(57)【要約】  本発明は、アシュワガンダの植物抽出物、並びにアルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性疾病及び／又は疾患の処置に有用な前記抽出物を含む組成物に関する。本発明は、この抽出物の調製のための方法をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約７０〜８０％のウィタノライド及び約１５〜２５％のウィタノサイドを含むアシュワガンダ抽出物。
【請求項２】
前記抽出物が７５％のウィタノライド及び２０％のウィタノサイドを含む請求項１に記載のアシュワガンダ抽出物。
【請求項３】
ウィタフェリンを含まない請求項１に記載のアシュワガンダ抽出物。
【請求項４】
アシュワガンダの根茎から得られた請求項１に記載のアシュワガンダ抽出物。
【請求項５】
アルツハイマー病、パーキンソン病及び老年性認知症からなる群から選択された神経変性疾患を処置するのに有用である請求項１に記載のアシュワガンダ抽出物。
【請求項６】
粉末、液体、カプセル又は錠剤の形態である請求項１に記載のアシュワガンダ抽出物。
【請求項７】
アルツハイマー病の処置に有用である請求項１に記載のアシュワガンダ抽出物。
【請求項８】
アルツハイマー病の処置のための前記抽出物の効果的な用量が０．５ｇ／日／ｋｇ体重〜１ｇ／日／ｋｇ体重の範囲である請求項７に記載のアシュワガンダ抽出物。
【請求項９】
請求項１に記載のアシュワガンダ抽出物及び医薬的に許容可能なキャリアを有する医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載のアシュワガンダ抽出物を有する栄養補助組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載のアシュワガンダ抽出物を有する薬草組成物。
【請求項１２】
アシュワガンダの根茎を提供すること、前記根茎を室温で約６０〜７５時間、有機溶媒を用いて抽出して根茎抽出物を得ること、前記根茎抽出物から前記溶媒を除去して乾燥根茎抽出物を得ること、前記乾燥根茎抽出物を１０％メタノール−クロロホルム混合物を用いて処理してアシュワガンダの植物抽出物を得ること、を含むアシュワガンダの植物抽出物の調製方法。
【請求項１３】
有機溶媒がクロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、エタノール、メタノール及びこれらの混合物からなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
有機溶媒がクロロホルム及びメタノールの混合物である請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記混合物中のクロロホルムとメタノールの比率が２：３、１：１又は３：２である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
７５％のウィタノライド及び２０％のウィタノサイドを含むアシュワガンダの植物抽出物の治療的な有効量を対象に投与することを含む神経変性疾患を改善する方法。
【請求項１７】
前記変性神経疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病及び老年性認知症からなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記アシュワガンダの植物抽出物が約０．５ｇ／日／ｋｇ体重〜１ｇ／日／ｋｇ体重の用量で前記対象に投与される請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
アルツハイマー病、パーキンソン病及び老年性認知症からなる群から選択された神経変性疾患の処置に有用な医薬の調製のための、請求項１に記載のアシュワガンダの抽出物の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アシュワガンダ（Withania somnifera）の植物抽出組成物、及びアルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性疾病又は疾患を処置することへのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）及び老年性認知症などの種々の神経変性疾患の発症率は、加齢とともに増加する。ＰＤが振戦、硬直及び動作緩慢を特徴とする一方、ＡＤは、失語症、失行症及び失認症をそれぞれ発生させる言語野、巧みな運動及び認識などの高度な認識機能に影響を与える、短期記憶喪失の後の認識機能障害（知能障害）を特徴とする。また、脳の前頭葉及び側頭葉に密接に関連する意思決定及び計画などの機能にも影響を及ぼす。
【０００３】
アルツハイマー病の疫学が示すように、全世界で２６００万人以上の人々が、２００６年においてアルツハイマー病に罹患しており、２０５０年までに１億６００万人以上に増加するであろう（非特許文献１）。ＡＤの有病率が最も大きく増加するのは、アジアであろう。現在、全世界のアルツハイマーの症例の４８％がアジアに存在している。症例の数は、アジアにおいて、２００６年の１２６５万人から２０５０年には６２８５万人へと増加すると考えられている。
【０００４】
アルツハイマー病は、進行性で不可逆な神経変性疾患であって、この疾患の原因病理論がほとんど理解されていないことから、現在、利用可能な治療はない。ＡＤに利用可能な市販の薬物は、この疾病を予防又は治癒させず、症状の管理のみのために承認されている（非特許文献２）。この破滅的な疾患の病的影響を最小限とするために早期発見及び治療的介入が緊急に必要とされている。アーユルベーダなどの伝統的な医薬のシステムは、これらの疾患の処置のための治療的介入戦略の発達に利用され得る広範な資源を提供する。
【０００５】
現在の植物種は、医療目的で広範に使用されている。ハーブは、天然物であって、合成薬よりもより安全で、神経系の種々の複合的な疾患を処置するのに有効である。例えば、イチョウ抽出物は、ＡＤのマウスモデルにおいて空間学習や空間記憶の障害を防止することが示されている（非特許文献３）。同様に、過去の研究が示すように、アシュワガンダが、記憶を促進することを補助し得る。
【０００６】
インドの朝鮮人参としても知られていたＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ（アシュワガンダ）は、インドの医薬システムで言及された高齢者用の強壮剤の主要なハーブ成分のひとつである。アシュワガンダは、種々の範囲の病気の処置及び予防のためのものとして知られている。このハーブの伝統的な用途は、強壮剤及び活性化剤としてのものである。寿命を延長させ、精神機能及び肉体的スタミナを増強し、性機能を向上させる（これにより、ハーブのバイアグラというニックネームを得た）と考えられている。また、学習能力及び記憶容量を向上させることを助けもする。
【０００７】
