(57)【要約】  ヘリコバクター・ピロリ感染の治療におけるヒトＣＤ４６ポリペプチド又はその有効な変異体の使用を開示する。関連薬剤及びその製造における使用、医薬組成物、治療方法なども開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター・ピロリ（ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）に対して抗菌活性があるペプチドであって、式（Ｉ）：
Ｘａ−ＺＡ−ＰＰＰ−Ｘｂ−ＥＶＦ−ＺＢ−Ｘｃ（Ｉ）
［式中、
Ｘａが、長さａ残基を有する任意のアミノ酸残基の配列を示し、任意選択であり、
Ｘｂが、長さｂ残基を有する任意のアミノ酸残基の配列を示し、
Ｘｃが、長さｃ残基を有する任意のアミノ酸残基の配列を示し、任意選択であり、
ａが、０〜５０の整数であり、
ｂが、６〜２０の整数であり、
ｃが、０〜５０の整数であり、
ＺＡが、アミノ酸配列ＣＴ（配列番号１の残基１２８〜１２９）を示し、任意選択であり、
ＺＢが、アミノ酸配列ＥＹＬＤ（配列番号１の残基１４８〜１５１）を示し、任意選択であり、
ただしＺＡ及びＺＢの少なくとも一方が存在し、
ペプチドの分子量が、６０００Ｄａ未満である］
による構造を有する上記ペプチド。
【請求項２】
ＺＡが存在する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ＺＢが存在する、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
ｂが、８〜１６である、請求項１から３までのいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
ｂが、１０〜１４である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
ｂが、１１〜１３である、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
ｂが、１２である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｘｂが、配列：ＫＩＫＮＧＫＨＴＦＳＥＶ（配列番号１の残基１３１〜１４４）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を示す、請求項１から３までのいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
Ｘｂが、配列：ＫＩＫＮＧＫＨＴＦＳＥＶ（配列番号１の残基１３１〜１４４）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を示す、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
Ｘｂが、配列：ＫＩＫＮＧＫＨＴＦＳＥＶ（配列番号１の残基１３１〜１４４）と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を示す、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
Ｘｂが、配列：ＫＩＫＮＧＫＨＴＦＳＥＶ（配列番号１の残基１３１〜１４４）を有するアミノ酸配列を示す、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
ａ及びｃの両方が０〜２５である、請求項１から１１までのいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１３】
ａ及びｃの両方が０〜１０である、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
ａ及びｃの両方が０〜２である、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
配列：ＣＴＰＰＰＫＩＫＮＧＫＨＴＦＳＥＶＥＶＦＥＹＬＤ（配列番号１の残基１２８〜１５１）を含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１６】
ヘリコバクター・ピロリ（ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）に対して抗菌活性があるペプチドであって、
配列番号１のアミノ酸１９０〜２１６に記載の配列を含むペプチド、
配列番号１のアミノ酸１９０〜２１６又はその部分配列と同一の配列を有する少なくとも８アミノ酸残基を含むペプチド、
配列番号１のアミノ酸１９０〜２１６又はその部分配列と少なくとも５０％の同一性がある配列を有する少なくとも１０アミノ酸残基を含むペプチド
から成る群から選択され、
ただし前記ペプチドの分子量が６０００Ｄａ未満である上記ペプチド。
【請求項１７】
天然に存在するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を含まず、前記アミノ酸残基を連結している完全に天然のペプチド骨格を有する、請求項１から１６までのいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１８】
１個、又は２個以上のアミノ酸類似体又はアミノ酸模倣体を含む、請求項１から１６までのいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１９】
前記骨格が、１個、又は２個以上の非天然の結合を含む、請求項１から１６まで又は１８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２０】
前記非天然の結合が、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス又はトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、及び−ＣＨ２ＳＯ−から成る群から選択される結合を含む、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
修飾された末端を有する、請求項１から２０までのいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２２】
薬剤として使用する、請求項１から２１までのいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２３】
ヘリコバクター・ピロリ（ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）感染の治療に使用する、請求項１から２２までのいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２４】
経口投与によって使用する、請求項２２又は２３に記載のペプチド。
【請求項２５】
請求項１から２４までのいずれか一項に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２６】
ヘリコバクター・ピロリ（ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）感染の治療に使用するヒトＣＤ４６ポリペプチド（配列番号１）の有効な変異体を含む薬剤。
【請求項２７】
前記有効な変異体が、配列番号１のアミノ酸１２８〜１５１又はその有効な変異体を含むペプチドである、請求項２６に記載の薬剤。
【請求項２８】
前記有効な変異体が、配列番号１のアミノ酸１９０〜２１６又はその有効な変異体を含むペプチドである、請求項２６に記載の薬剤。
【請求項２９】
前記有効な変異体が、６０００Ｄａ未満の分子量を有する、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項３０】
前記有効な変異体が、ヒトＣＤ４６ポリペプチド（配列番号１）である、請求項２６に記載の薬剤。
【請求項３１】
前記有効な変異体が、ヘリコバクター・ピロリ（ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）に対する殺菌効果を有する、請求項２６から３０までのいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項３２】
前記有効な変異体が、ヘリコバクター・ピロリ（ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）に対する殺菌効果を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、１ｍＭの濃度で細菌生存率を少なくとも５０％減少させる、請求項３１に記載の薬剤。
【請求項３３】
前記有効な変異体が、ヘリコバクター・ピロリ（ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）ウレアーゼ（ＵｒｅＡ）阻害活性を有する、請求項２６から３２までのいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項３４】
前記有効な変異体が、ヘリコバクター・ピロリ（ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）ウレアーゼ（ＵｒｅＡ）阻害活性を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、１ｍＭの濃度で少なくとも５０％阻害する、請求項３３に記載の薬剤。
【請求項３５】
医薬として許容される安定剤、担体、賦形剤又は希釈剤を更に含む、請求項２６から３４までのいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項３６】
前記薬剤が経口投与用である、請求項２６から３５までのいずれかに記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）感染の薬物療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
病原体としてのヘリコバクター・ピロリ
ヘリコバクター・ピロリは、世界人口の半分以上のヒト胃及び十二指腸粘膜に定着するグラム陰性バクテリアである。細菌は、粘液層と結びついて胃上皮に付着して見つかる。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染は、しばしば幼児期に獲得され、直接接触を通じて、又は汚染した食品及び水を摂取することによって広がる。細菌は、胃環境において数十年間、更に宿主の一生涯を通じて持続感染することができる。Ｈ．ピロリ感染は、胃十二指腸潰瘍の最も強力な危険因子として知られ、更に胃腺癌及び胃粘膜関連リンパ組織リンパ腫の原因物質として明らかにされた最初のバクテリアである。
【０００３】
Ｈ．ピロリは、多数の異なるコロニー形成及び毒性決定因子を保有する。ｕｒｅＡ及びｕｒｅＢによってコードされるウレアーゼ酵素は、コロニー形成部位で尿素を分解することによって胃液酸度を中和する。細菌鞭毛が運動性を媒介する。ＶａｃＡ細胞毒素及びＣａｇＡ病原性島は、細胞毒性に関与し上皮生物学に影響する。最も研究されたＨ．ピロリ接着分子は、宿主細胞糖タンパク質上の炭水化物構造を結合する外膜タンパク質である。ＢａｂＡ接着分子は、フコシル化血液型抗原ルイス−ｂを結合し、シアル酸結合接着分子（ＳａｂＡ）は、胃上皮細胞上のシアル化炭水化物構造に結合する。ＨｏｐＺ、ＨｏｐＨ、ＡｌｐＡ及びＡｌｐＢなど他のいくつかの外膜タンパク質が細菌の宿主細胞への付着を媒介することも示されてきた。
【０００４】
宿主免疫系によって放出される活性酸素種に対抗し、胃粘膜内に生存するために、Ｈ．ピロリは多数の無毒化タンパク質を備えている。これらの中で、アルキルヒドロペルオキシド還元酵素（ＡｈｐＣ、ａｈｐＣ遺伝子にコードされる）は、最も大量にあるタンパク質である。ＡｈｐＣは、２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンのメンバーであり、チオレドキシン依存的である。Ｈ．ピロリのＡｈｐＣは、真正細菌のＡｈｐＣよりヒトのペルオキシレドキシンファミリー（Ｐｒｘｓ）と相同性があることが示されている。これは、長期の感染により細菌ＡｈｐＣとヒトＰｒｘｓ遺伝子との組換えが促進されて、ヒト様ＡｈｐＣが形成される可能性があることを示唆している。
【０００５】
補体系及びＣＤ４６
