(57)【要約】  本発明は、異常赤血球生成に関連する疾患及び障害を治療する方法を提供する。具体的には、本発明は、ｍｉＲ−４５１の阻害薬を投与することによる対象における赤血球増加症の治療方法を提供する。ｍｉＲ−４５１ミメティックを投与することにより対象において赤血球数を増加させる方法及び貧血症を治療する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要がある対象における赤血球増加症の治療方法であって、前記対象にｍｉＲ−４５１の阻害薬を投与する工程を含む方法。
【請求項２】
前記ｍｉＲ−４５１の阻害薬の投与後に前記対象の赤血球数が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍｉＲ−４５１の阻害薬が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、成熟ｍｉＲ−４５１配列と少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３の配列と少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの糖修飾及び／又は骨格修飾を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記糖修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾又はロックド核酸修飾である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記骨格修飾が、ホスホロチオエート修飾である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、約８〜約１８ヌクレオチド長である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０からなる群から選択される配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、静脈内投与経路又は皮下投与経路により投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、真性赤血球増加症、原発性家族性先天性赤血球増加症、又は赤血球増加症に関連する疾患と診断されるか、それに罹患しているか、又はそれを発症するリスクがある、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記赤血球増加症に関連する疾患が、気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、うっ血性心不全、睡眠時無呼吸、多発性骨髄腫、又は肺高血圧症である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
対象における赤血球前駆体に対する成熟赤血球の比を調節する方法であって、ｍｉＲ−４５１活性又は発現の調節薬を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項１５】
前記成熟赤血球がＣＤ７１陰性及びＴＥＲ  １１９陽性である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｍｉＲ−４５１活性又は発現の調節薬が、ｍｉＲ−４５１阻害薬である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記赤血球前駆体に対する成熟赤血球の比が、前記ｍｉＲ−４５１阻害薬の投与後に前記対象において低下する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｍｉＲ−４５１阻害薬が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、成熟ｍｉＲ−４５１配列と少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３の配列と少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの糖修飾及び／又は骨格修飾を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記糖修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾又はロックド核酸修飾である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記骨格修飾が、ホスホロチオエート修飾である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｍｉＲ−４５１活性又は発現の調節薬がｍｉＲ−４５１ミメティックである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記赤血球前駆体に対する成熟赤血球の比が、前記ｍｉＲ−４５１ミメティックの投与後に前記対象において増加する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｍｉＲ−４５１ミメティックが、成熟ｍｉＲ−４５１配列を含むポリヌクレオチドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号３の配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドが、ベクターから発現される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
必要がある対象において赤血球数を増加させる方法であって、前記対象にｍｉＲ−４５１ミメティックを投与する工程を含む方法。
【請求項３１】
前記対象が、再生不良性貧血又は赤血球無形成症と診断されるか、それに罹患しているか、又はそれを発症するリスクがある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｍｉＲ−４５１ミメティックが、成熟ｍｉＲ−４５１配列を含むポリヌクレオチドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号３の配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドが、ベクターから発現される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
必要がある対象における骨髄増殖性疾患の治療方法であって、前記対象にｍｉＲ−４５１の阻害薬を投与する工程を含む方法。
【請求項３７】
前記骨髄増殖性疾患が、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、骨髄線維症、又は白血病である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記白血病が慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）又は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｍｉＲ−４５１阻害薬が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、約８〜約３０ヌクレオチド長であり、かつ成熟ｍｉＲ−４５１配列と少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３の配列と少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０からなる群から選択される配列を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの糖修飾及び／又は骨格修飾を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記糖修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾又はロックド核酸修飾である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記骨格修飾が、ホスホロチオエート修飾である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、静脈内投与経路又は皮下投与経路により投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
成熟ｍｉＲ−４５１配列と少なくとも部分的に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を含む医薬組成物であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの糖修飾及び／又は骨格修飾と薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項４８】
前記少なくとも１つの糖修飾が、二環状糖ヌクレオシド修飾又は２’Ｏ−メチル修飾である、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記少なくとも１つの骨格修飾が、ホスホロチオエート修飾である、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、約８〜約１８ヌクレオチド長である、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０からなる群から選択される配列を有する、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの前記有効量が、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記組成物が、静脈内投与又は皮下投与用に製剤化される、請求項４７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１０年１月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／２９６，７８３号、及び２０１０年２月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／２８２，５４６号の利益を主張し、これらの仮出願は全体として参照により本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府の支援に関する記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（National Institute of Health）により交付された助成金番号第ＨＬ０９３０３９号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
電子的に提出されたテキストファイルに関する記載事項
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、全体として参照により本明細書に援用される：配列表のコンピュータ可読フォーマットコピー（ファイル名：MIRG_021_01WO_SeqList_ST25.txt、記録日：２０１１年１月２０日、ファイルサイズ６キロバイト）。
