な少なくとも１つの置換基を含むリシルピリジノリンあるいはヒドロキシリシルピリジノリンの量を測定することを包含する，分解コラーゲンの組織起源を決定する方法が提供される。
　他の局面では，本発明は，少なくとも１つの結合アミノ酸を有するリシルピリジノリンあるいはヒドロキシリシルピリジノリンを含むコラーゲン断片に特異的な抗体，好ましくはモノクローナル抗体に関する。
　他の局面では，本発明は，結合糖残基を有するヒドロキシリシルピリジノリンを含むコラーゲン断片に特異的な抗体，好ましくは，モノクローナル抗体に関する。
　好ましくは，上記ピリジノリンはアミノ酸原鎖の一部で置換されている。
　好ましくは，上記アミノ酸鎖の短い部分は，それぞれ１〜５個のアミノ酸を有する。
　好ましくは，上記糖質は，ガラクトースとの糖鎖形成により，あるいはグルコースおよびガラクトースとの糖鎖形成により，ピリジノリンに結合している。
　コラーゲンは，骨あるいは軟骨と好適に結合し得る。
　本発明の実施態様を，実施例により，さらに詳細に説明する。
　コラーゲンは，次の一般的な構造を有する：
　Ａ，Ｂ，およびＣは，アミノ酸であり，Ｐは，リシルピリジノリンまたはヒドロキシリシルピリジノリンあるいはグリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリンである。例えば，尿のような生体液中に存在する場合には，Ａ鎖，Ｂ鎖，およびＣ鎖は，切断され，長さが不確定になる。本発明は，特定の体組織に由来するコラーゲンにより，次の物質が生体液試料中に存在するという事実に基づいている：
　ここで，Ａ，Ｂ，およびＣは，１〜５個のアミノ酸から成る短い鎖であり，Ａ，Ｂ，およびＣは，必ず存在する。Ａｘ，Ａｙ，Ｂｘ，Ｂｙ，Ｃｘ，Ｃｙなどは，必ずしも存在するとは限らない原鎖の他の部分である。さらに，Ａ，Ｂ，およびＣは，特定の組織起源に特異的である。したがって，本発明のこの局面では，次のユニットが機能する。
　本発明の他の局面では，Ｘは，必ずしも結合アミノ酸を有するとは限らないグリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリンであり得る。
　ヘリックス中のヒドロキシリジン残基は，そのヒドロキシ基において，糖グループを付加することにより，グリコシル化される。ピリジノリン（Ｐｙｄ）架橋の形成がグリコシル化ヒドロキシリジンを伴う場合には，グリコシル化架橋が生成する。ヘリックス中のリジン残基との反応により形成されたリシルピリジノリンのような架橋類似物は，側鎖ヒドロキシル基を有さないので，いかなるグリコシル化誘導体をも形成し得ない。
　グリコシル化には，ガラクトース（Ｇａｌ）のみ，あるいは二糖グルコシルガラクトース（Ｇａｌ．Ｇｌｃ）という２つのタイプがある。したがって，下記に示すように，グリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリンは，２つのＰｙｄ−ＧａｌおよびＰｙｄ−Ｇａｌ．Ｇｌｃ．という形を取り得る。
　ヒドロキシリジンの二糖誘導体に対する単糖誘導体の相対的な割合は，組織により異なる。重要な主組織（すなわち，ピリジノリンを含むもの）については，骨コラーゲンでは，単糖誘導体が豊富であるのに対し，軟骨は，ほとんど全てがＧａｌ．Ｇｌｃを含む。
　ピリジノリンの単糖誘導体および二糖誘導体（構造ＩおよびＩＩ）の両方は，ヒトの尿から単離され，同定された。これらの成分は，通常，尿の中に存在するが，様々な骨の疾患および関節炎では多量に存在することがわかった。
　これらの知見の主な重要点は，以下のとおりである：
１．上記の成分は，加水分解処理を行わなくても，尿中に存在する。したがって，分析方法を直接，尿に適用し得る。