植物抽出物の成分のひとつであるウィタノライド−Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで重篤に障害を受けたニューロンにおいて、神経突起を再生し、シナプスを再構築することを示されてきた（非特許文献４）。
【０００８】
Ｇｈｏｓｈａｌ（特許文献１、２００４年）は、樹齢１〜２年の植物の根茎及び葉に由来のＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の調製方法を開示する。この方法は、外因性の多糖類の存在下、水性アルコールの抽出法を含む。
【０００９】
Ｇｈｏｓｈａｌ（特許文献２、２００８年）は、使用者のための認識力増強効果を高める安定な薬草の粉末の形態のＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出組成物を開示する。この組成物は、８〜２５％のウィタノライドグリコシド及びシトインドサイド、２５〜７５％のオリゴ糖、多糖（１０％未満）並びにフリーのウィタフェリンＡ（２％未満）を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許６，７１３，０９２号明細書
【特許文献２】米国特許７，３１８，９３８号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｒｏｏｋｍｅｙｅｒ  Ｒ．、Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｅ．、Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｇｒａｈａｍ  Ｋ．及びＡｒｒｉｇｈｉ  Ｈ．Ｍ．著、”Ｆｏｒｅｃａｓｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ．”、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ、２００７年、３巻、ｐ．１８６〜１９１
【非特許文献２】Ｍｅｌｎｉｋｏｖａ、２００７年
【非特許文献３】Ｑｕｉｎｎら著、２００３年
【非特許文献４】Ｋｕｂｏｙａｍａ  Ｔ．、Ｔｏｈｄａ  Ｃ．及びＫｏｍａｔｓｕ  Ｋ．著、”Ｎｅｕｒｉｔｉｃ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｗｉｔｈａｎｏｌｉｄｅ  Ａ．”、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００５年４月、１４４巻、７号、ｐ．９６１〜９７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出組成物及びこの抽出物を調製するための方法を提供する。本発明に開示の植物抽出物は、アルツハイマー病などの神経変性疾病又は疾患の処置に有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一つの態様は、約７０〜８０％のウィタノライド及び約１５〜２５％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物を提供する。
【００１４】
本発明の一つの態様は、７５％のウィタノライド及び２０％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物を提供する。
【００１５】
本発明のその他の態様は、約７５％のウィタノライド及び約２０％のウィタノサイド並びに医薬的に許容可能なキャリアを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物を含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明の他の実施態様は、約７５％のウィタノライド及び約２０％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物を含む栄養補助組成物を提供する。
【００１７】
本発明のさらに他の態様は、約７５％のウィタノライド及び約２０％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物を含むハーブ組成物を提供する。
【００１８】
本発明のよりさらに他の態様は、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物の調製方法を提供するものであって、この方法は、Ｗｉｔｈａｎｉａの根茎を提供すること、根茎抽出物を得るために、前記根茎を室温において約６０〜７５時間、有機溶媒で抽出すること；乾燥根茎抽出物を得るために、根茎抽出物から溶媒を除去すること；根茎抽出物の活性画分を得るために、乾燥根茎抽出物を、１０％のメタノール−クロロホルムの混合物で処理することを含む。
【００１９】
本発明のよりさらに他の態様は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）及び老年性認知症からなる群から選択された神経変性疾患の処置に有用な医薬の調製のための、約７５％のウィタノライド及び約２０％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の用途を提供する。
【００２０】
本発明のさらに他の態様は、必要とする対象に、約７５％のウィタノライド及び約２０％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物の治療上の有効量を投与することを含む、神経変性疾患を改善する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】植物抽出物（ＰＥ）による処置が、放射状のアーム迷路（ＲＡＭ）中におけるＴｇマウスの学習及び記憶能力を向上させることを示す。
【図２】植物抽出物（用量：１ｇ／ｋｇ体重）で処置したＴｇマウス（９月齢）において、プラーク及びユビキチン化されたタンパク質凝集物が完全に除去されたことを示す：（ａ）環状の脳の切片は、連続的に切断され、プラークについて、Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙの銀染色で（１０日ごとに）染色し、β−アミロイド及びユビキチン（ユビキチン−ＩＨＣ）の免疫染色を行った。（ｂ）プラークにより覆われ、並びに皮質及び海馬におけるアミロイド及びユビキチン化タンパク質凝集物により免疫染色された表面積の割合の定量的評価を示す。全てのデータは、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝４）である。アスタリスクは、コントロールに対して有意差のある値を示す（ｐ＜０．００１）。処置群は、ビヒクルで処置されたもの（Ｖ／Ｖｅｈ）、植物抽出物で処置されたもの（Ｔ／Ｔｒｔ）で示され、画像は、皮質（ＣＴ）、海馬（ＨＰ）から得たものである。
