(57)【要約】  本明細書中で提供されるのは、少なくとも一の遺伝的バリアントの存在または不存在を検出すること、または補因子治療可能な症状に対する素因を決定すること、遺伝子バリアントに基づいた個別化された栄養的アドバイスプランを作成することにより、個人の遺伝子的構造に基づいた個人のためのビタミンなどの一またはそれ以上の補因子を同定するための方法およびシステムである。また、本明細書中で提供されるのは、遺伝子的構造により決定される補因子の調合物およびこれらの調合物を決定するためのおよび製造するための方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
補因子を含む調合物であって、前記調合物が、個人の遺伝子的構造により決定された量で存在する、調合物。
【請求項２】
補因子の大多数を含み、ここで少なくとも前記大多数内の前記補因子が、個人の遺伝子的構造により決定された量で存在する、請求項１に記載の調合物。
【請求項３】
前記補因子が、ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（カルシフェロール）、ビタミンＥ、ビタミンＫ（フィロキノン）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ９（葉酸塩／葉酸）、ビタミンＢ１２（トコフェロール）ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）からなる群から選択される、請求項１に記載の調合物。
【請求項４】
補因子の前記大多数が、ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（カルシフェロール）、ビタミンＥ、ビタミンＫ（フィロキノン）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ９（葉酸塩／葉酸）、ビタミンＢ１２（トコフェロール）ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）から選択される少なくとも２つの補因子を含む、請求項２に記載の調合物。
【請求項５】
除放形態として調製される、請求項１の調合物。
【請求項６】
経口摂取可能である、請求項１に記載の調合物。
【請求項７】
静脈内、皮下、または筋肉内投与のために調製される、請求項１の調合物。
【請求項８】
単位投薬として調製される、請求項１の調合物。
【請求項９】
錠剤またはカプセルとして調製される、請求項１の調合物。
【請求項１０】
液体形態である、請求項１に記載の調合物。
【請求項１１】
前記遺伝子的構造が、代謝経路中に一またはそれ以上の遺伝子でコードされた一またはそれ以上の酵素について遺伝的バリアントを含み、ここで前記遺伝的バリアントが、補因子治療可能な症状と相関する、請求項１に記載の調合物。
【請求項１２】
前記補因子治療可能な症状が、神経管欠損を伴う子孫を有する、請求項１１に記載の調合物。
【請求項１３】
前記補因子治療可能な症状が、二分脊椎症、口蓋裂、もしくは無脳症を伴う子孫を有する症状、または早産を有する症状から選択される、請求項１１に記載の調合物。
【請求項１４】
前記個人による使用のための教示を伴う、請求項１に記載の調合物。
【請求項１５】
（ａ）前記補因子を選択すること、および
（ｂ）摂取可能または注射可能な形態で賦形剤を伴う前記補因子を混合すること
を含む、請求項１に記載の調合物を調製するための方法。
【請求項１６】
前記選択するためのステップが、補因子の大多数を選択することを含み、ここで、前記大多数内の前記補因子の少なくともサブセットが、前記個人の遺伝子的構造により決定される量について存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記補因子が、前記個人の少なくとも一の個人的特性に基づいて選択され、ここで、前記個人的特性が、体重、身長、ボディマスインデックス、民族、先祖、性別、年齢、家族歴、病歴、運動習慣、および食習慣からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）前記個人の生物学的サンプルから少なくとも一の遺伝的バリアントの存在または不存在を決定すること、ここで前記少なくとも一の遺伝的バリアントは、前記少なくとも一の遺伝的バリアントを欠損する個人に対して推奨される量と比較して前記補因子の量の少なくとも１％について異なる補因子の推奨される量と相関し、および
（ｂ）前記少なくとも一の遺伝的バリアントが、前記生物学的サンプル中に検出されるとき、前記個人のための補因子の異なる量を推奨すること
を含む、個人のための補因子の量を決定するための方法。
【請求項１９】
前記遺伝的バリアントが、前記少なくとも一の遺伝的バリアントを欠損する個人に対して推奨される量よりも少なくとも１％超異なる補因子の推奨される量と相関する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝的バリアントが、少なくとも一の遺伝的バリアントを欠損する個人に対し推奨される量よりも少なくとも１％未満異なる補因子の推奨される量と相関する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝的バリアントが、少なくとも５００％異なる補因子の推奨される量と相関する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記個人が、補因子治療可能な症状のためのリスクまたは素因を伴う女性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記補因子治療可能な症状が、神経管欠損を伴う子孫を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記補因子治療可能な症状が、二分脊椎症、口蓋裂、もしくは無脳症を伴う子孫を有する症状、または早産を有する症状から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記女性が、妊娠しており、および前記補因子治療可能な症状が二分脊椎症を伴う子孫を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）前記個人の生物学的サンプルから遺伝的バリアントの大多数の存在または不存在を検出すること、ここで前記遺伝的バリアントの大多数が、表Ａ‐Ｘから選択され、および
（ｂ）遺伝的バリアントの大多数が、前記生物学的サンプルについて決定されるとき、前記補因子治療可能な症状について前記素因を決定すること
を含む、個人における補因子治療可能な症状に対してリスクまたは素因を決定するための方法。
【請求項２７】
前記遺伝的バリアントの大多数が、少なくとも２の遺伝的バリアントを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝的バリアントの大多数が、少なくとも３の遺伝的バリアントを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記個人の補因子に依拠する酵素欠損または前記個人の健康管理マネージャーの前記リスクを報告することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記補因子治療可能な症状が、神経管欠損を伴う子孫を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記補因子治療可能な症状が、二分脊椎症、口蓋裂、無能症を伴う子孫を有する症状、または早産を有する症状からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
単離された核酸またはそれらの相補鎖、ここで前記核酸が、表Ａ‐Ｘで示された一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、核酸またはそれらの相補鎖。
【請求項３３】
請求項３２に記載の単離された核酸の大多数をその上に固定されて含む、アレイ。
【請求項３４】
（ｉ）データ処理装置上の第一データセットを提供するために、前記第一データセットが、前記個人の遺伝的バリアントの存在と相関するための情報を含み、ここで、遺伝的バリアントが、個人が、補因子に依拠する酵素欠損のリスクであり、および
（ｉｉ）データ処理装置上の第二データセットを提供するために、前記第二データセットが、少なくとも一のライフスタイル推奨を伴う前記補因子に依拠する酵素欠損をマッチングするための情報を含み、および
（ｉｉｉ）（ｉ）の遺伝的バリアントに基づく個別化された栄養的アドバイスプランを作成するために、ここで当該プランが、ステップ（ｉｉ）についてマッチした少なくとも一のライフスタイル推奨を含む
を含む、個人のための個別化された栄養的アドバイスプランを提供するための、コンピュータに補助された方法。
【請求項３５】
前記個別化されたライフスタイルアドバイスプランが、ビタミンサブタイプの推奨される最小および／または最大量を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記個別化されたライフスタイルアドバイスプランが、前記個人の遺伝的バリアントに基づいた量について推奨される一またはそれ以上の補因子を含む、請求項３４の方法。
【請求項３７】
固有ＩＤの使用を伴うインターネットを介して個人に対してプランを提供するためのステップを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
個人または彼／彼女の代理人に対してワイヤレスにプランを提供するためのステップを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
アイフォン（ｉ‐Ｐｈｏｎｅ）（登録商標）を介して個人にプランを提供するためのステップを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
（ｉｉ）の遺伝的バリアントが、一またはそれ以上の補因子に依拠する酵素欠損と相関する遺伝子バリアントの大多数を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
一またはそれ以上の補因子に依拠する酵素欠損が、葉酸塩／葉酸欠損である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
データ処理装置上の第三データセットが、さらに請求項３４に記載の方法を含み、前記第三データセットが、前記個人の一またはそれ以上の個人の特性上の情報を含む、前記方法。
【請求項４３】
前記個人の特性が、体重、身長、ボディマスインデックス、民族、祖先、性別、年齢、家族歴、病歴、運動習慣、および食習慣からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
（ｉ）の第一データセットを提供することおよび／または（ｉｉ）の第二データセットを提供することが、前記個人または彼／彼女の代理人によりそれぞれのデータセットの情報を入力することにより実行される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記プランが、一またはそれ以上のウェブページとハイパーリンクすることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４６】
第一データセットが、表Ａ‐Ｘから選択される遺伝的バリアントの大多数を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
（ｉ）データ処理装置が、第一データセットおよび／または第二データセットを処理するために構成され、前記第一データセットが、個人の遺伝的バリアントの存在と相関するための情報を含み、ここで、遺伝的バリアントが、個人が、補因子に依拠する酵素欠損のリスクであることを示し、および前記第二データセットが、少なくとも一のライフスタイル推奨を伴う前記補因子に依拠する酵素欠損とマッチングするための情報を含み、および
（ｉｉ）出力装置が、前記個人の遺伝的バリアントに基づいた個別化された栄養的アドバイスプランを作成するために構成され、ここで本プランが、（ｉ）についてマッチされた少なくとも一のライフスタイル推奨を含む
を含む、コンピュータシステム。
【請求項４８】
第一データセットおよび／または第二データセット上の情報を入力するために構成された入力装置をさらに含む、請求項４７に記載のコンピュータシステム。
【請求項４９】
入力装置が、前記個人の一またはそれ以上の個人的な特性上の情報を入力するために構成された、請求項４８に記載のコンピュータシステム。
【請求項５０】
（ａ）前記個人の生物学的サンプル由来の少なくとも一の遺伝的バリアントの存在または不存在と関係する情報を取集すること、ここで前記少なくとも一の遺伝的バリアントが、少なくとも一の遺伝的バリアントを欠損する個人に対して推奨される量と比較して前記補因子の少なくとも１％異なる補因子の推奨される量と相関し、および
（ｂ）前記少なくとも一の遺伝的バリアントが、前記生物学的サンプル中で検出されるとき、前記個人のための補因子の異なる量を推奨すること
を含む、個人のための個別化された栄養的アドバイスプランを提供するためのビジネス方法。
【請求項５１】
前記遺伝的バリアントが、少なくとも一の遺伝的バリアントを欠損する個人に対して推奨される量よりも少なくとも１％超異なる補因子の推奨される量と相関する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記遺伝的バリアントが、少なくとも一の遺伝的バリアントを欠損する個人に対する推奨される量よりも少なくとも１％未満異なる補因子の推奨される量と相関する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記遺伝的バリアントが、少なくとも５００％異なる補因子の推奨される量と相関する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記個人が、補因子治療可能な症状のためのリスクまたは素因を伴う女性である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記補因子治療可能な症状が、神経管欠損を伴う子孫を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記補因子治療可能な症状が、二分脊椎症、口蓋裂、または無能症を伴う子孫を有する症状、または早産を有する症状から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記個人が、妊娠した女性であり、および前記補因子治療可能な症状が、二分脊椎症を伴う子孫を有する、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
葉酸塩（ｆｏｌａｔｅ）／ホモシステイン代謝経路は、葉酸塩を代謝し、および／またはホモシステインに作用する酵素のネットワーク、及び酵素経路を構成する。この経路は、メチオニン合成酵素反応を介して繋がっており、そして細胞培養、動物モデルシステムにおいて、そしてヒトにおいて限界葉酸欠乏は、ホモシステインの再メチル化を損なわせる（例えば、Ｓｔｏｒｖｅｒ ＰＪ．２００４．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｆｏｌａｔｅ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ12 ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｕｔｒ Ｒｅｖ ６２：Ｓ３‐１２)。
【０００２】
葉酸不足は、神経管欠損症（ＮＴＤ）や、他の出生異常及び妊娠結果の悪化、例えば口唇・口蓋裂、子癇前症、早産／低出生体重、及び反復性偶発的初期流産などと関連する（例えば、Ｍｉｌｌｓ  ｅｔ  Ａｌ．，１９９５．Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｂｙ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｄｅｆｅｃｔｓ．Ｌａｎｃｅｔ ３４５：１４９‐１１５１参照)。葉酸不足は、心血管疾患、冠動脈疾患、虚血性脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、血栓症、網膜動脈閉塞、ダウン症、直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、鬱病、統合失調症、アルツハイマー病／認知症、加齢性黄斑変性、及び緑内障と関連してきた。
【０００３】
葉酸塩／ホモシステイン代謝経路における全ての代謝工程は、葉酸不足及び／又はホモシステイン代謝に関連する病状及び疾患に潜在的に関連している。葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する酵素としては、例えば二機能性酵素ＡＩＣＡＲトランスフォルミラーゼ、及びＩＭＰシクロヒドラーゼ（ＡＴＩＣ）、グリシンアミドリボヌクレオチドトランスフォルミラーゼ（ＧＡＲＴ）、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼＩ-α（ＭＡＴ１Ａ）、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼＩＩ-α、（ＭＡＴ２Ａ）、メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）、及びメチルテトラヒドロフォレートシンセターゼ（ＭＴＨＦＳ）が挙げられる。葉酸不足は、ＭＴＨＦＲ及びＣＢＳの両者のアロステリック阻害剤であるＳ-アデノシル-メチオニン（ＳＡＭ）により媒介されるメチル化を損なわせる（例えば、Ｋｒａｕｓ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ３‐ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｕｒｉａ．Ｈｕｍ  Ｍｕｔ  １３：３６２‐３７５；Ｄａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８２．Ｉｎ  Ｆｌａｖｉｎｓ  ａｎｄ  Ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｅｄｓ．Ｍａｓｓｅｙ，Ｖ．＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｈ，(Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ)，ｐｐ．１６５‐１７２）。Ｓ‐アデノシル‐ホモシステイン：Ｓ-アデノシルメチオニンの比（ＳＡＨ／ＳＡＭ）の増加が、ＮＴＤの発達のメカニズムにおいて指摘されている。
【０００４】
５，１０‐メチレンテトラヒドロフォレートレダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）は、ホモシステインがメチオニンへと変換される葉酸依存的多段階経路に係わっている。ホモシステインの変換の低下が、高ホモシステイン症を導きうる。
【０００５】
ＭＴＨＦＲのいくつかの希な変異が同定されており、それは臨床ＭＴＨＦＲ欠損、常染色体劣性疾患と関連している。ＭＴＨＦＲ欠損の臨床症状は、かなり可変的であり、そして発達遅延、運動異常及び歩行障害、発作、及び早産血管系疾病が挙げられる。
【０００６】
ＭＴＨＦＲのよくある多型、例えば機能的障害アレルＡ２２２Ｖも記載されている。よくある多型と疾患との間の遺伝的関連は一定ではない。これは、一部には疾患の潜在的リスクを目立たなくする葉酸利用能の補償的効果のためであるかもしれないし、未だに同定されていない低頻度で生じる障害アレルがこのような疾患に寄与しているためであるかもしれない。興味深いことに、よくある多型は、化学治療薬、例えばメトトレキサート及び５‐フルオロウラシルの効果や毒性における個々の変動と関連している。
【０００７】
酵母遺伝子ｍｅｔｌ１の機能の補償についてのアッセイが記載されている（Ｓｈａｎ  ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ，７２４：３２６１ ８，１９９９）。このアッセイでは、野生型ヒトＭＴＨＦＲは、Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)におけるｍｅｔｌ１変異を補完することが示された。しかしながら、機能的障害アレルＡ２２２Ｖが、酵母変異を補完について野生型酵素と同様の能力を有することにより示されるように、このアッセイは、ＭＴＨＦＲ変異による活性の定量的変化に対して感受性ではないし、このアッセイは、葉酸利用能の効果に対しても感受性ではない。
【０００８】
葉酸を利用する酵素に加えて、少量のビタミンＢ6及びＢ12依存性酵素、及び酵素経路は、ホモシステイン代謝、ＮＴＤ及び他の出生異常及び妊娠結果の悪化に関連している。例えば、Ｂ6利用酵素であるシスタチオン‐１３‐シンターゼ（ＣＢＳ）の欠損は、ホモシステインの蓄積をもたらす（Ｋｒａｕｓ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ １３‐ｓｙｎｔｈａｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ．Ｈｕｍ Ｍｕｔ １３：３６２‐３７５)。同様に、Ｂ6利用酵素であるシスタチオニンγ-リアーゼ（ＣＴＨ）の単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）は、ホモシステイン症に関連した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  CTH ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ． Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  ６５：  ４８３‐４８６）。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、部分的に、代謝経路内の酵素をコードする遺伝子の障害アレルを同定し、そして補因子による改善に対するその感受性を測定するための新規のインビボアッセイを開発することに基づく。機能的に相同な目的の酵素による補完を可能にする第一変異と、株を補因子の補充に依存性にする第二変異とを含む、化合物による酵母の変異体は、補因子の利用能の機能として酵素補完の研究に供される。治療可能なアレルも含む補因子感受性の障害アレルが同定される可能性があり、そして補因子利用可能性：酵素活性の関係が、本明細書中に開示されるアッセイを用いて解析され得る。得られた結果は、予防的及び治療的栄養補助を通知するために使用されてもよいし、代謝酵素機能不全及び異常代謝に関連する病状及び疾患を予防及び治療するために使用されてもよい。
【００１０】
本発明は、酵素をコードする遺伝子において、低頻度で生じる障害アレルを補因子が改善するということが、驚くべきことに一般的であることをはじめて示したことに部分的に由来している。本明細書中に例示されるように、代謝経路における複数の補因子感受性遺伝子が、おのおの、集合における複数の低頻度突然変異を有し得る。まとめると、これらの変異は、一の遺伝子における単一の低頻度で障害アレルを試験することから明らかになるものよりも、重大な影響を代謝経路に与える。それ以上に、複数の低頻度で障害アレルについてヘテロ接合である細胞は、量的不足を示すので、そのような個々として希なアレルがまとまって現れると、より一般的な多型が存在しない場合においてさえ一般的な表現系に関与することもある。経路に対して影響を有する低頻度で障害アレルは、一般的な多型で観察される表現型のバリエーションに寄与することもある。したがって、本発明は、酵素をコードする遺伝子において低頻度で障害アレルを検出及び特徴決定すること、そしてその有効な回復を決定することに特に着目した診断及び予後予測方法に関する。
【００１１】
本発明は、特に葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する酵素をコードする遺伝子において、新規の低頻度で障害アレルを同定し、そして特徴決定するために、これらのアッセイを特異的に行うことに部分的に由来する。ＭＴＨＦＲについて本明細書において示される様に、多くの低頻度で障害アレルが存在し、それは累積的に酵素欠損に寄与することができるが、補因子の補給により消散することもある。本発明はまた、ＭＴＨＦＲの障害アレルが、酵素のＮ‐末端触媒ドメインのコード化配列に位置する配列変化を含むことを発見したことに部分的に由来している。
【００１２】
一つの側面では、したがって本発明は、例えばＡＴＩＣ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＭＴＨＦＲ、及びＭＴＨＦＳを含む、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の障害であるが、治療可能であるアレルを検出するためのインビボアッセイを提供する。野生型ヒトＭＴＨＦＲ活性が、ｍｅｔ１１欠損を相補する補償的アッセイ（Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ，２７４：３２６１３‐３２６１８，１９９９）は、感受性は高くなく、そして全ての機能的障害ヒトＭＴＨＦＲアレルを検出することができない。例えば、このアッセイは、野生型ＭＴＨＦＲと、機能的に障害されたよくある多型であるＡ２２２Ｖを区別することができない。さらに、このアッセイは、葉酸レベルと酵素活性との間の関係について何も明らかにしていない。
【００１３】
本明細書において開示されたインビボアッセイは、高い感受性であり、そしてＭＴＨＦＲについて本明細書に示されるように、葉酸に対するその感受性を同時に測定する一方で、葉酸塩／ホモシステイン代謝に係わる遺伝子の障害アレルを明らかにすることができる。同定されたアレルとしては、低頻度のアレル、ヘテロ接合体としての表現型を示す優性又は相互優性アレル、葉酸により治癒可能なアレルを含む葉酸感受性のアレル、及びこれらの特徴の組合せを有するアレルを含む。重要なことに、これらの障害アレルは、様々な症状及び疾患のリスク、並びに化学治療剤の様々な効力及び毒性に係わっている。これらの障害アレルの欠損症は、葉酸利用能の保証効果のため、ある個人においては症状、疾患、又は化学療法への応答の変化として徴候を示さないこともある。ＭＴＨＦＲの機能的障害アレルを明らかにする能力は、そのような症状及び疾患のリスク、並びに化学治療の潜在的な治療効果及び毒性をスクリーニングする方法を提供する。
【００１４】
本発明は、ＣＴＨ及びＣＢＳの障害アレルを検出するインビボアッセイも提供する。これらの遺伝子について機能的障害アレルを明らかにする能力は、関連する疾患及び症状のリスクをスクリーニングする方法を提供する。
【００１５】
したがって、一つの側面では、本発明は、代謝経路において酵素をコードする遺伝子の障害アレルを検出し、そして補因子への感受性を決定するインビボアッセイを提供する。このアッセイは、野生型の酵素をコードする遺伝子によって補償されうる第一遺伝子における第一変異を含み、そして酵母株を、第一遺伝子の機能に関連するアッセイ可能な表現型について補因子（またはその前駆体）の補給に依存性にする第二遺伝子における第二変異を含む酵母株の使用を含む。
【００１６】
本方法は、（ｉ）酵母細胞に酵素をコードする遺伝子の試験アレルを導入するステップ、ここで当該酵母細胞は、上記酵素をコードする遺伝子に機能的に相同である第一遺伝子における第一変異、及び酵母細胞を酵素機能に必要とされる補因子を補充することに依存性にする第二遺伝子（または遺伝子の群）における第二変異を含み、ここで第一変異は、第一遺伝子の機能に関連する酵母の測定可能な特徴を変化させ；（ｉｉ）培養培地に上記補因子を補充するステップ；および（ｉｉｉ）野生型酵素の存在下よりは、上記試験アレルの存在下における測定可能な特徴の回復が少ないことを検出し、それにより上記試験アレルによる第一遺伝子変異の補償が不完全であることを検出し、そして上記試験アレルを障害アレルとして同定するステップを含む。補充された補因子の量を滴定することにより、障害アレルの補因子利用性についての感受性を測定する。
【００１７】
一つの実施態様では、二倍体の酵母細胞が用いられる。二倍体酵母は、試験アレルについてホモ接合性であっても、ヘテロ接合であってもよい。二倍体酵母は、野生型遺伝子と試験アレルを含んでもよい。二倍体酵母は、試験アレルの組合せを含んでもよい。
【００１８】
好ましい実施態様において、酵素をコードする遺伝子は、配列の点で天然アレルに対応しているか、又は個々の天然アレルの複合物（ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に対応している。好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、ヒト酵素をコードする遺伝子のアレルか、又は個々のヒトアレルの複合物を含む。
【００１９】
好ましい実施態様では、酵母はＳ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)である。
【００２０】
一つの実施態様では、第一酵母遺伝子はｍｅｔ１３であり、そして第二酵母遺伝子はｆｏｌ３である。かかる酵母株は、ＭＴＨＦＲアレルの活性や、葉酸状態に対するその応答を決定するために使用されてもよい。したがって、一つの実施態様では、本発明は、葉酸状態の関数として活性をさらに測定することができる、ＭＴＨＦＲアレルの活性を測定するためのインビボアッセイを提供する。好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、天然のヒトＭＴＨＦＲアレルを含む。別の好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、個別のヒトＭＴＨＦＲアレルの複合物を含む。
【００２１】
好ましい実施態様では、アッセイ方法は、目的のＭＴＨＦＲアレルの活性を、野生型ＭＴＨＦＲのアレルの活性と比較することを含む。
【００２２】
好ましい実施態様では、アッセイ方法は、葉酸の量を滴定して、葉酸利用能に対してＭＴＨＦＲ酵素が感受性であるかを決定した。
【００２３】
一つの実施態様では、酵母は二倍体である。一つの実施態様では、二倍体酵母は、補償について試験されたＭＴＨＦＲアレルについてヘテロ接合である。一つの実施態様では、二倍体酵母は、野生型ＭＴＨＦＲと変異ＭＴＨＦＲアレルを含む。
【００２４】
好ましい実施態様では、アッセイにおける測定結果は、成長である。
【００２５】
１の実施態様では、第一酵母遺伝子はａｄｅ１６又はａｄｅ１７であり、そして第二酵母遺伝子はｆｏｌ３である。このような酵母株は、二機能性の酵母ＡＩＣＡＲトランスフォルミラーゼとＩＭＰシクロヒドラーゼ（ＡＴＩＣ）アレルの活性や、葉酸状態に対するそれらの応答を測定するために用いられてもよい。したがって、一つの実施態様では、本発明は、ＡＴＩＣアレルの活性を測定するためのインビボアッセイを提供し、それは葉酸状態の関数として活性を測定することがさらにできる。好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、天然のヒトＡＴＩＣアレルを含む。別の好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、個々のヒトＡＴＩＣアレルの複合物を含む。
【００２６】
一つの実施態様では、第一酵母遺伝子は、ａｄｅ７であり、そして第二酵母遺伝子はｆｏｌ３である。このような酵母株は、グリシンアミドリボヌクレオチドトランスフォルミラーゼ（ＧＡＲＴ）アレルの活性や、葉酸状態へのその応答を決定するために使用されてもよい。したがって、一つの実施態様では、本発明は、ＧＡＲＴアレルの活性を測定するためのインビボアッセイを提供し、これはさらに葉酸状態の関数として活性を測定することができる。好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、天然ヒトＧＡＲＴアレルを含む。別の好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、個別のヒトＧＡＲＴアレルの複合物を含む。
【００２７】
一つの実施態様では、第一酵母遺伝子は、ｓａｍ１ 又はｓａｍ２であり、そして第二酵母遺伝子はｆｏｌ３である。このような酵母株は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼＩα（ＭＡＴ１Ａ）アレルの活性、及び葉酸状態に対するその応答を決定するために使用されてもよい。したがって、一つの実施態様では、本発明は、ＭＡＴ１Ａアレルの活性を決定するためのインビボアッセイを提供し、これはさらに葉酸状態の関数として活性を測定することができる。好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、天然ヒトＭＡＴ１Ａアレルを含む。別の好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、個別のヒトＭＡＴ１Ａアレルの複合物を含む。
【００２８】
一つ実施態様では、第一酵母遺伝子は、ｓａｍ１又はｓａｍ２であり、そして第二酵母遺伝子はｆｏｌ３である。このような酵母株は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼＩＩα（ＭＡＴ２Ａ）の活性、及び葉酸状態に対するその応答を決定するために用いられてもよい。したがって、一つ実施態様では、本発明は、ＭＡＴ２Ａアレルを測定するためのインビボアッセイを提供し、これはさらに葉酸状態の関数として活性を決定することができる。好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、天然ヒトＭＡＴ２Ａアレルを含む。別の好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、個々のヒトＭＡＴ２Ａアレルの複合物を含む。
【００２９】
一つの実施態様では、第一酵母遺伝子は、ｆａｕ１であり、そして第二酵母遺伝子はｆｏｌ３である。そのような酵母株は、メチルテトラヒドロフォレート合成酵素（ＭＴＨＦＳ）アレルの活性や、葉酸状態へのその応答性を決定するために用いられてもよい。したがって、一つの実施態様では、本発明は、ＭＴＨＦＳアレルの活性を決定するためのインビボアッセイを提供し、これはさらに葉酸状態の関数として活性を決定することができる。好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、天然ヒトＭＴＨＦＳアレルを含む。別の好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、個々のヒトＭＴＨＦＳアレルの複合物を含む。
【００３０】
他の実施態様では、第一酵母遺伝子は、ｃｙｓ３であり、そして第二酵母遺伝子はｓｅｘｔｕｐｌｅ‐ｄｅｌｅｔｅ  ｓｎｏ１Δ  ｓｎｏ２Δ  ｓｎｏ３Δ  ｓｎｚ１Δ  ｓｎｚ２Δ  ｓｎｚ３Δである。そのような酵母株は、ＣＴＨアレルの活性、およびビタミンＢ6状態についてのそれについての反応を決定するために使用されてもよい。従って、一つの実施態様では、本発明は、ＣＴＨアレイの活性を決定するためのインビボアッセイを提供し、そしてそれは、さらにビタミンＢ6状態の機能として活性を決定することができる。好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、天然ヒトＣＴＨアレルを含む。他の好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、個々のヒトＣＴＨアレルの編集物（ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）を含む。
【００３１】
他の実施態様では、ｃｙｓ４であり、そして第二酵母遺伝子は六倍（六重）‐欠失（ｓｅｘｔｕｐｌｅ‐ｄｅｌｅｔｅ）ｓｎｏ１Δ  ｓｎｏ２Δ  ｓｎｏ３Δ  ｓｎｚ１Δ  ｓｎｚ２Δ  ｓｎｚ３Δである。そのような酵母株は、ＣＢＳアレイ、およびビタミンＢ6状態についてのそれについての反応を決定するために使用されてもよい。従って、一つの実施態様において、本発明は、ＣＢＳアレルの活性を決定するためのインビトロアッセイを提供し、そしてそれはさらにビタミンＢ6状態の機能として活性を決定することができる。好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、天然ヒトＣＢＳアレルを含む。他の好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、個々のヒトＣＢＳアレルの編集物を含む。
