(57)【要約】  哺乳類患者におけるＧｖ  ＨＤ合併症の発生予防または治療のための方法であって、哺乳類に、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫に富化された細胞集団並びに／またはそれ由来の可溶性因子を投与することを含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類患者におけるＧｖＨＤ合併症の発生予防または治療のための方法であって、前記哺乳類に、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫に富化された細胞集団並びに／またはそれ由来の可溶性因子を投与することを含む方法。
【請求項２】
前記哺乳類に、（ａ）骨髄系統細胞の前駆細胞、および（ｂ）ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫に富化された細胞集団並びに／またはそれ由来の可溶性因子を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫細胞に富化された細胞集団並びに／またはそれ由来の可溶性因子が、骨髄系統の前駆細胞の投与前に哺乳類に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫細胞に富化された細胞集団並びに／またはそれ由来の可溶性因子が、骨髄系統の前駆細胞と同時に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記骨髄系統の前駆細胞が悪性または遺伝性の血液の疾患を治療するために哺乳類に投与される同種異系細胞である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫が同種異系である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫細胞に富化された細胞集団並びに／またはそれ由来の可溶性因子が全身投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫細胞に富化された細胞集団並びに／またはそれ由来の可溶性因子が静脈内注射によって投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
０．１×１０６〜５×１０６個のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫を投与することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
０．３×１０６〜２×１０６個のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫を投与することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
低用量のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫を投与することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記低用量のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫が０．１×１０５〜０．５×１０６個のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記低用量のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫が約０．３×１０６個のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫に富化された集団並びに／またはそれ由来の可溶性因子が週１回以下の頻度で投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳類が、化学療法および放射線療法後に再生不良性貧血、骨髄線維症、または骨髄機能不全を患っている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳類に免疫抑制剤を投与することをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血前駆細胞の移植を増進し、骨髄移植を増進し、移植片対宿主病を予防または低減するための方法に関する。一実施形態では、本発明は、哺乳類患者、特にヒト患者における同種骨髄移植後の合併症、すなわち、移植片対宿主病を予防または軽減することに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄移植は、骨髄を破壊する過程の後に行われることが望ましい。例えば、大量の（ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ）全身放射線療法または化学療法後、骨髄は最初の標的となり機能が停止する。転移性癌は、一般的に、癌を破壊することを目的とする非常に大量の化学療法で治療されるが、それはまた骨髄をも効果的に破壊してしまう。これにより骨髄移植の必要性が生じる。しかし、骨髄移植に伴う骨髄障害が関係する、最も急性で生命に関わる状態以外のものを軽減することは、移植片対宿主病（ＧvＨD）が発症する可能性があるために、一般的にリスクが高すぎると見なされる。
【０００３】
ＧｖＨＤは、同種骨髄移植または同種幹細胞移植の成功と有効性を制限する主な要因となる、免疫障害である。ＧｖＨＤは、慢性疾患を引き起こす全身性の炎症反応であり、宿主哺乳動物を死亡させる場合もある。現在でも、同種移植は、ドナーが宿主と高い組織適合性を有している場合でさえ、ＧｖＨＤの随伴という深刻なリスクを常に伴う。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１６：１８２７−１８３５，  ２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＧｖＨＤの原因は、ドナーＴ細胞が全身に分布した不適合性の宿主抗原に応答し、強力な炎症を引き起こすことによるものである。ＧｖＨＤにおいて、ドナーと宿主の差異を認識する成熟ドナーＴ細胞は、全身で活性化状態となる。ＧｖＨＤを予防および治療するための現在の方法には、シクロスポリンＡおよび副腎皮質ステロイド等の薬剤の投与が含まれる。これらは深刻な副作用を有しており、長期間服用しなければならず、且つ、投与およびモニターのための費用が高い。ＧｖＨＤ予防にＴ細胞除去を利用する試みもなされてはいるが、これには高性能で高価な設備と専門知識が必要とされる。かなりの確率でＴ細胞除去は、骨髄幹細胞移植の失敗、造血系の再構成の失敗、感染、または再発という、深刻な問題をもたらす。Ｔ細胞除去をより制限した場合、ＧｖＨＤを惹起する能力を未だ有する細胞をあとに残してしまう。結果、ＧｖＨＤを治療する現在の方法は、限定されたドナーと宿主の組合せにおいてのみ成功するものであるため、多くの患者は、命を救う可能性がある治療を受けることができない。
【０００６】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は強力な免疫抑制活性を示すが、この活性は、臨床症状において、本来であれば致命的な骨髄移植の合併症である移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を治療することに上手く利用されている。性質決定が限定的であるため、ＭＳＣ調製物は非常に不均一であり、このことがそれらの免疫抑制の規模、ひいては臨床的利点をも制限してしまっている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に至る研究で、本発明者は、間葉系幹細胞とＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ（ｂｒｉｇｈｔは強陽性）多能性細胞調製物を、それらのＧｖＨＤに対する効果という点から比較した。驚くべきことに、ＧｖＨＤを改善することにおいて、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉｇｈｔ多能性細胞調製物は間葉系幹細胞調製物よりもかなり優れていた。
【０００８】
従って、本発明は、哺乳類患者におけるＧｖＨＤ合併症の発症（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を軽減するための方法を提供し、方法は、患者に、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫に富化された細胞集団並びに／またはそれ由来の可溶性因子を投与することを含む。
【０００９】
一実施形態では、前記哺乳類患者は、骨髄移植を受けているか、または受ける間近である。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、骨髄移植によって引き起こされる哺乳類患者におけるＧｖＨＤ合併症の発症を軽減するための方法を提供し、方法は、患者に、（ａ）骨髄系統細胞の前駆細胞、並びに（ｂ）ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫に富化された細胞集団並びに／またはそれ由来の可溶性因子を投与することを含み、ここでＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫に富化された細胞集団並びに／またはそれ由来の可溶性因子は、患者におけるＧｖＨＤの重症度を低減させるのに有効な量で投与される。
【００１１】
一実施形態では、移植片対宿主病はＴ細胞免疫応答の結果によるものである。一例では、Ｔ細胞はドナー由来のものであり、抗原はレシピエント由来のものである。例えば、Ｔ細胞は移植片の中に存在していてもよい。別の実施形態では、Ｔ細胞はレシピエント由来であり、抗原はドナー由来である。
【００１２】
本方法の別の実施形態では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫細胞並びに／またはそれに由来する可溶性因子は、Ｔ細胞の同時刺激を遮断するための分子を発現するよう遺伝子改変されている。
【００１３】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は自己のものであっても同種異系のものであってもよい。一実施形態では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は同種異系のものである。
【００１４】
本方法の別の実施形態では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫細胞は、投与または可溶性因子を得ることより前に培養液中で増殖済みである。
【００１５】
例示的な細胞の投与量には、０．１×１０６〜５×１０６個のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫が含まれる。例えば、前記方法は、０．３×１０６〜２×１０６個のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫を投与することを含む。
【００１６】
前記方法の１つの形態には、低用量のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫を投与することが含まれる。そのような低用量は、例えば、約０．３×１０６個のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫等の、０．１×１０５〜０．５×１０６個のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫である。
【００１７】
本開示は前記細胞および／または可溶性因子を多数投与することも企図している。例えば、そのような方法は、前記細胞を投与すること、および対象をモニターしてＧｖＨＤの１つまたは複数の症状がいつ発生または再発するかを決定すること、並びにさらなる投与量の前記細胞および／または可溶性因子を投与することを含み得る。ＧｖＨＤの症状を評価するのに適切な方法は、当業者には明らかである、および／または本明細書に記載されるだろう。
【００１８】
一例では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫に富化された集団並びに／またはそれに由来する可溶性因子は、週に１回またはそれより少ない頻度、例えば、４週間毎に１回またはそれより少ない頻度で投与される。
【００１９】
別の実施形態では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫細胞に富化された細胞集団並びに／またはそれに由来する可溶性因子は、全身投与される。例えば、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞および／もしくはその子孫細胞に富化された細胞集団並びに／またはそれに由来する可溶性因子は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、大動脈中、心臓の心房もしくは心室中、または臓器に連結した血管中、例えば、腹大動脈、上腸間膜動脈、膵十二指腸動脈もしくは脾動脈中に投与することができる。
【００２０】
別の実施形態では、本発明の方法はさらに、免疫抑制剤を投与することを含む。免疫抑制剤は、前記移植細胞が機能的であることを可能にするのに十分な時間投与され得る。一例では、免疫抑制剤はシクロスポリンである。シクロスポリンは５〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与され得る。
【００２１】
本明細書の全体を通じて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、記載される要素、整数もしくはステップ、または複数の要素、整数もしくはステップの群の包含を意味するが、他のいかなる要素、整数もしくはステップ、または複数の要素、整数もしくはステップの群の排除を意味するものではないことは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】成人ＢＭＭＮＣによるＴＮＡＰ（ＳＴＲＯ−３）および間葉系前駆細胞マーカー、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔの共発現。  ＳＴＲＯ−１  ＭＡＣＳで選別したＢＭＭＮＣのインキュベーション、およびＦＩＴＣ共役型ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体での間接標識（ｘ軸）、およびＰＥ共役型ヤギ抗マウスＩｇＧで間接標識されたＳＴＲＯ−３ｍＡｂ（マウスＩｇＧ１）（ｙ軸）によって、二色免疫蛍光法およびフローサイトメトリーを行った。ドットプロットヒストグラムはリストモードデータとして収集した５×１０４個の事象を表わしている。垂直線および水平線は、同条件下で処置したアイソタイプ一致の対照抗体、１Ｂ５（ＩｇＧ）および１Ａ６．１２（ＩｇＭ）で得られた平均蛍光の１．０％未満の活性レベルに設定した。結果は、少数のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞集団がＴＮＡＰを共発現したが（右上の象現）、一方残りのＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＴＲＯ−３ｍＡｂと反応しなかったことを示している。