補体系は、病原体を除去するのに重要な役割を担う。多くの細菌は、補体制御因子を妨害することによってヒト補体系の仕組みを逃れる能力を発達させてきた。ＣＤ４６（赤血球を除く実質的に全ての細胞に発現されるヒト細胞表面の糖タンパク質）は、セリンプロテアーゼ因子Ｉによって沈着したＣ３ｂ及びＣ４ｂのタンパク質分解において補因子として働くことにより補体の活性化を制御する。ＣＤ４６は、相同な４つの補体制御タンパク質反復配列（ＣＣＰＲ−１、−２、−３、及び−４）である、セリン−トレオニン−プロリン（ＳＴＰ）に富んだドメイン、膜貫通疎水性ドメイン、細胞質アンカー、及び細胞質尾部から成る。ＣＤ４６の主要な４つのアイソフォームは、ＳＴＰドメインの選択的スプライシング及び２つの細胞質尾部（Ｃｙｔ−１及びＣｙｔ−２）のうち一方の選択によって発現される（Ｄｈｉｍａｎ，Ｎ．、Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．及びＰｏｌａｎｄ，Ｇ．Ａ．、Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ＳＬＡＭ  ａｎｄ  ＣＤ４６．、Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ、１４巻、２１７〜２２９ページ（２００４）；Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｂ．及びＡｔｋｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．、ＣＤ４６  ｉｎ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、１０巻、４５９〜４６５ページ（２００４）；Ｒｉｌｅｙ−Ｖａｒｇａｓ，Ｒ．Ｃ．、Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｂ．、Ｋｅｍｐｅｒ，Ｃ、Ｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｍ．Ｋ．及びＡｔｋｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．、ＣＤ４６：ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｂｅｙｏｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２５巻、４９６〜５０３ページ（２００４）を参照のこと）。ＣＤ４６は、アデノウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、病原性ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、はしかウイルス及び化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に対する受容体である。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及び淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）による上皮細胞の感染は、ＣＤ４６の脱落を引き起こす。
【０００６】
ＣＤ４６は、無感染の個体のヒト胃上皮並びに胃潰瘍、十二指腸潰瘍及び腺癌を患うＨ．ピロリ感染患者において発現されるが（Ｃｏｒｒｅａ，Ｐ．、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．、Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ、１９巻、付録１、Ｓ３７〜４３ページ（１９９５））、Ｈ．ピロリ感染におけるＣＤ４６の役割は、まだ解明されていない。
【０００７】
Ｈ．ピロリ感染に対する現在の療法
Ｈ．ピロリ感染を効果的に根絶する試みとして、３剤併用療法が通常使用される。今日では、標準的な３剤併用療法は、アモキシシリン、クラリスロマイシン及びプロトンポンプ阻害剤（オメプラゾール、ランソプラゾール、パントプラゾール又はエゾメプラゾールなど）である。メトロニダゾールを用いる手順も使用されている。通常、使用される抗生物質は広い抗菌スペクトルを有し、本来の腸細菌叢に影響を及ぼすため、消化管副作用をもたらす。更に、広スペクトルな抗生物質の使用は抗生物質耐性の発生の一因となる可能性があり、それは憂慮すべき深刻さを増す問題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、現在の療法に付随する問題を有さないＨ．ピロリ感染の薬物療法を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
定義
「アミノ酸」という用語は、タンパク質中に天然に存在するアミノ酸を含み、そのアミノ酸が生物学的起源か非生物学的起源（化学的に合成されたものなど）かどうかの制限は無い。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、並びに細胞によって翻訳後修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸及びＯ−ホスホセリンである。その用語は、アミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を含むこともできる。好ましい実施形態の関連において、その用語は天然に存在するアミノ酸だけを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｈ．ピロリが胃上皮のＡＧＳ細胞においてＣＤ４６の脱落を誘導することを示す図である。（Ａ）感染１８時間後の野生型Ｈ．ピロリＪ９９、２６６９５及びＨＰＧＡｌのＡＧＳ細胞への付着。細菌を、感染多重度（ＭＯＩ）１００で添加した。結果は、独立した３回の実験による３つ組サンプルに基づいた平均と標準偏差を表す。（Ｂ）ＣＤ４６の減少を引き起こす胃上皮細胞の感染。ＡＧＳ細胞に、Ｈ．ピロリＪ９９、２６６９５及びＨＰＧＡｌをＭＯＩ  １００で１８時間感染させた。無感染（黒い陰影範囲）及び感染したＡＧＳ細胞（陰無し範囲）におけるＣＤ４６の発現を、ＣＤ４６特異的抗体を使用するフローサイトメトリーで分析した。（Ｃ）Ｈ．ピロリ感染後の細胞上清中のＣＤ４６の存在を示すＥＬＩＳＡ。マイクロタイタープレートに無感染（対照）及び感染した細胞の上清を２４時間塗布し、ＣＤ４６ポリクローナル抗体（Ｈ２９４）、続いてＨＲＰ結合抗ＩｇＧを重層した。結果は独立した３回の実験の３つ組を表し、エラーバーは平均±ｓ．ｄ．（＊Ｐ≦０．００１）を表す。
【図２】ＣＤ４６がＨ．ピロリに結合することを示す図である。（Ａ）上記のライリー−Ｖａｒｇａｓらを改作したＣＤ４６−ＢＣ１の細胞外領域の概略図。（Ｂ）細菌溶菌液に結合しているｒＣＤ４６のＥＬＩＳＡ分析。マイクロタイタープレートにＨ．ピロリ（Ｊ９９、２６６９５、ＨＰＧＡ１）の溶菌液を塗布し、ｒＣＤ４６  ２．５μｇ又はＨ．ピロリ溶菌液をそれぞれ１時間重層し、ＣＤ４６抗体及びＡｌｅｘａ４８８結合抗ウサギＩｇＧを用いて染色した。（Ｃ）Ｈ．ピロリ株に結合しているｒＣＤ４６のフローサイトメトリー分析。対数期の細菌（１０７ＣＦＵ／ｍｌ）を３０μｇ／ｍｌ  ｒＣＤ４６と共に２時間インキュベーションし、洗浄し、ＣＤ４６ポリクローナル抗体、続いてＡｌｅｘａ４８８結合抗ウサギＩｇＧを用いて染色し、フローサイトメトリーで分析した。（Ｄ）ＣＤ４６抗体又はＣ３ｂにより、Ｈ．ピロリＪ９９とｒＣＤ４６との相互作用を遮断することができる。ｒＣＤ４６を緩衝液、Ｃ３ｂ又はＣＤ４６抗体と共に３７℃で１時間プレインキュベーションし、次いで細菌を加えて更に２時間インキュベーションした。対照として、ｒＣＤ４６の有り無しで細菌をインキュベーションした。細菌懸濁液を洗浄し、ＣＤ４６ポリクローナル抗体及びＡｌｅｘａ４８８結合抗ウサギＩｇＧを用いて染色し、フローサイトメトリーで分析した。結果は独立した２回の実験の３つ組を表し、エラーバーは平均±ｓ．ｄ．（＊Ｐ≦０．０１）を表す。（Ｅ）Ｈ．ピロリに結合しているｒＣＤ４６の顕微鏡的検出。細菌（１０６ｃｆｕ／ｍｌ）を、３０μｇ／ｍｌ  ｒＣＤ４６の有り（＋ＣＤ４６）無し（−ＣＤ４６）で２時間インキュベーションし、洗浄し、ＣＤ４６ポリクローナル抗体及び抗ＩｇＧ二次抗体を用いて染色し、蛍光倒立顕微鏡で分析した。画像は、３回の別々の実験のうちの１つを代表する。（Ｆ）ＣＤ４６結合に応答して変形したＨ．ピロリの形態。
【図３】組換えＣＤ４６がＨ．ピロリに対して殺菌性であることを示す図である。（Ａ）１０５細菌／ｍｌのＨ．ピロリＪ９９を、０、５、１０、３０、５０又は１００μｇ／ｍｌの精製したｒＣＤ４６又は精製したチオレドキシン（Ｔｒｘ）と共に１０％ＣＯ２及び５％Ｏ２下に３７℃で６時間インキュベーションした。（Ｂ）１０５細菌／ｍｌのＨ．ピロリＪ９９を、３０μｇ／ｍｌ  ｒＣＤ４６と共に０、６及び２４時間インキュベーションした。コロンビア血液寒天プレート上で連続希釈物を平板培養することによって、生存細菌数を数えた。ｒＣＤ４６インキュベーション後のコロニー形成単位（ｃｆｕ）をｒＣＤ４６無しの対照ｃｆｕで割って、生存率を表示する（＊Ｐ≦０．００６）。（Ｃ）ｒＣＤ４６による細菌の透過化を、Ｃ３ｂによって遮断することができる。Ｈ．ピロリＪ９９株を添加する前に、ｒＣＤ４６を緩衝液又はＣ３ｂと共に２時間プレインキュベーションした。精製したチオレドキシン（Ｔｒｘ）又はｒＣＤ４６無しの緩衝液を陰性対照として使用した。細菌を、ＰＩを用いて染色し、固定し、フローサイトメトリーで分析した（＊＊Ｐ≦０．００１）。（Ｄ）Ｇｉｌｌらを改作したＣＤ４６のＣＣＰ１〜４ドメインの概略図（Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｂ．、Ｓｐｉｔｚｅｒ，Ｄ．、Ｋｏｏｍｅｙ，Ｍ．、Ｈｅｕｓｅｒ，Ｊ．Ｅ．及びＡｔｋｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．、Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｈｏｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐｉｌｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ．、Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７巻、１６７２〜１６８３ページ（２００５））。濃い印はＣＤ４６内の４つの合成ペプチド、Ｐ１〜Ｐ４、の位置である（ＣＣＰ１〜４）。（Ｅ）ペプチドと共にインキュベーションした後のＨ．ピロリの生存。細菌（１０５ＣＦＵ／ｍｌ）を３０μＭの各ペプチドと共に６時間インキュベーションし、連続希釈し、プレート上に広げて生菌数を算定した。（Ｆ）０、５、１０、２０又は３０μＭのＰ３−ペプチドと共に６時間インキュベーションした後のＨ．ピロリ（１０５ＣＦＵ／ｍｌ）の生存。細菌を連続希釈し、プレート上に広げて生菌数を算定した。結果は独立した３回の実験の３つ組を表し、エラーバーは平均±ｓ．ｄ．を表す。
【図４】ｒＣＤ４６及びペプチド−Ｐ３が、Ｈ．ピロリのウレアーゼ活性を阻害することを示す図である。（Ａ）親和性クロマトグラフィーによるＨ．ピロリのｒＣＤ４６結合リガンドの同定。質量分析法によって、分子量２０及び２８ｋＤａの２本の顕著なバンドをウレアーゼＡ及びアルキルヒドロペルオキシド還元酵素（ＡｈｐＣ、ａｈｐＣ遺伝子にコードされる）として同定した。（Ｂ）ｒＣＤ４６によるＨ．ピロリウレアーゼ活性の時間経過阻害。方法に示した通り、尿素含有反応緩衝液の添加によってウレアーゼ活性をアッセイした。（Ｃ）Ｈ．ピロリＪ９９及びその変異株（ΔｕｒｅＡ及びΔｕｒｅＡ／ΔａｈｐＣ）に結合しているｒＣＤ４６のフローサイトメトリー分析。細菌（１０７ＣＦＵ／ｍｌ）を、３０μｇ／ｍｌ  ｒＣＤ４６と共に２時間インキュベーションし、洗浄し、ＣＤ４６ポリクローナル抗体、続いてＡｌｅｘａ４８８結合抗ウサギＩｇＧを用いて染色し、フローサイトメトリーで分析した。（Ｄ）Ｈ．ピロリＪ９９及びその変異株（ΔｕｒｅＡ、ΔａｈｐＣ及びΔｕｒｅＡ／ΔａｈｐＣ）に結合しているペプチドのフローサイトメトリー分析。細菌（１０７ＣＦＵ／ｍｌ）を、２０μＭのＦＩＴＣ−Ｐ３、ＦＩＴＣ−Ｐ１又はランダムペプチド（ＲＰ）と共に２時間インキュベーションし、洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。（Ｅ）Ｈ．ピロリＪ９９のウレアーゼ活性に対するＣＤ４６  Ｐ３ペプチド及びＰ１ペプチドの効果。Ｈ．ピロリＪ９９の全タンパク質抽出物タンパク質１μｇを３０μＭのＰ３又はＰ１ペプチドと共に０〜６０分間インキュベーションした。方法に示した通り、尿素含有反応緩衝液の添加によってウレアーゼ活性をアッセイした。結果は独立した３回の実験の３つ組を表し、エラーバーは平均±ｓ．ｄ．を表す（＊Ｐ≦０．０１、＊＊Ｐ≦０．０５、＊＊＊Ｐ≦０．００３）。