【００３２】
一つの側面では、本発明は、ＡＴＩＣ、ＧＡＲＴ，ＭＡＴＩＡ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＴＨＦＲ、およびＭＴＨＦＳからなる群から選択される酵素をコードする遺伝子の障害アレルを検出することおよびそれらの葉酸塩の反応性を決定することができる酵母株を提供する。いくつかの実施態様では、酵母は、それぞれのそのような酵素をコードする遺伝子のための本明細書で上述したそれぞれの変異および付加を含む。
【００３３】
一つの実施態様では、本発明は、ＣＴＨの障害アレルを検出することおよびそれらのビタミンＢ6の反応性を決定することができる酵母株を提供する。
【００３４】
一つの側面では、本発明は、例えば葉酸塩／ホモシステイン代謝などの代謝経路について酵素をコードする遺伝子の障害アレルを検出することを提供する。一つの実施態様では、障害アレルは、ヒトＡＴＩＣ，ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＴＨＦＲ、および／またはＭＴＨＦＳについて自然に発生する。一つの実施態様では、障害アレルは、ＣＢＳアレルである。一つの実施態様では、障害アレルは、ＣＴＨアレルである。いくつかの実施態様では、本方法は、インビボアッセイおよび本明細書で提供される方法を用いる治癒可能な補因子であることを示される代謝酵素をコードする遺伝子について障害アレルを検出することを含む。
【００３５】
他の側面では、本発明は、対象からサンプルを取得しおよび前記サンプルについて障害アレルの大多数の存在または不存在（ａｂｓｅｎｃｅ）を検出することを含む、対象について代謝酵素欠損を同定しおよび／または特徴づけるための方法を提供し、その中に少なくとも一の障害アレルの存在は、対象が酵素欠損のリスクであることを示す。障害アレルの大多数は、代謝経路について同じ酵素をコードする遺伝子からであってもよく、または同じ経路について複数の遺伝子由来のアレルであってもよい。
【００３６】
いくつかの実施態様では、一またはそれ以上の障害アレルは、例えば一般的に、一般集団の４％未満、より一般的に、一般集団の３％未満、好ましくは２．５％未満‐２％、およびもっとも好ましくは、一般集団の１％未満を示す低頻度アレルである。いくつかの実施態様では、一またはそれ以上の障害アレルは、治療可能な補因子アレルである。特に好ましい実施態様では、障害性の治癒可能な補因子アレルは、本明細書で提供されるインビボアッセイおよび方法により同定される。
【００３７】
サンプル中の特定のアレルの検出は、当該技術分野において共通であり、および任意の通常の検出プロトコールは、例えば本明細書で記載されたようなハイブリダイゼーション、増幅、シークエンシング、ＲＦＬＰ分析などに基づくプロトコールを含む対象方法について利用してもよい。また、本明細書では、核酸サンプル中のアレルの検出について特定の有用性を有する将来開発されるプロトコールおよび／または材料が使用のために考慮される。
【００３８】
さらなる側面では、対象中の代謝酵素欠損を治療するための方法は、本明細書中に記載したように、そのような欠損を有するまたは有する疑いのある対象由来のサンプルを得ること、サンプル中の障害性の治癒可能な補因子アレルの大多数の存在または不存在を検出すること、およびサンプル中の検出された障害アレルの数および種類に基づき対象に適当な補因子サプリメントを投与することを含むことを提供する。
【００３９】
一つの実施態様では、方法はさらに、本明細書中で記載したように、酵素活性を決定するためのインビボアッセイの使用を含む。
【００４０】
一つの実施態様では、方法はさらに、本明細書中で記載したように、酵素活性を決定するためのインビボアッセイの使用、および酵素をコードする核酸中の変異を決定することを含む。
【００４１】
一つの実施態様では、方法はさらに、本明細書中で記載したように、酵素活性を決定するためのインビボアッセイの使用、および高温での酵素安定性を決定するための温度感受性アッセイを含む。
【００４２】
一つの実施態様では、方法はさらに、本明細書中で記載したように、酵素活性を決定するためのインビボアッセイの使用、および酵素の比活性を決定するためのインビトロアッセイを含む。
【００４３】
一つの側面では、本発明は、異常なホモシステイン代謝に伴う疾患または状態のリスクをスクリーニングするための方法を提供する。方法は、本明細書中で記載したように、ホモシステイン代謝に関連する遺伝子の障害アレルのためのスクリーニングを含む。好ましい実施態様では、本方法は、本明細書中で記載のインビトロアッセイを使用することにより、そのように特徴づけられた障害アレルを検出することを含む。好ましい実施態様では、疾患または状態は、心血管疾患、冠動脈疾患、虚血性脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、血栓症、網膜動脈閉塞、ダウン症、直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、鬱病、統合失調症、アルツハイマー病／認知症、加齢性黄斑変性、および緑内障からなる群から選択される。
【００４４】
一つの実施態様では、方法は、本明細書中で記載したように、ＡＴＩＣ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＴＨＦＲ、および／またはＭＴＨＦＳの障害アレルのためのスクリーニングを含む。
【００４５】
一つの実施態様では、方法は、本明細書中で記載したように、ＣＢＳの障害アレルのためのスクリーニングを含む。
【００４６】
一つの実施態様では、方法は、本明細書中で記載したように、ＣＴＨの障害アレルのためのスクリーニングを含む。
【００４７】
一つの側面では、本発明は、個人の化学療法剤反応ポテンシャルを決定するための方法を提供する。方法は、本明細書中で記載したように、葉酸塩／ホモシステインに関連する遺伝子の障害アレルを検出するための方法の使用を含む。好ましい実施態様では、遺伝子は、ＭＴＨＦＲ，ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＧＡＲＴからなる群から選択される。本明細書中に記載されたインビボアッセイ方法によりおよび／または特定のアレルのための検出方法の適用により個人について障害アレルの検出は、低減された反応ポテンシャルを示す。
【００４８】
一つの側面では、本発明は、個人にとって潜在的化学療法的毒性を決定するための方法を提供する。方法は、本明細書中で記載したように、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する遺伝子の障害アレルを検出するための方法の使用を含む。好ましい実施態様では、遺伝子は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＧＡＲＴからなる群から選択される。本明細書中に記載されるインビボアッセイ方法によりおよび／または特定のアレルのための検出方法の適用により個人における障害アレルの検出は、増加された毒性ポテンシャルを示す。
【００４９】
一つの側面では、本発明は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＧＡＲＴからなる群から選択される酵素をコードする遺伝子のアレルと配列において相同する単離された核酸を提供する。一つの実施態様では、単離された核酸は、表Ａで開示されたＳＮＰなどのＭＴＨＦＲ遺伝子のアレイの配列を有するおよび／または含む。一つの実施態様では、単離された核酸は、表Ｂで開示されたＳＮＰなどのＡＴＩＣ遺伝子のアレルの配列を有するおよび／または含む。一つの実施態様では、単離された核酸は、表Ｃで開示されたＳＮＰなどのＭＴＨＦＳのアレルの配列を有するおよび／または含む。一つの実施態様では、単離された核酸は、表Ｄで開示されたＳＮＰなどのＭＡＴ１Ａ遺伝子のアレルの配列を有するおよび／または含む。一つの実施態様では、単離された核酸は、表Ｅで開示されたＳＮＰなどのＭＡＴ２Ａ遺伝子のアレルの配列を有するおよび／または含む。一つの実施態様では、単離された核酸は、表Ｆで開示されたＳＮＰなどのＧＡＲＴ遺伝子のアレルの配列を有するおよび／または含む。一つの実施態様では、核酸は、ＭＴＨＦＲアレルの配列に相当し、およびＭｌ１０１、Ｈ２ｌ３Ｒ、Ｄ２２３Ｎ、Ｄ２９１Ｎ、Ｒ５１９Ｃ、Ｒ５１９Ｌ、およびＱ６４８Ｐからなる群から選択されるＭＴＨＦＲタンパク質中の非同義（ｎｏｎ‐ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ）変異をコードする配列を含む。
【００５０】
一つの側面では、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する遺伝子の障害アレルを検出するためのアレイを提供する。
【００５１】
一つの実施態様では、本発明は、ＡＴＩＣ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＴＨＦＲおよびＭＴＨＦＳからなる群から選択される遺伝子の障害アレルを検出するためのアレイを提供する。好ましい実施態様では、アレイは、群から選択される遺伝子のための障害性の一超の障害アレルを検出することができる。好ましい実施態様では、アレイは、上記群から選択される遺伝子の大多数から一超の障害アレルを検出することができる。一つの実施態様では、アレイは、群から選択される遺伝子の大多数のそれぞれから一超の障害アレルを検出することができる。好ましい実施態様では、アレイは、障害アレルを治癒可能であるそのような障害アレルを検出することができる。好ましい実施態様では、アレイは、障害アレルを治癒可能であるそのような障害アレルの大多数を検出することができる。いくつかの実施態様では、障害アレルの少なくとも一つが、低頻度アレルである。
【００５２】
一つの実施態様では、本発明は、障害ＭＴＨＦＲアレルを検出するためのアレイを提供する。一つの実施態様では、アレイは、Ｍｌ１０１、Ｈ２１３Ｒ、Ｄ２２３Ｎ、Ｄ２９１Ｎ、Ｒ５１９Ｃ、Ｒ５１９Ｌ、およびＱ６４８Ｐをコードするものからなる群から選択される非同義変異を含むＭＴＨＦＲアレルをハイブリダイズすることができる一またはそれ以上の核酸を含む。
【００５３】
一つの実施態様では、本発明は、ＣＢＳの障害アレルを検出するためのアレイを提供する。アレイは、ＣＢＳの障害アレルとハイブリダイズすることができる一またはそれ以上の核酸を含む。
【００５４】
一つの実施態様では、本発明は、ＣＴＨの障害アレルを検出するためのアレイを提供する。アレイは、ＣＴＨの障害アレルとハイブリダイズすることができる一またはそれ以上の核酸を含む。
【００５５】
好ましい実施態様では、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する大多数の遺伝子の障害アレルを検出するためのアレイを提供する。本発明のアレイは、当該技術分野で知られた任意の多くのアレイ、プローブおよび読み出し技術を使用してもよい。
【００５６】
一つの側面では、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する遺伝子の治療可能な障害アレルを蔵匿している個人についての異常な葉酸塩／ホモシステイン代謝に伴う状態または疾患を予防するための方法を提供する。一つの実施態様において、本方法は、葉酸の個人摂取を増加することを含む。一つの実施態様において、本方法は、ビタミンＢ6の個人摂取を増加することを含む。好ましい実施態様では、本方法は、本明細書に記載されたように、異常な葉酸塩／ホモシステイン代謝を伴う疾患または状態のリスクのためのスクリーニングの方法を含む。
【００５７】
一つの側面では、本発明は、ここで患者が、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する遺伝子の治療可能な障害アレルを有する異常な葉酸塩／ホモシステインを伴う状態または疾患を治療するための方法を提供する。一つの実施態様では、患者の葉酸摂取を増加することを含む。一つの実施態様では、個人のビタミンＢ6摂取を増加することを含む。好ましい実施態様では、本方法は、本明細書で記載したように、異常な葉酸塩／ホモシステイン代謝を伴う疾患または状態のリスクをスクリーニングするための方法を含む。
【００５８】
一つの側面では、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する治療可能な障害アレルを蔵匿するための個人の化学療法的な反応ポテンシャルを増加するための方法を提供する。本方法は、葉酸の個人摂取を増加することを含む。好ましい実施態様では、本方法は、本明細書中に記載したように、異常な葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する疾患または状態のリスクのためのスクリーニングの方法を含む。好ましい実施態様では、遺伝子は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＧＡＲＴからなる群から選択される。
【００５９】
一つの側面では、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する遺伝子の治療可能な障害アレルを蔵匿するための個人のための化学療法の毒性を低減する方法を提供する。本方法は、葉酸の個人の摂取を増加することを含む。好ましい実施態様では、本方法は、本明細書中で記載したように、異常な葉酸塩／ホモシステイン代謝を伴う疾患または状態のリスクをスクリーニングする方法を含む。好ましい実施態様では、遺伝子は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＧＡＲＴからなる群から選択される。
【００６０】
他の側面では、本発明は、補因子を含む調合物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を提供し、ここで前記補因子は、個人の遺伝子的構造（ｍａｋｅｕｐ）により決定される量について存在する。本発明の調合物は、補因子の大多数を含むことができ、ここで前記大多数内に少なくとも前記補因子のサブセットが、個人の遺伝子的構造により決定される量について存在する。一つの実施態様では、補因子は、ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（カルシフェロール）、ビタミンＥ、ビタミンＫ（フィロキノン）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ９（葉酸塩／葉酸）、ビタミンＢ１２（トコフェロール）ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、およびコリンからなる群から選択される。他の実施態様では、前記補因子の大多数は、ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（カルシフェロール）、ビタミンＥ、ビタミンＫ（フィロキノン）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ９（葉酸塩／葉酸）、ビタミンＢ１２（トコフェロール）ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、およびコリンからなる群から選択される少なくとも２の補因子を含む。
【００６１】
いくつかの実施態様では、本発明の調合物は、徐放形態として調製されてもよい。他の実施態様では、本発明の調合物は、経口摂取可能である。調合物は、錠剤またはカプセル形態で、または液体で、単位投薬としてでもよい。調合物は、静脈内、皮下、または筋肉内投与用にまた調製されてもよい。所望するなら、本発明の調合物は、前記個人により、使用のための説明書を添付してもよい。
【００６２】
さらに他の側面では、本発明は：（ａ）補因子を選択すること、ここで前記補因子は、個人の遺伝子的構造により決定される量で存在し；および（ｂ）摂取可能または注射可能な形態で賦形剤と一緒に混合することを含む、調合物を調製するための方法を提供する。一つの実施態様では、選択のステップは、補因子の大多数を選択することを含み、ここで前記大多数内に少なくとも前記補因子のサブセットが、前記個人の遺伝子的構造により決定された量について存在する。他の実施態様では、前記補因子は、前記個人の少なくとも一の個人的な特性に基づき選択され、ここで前記個人的な特性は、体重、身長、ボディマスインデックス、民族、祖先、性別、年齢、家族歴、病歴、運動習慣、および食習慣からなる群から選択される。
【００６３】
関係するが、分離した一つの側面では、本発明は：（ａ）前記個人の生物学的サンプル由来の遺伝的バリアントの大多数の存在または不存在を決定すること、ここで遺伝的バリアントの前記大多数が、表Ａ‐Ｘから選択され；（ｂ）前記の遺伝的バリアントの大部分が、前記生物学的サンプル中で検出されるとき、前記素因を前記補因子の治療可能な症状と決定することを含む、個人についての治療可能な症状の補因子のリスクまたは素因を決定するための方法を提供する。いくつかの実施態様では、遺伝的バリアントの大多数は、少なくとも２、３、４，５，５、７，８，９，１０，２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００またはそれ以上の遺伝的バリアントを含む。他の実施態様では、目的の方法は、さらに前記個人または前記個人の健康管理マネージャーの補因子依存酵素欠乏の前記リスクを報告することを含む。
【００６４】
さらに他の側面では、本発明は：（ａ）前記個人の生物学的サンプル由来の少なくとも一の遺伝的バリアントの存在または不存在を検出すること、ここで前記少なくとも一の遺伝的バリアントが、少なくとも一の遺伝的バリアントを欠損している個人の推奨される量と比して前記補因子の質量の少なくとも１％異なる補因子の推奨される量と互いに関係があり；および（ｂ）前記少なくとも一の遺伝的バリアントが、前記生物学的サンプル中に検出されるとき、前記個人のための補因子の前記異なる量を推奨することを含む、個人のための補因子の量を決定するための方法を提供する。いくつかの実施態様では、遺伝的バリアントは、前記少なくとも一の遺伝的バリアントを欠損する個人に推奨される量よりも少なくとも１％超異なる補因子の推奨される量と互いに関係がある。他の実施態様では、遺伝的バリアントは、前記少なくとも一の遺伝的バリアントを欠損する個人に推奨される量よりも少なくとも１％未満異なる補因子の推奨される量と互いに関係がある。さらに他の実施態様では、遺伝的バリアントは、少なくとも５００％異なる補因子の推奨される量と互いに関係がある。個人は、治療可能な症状の補因子のためのリスクまたは素因を伴う女性であってもよい。
【００６５】
本発明はさらに、分離された核酸またはそれらの補体を提供し、ここで前記核酸は、表Ａ‐Ｚで示す一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。また、本発明の分離された核酸の大多数がその上に固定されたアレイが考慮される。
【００６６】
本発明は：（ｉ）データ処理装置上で第一データセットを提供すること、前記第一データセットは、前記個人の遺伝的バリアントの存在と互いに関係がある情報を含み、ここで、遺伝的バリアントは、個人が、補因子依存酵素欠損のリスクであることを示し；（ｉｉ）データ処理装置上で第二データセットを提供すること、前記第二データセットは、少なくとも一の推奨ライフスタイルで、前記補因子依存酵素欠損とマッチングする情報を含み；および（ｉｉｉ）（ｉ）の遺伝的バリアントに基づいた個人的な栄養アドバイスプランを作成すること、ここで計画は、ステップ（ｉｉ）においてマッチングする少なくとも一の推奨ライフスタイルを含む、を含んでいる個人のための個人的な栄養アドバイスプランを提供するための方法に関連するコンピュータをまた提供する。いくつかの実施態様では、前記個人的なライフスタイルアドバイスプランは、ビタミンサブタイプの推奨される最小および／または最大量を含む。いくつかの実施態様では、第一データセットは、表Ａ‐Ｚから選択される遺伝的バリアントの大多数を含む。他の実施態様では、個人的なライフスタイルアドバイスプランは、前記個人の遺伝的バリアントに基づく量について一またはそれ以上の補因子を含む。所望するなら、本方法は、固有ＩＤコードの使用を伴い、インターネットを経由して個人に計画を送達するためのステップを含む。そのような送達は、例えばアイフォン（Ｉ‐Ｐｈｏｎｅ）（登録商標）を介して、個人または彼／彼女の代理人に無線でなされてもよい。いくつかの実施態様では、計画は、一またはそれ以上のウェブページとハイパーリンクすることを含む。いくつかの他の実施態様では、目的の方法により解析された一またはそれ以上の補因子依存酵素欠損は、葉酸塩／葉酸欠乏である。他の実施態様では、コンピュータ関連方法は、データ処理装置上で第三データセットを包含し、そして前記第三データセットは、前記個人の一またはそれ以上の個人特性上の情報を含む。個人特性は、体重、身長、ボディマスインデックス、民族、祖先、性別、年齢、家族歴、病歴、運動習慣、および食習慣を含むが、それだけには限定されない。本方法の実施では、（ｉ）の第一データセットを提供するためのステップおよび／または（ｉｉ）の第二データセットを提供するためのステップは、前記個人または彼／彼女の代理人によるそれぞれのデータセットの情報を入力することにより実行されてもよい。
【００６７】
本発明は、さらに（ｉ）データ処理装置は、第一データセットおよび／または第二データセットを加工するために構成され、前記第一データセットは、個人の遺伝的バリアントの存在と互いに関係する情報を含み、ここで、遺伝的バリアントは、個人が補因子依存酵素欠損のリスクであり、および前記第二データセットが、少なくとも一の推奨ライフスタイルで、前記補因子依存酵素欠損とマッチングする情報を含んでいることを示し；および（ｉｉ）出力装置は、前記個人の遺伝的バリアントに基づいた個人的な栄養アドバイスプランを作成するために構成され、ここで計画は、（ｉ）についてマッチされた少なくとも一の推奨ライフスタイルを含む、を含んでいるコンピュータシステムを提供する。コンピュータシステムは、本明細書中では、さらに第一データセットおよび／または第二データセット上の情報を入力するために構成された入力装置を含む。いくつかの実施態様では、入力装置は、前記個人の一またはそれ以上の個人特性上の情報を入力するために構成される。
【００６８】
また、本発明において提供されるものは、個人のための個人的栄養アドバイスプランを提供するためのビジネス方法であり：前記個人の生物学的サンプル由来の少なくとも一の遺伝的バリアントの存在または不存在に関する情報を収集すること、ここで、前記少なくとも一の遺伝的バリアントは、前記少なくとも一の遺伝的バリアントを欠損している個人に推奨される量と比べて前記補因子の少なくとも１％異なる補因子の推奨される量と互いに関係があり；および前記少なくとも一の遺伝的バリアントが、前記生物学的サンプル中で検出されるとき、前記個人のための補因子の前記異なる量を推奨すること、を含む。
【００６９】
本明細書中で考慮された方法は、遺伝的バリアントが、前記少なくとも一の遺伝的バリアントを欠損している個人に推奨される量よりも少なくとも１％、５％、１０％、１００％、５００％、１０００％異なる補因子の推奨される量と互いに関係する側面を包含する。目的の方法はまた、遺伝的バリアントが、前記少なくとも一の遺伝的バリアントを欠損している個人に推奨される量よりも少なくとも１％、５％、１０％、１００％、５００％、１０００％異なる補因子の推奨される量と互いに関係がある側面を考慮する。本明細書中で開示された本発明はまた、これに限定されないが、神経管欠損（例えば、二分脊椎症）、口蓋裂、または無脳症を伴う子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）を有すること、または早産を有することを含む補因子の治療可能な症状を包含する。いくつかの実施態様では、目的の個人は、妊娠した女性であり、および前記補因子の治療可能な症状は、二分脊椎症を伴う子孫を有することである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、ｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ細胞の増殖速度およびヒトＭＴＨＦＲの細胞間活性における葉酸補充の効果。（ａ）Ｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ  ＭＥＴ１３一倍体酵母の増殖を、材料および方法で記載したように９６穴プレートで測定した。培地に、示された濃度で、葉酸を追加した。ＦＯＬ３標識した曲線（ＦＯＬ３  ＭＥＴ１３）は、葉酸を追加しない培地での増殖由来である。（ｂ）メチオニン欠乏および示した濃度において葉酸を追加した培地におけるｐｈＭＴＨＦＲで形質転換したｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ  ｍｅｔ１３Δ：：ＫａｎＭＸ一倍体酵母の増殖。３の独立した形質転換体を、試験再現性（ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ）のそれぞれの葉酸濃度で試験した。ｍｅｔ３Δで標識した曲線は、細胞の単一分離を示し、空ベクターで形質転換し、葉酸５０μｇ／ｍｌで増殖した。
【図２】図２は、非同義のＭＴＨＦＲ集団バリアントの機能的影響および葉酸塩治療可能性。（ａ）６ＭＴＨＦＲバリアントを、３の異なる葉酸濃度でメチオニンを欠乏している培地について、ｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ  ｍｅｔ１３Δ：：ＫａｎＭＸ細胞を救済するための能力を試験した。Ｍｌ１０１アレルおよびＭｌ１０１Ａ２２２Ｖ二重置換アレルを、５０および２５μｇ／ｍｌ葉酸のみで試験した。Ｍａｊｏｒで標識された曲線は、集団中でもっとも一般的なＭＴＨＦＲアレルに対応する。それぞれの曲線は、３‐６の独立した形質転換体のプール由来である。（ｂ）ほとんど同じサイズ（３５）のＮ末端触媒ドメインおよびＣ末端制御ドメインに分割されたＭＴＨＦＲタンパク質（６５６アミノ酸）の模式図。すべての非同義の変化の位置を示した。良性の変化をグリーンで示した。１‐４番の変化は、重症度の増加している順について示された葉酸塩治療上のアレルを表す。変化＃５（Ｒ１３４Ｃ）は、ほとんど機能を失い、および葉酸塩治療上として指定されないが、いくぶん葉酸塩増大可能である。
【図３】図３は、ＭＴＨＦＲバリアントの酵素活性。示されたＭＴＨＦＲ構築物で形質転換した細胞由来の酵母粗抽出物を準備し、および本明細書中の記載されたようにＭＴＨＦＲ活性をアッセイした。示された時間についての熱処理を、放射線標識物質の添加前の反応物で行った。測定は、３連アッセイの２の独立したセットの平均であり；エラーバーは、６データポイントの標準偏差である。
【図４】図４は、酵母について再現されたようなＭＴＨＦＲバリアントのためのヘテロ接合体表現型。ＭＴＨＦＲアレルのホモ接合性またはヘテロ接合性を、本明細書中に記載されたように、ｍａｊｏｒ、Ｒ１３４ＣおよびＡ２２２Ｖアレルについて二倍体酵母について再構築した。二倍体を、ゲノムについて統合されたＭＴＨＦＲの単一アレルをそれぞれ表現した一倍体株の交配から取得した。葉酸追加の機能としての増殖を、一倍体に関して正確にアッセイした。
【図５】図５は、酵母中で発現されたヒトＭＴＨＦＲバリアントの免疫ブロットである。（ａ）抽出物を、異なるＭＴＨＦＲを担っている酵母細胞から作り、および本明細書中で記載されたように抗ＨＡ抗体で検出した。Ａ２２２ＶＭ１１０Ｉは、二重置換されたアレイであり；Ｍａｊｏｒは、集団中でもっとも一般的なＭＴＨＦＲアレルを示す。右から２つのレーンは、ｍａｊｏｒアレルおよび非リン酸化Ｔ３４Ａアレル（３７）を並べたものである。（ｂ）機能的影響の重症度を増加する機能としてプロットされるこの研究において同定されたＭＴＨＦＲのすべてのバリアント用の、非リン酸化されたより低いバンドとリン酸化されたより高いバンドのシグナル強度の比。Ｘ軸上のアレルを、活性に関して良性（ｂｅｎｉｇｎ）またはランク順として分類した。すべての良性アレル（Ｍａｊｏｒアレルおよびすべての制御ドメイン変化を含む）を、２のＭＴＨＦＲ種のほとんど同じ比率でプロットしおよび示し、従って記号をオーバーラップした。
【図６】図６は、ヒトＢ酵素：ＣＢＳおよびＣＴＨについての反応性‐Ｂ6用のアッセイ。
【図７】図７は、個人の遺伝子的構造（ｍａｋｅｕｐ）を解析するため、および個人のための補因子の調合（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、補因子治療可能な症状のリスクまたは素因、または両方を検出するための代表的なシステムの模式図。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
発明の詳細な説明
上で記載したように、本発明は、代謝経路内の酵素をコードする遺伝子の障害アレルを同定するため、および補因子治療のそれらの感受性を検出するためのインビボアッセイを提供する。目的の機能的相同性の酵素により相補性を許容する第一変異、および補因子を伴う追加に依存する株をレンダリングする第二変異（または変異群）を含む酵母変異化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は、補因子有効性の機能として酵素相補性の研究のために提供される。有意に、本発明はまた、酵素をコードする遺伝子中の低頻度障害アレルの補因子治療が、驚くべきことに共通であること、およびそれらのアレルが、代謝経路上で著しい影響を集団的に有することができることを証明した。従って、本発明は、酵素をコードする遺伝子中のそのような低頻度障害アレルの検出および性質決定、およびそれらの効果的な治療の決定を特に見据えた診断および予後診断方法を考慮する。
【００７２】
ＭＴＨＦＲの「Ｎ末端触媒ドメイン」は、ヒトＭＴＨＦＲ中の１‐３５９アミノ酸を指す。参照ヒトＭＴＨＦＲｍＲＮＡシークエンスは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ００５９５８で見出され、一方でコードする６５６アミノ酸は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ００５９５８で見出される。
【００７３】
ＭＴＨＦＲにより、機能不全は、野生種ＭＴＨＦＲ活性からの偏差を意味する。酵素機能不全および関連した状態および疾患は、例えば、酵素の比活性における変化、酵素の誤った局在化、酵素のレベルの変化、および他の変化を通じて生じる。
【００７４】
酵素活性およびそれらの補因子との反応性を測定するためのインビボアッセイ。
【００７５】
本明細書中で提供されるアッセイは、機能的相同性の酵母遺伝子について補体変異の酵素をコードする遺伝子のアレルの能力を試験するために使用されてもよく、同様に補因子に対するこれらの酵素の反応性を測定するために使用されてもよい。アッセイは、酵母遺伝子の普通の機能に伴う、およびその機能不全により変化した結果または表現型を測定することを含む。
【００７６】
アッセイは、目的の機能的相同性の酵素により相補性を許容する第一変異、および第一遺伝子の機能に関連のあるアッセイできる表現型のための補因子の追加に依存する株をレンダリングするための第二変異を含む酵母株の使用を含む。
【００７７】
本方法は、（ｉ）酵母細胞内に酵素をコードする遺伝子の試験アレルを導入すること、ここで酵母細胞は、酵素をコードする遺伝子と機能的相同性である第一遺伝子についての第一変異、および酵素機能のため要求される補因子の追加に依存する酵母細胞を与える第二遺伝子（または遺伝子群）を含み、ここで第一変異は、第一遺伝子の機能と関連する酵母の測定可能な特性を変化し；（ｉｉ）増殖培地に補因子を追加すること；および（ｉｉｉ）野生型酵素の存在下よりも試験アレル存在下のほうがより少ない測定可能な特性の修復を検出すること、それによって試験アレルにより、第一遺伝子変異の不完全な相同性を検出すること、および障害アレルとして試験アレルを同定することを含む。追加された補因子の量を変化することにより、障害アレルの補因子利用能の反応性を測定する。
【００７８】
好ましい実施態様では、酵素をコードする遺伝子の試験アレルは、自然発生アレルと、または個人の自然発生遺伝子多型の編集（ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）と順に対応する。好ましい実施態様では、試験アレルは、ヒト遺伝子のアレル、またはヒトアレルの大多数中の個人の遺伝子多型の編集と順に対応する。
【００７９】
好ましい実施態様では、酵母は、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、しかしながら酵母の他の種が使用されてもよい。
【００８０】
一つの実施態様では、二倍体酵母が使用される。二倍体酵母は、試験アレルのためにホモ接合性またはヘテロ接合性であってもよい。二倍体酵母は、試験アレルの結合を含む。本明細書中で証明されるように、機能的障害アレルは、ヘテロ接合性表現型を有するアレルを含む。一つの実施態様では、二倍体酵母は、相補性のために試験されたアレルに関してヘテロ接合性である。一つの実施態様では、二倍体酵母は、野生型アレルおよび酵素をコードする遺伝子の障害アレルを含む。
【００８１】
好ましい実施態様では、アッセイの測定される結果は、増殖である。
【００８２】
好ましい実施態様では、アッセイ方法は、野生型アレルに対応するアレルと目的の試験アレルの活性を比較することを含む。
【００８３】
一つの実施態様では、本発明は、試験アレル、例えば酵素をコードする遺伝子のアレルの活性を決定するためのインビボアッセイを提供する。一つの実施態様では、酵素をコードする遺伝子は、葉酸塩／ホモシステイン代謝を包含または関係する。他の実施態様では、試験アレルは、ＭＴＨＦＲアレル、ＡＴＩＣアレル、ＧＡＲＴアレル、ＭＡＴ１Ａアレル、ＭＡＴ２Ａアレル、およびＭＴＨＦＳアレルからなる群から選択され、そしてアッセイは、さらに葉酸塩状態の機能として活性を決定することができる。他の実施態様では、酵素をコードするアレルは、ＣＴＨアレルおよびＣＢＳアレルからなる群から選択される。
【００８４】
一つの実施態様では、試験アレルは、ＭＴＨＦＲアレルであり、およびＮ末端触媒ドメイン中に少なくとも一の置換およびＣ末端制御領域中に少なくとも一の変異を含む。Ｃ末端領域のみについての置換は、典型的に機能を改悪しない一方、それらは、機能的にアレルを改悪するように他の置換と結合するかもしれない。
【００８５】
好ましい実施態様では、第一変異は、酵母遺伝子ｍｅｔ１３中であり、そしてそれは、野生型ヒトＭＴＨＦＲにより、機能的に補充されてもよい。他の実施態様では、第一酵母遺伝子は、ａｄｅ１６またはａｄｅ１７であり、そしてそれは、野生型ヒトＡＴＩＣにより、機能的に補充されてもよい。一つの実施態様では、第一酵母遺伝子は、ａｄｅ７であり、そしてそれは、野生型ヒトＧＡＲＴにより、機能的に補充されてもよい。一つの実施態様では、第一酵母遺伝子は、ｓａｍ１またはｓａｍ２であり、そしてそれは、野生型ヒトＭＡＴ１Ａまたは野生型ヒトＭＡＴ２Ａにより、機能的に補充されてもよい。一つの実施態様では、第一酵母遺伝子は、ｆａｕ１であり、そしてそれは、野生型ヒトＭＴＨＦＳにより、機能的に補充されてもよい。
【００８６】
好ましい実施態様では、第二変異は、酵母遺伝子ｆｏｌ３中であり、そしてそれは追加された培地中の葉酸塩に依拠する酵母を与える。そのような酵母株は、試験アレルの活性、第一変異に依存する試験アレル、および葉酸塩状態に対するそれらの反応を決定するために使用されてもよい。例えば、酵母遺伝子ｍｅｔ１について第一変異、および酵母遺伝子ｆｏｌ３について第二変異を有する酵母化合物は、ＭＴＨＦＲアレルの活性および葉酸状態に対するそれらの反応を決定するために使用されてもよい。
【００８７】
好ましい実施態様では、アッセイ方法は、試験アレルによりコードする酵素が、葉酸塩利用能に感受性であるかどうかを決定するために葉酸塩の量を変更することを含む。好ましい実施態様では、アッセイ方法は、５０μｇ／ｍｌ未満の葉酸塩の存在の結果を測定することを含む。好ましい実施態様では、アッセイ方法は、約５０μｇ／ｍｌの葉酸塩の存在の結果を測定することを含む。好ましい実施態様では、アッセイ方法は、５０μｇ／ｍｌ超の葉酸塩の存在の結果を測定することを含む。
【００８８】
一つの実施態様では、葉酸塩は、酵素をコードする遺伝子の障害アレルが、葉酸塩により治療可能であるかどうかを決定するために変更される。
【００８９】