【図３】Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物（１ｇ／ｋｇ体重）が、９月齢のＴｇオスマウスの皮質に存在するβ−アミロイド蓄積を減少させることを示す。蓄積するアミロイドは、Ａβ（１〜４２、ａ）、Ａβ（１〜４０、ｂ）に対するＥＬＩＳＡを用いて定量化し、ｃは、Ａβ４２及びＡβ４０の比率を示す。データは、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝６）である。アスタリスクは、コントロールに対して有意差を有する値を示す（ｐ＜０．００１）。
【図４】Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物（１ｇ／ｋｇ）が、９月齢のＴｇメスマウスの皮質に存在するβ−アミロイド蓄積を減少させることを示す。蓄積するアミロイドは、ＥＬＩＳＡを用いて定量化した。パネルＩ、ＩＩ、ＩＩＩは、それぞれ、皮質、海馬及び血清におけるＡβの負荷を示す。ａ、ｄ、ｇは、Ａβ（１〜４２）の定量値を示す；ｂ、ｅ、ｈは、Ａβ（１〜４０）の定量値を示す；ｃ、ｆ、ｉは、Ａβ４２とＡβ４０の比率を示す。全てのデータは、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝５）である。アスタリスクは、コントロールに対して有意差を有する値を示す（ｐ＜０．００１）。
【図５】Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物（用量：０．１ｇ／ｋｇ及び０．５ｇ／ｋｇ）で処置したＴｇマウス（９ヶ月齢）におけるプラーク及びユビキチン化されたタンパク質凝集物の減少を示す。（ａ）環状の脳の切片は、連続的に切断され、Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙの銀染色を用いてプラークについて染色された（毎１０日目）。（ｂ）皮質及び海馬におけるプラークにより覆われた表面積の割合の定量的評価について示す。全てのデータは、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝５）である。アスタリスクは、コントロールに対して有意差を有する値を示す（ｐ＜０．００１）。各群の動物は、ビヒクルで処置されたもの（Ｖ／Ｖｅｈ）、植物抽出物で処理されたもの（Ｔ／Ｔｒｔ）として示され、画像は、皮質（ＣＴ）、海馬（ＨＰ）から得たものである。
【図６】Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物（０．５ｇ／ｋｇ）で処置した９ヶ月齢のＴｇオスマウスの皮質において蓄積するβ−アミロイドの減少を示す。ＥＬＩＳＡは、（ａ）Ａβ（１〜４２）、（ｂ）Ａβ（１〜４０）を定量するように行われ、（ｃ）は、Ａβ４２とＡβ４０の比率を示す。データは、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝６）である。アスタリスクは、コントロールに対して有意差を有する値を示す（ｐ＜０．００１）。
【図７】Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物（ＰＥ）で処理した後の２３ヶ月齢のＴｇマウスにおいて、放射状のアーム迷路（ＲＡＭ）を用いて試験した学習及び記憶能力が向上したことを示す。メスＡＰＰ／ＰＳ１マウス（２３ヶ月齢）は、ＰＥ（１ｇ／ｋｇ）、ビヒクルを用いて３０日の全期間処置され、この間、ＲＡＭにおける能力について評価された。（ａ）実験の時間は、課題が完了した時間として評価された。（ｂ）参照記憶エラー（ＲＭＥ）は、餌をしかけられていないアームに最初に侵入した回数として評価された。（ｃ）正解の作業記憶エラー（ＣＷＥ）は、餌をしかけられたアームに再度侵入する回数として評価された。（ｄ）不正解の作業記憶エラー（ＩＣＷＥ）は、餌をしかけられていないアームに再度侵入した回数として評価された。データは、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝５）である。アスタリスクは、コントロールに対して有意差を有する値を示す（ｐ＜０．００１）。各群の動物は、ビヒクルで処置されたトランスジェニックマウス（Ｔｇ−Ｖｅｈ）、植物抽出物で処置されたトランスジェニックマウス（Ｔｇ−Ｔｒｔ）として示された。
【図８】植物抽出物（用量：１ｇ／ｋｇ体重）で処置した２３ヶ月齢のＴｇマウスにおいてプラーク及びユビキチン化されたタンパク質凝集物が減少したことを示す。（ａ）環状の脳の切片は、連続的に切断され、プラークについて、Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙの銀染色で（１０日ごとに）染色し、β−アミロイド及びユビキチン（ユビキチン−ＩＨＣ）の免疫染色を行った。（ｂ）プラークにより覆われ、並びに皮質及び海馬におけるアミロイド及びユビキチン化タンパク質凝集物により免疫染色された表面積の割合の定量的評価を示す。全てのデータは、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝５）である。アスタリスクは、コントロールに対して有意差のある値を示す（ｐ＜０．００１）。処置群は、ビヒクルで処置されたもの（Ｖ／Ｖｅｈ）、植物抽出物で処置されたもの（Ｔ／Ｔｒｔ）で示され、画像は、皮質（ＣＴ）、海馬（ＨＰ）から得たものである。
【図９】Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物（１ｇ／ｋｇ）で処置した２３ヶ月のＴｇメスマウスに蓄積するβ−アミロイドが減少したことを示す。蓄積するアミロイドは、ＥＬＩＳＡを用いて定量化した。パネルＩ、ＩＩ、ＩＩＩは、それぞれ、皮質、海馬及び血清におけるＡβの負荷を示す。ａ、ｄ、ｇは、Ａβ（１〜４２）の定量値を示す；ｂ、ｅ、ｈは、Ａβ（１〜４０）の定量値を示す；ｃ、ｆ、ｉは、Ａβ４２とＡβ４０の比率を示す。全てのデータは、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝５）である。アスタリスクは、コントロールに対して有意差を有する値を示す（ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明で用いるものとして、用語「Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物」、「Ｗｉｔｈａｎｉａ根茎抽出物」、「根茎抽出物」、「植物抽出物」及び「ハーブ抽出物」は、相互に入れ替え可能な用語として用いる。
【００２３】
本発明は、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ植物抽出組成物、及びアルツハイマー病などの神経変性疾病又は疾患の処置への使用を提供する。本発明は、この抽出物の調製方法をさらに提供する。
【００２４】