【図５】マウスモデルにおいてＣＤ４６Ｐ３ペプチドの経口投与によりＨ．ピロリ感染が除去されることを示す図である。ＣＤ４６トランスジェニックマウス（群当たり１０〜１２匹のマウス）に、１０８ｃｆｕ／ｍｌのＨ．ピロリ６７：２１株を１日に１回、３日間隔で経口感染させた。感染８週間後に、２０μＭのＰ３ペプチド１００μＬ（＋Ｐ３）又はＰＢＳ（−Ｐ３）を用いて２週間、マウスを経口的に処置した。治療の２週間後に、マウス胃組織を解剖し、ホモジナイズして細菌負荷を検出した、又は免疫染色用に切片化した。（Ａ）無感染対照（黒丸）、ＰＢＳ処理（−Ｐ３）（黒菱形）、Ｐ３処理（＋Ｐ３）（白丸）マウスの胃組織のコロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｇをｌｏｇ１０で算定した細菌負荷。感染１０週間後のＰＢＳ処理したマウスにおけるコロニー形成は、Ｐ３処理したマウスより著しく高かった（Ｐ≦０．００１）。（Ｂ）抗ＣＤ４６抗体又は抗Ｈ．ピロリ抗体のいずれかを使用する、感染１０週間後の胃組織切片のＣＤ４６及びＨ．ピロリの免疫染色。（Ｃ）抗ＣＤ４６を用いて染色し、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアで分析した胃組織におけるＣＤ４６の強度。Ｈ．ピロリに感染したＣＤ４６トランスジェニックマウスの胃組織におけるＣＤ４６レベルは、Ｐ３処理したマウスと比較して感染マウスにおいて著しく減少したＰ＜０．０１。（Ｄ）ＥＬＩＳＡによって測定した、胃組織中のＩＬ−６、ＴＮＦ及びＩＬ−１０のサイトカインレベル。ＰＢＳ処理マウス（−Ｐ３）と比較して、Ｐ３処理マウスにおけるＩＬ−１０レベルは上昇した。処理及び無処理マウスの間で、ＩＬ−６とＴＮＦのレベルに顕著な差はなかった。結果は、指示した各治療に使用したマウスの数（ｎ）での独立した２回の実験を表し、エラーバーは平均±ｓ．ｄ．を表す。
【図６】Ｐ３ペプチドの活性部位の決定を示す図である。ペプチドＰ−２５の異なる変異体とインキュベーションした後のＨ．ピロリの生存。Ｐ３−２５は、原型のペプチドＰ３と比較してＮ末端に追加のロイシン（Ｌ）を有した。細菌（１０５ＣＦＵ／ｍｌ）を、３０μＭの各ペプチドと共に６時間インキュベーションし、連続希釈し、プレート上に広げて生菌数を算定した。（Ａ）ペプチドＰ３−２５のＮ末側端半分（Ｐ３−１２）、Ｃ末端側半分（Ｐ３−１３）及び中間部分（Ｐ３−１４）を含むペプチド。（Ｂ）連続したＣ末端欠失（Ｐ３−１５、Ｐ３−１８、Ｐ３−２１）、及び連続したＮ末端欠失（Ｐ３−１６、Ｐ３−１９、Ｐ３−２２）を有するペプチド。対照として、ランダムペプチド（ＲＰ−２５）を使用した。結果は、１回の実験の３つ組を表す。
【００１１】
「アミノ酸類似体」という用語は、タンパク質中に天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学的構造を有する、すなわちα−炭素（定義上、水素、カルボキシル基、アミノ基に結合される）を有するが、タンパク質中で天然には存在しない側鎖（Ｒ基）を有する本来のアミノ酸とは異なる化合物を意味する。換言すれば、そのような類似体は非天然の修飾されたＲ基を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学的構造のペプチド骨格を保持している。例には、ノルロイシン、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド及びメチオニンメチルスルホニウムが含まれる。
【００１２】
「アミノ酸模倣体」という用語は、アミノ酸の一般的な化学的構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の形で機能する化合物を意味する。例えば、アミノ酸模倣体は、β−及びγ−アミノ酸を含む。
【００１３】
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、長さに上限の無いペプチドを意味する。換言すれば、その用語はポリペプチド及びタンパク質も包含する。好ましい実施形態の関連において、その用語は、ペプチド結合によって連結された天然に存在するアミノ酸の線状鎖から成る分子だけを意味する。しかし、その用語は１つ又は複数のアミノ酸類似体を含むペプチドを包含することもできる。その用語は、１つ又は複数のアミノ酸模倣体を含むペプチドを包含することもできる。その用語は、更にペプチド模倣体及び機能的誘導体を含むことができる。
【００１４】
「ムテイン」という用語はひな形ペプチドの変異体を意味し、ひな形ペプチド配列のアミノ酸残基の１つ若しくは複数が異なるアミノ酸残基で置き換えられる若しくは欠失されており、又は１つ若しくは複数のアミノ酸残基が原型の配列であるひな形ペプチドに追加されている。ムテイン配列を有するペプチドは、合成によって及び／又は部位特異的突然変異技術、若しくは公知である他の任意の適当な技術によって調製できる（例えば、Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８、又はＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９８３、を参照のこと、参照により本明細書に組み込む）。
【００１５】
本発明によるムテインにおける好ましい変化は、「保存的」置換として公知なものである。保存的アミノ酸置換は、群のメンバー間での置換がその分子の生物学的機能を保持するような十分に類似した物理化学的特性を有する群の中の同義アミノ酸を含むことができる、Ｇｒａｎｔｈａｍ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８５巻、８６２〜８６４ページ（１９７４）。具体的には、挿入又は欠失が少しのアミノ酸、例えば３０個未満、好ましくは１０個未満しか伴わず、機能的構造にとって重要なアミノ酸（例えば、システイン残基）を取り除いたり移動させたりしない場合に、それらの機能を変えること無しに、上で定義した配列にアミノ酸の挿入及び欠失を作れることも明らかである、Ａｎｆｉｎｓｅｎ、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ｔｈａｔ  Ｇｏｖｅｒｎ  Ｔｈｅ  Ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈａｉｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８１巻、２２３〜２３０ページ（１９７３）。そのような欠失及び／又は挿入によって生成されるムテインは、本発明の範囲内である。
【００１６】
好ましい同義アミノ酸群は表１に定義されたものであり、列に優先度の順序の指標を含む。
【表１】
2013533848.tif 000002
【００１７】
本発明に使用するヒトＣＤ４６のムテインを得るのに使用可能な、タンパク質中にアミノ酸置換を作る例には、Ｍａｒｋらの米国特許ＲＥ３３，６５３号、第４，９５９，３１４号、第４，５８８，５８５号及び第４，７３７，４６２号；Ｋｏｔｈｓらの第５，１１６，９４３号；Ｎａｍｅｎらの第４，９６５，１９５号；Ｃｈｏｎｇらの第４，８７９，１１１号；及びＬｅｅらの第５，０１７，６９１号などに示された公知の任意の方法ステップ；及び米国特許第４，９０４，５８４号（Ｓｈａｗら）に示されたリシン置換タンパク質が含まれる。
【００１８】
「配列同一性パーセント」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して又は目視検査によって測定した場合の、２つ以上の配列又は部分配列の間の類似度を意味する。２つの配列は、それらの全長（例えば、それらが実質的に異なる長さの場合、その２つのうち短い方の長さ）にわたって、又は少なくとも少なくとも約１０、約２０、約３０、約５０若しくは約１００個の隣接するアミノ酸残基など部分配列にわたって比較できる。
【００１９】
天然配列と変異体との配列同一性パーセントを決定する場合、天然配列は参照配列として機能し、それに対して試験（変異体）配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験及び参照配列をコンピュータに入力し、部分配列座標を指定し、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較して試験配列（単数又は複数）の配列同一性パーセントを算出する。
【００２０】
比較するのに最適な配列の整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２巻：４８２ページ（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３ページ（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻：２４４４ページ（１９８８）の類似性検索法によって、これらアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ実装によって、又は目視検査（一般にＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ及びＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９より追補される）を参照のこと）によって、実行できる。これらの各参照文献及びアルゴリズムを、その全体を参照により本明細書に組み込む。上述したアルゴリズムのいずれかを使用する場合、「ウインドウ」長さ、ギャップペナルティなどに関しては、初期設定パラメータを使用する。
【００２１】
配列同一性パーセント及び配列類似性を決めるのに適切なアルゴリズムの一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜４１０ページ（１９９０）に記述されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、米国バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から一般公開されている。このアルゴリズムは、まず最初に、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列対（ＨＳＰ）の同定を行い、そのクエリー配列は、データベース配列中の同じ長さのワードと整列されたとき、いくらかの正に評価される閾値スコアＴと一致する又はそれを満たす。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（上記のＡｌｔｓｃｈｕｌら）と呼ばれる。これら最初の近傍ワードヒットは、検索を開始するためのシードとして機能し、それらを含んでいる更に長いＨＳＰを見つけ出す。次いでワードヒットは、累積整列スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に広げられる。各方向のワードヒットの拡張は、次の場合に停止する：累積整列スコアが、得られた最大値から量Ｘだけ低下する；１つ又は複数の負にスコアされる残基の整列が蓄積することにより累積スコアが０以下になる、又は配列の両末端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータであるＷ、Ｔ及びＸは、整列の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期設定としてワード長（Ｗ）１１と、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻：１０９１５ページ（１９８９）を参照のこと）と、整列（Ｂ）５０と、期待値（Ｅ）１０と、Ｍ＝５と、Ｎ＝−４と、両鎖の比較とを使用する。配列間の同一性パーセントを決定するには、その初期設定パラメータを用いるＢＬＡＳＴアルゴリズムが好ましい。
【００２２】
配列同一性パーセントの算出に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列の間の類似性の統計分析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、５８７３〜５７８７ページ（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの基準は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのアミノ酸配列間の一致が偶然に起こり得る確率の指標を提供する。