【図２−１】培養および増殖したＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＭＰＣのＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔまたはＳＴＲＯ−１ｄｉｍ（ｄｉｍは弱陽性）子孫の遺伝子発現プロファイル。  ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた骨髄ＭＰＣの単個細胞浮遊液をトリプシン／ＥＤＴＡ処理によって調製した。細胞をＳＴＲＯ−１抗体で染色（ｓｔａｉｎ）し、続いてその抗体を、ヤギ抗マウスＩｇＭ−フルオレセインイソチオシアネートと一緒にインキュベートすることによって明らかにした。蛍光標識細胞分取後に、細胞内全ＲＮＡをＳＴＲＯ−１ｄｉｍまたはＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ発現細胞の精製集団から調製した（Ａ）。ＲＮＡｚｏｌＢ抽出法、および標準的な手順を用いて、各亜集団から全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡ合成の鋳型として用いた。前述した標準的なプロトコール（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１６：１８２７−１８３５，  ２００３）を用いて、種々の転写物の発現をＰＣＲ増幅によって評価した。本研究に用いたプライマーセットを表２に示す。増幅後、各反応混合物を１．５％アガロースゲル電気泳動で分析し、エチジウムブロマイド染色で可視化した（Ｂ）。各細胞マーカーについての相対的な遺伝子発現を、ＩｍａｇｅＱａｎｔソフトウェアを用い、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現を基準にして、評価した（Ｃ）。
【図２−２】培養および増殖したＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＭＰＣのＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔまたはＳＴＲＯ−１ｄｉｍ（ｄｉｍは弱陽性）子孫の遺伝子発現プロファイル。  ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた骨髄ＭＰＣの単個細胞浮遊液をトリプシン／ＥＤＴＡ処理によって調製した。細胞をＳＴＲＯ−１抗体で染色（ｓｔａｉｎ）し、続いてその抗体を、ヤギ抗マウスＩｇＭ−フルオレセインイソチオシアネートと一緒にインキュベートすることによって明らかにした。蛍光標識細胞分取後に、細胞内全ＲＮＡをＳＴＲＯ−１ｄｉｍまたはＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ発現細胞の精製集団から調製した（Ａ）。ＲＮＡｚｏｌＢ抽出法、および標準的な手順を用いて、各亜集団から全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡ合成の鋳型として用いた。前述した標準的なプロトコール（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１６：１８２７−１８３５，  ２００３）を用いて、種々の転写物の発現をＰＣＲ増幅によって評価した。本研究に用いたプライマーセットを表２に示す。増幅後、各反応混合物を１．５％アガロースゲル電気泳動で分析し、エチジウムブロマイド染色で可視化した（Ｂ）。各細胞マーカーについての相対的な遺伝子発現を、ＩｍａｇｅＱａｎｔソフトウェアを用い、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現を基準にして、評価した（Ｃ）。
【図３】培養および増殖後ＳＴＲＯ−１＋ＭＰＣのＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ子孫は高レベルのＳＤＦ−１を発現するが、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍ子孫は発現しない。  （Ａ）ＭＡＣＳで単離したＳＴＲＯ−１＋ＢＭＭＮＣの調製物を、ＦＡＣＳを用いて、領域に応じた異なるＳＴＲＯ−１サブセット、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよびＳＴＲＯ−１ｄｉｍ／ｄｕｌｌ（ｄｕｌｌは微陽性）に区画した。各ＳＴＲＯ−１亜集団から全ＲＮＡを調製し、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔサブトラクションハイブリダイゼーションライブラリーを構築するのに用いた（Ｂ−Ｃ）。ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔサブトラクテッドｃＤＮＡで形質転換した細菌のクローンから増幅した代表的なＰＣＲ産物でブロットされている複製ニトロセルロースフィルター。その後、フィルターを［３２Ｐ］デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）‐標識ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ（Ｂ）またはＳＴＲＯ−１ｄｉｍ／ｄｕｌｌ（Ｃ）サブトラクテッドｃＤＮＡのいずれかで精査した。矢印は、ヒトＳＤＦ−１に対応するｃＤＮＡ断片を含む１クローンの特異的な発現を示している。（Ｄ）培養前に新たにＭＡＣＳ／ＦＡＣＳで単離したＢＭＭＮＣ  ＳＴＲＯ−１集団から調製した全ＲＮＡ中のＳＤＦ−１およびグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）転写物の相対的な発現を示している逆転写酵素（ＲＴ）‐ＰＣＲ分析。ｂｐは塩基対を示している。
【図４】Ｔ細胞増殖阻害におけるＳＴＲＯ−１陰性ＭＳＣ（調製物Ａ）およびＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＭＰＣ（調製物Ｂ）の効率比較。  ＰＢＭＣを、調製物ＡまたはＢの非存在下または存在下で、ＣＤ３／ＣＤ２８被膜ビーズで４日間刺激した。Ｔ細胞の増殖を、カウント／分（ｃｐｍ）として、３Ｈ−Ｔｄｒ取り込みによって測定した。
【図５】Ｔ細胞増殖阻害におけるＳＴＲＯ−１陰性ＭＳＣ（調製物Ａ）およびＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＭＰＣ（調製物Ｂ）の効率比較。  ＰＢＭＣを異なる濃度の調製物ＡまたはＢの存在下でＣＤ３／ＣＤ２８被膜ビーズで４日間刺激した。種々の培地におけるＴ細胞増殖を３Ｈ−Ｔｄｒ取り込みによって測定し、ＰＢＭＣをＭＳＣ非存在下で刺激した対照Ｔ細胞増殖の百分率として報告した。
【図６】ＧｖＨＤに対するＳＴＲＯ−１陰性ＭＳＣ（調製物Ａ）およびＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＭＰＣ（調製物Ｂ）の効果比較。  Ｂ１０．Ｄ２（Ｈ２ｄ）ドナー由来の、Ｔ細胞を除去した骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）（５×１０６）および脾細胞（３０×１０６）を、致死的な放射線（７５０ｃＧｙ）を与えたＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）レシピエントマウスに静脈注射した。４週間後、レシピエントマウスに、マウス１匹当たり１×１０６個のＭＳＣ（調製物Ａ１）もしくはＭＰＣ（調製物Ｂ１）を注射するか、またはさらなる治療を与えなかった（対照）。１群当たり８匹のマウスに注射した。マウスは週間隔で評価した。時間は週の数を指している。
【図７】ＧｖＨＤに対するＳＴＲＯ−１陰性ＭＳＣ（調製物Ａ）およびＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＭＰＣ（調製物Ｂ）の効果比較  Ｂ１０．Ｄ２（Ｈ２ｄ）ドナー由来の、Ｔ細胞を除去した骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）（５×１０６）および脾細胞（３０×１０６）を、致死的な放射線（７５０ｃＧｙ）を与えたＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）レシピエントマウスに静脈注射した。４週間後、レシピエントマウスに、１もしくは２×１０６細胞の調製物ＡもしくはＢ（Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２）を注射するか、またはさらなる治療を与えなかった（対照）。１群当たり８匹のマウスに注射した。
【図８】ＧｖＨＤに対する高用量のＳＴＲＯ−１陰性ＭＳＣ（調製物Ａ）およびＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＭＰＣ（調製物Ｂ）の効果比較。  Ｂ１０．Ｄ２（Ｈ２ｄ）ドナー由来の、Ｔ細胞を除去した骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）（５×１０６）および脾細胞（３０×１０６）を、致死的な放射線（７５０ｃＧｙ）を与えたＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）レシピエントマウスに静脈注射した。４週間後、レシピエントマウスに、２×１０６細胞の調製物ＡもしくはＢ（Ａ２、Ｂ２）を注射するか、またはさらなる治療を与えなかった（対照２）。１群当たり８匹のマウスに注射したが、Ｂ２群およびＡ２群への注射後間もなく、それぞれ４匹および３匹のマウスが死亡した。
【図９】ＧｖＨＤに対する低用量のＳＴＲＯ−１陰性ＭＳＣ（調製物Ａ）およびＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＭＰＣ（調製物Ｂ）の効果比較。  Ｂ１０．Ｄ２（Ｈ２ｄ）ドナー由来の、Ｔ細胞を除去した骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）（５×１０６）および脾細胞（３０×１０６）を、致死的な放射線（７５０ｃＧｙ）を与えたＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）レシピエントマウスに静脈注射した。４週間後、レシピエントマウスに、０．３×１０６細胞の調製物ＡもしくはＢ（Ａ０．３、Ｂ０．３）を注射するか、またはさらなる治療を与えなかった（対照２）。１群当たり６匹のマウスに注射した。グラフは、各マウスごとのＧｖＨＤスコアを報告している。
【図１０】ＧｖＨＤに対する低用量ＳＴＲＯ−１陰性ＭＳＣ（調製物Ａ）およびＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＭＰＣ（調製物Ｂ）の効果比較。  Ｂ１０．Ｄ２（Ｈ２ｄ）ドナー由来の、Ｔ細胞を除去した骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）（５×１０６）および脾細胞（３０×１０６）を、致死的な放射線（７５０ｃＧｙ）を与えたＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）レシピエントマウスに静脈注射した。４週間後、レシピエントマウスに、０．３×１０６細胞の調製物ＡもしくはＢ（Ａ０．３、Ｂ０．３）を注射するか、またはさらなる治療を与えなかった（対照２）。１群当たり６匹のマウスに注射した。グラフは、各群の平均ＧｖＨＤスコアを報告している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明で提示された結果は、ＧｖＨＤを改善することにおいて、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞に富化された細胞集団が、ＳＴＲＯ−１陰性間葉系幹細胞調製物よりも予想外にもかなり優れていたことを示している。
【００２４】
従って、本発明は、哺乳類患者におけるＧｖＨＤ合併症の発症を軽減するための方法を提供し、方法は、患者に、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫に富化された細胞集団並びに／またはそれ由来の可溶性因子を投与することを含む。
【００２５】
例えば、本発明は、骨髄移植によって引き起こされる哺乳類患者におけるＧｖＨＤ合併症の発症を軽減するための方法を提供し、方法は、患者に、（ａ）骨髄系統細胞の前駆細胞、並びに（ｂ）ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫に富化された細胞集団並びに／またはそれ由来の可溶性因子を投与することを含み、ここでＳｔｒｏ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫に富化された細胞集団並びに／またはそれ由来の可溶性因子は、患者におけるＧｖＨＤの重症度を低減させるのに有効な量で投与される。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「可溶性因子」という用語は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫によって産生される、水溶性のあらゆる分子、例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、リポ蛋白、リポペプチド、炭水化物等を意味すると解されるものとする。そのような可溶性因子は、細胞内に存在し得る、および／または細胞によって分泌され得る。そのような可溶性因子は、複雑な混合物（例えば、上清）および／もしくはその画分であり得る、並びに／または精製された因子であり得る。本発明の一実施形態では、可溶性因子は、上清中に存在するか、上清中に含有される。従って、１つまたは複数の可溶性因子の投与を対象とする本明細書のいかなる実施形態も、上清の投与に準用すると解されるものとする。
【００２７】
本発明の方法には、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫細胞に富化された細胞集団単独、並びに／またはそれに由来する可溶性因子の投与が含まれ得る。本発明の方法には、子孫細胞単独、または子孫細胞由来の可溶性因子の投与も含まれ得る。本発明の方法には、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞およびその子孫細胞の混合集団、またはＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞およびその子孫細胞の混合培養から得た可溶性因子の投与も含まれ得る。
【００２８】
本発明の好ましい適用対象はヒトであるが、本発明は動物にも適用可能であることが予想され、これらには、雌ウシ、ヒツジ、ブタ等の農業動物、イヌ、ネコ等の家畜、マウス、ラット、ハムスターおよびウサギ等の実験動物またはウマ等のスポーツに用いられる場合がある動物が含まれ得る。
【００２９】