他の実施態様では、第一酵母遺伝子は、ｃｙｓ３であり、および第二酵母遺伝子は、六倍（六重）‐欠失ｓｎｏ１Δｓｎｏ２Δｓｎｏ３Δｓｎｚ１Δｓｎｚ２Δｓｎｚ３Δである。そのような酵母株は、ＣＴＨアレルの活性、およびビタミンＢ6の状態に対してのそれらの反応を決定するために使用されてもよい。従って、一つの実施態様では、本発明は、ＣＴＨアレルの活性を決定するためのインビボアッセイを提供し、そしてそれは、さらにビタミンＢ6の状態の機能として活性を決定することができる。好ましい実施態様では、ＣＴＨアレルは、自然発生ヒトアレルを含む。他の好ましい実施態様では、ＣＴＨアレルは、個人のヒトＣＴＨアレルの編集を含む。
【００９０】
他の実施態様では、第一酵母遺伝子は、ｃｙｓ４であり、および第二酵母遺伝子は、六倍（六重）‐欠失ｓｎｏ１Δｓｎｏ２Δｓｎｏ３Δｓｎｚ１Δｓｎｚ２Δｓｎｚ３Δである。そのような酵母株は、ＣＢＳアレルの活性、およびビタミンＢ6の状態に対してのそれらの反応を決定するために使用されてもよい。従って、一つの実施態様では、本発明は、ＣＢＳアレルの活性を決定するためのインビボアッセイを提供し、そしてそれはさらにビタミンＢ6の状態の機能として活性を決定することができる。好ましい実施態様では、ＣＢＳアレルは、自然発生ヒトアレルを含む。他の好ましい実施態様では、ＣＢＳアレルは、個人のヒトＣＢＳアレルの編集を含む。
【００９１】
以下の表１は、酵素をコードする遺伝子のリストであり、および酵素をコードする遺伝子のアレルの活性を決定するために使用されてもよい酵母変異の代表的な化合物を提供する。
【００９２】
【表１】
2013506689.tif 000002
【００９３】
酵母株は、当該技術分野において周知な方法により、産生されてもよい。例えば、Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ，２７４：３２６１３‐３２６１８，１９９９を参照。
【００９４】
酵母株内への核酸の導入は、当該技術分野において周知な方法を使用することで行われてもよい。例えば、Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ，２７４：３２６１３‐３２６１８，１９９９を参照。
【００９５】
酵素をコードする遺伝子のアレル
【００９６】
実施例の項で記載したように、わずかに酵素に影響を及ぼす、例えば酵素をコードする遺伝子の障害アレルの結果生じる単一ヌクレオチド遺伝子多型は、アレルの頻度にかかわらず本明細書中に開示されたインビボアッセイを使用することにより特徴づけられてもよい。例えば、本明細書中に開示された方法は、アレルが障害アレルかどうか、および仮にそうなら、障害アレルが、補因子治療可能であるかどうかを決定するために使用される。表４および表Ａ‐Ｆ中で提供されるものは、本明細書中に記載されたアッセイにより特徴づけられる（表４）または特徴づけられてもよい（表Ａ‐Ｆ）酵素をコードする遺伝子ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２ＡおよびＧＡＲＴのための単一ヌクレオチド遺伝子多型である。これらの表は、また、以前に同定されなかったこれらの遺伝子のためのＳＮＰ（複数）を提供する。従って、本明細書中で開示されたものは、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＧＡＲＴからなる群から選択される酵素をコードする遺伝子のためのアレルである。また、本明細書中で提供されるものは、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＧＡＲＴ、同様に、ＡＨＣＹ、ＡＭＴ、ＣＢＳ、ＣＴＨ、ＤＨＦＲ、ＦＰＧＳ、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＨＦＤ２、ＭＴＲ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２、またはＴＹＭＳ、表Ａ‐Ｘ中に列挙されたそれらのものなどの遺伝子の遺伝的バリアントである。
【００９７】
これらのアレルは、本明細書中に開示されたアッセイを使用することにより特徴づけられてもよく、および本明細書中で開示されたようにスクリーニング、予防および治療の方法について有利に検出されてもよい。当業者は、治療可能な補因子として障害アレルの特徴づけが、本明細書中に開示したようにスクリーニング、予防および治療の方法を伝えることを理解しおよび評価するであろう。
【００９８】
本明細書中で使用されるように、「アレル」は、一塩基多型（ＳＮＰ）などのヌクレオチドシークエンスであり、ゲノム中の一超の形態について存在する。本明細書中で使用される「アレル」は、ゲノム遺伝子座の自然発生シークエンスに限定されない。「アレル」は、そこから由来の転写物およびスプライスされたシークエンスを含む（ｍＲＮＡシークエンス、ｃＤＮＡシークエンス）。「アレル」は、自然発生アレルまたは合成アレルであってもよい。これらは、Ｎ末端触媒ドメインについての変異と同様にＣ末端制御領域についての変異であってもよい。
【００９９】
「ホモ接合性」は、本発明によれば、遺伝子の２つの複製またはＳＮＰが、他のアレルに対してシークエンスについて同一であることを示す。例えば、酵素をコードする遺伝子の野生型アレルのための対象ホモ接合性は、シークエンスの少なくとも２つの同一の複製を含む。そのような対象は、代謝経路内での補因子依存酵素欠損に対して素因とならないであろう。
【０１００】
本明細書中で使用されるように「ヘテロ接合性」は、アレルの２つの異なる複製、例えば、野生型アレルの一つの複製およびバリアントアレルの一つの複製が、ゲノム中に存在することを示し、そしてそれは、障害アレルであろう。そのようなゲノムを有する対象は、ヘテロ接合性であり、および代謝疾患内の補因子依存酵素欠損に対する素因となるであろう。「ヘテロ接合性」はまた、そのアレルについて２つの異なる変異を有する対象を包含する。
【０１０１】
「障害アレル」により、機能的に障害代謝酵素をコードする遺伝子のアレルを意味し、そして機能的障害性は、補因子治療可能かもしれずまた可能でないかもしれない。
【０１０２】
「障害アレル変異」は、障害アレルの機能的障害性を基礎となし、および変異の位置で野生型シークエンスから障害アレルを区別する特定の核酸変異を指す。典型的に、障害アレル変異は、単一コドンについて非同義の点突然変異である。
【０１０３】
「補因子治療可能（ｃｏｆａｃｔｏｒ‐ｒｅｍｅｄｉａｂｌｅ）」は、障害代謝酵素の機能的障害性を補うための改変した（ａｌｔｅｒｅｄ）補因子レベル能力を指す。
【０１０４】
補因子の追加（補充）は、補因子に変換することができる補因子の前駆体の補充を含む。
【０１０５】
「補因子」は、目的の酵素の直接の補因子（例えば、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＭＴＨＦＳのための葉酸塩）である因子、同様に目的の酵素のために間接の補因子である因子を指す。従って、補因子は、酵素機能に直接のまたは間接の強い影響を与える。
【０１０６】
当該技術分野で知られる頻度の測定は、アレル頻度、すなわち特定のＳＮＰを有する集団について遺伝子の機能を含む。任意の遺伝子のためのアレル頻度は、１に総計されるべきである。当該技術分野で知られる頻度の他の測定は、「ヘテロ接合性頻度」、すなわち、２つのアレル、または遺伝子のＳＮＰの２つの形態、それぞれの親由来の遺伝性の一つを伝える集団についての個人の機能である。代替的に、特定のアレルのためのホモ接合性である個人の数は、有効な測定であるかもしれない。アレル頻度、ヘテロ接合性頻度、およびホモ接合性頻度の間の関係は、ハーディ‐ワインベルク平衡により多くの遺伝子のために記載されており、そしてそれは、平衡で自由に交配した集団中で、アレイ頻度、ヘテロ接合性頻度、およびホモ接合性頻度の間の関係を提供する。たいていのヒト分散は、実質的に、ハーディ‐ワインベルク平衡である。本明細書中で使用されるように、「低頻度アレル」は、４％未満のアレル頻度を有する。
【０１０７】
本明細書中の開示は、葉酸塩／ホモシステイン代謝を包含するまたは関係するヒト酵素をコードする遺伝子のためのアレルである。「葉酸塩／ホモシステイン代謝」によりは、葉酸塩および／またはホモシステイン代謝を意味する。そのような酵素をコードする遺伝子は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＴＨＦＳを含む。Ｈｕｇｏ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＧＮＣ）シンボル、ＧｅｎｅＩＤｓ、ＮＣＢＩヌクレオチドアクセッション番号（ＮＣ）、ＮＣＢＩポリペプチドアクセッション番号（ＮＢ＿）および葉酸塩／ホモシステイン代謝を包含するまたは関係する酵素をコードする遺伝子名は、表２において提供する。
【０１０８】
【表２】
2013506689.tif 000003
【０１０９】
ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＡＨＣＹ、ＡＨＣＹＬ１ＡＨＣＹＬ２、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＡＬＤＨＬ２、ＡＭＴ、ＢＨＭＴ１、ＢＨＭＴ２、ＣＢＳ，ＣＴＨ、ＤＨＦＲ、ＤＭＧＤＨ、ＦＰＧＳ、ＧＧＨ、ＭＴＦＭＴ、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＨＦＤ２、ＭＴＲ、ＭＴＲＲ、ＮＡＡＬＡＤ２、ＳＡＲＤＨ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２またはＴＹＭＳを含むＭＴＨＦＳ以外の他の酵素をコードする遺伝子は、それらすべてが表３中に示される。遺伝的バリアントは、表Ａ‐Ｚ中にそれらの任意を列挙し、およびそれらは個人の遺伝子的構造について検出できおよび個人のための調合物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）用の、一またはそれ以上補因子、または一またはそれ以上の補因子の量を選択するために使用できる。表Ｇ‐Ｘ中に示されたように、（遺伝子）多型表現型の決定（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）（「ポリフェン（Ｐｏｌｙｐｈｅｎ）」例えば、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｂｗｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｐｐｈ／を参照）、ＳＩＦＴ（Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ｉｎｔｏｌｅｒａｎｔ  Ｆｒｏｍ  Ｔｏｌｅｒａｎｔ、例えば、Ｎｇ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３  ｊｕｌｙ  １；３１（１３）：３８１２‐３８１４）を参照）、ＭＡＦ（少数のアレル頻度（Ｍｉｎｏｒ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）およびＨＷＥ（ハーディワインベルク平衡）が、遺伝的バリアントを決定してもよい。いくつかの実施態様では、これらからの情報は、遺伝的バリアントの機能的影響についての情報を提供するために使用でき、または補因子依存酵素欠損のリスクまたは補因子の治療可能な症状を決定するために使用できる。いくつかの実施態様では、遺伝的バリアントの機能的影響は、本明細書中で開示された酵母アッセイなどのインビボアッセイにより決定できる。
【０１１０】
【表３】
2013506689.tif 000004
【０１１１】
一つの側面では、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連するヒト酵素をコードするアレルと順に対応する単離された核酸を提供する。例えば、本発明は、ＭＴＨＦＲアレル、ＡＴＩＣアレル、ＧＡＲＴアレル、ＭＡＴ１Ａアレル、ＭＡＴ２Ａアレル、およびＭＴＨＦＳアレルからなる群から選択される酵素をコードするアレルと順に対応する単離された核酸を提供し、そしてそれは、補因子治療可能であってもよくまたはなくてもよい。これらのアレルは、低頻度アレルを含む。これらのアレルは、障害アレルを含む。アレルはまた、ＡＨＣＹ、ＡＨＣＹＬ１、ＡＨＣＹＬ２、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＡＬＤＨＬ２、ＡＭＴ、ＢＨＭＴ１、ＢＨＭＴ２、ＣＢＳ、ＣＴＨ、ＤＨＦＲ、ＤＭＧＤＨ、ＦＰＧＳ、ＦＴＣＤ、ＧＧＨ、ＭＴＦＭＴ、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＨＦＤ２、ＭＴＲ、ＭＴＲＲ、ＮＡＡＬＡＤ２、ＳＡＲＤＨ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２またはＴＹＭＳアレルであってもよい。
【０１１２】
従って、本明細書中で提供されるものは、ＭＴＨＦＲ遺伝子のアレルと順に対応する単離された核酸であり、ここで前記核酸は、ＭＴＨＦＲ遺伝子の４０７８ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の４２３４ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の５７３３ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の５８７２ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の６６４２ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の６６５７ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の６６８１ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の６７７４ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の１０９０６ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の１１６５６ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の１１６６８ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の１１９０２ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の１２２３２ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の１２６２２ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の１２７５９ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の１３０４０ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の１４５９３ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の１４６１２ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の１４７０５ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の１６１７０ヌクレオチド；ＭＴＨＦＲ遺伝子の１６４０１ヌクレオチド；およびＭＴＨＦＲ遺伝子の１６４５１ヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチドについて見出されるＳＮＰを含む。ＳＮＰｓまたはＭＴＨＦＲの遺伝的バリアントの例は、表ＡおよびＳ中で提供される。
【０１１３】
また本明細書中で提供されるのは、ＡＴＩＣ遺伝子のアレルと順に対応する単離された核酸であり、ここで前記核酸は、ＡＴＩＣ遺伝子の１１００ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１１１４ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１１７９ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１２４４ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１２７０ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１２８８ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１３０１ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１３８０ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１３９６ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１４５３ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１５０６ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１６８９ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の７２２７ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の７２３２ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の７３８８ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の８７５６ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の８８０８ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１４０９９ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１４１４０ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１４１４４ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１４１８３ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１４２２９ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１４２３８ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１４２４５ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１４２６０ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１４４８９ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１４９７０ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１５００３ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１５０４０ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１５０４３ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１５１４９ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１５２４０ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１５８４４ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の１６０６３ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２１３６３ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２１３７２ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２１４００ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２１５２１ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２１６１１ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２２１８７ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２２２７３ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２２２８２ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２２２９１ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２２３４２ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２２５１２ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２２５１９ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２２５３８ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２２５６４ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２２５８９ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２２７３７ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２４９９２ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２５００９ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２７７５７ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２７８５５ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２７９８５ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の２８０１５ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３３９０１ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３３９１９ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３３９２０ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３３９３３ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３５７２３ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３５７３７ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３５７４２ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３５８４０ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３５９１７ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３５９６８ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３５９７３ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３８３３８ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３８３４２ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３８４３７ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３８３４２ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３８５８２ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３８６２７ヌクレオチド；ＡＴＩＣ遺伝子の３８６６７ヌクレオチド；およびＡＴＩＣ遺伝子の３８７２５ヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチドについて見出されるＳＮＰを含む。ＳＮＰｓまたはＡＴＩＣの遺伝的バリアントの例は、表ＢおよびＩ中で提供される。
【０１１４】
また本明細書中で提供されるものは、ＭＴＨＦＳ遺伝子のアレルと順に対応する単離された核酸であり、ここで前記核酸は、ＭＴＨＦＳ遺伝子の８８０８ヌクレオチド；ＭＴＨＦＳ遺伝子の８９１２ヌクレオチド；ＭＴＨＦＳ遺伝子の８９５７ヌクレオチド；ＭＴＨＦＳ遺伝子の８９９８ヌクレオチド；ＭＴＨＦＳ遺伝子の５２５６０ヌクレオチド；ＭＴＨＦＳ遺伝子の５２８７８ヌクレオチド；およびＭＴＨＦＳ遺伝子の５２９０２ヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチドについて見出されるＳＮＰを含む。ＳＮＰｓまたはＭＴＨＦＳの遺伝的バリアントの例は、表ＣおよびＴ中で提供される。
【０１１５】
また本明細書中で提供されるものは、ＭＡＴ１Ａ遺伝子のアレルと順に対応する単離された核酸であり、ここで前記核酸は、ＭＡＴ１Ａの５０４５ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの５１８１ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの５２３３ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの６７３９ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの６７９５ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの９８３３ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１０００６ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１０３１２ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１０３３９ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１０３７４ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１０４８４ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１０５５５ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１４０３８ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１４１１４ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１４１７７ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１５４２４ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１５５００ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１５６４６ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１５７０６ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１５７１５ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１５７３０ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１５７５８ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１６１３３ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１６１７４ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１５７０６ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１５７１５ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１５７３０ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１５７５８ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１６１３３ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１６１７４ヌクレオチド；ＭＡＴ１Ａの１６２１８ヌクレオチド；およびＭＡＴ１Ａの１６９７１ヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチドについて見出されるＳＮＰを含む。ＳＮＰｓまたはＭＡＴ１Ａの遺伝的バリアントの例は、表ＤおよびＯ中で提供される。
【０１１６】
また本明細書中で提供されるものは、ＭＡＴ２Ａ遺伝子のアレルと順に対応する単離された核酸であり、ここで前記核酸は、ＭＡＴ２Ａ遺伝子の２８７１ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の２８７３ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の２９３９ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の３２８７ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の３３９４ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の３４６６ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の３４９８ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の３６５０ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の３７０４ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の４１７４ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の４４４９ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の４４７６ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の４６０８ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の４６６０ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の４６９２ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の４９３１ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の５３１３ヌクレオチド；ＭＡＴ２Ａ遺伝子の５４６０ヌクレオチド；およびＭＡＴ２Ａ遺伝子の５４８０ヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチドについて見出されるＳＮＰを含む。ＳＮＰｓまたはＭＡＴ２Ａの遺伝的バリアントは、表ＥおよびＰ中で提供される。
【０１１７】