【００２３】
「ペプチド模倣体」という用語は、機能上ペプチドの類似体であるが、少なくとも部分的に非ペプチド構造を有する合成又は半合成化合物を意味する。ペプチド模倣体は一般に、ひな型ペプチドに類似した特性を有する非ペプチド薬剤として製薬業界で使用される。（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．、１５巻：２９ページ（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ及びＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ、ＴＩＮＳ、３９２ページ（１９８５）；及びＥｖａｎｓらＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３０巻、１２２９ページ（１９８７）、これらを参照により本明細書に組み込む）を参照のこと。治療上有用なペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣体を使用して、同等な又は増強された治療的若しくは予防的効果を生成できる。通常、ペプチド模倣体はひな型ペプチド（すなわち、本発明に開示されるペプチドなど生物学的又は薬理学的活性を有するペプチド）と構造的に類似しているが、１つ以上、又は全てのペプチド結合のペプチド骨格（ひな型ペプチドに存在する結合など）が非天然の結合によって置き換わっている。そのような結合は、好ましくは、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、及び−ＣＨ２ＳＯ−から成る群から選択できる。模倣体は、全体的にアミノ酸類似体又は模倣体のいずれかより成ってよく（上記を参照のこと）、又は天然に存在するアミノ酸とアミノ酸類似体若しくは模倣体とのキメラポリマーであってよい。ペプチド模倣体は、ムテインとの関連で以下に説明した方法で、本来のアミノ酸置換（ひな型ペプチドに対する）を追加的に組み込むことができる。換言すれば、ペプチド模倣体は、ひな型ペプチドのムテインに基づくこともできる。
【００２４】
ペプチドの「機能的な誘導体」という用語は、当該技術分野に公知の手段により、残基上に側鎖として存在する官能基又はＮ−若しくはＣ末端基を化学的、物理的又は酵素的に修飾することによって調製されるペプチドであると理解される。これら誘導体には例えば、ポリエチレングリコール側鎖、蛍光標識（例えばＦＩＴＣ）などの標識、炭水化物側鎖及び類似の付加物が含まれ得る。他の誘導体には、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアと又は第１級若しくは第２級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アミノ酸残基の遊離アミノ基とアシル部分とで形成されるＮ−アシル誘導体（例えばアルカノイル又は炭素環式アロイル基）、又は遊離ヒドロキシル基（例えばセリル若しくはトレオニル残基のヒドロキシル基）とアシル部分とで形成されるＯ−アシル誘導体、が含まれる。
【００２５】
「抗菌活性」という用語は、殺菌活性と静菌活性の両方を包含する。
【００２６】
第１の態様において、本発明は、ヘリコバクター・ピロリに対して抗菌活性があるペプチドであって、式（Ｉ）：
Ｘａ−ＺＡ−ＰＰＰ−Ｘｂ−ＥＶＦ−ＺＢ−Ｘｃ（Ｉ）
［式中、
Ｘａが、長さａ残基を有する任意のアミノ酸残基の配列を示し、任意選択であり、
Ｘｂが、長さｂ残基を有する任意のアミノ酸残基の配列を示し、
Ｘｃが、長さｃ残基を有する任意のアミノ酸残基の配列を示し、任意選択であり、
ａが、０〜５０の整数であり、
ｂが、６〜２０の整数であり、
ｃが、０〜５０の整数であり、
ＺＡが、アミノ酸配列ＣＴ（配列番号１の残基１２８〜１２９）を示し、任意選択であり、
ＺＢが、アミノ酸配列ＥＹＬＤ（配列番号１、配列番号２０の残基１４８〜１５１）を示し、任意選択であり、
ただしＺＡ及びＺＢの少なくとも一方が存在し、
ペプチドの分子量が、６０００Ｄａ未満である］
による構造を有するペプチドを提供する。
【００２７】
具体的には、ＺＡが存在するがＺＢは存在しなくてよい。或いは、ＺＢが存在するがＺＡは存在しなくてよい。更に別の変形例において、ＺＡとＺＢの両方が存在してよい。
【００２８】
ＰＰＰとＥＶＦ−モチーフの間のＸｂによって示される残基は、基本的にスペーサーとして機能する。スペースの長さは、６〜２０残基のアミノ酸鎖に相当するべきである。
【００２９】
好ましくは、ｂは８〜１６であり、より好ましくは、ｂは１０〜１４であり、更により好ましくは、ｂは１１〜１３であり、最も好ましくは、ｂは１２である。
【００３０】
Ｘｂによって示されるスペーサーは、対応する天然のヒトＣＤ４６配列ＫＩＫＮＧＫＨＴＦＳＥＶと類似性がある配列を有することができる。スペーサーは、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性、又は上述した数字のいずれか２つの組合せによって作成される任意の区間同一性％、例えば７０％〜９９％若しくは８０％〜９９％の同一性で、ＫＩＫＮＧＫＨＴＦＳＥＶと配列同一性を有することができる。
【００３１】
Ｘｂは、配列：ＫＩＫＮＧＫＨＴＦＳＥＶ（配列番号１、配列番号２１の残基１３１〜１４４）と７０％〜１００％の同一性を有するアミノ酸配列を示すことができ、より好ましくは、同一性は８０〜１００％であり、更により好ましくは９０〜１００％であり、なお一層好ましくは９５〜１００％であり、最も好ましくは、Ｘｂは配列：ＫＩＫＮＧＫＨＴＦＳＥＶ（配列番号２１）を有するアミノ酸配列を示す。
【００３２】
好ましくは、ａとｃの両方が０〜２５であり、より好ましくは、ａとｃの両方が０〜１０であり、なお一層好ましくは、ａとｃの両方が０〜２であり、最も好ましくは、ａとｃの両方が０（ＸａとＸｃの両方が存在しないことを意味する）である。
【００３３】
最も好ましくは、ペプチドは配列：ＣＴＰＰＰＫＩＫＮＧＫＨＴＦＳＥＶＥＶＦＥＹＬＤ（配列番号１、配列番号１８の残基１２８〜１５１）を含む。
【００３４】
第２の態様において、ヘリコバクター・ピロリに対して抗菌活性があるペプチドであって、
配列番号１のアミノ酸１９０〜２１６に記載の配列を含むペプチド、
配列番号１のアミノ酸１９０〜２１６又はその部分配列と同一の配列を有する少なくとも８アミノ酸残基を含むペプチド、及び
配列番号１のアミノ酸１９０〜２１６又はその部分配列と少なくとも５０％（５０〜１００％を意味する）の同一性がある配列を有する少なくとも１０アミノ酸残基を含むペプチド
から成る群から選択され、
ただしそのペプチドの分子量が６０００Ｄａ未満であるペプチドが提供される。
【００３５】
前述の抗菌活性は、殺菌活性であり得る。
【００３６】
第１又は第２の態様のペプチドは、好ましくは天然に存在するアミノ酸残基だけを含み、アミノ酸残基を連結している完全に天然のペプチド骨格を有する。
【００３７】
第１又は第２の態様のペプチドは、０、１、２、３、又は４個以上のアミノ酸類似体若しくはアミノ酸模倣体を含むことができる。
【００３８】
第１又は第２の態様のペプチドは、０、１、２、３、又は４個以上の非天然の結合を含む骨格を含むことができる。非天然の結合は、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス又はトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、及び−ＣＨ２ＳＯから成る群から選択される結合を含むことができる。
【００３９】
第１又は第２の態様のペプチドは、修飾された末端（Ｎ末端又はＣ末端）を有することができる。
【００４０】
第３の態様において、薬剤として使用する、好ましくはヘリコバクター・ピロリ感染の治療に使用する、第１又は第２の態様のペプチドが提供される。関連する第４の態様において、薬剤、好ましくはヘリコバクター・ピロリ感染の治療薬の製造における第１又は第２の態様のペプチドの使用が提供される。関連する第５の態様において、それを必要とする患者、好ましくはヘリコバクター・ピロリ感染を治療する必要性がある患者に、第１又は第２の態様のペプチドを投与することを含む治療方法が提供される。
【００４１】
第３の態様のペプチドは、好ましくは経口投与で使用する。第４の態様の薬剤は、好ましくは経口投与用である。第５の態様の方法における投与は、好ましくは経口である。
【００４２】
第６の態様において、第１、第２又は第３の態様によるペプチドを含む医薬組成物も提供される。
【００４３】
第７の態様において、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療に使用するヒトＣＤ４６ポリペプチド（配列番号１）の有効な変異体を含む薬剤が提供される。
【００４４】
第８の態様において、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療薬の製造におけるヒトＣＤ４６ポリペプチド（配列番号１）の有効な変異体の使用が提供される。
【００４５】
第９の態様において、ヘリコバクター・ピロリに感染した対象などそれを必要とする対象に、好ましくは経口で、ヒトＣＤ４６ポリペプチド（配列番号１）の有効な変異体を投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療方法が提供される。
【００４６】
有効な変異体は、配列番号１のアミノ酸１２８〜１５１、又はその有効な変異体を含むペプチドであり得る。
【００４７】
有効な変異体は、配列番号１のアミノ酸１９０〜２１６、又はその有効な変異体を含むペプチドでもあり得る。
【００４８】
有効な変異体は、６０００Ｄａ未満の分子量を有することができる。
【００４９】
有効な変異体は、ヒトＣＤ４６ポリペプチド（配列番号１）であり得る。
【００５０】
有効な変異体は、ヘリコバクター・ピロリに対する殺菌効果を有することができる。
【００５１】
有効な変異体は、ヘリコバクター・ピロリに対する殺菌効果を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１ｍＭの濃度、より好ましくは１００μＭ、更により好ましくは３０μＭ、なお一層好ましくは７μＭ、最も好ましくは１μＭで、細菌生存率を少なくとも５０％減少させる（５０％〜１００％の減少を意味する）ことができる。
【００５２】
有効な変異体は、ヘリコバクター・ピロリウレアーゼ（ＵｒｅＡ）阻害活性を有することができる。
【００５３】
有効な変異体は、ヘリコバクター・ピロリウレアーゼ（ＵｒｅＡ）阻害活性を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１ｍＭの濃度、より好ましくは１００μＭ、更により好ましくは３０μＭ、なお一層好ましくは７μＭ、最も好ましくは１μＭで、少なくとも５０％阻害する（５０％〜１００％の阻害を意味する）ことができる。
【００５４】
その薬剤は、医薬として許容される安定剤、担体、賦形剤又は希釈剤を更に含むことができる。その薬剤は、経口投与用であり得る。
【００５５】
好ましくは、上記の態様の有効な変異体は、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは１５アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基の配列を有するペプチドを含み、好ましくは前記配列がヒトＣＤ４６（配列番号１）又はその部分配列と同一である。
【００５６】
好ましくは、上記の態様の有効な変異体は、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは１５アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基の配列を有するペプチドを含み、前記配列はヒトＣＤ４６（配列番号１）又はその部分配列のムテインに対応する。
【００５７】
好ましくは、前記ムテインは、配列番号１との間で少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、なお一層好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは９０％の配列同一性を示す。
【００５８】
好ましくは、上記の有効な変異体は、天然のペプチド骨格を有する。好ましくは、前記ペプチドは、ペプチド模倣体である。好ましくは、前記変異体はアミノ酸類似体又は模倣体を含むが、天然に存在するアミノ酸しか含まなくてもよい。好ましくは、前記変異体は、共有結合した蛍光標識などの標識を有するなど、機能的誘導体である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリの病原性の原因となる新規な機序を同定し、ヘリコバクター・ピロリ感染に対する新規な療法を考案することが可能になった。この洞察は、