【０００４】
本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の活性又は発現を制御することによる、異常赤血球生成に関連する障害及び疾患の治療に関する。特に、本発明は、ｍｉＲ−４５１の発現を制御することにより赤血球増加症又は貧血症を治療することに関する。
【背景技術】
【０００５】
赤血球増加症、すなわち赤血球量の不適切な増加は、先天性又は後天性のいずれもあり得る。真性赤血球増加症（ＰＶ）としても知られる原発性赤血球増加症は、ＪＡＫ２−Ｖ６１７Ｆ突然変異を獲得した骨髄系前駆細胞のクローン性増殖から生じる後天性疾患である。ＰＶ症例の９５％に認められるこの突然変異は、赤血球前駆細胞の過剰な成熟を引き起こし、循環成熟赤血球が過剰となる。約１０万人に２人がＰＶを有し、その有病率は女性より男性の方が高い。脳血管事象、心筋梗塞、深部静脈血栓症、及び肺塞栓症を含め、赤血球量の増加に直接起因する高い罹患率及び死亡率が認められる。診断時からの生存期間中央値は約１３年であり、死亡のうち４０％超は血栓事象によるものである。現在、この疾患の一次療法は静脈切開術による赤血球量の調節である。適切なＰＶ治療には、重大な毒性なしに赤血球量を直接下げる治療化合物が開発されなければならない。
【０００６】
貧血症は、正常な赤血球数が減少し、又は正常な血中ヘモグロビン値が低下するもので、最も一般的な血液障害であり、過剰な失血（例えば、出血）、過剰な血球破壊（例えば、溶血）、及び赤血球産生の不足（例えば、赤血球生成不全）を含む様々な要因によって引き起こされ得る。現行の貧血症治療は、多くの場合に根底にある原因によって決まり、鉄補給、外因性エリスロポエチン、及び輸血が含まれる。特に、再生不良性貧血は、骨髄が十分な量の血球を産生できないことによって起こる。再生不良性貧血は、典型的には従来の抗貧血治療に反応せず、病態を寛解させるには骨髄移植が必要となり得る。従って、貧血症のためのさらなる治療、特に血球産生を増加させるように作用する治療が、常に必要とされている。
【０００７】
最近になってｍｉＲＮＡが、とりわけ発生タイミングの制御、アポトーシス、脂肪代謝、及び造血細胞分化を含め、多くの生物学的過程と関連付けられるようになっている。ｍｉＲＮＡは約１８〜約２５ヌクレオチド長の小型の非タンパク質コードＲＮＡであり、個々のｍｉＲＮＡ遺伝子から得られるか、タンパク質コード遺伝子のイントロンから得られるか、又は複数の近縁のｍｉＲＮＡをコードすることが多いポリシストロン性転写物から得られる。Carrington et al.（Science, Vol. 301(5631):336-338, 2003）によるレビューを参照のこと。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの抑制因子として、その配列が完全に相補的であるときはその分解を促進することにより働き、又はその配列がミスマッチを含むときは翻訳を阻害することにより働く。多くのｍｉＲＮＡが組織特異的であり、そのため遍在的に発現した遺伝子を組織特異的な形で制御することが可能である。これらの特性から、ｍｉＲＮＡを制御すれば、複合的な疾患状態に対して組織特異的な形で治療上の影響を与え得るものと考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、一部には、正常な赤血球生成にｍｉＲ−４５１が必要であり、ｍｉＲ−４５１発現量が低下すると成熟赤血球が著しく減少するという発見に基づく。従って、ｍｉＲ−４５１発現の調節は、赤血球増加症及び貧血症などの、異常赤血球生成に関連する障害及び疾患を処置する治療手法を提供する。従って、一実施形態において本発明は、ヒトを含む、必要がある対象において、ｍｉＲ−４５１の阻害薬を対象に投与することにより赤血球増加症を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、ｍｉＲ−４５１阻害薬は、成熟ｍｉＲ−４５１配列の全て又は一部と少なくとも部分的に相補的な配列を含む修飾又は非修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｍｉＲ−４５１阻害薬の投与後、対象の赤血球数は減少する。対象は、真性赤血球増加症、原発性家族性先天性赤血球増加症、又は赤血球増加症に関連する疾患と診断されるか、それに罹患しているか、又はそれを発症するリスクがあり得る。
【０００９】
本発明はまた、対象において赤血球数を増加させる方法も含む。一実施形態では、この方法は、対象にｍｉＲ−４５１ミメティック（mimetic）を投与する工程を含む。ｍｉＲ−４５１ミメティックは、成熟ｍｉＲ−４５１配列、前駆ｍｉＲ−４５１配列、又は一次ｍｉＲ−４５１配列を含むポリヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ｍｉＲ−４５１配列を含むポリヌクレオチドはベクターから発現される。対象は、赤血球無形成症又は貧血症の一種、例えば再生不良性貧血と診断されるか、それに罹患しているか、又はそれを発症するリスクがあり得る。
【００１０】
本発明はまた、対象における赤血球前駆体に対する成熟赤血球の比を調節する方法も提供する。一実施形態では、この方法は、ｍｉＲ−４５１活性又は発現の調節薬を対象に投与する工程を含む。赤血球前駆体に対する成熟赤血球の比の低下は、本発明のｍｉＲ−４５１阻害薬を投与することにより達成することができる。赤血球前駆体に対する成熟赤血球の比の増加は、本発明のｍｉＲ−４５１ミメティックを投与することにより達成することができる。一部の実施形態では、成熟赤血球はＣＤ７１陰性及びＴＥＲ  １１９陽性である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】野生型マウスから単離した示される組織におけるｍｉＲ−４５１発現のノーザンブロット分析。ＢＭ、骨髄；Ｌｇ、肺；Ｓｐ、脾臓；Ｋ、腎臓；Ｈ、心臓；ＳｋＭ、骨格筋；Ｂｌ、膀胱；Ｌｖ、肝臓。
【図２】Ａ．野生型（ＷＴ；ｍｉＲ−４５１＋／＋）動物、ヘテロ接合体（Ｈｅｔ；ｍｉＲ−４５１＋／−）動物、及びｍｉＲ−４５１ノックアウト（ＫＯ；ｍｉＲ−４５１−／−）動物から単離した骨髄組織におけるｍｉＲ−４５１発現のノーザンブロット（左側のパネル）及び定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析（右側のパネル）。ＲＮＵ６Ｂ発現を負荷対照として使用した。Ｂ．８週齢の野生型マウス（ＷＴ；ｍｉＲ−４５１＋／＋）及びｍｉＲ−４５１対立遺伝子が双方とも欠損したマウス（ＫＯ；ｍｉＲ−４５１−／−）におけるヘマトクリット値。
【図３】Ｅ１４．５における全載（whole mount）野生型（ｍｉＲ−４５１＋／＋）胚又はｍｉＲ−４５１ノックアウト（ｍｉＲ−４５１−／−）胚。矢印は胎児肝を示す。ｍｉＲ−４５１ノックアウト胚は蒼白及び胎児肝のサイズ縮小を呈する。
【図４】Ａ．交配後１４．５日目及び１６．５日目の野生型（ｍｉＲ−４５１＋／＋）動物、ｍｉＲ−４５１ヘテロ接合体（ｍｉＲ−４５１＋／−）動物、及びｍｉＲ−４５１ノックアウト（ｍｉＲ−４５１−／−）動物から単離した赤血球のフローサイトメトリー分析。ＣＤ７１＋細胞をｙ軸上に示し、ＴＥＲ１１９＋細胞をｘ軸上に示す。Ｂ．交配後１６．５日目のＷＴ（ｍｉＲ−４５１＋／＋）動物、ｍｉＲ−４５１  Ｈｅｔ（ｍｉＲ−４５１＋／−）動物、及びｍｉＲ−４５１  ＫＯ（ｍｉＲ−４５１−／−）動物からそれぞれ得られた未熟赤血球及び成熟赤血球に相当する領域ＩＩＩ及び領域ＩＶにおける赤血球の割合。
【図５】５倍（左側のパネル）又は４０倍（右側のパネル）に拡大した、成体の野生型（ｍｉＲ−４５１＋／＋）マウス又はｍｉＲ−４５１ノックアウト（ｍｉＲ−４５１−／−）マウスから単離した脾臓の組織切片。切片はヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ｍｉＲ−４５１ノックアウトの脾臓は赤血球前駆体の著しい膨張を示す。
【図６】Ａ．成体の野生型（ｍｉＲ−４５１＋／＋）動物、ｍｉＲ−４５１ヘテロ接合体（ｍｉＲ−４５１＋／−）動物、及びｍｉＲ−４５１ノックアウト（ｍｉＲ−４５１−／−）動物から単離した骨髄のフローサイトメトリー分析。ＣＤ７１＋細胞をｙ軸上に示し、ＴＥＲ１１９＋細胞をｘ軸上に示す。Ｂ．野生型（ｍｉＲ−４５１＋／＋）動物、ｍｉＲ−４５１ヘテロ接合体（ｍｉＲ−４５１＋／−）動物、及びｍｉＲ−４５１ノックアウト（ｍｉＲ−４５１−／−）動物からの骨髄組織中のＣＤ７１−／ＴＥＲ１１９＋成熟赤血球（領域ＩＶ）の割合。
【図７】フェニルヒドラジン（ＰＨＺ）溶血ストレス試験後のｍｉＲ−４５１野生型（ＷＴ）動物及びノックアウト（ＫＯ）動物のヘマトクリット。ｍｉＲ−４５１動物は、高い赤血球形成速度が十分には生じないことを示す。
【図８】Ａ．ＹＷＨＡＺのｍｉＲ−４５１（配列番号３）についての、異なる種（配列番号１１〜１４）の間で保存された３’−ＵＴＲ結合部位を示す概略図。ｍｉＲ−４５１シード領域を赤色で強調表示している。Ｂ．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｍｉＲ−４５１ノックアウト（ＫＯ）動物では、野生型（ＷＴ）動物と比較して、ＹＷＨＡＺ転写物の著しいアップレギュレーションがあり、１４−３−３タンパク質をコードする他の転写物において著しい変化はないことを示す。
【図９】ｍｉＲ−４５１による赤血球分化の可能な制御経路の概略図。ｍｉＲ−４５１は、シャペロン分子１４−３−３ζをコードする遺伝子であるＹＷＨＡＺの発現を阻害し、それにより成長因子受容体からの下流シグナル伝達を妨げ得る。
【図１０】Ａ．ミスマッチを有する対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（ｍｍ−４５１）又は成熟ｍｉＲ−４５１と相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（抗４５１）を静脈内注射したマウスから単離した骨髄からのノーザンブロット分析。Ｂ．ミスマッチを有する対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（ｍｍ−４５１）又はｍｉＲ−４５１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（抗４５１）を注射した、骨髄を単離した動物のフローサイトメトリー分析。ＣＤ７１＋細胞をｙ軸上に示し、ＴＥＲ１１９＋細胞をｘ軸上に示す。Ｃ．それぞれ未熟赤血球及び終末分化した赤血球に相当する領域ＩＩ及び領域ＩＶにおける赤血球の割合。
【図１１】ａｎｔｉｍｉＲ−４５１は生体内でのｍｉＲ−４５１発現を抑制する。生理食塩水、２５ｍｇ／ｋｇミスマッチ、又は２５ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍｉＲ−４５１のいずれかで処置した動物の骨髄から回収したＲＮＡのノーザンブロット分析から、ａｎｔｉｍｉＲ治療群においてのみ成熟ｍｉＲ−４５１が抑制されることが分かる。全ＲＮＡを示す臭化エチジウム染色アクリルアミドゲルを負荷対照（loading control）として示す。各レーンが個々の動物に相当する。
【図１２】ａｎｔｉｍｉＲ−４５１はＰＶの異種移植モデルにおいてヘマトクリットを低下させる。ａｎｔｉｍｉＲ−４５１（ａｎｔｉｍｉＲ）又はミスマッチａｎｔｉｍｉＲ（ミスマッチ）のいずれかで処理した野生型ヒトＪＡＫ２キナーゼ（ＷＴ）又は構成的活性型ＪＡＫ２−Ｖ６１７Ｆ（ＶＦ）のいずれかに感染させた幹細胞を移植したマウスのヘマトクリット分析から、ＶＦ−ａｎｔｉｍｉＲ群においてのみヘマトクリットが低下することが分かる。ＷＴ−ミスマッチ、ＷＴ−ａｎｔｉｍｉＲ、及びＶＦ−ミスマッチについてはｎ＝１。ＶＦ−ａｎｔｉｍｉＲについてはｎ＝４。