また本明細書中で提供されるものは、ＧＡＲＴ遺伝子のアレルと順に対応する単離された核酸であり、ここで前記核酸は、ＧＡＲＴ遺伝子の３７８２ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の３８４２ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の７７４５ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の７９８４ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１０７７５ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１１５２１ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１１５２２ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１１５４１ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１２３５６ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１４２００ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１４２７３ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１４２８２ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１４７３９ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１４７８１ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１８０５５ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１８０６４ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１８１３０ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１８１４２ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１８１９７ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１８２３２ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の１８４０１ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の２０８１２ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の２０８２５ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の１６１７４ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の１５７０６ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の２０８６２ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の２２４８１ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の２２５２１ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の２５４２５ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の２５４３３ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の２５６０１ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の２５８６７ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の２５９１２ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の２５９５１ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の２５９５６ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の２６１２７ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の２６１９５ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の３１６２７ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の３１６４１ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の３１８８７ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の３１９０２ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の３１９３３ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の３３１７３ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の３３２６４ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の３１９３３ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の３３１７３ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の３３２６４ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の３３２８６ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の３６９６３ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の３６９６４ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の３７４２８ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の３７４３３ヌクレオチド；ＣＡＲＴ遺伝子の３８７６２ヌクレオチド；ＧＡＲＴ遺伝子の３８９１４ヌクレオチド；およびＣＡＲＴ遺伝子の３８９８９ヌクレオチドからなる群から選択されるＧＡＲＴ遺伝子中のヌクレオチドについて見出される一のＳＮＰを含む。ＳＮＰｓまたはＧＡＲＴの遺伝的バリアントの例は、表ＦおよびＮ中で提供される。
【０１１８】
また本明細書中で提供されるものは、ＡＨＣＹ、ＡＨＣＹＬ１、ＡＨＣＹＬ２、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＡＬＤＨＬ２、ＡＭＴ、ＡＴＩＣ、ＢＨＭＴ１、ＢＨＭＴ２、ＣＢＳ、ＣＴＨ、ＤＨＦＲ、ＤＭＧＤＨ、ＦＰＧＳ、ＧＡＲＴ、ＧＧＨ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＴＦＭＴ、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＨＦＤ２、ＭＴＨＦＲ、ＭＴＨＦＳ、ＭＴＲ、ＭＴＲＲ、ＮＡＡＬＡＤ２、ＳＡＲＤＨ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２またはＴＹＭＳのアレルについて配列決定を含む単離された核酸である。核酸は、ＳＮＰなどの遺伝的バリアントである。いくつかの実施態様では、アレルは、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＧＡＲＴ、ＡＨＣＹ、ＡＭＴ、ＣＢＳ、ＣＴＨ、ＤＨＦＲ、ＦＰＧＳ、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＨＦＤ２、ＭＴＲ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２、またはＴＹＭＳ、表Ａ‐Ｘ中で列挙されたそれらなどの遺伝的バリアントを含む。例えば、アレルは、ＡＨＣＹ、ＡＭＴ、ＣＢＳ、ＣＴＨ、ＤＨＦＲ、ＦＰＧＳ、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＨＦＤ２、ＭＴＲ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２、またはＴＹＭＳ、表Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｕ、Ｖ、ＷまたはＸ中で列挙されたそれらの遺伝的バリアントを含んでもよい。単離された核酸、またはそれらの補体は、表Ａ‐Ｘ中で示されるなどの遺伝的バリアントまたはＳＮＰを含む。
【０１１９】
また本明細書中で提供されるものは、ＡＨＣＹ、ＡＨＣＹＬ１、ＡＨＣＹＬ２、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＡＬＤＨＬ２、ＡＭＴ、ＡＴＩＣ、ＢＨＭＴ１、ＢＨＭＴ２、ＣＢＳ、ＣＴＨ、ＤＨＦＲ、ＤＭＧＤＨ、ＦＰＧＳ、ＧＡＲＴ、ＧＧＨ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＴＦＭＴ、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＨＦＤ２、ＭＴＨＦＲ、ＭＴＨＦＳ、ＭＴＲ、ＭＴＲＲ、ＮＡＡＬＡＤ２、ＳＡＲＤＨ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２、またはＴＹＭＳの遺伝的バリアント、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＧＡＲＴ、ＡＨＣＹ、ＡＭＴ、ＣＢＳ、ＣＴＨ、ＤＨＦＲ、ＦＰＧＳ、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＨＦＤ２、ＭＴＲ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２、またはＴＹＭＳの遺伝的バリアントなど、表Ａ‐Ｘ中で列挙されたそれらなどを検出するための、約１０‐約１００、約２０‐約５０、または少なくとも約１０、１５、または２０ヌクレオチドなどのプローブである。
【０１２０】
一つの実施態様では、本発明は、Ｍ１１０Ｉ、Ｈ２１３Ｒ、Ｄ２２３Ｎ、Ｄ２９１Ｎ、Ｒ５１９Ｃ、Ｒ５１９ＬおよびＱ６４８Ｐからなる群から選択されるＭＴＨＦＲタンパク質について非同義の変異をコードするシークエンスを含むヒトＭＴＨＦＲアレルと順に対応する単離された核酸を提供する。一つの実施態様では、本発明は、Ｍ１１０Ｉ、Ｈ２１３Ｒ、Ｄ２２３Ｎ、Ｄ２９１Ｎ、Ｒ５１９Ｃ、Ｒ５１９Ｌ、およびＱ６４８Ｐからなる群から選択されるＭＴＨＦＲタンパク質について非同義の変異をコードするシークエンスを含む二またはそれ以上のヒトＭＴＨＦＲアレルと順に対応する核酸を提供する。
【０１２１】
本明細書中で使用される用語「単離された」は、他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または自然に付随する他の物質を実質的に除去したポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドシークエンスは、ＤＮＡおよびＲＮＡシークエンスを含む。
【０１２２】
本明細書中で提供される核酸は、本明細書中で開示された検出のための方法において、プローブ（例えば、アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ）またはプライマーとして有用であってもよい。この目的のための適当なプローブまたはプライマーの設計は、いくつかの因子の考慮を必要とする。例えば、１０、１５、または１８ヌクレオチドから約２０、または３０ヌクレオチドの間の長さを有するフラグメントは、特定の有用性を見出すであろう。より長いシークエンス、例えば、４０、５０．８０、９０、１００、さらに全長までは、ある実施態様のためにさらにより好ましい。少なくとも約１８‐２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの長さは、アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブとして有用であるために、十分に特異的なハイブリダイゼーションを許容するため十分なように、当業者により、よく容認される。さらに、想像された適用に依拠して、目的シークエンスついてのプローブの選択性の変化する程度を達成するためにハイブリダイゼーションの変化する条件を利用することを望むであろう。高選択性を必要とする適用のため、ハイブリッド形成のための相対的にストリンジェントな条件を利用することを典型的に望むであろう。例えば、相対的に低い塩および／または高い温度状態、０．０２Ｍ‐０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、約５０℃‐約７０℃の温度などである。そのような選択的な条件は、もしプローブおよびテンプレートまたは標的ポリヌクレオチドフラグメントの間にミスマッチがあれば、ほとんど許容しないであろう。
【０１２３】
また提供されるものは、本発明の核酸を含むベクターである。これらのベクターは、適当な宿主細胞で本発明の核酸の発現を提供する発現ベクターを含む。
【０１２４】
そのうえ、提供されるものは、本発明の核酸を含む宿主細胞である。また提供されるものは、本発明のベクターを含む宿主細胞である。本発明はまた、本発明の核酸によりコードする酵素を生産するための方法を提供し、そしてその方法は、本発明の宿主細胞を培養することを含む。
【０１２５】
また提供されるものは、本発明の核酸によりコードする単離された酵素である。
【０１２６】
障害アレルの検出
【０１２７】
本明細書中で開示された方法（例えば、代謝経路に関する遺伝子の障害アレルと関連する状態または疾患をスクリーニングし、予防し、および／または治療するための方法）は、一般的に、障害アレルの結果生じる代謝経路内での少なくとも一の酵素をコードする遺伝子について一塩基多型（ＳＮＰｓ）の大多数の存在または不存在を検出するために必要であり、好ましくは試験遺伝子中の既知のＳＮＰ５の大多数である。アレルおよび／または予定されたＳＮＰシークエンスは、アレル特異的ハイブリダイゼーション、通常および障害アレルの間の識別を可能にするシークエンス依存型技術により検出されてもよい。アレル特異的アッセイは、マッチするシークエンス（例えば、通常：通常または障害：障害）と比較されるように、それぞれとハイブリダイズするためのミスマッチされた核酸シークエンス（例えば、通常：障害）の分化能に依拠する。
【０１２８】
方法の多様性は、個人についての一またはそれ以上の一塩基多型の存在を検出するために利用可能である。この分野についての進歩は、正確な、容易な、および高価でない大規模ＳＮＰ遺伝子型同定を提供してきた。ごく最近、例えば、ダイナミック  アレル‐スペシフィック  ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシークエンス法、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、同様に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰチップなどの様々なＤＮＡチップ技術を含むいくつかの新しい技術が、記述されている。これらの方法は、典型的にＰＣＲによる試験遺伝子の増幅を必要とするであろう。侵襲的開裂（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃｌｅａｖａｇｅ）による小シグナル分子の生産、それに続くマススペクトロメトリー又は固定化パドロックプローブ（ｐａｄｌｏｃｋ ｐｒｏｂｅ）及びローリングサークル増幅に基づく、他の新たに開発された方法は、最終的には、ＰＣＲの必要をなくす。特定の一塩基多型を検出するための当該技術分野で公知のいくつかの方法を以下に概要を述べる。本発明の方法は、すべての利用可能な方法を含むものと理解される。
【０１２９】
いくつかの方法は、一塩基多型の解析を容易にするために開発されてきた。一つの実施態様では、一塩基多型は、例えば、Ｍｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ．（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６５６，１２７）において開示されるように、特定化されたエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを使用することにより検出できる。当該方法によると、アレルの３’に隣接したアレルシークエンスに相補的なプライマーを、特定の動物またはヒトから得られた標的分子とハイブリダイズさせることができる。仮に、この標的分子上のアレルが、存在している特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含むならば、その誘導体はハイブリダイズしたプライマーの末端に取り込まれるであろう。このような取り込みはプライマーをエキソヌクレアーゼに対し耐性とし、それによりその検出を可能とする。サンプルのエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の実体は既知であることから、プライマーがエキソヌクレアーゼに耐性となったという発見は、標的分子のアレルに存在するヌクレオチドが、反応に使用したヌクレオチド誘導体のアレルと相補的であることを示す。この方法は、大量の外来性のシークエンスデータの決定を必要としないという利点を有する。
【０１３０】
本発明の他の実施態様では、アレルのヌクレオチドの同一性を決定するために、溶液に基づく方法を使用する。Ｃｏｈｅｎ，Ｄ． ｅｔ ａｌ．（フランス特許２，６５０，８４０；ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）。米国特許第４６５６１２７号のＭｕｎｄｙの方法のように、アレルの３’に隣接するアレルシークエンスに相補的なプライマーを使用する。この方法は、標識されたジデオキシヌクレオチド誘導体を使用して、その部位のヌクレオチドの同一性を決定するものであるが、この誘導体は、もし当該アレルのヌクレオチドに相補的であるならば、プライマーの末端に取り込まれるであろう。
【０１３１】
ジェネティック  ビット  アナリシスまたはＧＢＡとして既知の代替的な方法が、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（ＰＣＴ出願第ＷＯ９２／１５７１２号）により記載される。Ｇｅｏｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．の方法は、標識されたターミネーターおよびアレルの３シークエンスに相補的なプライマーの混合物を使用する。よって、取り込まれるこの標識されたターミネーターは、試験遺伝子のアレル中に存在するヌクレオチドに相補的であって、かつこれにより決定される。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（フランス特許２，６５０，８４０；ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）の方法とは対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、プライマー又は標的分子を固相に固定化する、不均一相アッセイ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｈａｓｅ ａｓｓａｙ）であることが好ましい。
【０１３２】
近年、ＤＮＡ中のアレルをアッセイするためのいくつかのプライマーにより誘導するヌクレオチド取り込み方法が記載されてきた（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９‐７７８４（１９８９）；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．‐Ｃ．， ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８：６８４‐６９２（１９９０）； Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３‐１１４７（１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９‐１６４（１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＧＡＴＡ ９：１０７‐１１２（１９９２）；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１‐１７５（１９９３））。これらの方法はすべて、アレルの塩基を識別するのに標識されたデオキシヌクレオチドの取り込みに頼っている点で、ＧＢＡ（登録商標）とは相違している。このような形式では、シグナルは、取り込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドのランに存在する多型は、そのランの長さに比例するシグナルを生ずる（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．‐Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６‐５９（１９９３））。
【０１３３】
任意の細胞種類または組織は、本明細書中で記載された診断において使用するための核酸サンプルを取得するために利用されてもよい。好ましい実施態様では、ＤＮＡサンプルは、体液、例えば、既知の技術（例えば、静脈穿刺）により取得された血液、または唾液から得る。代替的に、核酸試験は、乾燥サンプル（例えば、毛髪または皮膚）で行うことができる。ＲＮＡまたはタンパク質を使用したとき、利用してもよい細胞または組織は、酵素をコードする遺伝子を発現していなければならない。
【０１３４】
検出方法は、核酸の精製が必要とならないよう、生検又は切除から得られる患者組織の（固定化および／または凍結した）組織切片について、インサイチュで直接実施される場合もある。核酸試薬をこのようなインサイチュ方法のためにプローブおよび／またはプライマーとして使用できる（例えば、Ｎｕｏｖｏ，Ｇ．Ｊ．，１９９２，ＰＣＲ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照）。
【０１３５】
主として１個の核酸シークエンスの検出に焦点を絞った方法に加えて、次の検出スキームでもプロファイルを評価することができる。例えば、ディファレンシャルディスプレイ法、ノーザン解析および／またはＲＴ‐ＰＣＲを利用することにより、フィンガープリントプロファイルを作製できる。
【０１３６】
好ましい検出方法は、酵素をコードする遺伝子の少なくとも一のアレルの領域を重複しているプローブを使用するアレル特異的ハイブリダイゼーションである。
【０１３７】
アレル特異的ハイブリダイゼーションを使用する障害アレルの検出
【０１３８】
当該技術分野において周知の様々な方法が、アレル特異的ハイブリダイゼーションにより障害アレルの検出のために使用されてもよい。好ましくは、試験アレルは、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）でプローブされ、およびそれぞれのＡＳＯは、既知のアレルのシークエンスを含む。ＡＳＯ解析は、標的ポリヌクレオチドフラグメントをハイブリダイズするためのアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブの能力を試験することにより、標的ポリヌクレオチドフラグメント中の特定シークエンス置換を検出する。好ましくは、アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブは、障害アレルの標的シークエンス（またはその補体（相補配列））を含む。標的ポリヌクレオチドフラグメント中の障害アレルの存在は、野生型アレルのシークエンスを含むオリゴヌクレオチドプローブが標的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしない条件下での、アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリヌクレオチドフラグメントとの間のハイブリダイゼーションにより示される。障害アレルのシークエンスを有するアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリヌクレオチドフラグメントの間のハイブリダイゼーションの不存在は、標的フラグメントについて障害アレルが存在しないことを示す。
【０１３９】
一つの実施態様では、試験遺伝子（複数）は、標準的なドットブロット形式でプローブされてもよい。ＡＳＯと対応するシークエンスを含む試験遺伝子内のそれぞれの領域は、固相表面上に個別に、例えば膜上に個別のドットとして、アプライされる。それぞれ個別の領域は、例えば、当該技術分野で周知の方法を使用して、個別のＰＣＲ増幅産物として生産され得る（例えば、Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．，１９８７，米国特許第４，６８３，２０２号の実施態様を参照）。
【０１４０】
ＡＳＯ解析を実行するためのドットブロット形式の変法として使用され得る膜に基づく形式には、これらに限定されないが、リバースドットブロット（多重増幅アッセイ）、および多重アレル特異的診断アッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｌｌｅｌｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｓｓａｙ（ＭＡＳＤＡ））がある。
【０１４１】
リバースドットブロット形式において、例えば既知のシークエンスを有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドプローブは、固相表面上に固定化され、および続いて標識された試験ポリヌクレオチドフラグメントを含む試料とハイブリダイズされる。この場合において、標識された試験ポリヌクレオチドフラグメントを含む試料を調製するために、増幅に先立ち、プライマーが標識されるか、またはＮＴＰが標識されてもよい。代替的に、試験ポリヌクレオチドフラグメントは、単離および／または合成後に標識される場合もある。多重形式において、個々の試料は、ただ単一な標的シークエンスの代わりに、試験遺伝子中の複数の標的シークエンスを含む。例えば、それぞれ少なくともＡＳＯ標的シークエンスの一つを含む複数のＰＣＲ産物が、同一のサンプルドット内にアプライされる。複数のＰＣＲ産物は、Ｃａｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５８２，９８９号の方法を使用して、単一の増幅反応で同時に生産され得る。従って、対応するシークエンスがサンプルドット中に現れるそれぞれのＡＳＯにより、同一のブロットがプローブされ得る。
【０１４２】
ＭＡＳＤＡ形式は、各ブロットをプローブするために、複数のＡＳＯを使用する（複数の標的シークエンスを有するドットを含む）ことにより、多重形式の複雑さのレベルを拡張する。この方法は、Ａ．Ｐ．Ｓｈｕｂｅｒの米国特許第５，５８９，３３０号及びＭｉｃｈａｌｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５９（４）：Ａ２７２，ｐｏｓｔｅｒ  １５７３（Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９６）に記載されており、それぞれ全体を参照することにより本明細書中に組み込む。第一に、複数のＡＳＯプローブと固定化サンプルとの間のハイブリダイゼーションを検出する。この方法は、所定のドット中の複数の標的シークエンスにおける突然変異の発生が、任意の陽性ハイブリダイゼーションシグナルが、対応する障害アレルとハイブリダイズするプローブ混合物中の単一のＡＳＯに基づくというのに十分に稀であるという前提による。それから、ハイブリダイズするＡＳＯは、それをハイブリダイゼーション部分から単離して、そのヌクレオチドシークエンスを決定することにより同定される。
【０１４３】
ドットブロット、リバースブロット、多重、およびＭＡＳＤＡ形式において使用し得る適当な材料は、当該技術分野において周知であり、およびこれらに限定されないが、ナイロンおよびニトロセルロース膜を含む。
【０１４４】
標的シークエンスが、ＰＣＲ増幅により生産されるとき、出発材料は、染色体ＤＮＡであってもよく、この場合ＤＮＡは直接増幅される。代替的に、出発材料が、ｍＲＮＡであり得て、その場合、ｍＲＮＡは最初にｃＤＮＡに逆転写され、それからＲＴ−ＰＣＲの周知の技術により増幅される（例えば、ＧｅＩｆ ａｎｄ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，５６１，０５８号を参照）。
【０１４５】
上述した方法は、シークエンス変異（例えば、障害アレル）の限定された数の穏やかなスクリーニングに適している。しかしながら、迅速な分子診断、良好なコストの大規模スクリーニングの要望を受け、ＡＳＯの基礎概念を統合しつつ、変異検出の許容量及びサンプル数を大幅に改良した技術が開発された。上記の方法に対するそれらの変法として、これに限定されないが、大規模チップアレイシークエンス型技術（ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｃｈｉｐ ａｒｒａｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ‐ｂａｓｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）が挙げられる。大規模アレイを使用することにより、多くのシークエンスバリアントを迅速に解析できる。チップアレイの応用と開発の違いについてのレビューは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：１１０‐１１５（Ｍａｒｃｈ １９９６）および Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，１ ：１８３‐２００（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９６）にカバーされている。チップアレイの製造に関して、いくつかのアプローチが存在する。限定されないが：固定化オリゴヌクレオチドを付着させる固相担体、及びプローブに対する標的ポリヌクレオチドのシークエンスに基づく技術における、バリアントや変化を同定するための標識技術に違いがある。
【０１４６】
「ＤＮＡチップ」の大規模解析の有望な方法論は、Ｈａｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４：４４１４４７ （１９９６）に記載されており、そのすべてが本明細書中に参照により取り込まれる。Ｈａｃｉａ ｅｔ ａｌ．，が述べているように、９６，０００超のオリゴヌクレオチドの高密度アレイでは、長さ２０ベースの各ヌクレオチドが、光誘導化学合成を用いて、単一のガラス又はシリコンチップ上に固定化される。アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブの数及びデザイン次第で、潜在的には、配列中のあらゆる塩基の変化を確認できる。チップに利用されるアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブは、従って、例えば、集団中で発生することが、まだ知られていないＳＮＰのシークエンス変異を含む場合があり、またはＳＮＰは集団中で発生することが既知のＳＮＰに限定される場合もある。
【０１４７】
チップ上の特定のオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーションの前に、当業者に周知の方法により、試験サンプルが単離、増幅及び標識（例えば、蛍光マーカー）される。試験ポリヌクレオチドは、その後、固定化されたアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする。標的ポリヌクレオチドフラグメントの固定化アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブに対するシークエンスに基づく技術の強度が定量され、そして参照シークエンスと比較される。得られた遺伝子情報を、分子診断に使用できる。通常、これに限定されないが、分子診断における「ＤＮＡチップ」の用途は、既知のＳＮＰのスクリーニングである。しかし、これは、この分野で既知の突然変異の解析のみにこの技術を限定してしまうことになる。本発明は、従来可能であったよりも遥かに多くの突然変異についてのアレル特異的ハイブリダイゼーション解析を可能とする。それゆえ、大規模ＡＳＯ解析の効率および包括性は拡張されつつ、面倒な終末間（ｅｎｄ‐ｔｏ‐ｅｎｄ）シークエンス解析の必要性を低下させ、既知の突然変異のみならず、包括的に、許容される原理により予想される起こり得るすべての突然変異に対応し、そしてこれらの面倒な試験に関連するコストおよび時間が減少する。
【０１４８】
従って、一つの側面では、本発明は、酵素をコードする遺伝子または酵素をコードする核酸の障害アレルを検出するための方法を提供する。例えば、本明細書中で提供されるのは、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＣＢＳ、ＣＴＨ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＭＴＨＦＳのアレルを決定するための方法である。また、本明細書中で提供されるのは、ＡＨＣＹ、ＡＨＣＹＬ１、ＡＨＣＹＬ２、ＡＬＤＨ１Ｌ１ＡＬＤＨＬ２、ＡＭＴ、ＢＨＭＴ１、ＢＨＭＴ２、ＤＨＦＲ、ＤＭＧＤＨ、ＦＰＧＳ、ＦＴＣＤ、ＧＧＨ、ＭＴＦＭＴ、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＨＦＤ２、ＭＴＲ、ＭＴＲＲ、ＮＡＡＬＡＤ２、ＳＡＲＤＨ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２、またはＴＹＭＳのアレルを検出するための方法である。さらに、本方法は、表Ａ‐Ｘ中で列挙されたそれらなどの、ＳＮＰなどの遺伝的バリアントを検出するために使用できる。
【０１４９】
一つの実施態様では、酵素をコードする核酸について、ＳＮＰ、または他の遺伝的バリアントを検出することは、核酸配列決定を含む。一つの実施態様では、酵素をコードする核酸について突然変異を検出することは、ＰＣＲを含む。一つの実施態様では、酵素をコードする核酸について突然変異を検出することは、ＲＦＬＰ解析を含む。一つの実施態様では、酵素をコードする核酸について突然変異を検出することは、核酸ハイブリダイゼーションを含む。ハイブリダイゼーションによる突然変異ＳＮＰを検出することは、例えば、そのようなＳＮＰを含む酵素をコードする核酸またはそれらのフラグメントとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸を含む核酸アレイを使用して行われてもよい。
【０１５０】
一つの実施態様では、本発明は、本明細書中で記載したように、酵素をコードする遺伝子のアレルの活性を決定するためのインビボアッセイの使用を含む。
【０１５１】
方法の組み合わせは、酵素をコードする遺伝子の障害アレルを検出しおよび特徴づけるために、また使用してもよい。一つの実施態様では、本発明は、本明細書中で記載したように酵素をコードする遺伝子の活性を決定するため、および酵素をコードする核酸についてＳＮＰを決定するためのインビボアッセイの使用を含む。
【０１５２】
一つの実施態様では、本発明は、本明細書中で記載したように、酵素活性を決定するためのインビボアッセイおよび高温で酵素安定性を決定するための温度感受性アッセイの使用を含む。
【０１５３】
一つの実施態様では、本発明は、本明細書中で記載したように、酵素活性を決定するためのインビボアッセイ、および酵素の比活性を決定するためのインビトロアッセイの使用を含む。
【０１５４】
好ましい実施態様では、ＭＴＨＦＲの障害アレルは、Ｍ１１０Ｉ、Ｈ２１３Ｒ、Ｄ２２３Ｎ、Ｄ２９１Ｎ、Ｒ５１９Ｃ、Ｒ５１９Ｌ、およびＱ６４８Ｐからなる群から選択されるＭＴＨＦＲタンパク質について突然変異をコードする非同義の置換を含む。特に好ましい実施態様では、障害アレルは、Ｍ１１０Ｉ、Ｈ２１３Ｒ、Ｄ２２３Ｎ、および２９１Ｎからなる群から選択されるＭＴＨＦＲタンパク質について突然変異をコードする非同義の置換を含む。
【０１５５】
酵母株
【０１５６】
一つの側面では、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する酵素の障害アレルを検出することができる酵母株を提供する。そのような酵母株は、本明細書中で記載した方法について有用である。酵母株は、対象となる機能的に相同の酵素により補完できる第一変異、および第一遺伝子の機能と関連するアッセイ可能な表現型のための補因子添加に依拠した株を与える第二変異（又は突然変異群）を含むことにより示す。
【０１５７】
一つの実施態様では、本発明は、ＣＴＨの障害アレルを検出しおよびビタミンＢ6に対してのそれらの反応性を決定することができる酵母株を提供する。好ましい実施態様では、酵母株は、ｃｙｓ３および六倍（六重）欠失ｓｎｏ１Δｓｎｏ２Δｓｎｏ３Δｓｎｚ１Δｓｎｚ２Δｓｎｚ３Δについての変異を含む。
【０１５８】
一つの実施態様では、本発明は、ＣＢＳの障害アレルを検出しおよびビタミンＢに対してのそれらの反応性を決定することができる酵母を提供する。好ましい実施態様では、酵母株は、ｃｙｓ４および六倍（六重）欠失ｓｎｏ１Δｓｎｏ２Δｓｎｏ３Δｓｎｚ１Δｓｎｚ２Δｓｎｚ３Δを含む。
【０１５９】
一つの実施態様では、本発明は、ＭＴＨＦＲの障害アレルを検出しおよび葉酸塩に対するそれらの反応性を決定することができる酵母株を含む。好ましい実施態様では、酵母株は、ｍｅｔ３およびｆｏｌ３について変異を含む。
【０１６０】
疾患のリスクのためのスクリーニング
【０１６１】
一つの側面では、本発明は、異常葉酸塩／ホモシステイン代謝と関連する状態または疾患のリスクのためのスクリーニングの方法を提供する。本方法は、本明細書中で記載したように、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関する遺伝子の障害アレルのためのスクリーニングを含む。
【０１６２】
一つの実施態様では、本発明は、酵素機能不全に伴う疾患または状態のリスクのためのスクリーニングの方法を提供し、ここで酵素は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＧＡＲＴからなる群から選択される酵素である。好ましい実施態様では、疾患または状態は、心血管疾患、冠動脈疾患、虚血性脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、神経管欠損、口唇口蓋裂（ｏｒｏｆａｃｉａｌ ｃｌｅｆｔ）、子癇前症（ｐｒｅ‐ｅｃｌａｍｐｓｉａ）、早産（ｐｒｅ−ｔｅｒｍ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）／低出生体重児（ｌｏｗ ｂｉｒｔｈｗｅｉｇｈｔ）、反復早期自然流産（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｅａｒｌｙ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｂｏｒｔｉｏｎ）、血栓症、網膜動脈閉塞、ダウン症、直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、鬱病、統合失調症、アルツハイマー病／認知症、加齢性黄斑変性、及び緑内障からなる群から選択される。本方法は、本明細書中に記載されたように、ＭＴＨＦＲの障害アレル、ＡＴＩＣの障害アレル、ＭＴＨＦＳの障害アレル、ＭＡＴ１Ａの障害アレル、ＭＡＴ２Ａの障害アレル、およびＧＡＲＴの障害アレルからなる群から選択される障害アレルを検出するための方法の使用を含む。