１）Ｈ．ピロリが生物学的に関連のある、細菌性の胃上皮細胞相互作用及びＣＤ４６トランスジェニックマウス（例１）から成るｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、ＣＤ４６の下方制御を誘導するという研究結果、
２）ＣＤ４６／ペプチドと２つのＨ．ピロリタンパク質であるＵｒｅＡ及びＡｈｐＣとの相互作用の可能性の同定（例２）、
３）ｒＣＤ４６とＰ３ペプチドなどＣＤ４６から得られる特定のペプチドの両方が、Ｈ．ピロリの増殖並びにウレアーゼ活性を阻害することの発見（例３〜５）、及び
４）Ｐ３ペプチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験モデルにおいて胃から細菌を根絶することの実証（例６）
により得られた。
【００６０】
したがって本発明は、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療に使用するヒトＣＤ４６（配列番号１）又はその有効な変異体を含む薬剤を提供する。換言すれば、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療薬の製造に対するヒトＣＤ４６（配列番号１）又はその有効な変異体の使用を開示する。更に換言すれば、本発明は、ヒトＣＤ４６（配列番号１）又はその有効な変異体を、それを必要とする対象に投与することを含む、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療方法を開示する。
【００６１】
ヒトＣＤ４６タンパク質の多くの変異体が有効であり、本発明の教示によって過度の負担無しに利用できることは、当業者には直ちに理解される。有効性について、当業者の日常的な作業だけが、前記変異体の合成及び試験に必要とされる。
【００６２】
有効な変異体という用語は、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療に効果があるヒトＣＤ４６の変異体を含む。本発明の範囲で「有効な変異体」であるためには、その変異体は、以下で詳述する特定の機能的及び構造的特徴を保有する必要がある。
【００６３】
ヒトＣＤ４６の有効な変異体の機能的特徴
有効な変異体は、ヘリコバクター・ピロリに対する殺菌効果を有する変異体であり得る。有効な変異体は、ヘリコバクター・ピロリに対する殺菌効果を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１ｍＭの濃度、より好ましくは１００μＭ、更により好ましくは３０μＭ、なお一層好ましくは７μＭ、最も好ましくは１μＭで、細菌生存率を少なくとも５０％減少させる（５０％〜１００％の減少を意味する）ことができる。当業者は、例えば、例４又は６に開示した方法によって、過度の負担無しに殺菌効果を決定できる。
【００６４】
代替的に又は追加的に、有効な変異体は、ヘリコバクター・ピロリウレアーゼ（ＵｒｅＡ）阻害活性を有することができる。有効な変異体はヘリコバクター・ピロリウレアーゼ（ＵｒｅＡ）阻害活性を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１ｍＭ濃度、より好ましくは１００μＭ、更により好ましくは３０μＭ、なお一層好ましくは７μＭ、最も好ましくは１μＭで、少なくとも５０％阻害する（５０％〜１００％の阻害を意味する）ことができる。当業者は、例えば、例５に開示した方法によって、過度の負担無しにヘリコバクター・ピロリウレアーゼ（ＵｒｅＡ）阻害活性を決定できる。
【００６５】
ヒトＣＤ４６の有効な変異体の構造的特徴
以下の文脈において「有効な」という用語は、前述のヒトＣＤ４６ポリペプチド（配列番号１）の有効な変異体の機能的特徴を保有するものと理解される。
【００６６】
「有効な変異体」という用語は、
ａ）ヒトＣＤ４６の部分配列を含むヒトＣＤ４６ポリペプチドの有効な断片、
ｂ）ヒトＣＤ４６ポリペプチド又は（ａ）で定義したその有効な断片の有効なムテイン、
ｃ）ヒトＣＤ４６又は（ａ）で定義したその有効な断片若しくは（ｂ）で定義したその有効なムテインを含むヒトＣＤ４６ポリペプチドの有効な融合タンパク質、
ｄ）ヒトＣＤ４６又は（ａ）、（ｂ）若しくは（ｃ）で定義したその有効な変異体の有効なペプチド模倣体、及び
ｅ）ヒトＣＤ４６又は（ａ）、（ｂ）、（ｃ）若しくは（ｄ）で定義したその有効な変異体の有効な機能的誘導体
を包含する。
【００６７】
好ましくは、有効な変異体は、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは１５アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基の配列を含むペプチドを含み、前記配列はヒトＣＤ４６（配列番号１）又はその部分配列と同一である。
【００６８】
更に好ましくは、その有効な変異体は、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは１５アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基の配列を含むペプチドを含み、前記配列は、ヒトＣＤ４６（配列番号１）又はその部分配列のムテインに対応する。
【００６９】
好ましくは、その有効な変異体は、６０００Ｄａ未満の分子量を有する。
【００７０】
ヘリコバクター・ピロリ感染の治療に有効な配列番号１の可能なムテインの例には、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を、又は上述した数字のいずれか２つの組合せによって作成される任意の区間同一性％、例えば７０％〜９９％若しくは８０％〜９９％の同一性、を有する配列が含まれる。好ましくは、そのムテイン配列は、配列番号１と少なくとも５０％（５０％〜１００％）、より好ましくは少なくとも６０％（６０％〜１００％）、更により好ましくは少なくとも７０％（７０％〜１００％）、なお一層好ましくは８０％（８０％〜１００％）、最も好ましくは９０％（９０％〜１００％）の配列同一性を示す。
【００７１】
上述した有効な変異体ペプチドは、好ましくは天然のペプチド骨格を有する、又はペプチド模倣体であり得る。好ましくは、前記ペプチドは天然に存在するアミノ酸だけを含み、又は１、２、３、若しくは４個以上のアミノ酸類似体若しくは模倣体を含むことができる。
【００７２】
医薬組成物及び投与
本発明の薬剤は、医薬として許容される安定剤、担体、賦形剤又は希釈剤を更に含むことができる。換言すれば、その薬剤は医薬組成物であり得る。
【００７３】
薬剤（又はその医薬組成物）は、好ましくは経口投与用として処方される。ペプチド薬剤は通常、取り込まれる前に消化器系によって分解されるので、経口投与は、通常とは異なるペプチド薬剤の投与法である。ヘリコバクター・ピロリ感染において、本発明者は、本発明の薬剤が実際に経口投与できることを示した（例６を参照のこと）。経口投与は利便性という理由で好ましいが、この場合にも、処置するべき感染が主に存在する胃内壁の粘液において有効な濃度を得るために、高濃度の薬剤に全身を曝露する必要がないという利点もある。
【００７４】
その薬剤（又はその医薬組成物）は、好ましくは錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、混合剤などを含めた公知の経口剤形である。
【００７５】
用法に関しては、日常の実験によって、当業者はヘリコバクター・ピロリ感染の治療に有効な用量を決定できる。有効量は、剤形、対象のサイズ、感染の重症度及び対象に感染している特定の細菌株に応じて変化させることができる。
【００７６】
その有効量は、好ましくは、０．０１〜１，０００，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、より好ましくは、０．１〜１００，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、更により好ましくは１〜１０，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、最も好ましくは１００〜１０００ｎｍｏｌ／ｋｇである。
【００７７】
新規なペプチド及びその使用
本発明は、
ａ）配列番号１のアミノ酸１２８〜１５１に記載の配列を含むペプチド、
ｂ）配列番号１のアミノ酸１９０〜２１６に記載の配列を含むペプチド、
ｃ）配列番号１のアミノ酸１２８〜１５１と同一の配列又はその部分配列を有する少なくとも８アミノ酸残基を含むペプチド、
ｄ）配列番号１のアミノ酸１９０〜２１６と同一の配列又はその部分配列を有する少なくとも８アミノ酸残基を含むペプチド、
ｅ）配列番号１のアミノ酸１２８〜１５１と少なくとも５０％の同一性がある配列又はその部分配列を有する少なくとも１０アミノ酸残基を含むペプチド、及び
ｆ）配列番号１のアミノ酸１９０〜２１６と少なくとも５０％の同一性がある配列又はその部分配列を有する少なくとも１０アミノ酸残基を含むペプチド
から成る群から選択されるペプチドも開示する。
【００７８】
好ましくは、上記のｃ）及び／又はｄ）において同一な配列の長さは、少なくとも１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２アミノ酸、更により好ましくは少なくとも１４アミノ酸、なお一層好ましくは少なくとも１６アミノ酸、最も好ましくは少なくとも２０アミノ酸である。同一配列の最大の長さは、ｃ）及びｄ）についてそれぞれ２３及び２６である。
【００７９】
好ましくは、上記のｅ）及び／又はｆ）において部分的に同一な配列の長さは、少なくとも１２アミノ酸、より好ましくは少なくとも１４アミノ酸、更により好ましくは少なくとも１６アミノ酸も、なお一層好ましくは少なくとも２０アミノ酸、最も好ましくは少なくとも２３アミノ酸である。部分的に同一な配列の最大長さは、ｅ）及びｆ）についてそれぞれ２３及び２６である。
【００８０】
好ましくは、そのペプチドは、６０００Ｄａ未満の分子量を有する。
【００８１】
好ましくは、上記のｅ）及び／又はｆ）において部分的に同一な配列は、前記配列番号１のアミノ酸と少なくとも５０％（５０％〜１００％）、より好ましくは少なくとも６０％（６０％〜１００％）、更により好ましくは少なくとも７０％（７０％〜１００％）、なお一層好ましくは８０％（８０％〜１００％）、最も好ましくは９０％（９０％〜１００％）の配列同一性を示す。
【００８２】
前記ペプチドを、薬剤として使用する、好ましくはヘリコバクター・ピロリ感染の治療に使用することについても開示する。
【００８３】
前記ペプチドを含む医薬組成物も開示する。
【００８４】
本発明は特定の開示された実施形態について記述されているが、当業者は、特に言及されないがそれでもなお添付の特許請求の範囲内である他の実施形態、変形、又は組合せを予見することができる。
【００８５】
本明細書に引用される全ての参照文献は、その全てを参照により本明細書に組み込む。本明細書で使用される「含んでいる」という表現が、記載された項目を含むがこれに限定されないということは理解されよう。
【００８６】
ここで、本発明を以下の非限定的な例によって記述する。
【実施例】
【００８７】
以下の例において使用される方法の詳細な説明について、読者は、表題「材料及び方法」の欄の関連説明を参照されたい。
【００８８】
（例１）
Ｈ．ピロリは、ヒト胃上皮細胞からのＣＤ４６の脱落を誘導する
ＣＤ４６を高レベルで発現するＡＧＳ胃上皮細胞並びに３種のＨ．ピロリ野生型株、Ｊ９９、ＨＰＡＧ１及び２６６９５を使用して、ヒトＣＤ４６とＨ．ピロリとの相互作用を研究した。感染１８時間後、３つ全ての株がＡＧＳ細胞に付着した（図１Ａ）。Ｈ．ピロリによる胃上皮細胞の感染がＣＤ４６の発現に変化をもたらしたかどうか決定するために、ＡＧＳ細胞を、Ｈ．ピロリ株とＭＯＩ  １００で、又は培地単独と１８時間インキュベーションした。フローサイトメトリーによる分析から、Ｈ．ピロリの感染により３つ全てのＨ．ピロリ株の細胞表面でＣＤ４６が９０％以上減少したことが、明らかになった（図１Ｂ）。ＥＬＩＳＡアッセイにより、感染細胞から集めた上清中に無感染の対照と比較して、より多量のＣＤ４６が実証された（Ｐ≦０．０１）、（図１Ｃ）。これらのデータは、Ｈ．ピロリの感染が、ヒト胃上皮ＡＧＳ細胞からのＣＤ４６の脱落を助長することの証拠となる。
【００８９】
（例２）
Ｈ．ピロリは、組換えＣＤ４６（ｒＣＤ４６）に結合する