従って、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫並びに／またはそれ由来の可溶性因子は、ドナーまたは外来の骨髄細胞に対し、レシピエントの免疫系を適当な状態にするのに使用することができ、それは、レシピエントに、ドナー細胞の移植前、または移植と同時に、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫並びに／またはそれ由来の可溶性因子を、レシピエントのＴ細胞による移植片に対する免疫応答を低減または除去するのに有効な量で、投与することによるものである。ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫並びに／またはそれ由来の可溶性因子は、ドナーまたは外来の組織と一緒に存在する場合に、Ｔ細胞応答が低減または除去されるように、レシピエントのＴ細胞に影響を与える。
【００３０】
従って、骨髄（造血幹細胞）移植という状況において、移植片による宿主の攻撃は低減または除去され得る。骨髄または末梢血幹細胞のレシピエントへの移植前に、ドナー骨髄をレシピエントのＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫細胞並びに／またはそれ由来の可溶性因子で前処置してもよい。好ましい実施形態では、ドナー骨髄は、最初にレシピエントの組織／細胞と接触させられ、その後ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫並びに／またはそれ由来の可溶性因子によって処置される。限定されるものではないが、レシピエントの組織または細胞との最初の接触は、髄におけるＴ細胞を活性化させる働きをすると考えられている。続くＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫並びに／またはそれ由来の可溶性因子での処置によって、髄におけるＴ細胞のさらなる活性化が阻害または除去され、結果、ドナーの組織による悪影響が低減または除去され、つまり、その処置によって移植片対宿主応答が低減または除去される。
【００３１】
さらなる実施形態では、移植片対宿主病を患う移植レシピエントは、ドナーに対し自家性または同種異系である、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫並びに／またはそれ由来の可溶性因子を、宿主の移植片拒絶反応を低減または除去するのに有効な量で、かかるレシピエントに投与することによって、その重症度を低減または除去するための処置をなされ得るが、ここで、同種異系細胞は、レシピエントに対し自家性のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫細胞であってもよいし、第三者のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫細胞であってもよい。ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫並びに／またはそれ由来の可溶性因子は、ドナー組織における活性化Ｔ細胞がレシピエントに対する免疫応答を開始するのを阻害または抑制することで、移植片対宿主応答を低減または除去する。
【００３２】
レシピエントのＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫細胞並びに／またはそれ由来の可溶性因子は、移植前にレシピエントから得ることができ、保存および／または培養増殖して、進行中の移植片による宿主への攻撃を治療するのに十分な量で、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫細胞並びに／またはそれ由来の可溶性因子の予備をつくることができる。
【００３３】
さらに、本発明のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫細胞、並びに／またはそれに由来する可溶性因子を用いた１回のみの処置は、長期に亘る免疫抑制剤治療の必要性を排除するため、必要とされ得ると考えられる。あるいは、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞および／もしくはその子孫細胞並びに／またはそれに由来する可溶性因子の複数回投与が採用され得る。
【００３４】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫細胞並びに／またはそれに由来する可溶性因子の投与量は、広い範囲内で変化し、当然ながら、各々の特殊な症例における個々の要求に合わせられるだろう。通常、非経口投与の場合、レシピエントの体重１キログラム当たり約０．０１〜約５百万個の細胞を投与することが通例である。使用される細胞数は、レシピエントの体重および状態、投与の回数または頻度、並びに当業者に知られる他の可変要素（ｖａｒｉａｂｌｅ）によって決まる。
【００３５】
前記細胞は、約０．０１〜約５×１０６細胞／ｍｌの濃度で、適切な希釈液中に懸濁することができる。本発明の一形態は、低用量のＳＴＲＯ−１強陽性細胞および／またはその子孫を投与することを含む。そのような低用量は、例えば、０．１×１０５〜０．５×１０６個のＳＴＲＯ−１強陽性細胞および／またはその子孫であり、例えば、約０．３×１０６個のＳＴＲＯ−１強陽性細胞および／またはその子孫である。
【００３６】
注射液に用いる適切な賦形剤は、緩衝食塩水溶液または他の適した賦形剤等の、生物学的および生理学的に細胞およびレシピエントに適合するものである。投与用の組成物は、好ましくは、適当な無菌性および安定性を満たして、標準方法に従って製剤化、製造および保存される。
【００３７】
以下の例は本発明の態様をさらに説明するものである。もっとも、それらは本明細書に記載される本発明の教示または開示を限定するものではない。
【００３８】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞または子孫細胞、およびそれに由来する上清または１つもしくは複数の可溶性因子
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、骨髄、血液、歯髄細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靱帯、腱、骨格筋、真皮、および骨膜で見出される細胞であり；典型的には、中胚葉および／または内胚葉および／または外胚葉等の生殖細胞系に分化することができる。従って、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、多数の細胞型、例えば、限定はされないが、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋肉組織、および線維性結合組織に分化可能である。これらの細胞が迎える具体的な細胞系譜の決定および分化経路は、増殖因子、サイトカイン、および／または宿主組織によって構築される局所的な微小環境の条件等の機械的影響および／または内在性生物活性因子からの種々の影響に依存する。従って、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、分裂して、どちらも幹細胞である娘細胞を生じる非造血系前駆細胞であるか、または適切な時期に不可逆的に分化して表現型を持つ細胞（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｅｌｌ）を生じる前駆細胞であることが好ましい。
【００３９】
好ましい実施形態では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、対象、例えば、治療を受ける対象または近縁の（ｒｅｌａｔｅｄ）対象もしくは非近縁の（ｕｎｒｅｌａｔｅｄ）対象（同一種か異種かに関わらない）から得られた試料から富化される。「富化された」、「富化」という用語またはその変化形は、無処置の集団と比較したときに、ある特定の細胞型の割合またはいくつかの特定の細胞型の割合が増加している細胞集団を記述するために本明細書では使用される。
【００４０】
一実施形態では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍまたはＳＴＲＯ−１ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅは中間）細胞と比べて優先的に富化される。
【００４１】
好ましい実施形態では、本発明で用いられる細胞は、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−２＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４６＋、３Ｇ５＋またはそのあらゆる組合せから成る群から、個々に、または集合的に選択される１つまたは複数のマーカーを発現する。
【００４２】
「個々に」とは、本発明が、列挙されたマーカーまたはマーカー群を個別に含むこと、および、個々のマーカーまたはマーカー群が本明細書では個別に記載されてはならないにもかかわらず、添付の特許請求の範囲は、かかるマーカーまたはマーカー群を互いから個別に、且つ可分的に定義してもよいことを意味している。
【００４３】
「集合的に」とは、本発明があらゆる数の、またはあらゆる組合せの列挙されたマーカーまたはペプチド群を含むこと、および、かかるあらゆる数の、またはあらゆる組合せの列挙されたマーカーまたはマーカー群が本明細書では具体的に記載されてはならないにもかかわらず、添付の特許請求の範囲は、かかる組合せまたは部分的な組合せを、マーカーまたはマーカー群の他のあらゆる組合せから個別に、且つ可分的に定義してもよいことを意味している。
【００４４】
好ましくは、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、さらに、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−２＋および／またはＣＤ１４６＋のうちの１つまたは複数である。
【００４５】
所与のマーカーに関して「陽性」であると見なされる細胞は、その用語が蛍光の強度に関連する場合、マーカーが細胞表面上に存在している程度に応じた、低（低（ｌｏ）または弱陽性（ｄｉｍ））レベルもしくは高（強陽性（ｂｒｉｇｈｔ、ｂｒｉ））レベルのマーカー、または細胞の分取過程で使用される他のマーカーのどちらかを発現している場合がある。低（または弱陽性もしくは微陽性）および強陽性の差異は、分取されている特定の細胞集団上の使用されるマーカーとの関連で理解されるだろう。所与のマーカーに関して「陰性」であると見なされる細胞は、必ずしもその細胞に全く存在していないわけではない。この用語は、マーカーが、前記細胞によって相対的に非常に低いレベルで発現されていること、および、検出可能な程度に標識された場合に、マーカーが非常に小さなシグナルを発すること、またはバックグラウンドレベル以上には検出不能であること、を意味する。
【００４６】
「強陽性（ｂｒｉｇｈｔ）」という用語は、本明細書で使用される場合、検出可能な程度に標識された場合に、相対的に大きなシグナルを発する細胞表面上マーカーを指している。理論に制限されることを望むものではないが、「強陽性」細胞は、試料中の他の細胞よりもいっそう多くの標的マーカータンパク質（例えばＳＴＲＯ−１から識別される抗原）を発現すると提唱されている。例えば、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、ＦＩＴＣ結合ＳＴＲＯ−１抗体で標識された場合、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析によって測定される、非強陽性細胞（ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ／ｄｉｍ）よりも大きな蛍光シグナルを発する。好ましくは、「強陽性」細胞は、出発試料中に含まれる最も明るく標識された骨髄単核細胞のうちの少なくとも約０．１％を構成している。他の実施形態では、「強陽性」細胞は、出発試料中に含まれる最も明るく標識された骨髄単核細胞のうちの少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、または少なくとも約２％を構成している。好ましい実施形態では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、「バックグラウンド」、すなわちＳＴＲＯ−１−である細胞と比較して、ＳＴＲＯ−１の細胞表面発現が２対数分（２  ｌｏｇ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）高い。比較した場合、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍおよび／またはＳＴＲＯ−１ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ細胞は、「バックグラウンド」よりも、ＳＴＲＯ−１の細胞表面発現が２対数未満分高く、典型的には、約１対数以下分高い。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「ＴＮＡＰ」という用語は、組織非特異的なアルカリホスファターゼの全てのアイソフォームを包含することが意図されている。例えば、前記用語には、肝アイソフォーム（ＬＡＰ）、骨アイソフォーム（ＢＡＰ）および腎アイソフォーム（ＫＡＰ）が包含される。好ましい実施形態では、ＴＮＡＰはＢＡＰである。特に好ましい実施形態では、ＴＮＡＰは、本明細書で使用される場合、ブダペスト条約の規定に基づきＰＴＡ−７２８２の受託番号で２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるＳＴＲＯ−３抗体と結合することができる分子を指す。
【００４８】
さらに、好ましい実施形態では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞はクローン原性のＣＦＵ−Ｆを生じさせることができる。
【００４９】
かなりの割合の多能性細胞が、少なくとも２種類の異なる生殖細胞系に分化できることが好ましい。多能性細胞が分化決定され得る系譜の例としては、限定はされないが、骨前駆細胞；胆管上皮細胞および肝細胞への多分化能を有する肝細胞前駆細胞；乏突起膠細胞および星状膠細胞へと進行するグリア細胞前駆細胞を生じることができる神経限定細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ）；ニューロンへと進行する神経前駆細胞；心筋および心筋細胞の前駆細胞、グルコース応答性インスリン分泌膵β細胞株が挙げられる。他の系譜としては、限定はされないが、象牙芽細胞、象牙質産生細胞および軟骨細胞、並びに以下の前駆細胞：網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト等の皮膚細胞、樹状細胞、毛包細胞、尿細管上皮細胞、平滑筋細胞および骨格筋細胞、精巣前駆細胞、血管内皮細胞、腱、靱帯、軟骨、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄基質、心筋、平滑筋、骨格筋、周皮細胞、血管細胞、上皮細胞、グリア細胞、神経細胞、星状膠細胞および乏突起膠細胞が挙げられる。
【００５０】
別の実施形態では、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、培養後、造血細胞を生じさせることができない。
【００５１】