【０１６３】
一つの実施態様では、本発明は、ＣＢＳ機能不全を伴う疾患または状態のリスクのためのスクリーニングの方法を提供する。好ましい実施態様では、疾患または状態は、心血管疾患、冠動脈疾患、虚血性脳梗塞、アテローム性動脈硬化、神経管欠損、口唇口蓋裂、子癇前症、早産／低出生体重児、反復早期自然流産、血栓症、網膜動脈閉塞、ダウン症、直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、鬱、統合失調症、アルツハイマー症／認知症、加齢性黄斑変性症、及び緑内障からなる群から選択される。本発明は、本明細書中で記載されたように、障害ＣＢＳアレルを検出するための方法の使用を含む。
【０１６４】
一つの実施態様では、本発明は、ＣＴＨ機能不全を伴う疾患および状態のリスクのためのスクリーニングの方法を提供する。好ましい実施態様では、疾患または状態は、心血管疾患、冠動脈疾患、虚血性脳梗塞、アテローム性動脈硬化、神経管欠損、口唇口蓋裂、子癇前症、早産／低出生体重児、反復早期自然流産、血栓症、網膜動脈閉塞、ダウン症、直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、鬱、統合失調症、アルツハイマー症／認知症、加齢性黄斑変性症、及び緑内障からなる群から選択される。本発明は、本明細書中で記載されたように、障害ＣＴＨアレルを検出するための方法の使用を含む。
【０１６５】
化学療法反応能力のためのスクリーニング
【０１６６】
一つの側面では、本発明は、個人の化学療法反応能力を決定するための方法を提供する。本方法は、本明細書中で記載したように、葉酸塩／およびホモシステイン代謝に関する遺伝子の障害アレルを検出するための方法の使用を含む。好ましい実施態様では、遺伝子は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＧＡＲＴからなる群から選択される。個人についての障害アレルの検出は、減少した反応能力を示す。
【０１６７】
好ましい実施態様では、化学療法剤は、メトトレキサート又は５−フルオロウラシルである。
【０１６８】
化学療法毒性のためのスクリーニング
【０１６９】
一つの側面では、本発明は、個人ついての化学療法毒性を決定するための方法を提供する。本発明は、本明細書中で記載したように、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関する遺伝子の障害アレルを検出するための方法の使用を含む。好ましい実施態様では、遺伝子は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＧＡＲＴからなる群から選択される。個人について障害アレルの検出は、増加した毒性能力を示す。
【０１７０】
好ましい実施態様では、化学療法剤は、メトトレキサート又は５−フルオロウラシルである。
【０１７１】
予防および治療
【０１７２】
一つの側面では、本発明は、代謝酵素欠損を伴う状態または疾患を予防するための方法を提供する。本発明は、上記アッセイおよび方法から取得される情報に基づいて補因子の個人の取り込みを増加することを含み、そしてそれは、補因子感受性の障害アレルの存在を伝える。好ましい実施態様では、本方法は、本明細書中で記載したように、代謝遺伝子の補因子治療可能な障害アレルを検出することを含む。
【０１７３】
一つの実施態様では、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝異常を伴う状態または疾患を予防するための方法を提供する。本方法は、葉酸塩および／またはビタミンＢの個人の摂取を増加することを含む。好ましい実施態様では、本方法は、本明細書中で記載したように、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関する遺伝子の障害アレルを検出することを含む。
【０１７４】
一つの実施態様では、本発明は、補因子治療可能な酵素をコードする遺伝子の障害アレルを有する個人について酵素機能不全を伴う状態または疾患を予防するための方法を提供し、ここで、酵素をコードする遺伝子は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＧＡＲＴからなる群から選択される。本方法は、葉酸塩の個人の摂取を増加することを含む。
【０１７５】
一つの実施態様では、本発明は、障害ＣＢＳアレルを有する個人についてＣＢＳ機能不全を伴う状態または疾患を予防するための方法を提供する。本方法は、ビタミンＢ6の個人の摂取を増加することを含む。
【０１７６】
一つの実施態様では、本発明は、障害ＣＴＨアレルを有する個人についてＣＴＨ機能不全を伴う状態または疾患を予防するための方法を提供する。本方法は、ビタミンＢ5の個人の摂取を増加することを含む。
【０１７７】
一つの側面では、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝異常を伴う状態または疾患を治療するための方法を提供する。本方法は、本明細書中で記載したように、葉酸塩および／またはビタミンＢ6の個人の摂取を増加することを含む。
【０１７８】
一つの実施態様では、本発明は、補因子治療可能な酵素をコードする遺伝子の障害アレルを有する個人について酵素機能不全を伴う状態または疾患を治療するための方法を提供し、ここで酵素をコードする遺伝子は、補因子により治療可能な、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＧＡＲＴからなる群から選択され、ここで、本方法は、葉酸の個人の摂取を増加することを含む。
【０１７９】
一つの実施態様では、本発明は、障害ＣＢＳアレルを有する個人についてＣＢＳ機能不全を伴う状態または疾患を治療するための方法を提供する。本方法は、ビタミンＢ6の個人の摂取を増加することを含む。
【０１８０】
一つの実施態様では、本発明は、障害ＣＴＨアレルを有する個人についてＣＴＨ機能不全を伴う状態または疾患を治療するための方法を提供する。本発明は、ビタミンＢ6の個人の摂取を増加することを含む。
【０１８１】
調合物
本発明は、さらに個人のために一またはそれ以上の補因子を含む調合物を提供する。一またはそれ以上の補因子は、個人の遺伝子的構造に基づき選択される。例えば、調合物は、補因子の大多数を含むことができ、ここで、少なくとも補因子の大多数内の補因子のサブセットは、個人の遺伝子的構造に基づき選択される。いくつかの実施態様では、調合物中でなされる選択されたすべての補因子は、個人の遺伝子的構造に基づく。例えば、調合物中に存在する少なくとも一の大多数の補因子などのサブセットは、個人の遺伝子的構造に基づいてもよい。さらに他の実施態様では、少なくとも３，４、５、６、７、８，９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、５０、７５、または１００の補因子が、調合物中に存在し、ここで調合物中に存在する補因子のすべて、またはサブセットは、個人の遺伝子的構造に基づく調合物のために選択される。
【０１８２】
本明細書中で開示される調合物は、個人の遺伝子的構造により決定される量について存在する一またはそれ以上の補因子を含むことができる。一つの実施態様では、調合物は、補因子を含み、ここで、補因子は個人の遺伝子的構造に基づき選択された量について存在する。他の実施態様では、調合物は、個人の遺伝子的構造に基づいた量について存在する補因子の少なくともサブセットについて補因子の大多数を含む。他の実施態様では、補因子の少なくとも２またはそれ以上の大多数は、個人の遺伝子的構造に基づいた量について存在する調合物で存在する。さらに他の実施態様では、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、５０、７５、１００の補因子が、調合物中に存在し、ここで、調合物中に存在する補因子のすべて、またはサブセットが、個人の遺伝子的構造に基づく量について存在する。
【０１８３】
遺伝子的構造の解析
【０１８４】
本明細書中で開示された調合物は、個人の遺伝子的構造に基づき選択された一またはそれ以上の補因子を含む。個人の遺伝子的構造は、個人の生物学的なサンプルの解析を通じて、決定できる。解析は、補因子酵素欠損または補因子治療可能状態と関連する遺伝的バリアントの不存在または存在を検出することを含む。いくつかの実施態様では、遺伝的バリアントの大多数は、解析される。一またはそれ以上の遺伝的バリアントの存在または不存在は、補因子依存性の酵素欠損を有する個人のリスクまたは素因を決定するために使用できる。一またはそれ以上の遺伝的バリアントの存在または不存在は、補因子治療可能な症状を有する個人のリスクまたは素因を決定するために使用できる。
【０１８５】
個人の遺伝子的構造は、個人の生物学的サンプルの解析を通じて得ることができる。個人は、遺伝子的サンプルが由来してもよい任意のサンプルなど、生物学的サンプルを提供できる。サンプルは、口腔綿棒、唾液、血液、毛髪、または個人から得られる任意の他の種類のサンプルであってもよい。サンプルは、第三者によって取得されてもよく、および他人により解析されてもよい。サンプルは、予め保存しておいてもよい。代替的に、サンプルは、単一の集団（ｓｉｎｇｌｅ  ｐａｒｔｙ）により取得および解析されてもよい。
【０１８６】
個体は、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、トリ、ヒツジ、ウシ、サルまたは他の動物などの動物でよい。いくつかの実施態様では、個体はヒトである。ヒトは、任意の年齢でよい。ヒトは、胎児、幼児、小児、青年、成人、または老人個体であってもよい。個人は、年齢５０歳以上、年齢６０歳以上、またはそれ以上の成人であってもよい。個人は、出産可能年齢であってもよい。個人は、女性または男性であってもよい。
【０１８７】
いくつかの実施態様では、個人は、妊娠した女性である。さらに他の実施態様では、個人は、胎児など、またはまだ子供を妊娠しているような、すぐに子供が生まれる女性または男性の親でもよい。例えば、子供を有することに興味がある女性または妊娠した女性などの女性の遺伝子的構造は、酵素欠損に依拠した症状などの症状を有する小児のリスクを決定するために解析され、または治療可能な補因子である。さらに他の実施態様では、父または小児の父の遺伝子的構造は、解析される。母または父のための調合物は、かれらの遺伝子的構造に基づいて決定でき、ここで、調合物は、母、父、および／または小児の健康を改善でき、父、母、および／または小児の酵素欠損依存性の補因子を治療でき、または母、父、および／または小児の治療可能な症状を治療できる。
【０１８８】
個人は、補因子依存性の酵素欠損などの代謝状態の家族歴を有するかもしれない。いくつかの実施態様では、個人は、補因子依存性の酵素欠損などの代謝状態の任意の症状または状態を経験しない。さらに他の実施態様では、個人は、補因子依存性の酵素欠損などの代謝状態の一またはそれ以上の症状または状態を経験しない。
【０１８９】
個人の遺伝子的構造は、補因子依存性の酵素欠損などの素因、リスク、診断、予後診断、または代謝状態のセラノーシス（ｔｈｅｒａｎｏｓｉｓ）を決定するために解析できる。解析は、補因子依存性の酵素欠損の存在または不存在、治療の有効性、または治療の反応を決定するために使用できる。いくつかの実施態様では、解析は、補因子治療可能な症状の存在または不存在、治療の有効性、または治療の反応を決定するために使用できる。
【０１９０】
例えば、補因子治療可能な症状は、ビタミン欠乏であってもよく、またはそのような欠乏の症状を示す。ビタミン欠乏は、ビタミンＡ欠乏、ビタミンＡ過剰症、ビタミンＤ欠乏および依存、ビタミンＤ過剰症、ビタミンＥ欠乏および毒性、ビタミンＫ欠乏、ビタミンＫ過剰症、必須脂肪酸欠乏、チアミン欠乏、リボフラビン欠乏、ナイアシン欠乏、ビタミンＢ．ｓｕｂ．６欠乏および依存、ビオチン欠乏および依存、パントテン酸欠乏、カルニチン欠乏またはビタミンＣ欠乏である。他の実施態様では、補因子治療可能な症状は、ミネラル欠乏であってもよく、またはそのような欠乏の症状を示す。例えば、ミネラル欠乏は、リン酸塩欠乏、ヨウ素欠乏、フッ素欠乏、亜鉛欠乏、銅代謝障害、後天的な銅欠乏、後天的な銅中毒症、遺伝性の銅欠乏、または遺伝的な銅中毒症を含む。
【０１９１】
補因子治療可能な症状は、ビタミン欠乏症またはビタミン過剰症であってもよい。いくつかの実施態様では、アビアトミン（ａｖｉａｔｍｉｎｅ）は、理論に拘束されることなくビタミンＡ欠乏であり、眼球乾燥症または夜盲症などの状態となり、チアミン欠乏は、脚気などの状態となり、ナイアシン欠乏は、ペラグラなどの状態となり、ビタミンＢ１２欠乏は、壊血病などの症状となり、巨赤芽球性貧血などの状態となり、ビタミンＣ欠乏は、壊血病などの状態となり、ビタミンＤ欠乏は、くる病などの状態になり、またはビタミンＫ欠乏は、障害凝固などの状態になる。
【０１９２】
補因子治療可能な症状は、免疫状態、小児の発達、心血管状態、および加齢の効果などの状態をまた含む。例えば、補因子治療可能な症状は、低骨密度、クローン病、または多発性硬化症であってもよい。
【０１９３】
いくつかの実施態様では、補因子治療可能な症状は、早産を有することを含む。他の状態は、二分脊椎症、成長および精神発達についての異常、口蓋裂、無能症、または任意の他の神経管欠損（ＮＴＤ）を伴う子孫を有することを含む。いくつかの実施態様では、補因子治療可能な症状は、補因子治療可能な症状を伴う小児を有する能力または素因である。いくつかの実施態様では、補因子治療可能な症状は、神経管欠損などの先天性欠損を伴う小児を有するリスクまたは素因である。いくつかの実施態様では、ＮＴＤは、二分脊椎症である。他の欠損は、早産または口蓋裂であってもよい。
【０１９４】
他の実施態様では、個人の遺伝子的構造は、解析され、および個人は、補因子治療可能な症状に対して低リスクまたは素因を有する。解析は、補因子の選択のための、または補因子の大多数のための、個人の健康を改善する個人用の調合物のための情報を提供するために使用できる。代替的に、調合物は、補因子依存性の酵素欠損などの、個人の既知または未知の一またはそれ以上の症状の回復について助けることができる。
【０１９５】
個人の遺伝子的構造は、一の補因子の量、または補因子の大多数、個人のための調合物についての存在の情報をまた提供できる。例えば、仮に、個人の遺伝子的構造が、解析され、および個人が、補因子治療可能な症状に対して低リスクまたは素因を有するなら、調合物は、ガイドライン中で示されたように基づく推奨された投与量または日常摂取量と比較して、一またはそれ以上の補因子のより低い量を含んでもよい（例えば、表５および６を参照）。代替的に、調合物は、補因子依存性酵素欠損または補因子治療可能な症状のリスクまたは診断を伴う個人にとって、推奨された投与量または日常摂取量よりもより高い量を含んでもよい。
【０１９６】
一またはそれ以上の遺伝的バリアントの解析は、一またはそれ以上の補因子治療可能な症状のリスクまたは素因または診断を決定するために使用できる。例えば、個人の生物学的サンプル由来の遺伝的バリアントの大多数の存在または不存在は、個人が、補因子依存性酵素欠損のリスクであることを示すことができる。補因子依存性酵素欠損は、補因子治療可能状態であってもよい。遺伝的バリアントの大多数は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、または１００遺伝的バリアントを含んでもよい。遺伝的バリアントは、同じ代謝経路の同じ遺伝子、または異なる遺伝子、または、異なる代謝経路について異なる遺伝子でもよい。遺伝的バリアントの大多数の解析は、単一遺伝子バリアントまたは遺伝的バリアントの大多数未満の解析に基づく調合物と比較して補因子治療可能な症状の一またはそれ以上の症状の改善された健康または改善された回復を提供する個人のためのより包括的なまたは特異的な調合物を提供できる。
【０１９７】
遺伝的バリアントは、一塩基多型（ＳＮＰ）、切断（ｔｒａｎｃａｔｉｏｎ）、挿入、欠失、または反復（ｒｅｐｅａｔ）であってもよい。遺伝的バリアントは、またヌクレオチド反復、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、染色体転位、染色体重複、またはコピー数多型（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）でもよい。いくつかの実施態様では、コピー数多型は、マイクロサテライト反復、ヌクレオチド反復、セントロメア反復、またはテロメア反復である。
【０１９８】
遺伝的バリアントは、ビタミンなどの補因子の生合成のための経路などの代謝経路についての遺伝子であってもよい。例えば、経路は、これに限定されないが、チアミン代謝経路、リボフラビン代謝経路、ビタミンＢ6代謝経路、ニコチン酸およびニコチンアミド代謝経路、パントテン酸およびＣｏＡ生合成経路、ビオチン代謝経路、リポ酸代謝経路、葉酸塩／ホモシステイン代謝経路、レチノール代謝経路、ポルフィリン代謝経路、ユビキノンおよび他のテルペノイドキノン生合成経路を含んでもよい。
【０１９９】
遺伝的バリアントは、ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（カルシフェロール）、ビタミンＥ、ビタミンＫ（フィロキノン）、ビタミンＢ1（チアミン）、ビタミンＢ2（リボフラビン）、ビタミンＢ3（ナイアシン）、ビタミンＢ6（ピリドキシン）、ビタミンＢ9（葉酸塩／葉酸）、ビタミンＢ12（トコフェロール）、ビタミンＢ7（ビオチン）、ビタミンＢ5（パントテン酸）、またはコリンを代謝するための経路についての遺伝子であってもよい。一つの実施態様では、遺伝的バリアントは、ＡＨＣＹ、ＡＨＣＹＬ１、ＡＨＣＹＬ２、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＡＬＤＨＬ２、ＡＭＴ、ＡＴＩＣ、ＢＨＭＴ１、ＢＨＭＴ２、ＣＢＳ、ＣＴＨ、ＤＨＦＲ、ＤＭＧＤＨ、ＦＰＧＳ、ＦＴＣＤ、ＧＡＲＴ、ＧＧＨ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＴＦＭＴ、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＨＦＤ２、ＭＴＨＦＲ、ＭＴＨＦＳ、ＭＴＲ、ＭＴＲＲ、ＮＡＡＬＡＤ２、ＳＡＲＤＨ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２、またはＴＹＭＳなどの葉酸塩経路についての遺伝子である。ＳＮＰなどの遺伝的バリアントは、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＧＡＲＴ、ＡＨＣＹ、ＡＭＴ、ＣＢＳ、ＣＴＨ、ＤＨＦＲ、ＦＰＧＳ、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＨＦＤ２、ＭＴＲ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２、またはＴＹＭＳの遺伝的バリアントから選択されてもよい。例えば、遺伝的バリアントは、表Ａ‐Ｚから選択されてもよい。いくつかの実施態様では、遺伝的バリアントは、表Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｕ、Ｖ、Ｗ、およびＸ中で一またはそれ以上列挙されたなどの、ＡＨＣＹ、ＡＭＴ、ＣＢＳ、ＣＴＨ、ＤＨＦＲ、ＦＰＧＳ、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＨＦＤ２、ＭＴＲ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２、またはＴＹＭＳである。
【０２００】
遺伝的バリアントは、公知文献または科学雑誌またはミーティングを通じて同定されてもよい。代替的に、かれらは遺伝的バリアントを本明細書中で開示した方法を通じて同定してもよい。例えば、一またはそれ以上の個人は、補因子治療可能な症状などの既知の代謝状態を有してもよい。かれらのゲノムは、解析してもよく、および遺伝的バリアントは同定してもよく、および遺伝的バリアントは、他の個人についての遺伝的バリアントを検出することおよび他の個人についての補因子治療可能な症状を同定することなどで、本明細書中で開示された方法について使用されてもよい。従って、本開示の他の側面は、遺伝的バリアントを伴う遺伝的バリアントのリストをアップデートし、同様に科学文献および他の公に利用可能な情報源を通じて遺伝的バリアントを同定する。例えば、遺伝的バリアントの現存するデータベースおよびそれらの補因子依存性酵素欠損、補因子治療可能状態、推奨される補因子および補因子の量のそれらの相関は、遺伝的バリアントまたは公に利用可能な情報源を通じて同定された新しい遺伝的バリアントでアップデートできる。
【０２０１】
遺伝的バリアントは、本明細書中で記載されるそれらなどの、当該技術分野において既知の任意の方法を使用することにより解析できる。例えば、解析は、ＤＮＡ配列決定、リアルタイムＰＣＲなどのＰＣＲに基づく方法、質量分析（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ／ＭＳ方法）、ビーズに基づくアッセイ、融解曲線アッセイ、またはマイクロアレイにより実行できる。解析は、また、フラグメント長多型アッセイ（制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）、切断酵素フラグメント長多型アッセイ（ＣＦＬＰ））、テンプレートとして、アレル特異的オリゴヌクレオチドを使用する一本鎖高次構造多型解析ハイブリダイゼーション方法（例えば、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ方法、インベーダー方法、ＤＮＡチップ方法）、プライマー伸長反応方法、対立遺伝子特異的増幅変異検出システム（ＡＲＭＳ）などにより実行されてもよく、およびまた使用されてもよい。
【０２０２】
任意の市販のキット、システム、およびプラットフォームは、本明細書中で記載された遺伝的バリアントを解析するために使用できる。例えば、アレイ、これらに限定されないが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｏｍｅ‐Ｗｉｄｅ  Ｈｕｍａｎ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ  ６．０などのアフィメトリクス（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）のアレイ、またはＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＣＧＨ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｋｉｔ  ２４４Ａなどのアジレント（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）のアレイなど、および関連する製品が使用できる。Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨＤ  ＢｅａｄＣｈｉｐｓまたはＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｚｙｅｒなどのイルミナなどのビーズに基づくプラットフォーム、並びに関連するプラットフォームおよび技術がまた使用できる。イルミナなどの市販または開発中の配列決定プラットフォーム、アプライドバイオシステムズ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のＧｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒなど、４５４ライフサイエンス（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）のＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒなど、ヘリコスバイオサイエンスコーポレーション（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）のＨｅｌｉｃｏｓ（商標）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、および他の関連する製品または技術が、また使用できる。他のプラットフォーム、融解曲線解析の使用など、これらに限定されないが、Ｑｉａｇｅｎ  ＨＲＭ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．６５６９６２７の使用など、およびＰＣＲに基づく方法、これらに限定されないが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからなど）など、または定量的リアルタイムＡＲＭＳ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）Ｐｒｉｍｅｒｓ（ＤｘＳ  Ｌｔｄ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）の使用を通じてなどが、また使用できる。
【０２０３】
遺伝的バリアントの検出は、間接または直接であってもよい。例えば、補因子治療可能な症状と相関する遺伝的バリアント、「ＳＮＰ  Ａ」は、直接検出できる。代替的に、ＳＮＰ  Ａは、他の遺伝的バリアント「ＳＮＰ  Ｂ」と結合不均衡であってもよい。例えば、ＳＮＰ  Ａは、ＳＮＰ  Ｂの検出を通じて、間接的に検出されてもよい。
【０２０４】
いくつかの実施態様では、マイクロアレイは、遺伝的バリアントを検出するために使用される。例えば、マイクロアレイは、サンプルについて一またはそれ以上の遺伝的バリアントを検出するための一またはそれ以上の核酸を含んでもよい。本マイクロアレイは、表Ａ‐Ｚ中で列挙されるそれらなどの一またはそれ以上の遺伝的バリアントを検出するための核酸を含んでもよい。例えば、マイクロアレイは、その上に固定化された、表Ａ‐Ｚ中で列挙されたそれらなどの遺伝的バリアントを含む単離された核酸の大多数を含んでもよい。マイクロアレイは、表Ａ‐Ｚ中で列挙されたそれらなどの一またはそれ以上の遺伝的バリアントを特異的に検出するためのプローブを含んでもよい。
【０２０５】
補因子
【０２０６】
本明細書中で開示された調合物は、大多数の補因子など、一またはそれ以上の補因子を含んでもよく、ここで補因子の大多数のサブセットまたはすべては、調合物について、個人の遺伝子的構造から選択される。さらに、調合物について一またはそれ以上の補因子の量は、また個人の遺伝子的構造から決定されてもよい。
【０２０７】
補因子は、タンパク質を伴いおよびタンパク質の生物学的活性を助ける、天然起源または合成の非タンパク質化合物である。例えば、補因子は、通常、酵素を伴いおよびしばしば、酵素活性にとって必要である。補因子は、タンパク質と緩く結合または伴ってもよく、および補酵素と呼ばれる。他の実施態様では、補欠分子族などの補因子は、タンパク質と強固に付随しまたは結合する。本明細書中で開示される補因子は、目的の酵素の直接補因子であってもよく（例えば、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＭＴＨＦＳのための葉酸塩）、同様に目的の酵素のための間接補因子であってもよい。従って、補因子は、酵素機能に直接的にまたは間接的に影響を与えることができる。
【０２０８】
本明細書中で開示された補因子は、合成または天然起源でもよい。例えば、補因子は、インビトロで化学合成を通じて製造されまたは生物から精製され得る。調合物は、合成、天然起源、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【０２０９】
補因子は、有機物または無機物でもよい。本明細書中で開示された調合物は、有機物、無機物、またはそれらの組み合わせである一またはそれ以上の補因子を含んでもよい。例えば、補因子は、ビタミンまたはビタミン由来の分子などの有機物であってもよい。補因子は、ＡＴＰ、補酵素Ａ、ＦＤＡおよびＮＡＤ+などの、それらの構成の一部としてヌクレオチドアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を含んでもよい。他の有機物補因子は、フラビンまたはヘムを含む。
【０２１０】
個人の遺伝子的構造に基づいて選択される補因子は、表５についてのそれらなどのビタミンであってもよい。ビタミンは、水溶性または脂溶性であってもよい。例えば、調合物は、一またはそれ以上の以下のビタミン：ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（カルシフェロール）、ビタミンＥ、ビタミンＫ（フィロキノン）、ビタミンＢ1（チアミン）、ビタミンＢ2（リボフラビン）、ビタミンＢ3（ナイアシン）、ビタミンＢ6（ピリドキシン）、ビタミンＢ9（葉酸塩／葉酸）、ビタミンＢ12（トコフェロール）、ビタミンＢ7（ビオチン）、ビタミンＢ5（パントテン酸）、またはコリンを含んでもよい。調合物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７，８，９，１０、１１、１２、１３、または１４の上述のビタミンを含んでもよい。いくつかの実施態様では、調合物は、ビタミンを含まない。
【０２１１】
補因子は、また、表６中で列挙されたそれらなどの、ミネラルまたは金属イオンなどの無機物補因子でもよい。例えば、無機物補因子は、これらに限定されないが、Ｍｇ2+、Ｃｕ+、Ｍｎ2+、または鉄‐硫黄クラスターなどの金属イオンであってもよい。本明細書中で開示される調合物は、任意の一またはそれ以上のカルシウム、リン、鉄、ヨウ素、マグネシウム、亜鉛、セレン、銅、マンガン、クロム、またはモリブデンを含んでもよい。調合物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１の上述したミネラルを含んでもよい。いくつかの実施態様では、調合物は、ミネラルを含まない。
【０２１２】
補因子の量
【０２１３】
本明細書中で開示される調合物の他の側面は、調合物中の一またはそれ以上の補因子の量は、個人の遺伝子的構造に基づいて選択される。一つの実施態様では、調合物は、補因子の量が、個人の遺伝子的構造により決定される補因子を含む。他の実施態様では、調合物は、補因子のサブセットまたは補因子のすべてが、個人の遺伝子的構造により決定される量について存在する補因子の大多数を含む。調合物について推奨される量は、典型的に、例えば、量が、調合物の日常的な摂取に基づいてもよい、調合物の投薬療法に基づく。代替的に、量は、一日２回、一日３回、毎週、隔週、毎月または隔月療法に基づいてもよい。
【０２１４】
個人の遺伝子的構造は、個人が摂取すべきもしくは摂取することが推奨されるべき、またはそれらの食事と伴に補われるべき一またはそれ以上の補因子を決定するために使用でき、異なる遺伝子的構造を伴う他の個人用に推奨されるものとは異なる。例えば、個人の食事について補因子を追加するための要求と相関する少なくとも一の遺伝的バリアントの存在または不存在は、個人の生物学的サンプル中で検出し得る。遺伝的バリアントの存在を検出することは、個人のための補因子推奨される量が、遺伝的バリアントを欠乏する個人のための推奨される量よりも異なることを決定するために、その後使用され得る。代替的に、遺伝的バリアントの不存在を検出することは、個人のための補因子の推奨される量が、遺伝的バリアントを伴う個人のための推奨される量よりも異なることを決定するためにまた使用され得る。いくつかの実施態様では、遺伝的バリアントの大多数の不存在または存在は、個人が摂取すべき、またはかれらの食事に追加すべき一またはそれ以上の補因子の量を決定するために使用される。例えば、少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１５，２０，２５，３０，４０，５０，７５、または１００遺伝的バリアントの存在または不存在は、個人について検出され得、および個人が摂取すべき、またはかれらの食事に追加すべき一またはそれ以上の補因子と相関し得る。
【０２１５】
特定の遺伝的バリアントを伴わない個人と比較して特定の遺伝的バリアントを伴う個人の間の補因子の推奨される量についての相違は、補因子の少なくとも約１、５，１０，１５，２０、２５、３０，３５，４０，４５，５０，７５，１００，１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００％の重量、質量、またはＩＵの相違があってもよい。重量は、補因子の乾燥重量または当量または補因子の生物学的活性であってもよい。
【０２１６】
例えば、特定のＳＮＰを伴う個人は、葉酸４００ｍｃｇの推奨される一日投与量を有してもよいが、そのＳＮＰを伴わない個人は、その１０００％である推奨される一日投与量を有してもよく、そしてそれは葉酸４ｍｇである。他の例では、特定のＳＮＰを伴う個人は、葉酸４００ｍｃｇの推奨される一日投与量を有してもよいが、そのＳＮＰを伴わない個人は、その２５％である推奨される一日投与量を有してもよく  そしてそれは葉酸１００ｍｃｇである。
【０２１７】
いくつかの実施態様では、個人の遺伝的バリアントの存在は、遺伝的バリアントを伴わない個人のため推奨される補因子の量よりもより多い補因子の個人の摂取量である推奨と相関する。代替的に、個人について遺伝的バリアントの不存在は、遺伝的バリアントを伴う個人のための推奨された補因子の量よりもより多い補因子の個人摂取量である推奨と相関する。例えば、遺伝的バリアントの存在は、遺伝的バリアントを伴わない個人が、それらの食事で摂取または追加すべき量よりも少なくとも約１．１倍多い補因子の量を、個人が摂取すべきことを決定するために使用され得る。他の実施態様では、遺伝的バリアントを伴う個人の補因子の量は、摂取することを推奨される遺伝的バリアントを伴わない個人の少なくとも約１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０，３０、４０、または５０倍の量を摂取すべきである。例えば、遺伝的バリアントの存在は、妊娠している女性由来のサンプルについて検出される。遺伝的バリアントの存在は、遺伝的バリアントを伴わない個人と比較して葉酸などの補因子の５倍量を個人が彼女の食事に追加する推奨と相関し、そしてそれは早産または二分脊椎症または口蓋裂を伴った小児の出産など、補因子依存性酵素欠損のリスクを低減する。
【０２１８】
さらに他の実施態様では、遺伝的バリアントの存在を検出することは、遺伝的バリアントが、摂取するために推奨されない個人の量未満である補因子の量を摂取するために推奨されている個人と相関する。代替的に、遺伝的バリアントの存在を検出することは、遺伝的バリアントが、摂取することを推奨される個人の量未満の補因子の量を摂取するために推奨されている個人と相関する。例えば、個人のサンプルにおける遺伝的バリアントの存在は、個人が、遺伝的バリアントを伴わない個人のため推奨されたような補因子に量よりも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または５０倍未満を摂取すべきことを示し得る。
【０２１９】
個人の遺伝子的構造は、一またはそれ以上の個人の補因子が、摂取、またはかれらの食事に追加すべき量は、官庁または保健機関により推奨される量より超過、未満または相当することを決定するために使用され得る。例えば、個人の遺伝子的構造は、個人により摂取される一またはそれ以上の補因子の量は、食品医薬品局（ＦＤＡ）により推奨される量超過、未満、または相当であることを決定するために使用し得る。
【０２２０】
個人の遺伝子的構造は、個人により摂取される一またはそれ以上の補因子は、基準一日摂取量（ＲＤＩ）超過、未満、または相当であるべきであることを決定するために使用され得る（例えば、表５および６参照）。例えば、出産可能な年齢の女性は、合成葉酸４００ｍｃｇを摂取することを推奨される（例えば表５を参照）。しかしながら、女性の遺伝子的構造の解析は、女性が、少なくとも葉酸４ｍｇなど、少なくとも５倍または少なくとも１０倍量を摂取すべきであることを決定することができる。他の実施態様では、個人の遺伝子的構造は、個人が、ＲＤＩで推奨される量未満の補因子の一日摂取を有するべきであることを決定するために使用されてもよい。例えば、個人の調合物は、ＲＤＩの半分量である葉酸の量を含んでもよい。