Ｈ．ピロリの感染後にＣＤ４６が胃上皮細胞から放出されるので、本発明者らはＨ．ピロリがＣＤ４６を結合する可能性があると仮定した。本発明者らは、組換えチオレドキシン−ＣＤ４６融合タンパク質（ｒＣＤ４６）を作製し、精製した（図２Ａ）。細菌に対するｒＣＤ４６の結合を、３つの異なる方法、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡検査で算定した。Ｈ．ピロリ溶菌液及びＣＤ４６抗体を使用するＥＬＩＳＡにより、全ての株がｒＣＤ４６に結合することが実証された（図２Ｂ）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の溶菌液又はチオレドキシン単独では、かなり低下したレベルで結合したので、その結合はＨ．ピロリに特異的だった（データ不掲載）。反対に、ｒＣＤ４６とカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）との相互作用は、検出されなかった（データ不掲載）。フローサイトメトリー分析から、株の間で結合レベルは少し変化したが、３つ全てのＨ．ピロリ株がｒＣＤ４６に結合することが実証された（図２Ｃ）。更に、増殖培地のｐＨの変化は、Ｈ．ピロリとｒＣＤ４６との相互作用に影響を及ぼさなかった（データ不掲載）。これらデータにより、Ｈ．ピロリとｒＣＤ４６との相互作用が特異的であることが実証される。
【００９０】
細胞表面に堆積した後、Ｃ３ｂは高い親和性でＣＤ４６を結合する。ＣＤ４６−Ｈ．ピロリの相互作用の特異性を更に確認するために、Ｃ３ｂを使用する競合アッセイを計画した。Ｊ９９株が強いｒＣＤ４６結合を示したので、これらの研究用として選択した（図２Ｄ）。組換えＣＤ４６を、Ｃ３ｂ又は抗ＣＤ４６抗体と１時間プレインキュベーションし、更に細菌と２時間インキュベーションした。フローサイトメトリー分析により、Ｃ３ｂとＣＤ４６抗体の両方が、Ｈ．ピロリに対するｒＣＤ４６の結合を著しく遮断することが示された。これらデータにより、Ｃ３ｂ及びＨ．ピロリが、重複している又は密接に関連したＣＤ４６ドメインを認識することが確認される。ＣＤ４６中のＣ３ｂ結合に関与する部位が、Ｃ末端補体制御タンパク質ドメインであるＣＣＰ−３及びＣＣＰ−４にマップされた。ここでその結果は、Ｈ．ピロリもこれらのドメインに結合することを支持している（図２Ｄ）。Ｈ．ピロリに対するｒＣＤ４６の結合は、抗ＣＤ４６抗体を使用する免疫蛍光顕微鏡観察によっても実証された（図２Ｅ）。予想外に、ＣＤ４６の結合は、細菌の形態の変形、つまり細菌のらせん形状の消失、細菌の凝集の増大、及び細菌の溶菌をもたらした（図２Ｆ）。
【００９１】
（例３）
ＣＤ４６は、Ｈ．ピロリの増殖を阻害する
Ｈ．ピロリＪ９９をｒＣＤ４６  ０〜１００μｇと６時間インキュベーションすることにより、Ｈ．ピロリに対するｒＣＤ４６の殺菌効果を更に評価した。ｒＣＤ４６を用いる治療は用量依存的に細菌生存を損なったが、対照タンパク質のチオレドキシン（Ｔｒｘ）は殺菌効果を有さなかった（図３Ａ）。Ｈ．ピロリをｒＣＤ４６と共に０、６、２４時間インキュベーションすることにより、細菌生存を経時的に調査した。細菌生存は長いインキュベーション時間によって明らかに減少した（図３Ｂ）。したがって、ｒＣＤ４６は、用量及び時間依存的にＨ．ピロリの増殖を阻害する。
【００９２】
ｒＣＤ４６の殺菌効果の機序を理解するために、Ｈ．ピロリをｒＣＤ４６と２時間プレインキュベーションし、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。ＰＩは通常、細胞透過性ではなく、死細菌のＤＮＡだけを染色する。ｒＣＤ４６を用いて前処理した細菌は陽性ＰＩ染色を示したので、膜の透過化が示唆された（図３Ｃ）。チオレドキシンと共にインキュベーションした細菌の場合、又はｒＣＤ４６がＣ３ｂと共にプレインキュベーションされたとき、ＰＩ−染色は観察されなかった（Ｐ≦０．００１）。Ｈ．ピロリに結合しているｒＣＤ４６が細菌膜漏出をもたらし、Ｃ３ｂがこの殺菌効果を遮断できることが、これらのデータから実証される。
【００９３】
（例４）
ＣＤ４６の２４アミノ酸ペプチドは、Ｈ．ピロリの増殖を阻害する
Ｈ．ピロリに対して阻害活性があるＣＤ４６ドメイン（単数又は複数）を同定するために、親水性であり潜在的に露出されたＣＤ４６のＣＣＰ領域に対応する４つのペプチド、ＣＣＰ１（Ｐ１：３７〜５６）、ＣＣＰ２（Ｐ２：８１〜１０４）、ＣＣＰ３（Ｐ３：１２８〜１５１）、及びＣＣＰ４（Ｐ４：１９０〜２１６）（配列番号１に対応して示される間隔）を合成した（図３Ｄ）。Ｈ．ピロリを各ペプチドと６時間混合し、殺菌効果を評価した。Ｐ１とＰ２は細菌生存に検出可能な効果がなかった（図３Ｅ）が、ペプチドＰ３とＰ４の両方が細菌の増殖を阻害した。Ｐ３は、最も効果的な阻害剤であり８０％の細菌が死滅した。Ｐ３が媒介する殺菌効果の速度論を調査するために、本発明者らは、異なる濃度のＰ３と共に細菌を６時間インキュベーションした。ペプチドＰ３は、５μＭで４０％の殺菌、７μＭで５０％の殺菌、３０μＭで８０％の用量依存的殺菌効果を見せた（図３Ｆ）。これらのデータは、Ｈ．ピロリとＣＤ４６との接触点がＣＤ４６のＣＣＰ−３領域内に位置し、その領域が以前に報告されたＣ３ｂに対する結合領域でもあることを示唆している。合わせて考えると、Ｈ．ピロリの増殖を阻害する能力がある２４アミノ酸のペプチドＰ３が同定された。
【００９４】
Ｐ３ペプチドの異なる断片及び変異体（配列番号２２〜３２）を使用するマッピング実験を実施して、抗菌効果に重要な配列モチーフを更に特定した。Ｐ３−２１（配列番号２７）及びＰ３−２２（配列番号２９）などいくつかの短い変異体は抗菌効果を示したが、親Ｐ３（配列番号１８）より有効でなかった（図６を参照のこと）。
【００９５】
ＥＶＦ−配列（Ｐ３−２５の残基１９〜２１に対応する）が取り除かれたとき、Ｐ３−２１の抗菌活性は失われた（Ｐ３−２１をＰ３−１８［配列番号２８］と比較のこと）。ＰＰＰのモチーフ（Ｐ３−２５の残基４〜６に対応する）の削除により、Ｐ３−２２が抗菌活性を全て失ったことも明らかであった。したがって、ＰＰＰとＥＶＦモチーフの両方の存在が抗菌活性に不可欠であると結論できる。
【００９６】
Ｐ３とＰ３−２５との比較から、これらペプチドの両方に同程度の効果があったので、Ｐ３−２５上のＮ末端のＬは抗菌効果に必要でないことが明らかになる。反対に、Ｐ３−２２とＰ３−２５との比較から、ＣＴ−モチーフ（Ｐ３−２５の残基２〜３）が抗菌活性の改善に著しく寄与したことが示される。同様に、Ｐ３−２１とＰ３−２５との比較から、Ｃ末端のＥＹＬＦ−モチーフ（残基２２〜２５  Ｐ３−２５）が抗菌活性の改善に著しく寄与したことが明らかになった。
【００９７】
Ｐ３−１５（配列番号２６）とＰ３−１９（配列番号３０）の両方は、それぞれＮ末端ＣＴＰＰＰ又はＣ末端ＥＶＦＥＹＬＤモチーフを含むにもかかわらず、測定可能な抗菌活性を有さない点に留意されたい。この観察は更に、ＰＰＰとＥＶＦ−モチーフの両方が不可欠であるという結論を支持する。
【００９８】
（例５）
ｒＣＤ４６及びペプチドＰ３は、Ｈ．ピロリのウレアーゼ活性を阻害する
ＣＤ４６に結合する細菌のリガンドを見つけるために、プルダウンアッセイを実施した。細菌抽出物全部を、ｒＣＤ４６を事前に結合させたＴａｌｏｎ親和性カラムに通した。溶出画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシーブリリアントブルーを用いて染色した（図４Ａ）。質量分析法によって、分子量２１ｋＤａ及び２６ｋＤａの２本の顕著なバンドを、ＵｒｅＡ及びアルキルヒドロペルオキシド還元酵素（ＡｈｐＣはａｈｐＣ遺伝子にコードされる）として同定した。
【００９９】
Ｈ．ピロリのウレアーゼは、胃感染の発生及び胃粘膜における損傷の誘導に重要な毒性因子である。その酵素は、ＵｒｅＡとＵｒｅＢの２つのサブユニットから成り、細胞質、ペリプラズム及び膜に見られる。ウレアーゼ活性の阻害がＨ．ピロリに致死的であることは公知である。ｒＣＤ４６は、細菌に結合することによってＨ．ピロリに対して殺菌性なので、我々はｒＣＤ４６がウレアーゼ活性を遮断できるかどうか試験した。これを決定するために、Ｈ．ピロリＪ９９の総タンパク質抽出物をｒＣＤ４６の有り無しでインキュベーションし、ウレアーゼ活性を分析した。ｒＣＤ４６と２０分間プレインキュベーションすることにより、対照と比較してウレアーゼ活性が９５％以上阻害された（図４Ｂ）。
【０１００】
ａｈｐＣによってコードされるＡｈｐＣは、有機ヒドロペルオキシドの還元においてはペルオキシドレダクターゼとして、及び酸化的ストレス下ではタンパク質の誤った折り畳みを防ぐための分子シャペロンとして機能する。ＵｒｅＡ及びＡｈｐＣがＣＤ４６のリガンドであることを更に確認するために、本発明者らは、Ｊ９９株のΔｕｒｅＡ変異株及びΔｕｒｅＡ／ΔａｈｐＣ二重変異株を作製したが、本発明者らはΔａｈｐＣＡ単一変異株を作製できなかった（材料及び方法の欄を参照のこと）。ΔｕｒｅＡ変異株はｒＣＤ４６結合能が著しく損なわれ、二重変異株とｒＣＤ４６との相互作用は完全に破壊された。これはＵｒｅＡ／ＡｈｐＣがＣＤ４６との相互作用に重要な役割を果たすことを示唆している（図４Ｃ）。Ｐ３ペプチドもＵｒｅＡ及びＡｈｐＣを結合することを検証するために、Ｐ３−ＦＩＴＣ及びＰ１−ＦＩＴＣを野生型Ｊ９９、ΔｕｒｅＡ、ΔａｈｐＣ及びΔｕｒｅＡ／ΔａｈｐＣと共にインキュベーションし、フローサイトメトリーで分析した。Ｐ１ペプチド及びランダムなペプチドは野生株又は変異株に結合しなかったが、Ｐ３ペプチドはｒＣＤ４６と類似の様式でＨ．ピロリに結合した。すなわち、Ｐ３と比較して、ΔｕｒｅＡは４７％結合し、ΔａｈｐＣは５５％結合したが、ΔｕｒｅＡ／ΔａｈｐＣは結合しなかった（図４Ｄ）。データを更に強化するために、本発明者らはｕｒｅＡ及びａｈｐＣ変異株を相補した。その後、その変異株はペプチドＰ３結合能を回復した。
【０１０１】
ｒＣＤ４６とＰ３ペプチドが相当する殺菌様式を有したので、本発明者らは、Ｐ３ペプチドもウレアーゼ活性を阻害できるかどうか試験した。Ｐ３ペプチドはＪ９９のウレアーゼ活性を阻害したがＰ１ペプチドはしなかった（図４Ｅ）。これらのデータは、ｒＣＤ４６及びペプチドＰ３が不可欠な毒性特性、すなわちウレアーゼ活性を、多分ＵｒｅＡを直接標的にすることによって阻害することの証拠となる。
【０１０２】
（例６）
Ｐ３ペプチドの経口投与は、マウスにおいてＨ．ピロリ感染を除去する
酸性の胃粘膜における細菌生存にはウレアーゼ活性が不可欠なので、次にペプチドＰ３によるウレアーゼ活性の阻害がｉｎ  ｖｉｖｏでＨ．ピロリのコロニー形成に影響力がある可能性があるかどうかを評価した。Ｈ．ピロリ６７：２１株はマウスの胃粘膜に定着するので、この株をｉｎ  ｖｉｖｏ実験に使用した。６７：２１株は、Ｊ９９と比較して、ｒＣＤ４６及びペプチドＰ３と類似の結合及び相互作用を示した（データ不掲載）。加えて、Ｊ９９株のｕｒｅＡ変異株と同様に、６７：２１株のｕｒｅＡ変異株がＰ３に対する結合を減少させることを実証した。ＣＤ４６トランスジェニックマウスに、Ｈ．ピロリ６７：２１株を１日に１回、３日間、経口感染させた。感染８週間後、治療前にＨ．ピロリのコロニー形成を確認した。マウスにＰ３ペプチド２０μｇを１日１回、２週間、経口的に与え、対照群マウスには同じ方法でＨ２Ｏを与えた。胃組織中の生存細菌数を、生菌数を算定することにより決定した。無処理のマウスは高い細菌負荷を示したが、Ｐ３処理したマウスにＨ．ピロリを検出できなかったことは、ペプチドＰ３を用いる治療によりマウス胃からＨ．ピロリが一掃されたことを示している（図５Ａ）。Ｈ．ピロリに誘導されるＣＤ４６の脱落へのＰ３ペプチドの影響力を評価するために、処理、無処理及び対照のマウスの胃から得た組織切片を、Ｈ．ピロリ及びＣＤ４６抗体を用いて免疫染色することにより検査した。Ｈ．ピロリは、無処理マウスの胃表面粘膜に存在した；しかし、Ｐ３処理及び対照マウスは検出可能なＨ．ピロリを示さなかった（図５Ｂ）。無処理マウスにおけるＣＤ４６の強度は、Ｐ３処理したマウスより著しく低かった（Ｐ≦０．０１）（図５Ｃ）。胃粘膜中のＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１０を含めたサイトカインの応答をＥＬＩＳＡで測定することにより、Ｈ．ピロリによって誘発される宿主応答を更に調査した。Ｐ３処理したマウス中のＩＬ−１０レベルは無処理マウスより高かったが、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αのレベルは群の間で著しい違いがなかった。処理マウスの胃組織中にＩＬ−１０レベルの著しい増加があったという発見は、Ｐ３の補充により炎症応答を減少できることを示唆している（図５Ｄ）。合わせて考えると、これらデータから、ＣＤ４６ペプチドＰ３がｉｎ  ｖｉｖｏで殺菌効果を示し、Ｐ３の補充により宿主での抗炎症応答を増強できることが明らかになる。