一実施形態では、本細胞は治療を受ける対象から採取され、標準的な技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、自己成分または同種異系成分としてその対象に投与するための上清または可溶性因子または増殖した細胞を得るために用いられる。別の実施形態では、樹立されたヒト細胞株のうちの１つまたは複数の細胞が用いられる。本発明の別の有用な実施形態では、非ヒト動物の（または、患者がヒトでない場合は別の種に由来の）細胞が用いられる。
【００５２】
本発明は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫細胞（後者は増殖後細胞（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｃｅｌｌ）とも称される）から得られる、または由来する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養から生成される上清または可溶性因子の使用も企図している。本発明の増殖後細胞は、培養条件（培地中の刺激因子の数および／または種類を含む）、継代数等に応じて、種々様々な表現型を有し得る。ある実施形態では、子孫細胞は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０回の継代後に、親集団から得られる。もっとも、子孫細胞は、任意の回数の継代後に親集団から得ることができる。
【００５３】
子孫細胞は任意の適切な培地中で培養することによって得ることができる。「培地」という用語は、細胞培養に関して使用される場合、細胞周辺の環境の成分を含む。培地は固体、液体、気体または相および物質の混合物であってもよい。培地には、液体の増殖培地、および細胞増殖を維持しない液体培地が含まれる。また、培地には、寒天、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲン基質等のゼラチン質の培地も含まれる。気体培地の例としては、ペトリ皿または他の固体もしくは半固体の担体上で増殖している細胞が曝される気相が挙げられる。また、「培地」という用語は、それが未だ細胞と接触していない場合であっても、細胞培養での使用を目的としている物質を指す。すなわち、細菌培養用に調製された栄養分に富んだ液体が培地である。水または他の液体と混合されたときに細胞培養に適したものとなる粉末状混合物は、「粉末状培地」と称することができる。
【００５４】
一実施形態では、本発明の方法に有用な子孫細胞は、ＳＴＲＯ−３抗体で標識した磁気ビーズを用いて、ＴＮＡＰ＋ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞を骨髄から単離し、その後、その単離細胞を培養増殖することによって得られる（適切な培養条件の例は、Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  ８５：  ９２９−９４０，  １９９５を参照）。
【００５５】
一実施形態では、そのような増殖後細胞（子孫）（好ましくは、少なくとも５回継代後）は、ＴＮＡＰ−、ＣＣ９＋、ＨＬＡクラスＩ＋、ＨＬＡクラスＩＩ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ３−、ＣＤ１１ａ−ｃ−、ＣＤ３１−、ＣＤ８６−、ＣＤ３４−および／またはＣＤ８０−であり得る。しかし、可能性としては、本明細書に記載の条件とは異なる培養条件下では、種々のマーカーの発現は異なる場合がある。また、これらの表現型の細胞は増殖後の細胞集団において優勢であり得るが、一方で、そのことはこの表現型を有さない細胞の割合が小さいことを意味するものではない（例えば、わずかな比率の増殖後細胞はＣＣ９−であり得る）。好ましい一実施形態では、増殖後細胞は異なる細胞型への分化能をまだなお有している。
【００５６】
一実施形態では、上清もしくは可溶性因子、または細胞それ自体を得るために用いられる消費後（ｅｘｐｅｎｄｅｄ）細胞集団が含む細胞は、そのうち少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％がＣＣ９＋である。
【００５７】
別の実施形態では、上清もしくは可溶性因子、または細胞それ自体を得るために用いられる増殖後細胞集団が含む細胞は、そのうち少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％がＳＴＲＯ−１＋である。
【００５８】
さらなる実施形態では、増殖後細胞は、ＬＦＡ−３、ＴＨＹ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、３Ｇ５、ＣＤ４９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、インテグリンβ６−１９、トロンボモジュリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、レプチン−Ｒ（ＳＴＲＯ−２はレプチン−Ｒである）、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよびＣＤ１４６から成る群から集合的に、もしくは個々に選択される１つもしくは複数のマーカー、またはこれらのマーカーのあらゆる組合せを発現し得る。
【００５９】
一実施形態では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞由来の子孫細胞は、Ｓｔｒｏ−１ｄｉｍマーカー陽性である。これらの細胞は、組織特異的分化決定済細胞（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  Ｃｅｌｌ、ＴＳＣＣ）と称され、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞よりも分化により傾倒しているため、誘導因子に応答する能力がより低い。ＴＳＣＣが分化決定され得る系譜の例としては、限定はされないが、胆管上皮細胞および肝細胞への多分化能を有する肝細胞前駆細胞；乏突起膠細胞および星状膠細胞へと進行するグリア細胞の前駆細胞、並びにニューロンへと進行する神経前駆細胞を生じることができる神経限定細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ）；心筋および心筋細胞の前駆細胞、グルコース応答性インスリン分泌膵β細胞株が挙げられる。他の分化決定された前駆細胞には、限定はされないが、軟骨細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞、象牙質産生細胞および軟骨細胞、並びに以下の前駆細胞：網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト等の皮膚細胞、樹状細胞、毛包細胞、尿細管上皮細胞、平滑筋および骨格筋細胞、精巣前駆細胞、血管内皮細胞、腱、靱帯、軟骨、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄基質、破骨細胞並びに造血支持間質（ｈａｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ−ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  ｓｔｒｏｍａ）、心筋、平滑筋、骨格筋、周皮細胞、血管細胞、上皮細胞、グリア細胞、ニューロン細胞、星状膠細胞並びに乏突起膠細胞が含まれる。前駆細胞には、具体的には脂肪組織、疎性結合組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織および線維性結合組織を含む、結合組織へと特異的に誘導されるものが含まれる。
【００６０】
別の実施形態では、子孫細胞は、ＷＯ２００６／０３２０９２で定義および／または記載される、多能性増殖後ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞子孫（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  ＳＴＲＯ−１＋  Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｏｇｅｎｙ）（ＭＥＭＰ）である。子孫が由来し得るＳＴＲＯ−１＋多能性細胞が富化された集団を作製する方法は、ＷＯ０１／０４２６８およびＷＯ２００４／０８５６３０に記載されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの状況では、ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞は完全に純粋な作製物として存在することはまれであり、通常は組織特異的分化決定済み（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞（ＴＳＣＣ）である他の細胞と一緒に存在している。ＷＯ０１／０４２６８は、そのような細胞を骨髄から約０．１％〜９０％の純度レベルで回収することに言及している。子孫が由来するＭＰＣを含む集団は、組織源から直接回収してもよいし、あるいは、ｅｘ  ｖｉｖｏで既に増殖させてある集団であってもよい。
【００６１】
例えば、子孫は、それらが存在する集団の全細胞の少なくとも約０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９５％を含む、収集され、増殖していない、実質的に精製されたＳＴＲＯ−１＋多能性細胞の集団から得てもよい。このレベルは、例えば、ＴＮＡＰ、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ、３Ｇ５＋、ＶＣＡＭ−１、ＴＨＹ−１、ＣＤ１４６およびＳＴＲＯ−２から成る群から個々に、または集合的に選択される少なくとも１つのマーカーが陽性である細胞を選別することによって達成することができる。
【００６２】
ＭＥＭＰＳは、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔマーカーに対し陽性であり、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）マーカーに対し陰性であるという点で、新たに収集されたＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞と区別することができる。対照的に、新たに単離されたＳｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよびＡＬＰの両方に対し陽性である。本方法の好ましい実施形態では、投与される細胞のうち少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％が、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ、ＡＬＰ−の表現型を有する。さらなる好ましい実施形態では、ＭＥＭＰＳはＫｉ６７、ＣＤ４４および／またはＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＶＬＡ−３、α３β１マーカーのうちの１つまたは複数に対し陽性である。さらなる好ましい実施形態では、ＭＥＭＰはＴＥＲＴ活性を示さず、および／または、ＣＤ１８マーカーに対し陰性である。
【００６３】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞出発集団は、あらゆる１つまたは複数の組織型、例えば、骨髄、歯髄細胞、脂肪組織および皮膚由来、あるいは、より広範に、脂肪組織、歯、歯髄、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、膵臓、骨、靱帯、骨髄、腱および骨格筋由来であってもよい。
【００６４】
本方法を実施する際、任意の所与の細胞表面マーカーを保有している細胞の分別は、いくつかの異なる方法によって達成できるが、好ましい方法は、結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を関係するマーカーに結合し、高レベル結合、または低レベル結合または結合なしのいずれかである、結合を示す細胞を分別することに依存することは理解されるだろう。最も都合のよい結合物質は、抗体または抗体ベースの分子であり、好ましくはモノクローナル抗体であるか、またはモノクローナル抗体に基づいており、このことはこれら後者の作用物質の特異性によるものである。抗体は両方のステップに用いることができるが、他の作用物質を用いてもよく、従って、マーカーを保有している細胞、またはマーカーがない細胞を富化するために、これらのマーカーに対するリガンドを使用してもよい。
【００６５】
抗体またはリガンドを固体の担体に付着させることで、粗分別が可能となる
分別技術は、収集される画分の生存能の保持率を最大とすることが好ましい。異なる効率の種々の技術が、比較的粗い分別を行うために使用可能である。使用される具体的な技術は、分別効率、随伴する細胞毒性、実施の容易さおよび速さ、並びに高性能機器および／または技巧の必要性に応じたものとなるだろう。分別の手順には、限定はされないが、抗体被膜磁気ビーズを用いた磁気分別、アフィニティークロマトグラフィーおよび固体の基盤に付着した抗体での「パニング」が含まれ得る。正確な分別を提供する技術としては、限定はされないが、ＦＡＣＳが挙げられる。ＦＡＣＳを実施するための方法は、当業者には明らかであるだろう。
【００６６】
本明細書に記載のマーカーの各々に対する抗体は市販されており（例えば、ＳＴＲＯ−１に対するモノクローナル抗体はＲ＆Ｄシステム社、米国から購入できる）、ＡＴＣＣまたは他の預託機関から入手可能であり、および／または、当該分野で認知されている技術を用いて作製することができる。
【００６７】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞を単離するための方法は、例えば、ＳＴＲＯ−１の高レベル発現を認識する磁気活性化細胞分取（ＭＡＣＳ）を利用する固相分取ステップである第一ステップを含むことが好ましい。その後所望であれば、第二の分取ステップを続けて、より高レベルの前駆細胞発現をもたらすことができる。この第二の分取ステップには、２つ以上のマーカーの使用が含まれ得る。
【００６８】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞を得るための方法には、既知の技術を用いた第一富化ステップの前に、細胞の源を収集することが含まれてもよい。従って、組織が外科的に摘出される。源組織を構成する細胞は、その後分別されて、いわゆる単一細胞浮遊液にされる。この分別は、物理的手段および／または酵素的手段によって達成することができる。
【００６９】
適切なＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞集団を得た後、細胞を任意の適切な手段で培養または増殖させてＭＥＭＰを得ることができる。
【００７０】
一実施形態では、前記細胞は治療を受ける対象から採取され、標準的な技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、その対象に自己または同種異系間の組成物として投与することを目的とした上清または可溶性因子または増殖後細胞を得るために用いられる。別の実施形態では、樹立されたヒト細胞株のうちの１つまたは複数の細胞が、上清または可溶性因子を得るために使用される。本発明の別の有用な実施形態では、非ヒト動物（または、患者がヒトでない場合は別の種に由来）の細胞が、上清または可溶性因子を得るために使用される。