【図１３】ａｎｔｉｍｉＲ−４５１はヒトＣＤ３４陽性造血細胞における赤血球系分化を減弱させる。ヒトＣＤ３４＋幹細胞にａｎｔｉｍｉＲ−４５１又はミスマッチａｎｔｉｍｉＲのいずれかをヌクレオフェクト（nucleofect）した。これらの細胞を１０日間自発的に分化させた時点で、フローサイトメトリーにより赤血球分化を分析した。赤血球マーカーＣＤ７１及びＴｅｒ１１９について細胞を染色した。最も分化した赤血球が領域４（Ｒ４）にある一方、分化が少ない赤血球系細胞が領域２（Ｒ２）にある。各領域においてゲーティングされた（gated）割合をそれぞれのゲート内に記載する。これらの細胞にａｎｔｉｍｉＲ−４５１をヌクレオフェクトすると、ミスマッチａｎｔｉｍｉＲをヌクレオフェクトした細胞と比較して赤血球系分化が低下することは明白である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、一部には、哺乳動物の赤血球成熟にｍｉＲ−４５１が必要であるという発見に基づく。ｍｉＲ−４５１対立遺伝子双方が欠損したマウスは成熟赤血球のほぼ完全な消失を示し、一方、ヘテロ接合体動物は正常値の約半分の成熟赤血球を有する。従って、ｍｉＲ−４５１発現の調節を用いて成熟赤血球（erythrocyte）又は赤血球（red blood cell）産生を制御することができる。従って、本発明は、赤血球増加症及び貧血症などの、異常な成熟赤血球値に関連した疾患及び障害を治療する方法を提供する。
【００１３】
ヒトでは、ｍｉＲ−４５１は、１７番染色体の遺伝子間領域からのｍｉＲ−１４４と共に発現する。ヒト及びマウスのｍｉＲ−４５１の配列をコードするｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを、以下にそれぞれ配列番号１及び配列番号２として示す。成熟ｍｉＲ−４５１配列を配列番号３に提供する。マウスのｐｒｉ−ｍｉＲ−１４４／４５１配列を配列番号１５に提供する。予測されるｐｒｉ−ｍｉＲ−１４４／４５１配列位置は１７番染色体上のゲノム座標２４２１２５１３〜２４２１２７６２である（Saini et al. (2008) BMC Genomics, Vol 9: 564、これは参照により本明細書に援用される）。本発明はまた、ヒトｐｒｉ−ｍｉＲ−１４４／４５１配列の使用も含む。
ヒトｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１（配列番号１）
５’−ＣＵＵＧＧＧＡＡＵＧ  ＧＣＡＡＧＧＡＡＡＣ  ＣＧＵＵＡＣＣＡＵＵ  ＡＣＵＧＡＧＵＵＵＡ  ＧＵＡＡＵＧＧＵＡＡ  ＵＧＧＵＵＣＵＣＵＵ  ＧＣＵＡＵＡＣＣＣＡ  ＧＡ−３’
マウスｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１（配列番号２）
５’−ＣＵＵＧＧＧＡＡＵＧ  ＧＣＧＡＧＧＡＡＡＣ  ＣＧＵＵＡＣＣＡＵＵ  ＡＣＵＧＡＧＵＵＵＡ  ＧＵＡＡＵＧＧＵＡＡ  ＣＧＧＵＵＣＵＣＵＵ  ＧＣＵＧＣＵＣＣＣＡ  ＣＡ−３’
成熟ｍｉＲ−４５１（配列番号３）
５’−ＡＡＡＣＣＧＵＵＡＣ  ＣＡＵＵＡＣＵＧＡＧ  ＵＵ−３’
マウスｐｒｉ−ｍｉＲ−１４４／４５１（配列番号１５）
５’−ＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＴＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＧＧＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＧＣＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＴＡＴＡＧＧＴＣＴＧＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＣＡＡＣＴＴＣＧＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＴＡＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＧＡＧＡＣＣＣＧＡＧＴＡＧＡＣＣＴＴＡＧＣＴＴＣＣＴＴＣＴＣＴＡＡＧＣＣＡＣＣＴＧＧＧＧＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＡＧＧＧＡＣＴＴＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＡＡＴＣＣＣＣＴＧＧＣＴＣＡＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＴＧＧＣＴＧＧＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＡＣＴＧＴＡＡＧＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＣＴＡＣＡＧＴＡＴＡＧＡＴＧＡＴＧＴＡＣＴＡＧＴＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＴＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＴＡＡＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＣＡＣＴＴＧＧＧＡＡＴＧＧＣＧＡＧＧＡＡＡＣＣＧＴＴＡＣＣＡＴＴＡＣＴＧＡＧＴＴＴＡＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＣＧＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＡＣＡＡＡＣＴＧＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＧＡＡＡＧＧＧＴＡＣＡＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＴＧＣＣＡＡＡＧＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＡＴＡＡＧＡＧＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＴＴＡＧＣＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＡＴＧ−３’
【００１４】
本明細書に開示されるＲＮＡ配列がデオキシリボヌクレオチドを必要とする実施形態で使用される場合、ウリジン残基の代わりにチミジン残基が用いられることが理解される。同様に、本明細書に開示されるＤＮＡ配列がリボヌクレオチドを必要とする実施形態で使用される場合、チミジン残基の代わりにウリジン残基が用いられる。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−４５１活性又は発現の阻害薬を投与することにより、必要がある対象において赤血球増加症を治療する方法を提供する。本明細書で使用されるとき、用語「対象」又は「患者」は、限定なしに、ヒト及び他の霊長類（例えば、チンパンジー並びに他の類人猿及びサル種）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ）、家庭内飼育哺乳動物（例えば、イヌ及びネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、及びモルモットなどのげっ歯類）、及び鳥類（例えば、家庭内飼育鳥、野鳥及び狩猟鳥、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ及び他の家禽、アヒル、ガチョウなど）を含め、任意の脊椎動物を指す。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。他の実施形態では、対象はヒトである。
【００１６】
赤血球増加症は、赤血球量の増加を特徴とする骨髄増殖性疾患である。原発性赤血球増加症又は真性赤血球増加症は、過剰な赤血球産生をもたらす骨髄の異常により引き起こされると考えられている。本発明の方法は、必要がある対象にｍｉＲ−４５１阻害薬を投与し、それにより成熟赤血球（erythrocyte）又は赤血球（red blood cell）の数を減少させることによる赤血球増加症の治療を提供する。一実施形態では、対象の赤血球数は、ｍｉＲ−４５１の阻害薬の投与後に、ｍｉＲ−４５１阻害薬の投与を受けていない対象と比較して減少する。例えば対象の赤血球数は、ｍｉＲ−４５１阻害薬の投与後に、ｍｉＲ−４５１阻害薬の投与を受けていない対象と比較して約１０％、２０％、３０％、又は約４０％減少し得る。別の実施形態では、対象の赤血球数は正常な赤血球数値の範囲内になるまで減少する。正常赤血球数は、女性について約４２０〜約５４０万細胞／μＬ、男性について約４７０〜約６１０万細胞／μＬ、及び小児について約４６０〜約４８０万細胞／μＬである。特定の実施形態では、対象は、真性赤血球増加症、原発性家族性先天性赤血球増加症、又は赤血球増加症に関連する疾患と診断されるか、それに罹患しているか、又はそれを発症するリスクがある。赤血球増加症に関連する疾患には、限定はされないが、気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、うっ血性心不全、睡眠時無呼吸、多発性骨髄腫、又は肺高血圧症が含まれる。従って、本発明はまた、ｍｉＲ−４５１阻害薬を投与することにより赤血球増加症に関連する疾患を治療する方法も包含する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−４５１阻害薬を投与することにより対象において他の骨髄増殖性疾患を治療又は予防する方法を含む。例えば、一実施形態では、本発明は、必要がある対象において本態性血小板血症（essential thromobocythemia）（本態性血小板増加症（essential thromobocytosis）とも称される）を治療する方法を提供し、この方法は、対象にｍｉＲ−４５１阻害薬を投与する工程を含む。本態性血小板血症は、血小板の過剰産生を特徴とする疾患である。一部の実施形態では、対象の血小板数は、ｍｉＲ−４５１阻害薬の投与後に、ｍｉＲ−４５１阻害薬の投与を受けていない対象の血小板数と比較して減少する。他の実施形態では、対象においてｍｉＲ−４５１阻害薬の投与後に、ｍｉＲ−４５１阻害薬の投与を受けていない対象と比較して脾臓肥大の縮小が起こる。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、必要がある対象において骨髄線維症を治療又は予防する方法を提供し、この方法は、対象にｍｉＲ−４５１阻害薬を投与する工程を含む。原発性又は特発性骨髄線維症に罹患している患者の骨髄は膠質性の結合組織線維に置き換わり、進行性汎血球減少症が引き起こされる。特定の実施形態では、対象の骨髄の線維含有量が、ｍｉＲ−４５１阻害薬の投与後に、ｍｉＲ−４５１阻害薬の投与を受けていない対象と比較して減少する。他の実施形態では、対象の赤血球、白血球、及び／又は血小板数が、ｍｉＲ−４５１阻害薬の投与後に、ｍｉＲ−４５１阻害薬の投与を受けていない対象と比較して増加する。