２．上記の２成分を分析することにより，コラーゲン分解に関する組織特異的な情報が得られる。Ｐｙｄ−Ｇａｌを測定することにより，骨のコラーゲン再吸収の指標が提供される：尿中のＰｙｄ−Ｇａｌ．Ｇｌｃ量は，主として，骨あるいは軟骨の分解の指標となる。そして，Ｐｙｄ−ＧａｌおよびＰｙｄ−Ｇａｌ．Ｇｌｃの相対量は，骨および軟骨の相対的な分解度に関する情報を提供する。
３．糖グループの存在により，上記成分の抗原性（それにより，良好な抗体を生じさせることのできる容易さ）が増大する。各構造に特異的な抗体が産生されるように，糖質部分は，抗体認識部位の一部を形成する。
　特に重要な２タイプの組織は骨および軟骨である。骨および軟骨の両方におけるコラーゲン分解の存在が関節の障害あるいは疾病の指標であるのに対し，骨コラーゲンのみの分解の存在はオステオポローシスおよび他の骨障害の指標である。
　一般に，本発明は，以下の工程により，実施され得る：
１．生体液中の重要な特定のＸを同定する。
２．Ｘを単離する。
３．Ｘを適当なタンパクに結合させる。
４．３の生成物を宿主動物に注入し，抗体を生じさせる。
５．この抗体をＥＬＩＳＡあるいは他の適当な分析法において使用する。
　本発明のより具体的な実施例を示す。
　スキーム１および２は，尿から架橋を含む断片を単離するための手順を要約したものであり，単離される成分の詳細が与えられている。これらスキームの変形については，以下で詳述する。
実施例１
方法
ａ．高濃度の全ピリジニウム架橋を含む尿試料を，骨折の転換が増進する（副甲状腺機能亢進症）か，あるいは軟骨および骨の分解が増進する（リウマチ様関節炎）ような症状のどちらかを伴う疾患を持つ患者より採取した。
ｂ．全部で，１．０〜１．５１の尿を，凍結乾燥し，０．２Ｍ酢酸中に再溶解させ，Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ２の２．６ｘ１４０ｃｍカラムを用いて，バッチ方式で，ゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。
ｃ．ピリジニウム架橋誘導体を含む選択画分を，Ｃ１８支持体を用い，アセトニトリルを含む移動相で溶出する逆相ＨＰＬＣにより，再度，クロマトグラフィーにかけた。これら，ペプチドをＤＥＡＥカラムおよびＳＰ−５ＰＷカラムを用いたイオン交換ＨＰＬＣにより，さらに精製した。
ｄ．単離した成分を高速原子衝撃マススペクトロメトリーおよびアミノ酸配列分析により特性付けた；グリコシル化部位は，これらペプチドのアルカリ加水分解産物のガス液体クロマトグラフィーにより，同定された。
ｅ．骨および軟骨の中の架橋部位の周辺のアミノ酸配列を知ることにより，尿より単離したペプチドの組織起源を確定した。様々な組織の代表的なコア配列を含む，多種類の多くのペプチドを，抗体を生成させるために選んだ。
ｆ．各々の精製されたペプチド（１μｍｏｌ）は，Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライドを用いて卵白アルブミン（０．２５μｍｏｌ）に共有結合させた。
ｇ．Ｂａｌｂ／ｃマウスを卵白アルブミン複合体で免疫し，Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞を用いて，融合を行った後，モノクローナル抗体を生成させた。陽性のクローンを，別のカルボジイミド試薬Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−２−（４’−メチルモルホリニウム）エチルカルボジイミド−ｐ−トルエンスルフォネートとの反応によりゼラチンに結合させたペプチドで被覆されたマイクロチューブプレートを用いたＥＬＩＳＡにより，検出した。