【００７１】
本発明は、あらゆる非ヒト動物種由来の細胞、例えば、限定はされないが、非ヒト霊長類細胞、有蹄動物、イヌ、ネコ、ウサギ、げっ歯類、トリ、および魚の細胞を用いて実施することができる。本発明を実施することができる霊長類細胞としては、限定はされないが、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、および他のあらゆる新世界ザルまたは旧世界ザルの細胞が挙げられる。本発明を実施することができる有蹄動物細胞としては、限定はされないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、水牛およびバイソンの細胞が挙げられる。本発明を実施することができるげっ歯類細胞としては、限定はされないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスターおよびスナネズミの細胞が挙げられる。本発明を実施することができるウサギ種の例としては、家畜化されたウサギ、ノウサギ（ｊａｃｋ  ｒａｂｂｉｔ，  ｈａｒｅ）、ワタオウサギ、カンジキウサギ、およびナキウサギが挙げられる。ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）は、本発明を実施することができるトリ種の一例である。
【００７２】
本発明の方法に有用な細胞は、使用前、または上清もしくは可溶性因子を得る前に、保存することができる。真核細胞、具体的には哺乳類細胞を保存および保管するための方法およびプロトコールは、当該技術分野において周知である（例えば、Ｐｏｌｌａｒｄ，  Ｊ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｊ．  Ｍ．  （１９９７）  Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．；  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．  Ｉ．  （２０００）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  Ｎ．Ｊ．を参照）。
【００７３】
遺伝子改変細胞
一実施形態では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫細胞は、遺伝子改変されて、例えば、関心のタンパク質、例えば、治療効果および／または予防効果を与えるタンパク質、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、膵リパーゼもしくは膵アミラーゼ、または促進された血管新生に関連するもしくはその原因となるポリペプチド、または細胞の膵細胞もしくは血管細胞への分化に関連するポリペプチドを発現および／または分泌する。
【００７４】
細胞を遺伝子改変する方法は、当業者には明らかであるだろう。例えば、細胞で発現されるべき核酸は、細胞での発現を誘導するためのプロモーターと機能的に連結される。例えば、核酸は、例えば、ウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）またはＳＶ−４０プロモーター等の、対象の種々の細胞中で機能できるプロモーターに連結される。さらなる適切なプロモーターは当該技術分野において周知であり、本発明の実施形態に準用すると解されるものとする。
【００７５】
好ましくは、核酸は発現コンストラクトの形態で提供される。本明細書で使用される場合、「発現コンストラクト」という用語は、細胞中で機能的に連結された核酸（例えば、レポーター遺伝子および／または対抗選択可能な（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）レポーター遺伝子）を発現させる能力を有する核酸を指す。本発明の枠組みにおいては、発現コンストラクトは、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスのサブゲノム断片もしくはゲノム断片、または異種ＤＮＡを発現可能な形態で維持および／または複製できる他の核酸を含むか、またはそれら自身であってもよいことは理解されるべきである。
【００７６】
本発明を実施するための適切な発現コンストラクトを構築するための方法は、当業者には明らかであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ  （Ｉｎ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ＩＳＢＮ  ０４７  １５０３３８，  １９８７）  またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ  （Ｉｎ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００１）に記載されている。例えば、発現コンストラクトの各成分は、例えばＰＣＲを用いて適切な鋳型核酸から増幅され、その後、例えばプラスミドまたはファージミド等の適切な発現コンストラクト中にクローニングされる。
【００７７】
そのような発現コンストラクトに適切なベクターは、当該技術分野において周知であり、および／または、本明細書に記載されている。例えば、哺乳類細胞における、本発明の方法に適切な発現ベクターは、例えば、インビトロジェン社より提供されるｐｃＤＮＡベクター一式のベクター、ｐＣＩベクター一式（プロメガ社）のベクター、ｐＣＭＶベクター一式（クロンテック社）のベクター、ｐＭベクター（クロンテック社）、ｐＳＩベクター（プロメガ社）、ＶＰ１６ベクター（クロンテック社）またはｐｃＤＮＡベクター一式（インビトロジェン社）のベクターである。
【００７８】
当業者は、さらなるベクター、および例えば、インビトロジェン社、クロンテック社またはプロメガ社等の、そのようなベクターの供給源は承知しているだろう。
【００７９】
単離された核酸分子またはそれを含む遺伝子コンストラクトを発現のために細胞に導入する手段は、当業者に周知である。所与の生物体に用いられる技術は、既知の優れた技術に依存する。組換えＤＮＡを細胞に導入するための手段としては、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによって媒介されるトランスフェクション、例えばリポフェクタミン（ギブコ社、米国メリーランド州）および／またはセルフェクチン（ギブコ社、米国メリーランド州）による、リポソームによって媒介されるトランスフェクション、ＰＥＧによって媒介されるＤＮＡの取り込み、エレクトロポレーション、並びに、例えばＤＮＡを被膜したタングステンまたは金粒子（アグラセタス社（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ  Ｉｎｃ．）、米国ウィスコンシン州）による微小粒子照射（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）が特に挙げられる。
【００８０】
あるいは、本発明の発現コンストラクトはウイルスベクターである。適切なウイルスベクターは当該技術分野において周知であり、市販されている。核酸の運搬および宿主細胞ゲノムへの核酸の組み込みを目的とした従来のウイルスベースの系としては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。あるいは、アデノウイルスベクターが、エピソームのままの核酸を宿主細胞に導入するのに有用である。ウイルスベクターは、標的細胞および標的組織における遺伝子導入の、効率的で且つ用途の広い方法である。さらに、高い導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織で確認されている。
【００８１】
例えば、レトロウイルスベクターは、通常、最大６〜１０ｋｂの外来配列パッケージング容量を有する、シス作動性長末端反復配列（ＬＴＲ）を含む。最小のシス作動性ＬＴＲであってもベクターの複製およびパッケージングには十分であり、その後、発現コンストラクトを標的細胞に組み込むのに使用され、長期発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳｒＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびその組合せをベースとするものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ５６：２７３１−２７３９  （１９９２）；  Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：１６３５−１６４０  （１９９２）；  Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：５８−５９  （１９９０）；  Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３：２７４−２３１８  （１９８９）；  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：２２２０−２２２４  （１９９１）；  ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００；  Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｍａｎ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０，  １９８９；  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｄ．  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：５−１４，  １９９０；  Ｓｃａｒｐａ  ｅｔ  ａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５：８４９−８５２，  １９９１；  Ｂｕｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７，  １９９３を参照）。
【００８２】
また、様々なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系が核酸運搬用に開発されている。ＡＡＶベクターは、当該技術分野において周知の技術を用いて容易に構築することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開第ＷＯ９２／０１０７０号および同第ＷＯ９３／０３７６９号；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：３９８８−３９９６，  １９８８；  Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５３３−５３９，  １９９２；  Ｍｕｚｙｃｚｋａ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：９７−１２９，  １９９２；  Ｋｏｔｉｎ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１，  １９９４；  Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１６５−１６９，  １９９４；  並びにＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７９：１８６７−１８７５，  １９９４を参照されたい。
【００８３】
本発明の発現コンストラクトを運搬するのに有用なさらなるウイルスベクターとしては、例えば、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルス等の痘ファミリー（ｐｏｘ  ｆａｍｉｌｙ）のウイルス由来のもの、またはアルファウイルス属または複合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）ウイルスベクター（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ５６：３１７−３２１，  １９８９に記載のもの）が挙げられる。
【００８４】
細胞および可溶性因子の治療／予防における有用性試験
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞由来の可溶性因子の、ＧｖＨＤの発生または進行を治療または阻止または遅延する能力を測定する方法は、当業者には明らかであるだろう。
【００８５】
例えば、可溶性因子の免疫抑制活性を測定するための適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、本明細書の実施例５に記載されている。
【００８６】
別の例では、可溶性因子の有効性は、本明細書の実施例６および実施例７に記載されるように、ＧｖＨＤのｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて評価することができる。
【００８７】
上記のことから当業者には明らかであるが、本開示はまた、ＧｖＨＤを治療、阻止または遅延するための可溶性因子を同定または単離するための方法を提供し、方法には、
（ｉ）  ＧｖＨＤを患っている試験対象に可溶性因子を投与すること、およびその対象におけるＧｖＨＤの進行を評価すること；
（ｉｉ）  （ｉ）の対象におけるＧｖＨＤレベルを、可溶性因子を投与されていないＧｖＨＤを患っている対照となる対象におけるＧｖＨＤレベルと比較すること、を含み、
ここで、対照となる対象と比較して試験対象のＧｖＨＤが減少していることは、可溶性因子がＧｖＨＤを治療、防止または遅延させたことを示唆する。
【００８８】
細胞性組成物
一実施形態では、本発明のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫細胞は、組成物の形態で投与される。好ましくは、かかる組成物は薬剤的に許容できる担体および／または賦形剤を含む。
【００８９】
「担体」および「賦形剤」という用語は、貯蔵、投与、および／または活性化合物の生物活性を促進するために当該技術分野において従来的に用いられる組成物を指す（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （１９８０）を参照）。担体は活性化合物のあらゆる望ましくない副作用を減らすこともできる。適切な担体は、例えば、安定であり、例えば、担体中の他の成分と反応できない。一例では、担体は、治療に使用された投与量および濃度において、重大な局所的または全身的な有害作用をレシピエントにもたらさない。
【００９０】
本発明のための適切な担体には、従来的に使用されるものが含まれ、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、ラクトース、リンゲル液、緩衝液、ヒアルロナンおよびグリコールは、特に（等張である場合）水剤用に、好ましい液体担体である。適切な医薬担体および賦形剤としては、デンプン、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。
【００９１】