【００１９】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−４５１阻害薬を投与することにより、対象において白血病を予防又は治療する方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、真性赤血球増加症と診断されるか、それに罹患しているか、又はそれを発症するリスクがあり、白血病を発症するリスクがある。特定の実施形態では、白血病は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）である。他の実施形態では、白血病は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。さらに他の実施形態では、白血病は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）又は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【００２０】
ｍｉＲ−４５１活性又は発現の阻害薬は、成熟ｍｉＲ−４５１配列の全て又は一部を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含み得る。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの化学修飾（例えば、糖修飾又は骨格修飾）を含む。例えば、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の「コンフォメーションが制限された」又は二環状糖ヌクレオシド修飾（ＢＳＮ）から構成されてもよく、これはＢＳＮを含むオリゴヌクレオチドとその相補的マイクロＲＮＡ標的鎖との間に形成される複合体に熱安定性の向上をもたらす。例えば、一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの「ロックド（locked）核酸」を含む。ロックド核酸（ＬＮＡ）は、リボース糖部分が「ロックされた」構造である２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド（構造Ａ）を含む。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’，４’−Ｃで架橋された２’デオキシリボヌクレオシド（ＣＤＮＡ、構造Ｂ）を含む。例えば、米国特許第６，４０３，５６６号及びWang et al. (1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 9: 1147-1150（双方とも全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、構造Ｃに示される構造を有する少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。ｍｉＲ−４５１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＳＮ（ＬＮＡ、ＣＤＮＡなど）又は他の修飾ヌクレオチドと、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドとの組み合わせを含むことができる。
【化１】
2013530160.tif 000002
【００２１】
或いは、アンチセンスオリゴヌクレオチドはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むことができ、これは糖リン酸骨格ではなく、ペプチドベースの骨格を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する他の修飾糖又はリン酸ジエステル修飾も企図される。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが含み得る他の化学修飾には、限定はされないが、２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）修飾、２’−フルオロ修飾、及び４’チオ修飾などの糖修飾、並びに１つ又は複数のホスホロチオエート結合、モルホリノ結合、又はホスホノカルボキシレート結合などの骨格修飾が含まれる（例えば、全体として参照により本明細書に援用される米国特許第６，６９３，１８７号及び同第７，０６７，６４１号を参照のこと）。一実施形態では、ｍｉＲ−４５１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、各塩基に２’Ｏ−メチル糖修飾を含み、ホスホロチオエート結合によって連結される。アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に長さがより短いもの（例えば１５ヌクレオチド未満）は、１つ又は複数の親和性を増強する修飾、例えば、限定はされないが、ＬＮＡ修飾、二環状ヌクレオシド修飾、ホスホノホルメート修飾、２’Ｏ−アルキル修飾などを含み得る。一部の実施形態では、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’末端及び３’末端の双方に２’−Ｏ−メトキシエチルで修飾されたリボヌクレオチドを含み、少なくとも１０個のデオキシリボヌクレオチドが中心にある２’−Ｏ−メトキシエチル「ギャップマー」である。このような「ギャップマー」は、ＲＮＡ標的のＲＮアーゼＨ依存性の分解機構を引き起こす能力を有する。安定性を亢進し、かつ効力を向上させるアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾、例えば全体として参照により本明細書に援用される米国特許第６，８３８，２８３号に記載される修飾が、当該技術分野において公知であり、本発明の方法での使用に好適である。例えば、生体内での送達及び安定を促進するため、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその３’末端で、コレステロール部分などのステロイド、ビタミン、脂肪酸、炭水化物若しくはグリコシド、ペプチド、又は他の小分子リガンドに連結されてもよい。
【００２２】
ｍｉＲＮＡの活性の阻害に有用な好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５〜約２５ヌクレオチド長、約１０〜約３０ヌクレオチド長、又は約２０〜約２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｍｉＲ−４５１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約８〜約１８ヌクレオチド長、及び他の実施形態では約１２〜約１６ヌクレオチド長である。ｍｉＲ−４５１に相補的な任意の８ｍｅｒ又はそれ以上、すなわち、ｍｉＲＮＡの５’末端に相補的であり、ｍｉＲＮＡの完全相補配列にわたって至る任意のａｎｔｉｍｉＲが用いられ得る。例えば、一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは５’−ＡＡＣＵＣＡＧＵＡＡＵＧＧＵＡＡＣＧＧＵＵＵ−３’（配列番号４）の配列を有する。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは５’−ＡＡＣＧＧＵＵＵ−３’（配列番号６）の配列を有する。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは５’−ＧＵＡＡＣＧＧＵＵＵ−３’（配列番号７）の配列を有する。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは５’−ＵＧＧＵＡＡＣＧＧＵＵＵ−３’（配列番号８）の配列を有する。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは５’−ＡＡＵＧＧＵＡＡＣＧＧＵＵＵ−３’（配列番号９）の配列を有する。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは５’−ＧＵＡＡＵＧＧＵＡＡＣＧＧＵＵＵ−３’（配列番号１０）の配列を有する。ｍｉＲ−４５１の他の好適な阻害薬は、５’−ＡＧＵＡＡＵＧＧＵＡＡＣＧＧＵＵ−３’（配列番号１６）、５’−ＧＵＡＡＵＧＧＵＡＡＣＧＧＵＵ−３’（配列番号１７）、５’−ＵＡＡＵＧＧＵＡＡＣＧＧＵＵＵ−３’（配列番号１８）、５’−ＵＡＡＵＧＧＵＡＡＣＧＧＵＵ−３’（配列番号１９）、及び５’−ＵＡＡＣＧＧＵＵ−３’（配列番号２０）からなる群から選択される配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲ−４５１配列の全て又は一部と少なくとも部分的に相補的な、例えば成熟ｍｉＲ−４５１配列の全て又は一部と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的な配列を含み得る。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲ−４５１配列の全て又は一部と実質的に相補的な、すなわち標的ポリヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的であり得る。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲ−４５１配列の全て又は一部と１００％相補的な配列を含む。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号３と少なくとも部分的に相補的である。
【００２３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−４５１の前駆体ｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）の全て又は一部と少なくとも部分的に相補的な、例えばｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１配列の全て又は一部と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的な配列を含み得る。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１のステム−ループ領域の外側に位置する配列と少なくとも部分的に相補的な配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ−４５１阻害薬は、配列番号１又は配列番号２のｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１配列の全て又は一部と少なくとも部分的に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−４５１の一次ｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の全て又は一部と少なくとも部分的に相補的な配列を含み得る。例えば、詳細な一実施形態では、ｍｉＲ−４５１の阻害薬は、配列番号１５のｐｒｉ−ｍｉＲ−４５１配列又は対応するヒトｐｒｉ−ｍｉＲ−４５１配列の全て又は一部と少なくとも部分的に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２４】