さらに、本発明は、、乾燥したＷｉｔｈａｎｉａ根茎の粉末を従来の方法により調製すること、根茎の粉末にＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１：１）を添加すること；室温で約７２時間攪拌すること；内容物をろ過すること、及び減圧下、ロータリーエバポレーターを用いて３５〜４０℃で、澄明なろ過物から溶媒を除去すること、抽出された植物材料に、新鮮なＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１：１）を添加すること、抽出工程を４回繰り返すこと、抽出物の均一性についてチェックすること、集められた抽出物から溶媒を除去すること、及び室温で空気乾燥することで微量の溶媒を除去し、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ根茎の生物学的に活性な成分を有する精製された植物抽出物を得ることを含む、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの根茎からの植物抽出物の調製方法を提供する。
【００２５】
本発明は、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物、及び根茎抽出物などのＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの抽出物の生物学的に活性な成分を含む組成物に関する。
【００２６】
本発明は、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物、及びＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の生物学的に活性な成分を含む医薬組成物に関する。
【００２７】
本発明の一つの態様は、神経疾病の予防及び治療的処置におけるＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の用途を提供する。
【００２８】
本発明の一つの態様は、神経変性疾患の予防及び治療的処置におけるＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の用途を提供する。
【００２９】
本発明の別の態様は、アルツハイマー病の予防及び治療的処置におけるＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の用途を提供する。
【００３０】
さらに、本発明の別の態様は、神経疾病の予防及び治療的処置に有用なＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の生物学的に活性な成分を含む医薬組成物を提供する。
【００３１】
さらに、本発明の別の態様は、神経変性疾患の予防及び治療的処置に有用なＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の生物学的に活性な成分を含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
さらに、本発明の別の態様は、アルツハイマー病の予防及び治療的処置に有用なＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の生物学的に活性な成分を含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
本発明の一つの態様は、神経疾病の予防及び治療的処置のための医薬の調製におけるＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の用途を提供する。
【００３４】
本発明の一つの態様は、神経変性疾患の予防及び治療的処置のための医薬の調製におけるＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の用途を提供する。
【００３５】
本発明の別の態様は、アルツハイマー病の予防及び治療的処置のための医薬の調製におけるＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の用途を提供する。
【００３６】
本発明の別の態様は、Ｗｉｔｈａｎｉａ根茎の生物学的に活性な成分を含む医薬組成物の有効量を提供することを含む、神経疾患の処置の治療的方法を提供する。
【００３７】
本発明の別の態様は、Ｗｉｔｈａｎｉａ根茎の生物学的に活性な成分を含む医薬組成物の有効量を提供することを含む、神経変性疾患の処置の治療的方法を提供する。
【００３８】
本発明の別の態様は、Ｗｉｔｈａｎｉａ根茎の生物学的に活性な成分を含む医薬組成物の有効量を提供することを含む、アルツハイマー病の処置の治療的方法を提供する。
【００３９】
本発明のさらに別の態様は、Ｗｉｔｈａｎｉａ根茎の生物学的に活性な成分を含む医薬組成物の有効量を提供することを含む、神経疾患の処置の予防的方法を提供する。
【００４０】
本発明のさらに別の態様は、Ｗｉｔｈａｎｉａ根茎の生物学的に活性な成分を含む医薬組成物の有効量を提供することを含む、神経変性疾患の処置の予防的方法を提供する。
【００４１】
本発明の別の態様は、Ｗｉｔｈａｎｉａ根茎の生物学的に活性な成分を含む医薬組成物の有効量を提供することを含む、アルツハイマー病の処置の予防的方法を提供する。
【００４２】
本発明は、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物、及びＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の生物学的に活性な成分を含む組成物に関する。
【００４３】
本発明の一つの実施態様は、疾病の予防及び治療的処置においてＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の生物学的に活性な成分の用途を提供する。
【００４４】
本発明の別の実施態様は、神経疾病又は疾患の予防及び治療的処置におけるＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の用途を提供する。
【００４５】
本発明の他の実施態様は、神経変性疾患又は疾病の予防及び治療的処置におけるＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の用途を提供する。
【００４６】
さらに、本発明の別の実施態様は、アルツハイマー病の予防及び治療的処置におけるＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の用途を提供する。
【００４７】
本発明の一つの実施態様は、健康又は栄養補助食品としてのＷｉｔｈａｎｉａ根茎抽出物の用途を提供する。
【００４８】
本発明の一つの実施態様は、神経疾病の治療的及び／又は予防的処置に有用なＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の生物学的に活性な成分を含む医薬組成物を提供する。