【０１０３】
材料及び方法
細菌株、細胞系、及び増殖条件
Ｈ．ピロリＪ９９株（ＡＴＣＣ７００３９２）及び２６６９９５株（ＡＴＣＣ７００８２４）を、アメリカンタイプセルコレクション（ＡＴＣＣ）から得た。Ｈ．ピロリＨＰＧＡ１は、以前に記載されている（Ｏｈ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｔｒｏｐｈｉｃ  ｇａｓｔｒｉｔｉｓ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｓｔｒａｉｎ：ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０３巻、９９９９〜１０００４ページ（２００６））。細菌を、８％ウマ血液（ＳＶＡ）及び８％ウマ血清（ＳＶＡ）を補充したコロンビア血液寒天プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で、１０％ＣＯ２及び５％Ｏ２雰囲気中で、３７℃で培養した。液体培養を調製するために、細菌を血液寒天から集め、８％ウマ血清及び５ｍｌ／Ｌイスオビトクス（ｉｓｏｖｉｔｏｘ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含むブルセラ菌培養液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に懸濁し、２４時間インキュベーションした。分光光度計（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用して６００ｎｍで光学密度を測定することにより、細菌の濃度を決定した。
【０１０４】
ヒト胃細胞系ＡＧＳ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７３９）を、アメリカンタイプセルコレクション（ＡＴＣＣ）から入手した。１０％の熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中で、細胞を維持した。
【０１０５】
付着アッセイ
ＡＧＳ細胞を２４穴細胞培養プレート中に抗生物質無しで増殖させ、感染させる前に細胞培地を交換した。Ｈ．ピロリ株をブルセラ菌培養液中で終夜増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、細胞培地に再懸濁し、ＡＧＳ細胞に添加して感染多重度ＭＯＩ  １００：１を得て、細菌を１８時間付着させておいた。細胞をＰＢＳで３回洗浄して結合していない細菌を取り除いた。次いで、細胞を１％サポニンと５分間インキュベーションし、連続希釈し、コロンビア血液寒天プレート上に広げた。平板培養３〜５日後に、コロニー形成単位を数えた。
【０１０６】
フローサイトメトリーアッセイ
ＡＧＳ細胞を６穴ディッシュ中に８０〜９０％のコンフルエントまで増殖させ、感染させる前に細胞培地を新鮮な培地に交換した。以前に記述されている通り細菌を調製し、ＭＯＩ  １００：１で添加した。感染１８時間後に、細胞をトリプシン処理によって集め、ＰＢＳで２回洗浄し、１０００ｘｇで５分間遠心した。ペレットを、ＣＤ４６に対するポリクローナル抗体（Ｈ−２９４、Ｓａｉｎｔ  Ｃｒｕｓｅ、１：２００希釈）を含むＰＢＳに再懸濁し、４℃で４５分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：４００希釈）に再懸濁し、氷上で４５分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄してフローサイトメトリーで分析した。データをＣｅｌｌｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で更に加工した。ｒＣＤ４６結合のフローサイトメトリー。対数期のＨ．ピロリをｒＣＤ４６と最終濃度３０μｇ／ｍｌで、３７℃で２時間プレインキュベーションした。結合していないｒＣＤ４６をＰＢＳで洗浄して取り除き、ｒＣＤ４６の結合を上述の通り分析した。ＦＩＴＣ−Ｐ３ペプチド（３０μＭ）とＨ．ピロリとの相互作用に関して行い、ｒＣＤ４６結合として分析した。
【０１０７】
細胞培養上清の調製
ＡＧＳ細胞を６穴ディッシュ中に８０〜９０％のコンフルエントまで増殖させ、感染させる２４時間前に細胞培地を交換した。以前に記述されている通り細菌を調製し、ＭＯＩ  １００：１で添加した。感染及び無感染の細胞の上清を２４時間後に集め、濃縮し、１００ｍＭ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に再懸濁した。その後、各懸濁液１００μｌを、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルに添加し、４℃で終夜インキュベーションした。ウェルを５％のスキムミルクでブロッキングし、ＰＢＳで洗浄した。ＣＤ４６に対するポリクローナル抗体（Ｈ−２９４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：５０００希釈）、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ウサギ抗体（１７０−６５１５、ＢｉｏＲａｄ、１：４０００希釈）とインキュベーションすることにより、ＣＤ４６を同定した。添加後に、基質を添加し、Ａ４５０を測定した。実験を３つ組で２回繰り返し、平均及び標準偏差を算出した。
【０１０８】
ｒＣＤ４６の精製及び親和性クロマトグラフィー
配列番号１のアミノ酸１〜２９３を含む組換えＣＤ４６を、大腸菌で発現させ精製した。簡潔には、チオレドキシン及びＣＤ４６の細胞外領域から成る融合タンパク質を、使用説明書に従ってカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）にかけて精製した。
【０１０９】
ＣＤ４６−ＢＣ１アイソフォームの完全な細胞外領域を、フォワードプライマー
【化１】
2013533848.tif 000003
とリバースプライマー
【化２】
2013533848.tif 000004
を用いてＰＣＲ増幅し、ＴＯＰＯ発現ベクターｐＥＴ１０２Ｄにライゲーションした。組換えｔｒｘ−ＣＤ４６−６ｘｈｉｓタンパク質を、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株で産生させ、使用説明書に従ってＴａｌｏｎ金属親和性樹脂を用いて精製した。簡潔には、細胞を２００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地中で、３７℃で４〜６時間培養した。ＯＤ６００＝０．６〜０．８のときに、０．５ｍＭのＩＰＴＧによって、培養物を更に４時間誘導した。細菌を回収し、５０ｍＭトリス、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭイミダゾール及び５ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む溶菌緩衝液中で、室温で２０分間インキュベーションした。混合物を０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ及び１Ｕ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ中、室温で５分間インキュベーションし、超音波処理し、１５０００ｇで１時間遠心した。タンパク質をＴａｌｏｎ樹脂カラムにかけて精製し、２００ｍＭイミダゾールを用いて溶出した。チオレドキシン対照タンパク質を、ｐＥＴ３２ａ＋ベクターを含むＢＬ２１（ＤＥ３）宿主細胞によって産生し、精製した。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確かめた。
【０１１０】
親和性クロマトグラフィー
以前に記述されている通り、Ｈ．ピロリＪ９９株（１０８細菌／ｍｌ）の細胞抽出物を調製した（Ｎａｇａｔａ，Ｋ．、Ｓａｔｏｈ，Ｈ．、Ｉｗａｈｉ，Ｔ．、Ｓｈｉｍｏｙａｍａ，Ｔ．及びＴａｍｕｒａ，Ｔ．、Ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｐｒｏｔｏｎ  ｐｕｍｐ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｌａｎｓｏｐｒａｚｏｌｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｕｒｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ：ｕｎｉｑｕｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｆｏｒ  Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ  ｃｅｌｌｓ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、３７巻、７６９〜７７４ページ（１９９３））。ｒＣＤ４６と結合させたＴａｌｏｎ親和性カラムに細胞抽出物を載せ、洗浄後に、画分をｒＣＤ４６精製方法に従って溶出した。タンパク質画分を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブルーを用いて染色した。分子量２０及び２８ｋＤａの２本バンドをゲルから切り出し、質量分析で同定した。
【０１１１】
ｒＣＤ４６とＨ．ピロリとの相互作用のＥＬＩＳＡ分析
Ｈ．ピロリをブルセラ菌培養液中で終夜増殖させ、遠心によって細胞を回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、１０７ｃｆｕ／ｍｌになるように１００ｍＭ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に再懸濁した。その後、各懸濁液１００μｌをＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルに分注し、４℃で終夜インキュベーションした。ウェルを５％のスキムミルクでブロッキングし、ＰＢＳで洗浄し、組換えＣＤ４６（２．５μｇ／ｍｌ）１００μｌと共に１時間インキュベーションし、続いてＣＤ４６に対するポリクローナル抗体（Ｈ−２９４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：５０００希釈）とインキュベーションした。一次抗体とのインキュベーションの後に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ウサギ抗体（１７０−６５１５、ＢｉｏＲａｄ、１：４０００希釈）を続けた。ＰＢＳで洗浄した後、基質を添加し、４５０ｎｍで吸光度を決定した。実験を３つ組で２回繰り返し、平均及び標準偏差を算出した。
【０１１２】
蛍光顕微鏡検査
顕微鏡分析のために、ｒＣＤ４６をＨ．ピロリ株とインキュベーションし、フローサイトメトリー用の手順に従って染色した。倒立蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ｃｅｌｌｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ）を用いて、６３ｘ倍率で、ＣＣＤカメラで画像を撮影した。画像を、セルビジョン（ｃｅｌｌｖｉｓｉｏｎ）ソフトウェア及びａｄｏｂｅ  ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアで更に加工した。
【０１１３】
殺菌性アッセイ
寒天プレート上のＨ．ピロリＪ９９を、ブルセラ菌培養液に懸濁し、約１０５ｃｆｕ／ｍｌに希釈した。２００μＬの細菌懸濁液を、ｒＣＤ４６（最終濃度（３０μｇ／ｍｌ））と共に軽く振盪させながら０、６又は２４時間インキュベーションした。チオレドキシン及びＰＢＳを対照として使用した。細菌を連続希釈し、コロンビア血液寒天プレート上で平板培養し、４〜７日間インキュベーションした後に数えた。Ｈ．ピロリを（３０μＭ）のＣＤ４６ドメイン（ＣＣＰ１〜４）とインキュベーションし、又は他の実験において、Ｈ．ピロリを様々な濃度の様々なＣＤ４６由来合成ペプチドとインキュベーションし、バクテリアの増殖を上述の通りモニタリングした。
【０１１４】
競合アッセイ