本明細書に記載されるｍｉＲ−４５１阻害薬は、赤血球増加症（例えば、真性赤血球増加症）及び他の骨髄増殖性疾患、例えば、本態性血小板血症、骨髄線維症、及び骨髄性白血病の治療に使用される他の治療剤と共に投与されてもよい。例えばｍｉＲ−４５１は、限定はされないが、血液希釈剤（例えばアスピリン）、インターフェロンα、アナグレリド、ヒドロキシウレア、化学療法剤、ダサチニブ（スプリセル（Sprycel））、ＩＮＣＢ−１８４２４、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１）、ギビノスタット（givinostat）（ＩＴＦ−２３５７）、ＸＬ−０１９、ＭＫ−０６８３、ペグ化インターフェロンα２ａ（ペガシス（Pegasys））、ＴＡＫ−９０１、及びエルロチニブを含む治療剤と同時投与されてもよい。ｍｉＲ−４５１阻害薬は他の治療剤の投与前又は投与後に投与され得る。一部の実施形態では、ｍｉＲ−４５１阻害薬は他の治療剤と同時に投与される。特定の実施形態では、ｍｉＲ−４５１阻害薬は、骨髄増殖性疾患を寛解させるために用いられる手技、例えば、静脈切開術、血小板アフェレーシス、及び骨髄移植の前又は後に投与される。
【００２５】
本発明はまた、必要がある対象において赤血球数を増加させる方法も含む。一実施形態では、この方法は、対象にｍｉＲ−４５１ミメティックを投与する工程を含む。本明細書で使用されるとき、「ｍｉＲ−４５１ミメティック」は、ｍｉＲ−４５１がもたらす生物学的作用を生じる薬剤である。ｍｉＲ−４５１ミメティックは、ｍｉＲ−４５１発現又は活性の作動薬である薬剤、又はｍｉＲ−４５１機能を高める薬剤を含むことができる。特定の実施形態では、対象は、貧血症、例えばある種の小球性貧血、大球性貧血、又は正球性貧血と診断されるか、それに罹患しているか、又はそれを発症するリスクがある。一実施形態では、対象は、再生不良性貧血又は赤血球無形成症と診断されるか、それに罹患しているか、又はそれを発症するリスクがある。別の実施形態では、対象は、栄養素欠乏症、例えば、鉄欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症、又は葉酸欠乏症と診断されるか、それに罹患しているか、又はそれを発症するリスクがある。さらに別の実施形態では、対象は、溶血性貧血と診断されるか、それに罹患しているか、又はそれを発症するリスクがある。
【００２６】
ｍｉＲ−４５１ミメティックは、赤血球数を増加させるための、又は様々な種類の貧血症を治療するための他の公知の治療剤と共に投与されてもよい。例えば、ｍｉＲ−４５１ミメティックは、エリスロポエチン、経口鉄補給（例えば、硫酸第一鉄、フマル酸第一鉄、又はグルコン酸第一鉄）、葉酸、ビタミンＢ１２、又はエポエチンアルファと共に投与されてもよい。ｍｉＲ−４５１ミメティック治療はまた、貧血症を治療するための他の手技、例えば輸血又は骨髄移植と共に行われてもよい。例えば、一実施形態では、本発明のｍｉＲ−４５１ミメティックは、被骨髄移植者に移植する前に、血液骨髄提供者又は血液骨髄被移植者自身から得られる造血前駆細胞に送達され得る。
【００２７】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−４５１ミメティック又は作動薬は、成熟ｍｉＲ−４５１配列（配列番号３）をコードするポリヌクレオチドである。別の実施形態では、ｍｉＲ−４５１ミメティック又は作動薬は、ｍｉＲ−４５１のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列（例えば、配列番号１５）を含むポリヌクレオチドであってもよい。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−４５１ミメティック又は作動薬は、ｍｉＲ−４５１のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。例えば、ポリヌクレオチドは配列番号１又は配列番号２の配列を含み得る。かかるポリヌクレオチドは約１８〜約２０００ヌクレオチド長、約７０〜約２００ヌクレオチド長、約２０〜約５０ヌクレオチド長、又は約１８〜約２５ヌクレオチド長であり得る。成熟ｍｉＲ−４５１、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１、又はｐｒｉ−ｍｉＲ−４５１配列を含むポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、１つ又は複数の化学修飾、例えば、ロックド核酸、ペプチド核酸、糖修飾、例えば、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）修飾、２’−フルオロ修飾、及び４’チオ修飾など、並びに骨格修飾、例えば、１つ又は複数のホスホロチオエート結合、モルホリノ結合、又はホスホノカルボキシレート結合などを含み得る。一実施形態では、ｍｉＲ−４５１配列を含むポリヌクレオチドは、コレステロールなどのステロイド、ビタミン、脂肪酸、炭水化物若しくはグリコシド、ペプチド、又は別の小分子リガンドにコンジュゲートされる。
【００２８】
特定の実施形態では、成熟ｍｉＲ−４５１、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１、又はｐｒｉ−ｍｉＲ−４５１配列を含むポリヌクレオチドは、発現ベクターから発現されてもよい。加えて、本明細書に記載される任意のｍｉＲ−４５１阻害薬は、ｍｉＲ−４５１阻害薬をコードする発現ベクターを投与することによって対象に送達することができる。「ベクター」は、目的の核酸を細胞内部に送達するために使用することのできる組成物（composition of matter）である。数多くのベクターが当該技術分野において公知であり、そのようなベクターには、限定はされないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン化合物又は両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが含まれる。従って用語「ベクター」は、自己複製プラスミド又はウイルスを含む。一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターの例には、限定はされないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれる。発現構築物は生細胞内で複製することができ、又はそれは合成的に作製することができる。本願の目的上、用語「発現構築物」、「発現ベクター」、及び「ベクター」は、本発明の適用を一般的かつ説明的意味で示すために同義的に使用され、本発明を限定することは意図されない。
【００２９】
一実施形態では、ｍｉＲ−４５１配列を含むポリヌクレオチドを発現するための発現ベクターは、成熟ｍｉＲ−４５１配列（例えば、配列番号３）、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１配列（例えば、配列番号１又は配列番号２）、又はｐｒｉ−ｍｉＲ−４５１配列（例えば、配列番号１５）を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。別の実施形態では、本発明のｍｉＲ−４５１阻害薬を発現するための発現ベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、ここで、発現したアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、ｍｉＲ−４５１の成熟配列（例えば、配列番号３）と部分的に又は完全に相補的である。語句「作動可能に連結された」又は「転写調節下にある」は、本明細書で使用されるとき、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチドの発現を調節するためにプロモーターがポリヌクレオチドに対して正しい位置及び向きにあることを意味する。本明細書で使用されるとき、「プロモーター」は、遺伝子の特定の転写を開始するために必要な、細胞の合成機構により認識されるＤＮＡ配列、又は導入された合成機構を指す。好適なプロモーターには、限定はされないが、ＲＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ、及びウイルスプロモーター（例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス長末端反復）が含まれる。一実施形態では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。特に興味深いのは、赤血球前駆細胞プロモーター、及びより詳細には、赤血球特異的プロモーター、例えば、ＨＫ１（de Vooght et al. (2009) Haematologica, Vol. 94: 1203-1210）、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＣＥＢＰ／α、ＰＵ．１、及びＳＴＡＴ５プロモーターである。特定の実施形態では、ｍｉＲ−４５１をコードするポリヌクレオチド又はｍｉＲ−４５１阻害薬に作動可能に連結されたプロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターは当該技術分野において公知であり、限定はされないが、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答エレメント、アデノウイルス後期プロモーター、及び誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲが含まれる。
【００３０】
本発明はまた、対象における赤血球前駆体に対する成熟赤血球の比を調節する方法も提供する。一実施形態では、この方法は、ｍｉＲ−４５１活性又は発現の調節薬を対象に投与する工程を含む。「ｍｉＲ−４５１活性又は発現の調節薬」は、ｍｉＲ−４５１の活性又は発現を阻害し、又は低下させる薬剤、例えば本明細書に記載されるとおりのｍｉＲ−４５１阻害薬を含む。ｍｉＲ−４５１活性又は発現の調節薬はまた、ｍｉＲ−４５１作動薬又はミメティック、例えば、ｍｉＲ−４５１配列（例えば、成熟ｍｉＲ−４５１、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１、又はｐｒｉ−ｍｉＲ−４５１）を含むポリヌクレオチド、又はｍｉＲ−４５１発現を増加させる薬剤、例えば転写因子又は成長因子も含む。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「成熟赤血球」は終末分化した赤血球を指す。一部の実施形態では、成熟赤血球はＣＤ７１陰性及びＴＥＲ  １１９陽性である。「赤血球前駆体」は、ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅを含む、網赤血球及び成熟赤血球を生成する前駆細胞を指す。赤血球前駆体は、典型的にはＣＤ７１、エリスロポエチン受容体、及びｃ−ｋｉｔについて陽性である。一実施形態では、調節薬はｍｉＲ−４５１阻害薬であり、ｍｉＲ−４５１阻害薬の投与後に対象において赤血球前駆体に対する成熟赤血球の比が低下する。本明細書に記載される任意のｍｉＲ−４５１阻害薬、例えばｍｉＲ−４５１配列の全て又は一部と少なくとも部分的に相補的な配列を含む修飾又は非修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが、本方法での使用に好適である。
【００３２】