【００４９】
本発明の一つの実施態様は、疾病の処置のためのその他の医薬品及び／又は組成物と組み合わせて投与され得る医薬組成物を提供する。
【００５０】
本発明の別の実施態様は、医薬的に許容可能な賦形剤とともにＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の有効量を含む組成物を提供する。
【００５１】
本発明の別の実施態様は、健康又は栄養補助食品として医薬的に許容可能な賦形剤とともにＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の有効量を含む組成物の用途を提供する。
【００５２】
本発明の別の実施態様は、神経疾病又は疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製におけるＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の用途である。
【００５３】
本発明の別の実施態様は、神経変性疾病又は疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製におけるＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の用途である。
【００５４】
本発明の別の実施態様は、アルツハイマー病の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製におけるＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の用途である。
【００５５】
抽出は、アルコール消化、水蒸気蒸留、共溶媒を添加することによる超臨界流体抽出法などの一般的な抽出方法、及びその他の従来の抽出法により行われ得る。
【００５６】
本発明は、Ｗｉｔｈａｎｉａ根茎の生物学的に活性な成分を含む医薬組成物の有効量を提供することを含む、神経疾患の処置の治療方法を提供する。
【００５７】
本発明は、Ｗｉｔｈａｎｉａ根茎の生物学的に活性な成分を含む医薬組成物の有効量を提供することを含む、神経疾患の処置の予防方法をさらに提供する。
【００５８】
本発明の一つの実施態様は、従来の方法により乾燥したＷｉｔｈａｎｉａ根茎の粉末を調製するステップ、根茎粉末にＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１：１）を添加するステップ；室温で約７２時間攪拌するステップ；内容物をろ過し、減圧下、ロータリーエバポレーターを用いて３５〜４０℃で澄明なろ液から溶媒を除去するステップ；抽出した植物材料に新鮮なＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１：１）を添加するステップ及び抽出工程を４回繰り返すステップ；均一性について抽出物をチェックするステップ及び集めた抽出物から溶媒を除去するステップ並びに室温で空気乾燥することにより微量の溶媒を除去し、Ｗｉｔｈａｎｉａ根茎の生物学的に活性な成分を有する精製された植物抽出物を得るステップを含む、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ根茎からの植物抽出物の調製及び精製方法を提供する。
【００５９】
図１：オスのＡＰＰ／ＰＳ１マウス（９ヶ月齢）は、ＰＥ（１ｇ／ｋｇ）又はビヒクルを用いて３０日の全期間の間処理され、この間、ＲＡＭにおける能力を評価した。（ａ）実験の時間は、課題が完了した時間として評価された。（ｂ）参照記憶エラー（ＲＭＥ）は、餌をしかけられていないアームに最初に侵入した回数として評価された。（ｃ）正解の作業記憶エラー（ＣＷＥ）は、餌をしかけられたアームに再度侵入する回数として評価された。（ｄ）不正解の作業記憶エラー（ＩＣＷＥ）は、餌をしかけられていないアームに再度侵入した回数として評価された。ＷＴ−Ｖｅｈ及びＷｔ−Ｔｒｔは、全てのパラメータについてＲＡＭにおいて同様に行った。データは、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝６）として示した。アスタリスクは、コントロールに対して有意差を有する値を示す（ｐ＜０．０５）。処置群は、ビヒクルで処置されたトランスジェニックマウス（Ｔｇ−Ｖｅｈ）；植物抽出物で処置されたトランスジェニックマウス（Ｔｇ−Ｔｒｔ）；ビヒクルで処置された野生型（Ｗｔ−Ｖｅｈ）及び植物抽出物で処置された野生型（ＷＴ−Ｔｒｔ）として示された。
【００６０】
一つの実施態様において本発明によると、約７０〜８０％のウィタノライド及び約１５〜２５％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物を提供する。
【００６１】
一つの実施態様において本発明によると、７５％のウィタノライド及び２０％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物を提供する。
【００６２】
本発明のさらに別の実施態様において、約７５％のウィタノライド及び約２０％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物を提供し、この抽出物は、ウィタフェリンを含まない。
【００６３】
本発明のさらに別の実施態様において、約７５％のウィタノライド及び約２０％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物を提供し、この抽出物は、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの根茎から得られたものである。
【００６４】
本発明の一つの実施態様は、約７５％のウィタノライド及び約２０％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物を提供し、この抽出物は、アルツハイマー病、パーキンソン病及び老年性認知症からなる群から選択された神経変性疾患の処置に有用である。
【００６５】
本発明の別の実施態様は、約７５％のウィタノライド及び約２０％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物を提供し、この抽出物は、粉末、液体、カプセル又は錠剤の形態である。
【００６６】
本発明の別の実施態様は、約７５％のウィタノライド及び約２０％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物を提供し、この抽出物は、アルツハイマー病の処置に有用である。
【００６７】
本発明の別の実施態様は、約７５％のウィタノライド及び約２０％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物を提供し、この抽出物は、アルツハイマー病の処置に有用であり、アルツハイマー病の処置のための抽出物の有効量は、０．５／日／ｋｇ体重〜１ｇ／日／ｋｇ体重の範囲である。