【０２２１】
個人のサンプルは、個人の食事内に追加すべき補因子の量と相関する少なくとも一の遺伝的バリアントの存在または不存在について解析できる。例えば、遺伝的バリアントの存在を決定することは、個人のための補因子の推奨された量が、保健機関のより推奨された量よりも異なることを決定するためにさらに使用され得る。代替的に、遺伝的バリアントの不存在を検出することは、個人のための補因子の推奨される量が、ＲＤＩ量などの官庁により推奨される量よりも異なることを決定するためにまた使用され得る。いくつかの実施態様では、遺伝的バリアントの大多数の不存在または存在は、個人がかれらの食事で摂取または追加すべき一またはそれ以上の補因子の量を決定するために使用される。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、または１００の遺伝的バリアントの存在または不存在は、個人について検出され得、および個人がかれらの食事で摂取または追加すべき一またはそれ以上の補因子の量と相関する。
【０２２２】
ＲＤＩなどの官庁により提案される推奨される値と比較して、特定の遺伝的バリアントを伴う個人間の補因子の推奨される量についての相違は、補因子の重量、質量、またはＩＵの少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００％の相違があり得る。例えば、ＲＩＤでは葉酸４００ｍｃｇであるが、特定のＳＮＰを伴う個人では、その２５％である推奨される一日用量を有してもよく、そしてそれは、葉酸１００ｍｃｇである。他の例では、特定のＳＮＰを伴う個人は、ＲＤＩの１０００％の推奨される一日用量を有してもよく、そしてそれは、葉酸４ｍｇである。
【０２２３】
いくつかの実施態様では、個人について遺伝的バリアントの存在は、個人が、ＲＤＩ量などの官庁により推奨される補因子の量よりも多い補因子の量を摂取する推奨と相関する。代替的に、個人の遺伝的バリアントの不存在は、個人が、官庁または保健機関により推奨される補因子の量よりも多い補因子の量を摂取する推奨と相関する。例えば、遺伝的バリアントの存在は、個人が、官庁または保健機関により推奨される量よりも少なくとも約１．１倍多い補因子の量を摂取するべきであることを決定するために使用できる。他の実施態様では、遺伝的バリアントを伴う個人が摂取すべき補因子の量は、官庁または保健機関により推奨される量の少なくとも約１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または５０倍である。例えば、遺伝的バリアントの存在は、妊娠した女性由来のサンプルについて検出される。遺伝的バリアントの存在は、個人が、ＲＤＩ量と比較して、葉酸などの補因子の５倍量を彼女の食事に追加する推奨と相関し、そしてそれは、早産、または二分脊椎症または口蓋裂を伴った小児の出産などの補因子依存性の酵素欠損のリスクを低減することを助ける。
【０２２４】
さらに他の実施態様では、遺伝的バリアントの存在を検出することは、官庁または保健機関により推奨される量よりも少ない補因子の量を摂取するために推奨されている個人と相関する。代替的に、遺伝的バリアントの不存在を検出することは、官庁または保健機関により推奨される量よりも少ない補因子の量を摂取するために推奨されている個人と相関する。例えば、個人のサンプルについて遺伝的バリアントの存在は、個人が、遺伝的バリアントを伴わない個人のため推奨されたような補因子の量よりも、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７，８，９，１０、２０、３０、４０、または５０倍少ない量を摂取すべきことを示し得る。
【０２２５】
個人的な特性
【０２２６】
個人ための調合物のための、一またはそれ以上の補因子の選択、一またはそれ以上の補因子の量、または両方は、また個人の個人的な特性に基づいてもよい。例えば、一またはそれ以上の補因子の選択は、個人の遺伝子的構造および一またはそれ以上の個人の個人的な特性に基づいてもよい。個人的な特性は、これらに限定されないが、一またはそれ以上の以下の：体重、身長、ボディマスインデックス、民族、先祖、性別、年齢、家族歴、病歴、運動習慣、または前記個人の食習慣であってもよい。
【０２２７】
例えば、個人の遺伝子的構造の解析は、個人のための補因子の大多数を決定するために使用される。補因子は、２つのビタミンおよびミネラルを含む。個人の食習慣が、個人がミネラルの高摂取を有することを示し、従って、個人にとって推奨される調合物は、２つのビタミンを含む。
【０２２８】
他の例では、個人の遺伝子的構造の解析は、個人のための補因子の大多数を決定するために使用される。補因子は、変化する量の３つのビタミンを含む。個人の食習慣が、個人がこれらのビタミンの低摂取を有することを示し、従って、３つのビタミンを含む調合物は、投与量について、個人単独の遺伝子的構造の解析よりもより高いことが示されてきた。代替的に、個人の食事は、これらのビタミンの高摂取を示し、および従って、ビタミンの調合物は、個人単独の遺伝子的構造の解析により決定されるような量と比較してビタミンの減少した量を含む。
【０２２９】
一つの実施態様では、個人の特性は、遺伝子的解析のみでは、女性は６００ｍｃｇの葉酸を摂取すべきことが決定されるように、性別および妊娠状態である。しかしながら、妊娠している彼女の個人的な特性を考慮すると、葉酸の推奨される量は、４ｍｇである。
【０２３０】
さらに他の実施態様では、個人の代謝速度、タンパク質の発現量、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、代謝物質のレベルなどの特性は、また、個人のための調合物の一またはそれ以上の補因子の選択、一またはそれ以上の補因子の量、または両方に組み込まれてもよい。
【０２３１】
用語「個人」または「対象」は、互換的に使用され、およびヒト対象を含む哺乳類対象を指す。
【０２３２】
投薬形態
【０２３３】
個人の遺伝子的構造により選択される一またはそれ以上の補因子を含む調合物は、当該技術分野で知られる任意の方法により、調製できる。個人の遺伝子的構造により決定されるような一またはそれ以上の補因子の量などの記載された用量は、対象の体重、同様に投与形態、投与の経路および期間などの個人の個人的な特性に依存してまた変化できる。例えば、調合物は、経口、直腸、非経口、経腸、経皮、静脈、局所、皮下、筋肉内、または栄養管投与で調合できる。
【０２３４】
また、本明細書中で提供されるものは、補因子を選択することを含んでもよい調合物を調製するための方法であり、ここで補因子は、個人の遺伝子的構造および摂取可能な、または注射可能な形態について賦形剤を伴う補因子に基づいて選択する量について存在する。調合物を調製するための方法は、補因子の大多数を含む方法は、補因子の大多数を選択することを含んでもよく、ここで、補因子の少なくともサブセットは、個人の遺伝子的構造、および摂取可能なまたは注射可能な形態についての賦形剤を伴う補因子を混合することに基づいて選択される。
【０２３５】
調合物は、除放形態または即放形態として調製できる。調合物は、単位投薬量として調製できる。いくつかの実施態様では、調合物は、経口摂取可能である。調合物は、粉末形態であってもよく、顆細、錠剤またはカプセルの形態であってもよい。調合物は、また液体形態であってもよい。
【０２３６】
調合物は、個人の遺伝子的構造および例えば、錠剤、ペレット、カプセル、坐薬、溶液、エマルジョン、懸濁液、および使用のために適当な任意の他の形態用の一般的に非毒性の医薬品的に許容できる担体を伴う化合物により選択される一またはそれ以上の補因子を含んでもよい。調合物は、また、タルク、水、グルコース、ラクトース、ガム、アカシア、ゼラチン、マンニトール、スターチペースト、３ケイ酸マグネシウム、コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、ポテトスターチ、尿素などの担体をまた含んでもよく、および製造調製について、固体、半固形、または液体形態についての使用のための適当な他の担体、および追加的に、補助、安定、濃化および着色剤および香料が使用されてもよい。
【０２３７】
調合物の固体組成物を調製するために、錠剤形態など、キャプレット、ソフトゼラチンカプセルを含むカプセル、およびロゼンジなどが本明細書中で、開示される。本明細書中で開示された調合物の固形形態は、当該技術分野において知られた方法により作られ、およびさらに、適当な結合剤、潤滑剤、希釈剤、崩壊剤、着色剤、香料、流動誘導（ｆｌｏｗ‐ｉｎｄｕｃｉｎｇ）剤、溶融剤、当該技術分野において知られた多くのバリエーションを含んでもよい。本発明の経口投与形態は、場合により、一またはそれ以上の湿気、酸素、および光から調合物を保護するため、または任意の所望しない風味または外観をマスクするためにフィルムコーティングを有してもよい。適当なコーティング剤は、例えば、セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む。
【０２３８】
いくつかの実施態様では、補因子の一またはそれ以上の調合物は、カプセル中にカプセル化されたビーズの大多数である。例えば、ビーズの大多数、ビーズのさまざまなサブセットは、さまざまな補因子を含んでもよい。代替的に、ビーズの大多数は、単一の補因子であってもよい。いくつかの実施態様では、約１μｍ‐１０００μｍの直径を有してもよく、補因子を含んでもよい。いくつかの実施態様では、サイズは、約３００μｍ‐９００μｍ、または約４５０μｍ‐約８２５μｍの範囲である。それぞれのビーズは、同じ補因子または異なる補因子を有してもよい。いくつかの実施態様では、カプセル中のビーズの大多数は、ビーズの大多数の異なるサブセットが存在する異なる補因子を含む。
【０２３９】
いくつかの実施態様では、ビーズは、例えば、砂糖（例えば、スクロース、マンニトールなど）、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、界面活性剤（ラウリル硫酸ナトリウム、クレモホール、ツイーン、スパン、プルロニックなど）の可溶性組成物、不溶性滑剤組成物（結晶セルロース、リン酸カルシウム、タルク、フュームドシリカなど）、コーティング剤（適当なコーティング剤の例は、ポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ワックス、脂肪酸などである）、適当な剤についての分散（例は、ワックス、ポリマー、生理的に許容されるオイル、可溶剤など）または上記の組み合わせと混合された補因子を含んでもよい。
【０２４０】
いくつかの実施態様では、調合物は、一またはそれ以上の本質的に均質な混合物を含む固形組成であるように、組成が、錠剤、ピルおよびカプセルなどの同様に効果的な単位投薬量形態に容易に細分化されてもよいように、一またはそれ以上の補因子が、組成のすみからすみまで均等に分散されるように調製される。
【０２４１】
本明細書中に開示されている調合物における液体形態は、水溶液、適当な香りをつけたシロップ、水性またはオイル懸濁液、および綿実油、ゴマ油、ココナッツオイル、ピーナッツオイルなどの食用油を伴う香りをつけたエマルジョン同様にエリキシル剤および類似の医薬品媒体を含む、経口投与または注射により取り込まれてもよい。均一な懸濁にための適当な分散または懸濁剤は、トラガント、アカシア、アルギネート、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンを含む。
【０２４２】
経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態を投与してもよく、またそれらは、使用前に水または他の適当な媒体で再構成するための乾燥製品として存在してもよい。そのような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロースまたは硬化食用脂肪（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｅｄｉｂｌｅ  ｆａｔ）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性媒体（例えば、アーモンドオイル、油性エステルまたはエチルアルコール）、保存料（例えば、メチルまたはプロピルｐ-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）および人工的または天然着色料および／または甘味料などの医薬品的に許容された添加物を伴う慣用手段により調製されてもよい。
【０２４３】
頬側投与のための調合物は、慣用手段で調合された錠剤またはロゼンジの形態を摂取してもよい。
【０２４４】
個人の遺伝子的構造により選択される一またはそれ以上の補因子は、注射により非経口的な投与のため調合してもよく、そしてそれは、慣用のカテーテル方法またはインフュージョンを使用することを含む。注射のための調合物は、添加された保存料を伴う、アンプル、またはバイアル瓶（ｍｕｌｔｉ-ｄｏｓｅ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）などの単位投薬形態について存在してもよい。組成は、懸濁液、溶液または油性または水性媒体についてのエマルジョンのような形態で摂取してもよく、および懸濁、安定および／または分散剤などの調合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含んでもよい。代替的に、一またはそれ以上の補因子を含む調合物は、使用前に、無菌パイロジェンフリー水などの適当な媒体で再構成するための粉末形態でもよい。
【０２４５】
本明細書中で記載されている調合物は、また、緩効性、徐放性、または放出制御調合物であってもよい。例えば、調合物は、即放性調合物を伴うものよりもより低頻度または速度で一またはそれ以上の補因子を放出してもよく（すなわち、一日一回対一日２回または一日３回）、そしてそれは、個人のコンプライアンスおよび介護者都合を改善することができる。これらの調合物は、特にそれらが、さらにコンプライアンスおよび密着性を改善するための投与の開始から生物学的に効果的な量で一またはそれ以上の補因子を提供するために有用であってもよく、および短期間に補因子の効果的な定常状態の濃度の達成を可能にできる。さらに、制御放出調合物は、安全に投与される補因子の高用量を許容し、さらにさまざまな指示のためのこれらの調合物の有用性を増加することができる。
【０２４６】
本明細書中で提供される制御放出投薬形態を使用することで、一またはそれ以上の補因子は、補因子の同じ量の即放性調合物において見られるよりもより遅い速度でその投与形態について放出することができる。いくつかの実施態様では、制御放出調合物について投与から最大濃度の規定された期間を超えて濃度についての変化として測定された生物学的サンプルについての変化の速度は、即放調合物の速度の約８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％未満である。さらに、いくつかの実施態様では、経時的濃度について変化の速度は、即放形態のための速度の約８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％未満である。
【０２４７】
いくつかの実施態様では、経時的濃度の変化の速度は、相対的に比例した方法について最大濃度の時間を増加することにより減少する。例えば、最大濃度時間について２倍増加は、約２の係数（ｆａｃｔｏｒ）により濃度について変化の速度を減少してもよい。その結果として、一またはそれ以上の補因子は、即放投与形態を超えて著しく減少した速度でその最大濃度を達成するように提供されてもよい。本発明の組成は、２４時間、１６時間、８時間、４時間、２時間、または少なくとも１時間まで最大濃度について変化を提供するために調合されてもよい。濃度の変化の速度について関連する減少は、約０．０５、０．１０、０．２５、０．５または少なくとも０．８の係数までであってもよい。ある実施態様では、これは、その投与の１時間以内に循環中に一またはそれ以上の補因子の約３０％、５０％、７５％、９０％、または９５％未満を放出により実行する。
【０２４８】
場合により、制御放出調合物は、同じ補因子の同じ用量の即放調合物のためのそれらの７５％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％未満の初期（例えば、投与後２時間‐投与後４時間）傾斜を有する血漿濃度曲線を示す。
【０２４９】
いくつかの実施態様では、溶解試験において測定されたように補因子の放出速度は、最初の１、２、４、６、８，１０または１２時間を越えて同じ補因子の即放調合物用の速度の約８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％未満である。
【０２５０】
本明細書中で提供される制御放出調合物は、さまざまな形式を採用できる。いくつかの実施態様では、調合物は、液体投与形態（例えば、懸濁液またはスラリー）、および経口固形投与形態（例えば、錠剤または混合散剤（ｂｕｌｋ  ｐｏｗｄｅｒ）、これらに限定されないが、本明細書中に記載されたものを含む経口投与形態である。
【０２５１】
本明細書中で開示された調合物の制御放出錠剤は、マトリックス、リザーバーまたは浸透圧システムであってもよい。任意の３つのシステムが適当であるが、後者の２つのシステムは、個人の遺伝子的構造に依拠する、単一補因子の大量の包含のため、または補因子の大多数の包含のためなどの、相対的に大質量をカプセル化するためのより最適な能力を有することができる。いくつかの実施態様では、リザーバーシステムに基づく遅効性錠剤は、ここで、一またはそれ以上の補因子を含む核は、多孔性膜のコーティングによりカプセル化され、そしてそれは、水和作用にあたり、一またはそれ以上の補因子をそれを通じて拡散することを可能にする。効果的な成分の結合された量は、一般的にグラム量であるため、効率的なデリバリーシステムは、最適な結果を提供できる。
【０２５２】
従って、錠剤またはピルは、またコーティングされてもよく、または他方で持続性（遅延性）の利点を与えるための投与形態を提供するために構成される。例えば、例えば、錠剤またはピルは、内部の投与量、外部の投与量構成要素を含み、後者は前者の外被の形態となる。２つの構成要素は、胃中での分解に耐えるため提供され、および内部構成要素が十二指腸内をそのまま通過することを許容し、または放出について遅延させるための腸溶層（ｅｎｔｅｒｉｃ  ｌａｙｅｒ）により分離されてもよい。材料の多様性は、そのような腸溶層またはコーティングのために使用でき、そのような材料は、いくつかのポリマー酸（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）およびシェラック、セチルアルコールおよびセルロースアセテートのようなそのような材料を伴うポリマー酸の混合物を含む。いくつかの実施態様では、補因子の大多数を含む調合物は、異なる速度または異なる時間で放出される異なる補因子を有してもよい。例えば、腸溶層と伴に散在性の補因子の追加的な層があってもよい。
【０２５３】
除放性錠剤を作るための方法は、米国特許公開第２００６／０５１４１６および２００７／００６５５１２、または本明細書中で開示された他の参照を参照などの当該技術分野において知られる。米国特許番号第４，７６９，０２７、４，８９７，２６８、および５，３９５，６２６中に記載されたような方法が、個人の遺伝子的構造により決定される一またはそれ以上の補因子の徐放性調合物を調製するために使用できる。いくつかの実施態様では、調合物は、米国特許番号第６，９１９，３７３、６，９２３，８００、６，９２９，８０３、および６，９３９，５５６中に記載されるようなＯＲＯＳ（登録商標）技術を使用することで調製される。米国特許番号第６，７９７，２８３、６，７６４，６９７、および６，６３５，２６８中で記載されるような他の方法が、また本明細書中で開示される調合物を調製するために使用できる。
【０２５４】
さらに、本明細書中で開示される調合物を作るための方法は、また適当なおよび所望する風味、テクスチャー、または粘度を有するために調合されてもよい。例えば、調合物は、芳香剤、着色剤などの剤を含んでもよく、および他の剤を使用することもできる。例えば、ペクチン酸およびそれの塩、アルギン酸およびそれの塩、有機酸、付着性の保護コロイド、ｐＨ制御剤、安定剤、保存剤、グリセリン、アルコールなどである。
【０２５５】
いくつかの実施態様では、個人の遺伝子的構造により決定されたような一またはそれ以上の補因子を含む調合物は、食品、食品添加物または飲料などの消費のための適当なおよび所望する風味、テクスチャー、および粘度を有するために調合され得る。任意の適当な食品担体が、現在の食品消費について使用されてもよい。本発明の食品担体は、実際に任意の食品製品を含む。そのような食品担体は、食品バー（グラノーラバー、タンパク質バー、キャンディバーなど）、シリアル製品（オートミール、ブレックファーストシリアル、グラノーラなど）、ベーカリー製品（パン、ドーナッツ、クラッカー、ベーグル、ペストリー、ケーキなど）、飲料（ミルクに基づく飲料、スポーツ飲料、フルーツジュース、アルコール飲料、ボトルドウォーター）、パスタ、穀物（ライス、コーン、オーツ、ライ、小麦、フラワーなど）、卵製品、スナック（キャンディ、チップス、ガム、チョコレートなど）、肉、フルーツ、および野菜を含むが、これらに限定されない。
【０２５６】
一つの実施態様では、仮に補因子の一またはそれ以上について存在する場合は、本明細書中で利用される食品担体は、所望しない風味（例えば、苦味）をマスキングできる。所望するなら、本明細書中で示される食品組成は、補因子の一またはそれ以上のそれよりもより望ましいテクスチャーおよびアロマを示す。
【０２５７】
他の実施態様では、固形食品担体は、栄養補助スナックバー、パスタ、パンなどの食事代替品の形態で本食品組成物を得るために本発明に従って使用されてもよい。さらに他の実施態様では、半固形食品担体は、ガム、チューイキャンディ（ｃｈｅｗｙ  ｃａｎｄｙ）またはスナックなどの形態で本食品組成物を得るために本発明に従って使用されてもよい。
【０２５８】
いくつかの実施態様では、栄養補助ジュース、コーヒー、ティー、ソーダ、フレーバーウォーターなどの飲料形態など液体食品担体が、使用できる。例えば、飲料は、通常の飲料について存在する多様なデオドラントまたは天然の炭水化物などの液体組成物と同様の調合物を含んでもよい。天然の炭水化物の例は、グルコースおよびフルクトースなどのモノサッカライド、マルトースおよびスクロースなどのジサッカライド、デキストリンおよびシクロデキストリンなどの転化糖、並びにキシリトールおよびエリスリトールなどの糖アルコールを含むが、これらに限定されない。タウマチン、ステビア抽出物、レバウディオサイドＡ（ｌｅｖａｕｄｉｏｓｉｄｅ  Ａ）、グリシルリチンなどの天然デオドラント、およびサッカリン、アスパルテームなどの合成デオドラントが、また使用されてもよい。芳香剤、着色剤などの剤、および他の剤が、また使用されてもよい。例えば、ペクチン酸およびそれの塩、アルギン酸およびそれの塩、有機酸、付着性の保護コロイド、ｐＨ制御剤、安定剤、保存料、グリセリン、アルコール、またはカーボナイジング（ｃａｒｂｏｎｉｚｉｎｇ）剤が、また使用できる。フルーツおよび野菜は、本明細書中で論じられた調合物を含む食品または飲料を調製するために使用できる。
【０２５９】
本明細書中で開示される調合物は、また、個人、または個人の遺伝子的構造上の報告を伴う個人の健康管理、服用量の指示および調合物の投与、個人のライフスタイル（推奨される運動または食習慣）、または遺伝的バリアントの情報およびそれらの補因子依存性の酵素欠損および補因子治療可能な症状を提供することができる。
【０２６０】
ビジネス方法
【０２６１】
また、本明細書中で開示されることは、一またはそれ以上の遺伝的バリアントの存在、不存在を決定することにより、個人の遺伝子的構造を決定するための、補因子依存性の酵素欠損を決定するための、および遺伝子的構造、補因子依存性酵素欠損、または両方を個人または彼／彼女の代理人に報告するためのサービスを提供するためのビジネス方法である。本明細書中で使用されるように、「彼／彼女の代理人」は、保護者、健康管理マネージャー、管理人（例えば、医師、看護師、医療補助者など）、薬剤師、親、弁護士、医師、個人の会計士であってもよい。
【０２６２】
また、本明細書中で提供されることは、一またはそれ以上の遺伝的バリアントの存在、不存在を決定することにより、個人の遺伝子的構造を決定するための、個人のための調合物用の一またはそれ以上の補因子を選択するための、および遺伝子的構造、一またはそれ以上の補因子の調合物、または両方を個人または個人の健康管理マネージャーに報告するためのサービスを提供するためのビジネス方法である。ビジネス方法は、また一またはそれ以上の遺伝的バリアントの存在または不存在を決定することにより個人の遺伝子的構造を決定すること、個人のための調合物用の一またはそれ以上の補因子の量を決定すること、および遺伝子的構造、一またはそれ以上の補因子の量を伴う調合物、または両方を個人または個人の健康管理マネージャーに報告するためのサービスを提供することを含んでもよい。
【０２６３】
いくつかの実施態様では、本方法は、本明細書中で記載したそれらなど、補因子依存性酵素欠損、補因子治療可能な症状、調合物のために選択される一またはそれ以上の補因子、または選択または決定ステップについて、調合物のための一またはそれ以上の補因子の量を決定することを、一またはそれ以上の個人的な特性に組み込むためにさらに含む。
【０２６４】
一またはそれ以上の遺伝的バリアントの存在または不存在など；代謝状態のリスク、素因、診断、または予後診断、補因子依存性の酵素欠損または補因子治療可能な症状；個人の遺伝子的構造に基づく調合物のために選択された補因子（複数）；調合物のための補因子（複数）の量；投薬療法などの情報は、個人または個人の健康管理マネージャーに対してサービスまたはビジネスとして提供できる。健康管理マネージャーは、健康管理者、医師、看護師、遺伝子カウンセラー、または他の健康管理の専門家であってもよい。いくつかの実施態様では、健康管理マネージャーは、製薬会社または栄養補助食品会社などの健康管理に関連する会社である。健康管理マネージャーは、個人についての調合物を管理し、個人をモニターし、または両方でもよい。
【０２６５】
例えば、個人は、管理された遺伝子的構造に基づいて選択された補因子の大多数を含む調合物を有してもよい。健康管理マネージャーは、個人を監視し、および調合物中の補因子の量が、個人にとって適当かまたは変えるべきかを決定する。結果のデータおよび情報は、個人についての一またはそれ以上の遺伝的バリアントに対する一またはそれ以上の補因子の量と相関するように使用でき、および他の個人の遺伝的バリアントに対する補因子の量と相関することについての将来の使用のために、データベースまたはコンピュータ読み取り可能な媒体中に保存できる。情報は、栄養補助食品会社に対して使用されまたは販売できる。
【０２６６】
他の実施態様では、健康管理マネージャーは、製薬会社でもよい。健康管理マネージャーは、個人のための遺伝子的構造により選択されるような、一またはそれ以上の補因子の調合物および一またはそれ以上の補因子の量が、治療上の有効性を増強するかもしれないかどうかを決定することに興味があってもよい。それ自体として、製薬会社は、異なる調合物をモニターするための臨床試験と同様に個人およびそれらの効果に対して管理されている治療を行ってもよい。
【０２６７】
いくつかの実施態様では、本明細書中で開示される方法は、さらに個人または個人の健康管理マネージャーに対して、個人の遺伝子的構造により選択されたような一またはそれ以上の補因子の調合物を提供することを含む。調合物は、個人の遺伝子的構造により決定されるような一またはそれ以上の補因子の量を含み得る。さらに、一またはそれ以上の補因子の選択、一またはそれ以上の補因子の量、または両方は、また、上述したように、一またはそれ以上の個人の個人的な特性に基づいてもよい。調合物は、本明細書中で開示された方法により生産されてもよい。さらに、調合物は、個人の遺伝子的構造の解析を実行するための同一または異なる集団により製造されてもよい。
【０２６８】
一またはそれ以上の集団、同一または異なる集団または集団（複数）などは、個人から生物学的サンプルを採取または取得でき、生物学的サンプルから一またはそれ以上の遺伝的バリアントを検出でき、一またはそれ以上の遺伝的バリアントに基づいた補因子依存性の酵素欠損を決定でき、個人の遺伝子的構造に基づいた個人のための調合物用の一またはそれ以上の補因子を決定でき、個人の遺伝子的構造に基づいた個人のための調合物用の一またはそれ以上の補因子の量を決定でき、任意の上述のステップ（遺伝子的構造の存在または不存在、補因子依存性の酵素欠損または補因子治療可能な症状のリスクまたは素因、調合物など）の結果を報告することができ、調合物を製造でき、または調合物を提供できる。
【０２６９】
一またはそれ以上の集団は、かれらが提供するプロセスまたはサービスのそれぞれのための、またはかれらが提供するサービスまたはプロセスのサブセットのための料金を請求してもよい。サービスのレベルに基づいた異なるレベルの料金または請求金額であってもよい。例えば、一またはそれ以上の遺伝的バリアントを検出するための集団は、より高い料金用のより多い遺伝的バリアントを検出するためのサービスを提供してもよい。
【０２７０】
また、本明細書中で提供されるものは、補因子治療可能な症状を伴う個人を分類するための方法である。例えば、個人の遺伝子的構造に基づき個人は、補因子依存性の酵素欠損または補因子治療可能な症状の低‐高リスク範囲の規模内で分類されてもよい。分類システムは、１‐５の範囲などの数的点数化システムであってもよく、ここで１は、低リスクを示し、および５は、高リスクを示す。他の実施態様では、分類システムは、記述的なまたはアルファベット順のシステムである。例えば、システムは、補因子依存性の酵素欠損について、「低リスク」、「中リスク」、または「高リスク」として個人を分類してもよい。代替的にシステムは、Ａ‐Ｅなどのアルファベット順のシステムに基づき個人を分類してもよく、ここで「Ａ」範囲は、個人が補因子依存性の酵素欠損について低リスクを有することを示し、および「Ｅ」範囲は、補因子依存性の酵素欠損について高リスクを個人が伴うことを示す。
【０２７１】
分類システムは、また、異なる色彩、シンボル、または他の表示で示してもよい。例えば、グリーン、オレンジ、およびレッドの色彩システムが使用されてもよく、ここでグリーンは、補因子依存性の酵素欠損の低リスクを示すために、オレンジは中リスクを示すために、およびレッドは高リスクを示すために使用される。分類するためのさまざまな方法は、組み合わせることができる。例えば、分類システムは、記述的スキームを伴う色彩スキームを組み合わせることができる。分類は、個人または個人の健康管理マネージャーに対して提示される報告中で提供できる。分類は、個人の遺伝子的構造由来の他の結果を報告するための同一または異なる集団により提供されてもよい。
【０２７２】
本明細書中で開示された方法は、個人または個人の健康管理マネージャーに対して一またはそれ以上の報告を提供することを含んでもよい。例えば、一またはそれ以上の報告は、個人の遺伝子的構造など、一またはそれ以上の遺伝的バリアントの存在または不存在などの情報；個人のための調合物用の一またはそれ以上の補因子または一またはそれ以上の補因子の量を決定することにより組み込んだ個人の個人的特性；補因子依存性の酵素欠損または個人の遺伝子的構造に基づく補因子治療可能な症状などの代謝状態のリスク、素因、診断、または予後診断；個人のための調合物用に選択された一またはそれ以上の補因子；または個人のための調合物用に決定された一またはそれ以上の補因子の量を含み得る。本明細書中で開示された方法は、また、個人に対しての一またはそれ以上の報告において個別化された栄養のまたは食事のプランを提供できる。
【０２７３】
報告は、ウェブサイトによりアクセス可能などのデジタル形式で提供されてもよい。報告は、また、コンピュータ読み取り可能な媒体に保存されるデジタル形式で提供されてもよい。報告は、また紙形態で提供できる。報告は、個人または個人の健康管理者に対してネットワークを使って送られてもよい。いくつかの実施態様では、更新された報告は、個人または個人の健康管理マネージャーに対して作成されおよび提供される。例えば、新たな遺伝的バリアントおよび相関は、科学的研究、公知文献、または他の情報源を通じて取得してもよい。新たな遺伝的バリアントおよび相関は、補因子に依拠する酵素欠損と関連することが以前は知られていなかった遺伝的バリアントでもよい。代替的に、遺伝的バリアントは、補因子に依拠する酵素欠損と関連することが知られているであろうが、相関は、従前の発見よりもより弱いまたはより強いであろう。他の実施態様では、遺伝的バリアントは、知られおよび以前に補因子に依拠する酵素欠損と関連してもよいが、新たな結果は、異なる補因子に依拠する酵素欠損との新たな関連を示す。
【０２７４】
新たな遺伝的バリアントおよび相関は、異なる補因子または個人のため作成された本来の調合物と比較して個人の調合物について補因子の組み合わせなどの、新たな結果を作成するために使用することができる。他の実施態様では、個人のための調合物について一またはそれ以上の補因子の異なる量が、新たな遺伝子敵バリアントから生じる。
【０２７５】
他の実施態様では、更新された報告は、更新された個人の個人的な特性に基づき作成される。例えば、最初の報告は、妊娠した女性のために作成された。出産後、個人は、一またはそれ以上の補因子の推奨される調合物が、もはや妊婦ではない女性に与えられる変化することを示す更新された報告を有することができる。他の実施態様では、個人は、最初の報告が最初に作成されたときと比較して、食事プランについての新たな医療の症状変化の発見に基づき更新された報告を有することができる。更新された報告は、異なる補因子または補因子の異なる量などの更新された調合物を含み得る。
【０２７６】
コンピュータシステム
【０２７７】
本発明のさらに他の側面では、本明細書中で開示された一またはそれ以上の方法を実行するためのコンピュータシステムが提供される。従って、本明細書中で開示される方法は、コンピュータシステム（またはデジタル装置）などの典型的な論理装置により実行できる。コンピュータシステムの例は、図７で示され、そしてそれは、個人の生物学的サンプルの解析から作成されたデータを受信および保存できる。例えば、コンピュータシステムは、表Ａ‐Ｚ中で列挙されたそれらなどの、生物学的サンプルについての一またはそれ以上の遺伝的バリアントの存在または不存在などのデータを保存できる。さらに、典型的な装置またはコンピュータシステムは、また個人のための一またはそれ以上の補因子の調合物を決定するための、個人のための調合物について一またはそれ以上の補因子の量を決定するための、補因子に依拠する酵素欠損のリスクまたは素因を決定するための、補因子治療可能な症状のリスクまたは素因を決定するための、補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状のための異なるリスクカテゴリーについて個人を分類するための、個人のための推奨プランによる個人化されたライフスタイルを決定するための、コンピュータにより決定された調合物を摂取するための指示を作成するための、または任意の上の決定または解析に基づく報告を作成するためのデータを解析できる。
【０２７８】
いくつかの実施態様では、一またはそれ以上のコンピュータシステムは、一またはそれ状の上述のプロセスを実行するために使用されてもよい。例えば、コンピュータシステムのネットワークが使用されてもよく、ここでコンピュータシステムのネットワークは、同じ場所または異なる場所でもよい。コンピュータシステムは、一つのコンピュータシステムからの結果、データ、または情報が、一またはそれ以上の他のコンピュータシステムに対して伝達でき、受信でき、および／または出力できるように、連結されてもよい。伝達は、ネットワーク接続、ワイヤレス接続、またはインターネット接続でもよい。そのような接続は、ワールドワイドウェブを通じて通信のために提供される。本発明に関するデータは、そのようなネットワークを通じて伝達できる。
【０２７９】
図７は、典型的なコンピュータシステム（またはデジタル装置）を示し、ここでコンピュータシステム７００は、媒体７１１および／またはネットワークポート７０５からの指示を読むことができる理論装置として理解され、そしてそれは、場合により据え付けられた媒体７１２を有するサーバー７０９と連結できる。図７で示されたシステムは、ＣＰＵ７０１、ディスクドライブ７０３、キーボード７１５および／またはマウス７１６などの任意の入力装置および任意のモニター７０７を含む。データ伝達は、ローカルまたは遠隔位置でサーバー７０９に対して示された通信媒体を通じて達成できる。