別の例では、担体は、例えば、その中で細胞が生育または懸濁される、培地組成物である。好ましくは、かかる培地組成物は、それを投与された対象においていかなる有害作用も誘導しない。
【００９２】
好ましい担体および賦形剤は、細胞の生存能および／または膵機能障害を減少、防止または遅延させる細胞の能力に悪影響を及ぼさない。
【００９３】
一例では、担体または賦形剤によって緩衝作用（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）がもたらされ、それにより細胞および／または可溶性因子が適切なｐＨに維持されることで生物活性が発現される。例えば、前記担体または賦形剤はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。ＰＢＳは、魅力的な担体または賦形剤であるが、その理由は、血流中または組織もしくは組織の周辺もしくは隣接領域中への、例えば、注射による直接的な適用を目的として、本発明の組成物が液体として製造されるような場合に、ＰＢＳが細胞および因子と最小限にしか相互作用せず、細胞および因子の迅速な放出を可能とするためである。
【００９４】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫細胞は、レシピエント適合性であり、レシピエントに対し有害ではない産物に分解される足場に組み込む、または埋め込むこともできる。これらの足場によって、レシピエントである対象に移植されるべき細胞に、支持および保護がもたらされる。天然および／または合成の生分解性足場は、そのような足場の例である。
【００９５】
種々の異なる足場が、本発明の実施において成功裏に使用され得る。好ましい足場としては、限定はされないが、生物的で、分解可能な足場が挙げられる。天然の生分解性足場としては、コラーゲン、フィブロネクチン、およびラミニン足場が挙げられる。細胞移植の足場のための適切な合成材料は、広範な細胞成長および細胞機能を支持可能なものであるべきである。そのような足場は再吸収可能なものであってもよい。適切な足場としては、例えば、Ｖａｃａｎｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｐｅｄ．  Ｓｕｒｇ．  ２３：３−９  １９８８；  Ｃｉｍａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ３８：１４５  １９９１；  Ｖａｃａｎｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｓｔ．  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．  Ｓｕｒｇ．  ８８：７５３−９  １９９１に記載されるような、ポリグリコール酸の足場；またはポリ酸無水物、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の合成高分子が挙げられる。
【００９６】
別の例では、本細胞はゲル状足場（アップジョン社のゼルフォーム等）に投与され得る。
【００９７】
本発明に有用な本細胞性組成物は、単独で、または他の細胞との混合物として投与されてもよい。本発明の組成物と併せて投与され得る細胞としては、限定はされないが、他の多分化能もしくは多能性を有する細胞もしくは幹細胞、または骨髄細胞が挙げられる。異なる型の細胞は、本発明の組成物と、投与の直前または少し前に混合することができ、あるいは、それらを投与前にある一定期間一緒に共培養してもよい。
【００９８】
好ましくは、本組成物は、有効量または治療的もしくは予防的に有効量の細胞を含む。例えば、本組成物は、約１×１０５ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞／ｋｇ〜約１×１０７ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞／ｋｇまたは約１×１０６ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞／ｋｇ〜約５×１０６ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞／ｋｇを含む。投与されるべき細胞の正確な量は、種々の因子、例えば、患者の年齢、体重、および性別、並びに膵機能障害の範囲および重症度に応じて決定される。
【００９９】
一部の実施形態では、細胞は、細胞が対象の血行路に出て行くことを拒むが、細胞から分泌された因子が血行路に進入することは許すチャンバー内に含まれる。このように、本細胞が対象の血行路に因子を分泌することを可能とさせることにより、可溶性因子は対象に投与され得る。そのようなチャンバーは、対象におけるある部位に均等に埋め込むことで可溶性因子の局所レベルを増加させることができ、例えば、移植臓器の中または近くに埋め込まれる。
【０１００】
本発明の一部の実施形態では、細胞性組成物を用いた治療の開始前に患者を免疫抑制することは、必ずしも必要であったり、望まれるわけではない。従って、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞またはその子孫の、同種異系間、さらには異種間での移植であっても、場合によっては許容されることがある。
【０１０１】
しかし、他の場合においては、細胞治療開始前に、患者を薬理学的に免疫抑制することが望ましいか、または適切であり得る。これは、全身的または局所的な免疫抑制剤の使用によって達成することができ、あるいは封入デバイスにて本細胞を送達することによって達成することもできる。本細胞は、細胞および治療因子に必要とされる栄養分および酸素を透過させるが、免疫液性因子および細胞は透過させないカプセルに封入してもよい。好ましくは、カプセルの材料は、アレルギーを起こしにくいもので、標的組織内に容易に且つ安定して位置し、移植された構造体に保護を与える。移植細胞に対する免疫応答を低減または除去するためのこれらおよび他の手段は、当該技術分野において周知である。代わりに、本細胞を、それらの免疫原性を低減させるために、遺伝的に改変してもよい。
【０１０２】
可溶性因子の組成物
本発明の一実施形態では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞由来の、および／または子孫細胞由来の上清または可溶性因子は、例えば、適切な担体および／または賦形剤を含む組成物の形態で、投与される。好ましくは、担体または賦形剤は可溶性因子または上清の生物学的効果に悪影響を及ぼさない。
【０１０３】
一実施形態では、本組成物は、可溶性因子または上清の成分、例えば、プロテアーゼ阻害剤を安定化させるための組成物を含む。好ましくは、プロテアーゼ阻害剤は、対象に対し有害作用を有するのに十分な量では含まれない。
【０１０４】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞由来の、および／または子孫細胞由来の上清または可溶性因子を含む組成物は、例えば、培地中で、または安定な担体もしくは緩衝溶液、例えば、リン酸緩衝食塩水中で、適切な液体懸濁液として調製してもよい。適切な担体は本明細書の上記の通りである。別の例では、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞由来の、および／または子孫細胞由来の上清または可溶性因子を含む懸濁液は、注射用の油状懸濁液である。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油等の脂肪油；またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル；またはリポソームが挙げられる。注射用に使用されるべき懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン等の、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。所望により懸濁液は、化合物の溶解性を増加させ、高濃度での溶液の調製を可能とさせる、適切な安定剤または作用物質を含んでもよい。
【０１０５】
無菌の注射溶液は、必要とされる量の上清または可溶性因子を、上記成分のうちの１つまたは組合せと一緒に、適切な溶媒に組み入れ、必要に応じて、その後フィルター滅菌を行うことによって、調製できる。
【０１０６】
通常、分散液は、上清または可溶性因子を、基本（ｂａｓｉｃ）分散媒および上に列挙されたものから必要な他の成分を含有する無菌のビヒクルに組み入れることによって調製される。無菌注射剤調製用の無菌散剤の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それによって、活性成分およびその予め細菌濾過した溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。本発明の別の態様によれば、上清または可溶性因子は、その溶解性を増強する１つまたは複数のさらなる化合物と共に製剤化され得る。
【０１０７】
担体または賦形剤の他の例は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ．；  Ｇｅｎｎａｒｏ  （２０００）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ．；  Ａｖｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  （１９９３）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ；  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  （１９９０）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｔａｂｌｅｔｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ；  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  （１９９０）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ；  Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ  （２０００）  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ．に記載されている。
【０１０８】
治療組成物は、通常、製造および貯蔵の条件下では無菌且つ安定であるべきである。本組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または他の規則構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、および適切なその混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチン等の被膜の使用によって、分散の場合に必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、本組成物中に等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール等、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいだろう。注射用組成物の持続的吸収は、本組成物中に、吸収を遅らせる作用物質、例えば、一ステアリン酸塩およびゼラチンを含むことによってもたらされ得る。さらに、可溶性因子を、徐放性製剤、例えば徐放性ポリマーを含む組成物中に、投与してもよい。例えば、移植片およびマイクロカプセル化した送達系を含む徐放性製剤等、活性化合物は化合物を急速な放出から保護する担体と一緒に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）等の、生分解性、生体適合性の高分子を使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法が、特許をとられているか、または当業者に一般的に知られている。
【０１０９】
上清または可溶性因子は、例えば、可溶性因子を除放させるために、適切な基質と併せて投与してもよい。
【０１１０】
投与様式
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞またはその子孫は、外科的に移植、注射、送達（例えば、カテーテルまたは注射器を手段として）されてもよいし、あるいは、修復または増強を必要としている部位、例えば臓器に、または対象の血液系に直接的または間接的に投与されてもよい。
【０１１１】
好ましくは、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞またはその子孫は、対象の血流に送達される。例えば、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞またはその子孫は非経口的に送達される。非経口投与の経路の例としては、限定はされないが、静脈内、筋肉内、皮下、動脈内、腹腔内、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ，  ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、くも膜下腔内が挙げられる。好ましくは、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞またはその子孫は、動脈内、大動脈中、心臓の心房もしくは心室中、または膵臓に連結した血管、例えば、腹大動脈、上腸間膜動脈、膵十二指腸動脈または脾動脈中に送達される。
【０１１２】
心臓の心房または心室への細胞送達の場合、肺への急速な細胞送達によって生じ得る合併症を避けるため、細胞は左心房または左心室に投与されることが好ましい。
【０１１３】
好ましくは、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞またはその子孫は、例えば、注射器を用いて、またはカテーテルもしくは中心静脈カテーテル（ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｉｎｅ）を通じて、送達部位に注入される。
【０１１４】
治療製剤の投与計画の選択は、いくつかの因子、例えば、血清または組織での実体（ｅｎｔｉｔｙ）の代謝回転速度、症状レベル、および実体（ｅｎｔｉｔｙ）の免疫原性に依存する。投与計画は、許容できる副作用レベルを一貫させて、患者に送達される治療化合物の量を最大とすることが望ましい。従って、送達される製剤の量は、特定の実体（ｅｎｔｉｔｙ）および治療されている状態の重症度に部分的に依存する。
【０１１５】
一実施形態では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞またはその子孫は、単回急速投与量として送達される。あるいは、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞またはその子孫は、持続点滴によって、または、例えば、１日、１週間の間隔の、もしくは週に１〜７回の投与によって、投与される。好ましい投与プロトコールは、重大な望ましくない副作用を回避する、最大の投与量または投与頻度を含むものである。週当たりの合計投与量は、使用される化合物のタイプおよび活性に応じて決定される。適切な投与量の決定は、臨床医によって、例えば、当該技術分野において、治療に影響を与えると知られている、もしくは疑われている、または治療に影響を与えると予想されるパラメーターまたは因子を用いて、行われる。通常、投与はやや適量未満の量から開始され、その後、あらゆる負の副作用と比較して所望の、または最適の効果が達成されるまで、小さな増加量で増加される。重要な診断法には、糖尿病の症状の診断法が含まれる。