別の実施形態では、調節薬はｍｉＲ−４５１ミメティックであり、ｍｉＲ−４５１ミメティックの投与後に対象において赤血球前駆体に対する成熟赤血球の比が増加する。一実施形態では、ｍｉＲ−４５１ミメティックは、成熟ｍｉＲ−４５１配列を含むポリヌクレオチドである。本明細書には他の好適なｍｉＲ−４５１ミメティックが記載され、それにはｍｉＲ−４５１配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
【００３３】
本発明はまた、治療後におけるｍｉＲ−４５１阻害薬の除去又は排除方法も包含する。この方法は、ｍｉＲ−４５１ミメティック又はｍｉＲ−４５１阻害薬に対する結合部位を含むポリヌクレオチドを投与する工程を含み得る。別の実施形態では、本発明は、治療後におけるｍｉＲ−４５１ミメティックの除去又は排除方法を提供する。例えば、ｍｉＲ−４５１阻害薬又はｍｉＲ−４５１標的由来の結合領域を含むポリヌクレオチドが投与されることで、ｍｉＲ−４５１ミメティックが除去され得る。結合部位領域は、好ましくは、ｍｉＲ−４５１のシード領域と相補的な配列を含む。シード領域は、成熟ｍｉＲＮＡの塩基２〜８にわたるｍｉＲＮＡの５’部分であり、これは標的認識に重要である。一部の実施形態では、結合部位領域は、ＹＷＨＡＺ（１４−３−３ζ）、ＣＡＢ３９、ＶＡＰＡ、又はＣＵＧＢＰ２などの、ｍｉＲ−４５１の１つ又は複数の標的の３’ＵＴＲ由来の配列を含み得る。
【００３４】
本発明はまた、細胞におけるＹＷＨＡＺ（１４−３−３ζ）、ＣＡＢ３９、ＶＡＰＡ、又はＣＵＧＢＰ２の発現を制御する方法も含み、この方法は、細胞をｍｉＲ−４５１調節薬と接触させる工程を含む。一実施形態では、ＹＷＨＡＺ（１４−３−３ζ）、ＣＡＢ３９、ＶＡＰＡ、又はＣＵＧＢＰ２の発現は、ｍｉＲ−４５１ミメティックの投与後に細胞において低下する。別の実施形態では、ＹＷＨＡＺ（１４−３−３ζ）、ＣＡＢ３９、ＶＡＰＡ、又はＣＵＧＢＰ２の発現は、ｍｉＲ−４５１阻害薬の投与後に細胞において増加する。細胞はインビトロであっても、又はインビボであってもよい。一実施形態では、細胞は赤血球前駆体、網赤血球、又は赤血球である。
【００３５】
本発明はまた、ｍｉＲ−４５１の阻害薬又はミメティックと薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物も包含する。臨床適用が企図される場合、医薬組成物は、目的の適用に適切な形態で調製され得る。概してこれは、発熱性物質、並びにヒト又は動物に有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴い得る。
【００３６】
一実施形態では、医薬組成物は有効用量のｍｉＲ−４５１阻害薬を含む。例えば、医薬組成物は、本明細書に記載されるようなｍｉＲ−４５１を標的とする修飾又は非修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効用量を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０からなる群から選択される配列を有する修飾又は非修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、有効用量のｍｉＲ−４５１ミメティック又はｍｉＲ−４５１作動薬を含む。「有効用量」は、有益な又は所望される臨床結果を達成するのに十分な量である。本発明のｍｉＲＮＡ阻害薬又はｍｉＲＮＡ作動薬／ミメティックの有効用量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、又は約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇであり得る。何が有効用量と見なされ得るかについての正確な決定は、体格、年齢、治療される障害の種類（例えば赤血球増加症又は特定の種類の貧血症）、及び阻害薬又は作動薬の性質（例えば発現構築物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド二重鎖等）を含め、各患者の個別的な要因に基づき得る。従って、投薬量は、当業者が本開示及び当該技術分野における知識から容易に確定することができる。一部の実施形態では、特定の治療期間にわたって複数用量が対象に投与される。例えば、ある用量のｍｉＲ−４５１阻害薬又はｍｉＲ−４５１ミメティック／作動薬が、１日１回、週１回、月１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、又は半年に１回、対象に投与され得る。特定の実施形態では、対象は最初の時間点において初回用量の投与を受け、これは、１つ又は複数の後続の用量又は維持用量より高い用量である。
【００３７】
コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、並びに水中油乳剤、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベース系が、ｍｉＲＮＡ機能のオリゴヌクレオチド阻害薬、ｍｉＲＮＡ作動薬をコードするポリヌクレオチド、又は特定のｍｉＲＮＡ阻害薬若しくは作動薬を発現する構築物の送達媒体として使用され得る。本発明の核酸を対象に送達するのに好適な市販の脂肪乳剤には、イントラリピッド（Intralipid）（登録商標）、リポシン（Liposyn）（登録商標）、リポシン（Liposyn）（登録商標）II、リポシン（Liposyn）（登録商標）III、ニュートリリピッド（Nutrilipid）、及び他の同様の脂質乳剤が含まれる。生体内での送達媒体としての使用に好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち人工膜小胞）である。かかる系の調製及び使用は当該技術分野において公知である。例示的製剤は、米国特許第５，９８１，５０５号；米国特許第６，２１７，９００号；米国特許第６，３８３，５１２号；米国特許第５，７８３，５６５号；米国特許第７，２０２，２２７号；米国特許第６，３７９，９６５号；米国特許第６，１２７，１７０号；米国特許第５，８３７，５３３号；米国特許第６，７４７，０１４号；及び国際公開第０３／０９３４４９号（これらは全体として参照により本明細書に援用される）にも開示されている。
【００３８】
概して、送達媒体を安定にし、かつ標的細胞によって取り込ませるのに適切な塩及び緩衝液を用いることが望ましい。本発明の水性組成物は、薬学的に許容可能な担体又は水性媒体中に溶解又は分散した阻害薬ポリヌクレオチド又はｍｉＲＮＡポリヌクレオチド配列（例えばリポソーム若しくは他の複合体又は発現ベクター）を含む有効量の送達媒体を含む。語句「薬学的に許容可能な」又は「薬理学的に許容可能な」は、動物又はヒトに投与したとき有害反応、アレルギー反応、又は他の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容可能な担体」は、医薬品、例えばヒトへの投与に好適な医薬品の製剤化における使用に許容される溶媒、緩衝剤、溶液、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び剤の使用は、当該技術分野において公知である。任意の従来の媒体又は薬剤が本発明の活性成分と適合しない場合を除き、治療組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性成分も、それらが組成物のベクター又はポリヌクレオチドを不活性化しないことを条件に、組成物に組み込まれ得る。
【００３９】
本発明の活性組成物は従来の医薬製剤を含み得る。本発明に係るこれらの組成物の投与は、経路によって標的組織が利用可能となる限り、任意の一般的な経路によることができる。これには、経口、経鼻、又は口腔内が含まれる。或いは、投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内注射によってもよい。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、静脈内投与又は皮下投与用に製剤化される。かかる組成物は、通常は本明細書に記載されるとおりの薬学的に許容可能な組成物として投与され得る。
【００４０】
活性化合物はまた、非経口投与又は腹腔内投与されてもよい。例示として、遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液を、好適にはヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と混合して水中に調製することができる。分散体もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中に、及び油中に調製することができる。通常の保存及び使用条件下において、これらの製剤は概して防腐剤を含み、微生物の増殖を防止する。
【００４１】
注射用途に好適な医薬品形態には、例えば、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。概してこれらの製剤は無菌で、かつ注射がし易い程度に流動性である。製剤は製造及び保存条件下で安定していなければならず、かつ細菌及び真菌などの微生物の混入作用を防ぐものでなければならない。適切な溶媒又は分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物、及び植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散体の場合には要求される粒度を維持することにより、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に使用することによってもたらされ得る。
【００４２】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて任意の他の成分（例えば上記に列挙するとおり）と共に、溶媒中に活性化合物を適切な量で組み込み、次にろ過滅菌することにより調製され得る。概して分散体は、様々な無菌活性成分を、基本分散媒と、例えば上記に列挙するとおりの所望の他の成分とを含む無菌媒体に組み込むことにより調製される。滅菌注射用溶液の調製用滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥技法を含み、この技法は１つ又は複数の活性成分＋任意のさらなる所望の成分の粉末を、予め滅菌ろ過されたその溶液から得るものである。
【００４３】
本発明の組成物は、概して中性形態又は塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容可能な塩には、例えば、無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）から、又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸）から誘導される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）などが含まれる。タンパク質の遊離カルボキシル基と形成される塩もまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄）から、又は有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン）から誘導することができる。
【００４４】