【０２８０】
通信媒体は、任意の方法の伝達および／または受信データを含んでもよい。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、ワイヤレス接続またはインターネット接続でもよい。そのような接続は、ワールドワイドウェブを通じて通信のために提供される。本発明に関連するデータは、当事者７２２により受信および／またはレビューのためにそのようなネットワークまたは接続を通じて伝達できることが想像される。受信当事者７２２は、個人または健康管理マネージャーでもよいが、限定されない。一つの実施態様では、コンピュータ読み取り可能な媒体は、結果の伝達のために適当な媒体を含む。媒体は、補因子治療可能な症状のための調合物、リスクまたは素因、本明細書に記載された方法を使用することに由来する個人のための個別化された推奨ライフスタイルに関して結果を含む。
【０２８１】
コンピュータシステムは、補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状のリスク、素因、診断を伴う遺伝的バリアントの存在または不存在を相関することにより、個人の生物学的サンプルから得られた遺伝子的データを解析できる。例えば、コンピュータシステムは、補因子に依拠する酵素欠損、または補因子治療可能な症状に対する代謝経路について遺伝子の少なくとも一の遺伝的バリアントを相関するためのコードを有してもよい。コンピュータシステムは、仮に個人が特定の遺伝的バリアントを有する場合に、遺伝子バリアントおよび欠損または症状を有するオッズ比または相対的なリスクなどの補因子に依拠する酵素欠損、または補因子治療可能な代謝症状に対するそれらの関連または相関のデータベースを有することができる。コンピュータシステムは、その後、生物学的サンプルから得たデータと比較しおよび遺伝的バリアントおよび相関のデータベースと比較することにより、個人のリスクまたは素因、または補因子に依拠する酵素欠損、または補因子治療可能な代謝症状を決定できる。
【０２８２】
コンピュータシステムは、また個人の生物学的サンプルの解析から作成されたデータに基づくなど、個人の遺伝子的構造に基づく調合物のための一またはそれ以上の補因子を選択するために使用できる。例えば、コンピュータシステムは、特定の遺伝的バリアントを伴うまたは伴わない個人のための補因子調合物を決定するためのコードを比較できる。コンピュータシステムは、また、個人の遺伝子的構造に基づく調合物のための一またはそれ以上の補因子の量を決定するために使用できる。例えば、コンピュータシステムは、特定の遺伝子バリアントの存在または不存在に基づく個人のための調合物について一またはそれ以上の量を決定するためのコードを含み得る。
【０２８３】
いくつかの実施態様では、コンピュータシステムは、また、遺伝的バリアントのための大多数を解析しまたは相関することができる。例えば、コンピュータシステムは、個人のリスクまたは素因、または補因子に依拠する酵素欠損の診断、または補因子治療可能な代謝症状を決定するための遺伝的バリアントの大多数を相関するためのコードを含み得る。コンピュータシステムは、また、個人のための調合物における一またはそれ以上の補因子の量と遺伝的バリアントの大多数の相関のためのコードを含み得る。その上、コンピュータシステムは、さらに補因子に依拠する酵素欠損のリスクまたは素因、または補因子治療可能な症状；個人のための調合物についてあるべき一またはそれ以上の補因子；または個人のための調合物用の一またはそれ以上の補因子の量を決定するために個人的な特性に組み込まれてもよい。
【０２８４】
コンピュータシステムは、また、報告の作成、報告の出力、および報告の伝達のためのコードを含み得る。報告の伝達は、安全なネットワークなどのネットワークを通じてでもよい。同様に、個人の生物学的サンプルの解析から得られるデータは、受信でき、および安全なネットワークなどのネットワークを通じてデータを伝達することにより送信できる。いくつかの実施態様では、報告は、インターネットを経由して個人または個人の健康管理マネージャーに対して送信される。報告は、固有のＩＤコードの使用で伝達できる。報告は、家庭用コンピュータ、ワークコンピュータなどのコンピュータ、またはブラックベリー（Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ）（登録商標）、アイフォン（ｉＰｈｏｎｅ）（登録商標）などのスマートフォンなどのパーソナルデジタルアシスタントまたはデジタル装置、または任意の他の利用可能な装置で転送できる。
【０２８５】
さらに、本明細書中で記載されるコードは、コンピュータ読み取り可能な媒体上でコード化でき、そしてそれはコンピュータシステムの部分を形成できる。例えば、本明細書中で開示されるコンピュータシステムは、データ処理装置上の第一データセットを含むことができ、ここで、第一データセットは、補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状のリスクに対する個人の遺伝的バリアントの存在と相関するための情報を含む。コンピュータシステムは、さらにデータ処理装置上の第二データセットを含み、ここで第二データセットは、一またはそれ以上の情報を伴う補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状とマッチングするための情報を含む。いくつかの実施態様では、コンピュータシステムは、補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状のリスクに対する遺伝子バリアントの大多数を相関する情報を伴うデータセットを含む。その上、コンピュータシステムは、一またはそれ以上の補因子の調合物を伴う補因子に依拠する酵素欠損および補因子治療可能な症状をマッチングする個人的な特性を組み込むことができる。一またはそれ以上の個人的な特性上の情報は、本明細書中に記載されたコンピュータシステムのデータ処理装置上の他のデータセットを形成できる。コンピュータシステムは、また、一またはそれ以上の遺伝的バリアント、一またはそれ以上の補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状、一またはそれ以上の補因子の一またはそれ以上の調合物、または個人の一またはそれ以上の個人的な特性と相関する推奨ライフスタイル上のさらなるデータセットを含み得る。
【０２８６】
他の実施態様では、第一データセットは、補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状と相関する一またはそれ以上の遺伝子の一またはそれ以上の遺伝子バリアントと関連する情報を含む。例えば、本遺伝子は、チアミン代謝経路、リボフラビン代謝経路、ビタミンＢ６代謝経路、ニコチン酸塩およびニコチンアミド代謝経路、パントテン酸塩およびＣｏＡ生合成経路、ビオチン代謝経路、リポ酸代謝経路、葉酸塩／ホモシステイン代謝経路、レチノール代謝経路、ポルフィリン代謝経路、ユビキノンおよび他のテルペノイドキノン生合成経路を含んでもよいが、限定されない。遺伝的バリアントは、ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（カルシフェロール）、ビタミンＥ、ビタミンＫ（フィロキノン）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ９（葉酸塩／葉酸）、ビタミンＢ１２（トコフェロール）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、またはコリンを代謝するための経路について遺伝子でもよい。
【０２８７】
例えば、一またはそれ以上の遺伝子は、ＡＨＣＹ、ＡＨＣＹＬ１、ＡＨＣＹＬ２、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＡＬＤＨＬ２、ＡＭＴ、ＡＴＩＣ、ＢＨＭＴ１、ＢＨＭＴ２、ＣＢＳ、ＣＴＨ、ＤＨＦＲ、ＤＭＧＤＨ、ＦＰＧＳ、ＦＴＣＤ、ＧＡＲＴ、ＧＧＨ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＴＦＭＴ、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＨＦＤ２、ＭＴＨＦＲ、ＭＴＨＦＳ、ＭＴＲ、ＭＴＲＲ、ＮＡＡＬＡＤ２、ＳＡＲＤＨ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２、またはＴＹＭＳなどの葉酸塩経路から選択される遺伝子でもよい。第一データセットは、例えば少なくとも、２、３、４、５、６、７、８，９，１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、または１００遺伝子バリアントなどの遺伝子バリアントの大多数を含み得る。遺伝的バリアントは、同じ代謝経路についての同じ遺伝子、異なる遺伝子、または異なる代謝経路についての異なる遺伝子でもよい。ＳＮＰなどの遺伝子バリアントは、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＧＡＲＴ、ＡＨＣＹ、ＡＭＴ、ＣＢＳ、ＣＴＨ、ＤＨＦＲ、ＦＰＧＳ、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＨＦＤ２、ＭＴＲ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２、またはＴＹＭＳの遺伝子バリアントから選択できる。例えば、遺伝的バリアントは、表Ａ‐Ｘから選択できる。
【０２８８】
コンピュータシステムは、リスク、素因またはサンプルについて同定される一またはそれ以上の遺伝的バリアントのための補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状の感受性を割り当てるための遺伝子バリアント上の情報を含む第一データセットを使用でき、およびその後、補因子、補因子の大多数、または一またはそれ以上の量を含む調合物を割り当てるための第二データセットを使用できる。いくつかの実施態様では、コンピュータシステムは、第三データセットなどの他のデータセットを使用できる。
【０２８９】
例えば、個人的な特性上の情報を含む第三データセットを含み得る。コンピュータシステムは、リスク、素因または第一データセットを使用することから得られる補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状の感受性を修正するための、および／または、第二データセットを使用後得られる結果を修正することにより、補因子、補因子の大多数、または一またはそれ以上の補因子の量を含む調合物を割り当てるための個人的な特性の第三データセットを使用できる。
【０２９０】
例えば、個人は、補因子治療可能な症状の高いリスクを示す遺伝的バリアントを有する。個人は、また補因子の高い摂取を有する。第一データセットを使用することで、コンピュータシステムは、個人が補因子治療可能な症状の高いリスクを有することを決定する結果を作成するが、個人の特性を伴う第三データベースを使用することで、なぜなら個人の食事が、当該補因子の高い摂取を有するので、リスクが修正される。他の実施態様では、第二データセットの結果は、補因子の高い量の調合物を示すであろうが、個人が、補因子の高い摂取を有する第三データセットを考慮すると、調合物は、補因子のより低い量に修正されるであろう。
【０２９１】
さらに他の実施態様では、第三データセットは、ライフスタイル推奨を含むことができ、そしてそれは、個人のための個別化されたライフスタイル推奨を提供できる。個別化されたライフスタイル推奨は、栄養プラン、食事プラン、または運動プランでもよいが、限定されない。例えば、個別化されたライフスタイル推奨プランは、特定のビタミンまたはミネラルなどのさまざまな補因子の推奨された最小および／または最大量、個人の食事について含まれるべき食品または飲料、避けるべき食事の種類、および含むべき運動の種類を含んでもよいが、限定されない。コンピュータシステムは、第一データセットを使用することでコンピュータシステムにより決定されるような補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状に対してライフスタイル推奨をマッチするためのライフスタイル推奨の第三データセットを使用できる。ライフスタイル推奨の第三データセットは、また、第二データセットを使用後得られた補因子、補因子の大多数、または一またはそれ以上の補因子の量を含む調合物に基づく個別化された推奨を提供するために使用できる。
【０２９２】
例えば、個人は、補因子治療可能な症状の高いリスクを示す遺伝的バリアントを有する。第一データセットを使用することで、コンピュータシステムは、個人が補因子治療可能な症状の高いリスクを有することを決定することについての結果を作成するであろう、およびライフスタイル推奨を伴う第三データセットを使用することで、一またはそれ以上のライフスタイル推奨が、補因子について高い食品を含む個人のための食事プランを提供するなどの、補因子治療可能な症状のための個人のリスクとマッチするであろう。他の実施態様では、第二データセットの結果は、補因子の高い量の調合物を示すであろう、および個人により摂取する調合物に基づき、調合物の個人の摂取を補完する食事プランなどの、一またはそれ以上のライフスタイル推奨が作成されるであろう。
【０２９３】
さらに他の実施態様では、本明細書で記載されるコンピュータシステムは、サンプルについて同定された一またはそれ以上の遺伝的バリアント補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状のリスク、素因、または感受性を割り当てるために遺伝的バリアント上の情報を含む第一データセット；補因子、補因子の大多数、または一またはそれ以上の補因子の量を含む調合物を割り当てるための第二データセット；第一データセット、または一またはそれ以上の補因子を含む調合物の使用から得られた補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状のリスク、素因、または感受性を修正するための個人特性の第三データセット；個別化されたライフスタイル推奨を提供するための第四データセットなどの少なくとも４のデータセットを使用する。
【０２９４】
一つの実施態様では、少なくとも４のデータセットを使用するコンピュータシステムは、サンプルについて同定された一またはそれ以上の遺伝的バリアントのための補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状のリスク、素因、または感受性を割り当てるために遺伝的バリアント上の情報を含む第一データセットを使用する。コンピュータシステムは、その後、補因子、補因子の大多数、または一またはそれ以上の補因子の量を含む調合物を割り当てるために第二データセットを使用する。個人的な特性の第三データセットは、その後、第一データセットの使用から得られた補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状のリスク、素因、または感受性および／または第二データセットの使用から得られた一またはそれ以上の補因子を含む調合物を修正するために使用される。ライフスタイル推奨の第四データセットは、その後、第三データセットの使用から得られた補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状の修正されたリスクまたは感受性；および／または第三データセットの使用から得られた一またはそれ以上の補因子を含む調合物に対して一またはそれ以上のライフスタイル推奨をマッチングすることにより少なくともライフスタイル推奨を作成するために使用される。
【０２９５】
例えば、個人は、補因子治療可能な症状の高いリスクを含む遺伝的バリアントを有する。個人は、また、補因子の高い摂取を有する。第一データセットを使用することで、コンピュータシステムは、個人が、補因子治療可能な症状の高いリスクを有することを決定することについての結果を作成するであろう、しかし個人的な特性を伴う第三データセットを使用することで、個人の食事が、当該補因子の高い摂取を有するために、リスクは修正される。第二データセットの結果は、補因子の高い量の調合物を示すであろう、しかし個人的な特性の第三データセットを考慮すると、個人は、補因子の高い量を有するが、調合物は、補因子のより低い量に修正される。ライフスタイル推奨の第四データセットは、その後、第三データセットの使用から生じる補因子治療可能な症状の修正されたリスクに対して一またはそれ以上のライフスタイル推奨をマッチし、および／または第三データセットの使用から生じる補因子の修正された調合物に対して一またはそれ以上の推奨ライフスタイルをマッチするであろう。
【０２９６】
さらに他の実施態様では、コンピュータシステムは、さらに、本明細書中で記載されたような分類スキームなどの個人を分類するための情報を含むデータセットを含む。分類データセットは、本明細書中で記載した任意のデータセットと組み合わせて使用できる。例えば、第一データセットを使用することで、コンピュータシステムは、個人が、補因子治療可能な症状の高いリスクを有することを決定するための結果を作成できる。個人を分類するための情報を含むデータセットを使用することで、分類カテゴリーは、第一データセットの使用から得られたリスクとマッチされるであろう。他の実施態様では、第一データベースの使用から得られるリスクは、個人的な特性を伴うデータセットを使用することにより修正される。個人を分類するための情報を含むデータセットを使用することで、分類カテゴリーは、個人的な特性のデータセットを使用することで得られた修正されたリスクとマッチされるであろう。さらに他の実施態様では、個人を分類するためのデータセットを使用した後、一またはそれ以上の補因子の調合物、または一またはそれ以上の補因子の量上の情報を含むデータセットは、個人の分類に基づいた一またはそれ以上の補因子および／または一またはそれ以上の補因子の量とマッチするために使用できる。他の実施態様では、ライフスタイル推奨を含むデータセットは、個人の分類に基づいた個人の一またはそれ以上のライフスタイル推奨とマッチするために使用できる。
【０２９７】
さらに、本明細書中で記載された任意のデータセットの一つは、更新できる。例えば、補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状に対する遺伝的バリアントおよびそれらの相関のデータセットは、新たな遺伝的バリアントで更新でき、および相関は、科学的研究、公知文献または他の情報源を通じて得られてもよい。新たな遺伝的バリアントおよび相関は、補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状と関連するための既知でない新規な遺伝的バリアントでもよい。代替的に、遺伝的バリアントは、補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状と関連することが知られていてもよいが、相関は、以前の発見よりもより弱いまたはより強いであってもよい。他の実施態様では、遺伝的バリアントは知られ、および補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状と以前に関連するが、新たな結果は、異なる補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状と新たな関連を示す。
【０２９８】
さらに他の例では、補因子、補因子の大多数、または一またはそれ以上の補因子の量を含む調合物を割り当てるために使用されるデータセットは、新たな補因子、異なる補因子、または補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状の一定のリスクまたは素因に対して割り当てるために本来使用された量と異なる補因子の量で更新できる。
【０２９９】
個人的なデータセットは、また、個人の新たなまたは修正された特性を含むことにより、または補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状と関連することが以前に知られていない個人の特性で更新することにより更新することができ、または相関は、以前に発見されたものよりもより弱いまたは強くてもよい。データセットは、ライフスタイル推奨上の情報を含むことができ、および個人の分類は、また、科学的研究、公知文献、または他の情報源を反映することで更新できる。例えば、ライフスタイル推奨は、異なる補因子治療可能な症状を修正でき、または相関できる。
【０３００】
本明細書中で記載されたコンピュータシステムは、また、一またはそれ以上の以下：個人のサンプル由来の遺伝的バリアントの存在または不存在など、個人の遺伝子的構造；補因子に依拠する酵素欠損または補因子治療可能な症状の個人のリスク；個人の遺伝子的構造に基づく一またはそれ以上の補因子を含む調合物；個人の遺伝子的構造に基づく調合物のための一またはそれ以上の補因子の量；補因子治療可能な症状または補因子に依拠する酵素欠損のリスクまたは個人のための調合物を決定するために考慮される個人の個人的な特性；一またはそれ以上のライフスタイル推奨または個別化されたライフスタイル推奨プラン；および個人の分類を含む一またはそれ以上の報告を作成できる。
【０３０１】
報告は、ウェブサイトによりアクセス可能などのデジタル形式で提供されてもよい。報告は、また、コンピュータ読み取り可能な媒体上で保存されるデジタル形式で提供されてもよい。報告は、また紙形態で提供できる。報告は、ネットワークを通じた伝達によるなど、コンピュータにより、個人、個人の健康管理マネージャーなどの一またはそれ以上の集団、または調合物を製造することができる製造業者などの他の第三者集団に送信できる。調合物は、その後、個人または個人の健康管理者に対して出荷されまたは販売できる。いくつかの実施態様では、更新された報告は、個人または個人の健康管理マネージャーに対して作成されおよび提供される。報告は固有のＩＤコードの使用で送達できる。報告は、家庭用コンピュータ、またはワークコンピュータ、またはブラックベリー（Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ）（登録商標）、アイフォン（ｉＰｈｏｎｅ）（登録商標）などのスマートフォンなどのパーソナルデジタルアシスタントまたはデジタル装置、または任意の他の利用可能な装置などで、コンピュータに転送できる。
【０３０２】
【表４】
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【０３０３】
【表５】
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【０３０４】
【表６】
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【０３０５】
【表７】
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【０３０６】
【表８】
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【０３０７】
【表９】
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【０３０８】
【表１０】
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【０３０９】
【表１１】
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【０３１０】
【表１２】
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【０３１１】
【表１３】
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【０３１２】
【表１４】
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【０３１３】
【表１５】
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【０３１４】
【表１６】
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【０３１５】
【表１７】
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【０３１６】
【表１８】
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【０３１７】
【表１９】
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【０３１８】
【表２０】
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【０３１９】
【表２１】
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【０３２０】
【表２２】
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【０３２１】
【表２３】
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【０３２２】
【表２４】
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【０３２３】
【表２５】
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【０３２４】
【表２６】
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【０３２５】
【表２７】
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【０３２６】
【表２８】
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【０３２７】
【表２９】
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【０３２８】
【表３０】
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【０３２９】
【表３１】
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【０３３０】
【表３２】
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【０３３１】
【表３３】
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【０３３２】
【表３４】
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【０３３３】
【表３５】
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【０３３４】
【表３６】
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【０３３５】
【表３７】
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【０３３６】
【表３８】
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【０３３７】
【表３９】
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【０３３８】
【表４０】
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【０３３９】
【表４１】
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【０３４０】
【表４２】
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【０３４１】
【表４３】
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【０３４２】
【表４４】
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【０３４３】
【表４５】
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【０３４４】
【表４６】
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【０３４５】
【表４７】
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【０３４６】
【表４８】
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【０３４７】
【表４９】
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【０３４８】
【表５０】
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【０３４９】
【表５１】
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【０３５０】
【表５２】
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【０３５１】
【表５３】
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【０３５２】
【表５４】
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【０３５３】
【表５５】
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【０３５４】
【表５６】
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【０３５５】
【表５７】
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【０３５６】
【表５８】
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【０３５７】
【表５９】
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【０３５８】
本明細書中で示されおよび記載された本発明の好ましい実施態様とはいえ、そのような実施態様は、例のためにのみ提供されたことが当業者に明らかであろう。多くのバリエーション、変化、および置換が、本発明を変更することなく当業者によりすぐに生じるであろう。本明細書中で記載されたような開示の実施態様についてさまざまな代替が、本発明を実施することについて利用されてもよいことが理解されるべきである。以下の請求項が、本発明の範囲を規定することを企図し、ならびにこれらの請求項の範囲およびそれらの均等物内の方法および構成が、それらにより包含されることを企図する。
【実施例】
【０３５９】
実施例１：葉酸塩による治療が可能なＭＴＨＦＲ酵素変異のヒトにおける有病率
低頻度変異の発生率及び影響を判定し、及びビタミン治療の現象を調査するために、葉酸塩による治療可能なＭＴＨＦＲ酵素の大集団における有病率を求めた。５００人超の集団から１４個の異なる非同義の置換が同定され、それらの５つが酵素機能に障害を有していた。全ての有害アレルは少なくともある程度葉酸塩応答性であったが、５つの突然変異タンパク質中４つを、細胞内葉酸塩レベルを増大させることにより、完全に通常のレベルまで回復させられた。
【０３６０】
方法
【０３６１】
ＤＮＡサンプル集団。ＤＮＡサンプルを、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ （Ｃａｍｄｅｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ）から得た。
【０３６２】
ＭＴＨＦＲエキソンのシークエンシング。上記試料中の１１個のＭＴＨＦＲをコードするエキソンを、Ｖａｒｉａｎｔ ＳｅｑＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｌｉｎｅ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）から購入したプライマーのペアを使用して、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲシークエンシングにより配列決定した。これらのエキソン領域は、ＮＣＢＩ ＭＴＨＦＲ参照配列ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００５９５７）に対応しており、６５６アミノ酸のタンパク質（ＮＰ＿００５９５８）に対応していた。シークエンシングアンプリコン及びプローブの情報は、下記のアンプリコンにおいて、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｑｏｖ／ｑｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｂｅで入手可能である。
【０３６３】
エキソン１（ＲＳＡ００００４５６８４）； エキソン２（ＲＳＡ００００４５６８０）；エキソン３（ＲＳＡ０００５７７２４９）；エキソン４（ＲＳＡ００００４５６７８）； エキソン５（ＲＳＡ００００４５６７６）；エキソン６（ＲＳＡ００１３０８７９５）；エキソン７（ＲＳＡ００１２５３１９３）；エキソン８（ＲＳＡ００００４５６６９）；エキソン９（ＲＳＡ０００５８０７６７）；エキソン１０（ＲＳＡ ０００５８０７６６）；エキソン１１（ＲＳＡ０００５８０７６５，ＲＳＡ００００２７２４０）。コーディング領域に及ぶエキソン１１の部分のみ配列決定された。ベースコーリングに高い信頼性を保証するために、解析には高水準の読み取りのみが使用された（標的エキソンに及ぶ領域は平均ＱＶスコア＞４０；全てのエキソンは二重鎖読み取りでカバーされた）。これらのフィルタリング基準に基づき、各エキソンにおいて成功率（ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ）は８９．９％‐９５％であった（表Ｉ参照）。全ての配列情報は、ＳｅｑＳｃａｐｅソフトウェア一式（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して解析した。品質管理の手段として、ベースコーリングのサブセットをＴａｑＭａｎ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるアレル区別アッセイで直接評価し、下記の公表されている遺伝子型データとの比較を行った。
【０３６４】
プラスミド。誘導性酵母ＧＡＬ１プロモーターのコントロール下にある５’末端ＨＡ（ヘマグルチニンＡ）エピトープタグ付加ＭＴＨＦＲオープンリーディングフレーム（タンパク質配列ＮＰ＿００５９４８参照）及びＵＲＡ３選択マーカーを保有するプラスミドｐｈＭＴＨＦＲは、Ｗａｒｒｅｎ Ｋｒｕｇｅｒ （Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ｓｕｐｒａ）から頂戴したものである。このプラスミドを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた部位直接的突然変異形成による全てのＭＴＨＦＲバリアントを再構築するバックボーンとした。ガラクトース誘導性ＭＴＨＦＲバリアントを含む組み込みプラスミドをＰＣＲクローニングにより創作した。フラグメントは、ＵＲＡ３、ｐｈＭＴＨＦＲベースプラスミド由来のＧＡＬ１プロモーター及びＭＴＨＦＲコーディング領域をｐＨＯ‐ポリ‐ＨＯ（Ｖｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：ｅ５９）内に含み、プラスミドは、このカセットのＨＯ遺伝子座へのターゲット組み込み（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を可能とする。
【０３６５】