【００６８】
本発明の別の実施態様において、約７０〜８０％のウィタノライド及び約１５〜２５％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物並びに医薬的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供する。
【００６９】
約７０〜８０％のウィタノライド及び約１５〜２５％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物を含む栄養補助組成物を提供する。
【００７０】
本発明は、約７０〜８０％のウィタノライド及び約１５〜２５％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａを含むハーブ組成物をさらに提供する。
【００７１】
本発明の一つの実施態様において、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物の調製方法を提供し、この方法は、Ｗｉｔｈａｎｉａ根茎を提供すること、根茎抽出物を得るように、この根茎を、室温で約６０〜７５時間、有機溶媒で抽出すること；乾燥根茎抽出物を得るように、根茎抽出物から溶媒を除去すること；根茎抽出物の活性画分を得るように、乾燥根茎抽出物を１０％のメタノール−クロロホルム混合物で処置することを含む。
【００７２】
本発明の一つの実施態様において、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物の調製方法を提供し、この方法は、Ｗｉｔｈａｎｉａ根茎を提供すること、根茎抽出物を得るように、この根茎を、室温で約６０〜７５時間、有機溶媒で抽出すること；乾燥根茎抽出物を得るように、根茎抽出物から溶媒を除去すること；根茎抽出物の活性画分を得るように、乾燥根茎抽出物を１０％のメタノール−クロロホルム混合物で処置することを含み、有機溶媒は、クロロホルム及びメタノールの混合物である。
【００７３】
本発明の一つの実施態様において、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物の調製方法を提供し、この方法は、Ｗｉｔｈａｎｉａ根茎を提供すること、根茎抽出物を得るように、この根茎を、室温で約６０〜７５時間、有機溶媒で抽出すること；乾燥根茎抽出物を得るように、根茎抽出物から溶媒を除去すること；根茎抽出物の活性画分を得るように、乾燥根茎抽出物を１０％のメタノール−クロロホルム混合物で処置することを含み、有機溶媒は、クロロホルム及びメタノールの混合物であり、クロロホルムとメタノールの比率は、２：３、１：１又は３：２である。
【００７４】
本発明の一つの実施態様において、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物の調製方法を提供し、この方法は、Ｗｉｔｈａｎｉａ根茎を提供すること、根茎抽出物を得るように、この根茎を、室温で約６０〜７５時間、有機溶媒で抽出すること；乾燥根茎抽出物を得るように、根茎抽出物から溶媒を除去すること；根茎抽出物の活性画分を得るように、乾燥根茎抽出物を１０％のメタノール−クロロホルム混合物で処置することを含む、有機溶媒は、クロロホルム及びメタノールの混合物であり、メタノールとクロロホルムの比率は、１：１である。
【００７５】
本発明の別の実施態様において、必要とする対象に、約７０〜８０％のウィタノライド及び約１５〜２５％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物の治療的有効量を投与することを含む神経変性疾患を改善する方法を提供する。
【００７６】
本発明の別の実施態様において、必要とする対象に、７５％のウィタノライド及び２０％のウィタノサイドを有するＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物の治療的有効量を投与することを含む神経変性疾患を改善する方法を提供する。
【００７７】
本発明の別の実施態様は、対象に、約７０〜８０％のウィタノライド及び約１５〜２５％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物の治療的有効量を投与することを含み、神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病及び老年性認知症からなる群から選択される神経変性疾患を改善する方法を提供する。
【００７８】
本発明の別の態様態様は、必要とする対象に、約７０〜８０％のウィタノライド及び約１５〜２５％のウィタノサイドを含むＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物の治療的有効量を投与することを含み、神経変性疾患がアルツハイマー病である神経変性疾患を改善する方法を提供する。
【００７９】
本発明の別の実施態様は、必要とする対象に、約７０〜８０％のウィタノライド及び約１５〜２５％のウィタノサイドを有するＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物の治療的有効量を投与することを含み、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの植物抽出物が約０．５ｇ／日／ｋｇ体重〜１ｇ／日／ｋｇ体重の用量で対象に投与される神経変性疾患を改善する方法を提供する。
【００８０】
本発明の別の実施態様において、アルツハイマー病、パーキンソン病及び老年性認知症からなる群から選択される神経変性疾患の処置に有用な医薬の調製のための、約７０〜８０％のウィタノライド及び約１５〜２５％のウィタノサイドを有するＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の用途を提供する。
【００８１】
本発明の別の実施態様において、アルツハイマー病、パーキンソン病及び老年性認知症からなる群から選択される神経変性疾患の処置に有用な医薬の調製のための、７５％のウィタノライド及び２０％のウィタノサイドを有するＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ抽出物の用途を提供する。
【００８２】
好ましい実施態様に関連して本発明について述べたが、本発明がこれらの実施例に限定されることを意図されるものではないことを理解すべきである。逆に、添付の特許請求の範囲に定義されたもののように本発明の精神及び範囲内に含まれ得るものとして、全ての代替、改変及び等価物を包含することを意図するものである。
【実施例】
【００８３】
理解されるべきように、ここに述べる以下の実施例は、示すことのみを目的とするものであり、明細書を考慮した種々の改変又は変更は、当業者に示唆的であり、本願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に含まれるものである。