【実施例】
【０１１６】
実施例１：ＭＳＣ調製
ＭＳＣを、ＵＳ５，８３７，５３９に記載の通りに、骨髄から新規に生成する。およそ８０〜１００ｍｌの髄を無菌のヘパリン含有注射器内に吸引させ、ＭＳＣ生成のためＭＤＡＣＣ細胞治療研究所（ＭＤＡＣＣ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に搬送した。骨髄単核細胞をフィコール‐ハイパークを用いて単離し、ゲンタマイシン、グルタミン（２ｍＭ）および２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ハイクローン社（Ｈｙｃｌｏｎｅ））を含有するα改変ＭＥＭ（αＭＥＭ）を含む、フラスコ当たり５０ｍｌのＭＳＣ増殖培地と共に、２本のＴ１７５フラスコ内に入れた。
【０１１７】
前記細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２〜３日間培養し、その時点で非接着細胞を除去した；残った接着細胞を細胞コンフルエンスが７０％以上に達するまで続けて培養し（７〜１０日間）、その後細胞をトリプシン処理し、ＭＳＣ増殖培地（フラスコ当たり５０ｍｌの培地）と共に６本のＴ１７５フラスコに移した。ＵＳ５，８３７，５３９の表５に記載のように、このように単離して増殖させたＭＳＣはＳＴＲＯ−１陰性である。
【０１１８】
実施例２：ＳＴＲＯ−３＋細胞の選択によるＭＰＣの免疫選択
骨髄（ＢＭ）を、ロイヤルアデレード病院（Ｒｏｙａｌ  Ａｄｅｌａｉｄｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の施設倫理委員会により承認された方法に従って、健康な正常成人の志願者（２０〜３５歳）から採取する。簡潔には、４０ｍｌのＢＭを、後腸骨稜から、リチウム−ヘパリン抗凝固剤含有チューブに吸引する。
【０１１９】
ＢＭＭＮＣを、前述（Ｚａｎｎｅｔｔｉｎｏ，  Ａ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｂｌｏｏｄ  ９２：  ２６１３−２６２８）の通りに、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ニコメッドファーマ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ）、ノルウェイ、オスロ）を用いて、密度勾配分別によって調製する。４００×ｇ、４℃、３０分間の遠心分離後、淡黄色の層をホールピペットで除去し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ＣＳＬリミテッド社（ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、オーストラリア、ヴィクトリア）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲイサーズバーグ）から成る「ＨＨＦ」中で３回洗浄する。
【０１２０】
続いて、ＳＴＲＯ−３＋（またはＴＮＡＰ＋）細胞を、前述（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１６：  １８２７−１８３５；  Ｇｒｏｎｔｈｏｓ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｓｉｍｍｏｎｓ，  Ｐ．Ｊ．  （１９９５）  Ｂｌｏｏｄ  ８５：  ９２９−９４０）の通りに、磁気活性化細胞分取で単離した。簡潔には、およそ１〜３×１０８個のＢＭＭＮＣを、ＨＨＦ中１０％（ｖ／ｖ）正常ウサギ血清から成るブロッキング緩衝液中で、２０分間、氷上でインキュベートする。細胞を、ブロッキング緩衝液中１０μｇ／ｍｌのＳＴＲＯ−３ｍＡｂ溶液２００μｌと一緒に、氷上で１時間インキュベートする。続いて、細胞を４００×ｇでの遠心分離によってＨＨＦ中で２回洗浄する。ＨＨＦ緩衝液中１／５０希釈のヤギ抗マウスγ−ビオチン（サザンバイオテクノロジー社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）、英国バーミンガム）を加え、細胞を氷上で１時間インキュベートする。細胞を、上記と同様に、ＭＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを補充したＣａ２＋およびＭｎ２＋を含まないＰＢＳ）中で２回洗浄し、最終体積０．９ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁する。
【０１２１】
１００μｌのストレプトアビジンミクロビーズ（ミルテニーバイオテック社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）；ドイツ、ベルギッシュグラートバハ）を細胞懸濁液に添加し、氷上で１５分間インキュベートする。細胞懸濁液を２回洗浄し、０．５ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した後、ミニＭＡＣＳカラム（ＭＳ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ミルテニーバイオテック社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ））上に充填し、０．５ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で３回洗浄して、ＳＴＲＯ−３ｍＡｂ（２００５年１２月１９日にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）にＰＴＡ−７２８２の受託番号で寄託；国際公開第ＷＯ２００６／１０８２２９号を参照）と結合しなかった細胞を回収する。さらに１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液を加えた後、カラムを磁石から取り除き、ＴＮＡＰ＋細胞を陽圧で単離する。各画分からの細胞の一定分量をストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色し、純度をフローサイトメトリーで評価することができる。
【０１２２】
実施例３：ＳＴＲＯ−３ｍＡｂによって選択された細胞はＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞である。
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞を単離するための単一試薬として、ＳＴＲＯ−３ｍＡｂを用いることの可能性を確認することを目的とする実験を設計した。
【０１２３】
ＳＴＲＯ−３（ＩｇＧ１）はＳＴＲＯ−１（ＩｇＭ）とは異なるアイソタイプであることを考慮し、ＳＴＲＯ−３のクローン原性ＣＦＵ−Ｆを同定する能力を、ＭＡＣＳ方法を用いて単離されたＳＴＲＯ−１＋細胞とのその共発現に基づく２色ＦＡＣＳ分析によって評価した（図１）。ドットプロットヒストグラムは、リストモードデータとして収集された５×１０４個の事象を表わしている。垂直線および水平線は、同条件下で処理したアイソタイプ対応対照抗体、１Ｂ５（ＩｇＧ）および１Ａ６．１２（ＩｇＭ）で得られた平均蛍光の１．０％未満の反応性レベルに設定された。結果は、ＳＴＲＯ−１強陽性細胞のうち微量の集団がＴＮＡＰを共発現したが（右上象限）、残りのＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＴＲＯ−３ｍＡｂと反応しなかったことを示している。その後、４つの象限全てからＦＡＣＳで単離された細胞をＣＦＵ−Ｆの発生率に対して評価した（表１）。
【０１２４】
表１：細胞表面マーカーであるＳＴＲＯ−１およびＴＮＡＰの共発現に基づく２重染色ＦＡＣＳ分析によるヒト骨髄細胞の富化（図１参照）。ＦＡＣＳで分取した細胞を、２０％ＦＣＳを補充したαＭＥＭ中で、標準的なクローン原性条件下で培養した。データは、播種された１０５個細胞当たりの１４日目のコロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｆ）の平均数±ＳＥ（ｎは３つの異なる骨髄穿刺液）を表わしている。これらのデータは、ヒトＭＰＣがＳＴＲＯ−１抗原を明るく共発現するＢＭのＴＮＡＰ陽性画分だけに限定されていることを示している。
【０１２５】
【表１】
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【０１２６】
実施例４：Ｓｔｒｏ−１ｄｕｌｌ細胞およびＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞の相対的な遺伝子および細胞表面タンパク質の発現
最初の一連の実験では、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて、蛍光標識細胞分取により単離されたＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌまたはＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ集団によって発現される種々の系譜関連遺伝子の遺伝子発現プロファイルを調べた（図２Ａ）。第二の一連の実験では、フローサイトメトリーおよび平均チャネル蛍光分析を用いて、蛍光標識細胞分取によって単離されたＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌまたはＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ集団により発現される、種々の系譜関連タンパク質のうちの細胞表面タンパク質の発現プロファイルを調べた。
【０１２７】
全細胞内ＲＮＡを、２×１０６個のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔまたはＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ分取一次細胞、軟骨細胞ペレットおよび他の誘導された培養液のいずれかから調製し、ＲＮＡｚｏｌＢ抽出法（バイオテックスラボラトリーズ社（Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）、テキサス州ヒューストン）を用い、製造元の推奨に従って、溶解した。その後、ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（ファルマシアバイオテック社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、スウェーデン、ウプサラ）を用いて調製された、各亜集団から単離されたＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成の鋳型として使用した。種々の転写物の発現を、前述（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎ．  Ｒｅｓ．  １４：４８−５７，  １９９９）の通りに、標準的なプロトコールを用いてＰＣＲ増幅によって評価した。本研究で用いられたプライマーセットを表２に示す。増幅後、各反応混合物を１．５％アガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。ＲＮＡ完全性をＧＡＰＤＨの発現によって評価した。
【０１２８】
各細胞マーカーについての相対的な遺伝子発現を、ＩｍａｇｅＱａｎｔソフトウェアを用い、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現を基準にして評価した（図２Ｂ、Ｃ）。さらに、２色フローサイトメトリー分析を用い、ＳＴＲＯ−１抗体と組み合わせて、広範の細胞系譜関連マーカーの発現に基づくｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＭＰＣのタンパク質発現プロファイルを調べた。ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌおよびＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ培養細胞の、遺伝子およびタンパク質発現に基づく一般的な表現型の概要を表３に示す。データは、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＭＰＣが、アンジオポエチン−１、ＶＣＡＭ−１、ＳＤＦ−１、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、およびＲＡＮＫＬを含む血管周囲細胞に関連するマーカーの、特異的なより高い発現を示すことを表わしている。ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌおよびＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ培養細胞のタンパク質および遺伝子発現プロファイルの比較を、表３および表４に要約する。
【０１２９】
また、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞によって唯一発現される遺伝子を同定するために、サブトラクティブハイブリダイゼーション研究を行った。簡潔には、ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌおよびＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔを、上記の通りに単離した（図３Ａ参照）。全ＲＮＡを、ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０系（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ）を用いて５つの異なる髄試料からプールしたＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌおよびＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞から調製した。ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡ合成キット（クロンテック社）を用いてファーストストランド合成を行った。製造元の仕様書に従って、最初の室温プロセス中に形成される３’および５’プライマー末端の特異的なプライマー部位を用いる長距離ＰＣＲ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲキット；クロンテック社）によって、得られたｍＲＮＡ／一本鎖ｃＤＮＡハイブリッドを増幅した。ＳＴＲＯ−１強陽性ｃＤＮＡのＲｓａＩ消化後、２つの分割量（ａｌｉｑｕｏｔ）を使用して、クロンテック社製ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡサブトラクションキットを用いて、異なる特異的なアダプターオリゴヌクレオチドを連結した。製造元のプロトコールに従って、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ（テスター）およびＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ（ドライバー）ｃＤＮＡを用いて、逆の場合も同様に、２回のサブトラクティブハイブリダイゼーションを行った。また、この方法を逆に、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔドライバーｃＤＮＡに対してハイブリダイズしたＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌテスターｃＤＮＡを用いて行った。
【０１３０】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ集団によって唯一発現される遺伝子を同定するため、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ−サブトラクテッドｃＤＮＡを用いて、Ｔ／Ａクローニングベクターに連結されたＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔサブトラクテッドｃＤＮＡで形質転換された２００の無作為に選択された細菌クローンを含む、複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）低密度マイクロアレイフィルターを構築した。続いて、マイクロアレイを［３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識したＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔまたはＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌサブトラクテッドｃＤＮＡで精査した（図３Ｂ−Ｃ）。ディファレンシャルスクリーニングによって、ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌおよびＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ亜集団の間で高度に特異的に発現される合計４４のクローンが同定された。特異的に発現されるクローン全てのＤＮＡ塩基配列決定によって、１つのクローンのみが既知の間質細胞マイトジェンで代表的なもの；すなわち、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）であることが明らかにされた（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ａｎｄ  Ｓｉｍｍｏｎｓ，  Ｂｌｏｏｄ．  ８５：  ９２９−９４０，  １９９５）。興味深いことに、４４のクローンのうち６つが、ケモカインである間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）に対応しているＤＮＡ挿入断片を含むことが発見された。ヒトＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞中の多量のＳＤＦ−１転写物を、新しく分取したＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ、ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ、およびＳＴＲＯ−１ｎｅｇａｔｉｖｅ（ｎｅｇａｔｉｖｅは陰性）骨髄亜集団から調製した全ＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲで確認した（図３Ｄおよび表３）。
【０１３１】
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１３２】
表３．
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよびＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ集団における相対遺伝子発現の概要。逆転写ＰＣＲによって測定されたＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよびＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ集団の間で測定可能且つ特異的な発現を示す遺伝子のリストを示す。数値は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを基準にした相対的な遺伝子発現量を表わしている。
【０１３３】
【表３】
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【０１３４】
タンパク質細胞表面発現とＳＴＲＯ−１発現の密度を関連させるため、ｅｘ  ｖｉｖｏ増殖後細胞由来の骨髄ＭＰＣの単個細胞浮遊液をトリプシン／ＥＤＴＡ剥離によって調製し、続いて広範な細胞系譜関連マーカーを同定する抗体と組み合わせて、ＳＴＲＯ−１抗体と一緒にインキュベートした。ＳＴＲＯ−１をヤギ抗マウスＩｇＭ−フルオレセインイソチオシアネートを用いて同定し、一方で他の全てのマーカーはヤギ抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ−フィコエリトリンのいずれかを用いて同定した。細胞内抗原を同定するこれらの抗体について、細胞調製物を最初にＳＴＲＯ−１抗体で標識し、冷７０％エタノールで固定して細胞膜を透過性にし、その後、細胞内抗原に特異的な抗体と一緒にインキュベートした。アイソタイプ一致の対照抗体を同一の条件下で使用した。ＣＯＵＬＴＥＲ  ＥＰＩＣＳフローサイトメーターおよび収集されたリストモードのデータを用いて、２色フローサイトメトリー分析を行った。ドットプロットは、各系譜の細胞マーカー（ｙ軸）およびＳＴＲＯ−１（ｘ軸）の蛍光強度レベルを示している５，０００個のリストモードの事象を表わしている。垂直および水平の象限は、アイソタイプ一致の負の対照抗体を基準にして確立した。
【０１３５】
表４．
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよびＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ集団における相対的なタンパク質発現の概要
フローサイトメトリーで測定された、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよびＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ集団の間で特異的な発現を示したタンパク質のリストを示す。数値は染色の相対的な平均蛍光強度を表わしている。
【０１３６】
【表４】
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【０１３７】
これらの結果は、ＳＤＦ−１αおよびＲＡＮＫＬがＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞によって高発現されることを示している。これら両方のタンパク質は、ＧＶＨＤ等の免疫不全に対する保護を与えるＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の増加に関わることが知られているため、このことは重要である（Ｌｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２：１３７２−１３７９，  ２００６；  Ｈｅｓｓ，  Ｂｉｏｌ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  １２  （１  Ｓｕｐｐｌ  ２）：１３−２１，  ２００６；  ａｎｄ  Ｍｅｉｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０５：２６４３−２６５５，  ２００８）。
【０１３８】
実施例５．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫抑制活性
培養増殖されたＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞（ＭＰＣ（Ｂ））の免疫抑制活性を評価するため、読み取り（ｒｅａｄ−ｏｕｔ）として、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を用いた。結果を、実施例１の通りに単離した、培養増殖された、骨髄由来ＳＴＲＯ−１陰性細胞（ＭＳＣ（Ａ））の集団と比較した。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、４つの上昇する濃度のＭＳＣおよびＭＰＣ調製物の存在下で、ＣＤ３／ＣＤ２８被膜ビーズで刺激した。Ｔ細胞の増殖を３Ｈ−Ｔｄｒ取り込みによって測定した。
【０１３９】
ＭＳＣ（Ａ）およびＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＭＰＣ（Ｂ）を、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＣＤ３／ＣＤ２８刺激に対する応答を抑制するそれらの能力について試験した。ＭＳＣおよびＭＰＣまたは市販品の対照ヒトＭＳＣ（ロンザ社（Ｌｏｎｚａ））を、ＰＢＭＣの培養液に異なる比率で加えた。３日後、３Ｈ−Ｔｄｒを１８時間加え、培養液を回収した。
【０１４０】
ＣＤ３／ＣＤ２８に応答してのＰＢＭＣ増殖は全ての調製物によって用量依存的に阻害された。しかし、調製物Ｂは調製物Ａおよび対照ｈＭＳＣによって生じた効果よりも明らかに優れていた（図４）。ＭＳＣ：ＰＢＭＣ比が１：１００のとき、ＭＰＣ  Ｂは７０％の対照Ｔ細胞増殖をなお阻害したが、一方で対照の市販品ＭＳＣ（ロンザ社）およびＭＳＣ  Ａは、それぞれ５０％および６０％の阻害を生じた（図５）。
【０１４１】
実施例６：ＧｖＨＤの誘導および治療
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞（ＭＰＣ（Ｂ））のｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫抑制活性を、複数の非主要組織適合抗原遺伝子座にミスマッチを起こしているドナーレシピエント対に基づく移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のモデルを用いて調べた。Ｂ１０．Ｄ２（Ｈ２ｄ）ドナー由来の、Ｔ細胞を除去した骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）（５×１０６）および脾細胞（３０×１０６）を、致死的な放射線（７５０ｃＧｙ）を与えたＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）レシピエントマウスに静脈注射した。この状況では、Ｂ１０．Ｄ２由来の脾臓リンパ細胞はＢＡＬＢ／ｃレシピエント組織を認識および攻撃し、体重減少、線維症および脱毛をもたらす。前記疾患を、移植から４〜５週間目から、動物の体重を量り、皮膚症状を評価することによる従来の採点法を用いてモニターした。比較として、実施例１と同様に単離した骨髄由来ＳＴＲＯ−１陰性細胞（ＭＳＣ（Ａ））の免疫抑制活性を評価した。
【０１４２】
陽性対照群のマウスはさらなる処置を何も受けなかったが、実験群にはＭＳＣ（Ａ）またはＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＭＰＣ（Ｂ）を、２×１０６、１×１０６、または０．３×１０６／マウスの用量で、４週目から毎週３回、静脈注射された。マウスは週に２回モニターした。各群は８匹のマウスを含んでいた。
【０１４３】
実施例７：ＧｖＨＤの発症に対するＭＳＣおよびＭＰＣの効果。
【０１４４】
マウスは、１または２×１０６個のＭＳＣ  Ａ（Ａ１およびＡ２）、１または２×１０６個のＭＰＣ  Ｂ（Ｂ１およびＢ２）を受容した。ＭＳＣ処置の存在下、または非存在下における疾患の動態を、図６に報告する。１×１０６個の細胞を点滴した後、ＢおよびＡの効果の間に明らかな違いがあった。調製物Ａを受容したマウスは、細胞を受容していないマウスとの間に何ら実質的な差異を示さなかったが、調製物Ｂを注射された群は、前記疾患の重症度に対し劇的な有益作用を示した。移植から１３週間後、Ｂ１を受容したマウスは他の群の２．３と比較して、０．５の平均ＧｖＨＤスコアを有していた。
【０１４５】
次いで、抗ＧｖＨＤ効果が用量依存的であったかどうかを調べた。従って、前述の用量について記載された同じ様式に従って、ある群のマウスにはＡまたはＢの高用量（２×１０６／マウス）を注射し、ある群のマウスにはＡまたはＢの低用量（０．３×１０６／マウス）を注射した。図７は高用量の効果を報告している。高用量ＭＰＣ（Ｂ２）の治療効果はＡ２と比べて優れており、最初の１１週間は全くＧｖＨＤが見られなかった。１４および１５週目での、マウスあたりのＧｖＨＤの結果は、さらにより劇的であり、Ａ１群において生存したものが全くいなかった（図８）。
【０１４６】
最後に、９週のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＭＰＣ（Ｂ）による低用量注射（０．３×１０６／マウス）は、ＡよりもＧＶＨＤスコア減少についてよりすぐれた効果を有したことを再び示した（図９および１０）。
【０１４７】
この予備研究のデータは一貫して、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＭＰＣが、無処置またはＳＴＲＯ−１陰性ＭＳＣ処置と比べて、優れた免疫抑制能を示したことを表わしている。これはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて明らかであって、そして最も重要な事だが、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいても明らかであった。０．３〜２×１０６細胞／マウスの用量範囲で与えられた、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔＭＰＣは、ＧｖＨＤの阻止に対し劇的な臨床効果をもたらした。
【０１４８】
本文書で引用された参照は全て、参照によって本明細書に組み込まれたものとする。
【０１４９】
広義に記載される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、多数の変更および／または改変を特定の実施形態において示される本発明に対し行うことが可能であることは、当業者には理解されるだろう。従って、本発明の実施形態は、あらゆる観点において、説明のためのものであり、限定するものではないと見なされるべきである。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2013530991000001.app
【国際調査報告】
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2013530991.tif 000019
2013530991.tif 000020