Ｈ．ピロリ株を終夜増殖させ、約１０６ｃｆｕ／ｍｌに希釈した。ｒＣＤ４６（最終濃度３０μｇ／ｍｌ）を、２．５μｇ／ｍｌ  Ｃ３ｂ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）、又は２μｇ／ｍｌ  ＣＤ４６抗体（Ｈ−２９４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１時間プレインキュベーションし、続いてＨ．ピロリと更に２時間インキュベーションした。対照として、Ｈ．ピロリを、最終濃度（３０μｇ／ｍｌ）のｒＣＤ４６単独とインキュベーションした。サンプルを固定し、ＣＤ４６抗体を用いて染色し、前述の通りフローサイトメトリーで分析した。
【０１１５】
細菌の透過化を評価するために、ｒＣＤ４６（３０μｇ／ｍｌ）を２．５μｇ／ｍｌ  Ｃ３ｂと１時間プレインキュベーションし、続いてＨ．ピロリと更に２時間インキュベーションした。生産者の手順に従って（ＢＤ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）細菌を、ＰＩを用いて染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＡｒｉａ）で分析した。無処理の集団及び／又はチオレドキシンを使用して、死細胞の基礎レベルを定義した。次いで、処理した集団の割合から無処理の集団の細胞の割合を減算することによって、透過化された細胞の割合を決定した。
【０１１６】
ウレアーゼ活性アッセイ
ウレアーゼ活性を測定するために、以前に記述されている通り、我々は使用した４０。簡潔には、Ｊ９９株を１０８ｃｆｕ／ｍｌまで終夜増殖させた。細菌を回収し、洗浄し、脱気した氷冷２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で再懸濁した。懸濁液を氷冷しながら３０秒のパルスで３分間超音波処理し、１００００ｇで２０分間遠心して細胞残屑を取り除いた。その上清をウレアーゼ活性アッセイに使用した。１μｇのタンパク質を、最終濃度（３０μｇ／ｍｌ）のｒＣＤ４６又はＰ３ペプチドと３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーションの後に、５０ｍＭ尿素、０．０２％フェノールレッドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．８  １００μｌを、各ウェルに添加した。色の変化を、マイクロプレートリーダを用いて５６０ｎｍでモニタリングした。阻害率を以下の方程式によって決定した：阻害％＝［ｒＣＤ４６無しの活性］−［ｒＣＤ４６有りの活性］／［ｒＣ４６無しの活性］ｘ１００。
【０１１７】
ＣＤ４６ドメインのペプチド合成
ＣＣＰ−１内の領域３２〜５６（配列番号１に関連するアミノ酸）、ＣＣＰ−２内の８１〜１０５、ＣＣＰ−３内の１２８〜１５１、ＣＣＰ−４内の１９０〜２１６、ＦＩＴＣ−３２〜５６、ＣＣＰ１、及びＣＣＰ−３内のＮ末端ＦＩＴＣ−ＣＣＰ−１  １２８〜１５１に対応するＣＤ４６ドメインを、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ２．０，Ｉｎｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｐｔｉｄｅ２０．ｃｏｍ）で合成した。Ｎ末端に追加のロイシン（Ｌ）を有するペプチドＰ３（Ｐ３−２５）の変異体も合成した。Ｐ３−２５の様々な誘導体を合成し、そのアミノ酸配列を図６に示した。全てのペプチドは、純度９０〜９５％だった。ペプチドをＰＢＳに再懸濁し、使用前に−２０℃で貯蔵した。その後ペプチドを、使用濃度までブルセラ菌培養液又は水に希釈した。
【０１１８】
動物及び実験手順
ｈＣＤ４６Ｇｅトランスジェニックマウス系（ＣＤ４６＋／＋Ｃ５７ＢＬ／６）を、Ｂ６Ｃ３Ｆ１雑種を使用して作成した。全てのマウスを、ストックホルム大学の動物施設において標準的な条件の下で飼育した。動物の世話及び実験は組織ガイドラインに従い、全国倫理委員会によって認可されている。６〜８週齢マウス（ｎ＝２４）に、Ｈ．ピロリ６７：２１  ０．１ｍｌ（１０８ｃｆｕ／ｍｌ）を１日に１回、３日間隔で経口投与した。無感染対照マウス（ｎ＝１０）には、同様の方法でＰＢＳ  ０．１ｍｌを与えた。感染８週間後に、感染させたマウスを２群に分けた、一方の群には２０μＭ  Ｐ３ペプチド１００μｌを、他方の群にはＰＢＳ  １００μｌを、１日に１回、２週間経口的に接種した。治療の２週間後に、全てのマウスに麻酔をかけ、屠殺した。正中切開で開腹し、胃を摘出し、大彎に沿って切開した。胃内容物を、食塩水を用いて穏やかに洗い流した。３〜５ｍｍ幅で２つの縦長片を切り取った、一方はＨ．ピロリ培養用、他方は組織学的評価用である。胃組織をブルセラ培養液中でホモジナイズし、（２００μｇ／ｍｌ）及びナリジキシン酸（１０μｇ／ｍｌ）を含む血液寒天培地プレート上で希釈物を平板培養することによってコロニー形成を決定した。プレートを４〜７日間インキュベーションし、Ｈ．ピロリのコロニーをその形態とウレアーゼによって同定した。組織学的評価のために、胃組織を４％パラホルムアルデヒドに固定し、パラフィン包埋した。Ｈ．ピロリ及びＣＤ４６レベルを検出するために、組織切片をＨ．ピロリに対するマウス抗体（ｓｃ−６５４５４、１：５０希釈）及びＣＤ４６に対するウサギ抗体（Ｈ９４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１：５０希釈）と６０分間、続いて二次抗体としてＡｌｅｘａ４８８抗マウスＩｇＧ及びＡｌｅｘａ５９３結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５０希釈；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベーションした。切片をカールツァイスアクシオビジョン（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ）２．０５画像処理及び分析システム（Ｚｅｉｓｓ）を用いて視覚化した。
【０１１９】
胃組織中のインターロイキンＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＴＮＦ−αの測定
胃をブルセラ培養液中でホモジナイズし、上清を集め、分注し、−８０℃に貯蔵した。ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＴＮＦ−αのレベルを、市販のＥＬＩＳＡキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＩＬ−６，ＣＭＣ００６３、ＩＬ−１０，ＣＭＣ０１０３、及びＴＮＦ−α，ＣＭＣ３０１３）を使用して、製造業者の指示に従って測定した。各サンプルを２回測定した。
【０１２０】
Ｈ．ピロリΔｕｒｅＡ変異株の作製
クロラムフェニコール抵抗性遺伝子（ＣＡＴ）を、プライマー
【化３】
2013533848.tif 000005
を使用してｐＡＣＹ１８４からＰＣＲ増幅した。
【０１２１】
４８時間プレートからかき集めた細胞を洗浄することによって、Ｈ．ピロリＪ９９のゲノムＤＮＡを単離し、製造業者の指示に従ってＱｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡキット２．０ｍｌに再懸濁した。２対のｕｒｅＡ特異的プライマー
【化４】
2013533848.tif 000006
を使用して、各標的遺伝子の上流及び下流領域をそれぞれＰＣＲ増幅した。Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットを使用してＰＣＲ産物を精製した。末端で重複する相同性を考慮してプライマーを設計した。いずれのプライマーも添加せずに５サイクル、続いて２つのプライマーと共に３０サイクルする二段階ＰＣＲ反応で、異なるＰＣＲ断片をライゲーションした。形質転換によって構造物をＨ．ピロリＪ９９に導入し、４８時間後にブルセラ菌培養液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）０．２ｍｌに細胞をかき集め、コロンビア血液寒天プレート上に１００μｌ（１ｘ１０８細菌／ｍｌ）をスポットした。精製したＤＮＡ産物１５０ｎｇとインキュベーションした後に、形質転換された細胞の混合物をプレートに広げ、更に２４時間インキュベーションした。次いで、１５μｇクロラムフェニコール／ｍｌを含む選択コロンビア血液寒天プレート上に細胞をかき集め、３〜７日間インキュベーションした。そのクローンを、ＰＣＲ、ウエスタンブロット及びウレアーゼ活性試験によって確認した。
【０１２２】
Ｈ．ピロリΔｕｒｅＡ／ΔａｈｐＣ変異株
アルキルヒドロペルオキシド還元酵素遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子を用いて不活性化し、それを使用してＨ．ピロリＪ９９のΔｕｒｅＡ欠損変異株を形質転換した。カナマイシン耐性遺伝子を、プライマーｋａｎ−ｆｗｄ
【化５】
2013533848.tif 000007
とｋａｎ−ｒｅｖ
【化６】
2013533848.tif 000008
を用いてｐＤＯＮＲ、Ｐ４−Ｐ１Ｒから増幅した。ａｈｐＣ遺伝子の上流領域を、プライマーａｈｐＣ  ｕｐｓ−ｆｗｄ
【化７】
2013533848.tif 000009
とａｈｐＣ  ｕｐｓ−ｒｅｖ
【化８】
2013533848.tif 000010
を用いて増幅した。遺伝子の下流領域を、プライマーａｈｐＣ  ｄｓ−ｆｗｄ
【化９】
2013533848.tif 000011
とａｈｐＣ  ｄｓ−ｒｅｖ
【化１０】
2013533848.tif 000012
を用いて増幅した。重複する末端を有するようにプライマーを設計した。一段階で行うＰＣＲ：
（ｉ）いずれのプライマーも添加せずに７サイクル、続いて（ｉｉ）プライマーａｈｐＣ  ｕｐｓ−ｆｗｄとａｈｐＣ  ｄｓ−ｒｅｖと共に３５サイクル、で異なる３つのＰＣＲ断片をライゲーションした。上述の通り、選択プレート（１０μｇ／ｍｌカナマイシン及び１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を用いて、得られた断片をΔｕｒｅＡ欠損Ｈ．ピロリに組み込んだ。陽性の形質転換体を、プライマーａｈｐＣ−ｆｗｄ
【化１１】
2013533848.tif 000013
とａｈｐＣ−ｒｅｖ
【化１２】
2013533848.tif 000014
を使用するＰＣＲによって確認した。
【０１２３】
Ｈ．ピロリΔａｈｐＣ変異株及びその補体の作製
上記の通り、ａｈｐＣ遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で不活性化し、それを使用してＨ．ピロリを形質転換した。相補のために、プライマー
【化１３】
2013533848.tif 000015
を用いて下流領域を含む完全なａｈｐＣ遺伝子を増幅した。ａｐｈＣの上流領域を、プライマー
【化１４】
2013533848.tif 000016
を用いて増幅し、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子を、ｐＡＣＹ１８４からプライマー
【化１５】
2013533848.tif 000017
を使用して増幅した。重複する末端を有するようにプライマーを設計し、上述の通り一段階で行うＰＣＲにより互いに融合させた。上述の通り、１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む選択プレートを用いて、得られた断片をΔａｈｐＣ欠損Ｈ．ピロリに組み込んだ。陽性の形質転換体を、ａｈｐＣプライマー
【化１６】
2013533848.tif 000018
を使用するＰＣＲによって確認した。
【０１２４】
統計分析
ＡＮＯＶＡ一元配置分析を使用して有意性を算定した。全ての実験は独立した少なくとも２回の実験セットの３つ組で実施した。
【図１】
2013533848.tif 000019
【図２Ａ−Ｃ】
2013533848.tif 000020
【図２Ｄ−Ｆ】
2013533848.tif 000021
【図３】
2013533848.tif 000022
【図４】
2013533848.tif 000023
【図５Ａ．Ｃ．Ｄ】
2013533848.tif 000024
【図５Ｂ】
2013533848.tif 000025
【図６】
2013533848.tif 000026
【配列表】
2013533848000001.app
【国際調査報告】
2013533848.tif 000027
2013533848.tif 000028
2013533848.tif 000029
2013533848.tif 000030
2013533848.tif 000031
2013533848.tif 000032