【００８４】
（実施例１）
Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａからの活性画分の単離
粉末化された植物材料、つまり、Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａの根茎は、インドのＡｒｙａ  Ｖａｉｄｙａ  Ｓｈａｌａ、Ｋｏｔｔａｋｋａｌより得た。植物抽出物は、丸底フラスコ中、根茎粉末にＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１：１）を添加し、機械式攪拌機を用いて、室温で７２時間攪拌することで、調製した。内容物をろ過し、ロータリーエバポレーターを用いて、減圧下、３５〜４０℃、好ましくは３７℃で澄明なろ液から溶媒を除去した。抽出された植物材料に新鮮なＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１：１）を添加し、この抽出工程を４回繰り返した。これらの化学成分について均一であることを確認するように、４つの全ての抽出物を、ＣＨＣｌ３及びＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（９０：１０）溶媒系を用いたＴＬＣ上でチェックした。４つの全ての抽出物に同様の成分が含まれることを確認したので、これらを合わせた。泡立ちが始まるまで、上記の条件を用いて、合わせた抽出物から溶媒を除去した。残存する微量の溶媒は、室温で空気乾燥することにより除去され、乾燥抽出物をＷＳ−１とラベルした。
【００８５】
ＷＳ−１の試験サンプルについて、非極性から開始して極性へと至る種々の溶媒、即ち、石油エーテル、ＣＨＣｌ３、ＣＨ３ＣＯＣＨ３及びＭｅＯＨ中における溶解性をチェックした。最終的に、さらなる分画のため、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（９０：１０）を選択した。したがって、空気乾燥された画分ＷＳ−１は、溶解性成分のほとんどを溶解するように、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（９０：１０）（３×４００ｍＬ）で処理された。上記の通り溶媒を除去し、残存した画分に、活性を有することを見出し、ＷＳ−１ａ（薬物）としてラベルした。不溶性の部分についても乾燥させ、ＷＳ−１ｂとラベルした。異なるバッチから得られた活性画分（ＷＳ−１ａ）もまた、ＨＰ−ＴＬＣ上でチェックされ、同様の比率で類似の成分を含むことが見出された。抽出物の収率は、根茎粉末１ｋｇ当たり約２０ｇであった。
【００８６】
（実施例２）
トランスジェニック動物
動物
本研究では、幼弱（６ヶ月）及び高齢（２３ヶ月）マウス並びに年齢に適合した非トランスジェニックの同腹子からなる、オス及びメスのヘテロ型Ｂ６Ｃ３Ｔｇ動物を用いた。Ｂ６Ｃ３Ｔｇの二重のトランスジェニックマウスは、キメラのマウス／ヒトのアミロイド前駆体タンパク質（Ｍｏ／ＨｕＡＰＰ６９５ｓｗｅ）及び変異型ヒトプレセニリン１（ＰＳ１−ｄＥ９）を発現する。ＡＰＰにおけるスウェーデン変異（Ｋ５９５Ｎ／Ｍ５９６Ｌ）及びＰＳ１におけるエクソン９の欠失により、βセクレターゼ経路を介したプロセッシングを補助することによりトランス遺伝子により製造されるＡ−βの量が増加する。マウスは、アメリカのＪａｃｋｓｏｎ研究室により生産された（Ｂｏｒｃｈｅｌｔら著、１９９６年、Ｊａｎｋｏｗｓｋｙら著、２００１年）。ジェノタイピングにより、新生マウスの遺伝的構成を周期的に追跡した。
【００８７】
ジェノタイピングにより、新生マウスの遺伝的構成を周期的に追跡した。子孫については、尾から抽出されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によりトランス遺伝子の存在についての、ジェノタイピングを行った。
【００８８】
抽出及び給餌のスケジュール
植物抽出物（０．１〜１ｇ／ｋｇ体重）は、３０日間毎日単一用量で２５μＬ経口で投与可能なように、エタノールに懸濁した。中間年齢及び高齢のマウスには、１ヶ月の期間中、経口で植物抽出物又はビヒクル（エタノール）を給餌した。処置プロトコールは、挙動の評価を行うことなく３日間処置すること、及びその後、処置及び２８日間の挙動パラダイムを含む。
【００８９】
挙動パラダイム
マウスを、中央の８角形のプラットフォームから放射状に等間隔に伸びる全く同じ８本のアームからなり、７５ｃｍの高さがある放射状のアーム迷路（ＲＡＭ）でトレーニングした。ＲＡＭは、空間的及び作業記憶を評価する方法として用いられる。ＲＡＭにおける挙動評価は、正解の作業記憶エラー（餌を付されたアームへの再度の侵入の回数）、不正解の作業記憶エラー（餌を付されていないアームへの再度の侵入の回数）、参照記憶エラー（餌を付されていないアームへの最初の侵入の回数；トライアル当たり最大４つ）及び実験の時間（課題を完了する時間）をチェックすることを含む（Ｙｅｅら著、２００４年）。
【００９０】
挙動試験は、２８日間行われ、下記の事項を含む：
（ｉ）３日間の慣らしの期間
（ｉｉ）１０日間の前トレーニング
（ｉｉｉ）１５日間のトレーニング及び記録。トレーニングの最後の３日間は、ビデオでの記録も含んでいる。
【００９１】
（実施例３）
免疫組織化学及び染色プロトコール
動物は、１ヶ月の期間、薬物及びビヒクルで処置され、その終期において、屠殺された。脳を摘出し、大脳半球を分離し、左半球を、固定用の４％パラホルムアルデヒド中で保存し、２４時間放置した。その後、脳が溶液中で沈むまで、３０％スクロース溶液中で保存した。その後、クリオスタットを用いて３０μｍの厚みで薄切した。切片は、ＰＢＳ溶液中で浮かせた状態で保存した。各１０番目の切片をスライド上に載置した。
【００９２】
銀染色
切片を、蒸留水で各３分間３回洗浄し（洗浄ステップ）、１５分間、前もって温めた１０％硝酸銀溶液に浸漬した。洗浄ステップを繰り返し、洗浄された切片を、３０〜４５分間、アンモニア性硝酸銀溶液中に保存した。その後、発色するまで、切片を発色溶液に入れておいた。その後、反応を停止するように、切片を１％アンモニア溶液中に保存した。再び洗浄ステップを繰り返し、その後、過剰の染色剤を除去するように、切片を、５分間、５％チオ硫酸ナトリウム中に保存した（Ｂｅｅｃｈ  Ｒ．及びＤａｖｅｎｐｏｒｔ  Ｈ．著、１９３３年）。その後、脱水するため、切片を、アルコール勾配処置及びキシレン処置を行い、その後、ＤＰＸを用いてカバースリップを載せた。顕微鏡下で画像を撮影し、Ｌｅｉｃａより供給されているＩＭ５０ソフトウェアを用いてプラーク蓄積を測定した。
【００９３】
免疫組織化学