　このようにして生成したモノクローナル抗体を，様々な種類の骨障害および変性関節疾患の診断およびモニターのための免疫検定試験において使用した。
実施例２
方法
　工程１　元の量の１０分の１にまで濃縮した尿（３００ｍｌ）を，０．２Ｍ酢酸を溶離液として，セファデックスＧ２５Ｍのカラム（３．０ｘ１００ｃｍ）によるクロマトグラフィーにかけた。約６０％の特徴的なピリジニウム架橋蛍光を含む，５４０ｍｌと６３０ｍｌとの間（Ｖｅ／Ｖｏ＝１．６〜１．９）の画分をプールし，凍結乾燥させた。
　工程２　工程１の画分（２８０ｍｇ）を，セファデックスＧ１０のカラム（１．７ｘ１４０ｃｍ）によるクロマトグラフィーに再びかけ，０．２Ｍ酢酸で溶出させることにより，アミノ酸および他の低モル濃度の物質から架橋成分を分離した。これらの画分を，蛍光（Ｅｘ２９５ｎｍ；Ｅｍｍ．４００ｎｍ）によりモニターし，１０５ｍｌと１２１ｍｌとの間（Ｖｅ／Ｖｏ＝１．１〜１．３）で溶出した物質をプールし，蒸発乾固させた。
　工程３　工程２の画分を，ジビニルベンゼン（Ｌｏｃａｒｔｅ　Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｃａｔ　ＮｏＬＡ４８／０８）で架橋した（８％）スルホン化ポリスチレン樹脂ビーズ（５μ）のカラム（０．９ｘ１５ｃｍ）を用いて５６℃で行う陽イオン交換クロマトグラフィーにかけ，６７ｍＭクェン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８４）で溶出させた。５ｍｌの画分を採取し，適当な画分をセファデックスＧ１０のカラム（１．７ｘ５０ｃｍ）で脱塩し，凍結乾燥させた。
　このシステムでは，Ｐｙｄ−Ｇａｌ（Ｉ）は９１分と１０５分との間で溶出し，ｐｙｄ−Ｇａｌ．Ｇｌｃ（ＩＩ）は４１分と５０分との間で溶出した
　ＩおよびＩＩの最終精製は，Ｒｏｓｉｌ　Ｃ１８充填剤（３μ）のカラム（０．９ｘ２５ｃｍ）による逆相ＨＰＬＣで行い，０．１％ヘプタフルオロブチル酸および１５％〜３０％の直線勾配濃度のアセトニトリルで，３０分間溶出させた。（Ｉ）および（ＩＩ）は，それぞれ，１７．３分と１６．９分との間で溶出した。
特性付け
１．加水分解性
　穏やかな酸加水分解（０．１Ｍ　ＨＣｌ，１０８℃，１２時間）により，Ｐｙｄ−Ｇａｌ．Ｇｌｃ（ＩＩ）を，完全に，Ｐｙｄ−Ｇａｌ（Ｉ）およびピリジノリン（Ｐｙｄ）の混合物に転換した。Ｐｙｄ−Ｇａｌ（Ｉ）を，１０８℃の２ＭＨＣｌ中で８時間加水分解させることにより，この成分をＰｙｄに完全に転換させた。この挙動は，これらのタイプの成分に特徴的なものであり，従来より，ヒドロキシリジングリコシドのヒドロキシリジンヘの相互転換について知られている。
２．組成物
　強い鉱酸を用いて加水分解を行うと，成分（Ｉ）および（ＩＩ）の両方ともが，Ｐｙｄを生成し，加水分解産物中には他のアミノ酸が検出されなかった。この糖質組成を，２Ｍ硫酸中で加水分解させ，水素化ホウ素ナトリウムで還元した後，メチル化誘導体のガス液体クロマトグラフィーにより決定した。これらの結果およびＨＰＬＣによる架橋量の測定に基づくと，モル比は；
成分Ｉ　　ピリジノリン（１・０）；ガラクトース（０・９）
成分ＩＩ　ピリジノリン（１．０）；ガラクトース（０．８）
グルコース（０．９）
　したがって，上記の結果により，成分ＩおよびＩＩの構造は，先に示された通りであることが確認された。
　上記に加えて，工程３において，１８４分と１９５分との間で溶出した「Ｘ」と呼ぶ関連誘導体を単離した。この成分は，Ｐｙｄを含んでおり，骨障害を持つ患者において，その量が増加している。これら成分の免疫検定法は，アミノ基あるいはカルボキシル基によって，卵白アルブミンに結合させることにより，ペプチドについて述べたように，精度よく実施される。
　改変および改善は，本発明の範囲から逸脱することなく実施され得る。