製剤化後、溶液は好ましくは、投薬製剤に適合する方法で、かつ治療上有効な量で投与される。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセルなどの様々な剤形で容易に投与され得る。例えば水溶液での非経口投与については、概して溶液が好適に緩衝され、初めに希釈液が、例えば十分な量の生理食塩水又はグルコースで等張性にされる。かかる水溶液が、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与及び腹腔内投与に使用され得る。好ましくは、当業者に公知のとおり、特に本開示をふまえて、滅菌水性媒体が用いられる。例示として、単一用量を１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入液に添加するか、或いは計画された注入部位に注射してもよい（例えば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。治療される対象の条件に応じて、投薬量がいくらか異なることが必然的に生じ得る。いずれにしても、投与責任者が個々の対象に適切な用量を決定し得る。さらに、ヒトへの投与では、製剤は、アメリカ食品医薬局生物製剤部（FDA Office of Biologics）による基準が要件とするとおりの無菌性、発熱原性、一般安全性、及び純度の基準を満たさなければならない。
【００４５】
本発明は以下のさらなる例によりさらに説明され、これらの例は、限定するものとして解釈されてはならない。当業者は、本開示をふまえて、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく開示される具体的な実施形態に多くの変更を加えることができ、それでもなお同様の又は類似した結果を達成し得ることを理解しなければならない。
【実施例】
【００４６】
実施例１．ｍｉＲ−４５１ノックアウトマウスは赤血球成熟の不全を示す
ｍｉＲ−４５１発現を野生型マウスの様々な組織においてノーザンブロット分析により評価し、脾臓及び骨髄を含む造血組織で高度に発現することが見出された（図１）。かかる組織におけるｍｉＲ−４５１の機能をさらに調べるため、ｍｉＲ−４５１ノックアウトマウスを作成した。ｍｉＲ−４５１を標的とするベクターを生成するため、ｍｉＲ−１４４とｍｉＲ−４５１とのｐｒｅ−ｍｉＲ配列間に位置する保存性が低いＤＮＡエレメントの上流に延在する４．３ｋｂ断片（５’アーム）をＳａｃＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｐＧＫｎｅｏＦ２Ｌ２ｄｔａを標的とするプラスミドに、ｌｏｘＰ部位及びＦｒｔに隣接するネオマイシンカセットの上流でライゲートした。保存性が低い領域から下流にｍｉＲ−４５１  ｐｒｅ−ｍｉＲの外側へ延在する３．２ｋｂ断片（３’アーム）をＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ネオマイシン耐性カセットとＤｔａネガティブ選択カセットとの間でベクターにライゲートした。５’及び３’プローブによるサザンブロット分析により、破壊された対立遺伝子を有する標的ＥＳ細胞を同定した。ｍｉＲ−４５１を標的とする３つのＥＳクローンが同定され、胚盤胞注入に使用した。得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６と交配させて、突然変異体対立遺伝子の生殖細胞系列伝達を達成した。ｍｉＲ−４５１ｎｅｏ／ｎｅｏマウスを、遍在的に発現したＣＡＧ−ｃｒｅ導入遺伝子を有するＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させることにより、ｍｉＲ−４５１完全突然変異マウスを生成した。
【００４７】
ｍｉＲ−４５１の標的化された欠失から、ｍｉＲ−４５１ヘテロ接合体動物の骨髄におけるハプロ不全レベルのｍｉＲ−４５１、及びｍｉＲ−４５１ノックアウト（ＫＯ）動物における成熟ｍｉＲ−４５１の完全な欠損が明らかとなった（図２Ａ）。ｍｉＲ−４５１  ＫＯ動物はメンデル比で生まれた（表１）。しかしながら、成体ノックアウト動物（８週齢）のヘマトクリットは野生型同腹仔と比較して著しく低下した（図２Ｂ）。加えて、全載分析により明らかなとおり、ｍｉＲ−４５１  ＫＯ動物は胎生期Ｅ１４．５日目に胎児貧血を示した（図３）。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
ｍｉＲ−４５１対立遺伝子の一方又は双方が欠損した動物は、赤血球成熟不全を示した。ｍｉＲ−４５１野生型、ヘテロ接合体、及びノックアウトマウスから単離した骨髄細胞及び胎児肝細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中に再懸濁した。新鮮に単離した骨髄細胞及び胎児肝細胞を、マウスＩｇＧ（２００μｇ／ｍＬ、BD Pharmingen, San Diego, CA）の存在下にＰＢＳ／２％ＦＢＳ中４℃で免疫染色して、Ｆｃ受容体をブロックした。細胞をＰＥコンジュゲート抗Ｔｅｒ１１９抗体（１μｇ／ｍＬ  BD Pharmingen, San Diego, CA）、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ７１抗体（EBiosciences、１μｇ／ｍＬ、City）と共に１５分間インキュベートし、次にＡＰＣコンジュゲートアネキシンＶと共に１５分間インキュベートした。Becton Dickinson FACSCalibur（Franklin Lakes, NJ）でフローサイトメトリーを実施した。胎生期Ｅ１６．５日目、フローサイトメトリーにより評価したとき、ヘテロ接合動物において成熟ＣＤ７１−／ＴＥＲｌ１９＋赤血球集団が著しく減少し、ノックアウト動物で過度の減少があった（図４Ａ及び図４Ｂ）。成体脾臓の組織学的分析から、野生型同腹仔と比較したときのｍｉＲ−４５１ノックアウトマウスにおける赤血球前駆体の増加が明らかとなった（図５）。成体骨髄のフローサイトメトリー分析から、ヘテロ接合動物における成熟ＣＤ７１−／ＴＥＲｌ１９＋赤血球集団の減少及びノックアウトにおける過度の減少を含む同様の赤血球分化不全が明らかとなった（図６Ａ及び図６Ｂ）。
【００５０】
ｍｉＲ−４５１ノックアウト動物における赤血球生成を評価するため、野生型動物及びｍｉＲ−４５１ノックアウト動物の双方を溶血剤フェニルヒドラジンで刺激した。フェニルヒドラジンを先述のとおり４０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射した（Socolovsky et al. (2001) Blood, Vol. 98: 3261-3273）。フェニルヒドラジン注射後３日目、６日目、及び９日目に、処置した動物においてヘマトクリットを計測した。図７に示すとおり、ｍｉＲ−４５１ノックアウト動物はフェニルヒドラジン刺激後にヘマトクリットの著しい不足を示したことから、ｍｉＲ−４５１ノックアウト動物は高い赤血球形成速度を達成できないことが示唆される。
【００５１】
これらのデータは、ｍｉＲ−４５１が赤血球分化の過程を決定的に制御することを示している。ｍｉＲ−４５１が赤血球分化を制御する機構についてさらに解明するため、標的予測ソフトウェアを使用してｍｉＲ−４５１の標的候補を同定した。この分析に基づけば、ｍｉＲ−４５１はシャペロン／足場分子のＹＷＨＡＺ（１４−３−３ζ）の発現を阻害することによって赤血球分化を制御し得る。ＹＷＨＡＺ（１４−３−３ζ）はその３’ＵＴＲに保存されたｍｉＲ−４５１結合部位を含み（図８Ａ）、このタンパク質の発現はｍｉＲ−４５１ノックアウト動物において著しくアップレギュレートされる（図８Ｂ）。ＹＷＨＡＺ（１４−３−３ζ）は造血細胞中で高度に濃縮されることが示されており、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体などの成長因子受容体の下流のシグナルを調節することによってＲＢＣの分化に影響を及ぼすものと思われる（図９）（Barry et al. (2009) J. Biol. Chem., Vol. 284: 12080-12090）。
【００５２】
実施例２．ｍｉＲ−４５１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは生体内でのｍｉＲ−４５１発現を消失させ、成熟赤血球数を低下させる。
異常赤血球生成に関連する障害におけるｍｉＲ−４５１ノックダウンの治療可能性を調べるため、ｍｉＲ−４５１の分解を特異的に誘導するようにアンチセンスオリゴヌクレオチド（抗４５１）を設計した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは成熟ｍｉＲ−４５１配列と相補的であり、５’−ＡＡＣＵＣＡＧＵＡＡＵＧＧＵＡＡＣＧＧＵＵＵ−３’（配列番号４）の配列を有した。ミスマッチを有する配列５’−ＡＡＣＡＧＵＡＡＵＧＧＵＡＡＣＧＧＵＵＵ−３’（配列番号５）を対照として使用した。抗ｍｉＲ−４５１及びミスマッチを有する対照（ｍｍ−４５１）における全てのヌクレオシドを２’−ＯＭｅ修飾し、５’末端の２塩基及び３’末端の４塩基がホスホロチオエートインターヌクレオシド（internucleoside）を含んだ。パッセンジャー鎖の３’末端にヒドロキシプロリノール又は炭化水素（Ｃ４〜Ｃ８）リンカーを介してコレステロールを結合した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、生理食塩水、８０ｍｇ／ｋｇの抗４５１、又は８０ｍｇ／ｋｇのミスマッチを有する対照を２回静脈内注射した。２つの注射は２４時間空けた。２回目の注射の４８時間後、発現及びＦＡＣｓ分析のため動物から骨髄を回収した。ｍｉＲ−４５１についての骨髄のノーザンブロット分析から、抗４５１が生体内でｍｉＲ−４５１レベルを有効に低下させた一方、ミスマッチを有する対照が効果を有しなかったことが実証された（図１０Ａ）。処置した動物から単離した骨髄のフローサイトメトリー分析から、ミスマッチを有する対照の投与を受けた動物と比較したとき、抗ｍｉＲ−４５１オリゴヌクレオチドで処置した動物では成熟ＣＤ７１−／ＴＥＲｌ１９＋赤血球の数が減少し、それに対応して未熟赤血球の数が増加したことが明らかとなった（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。
【００５３】
これらの結果は、ｍｉＲ−４５１発現が生体内で効率的に調節され得ること、及びｍｉＲ−４５１阻害薬が、異常赤血球生成に関連する障害、例えば赤血球増加症の治療における新規な治療手段を提供することを示唆している。
【００５４】
実施例３．切断型（truncated）阻害薬によるアンチセンスオリゴヌクレオチド治療は生体内でｍｉＲ−４５１レベルを低下させ、赤血球数を変化させる。
マイクロＲＮＡのシード領域を標的化し、かつマイクロＲＮＡのより３’末端側に体系的に拡張するように、８〜１６ヌクレオチドの範囲の長さの、成熟ｍｉＲ−４５１配列を標的とする合成オリゴヌクレオチドの別の系列を設計した。これらのオリゴヌクレオチドは１つ又は複数の二環状ヌクレオシド（例えば、ＬＮＡ）を含んだ。その配列を以下に掲載する：
８ｎｔオリゴ：５’−ＡＡＣＧＧＵＵＵ−３’（配列番号６）
１０ｎｔオリゴ：５’−ＧＵＡＡＣＧＧＵＵＵ−３’（配列番号７）
１２ｎｔオリゴ：５’−ＵＧＧＵＡＡＣＧＧＵＵＵ−３’（配列番号８）
１４ｎｔオリゴ：５’−ＡＡＵＧＧＵＡＡＣＧＧＵＵＵ−３’（配列番号９）
１６ｎｔオリゴ：５’−ＧＵＡＡＵＧＧＵＡＡＣＧＧＵＵＵ−３’（配列番号１０）
【００５５】