切片を、蒸留水を用いて各３分３回洗浄した（洗浄ステップ）。その後、切片を、クエン酸ナトリウム緩衝液中に浸漬し、抗原回復のため、最初の笛が鳴るまで圧力鍋に保存した。その後、２０分間、ＰＢＳ中の３％Ｈ２Ｏ２中で切片を急冷した。洗浄ステップを繰り返した。通常のヤギ血清（３〜５％）を用いて、１時間ブロッキングを行った。その後、切片を、ブロッキング溶液中の一次抗体溶液（１：５００）中、一晩４℃で保存した。再び、洗浄ステップを繰り返した。その後、切片をＰＢＳ中の二次抗体（１：５００）中で、室温で１〜２時間保存した。洗浄ステップを繰り返した。Ｖｅｃｔｏｒから市販されているアビジン−ビオチン複合体を用いてシグナル強調を行った。最終的に、Ｖｅｃｔｏｒから市販されているＤＡＢ又はＮＯＶＡレッドキットを用いて発色させた。反応を停止させるため、切片を蒸留水で洗浄した。その後、ＤＡＢの場合、脱水するため、切片をアルコール勾配処理及びキシレン処理を行い、一方、ＮＯＶＡレッドの場合、脱水のため、キシレンのみを用い、その後、ＤＰＸを用いてカバースリップを載せた。顕微鏡下で画像を撮影し、ＩＭ５０ソフトウェアを用いてプラーク蓄積を測定した。
【００９４】
（実施例４）
ＥＬＩＳＡプロトコール
組織の調製
動物を、１ヶ月の期間、薬物及びビヒクルで処置し、最後の投与の後２４時間で屠殺した。脳を解剖し、脳半球を分離し、右半球を５つの主要な部分、即ち前頭皮質、残りの皮質、海馬、小脳、脳の残りの部分に解剖した。組織を、液体窒素を用いて凍結し、その後、ホモジナイズし、全ホモジネート、核除去後上清及び細胞質画分として分離するため遠心分離した。全ホモジネートを、グアニジン−塩酸（５Ｍ）で処理した。抗体１２Ｆ４及び１１Ａ５０−Ｂ１０をそれぞれ用いてβ−アミロイド１〜４２及び１〜４０についてＥＬＩＳＡを行った（Ｓｉｇｎｅｔ  ｃｏｖａｎｃｅ）。
【００９５】
プレートの調製
ＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．０５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３、蒸留水中、ｐＨ９．４）を用いて、濃度１．５μｇ／ｍＬの捕捉抗体（１２Ｆ４又は１１Ａ５０−Ｂ１０、Ｓｉｇｎｅｔ  ｃａｖａｎｃｅ）で、４℃で一晩コートした。ウェルを、洗浄緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ）で１５〜３０秒洗浄し、吸引し、その後、３００μＬのブロッキング溶液（０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．６ｍＭ  ＫＣｌ、０．５％ウシ血清アルブミン、水中、ｐＨ７．４）でブロッキングした。プレートを覆い、室温で１〜２時間インキュベートした。ウェルからブロッキング溶液を吸引した。標準液及びサンプルを、アッセイ緩衝液（０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．６ｍＭ  ＫＣｌ、０．５％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、水中、ｐＨ７．４）で希釈し、コートしたプレートに添加し、２時間インキュベートした。溶液を吸引し、ウェルを４回洗浄した（各３０秒）。検出抗体（ポリクローナルβ−アミロイドＨ−４３、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ．）を０．５μｇ／ｍＬに希釈し、ウェルに添加し、１時間インキュベートし、その後、洗浄ステップを行った。ビオチン化二次抗体を、アッセイ緩衝液で希釈し、ウェルに添加し、１時間インキュベートし、その後、洗浄した。ストレプトアビジンＨＲＰを希釈し、ウェルに添加し、３０分間インキュベートした。ＴＭＢキットで発色させ、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止させた。Ｂｉｏｒａｄ社製のＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍのＯＤを測定した。分析のため、標準曲線をプロットし、３次元非線形回帰を用いて曲線フィッティングを行い、サンプルの濃度を算出した。
【００９６】
（実施例５）
１ｇ／ｋｇ体重の用量の植物抽出物を用いて、９ヶ月のＢ６Ｃ３Ｔｇマウスで行われた挙動実験
９〜１０ヶ月齢のトランスジェニックマウス（ＡＰＰ及びＰＳ１の遺伝子を変異）を、植物抽出物（ＰＥ）及びビヒクルで、１ｇ／ｋｇ体重の用量で１ヶ月間処置した。マウスを、放射状のアーム迷路上で空間学習及び記憶についてトレーニングし試験した。ＰＥで処置したトランスジェニックマウスでは、記憶エラーの低下を示した（図１）。
【００９７】
染色
マウスを屠殺し、その脳を、染色及び生化学的アッセイ用に加工した。凍結切片を、銀染色、β−アミロイド免疫組織化学（ＩＨＣ）及びユビキチンＩＨＣを用いて染色した。
【００９８】
植物抽出物で処理することにより、ビヒクルで処理したマウスと比較して、プラークが完全に除去された。立体解析を行い、プラークで覆われた皮質又は海馬の面積の割合を算出した（図２）。
【００９９】
ＥＬＩＳＡを用いたアミロイド負荷
異なる形態のＡβを定量するため、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡを用いて、同じマウスの皮質、海馬及び血清におけるＡβ１〜４０、Ａβ１〜４２のβ−アミロイドの負荷を測定し、脳及び血清において、Ａβ１〜４０及びＡβ１〜４２が有意に低下したことが見出された（図３〜４）。
【０１００】
（実施例６）
０．１ｇ／ｋｇ及び０．５ｇ／ｋｇ体重の用量の植物抽出物を用いて、９ヶ月齢のＢ６Ｃ３Ｔｇマウスで行われた実験
０．１ｇ／ｋｇ及び０．５ｇ／ｋｇ体重の２つの異なる用量を用いて、上記の実験を繰り返した。結果は、以下の通りである。
【０１０１】
染色
低用量の植物抽出物であっても、プラーク負荷が有意に低下した（図５）。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡを用いたアミロイド負荷
０．５ｇ／ｋｇ体重の用量で、Ａβ４２及びＡβ４０のβ−アミロイド負荷が有意に低下したことを観察した（図６）。
【０１０３】
（実施例７）
１ｇ／ｋｇ体重の用量の植物抽出物を用いて、２３ヶ月齢のＢ６Ｃ３Ｔｇで行われた実験
２３ヶ月齢のトランスジェニックマウスについて同様の実験を行った。
【０１０４】
挙動
植物抽出物で処置した高齢のＴｇマウスは、ビヒクルで処置したＴｇマウスと比較して、放射状のアーム迷路での課題をうまくこなした。ビヒクルで処置したマウスと比較して、記憶エラーが有意に低下した（図７）。
【０１０５】
染色
ビヒクルで処置したＴｇ動物と比較して、植物抽出物で処置したＴｇ動物でプラークの負荷が有意に低下した（図８）。
【０１０６】
アミロイド負荷
ＥＬＩＳＡを用いて、同じマウスの皮質、海馬及び血清におけるＡβ１〜４０及びＡβ１〜４２のβ−アミロイド負荷を測定し、脳及び血清においてＡβ１〜４０、Ａβ１〜４２が有意に低下したことを見出した（図９）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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