株。全ての一倍体酵母株は、Ｓ２８８ｃがバックグラウンドのＭＡＴａ ｈｉｓ３ Ｉｅｕ２ ｕｒａ３ Ｉｙｓ２とした（Ｂｒａｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｙｅｓｔ １４：１１５‐３２）。ＭＡＴａ／ＭＡＴα二倍体株は、同系ＭＡＴａ及びＭＡＴα株を交雑することにより創作した。Ｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ及びｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ ｍｅｔ１３Δ：：ＫａｎＭＸ株は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｇｅｎｅ‐ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来の株を用いる標準的な交雑／胞子形成技術により取得した。二倍体（ＭＴＨＦＲバリアントにおいてホモ接合またはヘテロ接合）を、それぞれ組み込まれたバージョンのＧＡＬ１：ＭＴＨＦＲバリアントカセットを含むｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ ｍｅｔ１３Δ：：ＫａｎＭＸ一倍体を交雑することにより創作した。
【０３６６】
生育条件。葉酸塩を含まない合成生育培地として、最少培地（Ｓｈｅｒｍａｎ，２００２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．，ｅｄｓ．Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ（Ａｃａｄｅｍｉｃ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ３‐４１）にＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｖｉｔａｍｉｎｓ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）、および葉酸塩を除く全てのビタミンを加えたものを使用した。すべてのｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ細胞に５０μｇ／ｍｌフォリン酸（Ｓｉｇｍａ）を加えた。カイネティック増殖測定のため、ｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ ｍｅｔ１３Δ：：ＫａｎＭＸ細胞をＧＡＬ１プロモーター駆動性ＭＴＨＦＲバリアントで形質転換し、そしてフォリン酸（５０μｇ／ｍｌ）及びメチオニン（２０μｇ／ｍｌ）を添加した合成ガラクトース培地（２％ガラクトース、０．１％グルコース）中で対数増殖期に至るまで増殖した。細胞を３回洗浄し、そして様々な量の葉酸塩を含むがメチオニンを含まない新鮮なガラクトース培地を含む９６ウェルプレートに分注した。ウェルあたりの体積は２００μｌで、ＯＤ＝０．０１の細胞密度で開始した。３０℃で振とうなしで、Ｔｅｃａｎ ＧＥＮｉｏｓプレートリーダー中で少なくとも６０時間、吸光度を１５〜３０分置きに測定した。図１ａにおいて使用されたＭＥＴ１３細胞は、全ての増殖がメチオニン非存在下で行われた点を除き、上記と同じ方法で行った。
【０３６７】
ＭＴＨＦＲ酵素活性アッセイ。生理的条件下でＭＴＨＦＲにより触媒される逆反応を測定するアッセイは、既知のアッセイ（Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ｓｕｐｒａ）において、酵母抽出物を、リシスバッファー（１００ｍＭスクロース、５０ｍＭ ＫＨＰＯ４（ｐＨ６．３）、プロテアーゼ阻害剤カクテル）３５０μｌ中の４０ ＯＤ５９５細胞（上記フォリン酸及びメチオニンを加えたｆｏｌ３Δ ｍｅｔ１３Δ細胞）相当のビーズリシスにより作製する点を改変して行った。抽出物を短い遠心分離で清澄し、そして１０‐２００μｇの抽出物を使用して、活性の線形範囲（ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ）を決定した。放射性標識（５‐［１４Ｃ］ＭｅＴＨＦ）は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのものを用いた。加熱処理において、５‐［１４Ｃ］ＭｅＴＨＦを入れていない反応混合物を一定時間５５℃まで加熱して、そこで５‐［１４Ｃ］ＭｅＴＨＦを添加し、反応を進めた。
【０３６８】
ＭＴＨＦＲイムノブロット解析。１０ ＯＤ細胞（上記フォリン酸及びメチオニンを加えたｆｏｌ３Δｍｅｔ１３Δ細胞）相当を、２００μｌの０．１Ｍ ＮａＯＨ中で１５分間抽出した。５０μｌのＳＤＳサンプルバッファー（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ ６．８、０．４％ ＳＤＳ）を上清に加え、それをボイルし、清澄し、そしてＳＤＳ‐ＰＡＧＥに供した。ＨＡタグを付したＭＴＨＦＲバリアントをＬＩ‐ＣＯＲ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒで検出した。マウスモノクローナル抗ＨＡ抗体はＳｉｇｍａ製を用いた。ローディングコントロールの酵母３‐ホスホグリセレートキナーゼ（Ｐｇｋｉｐ）を、Ｊｅｒｅｍｙ Ｔｈｏｒｎｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）から頂戴したマウス抗体で検出した。
【０３６９】
結果
【０３７０】
ヒトにおけるＭＴＩ‐ｆＦＲバリアント。様々な民族の５６４人について、ヒトＭＴＨＦＲのコーディング領域の全体を、１１個のエキソンそれぞれにおけるコーディング部分を増幅することにより配列決定した。コーディング領域の長さ、調査されたアレルの数および全ての非同義の置換は、表４に列挙されている。いずれもコーディングＤＮＡは２，０８１，１０６ｂｐにのぼり、サンプリングされた全てのエキソンについて１，０００を超えるアレルまで解析した。これらのデータから１４の非同義の変化が見出され、それらの１１個がマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）＜１％を示し、７つのアレルは１回しか見られなかった。いくつかの低頻度アレルは、過去に見られたものであった（表４参照）。低頻度非同義の置換の数は、ランダム集団の細部まで採取した他の研究（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６：２６５‐７７；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，２００４，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １４：１８２１‐３１；Ｇｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７：４３５‐３８）と十分に一致した。さらに、３つのよく研究された一般的な置換が、予想された世界の集団頻度を示した（Ａ２２２Ｖ‐２９．３％、Ｅ４２９Ａ‐２３．６％、Ｒ５９４Ｑ‐４．４％）。
【０３７１】
ベースコーリングの正確性における品質管理チェックとして、独立してＰＣＲ増幅を行い、データの一致が１００％であった１００サンプルにおいて、ＴａｑＭａｎアレル識別アッセイにより、８つのバリアント（シングルトン（ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ）を４つ含む）を再解析した。更に、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｖｑｅｎｏｍ／）及びＰｅｒｌｅｇｅｎ （Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）のいずれもこの研究において一部が重複していたＣｏｒｉｅｌｌの試料を使用しており（ｄｂＳＮＰ ｂｕｉｌｄ １２７）、それらの集団ジェノタイピングデータは、８１７の遺伝子型コール（ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｃａｌｌ）中８１４において（９９．６％）一致していた。３つの不一致の遺伝子座の２つにおいて、発明者らの配列データは明確であり、正しいと思われた。
【０３７２】
４８０人から完全なコーディング領域の配列が取得された。１８人（４％）が低頻度非同義のバリアントのキャリアであった。意義深いことに、個人の多様性の大部分は、低頻度の変化を起こした３つの一般的な多型（Ａ２２２Ｖ、Ｅ４２９ＡおよびＲ５９４Ｑ）の組み合わせによりもたらされる。ほとんどの場合データからハプロタイプを類推することが出来なかったこの群中に、２８の異なる非同義的遺伝子型が観察された。
【０３７３】
インビボでのＭＴＨＦＲ‐葉酸塩の相互作用。遺伝的バリアントの臨床的意義は機能的結果を手掛かりとしているため、すべての非同義の変化が、それらのＭＴＨＦＲ機能に対する影響について、そして重要なことに障害アレルが葉酸塩応答性を呈するか否かについて試験した。葉酸塩栄養要求性（ｆｏｌ３）が、ｍｅｔ１３株に導入され、増殖培地中のフォリン酸濃度を変化させることにより、細胞内の葉酸塩濃度を滴定した。酵母中でフォリン酸（５‐ホルミル‐テトラヒドロフォレート）はメテニル‐テトラヒドロフォレートに代謝され、これが、他の葉酸塩補酵素に転換され得る（Ｃｈｅｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１４０５６‐６３）。このようにして、ヒトＭＴＨＦＲ機能性（メチオニン非存在下での増殖）は、次第に限定的になる葉酸塩ステータスとの関数として測定された。
【０３７４】
これらの条件下で、フォリン酸を５０μｇ／ｍｌ超添加しても、顕著な増殖に対する利益は生じなかった（図１ａ）。しかしながら、５０μｇ／ｍｌ未満の濃度では、増殖は、培地中の利用可能なフォリン酸濃度と明確に相関していた。従って、細胞内の葉酸塩レベルは、この範囲に用量を限定した。ＦＯＬ３細胞の増殖と比較すると、フォリン酸の添加は、内在性の葉酸塩の生合成の欠損を完全に補償しなかった。しかし、このギャップは、おそらく、増殖速度ではなく細胞が静止期に入る密度を反映するものであり、これは、フォリン酸の取り込みの制限、又は唯一の葉酸塩資源としてのフォリン酸の利用の制限を反映している。
【０３７５】
ヒトＭＴＨＦＲがｆｏｌ３ ｍｅｔ１３細胞を補完する能力は、培地中へのフォリン酸の補給に応じて発揮された（図１ｂ）。葉酸塩の補給に関しては、ＧＡＬ１プロモーターからのヒトＭＴＨＦＲの発現は、Ｍｅｔ１３ｐの欠損を完全には補償しなかった（図１ｂと図１ａの等量の葉酸塩を添加したＦＯＬ３ ＭＥＴ１３細胞とを比較）。従って、葉酸塩濃度が５０μｇ／ｍｌ未満である場合、葉酸塩及びＭＴＨＦＲの両方が増殖の律速要因となり、ＭＴＨＦＲ活性の微妙な変化が、増殖のリードアウト（ｒｅａｄｏｕｔ）に反映され得る。葉酸塩を５０μｇ／ｍｌ超添加しても、内在性酵母ＭＴＨＦＲ（ＭＥＴ１３、図１ａ）またはメジャーなヒトアレル（図１ｂ）のいずれかを発現する細胞の増殖において顕著な利益をもたらさないが、ＭＴＨＦＲの障害アレルにおいては有利である（下記参照）。
【０３７６】
ＭＴＨＦＲバリアントの機能的な影響。一定範囲の葉酸塩濃度において５つの非同義のアレルを試験して、観察される機能的影響の範囲を示した（図２ａ）。Ａ２２２Ｖバリアントの機能は、１００μｇ／ｍｌのフォリン酸でほぼ完全に回復したが、添加レベルを４分の１にする（２５μｇ／ｍｌ）と、活性は顕著に低下した（メジャーアレルとの比較）。従って、これらの条件下で、既知のＡ２２２Ｖ欠損の葉酸塩治療能は再現された。これらの条件下での酵母内の減少した葉酸塩の正確な細胞内濃度は分からなかった。しかし、Ａ２２２Ｖアレルの挙動は、酵母およびヒト細胞中の葉酸塩濃度を効果的にキャリブレートした。Ａ２２２Ｖの酵素活性は、一般的なアレルの本来の活性の約５０％で（Ｍａｒｔｉｎ，２００６，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １６：２６５‐７７； Ｒｏｚｅｎ，１９９７，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７８：５２３‐２６）、葉酸塩濃度５０μｇ／ｍｌでは、増殖率は５０％低下した。さらに、フォリン酸を５０μｇ／ｍｌ加えて増殖させた細胞を用いた無細胞アッセイにおけるＡ２２２Ｖ酵素活性も、５０％の低下が観察された（図３）。従って、酵母のＡ２２２Ｖの挙動は、ヒト細胞における挙動を再現していた。
【０３７７】
４つの低頻度アレルを、同様に試験した（図２ａ）。いずれの葉酸塩濃度においても増殖に影響を受けなかったＲ５１９Ｃは、良性と思われる。Ｒ１３４Ｃは全ての葉酸塩濃度で重度に阻害されていたが、若干葉酸応答性であった。Ｄ２２３Ｎ及びＭ１１０Ｉアレルは、フォリン酸濃度が５０μｇ／ｍｌ超のとき増殖がメジャーアレルと類似するが、フォリン酸濃度が５０μｇ／ｍｌ未満のときはメジャーアレルを下回る点で、Ａ２２２Ｖと同様の葉酸による治療可能な活性を示している（阻害の程度は軽いが）。
【０３７８】
ＭＴＨＦＲ酵素は、Ｎ末端触媒ドメイン及びＣ末端制御ドメインを有し、アロステリック阻害剤のＳ‐アデノシルメチオニンと結合する（ＡｄｏＭｅｔ；Ｓｕｍｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：７６９７‐７７００）。触媒ドメインにある６つのアレル（Ｍ１１０Ｉ、Ｒ１３４Ｃ、Ｈ２１３Ｒ、Ａ２２２Ｖ、Ｄ２２３Ｎ及びＤ２９１Ｎ）の内、良性なのはＨ２１３Ｒのみであった（図２ｂ）。Ｍ１１０Ｉ、Ａ２２２Ｖ、Ｄ２２３Ｎ及びＤ２９１Ｎは、これらの酵素バリアントが、葉酸塩添加量が多い（フォリン酸５０‐２００μｇ／ｍｌ）ときはメジャーアレルと類似した挙動をとり、さらに葉酸塩の添加量が限定されたときは顕著に弱体化した点で、葉酸により治療可能な挙動を示した。Ｒ１３４Ｃ変異体は、葉酸塩添加量のレベルにかかわらず、メジャーアレルの増殖速度に達することはなく、ゆえに、これは、応答性であるが治療可能ではないアレルとして分類された。制御ドメイン中の置換（Ｇ４２２Ｒ‐Ｔ６５３Ｍ）はいずれも、メジャーアレルと同様の挙動をとった（図２ｂ）。
【０３７９】
複数のアミノ酸置換の間の協調的な相互作用。変異の分布は、２つ（またはそれ以上）の置換を含む複合的なアレルの存在を示唆する。それゆえ、いくつかの複合的なアレル（個人のサンプルでのそれらの発生に基づく）を創作し、複数のアレルの組み合せが協調的又は抑制的効果を有するか否かを試験した。一般的なバリアントとＡ２２２Ｖとの組み合わせ（Ａ２２２Ｖ Ｅ４２９ＡおよびＡ２２２Ｖ Ｒ５９４０）において、マイナーアレルのホモ接合が、不毛（ａｒｉｄ）なアレルの少なくとも一つに観察され、それゆえ、そのようなバリアントが存在するのは当然である。しかしながら、低頻度バリアントにおいて、Ａ２２２Ｖバリアントと新規バリアントのいずれも、常にヘテロ接合として発生した。ハプロタイプは知られていないので、これらの個人は、２つの単一置換アレル又は複合的なアレルのいずれかを保持し得る。それゆえ、すべてのあり得る二重置換アレルを創作し、そしてそれらの機能をテストした（例えば、Ｍ１１０ｌ Ａ２２２Ｖ、図２ａ）。試験された２つの葉酸塩濃度において、Ｍ１１０ｌ Ａ２２２Ｖバリアントは、個別のアレルの合計よりも活性が低く、これは、複合的なアレルにおける協調的な機能不全が生じたことを意味する。フォリン酸濃度５０μｇ／ｍｌのとき、Ｍ１１０Ｉバリアントは、メジャーアレルとほとんど区別できないが、さらにそれは、Ａ２２２Ｖ機能不全を顕著に促進した。試験したすべての組み合わせにおいて、単独でも機能に影響をもたらすアレル（Ｍ１１０ＩおよびＤ２９１Ｎ）はＡ２２２Ｖと組み合わされたときに協調的であったが、良性の変化は、Ａ２２２Ｖの機能不全を促進しなかった。
【０３８０】
生化学アッセイによるインビボでの機能の再現。前記増殖アッセイの信頼性を評価するため、無細胞ＭＴＨＦＲ酵素アッセイを、粗酵母ライゼート中のすべてのバリアントにおいて実行した（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓを参照）。特定の活性の測定に加え、５５℃で様々な時間、加熱処理することにより、バリアントの熱不安定性（酵素安定性の尺度）を試験した。内因性の活性と増殖率との間には、良好な関連性があった（図３；メジャーＭＴＨＦＲアレル、Ａ２２２ＶおよびＲ１３４Ｃの非加熱サンプルの活性を図２の増殖曲線と比較）。さらに、Ａ２２２Ｖバリアントの酵素活性は、メジャーアレルの酵素活性の約５０％を示した。増殖アッセイにおける場合と同様に、Ｒ５１９Ｃバリアントは、メジャーアレルと類似の活性を呈し、および一般的なＥ４２９Ａバリアントを含む制御ドメインにおけるすべての変化の典型的なものであった（データなし）。Ｅ４２９Ａが酵素機能に影響を与えるという報告があったが、発明者らのデータは、この変化が良性であるという他の報告を支持する。
【０３８１】
Ａ２２２Ｖ突然変異酵素は、メジャー型よりも不安定で、熱不安定性が高く（Ｇｕｅｎｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：３５９‐６５；Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：１４８５３‐５８）、そしてこのバリアントの葉酸塩治療は、タンパク質の安定性を向上させることにより達成されていると考えられる。ここで使用される条件（５５℃、２０分）の下で、Ａ２２２Ｖはほとんど活性を失うが、一方メジャーアレルは元の活性の３０％を維持し、これは過去の研究を支持する。新規なＤ２２３Ｎアレルも、この場合において、葉酸塩治療能を同様に説明してもよい増大した熱不安定性を呈したが、酵素の機能不全はそれほど著しくはなかった。
【０３８２】
ヘテロ接合の表現型。低頻度アレルは通常はヘテロ接合として生じるので、その重要性が見過ごされる傾向がある。ＭＴＨＦＲアレルのヘテロ接合性の機能的重要性をより良く理解するために、それぞれ統合発現カセットから発現する同一のアレル（ホモ接合）またはヘテロ接合を構成する異なるアレルのいずれかを有する一倍体の株を交雑して、２つのヒトＭＴＨＦＲコピーを有する二倍体酵母を創作した（方法参照）。上記のように、これらの株を、葉酸塩添加に対する増殖の変化を試験した（図４）。このアッセイにおいて、ヘテロ接合は、葉酸塩を制限した条件の下では増殖の表現型が増悪し、これは、機能が低下したアレルが野生型と相互優性（ｃｏｄｏｍｉｎａｎｔ）であることを示す。
【０３８３】
増殖アッセイで測定した細胞内のＭＴＨＦＲ活性は、アレルの相加的効果を反映しているように見えた。さらに、ヘミ接合（１つに統合した発現アレルを有する二倍体；データなし）を用いた追加的な実験において、ヘテロ接合中のメジャーアレルとマイナーアレルとの間でのヘテロダイマーの形成が、突然変異アレルをほとんどまたはまったくレスキューしないことを示した。例えば、二倍体ＭＴＨＦＲメジャーアレル／ヌル細胞（ヘミ接合）は、すべての条件において、メジャーアレル／Ｒ１３４Ｃヘテロ接合と同様の挙動を示し、および低葉酸塩培地（Ａ２２２Ｖが不活性化される条件）においては、メジャーアレル／Ａ２２２Ｖヘテロ接合と同様の挙動を示した。従って、ヘテロ接合細胞の有害なアレルの表現型への関与は容易に観察され、ヒトゲノム中のヘテロ接合性に起因するより広範な表現型の結果（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ）が生じる可能性がある。
【０３８４】
リン酸化による酵母におけるＭＴＨＦＲバリアントの修飾。ＭＴＨＦＲバリアントタンパク質の存在量を、Ｎ末端に付したヘマグルチニンＡ（ＨＡ）エピトープタグに対する抗体を使用するイムノブロッティングにより判定し（図５ａ）。すべてのサンプルについて、タンパク質を約７２ｋＤ及び７８ｋＤの二重のバンドとして検出した。このパターンは、昆虫細胞で発現させたヒトＭＴＨＦＲにおいて観察されたものと酷似し、上の方のバンドは、Ｎ末端付近で多重にリン酸化されたＭＴＨＦＲを表す。昆虫細胞中でのＭＴＨＦＲのリン酸化は、３４の位置にあるスレオニンに依存しておりおよびこのスレオニンをアラニンに置き換える（Ｔ３４Ａ）と、リン酸化が起らなくなる。この変異は、Ｓ・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で発現したヒトＭＴＨＦＲと同じ効果を有し、およびこれは、昆虫細胞と同様に、上の方のバンドはリン酸化ＭＴＨＦＲであることを示した（図５ａ）。
【０３８５】
ＭＴＨＦＲのリン酸化の役割は、負の制御に関係することが示唆されている。この仮説の支持として、ここで観察されたリン酸化パターンは、細胞内のＭＴＨＦＲ活性と直接相関する。特に、非リン酸化：リン酸化形態の存在量の比率は、活性の低下に応じて増大した（図５ｂ）。興味深いことに、全てのバリアントの全体の存在量（リン酸化形態＋非リン酸化形態）は、顕著な違いはないように見えた。有害な置換が内因性の酵素安定性に影響するとしたら、他の要素がタンパク質レベルの規定に関係していない限り、このような結果にはならないはずである。
【０３８６】
全ての機能的障害アレルは、葉酸塩及びＦＡＤの結合部位を含む、ＭＴＨＦＲのＮ末端側にある触媒部分に集中していた。一方、ＭＴＨＦＲのＣ末端制御ドメイン中に同定された８つの非同義の置換は、いずれも、補完アッセイ及び無細胞酵素アッセイの両方において良性であった。さらに、制御ドメインの置換およびＡ２２２Ｖの複合的なアレルには、協調作用は認められなかった（図２）。Ｅ４２９Ａにおいて報告されたように、これらの変化が中性（ｎｅｕｔｒａｌ）であったか、またはアッセイがこれらの変化による機能不全を検出できなかったことが考えられる。しかしながら、この知見は、深刻な臨床的表現型を生じるＭＴＨＦＲの突然変異のほとんどが触媒ドメインにあったという観察（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｄ．ｃｆ．ａｃ．ｕｋ／ａｃ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）と一致していた。制御ドメインは、触媒ドメインの安定性において一定の役割を果たすという説がある。そうであるのなら、この役割はアミノ酸の置換にある程度耐性であり得て、および、どのようにＳ・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＮ末端ドメインとアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のＣ末端ドメインとを融合させたキメラＭＴＨＦＲ（酵母酵素の制御ドメインに約５０個の非同義の置換が入ったものに相当）が全く酵素活性を損なわないかも説明できる。Ｃ末端ドメインの一般的なＲ５９４０バリアントが、ＣＯＳ‐１細胞で発現されたときに、酵素活性に影響を及ぼした以前の報告は、注目すべきである。この変化は、良性のように見える、しかしながらそれは、酵母で発現した酵素の細胞ベースおよび無細胞アッセイにおいてのことである。この矛盾の理由は明らかでないが、イムノブロット解析において、これらの著者らが、単一の種のＭＴＨＦＲ（リン酸化状態不明）しか観察していないので、ホストの発現システムを反映したものであると考えられる。
【０３８７】
ヘテロ接合の表現型。機能的障害ＭＴＨＦＲアレルにおいてヘテロ接合である二倍体酵母の挙動から、ヘテロ接合の表現型は、特に葉酸塩を制限した条件下で明確に観察できることが示された（図４）。ほとんどの遺伝的バリアントが、ホモ接合性として発生し、および低頻度アレルが、集団中でヘテロ接合として本来存在するため、ヘテロ接合の表現型の出現は顕著であった。この結果は、リンパ球抽出物中の細胞ＭＴＨＦＲ活性が、遺伝子型と直接対応しており：Ａ２２２Ｖ（ＮＶ）のための個人のヘテロ接合が、メジャーアレル（ＮＡ）ホモ接合ため見られる全活性の約６５％を有し、Ａ２２２Ｖホモ接合（ＶＮ）ではＡ／Ａホモ接合活性の３０％保持された観察と矛盾しない。血清トリグリセライドレベルに影響するアディポカインＡＮＧＰＴＬ４についてアレルの全スペクトルを試験した最近の研究において、非同義のＥ４０Ｋアレルにおけるヘテロ接合は、血漿トリグリセライドレベルの低下と有意に関連した。ホモ接合よりもキャリアの数が遥かに多くなり得るため、従ってヘテロ接合が表現型として検出可能なケースは、低頻度バリアントの寄与の重要性が増大する。ヘテロ接合の表現型が、ＭＴＨＦＲ活性が細胞増殖の律速要因となる条件下で観察されたことに留意されたい。酵素的ステップがヒトの特定の経路において律速要因となるか否かは、遺伝的および環境的要因に依拠する。
【０３８８】
突然変異及びＭＴＨＦＲリン酸化および存在量。触媒ドメイン中の非同義の変化の葉酸治療は、タンパク質の安定化により（Ａ２２２Ｖなどは）、または補因子のＫｍなどの、分子機能の他の面を克服することにより生じる。少なくとも１つの有害アレルＤ２２３Ｎは、Ａ２２２Ｖと同様の熱不安定性の増大を示し、これは安定性の欠損を支持する。ＭＴＨＦＲの葉酸塩治療可能なアレルが、葉酸塩種が、酵素の不安定な形態を安定化するものであるとする仮説は、示唆されているように、ＭＴＨＦＲタンパク質のレベルが、変異体の内因性の活性に比例することを示唆する。しかし、発明者らの観察によると、リン酸化状態は酵素活性と相関する（図５）が、全体存在量（リン酸化形態＋非リン酸化形態）はそれほど変化しているように見えなかった（２倍以内）。以前の研究が、内因性の活性においてリン酸化の阻害効果を示してきたため、リン酸化ＭＴＨＦＲが酵素の活性形態である可能性は低い。これと一致して、増殖アッセイ及び酵素アッセイの両方におけるリン酸化阻害Ｔ３４Ａバリアントの挙動は、メジャーアレルのものと同様であった（データなし）。さらに、低い細胞間葉酸塩レベルは、ＭＴＨＦＲ安定性を低減する一方で（存在量により測定したように）、この効果は、機能を障害するアレルについて増強しない。これらの結果は、有害な変化がタンパク質不安定化を招くという予想と食い違うので、未知の競合的制御応答の存在が推測される。このように、変異体により活性は全く異なり得る（図２）が、合計のタンパク質存在量は異ならない場合がある（図５）。発明者らが得た結果は、リン酸化によるフィードバック制御に一致するが、ターンオーバーにおけるリン酸化の役割は知られていない。このように、Ｔ３４Ａの変化の効果を他の障害アレルと組み合わせて決定することは、興味深いものとなり得る。
【０３８９】
葉酸塩／ホモシステイン代謝経路
【０３９０】
葉酸塩／ホモシステイン代謝経路は、神経管欠損（ＮＴＤ）、並びに葉酸塩の添加が予防となることを示し、および上昇した血漿中のホモシステインレベルがリスクの増大に関与する他の不都合な妊娠結果のエチオロジーに関連する。葉酸塩およびホモシステイン代謝経路は、メチオニンシンターゼ反応を介して関連しており、そして細胞培養、動物モデルシステム中のわずかな葉酸塩の欠乏、およびヒト障害ホモシステイン再メチル化と関連している（例えば、Ｓｔｏｖｅｒ ＰＪ．２００４．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｆｏｌａｔｅ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ12 ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｕｔｒ Ｒｅｖ ６２：Ｓ３‐１２を参照）。ホモシステインは、ＮＴＤの危険因子と目されている（例えば、Ｍｉｌｌｓ ｅｔ．ａｌ．，１９９５．Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｂｙ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｄｅｆｅｃｔｓ．Ｌａｎｃｅｔ ３４５ １４９‐１１５１を参照）。葉酸塩の欠乏も、Ｓ‐アデノシル‐メチオニンにより誘導されるメチル化を阻害し（ＳＡＭ；例えば、Ｓｔｏｖｅｒ，ｓｕｐｒａ参照）、そしてそれは、ＭＴＨＦＲおよびＣＢＳ両方のアロステリック阻害剤である（例えば、Ｋｒａｕｓ ｅｔ ａｌ ，１９９９．Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ‐β‐ｓｙｎｔｈａｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ．Ｈｕｍ Ｍｕｔ １３：３６２‐３７５；Ｄａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ，１９８２．Ｉｎ Ｆｌａｖｉｎｓ ａｎｄ Ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｅｄｓ．Ｍａｓｓｅｙ，Ｖ．＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｈ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１６５‐１７２を参照）。さらに、Ｓ‐アデノシル‐ホモシステイン：Ｓ‐アデノシル‐メチオニン（ＳＡＨ／ＳＡＭ）の比率の上昇は、ＮＴＤ発生のメカニズムにおいて提案されている（例えば、Ｓｔｏｖｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｃｏｔｔ，２００１．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｆｏｌａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｄｅｆｅｃｔｓ．Ｂｉｂｌ Ｎｕｔｒ Ｄｉｅｔａ ５５ １９２‐１９５．ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｆｏｌａｔｅ， Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｕｂｅ Ｄｅｆｅｃｔｓ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｅｘｐｔｌ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２２６：２４３‐２７０．１，５，６を参照）。
【０３９１】
ホモシステイン代謝に関与する葉酸を利用しない酵素
【０３９２】
システイン‐ｆ３‐シンターゼ（ＣＢＳ）の機能不全はホモシステインレベルの亢進を引き起こし、シスタチオニン‐β‐リアーゼ（ＣＴＨ）のＳＮＰは、同様にホモシステインの増大に関与する（例えば、Ｋｒａｕｓ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ＣＴＨ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ ６５：４８３‐４８６を参照）。ＣＢＳおよびＣＴＨは、いずれも葉酸塩を利用しない酵素であるが、ビタミンＢ6補因子に依拠しており、障害アレルは、機能障害的な葉酸塩／ホモシステインのリスクを有する。ＣＢＳ及びＣＴＨの障害アレルは、Ｂ6治療の標的であり、これは、本明細書中に記載した、ＭＴＨＦＲ障害アレルに対する葉酸塩治療に類似する。ＣＢＳおよびＣＴＨの機能およびビタミン応答性は、酵母補完アッセイにおいて再現されている（図６）。
【０３９３】
Ｓ・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において再現される、ＣＢＳ突然変異酵素のビタミンＢ治療
【０３９４】
細胞間ビタミンＢ6（ピリドキシン）濃度の機能として、ＣＴＨおよびＣＢＳをアッセイするために、酵母株を加工した（図６）。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＣＴＨおよびＣＢＳのオルソログは、それぞれｃｙｓ３およびｃｙｓ４であり、それらの機能不全は、システイン栄養要求性を引き起こす。酵母株のバックグラウンドが、ｃｙｓ３またはｃｙｓ４の機能不全以外に、ピリドキシン生合成を欠損しているもの（六倍（六重）欠失ｓｎｏ１Δ ｓｎｏ２Δ ｓｎｏ３Δ ｓｎｚ１Δ ｓｎｚ２Δ ｓｎｚ３Δ，Ｓｔｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，２００３．Ｔｐｎ１ｐ，ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ6 ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：１８９９０‐１８９９６）であることを除き、本明細書中に記載したＭＴＨＦＲにおける試験と同様の方法で、ピリドキシン濃度に対して酵素を試験した。
【０３９５】
図６は、固形培地上での定量的酵母増殖アッセイを示し、および酵素がピリドキシン添加の機能として同族の酵母欠損酵素を救済し、およびＣＢＳ（Ｉ２７８Ｔ、Ｒ２６６Ｋ）の２のホモシステイン尿症アレルのビタミン応答性がこの相補性アッセイで再現されることの両方を示し：これらのアレルは、制限したＢ6レベルにおいて、野生型酵素よりもより感受性が高くなり、および同様により大きい増殖欠損を示す。ヒトＣＢＳによりｃｙｓ４突然変異についてシステイン栄養要求性の救済は、以前に示されている（Ｋｒｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ａ  ｙｅａｓｔ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ‐‐ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ４：１１５５‐１１６１；Ｋｒｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９４４．Ａｙｅａｓｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｂｅｔａｓｙｎｔｈａｓｅ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９１：６６１４‐６６１８）。
【０３９６】
実施例２：追加のＭＴＨＦＲバリアントサンプル集団の同定
神経管欠損に罹患した２５０人の新生児それぞれ、または神経管欠損に罹患していない２５０人の新生児それぞれの乾燥血液スポット（Ｇｕｔｈｒｉｅ Ｃａｒｄ）から、集団ゲノムＤＮＡを単離した。単離したゲノムＤＮＡサンプル中のＭＴＨＦＲエキソンを、実施例１に記載したように配列決定した。酵素の構造に影響が出ている突然変異を、コンセンサスヒトゲノムシークエンス（ＮＭ＿００５９５７）に対するミスマッチとして、シークエンスデータから同定した。全ての置換を、以下の表Ａに列挙する。
【０３９７】
ＭＴＨＦＲバリアントの機能的な影響を、実施例１において記載されるような機能的効果を観察するために、一定範囲の葉酸塩濃度を通して、本明細書中に記載されたインビボ酵母アッセイを使用して試験した。
【０３９８】
実施例３：ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２ＡおよびＧＡＲＴバリアントの同定
ＤＮＡサンプルの集団。神経管欠損に罹患した２５０人の新生児それぞれ、または神経管欠損に罹患していない２５０人の新生児それぞれの乾燥血液スポット（Ｇｕｔｈｒｉｅ Ｃａｒｄ）から、集団ゲノムＤＮＡを単離した。葉酸塩／ホモシステイン代謝経路の１８個の候補遺伝子中の合計２３４個のエキソンを配列決定した。酵素の構造に影響が出ているシークエンシング及びアンプリコンの突然変異を、表２に列挙したＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＧＡＲＴのコンセンサスヒトゲノムシークエンスに対するミスマッチとして、シークエンスデータから同定した。ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＧＡＲＴのすべての置換を、以下の表Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦにそれぞれ列挙する。
【０３９９】
ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、およびＧＡＲＴ変異の機能的影響を、実施例１に記載されるような機能的効果を観察するために、開示されたインビボ酵母アッセイを使用して、および表１に記載されたような適当な酵母株バックグラウンドを使用して、一定範囲の葉酸塩濃度を通じて試験した。
【０４００】
全ての引用文献は、引用されることによりそれらの全てが本明細書中に明示的に援用される。
【０４０１】
【表６０】
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【０４０２】
【表６１】
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【０４０３】
【表６２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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