上記に掲載した５つのオリゴヌクレオチドに加え、１４〜２２ヌクレオチド長の範囲の、成熟ｍｉＲ−４５１配列と相補的な配列を有する抗ｍｉＲ−４５１オリゴヌクレオチドも設計した。これらの抗ｍｉＲ−４５１オリゴヌクレオチドにおける全てのヌクレオシドは２’−ＯＭｅ修飾され、全ての塩基を連結するホスホロチオエートインターヌクレオシドを含んだ。
【００５６】
上記に記載する抗ｍｉＲ−４５１オリゴヌクレオチドのうちの１つをマウスに静脈内注射し、処置の２日後に様々な組織を採取する。ｍｉＲ−４５１についてのノーザンブロット分析を行い、ｍｉＲ−４５１発現の抑制における抗ｍｉＲ−４５１オリゴヌクレオチドの各々の有効性を決定する。加えて、ＦＡＣｓ分析及びヘマトクリットの決定のため、処置したマウスから骨髄試料及び血液試料を得る。結果は、抗ｍｉＲ−４５１オリゴヌクレオチドが生体内でｍｉＲ−４５１発現を有効に抑制し得ることを示すものと予想され、ｍｉＲ−４５１発現の低下は、ヘマトクリット及び成熟ＣＤ７１−／ＴＥＲ１１９＋赤血球数の低下と相関する。
【００５７】
実施例４．ａｎｔｉｍｉＲ−４５１は真性赤血球増加症の異種移植モデルにおいてヘマトクリットを低下させる
生体内でのｍｉＲ−４５１の発現に対するａｎｔｉｍｉＲ−４５１及びミスマッチ対照ａｎｔｉｍｉＲオリゴヌクレオチドの効果を調べるため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、生理食塩水、２５ｍｇ／ｋｇのミスマッチオリゴヌクレオチド、又は２５ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍｉＲ−４５１のいずれかにより２日連続で処置した。ａｎｔｉｍｉＲ−４５１オリゴヌクレオチドは成熟ｍｉＲ−４５１の１６ヌクレオチドと相補的であり、５’−ＡＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＣＧＧＴＴ−３’（配列番号２１）の配列を有した。ミスマッチを有する対照ａｎｔｉｍｉＲは、哺乳動物では発現しないＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ｍｉＲＮＡに特異的であり、５’−ＴＣＣＴＡＧＡＡＡＧＡＧＴＡＧＡ−３’（配列番号２２）の配列を有した。ａｎｔｉｍｉＲ−４５１及びミスマッチを有する対照ａｎｔｉｍｉＲの双方とも、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）とロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオシドとの組み合わせ（９個のＬＮＡ及び７個のＤＮＡ）を含み、かつ完全にホスホロチオレート化された骨格を含んだ。
【００５８】
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）に、生理食塩水、２５ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍＲｉ−４５１、又は２５ｍｇ／ｋｇのミスマッチ対照ａｎｔｉｍｉＲを２回注射した。注射は２４時間おいて実施した。２回目の注射の４８時間後、マウスを犠牲にし、大腿骨及び脛骨をＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清でフラッシュすることにより骨髄を回収した。骨髄からＲＮＡを回収し、マイクロＲＮＡのノーザンブロットを実施した。ノーザンブロット分析は、ａｎｔｉｍｉＲ−４５１治療群に成熟ｍｉＲ−４５１が存在しないことを示すが、ミスマッチ治療群又は生理食塩水治療群はいずれも、ｍｉＲ−４５１レベルに影響はなかった（図１１）。
【００５９】
真性赤血球増加症（ＰＶ）の血液学的パラメータに対するａｎｔｉｍｉＲ−４５１の効果を調べるため、本発明者らはＰＶのマウス異種移植モデルを利用した（Wernig et al. (2006) Blood, Vol. 107(11): 4274-4281）。このモデルはヒトＰＶのパラメータの多くを忠実に反復し、この疾患の広く認められたマウスモデルである。成体類似遺伝子型ＢＡＬＢ／Ｃ動物をCharles River Laboratoriesから購入した。初めにドナーマウスに５−フルオロウラシルを注射して未分化造血幹細胞の分裂を刺激した。４日後、それらの動物から骨髄を回収し、赤血球を選択的に溶解し、それらの細胞を、成長を補助し、かつウイルス認識タンパク質の発現を刺激するように設計されたサイトカインのカクテルを含む培地中で培養した。翌日、それらの細胞を、ＪＡＫ２−Ｖ６１７Ｆ突然変異体ヒトキナーゼ又は対照としての野生型ヒトＪＡＫ２キナーゼのいずれかを発現するレトロウイルスに感染させた。双方のウイルス構築物とも、内部リボソーム侵入部位からＧＦＰを発現した。それらの細胞を再び一晩培養することにより、ウイルスゲノムを挿入し、それぞれのＪＡＫ２アイソフォームを発現させた。感染の翌日、感染手順を繰り返し、細胞を静脈注射に好適な媒体中に懸濁した。
【００６０】
レシピエント動物に９００ｃＧｙを照射し、約４〜１０×１０５個の再懸濁細胞をレシピエント動物に静脈内注射した。次にこれらの動物を、抗生物質を投与して無菌環境に収容した。次に動物を７日間毎に瀉血させた。この間、ＧＦＰ陽性細胞の割合をフローサイトメトリーによりモニタし、Hemavet 850（Drew Scientific, Dusseldorf Germany）を利用して血液学的パラメータを計測した。ＧＦＰ陽性の割合は、形質導入された移植細胞の割合に相当する。移植後２〜３週間で移植及び血液学的修飾が顕著となった。移植後５週間で移植が完了し、それらのパラメータの変化が定常状態となった。野生型ヒトＪＡＫ２キナーゼの発現は血液学的パラメータに効果を有しないため、従って好適な対照である。
【００６１】
移植後５週間目、負荷用量２５ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍｉＲ−４５１（配列番号２１）又はミスマッチ対照（配列番号２２）オリゴヌクレオチドのいずれかを、ＰＶ動物及び対照動物の双方に２日連続で２回静脈内注射した。次にこれらの動物に、より低用量（１０ｍｇ／ｋｇ）を３日毎に静脈内注射して、ｍｉＲ−４５１の十分なノックダウンを維持した。７日毎にHemavet 850（Drew Scientific, Dusseldorf Germany）を使用して血液学的パラメータを計測した。注射及び血液学的パラメータのモニタリングは、初回の注射後６〜８週間継続した。興味深いことに、本発明者らは、ＰＶマウスにおけるａｎｔｉｍｉＲ−４５１療法の開始から４週間後にヘマトクリットの低下を観察した（図１２）。この低下は、ａｎｔｉｍｉＲ−４５１で処置したＰＶマウスにのみ観察され、ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドで処置したＰＶマウスでは観察されなかった。
【００６２】
これらの実験の結果は、ｍｉＲ−４５１成熟配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、生体内でｍｉＲ−４５１発現を有効に抑制すること、及びＰＶのマウスモデルにおいて、ａｎｔｉｍｉＲ−４５１オリゴヌクレオチドによる処置によりヘマトクリットが低下することを示す。従ってｍｉＲ−４５１は、骨髄増殖性疾患、例えば赤血球増加症の治療についての新規治療標的に相当する。
【００６３】
実施例５．ａｎｔｉｍｉＲ−４５１はヒトＣＤ３４陽性造血細胞における赤血球系分化を減弱させる。
ｍｉＲ−４５１のマウス突然変異体は、胚及び成体の双方の赤血球分化不全を示す（実施例１を参照のこと）。ａｎｔｉｍｉＲ−４５１がヒト造血幹細胞の分化パターンに影響を及ぼす能力を調べるため、本発明者らはヒトＣＤ３４陽性細胞を購入し、Amaxa Human CD34+ Cell Nucleofector Kit（Lonza, USA）を使用してａｎｔｉｍｉＲ−４５１（配列番号２１）又はミスマッチ対照（配列番号２２）のいずれかのヌクレオフェクションを実施した。凍結された精製ＣＤ３４＋ヒト細胞を解凍し、ヌクレオフェクション前に１〜２時間培養した。１×１０６細胞を１２ウェルプレートの単一のウェルに播いた。細胞を２００×ｇで回転させ、ヌクレオフェクション溶液（Nucleofection Solution）（Lonza, USA）に再懸濁した。次に、１００μＬの細胞懸濁液をａｎｔｉｍｉＲ−４５１又はミスマッチａｎｔｉｍｉＲのいずれかに添加して（アンチセンスオリゴヌクレオチドの説明については実施例４を参照のこと）、１００ｎＭの最終濃度のａｎｔｉｍｉＲ−４５１又はミスマッチ対照を含む溶液を得た。この溶液をキュベットに移した。ヌクレオフェクター（Nucleofector）装置（Lonza, USA）のＵ−００８プログラムでヌクレオフェクションを実施した。プログラムが終了したところで、細胞を５００μＬの培養培地と組み合わせた。次に培地を２〜３日おきに１０日間にわたり交換した。
【００６４】
ヌクレオフェクション後、細胞を培養培地中で１０日間インキュベートし、自発的に分化させた。これらの細胞は全ての造血細胞系譜に自発的に分化する。１０日目、細胞を赤血球系マーカーＣＤ７１及びＴｅｒ１１９について染色し、フローサイトメトリーにより分化を分析した。細胞をマウスＩｇＧ（２００μｇ／ｍＬ、BD Pharmingen）の存在下にＰＢＳ／２％ＦＢＳ中４℃で免疫染色して、Ｆｃ受容体をブロックした。細胞をＰＥコンジュゲート抗Ｔｅｒ１１９抗体（１μｇ／ｍＬ、BD Pharmingen）、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ７１抗体（EBiosciences、１μｇ／ｍＬ）と共に１５分間インキュベートした。Becton Dickinson FACSCalibur（Franklin Lakes, NJ）でフローサイトメトリーを実行した。
【００６５】
最も分化した赤血球は領域４（Ｒ４）にあり、一方、分化が低い赤血球系細胞は領域２（Ｒ２）にある（図１３を参照のこと）。各領域にゲーティングされた割合を、図１３のそれぞれのゲート内に掲載する。興味深いことに、ａｎｔｉｍｉＲ−４５１をヌクレオフェクトした細胞は、ミスマッチをヌクレオフェクトした細胞と比較したとき赤血球系成熟の減弱を示した（図１３）。これらのデータから、ａｎｔｉｍｉＲ−４５１によるｍｉＲ−４５１の阻害が、ｍｉＲ−４５１突然変異体マウスに認められるものと同様のヒト赤血球成熟の妨害をもたらすことが示唆される。
【００６６】
本明細書において考察され、及び引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、全体として参照により本明細書に援用される。記載される特定の方法論、プロトコル及び材料は異なってもよいため、開示される本発明がそれらに限定されないことが理解される。また、本明細書で使用される用語法は、あくまでも特定の実施形態を記載することを目的としているに過ぎず、本発明の範囲を限定する意図はないことも理解され、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【００６７】
当業者は、本明細書に記載される発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識し、又はルーチン程度の実験を用いて確かめることが可能であろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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